(57)【要約】      （修正有）【課題】  農産物（穀類、野菜）、畜産物（肉類）、水産物（魚介類）、毛髪、体液、微生物等の検体に含まれるＤＮＡを高精度、迅速、簡便且つ安価にＤＮＡ増幅及び解析することのできる技術を提供する。【解決手段】  検体中のＤＮＡをＰＣＲで増幅するに際して複数のＳＳＲプライマー対を用いるマルチプレックスを行い、ＰＣＲ産物の分離・解析を2.0〜4.0％のアガロース濃度のゲル電気泳動により行う。ＳＳＲプライマーとして、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化法のマルチプレックスと同様にＰＣＲ産物のサイズが重ならないプライマー対だけでなく、ＰＣＲ産物のサイズが重なるプライマー対を用いる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の特定の品種を識別しおよび／または他の品種の混入を検知する方法であって、検体中のＤＮＡをＰＣＲ反応で増幅する工程、および増幅後のＰＣＲ産物を分離し解析する工程を含む方法において、前記ＰＣＲ増幅工程が複数のＳＳＲプライマー対を用いるマルチプレックスによって行われることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ＰＣＲ産物の分離・解析工程が2.0〜4.0％のアガロース濃度のゲル電気泳動によって行われ、前記アガロース濃度下において、対象とする特定品種及び混入の可能性のある品種のＰＣＲ産物の電気泳動バンドが重ならないような複数のＳＳＲプライマー対を用いることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項３】
前記ＰＣＲ産物の分離・解析工程が2.0〜4.0％のアガロース濃度のゲル電気泳動によって行われ、前記アガロース濃度下において、対象とする特定品種のＰＣＲ産物の電気泳動バンドは重なるが、混入の可能性のある品種のＰＣＲ産物の電気泳動バンドは重ならないような複数のＳＳＲプライマー対を用いることを特徴とする請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ分析により、各種の検体（生物試料）において特定の品種を識別したり他品種の混入を検知するための新規な技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ分析は、学問の分野においてのみならず、産業上または社会的ないろいろな要求からも益々重要になっている。例えば、食品産業の分野においては、食品の偽装表示問題などに因り食品原材料のＤＮＡ分析の必要性が高まっており、この要求を満たすとともに食品の流通を妨げないために迅速な分析結果が求められている。ＤＮＡの分析は、大略、ＤＮＡの抽出、ＤＮＡの増幅、および解析の各工程から成り、このうちＤＮＡの増幅は、ターゲットとする遺伝子部位が多いほど高精度となるが、その半面、一度に分析できる検体数を減少させ、作業効率を大幅に低下させる。また、ＤＮＡの解析は、アガロースゲルよりアクリルアミドゲルやバイオアナライザー等の機器を使用したほうが多型を多く得られるが、その反面、数ｂｐの誤差が生じることから、解析結果の信頼性が疑われる可能性がある。
【０００３】
ＰＣＲ（polymerase chain reaction）は、ＤＮＡ（遺伝子）の増幅に多用される基本技術であり、ＳＳＲプライマーまたはＲＡＰＤ（ＲＡＰＤ−ＳＴＳ）プライマー等が用いられる。このうち、ＳＳＲ法によりＤＮＡを増幅するための従来から知られている手法は、単一のチューブごとに単一の組（セット）プライマー（プライマー対）を用いてＰＣＲ反応を実施している。その後、ＤＮＡの解析は、ＰＣＲ産物をアクリルアミドゲル、バイオアナライザー等の分離能力の高い機器を用いてＰＣＲ産物のサイズを決定している。これはＳＳＲプライマーによって増幅される部位の差が比較的小さいことによるものである。しかしながらこれらの機器は、数ｂｐの差を検出できるが、泳動による誤差が生じるという難点があった。
