(57)【要約】【課題】砒素等を含む有害化合物を効率的に無害化する方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明の有害化合物の無害化方法は、海洋性微細藻類を用いて砒素、アンチモン、セレンからなる群から選択される少なくとも１種の元素を含有する有害化合物を無害な物質とすることを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
海洋性微細藻類を用いて砒素、アンチモン、セレンからなる群から選択される少なくとも１種の元素を含有する有害化合物を無害な物質とする有害化合物の無害化方法。
【請求項２】
前記元素が砒素であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記有害化合物を前記海洋性微細藻類の生体内酵素によってメチル化することにより無害な物質とする請求項１又は２項に記載の方法。
【請求項４】
前記海洋性微細藻類がナノクロロプシス属に属する微細藻類であることを特徴とする請求項１〜３項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記メチル化によって、前記有害化合物をモノ、及び／又はジメチル化化合物とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ジメチル化化合物が、アルセノシュガー、ジメチルアルシン酸、ジメチルアルシノイルアセテート（DMAA）、ジメチルアルシノイルエタノール（DMAE）、ジメチルアルシノイルプロピオネート（DMAP）からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１〜５項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ジメチル化化合物が、実質的にアルセノシュガーからなることを特徴とする請求項１〜６項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
自然界に存在する海洋生物が含有する濃度以下に無機砒素を低減し、かつ無害な有機砒素に変換することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有害化合物を無害化する方法に関し、特に、砒素、アンチモン、セレンからなる群から選択される少なくとも一種を含有する有害化合物を無害化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
砒素、アンチモン、セレン等の重金属は、半導体等の工業材料として広く用いられている物質であるが、生物に有毒な物質であることから、環境中に流出することにより生物に与えられる影響が懸念されている。
【０００３】
従来、これらの重金属を除去する方法として、有毒な亜砒酸等の無機砒素を含む廃水にポリ塩化アルミニウム（PAC）等の凝集剤を添加し、該凝集剤と原水中の鉄分に砒素を凝集、吸着し、沈殿させた後、濾過により除去する方法や、活性アルミナ、セリウム系吸着剤により砒素化合物等を吸着させる方法等が一般に知られている。
【０００４】
一方、自然界において、環境中に含まれる無機砒素を取り込み、蓄積する藻類がいくつか存在する。これまでに、無機砒素を取り込み、蓄積する藻類として、クロレラ（Chlorella）等のいくつかの種の微細藻類が知られており、当該藻類の体内において砒素の大半が無機砒素として蓄積されているが、残りはメチル化された形態で蓄積されていることが知られている（非特許文献１及び２）。そして、一般に、メチル化された有機砒素化合物は哺乳動物に対して無機砒素よりも低い毒性を示すことが知られている。
これらの知見に鑑み、当該藻類を用いて砒素を回収する具体的な方法として、砒素耐性に関与するＰＴＢ１遺伝子を破壊することで藻類の砒素耐性を高め、環境中、排水中の砒素を回収し、無毒化する方法が提案されている（特許文献１）。
【０００５】
【非特許文献１】Maeda et al. 1990, Appl. Organomet. Chem., 4, 251-254
【非特許文献２】Gossler et al., 1997, Appl. Organomet. Chem., 11, 57-66
【特許文献１】特開２００３−２６５１８６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記吸着剤による方法は、処理量が不足しており、マテリアルバランスから見れば処理として不十分であり、さらに、保管の安全対策も十分なものとはなっていない。
【０００７】
