(57)【要約】【課題】アトピー性皮膚炎の治療や予防に有効な免疫調節剤及びそれを用いた免疫調節方法の提供。【解決手段】ＢＣＧを有効成分として含有する、Ｔｈ２誘導性樹状細胞のＴｈ１誘導性樹状細胞への機能変換剤；ＢＣＧを有効成分として含有する、胸腺間質リンパ球増殖因子（ＴＳＬＰ）が関与する疾患の治療又は予防薬；ケラチノサイトからＴＳＬＰを産生する哺乳動物由来の血液試料を分画し、樹状細胞画分を得る工程、前記樹状細胞画分を試験管内でＢＣＧとともにインキュベートする工程、及び前記インキュベート後の樹状細胞画分中の樹状細胞の機能を調べ、インキュベート前後で当該樹状細胞がＴｈ２誘導性樹状細胞優位からＴｈ１誘導性樹状細胞優位に機能変換したことを確認する工程を含む、Ｔｈ２誘導性樹状細胞のＴｈ１誘導性樹状細胞への機能変換方法；前記確認工程の後に、確認後の樹状細胞を採取した哺乳動物に投与する工程をさらに含む、前記機能変換方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコバクテリウム  ボビスのカルメット−ゲラン菌を有効成分として含有する、Ｔｈ２誘導性樹状細胞のＴｈ１誘導性樹状細胞への機能変換剤。
【請求項２】
前記Ｔｈ１誘導性樹状細胞におけるＯＸ４０リガンドの発現が、前記Ｔｈ２誘導性樹状細胞における発現に比べて抑制されている、請求項１に記載の機能変換剤。
【請求項３】
マイコバクテリウム  ボビスのカルメット−ゲラン菌を有効成分として含有する、胸腺間質リンパ球増殖因子が関与する疾患の治療または予防薬。
【請求項４】
前記疾患がアトピー性皮膚炎である請求項３に記載の治療または予防薬。
【請求項５】
下記工程：
ケラチノサイトから胸腺間質リンパ球増殖因子を産生する哺乳動物由来の血液試料を分画し、樹状細胞画分を得る工程、
前記樹状細胞画分を試験管内でマイコバクテリウム  ボビスのカルメット−ゲラン菌とともにインキュベートする工程、および
前記インキュベート後の樹状細胞画分中の樹状細胞の機能を調べ、インキュベート前後で当該樹状細胞がＴｈ２誘導性樹状細胞優位からＴｈ１誘導性樹状細胞優位に機能変換したことを確認する工程
を含む、Ｔｈ２誘導性樹状細胞のＴｈ１誘導性樹状細胞への機能変換方法。
【請求項６】
前記確認工程が、インキュベート前後の樹状細胞におけるＯＸ４０リガンドの発現量を比較することにより行われる、請求項５に記載の機能変換方法。
【請求項７】
前記確認工程の後に、確認後の樹状細胞を、採取した哺乳動物に投与する工程をさらに含む、請求項５または６に記載の機能変換方法。
【請求項８】
マイコバクテリウム  ボビスのカルメット−ゲラン菌の有効量を、ケラチノサイトから胸腺間質リンパ球増殖因子を産生する哺乳動物に投与することを含む、胸腺間質リンパ球増殖因子が関与する疾患の治療または予防方法。
【請求項９】
前記疾患の治療または予防が、樹状細胞におけるＯＸ４０リガンドのダウンレギュレーションを介して行われる、請求項８に記載の治療または予防方法。
【請求項１０】
前記疾患がアトピー性皮膚炎である請求項８または９に記載の治療または予防方法。
【請求項１１】
請求項３または４に記載の治療または予防薬、および当該治療または予防薬をアトピー性皮膚炎の治療もしくは予防に使用することができることまたは使用すべきであることを記載した当該治療または予防薬に関する記載物を含む商業パッケージ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、樹状細胞の機能変換を介してアレルギーを制御する分野に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー反応は、Ｂ細胞からのＩｇＥ産生を促進するヘルパー２型Ｔ細胞（Ｔｈ２細胞または単にＴｈ２と略す場合がある）により惹起されることが知られている。そして、このアレルギー反応のカスケードの上流において樹状細胞が重要な機能を発揮することが明らかにされつつある。
【０００３】
樹状細胞（Dendritic Cells：ＤＣ）は、分化経路の面からミエロイド系ＤＣとリンパ球系ＤＣに大別される。前者はミエロイド系のマーカーを発現しその分化成熟にＧＭ−ＣＳＦが必須である。ミエロイド系ＤＣにはランゲルハンス細胞（ＬＣ）、真皮ＤＣ、内皮系組織間質ＤＣ、輸入リンパ管のベール細胞、末梢血ＣＤ１１ｃ＋ＤＣが含まれ、in vitroで調製される単球由来ＤＣもこれに属する。ミエロイド系ＤＣは、未熟な成熟段階では旺盛な食作用機能を発揮する。一方、後者はＣＤ１１ｃ−ＣＤ４＋の表現型を示し、形質細胞様の形態をもつ血液中のＤＣ前駆細胞（plasmacytoid DC precursor:ｐＤＣ）やリンパ組織に分布するＣＤ１１ｃ−ＣＤ４＋ plasmacytoid cell (ＰＣ)として同定され、ＩＬ−３存在下で成熟する。また、ｐＤＣはウィルス感染によって多量の１型インターフェロン(ＩＦＮ−α／β)を産生する特性を有し、いわゆるnatural IFN-producing cell（ＩＰＣ）としても認知されている。これらの細胞は、ミエロイド系のマーカーを発現せず食作用機能をもたないこと、リンパ球特異的な分子の発現や遺伝子の再構成が認められることから、リンパ球系ＤＣと呼称される。このようにＤＣシステムは異なる分化経路・属性（lineage heterogeneity）を示す複数のＤＣサブセットから構成されており、Ｔ細胞応答の多様性を生み出す要因の一つと考えられる。
【０００４】
最近、アトピー性皮膚炎の病態に胸腺間質リンパ球増殖因子（thymic stromal lymphopoetin ；以下、ＴＳＬＰと省略する場合がある）がヒトＣＤ１１ｃ＋ＤＣを介して重要な役割を果たしていることが示され、注目されている（非特許文献１）。ＴＳＬＰはＩＬ−２ファミリーに属し、マウスではＢ細胞分化因子として機能するがヒトにおいてはＣＤ１１ｃ＋ＤＣ特異的に作用する。ＴＳＬＰで刺激したヒトＣＤ１１ｃ＋ＤＣ（ＴＳＬＰ−ＤＣ）をナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養すると、Ｔ細胞の活発な増殖が促され、Ｔ細胞からＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３などのＴｈ２サイトカインとＴＮＦ−αの産生が誘導される。一方、アトピー性皮膚炎の病変皮膚組織では表皮のケラチノサイトがＴＳＬＰを高発現していることから、皮膚表皮に異常発現するＴＳＬＰがアトピー性皮膚炎におけるアレルギー反応のトリガーとして機能すると考えられる。すなわち、ＴＳＬＰによって活性化されたＣＤ１１ｃ＋ＤＣがＴｈ２細胞を誘導することによりアトピー性皮膚炎の病態が形成されるものと認識される。したがって、ＴＳＬＰがアトピー性皮膚炎の治療のターゲットになりうることが予想される。
