(57)【要約】      （修正有）【課題】標的物質を簡便に検出することができる分子プローブとして、ホモジニアスアッセイに利用可能で、核酸に結合する能力を有するルシフェラーゼの提供。【解決手段】ルシフェラーゼを二分割し、夫々にＤＮＡに結合可能なドメインを連結させたものであり、両者が会合した際に、ルシフェラーゼ活性が発現する分割ルシフェラーゼ。及び、ルシフェラーゼを二分割し、夫々に配列特異的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を連結させたものであり、両者が会合した際に、ルシフェラーゼ活性が発現する分割ルシフェラーゼ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルシフェラーゼを二分割し、夫々にＤＮＡに結合可能なドメインを連結させたものであり、両者が会合した際に、ルシフェラーゼ活性が発現することを特徴とする分割ルシフェラーゼ。
【請求項２】
ルシフェラーゼを二分割し、夫々に配列特異的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を連結させたものであり、両者が会合した際に、ルシフェラーゼ活性が発現することを特徴とする分割ルシフェラーゼ。
【請求項３】
ルシフェラーゼを二分割し、夫々にニワトリ由来配列特異的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を連結させたものであり、両者が会合した際に、ルシフェラーゼ活性が発現することを特徴とする分割ルシフェラーゼ。
【請求項４】
以下の（ａ）及び（ｂ）であり、かつ（ａ）及び（ｂ）が会合した際に、酵素活性が発現することを特徴とする分割ルシフェラーゼ。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列と配列番号２で表されるアミノ酸配列とを連結してなるタンパク質
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列と配列番号２で表されるアミノ酸配列とを連結してなるタンパク質
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分割ルシフェラーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
ホタル由来のルシフェラーゼについて、長年に渡り仔細な研究がなされており、その反応機構は、
ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｏ２＋Ｈ２Ｏ
→ オキシルシフェリン＋ＡＭＰ＋ＰＰｉ＋ＣＯ２＋光
である。
発光量は、ＡＴＰ量に比例することから、ルシフェラーゼは、試料中のＡＴＰ量測定に利用することができる。
現在、ルシフェラーゼを用いたＡＴＰ検出法は、微生物あるいは食品残渣由来のＡＴＰ量を測定する清浄度検査又は微生物由来のＡＴＰ量を測定する菌数検査等の衛生検査分野で利用されている。また、化学修飾法（例えば、特許文献１参照）あるいは組み換え法（例えば、特許文献２参照）によりビオチン化されたビオチン化ルシフェラーゼは、そのビオチンを介してルシフェラーゼとアビジン又はストレプトアビジンとの複合体を作製することにより、例えば、現在多用されている酵素免疫測定法、ＤＮＡプローブ法、免疫染色法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法等のビオチン・アビジンを利用した検出系にホタルルシフェラーゼを用いた発光分析法を適用することができる。このように、ルシフェラーゼを用いた生物発光測定系は、臨床検査、衛生検査等に広く利用されている。
【０００３】
一方、分離、洗浄操作の不要なホモジニアスアッセイの需要は年々高まっている。酵素阻害剤を使用する方法（例えば、特許文献３参照）、補酵素を利用する方法（例えば、特許文献４−５参照）、ヌクレアーゼ、ベータガラクトシダーゼ等をフラグメント化し、再形成させることを特徴とする方法（例えば、特許文献６、非特許文献１参照）等多岐にわたって研究が行なわれている。
しかしながら、これまでに研究されてきた酵素の活性は、環境中あるいは生体試料中に広く存在することから、サンプル由来のバックグラウンドが問題となっている。洗浄操作の不要なホモジニアスアッセイとして用いることを考えると、サンプル由来のバックグラウンドがあることは、充分な機能を果たせない可能性がある。
