(57)【要約】【課題】体液性応答だけでなく細胞性免疫応答も産生する、マラリアワクチンにおいて使用する新規な改良された抗原を提供すること。【解決手段】本発明は、マラリア原虫のＣＳ蛋白質の一部と、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原とからなる新規なハイブリッド蛋白質を提供し、この蛋白質をワクチン処理の目的に使用することが開示されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的にマラリア原虫のＣＳ蛋白質の全てのＣ末端部分、ＣＳ蛋白質免疫優性領域の４以上のタンデム繰り返し配列およびＢ型肝炎ウイルス由来の表面抗原（ＨＢsＡｇ）からなることを特徴とするハイブリッド蛋白質。
【請求項２】
ＣＳ蛋白質がＨＢｓＡｇと融合している請求項１に記載のハイブリッド蛋白質。
【請求項３】
請求項１または２に記載のハイブリッド蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
転写調節エレメントと結合している請求項３に記載のＤＮＡを含有するベクター。
【請求項５】
請求項４のベクターで形質転換した宿主。
【請求項６】
宿主がエス・セレビシエである請求項５に記載の宿主。
【請求項７】
加えて、Ｂ型肝炎表面抗原をコードする遺伝子で形質転換された請求項６に記載の宿主。
【請求項８】
請求項１または２に記載のハイブリッド蛋白質からなるマルチマーリポ蛋白質粒子。
【請求項９】
請求項１または２に記載のハイブリッド蛋白質およびＢ型肝炎表面抗原からなる混合マルチマーリポ蛋白質粒子。
【請求項１０】
ハイブリッド蛋白質の表面抗原に対する割合が１：４である請求項９に記載の粒子。
【請求項１１】
適当な希釈剤または担体との混合物中、請求項１、２および８〜１０のいずれか１つに記載の免疫保護量の粒子または蛋白質からなるワクチン。
【請求項１２】
加えて、３−脱アシル化モノホスホリルリピッドＡからなる請求項１１記載のワクチン。
【請求項１３】
加えて、ミョウバンからなる請求項１２記載のワクチン。
【請求項１４】
水中油型エマルジョン中に調製された請求項１２記載のワクチン。
【請求項１５】
適当な宿主中で請求項１または２に記載の蛋白質をコードするＤＮＡを発現し、生成物を回収することからなる請求項１または２に記載のハイブリッド蛋白質の生成法。
【請求項１６】
請求項１または２に記載の蛋白質およびＢ型肝炎表面抗原をコードするＤＮＡをサッカロミセス属の株中に発現することからなる請求項８〜１０に記載の粒子の生成法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はハイブリッド蛋白質、その医薬における使用、特にマラリア感染症の予防における使用、およびこれを含有するワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
マラリアは、世界の主要な衛生問題のうちの一つであり、毎年２〜４百万人の人がこの病気でなくなっている。この病気の最も急性の形態は、原虫寄生体、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）によっておこり、マラリアによる死亡のほとんどはこれが原因である。
【０００３】
熱帯熱マラリア原虫の生活環は複雑で、完結するためにはヒトおよび蚊の２種の宿主を必要とする。人の感染は感染した蚊の唾液中のスポロゾイトの接種により始まる。スポロゾイトは肝臓に移動し、そこで肝細胞を感染させ、赤血球外細胞内段階を経てメロゾイト段階に分化し、赤血球（ＲＢＣ）に感染して、無性血液段階の周期的複製を開始する。サイクルは、ＲＢＣ中の多数のメロゾイトが有性段階ガメトサイトに分化し、これが蚊により摂取され、中部栄養管の一連の段階を経て発達し、スポロゾイトを産生し、これが唾液腺に移動することにより完了する。
【０００４】
熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト段階はマラリアワクチンの有効な目標である。スポロゾイトの主要な表面蛋白質は、サーカムスポロゾイト蛋白質（ＣＳ蛋白質）として知られる。この７Ｇ８株由来の蛋白質はクローンし、発現し、配列決定されている（非特許文献１参照）。７Ｇ８株由来の蛋白質は、３７回繰り返す４ペプチドＡｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏを含む中央免疫優性繰り返し領域に４個の副繰り返し配列Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏが散在していることを特徴とする。他の菌株においては、主および副繰り返し配列の数およびその相対的位置が変わる。ＣＳ蛋白質の繰り返しのない部分として示される非繰り返しアミノ酸配列からなるＮおよびＣ末端部分がこの中心部分に隣接している。
【０００５】
照射したスポロゾイトは、実験的なヒトマラリアに対して著しい保護作用を与える（非特許文献２参照）。しかし、生産が困難なため、照射したスポロゾイトは、ワクチン製造の点から実用的ではない。
サーカムスポロゾイト蛋白質ベースのサブユニットワクチンが提案されている。これらのうち２種のワクチンは臨床試験が行われている。１つは合成ペプチドで、もう１つは組み換え蛋白質である（非特許文献３および非特許文献４参照）。
【０００６】
【非特許文献１】ダーム（Dame）ら、サイエンス（Science）２２５（１９８４）ｐ５９３）
【非特許文献２】アメリカン・ジャーナル・オブ・トロピカル・メディスン・アンド・ハイジエン（Am.J.Trop.Med.Hyg.）２４：２９７−４０２，１９７５
【非特許文献３】バロウ（Ballou）ら、ランセット（Lancet):ｉ １２７７（１９８７）
【非特許文献４】ヘリントン（Herrington）ら、ネイチャー（Nature）３２８：２５７（１９８７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これらのワクチンは抗スポロゾイト応答を刺激するのに成功している。しかし、応答の大きさは期待はずれで、応答を全く起こさないワクチンもある。更に、その後の注射に関して抗体レベルの「増加」がなく、in vitro リンパ球増殖検定の結果から、これらの被験者のＴ細胞のほとんどは、優性繰り返し配列を認識しないことがわかった。それでも、各研究のワクチンは寄生虫血症を発現しなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、体液性応答だけでなく細胞性免疫応答も産生する、マラリアワクチンにおいて使用する新規な改良された抗原を提供する。好ましくは、抗原は免疫優性繰り返し配列に対する中和抗体の産生を誘起する。最も好ましくは、抗原は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）型および遅延型過敏性エフェクターＴ細胞媒介免疫応答を誘起し、好ましくはＴへルパー（ＴＨ）記憶細胞も誘起できるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
従って、本発明は、ＣＳ蛋白質の実質的に全てのＣ末端部分、免疫優性領域の４以上のタンデム繰り返し配列、およびＢ型肝炎ウイルス由来の表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を含むハイブリッド蛋白質を提供する。好ましくは、該ハイブリッド蛋白質は、ＣＳ蛋白質のＣ末端部分と実質的に同じである最低１６０個のアミノ酸を含む配列を含む。ＣＳ蛋白質はＣ末端から最後の１２個のアミノ酸を除いたものであってもよい。
【００１０】
