(57)【要約】【課題】ポリヌクレオチドの濃度が非常に低くてもそれを検出でき、しかも、速やかに分析結果の得られる分析装置を提供する。【解決手段】ポリヌクレオチド増幅反応を行うことにより試料内のポリヌクレオチドを増幅する方法であって、０．１〜１，０００ミクロンの範囲内の中規模断面寸法を少なくとも一つ有し、前記ポリヌクレオチドの生体外増幅のための少なくとも一つの試薬からなるポリヌクレオチド増幅反応室を少なくとも一つ有するように形成した固体基板と、前記試料を前記反応室に導入するために前記反応室と連通した少なくとも一つのポートとからなる装置を準備するステップと、前記ポートを介して前記反応室内に、ポリヌクレオチド試料と、ポリヌクレオチド試料の室内での増幅用の少なくとも一つの試薬と、ブロッキング試薬とを含む液体を導くステップとを含む。【選択図】図２２
2007050008.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチド増幅反応を行うことにより試料内のポリヌクレオチドを増幅する方法であって、
０．１〜１，０００ミクロンの範囲内の中規模断面寸法を少なくとも一つ有し、前記ポリヌクレオチドの生体外増幅のための少なくとも一つの試薬からなるポリヌクレオチド増幅反応室を少なくとも一つ有するように形成した固体基板と、前記試料を前記反応室に導入するために前記反応室と連通した少なくとも一つのポートとからなる装置を準備するステップと、
前記ポートを介して前記反応室内に、ポリヌクレオチド試料と、ポリヌクレオチド試料の室内での増幅用の少なくとも一つの試薬と、ブロッキング試薬とを含む液体を導くステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記装置は、前記ポートを前記反応室に連通させる流路を備えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記固体基板は、ガラス、シリコン、シリカ、ポリシリコン、窒化シリコン、二酸化シリコン、プラスチック材、有機ポリマー材の群から選ばれた材料で構成されてなることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記反応室は、深さが約５００ミクロン以下であることを特徴とする請求項１から３までの何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記反応室は、深さが約３００ミクロン以下であることを特徴とする請求項１から３までの何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記反応室は、深さが約８０ミクロン以下であることを特徴とする請求項１から３までの何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記反応室は、その体積に対する表面の面積の比が約３ｍｍ２／μｌ以上であることを特徴とする請求項１から６までの何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記反応室は、前記比が約５ｍｍ２／μｌ以上であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記反応室は、前記比が約１０ｍｍ２／μｌ以上であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記反応室におけるポリヌクレオチド反応の前記反応室の壁部による阻害を減少させるために、前記反応室の少なくとも一つの前記壁部に組成物を付着させることを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物は、前記壁部の表面と共有結合することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物は、ポリ塩化ビニルを含むポリマーであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物は、シラン、シリコーン、及び、シリコン酸化物からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ブロッキング剤は、ポリヌクレオチド及びポリペプチドからなる群より選ばれることを特徴とする請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ブロッキング剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリグアニル酸、ポリアデニル酸からなる群から選ばれたブロッキング用ポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ブロッキング剤は、牛血清アルブミン、ポリビニルピロリドン、ポリマレイミド、又は、マレイミドをさらに含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物は、ジメチルクロロシラン、ジメチルジクロロシラン、ヘキサメチルジシラザン、トリメチルクロロシランからなるぐんから選ばれるシランと、前記壁部の表面との反応によって形成されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物は、前記壁部の表面とシリコーン化試薬との相互作用によって形成されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物は、前記シリコーン被膜と結合するマクロ分子をさらに含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記マクロ分子は、アミノ酸ポリマーであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記マクロ分子は、ポリビニルピロリドン、ポリアデニル酸、及び、ポリマレイミドからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記装置は、前記反応室内の温度を規制する熱調節器をさらに備えることを特徴とする請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記装置は、前記ポリヌクレオチド増幅反応の生成物を検出する検出システムをさらに備えることを特徴とする請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記検出システムは、
前記ポリヌクレオチド増幅反応の生成物と接触すると、前記生成物と共に検出可能な複合体を形成する複合体形成剤と、
前記ポリヌクレオチド増幅反応生成物が前記複合体形成剤と接触し、前記検出可能な複合体が生成する室と、
前記室における前記検出可能な複合体の存在又は量を検出する検出器と
を備えることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記検出可能な複合体が生成される前記室は、ポリヌクレオチド増幅反応室であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記検出可能な複合体が生成される前記室は、前記ポリヌクレオチド増幅反応室と連通した検出室で構成されていることを特徴とする請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記反応室は、前記基板に配置したカバーにより少なくとも部分的に覆われていることを特徴とする請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポートと前記流路とは前記基板に形成されていることを特徴とする請求項２から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記装置は、前記基板上にカバーを更に備えていると共に、前記ポートと前記流路とは前記カバーに形成されていることを特徴とする請求項２から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記カバーは、ガラス、及び、有機ポリマー材からなる群から選ばれた材料からなることを特徴とする請求項２７から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記装置は、前記基板から延在し、前記ポートに対して押し込むと前記ポートをシールする部材をさらに備えることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概してポリヌクレオチドの増幅と種々の分析を行う方法と装置とに関する。詳述すれば、本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の如くのポリヌクレオチド増幅反応が係わる分析に用いる小型で、通常使捨て式のモジュールの構成に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近の数十年の間、種々の診断やモニターのために生物学的試料を分析する多数のプロトコールや試験キット、カートリッジなどが開発されている。免疫学的検定や免疫性定量測定(immunometric asay)、凝集反応分析、更には、ポリヌクレオチド増幅アッセイ（ポリメラーゼ連鎖反応の如く）に基づく分析、さては、リガンド-受容体相互作用、複合体試料における物質の示差的な移動など全ては、種々の生物学的組成物ないし汚染物質の存在ないし濃度を判定したり、特定の細胞型の存在を判定するのに使われている。
【０００３】
最近に至って生物学的試料を取り扱ったり、ある臨床試験を行うのに小型で使捨て式の装置が開発されている。ショウジ等は、シリコンウェハーに形成した超小型血液ガス分析器の利用を報告している。ショウジ等による「Sensors and Actuators（センサー類とアクチュエター類）」15: 101-107 (1988)。サトウ等は、ミクロ機械的シリコン装置を用いた細胞融合法を報告している。サトウ等による「Sensors and Actuators（センサー類とアクチュエター類）」A21-A23: 948-953 (1990)。チバ・コーニング・ダイアグノステイック社（米国）は、血栓を検出するためのマイクロプロセッサー制御式レーザー光検出器を製造している。
【０００４】
例えばシリコン基板を用いたミクロ機械加工法により、最小寸法が数十ミクロン（生物細胞の寸法）からナノメーター（ある生物学的マクロ分子の寸法）に至るまでの構造要素を備えたミクロ仕上げの装置(microengineered device)の製造が容易になっている。エンジェル等による「Scientific America（アメリカの科学）」248: 44-55 (1983)。ワイズ等による「Science（サイエンス）」254: 1335-42 (1991)や、クリッカ等による「J.Int. Fed. Clin. Chem.（国際臨床化学連盟機関誌）」6: 54-59 (1994)。この大きさの構造体を用いた大部分の実験は、ミクロ機械学、即ち、機械的運動と流れ特性とに係わるものである。これらの構造体の潜在的能力については、生命科学の分野ではまだ完全に解明されていない。
【０００５】
ブルネット（Exper. Cell Res., 167: 203-217 (1986)及び164: 11-26 (1986)）は、シリコン、チタン被覆ポリマーや類似のものでの溝における線維芽細胞と上皮細胞の挙動を調べている。マッカーシ等（Cancer Res., 41: 3046-3051 (1981)）は、溝付きプラスチック基板にける腫瘍細胞の挙動を調べた。ラセル（Blood Cells, 12: 179-189 (1986)）は、微小循環の理解を深めるために極細毛細管(microcapillaries)における白血球と赤血球の流れを研究している。ハングとワイズマンは、ミクロ機械加工したチャンネルでの流体力学の研究を発表しているが、分析装置に関したデータは出していない。ハング等による「Med. and Biol. Engineering」9: 237-245 (1971)及びワイズマン等による「Am. Inst. Chem. Eng. J.」17: 25-30 (1971)。コロンブス等は、実験用多チャンネル試験装置での離散型イオン選択電極に対する生物学的液体の毛細流れを制御するに当たって、Ｖ字形溝を直交配置形成した二つのシートからなるサンドイッチを用いている。コロンブス等による「Clin. Chem.」33: 1531-1537 (1987)。マスダ等とワシズ等とは、細胞の操作（例えば、細胞融合）のための流体流れ室(fluid flow chamber)の利用を報告している。マスダ等による「Proceedings IEEE/IAS Meeting」pp. 1549-1553 (1987)及びワシズ等による「Proceedings IEEE/IAS Meeting」pp. 1753-1740 (1988)。ｐＨ測定とバイオセンサー用の極小装置を開発するのに、シリコン基板が使われている。マッコーネル等による「Science」257: 1906-12 (1992)及びエリックソン等による「Clin. Chem.」39: 283-7 (1993)。しかし、生物学的流体の分析にこのような装置を用いる可能性は、今尚解明されていない。
【０００６】
