(57)【要約】      （修正有）【課題】標的とするＲＮＡのハンマーヘッドリボザイムによる加水分解を増強する方法を提供する。【解決手段】水溶液中のハンマーヘッドリボザイムに、―ＯＲ基を有する化合物（ここでＲはアルキル基または水素原子をあらわす）、たとえば、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、デキストラン、フィコール、グリセロール、１，３ープロパンジオール、２−メトキシエタノールおよび１，２−ジメトキシエタンからなる群から選択される少なくとも１つである化合物を共存させ、水溶液中の２価イオン濃度が１００ｍＭ以下で、標的とするＲＮＡを、たとえば３７℃超の温度で加水分解する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶液中のハンマーヘッドリボザイムに、―ＯＲ基を有する化合物（ここでＲはアルキル基または水素原子をあらわす）を共存させて、標的とするＲＮＡを加水分解する方法。
【請求項２】
水溶液中の２価イオン濃度が１００ｍＭ以下である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物が、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、デキストラン、フィコール、グリセロール、1，3−プロパンジオール、2−メトキシエタノールおよび1，2−ジメトキシエタンからなる群から選択される少なくとも一つである請求項１または２の方法。
【請求項４】
前記加水分解が、３７℃超の温度で行われる請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ポリエチレングリコール、エチレングリコール、デキストラン、フィコール、グリセロール、1，3−プロパンジオール、2−メトキシエタノールおよび1，2−ジメトキシエタンからなる群から選択される少なくとも一つの、ハンマーヘッドリボザイムによるインビトロでの標的ＲＮＡの加水分解増強剤。
【請求項６】
前記ポリエチレングリコールの分子量が、１００〜２００００である請求項５に記載の加水分解増強剤。
【請求項７】
ハンマーヘッドリボザイムと、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、デキストラン、フィコール、グリセロール、1，3−プロパンジオール、2−メトキシエタノールおよび１，２−ジメトキシエタンからなる群から選択される少なくとも一つとを含有する、標的ＲＮＡの加水分解剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハンマーヘッドリボザイムによる標的ＲＮＡの加水分解方法に関し、特に加水分解活性の増強剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
リボザイムの中ではハンマーヘッドリボザイムが、最も簡単な構造をもち、よく研究されている。
リボザイムはサイト特異的ホスホジエステル開裂を触媒し、その立体構造と活性は相互に関連している。リボザイムの活性は金属イオンによって促進される。金属イオンはリボザイムの活性状態を維持し、触媒化学において直接、役割を果たすこともできる。ハンマーヘッドリボザイムは最も小さいリボザイムの１つであり、簡単な構造をもち、研究されている。ハンマーヘッドリボザイムは保存されたヌクレオチドの活性中心を囲む３つの塩基対のステムを持つコア構造を形成する。ハンマーヘッドリボザイムは、中濃度の又は高濃度の２価の金属イオンの存在下で基質ＲＮＡの特定のサイトを効率的に開裂する。近年、天然のハンマーヘッドリボザイムのステムＩとIIとのループ‐ループ相互作用が、反応を低いＭｇ濃度でも可能にすることが報告された。そして低い２価のイオンの要求は生理学的イオン強度での活性に関連しているだろうと報告された。
ハンマーヘッドリボザイムは遺伝子発現の制御の例が挙げられるように細胞中で研究されてきた。
