(57)【要約】  【課題】全反射照明により励起された蛍光のロスを極力無くして、蛍光を効率よく取得可能な全反射蛍光顕微鏡を提供する。  【解決手段】光源１１と、光源１１からの光を集光させる集光レンズ１２と、対物レンズ１３と、標本１６からの光から蛍光を抽出するバリアフィルタ１４と、撮像素子１８を有する全反射蛍光顕微鏡である。対物レンズ１３の後側焦点位置をリレーし、対物レンズ１３の後側焦点位置Ｐ１と共役な位置Ｐ１’が集光レンズ１２による光源１１からの集光点に一致するように配置されたリレーレンズ１７と、リレーレンズ１７を介した対物レンズ１３の瞳位置と共役な位置に配置され、前記集光点に配置され、該集光点に集光された光線のみを反射するミラー２０と、ミラー２０の配置位置近傍に、リレーレンズ１７を経た標本１６からの光を撮像素子１８に向けて通過させる開口部材２１を有する。【選択図】  図１
2007193213.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源と、前記光源からの光を集光させる集光レンズと、対物レンズと、標本からの光から蛍光を抽出するバリアフィルタと、前記バリアフィルタを透過した光の像を撮像する撮像素子を有する全反射蛍光顕微鏡において、
前記対物レンズの後側焦点位置をリレーし、該対物レンズの後側焦点位置と共役な位置が前記集光レンズによる光源からの集光点に一致するように配置されたリレーレンズと、
前記集光点に配置され、該集光点に集光された光線を反射する反射部材と、前記反射部材の配置位置近傍に、前記リレーレンズを経た前記標本からの光を前記撮像素子に向けて通過させる開口部材を有することを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。
【請求項２】
前記開口部材が、透過率９０％以上のガラスで構成され、
前記反射部材が、前記開口部材のガラス面上に設けられていることを特徴とする請求項１に記載の全反射蛍光顕微鏡。
【請求項３】
標本で全反射された光の前記撮像素子への到達を阻止する阻止手段を、該標本で全反射された光が集光する位置又は該集光する位置と共役な位置に備えたこと特徴とする請求項１又は２に記載の全反射蛍光顕微鏡。
【請求項４】
前記反射部材が、前記集光点に対応した大きさの径を持つ点状の反射面を有していることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の全反射蛍光顕微鏡。
【請求項５】
前記反射部材が、前記集光点に対応した大きさの径を持ち、かつ、前記集光点の位置から通常の落射照明をする場合における光軸にかけて延びたライン状の反射面を有していることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の全反射蛍光顕微鏡。
【請求項６】
前記反射部材が、ダイクロイックミラーであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の全反射蛍光顕微鏡。
【請求項７】
前記阻止手段が、遮光部材であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の全反射蛍光顕微鏡。
【請求項８】
前記阻止手段が、ダイクロイックミラーであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の全反射蛍光顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全反射蛍光顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体細胞の機能解析等において、特に、細胞膜の機能を観察するための顕微鏡として、細胞膜およびその近傍からの全反射蛍光画像を取得する全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ：Ｔｏｔａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）が注目されている。
【０００３】
