(57)【要約】【課題】日光臭の原因物質である３−メチル−２−ブテン−１−チオール（３ＭＢＴ）を、官能閾値濃度より低い濃度域であって従来よりもさらに低い濃度域において、充分な感度と高い精度で定量分析することができる分析方法の提供。【解決手段】発酵麦芽飲料もしくはビール様飲料中に不活性ガスを吹き込み、該飲料から微量揮発性成分を追い出して捕集管中の捕集剤で捕集し、得られた捕集成分を、加熱脱着装置、クライオフォーカストラップ、およびキャピラリーガスクロマトカラムを通した後に質量分析器を用いて検出する、発酵麦芽飲料もしくはビール様飲料中の日光臭成分である３ＭＢＴの高感度定量分析方法であって、前記捕集管として２種以上の捕集管の組み合わせを使用し、かつ／または、内部標準物質として３ＭＢＴの安定同位体を用いることを特徴とする方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵麦芽飲料もしくはビール様飲料中に不活性ガスを吹き込み、該飲料から微量揮発性成分を追い出して捕集管中の捕集剤で捕集し、得られた捕集成分を、加熱脱着装置、クライオフォーカストラップ、およびキャピラリーガスクロマトカラムを通した後に質量分析器を用いて検出する、発酵麦芽飲料もしくはビール様飲料中の日光臭成分である３−メチル−２−ブテン−１−チオールの高感度定量分析方法であって、
前記捕集管として、捕集管中の成分がポリ（２，６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）（５０〜１００重量％）とグラファイトカーボン（５０〜０重量％）とからなる単一の捕集管を使用するか、または、ポリ（２，６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）を少なくとも各捕集管中の捕集剤として含んでなる、２種以上の捕集管の組み合わせを使用し、かつ
（１）  前記２種以上の捕集管の組み合わせが、第１の捕集管と、該第１の捕集管中の捕集剤を加熱脱着処理することによって発生する揮発性成分を捕集するように配置されてなる第２の捕集管とを少なくとも含んでなるものであり、ここで捕集管の少なくとも一つは、エタノール、二酸化炭素、水のような測定ノイズ成分に対する捕集効率を低く抑える構造を有してなること、
（２）  内部標準物質として、３−メチル−２−ブテン−１−チオールの安定同位体を用いること、
のいずれか一方または両方の条件下にて実施することを特徴とする、方法。
【請求項２】
第１の捕集管が、第１の捕集管中の捕集剤単位量当たりの、該捕集管を通過する微量揮発性成分の接触量を調節可能な構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１の捕集管中の全成分に対する捕集剤ポリ（２，６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）の重量％が、第２の捕集管中の全成分に対する捕集剤ポリ（２，６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）の重量％に比べて少なくなるように設定されてなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
第２の捕集管内の成分が全て、ポリ（２，６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）からなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
第１の捕集管内の成分が、ポリ（２、６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）と、３−メチル−２−ブテン−１−チオールに対する捕集能を実質的に有さない充填剤とからなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
充填剤がガラスビーズである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
不活性ガスの吹き込み温度が０〜４０℃であり、
捕集管における捕集温度が１０〜４０℃であり、かつ／または、
捕集管における脱着温度が約１８０℃である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
３−メチル−２−ブテン−１−チオールの安定同位体が、３−メチル−２−ブテン−１−チオール中の水素原子の１または２以上が水素元素の同位体（Ｄ体）に置換されてなるものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
３−メチル−２−ブテン−１−チオールの検出可能な濃度範囲が０．１１ｐｐｔ以上であって、繰り返し測定したときの分析値のばらつきを表すＣ．Ｖ．値が５．０％以下である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、発酵麦芽飲料またはビール様飲料中の日光臭成分である３−メチル−２−ブテン−１−チオールの高感度定量分析方法に関する。
【０００２】
背景技術
