(57)【要約】      （修正有）【課題】リグニン分解による木質廃棄物の再資源化、製紙工業におけるパルプ漂白の効率化、ダイオキシン等の難分解性の環境汚染物質の浄化、染料の分解除去など、多方面の産業応用が期待できる、実用性の高いリグニンペルオキシダーゼを提供すること。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるリグニンペルオキシダーゼ前駆体、または、該配列において一個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなるリグニンペルオキシダーゼ。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１ないし４のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、もしくはこれらのいずれかのアミノ酸配列において一個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１ないし４のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、もしくはこれらのいずれかのアミノ酸配列において一個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなり、リグニンペルオキシダーゼの前駆体たり得ることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１ないし４のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、もしくはこれらのいずれかのアミノ酸配列において一個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列を備えてなることを特徴とする、リグニンペルオキシダーゼ。
【請求項４】
配列番号１ないし４のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、もしくはこれらのいずれかのアミノ酸配列において一個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを前駆体とすることを特徴とする、リグニンペルオキシダーゼ。
【請求項５】
白色腐朽菌ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３株由来である、請求項３または４に記載のリグニンペルオキシダーゼ。
【請求項６】
配列番号５ないし８のいずれか一つで表される塩基配列から成るＤＮＡでコードされることを特徴とする、リグニンペルオキシダーゼ。
【請求項７】
配列番号５ないし８のいずれか一つで表される塩基配列から成るＤＮＡに、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡでコードされることを特徴とする、リグニンペルオキシダーゼ。
【請求項８】
リグニンペルオキシダーゼを生産する遺伝子を有し、コリオルス・ヴァージカラー・ＩＦＯ  ９７９１（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ  ＩＦＯ  ９７９１）の１０倍以上の最大活性蓄積量にてリグニンペルオキシダーゼを菌体外に生産可能なことを特徴とする、白色腐朽菌。
【請求項９】
リグニンペルオキシダーゼ生産の遺伝子として、配列番号５ないし８のいずれか一つで表される塩基配列からなるＤＮＡを有することを特徴とする、白色腐朽菌。
【請求項１０】
リグニンペルオキシダーゼ生産の遺伝子として、配列番号５ないし８のいずれか一つで表される塩基配列からなるＤＮＡに、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列を備えたＤＮＡ有することを特徴とする、白色腐朽菌。
【請求項１１】
リグニンペルオキシダーゼを生産する、白色腐朽菌ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３。
【請求項１２】
請求項７ないし９のいずれかに記載の白色腐朽菌を培養し、菌体外にリグニンペルオキシダーゼを分泌生産させることを特徴とする、リグニンペルオキシダーゼの製造方法。
【請求項１３】
配列番号１ないし４のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、または該配列において一個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなるリグニンペルオキシダーゼを生産可能であることを特徴とする、請求項１０に記載のリグニンペルオキシダーゼの製造方法。
【請求項１４】
請求項３または４に記載のリグニンペルオキシダーゼをコードする塩基配列を含有するＤＮＡ。
【請求項１５】
配列番号５ないし８のいずれか一つで表される塩基配列から成るＤＮＡ。
【請求項１６】
配列番号５ないし８のＤＮＡに、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリグニンペルオキシダーゼを最大活性蓄積量２０ｎｋａｔ／ｍｌ以上にて菌体外に生産可能な機能を有することを特徴とする、ＤＮＡ。
【請求項１７】
白色腐朽菌ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３由来であり、かつリグニンペルオキシダーゼをコリオルス・ヴァージカラー・ＩＦＯ  ９７９１（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ  ＩＦＯ  ９７９１）の１０倍以上の最大活性蓄積量にて菌体外に生産可能な機能を有することを特徴とする、ＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリグニンペルオキシダーゼとその製造方法、ＤＮＡ、およびそれを生産する白色腐朽菌に係り、詳しくは、パルプ中のリグニン分解やダイオキシン等の環境汚染物質の浄化などに有用な新規リグニンペルオキシダーゼとその製造方法、ＤＮＡ、およびそれを高生産する白色腐朽菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
リグニンペルオキシダーゼはリグニナーゼとも呼ばれ、マンガンペルオキシダーゼおよびラッカーゼと共に、木材の難生分解性成分であるリグニンの分解に関与する酵素である（以下、リグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼおよびラッカーゼを総称してリグニン分解酵素と略記することがある）。特にリグニンペルオキシダーゼは、通常の酸化酵素では酸化困難なリグニン骨格を最初に攻撃し、易分解性とする重要な酵素とされている（非特許文献１）。リグニンペルオキシダーゼは、ヘム鉄を活性中心として含み、過酸化水素を電子受容体とする酸化酵素であり、白色腐朽菌ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）の培養液から初めて単離精製された酵素である（非特許文献２）。その後、現在までに、多くの白色腐朽菌において菌体外に分泌生産されていることが見出されており、その遺伝子も多数分離されている。リグニン分解酵素は、多くの白色腐朽菌において、遺伝子座を異にする複数のアイソザイムが分泌生産されていることが報告されており、これらの微生物の強力なリグニン分解作用を反映するものと考えられている（非特許文献３、非特許文献１）。
【０００３】
白色腐朽菌の特性である強力なリグニン分解作用、およびその特性を担っているリグニンペルオキシダーゼを始めとするリグニン分解酵素は、木質廃棄物の再資源化（非特許文献１）、製紙工業におけるパルプ漂白の効率化（非特許文献４）、染料の分解（非特許文献５）、ダイオキシン等の難分解性の環境汚染物質の浄化（特許文献１、特許文献２、非特許文献６、非特許文献７）など、広く産業応用が期待されている。
【０００４】
微生物や酵素などの生物機能を活用した産業技術のメリットは、多大なエネルギーを要せず、しかも、二次廃棄物の発生による環境汚染を引き起こさないなど、今日、社会一般に求められている環境保全に寄与できる点にあり、このため、各方面で精力的に応用研究が進められている。
【０００５】
【特許文献１】特許第３５５００９９号「ダイオキシン分解能を有する新規微生物及びダイオキシン分解方法」
【特許文献２】特開２００１−３７４６５「ラッカーゼを用いるダイオキシン分解方法」
【非特許文献１】桑原,バイオサイエンスとインダストリー,  ５０，８７１−８７６（１９９２）
【非特許文献２】Ｔｉｅｎ  Ｍ．  ａｎｄ  Ｋｉｒｋ  Ｔ．Ｋ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，２２８０−２２８４（１９８４）
【非特許文献３】Ｆａｒｒｅｌｌ  Ｒ．Ｌ．，  Ｍｕｒｔａｇｈ  Ｋ．Ｅ．，  Ｔｉｅｎ  Ｍ．，  Ｍｏｚｕｃｈ  Ｍ．Ｄ．  ａｎｄ  Ｋｉｒｋ  Ｔ．Ｋ．，  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１１，３２２−３２８（１９８９）
【非特許文献４】Ｃａｌｌ  Ｈ．Ｐ．  ａｎｄ  Ｍｕｃｋｅ  Ｉ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，１６３−２０２（１９９７）
【非特許文献５】Ｖｙａｓ  Ｂ．Ｒ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｍｏｌｉｔｏｒｉｓ  Ｈ．Ｐ．，  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，６１，３９１９−３９２７（１９９５）
【非特許文献６】Ｔａｋａｄａ  Ｓ．，  Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｍ．，  Ｍａｔｓｕｅｄａ  Ｔ．，  Ｋｏｎｄｏ  Ｒ．  ａｎｄ  Ｓａｋａｉ  Ｋ．，  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，６２，４３２３−４３２８（１９９６）
【非特許文献７】辰巳憲司，  工業用水，４２０，１６−２８（１９９３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、白色腐朽菌およびリグニン分解酵素については、その有用性が充分に認識されているにも関わらず実用化に至った例は少ない。その理由の一つとして、白色腐朽菌によるリグニン分解酵素の生産量が非常に少ないために、充分な量を安価に供給できないことが挙げられる。生産量を増加させる試みも報告されているが、そのことによって食品への適用が困難になるなど利用できる産業分野が制限される場合もある（特開２００２−１７３４７、特開２００５−３４０５７）。そこで従来から、天然由来の、より高機能を有するリグニン分解酵素と、それを高生産できる微生物が強く求められている。
【０００７】
本発明の目的は、リグニン分解による木質廃棄物の再資源化、製紙工業におけるパルプ漂白の効率化、ダイオキシン等の難分解性の環境汚染物質の浄化、染料の分解除去など、多方面の産業応用が期待できる、実用性の高いリグニンペルオキシダーゼと該酵素を高生産する白色腐朽菌を新たに提供し、さらには該微生物を用いて菌体外に著量分泌生産させることを特徴とする、リグニンペルオキシダーゼの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らはこれまでも、青森県内から多数の白色腐朽菌を分離してきたが、今回、特に上記課題について鋭意研究を重ね、リグニン分解酵素の生産性について検討を加えた結果、ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３として特定される白色腐朽菌株が、１リットルの培養あたり８０ｍｇ以上のリグニンペルオキシダーゼを分泌生産することを明らかにした。つまり、かかる著量のリグニンペルオキシダーゼを菌体外に分泌する新規の白色腐朽菌の分離に成功し、そのリグニンペルオキシダーゼの性状および遺伝子構造を明らかにすることによって本発明を完成させるに至ったものである。すなわち、上記課題を解決するための手段として本願で特許請求される発明、もしくは少なくとも開示される発明は、以下のとおりである。
