(57)【要約】【課題】ヒト由来のジフテリア毒素受容体（DTR)遺伝子のノックインマウスを新たな疾患モデル動物として提供すること。【解決手段】ヒト由来のジフテリア毒素受容体(DTR)遺伝子がマウスゲノム上のlysozyme M(lysM)遺伝子座に挿入されていることを特徴とする、呼吸促拍症候群（RDS)モデルマウス。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来のジフテリア毒素受容体(DTR)遺伝子がマウスゲノム上のlysozyme M(lysM)遺伝子座に挿入されていることを特徴とする、呼吸促拍症候群（RDS)モデルマウス。
【請求項２】
ヒト由来のジフテリア毒素受容体(DTR)遺伝子のマウスゲノム上のlysozyme M(lysM)遺伝子座への挿入部位が、lysM遺伝子のエクソン１内である、請求項１に記載のRDSモデルマウス。
【請求項３】
ヒト由来のジフテリア毒素受容体(DTR)遺伝子をII型肺胞上皮細胞に特異的に発現することを特徴とする、請求項１又は２に記載のRDSモデルマウス。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載のRDSモデルマウスにジフテリア毒素（DT)とともに被験物質を投与し、II型肺胞上皮細胞のアポトーシス誘導及び／又は肺サーファクタントタンパク量を解析することを含む、RDSの治療及び／又は予防のための医薬をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺サーファクタントタンパクの欠乏によって呼吸不全をきたす呼吸促拍症候群（RDS)のモデルマウス及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
呼吸促拍症候群 (Respiratory Distress Syndromes: RDS)は、成人呼吸促拍症候群 (Adult Respiratory Distress Syndromes:ARDS)、新生児呼吸促拍症候群 (Idiopathic Respiratory Distress Syndromes:IRDS)が含まれ、感染や外傷などの様々な要素が引き金となって発症する呼吸不全疾患である。
【０００３】
RDSでは肺胞内のサーファクタントタンパク（肺サーファクタントタンパク）の減少が見られることが報告されており、この減少がRDSの病態を特定する一つでもある(非特許文献１）。従って、RDSの発症に関しては、この肺サーファクタントタンパクの量的・機能的欠如によって肺コンプライアンスが低下することが原因であるとする考えが有力である。
【０００４】
従来、肺サーファクタントタンパクの減少を伴う呼吸不全モデル動物を作成する方法としては、ラットにBleomycinを気管内投与する方法が知られている（非特許文献２）。しかしながら、この方法は薬剤の肺胞細胞に対する障害の機序が明らかでないことに加えて、気管内投与という複雑な方法をとらなければならないという欠点がある。
【０００５】
また、肺サーファクタントタンパクの一つであるsurfactant protein B (SP-B）欠損マウスは肺サーファクタントタンパクの機能欠損によると考えられる呼吸不全を起こすが（非特許文献３）、SP-Bの欠損マウスは、出生直後に死亡してしまうため、ARDSモデルマウスとしては用いることはできない。
【０００６】
以上のことから、肺サーファクタントタンパクの減少を伴う呼吸不全モデル動物には有用なものがなく、ヒトRDSとの関連性の高い、新たなモデル動物の開発が求められている。
【０００７】
一方、動物個体内で特定の細胞群がどのような生理機能を担っているのかを明らかにする目的で、その細胞群だけを除去するというアプローチがあるが、その方法の一つとしてジフテリア毒素とその受容体を利用し、任意の時期に標的細胞のみを特異的に破壊するTRECK法（toxin receptor-mediated cell knockout）が知られている。この方法は、細胞や臓器特異的なプロモーターの下流にヒト由来のジフテリア毒素受容体（DTR)をつないだ遺伝子をマウスに導入することによって、標的細胞に毒素受容体を発現するトランスジェニックマウスを作製するというものである。このトランスジェニックマウスにDTを投与することによって、標的細胞を一過的にin vivoで欠損させることができる（非特許文献４、５）。ジフテリア毒素受容体（DTR)として膜結合型HB-EGF（Heparin-binding EGF-like growth factor；ヘパリン結合性EGF様成長因子）が用いられているが、マウスHB-EGFは、ジフテリア毒素（DT）に対して親和性がほんどなく、耐性であるのに対して、ヒトHB-EGFは、ジフテリア毒素受容体 (DTR)として作用することが知られている(非特許文献６、７）。しかしながら、上記方法でDTRを標的細胞に発現させたマウスに対してDTを投与した場合、該マウスが、標的細胞の破壊に伴って、いかなる病態や機能変化を呈するかは不明である。
【非特許文献１】James F. Lewis and Ruud Veldhuizen, The role of exogenous surfactant in the treatment of acute lung injury, Annual Review of Physiology, 65, 613-642, 2003
