(57)【要約】      （修正有）【課題】  乳がんをはじめとする様々な上皮組織由来がんに対してより効果的ながんの治療薬を提供する。【解決手段】  ＡＤＰリボシル化因子を特異的に活性化する蛋白質に関するメッセンジャーＲＮＡの塩基配列と結合して、前記メッセンジャーＲＮＡを切断するオリゴリボヌクレオチドを合成し、このようなオリゴヌクレオチドでガン細胞を処理することによって、がんの浸潤・転移を抑制する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＤＰリボシル化因子を特異的に活性化する蛋白質に関するメッセンジャーＲＮＡのヌクレオチド配列と結合して、前記メッセンジャーＲＮＡを切断することを特徴とするオリゴリボヌクレオチド。
【請求項２】
ＡＤＰリボシル化因子を特異的に活性化する蛋白質が、ＡＤＰリボシル化因子６に対するグアニンヌクレオチド交換因子蛋白質であることを特徴とする請求項１に記載のオリゴリボヌクレオチド。
【請求項３】
２１ないし２３個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を有する請求項１に記載のオリゴリボヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号：１のヌクレオチド配列を有する請求項３に記載のオリゴリボヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号：２のヌクレオチド配列を有する請求項３に記載のオリゴリボヌクレオチド。
【請求項６】
メッセンジャーＲＮＡが配列番号：３のヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項１に記載のオリゴリボヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号：１のヌクレオチド配列を有するオリゴリボヌクレオチドおよび配列番号：２のヌクレオチド配列を有するオリゴリボヌクレオチドからなる２１ないし２３塩基対からなる二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項８】
配列番号：１のヌクレオチド配列を有するオリゴリボヌクレオチドおよび配列番号：２のヌクレオチド配列を有するオリゴリボヌクレオチドからなる２１ないし２３塩基対の二本鎖ｓｉＲＮＡを含有するヒトがん細胞の浸潤活性の阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん細胞の浸潤活性を阻害することによってがん転移を抑制するオリゴリボヌクレオチドに関する。さらに、本発明は、ＲａｓスーパーファミリーのメンバーであるＡＤＰリボシル化因子を特異的に活性化する蛋白質の発現を阻害する２１〜２３ｂｐの二本鎖ｓｉＲＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの最も大きな脅威はその浸潤・転移性にある。上皮がんの場合、転移の多くはまずがん細胞の基底膜への浸潤を介して起こる。このことは、ヒト乳がんにおいて顕著であることが病理学的所見により示されている（非特許文献１参照）。
近年では、浸潤・転移活性の阻害に関与することが知られている蛋白質分解酵素等を分子標的とした抗がん剤の臨床試験が世界レベルで多数実施されているものの、有効性が確認されたものは皆無に等しい。従って、新しい方法や分子標的を世界中の研究者らが模索しているのが現状である。
【０００３】
ＡＤＰリボシル化因子 (ADP-ribosylation factor: Arf)はRasスーパーファミリーに属する低分子量G蛋白質である。特に、ＡＤＰリボシル化因子６(Arf6)のGTP活性制御には、多数のGAP（GTPase activating protein）およびGEF（Guanine nucleotide exchange factor）蛋白質が関与することが知られている（非特許文献２参照）。
本発明者らは、Arf6のGTPaseサイクルの特異的制御が乳がん細胞の浸潤性獲得において必須の分子機構であることを見出した（非特許文献３参照）。このことから、Arf6のGTP活性制御に関わる因子であるGAPやGEF蛋白質は、がんの浸潤・転移活性の阻害を目標とする治療薬の新しい分子標的として、非常に有用であると考えられる。
しかしながら、Arf6のGTP活性制御によってがん細胞の浸潤・転移を制御しようとする研究は、ほとんどなされていない。
【０００４】
ヒトゲノムには、Arfを活性化するGEF蛋白質（ArfGEF蛋白質）が16種類存在することが明らかとなっている。そのメンバーの一つであるArfGEP100/BRAG2は、これまでに、Arf6に対して特異的なGEF活性を示す蛋白質であることが知られている（非特許文献４参照）。
【０００５】
【非特許文献１】Allred DC, Mohsin SK, & Fuqua SA. Endocr. Relat. Cancer, 2001, Mar; 8(1):47-61.