３−メチル−２−ブテン−１−チオール（以下において「３ＭＢＴ」ということがある）は、ビールの「日光臭」の原因物質として知られている。「日光臭」とは、ビールを日光もしくは蛍光灯の下に長時間曝した時に発生する異臭のことをいう。３ＭＢＴの前駆体は、ホップのイソα酸（苦味成分）であり、このイソα酸の側鎖が５２０ｎｍ以下の波長によって開裂して、含硫アミノ酸から発生したＳＨラジカルと結合してチオール化合物を生成する。これが３ＭＢＴである。３ＭＢＴの生成機構は未だ充分解明されていないが、ビールの製造工程中においても  微量の３ＭＢＴが生成されることが知られている。
【０００３】
３ＭＢＴは、官能閾値濃度が極めて低く（例えば４〜３５ｐｐｔ）、また反応性に富むため、官能閾値濃度以下の３ＭＢＴを精度良く分析することは困難であった。
【０００４】
例えば、J. Am. Soc. Brew. Chem., 1991, 49(4), pp162-165（非特許文献１）には、ビール中の３ＭＢＴを捕集剤に捕集した後、ガスクロマトグラム法とFlamePhotometric Detector（ＦＰＤ）検出器とを組合せて使用し、３ＭＢＴを定量する方法が報告されている。しかしながら、この方法は、官能閾値濃度以下の３ＭＢＴを定量分析するためには、必ずしも充分とは言えない点があった。
【０００５】
また、J. Am. Soc. Brew. Chem., 1993, 51(2), pp70-74（非特許文献２）には、３ＭＢＴをＨｇ(II)cyanideに捕集した後に、有機溶媒に抽出して、これをガスクロマトグラム法と質量分析器を組合せて使用することによって、官能閾値濃度以下（１ｐｐｔ以下）の３ＭＢＴを検出できたことが報告されている。ここでは、内部標準物質として１−ヘキサンチオールが使用されている。しかしながら、この方法は、感度的にはそれ以前の技術に比べて充分であるものの、操作が煩雑であり、極微量の反応性の高い３ＭＢＴを、精度良く、かつ効率的に定量分析することは容易ではなかった。
【０００６】
Proceedings of the 29th EBC Congress Dublin 2003（非特許文献３）には、捕集剤として４−ヒドロキシ水銀安息香酸ナトリウムを使用して分析を行ったところ、０．４ｎｇ／Ｌ（ｐｐｔ）のビール中の３ＭＢＴを定量できたことが報告されている。しかしながら、この方法は、操作が煩雑であり、また水銀を使用するため安全性の観点からは望ましくない。
【０００７】
特許第３３９０６９５号公報（特許文献１）には、捕集剤としてグラファイトカーボン１０〜５０重量％（好ましくは２０〜４０重量％）とポリ（２，６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）９０〜５０重量％（好ましくは８０〜６０重量％）とからなる組成物を使用するか、および／またはビール中に不活性ガスを吹き込むときのビール温度を−５℃〜１０℃（好ましくは−２℃〜５℃）とすることによって、官能閾値濃度以下の３ＭＢＴを検出できたことが開示されている。この方法による３ＭＢＴの検出限界は、計算上０．２１ｐｐｔであったことも開示されており、また測定の際の内部標準物質としては１−ヘキサンチオールが使用されている。しかしながら、この方法は、感度的にはそれ以前の技術に比べて充分であるものの、捕集剤に捕集した状態の安定性が悪いため、極微量の反応性の高い３ＭＢＴを、精度良く、かつ効率的に定量分析するのは容易ではない。すなわち、信頼度の高いデータを得るためには、１つのサンプルに対して、２〜５回程度またはそれ以上の繰返し測定を実施することが望ましく、操作が煩雑となり易い。
【０００８】
このため、３ＭＢＴを、官能閾値濃度より低い濃度域であって従来よりもさらに低い濃度域において、充分な感度を示し、かつ、高い精度で定量分析することができる定量分析方法が依然として望まれている。
【０００９】
【特許文献１】特許第３３９０６９５号公報
【非特許文献１】J. Am. Soc. Brew. Chem., 1991, 49(4), pp162-165
【非特許文献２】J. Am. Soc. Brew. Chem., 1993, 51(2), pp70-74
【非特許文献３】Proceedings of the 29th EBC Congress Dublin 2003
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは今般、パージ＆トラップ法とガスクロマトグラフ−質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）とを組み合わせて分析を行う際に、捕集剤としてポリ（２，６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）を使用した捕集管を２種以上組み合わせて使用することによって、測定ノイズを発生させうる成分を被検体中から効率的に排除でき、より低いレベルの３ＭＢＴを、高精度で定量分析することができることを見いだした。また本発明者らは、３ＭＢＴの定量分析を行う際に、内部標準物質として、３ＭＢＴの安定同位体を使用することによって、より低いレベルの３ＭＢＴを、高精度で定量分析できることを見いだした。本発明はこれら知見に基づくものである。
【００１１】
よって、本発明は、日光臭の原因物質である３ＭＢＴを、官能閾値濃度より低い濃度域であって従来よりもさらに低い濃度域において、充分な感度を示し、かつ高い精度で定量分析することができる３ＭＢＴの分析方法の提供をその目的とする。
【００１２】