また、上記微細藻類を用いて砒素を回収する方法では、藻類の体内に取り込まれた砒素の大半が毒性の高い無機砒素のままであるという問題がある。
そこで、本発明は、上記問題点を解決すべく、砒素等を含む有害化合物を効率的に無害化する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明者らは、各種藻類を用いて砒素等を含む有害化合物を無害な物質とすることを試み、藻類が有する当該有害化合物の無害化能力について鋭意検討した結果、本発明を見出した。
【０００９】
すなわち、本発明の有害化合物の無害化方法は、海洋性微細藻類を用いて砒素、アンチモン、セレンからなる群から選択される少なくとも１種の元素を含有する有害化合物を無害な物質とすることを特徴とする。
【００１０】
本発明の無害化方法の好ましい実施態様においては、前記元素が砒素であることを特徴とする。
【００１１】
本発明の無害化方法の好ましい実施態様においては、前記有害化合物を前記海洋性微細藻類の生体内酵素によってメチル化することにより無害な物質とすることを特徴とする。
【００１２】
本発明の無害化方法の好ましい実施態様においては、前記海洋性微細藻類がナノクロロプシス属に属する微細藻類であることを特徴とする。
【００１３】
本発明の無害化方法の好ましい実施態様においては、前記メチル化によって、前記有害化合物をモノ、及び／又はジメチル化化合物とすることを特徴とする。
【００１４】
本発明の無害化方法の好ましい実施態様においては、前記ジメチル化化合物が、アルセノシュガー、ジメチルアルシン酸、ジメチルアルシノイルアセテート（DMAA）、ジメチルアルシノイルエタノール（DMAE）、ジメチルアルシノイルプロピオネート（DMAP）からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。
【００１５】
本発明の無害化方法の好ましい実施態様においては、前記ジメチル化化合物が、実質的にアルセノシュガーからなることを特徴とする。
【００１６】
本発明の無害化方法の好ましい実施態様においては、自然界に存在する海洋生物が含有する濃度以下に無機砒素を低減し、かつ無害な有機砒素に変換することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の無害化方法によれば、砒素等を含む有害化合物を効率的に無害化する方法を提供し得るという有利な効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下に、本発明の詳細について説明する。本発明は、海洋性微細藻類を用いて砒素、アンチモン、セレンからなる群から選択される少なくとも１種の元素を含有する有害化合物を無害な物質とすることを特徴とする。ここで、本明細書において、有害化合物とは、環境中に流出し、生物に暴露された際に、何らかの悪影響を生物に与える恐れがある化合物を意味する。
【００１９】
前記有害化合物のうち砒素を含有する有害化合物としては、亜ヒ酸、五酸化砒素、三塩化砒素、五塩化砒素、硫化砒素化合物、シアノ砒素化合物、クロロ砒素化合物、及びその他の砒素無機塩類等が挙げられる。これらの砒素は、例えばLD50(mg/kg)（マウスにおける50％致死量）が20以下であり、一般に生物に対して有毒な値である。
【００２０】
また、アンチモンを含有する有害化合物としては、三酸化アンチモン、五酸化アンチモン、三塩化アンチモン、五塩化アンチモン等が挙げられる。
【００２１】
さらに、セレンを含有する有害化合物としては、二酸化セレン、三酸化セレン等が挙げられる。
【００２２】
本発明において、上記有害化合物の無害化は、海洋性微細藻類を用いて行う。具体的には、上記有害化合物を前記海洋性微細藻類の生体内酵素によってメチル化することにより無害な物質とすることができる。
ここで、例として砒素を含有する有害化合物と当該有害化合物をメチル化した化合物の毒性に関して述べると、無機砒素である亜ヒ酸のマウス急性毒性値LD50は4.5mg/kg、ヒ酸のLD50は14〜18mg/kgである。これに対し、モノメチル化された砒素（モノメチルアルソン酸）のLD50は1800mg/kg、ジメチル化された砒素（ジメチルアルシン酸）は1200mg/kgである。したがって、これらLD50の値から、有害化合物の毒性がメチル化によって低下することが分かる。本発明は、これらの作用を有用な海洋性微細藻類、とりわけ生体内酵素によって達成可能であることを本発明者らが見出したものである。
【００２３】