【０００５】
このようなＩｇＥ産生を促進するＴｈ２優位なアレルギー状態を、自然免疫系を活性化するＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）の作用を利用して細胞性免疫を促進するヘルパー１型Ｔ細胞（Ｔｈ１細胞または単にＴｈ１と略す場合がある）優位に変換する報告（非特許文献２〜４）や医薬品開発の現状がある。しかしながら、ＣｐＧ ＯＤＮによるＴｈ１増強作用はマウスでは顕著であるが、ヒトでは顕著ではない。その理由として考えられるメカニズムは、ＣｐＧ ＯＤＮの標的であるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ−９）が、マウスではプロフェッショナルな抗原提示細胞であるＤＣに発現しているが、ヒト末梢血ＤＣでは一部にしか発現していないことである。マウスではＤＣに発現するＴＬＲ−９を介してＣｐＧ ＯＤＮはＩＬ−１２を誘導し、Ｔｈ１分化増殖を促すことができるが、ヒトではＴＬＲ−９を発現する一部のＤＣ（ＣＤ１１ｃ−ＤＣ）に対してＣｐＧ ＯＤＮはＩＬ−１２産生を誘導しない（１型インターフェロンを産生するだけ）ので、Ｔｈ１分化増殖が著明に促進されないことになる。
【０００６】
一方、ヒトＤＣを刺激してＩＬ−１２等のサイトカインを産生しＴｈ１応答を誘導するアジュバント候補のひとつにマイコバクテリウム  ボビス（ウシ型結核菌）のカルメットーゲラン菌（ＢＣＧ）株がある。ＢＣＧをヒトミエロイド系未熟ＤＣ（末梢血単球からサイトカインにより分化誘導したＤＣ）に感染させると、ＤＣは成熟活性化し、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１２などの炎症性サイトカインの分泌と、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＭＨＣクラスＩ分子のアップレギュレーションを促進することが明らかにされている（非特許文献５〜９）。ＢＣＧにより成熟活性化したＤＣは、Ｔｈ１応答を誘導することが知られている（非特許文献６）。最近、このようなＢＣＧによるＤＣの成熟活性化は、pathogen associated molecular patterns（PAMPs）と呼ばれる一群の微生物に共通の分子構造を認識するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のうちＴＬＲ−２とＴＬＲ−４を介して起こることが明らかにされた（非特許文献７、１０）。実際、マウスの気管支喘息モデルでは、ＢＣＧの接種がＴｈ２応答を減弱させることが示されている（非特許文献１１）。そしてＢＣＧ投与によりＩＬ−１２を産生する成熟ＤＣが肺に集積すること、およびこのＩＬ−１２産生性のＤＣはナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をインターフェロン-γ産生性のＴｈ１細胞に分化させることが明らかにされた（非特許文献１２）。
【０００７】
特許文献１には、ＢＣＧの細胞壁骨格（ＣＷＳ）を用いる未成熟樹状細胞の成熟化方法が開示されている。上記ＢＣＧの作用は、未成熟樹状細胞の成熟化によりもたらされたものと理解される。特許文献２には、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、関節リウマチ又は多発性硬化症の治療に用いるヒト免疫制御性樹状細胞を含む医薬組成物が開示されているが、未成熟細胞を様々なサイトカインおよびリポポリサッカリド（ＬＰＳ）とともに培養して得られた樹状細胞を用いることを特徴とするものである。
【特許文献１】国際公開第０１／４８１５４号パンフレット
【特許文献２】特開２００４−２９８１８１号公報
【非特許文献１】Soumelis V et al. Nat Immunol 3: 605, 2002
【非特許文献２】Shirota H et al. J Respir Cell Mol Biol 22: 176, 2000
【非特許文献３】Shirota H et al. J Immunol 164: 5575, 2000
【非特許文献４】Sano K et al. J Immunol 170: 2367, 2003
【非特許文献５】Shanker G et al. J Transl Med 1: 7, 2003
【非特許文献６】Cheadle EJ et al. Immunology 108: 79, 2003
【非特許文献７】Tsuji S et al. Infection and Immunity 68: 6883, 2000
【非特許文献８】Kim KD et al. Immunology 97: 626, 1999
【非特許文献９】Thurnher M et al. Int J Cancer 70: 128, 1997
【非特許文献１０】Uehori J et al. Infection and Immunity 71: 4238, 2003
【非特許文献１１】Nahori MA et al. Vaccine 19: 1484, 2001
【非特許文献１２】Lagranderie M et al. Immunology 108: 352, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、アトピー性皮膚炎の治療や予防に有効な免疫調節剤およびそれを用いた免疫調節方法の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記問題点に鑑み、鋭意検討した結果、ＢＣＧの新たな作用および樹状細胞の制御方法を見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本願発明は、以下に示す通りである。
【００１０】
〔１〕  マイコバクテリウム  ボビスのカルメット−ゲラン菌（以下、ＢＣＧと略す場合がある）を有効成分として含有する、Ｔｈ２誘導性樹状細胞のＴｈ１誘導性樹状細胞への機能変換剤（以下、単に機能変換剤と略す場合がある）。
