(57)【要約】【課題】活動性心筋炎の検出方法および検出試薬を提供する。特に活動性心筋炎の中でもウイルス感染が原因となるウイルス性の活動性心筋炎を特異的に検出することができる方法およびその検出試薬を提供する。【解決手段】被験者の抗心筋型トロポニンI抗体価を指標とすることを特徴とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の抗心筋型トロポニンI抗体価を指標とすることを特徴とする、活動性心筋炎の検出方法。
【請求項２】
被験者の抗心筋型トロポニンI抗体価が、正常者の抗心筋型トロポニンI抗体価より有意に高いことをもって、当該被験者を活動性心筋炎と判断する請求項１記載の活動性心筋炎の検出方法。
【請求項３】
被験者について、抗心筋型トロポニンI抗体価を測定する工程と、遊離免疫グロブリン軽鎖のカッパ鎖量を測定する工程を有することを特徴とする、請求項１または２に記載する活動性心筋炎の検出方法。
【請求項４】
活動性心筋炎がウイルス性の活動性心筋炎である請求項１乃至３のいずれかに記載する活動性心筋炎の検出方法。
【請求項５】
心筋型トロポニンIまたはその部分ポリペプチドを、抗心筋型トロポニンＩ抗体価の測定試薬として含む、活動性心筋炎の検出試薬または当該試薬を含むキット。
【請求項６】
心筋型トロポニンIの部分ポリペプチドが、ヒト心筋型トロポニンIの少なくとも４１〜１１０番目のアミノ酸領域を有するヒト心筋型トロポニンIの部分ポリペプチドである請求項５に記載する活動性心筋炎の検出試薬または当該試薬を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活動性心筋炎の検出方法および検出試薬に関する。特に本発明は、活動性心筋炎の中でもウイルス感染が原因となるウイルス性の活動性心筋炎を検出するための方法およびその検出試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
心筋炎は心筋の炎症性病変に基づく心筋障害である。病理所見的には、心筋細胞壊死を伴う炎症細胞湿潤を認める活動性心筋炎とそれ以外の非活動性心筋炎に分類することができる。また、病因的にはウイルス感染によるウイルス性心筋炎、細菌等による細菌感染性心筋炎、および膠原病やサルコイドーシス等による非感染性心筋炎に分類される。日常遭遇する心筋炎の殆どは、コクサッキーウイルス、エコーウイルス（以上、ピコルナウイルス科に属するＲＮＡウイルス）、インフルエンザウイルス（オルソミクソウイルス科に属するＲＮＡウイルス）、ＨＩＶウイルス（レトロウイルス科に属するＲＮＡウイルス）、ＳＡＲＳウイルス（コロナウイルス科に属するＲＮＡウイルス）；Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（以上、肝炎ウイルス）；アデノウイルス、パルボウイルス、およびヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス、ＥＢウイルス、サイトメガロウイルス）などのＤＮＡウイルス等のウイルスによるものであり（非特許文献１〜１６など参照）、原因不明の特発性心筋炎もそれらの殆どがウイルス性であると考えられている。一般に、心筋炎は急性に発症し、ほぼ完全に治癒するものが多いが、心機能障害が長期にわたり持続するものもある。
【０００３】
心筋炎の臨床症状は、炎症症状と心症状とからなり、殆ど無症状のものから、心不全や不整脈により急速に死に至るものまで種々である。特にウイルス性心筋炎においては、感染初期に発熱、咳嗽、頭痛、咽頭痛、全身倦怠感などの風邪様症状や吐き気、嘔吐、下痢、腹痛等の消化器症状が出現し、その後に動悸、胸痛、不整脈、息切れ、心不全、アダムスーストークス症候群、夜間の呼吸困難、脚のむくみ、顔面蒼白、チアノーゼ、四肢末梢の冷感、関節痛、筋肉痛、発疹などの多彩な症状が出現する。このようにウイルス性心筋炎は風邪様症状を示すため、風邪と誤診されやすい疾患である一方、誤診による鎮痛解熱剤（非ステロイド系消炎剤）の投薬は心筋の破壊を悪化させる危険性があるため注意が必要である。またウイルス性心筋炎は、しばしば心異常を後遺する。急性期を乗り越えれば約43％は完全治癒するが、約40％は後遺症を残し、約3.2％は再発あるいは再燃をきたす(非特許文献１７)。更に、その後の追跡調査でも、後遺症をきたした一部が拡張型心筋症様病像を呈することが明らかにされている。拡張型心筋症の予後は極めて不良で、発症後5年および10年の生存率は、それぞれ54％および36％である(非特許文献１８)。
【０００４】
活動性心筋炎については抗炎症療法が、またウイルス性心筋炎についてはインターフェロンなどの抗ウイルス薬による抗ウイルス療法が有効であることが知られている。ゆえに、心筋炎においても、活動性心筋炎、またはウイルス感染が成因のひとつと考えられる症例については、早期に診断して上記の治療を始めることが拡張型心筋症などへの移行や後遺症を防止し、その結果良好な予後をもたらすものと期待できる。
【０００５】
このため、心筋炎の簡便で確実な診断法の開発が急務の課題となっており、その検査法の開発の意義は極めて大きい。
【非特許文献１】Grist NR et al. J Hyg 73:162-172, 1964
【非特許文献２】Bell EJ et al. J Hyg 93:197-203, 1984
【非特許文献３】Arch Virol 145: 2575-2600, 2000
【非特許文献４】Bowles NE et al. J Am Coll Cardiol 42:466-472, 2003
【非特許文献５】Onitsuka H et al. J Cardiol 37:315-323, 2001
【非特許文献６】Barbaro G. Herz 30:486-492, 2005
【非特許文献７】Felker GM. N Engl J Med 342:1120-1122, 2000