特に、ＨＢｓＡｇのＮ末端と直線的リンカーによりフレーム中に融合された熱帯熱マラリア原虫７Ｇ８のアミノ酸２１０〜３９８に実質的に対応する熱帯熱マラリア原虫のＣＳ蛋白質の一部を含む蛋白質が提供される。該リンカーはＨＢｓＡｇ由来のｐｒｅＳ２の一部を含んでもよい。
【００１１】
本発明は、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ配列も提供する。
【００１２】
特に好ましい具体例は、ＲＴＳで表わされるハイブリッド蛋白質である。ＲＴＳのアミノ酸配列を第５図に示す。このハイブリッド蛋白質は、
サッカロミセス・セレビシエＴＤＨ３遺伝子配列由来のヌクレオチド１０５９〜１０６１によりコードされるメチオニン残基［ムスティ・エイ・エム（Musti A.M.）ら、ジン（Gene）１９８３  ２５  １３３−１４３］；
ハイブリッド遺伝子を構築するのに用いられるクローニング法により得られるヌクレオチド配列（１０６２〜１０７０）由来の３個のアミノ酸：Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ｐｒｏ；
熱帯熱マラリア原虫７Ｇ８株のサーカムスポロゾイト蛋白質（ＣＳＰ）のアミノ酸２１０〜３９８に相当するヌクレオチド１０７１〜１６３７によりコードされる１８９個のアミノ酸（Ｄａｍｅら、前出）；
ハイブリッド遺伝子を構築するために用いられるクローニング法により得られるヌクレオチド１６３８〜１６４０によりコードされるアミノ酸（Ａｒｇ）；
ヌクレオチド１６４１〜１６５２によりコードされ、Ｂ型肝炎ウイルス
（ａｄｗ血清型）のｐｒｅＳ２蛋白質（９）の４個のカルボキシ末端残基に相当する４個のアミノ酸、Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ；
ヌクレオチド１６５３〜２３３０によりコードされ、Ｂ型肝炎ウイルス（ａｄｗ血清型）のＳ蛋白質を特定する２２６個のアミノ酸
を含む。
【００１３】
別の具体例において、熱帯熱マラリア原虫ＮＦ５４（モレキュラー・アンド・バイオケミカル・パラサイトロジー（Mol.Biochem Parasitol），３５：１８５−１９０，１９８９）由来のＣＳＰ遺伝子配列を用いて産生され、熱帯熱マラリア原虫ＮＦ５４由来のＣＳ蛋白質の２０７〜３９５領域の実質的に全部を含むＲＴＳ＊で表わされるハイブリッド蛋白質が提供される。
特に、ＲＴＳ＊は以下のものを含む：
ＴＤＨ３遺伝子配列由来のヌクレオチド１０５９〜１０６１によりコードされるメチオニン；
ハイブリッド遺伝子を構築するのに用いられるクローニング法によりえられるヌクレオチド配列（１０６２〜１０７０）由来の３個のアミノ酸：Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ｐｒｏ；
熱帯熱マラリア原虫ＮＦ５４株のサーカムスポロゾイト蛋白質（ＣＳＰ）のアミノ酸２０７〜３９５に相当するヌクレオチド１０７１〜１６３７によりコードされる１８９個のアミノ酸鎖（モレキュラー・アンド・バイオケミカル・パラサイトロジー，３５：１８５−１９０，１９８９）；
ハイブリッド遺伝子を構築するために用いられるクローニング法によりえられるヌクレオチド１６３８〜１６４０によりコードされるアミノ酸（Ｇｌｙ）；
ヌクレオチド１６４１〜１６５２によりコードされ、Ｂ型肝炎ウイルス（ａｄｗ血清型）ｐｒｅＳ２蛋白質の４個のカルボキシ末端残基に相当する４個のアミノ酸、Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ（ネイチャー  ２８０：８１５−８１９，１９７９）；
ヌクレオチド１６５３〜２３３０によりコードされ、Ｂ型肝炎ウイルス（ａｄｗ血清型）のＳ蛋白質を特定する２２６個のアミノ酸鎖（ネイチャー  ２８０：８１５−８１９，１９７９）。
【００１４】
ＲＴＳ＊のアミノ酸配列を第９図に示す。
ＲＴＳ＊を含有する発現カセットを構築し、これは以下の様な特性を有する：
エス・セレビシエＴＤＨ３遺伝子由来のヌクレオチド１から１０５８まで伸びるプロモーター配列；
ヌクレオチド１０５９から始まり、ヌクレオチド２３３０まで伸びるオープンリーディングフレーム。このオープンリーディングフレームは、そのすぐ後に翻訳終止コドンＴＡＡ（ヌクレオチド２３３１〜２３３３）が続く。該オープンリーディングフレームは、ハイブリッドＲＴＳ＊蛋白質を特定するアミノ酸をコードする。
エス・セレビシエＡＲＧ３遺伝子由来の塩基対２３３４から３５０４まで伸びる配列中に含まれる転写終止配列。
【００１５】
ヌクレオチド配列を第１０図に示す。
【００１６】
本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ配列は、好ましい具体例においては、好ましくは酵母遺伝子由来の転写調節エレメントに隣接し、発現ベクター中に含まれる。
このようなベクターは本発明の別の態様である。好ましいプロモーターは、エス・セレビシエＴＤＨ３遺伝子由来のプロモーターである（ムスティら、前出）。
【００１７】
本発明はまた、本発明にかかるベクターで形質転換された宿主細胞に関する。宿主細胞は、原核生物であっても真核生物であってもよいが、好ましくは、エス・セレビシエなどの酵母である。このような宿主においては、ハイブリッド蛋白質、例えばＲＴＳは、リポタンパク質粒子として発現される。選択された受容体酵母株は好ましくはすでにそのゲノム中にいくつかの組み込まれたＢ型肝炎Ｓ発現カセットのコピーを有する。得られた株は２種のポリペプチド、ＳおよびＲＴＳ（または他の本発明のハイブリッド蛋白質）を合成し、リポタンパク質粒子の混合物（たとえば、ＲＴＳ、ＳまたはＲＴＳ＊、Ｓ）中に自発的にコアセンブルされる。これらの粒子はその表面でハイブリッドのＣＳＰ配列を示すのが有利である。これらの混合粒子もまた、本発明に含まれる。有利には、これらの混合粒子中のＲＴＳ：ＳまたはＲＴＳ＊：Ｓの比率は１：４である。
【００１８】
本発明はまた、適当な希釈剤または担体との混合物中に免疫保護量の本発明の蛋白質または粒子を含むワクチンに関する。
【００１９】
本発明のワクチンにおいて、ハイブリッドの水溶液を直接用いてもよい。あるいは、あらかじめ凍結乾燥した、あるいはしていない蛋白質を公知のアジュバントと混合または吸収させてもよく、このようなアジュバントとしてはミョウバン、ムラミルジペプチド、Ｑuil Ａなどのサポニンが挙げられるが、これに限定されるわけではない。
【００２０】
免疫促進物質も選択的にまたは追加的に含まれる。この免疫促進物質の好ましい具体例は、３脱アシル化モノホスホリルリピッドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）である。
３脱アシル化モノホスホリルリピッドＡはアメリカ合衆国特許第４９１２０９４号およびイギリス特許出願第２２２０２１１号（リビ（Ribi））から公知であり、米国、モンタナ州、ルビ・イムノケム（Ribi Immunochem）から入手可能である。
【００２１】
本発明の蛋白質もこのようなリポソームの微粒子中に封入されてもよい。
【００２２】
ワクチン調製物は、ニュー・トレンズ・アンド・デベロプメンツ・イン・バクシンズ（New Trends and Developments in Vaccines，ボーラー（Voller）ら編，ユニバーシティ・パーク・プレス（University Park Press），ボルチモア，メリーランド州，米国，１９７８）に記載されている。リポソーム中の封入は、例えばフュラートン（Fullerton）（アメリカ合州国特許第４２３５８７７号）により記載されている。
【００２３】
通常のアジュバントを用いてもよいが、好ましい免疫促進物質は３脱アシル化モノホスホリルリピッドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）である。
