(57)【要約】【課題】薬剤類がリポソームに内包される期間を長期化する、すなわち、薬剤類の保持率を高めることを可能とする、リポソーム含有製剤の製造方法を提供する。【解決手段】リポソーム内に薬剤が保持される期間を延長するために、薬剤内包リポソームを調製した後、該リポソームを回収して凍結乾燥し、その後水性溶媒中に再分散させる。薬剤は水溶性であり、高濃度、例えば飽和濃度である該薬剤の水溶液を用いることにより前記薬剤内包リポソームを調製することが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤内包リポソームを調製する工程、該リポソームを凍結乾燥する工程、および得られた凍結乾燥リポソームを水性溶媒中に再分散させる工程を含むことを特徴とする、リポソーム含有製剤の製造方法。
【請求項２】
前記薬剤内包リポソームは、水溶性薬剤が飽和濃度で溶解している水溶液を内包したものであることを特徴とする、請求項１に記載のリポソーム含有製剤の製造方法。
【請求項３】
前記薬剤内包リポソームの脂質膜は、該脂質膜を構成する脂質に対して１〜４０質量％の割合のポリエチレングリコール鎖を有することを特徴とする、請求項１または２に記載のリポソーム含有製剤の製造方法。
【請求項４】
前記薬剤内包リポソームは、少なくとも、脂質膜の構成成分と、水溶性薬剤の水溶液と、超臨界もしくは亜臨界状態の二酸化炭素とを混合することにより調製することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のリポソーム含有製剤の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法により製造されたリポソーム含有製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポソーム含有製剤の製造方法に関し、より詳しくは、凍結乾燥を用いることによりリポソームに内包される薬剤類の保持期間を延長させたリポソーム含有製剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは、単層または複数層の脂質膜からなる閉鎖小胞体であり、また、各脂質膜は、リン脂質、糖脂質などの脂質によって形成される二重膜である。このリポソームは、水溶性の薬剤類をその内部（すなわち脂質膜で仕切られた空間内）に有する水相に、油溶性の薬剤類を二重膜の内部に保持させるために用いることができ、これにより、本来不安定で失活しやすい薬効成分をリポソームに安定的に内包させることが可能となる。また、リポソームの脂質膜は生体膜と類似の構造や機能を有するため、免疫系を刺激しにくい低抗原性ゆえに素材としての安全性が高く、しかも生体内でいずれ異化処理される。このようなことから、リポソームは診断、治療、化粧などの様々な分野での応用が期待され、各方面から検討され続けている。さらに近年では、薬物送達システム（ＤＤＳ）として、リポソームの粒径、脂質膜の性質などの調整を通じ生体内での挙動を制御することにより、受動的または能動的なターゲティング機能を利用するリポソーム含有製剤が盛んに研究されている。
【０００３】
薬剤類を内包するリポソームを調製する方法としては、例えば、超臨界または亜臨界炭酸ガスを利用して薬剤、化粧品等を内包するリポソームを調製し、このリポソームを含有する製剤を製造する方法が提案されている（例えば特許文献１、非特許文献１）。これらの方法によれば、比較的高い内包率を有する単層の脂質膜を有するリポソーム（ＬＵＶ）を、毒性が懸念されるクロル系有機溶媒を使用することなく、効率的に製造することが可能である。また、水溶性非電解質の物質等を効率よく内包させるなどの目的のために、例えば、リン脂質の転移温度以上に加熱した超臨界または亜臨界状態の二酸化炭素にリポソーム膜構成物質を分散させるなど、従来の超臨界二酸化炭素を用いた製造方法を改良した水溶性薬剤含有リポソームの製造方法も提案されている（例えば特許文献２）。
【０００４】
ところで、リポソームに内包される薬剤は、貯蔵、保管中に、浸透圧効果によるリポソーム構造の不安定化などのため、時間の経過とともに漏出していく傾向にある。特に、リポソーム内の水相に保持される水溶性薬剤は、リポソームの脂質膜内に保持される油溶性薬剤と比較して、そのような傾向が見られやすい。リポソーム含有製剤において、リポソームに水溶性薬剤を長期にわたって保持させ続けることは容易ではなく、そのための手法は実現化されていない。
【０００５】
上記の問題に対処するための一つの方法としては、薬剤類を内包するリポソームを凍結乾燥品として販売し、用事調製によりリポソーム含有製剤として使用する方法が考えられるが、使用者にとって作業が増えることになるため、即使用可能なリポソーム含有製剤の形態のまま、リポソーム内での薬剤類の保持率を高める手法が求められている。
