(57)【要約】      （修正有）【課題】in vitro系での簡便に皮膚バリア機能を評価できるスクリーニング方法を開発するためのタイトジャンクションの発現する表皮角化細胞層膜を提供する。【解決手段】表皮角化細胞をカルシウムイオンを０．１〜０．２ｍＭ含有する液体培地で支持体上にコンフルエントになるまで培養し、しかる後、カルシウムイオンを１〜２ｍＭ含有する液体培地で培養することにより、タイトジャンクションの発現する表皮角化細胞層膜が得られる。これにより、簡便に素材のスクリーニングができるようになった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
表皮角化細胞をカルシウムイオンを０．１〜０．２ｍＭ含有する液体培地で支持体上にコンフルエントになるまで培養し、しかる後、カルシウムイオンを１〜２ｍＭ含有する液体培地で培養し得られる表皮角化細胞層膜。
【請求項２】
前記支持体が、０．１〜１２μｍの微細孔を有するポリエチレンテレフタレート製、ポリカーボネート製、コラーゲン処理ポリテトラフルオロエチレン製から選択される隔膜であることを特徴とする、請求項１に記載の表皮角化細胞層膜。
【請求項３】
前記表皮角化細胞がヒト表皮角化細胞であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の表皮角化細胞層膜。
【請求項４】
請求項１〜３何れか１項に記載の表皮角化細胞層膜で隔された、二室の一室に被験物質で処理後或いは被験物質の添加と同時に、標識物質を充填し、被験物質の非存在下及び存在下における標識物質の他室への移動の程度を計測し、移動の程度が、被験物質の存在下に比して、被験物質の非存在下において著しかった場合に、被験物質の皮膚バリア層におけるバリア機能向上作用が著しいと判別することを特徴とする、被験物質の皮膚バリア層におけるバリア機能向上作用の鑑別法。
【請求項５】
請求項４における標識物質がイオン性の物質であり、その移動の程度が電気抵抗値の変化として鑑別されることを特徴とする、請求項４に記載のバリア機能向上作用の鑑別法。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の皮膚バリア層における透過抑制作用の鑑別法において、移動の程度が、被験物質の非存在下に比して、被験物質の存在下、非存在下の１０％以上の移動の抑制が観測された場合に、被験物質は皮膚バリア層透過抑制作用を有する物質であると判別することを特徴とする、皮膚バリア層におけるバリア機能向上作用を有する物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な表皮角化細胞層膜及びそれを利用した皮膚バリア層透過抑制作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、生体内部と外界を隔てて、生体内部からの水分の蒸散を抑制し、さらに外部からの物理的刺激や化学物質による刺激などから生体を防御している非常に重要な器官である。このように、生体を外部環境から、さらには水分などの蒸散から防御している皮膚であるが、最近の食生活の欧米化、環境ホルモンの影響、過度のエアコンによる皮膚の乾燥などの多様な影響により、皮膚バリア機能に変調を来しているヒトが増えてきている。皮膚バリア機能の低下がその増悪要因の一つであると言われているものにアトピー性皮膚炎や乾燥性皮膚疾患などがあるが、この様な病的疾患に至らないまでも、皮膚が乾燥してカサカサした皮膚状態に悩んでいるヒトも増加していると言われている。この様な乾燥症状を緩和する為に、皮膚のバリア機能を向上させる手段として、高分子物質やシリコーン油等を含む油剤などを含有した皮膚外用剤を塗布して物理的なバリア機能を付与することにより皮膚のバリア機能を向上させることが行われている。この様な、物理的手法による皮膚バリア機能を補完する手法以外に、皮膚そのもののバリア機能を向上させようという試みもある（例えば、特許文献１を参照）。しかし、皮膚そのもののバリア機能を向上させるためには、皮膚という生体組織を介しているため、皮膚そのものにおけるバリア機能の測定は、実験動物の皮膚を用いて行った結果をヒトに外挿するか、或いは、実際にヒトに対しての測定などを行うしか方法が無かった。さらに、皮膚バリア機能の測定においては、皮膚を通しての水分量の蒸散量を測定することにより皮膚バリア機能を測定する経表皮水分蒸散量（Trans Epidermal Water Loss；ＴＥＷＬ）の測定が通常行われている。また、ヒトの角層細胞の形態を測定することにより、そのバリア機能を簡便に推定できる技術（例えば、特許文献２を参照）も報告されている。しかし、これらの方法も、ヒトの皮膚でのデータの収集・測定を前提としており、スクリーニング系に使用できるほど簡便な方法とは言いにくい。すなわち、in vitro系での簡便な皮膚バリア機能を評価できる、簡便なスクリーニング方法が求められていたと言える。
