(57)【要約】【課題】被検物質が含まれる溶液を、選択結合性物質固定化担体上の選択結合性物質を破損することなく接触させることができ、被検物質と固定化された選択結合性物質との選択的な反応を簡便に且つ安定して行うことができる分析用担体を提供する。【解決手段】選択結合性物質がその表面に固定される担体であって、担体表面に、凹部および凸部からなる凹凸部を有し、前記凹凸部において、凸部は列状に配置され、前記凸部の列の間に列状に凹部が形成されてなり、前記凹部に、移動可能に格納されたマイクロロッドを含むことを特徴とする、分析用担体；前記基材を含む分析チップ；前記基材又は分析チップを用いた被検物質の分析方法；前記基材又は分析チップを含む分析キット。【選択図】    図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択結合性物質がその表面に固定される担体であって、
担体表面に、凹部および凸部からなる凹凸部を有し、
前記凹凸部において、凸部は列状に配置され、前記凸部の列の間に列状に凹部が形成されてなり、
前記凹部に、移動可能に格納されたマイクロロッドを含むことを特徴とする、分析用担体。
【請求項２】
前記凸部の上端面に、選択結合性物質が固定化されてなる請求項１に記載の分析用担体。
【請求項３】
前記分析用担体の凹凸部を有する表面に、平坦部が設けられてなることを特徴とする、請求項１又は２に記載の分析用担体。
【請求項４】
マイクロロッドの底面直径が、担体の凹部幅または凸部高さのいずれか小さい長さの９０％以下であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分析用担体。
【請求項５】
前記選択結合性物質が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、ペプチド、糖、糖鎖または脂質であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の選択結合性物質が固定化された分析用担体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の分析用担体の表面を覆い、前記分析用担体と接着されたカバー部材を更に備え、前記分析用担体と前記カバー部材との間に空隙を有し、前記カバー部材は前記空隙に連通する１つ以上の貫通孔を有することを特徴とする分析用チップ。
【請求項７】
分析用担体の凸部上端面とカバー部材との間隔の最短距離が、マイクロロッドの底面直径未満であることを特徴とする請求項６に記載の分析用チップ。
【請求項８】
マイクロロッドの底面直径が、前記空隙の高さまたは担体の凹部幅のいずれか小さい長さの９０％以下であることを特徴とする請求項６または７に記載の分析用チップ。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の分析用担体に、被検物質を接触させて選択的に結合させ、前記分析用担体上に前記選択結合性物質を介して結合した前記被検物質量を測定することを特徴とする、被検物質の分析方法。
【請求項１０】
前記分析用担体に被検物質を接触させるにあたり、前記分析用担体と被検物質が含まれる溶液とを撹拌することを特徴とする、請求項９に記載の分析方法。
【請求項１１】
請求項６〜８のいずれか一項に記載の分析用チップに、前記貫通孔から被検物質をアプライし、前記カバー部材に封止部材を貼付して前記貫通孔を封止し、前記被検物質を前記分析用チップを構成する担体に選択的に結合させ、更に前記分析用担体上に前記選択結合性物質を介して結合した前記被検物質量を測定することを特徴とする、被検物質の分析方法。
【請求項１２】
前記貫通孔から被検物質をアプライするにあたり、被検物質が含まれる溶液を貫通孔から注入するとともに、前記被検物質を前記分析用チップを構成する担体に選択的に結合させるにあたり、前記注入された溶液を撹拌することを特徴とする、請求項１１に記載の分析方法。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の分析用担体と、前記分析用担体の表面を覆い前記分析用担体と接着されたカバー部材と、前記カバー部材に貼付し前記貫通孔を封止する封止部材とを含むことを特徴とする分析用キット。
【請求項１４】
請求項６〜８のいずれか一項に記載の分析用チップと、前記カバー部材に貼付し前記貫通孔を封止する封止部材とを含むことを特徴とする分析用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロロッドを用いた分析用担体、及び該分析用担体を利用した分析方法に関し、詳しくは、検体と選択的に結合する物質（本明細書において「選択結合性物質」という。）が固定化され、検体と選択結合性物質の反応による分析を行う際に用いうる分析用担体、当該分析用担体を含む分析用チップ、及び前記分析用担体並びに前記分析用チップを用いた被検物質の分析方法、及び分析用担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
各種生物の遺伝情報解析の研究が始められている。ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列、また遺伝子配列にコードされる蛋白質およびこれら蛋白質から二次的に作られる糖鎖に関する情報が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子、蛋白質、糖鎖などの高分子体の機能は、各種の方法で調べることができる。主なものとして、核酸は、ノーザンブロッティング、あるいはサザンブロッティングのように、各種の核酸／核酸間の相補性を利用した方法により、各種遺伝子とその生体機能発現との関係を調べることができる。一方、蛋白質は、ウエスタンブロッティングに代表される蛋白質／蛋白質間の反応を利用し蛋白質の機能および発現について調べることができる。
【０００３】
近年、多数の遺伝子発現を一度に解析する手法として、ＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる新しい分析法が開発され、注目を集めている。これらの方法は、いずれも、核酸／核酸間ハイブリダイゼーション反応に基づく核酸検出・定量法である点で原理的には従来の方法と同じである。これらの方法は、蛋白質／蛋白質間あるいは糖鎖／糖鎖間や糖鎖／蛋白質間の特異的な反応に基づく蛋白質や糖鎖検出・定量に応用が可能である。これらの技術は、マイクロアレイ又はＤＮＡチップと呼ばれるガラスの平面基板片上に、多数のＤＮＡ断片や蛋白質、糖鎖が高密度に整列固定化されたものが用いられている点に大きな特徴がある。ＤＮＡチップの具体的使用法としては、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子等を蛍光色素等で標識したサンプルを平面基板片上でハイブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）同士を結合させ、その箇所を高解像度検出装置（スキャナー）で高速に読み取る方法や、電気化学反応にもとづく電流値等の応答を検出する方法が挙げられる。このようして、サンプル中のそれぞれの遺伝子量を迅速に推定できる。また、ＤＮＡチップの応用分野は、発現遺伝子の量を推定する遺伝子発現解析のみならず、遺伝子の一塩基置換（ＳＮＰ）を検出する手段としても大きく期待されている。
【０００４】
ＤＮＡチップによる検出の際は、調製したＤＮＡを含む溶液（ＤＮＡ溶液）を、ＤＮＡチップ上の選択結合性物質と反応させることが必要であるが、このような反応を促進させる方法も開発されている。例えば、特許文献１には、ＤＮＡ溶液上にビーズ状の微粒子をＤＮＡ溶液に添加しておいた微粒子分散溶液をＤＮＡチップにアプライして、ビーズを用いて前記溶液を撹拌しながらハイブリダイゼーションを行い、ＤＮＡチップを回転させることによってビーズが重力方向に落下することにより撹拌を行う方法が記載されている。
【０００５】
しかしながら、特許文献１の方法では、ビーズが沈殿や偏りを起こしやすいことから、溶液の撹拌に支障をきたすおそれがあった。また、ビーズとＤＮＡを同じ溶液中に分散することにより、ビーズがプローブＤＮＡを破損する危険もあった。さらに、微粒子分散溶液のピペットでの操作は、微粒子が沈殿を起こしやすいことなどから煩雑な作業となる。また、検体溶液を密閉する操作においては、検体溶液がシール剤に接触して、検体溶液へのシール剤のコンタミネーションによるバックグラウンドノイズの上昇や、溶液漏れによる検体溶液のロスが起こるといった不都合が多い。
従って、特許文献１に開示される技術に従って良好な分析を行うには、熟練した技術が必要であるという問題がある。
【０００６】
