(57)【要約】【課題】本発明は、従来の方法の欠点を解消し得る、アミロイドβ認識能に優れた、より機能性の高いアミロイドイメージング用プローブを提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、式（Ｉ）：2007106755.tif 000033［式中、ｎは１又は２である整数であり；−ＣＨ＝ＣＨ−は、Ｅ体又はＺ体であり；Ｒ１は、置換基により置換されていてもよい単環式又は二環式の芳香族基であり；Ｒ２は、窒素原子がＮオキシド基により置換されていてもよい単環式又は二環式の含窒素芳香族基である］で表される化合物、並びに本化合物を含有するアミロイドイメージング用プローブに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2007106755.tif 000029
［式中、ｎは１又は２である整数であり、
−ＣＨ＝ＣＨ−は、Ｅ体であってもＺ体であってもよく、
Ｒ１は、置換基により置換されていてもよく、環原子として酸素、窒素及び硫黄からなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子を有していてもよい、単環式又は二環式の芳香族基であり、
Ｒ２は、窒素原子がＮオキシド基により置換されていてもよい単環式又は二環式の含窒素芳香族基であって、環原子として酸素、窒素及び硫黄からなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子を更に有していてもよく、更なる置換基により置換されていてもよい、前記含窒素芳香族基である］
で表される化合物、又は該化合物の薬学的に許容される塩、若しくは溶媒和物を含有するアミロイドイメージング用プローブ。
【請求項２】
前記Ｒ１が、電子供与基により置換された、環原子として酸素、窒素及び硫黄からなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子を有していてもよい、単環式又は二環式の芳香族基である請求項１記載のアミロイドイメージング用プローブ。
【請求項３】
前記Ｒ２が、窒素原子がＮオキシド基により置換されていてもよい３−又は４−ピリジル基である請求項１又は２記載のアミロイドイメージング用プローブ。
【請求項４】
式（Ｉ）で表される化合物、又は該化合物の薬学的に許容される塩、若しくは溶媒和物が標識されている、請求項１〜３のいずれか１項記載のアミロイドイメージング用プローブ。
【請求項５】
標識が放射性核種によるものである、請求項４記載のアミロイドイメージング用プローブ。
【請求項６】
放射性核種がγ線放出核種である、請求項５記載のアミロイドイメージング用プローブ。
【請求項７】
γ線放出核種が５１Ｃｒ、５９Ｆｅ、５７Ｃｏ、６７Ｇａ、７５Ｓｅ、８１ｍＫｒ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、及び２０１Ｔｌからなる群より選択されるものである、請求項６記載のアミロイドイメージング用プローブ。
【請求項８】
標識が陽電子放出核種によるものである、請求項４記載のアミロイドイメージング用プローブ。
【請求項９】
陽電子放出核種が１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、３５ｍＣｌ、７６Ｂｒ、４５Ｔｉ、４８Ｖ、６０Ｃｕ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６６Ｇａ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、及び１２４Ｉからなる群より選択されるものである、請求項８記載のアミロイドイメージング用プローブ。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項記載のアミロイドイメージング用プローブと、医薬上許容される担体とを含む、アミロイドイメージング用組成物。
【請求項１１】
式（Ｉ）：
【化２】
2007106755.tif 000030
［式中、ｎは１又は２である整数であり、
−ＣＨ＝ＣＨ−は、Ｅ体であってもＺ体であってもよく、
Ｒ１は、置換基により置換されていてもよく、環原子として酸素、窒素及び硫黄からなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子を有していてもよい、単環式又は二環式の芳香族基であり、
Ｒ２は、窒素原子がＮオキシド基により置換されていてもよい単環式又は二環式の含窒素芳香族基であって、環原子として酸素、窒素及び硫黄からなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子を更に有していてもよく、更なる置換基により置換されていてもよい、前記含窒素芳香族基である］
で表される化合物（ただし、以下の
【化３】
2007106755.tif 000031
からなる群から選択される化合物を除く）、又は該化合物の薬学的に許容される塩、若しくは溶媒和物。
【請求項１２】
式（ＩＩ）：
【化４】
2007106755.tif 000032
［式中、Ｒ３及びＲ４は、互いに独立に、水素、メチル又はエチルである（ただしＲ３とＲ４が同時に水素である場合は除く）］
で表される化合物、若しくは該化合物のピリジル基上の窒素原子がＮオキシド基により置換された化合物、又はこれらの化合物の薬学的に許容される塩、若しくは溶媒和物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロイドイメージング用プローブに関するものである。本発明は、さらに詳しくは、従来の方法では達成することのできない高い選択的アミロイドイメージングを可能にするプローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）は脳にアミロイドβ（Ａβ）タンパク質が凝集して蓄積した老人斑が観察されるのがその病理像の特徴である。従来より、アルツハイマー病の診断方法としては、１）認知機能評価、２）髄液中のタウタンパク質の上昇やＡβタンパク質の低下をＥＬＩＳＡなどを用いて証明する生化学的な診断法、３）ＭＲＩによる神経画像の形態評価、Ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＰＥＴ）、Ｓｉｎｇｌｅ  ｐｈｏｔｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＳＰＥＣＴ）を用いた機能的評価による画像診断法等が知られており、アルツハイマー病の診断は現在これらの技術を用いて行われている。
【０００３】
上記１）〜３）のような技術はいずれも脳病に関連する診断を著しく進歩させた。しかしながら、神経病理学的には軽度認知障害の段階から脳に多数の老人斑が出現するにもかかわらず、上記技術ではきわめて早期の段階での診断や、無症状の段階での孤発性アルツハイマー病の発症を予測することは困難であり、アルツハイマー病の治療薬が開発されたとしてもより効果的な治療は行えないのが現状である。このため、アルツハイマー病に関して高選択的なＡβ認識能を有するアミロイドイメージング用プローブが求められている。
【０００４】
非特許文献１にはアミロイドイメージング用プローブについて総説されている。既存のアミロイドイメージング用プローブは選択性という点で満足のできるものではない。
【０００５】
