(57)【要約】      （修正有）【課題】形質転換植物によって生産される組換え前十二指腸（ｐｒｅｄｕｏｄｅｎａｌ）リパーゼ及びペプチド誘導体、それらの取得方法及びそれらの用途の提供。【解決手段】イヌ及びヒトの前十二指腸リパーゼをコードするｃＤＮＡを含有する組換えヌクレオチド配列を取得する。その組換えヌクレオチド配列を用い植物細胞（特にナス科植物：タバコ）を形質転換し、更に形質転換植物を得、それより抽出工程により前十二指腸リパーゼを取得する。上記リパーゼは医薬品組成物、機能性食品等の構成成分として利用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一方で図２に示されるイヌ胃リパーゼ（ＤＧＬ）をコードし、他方で植物細胞が該ｃＤＮＡによってコードされたイヌ胃リパーゼを産生することを可能にする要素、特に植物細胞の転写機構によって認識される転写プロモーターおよび転写ターミネーターをコードする、図３に示される組換えヌクレオチド配列の使用であって、該細胞からまたは該細胞から得られる植物から、組換えＤＧＬを活性な酵素の形態で得るという観点で植物細胞を形質転換するための、使用。
【請求項２】
組換えヌクレオチドであって、一方で図３に示されるｃＤＮＡであって、図２に示されるイヌ胃リパーゼ（ＤＧＬ）をコードし、他方で植物細胞が該ｃＤＮＡによってコードされたイヌ胃リパーゼを産生することを可能にする要素、特に植物細胞の転写機構によって認識される転写プロモーターおよび転写ターミネーターをコードすることを特徴とする、組換えヌクレオチド。
【請求項３】
−該ｃＤＮＡの下流に、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）のポリＡ35Sターミネーターまたはアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のポリＡ  NOSターミネーターを、
−該ｃＤＮＡの上流に、35Sプロモーター、CaMVからの重複する構成プロモーターである35Sプロモーター（pd35S）、ラディッシュのクルシフェリン遺伝子のpCRUプロモーター、アラビドプシス  サリアナ（Arabidopsis thaliana）のpGEA1もしくはpGEA6プロモーター、アグロバクテリウム  ツメファシエンスのpSPキメラプロモーター、pAR-IARイネプロモーターまたはpγzeinトウモロコシプロモーターを、
含むことを特徴とする、請求項２記載の組換えヌクレオチド。
【請求項４】
組換えＤＧＬを予め決められた植物細胞区画に指向させるペプチドをコードする配列を含むことを特徴とする、請求項２または３に記載の組換えヌクレオチド。
【請求項５】
以下から選択されることを特徴とする、請求項２〜４のいずれか１項に記載の組換えヌクレオチド：
−(pd35S-PS-LGCと呼ばれる)５’→３’方向に、CaMVのpd35Sプロモーター、スポラミンＡのシグナルペプチドをコードする配列を含むもので、後者はすぐ後に図３に示すヌクレオチド配列、次いでCaMVのpolyA 35Sターミネーターが続いている、
−(pd35S-PPS-LGCと呼ばれる)５’→３’方向に、CaMVのpd35Sプロモーター、スポラミンＡのプレプロペプチドをコードする配列を含むもので、後者はすぐ後に図３に示すヌクレオチド配列、次いでCaMVのpolyA 35Sターミネーターが続いている、
−(pd35S-PSLGL-LGCと呼ばれる)５’→３’方向に、CaMVのpd35Sプロモーター、RGL（rabbit gastic lipase）のシグナルペプチドの一部をコードする配列であって、以下に示す実施例に示した最初の19アミノ酸の配列からなり、Ｃ-末端の最後の３アミノ酸をコードする９ヌクレオチドが欠失しているものを含むもので、後者はすぐ後に図３に示したヌクレオチド配列、次いでCaMVのpolyA 35Sターミネーターが続いている、
−(pCRU-PS-LGCと呼ばれる)５’→３’方向に、クルシフェリンのpCRUプロモーター、スポラミンＡのシグナルペプチドをコードする配列を含むもので、後者はすぐ後に図３に示すヌクレオチド配列、次いでCaMVのpolyA 35Sターミネーターが続いている、
−(pCRU-PPS-LGCと呼ばれる)５’→３’方向に、クルシフェリンのpCRUプロモーター、スポラミンＡのプレプロペプチドをコードする配列を含むもので、後者はすぐ後に図３に示すヌクレオチド配列、次いでCaMVのpolyA 35Sターミネーターが続いている、
−(pCRU-PSLGL-LGCと呼ばれる)５’→３’方向に、クルシフェリンのpCRUプロモーター、上記のようなRGLシグナルペプチドの一部をコードする配列を含むもので、後者はすぐ後に図３に示すヌクレオチド配列、次いでCaMVのpolyA 35Sターミネーターが続いている、
−(pGEA1-PSLGL-LGCと呼ばれる)５’→３’方向に、Arabidopsis thalianaのpGEA1プロモーター、上記のようなRGLのシグナルペプチドの一部をコードする配列を含むもので、後者はすぐ後に図３に示すｃＤＮＡ、次いでCaMVのpolyA 35Sターミネーターが続いている、
−(pGEA6-PSLGL-LGCと呼ばれる)５’→３’方向に、Arabidopsis thalianaのpGEA6プロモーター、上記のようなRGLのシグナルペプチドの一部をコードする配列を含むもので、後者はすぐ後に図１もしくは図３に示すｃＤＮＡ、次いでCaMVのpolyA 35Sターミネーターが続いている、
−(pAR-IAR-PSLGL-LGCと呼ばれる)５’→３’方向に、イネのpAR-IARプロモーター、上記のようなRGLのシグナルペプチドの一部をコードする配列を含むもので、後者の配列はすぐ後に図３に示すヌクレオチド配列、次いでCaMVのpolyA 35SターミネーターもしくはAgrobacterium tumefaciensのポリＡNOSターミネーターが続いている、
−(pγzein-PSLGL-LGCと呼ばれる)５’→３’方向に、トウモロコシのpγzeineプロモーター、上記のようなRGLのシグナルペプチドの一部をコードする配列を含むもので、後者の配列はすぐ後に図３に示すｃＤＮＡ、次いでCaMVのpolyA 35Sターミネーターが続いている、
−(pγzein-PSLGL-LGC-KDELと呼ばれる)５’→３’方向に、トウモロコシのpγzeineプロモーター、上記のようなRGLのシグナルペプチドの一部をコードする配列を含むもので、後者はすぐ後に図３に示すヌクレオチド配列、次いでテトラペプチドであるKDELをコードする配列、次いでCaMVのpolyA 35Sターミネーターが続いている。
【請求項６】
請求項２〜５のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列をその複製に必須ではない部位に含んでいる、特にプラスミドであるベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターにより形質転換された、特に、Agrobacterium tumefaciensのような細菌である、細胞宿主。
【請求項８】
活性酵素形態の組換えＤＧＬの製造方法であって：
−特に、請求項６に記載のベクターにより形質転換された請求項７に記載の細胞宿主を用いて、請求項２〜５のいずれか１項に記載の組換え配列がこれらの細胞のゲノムに組み込まれるような方法で植物細胞を形質転換すること、
−場合により、上記の形質転換された細胞から形質転換された植物を得ること、
−上記の細胞もしくは形質転換された植物中に産生される上記の組換えＤＧＬを、特に抽出および場合によりそれに続く精製により回収すること、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項２〜５のいずれか１項に記載の１以上の組換えヌクレオチド配列がそのゲノムに安定に組み込まれており、場合により、酵素活性、より特定するとリパーゼ活性、を有する組換えＤＧＬを含む、特に、アブラナ、タバコ、トウモロコシ、エンドウ、トマト、ニンジン、コムギ、オオムギ、馬鈴薯、ダイズ、ヒマワリ、レタス、コメ、アルファルファおよびビートの根(beetroot)から選択されることを特徴とする、遺伝的に形質転換された植物もしくは植物の部分、特に葉および／または果実および／または種子および／または植物細胞。
【請求項１０】
そのアミノ酸配列が図２に示される酵素的に活性な組換えＤＧＬか、図２の55〜379位に位置するアミノ酸に限定されるポリペプチドから選択されるポリペプチドまたは図２の35〜379位に位置するアミノ酸に限定されるポリペプチドであって、これらのポリペプチドはリパーゼ活性を有し、請求項８に記載の方法を行うことにより実質的に純粋な形態で得られ、この方法は、組換えＤＧＬおよび／または上記のポリペプチドを、特に得られた酵素抽出物に対して行われるクロマトグラフィーにより精製する工程を包含する、組換えＤＧＬまたは誘導ポリペプチド。
【請求項１１】
酵素的に活性な組換えＤＧＬ、図２に示されたアミノ酸配列、および／またはリパーゼを有する、図２の55位〜379位に位置するアミノ酸により限定されたポリペプチドもしくは図２の35位〜379位に位置するアミノ酸により限定されたポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法を実施することにより得られる、酵素活性を有する植物抽出物。
【請求項１２】
酵素的に活性な組換えポリペプチドの重量％が、抽出物中に存在するタンパク質の総重量の約0.1％〜20％、特に約１％〜約15％であり、それは、葉の初期重量(FW)のｇ当たり約0.5U〜約1,000U/ｇに、特に葉のFWの約10U/ｇ〜約300U/ｇ、または種子のFWの約１U/ｇ〜約5,000U/ｇ、特に種子の約10U/ｇ〜約1,000U/ｇの酵素活性の測定単位に相当することを特徴とし、ここで、酵素活性がGargoury5（Gastroenterology, 91, 919-925(1986)）に記載の方法による単位で与えられる、請求項１１に記載の酵素活性を有する植物抽出物。
【請求項１３】
請求項９に記載した遺伝的に形質転換した植物もしくは植物の部分、特に葉および／または果実および／または種子、もしくは植物細胞の、健康な個体もしくは胃腸および／または膵臓のリパーゼの産生レベルに影響を与えるかもしくは与えない１以上の病状を患う個体、好ましくは脂肪の吸収の機構を変える医学的処置を受けている個体もしくは高齢者によって摂取される動物性もしくは植物性の脂肪の吸収を容易にすることを意図した薬剤の製造、および好ましくは生物における、好ましくは胃腸および／または膵臓のリパーゼであるリパーゼの不足に関連した病状、さらに好ましくは嚢胞性線維症、外分泌腺膵臓不全の処置のための薬剤の製造のための使用。
【請求項１４】
請求項１０に記載の組換えＤＧＬの、健康な個体もしくは胃腸および／または膵臓のリパーゼの産生レベルに影響を与えるかもしくは与えない１以上の病状を患う個体、好ましくは脂肪の吸収の機構を変える医学的処置を受けている個体もしくは高齢者によって摂取される動物性もしくは植物性の脂肪の吸収を容易にすることを意図した薬剤の製造、および好ましくは生物における、好ましくは胃腸および／または膵臓のリパーゼであるリパーゼの不足に関連した病状、さらに好ましくは嚢胞性線維症、外分泌腺膵臓不全の処置のための薬剤の製造のための使用。
【請求項１５】
請求項１１または１２に記載の酵素抽出物の、健康な個体もしくは胃腸および／または膵臓のリパーゼの産生レベルに影響を与えるかもしくは与えない１以上の病状を患う個体、好ましくは脂肪の吸収の機構を変える医学的処置を受けている個体もしくは高齢者によって摂取される動物性もしくは植物性の脂肪の吸収を容易にすることを意図した薬剤の製造、および好ましくは生物における、好ましくは胃腸および／または膵臓のリパーゼであるリパーゼの不足に関連した病状、さらに好ましくは嚢胞性線維症、外分泌腺膵臓不全の処置のための薬剤の製造のための使用。
【請求項１６】
組換えＤＧＬおよび／または請求項１０に記載のいくつかのポリペプチド、および／または請求項１１または１２に記載の１以上の酵素抽出物を、場合により薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせて含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１７】
請求項９に記載の遺伝的に形質転換した植物もしくは植物の部分、特に葉および／または果実および／または種子、もしくは植物細胞の、ヒトまたは動物の栄養補給を意図した食品、好ましくは健康な個体もしくは胃腸および／または膵臓のリパーゼの産生レベルに影響を与えるかもしくは与えない１以上の病状を患う個体によって摂取される動物性もしくは植物性の脂肪の吸収を容易にする機能性食品の製造のための使用。
【請求項１８】
請求項１０に記載の組換えＤＧＬの、ヒトまたは動物の栄養補給を意図した食品、好ましくは健康な個体もしくは胃腸および／または膵臓のリパーゼの産生レベルに影響を与えるかもしくは与えない１以上の病状を患う個体によって摂取される動物性もしくは植物性の脂肪の吸収を容易にする機能性食品の製造のための使用。
【請求項１９】
請求項９に記載の１以上の植物および／または植物の部分、ならびに／あるいは請求項１０に記載の組換えＤＧＬおよび／または１以上のポリペプチド、ならびに／あるいは請求項１１または１２に記載の１以上の酵素抽出物を含むことを特徴とする、機能性食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物による組換え前十二指腸(preduodenal)リパーゼの、特に、組換え胃リパーゼの生産、リパーゼ活性を有するそれらのポリペプチド誘導体、およびそれらの用途、特に機能性食品として、もしくは医薬組成物における、あるいは農業栄養物の(agro-alimentary)または工業的応用のための酵素処方物における用途に関する。
【０００２】
イヌ胃リパーゼ(ＤＧＬ)は、約50キロダルトン(kDa)の分子量を有する379アミノ酸(AA)の糖タンパク質であり、アミノ末端(ＮＨ２−末端)にシグナルペプチドを有する前駆体の形態で合成され、イヌの胃底の粘メンブランの中間細胞(median cell)により分泌される(Carriere F.et al.,1991)。
【０００３】
ヒト胃リパーゼ(ＨＧＬ)は、前駆体の形態で天然に合成され、Bodmer et al.,1987による刊行物に記載されている。成熟ＨＧＬタンパク質は、379アミノ酸により構成されている。そのシグナルペプチド(HGLSP)は、19アミノ酸からなる。
【０００４】
これらの酵素は、「前十二指腸の」と呼ばれるリパーゼのファミリーに属し、その内のあるメンバーは既に精製され、そしてある場合にはクローン化さえされている(Docherty A.J.P. et al., 1985; Bodmer M.W. et al., 1987; Moreau H. et al., 1988; 欧州特許第0191061号および第0261016号)。
【０００５】
長い間、食物の脂質の加水分解は膵臓によって生産される酵素の作用により小腸で起きると当然のように考えられてきた(Bernard C.,1849)。
【０００６】
しかしながら、複数の発見は、トリグリセリドの加水分解は前十二指腸の酵素という間接的な手段により胃で起き得るということを示唆していた(Volhard, F., 1901; Shonheyder, F., and Volquartz, K., 1945)。これらの酵素、特にイヌ胃リパーゼは、それらが哺乳動物の膵臓リパーゼとは区別される酵素的かつ物理化学的性質を有している。これらの胃リパーゼと膵臓リパーゼの差違は、実質的には以下の点に関する：分子量、アミノ酸組成、ペプシン耐性、基質特異性、作用の最適pHおよび酸性培地における安定性。
【０００７】
さらに、in vitroでは、ある条件下で、長鎖のトリグリセリドの加水分解に関して胃と膵臓のリパーゼの間で相乗作用を示すことも可能である(Gargouri, Y et al., 1989)。
【０００８】
患者が完全にもしくは部分的に外分泌腺膵臓分泌を欠いている、したがって、食物の加水分解に必要な酵素（アミラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ）を欠いているいくつかの病的状況（嚢胞性線維症、外分泌腺膵臓不全(exocrine pancreatic insufficiency)）が知られている。腸で脂肪が吸収されないことは、特に長鎖のトリグリセリドの場合、これらの患者の脂肪便中にそれ自身が著しく増加することにより証明され、そして若い患者の場合、体重増加が非常に著しく低下することにより証明される。これを治すため、ブタ膵臓抽出物をこれらの被検体に食事時に投与する。これらの抽出物の治療効果は、ＤＧＬの同時処方により、その作用の長鎖トリグリセリドに対する特異性のため、著しく改善され得る。
【０００９】
Carriere et al.,(1991)による記事は、ＤＧＬの精製およびＮＨ２−末端配列の決定を記載している。イヌの胃からこの酵素を抽出する方法も、この刊行物に記載されている。この方法は、本質的には、イヌの胃を、水溶性塩の存在下で酸性培地(pH2.5)に浸漬する工程を包含する。その塩は該培地中でリパーゼの塩析を促進する。このＤＧＬは、分子ふるいによる濾過およびイオン交換クロマトグラフィーの工程により均質にまで精製され得る。これらの方法によって入手した精製ＤＧＬは、49,000ダルトンの分子量を有する糖タンパク質であり、そのうち6,000は、糖部分に相当し、そして43,000は、タンパク質部分に相当する。
【００１０】
イヌの胃を調達する困難性という明らかな理由により、この方法の研究室におけるおよび工業的な開発が妨げられている。これにより、イヌの胃の使用を不要にするＤＧＬの大量生産を可能にする方法の発見が必要とされる。
【００１１】
ＤＧＬのヌクレオチド配列およびペプチド配列は、遺伝子工学を用いる方法により、ＤＧＬの工業的生産を目的として決定された。これらの研究は1993年12月16日に出願された国際出願第ＷＯ94/13816号の主題である。
【００１２】
この国際出願に記載された組換えＤＧＬの生産方法は、Escherichia coli(E.coli)を、ＤＧＬを生産し得る形質転換宿主細胞として請求している。
【００１３】
E.coliによる組換えＤＧＬの生産の間に出会ったいくつかの困難、特に、経費のかかる、発酵槽でのE.coliの大量培養の必要性により、発明者らはこのＤＧＬの別の生産方法を探すようになった。
【００１４】
哺乳動物細胞は、先験的に、哺乳動物遺伝子の発現にはより適切である。しかし、それらの使用によりタンパク質の成熟という問題が生じる。翻訳後成熟を現実化する酵素的な資質は、組織、器官もしくは種によりそれぞれ異なるのである。例えば、血漿タンパク質の翻訳後成熟は、それがヒトの血液から得た場合と組換え細胞、例えば、チャイニーズハムスターの卵巣細胞によって、もしくはトランスジェニック動物の乳の中で生産された場合で異なり得る。さらに、哺乳動物細胞によって得た低レベルの発現は非常に大量のin vitroでの培養に高い経費を必要とする。トランスジェニック動物（マウス、ヒツジおよびウシ）の乳中の組換えタンパク質の生産は、生産経費の減少、および発現レベルの問題の克服を可能にする。しかし、倫理上の問題およびウイルスおよびサブウイルスの混入（プリオン）の問題は残る。
【００１５】
これらの理由により、哺乳動物遺伝子の植物細胞へのトランスジェネシス(transgenesis)は、組換えタンパク質の、生産経費の減少した、そしてウイルスもしくはサブウイルス混入の危険のない大量の生産のための経路を提供し得る。
【００１６】
1983年、いくつかの研究所が、異種遺伝子を植物細胞のゲノムに移入すること(Bevan et al., 1983; Herrera-Estrella et al., 1983 aおよびb)、およびこれらの遺伝的に改変した細胞からトランスジェニック植物を再現することは可能であるということを発見した。したがって、その植物の全細胞は遺伝的に改変された性質を有し、それは、有性受精により子孫に伝えられる。
【００１７】
これらの研究の結果、種々のチームが植物細胞もしくはトランスジェニック植物における哺乳動物組換えタンパク質の生産に携わった(Barta et al., 1986; Marx, 1982)。この分野における最初の真に重要な結果の一つは、トランスジェニックタバコ植物における抗体の生産であった(Hiatt et al.,1989)。
【００１８】
異種タンパク質を種子内、すなわち植物内のタンパク質貯蔵部位で発現させるため、Vandekerckhoveのチーム(1989)は、leu−エンケファリンをコードする配列をArabidopsis thalianaの2Sアルブミンをコードする遺伝子に融合させた。この構築物を用いて、leu−エンケファリンを種子で特異的に、全タンパク質の0.1％のオーダーの発現レベルで発現するトランスジェニックアブラナ(rape)植物を生産した。1990年、Sijmonsとその同僚はヒト血清アルブミンの遺伝子をタバコおよび馬鈴薯の細胞に移入した。シグナルペプチドの起源が何であれ（ヒトもしくは植物）、ヒト血清アルブミンは全タンパク質の0.02％のオーダーのレベルで馬鈴薯の葉、茎および根茎で得られた。
【００１９】
他の哺乳動物組換えタンパク質もまた、植物で生産されている：Ｂ型肝炎の表面抗原(Mason et al., 1992)、インターフェロン(De Zoeten et al., 1989; Edelbaum et al., 1992; Truve et al., 1993)；ネズミ抗Streptococcus mutans抗体、虫歯用薬剤(Hiatt and Ma, 1992; Ma et al., 1994)、scFV抗ガン細胞抗体のフラグメント(Russel D., 1994)、抗ヘルペス抗体(Russel D., 1994)、ヒルジン(Moloney et al.,1994)、コレラトキシン(Hein R., 1994)およびヒト表皮成長因子(EGF)(Higo et al., 1993)。
【００２０】
これらの研究の全ては、植物細胞内での哺乳動物組換えタンパク質の生産は可能であり、ＤＮＡ配列からのタンパク質の合成の機構は動物細胞内と植物細胞内では同様であるということを示してきた。しかし、植物細胞と動物細胞には、特に、ポリマンノシドグリカンの複合グリカンへの成熟、またはシグナルペプチドの開裂部位では、いくつかの違いも存在し、したがって、活性なもしくは十分に活性な哺乳動物タンパク質は植物細胞の形質転換により得られるということが保証され得ない。
【００２１】
本発明者らは、適切な組換えヌクレオチド配列によって形質転換された植物細胞の使用により、工業的応用において開発され得る、組換えＤＧＬもしくは組換えＨＧＬ、または十分な酵素活性を有するこれらに由来するポリペプチドを入手することが可能であることを示した。
【００２２】
本発明の目的は、植物による、哺乳動物組換え前十二指腸リパーゼの、より特定すると、組換えＤＧＬもしくはＨＧＬの、または酵素活性、より特定するとリパーゼ活性、を有するこれらから誘導されるポリペプチドの、新しい生産方法を提供することであり、その結果、上記組換えリパーゼもしくはそれらの誘導ポリペプチドが工業的に用いられ得る。
【００２３】
本発明の別の目的は、そのような方法を実施するための手段、特に新しい組換えヌクレオチド配列、遺伝的に形質転換した植物細胞、遺伝的に形質転換した植物もしくは植物の一部（特に、葉、茎、果実、種子(seed)もしくは穀粒(grain)、根）、および遺伝的に形質転換されたこれらの植物もしくは植物の一部のフラグメントを提供することである。
【００２４】
本発明の目的はまた、新しい哺乳動物組換え前十二指腸リパーゼ、もしくは任意の誘導されたポリペプチドであって酵素的に活性で遺伝的に形質転換された植物細胞もしくは植物から入手されるものを提供することである。
【００２５】
本発明の目的はまた、酵素反応を、特に工業的規模で行う場合に用いられ得る新しい酵素組成物を提供することである。
【００２６】
本発明の目的はまた、新しい医薬組成物、特に生物中のリパーゼの生産における欠陥に関する病因、例えば嚢胞性線維症の処置において医薬組成物を提供することである。
【００２７】
本発明の別の目的は、新しいエネルギー源、生物燃料ともいう、であって、石油から誘導される燃料より汚染度が少なく生産も安価であるという利点を有するものを提供することである。
【００２８】
本発明は、以下の図面を補助として下記に例示される：
−図１は、ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示し、そのうち１〜1,137位に位置するヌクレオチドが図２に示すＤＧＬをコードし、SEQ ID NO:２に対応する、
−図２は、ＤＧＬのアミノ酸配列を示し、SEQ ID NO:２に対応する、
−図３は、図１に示したｃＤＮＡから誘導されたヌクレオチド配列を示し、SEQ ID NO:１に対応して、上記誘導配列の１〜1,137位に位置するこのヌクレオチドは図２に示すＤＧＬをコードし、SEQ ID NO:２に対応する、
−図４は、ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示し、このうち47〜1,240位に位置するヌクレオチドは398アミノ酸のＨＧＬの前駆体をコードし、104〜1,240位に位置するヌクレオチドは379アミノ酸の成熟ＨＧＬをコードする、
−図５は、ＨＧＬのアミノ酸配列を示し、ＨＧＬの前駆体は、１〜398位に位置するアミノ酸の範囲に限定され、成熟ＨＧＬは、20〜398位に位置するアミノ酸の範囲に限定される、
−図６、７および８は、本発明による組換え配列によって形質転換したタバコXanthiの葉および種子、アブラナの種子、ならびにトマトの葉および果実によって生産された組換えポリペプチドについての「ウエスタン」型の免疫検出実験の結果を示す、
−図９および１０は、タバコの葉から精製したＤＧＬのそれぞれ、ポリアクリルアミドゲルの電気泳動による分析と、このゲルのニトロセルロースメンブランへの転写とイヌの胃の抗リパーゼ抗体からの曝露の結果を示す、
−図１１は、組換えＤＧＬのグリカン性残基のメンブラン上の検出の例を示す、
−図１２は、アブラナ種子から精製したＤＧＬのポリアクリルアミドゲルの電気泳動による分析を示す、
−図１３、１４および１５は、本発明の形質転換種子からのメチルオレエートの調製により行った種々のテストを示す。
【００２９】
本発明は、一方で、任意の哺乳動物前十二指腸リパーゼ、すなわち、それらをコードするヌクレオチド配列が少なくとも約75％の、特に約77％〜約85％の相同性％を有し、そのアミノ酸配列が少なくとも70％、特に約80〜約90％の相同性％を有し、酸耐性の性質を有し、そして約１〜約５のｐＨで、特に約1.5〜約２のｐＨで活性であるリパーゼ、をコードするｃＤＮＡ、特に、任意の哺乳動物の胃リパーゼをコードするｃＤＮＡ、もしくは上記の前十二指腸リパーゼから１つの（またはそれ以上の）アミノ酸の付加および／またはサプレッションおよび／または置換により誘導されたポリペプチドであって、前十二指腸リパーゼについて上記に記載された性質を有するポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、他方で、植物細胞が該ｃＤＮＡによってコードされた前十二指腸リパーゼを生産すること、もしくは上記で定義した誘導されたポリペプチドを生産することを可能にする要素、特に植物細胞の転写機構によって認識される転写プロモーターおよび転写ターミネーターを、これらの細胞からもしくはこれらの細胞から得られる植物から、哺乳動物組換え前十二指腸リパーゼを活性な酵素の形態でもしくは上記に定義した後者から誘導された１つの（またはそれ以上の）ポリペプチドを得るという観点から植物細胞を形質転換するための要素、を含む組換えヌクレオチド配列の用途に関する。
【００３０】
本発明は、より特定すると、一方で、図１に示すｃＤＮＡであって、図２に示すイヌ胃リパーゼ(ＤＧＬ)をコードするもの、またはこのｃＤＮＡから、特に１つの（またはそれ以上の）ヌクレオチドの付加および／またはサプレッションおよび／または置換により誘導されたヌクレオチド配列であって、そのアミノ酸配列が図２に示すＤＧＬのそれと同じであるポリペプチド、またはＤＧＬから１つの（またはそれ以上の）アミノ酸の付加および／またはサプレッションおよび／または置換により誘導されたリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードし得る上記誘導された配列、および、他方では、植物細胞が上記ｃＤＮＡによってもしくは上記誘導された配列によってコードされたポリペプチドを生産することを可能にする要素、特に植物細胞の転写機構により（より特定すると、後者のＲＮＡポリメラーゼにより）認識される転写プロモーターおよび転写ターミネーターを、これらの細胞もしくは後者から得た植物から組換えＤＧＬを活性な酵素の形態で、もしくは上記で定義した後者から誘導した１つ（もしくはそれ以上）のポリペプチドを得るために植物細胞を形質転換するのため、の要素を含む組換えヌクレオチド配列の用途に関する。