一方、特許文献２には、磁気ビーズを含む反応溶液をＤＮＡチップにアプライして、ＤＮＡチップの外部から磁場の変動を与えることにより反応液を撹拌する方法が記載されている。
しかしながら、特許文献２の方法も、ビーズが沈殿や偏りを起こしやすいことから、溶液の撹拌に支障をきたすおそれがあった。また、ビーズがＤＮＡに接触しないための配慮は何らなされていないため、ビーズがＤＮＡを破損する危険もあった。
【０００７】
【特許文献１】特許第３５５７４１９号公報
【特許文献２】特開２００３−２４８００８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、前記課題を解決するもので、被検物質を、選択結合性物質固定化担体上の選択結合性物質を破損することなく接触させることができ、被検物質と固定化された選択結合性物質との選択的な反応を簡便に且つ安定して行うことができる分析用担体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため、本発明によれば、下記のものが提供される：
〔１〕  選択結合性物質がその表面に固定される担体であって、
担体表面に、凹部および凸部からなる凹凸部を有し、
前記凹凸部において、凸部は列状に配置され、前記凸部の列の間に列状に凹部が形成されてなり、
前記凹部に、移動可能に格納されたマイクロロッドを含むことを特徴とする、分析用担体。
〔２〕  前記凸部の上端面に、選択結合性物質が固定化されてなる前記〔１〕に記載の分析用担体。
〔３〕  前記分析用担体の凹凸部を有する表面に、平坦部が設けられてなることを特徴とする、前記〔１〕又は〔２〕に記載の分析用担体。
〔４〕  マイクロロッドの底面直径が、担体の凹部幅または凸部高さのいずれか小さい長さの９０％以下であることを特徴とする、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載の分析用担体。
〔５〕  前記選択結合性物質が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、ペプチド、糖、糖鎖または脂質であることを特徴とする、前記〔１〕〜〔４〕のいずれか一項に記載の選択結合性物質が固定化された分析用担体。
〔６〕  前記〔１〕〜〔５〕のいずれか一項に記載の分析用担体の表面を覆い、前記分析用担体と接着されたカバー部材を更に備え、前記分析用担体と前記カバー部材との間に空隙を有し、前記カバー部材は前記空隙に連通する１つ以上の貫通孔を有することを特徴とする分析用チップ。
〔７〕  分析用担体の凸部上端面とカバー部材との間隔の最短距離が、マイクロロッドの底面直径未満であることを特徴とする前記〔６〕に記載の分析用チップ。
〔８〕  マイクロロッドの底面直径が、前記空隙の高さまたは担体の凹部幅のいずれか小さい長さの９０％以下であることを特徴とする前記〔６〕または〔７〕に記載の分析用チップ。
〔９〕  前記〔１〕〜〔５〕のいずれか一項に記載の分析用担体に、被検物質を接触させて選択的に結合させ、前記分析用担体上に前記選択結合性物質を介して結合した前記被検物質量を測定することを特徴とする、被検物質の分析方法。
〔１０〕  前記分析用担体に被検物質を接触させるにあたり、前記分析用担体と被検物質が含まれる溶液とを撹拌することを特徴とする、前記〔９〕に記載の分析方法。
〔１１〕  前記〔６〕〜〔８〕のいずれか一項に記載の分析用チップに、前記貫通孔から被検物質をアプライし、前記カバー部材に封止部材を貼付して前記貫通孔を封止し、前記被検物質を前記分析用チップを構成する担体に選択的に結合させ、更に前記分析用担体上に前記選択結合性物質を介して結合した前記被検物質量を測定することを特徴とする、被検物質の分析方法。
〔１２〕  前記貫通孔から被検物質をアプライするにあたり、被検物質が含まれる溶液を貫通孔から注入するとともに、前記被検物質を前記分析用チップを構成する担体に選択的に結合させるにあたり、前記注入された溶液を撹拌することを特徴とする、前記〔１１〕に記載の分析方法。
〔１３〕  前記〔１〕〜〔５〕のいずれか一項に記載の分析用担体と、前記分析用担体の表面を覆い前記分析用担体と接着されたカバー部材と、前記カバー部材に貼付し前記貫通孔を封止する封止部材とを含むことを特徴とする分析用キット。
〔１４〕  前記〔６〕〜〔８〕のいずれか一項に記載の分析用チップと、前記カバー部材に貼付し前記貫通孔を封止する封止部材とを含むことを特徴とする分析用キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、核酸等のハイブリダイゼーションに代表される、被検物質と固定化された選択結合性物質との選択的な反応において、被検物質を、選択結合性物質固定化担体上の選択結合性物質を破損することなく接触させることができ、被検物質と固定化された選択結合性物質との選択的な反応を簡便に且つ安定して行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の分析用担体は、選択結合性物質がその表面に固定される担体であって、担体表面に、凹部および凸部からなる凹凸部を有し、前記凹凸部において、凸部は列状に配置され、前記凸部の列の間に列状に凹部が形成されてなり、前記凹部に、移動可能に格納されたマイクロロッドを含むことを特徴とする。
【００１２】
本発明の分析用担体は、その表面に、凹部及び凸部からなる凹凸部を有することが必要である。このような構造をとることにより、検出の際、非特異的に吸着した被検物質を検出することがないので、ノイズが小さく、結果的によりＳ／Ｎが良好な結果を得ることができる。ノイズが小さくなる具体的な理由は、以下の通りである。すなわち、凸部上端面に選択結合性物質を固定化した担体をスキャナーと呼ばれる装置を用いてスキャンすると、凹凸部の凸部上端面にレーザー光の焦点が合っていることから、凹部では、レーザー光がぼやけ、凹部に非特異的に吸着した検体の望まざる蛍光（ノイズ）を検出しがたいという効果があるためである。
【００１３】
上記凹凸部において、凸部は、列状に配置されることが必要である。すなわち、一定の方向に等間隔或いは任意の間隔にて凸部が配置されてなることが必要である。このように凸部が列状に配置されることにより、凹部にマイクロロッドを移動可能な状態で保持することができる。例えば、図１や図４に示す具体例で説明すると、凸部の列に挟まれた部分、或いは凹凸部と後述の平坦部との境界部分に凹部の列が形成され、凹部の列に格納されたマイクロロッドが前後方向に移動可能となる。
【００１４】
凸部が形成する列の間隔は、マイクロロッドのサイズに合わせて、マイクロロッドが円滑に移動可能な状態となるサイズを適宜設定することができるが、通常は、０．０１〜５ｍｍ、好ましくは、０．０５〜２ｍｍの範囲とすることができる。具体的には、凹部幅が０．２ｍｍの場合、マイクロロッドのサイズは直径０．１８ｍｍ以下、即ち凹部幅の９０％以下を好ましく用いることができる。凸部の列の数は、５〜４００列、好ましくは１６〜２００列とすることができる。また、凸部の列間の間隔は、等間隔としても良いし、任意の間隔としても良いが、図１及び図４に示すごとく、等間隔とすることが好ましい。
また、凸部の列内における配置間隔は、等間隔であっても良いし、任意の間隔であっても良いが、等間隔とすることが好ましく、特に、例えば図１及び図４に示すごとく、列の間隔と同等の間隔でかつＸＹ軸方向に列ができるように等間隔に配置されることが好ましい。
【００１５】
凹凸部の凸部の高さに関しては、それぞれの凸部の上端面の高さが略同一であるであることが好ましい。ここで、高さが略同一とは、多少高さの違う凸部の上端面に選択結合性物質を固定化し、これと蛍光標識した検体とを反応させ、そして、スキャナーでスキャンした際、その信号レベルの強度差が問題とならない高さをいう。具体的に高さが略同一とは、高さの差が５０μｍ以下であることをいう。高さの差は３０μｍ以下であることがより好ましく、高さが同一であればなお好ましい。なお、本願でいう同一の高さとは、生産等で発生するばらつきによる誤差も含むものとする。最も高い凸部上端面の高さと、最も低い凸部上端面の高さの差が５０μｍより大きいと、高さのずれた凸部上端面でのレーザー光がぼやけてしまい、この凸部上端面に固定化された選択結合性物質と反応した検体からのシグナル強度が弱くなる場合があるため好ましくない。
また、凸部分の上端面は、実質的に平坦であることが好ましい。ここで凸部上端面が実質的に平坦とは、２０μｍ以上の凹凸がないことを意味する。
【００１６】
本発明においては、上述した凹凸部のうち凸部の上端面に選択結合性物質（プローブ）が固定化される。選択結合性物質の固定化は、予めなされるものであっても良いし、選択結合性物質を固定化しないで担体のみを用意しておき、検体の分析の際に所望の検体に応じた選択結合性物質を適宜選択し固定することもできる。
