(57)【要約】【課題】現存する抗体よりなお少ない程度で、そして/またはより少数の患者において分裂促進活性を示す、変異した定常領域を有する抗ＣＤ３抗体の提供。【解決手段】ＥＵ番号付けシステムにより規定される残基２３４〜２３７の間に天然に存在しないアミノ酸セグメントを含む変異したＩｇＧ２定常領域であって、該変異したＩｇＧ２定常領域に連結した抗ＣＤ３抗体の可変領域を含む抗体が、天然のＩｇＧ２定常領域に連結した該抗ＣＤ３抗体の該可変領域を含む第２の抗体と比較して、ヒトＴ細胞において減少した分裂促進応答を誘導する、変異したＩｇＧ２定常領域。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
実施例等に記載される変異したＩｇＧ２構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異した不活化ＩｇＧ２ドメインおよびこれを組み込んだヒト化抗ＣＤ３抗体の設計に、免疫学および分子遺伝学の技術分野を適用する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Ｔ細胞上のＣＤ３複合体は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）ヘテロダイマーと密接に関連し、そして抗原結合の際のＴ細胞活性化において重要な役割を担う。特定の抗ＣＤ３抗体は、抗原の非存在下でＴ細胞を活性化し得る。このような活性化は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＦｃ部分と、Ｔ細胞上のＣＤ３複合体を架橋するための補助細胞上のＦｃレセプターとの相互作用に依存する。可溶性抗ＣＤ３ｍＡｂは、インビトロで、それらがプラスチックまたはＦｃレセプター保有細胞に結合していない場合、Ｔ細胞を増殖するようには刺激しない。
【０００３】
免疫抑制は、これらの抗体をヒト被験体またはマウスに投与することにより達成され得るが、効力は、しばしば２つの因子により緩和される。１つめは、外来タンパク質の複数注射から生じる抗グロブリン応答であり、そして２つめは、Ｔ細胞活性化から生じる第一用量症候群である。症状には、発熱、悪寒、下痢、および嘔吐が挙げられ、そして重篤な場合には死に至る。この症候群は、一過性のＴ細胞活性化の結果として宿主のサイトカイン放出により引き起こされる（Abramowiczら、Transplantation 47, 606（1989)を参照）。ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、およびＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカインが、これらの重篤な副作用に関連付けられている。マウスにおいて、２つの形態の抗ＣＤ３が、マウスＴ細胞を活性化することなく免疫抑制性であると報告されている：Ｆ(ａｂ')２形態（Hirschら、Transplantation49, 1117（1990)を参照）、およびマウスＩｇＧ３アイソタイプのキメラ形態（Alegreら、J.Immunol. 155, 1544（1995)を参照）。前者は、Ｆｃγレセプターに結合する定常領域の部分を欠失し、そして後者の定常領域は、マウスＦｃγレセプターに対して低親和性を有する。
【０００４】
ヒトの治療において、ヒト化されているだけでなく、免疫原性および毒性を最小化するためにＦｃγレセプターと相互作用し得ない抗ＣＤ３分子を有することが望ましい。３つのＦｃγレセプター、ＦｃＲＩ、ＦｃＲＩＩ、およびＦｃＲＩＩＩに対する種々のヒトＩｇＧアイソタイプのそれぞれの親和性が決定された（RavetchおよびKinet、Annu.Rev.Immunol. 9, 457（1991)を参照）。ＦｃＲＩは、単量体形態でＩｇＧに結合する高親和性レセプターであり、後者の２つは、多量体形態でのみＩｇＧに結合する低親和性レセプターである。一般に、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３の両方は、３つのレセプター全てに対し、ＩｇＧ４はＦｃＲＩに対し、そしてＩｇＧ２は、ＩＩａＬＲと呼ばれるＦｃＲＩＩの１つのタイプに対して顕著な結合活性を有する（Parrenら、J.Immunol.148, 695（1992); J.Clin.Invest. 90, 1537（1992)を参照）。ＩＩａＬＲは、白色人種集団の４０％において発現される、ＦｃＲＩＩの対立遺伝子である。幾人かの研究者は、種々のアイソタイプのキメラ抗ＣＤ３を作製したが、全てが、少なくとも幾人かのドナー由来の分裂促進性ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）であると報告された（Boltら、Eur.J.Immunol.,23, 403（1993)；Parrenら、Res.Immunol. 142, 793（1991)を参照）。それ故、天然に存在する形態のＦｃは、不活化抗ＣＤ３ｍＡｂを産生するためには不適切である。
【０００５】
抗ＣＤ３ ＩｇＧ１およびＩｇＧ４の下方ヒンジ/上方ＣＨ２領域に作製された変異は、これらの分子をより低い分裂促進性にすることが報告されている（Alegreら、Transplantation57, 1537（1994)；Alegreら、J.Immunol. 148, 3461（1992)を参照）。ＩｇＧ３の２３５位での変異は、ＦｃＲＩとの相互作用に影響することが報告され、そして２３４位および２３７位の変異は、ＦｃＲＩＩとの相互作用に影響することが報告されている（Lundら、J.Immunol.147, 2657（1991)を参照）。アグリコシル化（aglycosylated）形態の抗ＣＤ３もまた、Ｆｃγレセプターへの結合を損なっていることが報告されている（Boltら、Eur.J.Immunol.23, 403（1993)を参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これらの開発にも関わらず、現存する抗体よりなお少ない程度で、そして/またはより少数の患者において分裂促進活性を示す、変異した定常領域を有する抗ＣＤ３抗体の必要性が残る。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によって以下が提供される：
１．ＥＵ番号付けシステムにより規定される残基２３４〜２３７の間に天然に存在しないアミノ酸セグメントを含む変異したＩｇＧ２定常領域であって、該変異したＩｇＧ２定常領域に連結した抗ＣＤ３抗体の可変領域を含む抗体が、天然のＩｇＧ２定常領域に連結した該抗ＣＤ３抗体の該可変領域を含む第２の抗体と比較して、ヒトＴ細胞において減少した分裂促進応答を誘導する、変異したＩｇＧ２定常領域。
２．ＥＵ番号付けシステムにより規定される残基２３４、２３５、および２３７が、以下からなる群から選択されるアミノ酸のセグメントを形成する、変異したＩｇＧ２定常領域：
ａｌａ ａｌａ ｇｌｙ、
ｖａｌ ａｌａ ａｌａ、
ａｌａ ａｌａ ａｌａ、
ｖａｌ ｇｌｕ ａｌａ、および
ａｌａ ｇｌｕ ａｌａ。
３．前記セグメントがａｌａ ａｌａ ａｌａである、項目２に記載の変異したＩｇＧ２定常領域。
４．前記セグメントが、それ以外は天然に存在するヒトＩｇＧ２定常領域内に含まれる、項目３に記載の変異したＩｇＧ２定常領域。
５．少なくともＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を含む、項目２に記載の変異したＩｇＧ２定常領域。
６．図４の配列（配列番号９）を含む、項目５に記載のＩｇＧ２定常領域。
７．項目１に記載の変異したＩｇＧ２定常領域を含む、ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体。
８．項目２に記載の変異したＩｇＧ２定常領域を含む、ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体。
９．ヒト化されている、項目８に記載の抗体。
１０．ヒト化Ｍ２９１である、項目９に記載の抗体。
１１．前記ヒト化軽鎖が、図１Ｃ（配列番号６）の成熟アミノ酸配列を含み、そして前記ヒト化重鎖可変ドメインが、前記ＩｇＧ２定常領域に融合した図１Ｄ（配列番号８）の成熟アミノ酸配列を含む、項目１０に記載の抗体。
１２．由来の前記変異したＩｇＧ２定常領域の残基２３４、２３５、および２３７がセグメントａｌａａｌａ ａｌａを形成する、項目１１に記載の抗体。
１３．ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖を含む、項目１０に記載のヒト化抗体であって：
（１）該ヒト化軽鎖は、マウスＭ２９１免疫グロブリン軽鎖の対応する相補性決定領域由来のアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）、およびヒトκ軽鎖可変領域フレームワーク配列由来の可変領域フレームワークを含み、そして
（２）該ヒト化重鎖は、マウスＭ２９１免疫グロブリン重鎖の対応する相補性決定領域由来のアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）、および、Ｈ３０、Ｈ６７、Ｈ６８、Ｈ７０、Ｈ７２、およびＨ７４からなる群から選択される少なくとも１つの位置を除き、ヒト重鎖可変領域フレームワーク配列由来の可変領域フレームワークを含み、該アミノ酸位置は、該マウスＭ２９１免疫グロブリン重鎖可変領域フレームワークの相当位置に存在する同じアミノ酸により占められ；
ここで、該免疫グロブリンは、約１０７Ｍ−１の下限および該Ｍ２９１免疫グロブリンの結合親和性の約５倍の上限を有する結合親和性で、Ｔ細胞の表面上のＣＤ３抗原に特異的に結合する、ヒト化抗体。
１４．前記ヒト化軽鎖可変領域フレームワークが、サブグループＩのＨＦ２−１/１７抗体の軽鎖可変領域フレームワーク由来であり；
前記ヒト化重鎖領域フレームワークが、前記群から選択される少なくとも１つの位置を除き、そして４４位を除いて２１/２８抗体の重鎖領域可変フレームワーク由来であり、該アミノ酸位置が、ヒト免疫グロブリンサブグループＩコンセンサス配列の相当位置に存在する同じアミノ酸により占められる、
項目１３に記載のヒト化抗体。
