(57)【要約】【課題】癌細胞内でサイクリンＧ１タンパク質の機能に介入あるいはそれを阻害することによる癌の治療を提供すること。【解決手段】宿主にある一の腫瘍を処置するための薬学的組成物であって、サイクリンＧ１タンパク質を阻害する一つの作用薬を含み、前記作用薬は、サイクリンＧ１タンパク質のすべてを認識する抗体、またはその断片もしくは誘導体であり、該抗体の該断片もしくは誘導体は、改変されていない抗体に対してアミノ酸残基の欠失および／または置換を有する、組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主にある一の腫瘍を処置するための薬学的組成物であって、サイクリンＧ１タンパク質を阻害する一つの作用薬を含み、前記作用薬は、サイクリンＧ１タンパク質のすべてを認識する抗体、またはその断片もしくは誘導体であり、該抗体の該断片もしくは誘導体は、改変されていない抗体に対してアミノ酸残基の欠失および／または置換を有する、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の薬学的組成物であって、前記宿主の腫瘍細胞を形質導入するに適切な形態で、前記抗体またはその断片もしくは誘導体を含む、薬学的組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の薬学的組成物であって、ここで前記抗体またはその断片もしくは誘導体が、腫瘍細胞を形質導入するために適切な発現ビヒクルとしてレトロウイルスベクター内に含まれるポリヌクレオチドによってコードされる、薬学的組成物。
【請求項４】
非腫瘍細胞を不死化する方法であって、該方法は：
サイクリンＧ１タンパク質またはその誘導体をコードするポリヌクレオチドで該非腫瘍細胞を形質導入する工程を包含し、ここで、該誘導体は、ネイティブサイクリンＧ１タンパク質配列に関して、アミノ残基の酸欠失及び／または置換を含むがネイティブまたは改変されていないサイクリンＧ１タンパク質のものと同じ生物学的活性を保持し、そして、ネイティブまたは改変されていないサイクリンＧ１タンパク質を認識する抗体によって認識される、
方法。
【請求項５】
前記サイクリンＧまたはその誘導体をコードするポリヌクレオチドが、レトロウイルスベクター内に含まれる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
サイクリンＧ１タンパク質を阻害する作用薬をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターであって、ここで前記作用薬は、サイクリンＧ１タンパク質を阻害する一つの作用薬を含み、前記作用薬は、サイクリンＧ１タンパク質のすべてを認識する抗体、またはその断片もしくは誘導体であり、該抗体の該断片もしくは誘導体は、改変されていない抗体に対してアミノ酸残基の欠失および／または置換を有する、発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターであって、ここで前記発現ベクターがウイルスベクターであるベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターであって、ここで前記ベクターがレトロウイルスベクターである、ベクター。
【請求項９】
前記ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
宿主の再狭窄を予防または処置するための薬学的組成物であって、サイクリンＧ１タンパク質を阻害する作用薬を含み、ここで前記作用薬は、サイクリンＧ１タンパク質を阻害する一つの作用薬を含み、前記作用薬は、サイクリンＧ１タンパク質のすべてを認識する抗体、またはその断片もしくは誘導体であり、該抗体の該断片もしくは誘導体は、改変されていない抗体に対してアミノ酸残基の欠失および／または置換を有する、薬学的組成物。
【請求項１１】