【０００３】
【非特許文献１】Gesteland, R.F.; Cech, T.R.; Atkins, J.F. Eds., The RNA World 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999
【非特許文献２】Okumoto, Y.,; Tanabe, Y.; Sugimoto., N. Biochemistry 2003, 42, 2158-2165
【非特許文献３】Bevilacqua, P.C.; Brown, T.S.; Nakano, S.; Yajima, R. 2004, Biopolymers, 73, 90-109
【非特許文献４】Koculi, E., Lee, N. K., Thirumalai, D., and Woodson, S. A., J. Mol. Biol., 2004, 341, 27-36
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、標的とするＲＮＡの加水分解酵素反応を増強する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
すなわち、本発明は、以下のいずれかを提供する。
（１）水溶液中のハンマーヘッドリボザイムに、―ＯＲ基を有する化合物（ここでＲはアルキル基または水素原子をあらわす）を共存させて、標的とするＲＮＡを加水分解する方法。
（２）水溶液中の２価イオン濃度が１００ｍＭ以下である（１）に記載の方法。
（３）前記化合物が、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、デキストラン、フィコール、グリセロール、1，3−プロパンジオール、2−メトキシエタノールおよび1，2−ジメトキシエタンからなる群から選択される少なくとも一つである（１）または（２）の方法。
（４）前記加水分解が、３７℃超の温度で行われる（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）ポリエチレングリコール、エチレングリコール、デキストラン、フィコール、グリセロール、1，3−プロパンジオール、2−メトキシエタノールおよび1，2−ジメトキシエタンからなる群から選択される少なくとも一つの、ハンマーヘッドリボザイムによるインビトロでの標的ＲＮＡの加水分解増強剤。
（６）前記ポリエチレングリコールの分子量が、１００〜２００００である（５）に記載の加水分解増強剤。
（７）ハンマーヘッドリボザイムと、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、デキストラン、フィコール、グリセロール、1，3−プロパンジオール、2−メトキシエタノールおよび１，２−ジメトキシエタンからなる群から選択される少なくとも一つとを含有する、標的ＲＮＡの加水分解剤。
本発明はビトロ、またはビボで、ハンマーヘッドリボザイムに、特定の化合物を共存させて、標的とするＲＮＡを加水分解する方法である。このような方法は天然の生体内で起こっている可能性があるが、本発明は、天然の状態を含むものではなく、ビトロ、またはビボで、ハンマーヘッドリボザイムに、人為的に非天然の状態で特定の化合物である溶質を共存させて、標的とするＲＮＡを加水分解する方法である。本発明の「人為的に」とは、天然の状態に人為的に溶質を追加して存在させる場合も含む。
【発明の効果】
【０００６】
標的とするＲＮＡの加水分解を増強できる本発明の方法は、例えばＲＮＡウイルスであるＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）の増殖をビトロ、またはビボで抑制する際に有用な方法となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下に本発明を詳細に説明する。
【０００８】
