(57)【要約】【課題】配列特異性の高い核酸増幅を可能とする簡便な核酸増幅法の提供。【解決手段】等温下での核酸増幅反応により鋳型核酸中の標的核酸配列を増幅する方法であって、（ａ）標的核酸配列を含む鋳型核酸を用意する工程、（ｂ）ＲｅｃＡタンパク質を用意する工程、（ｃ）標的核酸配列の等温下での増幅を可能とするプライマーセットを用意する工程、および（ｄ）前記鋳型核酸および前記ＲｅｃＡタンパク質の存在下において、前記プライマーセットによる等温下での核酸増幅反応を行う工程を含んでなる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
等温下での核酸増幅反応により鋳型核酸中の標的核酸配列を増幅する方法であって、
（ａ）標的核酸配列を含む鋳型核酸を用意する工程、
（ｂ）ＲｅｃＡタンパク質を用意する工程、
（ｃ）標的核酸配列の等温下での増幅を可能とするプライマーセットを用意する工程、および
（ｄ）前記鋳型核酸および前記ＲｅｃＡタンパク質の存在下において、前記プライマーセットによる等温下での核酸増幅反応を行う工程
を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、鋳型上における該プライマーの伸長反応によって得られる核酸鎖において、該核酸鎖の５’末端部分が同一鎖上にハイブリダイズすることを可能とするものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズする配列（B'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（B-Bc'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズする配列（B'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（C）よりも５’側に存在する配列（D）の相補配列（Dc）にハイブリダイズする配列（D'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（B-Bc'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズする配列（B'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記プライマーセットが、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズする１種以上の第三のプライマーを含んでなるものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記プライマーセットが、鋳型核酸上の前記標的核酸配列よりも３’側の領域にハイブリダイズするアウタープライマーを含んでなるものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
核酸増幅反応がＡＴＰおよび／またはＡＴＰ類似体の存在下で行われる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
鎖置換能を有するポリメラーゼが使用される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
核酸増幅反応が融解温度調整剤の存在下で行われる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
融解温度調整剤が、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの２種以上の混合物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
等温下での核酸増幅反応により鋳型核酸中の標的核酸配列を増幅するためのキットであって、
（ａ）ＲｅｃＡタンパク質、および
（ｂ）標的核酸配列の等温下での増幅を可能とするプライマーセット
を含んでなる、キット。
【請求項１５】
前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、鋳型上における該プライマーの伸長反応によって得られる核酸鎖において、該核酸鎖の５’末端部分が同一鎖上にハイブリダイズすることを可能とするものである、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズする配列（B'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものである、請求項１４または１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（B-Bc'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものである、請求項１４または１５に記載のキット。
【請求項１８】
前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズする配列（B'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（C）よりも５’側に存在する配列（D）の相補配列（Dc）にハイブリダイズする配列（D'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものである、請求項１４または１５に記載のキット。
【請求項１９】
前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（B-Bc'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものである、請求項１４または１５に記載のキット。
【請求項２０】
前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズする配列（B'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものである、請求項１４または１５に記載のキット。
【請求項２１】
前記プライマーセットが、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズする１種以上の第三のプライマーを含んでなるものである、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２２】
前記プライマーセットが、鋳型核酸上の前記標的核酸配列よりも３’側の領域にハイブリダイズするアウタープライマーを含んでなるものである、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２３】
ＡＴＰおよび／またはＡＴＰ類似体をさらに含んでなる、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２４】
鎖置換能を有するポリメラーゼをさらに含んでなる、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２５】
融解温度調整剤をさらに含んでなる、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２６】
融解温度調整剤が、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの２種以上の混合物である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
等温下での核酸増幅反応により核酸試料中の核酸配列における変異の有無を判定する方法であって、
（ａ）核酸試料を用意する工程、
（ｂ）ＲｅｃＡタンパク質を用意する工程、
（ｃ）標的核酸配列の等温下での増幅を可能とするプライマーセットであって、該プライマーセットに含まれる少なくとも１種のプライマーが、前記変異の存在または不存在によって前記核酸試料中の標的配列との間で１以上のミスマッチを生じるように設計されたものである、プライマーセットを用意する工程、および
（ｄ）前記核酸試料および前記ＲｅｃＡタンパク質の存在下において、前記プライマーセットによる等温下での核酸増幅反応を行う工程
を含んでなる、方法。
【請求項２８】
前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、鋳型上における該プライマーの伸長反応によって得られる核酸鎖において、該核酸鎖の５’末端部分が同一鎖上にハイブリダイズすることを可能とするものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズする配列（B'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものである、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（B-Bc'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものである、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズする配列（B'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（C）よりも５’側に存在する配列（D）の相補配列（Dc）にハイブリダイズする配列（D'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものである、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（B-Bc'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものである、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズする配列（B'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものである、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記プライマーセットが、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズする１種以上の第三のプライマーを含んでなるものである、請求項２７〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記プライマーセットが、鋳型核酸上の前記標的核酸配列よりも３’側の領域にハイブリダイズするアウタープライマーを含んでなるものである、請求項２７〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