ＤＮＡのセグメントを増幅するのにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる方法は確立している。（例えばマニチス等による「分子クローニング：研究の手引き」(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboaratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pp. 14.1-14.35)。ＰＣＲ増幅反応は、例えばTaqＤＮＡポリメラーゼ（チーン等のよる「J. Bacteriol.」127: 1550 (1976)）の如くの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド・トリホスフェート及び、鋳型ＤＮＡの両側の鎖にあって、増幅すべきＤＮＡセグメント（プライマー）を囲む配列と相補的な異なった配列の二種のオリゴヌクレオチドを用いてＤＮＡ鋳型に対して行うことができる。反応成分は、二本鎖型鋳型ＤＮＡのハイブリッドを遊離（溶融）させる高温（例えば９４℃）とその後の低温（例えばプライマーのアニーリングの場合では４０〜６０℃、重合作用の場合では例えば７０〜７５℃）との間で循環させられている。ハイブリッドの遊離、アニーリング、重合作用のそれぞれの温度での繰返し反応サイクルにより、鋳型ＤＮＡの大凡指数関数的な増幅が期待できる。例えば、長さが２ｋｂまでで１μｇまでの目的ＤＮＡが、出発ＤＮＡが１０−６μgだけで増幅作用を３０〜３５サイクル行うことで得ることができる。熱循環器を用いてＰＣＲ連鎖反応を自動的に実行する機械は入手可能である（パーキン・エルマー社）。
【０００７】
ポリヌクレオチド増幅作用は、遺伝子異常の診断（エンゲルク等による「Proc. Natl. Acad. Sci.」85: 544 (1988)）、臨床試料における病原性有機組織の核酸配列の検出（オウ等による「Science」239: 295 (1988)）、例えば精液の如くの法医学サンプルの遺伝子鑑別（リー等による「Nature」335: 414 (1988)）、活性オンコジンにおける突然変異の分析（ファー等による「Proc. Natl. Acad. Sci.」85: 1929 (1988)）、そして、分子クローニングの多方面（オストによる「BioTechniques」6: 162 (1988)）などに適用されている。ポリヌクレオチド増幅分析は、プローブとして用いるクローンした二本鎖ＤＮＡの特異配列の生成や、ｃＤＮＡの特定のセグメントを選択増幅することによる非クローン遺伝子に特異なプローブの生成、少量のｍＲＮＡからのｃＤＮＡのライブラリーの生成、配列決定のためにのＤＮＡの大量生成、そして、突然異変の分析などに利用できる。
【０００８】
熱循環法を用いてポリヌクレオチド増幅反応を行う装置とシステムとは、従来より種々知られている。テンプルトンによる「Diag. Mol. Path.」1: 58-72 (1993)や、リザーディ等による「Biotechnology」6: 197-1202 (1988)、バックマン等によるヨーロッパ特許第320308号 (1989)、パナッチョ等による「BioTechniques」14: 238-43 (1993)などで説明されている。これらの装置では、水槽や空気槽、アルミの如くのドライブロックを用いるとか、移送に関して種々の設計理論を利用している。ハフ等による「BioTechniques」10: 102-12 (1991)、フィンドレー等による「Clin. Chem.」39: 1927-33 (1933)、ウイッター等による「Nucl. Acids Res.」17:4353-7 (1989)。小型反応室でのＰＣＲ反応については、ウイッター等による「Anal. Biochem.」186- 328-31 (1990)とウイッター等による「Clin. Chem.」39: 804-9 (1993)に説明されている。シリコンで構築したポリヌクレオチド増幅用マイクロ装置については、ノースロップ等による「Digest of Technical Papers: Transducers 1993（1993年度技術論文ダイジェスト）」（固体センサーとアクチュエーターに関する第７回国際会議議事録、ニューヨーク州ニューヨーク所在のInstitute of Electrical and Electronic Engineers発行、pp. 924-6及びノースロップ等による国際出願PCT WO 94/05414 (1994)などに記載されている。
【０００９】
シリカ粒子は核酸に結合することが分かっているので、ＰＣＲ分析に先立って核酸を単離するのに用いられている。ザイリンジャー等による「BioTechniques」14: 202-3 (1993)。従来、種々の分析に用いる極微流路と室が形成されたシリコンやその他の基板を用いることがなされているが、ポリヌクレオチド増幅反応の如くの装置において行う反応を阻害する表面の結合特性ないしその他の特性を減少させるために、ミクロ機械加工したシリコンないしその他の表面を変えてみることについては注目を浴びるようなことがなかった。ノースロップ等は、深さが０.５ミリのシリコン基板におけるＰＣＲ反応室のシラン化(silanization)について説明している。この点については、ノースロップ等による「Digest of Technical Papers: Transducers 1993（1993年度技術論文ダイジェスト）」（固体センサーとアクチュエーターに関する第７回国際会議議事録、ニューヨーク州ニューヨーク所在のInstitute of Electrical and Electronic Engineers発行、pp. 924-6及びノースロップ等による国際出願PCT WO 94/05414 (1994)などに記載されている。しかし、ノースロップ等による文献（「Digest of Technical Papers: Transducers 1993（1993年度技術論文ダイジェスト）」）では、シラン化がないと、反応室の未処理シリコン表面にはＰＣＲ反応に対する阻害作用はない、と説明している。
【００１０】
父親確定検査、遺伝病検査、感染症検査の如きの臨床試験や、環境科学や生命科学の分野での種々の検査などに広く利用できる利便性があって、迅速に行えるポリヌクレオチド増幅分析のためのシステムが求められている。また、高い歩留まりで、しかも基板の表面に起因する干渉なしでポリヌクレオチド増幅反応が行える、シリコンの如くの基板に構築した極微装置の開発も望まれている。
【００１１】
【特許文献１】国際公開第９３／２２０５８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９４／０５４１４号パンフレット
【特許文献３】特開平４−３３０２８１号公報
【特許文献４】特開平１−２６６８５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ポリヌクレオチド増幅反応を行うのに最適な反応環境を有するミクロ規模の分析装置であって、ポリヌクレオチドの濃度が非常に低くてもそれを検出でき、しかも、速やかに分析結果の得られる分析装置を提供するのを目的としたものである。本発明の別の目的は、広範囲の用途において予め選ばれた細胞ないし細胞のない試料についてのポリヌクレオチド増幅分析が迅速かつ自動的に行える、容易に大量生産できる使捨て式小型（例えば、体積約１ｃｃ以下）装置を提供することにある。本発明のまた別の目的は、ポリヌクレオチド増幅反応に対する基板表面による潜在的阻害作用をなくすために、シリコンの如くの固体基板に形成されたミクロ規模の反応室で利用する調剤(agents)を提供することにある。本発明の更に別の目的は、シリコンの如くの固体基板に構築したミクロ規模のポリヌクレオチド増幅室へ、或いはそこから試薬と液体試料とを移送させる装置を提供すると共に、増幅反応時に反応室をシールする装置をも提供することにある。また、本発明の更にまた別の目的は、ウイルスないし細菌感染検査や、細胞培養の汚染検査、細胞における組換えＤＮＡないし遺伝子の有無検査など、広範囲の臨床試験に直ちに利用できる装置を提供することにある。
【００１３】
本発明のこれら及びその他の目的と特徴については、これから行う説明や図面、請求の範囲などから理解されよう。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の趣旨）
本発明は、流体試料においてポリヌクレオチドを急速増幅させることのできるポリヌクレオチド増幅反応を行うための小型で、大量生産し得る一般に使捨て式の装置類を提供するものである。一実施の形態では、装置は、少なくとも一つのポリヌクレオチド増幅反応室を有するように組み立てた固体基板からなる。また、装置には、増幅反応時に少なくとも反応室の一部をシールするために、基板上に透明カバーの如くのカバーを備えていてもよい。更に、試料を反応室に導入するために、反応室と連通して少なくとも一つのポート（ここでは「試料入力ポート」とか単に「入力ポート」とか称している）が装置に備わっていてもよい。ポートから反応室まで延在しているか、二つかそれ以上の反応室を連通させるか何れか一方、又は両方のための流路が一つかそれ以上装置に形成されていてもよい。更に、反応室と連通していて、アクセスポート、入出力ポート、ベントとして利用できる別のポートも装置に備わっていてもよい。装置における一つかそれ以上のポートと流路の何れか一方、又は両方はカバーと基板の何れかに形成されていてもよい。この装置にあっては、反応室を形成する壁部によるポリヌクレオチド増幅反応に対する阻害作用をなくす組成物が反応室に設けられていてもよい。また、試料としてのポリヌクレオチドの増幅が行われるように反応室の内容物に対して熱循環をかける手段が装置に備わっていてもよい。
【００１５】
尚、本明細書では反応室ないし流路について「中規模(mesoscale)」なる用語を用いているが、これは、反応室や流路の少なくとも一つにおける少なくとも一つの断面寸法が約０.１〜1,0001ミクロンの間にあることを意味する。反応室に連なる流路は、その幅と深さが約２.０〜５００ミクロン程度であるのが望ましい。増幅作用が行われる基板における反応室は、一つかそれ以上のもっと大きい寸法、例えば幅と長さの何れか一方、又は両方が約１〜２０ミリであるのが望ましい。反応室の好ましい幅と長さは約５〜１５ミリである。反応室は、約０.１〜大きくても約1,000ミクロン程度の深さを有するように形成する。通常、反応室の深さは５００ミクロンより小さく、例えば約３００ミクロンより小さく、最適には約８０ミクロンより小さいのが望ましい。例えば３００ミクロン以下の浅い深さを有する反応室を形成すると、例えば基板を介して反応室の内容物への熱伝導が良好の行われ、そのために熱循環(thermal cycling)を必要とする増幅反応時での熱循環が効率的に行われる。しかし、一部の実施の形態では、反応室は、その深さが約５００〜1,000ミクロンとなるように形成していてもよい。装置全体の寸法は、それを構成する材料の種類にもよるが、厚みがミクロンオーダーから数ミリ程度に亙り、長さないし幅が０.２〜５.０センチに亙っている。
【００１６】
装置は、例えば基板ないしカバーを介して連通する穴により形成されている入力ポートを介して流路系に導入したミクロン量の試料の増幅と分析の何れか一方、又は両方に利用できる。通常、中規模流路系の容積は５０マイクロリットル以下であり、反応室の容積は２０マイクロリットル以下、例えば１０マイクロリットルかそれ以下である。別の実施の形態における個々の流路と反応室の容量は１マイクロリットル以下であり、例えばナノリットルないしピコリットルの範囲にある。非常に低濃度（例えば、ナノグラム量）のポリヌクレオチドは、急速（例えば、１０分以内）に増幅されて検出される。ポリヌクレオチド増幅アッセイが終わった後では、装置は捨ててもよいし、又は、洗浄した後に再使用に供してもよい。
【００１７】
一実施の形態では、反応室は、当該反応室の容積に対する当該反応室の壁の表面積の比が約３ｍｍ２／μｌ以上となるように形成されている。この反応室は、例えば５ｍｍ２／μｌ、最適には１０ｍｍ２／μｌより大きい容積に対する表面積比を有するように形成してもよい。この容積に対する表面積の比が増大すると、基板を介しての熱伝達が高まり、そのために反応の熱循環がより効率的となり、反応の生産性が増加する。しかし、容積に対する表面積比が増大すると、ポリヌクレオチド増幅反応に対する基板の壁部による潜在阻害作用が増加する。基板の素材によっては、中規模流路と反応室の壁部表面が、例えば素材と試料としてのポリヌクレオチド又は増幅試薬との結合作用を介して、ポリヌクレオチド増幅作用と干渉することがある。
【００１８】
本発明は、反応室に設けて反応に対するシリコン表面の如くの反応室壁部表面による潜在的阻害作用をなくす広範囲の組成物をも提供している。これらの組成物は、反応室の容積に対する表面積比が約３ｍｍ２／μｌないし５ｍｍ２／μｌ以上であれば特に有用であり、別の実施の態様にあっては、前記比が約１０ｍｍ２／μｌ以上もある反応室においても有用である。装置にはカバーが備わっていてもよく、その場合、反応室を覆うように配置して増幅反応時に当該反応室を密閉シールするようにする。このカバーは、ガラスないしシリコン、又はプラスチック材の如くの材料で構成してもよい。反応室を覆うようにカバーを利用すれば、反応室における液体と接触する全体の表面積が増大する。反応室に露現させたカバーの表面には、増幅反応に対するカバーの表面素材による潜在的阻害作用をなくすために、本明細書において開示する組成物で処理しておいてもよい。
