(57)【要約】【課題】新規なアレルギー性喘息の治療薬を提供すること。【解決手段】抗ＣＤ６９抗体を主成分とするアレルギー性喘息治療薬とする。また、可溶化ＣＤ６９分子を主成分とするアレルギー性喘息治療薬とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＣＤ６９抗体を主成分とするアレルギー性喘息治療薬。
【請求項２】
可溶化ＣＤ６９分子を主成分とするアレルギー性喘息治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー性喘息の治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
アトピー性気管支喘息をはじめとするアレルギー性喘息の発症は、抗原の吸入によりＴリンパ球（Ｔ細胞）がこれを認識して活性化し、好酸球や肥満細胞が気管支粘膜に浸潤してサイトカインや化学伝達物質などの生理活性物質が放出されて炎症が起き、気管支壁が厚く硬くなって気管支の内径が狭くなり、過敏症が亢進するとともに喘息が起こると考えられている。現在、喘息の薬物治療には抗炎症薬と気管支拡張薬が主に用いられ、吸入ステロイド薬、テオフィリン薬、ロイコトリエン受容体拮抗薬などの抗炎症薬や気管支拡張薬としてβ２刺激薬が使われている。
【０００３】
ところで、ヒトのＣＤ６９遺伝子は、１２番染色体、マウスでは６番染色体に位置している（ヒトのＣＤ６９遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号２に、マウスのＣＤ６９遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に、ヒトのＣＤ６９遺伝子のアミノ酸配列を配列表の配列番号４に、マウスのＣＤ６９遺伝子のアミノ酸配列を配列表の配列番号３に示す）。約７．５ｋｂのＣＤ６９遺伝子は５個のエクソンからなり、そのｍＲＮＡは分子量２２，０００から２４，０００のタンパク質に翻訳される。糖鎖修飾後、一つの分子は分子量２６〜２８ｋＤａに、ほかの分子は３２〜３４ｋＤａになってダイマーを形成する。分子量の違いは糖鎖の修飾の受け方によるものと考えられている。このＣＤ６９分子は、タンパク質のＮ末端が細胞内に、Ｃ末端が細胞外に位置するＩＩ型の膜貫通型タンパク質である（図１参照）。Ｎ末端から４０番目までのアミノ酸が細胞内、４１番目から６１番目までの疎水性アミノ酸領域が膜貫通部位、６２番目から１９９番目のアミノ酸が細胞外に位置していると考えられる。１６６番目のアミノ酸残基からのＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ配列が唯一の糖鎖結合可能部位で、この場所にＮ−グリコシレーションが起こり、細胞外の６個のシステイン残基におけるジスルフィド結合によって、ダイマーを形成していると考えられる（下記非特許文献１参照）。
【０００４】
またＣＤ６９は、Ｔ細胞やＢ細胞を刺激すると数時間以内に発現が上昇するため、早期活性化マーカー分子としてリンパ球の活性化の指標として広く用いられている（下記非特許文献２参照）。また、胸腺内で分化途中のセレクションを受けているＴ細胞にも発現がみられている（下記非特許文献３，４参照）。なお、ＣＤ６９には、コレセプターとして抗原レセプターからのシグナル伝達を増強する機能が推測されているが、詳細は不明である。リガンドは現在までのところ、同定されていない。一方、血小板には恒常的に発現しており、活性化した好中球や好酸球などにも発現がみられることから、血小板の機能発現や局所の炎症反応における役割が推測されている。また最近、関節炎の発症において好中球上のＣＤ６９分子が重要な役割を果たしていることが明らかになっている（下記非特許文献５参照）。
【０００５】
【非特許文献１】Ｚｉｅｇｌｅｒ，  Ｓ．  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  :  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ＣＤ６９:  ａ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３  :  １６４３−１６４８．  １９９３．