【非特許文献８】Chen J et al. Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi 32: 516-520, 2003
【非特許文献９】Yazu et al. Nippon Shokakibyo Gakkai Zasshi 85:1304-1307, 1988
【非特許文献１０】Ursell PC et al., Hum Pathol 15:481-484, 1984
【非特許文献１１】Matsumori A et al. Lab Inv 80:1137-1142, 2000
【非特許文献１２】Pauschinger M et al. Circulation 99: 1348-1354, 1999
【非特許文献１３】Kohl et al. Circulation 108: 945-950, 2003
【非特許文献１４】Bowles NE et al. J Am Coll Cardiol 42:466-472, 2003
【非特許文献１５】Bowles NE et al. J Am Coll Cardiol 42:466-472, 2003
【非特許文献１６】Kyto V et al. Clin Infect Dis 40: 683-688, 2005
【非特許文献１７】河村慧四郎他、昭和57年度厚生省特定疾患特発性心筋症調査研究班報告書、p．16、1983
【非特許文献１８】河合忠一ら、昭和57年度厚生省特定疾患特発性心筋症調査研究班研究報告書、p．63、1983
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、心疾患が疑われる被験者について、活動性心筋炎、特にウイルス性の活動性心筋炎の罹患を高い精度でしかも非侵襲的に検出するための方法、および当該方法に使用される試薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記目的を達成するために鋭意研究を重ねていたところ、活動性心筋炎の患者、特にウイルス感染が原因の活動性心筋炎の患者は、正常者、並びに非活動性心筋炎の患者や心筋炎を伴わない心不全の患者に比べて、抗心筋型トロポニンＩ抗体価が有意に高いことを見出し、当該心筋型トロポニンＩ抗体価が活動性心筋炎の診断、特にウイルス性の活動性心筋炎診断の指標となることを確信した。
【０００８】
本発明は、かかる知見に基づいて完成したものである。即ち、本発明は、抗心筋型トロポニンＩ抗体価を指標とする活動性心筋炎の検出方法、およびそれに使用する検出試薬を提供するものである。
【０００９】
本発明には、下記の態様が含まれる：
（１）活動性心筋炎の検出方法
(1-1)．被験者の抗心筋型トロポニンI抗体価を指標とすることを特徴とする、活動性心筋炎の検出方法。当該検出方法は、(a)被験者の生体試料中の抗心筋型トロポニンI抗体価を測定する工程を有する。
【００１０】
(1-2)．被験者の抗心筋型トロポニンI抗体価が、正常者の抗心筋型トロポニンI抗体価より有意に高いことをもって、当該被験者を活動性心筋炎と判断する(1-1)記載の活動性心筋炎の検出方法。当該検出方法は、(a)被験者の生体試料中の抗心筋型トロポニンI抗体価を測定する工程、(b)当該被験者の測定結果と正常者の抗心筋型トロポニンI抗体価（対照抗体価）とを対比する工程を有する。そして、(b)の結果から、被験者の抗心筋型トロポニンI抗体価が対照抗体価より有意に高い場合に当該被験者を活動性心筋炎と判断する方法である。
【００１１】
(1-3)．被験者について、抗心筋型トロポニンI抗体価を測定する工程と、遊離免疫グロブリン軽鎖のカッパ鎖量を測定する工程を有することを特徴とする(1-1)または(1-2)に記載する活動性心筋炎の検出方法。当該検出方法は、具体的には(a)被験者の生体試料中の抗心筋型トロポニンI抗体価を測定する工程、と(c) 被験者の生体試料中のＦＬＣのカッパ鎖量を測定する工程を有する。
【００１２】
(1-4)．被験者の中から、遊離免疫グロブリン軽鎖（FLC）のカッパ鎖量が、正常者のＦＬＣのカッパ鎖量より有意に高い人を選択する工程を有する (1-3)記載の活動性心筋炎の検出方法。当該検出方法は、上記(a)工程、(b)工程、および(c)工程に加えて、(d)被験者のＦＬＣカッパ鎖量の測定結果と正常者のＦＬＣカッパ鎖量（対照カッパ鎖量）とを対比する工程を有する。そして、(b) において、被験者の抗心筋型トロポニンI抗体価が対照抗体価より有意に高く、かつ(d)において、被験者のＦＬＣカッパ鎖量が対照カッパ鎖量より有意に高い場合には、当該被験者についてＢ細胞活性抑制という療法を選択することが可能となる。
【００１３】
(1-5)．活動性心筋炎がウイルス性の活動性心筋炎である(1-1)乃至(1-4)のいずれかに記載する活動性心筋炎の検出方法。
【００１４】
（２）活動性心筋炎の検出試薬および試薬キット
(2-1)．心筋型トロポニンIまたはその部分ポリペプチドを、抗心筋型トロポニンＩ抗体価の測定試薬として含む、活動性心筋炎の検出試薬または当該試薬を含むキット。
(2-2)．心筋型トロポニンIの部分ポリペプチドが、ヒト心筋型トロポニンIの少なくとも４１〜１１０番目のアミノ酸領域を有するヒト心筋型トロポニンIの部分ポリペプチドである(2-1)に記載する活動性心筋炎の検出試薬または当該試薬を含むキット。
(2-3)．ウイルス感染を原因とする活動性心筋炎の検出試薬または当該試薬を含むキット。
【００１５】
なお、本発明において「正常者」とは、心疾患に罹患しておらず、かつ心疾患履歴のない人、すなわち少なくとも心臓に関して正常である人を意味する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、心疾患が疑われる患者について、活動性心筋炎の罹患を、非活動性心筋炎や心筋炎を伴わない心不全と区別して検出することができるため、活動性心筋炎の特異的また高精度な診断方法として有効に利用することができる。活動性心筋炎は、心筋細胞壊死を伴う炎症細胞湿潤を認めるものであり、抗炎症療法が有効と考えられている。このため、本発明の方法により活動性心筋炎と判断された患者には、抗炎症療法を施すことによって早期に的確且つ有効な治療効果を得ることができる。