【００３１】
本発明はまた、ｃＤＮＡとして図１に示した上記で定義した任意の組換えヌクレオチド配列、または上記で定義したように後者から誘導したヌクレオチド配列にも関する。
【００３２】
この点で、本発明はより特定すると、図１に示したｃＤＮＡを含む上記で定義した任意のヌクレオチド配列であって図２に示したイヌ胃リパーゼ(ＤＧＬ)をコードする配列に関する。
【００３３】
本発明は、より特定すると、図１に示したｃＤＮＡから誘導されたヌクレオチド配列を含む上記の任意の組換えヌクレオチド配列に関し、上記誘導された配列は上記で定義され、図２に示すイヌ胃リパーゼ(ＤＧＬ)をコードする。そのような誘導された配列は好都合には図３に示したものであり、図１に示したものに対応し、その中で、第12位のヌクレオチドＡが、ヌクレオチドＧによって置き換えられ、第13位のヌクレオチドＴがヌクレオチドＣで置き換えられ、そして第15位のヌクレオチドＡがヌクレオチドＴで置き換えられている。
【００３４】
本発明による組換えヌクレオチド配列は、好都合には、本発明の組換えポリペプチド（すなわち、組換えＤＧＬもしくは上記の誘導された配列）を植物細胞の特定の区画、特に小胞体もしくは液胞に、あるいは細胞外にさえも、すなわちペクトセルロジック壁にもしくはアポプラズムと呼ばれる細胞外空間に指向させるペプチドをコードする１つ（もしくはそれ以上）の配列を有する。
【００３５】
本発明の植物細胞の形質転換に用いられ得る転写ターミネーターには、Franck et al., 1980による記事に記載されたカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)のpolyA 35Sターミネーター、もしくはノパリン(nopaline)を有するAgrobacterium tumefaciensのＴｉプラスミドのノパリンシンターゼの遺伝子の３’非コード領域に対応するpolyA NOSターミネーター(Depicker et al., 1982)が挙げられる。
【００３６】
この点で、本発明は、該ｃＤＮＡもしくはその誘導された配列の下流に、CaMVのpolyA 35SターミネーターもしくはAgrobacterium tumefaciensのpolyA NOSターミネーターを含有する上記の任意の組換えヌクレオチド配列に関する。
【００３７】
本発明の植物細胞の形質転換に用いられ得る転写プロモーターの中で挙げられるのは：
−35Sプロモーター、もしくは好都合にはCaMVの二重構造(double structured)35Sプロモーター(pd35S)で、これらのプロモーターは、本発明による組換えポリペプチドの発現を、本発明による形質転換された細胞から得た植物全体で可能にし、Kay et al., 1987による記事に記載されている、
−ラディッシュのクルシフェリンの遺伝子のpCRUプロモーターで、本発明による組換えポリペプチドの発現を、本発明による形質転換された細胞から得た植物の種子(seed)（もしくは穀粒(grain)）内のみで可能にし、Depigny-This et al., 1992による記事に記載されている、
−pGEA1およびpGEA6プロモーターはそれぞれArabidopsis thalianaの穀粒であるGEA1およびGEA6の貯蔵タンパク質の遺伝子の５'非コード領域に対応し(Gaubier et al., 1993)、穀粒での特異的な発現を可能にする、
−キメラプロモーターであるスーパー−プロモーターpSP(PCT/US94/12946)は、Agrobacterium tumefaciensのオクトピンシンターゼの遺伝子のプロモーターの３つの転写アクチベーターの、Agrobacterium tumefaciensのマンノピンシンターゼ遺伝子のプロモーターの転写アクチベーターエレメントの、およびマンノピンシンターゼのプロモーターの融合により構成される、
−McElroy et al.,(1991)によって記載されたプラスミドpAct1-F4に含有される、コメのアクチンプロモーターとそれに続くコメのアクチンイントロン(pAR-IAR)、
−Reina et al., (1990)に記載されたプラスミドpγ63に含有されたトウモロコシのγゼイン(zeine)の遺伝子のプロモーター(pγzeine)で、トウモロコシ種子の胚乳における発現を可能にする。
【００３８】
この点で、本発明は、該ｃＤＮＡもしくはその誘導された配列の上流に、CaMVの二重構造35Sプロモーター(pd35S)もしくはラディッシュのクルシフェリンの遺伝子のpCRUプロモーターもしくはArabidopsis thalianaのpGEA1もしくはpGEA6、もしくはAgrobacterium tumefaciensのpSPスーパー−プロモーター、もしくはコメのpAR-IARプロモーター、もしくはトウモロコシのpγzeineプロモーターを含有する上記の任意の組換えヌクレオチド配列に関する。
【００３９】
本発明に用いられる指向(directing)ペプチドをコードする配列は植物の、ヒトのもしくは動物の起源である得る
植物起源の指向性ペプチドをコードする配列の中で挙げられるのは：
−（以下に続く実施例に示した）69ヌクレオチドのヌクレオチド配列で、サツマイモのスポラミンＡの23アミノ酸のプレペプチド（シグナルペプチド）をコードするもの、このシグナルペプチドは、本発明の組換えポリヌクレオチドが本発明の形質転換された植物細胞の分泌系に進入することを可能にする（すなわち、おもに小胞体に進入する）、
−（以下に続く実施例に示した）42ヌクレオチドのヌクレオチド配列は、サツマイモのスポラミンＡの14アミノ酸のＮ−末端液胞指向性プロペプチドをコードし、本発明の組換えポリペプチドが本発明の形質転換された植物細胞の液胞に蓄積することを可能にする、
−（以下に続く実施例に示した）111ヌクレオチドのヌクレオチド配列は、上記のプロペプチドである14アミノ酸が続いている上記のシグナルペプチドである23アミノ酸のＮ−末端部分からＣ−末端部分でできたスポラミンＡの37アミノ酸のプレプロペプチドをコードし、このプレプロペプチドは、本発明の組換えポリペプチドが本発明の形質転換された植物細胞の分泌系に進入し液胞に蓄積することを可能にする、
上記の３つの配列はMurakami et al.,1986およびMatsuoka and Nakamura, 1991による記事に記載されている、
−特に、Schroeder et al., 1993、およびBednarek and Ralkhel 1991による記事のオオムギのレクチンのカルボキシ末端プロペプチド。
【００４０】
ヒトもしくは動物起源の指向性ペプチドをコードする配列の中で挙げられるのは、欧州特許第0191061号に記載されたヒト胃リパーゼ(ＨＧＬ)のシグナルペプチドをコードするもの、もしくは欧州特許出願第0542629号に記載されたウサギ胃リパーゼ(ＲＧＬ)のそれをコードするもので、その配列は以下の実施例に示されており、もしくはヒト膵臓リパーゼ(ＨＰＬ)のそれをコードするもの、もしくはイヌ胃リパーゼ(ＤＧＬ)のそれをコードするものである。
【００４１】
また、指向性ペプチドをコードする配列の中で挙げられるのは、テトラペプチドであるＫＤＥＬをコードするもので、小胞体を指向することを可能にする。
【００４２】
この点で、本発明は、シグナルペプチド、例えば、サツマイモのスポラミンＡのそれ、またはＨＧＬもしくはＲＧＬもしくはＤＧＬのそれの全てもしくは一部をコードする配列を含む上記の任意の組換えヌクレオチド配列に関し、この配列は該組換えヌクレオチド配列内の上記ｃＤＮＡもしくはその誘導された配列の上流であって用いられるプロモーターの下流に位置するシグナルペプチドをコードし、その結果、該組換えヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質において、シグナルペプチドの最後のＣ−末端のアミノ酸が上記ｃＤＮＡもしくはその誘導された配列によってコードされるポリペプチドのＮ−末端の最初のアミノ酸に結合している。
【００４３】
本発明はまた、液胞指向性ペプチド、特にサツマイモのスポラミンＡのそれの全部または一部をコードする配列を含む上記の任意の組換えヌクレオチド配列に関し、この配列は、該組換えヌクレオチド配列中のシグナルペプチドをコードする配列と上記ｃＤＮＡもしくはその誘導された配列をコードする配列との間に位置する液胞指向性ペプチドをコードし、その結果、該組換えヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質において、液胞指向性ペプチドのＮ−末端の最初のアミノ酸がシグナルペプチドのＣ−末端の最後のアミノ酸に結合しており、該指向性ペプチドのＣ−末端の最後のアミノ酸は、上記ｃＤＮＡもしくはその誘導された配列によってコードされるポリペプチドのＮ−末端の最初のアミノ酸に結合している。
【００４４】
本発明はまた、液胞指向性ペプチド、特にオオムギのレクチンのそれの全部または一部をコードする配列を含む上記の任意の組換えヌクレオチド配列にも関し、液胞指向性ペプチドをコードするこの配列は、該組換えヌクレオチド配列内の該ｃＤＮＡもしくはその誘導された配列をコードする配列の下流に位置し、その結果、該組換えヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質において、液胞指向性ペプチドのＮ−末端の最初のアミノ酸は該ｃＤＮＡもしくはその誘導された配列によってコードされるポリペプチドのＣ−末端の最後のアミノ酸に結合している。
【００４５】
本発明は、より特定すると以下の組換えヌクレオチド配列に関する：
−(pd35S-PS-DGLと呼ばれる)５’→３’方向に、CaMVのpd35Sプロモーター、スポラミンＡのシグナルペプチドをコードする配列を含むもので、後者はすぐ後に図３に示すヌクレオチド配列、次いでCaMVのpolyA 35Sターミネーターが続いている、
−(pd35S-PPS-DGLと呼ばれる)５’→３’方向に、CaMVのpd35Sプロモーター、スポラミンＡのプレプロペプチドをコードする配列を含むもので、後者はすぐ後に図３に示すヌクレオチド配列、次いでCaMVのpolyA 35Sターミネーターが続いている、
−(pd35S-RGLSP-DGLと呼ばれる)５’→３’方向に、CaMVのpd35Sプロモーター、RGLのシグナルペプチドの一部をコードする配列（すなわち、下記に示す実施例に示した最初の19アミノ酸の配列、Ｃ−末端の最後の３アミノ酸をコードする９ヌクレオチドがサプレッションされている）を含むもので、後者はすぐ後に図１に示したｃＤＮＡ、次いでCaMVのpolyA 35Sターミネーターが続いている、
−(pCRU-PS-DGLと呼ばれる)５’→３’方向に、クルシフェリンのpCRUプロモーター、スポラミンＡのシグナルペプチドをコードする配列を含むもので、後者はすぐ後に図３に示すヌクレオチド配列、次いでCaMVのpolyA 35Sターミネーターが続いている、
−(pCRU-PPS-DGLと呼ばれる)５’→３’方向に、クルシフェリンのpCRUプロモーター、スポラミンＡのプレプロペプチドをコードする配列を含むもので、後者はすぐ後に図３に示すヌクレオチド配列、次いでCaMVのpolyA 35Sターミネーターが続いている、
−(pCRU-RGLSP-DGLと呼ばれる)５’→３’方向に、クルシフェリンのpCRUプロモーター、ＤＧＬシグナルペプチド（上記のような）の一部をコードする配列を含むもので、後者はすぐ後に図１もしくは図３に示すｃＤＮＡ、次いでCaMVのpolyA 35Sターミネーターが続いている、
(pGEA1-RGLSP-DGLと呼ばれる)５’→３’方向に、Arabidopsis thalianaのpGEA1プロモーター、RGLのシグナルペプチド（上記のような）の一部をコードする配列を含むもので、後者はすぐ後に図１もしくは図３に示すｃＤＮＡ、次いでCaMVのpolyA 35Sターミネーターが続いている、
(pGEA6-RGLSP-DGLと呼ばれる)５’→３’方向に、Arabidopsis thalianaのpGEA6プロモーター、RGLのシグナルペプチド（上記のような）の一部をコードする配列を含むもので、後者はすぐ後に図１もしくは図３に示すｃＤＮＡ、次いでCaMVのpolyA 35Sターミネーターが続いている、
(pAR-IAR-RGLSP-DGLと呼ばれる)５’→３’方向に、コメのpAR-IARプロモーター、RGLのシグナルペプチド（上記のような）の一部をコードする配列を含むもので、後者はすぐ後に図１もしくは図３に示すｃＤＮＡ、次いでCaMVのpolyA 35SターミネーターもしくはAgrobacterium tumefaciensのpolyA NOSターミネーターが続いている、
(pγzeine-RGLSP-DGLと呼ばれる)５’→３’方向に、トウモロコシのpγzeineプロモーター、RGLのシグナルペプチド（上記のような）の一部をコードする配列を含むもので、後者はすぐ後に図１もしくは図３に示すｃＤＮＡ、次いでCaMVのpolyA 35Sターミネーターが続いている、
(pγzeine-RGLSP-DGL-KDELと呼ばれる)５’→３’方向に、トウモロコシのpγzeineプロモーター、RGLのシグナルペプチド（上記のような）の一部をコードする配列を含むもので、後者はすぐ後に図１もしくは図３に示すｃＤＮＡ、次いでテトラペプチドであるＫＤＥＬをコードする配列、次いでCaMVのpolyA 35Sターミネーターが続いている。
【００４６】
本発明の組換えヌクレオチド配列は、好都合には、該組換え配列のマーカーとして、特に該組換え配列によって形質転換された植物細胞のヌクレオチド配列を、されてないものから区別するために用いられ得るヌクレオチド配列も含む。
【００４７】
該組換え配列のマーカーとして用いられ得るそのようなヌクレオチド配列は、好ましくは、抗生物質に耐性な遺伝子から、特にカナマイシンに耐性な遺伝子から選択される。
【００４８】
本発明はまた、その複製にとって必須ではない部位に挿入された本発明の組換えヌクレオチド配列を有する任意のベクター、特に、プラスミドベクターにも関する。
【００４９】
本発明はまた、上記で定義したベクターによって形質転換された任意の宿主細胞、特に、任意の細菌、例えば、Agrobacterium tumefaciensにも関する。
【００５０】
本発明はまた活性な酵素の形態の組換えＤＧＬのおよび／または後者から、特に１つ（もしくはそれ以上の）アミノ酸の付加および／またはサプレッションおよび／または置換により誘導された、１つの（もしくはそれ以上の）ポリペプチドの任意の調製方法にも関し、この（もしくはこれらの）誘導されたポリペプチドはリパーゼ活性を有し、以下の工程を包含する：
−本発明の１つ（もしくはそれ以上）の組換えヌクレオチド配列がその細胞のゲノムに組み込まれるような植物細胞の形質転換、
−適切な場合、上記の形質転換細胞からの形質転換植物の生成、
−該細胞もしくは上記の形質転換植物内で生産された組換えＤＧＬおよび／または上記の誘導されたポリペプチドの、特に抽出、適切なら続く精製による回収。
【００５１】
本発明の上記の１つの実施態様によれば、植物細胞の形質転換は、Krens et al., 1982による記事に記載された方法に従って、本発明の組換えヌクレオチド配列をプロトプラストに、特に、後者を二価のカチオン(Ｃａ2+)の存在するポリエチレングリコール(ＰＥＧ)の溶液中でインキュベーションした後に、移入することにより実施することができる。
【００５２】
植物細胞の形質転換はまた、エレクトロポレーションによっても、特にFromm et al., 1986による記事に記載された方法に従って、実施することができる。
【００５３】
植物細胞の形質転換はまた、非常に速い速度で本発明の組換えヌクレオチド配列で被覆された金属の粒子の発射を可能にし、したがって遺伝子を細胞の核の内部に送達する遺伝子銃を用いることにより、特にSanford 1988による記事に記載された技術にしたがって、実施することもできる。
【００５４】
植物細胞の形質転換の別な方法は、De La Penna et al., 1987による記事に記載されたような、細胞質もしくは核のマイクロインジェクションの方法である。
【００５５】
本発明の上記の方法の特に好ましい実施態様によれば、植物細胞は、上記のように、後者を、本発明にしたがってベクターによって形質転換される細胞宿主と一緒にすることにより形質転換され、該細胞宿主は該植物細胞に感染することができ、後者のゲノムに、はじめは上記のベクターのゲノムに含まれていた本発明の組換えヌクレオチド配列を組込むことを可能にし得る。
【００５６】
上記の用いる細胞宿主は、好都合には、特にBevan, 1984およびAn et al., 1986による記事に記載された方法によればAgrobacterium tumefaciensであり、また、特にJouanin et al., 1987による記事に記載された方法によればAgrobacterium rhizogenesである。
【００５７】
本発明において形質転換され得る植物細胞のうち、アブラナ、タバコ、トウモロコシ、エンドウ、トマト、ニンジン、コムギ、オオムギ、馬鈴薯、ダイズ、ヒマワリ、レタス、コメおよびアルファルファのそれらが挙げられる。
【００５８】
本発明の上記の方法の１つの実施態様によれば、本発明の形質転換された植物細胞は、in vitroで、特にバイオリアクターでBrodelius, 1988による記事に記載された方法により、液体培地内で培養するか、Brodelius, 1979による記事に記載された方法により、固定された形態で培養するか、あるいはまたDeno et al,, 1987による記事に記載された方法により、in vitroで形質転換された根を培養することにより実施され得る。
【００５９】
上記のin vitro培養上清を、次いで、回収して、それらから、in vitroで培養された該形質転換された細胞により生産された組換えＤＧＬおよび／または上記で定義した誘導されたポリペプチドを抽出し、適切ならば特にクロマトグラフィーで精製する。
【００６０】
本発明の組換えＤＧＬおよび／または誘導されたポリペプチドの上記の調製方法の好ましい実施態様によれば、植物細胞の形質転換に、該形質転換された細胞の適切な培地中での培養による形質転換された植物の生産工程が続く。そのようにして得られた植物全体の細胞で生産された組換えＤＧＬおよび／または誘導されたポリペプチドは、抽出により回収され、この抽出は植物全体もしくはそれらの植物のフラグメント（特に、葉、茎、もしくは果実）、あるいはそれらの植物から生産される種子に対して実施され、この抽出には、適切なら、組換えＤＧＬおよび／またはその誘導されたポリペプチドの精製が続く。
【００６１】
上記の方法において組換えＤＧＬおよび／またはその誘導されたペプチドの回収に用いられる形質転換された植物は、Ｔ０世代の植物であり、すなわち、本発明の形質転換された細胞を適切な培地上で培養することにより得られるものであり、あるいは好都合には先行世代の植物の自家受精により得られる次世代のもの(Ｔ１、Ｔ２など)で、そこでは本発明の組換えヌクレオチド配列はメンデルの法則に従って再生産される。
【００６２】
本発明による方法を実施することにより得られ得る組換えＤＧＬから誘導されるポリペプチドのうち、以下のものを挙げることができる：
−図２の55〜379位に位置するアミノ酸により限定されるポリペプチドで、ポリペプチド(Δ54)とも呼ばれ、SEQ ID NO:４で示されるポリペプチド。該ポリペプチドはSEQ ID NO:３によって示されるヌクレオチド配列によってコードされている、
−図２の５〜379位に位置するアミノ酸により限定されるポリペプチドで、ポリペプチド(Δ４)とも呼ばれ、SEQ ID NO:６で示されるポリペプチド。該ポリペプチドはSEQ ID NO:５によって示されるヌクレオチド配列によってコードされている。
【００６３】
本発明はさらに特定すると、上記のような任意の、図２に示す組換えＤＧＬの、そして適切な場合には、１つ（もしくはそれ以上）の誘導されたポリペプチド、特に上記のポリペプチド(Δ54)および／またはポリペプチド(Δ４)の調製方法に関し、この方法は、植物細胞の形質転換を、後者のゲノムに、一方で図１に示すｃＤＮＡを含み、他方でＲＧＬの22アミノ酸のシグナルペプチドをコードする配列、好都合にはＲＧＬのシグナルペプチドの最初の19アミノ酸コードするそれを含む上記の組換え配列の組込みによって行われる工程を特徴とする。
【００６４】
本発明はより特定すると上記のような図２に示す組換えＤＧＬの、適切な場合、ポリペプチド(Δ54)および／またはポリペプチド(Δ４)と組み合わせた調製方法に関し、以下を包含することを特徴とする：
−植物の葉の外植細胞の、後者を上記の組換えヌクレオチド配列pd35S-RGLSP-DGLを含む上記のようなプラスミドで形質転換されたAgrobacterium tumefaciensの株と適切な培養上清上で一緒にすることによる形質転換、
−カナマイシン含有培地上での形質転換外植片の選択、
−上記の形質転換外植片から、それを適切な培地上で培養することにより形質転換植物を生産すること
−組換えＤＧＬの抽出、および適切な場合、ポリペプチド(Δ54)および／またはポリペプチド(Δ４)の抽出、特に、上記の形質転換された植物の葉および／または種子および／または果実を適切な緩衝液中ですりぶつし、遠心分離し、酵素活性を有する植物抽出物を構成する上清を回収すること、
−適切な場合、先行工程の間に得られた抽出物から、特に上清に対して行われるクロマトグラフィーにより、組換えＤＧＬを精製すること、それにより組換えＤＧＬの調製物は実質的に純粋な形態となる。
【００６５】
本発明はまた、実質的に純粋な形態の上記のポリペプチド(Δ54)またはポリペプチド(Δ４)の調製に、上記方法を使用することにも関し、上記の方法で得られた抽出物由来の後者の精製により、特に抽出物の上清に対して行われたクロマトグラフィーによる。
【００６６】
本発明はまた、特に、適切な場合には、実質的に純粋な形態の、上記の方法の実行による、上記のポリペプチド(Δ４)の調製方法に関し、ここで、配列pd35S-RGLSP-DGLによって形質転換された細胞は、ナス科の外植細胞、特にタバコもしくはトマトである。
【００６７】
上記の方法の１つの実施態様によれば、ポリペプチド(Δ４)は、具体的には、上記の形質転換されたタバコ植物の葉の抽出により得ることができ、特に、これらの葉を適切な緩衝液中で摩砕し、遠心分離しそして上清を回収することにより得ることができる。ポリペプチド(Δ４)は、次いで、該ポリペプチド(Δ４)を含有する上記の葉の抽出物から、特に上記の上清に対して行われるクロマトグラフィーにより精製することができる。
【００６８】
本発明はより特定すると、組換えＤＧＬおよび／または上で定義した後者から誘導される１つ（もしくはそれ以上）のポリペプチドを調製するための上記の任意の方法に関し、植物細胞の形質転換の工程が、後者のゲノムへの、一方では図３に示すヌクレオチド配列を含み、他方では上記のスポラミンＡのシグナルペプチドをコードする配列を含む配列の組込みにより行われることを特徴とする。
【００６９】
上記の方法を実施することにより得られ得る組換えＤＧＬから誘導されるポリペプチドのうち、上記のポリペプチド(Δ54)および／またはポリペプチド(Δ４)が挙げられる。
【００７０】
本発明は特に上記の組換えＤＧＬおよび／またはポリペプチド(Δ54)および／またはポリペプチド(Δ４)の調製方法に関し、以下を包含することを特徴とする：
−植物の外植細胞（特に葉の外植片）の、後者を、組換えヌクレオチド配列pd35S-PS-DGLおよび／または配列pd35S-PPS-DGLを含有する上記のプラスミドで形質転換されたAgrobacterium tumefaciensの株と一緒にすることによる形質転換、
−カナマイシン含有培地上での形質転換された外植片の選択、
−上記の形質転換された外植片からの、適切な培地上での後者の培養による、形質転換された植物の生産、
−組換えＤＧＬおよび／またはポリペプチド(Δ54)および／またはポリペプチド(Δ４)の、特に上記の形質転換された植物の葉および／または種子および／または果実の適切な緩衝液中での摩砕による抽出、遠心分離、および酵素活性を有する植物抽出物を構成する上清の回収、
−適切な場合、組換えＤＧＬおよび／またはポリペプチド(Δ54)および／またはポリペプチド(Δ４)の先行工程の間に得られた抽出物からの、特に上清に対して行われるクロマトグラフィーによる精製、それにより組換えＤＧＬおよび／またはポリペプチド(Δ54)および／またはポリペプチド(Δ４)の調製物は実質的に純粋な形態となる。
【００７１】
本発明は、より特定すると、上記のポリペプチド(Δ54)および／またはポリペプチド(Δ４)の、上記の方法の実施による、調製方法に関し、ここで、形質転換される細胞はナス科の、特にタバコもしくはトマトの葉の外植細胞である。
【００７２】
本発明の上記の方法の特定の実施態様によれば、ポリペプチド(Δ54)は、特に、上記の形質転換されたタバコ種子から、特にそれらの種子を適切な緩衝液中で摩砕することによる抽出、遠心分離、および上清の回収により得ることができる。次いで、このポリペプチド(Δ54)は、該ポリペプチド(Δ54)を含有する上記の種子抽出物から、特に上記の上清に対して行われるクロマトグラフィーにより、精製することができる。
【００７３】
本発明はより特定すると、組換えＤＧＬおよび／またはポリペプチド(Δ54)および／またはポリペプチド(Δ４)の調製方法に関し、以下を包含することを特徴とする：
−植物の外植細胞（特に葉の外植片）の、後者を、組換えヌクレオチド配列pCRU-PPS-DGLおよび／または配列pCRU-PS-DGLおよび／または配列pGEA1-RGLSP-DGLおよび／または配列pGEA6-RGLSP-DGLおよび／または配列pAR-IAR-RGLSP-DGLおよび／または配列pγzeine-RGLSP-DGLおよび／または配列pγzeine-RGLSP-DGL-KDELを含有する上記のプラスミドにより形質転換されたAgrobacterium tumefaciensの株と一緒にすることによる形質転換、
−カナマイシン含有培地上での形質転換された外植片の選択、
−上記の形質転換された外植片からの、適切な培地上での後者の培養による、形質転換された植物の生産、
−組換えＤＧＬおよび／またはポリペプチド(Δ54)および／またはポリペプチド(Δ４)の、特に上記の形質転換された植物により生産された種子の適切な緩衝液中での摩砕による抽出、遠心分離、および酵素活性を有する植物抽出物を構成する上清の回収、
−適切な場合、組換えＤＧＬおよび／またはポリペプチド(Δ54)および／またはポリペプチド(Δ４)の先行工程の間に得られた抽出物からの、特に上清に対して行われるクロマトグラフィーによる精製、それにより組換えＤＧＬおよび／またはポリペプチド(Δ54)および／またはポリペプチド(Δ４)の調製物は実質的に純粋な形態となる。
【００７４】
本発明はより特定すると、上記のポリペプチド(Δ54)の、上記の方法を実施することによる調製方法に関し、ここで、形質転換される細胞はアブラナ、およびタバコの外植細胞であり、そしてポリペプチド(Δ54)の抽出は形質転換された種子の摩砕により行う。
【００７５】
上記の方法で形質転換された植物細胞は、好都合にはタバコ、アブラナ、トウモロコシ、エンドウ、トマト、ニンジン、コムギ、オオムギ、馬鈴薯、ダイズ、ヒマワリ、レタス、コメおよびアルファルファから選択される。
【００７６】
本発明のより特定の目的は、組換えＤＧＬおよび／またはポリペプチド(Δ54)および／またはポリペプチド(Δ４)の調製方法であり、以下を包含することを特徴とする：
−トウモロコシカルスの、配列pAR-IAR-RGLSP-DGLおよび／または配列pγzeine-RGLSP-DGLおよび／または配列pγzeine-RGLSP-DGL-KDELを含有するプラスミドによる粒子銃を用いる後者のボンバードによる形質転換、
−カナマイシンのような選択物質を含有する培地上での形質転換されたカルスの選択、
−上記の形質転換されたカルスからの、適切な培地上での後者の培養による、形質転換されたトウモロコシ植物の生産、
−組換えＤＧＬおよび／またはポリペプチド(Δ54)および／またはポリペプチド(Δ４)の、特に上記の形質転換された植物により生産された種子の適切な緩衝液中での摩砕による抽出、遠心分離、および酵素活性を有する植物抽出物を構成する上清の回収、
−適切な場合、組換えＤＧＬおよび／またはポリペプチド(Δ54)および／またはポリペプチド(Δ４)の先行工程の間に得られた抽出物からの、特に上清に対して行われるクロマトグラフィーによる精製、それにより組換えＤＧＬおよび／またはポリペプチド(Δ54)および／またはポリペプチド(Δ４)の調製物は実質的に純粋な形態となる。
【００７７】
本発明はまた、そのゲノムに安定な方法で組み込まれた本発明の上記のような１つ（もしくはそれ以上）の組換えヌクレオチド配列を含有する任意の遺伝的に形質転換された植物細胞にも関する。
【００７８】
本発明はまた、本発明の１つ（もしくはそれ以上）の組換えポリペプチド、例えば、組換えＤＧＬおよび／またはポリペプチド(Δ54)および／またはポリペプチド(Δ４)を含有する、上記のような任意のトランスジェニック植物細胞にも関し、該植物細胞は、酵素活性、より特定すると、以下に定義するリパーゼ活性を有する植物細胞とも呼ばれる。
