(57)【要約】      （修正有）【課題】遺伝子欠損の検査を簡便に、しかも精度よく多数検体を効率よく検査できる核酸配列欠損の検出方法の提供。【解決手段】核酸配列の欠損領域の５’側あるいは３’側に少なくとも連続した相補的な２塩基を含むオリゴヌクレオチドプライマーであり、かつ、少なくとも１塩基が標的核酸配列に対してミスマッチであるオリゴヌクレオチドを用いる。遺伝子欠損変異を有する核酸のみを特異的に増幅することができ、核酸配列欠損の検出キットに利用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸配列の欠損またはその有無を検出する方法であって、欠損領域に付加された５’側あるいは３’側に、標的核酸配列に相補的な少なくとも連続した2塩基を含むオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする核酸配列欠損の検出方法。
【請求項２】
核酸配列の欠損領域またはその有無を検出する方法であって、欠損領域に付加された５’側あるいは３’側に、標的核酸配列に相補的な少なくとも連続した2塩基を含むオリゴヌクレオチドであり、かつ、少なくとも1塩基が標的核酸配列に対してミスマッチであることを特徴とするオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする核酸配列欠損の検出方法。
【請求項３】
野生型の配列を含む試料中に10%以下の存在比で混在する欠損変異型の配列を有する試料を検出できることを特徴とする請求項１または２に記載の核酸配列欠損の検出方法。
【請求項４】
DNAポリメラーゼを用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の核酸配列欠損の検出方法。
【請求項５】
耐熱性を有するDNAポリメラーゼを用いることを特徴とする請求項４に記載の核酸配列欠損の検出方法。
【請求項６】
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いることを特徴とする請求項４または５に記載の核酸配列欠損の検出方法。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドが標識されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の核酸配列欠損の検出方法。
【請求項８】
標識がビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、放射線物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体及び導電性物質からなる群より選ばれたすくなくとも１種以上の化合物であることを特徴とする請求項７に記載の核酸配列欠損の検出方法。
【請求項９】
核酸配列の欠損領域またはその有無を検出する方法であって、欠損領域に付加された５’側あるいは３’側に、標的核酸配列に相補的な少なくとも連続した2塩基を含むオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする核酸配列欠損の検出キット。
【請求項１０】
核酸配列の欠損領域またはその有無を検出する方法であって、欠損領域に付加された５’側あるいは３’側に、標的核酸配列に相補的な少なくとも連続した2塩基を含むオリゴヌクレオチドであり、かつ、少なくとも1塩基が標的核酸配列に対してミスマッチであることを特徴とするオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする核酸配列欠損の検出キット。
【請求項１１】
野生型の配列を含む試料中に10%以下の存在比で混在する欠損変異型の配列を有する試料を検出できることを特徴とする請求項９または１０に記載の核酸配列欠損の検出キット。
【請求項１２】
DNAポリメラーゼを用いることを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載の核酸配列欠損の検出キット。
【請求項１３】
耐熱性を有するDNAポリメラーゼを用いることを特徴とする請求項１２に記載の核酸配列欠損の検出キット。
【請求項１４】
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いることを特徴とする請求項１２または１３に記載の核酸配列欠損の検出キット。
【請求項１５】
オリゴヌクレオチドが標識されていることを特徴とする請求項９〜１４のいずれかに記載の検出キット。
【請求項１６】
標識が蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、磁性体及び導電性物質からなる群より選ばれたすくなくとも１種以上の化合物であることを特徴とする請求項１５記載の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の欠損領域またはその有無の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、個体の疾患を診断するに当たり、その個体由来の遺伝子情報を利用することが行われている。臨床分野においても、機能蛋白の遺伝的な欠損や、機能異常が原因とされる遺伝病などを診断するために、広範に実施されつつある。
【０００３】
個体より採取した核酸に存在する遺伝子欠損を調べることで、例えば薬剤に対する感受性を予測したり（非特許文献１）、あるいは病原菌などの毒性判定（特許文献１）などに利用することが可能である。
【０００４】
遺伝子欠損の検出は、個体より抽出された核酸に対して行われるため、個体に対する負担が極めて少ないという利点がある。
【０００５】
従来、用いられてきた遺伝子欠損の検出方法としては、ダイレクトシーケンス法、PCR-RFLP法、PCR法、質量分析などが挙げられる。
【０００６】
