(57)【要約】【課題】保存およびその後の分析を伴わずに、このような保護添加剤の最適濃度を決定するための改善された迅速な方法を提供すること。【解決手段】本発明は、少なくとも一つの生体マクロ分子の種および少なくとも一つの保護添加剤の種を含有する溶液中において、変性および凝集に対して敏感な生体マクロ分子、例えばタンパク質または核酸を保護できる添加剤の最適濃度を決定するための方法であって：ａ）前記溶液を超音波で処理することと；ｂ）前記溶液中における超音波速度および／または前記溶液の超音波吸収の１以上の超音波パラメータの値を記録することを含んでなる方法を提供する。該方法は、保護添加剤の濃度に依存した超音波パラメータの臨界的な変化を検出することを可能にし、この変化は、添加剤と生体マクロ分子の間および／または異なる生体マクロ分子の間の相互作用または相互作用の変化、および／または生体マクロ分子のコンホメーションの変化を示すものである。従って、このような変化の測定は、生体マクロ分子を変性および凝集から保護するための前記添加剤の最適濃度を決定するために使用することができる。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
変性および凝集に対して敏感な少なくとも一つの生体マクロ分子の種および少なくとも一つの保護添加剤の種を含有する溶液中において、前記敏感な生体マクロ分子を変性および凝集に対して保護できる添加剤の最適濃度を決定するための方法であって：
ａ）変性および凝集し易い少なくとも一つの生体マクロ分子種および少なくとも一つの保護添加剤種を含有する溶液を、超音波で処理することと；
ｂ）前記溶液中における超音波速度および前記溶液の超音波吸収から選択される少なくとも一つの超音波パラメータの値を記録すること
を含んでなる方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって：更に、
（ｃ）工程ｂ）で得られた前記超音波パラメータの値を基準値と比較すること
を含んでなる方法。
【請求項３】
請求項１または２にお記載の方法であって、前記生体マクロ分子が、ペプチド、タンパク質、核酸、およびそれらの天然もしくは合成の誘導体からなる群から選択される方法。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載の方法であって、前記添加剤が、オリゴ-もしくはポリ-ヒドロキシ化合物、およびオリゴ-もしくはポリ-エーテル化合物からなる群から選択される方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記添加剤が糖、特にグルコース、蔗糖またはトレハロースである方法。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載の方法であって、前記工程ｂ）で得た値を、同じ濃度の同じ保護添加剤を有し且つ前記生体マクロ分子を含まない基準溶液中で記録された同じパラメータの値と比較する方法。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか１項に記載の方法であって、保護添加剤の濃度を徐々に増大させた一連の溶液を超音波で処理し、工程ｂ）で得られた値、または工程ｂ）で得られた値と基準値との間の差を保護添加剤の濃度に対してプロットする方法。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか１項に記載の方法であって、保護添加剤の濃度に依存した超音波パラメータの臨界的な変化を観察し、前記生体マクロ分子を変性および凝集から保護するための前記添加剤の最適濃度を決定するために使用する方法。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか１項に記載の方法であって、前記超音波パラメータが、前記溶液中における超音波速度である方法。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れか１項に記載の方法であって、超音波共鳴器を使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
一定の低分子物質が、敏感な生体マクロ分子を変性および不可逆的凝集から保護できることが周知である。このような添加剤は、例えば、ポリヒドロキシ化合物またはポリエーテル化合物である。それらは、生体分子の表面を保護して、変性または不可逆的凝集に導き得る分子間の直接の接触を防止する。このような保護添加剤の存在下において、生体マクロ分子は溶液で保存することができ、凍結保存および再解凍することができ、更には凍結乾燥して長期間保存することができ、その後には、水性媒質の添加によって再度溶解することにより、未変性の生体マクロ分子の溶液を製造できることが知られている。
【０００２】
保護効果を保証するために必要とされるこのような添加剤の有効濃度を決定するには、それぞれの保護物質を種々の濃度で添加して、生体マクロ分子の溶液を調製しなければならないので、面倒で且つ時間がかかる。これらのサンプルは、長期間に亘って保存し、次いで変性もしくは凝集した生体マクロ分子を分析されなければならない。または、それらを凍結して長期間保存し、再解凍し、変性もしくは凝集した生体分子について分析しなければならない。或いは、それらを凍結乾燥して長期間保存し、水性媒質の添加により再度溶解させなければならない。何れの場合にも、当該添加剤の保護効果についての言及は、長期の保存期間の後にのみ可能である。