凸部の上端面に固定化できる選択結合性物質（例えば核酸）は、データとして必要なものを適宜選択することができるが、単なるダミーの選択結合性物質であっても良い。また、すべての凸部表面に選択結合性物質を結合する必要は無く、何も固定化していない凸部を有していても良い。
【００１７】
本発明の担体の凸部の上端面の面積は、略同一であることが好ましい。凸部の上端面の面積が略同一であることにより、多種の選択結合性物質が固定化される部分の面積を同一にできるので、後の解析に有利である。ここで、凸部の上部の面積が略同一とは、凸部の中で最も大きい上端面積を、最も小さい上端面積で割った値が１．２以下であることを言う。
【００１８】
選択結合性物質が固定化された凸部の上端面の面積は、特に限定されるものではないが、選択結合性物質の量を少なくすることができる点とハンドリングの容易さの点から、１ｍｍ2以下、１０μｍ2以上が好ましい。
【００１９】
本発明の担体において、さらに好ましくは、その担体における凹凸部を有する面に、さらに平坦部が設けられていることが好ましい。このような構造とすることにより、凹凸部に被検物質が含まれる溶液（以下、検体溶液という。）をアプライすることが容易となり、マイクロロッドを選択結合性物質に接触させること無く凹部に保持することが可能となる。
凹凸部の凸部の上端面の高さと平坦部の高さは、略同一であることが好ましい。すなわち、平坦部の高さと凸部上端面の高さの差は、５０μｍ以下であることが好ましい。凸部上端面の高さと平坦部の高さの差が５０μｍを超えると、検出できる蛍光強度が弱くなる場合があるため好ましくない。平坦部の高さと凸部上端面の高さの差は、より好ましくは３０μｍ以下であり、最も好ましくは、平坦部の高さと凸部の高さは同一である。
【００２０】
本発明で好ましく用いられる担体の凹凸部における凸部の高さ、即ち凸部上端面と凹部底面との高さの差は、１０μｍ以上、５００μｍ以下が好ましく、５０μｍ以上、３００μｍ以下が特に好ましい。凸部の高さが１０μｍより低いと、スポット以外の部分の非特異的に吸着した検体試料を検出してしまうことがあり、結果的にＳ／Ｎが悪くなることがあるため好ましくない。また、凸部の高さが５００μｍより高いと、凸部が折れて破損しやすいなどの問題が生じる場合があり好ましくない。
【００２１】
本発明の担体の具体例を、図１及び図２に例示する。
図１及び図２に示す例において、分析用担体１の表面には、複数の凸部１１を含む凹凸部１２により構成されており、その周りに平坦部１３が設けられている。凸部１１の上端面には、選択結合性物質（例えば核酸）が固定化されている。この平坦部を使って、容易にスキャナーの励起光等の測定用の光線の焦点を凸部の上端面に合わせることが可能となる。より具体的に説明すると、担体の表面に測定用のレーザー等の照射光（実線の矢印）を照射するにあたり焦点を合わせる際には、図３に示すように、バネ４０で付勢して治具４１に分析用担体１を突き当て、この治具の突き当て面４２の高さにレーザー光４４が合焦するようレンズ４３等により予め焦点を調整しておくことが多い。本発明の分析用担体の平坦部を治具の面４２に突き当てることにより、容易に担体の凸部上端面にスキャナーのレーザー光の焦点を合わせることが可能となる。なお、図３の例においては、分析用担体１は、選択結合性物質が固定化された面が下側になるよう固定されている。
【００２２】
本発明の分析用担体は、上記凹凸部の凹部に移動可能に格納されたマイクロロッドを含むことが必要である。当該マイクロロッドを含むことにより、検体溶液をアプライした後に分析用担体を揺動、回転等させることで、空隙内でマイクロロッドが重力、振動、遠心力等により運動するので、検体溶液と本発明の分析用担体との十分な撹拌を達成し、より精密な分析を行うことができる。
【００２３】
本発明のマイクロロッドを含む分析用担体を表面上方より見た概略図を、図４に示す。図４に示すように、マイクロロッド２は、凸部の列の間に形成された凹部を、前後方向（矢印参照）に移動可能に格納されている。
このような構成をとることで、担体に重力、振動、遠心力等を与えることにより、被検物質を含む検体溶液を撹拌して、選択結合性物質と被検物質との反応を効率よく促進することが可能である。すなわち、球状や多角形状等マイクロロッド状以外の形状の微粒子を凹部に格納した場合と比較して説明すると、次の通りである。球状等の微粒子の場合、凹部内を自由に移動できるので、撹拌により凹部の特定の箇所に偏り撹拌が実質上停滞する可能性がある。これに対し、マイクロロッドの場合には、凹部のある列に必ず格納されるので、偏る可能性が低く、効率良い撹拌を進めることができる。
【００２４】
前記マイクロロッドの形状は、マイクロロッド状（微細な棒状）であれば特に限定されず、円筒状、角柱状などの任意の形状とすることができる。また、マイクロロッドのサイズも、凹部を移動可能なサイズであれば特に限定されない。例えば形状が円筒状の場合、長さ５０〜７００００μｍ、底面直径１０〜４００μｍとすることができ、更に好ましくは長さ２０００〜４００００μｍ、底面直径５０〜３００μｍの範囲とすることができる。
【００２５】
また、マイクロロッドの底面直径は、担体の構造にあわせて適宜選択して用いることができる。例えば、後述するカバー部材を備えていない担体に円筒状のマイクロロッドを用いる場合には、マイクロロッドの底面直径は、担体の凹部幅または凸部高さのいずれか小さい長さの９０％以下のサイズを好ましく用いることができる。具体的には、凹部幅５００μｍ、凸部高さ２００μｍの構造の場合、底面直径１８０μｍ以下であることが好ましい。但し、この場合、底面直径が小さすぎると溶液の抵抗のために十分に撹拌が行えないという理由から１０μｍ以上であることが好ましい。また、後述するカバー部材を備える担体に円筒状のマイクロロッドを用いる場合には、カバー部材、接着層及び担体とからなる空間の高さ、すなわち担体凹部底面とカバー部材との距離または担体の凹部幅のいずれか最も小さい長さの９０％以下のサイズを好ましく用いることができる。具体的には、空間の高さが２００μｍ、凹部幅が２５０μｍである場合、底面直径１８０μｍ以下のマイクロロッドを用いることが好ましい。
【００２６】
ここで、本発明において、マイクロロッドの底面直径とは、マイクロロッドの底面の形状によらず、底面の最大幅のことを意味する。例えば、マイクロロッドが角柱状の場合は、底面の最大幅となる断面矩形の最長対角線の長さを底面直径とみなすことができる。
【００２７】
マイクロロッドの長さは、担体の凸部の列の数に応じて決めることができる。具体的には、凸部の列の間隔１つ分の長さから、凸部の列の間隔の長さに（凸部の列の数−１）、すなわち凸部間隔の数を乗じた長さまでの範囲で好ましく用いることができる。
【００２８】
また、マイクロロッドの配置密度は、凸部間に形成される凹部あたり１本或いは２本以上とすることができるが、１本とすることが好ましい。また、凸部間に形成される凹部すべてにマイクロロッドを格納する必要はなく、格納しない列と格納する列を設けるものであっても良い。例えば、２〜８列、特に４〜５列おきに格納することができる。また、凸部をＸＹ軸方向に列状に配置する場合は、凹部もＸＹ軸方向に形成されることとなり、この場合、ＸＹ軸方向のいずれの凹部にもマイクロロッドを格納することができる。
【００２９】
前記マイクロロッドの材質は、特に限定されないが、ガラス、セラミック（例えばイットリウム部分安定化ジルコニア）、金属（例えば金、白金、ステンレス）、プラスチック（例えばナイロンやポリスチレン）等を用いることができる。
上述のマイクロロッドは、本発明の分析用担体に予め格納した態様とすることができるが、検体溶液にマイクロロッドを混入させて検体溶液のアプライと同時にマイクロロッドを格納してもよく、または検体溶液のアプライの前又は後に、マイクロロッドを別途格納してもよい。
【００３０】
本発明の担体の材質は、特に限定されないが、ガラス、セラミック、シリコンなどの無機材料、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、シリコーンゴム等のポリマーなどを挙げることができる。この中でも、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）エラストマー、ガラス及びシリコンを特に好ましく用いることができる。
【００３１】
本発明の分析用担体は、少なくとも一部が黒色であることが好ましい。このようにすることにより、担体からの自家蛍光を低減することができる。担体の黒色にする部分としては、凹凸部が設けられた担体の本体でも良いし、凸部の側面、凹部に設けられた疎水的な材料や絶縁層でも良いし、これらの全部でも良い。
【００３２】
ここで、担体が黒色であるとは、可視光（波長４００ｎｍ〜８００ｎｍ）において、担体の黒色部分の分光反射率が特定のスペクトルパターン（特定のピークなど）を持たず、一様に低い値であり、かつ、担体の黒色部分の分光透過率も、特定のスペクトルパターンを持たず、一様に低い値であることを意味する。