【００１９】
反応室の壁部による増幅反応に対する阻害作用を減少させるために反応室に用いる組成物は、反応室表面に共有結合させるか、または非共有結合させて付着させてもよく、或いは、増幅反応時に当該組成物を溶液の形で反応室に臨むようにしてもよい。一実施の形態では、装置における一つかそれ以上の反応室と流路の何れか一方、又は両方の壁面に、ジメチルクロロシランや、ジメチルジクロロシラン、ヘキサメチルジシラザン、トリメチルクロロシラン（例えば、イリノイ州ロックフォード所在のピアース社から入手可能）などの如くのシラン化試薬を用いてシランで塗布してもよい。別の方法としては、シリコン基板に形成した反応室と流路の何れか一方、又は両方の壁部表面に、例えば商標名AquaSilないしSurfasil（イリノイ州ロックフォード所在のピアース社のもの）または商標名Sigmacote（ミズーリ州セントルイス所在のシグマ化学社のもの）の如くのシリコーン化試薬を用いて比較的不活性な塗膜を設けてもよい。ピアース社（イリノイ州ロックフォード所在）やシグマ化学社（ミズーリ州セントルイス所在）の如くの製造業者から入手可能なシラン化試薬は、加水分解基(hydrolyzable group)を含有するオルガノシランであって、溶液状態で加水分解してシラノールを生成するが、これも重合して反応室の表面に膜を形成すると共に、反応室の表面におけるヒドロキシル基と反応するから、反応室の全ての表面に膜がしっかりと密着して形成される。塗布膜は、増幅反応時での反応室の壁部の阻害作用を減少させるために、当該塗布膜と非共有結合ないし共有結合するマクロ分子（本明細書では、時として「ブロッキング剤」と称する）を含んでいてもよい。有用なマクロ分子としては、アミノ酸ポリマー、もしくは、ポリビニールピロリドン、ポリアデニル酸、ポリマレイミドの如きのポリマーなどが挙げられる。
【００２０】
壁面による増幅阻害作用を減少させるために、シリコン酸化膜をシリコン基板上の反応室と流路の何れか一方、または両方の壁部の表面に設けてもよい。このシリコン酸化膜は、酸素の存在のもとで基板を加熱する熱的方法で形成することができる。別の方法としては、プラズマ酸化促進法(plasma-enhanced oxidation process)や化学蒸着法を用いてもよい。また、反応室と流路の何れか一方、または両方の壁部に、塩化ポリビニールの如くのポリマーを塗布してもよい。
【００２１】
試料としてのポリヌクレオチドと増幅試薬とを反応室に添加するに先立って、別のポリヌクレオチド（本明細書では時として「ブロッキング用」ポリヌクレオチドと称する）を反応室に添加してもよく、その一例として、ゲノムＤＮＡまたはポリアデニル酸を、試料としてのポリヌクレオチドの濃度よりも好ましくは高い濃度で添加する。こうすることにより、ポリヌクレオチドが試料としてのポリヌクレオチド又は分析試薬と潜在的に結合して反応の歩留まり(yield)もしくは分析の精度を減少させると思われる壁面上の部位に付着する。従って、一実施の形態では、ブロッキング用ポリヌクレオチドが、反応室の壁表面における遊離ヒドロキシ基の如くのポリヌクレオチド結合部位を占有するように、当該ブロッキング用ポリヌクレオチドをシリコン基板に構築した反応室に設けている。増幅反応との干渉を避けるには、ブロッキング用ポリヌクレオチドとしては、試料としてのポリヌクレオチドの配列に無関係の配列を有するものとすべきである。ポリグアニル酸ないし、カゼイン、血漿アルブミンの如くの種々のポリペプチドなど、反応室壁表面に結合するその他の組成物をブロッキング剤として利用することもできる。
【００２２】
装置は、反応室でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の如くのポリヌクレオチド増幅反応を反応室で行うのに用いることができる。この反応室には、試料としてのポリヌクレオチド、ポリメラーゼ、ヌクレオシド・トリホスフェート、試料としてのポリヌクレオチドとハイブリッド化可能な(hybridizable)第１プライマー、試料としてのポリヌクレオチドと相補的な配列とハイブリッド化可能な第２プライマーなどを含む、ＰＣＲに必要な試薬が設けられており、前記第１及び第２プライマーは増幅したポリヌクレオチド生成物の末端を形成している。装置には、増幅反応室の内容物に熱循環をかける手段も備わっており、そのために各サイクル時に温度が、(１)二本鎖ポリヌクレオチドのハイブリッドを遊離（溶融）させ、(２)プライマーを一本鎖ポリヌクレオチドにアニーリングし、(３)プライマー間で増幅したポリヌクレオチドを合成するように制御される。従来より知られているその他の増幅法も利用できるものであり、その一例として、必ずしもそれに限られるものではないが、(１)自己持続配列複製法(self-sustained sequence replication)（３ＳＲ）や鎖置換増幅法(straind-displacement amplification)（ＳＤＡ）の如くの目的ポリヌクレオチド増幅法、(２)「分岐鎖(branched chain)」ＤＮＡ増幅法（カリフォルニア州エメリーヴィル所在のチロン社）の如くの、目的ポリヌクレオチドについている信号の増幅に基づく方法、(３)リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）やＱＢレプリカーゼ増幅（ＱＢＲ）の如くの、プローブＤＮＡの増幅に基づく方法、(４)連結反応による転写（ＬＡＴ）や核酸配列依存増幅（ＮＡＳＢＡ）、修復連鎖反応（ＲＣＲ）、循環プローブ反応(cycling proble reaction)（ＣＰＲ）の如くの種々のその他の方法（これらの方法の概要と出所については、ニュージャージ州モンクレアー所在のジェネシスグループの「The Genesis Report」、DX、Vol. 3、No.4、1994年２月発行の第２頁から第７頁を参照されたし）が挙げられる。
【００２３】
反応室は、従来のＰＣＲの如く、熱循環を要するポリヌクレオチド増幅反応に必要な温度間で順次熱循環させられる一つの部分からなるものであってもよい。別の方法としては、二つかそれ以上の部分で反応室を構成して、それぞれをハイブリッドの遊離、アニーリング、重合作用に必要な温度に設定するようにしてもよく、その場合では、例えばコンピューターで制御し得るポンプの如くの反応を実行するために部分間で反応室の内容物を移送させる手段を備えている。反応室は、基板上に配置するカバーで当該反応室の少なくとも一部が塞がれるようにしてもよい。また、本明細書で説明するように、増幅したポリヌクレオチドを検出する手段をも装置に設けてもよい。この装置は、細胞や溶液におけるポリヌクレオチドの有無の分析、特定のポリヌクレオチドをマーカーとして用いたウイルスないし細菌の種類の分析など、種々のポリヌクレオチド分析を高感度にて迅速に自動的に行うに当たって利用できる。
【００２４】
中規模流路と反応室とは、写真平板法、エッチング法、レーザー加工、LIGA処理法（ベッカー等による「Microelec. Eng.」4: 35-56, 1986）、プラスチック成型法など、従来より確立しているミクロ機械加工法を用いて固体基板から構築することができる。装置における中規模流路系は、基板の表面に流路と一つかそれ以上の反応室を形成し、その後に基板表面上にカバーを接着ないしクランプすることにより形成できる。固形基板とカバーの何れか一方、又は両方は、シリコンやポリシリコン、シリカ、ガラス、砒素ガリウム、ポリイミド、窒化シリコン、二酸化シリコンの如くの材料で構成してもよい。別の方法として、カバーと基板の何れか一方、又は両方を、アクリル、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレンなどのプラスチック材で構成してもよい。所望によっては、カバーと基板の何れか一方、又は両方を透明材で構成してもよい。
【００２５】
装置の基板を収納する場所を有し、所望によっては基板上の一つかそれ以上の入力ポートと接続される一つかそれ以上の流路を有する器具を装置と一緒に用いてもよい。特定のポリヌクレオチドを含んでいると思われる生物学的液体の試料を入力ポートに導入した後に、基板を器具に載置し、例えば器具に配置したポンプを駆動して当該試料を流路系に流す。別の方法としては、器具（例えば、当該器具に取り付けた注入器）により基板に試料を注入してもよい。アッセイに必要なポリメラーゼ酵素の如くの試料は（液状ないし固形状で）基板への注入に先立ってポリヌクレオチド試料に添加しておいてもよい。別の方法としては、アッセイを終わらせるのに必要な試薬を器具で別の入力ポートを介して反応室に注入してもよい。流体試料や試薬も毛細管現象で、或いは、重力作用により中規模流路系に流入する。
【００２６】
本発明は、増幅反応時に装置における流体入出力ポートの一つかそれ以上をシールする手段を備えている。これにより、熱循環時に液体が蒸散するのを防ぐことができ、従って、増幅反応時に好ましい反応濃度を維持することができる。一実施の形態においては、装置のポートを介して反応室へ、又は反応室から流体を給送する手段が装置に備わっていて、当該手段は当該ポートに気密状態で取り付けられる又はロックでき、流体を反応室に送り込んだ後にはポートを可逆的にシールする。例えば、流体供給装置は注入器もしくはピペットで構成してもよい。一実施の形態では、流体供給装置をピペットで構成し、該ピペットはピペット先端を有していると共に、このピペット先端と入力ポートとの間で流体を移送する孔が前記ピペット先端に形成されている。このピペット先端は、所望に応じてはピペットから取り外し自在にしてもよく、また、試料間での汚染を防ぐために使い捨てにしてもよい。
【００２７】
装置には、シリコンの如くの熱伝導材からなる基板と、該基板上に配置したカバーとで構成してもよく、その場合でのカバーはガラスやプラスチック材の如くの透明材で構成してもよい。また、中規模ポリヌクレオチド増幅室が装置に備わっていてもよく、この場合での増幅室は基板か、カバーの何れかに形成してもよい。カバーには、反応室へ、或いは反応室から試料と試薬溶液とを移し変えるために用いるピペットを受け入れる空洞を備えていてもよい。更に、ピペットを空洞に挿入したときにピペット先端の孔と反応室との間で基板とカバーの何れか一方、又は両方を介して連通する流路を装置に形成しておいてもよい。孔は、ピペットが空洞に差し込まれると、ピペット先端が孔から流路を介して反応室へと液体が流入する第１位置と、孔が空洞の壁部に対面して流路と反応室とを反応時にシールする第２位置との間を移動し得るようにピペット先端の壁部に形成してもよい。また、押込み自在部材を基板から延在するように設けて、当該部材をポートに対して押し込むとポートがシールされるようにしてもよい。
【００２８】
反応室の一つかそれ以上の部分の温度は、例えば反応室近傍において基板上に一つかそれ以上の電気抵抗ヒーターを設けるか、又は、パルスレーザー光ないし電磁エネルギーを反応室に指向させることにより調節することができる。器具には、例えば反応室の電気抵抗ヒーターを励起させるために基板の構造体に集積させた接点と接続される電気接点が収納部位に設けられていてもよい。また、反応室の温度調節をはかどらせるために冷却素子を器具に設けてもよい。更に、器具には、装置におけるセンサーと接続されて、ハイブリッドの遊離と重合反応に必要な温度サイクルを熱的に調整する従来公知の回路が備わっていてもよい。
【００２９】
中規模反応室でのポリヌクレオチド増幅反応により生成された増幅ポリヌクレオチドは、基板におけるポートを介して回収できると共に検出できる。別の方法としては、従来より知られている特定の試薬と方法とを用いて、反応室における増幅生成物を直接検出するようにしてもよい（例えば、パーキン・エルマー社より入手可能な商標名「Taq Man」ＰＣＲ試薬とキット）。もう一つの別の方法として、中規模検出部域を中規模流路系の一部として装置における反応室と連通した状態で、基板上にミクロ形成しておいてもよい。この検出部域には、標識ポリヌクレオチドないし抗体プローブの如く、増幅したポリヌクレオチドと検出可能な状態で結合し得る標識結合成分が含まれていてもよい。この検出部域での重合したポリヌクレオチド生成物の存在が、例えば重合したポリヌクレオチドと結合成分との凝集をガラス製カバーを介して、或いは、基板それ自体の半透明ないし透明部分を介して光学的に検出することにより検出できる。別の方法としては、検出部域は、増幅したポリヌクレオチドを電気泳動法により分離検出する一群の流路ないしマイクロリトグラフ・アレーからなるものでもよい。
【００３０】
陽性アッセイは、反応室で増幅したポリヌクレオチドが生成される時の流路系の異なった個所での圧力ないし電導性の変化の如くの流体試料の流れ特性の検出可能な変化で表される。一実施の形態では、装置はポリヌクレオチド増幅反応室と検出部域（例えば室又は流路の一部）からなる中規模流路系を備えており、例えば検出部域に配置した光学窓を介して陽性結果を読み取ることのできる分光光度計の如くの検出装置を備えた器具を一緒に用いる。この器具は、反応室、検出部域、もしくは流路系のその他の部域で検出した圧力読取り値、導電性読取り値などを表す電気信号を受信するように構築してもよい。
【００３１】