【非特許文献２】Rashmin C. Savani, Rodolfo I. Godinez, Marye H. Godinez, Erica Wentz, Aisha Zaman, Zheng Cui, Patricia M. Pooler, Susan H. Guttentag, Michael F. Beers, Linda W. Gonzales, and Philip L. Ballard, Respiratory distress after intratracheal bleomycin： selective deficiency of surfactant proteins B and C, American Jounal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology, 281(3), L685-L696, 2001
【非特許文献３】K. Tokieda, J. A. Whitsett, J. C. Clark, T. E. Weaver, K. Ikeda, K. B. McConnell, A. H. Jobe, M. Ikegami and H. S. Iwamoto, Pulmonary dysfunction in neonatal SP-B-deficient mice, American Jounal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology, 17(4), L875-L882, 1997
【非特許文献４】Saito M, Iwawaki T, Taya C, Yonekawa H, Noda M, Inui Y, Mekada E, Kimata Y, Tsuru A, Kohno K., Diphtheria toxin receptor-mediated conditional and targeted cell ablation in transgenic mice., Nat. Biotechnol, 19, 746-750, 2001
【非特許文献５】Jung S, Unutmaz D, Wong P, Sano G, De los Santos K, Sparwasser T, Wu S, Vuthoori S, Ko K, Zavala F, Pamer EG, Littman DR, Lang RA. In vivo depletion of CD11c(+) dendritic cells abrogates priming of CD8(+) T cells by exogenous cell-associated antigens, Immunity, 17, 211-220, 2002
【非特許文献６】Pappenheimer AM Jr, Harper AA, Moynihan M, Brockes JP., Diphtheria toxin and related proteins: effect of route of injection on toxicity and the determination of cytotoxicity for various cultured cells, J Infect Dis, 145, 94-102, 1982
【非特許文献７】Mitamura T, Higashiyama S, Taniguchi N, Klagsbrun M, Mekada E., Diphtheria toxin binds to the epidermal growth factor (EGF)-like domain of human heparin-binding EGF-like growth factor/diphtheria toxin receptor and inhibits specifically its mitogenic activity, J Biol Chem, 270, 1015-1019, 1995
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、ヒト由来のジフテリア毒素受容体（DTR)遺伝子のノックインマウスを新たな疾患モデル動物として提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記のTRECK法を用いてマクロファージ欠損マウスの作製を企図し、マクロファージに特異的に発現するlysozymeM (LysM)遺伝子にヒト由来のジフテリア毒素受容体（DTR)遺伝子を挿入したマウス（LysM/DTR マウス）を作製し、該マウスにジフテリア毒素（DT)を投与したところ、マクロファージのみならず、肺サーファクタントの産生細胞であるII型肺胞上皮細胞にアポトーシスが誘導されることを見出した。また、このLysM/DTR マウスは驚くべきことにヒトの呼吸促拍症候群(Respiratory Distress Syndromes: RDS)に類似する、肺サーファクトタンパクの顕著な減少が誘発されたことから、該マウスが肺サーファクトタンパクの減少を伴う新たな呼吸不全モデル動物として利用できることをも見出した。本発明はかかる知見により完成されたものである。