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、ＥＵ番号付けシステムにより規定される残基２３４と残基２３７との間に天然には存在しないアミノ酸セグメントを含む、変異したＩｇＧ２定常領域を提供する。このようなＩｇＧ２定常領域を組み込まれている抗ＣＤ３抗体は、Ｆｃγレセプターへの特異的な結合を通じてＴ細胞において分裂促進応答を誘導することなく、Ｔ細胞上のＣＤ３抗原に特異的に結合し得る。好適な変異したＩｇＧ２定常領域において、残基２３４、２３５、および２３７は、以下のアミノ酸セグメントのうちの１つを形成する：ａｌａａｌａ ｇｌｙ、ｖａｌ ａｌａ ａｌａ、ａｌａ ａｌａ ａｌａ、ｖａｌ ｇｌｕ ａｌａ、およびａｌａ ｇｌｕ ａｌａ。２３６位（ＥＵ番号付けシステムにより規定される）は、野生型ＩｇＧ２定常領域と同様に、これらの変異した定常領域では占有されていないことに注意。通常、変異したセグメントは、これ以外は天然に存在するヒトＩｇＧ２定常領域中に含まれる。本発明はさらに、変異したＩｇＧ２定常領域を組み込んだ抗ＣＤ３抗体（好ましくは、ヒト化抗体）を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、変異したＩｇＧ２ドメインが組み込まれ得る、マウスＭ２９１抗体由来の新規なヒト化抗体を提供する。好ましいヒト化軽鎖は、Ｍ２９１免疫グロブリン軽鎖の対応する相補性決定領域からのアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）、およびヒトκ軽鎖可変領域フレームワーク配列からの可変領域フレームワークを含む。好ましいヒト化重鎖は、Ｍ２９１免疫グロブリン重鎖の対応する相補性決定領域からのアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）、ならびに、Ｈ３０、Ｈ６７、Ｈ６８、Ｈ７０、Ｈ７２、およびＨ７４からなる群から選択される少なくとも１つの位置（このアミノ酸位置は、マウスＭ２９１免疫グロブリン重鎖可変領域フレームワークの相当位置に存在する同じアミノ酸により占められる）を除いて、ヒト重鎖可変領域フレームワーク配列からの可変領域フレームワークを含む。免疫グロブリンは、Ｔ細胞の表面上のＣＤ３抗原に特異的に結合し、そして通常は、約１０７Ｍ−１の下限およびＭ２９１免疫グロブリンの結合親和性の約５倍の上限を有する結合親和性を有する。好ましくは、ヒト化軽鎖可変領域フレームワークは、サブグループＩのＨＦ２−１/１７抗体の軽鎖可変領域フレームワーク由来である。好ましくは、ヒト化重鎖領域フレームワークは、２１/２８抗体の重鎖領域可変フレームワーク由来である。この場合において、Ｈ４４位は、ヒト免疫グロブリンサブグループＩコンセンサス配列の相当位置に存在する同じアミノ酸と置換され得る。
【００１０】
定義
用語ＩｇＧ２定常領域は、EllisonおよびHood、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79, 1984（1981）によって記載される特定のＩｇＧ２定常領域配列、その対立遺伝子改変体、および高度な配列同一性（例えば、EllisonおよびHood（前出）の配列に対して少なくとも９０、９５、または９９％の配列同一性）を有するそれらの他の形態をいう。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。この用語は、全長定常領域およびそのフラグメント（例えば、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域、ならびにこれらの組合せ）を含む。ＩｇＧ２定常領域は、ヒトおよび霊長類において見出される。
【００１１】
配列同一性の割合は、ＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムにより、デフォルトギャップ重み（default gap weight）を用いて決定される。
【００１２】
定常領域のアミノ酸は、ヒト抗体ＥＵとのアラインメントによって番号付けされる（Cunninghamら、J.Biol.Chem., 9, 3161（1970)を参照）。すなわち、抗体の重鎖および軽鎖を、アミノ酸配列の同一性を最大にするようにＥＵの重鎖および軽鎖と整列させ、そして抗体の各アミノ酸に、ＥＵの対応するアミノ酸と同じ番号を割り当てる。ＥＵの番号付けシステムは、当該分野において従来より用いられている（一般に、Kabatら、Sequencesof Protein of Immunological Interest, NIH公報第91-3242号、米国保健社会福祉省(1991)を参照）。この慣例に従って、EllisonおよびHood（前出）によって記載される野生型ＩｇＧ２定常領域は、２３６位のアミノ酸を欠失する。免疫グロブリンの成熟重鎖および軽鎖の可変領域由来のアミノ酸は、本明細書中でそれぞれＨｘおよびＬｘと命名され、ここで、ｘは、可変領域配列における位置を表す数である。
【００１３】
本発明の抗ＣＤ３抗体は、ヒトＣＤ３抗原に対する特異的結合を示す。ヒトＣＤ３に対するほとんどの抗体は、下等哺乳動物由来の同族抗原と交差反応しない。
【００１４】
アミノ酸置換を保存的または非保存的と分類するために、アミノ酸を以下のように群分けする：群Ｉ（疎水性側鎖）：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；群II（中性親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；群III（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；群IV（塩基性側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｕ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；群Ｖ（鎖の配向に影響を与える残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および群VI（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。保存的置換は、同一のクラスのアミノ酸間の置換を含む。非保存的置換は、これらのクラスのうちのあるクラスのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することである。
【００１５】
Ｎ末端からＣ末端へ、軽鎖および重鎖は共に、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。アミノ酸の各ドメインへの割当は、Kabat（1991)(前出）、および/またはChothiaおよびLesk、J.Mol.Biol. 196:901-917（1987)；Chothiaら、Nature342: 878-883（1989）の定義に従う。
【００１６】
基本的抗体構造単位は、テトラマーを含むことが知られている。各テトラマーは、ポリぺプチド鎖の２つの同一な対から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担う約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を規定する。各軽/重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。したがって、インタクトな抗体は、２つの結合部位を有する。
【００１７】
軽鎖は、κまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、そして抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥとして規定する。軽鎖および重鎖内で、可変および定常領域は、約１２またはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖はまた、約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。（一般に、Fundamental Immunology（Paul,W.編、第２版、Raven Press, N.Y., 1989）、第７章（その全体が全ての目的で参考として援用される）を参照。）
用語エピトープは、免疫グロブリンまたはＴ細胞レセプターと特異的に結合し得る任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面配置（grouping）からなり、そして通常、特異的な３次元構造的特徴および特異的な電荷的特徴を有する。
【００１８】
用語患者は、ヒトおよび動物被験体を含む。
【００１９】
試験抗体は、過剰な試験抗体が、競合アッセイにおいて抗原への参照抗体の結合を実質的に阻害する場合、抗原への特異的結合について参照抗体と競合する。実質的に阻害するとは、試験抗体が参照抗体の特異的結合を、通常、少なくとも１９％、２５％、５０％、７５％、または９０％低減させることを意味する。競合抗体は、参照抗体と同一または類似の抗原上エピトープに結合するか、または参照抗体によって結合されるエピトープに対して、参照抗体の抗原への結合を阻害するに十分近位にあるエピトープに結合する。
【００２０】
詳細な説明
本発明は、それらがＦｃγレセプターに特異的に結合し、そしてそれによりほとんどの患者のＴ細胞において分裂促進応答を活性化する能力を実質的に失うように変異されたＩｇＧ２定常領域を提供する。本発明はまた、変異されたＩｇＧ２定常領域が組み込まれ得る、マウスＭ２９１抗体に由来する新規なヒト化抗ＣＤ３抗体を提供する。変異されたＩｇＧ２定常領域はまた、他の抗ＣＤ３または他の抗体中へ組み込まれ得る。
【００２１】
Ｉ．ＩｇＧ２定常領域の変異
本発明は、Ｆｃγレセプターと相互作用する能力を実質的に欠くＣＨ２領域の変異を有するＩｇＧ２定常領域を提供する。Ｆｃγレセプター結合の喪失に関連する変異は、ＩｇＧ２定常領域の残基２３４〜２３７内で起こる（残基は、ＥＵ慣例によって番号づけられる）。変異は、いくつかの制約に従い選択される。第一に、変異は、ＩｇＧ２によって天然には認識されない他のＦｃγレセプターへの結合の獲得を付随して引き起こすことなく、ＩｇＧ２（ＦｃＲＩＩ）によって天然に認識されるＦｃγレセプターへの特異的結合の喪失（すなわち、Ｋａ＜１０６Ｍ−１）を引き起こすべきである。すなわち、本発明の変異形態のＩｇＧ２は、通常、（少なくとも、頻繁に生じる対立遺伝子形態の）任意のＦｃγレセプターへの特異的結合を示さない。Ｆｃγレセプターへの結合の実質的な喪失は、Ｔ細胞の分裂促進活性の実質的な喪失を生じる。
【００２２】
第二に、変異したＩｇＧ２定常領域を組み込んだ抗ＣＤ３抗体は、野生型ＩｇＧ２定常領域を有するが、その他は同一である第二の抗ＣＤ３抗体と、ＣＤ３に対して、実質的に同一の結合親和性およびアビディティー（例えば、３、５、または１０倍の係数内）を有するべきである。変異はまた、結合の特異性に影響を与えるべきでない（例えば、変異したＩｇＧ２定常領域を有する抗体は、ヒトＣＤ３への結合について、非変異形態の抗体と競合するべきである）。第三に、変異は、免疫原性の増大を生じるほど天然の定常領域の構造から離れて、定常領域の構造を乱すべきではない。したがって、本発明の変異された定常領域を有する抗体は、治療的方法において、Ｔ細胞免疫応答を抑制するに有用なままである。