〔２〕  前記Ｔｈ１誘導性樹状細胞におけるＯＸ４０リガンドの発現が、前記Ｔｈ２誘導性樹状細胞における発現に比べて抑制されている、前記〔１〕に記載の機能変換剤。
〔３〕  ＢＣＧを有効成分として含有する、胸腺間質リンパ球増殖因子（以下、ＴＳＬＰと略す場合がある）が関与する疾患の治療または予防薬。
〔４〕  前記疾患がアトピー性皮膚炎である前記〔３〕に記載の治療または予防薬。
〔５〕  下記工程：
ケラチノサイトからＴＳＬＰを産生する哺乳動物由来の血液試料を分画し、樹状細胞画分を得る工程、
前記樹状細胞画分を試験管内でＢＣＧとともにインキュベートする工程、および
前記インキュベート後の樹状細胞画分中の樹状細胞の機能を調べ、インキュベート前後で当該樹状細胞がＴｈ２誘導性樹状細胞優位からＴｈ１誘導性樹状細胞優位に機能変換したことを確認する工程
を含む、Ｔｈ２誘導性樹状細胞のＴｈ１誘導性樹状細胞への機能変換方法。
〔６〕  前記確認工程が、インキュベート前後の樹状細胞におけるＯＸ４０リガンドの発現量を比較することにより行われる、前記〔５〕に記載の機能変換方法。
〔７〕  前記確認工程の後に、確認後の樹状細胞を、採取した哺乳動物に投与する工程をさらに含む、前記〔５〕または〔６〕に記載の機能変換方法。
〔８〕  ＢＣＧの有効量を、ケラチノサイトからＴＳＬＰを産生する哺乳動物に投与することを含む、ＴＳＬＰが関与する疾患の治療または予防方法。
〔９〕  前記疾患の治療または予防が、樹状細胞におけるＯＸ４０リガンドのダウンレギュレーションを介して行われる、前記〔８〕に記載の治療または予防方法。
〔１０〕  前記疾患がアトピー性皮膚炎である前記〔８〕または〔９〕に記載の治療または予防方法。
〔１１〕  前記〔３〕または〔４〕に記載の治療または予防薬、および当該治療または予防薬をアトピー性皮膚炎の治療もしくは予防に使用することができることまたは使用すべきであることを記載した当該治療または予防薬に関する記載物を含む商業パッケージ。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＢＣＧを含有する機能変換剤は、
１）ＢＣＧは、ＴＳＬＰによるミエロイド系樹状細胞からＴｈ２誘導性の成熟樹状細胞への誘導を阻害することにより、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞をＴｈ１優位に誘導可能であること、
２）ＢＣＧは、ＴＳＬＰによりミエロイド系樹状細胞からＴｈ２誘導性の成熟樹状細胞が誘導された場合であっても、当該成熟樹状細胞をＴｈ１誘導性樹状細胞に機能変換可能であること、ならびに
３）ＢＣＧは、好ましくは成熟樹状細胞におけるＯＸ４０リガンドの発現を抑制可能であること
が解明されたことにより、一旦Ｔｈ２優位に傾いた樹状細胞の機能を有効にＴｈ１優位に変換することができる。
本発明のＴＳＬＰが関与する疾患の治療または予防薬によると、ＢＣＧを含有することから、安全かつ有効に当該疾患、特にアトピー性皮膚炎を治療または予防することができる。本発明の機能変換方法によると、生体外で樹状細胞画分をＢＣＧで処理することにより、安全かつ有効に、Ｔｈ２優位に傾いた樹状細胞の機能をＴｈ１優位に変換することができる。また、本発明のＴＳＬＰが関与する疾患の治療または予防方法によると、ＢＣＧの有効量を投与することにより、安全かつ有効に当該疾患、特にアトピー性皮膚炎を治療または予防することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の機能変換剤の有効成分であるマイコバクテリウム  ボビスのカルメット−ゲラン菌株（ＢＣＧ）は、弱毒菌であり、長年結核ワクチンとして用いられてきたものである。本発明においては、ＢＣＧおよびその継代培養株であれば特に限定されるものではないが、日本株（Tokyo 172 strain）が好適に用いられる。ＢＣＧは生菌であっても死菌であってもよい。また、ＢＣＧの菌体の一部（例えば細胞壁骨格（ＣＷＳ）、細胞壁（ＣＷ）等）も、本発明の範囲に包含される。ＢＣＧのＣＷＳは、公知文献（Cancer Res., 33, 2187-2195(1973); J. Natl. Cancer Inst., 48, 831-835(1972); J. Bacteriol., 94, 1736-1745(1967); Gann, 69, 619-626(1978); J. Bacteriol., 92, 869-879(1966); J. Natl. Cancer Inst., 52, 95-101(1974)等）に基づき、単離または製造することが可能である。
【００１３】
前記ＢＣＧの力価は、樹状細胞の機能変換に必要かつ十分な力価であれば特に限定されるものではない。ＢＣＧ菌体を用いて機能変換する場合、樹状細胞１個当たり、０．１〜２０ＭＯＩ、好ましくは１〜１０ＭＯＩとなるように機能変換剤と樹状細胞とを接触させる。ここで、ＭＯＩとは感染多重度を意味し、１ＭＯＩは、１個の細胞に対して１個のウイルス粒子を感染させることである。このように通常ＭＯＩは感染ウイルス粒子に対して用いられる用語であるが、本発明においても１樹状細胞あたりの接触ＢＣＧ菌体数を調節して投与するため、便宜上ＭＯＩを用いる。ＢＣＧ菌体は、前記ＭＯＩを目安にして、機能変換剤に配合される。
【００１４】
本発明の機能変換剤におけるＢＣＧの含有量は、所望の機能変換効果を奏することができる範囲で適宜設定することができるが、通常、０．０００１〜１００重量％である。
【００１５】
前記ＢＣＧは、樹状細胞、特にＴｈ２誘導性樹状細胞におけるＯＸ４０リガンドの発現を抑制する作用を有する。ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）は、ＣＤ１４３とも呼ばれ、樹状細胞表面に発現し、ＯＸ４０−ＯＸ４０リガンド系で免疫反応に重要な機能を有する因子である。ヒトＯＸ４０リガンドのアミノ酸配列および塩基配列は、GenBank Accession No. NM_003326に開示されている。
【００１６】
本発明の機能変換剤における機能変換の成否は、機能変換処理後の樹状細胞をアロＣＤ４＋ナイーブＴ細胞とインキュベートし、当該Ｔ細胞からのインターフェロンγ等のＴｈ１サイトカインの誘導を調べることにより確認することができる。あるいは、機能変換前後の樹状細胞におけるＯＸ４０リガントの発現量を調べ、変換後の発現量が変換前の発現量に比べて有意に減少しているか否かにより確認することができる。本発明の機能変換剤を用いた機能変換方法およびその確認方法は、後述する。
