(57)【要約】【課題】本発明は、研究目的に使用されると考えられるヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ニワトリの１４種の動物種について動物種検出法を提供することを課題とする。【解決手段】１４種の対象動物のミトコンドリアＤＮＡ配列を標的とするユニバーサルプライマーおよび、各動物種に特異的な種検出プライマーを用いることによる。まず、ユニバーサルプライマーにより目的とするミトコンドリアＤＮＡ領域を増幅して一次増幅産物を得、次に該一次増幅産物を検体として、各動物種に特異的な種検出プライマーを用いた二次増幅を行うことにより、種特異的なＤＮＡを高い感度で検出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含むことを特徴とする動物種検出方法：
１）少なくとも２種以上の動物種に対して、ミトコンドリアＤＮＡの特定の部位を普遍的に増幅しうるユニバーサルプライマーを用いて、ＤＮＡの増幅処理を行う第一次増幅工程；
２）上記第一次増幅工程により得られた一次増幅産物を検体とし、検出すべき動物種に特異的な種検出プライマーを用いて、該動物種のＤＮＡを増幅する第二次増幅工程；
３）上記第二次増幅工程により得られた二次増幅産物を解析することにより、動物種を同定する工程。
【請求項２】
少なくとも２種以上の動物種が、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリから選択される少なくとも２種以上である請求項１に記載の動物種検出方法。
【請求項３】
ユニバーサルプライマーが、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの１４種の動物種のミトコンドリアＤＮＡの特定の部位を普遍的に増幅しうるオリゴヌクレオチドからなる請求項１または２に記載の動物種検出方法。
【請求項４】
ユニバーサルプライマーにより増幅されるミトコンドリアＤＮＡの特定の部位が、ミトコンドリアＤＮＡ上のチトクロームｂをコードする遺伝子に含まれる領域から１６Ｓリボゾームをコードする遺伝子に含まれる領域である請求項１〜３のいずれか１に記載の動物種検出方法。
【請求項５】
ユニバーサルプライマーが、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの１４種の動物種のミトコンドリアＤＮＡの特定の部位を普遍的に増幅しうるオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドが以下から選択されてなるユニバーサルプライマー：
１）配列表の配列番号１または２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
２）上記１）で示されるオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
３）上記１）または２）で示されるオリゴヌクレオチドに、１もしくは複数個の塩基が置換し、欠失し、挿入し、あるいは付加されてなるオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
検出すべき動物種に特異的な種検出プライマーが、検出すべき動物種由来のミトコンドリアＤＮＡの領域を増幅しうるオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドが、以下より選択されてなる種検出プライマー：
１）ヒト由来のミトコンドリアＤＮＡを特異的に増幅し、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの動物種由来のＤＮＡを増幅しない塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
２）アフリカミドリザル由来のミトコンドリアＤＮＡを特異的に増幅し、ヒト、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの動物種由来のＤＮＡを増幅しない塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
３）カニクイザル由来のミトコンドリアＤＮＡを特異的に増幅し、ヒト、アフリカミドリザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの動物種由来のＤＮＡを増幅しない塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
４）マウス由来のミトコンドリアＤＮＡを特異的に増幅し、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの動物種由来のＤＮＡを増幅しない塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
５）ラット由来のミトコンドリアＤＮＡを特異的に増幅し、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの動物種由来のＤＮＡを増幅しない塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
６）チャイニーズハムスター由来のミトコンドリアＤＮＡを特異的に増幅し、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの動物種由来のＤＮＡを増幅しない塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
７）シリアンハムスター由来のミトコンドリアＤＮＡを特異的に増幅し、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの動物種由来のＤＮＡを増幅しない塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
８）モルモット由来のミトコンドリアＤＮＡを特異的に増幅し、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの動物種由来のＤＮＡを増幅しない塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
９）ウサギ由来のミトコンドリアＤＮＡを特異的に増幅し、ヒト、アフリカミドリザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの動物種由来のＤＮＡを増幅しない塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
１０）イヌ由来のミトコンドリアＤＮＡを特異的に増幅し、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、モルモット、シリアンハムスター、ウサギ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの動物種由来のＤＮＡを増幅しない塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
１１）ネコ由来のミトコンドリアＤＮＡを特異的に増幅し、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、モルモット、シリアンハムスター、ウサギ、イヌ、ウシ、ブタおよびニワトリの動物種由来のＤＮＡを増幅しない塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
１２）ウシ由来のミトコンドリアＤＮＡを特異的に増幅し、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、モルモット、シリアンハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタおよびニワトリの動物種由来のＤＮＡを増幅しない塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
１３）ブタ由来のミトコンドリアＤＮＡを特異的に増幅し、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、モルモット、シリアンハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシおよびニワトリの動物種由来のＤＮＡを増幅しない塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
１４）ニワトリ由来のミトコンドリアＤＮＡを特異的に増幅し、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、モルモット、シリアンハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシおよびブタの動物種由来のＤＮＡを増幅しない塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
検出すべき動物種に特異的な種検出プライマーが、検出すべき動物種由来のミトコンドリアＤＮＡの領域を増幅しうるオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドが、以下より選択されてなる種検出プライマー：
１）配列表の配列番号３〜３０のいずれかで示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
２）上記１）で示されるオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
３）上記１）または２）で示されるオリゴヌクレオチドに、１もしくは複数個の塩基が置換し、欠失し、挿入し、あるいは付加されてなるオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項５で特定されるユニバーサルプライマーを用いて第一次増幅工程を行う請求項１〜４のいずれか１に記載の動物種検出方法。
【請求項９】
請求項６または７で特定される種検出プライマーを少なくとも２種混合したプライマーミックスを用いて第二次増幅工程を行う請求項１〜４または請求項８のいずれか１に記載の動物種検出方法。
【請求項１０】
プライマーミックスが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、ウシおよびブタに各々特異的なプライマーを含む請求項９に記載の動物種検出方法。
【請求項１１】
プライマーミックスが、アフリカミドリザルおよびカニクイザルに各々特異的なプライマーを含む請求項９に記載の動物種検出方法。
【請求項１２】
プライマーミックスが、さらにチャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、イヌおよびニワトリに各々特異的なプライマーを含む請求項９に記載の動物種検出方法。
【請求項１３】
請求項６または７で特定される種検出プライマーを少なくとも２種混合してなるプライマーミックス。
【請求項１４】
プライマーミックスが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、ウシおよびブタに各々特異的なプライマーを含む請求項１３に記載のプライマーミックス。
【請求項１５】
プライマーミックスが、アフリカミドリザル、カニクイザル、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、イヌおよびニワトリに各々特異的なプライマーを含む請求項１３に記載のプライマーミックス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの少なくとも２種の動物種由来ミトコンドリアＤＮＡに含まれる各動物種特異的ＤＮＡ配列を増幅する工程を含む動物種検出（同定）方法、およびその工程で使用されるＤＮＡ増幅プライマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養を用いた研究においては、ある動物種に由来する細胞が別の動物種に由来する細胞に汚染、置換してしまう事例がしばしばみられ、問題となっている。細胞の由来動物種を同定するためには、従来はアイソザイム分析、免疫学的手法や染色体分析法などが用いられてきた。しかしこれらの方法は、特殊な機器・試薬が必要であったり、高度な技法や知識を要し、検査に長時間を要し、微量の他種由来試料の混入の判別が困難であるなどの問題があった。
【０００３】
近年では、種特異的なＤＮＡ情報に基づいた手法による由来種の同定が実施可能である。しかし、ＤＮＡシーケンサーによって塩基配列そのものを決定する方法は、多大な時間と労力を要する等の理由で一般的な研究室では行いがたい。
