(57)【要約】【課題】細胞の侵入性および培地の浸透性に優れ、細胞の３次元培養を容易かつ効率的に行うことができる細胞培養担体およびこれを用いた細胞培養方法を提供する。【解決手段】複数の球状の気孔が全体にわたって連通した多孔質構造を有し、気孔率が６０％以上８０％以下、平均気孔径が１００μｍ以上４００μｍ以下、各気孔間の連通部の径が１０μｍ以上１００μｍ以下の多孔体からなり、前記多孔体は、ハイドロキシアパタイトまたは／およびリン酸三カルシウムからなるリン酸カルシウム系セラミックス多孔体であり、直径１００μｍ以上１０００μｍ以下の貫通孔が３ｍｍ以上５ｍｍ以下の間隔で形成されている培養担体を用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の球状の気孔が全体にわたって連通した多孔質構造を有し、気孔率が６０％以上８０％以下、平均気孔径が１００μｍ以上４００μｍ以下、各気孔間の連通部の径が１０μｍ以上１００μｍ以下の多孔体からなり、前記多孔体は、ハイドロキシアパタイトまたは／およびリン酸三カルシウムからなるリン酸カルシウム系セラミックス多孔体であり、直径１００μｍ以上１０００μｍ以下の貫通孔が３ｍｍ以上５ｍｍ以下の間隔で形成されていることを特徴とするリン酸カルシウム系細胞培養担体。
【請求項２】
前記セラミックス多孔体は、表面部における気孔率が７５％以上８０％以下、平均気孔径が３００μｍ以上４００μｍ以下、連通部径が５０μｍ以上８０μｍ以下であり、内部から表面に向かって気孔径および連通部径が増大する傾斜構造を有していることを特徴とする請求項１記載のリン酸カルシウム系細胞培養担体。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の細胞培養担体を用いる細胞培養方法であって、前記多孔体の浸漬または前記多孔体に形成された貫通孔からの注入により、培地を多孔体内部まで浸透させた後、細胞を播種することを特徴とする細胞培養方法。
【請求項４】
前記培地には、ＦＢＳ、アスコルビン酸、ストレプトマイシン、β−グリセロリン酸およびデキサメタゾンのうちの少なくともいずれか１種が添加されていることを特徴とする請求項３記載の細胞培養方法。
【請求項５】
前記多孔体内部には、培地を浸透させる前に、多孔体に形成された貫通孔からの注入により、細胞増殖因子を担持させることを特徴とする請求項３または請求項４記載の細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン酸カルシウム系セラミックス多孔体からなり、細胞の侵入性および培地の浸透性等に優れた細胞培養担体およびこれを用いた細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、医療技術や医薬品の開発等を目的として、種々の動物実験や細胞培養実験が行われている。
動物実験は、生体内において反応を解析することができるという利点を有している反面、ヒトと他の動物との種差により、得られた結果が、必ずしも信頼できるとは限らず、また、多くの動物を犠牲にしなければならないという課題を有している。
【０００３】
一方、細胞培養実験は、ヒト、特に、患者自身の細胞を培養して、目的の作用を直接検討することができるという利点を有している。
しかしながら、従来の細胞培養は、２次元培養であるため、実際の生体の器官とは差異が生じていた。
【０００４】
このため、ヒトを含めた動物の組織細胞を３次元的に培養し、培養細胞によって生体の器官を再構築しようとする試みが検討されている。
このような３次元細胞培養方法としては、例えば、細胞をコラーゲンゲル内に包埋して、３次元的に培養する方法が知られている。
また、例えば、特許文献１に記載されているような３次元連通構造を有するリン酸カルシウム系セラミックス多孔体を細胞培養担体として用いる研究開発も進められている。
【特許文献１】特開昭６０−１６８７９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来の３次元細胞培養方法であるコラーゲンゲル培養法は、細胞数が増加するにつれて、内側の細胞に栄養分を供給が妨げられ、また、同時に、それらの細胞が分泌する細胞代謝物を外部へ放出することも困難となるという課題を有していた。
【０００６】