この分光反射率、分光透過率の値としては、可視光（波長４００ｎｍ〜８００ｎｍ）の範囲の分光反射率が７％以下であり、同波長範囲での分光透過率が２％以下であることが好ましい。尚、ここで言う分光反射率は、ＪＩＳ  Ｚ  ８７２２の条件Ｃに適合した、照明・受光光学系で、担体からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を言う。
【００３３】
黒色にする手段としては、本発明の分析用担体に黒色物質を含有させることにより達成しうる。この黒色物質は、光を反射したり透過し難いものであれば、特に制限はないが、好ましいものを挙げると、カーボンブラック、グラファイト、チタンブラック、アニリンブラック、Ｒｕ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｃｏ、およびＣｕの酸化物、Ｓｉ、Ｔｉ、Ｔａ、ＺｒおよびＣｒの炭化物などの黒色物質が使用できる。
【００３４】
これらの黒色物質は単独で含有させる他、２種類以上を混合して含有させることもできる。例えば、ポリエチレンテレフタレート、シリコーン樹脂などのポリマーの場合は、この中の黒色物質の中でも、カーボンブラック、グラファイト、チタンブラック、アニリンブラックを好ましく含有させることができ、特にカーボンブラックを好ましく用いることができる。ガラス、セラミックの無機材料の場合は、Ｒｕ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｃｏ、およびＣｕの酸化物、Ｓｉ、Ｔｉ、Ｔａ、ＺｒおよびＣｒの炭化物を好ましく含有させることができる。
【００３５】
本発明の分析用担体の形状については、担体表面に、上述したような凹部および凸部からなる凹凸部を有するものであれば、特に限定されるものではない。
また、本発明の分析用担体は、各種製法にて製造することができる。例えば、材質がポリマー等の場合、射出成形法、ホットエンボス法、鋳型内で重合させる方法等により成型することができる。また、材質がガラスやセラミック等の無機物の場合、サンドブラスト法、シリコンの場合は公知の半導体プロセスなどで成型することができる。
成型した担体は、選択結合性物質をその表面に固定化するのに先立ち、必要に応じて各種の表面処理を施すことができる。かかる表面処理としては、具体的には例えば特開２００４−２６４２８９号公報に記載されるものなどを挙げることができる。
【００３６】
本発明の分析用担体は、検体の分析用チップとして用いることができる。
本発明において、分析用チップとは、被検物質が含まれる溶液（検体溶液）を当該チップにアプライし、検体の存在の有無や、検体の量や、検体の性状等を測定するために用いるチップをいう。具体的には、担体表面に固定化された選択結合性物質と検体との反応により、検体の量や、検体の有無を測定するバイオチップが挙げられる。より具体的には、核酸を担体表面に固定化したＤＮＡチップ、抗体に代表されるタンパク質を担体表面に固定化したタンパク質チップ、糖鎖を担体表面に固定化した糖鎖チップ、及び細胞を担体表面に固定化した細胞チップ等が挙げられる。
【００３７】
本発明において、選択結合性物質とは、検体と直接的又は間接的に、選択的に結合し得る各種の物質を意味する。担体の表面に結合しうる選択結合性物質の代表的な例としては、核酸、蛋白質、ペプチド、糖類、脂質を挙げることができる。
核酸としては、ＤＮＡやＲＮＡでも良く、またＰＮＡでも良い。特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう「選択結合性物質」に該当する。
核酸は、生細胞等天然物由来のものであっても良いし、核酸合成装置により合成されたものであっても良い。生細胞からのＤＮＡ又はＲＮＡの調製は、公知の方法、例えばＤＮＡの抽出については、Ｂｌｉｎらの方法（Blin et al., Nucleic Acids Res. 3: 2303 (1976)）等により、また、ＲＮＡの抽出については、Ｆａｖａｌｏｒｏらの方法（Favaloro et al., Methods Enzymol.65: 718 (1980)）等により行うことができる。固定化する核酸としては、更に、鎖状若しくは環状のプラスミドＤＮＡや染色体ＤＮＡ、これらを制限酵素により若しくは化学的に切断したＤＮＡ断片、試験管内で酵素等により合成されたＤＮＡ、又は化学合成したオリゴヌクレオチド等を用いることもできる。
【００３８】
また、蛋白質としては、抗体及びＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ´）2フラグメントのような、抗体の抗原結合性断片、並びに種々の抗原を挙げることができる。抗体やその抗原結合性断片は、対応する抗原と選択的に結合し、抗原は対応する抗体と選択的に結合するので、「選択結合性物質」に該当する。
糖類としては、各種単糖のほか、オリゴ糖や多糖などの糖鎖を挙げることができる。
脂質としては、単純脂質の他、複合脂質であっても良い。
更に、上記核酸、蛋白質、糖類、脂質以外の抗原性を有する物質を固定化することもできる。また、選択結合性物質として、担体の表面に細胞を固定化してもよい。
これらの選択結合性物質のうち特に好ましいものとして、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、ペプチド、糖、糖鎖または脂質を挙げることができる。
【００３９】
本発明の分析用担体を分析用チップとして用いる場合には、該分析用担体の表面を覆い前記分析用担体と接着されたカバー部材を更に備えるものであっても良い。カバー部材を備えることにより、検体溶液を簡便に密閉保持することができ、その結果、検体と、担体の領域（図２中の１２）に固定化された選択結合性物質との反応を、安定して行うことができる。また、特に分析用担体とカバー部材とが接着され一体となっていることにより、マイクロロッドを予め封入しておくことができ、検体溶液をアプライする作業を容易に行うことが可能である。そして、検体溶液をアプライした後の貫通孔を塞ぐ作業においてもテープやシール剤が検体溶液と接触することがないので、バックグラウンドノイズが上昇しないという利点もある。
【００４０】
図５は、前記分析用担体に加え、更にカバー部材、接着層、貫通孔及び液面駐止用チャンバーを有する本発明の分析用チップの概略的な態様の例を示す斜視図であり、図６は図５の分析用チップを矢印Ａ１に沿った面で切断した断面図である。図５及び図６に示す例においては、分析用担体１が、接着層３０を介してカバー部材３で覆われ、選択結合性物質が固定化された領域１２を含む空隙３１を形成している。空隙３１は、複数の貫通孔３２を介して外部と連通する他は、外部と連通しない閉じた空間である。
【００４１】
前記カバー部材は、前記分析用担体の表面の少なくとも一面の一部を覆い、担体と、カバー部材との間に空隙を有するよう接着されることができる。そして、担体は、好ましくはその表面であって前記空隙内に位置する領域上に固定化された選択結合性物質を有する。即ち、好ましくは、前記選択結合性物質が固定化された領域が、当該空隙内に存在するように、前記カバー部材は前記分析用担体に接着される。前記カバー部材は、前記空隙が形成される限りにおいて、どのような態様で接着されてもよいが、好ましくは、両面テープ、樹脂組成物等の接着層を介して接着される。
【００４２】
前記カバー部材は、前記空隙に連通する１つ以上の貫通孔を有するものとすることができ、複数の貫通孔を有することが好ましい。より具体的には、貫通孔は、一つの空隙に対して複数あることが好ましく、中でも３個から６個とすることにより、検体溶液の充填が容易となるので特に好ましい。なお、後述するように、空隙が、互いに連通しない複数の空間に分かれている場合は、各空間あたりに複数個、より好ましくは３〜６個の貫通孔を有することが好ましい。カバー部材が複数の貫通孔を有する場合、それらの孔径は、同一でも異なっていてもよいが、複数の貫通孔のうちの一つをアプライ口とし、他の貫通孔を空気の抜け口として機能させる場合、検体溶液のアプライの容易さ及び検体溶液の密閉保持性の点から、アプライ口のみをアプライに必要な広い孔径としその他の貫通孔をより狭い孔径とすることが、好ましい。具体的には、アプライ口の貫通孔サイズは直径０．０１から２．０ｍｍの範囲内とし、その他の貫通孔の直径を０．０１〜１．０ｍｍとすることが好ましい。
【００４３】