【非特許文献２】Sabe H. J. Biochem. 2003, Oct; 134(4):485-489, Donaldson JG. J. Biol. Chem. 2003, Oct 24; 278(43):41573-41576.
【非特許文献３】Hashimoto S, Onodera Y, Hashimoto A, Tanaka M, Hamaguchi M, Yamada A, & Sabe H. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004, Apr 27; 101(17):6647-6652.
【非特許文献４】Someya A, Sata M, Takeda K, Pacheco-Rodriguez G, Ferrans VJ, Moss J. & Vaughan M. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 2001, Feb 27; 98(5):2413-2418.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、がんの治療に関して、がんの浸潤・転移を抑制する手立てを提供することである。本発明の目的は、今までにはない分子標的を利用し、より効果的ながんの治療薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ヒトゲノムに存在する16種類のArfGEF蛋白質に関するmRNAに特異的に結合し、そのmRNAを分解することによって翻訳を妨げる現象（ＲＮＡ干渉）を引き起こす２１〜２３ｂｐのＲＮＡ（small interfering RNA: siRNA）を合成し、高浸潤性の乳がん細胞であるMDA-MB-231細胞をsiRNAで処理することによって、ArfGEF蛋白質の発現を抑制させた。
その結果、ArfGEP100/BRAG2（配列番号：３）に対する二本鎖siRNAを用いて発現抑制した場合に、MDA-MB-231細胞の浸潤活性が著しく抑制されることを見出した。さらに、この抑制効果は、その他の浸潤性がん細胞、例えば、神経膠芽腫、肺がん由来の細胞株の浸潤活性に対しても特異的な抑制効果を示した。本発明は、この発見に基づいてなされたものであり、ＡＤＰリボシル化因子を特異的に活性化する蛋白質に関するメッセンジャーＲＮＡの塩基配列と結合して、前記メッセンジャーＲＮＡを切断するオリゴリボヌクレオチドに関し、より詳しくは、ＡＤＰリボシル化因子６に対するグアニンヌクレオチド交換因子蛋白質であるArfGEP100/BRAG2に対する二本鎖siRNAに関する。
【０００８】
本発明の二本鎖siRNAにより治療の対象となるがんは、あらゆる臓器の上皮組織由来のがんである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明において、今まで試されたことがない蛋白質を分子標的とし、特異的siRNAを用いて当該蛋白質の発現を抑制することによって、非常に効果的に乳がんの浸潤活性を阻害し、その結果として転移活性を抑制できることが示された。特にsiRNAは低分子性化合物であり、実際に薬物として生体に投与できる可能性が高い。また、がん以外の他の疾患に関しても、原因蛋白質の同定に伴い、それらのsiRNAによる原因蛋白質の発現抑制による治療法の開発が既に着手されている。
本明細書において、がん細胞の浸潤を抑制するsiRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖の配列を示したことにより、今後、乳がんをはじめとする様々な上皮組織由来がんに対して有効な薬剤の開発を促進することができると期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明において、例えば、配列番号：３のヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡに特異的に結合し、このｍＲＮＡを切断するオリゴリボヌクレオチドを合成する。
このようなオリゴリボヌクレオチドは、３０個以下のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を有するＲＮＡであり、２１〜２３個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を有するRNAであることが望ましい。