【００２３】
これらの基準を満たす異なる変異の組合せを含む５つの例示的なＩｇＧ２定常領域の単離を、以下に記載する。これらの定常領域において、ＥＵ番号付けシステムによって規定される残基２３４、２３５、および２３７は、以下からなる群より選択されるアミノ酸セグメントを形成する：
ａｌａ ａｌａ ｇｌｙ、
ｖａｌ ａｌａ ａｌａ、
ａｌａ ａｌａ ａｌａ、
ｖａｌ ｇｌｕ ａｌａ、および
ａｌａ ｇｌｕ ａｌａ。
２３６位は、野生型ＩｇＧ２定常領域と同様に、これらの変異体定常領域において占有されていない。
【００２４】
同等に、これらの変異体定常領域は、２３４位と２３７位との間に、以下の天然に生じないアミノ酸セグメントの１つを含むとして記載され得る：
ａｌａ ａｌａ   ｇｌｙ、
ｖａｌ ａｌａ   ａｌａ、
ａｌａ ａｌａ   ａｌａ、
ｖａｌ ｇｌｕ   ａｌａ、
ａｌａ ｇｌｕ   ａｌａ、
ここで、 は、２３６位のアミノ酸が存在しないことを表す。
【００２５】
これらの例における全ての置換が、上記のアミノ酸分類によって保存的であるわけではないが、これらは、それらを含むＩｇＧ２定常領域の電荷分布またはコンホメーションの実質的な変化を導入しない。したがって、Ｔ細胞のＦｃγレセプター結合および分裂促進活性は、相対的に保存的な改変によって実質的に低減され得る。基準を満たし得る他の変異は、アミノ酸２３４〜２３７を、別々にまたは一緒に、２０の通常アミノ酸の任意のもので置換することによって、あるいはこれらのアミノ酸の任意のものを欠失させることによって作製され得る。
【００２６】
変異されたＩｇＧ２定常領域は、組換え技術によって抗ＣＤ３抗体に組み込まれる。完全にヒトの、もしくはヒト化された抗ＣＤ３抗体（例えば、ヒト化Ｍ２９１またはヒト化ＯＫＴ３）が、最も適切である（Allegreら（1992）前出）。これらの定常領域を組み込んだ抗体は、少なくともほとんど（本明細書中で使用される場合、少なくとも６７％、７５％、９０％、または９５％を意味する）の患者において、サイトカインの有害な放出を生じる分裂促進活性を誘導することなく、Ｔ細胞の免疫応答を抑制し得る点で、免疫抑制剤としての所望の特性を有する。本発明の変異したＩｇＧ２定常領域を組み込んだ抗ＣＤ３抗体は、その抗体のＦ(ａｂ')２フラグメント（ＦｃγＲ結合ドメインを完全に欠く）より、Ｆｃγレセプターに対して顕著に大きな（例えば、２、５、または１０倍より大きい）結合を示さない。この結合親和性喪失の結果として、変異したＩｇＧ２定常領域を組み込んだ抗ＣＤ３抗体は、バックグランドレベルに比較して、Ｔ細胞において顕著な増殖活性を刺激しない。さらに、本発明の変異したＩｇＧ２定常領域を組み込んだ抗ＣＤ３抗体は、対応するＦ(ａｂ')２フラグメントと比較して、抗体によって結合されたＴ細胞による、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、またはＩＦＮ−γ）の放出を顕著に刺激しないし、ＩＬ−２レセプターの発現も顕著に誘導しない。すなわち、ほとんどの患者において、またはほとんどのドナー由来の細胞を使用するインビトロで、分裂促進活性（すなわち、誘導された、増殖および/またはサイトカイン放出および/またはレセプター発現）が、変異していないＩｇＧ１および/またはＩｇＧ２抗ＣＤ３抗体で観察される対応する活性から少なくとも２、５、１０、または１００倍低減され、そして/またはＦ(ａｂ')２フラグメントでの活性の１/２〜２、１/５〜５、または１/１０〜１０倍以内である。変異したＩｇＧ２定常領域を組み込んだ抗体は、より長い血清半減期のＦ(ａｂ')２フラグメントを超える利点を提供する。変異したＩｇＧ２領域を組み込んだ抗体はまた、おそらくそれがＦｃγレセプターと相互作用し得ないことにより、野生型定常領域を有する抗体と比較して、しばしば、より長いインビボ半減期および低減された免疫原性を示す。
【００２７】
II．ヒト化抗ＣＤ３抗体
本発明は、さらに、変異したＩｇＧ２定常領域がその中に組み込まれ得る、マウス抗体Ｍ２９１に由来する新規なヒト化抗ＣＤ３抗体を提供する（米国特許出願第08/397,411号（全ての目的のためにその全体が参考として援用される）もまた参照）。ヒト化抗体はまた、他の定常領域とともに、またはインタクトな定常領域を欠くフラグメントとして使用され得る。ヒト化形態の免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリン（アクセプター免疫グロブリンと呼ばれる）に実質的に由来する可変フレームワーク領域、およびマウス免疫グロブリン（ドナー免疫グロブリンと呼ばれる）に実質的に由来する相補性決定領域を有する。定常領域はまた、存在する場合、ヒト免疫グロブリンに実質的に（例えば、８５％、９０％、９５％またはより高く）由来する。ヒト化抗体は、それらのそれぞれの抗原に対して、少なくとも１０７、１０８、１０９、または１０１０Ｍ−１の特異的結合親和性を示す。しばしば、ヒト化抗体の結合親和性の上限および下限は、それらが由来したマウス抗体の親和性の３または５または１０の係数内である。
【００２８】
ヒト化免疫グロブリンのＣＤＲおよびフレームワーク成分が選択されれば、種々の方法が、そのような免疫グロブリンを産生するために利用可能である。コードの縮重のために、種々の核酸配列が、各々の免疫グロブリンアミノ酸配列をコードする。所望の核酸配列は、デノボ固相ＤＮＡ合成により、または所望のポリヌクレオチドの以前に調製された変異体のＰＣＲ変異誘発により産生され得る。本願において記載される抗体をコードする全ての核酸は、明白に、本発明中に包含される。
【００２９】
上記のようなヒト化抗体の可変セグメントは、代表的には、上記のように、変異したＩｇＧ２定常領域に連結される。しかし、他の定常領域もまた用いられ得る（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ、ならびに任意のアイソタイプ（ＩｇＧ１、天然ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む）を含む）。ヒト化抗体が細胞傷害活性を示すことが所望される場合、定常ドメインは通常補体結合定常ドメインであり、そしてクラスは代表的にはＩｇＧ１である。そのような細胞傷害活性が所望されない場合、定常ドメインは、ＩｇＧ２クラスまたはＩｇＧ４クラスの定常ドメインであり得る。ヒト化抗体は、１つより多いクラスまたはアイソタイプに由来する配列を含み得る。ヒト定常領域ＤＮＡ配列は、周知の手順に従って、種々のヒト細胞（しかし、好ましくは、不死化Ｂ細胞）から単離され得る（Kabatら（前出）およびWO87/02671を参照）。通常、抗体は、軽鎖および重鎖の両方の定常領域を含む。重鎖定常領域は、通常、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域、および時にはＣＨ４領域を含む。
【００３０】
別の局面において、本発明は、開示される抗体および定常領域をコードするＤＮＡセグメントを包含する。ヒト化軽鎖および重鎖可変領域（必要に応じて定常領域に連結される）をコードする核酸は、発現ベクター中に挿入される。軽鎖および重鎖は、同一かまたは異なる発現ベクター中にクローン化され得る。免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡセグメントは、発現ベクターにおいて制御配列（これは免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする）に作動可能に連結される。そのような制御配列としては、シグナル配列、プロモーター、エンハンサー、および転写終結配列が挙げられる（Queenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86, 10029（1989)；WO 90/07861；Coら、J.Immunol.148, 1149（1992)、Antibody Engineering, A Practical Guide（Borrebaeck編、Freeman、NY1992)(全ての目的のためにそれらの全体が参考として本明細書中に援用される）を参照）。
【００３１】
Ｅ．ｃｏｌｉは、本発明のＤＮＡ配列のクローン化および/または発現のために特に有用な１つの原核生物宿主である。使用のために適切な他の微生物宿主としては、桿菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、および他の腸内細菌（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、および種々のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種）が挙げられる。これらの原核生物宿主においてまた発現ベクターを作製し得る。この発現ベクターは、代表的には、宿主細胞と適合性の発現制御配列（例えば、複製起点）を含む。さらに、任意の数の種々の周知のプロモーターが存在し得る（例えば、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、βラクタマーゼプロモーター系、またはファージλ由来のプロモーター系）。プロモーターは、代表的には、必要に応じてオペレーター配列とともに発現を制御し、そしてリボソーム結合部位配列などを、転写および翻訳を開始および完了するために有する。
【００３２】
他の微生物（例えば、酵母）もまた、発現のために使用され得る。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓが好ましい宿主であり、適切なベクターは発現制御配列（例えば、プロモーター（３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖系酵素のプロモーターを含む)）、ならびに複製起点、終結配列などを、所望により、有する。
【００３３】