ハンマーヘッドリボザイムは、低分子量のリボザイムであり、数個のステム（またはヘリックス）とループの組合せで構成される。ハンマーヘッドリボザイムは、本来、シス（分子内）で働き自己切断を触媒するが、触媒部位と基質とに分けたトランス（分子間で作用する）型の制限リボヌクレアーゼとしてデザインし用いることができる。ハンマーヘッドリボザイムはＲＮＡを切断する酵素であるので、ＲＮＡウイルスであるＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）などの増殖抑制剤としての利用が可能である。
【０００９】
ハンマーヘッドリボザイムは、図１に示されるように、ステムI、ステムII、ステムIII、の３つのステムと、それらによって形成される保存されたコア配列からなる。トランス型では、約３０塩基のハンマーヘッドリボザイムはアンチセンス鎖としてステムIとステムIIIを形成し、基質を認識する。ステムIIは、ＧＡミスマッチ塩基対を形成する保存されたコア領域へと続き、Ｇ10.1、Ｃ11.1塩基対とともに、このＧＡミスマッチ領域には二価金属イオン結合部位があり活性発現に重要である。さらにウリジンターン（ＣＵＧＡ配列）によりステムIIとステムIとは近づき、ハンマーヘッドリボザイム基質複合体の三次元構造はγ字型をとる。
【００１０】
本発明に用いるハンマーヘッドリボザイムは、化学合成が可能であり、所望の配列をデザインすることができる。
基質は、必須配列としてＮＵＸ（Ｎはすべての塩基、ＸはＧ以外の塩基）をもつＲＮＡで２０〜６０塩基のアミノ酸配列であり、ハンマーヘッドリボザイムのステムIとステムIIIに対してアンチセンス鎖を形成できるものであればいずれでもよい。
【００１１】
リボザイムと基質は、ステムの配列や長さには特に制限がない。具体例として、図1に示すステムIとIIとの間にループ‐ループ相互作用がない短縮リボザイム（truncated ribozyme)と、図２に示すループ‐ループ相互作用のためのヌクレオチドを持つ伸張リボザイム（extended ribozyme)が例示されるが、これらには限定されない。
【００１２】
ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）などを基質としてハンマーヘッドリボザイムをデザインすれば、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）の増殖を効果的に抑制できる可能性があり、増強抑制剤として利用できる。
ハンマーヘッドリボザイムと基質とは、互いにセンスとアンチセンスの結合部位を持つＲＮＡであり、それぞれ合成が可能であり、所望の配列をそれぞれデザインすることができる。ｔＲＮＡ連結リボザイムや、リン酸のチオ化ＲＮＡなどの、複合ＲＮＡや修飾ＲＮＡであってもよい。
【００１３】
本発明の方法でハンマーヘッドリボザイムが標的ＲＮＡを加水分解する際に共存させる―ＯＲ基を有する化合物（ここでＲはアルキル基，または水素原子をあらわす）は、限定されないが、中性の分子である。―アルコキシ基および・またはＯＨ基を有し水溶性であり、炭化水素化合物であることが好ましい。なおＲがアルキル基の場合は炭素数１〜４のアルキル基が好ましい。
具体的には、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、デキストラン、フィコール（ショ糖とエピクロルヒドリンの共重合物）、グリセロール、1，3−プロパンジオール、2−メトキシエタノールおよび1，2−ジメトキシエタンが例示される。
本発明の方法では、基質を共存させて、ハンマーヘッドリボザイムの標的ＲＮＡを加水分解する活性を増強させることができる。そのような溶質は、標的ＲＮＡの加水分解増強剤として有用である。
【００１４】
また、所望のハンマーヘッドリボザイムと、上記の単独又は複数の溶質とを組み合わせれば、所望のハンマーヘッドリボザイムが加水分解する標的ＲＮＡのための加水分解剤として有用である。ハンマーヘッドリボザイムと、溶質との組み合わせは、それぞれ凍結乾燥して混合し組成物としてもよいが、別々の物質として使用時に組み合わせてもよい。