【０００６】
リポソーム含有製剤の調製における凍結乾燥技術の利用に関しては、例えば、安定剤としてソルビトールを用いること、リン脂質とステロールとを特定の配合比で用いることなどにより、両親媒性薬剤を包封する多重層の脂質膜を有するリポソーム（ＭＬＶ）を安定的に凍結乾燥できること（特許文献３）、水溶性物質を内包する小胞体を凍結乾燥等により乾燥させた後、該水溶性物質の水溶液に分散させ、得られた小胞体分散液を高圧下で均一孔径のフィルターに透過させることにより、水溶性物質の小胞体への封入が効率よく進
行し、同時に、小胞体の粒子径を均一化できること（特許文献４）、凍結乾燥したリポソームの再水和を低温条件下にて行うことにより内包物の漏出が抑制されること（特許文献５）などが知られている。しかしこれらの文献には、凍結乾燥技術を用いることにより、一定期間（例えば数週間程度以上）に亘る薬剤類の保持率が改善されるということは、何ら記載されていない。
【特許文献１】特開２００３−１１９１２０号公報
【特許文献２】特開２００５−１６２６７８号公報
【特許文献３】特表２００１−５０１９１１号公報
【特許文献４】ＷＯ２００２／０３８１２８
【特許文献５】特開平１０−２９９３０号公報
【非特許文献１】Pharm Tech Japan．Vol.19 No.5，91-100（2003）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、薬剤類がリポソームに内包される期間を長期化する、すなわち、長期間にわたる薬剤類の保持率を高めることを可能とする、リポソーム含有製剤の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、薬剤類を内包するリポソームの分散液を調製し、一旦これらを凍結乾燥した後、水性溶媒に再分散させて得られたリポソーム含有製剤は、凍結乾燥により薬剤または薬剤水溶液が固体化することにより、薬剤類（特に水溶性薬剤類）の保持率が従来より改善されることを見出し、本願発明を完成させるに至った。
【０００９】
本発明に係るリポソーム含有製剤の製造方法は、薬剤内包リポソームを調製する工程、該リポソームを凍結乾燥する工程、および得られた凍結乾燥リポソームを水性溶媒中に再分散させる工程を含むことを特徴とする。
【００１０】
また、前記薬剤が水溶性であり、高濃度、例えば飽和濃度である該薬剤の水溶液を用いて前記薬剤内包リポソームを調製することは、保持率を向上させる観点から好ましい。
さらに、薬剤内包リポソームの最外層の脂質膜表面が、該最外層の脂質膜を構成する脂質に対して１〜４０質量％の割合のポリエチレングリコール鎖で修飾されていることは、リポソームの安定性を向上させる上で好ましい。
【００１１】
本発明で用いられる上記のような薬剤内包リポソームは、少なくとも、脂質膜の構成成分と、水溶性薬剤の水溶液と、超臨界もしくは亜臨界状態の二酸化炭素とを混合することにより、好適に調製することができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の製造方法により、長期間にわたってリポソームに薬剤が内包され続けるようになり、ターゲティング機能などにより優れたリポソーム含有製剤が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明のリポソーム含有製剤の製造方法に含まれる、薬剤内包リポソームを調製する工程、該薬剤内包リポソームを凍結乾燥する工程、および凍結乾燥リポソームを再分散させる工程のそれぞれについて、順次説明する。本発明では、リポソームに内包される薬剤の凍結乾燥工程における結晶化が、再分散工程後の薬剤の漏出を抑制する効果をもたらすため、保持率の高いリポソーム含有製剤が得られる。
【００１４】
なお、本明細書において、「薬剤内包リポソーム」とは、脂質膜の層間の水相に水溶性
薬剤を保持し、さらに脂質膜内に脂溶性薬剤を含有していてもよいリポソームをいう。「リポソーム含有製剤」は、上記薬剤内包リポソームを含む製剤であり、リポソーム内部の水相およびリポソームを懸濁する水性媒体中に、水溶性薬剤および必要に応じて製薬助剤を含有するものをいう。
【００１５】
また、本明細書において「保持率」とは、薬剤内包リポソームの調製直後にリポソームに内包される薬剤が一定時間経過後にリポソーム内に残存している割合、つまり、「一定時間経過後の薬剤内包リポソームに内包される薬剤の重量」の「製造直後の薬剤内包リポソームに内包される薬剤の重量」に対する割合で表される。一方、「内包率」とは、リポソーム含有製剤に含まれる全ての薬物類（すなわち、リポソームに内包される薬物類と、リポソームの分散媒である水性溶媒中に含まれる薬物類との合計）の量に対する、リポソームに内包される薬物類の量の割合である。
