(57)【要約】【課題】分離、精製後の核酸抽出液中の不純物を減らし、純度の高い核酸を得、洗浄液の膜通過性を改善し、目詰まりを減らす。さらに、分離性能に優れ、加工が容易であり、実質的に同一の分離性能を有するものを大量に生産可能な核酸の分離精製方法、及び該方法を実施に適した核酸分離精製ユニットを提供する。【解決手段】洗浄回数とともに洗浄液量を増加させることによって、発生した泡を洗い流すことで、核酸抽出液中への不純物を減らす。さらに、最初の洗浄液量を減らすことで、最も通過時間が長い最初の洗浄液通過時間を短くすることで、目詰まりの可能性を低くする。さらに、ライセート液量よりも多くの洗浄液を使用することで、ライセート溶液から由来する核酸抽出液中への不純物の混入を減らす。さらに、ライセート液量よりも少ない洗浄液を用いることで、発生した泡を洗い流すことによって、核酸抽出液中への不純物の混入を減らす。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む核酸抽出法。
（ａ）生体材料を溶解液と接触させることで、生体材料を溶解させて核酸を溶出させる工程
（ｂ）工程（ａ）で得られた核酸を溶出させた溶液に水溶性有機溶媒を加えることでライセート溶液を調製する工程
（ｃ）工程（ｂ）で得られたライセート溶液と固体材料とを接触させることで溶解液中の核酸を固体材料に吸着させる工程
（ｄ）固体材料における抽出対象核酸以外の不純物を洗浄液を用いて洗浄する際に、洗浄工程を２回以上行い、先の洗浄における洗浄液面よりも後の洗浄における洗浄液面の方が高いことを特徴とする洗浄工程
（ｅ）固体材料に吸着させた核酸を回収液を用いて脱着させる抽出工程
【請求項２】
生体材料に対して溶解液を添加する前に、分散液を用いて生体材料を分散させることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出法。
【請求項３】
工程（ａ）において溶解液に０．１から１０ｍｏｌ／ｌのカオトロピック塩を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の核酸抽出法。
【請求項４】
工程（ａ）において溶解液に水溶性有機溶媒が５０体積％以下含まれていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
【請求項５】
水溶性有機溶媒がメタノール、エタノール、イソプロパノールまたはブタノールのいずれか一つもしくは混合物であることを特徴とする請求項４に記載の核酸抽出法。
【請求項６】
工程（ａ）において、溶解液に０．００１〜３０質量％の界面活性剤が含まれていることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
【請求項７】
工程（ａ）において、溶解液に緩衝液が含まれていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
【請求項８】
工程（ａ）において、溶解液に消泡剤が含まれていることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
【請求項９】
工程（ａ）の後に、０．００１〜３０質量％の界面活性剤を含む溶液を添加することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
【請求項１０】
工程（ｂ）において核酸を含む溶解液に水溶性有機溶媒を１０体積％から６０体積％になるように加えて、ライセート溶液を調製することを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
【請求項１１】
請求項１に記載の工程（ａ）または（ｂ）の後の工程において、機械的往復運動を行うことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
【請求項１２】
工程（ｃ）において、表面が水酸基から構成されている固体材料を用いることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
【請求項１３】
工程（ｃ）において、固体材料がカートリッジに保持されている容器を用いることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
【請求項１４】
工程（ｃ）において、ライセート溶液を２つ以上の容器に分注することで抽出を行うことを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
【請求項１５】
工程（ｃ）において、ライセート溶液をカートリッジに入れる際にライセート中の泡をカートリッジに入れないことを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
【請求項１６】
工程（ｃ）において、ライセート溶液をカートリッジに入れる際に、カートリッジ内壁で浸漬するカートリッジ内面以外の内面にライセート溶液を付着させないことを特徴とする請求項１〜１５のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
【請求項１７】
工程（ｄ）において、洗浄液中の水溶性有機溶媒の濃度を二種類用いることを特徴とする請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
【請求項１８】
工程（ｄ）において、塩から構成された溶液を用いることを特徴とする請求項１〜１７のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
【請求項１９】
塩が塩化ナトリウムであることを特徴とする請求項１〜１８のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
【請求項２０】
工程（ｄ）において、洗浄液に消泡剤を含むことを特徴とする請求項１〜１９のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
【請求項２１】
工程（ｄ）または（ｅ）において、ライセート溶液、洗浄液及び回収液のうちの少なくともいずれか一つが、圧力変化もしくは遠心により固体材料と接触させる工程を含むことを特徴とする請求項１〜２０のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
【請求項２２】
容器、分散液、溶解液、洗浄液、回収液、核酸を結合させるための固体材料のうち少なくとも二つ以上を含む請求項１〜２１のいずれか１項に記載の核酸抽出法を行うためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体材料から核酸を抽出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸抽出法は、溶液状態で行う方法と、核酸を含む溶液と固体材料とを接触させることで核酸を吸着させ、不要物を洗浄した後、目的の核酸を脱着することで行う固体材料を用いた方法に大別できる。
【０００３】
溶液状態で行う方法は最も古くから行われており、エタノールで核酸を沈殿させ、これをガラス棒に絡ませて行う。この方法は、非常に簡便であるが、収量や純度に大きな問題がある。これらの問題を改良する方法として、非特許文献１で報告されたグアニジンチオシアネートを加えて細胞を溶解させた後、酸性条件下でフェノールを用いて共存するＤＮＡを除去することでＲＮＡを得るＡＧＰＣ（Acid Guanidinium Phenol Chloroform）法、ＲＮＡがＤＮＡやタンパク質と比較して浮遊密度が高いことを利用したグアニジン−塩化セシウム遠心法などがある。しかしながら、フェノールやクロロホルムなどの有害な有機化合物を使用すること、煩雑な操作が必要で精度ある抽出を行うためには熟練した技術が必要であることなど多くの欠点がある。
【０００４】
これらの欠点を改良する方法として、核酸分解作用を持つヌクレアーゼ等の酵素活性を阻害するグアニジンチオシアネートなどのカオトロピック塩を用いて細胞を溶解し、エタノールを加えることでライセート溶液を調製し、これをシリカなどの固体材料と接触させることで核酸を吸着した後、洗浄工程を経て核酸を脱着させる方法が開発された（非特許文献２）。
【０００５】
これとは別の方法で、磁性シリカ粒子を用いた核酸抽出法が開発され、反応効率、洗浄効率の改善が行われた。さらに、多孔質膜を用いた核酸抽出法が開発され、高純度の核酸を短時間で、簡便な方法で得られるようになった。
【０００６】
本発明者らも、固体吸着材料として、非常に薄い多孔質膜を用いることで、より簡便で分離特性に優れた核酸分離精製法を開発してきた。しかし、大量の生体材料を試料とした場合、例えばより多くの細胞数を処理する場合、多孔質膜を種々溶液が通過するのに必要な通過時間が長くなることが明らかとなったので、分散液、特にＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液、界面活性剤の種類と濃度、カオトロピック塩の種類と濃度、溶解液添加後のピペッティングと攪拌、水溶性有機溶媒を添加後の攪拌、水溶性有機溶媒を添加する回数、ホモジナイズ法、多孔質膜の細孔サイズなどを種々検討し、通過性を改善、すなわちより多くの細胞数を処理できる方法を開発してきた（特許文献１、２、３）。
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−１２８６９１号公報
【特許文献２】特願２００５−２８２１３０
【特許文献３】特願２００５−０２８９９１
【非特許文献１】P. D. Siebert, A.Chenchik, Nucleic Acids Res., 21, 2019-2020 (1993).