【００１７】
また本発明によれば、活動性心筋炎の中でも特にウイルス感染を原因とする活動性心筋炎を特異的に検出することができるため、ウイルス性の活動性心筋炎の特異的また高精度な診断方法として有効に利用することができる。本発明の方法によりウイルス性の活動性心筋炎と判断された患者には、抗ウイルス療法を施すことによって早期に的確且つ有効な治療効果を得ることができる。
【００１８】
また本発明の方法は、心筋生検によらず、被験者の血液や尿試料を使用して、非侵襲的な方法で活動性心筋炎の有無を簡便に判定することができる点で有用な方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明が対象とする活動性心筋炎は、心筋細胞壊死を伴い、炎症細胞湿潤が存在する心筋炎である。このような病理的所見が認められる活動性心筋炎の治療方法には、他の心疾患（例えば、非活動性心筋炎、心筋炎を伴わない心疾患）と異なり、抗炎症療法が有効である。
【００２０】
特に本発明が対象とする活動性心筋炎は、ウイルス感染を原因とするウイルス性の活動性心筋炎である。かかるウイルス性心筋炎の治療方法には、非ウイルス性心筋炎と異なり、抗ウイルス療法が有効である。
【００２１】
ウイルス性心筋炎は、ウイルス抗体に対する抗体価または心筋組織からのウイルスの検出の有無により、膠原病やサルコイドーシス等による「非ウイルス性心筋炎」とは明確に区別することができる。また本発明が対象とする「ウイルス性心筋炎」は、ウイルス抗体に対する抗体価および細菌に対する抗体価、または心筋組織からのウイルスまたは細菌の検出の有無により、ウイルス以外の細菌等による「細菌感染性心筋炎」とは明確に区別することができる。かかる「ウイルス性心筋炎」と「非ウイルス性心筋炎」および「細菌感染性心筋炎」との区別に関しては、例えば、文献Viral infection of the heart, J. E. Banatvala編集、Edward Arnold社出版、ロンドン1993, pp.1-257を参照することができる。
【００２２】
本発明において、ウイルス性心筋炎を引き起こすウイルスは、その限りにおいて特に制限されない。かかるウイルス性心筋炎を引き起こすウイルスには、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに属する病原ウイルスが含まれる。そのような病原ウイルスのうち、ＤＮＡウイルスとしては、例えば、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ＥＢウイルス等）、アデノウイルス、パルボウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス等を挙げることができる。また上記病原ウイルスのうち、ＲＮＡウイルスとしては、例えば、ピコルナウイルス科に属するウイルス（例えば、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、脳心筋炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス）、オルソミクソウイルス科に属するウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、レトロウイルス科に属するウイルス（例えば、ＨＩＶウイルス）、コロナウイルス科に属するウイルス（例えば、ＳＡＲＳウイルス）、その他、レオウイルス、トガウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、カリシウイルスを挙げることができる。また、ウイルス性心筋炎を引き起こすＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに属する病原ウイルスには、肝炎ウイルス、特にＡ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスが含まれる。好適なウイルスとしては、上記ピコルナウイルス科に属するウイルス（例えば、コクサッキーウイルスおよびエコーウイルス）、各種の肝炎ウイルス（特にＡ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス）を挙げることができる。より好ましくは肝炎ウイルス、特にＣ型肝炎ウイルスである。
【００２３】
本発明の活動性心筋炎の検出方法は、被験者の生体試料中の抗心筋型トロポニンI抗体価を指標とすることを特徴とする。すなわち、本発明の方法は、被験者の生体試料を対象として、当該生体試料の抗心筋型トロポニンI抗体価を測定することによって実施することができる。
【００２４】
対象となる生体試料は、測定対象となる抗心筋型トロポニンI抗体の存在が認められる生体（ヒト、その他の動物を含む）に由来する試料であれば特に限定されることなく、一般の臨床検査において検体とされる試料を広く挙げることができる。具体的には血液（血清や血漿を含む）、尿、脊髄液、羊水、唾液等の体液を例示することができる。好ましくは血液および尿、より好ましくは血液であり、なかでも特に好ましくは血清である。
【００２５】
抗心筋型トロポニンI抗体の測定に使用される抗原としては、検出すべき測定対象の抗心筋型トロポニンI抗体と免疫反応（抗原−抗体反応）する抗原であれば特に制限はされない。好ましくはヒト抗心筋型トロポニンI抗体と免疫反応（抗原−抗体反応）する抗原である。かかる抗原としては心筋型トロポニンIを挙げることができる。上記要件を満たす限りにおいて、心筋型トロポニンIは全長であってもよいし、その部分断片（部分ペプチド）であってもよい。好適なものとしてヒト心筋型トロポニンIまたはその部分ペプチドを挙げることができるが、心筋型トロポニンIは一般に種間の相同性が高いことを鑑みれば（例えば、ヒト心筋型トロポニンIとマウスまたはラットの心筋型トロポニンIは、アミノ酸配列において92.4％の同一性を有することが知られている）、ヒト由来に限らず、ヒト心筋型トロポニンIとアミノ酸配列において同一性が高いマウスやラットなどのヒト以外の哺乳類に由来する心筋型トロポニンIまたはその部分ペプチドを使用することもできる。