【００７９】
本発明はまた、そのゲノムに安定な方法で組み込まれた、本発明の上記のような１つ（もしくはそれ以上）のヌクレオチド配列を有する遺伝的に形質転換された種子にも関する。
【００８０】
本発明はまた、本発明の１つ（もしくはそれ以上）の組換えポリペプチド、例えば、組換えＤＧＬおよび／またはポリペプチド(Δ54)および／またはポリペプチド(Δ４)を含有する、上記のような任意のトランスジェニック種子にも関し、該種子は、酵素活性、より特定すると、以下に定義するリパーゼ活性を有する種子とも呼ばれる。
【００８１】
本発明の形質転換された種子は、本発明の遺伝的に形質転換された植物から収穫されるものであり、これらの形質転換された植物は、上記のＴ０世代で本発明の形質転換された細胞の培養により生産されるものであるか、あるいは自家受精によって得られる次世代の（Ｔ１、Ｔ２など）ものまたは先行世代（上に示した）の掛け合わせ植物のいずれかである。
【００８２】
本発明はまた、遺伝的に形質転換した植物もしくは植物の一部（特に、外植片、茎、葉、根、花粉など）に関し、それらがそのゲノムに安定な方法で組み込まれた１つ（もしくはそれ以上）の上記の本発明の組換えヌクレオチド配列を含有することを特徴とする。
【００８３】
本発明はまた、本発明の１つ（もしくはそれ以上）の組換えポリペプチド、例えば、組換えＤＧＬおよび／またはポリペプチド(Δ54)および／またはポリペプチド(Δ４)を含有する、上記のトランスジェニック植物もしくはその植物の一部に関し、該植物もしくはその植物の一部は酵素活性、より特定すると、以下に定義するリパーゼ活性を有する植物もしくは植物断片とも呼ばれる。
【００８４】
本発明はより特定すると、本発明の上記の細胞もしくは種子の培養により得られる上記の形質転換された植物に関する。
【００８５】
本発明の形質転換された植物もしくはその一部は、好都合には、アブラナ、タバコ、トウモロコシ、エンドウ、トマト、ニンジン、コムギ、オオムギ、馬鈴薯、ダイズ、ヒマワリ、コメ、レタス、およびアルファルファもしくはこれらの植物の一部から選択される。
【００８６】
本発明は酵素活性、より特定すると、以下に定義するリパーゼ活性を有する任意の植物抽出物で、上記の本発明の方法の一つを実施することにより調製され、活性な酵素として本発明の１つ（もしくはそれ以上）の組換えポリペプチド、例えば、組換えＤＧＬおよび／またはポリペプチド(Δ54)および／またはポリペプチド(Δ４)を含有するものに関する。
【００８７】
本発明の酵素活性を有する植物もしくは植物の一部および植物抽出物のリパーゼ（もしくは脂肪分解）活性は、特に、短鎖のトリグリセリド（例えば、トリブチリン）を基質として用いるGargouri (Gargouri et al., 1986)の方法により測定することができる。この酵素活性は、単位Ｕで表され、１単位Ｕは、37℃、最適ｐＨ条件下で１分当たり、１μモルの遊離の脂肪酸を放出するのに必要な酵素の量に相当する。
【００８８】
本発明の酵素活性を有する植物抽出物は、好都合には、酵素的に活性な組換えポリペプチドの重量％が、この抽出物中に存在するタンパク質の総重量の約0.1％〜20％、より特定すると約１％〜約15％であり、それは、葉の初期重量(Fresh weight：FW)のｇ当たり約0.5U〜約1,000U/ｇに、特に葉のFWの約10U/ｇ〜約300U/ｇ、または種子のFWの約１U/ｇ〜約5,000U/ｇ、特に種子の約10U/ｇ〜約1,000U/ｇの酵素活性の測定単位に相当する。
【００８９】
本発明は、より特定すると、以下の酵素活性を有する植物抽出物に関する：
★植物の葉および／または果実および／または種子の抽出物であって、上記の方法の１つにより配列pd35S-RGLSP-DGLもしくは配列pd35S-PS-DGLもしくは配列pd35S-PPS-DGLによるそれらの植物の外植細胞の形質転換によって得られ、かつ組換えＤＧＬおよび／またはポリペプチド(Δ54)および／またはポリペプチド(Δ４)を含有するもの、特に：
−上記の方法により配列pd35S-PS-DGLもしくは配列pd35S-PPS-DGLによるタバコの葉の外植細胞の形質転換によって得られ、ポリペプチド(Δ54)をポリペプチド(Δ４)と組み合わせて含有するタバコの葉の抽出物で、これら２つのポリペプチドの混合物の、抽出物中に存在するタンパク質の総重量に対する重量％は、約0.1％〜約20％であり、該抽出物の酵素活性は、FWの約100U/g〜約300U/gである、
−上記の方法により配列pd35S-PS-DGLもしくは配列pd35S-PPS-DGLによるトマトの葉の外植細胞の形質転換によって得られ、ポリペプチド(Δ54)をポリペプチド(Δ４)と組み合わせて含有するトマトの葉もしくは果実の抽出物で、これら２つのポリペプチドの混合物の、抽出物中に存在するタンパク質の総重量に対する重量％は、約0.1％〜約20％であり、該抽出物の酵素活性は、FWの約100U/g〜約300U/gである、
−上記の方法により配列pd35S-RGLSP-DGLによるタバコの葉の外植細胞の形質転換によって得られ、ポリペプチド(Δ４)を含有するタバコの葉の抽出物で、このポリペプチド(Δ４)の、抽出物中に存在するタンパク質の総重量に対する重量％は、約0.1％〜約20％であり、該抽出物の酵素活性は、FWの約100U/g〜約300U/gである、
−上記の方法により配列pd35S-PS-DGLもしくは配列pd35S-PPS-DGLによるタバコの葉の外植細胞の形質転換によって得られ、ポリペプチド(Δ54)を含有するタバコの葉の抽出物で、このポリペプチド(Δ54)の、抽出物中に存在するタンパク質の総重量に対する重量％は、約0.1％〜約１％であり、該抽出物の酵素活性は、FWの約10U/g〜約300U/gである、
★植物の種子の抽出物であって、上記の方法の１つにより配列pCRU-PS-DGLもしくは配列pCRU-PPS-DGL、もしくは配列pGEA1-RGLSP-DGLもしくは配列pGEA6-RGLSP-DGLによるそれらの植物の外植細胞の形質転換によって得られ、かつ組換えＤＧＬおよび／またはポリペプチド(Δ54)および／またはポリペプチド(Δ４)を含有するもの、特に：
−上記の方法により配列pCRU-PS-DGLもしくは配列pCRU-PPS-DGL、もしくは配列pGEA1-RGLSP-DGLもしくは配列pGEA6-RGLSP-DGLによるアブラナの種子の外植細胞の形質転換によって得られ、ポリペプチド(Δ54)を含有するアブラナの種子の抽出物で、このポリペプチド(Δ54)の、該抽出物中に存在するタンパク質の総重量に対する重量％は、約0.1％〜約１％であり、該抽出物の酵素活性は、FWの約10U/g〜約1,000U/gである、
★植物の種子の抽出物であって、上記の方法の１つにより配列pAR-IAR-RGLSP-DGLおよび／または配列pγzeine-RGLSP-DGLおよび／または配列pγzeine-RGLSP-DGL-KDELによるそれらの植物の外植細胞の形質転換によって得られ、かつ組換えＤＧＬおよび／またはポリペプチド(Δ54)および／またはポリペプチド(Δ４)を含有するもの、特に：
−上記の方法により配列pAR-IAR-RGLSP-DGLおよび／または配列pγzeine-RGLSP-DGLおよび／または配列pγzeine-RGLSP-DGL-KDELによるアブラナの葉の外植細胞の形質転換によって得られ、ポリペプチド(Δ54)を含有するトウモロコシの種子の抽出物で、このポリペプチド(Δ54)の、該抽出物中に存在するタンパク質の総重量に対する重量％は、約0.1％〜約１％であり、該抽出物の酵素活性は、FWの約10U/g〜約1,000U/gである。
【００９０】
本発明はまた、任意の酵素的に活性な組換えＤＧＬであって、そのアミノ酸配列が図２に示されているもの、後者から、特に１つ（もしくはそれ以上）のアミノ酸の付加および／またはサプレッションおよび／または置換により誘導されるポリペプチドであって、これらの誘導されたポリペプチドはリパーゼ活性を有し、例えば、実質的に純粋な形態で上記の本発明の方法の一つを実施することによって得られるものにも関し、これらの方法は、本発明の組換えポリペプチドの精製の工程、特に、上記の酵素抽出物に対して行われるクロマトグラフィーによる工程を包含する。
【００９１】
上記の組換えＤＧＬから誘導されるポリペプチドとして、本発明は特に上記のポリペプチド(Δ54)および(Δ４)に関し、これらの分子量は、それぞれ約37kDaと、約49kDaである。
【００９２】
上記のリパーゼ活性を有する酵素的に活性な組換えＤＧＬもしくは誘導されたポリペプチドは、上記のGargouriの方法によって測定されたリパーゼ活性を有し得る任意の組換えポリペプチドを意味すると理解される。
【００９３】
例示の方法により、本発明の組換えポリペプチドは、組換えポリペプチドの約10U/mg〜約1,000U/mg、好都合には約100U/mg〜約600U/mgのリパーゼ活性を有する。
【００９４】
本発明はより特定すると、タバコの葉もしくは種子の抽出物の精製により得られる組換えＤＧＬに関する。これらの葉もしくは種子は、形質転換されたタバコ植物を起源とし、それ自身は配列pd35S-RGLSP-DGLによって形質転換されたタバコ細胞から上記の方法により得られ、該組換えＤＧＬは上記のリパーゼ活性を有している。
【００９５】
本発明はまた、植物、特にナス科、例えば、形質転換されたタバコもしくはトマトの葉および／または種子および／または果実の酵素的抽出物の精製により得られたポリペプチド(Δ54)およびポリペプチド(Δ４)にも関する。この植物自体は、配列pd35S-PS-DGLもしくは配列pd35S-PPS-DGLもしくは配列pd35S-RGLSP-DGLにより形質転換された植物細胞から上記の方法により得られ、該組換えポリペプチド(Δ54)および(Δ４)は上記のリパーゼ活性を有している。
【００９６】
本発明はまた、タバコの種子もしくはアブラナの種子の酵素抽出物の精製により得られるポリペプチド(Δ54)にも関する。これらの種子は、それぞれ形質転換されたタバコ植物もしくはアブラナ植物を起源とし、それ自体は、それぞれ配列pCRU-PS-DGLもしくは配列pCRU-PPS-DGLによって形質転換されたタバコ細胞もしくはアブラナ細胞から上記の方法により得られ、この組換えポリペプチド(Δ54)は、上記のリパーゼ活性を有している。
【００９７】
本発明はまた、アブラナの種子の酵素抽出物の精製により得られるポリペプチド(Δ54)およびポリペプチド(Δ４)にも関する。これらの種子は、形質転換されたアブラナ植物を起源とし、それ自体は、それぞれ配列pGEA1-RGLSP-DGLおよび／または配列pGEA6-RGLSP-DGLによって形質転換されたアブラナ細胞から上記の方法により得られ、この組換えポリペプチド(Δ54)および(Δ４)は、上記のリパーゼ活性を有している。
【００９８】
本発明はまた、トウモロコシの種子の酵素抽出物の精製により得られるポリペプチド(Δ54)およびポリペプチド(Δ４)にも関する。これらの種子は、形質転換されたトウモロコシ植物を起源とし、それ自体は、それぞれ配列pAR-IAR-RGLSP-DGLおよび／または配列pγzeine-RGLSP-DGL、および／または配列pγzeine-RGLSP-DGL-KDELによって形質転換されたトウモロコシ細胞から上記の方法により得られ、この組換えポリペプチド(Δ54)および(Δ４)は、上記のリパーゼ活性を有している。
【００９９】
本発明のポリペプチド(Δ54)およびポリペプチド(Δ４)の見かけの分子量は、それぞれ、３７kDaと４９kDaであり、ポリアクリルアミドゲルによる分析およびニトロセルロースへの電気的転写（これらの方法は、以下の本発明の実施態様例で詳説する）後の免疫検出により測定された。
【０１００】
本発明は、本発明の組換えポリペプチドに対する抗体、そしてより特定すると、本発明の組換えＤＧＬに対する、および／または上記のポリペプチド(Δ54)に対するおよび／またはポリペプチド(Δ４)に対する抗体で、やはりＨＧＬを認識し得る抗体に関する。
【０１０１】
そのような抗体は、これらのペプチドで動物を免疫し、続いて形成された抗体を回収することにより得ることができる。
【０１０２】
この産生がポリクローナル抗体に制限されないことはいうまでもない。
【０１０３】
それは、動物の脾臓細胞から、特に、一方は本発明の精製されたポリペプチドの一つに対して免疫されたマウスもしくはラットと、他方は適切なミエローマの細胞から従来の方法により形成された任意のハイブリドーマで、動物の最初の免疫に用いられた上記のペプチドならびにＨＧＬを認識するモノクローナル抗体の生産能によって選択することができるハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体にも適用される。
【０１０４】
本発明はまた、本発明の形質転換された植物、植物の部分、植物細胞もしくは種子の、本発明の１つ（もしくはそれ以上）の組換えポリペプチド、例えば、組換えＤＧＬもしくは上記で定義したその誘導されたポリペプチドの、特に、本発明の上記の方法の一つを実施することによる調製のための使用に関し、該組換えポリペプチドは、実質的に純粋な形態であるか、もしくは上記で定義した酵素活性を有する植物抽出物中に含有される。
【０１０５】
本発明はまた、ヒトもしくは動物の食物、植物もしくは植物の部分の分野における、上記で定義した本発明の酵素活性のもしくは本発明の組換えポリペプチド、例えば、組換えＤＧＬもしくは上記で定義したその誘導されたポリペプチドの用途にも関する。
【０１０６】
本発明はより特定すると、本発明の酵素活性を有する植物もしくは植物の部分、特に葉、果実、種子の食物としての用途に関する。
【０１０７】
この点で、本発明はより特定すると、上記の酵素活性を有する植物もしくはこの植物の部分、特に葉もしくは果実、または後者により産生される種子を含む任意の食物に関し、それらは人間もしくは動物にとって食用に適した性質を有し得る。
【０１０８】
本発明はまた、上記の酵素活性を有する１つ（もしくはそれ以上）の植物および／またはこの（これらの）植物の部分、特に、この（これらの）植物の葉および／または種子および／または果実および／または上記の酵素活性を有する１つ（もしくはそれ以上）の植物抽出物および／または本発明の１つ（もしくはそれ以上）の組換えポリペプチドを含む任意の栄養組成物にも関し、適切ならば、１つ（もしくはそれ以上）の他の食用に適した化合物と組み合わせる。
【０１０９】
上記の栄養組成物に含まれる植物もしくは植物の部分は、好都合には、摩砕された物質の形態である。
【０１１０】
本発明の食物はまた、機能性食品とも呼ばれ、あるいは本発明の栄養組成物は、より特定すると、健康な個体もしくは胃腸および／または膵臓のリパーゼの産生レベルに影響を与えるかもしくは与えない１以上の病状を患っている個体によって摂取される動物性もしくは植物性の脂肪の吸収を容易にすることを意図している。この点で、本発明の食物もしくは栄養組成物は、好都合には、栄養補給物質として用いられる。
【０１１１】
本発明はまた、本発明の酵素活性を有する植物もしくは植物の部分、特に葉および／または果実および／または種子、もしくは植物細胞、あるいは上記で定義した酵素活性を有する植物抽出物、あるいは本発明の組換えポリペプチド、例えば、組換えＤＧＬもしくは上記で定義したその誘導されポリペプチドの、健康な個体もしくは胃腸および／または膵臓のリパーゼの産生レベルに影響を与えるかもしくは与えない１以上の病状を患っている個体によって摂取される動物性もしくは植物性の脂肪の吸収を容易にすることを意図した薬剤（もしくは医薬組成物）の調製のための用途にも関する。
【０１１２】
特に、そのような医薬組成物は、好都合には、脂肪の吸収の機構を変える医学的処置を受けている個体もしくは高齢者に対して用いられる。
【０１１３】
本発明の医薬組成物はまた、より特定すると、その生物中で不十分なリパーゼ（特に胃腸および／または膵臓のリパーゼ）に関連した病状、より特定すると、嚢胞性線維症、外分泌腺膵臓不全のような病状の処置を意図する。
【０１１４】
本発明は、特に、上記の酵素活性を有する１つ（もしくはそれ以上）の植物抽出物および／または１つ（もしくはそれ以上）の本発明の組換えポリペプチドを含み、適切ならば、薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせた任意の医薬組成物に関する。
【０１１５】
本発明はまた、特に、組換えＤＧＬおよび／またはポリペプチド(Δ54)および／またはポリペプチド(Δ４)を実質的に純粋な形態でもしくは上記の酵素抽出物の形態で含む、上記の医薬組成物に関する。
【０１１６】
本発明の医薬組成物は、好ましくは、経口で、特に、カプセル、錠剤もしくは希釈用の粉末の形態で投与され得るし、また投与される。
【０１１７】
ヒトの一日の用量は、好都合には、該医薬組成物が上記の酵素抽出物を含む場合には、約200mg〜約1,000mg、好ましくは主な食事時に配分され、該医薬組成物が実質的に純粋な形態の本発明の組換えポリペプチドを含む場合には約100mg〜約500mgである。
【０１１８】
本発明はまた、本発明の酵素活性を有する植物もしくは植物の部分、特に、葉および／または果実および／または種子、または植物細胞、または上記で定義した酵素活性を有する植物抽出物、または本発明の組換えポリペプチド、例えば、組換えＤＧＬもしくは上記で定義したその誘導されたポリペプチドを、工業の、農業栄養物の、もしくは農工業の分野、特に脂肪工業、脂肪化学もしくは牛乳工業で酵素反応を行うための用途に関する。
【０１１９】
この点で、本発明は、工業の、農業栄養物の、もしくは農工業の分野で、とくに脂肪工業、脂肪化学もしくは牛乳工業で、特に、酵素的生物変換もしくは生物触媒の、１以上の酵素反応を実施することによる任意の方法に関し、これらの酵素反応は、本発明の酵素活性を有する植物もしくは植物の部分、特に葉および／または果実および／または種子、あるいは、植物細胞、あるいは上記で定義した酵素活性を有する植物抽出物、あるいは本発明の組換えポリペプチド、例えば、組換えＤＧＬもしくは上記で定義したその誘導されたポリペプチドという手段により実施される。
【０１２０】
本発明は、特に、工業の、農業栄養物の、もしくは農工業用途を意図した酵素調製物に関し、それは上記の方法を実施することに用いることができ、上記で定義した１つ（もしくはそれ以上）の酵素活性を有する植物抽出物、および／または１つ（もしくはそれ以上）の本発明の組換えポリペプチド、特に組換えＤＧＬおよび／またはポリペプチド（Δ54）および／またはポリペプチド（Δ４）を、適切なら１つ（もしくはそれ以上）の添加剤もしくは上記の工業用途により用いられ得る他の酵素と組み合わせて含有する。
【０１２１】
本発明は、より特定すると、本発明の酵素活性を有する植物もしくは植物の部分、特に葉および／または果実および／または種子、あるいは植物細胞を、工業的規模で、酵素的生物変換反応もしくは生物触媒反応、例えば、酵素的加水分解もしくはトランスエステル化、を行わせるための用途に関する。
【０１２２】
本発明の酵素活性を有する植物もしくはこれらの植物の部分、特に葉および／または果実および／または種子、または植物細胞は、好都合には、酵素源としても反応基質としてもどちらでも用いられる。
【０１２３】
本発明はまた、本発明の酵素活性を有する植物、もしくはこれらの植物の部分、特に葉および／または果実および／または種子、または植物細胞、より特定すると、組換えＤＧＬおよび／またはポリペプチド（Δ54）および／またはポリペプチド（Δ４）を含有する植物、を用いる任意の生物触媒方法に関し、該植物もしくはその部分は、酵素源としても反応基質としてもどちらでも用いられる。
【０１２４】
本発明はより特定すると、本発明の酵素活性を有する植物もしくはこれらの植物の部分の生物燃料の調製のための用途に関する。
【０１２５】
この点で、本発明は、アルコール、特に、メタノールもしくはエタノールの、本発明の形質転換した植物の全部もしくは一部を摩砕した物質への添加、好ましくは、摩砕した物質は本発明の形質転換したアブラナ、ヒマワリ、もしくはダイズの種子のものであり、およびその生物燃料の回収、特に濾過による生物燃料の任意の調製方法に関する。
【０１２６】
本発明はまた、植物の脂肪酸のエステル、例えば、上記の方法を実施することにより得られるもの、特に、オレイン酸のメチルエステルに関する。
【０１２７】
本発明はまた、上記の方法を実施することにより得られる生物燃料に関し、より特定すると、植物の脂肪酸のエステルを含む上記の任意の生物燃料に関する。
【０１２８】
本発明はより特定すると、上記の方法をアブラナの種子に対して実施することにより得られる生物燃料で、オレイン酸のメチルエステルを含有するものに関する。
【０１２９】
本発明はまた、本発明の組換えポリペプチドに対する上記の抗体の、ＤＧＬもしくはＨＧＬを含み得る生物学的試料中のそれの検出方法もしくはアッセイを行うための用途に関する。
【０１３０】
本発明はより特定すると、これらの抗体の、生物中のリパーゼの過剰産生、もしくは反対の、不足、または産生の欠除に関連した病状のin vitro診断方法を行うための用途に関する。
【０１３１】
患者から採取した生物学的試料に対して行われるこのin vitro診断法は、この試料を本発明の１以上の抗体と一緒にする工程、それに続く先行工程中に形成された任意の抗体−ＨＧＬ複合体の検出の工程を包含する。
【０１３２】
この点で、本発明はまた、in vitro検出もしくは診断の上記の方法を行うための以下を含むキットにも関する：
−上記の抗体、好都合には、放射性にもしくは酵素的に標識されている、およびこれらの抗体とＨＧＬとの間の免疫反応を行うのに好ましい培地を構成する試薬、
−これらの抗体とＨＧＬとの間に形成された免疫学的複合体の検出を可能にする試薬。
【０１３３】
本発明は、より特定すると、一方で図４に示すｃＤＮＡであって図５に示すヒト胃リパーゼ(ＨＧＬ)をコードするｃＤＮＡ、もしくはこのｃＤＮＡから、特に１つ（もしくはそれ以上）のヌクレオチドの付加および／またはサプレッションおよび／または置換により誘導されるヌクレオチド配列であって、該誘導された配列はポリペプチドで、そのアミノ酸配列が図５に示すＨＧＬのそれと同一であるもの、または１つ（もしくはそれ以上）のアミノ酸の付加および／またはサプレッションおよび／または置換によりＨＧＬから誘導されるポリペプチドで、この誘導されたポリペプチドがリパーゼ活性をもつものをコードするもの、を含み、他方では、植物細胞が該ｃＤＮＡによって、もしくは上記の誘導された配列によってコードされるポリペプチドを産生するのを可能にする要素、特に植物の転写機構（より特定すると転写ターミネーターのＲＮＡポリメラーゼ）によって認識される転写プロモーターおよび転写ターミネーター、を含む組換えヌクレオチド配列の、これらの細胞もしくは後者から得られた植物から、活性な酵素の形態の組換えＤＧＬもしくは上記で定義した後者から誘導された１つ（もしくはそれ以上）のポリペプチドを得るための、植物細胞の形質転換のための用途に関する。
【０１３４】
この点で、本発明は、組換えＤＧＬの調製という観点による植物の形質転換における上記の任意の組換えヌクレオチド配列に関し、ここで、ヌクレオチド配列は、図１もしくは図３に示したＤＧＬをコードし、ＨＧＬをコードし図４に示されるヌクレオチド配列で置換される。
【０１３５】
本発明はより特定すると、以下の組換えヌクレオチド配列に関する：
−(pSP-HGLSP-HGLと呼ばれる)５’→３’方向に、Agrobacterium tumefaciensのpSPプロモーター、ＨＧＬのシグナルペプチドをコードする配列を含むもので、後者はすぐ後に図４に示すヌクレオチド配列、次いでCaMVのpolyA 35Sターミネーターが続いている、
−(pSP-HPLSP-HGLと呼ばれる)５’→３’方向に、Agrobacterium tumefaciensのpSPプロモーター、HPLのシグナルペプチドをコードする配列を含むもので、後者はすぐ後に図４に示すヌクレオチド配列、次いでCaMVのpolyA 35Sターミネーターが続いている、
−(pSP-RGLSP-HGLと呼ばれる)５’→３’方向に、Agrobacterium tumefaciensのpSPプロモーター、RGLのシグナルペプチドをコードする配列（上記）をふくむもので、後者はすぐ後に図４に示したヌクレオチド配列、次いでCaMVのpolyA 35Sターミネーターが続いている。
【０１３６】
本発明はまた、上記のような、ベクターおよびこれらのベクターで形質転換された細胞性宿主であって、ＨＧＬおよび／またはその誘導された配列をコードする上記の組換えヌクレオチド配列を含むものにも関する。
【０１３７】
本発明はまた、活性な酵素の形態の組換えＨＧＬおよび／または後者から、特に１つ（もしくはそれ以上）のアミノ酸の付加および／またはサプレッションおよび／または置換により誘導された１つ（もしくはそれ以上）のポリペプチドで、リパーゼの活性を有するものの調製のための任意の方法にも関し、以下を包含することを特徴とする：
−本発明の１つ（もしくはそれ以上）の組換えヌクレオチド配列がこれらの細胞のゲノムに組み込まれるような形質転換、
−適切なら、上記の形質転換された細胞からの形質転換された植物の生産、
−該細胞もしくは上記の形質転換された植物からの組換えＨＧＬおよび／または上記の誘導されたポリペプチドの、特に抽出および適切ならそれに続く精製による回収。
【０１３８】
本発明はさらに特定すると、図４に示す配列を含む上記の組換え配列を用いる組換えＤＧＬおよび／またはその誘導されたポリペプチドの生産にしたがった、組換えＨＧＬの上記の方法の実施による任意の生産方法に関する。
【０１３９】
本発明の方法を実施することにより得ることができる組換えＨＧＬから誘導されるポリペプチドのうち挙げられるのは：
−図５の74〜398位に位置するアミノ酸の範囲に限定されるポリペプチドで、ポリペプチド（Δ54HGL）とも呼ばれる、
−図５の24〜398位に位置するアミノ酸の範囲に限定されるポリペプチドで、ポリペプチド（Δ４HGL）とも呼ばれる。
【０１４０】
本発明はより特定すると、組換えＨＧＬおよび／またはポリペプチド（Δ54HGL）および／またはポリペプチド（Δ４HGL）の上記の調製方法に関し、以下を包含することを特徴とする：
−植物の葉の外植細胞の、後者を上記の組換えヌクレオチド配列pSP-HGLSP-HGLおよび／またはpSP-HPLSP-HGLおよび／またはpSP-RGLSP-HGLを含む上記のようなプラスミドにより形質転換されたAgrobacterium tumefaciensの株と適切な培養上清上で一緒にすることによる形質転換、
−カナマイシン含有培地上での形質転換外植片の選択、
−上記の形質転換外植片からの、後者の適切な培地上での培養による形質転換植物の生産、
−組換えＨＧＬおよび／またはポリペプチド（Δ54HGL）および／またはポリペプチド（Δ４HGL）の、特に、上記の形質転換された植物の葉および／または種子および／または果実を適切な緩衝液中での摩砕、遠心分離、および酵素活性を有する植物抽出物を構成する上清の回収による、抽出、
−適切な場合、先行工程の間に得られた抽出物からの、特に上清に対して行われるクロマトグラフィーによる、組換えＨＧＬおよび／またはポリペプチド（Δ54HGL）および／またはポリペプチド（Δ４HGL）の抽出、それにより組換えＨＧＬおよび／またはポリペプチド（Δ54HGL）および／またはポリペプチド（Δ４HGL）の調製物は実質的に純粋な形態となる。
【０１４１】
本発明はまた、そのゲノムに安定な方法で組み込まれた本発明の１つ（またはそれ以上）の上記の組換えヌクレオチド配列を含有する任意の植物もしくはこの植物の部分、特に葉および／または果実および／または種子に関する。
【０１４２】
本発明は、酵素活性、より特定すると以下で定義するリパーゼ活性を有する、上記の本発明の方法の一つを実施することにより調製され、活性な酵素として、本発明の１つ（またはそれ以上）の組換えポリペプチド、例えば、組換えＨＧＬおよび／またはポリペプチド（Δ54HGL）および／またはポリペプチド（Δ４HGL）を含む任意の植物抽出物に関する。
【０１４３】
本発明はより特定すると、植物の外植片を、配列pSP-HGLSP-HGLおよび／または配列pSP-HPLSP-HGLおよび／または配列pSP-RGLSP-HGLを用いる形質転換により上記の方法の一つにより得た植物の葉および／または種子の抽出物で、組換えＨＧＬおよび／またはポリペプチド（Δ54HGL）および／またはポリペプチド（Δ４HGL）を含むものに関する：特に
−上記の方法により配列pSP-HGLSP-HGL、または配列pSP-HPLSP-HGL、または配列pSP-RGLSP-HGLによるタバコの葉の外植細胞の形質転換によって得られ、かつポリペプチド（Δ54HGL）を、ポリペプチド（Δ４HGL）と組み合わせて含有するタバコの葉または種子の抽出物であって、これら２つのポリペプチドの混合物の、該抽出物中に存在するタンパク質の総重量に対する重量％は、約0.1％〜約20％であり、該抽出物の酵素活性は、FWの約100U/g〜約300U/gである、