【非特許文献２】R. Boom et al., Journal of Clinical Microbiology, 28, 495-503 (1990).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、分離精製後の核酸抽出液中の不純物を可能な限り減少させ、純度の高い核酸を得ることである。本発明の別の課題は、洗浄液の通過時間を短くすることで核酸抽出時の目詰まりを減らすこと、さらに、通過性を良くしたことにより、より多くの検体量、例えば、細胞数が処理可能となる方法を提供すること、抽出時間を短縮することである。
【０００９】
また、本発明の別の課題は、実質的に同一の分離性能を有するものを大量に生産可能である固相を使用した核酸の分離精製方法、及びその方法を実施するのに適した核酸分離精製ユニットを提供することである。本発明のさらに別の課題は、特殊な技術、複雑な操作、および特殊な装置を必要とせずに、簡便かつ迅速に小型の装置を用いて、核酸を分離精製することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明では、生体材料を溶解させることで、生体材料中に含まれている核酸成分を、固体材料、例えば、多孔質膜などをカートリッジなどの容器に固定化させた容器と接触させることで、核酸を分離・精製する。この時に、核酸抽出後の回収液中の不純物を減らすために洗浄液を用いるが、この洗浄液の液量を検討することによって、上記課題を達成できることを見出し、本発明を完成させたものである。即ち、本発明は、下記の構成よりなるものである。
【００１１】
１．以下の工程を含む核酸抽出法。
（ａ）生体材料を溶解液と接触させることで、生体材料を溶解させて核酸を溶出させる工程
（ｂ）工程（ａ）で得られた核酸を溶出させた溶液に水溶性有機溶媒を加えることでライセート溶液を調製する工程
（ｃ）工程（ｂ）で得られたライセート溶液と固体材料とを接触させることで溶解液中の核酸を固体材料に吸着させる工程
（ｄ）固体材料における抽出対象核酸以外の不純物を洗浄液を用いて洗浄する際に、洗浄工程を２回以上行い、先の洗浄における洗浄液面よりも後の洗浄における洗浄液面の方が高いことを特徴とする洗浄工程
（ｅ）固体材料に吸着させた核酸を回収液を用いて脱着させる抽出工程
２．生体材料に対して溶解液を添加する前に、分散液を用いて生体材料を分散させることを特徴とする前項１に記載の核酸抽出法。
３．工程（ａ）において溶解液に０．１から１０ｍｏｌ／ｌのカオトロピック塩を含むことを特徴とする前項１または２に記載の核酸抽出法。
４．工程（ａ）において溶解液に水溶性有機溶媒が５０体積％以下含まれていることを特徴とする前項１〜３のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
５．水溶性有機溶媒がメタノール、エタノール、イソプロパノールまたはブタノールのいずれか一つもしくは混合物であることを特徴とする前項４に記載の核酸抽出法。
６．工程（ａ）において、溶解液に０．００１〜３０質量％の界面活性剤が含まれていることを特徴とする前項１〜５のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
７．工程（ａ）において、溶解液に緩衝液が含まれていることを特徴とする前項１〜６のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
８．工程（ａ）において、溶解液に消泡剤が含まれていることを特徴とする前項１〜７のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
９．工程（ａ）の後に、０．００１〜３０質量％の界面活性剤を含む溶液を添加することを特徴とする前項１〜８のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
１０．工程（ｂ）において核酸を含む溶解液に水溶性有機溶媒を１０体積％から６０体積％になるように加えて、ライセート溶液を調製することを特徴とする前項１〜９のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
１１．前項１に記載の工程（ａ）または（ｂ）の後の工程において、機械的往復運動を行うことを特徴とする前項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
１２．工程（ｃ）において、表面が水酸基から構成されている固体材料を用いることを特徴とする前項１〜１１のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
１３．工程（ｃ）において、固体材料がカートリッジに保持されている容器を用いることを特徴とする前項１〜１２のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
１４．工程（ｃ）において、ライセート溶液を２つ以上の容器に分注することで抽出を行うことを特徴とする前項１〜１３のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
１５．工程（ｃ）において、ライセート溶液をカートリッジに入れる際にライセート中の泡をカートリッジに入れないことを特徴とする前項１〜１４のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
１６．工程（ｃ）において、ライセート溶液をカートリッジに入れる際に、カートリッジ内壁で浸漬するカートリッジ内面以外の内面にライセート溶液を付着させないことを特徴とする前項１〜１５のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
１７．工程（ｄ）において、洗浄液中の水溶性有機溶媒の濃度を二種類用いることを特徴とする前項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
１８．工程（ｄ）において、塩から構成された溶液を用いることを特徴とする前項１〜１７のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
１９．塩が塩化ナトリウムであることを特徴とする前項１〜１８のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
２０．工程（ｄ）において、洗浄液に消泡剤を含むことを特徴とする前項１〜１９のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
２１．工程（ｄ）または（ｅ）において、ライセート溶液、洗浄液及び回収液のうちの少なくともいずれか一つが、圧力変化もしくは遠心により固体材料と接触させる工程を含むことを特徴とする前項１〜２０のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
２２．容器、分散液、溶解液、洗浄液、回収液、核酸を結合させるための固体材料のうち少なくとも二つ以上を含む前項１〜２１のいずれか１項に記載の核酸抽出法を行うためのキット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法により、核酸抽出後の回収液中の不純物が従来法よりも減少し、より純度の高い目的物、すなわち高純度核酸を得ることが出来る。更に、本発明の方法においては、洗浄工程を工夫することによって洗浄液工程の通過時間が短縮され、目詰まりの発生率が減少し、より多くの検体が処理でき、抽出のスループットが向上する。さらに、本発明の方法によれば、特殊な技術、複雑な操作、および特殊な装置を必要とせずに、簡便かつ迅速に、自動的に核酸を分離精製できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明では、特願２００５−２８２１３０、特願２００５−０２８９９１、特願２００６−０２７３８３、特願２００６−０２７４９５、特願２００５−２４９６９４、特願２００５−０８２２８３、特願２００５−０８００４０、特願２００５−０５９０５７、特願２００５−０２９１７７、特願２００５−０２７９１８、特願２００４−０６６８０１に記載された方法も含むものとする。
【００１４】
固体材料を用いて核酸を抽出する場合、ライセート溶液を通過させた膜に対して洗浄液で洗浄した後、回収液により固体材料から核酸を脱着させることで、核酸を回収する。後の遺伝子検出などの工程に影響を及ぼす可能性を可能な限り排除するために、抽出後の核酸は高純度であることが好ましい。例えば、溶解液中に含まれているグアニジンチオシアネートなどのカオトロピック塩は酵素反応などに影響を及ぼす。本発明者らは、これらの検体や溶解液などから由来する種々の不純物を可能な限り減少させる方法として、洗浄液の洗浄方法に着目して、鋭意検討を行うことで本発明を完成するに至った。
【００１５】
本発明の核酸抽出法は、下記の工程（ａ）〜（ｇ）を少なくとも含むものである。
（ａ）生体材料を溶解液と接触させることで、生体材料を溶解させるとともに生体材料中に含まれている核酸を溶出させる工程（以下、「溶解工程」とも言う。）
（ｂ）水溶性有機溶媒を加えることでライセート溶液を調製する工程（以下、「ライセート工程」とも言う。）
（ｃ）ライセート溶液と固体材料とを接触させることで溶解液中に含まれている核酸を固体材料に吸着させる工程（以下、「吸着工程」とも言う。）
（ｄ）固体材料を洗浄液で洗浄する工程（以下、「洗浄工程」とも言う。）
（ｅ）回収液により固体材料から核酸を脱着させ、カートリッジ容器外に排出する工程（以下、「回収工程」とも言う。）
【００１６】
１．溶解工程（ａ）
本発明の核酸抽出法では、工程（ａ）において生体材料から核酸を抽出する場合、予め生体材料を適当な分散液に分散させておくことが好ましい。特に、ペレット化した細胞を使用する場合には、分散性向上の観点から、分散液を用いることが好ましい。分散液を用いることにより、固体状態もしくはそれに近い状態の生体材料を分散させることで、溶解液添加時の生体材料溶解の均一化、均一化したことによる収量、通過時間などの安定性、ライセート溶液や洗浄液、回収液の通過時間短縮を行うことが出来る。