【非特許文献１】日本老年医学会雑誌，４１巻，２号，ｐ．１７５−１７８（２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされたものであって、従来の方法の欠点を解消し得る、アミロイドβ認識能に優れた、より機能性の高いアミロイドイメージング用プローブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の発明を包含する。
【０００８】
（１）式（Ｉ）：
【化１】
2007106755.tif 000002
［式中、ｎは１又は２である整数であり、
−ＣＨ＝ＣＨ−は、Ｅ体であってもＺ体であってもよく、
Ｒ１は、置換基により置換されていてもよく、環原子として酸素、窒素及び硫黄からなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子を有していてもよい、単環式又は二環式の芳香族基であり、
Ｒ２は、窒素原子がＮオキシド基により置換されていてもよい単環式又は二環式の含窒素芳香族基であって、環原子として酸素、窒素及び硫黄からなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子を更に有していてもよく、更なる置換基により置換されていてもよい、前記含窒素芳香族基である］
で表される化合物、又は該化合物の薬学的に許容される塩、若しくは溶媒和物を含有するアミロイドイメージング用プローブ。
【０００９】
（２）前記Ｒ１が、電子供与基により置換された、環原子として酸素、窒素及び硫黄からなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子を有していてもよい、単環式又は二環式の芳香族基である（１）記載のアミロイドイメージング用プローブ。
（３）前記Ｒ２が、窒素原子がＮオキシド基により置換されていてもよい３−又は４−ピリジル基である（１）又は（２）記載のアミロイドイメージング用プローブ。
（４）式（Ｉ）で表される化合物、又は該化合物の薬学的に許容される塩、若しくは溶媒和物が標識されている、（１）〜（３）のいずれかに記載のアミロイドイメージング用プローブ。
（５）標識が放射性核種によるものである、（４）記載のアミロイドイメージング用プローブ。
（６）放射性核種がγ線放出核種である、（５）記載のアミロイドイメージング用プローブ。
（７）γ線放出核種が５１Ｃｒ、５９Ｆｅ、５７Ｃｏ、６７Ｇａ、７５Ｓｅ、８１ｍＫｒ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、及び２０１Ｔｌからなる群より選択されるものである、（６）記載のアミロイドイメージング用プローブ。
（８）標識が陽電子放出核種によるものである、（４）記載のアミロイドイメージング用プローブ。
（９）陽電子放出核種が１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、３５ｍＣｌ、７６Ｂｒ、４５Ｔｉ、４８Ｖ、６０Ｃｕ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６６Ｇａ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、及び１２４Ｉからなる群より選択されるものである、（８）記載のアミロイドイメージング用プローブ。
（１０）（１）〜（９）のいずれかに記載のアミロイドイメージング用プローブと、医薬上許容される担体とを含む、アミロイドイメージング用組成物。
（１１）式（Ｉ）：
【００１０】
【化２】
2007106755.tif 000003
【００１１】
［式中、ｎは１又は２である整数であり、
−ＣＨ＝ＣＨ−は、Ｅ体であってもＺ体であってもよく、
Ｒ１は、置換基により置換されていてもよく、環原子として酸素、窒素及び硫黄からなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子を有していてもよい、単環式又は二環式の芳香族基であり、
Ｒ２は、窒素原子がＮオキシド基により置換されていてもよい単環式又は二環式の含窒素芳香族基であって、環原子として酸素、窒素及び硫黄からなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子を更に有していてもよく、更なる置換基により置換されていてもよい、前記含窒素芳香族基である］
で表される化合物（ただし、以下の
【化３】
2007106755.tif 000004
からなる群から選択される化合物を除く）、又は該化合物の薬学的に許容される塩、若しくは溶媒和物。
【００１２】
(12)式（ＩＩ）：
【化４】
2007106755.tif 000005
［式中、Ｒ３及びＲ４は、互いに独立に、水素、メチル又はエチルである（ただしＲ３とＲ４が同時に水素である場合は除く）］
で表される化合物、若しくは該化合物のピリジル基上の窒素原子がＮオキシド基により置換された化合物、又はこれらの化合物の薬学的に許容される塩、若しくは溶媒和物。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、高選択的なアミロイドβ認識能を有するアミロイドイメージング用プローブが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、式（Ｉ）：
【００１５】
【化５】
2007106755.tif 000006
で表される化合物のアミロイドイメージング用プローブとしての新規用途に関する。本発明はまた上記式（Ｉ）で表される化合物に包含される新規化合物に関する。
【００１６】
上記式（Ｉ）においてｎは１又は２、好ましくは２である整数である。ｎが２である場合、上記化合物はジエノン誘導体となり、α，β，γ，δ―不飽和共役系が形成され、この不飽和共役系が電子吸引基として機能することによりアミロイドβ特異性が更に高まる。
【００１７】
上記式（Ｉ）において−ＣＨ＝ＣＨ−は、ｎが２である場合は各−ＣＨ＝ＣＨ−について互いに独立に、Ｅ体であってもＺ体であってもよいが、好ましくはＥ体（ｎが２である場合はＥ，Ｅ体）である。
【００１８】
Ｒ１は、置換基により置換されていてもよく、環原子として酸素、窒素及び硫黄からなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子を有していてもよい、好ましくは５〜１０員である、単環式又は二環式の芳香族基である。Ｒ１は好ましくは、置換基により置換されていてもよい、フェニル基、１−又は２−ナフチニル基等の芳香族炭化水素基、２−又は３−フリル基、２−又は３−チエニル基、２−又は３−ピロリル基、１−、２−又は３−インドリル基、２−又は３−ベンゾフラニル基等のヘテロ芳香族基であり、より好ましくはフェニル基である。
【００１９】
Ｒ１上の置換基は電子供与基であることが好ましく、例えば、−ＮＲ３Ｒ４（式中、Ｒ３及びＲ４は、互いに独立に、水素、メチル又はエチルである（ただしＲ３とＲ４が同時に水素である場合は除く））、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル等のアルキル基、メトキシ等のアルコキシル基、フェニル、ベンジル等の芳香族基，フルオロエチル、p-フルオロベンジル等のハロゲンを含む基等が挙げられ、特に前記−ＮＲ３Ｒ４（とりわけＲ３及びＲ４がともにメチルであるもの）が好ましい。
【００２０】
