(57)【要約】【課題】本発明は、高温や強アルカリといった様々な過酷環境下でも酵素の活性を安定化するための技術と、この様な過酷環境下でも活性を示す酵素組成物であり環境浄化や化学合成等に使用できるものを提供することを目的とする。【解決手段】本発明に係る酵素活性の安定化方法は、酵素にポリグルタミン酸を添加することを特徴とする。また、本発明の酵素組成物は、酵素とポリグルタミン酸を含有することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素にポリグルタミン酸を添加することを特徴とする酵素活性の安定化方法。
【請求項２】
酵素とポリグルタミン酸を含有することを特徴とする酵素組成物。
【請求項３】
酵素に対して５質量％以上のポリグルタミン酸を含有する請求項２に記載の酵素組成物。
【請求項４】
ポリグルタミン酸を構成するグルタミン酸におけるＬ−グルタミン酸の割合が９０％以上である請求項２または３に記載の酵素組成物。
【請求項５】
ポリグルタミン酸の平均分子質量が２００ｋＤａｌ以上である請求項２〜４のいずれかに記載の酵素組成物。
【請求項６】
請求項２〜５のいずれかに記載の酵素組成物を使用することを特徴とする環境浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素活性を安定化する方法と、酵素活性が安定化された酵素組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年のバイオ技術の進展を支えているものの一つに、酵素と呼ばれるタンパク質性の生体触媒が知られている。その潜在的な有用性は、ヒトの健康状態を追跡するセンサー素子、有用物質の効率的な合成に必須の反応触媒、環境汚染のモニターリングや汚染物質分解を可能にする環境修復材料など、極めて広範囲に及ぶ。
【０００３】
例えば、近年、工業分野等で多量に用いられ、微量でも環境や生体に悪影響を与え得る有害化合物を、酵素で処理する技術が研究されている。酵素による有害化合物の処理は、吸引吸着法などの物理的方法より穏和な条件で安価に実施でき、また、微生物による処理よりも環境へ悪影響を与える可能性が低い。酵素はアミノ酸重合物であるため、その役割を終えた後は速やかに分解されることによる。この様に、２１世紀に入り、生物と環境に優しい酵素の適用分野や用途の拡大が強く望まれている。
【０００４】
しかしその一方で、酵素は、温度やｐＨの変動、タンパク質分解酵素の存在など、環境中に存在する様々な変性要因に対して感受性が高い。また、酵素は一般的に熱に弱いことから、低温で保存される場合が多い。よって、保存のための凍結操作と使用時の融解操作を繰り返し受ける場合がある。これら様々な要因による活性の低下や寿命の短さが、酵素の利用範囲の制限や使用効率の低さに繋がっている。
【０００５】
そこで高温下や有機溶媒中など、通常の酵素が失活してしまう条件下で酵素反応を行なうための技術が検討されている。例えば特許文献１には、酵素の表面を乳化剤やその他の両性物質で被覆修飾することによって、酵素の耐熱性と耐有機溶媒性を高める技術が記載されている。当該特許文献の実施例では、加水分解酵素であるリパーゼの安定性を向上できたことが示されている。
【０００６】
しかし、当該技術では酵素の保護に人工化合物が用いられており、環境中で当該技術を用いる場合、かかる人工化合物が環境汚染の原因となるおそれがある。
【０００７】
そこで、酵素を改質して活性の安定化を図るのではなく、高温下など過酷な条件でも活性を示す酵素自体を単離する方法がある。かかる酵素であれば、過酷な自然環境下でも作用を発揮できる可能性がある。例えば特許文献２には、高温でも生育できる超好熱始原菌由来の超耐熱性リガーゼが開示されている。
【０００８】
しかし、様々な環境下でも活性を維持することができ、且つ所望の活性を有する酵素のスクリーニングは難しく、多大な時間と費用を費やすことは避けられない。また、過酷環境下でも生存可能な極限環境微生物の培養は概して困難であり、所望の酵素が見出されたとしても十分な量を確保することはさらに難しい。
