(57)【要約】【課題】反応結果のばらつきを軽減する事ができるマイクロチップ及び化学反応検出システムを提供すること。【解決手段】化学反応又は生化学反応を目的とした反応部、幅が１μｍ〜１ｃｍの流路、前記流路に流体を導入可能な導入孔、及び前記流路から流体を排出可能な排出孔を有するマイクロチップであって、更に前記反応に使用する試薬を蓄えるためのリザーバー部を同一チップ内に有し、導入孔、リザーバー部、反応部がこの順に配置され、かつ前記流路によって導通していることを特徴とするマイクロチップ。【選択図】  図１
2007292527.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幅が１μｍ〜１ｃｍの流路、前記流路に流体を導入可能な導入孔、及び前記流路から流体を排出可能な排出孔とを有するマイクロチップであって、更に化学反応又は生化学反応に使用する試薬を蓄えるためのリザーバー部を同一チップ内に有し、かつ前記流路によって導通していることを特徴とするマイクロチップ。
【請求項２】
化学反応又は生化学反応を目的とした反応部、幅が１μｍ〜１ｃｍの流路、前記流路に流体を導入可能な導入孔、及び前記流路から流体を排出可能な排出孔を有するマイクロチップであって、更に前記反応に使用する試薬を蓄えるためのリザーバー部を同一チップ内に有し、導入孔、リザーバー部、反応部がこの順に配置され、かつ前記流路によって導通していることを特徴とするマイクロチップ。
【請求項３】
前記リザーバー部と前記反応部との間に更に流体の流量の調節又は流体の送液／停止を切り替えることができるバルブを有する請求項２記載のマイクロチップ。
【請求項４】
前記流路が分岐部がないものであり、前記流路内にリザーバー部及び反応部が形成されている請求項２又は３記載のマイクロチップ。
【請求項５】
請求項１記載のマイクロチップと、化学反応又は生化学反応を目的とした反応部、幅が１μｍ〜１ｃｍの流路、前記流路に流体を導入可能な導入孔、及び前記流路から流体を排出可能な排出孔を有する第２のマイクロチップとを導通手段により連結して構成される化学反応検出システム。
【請求項６】
請求項１〜４いずれか記載のマイクロチップに化学反応又は生化学反応に使用する試薬を導入し、使用するまでは凍結保存し、使用直前に解凍する事によって化学反応又は生化学反応を行う事を特徴とする化学反応検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機化合物、生体試料などの微量試料を混合、反応、合成、抽出、分離する事を目的としたマイクロチップであってそれら操作結果を検出する事が可能な化学反応検出システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
有機化学、生化学分野において混合、反応、合成、抽出、分離、分析について高速化、微少試料、微小空間での操作が注目されており、その技術を確立するためにマイクロチップの研究が精力的に進められている。
一般的にマイクロチップ は、微細な流路をもったガラス基板と試料を導入及び排出する孔をもったガラス基板の２枚が接合されたものである。
【０００３】
マイクロチップ内で前述した混合、反応、合成、抽出、分離（以後、これら５工程を反応と略す）が行われた後、それらによって得られた生成物について該マイクロチップ内で分析・検出（以後、これら２工程を検出と略す）を行う。  前述の反応・検出を行う際、一般的に反応に必要な試薬を順に送液する。マイクロチップ外に試薬を貯蔵するリザーバーを設け試薬をポンプを用いて送液する。試薬を別の試薬へ変更する度にポンプの入れ替えや流路の洗浄工程が必要になる。また、操作の際に気泡や不純物が混入しやすく反応結果のばらつきの原因となる。
この課題の対策としてリザーバーを１枚のマイクロチップ内に封入する方法があるが、試薬を入れ替える際に流路の分岐の部分に先に送液した試薬が残留し反応結果のばらつきの原因となる。
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−４６２８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、操作の際に気泡や不純物の混入を防ぎ、反応結果のばらつきを軽減する事ができるマイクロチップ及び化学反応検出システムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下の通りである。