【非特許文献２】Ｔｅｓｔｉ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  :  Ｔｈｅ  ＣＤ６９  ｒｅｃｅｐｔｏｒ:  ａ  ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ  ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ｆｏｒ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  １５  :  ４７９−４８３，  １９９４．
【非特許文献３】Ｙａｍａｓｈｉｔａ，  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．  :  ＣＤ６９  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ  ｗｈｉｃｈ  ａｕｄｉｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ５  :  １１３９−１１５０，  １９９３．
【非特許文献４】Ｎａｋａｙａｍａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  :  Ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｕｒｅ，  ｓｉｎｇｌｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｓ  ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ＣＤ６９  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｒ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６８  :  ８７−９４，  ２００２．
【非特許文献５】Ｍｕｒａｔａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  :  ＣＤ６９−ｎｕｌｌ  ｍｉｃｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５  :  ９８７−９９２，  ２００３．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記文献で示したとおり、これまでにＣＤ６９の発現については多数の報告があるが、その機能についての詳細は不明である。確かに上記非特許文献５では、関節炎の発症にＣＤ６９を発現する好中球が重要な役割をしていることが明らかとなっているため、炎症の発症におけるＣＤ６９の役割が推測されているが、他の炎症疾患における関与については明らかになっていない。
【０００７】
また現在、アレルギー性喘息の治療薬としては、吸入ステロイド薬などの抗炎症薬やβ２刺激薬をはじめとする気管支拡張薬が主に使われているが、これらの薬剤はいずれもアレルギー反応の結果起こる炎症や気道の狭窄を対症療法的に抑制するものであり、免疫反応自体を抑制するものではない。即ちこれまでのところ、アレルギーの発症と綿密な関係のあるＴｈ２メモリーＴ細胞の分化やそれらが抗原を認識して活性化することにより誘導される好酸球等のエフェクター細胞の炎症巣への浸潤を直接抑制するような喘息治療薬はない。  従って、それらの働きを抑制する薬剤の開発ができれば有用な治療薬になると考えられる。
【０００８】
そこで、本発明は新規なアレルギー性喘息の治療薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ＣＤ６９分子の機能に関する解析はこれまであまりすすんでいなかったが、本発明者らが鋭意検討を行ったところ、ＣＤ６９分子が喘息の発症に関与することが明らかとなった。具体的に説明すると、発明者らがＣＤ６９ＫＯマウスを作製し、気管支喘息・気道炎症の動物モデルを用いて調べたところ、ＣＤ６９  ＫＯマウスでは喘息が起こらないことを確認した。さらに抗ＣＤ６９抗体を投与してＣＤ６９の働きを阻害した場合にも、同様に喘息が抑制されることを確認した。このことから、抗ＣＤ６９抗体や可溶化ＣＤ６９が喘息の治療薬として有用であると考えられた。
【００１０】
即ち、本発明に係るアレルギー性喘息治療薬は、抗ＣＤ６９抗体を主成分とすることを特徴とする。
【００１１】
また、本発明に係るアレルギー性喘息治療薬は、可溶化ＣＤ６９分子を主成分とすることを特徴とする。なお、ここで「可溶化」とは、遺伝子組み換え技術を駆使して、分子の細胞外領域だけを単独または他の分子とのキメラ分子として水に可溶性の分子としたものをいう。
【発明の効果】
【００１２】