上記式（Ｉ）においてＲ２は、窒素原子がＮオキシド基により置換されていてもよい、好ましくは５〜１０員である、単環式又は二環式の含窒素芳香族基である。該含窒素芳香族基は、環原子として酸素、窒素及び硫黄からなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子を更に有していてもよく、更なる置換基（例えばメチル、エチル等の低級アルキル基、フェニル、ベンジル等の芳香族基，フルオロエチル、p-フルオロベンジル等のハロゲンを含む基）により置換されていてもよい。Ｒ２としては２−、３−又は４−ピリジル基、２−、３−、４−、５−、６−、７−又は８−キノリル基が好ましく、３−又は４−ピリジル基がより好ましい。これらの基においては、窒素原子がＮオキシド基により置換されていてもよい。Ｒ２としては３−ピリジル基、又は窒素原子がＮオキシド基により置換された３−ピリジル基が最も好ましい。
【００２１】
式（Ｉ）で表される化合物のうち、アミロイドイメージング用プローブとして最も好ましい化合物は、式（ＩＩ）：
【化６】
2007106755.tif 000007
［式中、Ｒ３及びＲ４は、互いに独立に、水素、メチル又はエチルである（ただしＲ３とＲ４が同時に水素である場合は除く）］
で表される化合物又は該化合物のピリジル基上の窒素原子がＮオキシド基により置換された化合物である。とりわけ、Ｒ３とＲ４がともにメチルである場合が好ましい。
【００２２】
式（Ｉ）で表される化合物のうち、式（ＩＩ）で表される化合物以外にも種々の化合物がアミロイドイメージング用プローブとして好適に使用することができる。アミロイドイメージング用プローブとして好適に使用することができる化合物（式（ＩＩ）で表される化合物も含む）の一例を表１に示す。表１中の「化合物番号」は本発明者らが便宜上付した番号であり、本明細書ではこの化合物番号により化合物を特定する場合がある。
【００２３】
【表１】
2007106755.tif 000008
2007106755.tif 000009
2007106755.tif 000010
【００２４】
表１に示す化合物のなかでも、化合物番号２３９−５、２３９−６、２３９−１９、２３９−２５、２４０−７、２４０−１１、２４０−１３、２４０−２４及び２４０−２６の化合物はアミロイドとの親和性が特に高く、本発明に好適に使用することができる。
【００２５】
本発明に用いられる化合物は、薬学的に許容される塩、又は溶媒和物の形態で使用されてもよい。本発明に用いられる化合物が塩基性基を有する場合、薬学的に許容される塩としては有機酸又は無機酸との塩が挙げられ、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、シクロヘキシルスルファミン酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ナウタレンスルホン酸塩などが挙げられる。本発明に用いられる化合物が酸性基を有する場合、薬学的に許容される塩としては有機塩基又は無機塩基との塩が挙げられ、例えばナトリウム塩、カリウム塩のようなアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；トリエチルアミン塩、エタノールアミン塩、アミノ酸塩（リジン塩、アルギニン塩など）のような有機アミン塩などが挙げられる。薬学的に許容される溶媒和物としては水和物が挙げられる。
【００２６】
本発明に係るアミロイドイメージング用プローブは次の態様で使用することができる。本発明に係るアミロイドイメージング用プローブを標識物質により標識し、標識された前記プローブを生体に生体内投与（例えば静脈内投与）した後、ＰＥＴやＳＰＥＣＴなどの画像計測装置を用いて脳内の老人斑の蓄積量や分布を測定し、アルツハイマー病等のアミロイドが蓄積する疾患の早期診断または発症予測を行うことができる。標識物質としては放射性核種等が挙げられるがこれらには限定されない。放射性核種としては５１Ｃｒ、５９Ｆｅ、５７Ｃｏ、６７Ｇａ、７５Ｓｅ、８１ｍＫｒ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、２０１Ｔｌなどのγ線放出核種や、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、３５ｍＣｌ、７６Ｂｒ、４５Ｔｉ、４８Ｖ、６０Ｃｕ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６６Ｇａ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、１２４Ｉなどの陽電子放出核種などが挙げられるがこれらには限定されない。なお当業者には自明であるが“ｍ”とは核異性体を示す。
【００２７】
さらに、本発明の化合物は、老人斑に特異的に結合し、強い蛍光を発することから、アルツハイマー病患者の生検または死後における病理診断の染色剤としても有用である。本発明化合物による脳切片の染色は「候補化合物のスクリーニング」に示したような通常の方法で行える。その際の化合物の濃度は１μＭ、５分間のインキュベーションで十分である。（図４）
【００２８】
本発明に係るアミロイドイメージング用プローブは医薬上許容される担体と組み合わせされて、アルツハイマー病等のアミロイドが蓄積する疾患の画像診断に用いるための組成物（すなわち、アミロイドイメージング用組成物）として提供されてもよい。医薬上許容される担体としては可溶化剤、ｐＨ調整剤、安定剤が挙げられるがこれらには限定されない。具体的な担体の例としては、ポリソルベート８０、炭酸水素ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸が挙げられるがこれらには限定されない。
【００２９】
上記化合物の製造方法は特に限定されない。例えば本発明のジエノン化合物（Ｒ１ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２）は、α,β−不飽和アルデヒド（Ｒ１ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｏ）とアセチルピリジン、アセチルピリジンオキシド等のアセチル基を有する芳香族化合物（ＣＨ３Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２）とをメタノール中でアミン触媒存在下、加熱することにより６０〜９０％の単離収率で得られる。またアミン触媒は、その塩としての塩酸塩や酢酸塩でも同様な結果を与える。アミン触媒としては、ピロリジンまたはその塩酸塩が特に好ましい。より具体的な製造方法の例は実施例を参照されたい。
【００３０】
以下本発明を実施例により具体的に説明するが本発明は実施例により限定されない。
【実施例】
【００３１】
候補化合物のスクリーニング
SIGMA-ALDRICHのLibrary of Rare Chemicals の1100化合物について、アルツハイマー病（AD）脳切片を用いて老人斑に対する化合物の親和性についてのスクリーニングを行った。AD 脳をホルマリン固定し保存したものをphosphate-buffered saline (PBS) で洗浄、10, 20, 30% sucrose に浸漬しドライアイスーアセトン中でOCT Compound に凍結包埋しクリオスタットを用いて30mmに薄切しAD脳切片を作製した。
【００３２】