（１）幅が１μｍ〜１ｃｍの流路、前記流路に流体を導入可能な導入孔、及び前記流路から流体を排出可能な排出孔とを有するマイクロチップであって、更に化学反応又は生化学反応に使用する試薬を蓄えるためのリザーバー部を同一チップ内に有し、かつ前記流路によって導通していることを特徴とするマイクロチップ。
（２）化学反応又は生化学反応を目的とした反応部、幅が１μｍ〜１ｃｍの流路、前記流路に流体を導入可能な導入孔、及び前記流路から流体を排出可能な排出孔を有するマイクロチップであって、更に前記反応に使用する試薬を蓄えるためのリザーバー部を同一チップ内に有し、導入孔、リザーバー部、反応部がこの順に配置され、かつ前記流路によって導通していることを特徴とするマイクロチップ。
（３）前記リザーバー部と前記反応部との間に更に流体の流量の調節又は流体の送液／停止を切り替えることができるバルブを有する（２）記載のマイクロチップ。
（４）前記流路が分岐部がないものであり、前記流路内にリザーバー部及び反応部が形成されている（２）又は（３）記載のマイクロチップ。
（５）（１）記載のマイクロチップと、化学反応又は生化学反応を目的とした反応部、幅が１μｍ〜１ｃｍの流路、前記流路に流体を導入可能な導入孔、及び前記流路から流体を排出可能な排出孔を有する第２のマイクロチップとを導通手段により連結して構成される化学反応検出システム。
（６）（１）〜（４）いずれか記載のマイクロチップに化学反応又は生化学反応に使用する試薬を導入し、使用するまでは凍結保存し、使用直前に解凍する事によって化学反応又は生化学反応を行う事を特徴とする化学反応検出方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明に従うと、前述の反応・検出を行う際、試薬を別の試薬へ変更する度にポンプの入れ替えや流路の洗浄工程が不要になる為、操作の際に気泡や不純物の混入を防ぐことができ反応結果のばらつきを軽減する事ができる。
また、導入孔、流路、リザーバー部、流路、反応部が順に並んでおり流路の分岐がない為、分岐点における試薬の残留を防ぐ事ができ、反応結果のばらつきを軽減する事ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明のマイクロチップの一実施態様を図１に示す。図１は、導入孔２、リザーバー部３、５、７、バルブ４１、４２、４３、反応部８が順に形成され、微細な流路により分岐部がなく導通されているマイクロチップである。
【０００９】
本発明のマイクロチップに使用する素材はガラス又はプラスチックが好ましい。
【００１０】
本発明のリザーバー部は、化学反応又は生化学反応に使用する試薬を蓄えるためのチップ内に形成される部位である。リザーバー部の形状は流路同様に溝形状でも構わないし円柱状、半球上でも差し支えない。抗原抗体反応に使用する場合の試薬は、標識抗体溶液、抗原溶液、及び洗浄剤等である。
【００１１】
リザーバー部と反応部が同一チップ内に形成されている場合、リザーバー部と反応部との間に更に流体の流量の調節又は流体の送液／停止を切り替えることができるバルブを有することが好ましい。
【００１２】
バルブは小型化を考慮するとダイヤフラム式バルブ、電磁バルブ、又は手動式回転バルブが好ましい。特に簡便なものとして、シリコンゴム等の素材で形成された３方弁を有する３方弁バルブが挙げられる。
【００１３】
反応部の一例としては、図２に示すように、流路の底面１１から流路の上面１０に向かって突起部からなるダム部９を形成し、抗体が固定化されたマイクロビーズ８を流路内に固定化したものが挙げられる。
【００１４】
本発明のマイクロチップの他の実施態様としては、図１に示すマイクロチップにおいて、導入孔２、リザーバー部３、５、７、バルブ４１、４２、４３が順に形成され、微細な流路により分岐部がなく導通されているマイクロチップで、反応部がない形態である。
この第１のマイクロチップと、反応部を有する第２のマイクロチップとを導通手段により連結して化学反応検出システムが得られる。
【００１５】
本発明のマイクロチップの導入孔からポンプを用いて送液する際に使用するチューブ、あるいはマイクロチップを連結するのに使用するチューブやジョイントの素材は、反応物の付着が少ないテフロン（登録商標）、ポリプロピレン、ＰＥＥＫ（＝ポリエーテルエーテルケトン）などが好ましい。
【００１６】
本発明において、化学反応を検出する検出部を、反応部を有するマイクロチップと同じチップ上に設けても良い。又は反応部を有するマイクロチップと、検出部を有する別の検出用マイクロチップとを連結する方法もある。検出機としては熱レンズ検出器（以下、ＴＬＭと略す。）のような流体を正確に測定できるようなものが好ましい。
【００１７】