【００１７】
前記分散液の種類は、浸透圧の違いによる生体材料の膨潤、破裂、収縮が最小限であり、細胞を分散させることが可能なものであれば、どの様なものでも用いることが出来る。好ましい分散液として、例えば、緩衝液をあげることができる。緩衝液の中でも、生化学用のｐＨ緩衝剤、特にグッド緩衝液が好ましい。
【００１８】
本発明者らが鋭意検討を行った結果、前記グッド緩衝液の中でもＢｉｓ−Ｔｒｉｓ（Ｎ，Ｎ−ｂｉｓ（２−ｈｙｄｏｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏｔｒｉｓ  （ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）  ｍｅｔｈａｎｅ）緩衝液は通過時間が短く、目詰まりを起こす可能性が低いことを明らかにしたので、好適に用いることが出来る。グッド緩衝剤の一例として、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ以外に、ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ)−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＩＰＥＳ（Ｐｉｐｅｒａｘｉｎｅ−１，４−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ)）、ＡＣＥＳ（Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｎｏ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＣＡＰＳ（Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＴＥＳ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）等が挙げられる。
【００１９】
前記分散液の液量は特に限定されないが、生体材料の量が多いほど、細胞数が多いほど分散液量を増加させて使用することが好ましい。しかし、分散液量の増加は、細胞の溶解作用とヌクレアーゼ活性を抑制する作用を持つカオトロピック塩濃度の低下を招くとともに、液量増加による通過時間の増加をも招く。これらのことから、本発明で使用する分散液の液量は、好ましくはライセート液量の８０体積％以下、更に好ましくは５０体積％以下、最も好ましくは２０体積％以下の液量である。
【００２０】
前記分散液は浸透圧などの作用により細胞が全壊もしくは部分的に分解しないような濃度で使用することが好ましく、低すぎても高すぎても好ましくない。さらに、分散液の濃度は、ライセート溶液および洗浄液の通過時間に影響を及ぼし、例えば、分散液としてＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．５）を用い、液量として３０μｌを用いる場合、分散液の濃度が低いと、ライセート溶液、洗浄液の通過時間が長くなる。分散液の濃度が高いと細胞は部分的に溶解し、細胞内の核酸やタンパクなどが溶出し、溶出した核酸分解酵素の作用などにより核酸が分解され、抽出後の核酸の収量が低下する可能性がある。核酸の収量が低下すると、核酸に対する不純物の量が増加する。これらのことから、本発明の核酸抽出法において使用する分散液の濃度は、０．０１ｍｏｌ／ｌ以上、１０ｍｏｌ／ｌ以下が好ましく、０．１ｍｏｌ／ｌ以上、１ｍｏｌ／ｌ以下がより好ましい。
【００２１】
前記ペレット化した細胞を調製する場合、使用するＰＢＳを可能な限り取り除き、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液に置換、もしくはペレット細胞にＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液を添加することで、ライセート溶液、洗浄液の通過時間を大幅に短縮させることができる。したがって、ＰＢＳなどの通過時間を長くする原因となる分散液などを取り除いてから、別の分散液を添加することで、細胞を再分散させてもよく、細胞ペレットに極少量残存するＰＢＳはそのままにしておき、必要量のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液を加えてもよい。また、通過時間が問題とならなければ、分散液を使用しなくてもよい。また、分散液を加えた後に、タッピングにより細胞を効率よく分散させてもよく、ピペッティングを行うことにより、より効率よく細胞を分散させてもよい。また、凍結した細胞ペレットは、これらの処理の前に融解しておくことが、操作性の観点から好ましい。
【００２２】
また、平面板、例えば、シャーレ内で培養した細胞の場合、分散液を使用せずとも抽出は可能である。シャーレ内の培養液は除去しておくことが好ましい。培養液除去後のシャーレに対してそのまま溶解液を加えてもかまわないが、培養液除去後にＰＢＳなどの洗浄液を用いて細胞を洗浄することは、通過性の観点からより好ましい。さらに、抽出後の核酸への検体由来の不純物の量が減少するので好ましい。これらは、細胞外マトリックスなどが洗浄により除去されるためと推定している。
【００２３】
本発明の核酸抽出法では、工程（ａ）において生体材料を溶解させるとともに生体材料中に含まれている核酸を溶出させるため、生体材料と溶解液を接触させる。該溶解液はカオトロピック塩を含有していることが好ましい。該カオトロピック塩としては、特に限定は無く、公知のカオトロピック塩を使用することができる。例えば、カオトロピック塩としては、グアニジン塩、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、尿素、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化カルシウム、臭化アンモニウム、過塩素酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、アンモニウムイソチオシアネート、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム等を使用することができる。中でもグアニジン塩が好ましい。グアニジン塩としては、塩酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン、グアニジンチオシアン酸塩（チオシアン酸グアニジン）が挙げられ、中でも塩酸グアニジンまたはグアニジンチオシアン酸塩が好ましい。これらの塩は単独でも、複数組み合わせて用いてもよい。
【００２４】
前記溶解液中のカオトロピック塩の濃度は、細胞を十分に溶解することができ、調製したライセート溶液、洗浄液の通過時間が短い濃度であれば特に限定されない。しかし、濃度が低すぎると生体材料の溶解が不十分であることが原因で通過時間は短くなるが、抽出後、核酸の収量が大幅に低下し、また、高濃度にしすぎると、溶解液保存時に低温下でカオトロピック塩は析出する。抽出後の核酸の収量が低下すると、抽出液中の核酸に対する不純物の量が増加する。したがって、溶解液中のカオトロピック塩の濃度は、０．１から１０ｍｏｌ／ｌであることが好ましく、０．５ｍｏｌ／ｌから５ｍｏｌ／ｌ以下がより好ましく、３ｍｏｌ／ｌから４．５ｍｏｌ／ｌ以下が最も好ましい。
【００２５】
前記溶解液は、核酸安定化剤を含有していることが好ましい。ここで「核酸安定化剤」とは、検体中の核酸を安定に存在させることができる試薬を示す。核酸安定化剤は、核酸そのものを安定に存在させることが出来る試薬であるとともに、核酸を不安定化、例えば、核酸を分解するようなヌクレアーゼなどの核酸分解酵素による分解作用を低下もしくは完全に阻害させることで、核酸を分解させない試薬をも含むものとする。核酸安定化剤は、カオトロピック塩、界面活性剤、緩衝剤および消泡剤の中から選ばれるいずれか１つ以上と共存させることが好ましい。
【００２６】
前記ヌクレアーゼ活性を不活性化させる作用を有する核酸安定化剤として、一般的に還元剤として使用される化合物を用いることができる。このような還元剤として、水素、ヨウ化水素、硫化水素、水素化アルミニウムリチウム、水素化ホウ素ナトリウム等の水素化化合物、アルカリ金属、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム、亜鉛等の電気的陽性の大きい金属、またはそれのアマルガム、アルデヒド類、糖類、ギ酸、シュウ酸などの有機酸化物、メルカプト化合物等が挙げられる。中でもメルカプト化合物が好ましい。メルカプト化合物として、Ｎ−アセチルシステイン、メルカプトエタノールや、アルキルメルカプタン等が挙げられる。メルカプト化合物は単独または複数組み合わせて用いてもよい。また、核酸安定化剤として、２−メルカプトエタノールを用いた場合、その濃度が高いほど通過時間は短くなる。しかし、濃度が高ければ高いほど作業環境性が悪化する。
【００２７】
したがって、前記核酸安定化剤の濃度は０．０１〜２０質量％が好ましく、０．０３〜１５質量％がより好ましい。前記メルカプト化合物を核酸安定化剤として用いる場合は、溶解液におけるメルカプト化合物の濃度は０．０１〜２０質量％が好ましく、０．０５〜１５質量％がより好ましく、０．０５〜５質量％が最も好ましい。
【００２８】
本発明者らは、溶解液中に界面活性剤を加えることによって、ライセート溶液の通過時間、洗浄液の通過時間を短くすることが出来ることを見出した。更に、界面活性剤は、低細胞数の生体材料を用いたことによる核酸収量の低下を大幅に防ぐことが出来る。これは、水溶性有機溶媒のライセート中での濃度が低い場合に特に顕著である。この様な例として、ライセート溶液や洗浄液の通過時間を短くするために、ライセート溶液中の水溶性有機溶媒の濃度を下げることがあるが、その場合には、通過時間が短くなる反面、収量低下が生じる。収量低下が発生すると、抽出液中の核酸に対する不純物の量が増加し、抽出後に核酸を遺伝子検査などで使用する際に不都合が生じる可能性がある。そこで、界面活性剤を添加することによって、収量低下を改善することも出来る。該界面活性剤としては、例えば、ノニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、両性界面活性剤が挙げられ、ノニオン界面活性剤およびカチオン界面活性剤が好ましい。