【０００９】
ところで、近年における健康ブームにより納豆に注目が集まっており、納豆の糸に関する研究も進んでいる。例えば、納豆の糸の主成分であるポリグルタミン酸は、カルシウムの腸管吸収を増強する作用があることから骨粗鬆症の予防薬としての用途が見出されており、また、生分解性であることから環境に優しい新素材としての利用も期待されている。さらにポリグルタミン酸は優れた保水作用を有することから、化粧料としても利用されている（特許文献３）。
【特許文献１】特開平６−１１３８４７号公報（特許請求の範囲、実施例）
【特許文献２】特開２０００−３０８４９４号公報（特許請求の範囲）
【特許文献３】特開２０００−７２６５２号公報（特許請求の範囲）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述した様に、従来、高温条件下においても酵素の活性を安定化する技術や、過酷条件下でも活性を示す酵素は知られていた。しかし、環境の浄化にこれら酵素を用いる場合には、依然として問題が存在する。
【００１１】
即ち、汚染土壌や汚染水では、ｐＨをはじめとする様々な環境ファクターが本来あるべき姿を逸脱して異常化している。その結果、生体触媒である酵素は変性し、その活性が極度に低下してしまう。また、高ｐＨ下で生育できる好アルカリ細菌等から過酷環境下でも活性を発揮し得る酵素をスクリーニングすることも考えられるが、所望の活性を示す酵素が得られるとは限らない。さらに、過酷環境下でも生存可能な極限環境微生物の培養は概して煩雑で、所望の酵素が見出されたとしても十分量確保することは困難とされている。
【００１２】
そこで本発明が解決すべき課題は、高温や強アルカリといった様々な過酷環境下でも酵素の活性を安定化するための技術と、この様な過酷環境下でも活性を示す酵素組成物であり、微量物質の検出、環境浄化、および化学合成等に広く使用できるものを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、過酷条件下でも既存酵素の活性を安定化するための条件につき鋭意研究を重ねた。その結果、納豆の糸の主成分であり高い安全性と水溶性を備えたポリグルタミン酸を添加すれば酵素活性の安定性を顕著に向上できることを見出して、本発明を完成した。
【００１４】
即ち、本発明に係る酵素活性の安定化方法は、酵素にポリグルタミン酸を添加することを特徴とする。
【００１５】
また、本発明の酵素組成物は、酵素とポリグルタミン酸を含有することを特徴とする。
【００１６】
上記酵素組成物としては、酵素に対して５質量％以上のポリグルタミン酸を含有するものが好適である。酵素に対して十分量のポリグルタミン酸を添加することによって、活性を安定して発揮せしめることができる。また、ポリグルタミン酸を構成するグルタミン酸におけるＬ−グルタミン酸の割合を９０％以上とすることや、平均分子質量が２００ｋＤａｌ以上のポリグルタミン酸を用いることも好ましい態様である。これらポリグルタミン酸は、特に優れた酵素活性の安定化作用を有するからである。
【００１７】
本発明の環境浄化方法は、上記酵素組成物を使用することを特徴とする。本発明の酵素組成物は、従来の酵素では活性を発揮できなかった環境下においても活性を示し、有害化合物を分解等することができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係る酵素活性の安定化方法によれば、高温や高ｐＨ、プロテアーゼの存在といった様々な過酷環境下や、凍結と融解の繰り返しといった過酷な使用条件下においても酵素の活性を安定的に発揮せしめることができる。また、本発明の酵素組成物は同様の過酷な条件下や使用条件下でも活性を示し、特に従来の一般的な酵素ではその効果を発揮できなかった環境中でも有害化合物を分解等できることから、産業上極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明に係る酵素活性の安定化方法は、酵素にポリグルタミン酸を添加することを特徴とする。また、本発明の酵素組成物は、酵素とポリグルタミン酸を含有する。
