(57)【要約】【課題】経口的あるいは経肛門的に細長い体腔内を経由して細胞シートをその接着面を他の部位に接着させることなく患部に到達させるよう細胞シートを簡易に供給する。【解決手段】温度により親水性と疎水性とが切り替わる温度応答性を有する温度応答性部材２を細胞懸濁液Ａに浸漬して培養し、温度応答性部材の表面に細胞シートを形成するステップと、細胞シートが形成された温度応答性部材を細胞懸濁液から取り出して体腔内を搬送するステップと、体腔内の患部近傍において、温度応答性部材を冷却して細胞シートを剥離させるステップとを備える細胞シートの供給方法を提供する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
温度により親水性と疎水性とが切り替わる温度応答性を有する温度応答性部材を細胞懸濁液に浸漬して培養し、温度応答性部材の表面に細胞シートを形成するステップと、
細胞シートが形成された温度応答性部材を細胞懸濁液から取り出して体腔内を搬送するステップと、
体腔内の患部近傍において、温度応答性部材を冷却して細胞シートを剥離させるステップとを備える細胞シートの供給方法。
【請求項２】
前記温度応答性部材が、シート状である請求項１に記載の細胞シートの供給方法。
【請求項３】
前記温度応答性部材が、変形可能な部材により構成されている請求項１または請求項２に記載の細胞シートの供給方法。
【請求項４】
前記温度応答性部材が、形状記憶アクチュエータを備える請求項３に記載の細胞シートの供給方法。
【請求項５】
前記温度応答性部材が、メタルステントである請求項３に記載の細胞シートの供給方法。
【請求項６】
前記温度応答性部材が、バルーンである請求項３に記載の細胞シートの供給方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞シートの供給方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、例えば、瘢痕性角結膜症等の中度または重度の角膜疾患等の治療のために培養上皮細胞シートが用いられている（例えば、特許文献１参照。）。また、火傷等の皮膚損傷を治療するために、火傷により死滅した表皮を除去し、除去された部分をマスキングするために細胞シートが用いられている（例えば、特許文献２参照。）。これらの細胞シートは、患者本人の正常な細胞を採取して培養することにより製造されるものであるため、免疫拒絶反応等の問題がないという利点がある。
【０００３】
また、特許文献２においては、細胞シートの製造方法として、温度応答性ポリマーにより表面を被覆した培養容器を用いる方法が開示されている。温度応答性ポリマーは、温度により疎水性から親水性に急激に変化する性質を有し、例えば、３７℃での培養時には、疎水性を呈して、接着性の細胞を接着状態に維持して成長を促進し、剥離させるときには、例えば、２０℃程度に冷却することにより、親水性に変化させ、培養容器から細胞を容易に剥離させることができる。
【０００４】
温度応答性ポリマーを使用することにより、従来トリプシン等のタンパク質分解酵素を用いて剥離させていた場合と比較すると、細胞に与える損傷が少なく、健全な状態の細胞シートを製造することができるという利点がある。
そして、このようにして剥離された細胞シートは、培養容器の底面に設けられた温度応答性ポリマーの作用により剥離されたものであるため、細胞自体の接着性に変化はなく、剥離された後は、培養容器に接着していた面を接着面として患部に貼り付けマスキング等に利用することができる。
【特許文献１】特開２００２−３３１０２５号公報
【特許文献２】国際公開第０２／１０３４９パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上述した角膜疾患の治療や、火傷時の皮膚の治療等のように、人体の外部に露出する部位の治療に際しては、上記細胞シートの接着面が他の部位に接着しないように広げたままで、容易に患部に配置することができるが、例えば、食道、胃あるいは腸の内壁に形成された潰瘍や、内視鏡的に粘膜が切除された部位に細胞シートを配置するには、経口的あるいは経肛門的に細長い体腔内を経由して細胞シートを挿入していく必要があり、細胞シートの接着面自体を他の部位に接着させることなく患部に到達させることが困難である。
【０００６】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、経口的あるいは経肛門的に細長い体腔内を経由して細胞シートをその接着面を他の部位に接着させることなく患部に到達させるよう細胞シートを簡易に供給することを可能とする細胞シートの供給方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する