【００２９】
前記ノニオン界面活性剤として、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤、脂肪酸アルカノールアミドが挙げられ、より好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤である。ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）アルキルエーテル系界面活性剤の中でも、ＰＯＥデシルエーテル、ＰＯＥラウリルエーテル、ＰＯＥトリデシルエーテル、ＰＯＥアルキレンデシルエーテル、ＰＯＥソルビタンモノラウレート、ＰＯＥソルビタンモノオレエート、ＰＯＥソルビタンモノステアレート、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥアセチレングリコールがさらに好ましい。
【００３０】
前記カチオン界面活性剤として、セチルトリメチルアンモニウムプロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリドが挙げられる。
【００３１】
本発明者らが界面活性剤の濃度を鋭意検討した結果、溶解液中の界面活性剤の濃度を高くすると、ライセート溶液通過時間、洗浄液通過時間が短くなった。しかし、界面活性剤の濃度を高くしすぎると、カオトロピック塩の種類によっては核酸回収量の低下を招くとともに、泡の発生が問題となった。したがって、本発明の核酸抽出法では、溶解液中の界面活性剤の濃度は、０．０５質量％〜３０質量％が好ましく、０．１質量％〜７．５質量％がより好ましい。
【００３２】
また、界面活性剤を使用することで、ライセート溶液が泡立ち易くなるので、操作の容易性の観点から、界面活性剤を全く使用しなくとも十分な性能が得られるのであれば界面活性剤を使用しなくてもよいし、界面活性剤と共に消泡剤を用いてもよい。消泡剤を用いることにより、細胞溶解液やライセート溶液調製時の泡の発生を抑えることが出来、操作性を向上させることが出来る。更に、泡の発生が抑えられることは、攪拌効率の向上が期待でき、ライセート溶液、洗浄液、回収液の通過時間が短くなり、収量も増加する。更に、カートリッジへのライセート溶液添加時に、泡が入る量が減ることは、カートリッジ内の泡の残存に由来する回収液の純度の低下が抑えられ高純度の核酸を得ることが出来る。
【００３３】
前記消泡剤は、界面活性剤を使用しない場合でも有効である。すなわち、界面活性剤が入っていなくても、生体材料が泡の発生源となる場合があり、消泡剤を用いることによって泡が発生する可能性が小さくなるためである。
【００３４】
前記消泡剤としては、シリコン系消泡剤（例えば、シリコーンオイル、ジメチルポリシロキサン、シリコーンエマルジョン、変性ポリシロキサン、シリコーンコンパウンドなど）、アルコール系消泡剤（例えば、アセチレングリコール、ヘプタノール、エチルエキサノール、高級アルコール、ポリオキシアルキレングリコールなど）、エーテル系消泡剤（例えば、ヘプチルセロソルブ、ノニルセロソルブ−３−ヘプチルコルビトールなど）、油脂系消泡剤（例えば、動植物油など）、脂肪酸系消泡剤（例えば、ステアリン酸、オレイン酸、パルミチン酸など）、金属セッケン系消泡剤（例えば、ステアリン酸アルミ、ステアリン酸カルシウムなど）、脂肪酸エステル系消泡剤（例えば、天然ワックス、トリブチルホスフェートなど）、リン燐酸エステル系消泡剤（例えば、オクチルリン酸ナトリウムなど）、アミン系消泡剤（例えば、ジアミルアミンなど）、アミド系消泡剤（例えば、ステアリン酸アミドなど）、その他の消泡剤（例えば、硫酸第二鉄、ボーキサイトなど）などが挙げられる。これらの消泡剤は、単独または複数組み合わせて用いてもよい。特に好ましくは、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の２つの成分を組み合わせて使用することである。本発明の核酸抽出法において、溶解液中における消泡剤の濃度は０．１〜１０質量％であることが好ましい。
【００３５】
本発明の核酸抽出法では、工程（ａ）の溶解液中に水溶性有機溶媒を混合しておくことで、ライセート溶液、洗浄液の通過時間を大幅に短くすることが出来る。特に、洗浄液通過時間への効果は大きい。さらに、一回の溶出工程において、抽出膜からより核酸が溶出しやすくなる。工程（ａ）において、溶解液中の水溶性有機溶媒の濃度は７０体積％以下が好ましく、５０体積％以下が特に好ましく、２０％体積以下が最も好ましい。
【００３６】
前記水溶性有機溶媒の種類は、アセトン、アルコール類、ジメチルホルムアミド等が挙げられる。中でも、アルコール類が好ましい。アルコール類は、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでも良い。とりわけメタノール、エタノール、プロパノール及びその異性体、ブタノール及びその異性体をより好ましく用いることができる。これらの中でも、環境負荷の低減、有毒性の観点からエタノールが特に好ましい。これらの水溶性有機溶媒は単独でも複数組み合わせて用いてもよい。
【００３７】
また、本発明の核酸抽出法においては、ライセート溶液、洗浄液の通過速度が十分に速ければ、水溶性有機溶媒を加えなくとも良い。この様な例として、例えば、低細胞数を取り扱う場合を挙げることが出来る。
【００３８】
また、工程（ａ）において溶解液を加えた後に機械的往復運動を行うことが好ましい。機械的往復運動として、例えばピペッティング操作が挙げられる。細胞数が多い場合には、ピペッティングは特に有効である。ピペッティングを行う際は、溶解液を加えたピペットを用いて、溶解液を加えると同時に行うことが作業性の観点から望ましい。
【００３９】
工程（ａ）において、生体材料を溶解させた溶液に対してピペッティング操作を行って作成した溶解液、もしくは生体材料を溶解させることで調製した溶解液に対して、攪拌操作を行うことがより好ましい。攪拌時間を長くすればするほど、ライセート溶液通過時間、洗浄液通過時間が短くなり、核酸の回収量が増加し、核酸回収量が安定化する。核酸の回収量が増加すると、抽出後の核酸に対する不純物の量が減少する。
【００４０】
前記生体材料は、溶解液を添加する前、溶解液を添加した後、ライセート溶液を調製した後、あるいはいずれの工程でホモジナイズ処理を行ってもよい。ホモジナイズ処理することで、通過時間を長くするような成分、例えば、目詰まりの原因となる物質が粉砕され、目詰まりの改善および通過時間が短くなる。ホモジナイズ処理は、例えば、超音波処理、鋭利な突起物を用いる処理、高速攪拌処理を用いる処理、微細空隙から押し出す処理、ピペッティング、ガラス、ステンレス、ジルコニアなどのビーズを用いる処理等で行うことができる。
【００４１】
前記ホモジナイズの方法は、特に限定されず、一般的に行われている方法を用いることが出来る。一例を挙げると、攪拌装置により３０から６０００ｒｐｍで１秒から３分間混合することが好ましい。これにより、最終的に分離精製される核酸収量を好適に増加させることができるとともに、通過時間が短くなる。さらに、抽出後の核酸の純度が良くなる。例えば、ＲＮＡを抽出する場合、ゲノムＤＮＡが切断され、抽出溶液中へのゲノムＤＮＡの混入が大幅に減少する。
【００４２】
２．ライセート工程（ｂ）
本発明の核酸抽出法では、工程（ｂ）において、前記工程（ａ）によって調製した生体材料を溶解して核酸を溶出させた溶解液中に、水溶性有機溶媒を添加し、核酸吸着能を持った固体材料、例えば、表面に水酸基を有する固体材料と接触させる。この操作により、試料溶液中の核酸が表面に水酸基を有する有機高分子に吸着、多孔膜の場合はフイルター表面、細孔に捕捉および吸着する。
【００４３】
前記水溶性有機溶媒としては、特に限定されないが、アルコール類が好ましい。アルコール類としては、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでもよく、メタノール、エタノール、プロパノール又はその異性体、ブタノール又はその異性体が好ましい。これら水溶性有機溶媒は、単独でも複数組み合わせて用いてもよい。特に好ましい水溶性有機溶媒として、エタノールが挙げられる。
【００４４】
前記水溶性有機溶媒の濃度が低いと核酸回収量が低下する。これはライセート溶液が膜を通過している間に膜に保持すべき核酸が膜に結合せずに通過液側に移動してしまい、核酸の回収量が低下することが原因と推定している。水溶性有機溶媒の濃度が高いと、ライセートなどの溶液、洗浄液が非常に通過しやすくなるが、核酸の回収量は低下する。核酸の回収量が低下すると、抽出後の核酸に対する不純物の量が増加し、高純度核酸が得られにくくなる。したがって、工程（ｂ）における水溶性有機溶媒の濃度は、ライセート溶液を調製した時の濃度で１０体積％から６０体積％が好ましく、２０体積％から４０体積％が特に好ましい。
【００４５】
本発明の核酸抽出法では、工程（ｂ）において、前記工程（ａ）によって調製した生体材料を溶解して核酸を溶出させた溶解液中に、水溶性有機溶媒を添加した後、少なくとも一回の機械的往復運動、例えばピペッティング操作もしくは攪拌操作もしくはこれらの両方を行うことが好ましい。攪拌操作を行う場合には、一回で行うこともできるが、攪拌を二回行い、最初の攪拌では検体一本ずつ行い、二回目の攪拌では検体をまとめて行うこともできる。二回攪拌を行うことは、検体数が多い場合には、特に有効である。攪拌時間は、一回目も二回目も０．１秒以上６００秒以下であれば良い。使用者の負担軽減から、一回目の攪拌時間を短く、二回目の攪拌時間を一回目よりも長くする方が好ましい。
【００４６】
水溶性有機溶媒を加えた後の前記ピペッティングは、その回数を増やせば増やすほど、ライセート溶液、洗浄液の通過時間が短くなり、核酸の収量が向上する。また、使用する細胞数が少ない場合には、使用者の負担軽減の観点から、一回の攪拌操作、もしくはピペッティング操作だけでもかまわない。
【００４７】
３．吸着工程（ｃ）
