(57)【要約】【課題】分解が困難な芳香族炭化水素を含む石油等の環境汚染物質の微生物による新規な分解方法を提供し、石油汚染環境等に投入することにより安全かつ安価に広範囲の種類の芳香族化合物を含む環境汚染物質を分解でき、効率的は環境浄化を行う.【解決手段】スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．ＫＡ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４４）及びシュードモナス  フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＩＰ０１（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５９４）を用いることを特徴とする環境汚染物質の分解方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．ＫＡ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４４）及びシュードモナス  フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＩＰ０１（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５９４）を用いることを特徴とする環境汚染物質の分解方法。
【請求項２】
環境汚染物質が石油由来物質である請求項１記載の環境汚染物質の分解方法。
【請求項３】
石油由来汚染物質が芳香族化合物である請求項２記載の環境汚染物質の分解方法。
【請求項４】
芳香族化合物がベンゼン、トルエン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、フェナントレン、フルオレン、アントラセン、フルオランテン、ナフタレン、アセトナフチレン、アセトナフテン、ピレン、ポリ臭化ジフェニルエーテルである請求項３記載の環境汚染物質の分解方法。
【請求項５】
石油由来物質がアルカンである請求項２記載の環境汚染物質の分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は石油等の環境汚染物質、特に芳香族炭化水素の微生物を用いた分解方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発ガン性・変異原性を有する環境汚染物質として知られている芳香族化合物の中にはベンゼン、トルエン、キシレンなど揮発性が高く、大気中に放出された場合には人体に取り込まれやすいものや、多環性芳香族炭化水素（ＰＡＨｓ）など、生分解が難しいものがある。原油の流出事故時やディーゼル自動車排ガスとして芳香族化合物汚染が問題になる場合、汚染物質は単一でない場合がほとんどで、効率的に分解除去することは非常に困難である。単環から複素環までのさまざまな芳香族化合物を短期間に分解する微生物や、それを用いた環境浄化の方法の確立が求められている。
【０００３】
特許文献１には、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属し炭化水素分解能を有し、炭化水素を唯一の炭素源として海洋環境中で良好な生育を示すシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．ＡＪ１−１−１株、及び炭化水素で汚染された海洋環境を、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属し炭化水素分解能を有し、炭化水素を唯一の炭素源として海洋環境中で良好な生育を示す微生物で処理することを特徴とする海洋汚染処理方法が開示されている。
【０００４】
特許文献２には、人体に安全で、処理コストが安価で済み、これまで微生物処理で脱臭困難であった複数の芳香族有機化合物を高濃度に含む混合悪臭ガスにも対処できる微生物脱臭法として、トルエン分解能を有する微生物Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＴＯＬ−１、キシレン分解能を有する微生物Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＸＹＬ−９０９、メチルエチルケトン分解能を有する微生物Ｇｒａｐｈｉｕｍ  ｓｐ．ＭＥＫ−５および／またはメチルエチルケトン分解能を有する微生物Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＭＥＫ−８を用いてトルエン、キシレンおよび／またはメチルエチルケトンを分解することを特徴とする脱臭法が開示されている。
【０００５】
特許文献３には、微生物がリン５ｐｐｍ以下および窒素５０ｐｐｍ以下の条件で生育可能なＲａｓｔｏｎｉａ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属およびＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ属に属する低栄養性微生物及び該低栄養性微生物で石油汚染物質、石油汚染土壌または製油所排水、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族化合物汚染物質、例えば芳香族化合物汚染土壌または芳香族化合物を含有する排水等を処理する方法が開示されている。
