(57)【要約】【課題】被験試料に含まれるmiRNA等のnon-coding RNA(ncRNA)を検出して得られた検出データを補正するにあたり、内部コントロール指標とする核酸が検出対象であるmiRNA等に比べて被験試料中に過剰に存在する場合であっても、上記データ補正のコントロール指標として有効に利用できるようにする、ncRNAの検出データの補正方法を提供する。【解決手段】本発明は、被験試料に含まれるncRNAの検出データ補正方法であって、前記被験試料中のコントロール指標とする核酸（指標核酸）に対し相補的な配列を有する核酸を当該被験試料に添加する工程、前記ncRNAに対する核酸プローブ及び前記指標核酸に対する核酸プローブを固定した核酸固定化基板と、前記添加後の被験試料とを接触させる工程、並びに、前記ncRNA及び前記指標核酸と前記核酸プローブとのハイブリダイゼーション反応を検出する工程を含む方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験試料に含まれるnon-coding RNAの検出データを補正する方法であって、
前記被験試料中のコントロール指標とする核酸配列に対し相補的な配列を有する核酸を当該被験試料に添加する工程、
前記non-coding RNAに対する核酸プローブ及び前記コントロール指標とする核酸に対する核酸プローブを固定した核酸固定化基板と、前記添加後の被験試料とを接触させる工程、並びに
前記non-coding RNA及び前記コントロール指標とする核酸と、前記核酸プローブとのハイブリダイゼーション反応を検出する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記non-coding RNAが、micro RNA及び／又はsmall interference RNAを含むものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記コントロール指標とする核酸がハウスキーピングRNAである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ハウスキーピングRNAが5S rRNAである、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験試料中のnon-coding RNAの検出データを補正する方法に関する。詳しくは、核酸固定化基板（核酸マイクロアレイ）を用いて得られるnon-coding RNAの検出データを補正する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
non-coding RNA（ncRNA）とは、タンパク質をコードしないRNAの総称であり、ハウスキーピングRNAと調節系のRNAとに大別される。前者のハウスキーピングRNAとしては、リボゾームRNA（rRNA）、転移RNA（tRNA）、スプライシングに関与する核内低分子RNA（snRNA）、rRNAの修飾に関与する核小体低分子RNA（snoRNA）等が知られている。一方、後者の調節系RNAについては、生体機能の解明に重要な機能を果たしている因子として、近年特に注目を集めているものであり、遺伝子発現やRNAの細胞内分布を調節し遺伝子発現抑制機構に重要な役割を担っていることが最近になって明らかにされつつある。この調節系RNAが機能する遺伝子発現抑制機構は、RNA干渉（RNAi）と呼ばれ、１９８８年に線虫を用いた実験で明らかにされ、その後、ショウジョウバエや哺乳類細胞でも同様の機構の存在が明らかとなった。この調節RNAとしてのncRNAは、鎖長がおよそ２０〜２５塩基であり、その作用機序は、micro RNA（miRNA）による翻訳抑制と、small interference RNA（siRNA）による標的mRNAの切断及び標的DNA領域のヘテロクロマチン化を介した遺伝子サイレンシングとに大別される。
【０００３】
miRNAは、内在性miRNA遺伝子からヘアピン様構造のRNA（前駆体）として転写されてくる。この前駆体は、特定の酵素RNAse III切断活性を有するdsRNA切断酵素（Drosha、Dicer）により切断された後、二本鎖の形態へと変化し、その後一本鎖となる。そして、片方のアンチセンス鎖がRISCと称するタンパク質複合体に取り込まれ、mRNAの翻訳抑制に関与すると考えられている。このように、miRNAは、転写後、各段階においてその態様は異なるので、通常、miRNAをターゲット（検出対象）とする場合は、ヘアピン構造体、二本鎖構造体、一本鎖構造体等の各種形態を考慮する必要がある。
【０００４】
一方、siRNAは、ウイルス、トランスポゾン、トランスジーン、内在性dsRNA等の長鎖dsRNAから、RNAse III切断活性を有するdsRNA切断酵素（Dicer）により切り出される。その後、dsRNAの片方のアンチセンスRNAが、RISC、又はRITSと称するタンパク質複合体に取り込まれ、複合体としてmRNAの分解又は転写抑制に関与する。従って、siRNAの取り得る態様としては、dsRNAとしての二本鎖の状態、RISCとの複合体を形成している一本鎖の状態もあるので、通常、siRNAをターゲット（検出対象）とする場合は、長鎖dsRNA、切断後のsiRNA、又は一本鎖等の各種形態を考慮する必要がある。
【０００５】