核酸増幅反応がＡＴＰおよび／またはＡＴＰ類似体の存在下で行われる、請求項２７〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
鎖置換能を有するポリメラーゼが使用される、請求項２７〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
核酸増幅反応が融解温度調整剤の存在下で行われる、請求項２７〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
融解温度調整剤が、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの２種以上の混合物である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
等温下での核酸増幅反応により核酸試料中の核酸配列における変異の有無を判定するためのキットであって、
（ａ）ＲｅｃＡタンパク質、および
（ｂ）標的核酸配列の等温下での増幅を可能とするプライマーセットであって、該プライマーセットに含まれる少なくとも１種のプライマーが、前記変異の存在または不存在によって前記核酸試料中の標的配列との間で１以上のミスマッチを生じるように設計されたものである、プライマーセット
を含んでなる、キット。
【請求項４１】
前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、鋳型上における該プライマーの伸長反応によって得られる核酸鎖において、該核酸鎖の５’末端部分が同一鎖上にハイブリダイズすることを可能とするものである、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズする配列（B'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものである、請求項４０または４１に記載のキット。
【請求項４３】
前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（B-Bc'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものである、請求項４０または４１に記載のキット。
【請求項４４】
前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズする配列（B'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（C）よりも５’側に存在する配列（D）の相補配列（Dc）にハイブリダイズする配列（D'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものである、請求項４０または４１に記載のキット。
【請求項４５】
前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（B-Bc'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものである、請求項４０または４１に記載のキット。
【請求項４６】
前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズする配列（B'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものである、請求項４０または４１に記載のキット。
【請求項４７】
前記プライマーセットが、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズする１種以上の第三のプライマーを含んでなるものである、請求項４０〜４６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４８】
前記プライマーセットが、鋳型核酸上の前記標的核酸配列よりも３’側の領域にハイブリダイズするアウタープライマーを含んでなるものである、請求項４０〜４６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４９】
ＡＴＰおよび／またはＡＴＰ類似体をさらに含んでなる、請求項４０〜４６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５０】
鎖置換能を有するポリメラーゼをさらに含んでなる、請求項４０〜４６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５１】
融解温度調整剤をさらに含んでなる、請求項４０〜４６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５２】
融解温度調整剤が、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの２種以上の混合物である、請求項５１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、遺伝子工学分野において有用な核酸配列の増幅法に関するものであり、より詳細には、鎖置換反応を利用した核酸配列の等温増幅法、ならびにこの方法を利用した変異検出法に関するものである。
【０００２】
背景技術
遺伝子工学分野においては、遺伝的な特徴を直接的に分析しうる方法として、核酸配列の相補性に基づく分析が知られている。このような分析では、試料中に存在する目的遺伝子量が少ない場合には、一般にその検出が容易ではないため、目的遺伝子そのものを予め増幅することが必要となる。
【０００３】
目的遺伝子の増幅（核酸増幅）は、主に、ＤＮＡポリメラーゼを利用した酵素的方法により行われる。このような酵素的方法の主要なものとしては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法；米国特許第４６８３１９５号明細書、米国特許第４６８３２０２号明細書および米国特許第４８００１５９号明細書）、さらには、ＰＣＲ法と逆転写酵素反応を組合わせた逆転写ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ法；Trends in Biotechnology 10, pp146-152, 1992）がある。これらの方法は、鋳型となる二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離（変性）、一本鎖核酸へのプライマーのアニーリング、およびプライマーからの相補鎖合成（伸長）の３つの段階からなる反応を繰り返すことにより、ＤＮＡまたはＲＮＡからの目的遺伝子の増幅を可能とするものである。これらの方法では、反応溶液を上記３段階のそれぞれに適した温度に調節する計３工程の繰り返しが必要とされる。
【０００４】
近年、等温状態で実施可能な核酸増幅法が開発されている。このような方法としては、例えば、特公平７−１１４７１８号公報に記載の鎖置換型増幅（ＳＤＡ；strand displacement amplification）法、自立複製（３ＳＲ；self-sustained sequence replication）法、日本国特許第２６５０１５９号公報に記載の核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ；nucleic acid sequence based amplification）法、ＴＭＡ(transcription-mediated amplification)法、日本国特許第２７１０１５９号公報に記載のＱベータレプリカーゼ法、米国特許第５８２４５１７号明細書、国際公開第９９／０９２１１号パンフレットまたは国際公開第９５／２５１８０号パンフレットに記載の種々の改良ＳＤＡ法、国際公開第００／２８０８２号パンフレットに記載のＬＡＭＰ法（Loop-Mediated Isothermal Amplification）、国際公開第０２／１６６３９号パンフレットに記載のＩＣＡＮ法（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）、国際公開第２００４／０４００１９号パンフレットに記載の方法、国際公開第２００５／０６３９７７号パンフレットに記載のＳＭＡＰ法等が挙げられる。これらの等温核酸増幅法に関与する全段階の反応は一定の温度に保たれた反応混合物中で同時に進行する。
【０００５】
国際公開第００／２８０８２号パンフレット（特許文献１）に記載のＬＡＭＰ法では、４種類のプライマーが必要とされ、それらが６個所の領域を認識することにより、目的遺伝子の増幅が可能となる。すなわち、この方法では、まず、第一のプライマーが鋳型鎖にアニーリングして伸長反応が起こり、次に、第一のプライマーよりも上流側に設計された第二のプライマーによる鎖置換反応により第一のプライマーによる伸長鎖が鋳型鎖から分離する。この時に、剥ぎ取られた第一のプライマー伸長産物の構成に起因して伸長鎖の５’末端部分でステムループ構造が形成される。これと同様の反応が二本鎖核酸のもう一方の鎖、もしくは、剥ぎ取られた第一のプライマー伸長産物の３’末端側についても行なわれ、これらの反応が繰り返されることにより、標的核酸が増幅される。この方法では、プライマー伸長鎖に対する相補鎖合成により３’末端においてステムループ構造を形成する増幅産物が得られ、その３’末端を合成起点とする相補鎖合成が連続して生じるため、多くの標的核酸配列がプライマー配列を介して連結された長い増幅産物が得られる。
【０００６】
国際公開第２００４／０４００１９号パンフレット（特許文献２）に記載の方法では、プライマー伸長鎖の５’末端部分においてステムループ構造を形成しうるループ形成プライマーのペアが用いられる。このループ形成プライマーは、鋳型にアニーリングしてプライマー伸長反応を経た後、その伸長鎖の５’末端において自動的に同伸長鎖に折り返してループを形成し、これにより一本鎖の状態となった鋳型上の領域に同じプライマーがアニーリングすることを可能とする。この方法でも、プライマー伸長鎖に対する相補鎖合成により３’末端においてステムループ構造を形成する増幅産物が得られ、その３’末端を合成起点とする相補鎖合成が連続して生じるため、多くの標的核酸配列がプライマー配列を介して連結された長い増幅産物が得られる。
【０００７】
国際公開第２００５／０６３９７７号パンフレット（特許文献３）に記載のＳＭＡＰ法では、国際公開第２００４／０４００１９号パンフレットに記載のループ形成プライマーと、相互に相補的な配列を一本鎖上に連結した折り畳み配列を５’末端部分に含む折り畳みプライマーとからなるプライマーペアが用いられる。この方法では、プライマー伸長鎖に対する相補鎖合成により３’末端においてステムループ構造または折り畳み構造を形成する増幅産物が得られ、その３’末端を合成起点とする相補鎖合成が連続して生じるため、多くの標的核酸配列がプライマー配列を介して連結された長い増幅産物が得られる。
【０００８】