前記サイクリンＧ１を阻害する作用薬は、侵襲性血管処置の部位において活性である、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記侵襲性血管処置は血管形成である、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記侵襲性血管処置は血管移植である、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記サイクリンＧ１を阻害する作用薬は、血管損傷部位で活性である、請求項に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
【数１−１】
2007209344.tif 000002
【０００２】
【数２−１】
2007209344.tif 000003
。
【背景技術】
【０００３】
【数２−２】
2007209344.tif 000004
【０００４】
【数３−１】
2007209344.tif 000005
【０００５】
【数４−１】
2007209344.tif 000006
【０００６】
【数５−１】
2007209344.tif 000007
。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
【数５−２】
2007209344.tif 000008
【０００８】
【数６−１】
2007209344.tif 000009
。
【０００９】
本発明はさらに、以下を提供する。
【００１０】
【数８９−１】
2007209344.tif 000010
【００１１】
【数９０−１】
2007209344.tif 000011
【００１２】
【数９１−１】
2007209344.tif 000012
【００１３】
【数９２−１】
2007209344.tif 000013
【００１４】
【数９３−１】
2007209344.tif 000014
【００１５】
【数９４−１】
2007209344.tif 000015
。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
この発明はこれから図面と関連して説明される。
【００１７】
【数１１−１】
2007209344.tif 000016
【００１８】
【数１２−１】
2007209344.tif 000017
【００１９】
【数１３−１】
2007209344.tif 000018
【００２０】
【数１４−１】
2007209344.tif 000019
【００２１】
【数１５−１】
2007209344.tif 000020
【００２２】
【数１６−１】
2007209344.tif 000021
【００２３】
【数１７−１】
2007209344.tif 000022
【００２４】
【数１８−１】
2007209344.tif 000023
【００２５】
【数１９−１】
2007209344.tif 000024
【００２６】
【数２０−１】
2007209344.tif 000025
【００２７】
【数２１−１】
2007209344.tif 000026
【００２８】
【数２２−１】
2007209344.tif 000027
【００２９】
【数２３−１】
2007209344.tif 000028
【００３０】
【数２４−１】
2007209344.tif 000029
【００３１】
【数２５−１】
2007209344.tif 000030
【００３２】
【数２６−１】
2007209344.tif 000031
【００３３】
【数２７−１】
2007209344.tif 000032
【００３４】
【数２８−１】
2007209344.tif 000033
【００３５】
【数２９−１】
2007209344.tif 000034
【００３６】
【数３０−１】
2007209344.tif 000035
【００３７】
【数３１−１】
2007209344.tif 000036
【００３８】
【数３２−１】
2007209344.tif 000037
【００３９】
【数３３−１】
2007209344.tif 000038
【００４０】
【数３４−１】