【０００３】
この様な皮膚バリア機能に影響を及ぼす重要な要素として、表皮角化細胞におけるタイトジャンクションを介した結合の緻密さが存すると言われている。通常細胞膜における物質の透過性を検討する場合には、例えば、ヒト結腸癌由来のＣａｃｏ−２細胞などを透過性の膜上に培養して、小腸様の単層の細胞層を形成させ、この単層培養細胞層のそれぞれの面の接する溶液間の電気抵抗値を測定することにより、この各細胞間のタイトジャンクションの形成を促進することによる経腸管吸収の抑制作用を有する素材に関する報告（例えば、特許文献３を参照）、さらに、同様のヒト結腸癌由来Ｃａｃｏ−２細胞の形成した単層培養細胞層において、細胞層の一方の面の接する培養液中に蛍光物質を存在させ、この細胞層を透過する蛍光物質を測定することにより、タイトジャンクションの形成度合いを判定する経腸管吸収促進物質のスクリーニング法（例えば、特許文献４を参照）に関する報告があるように、単層の細胞膜を形成させて、該細胞膜を介した物質の移動を検討する方法が一般的であるが、ヒトの培養表皮角化細胞は、単層培養しても、Ｃａｃｏ−２細胞のような強固なタイトジャンクションを形成しないと言われており、皮膚機能に類似した機能を有する細胞膜層が得られておらず、この為Ｃａｃｏ−２における様な検討ができないのが現状であった。
【０００４】
一方、表皮角化細胞を利用した皮膚機能に影響を及ぼす物質の評価は既に知られている（例えば、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８を参照）が、前記の現状から、これらの評価においては現実とそぐわない点があることは否めなかった。
【０００５】
他方、表皮角化細胞をカルシウムイオンを０．１〜０．２ｍＭ含有する液体培地で支持体上にコンフルエントになるまで培養し、しかる後、カルシウムイオンを１〜２ｍＭ含有する液体培地で培養して表皮角化細胞層膜を構築する手法は全く知られていなかったし、この様な方法で構築される表皮角化細胞層膜にタイトジャンクションが発現しており、これを利用することにより、実情に即した皮膚バリア機能向上のための素材のスクリーニングが行えることも全く知られていなかった。
【０００６】
【特許文献１】特開平１１−２５５６１４号公報
【特許文献２】特開２００５−１８９０１１号公報
【特許文献３】特開平０９−３０９７８号公報
【特許文献４】特開２００２−２５７８２８号公報
【特許文献５】特開２００５−１５４４１３号公報
【特許文献６】特開２００２−３７２５３０号公報
【特許文献７】特開２００２−２１８９７１号公報
【特許文献８】特開２０００−２０１６９５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、この様な状況下為されたものであり、実情に即した皮膚バリア機能向上のための素材のスクリーニングを行うために、タイトジャンクションの発現する表皮角化細胞層膜を構築する技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この様な状況に鑑みて、本発明者らは、タイトジャンクションの発現する表皮角化細胞層膜を構築する技術を求めて、鋭意研究努力を重ねた結果、表皮角化細胞をカルシウムイオンを０．１〜０．２ｍＭ含有する液体培地で支持体上にコンフルエントになるまで培養し、しかる後、カルシウムイオンを１〜２ｍＭ含有する液体培地で培養することにより、この様な表皮角化細胞層膜が得られることを見いだし、発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下に示すとおりである。
（１）表皮角化細胞をカルシウムイオンを０．１〜０．２ｍＭ含有する液体培地で支持体上にコンフルエントになるまで培養し、しかる後、カルシウムイオンを１〜２ｍＭ含有する液体培地で培養し得られる表皮角化細胞層膜。
（２）前記支持体が、０．１〜１２μｍの微細孔を有するポリエチレンテレフタレート製、ポリカーボネート製、コラーゲン処理ポリテトラフルオリエチレン製から選択される隔膜であることを特徴とする、（１）に記載の表皮角化細胞層膜。
（３）前記表皮角化細胞がヒト表皮角化細胞であることを特徴とする、（１）又は（２）に記載の表皮角化細胞層膜。
（４）（１）〜（３）何れか１項に記載の表皮角化細胞層膜で隔された、二室の一室に被験物質で処理後或いは被験物質の添加と同時に標識物質を充填し、被験物質の非存在下及び存在下における標識物質の他室への移動の程度を計測し、移動の程度が、被験物質の存在下に比して、被験物質の非存在下において著しかった場合に、被験物質の皮膚バリア層におけるバリア機能向上作用が著しいと判別することを特徴とする、被験物質の皮膚バリア層におけるバリア機能向上作用の鑑別法。