本発明は、温度により親水性と疎水性とが切り替わる温度応答性を有する温度応答性部材を細胞懸濁液に浸漬して培養し、温度応答性部材の表面に細胞シートを形成するステップと、細胞シートが形成された温度応答性部材を細胞懸濁液から取り出して体腔内を搬送するステップと、体腔内の患部近傍において、温度応答性部材を冷却して細胞シートを剥離させるステップとを備える細胞シートの供給方法を提供する。
【０００８】
本発明によれば、温度応答性部材を細胞懸濁液に浸漬して培養することにより温度応答性部材の表面に細胞シートが形成される。細胞シートが形成された温度応答性シートを体腔内に挿入して搬送し、患部近傍において冷却することにより、細胞シートを剥離させて患部に適用することが可能となる。
この場合において、本発明によれば、温度応答性部材の表面に培養により形成した細胞シートを剥離させることなくそのまま体腔内に挿入するので、患部近傍においてリリースするまで、細胞シートを単独で取り扱わずに済み、作業が簡易かつ容易である。搬送中は、細胞シートの接着面を温度応答性部材に接着させたままの状態に維持でき、体腔内の各部への接着や、細胞シート自体の接着面どうしの接着等の不都合の発生を未然に防止することができる。また、リリース時は、温度応答性部材を冷却するだけで、容易に細胞シートを剥離させて患部に対してリリースすることができる。
【０００９】
上記発明においては、前記温度応答性部材が、シート状であることとしてもよい。
このようにすることで、細胞シートを皺寄せることなく広げた状態で搬送することが可能となり、患部への接着作業を容易にすることができる。
【００１０】
また、上記発明においては、前記温度応答性部材が、変形可能な部材により構成されていることとしてもよい。
このようにすることで、口や肛門から患部近傍までの狭隘な体腔内においては細胞シートを接着させた温度応答性部材を細く変形させることにより、体腔内を容易に搬送することができる。また、患部近傍において温度応答性部材を広げるように変形させることにより、細胞シートを広げることが可能となり、患部への接着作業を容易にすることができる。
【００１１】
さらに、上記発明においては、前記温度応答性部材が、形状記憶アクチュエータを備えることとしてもよい。
このようにすることで、形状記憶アクチュエータに温度変化を与え、簡易に所望の形態に変形させることができる。形状記憶アクチュエータとしては、形状記憶合金あるいは形状記憶ポリマーが挙げられる。
【００１２】
また、上記発明においては、前記温度応答性部材が、メタルステントであることとしてもよい。
このようにすることで、口や肛門から患部近傍までの狭隘な体腔内においては細胞シートを接着させたメタルステントを細く変形させることにより、体腔内を容易に搬送することができる。また、患部近傍においてメタルステントを広げるように変形させることにより、細胞シートを広げることが可能となり、患部への接着作業を容易にすることができる。
【００１３】
また、上記発明においては、前記温度応答性部材が、バルーンであることとしてもよい。
このようにすることで、口や肛門から患部近傍までの狭隘な体腔内においては細胞シートを接着させたバルーンを収縮させることにより、体腔内を容易に搬送することができる。また、患部近傍においてバルーンを膨張させることにより、患部に適した形状に細胞シートを広げ流ことができ、患部への接着作業を容易にすることができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、経口的あるいは経肛門的に細長い体腔内を経由して細胞シートをその接着面を他の部位に接着させることなく患部に到達させる細胞シートを簡易に供給することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の第１の実施形態に係る細胞シート１の供給方法について、図１〜図５を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る細胞シート１の供給方法は、培養ステップと搬送ステップとリリースステップとを備えている。
【００１６】
培養ステップは、図１に示されるように、シート状の温度応答性部材（以下、温度応答性シートという。）２を使用する。温度応答性シート２は、その表面に温度応答性処理が施された接着部２ａを備えている。温度応答性処理は、例えば、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドからなる高分子を塗布したものであり、３２℃以上で疎水性、３２℃より低い温度で親水性を呈するようになっている。