植物および植物細胞培養物は、本発明のヒト化免疫グロブリンの発現のために使用され得る。（LarrickおよびFry、Hum.Antibodies Hybridomas 2(4):172-89（1991)；Benvenutoら、PlantMol.Biol. 17(4):865-74（1991)；Durinら、Plant Mol.Biol. 15(2):281-93（1990)；Hiattら、Nature342:76-8（1989)(全ての目的のためにそれらの全体が参考として本明細書中に援用される)）。好ましい植物宿主としては、例えば以下が挙げられる：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｒｕｓｔｉｃａ、およびＳｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ。本発明のヒト化抗ＣＤ３抗体をコードするポリヌクレオチド配列を発現させるための好ましい発現カセットは、プラスミドｐＭＯＧ１８であり、ここで、ヒト化免疫グロブリン鎖をコードする挿入されるポリヌクレオチド配列は、二重にされたエンハンサーを有するＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターに作動可能に連結される；ｐＭＯＧ１８は、Sijmonsら、Bio/Technology8:217-221（1990)(全ての目的のためにその全体が参考として本明細書中に援用される）の方法に従って使用される。あるいは、植物におけるヒト化免疫グロブリンの発現のための好ましい実施態様は、Hiattら（前出）により使用される免疫グロブリン配列の、本発明のヒト化抗ＣＤ３抗体をコードするポリヌクレオチド配列への置換を有して、Hiattら（前出）の方法に従う。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  Ｔ−ＤＮＡに基づくベクターもまた、ヒト化免疫グロブリン配列を発現させるために使用され得、好ましくはそのようなベクターは、スペクチノマイシン耐性をコードするマーカー遺伝子または他の選択マーカーを含む。
【００３４】
昆虫細胞培養物もまた、本発明のヒト化免疫グロブリンを産生するために、代表的には、バキュロウイルスに基づく発現系を用いて使用され得る。ヒト化免疫グロブリンは、Putlitzら、Bio/Technology 8:651-654（1990)(全ての目的のためにその全体が参考として本明細書中に援用される）の方法に従って、ヒト化免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチド配列を発現させることにより産生され得る。Putlitzらの方法は、本発明のヒト化抗ＣＤ３抗体をコードするポリヌクレオチド配列が、PutlitzらのマウスモノクローナルＡｂ６Ａ４の重鎖および軽鎖のｃＤＮＡ配列のかわりに挿入される改変を有して従われ得る。
【００３５】
微生物および植物に加えて、哺乳動物組織細胞培養物もまた、本発明のポリペプチドを発現および産生するために使用され得る（Winnacker, From Genes to Clones（VCH Publishers, NY, 1987）を参照)(全ての目的のためにその全体が参考として本明細書中に援用される）。インタクトな免疫グロブリンを分泌し得る多数の適切な宿主細胞株が当該分野において開発されているので、哺乳動物細胞が実際に好ましく、そして哺乳動物細胞としては、ＣＨＯ細胞株、種々のＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、好ましくはミエローマ細胞株など、または形質転換されたＢ細胞またはハイブリドーマが挙げられる。これらの細胞のための発現ベクターは、発現制御配列（例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサー（Queenら、Immunol.Rev.89:49-68（1986)(全ての目的のためにその全体が参考として本明細書中に援用される)))、ならびに必要なプロセシング情報部位（例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列）を含み得る。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルスなどに由来するプロモーターである。一般に、選択マーカー（例えば、ｎｅｏＲ発現カセット）が、発現ベクター中に含まれる。
【００３６】
本発明の抗体は、フラグメントおよびインタクトな抗体を包含する。代表的には、これらのフラグメントは、それらが由来したインタクトな抗体と、抗原結合について競合する。フラグメントは、代表的には、少なくとも１０７Ｍ−１、およびより代表的には１０８Ｍ−１または１０９Ｍ−１の親和性（すなわち、インタクトな抗体と同じ範囲内）で結合する。ヒト化抗体フラグメントは、分離した重鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２、およびＦｖ、ならびに単鎖抗体を包含する。フラグメントは、組換えＤＮＡ技術によるか、またはインタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的分離により産生される。
【００３７】
III．ヒト抗体
本発明の変異したＩｇＧ２定常領域はまた、ＣＤ３に対する完全ヒト抗体の可変ドメインに、組換え発現技術により連結され得る。ヒト抗体は、下記の種々の技術により産生される。いくつかのヒト抗体は、競合結合実験によるか、あるいはそうでなければ、特定のマウス抗体（例えば、Ｍ２９１もしくはＯＫＴ３）と同じか、もしくは重複するエピトープ特異性を有するように選択される。
【００３８】
ａ．トリオーマ法
基本的なアプローチおよびこのアプローチにおける使用のための例示的な細胞融合パートナーＳＰＡＺ−４は、Oestbergら、Hybridoma 2:361-367（1983)；Oestberg、米国特許第4,634,664号；およびEnglemanら、米国特許第4,634,666号（その各々は、全ての目的のためにその全体が参考として援用される）により記載されている。この方法により得られる抗体産生細胞株は、トリオーマ（trioma）と呼ばれる。なぜなら、それらは３つの細胞（２つのヒトおよび１つのマウス）に由来するからである。最初に、マウスミエローマ株が、ヒトＢリンパ球と融合されて、非抗体産生異種ハイブリッド細胞（例えば、Oestberg（前出）により記載されたＳＰＡＺ−４細胞株）が得られる。次いで、異種細胞は、免疫されたヒトＢリンパ球と融合されて、抗体産生トリオーマ細胞株が生じる。
【００３９】
免疫されたＢ細胞は、ヒトドナーの血液、脾臓、リンパ節、または骨髄から得られる。ヒトＴ細胞またはＣＤ３での生きているヒトのインビボ免疫は、有害な応答を開始する危険のために、通常望ましくない。したがって、Ｂリンパ球は通常、インビトロにおいて、Ｔ細胞、精製ＣＤ３、またはその抗原性フラグメントで免疫される。好ましくは、ヒト形態のＣＤ３が使用される。Ｂリンパ球は、代表的には、７〜１４日間、１０％ヒト血漿を補充したＲＰＭＩ−１６４０（Engleman（前出）を参照）のような培地において、抗原に曝露される。
【００４０】
免疫されたＢリンパ球は、ＳＰＡＺ−４のような異種ハイブリッド細胞に、周知の方法により融合される。例えば、細胞は、４０〜５０％のＭＷ１０００〜４０００のポリエチレングリコールで、約３７℃にて、約５〜１０分間処理される。細胞は融合混合物から分離され、そして所望のハイブリッドについて選択培地（例えば、ＨＡＴまたはＡＨ）中で増殖させられる。必要とされる結合特異性を有する抗体を分泌するクローンは、トリオーマ培養培地を、ＣＤ３またはそのフラグメントに結合する能力についてアッセイすることにより同定される。所望の特異性を有するヒト抗体を産生するトリオーマは、限界希釈技術によりサブクローン化され、そして培養培地中でインビトロで増殖させられる。次いで、得られたトリオーマ細胞株は、ＣＤ３またはそのフラグメントに結合する能力について試験される。
【００４１】
トリオーマは遺伝的に安定であるが、それらは、抗体を非常に高レベルでは産生しない。発現レベルは、抗体遺伝子をトリオーマから１つ以上の発現ベクター中にクローン化し、そしてこのベクターを、組換え免疫グロブリンまたはヒト化免疫グロブリンの発現のために、上記で論じた細胞株のような細胞株中に形質転換することにより増大され得る。
【００４２】
ｂ．トランスジェニック非ヒト哺乳動物
ＣＤ３に対するヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン座の少なくとも１つのセグメントをコードするトランスジーンを有する非ヒトトランスジェニック哺乳動物から産生され得る。通常、このようなトランスジェニック哺乳動物の内因性免疫グロブリン座は、機能的に不活化される。好ましくは、ヒト免疫グロブリン座のセグメントは、重鎖成分および軽鎖成分の再編成されていない配列を含む。内因性免疫グロブリン遺伝子の不活化および外因性免疫グロブリン遺伝子の導入は共に、標的付けられた相同組換え、またはＹＡＣ染色体の導入により達成され得る。このプロセスから得られるトランスジェニック哺乳動物は、免疫グロブリン成分配列を機能的に再編成し得、そして内因性免疫グロブリン遺伝子を発現することなく、ヒト免疫グロブリン遺伝子によりコードされる種々のアイソタイプの抗体レパートリーを発現し得る。これらの特性を有する哺乳動物の作製および特性は、例えば、Lonbergら、WO93/12227（1993)；Kucherlapati、WO91/10741（1991)(これらの各々は、その全体が全ての目的のために参考として援用される）により詳細に記載される。トランスジェニックマウスは特に適切である。抗ＣＤ３抗体は、LonbergまたはKucherlapati（前出）により記載されるようなトランスジェニック非ヒト哺乳動物を、Ｔ細胞、ＣＤ３、またはそれらの抗原性フラグメントで免疫することにより得られ得る。モノクローナル抗体は、例えば、従来のKohler-Milstein技術を用いて、このような哺乳動物由来のＢ細胞を、適切なミエローマ細胞株に融合することにより調製される。
【００４３】
ｃ．ファージディスプレイ法
ヒト抗ＣＤ３抗体を得るためのさらなるアプローチは、ヒトＢ細胞由来のＤＮＡライブラリーを、Huseら、Science 246:1275-1281（1989）により概説される一般的なプロトコルに従ってスクリーニングすることである。ＣＤ３またはそのフラグメントに結合する抗体が選択される。次いで、このような抗体（または結合性フラグメント）をコードする配列がクローン化および増幅される。Huseにより記載されるプロトコルは、ファージディスプレイ技術と組み合わされるとより効率的になる。例えば、Dowerら、WO91/17271およびMcCaffertyら、WO92/01047（これらの各々は、その全体が全ての目的のために参考として援用される）を参照。これらの方法において、メンバーが外側表面上に異なる抗体を提示するファージライブラリーが産生される。抗体は、通常、ＦｖまたはＦａｂフラグメントとして提示される。所望の特異性を有する抗体を提示するファージは、ＣＤ３またはそのフラグメントに対する親和性富化により選択される。
【００４４】