【０００６】
特許文献４には、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属に属する微生物であって、特にＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＡＮ１７ＡまたはＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＡＮ１７Ｐを用いて、環境汚染物質、特に石油で汚染された環境を処理することを特徴とする汚染環境の浄化方法が開示されている。
しかし、これら微生物の芳香族化合物の分解能は十分ではなく、新規の微生物による環境汚染浄化方法が求められている。
【特許文献１】特開平７−２３７７３号公報
【特許文献２】特開平１１−１５５５６０号公報
【特許文献３】特開平１１−２６６８５８号公報
【特許文献４】特開２００４−１５９５９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように、新規の微生物による環境汚染浄化方法が求められている。従って、本発明の課題は分解が困難な芳香族炭化水素を含む石油等の環境汚染物質の微生物による新規な分解方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討の結果、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．ＫＡ１とシュードモナス  フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＩＰ０１を併用することにより、広範囲の種類の芳香族化合物及びそれらを含む石油等の環境汚染物質を分解することを見いだし、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明の第１は、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．ＫＡ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４４）及びシュードモナス  フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＩＰ０１（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５９４）を用いることを特徴とする環境汚染物質の分解方法に関する。
本発明の第２は、環境汚染物質が石油由来物質である第１の発明に記載の環境汚染物質の分解方法に関する。本発明の第３は、石油由来汚染物質が芳香族化合物である第２の発明に記載の環境汚染物質の分解方法に関する。
本発明の第４は、芳香族化合物がベンゼン、トルエン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、フェナントレン、フルオレン、アントラセン、フルオランテン、ナフタレン、アセトナフチレン、アセトナフテン、ピレン、ポリ臭化ジフェニルエーテルである第３の発明に記載の環境汚染物質の分解方法に関する。
本発明の第５は、石油由来物質がアルカンである第２の発明に記載の環境汚染物質の分解方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．ＫＡ１株及びシュードモナス  フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＩＰ０１株の２株を組み合わせて石油汚染環境等に投入すれば、安全かつ安価に広範囲の種類の芳香族化合物を含む環境汚染物質を分解でき、効率的な環境浄化を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．ＫＡ１は、カルバゾール資化菌として取得され、これを用いた四塩素化ダイオキシンを含む芳香族化合物分解方法が本願出願人により特願２００４−１５７０６７として出願されている。本菌は独立行政法人産業技術総合研究所
特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４４である。
【００１２】
一方、シュードモナス  フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＩＰ０１はクメン分解菌として取得され、本菌のクメンを２−ヒドロキシ−６−オキソ−７−メチルオクタ−２，４−ジエン酸に分解する遺伝子のクローニング、塩基配列が報告されている（Ｈ．Ａｏｋｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ
Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．８１，Ｎｏ．３，１８７−１９６（１９９６））。本菌は独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−２０５９４である。
【００１３】