2007209344.tif 000039
【００４１】
【数３５−１】
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【００４２】
【数３６−１】
2007209344.tif 000041
【００４３】
【数３７−１】
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【００４４】
【数３８−１】
2007209344.tif 000043
【００４５】
【数３９−１】
2007209344.tif 000044
【００４６】
【数４０−１】
2007209344.tif 000045
【００４７】
【数４１−１】
2007209344.tif 000046
【００４８】
【数４２−１】
2007209344.tif 000047
【００４９】
【数４３−１】
2007209344.tif 000048
【００５０】
【数４４−１】
2007209344.tif 000049
【００５１】
【数４５−１】
2007209344.tif 000050
【００５２】
【数４６−１】
2007209344.tif 000051
【００５３】
【数４７−１】
2007209344.tif 000052
。
【実施例】
【００５４】
【数４７−２】
2007209344.tif 000053
【００５５】
【数４８−１】
2007209344.tif 000054
【００５６】
【数４９−１】
2007209344.tif 000055
【００５７】
【数５０−１】
2007209344.tif 000056
【００５８】
【数５１−１】
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【００５９】
【数５２−１】
2007209344.tif 000058
【００６０】
【数５３−１】
2007209344.tif 000059
【００６１】
【数５４−１】
2007209344.tif 000060
【００６２】
【数５５−１】
2007209344.tif 000061
【００６３】
【数５６−１】
2007209344.tif 000062
【００６４】
【数５７−１】
2007209344.tif 000063
【００６５】
【数５８−１】
2007209344.tif 000064
【００６６】
【数５９−１】
2007209344.tif 000065
【００６７】
【数６０−１】
2007209344.tif 000066
【００６８】
【数６１−１】
2007209344.tif 000067
【００６９】
【数６２−１】
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【００７０】
【数６３−１】
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【００７１】
【数６４−１】
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【００７２】
【数６５−１】
2007209344.tif 000071
【００７３】
【数６６−１】
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【００７４】
【数６７−１】
2007209344.tif 000073
【００７５】
【数６８−１】
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【００７６】
【数６９−１】
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【００７７】
【数７０−１】
2007209344.tif 000076
【００７８】
【数７１−１】
2007209344.tif 000077
【００７９】
【数７２−１】
2007209344.tif 000078
【００８０】
【数７３−１】
2007209344.tif 000079
【００８１】