【００１６】
薬剤内包リポソームの調製工程
本発明の製造方法の対象となる薬剤内包リポソームは、これまでに提案されている各種の方法により調製することができ、調製方法は特に限定されるものではない。製造方法が異なると最終的にできあがったリポソームの形態および特性もまた著しく異なることが多いため、所望するリポソームの形態および特性に応じた製造方法を適宜選択すればよい。
【００１７】
従来、薬剤内包リポソームの調製方法としては、例えば、バンガム（Bangham）法、逆
相蒸発法（ＲＥＶ法）などが用いられていた。バンガム法で調製されたリポソームは、例えば粒子径が０.１〜１０μｍ程度の、多重層の脂質膜を有するリポソーム（ＭＬＶ：multilamellar vesicle）であり、１個のリポソーム形成に使われる脂質量が多いため、水溶性物質のリポソーム内への内包率が極めて低い。一方、逆相蒸発法では、水溶性物質の内包率の比較的大きい、単層の脂質膜を有するリポソーム（ＬＵＶ：large unilamellar vesicle）が得られる。しかしいずれの方法においても、リン脂質などの膜成分を溶解する
溶剤として有機溶媒、特にクロロホルム、ジクロロメタンといったクロル系溶剤が使用されており、有機溶媒の完全な除去は容易でないことから、得られるリポソームに残存する溶剤の人体への毒性が問題とされている。
【００１８】
このような製造方法に対して、超臨界状態または亜臨界状態の二酸化炭素を使用するリポソーム製造法（以下「超臨界二酸化炭素法」とよぶ。）は、従来法に比べてリポソームの生成率、封入する薬物の内包率、内包されている薬物のリポソーム内の保持率が高いこと、さらにクロル系有機溶媒を使用せずに行えるなどの利点を有することから、本発明においても好適に用いられる。
【００１９】
＜超臨界二酸化炭素法＞
上記の超臨界二酸化炭素法は、概説すると、圧力容器内で、リポソーム膜構成成分と、水溶性薬剤の水溶液（必要に応じて製薬助剤が配合されていてもよい）と、超臨界二酸化炭素（亜臨界二酸化炭素を含む、以下同じ。）とを混合し、次いで、この圧力容器内を減圧して二酸化炭素を排出することにより、水溶性薬剤が内包されたリポソームの水性分散液を調製する方法である。
【００２０】
二酸化炭素は、臨界温度が３１.１℃、臨界圧力が７.３８ＭPaと比較的扱いやすく、高純度流体が安価で容易に入手でき、不活性なガスであるため残存しても人体に無害である。上記の混合工程における超臨界状態の二酸化炭素の温度は、通常２５〜２００℃、好ましくは３２〜１００℃、さらに好ましくは３５〜８０度であり、また、圧力は、好ましくは４.９〜４９ＭPa、より好ましくは９.８〜３９ＭPaである。
【００２１】
超臨界二酸化炭素法においては、まず、上記のような好適な圧力および温度の条件下に
ある超臨界二酸化炭素中で、リン脂質などのリポソーム膜を構成する成分を混合する「第１工程」を行う。この際、例えばポリエチレングリコールなど、人体に対する安全性が高く除去が容易である溶媒を、超臨界二酸化炭素の０.１〜１０質量％程度の割合で、溶解
助剤として添加し、脂質膜成分の溶解性を向上させることも可能である。
【００２２】
なお、超臨界状態の二酸化炭素と、脂質膜構成成分等との混合は、超臨界二酸化炭素流体および脂質膜構成成分等を特定条件下にある圧力容器内に添加することにより行ってもよく、あるいは、液体二酸化炭素および脂質膜構成成分等を圧力容器内に充填した後、特定条件下で加圧・加熱することにより、液体二酸化炭素を超臨界状態にすることにより行ってもよいが、操作性などの点からは、後者のような手順で行うことが望ましい。
【００２３】
上記の第１工程の後、混合物を攪拌しながら、薬剤水溶液（例えば、非イオン性水溶性造影剤の水溶液、詳細は後述する。）を圧力容器内に連続的に添加し、水／二酸化炭素エマルジョンを形成させる「第２工程」を行う。このエマルジョン系において、脂質膜成分は内側に水相を閉じ込めたミセル状の形態で、二酸化炭素中に離合集散していると推定される。またこの第２工程では、必要に応じて、製剤助剤（例えばアミン系緩衝剤およびキレート化剤、詳細は後述する。）を薬剤水溶液と合わせて添加してもよい。
【００２４】