（５）（４）における標識物質がイオン性の物質であり、その移動の程度が電気抵抗値の変化として鑑別されることを特徴とする、（４）に記載のバリア機能向上作用の鑑別法。
（６）（４）又は（５）に記載の皮膚バリア層の透過抑制作用の鑑別法において、移動の程度が、被験物質の非存在下に比して、被験物質の存在下、非存在下の１０％以上の移動の抑制が観測された場合に、被験物質は皮膚バリア層透過抑制作用を有する物質であると判別することを特徴とする、皮膚バリア層におけるバリア機能向上作用を有する物質のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、実情に即した皮膚バリア機能向上のための素材のスクリーニングを行うために有用な、タイトジャンクションの発現する表皮角化細胞層膜を構築する技術を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の表皮角化細胞層膜は、表皮角化細胞をカルシウムイオンを０．１〜０．２ｍＭ含有する液体培地で支持体上にコンフルエントになるまで培養し、しかる後、カルシウムイオンを１〜２ｍＭ含有する液体培地で培養し得られることを特徴とする。
【００１１】
前記表皮角化細胞層膜形成に用いる表皮角化細胞としては、自己増殖性を有する正常な表皮角化細胞であれば使用可能であり、マウス、ブタ、ラットなどの異種の動物の細胞でも使用可能であるが、ヒトの皮膚へ適用を目的としていることから、ヒトの細胞を用いるのが好ましい。動物の表皮角化細胞を用いる場合には、動物より表皮角化細胞を採取し、常法に従って処理して用いることもできるし、既に市販されているものを購入して利用することもできる。ヒトの細胞としては、多くのメーカーより正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ：Natural Human Epidermal Keratinocytes）が、市販されており、これらを購入して使用することができ、好ましい。
【００１２】
かかる表皮角化細胞を培養すべきカルシウムイオンを０．１〜０．２ｍＭ含有する液体培地としては、表皮角化細胞培養用の市販の培地を用いることができ、例えば、０．１５ｍＭのＣａを含有する液体培地である、「Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２」（倉敷紡績株式会社製）が好適に例示できる。かかる培地を用いて、支持体の存在下表皮角化細胞を２×１０６cell／ｍｌ播種し、３５〜４０℃で５０％二酸化炭素気流下で４８〜９６時間培養することにより、支持体にコフルエントな状態で細胞層が形成される。ここで、コンフルエントな状態としては、支持体の表面全体に少なくとも一層の細胞が存在し、部分的には、多くとも３層程度の積層でとどまっている状態を意味する。又、前記支持体としては、この様な細胞層膜の構築に使用される支持体であれば特段の限定はなく、０．１〜１２μｍの微細孔が存在する膜が好ましく例示できる。この様な細胞層膜構築のための支持体は既に市販されているものが存し、かかる市販品を購入して使用することができる。例えば、コーニング社やミリポア社より、ポリエチレンテレスタレート製、ポリカーボネート製、コラーゲン処理ポリテトタフルオロエチレン製の膜が市販されているので、これらを購入して使用することができ、好ましい。これらの中では、コーニング社製「トランスウェル」（０．４μｍポアを有するポリエチレンテレフタレート膜）が好ましく例示できる。又、カルシウムイオンを１〜２ｍＭ含有する液体培地としては、前記「Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２」に適宜塩化カルシウムなどのカルシウム塩を添加して調整し、用いることができる。かかる液体培地中で前記支持体上にコンフルエントとなって構築された表皮角化細胞層膜を３５〜４０℃で５０％二酸化炭素気流下で４８〜９６時間培養することにより、タイトジャンクション構造を有する細胞膜とすることができる。これに被験物質を加えて更に同条件で２４〜９６時間培養し、加えないで培養を続けたものとの膜の透過性の差を見ることにより、被験物質の表皮角化細胞層膜への影響を知ることができる。透過性の差は以下の鑑別法で述べるように鑑別できる。
【００１３】
