(57)【要約】【課題】  皮膚を保護する新規で安全な皮膚外用組成物を提供する。【解決手段】  羅漢果抽出物にソホロリピッドを配合することにより、線維芽細胞賦活効果、コラーゲン合成促進効果、肌荒れ改善効果および紫外線に対する皮膚保護効果を著しく増強することが可能となった。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
羅漢果抽出物およびソホロリピッドを含有する皮膚外用組成物。
【請求項２】
線維芽細胞賦活効果を有する請求項１の皮膚外用組成物。
【請求項３】
コラーゲン合成促進効果を有する請求項１の皮膚外用組成物。
【請求項４】
肌荒れ改善効果を有する請求項１の皮膚外用組成物。
【請求項５】
紫外線に対する皮膚保護効果を有する請求項１の皮膚外用組成物。
【請求項６】
羅漢果抽出物を０．０１重量％〜１０重量％およびソホロリピッドを０．００１％〜５．０重量％含む、請求項１の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、羅漢果抽出物およびソホロリピッドを含有する線維芽細胞賦活効果、コラーゲン合成促進効果、肌荒れ改善効果および紫外線に対する皮膚保護効果を有する皮膚外用組成物を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】  洗剤中の界面活性剤や紫外線等の外来ストレスまたは加齢によって表皮ターンオーバーの異常や真皮の線維芽細胞の機能低下やマトリックス線維の減少または変性を生じ、シワの発生および皮膚弾性の低下などの皮膚老化現象をもたらす（非特許文献１、非特許文献２参照）。従って、皮膚の老化防止、改善作用を有する皮膚外用剤には、線維芽細胞の賦活作用あるいはマトワックス線維であるコラーゲンの合成促進作用を有する肌荒れ改善成分や、紫外線障害から皮膚を保護する成分が配合されていることが有用とされている（非特許文献３参照）。【０００３】  例えば、線維芽細胞賦活化剤として、アブラナ科ブラシカ属の抽出物（特許文献１参照）、ショウガ科ウコン属植物の抽出物（特許文献２参照）；コラーゲン合成促進剤として、Ｌ−アスコルビン酸およびその誘導体（特許文献３参照）、グリコサミンおよびその誘導体（特許文献４参照）；過酸化脂質や紫外線に対する細胞毒性抑制剤として、セイヨウスノキ抽出物（特許文献５参照）、ダイオウ抽出物（特許文献６参照）、グラブリジン（特許文献７参照）、セリシン（特許文献８参照）などが開示されている。また、紫外線の影響を抑制するために、酸化チタンや酸化亜鉛などの紫外線遮蔽剤や有機紫外線吸収剤を含んだサンスクリーン剤などが用いられてきた（非特許文献４、非特許文献５参照）。【０００４】  しかしながら，上記開示されている成分の中には、作用が弱く、または、有効な効果を得るためにかなりの量を含有させなければならなかったり、中には、安定性が悪いものも存在するなどの問題点が多い。さらに、酸化チタンや酸化亜鉛などの紫外線遮蔽剤や有機紫外線吸収剤を含むサンスクリーン剤は、紫外線により二次的に活性酸素を発生させたり、紫外線吸収剤自体に皮膚刺激性があるなどの問題があることから、安全で、効果の高い皮膚外用剤の開発が望まれている。【０００５】  一方、羅漢果抽出物については、皮膚外用剤への配合例として、皮脂の酸化を防ぎ、皮膚炎等の皮膚疾患を防ぐ化粧料があるが（特許文献９参照）、皮脂の抗酸化により皮膚を守る効果が実証されていない。羅漢果抽出物が紫外線吸収剤の効果を高めることも知られているが（特許文献１０参照）、紫外線による皮膚ダメージに対する保護効果は、配合されている紫外線吸収剤の効果である。また、羅漢果抽出物を含有するストレスによる肌荒れ予防改善も提案されているが（特許文献１１参照）、単独では効果が低い。このように、前記記載の先行技術にある羅漢果抽出物は、それ自身で紫外線保護効果や肌荒れ改善効果があるものの、その効果は低く、あくまで補助的な成分に過ぎない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  本発明者らは、羅漢果抽出物の薬理作用を調べたところ、これらの先行技術以外に、細胞賦活作用、コラーゲン合成促進作用を有することを初めて見出した。しかし、単独ではその作用は弱く、羅漢果抽出物を有効成分とする皮膚保護剤とするには、何らかの成分を加え、作用を増強させる必要がある。そこで、羅漢果抽出物の効果を増強させる物質について鋭意検索したところ、バイオサーファクタントの一種であるソホロリピッドが羅漢果の線維芽細胞賦活作用、コラーゲン合成促進作用、紫外線保護効果を著しく増強し、肌荒れ改善効果を発揮することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】  すなわち、本発明は、羅漢果抽出物およびソホロリピッドを含有する皮膚外用組成物に関するものである。