ファージディスプレイ法の変形では、選択されたマウス抗体の結合特異性を有するヒト抗体が産生され得る。Winter、WO92/20791を参照。この方法において、選択されたマウス抗体（例えば、Ｍ２９１）の重鎖または軽鎖いずれかの可変領域が、出発物質として用いられる。例えば、軽鎖可変領域が出発物質として選択される場合、メンバーが同じ軽鎖可変領域（すなわち、マウス出発物質）および異なる重鎖可変領域を提示する、ファージライブラリーが構築される。重鎖可変領域は、再編成されたヒト重鎖可変領域のライブラリーから得られる。ＣＤ３に対して強力な特異的結合（例えば、少なくとも１０８、そして好ましくは、少なくとも１０９Ｍ−１）を示すファージが選択される。次いで、このファージ由来のヒト重鎖可変領域は、さらなるファージライブラリーを構築するための出発物質として供される。このライブラリーでは、各ファージは、同じ重鎖可変領域（すなわち、第１のディスプレーライブラリーから同定された領域）および異なる軽鎖可変領域を提示する。軽鎖可変領域は、再編成されたヒト可変軽鎖領域のライブラリーから得られる。再び、ＣＤ３に対して強力な特異的結合を示すファージが選択される。これらのファージは、完全にヒトの抗ＣＤ３抗体の可変領域を提示する。これらの抗体は、通常、マウス出発物質（例えば、Ｍ２９１）と同一もしくは類似のエピトープ特異性を有する。
【００４５】
IV．治療方法
本発明の抗体を含有する薬学的組成物は、所望でない免疫応答を顕現する病的状態を罹っているか、またはその危険にある患者への非経口（すなわち、皮下、筋肉内、そして特に静脈内）投与に有用である。このような病的状態は、自己免疫疾患、移植片拒絶（特に、心臓、肺、腎臓、または肝臓の移植の後）、対宿主性移植片病（骨髄移植の後）、炎症、アレルギー反応、および敗血症を含む。例示的な自己免疫疾患は、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、および炎症性腸疾患である。薬学的組成物は、急性発赤またはこれらもしくは他の自己免疫疾患の悪化の処置に特に有用である。
【００４６】
非経口投与のための組成物は、通常、受容可能なキャリア（好ましくは、水性キャリア）中に溶解した抗体の溶液またはそれらのカクテルを含む。種々の水性キャリア（例えば、水、緩衝化水、０.４％生理食塩水、０.３％グリシンなど）が用いられ得る。これらの溶液は無菌であり、そして一般に粒子状物質を含まない。組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる、ｐＨ調整剤および緩衝化剤、毒性調整剤などのような薬学的に受容可能な補助物質（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム）を含み得る。こらの処方物における抗体の濃度は、広範に（すなわち、約０.０１重量％未満から、通常、少なくとも約０.１重量％〜５重量％程度まで）変化し得、そして選択される特定の投与様式に従い、主に液体の容量および粘性に基づいて選択される。
【００４７】
静脈内注入のための代表的な組成物は、２５０ｍｌの滅菌リンゲル溶液および１０ｍｇ〜１００ｍｇの抗体を含むように作製され得る。Remington's Pharmaceutical Science（第15版、Mack Publishing Company,Easton, Pennsylvania, 1980）を参照。
【００４８】
本発明の抗体を含む組成物は、予防的および/または治療的処置のために投与され得る。治療的適用では、組成物は、既に罹患した患者に、その病的状態および合併症を治癒させるかまたは少なくとも部分的に抑制するに十分な量で投与される。これを達成するに適切な量は、「治療有効用量」として定義される。この使用に有効な量は、病的状態の重篤度および患者自身の免疫系の一般的状態に依存するが、一般に、１用量あたり約０.０１〜約１００ｍｇの抗体の範囲であり、１患者あたり約０.１〜５０ｍｇの投薬量および１〜１０ｍｇの投薬量がより通常に用いられる。単回投与または１日毎、１週間毎、または１ヶ月毎のスケジュールでの複数回投与が、実施され得る。用量レベルおよびパターンは、処置医により選択される。
【００４９】
予防的適用では、抗体を含む組成物は、疾患状態を進展させる危険にある患者に投与されて患者の抵抗性を増強する。このような量は、「予防有効用量」として定義される。この使用において、正確な量は、再び、患者の健康状態および免疫の一般レベルに依存するが、しかし一般的には、１用量あたり０.１〜１００ｍｇ、特に１患者あたり１〜１０ｍｇの範囲である。
【００５０】
IV．診断方法
Ｍ２９１抗体（マウスおよびヒト化形態の両方）はまた、病原性生物に感染した患者の免疫学的モニタリング（例えば、ＡＩＤＳ患者のＴ細胞数の決定）または免疫系の障害を有する患者の免疫学的モニタリングにおける診断方法に有用である。診断の方法は、インビトロで患者由来の細胞サンプル（例えば、血液サンプル、リンパ節生検または組織）を用いて実施され得るか、またはインビボ画像化により実施され得る。Ｍ２９１抗体はまた、白血球サブタイプを分類することにおける調査目的のために、例えば、抗体パネルの一部として用いられ得る。このような目的のためには、Ｍ２９１は、好ましくは、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、または他の当該分野で公知のアッセイ形式において用いられる。
【００５１】
実施例
１．材料および方法
ａ．Ｖ領域ｃＤＮＡのクローン化
ＯＫＴ３のＨ鎖およびＬ鎖のＶドメインｃＤＮＡを、Coら、J.Immunol. 148, 1149（1992）により記載される係留ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法により、ＯＫＴ３を発現するハイブリドーマ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ ８００１）からクローン化した。増幅を、マウスγ鎖およびκ鎖のＣ領域にそれぞれアニールする３'プライマー、ならびにそのｃＤＮＡの付加されたＧテイルにアニールする５'プライマーを用いてｃＤＮＡについて実施した。ＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを、配列決定のためにｐＵＣ１９ベクターにサブクローン化した。これらの配列は、Woodleら（Woodleら、J.Immunol.148, 2756（1992）を参照）によって公開された配列と同一であった。
【００５２】
ｂ．キメラ抗ＣＤ３抗体の発現
ＯＫＴ３のＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡから、シグナル配列、Ｊセグメント、およびスプライスドナー配列を含むエキソンを作製し、そしてＸｂａＩ部位により包囲した（Coら、J.Immunol. 148, 1149（1992)を参照）。ＶＬ配列を発現ベクターｐＶｋ.ｒｇのＸｂａＩ部位に挿入し、そしてＶＨ配列を種々の重鎖発現ベクター（例えば、ｐＶｇ２.Ｄ.Ｔｔ）に同様に挿入した。ベクターｐＶｋ.ｒｇは、ｇｐｔ単位の方向が逆転していることを除いて、ｐＶｋ（Coら、同書）と同様である。ベクターｐＶｇ２.Ｄ.Ｔ.ｔはｐＶｇ１（Coら、同書）と同様であるが、γ１の代わりにγ２定常領域（EllisonおよびHood、前掲書）を含むゲノムフラグメントを含み、そしてヒト補体遺伝子Ｃ２の転写ターミネーター（Ｔｔ)(Ｃ２ポリＡ部位から＋３７〜＋１６２ｂｐ；Ashfieldら、EMBOJ. 10, 4197（1991)を参照）を含む。種々のヒト重鎖ベクターは、Ｆｃコード配列のみが異なる。１つのプラスミドにおける重鎖および軽鎖の同時発現のためには、ｈＣＭＶプロモーター、重鎖遺伝子全体、ポリＡシグナル、および転写終結シグナルを含むＥｃｏＲＩフラグメントを重鎖発現ベクターから採取し；そして軽鎖発現プラスミドの唯一のＥｃｏＲＩ部位にクローン化する（図２）。得られる各プラスミドは、１つのベクター中にコードされる重鎖および軽鎖の両方を有する。これらの間に位置する転写終結シグナル（Ｔｔ）の存在に起因して、２つの遺伝子は、ｈＣＭＶプロモーターにより独立して転写される（Boshartら、Cell41, 521（1985)を参照）。１つの場合において、ヒトγ１定常領域遺伝子のＣＨ１エキソンおよびヒンジのみを含ませ、そしてヒンジエキソンがロイシンジッパーＦｏｓをコードするＤＮＡと融合させてキメラＦ(ａｂ')２Ｆｏｓを作製した（Tsoら、J.Hematother.4, 389（1995)を参照）。特定の抗体の発現のために、対応するプラスミドを、エレクトロポレーションによりマウスミエローマ細胞株ＴＳ０中にトランスフェクトした。ＴＳ０細胞は、マウスミエローマＮＳ０細胞（ＥＣＡＣＣ８５１１０５０３）から、Satoらの手順（Satoら、J.Exp.Med. 165, 1761（1987)を参照）に従い、無血清培地中で増殖する能力について選択することにより誘導される。各トランスフェクション由来の細胞を、ｇｐｔ発現について選択した。トランスフェクタントを無血清培地中で増殖させ、そして消費培養物からプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーにより抗体を精製した。
【００５３】
ｃ．γ２およびγ４ ＣＨ２エキソンの変異誘発
ＰＣＲ手順を使用して、γ２およびγ４エキソンのＣＨ２領域中に変異を導入した。各変異誘発のために、変異させた配列を含む２つの相補的プライマーを合成した。これらのうちの一方を、ＰＣＲ反応によって５'部分を合成するための上流プライマーと共に使用し、そして他方を、所望のフラグメントの３'部分を合成するための下流プライマーと共に使用した。野生型Ｆｃ配列をテンプレートとして使用した。次いで、２つのＰＣＲ産物を混合し、アニールさせ、そして上流プライマーおよび下流プライマーを使用して再び増幅した。γ２変異誘発のために、使用した上流プライマーは、５'ＧＧＡＣＡＣＣＴＴＣＴＣＴＣＣＴＣＣＣ（配列番号１０）であり、そして下流プライマーは、５'ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＴＧＧＧＣＣＧＡＧＣＣＧＧＣＣＴＣＴＧＴＣＣ（配列番号１１）であった。これらのプライマーは、それぞれ、ヒンジエキソンおよびＣＨ２エキソンに隣接する。変異体１のための２つの相補的プライマーは、５'ＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＣＧＧＣＡＧＧＡＣＣＧＴＣＡ（配列番号１２）および５'ＴＧＡＣＧＧＴＣＣＴＧＣＣＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣ（配列番号１３）であった。他の全てのＩｇＧ２変異体のための相補的プライマーは、変異させたコドンを除いて同様であった。増幅反応産物を、ＰｓｔＩおよびＳｆｉＩ（ヒンジエキソンおよびＣＨ２エキソンに隣接する２つの制限部位）で切断し、そして生じた５２５ｂｐフラグメントを、ＩｇＧ２発現ベクターのＰｓｔＩ部位とＳｆｉＩ部位との間に導入した。同様に、変異誘発させた２４１ｂｐのＰｓｔＩ−ＰｍｌＩフラグメントをγ４のＣＨ２エキソンについて産生し、そしてＩｇＧ４発現ベクター中に導入した。配列分析を、各発現ベクターについて行い、所望の変異のみが導入されたことを確認した。