【００１０】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
(1) ヒト由来のジフテリア毒素受容体(DTR)遺伝子がマウスゲノム上のlysozyme M(lysM)遺伝子座に挿入されていることを特徴とする、呼吸促拍症候群（RDS)モデルマウス。
(2) ヒト由来のジフテリア毒素受容体(DTR)遺伝子のマウスゲノム上のlysozyme M(lysM)遺伝子座への挿入部位が、lysM遺伝子のエクソン１内である、(1)に記載のRDSモデルマウス。
(3) ヒト由来のジフテリア毒素受容体(DTR)遺伝子がII型肺胞上皮細胞に特異的に発現することを特徴とする、(1)又は(2)に記載のRDSモデルマウス。
(4) (1)から(3)のいずれかに記載のRDSモデルマウスにジフテリア毒素（DT)とともに被験物質を投与し、II型肺胞上皮細胞のアポトーシス誘導及び／又は肺サーファクタントタンパク量を解析することを含む、RDSの治療及び／又は予防のための医薬をスクリーニングする方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ヒトのRDSと類似した病態を呈するRDSモデルマウスが提供される。本発明のRDSモデルマウスは、ヒトのRDSの治療及び／又は予防のための医薬のスクリーニング、その病因の究明や病態の解析のめの実験動物として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
１．呼吸促拍症候群（RDS)モデルマウスの作製
本発明の呼吸促拍症候群（Respiratory Distress Syndromes（RDS）、以下RDSという)モデルマウスは、ヒト由来のジフテリア毒素受容体(DTR)遺伝子がマウスゲノム上のlysozyme M(lysM)遺伝子座に挿入されていることを特徴とする。
【００１３】
本発明のRDSモデルマウスは、公知の遺伝子ターゲティング法に基本的に準じ、例えば以下の操作によって作製することができる。
【００１４】
まず、ヒト由来のジフテリア毒素受容体(DTR)遺伝子をマウスゲノム上のlysozyme M(lysM)遺伝子座に相同組換えにより挿入するためのターゲティングベクターを作製する。DTR遺伝子のlysM遺伝子座への挿入は、lysM遺伝子のエクソン部分、例えば、本発明においては、エクソン１内に行う。より具体的にはLysM遺伝子の開始コドン（ATG)にhDTRcDNAのATGを合わせて挿入する。
【００１５】
lysM遺伝子は、その塩基配列情報（GenBank No. NT_039500)に基づいて、一般的な遺伝子工学的手法により容易に取得することができる。マウス由来のlysM遺伝子は、マクロファージや単球のような骨髄単球性細胞において特異的に発現している(Cross M, Mangelsdorf I, Wedel A, Renkawitz R, Mouse lysozyme M gene, isolation, characterization, and expression studies. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 85, 6232-6236, 1988；Cross M, Renkawitz R. Repetitive sequence involvement in the duplication and divergence of mouse lysozyme genes, EMBO J., 9, 1283-1288, 1990)。
【００１６】
従って、lysMを遺伝子発現している上記の細胞や組織からゲノムDNAを抽出し、常法に従って調製したゲノムDNAライブラリー、あるいは、市販のマウスのゲノムDNAライブラリー（例えば、Stratagene社製）から、上記の配列情報に基づいて設計したlysM遺伝子に特有の適当なプローブを用い、所望のクローンを選択することにより取得することができる。
ゲノムDNAの起源としては、既に構築されている汎用近交系マウス（129Sv，C56BL6J，DBA2J，BALBc，129Svなど)の組織やこれらに由来する培養細胞等が例示される。
【００１７】
lysM遺伝子をゲノムDNAライブラリーからスクリーニングする方法も特に制限されず、プラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、これらの組合せ等、通常の方法に従うことができる。
【００１８】
また、ヒト由来のDTR遺伝子として、HB-EGF（Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor；ヘパリン結合性EGF様成長因子)cDNAを用いることができる。HB-EGF遺伝子もまた公知の塩基配列情報（GenBank No. NM_001945）からPCR法によって、あるいは該塩基配列を有するDNA断片をプローブとするハイブリダイゼーションによって取得することができる。
【００１９】