【００１１】
siRNAは二本鎖のオリゴリボヌクレオチドである。まずセンス鎖オリゴリボヌクレオチドおよびアンチセンス鎖オリゴリボヌクレオチドをそれぞれ合成する。一般的に、保護基のついた4種類のオリゴリボヌクレオチドを用い、合成機を使用した有機合成で合成する。RNAは4種類のヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）がホスホジエステル結合によって連なったポリマー分子で、合成はアミダイドに、バックボーンを形成する糖の2'末端に2'-ビス（アセトキシエトキシ）−メチルエーテル（2'-ACE）保護基をつけ、１塩基ずつリン酸結合（カップリング）させることによって行う。
合成された一本鎖RNAは、100mM TEMED-酢酸塩（pH3.8）バッファーで60℃で30分間反応させることにより脱保護を行い、HPLCを用いて品質チェックを行う。高い純度のRNAを必要とする場合は、さらに変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはHPLCで精製を行う。
【００１２】
本発明においては、ArfGEP100/BRAG2に対するsiRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖として、それぞれ、２１量体からなるヌクレオチド配列（配列番号：１：gugaaaucacuggccgaguuu）および（配列番号：２：acucggccagugauuucacuu）を合成した。
【００１３】
次に、両鎖をアニーリングさせる。濃度約50mM（50pmol/μL）の両鎖の水溶液を調整し、各々の水溶液と5×アニーリング用バッファー（500mM酢酸カリウム、150mM HEPES-KOH, pH7.4, 10mM酢酸マグネシウム）を混合した溶液を90℃で1分間加熱し、その後37℃で60分間保温する。このことにより、センスオリゴリボヌクレオチドとアンチセンスオリゴリボヌクレオチドは互いにアニーリングし、ヒトがん細胞の浸潤を阻害するArfGEP100/BRAG2に対する二本鎖siRNAを形成する。
【００１４】
siRNAはリポフェクション法を用いて製剤化できる。リポフェクション法には、通常ホスファチジルセリンからなるリポソームが用いられる。ホスファチジルセリンは陰電荷を有するため、ホスファチジルセリンの代用として、より安定したリポソームを作りやすいN-[1-（2,3-ジオレイルオキシ）プロピル]-N,N,N-トリエチルアンモニウムクロライド（DOTMA）という陽イオン性脂質（商品名：トランスフェクタム、リポフェクトアミン）を用いることが好ましい。
これらの陽イオン性脂質と陰電荷を持つsiRNAとの複合体を形成させると、全体として正に荷電しているリポソームが、負に荷電している細胞の表面に吸着し、細胞膜と融合できることでsiRNAを細胞内に導入することができる。
【実施例】
【００１５】
実施例１：ArfGEP100/BRAG2に対するsiRNA処理によるArfGEP100/BRAG2蛋白質の発現抑制
常法によりアニールさせたArfGEP100/BRAG2に対するsiRNA（以下、「ArfGEP100 siRNA」という。）を、250nMの濃度でヒト乳がん細胞であるMDA-MB-231細胞に導入した。導入にはオリゴフェクタミン (ギブコ BRL社製)を使用した。ArfGEP100 siRNA導入48時間後、細胞抽出液をRIPAバッファー［1% ノニデット（Nonidet）-40, 1% デオキシコラート, 0.1% SDS, 150mM NaCl, 20mM Tris-HCl, pH7.4, 5mM EDTA, 1mM Na3VO4, 1mM フェニルメチルスルホニルクロライド, 5μg/mL アプロチニン, 2μg/L ロイペプチンおよび3μg/mL ペプスタチンA］により作成した。それぞれの抽出液20μgを８%ポリアクリドアミドゲル電気泳動に供した。
【００１６】
引き続き、以下のようにして、ウエスタンブロットにより上記抽出液中のArfGEP100/BRAG2蛋白質を検出した。まず、電気泳動後のゲル中の蛋白質を0.45μmのニトロセルロース膜［イモビロン(Immobilon)；ミリポア社製］にブロット後、膜に5％ウシアルブミンを含むTBST（0.1% Tween-20, 150mM NaCl, 10mM Tris-HCl）をのせて非特異的結合をブロックした。