ダイレクトシーケンス法は、野生型の配列を含む試料と変異型の配列を含む試料が混在する場合、特に野生型の配列が多く存在する試料では、野生型に対する反応が優位となるため、ごくわずかに存在する変異型を検出することは困難である。
【０００７】
PCR-RFLP法はまずPCR反応を行い、続いて制限酵素処理を行うため、操作が煩雑であり、多数検体を同時に処理するには不適当である。また標的核酸中に適当な制限酵素認識部位が存在しない場合には、用いることが困難である。
【０００８】
PCR反応を行い、得られたPCR産物を電気泳動にて検出し、野生型と欠損変異型のPCR産物サイズの差から、欠損の有無を判定する方法は、最も簡便かつコストのかからない方法である。しかし、欠損領域が狭い場合、実際には電気泳動による判定は極めて困難である。
【０００９】
質量分析は、標的配列をPCR反応で増幅させ、得られたPCR産物を質量分析装置内でレーザー光照射によりイオン化する。電荷を帯びたPCR産物は高電界場により加速され、真空空間を飛行する。検出器に到達するまでの飛行時間により、PCR産物の質量を決定することができるが、解析には特別な機器を要する。
【００１０】
【特許文献１】特開２００４−１４７５０７号公報
【非特許文献１】Shin-Feng Huang et al ,Clinical Cancer Research Vol.10, pp.8195-8203,  2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は遺伝子欠損の検査を特別な機器を要することなく簡便に、しかも精度よく多数検体を効率よく検査できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、欠損領域の５’側あるいは３’側に標的核酸配列に対して相補的な、少なくとも連続した相補的な2塩基を含むオリゴヌクレオチドを用いることで、遺伝子欠損変異を有する核酸のみを特異的に増幅可能であることを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明は遺伝子欠損を有する標的配列に対して、欠損領域の５’側あるいは３’側に標的核酸配列に対して相補的な、少なくとも連続した相補的な2塩基を含むオリゴヌクレオチドを用いた遺伝子欠損の検出方法を提供する。
１．核酸配列の欠損またはその有無を検出する方法であって、欠損領域に付加された５’側あるいは３’側に、標的核酸配列に相補的な少なくとも連続した2塩基を含むオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする核酸配列欠損の検出方法。
２．核酸配列の欠損領域またはその有無を検出する方法であって、欠損領域に付加された５’側あるいは３’側に、標的核酸配列に相補的な少なくとも連続した2塩基を含むオリゴヌクレオチドであり、かつ、少なくとも1塩基が標的核酸配列に対してミスマッチであることを特徴とするオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする核酸配列欠損の検出方法。
３．野生型の配列を含む試料中に10%以下の存在比で混在する欠損変異型の配列を有する試料を検出できることを特徴とする１または２の核酸配列欠損の検出方法。
４．DNAポリメラーゼを用いることを特徴とする１〜３のいずれかの核酸配列欠損の検出方法。
５．耐熱性を有するDNAポリメラーゼを用いることを特徴とする４の核酸配列欠損の検出方法。
６．３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いることを特徴とする４または５の核酸配列欠損の検出方法。
７．オリゴヌクレオチドが標識されていることを特徴とする１〜６のいずれかの核酸配列欠損の検出方法。
８．標識がビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、放射線物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体及び導電性物質からなる群より選ばれたすくなくとも１種以上の化合物であることを特徴とする７の核酸配列欠損の検出方法。
９．核酸配列の欠損領域またはその有無を検出する方法であって、欠損領域に付加された５’側あるいは３’側に、標的核酸配列に相補的な少なくとも連続した2塩基を含むオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする核酸配列欠損の検出キット。
１０．核酸配列の欠損領域またはその有無を検出する方法であって、欠損領域に付加された５’側あるいは３’側に、標的核酸配列に相補的な少なくとも連続した2塩基を含むオリゴヌクレオチドであり、かつ、少なくとも1塩基が標的核酸配列に対してミスマッチであることを特徴とするオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする核酸配列欠損の検出キット。
１１．野生型の配列を含む試料中に10%以下の存在比で混在する欠損変異型の配列を有する試料を検出できることを特徴とする９または１０の核酸配列欠損の検出キット。
１２．DNAポリメラーゼを用いることを特徴とする９〜１１のいずれかの核酸配列欠損の検出キット。
１３．耐熱性を有するDNAポリメラーゼを用いることを特徴とする１２の核酸配列欠損の検出キット。
１４．３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いることを特徴とする１２または１３の核酸配列欠損の検出キット。
１５．オリゴヌクレオチドが標識されていることを特徴とする９〜１４のいずれかの検出キット。