また、特許文献１に記載されているような３次元連通構造を有するリン酸カルシウム系セラミックス多孔体の細胞培養担体は、細胞播種の際、細胞懸濁液が多孔体内部にまで浸透せず、細胞が内部にまで侵入し難い。また、培養期間が長くなるほど、培地交換の際、培地が多孔体内部に浸透し難くなり、多孔体内部の細胞に栄養分を供給することが困難となるという課題を有していた。
【０００７】
本発明は、上記技術的課題を解決するためになされたものであり、細胞の侵入性および培地の浸透性に優れ、細胞の３次元培養を容易かつ効率的に行うことができる細胞培養担体およびこれを用いた細胞培養方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係るリン酸カルシウム系細胞培養担体は、複数の球状の気孔が全体にわたって連通した多孔質構造を有し、気孔率が６０％以上８０％以下、平均気孔径が１００μｍ以上４００μｍ以下、各気孔間の連通部の径が１０μｍ以上１００μｍ以下の多孔体からなり、前記多孔体は、ハイドロキシアパタイトまたは／およびリン酸三カルシウムからなるリン酸カルシウム系セラミックス多孔体であり、直径１００μｍ以上１０００μｍ以下の貫通孔が３ｍｍ以上５ｍｍ以下の間隔で形成されていることを特徴とする。
このような培養担体によれば、細胞の侵入性や培地の浸透性の向上が図られ、リン酸カルシウム系セラミックス多孔体からなる培養担体によって、３次元培養を容易かつ効率的に行うことができる。
【０００９】
前記セラミックス多孔体は、表面部における気孔率が７５％以上８０％以下、平均気孔径が３００μｍ以上４００μｍ以下、連通部径が５０μｍ以上８０μｍ以下であり、内部から表面に向かって気孔径および連通部径が増大する傾斜構造を有していることが好ましい。
このような傾斜構造を有する多孔体とすることにより、細胞の侵入および細胞培養時における培地の浸透性をより促進することができる。
【００１０】
また、本発明に係る細胞培養方法は、上記細胞培養担体を用いる細胞培養方法であって、前記多孔体の浸漬または前記多孔体に形成された貫通孔からの注入により、培地を多孔体内部まで浸透させた後、細胞を播種する。
本発明に係る細胞培養担体を用いることにより、培養担体への細胞播種前の培地の浸透を容易に行うことができる。
【００１１】
また、前記培地には、ＦＢＳ、アスコルビン酸、ストレプトマイシン、β−グリセロリン酸およびデキサメタゾンのうちの少なくともいずれか１種が添加されていることが好ましい。
培地中に、上記のような細胞を維持するために必要な物質を添加しておくことにより、細胞の増殖性を促進し、３次元培養を効率的に行うことができる。
【００１２】
同様の観点から、前記多孔体内部には、培地を浸透させる前に、多孔体に形成された貫通孔からの注入により、細胞増殖因子を担持させることが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
上述したとおり、本発明に係るリン酸カルシウム系細胞培養担体を用いれば、細胞の侵入性や培地の浸透性が改善され、培養担体の内部においても、細胞の増殖性を活発化させることができる。
したがって、上記培養担体を用いた本発明に係る細胞培養方法によれば、細胞を３次元的に効率的に増殖させ、かつ、高い生存率で自己組織を形成することが可能となり、生体組織の再生治療への応用に貢献し得るものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明についてより詳細に説明する。
本発明に係るリン酸カルシウム系細胞培養担体は、所定の多孔質構造を有するリン酸カルシウム系セラミックス多孔体からなり、所定の貫通孔が形成されているものである。
すなわち、本発明に係る細胞培養担体は、リン酸カルシウム系セラミックス多孔体において、気孔径や連通部径を制御し、また、該多孔体に貫通孔を形成したものであり、これにより、細胞の侵入性や培地の浸透性の改善を図ったものである。
ここで、連通部とは、隣り合う略球状の気孔同士が接触して開口した部分をいう。
【００１５】
本発明においては、前記リン酸カルシウム系セラミックス多孔体は、ハイドロキシアパタイト（ＨＡｐ）もしくはリン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）または両者の混合物からなることが好ましい。
ＨＡｐおよびβ−ＴＣＰはいずれも、生体親和性、生体適合性に優れており、細胞の足場としても好適である。
【００１６】