【００２６】
なお、心筋型トロポニンIは、心筋の収縮単位サルコメアを構成するthin filamentの成分の一つであり、心筋細胞の収縮に関わることが知られている。例えばヒト心筋型トロポニンIは、配列表：配列番号１に示すように２１０個のアミノ酸配列からなる蛋白質であり（GenBank accession No.NP_000364）、また、その遺伝子も既にクローニングされ塩基配列も公知になっている（GenBank accession No.NM_000363）（例えば、Vallius WJ et al., FEBS Lett. 270; 57-61, 1990など）。配列番号２にその塩基配列を示す。うち塩基番号90〜722の領域がコード領域である。
【００２７】
またマウスおよびラットに由来する心筋型トロポニンIもクローニングされており、その遺伝子およびアミノ酸配列もいずれも公知になっている（マウス：文献Ausoni S et al., J Biol Chem. 269: 339-346, 1994、アミノ酸配列；GenBank accession No.NP_033432、塩基配列；GenBank accession No.NM_009406）（ラット：文献Murphy AM et al., Biochemistry 30:707-712, 1991、アミノ酸配列；GenBank accession No.NP_058840、塩基配列；GenBank accession No.NM_017144）。
【００２８】
心筋型トロポニンIの部分ペプチドとしては、抗心筋型トロポニンI抗体と特異的に抗原−抗体反応する抗原性を有するものであれば、特に制限されない。一般にIgG（自己抗体）を認識するアミノ酸残基数は３〜４残基といわれることから、心筋型トロポニンIのアミノ酸配列において連続する４残基以上のアミノ酸配列を有する部分ペプチドであればよい。例えば、ヒト心筋型トロポニンIの部分ペプチドの例として、４１〜１１０番目のアミノ酸領域を含むペプチドを好適に挙げることができる。
【００２９】
尚、採用しようとする部分ペプチドが本発明の検出方法において良好に使用し得るかは、抗心筋型トロポニンI抗体との反応性（抗原−抗体反応性）を常法に従って試験することにより、容易に確認することができる。
【００３０】
これらの心筋型トロポニンIまたはその部分ペプチド（以下、これらを総じて「抗原」ともいう）は、本発明の抗心筋型トロポニンI抗体の検出方法において、所望により、常法に従って任意の固相に固定化して用いることができる。当該固相としては、この技術分野において慣用の各種の固相が利用でき、例えばガラス、セルロース粉末、セファデックス、セファロース、ポリスチレン、濾紙、カルボキシメチルセルロース、イオン交換樹脂、デキストラン、プラスチックフィルム、プラスチックチューブ、ナイロン、ガラスビーズ、絹、ポリアミン−メチルビニルエーテル−マレイン酸共重合体、アミノ酸共重合体、エチレン−マレイン酸共重合体等の種々の素材からなるスティック、ビーズ、プレート（マイクロプレートを含む）、試験管等を広く例示できる。
【００３１】
固定化方法についても特に制限はなく、物理的結合及び化学的結合のいずれをも使用できる。例えば、共有結合法としてジアゾ法、ペプチド法（酸アミド誘導体法、カルボキシルクロライド樹脂法、カルボジイミド樹脂法、無水マレイン酸誘導体法、イソシアナート誘導体法、臭化シアン活性化多糖体法、セルロースカルボナート誘導体法、縮合試薬を使用する方法等）、アルキル化法、架橋試薬による担体結合法（例えば架橋試薬としてグルタールアルデヒド、ヘキサメチレンイソシアナート等を用いるもの）、Ｕｇｉ反応による担体結合法等の化学的反応：或いはイオン交換樹脂のような担体を用いるイオン結合法：ガラスビーズ等の多孔性ガラスを担体として用いる物理的吸着法等が例示できる。
【００３２】
なお、測定系に使用される抗原の量は、特に制限されず、採用する測定系において慣用の抗原量に応じて任意に決定することができる。例えば、サンドイッチ法を採用する場合には、通常、測定対象である抗心筋型トロポニンI抗体に対して過剰の抗原が使用され、例えば１００μｌ容量で反応させる場合を例に挙げると、通常０．１〜１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは１〜１０μｇ／ｍｌ程度の使用を例示することができる。
【００３３】
上記抗原と被験者の生体試料中の測定対象抗体（抗心筋型トロポニンI抗体）との免疫反応（抗原−抗体反応）は、特に制限されず、通常の免疫反応における条件が採用される。一般には４５℃以下、好ましくは約４〜４０℃、より好ましくは２５〜４０℃程度の温度条件下で、抗原と測定対象抗体を含み得る生体試料とを共存させ、約０．５〜４０時間、好ましくは１〜２０時間程度、放置もしくはインキュベーションする方法を挙げることができる。また、反応に使用される溶媒及びそのｐＨも、当該反応に悪影響を与えないものであれば特に制限されず、常法に従って若しくはそれに準じて、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩緩衝液、酢酸緩衝液等のｐＨが約５〜９程度の緩衝液を例示することができる。
【００３４】