【００２０】
本発明によりその活性を安定化する酵素の種類は、特に制限されない。例えば、難分解性化合物の水溶性を高める酸化酵素や分解に係るオキシゲナーゼ、化学反応に有用な転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼなどを挙げることができる。また、遺伝子工学分野で高い利用価値が知られているものの、極端な不安定性のために低温設備をはじめとする特殊な反応環境を要し、現状では利用範囲に制限のあるＤＮＡリガーゼもこの対象となる。
【００２１】
本発明で用いるポリグルタミン酸（以下、「ＰＧＡ」という）は、下記構造を主要骨格とするものである。
【化１】
2007097586.tif 000002
【００２２】
ＰＧＡは、酵素や構造タンパク質と同じく生物が作るアミノ酸の重合物であり、酵素と類似の物理化学性を備えている。他方、基本的には酵素のような触媒機能を備えておらず、その主骨格はむしろ人工ナイロンの構造に類似している。ＰＧＡには、素材としての強靱性や汎用性に加え、納豆の糸の主成分であることからも分かる様に食べても安心である上に、微生物による分解が容易であることから環境にも優しい生分解性バイオナイロンとして大きな期待が寄せられている。
【００２３】
但し、本発明で用いるＰＧＡは、上記構造を有するもののみに限定されるものではない。例えば、上記化合物はγ−ＰＧＡであるが、一部α−カルボン酸でアミド結合を形成しているものであってもよく、また、側鎖で架橋されているものや側鎖カルボン酸の全部または一部が塩やエステルとなっているもの、一部のグルタミン酸が他のアミノ酸により置換されているものなど、γ−ＰＧＡが主要骨格であるといえるものであれば本発明で使用することができる。但し、本発明のＰＧＡは、全てグルタミン酸および／またはその誘導体で構成されていることが好ましい。また、ＰＧＡを構成するグルタミン酸は、Ｄ型でもＬ型でもよい。
【００２４】
但し、本発明のＰＧＡを構成するグルタミン酸におけるＬ−グルタミン酸（以下、グルタミン酸を「Ｇｌｕ」という）の割合は、９０％以上が好適である。高い割合でＬ−Ｇｌｕを含むＰＧＡは保水性や構造上の規則性が高く、生細胞や酵素を外部環境から保護する作用に優れることから、これらの機能性維持に格段の効果を示す。当該値としては、９５％以上がより好ましく、９８％以上がさらに好ましく、特に、実質的に１００％のＧｌｕがＬ−Ｇｌｕであることが好ましい。ここで「実質的に１００％」とは、下記の測定方法において、Ｄ−Ｇｌｕの明確なピークが検出できないことをいう。
【００２５】
Ｌ−Ｇｌｕの割合は、例えば以下の方法により測定できる。先ず、測定対象であるＰＧＡを分取し、６Ｎ塩酸に溶解した上で１０５℃、８時間程度の加水分解反応に供する。この際、ＰＧＡの主骨格はαアミド結合でなくγアミド結合を介するいわゆるポリイソペプチドであるため、ラセミ化され難い。得られた加水分解物に含まれるＧｌｕについて、キラル分割ＨＰＬＣにより解析し（M．Ashiuchiら，Appl．Environ．Microbiol．，Vol．70，p．4249-4255（2004年）を参照）、ＤＬ含有比を決定することによって、Ｌ−Ｇｌｕの割合を算出することができる。
【００２６】
ＰＧＡの平均分子質量は、２００ｋＤａｌ以上が好適である。基本的には、平均分子質量の増大に伴って酵素の保護効果が増大する傾向があり、２００ｌＤａｌ以上であれば十分に当該効果が期待できる。より好ましくは５００ｋＤａｌ以上、さらに好ましくは１０００ｋＤａｌ以上である。但し、本発明による酵素の保護効果は、Ｌ−Ｇｌｕ含有率によるところが大きく、その比率がやや低いもの（６０％程度）ならば、３８００ｋＤａｌ付近で優れた結果が期待できるのに対し、特に光学純度が優れたもの（１００％）であれば、平均分子質量１０００ｋＤａｌを確保することで良好な保護効果を発揮させることができる。