ところで、一般に、核酸固定化基板（核酸マイクロアレイ）を用いた発現解析では、基板（チップ）間、サンプル間、又は検出用標識の違い等による検出データの誤差や開きを補正する場合、内部コントロール指標（ポジティブコントロール）としてハウスキーピング遺伝子等が用いられる（特許文献１参照）。しかしながら、検出ターゲットが上記miRNA等の場合、当該ハウスキーピング遺伝子を内部コントロール指標として用いることは困難である。その理由は、miRNA等を含むサンプル調製は、細胞又は組織から２０塩基程度の短い鎖長のRNAを分画精製することにより行うが、上記ハウスキーピング遺伝子等のコーディング領域の転写産物とmiRNA等とは鎖長が大きく異なるため、両者を同じ画分に分画することは難しく、miRNA等とハウスキーピング遺伝子転写産物とを共に含むサンプル調製は困難であるからである。
【０００６】
従って、miRNA等の短い鎖長のncRNAを検出し解析しようとする分野においては、有効なコントロール指標を用いて検出データの補正を行う技術の確立が急務の課題となっている。その解決策の一つとして、5SrRNA等の低分子のハウスキーピングRNAをコントロール指標として用いる方法が提案されている。しかしながら、通常、5SrRNA等の存在量は、miRNA等の約100倍から約10,000倍と非常に多く、miRNA等の検出が可能な比較的高感度の検出条件の下では、5SrRNA等の検出値は、有効に検出できる範囲を大きく超えた結果となるため、5SrRNA等の低分子のハウスキーピングRNAをコントロール指標としてmiRNA等の検出データを補正することは極めて困難である。
【特許文献１】特開平１１−５１２２９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明の解決しようとする課題は、被験試料に含まれるmiRNA等のncRNAを検出して得られた検出データを補正するにあたり、内部コントロール指標とする核酸が検出対象であるmiRNA等に比べて被験試料中に過剰に存在する場合であっても、上記データ補正のコントロール指標として有効に利用できるようにする、ncRNAの検出データの補正方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
被験試料に含まれるnon-coding RNAの検出データを補正する方法であって、前記被験試料中のコントロール指標とする核酸配列に対し相補的な配列を有する核酸を当該被験試料に添加する工程、前記non-coding RNAに対する核酸プローブ及び前記コントロール指標とする核酸に対する核酸プローブを固定した核酸固定化基板と、前記添加後の被験試料とを接触させる工程、並びに前記non-coding RNA及び前記コントロール指標とする核酸と、前記核酸プローブとのハイブリダイゼーション反応を検出する工程を含む、前記方法。
上記方法において、non-coding RNAとしては、例えば、micro RNA及び／又はsmall interference RNAを含むものが挙げられる。また、コントロール指標とする核酸としては、例えば、ハウスキーピングRNAが挙げられ、当該ハウスキーピングRNAとしては、例えば、5S rRNAが挙げられる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法によれば、被験試料に含まれるmiRNA等のncRNAを検出して得られた検出データを補正するにあたり、内部コントロール指標とする核酸（指標核酸）が検出対象であるmiRNA等に比べて被験試料中に過剰に存在する場合であっても、予め、当該指標核酸と相補的に結合し得る核酸（捕捉用核酸）を一定量添加しておくことで、上記データ補正のコントロール指標として有効に利用できるようにすることができる。これにより、例えば、各種組織由来の被験試料に含まれるmiRNA等の発現量の比較解析を容易に行うことができ、本発明の方法は極めて有用であると言える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．概要
本発明でいう「検出データの補正」とは、被験試料ごとに異なる種類の検出用標識を用いて得られた各検出データや、異なる基板間（チップ、マイクロアレイ）又は異なるサンプル間における各検出データを、相対的に同じレベルで有効に比較できるようにするために、検出感度の違いや検出データの誤差等を補正することを意味する。
【００１１】
以下に、本発明の検出データの補正方法の概略について、図１Ａ及び図１Ｂを参照しながら例示説明する。
【００１２】
まず、図１Ａでは、本発明の方法を適用しない場合（従来例）について例示する。具体的には、図１Ａでは、Ａ組織及びＢ組織という異なる組織由来の核酸（指標核酸及びターゲット核酸）をそれぞれ「標識ａ」及び「標識ｂ」という別の検出用標識（蛍光標識等）でラベル化して、両被験試料を含むハイブリダイゼーション溶液を調製し（図１Ａ(１)）、ハイブリダイゼーション反応後、「標識ａ」及び「標識ｂ」で標識化した核酸をそれぞれ検出する（図１Ａ(２)）、というアッセイ系を示している。
【００１３】
このアッセイ系は、コントロールとなる指標核酸として5SrRNA等の低分子のハウスキーピングRNAを用い、ターゲットであるmiRNA等の短い鎖長のncRNAを検出して、組織ごとに検出データを比較しようとするものである。しかしながら、通常、5SrRNA等の存在量は、miRNA等のncRNAの約100倍から約10,000倍と非常に多く、miRNA等の検出が可能な比較的高感度の検出条件の下では、5SrRNA等の検出値は、検出可能な範囲を大きく超えてしまう。つまり、図１Ａ(２)のグラフに示すように、いずれの標識について検出した場合も、コントロールである指標核酸の検出データは検出可能な範囲（当該範囲の上限は14とする）を大きく超える結果となる。このため、指標核酸の検出データを有効なコントロールとして用いることは極めて困難であり、Ａ組織及びＢ組織のそれぞれに由来するターゲット核酸の量を比較することができない。