【数７４−１】
2007209344.tif 000080
【００８２】
【数７５−１】
2007209344.tif 000081
【００８３】
【数７６−１】
2007209344.tif 000082
【００８４】
【数７７−１】
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【００８５】
【数７８−１】
2007209344.tif 000084
【００８６】
【数７９−１】
2007209344.tif 000085
【００８７】
【数８０−１】
2007209344.tif 000086
【００８８】
【数８１−１】
2007209344.tif 000087
【００８９】
【数８２−１】
2007209344.tif 000088
【００９０】
【数８３−１】
2007209344.tif 000089
【００９１】
【数８４−１】
2007209344.tif 000090
【００９２】
【数８５−１】
2007209344.tif 000091
【００９３】
【数８６−１】
2007209344.tif 000092
【００９４】
【数８７−１】
2007209344.tif 000093
【００９５】
【数８８−１】
2007209344.tif 000094
。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１Ａ】図１はヒトサイクリンＧ１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
【図１Ｂ】図１はヒトサイクリンＧ１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
【図１Ｃ】図１はヒトサイクリンＧ１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
【図１Ｄ】図１はヒトサイクリンＧ１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
【図１Ｅ】図１はヒトサイクリンＧ１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
【図２】図２はβ−ガラクトシターゼ、あるいは１ａｃＺ遺伝子を含むレトロウイルスベクターでのＭＧ−６３骨原性肉腫細胞の形質導入に続くその細胞の染色を描く。
【図３】図３は単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を含むレトロウイルスベクターで形質導入されたＭＧ−６３細胞およびそのようなベクターで形質導入されなかった細胞の混合物における密集の度合のグラフである。
【図４】図４はレトロウイルスベクターＧ１ａＤ１ＳｖＮａ、ＧｌａＧ１ＳｖＮａ、Ｇ１ｐ２１ＳｖＮａおよびＧ１ＸＳｖＮａの図式である。
【図５】図５はＧ１ＸＳｖＮａ、Ｇ１ａＤ１ＳｖＮａ、Ｇ１ａＧ１ＳｖＮａ、あるいはＧ１ｐ２１ＳｖＮａで形質導入されたＭＧ−６３細胞の培養における細胞総数のグラフである。
【図６】図６はＧ１ＸＳｖＮａ、Ｇ１ａＧ１ＳｖＮａ、あるいはＧ１ａＤ１ＳｖＮａで形質導入されたＭＧ−６３細胞におけるｐ２９サイクリンＧ１タンパク質の発現のウエスタンブロットである。
【図７】図７はＧ１ＸＳｖＮａ、Ｇ１ａＧ１ＳｖＮａ、Ｇ１ａＤ１ＳｖＮａ、あるいはＧ１ｐ２１ＳｖＮａでＭＧ−６３細胞の形質導入７２時間後の顕微鏡検査によるその細胞の形態学的外観を描く。
【図８】図８はＧ１ＸＳｖＮａ、Ｇ１ａＧ１ＳｖＮａ、Ｇ１ａＤ１ＳｖＮａあるいはＧ１ｐ２１ＳｖＮａで形質導入されたＭＧ−６３細胞の培養における細胞消滅細胞の検出を描く。
【図９Ａ】図９ＡはアンチセンスサイクリンＧ１を運ぶレトロウイルスベクター（Ｇ１ａＧ１ＳｖＮａ）でのＶＸ２癌細胞の形質導入４８時間後のＰＩ染色核を対照（Ｇ１ＸＳｖＮａ）ベクターのそれと比較したＦＡＣＳ（蛍光活性細胞分離装置）分析を描く。
【図９Ｂ】図９ＢはアンチセンスサイクリンＧ１を運ぶレトロウイルスベクター（Ｇ１ａＧ１ＳｖＮａ）でＭＧ−６３骨肉腫細胞の形質導入４８時間後のＰＩ染色核を対照（Ｇ１ＸＳｖＮａ）ベクターのそれと比較したＦＡＣＳ分析を描く。