１６．標識が蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、磁性体及び導電性物質からなる群より選ばれたすくなくとも１種以上の化合物であることを特徴とする１５の検出キット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は遺伝子欠損の検査をできる方法を提供し、測定に際して特別な機器、設備を必要とせずに安価で簡便に、しかも精度よく多数検体を効率よく検査できるといった格段の効果を有する検査方法、検査試薬およびキットを提供することを可能にした。
【００１５】
本発明の特徴は、被験核酸試料の検査しようとする欠損領域の５’側あるいは３’側に標的核酸配列に対して相補的な、少なくとも連続した相補的な2塩基を含むオリゴヌクレオチドを用いることである。
【００１６】
本発明のオリゴヌクレオチドは遺伝子欠損を有する核酸のみを特異的に増幅させることが可能であるため、野生型と変異型の核酸が混在している試料でも検出は可能であり、しかも特別の操作を要しない。
【００１７】
さらに本発明では、前記オリゴヌクレオチドの欠損領域の５’側あるいは３’側の標的核酸に対して相補的な塩基のうち、1塩基がミスマッチであることを特徴とするオリゴヌクレオチドを用いることで、野生型と変異型の識別を、より精度よく行えることを見出した。
【００１８】
本発明の実施にあたっては、特殊な機器、設備を必要としないため、安価で簡便に、しかも精度よく多数検体を効率よく検査できる。
【００１９】
本発明のオリゴヌクレオチドを用いることで遺伝子欠損を有する核酸のみを特異的に増幅可能であるため、被験核酸試料が野生型であるか変異型であるかを容易に判定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本願発明の一つは、核酸配列の欠損領域またはその有無を検出する方法であって、（ａ）欠損後の核酸配列と相補的であり（ｂ）欠損地点を含んでおり（ｃ）３’末端から該欠損地点までの塩基数が２塩基以上である欠損型検出用プライマーを含有する核酸増幅用組成物を用いて、欠損が予想される標的核酸配列から核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応から得られる核酸増幅産物の有無を判定することを特徴とする核酸配列欠損の検出方法である。また、本願発明の一つは、（ａ）欠損後の核酸配列と相補的であり（ｂ）欠損地点を含んでおり（ｃ）３’末端から該欠損地点までの塩基数が２塩基以上である欠損型検出用プライマーを少なくとも含有することを特徴とする核酸配列欠損の検出キットでもある。
以下に、本発明について詳細に説明する。
【００２１】
「標的核酸配列」とは、被験核酸試料において、その存在の有無を検査したい核酸配列を指す。例えば、標的核酸配列が薬効の発揮に関与する遺伝子であった場合、標的核酸配列の有無、あるいは標的核酸配列中の変異の有無を検査することによって、薬剤の使用の可否を判断することも可能になる。本願発明では、「標的核酸配列」を「標的配列」と称することがある。
【００２２】
「欠損変異」とは、野生型の配列のうち、少なくとも1塩基以上が欠損する変異を言う。一般的には、野生型配列中の連続する少なくとも2塩基以上が欠損する変異を指し、欠損する塩基数は10塩基前後から数100塩基に及ぶ場合もある。また、野生型配列中の複数箇所に欠損が生じる欠損変異もある。本願発明では、「欠損変異」を「欠損」と称することもある。また本願発明では、欠損変異が生じた遺伝子を「欠損変異遺伝子」と称することがある。また、「欠損変異遺伝子」の遺伝子のタイプを「変異型」または「欠損変異型」と称することがある。
【００２３】
「欠損配列」とは、同一遺伝子配列の野生型の核酸配列と欠損変異型の核酸配列を比較した際に、野生型には存在するが、欠損変異型には存在しない核酸配列を指す。
【００２４】
「核酸配列欠損」とは、ある遺伝子配列上において一定の領域の核酸配列が消失する変異を指す。
【００２５】
「欠損領域」とは、同一遺伝子配列の野生型の核酸配列と欠損変異型の核酸配列を比較した際に、野生型には存在するが、欠損変異型には存在しない核酸配列領域を指す。
【００２６】
「欠損地点」とは、図１で示すように欠損後に、欠損の前後の核酸配列が結合する部位をいう。さらには、結合する部位において塩基と塩基の境目をいう。
【００２７】
「欠損型検出用プライマー」とは、（ａ）欠損後の核酸配列と相補的であり（ｂ）欠損地点を含んでおり（ｃ）３’末端から該欠損地点までの塩基数が２塩基以上５塩基以下であるプライマーをいう。本願明細書においては、「欠損型検出用プライマー」が、アンチセンスプライマーの場合は「変異型検出用アンチセンスプライマー」または「変異検出用リバースプライマー」と称することもある。また、「欠損型検出用プライマー」がセンスプライマーの場合は「変異検出用センスプライマー」または「変異検出用フォワードプライマー」と称することもある。図１においては、「変異検出用リバースプライマー」及び「変異検出用フォワードプライマー」で説明している。図１に記載のように、「変異検出用リバースプライマー」及び「変異検出用フォワードプライマー」は、欠損後の核酸配列において欠損地点をまたいでハイブリダイズする。
「欠損型検出用プライマー」すなわち、「変異検出用リバースプライマー」または「変異検出用フォワードプライマー」の３’末端から欠損地点までの塩基数が１塩基であると、特異性が失われるため好ましくないが、本発明の効果を損なわない程度に設定しても良い。
さらに、「欠損型検出用プライマー」すなわち、「変異検出用リバースプライマー」または「変異検出用フォワードプライマー」のTmは特に限定はされないが50〜80℃が好ましく、さらに好ましくは65〜80℃であることが望ましい。「欠損型検出用プライマー」の鎖長は特に限定はされないが、好ましくは１５〜３５塩基、１８〜３０、さらに好ましくは２０〜２５塩基である。
【００２８】