本発明による発酵麦芽飲料もしくはビール様飲料中の日光臭成分である３−メチル−２−ブテン−１−チオールの高感度定量分析方法は、発酵麦芽飲料もしくはビール様飲料中に不活性ガスを吹き込み、該飲料から微量揮発性成分を追い出して捕集管中の捕集剤で捕集し、得られた捕集成分を、加熱脱着装置、クライオフォーカストラップ、およびキャピラリーガスクロマトカラムを通した後に質量分析器を用いて検出するものであって、
前記捕集管として、捕集管中の成分がポリ（２，６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）（５０〜１００重量％）とグラファイトカーボン（５０〜０重量％）とからなる単一の捕集管を使用するか、または、ポリ（２，６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）を少なくとも各捕集管中の捕集剤として含んでなる、２種以上の捕集管の組み合わせを使用し、かつ
（１）  前記２種以上の捕集管の組み合わせが、第１の捕集管と、該第１の捕集管中の捕集剤を加熱脱着処理することによって発生する揮発性成分を捕集するように配置されてなる第２の捕集管とを少なくとも含んでなるものであり、ここで捕集管の少なくとも一つは、エタノール、二酸化炭素、水のような測定ノイズ成分に対する捕集効率を低く抑える構造を有してなること、
（２）  内部標準物質として、３−メチル−２−ブテン−１−チオールの安定同位体を用いること、
のいずれか一方または両方の条件下にて実施することを特徴とする方法である。
【００１３】
本発明の方法によれば、発酵麦芽飲料もしくはビール様飲料（製造工程の半製品を含む）中に含まれ得る微量の３ＭＢＴを、官能閾値以下の濃度であっても、高い精度で定量分析することができる。本発明の方法によれば、従来知られている方法（例えば特許第３３９０６９５号公報に記載の方法）に比べて、検出限界の下限値濃度を半分以下のレベルにまでさらに下げることができ、この結果、このような低濃度の３ＭＢＴを高精度で検出することが可能となる。また本発明によれば、分析の際に、被検体となる飲料中に不活性ガスを吹き込むときの飲料温度を低温（例えば０℃より低い温度）にする必要が無い。したがって、本発明の方法は、緻密な工程管理、品質管理に貢献できるものであり、さらに日光臭を発生し難いホップ加工品の開発、工程条件の確立、新容器の開発に役立つものである。
【発明の具体的説明】
【００１４】
本発明による方法は、前記したように、発酵麦芽飲料もしくはビール様飲料中の日光臭成分である３−メチル−２−ブテン−１−チオールの高感度定量分析方法であって、発酵麦芽飲料もしくはビール様飲料中に不活性ガスを吹き込み、該飲料から微量揮発性成分を追い出して捕集管中の捕集剤で捕集し、得られた捕集成分を、加熱脱着装置、クライオフォーカストラップ、およびキャピラリーガスクロマトカラムを通した後に質量分析器を用いて検出する方法、すなわち、パージ＆トラップ法とガスクロマトグラフ−質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）とを組み合わせて分析を行うことをその基本的構成とするものである。
【００１５】
本発明において、「発酵麦芽飲料」とは、麦芽を用いて得られた加ホップ麦汁を主成分とする原料を、発酵させることによって得られる飲料をいい、例えば、ビール、発泡酒等が挙げられる。
また、「ビール様飲料」には、前記した「発酵麦芽飲料」以外の飲料であって、発酵麦芽飲料と同等に、日光暴露によって３−メチル−２−ブテン−１−チオールによる日光臭が発生もしくは増加し得る飲料、すなわち３ＭＢＴもしくはその前駆体を含有し得る飲料であれば、いずれのものも包含される。「ビール様飲料」としては、例えば、ビールと同等もしくは類似した風味を有する、穀物を原料とする発酵飲料などが挙げられ、具体例として、大豆やエンドウ豆のような豆類由来成分とホップとを原料として発酵させることによって得られる飲料（いわゆる、酒税法上「その他雑酒２」に分類されるアルコール飲料を包含する）などが挙げられる。
【００１６】
またここでいう「飲料」には、製品としての飲料が含まれることは当然として、該飲料を製造する過程における半製品の状態のものや、飲料の評価の際等に使用される３ＭＢＴを含むコントロール溶液等も包含される。
【００１７】
「不活性ガス」としては、例えば、窒素ガス、ヘリウムガス、アルゴンガス等が挙げられ、好ましい例としては、高純度の窒素ガスが挙げられる。
【００１８】
本発明におけるパージ＆トラップ処理は、慣用のパージ＆トラップ装置であればいずれのものにおいても実施することができる。したがって、本発明においては、市販のパージ＆トラップ装置を適宜使用することができる。また本発明におけるＧＣ／ＭＳ法も、慣用のＧＣ／ＭＳ装置であればいずれのものにおいても実施することができる。したがって、本発明においては、市販のＧＣ／ＭＳ装置を適宜使用することができる。
【００１９】
本発明の第一の態様によれば、本発明による方法であって、前記（１）の条件下にて実施される方法が提供される。換言すると、本発明の第一の態様によれば、パージ＆トラップ法とＧＣ／ＭＳとを組み合わせて分析を行う、発酵麦芽飲料もしくはビール様飲料中の３ＭＢＴの高感度定量分析方法であって、捕集管として、ポリ（２，６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）を少なくとも各捕集管中の捕集剤として含んでなる、２種以上の捕集管の組み合わせを使用する方法が提供される。このとき、この２種以上の捕集管の組み合わせは、第１の捕集管と、該第１の捕集管中の捕集剤を加熱脱着処理することによって発生する揮発性成分を捕集するように配置されてなる第２の捕集管とを少なくとも含んでなるものであり、ここで捕集管の少なくとも一つは、エタノール、二酸化炭素、水のような測定ノイズ成分に対する捕集効率を低く抑える構造を有してなるものである。好ましい態様によれば、ここで、第１の捕集管は、エタノール、二酸化炭素、水のような測定ノイズ成分に対する捕集効率を低く抑える構造を有してなるものである。