化合物を1, 10, 100μM の濃度に蒸留水で希釈した液中に、AD脳切片を浮遊させ１時間インキュベーションした。切片を蒸留水で3回洗浄し、スライドグラスにマウントした後、蛍光顕微鏡で検鏡した。蛍光顕微鏡像の一例を図１に示す。1100化合物のうち11化合物が老人斑に親和性があり、そのうち6化合物が、老人斑に親和性を有する化合物として従来知られていない構造を有するものであった。図1には、上記6化合物のうち、化合物番号239及び240の化合物の結合により可視化された老人斑（矢印）を示す。
【００３３】
化合物239、240は次の構造を有する。
【化７】
2007106755.tif 000011
【００３４】
【化８】
2007106755.tif 000012
【００３５】
上記2つの化合物239、240をリード化合物として、アミロイドβ(Aβ)タンパク質との結合親和性、特異性をさらに高めた種々の誘導体（表１に示す各化合物）を合成した。
【００３６】
化合物239-22及び240-24の合成例
化合物239-22（スキーム中の9）及び240-24（スキーム中の10）は以下のスキームにより合成することができる。
【００３７】
【化９】
2007106755.tif 000013
【００３８】
各工程について以下に説明する。
【００３９】
(2) の合成
【化１０】
2007106755.tif 000014
【００４０】
50 mLナス型フラスコに4-ヨード-フェニルアミン (1) 2.00 g (9.13 mmol)を入れ、窒素置換した。そこに、無水CH2Cl2 9 mL、無水DMF 6 mL、およびEt3N 2.4 mL (18.3 mmol)を加え、氷浴で0 ℃に冷却した。そこに、無水CH2Cl23mLに溶かしたジ-tert-ブチルジカルボネート 2.18 g (10.0 mmol)を滴下し、室温まで昇温した。室温のまま、13時間撹拌した。そのとき、白色固体(1,3-ビス-(4-ヨード-フェニル)-ウレア)が生じた。反応の終了をTLCで確認した後、白色固体(1,3-ビス-(4-ヨード-フェニル)-ウレア)を吸引濾過し、Et2Oで洗浄した。濾液に蒸留水15 mLを加え、水層を20 mL のEt2Oで3回抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル = 20:1)で精製し、得られた白色固体を10 mLのヘキサンで3回洗浄し、2を766.1 mg (収率26%)得た。TLC (ヘキサン:酢酸エチル= 5:1) 1: Rf = 0.19，2: Rf = 0.44，2: 1H-NMR(300 MHz, CDCl3) δ 7.58 (2H, d, J = 8.8 Hz), 7.15 (2H, d, J = 8.8 Hz), 6.43 (1H, br s), 1.51 (9H, s)。
【００４１】
(3) の合成
【化１１】
2007106755.tif 000015
【００４２】
50 mLナス型フラスコにNaH 105.6 mg (60％，2.64 mmol) を入れ、ヘキサンで洗浄し、窒素を吹き付けて乾燥した。そこに、無水THF 2.5 mL加え氷浴で0 ℃に冷却した。そこに、無水THF 2.5 mLに溶かした2 766.1 mg (2.40 mmol)をゆっくり滴下した。このとき激しく発泡した。その後、0 ℃で15分、室温で1時間撹拌し、crude NMRで2の消失を確認した。反応を氷浴で冷やし、飽和NH4Cl aq を滴下してクエンチし、蒸留水5 mL加え、水層を20 mL のEt2Oで3回抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥し、溶媒を減圧留去し、3 845.4 mg得た。TLC (ヘキサン : 酢酸エチル = 5:1) 2 : Rf = 0.44，3 : Rf = 0.44, 3 : 1H-NMR(300 MHz, CDCl3) δ 7.63 (2H, d, J = 8.8 Hz), 7.00 (2H, d, J = 8.8 Hz), 3.23 (3H, s), 1.45 (9H, s)。
【００４３】
(4) の合成
【化１２】
2007106755.tif 000016
【００４４】
50 mLナス型フラスコに未精製の3 1.54 g (4.62 mmol)、無水K2CO3 3.19 g (23.1 mmol)、および、Pd(PPh3)4133.5 mg (0.116 mmol)を入れ、アルゴン置換した。そこに、無水DMF 10 mL、アクリル酸エチル 1.0 mL (9.24 mmol)を加え、脱気とアルゴン置換を3回繰り返した。反応混合物を80 ℃で13時間撹拌した。このとき、系内が黒く変化した。反応の終了をTLCで確認した後、反応混合物を室温まで冷やした後、固体を減圧下でセライト濾過した。濾液に蒸留水20 mL加え、水層を20 mL のEt2Oで3回抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘキサン: Et2O = 5:1)で精製し、4 を1.26 g (収率 89%)得た。TLC (ヘキサン : 酢酸エチル = 5:1) 3 : Rf = 0.44，4 : Rf = 0.27, 4 : 1H-NMR(300 MHz, CDCl3) δ 7.65 (1H, d, J = 16 Hz), 7.48 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.27 (2H, d, J = 8.5 Hz), 6.38 (1H, d, J = 16 Hz), 4.26 (2H, q, J = 7.2 Hz), 3.28 (3H, s), 1.57 (9H, s), 1.34 (3H, q, J = 7.2 Hz)。
【００４５】
(5) の合成
【化１３】
2007106755.tif 000017
【００４６】
50 mLナス型二口フラスコに LiAlH4156.7 mg (4.13 mmol)入れ、窒素置換した。そこに、無水Et2O 10 mL加え、氷浴で0 ℃に冷却した。無水Et2O 4 mLに溶かした4 1.26 g (4.13 mmol)をゆっくり滴下し、氷浴のまま20分撹拌した。反応の終了をTLCで確認した後、蒸留水を滴下してクエンチした。そこに、Et2O 10 mL加え、上澄み液を集めることを3回繰り返した。水層は蒸留水30 mL加え、30 mL のEt2Oで3回抽出し、集めた上澄み液に加えた。有機層をNa2SO4で乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘキサン: Et2O = 1:1から1:2へ)で精製し、5 を874.3 mg (収率 80%)得た。TLC (ヘキサン : 酢酸エチル = 5:1) 4 : Rf = 0.27，5 : Rf = 0.01,  5 : 1H-NMR(300 MHz, CDCl3) δ 7.34 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.19 (2H, d, J = 8.2 Hz), 6.59 (1H, d, J = 15.7 Hz), 6.33 (1H, dd, J = 5.5, 16 Hz), 4.32 (2H, br d, J = 5.5 Hz), 3.25 (3H, s), 1.45 (9H, s)。
【００４７】
(6) の合成
【化１４】
2007106755.tif 000018
【００４８】