【００１４】
これに対し、本発明では、図１Ａのアッセイ系と同様にハイブリダイゼーション溶液を調製するが、さらにこの溶液に捕捉用核酸を添加する（図１Ｂ(１)）。上述したように、指標核酸の存在量はターゲット核酸に比べて非常に多いため、ハイブリダイゼーション反応の前に、指標核酸を適当量取り除いておくことが重要となるからである。具体的には、捕捉用核酸を核酸試料中に適当量添加して指標核酸と結合させることにより、ハイブリダイゼーション反応時に指標核酸の核酸プローブへの過剰結合を回避して（すなわち、一定量の指標核酸については当該反応には関与しないようにして）、指標核酸を検出可能な範囲内で検出できるように制御することができる。本発明では、次いで、ハイブリダイゼーション反応のあと、図１Ａのアッセイ系と同様に各標識で標識化した核酸を検出し、指標核酸の検出データに基づいてターゲット核酸の検出データを補正する（図１Ｂ(２)）、というアッセイ系となる。
【００１５】
このアッセイ系では、ハイブリダイゼーション溶液に捕捉用核酸を添加しているため、図１Ｂ(２)に示す各標識の検出結果を示すグラフでは、いずれも、コントロールである指標核酸の検出データは検出可能な範囲内で検出された結果となっている（標識ａでは検出値10、標識ｂでは検出値5）。従って、指標核酸の検出データに基づいて、ターゲット核酸の検出データの補正を行い、各試料中のターゲット核酸の存在量を相対的に比較することができる。
【００１６】
具体的には、まず各標識で標識化した指標核酸の検出データのレベルを揃える。例えば、図１Ｂ(２)の「検出データの補正」のグラフに示すように、標識ａの指標核酸の検出データ（検出値10）を基準とし、これに対して標識ｂの指標核酸の検出データ（検出値5）が標識ａの指標核酸の検出データと一致するように換算し（この場合２倍換算）、検出データのレベルを均一化する。そして、同様の換算（2倍換算）を、標識ｂのターゲット核酸の検出データについても行う。つまり、ターゲット１については検出値10（検出値5×2倍）、ターゲット２については検出値4（検出値2×2倍）、ターゲット３については検出値6（検出値3×2倍）となるようにデータ補正する。これにより、ターゲット核酸（ターゲット１〜３）について各試料ごとの存在量を相対的に比較することができ、ひいては各組織（Ａ組織及びＢ組織）におけるターゲット核酸の発現量を有効に比較することができる。
【００１７】
なお、上記例示において、コントロールとなる指標核酸としては、各組織由来の細胞に共通に含まれ且つ同程度発現している核酸を選択することが重要であるが、本発明では、上述したように捕捉用核酸を用いるため、5SrRNA等の低分子のハウスキーピングRNAを用いることができる。また、ハイブリダイゼーション溶液に用いる各組織由来の核酸試料の添加量は、各試料中の指標核酸の含有量が少なくとも相対量において実質的に同じとなるように設定することが重要である。さらに、捕捉用核酸の添加量は、各試料中のすべての指標核酸が有効に検出可能な範囲内で検出され得る量となるように設定する必要がある。なお、有効に検出可能な範囲（上限、下限）は、通常、使用する検出機器の性能により決定される。指標核酸及びターゲット核酸の検出は、ハイブリダイゼーション溶液とマイクロアレイとを接触させ、ハイブリダイゼーション反応を行った後、検出用標識ごとに行う。標識ごとの検出は、同一工程で複数の標識を一度に検出してもよいし、別工程で複数の標識を個別に検出してもよい。
【００１８】
図１Ｂに示す本発明の方法の例示は、ハイブリダイゼーション溶液とマイクロアレイの組合せが１組である例示、即ちいわゆる一元系の場合の例示である。しかし本発明はこれには限定されず、上記組合せが２組以上である二元系、三元系、・・・、ｎ元系の場合、即ち１種又は２種以上のハイブリダイゼーション溶液と２つ以上のマイクロアレイとを用いる場合においても、同様の原理で検出データの補正及び有効な相対比較を行うことができる。
２．検出データの補正方法
本発明は、被験試料に含まれるnon-coding RNA (ncRNA)の検出データを補正する方法であって、下記(i)〜(iii)の工程を含む方法である。
【００１９】
(i) 被験試料中のコントロール指標とする核酸（指標核酸）の配列に対し相補的な配列を有する核酸（捕捉用核酸）を当該被験試料に添加する工程（添加工程）。
【００２０】
(ii) 前記ncRNAに対する核酸プローブ及び前記指標核酸に対する核酸プローブを固定した核酸固定化基板と、前記添加後の被験試料とを接触させる工程（接触工程）。
【００２１】
(iii) 前記ncRNA及び前記指標核酸と、前記核酸プローブとのハイブリダイゼーション反応を検出する工程（検出工程）。この検出工程でいう「検出」とは、先に図１Ｂを用いて例示したように、得られた指標核酸の検出データに基づいて、ターゲット核酸であるncRNAの検出データを補正することも含む意味である。
【００２２】
なお、本発明の方法は、上記各工程以外に他の何らかの工程を含んでいてもよく、限定はされない。例えば、接触工程後に、核酸固定化基板を洗浄する工程（洗浄工程）等が好ましく挙げられる。
【００２３】
(1) 被験試料の調製
