(57)【要約】【課題】  環境中に存在する個々の微生物の種類や発現量を特定することなく、細菌叢全体としての遺伝子発現パターンを解析することにより、当該細菌叢の内部又は外部環境の評価を行う。【解決手段】２種以上の細菌に由来するゲノムDNAを断片化して得られるゲノムDNA断片について、その個々の塩基配列を含むプローブを固定化した固相化担体を用いて、解析対象試料中の細菌叢に由来するゲノムDNAの出現パターンを解析し、その発現パターンに基づき前記解析対象試料中の細菌叢の内部及び／又は外部の状態を分析する。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
解析対象試料中の細菌叢を分析する方法であって、
２種以上の細菌に由来するゲノムDNAを断片化して得られるゲノムDNA断片について、その個々の塩基配列を含むプローブを固定化した固相化担体を用いて、解析対象試料中の細菌叢に由来するゲノムDNAの出現パターンを解析し、その出現パターンから前記解析対象試料中の細菌叢の内部及び／又は外部の状態を分析することを特徴とする方法。
【請求項２】
以下の工程を含む、請求項１に記載の方法：
ａ）２種以上の細菌に由来するゲノムDNAを断片化して得られるゲノムDNA断片について、その個々の塩基配列を含む核酸プローブが固定化された固相化担体を用意し、
ｂ）前記固相化担体に解析対象試料中の細菌叢に由来するゲノムDNAから調製した標識DNAをハイブリダイズさせ、
ｃ）得られる信号強度に基づき、解析対象試料中の細菌叢に由来するゲノムDNAの出現パターンを解析し、その発現パターンから前記解析対象試料中の細菌叢の内部及び／又は外部の状態を分析する。
【請求項３】
前記工程ｃ）で得られた解析対象試料中の細菌叢に由来するゲノムDNAの出現パターンと、既知の条件下での細菌叢に由来するゲノムDNAの出現パターンとの比較解析工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記比較解析工程が、既知の条件下での細菌叢に由来するゲノムDNAの出現パターンと当該細菌叢の内部及び／又は外部の状態に関する情報を連携させて格納したデータベースを用いて行われることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ゲノムDNAを断片化して得られるDNA断片が25bp〜200kbの塩基長であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
標識DNAが、mRNAを鋳型として調製した標識cDNAであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
固相化担体が、マイクロアレイ、チップ、メンブレンフィルター、又はビーズである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法を利用した、腸内細菌叢の評価方法。
【請求項９】
２種以上の細菌に由来するゲノムDNAを断片化して得られるゲノムDNA断片について均一化処理を行った後、その個々の塩基配列を含むプローブを固定化した固相化担体を用いることを特徴とする、請求項８に記載の腸内細菌叢の評価方法。
【請求項１０】
２種以上の細菌に由来するRNAに由来するcDNAについて均一化処理を行った後、その個々の塩基配列を含むプローブを固定化した固相化担体を用いることを特徴とする、請求項８に記載の腸内細菌叢の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌叢の分析方法に関する。より詳しくは、解析対象試料に含まれる細菌叢のゲノムDNAパターンを解析することにより、当該細菌叢やこれをとりまく環境条件を分析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