一方、種特異的なＤＮＡ情報に基づいたポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、単に「ＰＣＲ」という。）反応を用いた検査法は、１）検査に必要な機器・試薬が細胞培養を使用する多くの医学・生物学研究室に普及している；２）操作が簡便であり、高度に専門的な知識を要しない；３）きわめて微量のＤＮＡを対象とした検査ができ、アイソザイム法等と比較して異種由来細胞の混入をより高感度に検出できる；４）検査に要する時間が短い；などの利点があり、培養細胞の由来種を同定する方法として幾つか報告されている。
【０００４】
例えば、非特許文献１には、核ＤＮＡのアルドラーゼ遺伝子を標的とする一組のプライマーを用いたＰＣＲ法が開示されており、１３種の動物を識別可能としている。しかし、この方法においては、ヒトとアフリカミドリザル、あるいはマウスとラットの組合せにおいて増幅されるＤＮＡ産物のサイズがほとんど同じであるため、最終的な識別には塩基配列の決定を要し、生命科学研究において高頻度に利用される細胞の由来種であるヒト、マウス、ラットの同定法として成功しているとはいい難い。
【０００５】
非特許文献２には、核ＤＮＡのβ−グロビン遺伝子を増幅対象とした種特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ法により、動物種の同定を行う方法が開示されている。しかし、同定できる動物はヒト、マウス、ラット、シリアンハムスターのわずか４種であり、培養細胞として広く用いられている他の動物種、例えばアフリカミドリザルや、チャイニーズハムスター等については開示されていない。
【０００６】
非特許文献３には、ミトコンドリアＤＮＡのチトクロームｃオキシダーゼ遺伝子とチトクロームｂ遺伝子を標的とした種特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ法が開示され、ＰＣＲ法により９種の動物を判定可能としている。しかしながらこの報告においては、同定（検出）対象としている９動物種のＤＮＡの増幅産物のサイズがきわめて近いため、複数の動物種由来ＤＮＡが混合する検体、例えばクロスコンタミネーションの検出の際にミックスプライマーを用いた同時判定がきわめて困難である。さらに、研究においてよく利用されるチャイニーズハムスターを検出する方法が開示されていない。
【０００７】
非特許文献４には、ミトコンドリアＤＮＡのチトクロームｂ遺伝子を標的とした食肉を対象とした検査方法が開示されている。本方法は、プライマーの片方を共通にし、もう一方のプライマーで種特異的に検出可能とするマルチプレックスＰＣＲ法によるが、プライマーのデザイン上、一種類のプライマーペアでのみ使用するのは困難である。さらに、研究においてよく利用されるチャイニーズハムスターを検出する方法が開示されていない。
【非特許文献１】Lieu et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim., 39, 424 (2003)
【非特許文献２】Klaus et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim., 39, 468 (2003)
【非特許文献３】Parodi et al., Biotechniques 32, 432 (2002)
【非特許文献４】Matsunaga et al., Meat Science 51, 143 (1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、研究目的に使用されると考えられる１４の動物種、すなわち、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリについての動物種検出法を提供することを課題とする。さらに本発明は、動物種検出のために使用するプライマーを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために、１４種の対象動物のうち、少なくとも２種以上、好ましくは１４種すべての動物種において相同性が高いミトコンドリアＤＮＡの特定の領域の配列を標的とするユニバーサルプライマーを用いて、一次増幅産物を得た。次いで該一次増幅産物を検体として各動物種に特異的な動物種検出プライマー（以下、「種検出プライマー」という。）を用いた二次増幅を行うことにより、種特異的なＤＮＡを高い感度で検出することに成功し、本発明を完成した。さらに、本発明の種検出プライマーを用いてＤＮＡ増幅を行ったときの増幅産物の大きさが異なることから、各種検出プライマーを混合したミックスプライマーによりＤＮＡの動物種を検出することができる。
【００１０】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．以下の工程を含むことを特徴とする動物種検出方法：
１）少なくとも２種以上の動物種に対して、ミトコンドリアＤＮＡの特定の部位を普遍的に増幅しうるユニバーサルプライマーを用いて、ＤＮＡの増幅処理を行う第一次増幅工程；
２）上記第一次増幅工程により得られた一次増幅産物を検体とし、検出すべき動物種に特異的な種検出プライマーを用いて、該動物種のＤＮＡを増幅する第二次増幅工程；
３）上記第二次増幅工程により得られた二次増幅産物を解析することにより、動物種を同定する工程。
２．少なくとも２種以上の動物種が、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリから選択される少なくとも２種以上である前項１に記載の動物種検出方法。
３．ユニバーサルプライマーが、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの１４種の動物種のミトコンドリアＤＮＡの特定の部位を普遍的に増幅しうるオリゴヌクレオチドからなる前項１または２に記載の動物種検出方法。
４．ユニバーサルプライマーにより増幅されるミトコンドリアＤＮＡの特定の部位が、ミトコンドリアＤＮＡ上のチトクロームｂをコードする遺伝子に含まれる領域から１６Ｓリボゾームをコードする遺伝子に含まれる領域である前項１〜３のいずれか１に記載の動物種検出方法。
５．ユニバーサルプライマーが、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの１４種の動物種のミトコンドリアＤＮＡの特定の部位を普遍的に増幅しうるオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドが以下から選択されてなるユニバーサルプライマー：
１）配列表の配列番号１または２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
２）上記１）で示されるオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
３）上記１）または２）で示されるオリゴヌクレオチドに、１もしくは複数個の塩基が置換し、欠失し、挿入し、あるいは付加されてなるオリゴヌクレオチド。
６．検出すべき動物種に特異的な種検出プライマーが、検出すべき動物種由来のミトコンドリアＤＮＡの領域を増幅しうるオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドが、以下より選択されてなる種検出プライマー：
１）ヒト由来のミトコンドリアＤＮＡを特異的に増幅し、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの動物種由来のＤＮＡを増幅しない塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
２）アフリカミドリザル由来のミトコンドリアＤＮＡを特異的に増幅し、ヒト、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの動物種由来のＤＮＡを増幅しない塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
３）カニクイザル由来のミトコンドリアＤＮＡを特異的に増幅し、ヒト、アフリカミドリザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの動物種由来のＤＮＡを増幅しない塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
４）マウス由来のミトコンドリアＤＮＡを特異的に増幅し、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの動物種由来のＤＮＡを増幅しない塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
５）ラット由来のミトコンドリアＤＮＡを特異的に増幅し、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの動物種由来のＤＮＡを増幅しない塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
６）チャイニーズハムスター由来のミトコンドリアＤＮＡを特異的に増幅し、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの動物種由来のＤＮＡを増幅しない塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
７）シリアンハムスター由来のミトコンドリアＤＮＡを特異的に増幅し、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの動物種由来のＤＮＡを増幅しない塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
８）モルモット由来のミトコンドリアＤＮＡを特異的に増幅し、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの動物種由来のＤＮＡを増幅しない塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
９）ウサギ由来のミトコンドリアＤＮＡを特異的に増幅し、ヒト、アフリカミドリザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの動物種由来のＤＮＡを増幅しない塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
１０）イヌ由来のミトコンドリアＤＮＡを特異的に増幅し、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、モルモット、シリアンハムスター、ウサギ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの動物種由来のＤＮＡを増幅しない塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
１１）ネコ由来のミトコンドリアＤＮＡを特異的に増幅し、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、モルモット、シリアンハムスター、ウサギ、イヌ、ウシ、ブタおよびニワトリの動物種由来のＤＮＡを増幅しない塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
１２）ウシ由来のミトコンドリアＤＮＡを特異的に増幅し、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、モルモット、シリアンハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタおよびニワトリの動物種由来のＤＮＡを増幅しない塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
１３）ブタ由来のミトコンドリアＤＮＡを特異的に増幅し、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、モルモット、シリアンハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシおよびニワトリの動物種由来のＤＮＡを増幅しない塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
１４）ニワトリ由来のミトコンドリアＤＮＡを特異的に増幅し、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、モルモット、シリアンハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシおよびブタの動物種由来のＤＮＡを増幅しない塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