−上記の方法により配列pSP-RGLSP-HGLによるタバコの葉の外植細胞の形質転換によって得られ、ポリペプチド（Δ４HGL）を含有するタバコの葉の抽出物で、このポリペプチドの、該抽出物中に存在するタンパク質の総重量に対する重量％は、約0.1％〜約20％であり、該抽出物の酵素活性は、FWの約100U/g〜約300U/gである。
【０１４４】
本発明はまた、任意の酵素的に活性な組換えＨＧＬで、そのアミノ酸配列は図５に示されているもの、特に１つ（またはそれ以上）のアミノ酸の付加および／またはサプレッションおよび／または置換により後者から誘導されるポリペプチド、より特定すると、ポリペプチド（Δ54HGL）および（Δ４HGL）に関し、これらの誘導されたポリペプチドはリパーゼ活性を有し、上記の本発明の方法の一つを実施することにより実質的に純粋な形態で得られるものであり、これらの方法は、本発明の組換えポリペプチドの、特に上記の酵素抽出物に対して行われるクロマトグラフィーによる、精製の工程を包含する。
【０１４５】
組換えＤＧＬについて先に記載したように、本発明はまた以下にも関する：
−本発明の組換えＨＧＬもしくはその誘導されたポリペプチドに対するポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、および上記のようなそれらの用途、
−工業的目的のための、上記の酵素活性を有する植物もしくは植物の部分、特に葉および／または果実および／または種子、または植物の細胞または抽出物、あるいはまた本発明のＨＧＬもしくはその誘導されたポリペプチドを基にした食物もしくは栄養組成物または医薬組成物、あるいは酵素調製物、
−本発明の組換えＨＧＬもしくはその誘導されたポリペプチド、または上記で定義した酵素活性を有する植物、または植物の部分、特に葉および／または果実および／または種子および／または植物抽出物から実施される、上記の任意の酵素的生物転換方法もしくは生物触媒、または生物燃料調製物。
【０１４６】
本発明は、上記の組換えヌクレオチド配列の調製および本発明の組換えポリペプチドを産生する形質転換された植物、および生物燃料の調製方法についての詳細な説明においてさらに説明される。
【０１４７】
１．イヌ胃リパーゼの組換えタンパク質をコードし、ナス科植物の葉および種子における発現を可能とするキメラ遺伝子の構築
Ｉ−Ａ）組換えＤＧＬをコードし、タバコにおける発現を可能とするキメラ遺伝子の構築
イヌ胃リパーゼ（ＤＧＬ）をコードする遺伝子の、タバコの葉および種子における発現には、以下の調節配列が必要である：
１．CaMV（カリフラワーモザイクウイルス）の二重構造プロモーター35S(pd35S)
これは、転写を活性化し、天然プロモーター35SのＴＡＴＡエレメントの上流に位置する配列の重複(dupulication)に対応するものである（Kay et al., 1987）。
２．転写終結配列であるターミネーターpolyA 35Sは、カリフラワーモザイクウイルスの配列の３’非コード領域に対応し、二本鎖環状ＤＮＡであって、転写物35Sを産生する(Franck et al., 1980)。
【０１４８】
組換えＤＮＡ技術を用いることによる各種プラスミドの構築(Sambrook et al., 1989)は、pBIOC４に由来する。このバイナリープラスミドは、pGA492（An, 1986）に由来し、これは、そのトランスファーＤＮＡ上の、左右の境界の間に、Agrobacterium tumefaciensのプラスミドpTiT37を起源とする以下の配列を有する：
ノパリンシンターゼをコードするnos遺伝子の構造プロモーター(Depicker et al., 1982)、つまりネオマイシンホスホトランスフェラーゼII(Berg and Berg, 1983)をコードするnptII遺伝子をコードする配列は、最初の８コドンの領域を欠失しており（その開始コドンはメチオニンＡＴＧである）、nos遺伝子をコードする配列の配列の最初の14コドンの配列(Depicker et al., 1982)、最初の14コドンの領域を失っているnos遺伝子をコードする配列、nosターミネーター(Depicker et al., 1982)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードするcat遺伝子に先行する多重クローニング部位（ポリリンカーとも呼ばれる）(HindIII-XbaI-SacI-HpaI-KpnI-ClaI-BglII)を含む領域(Close and Rodriguez, 1982)、およびAgrobacterium tumefaciens(Liu et al., 1993)のプラスミドpTiA6の遺伝子６の末端配列と融合している。cat遺伝子をコードするほぼすべての配列を除去するために、プラスミドpGA492を、SacI（ポリリンカーの制限部位）、そしてScaI（cat遺伝子の配列に存在する制限部位）により２回消化し、次に製造業者の指示にしたがって、酵素Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ(New England Biolabs)の作用に付した。改変プラスミド(20ng)の連結は、10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)１μl；酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)2.5Uを含む10μlの反応媒質中、14℃で16時間行った。あらかじめ受容能を持つようにしておいた細菌Escherichia coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)。テトラサイクリン12μg/mlで選択した、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)で抽出し、制限酵素による酵素消化により分析した。次に、保持されたクローンのプラスミドＤＮＡのHindIII制限部位を、リン酸化HindIII-EcoRIアダプターを用いて、EcoRI制限部位に改変した(Stratagene Cloning Systems)。この改変を行うために、保持されたクローンのプラスミドＤＮＡ500ngを、HindIIIにより消化し、製造業者の指示にしたがって、ウシ腸のアルカリホスファターゼ酵素（Boehringer Mannheim）により、脱リン酸化し、HindIII-EcoRI ＤＮＡアダプター1,500ng、1/10容量の３M酢酸ナトリウム（pH４．８）、および2.5容量の無水エタノールの存在下、−80℃で30分間、共沈させた。12,000gで30分間遠心分離した後、沈殿したＤＮＡを、70％エタノールで洗浄し、乾燥し、水８μlにとり、65℃で10分間保持し、次に10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)１μl、および酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)2.5Uの存在下、14℃で16時間連結させた。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを、65℃で10分間不活性化した後、連結反応混合物を、EcoRIで消化し、0.8％アガロースゲルを用いた電気泳動により精製し、電気溶出(electroelute)(Sambrook et al., 1989)し、1/10容量の３M酢酸ナトリウム（pH4.8）、および2.5容量の無水エタノールの存在下、−80℃で30分間沈殿させ、12,000gで30分間遠心分離し、70％エタノールで洗浄し、乾燥し、次に上述したように連結させた。あらかじめ受容能を持つようにしておいた細菌Escherichia coli DH5αを、形質転換した(Hanahan, 1983)。テトラサイクリン12μg/mlで選択した、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)で抽出し、特にHindIIIおよびEcoRIによる酵素消化により分析した。得られたバイナリープラスミドは、cat遺伝子をコードする配列の最後の９コドンを有しているのみであり、そのEcoRI部位が独自のものであり、pBIOC４と呼ぶことに���た。
【０１４９】
プロモーターpd35SとターミネーターpolyA 35Sからなる発現カセットを、プラスミドpJIT163Δを用いて単離した。プラスミドpJIT163Δは、プラスミドpJIT163から誘導したものであり、これ自身は、プラスミドpJIT60から誘導したものである(Guerineau and Mullineaux, 1993)。プラスミドpJIT163は、ポリリンカーのHindIIIとSalI部位との間にＡＴＧコドンを有している。このＡＴＧを抑制し、プラスミドpJIT163Δを得るために、プラスミドpJIT163DNAを、HindIIIおよびSalIで２回消化し、0.8％アガロースゲルによる電気泳動で精製し、電気溶出し(Sambrook et al., 1989)、1/10容量の３M酢酸ナトリウム（pH4.8）および2.5容量の無水エタノールの存在下、−80℃で30分間沈殿させ、12,000gで30分間遠心分離し、70％エタノールで洗浄し、乾燥し、製造業者の指示にしたがってKlenow酵素(New England Biolabs)の作用に付し、１容量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：１）、そして次に１容量のクロロホルム：イソアミルアルコール（24：１）による抽出で脱タンパク質し、1/10容量の３M酢酸ナトリウム（pH4.8）と、2.5容量の無水エタノールの存在下、−80℃で30分間沈殿させ、12,000gで30分間遠心分離し、70％エタノールで洗浄し、乾燥し、最後に10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)１μlと酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)2.5Uの存在下、14℃で16時間連結させた。あらかじめ受容能を持つようにしておいた細菌Escherichia coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)。アンピシリン50μg/mlで選択した、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)で抽出し、制限酵素による酵素消化で分析した。プロモーターpd35SとターミネーターpolyA 35S（SacI-XhoIフラグメント）からなる発現カセットを単離するために、保持されたクローンpJIT163ΔのプラスミドＤＮＡを、SacIおよびXhoIで消化した。発現カセットを有するSacI-XhoIフラグメントを、0.8％アガロースゲルによる電気泳動により精製し、電気溶出(Sambrook et al., 1989)し、1/10容量の３M酢酸ナトリウム（pH4.8）、そして2.5容量の無水エタノールの存在下、−80℃で30分間沈殿させ、12,000gで30分間遠心分離し、70％エタノールで洗浄し、乾燥し、次に製造業者の指示にしたがってMung Bean Nuclease酵素(New England Biolabs)の作用に付した。この精製した挿入物（200ng）を、EcoRIで消化しておいたpBIOC４のプラスミドＤＮＡ（20ng）にクローニングし、酵素Mung Bean Nucleaseにより処理し、製造業者の指示にしたがってウシ腸のアルカリホスファターゼ酵素(Boehringer Mannheim)により脱リン酸化した。連結反応は、20μl中、10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)２μl、50％ポリエチレングリコール8000 ２μl、および酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)５Uの存在下、14℃で16時間行った。あらかじめ受容能を持つようにしておいた細菌Escherichia coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)。テトラサイクリン12μl/mlで選択した、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)で抽出し、制限酵素による酵素消化により分析した。得られたプラスミドを、pBIOC21と呼ぶことにした。
【０１５０】
イヌ胃リパーゼ（ＤＧＬ）は、前駆体の形で天然に合成される。成熟ＤＧＬタンパク質は、379アミノ酸からなる。ＤＧＬの相補ＤＮＡを、国際出願No. WO 94/13816に記載されているように、発現ベクターpRU303のBglIIおよびSalI部位でクローニングして、ベクターpDGL5.303とした。これを、バイナリープラスミドpBIOC25（ＰＳ−ＤＧＬを含む）、およびpBIOC26（ＰＰＳ−ＤＧＬを含む）の構築のために用い、成熟ＤＧＬをコードする配列は、それぞれ植物由来のシグナルペプチド（ＰＳ）、またはプレプロペプチド（ＰＰＳ、つまりＮ−末端液胞指向配列(vacuole-directing sequence)が続くシグナルペプチド）をコードするそれによって先行されている。それぞれ23および37のアミノ酸からなるＰＳおよびＰＰＳ配列は、サツマイモの塊茎状根の貯蔵タンパク質、スポラミンＡの配列である(Murakami et al., 1986; Matsukoa and Nakamura, 1991)。
【０１５１】
成熟ＤＧＬの配列と、指向シグナル、ＰＳまたはＰＰＳのそれとの間の融合を簡略化するために、２個のオリゴデオキシヌクレオチド、5’caggagatc TTG TTT GGA AAG CTT CAT CCC 3’（プラスミド中に独自のBglII部位を含み、補助的HindIII部位を提供する）、および5’ CAT ATT CCT CAG CTG GGT ATC 3’（プラスミドに独自のPvuII部位を含む）を用いるＰＣＲによる突然変異により、成熟ＤＧＬ配列の４番目および５番目のコドンへ、補助的HindIII制限部位を導入することによって、プラスミドpDGL5.303を改変した。ＰＣＲによるBglII-PvuIIフラグメントの増幅は、10倍濃縮ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（500mMのＫＣｌ、100mMのTris-ＨＣｌ、pH9.0、および１％Triton x100）10μl、25mMのＭｇＣｌ２を６μl、10mMのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）３μl、上述の２種類のオリゴデオキシヌクレオチドそれぞれ100pM、マトリックスＤＮＡ（ＤＧＬの相補ＤＮＡを含む発現ベクターpRU303）５ng、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(Promega)2.5U、そしてワセリン油２滴を含む反応媒質100μl中で行った。ＤＮＡは、94℃で５分間変性し、30サイクル（それぞれ、94℃での変性１分間、50℃でのハイブリダイゼーション１分間、72℃での伸長１分間からなる）に付し、次に72℃での伸長を５分間続けた。このＰＣＲ反応を、Perkin Elmer Cetusの「DNA Thermal Cycler」機中で行った。クロロホルムで抽出することによって、油状物を除去した。次に、反応媒質中に含まれるＤＮＡフラグメントを、1/10容量の３M酢酸ナトリウム（pH4.8）、そして2.5容量の無水エタノールの存在下、−80℃で30分間、沈殿させ、12,000gで30分間遠心分離し、70％エタノールで洗浄し、乾燥し、２種類の制限酵素、BglIIおよびPvuIIで消化させた。ＰＣＲに由来する消化されたＤＮＡフラグメントを、２％アガロースゲルによる電気泳動により精製し、電気溶出し(Sambrook et al., 1989)、1/10容量の３M酢酸ナトリウム（pH4.8）および2.5容量の無水エタノールの存在下、−80℃で30分間沈殿させ、12,000gで30分間遠心分離し、70％エタノールで洗浄し、乾燥し、そしてBglIIおよびPvuIIにより２回消化させ、0.8％アガロースゲルによる電気泳動により精製し、電気溶出し、アルコール中での沈殿に付し、乾燥し、製造業者に指示にしたがってウシ腸のアルカリホスファターゼ酵素(Boehringer Mannheim)により脱リン酸化しておいたベクターpDGL5.303のプラスミドＤＮＡに連結した。連結は、上述の脱リン酸化ベクター100ng、および上述したＰＣＲによる増幅に由来する消化されたＤＮＡフラグメント50ngにより、反応媒質10μl中、10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)１μl、および酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)2.5Uの存在下、14℃で16時間行った。あらかじめ受容能を持つようにしておいた細菌Escherichia coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)。アンピシリン50μg/mlで選択した、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)で抽出し、制限酵素による酵素消化で分析した。保持されたいくつかのクローンのプラスミドＤＮＡを、Ｔ７TM配列決定キット(Pharmacia社販売)による配列決定により、ジデオキシヌクレオチド法(Sanger et al.,1977)により確認した。このHindIII制限部位の導入によっても、ＤＧＬの遺伝子コードは改変されない。実際、天然ＤＧＬ配列であるAAA TTA(Lys-Leu)は、AAG CTT(Lys-Leu)になる。得られたプラスミドは、pBIOC22と呼ぶことにし、以下に対応する成熟ＤＧＬタンパク質の配列を含んでいる：
【０１５２】
【表１】
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【０１５３】
ａ．ＰＳ−ＤＧＬを含むバイナリープラスミドpBIOC25の構築
成熟ＤＧＬタンパク質のポリペプチドLeu-Phe-Gly-Lys（最初の４アミノ酸）をコードする配列を抑制するために、プラスミドpBIOC22を、全体的にはBglIIにより、部分的にはHindIIIにより、消化させた。この配列を、成熟ＤＧＬタンパク質をコードする配列の最初の４コドンのそれと融合した、２３アミノ酸 のシグナルペプチドＰＳをコードする配列（ATG AAA GCC TTC ACA CTC GCT CTC TTC TTA GCT CTT TCC CTC TAT CTC CTG CCC AAT CCA GCC CAT TCC)と置換した（ＰＳ−成熟ＤＧＬの最初の４コドン）。配列、「ＰＳ−成熟ＤＧＬの最初の４コドン」を、プラスミドpMAT103（Matsuoka and Nakamura, 1991）を用いたＰＣＲにより、２個の以下のオリゴデオキシヌクレオチド、5’caggagatctg ATG AAA GCC TTC ACA CTC GC3’および5’G ATG AAG CTT TCC AAA CAA GGA ATG GGC TGG ATT GGG CAG G3’により、段落Ｉに上述したＰＣＲ増幅のプロトコールにしたがって、増幅した。ＢＧｌIIおよびHindIIIによる二重酵素消化の後、ＰＣＲ増幅に由来するＤＮＡフラグメントを、２％アガロースゲルによる電気泳動により精製し、電気溶出し(Sambrook et al., 1989)、1/10容量の３M酢酸ナトリウム（pH4.8）および2.5容量の無水エタノールの存在下、−80℃で30分間沈殿させ、12,000gで30分間遠心分離し、70％エタノールで洗浄し、乾燥し、そしてBglIIおよびHindIIIにより二重に消化させ、0.8％アガロースゲルによる電気泳動により精製し、電気溶出し(Sambrook et al., 1989)、アルコールによる沈殿に付し、乾燥し、製造業者に指示にしたがってウシ腸のアルカリホスファターゼ酵素(Boehringer Mannheim)により脱リン酸化しておいたpBIOC22のプラスミドＤＮＡに連結した。連結は、上述の脱リン酸化ベクター100ng、および上述したＰＣＲ増幅に由来する消化されたＤＮＡフラグメント50ngにより、反応媒質10μl中、10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)１μl、および酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)2.5Uの存在下、14℃で16時間行った。あらかじめ受容能を持つようにしておいた細菌Escherichia coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)。アンピシリン50μg/mlで選択した、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)で抽出し、制限酵素による酵素消化で分析した。保持されたいくつかのクローンのプラスミドＤＮＡを、Ｔ７TM配列決定キット(Pharmacia社販売)による配列決定により、ジデオキシヌクレオチド法(Sanger et al.,1977)により確認した。ＰＳおよび成熟ＤＧＬの配列を、そのオープンリーディングフレームを保持しながら、クローニングした。ＰＳおよび成熟ＤＧＬの配列の間の開裂配列は、Ser-Leuである。得られたプラスミドを、pBIOC23と呼ぶことにした。pBIOC23から出発して、ＰＳ−ＤＧＬの配列を有するBglII-XbaIフラグメントを、BglIIおよびXbaIによる二重酵素消化、0.8％アガロースゲルによる電気泳動による精製、電気溶出(Sambrook et al., 1989)、アルコールによる沈殿、そして乾燥により単離した。次に、このＤＮＡフラグメントを、製造業者の指示にしたがってKlenow酵素で処理し、そしてHindIII部位において消化し、Klenowで処理し、製造業者の指示にしたがって、ウシ腸のアルカリホスファターゼ酵素（Boehringer Mannheim）により脱リン酸化しておいたpBIOC21のプラスミドＤＮＡに連結した。連結は、上述の脱リン酸化ベクター20ng、および上述したＰＳ−ＤＧＬを含有するＤＮＡフラグメント200ngにより、反応媒質20μl中、10倍濃縮Ｔ４ＤＮ��リガーゼ緩衝液(Amersham)２μl、50％ポリエチレングリコール8000 ２μl、および酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)５Uの存在下、14℃で16時間行った。あらかじめ受容能を持つようにしておいた細菌Escherichia coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)。テトラサイクリン12μg/mlで選択した、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)で抽出し、制限酵素による酵素消化で分析した。得られたクローンを、pBIOC25と呼ぶことにした。組換えタンパク質ＰＳ−ＤＧＬをコードするフラグメントのヌクレオチド配列は、Ｔ７TM配列決定キット(Pharmacia社販売)による配列決定により、ジデオキシヌクレオチド法(Sanger et al.,1977)により確認した。バイナリーベクターpBIOC25のプラスミドＤＮＡを、Holsters et al.,(1978)の方法にしたがって、Agrobacterium tumefaciensのLBA4404株に直接形質転換により、導入した。保持されたクローンの有効性を、導入されたプラスミドＤＮＡの酵素消化により確認した。
【０１５４】
ｂ．ＰＰＳ−ＤＧＬを含有するバイナリープラスミドpBIOC26の構築
成熟ＤＧＬタンパク質のポリペプチドLeu-Phe-Gly-Lysをコードする配列を抑制するために、プラスミドpBIOC２２を、全体的にはBglIIにより、部分的にはHindIIIにより、消化させた。この配列を、成熟ＤＧＬタンパク質の最初の４コドンのそれと融合した、37のアミノ酸 のシグナルペプチドＰＰＳをコードする配列(ATG AAA GCC TTC ACA CTC GCT CTC TTC TTA GCT CTT TCC CTC TAT CTC CTG CCC AAT CCA GCC CAT TCC AGG TTC AAT CCC ATC CGC CTC CCC ACC ACA CAC GAA CCC GCC)と置換した（ＰＰＳ−成熟ＤＧＬの最初の４コドン）。配列、「ＰＰＳ−成熟ＤＧＬの最初の４コドン」を、プラスミドｐＭＡＴ１０３(Matsuoka and Nakamura, 1991)を用いたＰＣＲにより、２個の以下のオリゴデオキシヌクレオチド、5’caggagatctgATG AAA GCC TTC ACA CTC GC3’および5’G ATG AAG CTT TCC AAA CAA GGC GGG TTC GTG TGT GGT TG 3’により、段落Ｉに上述したＰＣＲ増幅のプロトコールにしたがって、増幅した。BglIIおよびHindIIIによる二重酵素消化の後、ＰＣＲ増幅に由来するＤＮＡフラグメントを、２％アガロースゲルによる電気泳動により精製し、電気溶出し(Sambrook et al., 1989)、1/10容量の３M酢酸ナトリウム（pH4.8）および2.5容量の無水エタノールの存在下、−80℃で30分間沈殿させ、12,000gで30分間遠心分離し、70％エタノールで洗浄し、乾燥し、そしてBglIIおよびHindIIIにより二重消化させ、0.8％アガロースゲルによる電気泳動により精製し、電気溶出し、アルコールによる沈殿に付し、乾燥し、製造業者の指示にしたがってウシ腸のアルカリホスファターゼ酵素（Boehringer Mannheim）により脱リン酸化しておいたpBIOC22のプラスミドＤＮＡに連結した。連結は、上述の脱リン酸化ベクター100ng、および上述したＰＣＲ増幅に由来する消化されたＤＮＡフラグメント50ngにより、反応媒質10μl中、10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)１μl、および酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)2.5Uの存在下、14℃で16時間行った。あらかじめ受容能を持つようにしておいた細菌Escherichia coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)。アンピシリン50μg/mlで選択した、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)で抽出し、制限酵素による酵素消化で分析した。
【０１５５】
保持されたいくつかのクローンのプラスミドＤＮＡを、Ｔ７TM配列決定キット(Pharmacia社販売)による配列決定により、ジデオキシヌクレオチド法(Sanger et al., 1977)により確認した。ＰＰＳおよび成熟ＤＧＬの配列を、そのオープンリーディングフレームを保持しながら、クローニングした。この２つの配列の間の開裂配列は、Ala-Leuである。得られたプラスミドを、pBIOC24と呼ぶことにした。pBIOC24から出発して、ＰＰＳ−ＤＧＬの配列を有するBglII-XbaIフラグメントを、BglIIおよびXbaIによる二重酵素消化により単離し、0.8％アガロースゲルによる電気泳動により精製し、電気溶出し(Sambrook et al., 1989)、アルコールにより沈殿させ、そして乾燥した。次に、このＤＮＡフラグメントを、製造業者の指示にしたがってKlenow酵素で処理し、そしてHindIII部位において消化し、Klenowで処理し、製造業者の指示にしたがって、ウシ腸のアルカリホスファターゼ酵素(Boehringer Mannheim)により脱リン酸化しておいたpBIOC21のプラスミドＤＮＡに連結した。連結は、上述の脱リン酸化ベクター20ng、および上述したＰＰＳ−ＤＧＬを含有するＤＮＡフラグメント200ngにより、反応媒質20μl中、10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)２μl、50％ポリエチレングリコール8000 ２μl、および酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)５Uの存在下、14℃で16時間行った。あらかじめ受容能を持つようにしておいた細菌Escherichia coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)。テトラサイクリン12μg/mlで選択した、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)で抽出し、制限酵素による酵素消化で分析した。得られたクローンを、pBIOC26と呼ぶことにした。組換えタンパク質ＰＰＳ−ＤＧＬをコードするフラグメントのヌクレオチド配列は、Ｔ７TM配列決定キット(Pharmacia社販売)による配列決定により、ジデオキシヌクレオチド法(Sanger et al., 1977)により確認した。バイナリーベクターpBIOC26のプラスミドＤＮＡを、Holsters et al., (1978)の方法にしたがって、Agrobacterium tumefaciensのLBA4404株に直接形質転換により、導入した。得られたクローンの有効性を、導入されたプラスミドＤＮＡの酵素消化により確認した。