典型的には、３Ｄ−ＭＰＬを用いた場合、抗原および３Ｄ−ＭＰＬはミョウバンを加えるかまたは水中油型乳剤中に処方される。３Ｄ−ＭＰＬはエフェクターＴ細胞応答の刺激物質であるのでこれを混ぜるのが有利である。
【００２４】
従って本発明の好ましい具体例は、本明細書中に記載したように、３Ｄ−ＭＰＬおよび担体と組み合わせたハイブリッド蛋白質、好ましくはＲＴＳまたはＲＴＳ＊を含むワクチンを提供する。典型的には、担体は水中油型乳剤またはミョウバンである。
【００２５】
最も好ましい具体例においては、ハイブリッド蛋白質は本明細書において記載したような粒子または混合粒子である。
【００２６】
各ワクチン用量中の本発明の蛋白質の量は典型的ワクチン中著しい副作用を起こさずに免疫保護応答を誘起できる量に選択される。このような量は、用いた特定の免疫原およびワクチンがアジュバントを含むかどうかにより変わる。一般的に、各用量は１〜１０００μｇ、好ましくは１〜２００μｇ、最も好ましくは１０〜１００μｇの蛋白質を含む。特定のワクチンについて最適な量は、抗体価の観察および他の患者における他の応答を含めた標準的研究により決定できる。初回接種の後、患者は好ましくは約４週間で追加免疫を受け、その後感染の危険がある間は６ヵ月ごとに繰り返し追加免疫を行う。本発明の蛋白質に対する免疫応答はアジュバントおよびまたは免疫促進物質の使用により向上する。
【００２７】
本発明の蛋白質は好ましくは酵母、特にサッカロミセス属に属する酵母中に発現される。
【００２８】
本発明の別の態様は、本発明のハイブリッド蛋白質の調製法を提供することであり、該方法は、該蛋白質をコードするＤＮＡ配列を適当な宿主、好ましくは酵母中で発現し、生成物を回収することからなる。
【００２９】
本発明の蛋白質をサッカロミセス株中で発現することが特に好ましい。ＲＴＳを例えばこのような菌株中で発現した場合、これは自発的にマルチマーリポタンパク質粒子中で集合する。
これらの粒子は免疫原性が高く、強い体液性応答ならびに免疫学的記憶を誘起し、またＣＴＬおよびＤＴＨ型のエフェクターＴ細胞を誘起することができる。
【００３０】
本発明の更に別の態様は、既に記載したように有効量のワクチンを投与することによるマラリア原虫感染症にかかっている患者の治療法である。
【実施例１】
【００３１】
１．ＲＩＴ４３８３株のＲＴＳ、Ｓの構築
ＳおよびＲＴＳポリペプチドの両方を含有する粒子の産生に用いるエス・セレビシエＲＩＴ４３８３株は、各蛋白質に対して別の発現カセットを有する。Ｓ遺伝子発現カセットは定住Ｔｙレトロトランスポンソンズと相同な直線状組み込みベクターを用いてゲノム中の最低２個の部位で５〜６個のコピー中に組み込まれる。ＲＴＳ遺伝子発現カセットは、Ｓ遺伝子カセットの組み込みに用いたものと同様の直線状組み込みベクターを用いてゲノム中の１または２個の部位で２〜３個のコピー中に組み込まれる。両タイプのカセットからの発現は、酵母ＴＤＨ３遺伝子由来のプロモーターにより行われる。
【００３２】
１.１発現カセットおよび組み込みベクター（ｐＲＩＴ１３０３４）の構築
Ｓ遺伝子発現カセット（第１Ａ図）はＲＩＴ４３７６株（１）中に見られるものと同じであり、１０５８ｂｐのＴＤＨ３プロモーターフラグメント、６８１ｂｐのＳ遺伝子配列、６ｂｐのＥｃｏＲ１リンカーを含むスペーサーおよびＡｒｇ３転写ターミネーターを有する１１６５ｂｐのフラグメントからなる。Ｓコーディング配列は、ａｄｗ血清型のウイルスの完全ゲノムクローン（ｐＲＩＴ１０６１６）からのサブクローニングにより得られる。
Ｓ発現カセットの酵母ゲノム中への組み込みに用いられるＴｙベクター、ｐＲＩＴ１３０３４の構造を第２図に示す。このタイプの酵母ゲノム中の発現カセットの組み込み用ベクターの構造および使用は、ジェイコブズ（Jacobs）ら（２）に記載されている。ｐＲＩＴ１３０３４はＳ遺伝子カセット、ＵＲＡ３遺伝子およびｐＵＣ９上にクローンされたＴｙエレメントのコピー中に挿入されたＣＵＰ１遺伝子を含有する。ＵＲＡ３遺伝子およびＣＵＰ１遺伝子は両方とも形質転換された酵母コロニーを、形質転換されていないコロニーから区別する選択マーカーを提供する。ｐＵＣ９は、ビエイラ＆メッシング（Vieira ＆ Messing）（３）に記載されており、ＵＲＡ３フラグメントはｐＦＬ４４由来であり［エフ．ラクロート（F.Lacroute），ＣＮＲＳ，ストラスブール］、ＣＵＰ１フラグメントはｐＣＵＰ５由来であり（ティー・ブット（T.Butt,）ＳＫＦ Ｌabs，フィラデルフィア）、  Ｔｙエレメントはジュニアウス（Juniaux）ら（４）からのものであり、Ｓ遺伝子カセットはｐＲＩＴ１２３５３由来である。ｐＲＩＴ１３０３４のＸｈｏＩエンドヌクレアーゼを用いた消化により、第３図に示す８５００ｂｐの直線状フラグメントが遊離し、これを定住Ｔｙエレメントと遊離末端の相同な組み換えによりゲノム中に組み込むことができる。
【実施例２】
【００３３】
Ｙ１２９５株の構築
受容体株ＥＪ  ｃｕｐ１Ｄ−３ｄ（ｔｒｐ１、ｌｅｕ２、ｕｒａ３、ｃｕｐ１、ｇａｌ１Ｄ、ＭＡＴα）をｐＲＩＴ１３０３４由来の直線状ベクターフラグメントの形質転換による一次導入に用いた。この株は１個の破砕された遺伝子座ｃｕｐ１、ｃｕｐ１を含む。
直線状ＸｈｏＩフラグメントで形質転換した後、Ｕｒａ＋コロニーを単離し、銅耐性に関してスクリーンする。サザンブロッティング分析で測定すると、より耐性の強い形質転換体が２〜５個のベクターのコピーを組み込んでいた。２個の形質転換体コロニーのコピー、推定３〜４個のコピーを有するＭＳ９および４〜５個の組み込み直線ベクターのコピーを有するＭＳ２３が保持されている。ＭＳ２３株を次にＥＪ  ｃｕｐ１Ｄ−７ｂ株（ｔｒｐ１、ｕｒａ３、ｃｕｐ１、ｇａｌ１Ｄ、ＭＡＴα）と交雑させ、ハプロイド有子嚢胞子を回収してＭＳ２３−２ａを得る。
この菌株を次にＭＳ９と戻し交雑すると得られたＬｅｕ−、Ｔｒｐ−ハプロイド分離体（ＭＳ５４−２ｃ）は５〜６個の組み込まれた発現カセットを含む。サザンブロッティングによると、ＭＳ５４−２Ｃは１遺伝子座に４〜５個の組み込みベクターのタンデムコピーを有し、更に別の遺伝子座に組み込まれた１個のコピーを有する。発現カセットの５〜６個のコピー全てはカセットフラグメントを遊離するための全酵母細胞ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩエンドヌクレアーゼでの消化を受けず、Ｓ遺伝子特異性プローブを用いたサザンブロッティングにより予想される３ｋｂのバンドが得られる。この菌株の自発的Ｔｒｐ＋復帰変異体、ＭＳ５４−２ｃ−Ｔが得られる。実験室受入番号Ｙ１２９５。
【実施例３】
【００３４】
ＲＴＳ発現カセットの構築
ＲＴＳハイブリッド蛋白質の発現カセットを、多段階のクローニング法により構築し、イー・コリ酵母シャトルベクターＹｅｐ１３（６）中にクローンして、プラスミドＹｅｐ１３ＲＴＳ（第４図）を得る。カセットの構造を第１Ｂ図に示す。全ヌクレオチド配列を直接配列決定（コーディング配列および非翻訳調節配列の一部に関して）または関連する文献を参考にして（プロモーターおよびターミネーター配列の一部に関して）決定した。ＤＮＡ配列を第５図に示す。これは以下の要素を含有する：
エス・セレビシエＴＤＨ３遺伝子由来のヌクレオチド１から１０５８まで伸びるプロモーター配列；
ヌクレオチド１０５９で始まり、ヌクレオチド２３３０まで伸びるオープンリーディングフレーム。このオープンリーディングフレームのすぐ後には翻訳終止コドンＴＡＡ（ヌクレオチド２３３１から２３３３）が続く。オープンリーディングフレームはハイブリッドＲＴＳ蛋白質を特定するアミノ酸をコードする；
エス・セレビシエＡＲＧ３遺伝子（クラビール（Crabeel）ら  ＥＭＢＯ Ｊ．１９８３  ２：２０５−２１２）由来の、２３３４から３５０４塩基対まで伸びる配列中に含まれる転写停止配列。