全反射蛍光顕微鏡では、レーザ光を、集光レンズを介して対物レンズ内の瞳（後側焦点位置の領域）における極く一部の所定領域に集光させ、対物レンズを介してガラス表面近傍の試料のみを対象に局所的に斜めに全反射照明させる。そして、このときにガラスと試料の境界面で試料側に数１００ｎｍ以下の僅かな範囲にしみ出すエバネッセント光を用いて試料からの蛍光を励起する。全反射蛍光顕微鏡によれば、バックグラウンド・ノイズ（散乱光など）が極めて低いため、微弱な蛍光での観察を行うことができる。
従来、この種の全反射蛍光顕微鏡としては、例えば、次の特許文献１に記載のように、ダイクロイックミラーを用いた全反射蛍光顕微鏡がある。
【０００４】
図７は従来の特許文献１に記載されているタイプの全反射蛍光顕微鏡の要部概略構成図である。
図７に示した全反射蛍光顕微鏡は、光源５１と、集光レンズ５２と、対物レンズ５３と、バリアフィルタ５４を有している。
集光レンズ５２は、光源５１から出射されたレーザ光を対物レンズ５３内の瞳（後側焦点位置の領域）における光軸からシフトした極く一部のスポット状の所定領域Ｐ１に集光させるように設けられている。対物レンズ５３は、集光レンズ５２を介して集光されたレーザ光をガラス５５表面近傍の試料（標本）５６のみを対象に局所的に斜めに全反射照明するように構成されている。
【０００５】
また、集光レンズ５２と対物レンズ５３との間には、集光レンズ５２を経たレーザ光を対物レンズ５３に導くとともに、全反射照明により励起され、対物レンズ５３を経た蛍光の有効光束領域をカバーする大きさの入射面を有し、標本５６からの入射光のうち、標本５６で全反射され、対物レンズ５３を経た発散途中の戻り光をカットし、所望の蛍光を透過するダイクロイックミラー５７が設けられている。
バリアフィルタ５４は、ダイクロイックミラー５７を透過した光のうち、僅かに残る蛍光以外の光を反射し、蛍光のみを撮像素子等の蛍光検出手段５８側に透過するように構成されている。
【０００６】
このように構成された全反射蛍光顕微鏡では、光源５１から出射したレーザ光は、集光レンズ５２を介して収束光となり、途中、ダイクロイックミラー５７で反射され、対物レンズ５３内の瞳におけるスポット状の所定領域Ｐ１に集光し、対物レンズ５３を介して標本５６を全反射照明する。すると、全反射照明する際にしみ出したエバネッセント光により標本５６から蛍光が励起される。励起された蛍光は、対物レンズ５３を経てダイクロイックミラー５７を透過し、バリアフィルタ５４を介して僅かに残る所望の蛍光波長以外の光が除去され、結像レンズ６２、蛍光検出手段５８を介して取得される。また、標本５６で全反射された戻り光は、対物レンズ５３内の瞳におけるスポット状の所定領域Ｐ１とは異なる所定領域Ｐ２に集光し、対物レンズ５３を経てダイクロイックミラー５７で反射されて、蛍光検出手段５８への入射が阻止される。
これにより、全反射照明によって励起された所望の蛍光のみが取得される。
【０００７】
しかし、ダイクロイックミラーは、分光特性の立ち上がりの波長幅がある程度広くなる。
このため、図７に示したタイプの全反射蛍光顕微鏡の場合、所望波長領域以外の光の透過を完全に阻止するような透過率特性を有するダイクロイックミラーを用いると、全反射された戻り光とともに観察に必要な蛍光も相当量カットされてしまう。これでは、得られる微弱な蛍光の光量がより少なくなり、観察画像が暗くなって観察し難くなる。
一方、所望波長領域の光を極力透過させるような透過率特性を有するダイクロイックミラーを用いると、所望波長領域以外の不要な光も相当量透過させてしまう。これでは、微弱な蛍光に対して他の強い光がノイズとなって観察画像が白っぽくなり観察し難くなる。
このように、ダイクロイックミラーを用いた、特許文献１に記載されているようなタイプの全反射蛍光顕微鏡には、得られる微弱な蛍光の光量のロスが大きく、或いは、不要な光が混入する度合いが高く観察に難くなるという問題があった。
【０００８】
しかるに、ダイクロイックミラーを用いない全反射蛍光顕微鏡が、例えば、次の特許文献２に提案されている。
図８は従来の特許文献２に記載されているタイプの全反射蛍光顕微鏡の要部概略構成図である。