一方で、ＰＣＲ法をはじめとするプライマーを用いた核酸増幅技術においては、目的の核酸配列の不十分な増幅および目的以外の増幅産物の増加など、その配列特異性が十分に確保されないという問題が生ずることがある。
【０００９】
核酸増幅反応における配列特異性を向上させるため、ＰＣＲ法に関して、反応液中に一本鎖ＤＮＡに結合する大腸菌由来のＤＮＡ結合タンパク質を添加することが報告されている。また、同じ目的で、ＰＣＲ反応液中に、大腸菌等に由来するＲｅｃＡタンパク質とＡＴＰγ−ｓとを添加する方法（特許文献４：国際公開第９１／１７２６７号パンフレット）、Thermus aquaticus由来のＲｅｃＡタンパク質とＡＴＰとを添加する方法（特許文献４：国際公開第９１／１７２６７号パンフレット）、Thermus thermophilus由来のＲｅｃＡタンパク質を添加する方法（特許文献５：特開２００５−１１０６２１号公報）、およびThermus thermophilus由来のＲｅｃＡタンパク質とＡＴＰγ−ｓとを添加する方法（特許文献６：国際公開第２００４／０２７０６０号パンフレット）が報告されている。
【００１０】
近年、遺伝子の挿入、欠失などの遺伝子情報を迅速に検出する診断技術は非常に重要視されており、例えば、癌細胞などに特異的に発現されるｍＲＮＡや遺伝子マーカーの迅速かつ特異的な検出などに利用可能な技術が重要視されている。よって、配列特異性が高く、増幅効率の高い核酸増幅法が依然として求められている。
【００１１】
【特許文献１】国際公開第００／２８０８２号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００４／０４００１９号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００５／０６３９７７号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９１／１７２６７号パンフレット
【特許文献５】特開２００５−１１０６２１号公報
【特許文献６】国際公開第２００４／０２７０６０号パンフレット
【発明の概要】
【００１２】
本発明者らは、等温下での核酸増幅反応を、ＲｅｃＡタンパク質の存在下で行うことにより、核酸増幅の配列特異性が顕著に向上することを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【００１３】
従って、本発明の目的は、配列特異性の高い核酸増幅を可能とする簡便な核酸増幅法を提供することにある。
【００１４】
そして、本発明による核酸増幅法は、等温下での核酸増幅反応により鋳型核酸中の標的核酸配列を増幅する方法であって、（ａ）標的核酸配列を含む鋳型核酸を用意する工程、（ｂ）ＲｅｃＡタンパク質を用意する工程、（ｃ）標的核酸配列の等温下での増幅を可能とするプライマーセットを用意する工程、および（ｄ）前記鋳型核酸および前記ＲｅｃＡタンパク質の存在下において、前記プライマーセットによる等温下での核酸増幅反応を行う工程を含んでなるものである。
【００１５】
本発明によれば、簡便な操作によって鋳型に含まれる標的核酸配列を正確に増幅することが可能となる。このことから、本発明によれば、核酸試料における標的核酸の検出、遺伝子中の変異、特に一塩基変異の検出などを、迅速、簡便かつ正確に行うことが可能となる。
【発明の具体的説明】
【００１６】
本発明において「ＲｅｃＡタンパク質」とは、ＤＮＡの相同組み換えに関与するタンパク質の一種であって、ＡＴＰアーゼの作用を示し、二本鎖ＤＮＡを部分的に巻き戻し、一本鎖の相補的な鎖と水素結合を形成させることによってＤＮＡの組み換えを誘発するタンパク質をいう。また、本発明において「ＲｅｃＡタンパク質」は、天然のＲｅｃＡタンパク質と同様の機能を有する変異体、改変タンパク質、および断片を含む。ＲｅｃＡタンパク質としては、当技術分野において公知の様々なものから選択して用いることができ、例えば、大腸菌、Thermus thermophilus、Thermus aquaticusなどに由来するＲｅｃＡタンパク質を用いることができる。このようなＲｅｃＡタンパク質、ならびにその変異体、改変タンパク質、および断片については、例えば、国際公開第９１／１７２６７号パンフレット、特開２００５−１１０６２１号公報、国際公開第２００４／０２７０６０号パンフレット等を参照されたい。
【００１７】
反応溶液中におけるＲｅｃＡタンパク質の濃度は、その種類に応じて当業者により適宜決定されるが、好ましくは０．００１〜５０００ｎｇ／μＬ、さらに好ましくは０．０１〜５００ｎｇ／μＬ、さらに好ましくは０．１〜５０ｎｇ／μＬとされる。
【００１８】
さらに、ＲｅｃＡタンパク質はＡＴＰ（アデノシン５’−三リン酸）またはその類似体の存在下において活性化することが知られている。よって、本発明の好ましい実施態様によれば、本発明における核酸増幅反応は、ＡＴＰおよび／またはＡＴＰ類似体の存在下で行われる。ＡＴＰ類似体は、ＡＴＰと同様にＲｅｃＡタンパク質を活性化しうるＡＴＰの構造類似体のいずれであってもよく、当業者であれば適宜選択することができる。このようなＡＴＰ類似体としては、例えば、ＡＴＰγ−ｓ、ｒＡＴＰ、ｄＡＴＰなどを挙げることができ、好ましくはＡＴＰγ−ｓとされる。本発明における核酸増幅反応では、ＡＴＰおよびＡＴＰ類似体から選択される１種の物質を単独で用いてもよく、または２種以上の物質を組み合わせて用いてもよい。
【００１９】
反応溶液中におけるＡＴＰおよびＡＴＰ類似体の濃度の合計は、ＲｅｃＡタンパク質が十分に活性化されるように当業者により適宜決定されるが、好ましくは０．００１〜１０００ｍＭ、さらに好ましくは０．０１〜１００ｍＭ、さらに好ましくは０．１〜１０ｍＭとされる。
【００２０】
本発明に用いられるプライマーセットは、標的核酸配列の等温下での増幅を可能とするものである。等温下で行なわれる核酸増幅法としては、当技術分野において様々な方法が知られており、例えば、ＳＤＡ法（特公平７−１１４７１８号公報）、改良ＳＤＡ法（米国特許第５８２４５１７号明細書；国際公開第９９／０９２１１号パンフレット；国際公開第９５／２５１８０号パンフレット）、ＮＡＳＢＡ法（日本国特許第２６５０１５９号公報）、ＬＡＭＰ法（国際公開第００／２８０８２号パンフレット）、ＩＣＡＮ法（国際公開第０２／１６６３９号パンフレット）、国際公開第２００４／０４００１９号パンフレットに記載の方法、国際公開第２００５／０６３９７７号パンフレットに記載のＳＭＡＰ法等が挙げられる。よって、当業者であれば、利用する核酸増幅法の種類に応じて、本発明に用いられる適切なプライマーセットを設計することが可能である。
【００２１】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーは、鋳型上における該プライマーの伸長反応によって得られる核酸鎖において、該核酸鎖の５’末端部分が同一鎖上にハイブリダイズすることを可能とするもの（以下「折り返しプライマー」という）とされる。ここで、「核酸鎖」とは、ＤＮＡ鎖、ＲＮＡ鎖およびＤＮＡ／ＲＮＡ鎖のいずれをも意味し、好ましくはＤＮＡ鎖を意味する。本発明に用いられるプライマーセットは複数種の折り返しプライマーを含んでいてもよく、例えば、一つの折り返しプライマーをフォワードプライマーとして設計し、他の折り返しプライマーをリバースプライマーとして設計することが好ましい。
【００２２】
本発明において「標的核酸」または「標的核酸配列」とは、増幅しようとする核酸またはその配列そのものだけでなく、これに相補的な配列または該配列を有する核酸をも意味する。
【００２３】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明によるプライマーの一部がストリンジェントな条件下で標的核酸にハイブリダイズし、標的核酸以外の核酸分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明によるプライマーとその相補鎖との二本鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)等を参照することができる。例えば、使用するプライマーの融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、プライマーを標的核酸に特異的にハイブリダイズさせることができる。このようなプライマーは、市販のプライマー構築ソフト、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３（Whitehead Institute for Biomedical Research社製）などを用いて設計することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、ある標的核酸にハイブリダイズするプライマーは、その標的核酸に相補的な核酸分子の全部または一部の配列を含んでなるものである。
【００２４】
前記プライマーセットに含まれる折り返しプライマーは、当業者であれば適宜設計することができる。折り返しプライマーは、典型的には、鋳型にハイブリダイズする配列をその３’末端部分に含んでなり、該プライマーの伸長鎖上のいずれかの領域にハイブリダイズする配列を５’側に含んでなるものとすることができる。このような折り返しプライマーは、例えば、国際公開第００／２８０８２号パンフレット、国際公開第２００４／０４００１９号パンフレット、国際公開第２００５／０６３９７７号パンフレット等の記載に従って、適切に設計することができる。
【００２５】
本発明のさらに好ましい実施態様によれば、前記プライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーは、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズする配列（B'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものとされる。このプライマーは前記折り返しプライマーの一例であり、以下「ループ形成プライマー」という。
【００２６】
ループ形成プライマーによる核酸合成の作用機序を図１に模式的に示す。まず、鋳型となる核酸中の標的核酸配列を決定し、その標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）、および配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）を決定する。ループ形成プライマーは、配列（Ac'）を含んでなり、さらにその５’側に配列（B'）を含んでなる。配列（Ac'）は、配列（A）にハイブリダイズするものであり、配列（B'）は、配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズするものである。ここで、ループ形成プライマーは、前記配列（Ac'）と前記配列（B'）の間に、反応に影響を与えない介在配列を含んでいてもよい。このようなプライマーを鋳型核酸にアニーリングさせると、プライマー中の配列（Ac'）が標的核酸配列の配列（A）にハイブリダイズした状態となる（図１(a)）。この状態でプライマー伸長反応が起こると、標的核酸配列の相補配列を含む核酸が合成される。そして、合成された核酸の５’末端側に存在する配列（B'）が、同核酸中に存在する配列（Bc）にハイブリダイズし、これにより、合成された核酸の５’末端部分においてステムループ構造が形成される。その結果、鋳型核酸上の配列（A）が一本鎖となり、この部分に先のループ形成プライマーと同一の配列を有する他のプライマーがハイブリダイズする（図１(b)）。その後、鎖置換反応により、新たにハイブリダイズしたループ形成プライマーからの伸長反応が起こると同時に、先に合成された核酸が鋳型核酸から分離される（図１(c)）。