土壌のような環境には多種類の細菌が常在しており、常在微生物叢を形成している。また、人を含めた動物の腸内にも同様に多種類の細菌が常在しており、これらは腸内細菌叢と呼ばれている。一般的な細菌の分析方法は寒天培地上に生育する微生物コロニーの性状分析によって行われるが、現在培養可能な微生物の割合は１％程度と推定され、ほとんどの微生物種は培養困難であることから細菌叢の実態は明らかではない。そのため、培養法による細菌叢の分析では培養可能な特定の微生物種のみが評価対象となっていた。
【０００３】
近年分子生物学の発展により生物が共通に持つリボゾーム遺伝子の配列を利用した分析方法が利用されるようになった。細菌叢分析方法の一つとしてPCR法により増幅したリボゾーム遺伝子を各微生物のリボゾーム遺伝子の塩基組成差を利用して分離解析する変性勾配ゲル電気泳動法（DGGE法）がある。また、別法として同様にPCRにより増幅したリボゾーム遺伝子を制限酵素の認識特異性を利用して分離するT-RFLP法がある。これらの方法はPCR法を用いることにより微生物の培養過程が不要となるため、培養法による分析と比較してより多くの微生物種情報が得られる。しかし、PCR法は使用するプライマーの配列と微生物のDNA配列の一致度や、微生物DNA配列の塩基組成といった制御不能の要因により増幅効率に偏りが生じるという問題がある。
【０００４】
これに対し、多数の遺伝子の解析を達成するマイクロアレイやチップによる分析方法も開発されている。細菌叢の分析では主に多種の微生物に対応した各々のリボゾーム遺伝子を固定化したチップ（特許文献１参照）や、ゲノムDNA又はcDNAを固定化したアレイ（特許文献２参照）の利用が検討されている。しかし、これらの方法はリボゾーム遺伝子やゲノムDNA（又はcDNA）が既に明らかになっている微生物にしか適用できないという問題がある。
【０００５】
また、既知の環境浄化微生物が共通して発現する遺伝子を解析し、これを固定化したアレイを用いて、新たな環境浄化微生物の探索や最適浄化条件の検討も提案されている（特許文献３参照）。しかし、この方法は既知の環境浄化微生物に関する蓄積されたゲノム情報とその解析が前提条件となる。
【０００６】
cDNA配列のプローブ化には各々の遺伝子配列情報及びそれらの遺伝子配列を有するDNA断片の単離が必要となる。またオリゴヌクレオチドプローブの設計にはORF配列情報やEST配列情報、より望ましくはゲノム配列情報が必要であり、これらの配列情報の取得には大きなコストが必要であるため、マイクロアレイの利用可能な生物種は限られている。
【０００７】
一方、近年ランダムゲノムライブラリーを利用したDNAアレイの作製について報告がなされた（非特許文献１及び２参照）。これらは、作製したゲノムライブラリーからPCRによって基板に固定するDNA断片を調製し、DNAアレイを作製するものである。これらのアレイは、いずれも特定の微生物の遺伝子解析を目的としたもの（単一の生物のゲノムDNAを材料に用いたもの）であって、“複数の菌の混合物”を解析対象としたものではない。
【０００８】
【特許文献１】特開２００１−１４９０７３
【特許文献２】特開２０００−２５３８８６
【特許文献３】特開２００３−５１７８４３
【非特許文献１】Zeigler et al., Mol. Microbiol. 48:1089-1105, 2003
【非特許文献２】Parro et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:7883-7888
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
マイクロアレイの開発により、環境中に存在する微生物の網羅的な解析が可能となった。しかしながら、上述のとおり細菌叢を構成する微生物の種類や特定微生物の発現量を個別に解析することは現実的ではない。本発明の課題は、環境中に存在する個々の微生物の種類や存在比を特定することなく、細菌叢全体としてのゲノムDNA出現パターンを解析することにより、当該細菌叢をとりまく環境の評価を行うことにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するための手段として、発明者らは以下の方法を提唱する。
【００１１】