基板は、混合物における幾つかのポリヌクレオチドの増幅と検出の何れか一方、又は両方を高速にて平行して行えるように、複数の反応室と検出室の何れか一方、又は両方を備えていてもよい。中規模流路系には、マイクロ試料を反応室へ移すに先立って当該試料における細胞を崩壊させるために、突起ないし断面減少部位を設けておいてもよい。シリコンの尖鋭片を流路に設けて、これをもって崩壊手段としてもよい。また、中規模流路系には結合成分があってもよく、その場合、例えば流路の壁部に当該結合成分を固定させて比較的低流量で不均質細胞群における特定の細胞を結合させると共に、それよりも多い流量で、或いは溶媒の特性を変えることにより、細胞崩壊部域へ細胞を移すに先立って細胞型を反応室に放出する。この実施の形態にあっては、細胞内ＤＮＡないしＲＮＡが選ばれた細胞群から単離されて、一つの装置でのポリヌクレオチド分析のために中規模反応室へと移される。別の実施の形態では、後述するようにラテックスや磁性ビードの如くの固形粒子に結合試薬を固定してもよい。
【００３２】
ポリヌクレオチドプローブを塗布した磁性ビードの如くの複合体形成剤を中規模流路系に設けて、例えば器具における外部磁界で流路系を移動できるようにしてもよい。磁性ビードに固定したポリヌクレオチドプローブは、ビードをして反応室もしくは別の検出室における増幅したポリヌクレオチドに結合させることができる。固定したポリヌクレオチドプローブを含む磁性ビードは、アッセイの終わりに例えば流路系に搬送させるか、又は、反応室に導入して増幅したポリヌクレオチド生成物に結合させる。その後、結合したポリヌクレオチドを磁性ビードに吸着された形で、流路系の検出ないし精製室へ、或いは、回収ポートへ移す。別の方法としては、磁性ビードを装置の所定位置に保持して、ポリヌクレオチド生成物と結合した後に検出ないし精製室へ移送してもよい。
【００３３】
本発明のよる装置の幾つかの特徴と利点を表１に示す。この装置は、病原性細菌ないしウイルスの検出、ある細胞型の有無、細胞における遺伝子ないし組換えＤＮＡ配列の存在などを速やかに調べることができる。本明細書において開示する装置はすべて、中規模流路系がポリヌクレオチド増幅反応室、好ましくは少なくとの一つの中規模寸法を有するポリヌクレオチド増幅反応室を備えており、これが試料におけるポリヌクレオチドを増幅させるのに用いられると共に、必要な増幅試薬を含ませることができるようになっている点を特徴としている。また、装置は、ポリヌクレオチドを増幅させるのに広範囲の用途で用いることができる。アッセイが終わると、装置は捨ててもよいし、又は、洗浄した後に再使用に供してもよい。
【００３４】
【表１】
2007050008.tif 000003
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
（詳細な説明）
Ａ．概  論
それぞれの図面における同一符号は同一部品を示している。図面は必ずしも実物寸を示しているのではない。
【００３６】
本発明は、流体試料においてポリヌクレオチドを急速増幅させることのできるポリヌクレオチド増幅反応を行うための小型で、大量生産し得る一般に使捨て式の装置類を提供するものである。装置は、少なくとも一つのポリヌクレオチド増幅反応室を有するように組み立てた固体基板からなり、一般に長さと幅の何れか一方、または両方が約０．１〜５．０センチとなっている。装置の厚み方向に沿った断面での流路と室は三角形であってもよく、截頭円錘形、四角形、矩形、円形であってもよいし、その他の適当な形状であってもよい。この装置には、反応室と連通した試料入力ポートが備わっている。また、装置には、流路系のどこか適当なところに設けた別のポート（アクセス用ポート、入出力ポート、もしくはベントとして作用するものであってもよい）と、反応室と連通した一つかそれ以上の試料流路とを備えている。一つかそれ以上のポートは、大気に開放されていてもよいし、または、例えば装置を充填させる、或いは真空にさせるための適当な加圧装置ないし吸引装置に接続してもよいし、更には、例えば増幅反応時にシールするようにしてもよい。ポートと流路とは、基板上に形成してもよく、別の方法としては、基板上に配置したカバーに形成してもよく、或いは両方に形成してもよい。また、反応室の内容物を熱サイクルにかけて試料としてのポリヌクレオチドの増幅を行わしめるシステムを装置に設けていてもよい。
【００３７】
装置の反応室と流路の何れか少なくとも一方、好ましくは両方は、中規模の寸法を有している、即ち、少なくとも一つの断面寸法が０．１〜１，０００ミクロン程度となっている。反応室の深さとしては約５００ミクロン以下が望ましく、３００ミクロン以下がより望ましく、８０ミクロン以下の方がもっと望ましい。これらの反応室の幅と長さとは大きいのが望ましく、例えば約１〜２０ミリ程度が望ましく、約５〜１５ミリの方がより望ましい。
【００３８】
反応室の深さが浅いと、例えば基板近傍に定置させたヒーターから反応室の内容物への熱伝達が良好に行われて、増幅反応時での熱サイクルが効率的に行える利点がある。一実施の形態では、反応室は、当該反応室の体積に対する当該反応室の壁の表面積の比が約３ｍｍ２／μｌから約１０ｍｍ２／μｌ以上の範囲になるように形成されている。この体積に対する表面積の比が増大すると、基板を介しての熱伝達と反応の熱サイクルの効率が高まる。しかし、増幅反応時に基板の壁部による潜在的な阻害作用が、基板の素材によっては増加することがある。従って、当該処理が行われる反応室の壁面の阻害作用を減少させるのに有用な組成物、例えばシリコーンを壁面に設けている。
【００３９】
反応室の壁部による増幅反応に対する阻害作用を減少させるために用いた組成物は、反応室表面に共有結合させるか、または非共有結合させてもよい。別の方法としては、増幅反応時に当該組成物を溶液の形で反応室に臨むようにしてもよい。一実施の形態では、中規模流路と反応室とはシリコン基板に形成してもよい。反応室と流路の何れか一方、または両方の壁部には、装置におけるシリコン表面による反応阻害作用を減少させる組成物を塗布しておいてもよい。例えば、装置のシリコン表面に、ここに開示するように従来より入手可能な種々のシラン化(silanizing)試薬のどれかを塗布しておいてもよい。
【００４０】
一実施の形態では、本発明の装置は、反応室でポリメラーゼ連鎖反応を行うのに用いることができる。この反応室には、試料としてのポリヌクレオチド、Ｔａｑポリメラーゼの如くのポリメラーゼ、ヌクレオシド・トリホスフェート、試料としてのポリヌクレオチドとハイブリッド化可能な第１プライマー、ポリヌクレオチドと相補的な配列とハイブリッド化可能な第２プライマーなどを含む、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬が設けられており、前記第１及び第２プライマーは共重合製品としてのポリヌクレオチドの末端を形成している。試料に試薬を添加して、中規模反応室の入力ポートを介して配分してもよく、または、試料とは別に別の入力ポートを介して反応室に試薬を配分するようにしてもよい。
【００４１】
ポリメラーゼ連鎖反応は、従来より確立されている方法（1989年コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社発行、マニチス等による「分子クローニング：研究の手引き」(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboaratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に従って行ってもよい。その際従来より入手可能な熱安定性ポリヌクレオチド・ポリメラーゼを用いてもよい。装置としては、各サイクルにおいて温度を制御することにより二本鎖ポリヌクレオチドのハイブリッドを遊離させて単鎖ポリヌクレオチドを生成し、その後プライマーをアニーリングしてポリヌクレオチドの重合作用を惹起するように反応室の内容物を熱サイクルにかける手段を備えていてもよい。
【００４２】
本明細書ではポリメラーゼ連鎖反応によるポリヌクレオチド増幅作用を例示すると共にそれについて説明しているが、当業者には、本発明の装置と方法とは種々のその他のポリヌクレオチド増幅反応に等しくかつ効果的に適用できることは容易に理解される所である。そのような別の反応はポリメラーゼ連鎖反応の如く熱依存性であるか、または、一つの温度値において行われることがある（例えば、核酸配列依存増幅作用（ＮＡＳＢＡ））。更に、このような反応では、ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などを一例とする酵素と広範囲の増幅試薬とを用いてもよい。また、ポリヌクレオチドの変成は、温度変化を伴う、或いは伴わない公知の化学的ないし物理的な方法により達成できる。本発明の装置で行うポリヌクレオチド増幅反応法には、必ずしもこれに限られるものではないが、(１)自己持続配列複製法（３ＳＲ）や鎖置換増幅法（ＳＤＡ）の如くの目的ポリヌクレオチド増幅法、(２)「分岐鎖」ＤＮＡ増幅法（カリフォルニア州エメリーヴィル所在のチロン社）の如くの、目的ポリヌクレオチドについている信号の増幅に基づく方法、(３)リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）やＱＢレプリカーゼ増幅（ＱＢＲ）の如くの、プローブＤＮＡの増幅に基づく方法、(４)連鎖反応による転写（ＬＡＴ）や核酸配列依存増幅の如くの転写依存法(transcription-based methods)、(５)修復連鎖反応（ＲＣＲ）や循環プローブ反応（ＣＰＲ）の如くの種々のその他の方法（これらの方法の概要と出所については、ニュージャージ州モンクレアー所在のジェネシスグループの「The Genesis Report」、DX、Vol. 3、No.4、1994年２月発行の第２頁から第７頁を参照されたし）が挙げられる。
【００４３】
本発明の装置の容積は小さく、極少量（例えば、５０マイクロリットル以下、好ましくは１０マイクロリットル以下）の液体試料について分析を行うことができるようになっている。この装置の中規模流路システムは、マイクロリットルのオーダーの容積、または別の方法としてナノメーターのオーダーの容積を有するようにミクロ形成(microfabrication)されていてもよく、これにより分析に必要な液体試料と液体試薬の何れか一方、または両方の量を制限できる利点がある。この装置は、細胞や溶液内のポリヌクレオチドの分析を含む種々のポリヌクレオチド分析を高感度にて自動的かつ高速にて行うのに用いることができる。分析が終わると、装置は清浄した上で再使用してもよいし、または捨ててもよい。使捨て式装置を用いれば、汚染を避けることができ、バイオハザードを減らすことができる。試料と反応混合物とは常時、閉じこめられており、体積が小さいことから廃物処理が簡単にできる。
【００４４】
Ｂ．基板形成
固体基板と好みに応じて用いる基板上のカバーとからなる分析装置は、広範囲の材料を利用して中規模流路と反応室をと備えて形成することができる。所望によっては、容易に滅菌できる材料で構成してもよい。シリコンは、その精密かつ有効な製造ができる技術が充分発展していることから有用な材料であるが、広範囲のその他の材料でも本発明の範囲において利用できる。利用できるその他の材料としては、例えばポリシリコン、窒化シリコン、二酸化シリコン、ポリイミド、クロームないしアルミの如くの熱電対材、並びに水晶、ガラス、ダイヤモンド、ポリカーボネート、ポリスチレン、及びポリテトラフルオロエチレンの如くのその他のポリマーなどが挙げられる。その他に考えられる材料としては、超合金、ジルカロイ、鋼、金、銀、銅、タングステン、モリブデン、タンタル、コバール(KOVAR)、セラミック、ケブラー(KEVLAR)、カプトン(KAPTON)、マイラー(MYLAR)、黄銅、サファイア、それに、従来より入手可能な広範囲のプラスチック材や有機ポリマー材が挙げられる。
【００４５】
ポートや、試料流路と反応室を含む中規模流路系、及びその他の機能要素などは、当業者にはよく知られている種々のミクロ機械加工法を用いることにより、例えばシリコン基板から低廉にて大量製造することができる。知られているミクロ機械加工法としては、化学蒸着法の如くの膜蒸着法、レーザーに依る形成法ないし、紫外線照射法、Ｘ線照射法、LIGA法の如くの光食刻法、プラスチック成型法、湿式化学法ないしプラズマ法の何れかで行うエッチング法などが挙げられる。（一例として、マンズ等によるTrends in Analytical Chemistry（分析化学の傾向）、10: 144-149 (1991)を参照されたし。）流路や反応室、及び複数のポートの配置は、装置内で試料と試薬とを順次、適切なタイミングに定量的に正確な添加が行えるようにする。
【００４６】
一実施の形態では、種々の幅と深さの流路ないし室をシリコンの如くの基板に形成するが、少なくとも何れか一方は中規模寸法となっている。形成した中規模流路と反応室とを有する基板は、ガラス製カバーで覆ってシールしてもよく、その際、ガラス製カバーは基板にクランプするか、陽極酸化法で結合させるか、またはその他の方法で取り付けてもよい。その他の透明ないし不透明材料をカバーの材料として用いてもよい。別の方法としては、二枚の基板を挟持させるか、二つのガラス製カバーの間に一枚の基板を挟持させてもよい。透明カバーを利用すれば、中規模流路系における内容物を活発に観察する窓が得られることになる。その他の製造方法を利用することもできる。
【００４７】
Ｃ．不動態化法(Passivation Method)