また、例えば、ベータガラクトシダーゼを用いる方法は、標的物質がないときにも少なからず酵素反応を示し、高いバックグラウンドの原因となっている。このように、これまでに示されたホモジニアスアッセイは、実サンプルを検査目的で測定するには充分なものではなかったといえる。上記で述べたルシフェラーゼに関して言えば、ある種の甲虫類以外でこの活性を有するものはないため、例えば、生体成分を測定しようとしたときに、サンプル由来のバックグラウンドは限りなくゼロに近づくといえる。
【０００４】
近年、３次元構造を有する一本鎖核酸であるアプタマーが注目されている。分子認識を有するよう選抜することで、いわゆる抗体の代替として利用できることがわかってきている。
しかしながら、抗体による測定でよく使われるように酵素で標識しようとした場合、従来のようにタンパク質同士を連結させる方法では効率よく標識できないと思われる。ルシフェラーゼとアプタマー等の核酸を連結させる方法が開発されれば、高感度、低バックグラウンドのホモジニアスアッセイが可能になると思われる。
【０００５】
【特許文献１】特開昭６０−１３８４６３号公報
【特許文献２】特開平８−３０８５７８号公報
【特許文献３】米国特許第４１３４７９２号明細書
【特許文献４】米国特許第４２１３８９３号明細書
【特許文献５】米国特許第４３１８９８３号明細書
【特許文献６】米国特許第４３７８４２８号明細書
【非特許文献１】アナリティカル・ケミストリー（Analytical Chemistry）、（米国）、２００２、第７４巻、ｐ.２５００−２５０４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、ホモジニアスアッセイに利用可能で、核酸に結合する能力を有するルシフェラーゼを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者等は、前記課題解決のために鋭意研究を重ねた結果、ルシフェラーゼを分割し、夫々ＤＮＡ結合タンパク質との融合タンパク質を作製し、極めて簡便に標的物質の存在を検出できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
（１）ルシフェラーゼを二分割し、夫々にＤＮＡに結合可能なドメインを連結させたものであり、両者が会合した際に、ルシフェラーゼ活性が発現することを特徴とする分割ルシフェラーゼ。
（２）ルシフェラーゼを二分割し、夫々に配列特異的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を連結させたものであり、両者が会合した際に、ルシフェラーゼ活性が発現することを特徴とする分割ルシフェラーゼ。
（３）ルシフェラーゼを二分割し、夫々にニワトリ由来配列特異的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を連結させたものであり、両者が会合した際に、ルシフェラーゼ活性が発現することを特徴とする分割ルシフェラーゼ。
（４）以下の（ａ）及び（ｂ）であり、かつ（ａ）及び（ｂ）が会合した際に、酵素活性が発現することを特徴とする分割ルシフェラーゼ。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列と配列番号２で表されるアミノ酸配列とを連結してなるタンパク質
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列と配列番号２で表されるアミノ酸配列とを連結してなるタンパク質
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、標的物質を簡便に検出することができる分子プローブが提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、ＤＮＡに結合能力を有し、会合により酵素活性が復活することを特徴とする分割ルシフェラーゼであり、以下に示すものに限定するものではない。
ルシフェラーゼとしては甲虫、例えば、ゲンジボタル、ヘイケボタル、アメリカボタル等を由来とするルシフェラーゼ（ＥＣ１．１３．１２．７）を用いることができ、発光反応を示す酵素であれば、由来が異なっても利用できる。