【０００９】
（１）  配列番号１ないし４のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、もしくはこれらのいずれかのアミノ酸配列において一個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）  配列番号１ないし４のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、もしくはこれらのいずれかのアミノ酸配列において一個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなり、リグニンペルオキシダーゼの前駆体たり得ることを特徴とする、ポリペプチド。
（３）  配列番号１ないし４のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、もしくはこれらのいずれかのアミノ酸配列において一個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列を備えてなることを特徴とする、リグニンペルオキシダーゼ。
（４）  配列番号１ないし４のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、もしくはこれらのいずれかのアミノ酸配列において一個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを前駆体とすることを特徴とする、リグニンペルオキシダーゼ。
【００１０】
（５）  白色腐朽菌ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３株由来である、（３）または（４）に記載のリグニンペルオキシダーゼ。
（６）  配列番号５ないし８のいずれか一つで表される塩基配列から成るＤＮＡでコードされることを特徴とする、リグニンペルオキシダーゼ。
（７）  配列番号５ないし８のいずれか一つで表される塩基配列から成るＤＮＡに、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡでコードされることを特徴とする、リグニンペルオキシダーゼ。
【００１１】
（８）  リグニンペルオキシダーゼを生産する遺伝子を有し、コリオルス・ヴァージカラー・ＩＦＯ  ９７９１（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ  ＩＦＯ  ９７９１）の１０倍以上の最大活性蓄積量にてリグニンペルオキシダーゼを菌体外に生産可能なことを特徴とする、白色腐朽菌。
（８−２）  リグニンペルオキシダーゼを生産する遺伝子を有し、コリオルス・ヴァージカラー・ＩＦＯ  ９７９１（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ  ＩＦＯ  ９７９１）の５０倍以上の最大活性蓄積量にてリグニンペルオキシダーゼを菌体外に生産可能なことを特徴とする、白色腐朽菌。
（９）  リグニンペルオキシダーゼ生産の遺伝子として、配列番号５ないし８のいずれか一つで表される塩基配列からなるＤＮＡを有することを特徴とする、白色腐朽菌。
（１０）  リグニンペルオキシダーゼ生産の遺伝子として、配列番号５ないし８のいずれか一つで表される塩基配列からなるＤＮＡに、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列を備えたＤＮＡ有することを特徴とする、白色腐朽菌。
（１１）  リグニンペルオキシダーゼを生産する、白色腐朽菌ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３。
（１２）  （７）ないし（９）のいずれかに記載の白色腐朽菌を培養し、菌体外にリグニンペルオキシダーゼを分泌生産させることを特徴とする、リグニンペルオキシダーゼの製造方法。
（１３）  配列番号１ないし４のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、または該配列において一個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなるリグニンペルオキシダーゼを生産可能であることを特徴とする、（１０）に記載のリグニンペルオキシダーゼの製造方法。
【００１２】
（１４）  （３）または（４）に記載のリグニンペルオキシダーゼをコードする塩基配列を含有するＤＮＡ。
（１５）  配列番号５ないし８のいずれか一つで表される塩基配列から成るＤＮＡ。
（１６）  配列番号５ないし８のＤＮＡに、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリグニンペルオキシダーゼを最大活性蓄積量２０ｎｋａｔ／ｍｌ以上にて菌体外に生産可能な機能を有することを特徴とする、ＤＮＡ。
（１７）  白色腐朽菌ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３由来であり、かつリグニンペルオキシダーゼをコリオルス・ヴァージカラー・ＩＦＯ  ９７９１（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ  ＩＦＯ  ９７９１）の１０倍以上の最大活性蓄積量にて菌体外に生産可能な機能を有することを特徴とする、ＤＮＡ。
（１７−２）  白色腐朽菌ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３由来であり、かつリグニンペルオキシダーゼをコリオルス・ヴァージカラー・ＩＦＯ  ９７９１（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ  ＩＦＯ  ９７９１）の５０倍以上の最大活性蓄積量にて菌体外に生産可能な機能を有することを特徴とする、ＤＮＡ。
【００１３】
以上のように本願発明は、リグニン分解酵素を生産する、特にはリグニンペルオキシダーゼを菌体外に分泌、著量生産する、白色腐朽菌株ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３を提供するものである。さらに本願では、この菌株が生産するリグニンペルオキシダーゼの調製方法、該酵素の性質、構造を明らかにし、加えて４種類の新規のリグニンペルオキシダーゼｃＤＮＡを単離、それらの全構造を明らかにした。つまり、該菌株を培養して菌体外に生産することを特徴とする新規リグニンペルオキシダーゼの製造方法を提供し、さらに、新規リグニンペルオキシダーゼの遺伝子を提供し、遺伝子工学的生産をも可能とする新たな手段を与えるものである。
【００１４】
本菌株について、リボソーム遺伝子構造を基に分類を行った結果、一致する既知菌株はなく、アナタケ目サルノコシカケ科に属する新種と結論した。本菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３として寄託されている。従来菌のリグニンペルオキシダーゼ生産量は数ｍｇ程度［Ｔｉｅｎ  Ｍ．  ａｎｄ  Ｋｉｒｋ  Ｔ．Ｋ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，２２８０−２２８４（１９８４）］であることから、本菌株は極めて高いリグニンペルオキシダーゼ生産能を有しており、今後、産業応用が大いに期待できる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のリグニンペルオキシダーゼとその製造方法、ＤＮＡ、およびそれを生産する白色腐朽菌は上述のように構成されるため、これによれば新規のリグニンペルオキシダーゼを高効率にかつ著量生産可能であり、木質廃棄物の脱リグニン化、製紙工業におけるパルプ漂白の効率化、ダイオキシン等の難分解性の環境汚染物質の分解、染料の分解除去など、様々な産業分野におけるリグニンペルオキシダーゼの利用を、拡大・促進することができる。また、そのことは環境保全に貢献するものでもある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明をより詳細に説明する。
＜１  白色腐朽菌ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３＞
ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３株は、青森県内から新たに採取された白色腐朽菌であって、後述のポリペプトンとグルコースを主成分とする液体培地での静置培養において、リグニン分解に関与している酵素であるラッカーゼ（Ｌａｃ）、マンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）およびリグニンペルオキシダーゼ（ＬｉＰ）を生産し、特にＬｉＰを菌体外に著量蓄積する菌株として見出されたものである。
【００１７】
＜２  白色腐朽菌ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３の分離＞
ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３株は、文献［橘，大川，伊藤，沖，平林，紙パルプ技術協会誌，５０，１８０６−１８１５（１９９６）］に記載のリグニン分解微生物分離用培地を用いて分離した。すなわち、野外より採取した腐朽材片を滅菌蒸留水に懸濁し、この懸濁液を、前記の文献に記載の、上層に色素レマゾールブリリアントブルーＲを含む２層からなる寒天培地上に塗沫して、２５℃で培養した。当該色素を脱色した菌株のコロニーを釣菌し、新しく調製した上記２層寒天培地に塗抹して、２５℃で培養する操作を繰り返して純粋に分離した。分離した菌株は、日水製薬社製ポテトデキストロース寒天培地（１リットルあたり、ポテト浸出液末４．０ｇ、ブドウ糖２０ｇ、寒天１５ｇ、ｐＨ６．０）を用いて調製したスラントに植菌し、２５℃で培養後、４℃に保存した。ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３株はこのスクリーニングにおいて良好な脱色成績を示す菌株の１つとして分離されたものである。
【００１８】
ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３株は、ポテトデキストロース寒天培地で２５℃で培養することにより、白色綿状の集落を形成する。また、全ての分離菌株について、下記のとおりリグニン分解酵素生産性を比較した結果、ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３株は、ラッカーゼ（Ｌａｃ）、マンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）およびリグニンペルオキシダーゼ（ＬｉＰ）を生産し、特にＬｉＰを菌体外に著量生産する菌株であることが明らかとなった。
【００１９】
＜３  リグニン分解酵素の生産性＞
ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３株を下記のようにポリペプトン／グルコース培地で２５℃で静置培養し、下記の活性測定法により、培養液中の酵素活性を測定した。その結果、ＬｉＰ活性は１５〜２５日間、Ｌａｃ活性は２０〜３０日間、ＭｎＰ活性は１５〜２５日間の培養で培地中の蓄積量が最大となることがわかった。最大蓄積量はＬｉＰ活性でおよそ２５ｎｋａｔ／ｍｌ、Ｌａｃ活性で２０ｎｋａｔ／ｍｌ、ＭｎＰ活性で１ｎｋａｔ／ｍｌであった。この条件で、対照試験株コリオルス・ヴァージカラー・ＩＦＯ  ９７９１（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ  ＩＦＯ  ９７９１  以下「ＩＦＯ  ９７９１株」ともいう）は、Ｌａｃ活性でおよそ２０ｎｋａｔ、ＭｎＰ活性は１ｎｋａｔと同程度の蓄積量を示すが、ＬｉＰ活性は０．１〜０．５ｎｋａｔ／ｍｌであった。よって、ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３株はＩＦＯ  ９７９１株の５０〜２５０倍のＬｉＰ生産性を有していることが示された。
【００２０】
後述するように、本菌株は、この培養条件で７種以上のＬｉＰを同時に生産していた。また、遺伝子解析によって、４種の異なるＬｉＰのｃＤＮＡが分離された。
＜３−１  培養方法＞
ポテトデキストロース寒天培地（日水製薬社製）で２５℃、７日間培養後、３００ｍｌの三角フラスコに入れた６０ｍｌのポリペプトン／グルコース培地（１Ｌ中：ポリペプトン１０ｇ、グルコース１０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ５００ｍｇ、チアミン塩酸２ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  １６ｍｇ、ｐＨ５．６、ろ過滅菌）に植菌し、２５℃で静置培養した。培養液中の酵素活性を経日的に測定した。
【００２１】
＜３−２  リグニン分解酵素の活性測定法＞
ＬｉＰについては、終濃度０．４ｍＭのベラトリルアルコール、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０、０．１５ｍＭ過酸化水素、０．１Ｍ酒石酸ナトリウム（ｐＨ３．０）および試料からなる総量３ｍｌの反応溶液を調製し、３７℃で、３１０ｎｍにおける吸光度増加速度を測定した（光路長１ｃｍ）。ベラトリルアルコールの酸化生成物の分子吸光係数（９，３００Ｍ−１・ｃｍ−１）を用いて酵素活性を算出した［Ｔｉｅｎ  Ｍ．  ａｎｄ  Ｋｉｒｋ  Ｔ．Ｋ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ８１，  ２２８０−２２８４（１９８４）］。活性単位１ｋａｔのＬｉＰは、この反応条件で１秒間に１ｍｏｌのベラトリルアルコールを酸化する酵素量とした。
【００２２】
Ｌａｃについては、終濃度８．３μＭのシリンガルダジン、３７ｍＭ２−モルホリノエタンスルホン酸ナトリウム（ｐＨ５．３）および試料からなる総量３ｍｌの反応溶液を調製し、３０℃で、５２７ｎｍにおける吸光度増加速度を測定した（光路長１ｃｍ）。シリンガルダジン酸化生成物の分子吸光係数（６５，０００Ｍ−１・ｃｍ−１）を用いて、酵素活性を算出した［Ｌｅｏｎｏｗｉｃｚ  Ａ．ａｎｄ  Ｇｒｚｙｗｎｏｗｉｃｓ  Ｋ．，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，３，５５−５８（１９８１）］。Ｌａｃ１ｋａｔは、この反応条件で１秒間に１ｍｏｌのシリンガルダジンを酸化する酵素量とした。
【００２３】
ＭｎＰについては、終濃度０．２ｍＭの硫酸マンガン、０．１ｍＭ過酸化水素、５０ｍＭマロン酸ナトリウム（ｐＨ４．５）および試料からなる総量３ｍｌの反応溶液を調製し、３０℃で、２７０ｎｍにおける吸光度増加速度を測定した（光路長１ｃｍ）。生成物のＭｎ（ＩＩＩ）−マロン酸錯体の分子吸光係数（１１，５９０Ｍ−１・ｃｍ−１）を用いて酵素活性を算出した［Ｐｅｒｉｅ  Ｆ．Ｈ．  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ  Ｍ．Ｈ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５７，２２４０−２２４５（１９９１）］。ＭｎＰ１ｋａｔは、この反応条件で１秒間に１ｍｏｌのＭｎ（ＩＩ）を酸化する酵素量とした。
【００２４】
＜４  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３株の分類＞
ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３株について、分類上有用な遺伝子領域となっている５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子ならびにその近傍、１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、および２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子５’末端領域の塩基配列を決定し、その相同性検索（ＢＬＡＳＴ）を行うことにより同定を試みた。その結果、ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３株はアナタケ目（Ｐｏｒｉａｌｅｓ）に含まれる新種と判断された。
【００２５】
＜４−１  リボソームＲＮＡ遺伝子領域のＤＮＡ断片の調製と塩基配列分析＞
ＭＴ０１５の凍結乾燥菌体を液体窒素存在下で破砕、ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＤＮＡを抽出した。リボソームＲＮＡ遺伝子領域のＤＮＡ断片の調製は、Ｗｈｉｔｅらの方法［ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３１５−３２２  （１９９０）］に従い、５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を含むＤＮＡの調製にはプライマーＩＴＳ４およびＩＴＳ５を、１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を含むＤＮＡの調製にはプライマーＮＳ１およびＮＳ８を、２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子５’末端領域を含むＤＮＡの調製にはプライマーＬＲ０ＲおよびＬＲ７を用い、ＰＣＲ法によってそれぞれのＤＮＡ断片を調製した。
【００２６】
ＰＣＲは、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＰＣＲ  Ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に、蒸留水、プライマー（４０ｐｍｏｌ）、ＭＴ０１５のＤＮＡ（１０〜５０ｎｇ）を加えて、総量２５μｌの反応液とし、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、９６℃３分保持−９４℃３０秒・５５℃３０秒・７２℃１分を３０サイクル−７２℃４分保持の条件で行った。得られたＤＮＡ断片はＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。
それぞれの精製ＤＮＡ断片について、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてシークエンシング反応を行い、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により分析した。
【００２７】
以上の結果、５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子ならびにその近傍の６０４塩基対（配列番号９）、１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のほぼ全長１７３７塩基対（配列番号１０）、および２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子５’末端領域の６０２塩基対（配列番号１１）の塩基配列を決定した。
【００２８】
＜４−２  相同性検索＞
これらの塩基配列について、米国ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）が提供しているＢＬＡＳＴ相同性検索を利用し、ＧｅｎＢａｎｋ登録データ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ国際データベース）について相同性検索を行った。その結果、登録データには、どの遺伝子領域についても塩基配列の一致する登録菌株はなかった。一方、５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子については、タバコウロコタケ目のフェリヌス・イグニアリウス（Ｐｈｅｌｌｉｎｕｓ  ｉｇｎｉａｒｉｕｓ）との相同性が９８％と登録菌株中で最も高い相同性を示したが、属の分類に有用な１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子について、アナタケ目サルノコシカケ科のフォメス・フォメンタリウス（Ｆｏｍｅｓ  ｆｏｍｅｎｔａｒｉｕｓ）との相同性が９８％、２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子については、アナタケ目サルノコシカケ科のイルペックス・ラクテウス（Ｉｒｐｅｘ  ｌａｃｔｅｕｓ）との相同性が９９％と最も高く、近縁関係が見出された。この結果からＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３株はアナタケ目（Ｐｏｒｉａｌｅｓ）に含まれる新種と判断された。特にはサルノコシカケ科（Ｐｏｒｉｐｏｒａｃｅａｅ）のフォメス（Ｆｏｍｅｓ）属（ツリガネタケ）やイルペックス（Ｉｒｐｅｘ）属（ウスバタケ）に近縁と推定された。
【００２９】
＜５  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３株由来のＬｉＰの精製＞
上述のようにして培養したＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３株の培養液からのＬｉＰの精製例を示す。本精製方法によれば、培養液１Ｌあたり蛋白質量として３８ｍｇ（１０７００ｎｋａｔ）のＬｉＰが回収できることがわかった。また、活性回収率から逆算すると、１Ｌの培養液あたりおよそ８０ｍｇのＬｉＰが生産されているものと考えられた。このＬｉＰ標品は後述するように、各種ＬｉＰの混合物として得られた。
【００３０】
＜５−１  イオン交換クロマトグラフィーによる精製＞
培養液を試料としてｐＨ安定性を調べた結果、ＬｉＰ活性はｐＨ５．５〜７で安定だったため、リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）を基本の緩衝液として用い、以下のようにイオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過によって精製を行った。
【００３１】
ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３株を上記の培養条件で２１日間培養した培養液（８８ｍｌ、総ＬｉＰ活性１９４０ｎｋａｔ；総Ｌａｃ活性１２７０ｎｋａｔ；総ＭｎＰ活性１０６ｎｋａｔ）を０．２２μｍのフィルターでろ過して培養上清を回収し、さらに限外ろ過（ＹＭ１０フィルター，Ａｍｉｃｏｎ社）により濃縮脱塩した後、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）溶液（９．７ｍｌ）とした。この濃縮によって少量の不溶物を生じるので、これを０．２２μｍのフィルターで除去した後、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラム（２．１×２４ｃｍ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にかけ、２００ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で洗浄後、直線濃度勾配の０〜０．４Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）（総量６００ｍｌ）で溶出し、最後に１Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）２００ｍｌで洗浄した。