【００２０】
このような２以上の捕集管の組み合わせには、これら第１および第２の捕集管を含んでなるものである限り、さらに、第３、第４等のような捕集管が組み合わされても良い。したがって本発明の第一の態様は、捕集剤として、複数の捕集管を直列に多段階に配置してなる、捕集管の組み合わせが包含される。好ましくは、該組み合わせは、第１の捕集管と第２の捕集管とからなる、２つの捕集管の組み合わせである。
【００２１】
本発明において、エタノール、二酸化炭素、水のような成分は、ＧＣ／ＭＳによる分析段階において測定ノイズを発生させ易い成分である。これら測定ノイズ成分は、パージ＆トラップ処理して得られる微量揮発成分中にも混入し得る。本発明においては、捕集剤として、２種以上の捕集管を多段階に配置して、パージ＆トラップ処理を行うことにより、これら測定ノイズ成分を、ＧＣ／ＭＳ装置に至る前の段階までに、効率的に排除することができる。さらに、このとき、捕集管として、エタノール、二酸化炭素、水のような測定ノイズ成分に対する捕集効率を低く抑える構造を有してなるものを使用することによって、極めて効率的にこれら測定ノイズ成分を排除することができる。
【００２２】
ここで、捕集管が「測定ノイズ成分に対する捕集効率を低く抑える構造を有する」とは、捕集剤の、３ＭＢＴと、測定ノイズ成分とに対する捕集能力、すなわち、親和性に着目して、３ＭＢＴは捕集されるが、測定ノイズ成分は捕集され難くなるように捕集管内の捕集剤の構成割合または配置を調節した状態をいう。この捕集剤の構成割合または配置は、捕集管中の捕集剤単位量当たりの、該捕集管を通過する微量揮発性成分の接触量に基づいて適宜変更することができる。ここで接触量は、例えば、捕集管を通過する揮発性成分の量（一測定当たりの全量）を、捕集管中の捕集剤の重量で除した値と定義することができる。この接触量は、捕集管を通過する揮発性成分と、捕集管内の捕集剤とが接触する程度（機会）を表すことができる。
【００２３】
捕集剤であるポリ（２，６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）は、３ＭＢＴの捕集効率に優れるものである。このポリ（２，６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）による３ＭＢＴの捕集能力は、測定ノイズ成分の捕集能力に比べて高いと考えた。このため、捕集管を通過する揮発性成分の接触量を低く抑えることにより、３ＭＢＴは捕集されるが、測定ノイズ成分は捕集され難い状態を作り出すことができる。該接触量を低く抑える手段としては、例えば、捕集管内の成分の内、捕集剤の割合を下げ、代わりに３ＭＢＴに対する捕集能を実質的に有さない充填剤を使用することが挙げられる。また、捕集管自体の体積を減らすかまたはその長さを短くするとしても良い。
【００２４】
したがって、捕集管の「測定ノイズ成分に対する捕集効率を低く抑える構造」としては、好ましくは、捕集管内の成分が、ポリ（２、６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）と、３ＭＢＴに対する捕集能を実質的に有さない充填剤とからなる混合物からなる場合である。ここで、３ＭＢＴに対する捕集能を実質的に有さない充填剤は、３ＭＢＴに対する捕集能を実質的に有さないものであれば、測定ノイズ成分を捕集できるものであってもよいし、それらの捕集能も有さないものであってもよい。また「捕集能を実質的に有さない」とは、捕集処理後に脱着処理を実施しても対象物質を、本願発明の目的である分析をできるレベルには得られないことをいう。このような充填剤としては、例えば、ガラスビーズ、ガラスウール等が挙げられるが、作業性の観点からは、ガラスビーズが好ましい。
【００２５】
したがって、本発明の好ましい態様によれば、第１の捕集管の管内の成分は、捕集剤としてのポリ（２、６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）と、ガラスビーズとからなる。
【００２６】
充填剤としてガラスビーズを使用する場合、第１の捕集管におけるポリ（２、６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）と、ガラスビーズとの重量比率は、例えば、１０：１〜１：１０、好ましくは８：２〜２：８である。
【００２７】
本発明の第一の態様における一つの好ましい態様によれば、第１の捕集管は、第１の捕集管中の捕集剤単位量当たりの、該捕集管を通過する微量揮発性成分の接触量を調節可能な構造を有する。これにより、被検体である発酵麦芽飲料もしくはビール様飲料の種類、測定機器等の条件等に応じて、測定ノイズ成分を効率的に排除できる構成を、第１の捕集管において適宜選択することが可能となる。例えば、前述のように、第１の捕集管の管内の成分が、捕集剤としてのポリ（２、６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）と、ガラスビーズとからなる場合、その構成比を調節できるような構造に第１の捕集管をしておくことが挙げられる。