【００１５】
以下に、本発明の方法を具体的に説明する。
＜―ＯＲ基を有する化合物の共存による影響＞
本発明の方法によれば、基質ＲＮＡの開裂の速度定数(ｋ)は、―ＯＲ基を有する化合物である溶質を共存させると、希薄溶液で得られたものと比較して、ＰＥＧ８０００とＰＥＧ２００が反応速度でそれぞれ６．６倍、３．６倍である。ＥＧ(エチレングリコール）、デキストラン、フィコールは、２．０〜２．８倍増加した。ポリエチレングリコールは、分子量が１００〜２００００のものが好ましく、２００〜１５０００のものがより好ましい。
共存させる溶質の濃度は限定されないが、１０質量％〜４０質量％が好ましい。より好ましくは１５質量％〜３０質量％である。この理由は、濃度が低すぎると効果がなく、一方多くの溶質は高濃度になるとハンマーヘッドリボザイムと基質ＲＮＡの会合を妨げ、また、高分子量のＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、デキストラン、フィコールが３０質量％を超える溶液の調製が困難なためである。
【００１６】
＜２価のイオンの影響＞
本発明者等の研究によれば、共存させる溶質はハンマーヘッドリボザイム活性を増強でき、有効な反応に対する２価のイオン濃度を減少し、高温でのハンマーヘッドリボザイム複合体の熱変性を防止する。これらの観測は共存させる溶質による活性構造の安定化と一致している。ヌクレオチドのホールデイングに対して溶質を存在させることによる熱安定性は、ヌクレオチドの立体構造、ヌクレオチドの長さ，塩の条件、水の活性、ヌクレオチドの溶媒和に影響される。
共存させる溶質の存在下で、２価のイオンの要求がより小さくなることは、生理的イオン強度でのハンマーヘッドリボザイム活性に関連していると考えられる。２価イオンとしては、マグネシウム、カルシウム、マンガンなどが挙げられる。２価イオンの好ましい濃度としては、１００ｍＭ以下、さらに好ましくは１０ｍＭ以下である。
【００１７】
＜温度の影響＞
加水分解温度は、限定されないが、１０℃〜８０℃、好ましくは室温〜６０℃、より好ましくは３７℃超の温度で行われる。ハンマーヘッドリボザイムは、３７℃超で急激にその活性を低下させるが、反応溶液に溶質を共存させる本発明の方法を用いれば、温度が高くても高い酵素活性が維持される。したがって、本発明のハンマーヘッドリボザイムと溶質よりなる加水分解剤は、ハンマーヘッドリボザイム単独の加水分解剤に比べて、温度が高くても酵素活性を維持できる。
【００１８】
＜溶質の分子量の影響＞
共存させる溶質の分子量が増加すると、ハンマーヘッドリボザイムの酵素活性が増加する。溶質がＰＥＧの場合は、ＰＥＧ８０００とＰＥＧ２００００の反応定数はほぼ同じで、分子量による酵素活性の増加は飽和値があるようである。
【００１９】
＜溶質のＯＨ基の影響＞
ＥＧ、およびＥＧと同様の化学構造のマクロ分子ポリオールである（８）グリセロール、（９）1，3-プロパンジオール、（１０）2-メトキシエタノール、（１１）1，2-ジメトキシエタンをさらに共存させる溶質として調べた結果、これらの溶質もハンマーヘッドリボザイムの加水分解反応速度を増強した。実施例で示すように、1，2-ジメトキシエタンは、ＰＥＧ２００及びマクロ分子ポリオールよりも大きい速度定数を示した。
これらの結果から、ＥＧのＯＨ基の変性、又は共存させる溶質のＯＨ基の減少は活性の増強をもたらすことが示唆された。ハンマーヘッドリボザイム活性の有効な共存させる溶質は、大きなサイズのＰＥＧと全溶質の質量に比べてＯＨ基の質量がかなり小さい1，2-ジメトキシエタンであった。このことはハンマーヘッドリボザイム活性の減少に対して直接又は間接のＯＨ基の役割を示唆している。
本発明者等は、これまでに、ＤＮＡの二重鎖の安定性に対しての共存させる溶質のＯＨ基の影響を発表している。細胞中の媒体では、多数の小さな分子が共存する状態で、生体分子が全体積の２０〜４０％を占める。したがって希薄溶液では観測されない特性が、細胞環境の結果として遭遇でき、分子クラウディングと呼ばれる。本発明の方法におけるハンマーヘッドリボザイム酵素活性の増強は、共存させる溶質の化学構造に依存していて細胞中のハンマーヘッドリボザイム活性と同様にＲＮＡホールデイングの安定性に見通しを与えるものであると考えられる。