【００２７】
Ｇｌｕの平均分子質量の測定は、一般的に用いられているゲルパーミエーションＨＰＬＣ解析に加え、メチレンブルー染色によるＰＧＡの視覚化を伴うＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法や、アミド修飾剤を利用した化学的定量法（C．Parkら，J．Mol．Catal．B：Enzym．，Vol．35，p．128-133（2005年）参照）などを適用することができる。なお、ゲルパーミエーションＨＰＬＣ解析以外の方法では、１０００ｋＤａｌ以上の平均分子質量は測定限界を超える場合がある。
【００２８】
酵素に対するＰＧＡの添加量は、５質量％以上が好ましい。５質量％未満であると十分に酵素活性を安定化することができない場合があるからである。酵素活性の安定化効果は、ＰＧＡ量が増えるほど向上するので、より好ましくは１０質量％以上、さらに好ましくは３０質量％以上、特に好ましくは５０質量％以上とする。一方、ＰＧＡの量が酵素の６質量倍を超えると、酵素分子の大半がＰＧＡ内に封入された状態を形成し易くなり、見かけの酵素活性が低下するおそれがあるため、６質量倍以下とすることが好ましい。但し、ＰＧＡ添加量が増えるほど安定性は向上するので、酵素の種類や用途に応じて混合比を適宜検討するべきである。
【００２９】
ＰＧＡは、市販のものがあれば所望のものを購入して使用すればよいが、天然物から単離精製して用いることができる。例えば、納豆菌が産生するいわゆる「納豆の糸」から単離精製して用いてもよい。平均分子質量にして１０００ｋＤａｌを遥かに上回る超高分子ＰＧＡの調製としては、納豆菌の近縁で韓国の伝統的発酵食品であるスタータの製造で用いられる戦国醤菌を利用する方法がある（C．Parkら，J．Mol．Catal．B：Enzym．，Vol．35，p．128-133（2005年）参照）。戦国醤菌が作るＰＧＡを構成するＧｌｕのＤＬ比は、培地中の硫酸アンモニウム濃度によって変化する（同上論文参照）。また、市販のものや単離精製したものをさらに化学的手段や酵素により切断や修飾等したものも使用することができる。さらに、納豆菌以外でも、古細菌など種々の極限環境生物が産生するＰＧＡやその構造類似物を調製し、これを利用してもよい。
【００３０】
本発明組成物の形態は特に制限されず、酵素とＰＧＡを含む粉末状組成物であってもよいし、その溶液や懸濁液であってもよい。粉末状の組成物は、酵素とＰＧＡおよびその他の添加成分を単に混合するのみでもよいが、いったん溶液や懸濁液とした後に凍結乾燥してもよい。
【００３１】
本発明の酵素組成物は、微量物質の検出、環境浄化、化学合成等に使用できる。例えば、汚染土壌や汚染水にそのまま或いはその水溶液または懸濁液を散布したり投入すればよい。微量物質の検出や化学合成に利用する場合には、公知の酵素組成物の使用方法を適用することができる。但し、水溶液や懸濁液として使用する場合には、ＰＧＡ濃度が１０容量％を超えると粘性が過剰に上がることがあるので、適宜調整する。
【００３２】
上記方法により得られた本発明の酵素組成物は、高温や高ｐＨ下でも酵素活性が安定化されていることから取扱いがより容易になる。また、高塩環境下や有機溶媒中でも、さらに酵素阻害剤や酵素を分解してしまうプロテアーゼの存在下においても、酵素が保護されその活性が維持され得る。よって、本発明の酵素組成物は、従来の酵素が使用できなかった様な条件下でも使用が可能である。また、本発明の酵素組成物は、凍結と融解を繰り返した後でも酵素活性が維持されており、保存安定性に優れる。
【００３３】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例により制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００３４】
実施例１  温度に関する酵素活性の安定化実験