【００２７】
上記の作用機序において、配列（B'）が配列（Bc）にハイブリダイズする現象は、典型的には、同一鎖上に相補領域が存在することにより起こる。一般に、二本鎖核酸が一本鎖に解離するときは、その末端あるいはそれ以外の比較的不安定な部分から部分的な解離が始まる。上記ループ形成プライマーによる伸長反応で生成した二本鎖核酸は、比較的高温では末端部分の塩基対は解離と結合の平衡状態にあり、全体としては二本鎖を保っている。そのような状態で末端の解離した部分に相補的な配列が同一鎖上に存在すると、準安定な状態としてステムループ構造を形成することができる。このステムループ構造は安定的には存在しないが、その構造の形成により剥き出しとなった相補鎖部分（鋳型核酸上の配列（A））に同一の他のプライマーが結合し、すぐさまポリメラーゼが伸長反応を行うことにより、先に合成された鎖が置換されて遊離すると同時に、新たな二本鎖核酸を生成することができる。
【００２８】
本発明のさらに好ましい実施態様におけるループ形成プライマーの設計基準は次のとおりである。まず、プライマーの伸長により鋳型核酸の相補鎖が合成された後に新たなプライマーが効率よく同鋳型核酸にアニーリングするためには、合成された相補鎖の５’末端におけるステムループ構造形成により、鋳型核酸上の前記配列（A）の部分を一本鎖とする必要がある。そのためには、配列（Ac'）の塩基数Ｘと標的核酸配列中における前記配列（A）と前記配列（B）に挟まれた領域の塩基数Ｙとの差（Ｘ−Ｙ）の、Ｘに対する割合（Ｘ−Ｙ）／Ｘが重要となる。ただし、鋳型核酸上において配列（A）よりも５’側に存在する、プライマーのハイブリダイズとは関係無い部分まで一本鎖とする必要はない。また、新たなプライマーが効率よく鋳型核酸にアニーリングするためには、上述のステムループ構造形成を効率よく行なうことも必要となる。そして、効率の良いステムループ構造形成、すなわち、効率の良い配列（B'）と配列（Bc）とのハイブリダイゼーションには、前記配列（B'）と前記配列（Bc）との間の距離（Ｘ＋Ｙ）が重要となる。一般に、プライマー伸長反応のための最適温度は最高でも７２℃付近であり、そのような低い温度では、伸長鎖が長い領域にわたって解離することは困難である。従って、配列（B'）が配列（Bc）に効率よくハイブリダイズするためには、両配列の間の塩基数は少ないほうが好ましいと考えられる。一方で、配列（B'）が配列（Bc）にハイブリダイズして鋳型核酸上の前記配列（A）の部分を一本鎖とするためには、配列（B'）と配列（Bc）との間の塩基数は多い方が好ましいと考えられる。
【００２９】
以上のような観点から、本発明のさらに好ましい実施態様による前記ループ形成プライマーは、プライマーを構成する配列（Ac'）と配列（B'）の間に介在配列が存在しない場合において、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００以上、好ましくは０．００以上、さらに好ましくは０．０５以上、さらに好ましくは０．１０以上となり、また、１．００以下、好ましくは０．７５以下、さらに好ましくは０．５０以下、さらに好ましくは０．２５以下となるように設計される。さらに、（Ｘ＋Ｙ）は、好ましくは１５以上、さらに好ましくは２０以上、さらに好ましくは３０以上とされ、また、好ましくは５０以下、さらに好ましくは４８以下、さらに好ましくは４２以下とされる。
【００３０】
また、プライマーを構成する配列（Ac'）と配列（B'）の間に介在配列（塩基数はＹ’）が存在する場合には、本発明のさらに好ましい実施態様による前記ループ形成プライマーは、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００以上、好ましくは０．００以上、さらに好ましくは０．０５以上、さらに好ましくは０．１０以上となり、また、１．００以下、好ましくは０．７５以下、さらに好ましくは０．５０以下、さらに好ましくは０．２５以下となるように設計される。さらに、（Ｘ＋Ｙ＋Ｙ’）は、好ましくは１５以上、さらに好ましくは２０以上、さらに好ましくは３０以上とされ、また、好ましくは１００以下、さらに好ましくは７５以下、さらに好ましくは５０以下とされる。
【００３１】
前記ループ形成プライマーは、与えられた条件下で必要な特異性を維持しながら標的核酸との塩基対結合を行うことができる程度の鎖長を有するものである。このプライマーの鎖長は、好ましくは１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは２０〜６０ヌクレオチドとする。また、前記第一のプライマーを構成する配列（Ac'）と配列（B'）の長さは、それぞれ、好ましくは５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは７〜３０ヌクレオチドである。また、必要に応じて、配列（Ac'）と配列（B'）の間に、反応に影響を与えない介在配列を挿入してもよい。
【００３２】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、本発明によるプライマーセットに含まれる少なくとも一種のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（B-Bc'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものとされる。このプライマーは前記折り返しプライマーの一例であり、以下「折り畳みプライマー」という。
【００３３】
このような折り畳みプライマーの構造は、例えば、図２に示すようなものであるが、図２に示される配列やヌクレオチド数に限定されるものではない。折り畳みプライマーを構成する配列（Ac'）の長さは、好ましくは５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは１０〜３０ヌクレオチドである。また、前記折返し配列（B-Bc'）の長さは、好ましくは２〜１０００ヌクレオチド、より好ましくは２〜１００ヌクレオチド、さらに好ましくは４〜６０ヌクレオチド、さらに好ましくは６〜４０ヌクレオチドであり、折返し配列の内部におけるハイブリダイゼーションによって形成される塩基対のヌクレオチド数は、好ましくは２〜５００ｂｐ、より好ましくは２〜５０ｂｐ、さらに好ましくは２〜３０ｂｐ、さらに好ましくは３〜２０ｂｐである。折返し配列（B-Bc'）のヌクレオチド配列はいかなる配列であってもよく、特に限定されるものではないが、好ましくは標的核酸配列にハイブリダイズしない配列とされる。また、必要に応じて、配列（Ac'）と折返し配列（B-Bc'）の間に、反応に影響を与えない介在配列を挿入してもよい。
【００３４】
折り畳みプライマーは、ループ形成プライマーについて説明した作用機序と同様に作用することが可能である。一般に、二本鎖核酸が一本鎖に解離するときは、その末端あるいはそれ以外の比較的不安定な部分から部分的な解離が始まる。折り畳みプライマーによる伸長反応で生成した二本鎖核酸は、比較的高温では末端部分の塩基対は解離と結合の平衡状態にあり、全体としては二本鎖を保っている。このように解離した末端部分において、新たな折り畳みプライマーが鋳型にアニーリングし、そこから鎖置換を伴う相補鎖合成が進行する。
【００３５】
これらのループ形成プライマーおよび折り畳みプライマーは、任意の組み合わせで用いることができる。すなわち、２種類のループ形成プライマーをフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして用いてもよいし、２種類の折り畳みプライマーをフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして用いてもよいし、あるいは、ループ形成プライマーと折り畳みプライマーとをフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして用いてもよい。
【００３６】
本発明の特に好ましい実施態様によれば、本発明に用いられるプライマーセットは、２種類のループ形成プライマーをフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして含むものとされる。すなわち、この実施態様では、前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズする配列（B'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものとされ、前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（C）よりも５’側に存在する配列（D）の相補配列（Dc）にハイブリダイズする配列（D'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものとされる。
【００３７】
本発明の他の実施態様によれば、本発明に用いられるプライマーセットは、２種類の折り畳みプライマーをフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして含むものとされる。すなわち、この実施態様では、前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（B-Bc'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものとされ、前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものとされる。
【００３８】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、本発明に用いられるプライマーセットは、ループ形成プライマーと折り畳みプライマーとの組み合わせをプライマーペアとして含むものとされる。すなわち、この実施態様では、本発明によるプライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズする配列（B'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものとされ、前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものとされる。