本発明の方法を実施するにあたり、所望の組織から、ターゲット核酸となるncRNAを含む被験試料（ターゲット核酸試料）を調製する方法としては、特に限定はなく、公知の一般的な調製方法が採用できる。例えば、市販の教本である「DNA実戦マニュアル（羊土社）」及び「バイオ実験イラストレイテッド３+（秀潤社）」などに記載の方法を用いることができる。ターゲット核酸を検出するための標識化に関しても、特に限定はなく、例えば、蛍光標識、化学発光標識、ラジオアイソトープ標識及び電気化学的検出手段等が利用できるが、簡便性や汎用性の面から、光学的検出手段が利用できる標識、すなわち蛍光標識又は化学発光標識を用いることが好ましい。これらの標識化の方法については、専用標識キットが一般に市販されているので、付属のマニュアル等に記載の方法を用いることができる。
【００２４】
本発明の方法において、検出対象となるncRNAとしては、例えば、miRNA、siRNA、rRNA、snRNA、snoRNA、tRNA等が挙げられるが、ターゲット核酸としては、miRNA及びsiRNAが好ましい。また、コントロール指標とする核酸（指標核酸）としては、発現量又は存在量に大きな変動のない、ハウスキーピングRNAと称されるrRNA、snRNA、snoRNA、tRNA等が好ましく、より好ましくはrRNAであり、さらに好ましくは5SrRNAである。なお、指標核酸は１種のみ用いても２種以上を併用してもよく、限定はされない。
【００２５】
以下、本発明の方法における各工程の具体的内容について説明する。
【００２６】
(2) 添加工程
ハウスキーピングRNA等の指標核酸は、被験試料中に、ターゲット核酸となるncRNAに比べて過剰に存在している。
【００２７】
添加工程では、上記指標核酸を、核酸プローブとのハイブリダイゼーション反応の前に適当量取り除いておくことが重要である。具体的には、指標核酸に対し相補的な配列を有する核酸（捕捉用核酸：例えば合成DNA等）を、ターゲット核酸試料中に適当量添加して、指標核酸と結合させることにより、指標核酸の核酸プローブへの過剰結合を回避し、指標核酸の検出値を有効に検出可能な範囲内で検出できるように制御する。
【００２８】
捕捉用核酸としては、好ましくはDNA又はRNAであるが、その他、指標核酸に対して特異的結合が可能な化合物、例えばPNAのような核酸アナログ等も使用できる。捕捉用核酸は、例えば、鋳型となる核酸とプライマーを用いたPCR等による合成方法や、人工的にヌクレオチドを所望の塩基配列となるよう化学合成する方法等で作製することができる。捕捉用核酸の塩基長は、指標核酸と特異的に結合するのに十分な塩基長であればよく、特に制限はないが、例えば、指標核酸の塩基長の５割以上であることが好ましく、より好ましくは７割以上、さらに好ましくは８割以上である。また、捕捉用核酸としては、指標核酸に対する核酸プローブと同様の塩基配列を有するものがより好ましい。
【００２９】
添加工程において補足用核酸を添加する被験試料は、通常、ハイブリダイゼーション溶液として調製しておいたものを用いる。ハイブリダイゼーション溶液の組成は、通常のハイブリダイゼーションに用いられる一般的溶液組成であるターゲット核酸、界面活性剤のSDS、SSCであり、当該溶液の調製は、基本的には、前述した市販の教本である「DNA実戦マニュアル（羊土社）」及び「バイオ実験イラストレイテッド３+（秀潤社）」等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００３０】
添加工程において、捕捉用核酸の添加量は、経験的に知られている指標核酸（ハウスキーピングRNA等）の存在量に基づいて設定することができる。例えば、指標核酸としてハウスキーピングRNAを用いる場合を考えると、通常、total RNA(10μg)の中から分画取得される低分子RNAの量は0.１μｇ〜1.0μgの範囲内であり、当該低分子RNA中のハウスキーピングRNAの存在量は80％〜95％の範囲内である。そして、これらのハウスキーピングRNAの構成としては5SrRNA、tRNA、snRNA、snoRNAが含まれる。従って、捕捉用核酸の添加量は、例えば、0.01〜0.95μgの範囲が好ましく、0.01〜0.5μgの範囲がより好ましい。また、指標核酸として、複数種のハウスキーピングRNAを用いる場合でも、その種類に応じた捕捉用核酸を個別に用意し、ハイブリダイゼーション溶液に添加すればよい。
【００３１】
添加工程において、捕捉用核酸を添加するタイミングは、限定はされず、ターゲット核酸試料調製時、ハイブリダイゼーション溶液調製時、及びハイブリダイゼーション反応時等のいずれでもよい。また、添加の回数は、限定はされず、１回でもよいし２回以上行ってもよい。さらに、添加の態様としては、別途作製した捕捉用核酸を添加する、いわゆる外部添加に限らず、例えば、調製したターゲット核酸試料中の核酸成分を捕捉用核酸として用いる、いわゆる内部添加の態様も採用することができる。
【００３２】
(3) 接触工程
接触工程では、上記添加工程で得られた被験試料（ハイブリダイゼーション溶液）を、核酸プローブに接触させてハイブリダイゼーション反応を行う。詳しくは、上記添加工程で得られた被験試料と、核酸固定化基板（以下、マイクロアレイ）とを接触させることにより上記反応を行う。
【００３３】
マイクロアレイとは、核酸プローブを固体基板上に固定化した核酸検出用デバイスであり、その態様は、例えば、シリコン基板上に半導体技術を応用してオリゴ核酸プローブを逐次合成して作製するタイプもの（Science 251, 767-773 (1991)）、スライドガラスに核酸断片をスポットするスポッティング法によるタイプのもの（Science 270, 467-470 (1995)）、又は、貫通孔基板に核酸を固定化したタイプのもの（貫通孔型マイクロアレイ；特許第3510882号公報、特開2004-163211号公報等）など様々なものが開発されており、本発明で用いるマイクロアレイとしては、特に制限はされず、いずれのタイプのものも使用できる。中でも、上記貫通孔型マイクロアレイが好ましい。