【００２８】
本発明の第一の態様における別の一つの好ましい態様によれば、第１の捕集管中の全成分に対する捕集剤ポリ（２，６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）の重量％は、第２の捕集管中の全成分に対する捕集剤ポリ（２，６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）の重量％に比べて少なくなるように設定されてなる。このような構成を採用することによって、第１の捕集管において、測定ノイズ成分に対する捕集効率を低く抑えられて、測定ノイズ成分が排除され、続く第２の捕集管において、より選択的に３ＭＢＴを捕集することを好適に行うことができる。また、捕集剤として使用される捕集管の組み合わせとして、捕集管の段数が３段またはさらに多い場合には、該組み合わせの捕集管中、パージプロセスに近い上流の捕集管となるほど、管内の全成分に対する捕集剤の重量％が少なくなるように設定することが望ましい。
【００２９】
本発明の第一の態様において、第２の捕集管内の成分は、好ましくは、その全てがポリ（２，６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）からなる。換言すると、第２の捕集管の管内成分の１００％は、ポリ（２，６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）であることが好ましい。
【００３０】
よって、本発明の第一の態様における特に好ましい態様によれば、第１の捕集管は、捕集剤としてのポリ（２、６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）と、ガラスビーズとを含んでなり、かつ、第２の捕集管は、管内の成分が全て、ポリ（２，６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）である。このような構成を採用することによって、高精度で、検出限界に優れた３ＭＢＴの定量分析が可能となる。
【００３１】
本発明の第一の態様において、パージ＆トラップ処理の際には、被検体となる飲料に対し、内部標準物質を使用することが好ましい。ここで使用可能な内部標準物質としては、３ＭＢＴと物理化学的性質が類似する物質であれば適宜使用することができ、例えば、メチルエチルメルカプタン、１−ヘキサンチオール、１−オクタンチオール、３ＭＢＴの安定同位体などが使用可能である。内部標準物質の使用量は、被検体である飲料中に含まれる３ＭＢＴ量に応じて適宜変更することができる。
【００３２】
本発明の第二の態様によれば、本発明による方法であって、前記（２）の条件下にて実施される方法が提供される。換言すると、本発明の第二の態様によれば、パージ＆トラップ法とＧＣ／ＭＳとを組み合わせて分析を行う、発酵麦芽飲料もしくはビール様飲料中の３ＭＢＴの高感度定量分析方法であって、内部標準物質として、３−メチル−２−ブテン−１−チオールの安定同位体を用いる方法が提供される。内部標準物質として、３ＭＢＴの安定同位体を用いることによって、本発明による方法は、従来よりさらに低い検出限界域まで、優れた精度により３ＭＢＴの定量分析を行うことができる。内部標準物質として３ＭＢＴの安定同位体を用いることは、被検体中の３ＭＢＴが官能閾値濃度以下である場合に特に威力を発揮する。
【００３３】
本発明の第二の態様においては、捕集剤としては、捕集管中の成分がポリ（２，６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）（５０〜１００重量％）とグラファイトカーボン（５０〜０重量％）とからなる単一の捕集管を使用するか、または、ポリ（２，６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）を少なくとも各捕集管中の捕集剤として含んでなる、２種以上の捕集管の組み合わせを使用する。またここで、捕集管が２種以上の捕集管の組み合わせである場合、各捕集管が直列的に配置されて、上流に位置する捕集管中の捕集剤を加熱脱着処理することによって発生する揮発性成分を捕集できるように、次の捕集管が配置されてなることが好ましい。
【００３４】
本発明において、「３ＭＢＴの安定同位体」とは、３ＭＢＴを構成する元素の原子の少なくともいずれか一つが、その元素の安定同位体元素で置換されてなるものをいう。このような安定同位体元素としては、例えば、重水素原子（Ｄ）、三重水素原子（Ｔ）、Ｃ１３、Ｓ３４が挙げられる。好ましくは、３ＭＢＴの安定同位体は、３ＭＢＴ中の水素原子の１または２以上が水素元素の同位体（Ｄ体）に置換されてなるものであり、より好ましくは、３ＭＢＴ中の２つの水素原子が、同位体である重水素（Ｄ体）により置換されてなるもの（ｄ２−３ＭＢＴ）である。このとき、水素原子の置換位置は特に限定されず、３ＭＢＴの構造上の任意の水素原子が同位体に置換されることができる。
【００３５】
本発明において、このような３ＭＢＴの安定同位体は、慣用の方法によって、３ＭＢＴ上の原子を置換することにより調製することができる。あるいは、３ＭＢＴを合成する過程の中間体において、その中の原子を置換することによって調製することができる。例えば、ｄ２−３ＭＢＴは、下記のようなスキームに従って製造することができる。