図８に示した全反射蛍光顕微鏡では、集光レンズ５２と対物レンズ５３との間に、集光レンズ５２を経た収束途中のレーザ光を対物レンズ５３の瞳（後側焦点位置の領域）における光軸からシフトした極く一部のスポット状の所定領域Ｐ１に導くミラー５９と、標本５６からの入射光のうち、標本５６で全反射され、対物レンズ５３を経た発散途中の戻り光をカットするためのミラー６０とが、全反射照明により励起され対物レンズ５３を経た蛍光の有効光束領域内の一部の所定領域Ｐ２に、それぞれ別個に配置して構成されている。
【０００９】
このように構成された全反射蛍光顕微鏡では、光源５１から出射したレーザ光は、集光レンズ５２を介して収束光となり、途中、ミラー５９で反射され、対物レンズ５３内の瞳におけるスポット状の所定領域Ｐ１に集光し、対物レンズ５３を介して標本５６を全反射照明する。すると、全反射照明する際にしみ出したエバネッセント光により標本５６から蛍光が励起される。励起された蛍光は、対物レンズ５３を経て、ミラー５９，６０で遮断される以外、バリアフィルタ５４に入射し、バリアフィルア５４を介して僅かに残る所望の蛍光波長以外の光が除去され、結像レンズ６２、蛍光検出手段５８を介して取得される。また、標本５６で全反射された戻り光は、対物レンズ５３内の瞳におけるスポット状の所定領域Ｐ１とは異なる所定領域Ｐ２に集光し、対物レンズ５３を経てミラー６０で反射されることによって蛍光検出手段５８とは異なる方向に偏向されて、蛍光検出手段５８への入射が阻止される。
従って、図８に示した特許文献２に記載されたようなタイプの全反射蛍光顕微鏡によれば、全反射照明により励起された蛍光の光束有効領域全体に図７に示したようなダイクロイックミラーを配置しないで済むので、その分、観察に必要な蛍光がカットされずに済み、微弱な蛍光の観察に有利となる。
【特許文献１】特開２００１−２７２６０６号公報
【特許文献２】特開２００３−１４００５２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、図８に示したような特許文献２に記載されたタイプの全反射顕微鏡では、集光レンズ５２を介して対物レンズ５３の瞳におけるスポット状の所定領域Ｐ１に結像させるまでの途中の収束光路と、全反射照明により励起され対物レンズ５３を経た蛍光の有効光束領域内とが重なる所定領域にミラー５９，６０が配置されている。そして、ミラー５９は、集光レンズ５２を経た収束途中のレーザ光束を、対物レンズ５３の瞳におけるスポット状の所定領域Ｐ１に導くために相当量の面積を必要とする。また、ミラー６０は、標本５６で全反射され対物レンズ５３内の瞳の所定領域Ｐ２で集光され、対物レンズ５３を経た発散途中の戻り光をカットするために相当量の面積を必要とする。このため、全反射照明により励起された蛍光の有効光束領域において相当面積の光束領域が、ミラー５９やミラー６０によって遮られてしまうことになる。このため、特許文献２に記載された全反射顕微鏡を用いても、観察に必要な蛍光が相当量カットされ、光量のロスが多く出てしまい、微弱な蛍光を効率良く取得することが出来なかった。
【００１１】
本発明は、上記課題を鑑みてなされたものであり、全反射照明により励起された蛍光のロスを極力無くして、蛍光を効率よく取得可能な全反射蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するため、本発明による全反射蛍光顕微鏡は、光源と、前記光源からの光を集光させる集光レンズと、対物レンズと、標本からの光から蛍光を抽出するバリアフィルタと、前記バリアフィルタを透過した光の像を撮像する撮像素子を有する全反射蛍光顕微鏡において、前記対物レンズの後側焦点位置をリレーし、該対物レンズの後側焦点位置と共役な位置が前記集光レンズによる光源からの集光点に一致するように配置されたリレーレンズと、前記集光点に配置され、該集光点に集光された光線を反射する反射部材と、前記反射部材の配置位置近傍に、前記リレーレンズを経た前記標本からの光を前記撮像素子に向けて通過させる開口部材を有することを特徴としている。
【００１３】
また、本発明の全反射蛍光顕微鏡においては、前記開口部材が、透過率９０％以上のガラスで構成され、前記反射部材が、前記開口部材のガラス面上に設けられているのが好ましい。