20 mLナス型フラスコにMS4Aを765mg入れ、真空下で加熱しながらMS4Aを15分間活性化させた。その後、アルゴン置換し、5 874.3 mg (3.32 mmol)、N-メチルモルホリン (NMO) 583.4 mg (4.98 mmol)、無水CH2Cl2 7 mLを加え、氷浴で0 ℃に冷却した。その後、テトラ-n-プロピルアンモニウムペルルテナート (TPAP) 63.3 mg (0.166 mmol)を一度に加えた。その後、室温に昇温し、1時間撹拌した。反応の終了をTLCで確認した後、反応混合物を直接フラッシュカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2のみ、からCH2Cl2:MeOH = 100:1へ)で精製し、6 を694.0 mg (収率 80％)得た。TLC (ヘキサン : 酢酸エチル = 5:1) 5 : Rf = 0.01，6 : Rf = 0.14,  6 : 1H-NMR(300 MHz, CDCl3) δ 9.69 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.53 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.44 (1H, d, J = 16 Hz), 7.34 (1H, d, J = 8.5 Hz), 6.68 (2H, dd, J = 16, 7.7Hz), 3.30 (3H, s), 1.48 (9H, s)。
【００４９】
(7) の合成
【化１５】
2007106755.tif 000019
【００５０】
10mLナス型フラスコに3-アセチルピリジン 80.5 mg (0.664 mmol)、6 347.0 mg (1.33 mmol)、MeOH 2 mLを入れ、窒素置換した。そこに、ピロリジン17 μL(0.199 mmol)を加え、60 ℃で5時間撹拌した。反応の終了をcrude NMRで確認した後、MeOHを減圧留去した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘキサン: 酢酸エチル = 2.5:1から1.5:1へ)で精製し、7 を182.6 mg (収率 75%)得た。TLC (ヘキサン : 酢酸エチル = 1:1), 7: 1H-NMR(300 MHz, CDCl3) δ 9.18 (1H, dd, J = 2.2, 0.8Hz), 8.79 (1H, dd, J = 4.9, 0.9 Hz), 8.28 (1H, dt, J = 8.0, 2.2Hz), 7.64 (1H, ddd, J = 15, 8.8, 1.3 Hz), 7.44-7.45 (3H, m), 7.22-7.30 (2H, m), 6.99-7.06 (3H, m), 3.28 (3H, s), 1.47 (9H, s)。
【００５１】
(8) の合成
【化１６】
2007106755.tif 000020
【００５２】
10mLナス型フラスコに3-アセチルピリジンN-オキシド80.5 mg (0.664 mmol)、6 347.0 mg (1.33 mmol)、MeOH 2 mLを入れ、窒素置換した。そこに、ピロリジン17 μL(0.199 mmol)を加え、60 ℃で5時間撹拌した。反応の終了をcrude NMRで確認した後、MeOHを減圧留去した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2:MeOH = 60:1から45:1へ)で精製し、8 を165.3 mg (収率 65%)得た。TLC (CH2Cl2:MeOH = 10:1) 3-アセチルピリジンN-オキシド:Rf = 0.29，6 : Rf = 0.84，8: Rf = 0.29, 8 : 1H-NMR(300 MHz, CDCl3) δ 8.75 (1H, s), 8.37 (1H, d, J = 6.1 Hz), 7.81 (1H, d, J = 7.4 Hz), 7.67 (1H, dd, J = 15, 11 Hz), 7.48 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.43 (1H, dd, J = 7.4, 6.1Hz), 7.28 (2H, d, J = 8.5 Hz), 6.99 (1H, d, J = 15 Hz), 6.96 (1H, d, J = 15, 11 Hz), 6.89 (1H, dd, J = 15, 15 Hz), 3.29 (3H, s), 1.48 (9H, s)。
【００５３】
(9) の合成
【化１７】
2007106755.tif 000021
【００５４】
10mLナス型フラスコに7 165.3 mg (0.434 mmol)を入れ、窒素置換した。そこに、無水CH2Cl2 1 mLを加え、氷浴で0 ℃に冷却した後、トリフルオロ酢酸 1 mLを滴下した。その後、室温に昇温して、30分撹拌した。反応の終了をTLCで確認した後、反応混合物を飽和K2CO3aqを氷浴下で滴下してクエンチした。反応混合物をCH2Cl2でCH2Cl2に色がつかなくなるまで抽出し、Na2SO4で乾燥した。その後、溶媒を減圧留去して、9を129.4 mg (収率 98％)得た。TLC (ヘキサン : 酢酸エチル = 1:1) 7: Rf = 0.33，9: Rf = 0.30, 9: 1H-NMR(300 MHz, CDCl3) δ 9.16 (1H, d, J = 5.1 Hz), 8.76 (1H, dt, J = 5.1, 1.7Hz), 8.25 (1H, dt, J = 7.9,  1.7Hz), 7.66 (1H, dd, J = 15, 11 Hz), 7.43 (1H, ddd, J = 7.9, 5.1, 0.8 Hz),  7.38 (2H, d, J = 9.2 Hz), 6.99 (1H, d, J = 15 Hz), 6.95 (1H, d, J = 15 Hz), 6.85 (1H, dd, J = 15 ,11 Hz), 6.58 (2H, d, J = 8.8 Hz), 2.89 (3H, s)。
【００５５】
(10) の合成
【化１８】
2007106755.tif 000022
【００５６】
10mLナス型フラスコに8 165.3 mg (0.434 mmol)を入れ、窒素置換した。そこに、無水CH2Cl2 1 mLを加え、氷浴で0 ℃に冷却した後、トリフルオロ酢酸 1 mLを滴下した。その後、室温に昇温して、30分撹拌した。反応の終了をTLCで確認した後、反応混合物を飽和K2CO3aqを氷浴下で滴下してクエンチした。反応混合物をCH2Cl2でCH2Cl2に色がつかなくなるまで抽出し、Na2SO4で乾燥した。その後、溶媒を減圧留去して、10を122.6 mg (収率 >99％)得た。TLC (CH2Cl2:MeOH = 10:1 ２重展開) 8: Rf = 0.41，10: Rf = 0.38, 10: 1H-NMR(300 MHz, CDCl3) δ 8.72 (1H, t, J = 1.4 Hz), 8.32 (1H, dt, J =6.3, 0.9Hz), 7.78 (1H, dt, J = 11, 6.3 Hz), 7.68 (1H, dd, J = 14.5, 11 Hz), 7.23-7.42 (3H, m), 7.03 (1H, d, J = 15 Hz), 6.82 (1H, dd, J = 15, 1.1 Hz), 6.77 (1H, d, J = 15 Hz), 6.58 (2H, d, J = 8.8 Hz), 2.90 (3H, s)。
【００５７】
化合物239-6及び240-13の合成