前記多孔体の多孔質構造は、複数の球状の気孔が全体にわたって連通しており、気孔率が６０％以上８０％以下、平均気孔径が１００μｍ以上４００μｍ以下、各気孔間の連通部の径が１０μｍ以上１００μｍ以下であることが好ましい。
上記のように、気孔が内部から表面まで全体に連通して存在していることにより、細胞が多孔体の内部にまで侵入しやすく、また、培地も浸透しやすくなる。また、該多孔体内で増殖した細胞にも、細胞増殖因子や栄養分を効率的に供給することができる。
なお、前記気孔率は、多孔体の密度と理論密度から導くことができる。また、平均気孔径は、特許第３４００７４０号公報に記載の樹脂封埋による方法で求められ、連通孔径は、水銀圧入法により求めることができる。
【００１７】
前記セラミックス多孔体の気孔率が６０％未満である場合、また、平均気孔径が１００μｍ未満である場合、細胞や培地が容易に侵入できるような連通孔を得ることが難しい。
一方、前記気孔率が８０％を超える場合、また、平均気孔径が４００μｍを超える場合、多孔体内部に侵入した細胞が流出しやすく、多孔体上に定着し難くなるとともに、培養担体の強度が不十分となる。
前記気孔率は６５％以上７５％以下であり、また、平均気孔径は１５０μｍ以上３００μｍ以下であることがより好ましい。
【００１８】
また、前記セラミックス多孔体の各気孔間の連通部の径が１０μｍ未満である場合、細胞を培養する担体の連通性が不十分であり、培地に供給した細胞増殖因子や栄養分等が、十分に細胞に行き渡らず、担体内部の細胞が死滅したり、増殖が不十分となる場合がある。
一方、前記径が１００μｍを超える場合、多孔体内部に侵入した細胞が流出しやすく、多孔体上に定着し難くなる。
前記連通部径は３０μｍ以上８０μｍ以下であることがより好ましい。
【００１９】
なお、上記のようなセラミックス多孔体は、スポンジ状の有機多孔体にスラリーを塗布して有機多孔体を焼き抜くセラミックフォームや、スラリーを撹拌起泡して焼結する特許第３４００７４０号に記載されている方法等によって得ることができるが、後者の方法により得ることがより好ましい。
【００２０】
前記多孔体に形成される貫通孔は、直径１００μｍ以上１０００μｍ以下であり、３ｍｍ以上５ｍｍ以下の間隔であることが好ましい。
この貫通孔により、細胞播種時における細胞の侵入および細胞培養時における培地の浸透性を促進することができ、さらに、多孔体内部に、細胞懸濁液、培地および細胞増殖因子等をシリンジ等を用いて注入することも可能となる。
【００２１】
前記貫通孔は、直径１００μｍ未満の貫通孔を形成することは困難である一方、直径１００μｍを超える場合は、多孔体の強度を十分に保つことが困難となる。
前記貫通孔の直径は、２５０μｍ以上７５０μｍ以下であることがより好ましい。
また、貫通孔の間隔は、細胞の侵入および培地の浸透性の観点および多孔体の強度保持の観点から、上記範囲内であることが好ましく、その配置は、平行または交差状のいずれでもよく、多孔体の形状に応じて、適宜定めることができる。
【００２２】
前記セラミックス多孔体は、表面部における気孔率が７５％以上８０％以下、平均気孔径が３００μｍ以上４００μｍ以下、連通部径が５０μｍ以上８０μｍ以下であり、内部から表面に向かって気孔径および連通部径が増大する傾斜構造を有していることが好ましい。
ここでいう表面部とは、多孔体の表面から深さ１〜５ｍｍ程度の範囲内の部分を指す。
このような多孔体における気孔径および連通部径の傾斜構造は、例えば、セラミックス多孔体作製時において、成形後、焼成する前に減圧状態とすることにより、容易に形成することができる。
このような傾斜構造を有する多孔体とすることにより、細胞の侵入および細胞培養時における培地の浸透性をより促進することができる。
【００２３】
上記のような多孔体からなる細胞培養担体を用いることにより、該多孔体の浸漬または前記多孔体に形成された貫通孔からの注入により、培地を多孔体内部まで容易に浸透させることができる。
このように、培地が培養担体の内部にまで行き渡らせておくことにより、細胞播種時における細胞の侵入が促進され、細胞の接着性を高めることができる。
【００２４】
本発明に係る培養担体を適用する細胞としては、間葉系幹細胞が好ましい。
また、上記のような細胞の培養に用いられる培地は、特に限定されるものではなく、培養する細胞に応じて、適宜選択することができる。例えば、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、イーグル培地等が好適に用いられる。