本発明の核酸抽出法では、工程（ｃ）において、前記工程（ｂ）で得られたライセート溶液と固体材料とを接触させ、溶解液中の核酸を固体材料に吸着させる。本発明に使用する固体材料は、１枚であってもよいが、複数枚を使用することもできる。また、複数枚使用する場合、固体材料は同一のものであってもよく、異なるものであってもよい。
【００４８】
工程（ｃ）においては、作成したライセート溶液を二つ以上のカートリッジに分注することで、本来ならばより少ない本数のカートリッジを使用した場合には、目詰まり、もしくはライセート溶液、洗浄液の通過時間が長くなるような検体でも目詰まりなく、短時間で抽出を行わせることが出来る。
【００４９】
前記カートリッジは複数本使用してもよい。カートリッジを複数本用いる場合には、１回以上のピペッティングを行うことが望ましい。これは、ライセート溶液を均一化し、カートリッジ間で得られる核酸の量を均一にすると共に、目詰まりの原因となる物質を均一化させ、不均一から生じる通過時間の偏りから生じる目詰まりの発生を可能な限り減少させるためである。同様の理由から、カートリッジに添加するライセート液量も可能な限りカートリッジ間で同一量であることが好ましい。
【００５０】
前記カートリッジにライセート溶液を添加するときは、可能な限り泡を入れないようにして添加することが好ましい。これは、泡から由来する不純物が抽出液中に混入しないようにするためである。可能な限り泡を入れない方法の例として、ライセート調製時に消泡剤を使用することで泡の発生を抑えること、ライセート調製後に遠心処理を行い泡を消失させること、ライセート調製に使用した容器からライセート溶液をカートリッジにピペットなどを用いて添加する際に可能な限り泡を吸い取らないようにすること、カートリッジ壁面をライセート溶液が伝わるようにライセートを添加すること、ライセートをカートリッジに添加後カートリッジ内に残存している泡を吸い取ること、ライセートをカートリッジに添加後遠心操作を行うことで泡を消失させることといった方法が挙げられる。
【００５１】
また、工程（ｃ）において、ライセート溶液がカートリッジ内で浸漬するカートリッジ内面以外の内面にライセート溶液が付着しないようにして入れることが好ましい。これは、抽出液中にライセート由来の不純物の混入を減らすためである。ライセート溶液がカートリッジ内で浸漬するカートリッジ内面以外の内面にライセート溶液が付着しないようにして入れるための方法の例として、カートリッジ内にライセート溶液添加後に形成されるライセート形成面よりも下部にピペットの先端を位置するようにしライセートを添加することといった方法が挙げられる。
【００５２】
４．洗浄工程（ｄ）
本発明の核酸抽出法では、工程（ｄ）において固体材料中の抽出対象核酸以外の不純物を洗浄液を用いて洗浄する。該洗浄液に含まれる水溶性有機溶媒としては、アルコールを用いることができる。アルコールとしては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−イソプロパノール、ブタノールが挙げられる。プロパノールとしては、イソプロパノール、ｎ−プロパノールのいずれでもよく、ブタノールも直鎖状でも分岐状でもいずれでもよい。これらアルコールは、複数種類を使用することもできる。中でもエタノールを用いることが好ましい。
【００５３】
前記洗浄液中に含まれる水溶性有機溶媒の量は、５〜１００質量％であることが好ましく、５〜４０質量％であることがより好ましい。この範囲で、ＤＮＡのコンタミネーションが増大することなく、目的のＲＮＡが多孔性膜から脱着することがなく、したがって、ＲＮＡを純度よく、回収量を高くすることができ好ましい。
【００５４】
一方、前記洗浄液に含まれる水溶性塩は、ハロゲン化物の塩であることが好ましく、中でも塩化物が好ましい。また、該水溶性塩は、一価または二価のカチオンであることが好ましく、特にアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩が好ましく、中でもナトリウム塩及びカリウム塩が好ましく、ナトリウム塩が最も好ましい。
【００５５】
工程（ｄ）において前記水溶性塩が洗浄液中に含まれる場合、その濃度は１０ｍｍｏｌ／ｌ以上であることが好ましく、その上限は不純物の溶解性を損なわない範囲であれば特に問わないが、１ｍｏｌ／ｌ以下であることが好ましく、０．１ｍｏｌ／ｌ以下であることがより好ましい。よりさらに好ましくは、水溶性塩が塩化ナトリウムであり、とりわけ、塩化ナトリウムが２０ｍｍｏｌ／ｌ以上含まれていることが好ましい。
【００５６】
前記洗浄液は、カオトロピック物質を含んでいないことが好ましい。これによって、回収工程においてカオトロピック物質が混入する可能性を減らすことができる。回収工程時に、カオトロピック物質が混入すると、しばしばＲＴ−ＰＣＲ反応等を行う場合の酵素反応を阻害するので、後に酵素反応等を行う場合を考慮すると洗浄液にカオトロピック物質を含まないことが理想的である。また、カオトロピック物質は、腐食性があり有害であるので、この点でもカオトロピック物質を用いないで済むことは、実験者にとっても試験操作の安全上極めて有利である。
【００５７】
工程（ｄ）においては、ライセート液量がカートリッジ容量よりも少ない場合で、カートリッジ内にライセート溶液をアプライする場合、ライセート溶液アプライによりカートリッジ内部に形成された液面の高さよりも、洗浄工程によってカートリッジ内にアプライされた洗浄液によって形成された液面の高さをより高くすることもできる。液面の高さをより高くするための方法として、例えば、特定のプロトコールにおいて採用されているライセート液量よりも多い液量を洗浄液として添加することが出来る。この操作は、非自動化された方法によって行っても良いし、予め洗浄液量を核酸抽出機に入力しておき、自動的に洗浄液を添加する方法などがある。また、遠心操作によって、ライセート液面を低下させてもかまわない。
【００５８】
ライセート溶液アプライによりカートリッジ内部に形成された液面の高さよりも、洗浄工程によってカートリッジ内にアプライされた洗浄液によって形成された液面の高さをより高くすることで、カートリッジの内側の壁面に残存しているライセート溶液が洗浄され、ライセート溶液に由来する抽出対象核酸以外の成分が核酸回収（抽出）液中に混入する可能性を減らすことが出来る。もし、カートリッジの内側でライセート溶液によって形成された液面が洗浄液によって形成された液面よりも高ければ、カートリッジ内に形成されたライセート溶液層から重力の作用によって、カートリッジ下方にライセート溶液が流れ込み、回収液中にライセート溶液が混入する可能性が高くなる。その一方で、カートリッジの内側で、ライセート溶液によって形成された液面が洗浄液によって形成された液面よりも低ければ、ライセート溶液は十分に洗浄され、回収溶液中にライセート溶液由来の成分が混入する可能性は低下する。
【００５９】
前記ライセート溶液調製時には、種々の原因で泡が発生する場合がある。本発明者らは、カートリッジへのアプライ時に、この泡のカートリッジへの混入を最小限にすることで、核酸回収後の回収液中への不純物の混入が減少することを見出した。カートリッジ内に泡が残っていると、ライセート溶液や洗浄液を加えた時に、その浮力によって、カートリッジ内にそれらの溶液が形成する液面付近に泡が集合する。この様な状況になると、泡はカートリッジ内部の溶液によって形成された液面にとどまり、加圧もしくは遠心によってライセート溶液や洗浄液をカートリッジ中の固体材料中を通過させても、カートリッジの内壁には泡がそのまま残っていることが多く、回収液をカートリッジ内にアプライした後に、回収液に残存している泡から不純物が混入し、核酸抽出液中に混入する可能性がある。従って、カートリッジへのアプライ時に、可能な限り泡を混入しないようにアプライすることによって、抽出液中にライセート由来の不純物が混入する可能性を減少させることが出来る。
【００６０】
工程（ｄ）において、ライセート液量がカートリッジ容量と比べて同程度の容量の場合、カートリッジ内でライセート溶液によって形成された液面よりも、洗浄液によって形成された液面を低くすることもできる。これにより、カートリッジ内のライセート溶液の上に形成された泡の集合部位をカートリッジの高さの低いところに形成させることが出来、後の洗浄工程において洗浄効率を上げることが可能となるからである。これは以下のようになると考えられる。
【００６１】
前記ライセート溶液中には泡の発生の原因となる物質が多く含まれている。高濃度のライセート溶液の量が多ければ多いほど洗浄液添加時に泡が発生する可能性が高くなる。カートリッジへライセート溶液を添加し、加圧もしくは遠心により固体材料中を通過させた後はライセート溶液由来の成分が残っている。この状態で洗浄液を加えると泡が発生する可能性が高いが、ライセート溶液によって形成されたカートリッジ内の液面よりも、最初の洗浄液によって形成された液面を低くしておけば、仮に泡が発生し、最初の洗浄液を加圧もしくは遠心により通過させた後、泡がカートリッジ内に残ったとしても、カートリッジ内に形成された泡の層よりも、次の洗浄液が形成する液面を高くする、すなわち、液量を多くすることで、泡が破壊、あるいは、洗浄液通過時に押し流される可能性が高くなる。この結果、泡から由来する不純物の抽出液への混入の可能性が低くなり、高純度核酸が得られるようになったと推定している。この場合は、ライセート液量が多く、洗浄液量をライセート液量よりも多くすることが困難な場合に有効である。泡の発生は、水溶性有機溶媒の濃度が低いほど顕著である。３０％以下の水溶性有機溶媒を洗浄液として用いる場合には、本発明は特に効果がある。
【００６２】
本発明の核酸抽出法では、工程（ｄ）において、前記工程（ｃ）で核酸を吸着させた固体材料洗浄工程において、洗浄液による洗浄操作を数回行う場合、洗浄操作に使用する洗浄液の液面を後の洗浄操作において高くすることが好ましい。より好ましくは、洗浄操作に使用する洗浄液の量を後の洗浄操作において増加させる。例えば、最初の洗浄液量を５００μｌとし、次の洗浄液量を７５０μｌ、その次の洗浄液量を７５０μｌにすることが出来る。この様な操作を行うことで、より高純度の核酸を得ることが出来る。これは、カートリッジ内壁に泡が洗浄時に残っていた場合には、先行するライセート溶液添加もしくは洗浄操作により形成されたカートリッジ内の泡の位置よりも、続く洗浄液によりカートリッジ内に形成された液面を高くすれば、洗浄液をカートリッジ内に加え、加圧又は遠心時の洗浄液に固体材料を通過させるときに、泡が破壊もしくは洗い流され、回収液中へ泡から由来する不純物の量が減少し、より高純度の核酸が得られやすくなるからである。