【００１７】
本発明の機能変換剤は、ＢＣＧの有効量に加え、任意の担体を含むことができる。
【００１８】
任意の担体としては、例えば、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤；メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤；界面活性剤等の分散剤；水、生理食塩水、緩衝液等の希釈剤などが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００１９】
本発明のＴＳＬＰが関与する疾患の治療または予防薬は、前記ＢＣＧを有効成分として含有するものである。
【００２０】
本発明においてＴＳＬＰとは、ＩＬ−２ファミリーに属し、ヒトにおいてはＣＤ１１ｃ＋ＤＣ特異的に作用する因子である。ＴＳＬＰで刺激したヒトＣＤ１１ｃ＋ＤＣ（ＴＳＬＰ−ＤＣ）をナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養すると、Ｔ細胞の活発な増殖が促され、Ｔ細胞からＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３などのＴｈ２サイトカインとＴＮＦ−αの産生が誘導される。アトピー性皮膚炎の病変皮膚組織では表皮のケラチノサイトがＴＳＬＰを高発現していることから、皮膚表皮に異常発現するＴＳＬＰがアトピー性皮膚炎におけるアレルギー反応のトリガーとして機能すると考えられる。すなわち、ＴＳＬＰによって活性化されたＣＤ１１ｃ＋ＤＣがＴｈ２細胞を誘導することによりアトピー性皮膚炎の病態が形成されるものと認識される。ヒトＴＳＬＰのアミノ酸配列および塩基配列は、GenBank Accession No. NM_138551に開示されている。
【００２１】
本発明においてＴＳＬＰが関与する疾患とは、ケラチノサイトから産生されたＴＳＬＰによって活性化されたＣＤ１１ｃ＋ＤＣがＴｈ２細胞を誘導することにより引き起こされるあらゆる疾患をいい、具体的には、アトピー性皮膚炎などがあげられる。
【００２２】
本発明の治療または予防薬の有効成分であるＢＣＧは、前記機能変換剤において記載した通りである。
【００２３】
本発明の治療または予防薬は、ＢＣＧの有効量に加え、医薬上許容され得る担体を含むことができる。
【００２４】
医薬上許容され得る担体としては、前記機能変換剤において記載したものと同様のものを用いることができる。また、投与剤型に応じて、下記のように適する担体を選択することができる。
【００２５】
本発明の治療または予防薬は、所望の効果を奏するような投与剤型、好ましくは非経口的な投与剤型にすることが好ましい。非経口的な投与（例えば、皮内注射、皮下注射、経皮注射（管針法）、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これにはアスコルビン酸、クエン酸、亜硫酸ナトリウム等の抗酸化剤；クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、酢酸ナトリウム、リン酸、リン酸ナトリウム等の緩衝剤；塩化カリウム、塩化ナトリウム、グリセリン、ブドウ糖等の等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これにはメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤；果糖、キサンタンガム、グリセリン等の増粘剤；安息香酸ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【００２６】
本発明の治療または予防薬の有効成分としてＢＣＧの生菌を用いる場合には、これを凍結乾燥させた生ワクチン製剤とすることもまた好ましい。生ワクチン製剤は、適切な分散溶媒（例えば蒸留水、生理食塩水等）を用いて分散され、管針法にて接種される。更に、有効成分として菌体の一部（例えば細胞壁骨格、細胞壁）を用いる場合には、エマルション製剤（例えば水中油型（ｏ／ｗ）エマルション製剤等）の剤型をとることが好ましい。エマルション製剤の構成成分である油状物質としては鉱物油や動植物油等があげられる。エマルション製剤は必要に応じて界面活性剤、安定化剤、賦形剤等を含むことができる。また、エマルション製剤は凍結乾燥製剤の形とすることも可能である。その際、凍結乾燥製剤を分散するために使用される分散溶媒は、エマルション粒子の分散媒体となるものであり、蒸留水、生理食塩水等があげられるが、注射可能な分散溶媒であれば特に限定されない。
【００２７】
本発明の治療または予防薬の適用量は、疾患の重篤度、適用対象となる動物種、適用対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に設定することはできないが、通常、成人１回あたり有効成分量として小児へのＢＣＧワクチン接種１回量の１／３である。投与回数は、４ヶ月間隔で年３回を基本とする。
【００２８】
適用対象となる動物は、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物であり、ヒト以外の哺乳動物としてはサル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットなどがあげられる。
【００２９】
本発明のＴｈ２誘導性樹状細胞のＴｈ１誘導性樹状細胞への機能変換方法は、下記工程を含むことを特徴とする：
ケラチノサイトからＴＳＬＰを産生する哺乳動物由来の血液試料を分画し、樹状細胞画分を得る工程、
前記樹状細胞画分を試験管内でＢＣＧとともにインキュベートする工程、および
前記インキュベート後の樹状細胞画分中の樹状細胞の機能を調べ、インキュベート前後で当該樹状細胞がＴｈ２誘導性樹状細胞優位からＴｈ１誘導性樹状細胞優位に機能変換したことを確認する工程。
【００３０】
（１）ケラチノサイトからＴＳＬＰを産生する哺乳動物由来の血液試料を分画し、樹状細胞画分を得る工程
前記哺乳動物としては、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットなどがあげられるが、ヒトが好ましい。