なお、欠損型検出用プライマーは、欠損型検出用プライマーの伸長生成物に相補的であるプライマー（本発明では、共通プライマー、共通センスプライマー、共通アンチセンスプライマーまたは共通オリゴヌクレオチドプライマーと称することもある）とともに用いて核酸増幅反応に供しても良い。すなわち、図１で説明するならば「変異検出用リバースプライマー」は対をなす「フォワードプライマー」と、「変異検出用フォワードプライマー」は対をなす「リバースプライマー」とともに核酸増幅反応に供しても良い。増幅されるPCR産物のサイズは1000bp以下、好ましくは500bp以下、さらに好ましくは300bp以下であることが望ましい。共通プライマーの鎖長は特に限定はされないが、好ましくは１５〜３５塩基、１８〜３０、さらに好ましくは２０〜２５塩基である。
【００２９】
「核酸増幅用組成物」とは、欠損型検出用プライマーからの伸長物が得られ、さらにその伸長物が複製される組成であれば構わない。例えば通常の核酸増幅方法に使用される組成であれば構わない。ＰＣＲを例に挙げると、欠損型検出用プライマーを含有し、さらに、欠損型検出用プライマーの伸長生成物に相補的であるプライマー（共通オリゴヌクレオチドプライマーと称することもある）と、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、などが含まれておればよい。さらには、マグネシウムイオン、アンモニウムイオンやカリウムイオンなどが含まれていてもよい。ＢＳＡ、非イオン界面活性剤、例えばTriton X-100および緩衝液が存在していてもよい。さらに、必要により、補助溶解剤、例えばグリセリン、ＤＭＳＯ、ポリエチレングリコールなどを含んでいてもよい。緩衝液としては、Ｔｒｉｓ緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（トリシン緩衝液）、Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）グリシン（バイシン緩衝液）などが使用される。最適の緩衝液およびｐＨは使用するＤＮＡポリメラーゼに依存する。例えば、ＫＯＤポリメラーゼおよび該酵素の変異体を使用する場合は、ｐＨ７．５〜９．２（２５℃において、１０ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは２０〜１２０ｍＭである。２価カチオンはマグネシウムイオンが好ましく、塩化マグネシウムなどが使用される。その濃度は１〜２ｍＭであることが好ましい。１価カチオンはアンムニウムイオンまたはカリウムイオンが好ましく、硫酸アンモニウム、グルタミン酸カリウム、酢酸カリウムなどが使用される。それらの濃度は２〜５０ｍＭであればよい。プライマーの濃度は、０．２〜１μＭでよい。なお、これらの組成は一例を挙げたすぎず、限定されるものではない。なお、核酸配列欠損の検出キットにこれらの組成物が含まれていても良い。
【００３０】
「欠損領域に付加された３’側に、標的核酸配列に相補的な少なくとも連続した2塩基を含むオリゴヌクレオチド」とは、標的配列に対してフォワード側に設計した変異検出用プライマー、すなわち、図１で説明するならば「変異検出用フォワードプライマー」をいう。
【００３１】
「５’側に、標的核酸配列に相補的な少なくとも連続した2塩基を含むオリゴヌクレオチド」とは、標的配列に対してリバース側に設計した変異検出用プライマー、すなわち、図１で説明するならば「変異検出用リバースプライマー」をいう。
【００３２】
本発明に用いるオリゴヌクレオチドの設計の1例を図1に示す。変異検出用オリゴヌクレオチドプライマーをリバース側に設計した場合、変異検出用プライマーは欠損領域に対して相補的な配列を有さないため、野生型の配列を有する核酸試料には結合できないため、核酸は増幅されない。一方、欠損変異を有する変異型の核酸試料が存在する場合、変異検出用プライマーは前記核酸試料に対して相補的であるため、DNAポリメラーゼ存在下では伸長反応が生じ、欠損変異を有する核酸が増幅される。
変異検出用プライマーをフォワード側に設計した場合でも、同様に欠損変異を有する核酸のみを増幅することができる。
【００３３】
「共通オリゴヌクレオチドプライマー」とは、変異検出用プライマーと対になり、標的配列を増幅させるためのプライマーの中を指す。変異検出用プライマーと共通オリゴヌクレオチドプライマーは1対1のセットで用いてもよいし、複数の変異検出用プライマーに対して共通オリゴヌクレオチドプライマーは１本のみであっても構わない。
【００３４】
「欠損領域に付加された５’側あるいは３’側に、標的核酸配列に相補的な少なくとも連続した2塩基を含むオリゴヌクレオチドを用いる」とは、上記に説明した欠損領域に付加された５’側あるいは３’側に、標的核酸配列に相補的な少なくとも連続した2塩基を含むオリゴヌクレオチドと、共通オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、核酸増幅反応に供することも含む。核酸増幅反応によって得られる核酸増幅産物を調べ核酸配列の欠損またはその有無を検出しても良い。
【００３５】
「少なくとも1塩基が標的核酸配列に対してミスマッチである」とは、欠損領域に付加された５’側あるいは３’側に存在する標的核酸配列に相補的な連続した塩基のうち、少なくとも1塩基が標的核酸配列に対して相補的でない塩基に置換されていることを指す。
【００３６】