上記ＫＡ１は多環芳香族化合物のうち、ナフタレン、フルオレンなど２〜３環を中心に、４環以下の化合物を分解できる。また、ベンゼン、トルエンのような揮発性の高い芳香族化合物に対しても優れた分解活性を有する。一方、ＩＰ０１は単環の芳香族化合物全般に対し強い分解活性を有し、特に前記のベンゼン、トルエンのほか、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレンについて優れた分解活性を有する。また、ＫＡ１、ＩＰ０１ともにノルマルアルカン類も分解することが明らかとなった。これら２株を組み合わせて油汚染環境等に投入すれば、４環以下の芳香族化合物について安全安価で効率的な環境浄化を行うことができる。また、ＫＡ１は難燃剤として多用され、近年低濃度で甲状腺ホルモンや神経の発達を阻害する可能性が指摘されているポリ臭化ジフェニルエーテルも分解することができる。
【００１４】
ＫＡ１の培養に用いる培地は、これらの微生物が良好に増殖し，かつカルバゾール分解能や多環芳香族化合物分解能が発現できる培地であれば、いかなる組成でもよい。炭素源としては、カルバゾールを唯一の炭素源・エネルギー源として用いることができるが，多環芳香族化合物を含む原油，灯油，軽油、重油等の石油製品、船舶や工場からの流出油なども利用することができる。さらに、炭水化物、ピルビン酸のような有機酸，廃糖蜜なども用いることができる。また、疎水性の芳香族化合物や石油類を微生物によって分解され易くするため、これらにツイーン８０のような界面活性剤を添加し，さらに超音波発生器にて乳化・分解させる場合もある。芳香族化合物を微量のエタノールやアセトンに溶解して添加することもできる。窒素源としては微生物に利用される有機・無機化合物であればよい。有機窒素源としては肉エキス、ペプトン、酵母エキス、コンスティープリカー、脱脂大豆、カゼインなどが、無機窒素源としてアンモニウム塩、硝酸塩、尿素などが利用できる。無機塩類としては、各種リン酸塩，塩化ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、カルシウム、亜鉛、モリブデンなどを添加してもよい。また、増殖因子として、ビタミン類、アミノ酸類があり、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、コンスティープリカーなど前記栄養因子を含有する天然有機栄養物を添加してもよい。
【００１５】
ＫＡ１の培養は好気的条件、例えば振盪培養法、通気攪拌培養法が好適であるが、適宜液体静置培養を組み合わせてもよいし、また液体静置培養でもよい。培地のｐＨは５−９、好ましくは６−８であればよい。培養温度は１５−３７℃、好ましくは２５−３５℃であればよい。
【００１６】
ＩＰ０１の培養に用いる培地は、これらの微生物が良好に増殖し，かつクメン分解能や単環芳香族化合物分解能が発現できる培地であれば、いかなる組成でもよい。炭素源としては、クメンを唯一の炭素源・エネルギー源として用いることができるが，単環芳香族化合物を含む原油，灯油，軽油、重油等の石油製品、船舶や工場からの流出油なども利用することができる。さらに、炭水化物、ピルビン酸のような有機酸，廃糖蜜なども用いることができる。また、疎水性の芳香族化合物や石油類を微生物によって分解され易くするため、これらにツイーン８０のような界面活性剤を添加し，さらに超音波発生器にて乳化・分解させる場合もある。芳香族化合物を微量のエタノールやアセトンに溶解して添加することもできる。窒素源としては微生物に利用される有機・無機化合物であればよい。有機窒素源としては肉エキス、ペプトン、酵母エキス、コンスティープリカー、脱脂大豆、カゼインなどが、無機窒素源としてアンモニウム塩、硝酸塩、尿素などが利用できる。無機塩類としては、各種リン酸塩，塩化ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、カルシウム、亜鉛、モリブデンなどを添加してもよい。また、増殖因子として、ビタミン類、アミノ酸類があり、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、コンスティープリカーなど前記栄養因子を含有する天然有機栄養物を添加してもよい。
【００１７】
ＩＰ０１の培養は好気的条件、例えば振盪培養法、通気攪拌培養法が好適であるが、適宜液体静置培養を組み合わせてもよいし、また液体静置培養でもよい。培地のｐＨは５−９、好ましくは６−８であればよい。培養温度は１５−３７℃、好ましくは２５−３５℃であればよい。
【実施例１】
【００１８】
（ＫＡ１株による多環芳香族化合物の分解）
カルバゾール０．０５％を単一の炭素源とする液体培地でスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．ＫＡ１株を３０℃、２４時間振盪培養し、遠心集菌した。得られた菌体を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２度洗浄後、同緩衝液１ｍｌにＯＤ６００＝２．０となるよう懸濁し、多環芳香族化合物の混合液を１０μｌ添加、密栓して３０℃にて振盪した。３日後に残存基質をジクロロメタンを用いて抽出し、それぞれの残存量をＧＣ−ＭＳで定量した。その結果、ＫＡ１株は添加した１６種のうち、フルオレン、フェナントレン、アントラセン、フルオランテンに対し顕著な分解作用を示した。残存率より算出した分解率を表１に示す。また、ナフタレン、アセナフチレン、アセナフテン、ピレンの分解にも有効であった。