【００１４】
また、本発明の全反射蛍光顕微鏡においては、標本で全反射された光の前記撮像素子への到達を阻止する阻止手段を、該標本で全反射された光が集光する位置又は該集光する位置と共役な位置に備えるのが好ましい。
【００１５】
また、本発明の全反射蛍光顕微鏡においては、前記反射部材が、前記集光点に対応した大きさの径を持つ点状の反射面を有しているのが好ましい。
【００１６】
また、本発明の全反射蛍光顕微鏡においては、前記反射部材が、前記集光点に対応した大きさの径を持ち、かつ、前記集光点の位置から通常の落射照明をする場合における光軸にかけて延びたライン状の反射面を有しているのが好ましい。
【００１７】
また、本発明の全反射蛍光顕微鏡においては、前記反射部材が、ダイクロイックミラーであるのが好ましい。
【００１８】
また、本発明の全反射蛍光顕微鏡においては、前記阻止手段が、遮光部材であるのが好ましい。
【００１９】
また、本発明の全反射蛍光顕微鏡においては、前記阻止手段が、ダイクロイックミラーであるのが好ましい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の全反射蛍光顕微鏡によれば、全反射照明により励起された蛍光のロスを極力無くして、蛍光を効率よく取得可能な全反射蛍光顕微鏡が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
図１は本発明の一実施形態にかかる全反射蛍光顕微鏡の概略構成図、図２は図１の全反射蛍光顕微鏡に用いられる開口部材と開口部材近傍に設けられる反射部材とを示す説明図である。
【００２２】
本実施形態の全反射蛍光顕微鏡は、光源１１と、集光レンズ１２と、対物レンズ１３と、バリアフィルタ１４と、撮像素子を備えた撮像手段１８と、リレーレンズ１７と、ミラー１９と、反射部材２０と、開口部材２１と、阻止手段２２を有している。なお、図中、１５はカバーガラス、１６は標本、６１はイマージョンオイル、２３は標本１６で励起された蛍光を撮像素子上に結像するための撮像レンズである。
光源１１は、レーザ装置で構成されている。なお、レーザ装置は、所定波長を出力するように構成されたもの、所望の波長のレーザを適宜選択して出力されるように構成されたもののいずれも適用できる。
集光レンズ１２は、光源１１からのレーザ光を対物レンズ１３内の瞳（後側焦点位置の領域）における光軸からシフトした極く一部のスポット状の所定領域Ｐ１と共役な所定位置Ｐ１’に集光するように配置されている。
対物レンズ１３は、瞳面におけるスポット状の所定領域Ｐ１に集光された光源１１からの入射光をカバーガラス１５表面近傍の標本１６のみを対象に局所的に斜めに全反射照射するとともに、標本１６で全反射された戻り光を瞳面における所定のスポット状の所定領域Ｐ１とは異なる所定領域Ｐ２に集光する。また、リレーレンズ１７、撮像レンズ２３と相俟って、標本１６で励起された蛍光を撮像素子１８の撮像面上で結像するように配置されている。
バリアフィルタ１４は、標本１６からの光のうち所望の蛍光波長のみを透過し、それ以外の波長の光を除去するように構成されている。
【００２３】
リレーレンズ１７は、対物レンズ１３内の瞳（後側焦点位置の領域）を、集光レンズ２３による光源１１からの集光点にリレーし、対物レンズ１３内の瞳におけるスポット状の所定領域Ｐ１と共役な位置Ｐ１’が、集光レンズ１２により集光される、光源１１からの集光点に一致するように配置されている。
反射部材２０は、リレーレンズ１７を介した対物レンズ１３内の瞳におけるスポット状の所定領域Ｐ１と共役な位置Ｐ１’(即ち、上記光源１１からの集光点に一致した位置)に配置され、集光レンズ１２により集光される、光源１１からの集光点に集光された光線を反射するように構成されている。そして、反射部材２０は、図２に示すように、前記集光点に対応した大きさの径を持ち、且つ、集光点の位置から光軸の中心にかけて延びたライン状に形成されたミラー面を有している。