本発明の被験物質の皮膚バリア層のバリア機能向上作用の鑑別法は、前記本発明の表皮角化細胞層膜を隔膜とした二室のチャンバーの一方に、被験物質を充填し前もって細胞層膜を被験物質で処理した後、或いは、被験物質と標識物質を同時に培地などのベヒクルとともに充填し、標識物質の他室への移動がどの程度被験物質の存在下阻害されるかを指標に鑑別される。ここで、標識物質としては、その移動が明確に検知できるものであればその種類を問わず、電位差、電導度、電気抵抗の変化などでその移動が把握できるイオン性物質、吸光度や蛍光強度でその移動が把握できる蛍光標識物質や色剤などが例示できる。特に好ましいものとしてはイオン性物質が例示できる。かかるイオン性物質は培地に含有されているものでも良く、この場合は被験物質と標識物質の同時投与となり、かかるイオン性物質の移動の程度は細胞層の電気抵抗値を測定することにより鑑別できる。蛍光標識物質としては、蛍光標識デキストリンなどが例示でき、添加後更にインキュベーションをして蛍光強度の変化を見ることが好ましい。
【００１４】
かかる鑑別において、標識物質の移動が、被験物質の存在下での表皮角化細胞層膜形成で阻害された場合、表皮角化細胞層膜の構築が緻密にされていると判断され、これによってin vivo  の皮膚に適用した場合には、角層の物質透過の阻害性が向上し、以て、皮膚バリア機能が向上されると判定される。従ってこの様な被験物質は、皮膚に塗布すれば角層バリア機能を向上させる素材であると判別される。この有効性は、前記標識物質の移動の抑制において、被験物質の非存在下に比して、被験物質の存在下、非存在下の１０％以上の移動の抑制が観測された場合に有効と判別される。又、その抑制の程度が著しいほど、角層バリア機能の向上作用は著しいと判別される。
【００１５】
以下に、実施例をあげて、本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明がかかる実施例にのみ限定されないことは言うまでもない。
【実施例１】
【００１６】
培養表皮角化細胞層におけるタイトジャンクションの検出（蛍光抗体染色法）
凍結正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社製）を解凍し、０．１５ｍＭ−Ｃａ含有培養液（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２；倉敷紡績株式会社製）にて、３７℃、５０％二酸化炭素雰囲気下で培養した。この正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）をMillicell Tissue Culture Plate（ミリポア社製）にコーニング社製トランスウェル（直径１２ｍｍ、ポリエチレンテレフタレート０．４μｍポア）をセットし、上層０．５ｍｌ、下層０．５ｍｌの前記培養液を入れ、２×１０５／ｃｍ２で播種し、さらに７２時間培養した。コンフルエントになったことを確認し、そのまま０．１５ｍＭ−Ｃａ含有−Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地で９６時間培養を続けたものと、１．４５ｍＭ−Ｃａ含有−Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に交換し、その後９６時間培養したものに関して、タイトジャンクション構成タンパクの１つであるオクルーディンの抗体染色を実施した。すならち、この培養ヒト表皮角化細胞を１％ホルマリン水溶液にて固定し、ブロッキング操作の後、抗オクルーディンン一次抗体（ウサギ製：ＺＹＭＥＤ社製）とＦＩＴＣ標識二次抗体（ロバ製：ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）処理による蛍光抗体染色を行った。結果を図１（高カルシウム条件）、図２（低カルシウム条件）に示す。図１、図２の結果より、培養途中でコンフルエントに達した後に、高カルシウム条件で培養することにより、図１に示すように、タイトジャンクション構成タンパク質の１つであるオクルーディンが細胞膜周辺に強く発現していることが判った（矢印）。一方、低カルシウム条件でそのまま培養を続けたものでは、この様なオクルーディンの強い発現と膜への局在は観察されず（図２）、本発明のスクリーニング方法で用いた条件において、タイトジャンクションが強く形成されていることが示唆された。
【実施例２】
【００１７】
電流の抵抗値によるイオン性物質の透過抑制作用の測定
凍結正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社製）を解凍し、０．１５ｍＭ−Ｃａ含有培養液（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２；倉敷紡績株式会社製）にて、３７℃、５０％二酸化炭素雰囲気下で培養した。この正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）をMillicell Tissue Culture Plate（ミリポア社製）にコーニング社製トランスウェル（直径１２ｍｍ、ポリエチレンテレフタレート０．４μｍポア）をセットし、上層０．５ｍｌ、下層０．５ｍｌの前記培養液を入れ、２×１０５／ｃｍ２で播種し、さらに７２時間培養した。コンフルエントになったことを確認し、１．４５ｍＭ−Ｃａ含有−Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に交換し、その後９６時間培養した。その後、実施例２の製造例１のオウレン抽出エキス或いは実施例２の製造例２のトウヒ抽出エキスを１０―５ｖ／ｖ％となるように培養液中に添加した培養液に交換して、培養を継続し、１日後、２日後、３日後にＴＥＲを測定した。抽出エキスの添加時のＴＥＲ（Transepitherial Electrical Resistance）値（Ωｍ）に対する、一定時間後のＴＥＲ値の割合（％）で示した。