先ず、ルシフェラーゼを２つのドメインに分割する。ルシフェラーゼ立体構造データを考慮し、分割位置を決定することもできる。その際、分割されたルシフェラーゼ断片の酵素活性を確認し、単独では活性を有しないか又はほとんど無視できる程度に低いことが望ましい。分割されたルシフェラーゼ断片は、１つの分子内において会合することではじめてルシフェラーゼとしての酵素活性を発現することが必要である。
分割ルシフェラーゼは、そのまま、又は、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された分割ルシフェラーゼも用いることができる。
更に、分割されたルシフェラーゼ断片に同一の分子を認識する分子認識素子を夫々結合させ、分割されたルシフェラーゼ断片が同一のターゲット分子を認識したときに２つの分割されたルシフェラーゼ断片が会合し、ルシフェラーゼとしての発光酵素機能を発揮する分子プローブ用ルシフェラーゼとなる。
【００１０】
分子認識素子としては、例えば、配列特異的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（以下、ＳＳＤＢＰと略称する。）が挙げられる。使用したニワトリ由来ＳＳＤＢＰは、分子量２９ｋＤａの小タンパク質であり、特定の配列を有する一本鎖ＤＮＡに結合する〔バイオケム．ジェイ．(Biochem.J.)，(1998)，vol.331，p.447-452）〕。
ルシフェラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡ配列上の相当箇所で分割したものを作製する。夫々、数個のアミノ酸リンカーでＳＳＤＢＰ遺伝子とリーディングフレームがあるようにデザインする。得られたルシフェラーゼ断片及びＳＳＤＢＰが融合した遺伝子ＤＮＡが挿入されたプラスミドで大腸菌を形質転換する。得られた形質転換体を培養し、通常の方法で目的タンパク質を精製する。
【００１１】
得られたルシフェラーゼ断片−ＳＳＤＢＰ融合タンパク質に、ＳＳＤＢＰに結合する配列と標的物質に結合する配列を含む一本鎖ＤＮＡをデザイン合成し、更に、コンプレックスを作らせる。これにより、新たな分子プローブ用分割ルシフェラーゼが完成する。一本鎖ＤＮＡ及びＳＳＤＢＰの結合を強固にするため、紫外線照射等の方法をとることもできる。一本鎖ＤＮＡ配列を標的物質に適した配列に変更することにより、標的別の分子プローブが簡単に作製可能となる。
例えば、ターゲットとなるＤＮＡ配列に対し、その５’側の配列に相補的な配列を有するＤＮＡプローブをＳＳＤＢＰ認識配列を介してルシフェラーゼ断片−ＳＳＤＢＰ融合タンパク質に結合させる。また同様に、ターゲットＤＮＡ配列に対し上記配列と重ならない３’側の配列に相補的な配列を有するＤＮＡプローブをＳＳＤＢＰ認識配列を介してもう１つのルシフェラーゼ断片−ＳＳＤＢＰ融合タンパク質に結合させる。このように作製した２種の分子プローブ用ルシフェラーゼ及びターゲットＤＮＡ配列が混合されると、相補的な配列において二本鎖ＤＮＡが形成されることにより、ルシフェラーゼの断片同士が会合できる立体位置関係に局在する。すなわち、二本鎖ＤＮＡが形成されることによりルシフェラーゼ酵素活性が発現され、同酵素の発光反応が観測される。
【００１２】
このように、２種のＤＮＡプローブを結合させた分子プローブ用ルシフェラーゼと未知ＤＮＡ試料とを混合することにより、発光反応検出により、特定ＤＮＡ配列の有無を洗浄分離操作が不要なホモジニアスシステムにおいて検出が可能となる。
また、タンパク質を標的とする場合においては、ルシフェラーゼ断片−ＳＳＤＢＰ融合タンパク質中のＳＳＤＢＰに特定のタンパク質立体構造を認識できるＤＮＡアプタマーを結合させることにより、新規なホモジニアスタンパク質センシングシステムが開発できる。アプタマーとは、一本鎖核酸に標的結合性を有するよう立体構造をとらせたものであり、抗体の代わりになるものとして、検査あるいは医薬品として用いられ始めている。この場合、標的となるタンパク質に対し、独立した２箇所の異なる構造を認識する２種のＤＮＡアプタマーを用いる。夫々のＤＮＡアプタマーをＳＳＤＢＰ認識配列を介して２種のルシフェラーゼ断片−ＳＳＤＢＰ融合タンパク質に結合させる。このように作成した２種の分子プローブ用ルシフェラーゼ及び標的タンパク質が混合されると、２つのＤＮＡアプタマーがタンパク質に結合することにより、２つのルシフェラーゼ断片が会合できる立体位置関係に局在する。このことにより、アプタマーがタンパク質を認識・結合することによりルシフェラーゼ酵素活性が発現され、同酵素の発光反応が観測される。