また、ターゲティングベクターは、相同組換えを起こしたマウス胚性幹細胞（ES)細胞の選択を容易にかつ効率的にするために、選択（ポジティブ−ネガティブ選択）用マーカー遺伝子が挿入される。ポジティブ選択用マーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、好ましくはネオマイシン耐性遺伝子が挙げられ、ネガティブ選択用マーカー遺伝子としては、HSVチミジンキナーゼ（TK）遺伝子、ジフテリア毒素Ａ遺伝子等などが挙げられる。ポジティブ選択により安定な組換え体が選択され、ネガティブ選択により、生き残った細胞群からランダム組換え体が排除される。
【００２０】
次に、上記のターゲティングベクターをマウスES細胞に導入し、マウスES細胞のゲノムDNAのlysM遺伝子が、ターゲティングベクター中のヒト由来のDTR遺伝子に相同組換えを起こした細胞を選択する。ターゲティングベクターの導入は、常法に従って行うことができ、具体的にはエレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、DEAE−デキストラン法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。また、相同組換えを起こした細胞の選択は、上記の選択マーカーにより行い、選択された細胞における導入遺伝子の確認は、サザンブロット法やPCR法にて行うことができる。この相同組換えにおいては、ES細胞内のlysM遺伝子とターゲティングベクターの対応する領域との間で組換えが生じ、ターゲティングベクターに挿入されていたヒト由来のDTR遺伝子がES細胞のゲノムlysM遺伝子に挿入される。
【００２１】
次に、相同組換えが確認されたES細胞を、野生型マウスより採取した胚盤胞にマイクロインジェクション法により導入し、さらに偽妊娠マウス（仮親）の子宮角に移植して個体へと発生させ、キメラマウスを産出させる。キメラマウスの生殖細胞が相同組換え体に由来すれば、このキメラマウスを野生型マウスと交雑することによって、対立遺伝子の一方でlysM遺伝子にDTR遺伝子が挿入されたヘテロ接合体のノックインマウスを得ることができる。
【００２２】
２. RDSモデルマウスの用途
上記のようにして作製される本発明のRDS モデルマウスは、後記実施例に示すように、ジフテリア毒素（DT)投与により、マクロファージとともにII型肺胞上皮細胞にアポトーシスが誘導されるほか、肺サーファクトタンパクが顕著に減少する。この肺サーファクトタンパクの顕著な減少は、ヒトRDSと酷似した症状である。従って、本発明のRDSモデルマウスは、II型肺胞上皮細胞のアポトーシス誘導及び／又は肺サーファクタントタンパク量を指標として、RDSの治療及び／又は予防のための医薬のスクリーニングに利用できる。さらに、本発明のRDSモデルマウスは、RDS治療薬の候補化合物の効果評価、RDSの発症機構解明の研究などに利用できる。
【００２３】
本明細書において、RDSとは、代表的には成人呼吸促拍症候群 (Adult Respiratory Distress Syndromes:ARDS)、急性呼吸促迫症候群、新生児呼吸促拍症候群 (Idiopathic Respiratory Distress Syndromes:IRDS)をいうが、その原因となる肺疾患、例えば、間質性肺炎〔特発性間質性肺炎(IIP)、膠原病性間質性肺炎(CDIP）〕、肺感染症、原発性肺腺癌、肺癌などの放射線治療に合併する放射性肺炎、過敏性肺炎、先天性肺胞蛋白症なども含めるものとする。
【００２４】
すなわち、本発明によれば、上記のRDSモデルマウスにジフテリア毒素（DT)とともに被験物質を投与し、II型肺胞上皮細胞のアポトーシス誘導及び／又は肺サーファクタントタンパク量を解析することを含む、RDSの治療及び／又は予防のための医薬のスクリーニングする方法が提供される。
【００２５】
例えば、RDSモデルマウスにジフテリア毒素（DT)とともに被験物質を投与し、II型肺胞上皮細胞のアポトーシス誘導及び／又は肺サーファクタントタンパク量を調べ、アポトーシス誘導を抑制及び／又は肺サーファクタントタンパク量の減少の抑制が認められる場合の被験物質は、RDS治療及び／又は予防のための医薬の候補とすることができる。また、上記のスクリーニング方法では、DTを静脈内あるいは腹腔内投与することによりRDSの病態を惹起することができることから従来のBleomycinを気管内投与する方法よりも簡便であるため、一度に大量の被験物質を扱う場合や、一次スクリーニングを行う場合等に有効である。
【００２６】
本発明のスクリーニング方法の対象となる被験物質の種類は特に限定されない。例えば、天然に生じる分子(例えば、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸など)；脂質、ステロイド、グリコペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカンなど；あるいは天然に生じる分子の合成アナログ又は誘導体(例えば、ペプチド擬態物など)；及び天然に生じない分子(例えば、コンビナトリアルケミストリー技術等を用いて作成した低分子有機化合物)；ならびにそれらの混合物などを挙げることができる。また、被験物質としては単一の被験物質を独立に試験しても、いくつかの候補となる被験物質の混合物（ライブラリーなどを含む）について試験をしてもよい。複数の被験物質を含むライブラリーとしては、合成化合物ライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）、ペプチドライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）などが挙げられる。