【００１８】
結果を図３（オウレン抽出エキス）、図４（トウヒ抽出エキス）に示す。図３、図４の結果より、エキス類無添加のコントロールに比べて、オウレン抽出エキス、トウヒ抽出エキス共にＴＥＲ値が上昇し、培養表皮角化細胞層のイオン性物質の透過が抑制され、電気抵抗値が上昇していることが確認できた。これより、細胞層間の結合が緻密になり、バリア機能が向上していることが判り、オウレン抽出エキス、トウヒ抽出エキス共に皮膚バリア機能を向上させる作用を有していることがわかった。尚、これらの抽出物は以下の製造例の手順で作成された。
【００１９】
（製造例１）
キンポウゲ科オウレン属オウレンの根茎１ｋｇを裁断し、５０％エタノール水溶液１０Ｌ中に浸漬し、１週間放置した。濾過後、濾液を濃縮し、凍結乾燥した。この凍結乾燥物中のパルマチンの濃度を測定し、パルマチンの濃度が、０．０５〜０．１質量％となるように５０％エタノール水溶液を添加し、オウレン抽出エキスを作製した。
【００２０】
（製造例２）
ミカン科ミカン属ダイダイの皮（トウヒ）の乾燥物１ｋｇを５０％−１，３−ブタンジオール１０Ｌ中に浸漬し、１週間放置した。濾過後、濾液中のヘスペリジン濃度を測定し、０．０２〜０．１質量％となるように５０％−１，３−ブタンジオール量を調整し、トウヒ抽出エキスを作製した。
【実施例３】
【００２１】
蛍光物質の透過性抑制による皮膚バリア機能の測定
凍結正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社製）を解凍し、０．１５ｍＭ−Ｃａ含有培養液（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２；倉敷紡績株式会社製）にて、３７℃、５０％二酸化炭素雰囲気下で培養した。この正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）をMillicell Tissue Culture Plate（ミリポア社製）にコーニング社製トランスウェル（直径１２ｍｍ、ポリエチレンテレフタレート０．４μｍポア）をセットし、上層０．５ｍｌ、下層０．５ｍｌの前記培養液を入れ、２×１０５／ｃｍ２で播種し、さらに７２時間培養した。コンフルエントになったことを確認し、１．４５ｍＭ−Ｃａ含有−Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に交換し、その後９６時間培養した。その後、実施例２の製造例１のオウレン抽出エキスを無添加、１０―５ｖ／ｖ％となるように培養液中に添加した培養液に交換して、培養を継続した、１日後に上層、下層の培地をＰＢＳに交換し、ＰＢＳにて計３回洗浄し、上層に１ｍｇ／ｍｌ−ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎ  ＰＢＳ溶液０．５ｍｌ、下層にＰＢＳを０．５ｍｌに置換して、２４時間後の下層の蛍光強度を測定した。結果を図５に示す。図５の結果より、エキス無添加のコントロールに比べて、オウレン抽出エキスを添加して培養した系において、ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎの透過性が低下し、培養表皮角化細胞層のバリア機能が向上していることが判り、オウレン抽出エキスは皮膚バリア機能を向上させる作用を有していた。
【産業上の利用可能性】
【００２２】
本発明は、角層バリア機能を向上する素材のスクリーニングに応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】実施例１（高カルシウム条件）の染色の結果を示す図である。
【図２】実施例１（低カルシウム条件）の染色の結果を示す図である。
【図３】実施例２（オウレン抽出エキス）の結果を示す図である。
【図４】実施例２（トウヒ抽出エキス）の結果を示す図である。
【図５】実施例３の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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