本発明に使用されるオリゴヌクレオチド及びプライマーは、標識されていてもよい。標識することで検出操作を簡便化できる。標識方法としては、一般的な標識方法で構わない。  標識としては、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、放射線物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質などを用いればよい。例えば、標識が蛍光化学物質または蛍光蛋白質の場合、特定波長の光を照射し蛍光化学物質または蛍光蛋白質を励起させ、基底状態に変換される際に生じる特定波長の蛍光量を測定することが可能である。これらに用いられる蛍光化学物質としては、FITC、FAM、TAMRA、TexasRed、VIC、Cy3、Cy5、HEX等が挙げられ、蛍光蛋白質としては、GFP、YFP、RFP等を挙げることができる。標識が酵素である場合、酵素の基質を添加することによって生成される反応生成物を検出することによって測定が可能である。これらに用いられる酵素と基質の組み合わせとしては、アルカリフォスファターゼとパラニトロフェニルリン酸、CDP-star、AMPPD、DDAOphospate、BCIP-NBT等の組み合わせ、パーオキシダーゼとTMB、Lumi-Light（ロッシュ・ダイアグノスティックス）、SAT-1（同仁化学）等の組み合わせ、ジアホラーゼとNTB等の組み合わせ、各種オキシダーゼと基質、各種デヒドロゲナーゼと基質の組み合わせ等、反応生成物が検出されるものであれば、これらに限定されることはなく用いることが可能である。標識が磁性体の場合、磁気を検出することによって測定が可能である。標識が導電性物質の場合、電流値を検出することによって測定が可能である。
【００３７】
アッセイに用いる核酸試料溶液は、患者の血液、組織から、既知の方法により調製してもよい。代表的なものとして、フェノール／クロロホルム抽出法（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  ａｃｔａ 第７２巻、第６１９〜６２９頁、１９６３年）、アルカリＳＤＳ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ 第７巻、第１５１３〜１５２３頁、１９７９年）等の液相で行う方法がある。また、核酸の単離に核酸結合用担体を用いる系としては、ガラス粒子とヨウ化ナトリウム溶液を使用する方法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．  ＵＳＡ 第７６−２巻、第６１５〜６１９頁、１９７９年）、ハイドロキシアパタイトを用いる方法（特開昭６３−２６３０９３号公報）等がある。その他の方法としてはシリカ粒子とカオトロピックイオンを用いた方法（Ｊ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ 第２８−３巻、第４９５〜５０３頁、１９９０年、特開平２−２８９５９６号公報）が挙げられる。
【００３８】
核酸増幅方法としては、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-basedamplification method；Ｎａｔｕｒｅ 第３５０巻、第９１頁(1991)）、ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報、特開平２−２９３４号公報）、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification：Nucleic acid research 第２０巻、第１６９１頁(1992)）、ＲＣＲ（国際公開９０／１０６９号公報）、ＴＭＡ（Transcription mediated amplification method；J.Clin.Microbiol. 第３１巻、第３２７０頁(1993)）ＬＡＭＰ（loop-mediated isothermal amplification method :J Clin Microbiol. 2004 第42巻:第1,956頁）、ＩＣＡＮ（isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids: Kekkaku. 2003 第78巻、第５３３頁）などが挙げられる。
【００３９】
なかでもＰＣＲ法は、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のオリゴヌクレオチド及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各オリゴヌクレオチドと、それぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各オリゴヌクレオチドを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上上記一対のオリゴヌクレオチドで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２n倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。よって、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出することが可能であり、最近非常に広く用いられている技術である。
【００４０】
本発明を実施する場合、本発明で用いるオリゴヌクレオチドと、これと対になる被験核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチドを組み合わせたPCR反応にて被験核酸試料中の標的配列を増幅することが望ましい。
なお、PCR法自体はこの分野において周知であり、必要な試薬類のキットおよび装置も市販されているので、これらを用いて容易に行うことができる。
【００４１】
さらに、本発明で用いるオリゴヌクレオチドと、これと対になる被験核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチドを組み合わせたPCRを行い、得られた増幅産物の融解曲線解析を行うことで欠損変異の検出が簡便に行うことができるようになる。また、標的核酸配列を特異的に増幅可能オリゴヌクレオチドと欠損変異を増幅するオリゴヌクレオチドを複数組み合わせて用いることも可能である。
【００４２】
本発明で用いるオリゴヌクレオチドは、被験核酸試料の検査しようとする特定の欠損領域の５’側あるいは３’側に標的核酸配列に対して相補的な、少なくとも連続した相補的な2塩基、好ましくは3〜5塩基を含むオリゴヌクレオチドである。
【００４３】