【発明の効果】
【０００８】  以上記載のごとく、本発明は、線維芽細胞賦活作用、コラーゲン合成作用を有し、肌荒れ改善効果および紫外線保護効果を著しく発揮する皮膚外用組成物を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】  羅漢果は、中国広西省の桂林周辺で育つ、ウリ科、ツルレイシ属の植物の果実である。学名はＳｉｒａｉｔｉａ  ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉ  Ｓｗｉｎｇｌｅという。本発明において羅漢果抽出物を得る方法としては、水蒸気蒸留法、圧搾法、アルコール等の溶剤による溶剤抽出法、超臨界抽出法等が挙げられる。例えば、好適な羅漢果抽出物として、熱水抽出物があげられ、６０〜１００℃、好ましくは８０〜１００℃、より好ましくは９０〜１００℃の温度の加温水で抽出し、濃縮したものである。この水としては、水道水、イオン交換水、蒸留水等が挙げられ、好ましくは、イオン交換水または蒸留水が用いられる。【００１０】  ソホロリピッドは、Ｇｏｒｉｎらによって１９６１年に発見された糖脂質型バイオサーファクタントである（非特許文献６）。構造の詳細について特許文献１２を参照する。ソホロリピッドは、微生物の培養によって得られ、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ、Ｃ．ａｐｉｃｏｌａ、Ｃ．ｐｅｔｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃ．ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓなどのＣａｎｄｉｄａ．属の酵母を、高濃度の糖と油性基質を同時に与えて培養すると培地中に多量に蓄積される。上記微生物の培養液から、遠心分離、デカンテーション、酢酸エチル抽出などの方法で分離後、ヘキサンで洗浄することにより、茶褐色、粘性のある液体として得られる。上記の培養および回収法に限らず、当該分野で公知の任意の培養および回収方法を用いてソホロリピッドを得ることができる。一般に、ソホロリピッドは、ラクトン環をもつ分子（ラクトン型）と、これが開環した分子（酸型）との混合物の形態で存在するとされている。ラクトン型と酸型の比率が、１０：９０〜１００：０であり、好ましくは６０：４０〜１００：０であり、より好ましくは９０：１０〜１００：０である。【００１１】
【非特許文献１】正木  仁、フレグランスジャーナル、２６（４）、１８−２６（１９９８）
【非特許文献２】段野  貴一郎、フレグランスジャーナル、２６（４）、１１−１７（１９９８）
【非特許文献３】田中  浩、フレグランスジャーナル、２６（４）、４３−４７（１９９８）
【非特許文献４】Ｓｈａａｔｈ，Ｎ．Ａ．、Ｃｏｓｍｅｔ．Ｔｏｉｌｅｔ．、１０１（３）、５５−７０（１９８６）
【非特許文献５】黒沢  卓文、フレグランスジャーナル、２９（５）、１４−１９（１９９９）
【非特許文献６】Ｇｏｒｉｎ、Ｃａｎ．Ｊ  Ｃｈｅｍ．、３９、８４６（１９６１）
【特許文献１】特開２００３−２３８４２９
【特許文献２】特開２００４−７５６３２
【特許文献３】特開２０００−１５９６５６
【特許文献４】特開２００４−８３４３４
【特許文献５】特開２００２−６８９５３
【特許文献６】特開２０００−２８１５２８
【特許文献７】特開２００４−２５０３６８
【特許文献８】特開２００３−２５２７４４
【特許文献９】特開平１０−１３０１３７号
【特許文献１０】特開平１０−１８２４０６号
【特許文献１１】特開平２００１−３２２９３９号
【特許文献１２】特開２００３−１３０９３