中規模増幅反応室または流路に、その壁部を構成している材料が斯かる処理を必要とするのであれば、その壁部の壁面を不動態化するために、即ち、壁面による増幅反応阻害作用をなくすために組成物を設けてもよい。この組成物は反応室または流路の壁部の表面に共有結合させるか、または非共有結合させてもよい。例えば、壁面に従来より知られている広範囲のシラン化材のどれかを塗布してもよい。別の方法としては、分析時に当該組成物を溶液の形で、試料としてのポリヌクレオチドと増幅試薬と一緒に反応室に臨むようにしてもよい。中規模反応室は、当該反応室の体積に対する当該反応室を形成する壁の表面積の比が約３ｍｍ２／μｌから約１０ｍｍ２／μｌ以上、所望に応じては２０ｍｍ２／μｌ以上の範囲になるように形成されている。この体積に対する表面積の比が増大すると、基板を介しての熱伝達が促進されると共に、熱依存製増幅反応が一層急速に循環させられる。但し、体積に対する表面積の比が増大すると、それと同時に壁面の阻害作用も著しくなることがある。反応室の壁部による増幅阻害作用を減少させる組成物は、体積に対する表面積の比が大きい、例えば約３ｍｍ２／μｌより大きい反応室には特に有用である。
【００４８】
ここで説明する不動態化用組成物とその方法とは、反応室の表面を不動態化すると増幅反応が向上することが観察されるある材料に対してしか適用できないことが、当業者には知られているところである。本発明の装置で用いることが考えられるある材料はもとより不活性であり、それが故に、ここで説明する不動態化処理を施しても利益はないこともあり得る。
【００４９】
基板は、シリコンないしガラスの如きの熱伝導性材料で構成してもよい。反応室と流路の何れか一方、または両方の壁部は、その表面に従来公知のシラン化材を用いてシランで塗布することにより不動態化してもよい。有用なシラン化材としては、ジメチルクロロシラン（ＤＭＣＳ）や、ジメチルジクロロシラン（ＤＭＤＣＳ）、ヘキサメチルジシラザン(hexamethyldisilazane)（ＨＭＤＳ）、トリメチルクロロシラン（ＴＭＣＳ）などが挙げられる。これらのクロロシランは、シリコンないし、例えば試料としてのポリヌクレオチドまたは増幅試薬と結合することにより反応と干渉すると思われる他の材料からなる壁部の表面のヒドロキシル基と共有結合反応する。
【００５０】
また、反応室と流路の何れか一方、または両方の壁部には、例えば「Aquasil」（イリノイ州ロックフォード所在のピアース社の商標名、「アクアジル」）、「Surfasil」（イリノイ州ロックフォード所在のピアース社の商標名、「サーファジル」）、「Sigmacote」（ミズーリ州セントルイス所在のシグマ社の商標名、「シグマコート」）の如きの市販のシリコーン化試薬を用いてシリコーン被膜を設けておいてもよい。ピアース社（イリノイ州ロックフォード所在）や、シグマ化学社（ミズーリ州セントルイス所在）の如きの会社から市販されているシリコーン化試薬は、加水分解基(hydrolyzable group)を含有するオルガノシランであって、溶液状態で加水分解してシラノールを生成するが、これも重合して反応室の表面に膜を形成すると共に、反応室の表面におけるヒドロキシル基と反応するから、反応室の全ての表面に膜がしっかりと密着して形成される。
【００５１】
塗布膜は、増幅反応時での反応室の壁部の阻害作用を減少させるために、当該塗布膜と非共有結合ないし共有結合するマクロ分子を含んでいてもよい。有用なマクロ分子としては、アミノ酸ポリマー、もしくは、ポリビニールピロリドン(polyvinylpyrrolidone)、ポリアデニル酸(polyadenylic acid)、ポリマレイミド(polymaleimide)の如きのポリマー、マレイミドの如くの組成物などが挙げられる。その他の有用なマクロ分子として、例えばポリ-Ｌ-アラミン、ポリ-Ｌ-アスパラギン酸、ポリグリシン、ポリ-Ｌ-フェニルアラニン、ないしポリ-Ｌ-トリプトファンがある。シリコン塗布壁面に依る増幅阻害作用を減少させるために、シリコン酸化膜を反応室と流路の何れか一方、または両方の壁部に設けてもよい。このシリコン酸化膜は、酸素の存在のもとで基板を加熱する熱的方法で形成することができる。別の方法としては、プラズマ酸化促進法や化学蒸着法を用いてもよい。また、反応室と流路の何れか一方、または両方の壁部に、塩化ポリビニールの如くのポリマーを塗布してもよい。例えば、クロロホルムに溶解した塩化ポリビニール溶液を中規模流路系に付けて、溶媒を蒸散させて塗布膜を形成する方法も利用できる。
【００５２】
別の実施の形態では、ポリヌクレオチドやポリペプチドの如きのブロッキング剤を反応室に添加してもよい。例えば、反応室における溶液にゲノムＤＮＡまたはポリアデニル酸を、試料としてのポリヌクレオチドの濃度よりも好ましくは高い濃度で添加してもよい。こうすることにより、ポリヌクレオチドが試料としてのポリヌクレオチド又は分析試薬と潜在的に結合して反応の歩留まり(yield)を減少させると思われる壁面上の部位に付着する。ブロッキング用ポリヌクレオチドとしてＤＮＡ又はＲＮＡを用いると、増幅反応と干渉する配列を効果的に排除する（即ち、試料としてのポリヌクレオチドの配列に関係のない配列だけを有するようになる）。ブロック剤として利用できるその他の組成物としては、ウシ乳漿アルブミン、アミノ酸ポリマー、ポリビニールピロリドンの如きのポリマー、ポリマレイミド、マレイミドの如くの組成物などが挙げられる。
【００５３】
Ｄ．熱循環(Thermal Cycling)
ＰＣＲ反応の如きのポリヌクレオチド増幅反応は、図１Ａと図２Ａに示した装置１０の反応室で行われる。装置１０の別の実施の形態を図１Ｂと図２Ｂとに示している。図１Ａ、図１Ｂ、図２Ａ、図２Ｂに概略的に図示したように、装置１０は、入力ポート１６、中規模流路２０、反応室２２とがミクロ形成(microfabricated)されているシリコン基板１４からなる。ポリヌクレオチド試料と重合反応に必要な試薬とを添加して、流路２０の一端に形成した入力ポート１６を経て反応室２２から流路２０を介して生成物を取り出す（必要に応じて）。基板１４は、例えばガラスないしプラスチック製のカバー１２に覆われている。この装置１０は、図３Ａに概略的に図示した器具５０の如くの器具と組み合わせて用いてもよい。器具５０は、装置１０を保持すると共に、例えば装置１０のポート１６の如くのポートを器具内の液体路５６と接続する収納部５８を備えている。この器具５０のポンプ５２は、器具の液体路５６から入力ポート１６を介して反応室２２へ試料と試薬の何れか一方、又は両方を送り込むのに用いる。
【００５４】
器具５０には、ＰＣＲ室の温度を制御するために、例えば電気加熱素子と冷却コイルの何れか一方、又は両方の如くの加熱冷却素子５７を備えていてもよい。電気加熱素子はこれを基板に集積してもよく、その場合、器具における電気接点と接続する電力供給接点は反応室２２の下方に設ける。別の方法としては図３Ｂに示すように、レーザー、ペルチェヒーター、電磁エネルギー源の如くの加熱手段５３を装置１０における反応室の上方もしくは近傍に設けてもよい。また、ヒーターは反応室の下方において器具に設けてもよい。器具のマイクロプロセッサーは、ハイブリッドを遊離させるのに適した例えば９４℃の温度と、アニーリングと重合作用に適した例えば４０〜６０℃（アニーリングの場合）ないし７０〜７５℃（重合作用の場合）の温度との間に亙って増幅室に温度サイクルを与えるために、加熱素子を制御するのに用いられている。熱電対、サーミスターもしくは抵抗温度計を器具と電気接触した状態で基板に設けて、マイクロプロセッサーが反応室の温度サイクルを検出して維持するようにしてもよい。加熱と検出の両作用は、例えば抵抗温度計の如くの両作用を兼ねた一つの素子を用いることにより、組み合わせることができ、その場合、加熱作用と検出作用とは同時に行われたり、或いは多重方式で行わせることができる。
【００５５】
熱電気ヒートポンプ（ニュージャージ州トレントン所在のMaterials Electronic Products社製）、ペルチェ熱電対、ジュール・トンプソン冷却装置の如くの冷却素子も、反応室の温度を調節するために器具に具備させてもよい。別の実施の形態では、図３Ｂに示した器具においては、反応室の温度はガラス製カバー１２を介して反応室に指向させた同調レーザーパルス(timmed laser pulse)で制御して、ポリヌクレオチド増幅サイクルに必要な温度まで試料を順次加熱、冷却している。
【００５６】
また、加熱作用と冷却作用とは、両作用を行うペルチェ熱電対を用いることにより組み合わせることができる。シリコンの熱特性により加熱・冷却サイクルを急速に行うことができる。前記した体積に対する表面積の比が大きい、たとえは３ｍｍ２／μｌより大きい反応室を用いることは、反応室の内容物に対する熱伝導が促進されることから、有利である。これにより熱循環の効率や反応室内での増幅作用の生産性が高まる。
【００５７】
図４、図５、図６Ａに概略的に示したように、中規模ポリヌクレオチド増幅反応室は、流路２０Ｂで互いに連通した複数の部分、例えば二つの部分２２Ａ、２２Ｂからなるものとしてミクロ形成してもよい。この実施の形態においては、部分２２Ａは、ハイブリッドの遊離に適した温度に加熱ないし維持しておき、部分２２Ｂはアニーリングと重合作用に適した温度に加熱ないし維持しておくこともできる。分析時には、器具５０（図６Ａ）に装置２０を載置する。器具５０には反応室部分の温度を制御する手段５７が備わっている。別の方法としては、反応室部分を加熱するのにレーザーを用いてもよい。熱電対ないしその他の温度検出装置を基板に設けて、反応室の部分の温度をモニターするようにしてもよく、その場合での出力信号はマイクロプロセッサーを借りて熱入力を制御するのに用いてもよい。
【００５８】
操作するに当たっては、器具におけるポンプ５２を用いて試料としてのポリヌクレオチドと必要な試薬とを液体路５６から入力ポート１６Ａを介して部分２２Ａへ供給する。器具におけるマイクロプロセッサーにより制御されるようになっているポンプ５２は試料を流路２０Ｂを介して部分２２Ａと部分２２Ｂとの間で周期的に移送させるのにも使われており、こうすることによりポリヌクレオチド増幅反応サイクルを繰り返して行わせることができる。この時ポート１６Ｂはベントとして作用する。反応が終わると、器具５０におけるポンプ５２を利用して、ポート１５Ｂを介して器具の液体路５６を経てポート５９から生成物を取り出す。言うまでもないことではあるが、反応室は三室かそれ以上用いることもでき、その場合各室の温度を特定の反応を行わせるのに適当な温度に維持する。
【００５９】
図４、図５、図６Ｂに示した装置１０では、部分２２Ａを二本鎖ＤＮＡのハイブリッドを遊離させるのに適当な温度、例えば９４℃まで加熱するのに加熱素子を用いるが、部分２２Ｂと、部分２２Ａと部分２２Ｂとを連通させる流路２０Ｂとは部分２２Ａから隔離して、部分２２Ａから部分２２Ｂに加熱された試料が移送されると、試料が次のサイクルに備えて部分２２Ａに戻される前に当該試料の熱が発散してアニーリングと重合作用に必要な温度まで試料の温度が降下するようにしてもよい。これは、シリコンが比較的高い熱伝導性を有している一方、液体試料と基板との間の界面の面積が大きいことから容易に達成できる。この実施の形態にあっては、器具５０のマイクロプロセッサーは、部分２２Ａと部分２２Ｂとの間での流れサイクルを規制するポンプ５２を制御するのに利用する。従って、反応室間での流路に沿って、ダイナミックな熱平衡作用により温度勾配が醸し出され、一つの加熱源を用いるだけで両反応室に適切な温度が得られるようになる。他の構成も考えられる。例えば、アニーリングと重合反応とを一つの反応室の異なった部分で、それぞれを最適温度に設定して行うようにすることも考えられる。
【００６０】
Ｅ．シール液移送ポート
装置は、中規模ポリヌクレオチド増幅室を備えて固体基板で構成されている。また、少なくとも一つの試料入力ポートと、該入力ポートを反応室に連通させる試料流路をも装置に含まれている。装置における一つかそれ以上のポートと流路とは基板に形成してもよく（図１Ａ）、又は、基板に配置したカバーに形成してもよい（図１Ｃ）。カバーは、例えばガラスとか、従来より入手可能な広範囲のプラスチック材の如くの透明材料で構成してもよい。
【００６１】
本発明は、熱循環時に液体が蒸発するのを防ぐために、増幅反応時に一つかそれ以上のポートをシールする手段を提供している。一実施の形態では、ポートを介して反応室へ、或いは反応室から液体を送出する液体供給装置が設けられており、この液体供給装置はポートと密着ないし相互ロックされるようになっていると共に、反応室へ液体を供給した後にポートをシールするようになっている。液体供給装置として、基板における液体入出ポートと密着してシールすることのできる注入器ないしピペットを用いることができる。
【００６２】
図１９と図２２に示したように、一実施の形態では、ピペット８６を気密に受承するための空洞８７をカバー１２に形成している。ピペット８６にはピペット先端８４があって、このピペット先端８４には、ピペットを空洞８７に差し込むと、当該先端８４からカバーにおける流路２０Ａを介して基板１４における流路２０Ｂと増幅反応室２２へと液体を流入させるための孔８８が形成されている。所望によっては、ピペット先端は、ピペットに対して取外し自在にして、試料が汚染されるのを防ぐために使捨てにしてもよい。
【００６３】
図２０に示したように、孔８８は、ピペット先端８４の側壁に形成して、ピペットが図２２に示した装置１０の空洞８７に挿入されると、ピペット先端が孔８８から流路２０Ａを介して反応室２２へと液体が流入する第１位置と、孔が空洞８７の壁部に対面して流路２０Ａと反応室２２とを反応時にシールする第２位置との間を移動し得るようにする。また、図２１に示すように押込み自在部材８５を、基板から延在するように設けて、当該部材８５を押し込むとポートがシールされるようにしてもよい。