本発明の検出方法は、基本的には、生体試料中に存在する測定対象の抗体（抗心筋型トロポニンI抗体）と当該抗体に対する固定化されていてもよい抗原との免疫反応（抗原−抗体反応）工程を有するものであればよく、他の工程は特に制限されないが、更に、当該抗原に捕捉された測定対象抗体と抗体検出試薬との反応工程を含むことが好ましい。また、検出特異性を上げる方法として、抗原−抗体反応工程で得られた免疫複合体（抗原−抗体結合物）から、一旦慣用のＩｇＧ解離法を用いて抗心筋型トロポニンI抗体を単離し、これを再度抗原との免疫反応（抗原−抗体反応）に供して、次いで抗体検出試薬と反応させる方法を用いることもできる。
【００３５】
抗原−抗体反応工程で得られる免疫複合体（抗原−抗体結合物）を検出・測定する方法並びにそれらの条件は、特に制限されることなく、通常の免疫測定法で用いられるものと同じか、若しくはそれに準じた方法及び条件を採用することができる。
【００３６】
本発明の方法は、好適にはサンドイッチ法に従って実施することができる。例えば、固相化サンドイッチ法によれば、測定対象である生体試料中の抗体（抗心筋型トロポニンI抗体）は例えば次のようにして測定することができる。
【００３７】
まず、測定対象である抗心筋型トロポニンI抗体と特異的に抗原−抗体反応する抗原を固相化してなる固相化抗原に、測定対象抗体を含み得る検体としての生体試料（例えば、血清試料）を加えて、抗原−抗体反応を行わせる。次いで、未結合物質を、例えば洗浄により除去し、次いで抗体検出試薬を加えて、抗原−抗体結合物における測定対象抗体と反応させ、当該試薬に応じた検出手段によって抗原−抗体結合物の存在を検出するか、又はその量を測定する。上記において、より簡便には、金コロイド着色ラテックス粒子等を標識してなる抗体検出試薬を用いたイムノクロマト法の採用を例示することができる。
【００３８】
これら測定手法における各種手段の選択やそれらの改変等はいずれも当業者のよく知るところであり、本発明においてはそれら各手法のいずれによることもできる〔「臨床検査法提要」、金原出版、1995年等参照〕。
【００３９】
ここで抗体検出試薬としては、特に制限されることなく、一般に当業界で用いられている各種の試薬を広く用いることができる。例えば、測定対象である抗体（イムノグロブリン）と結合し得る抗ヒトイムノグロブリン抗体等を挙げることができる。なお、該抗ヒトイムノグロブリン抗体には、測定対象である各クラスのイムノグロブリンを免疫源として免疫された任意の被免疫動物から得られる抗血清又はその精製物（ポリクローナル抗体 ）或いはモノクローナル抗体が包含される。
【００４０】
これらの抗体検出試薬は、常法に従い調製することができ、また市販品としても入手することができる。
【００４１】
当該抗体検出試薬は、その検出の為に、通常の標識剤によって、直接的に修飾されていてもよいし、また付加的な検出手段により間接的に修飾することもできる。この標識剤としては、特に制限はされず、従来公知のもの又は将来使用され得るいずれのものをも用いることができるが、具体的には125Ｉ、3Ｈ、14Ｃ等の放射性同位元素類；アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の酵素類；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）等の蛍光物質類；及び１Ｎ−（２，２，６，６−テトラメチル−１−オキシル−４−ピペリジル）−５Ｎ−（アスパルテート）−２，４−ジニトロベンゼン（ＴＯＰＡ）等が例示され、これらを標識剤として使用する免疫測定法は、それぞれラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、フルオロイムノアッセイ及びスピンイムノアッセイと称されている。好ましくは、標識剤として、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）やペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の酵素を使用したエンザイムイムノアッセイである。
【００４２】
尚、これらの標識剤による標識方法や間接的な標識化による修飾方法、並びにそれらの検出方法等は、自体公知の方法に従って行うことができる（「単クローン抗体」岩崎辰夫 他著、講談社サイエンティフィク、1984；「酵素免疫測定法」第２版、石川栄治 他著、医学書院、1982等）。
【００４３】
本発明の検出方法は、抗体検出のための抗原として、抗心筋型トロポニンI抗体に特異的に反応する抗原を使用することを必須とするものであって、その限りにおいて、他の基本的操作等は特に制限されることなく、通常の免疫測定法における方法及び慣用の方法等を広く採用することができる。故に、抗原−抗体結合物と上記の抗体検出試薬との反応条件も特に制限されず、通常の免疫反応における条件が採用される。通常、前述する抗原−抗体反応の条件と同様な条件、例えば通常４５℃以下、好ましくは約４〜４０℃、より好ましくは２５〜４０℃程度の温度条件下、ｐＨが約５〜９程度の下で、約０．５〜４０時間、好ましくは１〜２０時間程度放置するかもしくはインキュベーションする方法を挙げることができる。
【００４４】
生体試料における抗心筋型トロポニンI抗体の存在有無、或いはその含有量は、常法に従って、抗体検出試薬の標識に用いた標識剤（或はその間接的な標識）の種類に応じた標識活性を測定することにより、或いはその測定値から換算した抗体力価に基づいて評価することができる。
【００４５】
本発明の検出方法において、被験者の生体試料について測定された抗心筋型トロポニンI抗体価が、正常者（心筋炎に罹患していない被験者）の生体試料について同様に測定された抗心筋型トロポニンI抗体価（対照抗体価）に比して有意に高い場合、当該被験者を活動性心筋炎に罹患している可能性が高いと判断することができる。ここで「有意に高い」とは、統計学的な処理において有効水準が５％以下である場合、好ましくは有意差Ｐ＜０.０５である場合を意味する。また、抗心筋型トロポニンI抗体価の絶対値が０.１ＡＵ（Arbitrary Units）以上である場合は、対照抗体価と対比しなくても、活動性心筋炎に罹患している可能性が高いと判断することができる。