【０１５６】
ｃ．ＲＧＬＳＰ−ＤＧＬを含有するバイナリープラスミドpBIOC41の構築
ウサギ胃リパーゼを、ＮＨ２−末端に位置し、成熟リパーゼのポリペプチド配列に先行する22アミノ酸のシグナルペプチドからなる前駆体の形で、合成した。ウサギ胃リパーゼをコードする完全ｃＤＮＡを含むクローンpJO101は、「Institut de Recherche Jouveinal」により1992年11月12日出願の、「ウサギ胃リパーゼおよびペプチド誘導体をコードする核酸、これらのポリペプチド産生のためのそれらの用途、および後者に基づく医薬組成物」という名称の欧州特許出願No. 92 403 055.4に記載されている。
【０１５７】
イヌ胃リパーゼのポリペプチド配列と、ウサギ胃リパーゼ前駆体のそれを並べることにより、ＬＦＧＫの配列は、２つのタンパク質に存在することが証明されている。精製天然タンパク質（Moreau et al., 1988）から決定されたウサギリパーゼのポリペプチド配列においては、最初の３つの残基、Ｌ、Ｆ、およびＧが存在せず、ＲＧＬの22アミノ酸のシグナルペプチドの部分を形成している。その結果、これらの３つの共通するアミノ酸を欠いたウサギ胃リパーゼのシグナルペプチドを、イヌ胃リパーゼの成熟タンパク質配列と融合させた。そのポリペプチド配列は、以下の19アミノ酸からなる：ＭＷＶＬＦＭＶＡＡＬＬＳＡＬＧＴＴＨＧ。
【０１５８】
成熟ＤＧＬタンパク質のポリペプチドLeu-Phe-Gly-Lys（最初の４アミノ酸）をコードする配列を抑制するために、プラスミドpBIOC22を、全体的にはBglIIにより、部分的にはHindIIIにより、消化させた。この配列を、成熟ＤＧＬタンパク質の最初の４コドンのそれと融合した、19アミノ酸 のウサギ胃リパーゼのシグナルペプチドＲＧＬＳＰをコードする配列(ATG TGG GTG CTT TTC ATG GTG GCA GCT TTG CTA TCT GCA CTT GGA ACT ACA CAT GGT)と置換した（「ＲＧＬＳＰ−成熟ＤＧＬの最初の４コドン」）。配列、「ＲＧＬＳＰ−成熟ＤＧＬの最初の４コドン」を、プラスミドpJO101を用いたＰＣＲにより、２個の以下のオリゴデオキシヌクレオチド、5’aggagatctcaacaATG TGG GTG CTT TTC ATG GTG 3’および5’G ATG AAG CTT TCC AAA CAA ACC ATG TGT AGT TCC AAG TG 3’により、段落Ｉに上述したＰＣＲ増幅のプロトコールにしたがって、増幅した。BglIIおよびHindIIIによる二重酵素消化の後、ＰＣＲ増幅に由来するＤＮＡフラグメントを、２％アガロースゲルによる電気泳動により精製し、電気溶出し(Sambrook et al.,1989)、1/10容量の３M酢酸ナトリウム（pH4.8）および2.5容量の無水エタノールの存在下、−80℃で30分間沈殿させ、12,000gで30分間遠心分離し、70％エタノールで洗浄し、乾燥し、そしてBglIIおよびHindIIIにより二重に消化させ、0.8％アガロースゲルによる電気泳動により精製し、電気溶出し(Sambrook et al., 1989)、アルコールによる沈殿に付し、乾燥し、製造業者の指示にしたがってウシ腸のアルカリホスファターゼ酵素(Boehringer Mannheim)により脱リン酸化しておいたpBIOC22のプラスミドＤＮＡに連結した。連結は、上述の脱リン酸化ベクター100ng、および上述したＰＣＲ増幅に由来する消化されたＤＮＡフラグメント50ngにより、反応媒質10μl中、10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)１μl、および酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)2.5Uの存在下、14℃で16時間行った。あらかじめ受容能を持つようにしておいた細菌Escherichia coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)。アンピシリン50μg/mlを含有する培地で選択した、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)で抽出し、制限酵素による酵素消化で分析した。保持されたいくつかのクローンのプラスミドＤＮＡを、Ｔ７TM配列決定キット(Pharmacia社販売)による配列決定により、ジデオキシヌクレオチド法(Sanger et al.,1977)により確認した。ＲＧＬＳＰおよび成熟ＤＧＬの配列を、そのオープンリーディングフレームを保持しながら（つまり、これらが独自のオープンリーディングフレームを構成するように）、クローニングした。ＲＧＬＳＰの配列と成熟ＤＧＬの配列の間の開裂配列は、Gly-Leuである。得られたプラスミドを、pBIOC40と呼ぶことにした。pBIOC40から出発して、ＲＧＬＳＰＳ−ＤＧＬの配列を有するBglII-XbaIフラグメントを、BglIIおよびXbaIによる二重酵素消化、0.8％アガロースゲルによる電気泳動による精製、電気溶出(Sambrook et al., 1989)、アルコールによる沈殿、そして乾燥により単離した。次に、このＤＮＡフラグメントを、製造業者の指示にしたがってKlenow酵素で処理し、そしてHindIII部位において消化し、Klenowで処理し、製造業者の指示にしたがって、ウシ腸のアルカリホスファターゼ酵素（Boehringer Mannheim）により脱リン酸化しておいたpBIOC21のプラスミドＤＮＡに連結した。連結は、上述の脱リン酸化ベクター20ng、および上述したＲＧＬＳＰ−ＤＧＬを含有するＤＮＡフラグメント200ngにより、反応媒質20μl中、10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)２μl、50％ポリエチレングリコール8000 ２μl、および酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)５Uの存在下、14℃で16時間行った。あらかじめ受容能を持つようにしておいた細菌Escherichia coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)。テトラサイクリン12μg/mlを含む培地で選択した、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)で抽出し、制限酵素による酵素消化により分析した。得られたクローンを、pBIOC41と呼ぶことにした。組換えタンパク質ＲＧＬＳＰ−ＤＧＬをコードするフラグメントのヌクレオチド配列は、Ｔ７TM配列決定キット(Pharmacia社販売)による配列決定により、ジデオキシヌクレオチド法(Sanger et al.,1977)により確認した。バイナリーベクターpBIOC41のプラスミドＤＮＡを、Holsters et al., (1978)の方法にしたがって、Agrobacterium tumefaciensのLBA4404株に直接形質転換により、導入した。保持されたクローンの有効性を、導入されたプラスミドＤＮＡの酵素消化により確認した。
【０１５９】
Ｉ−Ｂ）組換えＤＧＬをコードし、トマトにおける発現を可能とするキメラ遺伝子の構築
ここで使用する構築物は、タバコの遺伝的形質転換に使用したものと同じであり、つまりプラスミドpBIOC25、pBIOC26、およびpBIOC41である。
【０１６０】
II．イヌ胃リパーゼの組換えタンパク質をコードし、アブラナ種子における発現を可能とするキメラ遺伝子の構築
ａ）プロモーターｐＣＲＵを含有するバイナリープラスミドpBIOC28の構築
アブラナ種子におけるイヌ胃リパーゼ（ＤＧＬ）の発現には、以下の調節配列の間に、ＤＧＬをコードするｃＤＮＡの挿入が必要であった；
１．種子の貯蔵タンパク質、ラディッシュのクルシフェリンＡ(Cruciferin A)(Depigny-This et al.,1992)の遺伝子の５’非コード領域に対応し、種子における特異的な発現を可能とするプロモーターpCRU；
２．転写終結配列である二本鎖環状ＤＮＡのターミネーターpolyA 35S（カリフラワーモザイクウイルスの配列の３’非コード領域に対応する）（これは、転写物35Sを産生する）（Franck et al., 1980）
【０１６１】
pBIOC21に似ているが、プロモーターpd35Sが、プロモーターpCRUに置換されているバイナリープラスミドを得るために、プロモーターpCRUを含有する、「Klenowで処理されたEcoRI-BamHI」フラグメントを、pBI221(Depigny-This et al., 1992により販売)から誘導したプラスミド、pBI221-CRURSPを用いて単離した。プラスミドpBI221-CRURSPは、pBI221（Clontechにより販売）から、プロモーター35Sを、プロモーターpCRUで置換することによって、誘導する。
【０１６２】
プロモーターpCRUを有するフラグメント「Klenowで処理されたEcoRI-BamHI」は、0.8％アガロースゲルによる電気泳動により精製し、電気溶出し(Sambrook et al., 1989)、アルコールによる沈殿に付し、乾燥し、そして次に、製造業者の指示にしたがってＴ４ＤＮＡポリメラーゼ(New England Biolabs)で処理し、BamHIで消化し、0.8％アガロースゲルによる電気泳動で精製し、電気溶出し(Sambrook et al.,1989)、アルコールによる沈殿に付し、乾燥し、製造業者の指示にしたがってウシ腸のアルカリホスファターゼ酵素(Boehringer Mannheim)により脱リン酸化した、KpnIで消化したpJIT163（段落Ｉに記載されたような）のプラスミドＤＮＡに連結した。連結は、上述の脱リン酸化ベクター20ng、および上述した「Klenowで処理されたEcoRI-BamHI」のＤＮＡフラグメント200ngにより、反応媒質20μl中、10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)２μl、50％ポリエチレングリコール8000 ２μl、および酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)５Uの存在下、14℃で16時間行った。あらかじめ受容能を持つようにしておいた細菌Escherichia coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)。アンピシリン50μg/mlを含む培地で選択した、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)で抽出し、制限酵素による酵素消化により分析した。得られたプラスミドを、pBIOC27と呼ぶことにした。
【０１６３】
プロモーターpCRUとターミネーターpolyA 35Sからなる発現カセットを、pBIOC27を用い、XhoIによる全体的消化、続いてEcoRIによる部分的消化により単離した。これを、0.8％アガロースゲルによる電気泳動により精製し、電気溶出し(Sambrook et al.,1989)、アルコールによる沈殿に付し、乾燥し、製造業者の指示にしたがってKlenow(New England Biolabs)で処理し、そしてEcoRI部位でKlenowで処理された、製造業者の指示にしたがってウシ腸アルカリホスファターゼ酵素(Boehringer Mannheim)で脱リン酸化されたpBIOC24のプラスミドＤＮＡに連結した。連結は、上述の脱リン酸化ベクター20ng、および上述したＤＮＡフラグメントXho-I-EcoRI 200ngにより、反応媒質20μl中、10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)２μl、50％ポリエチレングリコール8000 ２μl、および酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)５Uの存在下、14℃で16時間行った。あらかじめ受容能を持つようにしておいた細菌Escherichia coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)。テトラサイクリン12μg/mlを含む培地で選択した、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)で抽出し、制限酵素による酵素消化により分析した。得られたプラスミドを、pBIOC28と呼ぶことにした。
【０１６４】
ｂ．ＰＰＳ−ＤＧＬを含有するバイナリープラスミドpBIOC29の構築
pBIOC24を用いた、配列ＰＰＳ−ＤＧＬを有するBglII-XbaIフラグメントの単離は、Ｉ−Ａ−ｂに既に記載されている。Klenowで処理されたEcoRI部位で、製造業者の指示にしたがってウシ腸のアルカリホスファターゼ酵素(Boehringer Mannheim)で脱リン酸化した、pBIOC28のプラスミドＤＮＡに、このフラグメントを連結した。連結は、上述の脱リン酸化ベクター20ng、およびＰＰＳ−ＤＧＬを含有するＤＮＡフラグメントBglII-XbaI 200ngにより、反応媒質20μl中、10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)２μl、50％ポリエチレングリコール8000 ２μl、および酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)５Uの存在下、14℃で16時間行った。あらかじめ受容能を持つようにしておいた細菌Escherichia coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)。テトラサイクリン12μg/mlを含む培地で選択した、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)で抽出し、制限酵素による酵素消化により分析した。得られたプラスミドを、pBIOC29と呼ぶことにした。組換えタンパク質ＰＰＳ−ＤＧＬのヌクレオチド配列は、Ｔ７TM配列決定キット(Pharmacia社販売)による配列決定により、ジデオキシヌクレオチド法(Sanger et al., 1977)により確認した。バイナリーベクターpBIOC29のプラスミドＤＮＡを、Holsters et al. (1978)の方法にしたがって、Agrobacterium tumefaciensのLBA4404株に直接形質転換により、導入した。保持されたクローンの有効性を、導入されたプラスミドＤＮＡの酵素消化により確認した。
【０１６５】
ｃ）pGEA1Dプロモーターを含有するバイナリープラスミドpBIOC90およびpBIOC91の構築
アブラナ種子におけるイヌ胃リパーゼ（ＤＧＬ）をコードする動物遺伝子の発現には、以下の調節配列が必要であった：
１．種子の貯蔵タンパク質の遺伝子、Arabidopsis thaliana(Gaubier et al.,1993)のGEA1の５’非コード領域に対応し、種子における特異的発現を可能とするプロモーターpGEA1、；
２．転写終結配列である二本鎖環状ＤＮＡのターミネーターpolyA 35S（カリフラワーモザイクウイルスの配列の３’非コード領域に対応する）（これは、転写物35Sを産生する）（Franck et al., 1980）。
【０１６６】
pBIOC21に似ているが、プロモーターpd35Sが、プロモーターpGEA1Dに置換されている、バイナリープラスミドpBIOC90を得るために、プロモーターpGEA1を含有する、HindIII-Klenowで処理されたBamHIフラグメントを、プラスミドpGUS2-pGEA1を用いて単離した。pBI221から、プロモーターｐ35SをプロモーターpGEA1で置換することによって誘導されたクローンpGUS-2-pGEA1は、フレーム中に、２つのＡＴＧを含んでいる：遺伝子GEA1(Em2)のＡＴＧと、gus遺伝子のＡＴＧである。GEA1遺伝子のＡＴＧを、破壊した。次に、クローンpGUS-2-pGEA1のGEA1遺伝子のSalI部位と、ＡＴＧから上流にある配列の間に含まれるＤＮＡフラグメントを、２種類のオリゴヌクレオチド(5’CAAACGTGTACAATAGCCC 3’および5’CCCGGGGATCCTTTTTTG3’)を用いてＰＣＲにより増幅した。ハイブリダイゼーション温度は、調節した。ＰＣＲにより増幅したフラグメントを、SalIおよびBamHIで消化し、２％アガロースゲルによる電気泳動で精製し、電気溶出し（Sambrook et al. 1989）、1/10容量の３M酢酸ナトリウム（pH4.8）および2.5容量の無水エタノールの存在下、−80℃で30分間沈殿させ、12,000gで30分間遠心分離し、70％エタノールで洗浄し、そしてSalIおよびBamHIにより二重消化し、0.8％アガロースゲルによる電気泳動により精製し、電気溶出し(Sambrook et al.1989)、アルコールによる沈殿に付し、乾燥しておいたpGUS-2-GEA1のプラスミドＤＮＡに連結した。連結は、ベクター100ng、および上述したＰＣＲ増幅に由来する消化されたＤＮＡフラグメント50ngにより、反応媒質10μl中、10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)１μl、および酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)2.5Uの存在下、14℃で16時間行った。あらかじめ受容能を持つようにしておいた細菌Escherichia coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)。アンピシリン50μg/mlで選択した、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)で抽出し、制限酵素による酵素消化で分析した。保持された特定のクローンを、Ｔ７TM配列決定キット(Pharmacia社販売)による配列決定により、ジデオキシヌクレオチド法(Sanger et al.,1977)により確認した。得られたクローンを、pGUS-2-pGEA1Dと呼ぶことにした。
【０１６７】
pGUS-2-pGEA1Dから単離し、製造業者(Biolabs)の指示にしたがってKlenow処理した、プロモーターpGEA1Dを有する、HindIII-BamHIフラグメントを、0.8％アガロースゲルによる電気泳動により精製し、電気溶出し(Sambrook et al. 1989）、アルコールによる沈殿に付し、乾燥し、そして製造業者の指示にしたがって酵素Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ(Biolabs)で処理したKpnIおよびHINDIII部位でpBIOC21のプラスミドＤＮＡに連結した。連結は、脱リン酸化したpBIOC21 20ng、および上述したXhoI-EcoRI ＤＮＡフラグメント200ngにより、反応媒質20μl中、10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)２μl、50％ポリエチレングリコール8000 ２μl、および酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)５Uの存在下、14℃で16時間行った。あらかじめ受容能を持つようにしておいた細菌Escherichia coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)。テトラサイクリン12μg/mlで選択した、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)で抽出し、制限酵素による酵素消化で分析した。得られたプラスミドを、pBIOC90と呼ぶことにした。
【０１６８】
バイナリープラスミドpBIOC91を得るために、pBSII-pGEA1Dより単離した発現カセット「pGEA1D-tNOS」を、バイナリープラスミドpSCV1.2に導入した。これ自体は、（Fromm et al. (1986)）に記載の発現カセット「ｐ35S-nptII-tNOS」を有するHindIIIフラグメントを、Edwards G.A.によって1990年に構築されたpSCV1のHindIII部位に、通常のクローニング操作の後にクローニングすることによって得られた。
【０１６９】
プラスミドpBSII-pGEA1Dは、２つの段階で得られた；
−一方では、製造業者の指示にしたがって酵素Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（Biolabs）で処理し、精製した、Agrobacterium tumefaciensのtNOS（ノパリンシンターゼの遺伝子のターミネーター）を有するSacI-EcoRIフラグメントを、製造業者の指示にしたがってウシ腸のアルカリホスファターゼ酵素(Boehringer Mannheim)によって脱リン酸化したpBSIISK+（Stratageneにより販売）のEcoRV部位にクローニングした。連結は、脱リン酸化ベクター20ng、および上述のtNOSを含有するＤＮＡフラグメント200ngにより、反応媒質20μl中、10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)２μl、50％ポリエチレングリコール8000 ２μl、および酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)５Uの存在下、14℃で16時間行った。あらかじめ受容能を持つようにしておいた細菌Escherichia coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)。アンピシリン50μg/mlで選択した、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)で抽出し、制限酵素による酵素消化で分析した。保持された特定のクローンを、Ｔ７TM配列決定キット(Pharmacia社販売)による配列決定により、ジデオキシヌクレオチド法(Sanger et al.,1977)により確認した。得られたプラスミドを、pBSII-tNOSと呼ぶことにした。
【０１７０】
−他方、酵素Klenowで処理したHindIIIおよびBamHIで二重消化し、精製したpGEA1Dを有するフラグメントを、プラスミドpBSII-tNOSの「Klenowで処理したXbaIおよびBamHI」部位においてクローニングした。連結は、上述のベクター100ng、および上述のＤＮＡフラグメント50ngにより、反応媒質10μl中、１０倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)１μl、および酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)2.5Uの存在下、14℃で16時間行った。あらかじめ受容能を持つようにしておいた細菌Escherichia coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)。アンピシリン50μg/mlで選択した、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)で抽出し、制限酵素による酵素消化で分析した。得られたプラスミドを、pBSII-pGEA1Dと呼ぶことにした。
【０１７１】
次に、Klenowで処理されたXbaI-HindIIIフラグメントによって保持されている発現カセット「pGEA1D-tNOS」を、製造業者の指示にしたがってウシ腸のアルカリホスファターゼ酵素(Boehringer Mannheim)によって脱リン酸化したpSCV1.2のSmaI部位にクローニングした。連結は、脱リン酸化pSCV1.2 20ng、および発現カセット「pGEA1D-tNOS」を有するフラグメント200ngにより、反応媒質20μl中、10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)２μl、50％ポリエチレングリコール8000 ２μl、および酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)５Uの存在下、14℃で16時間行った。あらかじめ受容能を持つようにしておいた細菌Escherichia coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)。アンピシリン50μg/mlで選択した、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)で抽出し、制限酵素による酵素消化で分析した。得られたプラスミドを、pBIOC91と呼ぶことにした。
【０１７２】
ｄ）pGEA6Dプロモーターを含有するバイナリープラスミドpBIOC92の構築
アブラナ種子におけるイヌ胃リパーゼ（ＤＧＬ）をコードする動物遺伝子の発現には、以下の調節配列が必要であった；
１．種子の貯蔵タンパク質の遺伝子、Arabidopsis thaliana (Gaubier et al.,1993)のGEA6の５’非コード領域に対応し、種子における特異的発現を可能とするプロモーターpGEA6；
２．転写終結配列である二本鎖環状ＤＮＡのターミネーターpolyA 35S（カリフラワーモザイクウイルスの配列の３’非コード領域に対応する）（これは、転写物35Sを産生する）（Franck et al., 1980）。
【０１７３】
pBIOC21に似ているが、プロモーターpd35Sが、プロモーターpGEA6Dで置換されている、バイナリープラスミドpBIOC92を得るために、プロモーターpGEA6を含有する、フラグメントEcoRI-Klenow処理されたBamHIを、プラスミドpGUS2-pGEA6を用いて単離した。pUC18から誘導されたクローンpGUS-2-pGEA6は、相内に２つのＡＴＧを有している：GEA6遺伝子(Em6)のＡＴＧ、およびgus遺伝子のＡＴＧ。GEA6遺伝子のＡＴＧを破壊した。次に、クローンpGUS-2-pGEA6のGEA6遺伝子の、AccI部位とＡＴＧの上流の配列との間に含まれるＤＮＡフラグメントを、２種類のオリゴヌクレオチド（5’AAGTACGGCCACTACCACG3’および5’CCCGGGGATCCTGGCTC3’)を用いて、ＰＣＲにより増幅した。ハイブリダイゼーション温度は、調節した。
【０１７４】
ＰＣＲにより増幅したフラグメントは、AccIおよびBamHIで消化し、２％アガロースゲルによる電気泳動により精製し、電気溶出し（Sambrook et al., 1090）、1/10容量の３M酢酸ナトリウム（pH4.8）および2.5容量の無水エタノールの存在下、−80℃で30分間沈殿させ、12,000gで30分間遠心分離し、70％エタノールで洗浄し、乾燥し、そしてAccIおよびBamHIにより二重消化し、0.8％アガロースゲルによる電気泳動により精製し、電気溶出し（Sambrook et al. 1989）、アルコールによる沈殿に付し、乾燥しておいたpGUS-2-GEA6のプラスミドＤＮＡに連結した。連結は、上述のベクター100ng、および上述したＰＣＲ増幅に由来する消化されたＤＮＡフラグメント50ngにより、反応媒質10μl中、10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)１μl、および酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)2.5Uの存在下、14℃で16時間行った。あらかじめ受容能を持つようにしておいた細菌Escherichia coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)。アンピシリン50μg/mlで選択した、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)で抽出し、制限酵素による酵素消化で分析した。保持された特定のクローンを、Ｔ７TM配列決定キット(Pharmacia社販売)による配列決定により、ジデオキシヌクレオチド法(Sanger et al., 1977)により確認した。得られたクローンを、pGUS-2-pGEA6Dと呼ぶことにした。
【０１７５】