【００６４】
前述したようにシール液体移送ポートを備えてなる装置は、ポリヌクレオチド増幅以外の種々の目的に利用することができる。例えば同時係属の出願（出願番号は未着）に開示されているように試料調製、イムノアッセイ、或いは両方を行う別の装置に前述した如くのポートを設けてもよい。
【００６５】
Ｆ．増幅したポリヌクレオチドの検出
反応室にある増幅したポリヌクレオチドは、従来公知のポリヌクレオチド検出方法、例えば臭化エチジウムの存在の下でアガロースゲルの電気泳動法などにより検出できる。一実施の形態では、増幅されたポリヌクレオチドの生成物は、その検出のために開発されている市販の試薬（例えば、パーキン・エルマー社の商標名「Taq Man（タクマン）」試薬）を用いることで反応室において直接検出できる。装置には、基板か、又はこの基板と一緒に使う器具に設けた形で、増幅したポリヌクレオチドを検出する手段が備わっている。装置における増幅したポリヌクレオチド生成物の存在は、必ずしもこれに限られるものではないが、(１)中規模流路系を流入出する試料液の圧力ないし導電性をモニターする、(２)例えばポリヌクレオチド生成物を標識したプローブに結合させることにより、例えば標識オリゴノヌクレオチドないし抗体プローブの如きの検出可能複合体を形成する、(３)ポリヌクレオチド生成物を反応体と試料のその他の成分とから電気泳動法により分離することからなる種々の方法を用いることにより検出できる。
【００６６】
分析装置は、装置における中規模流路の内容物を観察する器具と一緒に用いることもできる。一実施の形態でのその器具は、装置の中規模流路の内容物を観察する顕微鏡からなる。別の実施の形態としては、図１７と図１８に概略的に示した器具６０における器具にカメラを具備させている。器具６０は、ハウジング６２と、観察スクリーン６４と、装置を器具に挿入するスロット６６とからなる。図１８において断面図で示したように、器具６０には、ビデオカメラ６８と、光学系７０と、装置１０を保持すると共に、装置１０の位置と角度とを手動調節できるようにしたチルト機構７２をも備わっていてもよい。光学系７０は流路の内容物を拡大するレンズ系と光源とからなる。ビデオカメラ６８とスクリーン６４とは、ポリヌクレオチド増幅生成物の存在により惹起された流れ特性ないし色とかの試料液の性質の変化が視覚的にモニターできるようにしていると共に、所望に応じては器具を用いることによりその変化が記録できるようになっている。また、液体試料の反応室への添加と、そこから取り出しも、例えば器具を用いることにより光学的にモニターすることができる。
【００６７】
一実施の形態では、基板において反応室と連通した状態で中規模流路系に検出室を形成することにより、増幅したポリヌクレオチド生成物を検出することができる。この検出室には、例えば増幅したポリヌクレオチドに結合して検出可能複合体を形成する結合成分(binding moiety)の如くの複合体生成剤を設けていてもよい。この結合成分としては、例えばポリヌクレオチドないし抗体プローブがある。検出室は、1992年５月１日に出願した米国特許出願第07/877,702号に開示した方法に従って形成してもよい。別の実施の形態にあっては、反応が終わった後に反応室に複合体生成剤を添加して、その検出において検出可能複合体を生成してもよい。装置は、アッセイ時に得られたデータを検出記録するマイクロプロセッサーを含む器具の如くの検出器と一緒に利用してもよい。
【００６８】
一実施の形態では、中規模検出室に、例えばビードないしその他の粒子の如く、ポリヌクレオチドに結合できる不活性基体(inert substrate)を設けて、重合したポリヌクレオチド生成物の存在の下でビードが検出し得る凝集を起こすようにしてもよい。粒子が形成する凝集は、抗体とかの結合成分をその粒子に付着させると一層促進される。
【００６９】
ポリヌクレオチド生成物に結合し得る抗体ないしその他の結合成分は、検出に導入するか、化学的又は吸着法により検出部域の表面に塗布する、別の方法としては検出部域における不活性粒子の表面に塗布させることにより、結合作用が行われるようにしてもよく、これによりポリヌクレオチドの正の調節(positive test)が出るようにすることができる。シラン化表面(silaceous surface)の化学的活性化の技法は、特にクロマトグラフィーの分野で開発されている。（例えばニューヨーク州のJohn Wiley社から出版されているＷ．Ｈ．スカウテンを編者とする「Solid Phase Biochemistry（固相生化学）」におけるハラー、pp535-597 (1983)、「Anal. Biochem.（分析生化学） 170」、68-72 (1988)におけるマンデニアス等を参照のこと）。一実施の形態では、結合成分は抗体からなり、従来公知のイムノアッセイ法を検出部域で行っている。（例えば、イムノアッセイの概論については、オックスフォードのブラックウェル科学出版社から1986年に出版されているボルトン等による「Handbook of Experimental Immunology（実験免疫学便覧）」、第１巻第２６章を参照のこと）。
【００７０】
蛍光分子ないし蛍光ビードの如くの光学検出可能な標識を結合成分に付けることで、増幅したポリヌクレオチド生成物の検出を容易にしてもよい。別の方法としては、蛍光標識抗体の如くの二番目に標識した物質を流路系を介して供給して、検出部域においてポリヌクレオチドと結合成分との結合複合体に結合させ、これにより、分析質(analyte)の存在を表す光学的検出可能な成分(moiety)を含む「サンドイッチ」が出るようにしている。検出部域における結合成分への増幅したポリヌクレオチドの結合作用は、例えば光学的、つまり視覚的又は機械により検出部域を覆う透明窓を介して検出できる。一実施の形態では、二本鎖ポリヌクレオチドに結合すると蛍光発光が高まる臭化エチジウムの如きの染料を添加することにより、増幅したポリヌクレオチドの生成を検出することができる。ヒグチ等による「Biotechnology（バイオテクノロジー）」、10: 413 (1992)を参照のこと。
【００７１】
検出室には、例えばビードに固定した標識ポリヌクレオチドの如きの、増幅したポリヌクレオチドの鎖の内の一本に結合し得る標識した相補的ポリヌクレオチドを設けて、ビード凝集により増幅したポリヌクレオチド生成物が検出できるようにしてもよい。従来より知られているポリヌクレオチドのハイブリッド化法を利用することもできる。コールド・スプリング・ハーバー出版社から1989年に出版されているマニアチス等による「Molecular Cloning: A Laboratory Manual（分子クローニング：研究の手引き）」第２版、「Anal. Chem.（分析化学）」、198: 303-311 (1991)におけるヴェナー等を参照のこと。ポリヌクレオチドプローブを、例えばサブミクロンのラテックス粒子に付着させてもよい。ウォールフ等による「Nucleic Acids Research（核酸研究）」、15: 2911-2926(1987)を参照のこと。
【００７２】
別の実施の形態においては、本発明の中規模装置に適した電気泳動法により反応物と元の試料の成分からポリヌクレオチド増幅生成物を分離している。そのような方法は従来公知である。例えば、ＤＮＡ分子を電気泳動法で分離するために二酸化シリコンにマイクロリトグラフアレーが工夫されている（「Nature（自然）」、358: 600-602, 1992におけるフォークマスとオースチンを参照のこと。また、毛細管電気泳動を行って種々の生物学的分子を分離するために種々の流路の組合せをガラスチップにミクロ形成している。（「Science（科学）」、261: 895-897, 1993におけるハリソン等を参照のこと）。
【００７３】
この実施の形態では、本発明の装置には、流路のマイクロリトグラフアレーないし群からなる検出部域が形成されていて、この検出部域に適当な電界を惹起することで（例えば、検出部域の何れかの端部に微小電極を設けることで）チップ上で電気泳動が行えるようにしている。検出部域の一端には、電気泳動を行うに先立って反応室の内容物を収集する充填部域が設けられている。反応混合物の種々の成分を電気泳動法により互いに分離する。ポリヌクレオチド増幅生成物は、既知の大きさの分子と寸法を比較することにより識別できる。一実施の形態では、寸法マーカーを検出部域に（アクセスポートを介して）導入して、電気泳動により分離し、結果を（例えばコンピューターのメモリーに）記録保存している。その後、反応室の内容物を検出部域へ移して、電気泳動により分離し、結果を記録すると共に、寸法マーカーの電気泳動で得た結果と比較する。このようにして、ポリヌクレオチド増幅生成物を識別すると共に、後日の利用に備えて精製するが、その際、ポリヌクレオチド生成物を捕捉するのに不活性物質や結合成分は用いない。
【００７４】
ポリヌクレオチド増幅作用は、米国特許出願第08/250,100号に開示されているように反応室で精製するポリヌクレオチドの存在により惹起される流れ抵抗(flow restriction)に敏感な検出部域を用いることによっても検出できる。また、増幅されたポリヌクレオチドも、流路系を流入出する液体試料の圧力又は導電性を検出することにより検出することもできる。導電性は、例えば基板を延在して、装置と共に用いる器具における電気接点と接続した電気接点を用いることにより測定できる。電気接点は、公知の方法、例えば熱勾配部位溶融の種々の方法で形成することができる。（1986年開催のワシントンにおけるＡＣＳシンポジウムシリーズ309の第２頁、ディ．シューツルとアル．ハッマールを編者とする「Fundamentals and Applications of Chemical Sensors（化学センサーの基本とその応用）」におけるゼメル等を参照のこと）。
【００７５】
反応室における増幅されたポリヌクレオチドは、試料液の圧力をモニターすることにより検出できる。例えば、図６Ａに概略的に示したように器具５０に収納させた装置１０にあっては、ポート１６を介して流路系に流入出する試料液に連携させた圧力検出器５４で、重合生成物の存在とそれに伴う流れ詰まりないし流れ抵抗により惹起された圧力降下を検出することができる。中規模圧力検出器も、シリコン基板上に直接形成してもよい。「Scientific American（アメリカの科学人）」、248: 44-55 (1983)。
【００７６】
ポリヌクレオチド増幅作用は、「フラクタル」パターン、即ち、発散流路(diverging flow channel)パターンと共に構成した、流れ抵抗に敏感な中規模流路系を用いて検出することができる。この場合での流路はシリコン基板上に、寸法が漸次減少して漸次狭い流路として形成する。尚、分岐流路を一例として例示しているが、当業者には、異なった数の平行流路、又は、断面積が減少した流路の対称もしくは非対称パターンを備えた形で装置を構成することが容易に考えられる所である。別の方法としては、本願出願人が有する米国特許出願第08/250,100号に開示されているように、狭部域を有する一本の流路を用いてもよい。
【００７７】
図７は、ポート１６と、部分２２Ａと部分２２Ｂとからなる反応室とに流路２０を介して連通させた流路４０の系が形成された基板１４の概略平面図を示している。試料に増幅したポリヌクレオチド生成物が存在していると、流路における流れ特性に影響が及ぶ。この実施の形態における流路４０は、対称配置になっていると共に、パターンの中心へ行くに従って直径が漸次減少している。この流路パターンでの流れは、増幅したポリヌクレオチド生成物の存在により惹起される流体粘性の変化に敏感である。別の方法として、図１３に示したようにもっと複雑な流路系を用いることもできる。図１３は、一対の流路系４０Ａと４０Ｂとを示している。流路系４０Ａは、パターンの中心へ行くに従って漸次狭くなる流路として形成されているので、流れ抵抗に対する感度を高めている。
【００７８】
流れ抵抗は、検出部域の上方を覆う透明カバーを介して例えば光学的に検出できる。別の方法としては、一つかそれ以上の圧力検出器を用いて、流れ抵抗の発生した流路部分又はその下流側での増幅したポリヌクレオチドの堆積による流れ特性の変化により惹起される圧力変化を検出してもよい。ポリヌクレオチドが増幅されるときでの導電性の変化をも、流れ部位に臨ませた電気導電性検出器で容易に検出できる。例えば、入力ポート１６Ａから出力ポート１６Ｂへと連なる流路での流れ抵抗の発生した部域４０における詰まりは、従来公知の導電性プローブ１７で検出することができ、その時のプローブ１７からの出力信号は、流出路における水ないし水溶液の有無を表すものとなる。標識抗体や標識ポリヌクレオチドプローブの如きの結合成分を流れ抵抗発生部域に、例えば不動化して臨ませてもよく、又は、ビードの如くの固相反応物に付着させてもよく、何れにしても増幅したポリヌクレオチドに結合して、流れ抵抗発生部域で流量減少障碍(flow reduction restriction)を生ずるようになる。
【００７９】
一実施の形態では、中規模流路系には、下流側でのポリヌクレオチド分析に備えて試料から細胞を崩壊(lysing)させる崩壊室を設けている。また、装置にはヘテロゴニーの細胞群から特定の細胞だけを分離する部域が設けられている。細胞分離部域には、基板内の構造体上に結合成分が固定されていて、選択的かつ可逆的に目的細胞を蛋白質の如くの特異細胞表面分子を介して結合するようになっている。試料におけるその他の細胞は、下流へと通過して出力ポートを介して回収溜へと排出される。細胞を例えば緩衝液の流れで洗い流すまで流し続けてもよい。流量と圧力が高いと、又は、溶媒の組成を変えると、洗浄した細胞が、それが固定してあった構造体から開放され、かくて細胞分離部域から下流の方へと流れて崩壊手段(lysing means)に達し、そこで細胞内ＲＮＡないしＤＮＡのＰＣＲ分析に先立って細胞が崩壊させられる。