７．検出すべき動物種に特異的な種検出プライマーが、検出すべき動物種由来のミトコンドリアＤＮＡの領域を増幅しうるオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドが、以下より選択されてなる種検出プライマー：
１）配列表の配列番号３〜３０のいずれかで示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
２）上記１）で示されるオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
３）上記１）または２）で示されるオリゴヌクレオチドに、１もしくは複数個の塩基が置換し、欠失し、挿入し、あるいは付加されてなるオリゴヌクレオチド。
８．前項５で特定されるユニバーサルプライマーを用いて第一次増幅工程を行う前項１〜４のいずれか１に記載の動物種検出方法。
９．前項６または７で特定される種検出プライマーを少なくとも２種混合したプライマーミックスを用いて第二次増幅工程を行う前項１〜４または前項８のいずれか１に記載の動物種検出方法。
１０．プライマーミックスが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、ウシおよびブタに各々特異的なプライマーを含む前項９に記載の動物種検出方法。
１１．プライマーミックスが、アフリカミドリザルおよびカニクイザルに各々特異的なプライマーを含む前項９に記載の動物種検出方法。
１２．プライマーミックスが、さらにチャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、イヌおよびニワトリに各々特異的なプライマーを含む前項９に記載の動物種検出方法。
１３．前項６または７で特定される種検出プライマーを少なくとも２種混合してなるプライマーミックス。
１４．プライマーミックスが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、ウシおよびブタに各々特異的なプライマーを含む前項１３に記載のプライマーミックス。
１５．プライマーミックスが、アフリカミドリザル、カニクイザル、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、イヌおよびニワトリに各々特異的なプライマーを含む前項１３に記載のプライマーミックス。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の動物種検出方法に使用する種検出プライマーは、ミトコンドリアＤＮＡの特定の領域を増幅するものである。核ＤＮＡは体細胞一個に２コピー含まれているのに対し、ミトコンドリアＤＮＡは５００〜１０００コピー以上含まれているため、核ＤＮＡを標的としたプライマーを用いたＤＮＡ増幅に比べ高い検出感度が得られる。
【００１２】
本発明のユニバーサルプライマーを用いて第一次増幅産物を得ることで、まずミトコンドリアＤＮＡを増幅することができる。次に該第一次増幅産物を検体として種検出プライマーを用いて二次増幅産物を得ることで、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ニワトリの各ＤＮＡを高感度で検出することができ、動物種の同定を行うことができる。このように一次ＤＮＡ増幅と二次ＤＮＡ増幅を行うことで、核ＤＮＡを鋳型とした非特異的増幅を防ぐことができ、高い検出感度で種特異的なＤＮＡの検出をすることができる。
【００１３】
さらに、本発明の種特異的な種検出プライマーは種特異的な増幅産物の大きさが異なるように設計されており、これにより、各種検出プライマーをミックスしたミックスプライマーを用いたマルチプレックスなＤＮＡ増幅を行っても動物種を判別することができ、容易に短時間で種特異的なＤＮＡの検出をすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の動物種を検出するための検査対象となるＤＮＡは、ミトコンドリアＤＮＡである。ミトコンドリアＤＮＡは、リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を形成する２種類の遺伝子、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を形成する２２種類の遺伝子および１３種類のタンパク質を形成する遺伝子と、何の遺伝子も指定しないＤ−ループ領域を含む構成からなる。
【００１５】
本発明において、「ミトコンドリアＤＮＡの特定の部位」とは、図１ａに示すチトクロームｂ遺伝子に含まれる領域から１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子に含まれる領域をいい、具体的にはチトクロームｂ遺伝子の一部、Ｄ−ループ、１２ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子、１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子の一部を含む約４〜５ｋｂの領域をいう。
【００１６】
本発明において、「ユニバーサルプライマー」とは、ミトコンドリアＤＮＡを認識し得るプライマーをいい、さらには、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの１４種の動物から選択される少なくとも２種以上について、ミトコンドリアＤＮＡの相同性の高い領域を認識し、該プライマーを用いることにより、各動物種のミトコンドリアＤＮＡの特定の領域を増幅しうるプライマーをいう。好ましくは上記１４種のすべての動物種について、各動物種のミトコンドリアＤＮＡの特定の領域を増幅しうるプライマーが好適である。また、本発明のユニバーサルプライマーは、さらに上記の１４種以外の動物種のミトコンドリアＤＮＡの特定の領域を増幅しうるものであってもよい。
【００１７】
本発明のユニバーサルプライマーは次のようにして得ることができる。上記ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの１４動物種のミトコンドリアＤＮＡの完全、あるいは部分塩基配列を公的ＤＮＡデータベースから取得し、これらの塩基配列を比較して相同性がきわめて高い領域を調べる。該相同性が極めて高い領域を標的としたオリゴヌクレオチドをユニバーサルプライマーとして設計することができる。相同性の高い領域は、例えばGenetyx-Winなどの一般的に使用されている遺伝子解析ソフトを用いて調べることができる。しかしながら、ユニバーサルプライマーの設計は、塩基配列の相同性のほか、増幅するＤＮＡの長さ、各動物種での増幅効率、各種検出プライマーとの非特異反応の排除などを考慮して選択しなければならない。従って、相同性が高いという観点のみからユニバーサルプライマーを設計することは殆ど不可能である。
【００１８】
具体的には次のようにしてユニバーサルプライマーを設計することができる。まず、既知のデータベースで公開されているミトコンドリアＤＮＡの塩基配列を比較検討し、遺伝子解析ソフトを用いて、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリについて、相同性の高い領域二ヶ所を調べる。さらにソフトが機能しなかった微細なずれを手動で調節した遺伝子リストを作成し、そのなかでユニバーサルプライマーとして機能しうる部分であって、種特異性のある部分も含めて増幅可能であり、遺伝子配列のバランスの良い部位を選別する。この二つの領域に含まれる塩基配列に相補的なオリゴヌクレオチドを幾つか検討し、ユニバーサルプライマーを取得する。このようにして選択された該相同性の高い領域の一つはミトコンドリアＤＮＡのチトクロームｂ遺伝子中に存在し、他方は１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子中に存在することを確認することができる。
【００１９】
上記方法により取得したユニバーサルプライマーで挟まれるミトコンドリアＤＮＡの領域はチトクロームｂ遺伝子からＤ−ループ、１２ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子、１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子にいたる約４〜５ｋｂの領域である。
【００２０】
該ユニバーサルプライマーを所定条件のＤＮＡ増幅反応に供することで、少なくともヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシおよびブタ由来のミトコンドリアＤＮＡのチトクロームｂ遺伝子からＤ−ループ、１２ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子、１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子にいたるＤＮＡ断片を検出可能に増幅する。また、例えばニワトリのミトコンドリアＤＮＡのように、理論的には本発明のユニバーサルプライマーで増幅可能な塩基配列が存在するにもかかわらず、検出感度の問題で増幅産物が検出されない場合もある。
【００２１】
本発明のユニバーサルプライマーの、各動物のミトコンドリアＤＮＡ上における標的部位として表１に示す領域および図１ｂに示す部位が例示される。また、ユニバーサルプライマーの具体的な塩基配列は、表２（配列表）に示す配列番号１および２が例示される。
【００２２】
【表１】
2007209281.tif 000002
【００２３】
【表２】
2007209281.tif 000003
【００２４】
本発明のユニバーサルプライマーは、上記特定の部位を普遍的に増幅しうるオリゴヌクレオチドであって、塩基数が１５〜５０、好ましくは１５〜４０、より好ましくは２０〜３０の間から選択される長さであり、具体的には以下の１）〜３）で示される各オリゴヌクレオチドから選択される。
１）配列表の配列番号１または２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
２）上記１）で示されるオリゴヌクレオチドから選択されるいずれかのオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
３）上記１）または２）から選択されるオリゴヌクレオチドに、１もしくは複数個の塩基が置換し、欠失し、挿入し、あるいは付加されてなるオリゴヌクレオチド。
【００２５】
ＤＮＡをＰＣＲ法により増幅するためには、通常フォワードプライマーとリバースプライマーの２種をプライマーセットとして使用する。例えば配列番号１に示すフォワードプライマーと配列番号２に示すリバースプライマーの２種をプライマーセットとして使用することで、ミトコンドリアＤＮＡの上記特定の部位を普遍的に増幅することができる。ユニバーサルプライマーとして使用しうるフォワードプライマーとリバースプライマーのプライマーセットは、上記の１）〜３）に示される各オリゴヌクレオチドから選択され、鋳型となる塩基配列との関係で決定される。
【００２６】
本発明の「種検出プライマー」は、前記ユニバーサルプライマーで増幅されると予測されるミトコンドリアＤＮＡ領域内を対象として、各動物種に特異的な塩基配列に基づいて設計することができる。すなわち、本発明の種検出プライマーは、増幅操作を行ったときに、上記ユニバーサルプライマーにより増幅されるミトコンドリアＤＮＡの領域に含まれる塩基配列について、対象動物種特異的に増幅し、他の動物種では増幅しないように設計されたオリゴヌクレオチドをいう。ただし、オリゴヌクレオチドの塩基配列の関係から、対象動物種ではない動物種のＤＮＡが非特異的に増幅する場合であっても、増幅産物のサイズから対象動物種と他の動物種が判別されるように設計されているのであれば、若干の非特異反応が認められるものであっても良い。
【００２７】
本発明の各種検出プライマーは、各動物種由来の特定の部位を増幅しうるオリゴヌクレオチドであればよく、特に限定されないが、塩基数が１５〜５０、好ましくは１５〜４０、より好ましくは２０〜３０の間から選択される長さであり、具体的には以下の１）〜３）に示される各オリゴヌクレオチドから選択される。
１）配列表の配列番号３〜３０のいずれかで示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
２）上記１）に示されるオリゴヌクレオチドから選択されるいずれかのオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
３）上記１）または２）から選択されるオリゴヌクレオチドに、１もしくは複数個の塩基が置換し、欠失し、挿入し、あるいは付加されてなるオリゴヌクレオチド。
【００２８】