【００３６】
【化１】
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【００３７】
本発明の第三の態様によれば、本発明による方法であって、前記（１）および（２）の両方の条件下にて実施される方法が提供される。換言すると、本発明の第三の態様によれば、パージ＆トラップ法とＧＣ／ＭＳとを組み合わせて分析を行う、発酵麦芽飲料もしくはビール様飲料中の３ＭＢＴの高感度定量分析方法であって、捕集管として、ポリ（２，６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）を少なくとも各捕集管中の捕集剤として含んでなる、２種以上の捕集管の組み合わせを使用し、かつ、内部標準物質として、３−メチル−２−ブテン−１−チオールの安定同位体を用いる方法が提供される。このとき、この２種以上の捕集管の組み合わせは、第１の捕集管と、該第１の捕集管中の捕集剤を加熱脱着処理することによって発生する揮発性成分を捕集するように配置されてなる第２の捕集管とを少なくとも含んでなるものであり、ここで捕集管の少なくとも一つは、エタノール、二酸化炭素、水のような測定ノイズ成分に対する捕集効率を低く抑える構造を有してなるものである。好ましい態様によれば、ここで、第１の捕集管は、エタノール、二酸化炭素、水のような測定ノイズ成分に対する捕集効率を低く抑える構造を有してなるものである。このように特定の捕集剤と、特定の内部標準物質とを用いて分析を行うことによって、従来よりさらに低い検出限界域まで、より優れた精度で、３ＭＢＴの定量分析を行うことができる。
【００３８】
本発明におけるパージ＆トラップ処理を実施するための装置の一例の概略図を図１に示す。本発明におけるパージ＆トラップ装置について、図１の場合を例として用い、以下に説明する。
【００３９】
まず、ガス洗浄壜１中に、所定量（例えば、７５ｍＬ程度）の被検体（発酵麦芽飲料もしくはビール様飲料等）と、好ましくは内部標準物質である３ＭＢＴ安定同位体とを入れ、バス２中に浸漬させる。バスには液体（低温にする必要が無いので通常は水）を入れ、バス温度を０℃〜４０℃に調節し、バス中の被検体温度をその温度に制御する。不活性ガス（例えば、高純度窒素ガス）を被検体中に吹込み、被検体中の３ＭＢＴと、３ＭＢＴ安定同位体とを追い出す（パージする）。このとき、不活性ガスの吹き込み時間は、通常、５〜１０分程度であり、吹き込み速度は、通常２０〜２００ｍＬ／ｍｉｎ、好ましくは５０〜１００ｍＬ／ｍｉｎのガス流量とすることができる。また吹き込みガスの温度は、バス温度を考慮して適宜設定できるが、通常は−１０〜５０℃であり、好ましくは０〜４０℃、より好ましくは１０〜２０℃である。追い出された３ＭＢＴを含む微量揮発性成分を、パージ＆トラップ装置内において、捕集管３中の捕集剤によって捕集する。このとき捕集剤としては、ポリ（２，６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）を少なくとも使用する。捕集を行う際の捕集管の温度、すなわち、捕集温度は、通常−５〜５０℃であり、好ましくは１０〜４０℃、より好ましくは１０〜２０℃である。捕集処理後、捕集管内の捕集成分を、加熱脱着処理を施すことにより、捕集管から脱着させる。このとき、加熱脱着処理は、捕集管を約１８０℃、またはそれ以上に昇温させることにより行うことができる。
【００４０】
なおここで、「約」を用いた値の表現は、その値を設定することによる目的を達成する上で、当業者であれば許容することができる値の変動を含む意味である。
【００４１】
よって本発明の一つの好ましい態様によれば、本発明の方法において、不活性ガスの吹き込み温度は０〜４０℃であり、捕集管における捕集温度は１０〜４０℃であり、かつ／または、捕集管における脱着温度は約１８０℃である。
【００４２】
好ましくは、捕集管３の後に、さらに第２段目として、捕集剤が充填された捕集管４を設置し、２段階の捕集をする。この場合、第１段目の捕集管（ここでは捕集管３）において、検体中から追い出された揮発性成分中から、分析の妨害となるエタノール、炭酸ガス（ＣＯ２）、水のような成分（測定ノイズ成分）を系外に排出されるようにしてできるだけ多く除く。次いで、この捕集管３に加熱脱着処理を施し（例えば昇温条件、約２０℃から約１８０℃に昇温）、測定ノイズ成分を極力除いた３ＭＢＴを含む揮発性成分（好ましくは３ＭＢＴに加えて内部標準物質３ＭＢＴ安定同位体を含む）を脱着させる。続いて、第２段目の捕集管（ここでは捕集管４）において、該３ＭＢＴを含む揮発性成分から、３ＭＢＴと好ましくは３ＭＢＴ安定同位体とを捕集する。この第２段目の捕集管でも、第１段目から移行してきた微量の水、エタノール、炭酸ガスのような測定ノイズ成分を破過し系外に排出して取り除くことができる。ここで、第１段目の捕集管３の管内の成分は、好ましくは、捕集剤であるポリ（２，６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）と、充填剤であるガラスビーズとの混合物である。このような構成とすることで、捕集管３では、３ＭＢＴを含む成分がポリ（２，６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）に捕集され、また、水、エタノールのような測定ノイズ成分がガラスビーズに捕集される一方、その過剰分は破過し系外に排出されることとなる。また、第２段目の捕集管４の管内の成分は、好ましくは、捕集剤であるポリ（２，６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）（１００重量％）である。次に、この捕集管４に加熱脱着処理を施し（例えば昇温条件、約２０℃から約１８０℃に昇温）、３ＭＢＴを含む揮発性成分を脱着させる。