上記の第２工程に引き続き、攪拌を続行してエマルジョンを安定化させた後、さらに、二酸化炭素相と水相とが分離するまで水を連続的に添加する「第３工程」を行う。この工程において、水相の増大とともに系の相転移が起こり、水／二酸化炭素エマルジョンおよび二酸化炭素／水エマルジョンの２相系を経て、過剰な二酸化炭素が二酸化炭素／水エマルジョンと分離する。リポソームは水相に転相しているため、系内を減圧して二酸化炭素を排出すると、薬剤・製剤助剤水溶液を内包するリポソームが分散している水性分散液が生成する。この際、リポソームに内包された薬剤・製剤助剤水溶液の濃度と、リポソームが分散している水性溶媒中の薬剤・製剤助剤の濃度は、実質的に同一である。なお、第３工程で添加する水は、純水に限られるものではなく、水溶液を用いてもよい。例えば、前記第２工程における薬剤水溶液を用いることで、第２および第３工程を一体的に行うことも可能である。
【００２５】
超臨界二酸化炭素法における、リポソーム膜構成成分と、水溶性薬剤の水溶液（必要に応じて製薬助剤が配合されていてもよい）と、超臨界二酸化炭素との混合比は、これらを均一に混合し、均質なリポソームを調製できるよう適宜調節することができる。例えば、超臨界二酸化炭素１質量部に対して、リポソーム膜構成成分を０.０１〜０.３質量部、好ましくは０.０３〜０.１質量部の割合で配合すれば、前記の第１工程における混合を行いやすい。また、薬剤水溶液１ｍＬに対して、リポソーム膜構成成分が２０〜１５０ｍｇ、好ましくは３５〜１００ｍｇの割合となるようこれらを配合することにより、前記の第２工程で溶液の均一な混合が行える。
【００２６】
攪拌・混合手段は、上記の成分などを均一に分散、混合できるものであれば特に制限されるものではなく、例えば、マグネチックスターラー、ホモジナイザー、ホモミキサー、ウルトラミキサーなど、公知の攪拌・混合装置を使用することが可能である。混合しにくい場合は、強攪拌装置を用いてもよい。
【００２７】
以上のような超臨界二酸化炭素法により得られる薬剤内包リポソームには、前記ＬＵＶが高い割合で含まれる。ＬＵＶは、１つあたりの内容容積が大きいため、効率的に薬剤を内包できるという利点があり、本発明においても好適に用いることができる。一方、従来の製造方法により得られる薬剤内包リポソームには、様々なサイズ、形態のＭＬＶが多く存在する。ＭＬＶは、リポソームの投与量（換言すれば投与脂質量）あたりの内包薬剤量がＬＵＶよりも劣るが、半面、リポソーム膜の安定性が高く、薬剤を漏出しにくい性質も
有する。これらの事項などの兼ね合いを考慮し、所望の態様の薬剤内包リポソームを使用するようにすればよい。
【００２８】
なお、リポソームが何層の脂質膜からなるのかは、凍結かつ段（Freeze fracture）レ
プリカ法によりリポソームの跡をカーボン膜に残し、この像を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて観察することで確認できる。観察された像に“段差”がない場合は１層のみ、“段差”がある場合は２層以上と判定される。
【００２９】
＜濾過工程＞
必要に応じて、上述のようにして得られた薬剤内包リポソームの分散液を、一定サイズの孔径を有する濾過膜に強制的に透過させることにより、リポソームの粒径分布を所望の範囲内に揃えてもよい。例えば、孔径０.１〜０.４μｍのポリカーボネート膜またはセルロース膜をフィルターとして装着した静圧式押出し装置に通すことにより、中心粒径が１００〜３００ｎｍ程度である薬剤内包リポソームが効率よく調製される。このようなサイズの薬剤内包リポソームは、毛細血管を閉塞するおそれがほとんどないと同時に、がん組織近辺の血管にできる間隙を通過できるといった利点を有する。上記の静圧式押出し装置としては、例えば、日油リポソーム社製「エクストルーダー」、野村マイクロサイエンス社製「リポナイザー」などが挙げられる。
【００３０】
このような濾過工程を取り入れることにより、薬剤内包リポソームのサイジングに加えて、望ましくない物質の除去、濾過滅菌も合わせて可能になるという利点もある。さらに引き続き、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過などにより、リポソーム内に未保持の薬剤等を除去して精製してもよい。濾過工程等は、目的に応じて一回または複数回組み合わせて行うことができる。
【００３１】
＜リポソームに内包される薬剤および製剤助剤＞
薬剤内包リポソームの調製の際に用いられる水溶性薬剤の水溶液（薬剤水溶液）は、常法に従って、水溶性薬剤を所定量の水性媒体に溶解させることにより調製される。
【００３２】