【００２７】
被験物質の投与量や濃度は適宜設定することができるが、例えば、希釈系列を作成するなどして複数の投与量を設定してもよい。被験物質の投与期間も適宜設定することができるが、例えば、１日から数週間までの期間に渡って投与することができる。本発明のRDSモデルマウスに被験物質を投与する場合の投与経路は特に限定されず、被験物質の種類に応じて経口投与、静脈注射、腹腔内注射、気管内投与、経皮投与、皮下注射等の投与形態を適宜使用することができる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものでない。
（実施例１） LysM/DTR マウスの調製
(1)ターゲティングベクターの構築
転写開始部位に対して-1.6kbから+6.6 kbまでの領域を含むlysM遺伝子のゲノムクローンをBACライブラリー(129/Sv マウスゲノムDNA)から得た。ターゲティングベクター(図１）を構築するために、5’アームと3’アームを作製した。5’アームは、マウスlysMのプロモーターを含む1560bp断片(NT_039500の31142760-31144319)をPCRで増幅し、配列決定することによって作製した。また、3’アームは、マウスlysMのエクソン１の一部とエクソン2〜4を含む6645bp断片（NT_039500の31136000-31142644)をPCRで増幅し、配列決定したスプライシングドナーサイトを含む220bpの断片に、それに続く約5.1kbのNcoI断片と約1.3kbのNcoI-SacI断片を結合させることによって作製した。両アームをpBluescript II SK(+)ベクター(stratagene, La Jolla, CA)にクローニングした。
【００２９】
ポリアデニル化シグナルをその下流に結合したヒトHB-EGF (DTR) cDNAの700 bp断片（NM_001945の262-961）をpMS7プラスミドからPCR 増幅し、そして5’アームのすぐ下流（lysM遺伝子の第1エクソン内にある内在性ATG 開始部位）にサブクローニングした。相同な組換え体を選ぶために、loxP-flanked neor カセットをヒトDTR遺伝子の下流にクローニングした。また、チミジンキナーゼ（TK)遺伝子を、ランダム組換え体に対して選別するために3’アームの下流に挿入した。
【００３０】
(2) LysM/DTR ヘテロマウスの作出
線状化したターゲティング構築物をES細胞にトランスフェクトし、ヒトDTRノック-インアレルを有するヘテロ接合性ES細胞を、胚盤胞とともに凝集してLysM/DTR キメラマウスを調製した。その後キメラマウスをC57BL/6 野生型マウスと交配してLysM/DTR ヘテロ接合性マウスを得た。LysM/DTR マウスの相同組換えをサザンブロット分析によって確認した（図２)。
【００３１】
上記とは別に、LysM/DTR マウスとCAG-Cre マウス(Sakai K, Miyazaki J, A transgenic mouse line that retains Cre recombinase activity in mature oocytes irrespective of the cre transgene transmission, Biochem. Biophys. Res. Commun., 237, 318-324, 1997）を交配してターゲットアレルからNeo遺伝子を欠失させ、Neo遺伝子を有さないLysM/DTRマウスを得た。しかしながら、Neo欠失はDTRの発現レベルにもマクロファージにおけるDTに対する感受性にもほとんど影響を与えなかった。従って、Neo遺伝子を有するLysM/DTRマウスをさらなる実験に用いることにした。
【００３２】
(実施例２） LysM/DTR マウス由来のマクロファージの分析
LysM/DTR から得たマクロファージがDTRを発現するか、またDTに感受性であるかどうかを調べた。
【００３３】
WTマウス及びLysM/DTRマウスから得たチオグリコレート−誘導腹腔マクロファージをAlexa488-標識抗-DTR抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。
【００３４】
図３に示すように、ヒトDTRは、LysM/DTRマウスから得たチオグリコレート−誘発マクロファージ上に発現した。
【００３５】
次に、WTマウス及びLysM/DTRマウスから得たチオグリコレート−誘発マクロファージを一晩培養し、種々の濃度（0.00001〜1000 ng/ml)のDTを添加した。20時間後、細胞生存性をWST-8試薬によって測定した。
【００３６】