【００３１】
ケラチノサイトからＴＳＬＰを産生する哺乳動物とは、ケラチノサイトでＴＳＬＰを発現しているかまたはその可能性のある哺乳動物であって、好ましくはＴＳＬＰが関与する疾患に罹患しているか、過去に罹患していたか、あるいは罹患するリスクを持った動物をいう。
【００３２】
ケラチノサイトからのＴＳＬＰの産生は、対象哺乳動物のケラチノサイトを採取し、当該細胞からｍＲＮＡを単離し、ＰＣＲによりＴＳＬＰの発現を調べる方法、抗ＴＳＬＰ抗体を用いた免疫学的手法により当該細胞におけるＴＳＬＰの存在を調べる方法などの公知の方法により確認することができる。
【００３３】
前記哺乳動物由来の血液試料としては、通常末梢血を用いる。血液試料を分画する方法は、公知の方法により行うことができる。例えば、後述の実施例、材料と方法の（２）に準じて、比重遠心分離法により末梢血単核球を分離し、表面マーカーを認識する種々の標識抗体を用いてセルソーターにより分画する方法があげられる。
【００３４】
前記分画により得られる樹状細胞画分は、ヒトの場合、ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞を含む画分であることが必要である。
【００３５】
（２）前記樹状細胞画分を試験管内でＢＣＧとともにインキュベートする工程
インキュベーションは、樹状細胞の試験管内での培養に通常用いられる培地を用いて常法により行う。一具体例として、１０％ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地中に、前記樹状細胞画分とＢＣＧとを加え、約３７℃で数時間〜７日間程度培養する。
【００３６】
（３）前記インキュベート後の樹状細胞画分中の樹状細胞の機能を調べ、インキュベート前後で当該樹状細胞がＴｈ２誘導性樹状細胞優位からＴｈ１誘導性樹状細胞優位に機能変換したことを確認する工程
機能変換の確認方法は、前記インキュベート後の樹状細胞、すなわち、ＢＣＧで刺激後の樹状細胞を、例えば、アロＣＤ４＋ナイーブＴ細胞と共培養し、培養後の当該Ｔ細胞からのサイトカイン産生を抗サイトカイン抗体を用いて調べる方法があげられる。対照としてＢＣＧで刺激前の樹状細胞またはＢＣＧなしでインキュベートした樹状細胞を、前記と同条件下でアロＣＤ４＋ナイーブＴ細胞と共培養し、サイトカイン産生を調べる。ＢＣＧで刺激後の樹状細胞が刺激前または刺激なしの樹状細胞と比べて、Ｔ細胞からのＴｈ１サイトカインを有意に産生させる場合、Ｔｈ２誘導性樹状細胞優位からＴｈ１誘導性樹状細胞優位に機能変換したと定義することができる。ここで、Ｔｈ１サイトカインとしては、インターフェロン（ＩＦＮ）γなどがあげられる。
【００３７】
別の方法として、ＢＣＧで刺激後の樹状細胞におけるＯＸ４０リガンドの発現をＰＣＲ等により調べ、ＢＣＧで刺激前または刺激なしの樹状細胞と比べてＯＸ４０リガンドの発現量が低下している場合、Ｔｈ２誘導性樹状細胞優位からＴｈ１誘導性樹状細胞優位に機能変換したと定義することができる。
【００３８】
前記確認工程は、解析が短時間で容易なことから、インキュベート前後の樹状細胞におけるＯＸ４０リガンドの発現量を比較することにより行われることが好ましい。
【００３９】
本発明の機能転換方法は、いわゆるエクスビボ（ex vivo）による治療を目的とする場合、（４）前記確認工程の後に、確認後の樹状細胞を、採取した哺乳動物に投与する工程を含むことが好ましい。機能転換した樹状細胞を採取した哺乳動物に投与する方法としては、公知の方法により行うことができ、例えば、注射（皮下、皮内、静脈内等）による方法があげられる。
【００４０】
本発明のＴＳＬＰが関与する疾患の治療または予防方法は、ＢＣＧの有効量を、ケラチノサイトからＴＳＬＰを産生する哺乳動物に投与することを特徴とする。
【００４１】
前記哺乳動物は、ヒトおよびヒトを除く哺乳動物であり、ヒトを除く哺乳動物としては前記した通りである。前記疾患は、アトピー性皮膚炎であることが好ましい。
【００４２】
本方法においては、ＢＣＧの有効量を投与することから、樹状細胞におけるＯＸ４０リガンドのダウンレギュレーションを介して前記疾患の治療または予防が行われることが好ましい。
【００４３】
以下、実施例等により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら制限されるものではない。
【実施例】
【００４４】
材料と方法
（１）試薬類、ＥＬＩＳＡキットおよび抗体
次の物質は表示の通り入手した。
Lymphoprep（Nycomed Pharma AS；ノルウェー・オスロ）、
ＢＣＧ（Mycobacterium Bacille Calmette-Guerin, strain:Tokyo 172）（CALBIOCHEM；カリフォルニア州サンディエゴ）、
ＲＰＭＩ ｍｅｄｉｕｍ １６４０（Invitorogen Corporation；カリフォルニア州カールスバッド）、
ＦＢＳ（ウシ胎児血清）（HyClone：ユタ州ロガン）、
Ionomycin、ＰＭＡ（Phorbol 12-myristate 13-acetate）、ＢＦＡ（(+)-Brefeldin A）（Alexis Biochemicals Industriestrasse；スイス・ルーセン）、
FIX&PERM cell permeabilization reagents（CALTAG Laboratories；カリフォルニア州バーリンガム）、
Dynabeads M-450（Dynal；ノルウェー・オスロ）、
ヒトＣＤ４ Microbeads（Miltenyi Biotec；ドイツ・グラドバッハ）
【００４５】
次の抗体は表示の通り入手した。
抗ＣＤ３抗体（HIT3a）、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１６抗体（3G8）、抗ＣＤ１９抗体（HIB19）、抗ＣＤ５６抗体（B159）および抗ＣＤ２３５ａ抗体（GA-R2）、抗ＩＬ−１０抗体、抗ＩＬ−１２抗体（BD Pharmingen；カリフォルニア州サンディエゴ）