アレルギー性喘息発症の分子メカニズムについては依然として不明な点が多かったが、本発明らによりアレルギー性喘息の発症におけるＣＤ６９分子の重要性が明らかとなった。つまり、ＣＤ６９の働きを抗ＣＤ６９抗体や可溶化ＣＤ６９分子を用いて阻害することによってアレルギー性喘息の発症を抑制できるため、これまでになかった作用機序によるアレルギー性喘息の治療薬を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。
【００１４】
本発明の実施に係るアレルギー性喘息治療薬は、抗ＣＤ６９抗体を主成分とすることを特徴とする。抗ＣＤ６９抗体を用いることにより、ＣＤ６９の働きを阻害することができ、アレルギー性喘息治療薬として用いることができる。なお抗ＣＤ６９抗体としては、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であっても良く、周知の方法で作成することができる。また抗ＣＤ６９抗体は、例えばヒトＣＤ６９分子をマウスに免疫して作製したマウスモノクローナル抗体を改良し、抗原認識部位以外の定常領域をヒトのものに置き換えたヒト型化抗体とする。これを実際にヒトに投与する場合は、水溶液とし、注射剤とすることにより投与することができる。
【００１５】
また、ＣＤ６９の働きを阻害するための他の一態様としては、可溶化ＣＤ６９分子を主成分とすることとも有用である。なおこの場合、可溶化ＣＤ６９分子としては、遺伝子組み換え技術を駆使し、ヒトＣＤ６９分子の細胞外領域とヒトイムノグロブリンの定常領域を結合させたキメラ分子とすることも有用である。また可溶化ＣＤ６９分子もヒトに投与する場合は、水溶液とし、注射剤とすることにより投与することができる。
【００１６】
以上を踏まえ、本発明に係るアレルギー性喘息治療薬の効果を確認すべく実験を行った。以下に図面とともに説明する。
【００１７】
（実験例）
（ノックアウトマウス（ＫＯマウス）の作製）
ターゲットとする領域と同じ配列をもち、その間に薬剤選択マーカー、遺伝子をあらかじめ組み込んだターゲティングベクターを作製した。これを用いて受精卵の発生初期の細胞を培養したＥＳ細胞の中の染色体で相同性組み換えを起こさせ、もう一度受精卵に注入して、そのＥＳ細胞由来の個体を作製した。ＣＤ６９遺伝子は５つのエクソンからなるが、エクソン１をｎｅｏ耐性遺伝子で置き換えてＣＤ６９分子が発現できないようにしたＫＯマウスを作製した（図２参照）。
【００１８】
（ＯＶＡ誘導性の気道炎症モデルについて）
マウスでの喘息モデルとして卵白アルブミン（ＯＶＡ）を用いた気道炎症モデルがある。これは、ＯＶＡ−ａｌｕｍで免疫後、ＯＶＡを吸入させて気道炎症を起こすものである。ＯＶＡ特異的Ｔｈ２細胞の分化・誘導が必須で、気管支周囲や血管周囲に好酸球性の浸潤を特徴とする。メタコリンなどによる気道収縮を起こしたときに非常に強く反応する（気道過敏症）ことで機能的な評価も可能であり、喘息のマウス実験モデルとして使用されている。
【００１９】
（ＣＤ６９ノックアウトマウスでみられた気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中の好酸球浸潤の減少）
Ｄａｙ０とｄａｙ７にＯＶＡをａｌｕｍと一緒に腹腔に注射してＯＶＡ特異的Ｔ（Ｔｈ２）細胞分化を誘導した。Ｄａｙ１４とｄａｙ１６にＯＶＡを吸入（Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）させ、ｄａｙ１８に肺胞洗浄を行った。その結果、肺胞洗浄液中の浸潤細胞のなかの好酸球の割合、絶対数ともにＣＤ６９ノックアウトマウスは正常マウス（ＷＴ）に比較して減少していることがわかった。（図３参照）
【００２０】
（ＣＤ６９ノックアウトマウスにおける気管支周囲および血管周囲での細胞浸潤の減少）
Ｄａｙ０とｄａｙ７にＯＶＡをａｌｕｍと一緒に腹腔に注射してＯＶＡ特異的Ｔｈ２細胞分化を誘導し、Ｄａｙ１４とｄａｙ１６にＯＶＡを吸入させた。Ｄａｙ１７に肺の組織切片を作製し、ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ/ｅｏｓｉｎ  （Ｈ&Ｅ）染色を行った。浸潤細胞の種類と数を調べたところ、ＣＤ６９ノックアウトマウスでは浸潤細胞が減少していた（図４参照）。
【００２１】
（ＣＤ６９ノックアウトマウスでみられたメタコリンに対する気道過敏症の抑制）