pGUS-1-pGEA6Dから単離されたプロモーターpGEA6Dを有し、製造業者(Biolabs)の指示にしたがってKlenow処理されたEcoRI-BamHIフラグメントを、0.8％アガロースゲルによる電気泳動により精製し、電気溶出し（Sambrook et al.,1989）、アルコールによる沈殿に付し、乾燥し、そして改変pBIOC21のプラスミドＤＮＡに、Klenow処理されたXhoI部位において連結した。改変したプラスミドpBIOC21は、プロモーターpd35Sを有するフラグメントを除去するとともにそれを、pBSIISK+のKpnI-XhoI-SalI-ClaL-HindIII-BamHI-SmaI-EcoRI-EcoRV部位の化合物ポリリンカーを有するKpnI-EcoRVフラグメントと置換するため、pBIOC21を、Klenow処理されたHindIIIおよびKpnIにより二重消化することによって得たものである。
【０１７６】
連結は、脱リン酸化した改変pBIOC21 20ng、および上述したEcoRI-BamHI ＤＮＡフラグメント200ngにより、反応媒質20μl中、10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)２μl、50％ポリエチレングリコール8000 ２μl、および酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)５Uの存在下、14℃で16時間行った。あらかじめ受容能を持つようにしておいた細菌Escherichia coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)。テトラサイクリン12μg/mlで選択した、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)で抽出し、制限酵素による酵素消化で分析した。得られたプラスミドを、pBIOC92と呼ぶことにした。
【０１７７】
ｅ）ＲＧＬＳＰ−ＤＧＬを含有するバイナリープラスミドpBIOC93、pBIOC94、pBIOC95、pBIOC96、およびpBIOC97の構築
プラスミドpBIOC40は、上述した。このプラスミドは、配列ＲＧＬＳＰ−ＤＧＬを有するフラグメントBglII-XbaIを含む。
【０１７８】
このフラグメントを、BglIIおよびXbaIによる二重酵素消化により単離し、0.8％アガロースゲルによる電気泳動により精製し、電気溶出し、アルコールによる沈殿に付し、乾燥し、Klenowで処理し、そしてKlenow処理したEcoRIで消化し、脱リン酸化した（上述の）pBIOC28に連結して、pBIOC93を得るか；、あるいはKlenow処理したEcoRIで消化し、脱リン酸化したpBIOC90に連結して、pBIOC94を得るか；あるいはSmaIで消化し、脱リン酸化したpBIOC91に連結して、pBIOC95を得るか、あるいはKlenow処理したHindIIIにより消化し、脱リン酸化したpBIOC92に連結して、pBIOC96を得た。
【０１７９】
プラスミドpBIOC97は、発現カセット「pGEA6D-RGLSP-DGL-t35S」を有するフラグメントKpnI-EcoRVのクローニングにより得られるが、この発現カセットは、酵素Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、0.8％アガロースゲルによる電気泳動により精製し、電気溶出し、アルコールによる沈殿に付し、乾燥し、そしてSmaIにより消化し、脱リン酸化したpSCV1.2に連結したものである。発現カセット「pGEA6D-RGLSP-DGL-t35S」は、pBIOC92に由来する。
【０１８０】
III．ヒト胃リパーゼ組換えタンパク質をコードし、例えばタバコ葉および種子中に構造的発現を可能にするキメラ遺伝子の構築
ａ）キメラプロモーターSUPER-PROMOTOR pSPを含有するバイナリープラスミドpBIOC82の構築
ヒト胃リパーゼ（ＨＧＬ）をコードする遺伝子のタバコ葉における発現には、以下の調節配列を必要とした；
１．キメラプロモーターSUPER-PROMOTOR(pSP；PCT/US94/12946）。これは、Agrobacterium tumefaciensのオクトピンシンターゼ遺伝子のプロモーターの３つの転写活性要素、Agrobacterium tumefaciensのマンノピンシンターゼ遺伝子のプロモーターの転写活性要素、およびマンノピンシンターゼプロモーターの融合により構築される。
２．カリフラワーモザクウイルス二本鎖環状ＤＮＡの配列の３’非コード領域に対応し、転写物35S を生成する、転写終結配列ターミネーターpolyA 35S（Franck et al., 1980）
【０１８１】
pBIOC21と同様なプラスミドであるが、プロモーターpd35SがプロモーターpSPで置換されているバイナリープラスミドを得るためには、プロモーターpSPを含有するKlenow酵素処理したpvuII-SalIフラグメントを、pBISNIプラスミド(PCT/US94/12946)を用いて単離し、１％アガロースゲル上で電気泳動により精製し、電気溶出し(Sambrook et al.,1989)、アルコールで沈殿させ、乾燥して、KpnIおよびEcoRIで二重に消化し、ＤＮＡＴ４ポリメラーゼ処理し、製造者の指示にしたがって仔牛腸のアルカリホスファターゼ酵素(Boehringer Mannheim)により脱リン酸化したプラスミドＤＮＡであるpBIOC81に連結した。プラスミドpBIOC81はXbaI部位を除去したpBIOC21に相当する。これを行うためには、プラスミドpBIOC21をXbaIで消化し、次いでKlenow酵素処理に付し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの作用により連結した。
【０１８２】
連結は、上記の脱リン酸したベクター20ngおよび、上記のpSPを有するＤＮＡフラグメント200ngにより、反応媒質20μl中、10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)２μl、50％ポリエチレングリコール8000 ２μlおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ酵素(Amersham)５Uの存在下、14℃で16時間実施した。あらかじめ受容能を持つようにした細菌Escherichia coli DH5αを、形質転換した（Hanahan,1983）。テトラサイクリン12μg/mlで選択して得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)により抽出し、制限酵素による酵素消化によって分析した。得られたプラスミドをpBIOC82と呼ぶことにした。
【０１８３】
ヒト胃リパーゼ（ＨＧＬ）は、天然には、Bodmer et al.,1987の刊行物に記載された前駆体の形で合成される。成熟ＨＧＬタンパク質は、379個のアミノ酸から構成されている。そのシグナルペプチド（ＨＧＬＳＰ）は、19個のアミノ酸からなる。ＨＧＬＳＰとＨＧＬの間の制限部位は、Gly-Leuである。
【０１８４】
ＨＧＬの前駆体をコードする配列は、ＨＧＬＳＰ−ＨＧＬを含有するpBIOC85、ＨＰＬＳＰ−ＨＧＬを含有するpBIOC87およびＲＧＬＳＰ−ＨＧＬを含有するpBIOC89の、バイナリープラスミドの構築に用いられ、この時、ＨＧＬをコードする配列は、その天然のシグナルペプチドＨＧＬＳＰ、ヒト膵臓リパーゼのシグナルペプチド（ＨＰＬＳＰ；Giller et al., 1992）およびウサギ胃リパーゼシグナルペプチド（ＲＧＬＳＰ；上記；欧州特許第92.403055.4号）をそれぞれコードする配列により先導される。
【０１８５】
ＨＧＬの前駆体をコードする配列は、PstIおよびDraIによる二重消化により単離され、0.8％アガロース上で電気泳動により精製され、電気溶出され(Sambrook et al., 1989)、1/10容量のPH4.8の３M酢酸ナトリウム、2.5容量の無水エタノールの存在下、−80℃で30分間沈殿させ、12,000ｇで30分間遠心分離し、70％エタノールで洗浄して乾燥した。次いで、Stratagene社から販売されているpBSIISK+プラスミドのPstIおよびSpeI部位でクローン化した（製造会社の指示により、酵素Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ(Biolabs)の作用に付した）。連結は、ベクター100ngおよび上記のＨＧＬ前駆体をコードする配列を有しているＤＮＡフラグメント50ngにより、反応媒質10μl中、10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)１μlおよび酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)2.5Uの存在下、14℃で16時間行った。あらかじめ受容能を持つようにした細菌Escherichia coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)。アンピシリン50μg/mlで選択し、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)により抽出し、制限酵素による酵素消化によって分析した。得られたプラスミドを、pBIOC83と呼ぶことにした。
【０１８６】
２つのオリゴデオキシヌクレオチド、すなわち5’aaactgcaggctcgag TTG TTT GGA AAA TTA CAT CCT GGA tcc CCT GAA GTG ACT ATG 3’（独自のPstI、XhoIおよびBamHI部位を有する）および5’AAT GGT GGT GCC CTG GGA ATG GCC AAC ATA GTG TAG CTG C 3’（独自のMscI部位をプラスミドpBIOC83中に有する）を用いたＰＣＲ法による部位特異的変異により、９番目と10番目のコドンにそれまで存在しなかったBamHI部位を導入することにより、成熟したＨＧＬをコードする配列を改変した。
【０１８７】
PstI-MscIフラグメントのＰＣＲ増幅は、10倍濃縮ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（ＫＣｌ 500M、Tris-ＨＣｌ（pH9.0）100mMおよび１％Triton x100）10μl、25mMのＭｇＣｌ2６μl、10mMのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）３μl、上記の２つのオリゴデオキシ−ヌクレオチド各100pM、マトリックスＤＮＡ（ベクターpBIOC83）５ng、ＴａｇＤＮＡポリメラーゼ（Promega）2.5Uおよびワセリン油２滴を含む反応媒質100μl中で実施した。ＤＮＡを、94℃で５分間変性させ、94℃での変性１分間、65℃でのハイブリダイゼーション１分間および72℃での伸長１分間から構成されるサイクルを30回繰り返し、次いで72℃での伸長を５分間継続した。このＰＣＲ反応は、Perkin Elmer Cetus社の「DNA Thermal Cycler」機により実施した。クロロホルムによる抽出によって油状物を除去した。反応媒質中に含まれるＤＮＡフラグメントを、次いで1/10容量の３M酢酸ナトリウム（pH4.8）および2.5容量の無水エタノールの存在下、−80℃で30分間沈殿させ、12,000ｇで30分遠心分離し、70％エタノールで洗浄し、乾燥し、PstIおよびMscIの２つの制限酵素により消化した。ＰＣＲ増幅により得たこの消化されたＤＮＡフラグメントを、２％アガロースゲル上で電気泳動により精製し、電気溶出(Sambrook et al., 1989)し、1/10容量の３M酢酸ナトリウム（pH4.8）および2.5容量の無水エタノールの存在下、−80℃で30分間沈殿させ、12,000ｇで30分間遠心分離し、70％エタノールで洗浄し、乾燥して、次いで、PstIおよびMscIで２回消化し、0.8％アガロースゲル上で電気泳動により精製し、電気溶出し、アルコールで沈殿させ、乾燥したプラスミドＤＮＡpBIOC83に連結した。連結は、ベクター100ngおよび上記のＰＣＲによる増幅で得た、消化されたＤＮＡフラグメント50ngにより、反応媒質10μl中、10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)１μl、および酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)2.5Uの存在下、14℃で16時間実施した。あらかじめ受容能を持つようにした細菌Escherichia coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)。アンピシリン50μg/mlで選択されて得られたクローンのプラスミドＤＮＡは、アルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)により抽出し、制限酵素による酵素消化により分析した。いくつかの保持されたクローンは、Pharmacia社から販売されているＴ７TM配列決定キットを用いてジデオキシヌクレオチド法(Sanger et al., 1977)により配列分析することにより確認された。BamHI制限部位の導入によりＨＧＬの遺伝コードが改変されることはない。実際、天然のＨＧＬ配列ＧＧＡ  ＡＧＣ(Gly-Ser)は、ＧＧＡ  ＴＣＣ(Gly-Ser)となった。得られたプラスミドをpBIOC84と呼ぶことにした。
【０１８８】
ｂ）ＨＧＬＳＰ−ＨＧＬを含有するバイナリープラスミドpBIOC85の構築
ＨＧＬＳＰ−ＨＧＬ配列を含有するPstI-XbaIフラグメントを、PstIおよびXbaIによる二重の酵素消化によってpBIOC83から単離し、0.8％アガロースゲル上で電気泳動させ、電気溶出し(Sambrook et al.,1989)、アルコールで沈殿させて乾燥した。次いで、このＤＮＡフラグメントを酵素Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ(Biolabs)により、製造会社の指示にしたがって処理し、EcoRI部位で消化され、Klenow酵素（Biolabs）で処理して、仔牛腸のアルカリホスファターゼ酵素(Boehringer Mannheim)により、製造会社の指示にしたがって脱リン酸化したpBIOC82のプラスミドＤＮＡに連結した。連結は、上記した脱リン酸したベクター20ngおよび、上記のＨＧＬＳＰ−ＨＧＬを含有するＤＮＡフラグメント200ngにより、反応媒質20μl中、10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)２μl、50％ポリエチレングリコール8000 ２μlおよび酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)５Uの存在下、14℃で16時間実施した。あらかじめ受容能を持つようにした細菌Escherichia coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)。テトラサイクリン12μg/mlで選択されて得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)により抽出し、制限酵素による酵素消化により分析した。得られたクローンをpBIOC85と呼ぶことにした。組換えタンパク質ＨＧＬＳＰ−ＨＧＬをコードするこのフラグメントの核酸配列は、Pharmacia社から販売されている、Ｔ７TM配列決定キットにより、ジデオキシヌクレオチド法(Sanger et al., 1977)で配列決定して確認された。ＨＧＬＳＰ配列と成熟ＨＧＬ配列との間の制限配列は、Gly-Leuである。バイナリーベクターpBIOC85のプラスミドＤＮＡを、Holsters et al.(1978)の方法にしたがって、Agrobacterium tumefaciensのLBA4404株に直接的形質転換により導入した。保持されたクローンの有効性は、導入されたプラスミドＤＮＡの酵素消化により確認された。
【０１８９】
ｃ）ＨＰＬＳＰ−ＨＧＬを含有するバイナリープラスミドpBIOC86の構築
シグナルペプチドＨＧＬＳＰおよび成熟ＨＧＬタンパク質の最初の８個のアミノ酸(Leu-Phe-Gly-Lys-Leu-His-Pro-Gly)をコードする配列を抑制するため、プラスミドpBIOC84を、PstIおよびBamHIにより二重消化した。この配列を、成熟ＨＧＬタンパク質の最初の８コドンをコードする配列に融合させた16アミノ酸のシグナルペプチドＨＰＬＳＰ（ATG CTG CCA CTT TGG ACT CTT TCA CTG CTG CTG GGA GCA GTA GCA GGA)をコードする配列により置換した（「ＨＰＬＳＰ−成熟ＨＧＬの最初の８コドン」）。配列「ＨＰＬＳＰ−成熟ＨＧＬの最初の８コドン」は、マトリックス5’aaactgcaggctcgagaacaATG CTG CCA CTT TGG ACT CTT TCA CTG CTG CTG GGA GCA GTA GCA GGA TTG TTT GGA AAA TTA CAT CCT GGA tcc CCT G 3’から、5’aaactgcaggctcgagaacaATG C 3’および5’C AGG gga TCC AGG ATG TAA TTT TCC 3’の２つのオリゴデオキシヌクレオチドを用いて以前に記載されたＰＣＲ増幅プロトコルにしたがい、ＰＣＲにより増幅された（上記段落Ｉ参照）。ハイブリダイゼーション温度は調整した。PstIおよびBamHIによる二重の酵素消化の後、ＰＣＲ増幅により得られたこのＤＮＡフラグメントを２％アガロースゲル上で電気泳動して精製し、電気溶出し（Sambrook  et al. 1989）、1/10容量の３M酢酸ナトリウム（pH4.8）および2.5容量の無水エタノールの存在下、−80℃で30分間沈殿させ、12,000ｇで30分間遠心分離し、70％エタノールで洗浄し、乾燥して、次いで、PstIおよびBamHIで２重消化し、0.8％アガロースゲル上で電気泳動により精製し、電気溶出（Sambrook et al.,1989）し、アルコールで沈殿させ、乾燥したプラスミドＤＮＡ pBIOC84に連結した。連結は、ベクター100ngおよび上記したＰＣＲ増幅により得られた消化ＤＮＡフラグメント50ngにより、反応媒質10μl中、酵素10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)１μlおよび酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)2.5Uの存在下、14℃で16時間実施した。あらかじめ受容能を持つようにした細菌Eschericha coli DH5 αを形質転換した(Hanahan, 1983)。アンピシリン50μg/mlで選択して得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法（Birnboim and Doly, 1979）により抽出し、制限酵素を用いた酵素消化により分析した。ある種の保持されたクローンは、Pharmacia社から販売されているＴ７TM配列決定キットを用いてジデオキシヌクレオチド法(Sanger et al., 1977)により配列を確認した。ＨＰＬＳＰおよび成熟ＨＧＬの配列を、これらのオープンリーディングフレームを保持しつつクローン化した（すなわち、それらが独自のオープンリーディングフレームを構築するように）。ＨＰＬＳＰ配列と成熟ＨＧＬ配列との間の制限配列は、Gly-Leuである。得られたプラスミドをpBIOC86と呼ぶことにした。
【０１９０】
ＨＰＬＳＰ−ＨＧＬ配列を含有しているPstI-XbaIフラグメントを、BIOC86から、PstIおよびXbaIによる二重の酵素消化により単離し、0.8％アガロースゲル上の電気泳動により精製し、電気溶出し(Sambrook et al., 1989)、アルコールによる沈殿に付し、乾燥した。次いで、このＤＮＡフラグメントを酵素Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（Biolabs）により製造会社の指示にしたがって処理して、EcoRI部位で消化され、Klenow酵素（Biolabsb）により処理され、製造会社の指示どおりにウシ腸のアルカリホスファターゼ酵素(Boehringer Mannheim)によって脱リン酸化されたプラスミドＤＮＡであるpBIOC82に連結した。連結は、上記の脱リン酸化したベクター20ngおよび上記したＨＰＬＳＰ−ＨＧＬを含有するＤＮＡフラグメント200ngにより、反応媒質20μl中、10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)２μl、50％ポリエチレングリコール8000 ２μlおよび酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)の存在下、14℃で16時間実施した。予め受容能を持つようにした細菌Eschericha coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)。テトラサイクリン12μg/mlを含有する媒質中で選択して得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)により抽出し、制限酵素を用いた酵素消化により分析した。得られたクローンをpBIOC87と呼ぶことにした。組換えタンパク質ＨＰＬＳＰ−ＨＧＬをコードするフラグメントの核酸配列は、Pharmacia社から販売されているＴ７TM配列決定キットを用いてジデオキシヌクレオチド法(Sanger et al., 1977)により配列を確認した。バイナリーベクターpBIOC87のプラスミドＤＮＡを、Holsters et al. (1978）の方法にしたがって、Agrobacterium tumefaciensのLBA4404株に直接的形質転換により導入した。保持されたクローンの有効性は、導入されたプラスミドＤＮＡの酵素消化により確認した。
【０１９１】
ｄ）ＲＧＬＳＰ−ＨＧＬを含有するバイナリープラスミドpBIOC89の構築
シグナルペプチドＨＧＬＳＰおよび成熟ＨＧＬタンパク質の最初の８個のアミノ酸(Leu-Phe-Gly-Lys-Leu-His-Pro-Gly)をコードする配列を抑制するため、プラスミドpBIOC84を、PstIおよびBamHIにより二重消化した。この配列を、成熟ＨＧＬタンパク質の最初の８コドンに融合させた19アミノ酸のシグナルペプチドＲＧＬＳＰ（ATG TGG GTG CTT TTC ATG GTG GCA GCT TTG CTA TCT GCA CTT GGA ACT ACA CAT GGT)をコードする配列により置換した（「ＲＧＬＳＰ−成熟ＨＧＬの最初の８コドン」）。配列「ＲＧＬＳＰ−成熟ＨＧＬの最初の８コドン」は、上記のＰＣＲ増幅プロトコールにしたがって、マトリックス5’aaactgcaggctcgagaacATG TGG GTG CTT TTC ATG GTG GCA GCT TTG CTA TCT GCA CTT GGA ACT ACA CAT GGT TTG TTT GGA AAA TTA CAT CCT GGA tcc CCT G 3’から、5’aaactgcaggctcgagaacaATG TGG 3’および5’C AGG gga TCC AGG ATG TAA TTT TCC 3’の２つのオリゴデオキシヌクレオチドを用いてＰＣＲにより増幅された（上記段落Ｉ参照）。ハイブリダイゼーション温度は調整した。PstIおよびBamHIによる二重の酵素消化の後、ＰＣＲ増幅により得られたこのＤＮＡフラグメントを２％アガロースゲル上で電気泳動して精製し、電気溶出し（Sambrook  et al. 1989）、1/10容量の３M酢酸ナトリウム（pH4.8）および2.5容量の無水エタノールの存在下、−80℃で30分間沈殿させ、12,000ｇで30分間遠心分離し、70％エタノールで洗浄し、乾燥して、次いで、PstIおよびBamHIで２回消化し、0.8％アガロースゲル上で電気泳動により精製し、電気溶出（Sambrook et al.,1989）し、アルコールで沈殿させ、乾燥したプラスミドＤＮＡであるpBIOC84に連結した。連結は、ベクター100ngおよび上記したＰＣＲ増幅により得られた消化ＤＮＡフラグメント50ngにより、反応媒質10μl中、10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)１μlおよび酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)2.5Uの存在下、14℃で16時間実施した。あらかじめ受容能を持つようにした細菌Eschericha coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)。アンピシリン50μg/mlで選択して得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)により抽出し、制限酵素を用いた酵素消化により分析した。ある種の保持されたクローンは、Pharmacia社から販売されているＴ７TM配列決定キットを用いてジデオキシヌクレオチド法(Sanger et al., 1977)により配列を確認した。ＲＧＬＳＰおよび成熟ＨＧＬの配列を、これらのオープンリーディングフレームを保持しつつクローン化した（すなわち、それらが独自のオープンリーディングフレームを構築するように）。配列ＲＧＬＳＰと成熟ＨＧＬとの間の制限配列は、Gly-Leuである。得られたプラスミドをpBIOC88と呼ぶことにした。
【０１９２】
ＲＧＬＳＰ−ＨＧＬ配列を含有しているPstI-XbaIフラグメントを、pBIOC88から、PstIおよびXbaIによる二重の酵素消化により単離し、0.8％アガロースゲル上の電気泳動により精製し、電気溶出し(Sambrook et al., 1989)、アルコールによる沈殿に付し、乾燥した。次いで、このＤＮＡフラグメントを酵素Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ(Biolabs)により製造会社の指示にしたがって処理して、XbaI部位で消化され、Klenow酵素（Biolabs）により処理され、製造会社の指示どおりにウシ腸のアルカリホスファターゼ酵素(Boehringer Mannheim)によって脱リン酸化されたプラスミドＤＮＡであるpBIOC82に連結した。連結は、上記の脱リン酸化したベクター20ngおよび上記のＲＧＬＳＰ−ＨＧＬを含有するＤＮＡフラグメント200ngにより、反応媒質20μl 中、10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)２μl、50％ポリエチレングリコール8000 ２μlおよび酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)５Uの存在下で14℃で16時間実施した。予め受容能を持つようにした細菌Eschericha coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)。テトラサイクリン12μg/mlで選択して得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)により抽出し、制限酵素を用いた酵素消化により分析した。得られたクローンをpBIOC89と呼ぶことにした。組換えタンパク質ＲＧＬＳＰ−ＨＧＬをコードするフラグメントの核酸配列は、Pharmacia社から販売されているＴ７TM配列決定キットを用いてジデオキシヌクレオチド法(Sanger et al.,1977)により配列を確認した。バイナリーベクターpBIOC89のプラスミドＤＮＡを、Holsters et al. (1978）の方法にしたがって、Agrobacterium tumefaciensのLBA4404株に直接的形質転換により導入した。保持されたクローンの有効性は、導入されたプラスミドＤＮＡの酵素消化により確認した。
【０１９３】
IV．イヌ胃リパーゼの組換えタンパク質をコードし、トウモロコシ種子における発現を可能にするキメラ遺伝子の構築
ａ）ＲＧＬＳＰ−ＤＧＬを含有し、トウモロコシ種子において構成的発現を可能にするプラスミドpBIOC98およびpBIOC99の構築
イヌ胃リパーゼ（ＤＧＬ）をコードする動物遺伝子のトウモロコシ種子における構成的発現には、以下の調節配列が必要であった；
１．構成的発現を可能にする２つのプロモーターのうちの一つ：
−McElroy et al.(1991)により記載された、プラスミドpAct1-F4中に含有される、コメのアクチンイントロンが続いているコメのアクチンプロモーター（pAR-IAR）；
−CaMV（カリフラワーモザイクウイルス）の二重構造プロモーター35S（pd35S。これは、天然35SプロモーターのＴＡＴＡエレメントから上流に位置する、転写を活性化する配列の重複に相当する（Kay et al., 1987）；