これらの培地には、さらに、ＦＢＳ（fetal bovine serum；ウシ胎児血清）、アスコルビン酸、ストレプトマイシン、β−グリセロリン酸、デキサメタゾン、その他の抗生物質等の細胞を維持するために必要な物質を添加しておくことが好ましい。
培地中に、血清の他、上記のような種々の物質を添加することにより、細胞の増殖性を促進し、３次元培養を効率的に行うことができる。
【００２５】
さらにまた、前記多孔体内部には、培地を浸透させる前に、多孔体に形成された貫通孔からの注入により、細胞増殖因子を担持させておくことが好ましい。
該多孔体に担持させる細胞増殖因子の種類としては、例えば、骨芽細胞の増殖を目的とする場合には、ＢＭＰ（骨形成因子）、ＦＧＦ（線維芽細胞成長因子）、ＴＧＦ−β（トランスフォーミング成長因子）、ＩＧＦ（インスリン成長因子）、ｂ−ＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）等、骨形成に寄与する細胞増殖因子を用いることが好ましい。
なお、これらの細胞増殖因子は、水溶液として添加してもよいが、拡散時間の制御の観点から、コラーゲン粒子等に担持させたものも混合して用いることが好ましい。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに具体的に説明するが、本発明は、下記実施例により制限されるものではない。
［実施例１］
セラミックス原料として平均粒径１μｍのＨＡｐ原料粉末４００．００ｇに、分散媒として１５ｗｔ％ポリエチレンイミン水溶液３２７．２７ｇを加え、ボールミルで４８時間撹拌混合して原料スラリーを調製した。
この原料スラリー６００．００ｇに、起泡剤としてポリオキシエチレンラウリルエーテル１．２０ｇを添加して撹拌し、泡沫状スラリーとした。
さらに、架橋剤としてソルビトールポリグリシジルエーテル１１．７４ｇを添加し、混合後、型に鋳込み、ゲル化体を得た。
得られたゲル化体を減圧し、硬化後、型から取り出し、３０℃、湿度９０％の加湿乾燥器内で一昼夜乾燥させ、成形体（乾燥体）を得た。
この成形体を、１２００℃で１時間焼成して、焼結体を得た。
得られた焼結体に、直径５００μｍの貫通孔を５ｍｍ間隔で開けた後、直径１３ｍｍ、高さ３ｍｍの円柱状に加工し、培養担体とした。
この培養担体の気孔率は表面部が約８０％、内部が約７２％、平均気孔径は３３０μｍ、連通部径は約６０μｍであった。
【００２７】
培養実験は、１２穴の細胞培養用ポリスチレンプレートを用い、播種する細胞は新生児Ｃ５７ＢＬ／６ マウス頭蓋冠由来の骨芽細胞様樹立株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１、培地はＦＢＳを１０ｖｏｌ％添加したα−ＭＥＭ（以下、α−ＭＥＭ（＋）培地という。）を用いた。以下の比較例１〜３においても同様である。
【００２８】
細胞播種前日に、前記培養担体（多孔体）の貫通孔からシリンジを用いて、リン酸緩衝液に溶解した増殖因子ｒｈＢＭＰ−２を注入し、多孔体内部に担持させた後、該多孔体をα−ＭＥＭ（＋）培地に浸漬した。
次に、前記多孔体上に、細胞密度３×１０4個／ｃｍ3の細胞懸濁液２ｃｍ3を播種し、５％ＣＯ2インキュベータ内で３７℃で培養を行った。
１日おきに培地交換を行い、培地の一部は、前記貫通孔からシリンジを用いて注入し、多孔体内部にも新しい培地を供給した。この培養期間中の培地には、１０ｖｏｌ％ＦＢＳの他、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０ｍＭβ−グリセロリン酸および１×１０-8Ｍデキサメタゾンを添加したものを用いた。
なお、培養担体を用いず、１２穴の細胞培養用ポリスチレンプレートに直接培地を供給し、培養したものを、対照のための標準試料とした。
培養した細胞について、増殖性および形態をＳＥＭ観察し、また、ＡＬＰ活性（Ｂｅｓｓｅｙ−Ｌｏｗｒｙ法）の評価を行った。
【００２９】
培養１，３，５，７日目の細胞増殖性を調べたところ、培養担体（多孔体）用いた場合においても、標準試料と同様の良好な増殖性を示し、経時的に細胞数が増加していることが認められた。
また、培養１日目で、多孔体表面だけでなく、内部にも細胞が接着し、伸展している様子が観察された。
培養７日目には、細胞が多孔体表面を覆い、コンフルエントに達し、多孔体内部でも細胞が増殖している様子が観察された。
【００３０】