図４に示すように、LysM/DTRマウスから得たチオグリコレート−誘発マクロファージをDTで処理すると、細胞は用量依存的に死滅した。一方、野生型マウスから得たマクロファージはDTに対して完全に耐性であった。これらの結果は、ノックインマウスから得たマクロファージはその細胞表面上に機能的DTRを発現することを示す。
【００３７】
(実施例３） LysM/DTR マウスへのDT 投与の影響
LysM/DTR マウスへのDT投与の影響を調べた。種々の量（40, 10, 2.5, 0.625μg/kg）のDTをLysM/DTR マウス（各群６匹）の腹腔内に投与したところ、高用量のDT投与によってマウスが死亡することがわかった (図５)。40μg/kgのDTをトランスジェニックマウスに投与したとき、全てのマウスは低運動性、猫背、及び乱れた毛並みを示し、96時間内に死亡した。10μg/kgのDTを投与した場合、マウスはかなり衰弱し、半分のマウスが投与後１週間以内に死亡した。一方、WTマウスのいずれもが40μg/kg DT投与でも死亡しなかった。
【００３８】
（実施例４） LysM/DTR マウスの肺の分析
(1) 解剖学的・組織学的分析
WTマウス及びLysM/DTRマウスに40μg/kgのDTを投与した。マウスはDT投与24時間又は48時間後に犠牲にした。
【００３９】
肺を4% PFA のPBS溶液中に固定化し、濃度段階をつけたエタノールシリーズで脱水し、キシレンで清浄し、パラフィンに包埋した。5μmの肺切片をMAS-コートスライドに載せ、ヘマトキシリン・エオジン(HE)で染色した。
【００４０】
解剖所見では、肺に重篤な鬱血(congestion)が見られた（図６Ａ)。肺の組織学的分析では、肺胞壁が厚くなり、肺胞空間が減少していた（図６Ｂ)。さらに、赤血球は間質間充織(interstitial mesenchyme) において顕著に広がっており、肺に重篤な鬱血があることを示した。また、心臓を含む他の器官を顕微鏡によって観察したが、弱い鬱血が見られた肝臓を除き他の器官ではなんらの異常も示さなかった。これらの結果から、LysM/DTRマウスではDT投与によって肺が主に損傷されることが示された。
【００４１】
(2) アポトーシス分析
DTは受容体を通して細胞内に集積し、延長因子1のADPリボシル化によってアポトーシスを引き起こす（Van Ness BG, Howard JB, Bodley JW, ADP-ribosylation of elongation factor 2 by diphtheria toxin. Isolation and properties of the novel ribosyl-amino acid and its hydrolysis products, J. Biol. Chem., 255, 10717-10720, 1980)。
【００４２】
アポトーシス細胞を検出するために、Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit (Chemicon, Temecula, CA)を用い、肺切片に対してTUNEL染色を行った。
【００４３】
DT投与したWT マウスでは、TUNEL-陽性細胞は肺において全く観察されなかった(図６Ｃ)。一方、多数の細胞が、DT 投与24時間後のLysM/DTRマウスの肺においてTUNEL 陽性となった。TUNEL陽性細胞は肺胞空間の内側同様、肺胞上皮層に位置しており、これは幾つかの上皮細胞もまたDTによるアポトーシスを受けたことを示すものである。DTを投与したLysM/DTRマウスにおいて肺以外の組織の切片を用いて同様にTUNEL 染色を行ったが、TUNEL陽性細胞は、心筋細胞にはなく、肝細胞にも認められなかった。
【００４４】
(実施例５） LysM/DTR マウスの各器官における遺伝子発現解析
上記実施例４のDTを投与したLysM/DTR マウスの組織学的試験から、DTR遺伝子が肺のある細胞内で発現し、そしてその細胞がDT投与によって死滅した結果、呼吸不全を引き起こすことが強く示唆された。そこで、ノーザンブロット分析によってLysM/DTRマウスにおけるヒトDTR遺伝子とマウスlysM遺伝子の発現レベルを調べた。
【００４５】
各器官（リンパ節、脾臓、胸腺、肺、肝臓、腎臓、胃、小腸、結腸、精巣）から、10μgの全RNAを製造業者の指示(Qiagen, Hilden, Germany)に従い、RNeasy Kit を用いて単離した。単離した全RNA10μgをホルムアルデヒド-アガロースゲル電気泳動によって分離し、Biodyne A (PALL, East Hills, NY)に移した。ノーザンブロット分析をマウスlysozyme M 及びヒトDTR に対するDIG-標識cDNA プローブを用い、推奨されるプロトコル（DIG System User's Guide for Filter Hybridization; Roche, Indiananpolis, IN)に従って行った。
【００４６】
大量のマクロファージが存在しているリンパ節や脾臓などのようなリンパ系器官は、検出可能なlysozyme M mRNA レベルを示した(図７)。lysM 遺伝子はまた小腸において検出されるが、これはパネート(Paneth)細胞において特異的に発現し、lysM 遺伝子と高度な相同性を有するlysozyme P 遺伝子を検出している可能性がある。lysozyme M mRNAの発現はまた肺において検出され、その発現レベルは、リンパ節及び脾臓よりも高かった。lysM遺伝子の発現レベルに一致して、LysM/DTRマウスにおける外来性ヒトDTR遺伝子発現が肺組織で強く検出された。