６０００Ｕ／ｍｇの高純度大腸菌リガーゼ（宝酒造社製）の６０Ｕ／μＬ標準溶液を１Ｕ／μＬまで希釈液で希釈し、ＰＧＡ（Ｌ−Ｇｌｕ含有割合：１００％、平均分子質量：１０００ｋＤａｌ）をリガーゼに対して０、６または６０質量％（溶液全体に対して０、０．００１または０．０１容量％）となる様に加えた。次に、各酵素溶液を４、１６、３０、３７、５０または７０℃で１０分間加熱した。その後、各酵素溶液の一部（１Ｕ相当分）をライゲーション反応液（２０μＬ）へ添加し、あらかじめ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断してある基質ＤＮＡベクターｐＵＣ１８（宝酒造社製）の連結反応を行なった。また、ネガティブコントロールとして、上記酵素溶液の代わりに同量の蒸留水を添加したものを用いた。希釈液とライゲーション反応液の組成は、下記に示す通りである。
【００３５】
希釈液
２０ｍＭ                              Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１ｍＭ                                ＥＤＴＡ
１０ｍＭ                              （ＮＨ4）2ＳＯ4
１ｍＭ                                ジチオスレイトール
リガーゼに対して０、６、６０質量％    ＰＧＡ
ライゲーション反応液
３０ｍＭ                              Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１．２ｍＭ                            ＥＤＴＡ
１０ｍＭ                              （ＮＨ4）2ＳＯ4
１ｍＭ                                ジチオスレイトール
４ｍＭ                                ＭｇＣｌ2
０．１ｍＭ                            ＮＡＤ
２５ｎｇ                              基質ＤＮＡ
【００３６】
酵素活性の安定化の評価は、基質ＤＮＡの連結反応後の反応液による大腸菌の形質転換効率に基づいて行なった。実験の再現性を確保するため、形質転換を行なう宿主として市販の大腸菌ＪＭ１０９コンピーテントセル（宝酒造社製）を用いた。形質転換処理後、反応液を抗生物質であるアンピシリンを含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（ＬＢ培地）に塗布し、２４時間後における生育コロニー数をカウントした。得られた数値から、各酵素溶液に含まれるベクターの量から形質転換効率を算出した。標準的な反応条件で得られる５．５×１０4個／μｇの形質転換効率を相対活性１００とし、活性評価に適用した。また、各試験条件について独立した試行を４〜９回行い、平均値を算出した。結果を図１に示す。なお、ネガティブコントロールでは生育コロニー数は０〜数個程度であったため、この活性評価システムはリガーゼ活性測定に適するものであることが確認された。
【００３７】
当該結果によれば、ＰＧＡを添加しない場合のリガーゼ活性は、３７℃を超えると急速に低下する。これに対してＰＧＡを添加した場合には、高温下での活性安定性が明らかに向上している。特に、酵素に対して６０質量％添加した場合の活性安定化効果は優れており、耐熱性を約２０℃高めることができた。タンパク質工学分野においては、酵素の耐熱性を１℃上昇させるのに大変な労力を要することを考慮すれば、本発明がいかに簡便で効率的であるかが分かる。
【００３８】
実施例２  強アルカリ条件に関する酵素活性の安定化実験