【００３４】
本発明で用いるマイクロアレイは、具体的には、検出対象であるncRNAに対する核酸プローブとともに、指標核酸に対する核酸プローブも固定したマイクロアレイである。接触工程では、当該マイクロアレイと、上記添加工程で得られた被験試料とを、一定条件下で接触させることで、ハイブリダイゼーション反応を行うことができる。ここで接触とは、マイクロアレイと被験試料中の核酸とを、少なくとも、当該マイクロアレイ上に固定化された核酸プローブと当該被験試料中の核酸とが自由に結合可能な状態に保持することを意味する。従って、接触の態様としては、例えば、所定の容器にマイクロアレイ及び被験試料を入れて、マイクロアレイ基板上の核酸プローブ固定化部位を当該被験試料に浸漬させる方法等が好ましく利用できる。また、マイクロアレイ基板上の核酸プローブ固定化部位に被験試料を直接乗せて接触させてもよい。
【００３５】
接触工程におけるハイブリダイゼーション反応の方法及び条件に関しては、特に限定はなく、前述した市販の教本である「DNA実戦マニュアル（羊土社）」及び「バイオ実験イラストレイテッド３+（秀潤社）」等に記載の方法及び条件を適宜採用することができる。また、必要に応じて、Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))等を参照することもできる。
【００３６】
接触工程では、マイクロアレイ基板上のハイブリダイゼーション反応と、指標核酸及び捕捉用核酸の反応とが、競争的に行われることとなり、結果として、マイクロアレイ基板上の核酸プローブと結合する指標核酸の量が、有効な検出範囲内の量に容易に制御され得る。
【００３７】
(4) 洗浄工程
上記接触工程におけるハイブリダイゼーション反応の終了後、特異的ハイブリダイゼーション反応（すなわち被験試料中の核酸と核酸プローブとの反応）を検出する前に、マイクロアレイを一定条件下で洗浄しておくことが好ましい。これにより、非特異的吸着物質や非特異的核酸ハイブリッド等の除去を行う。上記洗浄操作の方法は、限定はされず、前述した市販の教本である「DNA実戦マニュアル（羊土社）」及び「バイオ実験イラストレイテッド３+（秀潤社）」等に記載の方法が利用できる。
【００３８】
(5) 検出工程
検出工程において採用し得る検出方法としては、前述したように、一般的な汎用技術が利用できるが、なかでも光学的検出手段である蛍光検出や化学発光検出を利用した方法が、簡便であり、汎用性がある点で好ましい。マイクロアレイにおける光学標識を検出する手段としては、例えば、レーザー走査型の蛍光検出装置、冷却CCDカメラを搭載した蛍光顕微鏡などが市販されており、これらの装置を用いて検出することができる。
【００３９】
検出工程では、得られた検出データに基づいてデータ補正を行うことも含む。すなわち、得られた指標核酸の検出データに基づいて、ターゲット核酸であるncRNAの検出データを補正することにより、例えば前記「１．概要」において図１Ｂを用いて例示したように、異なる組織由来のターゲット核酸の相対量を有効に比較することができる。また、異なる基板間（チップ、マイクロアレイ）又は異なるサンプル間における検出データの誤差についても、同様に指標核酸の検出データを基準にして補正し、各基板ごと又は各サンプルごとのターゲット核酸の相対量を有効に比較することができる。
(6) 本発明の方法を利用した定量的検出方法
以上に説明した本発明のデータ補正方法を利用すれば、被験試料に含まれるnon-coding RNA(ncRNA)を定量的に検出することもできる。
【００４０】
よって、本発明は、被験試料に含まれるncRNAを定量的に検出する方法であって、下記工程を含む方法を提供することができる。
【００４１】
前記被験試料中のコントロール指標とする核酸（指標核酸）に対し相補的な配列を有する核酸（捕捉用核酸）を当該被験試料に添加する工程
前記ncRNAに対する核酸プローブ及び前記指標核酸に対する核酸プローブを固定した核酸固定化基板と、前記添加後の被験試料とを接触させる工程
前記ncRNA及び前記指標核酸と、前記核酸プローブとのハイブリダイゼーション反応を検出する工程
ターゲット核酸であるncRNAを定量的に検出するためには、指標核酸の検出データから当該指標核酸の絶対量を把握しておくことが前提となる。従って、ハイブリダイゼーション反応及び当該反応の検出に先立ち、予め、被験試料中の指標核酸の絶対量を、公知の測定方法により求めておく必要があり、例えば、UV光度計によるAbs260／280による吸光光度検査、バイオアナライザー2100（Agilent社製）等の測定方法を用いることができる。
【００４２】
また、捕捉用核酸の添加に関しては、添加した捕捉用核酸と反応し得る指標核酸の絶対量（すなわちマイクロアレイ上の核酸プローブとは結合し得ず検出データには反映されない指標核酸の絶対量）が把握できるように、捕捉用核酸の添加量を設定する必要がある。指標核酸の検出データに相当する絶対量が特定できることにより、この検出データを基準（指標）としてターゲット核酸の検出データから当該ターゲット核酸の定量化が可能となる。ここで、捕捉用核酸と反応し得る指標核酸の絶対量を求める方法としては、限定はされないが、例えば、添加する捕捉用核酸の分子数を予め算出しておき、これと同分子数の指標核酸の合計量を算出する方法等が挙げられる。
３．検出データ補正用キット
本発明は、被験試料に含まれるnon-coding RNA (ncRNA)の検出データを補正するためのキットであって、下記(a)及び(b)を含むものである。