【００４６】
また、本発明の活動性心筋炎の検出方法は、上記抗心筋型トロポニンI抗体価の測定工程に加えて、遊離免疫グロブリン軽鎖（ＦＬＣ）のカッパ鎖量を測定する工程を有していてもよい。ＦＬＣのカッパ鎖の量は血液（血清または血漿を含む）または尿を試料として、Nakano, T. et al., J Immunological Method, 293, 183-189, 2004の記載に従って測定することができる。一般に遊離免疫グロブリン軽鎖（FLC）のカッパ鎖の高値は、カッパ鎖を産生するＢ細胞が活性化していることを示す。よって、被験者の生体試料について測定されたＦＬＣのカッパ鎖量が、正常者（心筋炎に罹患していない被験者）の生体試料について同様に測定されたＦＬＣのカッパ鎖量（対照カッパ鎖量）に比して有意に高い場合、もしくはＦＬＣのカッパ鎖の絶対値が３４ｍｇ／Ｌ（正常者の平均＋標準偏差）程度以上である場合には、活動性心筋炎の原因の一つとして、ある種のＢ型リンパ球の活性化を考えることができる。すなわち、本発明の検出方法において、抗心筋型トロポニンＩ抗体価の測定と遊離免疫グロブリン軽鎖（FLC）量の測定を組み合わせて行い、両者の測定値がいずれも高い場合には、活動性心筋炎の成因の一つがＢ型リンパ球の活性化にあると判断することができる。この場合、カッパ鎖を産生するＢ細胞の活性抑制という療法を選択することにより、的確且つ有効な治療効果を得ることができる。
【００４７】
なお、上記において「有意に高い」か否かは、前述する有効水準または有意差を指標に判断することができる。
【００４８】
上記本発明の検出方法は、この測定の為の試薬または試薬キットを利用することにより簡便に実施することができる。
【００４９】
ゆえに本発明は、活動性心筋炎の検出方法を簡便に行うために有用な活動性心筋炎の検出試薬および試薬キットを提供する。当該試薬は、生体試料中に含まれる抗心筋型トロポニンI抗体を、抗原−抗体反応を利用して検出測定するための試薬であり、ゆえに抗心筋型トロポニンI抗体と特異的に反応する抗原として、心筋型トロポニンIまたはその部分ペプチドを試薬として含むことを特徴とする。
【００５０】
心筋型トロポニンIとして、好ましくはヒト由来の心筋型トロポニンIであるが、前述するようにヒト心筋型トロポニンIに代えて、ヒト心筋型トロポニンIのアミノ酸配列と同一性が高い、例えばマウス由来またはラット由来の心筋型トロポニンIも同様に使用することができる。心筋型トロポニンIの部分ペプチドも抗心筋型トロポニンI抗体と特異的に反応する限りにおいて特に制限されない。例えばヒト心筋型トロポニンIの部分ペプチドとしては、好適にはヒト心筋型トロポニンIの４１〜１１０番目のアミノ酸領域を含むペプチドを挙げることができる。
【００５１】
当該抗原は、前述する任意の固相に固定化されていてもよい。本発明の試薬は、上記の抗原のほか、抗原−抗体結合物を特異的に結合する抗体検出試薬を含有するキットの形態を有していてもよい。抗体検出試薬としては、前述のものを挙げることができる。当該試薬キットには、実施の便益のために、更に適当な反応液、希釈液、洗浄液、反応基質、ＩｇＧ解離法に使用する中和液、反応停止液、標識活性測定試薬等、が含まれていてもよい。
【実施例】
【００５２】
以下に、試験例によって本発明の効果を明らかにするが、これらは単なる例示であり、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００５３】
実施例１  抗原の作製
（１）リコンビナント・全長ヒト心筋型トロポニンI (rh cTnI-full)の作製
ヒト心臓のTotal RNA（CLONTECH社製)を鋳型として、下記のプライマー：
・full-FW：  5’-GACGGATCCATGGCCGATGGTAGCAGCGATGCGG-3’（配列番号３）
・full-RW：  5’-GACGAGCTCTCAGCTCTCAAACTTTTTCTTGCGG-3’（配列番号４）
を用いてRT-PCRを行い、全長ヒト心筋型トロポニンI（アミノ酸1-210）をコードするDNAに相当するcDNAを増幅取得した。取得したcDNA の塩基配列をシークエンスにより確認したところ、GenBankに登録されている全長ヒト心筋型トロポニンIをコードする塩基配列（コード領域）（Accession No. NM_000363）（配列番号２）と相違ないことを確認した。
【００５４】
上記で調製した全長ヒト心筋型トロポニンI  (rh cTnI-full) のcDNAを大腸菌発現ベクターpQE-30（QIAGEN製）に挿入し、融合蛋白を発現するベクターpQE-30/cTnIを得た。このベクターpQE-30/cTnIを大腸菌細胞株XL1-Blue（Stratagene製）に導入し、rh cTnIを発現する大腸菌細胞株XL1-Blue/cTnIを得た。この組換え大腸菌細胞株XL1-Blue/cTnIを50 μg/mlアンピシリン含有TB培地にて培養し、1 mM IPTGにより誘導し、rh cTnIを発現させた。次いで、rh cTnIを発現させた培養液を遠心分離(5000 rpm、5 min、4℃)して、大腸菌を沈殿させ、回収した菌体を500 mM NaCl含有25 mM リン酸緩衝液 (pH 8.0)に懸濁した後、氷中にて超音波破砕した。さらに得られた菌体液を遠心分離(15,000 rpm、30 min、4℃)し、rh cTnIを含む沈殿物を回収した。回収した沈殿物は500mM NaCl及び6M グアニジン塩酸含有25 mM リン酸緩衝液 (pH 8.0)に懸濁した後、氷中にて超音波破砕し、遠心(15,000 rpm、30 min、4℃)して、rh cTnIを含む上清を回収した。
【００５５】