ＤＮＡをＰＣＲ法により増幅するためには、通常フォワードプライマーとリバースプライマーの２種をプライマーセットとして使用する。例えば配列番号３に示すフォワードプライマーと配列番号４に示すリバースプライマーの２種をプライマーセットとして使用することで、ミトコンドリアＤＮＡの上記特定の部位に含まれるヒト特異的な部位を増幅することができる。各種検出プライマーとして使用しうるフォワードプライマーとリバースプライマーのプライマーセットは、上記の１）〜３）に示される各オリゴヌクレオチドから選択され、鋳型となる塩基配列との関係で決定される。
【００２９】
同様にして、各動物種検出のフォワードプライマーとリバースプライマーについても、配列番号５〜３０に具体的に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのほか、上記の１）〜３）に示される各オリゴヌクレオチドから選択され、鋳型となる塩基配列との関係で決定される。
【００３０】
本発明のヒト検出プライマーは、所定条件のＤＮＡ増幅反応に供されることによりヒト由来ＤＮＡのミトコンドリアＤＮＡの特定領域を検出可能に増幅することができる。しかし、同じ条件のＤＮＡ増幅反応に供されることによっては他の動物種由来のＤＮＡを増幅しないオリゴヌクレオチドである。具体的には表２（配列表）の配列番号３および４に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが例示される。
【００３１】
本発明のアフリカミドリザル検出プライマーは、所定条件のＤＮＡ増幅反応に供されることによりアフリカミドリザル由来ＤＮＡのミトコンドリアＤＮＡの特定領域を検出可能に増幅することができる。また、カニクイザル由来ＤＮＡの未知領域をも検出可能に増幅する。しかし、同じ条件のＤＮＡ増幅に供されることによっては他の動物種由来のＤＮＡを増幅しないオリゴヌクレオチドである。具体的には表２（配列表）の配列番号５および６に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが例示される。
【００３２】
本発明のカニクイザル検出プライマーは、所定条件のＤＮＡ増幅反応に供されることによりカニクイザル由来ＤＮＡのミトコンドリアＤＮＡの特定領域を検出可能に増幅することができる。しかし、同じ条件のＤＮＡ増幅に供されることによっては他の動物種由来のＤＮＡを増幅しないオリゴヌクレオチドである。具体的には表２（配列表）の配列番号７および８に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが例示される。
【００３３】
上記に示した本発明のアフリカミドリザル検出プライマーとカニクイザル検出プライマーの組み合わせは、所定条件のＤＮＡ増幅反応に供されることによりアフリカミドリザル由来ＤＮＡのミトコンドリアＤＮＡの特定領域を検出可能に増幅することができる。また、カニクイザル由来ＤＮＡのミトコンドリアＤＮＡの特定領域を検出可能に増幅することができる。しかし、同じ条件のＤＮＡ増幅に供されることによっては他の動物種由来のＤＮＡを増幅しないプライマーの組み合わせである。増幅されるアフリカミドリザルＤＮＡ断片と、カニクイザルＤＮＡ断片のサイズは異なるため、検査に供したＤＮＡがアフリカミドリザル由来であるかカニクイザル由来であるかを同定することができる。
【００３４】
本発明のマウス検出プライマーは、所定条件のＤＮＡ増幅反応に供されることによりマウス由来ＤＮＡのミトコンドリアＤＮＡの特定領域を検出可能に増幅することができる。しかし、同じ条件のＤＮＡ増幅に供されることによっては他の動物種由来のＤＮＡを増幅しないオリゴヌクレオチドである。具体的には表２（配列表）の配列番号９および１０に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが例示される。
【００３５】
本発明のラット検出プライマーは、所定条件のＤＮＡ増幅反応に供されることによりラット由来ＤＮＡのミトコンドリアＤＮＡの特定領域を検出可能に増幅することができる。しかし、同じ条件のＤＮＡ増幅に供されることによっては他の動物種由来のＤＮＡを増幅しないオリゴヌクレオチドである。具体的には表２（配列表）の配列番号１１および１２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが例示される。
【００３６】
本発明のチャイニーズハムスター検出プライマーは、所定条件のＤＮＡ増幅反応に供されることによりチャイニーズハムスター由来ＤＮＡのミトコンドリアＤＮＡの特定領域を検出可能に増幅することができる。しかし、同じ条件のＤＮＡ増幅に供されることによっては他の動物種由来のＤＮＡを増幅しないオリゴヌクレオチドである。具体的には表２（配列表）の配列番号１３および１４に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが例示される。
【００３７】
本発明のシリアンハムスター検出プライマーは、所定条件のＤＮＡ増幅反応に供されることによりシリアンハムスター由来ＤＮＡのミトコンドリアＤＮＡの特定領域を検出可能に増幅することができる。しかし、同じ条件のＤＮＡ増幅に供されることによっては他の動物種由来のＤＮＡを増幅しないオリゴヌクレオチドである。具体的には表２（配列表）の配列番号１５および１６に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが例示される。
【００３８】
本発明のモルモット検出プライマーは、所定条件のＤＮＡ増幅反応に供されることによりモルモット由来ＤＮＡのミトコンドリアＤＮＡの特定領域を検出可能に増幅することができる。しかし、同じ条件のＤＮＡ増幅に供されることによっては他の動物種由来のＤＮＡを増幅しないオリゴヌクレオチドである。具体的には表２（配列表）の配列番号１７および１８に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが例示される。
【００３９】
本発明のウサギ検出プライマーは、所定条件のＤＮＡ増幅反応に供されることによりウサギ由来ＤＮＡのミトコンドリアＤＮＡの特定領域を検出可能に増幅することができる。また、カニクイザル由来ＤＮＡの未知領域をも検出可能に増幅する。しかし、同じ条件のＤＮＡ増幅に供されることによっては他の動物種由来のＤＮＡを増幅しないオリゴヌクレオチドである。具体的には表２（配列表）の配列番号１９および２０に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが例示される。増幅されるウサギＤＮＡ断片と、カニクイザルＤＮＡ断片のサイズは異なるため、検査に供したＤＮＡがウサギ由来であるかカニクイザル由来であるかを同定することができる。
【００４０】
本発明のイヌ検出プライマーは、所定条件のＤＮＡ増幅反応に供されることによりイヌ由来ＤＮＡのミトコンドリアＤＮＡの特定領域を検出可能に増幅することができる。しかし、同じ条件のＤＮＡ増幅に供されることによっては他の動物種由来のＤＮＡを増幅しないオリゴヌクレオチドである。具体的には表２（配列表）の配列番号２１および２２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが例示される。
【００４１】
本発明のネコ検出プライマーは、所定条件のＤＮＡ増幅反応に供されることによりネコ由来ＤＮＡのミトコンドリアＤＮＡの特定領域を検出可能に増幅することができる。しかし、同じ条件のＤＮＡ増幅に供されることによっては他の動物種由来のＤＮＡを増幅しないオリゴヌクレオチドである。具体的には表２（配列表）の配列番号２３および２４に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが例示される。
【００４２】
本発明のウシ検出プライマーは、所定条件のＤＮＡ増幅反応に供されることによりウシ由来ＤＮＡのミトコンドリアＤＮＡの特定領域を検出可能に増幅することができる。しかし、同じ条件のＤＮＡ増幅に供されることによっては他の動物種由来のＤＮＡを増幅しないオリゴヌクレオチドである。具体的には表２（配列表）の配列番号２５および２６に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが例示される。
【００４３】
本発明のブタ検出プライマーは、所定条件のＤＮＡ増幅反応に供されることによりブタ由来ＤＮＡのミトコンドリアＤＮＡの特定領域を検出可能に増幅することができる。しかし、同じ条件のＤＮＡ増幅に供されることによっては他の動物種由来のＤＮＡを増幅しないオリゴヌクレオチドである。具体的には表２（配列表）の配列番号２７および２８に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが例示される。
【００４４】
本発明のニワトリ検出プライマーは、所定条件のＤＮＡ増幅反応に供されることによりニワトリ由来ＤＮＡのミトコンドリアＤＮＡの特定領域を検出可能に増幅することができる。しかし、同じ条件のＤＮＡ増幅に供されることによっては他の動物種由来のＤＮＡを増幅しないオリゴヌクレオチドである。具体的には表２（配列表）の配列番号２９および３０に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが例示される。
【００４５】
表２に示す各種検出プライマーセットを用いてＤＮＡ増幅を行った場合に、予測される増幅ＤＮＡ断片のサイズを表３に示した。
【表３】
2007209281.tif 000004
【００４６】
本発明のヒト、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、ブタ、ウシ検出各プライマーセットの組み合わせ（プライマーミックス）は、所定条件のＤＮＡ増幅反応に供されることによりヒト、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、ブタ、ウシ由来各ＤＮＡのミトコンドリアＤＮＡの特定領域を検出可能に増幅することができる。しかし、同じ条件のＤＮＡ増幅反応に供されることによってはカニクイザルを除く他の動物種由来のＤＮＡを増幅しないプライマーミックスである。増幅されるヒト、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、ブタ、ウシ、カニクイザルＤＮＡ断片のサイズはそれぞれ異なるため、個々の増幅産物の塩基配列を確認する必要なく、例えば電気泳動等により分子量の違いを検査することでヒト、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、ブタ、ウシ由来ＤＮＡを検出することができる。
【００４７】
本発明のアフリカミドリザル、カニクイザル、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、イヌおよびニワトリの各種検出プライマー各プライマーセットの組み合わせ（プライマーミックス）は、所定条件のＤＮＡ増幅反応に供されることによりアフリカミドリザル、カニクイザル、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、イヌ、ニワトリ由来ＤＮＡのミトコンドリアＤＮＡの特定領域を検出可能に増幅することができる。しかし、同じ条件のＤＮＡ増幅反応に供されることによっては他の動物種由来のＤＮＡを増幅しないプライマーミックスである。増幅されるアフリカミドリザル、カニクイザル、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、イヌ、ニワトリＤＮＡ断片のサイズはそれぞれ異なるため、上記同様に個々の増幅産物の塩基配列を確認する必要なく、アフリカミドリザル、カニクイザル、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、イヌ、ニワトリ由来ＤＮＡを検出することができる。
【００４８】
本発明のヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの１４種の種検出各プライマーセットの組み合わせ（プライマーミックス）は、所定条件のＤＮＡ増幅反応に供されることによりヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、およびニワトリ由来ＤＮＡのミトコンドリアＤＮＡの特定領域を検出可能に増幅することができる。また、カニクイザルＤＮＡの未知領域を検出可能に増幅する。増幅されるヒト、アフリカミドリザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタＤＮＡ断片のサイズはそれぞれ異なるため、上記同様に個々の増幅産物の塩基配列を確認する必要なく、ヒト、アフリカミドリザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ由来ＤＮＡを検出することができる。カニクイザルＤＮＡにおいて増幅される未知領域のＤＮＡ断片のサイズはニワトリＤＮＡにおいて増幅されるニワトリ特異的ＤＮＡ断片のサイズとほぼ同じであるため、カニクイザル特異的ＤＮＡ断片が観察された場合には被検ＤＮＡにカニクイザルＤＮＡが存在することを証明できるが、ニワトリＤＮＡとの混合物である可能性を簡便には排除することはできない。また、ニワトリＤＮＡに関しては、ニワトリ特異的ＤＮＡ断片が増幅され、かつカニクイザル特異的ＤＮＡ断片が認められない場合に、被検ＤＮＡにニワトリＤＮＡが存在することが分かる。しかし、被検ＤＮＡにカニクイザルＤＮＡが検出される場合には、被検ＤＮＡがカニクイザルＤＮＡであるのか、あるいはカニクイザルＤＮＡとニワトリＤＮＡの混合物であるのかは、簡便には識別することができない。