【００４３】
(a) 前記被験試料中のコントロール指標とする核酸（指標核酸）に対し相補的な配列を有する核酸（捕捉用核酸）
(b) 前記ncRNAに対する核酸プローブ及び前記コントロール指標とする核酸に対する核酸プローブを固定した核酸固定化基板
本発明のキットの構成成分である上記(a)捕捉用核酸および(b)核酸固定化基板については、前述した本発明の方法における説明記載が同様に適用できる。
【００４４】
本発明のキットは、上記(a)及び(b)の構成成分以外に、他の構成成分も含んでいてもよく、限定はされない。例えば、バッファー（例えばTris緩衝液等）、コントロール用試薬（例えば、組織サンプル、又は、ポジティブ若しくはネガティブコントロール用ターゲットオリゴヌクレオチド等）、標識用及び／又は検出用試薬（Cy3、Cy4、Cy5、VIC、FAM、Alaxa647、Alaxa 555等の蛍光色素）、界面活性剤溶液（SDS等）、洗浄溶液、説明書、説明図及び／又は製品情報、包装環境調節剤（例えば、氷、乾燥剤）等が挙げられる。
【００４５】
また、本発明のキットは、必要な構成成分のうちの一部のみを含む部分的キットであってもよく、その場合には、ユーザーが他の構成成分を用意することができる。さらに、本発明のキットは、各容器又は包装が使用する構成成分のうちの一部を含む、２つ以上の別個の容器又は包装を含むものであってもよい。
【００４６】
なお、本発明のキットは、前述したターゲット核酸の定量的検出方法を行うためのキットとしても利用することができる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００４７】
＜DNAマイクロアレイの製造＞
貫通孔型のDNAマイクロアレイを、以下の手順で製造した。
１．核酸プローブの調製
DNAマイクロアレイに搭載する核酸プローブ（キャプチャープローブ）として、下記表１に示す配列情報をもつ5'末端ビニル化核酸分子（17〜25mer）を用いた。これら核酸分子の合成方法を以下に示す。
【００４８】
まず、末端アミノ化核酸（5'-O-アミノヘキシル-核酸）を合成するために、アミダイト試薬を用いてDNA自動合成装置により、下記表１に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成した。その後、最終段階で、アミノリンクTM（PEバイオシステムズ社製）を各オリゴヌクレオチドに反応させ、次いで脱保護操作を行うことにより調製した。
【００４９】
【表１】
2007097429.tif 000002
【００５０】
2007097429.tif 000003
【００５１】
2007097429.tif 000004
【００５２】
2007097429.tif 000005
【００５３】
2007097429.tif 000006
【００５４】
2007097429.tif 000007
【００５５】
２．中空繊維束の製造
図５に示す配列固定器具を利用して中空繊維束（中空繊維配列体）を製造した。なお、図５中のｘ、ｙ、ｚは互いに直交する３次元軸であり、ｘ軸は上記中空繊維の長手方向と一致する。
【００５６】
まず、孔の中心間距離を０．４２ｍｍとして直径０．３２ｍｍの孔が縦横各１２列で合計１４４個設けられた、厚さ０．１ｍｍの多孔板２１を２枚準備した。これらの多孔板２１を重ね合わせて、そのすべての孔に、ポリカーボネート中空繊維３１（三菱エンジニアリングプラスチック社製、カーボンブラック１質量%含有）を１本ずつ通過させた。
【００５７】
ｘ軸方向に各中空繊維３１に０．１Ｎの張力をかけた状態で２枚の多孔板２１の位置を移動させて、中空繊維３１の一方の端部から２０ｍｍの位置と１００ｍｍの位置の２ヶ所に上記多孔板２１を固定した。即ち、２枚の多孔板２１の間隔を８０ｍｍとした。
【００５８】
次いで、上記多孔板間の空間の周囲３面を板状物４１で囲った。このようにして上部のみが開口状態にある容器を得た。
【００５９】
得られた容器の上部から樹脂原料を流し込んだ。当該樹脂原料としては、ポリウレタン樹脂接着剤（日本ポリウレタン工業（株）製、ニッポラン4276，コロネート4403）の総重量に対し、2.5質量％のカーボンブラックを添加したものを使用した。樹脂原料を流し込んだ後、容器を２５℃で１週間静置して樹脂を硬化させた。硬化後、容器から多孔板と板状物を取り除いて、中空繊維束を得た。
３．ゲル充填中空繊維配列体の製造
次に、下記表２に示す配合割合（核酸プローブに関しては濃度）で混合した単量体及び開始剤を含む、ゲル前駆体重合性溶液を調製した。
【００６０】
【表２】
2007097429.tif 000008
【００６１】
調製した各溶液を、384マイクロタイタープレートの所定のウェルに、８０μLずつ分注した。次に、上記分注後の384プレート及び中空繊維束をデシケーター内に配置し、デシケーター内を減圧状態にした後、中空繊維束の繊維束が固定されていない一方の端部を、384プレートに分注した溶液中に浸漬した。その後、デシケーター内に窒素ガスを封入して減圧状態を解き、中空繊維の中空部に、核酸プローブを含むゲル前駆体重合性溶液を導入させた。次いで、容器内を70℃とし、３時間かけて重合反応を行った。
【００６２】
このようにして、核酸プローブがゲル状物を介して中空繊維の中空部に保持された中空繊維束（ゲル充填中空繊維配列体）を得た。
４．薄片化
上記３．で得られた中空繊維束を、ミクロトームを用いて繊維の長手方向と直交する方向に厚さ０．５ｍｍで５０枚スライスし、得られた薄片シートをDNAマイクロアレイとした。
【実施例２】
【００６３】
＜5SrRNA捕捉用核酸を使用したmiRNAの検出＞