化合物239-6及び240-13はそれぞれ、上記合成例の最終化合物である9（化合物239-22）及び10（化合物240-24）のメチル化反応（ヨウ化メチル、K2CO3, DMF溶媒中）によって８０％〜９０％の収率で得ることができた。
【００５８】
また、市販の(CH3)2NC6H4-CH=CH-CH=Oと、3-アセチルピリジンとを、メタノール中でピロリジン触媒存在下にて４０℃で加熱することにより化合物239-6を99％の収率で得ることができた。また、3-アセチルピリジンに代えて3-アセチルピリジンオキシドを用いる以外は同一の方法により化合物240-13を90％の収率で得ることができた。
化合物239-6:  1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ9.16 (1H, br.s), 8.77 (1H, t, J = 5.0 Hz), 8.24 (1H, dt, J = 1.9, 8.0 Hz), 7.66 (1H, dd, J = 11, 15 Hz), 7.45 (1H, dd, J = 5.0, 8.0 Hz), 7.42 (2H, d, J = 9.0 Hz), 7.01 (1H, d, J = 15 Hz), 6.93 (1H, d, J = 15 Hz), 6.86 (1H, dd, J = 11, 15 Hz), 6.71 (2H, d, J = 9.0 Hz), 3.03 (6H, s)。
化合物240-13:  1H-NMR(300 MHz, CDCl3) δ8.71-8.78 (1H, m), 8.31-8.35 (1H, m), 7.85 (1H, d, J = 15 Hz), 7.76-7.85 (1H, m), 7.69 (1H, dd, J = 11, 15 Hz), 7.54 (2H, d, J = 8.8 z), 7.36-7.44 (1H, m), 7.12 (1H, d, J = 15 Hz), 7.04 (1H, d, J = 15 Hz), 6.84 (1H, dd, J = 11, 15 Hz), 6.68-6.80 (2H, m), 3.04 (6H, s)。
【００５９】
表１に示す他のジエノン化合物（239-19、239-25、240-7、240-13、240-24、240-26）も上記と同様のスキームにより合成することができた。
【００６０】
化合物239-19の合成
10 mLナス型フラスコに3-アセチルピリジン（43.4 mg ，0.358 mmol）、(E)-3-(4-(ジエチルアミノ)フェニル)アクリルアルデヒド（80.0 mg ，0.394 mmol）およびMeOH （1 mL）を入れ、窒素置換した。さらに、ピロリジン（9 μL，0.107 mmol）を加え、60℃で2.5時間撹拌した。反応の終了をNMRで確認した後、MeOHを減圧留去した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:EtOAc=3:1から2:1へ)で精製し、239-19（96.6 mg ，収率 88%）を得た。1H-NMR(300 MHz, d6-アセトン): δ9.16 (1H, dd, J = 0.8, 2.2 Hz), 8.75 (1H, dd, J = 1.7, 5.0  Hz), 8.30 (1H, ddd, J = 1.6, 2.2, 8.0 Hz), 7.61 (1H, dd, J = 11, 15 Hz), 7.53 (1H, ddd, J = 0.8, 4.7, 7.7 Hz), 7.45 (2H, d, J = 8.8 Hz), 7.15 (1H, d, J = 15 Hz), 7.10 (1H, d, J = 15 Hz), 6.98 (1H, ddd, J = 0.8, 11, 15 Hz), 6.73 (2H, d, J = 8.8 Hz), 3.45 (4H, q, J = 7.1 Hz), 1.16 (6H, t, J = 7.1 Hz)。
【００６１】
化合物239-25の合成
【化１９】
2007106755.tif 000023
【００６２】
50 ml 2口ナス型フラスコにNaH（1.45 g ，36.3 mmol）を入れ、ヘキサン(10 mL)で3回洗浄した後、窒素を吹き付けて乾燥させた。無水THF(15 mL)加え氷浴で0 ℃に冷却し、無水THF（5 mL）に溶解したメチルジエチルホスホノアセテート（7.28 g ，34.7 mmol）の溶液をゆっくり滴下した。その後、0 ℃のまま1時間撹拌した。このとき、激しく発泡すると同時に，反応混合物が無色透明になった。さらに、無水THF（5 mL）に溶解したインドール-3-カルバルデヒド（2.00 g ，16.5 mmol）を0 ℃でゆっくり滴下し、室温で21時間撹拌した。その後、half. sat. NH4Cl （4 mL）を0 ℃で加えた。さらに蒸留水（20 mL）を加えて、Et2O（25 mL）で3回抽出した。有機層を分離してNa2SO4で乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:Et2O=1:1)で精製し、239-25a（1.17 g，収率 80％）を得た。239-25a :1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ8.44 (1H, br.s), 7.93 (1H, d, J = 16 Hz), 7.89-7.95 (1H, m), 7.51 (1H, d, J = 2.7 Hz), 7.39-7.45 (1H, m), 7.26-7.33 (1H, m), 6.48 (1H, d, J = 16 Hz), 3.82 (3H, s)。
【００６３】
50 mLナス型フラスコに239-25a（2.64 g ，13.1 mmol）、無水CH2Cl2（15 mL）、無水DMF（10 mL）およびEt3N（3.7 mL ，26.2 mmol）を加え、窒素置換した後、氷浴で0 ℃に冷却した。そこに、無水CH2Cl2（5 mL）に溶解したジ-tert-ブチルジカルボネート（3.67 g ，19.7 mmol）を滴下し、室温で、19時間撹拌した。反応の終了をTLCで確認した後、蒸留水（15 mL）を加え、水層をEt2O（20 mL ）で3回抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:Et2O= 10:1)で精製し、239-25b（3.84 g ，収率97%）を得た。239-25b: 1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ8.19 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.86 (1H, s), 7.80-7.86 (2H, m), 7.39 (1H, td, J = 1.4, 7.6 Hz), 7.33 (1H, td, J = 1.4, 7.6 Hz), 6.54 (1H, d, J = 16 Hz), 3.82 (3H, s), 1.68 (9H, s)。
【００６４】