【００６３】
工程（ｄ）の洗浄工程において、異なる濃度の水溶性有機溶媒から構成された洗浄液を用いることもできる。水溶性有機溶媒、例えば、エタノールなどは消泡効果もある。洗浄工程において、高濃度の水溶性有機溶媒を一回以上カートリッジへ加えることによって、泡が消える可能性が高くなり、洗浄効率が向上することで、抽出液中への不純物の混入が減り、高純度核酸が得られやすくなる。ただし、回収液をカートリッジに滴下する直前の洗浄工程には高濃度水溶性有機溶媒を用いない方が良い。これは、抽出液中に水溶性有機溶媒が混入する可能性を減らすためである。
【００６４】
前記洗浄液には、消泡剤を含めてもかまわない。これは、洗浄時に発生する泡の発生を抑えることで、抽出液中に泡から由来する不純物の混入を抑えるためである。ただし、回収液添加直前の洗浄液には消泡剤を含んだ洗浄液は避けたほうが良い。これは、抽出液に消泡剤が混入するのを抑えるためである。
【００６５】
工程（ｄ）の洗浄工程において最初の洗浄液量を減らすことは、通過時間の短縮にも効果がある。すなわち、洗浄工程における洗浄液量を一定にした場合、洗浄液が膜を通過するのに必要な通過時間は、洗浄液量が同じ場合、一般的に最初に加えた洗浄液の膜通過時間が最も長く、洗浄回数が増加するにつれて通過時間は短くなり、最初の洗浄液量を減らすことは通過時間の短縮には効果的だからである。また、ライセート溶液、洗浄液が膜を通過した後の溶液を蓄えておく廃液タンクの液量が多いほど廃液タンクからの廃液の飛び跳ねによりカートリッジ先端へ付着する。回収液がカートリッジの下端を通過する際に、この付着液が抽出液に混入する可能性がある。しかし、最初の洗浄液量を減らすことは、全体の液量を減少させ、その結果、廃液の飛び跳ねが減少し、より高純度の核酸が得られやすくなる。
【００６６】
工程（ｄ）の洗浄工程において、二種の異なった濃度の水溶性有機溶媒から構成された洗浄液を用いることも出来る。洗浄液中の水溶性有機溶媒の濃度が高いほど洗浄液の膜通過時間は短いが、例えば、ＲＮＡを抽出する場合、この様な高濃度水溶性有機溶媒を使用することは、ゲノムＤＮＡを膜から脱着させることが出来ず、ゲノムＤＮＡの抽出液への混入が問題となる。しかし、洗浄工程の最初、途中もしくは最後に、この洗浄液よりも低い濃度の水溶性有機溶媒から構成された洗浄液を使用することで、ゲノムＤＮＡを膜から脱着させることが出来、抽出液中にゲノムＤＮＡが混入する可能性を低下させることが出来る。
【００６７】
この場合、低い水溶性有機溶媒から構成された洗浄液の液量は、高い水溶性有機溶媒から構成された洗浄液の液量よりも少ないほうが良い。これは、低い濃度の水溶性有機溶媒から構成された洗浄液の方が洗浄液の膜通過時間が長いからである。また、低い濃度の水溶性有機溶媒の代わりに、高濃度塩、例えば、塩化ナトリウムの水溶液、すなわち、水溶性有機溶媒が全く入っていない洗浄液を洗浄工程の途中に加えることも出来る。高濃度塩は、核酸の膜への吸着を促進すると推定しており、エタノールを含まずとも核酸が膜から脱着する量は少ない。
【００６８】
ＤＮＡとＲＮＡを含むライセート溶液からＲＮＡのみを選択的に分離精製する場合、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジに通過させ、核酸吸着性多孔性膜に核酸を吸着させた後、洗浄を行い、ＤＮａｓｅを作用させる工程を経ることにより行うことが出来る。該ＤＮａｓｅの種類は特に限定されず、いずれのＤＮａｓｅも用いることが出来る。また、ＤＮａｓｅの代わりに、好ましくは５０体積％以下、より好ましくは２０体積％以下の水溶性有機溶媒、例えば、エタノールを含み、さらに、好ましくは１０ｍＭ以上、より好ましくは３００ｍＭ以上の塩、例えば、塩化ナトリウムから構成された溶液を用いることも出来る。
【００６９】
核酸分離精製カートリッジの核酸吸着性多孔性膜でＤＮａｓｅを作用させる工程における時間は、ＤＮＡとＲＮＡを含む核酸混合物溶液中のＤＮＡ量と作用させるＤＮａｓｅ濃度により異なるが５秒〜３６０分が好ましく、３０秒〜１８０分がより好ましい。また、核酸分離精製カートリッジの核酸吸着性多孔性膜でＤＮａｓｅを作用させる工程における温度は４℃以上であればよく、１０〜５０℃が好ましく、反応効率を高めるため高温、例えば５０〜７０℃で行うこともできる。尚、「核酸吸着性多孔性膜でＤＮａｓｅを作用させる」とは、核酸吸着性多孔性膜における、核酸が吸着している部位とＤＮａｓｅを作用させることを意味し、「核酸吸着性多孔性膜で」とは、酸吸着性多孔性膜上に限らず、多孔性膜における孔中や、膜の裏側の孔の出口等も含む。ＤＮａｓｅの添加は、ＤＮａｓｅ添加後の洗浄液の通過時間を短くする、もしくは目詰まりを改善する効果も有する。
【００７０】
また、ＤＮａｓｅ以外に、タンパク分解酵素、脂質分解酵素、糖分解酵素、核酸分解酵素、クロロホルムやメタノールなどの有機溶媒のいずれか一つもしくはこれらを混合したものを添加することもできる。これらの添加により、膜上に残っている目詰まり原因物質の構成成分が分解促進されると推定している。その結果、洗浄液の通過性を向上させ、洗浄液通過時間の短縮、目詰まりの改善を行うことができる。これらの添加は、ライセート溶液通過後に行ってもかまわないが、数回洗浄液による洗浄を行った方がより好ましい。特に、タンパク分解酵素、脂質分解酵素、糖分解酵素、核酸分解酵素を用いる場合には、膜上に残存しているカオトロピック塩の影響で、これらの分解酵素が変性を受け、活性を阻害されることで、目詰まり原因物質の分解能力が低下し、洗浄液通過時間が短くならない可能性が高く、さらに、ゲノムＤＮＡを除去する場合、そのゲノムＤＮＡを切断する活性が低くなるからである。
【００７１】
５．回収工程（ｅ）
本発明の核酸抽出法では、工程（ｅ）において、回収液により固体材料から核酸を脱着させ、カートリッジ容器外に排出する。検体から調製した核酸混合物溶液の体積に対して、回収液の体積を調整してＲＮＡの脱着を行うことができる。分離精製されたＲＮＡを含む回収液量は、そのとき使用する検体量による。一般的によく使われる回収液量は数１０〜数１００μｌであるが、検体量が極微量である時や、逆に大量のＲＮＡを分離精製したい場合には回収液量は１μｌから数１０ｍｌの範囲で変える事ができる。
【００７２】
前記回収液としては、好ましくは精製蒸留水、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡバッファー等が使用できる。また、工程後に回収したＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）に供する場合、ＲＴ−ＰＣＲ反応において用いる緩衝溶液（例えば、ＫＣｌ  ７５ｍｍｏｌ／ｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍｍｏｌ／ｌ、ＭｇＣｌ2  ３．０ｍｍｏｌ／ｌ、ＤＴＴ  １０ｍｍｏｌ／ｌを最終濃度とする水溶液）を用いることもできる。
【００７３】
前記回収液のｐＨは、ｐＨ１〜１０であることが好ましい。さらには、ｐＨ２〜７であることが好ましい。また特にイオン強度と塩濃度は吸着ＲＮＡの溶出に効果を及ぼす。回収液は、５００ｍｍｏｌ／ｌ以下のイオン強度であることが好ましい。塩濃度は、０．５ｍｏｌ／ｌ以下であることが好ましく、さらには、０．０１ｍｍｏｌ／ｌ以上５０ｍｍｏｌ／ｌ以下であることが好ましい。こうすることで、ＲＮＡの回収率が向上し、より多くのＲＮＡを回収できることができる。
【００７４】
前記回収液の体積を少なくすることによって、濃縮された核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(核酸混合物溶液体積)＝１：１００〜９９：１００、更に好ましくは、(回収液体積)：(核酸混合物溶液体積)＝１：１０〜９：１０にすることができる。これにより核酸分離精製後工程において濃縮のための操作をすることなく、簡単に核酸を濃縮できる。これらの方法により検体よりも核酸が濃縮されている核酸溶液を得る方法を提供できる。
【００７５】
また別の態様としては、前記回収液の体積を調整することで核酸の脱着を行うことにより、希望の濃度の核酸を含む回収液を得ることができ、次工程、例えばＲＴ−ＰＣＲなどを行う場合に適した濃度の核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(核酸混合物溶液体積)＝１：１〜５０：１、更に好ましくは、(回収液体積)：(核酸混合物溶液体積)＝１：１〜５：１にすることができる。これにより核酸分離精製後に濃度調整をする煩雑さがなくなるというメリットを得られる。更に、十分量の回収液を使用することにより、多孔性膜からの核酸回収率の増加を図ることができる。
【００７６】
また、目的に応じて前記回収液の温度を変化させることで簡便に核酸を回収することができる。例えば、回収液の温度を０〜１０℃にして多孔性膜からの核酸の脱着を行うことで、酵素による分解を防止する何らかの試薬や特別な操作を加えることなく核酸分解酵素の働きを抑制して、核酸の分解を防ぎ、簡便に、効率よく核酸溶液を得ることができる。また、回収液の温度を１０〜３５℃とした場合、一般的な室温で核酸の回収を実施することが出来、複雑な工程を必要とせずに核酸を脱着させて分離精製することができる。
【００７７】
また別の態様としては、前記回収液の温度を高温、例えば３５〜７０℃することで、多孔性膜からの核酸の脱着を煩雑な操作を経ず簡便に高い回収率で実施することができる。
【００７８】
前記回収液の注入回数は限定されるものではなく、１回でも複数回でもよい。通常、迅速、簡便に核酸を分離精製する場合は、１回の回収で実施するが、大量の核酸を回収する場合等複数回にわたり回収液を注入してもよい。
【００７９】