【００３２】
図１は、本発明に係るＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３株由来ＬｉＰのイオン交換クロマトグラフィーによる精製過程を示すクロマトグラムである。クロマトグラフィーにおいては、流速は３０ｍｌ／ｈで行った。溶出液を５ｍｌずつ試験管に分画し、前記の測定法によって分画物中の酵素活性を測定した。総ＬｉＰ活性のおよそ８０％を占める主要ＬｉＰ活性ピークの画分（分画番号１１５〜１２５、図中、下線で示した画分）を集め、ＹＭ１０で濃縮脱塩し、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）溶液（２．８ｍｌ）とした。
【００３３】
＜５−２  ゲルろ過法による精製＞
この濃縮液を、さらに０．１Ｍ  ＮａＣｌ／２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ＨＲカラム（１．６×６０ｃｍ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｓｃｉｅｎｃｅｓ社）により分画した。
図２は、本発明に係るＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３株由来ＬｉＰのゲルろ過法による精製過程を示すクロマトグラムである。ゲルろ過においては、流速は６ｍｌ／ｈで行い、１．２ｍｌずつ分画し、前記の測定法によって酵素活性を測定した。単一のピークを示したＬｉＰ活性の溶出画分（試験管番号４５〜４８、図中、下線で示した画分）を回収し、ＹＭ１０で濃縮脱塩後、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）溶液に調整して−８０℃に保存した。
【００３４】
以上の精製の結果、初発８８ｍｌの培養液から蛋白質量３．３ｍｇ、総ＬｉＰ活性９４４ｎｋａｔのＬｉＰ標品が得られた。蛋白質量は標品の紫外吸光度（２１５ｎｍと２２５ｎｍの吸光度差）から求めた［菅原，副島，蛋白質の定量法（第３版），ｐｐ．１３５−１３７，学会出版センター（１９９０）］。すなわち、この精製方法で培養液１Ｌあたり蛋白質量として３８ｍｇ（１０７００ｎｋａｔ）のＬｉＰが回収できることがわかった。また、活性回収率は４９％であった。この回収率から逆算すると、１Ｌの培養液あたりおよそ８０ｍｇのＬｉＰが生産されていると考えられた。このＬｉＰ標品は、既知のＬｉＰと同様にヘム鉄に由来する４０７ｎｍの極大吸収を示し、茶褐色を呈していた。また、後述するように、このＬｉＰ標品はＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３株の複数のＬｉＰの混合物として得られた。
【００３５】
＜６  ＬｉＰの分子量、等電点および性質＞
＜６−１  分子量と等電点＞
図３Ａ、３Ｂは、本発明に係るＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３株由来ＬｉＰの電気泳動パターンである。図３Ａに示すパターンは、培養液および精製酵素の１２．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ−Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）によるものである。各レーンは、レーン１，分子量マーカ；２，培養液のＹＭ１０濃縮液；３，ＬｉＰである。ＣＢＢ染色を用いている。また図３Ｂに示すパターンは、精製酵素の等電点電気泳動（ＩＥＦ  ｐＨ  ２．５〜５）によるものである。各レーンは、レーン１，３，ｐＩマーカ；２，ＬｉＰである。ＣＢＢ染色を用いている。
【００３６】
ＬｉＰ標品は１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量４２０００に単一バンドを示した（図３Ａ）。この分子量は既知酵素と同様である。培養液のＹＭ１０濃縮試料の泳動像から、ＬｉＰが培養液中の主要な分泌蛋白成分であり、培養液は、直接に粗リグニンペルオキシダーゼまたは粗リグニン分解酵素剤として利用することも可能と考えられた。
【００３７】
一方、等電点電気泳動の結果（図３Ｂ）、このＬｉＰ標品はｐＩ４．３０〜２．９０に分布する７本（もしくは８本）のバンドを与えた。このことから、上記の精製方法によってＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３株の複数種のＬｉＰの濃縮物が得られたことがわかった。このことから、ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３株のＬｉＰは、他の白色腐朽菌のＬｉＰと同様に多重遺伝子を形成していることがわかった。これらのｐＩ値は既知のＬｉＰと同様であった。
【００３８】
＜６−２  性質＞
最適反応ｐＨは、終濃度０．４ｍＭのベラトリルアルコール、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０、０．１５ｍＭ過酸化水素、ｐＨ２．０〜５．０の０．１Ｍ酒石酸ナトリウム緩衝液およびＬｉＰ試料からなる総量３ｍｌの反応溶液を調製し、３７℃で、３１０ｎｍにおける吸光度増加速度を測定して求めた。その結果、ｐＨ２．０〜５．０で反応が認められ、ｐＨ３．０で最大の反応速度を示した。よって、ベラトリルアルコール酸化反応の最適ｐＨは、ｐＨ３．０であることが示された。
【００３９】
最高反応温度は、終濃度０．４ｍＭのベラトリルアルコール、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０、０．１５ｍＭ過酸化水素、０．１Ｍ酒石酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、およびＬｉＰ試料からなる総量３ｍｌの反応溶液を調製し、種々の温度で反応を行い、３１０ｎｍにおける吸光度増加速度を測定して求めた。その結果、４５℃で最大の反応速度を示した。よって、ベラトリルアルコール酸化反応の最高反応温度は４５℃であることが示された。
【００４０】
安定ｐＨ領域は、各種ｐＨ（２．５〜１１．６）の２０ｍＭ緩衝液（クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス塩酸、炭酸ナトリウム）のＬｉＰ溶液を調製し、これを２５℃で６時間保温後、標準のＬｉＰ活性測定法（終濃度０．４ｍＭのベラトリルアルコール、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０、０．１５ｍＭ過酸化水素、０．１Ｍ酒石酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、およびＬｉＰ試料からなる総量３ｍｌの反応溶液を調製し、３７℃で３１０ｎｍにおける吸光度増加速度を測定）で残存活性を測定した。この条件で、ｐＨ４．５〜８で８０％以上、ｐＨ５．５〜７で９０％以上、ｐＨ５．５〜６で１００％の活性が残存していた。また、反応性の高いｐＨ３．０では５０％、ｐＨ４．０で７５％の活性が残存していた。ｐＨ９以上の塩基性では不安定であり、残存活性は認められなかった。よって、２５℃で、９０％以上の活性残存率を示す安定ｐＨ領域はｐＨ５．５〜７であることが示された。
【００４１】
耐熱性は、ＬｉＰの２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）溶液を６０℃で一定時間加熱した後、上記の標準のＬｉＰ活性測定法で残存活性を測定し、評価した。その結果、ｐＨ６．０、６０℃での活性半減期は４０ｍｉｎであった。よって、耐熱性としてｐＨ６．０、６０℃での活性半減期は４０ｍｉｎであることが示された。また、たとえば４℃では、少なくとも１ヶ月間は活性低下が見られなかったことから、より低温で中性付近では、より長時間安定であることが示された。
【００４２】
ベラトリルアルコール酸化反応における反応速度定数は、種々の濃度のベラトリルアルコール、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０、０．１５ｍＭ過酸化水素、０．１Ｍ酒石酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、およびＬｉＰ試料からなる総量３ｍｌの反応溶液を調製し、３７℃で３１０ｎｍにおける吸光度増加速度を測定して求めた。ＬｉＰ標品による本条件下でのベラトリルアルコール酸化反応のミカエリス定数（Ｋｍ）は０．１４ｍＭ、最大反応速度（Ｖｍａｘ）は、蛋白質１ｍｇあたり４６０ｎｍｏｌ／秒である。
【００４３】
＜７  ＬｉＰの一次構造＞
ＬｉＰ標品のアミノ末端配列を調べ、それらの配列を基にＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）法によって全長ｃＤＮＡをクローニングし、ｃＤＮＡ配列にコードされたアミノ酸配列をもって一次構造とした。
【００４４】
ＬｉＰ標品はアミノ末端配列分析では、主要な配列として２箇所で複数のアミノ酸残基が重複したＮ末端配列を与えた（配列番号１２）。配列番号１２の配列を情報として行ったＲＡＣＥにより、この配列番号１２と一致するアミノ末端配列をコードするｃＤＮＡとしてＬＩＰ１（配列番号１および５）およびＬＩＰ４（配列番号４および８）、配列番号１２と１ヶ所で異なるアミノ末端配列をコードするｃＤＮＡのＬＩＰ２（配列番号２および６）、３ヶ所で異なるアミノ末端配列をコードするｃＤＮＡであるＬＩＰ３（配列番号３および７）の４種が得られた。配列番号５〜８はそれぞれのＬｉＰのアミノ酸配列のコード領域（ＣＤＳ）のみを示したものである。これらは全て新規酵素であり、既知のＬｉＰと高い一次構造の相同性を示すことから、ＬｉＰと判断することができた。上述の通り、ＬｉＰ標品はＩＥＦで７種（もしくは８種）の蛋白質バンドが見出されているため、配列番号１２以外のＮ末端配列を有する微量ＬｉＰも本標品中に存在することが容易に推測された。
【００４５】
アミノ末端配列分析で得られた配列（配列番号１２）は、ＬＩＰ１およびＬＩＰ４にコードされたアミノ酸配列において２７残基目のＶａｌから始まっているので、これらのｃＤＮＡにコードされているアミノ酸配列（配列番号１、４）は前駆体蛋白質のものであり、その上流は発現後に切断されるシグナル配列である。すなわち、これらは前駆体蛋白質として発現した後、分泌の過程で少なくともアミノ末端２６残基が切断されて成熟ＬｉＰとなるものと考えられた。ＬＩＰ２およびＬＩＰ３にコードされた蛋白質（配列番号２、３）もＬｉＰ前駆体であり、ＬＩＰ１およびＬＩＰ４との類似性から、アミノ末端２６残基がシグナル配列として切断されて成熟ＬｉＰとなるものと推測された。
【００４６】
＜７−１  アミノ末端配列分析＞
プロテインシーケンサー（ＰＰＳＱ−１０、島津製作所）を用いて気相エドマン分解法によりアミノ末端配列を調べた結果、主要な配列として  ＶＸＸＰＤＧＸＮＴＡＴＮＡＡＸＸＱＬＦＡＶＲＱＤＬ（配列番号１２）の２５残基の配列が見出された。このうち２残基目ＸではＡｌａとＴｈｒが、７残基目ＸはＶａｌとＬｙｓが主要なアミノ酸として検出された。このことからＩＥＦでも確認されたように本ＬｉＰ標品には複数種の蛋白質が共存していることがわかった。３、１５、１６残基目のＸは気相エドマンで主要なアミノ酸が検出されなかった未同定の残基を示すが、後に得られたｃＤＮＡ配列によりＣｙｓであることが確認された。この３ヶ所のＣｙｓは既知のＬｉＰでも高度に保存されている残基であった。