【００４７】
(実施例６） LysM/DTR マウスの肺胞に対する免疫組織化学分析
肺においては、肺胞マクロファージ（AMΦ）とII型肺胞上皮細胞 (AEC II)の両方がlysM 遺伝子を発現すると報告されている(Singh G, Katyal SL, Brown WE, Collins DL, Mason RJ, Pulmonary lysozyme--a secretory protein of type II pneumocytes in the rat, Am. Rev. Respir. Dis., 138, 1261-1267, 1988）。よって、LysM/DTR マウスのAMΦとAEC II はヒトDTRを発現し、DT投与によって死滅することが予想された。これらの推測を評価するために、AMΦとAEC IIに対して免疫組織化学分析を以下のようにして行った。
【００４８】
WTマウス及びLysM/DTRマウスに40μg/kgのDTを腹腔内投与した。DT投与48時間後に得られた肺を用い、AMΦ、AECI、AECIIに対する特異的マーカーであるF4/80(A)、caveolin-1(B)、及びTTF-1(C)でそれぞれ免疫染色した。
【００４９】
caveolin-1 及び TTF-1染色は次のようにして行った。マウスから得られた肺を4％ホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋した後、パラフィン切片をキシレン中で脱パラフィンし、濃度段階をつけたエタノールによって再水和化し、そして、スライドを抗原賦活化のためにオートクレーブにかけた。切片を3％過酸化水素のPBS溶液で急冷し、1.5％正常ヤギ血清及び2％block Ace (Snow Bland, Tokyo, Japan)にてブロッキングした。続いてスライドを抗-caveolin-1 Ab (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) 及び抗-TTF-1 Ab (Chemicon)で室温にて1時間免疫染色した。切片を洗浄し、ホースラディッシュパーオキダーゼ標識二次抗体と室温にて１時間インキュベートした。シグナルをLiquid DAB Substrate Kit (Zymed, San Francisco, CA)にて検出した。
【００５０】
一方、F4/80 染色は次のようにして行った。マウスの肺をTissue-Tek OCT (Miles Lab., Elkhart, IN)に包埋した。4μmの切片をAPS-コートスライドに載せた。切片をアセトンにて固定し、1.5％正常ヤギ血清及び2％block Ace (同上）にてブロッキングした。続いてスライドをビオチン化抗-F4/80 Ab (CALTAG Lab., Burlingame, CA)で室温にて１時間免疫染色した。以下のステップはパラフィン切片と同様にして行った。
【００５１】
LysM/DTR ではWTマウスに比べてAMΦもAEC IIもDT投与によって顕著に減少したが（図８Ａ、Ｃ）、lysM 遺伝子を発現しないAEC Iは影響を受けなかった（図８Ｂ）。
【００５２】
TTF-1 はまたクララ細胞においても発現したが (図８Ｃ：WTマウス 及びLysM/DTRマウスの上左領域）、クララ細胞ではDT 投与による影響は無視できるほどしか観察されなかった。これらの結果は、LysM/DTRマウスでは、AMΦ及びAEC IIがDT投与によって除去されることを示した。
【００５３】
(実施例７） LysM/DTR マウスにおける肺サーファクタントタンパクの分析
AEC II の重要な役割は、肺胞の表面張力を減少させることによって肺胞空間を安定させる機能を有する肺サーファクタントタンパク（SPs)の合成と分泌である。AEC IIの除去は肺胞空間のSPsの減少を引き起こすことが予想された。そこで、気管支肺胞洗浄（BAL)液中のSPsへのDT投与の影響を分析した。
【００５４】
(1) ウェスタンブロット分析
WTマウス及びLysM/DTRマウスにDTを投与し、DT投与24時間又は48時間後、各マウスにおいて、気管支肺胞洗浄（BAL)を700μlのPBSで2回実施した。細胞成分を遠心分離（200 g, 10分）によって除去した。SPB 分析のために、大凝集体をBAL試料から遠心分離（20,000 g, 60分）によって分離し、ペレットをPBSに再懸濁した。
【００５５】
BAL試料と大凝集体を15% ポリアクリルアミドゲル上でエレクトロポレーションし、Immobilon-P membrane (Millipore, Marlborough, MA)に移した。膜を抗-SP-A, B，及びD Abs (Chemicon)とのインキュベーション前に5% スキムミルクのTBS-T溶液中でブロッキングした。洗浄後、膜をホースラディッシュパーオキシダーゼ二次抗体とインキュベートした。シグナルをSuperSignal West Pico Substrate (Pierce, Rockford, IL)を用いて検出した。