まず、特定の環境条件における細菌叢から抽出したDNAをもとにゲノムライブラリーを作製し、このライブラリーに由来する核酸プローブを固定したマイクロアレイを作製する。このアレイに解析対象である環境中から抽出したDNAより調製した標識核酸をハイブリダイズさせ、アレイ上の各固定プローブからの信号強度に基づき、ゲノムDNA出現パターンを解析する。この出現パターンを種々の環境下の細菌叢について解析し、データベース化することにより、解析対象とする細菌叢の内部及び／又は外部の状態を評価する。
【００１２】
すなわち、本発明は、解析対象試料中の細菌叢を分析する方法であって、２種以上の細菌に由来するゲノムDNAを断片化して得られるゲノムDNA断片について、その個々の塩基配列を含むプローブを固定化した固相化担体を用いて、解析対象試料中の細菌叢に由来するゲノムDNAの出現パターンを解析し、その出現パターンから前記解析対象試料中の細菌叢の内部及び／又は外部の状態を分析することを特徴とする細菌叢の分析方法に関する。
【００１３】
ある実施形態において、前記方法は以下の工程を含む：
ａ）２種以上の細菌に由来するゲノムDNAを断片化して得られるゲノムDNA断片について、その個々の塩基配列を含む核酸プローブが固定化された固相化担体を用意し、
ｂ）前記固相化担体に解析対象試料中の細菌叢に由来するゲノムDNAから調製した標識DNAをハイブリダイズさせ、
ｃ）得られる信号強度に基づき、解析対象試料中の細菌叢に由来するゲノムDNAの出現パターンを解析し、その出現パターンから前記解析対象試料中の細菌叢の内部及び／又は外部の状態を分析する。
【００１４】
また別な実施形態において、前記方法は、工程ｃ）で得られた解析対象試料中の細菌叢に由来するゲノムDNAの出現パターンと、既知の条件下での細菌叢に由来するゲノムDNAの出現パターンとの比較解析工程をさらに含む。
【００１５】
この比較解析工程は、既知の条件下での細菌叢に由来するゲノムDNAの出現パターンと当該細菌叢の内部及び／又は外部の状態に関する情報を連携させて格納したデータベースを用いて行われることが好ましい。
【００１６】
本発明の方法において、ゲノムDNAを断片化して得られるDNA断片核酸プローブは25 bp〜200 kb塩基長であることが好ましい。
【００１７】
また、調製される標識DNAとしては、mRNAを鋳型として調製した標識cDNAを用いることもできる。
【００１８】
本発明で用いられる固相化担体の形態や形状は、特に限定されず、ガラス、金属、シリコン、合成樹脂等を基板としたマイクロアレイ、チップ、メンブレンフィルター、又はビーズ等を採用することができる。
【００１９】
前記固相化担体は、２種以上の細菌に由来するゲノムDNAを断片化して得られるゲノムDNA断片について均一化処理を行った後、その個々の塩基配列を含むプローブを固定化したものであってもよいし、あるいは、２種以上の細菌に由来するRNAに由来するcDNAについて均一化処理を行った後、その個々の塩基配列を含むプローブを固定化した固相化担体であってもよい。
【００２０】
本発明の方法は、後述するように、腸内細菌叢の評価や汚水処理プラントの細菌叢の評価に利用することができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、環境中に存在する個々の微生物の種類や存在比をあらかじめ特定することなく、細菌叢や当該細菌叢をとりまく環境の分析・評価が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
１．細菌叢ゲノムアレイの作製方法
図１を参照しながら、本発明にかかる細菌叢ゲノムアレイの作製方法について説明する。目的とする細菌叢のゲノムDNAを定法に従って抽出単離する。単離したゲノムDNAをそれぞれ25bp〜200kb塩基長、好ましくは500bp〜2000bp塩基長程度の長さに、切断し断片化する。ゲノムDNAの切断は、化学的方法、酵素的方法、物理的方法のいずれであってもよい。ゲノムDNA断片は、定法に従い適当なベクターに連結した後、大腸菌等にクローニングして、ゲノムDNAライブラリーを作製する。ゲノムDNAライブラリー中の各ゲノムDNA断片はベクタープライマーを用いてPCR増幅し、精製した後、適当な基板（ガラス、金属等）上にスポッター等を用いて固定化するか、あるいはPCR増幅を行うことなくプラスミド、コスミド、フォスミド、BAC等のゲノムDNAライブラリー作製に用いたベクターに連結した状態の各ゲノム断片を適当な基板（ガラス、金属等）上にスポッター等を用いて固定化する。