【００１２】  本発明において、剤型は例えば、ローション類、乳液類、クリーム類、パック類、ゲル等があり、皮膚外用剤として使用することができる。尚、本発明の製剤には羅漢果抽出物およびソホロリピッドの他に保湿剤、防腐剤、界面活性剤、増粘剤、油剤、溶剤、香料、ｐＨ調整剤等を本発明の目的を達成する範囲内で適宜配合することができる。【００１３】  羅漢果抽出物の配合量としては化粧品や皮膚外用剤の全成分組成物中、０．０１〜１０重量％であり、より好ましくは、０．０２５〜５重量％である。この範囲であれば、羅漢果抽出物の肌荒れ改善効果および紫外線保護効果がある。一方、ソホロリピッドの配合量として全成分組成物中０．００１％〜５．０重量％であり、より好ましくは、０．０１〜１重量％である。この範囲であれば、ソホロリピッドが羅漢果抽出物の肌荒れ改善効果および紫外線保護効果を著しく高めることができ、安全な皮膚外用組成物として利用できる。【００１４】  以下、実施例に基づいて本発明を詳説する。また、用いた試験方法については以下に示す。【００１５】  （羅漢果抽出物の製造例）羅漢果の乾燥物１００ｋｇに常水８０Ｌを加え、１００℃で１時間煎出したのち、ろ過する。減圧濃縮し、約５０重量％の抽出物を得る。【００１６】  （ソホロリピッドの製造例）詳細について特許文献２を参照する。グルコース１００ｇ、コーン油１００ｇ、塩化アンモニウム３ｇ、リン酸水素カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム５ｇ、酵母エキス５ｇに全量１Ｌになるように水を加え、２Ｌ容量の発酵槽に入れ、発酵液とする。この発酵液に、同上の組成をもつ培地で３０℃、４８時間回転振動培養して得たＣａｎｄｉｄａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａＡＴＣＣ  ２２２１４株の菌体液（５０ｍＬ）を接種し、温度３０℃、攪拌数５００ｒｐｍ、通気量１Ｌ／ｍｉｎの条件下で発酵を開始する。培養開始７日目後に発酵を停止させ、発酵槽から取り出した培養液を遠心分離し、培養液と菌体とを分離させる。培養液を２倍容の酢酸エチルと分液ロート中で混合し、ソホロリピッドの抽出を行う。抽出後、ヘキサンで洗浄し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、精製を行う。最終的に、ソホロリピッドを約１８ｇ得る。
【実施例１】
【００１７】表１の組成物１〜４を作製し、線維芽細胞賦活作用およびコラーゲン合成促進作用を調べた。【００１８】
【表１】
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【００１９】  ＜線維芽細胞賦活試験＞正常ヒト線維芽細胞を９６ウエルプレートに２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で播種し、５％ＦＢＳ（大日本製薬）入りのＤＭＥＭ（日水製薬）で２４ｈｒ培養した。組成物１〜４を１００倍希釈となるように添加した１％ＦＢＳ入り培地に交換し、４８ｈｒ後、１ｍｇ／ｍＬＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）２，５−ジフェニルテトラゾリンブロマイド］入り培地に交換した。３ｈｒ処理し、イソプロパノールで色素であるホルマザンを抽出し５７０ｎｍの吸光度を測定した。細胞賦活率は式１で求めた。
【式１】
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【００２０】  試験物質無添加（組成物１）と比較すると、羅漢果抽出物の添加（組成物３）によって正常ヒト線維芽細胞において細胞賦活作用が認められた。また、羅漢果抽出物とソホロリピッドが共存する（組成物４）と細胞賦活効果が著しく高くなった（図１）。このように、ソホロリピッドは羅漢果抽出物の細胞賦活作用を相乗的に高める効果が認められた。一方、ソホロリピッド単独（組成物２）ではほとんど細胞賦活作用がなかった。