実施例１で用いた希釈液のＴｒｉｓ−ＨＣｌをユニバーサルバッファーであるＣａｒｍｏｄｙの緩衝液（２００ｍＭ、M．AshiuchiとH．Misono，Biochim．Biophys．Acta，Vol．1435，p．153-159（1999年）を参照）に代え、最終ｐＨが３．８、５．６、７．４、８．４、９．５または１１．４となる様に調整した。それ以外は実施例１と同様にして、基質ＤＮＡの連結反応と形質転換反応を行ない、形質転換効率を算出した。結果を図２に示す。
【００３９】
当該結果の通り、使用したリガーゼの至適ｐＨは６〜７付近であるが、ＰＧＡを添加するとより高いｐＨでも活性が安定化されることが実証された。特に、酵素に対して６０質量％（反応溶液に対して０．１μＭに相当）添加した場合には、ｐＨ１１．４という強アルカリ条件下においても酵素活性は衰えず、高い活性安定化能が示された。
【００４０】
また、使用した緩衝液が２００ｍＭと高濃度であるのに対し、ＰＧＡの濃度は０．１μＭと低濃度で十分な酵素の保護効果を示すという事実は、ＰＧＡが享有する優れた酵素安定化作用を証明している。
【００４１】
実施例３  温度に関する酵素活性の安定化実験
戦国醤菌を用いて製造された、平均分子質量が確定しているＰＧＡを、ＢｉｏＬｅａｄｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（大韓民国大田市）より入手した。これらＰＧＡの平均分子質量は、それぞれ５０、２５０、３８００ｋＤａｌである。
【００４２】
上記３種のＰＧＡにおけるＬ−Ｇｌｕの割合を測定した。具体的には、各ＰＧＡ（０．４ｇ）を６Ｎ塩酸（０．４ｍＬ）に溶解し、１０５℃で８時間攪拌して加水分解した。得られた溶液をキラル分割ＨＰＬＣ（カラム：ダイセル社製、４．６ｍｍ×５０ｍｍ、溶出液：２ｍＭ硫酸銅水溶液、検出波長：２３５ｎｍ）で分析し、各ピーク強度を比較することによって、Ｌ−Ｇｌｕの割合を求めた（C．Parkら，J．Mol．Catal．B：Enzym．，Vol．35，p．128-133（2005年）参照）。その結果、上記３種のＰＧＡにおけるＬ−Ｇｌｕの割合は、何れも約６０％であった。
【００４３】
上記実施例１において、平均分子質量が１０００ｋＤａｌであり、Ｌ−ＧｌｕのみからなるＰＧＡ（以下、「Ｌ−ホモ型ＰＧＡ」という場合がある）と共に、上記３種のＰＧＡを酵素に対して６０質量％用い、各酵素組成物を４℃または１０分間保持した上で、上記実施例１と同様に酵素活性を求めた。４℃で保持した場合での活性を１００として、５０℃で加温した場合の相対的な残存活性を算出した。結果を図３に示す。
【００４４】
実施例４  強アルカリ条件に関する酵素活性の安定化実験
上記実施例１において、平均分子質量：１０００ｋＤａｌのＬ−ホモ型ＰＧＡと共に、上記３種のＰＧＡを酵素に対して６０質量％用い、最終ｐＨを５．６または１１に調整した上で、上記実施例１と同様に酵素活性を求めた。ｐＨ５．６での活性を１００として、ｐＨ１１での場合の相対的な残存活性を算出した。結果を図４に示す。
【００４５】
図１と２の結果と同様に、図３と４の通り、ＰＧＡは、高温や高ｐＨ下における酵素の安定化作用を有することが実証された。また、図３と４の結果の通り、ＰＧＡの平均分子質量が大きいほど、その酵素安定化作用は優れることが分かる。しかしながら、Ｌ−Ｇｌｕの割合が１００％で且つ平均分子質量が１０００ｋＤａｌのＬ−ホモ型ＰＧＡと、当該割合が６０％で且つ平均分子質量が３８００ｌＤａｌのものを比較すると、これらの酵素安定化作用は同等か、或いは前者の方がより優れた作用を発揮する場合もあった。以上の結果から、ＰＧＡの酵素安定化作用は平均分子質量が大きいほど高いが、平均分子質量よりもＬ−Ｇｌｕの割合の方が酵素安定化作用には重要であると結論した。
【００４６】
実施例５  ＰＧＡを利用した酵素のプロテアーゼ耐性化実験
実施例１の通りに各酵素組成物を調製し、次にプロテアーゼを１０-5、１０-4、１０-3、１０-2、１０-1、１または１０Ｕ添加した。各組成物を３７℃で１０分間加温した後、実施例２と同様の方法で酵素活性を測定した。なお、プロテアーゼの１Ｕは、対象酵素の活性を３７℃で１０分間の加温で完全に消失させるプロテイナーゼＫ（宝酒造社製）の酵素量に相当する。結果を図５に示す。