【００２３】
なお、アレイ上に固定するゲノムDNAライブラリーの元となるDNAは複数の環境条件における細菌叢から抽出したDNAの混合物であってもよい。さらに、ライブラリー作製において各微生物のDNA比を縮小するために事前に均一化処理を行うことも可能である。
【００２４】
２．細菌叢ゲノムアレイを用いた細菌叢の分析方法
図２及び図３を参照しながら、本発明にかかる細菌叢ゲノムアレイを用いた細菌叢の分析方法について説明する。
【００２５】
（１）  まず、試料（細菌叢）より定法に従いゲノムDNAを抽出単離する。単離したゲノムDNAを鋳型として、標識化ランダムプライマーとDNA合成酵素を用いて標識（例えば、Cy3又はCy5）されたDNAを作製する。標識DNAは精製した後、前項で作製した細菌叢アレイとハイブリダイゼーションさせ、得られる信号強度（蛍光強度）パターンをスキャナーで読み取り解析する。この信号強度は、２蛍光染色法を利用し、解析対象試料と適当な参照試料を異なる色素で標識した後マイクロアレイ上で競合ハイブリダイゼーションして得られる相対強度であってもよい。またスキャナーで読み取った信号強度は必要に応じて、誤差の調整や試料毎のばらつきの正規化を行ってもよい。さらに、信頼性限界ラインを特定して、相関性の低いデータを除いてもよい。なお、解析対象である環境中の細菌叢は、アレイを構成するゲノムライブラリーの元となった細菌叢と同一の構成を有する必要はなく、類似することが予想されればよい。
【００２６】
（２）  上記の手順に従い、種々の環境条件における細菌叢のDNA出現パターンを解析し、このDNA出現パターンを当該細菌叢の内部及び／又は外部の状態に関する特徴情報と連携（リンク）した形でデータベース（「細菌叢アレイデータベース」）に格納する。
【００２７】
（３）  解析対象試料（試験細菌叢）より、（１）と同様の方法でゲノムDNAを抽出単離し、前項で作製した細菌叢アレイを用いて信号強度パターンを解析する。この信号強度パターンを細菌叢アレイデータベース内に蓄積されているデータと比較解析し、類似の信号強度パターンとその特徴情報の抽出を行うことにより、解析対象試料中の細菌叢やこれをとりまく環境条件を推定する。
【００２８】
３．細菌叢ゲノムアレイの利用
以下に、本発明を利用したヒト腸内細菌叢の分析方法、及び汚水処理プラント等の細菌叢分析方法について概説する。
【００２９】
（１）腸内細菌叢の分析方法
便等より回収したヒト細菌叢から細菌叢マイクロアレイを作製する。この目的においては、細菌叢マイクロアレイ作製に用いる細菌叢由来のDNAは個人、年齢、性等の要因による微生物種の偏りが少ないことが望ましい。そのため、複数人の細菌叢由来DNAの混合物、より望ましくは先に述べた年齢や性を満遍なく包含する細菌叢由来DNAより細菌叢マイクロアレイを作製する。作製した細菌叢マイクロアレイに対し、検体となる個人の細菌叢由来DNAより合成した標識核酸をハイブリダイズさせることにより各個人の細菌叢パターンを得る。得られた細菌叢パターンを個人の年齢、性別、健康状態等の生体情報と共にデータベース化し、生体情報を特徴付ける細菌叢のパターンを抽出する。データベース化の後は、新たな検体から得られた細菌叢パターンをデータベースの細菌叢パターンと比較することにより被験者の健康状態を推察することが可能になる。腸内細菌は、被験者の健康状態のみならず、菜食・肉食等の食事状態、年齢、人種を把握する上でも重要なツールとなる。
【００３０】
（２）汚水処理プラント等の細菌叢分析方法