5SrRNAをコントロール指標とする核酸（内部コントロール）とし、この5SrRNAの捕捉用核酸を使用する場合の、miRNAの検出方法について以下に説明する。
１．生体材料からの蛍光標識低分子RNAの調製
マウスの各組織中に存在するmiRNA量を検出評価するため、マウス(C57BL/6、♀、7〜9W)の大脳及び肝臓の各々から、mirVanaTMmiRNA Isolation kit (登録商標：Ambion)を用いて低分子画分のRNAを分離した（なお、この低分子画分のRNAには各種miRNAのほか、指標核酸とする5SrRNAも含まれる。）。
【００６４】
これら低分子RNAをそれぞれ１〜5μg使用して、SilencerTM siRNA Labeling Kit kit (登録商標：Ambion)を用いて蛍光標識を行い、下記(a)及び(b)の検体溶液をそれぞれ調製した。
【００６５】
「蛍光標識化低分子RNA溶液」
(a) Ｃｙ３ラベル化肝臓由来低分子RNA溶液（０．６μｇ／μｌ）
(b) Ｃｙ５ラベル化大脳由来低分子RNA溶液（０．３μｇ／μｌ）
２．ハイブリダイゼーション
下記表３に示す組成及び仕込み量となるように、上記１．で調製した蛍光標識化低分子RNA溶液(a)及び(b)に、5SrRNAを捕捉するための「5SrRNAに対し相補な塩基配列を有するDNA（cccgaccctgcttagcttccgacat（配列番号183））溶液」、SSC及びSDS溶液などを加え、ハイブリダイゼーション溶液(c)を調製した。なお、ハイブリダイゼーション溶液(c)において、上記RNA溶液(a)とRNA溶液(b)に含まれる5SrRNAの量が実質的に同じとなるように、当該RNA溶液(a)及び(b)の仕込み量を調整した。
【００６６】
【表３】
2007097429.tif 000009
【００６７】
次に、このハイブリダイゼーション溶液(c)に、実施例１で製造したDNAマイクロアレイを浸漬し、８０℃で５分間加熱した。その後４０℃に戻し、ハイブリダイゼーションオーブンを用いて５０℃で１６時間ハイブリダイゼーション反応を行った。
３．洗浄及び検出
ハイブリダイゼーション反応後の洗浄操作は、下記の手順に従い、洗浄回数は、条件を毎回変えながら計４回行った。ただし、２回目以降は、洗浄操作毎に検出装置を用いてスポットの蛍光シグナル検出を行い、蛍光シグナルの強度データを取得した。
【００６８】
「洗浄操作及び蛍光シグナル検出の手順」
(1) ハイブリダイゼーション反応後のDNAマイクロアレイを、第１洗浄液（２×SSC、０．２％SDS、容量２０ｍｌ）により４０℃で１５分間洗浄した（第1回目洗浄）。次いで、第２洗浄液（２×SSC、容量２０ｍｌ）により４０で℃１５分間洗浄を行った（第２回目洗浄）。その後、このDNAマイクロアレイ上のスポットのシグナル検出を行うための準備として、検出用ホルダーにDNAマイクロアレイを乗せ、さらに０．２×SSC中に浸漬し、カバーガラスをかぶせた。このDNAマイクロアレイを乗せた検出用ホルダーをサンプルとし、三菱レイヨン社製の核酸マイクロアレイ自動検出装置(冷却CCDカメラ方式)（型番：0060304）を用いて、下記表４に示す検出条件で第１回目の検出を行った（検出１）。
【００６９】
【表４】
2007097429.tif 000010
【００７０】
(2) 検出１後のDNAマイクロアレイを第２洗浄液（２×SSC、容量２０ｍｌ）により４３℃で１５分間洗浄した（第３回目洗浄）後、検出１と同様の検出装置及び検出条件で、第２回目の検出を行った（検出２）。
【００７１】
(3) 検出２後のDNAマイクロアレイを第２洗浄液（２×SSC、容量２０ｍｌ）により５０℃で１５分間洗浄した（第４回目洗浄）した後、検出１と同様の検出装置及び検出条件で、第３回目の検出を行った（検出３）。
４．データ補正によるmiRNA発現量の評価
上記３．での検出において洗浄条件毎に取得したDNAマイクロアレイの各スポットの蛍光シグナル強度データを基に、肝臓由来miRNAと大脳由来miRNAとの発現量の差（miRNAの種類ごとの発現量の差）を、下記の算出式（Ｉ）から求められる値（Ｄ）により評価した。
【００７２】
Ｄ＝ Ｌｏｇ２［ＩＣｙ３／ＩＣｙ５］      （Ｉ）
（式中、ＩＣｙ３はＣｙ３蛍光シグナル強度（平均値）を表し、ＩＣｙ５はＣｙ５蛍光シグナル強度（平均値）を表す。）
ここで、上記算出式に代入するＣｙ５の強度データ（ＩＣｙ５）としては、実際のＣｙ５の検出強度の値に、5SrRNAに関するＣｙ３とＣｙ５の検出強度の値の比（Ｃｙ３／Ｃｙ５）を乗じてデータ補正することにより得られる数値を用いた。
５．結果
上記３．の検出１〜３で取得した蛍光シグナルの強度データを、「図２Ａ(a)〜(c)及び図２Ｂ(d)〜(e)」並びに「図２Ｃ(f)〜(h)及び図２Ｄ(i)〜(j)」に示し、上記４．でのmiRNA発現量の差の評価結果を「図３Ａ(a)〜(b)、図３Ｂ(c)及び図３Ｃ(d)〜(e)」に示した。
【００７３】
なお、図２Ａ〜Ｄのうち、図２Ａ,Ｂでは、Cy3で標識化した肝臓由来の低分子RNAの検出結果を表し、図２Ｃ,Ｄでは、Cy5で標識化した大脳由来の低分子RNAの検出結果を表している。また、図３Ａ〜Ｃの各グラフでは、それぞれ、グラフ中央の「0.0」の値を示すラインを境に、右側が正の値、左側が負の値を示す。
【００７４】
図２Ｂ(e)及び図２Ｄ(j)のグラフに示されるように、5SrRNAの蛍光シグナル強度は、検出可能範囲を超えず、miRNA発現量の差のデータ補正に用いるために十分なシグナル強度として取得することができた。このことから、5SrRNA捕捉用として、ハイブリダイゼーション時に添加した5SrRNAと相補なRNA配列が十分に機能していることが示された。