【００４７】
＜７−２  ＬｉＰ  ｃＤＮＡのクローニング＞
１）ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３株のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡの調製
ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３株を前述の培地で静置培養し、培地中のＬｉＰ活性の上昇期に菌体を回収した。菌体を液体窒素中で乳鉢で破砕し、ＱｉｕｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、同社のマニュアルに従ってｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを調製した。
【００４８】
２）５’ＲＡＣＥ用および３’ＲＡＣＥ用１本鎖ｃＤＮＡの調製
得られたｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡから、５’ＲＡＣＥおよび３’ＲＡＣＥの鋳型として用いる１本鎖ｃＤＮＡを調製した。反応は、市販のＲＡＣＥ用キット（商品名ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用い、同社の添付資料記載の方法に従って以下のように行った。すなわち、５’ＲＡＣＥ用ｃＤＮＡの調製においては、０．５μｇのｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡに１２ｐｍｏｌの該キット付属の５’ＲＡＣＥ  ＣＤＳ  Ｐｒｉｍｅｒおよび１２ｐｍｏｌの該キット付属のＢＤ  ＳＭＡＲＴ  ＩＩ  Ａ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅを加えて全量５μｌの水溶液とした。一方、３’ＲＡＣＥ用ｃＤＮＡの調製では、０．５μｇのｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡに１２ｐｍｏｌの該キット付属の３’ＲＡＣＥ  ＣＤＳ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａを加えて全量５μｌの水溶液とした。これらの混合液を７０℃で２分間加熱変性し、氷冷した後、それぞれの混合液に終濃度で５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．３）、７５ｍＭの塩化カリウム、６ｍＭの塩化マグネシウム、２ｍＭのジチオスレイトール、各１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを加え、最後に１μｌの該キット付属の逆転写酵素を加えて総量１０μｌとし、４２℃で１．５時間保温した。反応後、それぞれの反応液に該キット付属のＴｒｉｃｉｎｅ−ＥＤＴＡ緩衝液を４０μｌ加え、７２℃で７分間加熱後、氷冷した。それぞれ、５’ＲＡＣＥ用１本鎖ｃＤＮＡおよび３’ＲＡＣＥ用１本鎖ｃＤＮＡとして以後の実験に用いた。
【００４９】
３）５’ＲＡＣＥによるＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３株のリグニンペルオキシダーゼｃＤＮＡの検出
アミノ末端配列（配列番号１２）中の残基番号７−１４の配列ＶＮＴＡＴＮＡＡの配列に対応するアンチセンスプライマー１（５’ＧＣＮＧＣＲＴＴＮＧＴＮＧＣＮＧＴＲＴＴＮＡＣ、配列番号１３）、またはＫＮＴＡＴＮＡＡの配列に対応するアンチセンスプライマー２（５’ＧＣＮＧＣＲＴＴＮＧＴＮＧＣＮＧＴＲＴＴＹＴＴ、配列番号１４）のいずれかとＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ付属のユニバーサルプライマーの組み合わせで、ＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて以下のように５’ＲＡＣＥを行った。すなわち、前記の５’ＲＡＣＥ用１本鎖ｃＤＮＡ溶液（０．５μｌ）、２５ｐｍｏｌのアンチセンスプライマー１または２、２．５μｌの１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ  Ｍｉｘ（ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ付属）、終濃度各０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、０．５μｌの５０×ＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅおよび１０×ＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒから成る総量２５μｌの反応液を調製し、ＰＣＲ装置（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）上で、９４℃で３０秒間保持後、変性（９４℃、１０秒間）、アニーリング（６５℃、２０秒間）および伸長（７２℃、２分間）のサイクルを３０回繰り返して反応を終了した。増幅断片を市販の大腸菌プラスミド（商品名ｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ、  Ｎｏｖａｇｅｎ社）にＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５α株（ＴＯＹＯＢＯ社）を形質転換した。アルカリ?ＳＤＳ法によって形質転換株からプラスミドを調製した。
【００５０】
プラスミドに連結されたｃＤＮＡ断片の塩基配列は、ＤＮＡシーケンサー（型式ＳＱ−５５００、日立製作所）を用いて分析した。反応は、サイクルシーケンシング反応キット（商品名Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎｅｓｅ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ、日立計測器サービス社）により、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ標識プライマー（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ標識Ｍ１３  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（−２１）またはＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ標識Ｍ１３  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（−２９）、日立計測器サービス社）を用いて、同社の添付資料記載の方法に従って行った。その結果、アンチセンスプライマー１を用いた５’ＲＡＣＥからは配列番号１または２に記載のアミノ酸配列のアミノ末端側１残基目から１３残基目をコードするｃＤＮＡ断片を、アンチセンスプライマー２を用いた５’ＲＡＣＥからは配列番号３または４に記載のアミノ酸配列のアミノ末端側１残基目から１３残基目をコードするｃＤＮＡ断片を得た。このうち配列番号２のＬｉＰは、先に決定されたアミノ末端配列（配列番号１２）と１ヶ所（配列番号１２の残基番号２）において、配列番号３のＬｉＰは、先に決定されたアミノ末端配列（配列番号１２）と３ヶ所において異なるものであった（配列番号１２の残基番号で１７、２３、２５番のアミノ酸残基）。
【００５１】
４）３’ＲＡＣＥによるリグニンペルオキシダーゼの全長ｃＤＮＡのクローニング
３’ＲＡＣＥにより、リグニンペルオキシダーゼの全長オープンリーディングフレームを含むｃＤＮＡのクローニングを行った。前記の５’ＲＡＣＥによって得られた４種類のｃＤＮＡ断片の上流配列から、それぞれのリグニンペルオキシダーゼｃＤＮＡに対する特異的センスプライマー、すなわち、ＬＩＰ１の増幅のためのセンスプライマー１（配列番号１５）、ＬＩＰ２の増幅のためのセンスプライマー２（配列番号１６）、ＬＩＰ３の増幅のためのセンスプライマー３（配列番号１７）およびＬＩＰ４の増幅のためのセンスプライマー４（配列番号１８）を設計して反応に用いた。また、正確性を高めるためにＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いてＰＣＲを行った。
【００５２】
反応は、前記の３’ＲＡＣＥ用１本鎖ｃＤＮＡを蒸留水で１０倍に希釈した水溶液を０．５μｌ、７．５ｐｍｏｌのいずれかのセンスプライマー、３．７５μｌの１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ  Ｍｉｘ、終濃度各０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、終濃度１．５ｍＭ硫酸マグネシウム、０．５μｌのＫＯＤ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅおよび該酵素に添付されたＰＣＲ用緩衝液から成る総量２５μｌの反応液で行った。ＰＣＲは、９４℃で１分間保持後、変性（９４℃、５秒間）およびアニーリング／伸長（６８℃、９０秒間）を２５サイクル繰り返して終了した。それぞれ約１４００塩基対の鎖長を有する単一の増幅断片が得られた。
【００５３】
これらの断片を、市販の平滑末端ＤＮＡクローニングキット（商品名ｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ  Ｂｌｕｎｔ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ、Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて該キット付属のｐＴ７Ｂｌｕｅプラスミドに連結し、大腸菌ＤＨ５α株（ＴＯＹＯＢＯ社）を形質転換した。形質転換株から増幅断片を含むプラスミドをアルカリ?ＳＤＳ法によって調製し、前記の方法によって塩基配列を決定した。以上の結果、配列番号５〜８に記載されている全長オープンリーディングフレームを含んだ４種類のｃＤＮＡが取得された。配列番号５〜８はそれぞれ配列番号１〜４のアミノ酸配列をコードするものである。また、上記の通りＬｉＰ標品はＩＥＦで７種（もしくは８種）の蛋白質バンドが見出されていることから、他のアミノ配列を有する微量ＬｉＰも本標品中および培養液中に存在することが容易に推測された。
【００５４】
５）ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３株リグニンペルオキシダーゼのアミノ酸配列の類似性