【図１０】図１０：形質導入ＶＸ２未分化癌細胞内でアンチセンスサイクリンＧ１および野生型ｐ５３を運ぶレトロウイルスベクターの細胞静止作用。細胞密度は、Ｇ４１８選択前、レトロウイルスベクター形質導入後に連続間隔を置いてＶＸ２細胞の細胞培養内で細胞計数により測定された。
【図１１】図１１：Ｇ４１８選択後にアンチセンスサイクリンＧ１（Ｇ１ａＧ１ＳｖＮａ）、野生型ｐ５３（Ｇ１ｐ５３ＳｖＮａ）を運ぶレトロウイルスベクターあるいは対照（Ｇ１ＸＳｖＮａ）ベクターで形質導入１０日後のＶＸ２細胞の形態学的外観。
【図１２】図１２：アンチセンスサイクリンＧ１を運ぶ腫瘍内注入レトロウイルスベクターに続くヌードマウスにおけるＶＸ２腫瘍成長の阻害。縦軸にプロットされた腫瘍サイズの増加割合は横軸にプロットされた時間（日数）の関数として表される。
【図１３Ａ】図１３Ａ：アンチセンスサイクリンＧ１を運ぶレトロウイルスベクター（Ｇ１ａＧ１ＳｖＮａ）あるいは対照ベクター（Ｇ１ＸＳｖＮａ）で処置１週後の代表的ＶＸ２腫瘍保持マウスの肉眼で見える外観。
【図１３Ｂ】図１３Ｂ：アンチセンスサイクリンＧ１を運ぶレトロウイルスベクター（Ｇ１ａＧ７ＳｖＮａ）あるいは対照ベクター（Ｇ１ＸＳｖＮａ）での処理１週のホルマリン固定腫瘍切開部のヘマトキシリン−エオシン染色。倍率４０倍。
【図１４】図１４はＭＮＮＧ／ＨＯＳ細胞を注射され、レトロウイルスベクターＧ１ＳＸｖＮａあるいはＧ１ａＧ１ＳｖＮａの注射が続けられたマウスの腫瘍サイズのグラフである。腫瘍の量はレトロウイルスベクターの注射の０，４，６，８，１０および１２日後で測定される。
【図１５Ａ】図１５：（Ａ）Ｇ１ｎＢｇＳｖＮａベクターでの形質導入に続く核標的β−ガラクトシダーゼを発現する大動脈平滑筋細胞（青い核を持つ細胞）；（Ｂ）形質導入大動脈ＳＭＣ内でのアンチセンスサイクリンＧ１および野生型ｐ５３の細胞静止および細胞致死作用。細胞密度は対照ベクター（Ｇ１ＸＳｖＮａ）と同じくアンチセンスＧ１（Ｇ１ａＧ１ＳｖＮａ）および野生型ｐ５３（Ｇ１ｐ５３ＳｖＮａ）を運ぶレトロウイルスベクターで形質導入後連続間隔で収穫された大動脈ＳＭＣの培養での直接細胞計数により測定された；（Ｃ）レトロウイルスベクター（ｎ＝３  各グループ）で形質導入された後の培養大動脈ＳＭＣへの３Ｈ−チミジンとり込み。放射能はウエル当りｄｐｍとして表現される。その結果は算術平均±１標準偏差で表される。
【図１５Ｂ】図１５：（Ａ）Ｇ１ｎＢｇＳｖＮａベクターでの形質導入に続く核標的β−ガラクトシダーゼを発現する大動脈平滑筋細胞（青い核を持つ細胞）；（Ｂ）形質導入大動脈ＳＭＣ内でのアンチセンスサイクリンＧ１および野生型ｐ５３の細胞静止および細胞致死作用。細胞密度は対照ベクター（Ｇ１ＸＳｖＮａ）と同じくアンチセンスＧ１（Ｇ１ａＧ１ＳｖＮａ）および野生型ｐ５３（Ｇ１ｐ５３ＳｖＮａ）を運ぶレトロウイルスベクターで形質導入後連続間隔で収穫された大動脈ＳＭＣの培養での直接細胞計数により測定された；（Ｃ）レトロウイルスベクター（ｎ＝３  各グループ）で形質導入された後の培養大動脈ＳＭＣへの３Ｈ−チミジンとり込み。放射能はウエル当りｄｐｍとして表現される。その結果は算術平均±１標準偏差で表される。
【図１５Ｃ】図１５：（Ａ）Ｇ１ｎＢｇＳｖＮａベクターでの形質導入に続く核標的β−ガラクトシダーゼを発現する大動脈平滑筋細胞（青い核を持つ細胞）；（Ｂ）形質導入大動脈ＳＭＣ内でのアンチセンスサイクリンＧ１および野生型ｐ５３の細胞静止および細胞致死作用。細胞密度は対照ベクター（Ｇ１ＸＳｖＮａ）と同じくアンチセンスＧ１（Ｇ１ａＧ１ＳｖＮａ）および野生型ｐ５３（Ｇ１ｐ５３ＳｖＮａ）を運ぶレトロウイルスベクターで形質導入後連続間隔で収穫された大動脈ＳＭＣの培養での直接細胞計数により測定された；（Ｃ）レトロウイルスベクター（ｎ＝３  各グループ）で形質導入された後の培養大動脈ＳＭＣへの３Ｈ−チミジンとり込み。放射能はウエル当りｄｐｍとして表現される。その結果は算術平均±１標準偏差で表される。