【０００４】
一方、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化法においては従来からマルチプレックス法が知られている（例えば、非特許文献１：「ＤＮＡ分析による稲品種の識別」独立行政法人食品総合研究所発行）。増幅させるＤＮＡサイズの差が大きいことから、１チューブごとに２〜５組（セット）のプライマー（プライマー対）のＰＣＲ反応を実施できるが、検出感度が低下することやＲＡＰＤ法自体の再現性が低いこと、混合したサンプルをまとめて分析することができないという難点があった。
【非特許文献１】ＤＮＡ分析による稲品種の識別」独立行政法人食品総合研究所発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、上述したような問題を解決して、高精度、迅速、簡便且つ安価にＤＮＡ増幅及び解析することのできる新しい技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、従来には無いＳＳＲプライマーの使用方法によるＰＣＲ法を実現することにより如上の目的を達成できることを見出し、本発明を導き出したものである。
かくして、本発明に従えば、検体中の特定の品種を識別しおよび／または他の品種の混入を検知する方法であって、検体中のＤＮＡをＰＣＲ反応で増幅する工程、および増幅後のＰＣＲ産物を分離し解析する工程を含む方法において、前記ＰＣＲ増幅工程が複数のＳＳＲプライマー対を用いるマルチプレックスによって行われることを特徴とする方法が提供される。
【０００７】
本発明の特に好ましい態様に従えば、前記ＰＣＲ産物の分離・解析工程が2.0〜4.0％のアガロース濃度のゲル電気泳動によって行われ、前記アガロース濃度下において、対象とする特定品種及び混入の可能性のある品種のＰＣＲ産物の電気泳動バンドが重ならないような複数のＳＳＲプライマー対を用いる。本発明の更に別の特に好ましい態様に従えば、前記ＰＣＲ産物の分離・解析工程が2.0〜4.0％のアガロース濃度のゲル電気泳動によって行われ、前記アガロース濃度下において、対象とする特定品種のＰＣＲ産物の電気泳動バンドは重なるが、混入の可能性のある品種のＰＣＲ産物の電気泳動バンドは重ならないような複数のＳＳＲプライマー対を用いる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、高精度で簡便かつ確実、安価にＤＮＡ増幅及び解析が可能である。ＳＳＲプライマーを用いる本発明のマルチプレックス法によるＤＮＡ増幅及び解析を実施すれば、例えば、従来の手法では96穴ＰＣＲプレート使用の場合、１ＰＣＲ反応において16検体しか処理出来なかったものが、2〜4倍の32〜64検体の同時処理が可能となる。また、アガロースゲルを使用することにより、数ｂｐの差を検出することは出来ないが、その反面、泳動による誤差が少ないことから誤判定し易いという難点も解消される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明に関連して用いる以下の用語は、当該技術分野でよく知られているように、それぞれ、下記の意味を有するものである。
ＳＳＲ：「simple sequence repeat」の略称であり、ＤＮＡに存在する単純繰り返し配列である。
マルチプレックス：１つのＰＣＲ反応において複数の組（セット）のプライマー（プライマー対）を使用することであり、同時に複数のゲノム領域を増幅することができる。
ＲＡＰＤ−ＳＴＳ：ランダムな配列をプライマーとしてＰＣＲを行い、増幅されるＤＮＡ断片のパターンの違いで元の配列の差異を検出する（random amplified polymorphic DNA）に際して、ＳＴＳ（sequence tagged site）化、すなわち、ＲＡＰＤプライマーによるＤＮＡ増幅断片の塩基配列を調べて新たに１対のプライマーを設計することで特異性を高めることができる。