上記海洋性微細藻類としては、例えば、ナノクロロプシス属に属する微細藻類が挙げられる。このナノクロロプシス属に属する微細藻類は、上記有害化合物をメチル化する能力が高い。ナノクロロプシス属に属する微細藻類としては、例えば、Nannochloropsis oculate、Nannochloropsis salina、Nannochloropsis gaditana、Nannochloropsis granulata等が挙げられる。これらのナノクロロプシス属に属する微細藻類は、栽培漁業などで稚魚の飼料として使用され、大量培養技術が確立されていることから、上記有害化合物を工業的に無害化するのに適している。
【００２４】
なお、本発明の無害化方法においては、有害化合物の毒性を低下させるという観点から、前記メチル化によって、前記有害化合物をモノ、及び／又はジメチル化化合物とすることが好ましい。なお、LD50の値を高めより一層無害な化合物とするという観点と、より無害なトリメチル化化合物としやすいという観点から、前記有害な化合物をジメチル化化合物とすることがより好ましい。
【００２５】
砒素を含有する有害化合物から無害化されたモノメチル化化合物としては、モノメチルアルソン酸、モノメチルアルシン酸等が挙げられる。また、砒素を含有する有害化合物のジメチル化化合物としては、アルセノシュガー、ジメチルアルシン酸、ジメチルアルシノイルアセテート（DMAA）、ジメチルアルシノイルエタノール（DMAE）、ジメチルアルシノイルプロピオネート（DMAP）等が挙げられる。
これらの中でも、化学的に安定であり、かつ生体内酵素によってトリメチル化化合物としやすいという観点から、前記有害化合物をジメチル化した化合物が実質的にアルセノシュガーからなることが好ましく、ジメチル化した化合物のうち、50％以上がアルセノシュガーからなることがより好ましく、さらに90％以上がアルセノシュガーからなることがより好ましい。
【００２６】
アンチモンを含有する有害化合物から無害化されたモノメチル化化合物としては、モノメチルアンチモン等が挙げられる。また、アンチモンを含有する有害化合物のジメチル化化合物としては、ジメチルアンチモン等が挙げられる。
【００２７】
セレンを含有する有害化合物から無害化されたモノメチル化化合物としては、モノメチルセレノール、モノメチルセレン含有有糖化合物等が挙げられる。また、セレンを含有する有害化合物のジメチル化化合物としては、ジメチルセレン、ジメチルセレニド等が挙げられる。
【００２８】
上記海洋性微細藻類を用いた上記有害化合物の無害化は、例えば、以下のようにして行うことができる。すなわち、上記有害化合物が含まれる培養液で上記海洋性微細藻類を培養して有害化合物を海洋性微細藻類の体内に取り込ませ、取り込ませた有害化合物を、当該海洋性微細藻類の生体内酵素によってメチル化し、無害な物質であるモノ、及び／又はジメチル化化合物とすることができる。
【００２９】
微細藻類の培養方法については、特に限定されることはなく、常法を用いることができる。
【００３０】
藻体濃度が特定の濃度以上、特に３×１０6 細胞／ｍｌ以上になった時点で、培養中の培養液に新たに添加液を加えて、培養液中の栄養源、特に炭素源および窒素源の濃度を高濃度にすることで、藻体の増殖を十分に行うことができる。新たに添加される培地（添加液）に含まれる栄養源は、好ましくは炭素源、窒素源、無機塩類、重金属元素を含む成分の各々を組み合わせたものや、各々を単独に用いてもよい。
【００３１】
炭素源としては例えば、ガラクトース、グルコース、ラクトースの加水分解物などの炭水化物、魚油、大豆油などの油脂類、乳酸、酢酸などの有機酸類、エタノールなどのアルコール類などが挙げられ、さらにこれらを組み合わせることも可能である。添加液を添加した後の炭素源の含有量は、培養液中１５０ｇ／Ｌ以下であるのが生産性が高いこと、ｐＨをコントロールしなくてよい点で好ましい。
【００３２】
窒素源としては例えば、酵母エキス、牛肉エキス、ペプトン、廃糖蜜、コーンスティープリカーなど有機態窒素や、硝酸カリウム、塩化アンモニウム、グルタミン酸ナトリウムなど無機態窒素があげられ、さらにこれらを組み合わせることも可能である。添加液を添加した後の窒素源の含有量は、培養液中１５ｇ／Ｌ以下であるのが生産性が高い点で好ましい。
【００３３】
無機塩類としては、市販の人工海水の濃縮物を用いることも可能であるが、例えば、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、硝酸カリウム、リン酸水素カリウムなどを組み合わせて用いることも可能である。重金属元素を含む成分としては、例えば、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛などの単体、イオン、塩化物、硫酸塩、硝酸塩など、さらには塩化鉄、塩化マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛などの種々の塩が挙げられる。以上のほか、重金属元素を含む成分の安定化のために例えば、ホウ酸やエチレンジアミン四酢酸を用いることも可能である。