貫通孔３２は、その少なくとも１つが、その径を変化させて、上端に径の広い部分、いわゆる液面駐止用チャンバー３３を備えるものとしても良い。液面駐止用チャンバーを備えることにより、貫通孔３２からアプライされ空隙３１に充填された検体溶液の液面の上昇を抑え、貫通孔を封止部材３４で封止する際の封止を容易かつ確実に行うことが可能となるとともに、検体溶液の中に多数の気泡が入ったり、検体溶液の流出を防ぐことができるので好ましい。液面駐止用チャンバーの形状は特に限定されるものではなく、円柱形、角柱形、円錐形、角錐形、半球形、又はこれに近似した形状とすることができる。これらのうち、製造の容易さ及び検体溶液の上昇を抑制する効果の高さ等の観点から、円柱形が特に好ましい。
【００４４】
貫通孔の孔径サイズについては特に限定されるわけではないが、図７に示す縦断面形状の円筒形の貫通孔３２及び液面駐止用チャンバー３３との組み合わせの場合を例に挙げると、貫通孔３２の孔径サイズ（直径）は、０．０１から２．０ｍｍが好ましく、０．３から１．０ｍｍがより好ましい。孔径を０．０１ｍｍ以上とすることにより、検体溶液のアプライを容易に行うことができる。一方、貫通孔３２の直径を１．５ｍｍ以下とすることにより、アプライ後封止前の検体溶液の蒸発などをより効果的に抑制することができる。液面駐止用チャンバー３３の孔径サイズ（直径）については、１．０ｍｍ以上が好ましい。１．０ｍｍ以上とすることにより、貫通孔３２とのサイズの差を十分に得ることができ、十分な液面駐止効果が得られ好ましい。液面駐止用チャンバー３３の直径の上限は、特に限定されないが、１０ｍｍ以下とすることができる。また、液面駐止用チャンバー３３の深さは、特に限定されないが、０．１〜５ｍｍの範囲内とすることができる。
【００４５】
このようなカバー部材は、前述の分析用担体に、脱離可能に接着されていることが好ましい。本発明の分析用チップをＤＮＡチップとして用いる場合、通常、ＤＮＡチップを専用スキャナーで読み取ることが必要であるが、カバー部材が接着された状態では、専用スキャナーにセットすることが難しく、セットされたとしてもスキャン操作を実施するとカバー部材とスキャナーの光学系部品が接触し、故障の原因となることがある。また、カバー部材を介しての読み取りが可能であっても、読み取り値が不正確となりうる。そのため、読み取りの工程においてカバー部材を取り外せるよう、カバー部材が脱離可能であることが好ましい。
【００４６】
カバー部材を分析用担体に脱離可能に接着する態様は、特に限定されないが、カバー部材と担体が損傷されることなく脱離することが可能である態様が好ましい。例えば、両面テープ、樹脂組成物等の接着層を介して接着することができる。
【００４７】
接着層として両面テープを用いる場合、両面で接着力の異なる両面テープを用いることが好ましく、具体的には、該両面テープの接着力の弱い面を担体側に接着し、接着力の強い面をカバー部材側に接着することが好ましい。このような態様とすることにより、カバー部材を剥離する際に、両面テープがカバー部材に接着した状態で同時に担体より脱離し易く、それにより、担体上への接着層の残存による読み取りの工程における不都合を回避することができる。このような両面テープとしては、日東電工株式会社製の製品番号Ｎｏ．５３５Ａ、住友スリーエム株式会社製の製品番号９４１５ＰＣ及び４５９１ＨＬ、並びに株式会社寺岡製作所製の製品番号Ｎｏ．７６９１等が挙げられる。
【００４８】
接着層として樹脂組成物を用いる場合、当該樹脂組成物としては、アクリル系ポリマー、シリコーン系ポリマー、及びこれらの混合物からなる群より選択されるポリマーを含む樹脂組成物等を用いることができる。これらの樹脂組成物を利用することにより、両面テープに比べて密閉性を高めることが可能となるとともに、両面テープに比べて、長期間のインキュベーションに対しても安定であるため、そのような長期間のインキュベーションが必要な分析系においては特に好ましい。特に、接着層としてシリコーン系のエラストマーを用いると、密閉性が良好であり、しかも、容易に脱離が可能な状態でカバーを接着することができる。このようなエラストマーとしては、具体的には、シルガード（シルガードはダウコーニング社の登録商標）や、信越化学工業社製の二液型ＲＴＶゴム（型取り用）を挙げることができる。
【００４９】
上記カバー部材の形状は、前記分析用担体の表面の少なくとも一面の一部を覆い、担体と、カバー部材との間に空隙を有するよう接着されうるものであれば特に限定されないが、その外周部分において、担体に近い部分より担体に遠い部分において突出した部分を有する構造、すなわちオーバーハング構造が設けられたものとすることができる。オーバーハング構造を設けることにより、担体を損傷せずにカバー部材を脱離することが容易となるので、好ましい。
【００５０】
また、本発明の分析用チップは、カバー部材及び任意に接着層を含む構造により規定される空隙を有するが、当該空隙は、１つの空間でもよく、複数の仕切られた空間であってもよい。複数の仕切られた空間は、例えば図８に示すような仕切り構造により設けることができる。図８に示す例においては、カバー部材の凸部３Ａ及び分析用担体１が接着層３０Ａを介して接着することにより、複数の仕切られた空間３１を設けている。複数の仕切られた空間を設ける別の例として、例えば図９に示すような仕切り構造を設けることもできる。図９に示す例においては、担体の凸部１４及びカバー部材３が接着層３０Ｂを介して接着することにより、複数の仕切られた空間３１を設けている。また、さらに別の例として、図１０に示すように、担体及びカバー部材に特に仕切り構造を設けるための凸部を設けず、接着層３０Ａのみで空隙を仕切り、複数の仕切られた空間を設けることもできる。これらの例においては、空間３１は、互いに連通せず、それぞれが別々に、１以上の貫通孔３２及び液面駐止用チャンバー３３を有することになる。このように、複数の仕切られた空間を設けることによって、１枚の分析用チップに複数種の検体溶液をアプライすることが可能となり、従って複数種の検体を同時に１枚の分析用チップで測定することができる。
【００５１】
本発明の分析用チップは、一枚の担体あたり一枚のカバー部材を有していてもよく、二枚以上のカバー部材を有していてもよい。具体的には、図１１及び図１２に示す通り、一枚の分析用担体１上に、複数のカバー部材３Ｂを有することができる。複数のカバー部材３Ｂのそれぞれは、それぞれ別の接着層３０Ｃを介して分析用担体１上に設けることができる。好ましくは、複数のカバー部材３Ｂのそれぞれが、分析用担体１との間に空隙３１を有し、且つ各空隙に連通する１つ以上の貫通孔を有することができ、そして、各カバー部材３Ｂがそれぞれ別の、選択結合性物質が固定化された領域１２を有することができる。このような態様をとることによって、上記複数の仕切られた空間を有する態様と同様に、複数種の検体を同時に１枚の分析用チップで測定する等の効果を得ることができる。さらに、このような態様をとることにより、それぞれの領域１２についてカバー部材を独立して脱離させることができるので、例えば一つの領域１２について分析を行った後に他の領域１２を用いて分析を行うといった、独立した使用を行いうる。
【００５２】
本発明の分析用チップを構成するカバーの材料としては、特に限定されるものではないが、検体溶液をアプライした際に、溶液の様子を観察可能とするために、透明な材料が好ましい。そのような材質としては、ガラス又はプラスチックが挙げられる。特に、貫通孔や液面駐止チャンバー等の構造を容易に作製可能という点から、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート等の透明樹脂を好ましく用いることができる。カバーの作製方法も特に限定されるものではなく、切削加工や射出成型法による加工が可能である。大量生産が可能という観点から、射出成型法を好ましく用いることができる。
【００５３】
本発明の分析用チップにおける、凹凸部、カバー部材及びマイクロロッドの関係の好ましい例を、図１３を参照して説明する。図１３に示した例では、ＤＮＡ等の選択結合性物質４５は、分析用担体１の凸部上端面１１上に固定化されている。そして、マイクロロッド２は、分析用担体１の凹部の空隙内に載置されている。選択結合性物質４５及びマイクロロッド２は、ＤＮＡが含まれる検体溶液（図示せず）に触れることになる。検体溶液は、分析用担体１、接着層３０及びカバー部材３により規定される空隙内で保持されることになる。図１３の例においては、分析用担体の凸部上端面１１とカバー部材３との間隔の最短距離が、マイクロロッド２の底面直径未満となっている。それにより、マイクロロッドが凸部上端面１１に接触できなくなり、凸部上端面１１上の選択結合性物質４５を傷つけることを防ぐことができる。マイクロロッドの底面が、例えば楕円形、多角形等の非球状の形状である場合は、凸部上端面とカバー部材３との間隔の最短距離がマイクロロッドの底面最小径未満であれば、同様に凸部上端面１１とマイクロロッドとの接触を防ぎ、選択結合性物質４５の損傷を防ぐことが可能となる。
【００５４】
このような本発明の分析用担体は、各種検体の分析に利用することができる。