ＦＩＴＣ（fluorescen isothiocyanate）標識抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ１４抗体（exalpha Biologicals, Inc；マサチューセッツ州メイナード）、抗ＣＤ１５抗体（BD Pharmingen；カリフォルニア州サンディエゴ）、抗ＣＤ１６抗体（exalpha Biologicals, Inc；マサチューセッツ州メイナード）、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ５６抗体（BD Pharmingen；カリフォルニア州サンディエゴ）
ＰＥ（phycoerythrin）標識抗ＣＤ３抗体（exalpha Biologicals, Inc；マサチューセッツ州メイナード）、抗ＣＤ１４抗体（exalpha Biologicals, Inc；マサチューセッツ州メイナード）、抗ＣＤ１５抗体（IMMUNOTECH；フランス・マルセイユ）、抗ＣＤ１６抗体（exalpha Biologicals, Inc；マサチューセッツ州メイナード）、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ５６抗体（BD Pharmingen；カリフォルニア州サンディエゴ）、抗ＯＸ４０Ｌ（京都大学血液腫瘍内科  堀利行博士より供与）
ＰＥＣｙ５標識抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（IMMUNOTECH；フランス・マルセイユ）
【００４６】
ＥＬＩＳＡキットは表示の通り入手した。
ヒトＩＬ−４ＥＬＩＳＡキット、ヒトＩＬ−１０ＥＬＩＳＡキット、ヒトＩＬ−１２（p40+p70）ＥＬＩＳＡキット、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡキット（Pierce Biotechnology；イリノイ州ロックフォード）
【００４７】
（２）ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ）の採取
成人ボランティアドナーから末梢血を採取し、Lymphoprepを用いた比重遠心法でＰＢＭＣ（Peripheral Blood Mononuclear Cells：末梢血単核球）を分離した。ＰＢＭＣ中のＣＤ３、１４、１６、１９、５６、２３５ａ陽性細胞を、マウス抗ヒトＣＤ３抗体、ＣＤ１４抗体、ＣＤ１６抗体、ＣＤ１９抗体、ＣＤ５６抗体、ＣＤ２３５ａ抗体およびヒツジ抗マウスDynabeads M-450を用いて除去した。その後、抗ヒトＣＤ４ Microbeadsを用いてＣＤ４発現細胞を採取した。採取した細胞をＰＥ標識抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１５抗体、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ５６抗体、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１１ｃ抗体、ＰＥＣｙ５標識抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体で染色し、EPICS ALTRA HYPERSORT（BECKMAN COULTER, INC.；カリフォルニア州フラトン）を用いてＣＤ１１ｃ＋ ＤＣ（ＣＤ３-、ＣＤ１４-、ＣＤ１５-、ＣＤ１６-、ＣＤ１９-、ＣＤ５６-、ＣＤ１１ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋）を採取した。
【００４８】
（３）ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞の採取
成人ボランティアドナーから末梢血を採取し、Lymphoprepを用いた比重遠心法でＰＢＭＣを分離した。ＰＢＭＣ中のＣＤ４発現細胞を抗ヒトＣＤ４ Microbeadsを用いて採取した。採取した細胞をＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２５抗体および抗ＣＤ５６抗体、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ４５ＲＯ抗体、ＰＥＣｙ５標識抗ヒトＣＤ４抗体で染色し、EPICS ALTRA HyPerSort（Beckman Coulter, Inc.；カリフォルニア州フラトン）を用いてＣＤ４＋ナイーブＴ細胞（ＣＤ１４−、ＣＤ１６−、ＣＤ１９−、ＣＤ２５−、ＣＤ５６−、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４＋）を採取した。
【００４９】
（４）ＢＣＧによるＣＤ１１ｃ＋ ＤＣの刺激および共刺激分子のＦＡＣＳ分析
前述の方法で末梢血より採取したＣＤ１１ｃ＋ ＤＣを、１０％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ １６４０に再懸濁し、９６穴平底プレートに１０×１０４ずつ分配し、ＢＣＧ（MOI=10）を入れ３７℃で２４時間刺激した。２４時間刺激したＣＤ１１ｃ＋ＤＣをＥＤＴＡおよび２％ＦＢＳ含有のＰＢＳにて回収し、同緩衝液で２回洗浄後ＰＥ標識抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ８６抗体、抗マウスＩｇＧ１抗体にて染色し、FACScan flow cytometer（Becton Dickinson社）にて分析した。同時に、同様に採取した未熟なＤＣもＰＥ標識抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ８６抗体、抗マウスＩｇＧ１抗体にて染色し比較した（図１）。
図１より、未成熟なＤＣではＣＤ４０、ＣＤ８６共にほとんど発現が認められないが、ＢＣＧによる２４時間刺激後のＤＣでは、両分子共に著明に発現が増加したことがわかる。
【００５０】
（５）ＣＤ１１ｃ＋ ＤＣのサイトカイン産生の測定
前述の方法にて分離したＣＤ１１ｃ＋ＤＣを、１０％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ １６４０に再懸濁し、９６穴平底プレートに１０×１０４ずつ分配し、それぞれにmedium、ＧＭ−ＣＳＦ（100ng/ml）、ＬＰＳ（1μg/ml）、ＢＣＧ（MOI=10）を入れ３７℃で２４時間刺激した。２４時間刺激後、それぞれのＣＤ１１ｃ＋ＤＣ培養液の上清を採取し、ヒトＴＮＦ−αＥＬＩＳＡキット、ヒトＩＬ−１２（ｐ４０＋ｐ７０）ＥＬＩＳＡキットで測定した。結果を図２に示す。