ヌクレオチド１０５９から２３３０によりコードされるハイブリッドＲＴＳ蛋白質のアミノ酸配列を第５図に示し、これは以下の要素を含む：
ＴＤＨ３遺伝子配列由来の、ヌクレオチド１０５９から１０６１によりコードされるメチオニン残基；
ハイブリッド遺伝子を構築するのに用いられるクローニング法により産生されるヌクレオチド配列（１０６２〜１０７０）由来の３個のアミノ酸ＭｅｔＡｌａ  Ｐｒｏ；
熱帯熱マラリア原虫７Ｇ８株（８）のサーカムスポロゾイト蛋白質（ＣＳＰ）のアミノ酸２１０〜３９８に相当するヌクレオチド１０７１〜１６３７によりコードされる１８９個のアミノ酸鎖；
ハイブリッド遺伝子を構築するのに用いられるクローニング技法により産生されるヌクレオチド１６３８〜１６４０によりコードされるアミノ酸（Ａｒｇ）；
ヌクレオチド１６４１から１６５２によりコードされ、Ｂ型肝炎ウイルス（ａｄｗ血清型）ｐｒｅＳ２蛋白質（９）の４個のカルボキシ末端残基に相当する４個のアミノ酸Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ；
ヌクレオチド１６５３から２３３０によりコードされ、Ｂ型肝炎ウイルス（ａｄｗ血清型）を特定する２２６個のアミノ酸鎖。
【実施例４】
【００３５】
ＲＴＳカセット組み込みベクターｐＲＩＴ１３５３９の構築
ＲＴＳカセット組み込みベクターｐＲＩＴ１３５３９の構造を第６図に示す。
ＲＴＳ発現カセットをＴｙベースの組み込みベクターｐＲＩＴ１３１４４上に挿入する。このベクターは、ＬＥＵ２遺伝子がベクターｐＣＶ９（７）から単離されたＳａｌＩ−ＸｈｏＩフラグメントとしてＴｙエレメントのＳａｌＩ部位中に挿入されているｐＲＩＴ１２９２７（２）の誘導体である。従って、ＲＴＳ発現カセットをｐＲＩＴ１３１４４中に挿入した後、得られたプラスミドｐＲＩＴ１３５３９は発現カセットに加えて、選択マーカーとしてＬＥＵ２遺伝子を含有する（第５図）。ｐＲＩＴ１３５３９をＢｇｌＩＩエンドヌクレアーゼで消化すると、第７図に示す６８００ｂｐの直線状フラグメントが遊離され、これは定住Ｔｙエレメントとの遊離末端の相同組換によりゲノム中に組み込むことができる。
【実施例５】
【００３６】
実施例５ａ  Ｙ１２９５株の形質転換およびＲＩＴ４３８３株（Ｙ１５３０）の産生
ＳおよびＲＴＳ蛋白質の両方を発現する株を得るために、Ｙ１２９５を、Ｌｅｕ＋コロニーに関する選択を有する６８００ｂｐの直線状ＢｇｌＩＩフラグメントを用いて形質転換する。種々の割合でゲノム中に存在する両発現カセットのセットを含む数個の組み込み体が得られる。約１：４の割合でＲＴＳおよびＳ蛋白質を発現する選択された形質転換体の一つは公式名称はＲＩＴ４３８３（実験室受入番号Ｙ１５３０）である。
【００３７】
実施例５ｂ  Ｙ１２９５株の形質転換およびＹ１６３１株の産生
（ＲＴＳと）類似の構造を、熱帯熱マラリア原虫ＮＦ５４株（モレキュラー・アンド・バイオケミカル・パラサイトロジー（Mol.Biochem.Parasitol.）３５：１８５−１９０，１９８９）由来のＣＳＰ遺伝子配列を用いて産生する。得られた融合蛋白質は、熱帯熱マラリア原虫７Ｇ８株由来のＣＳＰを用いてえられる構造物と区別するためにＲＴＳ＊と表わす。
発現カセットの配列を第９図に示す。これは以下のエレメントを含む：
エス・セレビシエＴＤＨ３遺伝子由来のヌクレオチド１から１０５８まで伸びるプロモーター配列；
ヌクレオチド１０５９で始まり、ヌクレオチド２３３０まで伸びるオープンリーディングフレーム。このオープンリーディングフレームのすぐ後には翻訳終止コドンＴＡＡ（ヌクレオチド２３３１から２３３３）が続く。オープンリーディングフレームはハイブリッドＲＴＳ＊蛋白質を特定するアミノ酸をコードする；
エス・セレビシエＡＲＧ３遺伝子由来の、２３３４から３５０４塩基対まで伸びる配列中に含まれる転写終止配列。
ＲＴＳ＊融合蛋白質をコードするこの発現カセットを、ＲＴＳ構造物に関して既に記載したのと同じ方法を用いて形質転換し、酵母Ｙ１２９５株のゲノム中に形質転換し、組み込む。ＳおよびＲＴＳ＊蛋白質の両方を発現する形質転換されたクローンが得られる。１つのクローンを、約４Ｓ：１ＲＴＳ＊の割合で２個の蛋白質を発現するように選択する。クローンの実験室受入番号はＹ１６３１である。
【実施例６】
【００３８】
ＲＩＴ４３８３株の予備特質化
６．１イムノブロッティング分析
細胞を含まないＲＩＴ４３８３から調製した抽出物を種々の抗体を用いたイムノブロットにより分析した：
Ｓ蛋白質に対する単クローン性抗体（Ｍａｂ  ＨＢＳ１）；
ＲＴＳ蛋白質（Ｍａｂ１６７）の繰り返し部分に対する単クローン性抗体；
ＲＴＳ蛋白質（ウサギ血清Ｎｏ．２０）の繰り返しのない配列に対するウサギ血清。
酵母ＲＩＴ４３８３株において、２個の発現された生成物を単クローン性抗体ＨＢＳ１により認識する。即ち、Ｓ蛋白質に対応する２４ＫＤ蛋白質および４６ＫＤのＲＴＳハイブリッド蛋白質である。ＲＴＳハイブリッド蛋白質も、ＣＳＰの繰り返し、および非繰り返しエピトープに対する抗体により検出される。これらの結果から明らかに、ＲＩＴ４３８３株が同時に２個のＳおよびＲＴＳ抗原を、ＲＴＳ／Ｓが約１：４の割合で発現することがわかる。
【００３９】
６．２ＣｓＣｌ密度勾配遠心
ＲＩＴ４３８３株中の粒子の形成を、ＣｓＣｌ密度勾配遠心により分析する。粗抽出物（総蛋白質の±１５ｍｇ）を、１０ｍｌの１.５Ｍ  ＣｓＣｌ勾配上分析する（４００００ｒｐｍ、＋８℃、ベックマン５０Ｔｉローター中６８時間）。フラクション（０.５ｍｌ）を集め、ＨＢｓＡｇ（ＡＵＳＲＩＡ）に対して特異的な放射免疫検定法、ＲＴＳ特異的ＥＬＩＳＡおよび抗ＨＢｓＡｇ単クローン性抗体を用いたイムノブロットにより分析する。
第８図に示すように、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡおよびウェスタンブロットピークは、ｒｈｏ＝１.２１の浮遊密度に対応する勾配の同一フラクション（ｎｏ.１３）で現われ、このことは、ＳおよびＲＴＳモノマーの両方を含む混合粒子がこの株中に形成されたことを示す。
【実施例７】
【００４０】
シードロットの調製
マスターシードロットの製造法
Ｙ１５３０株（ＲＩＴ４３８３）をまず２０ｍｌの滅菌ＹＮＢ（Difco）（デキストロース（０.１％）および１.８％（ｗ／ｖ）寒天（Difco）で補足）をいれたペトリ皿中で３０℃で４８時間成育させる。表面成長株を滅菌ＹＮＢブロス（Difco）（デキストロース（１％）およびグリセロール（１０％）を追加）中に懸濁する。この懸濁液を無菌条件下で２ｍｌのポリプロピレンの栓をした滅菌試験管中に分配し（試験管１本につき１ｍｌ）、−７０℃で貯蔵する。
【００４１】
ワーキングシードロットの製造法
マスターシード試験管の１本をすばやく解凍し、その内容物を白金耳で前記のように調製したペトリ皿上に取り出す。３０℃で６３時間培養した後、表面成長物の一部を、４００ｍｌの滅菌ＹＮＢブロス（Difco）（デキストロース（２％）を追加）をいれた２Ｌコニカルフラスコに移す。培養物を３０℃で２４時間培養した後、無菌条件下で遠心する（６３００ｘｇで１５分）。ペレットを無菌ＹＮＢブロス（Difco）（デキストロース（１％）およびグリセロール（１０％）を追加）中に再懸濁する。これを無菌条件下で２ｍｌのガラス栓をした滅菌試験管中に分配し（試験管１本につき０.５ｍｌ）、−７０℃で貯蔵する。
【実施例８】
【００４２】
発酵
接種物の調製
（ａ）固体培地上の成育
バイアル１つ分のワーキングシードロットを素早く解凍し、デキストロース（１％）および１.８％（ｗ／ｖ）寒天（Difco）を追加した滅菌ＹＮＢブロス（Difco）を含有するペトリ皿上に分散させる。ペトリ皿を３００℃で４８時間培養する。
（ｂ）接種物の成育
ペトリ皿の表面成育物をデキストロース（２％）を追加した滅菌ＹＮＢブロス（Difco）中に懸濁し、２個のコニカルフラスコ（２Ｌ、フラスコ１個あたり４００ｍｌの液体）中に等分する。フラスコをロータリーシェーカー上で３０℃で２４時間培養する。