【００５４】
ｄ．Ｔ細胞増殖アッセイ
ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ中の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、９６ウェルマイクロタイタープレートに１ウェル当たり２×１０５細胞でプレートした。種々の濃度で抗体を添加し、そして細胞を３７℃にて３日間インキュベートした。［３Ｈ］チミジンを１ウェル当たり１μＣｉで添加し、そして収集前にプレートをさらに１２時間インキュベートした。細胞を細胞ハーベスターで収集し、そして［３Ｈ］チミジン取り込みを液体シンチレーションカウンターで測定した。全てのデータを３連の測定の平均として表した。
【００５５】
ｅ．ＦｃＲＩＩ依存性Ｔ細胞再標的アッセイ
活性化したヒトＴ細胞を、１０％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ培地中でＰＢＭＣをフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）と共に３７℃にて３日間インキュベートし、続いてＩＬ−２を含有する培地中で５日間継代することによって得た。Ｋ５６２細胞（ＦｃＲＩＩを発現する）を、１００μＣｉの５１Ｃｒを１ｍｌのＲＰＭＩ培地中の５×１０６個の標的細胞に添加することにより、５１Ｃｒで標識した。３７℃での１時間のインキュベーション後、細胞を２回洗浄した。Ｔ細胞（５０ｍｌ）および標識したＫ５６２標的細胞（５０ｍｌ中７×１０４個）を、Ｕ底マイクロタイタープレート中に２５：１のエフェクター：標的の比でプレートした。次いで、所望の濃度でキメラ抗ＣＤ３抗体を添加した。全てのサンプルを３連でプレートした。プレートを遠心し、３７℃にて４時間インキュベートし、そして再び遠心した。各サンプルからの１００μlの無細胞上清中に放出された５１Ｃｒの量を測定することによって、細胞溶解を測定した。計数をBeckmanモデル5500ガンマカウンターで行った。特異的な溶解の割合を以下の式によって決定した：（Ｅ−Ｓ/Ｍ−Ｓ）×１００。ここで、Ｅは、サンプルについての３連のサンプルカウント/分の平均であり、Ｓは、標的細胞のみを有するサンプル中の自発放出であり、そしてＭは、標的細胞および１００μlの１％ＳＤＳを有するサンプルについての最大放出である。
【００５６】
ｆ．ＣＤ３抗原に対するキメラＯＫＴ３抗体の相対的なアビディティを比較するための競合アッセイ
ヒトＴ細胞を、完全ＲＰＭＩ培地に２.５×１０６細胞/ｍｌで再懸濁した。試験（キメラＯＫＴ３）抗体またはコントロール（マウスＯＫＴ３）抗体の希釈物を添加し、そして４℃にて１時間インキュベートした。固定した亜飽和量のＦＩＴＣ結合マウスＯＫＴ３を添加し、そして細胞を４℃にて１時間インキュベートし、洗浄し、そして１％パラホルムアルデヒド中で再懸濁した。次いで、細胞をフローサイトメトリーを使用して分析した。各サンプルの蛍光強度を、競合抗体を含まないコントロールの蛍光強度と比較した。値を、コントロールの蛍光強度に対する百分率で表す。
【００５７】
ｇ．抗ＣＤ３媒介性サイトカイン放出およびＣＤ２５発現
ＰＢＭＣおよび抗体を、Ｔ細胞増殖アッセイと同様にプレートした。サンプルを、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２測定のために２４時間目に取り出し、そしてＩＮＦ−γ測定のために７２時間目に取り出した。市販のアッセイキットを使用して、培地中のＴＮＦ−αおよびＩＮＦ−γのレベルを測定した。ＩＬ−２のレベルを、ＩＬ−２依存性細胞株ＨＴ−２を使用する増殖アッセイによって測定した。９０時間目の活性化マーカーＩＬ−２レセプター−α（ＣＤ２５）を発現するＴ細胞の割合を、二色ＦＡＣＳアッセイを使用して測定した。ヒト化ＦＩＴＣ結合抗Ｔａｃ抗体を使用して、Ｔ細胞表面上の活性化マーカーＣＤ２５を標識し、そしてマウス抗ヒトＣＤ７抗体を、ＰＥ結合ヤギ抗マウスＩｇＧと併用して使用し、全Ｔ細胞を標識した。２つの細胞数の比をＣＤ２５ポジティブであるＴ細胞の百分率として表す。
【００５８】
２．結果
ａ．ＩｇＧ２のＣＨ２領域における変異
全ての野生型ＩｇＧアイソタイプのＣＨ２領域における配列を図３に示す。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、この領域において同一の配列Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを有し；そしてＩｇＧ４は、２３４位にＰｈｅ残基を有することのみが異なる。しかし、ＩｇＧ２は、この領域に非常に異なる配列を有する。２３６位のアミノ酸を欠いていることに加えて、ＩｇＧ２は、残りの３つの位置のうちの２つの位置（２３４および２３５）がＩｇＧ１、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４の配列と異なる。ＩｇＧ２の独特な配列ＶａｌＡｌａ   Ｇｌｙは、ＦｃＲＩＩのみに対する特異性を説明し得る。
【００５９】
変異を、一度に一つまたは組合せのいずれかで、この領域の全ての残基をカバーするように導入した。作製した５つのＩｇＧ２Ｆｃ改変体の２３４位〜２３７位の配列を、図３に示す。最初の３つの変異体は、Ａｌａ走査変異(scannig mutation)であった。２３５位は既にＡｌａ残基であるので、２３５位に変化させなかった。変異体４および５においては、２３５位もＧｌｕ残基に変化させた。マウスＩｇＧ２ｂアイソタイプの抗ＣＤ３（分裂促進性でない）は、この位置にＧｌｕ残基を有する。比較のために、ＩｇＧ４の２３４位および２３５位に２つのＡｌａ置換を含む変異体を作製した（Alegreら、Transplantation,57, 1537（1994）を参照）。ＩｇＧ２変異体３の重鎖定常領域の全体配列を図４に示す。
【００６０】
５つのＩｇＧ２変異体定常領域を、ＯＫＴ３可変領域と組み合わせることによってキメラＯＫＴ３抗体に組み込んだ。２３４位および２３５位に２つのＡｌａ置換を有するＩｇＧ４改変体および全ての天然ヒトＩｇＧアイソタイプも同様に行った。さらに、ＩｇＧ１に由来するキメラＯＫＴ３Ｆ(ａｂ')２を、ロイシンジッパー技術（Kostelnyら、J.Immunol., 148, 1547（1992）を参照）によって作製した。組換えＦ(ａｂ')２には、Ｆｃが全くない。これらのＯＫＴ３キメラ抗体およびフラグメントの全てを、８人のドナーからのヒトＰＢＭＣを使用する分裂促進アッセイでＴ細胞増殖について試験した。複数のドナーを使用した。なぜなら、ＰＢＭＣは、Ｆｃレセプターの多型性に起因して、抗ＣＤ３に対し異なって応答し得るからである。有用な抗ＣＤ３改変体は、好ましくは、ほとんどまたは全てのドナーからのＴ細胞に対して非分裂促進性であるべきである。異なる濃度の抗体もまた使用して、Ｔ細胞活性化が臨床的に関連する用量範囲で生じないことを確かめた。
【００６１】
ｂ．抗ＣＤ３ ＩｇＧ２変異体における減少した分裂促進活性
Ｔ細胞増殖アッセイの結果を図５に示す。ＩｇＧ１およびＩｇＧ４アイソタイプの抗ＣＤ３抗体は、試験したほとんどのドナーにおいて分裂促進性であり、そしてＩｇＧ２およびＩｇＧ３アイソタイプの抗ＣＤ３に対するドナーの応答に変動が存在した。５つ全てのＩｇＧ２変異体は、ＰＢＭＣにおける分裂促進活性を減弱していたが、野生型ＩｇＧ２は顕著な増殖を与えた。変異体２〜５は、最も少ない増殖を誘導した。ほとんどのドナーサンプルに対して、変異体２〜５の分裂促進活性は、Ｆｃの無いＦ(ａｂ')２の分裂促進活性と同程度に低く、そしてＩｇＧ４変異体より分裂促進性が小さかった。１つのドナー（Ｄ）においてのみ、高い抗体濃度（１μｇ/ｍｌ）で、著しい増殖がこれらの変異体について観察されたが、これは、サイトカイン放出ともＴ細胞活性化マーカーＣＤ２５の誘導とも関連しなかった。したがって、変異体２〜５は、不活化抗体の特性を有する。詳細には、それらは、ＩｇＧ４変異体よりずっと増殖を誘導しない。ＩｇＧ４変異体は、高濃度（１μｇ/ｍｌ）のＩｇＧ１および変異していないＩｇＧ４と同程度であった。
【００６２】
Ｃ．抗ＣＤ３ ＩｇＧ２変異体３は、ＦｃとＦｃＲＩＩとの相互作用に依存する再標的を媒介しない
Ｆｃレセプターを有する細胞およびＴ細胞を、抗ＣＤ３抗体が機能的なＦｃを有する場合、抗ＣＤ３抗体によって架橋し得る。このような架橋は、Ｔ細胞がＦｃレセプターを有する細胞を溶解（逆向溶解）することを誘発し得る。これは、抗ＣＤ３ＩｇＧ２変異体とＦｃレセプターとの相互作用についてプローブする高感度なアッセイを提供する。変異体３をこのアッセイにおける代表的なＩｇＧ２変異体として選んだ。ＩｇＧ２は主にＦｃＲＩＩと相互作用するので、Ｋ５６２細胞（これは、その表面上にＦｃＲＩＩを発現する）を、ＩｇＧ２変異体３媒介性逆向溶解についての標的細胞として使用した。データを図６に示す。抗ＣＤ３ＩｇＧ２変異体３は、逆向溶解を媒介することにおいて、Ｆ(ａｂ')２形態の抗体と同程度に不活性であったが、野生型ＩｇＧ２は、Ｋ５６２細胞の特異的溶解を３２％まで媒介し得た。ＩｇＧ１アイソタイプの活性は、ＦｃＲＩＩに対する低い親和性に起因して低かったが、ＩｇＧ１アイソタイプはなお、高い抗体濃度でＩｇＧ２レベルと等しい溶解を媒介し得た。別の実験において、抗ＣＤ３ＩｇＧ２および変異体３は共に、ＦｃＲＩ依存性逆向溶解を媒介することにおいて効果的でなかった。したがって、ＩｇＧ２変異体３のＦｃに導入した変異は、ＦｃＲＩに対するＩｇＧ２の乏しい親和性を逆転しなかった。これらの実験によって、変異体３は、ＦｃＲＩおよびＦｃＲＩＩに対する非常に低い親和性を有することを確認した。
【００６３】
ｄ．抗原に対するキメラ抗ＣＤ３のアビディティは、実質的に、アイソタイプによってもＦｃ変異によっても影響されなかった
ＯＫＴ３ ＩｇＧ２変異体３によるＴ細胞活性化またはＦｃＲＩＩ媒介性逆向溶解の欠如が、そのＴ細胞への結合の欠如に起因する可能性を排除するために、マウスＯＫＴ３、キメラＯＫＴ３Ｆ(ａｂ')２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ２変異体３のＴ細胞に対する相対的なアビディティを上記の競合アッセイを使用して評価した。キメラＯＫＴ３ＩｇＧ１は、ＦＩＴＣ標識マウスＯＫＴ３ならびに非標識ＯＫＴ３の結合をブロックした（図７）。したがって、この抗体は、マウスのＯＫＴ３のアビディティと非常によく似たアビディティを有さなければならない。キメラＯＫＴ３ＩｇＧ２およびＩｇＧ２変異体３は、ＦＩＴＣ標識マウスＯＫＴ３の結合をブロックすることにおいて、非標識ＯＫＴ３よりわずかに効率的でなかった。それらのアビディティを、キメラＩｇＧ１のアビディティと比較して１/２〜２倍から１/３〜３倍までの範囲内であると推定した。したがって、この実験は、ＩｇＧ２およびその変異体の抗原結合活性が、実質的に維持されたことを示した。類似のアビディティを有する野生型ＩｇＧ２は、適切なドナー由来のＰＢＭＣにおいてＴ細胞を活性化し得たので、このようなアビディティのわずかな減少は、変異体３におけるアビディティの欠如を説明するに十分ではない。