詳細は後述するが、本発明の製造方法では、リポソームに内包させる水溶性薬剤の濃度が高い場合、例えば飽和濃度である場合に、凍結乾燥工程による薬剤の保持率を高める効果が大きく現れる傾向にある。高濃度の薬剤水溶液を使用した場合、通常の濃度の試薬水溶液を内包させた場合よりも多くの薬剤を、単位体積あたりのリポソームに内包させることが可能となる。飽和濃度の薬剤水溶液は常法に従って調製すればよく、例えば、前述の超臨界二酸化炭素法における第２工程の反応温度にまで加熱した水に過剰の水溶性薬剤を添加して充分に混合した後、上澄みの飽和水溶液を第２工程で添加するなどして用いることができる。なお、薬剤水溶液の濃度は、その薬剤の性質、意図する製剤の投与経路および臨床上の指標といった諸要因を合わせて勘案し、調整することがより望ましい。
【００３３】
上記水性媒体としては、蒸留水、局方注射用水、純水などの水のほか、生理食塩水、各種緩衝液、塩類などを含む水溶液などを用いることができる。
また、上記水溶性薬剤としては、例えば、造影物質、抗がん性物質、抗真菌性物質、抗酸化性物質、抗菌性物質、抗炎症性物質、血行促進性物質、美白物質、肌荒れ防止物質、老化防止物質、発毛促進性物質、保湿性物質、ホルモン剤、ビタミン類、色素、およびタンパク質類などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
リポソーム含有製剤をＸ線検査用造影剤として用いる場合、造影物質として非イオン型（非電解質）水溶性ヨウド化合物を用いることが好適である。イオン型水溶性ヨウド化合物よりも望ましい造影物質としている理由は、イオン性官能基が溶液中でイオンに解離して高い浸透圧を示し、これがイオン型水溶性ヨウド化合物を含む造影剤の副作用の主因と
なっていることを重視することによる。前記の超臨界状態の二酸化炭素を使用する製造方法を用いた場合、非電解質物質であってもリポソーム内に効率よく内包させることが可能である。
【００３５】
上記の基準、製造コストおよび生理的、使用上の制約からの好ましい水溶性の非イオン性ヨウド化合物としては、例えば、イオメプロール、イオパミドール、イオヘキソール、イオペントール、イオプロミド、イオキシラン、イオシミド、イオベンゾール、イオトロラン、イオジキサノール、イオデシモル、イオタスル、メトリザミド、1,3−ビス−(Ｎ−3,5−ビス−(2,3−ジヒドロキシプロピルアミノカルボニル)−2,4,6−トリヨウドフェニ
ル)−Ｎ−ヒドロキシアセチル−アミノ)−プロパンなどが挙げられる。高度に親水性であり、かつ高濃度でも浸透圧が高くならない点から、イオメプロール、イオパミドール、イオトロラン、イオジキサノールがより好ましい。これらの化合物は単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３６】
また、リポソーム含有製剤を抗がん剤として用いる場合、がんの化学療法に用いられている抗がん性化合物をリポソームに内包させればよい。抗がん性化合物としては、例えば、アドリアマイシン、ビラルビシン、ビンクリスチン、タキソール、シスプラチン、マイトマイシン、５−フルオロウラシルなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３７】
以上のような薬物類は水性溶媒に溶解した形態でリポソームに内包されるが、リポソームの安定性の観点から、内包される薬物類のリポソームの脂質膜に対する重量比（薬物類重量／脂質膜重量）は、所定の範囲内にあることが望ましい。その重量比は、用いる薬物類により変動し、一概には決定されないが、例えば、造影物質である非イオン型ヨウド系化合物を用いる場合、通常は１〜８、好ましくは３〜８、より好ましくは５〜８程度である。上記重量比が１未満であると、比較的多量の脂質を注入する必要があり、薬物類の送達が非効率的になる。逆に上記重量比が８を越えると、リポソームは構造的に不安定になり、特にイオン強度の急激な変化には脆弱である傾向が見られるので、リポソーム含有製剤の貯蔵中または生体内への注入後において、リポソーム膜外への薬物の拡散、漏出が起こりやすくなるおそれがある。上記重量比は、用いる試薬水溶液の濃度やリポソームの大きさを調整することにより制御することが可能である。
【００３８】
一方、製薬助剤は、その用途、態様に応じて従来公知の各種物質を適宜選択することができるが、例えば、水溶性アミン系緩衝剤（好ましくはトロメタモールなど）、炭酸塩系緩衝剤などのｐＨ緩衝剤；エデト酸系キレート化剤（好ましくはＥＤＴＡＮａ2-Ｃａ）などのキレート化剤；α−トコフェロール、アスコルビン酸などの抗酸化剤；その他、浸透圧調節剤、安定化剤、粘度調節剤、保存剤、無機塩類、さらには血管拡張剤、凝固抑制剤などの薬理的活性物質が挙げられる。
【００３９】
＜リポソームの脂質膜＞