２．２つのターミネーターのうちの一つ：
−転写終結配列であるターミネーターpolyA 35S、これは、カリフラワーモザイクウイルスの二本鎖環状ＤＮＡの配列の３’非コード領域に相当し、転写物35Sを生成する（Franck et al., 1980）；
−転写終結配列であるターミネーターpolyA NOS、これは、Agrobacterium tumefaciensノパリン(nopaline)株のＴｉプラスミドのノパリンシンターゼの遺伝子の３’非コード領域に相当する(Depecker et al., 1982)。
【０１９４】
ＲＧＬＳＰ−ＤＧＬをコードする配列がpAR-IARのコントロールの下に置かれているプラスミドpBIOC98は、ＲＧＬＳＰ−ＤＧＬをコードする配列を、pBSII-pAR-IAR-tNOSの「NcoIおよびSalI」部位に有しているBglII-XbaIフラグメントをクローン化することにより得られる。
【０１９５】
ＲＧＬＳＰ−ＤＧＬをコードする配列を含有するBglII-XBaIフラグメントを、BglIIおよびXbaIにより二重に酵素消化してpBIOC40（上記）から単離し、0.8％アガロースゲル上で電気泳動により精製し、電気溶出し、アルコールで沈殿、乾燥し、次いでKlenow酵素により処理した。プラスミドpBSII-pAR-IAR-tNOSをSalIおよびNcoIで二重消化し、精製し、Mung Bean Nucleaseb酵素(Biolabs)で処理し、製造会社の指示にしたがって仔牛腸アルカリホスファターゼ(Boehringer Mannheim)で脱リン酸化した。連結は、脱リン酸化したベクター２０ng、および上記ＲＧＬＳＰ−ＤＧＬをコードする配列を含有するＤＮＡフラグメント200ngにより、反応媒質20μl中、10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)２μl、50％ポリエチレングリコール8000 ２μlおよび酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)５Uの存在下、14℃で16時間実施した。予め受容能を持つようにした細菌Escherichia coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)アンピシリン50μg/mlを含む培地で選択して得られたプラスミドＤＮＡのクローンを、アルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)により抽出し、制限酵素を用いた酵素消化により分析した。得られたプラスミドをpBIOC98と呼ぶことにした。
【０１９６】
プラスミドpAct1-F4から単離された「gus遺伝子をコードする配列のpAR-IAR-start」に対応する配列を含有するSnaBI-KpnIフラグメントのpBSII-tNOSの「Klenow酵素およびKpnIにより処理されたEco01091」部位でのクローニングから、pBSII-pAR-IAR-tNOSプラスミドが得られた。連結は、ベクター100ngおよび上記のＤＮＡフラグメント50ngにより、反応媒質10μl中、10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)１μlおよび酵素Ｔ４DNAリガーゼ(Amersham)2.5Uの存在下、14℃で16時間実施した。予め受容能を持つようにした細菌Eschericha coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)。アンピシリン50μg/mlを含む培地で選択して得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法（Birnboim and Doly, 1979）により抽出し、制限酵素を用いた酵素消化により分析した。
【０１９７】
Clontech社から販売されているpBI121から単離されたtNOS配列を有するSacI-EcoRIフラグメントを、SacIおよびEcoRVによる二重酵素消化により、Stratagene社から販売されているpBSIISK+の脱リン酸化部位EcoRVでクローニングし、２％アガロースゲル上の電気泳動により精製し、そしてＴ４ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって処理することによりプラスミドpBSII-tNOSを得た。連結は、脱リン酸化ベクター20ngおよび上記のtNOS配列を含有するＤＮＡフラグメント200ngにより、反応媒質20μl中、10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)２μl、50％ポリエチレングリコール8000の２μlおよび酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)５Uの存在下、14℃で16時間実施した。予め受容能を持つようにした細菌Eschericha coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)。アンピシリン50μg/mlを含む培地で選択して得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)により抽出し、制限酵素を用いた酵素消化により分析した。
【０１９８】
ＲＧＬＳＰ−ＤＧＬをコードする配列がpd35Sのコントロール下に置かれているプラスミドpBIOC99は、プラスミドpBSII-t35Sの「KpnIおよびBamHI」部位における、上記のpBIOC41から単離された「pd35S-RGLSP-DGL」に対応する配列を含有するKpnI-BamHIフラグメントのクローニングにより得られる。連結は、ベクター100ng、および上記ＤＮＡフラグメント50ngにより、反応媒質10μl中、10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)１μlおよび酵素Ｔ４DNA リガーゼ(Amersham)2.5Uの存在下、14℃で16時間消化して実施した。予め受容能を持つようにした細菌Eschericha coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)。アンピシリン50μg/mlを含む培地で選択して得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)により抽出し、制限酵素を用いた酵素消化により分析した。
【０１９９】
プラスミドpBSII-t35Sは、Stratagen社から販売されているプラスミドpBSIISK+の、Klenow酵素処理した脱リン酸化部位SpeIにおいて、pJITI63（上記）から単離されたt35S配列を含有するSmaI-EcoRVフラグメントをSmaIおよびEcoRVによる二重の酵素消化によってクローニングし、２％アガロースゲル上での電気泳動により精製することにより得られる。連結は、脱リン酸化ベクター20ng、および上記のt35S配列を含有するＤＮＡフラグメント200ngにより、反応媒質20μl中、10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)２μl、50％ポリエチレングリコール8000 ２μlおよび酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)５Uの存在下、14℃で16時間実施した。予め受容能を持つようにした細菌Escherichia coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)。アンピシリン50μg/mlを含む培地で選択して得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法（Birnboim and Doly, 1979）により抽出し、制限酵素を用いた酵素消化により分析した。
【０２００】
ｂ）それぞれＲＧＬＳＰ−ＤＧＬおよびＲＧＬＳＰ−ＤＧＬ−ＫＤＥＬを含有し、トウモロコシ種子胚乳における発現を可能にするpBIOC100およびpBIOC101の構築
トウモロコシ種子胚乳におけるイヌ胃リパーゼ（ＤＧＬ）をコードする動物遺伝子の発現には、以下の調節配列が必要である;
１．Reina et al.,1990により記載されたプラスミドp γ63中に含有されるトウモロコシγゼインの遺伝子プロモーター（pγzein）。プラスミドpγ63は、そのHindIIIおよびEcoRI部位の間にClontech社から販売されているpBI221の発現カセット「p35S-gus-tNOS］を有している、プラスミドpUC18のHindIIIおよびXbaI部位においてpγzeinをクローニングすることにより得られる。これは、トウモロコシ種子胚乳における発現を可能にする。
２．Agrobacterium tumefaciensノパリン株のＴｉプラスミドのノパリンシンターゼ遺伝子の３’非コード領域に相当する、転写終結配列ターミネーターpolyA NOS(Depicker et al.,1982)
【０２０１】
ＲＧＬＳＰ−ＤＧＬをコードする配列がpγzeinの調節の下に置かれているプラスミドpBIOC100は、「酵素Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼおよびBamHIにより処理されたプラスミドpγ63のSacI」の部位で、pBIOC40（上記）から単離された「Klenow酵素により処理されたXbaI-BglII」フラグメントをクローニングすることにより、得られる。連結は、ベクター100ngおよび上記したＤＮＡフラグメント50ngにより、反応媒質10μl中、10倍濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Amersham)１μlおよび酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Amersham)2.5Uの存在下、14℃で16時間実施した。あらかじめ受容能を持つようにした細菌Escherichia coli DH5αを形質転換した(Hanahan, 1983)。アンピシリン50μg/mlを含む培地で選択して得られたクローンのプラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法（Birnboim and Doly, 1979）により抽出し、制限酵素を用いた酵素消化により分析した。得られたプラスミドをpBIOC100と呼ぶことにした。
【０２０２】
プラスミドpBIOC101は、pBIOC100のNcoI-AflIIフラグメントを、上記した方法によりＰＣＲ増幅して得られた停止コドンの前に位置するテトラペプチドＫＤＥＬ（小胞体内へ指向させる）をコードする配列を含有するNcoI-AflIIフラグメントにより置き換えることにより得られる。この反応の間に用いられる２つのオリゴデオキシヌクレオチドは：5’ AAT CAC TTG GAC TTT ATC TGG Gcc atg gAT GCC 3’（独自のNcoI部位）および、5’ATT ctt aag AAA CTT TAT TGC CAA ATG TTT GAA CGA TCG GGG AAA TTC GAC GCG TCT AGA ACT ATA GCT CAT CCT TAT TAT CTG TTC CCA TCA TGG 3’（ＫＤＥＬおよび独自のAflII部位をコードする配列）である。ハイブリダイゼーションの温度は70℃であった。クローニングを前記のようにして実施した。
【０２０３】
Ｖ．トランスジェニックアブラナ植物の生産の例
アブラナの一種（Brassica napusのWESTAR種またはLimagrain株）の種子を、Domestosの15％溶液中で40分間消毒する。滅菌水で４回洗浄した後、直径７cm、高さ10cmの鉢１個あたり種子20個の量で、５g/lの寒天ゲルで固化した30g/lのショ糖を含むMurashigeおよびSkoogの無機培地（Sigma M5519)上で種子を発芽させる。これらの鉢を、80μEm-2S-1前後の光度下、16時間／８時間の光周期で26℃の栽培室内に置く。
【０２０４】
発芽の５日後に、子葉節の約１mm上方でそれぞれの葉柄を切断することによって、無菌条件下で子葉を除去する。
【０２０５】
平行して、プラスミドpBIOC29（またはpBIOC25)を有する、すなわち、指令シグナルＰＰＳ（またはＰＳ）をコードする配列に融合させた、イヌ胃リパーゼをコードする配列をプロモーターpCRU（またはpd35S)の制御下で挿入したプラスミドpGAZEを有するAgrobacterium tumefaciensを、用いた株の選択に用い得る抗生物質を補った、50ml三角フラスコ内の細菌培地２ＹＴ［Sambrook et al.,1989］10ml中で28℃で36時間、前培養する。
【０２０６】
この前培養物を用いて、同じ条件下で調製した新たな細菌培養物を１％の量で播種する。14時間後、培養物を3,000×ｇで15分間遠心分離し、細菌を等量の液体発芽培地に溶かす。この懸濁液を、直径５cmのペトリ皿に、５ml／皿の量で分割する。
【０２０７】
こうして調製したアグロバクテリア液に、葉柄の切断端を数秒間浸漬し、次いで、葉柄を再生培地に数mm押し込む。この培地は、発芽培地と同じ塩基組成を有し、芽の新形成を促進する植物ホルモンであるベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）４mg/mlを加えてある。直径９cmのペトリ皿（Greiner 参照番号664102）で、１皿あたり10個の外植片（葉柄付きの子葉）を栽培する。
【０２０８】
発芽と同じ環境条件下での同時培養の２日後に、選択剤：45mg/lの硫酸カナマイシン（Sigma、参照番号K4000)、および制菌剤：クラブラン酸のカリウム塩1/6（重量比）とアモキシシリンのナトリウム塩（Augmentin、注射可）5/6との600mg/lの量での混合物を補った、前述の培地を有するPhytatray box（Sigma、参照番号P1552)に、外植片を移植する。
【０２０９】
外植片は、３週間の間隔でのその後２回の機会に、同じ条件下の新たな培地に無菌条件下で移植する。
【０２１０】
２回か３回目の移植の終了時に出現した緑色の芽を外植片から分離し、前述のと同じであるがＢＡＰを欠く培地を容れた、直径５cm、高さ10cmの透明な鉢で個別に栽培する。３週間栽培した後、形質転換した芽の茎を切断し、芽を新鮮な培地の鉢に移植する。３〜４週間の終りに、根は、苗木のフィトトロン内での順化を可能にするのに充分なまでに発育する。緑色でないか、または根付かなかった芽は除去する。次いで、これらの苗木を、水で飽和させた土壌（Standard NF、U44551：褐色ピート40％、ふるいにかけたヒース30％、および砂30％）を満たした側面７cmの大鉢に移植する。このフィトトロン（温度21℃、光周期16時間／８時間、および相対湿度84％）での順化の２週間後に、遅効性肥料（Osmocote、土壌１ｌあたり４ｇの量で）で強化した同じ土壌を満たした、直径12cmの鉢に苗木を再移植し、次いで、１日２回水を２分間撒水する18℃に調節した温室（Ｓ２級）に移す。
【０２１１】
開花を見たときは、他家受精を防ぐように、これらに袋（Crispac、参照番号SM 570y、300mm×700mm）をかける。
【０２１２】
莢が成熟に達したとき、これらを採集、乾燥し、次いで破砕する。得られた種子は、生化学的活性の分析に用いる。トランスジェニックな子孫を、100〜150mg/lの量（遺伝子型による）で硫酸カナマイシンを含有する培地での発芽によって選択する。作業条件は、上記のそれと同じであるが、ガラス管内で１管あたり１個の種子として発芽を実施する点が異なる。最初の３週間に二次根を発生した苗木のみを、フィトトロンで順化させてから温室へと移す。
【０２１３】
VI．トランスジェニックなナス科の植物の生産の例
ａ）トランスジェニックなタバコ植物の生産
形質転換の実験に用いるタバコ植物（Nicotiana tabacum var.XanthiＮＣおよびＰＢＤ６）を、MurashigeおよびSkoog (1962)の基礎培地上でin vitroで栽培するが、これにはGamborg et al.(1968)によるビタミン類（Sigma、参照番号M0404)、20g/lの量のショ糖および８g/lの量の寒天（Merck)を加えておく。培地のpHを灰汁溶液で5.8に調整してから、120℃で20分間オートクレーブにかける。30日ごとに節間で切断することによって、タバコの苗木をこの増殖培地ＭＳ２０に移植する。
【０２１４】
in vitro培養はすべて、下記に規定した条件下で気候的に制御した室内で実施する：
−30μEm-2S-1の光度；16時間の光周期；
−日中26℃、夜間24℃の温度周期。
【０２１５】
用いた形質転換の手法は、Horsch et al.(1985)のそれに由来する。
【０２１６】
プラスミドpBIOC29、pBIOC26またはpBIOC25を有するAgrobacterium tumefaciens LBA4404株は、撹拌下、28℃で48時間、ＬＢ培地［Sambrook et al.,1989］中で前培養するが、これには適切な抗生物質（リファンピシンおよびテトラサイクリン）を添加しておく。次いで、この前培養物を同じ培地で50倍に希釈し、同じ条件下で培養する。一晩の後、培養物を遠心分離し（10分、3,000×ｇ）、細菌を等量の液体培地ＭＳ30（ショ糖30g/l)に溶かし、この懸濁液を10倍に希釈する。
【０２１７】
約１cm2の外植片を、上記の苗木の葉から切り出す。その後、細菌懸濁液に１時間接触させ、次いで、濾紙上で急速に乾燥させ、同時培養培地（固体のＭＳ30）上に置く。
【０２１８】
２日後に、ペトリ皿の選択剤のカナマイシン（200mg/l）、制菌剤のオーグメンチン（Augmentin：400mg/l）、および芽の誘導に必要なホルモン類（ＢＡＰ１mg/l、およびＡＮＡ0.1mg/l）を含有する再生培地ＭＳ30上へと外植片を移す。２週間栽培した後、外植片を同じ培地に移植する。更に２週間後、カナマイシンおよびAugmentinを加えた培地ＭＳ20で構成される、ペトリ皿の発生培地上に芽を移植する。１５日後、芽の半数を移植する。根付くのに約20日を要し、その終りには、苗木は、節間で切断することによってクローニングするか、温室に移植することができる。
【０２１９】
ｂ）トランスジェニックトマト植物の生産
品種ＵＣ８２Ｂのトマトの種子を、10％Domestosで15分間滅菌し、滅菌水で３回洗浄する。最後の洗浄は、撹拌下で10分間実施する。
【０２２０】
こうして滅菌した種子を、培地ＭＳＳＶ／２（Nitschによるビタミン類［ThomasおよびPratt、1981］、ショ糖30g/l、寒天（Merck)８g/lを加えたMurashigeおよびSkoog（1962、Sigma、参照番号M6899)／２の基礎培地、pH5.9）上で、気候制御した室内（30μEm-2S-1の光度、16時間／８時間の光周期、26℃）で、７または８日間発芽させる。
【０２２１】
用いた形質転換の手法は、Fillatti et al.(1987)のそれに由来する。
【０２２２】
プラスミドpBIOC25またはpBIOC26を有するAgrobacterium tumefaciens LBA4404株は、適切な抗生物質（リファンピシンおよびテトラサイクリン）を添加したＬＢ培地で、撹拌下、28℃で24時間、前培養する。次いで、この前培養物を、同じ培地で50倍に希釈し、同じ条件下で一晩培養する。600nmでのＯＤを測定し、アグロバクテリアを遠心分離し（10分間、3,000×ｇ）、600nmで0.8のＯＤを得るように液体培地ＫＣＭＳ［Fillatti et al.,1987による刊行物に記載］に溶かす。
【０２２３】
Fillatti et al,(1987)が記載したプロトコルのいくつかの段階では、技術的改良を用いた。
【０２２４】
外植片の前培養、および同時培養は、Fillatti et al,(1987)が記載したとおりに実施したが、培地ＫＣＭＳは、アセトシリンゴン（200mM）で補強した点が異なる。
【０２２５】
洗浄培地２Ｚは、カルベニシリンに代えて500mg/lのセフォタキシムを加える点が異なる。用いた発生培地は、MurashigeおよびSkoogの基礎培地（Sigma、MS6899）からなり、これにNitschによるビタミン類、ショ糖20g/l、カナマイシン50mg/l、オーグメンチン200mg/l、ＡＮＡ１mg/l、およびゼアチン0.5mg/lを加えてある。
【０２２６】
VII．トランスジェニックトウモロコシ植物の生産
ａ）遺伝的形質転換の標的としてのコウモロコシカルスの生産および利用
用いる方法が何であれ（エレクトロポレーション；Agrobacteria、微細繊維(microfibre)、粒子銃）、トウモロコシの遺伝的形質転換は、一般に、植物全体を再生できる能力を保持した、急速に分裂する未分化細胞の利用を必要とする。この種の細胞は、トウモロコシの胚のほぐしやすい(friable)カルス（タイプIIと呼ばれる）を包含する。
【０２２７】
これらのカルスは、遺伝子型Ｈ１IIの未成熟の胚からか（Ａ188×Ｂ73）、またはArmstrongが記載した方法および培地で得られる［Malze Handbook; (1994) M. Freeling, V. Walbot, Eds.; pp. 665-671］。このようにして得られたカルスを、開始培地での１５日ごとの連続移植によって増殖させ、そして維持する。
【０２２８】
次いで、Vain et al.が記載した方法［Plant Cell Tissue and Organ Culture (1989), 18:143-151］に従って、細胞のホルモンおよび浸透圧のバランスを変えることによって、これらのカルスから苗木を再生させる。次いで、これらの植物を温室内で順化させ、そこで、交配または自家受精させることができる。
【０２２９】
ｂ）トウモロコシの遺伝的形質転換のための粒子銃の利用
先行段落は、形質転換に必要な細胞系の生産および再生を記載しているが；ここで、改変された遺伝子の、植物のゲノムへの安定した組込みを導く、遺伝的形質転換の方法を記載する。この方法は、J. Finerが記載したもの［Plant Cell Report (1992), 11:323-328］と同一の粒子銃の利用に依存し；標的細胞は、段落１に記載のカルスフラグメントである。表面積が10〜20mm2のこれらのフラグメントを、射撃の４時間前に、開始培地と同一の培地を容れたペトリ皿の中心に１皿あたり16個の割合で配置したが、これには0.2Mのマンニトールと0.2Mのソルビトールとを加えてある。導入しようとする遺伝子を有するプラスミドを、Qiagen（登録商標）カラムで、製造者の指示に従って精製する。次いで、Kleinが記載したプロトコル［Nature (1987), 327:70-73］に従って、タングステン（Ｍ10）の粒子表面に沈澱させる。こうして被覆した粒子を、J. Finerが記載した銃およびプロトコル［Plant Cell Report (1992), 11:323-328］によって、標的細胞に向けて発射する。
【０２３０】
次いで、こうして射撃したカルスの皿を、Scellofrais（登録商標）を用いて密閉し、次いで、暗所で27℃で培養する。最初の移植は24時間後に実施し、次いで、15日ごとに３カ月間、開始培地と同一であるが、用いた遺伝子に応じて変え得る種類および濃度の選択剤を加えた培地上で実施する（段落３を参照されたい）。用い得る選択剤は、一般に、一定の除草剤（Basta（登録商標）、Round up（登録商標））、または一定の抗生物質（ヒグロマイシン、カナマイシン）の活性化合物からなる。
【０２３１】
３ケ月後、ときにはそれより早期に、通常、そして大部分は、１コピーまたはそれ以上の選択遺伝子がその遺伝子プールに組み込まれた細胞の分裂から得られる細胞で構成される、その増殖が選択剤で阻害されないカルスが得られる。そのようなカルスが得られる頻度は、射撃した皿１枚あたり約0.8個のカルスである。
【０２３２】
これらのカルスを同定、個別化かつ増幅し、次いで、苗木を再生するように培養する（段落ａを参照されたい）。形質転換しなかった細胞によるいかなる干渉も避けるため、これらの操作はすべて、選択剤を含有する培地上で実施する。
【０２３３】
こうして再生した植物を、温室内で順化させ、次いで栽培し、ここで交配または自家受精することができる。
【０２３４】
VIII．トランスジェニックタバコ植物でのイヌの胃リパーゼの発現の分析
ａ）プロトコル
温室内の植物から採集したタバコの葉からのリパーゼの抽出のプロトコルは、下記のとおりである：葉１ｇ（初期重量:Fresh weight）を、液体窒素中で、次いで４℃で、１mMＥＤＴＡおよび10mMメルカプトエタノールを加えた25mM Tris-ＨＣｌ緩衝液５ml、pH7.5（緩衝液Ａ）、または１mMＥＤＴＡ、10mMβ−メルカプトエタノール、0.2％Triton x-100および250mMＮａＣｌを加えた25mMグリシン−ＨＣｌ緩衝液５ml（緩衝液Ｂ）中で摩砕する。直ちに、摩砕した全材料を、４℃で15分間、10,000×ｇで遠心分離する。
【０２３５】
タバコの種子については、緩衝液Ｂで、緩衝液４mlあたり種子0.1ｇの量で抽出を実施する。
【０２３６】
リパーゼ活性は、Gargouri et al.（1986）の滴定分析法によって、pH-STATを用いて測定するが、ここで用いる基質はトリブチリンである。トリブチリンの乳濁液（乳濁液30mlあたり４ml）は、胆汁塩（1.04g/l)、ウシアルブミン（0.1g/l)およびＮａＣｌ（９g/l)の存在下で渦流として調製する。分析は、リパーゼの作用下で遊離された酪酸の、37℃で5.5に調整したpHでの炭酸ナトリウムの溶液による中和を含む。１単位のリパーゼは、最適のpH条件下（5.5）、37℃で１分間に１μMの脂肪酸の遊離を生じる酵素の量に相当する。天然の（精製された）イヌ胃リパーゼは、タンパク質１mgあたり570単位の比活性を有する。リパーゼ活性は、摩砕した全材料、沈澱または遠心分離上清について測定することができる。
【０２３７】
遠心分離上清（緩衝液Ａ）の総可溶性タンパク質の分析は、Bradford（1976）の方法によって実施する。
【０２３８】
遠心分離上清に対するサンドイッチＥＬＩＳＡ試験［Carriere et al.,1993］も、天然の抗ＤＧＬポリクローナル抗体の２集団を用いて実施する。第一の集団は、ヒト胃リパーゼと反応し、Affigel 10のカラムに接合したヒト胃リパーゼに対する全抗血清を用いて親和性によって精製しておいた、抗体を含む［Aoubala et al., 1993］。これらの抗体を用いて、ＥＬＩＳＡプレートのウェルを１μg/mlの濃度で被覆する。第二の集団は、ヒトリパーゼを認識しない抗体を含む。次いでこれらを、Sepharoseのカラムで精製し、プロテインＡに結合させ、次いでビオチンに結合させる。抗体の固着は、その酵素活性が基質のｏ−フェニレンジアミンを用いて立証される、ストレプトアビジン／ペルオキシダーゼ複合体という間接的手段によって検出する。得られた結果は、定性的な値であり、記号＋および−を用いて記録する。抽出緩衝液にＣＨＡＰＳ型の界面活性剤（３−（３−コールアミドプロピル）ジメチル−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（Sigma)を加えることによって、抽出の収率を向上させることができる。実際に、この場合は、上清での抽出収率は、約100％まで上昇する（表１を参照されたい）。
【０２３９】
【表２】
2007325590.tif 000003
【０２４０】
ｂ）植物シグナルペプチドによる発現；pBIOC25およびpBIOC26で形質転換したタバコの葉および種子に対する分析；ＥＬＩＳＡ試験
Xanthiの遺伝子型の98例のＴ０の植物（15〜20葉期）で得られた結果を表２に示す。分析はすべて、遠心分離前の葉または種子の摩砕混合物に対して実施した。各構築物について、測定した活性は、形質転換体により広範囲の変動性を示す。植物の約20％は、活性が皆無であるか、または検出するには弱過ぎる活性を有する。平均活性および最大活性を表２に示す。
【０２４１】
総タンパク質の量は、３構築物についてほぼ同じであって、平均が、葉ではFW（初期重量）１ｇあたり７および８mgであり、種子ではFW１ｇあたり34、31および38mgである。
【０２４２】
構築物pBIOC26で形質転換した葉での平均リパーゼ活性は、34U/g FW、すなわち総タンパク質については0.8％の発現である。種子では、平均活性は36U/g FW、すなわち0.2％である。形質転換体の一つで得られた最大活性は、146U/g FW（葉；発現2.5％）、および148U/g FW（種子；発現0.7％）である。
【０２４３】
構築物pBIOC25で形質転換した植物で分析した酵素活性も、同様である。葉での平均活性は、34U/g FW（発現0.8％）であり、最大活性は134U/g FW（総タンパク質の３％）である。種子では、平均活性は42U/g FW（0.3％）であり、最大活性は159U/g FW（１％）である。