汚水処理プラントより回収した細菌叢から細菌叢マイクロアレイを作製する。この時、処理能力の高い細菌叢のみではなく処理能力に異常が見られるプラントから回収した細菌叢に由来する細菌叢DNAを混合して細菌叢マイクロアレイを作製することが好ましい。作製した細菌叢マイクロアレイに対し、プラントから回収した細菌叢由来DNAから合成した標識核酸をハイブリダイズし、細菌叢パターンを得る。この時、各細菌叢パターンに対し、それらの元となったプラントの処理能力を同時にデータベース化する。本データベースに登録した細菌叢パターンを検証対象である細菌叢が示す細菌叢パターンを比較することにより、現在のプラントに存在する細菌叢の状態を把握し管理することが可能である。
【実施例】
【００３１】
実施例1：細菌叢由来ゲノムDNAライブラリーの作製とDNAアレイの作製
試験に用いる細菌叢として、20日間の集積培養によって廃水中のアンモニア分解能を示した細菌叢（集積後細菌叢）と集積前細菌叢を用いた。
【００３２】
遠心によって回収した集積後細菌叢からCTAB法によってDNA抽出を行った。得られた細菌叢由来ゲノムDNAをDNA断片化装置Hydroshear（GeneMachines製）を用いて物理的に切断した後、アガロースゲル電気泳動を行い約2,000bpの切断DNA断片を回収した。回収したゲノムDNA断片はDNA合成酵素であるKOD DNAポリメレース（東洋紡社）を用いて平滑化した。次に、平滑化したゲノムDNA断片を制限酵素HincIIによって切断したpUC19プラスミドベクターに連結し、大腸菌 XLI-Blue MRF'株のコンピテントセルに導入した。
【００３３】
寒天培地上に育成した大腸菌コロニーより、任意の1,920コロニーよりアルカリ-SDS法によってプラスミドDNAを回収し、集積後細菌叢ゲノムDNAライブラリーをプラスミド1,920クローンとして得た。
【００３４】
この1,920クローン中、365クローンについてベクタープライマーであるM13プライマーを用いた部分塩基配列解析を行った。塩基配列解析試薬にはBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems )を用い、塩基配列解析装置としてApplied Biosystems 3730xl DNA Analyzer (Applied Biosystems / HITACHI )を使用した。解析を行った各プラスミドについてそれぞれ得られた塩基配列のGC含量を算出し、GC含量が60%以上、40%以上60%未満、40%未満に分類した（図４）。ゲノム配列中のGC含量は微生物の種分類において重要な指標であり、本試験において得られた塩基配列が図４のように多様なGC含量を示したことから、作製した細菌叢ゲノムDNAライブラリーは複数の細菌種を含むこと、また作製した集積後細菌叢ゲノムライブラリーではGC含量60%以上の細菌が優先であることが確認された。
【００３５】
DNAアレイは回収したプラスミド1,920クローンをスポッターSP-BioIII（日立ソフト社製）によりスライドグラス上にスポッティングした後、80℃で処理しプラスミドをスライドグラス上に固定して作製した。
【００３６】
実施例2：DNAアレイハイブリダイゼーションの方法
集積前細菌叢由来ゲノムDNA及び集積後細菌叢由来ゲノムDNAを標識DNA作製の材料とした。標識DNAの合成は細菌叢ゲノムDNA3μgを鋳型とし、ランダム8merプライマー及びDNA合成酵素であるKlenow fragment（Invitrogen社）を用いて行った。
【００３７】
DNAアレイハイブリダイゼーションは実施例1にて作製したDNAアレイ1枚に対しCy5標識DNA及びCy3標識DNAを与える競合ハイブリダイゼーション法によって行った。ハイブリダイゼーションに続いて、DNAアレイの洗浄により余剰の標識DNAを除去し、蛍光信号測定器であるScanArray（Gsi Lumonics社）を用いてDNAアレイ上の各固定スポットの蛍光信号強度を測定した。次に各固定スポットについて縦軸を強度比としてlog2(Cy5/Cy3)、横軸を信号強度としてlog10 (Cy5×Cy3)を算出するMA-plotを作成し、競合ハイブリダイゼーションの結果を評価した。
【００３８】
実施例3：コントロールハイブリダイゼーションの結果
ゲノムDNAライブラリー作製に使用したものと同一の集積後細菌叢由来ゲノムDNAを鋳型としてCy5標識DNA及びCy3標識DNAをそれぞれ合成し、競合ハイブリダイセーションを行った。本結果のMA-plotを図５に示した。