【００４９】
プライマーは、通常用いられる方法によって合成することができる。一般的には、ＤＮＡ自動合成機を用いて支持体上でヌクレオチドを伸長し、次いで、脱保護および支持体からの切断を行う。次いで、通常用いられる方法（例えば、カラムクロマトグラフィー）によって精製して、目的のプライマーを得ることができる。配列表の配列番号１〜３０に示される各塩基配列に、１もしくは複数個の塩基が置換し、欠失し、挿入し、あるいは付加されたプライマーや、相補的なプライマーも上記方法により調製することができる。
【００５０】
被検試料としては、細胞、組織、（細胞、組織の）培養上清、血液、体液などが挙げられる。試料からのＤＮＡの抽出は、例えば、フェノール・クロロホルム法のような常法や、市販のＤＮＡ抽出キット（例えば、東洋紡社製、MAGEXTRACTOR GENOME DNA抽出キット）を用いることができる。試料から抽出したＤＮＡを検体として、本発明のプライマーを用いて核酸増幅反応を行う。核酸増幅反応は、本発明のプライマーを用いて所望のＤＮＡが増幅しうる反応であれば自体公知の増幅反応を適用することができ、特に限定されないが、最も汎用的に行われている増幅反応としてＰＣＲ反応を適用するのが最も好適である。ＰＣＲ反応により、本発明の各プライマーセットに挟まれた領域のＤＮＡ断片が増幅される。
【００５１】
本発明の動物種検出方法は、以下の工程を含むことを特徴とする。
１）少なくとも２種以上の動物種に対して、ミトコンドリアＤＮＡの特定の部位を普遍的に増幅しうるユニバーサルプライマーを用いて、ＤＮＡの増幅処理を行う第一次増幅工程；
２）上記第一次増幅工程により得られた一次増幅産物を検体とし、検出すべき動物種に特異的な種検出プライマーを用いて、該動物種のＤＮＡを増幅する第二次増幅工程；
３）上記第二次増幅工程により得られた二次増幅産物を解析することにより、動物種を同定する工程。
【００５２】
種特異的ＤＮＡ断片を増幅させる場合に、核由来ＤＮＡを鋳型とした増幅反応を抑えるために、まず、第一次増幅工程において、ユニバーサルプライマーを用いて一次増幅反応を行い、ミトコンドリアＤＮＡのチトクロームｂ遺伝子からＤ−ループ、１２ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子、１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子にいたる領域のＤＮＡをあらかじめ増幅させておく。この一次増幅反応により得られた一次増幅産物を検体として、第二次増幅工程において、各種検出プライマーを用いた二次増幅反応を行う。
【００５３】
ＤＮＡ増幅の反応条件は特に限定されず、各プライマーについてそれぞれ適切な条件を設定すればよい。
例えば、ユニバーサルプライマーを用いる第一次増幅工程においては、９４℃で５分熱変性した後、５９℃で一回目のアニーリングを５分行い、次いで、伸長反応７２℃で２．５分、熱変性９４℃で４５秒、アニーリング５９℃で４５秒からなる一連の反応を３５サイクル繰り返し、最後に７２℃で１０分の伸長反応を行うことができる。
【００５４】
また、第二次増幅工程において、種検出プライマーを使用する場合には、９４℃で５分熱変性した後、６０℃で一回目のアニーリングを５分行い、次いで、伸長反応７２℃で１．５分、熱変性９４℃で４５秒、アニーリング６０℃で３０秒からなる一連の反応を２５から３５サイクル繰り返し、最後に７２℃で１０分の伸長反応を行うことができる。
上記の反応条件は例示であって、所望のＤＮＡを増幅できる条件であれば、これらに限定されるものではないことは明らかである。
【００５５】
反応系におけるプライマーの濃度は、所望のＤＮＡが増幅しうる条件であれば良く、特に制限されないが、各プライマーは一般的には100〜1000 nMで使用することができ、約200 nMで使用することが好ましい。反応系のMgイオン濃度は、1.5〜3.0 mM程度、好適には2 mM程度とすることが望ましい。また、反応系に加えるTaqポリメラーゼは、たとえばタカラ社製 Ex taqのような、増幅効率に優れたものが望ましいが、通常のTaqポリメラーゼによってもＰＣＲ反応のサイクルを増すことにより増幅されるＤＮＡ断片の量を増加させることができる。
【００５６】
上記第二次増幅工程より得られた二次増幅産物（ＤＮＡ断片）を解析することにより、動物種を検出することができる。二次増幅産物の解析法としては、二次増幅産物から動物種を検出しうる方法であれば良く、特に限定されないが、例えば増幅産物の塩基配列のシークエンスを解析する方法や、増幅産物の分子量（サイズ）の違いを検出する方法などが挙げられる。本発明の種検出プライマーを用いて得られた二次増幅産物は、そのサイズが異なったものが得られるように設計されているため、分子量の違いを検出する方法を適用することができ、例えば電気泳動法による解析が好適である。具体的には、アガロースゲル電気泳動により二次増幅産物を分離し、エチジウムブロマイド等ＤＮＡ染色試薬により染色し、検出することができる。
【００５７】
試料中に所望の動物種由来のＤＮＡが存在していれば、上記のようにして増幅されたＤＮＡ断片が検出され得る。検出限界は、用いるプライマーの種類および組み合わせ、試料中の対象ＤＮＡの量、ＰＣＲ反応条件、検出方法などの種々の要因によって異なり得る。適切な条件を選択すれば、微量の試料においても、高感度でＤＮＡの存在を検出することができ、動物種を検出し、同定することができる。
例えば、適切な条件を設定すれば、試料にヒト由来ＤＮＡが含まれている場合、ユニバーサルプライマーとヒト検出プライマーを用いて、ＤＮＡ濃度1pg/50μlの反応液の検出感度で検出することが可能である。
【００５８】
本発明は、動物種検出方法の他、ユニバーサルプライマー、各種検出プライマーならびに各プライマーについてのプライマーセットも含まれる。また本発明は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、ブタおよびウシの各種検出プライマーを組み合わせてなるプライマーミックス、並びにアフリカミドリザル、カニクイザル、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、イヌおよびニワトリの各種検出プライマーを組み合わせてなるプライマーミックスにも及ぶ。さらには、１４種すべての各種検出プライマーを組み合わせてなるプライマーミックスにも及ぶ。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、実施例においては、プライマーの塩基配列が特定されて示されているが、その塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに１もしくは複数個の塩基が置換し、欠失し、挿入し、あるいは付加されたオリゴヌクレオチドであって、ＤＮＡ増幅反応に供されることによって、特定の動物種由来ＤＮＡを特異的に検出し得るプライマーもまた、本発明の範囲に含まれることはいうまでもない。
【００６０】
（実施例１）ユニバーサルプライマーによる各動物種由来のＤＮＡの増幅の有無の確認
ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの１４種類の動物種由来のＤＮＡの増幅の有無の確認を行った。
【００６１】
１）プライマーの調製
配列表の配列番号１および２に示す各ユニバーサルプライマーは、外部委託によりＤＮＡ合成機を用いて合成した。
２）ＤＮＡの調製
ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの１４動物種の各ＤＮＡは、各動物種由来細胞から、MAGEXTRACTOR GENOME DNA抽出キット（東洋紡社製）にて精製して得た。
３）ＰＣＲ反応
各動物種由来ＤＮＡの各々100 ngを鋳型とし、個別にユニバーサルプライマーを用いたＰＣＲを行った。反応液は各々総容量50μlとし、その組成は以下の通りである（いずれも終濃度）。
【００６２】
20 mM Tris-HCl (pH8.0)
50 mM KCl
2 mM MgCl2
200 μM dNTPs
200 nM ユニバーサルプライマー（フォワードプライマー）
200 nM ユニバーサルプライマー（リバースプライマー）
1.25 units/50μl Taq ポリメラーゼ（タカラ社製，製品名Ex taq）
100 ng/50μl 鋳型ＤＮＡ
【００６３】
この反応液をＰＣＲ装置であるサーマルサイクラー（タカラ社製）を用いて、９４℃で５分熱変性した後、５９℃で一回目のアニーリングを５分行った。次いで、伸長反応７２℃で２．５分、熱変性９４℃で４５秒、アニーリング５９℃で４５秒からなる一連の反応を３５サイクル繰り返し、最後に７２℃で１０分の伸長反応を行った。
【００６４】
反応終了後、各増幅産物の確認のため、１％アガロースゲル（SeaChem社、GTGアガロース）を支持体として、電気泳動装置（Mupid-2）により各一次ＰＣＲ産物（9μl）を電気泳動し、1μg/ml エチジウムブロマイドで染色後、ＵＶランプ下または蛍光イメージアナライザー（FMBIO II 日立ソフト社製）でバンドを確認した。
【００６５】
その結果、図２に示すように、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタの各ＤＮＡを鋳型とした場合に、各々約４〜５ｋｂの増幅産物が確認され、ユニバーサルプライマーが認識するミトコンドリアＤＮＡ配列から予想される増幅断片のサイズと一致した。ニワトリＤＮＡを鋳型とした場合には検出可能には増幅が認められなかった。
【００６６】
（実施例２）１４種類の各種検出プライマーによる増幅産物のサイズの確認
ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの各ＤＮＡを用いて各種検出プライマーによりＤＮＡを増幅したときの増幅産物の大きさを確認した。
【００６７】
１）プライマーの調製
配列表の配列番号１および２に示すユニバーサルプライマーおよび配列表の配列番号３〜３０に示す各種検出プライマーは、実施例１と同手法によりＤＮＡ合成機を用いて合成した。
２）ＤＮＡの調製
上記１４動物種の各ＤＮＡは、実施例１と同手法により各動物種由来細胞から、MAGEXTRACTOR GENOME DNA抽出キット（東洋紡社製）にて精製した。
３）ネスティッドＰＣＲ
各動物種由来ＤＮＡに対する各種検出プライマーにより増幅される産物のサイズを確認するために、以下の第一次ＰＣＲ、第二次ＰＣＲからなるネスティッドＰＣＲを行った。まず、各動物種由来ＤＮＡ 100 ngを鋳型とし、ユニバーサルプライマーを用いた一次ＰＣＲを行った。反応液は総容量50μlとし、その組成は以下の通りである（いずれも終濃度）。
【００６８】
20 mM Tris-HCl (pH8.0)
50 mM KCl
2 mM MgCl2
200 μM dNTPs
200 nM ユニバーサルプライマー（フォワードプライマー）
200 nM ユニバーサルプライマー（リバースプライマー）
1.25 units/50μl Taq ポリメラーゼ（タカラ社製，製品名Ex taq）
100 ng/50μl 鋳型ＤＮＡ
【００６９】
この反応液をＰＣＲ装置であるサーマルサイクラー（タカラ社製）を用いて、実施例１と同様に９４℃で５分熱変性した後、５９℃で一回目のアニーリングを５分行った。次いで、伸長反応７２℃で２．５分、熱変性９４℃で４５秒、アニーリング５９℃で４５秒からなる一連の反応を３５サイクル繰り返し、最後に７２℃で１０分の伸長反応を行った。次いで、各動物種由来ＤＮＡを鋳型とした一次ＰＣＲ産物（一次ＰＣＲ反応後の溶液）を検体とし、各種検出プライマーを用いて二次ＰＣＲを行った。反応液は総容量 50μlとし、その組成は以下の通りである（いずれも終濃度）。
【００７０】
20 mM Tris-HCl (pH8.0)
50 mM KCl
2 mM MgCl2
200 μM dNTPs
200 nM  種検出プライマー（フォワードプライマー）
200 nM  種検出プライマー（リバースプライマー）