【００６４】
ｅ．抗ＣＤ３ ＩｇＧ２変異体３はサイトカイン放出を誘導しない
次に、Ｔ細胞において、サイトカイン放出を誘導し、そしてＩＬ−２レセプターをアップレギュレートするＩｇＧ２変異体の能力を試験した。先に試験した８人のドナーのうち６人からのＰＢＭＣを、異なる濃度のキメラＯＫＴ３Ｆ(ａｂ')２ならびにキメラＯＫＴ３のアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ２変異体３と共に播種し；そして上清を、２４時間での活性化マーカーＴＮＦ−αおよびＩＬ−２；ならびに７２時間でのＩＦＮ−γについて試験した。さらに、Ｔ細胞を、９０時間での活性化マーカーＩＬ−２レセプター−α（ＣＤ２５）についてアッセイした。結果を図８および９に示す。予測されたとおり、ＩｇＧ１が、３つのサイトカインの放出およびＣＤ２５発現の誘導において最も活性であった。また、６人すべてのドナーにおいて、ＩｇＧ２により、測定可能な、ＣＤ２５の誘導およびサイトカイン放出が存在した。一方、ＩｇＧ２変異体３は、試験した３つの抗体の中で最も活性化が少なかった。全ての場合において、これらの活性化マーカーは、バックグラウンドを超えてかろうじて検出可能であった。ＩｇＧ２変異体３の高濃度（１μｇ/ｍｌ）で先にいくらかの増殖が観察されたドナーＤにおいてさえ（図５）、これらの活性化マーカーの発現は無視し得た。これらのアッセイに基づいて、抗ＣＤ３ＩｇＧ２変異体３は、Ｔ細胞活性化において最小限の効果を有するようであり、そしてこれらの実験において試験したすべての抗体の中で最も安全である。
【００６５】
３．ヒト化Ｍ２９１抗体の構築
ａ．マウスＭ２９１可変領域ｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定
マウスＭ２９１重鎖および軽鎖可変領域ｃＤＮＡを、ハイブリドーマ細胞から単離したｍＲＮＡから、係留ＰＣＲ（Coら、J.Immunol. 148: 1149（1992)）を使用してクローン化した。使用した５'プライマーは、ｃＤＮＡに付加したポリｄＧテイルにアニーリングし、そして３'プライマーは、定常領域にアニーリングした。次いで、増幅したＤＮＡフラグメントをｐＵＣ１９に挿入し、そしていくつかの重鎖および軽鎖クローンを配列決定し、それぞれが同じであることを見出した。これらの可変領域ｃＤＮＡ配列およびそれらに由来するアミノ酸配列を、図１Ａおよび図１Ｂに示す。
【００６６】
ｂ．ヒト化Ｍ２９１可変領域の設計
ヒト化抗体においてマウス抗体の結合親和性を保持するために、Queenらの一般手順に従った（Queenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86: 10029（1989)およびWO90/07861）。フレームワーク残基の選択は、高結合親和性を保持することにおいて重要であり得る。原則的に、任意のヒト抗体由来のフレームワーク配列は、ＣＤＲ移植のためのテンプレートとして役立つ；しかし、このようなフレームワークへのストレートなＣＤＲ置換は、抗原に対する結合親和性の顕著な喪失を導き得ることが実証されている（Glaserら、J.Immunol.149: 2606（1992)；Tempestら、Biotechnology 9：266（1992)；Shalabyら、J.Exp.Med. 17: 217（1992)）。ヒト抗体が元のマウス抗体に対してより相同であればあるほど、ヒトフレームワークが、親和性を低減させ得る歪みを、マウスＣＤＲ中へ導入する可能性は減少する。抗体配列データベースに対する配列相同性検索に基づけば、ヒト抗体ＨＦ２−１/１７は、マウスＭ２９１軽鎖可変領域に対して良好なフレームワーク相同性を提供し、そしてヒト抗体２１/２８は、マウスＭ２９１重鎖可変領域に対して良好なフレームワーク相同性を提供する。しかし、他の高度に相同なヒト抗体、特にヒトサブグループＩ由来のκ軽鎖またはヒトサブグループＩ由来の重鎖もまた、適切である（Kabatら（前出）によって規定される）。
【００６７】
コンピュータープログラムＥＮＣＡＤ（Levittら、J.Mol.Biol. 168: 595（1983)）を使用して、Ｍ２９１可変ドメインの分子モデルを構築した。これを使用して、Ｍ２９１フレームワークにおいて、それらと潜在的に相互作用するためにそのＣＤＲに充分近接であるアミノ酸を配置した。ヒト化Ｍ２９１軽鎖可変領域および重鎖可変領域を設計するために、マウスＭ２９１抗体由来のＣＤＲを、それぞれヒトＨＦ２−１/１７および２１/２８抗体の軽鎖および重鎖のフレームワーク領域に移植した。コンピューターモデルがＣＤＲとの顕著な接触を示唆するフレームワーク位置で、マウス抗体由来のアミノ酸を、元のヒトフレームワークアミノ酸と置換した。ヒト化Ｍ２９１について、これを、重鎖の残基３０、６７、６８、７０、７２、および７４にて行い、そして軽鎖の残基では行わなかった。また、ヒト抗体のデータベースにおいてそれらの位置でまれに存在するフレームワーク残基を、その位置のヒトコンセンサスアミノ酸により置換した。ヒト化Ｍ２９１について、これを重鎖の残基４４にて行った。
【００６８】
ヒト化Ｍ２９１抗体（ＨｕＭ２９１）軽鎖可変領域および重鎖可変領域の最終的な配列を図１Ｃおよび１Ｄに示す。しかし、潜在的なＣＤＲ接触残基の多くはは、抗体が抗原に対する実質的な親和性をなお保持することを可能にし得る他のアミノ酸の置換を受け入れ得る。以下の表は、代替のアミノ酸が適切であり得るフレームワーク中の多数の位置を列挙する（ＬＣ＝軽鎖、ＨＣ＝重鎖）：
位置          ＨｕＭ２９１      代替物
ＬＣ−６９          Ｄ            Ｅ、Ｓ
ＨＣ−３０          Ｉ            Ｔ，Ｖ，Ｌ
ＨＣ−４４          Ｇ            Ｒ
ＨＣ−６７          Ｋ            Ｒ
ＨＣ−６８          Ａ            Ｖ
ＨＣ−７０          Ｌ            Ｉ、Ｖ
ＨＣ−７２          Ａ            Ｒ
同様に、ヒト化Ｍ２９１可変ドメインにおいてＣＤＲと接触しない多くのフレームワーク残基は、ヒト化抗体の親和性または非免疫原性の顕著な損失を伴うことなく、ヒトＨＦ２−１/１７および２１/２８抗体の対応位置由来か、他のヒト抗体由来か、マウスＭ２９１抗体由来か、または他のマウス抗体由来のアミノ酸の置換に適応し得る。以下の表は、代替アミノ酸が適切であり得るフレームワーク中の多くのさらなる位置を列挙する：
位置          ＨｕＭ２９１      代替物
ＬＣ−３            Ｑ              Ｖ
ＬＣ−４            Ｍ              Ｌ
ＨＣ−１            Ｑ              Ｅ
ＨＣ−７５          Ｓ            Ａ、Ｔ
ＨＣ−８１          Ｍ            Ｉ、Ｌ，Ｖ
代替アミノ酸の組合せの選択を使用して、親和性、特異性、非免疫原性、製造の容易さ、および他の所望の特性の種々の組合せを有する形のヒト化Ｍ２９１を生成し得る。したがって、上記の表における例は、例示のために提供されるのであり、限定のために提供されるのではない。
【００６９】
ｃ．ヒト化Ｍ２９１の構築
一旦、ヒト化可変領域アミノ酸配列が上記のように設計された後、シグナルペプチド、スプライスドナーシグナル、および適切な制限部位を含み、上記アミノ酸配列をコードするようにＤＮＡセグメントを構築した。それぞれの可変領域コードセグメントを構築し、そして以下の４段階で１０個の重複する合成オリゴヌクレオチドを使用して増幅した：（１）重複オリゴヌクレオチドの４つの中央の対を変性させ、アニーリングさせ、そしてＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントで伸長させて、８つのより短いオリゴヌクレオチドから４つのより長い重複オリゴヌクレオチドを生成し；（２）これらの４つのオリゴヌクレオチドを変性して、次いで同様に組み合わせて２つのＤＮＡの重複フラグメントを形成し；（３）得られたオリゴヌクレオチド対を、同様に接合しコードセグメントの中央部分を形成し；そして（４）最後の２つの隣接オリゴヌクレオチド（両方ともＸｂａＩ制限部位を含む）をＰＣＲで使用して、コードセグメントをの増幅を完了した。
【００７０】
ヒト化可変領域コードセグメントを、ヒトCκコードセグメントまたはヒトＣγ２変異体３コードセグメント、またはヒトＣγ１コードセグメントのいずれかを含むヒト発現ベクター（すなわち、それぞれ、上記のようなｐＶｋ.ｒｇおよびｐＶｇ２.Ｄ.Ｔｔ）または類似ベクターｐＶｇ１.Ｄ.Ｔｔに挿入した。次いで、軽鎖および重鎖をコードするセグメントを、それぞれ、上記のように発現ベクターに挿入した（図２を参照のこと）。２つの発現プラスミドを、トランスフェクションのための準備においてＦｓｐＩで直線状にした。およそ２０μｇの各プラスミドを、製造者の指示に従い１５００Ｖおよび３μＦでの２つのパルスでＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ装置（Bio-Rad）を用いて、1×１０７個のＴＳ０細胞に別々にトランスフェクトした。細胞を９６ウェルの組織培養プレートに播種し、そして２日後に、選択培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、１×ペニシリン-ストレプトマイシン（Ｐ/Ｓ)(Gibco）、１×ＨＴ補助因子（Sigma）、０.２５ｍｇ/ｍｌキサンチン、１μｇ/ｍｌミコフェノール酸）を適用した。
【００７１】
およそ２週間後、出現したクローンを、ＥＬＩＳＡにより抗体産生についてスクリーニングした。高度にＩｇＧ１を産生するクローンおよびＩｇＧ２変異体３クローン由来の抗体を、細胞を血清無添加培地においてコンフルエンシーまで細胞を増殖させ、そして細胞が死滅するまで培養することにより調製した。培養上清を、プロテインＧセファロースカラム（Pharmacia）上に流し込み；抗体を０.１Ｍグリシン−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ２.５で溶出し、続いてリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析した。抗体の純度は、アクリルアミドゲル上でそれを流すことにより確認し、そしてその濃度は、１.３ｍｇの抗体タンパク質がＯＤ２８０読み取り値１.０を有すると仮定してＯＤ２８０読み取りにより決定した。