開口部材２１は、透過率９０％以上のガラスで構成されており、リレーレンズ１７を経た標本１６からの光を撮像素子１８に向けて透過させるようになっている。また、反射部材２０は、開口部材２１のガラス面に配置されている。
阻止部材２２は、遮光部材で構成されており、標本１６で全反射された戻り光が集光される対物レンズ１３の瞳における所定領域Ｐ２に配置されている。なお、遮光部材２２の配置は、対物レンズ内に限定されるものではなく、対物レンズ１３内の瞳における所定領域Ｐ２と共役な位置であれば、どこに配置してもよい。例えば、開口部材２１のガラス面上又はその近傍に、対物レンズ１３内の瞳における所定領域Ｐ２と共役な位置が位置する場合には、遮光部材２２を開口部材２１のガラス面上又はその近傍に配置してもよい。
【００２４】
このように構成された本実施形態の全反射蛍光顕微鏡によれば、光源１１から出射したレーザ光は、集光レンズ１２を介して、反射部材２０上の所定スポットＰ２に集光し、反射部材２０で反射される。反射部材２０で反射された光は、リレーレンズ１７を介して収束光となり、ミラー１９で反射された後、対物レンズ１３の瞳におけるスポット状の所定領域Ｐ１に集光する。集光した光は、対物レンズ１３を介して、カバーガラス１５の表面近傍の標本１６を局所的に斜めに全反射照明する。標本１６に照射された光のほとんどは、標本１６で全反射される。また、照射された光のうち、僅かな光が、カバーガラス１５と標本１６の境界面で標本１６側に数１００ｎｍ以下の僅かな範囲にエバネッセント光としてしみ出して標本１６を励起する。励起された標本１６からは蛍光が発する。標本１６で全反射された戻り光は、対物レンズ１３の瞳における所定領域Ｐ２に集光され、所定領域Ｐ２に設けられた遮光部材２２で遮光される。標本１６から発した蛍光は、対物レンズ１３、ミラー１９、リレーレンズ１７を経て、開口部材２０に到達する。開口部材２０に到達した光は、ミラー１９が設けられたライン状の領域を除いて開口部材２０を透過し、バリアフィルタ１４を介して所望の蛍光波長以外の光が除去されるとともに、所望の蛍光のみが抽出され、撮像レンズ２３を経て、撮像素子１８の撮像面上に結像される。撮像素子１８は結像された蛍光像を撮像する。撮像した蛍光画像は、全反射顕微鏡において一般的に用いられている画像処理手段、画像表示装置等（図示省略）を介して観察される。
【００２５】
このとき、本実施形態の全反射蛍光顕微鏡によれば、対物レンズ１３の瞳位置と共役な位置が、集光レンズ１２の集光点と一致するようにリレーレンズ１７を設け、且つ、その集光点に集光された光線を反射するように反射部材２０を配置したので、反射部材２０の径を集光レンズ１２の回折限界程度にまで最小限に小さくすることができる。そして、反射部材２０の配置位置近傍に開口部材２０を設けてリレーレンズ１７を経た試料１６からの光を通過させるようにしたので、試料からの光のうちミラー１９で遮られる光量のロスを最小にして、ほぼ最大光量の蛍光を取得することができる。
【００２６】
この点に関し、従来の特許文献２に記載のようなタイプの全反射蛍光顕微鏡における全反射蛍光の有効光束径に対するミラーで遮光される面積の割合をシミュレートして、本発明と比較説明する。
ここでは、図８に示した全反射蛍光顕微鏡の構成において、対物レンズ５３、ミラー５９，６０、集光レンズ５２は、それぞれ次のような諸元値とした。これらの値は、この種の全反射蛍光顕微鏡において一般的に用いられる値である。
(1)対物レンズ５３の焦点距離：３ｍｍ（無限遠対物レンズとし、焦点距離が１８０ｍｍの結像レンズ（ここでは、集光レンズ５２）と組み合わせたときに倍率が６０倍となる対物レンズ）、
(2)対物レンズ５３の瞳位置からミラー５９，６０までの距離：６０ｍｍ、
(3)対物レンズ５３の開口数ＮＡ：１．４５、
(4)対物レンズ５３の視野数：Φ１１ｍｍ（半径で５．５ｍｍ）、
(5)集光レンズ５２の焦点距離：１８０ｍｍ
【００２７】
対物レンズ５３の瞳径は、上記(1)と(3)より、
３ｍｍ（対物レンズの焦点距離）×１．４５（ＮＡ）×２＝Φ８．７ｍｍ
である。
従って、ミラー５９，６０の位置での対物レンズ５３の有効光束径は、上記(2)、(4)、(5)より、
Φ８．７ｍｍ（対物レンズ５３の瞳径）＋２×５．５ｍｍ（最大像高）／１８０ｍｍ（集光レンズ５２の焦点距離）×６０ｍｍ（ミラー５９，６０までの距離）