前記オリゴヌクレオチドのTmは５０〜８０℃であることが、望ましい。
【００４４】
本発明で用いるDNAポリメラーゼは耐熱性DNAポリメラーゼが望ましく、より好ましくは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼ、さらに好ましくはKOD DNAポリメラーゼ、あるいはPfu DNAポリメラーゼであることが望ましい。
【００４５】
本発明の検出方法は、欠損変異を有する核酸のみを特異的に増幅可能であるため、野生型と欠損変異型が混在する試料であっても、容易に欠損変異の有無を検出することができる。
【００４６】
欠損変異の検出感度は、野生型の鋳型中に10%以下の存在比で混在する欠損変異型の鋳型を検出できる感度であることが望ましい。
【００４７】
野生型の鋳型中に10%以下の存在比で混在する欠損変異型の鋳型を検出するには、欠損領域に付加された５’側あるいは３’側に、標的核酸配列に相補的な少なくとも連続した2塩基以上、好ましくは3塩基以上、より好ましくは4塩基以上有するオリゴヌクレオチドを用いることが望ましい。さらに、前記オリゴヌクレオチドのTmは50〜80℃、好ましくは65〜80℃であることが望ましい。前記オリゴヌクレオチドと対になる共通オリゴヌクレオチドプライマーによって増幅されるPCR産物のサイズは1000bp以下、好ましくは500bp以下、さらに好ましくは300bp以下であることが望ましい。さらには、DNAポリメラーゼは耐熱性DNAポリメラーゼが望ましく、より好ましくは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼがよい。さらに好ましくはKOD DNAポリメラーゼ、あるいはPfu DNAポリメラーゼであることが望ましい。
【００４８】
本発明のプライマーおよび遺伝子欠損部位と相補的あるいは相同的な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって、ＰＣＲ後、得られたＰＣＲ産物についてハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション法自体は周知の方法である。すなわち、水不溶性担体に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブに予め1本鎖にされたPCR産物を添加することにより、担体上にPCR産物が結合される。結合されたPCR産物が予め標識されていれば、その標識を検出することによって、PCR産物の配列を特定することが可能である。また、蛍光色素で予め標識されたオリゴヌクレオチドプローブと、５´ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを利用したいわゆるTaqmanアッセイであれば、ＰＣＲ反応と共に遺伝子欠損の検出が可能な試料を解析する上では極めて有効な方法である。あるいは、オリゴヌクレオチドプローブを用いた融解曲線解析を行なうことによっても、配列を特定することができる。他の方法としては、本願発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、被験核酸を特異的に増幅させるオリゴヌクレオチドとを組み合わせて用いることによって、欠損変異特異的に核酸断片を増幅させることも可能である。得られた核酸断片をＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩやエチレンブロマイドなどのインターカレーターを用いて蛍光検出することも可能であり、電気泳動にて増幅断片を検出しても良い。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００５０】
［実施例１］
（１）ヒトEGFR遺伝子のエクソン19 Del L747-S752欠損変異を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１〜６に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ１〜６と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託会社（（株）日本バイオサービス、オペロン（株）、プロリゴ（株）、シグマジェノシス（株）等）に依頼した。オリゴ１がエクソン19共通オリゴヌクレオチドプライマーであり、オリゴ２〜６がEGFR遺伝子のエクソン19 Del L747-S752欠損変異遺伝子（変異型）を増幅するためのアンチセンスプライマー（変異型検出用アンチセンスプライマーとして使用）である。
（２）PCR法によるヒトEGFR遺伝子の欠損変異の解析
ヒトEGFRエクソン19 Del L747-S752欠損変異遺伝子を含むプラスミドDNA溶液（試料1）、ヒトEGFRエクソン19野生型遺伝子を含むプラスミドDNA溶液（試料2）、および健常人ボランティアより採取したヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液（試料3）をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトEGFR遺伝子の欠損変異を解析した。
【００５１】
（ＰＣＲの実施）
上記で調製した試料1μｌ、オリゴ１およびオリゴ２を各２０pmoles、および１０×ＰＣＲｍｉｘ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ ＭｇSO4、ＫＯＤ−ｐｌｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅをミリＱ水に加えて全量を２５μｌとした。以下、オリゴ１およびオリゴ３〜６のいずれかを２０pmoles、および１０×ＰＣＲｍｉｘ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ ＭｇSO4、ＫＯＤ−ｐｌｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅをミリＱ水に加えて全量を２５μｌとした。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃で２分、次いで９４℃−１５秒のデナチュレーション工程、及び６０℃−３０秒のアニーリング及び６８℃−３０秒のＤＮＡ伸長反応工程を１サイクルとして、これを計３５サイクル行うことにより実施した。