【００７２】
ｄ．ヒト化Ｍ２９１の特性
ＣＤ３への結合についてマウスＭ２９１抗体と競合するヒト化Ｍ２９１抗体の能力を評価して、それにより結合親和性を測定するために、漸増する抗体濃度を、それぞれ１２.５ｎｇのトレーサ１２５Ｉ標識マウス抗体と混合し、そして０.２ｍｌの結合緩衝液（２％仔ウシ血清、０.１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）中の４×１０５のＩＬ−２活性化ヒトＴ細胞とともに氷上で９０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、そして遠心分離し、そしてそれらの放射活性を測定した。結合した抗体と遊離抗体との比を計算した。結合親和性をBerzofskyおよびBerkowerの方法に従って計算した（J.A.BerzofskyおよびI.J.Berkower、FundamentalImmunology, W.E.Paul編、Raven Press, New York、1984）。マウスＭ２９１およびＩｇＧ１ Ｍ２９１抗体は等量の効率で競合し（図１０）、そしてＫａ＝１.６×１０９Ｍ−１という非常に高い計算上の親和性を有しており、それゆえヒト化手順がもとの抗体の結合親和性を有意には変化させなかった。ヒト化ＩｇＧ２変異体３（ＩｇＧ２Ｍ３）抗体は、わずかにより少なく良好に競合しなかった。これはおそらく、ＩｇＧ２ヒンジ領域の、より大きい硬直性のためである。しかし、これはなお、Ｋａ＝５×１０８Ｍ−１という高い親和性を有していた。
【００７３】
種々のドナー由来のＰＢＭＣを用いてＴ細胞増殖およびリンホカイン放出を誘導するヒト化Ｍ２９１ＩｇＧ２Ｍ３抗体の能力は、上記のキメラＯＫＴ３ ＩｇＧ２変異体について上述した実験に類似した実験において評価した。それらの変異体のように、ヒト化Ｍ２９１ ＩｇＧ２Ｍ３抗体は、より少ない増殖を誘導し、そしてほとんどまたは全てのドナーからのサイトカインＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αならびにＩＬ−２の放出は全くないか低減していた（図１１）。
以上に引用したすべての刊行物および特許出願は、本明細書中で参考としてその全体が、各々の刊行物または特許出願が、特異的におよび個々に、そのように参考として援用されると示されるのと同程度の全ての目的のために援用される。本発明は、明瞭さおよび理解の目的で図面および実施例によりいくらか詳細が記載されているが、特定の変化および改変が添付の請求の範囲の範囲内で実施され得ることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１Ａ】マウス（Ａ〜Ｂ）またはヒト化（Ｃ〜Ｄ）Ｍ２９１抗体の軽鎖（Ａ、Ｃ）および重鎖（Ｂ、Ｄ）可変領域のｃＤＮＡ配列（配列番号：１、３、５、および７）および翻訳アミノ酸配列（配列番号：２、４、６、および８）である。各成熟鎖の第１のアミノ酸を、二重下線により示す。各鎖の３つのＣＤＲに下線を付す。
【図１Ｂ】マウス（Ａ〜Ｂ）またはヒト化（Ｃ〜Ｄ）Ｍ２９１抗体の軽鎖（Ａ、Ｃ）および重鎖（Ｂ、Ｄ）可変領域のｃＤＮＡ配列（配列番号：１、３、５、および７）および翻訳アミノ酸配列（配列番号：２、４、６、および８）である。各成熟鎖の第１のアミノ酸を、二重下線により示す。各鎖の３つのＣＤＲに下線を付す。
【図１Ｃ】マウス（Ａ〜Ｂ）またはヒト化（Ｃ〜Ｄ）Ｍ２９１抗体の軽鎖（Ａ、Ｃ）および重鎖（Ｂ、Ｄ）可変領域のｃＤＮＡ配列（配列番号：１、３、５、および７）および翻訳アミノ酸配列（配列番号：２、４、６、および８）である。各成熟鎖の第１のアミノ酸を、二重下線により示す。各鎖の３つのＣＤＲに下線を付す。
【図１Ｄ】マウス（Ａ〜Ｂ）またはヒト化（Ｃ〜Ｄ）Ｍ２９１抗体の軽鎖（Ａ、Ｃ）および重鎖（Ｂ、Ｄ）可変領域のｃＤＮＡ配列（配列番号：１、３、５、および７）および翻訳アミノ酸配列（配列番号：２、４、６、および８）である。各成熟鎖の第１のアミノ酸を、二重下線により示す。各鎖の３つのＣＤＲに下線を付す。
【図２】キメラ抗ＣＤ３抗体を発現するプラスミド構築物。ＯＫＴ３のＶＨおよびＶＬｃＤＮＡから、ＸｂａＩ部位に隣接したエキソンを作製した。ＶＬ配列を発現ベクターｐＶｋ.ｒｇ中に組み込み、そしてＶＨ配列を重鎖発現ベクターｐＶｇ２.Ｄ.Ｔｔ中に組み込んだ。次いで、２つのプラスミドを組換え、重鎖および軽鎖を同時発現する１つの単一プラスミドを生成した。ＰｓｔＩおよびＳｆｉＩ部位は、これらのプラスミドにおいて特有ではない。
【図３】４つのヒトＩｇＧアイソタイプ、５つのＩｇＧ２変異体、および１つのＩｇＧ４変異体のＣＨ２領域における配列。残基について、ＥＵ番号付けシステムを使用した。
【図４】ＩｇＧ２変異体３の重鎖定常領域におけるアミノ酸配列（配列番号９）。ＣＨ１ドメインは残基１１８〜２１５から、ヒンジは残基２１６〜２３０から、ＣＨ２は残基２３１〜３４０から、そしてＣＨ３は残基３４１〜４４７からなる。記号「−」は、ＥＵとの正確なアライメントのために導入されたスペースを示す。野生型ＩｇＧ２から変異した残基に下線を付す。残基２３４〜２３７を除いて、５つのＩｇＧ２変異体は全て同一配列を有する。５つの変異体についてのその領域における配列を、図３に示す。全ての残基を、ＥＵ番号付けシステムに従って命名する。
【図５】キメラＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体に応答したＴ細胞増殖。キメラ抗ＣＤ３抗体により誘導された８人のヒトドナー（ドナーＡ〜Ｈ）由来のＰＢＭＣによる［３Ｈ］−チミジン取り込みを測定した。ＰＢＭＣを、各抗ＣＤ３抗体と、１０ｎｇ/ｍｌ、１００ｎｇ/ｍｌ、および１μｇ/ｍｌで７２時間インキュベートし、さらに１２時間、［３Ｈ］−チミジンでパルスし、そして同位体の取り込みをシンチレーション計数により測定した。ＰＢＳは、リン酸緩衝化生理食塩水コントロールであり、Ｆｏｓは、ロイシンジッパーＦｏｓを含むキメラ抗ＣＤ３分子のＦ(ａｂ')２形を表し、Ｍ１〜Ｍ５は、ＩｇＧ２変異体１〜５を示し、ＡＡは、ＩｇＧ４のＡｌａ−Ａｌａ変異体を示し、そしてＶＺＶＩｇＧ１は、コントロールの非関連ヒト化抗体である。
【図６】再標的化Ｔ細胞芽球による溶解。［５１Ｃｒ］−標識化Ｋ５６２細胞およびヒトＴ細胞芽球を、４時間、種々の濃度のキメラ抗ＣＤ３抗体とインキュベートし、５１Ｃｒの放出を測定した。Ｆｏｓは、キメラ抗ＣＤ３分子のＦ(ａｂ')２形を表す。
【図７】キメラＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体の相対的アビディティーを比較するための競合アッセイ。活性化したヒトＴ細胞上の亜飽和量（subsaturating amount）のマウスＯＫＴ３−ＦＩＴＣを、マウスＯＫＴ３もしくはキメラＯＫＴ３−ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ２変異体３の量を増加させることによって置き換えた。ＶＺＶＩｇＧ１は、非関連性ヒト化抗体である。値を、任意の競合抗体を含まないコントロールの蛍光強度と比較したときの蛍光強度阻害率で表す。
【図８】キメラＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体により誘導されるＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの放出。６人のヒトドナー（ドナーＣ〜Ｈ）からのＰＢＭＣを、３種の濃度の各抗体と共に、Ｔ細胞増殖アッセイと同様にプレートした。ＩＦＮ−γの濃度（上段図）を７２時間で、ＴＮＦ−αの濃度（中段図）を２４時間で測定した。記号（★）は、サイトカインの濃度がアッセイの上限を超えることを示す。試験した抗体に対する各ドナーのＴ細胞増殖プロフィールを図５から得、そして下段図に示す。使用した４つの抗体は、キメラＯＫＴ３Ｆ(ａｂ')２(Ｆｏｓ)、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ２変異体３（Ｍ３）であった。ＰＢＳは、任意の抗体を含まないネガティブコントロールである。
【図９】キメラＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体によるＴ細胞におけるＩＬ−２の放出およびＩＬ−２レセプターα（ＣＤ２５）の発現の誘導。６人のヒトドナー（ドナーＣ〜Ｈ）からのＰＢＭＣを、３種の濃度の各抗体と共に、Ｔ細胞増殖アッセイと同様にプレートした。ＣＤ２５を発現するＴ細胞（ＣＤ７ポジティブ）の割合を、フローサイトメトリーにより９０時間で測定し（上段図）、そしてＩＬ−２の濃度を２４時間で測定した（中段図）。試験した抗体に対する各ドナーのＴ細胞増殖プロフィールを図５から得、そして下段図に示す。使用した４つの抗体は、抗ＣＤ３Ｆ(ａｂ')２(Ｆｏｓ)、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ２変異体３（Ｍ３）であった。PBSは、任意の抗体を含まないネガティブコントロールである。
【図１０】マウスおよびヒト化Ｍ２９１抗体の競合結合。漸増濃度の非放射性競合体抗体を、放射性標識トレーサーマウスＭ２９１抗体の存在下で、Ｔ細胞と共に、インキュベートし、そして結合/遊離放射活性の比を測定した。
【図１１】ヒト化Ｍ２９１抗ＣＤ３抗体により誘導されるＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、およびＩＬ−２の放出。アッセイを、示した抗体濃度を使用して、５人のヒトドナー由来のＰＢＭＣを用いて図８と同様に行い、そしてサイトカイン放出を、示した時間で測定した。
【００７５】
（配列表）
【００７６】
【数１−１】
2007106771.tif 000002
【００７７】
【数１−２】
2007106771.tif 000003
【００７８】
【数１−３】
2007106771.tif 000004
【００７９】
【数１−４】
2007106771.tif 000005
【００８０】
【数１−５】
2007106771.tif 000006
【００８１】
【数１−６】
2007106771.tif 000007
【００８２】
【数１−７】
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【００８３】
【数１−８】
2007106771.tif 000009
【００８４】
【数１−９】
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【００８５】
【数１−９】
2007106771.tif 000011
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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