50 mLナス型2口フラスコに LiAlH4（50.5 mg ，1.33 mmol）入れ、窒素置換し、無水Et2O（4 mL）加え、氷浴で0 ℃に冷却した。無水Et2O（3 mL）に溶解した239-25b（400.0 mg ，1.33 mmol）をゆっくり滴下し、氷浴のまま20分撹拌した。反応の終了をTLCで確認した後、蒸留水を滴下してクエンチした。さらに、Et2O（3 mL）加え、上澄み液を集めることを3回繰り返した。水層は蒸留水10 mL加え，20 mL のEt2Oで3回抽出し、集めた上澄み液に加えた。有機層をNa2SO4で乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘキサン: EtOAc = 4:1から2：1へ)で精製し、239-25cを220.4 mg (収率 61％)得た。239-25c: 1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ8.16 (1H, d, J = 8.2 Hz), 7.78 (1H, d, J = 8.2 Hz), 7.63 (1H, s), 7.27-7.37 (2H, m), 6.73 (1H, d, J = 16 Hz), 6.46 (1H, dt, J = 5.8, 16 Hz), 4.36 (3H, dd, J = 1.4, 5.8 Hz), 1.67 (9H, s)。
【００６５】
【化２０】
2007106755.tif 000024
【００６６】
10 mLナス型フラスコにMS4A（420 mg）を入れ、減圧下で加熱しながら活性化させた。その後、アルゴン置換し、239-25c （227.1 mg ，0.831 mmol）、N-メチルモルホリンオキシド（146.0 mg ，1.25 mmol）および無水CH2Cl2（ 2 mL）を加え、氷浴で0 ℃に冷却し、テトラ-n-プロピルアンモニウムペルルテナート（TPAP）（14.6 mg，0.0416 mmol）を一度に加えた。その後、室温で3時間撹拌した。反応の終了をTLCで確認した後、反応混合物を直接フラッシュカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2)で精製し、239-25d(177.3 mg ,収率 79%)を得た。239-25d： 1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ9.68 (1H, d, J = 7.7 Hz), 8.21 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.96 (1H, s), 7.82-7.86 (1H, m), 7.63 (1H, d, J = 16 Hz), 7.42 (1H, td, J = 1.1, 7.1 Hz), 7.36 (1H, td, J = 1.1, 7.1 Hz), 6.85 (1H, dd, J = 7.7, 16 Hz), 1.70 (9H, s)。
【００６７】
【化２１】
2007106755.tif 000025
【００６８】
10mLナス型フラスコに3-アセチルピリジン 51.9 mg (0.428 mmol)、239-25d, 174.2 mg  (0.642 mmol)およびMeOH 1 mLを入れ、窒素置換した。そこに、ピロリジン10μL (0.199 mmol)を加え、60 ℃で5時間撹拌した。反応の終了をcrude NMRで確認した後、MeOHを減圧留去した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘキサン: 酢酸エチル= 2:1から1:1.5へ)で精製し、239-25eを60.8 mg (収率 38%)得た。また、239-25eのBoc基が脱保護された239-25, 25.3 mg (収率 22%)得られた。また Boc基の脱保護はTFAで処理することで45%で239-25が得られた。239-25e: 1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ9.26 (1H, d, J = 1.9 Hz), 8.84 (1H, dd, J = 1.7, 5.2 Hz), 8.80 (1H, d, J = 8.2 Hz), 8.20 (1H, d, J = 7.4 Hz), 8.14 (1H, s), 7.86-7.89 (2H, m), 7.70-7.79 (2H, m), 7.34-7.43 (3H, m), 7.17-7.29 (2H, m), 7.60 (1H, d, J = 15 Hz), 1.70 (9H, s)。
239-25: 1H-NMR(300 MHz, d6-アセトン)δ10.8 (1H, br.s), 9.20-9.21 (1H, m), 8.35 (1H, dt, J = 1.9, 8.0 Hz), 8.20-8.07 (1H, m), 7.65-7.79 (2H, m), 7.45-7.59 (3H, m), 7.23-7.32 (4H, m)。
【００６９】
化合物240-26の合成
【化２２】
2007106755.tif 000026
【００７０】
10mLナス型フラスコに3-アセチルピリジン（51.9 mg ，0.428 mmol）、239-25d（174.2 mg， 0.642 mmol）およびMeOH（ 1 mL）を入れ、窒素置換した。さらにピロリジン（10μL，0.199 mmol）を加え、60 ℃で5時間撹拌した。反応の終了をNMRで確認した後、MeOHを減圧留去した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2:MeOH=60:1から20:1へ)で精製し、240-26a（60.8 mg，収率 38%）を得た。同時に、Boc基が脱保護された240-26（25.3 mg，収率 22％）を得た。またBoc基の脱保護はTFAで処理することで43％で239-25が得られた。240-26a：1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ8.75-8.79 (1H, m), 8.36-8.41 (1H, m), 8.04-8.22 (2H, m), 7.57-7.89 (3H, m), 7.06-7.59 (5H, m), 6.87-6.99 (1H, m), 1.70 (9H, s)。240-26：1H-NMR(300 MHz, d6-アセトン)δ10.9 (1H, br.s), 8.92 (1H, s), 8.60-8.63 (1H, m), 8.20-8.17 (1H, m), 8.01-8.04 (1H, m), 7.72-7.83 (3H, m), 7.31-7.58 (2H, m), 7.19-7.31 (4H, m)。
【００７１】
エノン化合物の合成
以下にエノンの合成法の代表的な例を示す。表１に示す他のエノン化合物も同様の方法で合成することができる。
【００７２】
化合物239-5の合成
【化２３】
2007106755.tif 000027
【００７３】
10 mLナス型フラスコに3-アセチルピロリジン（60.6 mg, 0.500 mmol）、4-(ジメチルアミノ)-ベンズアルデヒド（74.6 mg, 0.500 mmol）およびMeOH（0.7 mL）を入れ、窒素置換した。さらに、ピロリジン（5μL (0.101 mmol)を加え、60 ℃で4時間撹拌した。反応の終了をNMRで確認した後、MeOHを減圧留去後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:EtOAc=3:1から1:1へ)で精製し、239-5（102.6 mg ，収率 81%）を得た。239-5: 1H-NMR(300 MHz, CDCl3)δ9.23 (1H, d, J = 1.4 Hz), 8.79 (1H, dd, J = 1.4, 5.0 Hz), 8.45  (1H, dt, J = 1.7, 7.9 Hz), 7.86 (1H, d, J = 15 Hz), 7.59 (1H, t, J = 7.2 Hz), 7.56 (2H, d, J = 9.2 Hz), 7.27 (1H, d, J = 15 Hz), 6.72 (2H, d, J = 9.1 Hz), 3.08 (6H, s)。