【００５２】
（電気泳動を用いた検出）
増幅反応液5μｌを３％アガロースゲルを用いて電気泳動を行なった。結果を図２に示す。
電気泳動結果が示す通り、変異型検出用アンチセンスプライマーの欠損領域に相補的な３’側の塩基が２塩基以上のオリゴ３〜６を用いた試薬では変異型のみが増幅された。
【００５３】
[実施例2]
（１）ヒトEGFR遺伝子のエクソン19 Del L747-T751 del P753欠損変異を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１および７〜９に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ１および７〜９と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託会社（（株）日本バイオサービス、オペロン（株）、プロリゴ（株）、シグマジェノシス（株）等）に依頼した。オリゴ１がエクソン19共通オリゴヌクレオチドプライマーであり、オリゴ７〜９がEGFR遺伝子のエクソン19 Del L747-T751 del P753欠損変異遺伝子（変異型）を増幅するためのアンチセンスプライマー（変異型検出用アンチセンスプライマーとして使用）である。
（２）PCR法によるヒトEGFR遺伝子の欠損変異の解析
ヒトEGFRエクソン19 Del L747-T751 del P753欠損変異遺伝子を含むプラスミドDNA溶液（試料1）、ヒトEGFRエクソン19野生型遺伝子を含むプラスミドDNA溶液（試料2）、および健常人ボランティアより採取したヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液（試料3）をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトEGFR遺伝子の欠損変異を解析した。
【００５４】
（ＰＣＲの実施）
上記で調製した試料1μｌ、オリゴ１およびオリゴ７を各２０pmoles、および１０×ＰＣＲｍｉｘ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ ＭｇSO4、ＫＯＤ−ｐｌｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅをミリＱ水に加えて全量を２５μｌとした。以下、オリゴ１およびオリゴ８または９を２０pmoles、および１０×ＰＣＲｍｉｘ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ ＭｇSO4、ＫＯＤ−ｐｌｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅをミリＱ水に加えて全量を２５μｌとした。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃で２分、次いで９４℃−１５秒のデナチュレーション工程、及び６０℃−３０秒のアニーリング及び６８℃−３０秒のＤＮＡ伸長反応工程を１サイクルとして、これを計３５サイクル行うことにより実施した。
【００５５】
（電気泳動を用いた検出）
増幅反応液5μｌを３％アガロースゲルを用いて電気泳動を行なった。結果を図３に示す。
電気泳動結果が示す通り、変異型検出用アンチセンスプライマーの欠損領域に相補的な３’側の塩基が３塩基以上のオリゴ８および９を用いた試薬では変異型のみが増幅された。
【００５６】
[実施例3]
（１）ヒトEGFR遺伝子のエクソン19 Del L747-A750 substitution P欠損変異を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１および１０〜１２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ１および１０〜１２と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託会社（（株）日本バイオサービス、オペロン（株）、プロリゴ（株）、シグマジェノシス（株）等）に依頼した。オリゴ１がエクソン19共通オリゴヌクレオチドプライマーであり、オリゴ１０〜１２がEGFR遺伝子のエクソン19 Del L747-A750 substitution P欠損変異遺伝子（変異型）を増幅するためのアンチセンスプライマー（変異型検出用アンチセンスプライマーとして使用）である。
（２）PCR法によるヒトEGFR遺伝子の欠損変異の解析
ヒトEGFRエクソン19 Del L747-A750 substitution P欠損変異遺伝子を含むプラスミドDNA溶液（試料1）、ヒトEGFRエクソン19野生型遺伝子を含むプラスミドDNA溶液（試料2）、および健常人ボランティアより採取したヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液（試料3）をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトEGFR遺伝子の欠損変異を解析した。
【００５７】
（ＰＣＲの実施）