背景技術に関連した既述の説明から理解されるように、ＳＳＲ法によるＤＮＡ増幅及び分析するための従来の手法においては、単一のチューブごとに単一のプライマー（プライマー対）を用いてＰＣＲ反応を実施し、後続のＤＮＡ解析では、アクリルアミドゲル、バイオアナライザー等の分離能力の高い機器を用いてＰＣＲ産物のサイズを決定している。また、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化法のように増幅させるＤＮＡサイズの差が大きい場合には、十分に分離できる手法としてアガロースゲルが用いられている。
【００１０】
これに対して、本発明のＤＮＡ増幅及び解析法は、従来行われていないＳＳＲプライマーをマルチプレックスにしている。本発明は、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化法のマルチプレックスと同様にＰＣＲ産物のサイズが重ならないプライマーから成るだけでなく、ＰＣＲ産物のサイズが重なるプライマーから成ることは、これまでにない奇抜なＤＮＡ増幅及び解析法である。すなわち、本発明の方法は、本来は、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ化法のように増幅させるＤＮＡサイズの差が大きく、ＰＣＲ産物の有無で判別するプライマーをマルチプレックスにしていたものをＳＳＲマーカーに用いて、高精度な分析が可能となるように構成されている。本発明に従うＤＮＡ増幅及び解析法のこのような特徴は、プライマーの混合方式及びアガロースゲルの分離能力が低いことを逆手に取ることで実現されたものである。
【００１１】
上述したように、本発明のＤＮＡ増幅及び解析法の特徴は、単純にＰＣＲ産物のサイズが重ならないプライマーをマルチプレックスにしただけではなく、ＰＣＲ産物のサイズが重なるプライマーもマルチプレックスにして使用することにある。
図１は、本発明に従いマルチプレックスＰＣＲに用いられるＳＳＲプライマー（正確にはプライマー対であるが、以下、単にプライマーということもある。）の選別の仕方を示すものである。
まず、品種間で多型の得られたＳＳＲプライマーを用いて、プライマーごとに、対象とする品種（識別すべき特定の品種）と他品種（混入のある品種）のＤＮＡをＰＣＲで増幅し、そのＰＣＲ産物のサイズを、2.0〜4.0％のアガロース濃度の電気泳動により測定しておく。
【００１２】
ＰＣＲ産物のサイズが重ならないＳＳＲプライマーを選出する場合、図１の上段（イ）に記載されたプライマーＡとプライマーＢのように、対象品種のＤＮＡバンドの位置及び他品種のＤＮＡバンドの位置がいずれも異なっているプライマーを選出する。ＰＣＲ産物のＤＮＡサイズが一般的には互いに100ｂｐ程度離れているようになるＳＳＲプライマーを選出することにより、2.0〜4.0％のアガロース濃度のゲルを用いる電気泳動においてもＰＣＲ産物のＤＮＡバンドが互いに重ならず、解析が可能となる。
【００１３】
他方、ＰＣＲ産物のサイズが重なるＳＳＲプライマーを選出する場合、図１の下段（ロ）に記載されたプライマーＣとプライマーＤのように、対象品種のＤＮＡバンドの位置は重なるが、他品種のバンドが重ならないようなプライマーを選出する。この場合は、対象品種については、そのＰＣＲ産物のＤＮＡサイズの差が５ｂｐ以内であり、2.0〜4.0％の濃度のアガロースゲルでは明確に分離できないが、他品種についてはＰＣＲ産物のＤＮＡサイズが如上のように明確に分離できるようなＳＳＲプライマーの組合せとなる。
【００１４】
かくして、本発明に従えば、図１に沿って説明したプライマーＡとプライマーＢのような複数のＳＳＲプライマーを用いるマルチプレックスＰＣＲにより検体中のＤＮＡを増幅した後、そのＰＣＲ産物を2.0〜4.0％のアガロース濃度の電気泳動に供することにより、図１の（イ）および（ロ）の右端に示すような電気泳動パターンが得られるので、検体中の特定の品種を識別しおよび／または他の品種の混入を検知することができる。
【００１５】