[比較例１]
【００７５】
＜5SrRNA捕捉用核酸を使用しないmiRNAの検出＞
5SrRNAをコントロール指標とする核酸（内部コントロール）とするが、この5SrRNAの捕捉用核酸を使用しない場合のmiRNAの検出例を以下に説明する。
１．生体材料からの蛍光標識低分子RNAの調製
実施例２の１．と同様の方法で、下記(d)の検体溶液を調製した。
【００７６】
「蛍光標識化低分子RNA溶液」
(d) Ｃｙ３ラベル化肝臓由来低分子RNA溶液 （０．４μｇ／μｌ）
２．ハイブリダイゼーション
下記表５に示すの組成及び仕込み量となるように、上記１．で調製した蛍光標識化低分子RNA溶液(d)に、SSC及びSDS溶液などを加え、ハイブリダイゼーション溶液(e)を調製した。
【００７７】
【表５】
2007097429.tif 000011
【００７８】
次に、実施例２の２．と同様に、ハイブリダイゼーション溶液(e)中に、実施例１で作製したDNAマイクロアレイを浸漬し、８０℃で５分間加熱した。その後４０℃に戻し、ハイブリダイゼーションオーブンを用いて５０℃で１６時間ハイブリダイゼーション反応を行った。
３．洗浄及び検出
実施例２の３．に記載の手順と同様にして、洗浄条件毎の各スポットの蛍光シグナルを検出し強度データを取得した。
４．結果
上記３．で取得した各スポットの蛍光シグナル強度を、「図４Ａ(a)、図４Ｂ(b)、図４Ｃ(c)及び図４Ｄ(d)」に示した。図４Ｄ(d)のグラフに示されるように、5SrRNAの蛍光シグナル強度は、検出可能な範囲の上限を大きく超えていた。従って、5SrRNAに関する蛍光強度の値を利用して実施例２の４．のようなデータ補正を行うことは困難であると言える。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１Ａ】従来のnon-coding RNAの検出方法を例示する概略図である。
【図１Ｂ】本発明のnon-coding RNAの検出データ補正方法の一実施形態を例示する概略図である。
【図２Ａ】肝臓由来の被験試料に5SrRNA捕捉用核酸を添加した場合の、各種ncRNA（miRNA及び5SrRNA等）の検出結果（各スポットの蛍光シグナル強度データ）を示すグラフである。
【図２Ｂ】肝臓由来の被験試料に5SrRNA捕捉用核酸を添加した場合の、各種ncRNA（miRNA及び5SrRNA等）の検出結果（各スポットの蛍光シグナル強度データ）を示すグラフである。
【図２Ｃ】大脳由来の被験試料に5SrRNA捕捉用核酸を添加した場合の、各種ncRNA（miRNA及び5SrRNA等）の検出結果（各スポットの蛍光シグナル強度データ）を示すグラフである。
【図２Ｄ】大脳由来の被験試料に5SrRNA捕捉用核酸を添加した場合の、各種ncRNA（miRNA及び5SrRNA等）の検出結果（各スポットの蛍光シグナル強度データ）を示すグラフである。
【図３Ａ】図２Ａ,Ｂに示す検出結果と、図２Ｃ,Ｄに示す検出結果に基づく、各種miRNAの発現量の差（由来組織の違いによる発現量の差）の評価結果を示すグラフである。
【図３Ｂ】図２Ａ,Ｂに示す検出結果と、図２Ｃ,Ｄに示す検出結果に基づく、各種miRNAの発現量の差（由来組織の違いによる発現量の差）の評価結果を示すグラフである。
【図３Ｃ】図２Ａ,Ｂに示す検出結果と、図２Ｃ,Ｄに示す検出結果に基づく、各種miRNAの発現量の差（由来組織の違いによる発現量の差）の評価結果を示すグラフである。
【図４Ａ】肝臓由来の被験試料に5SrRNA捕捉用核酸を添加しなかった場合の、各種ncRNA（miRNA及び5SrRNA等）の検出結果（各スポットの蛍光シグナル強度データ）を示すグラフである。
【図４Ｂ】肝臓由来の被験試料に5SrRNA捕捉用核酸を添加しなかった場合の、各種ncRNA（miRNA及び5SrRNA等）の検出結果（各スポットの蛍光シグナル強度データ）を示すグラフである。
【図４Ｃ】肝臓由来の被験試料に5SrRNA捕捉用核酸を添加しなかった場合の、各種ncRNA（miRNA及び5SrRNA等）の検出結果（各スポットの蛍光シグナル強度データ）を示すグラフである。
【図４Ｄ】肝臓由来の被験試料に5SrRNA捕捉用核酸を添加しなかった場合の、各種ncRNA（miRNA及び5SrRNA等）の検出結果（各スポットの蛍光シグナル強度データ）を示すグラフである。
【図５】中空繊維束（中空繊維配列体）を製造用の配列固定治具を示す概略図である。
【符号の説明】
【００８０】
１１  孔
２１  多孔板
３１  中空繊維
４１  板状物
【配列表フリーテキスト】
【００８１】
配列番号１〜１８７：プローブ
【図１Ａ】
2007097429.tif 000012
【図１Ｂ】
2007097429.tif 000013
【図２Ａ】
2007097429.tif 000014
【図２Ｂ】
2007097429.tif 000015
【図２Ｃ】
2007097429.tif 000016
【図２Ｄ】
2007097429.tif 000017
【図３Ａ】
2007097429.tif 000018
【図３Ｂ】
2007097429.tif 000019
【図３Ｃ】
2007097429.tif 000020
【図４Ａ】
2007097429.tif 000021
【図４Ｂ】
2007097429.tif 000022
【図４Ｃ】
2007097429.tif 000023
【図４Ｄ】
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【図５】
2007097429.tif 000025
【配列表】
2007097429000001.app