上記で調製した試料1μｌ、オリゴ１およびオリゴ１０を各２０pmoles、および１０×ＰＣＲｍｉｘ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ ＭｇSO4、ＫＯＤ−ｐｌｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅをミリＱ水に加えて全量を２５μｌとした。以下、オリゴ１およびオリゴ１１または１２を２０pmoles、および１０×ＰＣＲｍｉｘ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ ＭｇSO4、ＫＯＤ−ｐｌｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅをミリＱ水に加えて全量を２５μｌとした。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃で２分、次いで９４℃−１５秒のデナチュレーション工程、及び６０℃−３０秒のアニーリング及び６８℃−３０秒のＤＮＡ伸長反応工程を１サイクルとして、これを計３５サイクル行うことにより実施した。
【００５８】
（電気泳動を用いた検出）
増幅反応液5μｌを３％アガロースゲルを用いて電気泳動を行なった。結果を図４に示す。
電気泳動結果が示す通り、変異型検出用アンチセンスプライマーの欠損領域に相補的な３’側の塩基が４塩基以上のオリゴ１２を用いた試薬では変異型のみが増幅された。
[実施例4]
（１）ヒトEGFR遺伝子のエクソン19 Del L747-S752欠損変異を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１および６、１３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ１および６、１３と示す）を合成した。オリゴ６と１３とも、３’末端から欠損地点までの塩基数が５塩基である。また、オリゴ１３には、３’末端から４番目に人為的ミスマッチ（C→A）がある。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託会社（（株）日本バイオサービス、オペロン（株）、プロリゴ（株）、シグマジェノシス（株）等）に依頼した。オリゴ１がエクソン19共通オリゴヌクレオチドプライマーであり、オリゴ６および１３がEGFR遺伝子のエクソン19 Del L747-S752欠損変異遺伝子（変異型）を増幅するためのアンチセンスプライマー（変異型検出用アンチセンスプライマーとして使用）である。
（２）PCR法によるヒトEGFR遺伝子の欠損変異の解析
ヒトEGFRエクソン19 Del L747-S752欠損変異遺伝子を含むプラスミドDNA溶液（試料1）、ヒトEGFRエクソン19 Del L747-T751 del P753欠損変異型遺伝子を含むプラスミドDNA溶液（試料2）、ヒトEGFRエクソン19野生型遺伝子を含むプラスミドDNA溶液（試料3）、および健常人ボランティアより採取したヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液（試料4）をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトEGFR遺伝子の欠損変異を解析した。
【００５９】
（ＰＣＲの実施）
上記で調製した試料1μｌ、オリゴ１およびオリゴ６を各２０pmoles、および１０×ＰＣＲｍｉｘ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ ＭｇSO4、ＫＯＤ−ｐｌｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅをミリＱ水に加えて全量を２５μｌとした。以下、オリゴ１およびオリゴ１１３を各２０pmoles、および１０×ＰＣＲｍｉｘ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ ＭｇSO4、ＫＯＤ−ｐｌｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅをミリＱ水に加えて全量を２５μｌとした。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃で２分、次いで９４℃−１５秒のデナチュレーション工程、及び６０℃−３０秒のアニーリング及び６８℃−３０秒のＤＮＡ伸長反応工程を１サイクルとして、これを計３５サイクル行うことにより実施した。
【００６０】
（電気泳動を用いた検出）
増幅反応液5μｌを３％アガロースゲルを用いて電気泳動を行なった。結果を図５に示す。
電気泳動結果が示す通り、変異型検出用アンチセンスプライマーの欠損領域に相補的な３’側の塩基のうち、３’側から４番目に人為的ミスマッチを含むオリゴ１３を用いた試薬ではDel L747-S752欠損変異型（試料1）のみが増幅された。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明により、被験核酸配列中の欠損領域またはその有無を特別な機器を用いることなく簡便でかつ再現性よく解析可能になり、これらの変異に関連のある病態、あるいは薬物使用の際に重要な情報を迅速に提供することができることからも、産業界に大きく寄与することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】プライマー設計の一例の概略図
【図２】ヒトEGFR遺伝子のエクソン19 Del L747-S752欠損変異の検出結果
【図３】ヒトEGFR遺伝子のエクソン19 Del L747-T751 del P753欠損変異の検出結果
【図４】ヒトEGFR遺伝子のエクソン19 Del L747-A750 substitution P欠損変異の検出結果
【図５】ヒトEGFR遺伝子のエクソン19 Del L747-S752欠損変異の検出結果
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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