図１に沿う以上の説明においては、２組（２セット）のプライマーを用いているが、更に多くの組のプライマーを用いても同様に分析が可能であり、また、図１の（イ）に示すようにＰＣＲ産物のサイズの重ならないプライマーを用いる手法と、図１の（ロ）に示すようにＰＣＲ産物のサイズの重なるプライマー対を用いる手法とを組み合わせて実施することもできる。
【００１６】
本発明の方法は、検体の種類に応じて、既に知られているＳＳＲプライマーから上記のように複数のセットのプライマーを選出したり、あるいは、新たにＳＳＲプライマーを設計して上記のような条件を満たすような複数のセットのプライマーを選出することにより実施することができる。
【００１７】
本発明におけるＰＣＲ産物の分離・解析は2.0〜4.0％のアガロース濃度のゲル電気泳動によって行われる。アガロースゲルの濃度が高すぎると、ＰＣＲ産物の分離能が大きすぎてＳＳＲプライマーを用いてＰＣＲを行う本発明の目的を達し得ない。勿論、アガロースゲルの濃度が低すぎると、そもそもＰＣＲ産物を分離することができなくなる。
【００１８】
ＳＳＲプライマーを用いる本発明のマルチプレックス法に使用する試薬ついては、特に限定されるものではなく、Taqポリメラーゼに付属する試薬が使用可能である。特に好ましい緩衝液としては、１Ｍトリス塩酸バッファー、塩化マグネシウムおよび１Ｍ  ＤＴＴから構成され、酵素の安定性を高める目的としてTritonX−100やＢＳＡを0.01％添加したLowバッファーである。
【００１９】
本発明のマルチプレックス法に使用する試薬量については、1チューブごとに1プライマーを用いる従来から知られたＰＣＲ反応と同様の試薬量で行うことが可能である。しかしながら、使用するプライマーによっては、Taqポリメラーゼ不足と考えられるＤＮＡ増幅量の低下が確認されている。ある特定のＳＳＲプライマーをマルチプレックスにする場合、基本使用量の1.5〜2.5倍量のTaqポリメラーゼを添加することで良好なＤＮＡ増幅を行うことが可能である。また、Taqポリメラーゼの種類を変更することで代用ができる。
【００２０】
本発明に従えば、如上の本発明のＤＮＡ増幅を行うＰＣＲ反応サイクルと温度、時間は、１チューブごとに１プライマーのＰＣＲ反応と同様のサイクルで行うことが可能である。ただし、サーマルサイクラーの機種によっては、同条件のＰＣＲ増幅に差が生じることから、アニーリングの温度、サイクル数、反応時間は、下記の範囲内で調節することにより、効率的な増幅が見込まれる。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
本発明のマルチプレックス法を用いるＤＮＡの増幅は、ＳＳＲプライマーを混合することから１チューブごとに１プライマーのＰＣＲ反応では見られなかった増幅阻害が見られることがある。通常、Taqポリメラーゼの量を増やすことで対応が可能であるが、それでも改善が見られない場合には、プライマーの濃度を調節することや、試薬の総量を変更することで改善される。プライマーの濃度は、ＤＮＡ増幅量の多いプライマー濃度を通常の20〜80％に減らすとよい。また、試薬の総量を20μｌから50μｌに変更するとよい。
【００２３】
本発明は、農産物（植物体、籾、玄米、精米、炊飯米、加工品）、畜産物（肉、加工品）、水産物（魚肉、加工品）、毛髪（毛根付き毛髪、毛幹）、さらには、体液（血液、精液など）、微生物（細菌など）等の各種検体（生物試料）のＳＳＲ法による分析に適用することができるが、これらに限定されるものではない。本発明のＤＮＡ増幅及び解析法に従えば、農産物、畜産物、水産物、毛髪、体液、微生物のいずれの検体においてもＤＮＡ増幅及び解析が可能である。
以下、実施例により本発明を詳しく説明するが、検体の種類、ＳＳＲプライマー、試薬などにおいて本発明は以下の実施例に示すものに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
（試薬の調製）
ＤＮＡ増幅は、下記のｉ〜ｖｉに示す試薬を調合して実施する。
Ｉ        ＤＷ（蒸留水）      9.8μｌ