【００４７】
図５の通り、ＰＧＡは酵素をプロテアーゼから保護し、酵素のプロテアーゼ耐性を高める効果がある。酵素の応用が期待される環境において、酵素の基質となる化合物のみが存在する状況はむしろ稀であり、診断や検出などの実用現場では、様々な生体成分が混在する場合が主となる。特に、酵素の分解を促進するプロテアーゼなどが混入しているケースは珍しくなく、酵素の利用効率や汎用性を低下させる一因ともなっている。現在は、かかるプロテアーゼの影響を低減する場合、人工的に化学合成されたプロテアーゼ阻害剤に頼るところが大きいものの、コスト面や環境への影響を考慮し、生分解性を備えた天然材料への転換が求められている。従って、ＰＧＡによる酵素のプロテアーゼ耐性化の発見は、バイオ産業上においても大きな意味を持つ。
【００４８】
実施例６  ＰＧＡを利用した酵素の凍結融解耐性化実験
実施例１の通りに各酵素組成物を調製し、次いで、これらを−３０℃で３０分間凍結した後、室温下２〜３分間で急速に溶解した。この操作を１、３、５、１０または１５回繰り返した後、実施例２と同様の方法で酵素活性を測定した。別途、上記凍結融解操作を行わない場合の酵素活性を測定してこれを１００とし、それぞれの相対的な酵素活性を算出した。結果を図６に示す。
【００４９】
図６の通り、ＰＧＡには凍結融解による酵素失活を大幅に緩和する効果がある。特に、酵素に対して６質量％（０．０１μＭに相当）以上のＰＧＡを添加することで、極めて優れた効果が発揮されることが分かった。凍結操作は、酵素の保存や輸送中にもよく使用され、凍結乾燥までされるケースも少なくない。一方、本来酵素は水環境中で自由に動き回ることでその機能を発揮するという特性があり、凍結操作は多かれ少なかれ酵素の変性要因となり、汎用性や利用効率を下げる原因となる。従って、凍結融解に対する酵素の耐性向上技術が持つ産業上の意義は大きい。
【００５０】
以上で実証した、ＰＧＡによる酵素の耐熱化、アルカリ耐性化、プロテアーゼ耐性化、そして凍結融解耐性化は、何れも酵素触媒素子の長寿命化、再利用性の向上、自然環境への直接利用の実現などに対して貢献度の大きな発見であり、現在よりも遥かに効率的で環境にやさしい酵素バイオテクノロジーの基礎を築くものとなり得る。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明に係る酵素組成物の高温下における酵素活性の安定化作用を示す図である。
【図２】本発明に係る酵素組成物の強アルカリ条件下における酵素活性の安定化作用を示す図である。
【図３】本発明に係る各種ＰＧＡによる酵素活性の熱安定化作用を示す図である。棒グラフ（白）のａはＰＧＡ無添加時のもの、棒グラフ（黒）はＬ−Ｇｌｕの割合が６０％のＰＧＡを添加したケースである。その内、ｂは平均分子質量５０ｋＤａｌのものを添加した場合（酵素溶液中の最終モル濃度：２μＭ）、ｃは平均分子質量２５０ｋＤａｌのものを添加した場合（同濃度：０．４μＭ）、ｄは平均分子質量３８００ｋＤａｌのものを添加した場合（同濃度：０．０２６μＭ）である。棒グラフ（斜線）のｅは、Ｌ−Ｇｌｕの割合が１００％のＰＧＡで平均分子質量１０００ｋＤａｌのものを添加した場合（同濃度：０．１μＭ）の結果である。
【図４】本発明に係る各種ＰＧＡによる酵素活性のアルカリ安定化作用を示す図である。図中のａ〜ｅは、図３と同義を示す。
【図５】本発明に係るＬ−ホモ型ＰＧＡによる酵素のプロテアーゼ耐性化を示す図である。
【図６】本発明に係るＬ−ホモ型ＰＧＡによる酵素の凍結融解耐性化を示す図である。
【図１】
2007097586.tif 000003
【図２】
2007097586.tif 000004
【図３】
2007097586.tif 000005
【図４】
2007097586.tif 000006
【図５】
2007097586.tif 000007
【図６】
2007097586.tif 000008