【００２０】
（実施例１）
用いられたハンマーヘッドリボザイムＲＮＡと基質ＲＮＡの配列は図１に示した。
ステムIとIIとの間にループ‐ループ相互作用はなく、活性のために、中濃度の又は高濃度のＭｇイオンが要求される。ハンマーヘッドリボザイムＲＮＡは基質ＲＮＡと会合し、続いて、基質ＲＮＡのＣ９,Ｃ１０についてのホスホジエステル結合を開裂する活性構造をとる。
【００２１】
＜基質ＲＮＡ開裂ハンマーヘッドリボザイム活性の測定＞
１．ハンマーヘッドリボザイムの開裂産物の確認
図３は、10ｍＭ、MgCl2，での図１に示す短縮リボザイムによる加水分解反応の結果を示す図である。図３（Ａ）は、２０ｗｔ％溶質濃度を含むバッファー溶液を３７℃で，３５秒間行ったハンマーヘッドリボザイムの加水分解反応のゲル電気泳動の図である。ＯＨ-とＴ１のレーンはアルカリ加水分解ラダーと、Ｇ残基の３'-側で特異的に開裂されたＲＮａｓｅＴ１消化バンドを示す。加水分解によって基質がＣ９の3'側で開裂していることを示している。
溶質の番号は以下の種類を示す。
（１）なし
（２）エチレングリコール２０wt％、
（３）分子量２００のＰＥＧ
（４）分子量８０００のＰＥＧ
（５）デキストラン１０（分子量MW=7万）
（６）デキストラン７０（分子量MW=7万）
（７）フィコール７０（分子量MW=7万）
Ｃ９の3'側の開裂産物を矢印で示している。
【００２２】
２．溶質の存在によるハンマーヘッドリボザイム加水分解速度の増強
図３（Ｂ）は、  10ｍＭ、MgCl2，と、上記の（１）〜（７）２０ｗｔ％溶質を含むバッファー溶液を、図1に示すハンマーヘッドリボザイムのステムＩとステムIIIに基質ＲＮＡを添加して、３７℃で測定されたハンマーヘッドリボザイム加水分解速度定数を示す。
開裂ＲＮＡ生産物の量は溶液中の溶質の存在で増加する。基質ＲＮＡの開裂の速度定数(ｋ)は、希薄溶液で得られたものと比較して、ＰＥＧ８０００とＰＥＧ２００が反応速度でそれぞれ６．６倍、３．６倍であった。ＥＧ,デキストラン、フィコールは、２．０〜２．８倍増加した。
【００２３】
３．温度の影響
図３（Ｃ）は、10ｍＭ、MgCl2での溶質の存在非存在での速度定数の温度依存性を示した。10ｍＭ、MgCl2、でのハンマーヘッドリボザイム活性は高温ではハンマーヘッドリボザイム基質複合体の変性（天然形からの変化）により減少することも観測されているが、溶質の共存はリボザイムを熱変性から保護するようである。ＥＧ以外の共溶質は、５０℃で７倍超反応を加速した。ＰＥＧ８０００を加えた場合は５０℃でもリボザイム活性は有効なままであり、希薄溶液より２７０倍より大きな活性を示した(図３Ｃ)
共溶質は短い塩基対の二本鎖を不安定にすることが知られているが、リボザイムの三次元ホールデイングは共溶質の存在で安定化されるようである。
【００２４】
４．ＰＥＧの分子量の影響
図３（Ｄ）は、異なる分子量の種々のサイズのPEGｓ、EGの存在下で図１のリボザイムの加水分解の反応速度を比較した結果を示す。ＰＥＧの分子量が増加すると、リボザイムの活性が増加したが、ＰＥＧ８０００とＰＥＧ２００００の反応定数は同じであった。
【００２５】
（比較例）
酵素なしのＲＮＡ開裂と比較するために、配列の真ん中に単鎖のリボヌクレオチドを持つ単鎖のＲＮＡ―ＤＮＡのキメラヌクレオチドを試験した。配列中には唯一のリボヌクレオチド残基があるのでそのリボヌクレオチドの3'末端で、加水分解が専ら起こった。ＲＮＡ加水分解は10ｍＭ、MgCl2、６０℃で、共溶質による加水分解速度の増加は見られなかった。この観察から溶質を共存させることは反応の化学ステップを直接加速するのではないことが示唆された。
【００２６】
(実施例２）