本発明の化学検出方法について、抗原抗体反応の場合の例を以下に示す。図１に示すマイクロチップのリザーバー部に標識抗体溶液、抗原溶液、及び洗浄剤充填し、各バルブを解放する事により反応を開始させる。又は、図１に示すマイクロチップのリザーバー部に標識抗体溶液、及び洗浄剤充填し、この状態でマイクロチップを凍結保存する。こうすることによって、リザーバー内の試薬の蒸発や流路内への気泡の混入を防止することができる。使用時に、マイクロチップを解凍し、抗原リザーバー部に抗原溶液を充填し各バルブを解放する事により反応を開始させる。
【実施例】
【００１８】
《実施例》
図１のように導入孔２、標識抗体溶液リザーバー３、バルブ４１、洗浄剤リザーバー５、バルブ４２、抗原溶液リザーバー７、バルブ４３、反応部８がこの順に並んだ微細な流路を有し且つ、流路内にダム９を有するマイクロチップ１を用意した。マイクロチップの素材は、環状オレフィン樹脂であり、寸法は７０ｍｍ×３０ｍｍ×０．７５ｍｍである。流路の幅は０．５ｍｍ、深さは０．５ｍｍである。バルブはシリコンゴム製の３方弁を用いた。
次いで、抗CEA（＝CARCINOEMBRYONIC ANTIGEN） 抗体をポリスチレン製のマイクロビーズに固相化し、１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝液で抗ＣＥＡ抗体により被覆されていないマイクロビーズ表面を被覆した。該マイクロビーズをマイクロチップに導入し流路内の反応部８に固定した。所定のリザーバーにCEA抗原溶液、洗浄剤(リン酸緩衝液)、ペルオキシダーゼ標識抗体溶液を封入した。その後、導入孔２より洗浄剤を２μL/分の速度で導入して、マイクロビーズに固相化された抗CEA抗体を、ＣＥＡ抗原、ペルオキシダーゼ標識抗ＣＥＡ抗体と順に反応させた。
最後に3,3',5,5'-TetramethylbenzidineとＨ2Ｏ2の混合溶液を基質として導入し酵素反応を実施した。該酵素反応により発色した基質を検出用マイクロチップ上でＴＬＭ(励起波長=６５０ｎｍ)を用いて発色量を計測した。各抗原濃度につきｎ＝５で測定しそれらの平均値及びばらつきを示す指標であるＣＶ値(=標準偏差/平均値×１００)を計算した。
【００１９】
《比較例》
図３のように導入孔２、反応部８、排出孔６が順に並んだ微細な流路を有し且つ、流路内にダム９を有するマイクロチップ１を用意した。マイクロチップの素材は、環状オレフィン樹脂であり、寸法は７０ｍｍ×３０ｍｍ×０．７５ｍｍである。流路の幅は０．５ｍｍ、深さは０．５ｍｍである。
次いで、抗CEA（＝CARCINOEMBRYONIC ANTIGEN） 抗体をポリスチレン製のマイクロビーズに固相化し、１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝液で抗ＣＥＡ抗体により被覆されていないマイクロビーズ表面を被覆した。該マイクロビーズをマイクロチップに導入し流路内の反応部８に固定した。
CEA抗原、洗浄剤(リン酸緩衝液)、ペルオキシダーゼ標識抗体の各試薬を別々のマイクロシリンジに入れそれぞれ順に導入孔２よりマイクロチップへ導入し、実施例と同様の反応を行った。
最後に3,3',5,5'-TetramethylbenzidineとＨ2Ｏ2の混合溶液を基質として導入し酵素反応を実施した。該酵素反応により発色した基質を検出用マイクロチップ上でＴＬＭ(励起波長=６５０ｎｍ)を用いて発色量を計測した。各抗原濃度につきｎ＝５で測定しそれらの平均値及びばらつきを示す指標であるＣＶ値(=標準偏差/平均値×１００)を計算した。
【００２０】
実施例及び比較例の抗原濃度に応じた発色量（＝ＴＬＭシグナル）を計測した結果を表１に示した。実施例、比較例ともにほぼ同等なTLMシグナル（平均値）を示したがＣＶ値は実施例の方が１／３に低減した。
【００２１】
【表１】
2007292527.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施例で使用したマイクロチップ
【図２】流路内の反応部のダム部（断面図）
【図３】比較例で使用したマイクロチップ
【符号の説明】
【００２３】
１  マイクロチップ
２  導入孔
３．標識抗体溶液のリザーバー
４１、４２、４３  流路切換バルブ
５  洗浄剤リザーバー
６  排出孔
７  抗原溶液リザーバー
８  反応部（抗体が固定化されたマイクロビーズ）
９  ダム
【図１】
2007292527.tif 000004
【図２】
2007292527.tif 000005
【図３】
2007292527.tif 000006