【００１９】
【表１】
2007215403.tif 000002
【実施例２】
【００２０】
（ベンゼン、トルエン、キシレン（略してＢＴＸという）の分解）
カルバゾール０．０５％を単一の炭素源とする液体培地でＫＡ１株を３０℃、２４時間振盪培養し、遠心集菌した。得られた菌体を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２度洗浄後、同緩衝液１ｍｌにＯＤ６００＝１．５となるよう懸濁した。このように調製したＫＡ１株懸濁液５ｍｌに、ベンゼン、トルエン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレンの１％ＤＭＳＯ溶液を酒類ずつ添加、密栓して３０℃にて振盪した。２４時間後、反応液をジクロロメタンで抽出し、それぞれの基質の残量量をＧＣ−ＭＳにて定量した。残存率より算出した分解率を表２に示す。
【００２１】
【表２】
2007215403.tif 000003
【００２２】
ＫＡ１株はベンゼン、トルエンについて顕著な分解作用を示し、ｏ−、ｍ−、ｐ−キシレンについても分解することがわかった。
【実施例３】
【００２３】
（ＩＰ０１株によるＢＴＸの分解）
クメン０．０５％を単一の炭素源とする液体培地でシュードモナス  フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＩＰ０１株を３０℃、４８時間振盪培養し、遠心集菌した。得られた菌体を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２度洗浄後、同緩衝液１ｍｌにＯＤ６００＝２．０となるよう懸濁し、それぞれ５μｌのベンゼン、トルエン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレンの１％ＤＭＳＯ溶液を１種類ずつ添加、密栓して３０℃にて振盪した。２４時間後に残存基質をジクロロメタンを用いて抽出し、それぞれの残存量をＧＣ−ＭＳで定量した。残存率より算出した分解率を表３に示す。ＩＰ０１株はベンゼン、トルエンの他、ｍ−、ｐ−キシレンにも顕著な分解活性を示し、特に分解が難しいとされるｏ−キシレンに対しても分解活性が高いことがわかった。
【００２４】
【表３】
2007215403.tif 000004
【実施例４】
【００２５】
（ＫＡ１株を用いたポリ臭化ジフェニルエーテルの分解）
カルバゾール０．０５％を単一の炭素源とする液体培地でＫＡ１株を３０℃、２４時間振盪培養し、遠心集菌した。得られた菌体を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２度洗浄後、同緩衝液１ｍｌにＯＤ６００＝１．５となるよう懸濁した。このように調製したＫＡ１株懸濁液１ｍｌに４，４’−ジブロモジフェニルエーテルを５０μｇ添加、密栓下で３０℃にて１８時間振盪後、酢酸エチル５ｍｌにて抽出した。この５μｌにＮ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド（ＭＳＴＦＡ）を５μｌ添加し、７０℃で２０分間保持し、生成物のトリメチルシリル化を行い、この１μｌをＧＣ−ＭＳにて分析した。この結果、４−ブロモカテコールのトリメチルシリル化誘導体の生成が確認され、ＫＡ１株はポリ臭化ジフェニルエーテルを分解する能力を有することがわかった。
【実施例５】
【００２６】
（液相中の軽油の分解）
実施例２で調製したＫＡ１株の菌体、実施例３で調製したＩＰ０１株の菌体それぞれ１ｍｌをベンゼン、トルエン、キシレンを各々１％添加した軽油１０μｌと混合し、密閉バイアル中で３０℃、２４時間インキュベートした。その後酢酸エチルを用いて反応液を全量抽出し、ＢＴＸ混合軽油の残存量をＧＣ−ＭＳを用いて定量した。全炭化水素（Ｔｏｔａｌ  Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ  Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ、以下ＴＰＨと略す）は、Ｃ１〜Ｃ２０の直鎖アルカン類の合計値を用いた。残存量から算出した分解率を表４に示す。それぞれの菌株は実施例１及び２の結果から予想される芳香族炭化水素類のほか、軽油中のノルマルアルカン類も分解し、ＴＰＨを効率的に減少させることがわかった。
【００２７】
【表４】
2007215403.tif 000005
【実施例６】
【００２８】
（実汚染土の分解）
実施例２で調製したＫＡ１株の菌体、実施例３で調製したＩＰ０１株の菌体それぞれ１ｍｌを軽油およびガソリン含有実汚染土１ｇに接種し、密閉バイアル中で３０℃、７日間インキュベートした。その後、土壌を全量、四塩化炭素で抽出し、ＦＴ−ＩＲによりＴＰＨの残存量を定量した。コントロールにはオートクレーブ処理した死菌を用いた。ＫＡ１株、およびＩＰ０１株による処理後の実汚染土１ｇ当たりのＴＰＨ（ｍｇ）を表５に示す。残存量から算出したＴＰＨの分解率はＩＰ０１株で８１．６％（軽油）、６７．７％（ガソリン）、ＫＡ１株で６５．０％（軽油）、５２．４％（ガソリン）であった。
【００２９】
【表５】
2007215403.tif 000006