【００４３】
発酵
５Ｌの脱イオン水((ＮＨ４)２ＳＯ４(４０ｇ)を追加)を入れた発酵槽(総容量２０Ｌ）をそのまま清浄なあらかじめフィルターを通した蒸気を用いて２バールｇの圧力で１２１℃で３０分間滅菌する。室温に冷却した後、発酵槽中の液体の体積を４Ｌに調節し、フィルター滅菌したＨＢ４溶液１Ｌを添加する。発酵は、２個のコニカルフラスコからの接種物(８００ｍｌ)を添加することにより開始する。
発酵は、フィードバッチ技法を用いて行い、これにより培養物を以下の組成の溶液と共に連続して供給する：
５ＬのＨＢ４溶液；
４Ｌのデキストロース８０％（１２１℃で滅菌）
培養密度は３０℃およびｐＨ５（ＮＨ４ＯＨを添加することにより維持する）での好気的成育により増加する。溶解酸素を、気流および撹拌速度を調節して約５０％飽和に維持する。供給物の添加速度は成育速度が最大になり、副生成物のエタノールの形成が最小になるようにあらかじめ決定しておく。
４０〜９０時間後に発酵を停止する。発酵の終わりで、全培養物体積は１０〜１８Ｌであり、乾燥細胞重量は３０および１００ｇ／Ｌの間である。培養物を迅速に１５〜２５℃に冷却し、酵母細胞を遠心分離によりブロスから回収する。濃縮した酵母細胞を、再遠心前にリン酸緩衝液（５０ｍＭ）で１度洗浄し、続いてポリエチレンの袋中で−７０℃で貯蔵する。
【００４４】
【表１】
2007209343.tif 000002
【実施例９】
【００４５】
ＲＴＳ／Ｓの抽出および精製
抽出法
９．１細胞懸濁液の精製
凍結濃縮酵母細胞（−７０℃）を一夜−３０℃で解凍し、続いて細胞の入ったポリエチレンの袋を水中（１０〜２０℃）につけることにより５〜１５℃で完全に解凍する。酵母細胞懸濁液を以下の成分を含有する燐酸緩衝溶液（ｐＨ８.０）を用いて調製する：エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ)、ｐ−メチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、イソプロパノールおよびｔｗｅｅｎ２０。
【００４６】
９．２細胞破砕
細胞を鉛を含まないガラスビーズ（直径０.４９〜０.７０ｍｍ）を含むビーズミル中で破砕する。−２０℃の冷却液を循環させて粉砕室を冷却し、粉砕室出口でのホモジネートの温度が１５℃を越えないようにする。液体流速は６Ｌ／時間、撹拌速度は３０００ｒｐｍである。このプロセスを２回行う。得られたホモジネートのｐＨは６.７〜７.５である。
【００４７】
９．３ポリエチレングリコール清澄化
ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）を破砕した細胞懸濁液に添加して、最終濃度を１０％にし（１０℃未満で３０分、ｐＨ６．１）、部分的に清澄化された上清を遠心分離により回収する（Ｊ２１Ｂベックマン遠心分離機、ＪＡ１０ローター、１７０００ｇで１時間）。
【００４８】
９．４メタノール清澄化
メタノールをｐＨ７でＰＥＧで清澄化した抗原に添加して、５容積のＰＥＧで清澄化した抗原に対してメタノール１容積の割合にする。１７０００ｇで２０分間遠心分離により清澄化された抗原をえる（Ｊ２１Ｂベックマン遠心分離機、ＪＡ１０ローター）。
【００４９】
９．５コロイドシリカ上への吸着／脱着
粗抗原を一夜１.５％（ｗ／ｖ）コロイドシリカ（アエロジル３８０、デグサ）上に４℃で吸着させる。
ペレットを連続して遠心分離し、ＮａＣｌ０.９％（ｗ／ｖ）中に再懸濁することにより洗浄（３回）後、１％ＴＷＥＥＮ２０を含有する１０ｍＭピロリン酸緩衝液ｐＨ９．５を用いて抗原を脱着させる。
脱着緩衝液体積はメタノールで清澄化した抗原溶液の１／８に相当する。脱着された抗原溶液をＬ８.７０ベックマン超遠心分離ローターＲ１９で、５００００ｇで６０分間超遠心分離により回収する。
【００５０】
９．６ジアフィルトレーション
精製工程の前に、脱着された抗原を５容積の６Ｍの尿素、５００ｍＭのＮaＣl、２０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌでｐＨ８．５で超遠心分離することにより洗浄し、蛋白質および脂質汚染物の大部分を除去する。
つぎに緩衝液を同じシステム（Ultrasette、３００ｋＤの公称カットオフのポリスルホン膜を備えたＦＩＬＴＲＯＮ）で５容積の１０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌでｐＨ８.１と交換する。
【００５１】
９．７ＤＥＡＥ−ＴＳＫ６５０（Ｍ）上イオン交換クロマトグラフィー
清澄化した溶液を１０ｍＭ  ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ８.１）で平衡化したアニオン交換カラム（ＤＥＡＥ−ＴＳＫ６５０（Ｍ））にかける。連続して２容積の１０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.１）および４０ｍＭＮａＣｌを追加した３容積の１０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.１）で洗浄した後、１容積未満の１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.１）を用いて抗原を脱着する。抗原を含むフラクションをプールする。
【００５２】
９．８Ｂutyl−ＴＳＫ６５０（Ｍ）上疎水性相互作用クロマトグラフィー
最終濃度が６５０ｍＭ  ＮａＣｌになるまでＮａＣｌを添加した後、抗原溶液を、２０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液、６００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８.１）で平衡化したＢutyl-ＴＳＫ６５０（Ｍ）カラムにかける。抗原の大部分は通過するが、不純物はゲルと結合する。
【００５３】
９．９限外濾過による濃縮
ＨＩＣプールを３００ｋＤａの公称カットオフのポリスルホン膜を備えたＵltrasetteシステム（ＦＩＬＴＲＯＮ）により濃縮する。
【００５４】
９．１０ＣｓＣｌ勾配中での超遠心
ＣｓＣｌをＢutyl−ＴＳＫプールに添加して、最終濃度を１.５Ｍにする。
５０.２Ｔｉベックマンローター中２７００００ｇで６５時間後、抗原を含有するフラクションを集める。
【００５５】
９．１１ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ  Ｓ３００（ＨＲ型）上でのサイズ排除クロマトグラフィー
緩衝液を交換し、低分子量の汚染物質を除去するために、抗原溶液をＳＥＰＨＡＣＲＹＬ  Ｓ３００  ＨＲカラムにかける。溶出緩衝液は、１５０ｍＭ ＮaＣlを含有する１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７.４）である。
滅菌濾過
１５０および４００μｇ  Ｌｏｗｒｙ／ｍｌ間に希釈し、ｐＨを６.８に調節した後、精製した抗原を０.２２μｍ滅菌フィルターを通して濾過することにより滅菌する。得られた溶液は、精製されたＲＴＳ／Ｓ粒子を含有する。
【実施例１０】
【００５６】
ＲＴＳ／Ｓの免疫学的特性化
１０．１抗原性
ＲＴＳ／Ｓ粒子の抗原性を試験するために、異なるエピトープに対する単クローン性抗体を結合させてＥＬＩＳＡを何回も行った。
用いた単クローン性抗体（ＭｏＡｂｓ)は以下のとおりである：
−ＭｏＡｂ  Ｒ１０：      ・ＣＳＰ領域の繰り返し配列（ＮＡＮＰ）に対して特異的
・ＩｇＭアイソタイプ
−ＭｏＡｂ  ＲＬ１１７：  ・ＣＳＰ領域の非繰り返し配列に対して特異的