1.25 units/50μl Taq ポリメラーゼ（タカラ社製，製品名Ex taq）
一次ＰＣＲ産物 0.1μl/50μl
【００７１】
この反応液をサーマルサイクラー（タカラ社製）を用いて、９４℃で５分熱変性した後、６０℃で一回目のアニーリングを５分行った。次いで、伸長反応７２℃で１．５分、熱変性９４℃で４５秒、アニーリング６０℃で３０秒からなる一連の反応を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃で１０分の伸長反応を行った。
【００７２】
二次ＰＣＲ反応終了後、各種検出プライマーにより得られた各二次ＰＣＲ産物の大きさを確認するために、2% アガロースゲル（SeaChem社、GTGアガロース）を支持体として、電気泳動装置（Mupid-2）により各二次ＰＣＲ産物（9μl）を電気泳動し、1μg/ml エチジウムブロマイドで染色後、ＵＶランプ下または蛍光イメージアナライザー（FMBIO II 日立ソフト社製）でバンドを確認した（図３）。
【００７３】
その結果、各動物種について一本のバンドが確認され、そのサイズは既知のミトコンドリアＤＮＡ配列から予測されるサイズ（表３）とほぼ一致した。すなわち、本発明の種検出プライマーを用いると、サイズの異なるＰＣＲ産物が得られるため、ＰＣＲ産物のシークエンスを調べる必要なく、各動物種を検出することが可能となることが確認された。
【００７４】
（実施例３）１４種類の各種検出プライマーの特異性の確認
ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの各ＤＮＡを用いて各種検出プライマーによりＤＮＡを増幅したときの動物種特異性の確認を行った。
【００７５】
１）プライマーの調製
各プライマーは、実施例２と同手法によりＤＮＡ合成機を用いて合成した。
２）ＤＮＡの調製
上記１４動物種の各ＤＮＡは、実施例１と同手法により各動物種由来細胞から、MAGEXTRACTOR GENOME DNA抽出キット（東洋紡社製）にて精製した。
３）ネスティッドＰＣＲ
各動物種由来ＤＮＡに対する各種検出プライマーの特異性を確認するために、第一次ＰＣＲ、第二次ＰＣＲからなるネスティッドＰＣＲを行った。ＰＣＲは、実施例２と同手法により行った。
【００７６】
反応終了後、各目的産物の確認のため、2% アガロースゲル（SeaChem社、GTGアガロース）を支持体として、電気泳動装置（Mupid-2）により各一次ＰＣＲ産物（9μl）を電気泳動し、1μg/ml エチジウムブロマイドで染色後、ＵＶランプ下または蛍光イメージアナライザー（FMBIO II 日立ソフト社製）でバンドを確認した（図４）。
【００７７】
図４（ａ）〜（ｎ）の結果から明らかなように、各種検出プライマーを使用した結果、全ての種について、塩基配列から予測されるサイズの部位に種特異的に増幅産物が確認された。
【００７８】
図４（ａ）に示すように、（二次ＰＣＲの際に）ヒト検出プライマーを使用した結果、ヒトＤＮＡの場合にのみ、塩基配列から予測されるサイズである４４１ｂｐに一致するサイズの増幅産物（バンド）が確認され、他の動物種では増幅産物は認められなかった。
【００７９】
また、図４（ｂ）に示すように、アフリカミドリザル検出プライマーを使用した結果には、アフリカミドリザルＤＮＡにおいて塩基配列から予測されるサイズである３０１ｂｐに一致するサイズの増幅産物が確認されたが、カニクイザルＤＮＡにおいても約３００ｂｐの増幅産物が見られた。この増幅産物が認められる理由としては、アフリカミドリザル検出プライマーの認識する領域において、アフリカミドリザルミトコンドリアＤＮＡ配列とカニクイザルミトコンドリアＤＮＡ配列の間にやや高い相同性があり、アフリカミドリザル検出プライマーがカニクイザルＤＮＡの相同的な領域を非特異的に増幅している可能性が考えられる。アフリカミドリザル、カニクイザル以外の動物種では増幅産物は認められなかった。
【００８０】
また、図４（ｃ）に示すように、カニクイザル検出プライマーを使用した結果、カニクイザルＤＮＡの場合にのみ、塩基配列から予測されるサイズである１１３２ｂｐに一致するサイズの増幅産物が確認され、他の動物種では増幅産物は認められなかった。
【００８１】
また、図４（ｄ）に示すように、マウス検出プライマーを使用した結果、マウスＤＮＡの場合にのみ、塩基配列から予測されるサイズである９４８ｂｐに一致するサイズの増幅産物が確認され、他の動物種では増幅産物は認められなかった。
【００８２】
また、図４（ｅ）に示すように、ラット検出プライマーを使用した結果、ラットＤＮＡの場合にのみ、塩基配列から予測されるサイズである４９３ｂｐに一致するサイズの増幅産物が確認され、他の動物種では増幅産物は認められなかった。
【００８３】
また、図４（ｆ）に示すように、チャイニーズハムスター検出プライマーを使用した結果、チャイニーズハムスターＤＮＡの場合にのみ、塩基配列から予測されるサイズである６０１ｂｐに一致するサイズの増幅産物が確認され、他の動物種では増幅産物は認められなかった。
【００８４】
また、図４（ｇ）に示すように、シリアンハムスター検出プライマーを使用した結果、シリアンハムスターＤＮＡの場合にのみ、塩基配列から予測されるサイズである２４５ｂｐに一致するサイズの増幅産物が確認され、他の動物種では増幅産物は認められなかった。
【００８５】
また、図４（ｈ）に示すように、モルモット検出プライマーを使用した結果、モルモットＤＮＡの場合にのみ、塩基配列から予測されるサイズである３３９ｂｐに一致するサイズの増幅産物が確認され、他の動物種では増幅産物は認められなかった。
【００８６】
また、図４（ｉ）に示すように、ウサギ検出プライマーを使用した結果、ウサギＤＮＡにおいて塩基配列から予測されるサイズである７０４ｂｐに一致するサイズの増幅産物が確認されたが、カニクイザルＤＮＡにおいても約５５０ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐの増幅産物が見られた。ウサギ、カニクイザル以外の動物種では増幅産物は認められなかった。
【００８７】
また、図４（ｊ）に示すように、イヌ検出プライマーを使用した結果、イヌＤＮＡの場合にのみ、塩基配列から予測されるサイズである７５５ｂｐに一致するサイズの増幅産物が確認され、他の動物種では増幅産物は認められなかった。
【００８８】
また、図４（ｋ）に示すように、ネコ検出プライマーを使用した結果、ネコＤＮＡの場合にのみ、塩基配列から予測されるサイズである１３９１ｂｐに一致するサイズの増幅産物が確認され、他の動物種では増幅産物は認められなかった。
【００８９】
また、図４（ｌ）に示すように、ウシ検出プライマーを使用した結果、ウシＤＮＡの場合にのみ、塩基配列から予測されるサイズである１０９０ｂｐに一致するサイズの増幅産物が確認され、他の動物種では増幅産物は認められなかった。
【００９０】
また、図４（ｍ）に示すように、ブタ検出プライマーを使用した結果、ブタＤＮＡの場合にのみ、塩基配列から予測されるサイズである８１９ｂｐに一致するサイズの増幅産物が確認され、他の動物種では増幅産物は認められなかった。
【００９１】
また、図４（ｎ）に示すように、ニワトリ検出プライマーを使用した結果、ニワトリＤＮＡの場合にのみ、塩基配列から予測されるサイズである１９７ｂｐに一致するサイズの増幅産物が確認され、他の動物種では増幅産物は認められなかった。実施例１に示したように、ニワトリＤＮＡの一次ＰＣＲにおいてはユニバーサルプライマーによる増幅産物が検出可能には認められないが、ニワトリ検出プライマーを用いた二次ＰＣＲを行うことにより、ニワトリ特異的な増幅が可能である。この理由として、一次ＰＣＲにおいて検出可能ではないものの増幅が起こっている可能性と、計算上ニワトリＤＮＡが二次ＰＣＲ反応液中に0.2 ng/50μlの濃度で存在するため、ニワトリＤＮＡを直接鋳型とした二次ＰＣＲ反応が起こっている可能性がある。
【００９２】
（実施例４）各動物ＤＮＡの検出感度の検討
ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタおよびニワトリの各ＤＮＡを用いて、各種検出プライマーによりＤＮＡを増幅したときの検出感度の確認を行った。
【００９３】
１）プライマーの調製
各プライマーは、実施例２と同様にＤＮＡ合成機を用いて合成した。
２）ＤＮＡの調製
上記１４動物種の各ＤＮＡは、実施例１と同手法により各動物種由来細胞から、MAGEXTRACTOR GENOME DNA抽出キット（東洋紡社製）にて精製した。
３）ネスティッドＰＣＲ
以下の一次ＰＣＲ、二次ＰＣＲからなるネスティッドＰＣＲを行い、本発明のプライマーによる各動物種由来ＤＮＡの検出感度を確認した。
まず、反応に供する各動物種由来ＤＮＡ量を 10 fgから100 ngの間で段階的に変え、ユニバーサルプライマーを用いた一次ＰＣＲを行った。反応液の総容量は50μlとし、その組成は以下の通りである（いずれも終濃度）。
【００９４】
20 mM Tris-HCl (pH8.0)
50 mM KCl
2 mM MgCl2
200 μM dNTPs
200 nM ユニバーサルプライマー（フォワードプライマー）
200 nM ユニバーサルプライマー（リバースプライマー）
1.25 units/50μl Taqポリメラーゼ（タカラ社製，製品名Ex taq）
10 fg/50μl〜100 ng/50μl 鋳型ＤＮＡ
【００９５】
この反応液をＰＣＲ装置であるサーマルサイクラー（タカラ社製）を用いて、９４℃で５分熱変性した後、５９℃で一回目のアニーリングを５分行った。次いで、伸長反応７２℃で２．５分、熱変性９４℃で４５秒、アニーリング５９℃で４５秒からなる一連の反応を３５サイクル繰り返し、最後に７２℃で１０分の伸長反応を行った。次いで、一次ＰＣＲ産物（一次ＰＣＲ反応後の溶液）を検体とし、一次ＰＣＲに供したＤＮＡの由来種に一致する種検出プライマーをそれぞれ用いて二次ＰＣＲを行った。反応液の総容量は50μlとし、その組成は以下の通りである（いずれも終濃度）。
【００９６】
20 mM Tris-HCl (pH8.0)
50 mM KCl
2 mM MgCl2
200 μM dNTPs
200 nM 種検出プライマー（フォワードプライマー）
200 nM 種検出プライマー（リバースプライマー）
1.25 units/50μl Taqポリメラーゼ（タカラ社製，製品名Ex taq）
一次ＰＣＲ産物 0.1μl/50μl
【００９７】
この反応液をサーマルサイクラー（タカラ社製）を用いて、９４℃で５分熱変性した後、６０℃で一回目のアニーリングを５分行った。次いで、伸長反応７２℃で１．５分、熱変性９４℃で４５秒、アニーリング６０℃で３０秒からなる一連の反応を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃で１０分の伸長反応を行った。
【００９８】
反応終了後、各目的産物の確認のため、2%アガロースゲル（SeaChem社、GTGアガロース）を支持体として、電気泳動装置（Mupid-2）により各一次ＰＣＲ産物（9μl）を電気泳動し、1μg/ml エチジウムブロマイドで染色後、ＵＶランプ下または蛍光イメージアナライザー（FMBIO II 日立ソフト社製）でバンドを確認した。
【００９９】
図５（ａ）に示すように、二次ＰＣＲにてヒト検出プライマーを用いた場合、ヒトＤＮＡの検出限界は 1 pgであった。
また、図５（ｂ）に示すように、二次ＰＣＲにてアフリカミドリザル検出プライマーを用いた場合、アフリカミドリザルＤＮＡの検出限界は 1 pgであった。
また、図５（ｃ）に示すように、二次ＰＣＲにてカニクイザル検出プライマーを用いた場合、カニクイザルＤＮＡの検出限界は 100 fgであった。
また、図５（ｄ）に示すように、二次ＰＣＲにてマウス検出プライマーを用いた場合、マウスＤＮＡの検出限界は 1 pgであった。
また、図５（ｅ）に示すように、二次ＰＣＲにてラット検出プライマーを用いた場合、ラットＤＮＡの検出限界は 100 fgであった。
また、図５（ｆ）に示すように、二次ＰＣＲにてチャイニーズハムスター検出プライマーを用いた場合、チャイニーズハムスターＤＮＡの検出限界は 1 pgであった。
また、図５（ｇ）に示すように、二次ＰＣＲにてシリアンハムスター検出プライマーを用いた場合、シリアンハムスターＤＮＡの検出限界は 100 fgであった。
また、図５（ｈ）に示すように、二次ＰＣＲにてモルモット検出プライマーを用いた場合、モルモットＤＮＡの検出限界は 100 fgであった。
また、図５（ｉ）に示すように、二次ＰＣＲにてウサギ検出プライマーを用いた場合、ウサギＤＮＡの検出限界は 10 pgであった。
また、図５（ｊ）に示すように、二次ＰＣＲにてイヌ検出プライマーを用いた場合、イヌＤＮＡの検出限界は 1 pgであった。
また、図５（ｋ）に示すように、二次ＰＣＲにてネコ検出プライマーを用いた場合、ネコＤＮＡの検出限界は 10 pgであった。