【０２４４】
構築物pBIOC29で形質転換した植物については、葉では活性が全く検出されない（種子特異的プロモーター）。種子では、平均活性は12U/g FW（発現0.1％）であり、最大活性は137U/g FW（0.7％）である。
【０２４５】
同じ形質転換事象の葉および種子での発現は、概して、良好な相関関係を示す。
【０２４６】
ＥＬＩＳＡ試験の結果も、酵素活性の分析のそれと一致する。すなわちリパーゼ活性を有する植物は、ＥＬＩＳＡ試験で陽性の結果を与える。
【０２４７】
これらの同じ植物でその後得られた結果は、リパーゼ活性が植物の発生の過程で変異できることを示す。実際に、総タンパク質に関してその発現が12〜15葉期で３％であった植物は、その後の分析の際に６％の発現を示した（開花したより年長の植物）。
【０２４８】
【表３】
2007325590.tif 000004
【０２４９】
FW：初期重量；最小：最小のものを発現する形質転換事象について得られた値；最大：最大のものを発現する形質転換事象について得られた値；ｎ：分析した形質転換事象の数。
【０２５０】
ｂ）ＲＧＬのシグナルペプチドによる発現；タバコの葉でのリパーゼ活性の分析
XanthiおよびpBD6の遺伝子型の44例のＴ０の植物（15〜20葉期）で得られた結果は、下記のとおりである：
分析はすべて、遠心分離前の葉の摩砕混合物に対して実施した。測定された活性は、形質転換体により広範囲の変動性を示す。植物の約20％は、活性が皆無であるか、または検出するには弱過ぎる活性を有する。構築物pBIOC41で形質転換した葉での平均リパーゼ活性は、遺伝子型Xanthiについては38U/g FWであり、遺伝子型PBD6については48U/g FWである。最大活性は、それぞれ152および226U/g FWである。
【０２５１】
IX．トランスジェニックトマト植物でのイヌ胃リパーゼの発現の分析
ａ）プロトコル
トマトの葉および果実からのリパーゼの抽出のプロトコルは、タバコの葉について記載したのと同様であるが、新鮮材料１ｇを緩衝液Ｂ４mlに溶かす点が異なる。リパーゼ活性は、タバコの葉について記載したとおりに測定する。
【０２５２】
ｂ）トマトの果実での分析
一次形質転換体30個の果実を分析した。
【０２５３】
果実で分析したリパーゼ活性は、同じ形質転換体に対する果実に応じて変動性である。それは、試験した構築物（pBIOC25またはpBIOC26)とは無関係に、熟した果実については５U/g FW、未熟な果実については35U/g FWという平均である。
【０２５４】
果実の熟成の間に、活性が低下することに注目しなければならない。例えば、与えられた一次形質転換体について、リパーゼ活性は、直径が10mmの緑色の果実については132U/g FW、直径が33mmの赤−緑色の果実については44U/g FW、そして直径が45mmの赤色の果実については36U/g FWである。
【０２５５】
Ｘ．組換えＤＧＬの「ウエスタン」型の免疫検出
ａ）トランスジェニックタバコ、およびアブラナの葉と種子とで発現したＤＧＬ
ａ．１）植物のシグナルペプチドによる発現；pBIOC25、pBIOC26およびpBIOC29によって形質転換したタバコ、ならびにアブラナの葉および種子での免疫検出
イヌ胃リパーゼについての「ウエスタン」型の免疫検出実験（「ウエスタンブロット」）［Renart and Sandoval, 1984］を、緩衝液Ａおよび緩衝液Ｂで抽出したタバコの葉、ならびにタバコおよびアブラナの種子のタンパク質に対して実施した（上記の抽出プロトコルを参照されたい）。これらの実験を実施するために、抽出したタンパク質（サンプルあたり30μgの総タンパク質）を、初めに、Laemmli U.K.(1970)の手法に従って、12.5％の変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、次いで、ニトロセルロースメンブランに移す。モルモットで得られた抗イヌリパーゼポリクローナル抗体をプローブとして用い、アルカリホスファターゼで標識したモルモットの抗ＩｇＧ抗体を用いて、検出を実施する。
【０２５６】
対照タンパク質は、天然のイヌ胃リパーゼであって、約50kDaの見かけ分子量での単一のバンドの形態で移動する（ＬＣ、図６）。イヌ胃リパーゼの移動は、形質転換しなかったタバコの葉の抽出物の存在下では、僅かに抑えられる（図６、ＬＣ＋Ｔ）。
【０２５７】
形質転換しなかったタバコおよびアブラナの葉と種子とのタンパク質抽出物では、バンドが全く検出されない。タバコの葉で生産されたリパーゼは、２本のバンドの形態をなす。定量的に最大であるバンドは、約37kDaの見かけ分子量を有し、上記ポリペプチド（Δ54）に相当する。細い方のバンドは、約49kDaの見かけ分子量を有し、上記ポリペプチド（Δ４）に相当する（図６、Ｆ）。種子のタンパク質抽出物では、より低分子量のバンドのみ視認できる（図６、ＧＴおよびＧＣ）。
【０２５８】
ａ．２）ＲＧＬのシグナルペプチドによる発現；pBIOC41で形質転換したタバコの葉および種子での免疫検出
緩衝液Ｂで抽出したタバコの葉および種子のタンパク質に対して（上記抽出プロトコルを参照されたい）、ウエスタンブロット［Renart and Sandoval、1984］を実施した。抽出したタンパク質を、初めに、Laemmli (1970)の手法に従って変性ポリアクリルアミドゲル(SDS-PAGE)上で分離し、次いで、ニトロセルロースメンブランに移す。モルモットで得られた抗イヌリパーゼポリクローナル抗体をプローブとして用い、アルカリホスファターゼで標識した抗モルモット抗体を用いて、検出を実施する。
【０２５９】
タバコの葉のウエスタンブロットの例を図７に示す。対照タンパク質は、イヌ胃リパーゼであって、約50kDaの見かけ分子量での単一のバンドの形態で移動する。形質転換しなかったタバコの葉のタンパク質抽出物では、バンドが全く検出されない（Ｔ）。葉の抽出物で生産されたリパーゼは、約48〜49kDaの見かけ分子量での主バンドの形態をなし、上記ポリペプチド（Ｄ４）に相当する。
【０２６０】
構築物pBIOC41で形質転換したタバコの種子では、組換えリパーゼは、葉でのそれと同じ形態をなす。
【０２６１】
ｂ）形質転換したタバコの葉のタンパク質抽出物中のＤＧＬ；脱グリコシル化の実験
脱グリコシル化実験のためのタンパク質抽出のプロトコルは、下記のとおりである：葉0.5g（初期重量）を、液体窒素中で、次いで４℃で、変性緩衝液（１％β−メルカプトエタノール、25mMＥＤＴＡおよび１％ＳＤＳを加えた100mMリン酸緩衝液、pH7.5）１ml中で摩砕する。摩砕した材料を、４℃で15分間、10,000×ｇで遠心分離する。タンパク質を変性させるため、上清を100℃で５分間インキュベーションして次いで10,000×ｇで２分間遠心分離する。次いで、上清を脱グリコシル化緩衝液（１％β−メルカプトエタノール、25mMＥＤＴＡ、0.1％ＳＤＳおよび１％オクチルグリコシドを加えた100mMリン酸緩衝液、pH7.5）で10倍に希釈する。酵素（Ｎ−グリコシダーゼＦ、ＰＮＧアーゼ、Boehringer）を、上清100μlあたり１Uの量で加える。酵素なしの対照を各サンプルについて実施する。対照タンパク質（イヌまたはウサギの胃リパーゼ）の脱グリコシル化を、同じ条件下で実施する。種々のタンパク質サンプルを、室温で８時間インキュベーションする。次いで、先行段落で述べたとおり、ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によってタンパク質を分離し、ニトロセルロースメンブランに移す。
【０２６２】
「ウエスタンブロット」の結果によれば、対照として用いた胃リパーゼは、約50kDaの見かけ分子量を有する。脱グリコシル化の後では、その見かけ分子量は、わずか約43kDaである。
【０２６３】
上記の条件下のＰＮＧアーゼなしでインキュベーションした後では、タバコの葉で生産されたリパーゼは、見かけ分子量が49kDa（ポリペプチド（Δ４））、37kDa（ポリペプチド（Δ54））および28kDaの３本のバンドの形態で現われる。分子量28kDaのバンドは、疑いもなく、室温で８時間のインキュベーションの際に生じたタンパク質分解の結果である。脱グリコシル化の後、３本のバンドの分子量は約１〜２kDa減少し、タバコの葉で生産されたタンパク質はグリコシル化されていることを示す。
【０２６４】
ｃ）トランスジェニックトマトの葉および果実で発現されるＤＧＬ
緩衝液Ｂで抽出したトマトの葉および果実のタンパク質で（上記の抽出プロトコルを参照されたい）、イヌ胃リパーゼについての「ウエスタン型」の免疫検出実験を実施した。これらの実験を実施するため、抽出したタンパク質（葉および果実について、それぞれ15μgおよび６μgの総可溶性タンパク質）を、段落Ｘ．ａ）に記載のとおりに変性性ポリアクリルアミドゲル上で分離する。
【０２６５】
対照タンパク質は、天然胃リパーゼ（トラック４、図８）であって、約50kDaの見かけ分子量での単一バンドの形態で移動する。
【０２６６】
形質転換しなかったトマトの葉および果実のタンパク質抽出物では、バンドが全く検出されない。
【０２６７】
トマトの葉および果実で生産されたリパーゼは、いずれの構築物（pBIOC25またはpBIOC26)を用いても、２本のバンドの形態をなす。定量的に最大であるバンドは、約37kDaの見かけ分子量を有し、上記ポリペプチド（Δ54）に相当する。細い方のバンドは、約49kDaの見かけ分子量を有し、上記ポリペプチド（Δ４）に相当する（図８）。
【０２６８】
XI．植物からのイヌ胃リパーゼの精製
ａ）タバコの葉からのＤＧＬの精製
タバコの葉で生産されたイヌ胃リパーゼの活性を、pHスタット（Mettler-Toledo-DL25)を用いて、調節されたpHを5.5に、温度を37℃に保ち、滴定分析法によって決定するが、基質としてはトリブチリンを用いる：渦流とした0.15MのＮａＣｌの水溶液29ml中に、トリブチリン１mlを乳化する。分析は、リパーゼの作用下で遊離された酪酸を、活発な機械的撹拌によって乳濁液を維持しつつ、0.02N炭酸ナトリウムの添加によって中和することを含む。１リパーゼ単位は、これらのpHおよび温度の条件下で１分間に遊離される脂肪酸１μMに相当する。
【０２６９】
最初のクロマトグラフィー段階の後、Gargouri et al.（1986）が記載した分析に従って、0.15MのＮａＣｌ、２mMタウロデオキシコール酸ナトリウムおよび1.5μMウシ血清アルブミンの溶液29ml中トリブチリン１mlの乳濁液について、分析サンプル0.5mlを用いてリパーゼ活性を証明する。
【０２７０】
凍結乾燥した葉１ｇを、30mlの20mMグリシン緩衝液、pH2.5の中で４℃で摩砕し、混合物を15分間穏やかに撹拌する。浸漬の間、１NのＨＣｌの添加によってpHを2.5に保つ。浸漬の産物を15,000×ｇで５分間遠心分離する。１NのＮａＯＨの添加によって、上清のpHを４に調整する。Miracloth(Calbiochem)による濾過の後、すべての上清を、20mM酢酸ナトリウム、pH4.0および20mMＮａＣｌの緩衝液中で平衡化し、10ml（直径1.6cm）の陽イオン交換樹脂カラム（Ｓ-Sepharose Fast Flow樹脂：Pharmacia)に、毎分１mlの流速でかける。２mlの画分を捕集する。上清の通過後、平衡緩衝液40mlでカラムを洗浄する。カラムに保持されたタンパク質を、下記のプロトコルに従って溶離させる：
−リパーゼ活性を含まないタンパク質の第一の組のピークの溶離のための、30分の過程での、20mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.0中の20mMから210mMまでのＮａＣｌの線形勾配で、分析サンプル１mlについて試験を実施する。
−210mMＮａＣｌで20分間のプラトー。
−第二の組のピークの溶離のための、30分の過程での、20mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.0中の210mMから500mMまでのＮａＣｌの線形勾配。分析サンプル0.5mlについて測定されたリパーゼ活性は、この第二の勾配の間に、300〜400mMのイオン強度で溶離される。
【０２７１】
30kDaの分子量限界のOmegacellという濃縮セル（Filtron Technology Corporation）を用いて、活性分画を捕集かつ濃縮する。
【０２７２】
濃縮物を、10mMTris−ＨＣｌ、pH８の緩衝液に対して12時間透析し、次いで、10mMTris−ＨＣｌ緩衝液、pH８で平衡化した陰イオン交換樹脂カラム（直径0.5cmおよび高さ５cmのMonoQ HR5/5：Pharmacia)にかける。分析サンプル0.5mlについて、リパーゼ活性を測定する。流速は毎分１ml、すなわち2.0mPaの圧力に保つ。保持されない画分の溶離、および10mlの10mMTris−ＨＣｌ緩衝液、pH８でのカラムの洗浄の後、０〜400mMＮａＣｌのイオン強度の線形勾配を、60分の過程で適用する。リパーゼ活性は、100mM〜200mMのイオン強度に対して溶離される。
【０２７３】
30kDaの分子量限界のOmegacell濃縮セルを用いて、活性画分を捕集し、濃縮する。濃縮物は、タバコの葉から抽出されたイヌ胃リパーゼの精製された形態を構成する。
【０２７４】
タンパク質濃度は、上清の濃度についてM. Bradford （1976）の方法に従い、最初のイオン交換クロマトグラフィー後の溶液に対してO.H. Lowry(1951)の方法に従って測定する。
【０２７５】
U.K. Laemmli（1970）の手法に従い、変性ポリアクリルアミドゲル(SDS-PAGE、12.5％)上での電気泳動によって、精製の様々な段階を分析する。ポリアクリルアミドゲル上でこのようにして分離されたタンパク質を、一方では、クーマシーブルーでの染色によって検出し、他方では、20mMTrisベース、150mMグリシンおよび20％エタノールの緩衝液中でメンブラン１cm2あたり2.3mAでの半乾式電気転写（Transblot SD、Biorad）の手法によって、ニトロセルロースメンブランに移す。ニトロセルロースメンブランに移された組換えイヌ胃リパーゼを、下記のプロトコルによる免疫検出によって検出する：
−５％の量の脱脂粉乳、および0.2％の量のTween 20を加えたＰＢＳ緩衝液で1/5,000に希釈した、モルモットで得られたイヌ胃抗リパーゼポリクローナル抗体による、室温で１時間の標的タンパク質の標識化、
−１％の量の脱脂粉乳および0.1％の量のTween 20を加えたＰＢＳ緩衝液の、それぞれ10分間の連続する３回の浴中でのメンブランの洗浄、
−１％の量の脱脂粉乳、および0.1％の量のTween 20を加えたＰＢＳ緩衝液で1/2,000に希釈した、ペルオキシダーゼ（Sigma)に結合させた抗モルモット抗体による、室温で１時間の標識化、
−１％の量の脱脂粉乳および0.1％の量のTween 20を加えたＰＢＳ緩衝液の、それぞれ10分間の連続する３回の浴中でのメンブランの洗浄、
−Ｈ2Ｏ2の存在下での、４−クロロ−１−ナフトール（Sigma)に対するペルオキシダーゼの、経時的に安定である青の発色を生じる作用の検出。
【０２７６】
葉で生産されるリパーゼは、約49kDa（ポリペプチド（Δ４））および37kDa（ポリペプチド（Δ54））の２本のバンドの形態をなす。
【０２７７】
ｂ）タバコの葉からのＤＧＬの精製の変法
タバコの葉で生産されたイヌ胃リパーゼの活性を、pHスタット（Mettler-Toledo-DL25)を用いて、Gargouri et al.(1986)が記載した滴定分析法によって決定する。
【０２７８】
短鎖トリグリセリドについての分析は、トリブチリンを基質として用いて実施する：トリブチリン１mlを、0.15MのＮａＣｌ、1.5μMウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および２mMタウロデオキシコール酸ナトリウム（ＮａＴＤＣ）の水溶液29mlに乳濁させる。調節されたpHを5.0に、温度を37℃に保つ。
【０２７９】
分析は、リパーゼの作用下で遊離された酪酸を、活発な機械的撹拌によって乳濁液を維持しつつ、0.02N炭酸ナトリウムの添加によって中和することを含む。
【０２８０】
長鎖トリグリセリドの分析は、30％の精製ダイズ油、1.2％の精製卵リン脂質、1.67％の無水グリセリン（IntralipidTM30％-Pharmacia AB, Stockholm, Sweden)による水性乳濁液を基質として用いて実施する。この懸濁液10mlを、0.15MのＮａＣｌ、30μM ＢＳＡおよび3.5mMＣａＣｌ2の水溶液20mlに乳濁させる。調節されたpHを4.0に、温度を37℃に保つ。
【０２８１】
分析は、リパーゼの作用下で遊離された脂肪酸を、活発な機械的撹拌によって乳濁液を維持しつつ、pHを４から９に跳躍させた後に0.2N炭酸ナトリウムを加えることにより中和することからなる。
【０２８２】
１リパーゼ単位は、各基質について規定されたpHおよび温度の条件下で１分間に遊離される脂肪酸１μMに相当する。
【０２８３】
凍結乾燥した葉２ｇを、60mlの0.2MのＮａＣｌ、pH３中で４℃で摩砕し、混合物を４℃で15分間穏やかに撹拌する。この浸漬の間、１NのＨＣｌの添加によってpHを３に保つ。浸漬の産物（ホモジネート）を10,000×ｇで10分間遠心分離する。Miracloth(Calbiochem)、および0.45μのミリポアフィルターによる濾過の後、すべての上清を、20mM酢酸ナトリウム、0.2MＮａＣｌ、pH３の緩衝液で平衡化した陽イオン交換樹脂カラム（Resource Ｓ、６ml：Pharmacia ：内径16mm×30mm）に、８ml／分（240cm・h-1)の流速で注入する。
【０２８４】
保持されなかった画分の通過後、その容積の30倍の平衡緩衝液でカラムを洗浄する。カラムに保持されたタンパク質は、７カラム容での20mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH３中の0.2M〜0.5MのＮａＣｌの線形勾配で溶離する。４mlの画分を捕集する。
【０２８５】
分析サンプル0.5mlについて測定したリパーゼ活性は、0.35MＮａＣｌのイオン強度で溶離される。
【０２８６】
30kDaの分子量限界のOmegacell濃縮セル（Filtron Technology Corporation）を用いて、活性画分を捕集し濃縮する。
【０２８７】
O. H. Lowry (1951)の方法に従って、タンパク質濃度の測定を実施する。
【０２８８】
ポリアクリルアミドゲルの例、およびニトロセルロースメンブランへのこのゲルの転写と、イヌ胃抗リパーゼ抗体からの検出との結果を示す（図９および１０）が、検出は、活性化剤（ＥＣＬウエスタンブロッティング：Amersham Life Science)の存在下でのルミノールに対するペルオキシダーゼの作用によって、そして記録は、写真フィルム上で行った。
−タンパク質でのグリカン性残渣の存在を、下記のプロトコルに従って決定した：
・ミクロセルロースメンブランへのタンパク質の固定化、
・過ヨウ素酸塩による処理、
・アルカリホスファターゼと結合したストレプトアビジンとの特異的反応、
・アルカリホスファターゼ（Glycotrack Oxford Glylosystem)との発色反応。
グリカン性残渣のメンブラン検出の例を示す（図１１）。
画分の純度は、高性能液体クロマトグラフィーによって確保する。
クロマトグラフはWaters 625 LCである。
ダイオードアレー検出器はWaters 991である。
カラムはVydac C4である。
溶離条件：
【０２８９】
【表４】
2007325590.tif 000005
【０２９０】
緩衝液Ａ：89.9％Ｈ2Ｏ、１０％アセトニトリル、0.1％トリフルオロ酢酸。
緩衝液Ｂ：100％アセトニトリル。
【０２９１】
【表５】
2007325590.tif 000006
【０２９２】
【表６】
2007325590.tif 000007
【０２９３】
ｃ）アブラナの種子からのＤＧＬの精製
アブラナの種子で生産された組換えＤＧＬの活性を、葉からの抽出の場合と同じ方法で決定する。
【０２９４】
アブラナの種子10ｇを、液体窒素中でよく摩砕する。得られた粉末を、ヘキサンを用い、12時間の穏やかな撹拌下、４℃での第一の浸漬によって脱脂する。全体をデカントし、ヘキサンを除去する。それぞれ４℃での1/2時間の穏やかな撹拌下で、粉末をヘキサン100mlで２回洗浄する。デカントによってヘキサンを除去する。ロータリーエバポレーター（Heidolph 94200）内で粉末を乾燥する。脱脂した粉末は、-20℃で貯蔵する。
【０２９５】
ＤＧＬの抽出は、脱脂した粉末から、pH３（１NＨＣｌ）のＮａＣｌの0.2M水溶液中に、粉末0.1ｇにつき水溶液２mlの割合で４℃で30分間浸漬することによって実施する。浸漬から得られた材料を、10,000×ｇで４℃で10分間遠心分離する。
【０２９６】
ペレットを除去する。上清が種子抽出物を構成する。
【０２９７】
種子抽出物を、10mM酢酸ナトリウム、pH４、140mMＮａＣｌ、３mMＫＣｌの緩衝液に対して透析し、次いで、樹脂（ヒドラジドAvidgel：Bioprobe International, Inc.）に結合させた、モルモットから得られたイヌ胃抗リパーゼポリクローナル抗体で構成した免疫アフィニティーカラムにかける。
【０２９８】
樹脂／種子抽出物の接触は、穏やかな撹拌下、４℃で30分間とする。次いで、樹脂を10カラム容の緩衝液、すなわち10mM酢酸ナトリウム、pH４、150mMＮａＣｌ、３mMＫＣｌで洗浄する。ＤＧＬを５カラム容の緩衝液、すなわち0.2Mのグリシン、pH2.8、150mMＮａＣｌで溶離させる。捕集した画分は、１カラム容に等しい体積を有し、体積比1/20の１M Tris緩衝液、pH９を含有する。変性性培地中のポリアクリルアミドゲル上の電気泳動による分析（図１２を参照されたい）は、約37kDaの分子量のタンパク質を示す。
【０２９９】
XII．脂肪酸エステルの合成
試験は、形質転換しなかったアブラナの種子で実施し、与えたリパーゼは：
−固定化酵素の調製品の形態（リポザイムlipozyme（Novo))、または遊離形態（ウサギ胃リパーゼ（JO 4002)）のいずれか、または
−イヌ胃リパーゼの遺伝子で形質転換したタバコの種子の形態（タバコＴ１４−４４、0.85％の発現）
である。
【０３００】
エステル化反応は、撹拌ベンチ（250rpm)上に置いた、密封するよう栓をしたガラス瓶内で、37℃で16時間実施する。用いた有機溶媒はヘキサンであって、その中で、脂肪酸は可溶性である。アブラナの種子に含まれるトリアシルグリセロールの理論量に対する化学量で、メタノールを加える。
【０３０１】
アブラナの脂肪酸の主成分はオレイン酸であり、選んだ参照用対照も、オレイン酸のメチルエステルである。合成は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって追跡する。移動溶媒は、ヘキサン、ジエチルエーテルおよび水の混合物（70:10:1）である。プレートでの検出は、エタノール中の硫酸（５％）を吹付けた後、高温条件下で実施する。
【０３０２】
第一の試験では、メタノール27μl（0.66mmol）およびリポザイム0.02ｇをナタネ油0.2ｇ（0.22mmol）に加え：参照用オレイン酸メチルのレベルで出現したスポットは皆無であった（図１３、カラム２）。
【０３０３】
第二の試験では、ナタネ油を、乾燥状態で摩砕したアブラナの種子0.5ｇに置き換え、ヘキサン１mlを加える：メチルエステルが合成される（図１３、カラム５）。
【０３０４】
続く試験では、上記の条件を下記の変更とともに反復する：リポザイムの量を0.006ｇに減らし、リポザイムをウサギ胃リパーゼ（JO 4002を0.007ｇ）に置き換える。オレイン酸メチルは、リポザイムの存在下で合成されるが、JO 4002の存在下では合成されない（図１４、カラム２）。
【０３０５】
最終的に、最後の試験では、形質転換したタバコの種子によって、リパーゼを与える（タバコの種子１ｇ）。メチルエステルの特徴的なスポットが出現する（図１５、カラム３）。
【０３０６】
結論として、上記の結果は、アブラナの種子の抽出物、アルコール、およびトランスジェニックタバコが生産した組換えイヌ胃リパーゼを一緒にするならば、生物燃料として利用できるメチルエステルの合成を導くエステル化反応が得られることを立証する。
【０３０７】
【表７−１】
2007325590.tif 000008
【０３０８】
【表７−２】
2007325590.tif 000009
【０３０９】
【表７−３】
2007325590.tif 000010
【０３１０】
【表７−４】
2007325590.tif 000011
【０３１１】
【表７−５】
2007325590.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【０３１２】
【図１】−図１：ＤＧＬをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列。
【図２】−図２：ＤＧＬのアミノ酸配列。
【図３】−図３：ＤＧＬをコードするｃＤＮＡに由来する、図２に示すＤＧＬをコードするヌクレオチド配列。
【図４】−図４：ＨＧＬをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列、およびＨＧＬのアミノ酸配列。
【図５】−図５：ＨＧＬのアミノ酸配列。
【図６】−図６：構築物pBIOC26、pBIOC25およびpBIOC29 で形質転換したXanthiのタバコの葉および種子、ならびにアブラナの種子によって生産された組換えポリペプチドの免疫検出；Ｅ：分子量範囲；ＬＣ：イヌ胃リパーゼ；Ｆ：構築物pBIOC25で形質転換した、タバコの葉、およびＧＴ：タバコの種子；ＧＣ：構築物pBIOC29で形質転換したアブラナの種子；Ｔ：形質転換しなかったタバコの葉。
【図７】−図７：構築物pBIOC25 およびpBIOC41で形質転換したタバコの葉によって生産された組換えポリペプチドの免疫検出；Ｅ：分子量範囲；ＬＣ：イヌ胃リパーゼ；１および３：構築物pBIOC41で形質転換したタバコの葉；２：構築物pBIOC25で形質転換したタバコの葉；Ｔ：形質転換しなかったタバコの葉。
【図８】−図８：構築物pBIOC25およびpBIOC26で形質転換したトマトの葉および果実によって生産された組換えポリペプチドの免疫検出：Ｔ１：形質転換しなかったトマトの果実、１および３：形質転換したトマトの果実、２：形質転換したトマトの葉、Ｒ：分子量範囲、ＬＣ：イヌ胃リパーゼＴ２：形質転換しなかったトマトの葉。
【図９】−図９：変性性培地でのポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上での電気泳動による分析。１：アブラナ種子の抽出物。２：タバコの葉から生産された組換えイヌ胃リパーゼ。３：天然のイヌ胃リパーゼ。４：分子量範囲。
【図１０】−図１０：ニトロセルロースメンブランへの転写後の先行分析の免疫検出：１：天然のイヌ胃リパーゼ。２：タバコの葉から生産された組換えイヌ胃リパーゼ。３：アブラナの種子の抽出物。
【図１１】−図１１：ニトロセルロースメンブランへの移転後のポリアクリルアミドゲルからのグリカン性残渣の存在下での免疫検出：１：アブラナ種子の抽出物。２：タバコの葉から生産された組換えイヌ胃リパーゼ。３：天然のイヌ胃リパーゼ。
【図１２】−図１２：アブラナの種子で生産されたｒ−ＤＧＬの免疫精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：１：天然のイヌ胃リパーゼ。２：組換えイヌ胃リパーゼ。３〜６：免疫精製カラムから溶離された保持されなかった画分。
【図１３】−図１３：ＴＬＣプレートでの検出；１：ナタネ油、酵素なし；２：ナタネ油＋リポザイム；３．オレイン酸のメチルエステル；４：アブラナの種子、酵素なし；５：アブラナの種子＋リポザイム。
【図１４】−図１４：ＴＬＣプレートの検出；１および４：酵素なしのアブラナの種子；２：アブラナの種子＋JO4002；３：オレイン酸のメチルエステル；５：アブラナの種子＋リポザイム。
【図１５】−図１５：ＴＬＣプレートでの検出；１：モノオレイン、ジオレイン、トリオレイン；２：オレイン酸のメチルエステル；３：アブラナの種子＋形質転換したタバコの種子。
【図１】
2007325590.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2007325590.tif 000020
【図９】
2007325590.tif 000021
【図１０】
2007325590.tif 000022
【図１１】
2007325590.tif 000023
【図１２】
2007325590.tif 000024
【図１３】
2007325590.tif 000025
【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年6月8日(2007.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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