本発明の製造方法が対象とするリポソームの膜脂質成分は、一般的に、リン脂質および／または糖脂質を主体として構成されるが、その他、ステロール類、グリコール類、カチオン性脂質、あるいはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基を有する脂質などが含まれてもよく、特に限定されるものではない。リポソームを構成する脂質膜の組成は、膜の強度、膜表面の電荷分布（ゼータ電位）、リポソームの親水性および生体内での挙動などに影響を与えるので、用途に応じて好適な組み合わせ、混合比を選択すればよい。
【００４０】
上記リン脂質としては、例えば、卵白、大豆などから得られるレシチン、リゾレシチンといった中性リン脂質、および／またはこれらの水素添加物、水酸化物の誘導体が好ましく使用される。その他のリン脂質としては、卵白、大豆もしくはその他の動植物に由来す
る、または半合成であるホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン；ならびに合成により得られるホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、ジミリストリルホスファチジルコリン（DMPC）、ジオレイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（DPPG）、ジステアロイルホスファチジルセリン（DSPS）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（DSPG）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（DPPI）、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（DSPI）、ジパルミトイルホスファチジン酸（DPPA）、ジステアロイルホスファチジン酸（DSPA）などを挙げることができる。
【００４１】
これらのリン脂質は、通常は単独で使用されるが、２種以上を併用してもよい。ただし、２種以上の荷電リン脂質を使用する場合には、負電荷のリン脂質同士または正電荷のリン脂質同士で使用することが、リポソームの凝集防止の観点から望ましい。また、中性リン脂質と荷電リン脂質を併用する場合、これらの重量比は、通常２００：１〜３：１、好ましくは１００：１〜４：１、より好ましくは４０：１〜５：１である。
【００４２】
糖脂質としては、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド硫酸エステルなどのグリセロ脂質、ガラクトシルセラミド、ガラクトシルセラミド硫酸エステル、ラクトシルセラミド、ガングリオシドG7、ガングリオシドG6、ガングリオシドG4などのスフィンゴ糖脂質などを挙げることができる。
【００４３】
また、ステロール類はリポソームの膜安定化剤として作用する。例えば、コレステロール、ジヒドロコレステロール、コレステロールエステル、フィトステロール、シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール、コレスタノール、またはラノステロールなどが挙げられる。さらに、１−Ｏ−ステロールグルコシド、１−Ｏ−ステロールマルトシドまたは１−Ｏ−ステロールガラクトシドといったステロール誘導体もリポソームの安定化に効果があることが示されている（特開平5-245357号公報）。これらの中で、特にコレステロールが好ましい。
【００４４】
ステロール類の使用量は、リン脂質１重量部に対して通常は０.０５〜１.５重量部、好ましくは０.２〜１重量部、より好ましくは０.３〜０.８重量部の割合である。０.０５重量部より少ないと、混合脂質の分散性を向上させるステロール類による安定化が発揮されず、リポソーム膜の強化につながらない。逆に２重量部より多すぎると、リポソームの形成が阻害されるか、形成されても不安定となる。場合によっては、形成されたリポソームの膜が硬くなり、例えばエクストルーダを用いた濾過工程の際に、リポソームの通過性が悪くなるという弊害も生じる。
【００４５】
さらに、リポソームの少なくとも最外層の脂質膜の表面を、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ、「ポリオキシアルキレン」ともいう。）鎖で修飾することにより、リポソームの崩壊、凝集などの問題を解決し、水性媒体中または血中での安定性を向上させることが可能である。
【００４６】
上記ＰＡＯ鎖としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖、すなわち一般式−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)n−Ｈで表される修飾鎖が好適である。式中、ｎ（オキシエチレン単