【００８０】
細胞崩壊手段は、細胞分離部域（もしあれば）とポリヌクレオチド増幅反応室との流路に設けるのが通常で、それにより細胞内ポリヌクレオチドについて分析を行うに先立って細胞が崩壊させられるのである。図９に示したように、細胞崩壊手段は、細胞膜穿刺突起９０からなり、これらの突起９０は流路２０の表面から突き出ている。液体の流れがこの穿刺突起９０を強制的に流れるようにさせられると、細胞が破裂する。別の実施の形態では、細胞崩壊手段として、充分な流れ圧力が作用すると細胞崩壊を行う断面積が狭くなった狭窄部域を以て構成している。また、細胞崩壊手段は中規模崩壊室に捕捉させたシリコン製の尖鋭片で構成してもよい。細胞含有試料を細胞崩壊室へと流し込む、例えばポンプの如きの手段を備えた器具により、充分な流れ圧力が作用すると細胞崩壊が惹起され、その後試料が流路系を介して反応室へと供給される。別の実施の形態では、細胞崩壊手段を細胞崩壊剤で構成してもよい。斯かる細胞崩壊剤はよく知られているものでよい。
【００８１】
反応室へ試薬を添加するのに、当該反応室と連通した基板上の別の入力ポートを介してこれを行ってもよい。ポリヌクレオチド分析に先立って細胞の残骸を除去するのに、基板上の流路にミクロ形成したフィルターを用いてもよい。図１４、図１５、図１６に示した一実施の形態では、装置２０のフィルター２４は、流路２０に比べて直径の小さい中規模流路で構成されている。従って、操作時には、試料は試料流路２０Ａからフィルター２４を介して流れることになる。試料からのろ過物は、フィルター２４からでて流路２０Ｂを流れる。このフィルター２４は、好ましい深さと幅が０．１〜５０ミクロン程度となるように直線状もしくは蛇行流路としてミクロ形成されていると共に、その最大深さと幅が約５００ミクロン程度の流路２０Ａと流路２０Ｂとを跨いでいる。図８に示したように、流路２０の表面には、ＰＣＲ分析室の上流側で細胞を寸法に従って分離する細胞篩を構成する突起８０が形成されていてもよい。細胞試料は一般に低圧の下で流路を流れ、突起８０間を通過するのに充分小さい細胞のみが下流側の機能要素に達することができる。これらの細胞はその後、細胞崩壊部域を介して分析のためにポリヌクレオチド増幅反応室へと供給される。
【００８２】
別の実施の形態にあっては、中規模流路系に常磁性ないし強磁性ビードを設けて、例えば器具において外部磁界により流路系に沿って移動できるようにしている。このようなビードは、装置における機能要素間で試薬を移送させる、或いは、試料、試薬、又は反応混合体を変位させるのに用いている。一実施の形態では、ポリヌクレオチドプローブを磁性ビード上に固定して、ビードが増幅したポリヌクレオチドに結合するようにしている。ポリヌクレオチドプローブの塗布膜からなる磁性ビードは、分析の終段階に流路系を介して反応室へと移送されて、増幅したポリヌクレオチド生成物と結合する。このように結合したポリヌクレオチド増幅生成物はその後、流路系における検出室もしくは精製室へ、或いは回収ポートへと磁性ビードに乗って送られる。
【００８３】
Ｇ．典型的な装置
図１０に示した本発明の一実施の形態では、流路２０Ｂで互いに連通している部分２２Ａと部分２２Ｂとからなる中規模ポリヌクレオチド増幅室がミクロ形成された基板１４で装置１０を構成している。この装置１０は、図６Ａに示した器具５０の如くの器具の如くの、当該装置を収納する収納部位を有する器具と一緒に用いられる。器具５０には、装置１０におけるポート１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、１６Ｄと接続される流路５６を備えている。また、ポート１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、１６Ｄを機械的に開閉する弁が器具５０に備わっている。ポート１６Ｅも、検出室２２Ｃに試薬を添加するために設けられている。一実施の形態では、装置の流路系は、水理学的に一杯満たされていて、器具における弁、別の方法としては装置における弁は流体の流れを指向させるのに用いられる。ＰＣＲ室の部分２２Ａ、２２Ｂは、ＰＣＲに必要な溶融温度とその他の熱依存性増幅反応に必要なアニーリング温度、例えば９４℃と４０〜６５℃とにそれぞれ加熱されている。前述したように、反応室の部分は、当該部分の下方において基板に集積させ、器具における電気要素と接続詞得る電気加熱要素で加熱するようにしてもよい。別の方法としては、光学レーザーを用いて、基板に配置したガラス製カバーを介して反応室の部分を加熱するようにしてもよい。器具と電気接続した状態で熱センサーを基板に設けてもよい。器具におけるマイクロプロセッサーは、反応室の部分の温度と流路系での流体の流れを制御するのに用いる。
【００８４】
装置１０における流路にはフィルター２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃが設けられている。フィルター２４Ａは、試料における細胞残骸とその他の不必要粒子が反応室に侵入するのを防ぐために用いる。フィルター２４Ｂと２４Ｃとは、複合体形成剤（即ち、ビード９２）を検出室２２Ｃに拘束するために用いている。従って、フィルター２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃは全て同一である必要はない。
【００８５】
操作に当たっては、ＰＣＲの如くの熱依存性増幅反応の場合では、先ず流路と室を緩衝液で充填しておいて、ポート１６Ａ、１６Ｃを開け、ポート１６Ｂ、１６Ｄを閉じておく。器具のポンプ５２により、試料液と、Ｔａｑポリメラーゼの如くの増幅に必要な試薬の何れか一方、又は両方と、プライマーと、ヌクレオシド・トリホスフェートとをポート１６Ａを介して、そしてフィルター２４Ａを介して反応室の部分２２Ａへ供給する。次にポート１６Ａを閉じ、ポート１６Ｂを開けて、器具におけるポンプ５２を利用して、ポリヌクレオチドのハイブリッドの遊離が行われる部分２２Ａと、アニーリングと重合作用とが行われる部分２２Ｂとの間で流路２０Ｂを介して流体の流れを循環させる。ポート１６Ｃは系のベントを行うのに利用してもよく、また、所望に応じてはＴａｑポリメラーゼ、ヌクレオシド・トリホスフェート、プライマー、その他の試薬を供給するのに利用してもよい。増幅循環反応(amplification cycling reaction)が終了すると、例えば３０〜３５サイクル後に、ポート１６Ｄを開けて、器具のポンプを稼働させて反応室の部分２２Ａと２２Ｂから、例えばビード９２に固定した増幅センス(amplified sense)と反センス(antisense)の何れか一方、又は両方に相補的なポリヌクレオチドを含む検出室２２Ｃへと反応生成物を供給する。増幅生成物は、たとえば検出部域に配置した透明カバーを介してビード９２の膠着を観察することにより検出できる。
【００８６】
図１０Ｂに別の実施の形態を示す。この装置の機能、構造、動作は、図１０Ａに示した装置のと同一ではあるが、検出部域２６を備えている点で異なっており、アレー（図示せず）の流路がポリヌクレオチド増幅生成物を電気泳動法で分離するために設けられていてもよい。この装置には、検出部域に対して材料を導入出するためのポート１６Ｅが設けられている。この装置も、図６Ａに示した器具５０と類似の器具と一緒に利用するようになっていて、検出部域２６に電界を印加させる手段を備えている。
【００８７】
図１１にまた別の実施の形態を示す。この装置の機能、構造、動作は、図１０に示した装置のと同一ではあるが、反応室が２２Ａで示したように一つしかない点で異なっている。この装置も、図３Ａに示した器具５０と類似の器具と一緒に利用するようになっているい。この装置には、溶解に必要な温度とアニーリングと重合作用に必要な温度まで反応室２２Ａを交互に加熱、冷却する手段が備わっている。
【００８８】
操作に当たっては、ＰＣＲの如くの反応に必要なポリメラーゼとその他の試薬とを含む試料をポート１６Ａを介して反応室２２Ａへ送り込むのに器具を利用する。送り込んだ後に器具に接続した弁を利用してポート１６Ａと１６Ｄを閉じる。そして器具における加熱素子を利用して、ハイブリッドの遊離に適した温度とアニーリングと重合作用に適した温度との間に亙って反応室を熱的循環させる。増幅サイクルが終了すると、ポート１６Ｂ、１６Ｄを開けて試料を、例えばビード９２ないし別の固形物質に固定したポリヌクレオチドプローブを含む検出室２２Ｂに供給する。この検出室での固形物質（例えば、ビード）の膠着の具合により、ポリヌクレオチドの陽性アッセイ結果(positive assay)が現れる。図１０Ｂに示した実施の形態では、反応室部分２２Ａ、２２Ｂの内容物は、検出部域２６に送られるようにして、そこでポリヌクレオチド生成物が電気泳動法により分離、識別されるようになっている。
【００８９】
以後、本発明の幾つかの実施例を以下に示す。
実施例  １
中規模反応室２２Ａを備えた図１１に概略を図示した装置でポリメラーゼ連鎖反応を行う。細胞内のポリヌクレオチドを検出するためのＰＣＲ分析を行うには、試料としての細胞溶解産物(cell lysate)を、Taqポリメラーゼ、ヌクレオシド・トリホスフェート、ポリヌクレオチドプライマー、それにＰＣＲに必要なその他の試薬を含む緩衝溶液に添加する。細胞溶解産物は、器具からポート１６Ａを介して反応室２２Ａに供給する。器具における弁を利用してポート１６Ａと１６Ｄとを閉じる。器具におけるマイクロプロセッサーと温度制御要素とを利用して、ポリヌクレオチドのハイブリッドの遊離に必要な９４℃と、アニーリングに必要な４０〜６０℃及びプライマー伸長法に必要な７０〜７５℃との間に亙って、反応室２２Ａにおいて温度循環を行う。
【００９０】
ポリメラーゼ連鎖反応が終わった後に、ポート１６Ｂと１６Ｄとを開き、ポート１６Ｂと接続した器具におけるポンプを利用して、ＰＣＲ反応室２２Ａから流路２０Ｂを介して検出室２２Ｂへ試料を送り込む。検出室２２Ｂには、増幅したポリヌクレオチドを結合し得る表面に固定した相補ポリヌクレオチドからなるビード９２が含まれている。増幅したポリヌクレオチドと相補的ポリヌクレオチドとの間でのハイブリッド遊離反応により生成するビードの凝集作用を、検出部域２２Ｂを覆って設けた窓を介して観察することにより、増幅したポリヌクレオチド生成物の存在の手がかりを得る。
【００９１】
実施例  ２
図１２は、生物学的流体試料における混合物内の特定細胞型群(subpopulation of cells)の細胞から拡散を分離して、特定のヌクレオチド配列についてアッセイを行うのに用いる基板１４を備えた装置１０を概略的に示している。この装置１０にミクロ形成されているものは中規模流路２０であって、この流路２０は、細胞分離室２２Ａ、細胞崩壊室２２Ｂ、フィルター部域２４、部分２２Ｃと部分２２ＤとからなるＰＣＲ反応室、流れ抵抗検出部域４０とを備えている。中規模流路系２０は、流体入出ポート１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、１６Ｄをも備えている。この装置は図６Ａに示した器具５０の如くの器具と一緒に用いる。
【００９２】
先ず、器具の弁を用いてポート１６Ｃ、１６Ｄを閉じ、ポート１６Ａ、１６Ｂを開ける。細胞の混合物を含む試料を器具のポンプ５２を利用して試料入力ポート１６Ａへ送り込み、そして分離室２２Ａへと中規模流路２０を介して流れるようにする。室２２Ａには、試料における所望型の細胞の表面分子に選択的に結合する結合成分が当該室の壁部に固定された形で含んでいる。残りの細胞成分は、ポート１６Ｂを介して基板から出てくる。室２２Ａで所望の細胞群の結合後に、緩衝液の流れ(flow with buffer)を続行して、細胞群を洗浄すると共に単離させる。次に、ポート１６Ｂを閉じ、ポート１６Ｂを開ける。すると、固定した細胞を引き離せるほど充分流れが増加する。これを続行して、室２２Ｂにおける膜穿刺突起９０を細胞が通過することで、当該細胞を引き裂いて細胞内成分を放出できるようにする。
【００９３】
試料の流れはその後フィルター２４を流れ、そこで大きい細胞膜成分とその他の残骸とがろ過されて、流路２０ＢによりＰＣＲ反応室部分２２Ｄに連通している中規模ＰＣＲ反応室部分２２Ｃへと流れる。その後、ＰＣＲアッセイに必要なＴａｑポリメラーゼとプライマー、その他の試薬を、器具における対応ポートと流路からポート１６Ｂを介して部分２２Ｄに添加することにより、分離した細胞の特定細胞型群からの細胞内可溶成分とＰＣＲ試薬とが混合されるようにする。ポート１６Ａを閉じて、ポート１６Ｂを介して接続した器具のポンプを利用して、例えば９４℃と６５℃とにそれぞれ設定した部分２２Ｃと部分２２Ｄとの間で流路２０Ｂを介してＰＣＲ試料と試薬とを循環させることで、ポリヌクレオチド溶融、アニーリング、重合作用からなるサイクルを複数回実行し、これにより生成物としてのポリヌクレオチドの増幅を行う。別の方法として、増幅反応時に全てのポートを閉じて、熱循環を上記実施例１について説明したのと同様に行ってもよい。次に、器具の弁を利用してポート１６Ｄを開ける。ポート１６Ｂに接続した器具のポンプを利用して、細胞群から単離した増幅ポリヌクレオチドを、分岐流路４０からなる検出部域へと送り出す。検出部域４０における流れ抵抗は、増幅したポリヌクレオチド生成物の存在を積極的に示す指標となり、当該検出部域を覆うガラス製カバーを介して光学的に検出される。