【００１７】
これにより、３２℃以上に維持することにより、接着部２ａに細胞シート１（図２参照。）を接着状態に保持することができ、それよりも低い温度に切り替えることにより、接着部２ａの細胞シート１を剥離させることができるようになっている。また、接着部２ａ以外の表面は、親水性を有するように処理されている。これにより、接着部２ａ以外の表面には、いかなる温度でも細胞が接着しないようになっている。
【００１８】
培養ステップにおいては、口腔粘膜を採取して所定の培地内に投入してなる細胞懸濁液Ａを貯留した培養容器３内に温度応答性シート２を浸漬して、温度３７℃、ＣＯ２濃度０．５％の培養条件に維持する。これにより、３７℃では疎水性を呈している温度応答性シート２の接着部２ａ表面に細胞懸濁液Ａ中に浮遊する細胞が接着して成長し、所定時間経過後に細胞シート１が形成される。これにより、図２に示されるように、温度応答性シート２と細胞シート１とが重ね合わせられた複合シート４が形成されるようになっている。
【００１９】
搬送ステップは、図３に示されるように、複合シート４を巻き取るように丸めて、図４に示されるように、内視鏡の挿入部５に長手方向に沿って設けられたチャネル６（図５参照。）に挿入可能な外径寸法を有する柔軟なチューブ７の先端部に複合シート４を収容する。これにより、経口的あるいは経肛門的に、先端部を体腔内の患部近傍に配置された内視鏡の挿入部５のチャネル６に沿って、複合シート４を収容したチューブ７を挿入することにより、複合シート４を患部近傍まで搬送することができる。
【００２０】
そして、リリースステップは、図５に示されるように、チャネル６の後方から導入したワイヤ等の押圧手段８により複合シート４をチャネル６外に押し出す。その後、チャネル６を介して導入した冷却水９を複合シート４にかけることにより３２℃より低い温度に冷却する。これにより、複合シート４を構成している温度応答性シート２の接着部２ａを親水性に変化させ、該接着部２ａに接着されている細胞シート１を容易に剥離させ、患部近傍にリリースすることができる。
【００２１】
このように本実施形態に係る細胞シート１の供給方法によれば、体腔内の患部近傍まで搬送する温度応答性シート２に、培養により直接、細胞シート１を接着状態に形成するので、形成された細胞シート１を患部近傍にリリースするまで剥離させる必要がなく、取扱性を向上することができるという利点がある。また、搬送中に細胞シート１が温度応答性シート２に接着状態に維持されることにより、細胞シート１の接着面１ａが露出しないので、細胞シート１が他の部位に接着してしまったり、細胞シート１の接着面１ａどうしが接着してしまったりする不都合の発生を未然に防止することができる。
【００２２】
また、本実施形態によれば、細胞シート１を温度応答性シート２に接着状態としているので、巻き取るように多重に丸めても細胞シート１が他の部位に接着することがなく、簡単に広げることができる。そして、多重に丸めることで、広い面積の細胞シート１をチューブ７内に収容することができ、比較的大きな患部を修復するための広い細胞シート１を供給することができる。
【００２３】
なお、本実施形態においては、単に、温度応答性処理を施した接着部２ａを有する温度応答性シート２に細胞シート１を重ねた複合シート４を例示したが、これに代えて、柔軟なシート内部に形状記憶合金（図示略）を埋め込んだもの、あるいは、形状記憶ポリマーにより構成された温度応答性シート２を採用してもよい。このようにすることで、温度変化を与えることにより、図１の平坦に広がった状態と、図２のように巻き取られた状態とを容易に切り替えることができる。
【００２４】
これにより、チャネル６内への複合シート４の挿入作業を容易にすることができるとともに、リリース時の展開もスムーズに行うことができる。また、細胞シート１のリリース時に、図２のように広げ、リリース後に図３のように巻き取って、再度チャネル６内に回収することも可能となる。
【００２５】
また、本実施形態においては、複合シート４をチャネル６内に収容して搬送し、患部近傍においてリリースすることとしたが、複合シート４をチャネル６内に収容することなく、内視鏡の挿入部５の先端に、図示しない鉗子等により把持した状態で、体腔内を搬送することにしてもよい。このようにすることで、チャネル６内から押し出す工程が不要となり、単に冷却するだけで、細胞シート１を患部近傍にリリースすることができる。
【００２６】