−ＭｏＡｂ  ＲＦ１：      ・ＨＢｓＡｇのＳ配列に対して特異的
・ＩｇＧアイソタイプ
Ｓｐ２／ＯＡｇ骨髄種細胞をＣＳＰ配列の繰り返しおよび非繰り返し領域の両方を含有する完全に純粋でないＲＴＳ様粒子で免疫したＢａｌｂ／Ｃマウスの脾細胞と融合することによりＭｏＡｂ  Ｒ１０およびＲＬ１１７を室中で調製する。
３バッチのＲＴＳ／Ｓワクチンを分析する：バッチナンバーは２４Ｍ３１、２４Ｍ３２および２４Ｍ３４である。
【００５７】
１０．２単クローン性抗体Ｒ１０（抗−繰り返し）との反応
抗−繰り返しＭｏＡｂ  Ｒ１０を「サンドウィッチ」ＥＬＩＳＡに用いる。試験するサンプルをあらかじめＭｏＡｂ  Ｒ１０をコートしたマイクロタイタープレート中で培養する。ペルオキシダーゼと結合した同じＭｏＡｂを次に添加する。３７℃で１時間培養し、洗浄した後、オルトフェニレンジアミンＨ２Ｏ２を添加することにより発色する。４９０ｎｍで吸光度を測定し、抗原濃度に対してプロットする。
結果
３バッチ：２４Ｍ３１、２４Ｍ３２および２４Ｍ３４はＭｏＡｂ  Ｒ１０と陽性に、適合して反応するので、ＲＴＳ／Ｓ粒子上に繰り返しエピトープが存在することが確認される。最大結合の５０％に達するのに必要な抗原量はバッチ２４Ｍ３１、２４Ｍ３２および２４Ｍ３４についてそれぞれ５１.２、３８.２および６０.６ｎｇである。
【００５８】
１０．３単クローン性抗体ＲＬ１１７（抗−繰り返し）との反応
ＭｏＡｂ  ＲＬ１１７のＲＴＳ、Ｓ粒子との反応性を「サンドウィッチ」ＥＬＩＳＡ試験で分析する。ＭｏＡｂ  ＲＬ１１７はペルオキシダーゼと結合し、ＲＴＳ／Ｓ粒子の検出に用いられ、繰り返し領域に関して特異的なＭｏＡｂ  Ｒ１０は粒子の捕獲に用いられる。
簡単に言うと、試験するサンプルをあらかじめＭｏＡｂ  Ｒ１０をコートしたマイクロタイタープレート中で培養する。ペルオキシダーゼと結合したＭｏＡｂ  ＲＬ１１７を次に添加し、３７℃で１時間培養し、洗浄した後、オルトフェニレンジアミンＨ２Ｏ２を添加することにより発色する。４９０ｎｍで吸光度を測定し、抗原濃度に対してプロットする。
結果
３バッチ：２４Ｍ３１、２４Ｍ３２および２４Ｍ３４はＭｏＡｂ  ＲＬ１１７およびＲ１０と陽性に、適合して反応するので、同一のＲＴＳ／Ｓ粒子上に繰り返しおよび非繰り返しエピトープが存在することが確認される。最大結合の５０％に達するのに必要な抗原量はバッチ２４Ｍ３１、２４Ｍ３２および２４Ｍ３４についてそれぞれ１６９.２、１１７.６および１８１.１ｎｇである。
【００５９】
１０．４単クローン性抗体ＲＦ１（抗Ｓ）との反応
ＲＴＳ／Ｓ粒子中のＳエピトープの存在をペルオキシダーゼと結合したＭｏＡｂ  ＲＦ１を検出に用いて「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡ試験により示す。Ｒ１０ＭｏＡｂはＲＴＳ、Ｓ粒子を捕獲するために、マイクロタイタープレート上に直接用いる。
要約すると、試験するサンプルをあらかじめＭｏＡｂ  Ｒ１０をコートしたマイクロタイタープレート中で培養する。ペルオキシダーゼと結合したＭｏＡｂ  ＲＦ１を次に添加する。３７℃で１時間培養し、洗浄した後、オルトフェニレンジアミンＨ２Ｏ２を添加することにより発色する。４９０ｎｍで吸光度を測定し、抗原濃度に対してプロットする。
結果
３バッチ：２４Ｍ３１、２４Ｍ３２および２４Ｍ３４はＭｏＡｂ  ＲＦ１およびＲ１０と陽性に反応するので、同じＲＴＳ／Ｓ粒子上に繰り返しおよびＳエピトープが存在することが確認される。最大結合の５０％に達するのに必要な抗原量はバッチ２４Ｍ３１、２４Ｍ３２および２４Ｍ３４についてそれぞれ５２.３、５５.２および１０６.２ｎｇである。
【実施例１１】
【００６０】
ＲＴＳ／Ｓ粒子のin vivoでの免疫原性
１１．１免疫原性の研究
（ＲＴＳ、Ｓ）粒子の免疫原性に関する試験を、マウスおよびセルコピテカス・イーチオプスサルにおいておこなった。
マウスにおいて、抗ＣＳＰ抗体をＲ３２ｔｅｔ３２抗原を抗繰り返し抗体の検出に用いてＥＬＩＳＡ試験により分析する。Ｒ３２ｔｅｔ３２はプラスミドｐＢＲ３２２のテトラサイクリン耐性遺伝子の３２個のアミノ酸部分と融合した３２個のＮＡＮＰ（主）繰り返し配列からなる。組み換え抗原はエシェリヒア．コリ中で産生する。ＣＳ蛋白質の非繰り返し配列に対する抗体（Ａｂｓ）をＲＬＦ抗原を用いたＥＬＩＳＡ試験により測定する。ＲＬＦ抗原は、インフルエンザウイルスのＮＳ１蛋白質の初めの８１個のアミノ酸と融合した繰り返し配列を含まない完全ＣＳ蛋白質非翻訳領域からなる。ＲＬＦ抗原をイー．コリ中で産生する。マウス血清を１：１００から初めて連続的に希釈し、力価をＥＬＩＳＡ試験（１）において光学密度１．０に対応する希釈度の逆数で表わす。抗ＣＳＰ  Ａｂｓの測定は、各血清に関して行い、力価の等比中項（ＧＭＴ）を計算する。
抗担体応答を分析するために、抗ＨＢｓ抗体力価も測定する（プールした血清のみ）。
マウスの試験において、ＲＴＳ、Ｓ粒子の免疫原性を評価するために、ＨＢｓＡｇの免疫原性について通常用いられるＢａｌｂ／Ｃマウス（Ｈ−２ｄハプロタイプ）も用いる。免疫化の腹腔内（i.p.）および皮下（s.c.）経路を比較し、免疫促進物質３−脱アシル化モノホスホリルリピッドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）の免疫応答に関する効果も試験する。
（ＲＴＳ、Ｓ）ワクチンの免疫原性も同様にセルコピテカス・イーチオプスサルにおいて試験する。
選択された個々のまたはプールした血清もそのプラスモジウム．ファルシパラムスポロゾイトによる人肝癌細胞系（ＨｅｐＧ２）のin vitroの破壊を抑制する能力に関して試験する（ＩＳＩ検定（２））。
【００６１】
１１．２マウスにおける免疫原性
実験１：  Ａｌ(ＯＨ)３上に吸着した臨床的（ＲＴＳ、Ｓ）バッチの免疫原性
方法
免疫化：
１０匹のＢａｌｂ／Ｃマウスに、あらかじめＡｌ(ＯＨ)３上に吸着させた各１μｇの３種の（ＲＴＳ、Ｓ）バッチ（２４Ｍ／３１、２４Ｍ／３２および２４Ｍ／３４）を１ヶ月間隔で２回腹腔内注射する。対照マウスに、ＨＢｓＡｇ（Ｅngerix−Ｂ、バッチＥＮＧ６１１Ｂ４）を注射する。３０日目および４５日目に、マウスを採血し、抗体価を各血清について測定する。
血清学的方法：
抗Ｒ３２ｔｅｔ３２および抗ＲＬＦ価を、それぞれコーティング抗原としてＲ３２ｔｅｔ３２およびＲＬＦを用いたＥＬＩＳＡにより測定する。マイクロプレートを試験する血清サンプル（１：１００から初めて２倍連続希釈１２回）とともに培養する。マウスＡｂｓをビオチニル化抗マウスＩｇ、続いてストレプタビジン：ビオチニル化ホースラディッシュペルオキシダーゼコンプレックスおよびオルトフェニレンジアミン／Ｈ２Ｏ２と反応させる。光学密度を４９０ｎｍで測定する。力価を光学密度１.０（最大結合の５０％）に対応する希釈度の逆数として表わす。各グループのマウスに関して、力価の等比中項（ＧＭＴ）を計算する。抗ＨＢｓ抗体価をHollingerの式（３）にしたがって計算し、ｍＩＵ／ｍｌで表わす。
結果
抗ＣＳＰ応答：
強い抗Ｒ３２ｔｅｔ３２および抗ＲＬＦ応答が試験した各（ＲＴＳ，Ｓ）バッチに関して観察された。バッチ間の明らかな違いはない。著しい追加抗原刺激の効果は２回目の投与の後観察される。ＨｂｓＡｇ（「Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂ」）で免疫したマウスをこの実験において負の対照として用いる。
抗ＨＢｓ応答：
（ＲＴＳ、Ｓ）バッチはＨＢｓＡｇキャリアー蛋白質に対する抗体を誘起する。試験はプールした血清のみに関して行った。
【００６２】
実験２：Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける（ＲＴＳ、Ｓ）粒子の免疫原性に対する免疫促進物質３Ｄ−ＭＰＬの効果