すなわち、本発明の分析用担体に、被検物質を接触させて選択的に結合させ、前記分析用担体上に前記選択結合性物質を介して結合した前記被検物質量を測定することにより、検体を分析することができる。
【００５５】
本発明の分析用担体や分析用チップを用いた測定方法に供せられる被検物質としては、測定すべき核酸、例えば、病原菌やウイルス等の遺伝子や、遺伝病の原因遺伝子等並びにその一部分、抗原性を有する各種生体成分、病原菌やウイルス等に対する抗体等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、これらの被検物質を含む検体としては、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、各種組織液等の体液や、各種飲食物並びにそれらの希釈物等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、検体となる核酸は、血液や細胞から常法により抽出した核酸を標識してもよいし、該核酸を鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって増幅したものであってもよい。後者の場合には、測定感度を大幅に向上させることが可能である。核酸増幅産物を検体とする場合には、蛍光物質等で標識したヌクレオシド三リン酸の存在下で増幅を行うことにより、増幅核酸を標識することが可能である。また、検体が抗原又は抗体の場合には、検体である抗原や抗体を常法により直接標識してもよいし、検体である抗原又は抗体を選択結合性物質と結合させた後、担体を洗浄し、該抗原又は抗体と抗原抗体反応する標識した抗体又は抗原を反応させ、担体に結合した標識を測定することもできる。
【００５６】
本発明の被検物質の分析方法においては、まず、前記本発明の分析用担体に被検物質を接触させて選択的に結合させる。すなわち、本発明の分析用担体に上述のような標識、増幅等を施した検体を水溶液や適当な緩衝液等に溶解させた検体溶液とし、担体に接触させれば良い。
担体への接触は、マイクロロッドが上記分析用担体の凹凸部に検体を水溶液や適当な緩衝液等の溶液とし、ピペット等の通常の器具で注入することにより行うことができる。
【００５７】
また、本発明の分析用チップを利用する場合には、前記カバー部材の貫通孔から被検物質をアプライし、前記カバー部材に封止部材を貼付して前記貫通孔を封止し、前記被検物質を前記分析用チップを構成する担体に選択的に結合させることができる。
貫通孔からの検体のアプライは、例えば、前記貫通孔からピペット等の通常の器具で注入して行うことができる。
【００５８】
カバー部材への封止部材の貼付は、貫通孔の一部又は全て、好ましくは全てを封止する態様にて行うことができる。前記封止部材としては、例えばカプトン（商標、ポリイミドフィルム、東レ・デュポン社製）、ポリエステル、セロハン、又は塩化ビニル製の粘着テープ等の可とう性のテープを好ましく挙げることができるが、これに限らず、非可とう性の板状の接着可能な任意の部材を用いることもでき、非定型のシーリング剤を用いることもできるが、液面駐止用チャンバーによる本発明の効果をより良好に得るという観点からは、可とう性のテープ及び板状の部材が好ましく、操作の簡便性などの観点から、可とう性のテープがさらに好ましい。封止部材としてテープ又は板状の部材を用いる場合、その使用枚数は任意である。具体的には、カバー部材上の全ての貫通孔を一枚の封止部材で封止してもよく、複数の封止部材を用いてそれぞれで複数の貫通孔の一部を封止してもよい。また、前記の通り一枚の担体上に複数のカバー部材が設けられている場合、カバー部材のそれぞれに別々の封止部材を用いてもよく、複数のカバー部材上の貫通孔をまとめて一枚の封止部材で封止してもよい。通常は、一枚のカバー部材あたり一枚の封止部材を用いることが、簡便且つ確実な封止を達成しうることから好ましい。
【００５９】
封止の具体例を、再び図１３を参照して説明する。図１３の例では、検体溶液（図示せず）を貫通孔３２よりアプライした後、可とう性の粘着テープ３４を、液面駐止用チャンバー３３の全面を覆うように貼付し、貫通孔を封止している。このような態様により、簡便で且つ検体溶液の漏出や測定誤差を招かない封止を達成できる。
【００６０】
本発明の分析方法において、選択的な結合とは、選択結合性物質と被検物質とを相互作用させ、前記被検物質を前記選択結合性物質を介して前記分析用担体に結合させることを意味する。本発明の分析用担体や分析用チップの場合には、分析用担体又はチップを揺動、回転させることにより、重力、振動、遠心力によってマイクロロッドが検体溶液中を移動するので、選択的結合を効率よく進めることができる。
選択的結合の際の反応温度及び時間は、ハイブリダイズさせる検体の核酸の鎖長や、免疫反応に関与する抗原及び／又は抗体の種類等に応じて適宜選択されるが、核酸のハイブリダイゼーションの場合、通常、４０℃〜７０℃程度で１分間〜十数時間、免疫反応の場合には、通常、室温〜４０℃程度で１分間〜数時間程度である。また、必要に応じて、分析用担体を揺動、回転等させ、選択的結合を促進することができる。
選択的結合が終了した後、通常はカバー部材を脱離させた後、次の工程に供することができる。
【００６１】
本発明の分析方法においては、上述の選択的結合の後、前記分析用担体上に前記選択結合性物質を介して結合した前記被検物質量を測定する。この測定も、従来の分析用チップにおける操作と全く同様に行うことができる。例えば、適宜蛍光標識され、選択結合性物質と結合した被検物質の質量について、公知のスキャナ等により、その蛍光量を読み取ることにより測定することができる。
【００６２】
本発明の分析方法において、選択結合性物質として核酸を固定化した場合には、この核酸又はその一部と相補的な配列を有する核酸を測定することができる。また、選択結合性物質として抗体又は抗原等の蛋白質を固定化した場合には、この抗体又は抗原と免疫的に反応する抗原又は抗体を測定することができる。なお、本明細書でいう「測定」には、検出と定量の両者の意味が含まれる。
【００６３】
本発明の分析用担体、及び分析用チップは、分析用キットとして提供されることも可能である。
すなわち、本発明の分析用キットは、上記分析用担体と、前記分析用担体の表面を覆い前記分析用担体と接着されたカバー部材と、前記カバー部材に貼付し前記貫通孔を封止する封止部材とを含むか、或いは、上記分析用チップと、前記カバー部材に貼付し前記貫通孔を封止する封止部材とを含むことを特徴とする。
本発明の分析用キットにおいて含まれうる前記カバー部材に関しては、本発明の分析用チップにおいて述べたとおりである。また、前記封止部材に関しては、前記本発明の分析方法において説明したものと同様のものを含むことができる。
このような本発明の分析用キットは、前記本発明の分析方法に従って使用することができる。
【実施例】
【００６４】
本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００６５】
実施例１
（ＤＮＡ固定化担体の作製）
公知の方法であるＬＩＧＡ（Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｅ  Ｇａｌｖａｎｏｆｏｒｍｕｎｇ  Ａｂｆｏｒｍｕｎｇ）プロセスを用いて、射出成形用の型を作製し、射出成型法により後述するような形状を有するＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）製の担体を得た。なお、この実施例で用いたＰＭＭＡの平均分子量は５万であり、ＰＭＭＡ中には１重量％の割合で、カーボンブラック（三菱化学製  ＃３０５０Ｂ）を含有させており、担体は黒色である。この黒色担体の分光反射率と分光透過率を測定したところ、分光反射率は、可視光領域（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）のいずれの波長でも５％以下であり、また、同範囲の波長で、透過率は０．５％以下であった。分光反射率、分光透過率とも、可視光領域において特定のスペクトルパターン（ピークなど）はなく、スペクトルは一様にフラットであった。なお、分光反射率は、ＪＩＳ  Ｚ  ８７２２の条件Ｃに適合した照明・受光光学系を搭載した装置（ミノルタカメラ製、ＣＭ−２００２）を用いて、担体からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。
【００６６】
担体の形状は、大きさが縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚み１ｍｍであり、担体の中央部分を除き表面は平坦であった。担体の中央には、直径１０ｍｍ、深さ０．２ｍｍの凹んだ部分が設けてあり、この凹みの中に、直径０．２ｍｍ、高さ０．２ｍｍの凸部を６４（８×８）箇所設けた。凹凸部分の凸部上面の高さ（６４箇所の凸部の高さの平均値）と平坦部分との高さの差を測定したところ、３μｍ以下であった。また、６４個の凸部上面の高さのばらつき（最も高い凸部上面の高さと最も低い凸部上面との高さの差）、さらには、凸部上面の高さの平均値と平坦部上面の高さの差を測定したところそれぞれ３μｍ以下であった。さらに、凹凸部凸部のピッチ（凸部中央部から隣接した凸部中央部までの距離）は０．６ｍｍであった。