位）は、好ましくは１０〜３５００、より好ましくは１００〜２０００である。また、ＰＥＧの使用量は、膜を構成する脂質に対して、好ましくは１〜４０質量％、より好ましくは５〜２５質量％である。
【００４７】
このようなＰＡＯ鎖の導入は、公知の技術を利用することができるが、好適には、原料
となるリン脂質類の中に予めリン脂質ポリアルキレンオキシド誘導体を配合して、リポソームを調製する方法が用いられる。用いるリン脂質ＰＡＯ誘導体の種類、ＰＡＯ鎖にさらに結合させる機能性官能基の種類、アルキレンオキシド基の平均付加モル数、脂質膜におけるＰＥＯ誘導体の配合量などは、適宜選択することが可能である。
【００４８】
薬剤内包リポソームの凍結乾燥工程
本発明の製造方法では、上記のような超臨界二酸化炭素法などにより得られる薬剤内包リポソームを対象として、急冷凍結後に水分を除去する、いわゆる「凍結乾燥」工程を行う。この工程により凍結乾燥された薬剤内包リポソーム（以下「乾燥凍結リポソーム」という。）では、内包される薬剤が非晶質の固体となっている。
【００４９】
本発明における凍結乾燥工程は、市販の凍結乾燥機を用いて、例えば、間接加熱凍結方法、冷媒直膨方法、熱媒循環方法、三重熱交換方法、重複冷凍方法などの常法に従って行えばよく、その態様は特に限定されない。
【００５０】
また、凍結乾燥は常法に従って行えばよく、リポソーム膜の組成や水溶性薬剤の種類などに応じて適切に条件を調節することもできるが、凍結乾燥の温度は、一般的には−１２０〜−２０℃、例えば−８０〜−６０℃であり、圧力は、一般的には１〜１５Pa、例えば５〜１０Paであり、時間は、一般的には６〜３６時間、例えば１６〜２６時間である。
【００５１】
凍結乾燥リポソームの再分散工程
本発明のリポソーム含有製剤は、上記方法により調製された凍結乾燥リポソームを水性媒体中に再分散させることにより製造される。凍結乾燥リポソームは、激しい攪拌や加熱などを行わなくても、水性媒体に短時間で完全に分散させることができる。
【００５２】
凍結乾燥リポソームの水性溶媒への再分散により、リポソーム膜を透過して水が流入し、リポソーム内に再び水相が形成される。その後、凍結乾燥により固体化していた薬剤または薬剤水溶液は、水との界面が小さいため、長時間かけてゆっくりと水に溶解していく。また、析出性の高い溶質（薬剤）であれば、飽和濃度には達しなくとも充分な高濃度の条件下で析出が進行し、リポソーム内で再結晶する。このような作用により、再分散された凍結乾燥リポソームにおいては、ずっと液体のままの薬剤水溶液を内包したリポソームと比較して、リポソーム膜外への薬剤の拡散、漏出速度を減速させ、長期間にわたって薬剤を保持させることが可能となる。
【００５３】
乾燥凍結リポソームを再分散させる水性媒体は、最終的に得られる製剤の態様に応じて所望の水性媒体を用いればよいが、リポソームに内包されているものと同じ水溶性薬剤、および必要に応じて製薬助剤等を含む水性溶媒であることが望ましい。リポソーム内部の水相における薬剤等の濃度と、リポソームが分散している水性媒体における薬剤等の濃度が実質的に同一である場合、著しい浸透圧差は生じないため、リポソームの不安定化を抑制し、薬剤等の保持率をより一層向上させることが可能となる。
【００５４】
また、投与の際の人体への影響を考慮した場合、血液と等張となるよう、浸透圧濃度を典型的には２５０〜５００ｍosmol／Ｌ、好ましくは２９０〜３５０ｍosmol／Ｌに調節してもよい。このような濃度とするために、非毒性の水溶性物質、例えば塩化ナトリウム等の塩類、マンニトール、グルコース、ショ糖、ソルビトール等の糖類などを媒質中に添加して用いることもできる。
【００５５】
リポソーム含有製剤の粘度、ｐＨなどの特性は、所望の範囲になるよう適宜調節すればよい。粘度については、製剤中においてリポソーム膜脂質の重量の割合が高くなると、製剤の粘度も大きくなる傾向にあることを考慮し、適切な粘度の製剤が得られるよう、乾燥
凍結リポソームと水性媒体との混合比を調節することが望ましい。３７℃におけるリポソーム含有製剤の粘度は、通常２０ｍPa・ｓ以下、好ましくは１８ｍPa・ｓ以下、より好ましくは１５ｍPa・ｓ以下である。また、ｐＨについては、緩衝液等を用いて生理的に許容できる範囲に調整すればよいが、室温での値で、通常は６.５〜８.５、好ましくは６.８
〜７.８程度である。
【００５６】
実施例等
［比較例１］
ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）368.4mg、コレステロール147.4mg、およびPEG-リン脂質（日本油脂株式会社製、SUNBRIGHT DSPE-020CN）111.5mgの混合物を、ス