【００１３】
すなわち、２種のＤＮＡアプタマーを結合させた分子プローブ用ルシフェラーゼと未知タンパク質試料とを混合することにより、発光反応検出により、特定タンパク質が洗浄分離操作の不要なホモジニアスシステムにおいて検出可能となる
このように、本発明で示されたルシフェラーゼ断片−ＳＳＤＢＰ融合タンパク質には様々な分子を認識できる分子素子を結合させることにより、汎用性の高い分子プローブとして多方面の分析での応用が期待される。特に、従来その実現が困難であった、ＤＮＡあるいはタンパク質のホモジニアス分析系が本分子プローブ用ルシフェラーゼを用いることで可能になる。
【００１４】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
【実施例１】
【００１５】
(ｐＳＳＤＢＰ−ＨＬｆＬの作製)
ヘイケルシフェラーゼのＮ末端側（アミノ酸配列１〜４３７ａａ、以下、Ｌドメインと略称する。配列番号１）を増幅するためＰＣＲプライマーを作製した（配列番号４及び５）。特開平１１−２３９４９３号公報記載のプラスミドｐＨＬｆＬＫを鋳型として、ＰＣＲにより増幅し、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化した。
精製したＤＮＡ断片をベクタープラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）のマルチクローニングサイト内のＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩサイトに挿入し、ｐＨＬｆ−Ｌを得た。
次いで、ニワトリ由来ＳＳＤＢＰ（配列番号２）を増幅するためにＰＣＲプライマーを作製した（配列番号６及び７）。Chicken Embryo cDNAライブラリー〔ニッポンジーンCap site cDNA, Chicken Embryo (5 days)(ニッポンジーン社製)〕を鋳型としてＰＣＲにより増幅し、ＥｃｏＲＩで消化した。精製したＤＮＡ断片を上記ｐＨＬｆ−ＬのＥｃｏＲＩサイトに挿入し、ｐＳＳＤＢＰ−ＨＬｆＬを得た。構築したプラスミドのＤＮＡ配列を、ＤＮＡシーケンサーにより確認した。
【００１６】
(ｐＨＬｆＳ−ＳＳＤＢＰの作製)
ヘイケルシフェラーゼのＣ末端側（アミノ酸配列４３８−５４９ａａ、以下、Ｓドメインと略称する。配列番号３）を増幅するためＰＣＲプライマーを作製した（配列番号８及び９）。特開平１１−２３９４９３号公報記載のプラスミドｐＨＬｆＬＫを鋳型として、ＰＣＲにより増幅し、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化した。
精製したＤＮＡ断片をベクタープラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）のマルチクローニングサイト内のＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩサイトに挿入し、ｐＨＬｆ−Ｓを得た。
次いで、同様にしてＰＣＲにより増幅したＳＳＤＢＰをＳａｌＩで消化、精製したＤＮＡ断片を上記ｐＨＬｆ−ＳのＳａｌＩサイトに挿入し、ｐＨＬｆＳ−ＳＳＤＢＰを得た。構築したプラスミドのＤＮＡを、ＤＮＡシーケンサーによりを確認した。
【００１７】
ルシフェラーゼ活性測定法の一例を以下に示した。
(試薬調整)
以下の試薬を調整した。
発光基質混合液；０．２ｍＭルシフェリン、２ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭ硫酸マグネシウム、５０ｍＭトリシン、ｐＨ７．８
(測定)
０．１ｍｌの発光基質混合液に０．０５ｍｌのサンプルを添加し、直ちにルミテスターＣ１００（キッコーマン社製）で発光量を測定した。
【実施例２】
【００１８】
(ヒスチジンタグ付加タンパク質の作製)