本発明者らはマウスにおける（ＲＴＳ、Ｓ）ワクチンの免疫原性に対する免疫促進物質３Ｄ−ＭＰＬの効果を分析した。腹腔内（i.p.）および皮下（s.c.）経路の両方の免疫化を試験した。
Ａ．ｉｐ経路による免疫化
方法
免疫化：
１０匹のＢａｌｂ／ＣマウスのグループにＡｌ(ＯＨ)３単独、またはＡl(ＯＨ)３＋３Ｄ−ＭＰＬ（５０μｇ／用量）上に吸着させた１μｇの（ＲＴＳ、Ｓ）（バッチ２４Ｍ／３４）を１ヶ月間隔で２回腹腔内注射する。対照マウスに、１５０ｍＭＮａＣｌを注射する。３０日目および４５日目に、マウスを採血し、抗体価を各血清について測定する。
血清学的方法：
血清学的方法は前記の始めの実験においてと同様である。
結果
抗ＣＳＰ応答：
（ＲＴＳ，Ｓ）ワクチンバッチは強い抗Ｒ３２ｔｅｔ３２および抗ＲＬＦ応答を両処方物において示す。全ての場合において、二回目の免疫化の後に著しい追加抗原刺激の効果が観察された。３Ｄ−ＭＰＬを含有する処方に関して得られた力価は全ての場合において、アルミニウムのみの処方物より高く、第一抗Ｒ３２ｔｅｔ３２応答（ｐ＝０．０２）において統計的に著しい増加が観察された。１５０ｍＭ  ＮａＣｌを注射したマウスのグループをこの実験における負の対照として用いた。
抗ＨＢ応答：
腹腔内経路により注射された（ＲＴＳ、Ｓ）ワクチン両処方物は強い抗ＨＢｓ応答を誘起する。著しい追加抗原投与の効果はいずれかの処方物を用いた２回目の免疫化の後に観察される。
【００６３】
Ｂ．s.c.経路による免疫化
方法
免疫化：
１０匹のＢａｌｂ／Ｃマウスの群にＡｌ(ＯＨ)３のみ、またはＡｌ(ＯＨ)３＋３Ｄ−ＭＰＬ（５０μｇ／用量）上に吸着させた１μｇの（ＲＴＳ、Ｓ）（バッチ２４Ｍ／３４）を１ヶ月間隔で２回皮下注射する。対照マウスに、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを注射する。３０日目および４５日目に、マウスを採血し、抗体価を各血清について測定する。
血清学的方法は前記の始めの実験においてと同様である。
結果
抗ＣＳＰ応答：
（ＲＴＳ，Ｓ）ワクチンバッチはＲ３２ｔｅｔ３２およびＲＬＦに対して正の応答を両処方物において誘起する。全ての場合において、二回目の免疫化の後に著しい追加抗原刺激の効果が観察された。３Ｄ−ＭＰＬ処方に関して抗Ｒ３２ｔｅｔ３２および抗ＲＬＦ応答（それぞれｐ＝０．１８およびｐ＝２．９）の両方に関して統計的に著しい高い力価が４５日目に観察される。しかし、一般には、力価は腹腔内経路で観察されたものよりも低い。１５０ｍＭ  ＮaＣｌを注射したマウスのグループをこの実験における負の対照として用いた。
抗ＨＢｓ応答：
腹腔内経路により注射された（ＲＴＳ、Ｓ）ワクチンの両処方物は良好な抗ＨＢｓ応答を誘起する。著しい追加抗原刺激の効果はいずれかの処方物を用いた２回目の免疫化の後に観察される。抗ＣＳＰ応答に関して観察されたように、抗ＨＢｓ応答は腹腔内経路に比べてこの経路に免疫化によるものは低い。
【００６４】
１１．３セルコピテカス・イーチオプスにおける免疫原性
Ａｌ(ＯＨ)３上に吸着した臨床的バッチ２４Ｍ／３２をもちいたセルコピテカス・イーチオプスサルにおける免疫原性を評価した。
方法
免疫化：
５匹のサルに、Ａｌ(ＯＨ)３（０.５ｍｇＡｌ＋＋＋）上に吸着させた２０μｇの（ＲＴＳ、Ｓ）粒子を０、２８および８４日目に筋肉内注射する。動物を０、１４、２８、４２、５６、６６および９８日目に採血した。Ｒ３２ｔｅｔ３２、ＲＬＦおよびＨＢｓ抗原に対する抗体を測定した。
血清学的方法：
抗Ｒ３２ｔｅｔ３２および抗ＲＬＦ抗体価を、マイクロプレート上にコートしたＲ３２ｔｅｔ３２およびＲＬＦ抗体をそれぞれ用いたＥＬＩＳＡにより測定する。プレートをつぎに試験する血清サンプル（１：１０から初めて２倍連続希釈１２回）とともに培養する。サル抗体をビオチニル化抗ヒトＩｇ、続いてストレプタビジン：ビオチニル化ホースラディッシュペルオキシダーゼコンプレックスおよびオルトフェニレンジアミン／Ｈ２Ｏ２により検出する。光学密度を４９０ｎｍで測定する。力価を光学密度１．０（最大結合の５０％）に対応する希釈度の逆数として表わす。各グループに関して、力価の等比中項（ＧＭＴ）を計算する。抗ＨＢｓ抗体価をHollingerの式（Hollingerら、１９８２）にしたがって計算し、ｍＩＵ／ｍｌで表わす。
結果
抗ＣＳＰ応答：
（ＲＴＳ，Ｓ）ワクチンはＲ３２ｔｅｔ３２およびＲＬＦ抗原の両方に対して５匹のサル全てにおいて正の応答を誘起した。著しい追加抗原刺激の効果は２回目の免疫化の１４日後（４２日目）に観察される。次に抗体価が３回目の免疫化までゆっくり減少するのが観察された。力価はサルＪｏ３５２の抗ＲＬＦの場合以外は３回目の免疫化の１４日後（９８日）に再び増加した。
３回目の免疫化の後（９８日）得られた抗Ｒ３２ｔｅｔ３２力価はしかし２回目の免疫化後（４２日）に観察されたものよりも高くない。
抗ＲＬＦ応答の場合(サルＪｏ３５３を除く)、３回目の免疫化の後（９８日）、２回目の免疫化後（４２日）のレベルにくらべて力価の増加が観察された。
抗ＨＢ応答：
全てのサルは免疫化の２回目（４２日）および３回目（９８日）の後著しい追加抗原刺激の効果に関する抗ＨＢｓ応答を示した。
【００６５】
（ＲＴＳ、Ｓ）粒子に対して得られた抗体の生物学的活性
（ＲＴＳ、Ｓ）ワクチンにより誘起された抗体の生物学的機能の測定値として、プールしたマウスおよび個々のさる血清をスポロゾイト侵入阻止（Inhibition of Sporozoite Invation（ＩＳＩ））検定により試験した（Hollingdaleら、１９８４）。この検定は熱帯熱マラリア原虫スポロゾイトによる人肝癌細胞系の
in vitroでの侵入を阻止する抗ＣＳＰ抗体の能力を測定するものでる。
結果
この実験の結果を第１表および第２表に示す。ＩＳＩ測定値を免疫前の対照血清の活性を抑制０％とした相対的な抑制（％）で表わす。参考のために、試験した血清の抗Ｒ３２ｔｅｔ３２およびＲＬＦ抗体価も含める。第１表は試験した全てのマウス血清が非常に強いＩＳＩ活性を有することを示す。第２表は全ての５匹のサルは対応する免疫血清に比べて９８日目に非常に強いＩＳＩ活性を有することを示す。
結論
（ＲＴＳ、Ｓ）粒子は、マウスおよびサルの両方においてＣＳＰの繰り返しおよび非繰り返しエピトープに対しておよび、ＨＢｓＡｇキャリアーのＳ蛋白質に対して高い抗体応答を誘起する。
マウスにおける一次抗体応答は３Ｄ−ＭＰＬの存在により向上する。
腹腔内注射の後得られた抗体価は、皮下経路による免疫価の後得られたものよりも高い。
２種の動物において誘記された抗体は、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイトによる培養された人肝癌細胞の侵入を効果的に予防した。
【００６６】
【表２】
2007209343.tif 000003
【００６７】
【表３】
2007209343.tif 000004
【００６８】
引例
（１）  ハンフォード・エヌ、カベゾン．ティー、コロー・ビー（Ｈａｎｆｏｒｄ  Ｎ，  Ｃａｂｅｚｏｎ  Ｔ，  Ｃｏｌａｕ  Ｂ）ら、「コンストラクション・アンド・キャラクタライゼーション・オブ・ア・サッカロミセス・セレビシエ・ストレイン（ＲＩＴ４３７６）エクスプレッシング．ヘパティティスＢサーフェイス・アンチゲン」（”Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｔｒａｉｎ（ＲＩＴ４３７６）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ＢＳｕｒｆａｃｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ”），  Ｐｏｓｔｇｒａｄ  Ｍｅｄ  Ｊ  ６３，Ｓｕｐｐ．２：６５−７０，１９８７