テンレス製の特性オートクレーブに仕込み、次いで、液体二酸化炭素13gを加え、50℃・12MPaの超臨界状態とした。
【００５７】
容器内を攪拌しながら、さらに造影剤溶液（日局  イオヘキソール：ヨウド濃度150mgI/mL）10ｍLを定量ポンプで連続的に注入した。注入終了後、容器内の二酸化炭素を排出し減圧して、リポソームの分散液を得た。
【００５８】
得られた分散液を80℃まで加熱し、アドバンテック社製のポリカーボネートフィルター、0.8μm、0.4μmおよび0.2μmを用いて３回加圧ろ過して造影剤溶液を含有するリポソーム分散液を得た。
【００５９】
この分散液に対して、セントラメイトホルダーLV（日本ポール社製  分画分子量10,000）を用いて限外濾過することで、外液をマンニトール３%溶液に置換したリポソーム分散
液を得た。
【００６０】
［比較例２］
造影剤溶液として、日局「イオヘキソール」に代えて日局「イオパミドール」（ヨウド濃度150mgI/mL）を用いた以外は、上記比較例１に記載の方法と同様にして、リポソーム
分散液を得た。
【００６１】
［実施例１］
ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）368.4mg、コレステロール147.4mg、およびPEG-リン脂質（日本油脂株式会社製、SUNBRIGHT DSPE-020CN）111.5mgの混合物を、ス
テンレス製の特性オートクレーブに仕込み、次いで、液体二酸化炭素13gを加え、50℃・12MPaの超臨界状態とした。
【００６２】
容器内を攪拌しながら、さらに造影剤溶液（日局  イオヘキソール：ヨウド濃度150mgI/mL）10ｍLを定量ポンプで連続的に注入した。注入終了後、容器内の二酸化炭素を排出し減圧して、リポソームの分散液を得た。
【００６３】
得られた分散液を80℃まで加熱し、アドバンテック社製のポリカーボネートフィルター、0.8μm、0.4μmおよび0.2μmを用いて３回加圧ろ過して造影剤溶液を含有するリポソーム分散液を得た。
【００６４】
この分散液に対して、セントラメイトホルダーLV（日本ポール社製  分画分子量10,000）を用いて限外濾過することで、外液をマンニトール３%溶液に置換したリポソーム分散
液を得た。
【００６５】
上述のようにして得た外液を置換したリポソーム分散液を、レイタント社製凍結乾燥機「LFD-600 DNCPS1」を用いて常法にて凍結乾燥し、粉末状リポソームを得た。これに、凍
結乾燥前のリポソーム分散液と同体積となるよう純水を加え、再水和したリポソーム分散液を得た。
【００６６】
［実施例２］
造影剤溶液として、ヨウド濃度150mgI/mLの日局「イオヘキソール」に代えて、ヨウド
濃度300mgI/mLの日局「イオヘキソール」を用いた以外は、上記実施例１に記載の方法と
同様にして、再水和したリポソーム分散液を得た。
【００６７】
［実施例３］
造影剤溶液として、ヨウド濃度150mgI/mLの日局「イオヘキソール」に代えて、ヨウド
濃度300mgI/mLの日局「イオパミドール」を用いた以外は、上記実施例１に記載の方法と
同様にして、再水和したリポソーム分散液を得た。
【００６８】
［造影剤の水に対する溶解性］
イオパミドール粉末612.4mgおよびイオヘキソール粉末647.1mgへ各1mLの純水を加えた
状態で、転倒攪拌をしたときの水に対する溶解性を評価した。結果は表１の通りである。イオパミドールはイオヘキソールよりも相対的に溶解性が悪い、すなわち、溶解の速度が遅く、析出性も高いため、本発明による薬剤保持期間を延長する効果がより現れやすいと考えられる。
【００６９】
【表１】
2007284395.tif 000002
【００７０】
［保持期間の調査］
上記比較例１〜２および実施例１〜３により得られた薬剤内包リポソームの分散液を常温・常圧で保存し、一定期間ごとに以下の測定方法に基づきリポソーム内容物の漏出を評価した。試料を遠心分離（6,000×ｇ、20分）し、得られる上清および残渣（リポソーム
）のそれぞれについて、重量および波長240nmにおける吸光度を測定した。この吸光度か
ら、あらかじめ濃度が既知の薬剤水溶液を用いて作成した吸光度と薬剤濃度の検量線に基づき、薬剤濃度を求めた。また、測定した重量からは近似式により体積を求めた。上清および残渣それぞれの薬剤濃度および体積から、漏出した薬剤およびリポソームに残存していた薬剤の重量が求められ、これにより薬剤保持率を算出した。
【００７１】
薬剤保持率が９５％以上である期間を「保持期間」とし、各薬剤内包リポソームの分散液についての保持期間を求めた。結果は表２に示すとおりである。
【００７２】
【表２】
2007284395.tif 000003