ｐＥＴ２８ａのＮｈｅＩ−ＸｈｏＩサイト間にＳＳＤＢＰ−ＨＬｆＬの構造遺伝子、ＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ間にＨＬｆＳ−ＳＳＤＢＰの構造遺伝子を導入し、夫々Ｎ末端及びＣ末端にヒスチジンタグが連結した状態で発現するようデザインした。すなわち、「ヒスチジンタグ−ＳＳＤＢＰ−ＨＬｆＬ」、「ＨＬｆＳ−ＳＳＤＢＰ−ヒスチジンタグ」として発現する。得られたプラスミドｐＨｉｓ−ＳＳＤＢＰ−ＨＬｆＬ、ｐＨＬｆＳ−ＳＳＤＢＰ−Ｈｉｓは、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに夫々ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６１１及びＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６１２として寄託されている。
【００１９】
ＳＳＤＢＰ−ＨＬｆＬを増幅するためＰＣＲプライマーを作製した（配列番号１０及び１１）。ｐＳＳＤＢＰ−ＨＬｆＬを鋳型として、ＰＣＲにより増幅し、ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで消化した。
精製したＤＮＡ断片をベクタープラスミドｐＥＴ２８ａ（ノバジェン社製）のマルチクローニングサイト内のＮｈｅＩ及びＸｈｏＩサイトに挿入し、ｐＨｉｓ−ＳＳＤＢＰ−ＨＬｆＬを得た。構築したプラスミドのＤＮＡ配列を、ＤＮＡシーケンサーにより確認した。
ＨＬｆＳ−ＳＳＤＢＰを増幅するためＰＣＲプライマーを作製した（配列番号１２及び１３）。ｐＨＬｆＳ−ＳＳＤＢＰを鋳型として、ＰＣＲにより増幅し、ＢｐｉＩ及びＸｈｏＩで消化した。
精製したＤＮＡ断片を、ベクタープラスミドｐＥＴ２８ａ（ノバジェン社製）のマルチクローニングサイト内のＮｃｏＩ及びＸｈｏＩサイトに挿入し、ｐＨＬｆＳ−ＳＳＤＢＰ−Ｈｉｓを得た。構築したプラスミドのＤＮＡ配列を、ＤＮＡシーケンサーにより確認した。
夫々のプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社製）に形質転換した。これらを３Ｌ卓上ファーメンター（いわしや社製）を用いて３０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬ培地中２Ｌに植菌し、３７℃で好気培養を行なった。培養条件は回転数８００ｒｐｍ、通気量２Ｌ/分、３７℃で６６０ｎｍでの吸光度が０．６から０．７となるまで培養し、終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、その後は回転数６００ｒｐｍ、通気量２Ｌ/分、２８℃で４時間誘導発現を行なった。
【００２０】
集菌（５０００×ｇ、１０分、４℃）、生理食塩水によって洗浄を行ない、得られた菌体を溶菌バッファー(５０ｍＭリン酸バッファー、０．３Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８)に懸濁し、フレンチプレスで破砕し、遠心分離によって細胞残渣を取り除いた。
Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビーズ（キアゲン社製）を用いてヒスチジンタグを有するタンパク質の粗精製を行なった。湿菌体約３ｇ分のライゼート（１０ｍｌ）に対して、５０％Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビーズ懸濁液を１ｍｌ添加し、４℃で１時間攪拌した後、オープンカラムに詰め、８ｍｌの洗浄バッファー１(２０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭリン酸バッファー、０．３Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８)、８ｍｌの洗浄バッファー２(６０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭリン酸バッファー、０．３Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８)で洗浄後、溶出バッファー(２５０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭリン酸バッファー、０．３Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８)で溶出させた。
ルミノメーターＣ−１００（キッコーマン社製）を用いて夫々のフラクションの発光量の測定を行なった（表１）。
【００２１】
【表１】