（２）  ジェイコブズ・イー、ルトガーズ・ティー、ボート・ピー（Ｊａｃｏｂｓ  Ｅ，  Ｒｕｔｇｅｒｓ  Ｔ，  Ｖｏｅｔ  Ｐ）ら、「シマルタネアス・シンセシス・アンド・アセンブリ・オブ・ベリアス．ヘパティティスＢサーフェイス．プロテインズ・イン・サッカロミセス・セレビシエ」（”Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  Ｖａｒｉｏｕｓ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ”），  Ｇｅｎｅ  ８０：２７９−２９１，１９８９
（３）  ビーラ・ジェイおよびメシング・ジェイ（Ｖｉｅｉｒａ  Ｊ  ａｎｄ  Ｍｅｓｓｉｎｇ  Ｊ）、「ｐＵＣプラスミズ、アンＭ１３ｍｐ−デライブド・システム・フォア・インサーション・ミュータゲネシス．アンド．シーケンシング・ウィズ・シンセティック．ユニバーサル・プライマーズ」（”Ｔｈｅ  ｐＵＣ  ｐｌａｓｍｉｄｓ，ａｎ  Ｍ１３ｍｐ７−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒｓ”），Ｇｅｎｅ  １９：２５９−２６８，１９８２
（４）  ジュニアウクス（Ｊｕｎｉａｕｘ）Ｅｍｂｏ  Ｊ  １：１１２５−１１３１，１９８２．
（５）  ヒンネン・エイ、ヒックス・ジェイビイおよびフィンク・ジイアール（Ｈｉｎｎｅｎ  Ａ，  Ｈｉｃｋｓ  ＪＢａｎｄ  Ｆｉｎｋ  ＧＲ）、「トランスフォーメーション・オブ・イースト」（”Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ”），  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７５：１９２９−１９３３，１９８０．
（６）  ブローチ・ジェイアール、ストラザン・ジェイエヌおよびヒックス・ジェイビイ（Ｂｒｏａｃｈ  ＪＲ，  Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ  ＪＮ，  ａｎｄ  Ｈｉｃｋｓ  ＪＢ）、「トランスフォーメーション・イン・イースト・デベロプメント・オブ・ア・ハイブリッド・クローニング・ベクター・アンド・アイソレーション・オブ・ザ・ＣＡＮ１ジーン」（”Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＡＮ１  Ｇｅｎｅ”），  Ｇｅｎｅ  ８：１２１−１３３，  １９７９
（７）  ツァン・エイチ（Ｚｈａｎｇ  Ｈ）ら、「ダブル・ストランデッド・ＳＤＮＡシーケンシング・アズ・ア・チョイス・フォア・ＤＮＡシーケンシング」、（”Ｄｏｕｂｌｅ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＳＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｓ  ａ  Ｃｈｏｉｃｅ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ”）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６：１２２０，１９８８
（８）  ダーム・ジェイビイ、ウィリアムズ・ジェイエル、マッカッチャン．ティーエフ（Ｄａｍｅ  ＪＢ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＪＬ，  ＭｃＣｕｔｃｈａｎ  ＴＦ）ら、「ストラクチャー・オブ・ザ・ジーン・エンコーディング・ジ・イムノドミナント・サーフェイス・アンチゲン・オン・ザ・スポロゾイツ・オブ・ザ・ヒューマン・マラリア・パラサイト・プラスモジウム・ファルシパラン」（”Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ  Ｓｕｒｆａｃｅ  
Ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｍａｌａｒｉａ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ”）  Ｓｃｉｎｅｎｃｅ  ２２５：５９３−５９９，１９８４．
（９）  バレンツェラ・ピー、グレイ・ピー、キロガ・エム（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  Ｐ，  Ｇｒａｙ  Ｐ，  Ｑｕｉｒｏｇａ  Ｍ）ら、「ヌクレオタイド・シーケンシズ・オブ・ザ・ジーン・コーディング・フォア・ザ・メイジャー・プロテイン・オブ・ヘパティティスＢバイラス・サーフェイス・アンチゲン」（”Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍａｊｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ”）  Ｎａｔｕｒｅ  ２８０：８１５−８１９，１９７９．
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】第１図（Ａ）Ｓ発現カセットおよび（Ｂ）ＲＴＳ発現カセットの制限エンドヌクレアーゼ地図を示す。各コーディング配列の範囲を黒色バーで示す。
【図２】プラスミドｐＲＩＴ１３０３４の構築を示す第２図である。Ｘｈｏｌエンドヌクレアーゼで消化し、遊離末端と定住Ｔｙエレメントとの相同性により酵母染色体に組み込むためのＳ発現カセットを含む８．５ｋｂ直線状ＤＮＡフラグメントを遊離させる。
【図３】ｐＲＩＴ１３０３４由来の８．５ｋｂ直線状Ｘｈｏｌフラグメントの制限地図を示す第３図である。該直線状フラグメントは、Ｓ発現カセットと共に形質転換された酵母細胞を選択するためのＵＲＡ３およびＣＵＰ１遺伝子を有する。
【図４】ＲＴＳ発現カセットの構築およびプラスミドＹｅｐ１３におけるクローニングを示す第４図である。
【図５−１】ＲＴＳ発現カセットのヌクレオチド配列およびＲＴＳ−ＨＢｓＡｇハイブリッドタンパク質の推定翻訳産物を示す第５図である。ＴＤＨ３  ＡＴＧコドンより開始する翻訳産物をＤＮＡ配列の下に示す。
【図５−２】第５図の続きを示す。
【図５−３】第５図の続きを示す。
【図５−４】第５図の続きを示す。
【図５−５】第５図の続きを示す。
【図６】プラスミドｐＲＩＴ１３５３９の構築を示す第６図である。ＢｇｌＩＩエンドヌクレアーゼで消化し、遊離末端と定住Ｔｙエレメントとの相同性により酵母染色体に組み込むためのＲＴＳ発現カセットを有する６．８ｋｂ直線状ＤＮＡフラングメントを遊離させる。
【図７】ｐＲＩＴ１３５３９由来の６．８ｋｂ直線状ＢｇｌＩＩフラグメントの制限地図を示す第７図である。該直線状フラグメントは、ＲＴＳ発現カセットと共に形質転換された酵母細胞を選択するためのＬＥＵ２遺伝子を有する。
【図８】ＲＩＴ４３８３より調製した細胞不含抽出物のＣｓＣｌ密度分析を示す第８図である。フラクションをＨＢｓＡｇに対して特異的なラジオイムノアッセイ（ＡＵＳＲＩＡ）およびＲＴＳ−特異的ＥＬＩＳＡにより分析した。上部のパネルは、抗−Ｓ  Ｍａｂを用いるフラクションのイムノブロット分析結果を示す。ピークフラクションの浮遊密度（ｒｈｏ）をその屈折率の測定値により算定した。
【図９−１】ＲＴＳ＊発現カセットのヌクレオチド配列およびハイブリッドタンパク質の推定翻訳産物を示す第９図である。
【図９−２】第９図の続きを示す。
【図９−３】第９図の続きを示す。
【図９−４】第９図の続きを示す。
【図９−５】第９図の続きを示す。
【図９−６】第９図の続きを示す。
【図９−７】第９図の続きを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図９−７】
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