【００３９】
これらループ形成プライマー（第一のプライマー）および折り畳みプライマー（第二のプライマー）による核酸増幅反応について考えられる作用機序を、図３（図３ａおよび図３ｂ）を用いて説明する。なお、図３では、説明を簡略化するため、ハイブリダイズする２つの配列を相互に相補的な配列としているが、これにより本発明が限定されるものではない。まず、第一のプライマーが標的核酸のセンス鎖にハイブリダイズし、該プライマーの伸長反応が起きる（図３(a)）。次いで、伸長鎖（−）上においてステムループ構造が形成され、これにより一本鎖となった標的核酸センス鎖上の配列（A）に新たな第一のプライマーがハイブリダイズし（図３(b)）、該プライマーの伸長反応が起きて、先に合成された伸長鎖（−）が脱離する。次に、脱離した伸長鎖（−）上の配列（C）に第二のプライマーがハイブリダイズし（図３(c)）、該プライマーの伸長反応が起き、伸長鎖（＋）が合成される（図３(d)）。生成した伸長鎖（＋）の３’末端と伸長鎖（−）の５’末端ではステムループ構造が形成され（図３(e)）、遊離型の３’末端である伸長鎖（＋）のループ先端から伸長反応が起こると同時に、前記伸長鎖（−）が脱離する（図３(f)）。ループ先端からの前記伸長反応により、伸長鎖（＋）の３’側に配列（A）および配列（Bc）を介して伸長鎖（−）が結合したヘアピン型の二本鎖核酸が生成し、その配列（A）および配列（Bc）に第一のプライマーがハイブリダイズし（図３(g)）、その伸長反応により伸長鎖（−）が生成する（図３(h)および(i)）。また、前記ヘアピン型二本鎖核酸の３’末端に存在する折返し配列によって遊離型の３’末端が提供され（図３(h)）、そこからの伸長反応により（図３(i)）、両端に折返し配列を有し、第一および第二のプライマーに由来する配列を介して伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）とを交互に含む一本鎖核酸が生成する（図３(j)）。この一本鎖核酸では、その３’末端に存在する折返し配列により遊離型の３’末端（相補鎖合成起点）が提供されるため（図３(k)）、同様の伸長反応が繰り返され、１回の伸長反応あたり２倍の鎖長となる（図３(l)および(m)）。また、図３(i)において脱離した第一のプライマーからの伸長鎖（−）では、その３’末端に存在する折返し配列により遊離型の３’末端（相補鎖合成起点）が提供されるため（図３(n)）、そこからの伸長反応により、両端にステムループ構造が形成され、プライマーに由来する配列を介して伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）とを交互に含む一本鎖核酸が生成する（図３(o)）。この一本鎖核酸においても、３’末端におけるループ形成によって相補鎖合成起点が順次提供されるため、そこからの伸長反応が次々に起こる。このようにして自動的に延長される一本鎖核酸には、第一のプライマーおよび第二のプライマーに由来する配列が伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）との間に含まれているため、各プライマーがハイブリダイズして伸長反応を起こすことが可能であり、これにより標的核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖が顕著に増幅される。
【００４０】
本発明に用いられるプライマーセットは、第一のプライマーおよび第二のプライマー以外に、１種以上の第三のプライマーを含むものとすることができる。第三のプライマーは、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズするものであればよいが、好ましくは、標的核酸配列またはその相補配列へのハイブリダイゼーションについて他のプライマーと競合しないものとされる。
【００４１】
本発明において「競合しない」とは、そのプライマーが標的核酸にハイブリダイズすることによって他のプライマーによる相補鎖合成起点の付与が妨げられないことを意味する。
【００４２】
折り返しプライマーにより標的核酸が増幅された場合には、図３に例示されるように、増幅産物は標的核酸配列とその相補配列とを交互に有するものとなる。その増幅産物の３’末端には折り返し配列またはループ構造が存在し、これにより提供される相補鎖合成起点から次々に伸長反応が起こっている。第三のプライマーは、このような増幅産物が部分的に一本鎖の状態になった時に、その一本鎖部分に存在する標的配列にアニ−リングすることができる。これにより、増幅産物中の標的核酸配列内に新たな相補鎖合成起点が提供され、そこからの伸長反応が起こるため、核酸増幅反応がより迅速に行われるようになる。
【００４３】
第三のプライマーは必ずしも１種類に限定されるわけではなく、核酸増幅反応の迅速性および特異性を向上させるためには２種類以上の第三のプライマーを同時に用いてもよい。これら第三のプライマーは、典型的には折り返しプライマーとは異なる配列からなるが、これらのプライマーと競合しない限りにおいて、部分的に重なる領域にハイブリダイズするものとしてもよい。第三のプライマーの鎖長は、好ましくは２〜１００ヌクレオチド、より好ましくは５〜５０ヌクレオチド、さらに好ましくは７〜３０ヌクレオチドとされる。
【００４４】
第三のプライマーは、折り返しプライマーによる核酸増幅反応をより迅速に進めるための補助的な働きをその主目的とするものである。従って、第三のプライマーは、折り返しプライマーの各３’末端のＴｍよりも低いＴｍを有するものとすることが好ましい。また、第三のプライマーの増幅反応液への添加量は、折り返しプライマーのそれぞれの添加量よりも少ない方が好ましい。
【００４５】
第三のプライマーとしては、国際公開第０２／２４９０２号パンフレットに記載のような、ループを形成できる構造をもつものを鋳型として、そのループ部分に相補鎖合成の起点を与えるものを挙げることができるが、これに限定されるものではない。すなわち、標的核酸配列内であれば、いかなる部位に相補鎖合成起点を提供するものであってもよい。
【００４６】
本発明に用いられるプライマーセットは、さらに、鋳型核酸上の前記標的核酸配列よりも３’側の領域にハイブリダイズするアウタープライマーを含んでなるものとしてもよい。
【００４７】
プライマーセットに含まれるプライマーは、デオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドにより構成される。本発明において、「リボヌクレオチド」（単に「Ｎ」ということもある）とは、リボヌクレオシド三リン酸をいい、例えば、ＡＴＰ，ＵＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰ等がある。さらに、リボヌクレオチドにはこれらの誘導体が含まれ、例えば、α位のリン酸基の酸素原子を硫黄原子に置き換えたリボヌクレオチド（α−チオ−リボヌクレオチド）等がある。
【００４８】
また、前記プライマーには、未修飾デオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾デオキシリボヌクレオチドで構成されたオリゴヌクレオチドプライマー、および未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドで構成されたオリゴヌクレオチドプライマー、未修飾デオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾デオキシリボヌクレオチドおよび未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマー等も含まれる。
【００４９】
プライマーセットに含まれるプライマーは、オリゴヌクレオチドの合成に用いることのできる任意の方法、例えば、リン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等により合成できる。前記プライマーは、例えば、ＡＢＩ社（Applied Biosystem Inc.）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いてホスホアミダイト法により合成すれば、容易に取得することができる。
【００５０】
本発明による核酸増幅法では、標的核酸配列を含む核酸分子を鋳型として、上述のプライマーセットを用いた核酸増幅反応が行なわれる。
【００５１】
核酸増幅反応において用いられる、標的核酸配列を含む鋳型核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらでもよい。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。ＲＮＡには、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡおよび合成ＲＮＡのいずれもが含まれる。これらの核酸は、例えば、血液、組織、細胞、さらには動物、植物のような生体由来試料、または生体由来試料、食品、土壌、排水等から分離された微生物由来試料から調製することができる。
【００５２】
鋳型核酸の単離は任意の方法で行うことができ、例えば、界面活性剤による溶解処理、音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌およびフレンチプレス等を用いる方法が挙げられる。また、内在性ヌクレアーゼが存在する場合には、単離された核酸を精製することが好ましい。核酸の精製は、例えば、フェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動、密度に依存した遠心分離などにより実施することが可能である。
【００５３】
より具体的には、前記鋳型核酸としては、上記方法により単離したゲノムＤＮＡやＰＣＲフラグメントのような二本鎖核酸、全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡから逆転写反応で調製されたｃＤＮＡのような一本鎖核酸のいずれも使用可能である。上記二本鎖核酸の場合は、変性工程（denaturing）を行なって一本鎖とすることにより、より最適に利用することができる。
【００５４】