＝Φ１２．３７ｍｍ
となる。
これを図４に概念的に示す。
なお、ここでのミラー５９，６０の位置での対物レンズ５３の有効光束径は、便宜上、光軸に対し垂直な面でのものとして算出してある。実際には、ミラー５９，６０は、夫々光軸に対し４５の角度で傾斜して設けられている。
【００２８】
次に、ミラー５９，６０の位置での全反射照明光の光線径及び全反射照明された戻り光の光線径は、それぞれ、
２×５．５ｍｍ（最大像高）／１８０ｍｍ（集光レンズ５２の焦点距離）×６０ｍｍ（ミラー５９，６０までの距離）＝Φ３．６７ｍｍ
となる。
これを図５に概念的に示す。
【００２９】
これらのことから、ミラー５９，６０の位置での全反射照明光線径及び全反射照明された戻り光の光線径の対物レンズ５３の有効光束径に対する比率は、
２×（３．６７／１２．３７）2＝０．１７６
となる。
ここで、ミラー５９，６０は全反射照明されて励起された蛍光のみを観察し、それ以外の光を除去するためにミラー面に入射した光を透過させることはない。
このため、図８の全反射蛍光顕微鏡を基にシミュレートした図４，図５の構成では、ミラー５９，６０により約１８％もの光量ロスが生じることになる。
また、対物レンズ５３の瞳位置とは異なる位置であって、対物レンズ５３の有効光束径内にミラー５９，６０を配置するため、ミラー５９，６０により視野の欠け、解像力の劣化も生じる。
【００３０】
また、実際には、全反射照明観察を行う顕微鏡においては、照明光の標本面への入射角度を変えることにより、全反射照明と通常の落射照明とに切り替えることができるようにすることが望まれる。通常の落射照明を行うためには、照明光を対物レンズに向けて反射する反射部材を対物レンズの光軸上に配置されていることが必要となる。このため、図６(a)に示す２つのミラー５９，６０に変えて、図６(b)に示すように、全反射照明光線径ａ及び全反射照明された戻り光の光線径ｂに加えて、対物レンズの有効光束径の中心領域ｃをもカバー可能な細長形状のミラー６１を備える必要がある。
このようにすると、ミラーによる光量の損失の割合が更に大きくなり、視野の欠けもより一層大きくなってしまう。
【００３１】
これに対し、本実施形態の全反射蛍光顕微鏡では、対物レンズ１３の瞳位置と共役な位置に前記集光点に集光された光線を反射するように反射部材２０を配置したので、図３(a)に示すように、反射部材２０の径を集光レンズ１２の回折限界程度（例えば、Φ２０μｍ程度）まで最小限に小さくすることができる。その場合、通常の落射照明を考慮せずに全反射照明のみを考慮すれば、反射部材２０はほぼ点状の大きさで足り、反射部材２０の位置での全反射照明光線径の対物レンズ１３の有効光束径に対する比率を、２％程度に抑えることができる。
しかも、本実施形態の全反射蛍光顕微鏡によれば、標本１６で全反射された光の撮像素子への到達を阻止する阻止手段としての遮光部材２２を、標本１６で全反射された光が集光する位置（所定領域Ｐ２）に備えたので、開口部材２１のガラス面上には反射部材２０以外に設けずに済ますことができ、より一層光量のロスを抑えることができ、かつ、視野かけのない観察像を得ることができる。
また、全反射照明と通常の落射照明とに切り替えることができるように顕微鏡を構成したとしても、反射部材２０は、集光点に対応した大きさの径を持つライン形状に形成すれば足りるので、図４〜図６、図８を用いて説明した特許文献２に記載されたタイプの全反射蛍光顕微鏡と比較して、光量のロスを格段と抑えることができ、かつ、視野かけのない観察像を得ることができる（図３(b)）。
なお、本実施形態の全反射蛍光顕微鏡において、遮光部材２２を、開口部材２１近傍における、標本１６で全反射された光が集光する位置（所定領域Ｐ２）と共役な位置に設けた場合も、遮光部材２２の径を、反射部材２０と同様、対物レンズ１３の回折限界程度（例えば、Φ２０μｍ程度）まで最小限に小さくすることができる。
【００３２】