【発明の概要】
【０００３】
従って、本発明の目的は、保存およびその後の分析を伴わずに、このような保護添加剤の最適濃度を決定するための改善された迅速な方法を提供することである。
【０００４】
驚くべきことに、高感度で且つ正確な超音波測定に基づいて、保存およびその後の分析を伴わずに、このような添加剤の保護効果を決定することが可能であることが見出された。鋭敏な超音波共鳴器技術を使用した、増大する濃度の保護添加剤を含有する生体マクロ分子の溶液中での超音波パラメータの測定は、サンプル中における保護効果の信頼性のある予測を可能にする。保護添加剤の濃度の増大に伴う超音波パラメータ特性（例えば超音波速度および超音波吸収）の変化は、保存、凍結乾燥、保存、再溶解もしくは凍結、保存および解凍の際の変性および／または凝集に対する生体マクロ分子の保護に必要とされる添加剤の臨界濃度を、信頼性をもって指示する。このような超音波測定を適用することによって、サンプルを保存した後に変性または凝集を分析することは、もはや必要なくなるであろう。
【０００５】
従って、上記で述べた問題は、本願の請求項１〜１０に従い、超音波測定に基づいて溶液中におけるこのような保護添加剤の最適濃度を決定する方法を提供することにより、本発明に従って解決される。
【発明の説明】
【０００６】
本発明は、高感度および精密な超音波測定に基づいて、保存およびその後の分析なしに、このような添加剤の保護効果の検出が可能であるとの発見に基づいている。鋭敏な超音波共鳴器技術を使用した、増大する濃度の保護添加剤を含有する生体マクロ分子の溶液での超音波パラメータの測定は、サンプル中における保護効果の信頼性のある予測を可能にする。保護添加剤の濃度の増大に伴う超音波パラメータ特性（例えば超音波速度および超音波吸収）の変化は、例えば凍結、凍結乾燥、保存、再溶解もしくは凍結、保存および解凍の際の変性および／または凝集に対する、生体マクロ分子の保護のために適切な添加剤の臨界濃度を信頼性をもって指示する。このような超音波測定を適用することによって、サンプルを保存した後の変性または凝集の分析は、もはや必要なくなるであろう。
【０００７】
変性および凝集に対して敏感な少なくとも一つの生体マクロ分子種および少なくとも一つの保護添加剤の種を含有する溶液中において、変性および凝集に対して敏感な生体マクロ分子を保護できる添加剤の最適濃度を決定するための本発明の方法は、下記の工程を含んでなるものである：
ａ）変性および凝集し易い少なくとも一つの生体マクロ分子種および少なくとも一つの保護添加剤種を含有する溶液を、超音波で処理する工程；および
ｂ）前記溶液中における超音波速度および／または前記溶液の超音波吸収のような１以上の超音波パラメータの値を記録する工程。
【０００８】
典型的には、該方法はまた、工程ｂ）で得られた前記超音波パラメータの値を基準値と比較する工程を具備する。この基準値は、同じ濃度の同じ保護添加剤を有し且つ前記生体マクロ分子を含まない基準溶液中で記録された同じパラメータの値であってよい。
【０００９】
本発明の特定の実施例においては、保護添加剤の濃度を徐々に増大させた一連の溶液を超音波で処理し、工程ｂ）で得られた値、または工程ｂ）で得られた値と基準値との間の差を、保護添加剤の濃度に対してプロットする。
【００１０】
本発明の方法は、保護添加剤の濃度に依存した超音波パラメータの臨界的な変化を検出することを可能にし、この変化は、添加剤と生体マクロ分子の間および／または異なる生体マクロ分子の間の相互作用または相互作用の（臨界的な）変化、および／または生体マクロ分子のコンホメーションの変化を示すものである。従って、このような変化の測定は、生体マクロ分子を変性および凝集から保護するための前記添加剤の最適濃度を決定するために使用することができる。
【００１１】
適切な生体マクロ分子は、変性および凝集に敏感な如何なるマクロ分子であってもよい。その限定的でない特定の例は、ペプチド、タンパク質、核酸、およびそれらの天然もしくは合成の誘導体などの生物学的マクロ分子である。更なる適切な生体マクロ分子は、当業者に明らかであろう。
【００１２】
適切な添加剤は、生体マクロ分子を変性および凝集から保護できる何れかの添加剤である。ここで使用する「保護する」の用語は、「防止する」並びに「阻害する」ことを含む。極めて多種類のこのような添加剤が、当該技術において周知であり、当業者が入手可能である。適切な添加剤の非限定的な特定の例は、オリゴ-もしくはポリ-ヒドロキシ化合物、およびオリゴ-もしくはポリ-エーテル化合物である。更に特殊な実施形態において、当該添加剤は糖、特にグルコース、蔗糖またはトレハロースである。明らかに、異なる添加剤の混合物を使用してもよい。
【００１３】
本発明の方法の好ましい実施形態において、前記超音波パラメータは、前記添加剤を含有する溶液中における超音波速度であり、該添加剤の濃度を増大させながら、この速度の変化が記録される。
【００１４】
好ましくは、超音波共鳴器を使用して超音波測定が行われる。適切な超音波共鳴器は当該技術において知られており、例えば、アメリカ合衆国ニュージャージー州のＴＦインスツルメントＩｎｃ．社、またはハイデルベルグ氏のＴＦインスツルメンツＧｍｂＨ社から入手可能である（例えば、ＲｅｓｏＳｃａｎシステム）。
【外国語明細書】
2007292759000001.pdf