また、図５（ｌ）に示すように、二次ＰＣＲにてウシ検出プライマーを用いた場合、ウシＤＮＡの検出限界は 100 fgであった。
また、図５（ｍ）に示すように、二次ＰＣＲにてブタ検出プライマーを用いた場合、ブタＤＮＡの検出限界は 1 pgであった。
また、図５（ｎ）に示すように、二次ＰＣＲにてニワトリ検出プライマーを用いた場合、ニワトリＤＮＡの検出限界は 10 pgであった。
【０１００】
（実施例５）マウス由来ＤＮＡに混入した微量なヒトＤＮＡの検出
１）プライマーの調製
各プライマーは、実施例２と同様にＤＮＡ合成機を用いて合成した。
２）ＤＮＡの調製
マウスＤＮＡ、ヒトＤＮＡは、各種にそれぞれ由来する細胞から、実施例１と同様にMAGEXTRACTOR GENOME DNA抽出キット（東洋紡社製）にて精製した。
３）ネスティッドＰＣＲ
マウスＤＮＡとヒトＤＮＡについて、各ＤＮＡの混合比を変えて混合したものを鋳型ＤＮＡとし、反応液量を50μlとして、ユニバーサルプライマーを用いた一次ＰＣＲを行った。反応液の組成は以下の通りである（いずれも終濃度）。
【０１０１】
20 mM Tris-HCl (pH8.0)
50 mM KCl
2 mM MgCl2
200 μM dNTPs
200 nM ユニバーサルプライマー（フォワードプライマー）
200 nM ユニバーサルプライマー（リバースプライマー）
1.25 units/50μl Taqポリメラーゼ（タカラ社製，製品名Ex taq）
約100 ng/50μl マウスＤＮＡ・ヒトＤＮＡ混合物
【０１０２】
この反応液をＰＣＲ装置であるサーマルサイクラー（タカラ社製）を用いて、９４℃で５分熱変性した後、５９℃で一回目のアニーリングを５分行った。次いで、伸長反応７２℃で２．５分、熱変性９４℃で４５秒、アニーリング５９℃で４５秒からなる一連の反応を３５サイクル繰り返し、最後に７２℃で１０分の伸長反応を行った。次いで、一次ＰＣＲ産物（一次ＰＣＲ後の溶液）を検体とし、ＰＣＲ反応液量を50μlとしてヒト検出プライマーを用いて二次ＰＣＲを行った。反応液の組成は以下の通りである（いずれも終濃度）。
【０１０３】
20 mM Tris-HCl (pH8.0)
50 mM KCl
2 mM MgCl2
200 μM dNTPs
200 nM ヒト検出プライマー（フォワードプライマー）
200 nM ヒト検出プライマー（リバースプライマー）
1.25 units/50μl Taqポリメラーゼ（タカラ社製, 製品名Ex taq）
一次ＰＣＲ産物 0.1μl/50μl
【０１０４】
この反応液をサーマルサイクラー（タカラ社製）を用いて、９４℃で５分熱変性した後、６０℃で一回目のアニーリングを５分行った。次いで、伸長反応７２℃で１．５分、熱変性９４℃で４５秒、アニーリング６０℃で３０秒からなる一連の反応を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃で１０分の伸長反応を行った。
【０１０５】
反応終了後、各目的産物の確認のため、2% アガロースゲル（SeaChem社、GTGアガロース）を支持体として、電気泳動装置（Mupid-2）により各一次ＰＣＲ産物（9μl）を電気泳動し、1μg/ml エチジウムブロマイドで染色後、ＵＶランプ下または蛍光イメージアナライザー（FMBIO II 日立ソフト社製）でバンドを確認した。
【０１０６】
図６に示すように、マウスＤＮＡ 100 ngにヒトＤＮＡ 10 pgを混合した場合でもヒト特異的な増幅産物が確認された。すなわち、マウスＤＮＡに対して１万分の１量のヒトＤＮＡが混入している場合でもヒトＤＮＡの検出が可能であることが示された。
【０１０７】
（実施例６）アフリカミドリザル検出プライマーとカニクイザル検出プライマーのミックスを用いたアフリカミドリザルおよびカニクイザルＤＮＡの検出
【０１０８】
１）プライマーの調製
各プライマーは、実施例２と同様にＤＮＡ合成機を用いて合成した。
２）ＤＮＡの調製
アフリカミドリザルＤＮＡ、カニクイザルＤＮＡは、各種にそれぞれ由来する細胞から、実施例１と同様にMAGEXTRACTOR GENOME DNA抽出キット（東洋紡社製）にて精製した。
３）ネスティッドＰＣＲ
アフリカミドリザル、あるいはカニクイザルのＤＮＡ 100 ngを各々鋳型とし、ユニバーサルプライマーを用いた一次ＰＣＲを行った。反応液の総容量は50μlとし、その組成は以下の通りである（いずれも終濃度）。
【０１０９】
20 mM Tris-HCl (pH8.0)
50 mM KCl
2 mM MgCl2
200 μM dNTPs
200 nM ユニバーサルプライマー（フォワードプライマー）
200 nM ユニバーサルプライマー（リバースプライマー）
1.25 units/50μl Taqポリメラーゼ（タカラ社製，製品名Ex taq）
100 ng/50μl 鋳型ＤＮＡ
【０１１０】
この反応液をＰＣＲ装置であるサーマルサイクラー（タカラ社製）を用いて、９４℃で５分熱変性した後、５９℃で一回目のアニーリングを５分行った。次いで、伸長反応７２℃で２．５分、熱変性９４℃で４５秒、アニーリング５９℃で４５秒からなる一連の反応を３５サイクル繰り返し、最後に７２℃で１０分の伸長反応を行った。次いで、一次ＰＣＲ産物（一次ＰＣＲ後の溶液）を検体とし、アフリカミドリザル検出プライマーおよびカニクイザル検出プライマーを混合したプライマーミックスを用いて二次ＰＣＲを行った。反応液の総容量は50μlとし、その組成は以下の通りである（いずれも終濃度）。
【０１１１】
20 mM Tris-HCl (pH8.0)
50 mM KCl
2 mM MgCl2
200 μM dNTPs
200 nM アフリカミドリザル検出プライマー（フォワードプライマー）
200 nM アフリカミドリザル検出プライマー（リバースプライマー）
200 nM カニクイザル検出プライマー（フォワードプライマー）
200 nM カニクイザル検出プライマー（リバースプライマー）
1.25 units/50μl Taqポリメラーゼ（タカラ社製，製品名Ex taq）
一次ＰＣＲ産物 0.1μl/50μl
【０１１２】
この反応液をサーマルサイクラー（タカラ社製）を用いて、９４℃で５分熱変性した後、６０℃で一回目のアニーリングを５分行った。次いで、伸長反応７２℃で１．５分、熱変性９４℃で４５秒、アニーリング６０℃で３０秒からなる一連の反応を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃で１０分の伸長反応を行った。
【０１１３】
反応終了後、各目的産物の確認のため、2% アガロースゲル（SeaChem社、GTGアガロース）を支持体として、電気泳動装置（Mupid-2）により各一次ＰＣＲ産物（9μl）を電気泳動し、1μg/ml エチジウムブロマイドで染色後、ＵＶランプ下または蛍光イメージアナライザー（FMBIO II 日立ソフト社製）でバンドを確認した。
【０１１４】
その結果、図７に示すように、アフリカミドリザルＤＮＡを鋳型とした場合では、塩基配列から予測されるアフリカミドリザル特異的増幅産物のサイズである３０１ｂｐに一致するサイズの増幅産物が確認され、また、カニクイザルＤＮＡを鋳型とした場合では、塩基配列から予測されるカニクイザル特異的増幅産物のサイズである１１３２ｂｐに一致した唯一の増幅産物が確認された。実施例３に記述したように、カニクイザルＤＮＡを鋳型とした場合には、二次ＰＣＲ反応においてアフリカミドリザル検出プライマーのみをプライマーとして用いると非特異的な増幅がみられるが（図４（ｂ））、本実施例６のようにアフリカミドリザル検出プライマーとカニクイザル検出プライマーを混合してＰＣＲに供することにより、アフリカミドリザル検出プライマーによる非特異的な増幅は抑えることができ、また、増幅産物のサイズの違いからアフリカミドリザルＤＮＡとカニクイザルＤＮＡを識別することが可能となることが確認された。非特異的増幅が抑えられる理由として、カニクイザル検出プライマーのカニクイザルＤＮＡへの親和性が高いため、ＰＣＲにおいて優先的に反応が進み、結果としてアフリカミドリザル検出プライマーによる増幅が抑えられていることが考えられる。
【０１１５】
（実施例７）種検出プライマーのミックスを用いたＤＮＡの由来動物種の検出
実施例６に記述したように、種検出プライマーは少なくとも２種以上混合して用いることができる。そこで、本実施例７においては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、ウシ、ブタの７種を検出する種検出プライマーミックス、並びにアフリカミドリザル、カニクイザル、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、イヌ、ニワトリの７種を検出する種検出プライマーミックスの検討を行った。
【０１１６】
１）プライマーの合成
各プライマーは、実施例２と同様にＤＮＡ合成機を用いて合成した。
２）ＤＮＡの調製
ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ニワトリの各ＤＮＡは実施例１と同様に各動物種由来細胞から、MAGEXTRACTOR GENOME DNA抽出キット（東洋紡社製）にて精製した。
【０１１７】
３）ネスティッドＰＣＲ
以下の一次ＰＣＲ、二次ＰＣＲからなるネスティッドＰＣＲを行った。まず、各動物種由来ＤＮＡ 100 ngを鋳型とし、ユニバーサルプライマーを用いた一次ＰＣＲを行った。反応液は総容量50μlとし、その組成は以下の通りである（いずれも終濃度）。
【０１１８】
20 mM Tris-HCl (pH8.0)
50 mM KCl
2 mM MgCl2
200 μM dNTPs
200 nM ユニバーサルプライマー（フォワードプライマー）
200 nM ユニバーサルプライマー（リバースプライマー）
1.25 units/50μl Taqポリメラーゼ（タカラ社製， 製品名Ex taq）
100 ng/50μl 鋳型ＤＮＡ
【０１１９】
この反応液をＰＣＲ装置であるサーマルサイクラー（タカラ社製）を用いて、９４℃で５分熱変性した後、５９℃で一回目のアニーリングを５分行った。次いで、伸長反応７２℃で２．５分、熱変性９４℃で４５秒、アニーリング５９℃で４５秒からなる一連の反応を３５サイクル繰り返し、最後に７２℃で１０分の伸長反応を行った。次いで、各動物種由来ＤＮＡを鋳型とした一次ＰＣＲ産物（一次ＰＣＲ反応後の溶液）を検体とし、二次ＰＣＲを行った。
【０１２０】
反応液は総容量50μlとし、
20 mM Tris-HCl (pH8.0)
50 mM KCl
2 mM MgCl2
200 μM dNTPs
1.25 units/50μl Taqポリメラーゼ（タカラ社製, 製品名Ex taq）
一次ＰＣＲ産物 0.1μl/50μlからなる溶液
に、次の組み合わせの種検出プライマーを加え、反応液とした。
【０１２１】
プライマーミックス１（各々フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む）：
ヒト検出プライマー；マウス検出プライマー；ラット検出プライマー；ウサギ検出プライマー；ネコ検出プライマー；ウシ検出プライマー；ブタ検出プライマー。いずれのプライマーも反応液中の終濃度は200 nMとした。
【０１２２】
プライマーミックス２（各々フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む）：
アフリカミドリザル検出プライマー；カニクイザル検出プライマー；チャイニーズハムスター検出プライマー；シリアンハムスター検出プライマー；モルモット検出プライマー；イヌ検出プライマー；ニワトリ検出プライマー。
いずれのプライマーも反応液中の終濃度は200 nMとした。
【０１２３】
この反応液をサーマルサイクラー（タカラ社製）を用いて、９４℃で５分熱変性した後、６０℃で一回目のアニーリングを５分行った。次いで、伸長反応７２℃で１．５分、熱変性９４℃で４５秒、アニーリング６０℃で３０秒からなる一連の反応を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃で１０分の伸長反応を行った。
【０１２４】
反応終了後、各目的産物の確認のため、2% アガロースゲル（SeaChem社、GTGアガロース）を支持体として、電気泳動装置（Mupid-2）により各一次ＰＣＲ産物（9μl）を電気泳動し、1μg/ml エチジウムブロマイドで染色後、ＵＶランプ下または蛍光イメージアナライザー（FMBIO II 日立ソフト社製）でバンドを確認した（図８）。
【０１２５】
図８ａに示すように、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、ウシ、ブタ検出プライマーからなるプライマーミックス１を使用した結果、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、ウシおよびブタの各ＤＮＡについて、表３に示した種特異的な増幅産物のサイズに一致する増幅産物が確認された。カニクイザルＤＮＡを鋳型とした場合には約２００ｂｐのサイズの非特異的増幅産物が認められるが、他種の特異的増幅産物とはサイズが異なるので識別は容易である。他の動物種由来ＤＮＡを鋳型とした場合には増幅産物は認められなかった。