配列番号１〜４のアミノ酸配列について、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）によって提供されているＦＡＳＴＡ検索プログラムを利用して、相同性検索を行った結果、全てＬｉＰのアミノ酸配列の特徴が保持された新規の酵素であることが明らかとなった。ｃＤＮＡのＬＩＰ１、ＬＩＰ２およびＬＩＰ４（配列番号５、６、８）にコードされたＬｉＰ前駆体（配列番号１、２、４）は３７２アミノ酸残基、ＬＩＰ３（配列番号７）にコードされたＬｉＰ前駆体（配列番号３）は３６８アミノ酸残基からなり、いずれも既知のＬｉＰと同様であった。ＬＩＰ１およびＬＩＰ２にコードされた前駆体はコリオルス・ヴァージカラー（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）のＬＰ１２と最も高い８５．６％の相同性、ＬＩＰ４にコードされた前駆体は同じくＣ・ヴァージカラーのＬＰ１２（Ｃ．  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ  ＬＰ１２）と最も高い８４．８％の相同性を示した。ＬＩＰ３にコードされた前駆体はＣ・ヴァージカラーのＬＰ７（Ｃ．  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ  ＬＰ７）と最も高い９９．２％の相同性を示した。全ての前駆体には１２９番目にＮ結合型糖鎖結合部位と成り得るＡｓｎ残基が１ヶ所存在し、既知酵素と同様に糖蛋白質と考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明によれば新規のリグニンペルオキシダーゼを高効率にかつ著量生産可能であり、木質廃棄物の脱リグニン化、製紙工業におけるパルプ漂白の効率化、ダイオキシン等の難分解性の環境汚染物質の分解、染料の分解除去など、様々な産業分野におけるリグニンペルオキシダーゼの利用を拡大・促進することができ、ひいては環境保全にも貢献し、産業上利用価値の高い発明である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明に係るＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３株由来ＬｉＰのイオン交換クロマトグラフィーによる精製過程を示すクロマトグラムである。
【図２】本発明に係るＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３株由来ＬｉＰのゲルろ過法による精製過程を示すクロマトグラムである。
【図３Ａ】本発明に係るＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３株由来ＬｉＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動パターンである。
【図３Ｂ】本発明に係るＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７５３株由来ＬｉＰの等電点電気泳動パターンである。
【図２】
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【図１】
2007215431.tif 000003
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年5月31日(2006.5.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１ないし４のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、もしくはこれらのいずれかのアミノ酸配列において一個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１ないし４のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、もしくはこれらのいずれかのアミノ酸配列において一個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなり、リグニンペルオキシダーゼの前駆体たり得ることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１ないし４のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、もしくはこれらのいずれかのアミノ酸配列において一個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列を備えてなることを特徴とする、リグニンペルオキシダーゼ。
【請求項４】
配列番号１ないし４のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、もしくはこれらのいずれかのアミノ酸配列において一個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを前駆体とすることを特徴とする、リグニンペルオキシダーゼ。
【請求項５】
白色腐朽菌ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３株由来である、請求項３または４に記載のリグニンペルオキシダーゼ。
【請求項６】
配列番号５ないし８のいずれか一つで表される塩基配列から成るＤＮＡでコードされることを特徴とする、リグニンペルオキシダーゼ。
【請求項７】
配列番号５ないし８のいずれか一つで表される塩基配列から成るＤＮＡに、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡでコードされることを特徴とする、リグニンペルオキシダーゼ。
【請求項８】
リグニンペルオキシダーゼを生産する遺伝子を有し、コリオルス・ヴァージカラー・ＩＦＯ  ９７９１（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ  ＩＦＯ  ９７９１）の１０倍以上の最大活性蓄積量にてリグニンペルオキシダーゼを菌体外に生産可能なことを特徴とする、白色腐朽菌。
【請求項９】
リグニンペルオキシダーゼ生産の遺伝子として、配列番号５ないし８のいずれか一つで表される塩基配列からなるＤＮＡを有することを特徴とする、白色腐朽菌。
【請求項１０】
リグニンペルオキシダーゼ生産の遺伝子として、配列番号５ないし８のいずれか一つで表される塩基配列からなるＤＮＡに、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列を備えたＤＮＡ有することを特徴とする、白色腐朽菌。
【請求項１１】
リグニンペルオキシダーゼを生産する、白色腐朽菌ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３。
【請求項１２】
請求項７ないし９のいずれかに記載の白色腐朽菌を培養し、菌体外にリグニンペルオキシダーゼを分泌生産させることを特徴とする、リグニンペルオキシダーゼの製造方法。
【請求項１３】
配列番号１ないし４のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、または該配列において一個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなるリグニンペルオキシダーゼを生産可能であることを特徴とする、請求項１０に記載のリグニンペルオキシダーゼの製造方法。
【請求項１４】
請求項３または４に記載のリグニンペルオキシダーゼをコードする塩基配列を含有するＤＮＡ。
【請求項１５】
配列番号５ないし８のいずれか一つで表される塩基配列から成るＤＮＡ。
【請求項１６】
配列番号５ないし８のＤＮＡに、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリグニンペルオキシダーゼを最大活性蓄積量２０ｎｋａｔ／ｍｌ以上にて菌体外に生産可能な機能を有することを特徴とする、ＤＮＡ。
【請求項１７】
白色腐朽菌ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３由来であり、かつリグニンペルオキシダーゼをコリオルス・ヴァージカラー・ＩＦＯ  ９７９１（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ  ＩＦＯ  ９７９１）の１０倍以上の最大活性蓄積量にて菌体外に生産可能な機能を有することを特徴とする、ＤＮＡ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本願発明者らはこれまでも、青森県内から多数の白色腐朽菌を分離してきたが、今回、特に上記課題について鋭意研究を重ね、リグニン分解酵素の生産性について検討を加えた結果、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３として特定される白色腐朽菌株が、１リットルの培養あたり８０ｍｇ以上のリグニンペルオキシダーゼを分泌生産することを明らかにした。つまり、かかる著量のリグニンペルオキシダーゼを菌体外に分泌する新規の白色腐朽菌の分離に成功し、そのリグニンペルオキシダーゼの性状および遺伝子構造を明らかにすることによって本発明を完成させるに至ったものである。すなわち、上記課題を解決するための手段として本願で特許請求される発明、もしくは少なくとも開示される発明は、以下のとおりである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
（５）  白色腐朽菌ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３株由来である、（３）または（４）に記載のリグニンペルオキシダーゼ。
（６）  配列番号５ないし８のいずれか一つで表される塩基配列から成るＤＮＡでコードされることを特徴とする、リグニンペルオキシダーゼ。
（７）  配列番号５ないし８のいずれか一つで表される塩基配列から成るＤＮＡに、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡでコードされることを特徴とする、リグニンペルオキシダーゼ。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
（８）  リグニンペルオキシダーゼを生産する遺伝子を有し、コリオルス・ヴァージカラー・ＩＦＯ  ９７９１（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ  ＩＦＯ  ９７９１）の１０倍以上の最大活性蓄積量にてリグニンペルオキシダーゼを菌体外に生産可能なことを特徴とする、白色腐朽菌。
（８−２）  リグニンペルオキシダーゼを生産する遺伝子を有し、コリオルス・ヴァージカラー・ＩＦＯ  ９７９１（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ  ＩＦＯ  ９７９１）の５０倍以上の最大活性蓄積量にてリグニンペルオキシダーゼを菌体外に生産可能なことを特徴とする、白色腐朽菌。
（９）  リグニンペルオキシダーゼ生産の遺伝子として、配列番号５ないし８のいずれか一つで表される塩基配列からなるＤＮＡを有することを特徴とする、白色腐朽菌。
（１０）  リグニンペルオキシダーゼ生産の遺伝子として、配列番号５ないし８のいずれか一つで表される塩基配列からなるＤＮＡに、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列を備えたＤＮＡ有することを特徴とする、白色腐朽菌。
（１１）  リグニンペルオキシダーゼを生産する、白色腐朽菌ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３。
（１２）  （７）ないし（９）のいずれかに記載の白色腐朽菌を培養し、菌体外にリグニンペルオキシダーゼを分泌生産させることを特徴とする、リグニンペルオキシダーゼの製造方法。
（１３）  配列番号１ないし４のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、または該配列において一個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなるリグニンペルオキシダーゼを生産可能であることを特徴とする、（１０）に記載のリグニンペルオキシダーゼの製造方法。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
（１４）  （３）または（４）に記載のリグニンペルオキシダーゼをコードする塩基配列を含有するＤＮＡ。
（１５）  配列番号５ないし８のいずれか一つで表される塩基配列から成るＤＮＡ。
（１６）  配列番号５ないし８のＤＮＡに、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリグニンペルオキシダーゼを最大活性蓄積量２０ｎｋａｔ／ｍｌ以上にて菌体外に生産可能な機能を有することを特徴とする、ＤＮＡ。