上記のＰＭＭＡ担体を１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に７０℃で１２時間浸漬した。これを、純水、０．１ＮのＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄し、担体表面にカルボキシル基を生成した。
【００６７】
（プローブＤＮＡの固定化）
配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ（６０塩基、５’末端アミノ化）を合成した。このＤＮＡ１７は５’末端がアミノ化されている。
このＤＮＡを、純水に０．３ｎｍｏｌ／μｌの濃度で溶かして、ストックソリューションとした。担体１６に点着する際は、ＰＢＳ（ＮａＣｌを８ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏを２．９ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を０．２ｇ純水に溶かし１ｌにメスアップしたものにｐＨ調整用の塩酸を加えたもの、ｐＨ５．５）でプローブＤＮＡの終濃度を０．０３ｎｍｏｌ／μｌとし、かつ、担体表面のカルボン酸とプローブＤＮＡの末端のアミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍｌとした。そして、これらの混合溶液をガラスキャピラリーで担体凸部上面に点着した。次いで、担体を密閉したプラスチック容器入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートして、純水で洗浄した。この反応スキームを図１４に示す。
【００６８】
（検体ＤＮＡの調整）
検体ＤＮＡとして、上記ＤＮＡ固定化担体に固定化されたプローブＤＮＡとハイブリダイズ可能な塩基配列を持つ配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡ（９６８塩基、以下、配列番号４のＤＮＡと記載することがある）を用いた。調製方法を以下に示す。
【００６９】
配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、配列番号２のＤＮＡと記載することがある）と配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、配列番号３のＤＮＡと記載することがある）を合成した。これを純水にとかして濃度を１００μＭとした。次いで、ｐＫＦ３  プラスミドＤＮＡ（タカラバイオ（株）製品番号；３１００）（配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡ：２２６４塩基、以下、配列番号５のＤＮＡと記載することがある）を用意して、これをテンプレートとし、配列番号２および配列番号３のＤＮＡをプライマーとして、ＰＣＲ反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により増幅を行った。
【００７０】
ＰＣＲの条件は以下の通りである。すなわち、ＥｘＴａｑ  ２μｌ、１０×ＥｘＢｕｆｆｅｒ  ４０μｌ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  ３２μｌ（以上はタカラバイオ（株）製  製品番号ＲＲ００１Ａに付属）、配列番号２のＤＮＡ溶液を２μｌ、配列番号３のＤＮＡ溶液を２μｌ、テンプレート（配列番号５のＤＮＡ）を０．２μｌ加え、純水によりトータル４００μｌにメスアップした。これらの混合液を、４つのマイクロチューブに分け、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲ反応を行った。これを、エタノール沈殿により精製し、４０μｌの純水に溶解した。ＰＣＲ反応後の溶液の一部をとり電気泳動で確認したところ、増幅したＤＮＡの塩基長は、およそ９６０塩基であり配列番号４のＤＮＡが増幅されていることを確認した。
【００７１】
次いで、９塩基のランダムプライマー（タカラバイオ（株）製；製品番号３８０２）を６ｍｇ／ｍｌの濃度に溶かし、上記のＰＣＲ反応後精製したＤＮＡ溶液に２μｌ加えた。この溶液を１００℃に加熱した後、氷上で急冷した。これらにＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ（株）製；製品番号２１４０ＡＫ）付属のバッファーを５μｌ、ｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰの濃度はそれぞれ２．５ｍＭ、ｄＣＴＰの濃度は４００μＭ）を２．５μｌ加えた。さらに、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ（アマシャムファルマシアバイオテク製；製品番号ＰＡ５３０２１）を２μｌ加えた。この溶液に１０ＵのＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔを加え、３７℃で２０時間インキュベートし、Ｃｙ３で標識された検体ＤＮＡを得た。なお、標識の際ランダムプライマーを用いたので検体ＤＮＡの長さには、ばらつきがある。最も長い検体ＤＮＡは配列番号４のＤＮＡとなる。なお、検体ＤＮＡの溶液を取り出して、電気泳動で確認したところ、９６０塩基に相当する付近にもっとも強いバンドが現れ、それより短い塩基長に対応する領域に薄くスメアがかかった状態であった。そして、これをエタノール沈殿により精製し、乾燥した。
【００７２】
この標識化された検体ＤＮＡを、１重量％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、５×ＳＳＣ（５×ＳＳＣとは、２０×ＳＳＣ（シグマ製）を純水にて４倍に希釈したもの。また、２０×ＳＳＣを純水で２倍に希釈したものを１０×ＳＳＣと表記し、２０×ＳＳＣの２倍希釈液を１０×ＳＳＣ、１００倍希釈液を０．２×ＳＳＣと表記する。）、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡの溶液（各濃度はいずれも終濃度）、４００μｌに溶解し、ハイブリダイゼーション用のストック溶液とした。
【００７３】
以下の実施例、比較例において、ハイブリダイゼーションの際の検体溶液は、特に断りのない限り、上記で調整したストック溶液を、１重量％ＢＳＡ、５×ＳＳＣ、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡ、０．１重量％ＳＤＳの溶液（各濃度はいずれも終濃度）で２００倍に希釈したものを用いた。なお、この溶液の検体ＤＮＡの濃度を測定したところ、１．５ｎｇ／μＬであった
【００７４】
（マイクロロッドの調製）
ＳＵＳ３１６製の棒線（ニラコ製、直径１８０μｍ（コーティング厚含））を３ｍｍの長さになるようにカットした。次に、これを０．１％中性洗剤で５分間超音波洗浄を行い、乾燥した。このマイクロロッド２を８×８の基板凸部１１間に７本、両端に２本、平行になるようにセットした（図１５）。
【００７５】
（カバー部材の接着）
厚さ１ｍｍのＰＭＭＡ板から切削加工により図１６に示す液面駐止用チャンバーが設けられた貫通孔を４つ有するカバー部材（外周部にオーバーハング構造有り）を作製し、これを両面テープ（厚さ１００μｍ）を用いてプローブＤＮＡ固定化領域に被さるようにマイクロロッドが設置された担体と接着した。
【００７６】
（ハイブリダイゼーション）
上記で得られたプローブＤＮＡを固定化した担体に上記検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた。具体的には、マイクロピペットを用いてハイブリダイゼーション用の溶液５０μｌを貫通孔より注入する。その後、カプトンテープ（アズワン  ５−５０１８−０１）で貫通孔を塞ぎ、これをマイクロチューブローテーター（アズワン製、商品番号：１−４０９６−０１）の回転面に設けたプラスチック容器内に固定し、４２℃、１６時間インキュベートした。さらに担体のプローブＤＮＡ固定化面は、ローテーターの回転面に対し直角となるようにした。その際、ローテーターの回転数は３ｒｐｍとし、ローテーターの回転面は、水平面と直角となるようにした。インキュベート後、担体からカバー部材と両面テープを脱離後に担体を洗浄、乾燥した。
【００７７】
（測定）