【００４３】
パージ＆トラップ処理が終了したら、予め液体窒素等の慣用の冷却剤で冷却しておいたクライオフォーカストラップ５に、捕集管より得られた３ＭＢＴを含む揮発性成分を送り、冷却させ、濃縮する。ここで、冷却させたクライオフォーカストラップ５の温度は、例えば−２００℃〜−５０℃、好ましくは−７０℃〜−１８０℃である。次いで、クライオフォーカストラップの温度を例えば５０℃〜２００℃、好ましくは６０℃〜１００℃に上げ、クライオフォーカストラップ中に冷却濃縮されていた３ＭＢＴを含む揮発性成分を、キャピラリーカラムに注入する。
このパージ＆トラップとクライオフォーカストラップ部分の装置としては、例えば、市販のＥＮＴＥＣＨ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ．Ｉｎｃ.製 ７１００Ａ（商品名）を用いることができる。
【００４４】
クライオフォーカストラップにおいて、ガス化された３ＭＢＴと３ＭＢＴ安定同位体は、キャリアガス（例えば、ヘリウムガスなど）によりガスクロマトグラフ装置に送られ、そこでキャピラリーカラムに注入させる。このようなＧＣ装置としては、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ社製や島津製作所製のＧＣ装置などを用いることができる。ここで使用されるキャピラリーカラムとしては、例えば、長さ６０ｍ、内径０．３２ｍｍ、膜厚１μｍのものを使用することができ、Ａｇｉｌｅｎｔ社製ＤＢ−１（商品名）のような市販品を使用することができる。キャピラリーカラムを収納するオーブンの分析時温度は、例えば、４０℃から毎分１０℃上昇させ、１５０℃となったところで毎分２０℃上昇させるように、最終的に２９０℃となるように設定することができる。
キャピラリーカラムで分離されたサンプル中の３ＭＢＴを、質量分析器（ＭＳ）により定量する。このようなＭＳ装置としては、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ社製５９７３ ｉｎｅｒｔなどを用いることができる。
【００４５】
本発明による３ＭＢＴの高感度定量分析方法は、前記したように、官能閾値濃度より低い濃度域であって従来よりもさらに低い濃度域において充分な感度と、高い精度で３ＭＢＴを、定量分析することができるものである。ここで、分析の「精度」とは、繰返し分析した際の分析値の“ばらつき”の程度を意味し、高精度とは、そのばらつきが少ない場合を意味する。本発明においては、この精度を下記のように定義されるＣ．Ｖ．値で評価することができる。
Ｃ．Ｖ．値（％）＝
［繰返し測定したときの分析値の標準偏差］／［分析値の平均値］ Ｘ １００
本発明によれば、Ｃ．Ｖ．値は、５．０％以下となるものであり、好ましくは３．０％以下、より好ましくは２．０％以下となる。このため本発明による方法は高い精度を有するものであって、分析の効率を高める上で有利である。
【００４６】
またここで、分析の「感度」が高いとは、３ＭＢＴの検出限界の下限値がより小さい値であることを意味する。検出限界値は、検出限度をＳ／Ｎ＝３を与える濃度とした場合の分析対象物質の濃度値と定義される。ここで、Ｓ／Ｎとは３ＭＢＴのシグナルピークの高さとノイズの高さとの比で表わされる。本発明によれば、３ＭＢＴの検出限界値、すなわち３ＭＢＴの検出可能な濃度範囲が、好ましくは０．１１ｐｐｔ以上である。このような検出限界の下限値は、従来の方法の場合にくらべて１／２以下の値であることから、飲料中に微量に含まれるだけでも問題となる３ＭＢＴを分析する上で、本発明の方法は優れた分析性能を有していると言える。
【００４７】
したがって、本発明の一つの好ましい態様によれば、本発明による方法において、３ＭＢＴの検出可能な濃度範囲が０．１１ｐｐｔ以上であって、繰り返し測定したときの分析値のばらつきを表すＣ．Ｖ．値が５．０％以下である。
【実施例】
【００４８】
本発明を以下の例によって詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４９】
実施例１：  内部標準物質の検討
冷蔵の市販製品ビール（キリンビール株式会社製、「一番搾り」（商品名））７５ｍＬを２５０ｍＬのガス洗浄壜に入れ、ここに消泡剤（シリコンオイル）を０．０１％量添加し、さらに内部標準物質として、メチルエチルメルカプタン、１−ヘキサンチオール、または３ＭＢＴ安定同位体をそれぞれ５０ｐｐｔとなるように添加した。なおここで、メチルエチルメルカプタンと１−ヘキサンチオールは市販品を使用し、また３ＭＢＴ安定同位体は、上記した３ＭＢＴ安定同位体の合成スキームにしたがって合成した「ｄ２−３ＭＢＴ」を用いた。
【００５０】
調製した各サンプルを、下記表１に示した条件で、パージ＆トラップ、およびＧＣ／ＭＳに供し、得られた結果から、３ＭＢＴのＣ．Ｖ．値および検出限界値を得た。
【００５１】
ここで、Ｃ．Ｖ．値（％）は、前記したように、分析精度を表す指標であって、繰返し分析した際の結果の“ばらつき”の程度を表すものであって、
Ｃ．Ｖ．値（％）＝