工程（ｅ）における核酸の回収工程では、核酸の回収液をその後の工程に使用できる組成にしておくことが可能である。分離精製された核酸は、しばしばＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼチェインリアクション）法が適用される。この場合、分離精製された核酸溶液はＲＴ−ＰＣＲ法に適したバッファー液で希釈する必要がある。本方法による回収工程において、回収液にＲＴ−ＰＣＲ法に適したバッファー液を用いることで、その後のＲＴ−ＰＣＲ工程へ簡便、迅速に移行することができる。
【００８０】
また、前記回収工程において、核酸の回収液に回収した核酸の分解を防ぐための安定化剤を添加しておくことも可能である。該安定化剤としては、抗菌剤、抗カビ剤や核酸分解抑制剤などを添加することができる。該核酸分解抑制剤としては、核酸分解酵素の阻害剤が挙げられ、具体的にはＥＤＴＡなどが挙げられる。また別の実施態様として、回収容器にあらかじめ安定化剤を添加しておくこともできる。
【００８１】
核酸を膜から脱着させる場合の回収液と膜との浸漬時間を長くすることで、浸漬時間が短い場合には数回の抽出操作を行わなければ吸着させた核酸が溶出しなかったのが、一回もしくはより少ない回数でより多くの核酸を溶出させることが可能となる。本発明者らが詳細に検討した結果、核酸を抽出する際の浸漬時間が０．１秒以上６００秒以下、好ましくは、１０秒以上３０秒以下であれば、十分な量の核酸を得ることが出来た。
【００８２】
したがって、溶解液中の界面活性剤の濃度を上げると、ライセート溶液、洗浄液の通過速度が短くなるが、予想される核酸の収量を得るためには、数回の抽出操作が必要となり、回収した核酸の濃度が低下するが、核酸を吸着させた膜と回収液との浸漬時間を増加させることでより多くの核酸が回収できる。
【００８３】
本発明において使用する検体は、核酸を含む生体材料であれば特に制限はなく、例えば診断分野においては、検体として採取された全血、血漿、血清、尿、便、精液、唾液等の体液、あるいは植物（又はその一部）、動物（またはその一部）、細菌、ウイルス、培養細胞、あるいはそれらの溶解物およびホモジネート物などの生物材料が対象となる。
【００８４】
前記培養細胞としては、浮遊系細胞、接着系細胞等が挙げられる。該浮遊系細胞とは培養液中で容器壁に付着することなく漂いながら生育、増殖する細胞を指し、例えばＨＬ６０、Ｕ９３７、ＨｅＬａＳ３等が代表的な細胞株として挙げられる。該接着系細胞とは培養液中で容器壁底面に付着し生育、増殖する細胞を指し、例えばＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＣＨＯ細胞等が代表的な細胞株として挙げられる。本発明において検体として用いられる動物（またはその一部）としては、動物組織が挙げられる。例えば、動物を解剖したとき或いは生検により採取可能な、肝臓、腎臓、脾臓、脳、心臓、肺や胸腺など個体を構成する組織全てを使用することができる。これらの検体は、細胞膜・核膜を溶解して核酸を溶出する試薬を含む水溶液、いわゆる核酸可溶化試薬で処理することが好ましい。これにより細胞膜・核膜が溶解されて、核酸が水溶液内に分散した核酸混合物溶液を得ることができる。
【００８５】
本発明において「核酸」とは一本鎖、二本鎖、三本鎖、四本鎖のいずれかもしくはそれらの混合物のいずれでもよく、また、分子量の制限も無い。また、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらが修飾されたもの、およびそれらの混合物、いずれのものでも良い。
【実施例】
【００８６】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００８７】
（実施例１）ＲＮＡ抽出時における洗浄液回数と通過時間との関係
凍結ペレットＨＬ６０（細胞数５×１０６個）に０．５Ｍ  ＢｉｓＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．５）を３０μｌ添加し、ピペッティングにより細胞を分散させた。溶解液としてＬＲＣ（富士写真フイルム株式会社製）を５４０μｌ加えることで細胞を溶解し、直ちにピペッティングを５回行った。ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００（ＥＹＥＬＡ製）を用いて攪拌処理（２，５００ｒｐｍ）を１分間行い、遠心によりスピンダウンさせた。そして、特級エタノール（和光純薬工業株式会社製）を２６０μｌ加え、１分間ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００を用いて攪拌（２，５００ｒｐｍ）を行った。その後、遠心によりスピンダウンさせることで、ライセート溶液を調製した。
【００８８】
ＮＥＸＴカートリッジ（富士写真フイルム株式会社製、口径７ｍｍ、洗浄液（ＷＲＴ）、回収液（ＣＲＴ）をＱｕｉｃｋＧｅｎｅ−８００（富士写真フイルム株式会社製）にセットした後、ＮＥＸＴカートリッジにライセート溶液を入れ、Ｑｕｉｃｋ  Ｇｅｎｅ  ８００のＲＮＡモードで抽出を行った。この時、すべての洗浄液量を同一にし、洗浄液量を５００μｌ、回収液量を１００μｌ、回収液の浸漬時間を１２０秒に設定した。
【００８９】
ＲＮＡ回収の定量および純度の決定は、紫外可視分光光度計ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて測定し、回収量は２６０ｎｍの吸光度から、核酸の純度は２６０ｎｍと２８０ｎｍの比率から決定し、この比率が１．８以上であれば、純度は良好と判断した。ＤＮＡの混入などはゲル電気泳動を用いて分析した。ゲル電気泳動の条件は、バッファーとしてＴＡＥ（Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ）を用い、試料５μｌとローディングバッファー（１０×Ｂｌｕｅ  Ｊｕｉｃｅ）とを混合後、全量を電気泳動した。
【００９０】
その結果、洗浄液の通過時間は一回目が３６．８秒、二回目が２０．２秒、三回目が１６．３秒、四回目が１４．９秒、五回目が１３．２秒となり、洗浄回数と共に通過時間は短くなった。通過時間は、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅの加圧ヘッドが加圧を開始してから、カートリッジ内の溶液が抜けるまでの時間である。
【００９１】
（実施例２）ＲＮＡ抽出時において、後の洗浄液量を増やした場合の抽出液中に含まれている不純物の量
凍結ペレットＨＬ６０（０．５×１０６個）に０．５Ｍ  ＢｉｓＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．５）を３０μｌ添加し、ピペッティングにより細胞を分散させた。グアニジンチオシアネートを主成分とする溶解液を４５０μｌ加えることで細胞を溶解し、直ちにピペッティングを５回行った。ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００（ＥＹＥＬＡ製）を用いて攪拌処理（２，５００ｒｐｍ）を１分間行い、遠心によりスピンダウンさせた。
【００９２】
特級エタノールを１９５μｌ加え、１分間ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００を用いて攪拌（２，５００ｒｐｍ．）を行った。その後、遠心によりスピンダウンさせることで、ライセート溶液を調製した。ＮＥＸＴカートリッジ（富士写真フイルム株式会社製、口径７ｍｍ、洗浄液（ＷＲＴ）、回収液（ＣＲＴ）をＱｕｉｃｋＧｅｎｅ−８００（富士写真フイルム株式会社製）にセットした後、ＮＥＸＴカートリッジにライセート溶液を入れ、Ｑｕｉｃｋ  Ｇｅｎｅ  ８００のＲＮＡモードで抽出を行った。この時、ライセート液量は６４５μｌとなり、洗浄液の液量は、一回目６００μｌ、二回目７５０μｌ、三回目７５０μｌに設定し、回収液量を１００μｌ、回収液の浸漬時間を３０秒に設定した。また、比較として、すべての洗浄液量を同一にし、洗浄液量を７５０μｌにしたものも抽出を行った。
【００９３】
ＲＮＡ回収の定量および純度の決定は、実施例１と同様にして行った。その結果、２３０ｎｍの吸光度、主として、グアニジンチオシアネートの吸光度は、最初の洗浄液として６００μｌを用い、二番目、三番目の洗浄液量を７５０μｌにしたものは、１．８５（光路長は１ｍｍで測定し、１０ｍｍ換算にしたもの）であったのが、洗浄液量が７５０μｌと一定の場合には、２３０ｎｍの吸光度は１．９８となり、洗浄液量を一定にした方がより純度がグアニジンチオシアネートを主成分とする不純物の量が多くなった。以上の結果から、後の洗浄液量を増加させた方が、抽出液中に含まれる不純物の量が少なくなることがわかった。
【００９４】
（実施例３）ＲＮＡ抽出時において、後の洗浄液量を増やした場合の通過時間
凍結ペレットＨＬ６０（５×１０６個）にＰＢＳを２０μｌ添加し、タッピングにより細胞を分散させた。グアニジンチオシアネートを主成分とする溶解液を４００μｌ加えることで細胞を溶解し、直ちにピペッティングを５回行った。ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００（ＥＹＥＬＡ製）を用いて攪拌処理（２，５００ｒｐｍ）を１分間行い、遠心によりスピンダウンさせた。そして、特級エタノールを１７０μｌ加え、１分間ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００を用いて攪拌（２，５００ｒｐｍ）を行った。その後、遠心によりスピンダウンさせることで、ライセート溶液を調製した。
【００９５】
ＮＥＸＴカートリッジ、洗浄液（ＷＲＴ）、回収液（ＣＲＴ）をＱｕｉｃｋＧｅｎｅ−８００にセットした後、ＮＥＸＴカートリッジにライセート溶液を入れ、Ｑｕｉｃｋ  Ｇｅｎｅ  ８００のＲＮＡモードで抽出を行った。この時、ＷＡＳＨ  ＣＯＵＮＴを３、ＷＡＳＨ  ＶＯＬ１を５０、ＷＡＳＨ  ＶＯＬ２を７５０、ＷＡＳＨ  ＶＯＬ３を７５０に設定した。比較例の場合には、ＷＡＳＨ  ＣＯＵＮＴを３、ＷＡＳＨ  ＶＯＬ１を７５０、ＷＡＳＨ  ＶＯＬ２を７５０、ＷＡＳＨ  ＶＯＬ３を７５０に設定した。
【００９６】