【００５６】
LysM/DTRマウスではDT-投与によってSP-Dの量は変化しなかったが、SP-A及びSP-Bは顕著に減少した（図９Ａ）。
【００５７】
(2) 免疫組織化学分析
DT投与したWTマウス及びLysM/DTRマウスから得た肺凍結切片における肺サーファクタントタンパク（SP-A, B, D）に対する免疫組織化学分析を行った。
【００５８】
肺をTissue-Tek OCT (Miles Lab., Elkhart, IN)に包埋し、4μmの切片をAPS-コートスライドに載せた。切片をアセトンにて固定し、1.5％正常ヤギ血清及び2％block Ace (同上）にてブロッキングした。続いてスライド抗-SP-A, B，及び D Abs (Chemicon)で4℃にて一晩免疫染色した。切片を洗浄し、ホースラディッシュパーオキダーゼ標識二次抗体と室温にて１時間インキュベートした。シグナルをLiquid DAB Substrate Kit (Zymed, San Francisco, CA)にて検出した。
【００５９】
LysM/DTRマウスでは、WTマウスで見られる濃い茶色のシグナルが見られず、肺サーファクタントタンパクの産生がないことが確認された（図９Ｂ）。
【００６０】
以上の結果から、LysM/DTRマウスではDT投与によってII型肺胞上皮細胞にアポトーシスが誘導され、該細胞の消失に伴って、肺サーファクタントタンパク量が減少することがわかった。SP-Bは、肺機能と生存に絶対的に必要な肺サーファクタントタンパクであり(Weaver TE, Conkright JJ, Function of surfactant proteins B and C, Annu. Rev. Physiol., 63, 555-578, 2001）、また、マウスにおけるSP-Bの不存在は誕生時において重篤な新生児呼吸窮迫を引き起こし、その後、進行的な呼吸不全となり、死に至ることが報告されている(Clark JC, Wert SE, Bachurski CJ, Stahlman MT, Stripp BR, Weaver TE, Whitsett JA, Targeted disruption of the surfactant protein B gene disrupts surfactant homeostasis, causing respiratory failure in newborn mice, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 92, 7794-7798, 1995）。従って、上記のLysM/DTRマウスへのDT投与による肺サーファクタントタンパク量の減少は呼吸不全に結びつくものであり、該マウスは肺サーファクタントタンパクの欠乏による呼吸不全疾患のモデルとして有効であるといえる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】LysM/DTRターゲティング構築物の模式図を示す。
【図２】野生型及びLysM/DTR ES細胞のEcoRI消化断片に対するゲノムサザンブロット分析を示す。
【図３】WTマウス及びLysM/DTRマウスから得たチオグリコレート−誘導腹腔マクロファージの抗DTR抗体を用いたフローサイトメトリーによる分析を示す。
【図４】WTマウス及びLysM/DTRマウスから得たチオグリコレート−誘導腹腔マクロファージのDT処理による細胞生存試験結果を示す。
【図５】DT投与後のLysM/DTRマウスの生存率を示す。
【図６】図６Ａは、DT投与後のWTマウス及びLysM/DTRマウスの肺の写真を示す。図６Ｂは、DT投与後のWTマウス及びLysM/DTRマウスの肺切片のヘマトキシリン・エオジン（HE）染色像を示す。図６Ｃは、DT投与後のWTマウス及びLysM/DTRマウスの肺切片のTUNEL染色像を示す。図６Ｃにおいて赤い矢印はTUNEL陽性細胞を示す（スケールバー：100μm)。
【図７】LysM/DTRマウスの各器官（リンパ節、脾臓、胸腺、肺、肝臓、腎臓、胃、小腸、結腸、精巣）におけるヒトDTRとマウスlysMのノーザンブロット分析を示す。下のパネルは、フィルターをメチレンブルーで染色した結果を示す。
【図８】WTマウス及びLysM/DTRマウスの肺胞マクロファージ（AMΦ）及び肺胞上皮細胞（AEC)に対するDT投与の影響を、AMΦ、AECI、AECIIに対する特異的マーカーであるAMF4/80(A)、caveolin-1(B)、及びTTF-1(C)をマーカーとした免疫染色によって調べた結果を示す（スケールバー：200μm)。
【図９】図９Ａは、WTマウス及びLysM/DTRマウスから得たBALにおける肺サーファクタントタンパクのイムノブロット分析を示す。図９Ｂは、WTマウス（a,c,e)及びLysM/DTRマウス（b,d,f)から得た肺凍結切片における肺サーファクタントタンパクの免疫組織化学分析を示す（スケールバー：200μm)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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