（１７）  白色腐朽菌ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３由来であり、かつリグニンペルオキシダーゼをコリオルス・ヴァージカラー・ＩＦＯ  ９７９１（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ  ＩＦＯ  ９７９１）の１０倍以上の最大活性蓄積量にて菌体外に生産可能な機能を有することを特徴とする、ＤＮＡ。
（１７−２）  白色腐朽菌ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３由来であり、かつリグニンペルオキシダーゼをコリオルス・ヴァージカラー・ＩＦＯ  ９７９１（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ  ＩＦＯ  ９７９１）の５０倍以上の最大活性蓄積量にて菌体外に生産可能な機能を有することを特徴とする、ＤＮＡ。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
以上のように本願発明は、リグニン分解酵素を生産する、特にはリグニンペルオキシダーゼを菌体外に分泌、著量生産する、白色腐朽菌株ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３を提供するものである。さらに本願では、この菌株が生産するリグニンペルオキシダーゼの調製方法、該酵素の性質、構造を明らかにし、加えて４種類の新規のリグニンペルオキシダーゼｃＤＮＡを単離、それらの全構造を明らかにした。つまり、該菌株を培養して菌体外に生産することを特徴とする新規リグニンペルオキシダーゼの製造方法を提供し、さらに、新規リグニンペルオキシダーゼの遺伝子を提供し、遺伝子工学的生産をも可能とする新たな手段を与えるものである。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本菌株について、リボソーム遺伝子構造を基に分類を行った結果、一致する既知菌株はなく、アナタケ目サルノコシカケ科に属する新種と結論した。本菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３として寄託されている。従来菌のリグニンペルオキシダーゼ生産量は数ｍｇ程度［Ｔｉｅｎ  Ｍ．  ａｎｄ  Ｋｉｒｋ  Ｔ．Ｋ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，２２８０−２２８４（１９８４）］であることから、本菌株は極めて高いリグニンペルオキシダーゼ生産能を有しており、今後、産業応用が大いに期待できる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
以下、本発明をより詳細に説明する。
＜１  白色腐朽菌ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３＞
ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３株は、青森県内から新たに採取された白色腐朽菌であって、後述のポリペプトンとグルコースを主成分とする液体培地での静置培養において、リグニン分解に関与している酵素であるラッカーゼ（Ｌａｃ）、マンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）およびリグニンペルオキシダーゼ（ＬｉＰ）を生産し、特にＬｉＰを菌体外に著量蓄積する菌株として見出されたものである。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
＜２  白色腐朽菌ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３の分離＞
ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３株は、文献［橘，大川，伊藤，沖，平林，紙パルプ技術協会誌，５０，１８０６−１８１５（１９９６）］に記載のリグニン分解微生物分離用培地を用いて分離した。すなわち、野外より採取した腐朽材片を滅菌蒸留水に懸濁し、この懸濁液を、前記の文献に記載の、上層に色素レマゾールブリリアントブルーＲを含む２層からなる寒天培地上に塗沫して、２５℃で培養した。当該色素を脱色した菌株のコロニーを釣菌し、新しく調製した上記２層寒天培地に塗抹して、２５℃で培養する操作を繰り返して純粋に分離した。分離した菌株は、日水製薬社製ポテトデキストロース寒天培地（１リットルあたり、ポテト浸出液末４．０ｇ、ブドウ糖２０ｇ、寒天１５ｇ、ｐＨ６．０）を用いて調製したスラントに植菌し、２５℃で培養後、４℃に保存した。ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３株はこのスクリーニングにおいて良好な脱色成績を示す菌株の１つとして分離されたものである。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３株は、ポテトデキストロース寒天培地で２５℃で培養することにより、白色綿状の集落を形成する。また、全ての分離菌株について、下記のとおりリグニン分解酵素生産性を比較した結果、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３株は、ラッカーゼ（Ｌａｃ）、マンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）およびリグニンペルオキシダーゼ（ＬｉＰ）を生産し、特にＬｉＰを菌体外に著量生産する菌株であることが明らかとなった。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
＜３  リグニン分解酵素の生産性＞
ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３株を下記のようにポリペプトン／グルコース培地で２５℃で静置培養し、下記の活性測定法により、培養液中の酵素活性を測定した。その結果、ＬｉＰ活性は１５〜２５日間、Ｌａｃ活性は２０〜３０日間、ＭｎＰ活性は１５〜２５日間の培養で培地中の蓄積量が最大となることがわかった。最大蓄積量はＬｉＰ活性でおよそ２５ｎｋａｔ／ｍｌ、Ｌａｃ活性で２０ｎｋａｔ／ｍｌ、ＭｎＰ活性で１ｎｋａｔ／ｍｌであった。この条件で、対照試験株コリオルス・ヴァージカラー・ＩＦＯ  ９７９１（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ  ＩＦＯ  ９７９１  以下「ＩＦＯ  ９７９１株」ともいう）は、Ｌａｃ活性でおよそ２０ｎｋａｔ、ＭｎＰ活性は１ｎｋａｔと同程度の蓄積量を示すが、ＬｉＰ活性は０．１〜０．５ｎｋａｔ／ｍｌであった。よって、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３株はＩＦＯ  ９７９１株の５０〜２５０倍のＬｉＰ生産性を有していることが示された。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
＜４  ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３株の分類＞
ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３株について、分類上有用な遺伝子領域となっている５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子ならびにその近傍、１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、および２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子５’末端領域の塩基配列を決定し、その相同性検索（ＢＬＡＳＴ）を行うことにより同定を試みた。その結果、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３株はアナタケ目（Ｐｏｒｉａｌｅｓ）に含まれる新種と判断された。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
＜４−２  相同性検索＞
これらの塩基配列について、米国ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）が提供しているＢＬＡＳＴ相同性検索を利用し、ＧｅｎＢａｎｋ登録データ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ国際データベース）について相同性検索を行った。その結果、登録データには、どの遺伝子領域についても塩基配列の一致する登録菌株はなかった。一方、５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子については、タバコウロコタケ目のフェリヌス・イグニアリウス（Ｐｈｅｌｌｉｎｕｓ  ｉｇｎｉａｒｉｕｓ）との相同性が９８％と登録菌株中で最も高い相同性を示したが、属の分類に有用な１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子について、アナタケ目サルノコシカケ科のフォメス・フォメンタリウス（Ｆｏｍｅｓ  ｆｏｍｅｎｔａｒｉｕｓ）との相同性が９８％、２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子については、アナタケ目サルノコシカケ科のイルペックス・ラクテウス（Ｉｒｐｅｘ  ｌａｃｔｅｕｓ）との相同性が９９％と最も高く、近縁関係が見出された。この結果からＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３株はアナタケ目（Ｐｏｒｉａｌｅｓ）に含まれる新種と判断された。特にはサルノコシカケ科（Ｐｏｒｉｐｏｒａｃｅａｅ）のフォメス（Ｆｏｍｅｓ）属（ツリガネタケ）やイルペックス（Ｉｒｐｅｘ）属（ウスバタケ）に近縁と推定された。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
＜５  ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３株由来のＬｉＰの精製＞
上述のようにして培養したＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３株の培養液からのＬｉＰの精製例を示す。本精製方法によれば、培養液１Ｌあたり蛋白質量として３８ｍｇ（１０７００ｎｋａｔ）のＬｉＰが回収できることがわかった。また、活性回収率から逆算すると、１Ｌの培養液あたりおよそ８０ｍｇのＬｉＰが生産されているものと考えられた。このＬｉＰ標品は後述するように、各種ＬｉＰの混合物として得られた。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３株を上記の培養条件で２１日間培養した培養液（８８ｍｌ、総ＬｉＰ活性１９４０ｎｋａｔ；総Ｌａｃ活性１２７０ｎｋａｔ；総ＭｎＰ活性１０６ｎｋａｔ）を０．２２μｍのフィルターでろ過して培養上清を回収し、さらに限外ろ過（ＹＭ１０フィルター，Ａｍｉｃｏｎ社）により濃縮脱塩した後、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）溶液（９．７ｍｌ）とした。この濃縮によって少量の不溶物を生じるので、これを０．２２μｍのフィルターで除去した後、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラム（２．１×２４ｃｍ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にかけ、２００ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で洗浄後、直線濃度勾配の０〜０．４Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）（総量６００ｍｌ）で溶出し、最後に１Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）２００ｍｌで洗浄した。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