【図１６】図１６：対照およびアンチセンスサイクリンＧ１レトロウイルスベクター（Ａ＝Ｇ１ＸＳｖＮａ対照ベクター；Ｂ−Ｄ＝Ｇ１ａＧ１ＳｖＮａ）で形質導入２４時間後に顕微鏡検査で観察された大動脈ＳＭＣの形態学的外観。アンチセンスサイクリンＧ１レトロウイルスベクター形質移入後血管ＳＭＣにおける細胞消滅の検出；（Ｅ）Ｇ１ＸＳｖＮａ対照ベクター形質導入細胞、（Ｆ）Ｇ１ａＧ１ＳｖＮａアンチセンスサイクリンＧ１ベクター形質導入細胞。濃い染色細胞消滅体は合胞体細胞内および外の両方で認められている。
【図１７−１】図１７：アンチセンスサイクリンＧ１ベクター形質導入大動脈ＳＭＣでの細胞致死「バイスタンダー」作用。アンチセンスサイクリンＧ１ベクターで前もって形質導入されたＳＭＣ培養に覆われた時に非形質導入蛍光標識大動脈ＳＭＣの多細胞性合胞体への取り込み。ＡおよびＢ、低倍率；ＣおよびＤ、高倍率；ＡおよびＣ、位相差；ＢおよびＤ、紫外線。蛍光標識を含む細胞を取り込む代表的な多核合胞体は矢印で同定される。（Ｅ）レトロウイルスベクター：Ｇ１ＸＳｖＮａ、対照ベクター；Ｇ１ａＧ１ＳｖＮａ、アンチセンスＧ１遺伝子を運ぶベクター；Ｇ１ｐ５３ＳｖＮａ、野生型ｐ５３を運ぶベクターで形質導入された血管ＳＭＣでの時間にわたる合胞体形成の定量化。
【図１７−２】図１７：アンチセンスサイクリンＧ１ベクター形質導入大動脈ＳＭＣでの細胞致死「バイスタンダー」作用。アンチセンスサイクリンＧ１ベクターで前もって形質導入されたＳＭＣ培養に覆われた時に非形質導入蛍光標識大動脈ＳＭＣの多細胞性合胞体への取り込み。ＡおよびＢ、低倍率；ＣおよびＤ、高倍率；ＡおよびＣ、位相差；ＢおよびＤ、紫外線。蛍光標識を含む細胞を取り込む代表的な多核合胞体は矢印で同定される。（Ｅ）レトロウイルスベクター：Ｇ１ＸＳｖＮａ、対照ベクター；Ｇ１ａＧ１ＳｖＮａ、アンチセンスＧ１遺伝子を運ぶベクター；Ｇ１ｐ５３ＳｖＮａ、野生型ｐ５３を運ぶベクターで形質導入された血管ＳＭＣでの時間にわたる合胞体形成の定量化。
【図１８】図１８：（Ａ）細胞を欠いている１ｍｍのトラックを創り出すために２００μｌピペットチップで掘られた大動脈ＳＭＣの高密度培養、（Ｂ）掘り出しおよび剥離細胞除去のための洗浄直後の「創傷」余白の外観、（Ｃ）トラックの余白に沿って核標的βガラクトシダーゼを発現する大動脈ＳＭＣ、（Ｄ）損傷２４時間後トラックへのＧ１ＸＳｖＮａ対照ベクター形質導入大動脈ＳＭＣの増殖および移動、（Ｅ）標識された合胞体形成を持つＧ１ａＧ１ＳｖＮａベクター形質導入大動脈ＳＭＣにおける細胞消滅および退化の変化。
【図１９−１】図１９：ラット頸動脈損傷の再狭窄モデルにおけるアンチセンスサイクリンＧ１ベクターの効率の検査。中膜のエラスチン層がヴァーヘフ染色により（Ａ−Ｄで）同定される。増殖平滑筋細胞（赤黄色染色細胞）よりなる新内膜はシリス赤色染色により同定される。ＡおよびＣ＝未処置動脈セグメント；ＢおよびＤ＝アンチセンスサイクリンＧ１ベクター処置動脈セグメント。ＥおよびＦ＝高倍率のそれぞれ未処置動脈セグメントおよびａＧ１処置動脈セグメント：Ｇ＝未処置（ＮＴ）、対照（ＧＩＸ）およびアンチセンスサイクリンＧ１（ａＧ１）処置の各動脈セグメントの新内膜の中膜に対する比率の分析が縦棒軸で表される。
【図１９−２】図１９：ラット頸動脈損傷の再狭窄モデルにおけるアンチセンスサイクリンＧ１ベクターの効率の検査。中膜のエラスチン層がヴァーヘフ染色により（Ａ−Ｄで）同定される。増殖平滑筋細胞（赤黄色染色細胞）よりなる新内膜はシリス赤色染色により同定される。ＡおよびＣ＝未処置動脈セグメント；ＢおよびＤ＝アンチセンスサイクリンＧ１ベクター処置動脈セグメント。ＥおよびＦ＝高倍率のそれぞれ未処置動脈セグメントおよびａＧ１処置動脈セグメント：Ｇ＝未処置（ＮＴ）、対照（ＧＩＸ）およびアンチセンスサイクリンＧ１（ａＧ１）処置の各動脈セグメントの新内膜の中膜に対する比率の分析が縦棒軸で表される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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