上記の逆転写反応に用いられる酵素は、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定されず、例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２ ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ）等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。このほか、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを使用することも可能である。また、本発明の目的のためには、高温で逆転写活性を有する酵素が最適であり、例えばサーマス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ等）、バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ等を使用できる。特に好ましい酵素を例示すれば、例えば、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼとして、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus、以下「Ｂ．ｓｔ」という）由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ）、およびバチルス・カルドテナックス（Bacillus caldotenax、以下「Ｂ．ｃａ」という）由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ）、例えばＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。例えば、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼは、反応にマンガンイオンを必要とせず、高温条件下で鋳型ＲＮＡの二次構造形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成することが可能である。
【００５５】
核酸増幅反応では、鋳型核酸が二本鎖核酸の場合でも、これをそのまま反応に用いることができるが、必要に応じてそれらを変性して一本鎖にすることにより、鋳型核酸へのプライマーのアニーリングを効率よく行なうこともできる。温度を約９５℃に上昇させることは、好ましい核酸変性法である。他の方法として、ｐＨを上昇させることにより変性させることも可能であるが、この場合には、プライマーを標的核酸にハイブリダイズさせるためにｐＨを低下させる必要がある。
【００５６】
本発明において、核酸増幅反応は等温下で行なわれる。ここで、「等温」とは、酵素およびプライマーが実質的に機能しうるような、ほぼ一定の温度条件下に保つことをいう。さらに、「ほぼ一定の温度条件」とは、設定された温度を正確に保持することのみならず、酵素およびプライマーの実質的な機能を損なわない程度の温度変化であれば許容されることを意味する。一定の温度条件下での核酸増幅反応は、使用する酵素の活性を維持できる温度に保つことにより実施することができる。また、この核酸増幅反応において、プライマーが標的核酸にアニーリングするためには、例えば、反応温度を、そのプライマーの融解温度（Ｔｍ）付近の温度、もしくはそれ以下に設定することが好ましく、さらには、プライマーの融解温度（Ｔｍ）を考慮し、ストリンジェンシーのレベルを設定することが好ましい。従って、この温度は、好ましくは、約２０℃〜約７５℃であり、さらに好ましくは、約３５℃〜約６５℃とする。
【００５７】
核酸増幅反応に用いられるポリメラーゼは、鎖置換（strand displacement）活性（鎖置換能）を有するものであることが好ましく、常温性、中温性、もしくは耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。また、このポリメラーゼは、天然体もしくは人工的に変異を加えた変異体のいずれであってもよい。このようなポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。さらに、このＤＮＡポリメラーゼは、実質的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないものであることが好ましい。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｂ．ｓｔ、Ｂ．ｃａ等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられる。核酸増幅反応において使用するＤＮＡポリメラーゼとしては、さらに、Vent DNAポリメラーゼ、Vent (Exo-) DNAポリメラーゼ、DeepVent DNAポリメラーゼ、DeepVent (Exo-) DNAポリメラーゼ、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ−２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Z-Taq DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Pfu turbo DNAポリメラーゼ、KOD DNAポリメラーゼ、9°Nm DNAポリメラーゼ、Therminator DNAポリメラーゼ等が挙げられる。
【００５８】
核酸増幅反応に用いられるその他の試薬としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等の触媒、ｄＮＴＰミックス等の基質、トリス塩酸バッファー、トライシンバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファー等の緩衝液を使用することができる。さらに、ジメチルスルホキシド(dimethyl sulfoxide)やベタイン（N,N,N-trimethylglycine）等の添加物、国際公開第９９／５４４５５号パンフレットに記載の酸性物質、陽イオン錯体等を使用してもよい。
【００５９】
核酸増幅反応において、核酸の増幅効率を高めるために、融解温度調整剤を反応溶液中に添加することができる。核酸の融解温度（Tm）は、一般的に、核酸中の二本鎖形成部分の具体的なヌクレオチド配列によって決定される。反応溶液中に融解温度調整剤を添加することにより、この融解温度を変化させることができ、従って、一定の温度下では、核酸における二本鎖形成の強度を調整することが可能となる。一般的な融解温度調整剤は、融解温度を下げる効果を有する。このような融解温度調整剤を添加することにより、２本の核酸の間の二本鎖形成部分の融解温度を下げることができ、換言すれば、その二本鎖形成の強度を下げることが可能となる。従って、前記核酸増幅反応においてこのような融解温度調整剤を反応溶液中に添加すると、強固な二本鎖を形成するＧＣの豊富な核酸領域や複雑な二次構造を形成する領域において効率的に二本鎖部分を一本鎖とすることが可能となり、これにより、プライマーによる伸長反応が終わった後に次のプライマーが目的領域にハイブリダイズしやすくなるため、核酸の増幅効率を上げることができる。本発明において用いられる融解温度調整剤およびその反応溶液中での濃度は、ハイブリダイゼーション条件に影響を与える他の反応条件、例えば塩濃度、反応温度等を考慮して、当業者により適切に選択される。従って、融解温度調整剤は特に制限されるものではないが、好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの任意の組み合わせとされ、より好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）とされる。
【００６０】
さらに、核酸増幅反応において、酵素安定化剤を反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の増幅効率を高めることが可能となる。本発明において用いられる酵素安定化剤は、グリセロール、ウシ血清アルブミン、糖類などの、当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されない。
【００６１】
さらに、核酸増幅反応において、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などの酵素の耐熱性を増強するための試薬を、酵素安定化剤として反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の合成効率および増幅効率を高めることが可能となる。このような試薬は当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されないが、好ましくは糖類、より好ましくは単糖またはオリゴ糖、さらに好ましくはトレハロース、ソルビトールもしくはマンニトール、またはこれらの２種以上の混合物とされる。
【００６２】
核酸増幅反応によって得られた増幅産物の存在は、多くのあらゆる方法により検出することができる。一つの方法は、一般的なゲル電気泳動による特定のサイズの増幅産物の検出である。この方法では、例えば、エチジウムブロマイドやサイバーグリーン等の蛍光物質により検出できる。他の方法としては、ビオチンのような標識を有する標識プローブを用い、これを増幅産物にハイブリダイズさせることにより検出することもできる。ビオチンは、蛍光標識されたアビジン、ペルオキシダーゼのような酵素に結合したアビジン等との結合により検出可能である。さらに別の方法としては、免疫クロマトグラフを用いる方法がある。この方法では、肉眼で検出可能な標識を利用したクロマトグラフ媒体を用いることが考案されている（イムノクロマトグラフィー法）。上記増幅断片と標識プローブとをハイブリダイズさせ、該増幅断片のさらに異なる配列とハイブリダイズ可能な捕捉用プローブをクロマト媒体に固定しておけば、その固定した部分でトラップすることができ、クロマト媒体での検出が可能となる。その結果、肉眼的にシンプルな検出が可能となる。さらに、本発明者らによる核酸増幅法では、核酸増幅反応における増幅効率が非常に高いため、増幅の副産物としてピロリン酸が生じることを利用して、増幅産物を間接的に検出することもできる。このような方法としては、例えば、ピロリン酸が反応溶液中のマグネシウムと結合することによりピロリン酸マグネシウムの白色沈澱が生じることを利用して、反応溶液の白濁を目視で観察する方法がある。また、他の方法としては、ピロリン酸がマグネシウムなどの金属イオンと強く結合して不溶性塩を形成することにより、反応溶液中のマグネシウムイオン濃度が著しく減少することを利用する方法がある。この方法では、マグネシウムイオン濃度に応じて色調が変化する金属指示薬（例えば、Eriochrome Black T、Hydroxy Naphthol Blue等）を反応溶液に添加しておくことにより、反応溶液の色の変化を目視で観察することにより、増幅の有無を検出することが可能となる。さらに、Calceinなどを利用することにより、増幅反応に伴う蛍光の増大を目視で観察することができるため、リアルタイムでの増幅産物の検出が可能となる。
【００６３】