【００７４】
化合物240-7の合成
【化２４】
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【００７５】
10 mLナス型フラスコに3-アセチルピリジン N-オキシド 137.1 mg (1.00 mmol)、インドール-3-カルバルデヒド 290.3 mg (2.00 mmol)およびi-PrOH 2 mLを入れ、窒素置換した。そこに、ピロリジン 25μL (0.300 mmol)と酢酸 17μL (0.300 mmol)を加え、85℃で21時間撹拌した。反応の終了をcrude NMRで確認した後、NaHCO3 aqで反応をクエンチし、30 mlのCH2Cl2で3回抽出した。その後、有機層をNa2SO4で乾燥し、溶媒を減圧留去した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2:MeOH = 80:1から25:1へ)で精製し、240-7を250.9 mg(収率 95％)得た。240-7: 1H-NMR(300 MHz, d6-DMSO)δ12.0 (1H, br.s), 8.81 (1H, t, J = 1.6 Hz), 8.20 (1H, s), 8.12-8.17(1H, m), 8.12 (1H, d, J = 15 Hz), 7.99 (1H, ddd, J = 1.1, 1.6, 7.7 Hz), 7.58 (1H, ddd, J = 0.6, 6.3, 8.0 Hz), 7.53 (1H, d, J = 15 Hz), 7.46-7.51 (1H, m), 7.19-7.28 (2H, m)。
【００７６】
アミロイドフィブリルと候補化合物との結合
アミロイドβタンパク質から調製されたアミロイドフィブリルに対する各候補化合物の結合能を確認した。
アミロイドβ40 (Aβ40) 及びアミロイドβ42 (Aβ42) (いずれも株式会社ペプチド研究所) をそれぞれ10mMになるようにDMSOに溶解し、Aβ40 又はAβ42のストック溶液とし、-80℃に保存した。Aβ40 又はAβ42のストック溶液をPBSで200μM に希釈し、37℃ で24 時間インキュベーションすることにより、アミロイドフィブリルを調製した。
【００７７】
24 穴プレートに入った2μM のAβ40 又はAβ42のフィブリル溶液に1μM の化合物239-6及び240-13を添加し、蛍光顕微鏡で検鏡した。蛍光顕微鏡像を図２に示す。化合物239-6及び240-13はともにアミロイドフィブリルと結合する能力を有することが示された。239-19、239-25、240-24、240-26についても同様の実験を行い、アミロイドフィブリルと結合することが確認された。
【００７８】
化合物のアミロイドフィブリルとチオフラビンTとの結合阻害実験
チオフラビンTは老人斑を構成するアミロイドβタンパク質に結合することが知られている。アミロイドβタンパク質から調製されたアミロイドフィブリルとチオフラビンTとの結合を競合的に阻害する化合物が、アミロイドイメージング用化合物として有用であると言える。そこで、各候補化合物のアミロイドフィブリルとチオフラビンTとの結合阻害実験を行なった。
【００７９】
Aβ40のフィブリル溶液を上記と同様の方法で調製した。6μMのチオフラビンT を含む4μM のAβ40フィブリル溶液に、候補化合物を1-20μMの各濃度で添加し、30分間インキュベートし、蛍光光度計を用いて（励起波長：440nm、蛍光波長：480mm）蛍光強度を測定した。
【００８０】
ポジティブコントロール試料として、アミロイドβタンパク質に結合する化合物として周知のCongo Redを用いた。
【００８１】
結果を図3に示す。化合物239-5、239-6、240-7、240-11、240-13はいずれも、Congo Redと同等またはそれ以上強力に、アミロイドフィブリルとチオフラビンTとの結合を阻害し得ることが明らかとなった。化合物239-6及び240-13は特に強力にアミロイドフィブリルとチオフラビンTとの結合を阻害した。
【００８２】
化合物239-6及び240-13のAD脳組織の老人斑への結合
スクリーニングと同様の方法（化合物濃度は1μM, インキュベーション時間は１分）を用いて、化合物239-6及び240-13のAD脳組織の老人斑への結合を確認した。
比較のためにAD脳組織の老人斑の免疫染色を行った。上記の手順で化合物239-6及び240-13のAD脳組織の老人斑への結合を確認した後、同一のAD脳切片をPBS で洗浄し、70% ギ酸で15 分処理し、0.3% H2O2 を含むメタノールで 30 分インキュベーションして内在性のペルオキシダーゼをブロックした後、5% ウマ正常血清（VECTOR）、0.4% TritonX-100を含むPBS 中で１時間ブロッキングし、1000 倍希釈した抗Aβモノクローナル抗体（4G8、SIGNET）でインキュベーションした（4℃、一晩）。PBSで洗浄後、ビオチン化抗マウスIgG抗体（1:500）(VECTOR)で1時間インキュベーションし、VECTASTAIN ABCキット(VECTOR)とDAB基質キット(VECTOR)を用いて発色を行った。結果を図4の下段に示す。
【００８３】
図4の写真から、化合物239-6及び240-13は免疫染色と同程度の鮮明さでAD脳組織の老人斑を可視化することができることがわかる。
【００８４】
トランスジェニックマウスへの化合物239-6の投与
化合物239-6をDNAトランスフェクション用カチオニックリポソーム溶液（Lipofectamine2000, Invitrogen）に飽和させた。
12月齢トランスジェニックマウス(APP swTg2576) に上記飽和液を、尾静脈から500μl 投与し、4時間後に脳を摘出しOCT Compound （Tissue-Tek）に凍結包埋し10μmの切片を作製し、蛍光顕微鏡で検鏡した。
【００８５】
また対照実験として、同様のトランスジェニックマウスを用い未投与のものも同様の処理を行った。
【００８６】
結果を図5に示す。各処理区についての上段と下段の写真は同一の試料についての倍率の異なる顕微鏡像である。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】アルツハイマー病（AD）脳切片を用いた老人斑に対するライブラリー化合物の親和性についてのスクリーニングにおける蛍光顕微鏡像の一例を示す写真である。
【図２】アミロイドフィブリルに対する本発明の化合物239-6及び240-13の結合能を示す蛍光顕微鏡像を示す写真である。
【図３】本発明の化合物によるアミロイドβフィブリルとチオフラビンTとの結合の阻害能を示す図である。
【図４】本発明の化合物の使用又は免疫染色により可視化されたAD脳の老人斑を示す写真である。
【図５】12月齢トランスジェニックマウスに尾静脈から化合物239-6を投与し4時間後に摘出した脳の蛍光顕微鏡像を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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