【００３９】
実施例4：集積培養前後の細菌叢ゲノムDNAの比較
Cy5標識DNAは集積前細菌叢由来ゲノムDNAを材料として合成し、Cy3標識DNAは集積後細菌叢由来ゲノムDNAを材料として合成した。競合ハイブリダイゼーションによって得られたMA-Plotを図６に示した。
【００４０】
コントロールハイブリダイゼーションの結果である図５と比較すると、図６ではスポットがクラスター状に分散することが観察された。横軸の信号強度は細菌叢中における各細菌の存在比を表し、縦軸の信号強度比は集積前後の細菌叢中における各細菌の存在比の変化を表す。よって、図６で得られたようなMA-Plotのクラスター状分散パターンは細菌叢遷移を示すものであり、細菌叢の差が大きければ大きな分散パターンを示す。本試験では排水中のアンモニア分解能の高い集積後細菌叢と分解能の低い集積前細菌叢を比較してクラスター状分散パターンを得た。つまり、本手法を用いたMA-Plotパターンの分析により細菌叢を構成する細菌群遷移を評価し、さらに細菌叢の示す活性能を分析することが可能である。
【００４１】
実施例5：特定スポットの塩基配列解析
塩基配列解析対象として集積によって存在比が増加した細菌を示すプラスミドを選択した。選択したスポット群を図７に示した。これら270クローンの塩基配列解析を行い、得られた各プラスミドについてそれぞれの塩基配列のGC含量を算出した。GC含量が60%以上、40%以上60%未満、40%未満に分類した（図８）。
【００４２】
実施例1に示した図４とは異なりGC含量40%以上60%未満の塩基配列を有するプラスミドが多数を占めており、集積前に優先であったGC含量60%以上の細菌ではなくGC含量40%以上60%未満の細菌が集積培養によって増加したことがわかった。本試験は集積培養前後の細菌叢遷移を分析したが、細菌叢の活性としては排水中のアンモニア分解能の上昇が観察されている。つまり、集積培養によって増加したGC含量40%以上60%未満の細菌がアンモニア分解に重要であることが推察される。
【００４３】
この結果はMA-Plot解析によって得られるクラスターを選抜し塩基配列を解析することにより、細菌叢活性に重要な細菌群を選択して遺伝子配列情報を取得できることを示している。よって本解析手法により構成する細菌種が不明の細菌叢であっても、特徴的な遷移を見せる細菌種のゲノムDNAを有するプラスミドの選択が可能であり、さらに塩基配列解析によりそれそれの細菌の識別に利用可能な遺伝子マーカーが取得可能となった。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明によれば、環境中に存在する個々の微生物の種類や発現量を特定することなく、細菌叢やこれをとりまく環境の分析・評価が可能になる。すなわち、本発明は、腸内細菌叢の分析による健康診断、汚水処理プラント等の細菌叢分析、食品等における混入微生物の検出など、種々の分野において利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、細菌叢ゲノムアレイの作製方法の概要を示す。
【図２】図２は、細菌叢ゲノムアレイによる細菌叢分析方法の概要を示す。
【図３】図３は、データベースを利用した細菌叢ゲノムアレイによる細菌叢分析方法の概要を示す。
【図４】図４は、集積後細菌叢ゲノムライブラリーの塩基配列解析によって得られたゲノム塩基配列のGC含量の分布を示す。
【図５】図５は、コントロールハイブリダイゼーションのMA-Plotを示す。
【図６】図６は、集積培養前後の細菌叢ゲノムDNA比較によって得られたMA-Plotを示す。
【図７】図７は、塩基配列解析対象として選択したスポット群（円内）を示す。
【図８】図８は、特定スポットの塩基配列解析によって得られたゲノム塩基配列のGC含量の分布を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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