培養１４，２１日目の単位ＤＮＡ量当たりのＡＬＰ活性は、培養担体を用いた場合の方が、標準試料よりも有意に高かった。標準試料においては、２次元培養であるのに対して、培養担体を用いた場合には、気孔の内部まで細胞が侵入し、多孔体内部においても細胞が増殖し、３次元培養が行われたためであると考えられる。
また、培養１４日目の方が、２１日目よりも高かったが、これは、２１日目には骨芽細胞の分化が進み、ＡＬＰ活性が低下し始めたためであると考えられる。
【００３１】
［実施例２］
実施例１と同様にして得られた培養担体（多孔体）に、細胞播種前日に、シリンジを用いて、貫通孔からα−ＭＥＭ（＋）培地を注入した。
実施例２および比較例１のように減圧することなく、多孔体全体に培地を容易に浸透させることができた。
次に、前記多孔体上に、細胞密度３×１０4個／ｃｍ3の細胞懸濁液２ｃｍ3を播種し、３７℃で５％ＣＯ2インキュベータ内で培養を行った。
細胞培養、培地交換、培養した細胞についての観察および評価は、実施例１と同様にして行った。この培養期間中の培地には、α−ＭＥＭ（＋）培地を用いた。
【００３２】
培養１，３，５，７日目における細胞増殖性を調べたところ、培養担体（多孔体）用いた場合においても、標準試料と同様の良好な増殖性を示し、また、多孔体内部でも細胞が増殖している様子が観察され、その数は、実施例１と比較すると、全体として約４／５であった。
また、培養１４，２１日目の単位ＤＮＡ量当たりのＡＬＰ活性は、培養担体（多孔体）用いた場合の方が、標準試料よりも高かったが、いずれにおいても、２１日目の方が、１４日目よりも高く、実施例１よりも全体的に７０％程度であった。実施例１において用いられた細胞増殖因子や培地への各種添加物質が、細胞を活性化させ、細胞の分化を促進する効果を有していることによると考えられる。
【００３３】
［比較例１］
実施例１と同様にして得られた焼結体に、貫通孔を形成せずに、直径１３ｍｍ、高さ３ｍｍの円柱状に加工し、培養担体（多孔体）とした。
細胞播種前日に、前記多孔体をα−ＭＥＭ（＋）培地に浸漬したところ、培地が多孔体表面に溜まり、多孔体内部にまで浸透し難かった。
このため、１２穴プレートに多孔体を入れて、培地を満たした状態のまま減圧し、多孔体内部にまで培地を浸透させたところ、実施例２に比べて、容易に浸透させることができた。
細胞培養、培地交換、培養した細胞についての観察および評価は、実施例１と同様にして行った。この培養期間中の培地には、α−ＭＥＭ（＋）培地を用いた。
【００３４】
培養１，３，５，７日目における細胞増殖性を調べたところ、培養担体（多孔体）用いた場合においても、標準試料と同様の良好な増殖性を示し、経時的に細胞数が増加していることが認められた。
また、培養１日目に、多孔体内部にも細胞が侵入し、培養７日目には、内部においても細胞が増殖している様子が観察されたが、その数は、実施例１と比較すると、全体として約３／５であった。
このことから、培養担体に貫通孔が形成されている場合（実施例２）の方が、貫通孔が形成されていない場合（比較例１）よりも、内部にまで培地や細胞が侵入しやすく、内部でもより細胞が増殖しやすいと言える。
【００３５】
［比較例２］
実施例１と同様にして得られたゲル化体を、減圧せずに、均一な気孔構造を有する成形体を作製した。この成形体を、実施例１と同様にして焼成し、得られた焼結体には貫通孔を形成せずに、直径１３ｍｍ、高さ３ｍｍの円柱状に加工し、培養担体（多孔体）とした。
細胞播種前日に、前記多孔体をα−ＭＥＭ（＋）培地に浸漬したところ、培地は、多孔体表面に溜まり、多孔体内部にまで浸透し難かった。
このため、１２穴プレートに多孔体を入れて、培地を満たした状態のまま減圧して、多孔体内部まで培地を浸透させた。
次に、前記多孔体上に、細胞密度３×１０4個／ｃｍ3の細胞懸濁液２ｃｍ3を播種し、５％ＣＯ2インキュベータ内で３７℃で培養を行った。
１日おきに培地交換を行い、培養した細胞について、実施例１と同様にして、観察および評価を行った。この培養期間中の培地には、α−ＭＥＭ（＋）培地を用いた。
【００３６】
培養１，３，５，７日目における細胞増殖性を調べたところ、培養担体（多孔体）用いた場合においても、標準試料と同様の良好な増殖性を示し、経時的に細胞数が増加していることが認められたが、多孔体の表面付近に細胞が密集しており、細胞数は、培養７日目においても、多孔体の内部（深部）では少なく、実施例１と比較すると、全体として約１／２であった。
このことから、均一な気孔構造の多孔体は、内部にまで培地や細胞が侵入し難く、３次元培養は困難であると言える。