また、平坦な温度応答性シート２に代えて、筒状に形成した温度応答性シート２の外面に細胞シート１を付着させた複合シート４の内部に、伸縮可能なメタルステント（図示略）等の拡張手段を配置することとしてもよい。このようにすることで、メタルステントを広げた状態で構成した複合シート４は、メタルステントを半径方向内方に縮小させることにより、皺寄せられてその外径寸法を縮小させることができる。この状態で、挿入部５のチャネル６内に収容することができる。
【００２７】
したがって、内視鏡の挿入部５のチャネル６を介して体腔内に接着させることなく、またそれ自体の接着面２ａどうしを接着させてしまうことなく、患部近傍まで搬送することができる。また、挿入部５のチャネル６からリリースした後には、メタルステントを拡張させることで、皺寄せられていた複合シート４を張るように拡張させ、細胞シート１を広げることができる。この状態で、温度応答性シート２を冷却することにより、広がった細胞シート１を容易に剥離させ、患部近傍にリリースすることができる。
【００２８】
また、同様にして、表面に温度応答性処理を施したバルーンの表面に細胞シート１を付着させたもの（図示略）を採用してもよい。バルーンを拡張させた状態で細胞シート１を接着させ、バルーンを収縮させることで、挿入部５のチャネル６内に容易に収容可能とすることができる。
【００２９】
したがって、内視鏡の挿入部５のチャネル６を介して体腔内に接着させることなく、またそれ自体の接着面２ａどうしを接着させてしまうことなく、患部近傍まで搬送することができる。そして、チャネル６内からリリースされた後には、バルーンを膨張させることにより、皺寄せられていた細胞シート１を張るように拡張させることができる。この状態で、バルーンを冷却することにより、広がった状態の細胞シート１を容易に剥離させ、患部近傍にリリースすることができる。
【００３０】
また、同様にして、ワイヤからなる環状のスネア（図示略）の内側に、膜状に温度応答性シート２を張り、該温度応答性シート２に細胞シート１を付着させることにしてもよい。スネアを収納形態とすることで、複合シート４をチャネル６内に収容可能な太さに容易に構成することができ、また、スネアをチャネル６外に突出させることにより、スネアの弾性によって複合シート４を広げることができる。
【００３１】
次に、本発明の第２の実施形態に係る細胞シート１の供給方法について、図６〜図９を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る細胞シート１の供給方法は、図６に示されるキャップ１０を使用する。
【００３２】
このキャップ１０は、図６に示されるように、略円筒状に形成され、長手軸方向の一端側に、内視鏡の挿入部５の先端に嵌合可能な嵌合部１１を備えている。また、キャップ１０の他端側には、その内表面に温度応答性処理が施された接着部１０ａが備えられている。
【００３３】
これにより、３２℃以上に維持することにより、接着部１０ａに細胞シート１を接着状態に保持することができ、それよりも低い温度に切り替えることにより、接着部１０ａの細胞シート１を剥離させることができるようになっている。また、接着部１０ａ以外の表面は、親水性を有するように処理されている。これにより、接着部１０ａ以外の表面には、いかなる温度でも細胞が接着しないようになっている。
【００３４】
このようなキャップ１０に細胞シート１を接着させるには、例えば、図７に示されるように、接着させる細胞を浮遊させた細胞懸濁液Ａに、長手軸を略水平にしたキャップ１０の一部を浸漬させ、その状態でキャップ１０を長手軸回りに回転させながら、所定の培養条件、例えば、温度３７℃、湿度１００％、ＣＯ２濃度０．５％に維持することにより回転培養する。これにより、温度応答性処理が施されている接着部１０ａには細胞が接着して成長し、それ以外の表面には細胞が接着しないので、接着部１０ａのみに細胞シート１が形成されることになる。
【００３５】
このようにして、細胞シート１を接着させたキャップ１０を細胞懸濁液Ａから取り出し、図８および図９に示されるように、内視鏡の挿入部５の先端に嵌合部１１を嵌合させて取り付け、例えば、長手軸に沿って切断線１ｂを形成する。そして、内視鏡の挿入部５を経口的あるいは経肛門的に体腔内に挿入することで、細胞シート１が体腔内を搬送されることになる。
【００３６】
この場合において、本実施形態に係る細胞シート１の供給方法によれば、細胞シート１はその接着面１ａをキャップ１０の内面に形成された接着部１０ａに接着状態に保持されたまま搬送されるので、搬送中に、細胞シート１が体腔内の他の部位に接着してしまったり、接着面１ａどうしが接着してしまったりする不都合の発生を防止できる。また、細胞シート１がキャップ１０の内面に配されているので、搬送中に体腔内の部位に接触することが回避され、細胞シート１を保護しながら搬送することができる。そして、このようにして搬送することにより、細胞シート１を健全な状態で患部近傍に配置することができるようになる。