さらに、本実施形態の全反射蛍光顕微鏡において、反射部材２０を、ダイクロイックミラーで構成するとさらに好ましい。例えば、ダイクロイックミラーを、全反射照明により励起された蛍光波長のみを透過し、それ以外の波長の透過を阻止するような透過率特性を有するように構成する。そのようにすれば、全反射された戻り光とともに観察に必要な蛍光もダイクロイックミラーで相当量カットされたとしても、ダイクロイックミラーを透過した蛍光の光量分が、反射部材２０を通常のミラーで構成した場合に比べてより多く撮像素子１８で得られる。このため、蛍光光量のロスをより一層少なくすることができる。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明の全反射蛍光顕微鏡は、全反射照明による生体細胞からの非常に微弱な蛍光を極力明るく観察することが求められる生物学、医学、薬学の分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明の一実施形態にかかる全反射蛍光顕微鏡の概略構成図である。
【図２】図１の全反射蛍光顕微鏡に用いられる開口部材と開口部材近傍に設けられる反射部材とを示す説明図である。
【図３】図１の全反射蛍光顕微鏡における開口部材及び反射部材の位置での対物レンズの有効光束領域と、全反射照明光の光線領域及び全反射照明された戻り光の光線領域との関係を示す説明図であり、(a)は全反射蛍光観察のみを行う顕微鏡として構成した場合、(b)は全反射と落射蛍光観察の両方を兼用可能な顕微鏡として構成した場合、(c)は(b)の顕微鏡において、遮光部材を、開口部材近傍における、所定領域Ｐ２と共役な位置に設けた場合を示している。
【図４】本発明の比較例にかかる、図８に示した全反射蛍光顕微鏡における対物レンズの瞳位置での瞳径と、反射部材（ミラー５９，６０）の位置での対物レンズの有効光束径の関係を示す説明図である。
【図５】本発明の比較例にかかる、図８に示した全反射蛍光顕微鏡における対物レンズの瞳位置での瞳径と、反射部材（ミラー５９，６０）の位置での全反射照明光の光線径及び全反射照明された戻り光の光線径との関係を示す説明図である。
【図６】本発明の比較例にかかる、図８に示した全反射蛍光顕微鏡における反射部材（ミラー５９，６０）の位置での対物レンズの有効光束領域と、反射部材（ミラー５９，６０）の位置での全反射照明光の光線領域及び全反射照明された戻り光の光線領域との関係を示す説明図であり、(a)は全反射蛍光観察のみを行う顕微鏡として構成する場合、(b)は全反射と落射蛍光観察の両方を兼用可能な顕微鏡として構成する場合を示している。
【図７】従来の特許文献１に記載されているタイプの全反射蛍光顕微鏡の要部概略構成図である。
【図８】従来の特許文献２に記載されているタイプの全反射蛍光顕微鏡の要部概略構成図である。
【符号の説明】
【００３５】
１１          光源
１２          集光レンズ
１３          対物レンズ
１４          バリアフィルタ
１５          ガラス
１６          標本
１７          リレーレンズ
１８          蛍光検出手段
１９          ミラー
２０          反射部材
２１          開口部材（ガラス板）
２２          遮光部材
２３          撮像レンズ
５１          光源
５２          集光レンズ
５３          対物レンズ
５４          バリアフィルタ
５５          ガラス
５６          標本
５７          ダイクロイックミラー
５８          蛍光検出手段
５９，６０    ミラー
６１          イマージョンオイル
６２          結像レンズ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2007193213.tif 000007
【図６】
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【図７】
2007193213.tif 000009
【図８】
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