図２より、ＢＣＧで刺激したＤＣはＩＬ−１２（ｐ４０＋ｐ７０）およびＴＮＦ−αを著明に産生し、ＬＰＳで刺激したＤＣよりも両サイトカインが多量に産生されることが明らかになった。
【００５１】
（６）ＴＳＬＰ±ＢＣＧで刺激したＣＤ１１ｃ＋ＤＣとアロＣＤ４＋ナイーブＴ細胞の共培養
medium、ＧＭ−ＣＳＦ（100ng/ml）、ＢＣＧ（MOI=10）、ＴＳＬＰ（50ng/ml）±ＢＣＧ（MOI=10）で２４時間刺激したＣＤ１１Ｃ＋ＤＣを、１０％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ １６４０にて回収し、同培養液で２回洗浄後再び同培養液にて懸濁し、９６穴平底プレートに１×１０４となるように分配し、これにアロＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を５×１０４ずつ加え３７℃で６日間共培養し、Ｔ細胞からのサイトカイン産生を細胞内サイトカイン染色法で染色してＦＡＣＳで解析した。結果を図３に示す。
図３より、ＢＣＧで刺激したＤＣとＣＤ４＋ナイーブＴ細胞の共培養により、ＩＦＮ−γ産生性のＴｈ１細胞が著明に増加することが明らかになった。一方、コントロールとしてmediumまたはＧＭ−ＣＳＦのみでＤＣを刺激した場合、ＢＣＧ刺激ＤＣに比べＴｈ１細胞の誘導は弱かった。
【００５２】
（７）ＣＤ１１ｃ＋ ＤＣと共培養したＴ細胞産生サイトカインの測定（細胞内サイトカイン染色法）
上記（６）の方法で６日間共培養したのち、Ｔ細胞を１０％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ １６４０にて回収し、同培養液で２回洗浄した。回収した細胞をＰＭＡ（75ng/ml）、Ionomycine（2μg/ml）で３７℃、４時間刺激した後、ＢＦＡ（10μg/ml）を加えて更に３７℃、２時間刺激した。合計６時間刺激後のＴ細胞をＰＢＳにて２回洗浄後、FIX&PERM cell permeabilization reagentsおよびＰＥ標識抗ヒトＩＦＮ−γ抗体、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩＬ−４抗体、ＩＬ−１３抗体、ＴＮＦ−α抗体にて細胞内サイトカインを染色し、FACScan flow cytometer（Becton Dickinson社）にて分析した（図４）。
図４より、ＴＳＬＰのみの刺激ではＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＴＮＦ-α産生性のＴｈ２細胞の誘導がみられるが、ＴＳＬＰにＢＣＧを同時添加して刺激したＤＣではＴｈ２細胞の減少がみられる一方、ＩＦＮ−γ産生性のＴｈ１細胞の有意な増加がみられた。
【００５３】
（８）ＣＤ１１ｃ＋ ＤＣとの共培養によるＴ細胞数の変化
上記（６）の方法で６日間共培養したのち、Ｔ細胞を１０％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ １６４０にて回収した。回収した細胞を同培養液に再懸濁し、０．５％トリパンブルー液で染色し、計算盤で生存細胞数をカウントした。この生存細胞数に、細胞内サイトカイン染色およびFACScan flow cytometerで測定したＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α産生細胞の割合を掛け、各サイトカイン産生性Ｔ細胞の絶対数を計算した（図５）。
図５より、ＴＳＬＰ刺激ＤＣでは３．１ｘ１０４個のＩＬ−４産生性Ｔ細胞が誘導されたが、ＴＳＬＰ＋ＢＣＧでＤＣを刺激した場合、ＩＬ−４産生性Ｔ細胞の誘導は１．２ｘ１０４個と減少していた。同様にＴＮＦ−α産生性のＴ細胞の誘導もＢＣＧ添加により減少した。一方、ＴＳＬＰ単独刺激に比べＴＳＬＰ＋ＢＣＧによる刺激では、ＩＦＮ−γ産生性のＴ細胞の誘導が増強した。
【００５４】
（９）ＴＳＬＰ±ＢＣＧで刺激したＣＤ１１ｃ＋ ＤＣとアロＣＤ４＋ナイーブＴ細胞との共培養によるＴ細胞産生サイトカインの測定（ＥＬＩＳＡ法）
末梢血より採取したＣＤ１１ｃ＋ ＤＣを、１０％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ １６４０に再懸濁し、９６穴平底プレートに１０×１０４ずつ分配し、それぞれにＴＳＬＰ（50ng/ml）、ＴＳＬＰ（50ng/ml）＋ＢＣＧ（MOI=10）を入れ３７℃で２４時間刺激した。２４時間刺激後、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣを１０％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ １６４０にて回収し、同培養液で２回洗浄後再び同培養液にて懸濁し、９６穴平底プレートに１×１０４となるように分配し、これにアロＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を５×１０４ずつ加え３７℃で６日間共培養した。６日間共培養したのち、Ｔ細胞を１０％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ １６４０にて回収し、同培養液で２回洗浄した。これをＰＭＡ（75ng/ml）、Ionomycine（2μg/ml）で３７℃、４８時間刺激した後上清を採取し、ヒトＩＦＮ−γＥＬＩＳＡキット、ヒトＩＬ−４ＥＬＩＳＡキットで測定した（図６）。
図６より、ＴＳＬＰ単独でＤＣを刺激した場合、多量のＩＬ−４が検出されたが、ＴＳＬＰ＋ＢＣＧの同時刺激ではＩＬ−４の産生は減少していた。一方、ＴＳＬＰ単独刺激に比べＴＳＬＰ＋ＢＣＧによる同時刺激ではＴ細胞からのＩＦＮ−γの産生は増強することが明らかになった。
【００５５】
（１０）ＴＳＬＰ刺激ＣＤ１１ｃ＋ ＤＣとアロＣＤ４＋ナイーブＴ細胞との共培養（ＢＣＧ非存在下または存在下）