【００９４】
実施例  ３
シリコン基板に形成して、種々の異なった不動態化法を用いて不動態化した、深さ８０ミクロン、幅８ミリ、長さ１４ミリの中規模反応室での試料としてのポリヌクレオチド（バクテリオファージ・ラムダＤＮＡ）の増幅作用を調べた。
【００９５】
反応を行うために、ＰＣＲ試薬（例えば、ヌクレオチド、AmpliTaq ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー及びバクテリオファージ・ラムダＤＮＡ試料）を試験管で混合して、シリコン基板における反応室へ移した。反応物の最終濃度は、各ヌクレオチドが２００ｍＭ、Ｔａｑポリメラーゼが０.２５Ｕ／１０ｍｌ、各プライマーが１．０ｍＭ、ＤＮＡ鋳型が１０ｍｌにつき０．１ｎｇであった。熱循環（通常、３５サイクル）を、コンピューター制御式ペルチェヒーター・クーラーを用いて自動的に行った。
【００９６】
シリコン基板に形成した中規模反応室の壁部の不動態化する種々の異なった不動態化法を用いて行ったＰＣＲ反応の結果を図２３に示す。図２３は、臭化エチジウムを含有するアガロースゲルで反応生成物を電気泳動したあとでの、当該アガロースゲルを示す図である。ゲルのレーン(lane)は下記に対応する。（１と７）分子量マーカー（1000、750、500、300、150及び５０ bp)；（２）パーキン-エルマー製9600型熱循環器で行った制御増幅反応(control amplification reaction)の生成物；（３）未処理反応室での増幅反応の生成物；（４）壁面に熱シリコン酸化膜を有する反応室での増幅反応の生成物；（５）シランとアンモニアの混合物を用いてプラズマ化学蒸着(plasma-enhanced chemical vapor deposition, PECVD)法で表面に形成した窒化シリコンを有する反応室での増幅反応の生成物；（６）PECVD法で形成したシリコン酸化膜を有する反応室での増幅反応の生成物をそれぞれ表す。シリコンを熱により酸化する方法については、例えば1990年にアジソン-ウェズリー社から出版されたランヤンとビーンによる「Semiconductor Integrated Circuit Processing Technology（半導体集積回路処理法）」の第３章で説明されている。プラズマ化学蒸着法により表面に膜を形成する方法については、例えば1983年にマックグロー-ヒル社から出版されたスツによる「VLSI Technology（ＶＬＳＩ技術）」の第３章で説明されている。
【００９７】
図２３に示したように、反応生成物は、熱酸化膜を有するシリコン反応室（レーン４）又はPECVD酸化膜を有するシリコン反応室（レーン６）において、未処理シリコン反応室（レーン３）におけるのと比べてほぼ増加している。それに対して、窒化シリコン膜のあるもの（レーン４）では、増幅反応に対して陽性の不動態化の効果は見られていない。
【００９８】
実施例  ４
シリコン基板に形成した中規模ポリヌクレオチド増幅反応室に、反応室へ基部の表面を不動態化する被膜を設ける。
【００９９】
流体入力ポートと出力ポート、当該入出力ポートと連通した流路を含む中規模流路系、ポリヌクレオチド増幅反応室とが備わったシリコン基板を用意する。深さ８０ミクロン、幅８ミリ、長さ１４ミリの中規模増幅反応室を、シリコーン化試薬(siliconizing reagent)と、所望に応じてはマクロ分子とで処理して、シリコン表面を不動態化する被膜を形成する。増幅反応室に、１００マイクロリットル容量のピペットを用いてチップの排出口に負圧をかけながら、AquaSilないしSurfasil（何れもイリノイ州ロックフォード所在のピアース社のもの）またはSigmacote（ミズーリ州セントルイス所在のシグマ化学社のもの）の如くのシリコーン化試薬を充填する。このシリコーン化試薬は、室温のもとで少なくとも約３０分間、チップ上で放置しておく。チップの排出口に一定の負圧を作用させて、少なくとも４時間かけてシリコーン化試薬を除去する。１００マイクロリットル容量ピペットを用いて、約１００マイクロリットルの蒸留水又は０．１モルのＴＥ緩衝液を流路系を介して入力ポートを経て増幅反応室へ注入する一方、出力ポートに負圧をかける。約６回、洗浄を繰り返す。最後の洗浄が終わったら、約１０〜１５分に亙って出力ポートに負圧をかけて流路から液を排出する。
【０１００】
別の方法としては、増幅室の表面をジメチルジクロロシラン（ＤＭＤＣＳ）ないしジメチルクロロシラン（ＤＭＣＳ）の如くのシランか試薬で不動態化する。シリコーン化ないしシラン化剤で表面を処理するのに用いる方法については、例えば、イリノイ州ロックフォード所在のピアース社の「Instructions: Siliconizing Agents（シリコーン化剤の使い方）」1993年版に記載されている。
【０１０１】
その後、所望に応じて増幅反応室に、例えばアミノ酸ポリマー（表２を参照のこと）の如くのマクロ分子（pH 8.6の0.1モルTris緩衝液に約１０mg/mlのマクロ分子）からなるブロッキング剤の溶液を、排出口に負圧をかけながら１００マイクロリットル容量ピペットを用いて充填する。マクロ分子溶液は、４℃の下で少なくとも約１時間に亙り増幅室にとどまるようにする。その後負圧を装置の排出口に約１０〜１５分間に亙ってかける。これで、シリコーン処理表面に非共有結合したマクロ分子の被膜ができる。
【０１０２】
実施例  ５
異なった被膜によるポリヌクレオチド増幅反応に対するシリコンの阻害作用を減少させる効果を試験した。
【０１０３】
Surfasil（イリノイ州ロックフォード所在のピアース社のもの）ないしSigmacote（ミズーリ州セントルイス所在のシグマ化学社のもの）をシリコン粉体のサンプルに被覆して乾燥した。その後、シリコン粒子に、表２に示した種々の異なったマクロ分子（ミズーリ州セントルイス所在のシグマ化学社から入手した）を実施例４で説明したのと同様に被覆した。それぞれの被覆したシリコン調剤を各４ミリグラムごと、４５マイクロリットルのＰＣＲ反応混合物（実施例３を参照のこと）を含む別々の反応試験管に入れて、パーキン-エルマー製9600型熱循環器にかけた。
【０１０４】
また、深さ８０ミクロン、幅８ミリ、長さ１４ミリの中規模反応室に、実施例４で説明した方法に従って、種々のマクロ分子（表２）に対応してシリコーン化試薬又はシラン化試薬の被膜を形成した。実施例３で説明した試薬を用いて、ＰＣＲ反応を被覆した反応室で行った。異なった被膜を用いて行った結果を、０から４のランク付けをした表２に示すが、陽性制御群(positive control)（GeneAmp 9600で行った）のランクは３である。表２に示したように、最も効果的な被膜は、ポリビニールピロリドン又はポリアデニル酸と一緒に用いたSurfasil（イリノイ州ロックフォード所在のピアース社のもの）である。
【０１０５】
【表２】
2007050008.tif 000004
【０１０６】
尚、前述の説明は単に例示のためになしたものであって、本発明は、ここで説明した構造と方法の神髄の範囲で種々の形を取ることができる。当業者には種々の変形例や改変などが考えられるところであり、これらの変形例や改変なども、請求の範囲で定める本発明の一部をなしているものと解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１Ａ】入口ポート１６とポリヌクレオチド増幅反応室２２とに接続した中規模流路２０が加工形成されていて、カバー１２を取り付けた状態での固体基板１４からなる本発明による装置１０の概略縦断面図である。
【図１Ｂ】入口ポート１６とポリヌクレオチド増幅反応室２２とに接続した中規模流路２０が加工形成されていて、カバー１２を取り付けた状態での固体基板１４からなる本発明の別の実施の形態による装置１０の概略縦断面図である。
【図１Ｃ】入口ポート１６とポリヌクレオチド増幅反応室２２とに接続した中規模流路２０が加工形成されていて、カバー１２にポート１６と流路２０とが室２２と連通して形成されている状態での固体基板１４からなる本発明の異なった実施の形態による装置１０の概略縦断面図である。
【図２Ａ】図１Ａに示した装置の斜視図である。
【図２Ｂ】図１Ｂに示した装置の斜視図である。
【図３Ａ】装置１０を支持するのに利用し得るもので、装置１０における反応室２２の温度を調節する加熱素子５７からなる概略図示の器具５０に収納させた分析装置１０の概略図である。
【図３Ｂ】装置１０を支持するのに利用し得るもので、装置１０における反応室２２の温度を調節する加熱素子５３からなる概略図示の器具５０に収納させた分析装置１０の概略図である。
【図４】入口ポート１６とポリヌクレオチド増幅反応室２２とに接続した中規模流路２０が加工形成されていて、カバー１２を基板の表面に取り付けた状態での固体基板１４からなる本発明による装置１０の概略縦断面図である。
【図５】図４に示した装置の斜視図である。
【図６Ａ】装置１０を支持するのに利用し得るもので、装置１０における反応室の部分２２の温度を調節する加熱素子５７からなる器具５０に収納させた分析装置１０の概略図である。
【図６Ｂ】装置１０を支持するのに利用し得るもので、装置１０における反応室の部分２２Ａの温度を調節する加熱素子５３からなる器具５０に収納させた分析装置１０の概略図である。
【図７】基板に配置されてその断面寸法が漸次減少している流路４０の偏向系からなる検出室と連通している、中規模反応室の部分２２Ａ、２２Ｂがミクロ形成されている基板の概略平面図を示す。
【図８】流路の壁部を延在する細胞ないし細胞残骸ろ過用突起８０のある基板１４上の流路２０の断面斜視図を示す。
【図９】流路の壁部を延在する細胞穿刺用突起９０のある基板１４上の流路２０の断面斜視図を示す。
【図１０Ａ】基板１４上にミクロ形成された反応室の部分２２Ａ、２２Ｂと検出室２２Ｃとからなる中規模分析装置の概略平面図を示す。
【図１０Ｂ】基板１４上にミクロ形成された反応室の部分２２Ａ、２２Ｂと検出域２６とからなる別の中規模分析装置の概略平面図を示す。
【図１１】基板１４にミクロ形成された反応室２２Ａからなる別の中規模分析装置の概略平面図を示す。
【図１２】細胞仕分け、細胞分析、ポリヌクレオチド分析などの種々の機能を行うのに適した一群の中規模室が形成されている分析装置の概略平面図を示す。
【図１３】二つの分岐流路が形成されている分析装置の概略平面図を示す。
【図１４】分析装置１０における流路２０にミクロ形成されている中規模フィルター２４の実施の形態を示す上面図である。
【図１５】分析装置１０における流路２０にミクロ形成されている中規模フィルター２４の別の実施の形態を示す上面図である。
【図１６】分析装置１０における流路２０にミクロ形成されている中規模フィルター２４のさらに別の実施の形態を示す上面図である。
【図１７】図１７は、装置１０にない部を見るために装置１０（図示せず）と共に用いる装置６０の概略斜視図である。
【図１８】図１７に示した装置の概略断面図を示す。
【図１９】基板１４と、ピペット８６が挿入されている空洞８７を有する透明カバー１２からなる装置の概略断面図を示す。
【図２０】孔８８を有するピペットの先端８４の概略断面図を示す。
【図２１】シールポート１６と流路２０とで構成してもよい部材８５を備えた基板１４の概略断面図を示す。
【図２２】基板１４上の流路２０Ｂと反応室２２とに連なる空洞８７と流路２０Ａとを備えた透明カバー１２からなる装置の概略斜視図を示す。
【図２３】中規模増幅室で増幅されたポリヌクレオチドの試料のアガロースゲル電気泳動パターンを示す図である。
【図１Ａ】
2007050008.tif 000005
【図１Ｂ】
2007050008.tif 000006
【図１Ｃ】
2007050008.tif 000007
【図２Ａ】
2007050008.tif 000008
【図２Ｂ】
2007050008.tif 000009
【図３Ａ】
2007050008.tif 000010
【図３Ｂ】
2007050008.tif 000011
【図４】
2007050008.tif 000012
【図５】
2007050008.tif 000013
【図６Ａ】
2007050008.tif 000014
【図６Ｂ】
2007050008.tif 000015
【図７】
2007050008.tif 000016
【図８】
2007050008.tif 000017
【図９】
2007050008.tif 000018
【図１０Ａ】
2007050008.tif 000019
【図１０Ｂ】
2007050008.tif 000020
【図１１】
2007050008.tif 000021
【図１２】
2007050008.tif 000022
【図１３】
2007050008.tif 000023
【図１４】
2007050008.tif 000024
【図１５】
2007050008.tif 000025
【図１６】
2007050008.tif 000026
【図１７】
2007050008.tif 000027
【図１８】
2007050008.tif 000028
【図１９】
2007050008.tif 000029
【図２０】
2007050008.tif 000030
【図２１】
2007050008.tif 000031
【図２２】
2007050008.tif 000032
【図２３】
2007050008.tif 000033