【００３４】
培地のｐＨは、例えば５〜８であるのが好ましい。このｐＨ安定化のために例えば、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、モルホリノエタンスルホン酸などの緩衝剤を用いることも可能である。好ましい組成の添加液の例は、下記培地例１の添加液等が挙げられる。さらに、炭素源、窒素源、無機塩類および重金属を含む成分の少なくとも１種、特に炭素源と窒素源と無機塩類と重金属を含む成分とを含有してなる添加液を、培養の途中で間欠的にまたは連続的に加えて、培養液中の炭素源、窒素源の濃度を調整し、かつ、炭素源、窒素源以外の無機塩類、重金属を含む成分等は初発培地と同程度の濃度に保持させることが、藻体の生産性を向上させる点で好ましい。調整された培養中の培養液の各成分の濃度は、例えば、炭素源０．１〜１５０ｇ／Ｌ、窒素源０．１〜１５ｇ／Ｌ、無機塩類０．１〜１００ｇ／Ｌ、重金属を含む成分０．００１〜１０００ｍｇ／Ｌであるのが好ましい。
【００３５】
栄養源の添加の方法としては、培養開始から一定量を連続的に添加する方法、または培養開始後一定量を間欠的に添加する方法のいずれもが用いることが可能である。複数種の栄養源を同時に添加してもよい。
【００３６】
また、培養する方法は、深部通気撹拌培養、回転振盪培養、通気撹拌培養、振盪培養等であるのが好ましい。
【００３７】
培養温度としては通常１５〜３４℃で藻体生産を行なうことが可能である。
【００３８】
また、好ましい態様において、自然界に存在する海洋生物が含有する濃度以下に無機砒素を低減し、かつ無害な有機砒素に変換する。ここで、「自然界に存在する海洋生物が含有する濃度以下」とは、砒素などによる汚染が無い環境下において、海洋生物が天然に含有する無機砒素の濃度以下であることを意味するものである。すなわち本発明の方法によれば、海洋性微細藻類を用いて、無機砒素の濃度を天然の海洋生物の濃度以下に低減し、同時に上述した無害な有機砒素へと変換することが可能である。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は、下記実施例に限定して解釈される意図ではない。
【００４０】
実施例１
本実施例では、微細藻類ナノクロロプシスに砒素を含有する化合物として亜ヒ酸を取り込ませ、当該亜ヒ酸を無害化することを試みた。以下にその手順及び結果を説明する。
【００４１】
（１）微細藻類培養
対数増殖期まで前培養した微細藻類ナノクロロプシス（Nannochloropsis oculata）をダイゴ人工海水SP（和光純薬）とダイゴIMK培地（和光純薬）からなる１Lの培地に１×１０６cells/mlとなるように植菌し、蛍光灯照射下、温度25度でバブリングを行い培養した。
【００４２】
（２）砒素取込試験
培養開始48時間後に金属砒素として１ｐｐｍとなるように亜ヒ酸ナトリウムを添加し、蛍光灯照射下、温度25度でバブリングを行い、砒素添加後１２０時間培養することで、砒素砒素の取込試験を実施した。
【００４３】
（３）砒素含有量測定
遠心分離により藻体を経時的にサンプリングし、藻体内の無機砒素および有機砒素を形態別砒素分析システム（島津製作所製  原子吸光分光光度計AA-6800、前処理装置ASA-2sp）により定量した。
【００４４】
図１に藻体内に取込まれた無機砒素、有機砒素濃度と藻体濃度の経時変化を示す。ここでiAsは無機砒素、MMAはモノメチル化砒素化合物、DMAはジメチル化砒素化合物を示す。
【００４５】
この図から、ナノクロロプシスの藻体内に添加した砒素が取込まれたことが分かる（砒素無添加の場合の藻体内の総砒素濃度は０．０２μｇ／ｇ  ｗｅｔ  ｃｅｌｌｓ）。培養時間と共に砒素の取込量が多くなる傾向となった。藻体内に取込まれた無機砒素は大部分がジメチル化された形で存在した。
【００４６】
図２に藻体内に取り込まれた無機砒素、モノメチル化砒素化合物、ジメチル化砒素化合物の比率を示す。
培養の何れの時間においても取り込まれた砒素の80％以上がジメチル化砒素化合物として存在し、無機砒素の残留が非常に少ないという結果となった。
【００４７】
実施例２
次に、実施例１のナノクロロプシス中の砒素形態分析を、HPLC-ICP-MS(Agilent7500ceSystem,Agilent1100System)を用いて行った。
【００４８】
（抽出）
抽出方法については、以下のように行った。