【００２１】  ＜コラーゲン合成促進試験＞正常ヒト繊維芽細胞を２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で３５ｍｍディッシュに播種し、１０％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ培地で２４ｈｒ培養する。組成物１〜４を１００倍希釈となるように添加した５％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ培地に交換後、６日間培養する。培養上清を取り、ＰＩＰ  ＥＩＡ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用いてコラーゲン量を測定し、式２でコラーゲン合成促進率を算出した。
【式２】
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【００２２】  試験物質無添加（組成物１）と比較すると、羅漢果抽出物の添加（組成物３）によってコラーゲン合成促進作用が認められた。また、羅漢果抽出物とソホロリピッドが共存する（組成物４）とコラーゲン合成促進効果が著しく高くなった（図２）。このように、ソホロリピッドと羅漢果抽出物の配合系において羅漢果抽出物のコラーゲン合成促進効果を相乗的に高める効果が認められた。なお、ソホロリピッド単独（組成物２）ではほとんどコラーゲン合成促進効果がなかった。
【実施例２】
【００２３】表２の組成物５〜７を作製し、肌荒れ改善効果および紫外線保護効果をさらに調べた。組成物５、６は比較例で、組成物７はこの発明の組成物である。【００２４】
【表２】
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【００２５】  ＜皮膚細胞賦活試験＞ヒトの表皮細胞および線維芽細胞から作製した３次元培養ヒトモデル皮膚を用いて、皮膚細胞賦活作用を評価した。３次元培養ヒトモデル皮膚の作製は、Ｅｕｎ  Ｋｙｕｎｇ  Ｙａｎｇ．、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｏｒｇａｎｓ、ＶｏＬ．２４、Ｎｏ．１、７−１７（２０００）の方法に従って行った。評価方法は以下に示す。組成物５、７をフィンチャンバーに接種し、３次元培養ヒトモデル皮膚の表皮側にのせ、２４ｈｒ培養する。フィンチャンバーを除き、３次元培養ヒトモデル皮膚をＰＢＳ（−）で洗浄後、２ｍｇ／ｍＬＭＴＴ入り培地に浸し２ｈｒ処理した。その後、３次元培養ヒトモデル皮膚を取り出し、０．０４Ｎ  ＨＣｌで酸性にしたイソプロパノールでホルマザンを抽出し５７０ｎｍの吸光度を測定した。式１で細胞賦活率を求めた。【００２６】  試験物質無添加（組成物１）と比較すると、羅漢果抽出物とソホロリピッド未配合のもの（組成物５）には全く細胞賦活作用がないのに対し、羅漢果抽出物とソホロリピッドの両方を配合したもの（組成物７）には高い細胞賦活効果が認められた（図３）。このように、本発明の組成物７を適用することにより、皮膚細胞賦活作用を著しく高める効果が認められた。【００２７】  ＜ＵＶＢ照射による皮膚ダメージの抑制試験＞３次元培養ヒトモデル皮膚を用いて、ＵＶＢ照射による皮膚細胞毒性に対する抑制効果を評価した。評価方法は以下に示す。組成物５〜７をフィンチャンバーに接種し、３次元培養ヒトモデル皮膚の表皮側にのせ、２４ｈｒ培養する。フィンチャンバーを除き、３次元培養ヒトモデル皮膚をＰＢＳ（−）で洗浄後、ＵＶＢランプで照射を行った（４８０ｍＪ／ｃｍ２）。照射後、さらに２４ｈｒ培養し、下層部から培地を５０μＬ取り出し、ＵＶＢなどの刺激によって前炎症サイトカインとして分泌されているＩＬ−１αの測定をＥＬＩＳＡキット（ピアス）で行う。また、３次元培養ヒトモデル皮膚を取り出し、ＰＢＳ（−）で洗浄後、２ｍｇ／ｍＬＭＴＴ入り培地に浸し２ｈｒ処理した。その後、３次元培養ヒトモデル皮膚を取り出し、０．０４Ｎ  ＨＣｌで酸性にしたイソプロパノールでホルマザンを抽出し５７０ｎｍの吸光度を測定した。式３で細胞残存率を求めた。
【式３】
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【００２８】  羅漢果抽出物とソホロリピッド未配合のもの（組成物５）と比較すると、羅漢果抽出物のみを配合したもの（組成物６）はＩＬ−１αの分泌を顕著に抑制した。さらに、ソホロリピッドと羅漢果抽出物両方配合したもの（組成物７）は羅漢果抽出物のみを配合したもの（組成物６）よりもＩＬ−１α分泌抑制効果が有意に高かった（図４）。このように、ソホロリピッドは羅漢果抽出物のＵＶＢ照射によって分泌されたＩＬ−１αに対する抑制効果を相乗的に高めることが明らかとなった。