【０１２６】
また、図８ｂに示すようにアフリカミドリザル、カニクイザル、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、イヌ、ニワトリ検出プライマーからなるプライマーミックス２を使用した結果、アフリカミドリザル、カニクイザル、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、イヌおよびニワトリの各ＤＮＡについて、表３に示した種特異的な増幅産物のサイズに一致する増幅産物が確認された。他の動物種由来ＤＮＡを鋳型とした場合には増幅産物は認められなかった。
【０１２７】
従って、プライマーミックス１を用いることにより、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、ウシ、ブタＤＮＡを検出することが可能であり、プライマーミックス２を用いることにより、アフリカミドリザル、カニクイザル、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、イヌ、ニワトリＤＮＡを検出することが可能であることが示された。
【０１２８】
（実施例８）各種検出プライマー１４種すべてのミックスを用いたＤＮＡの由来動物種の検出
【０１２９】
１）プライマーの合成
各プライマーは、実施例２と同様にＤＮＡ合成機を用いて合成した。
２）ＤＮＡの調製
ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ニワトリの各ＤＮＡは実施例１と同様に各動物種由来細胞から、MAGEXTRACTOR GENOME DNA抽出キット（東洋紡社製）にて精製した。
【０１３０】
３）ネスティッドＰＣＲ
以下の一次ＰＣＲ、二次ＰＣＲからなるネスティッドＰＣＲを行った。まず、各動物種由来ＤＮＡ 100 ngを鋳型とし、ユニバーサルプライマーを用いた一次ＰＣＲを行った。反応液は総容量50μlとし、その組成は以下の通りである（いずれも終濃度）。
【０１３１】
20 mM Tris-HCl (pH8.0)
50 mM KCl
2 mM MgCl2
200 μM dNTPs
200 nM ユニバーサルプライマー（フォワードプライマー）
200 nM ユニバーサルプライマー（リバースプライマー）
1.25 units/50μl Taqポリメラーゼ（タカラ社製，製品名Ex taq）
100 ng/50μl 鋳型ＤＮＡ
【０１３２】
この反応液をＰＣＲ装置であるサーマルサイクラー（タカラ社製）を用いて、９４℃で５分熱変性した後、５９℃で一回目のアニーリングを５分行った。次いで、伸長反応７２℃で２．５分、熱変性９４℃で４５秒、アニーリング５９℃で４５秒からなる一連の反応を３５サイクル繰り返し、最後に７２℃で１０分の伸長反応を行った。次いで、各動物種由来ＤＮＡを鋳型とした一次ＰＣＲ産物（一次ＰＣＲ反応後の溶液）を検体とし、各種検出プライマー１４種すべてのミックスを用いて二次ＰＣＲを行った。
【０１３３】
反応液は総容量50μlとし、
20 mM Tris-HCl (pH8.0)
50 mM KCl
2 mM MgCl2
200 μM dNTPs
1.25 units/50μl Taqポリメラーゼ（タカラ社製，製品名Ex taq）
一次ＰＣＲ産物 0.1μl/50μlからなる溶液
に、次の組み合わせの種検出プライマーを加え、反応液とした。
【０１３４】
プライマーミックス３（各々フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む）：
ヒト検出プライマー；アフリカミドリザル検出プライマー；カニクイザル検出プライマー；マウス検出プライマー；ラット検出プライマー；チャイニーズハムスター検出プライマー；シリアンハムスター検出プライマー；モルモット検出プライマー；ウサギ検出プライマー；イヌ検出プライマー；ネコ検出プライマー；ウシ検出プライマー；ブタ検出プライマー；ニワトリ検出プライマー。
いずれのプライマーも反応液中の終濃度は200 nMとした。
【０１３５】
この反応液をサーマルサイクラー（タカラ社製）を用いて、９４℃で５分熱変性した後、６０℃で一回目のアニーリングを５分行った。次いで、伸長反応７２℃で１．５分、熱変性９４℃で４５秒、アニーリング６０℃で３０秒からなる一連の反応を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃で１０分の伸長反応を行った。
【０１３６】
反応終了後、各目的産物の確認のため、2% アガロースゲル（SeaChem社、GTGアガロース）を支持体として、電気泳動装置（Mupid-2）により各一次ＰＣＲ産物（9μl）を電気泳動し、1μg/ml エチジウムブロマイドで染色後、ＵＶランプ下または蛍光イメージアナライザー（FMBIO II 日立ソフト社製）でバンドを確認した。
【０１３７】
図９に示すように、プライマーミックス３を使用した結果、ヒト、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、およびニワトリの各ＤＮＡについて、表３に示した種特異的な増幅産物のサイズに一致する唯一の増幅産物が確認された。アフリカミドリザルＤＮＡを鋳型とした場合には、アフリカミドリザル特異的増幅産物に加えて、約１０００ｂｐの非特異的増幅産物が認められた。この非特異的増幅産物のサイズは各種特異的増幅産物のサイズとは異なるため、識別が可能である。またブタＤＮＡを鋳型とした場合には、ブタ特異的増幅産物に加えて、約１３００ｂｐの非特異的増幅が認められた。この非特異的増幅産物のサイズは各種特異的増幅産物のサイズとは異なるため、識別が可能である。カニクイザルＤＮＡを鋳型とした場合にはカニクイザル特異的増幅産物に加えて約２００ｂｐの非特異的増幅産物が認められた。この非特異的増幅産物のサイズはニワトリ特異的増幅産物のサイズにきわめて近いため識別は困難であった。
【０１３８】
従って、プライマーミックス３を用いることにより、ヒト、アフリカミドリザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、およびブタＤＮＡを検出することが可能である。カニクイザルＤＮＡに関しては、カニクイザル特異的な約１１３２ｂｐの増幅産物が観察された場合に、被検ＤＮＡにカニクイザルＤＮＡが存在することが分かるが、ニワトリＤＮＡとの混合物である可能性を排除することはできない。また、ニワトリＤＮＡに関しては、約２００ｂｐの増幅産物が観察され、かつカニクイザル特異的増幅産物である約１１３２ｂｐの増幅産物が認められない場合に、被検ＤＮＡにニワトリＤＮＡが存在することが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１３９】
本発明の動物種検出方法およびプライマー、ヒト、アフリカミドリザル、カニクイザル、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ニワトリＤＮＡを高感度で検出、同定することができる。この１４種は細胞培養に広範に使用される細胞の主要な由来種であるため、特に細胞の由来種の同定や他種由来細胞のクロスコンタミネーションの検出に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１ａ】ユニバーサルプライマーに挟まれるミトコンドリアＤＮＡ遺伝子の模式図であり、ユニバーサルプライマーのミトコンドリアＤＮＡ上での位置関係を示す図である。
【図１ｂ】ユニバーサルプライマーが標的とする種々の動物ミトコンドリアＤＮＡ部位の塩基配列を示す図である。
【図２】ユニバーサルプライマーを用いて各動物種ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行った後の電気泳動図である。（実施例１）
【図３】ユニバーサルプライマーを用いた一次ＰＣＲと種検出プライマーを用いた二次ＰＣＲからなるネスティッドＰＣＲによる各動物種増幅産物のサイズを確認した電気泳動図である。（実施例２）
【図４】ユニバーサルプライマーを用いた一次ＰＣＲと種検出プライマーを用いた二次ＰＣＲからなるネスティッドＰＣＲによる各動物種ＤＮＡの反応性を示した電気泳動図である。（実施例３）(a)：種検出プライマーとしてヒト検出プライマーを用いた場合。(b)：種検出プライマー用としてアフリカミドリザル検出プライマーを用いた場合。(c)：種検出プライマーとしてカニクイザル検出プライマーを用いた場合。(d)：種検出プライマーとしてマウス検出プライマーを用いた場合。(e)：種検出プライマーとしてラット検出プライマーを用いた場合。(f)：種検出プライマーとしてチャイニーズハムスター検出プライマーを用いた場合。(g)：種検出プライマーとしてシリアンハムスター検出プライマーを用いた場合。(h)：種検出プライマーとしてモルモット検出プライマーを用いた場合。(i)：種検出プライマーとしてウサギ検出プライマーを用いた場合。(j)：種検出プライマーとしてイヌ検出プライマーを用いた場合。(k)：種検出プライマーとしてネコ検出プライマーを用いた場合。(l)：種検出プライマーとしてウシ検出プライマーを用いた場合。(m)：種検出プライマーとしてブタ検出プライマーを用いた場合。(n)：種検出プライマーとしてニワトリ検出プライマーを用いた場合。
【図５】ユニバーサルプライマーを用いた一次ＰＣＲと種検出プライマーを用いた二次ＰＣＲからなるネスティッドＰＣＲによる各動物種ＤＮＡの検出感度を示した電気泳動図である。（実施例４）(a)：種検出プライマーとしてヒト検出プライマーを用いた場合。(b)：種検出プライマーとしてアフリカミドリザル検出プライマーを用いた場合。(c)：種検出プライマーとしてカニクイザル検出プライマーを用いた場合。(d)：種検出プライマーとしてマウス検出プライマーを用いた場合。(e)：種検出プライマーとしてラット検出プライマーを用いた場合。(f)：種検出プライマーとしてチャイニーズハムスター検出プライマーを用いた場合。(g)：種検出プライマーとしてシリアンハムスター検出プライマーを用いた場合。(h)：種検出プライマーとしてモルモット検出プライマーを用いた場合。(i)：種検出プライマーとしてウサギ検出プライマーを用いた場合。(j)：種検出プライマーとしてイヌ検出プライマーを用いた場合。(k)：種検出プライマーとしてネコ検出プライマーを用いた場合。(l)：種検出プライマーとしてウシ検出プライマーを用いた場合。(m)：種検出プライマーとしてブタ検出プライマーを用いた場合。(n)：種検出プライマーとしてニワトリ検出プライマーを用いた場合。
【図６】ユニバーサルプライマーを用いた一次ＰＣＲとヒト検出プライマーを用いた二次ＰＣＲからなるネスティッドＰＣＲによるマウスＤＮＡに混入したヒトＤＮＡの検出感度を示した電気泳動図である。（実施例５）
【図７】アフリカミドリザルＤＮＡ、カニクイザルＤＮＡをそれぞれ鋳型とし、ユニバーサルプライマーを用いた一次ＰＣＲに次いで、アフリカミドリザル検出プライマー、カニクイザル検出プライマーのミックスプライマーを用いた二次ＰＣＲを行った結果を示す電気泳動図である。（実施例６）
【図８ａ】ユニバーサルプライマーを用いた一次ＰＣＲと、プライマーミックス１を用いた二次ＰＣＲからなるネスティッドＰＣＲによる各動物種ＤＮＡの反応性を示した電気泳動図である。（実施例７）
【図８ｂ】ユニバーサルプライマーを用いた一次ＰＣＲと、プライマーミックス２を用いた二次ＰＣＲからなるネスティッドＰＣＲによる各動物種ＤＮＡの反応性を示した電気泳動図である。（実施例７）
【図９】ユニバーサルプライマーを用いた一次ＰＣＲと、プライマーミックス３を用いた二次ＰＣＲからなるネスティッドＰＣＲによる各動物種ＤＮＡの反応性を示した電気泳動図である。（実施例８）
【図１ａ】
2007209281.tif 000005
【図１ｂ】
2007209281.tif 000006
【図２】
2007209281.tif 000007
【図３】
2007209281.tif 000008
【図４】
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【図５】
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【図６】
2007209281.tif 000011
【図７】
2007209281.tif 000012
【図８ａ】
2007209281.tif 000013
【図８ｂ】
2007209281.tif 000014
【図９】
2007209281.tif 000015
【配列表】
2007209281000001.app