［繰返し測定したときの分析値の標準偏差］／［分析値の平均値］ Ｘ １００
で定義される。
したがって各サンプルの場合のＣ．Ｖ．値は、この定義にしたがって算出した。
【００５２】
また検出限界値は、検出限度をＳ／Ｎ＝３を与える濃度とした場合の分析対象物質の濃度値と定義される。ここで、Ｓ／Ｎとは３ＭＢＴのシグナルピークの高さとノイズの高さとの比で表わされる。したがって、本実施例においては、３ＭＢＴを３．１ｐｐｔ含むビールの分析をしたところ、Ｓ／Ｎは８８．０であった。この値から、検出限界値を算出すると、３．１０／（８８．０／３）＝０．１０５、となり、したがって、ここでの３ＭＢＴの検出限界は０．１１ｐｐｔであることがわかった。
【００５３】
結果をまとめると、表２に示されるとおりであった。
結果から、３ＭＢＴ安定同位体が最もばらつきが小さく、内部標準物質として最も優れていることが判明した。また得られた検出限界値は、官能閾値を大幅に下回る値であった。
【００５４】
【表１】
2007178184.tif 000004
【００５５】
【表２】
2007178184.tif 000005
【００５６】
実施例２：  捕集剤の検討
冷蔵の市販製品ビール（キリンビール株式会社製、「一番搾り」（商品名））７５ｍＬを２５０ｍＬのガス洗浄壜に入れ、ここに消泡剤（シリコンオイル）を０．０１％量添加し、さらに内部標準物質（ｄ２−３ＭＢＴ）を５０ｐｐｔとなるように添加した。得られたサンプルを、捕集剤の条件を下記(a)および(b)の通りとした以外は、実施例１の場合と同様の条件にて、パージ＆トラップ、およびＧＣ／ＭＳに供し、得られた結果から、３ＭＢＴのＣ．Ｖ．値および検出限界値を得、評価した。
捕集剤の条件：
(a)  捕集剤は、１段階のみであり、その捕集剤成分として、ポリ（２，６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）（１００重量％）よりなる組成物を用いた（１段階法）。
(b)  実施例１と同様の条件の第１段目および第２段目の２段階の捕集剤を用いた（２段階法）。
【００５７】
結果は、表３に示されるとおりであった。捕集剤を１段階よりも２段階とした方が、優れた検出精度および検出限界を達成することができた。
【００５８】
【表３】
2007178184.tif 000006
【００５９】
実施例３：  ３ＭＢＴの検量線の作成
冷蔵の市販製品ビール（キリンビール株式会社製、「一番搾り」（商品名））７５ｍＬを２５０ｍＬのガス洗浄壜に入れ、０〜３０ｐｐｔの濃度となるように３ＭＢＴ標準原液を添加し、検量線用標準溶液を調製した。ここにそれぞれ、消泡剤（シリコンオイル）を０．０１％量添加し、さらに内部標準物質（ｄ２−３ＭＢＴ）を１００ｐｐｔとなるように添加した。得られたサンプルを、実施例１の場合と同様の条件にて、パージ＆トラップ、およびＧＣ／ＭＳに供し、得られた３ＭＢＴと内部標準物質のピーク面積値の比より検量線を作成した。
【００６０】
結果は図２に示されるとおりであった。
検量線における相関係数はｒ＝０．９９９となり、本発明の方法は定量性に優れた方法であることが確認された。
【００６１】
実施例４：  麦汁における３ＭＢＴ検量線の作成
冷蔵の麦汁７５ｍＬを２５０ｍＬのガス洗浄壜に入れ、０〜５０ｐｐｔの濃度となるように３ＭＢＴ標準原液を添加し、検量線用標準溶液を調製した。ここにそれぞれ、消泡剤（シリコンオイル）を０．０１％量添加し、さらに内部標準物質（ｄ２−３ＭＢＴ）を５０ｐｐｔとなるように添加した。得られたサンプルを、実施例１の場合と同様の条件にて、パージ＆トラップ、およびＧＣ／ＭＳに供し、得られた３ＭＢＴと内部標準物質のピーク面積値の比より検量線を作成した。
【００６２】
その結果、相関係数はｒ＝０．９９８となり、本発明の方法は、製造工程途中における半製品中の３ＭＢＴ測定手段としても優れた方法であることが確認された。
【００６３】
実施例５：  バス温度の影響
冷蔵の市販製品ビール（キリンビール株式会社製、「一番搾り」（商品名））７５ｍＬを２５０ｍＬのガス洗浄壜に入れ、ここに消泡剤（シリコンオイル）を０．０１％量添加し、さらに内部標準物質（ｄ２−３ＭＢＴ）を１００ｐｐｔとなるように添加した。得られたサンプルを、バス温度の条件をそれぞれ５，１０，２０，および４０℃とした以外は、実施例１の場合と同様の条件にて、パージ＆トラップ、およびＧＣ／ＭＳに供し、得られた結果から検出限界値を得、評価した。
【００６４】
結果は表４に示されるとおりであった。
バス温度を特に冷却させることなく、バス温度５〜４０℃の範囲において、良好な検出感度と精度を達成することができた。
【００６５】
【表４】
2007178184.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明に用いる装置の概略図である。
【図２】実施例３において得られた３ＭＢＴの検量線を表すグラフである。
【符号の説明】
【００６７】
１  ガス洗浄壜
２  バス
３  第１の捕集管
４  第２の捕集管
５  クライオフォーカストラップ
３１  ガラスビーズ
３２  ポリ（２，６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）
４１  ポリ（２，６−ジフェニル−ｐ−フェニレンオキサイド）
【図１】
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【図２】
2007178184.tif 000009