図４は、MgCl2なしで、３７℃で測定された図２に示す伸張リボザイムによるＲＮＡ加水分解の結果を示している。（Ａ）は、２０ｗｔ％共溶質の存在非存在での速度定数の比較である。(Ｂ)はＰＥＧの各種の分子量の存在下での反応定数を示す。種々のサイズのＰＥＧｓ、ＥＧの存在下で反応速度を比較した。ＰＥＧの分子量が増加すると、リボザイムの活性が増加したが、ＰＥＧ８０００とＰＥＧ２００００の反応定数は同じであった。
伸張リボザイムは低いＭｇ２+濃度でもリボザイム活性を示すことができたので、Ｍｇ２+なしでの伸張リボザイムへの共溶質の影響をさらに調べた。共溶質なしではＲＮＡ加水分解は非常に遅かった。６２時間後も検出できる生成物はなかった。
ＰＧ８０００と他の共溶質はリボザイム活性を非常に増強した（ＰＧ８０００の存在下２４時間反応後の反応生成物２６％）。ＰＥＧのサイズへの依存性は短縮リボザイムでも示されているので、図３と４の反応定数への共溶質の同様の影響は両方のリボザイム反応の増強が同様の機構であると考えられる。
【００２７】
（実施例３）
＜分子量による変化＞
ＥＧと同様の化学構造の（８）グリセロール、（９）1，3-プロパンジオール、（１０）2-メトキシエタノール、（１１）1，2-ジメトキシエタンの存在下で実施例１と同様のハンマーヘッドリボザイムの加水分解反応速度定数を比較した。結果としてこれらの共溶質も反応速度を増強した。1，2-ジメトキシエタンは、ＰＥＧ２００及びマクロ分子ポリオール共溶質よりも大きい速度定数を示した。一方共溶質があっても単鎖のＲＮＡ―ＤＮＡキメラ鎖に対して速度の増強は観察されなかった。
ハンマーヘッドリボザイム活性の増強は、マクロ分子のみでなく小さなサイズの分子でも観測されたので、共溶質の添加によって変化した溶質特性が、ハンマーヘッドリボザイムの活性に影響することがわかる。
＜ＯＨ基の影響＞
ＥＧのＯＨ基の変性、又は共溶質のＯＨ基の減少は活性の増強をもたらすことが示唆された。ハンマーヘッドリボザイム活性の有効な共溶質は、大きなサイズのＰＥＧと全溶質の質量に比べてＯＨ基の質量がかなり小さい1，2-ジメトキシエタンであった。このことはハンマーヘッドリボザイム活性の減少に対して直接又は間接のＯＨ基の役割を示唆している。
【００２８】
（実施例４）
＜Ｍｇ2+による変化＞
図５は、Ｍｇイオン濃度、温度、溶質の種類の変化による、本発明の溶質の存在下で実施例１で用いたと同様のハンマーヘッドリボザイムの加水分解反応での速度定数を測定したグラフである。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図1は、ハンマーヘッド短縮リボザイムＲＮＡと基質ＲＮＡの配列を示す模式図である。
【図２】図２は、ハンマーヘッド伸張リボザイムＲＮＡと基質ＲＮＡの配列を示す模式図である。
【図３】図３は、図１に示すハンマーヘッド短縮リボザイムのＲＮＡ加水分解を示す図である。図３（Ａ）は、ハンマーヘッド短縮リボザイム加水分解反応のゲル電気泳動の図である。図３（Ｂ）は、種々の溶質を含む溶液のハンマーヘッドリボザイム加水分解速度定数を示すグラフである。図３（Ｃ）は、ハンマーヘッドリボザイム加水分解速度定数の温度依存性を示すグラフである。図３（Ｄ）は、異なる分子量のＰＥＧの存在下でのハンマーヘッドリボザイム加水分解速度定数を示すグラフである。
【図４】図４は、図２に示すハンマーヘッド伸張リボザイムのＲＮＡ加水分解を示す図である。図４（Ａ）は、共存する溶質の非存在・存在下での速度定数の比較である。図４（Ｂ）は、異なる分子量のＰＥＧ溶質の存在下でのハンマーヘッドリボザイム加水分解速度定数を示すグラフである。
【図５】図５は、Ｍｇイオン濃度、温度、溶媒の種類の変化による、本発明の化合物の存在下でハンマーヘッドリボザイムの加水分解反応速度定数を示すグラフである。
【図１】
2007215502.tif 000002
【図２】
2007215502.tif 000003
【図３】
2007215502.tif 000004
【図４】
2007215502.tif 000005
【図５】
2007215502.tif 000006