2007325546.tif 000002
【実施例３】
【００２２】
(ｐＨｉｓ−ＳＳＤＢＰ−ＨＬｆＳの構築並びにＨｉｓ−ＳＳＤＢＰ−ＨＬｆＳの発現確認)
ｐＨｉｓ−ｓｓＤＢＰ−ＨＬｆＬからＬドメイン構造遺伝子(ＨＬｆＬ)を制限酵素ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩ消化により除去し、代わりにｐＨＬｆＬＫを鋳型としてＰＣＲ（配列番号１４及び１５）により増幅したＳドメインの構造遺伝子(ＨＬｆＳ)をＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ消化後、挿入し、ｐＨｉｓ−ＳＳＤＢＰ−ＨＬｆＳを構築した。
ＳＳＤＢＰ及びＨＬｆＳのリンカーとしては、リンカー配列（配列番号１６）を用いた。構築したプラスミドのＤＮＡ配列を、ＤＮＡシーケンサーにより確認した後、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換し、１５０ｍｌスケールでの培養を行ないＩＰＴＧで発現誘導を行なった。（実施例１）の方法に従って水溶性画分を調整し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより想定される大きさのバンドを確認でき、活性を確認したところ、ルシフェラーゼ活性はほとんど見られなかった。
【実施例４】
【００２３】
(ｐＨＬｆＬ−ＳＳＤＢＰ−Ｈｉｓの構築並びにＨＬｆＬ−ＳＳＤＢＰ−Ｈｉｓの発現確認)
ｐＨＬｆＳ−ＳＳＤＢＰ−ＨｉｓからＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩ消化によりＳＳＤＢＰ断片を切り出した。ｐＨＬｆＬＫを鋳型としてＰＣＲプライマー（配列番号１６及び１７）を用いてＨＬｆＬ断片を増幅し、ＢｐｉＩ及びＥｃｏＲＩ消化した後、精製した。これらを、ｐＥＴ２８ａベクターのＸｈｏＩ及びＮｃｏＩサイトに導入し、ｐＨＬｆＬ−ＳＳＤＢＰ−Ｈｉｓを作製した。
ＨＬｆＬＳ及びＳＳＤＢＰのリンカーとしては、リンカー配列ＦＦＡＧＹＣを用いた。構築したプラスミドのＤＮＡ配列を、ＤＮＡシーケンサーにより確認した後、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換し、１５０ｍｌスケールでの培養し、ＩＰＴＧで発現誘導を行なった。（実施例１）の方法に従って水溶性画分を調整し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより想定される大きさのバンドを確認でき、活性を確認したところ、ルシフェラーゼ活性はほとんど見られなかった。
【実施例５】
【００２４】
(Ｌドメイン及びＳドメインの会合によるルシフェラーゼの活性化の確認)
ＨＬｆＳ−ＳＳＤＢＰ−Ｈｉｓ並びにＨｉｓ−ＳＳＤＢＰ−ＨＬｆＬのフラクション２を用いて、Ｌドメイン及びＳドメインの会合によるルシフェラーゼの活性化の確認を行なった。０．０２５ｍｌのＨｉｓ−ｓｓＤＢＰ−ＨＬｆＬ及び０．０２５ｍｌのＨＬｆＳ−ＳＳＤＢＰ−Ｈｉｓを混合し、０．０５ｍｌの ５０ｍＭトリシン（ｐＨ７．８）並びに０．００５ｍｌの５０％Ｎｉ−ＮＴＡアガロース懸濁液を添加して室温で５分間混合した後、０．１ｍｌの発光基質反応液を加えて発光量を測定した（表２）。
ＨＬｆＳ−ＳＳＤＢＰ−Ｈｉｓ単独では発光を示さず、Ｈｉｓ−ＳＳＤＢＰ−ＨＬｆＬ単独ではわずかに発光を示した。また、夫々が単独に存在している系にＮｉ−ＮＴＡアガロースを添加してもその発光量は変化しなかった。一方、ＨＬｆＳ−ＳＳＤＢＰ−Ｈｉｓ及びＨｉｓ−ＳＳＤＢＰ−ＨＬｆＬを混合することにより、１．５倍の発光量が増加した。
【００２５】
このことから、Ｌドメイン及びＳドメインがある程度の濃度以上で溶液中に存在すると会合し、ルシフェラーゼ活性を示すことが確認された。また、混合系にＮｉ−ＮＴＡアガロースを添加すると、発光量は４倍程度増加した。Ｌドメイン単独系と比較するとその発光量は７倍以上となる。このことから、担体上のＮｉ−ＮＴＡにヒスチジンタグが結合し、局所的にＨＬｆＳ−ＳＳＤＢＰ−Ｈｉｓ及びＨｉｓ−ＳＳＤＢＰ−ＨＬｆＬの存在量が増えることにより、会合しているルシフェラーゼ分子の量が増え、発光量が増加したといえる。
【００２６】
【表２】
2007325546.tif 000003
【配列表】
2007325546000001.app