蛋白質の検出にはウサギ抗ArfGEP100/BRAG2抗体を1：1000に希釈して2時間反応させた。TBSTで洗浄した後、1:10,000に希釈したHRP結合抗ウサギ抗体（ジャクソン社製）を１時間反応させた。TBSTで洗浄した後、検出はECL試薬（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いた化学発光により行った。結果を図１の上段に示す。また、使用した抽出蛋白の総量の対照として、抗β−アクチン抗体を用いた結果を図１の下段に示す。
siRNA処理効果を確認するため、siRNA未処理のものと、ヒトゲノムには存在しない核酸配列である対照siRNAを使用した。
ArfGEP100 siRNA処理を行うことにより、ArfGEP100/BRAG2蛋白質の発現抑制を認めた。
【００１７】
実施例２：乳がん細胞の浸潤活性阻害試験
（１）：マトリゲル浸潤活性の抑制
MDA-MB-231細胞のマトリゲル上での浸潤活性に与える影響をボイデン・チャンバー法(Boyden Chamber Assay)により測定した。実施例１で得た条件によりArfGEP100 siRNA処理を行った。48時間培養した細胞を、マトリゲルを塗布したボイデン・チャンバーの上に播き、その6時間後における浸潤活性を測定した。
siRNA処理効果を確認するため、siRNA未処理のものと、ヒトゲノムには存在しない核酸配列である対照siRNAを使用した。その結果を図２に示す。縦軸は未処理の細胞の示すマトリゲル浸潤活性を100とした時の、各々の処理細胞の相対的浸潤活性を示す。
ArfGEP100 siRNAで処理した場合に、浸潤活性が大幅に低下している。
【００１８】
同時に、ArfGEP100 siRNAの細胞毒性を、MTSアッセイキット（3-(4,5-ジメチルチアゾル-2-イル)-5-(3-カルボキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム・アッセイ・キット；プロメガ社製）により評価した。
siRNA処理効果を確認するため、siRNA未処理のものと、ヒトゲノムには存在しない核酸配列である対照siRNAを使用した。その結果を図３に示す。縦軸は未処理の細胞の示す生存率を100とした時の、各々の処理細胞の相対的生存率を示す。
ArfGEP100 siRNAで処理した場合に、生存率に有意差はみられなかった。
【００１９】
これらの結果から、siRNA処理により、細胞毒性を生じることなく、浸潤活性を大幅に低下できたことが示された。
【００２０】
（２）ゼラチンマトリックスに対する分解活性の抑制
がんの浸潤の一つのプロセスに、細胞外マトリクス（基底膜）の分解がある。したがって、がん細胞の分解活性は浸潤活性に影響を与える。そこで、実施例１で得た24時間培養したMDA-MB-231細胞のゼラチンマトリックスに対する分解活性を測定した。
細胞を蛍光色素（Alexa-594）にて標識しさらにパラホルムアルデヒドにて架橋したゼラチン膜上に移し、その後16時間におけるゼラチンの分解活性を常法に従って測定することにより評価した。すなわち、分解された標識ゼラチンが細胞との接着面に一致する細胞の数を計測することにより細胞のマトリックス分解活性を評価した。縦軸は未処理の細胞の示すゼラチン分解活性を100とした時の、各々の処理細胞の相対的分解活性を示す。結果を図４に示す。
ArfGEP100 siRNAで処理した場合、ゼラチンマトリックスの分解活性が大幅に低下している。
【００２１】
この結果からも、siRNA処理により、がんの浸潤活性が抑制されることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ArfGEP100 siRNA処理によるArfGEP100/BRAG2蛋白質の発現抑制を示すウエスタンブロット電気泳動図。
【図２】ArfGEP100 siRNA処理による乳がん細胞浸潤活性の阻害を示すグラフ図：マトリゲルを塗布したボイデン・チャンバーにおける浸潤活性。
【図３】ArfGEP100 siRNA処理による乳がん細胞生存活性の阻害を示すグラフ図：細胞のMTS活性。
【図４】ArfGEP100 siRNA処理による乳がん細胞浸潤活性の阻害を示すグラフ図：ゼラチンマトリックスに対する分解活性の抑制活性。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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