回収した上清をNi-NTA agaroseと混合し、rh cTnIをNi-NTA agaroseと結合させた後、7M尿素含有20 mM トリス緩衝液(pH 7.5)にてアガロースを洗浄し、次いで200 mM イミダゾール及び7 M 尿素含有20 mM トリス緩衝液(pH 7.5)でrh cTnIを溶出した(Ni-NTA agarose 溶出画分)。さらに、当該Ni-NTA agarose 溶出画分をDEAE sepharose カラムに供して、rh cTnIを含む非結合画分を回収した(DEAE sepharose非結合画分)。当該DEAE sepharose非結合画分をCM sepharose カラムに通液して、CM sepharoseに結合させた後、0−500 mM NaCl濃度勾配の7 M 尿素含有20 mM トリス緩衝液(pH 7.5)により溶出させて、rh cTnIを含む画分を回収し、これを精製リコンビナント・全長ヒト心筋型トロポニンI （精製rh cTnI-full）とした。
【００５６】
（２）リコンビナント・部分ヒト心筋型トロポニンI (rh cTnI-middle)の作製
ヒト心臓のTotal RNA（CLONTECH社製)を鋳型として、下記のプライマー：
・middle-FW：  5’-GACGGATCCATCTCCGCCTCGAGAAAATTGCAGC-3’（配列番号５）
・middle-RW：  5’-GACGAATTCTCAGTGATGGTGATGGTGATGCTCTTCATCCACCTTGTCCACACGG-3’（配列番号６）
を用いてRT-PCRを行い、部分ヒト心筋型トロポニンI（アミノ酸41-110）をコードするDNAに相当するcDNAを増幅取得した。なお、上記プライマーmiddle-RWは、ヒト心筋型トロポニンIの110番目のアミノ酸をコードするコドンの直後に６個のヒスチジン（6×His）をコードする塩基配列と停止コドン(tag)を組み込んで設計したものである。取得したcDNA の塩基配列をシークエンスにより確認したところ、GenBankに登録されているヒト心筋型トロポニンIのアミノ酸41-110番目の領域をコードする塩基配列の3’端に、6×His-tag の配列が組み込まれた配列と相違ないことを確認した。
【００５７】
斯くして調製されたcDNAを大腸菌発現ベクターpGEX-2T（ファルマシア製）に挿入し、GST及び6xHis-tagをもつ融合蛋白を発現するベクターpGEX-2T/cTnI-middleを得た。このベクターを大腸菌細胞株JM-109（東洋紡製）に導入し、大腸菌JM109/cTnI-middleを得た。この組換え大腸菌株を50 μg/mlアンピシリンを含むTB培地にて培養し、1mM IPTGによりrh cTnI-middleの発現を誘導した。rh cTnI-middleを含む培養液を遠心分離(5,000 rpm、5 min、4℃)し、大腸菌を沈殿させ、沈殿させた菌体を500 mM NaCl、1% Triton X-100及び20 mMイミダゾール含有 25 mM リン酸緩衝液 (pH 8.0)に懸濁した後、氷中にて超音波破砕し、遠心分離(15,000 rpm、30 min、4℃)してrh cTnI-middleを含む上清を回収した。
【００５８】
この上清をNi-NTA agaroseと混合して、rh cTnI-middleをNi-NTA agaroseに結合させて、500 mM NaCl、1% Triton X-100及び20 mMイミダゾール含有25 mM リン酸緩衝液 (pH 8.0)で洗浄し、さらに1% Triton X-100含有25 mM リン酸緩衝液 (pH 8.0)で洗浄した後、1% Triton X-100及び200 mMイミダゾール含有25 mM リン酸緩衝液 (pH 8.0)を用いて、rh cTnI-middleを溶出した(Ni-NTA agarose 溶出画分)。当該Ni-NTA agarose 溶出画分をGlutathione sepharose カラムに通液した後、1% Triton X-100 含有リン酸緩衝液、次いでリン酸緩衝液で洗浄した後、10 mM  Glutathione含有50 mM トリス緩衝液(pH 8.0)を通液して、Glutathione sepharose カラムに結合させたrh cTnI-middleを溶出した(Glutathione sepharose溶出画分)。当該Glutathione sepharose溶出画分をリン酸緩衝液に対して透析し、回収した透析物を精製リコンビナント・部分ヒト心筋型トロポニンI （精製rh cTnI- middle）とした。
【００５９】
実施例２    抗トロポニンI(cTnI)抗体の測定方法
（１）前処理用抗原固相化プレートの調製
96穴プレート(Immunoplate II, Nunc)の各ウェルに、実施例１の（１）で調製した抗原(精製rh cTnI-full)を0.5 μg/wellの割合で加え、4℃で一晩放置した。次いで、上清を捨てた後、200 μlの1% BSA含有PBSを各ウェルに加え、室温で２時間放置し、抗原固相化プレートを作製した。
【００６０】
（２）一次反応
（１）の前処理用抗原固相化プレートの各ウェルを200 μlの洗浄液（0.1% Tween 20含有PBS)で５回洗浄し、洗浄後、予め希釈液（0.1% BSAおよび0.1% Tween 20含有PBS)にて10倍希釈した血清サンプルを100 μlをウェルに加え、4℃で一晩反応させた。反応後、プレートを洗浄液で５回洗浄し、100μlの回収液（10 mM glycine-HCl、pH 2.7)を各ウェルに加え、次いで、各ウェルから50μlづつ分取し、50μlの中和液（0.2%BSA及び0.2% Tween 20含有50mM リン酸緩衝液、pH 8.0)にて中和し、IgG（抗心筋型トロポニンＩ抗体）回収サンプルとした。
【００６１】
（３）反応用抗原固相化プレート
96穴プレート(Immunoplate II, Nunc)の各ウェルに、抗原(精製rh cTnI- middle)を 0.5 μg/wellの濃度で加え、4℃で一晩放置した。上清を捨てた後、200μlの1% BSA含有PBSを各ウェルに加え、室温で２時間放置し、反応用抗原固相化プレートを作製した。