図１は、本発明に係るＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３株由来ＬｉＰのイオン交換クロマトグラフィーによる精製過程を示すクロマトグラムである。クロマトグラフィーにおいては、流速は３０ｍｌ／ｈで行った。溶出液を５ｍｌずつ試験管に分画し、前記の測定法によって分画物中の酵素活性を測定した。総ＬｉＰ活性のおよそ８０％を占める主要ＬｉＰ活性ピークの画分（分画番号１１５〜１２５、図中、下線で示した画分）を集め、ＹＭ１０で濃縮脱塩し、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）溶液（２．８ｍｌ）とした。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
＜５−２  ゲルろ過法による精製＞
この濃縮液を、さらに０．１Ｍ  ＮａＣｌ／２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ＨＲカラム（１．６×６０ｃｍ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｓｃｉｅｎｃｅｓ社）により分画した。
図２は、本発明に係るＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３株由来ＬｉＰのゲルろ過法による精製過程を示すクロマトグラムである。ゲルろ過においては、流速は６ｍｌ／ｈで行い、１．２ｍｌずつ分画し、前記の測定法によって酵素活性を測定した。単一のピークを示したＬｉＰ活性の溶出画分（試験管番号４５〜４８、図中、下線で示した画分）を回収し、ＹＭ１０で濃縮脱塩後、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）溶液に調整して−８０℃に保存した。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
以上の精製の結果、初発８８ｍｌの培養液から蛋白質量３．３ｍｇ、総ＬｉＰ活性９４４ｎｋａｔのＬｉＰ標品が得られた。蛋白質量は標品の紫外吸光度（２１５ｎｍと２２５ｎｍの吸光度差）から求めた［菅原，副島，蛋白質の定量法（第３版），ｐｐ．１３５−１３７，学会出版センター（１９９０）］。すなわち、この精製方法で培養液１Ｌあたり蛋白質量として３８ｍｇ（１０７００ｎｋａｔ）のＬｉＰが回収できることがわかった。また、活性回収率は４９％であった。この回収率から逆算すると、１Ｌの培養液あたりおよそ８０ｍｇのＬｉＰが生産されていると考えられた。このＬｉＰ標品は、既知のＬｉＰと同様にヘム鉄に由来する４０７ｎｍの極大吸収を示し、茶褐色を呈していた。また、後述するように、このＬｉＰ標品はＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３株の複数のＬｉＰの混合物として得られた。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
＜６  ＬｉＰの分子量、等電点および性質＞
＜６−１  分子量と等電点＞
図３Ａ、３Ｂは、本発明に係るＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３株由来ＬｉＰの電気泳動パターンである。図３Ａに示すパターンは、培養液および精製酵素の１２．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ−Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）によるものである。各レーンは、レーン１，分子量マーカ；２，培養液のＹＭ１０濃縮液；３，ＬｉＰである。ＣＢＢ染色を用いている。また図３Ｂに示すパターンは、精製酵素の等電点電気泳動（ＩＥＦ  ｐＨ  ２．５〜５）によるものである。各レーンは、レーン１，３，ｐＩマーカ；２，ＬｉＰである。ＣＢＢ染色を用いている。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
一方、等電点電気泳動の結果（図３Ｂ）、このＬｉＰ標品はｐＩ４．３０〜２．９０に分布する７本（もしくは８本）のバンドを与えた。このことから、上記の精製方法によってＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３株の複数種のＬｉＰの濃縮物が得られたことがわかった。このことから、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３株のＬｉＰは、他の白色腐朽菌のＬｉＰと同様に多重遺伝子を形成していることがわかった。これらのｐＩ値は既知のＬｉＰと同様であった。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
＜７−２  ＬｉＰ  ｃＤＮＡのクローニング＞
１）ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３株のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡの調製
ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３株を前述の培地で静置培養し、培地中のＬｉＰ活性の上昇期に菌体を回収した。菌体を液体窒素中で乳鉢で破砕し、ＱｉｕｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、同社のマニュアルに従ってｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを調製した。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
３）５’ＲＡＣＥによるＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３株のリグニンペルオキシダーゼｃＤＮＡの検出
アミノ末端配列（配列番号１２）中の残基番号７−１４の配列ＶＮＴＡＴＮＡＡの配列に対応するアンチセンスプライマー１（５’ＧＣＮＧＣＲＴＴＮＧＴＮＧＣＮＧＴＲＴＴＮＡＣ、配列番号１３）、またはＫＮＴＡＴＮＡＡの配列に対応するアンチセンスプライマー２（５’ＧＣＮＧＣＲＴＴＮＧＴＮＧＣＮＧＴＲＴＴＹＴＴ、配列番号１４）のいずれかとＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ付属のユニバーサルプライマーの組み合わせで、ＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて以下のように５’ＲＡＣＥを行った。すなわち、前記の５’ＲＡＣＥ用１本鎖ｃＤＮＡ溶液（０．５μｌ）、２５ｐｍｏｌのアンチセンスプライマー１または２、２．５μｌの１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ  Ｍｉｘ（ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ付属）、終濃度各０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、０．５μｌの５０×ＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅおよび１０×ＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒから成る総量２５μｌの反応液を調製し、ＰＣＲ装置（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）上で、９４℃で３０秒間保持後、変性（９４℃、１０秒間）、アニーリング（６５℃、２０秒間）および伸長（７２℃、２分間）のサイクルを３０回繰り返して反応を終了した。増幅断片を市販の大腸菌プラスミド（商品名ｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ、  Ｎｏｖａｇｅｎ社）にＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５α株（ＴＯＹＯＢＯ社）を形質転換した。アルカリ−ＳＤＳ法によって形質転換株からプラスミドを調製した。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
５）ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３株リグニンペルオキシダーゼのアミノ酸配列の類似性
配列番号１〜４のアミノ酸配列について、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）によって提供されているＦＡＳＴＡ検索プログラムを利用して、相同性検索を行った結果、全てＬｉＰのアミノ酸配列の特徴が保持された新規の酵素であることが明らかとなった。ｃＤＮＡのＬＩＰ１、ＬＩＰ２およびＬＩＰ４（配列番号５、６、８）にコードされたＬｉＰ前駆体（配列番号１、２、４）は３７２アミノ酸残基、ＬＩＰ３（配列番号７）にコードされたＬｉＰ前駆体（配列番号３）は３６８アミノ酸残基からなり、いずれも既知のＬｉＰと同様であった。ＬＩＰ１およびＬＩＰ２にコードされた前駆体はコリオルス・ヴァージカラー（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）のＬＰ１２と最も高い８５．６％の相同性、ＬＩＰ４にコードされた前駆体は同じくＣ・ヴァージカラーのＬＰ１２（Ｃ．  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ  ＬＰ１２）と最も高い８４．８％の相同性を示した。ＬＩＰ３にコードされた前駆体はＣ・ヴァージカラーのＬＰ７（Ｃ．  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ  ＬＰ７）と最も高い９９．２％の相同性を示した。全ての前駆体には１２９番目にＮ結合型糖鎖結合部位と成り得るＡｓｎ残基が１ヶ所存在し、既知酵素と同様に糖蛋白質と考えられた。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
【図１】本発明に係るＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３株由来ＬｉＰのイオン交換クロマトグラフィーによる精製過程を示すクロマトグラムである。
【図２】本発明に係るＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３株由来ＬｉＰのゲルろ過法による精製過程を示すクロマトグラムである。
【図３Ａ】本発明に係るＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３株由来ＬｉＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動パターンである。
【図３Ｂ】本発明に係るＦＥＲＭ  Ｐ−２０７５３株由来ＬｉＰの等電点電気泳動パターンである。