ＤＮＡチップ用のスキャナー（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ）に上記処理後の担体をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態で測定を行った。その結果を表１に示す。ここで、蛍光強度とはスポット内の蛍光強度の平均値であり、バックグラウンドノイズとは、プローブＤＮＡを固定化していない凸部の蛍光強度である。結果を表１に示す。十分な蛍光シグナルが得られ、バックグラウンドノイズも低く抑えられた。操作も簡便であって、ハイブリダイゼーション後に検体溶液中に混入した泡もほとんど見られなかった。
【００７８】
比較例１
実施例１においてマイクロロッドを入れない場合の実験を行った。実験手順は、マイクロロッドを入れないこと以外、実施例１と同様である。結果を表１に示す。バックグラウンドノイズは実施例１と同等に低く抑えられたが、蛍光強度は十分の一以下であった。これは、マイクロロッドが無いために溶液が撹拌されなかった結果であると考えられる。
【００７９】
実施例２
ローテーターで基板を回転させる代わりに、振とう機（アズワン製、商品番号：１−１１９０−０１）を用い基板を水平旋回振とうさせた実験を行った。実験手順は、基板を振とう機の旋回面上に平行に設置したこと以外は実施例１と同様に行った。旋回条件は、２００ｒｐｍである。結果を表１に示す。実施例１と同等の蛍光シグナルが得られ、バックグラウンドノイズも低く抑えられた。操作も簡便であって、ハイブリダイゼーション後に検体溶液中に混入した泡もほとんど見られなかった。
【００８０】
実施例３
ローテーターで基板を回転させる代わりに、振とう機を用い基板を往復振とうさせた実験を行った。実験手順は、基板を振とう機に水平になるように設置したこと以外は実施例１と同様に行った。旋回条件は、２００ｒｐｍである。結果を表１に示す。実施例１と同等の蛍光シグナルが得られ、バックグラウンドノイズも低く抑えられた。操作も簡便であって、ハイブリダイゼーション後に検体溶液中に混入した泡もほとんど見られなかった。
【００８１】
実施例４
ローテーターで基板を回転させる代わりに、振とう機を用い基板を８の字振とうさせた実験を行った。実験手順は、基板を振とう機の８の字振とう面に平行に設置したこと以外は実施例１と同様に行った。旋回条件は、２００ｒｐｍである。結果を表１に示す。実施例１と同等の蛍光シグナルが得られ、バックグラウンドノイズも低く抑えられた。操作も簡便であって、ハイブリダイゼーション後に検体溶液中に混入した泡もほとんど見られなかった。
【００８２】
実施例５
実施例１のローテーターの回転面を水平より４５度傾けた検討を行った。実験手順は、ローテーターの回転面の傾きを水平より４５度傾けたこと以外実施例１と同様に行った。結果を表２に示す。実施例１と同等の蛍光シグナルが得られ、バックグラウンドノイズも低く抑えられた。また、ハイブリダイゼーション後のマイクロロッドの位置を観察したところ、一箇所に偏ることなくハイブリダイゼーション前と同じ列（凹部）に有ることが確認できた。
【００８３】
実施例６
水平旋回面と基板設置時の傾きについて実験を行った。実験手順は、水平旋回面に対して４５度傾けた状態で基板を振とう機に設置すること以外は実施例２と同様に行った。結果を表２に示す。実施例１と同等の蛍光シグナルが得られ、バックグラウンドノイズも低く抑えられた。また、ハイブリダイゼーション後のマイクロロッドの位置を観察したところ、一箇所に偏ることなくハイブリダイゼーション前と同じ列（凹部）に有ることが確認できた。
【００８４】
比較例２
実施例５において、マイクロロッドの代わりにガラスビーズを用いた場合の実験を行った。
【００８５】
（ガラスビーズの修飾）
直径が１５０μｍのガラスビーズ１０ｇを１０Ｎ  ＮａＯＨ溶液に浸漬した後、純水で洗浄した。ついで、ＡＰＳ（３−アミノプロピルトリエトキシシラン；信越化学工業（株）製）を２重量％の割合で純水に溶解した後、上記のガラスビーズを１時間浸漬し、この溶液から取り出した後に１１０℃で１０分間乾燥した。このようにして、ガラスビーズの表面にアミノ基を導入した。
【００８６】
ついで、５．５ｇの無水コハク酸を１−メチル−２−ピロリドン３３５ｍｌに溶解させた。１Ｍの５０ｍｌのホウ酸ナトリウム（ホウ酸３．０９ｇとｐＨ調整用の水酸化ナトリウムを加えて、純水で５０ｍｌにメスアップしたもの。ｐＨ８．０）に上記コハク酸溶液に加えた。この混合液に上記のガラスビーズを２０分間浸漬した。浸漬後、純水で洗浄および乾燥した。このようにして、ガラスビーズの表面のアミノ基と無水コハク酸を反応させて、ガラスビーズ表面にカルボキシル基を導入した。
【００８７】
実験手順はほぼ実施例１と同様であるが、上記の手順で修飾したガラスビーズ２ｍｇを担体の凹部に入れてからカバー部材を接着した。そして、ハイブリダイゼーションは、これをマイクロチューブローテーターの回転面に設けたプラスチック容器内に固定し、４２℃、１６時間インキュベートした。その際、ローテーターの回転数は３ｒｐｍとし、ローテーターの回転面は、水平面から４５度傾けてセットした。さらに担体のプローブＤＮＡ固定化面は、ローテーターの回転面に対し直角となるようにした。以上のようにすることでガラスビーズが重力方向に移動し続けることになり、検体溶液を攪拌しながらハイブリダイゼーションを行うことができる。
【００８８】
結果を表２に示す。バックグラウンドノイズについては実施例５と同等に低く抑えられたが、蛍光強度については実施例１の二分の一以下であった。これは、回転面を傾けたことでガラスビーズが鉛直方向下側に偏ってしまい、検体溶液の撹拌にムラが生じ、一部で撹拌が十分に行われなったからであると考えられる。
【００８９】
【表１】
2007178185.tif 000003
【００９０】
【表２】
2007178185.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１は、本発明の分析用担体の一例を概略的に示す斜視図である。
【図２】図２は、図１に例示される分析用担体の縦断面図である。
【図３】図３は、本発明の分析用担体を用いた反応の結果を読み取る治具及びスキャナーの一例を概略的に示す縦断面図である。
【図４】図４は、本発明の分析用担体の一例を表面上方より見た概略図である。
【図５】図５は、本発明の分析用チップの一例を概略的に示す斜視図である。
【図６】図６は、図５に示される本発明の分析用チップを矢印Ａ１に沿った面で切断した部分断面図である。
【図７】図７は、本発明の分析用チップにおける貫通孔及び液面駐止チャンバーの一例を示す部分断面図である。
【図８】図８は、仕切り構造を有する本発明の分析用チップの一例を概略的に示す縦断面図である。
【図９】図９は、仕切り構造を有する本発明の分析用チップの別の一例を概略的に示す縦断面図である。
【図１０】図１０は、本発明の分析用チップの別の一例を概略的に示す縦断面図である。
【図１１】図１１は、本発明の分析用チップの別の一例を概略的に示す斜視図である。
【図１２】図１２は、図１１に示される本発明の分析用チップを矢印Ａ２に沿った面で切断した部分断面図である。
【図１３】図１３は、本発明の分析用チップの別の一例を概略的に示す縦断面図である。
【図１４】図１４は、分析用担体へのＤＮＡ固定化の反応スキームの一例を概略的に示す図である。
【図１５】図１５は、本発明の分析用担体の一例を表面上方より見た概略図である。
【図１６】図１６は、本発明の分析用チップのカバー部材の一例を示す部分断面図である。
【符号の説明】
【００９２】
１  担体
１０  凹部
１１  凸部
１２  選択結合性物質が固定化された領域（凹凸部）
１３  平坦部
１４  担体凸部
１６  担体
１７  ＤＮＡ
２  マイクロロッド
３、３Ｂ  カバー部材
３Ａ  カバー部材凸部
３０、３０Ｃ  接着層
３０Ａ、３０Ｂ  仕切り構造の接着層
３１  空隙（空間）
３２  貫通孔
３３  液面駐止用チャンバー
３４  封止部材（テープ）
３５  担体とカバー部材との隙間
４０  マイクロアレイを治具に突き当てるためのバネ
４１  治具
４２  治具突き当て面
４３  対物レンズ
４４  レーザー励起光
４５  担体に固定化された選択結合性物質（ＤＮＡ）
Ｌ１  凸部ピッチ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2007178185.tif 000017
【図１４】
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【図１５】
2007178185.tif 000019
【図１６】
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【配列表】
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