Ｄａｙ０とｄａｙ７にＯＶＡをａｌｕｍと一緒に腹腔に注射してＯＶＡ特異的Ｔｈ２細胞分化を誘導し、Ｄａｙ１４とｄａｙ１６にＯＶＡを吸入させた。Ｄａｙ１７にメタコリン誘導性の気道抵抗の上昇を測定した。その結果、ＯＶＡを免疫した正常マウス（ＷＴ）ではメタコリンの濃度依存的に気道抵抗値が上昇したのに対し、ＣＤ６９ノックアウトマウスでは気道抵抗値は低いままであった（図５参照）。
【００２２】
図３〜５の結果より、ＣＤ６９ノックアウトマウスではアレルギー性喘息の発症が抑制されており、ＣＤ６９分子が喘息の発症に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。
【００２３】
（抗ＣＤ６９抗体投与による気管支肺胞洗浄液中の好酸球浸潤の減少）
正常マウスに対し、Ｄａｙ０とｄａｙ７にＯＶＡをａｌｕｍと一緒に腹腔に注射してＯＶＡ特異的Ｔｈ２細胞分化を誘導した。ＯＶＡを吸入させる前日（ｄａｙ１３とｄａｙ１５）に抗ＣＤ６９抗体（０．５  ｍｇ）を腹腔内注射し、ＯＶＡを吸入させた後、ｄａｙ１８に肺胞洗浄を行った。肺胞洗浄液中の浸潤細胞を抗ＣＤ６９抗体投与群とコントロール抗体投与群とで比較したところ、抗ＣＤ６９抗体投与群では有意に浸潤細胞のなかの好酸球の割合、絶対数が減少していた（図６参照）。
【００２４】
（抗ＣＤ６９抗体投与による気管支周囲および血管周囲での細胞浸潤の減少）
正常マウスに対し、Ｄａｙ０とｄａｙ７にＯＶＡをａｌｕｍと一緒に腹腔に注射してＯＶＡ特異的Ｔｈ２細胞分化を誘導した。ＯＶＡを吸入させる前日（ｄａｙ１３とｄａｙ１５）に抗ＣＤ６９抗体（０．５  ｍｇ）を腹腔内注射し、ＯＶＡを吸入させた後、Ｄａｙ１７に肺の組織切片を作製し、ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ/ｅｏｓｉｎ  （Ｈ&Ｅ）染色を行った。浸潤していた細胞の種類と数を調べたところ、抗ＣＤ６９抗体投与群では浸潤細胞が減少していた（図７参照）。
【００２５】
（抗ＣＤ６９抗体投与群でみられたメタコリンに対する気道過敏症の抑制）
正常マウスに対し、Ｄａｙ０とｄａｙ７にＯＶＡをａｌｕｍと一緒に腹腔に注射してＯＶＡ特異的Ｔｈ２細胞分化を誘導した。ＯＶＡを吸入させる前日（ｄａｙ１３とｄａｙ１５）に抗ＣＤ６９抗体（０．５  ｍｇ）を腹腔内注射し、ＯＶＡを吸入させた後、Ｄａｙ１７にメタコリン誘導性の気道抵抗の上昇を測定した。その結果、ＯＶＡを免疫した正常マウス（ＷＴ）およびコントロール抗体投与群ではメタコリンの濃度依存的に気道抵抗値が上昇したのに対し、抗ＣＤ６９抗体投与群では気道抵抗値は低いままであった（図８参照）。
【００２６】
図６〜８の結果より、ＯＶＡに対する免疫が成立した後でも、抗ＣＤ６９抗体投与により喘息反応が抑制できることが明らかになった。これによりＣＤ６９分子を標的にしたアレルギー性喘息の全く新しい治療が可能であると考えられた。
【００２７】
ヒトのＣＤ６９分子は、マウスと同じ１９９個のアミノ酸からなり、高いホモロジーをもっている。その発現パターンは両者でほぼ同じであり、機能面での違いはないと考えられている。したがって、マウスを用いて観察できたアレルギー性喘息の抑制はヒトにも応用可能であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
以上、本発明に係る抗ＣＤ６９抗体、可溶化ＣＤ６９分子は、アレルギー性喘息の新しい治療薬として産業上利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ＣＤ６９の分子構造を説明する図。
【図２】ＣＤ６９ノックアウトマウスの作成における遺伝子の配列を説明する図。
【図３】ＯＶＡ誘導性の気道炎症モデルに対し、ＢＡＬ液中の浸潤細胞中における好酸球の数を調べた結果を示す図。
【図４】ＯＶＡ誘導性の気道炎症モデルに対し、Ｈ＆Ｅ染色における湿潤細胞の数を調べた結果を示す図。
【図５】ＯＶＡ誘導性の気道炎症モデルに対し、メタコリン誘導性の気道抵抗の上昇を測定した場合の結果を示す図。
【図６】抗ＣＤ６９抗体を投与したＯＶＡ誘導性の気道炎症モデルに対し、ＢＡＬ液中の浸潤細胞中における好酸球の数を調べた結果を示す図。
【図７】抗ＣＤ６９抗体を投与したＯＶＡ誘導性の気道炎症モデルに対し、Ｈ＆Ｅ染色における湿潤細胞の数を調べた結果を示す図。
【図８】抗ＣＤ６９抗体を投与したＯＶＡ誘導性の気道炎症モデルに対し、メタコリン誘導性の気道抵抗の上昇を測定した場合の結果を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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