【００３７】
細胞シート１を接着させたキャップ１０が患部近傍に配置された場合には、挿入部５に備えられたチャネル６を介して３２℃より低い温度の冷却水を供給することにより、チャネル６の出口周囲に配置されているキャップ１０を冷却し、接着部１０ａの性質を親水性に変化させる。これにより、接着部１０ａに接着していた細胞シート１が容易に剥離し、患部に向けて供給されることになる。
【００３８】
この場合において、本実施形態によれば、キャップ１０の内面に設けられた接着部１０ａに保持していた細胞シート１をリリースするので、細胞シート１は接着面１ａを外側に向けた円筒状の形態でリリースされる。したがって、リリース位置付近に配置されている患部に容易に接着させることができる。
【００３９】
すなわち、円筒状のキャップ１０内面に接着されていた細胞シート１は、接着部１０ａから剥離されると、その径寸法を拡大するように広がるので、より平坦な部位に配されている患部にフィットするようになる。
【００４０】
また、この場合に、細胞シート１に形成された切断線１ｂが、細胞シート１を貼り付ける患部に対して反対側に配されるように搬送する。これにより、細胞シート１がキャップ１０の接着部１０ａから剥離されると、そのまま、患部に向けて移動するだけで、患部を覆うように適用することができる。
【００４１】
なお、本実施形態においては、内視鏡の挿入部５に備えられたチャネル６を介して冷却水を供給することにより、キャップ１０を冷却することとしたが、これに代えて、図１０に示されるように、キャップ１０の壁面内部を通る流路１２を設け、該流路１２に、挿入部５の外側を通して導いた外付けの給水チューブ１３を接続することにより、該給水チューブ１３を介して冷却水をキャップ１０の流路１２内に流通させ、キャップ１０を冷却することにしてもよい。
【００４２】
また、上記実施形態においては、キャップ１０の内面に接着部１０ａを設けることとしたが、これに代えて、体腔内の他の部位との接触が問題にならない場合には、図１１に示されるように、キャップ１０の外面に設けた接着部１０ａに細胞シート１を接着させることにしてもよい。このようにすることで、細胞シート１に切断線１ｂを形成する作業を容易にすることができる。
【００４３】
この場合には、細胞シート１に形成された切断線１ｂが、細胞シート１を貼り付ける患部側に配されるように搬送する。これにより、細胞シート１がキャップ１０の接着部１０ａから剥離されると、そのまま、患部に向けて移動するだけで、患部を覆うように適用することができる。
【００４４】
また、キャップ１０の外面に細胞シート１を接着させることに代えて、内視鏡の挿入部５自体の外周面に温度応答性処理を施して接着部とし、挿入部５を細胞懸濁液Ａ内に浸漬して培養し、該接着部に細胞シート１を接着させることにしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る細胞シートの供給方法における培養ステップを説明する斜視図である。
【図２】図１の細胞シートの供給方法において用いられる複合シートを示す斜視図である。
【図３】図２の複合シートを丸めた状態を示す斜視図である。
【図４】図３により丸められた複合シートを搬送用のチューブに収容する状態を説明する斜視図である。
【図５】図１の細胞シートの供給方法におけるリリースステップを説明する斜視図であり、（ａ）チューブ内に収容してチャネル内を搬送される複合シート、（ｂ）部分的にチューブから押し出された複合シート、（ｃ）チューブからリリースされた複合シートをそれぞれ示している。
【図６】本発明の第２の実施形態に係る細胞シートの供給方法に使用されるキャップを示す斜視図である。
【図７】図６の供給方法の培養ステップにおけるキャップの接着部への細胞シートの接着方法を示す説明図である。
【図８】図７の接着方法により細胞シートを接着させたキャップを内視鏡の先端部に取り付けた状態を示す斜視図である。
【図９】図８の状態を示す縦断面図である。
【図１０】図９の変形例を示す縦断面図である。
【図１１】図９の他の変形例を示す縦断面図である。
【符号の説明】
【００４６】
Ａ  細胞懸濁液
１  細胞シート
２  温度応答性シート（温度応答性部材）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2007229249.tif 000012
【図１１】
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