【００６２】
反応後、プレートを洗浄液で５回洗浄し、各ウェルに（２）で回収したIgG（抗心筋型トロポニンＩ抗体）回収サンプル(100μl)を加え、室温で２時間反応させた。反応後各ウェルを洗浄液で５回洗浄し、各ウェルに２万倍希釈したHRP標識ヒツジ抗ヒトIgG抗体を100μlづつ加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルに基質溶液（OPD）を100 μlづつ加え、室温で３０分間反応させた。反応後、各ウェルに2N H2SO４を100μlづつ加え発色反応を停止し、プレートリーダーで比色（λ= 492 nm）した。
【００６３】
実施例３
（１）心筋炎1,315例を、心筋生検による病理組織診断において活動性心筋炎との診断が確定した88例（活動性心筋炎）と、活動性心筋炎との診断が確定しなかった1,227例（非活動性心筋炎）とに分け、これらの各患者の血清サンプルを被験試料として、実施例２の方法に従って抗心筋型トロポニン抗体価を測定した。また、同様にして心筋炎を伴わない心不全例157例、および正常者61例についても同様に実施例２の方法に従って抗心筋型トロポニン抗体価を測定した。結果を図１に示す。
【００６４】
図１に示すように、活動性心筋炎の患者の抗心筋型トロポニン抗体価は、非活動性心筋炎の患者、心不全の患者、および正常者のいずれの抗心筋型トロポニン抗体価よりも顕著に高かった。一方、同時に測定した血中心筋型トロポニンＩ値、トロポニンＴ値、およびproBNP値には、症例間で差異は認められなかった。
【００６５】
このことから、抗心筋型トロポニン抗体価を指標とすることで、活動性心筋炎を、非活動性心筋炎や心不全などの他の心疾患と区別して診断することができると考えられる。
【００６６】
（２）（１）で活動性心筋炎と判断された88例、および非活動性心筋炎と判断された1227例のうち143例を、各々Ｃ型肝炎ウイルス感染（HCV感染）の有無によって分類した。なお、Ｃ型肝炎ウイルス感染の有無は、患者の血清を試料として、アボット社の検査試薬「アーキテクト（登録商標）ＨＶＣ」を用いてＣ型肝炎ウイルスの抗体価を測定することによって行い、抗体価が１.０以上の場合をＣ型肝炎ウイルス感染していると判断した。
【００６７】
活動性心筋炎88例のうち、HCV感染者は5例、HCV非感染者は83例であり、非活動性心筋炎143例のうち、HCV感染者は34例、HCV非感染者は119例であった。図２に、各症例群に抗トロポニン抗体価の平均値を纏めた結果を示す。図２に示すように、活動性心筋炎患者の中でもHCV感染者の抗トロポニン抗体価は顕著に高かった。一方、非活動性心筋炎患者の場合、HCV感染者と非HCV感染者間で抗トロポニン抗体価に殆ど差異はなかった。このことから、抗心筋型トロポニン抗体価を指標とすることで、活動性心筋炎の中でもウイルス性心筋炎を、非ウイルス性活動性心筋炎、心筋炎非活動性心筋炎および心不全などの他の心疾患と区別して診断することができることがわかる。
【００６８】
実施例４
心筋炎88例を対象として、抗心筋型トロポニン抗体価とFLCカッパ鎖量を測定した。抗心筋型トロポニン抗体価は、実施例２に記載の方法に従って測定した。またＦＬＣの測定は文献（J. Immunol. Methods, 2003, 275, 9-17）に従って行った。具体的には、まず、ＦＬＣ特異モノクローナル抗体（ヤマサ醤油（株）製）をコートした９６穴マイクロプレート（Nunc社製）に、被験者の血清試料または標準溶液を100μl毎加え、室温で２時間反応させた。洗浄後、二次抗体として抗カッパー軽鎖型抗体（ヤマサ醤油（株）製）の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識体を100μl加え、37℃で30分間反応させた。反応後、0.05％ Tween20を含むPBSで洗浄し、発色液（OPD、Sigma）を100μl分注し、発色させた。１Ｎ硫酸にて発色を停止後、492nmでの吸光度を測定した。なお、アッセイ用の緩衝液としては１％ウシ血清アルブミンを含む50mM  トリス塩酸（pH7.5）を用いた。  
【００６９】
その結果、心筋炎88例のうち、抗心筋型トロポニン抗体価高例（>0.1）は22例（25％）であり、そのうち（22例中）ＦＬＣカッパ値が高値（正常者の平均±標準偏差が34mg/Lを越える）を示した例は21例（95.54％）であった。
【００７０】
このことから、この21例に対しては、カッパ鎖を産生するＢ細胞の活性抑制という療法を選択することにより、活動性心筋炎を的確に治療することができるものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】実施例３（１）の結果を示す図である。心筋炎1,315例のうち活動性心筋炎88例および非活動性心筋炎1,227例、心筋炎を伴わない心不全例157例、および正常者61例の抗心筋型トロポニン抗体価（AU:Arbitrary Unit）を示す結果である。
【図２】実施例３（２）の結果を示す図である。活動性心筋炎88例のうちHCV感染者5例および非感染者83例、非活動性感染者143例のうちHCV感染者34例および非感染者119例、心筋炎を伴わない心不全例157例、並びに正常者61例の抗心筋型トロポニン抗体価（AU:Arbitrary Unit）を示す結果である。
【配列表フリーテキスト】
【００７２】
配列番号３はfull-FWのプライマーの塩基配列を示す。
配列番号４はfull-RWのプライマーの塩基配列を示す。
配列番号５はmiddle-FWのプライマーの塩基配列を示す。
配列番号６はmiddle-RWのプライマーの塩基配列を示す。
【図１】
2007292661.tif 000002
【図２】
2007292661.tif 000003
【配列表】
2007292661000001.app