湿重量で約5gの藻を、遠心分離用のチューブに入れ、10mlのメタノールと10mlの超純水の混合液を加えた。10分間超音波処理し、続いてホモジナイザー処理（キネマチカ社製：POLYTRON PT3100）を行い、24時間抽出を行った。10分間遠心分離処理し、その上清を採取した。残った沈殿物に、10mlのメタノールと10mlの超純水の混合液を加え、24時間抽出した。これらの操作を２回行い、３回分の上清を一つにして、ロータリーエバポレータで減圧乾固した。
得られた緑色固体約0.2gに水100mlを加え、緑色の溶液とした後、メンブランフィルター（メッシュ：0.22μｌ）でろ過し、分析試料とした。更に、超純水で10倍希釈して、HPLCを結合したICP-MS装置を用いて分析した。
【００４９】
（HPLC-ICP-MS 分析）
得られた分析試料を分配吸着/陽イオン交換複合分離モードのカラムを用いて、HPLC-ICP-MSにて砒素化合物の分析を行ったところ、図３に示す形態２のアルセノシュガー（3-[5-デオキシ-5-ジメチルアルシノイル]-β-D-リボシロキシ]-2-ヒドロキシプロピル  2,3-ジヒドロキシプロピルハイドロジェンホスフェート）及びその他のジメチル化化合物に帰属するピークが検出された。表１に、分析試料におけるジメチル化化合物の内訳を示す。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
表１に示したとおり、分析試料中のジメチル化化合物の約94％がアルセノシュガー（図３に示す形態２）であることがわかった。
【００５２】
比較例
比較例として、従来、砒素を取り込む藻類として既知である微細藻類クロレラ（Chlorella regularis）を用いて実施例と同様の砒素取り込み試験を行った。
【００５３】
（１）微細藻類培養
対数増殖期まで前培養した微細藻類クロレラ（Chlorella regularis）を１ＬのBold's Basal (BB) Mediumに１×１０６cells/mlとなるように植菌し、蛍光灯照射下、温度25度でバブリングを行い培養した。
【００５４】
（２）砒素取込試験
培養開始48時間後に砒素として１ｐｐｍとなるように亜ヒ酸ナトリウムを添加し、蛍光灯照射下、温度25度でバブリングを行い、砒素添加後１２０時間培養することで、砒素の取込試験を実施した。
【００５５】
（３）砒素含有量測定
遠心分離により藻体を経時的にサンプリングし、藻体内の無機砒素および有機砒素を形態別砒素分析システム（島津製作所製  原子吸光分光光度計AA-6800、前処理装置ASA-2sp）により定量した。
【００５６】
図４に藻体内に取込まれた無機砒素、有機砒素濃度と藻体濃度の経時変化を示す。ここでiAsは無機砒素、MMAはモノメチル化砒素化合物、DMAはジメチル化砒素化合物を示す。
【００５７】
この図からクロレラの藻体内に添加した砒素が取り込まれたことが分かる（砒素無添加の場合の藻体内の総砒素濃度は０．０２μｇ／ｇ  ｗｅｔ  ｃｅｌｌｓ）。培養時間と共に砒素の取込量が減る傾向となった。また、藻体内に取り込まれた無機砒素は大部分が無機砒素のまま存在し、メチル化された砒素は僅かであった。
【００５８】
図５にクロレラの藻体内に取込まれた無機砒素、モノメチル化砒素化合物、ジメチル化砒素化合物の比率を示す。
培養の何れの時間においても取り込まれた砒素は無機砒素のまま６０％以上の比率で存在し、メチル化された砒素の比率は４０％以下であった。
【００５９】
上記実施例１と比較例とを比較すると、ナノクロロプシスでは、取り込まれた無機砒素の残留がクロレラよりも非常に少なく、ナノクロロプシスが有する無機砒素のモノメチル化及びジメチル化能力がクロレラよりも高いことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、ナノクロロプシスの藻体内に取込まれた無機砒素、有機砒素濃度と藻体濃度の経時変化を示すグラフである。
【図２】図２は、ナノクロロプシスの藻体内に取り込まれた無機砒素、モノメチル化砒素化合物、ジメチル化砒素化合物の比率を示すグラフである。
【図３】図３は、各種アルセノシュガーの構造式を示す図である。
【図４】図４は、クロレラの藻体内に取込まれた無機砒素、有機砒素濃度と藻体濃度の経時変化を示すグラフである。
【図５】図５は、クロレラの藻体内に取り込まれた無機砒素、モノメチル化砒素化合物、ジメチル化砒素化合物の比率を示すグラフである。
【図３】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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