本発明による核酸増幅法は、顕著に高い配列特異性を有するものである。特に、この核酸増幅法によれば、標的核酸配列とは異なる配列を有する核酸は全く増幅されず、たとえその違いが一塩基であっても、全く増幅産物が得られない。本発明によるこのような高度な配列特異性は、当業者の予想を遙かに超えるものである。
【００６４】
本発明による高い配列特異性を有する核酸増幅法は、核酸試料中の核酸配列における変異の有無を判定するのに適している。よって、本発明によれば、等温下での核酸増幅反応により核酸試料中の核酸配列における変異の有無を判定する方法であって、（ａ）核酸試料を用意する工程、（ｂ）ＲｅｃＡタンパク質を用意する工程、（ｃ）上述のプライマーセットであって、該プライマーセットに含まれる少なくとも１種のプライマーが、前記変異の存在または不存在によって前記核酸試料中の標的配列との間で１以上のミスマッチを生じるように設計されたものである、プライマーセットを用意する工程、および（ｄ）前記核酸試料および前記ＲｅｃＡタンパク質の存在下において、前記プライマーセットによる等温下での核酸増幅反応を行う工程、を含んでなる方法が提供される。ここで、「変異」という用語は、１以上のヌクレオチドの置換、欠失および挿入のいずれをも包含する。
【００６５】
本発明において「ミスマッチ」とは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびチミン（Ｔ）（ＲＮＡの場合はウラシル（Ｕ））から選択される一組の塩基対が正常な塩基対（ＡとＴの組み合わせ、またはＧとＣの組み合わせ）ではないことを意味する。ミスマッチには、１つのミスマッチのみならず、複数の連続したミスマッチ、１または複数の塩基の挿入および／または欠失により生じるミスマッチ、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。
【００６６】
上記の１以上のミスマッチは、１塩基のミスマッチ、連続した複数のミスマッチ、または非連続的な複数のミスマッチとすることができる。
【００６７】
変異の存在または不存在によってミスマッチを生じる上記のプライマーは、検出の対象とする変異を有する標的核酸配列と該変異を有さない標的核酸配列とを比較することにより、当業者であれば適宜設計することができる。すなわち、これら２つの標的核酸配列の間で異なるヌクレオチドを含む領域にハイブリダイズするように、前記プライマーを設計すればよい。その際、前記プライマーは、変異を有する標的核酸配列に相補的な配列を含むように設計すれば、変異の不存在によってミスマッチを生じるものとなり、一方で、変異を有さない標的核酸配列に相補的な配列を含むように設計すれば、変異の存在によってミスマッチを生じるものとなる。
【００６８】
ループ形成プライマーが用いられる場合には、このプライマーは、前記変異の存在または不存在によって、前記配列（A）と前記配列（Ac'）との間で１以上のミスマッチを生じるように設計することができる。あるいは、このプライマーは、前記変異の存在または不存在によって、前記配列（Bc）と前記配列（B'）との間で１以上のミスマッチを生じるように設計することもできる。
【００６９】
折り畳みプライマーが用いられる場合には、このプライマーは、前記変異の存在または不存在によって、前記配列（C）と前記配列（Cc'）との間で１以上のミスマッチを生じるように設計することができる。
【００７０】
第三のプライマーが用いられる場合には、このプライマーは、前記変異の存在または不存在によって前記核酸配列またはその相補配列との間で１以上のミスマッチを生じるように設計することができる。
【００７１】
上記核酸増幅反応の他の条件は、本発明による核酸増幅法と同様に設定することができる。例えば、上記核酸増幅反応では、好ましくは上述の鎖置換能を有するポリメラーゼが使用される。また、必要に応じて、上述の融解温度調整剤、上述の酵素安定化剤などを用いてもよい。
【００７２】
本発明による変異検出法を行なった結果、変異の存在によりミスマッチを生じるプライマーを用いて増幅産物が得られた場合には核酸試料中に前記変異が存在しないものと判定することができ、逆に、増幅産物が得られなかった場合には前記変異が存在するものと判定することができる。一方で、変異の不存在によりミスマッチを生じるプライマーを用いて増幅産物が得られた場合には核酸試料中に前記変異が存在するものと判定することができ、逆に、増幅産物が得られなかった場合には前記変異が存在しないものと判定することができる。
【００７３】
本発明による核酸増幅法または変異検出法を実施するために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、本発明によれば、等温下での核酸増幅反応により鋳型核酸中の標的核酸配列を増幅するためのキットであって、（ａ）ＲｅｃＡタンパク質、および（ｂ）上述のプライマーセットを含んでなるキットが提供される。さらに、本発明によれば、等温下での核酸増幅反応により核酸試料中の核酸配列における変異の有無を判定するためのキットであって、（ａ）ＲｅｃＡタンパク質、および（ｂ）上述のプライマーセットであって、該プライマーセットに含まれる少なくとも１種のプライマーが、前記変異の存在または不存在によって前記核酸試料中の標的配列との間で１以上のミスマッチを生じるように設計されたものであるプライマーセット、を含んでなるキットが提供される。本発明によるキットはさらに、鎖置換能を有するポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、緩衝液などの上述の試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。
【実施例】
【００７４】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００７５】
例１：ループ形成プライマーのペアおよびＲｅｃＡタンパク質を用いた標的核酸配列の増幅
本例では、ループ形成プライマーのペアおよびThermus thermophilus由来のＲｅｃＡタンパク質を用いて、ヒトゲノム中に含まれるＥＧＦＲ（epidermal growth factor receptor）遺伝子内の標的核酸配列を増幅するための核酸増幅反応を行った。
【００７６】
ヒトゲノム中の標的核酸配列周辺の配列（配列番号１）と各プライマーとの位置関係は、図４に示すとおりである。具体的には、以下の配列を有するプライマーを設計した。
【００７７】
EGFR18F-01：5'-CCCAGCACTTGAGGATCTTGAAGGAAACTG-3'（配列番号２）、
EGFR18R-06：5'-CGGCACGGTGAGCCCAGAGGCCTGTGCCAG-3'（配列番号３）。
【００７８】
フォワードプライマーEGFR18F-01は、その３’末端側にある配列（２０ｍｅｒ：下線部以外）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’末端側にある配列（１０ｍｅｒ：下線部）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、該プライマーの３’末端塩基の１６塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするように設計されている。リバースプライマーEGFR18R-06は、その３’末端側にある配列（２０ｍｅｒ：下線部以外）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’末端側にある配列（１０ｍｅｒ：下線部）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、該プライマーの３’末端塩基の１６塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするように設計されている。
【００７９】
次いで、次の組成を有する反応液：１０×Ｂｕｆｆｅｒ（Bst DNA Polymeraseに添付のBuffer：New England BioLabs）、ＭｇＳＯ４（４ｍＭ）、ＤＭＳＯ（５％）、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（最終濃度にして１０万倍希釈、Molecular Probe）、ｄＮＴＰ（各０．４ｍＭ）、フォワードプライマーEGFR18F-01（３．２μＭ）、リバースプライマーEGFR18R-06（３．２μＭ）、Human Genomic DNA（１．６ｎｇ／μｌ、Promega）、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（８Ｕ／μｌ、New England BioLabs）、ＲｅｃＡタンパク質（５ｎｇ／μｌ）、およびＡＴＰ（１ｍＭ）を含有；を調製し、これを６０℃で１２０分間インキュベートした。これらの反応は、リアルタイムＰＣＲ装置Ｍｘ３０００Ｐ（Stratagene）を用いて行った。
【００８０】
核酸増幅反応における増幅産物量の経時変化を図５に示す。図５において、四角は鋳型（ヒトゲノムＤＮＡ）およびＲｅｃＡタンパク質をともに含有するサンプルを示し、丸は鋳型を含有し、ＲｅｃＡタンパク質を含有しないサンプルを示し、菱形は鋳型を含有せず、ＲｅｃＡタンパク質を含有するサンプルを示し、三角は鋳型とＲｅｃＡタンパク質をともに含有しないサンプルを示す。
【００８１】
鋳型を含有するサンプルについての増幅産物は、その配列決定により、いずれも標的核酸配列を有することが確認された。図５によれば、鋳型を含有するサンプルでは増幅産物が得られたが（四角および丸）、ＲｅｃＡタンパク質をさらに含有するサンプルの方が増幅効率が高いことが示された（四角）。鋳型を含有しないサンプルでは、ＲｅｃＡタンパク質を含有しないサンプルでは増幅産物が得られたが（三角）、ＲｅｃＡタンパク質を含有するサンプルでは増幅産物が全く得られなかった（菱形）。
【００８２】
例２：ループ形成プライマーのペアおよびＲｅｃＡタンパク質を用いた標的核酸配列の増幅における一塩基変異の影響
本例では、本発明による核酸増幅反応の特異性を確認するため、標的核酸配列中に一塩基変異を有する配列に対して設計したループ形成プライマーを用いて核酸増幅反応を行い、その結果を、一塩基変異の無い配列に対するループ形成プライマーによる核酸増幅反応の結果と比較した。
【００８３】
この目的のために、ヒトゲノム中に含まれるＣＹＰ２Ｃ１９＊２遺伝子内の領域を標的とし、一塩基変異を含む配列とこれを含まない配列のそれぞれに対してループ形成プライマーのペアを設計した。さらに、インナープライマーおよびアウタープライマーも設計した。ＣＹＰ２Ｃ１９＊２遺伝子中の増幅領域周辺の配列（配列番号４）と各プライマーとの位置関係は、図６に示すとおりである。具体的には、以下の配列を有するプライマーを設計した。
【００８４】
（１）野生型配列に特異的なループ形成プライマー：
FIP-W：5'-CCGGGAAATAATCTTTTAATTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAG-3'（配列番号５）、