【００２９】  殆ど効果のない羅漢果抽出物またはソホロリピッドのみを配合したもの（組成物５、６）に対し、ソホロリピッドと羅漢果抽出物両方配合したもの（組成物７）はＵＶＢ照射による細胞毒性に対する抑制効果が顕著に高かった（図５）。このように、羅漢果抽出物とソホロリピッドが共存する（組成物７）とＵＶＢ照射から細胞を保護する効果を有することが明らかとなった。
【００３０】  ＜ヒト皮膚ＵＶＢ障害抑制試験＞３０代男性１名の上腕約２ｃｍ×２ｃｍの２箇所に組成物５と組成物７をそれぞれ塗布し、２ｈｒ後に４８ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢを照射した。その後、目視で紅斑の有無および経時変化を観察した。また、経時的にテープストリッピングにより角質を採取し、画像解析により剥離した角質細胞面積率を、ＥＬＩＳＡキットで前炎症サイトカインであるＩＬ−１α分泌量を測定した。剥離角質細胞面積率は式４で求めた。
【式４】
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【００３１】  羅漢果抽出物とソホロリピッド未配合のもの（組成物５）で処理した部位はＵＶＢ照射によって２ｈｒ後に紅斑が観察され、７日後も紅斑が残っているのに対し、羅漢果抽出物とソホロリピッドを両方配合したもの（組成物７）で処理した部位は、１日後に紅斑が見られたものの、４日後に消失し、明らかにＵＶＢ照射により生じた紅斑が軽減されていることがわかった。また、ＵＶＢ照射によって分泌されたＩＬ−１αの量が顕著に減少していることから、羅漢果抽出物とソホロリピッドを含有する組成物（組成物７）がＩＬ−１αの分泌を阻害することにより炎症反応を抑制していることがわかった（図６）。
【００３２】  剥離した角質細胞量を測定した結果、羅漢果抽出物とソホロリピッドを両方配合したもの（組成物７）の処理によって剥離した角質細胞量が減少し（図７）、羅漢果抽出物とソホロリピッドを含有する組成物がＵＶＢ照射による角質ダメージも顕著に抑制した。これらのことから、本発明の組成物７はＵＶＢ照射から皮膚を保護する効果を示すことがわかった。
【００３３】  ＜肌荒れ改善効果＞１０名の肌荒れパネラーに組成物５と組成物７をそれぞれ５名ずつに一ヶ月間使用して、肌荒れ改善効果を評価した。肌荒れの改善程度は、無効、有効、非常に有効の３段階とした。なお、一ヶ月の使用における肌荒れ改善効果を表３に示した。
【００３４】
【表３】
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【００３５】  組成物５は肌荒れ改善効果が見られないのに対し、組成物７では３名に有効な効果が見られ、本発明の組成物７には肌荒れ改善効果を有することがわかった。
【００３６】  上記のことから、羅漢果抽出物およびソホロリピッドを含有する組成物を適用することによって、線維芽細胞賦活作用、コラーゲン合成促進作用を有しており、肌荒れ改善効果および紫外線保護効果を著しく発揮することが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】線維芽細胞賦活作用を示した図である。
【００３８】
【図２】コラーゲン合成促進作用を示した図である。
【００３９】
【図３】羅漢果抽出物とソホロリピッド配合処方の細胞賦活作用を示した図である。
【００４０】
【図４】ＵＶＢ照射によるＩＬ−１α分泌に対する羅漢果抽出物とソホロリピッド配合処方の抑制効果を示した図である。
【００４１】
【図５】ＵＶＢ照射による皮膚細胞毒性に対する羅漢果抽出物とソホロリピッド配合処方の抑制効果を示した図である。
【００４２】
【図６】ＵＶＢ照射による皮膚炎症反応に対する羅漢果抽出物とソホロリピッド配合処方の抑制効果を示した図である。
【００４３】
【図７】ＵＶＢ照射による角質細胞剥離量に対する羅漢果抽出物とソホロリピッド配合処方の抑制効果を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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