ＲＮＡ回収の定量および純度の決定は、実施例１と同様にして行った。その結果、ＲＮＡの収量は両方法とも４１μｇと変わらなかった。ライセートの通過時間も両方法とも約３０で変わらなかった。洗浄液１の通過時間は、３．７秒、洗浄液２の通過時間は１７．３秒、比較例の洗浄液１が２２．８秒であった。これらのことから、洗浄液の通過時間の最大値は、後の洗浄液量を増やしたほうが、比較例と比べて３４％通過時間が短くなり、後の洗浄液量を増やすことは、通過時間を短くすることに効果があることが分かった。
【００９７】
（実施例４）ＲＮＡ抽出時における、洗浄液量と純度の関係
凍結ペレットＨＬ６０（０．５×１０６個）に０．５Ｍ  ＢｉｓＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．５）を３０μｌ添加し、ピペッティングにより細胞を分散させた。グアニジンチオシアネートを主成分とする溶解液を４５０μｌ加えることで細胞を溶解し、直ちにピペッティングを５回行った。ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００（ＥＹＥＬＡ製）を用いて攪拌処理（２，５００ｒｐｍ）を１分間行い、遠心によりスピンダウンさせた。そして、特級エタノールを１９５μｌ加え、１分間ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００を用いて攪拌（２，５００ｒｐｍ）を行った。その後、遠心によりスピンダウンさせることで、ライセート溶液を調製した。
【００９８】
ＮＥＸＴカートリッジ（富士写真フイルム株式会社製、口径７ｍｍ、洗浄液（ＷＲＴ）、回収液（ＣＲＴ）をＱｕｉｃｋＧｅｎｅ−８００（富士写真フイルム株式会社製）にセットした後、ＮＥＸＴカートリッジにライセート溶液を入れ、Ｑｕｉｃｋ  Ｇｅｎｅ  ８００のＲＮＡモードで抽出を行った。この時、ライセート液量は６４５μｌとなった。洗浄液の液量は、すべて同一で、それぞれ７５０μｌ、５００μｌ、２５０μｌを用いた。
【００９９】
ＲＮＡ回収の定量および純度の決定は、実施例１と同様にして行った。その結果、２３０ｎｍの吸光度、主として、グアニジンチオシアネートの吸光度は、洗浄液として７５０μｌを用いた場合には、１．９８であったが、５００μｌの場合には２．０３、２５０μｌの場合には２．４４となった。ライセート液量は、６４５μｌであることから、これより大幅に液量の少ない２５０μｌではかなり純度が悪く、洗浄液量の増加と共に、純度は良くなった。特に、ライセート液量よりも液量が多い７５０μｌの洗浄液を用いた場合には、非常に良好な値となった。
【０１００】
（実施例５）ＲＮＡ抽出時における、カートリッジ壁面にライセート溶液を出来るだけ、つかないようにして、ライセート溶液を添加した場合の結果
凍結ペレットＨＬ６０（０．５×１０６個）に０．５Ｍ  ＢｉｓＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．５）を３０μ添加し、ピペッティングにより細胞を分散させた。グアニジンチオシアネートを主成分とする溶解液を４５０μｌ加えることで細胞を溶解し、直ちにピペッティングを５回行った。ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００（ＥＹＥＬＡ製）を用いて攪拌処理（２，５００ｒｐｍ）を１分間行い、遠心によりスピンダウンさせた。そして、特級エタノールを１９５μｌ加え、１分間ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００を用いて攪拌（２，５００ｒｐｍ）を行った。その後、遠心によりスピンダウンさせることで、ライセート溶液を調製した。
【０１０１】
ＮＥＸＴカートリッジ（富士写真フイルム株式会社製、口径７ｍｍ、洗浄液（ＷＲＴ）、回収液（ＣＲＴ）をＱｕｉｃｋＧｅｎｅ−８００（富士写真フイルム株式会社製）にセットした後、ＮＥＸＴカートリッジにライセート溶液を入れ、Ｑｕｉｃｋ  Ｇｅｎｅ  ８００のＲＮＡモードで抽出を行った。この時、ライセート液量は６４５μｌとなった。洗浄液の液量は、すべて同一で、７５０μｌを用いた。
【０１０２】
ＲＮＡ回収の定量および純度の決定は、実施例１と同様にして行った。その結果、カートリッジ内壁面に意図的にライセート溶液を付着させた場合の２３０ｎｍの吸光度は２．４９となり、可能な限りライセート溶液をカートリッジ内壁につかないように添加した場合には１．９８となった。これらのことから、カートリッジ内壁にライセート溶液はできるだけつかないことが良い。
【０１０３】
（実施例６）ＲＮＡ抽出時における、ＮａＣｌ濃度と通過時間との関係
凍結ペレットＨＬ６０（５×１０６個）にＰＢＳを２０μ添加し、タッピングにより細胞を分散させた。グアニジンチオシアネートを主成分とする溶解液を４００μｌ加えることで細胞を溶解し、直ちにピペッティングを５回行った。ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００（ＥＹＥＬＡ製）を用いて攪拌処理（２，５００ｒｐｍ）を１分間行い、遠心によりスピンダウンさせた。そして特級エタノールを１７０μｌ加え、１分間ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００を用いて攪拌（２，５００ｒｐｍ）を行った。その後、遠心によりスピンダウンさせることで、ライセート溶液を調製した。
【０１０４】
ＮＥＸＴカートリッジ、洗浄液（ＷＲＴ）、回収液（ＣＲＴ）をＱｕｉｃｋＧｅｎｅ−８００にセットした後、ＮＥＸＴカートリッジにライセート溶液を入れ、Ｑｕｉｃｋ  Ｇｅｎｅ  ８００のＲＮＡモードで抽出を行った。この時、ＷＡＳＨ  ＣＯＵＮＴを０、ＷＡＳ２  ＣＯＵＮＴを４、ＷＡＳ２  ＶＯＬ１を５０、ＷＡＳ２  ＶＯＬ２を７５０、ＷＡＳ２  ＶＯＬ３を７５０、ＷＡＳ２  ＶＯＬ４を７５０に設定した。ライセート溶液通過後、抽出機は自動的に停止するので、この時に、１００〜５０００ｍＭのＮａＣｌ溶液を２００μｌ添加し、添加後、抽出機を再スタートさせた。
【０１０５】
ＲＮＡ回収の定量および純度の決定は、実施例１と同様にして行った。
その結果判明したＲＮＡの収量と通過時間の関係を図１に示す。収量は、すべての場合で４１〜４６μｇ、ライセート溶液の通過時間は約３０秒となりほぼ同一であったが、１回目の洗浄はＮａＣｌ濃度が１０００ｍＭの時に最も通過時間が短く、２回目の洗浄も１３．５秒と最も短かった（図１）。ＮａＣｌを１００ｍＭ添加した場合には、通過時間は、洗浄液の１回目が１０．７秒、洗浄液の２回目が２２．５秒と、１０００ｍＭのＮａＣｌ溶液を添加した場合の方が、それぞれ、洗浄液の通過時間の最大値が、ＮａＣｌを１００ｍＭ加えた場合と比較して、１０００ｍＭのＮａＣｌを加えたほうが、洗浄液１、２ともに約４０％通過時間が短くなり、通過時間の短縮には有効であることが分かった。
【０１０６】
（実施例７）ＲＮＡ抽出時において、少量かつ低濃度エタノールを添加した場合の効果
５％ＣＯ２の存在下、３７℃にて３日間培養したＨＥＫ２９３（細胞数２．３×１０６個／３．５ｃｍディッシュ）の培養液を吸い取り、１ｍｌのＰＢＳで洗浄、吸引した後、５２５μｌのグアニジンチオシアネートを主成分とする溶解液をディッシュに添加し、セルスクレイパーを用いて細胞を溶解するとともにディッシュ表面からはがしとった。この溶液を１．７ｍｌのマイクロチューブに移した。ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００（ＥＹＥＬＡ製）を用いて攪拌処理（２，５００ｒｐｍ）を１分間行い、遠心によりスピンダウンさせた。そして、特級エタノールを１７５μｌ加え、１分間ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００を用いて攪拌（２，５００ｒｐｍ）を行った。その後、遠心によりスピンダウンさせることで、ライセート溶液を調製した。
【０１０７】
ＮＥＸＴカートリッジ、洗浄液（ＷＲＴ）、回収液（ＣＲＴ）をＱｕｉｃｋＧｅｎｅ−８００にセットした後、ＮＥＸＴカートリッジにライセート溶液を入れ、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ−８００のＲＮＡモードで抽出を行った。この時、ＷＡＳＨ  ＣＯＵＮＴを１、ＷＡＳ２  ＣＯＵＮＴを３、ＷＡＳＨ  ＶＯＬ１を５０、ＷＡＳ２  ＶＯＬ１を７５０、ＷＡＳ２  ＶＯＬ３を７５０、ＷＡＳ２  ＶＯＬ４を７５０に設定した。ライセート溶液通過後、抽出機は自動的に停止するので、この時に、２００μｌの１０％エタノールと５００ｍＭのＮａＣｌを主成分とする洗浄液をカートリッジに添加し、添加後、抽出機を再スタートさせた。添加位置以外の洗浄液は、７０％エタノールを主成分とする洗浄液を用いた。
【０１０８】
比較例としては、１０％エタノールを主成分とする洗浄液を用い、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ−８００の設定値を、ＷＡＳＨ  ＣＯＵＮＴを３、ＷＡＳＨ  ＶＯＬ１を７５０、ＷＡＳＨ  ＶＯＬ２を７５０、ＷＡＳＨ  ＶＯＬ３を７５０に設定した。
【０１０９】
ＲＮＡ回収の定量および純度の決定は、実施例１と同様にして行った。その結果、ライセートの通過時間は、約３０で比較例とほとんど変わらなかった。洗浄液の通過時間は４〜６秒で、比較例の１５〜２５秒と比べて非常に通過時間は短くなった。しかし、１０％エタノールからなる洗浄液を添加しない場合には、ゲノム核酸のコンタミが発生した（図２）。１０％エタノールからなる洗浄液を添加した場合には、洗浄液の通過時間が４〜６秒で、比較例と同程度のゲノム核酸の少なさであった（図２）。収量は、どの場合でも約４０μｇであった。
【０１１０】
以上の結果から、液量が少なく、エタノール濃度の異なる洗浄液を用いることは、ＲＮＡを抽出する際に、通過時間が短くなり、ゲノムＤＮＡのコンタミが少なくなり、収量もほとんど変わらず、非常に有効な方法と考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】添加するＮａＣｌの濃度を変えたときの通過時間と収量との関係を示す。
【図２】ＲＮＡ抽出時において、少量かつ低濃度エタノールを添加した場合の効果を示す。
【図１】
2007325562.tif 000002
【図２】
2007325562.tif 000003