Ｉｉ      10×ＰＣＲバッファー（付属）      2.0μｌ
Ｉｉｉ    ｄＮＴＰ（2.5ｍＭeach  付属）      1.0μｌ
Ｉｖ      Taqポリメラーゼ（2.5unit/μｌ）      0.2μｌ
Ｖ        プライマー（各4pmol/μｌ）      2.0μｌ
Ｖｉ      テンプレート（5〜20ng）      5.0μｌ
【実施例２】
【００２５】
（大豆のＤＮＡ分析）
大豆50ｇをミルサーにより粉砕し、粉砕物から1.5mlチューブにスパーテルにて検体として0.1ｇ採取した。この検体に、ＤＮＡ抽出バッファーを1000μl加えて攪拌後、60℃において10分加温した。その後、実施例１で調製したクロロホルム−イソアミルアルコールを500μl添加後、1分間転倒攪拌した。
次いで、遠心操作（16000g、10分）に供し、上澄み液を別の1.5mlチューブに300μl採取して２−プロパノールを200μl加えて攪拌した。5分静置後に遠心操作（16000g、20分）にかけ、上澄みを廃棄して沈殿物を乾燥した。これに70％エタノールを200μl添加後、すぐに廃棄した。エタノールを気化させた後、1×ＴＥ（Tris-EDTA）10μlを加えて冷蔵庫にて保管した。ＰＣＲに使用する際には、100倍に希釈して用いた。ＰＣＲ反応は、実施例1に記述のとおり、2.5unit／μlのTaq
ＤＮＡポリメラーゼ（北海道システム・サイエンス製）、付属の10×バッファー、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ、鋳型ＤＮＡ、プライマーを含む総量20μlの反応液を用いて行った。ＰＣＲ反応は、バイオラッド社のiCycle（商標）サーマルサイクラーにより94℃で30秒（熱変性）、47℃で40秒（アニーリング反応）、72℃で60秒（伸長反応）を１サイクルとするサイクルを35回行い、最後に伸長反応を完全に終わらせるために72℃で5分間保温した。
ＰＣＲ産物は、0.5×ＴＢＥバッファーにて2.5％アガロースゲルで、日本エイドー製大型サブマリン電気泳動装置を用いて230Ｖ−１時間15分の条件で電気泳動を行った。増幅産物を臭化エチジウムにより染色後、紫外線照射によりＤＮＡバンドパターンを検出した。
【００２６】
表１および表２は、対象品種として品種名「サチユタカ」の大豆、他品種として品種名「トヨコマチ」の大豆のＤＮＡ分析を行った場合を例に、使用したＳＳＲプライマーの塩基配列を示す。表１は、図１の（イ）に沿って既述したように、対象品種及び他品種のＰＣＲ産物の電気泳動バンドが重ならないＳＳＲプライマー（プライマー対）を用いる場合を例示するものであり、その電気泳動図が図２である。表２は、図１の（ロ）に沿って既述したように、対象品種のＰＣＲ産物の電気泳動バンドは重なるが、他品種のＰＣＲ産物の電気泳動パターンは重ならないようなＳＳＲプライマー（プライマー対）を用いる場合を例示するものであり、その電気泳動図が図３である。
対象とする特定品種（この例では、大豆サチユタカ）を識別することができ（図２のレーン５参照）、さらに、他の品種（この例では、大豆トヨコマチ）の混入を検知することができる（図２のレーン６および図３のレーン５参照）。
【００２７】
【表２】
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【００２８】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明に従いマルチプレックスＰＣＲに用いられるＳＳＲプライマーの選別の仕方を示す。
【図２】本発明に従って増幅された大豆のＤＮＡの存在を示す電気泳動図である。
【図３】本発明に従って増幅された大豆のＤＮＡの存在を示す電気泳動図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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