BIP-W：5'-CGGGAACCCGTGTTCTTTTACTTTCTCC-3'（配列番号６）。
【００８５】
（２）変異型配列に特異的なループ形成プライマー：
FIP-M：5'-CTGGGAAATAATCTTTTAATTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAG-3'（配列番号７）、
BIP-M：5'-CAGGAACCCGTGTTCTTTTACTTTCTCC-3'（配列番号８）。
【００８６】
FIP-WおよびBIP-Wは野生型配列に特異的なプライマーペアである。FIP-Wは、その３’末端側にある配列（３３ｍｅｒ：下線部以外）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’末端側にある配列（１２ｍｅｒ：下線部）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、該プライマーの３’末端塩基の２９塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするように設計されている。BIP-Wは、その３’末端側にある配列（１９ｍｅｒ：下線部以外）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、５’末端側にある配列（９ｍｅｒ：下線部）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、該プライマーの３’末端塩基の４７塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするように設計されている。一方で、FIP-MおよびBIP-Mは変異型配列に特異的なプライマーペアである。これらのプライマーは、一塩基変異に対応する５’末端から２番目の塩基（下線部）においてのみ、FIP-WおよびBIP-Wと相違している。
【００８７】
（３）インナープライマーおよびアウタープライマー：
LOOP-F：5'-GATAGTGGGAAAATTATTGC-3'（配列番号９）、
LOOP-B：5'-CAAATTACTTAAAAACCTTGCTT-3'（配列番号１０）、
F3：5'-CCAGAGCTTGGCATATTGTATC-3'（配列番号１１）、
B3：5'-AGGGTTGTTGATGTCCAT-3'（配列番号１２）。
【００８８】
LOOP-FおよびLOOP-B（インナープライマー）、F3（上流アウタープライマー）ならびにB3（下流アウタープライマー）は、図６に示される領域において鋳型にハイブリダイズする配列のみからなっている。
【００８９】
次いで、次の組成を有する反応液：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２０ｍＭ，ｐＨ８．８）、ＫＣｌ（１０ｍＭ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（１０ｍＭ）、ＭｇＳＯ４（４ｍＭ）、ベタイン（０．８Ｍ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（０．１％）、ｄＮＴＰ（各０．４ｍＭ）、野生型配列または変異型配列に特異的なループ形成プライマーのペア（それぞれ１６００ｎＭ）、インナープライマーLOOP-FおよびLOOP-B（それぞれ８００ｎＭ）、上流アウタープライマーF3（２００ｎＭ）、下流アウタープライマーB3（２００ｎＭ）、野生型配列を有するヒトゲノム（４０ｎｇ）、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（８Ｕ／μｌ、New England BioLabs）、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（最終濃度にして１０万倍希釈、Molecular Probe）、ＲｅｃＡタンパク質（５ｎｇ／μｌ）、およびＡＴＰ（１ｍＭ）を含有；を調製し、これを６０℃で６０分間インキュベートした。これらの反応は、リアルタイムＰＣＲ装置Ｍｘ３０００Ｐ（Stratagene）を用いて行った。
【００９０】
核酸増幅反応における増幅産物量の経時変化を図７に示す。図７において、四角は野生型配列に特異的なプライマーセット、ＲｅｃＡおよびＡＴＰを含有するサンプルを示し、丸は野生型配列に特異的なプライマーセットを含有するが、ＲｅｃＡおよびＡＴＰを含有しないサンプルを示し、菱形は変異型配列に特異的なプライマーセット、ＲｅｃＡおよびＡＴＰを含有するサンプルを示し、三角は変異型配列に特異的なプライマーセットを含有するが、ＲｅｃＡおよびＡＴＰを含有しないサンプルを示す。
【００９１】
増幅産物は、その配列決定により、いずれも標的核酸配列を有することが確認された。図７によれば、鋳型との間でミスマッチの無いループ形成プライマーを用いた場合には、ＲｅｃＡタンパク質の有無にかかわらず、３０分以内に大量の増幅産物が検出された（四角および丸）。鋳型との間でミスマッチを有するループ形成プライマーを用いた場合であっても、ＲｅｃＡタンパク質を含有しないサンプルでは２５〜５０分の間で増幅産物が検出された（三角）。これに対し、ＲｅｃＡタンパク質を含有する場合には、ミスマッチを有するループ形成プライマーにより増幅産物が検出されることはなかった（菱形）。これらの結果から、本発明による核酸増幅法は顕著に高い配列特異性を示し、例えば、鋳型における一塩基のミスマッチをも識別できることが示された。
【００９２】
例３：ループ形成プライマーと折り畳みプライマーとのペアおよびRecAタンパク質を用いた標的核酸配列の増幅
本例では、ループ形成プライマーと折り畳みプライマーとからなるプライマーペアおよびT.thermophilus由来ＲｅｃＡタンパク質を用いて、ヒトゲノム中の標的核酸配列増幅するための核酸増幅反応を行った。
【００９３】
ヒトゲノム中の標的核酸配列周辺の配列（配列番号１３）と各プライマーの位置関係は図８に示すとおりである。具体的には、以下の核酸配列を有するプライマーを設計した。
【００９４】
ループ形成プライマー：
2D6*44-F1：5’−CGCTGCACATGGCCTGGGGCCTCCTGCTCA―3’（配列番号１４）
【００９５】
2D6*44-F1はCYP2D6*1に特異的なプライマーである。2D6*44-F1はその3’末端領域にある配列（20mer：下線部以外）が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、5’末端側にある配列（10mer：下線部）が、そのプライマーによる伸長鎖上の、該プライマーの3’末端塩基の16塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするように設計されている。
【００９６】
折り畳みプライマー：
2D6*44-SR2：5’−TTTATATATATATAAACCCCTGCACTGTTTCCCAGA−3’（配列番号１５）
【００９７】
2D6*44-SR2はCYP2D6*1とCYP2D6*44の双方に特異的なプライマーである。2D6*44-SR2は3'末端側にある配列（20mer）が鋳型にアニーリングし、5’末端側にある配列（16mer：下線部）がその領域内で折り畳まれて図２に示す構造をとるように設計されている。
【００９８】
次いで、次の組成を有する反応液：Tris-HCl(20mM, pH8.8)、KCl(10mM)、(NH4)2SO4(10mM)、MgSO4(5mM)、DMSO(5%)、SYBRgreen(10万倍希釈、TaKaRa)、Triton X-100(0.1%)、dNTP(0.4mM)、2D6*44-F1（5μM）、2D6*44-SR2(5μM)、ヒトgenome DNA（40ng）、Bst polymerase(8U/μL、New England Biolabs)、RecAタンパク質(10ng/μL)、ATP（1.5mM）：を調製し、これを90分間インキュベートした。これらの反応はリアルタイムPCR装置Mx3000p（Stratagene）を用いて行った。
【００９９】
核酸増幅反応における増幅産物量の経時変化を図９に示す。図９において、丸はCYP2D6*1に特異的なプライマーセットを含有するサンプルを示し、四角はCYP2D6*1に特異的なプライマーセット、RecAおよびATPを含有するサンプルを示し、三角は、CYP2D6*1に特異的なプライマーセットを含有するが、鋳型DNAを含有しないサンプルを示し、ひし形は、CYP2D6*1に特異的なプライマーセット、RecAおよびATPを含有するが、鋳型DNAを含有しないサンプルを示す。
【０１００】
鋳型を含むサンプルの増幅産物は、その配列決定により、いずれも標的核酸配列を含んでいることが確認された。図９から明らかなように、RecAおよびATPを添加することによって、無添加よりも増幅反応が促進された。また、鋳型を含まないサンプルでは、RecAおよびATPを添加することによって非特異的な増幅を抑えることができた。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】図１は、ループ形成プライマーを用いた核酸増幅反応の作用機序を模式的に示した図である。
【図２】図２は、折り畳みプライマーの構造を例示した図である。
【図３ａ】図３ａは、ループ形成プライマーおよび折り畳みプライマーを用いた核酸増幅反応の作用機序を模式的に示した図である。
【図３ｂ】図３ｂは、ループ形成プライマーおよび折り畳みプライマーを用いた核酸増幅反応の作用機序を模式的に示した図である。
【図４】図４は、ヒトゲノムに含まれるＥＧＦＲ（epidermal growth factor receptor）遺伝子上の標的核酸周辺のヌクレオチド配列（配列番号１）、ならびにプライマーの設計に用いられた領域を示す図である。
【図５】図５は、ＲｅｃＡタンパク質およびループ形成プライマーのペアを用いた核酸増幅反応の経時変化を示すグラフである。
【図６】図６は、ヒトゲノムに含まれるＣＹＰ２Ｃ１９＊２遺伝子上の標的核酸周辺のヌクレオチド配列（配列番号４）、ならびにプライマーの設計に用いられた領域を示す図である。
【図７】図７は、ＲｅｃＡタンパク質およびループ形成プライマーのペアを用いた核酸増幅反応における、鋳型中の一塩基ミスマッチの影響を示すグラフである。
【図８】図８は、ヒトゲノムに含まれるＣＹＰ２Ｄ６＊１遺伝子上の標的核酸周辺のヌクレオチド配列（配列番号１３）、ならびにプライマーの設計に用いられた領域を示す図である。
【図９】図９は、ＲｅｃＡタンパク質およびループ形成プライマーと折り畳みプライマーとのペアを用いた核酸増幅反応の経時変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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