前述の通り末梢血より採取したＣＤ１１ｃ＋ ＤＣを、１０％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ １６４０に再懸濁し、９６穴平底プレートに１０×１０４になるよう分配し、ＴＳＬＰ（50ng/ml）を入れ３７℃で２４時間刺激した。２４時間刺激後、ＣＤ１１ｃ＋細胞を１０％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ １６４０にて回収し、同培養液で２回洗浄後再び同培養液にて懸濁し、９６穴平底プレートに１×１０４となるように分配し、これにアロＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を５×１０４ずつ加え、更にmediumもしくはＢＣＧ（MOI=10）を加え３７℃で６日間共培養した。
【００５６】
（１１）ＴＳＬＰ刺激ＣＤ１１ｃ＋ＤＣとＢＣＧ非存在下または存在下で共培養したＴ細胞から産生されるサイトカインの測定（細胞内サイトカイン染色法）
上記（１０）の方法で６日間共培養したのち、Ｔ細胞を１０％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ １６４０にて回収し、同培養液で２回洗浄した。洗浄後の細胞を、ＰＭＡ（75ng/ml）、Ionomycine（2μg/ml）で３７℃、４時間刺激した後、ＢＦＡ（10μg/ml）を加えて更に３７℃、２時間刺激した。合計６時間刺激後のＴ細胞をＰＢＳにて２回洗浄後、FIX&PERM cell permeabilization reagentsおよびＰＥ標識抗ヒトＩＦＮ−γ抗体、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩＬ−４抗体、ＴＮＦ−α抗体にて細胞内サイトカインを染色し、FACScan flow cytometer（Becton Dickinson社）にて分析した（図７）。
図７より、ＴＳＬＰで刺激されたＤＣではＩＬ−４およびＴＮＦ−α産生性のＴｈ２細胞の誘導がみられるが、一旦ＴＳＬＰで刺激され成熟したＤＣにＢＣＧを添加することにより、Ｔｈ２細胞誘導の減少がみられるとともにＩＦＮ−γ産生性のＴｈ１細胞の有意な増加がみられた。すなわち、ＢＣＧによりＤＣの機能変換がなされたことが示唆される。
【００５７】
（１２）ＴＳＬＰ刺激ＣＤ１１ｃ＋ＤＣとＢＣＧ非存在下または存在下におけるアロＣＤ４＋ナイーブＴ細胞との共培養によるＴ細胞数の変化
上記（１０）の方法で６日間共培養したのち、Ｔ細胞を１０％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ １６４０にて回収した。回収した細胞を同培養液に再懸濁し、０．５％トリパンブルー液で染色し、計算盤で生存細胞数をカウントした。この生存細胞数に、細胞内サイトカイン染色およびFACScan flow cytometerで測定したＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α産生細胞の割合を掛け、各サイトカイン産生性Ｔ細胞の絶対数を計算した（図８）。
図８より、ＴＳＬＰ刺激ＤＣでは３．０ｘ１０４個のＩＬ−４産生性Ｔ細胞が誘導されたが、共培養時ＢＣＧを添加した場合、ＩＬ−４産生性Ｔ細胞の誘導は１．４ｘ１０４個と減少していた。同様に、ＴＮＦ−α−産生性のＴ細胞の誘導もＢＣＧ添加により減少した。一方、ＢＣＧ添加により、ＩＦＮ−γ−産生性のＴ細胞の誘導が増強した。ＢＣＧ添加により、Ｔｈ２誘導性ＤＣがＴｈ１誘導性ＤＣに機能変換したことが示唆される。
【００５８】
（１３）ＴＳＬＰ±ＢＣＧ刺激ＣＤ１１ｃ＋ＤＣからのサイトカイン測定
図９は、ＴＳＬＰ（50ng/ml）±ＢＣＧ（10MOI）で２４時間刺激したＣＤ１１ｃ＋ＤＣからのＩＬ−１０産生をＥＬＩＳＡにて解析した結果である。ＢＣＧ単独刺激により大量のＩＬ−１０が産生された。ＴＳＬＰ＋ＢＣＧでも同様に大量のＩＬ−１０がＤＣから産生された。
【００５９】
（１４）ＴＳＬＰ±ＢＣＧで刺激したＤＣと抗ＩＬ−１０抗体非存在下または存在下でのアロＣＤ４＋ナイーブＴ細胞との共培養によるＴ細胞産生サイトカインの測定（細胞内サイトカイン染色法）
上記（２）で採取したＣＤ１１ｃ＋ＤＣを、１０％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ １６４０に再懸濁し、９６穴平底プレートに１０×１０4ずつ分配し、それぞれにＴＳＬＰ（50ng/ml）、ＴＳＬＰ（50ng/ml）＋ＢＣＧ（MOI=10）を入れ３７℃で２４時間刺激した。２４時間刺激後、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣを１０％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ １６４０にて回収し、同培養液で２回洗浄後再び同培養液にて懸濁し、９６穴平底プレートに１×１０4となるように分配し、これにアロＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を５×１０4ずつ加え、更にmediumもしくは抗ヒトＩＬ-１０抗体を加え３７℃で６日間共培養した。６日間共培養したのち、Ｔ細胞を１０％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ １６４０にて回収し、同培養液で２回洗浄した。洗浄後の細胞をＰＭＡ（75ng/ml）、Ionomycine（2μg/ml）で３７℃、４時間刺激した後、ＢＦＡ（10μg/ml）を加えて更に３７℃、２時間刺激した。合計６時間刺激後のＴ細胞をＰＢＳにて２回洗浄後、FIX&PERM cell permeabilization reagentsならびにＰＥ標識抗ヒトＩＦＮ-γ抗体、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩＬ−４抗体およびＴＮＦ−α抗体にて細胞内サイトカインを染色し、FACScan flow cytometer（Becton Dickinson社）にて分析した（図１０）。
図１０より、抗ＩＬ−１０ブロッキング抗体を添加しても、ＢＣＧによるＴＳＬＰ−ＤＣのＴｈ２誘導能の機能変換は解除されなかった。この結果は、ＢＣＧによるＴＳＬＰ−ＤＣのＴｈ２誘導能の抑制はＤＣが産生するＩＬ−１０に依存しないことを示している。
【００６０】
（１５）ＴＳＬＰ±ＢＣＧで刺激したＣＤ１１ｃ＋ＤＣの細胞表面ＯＸ４０ＬのＦＡＣＳ解析
上記（２）で末梢血から採取したＣＤ１１ｃ＋ ＤＣを、１０％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ １６４０に再懸濁し、９６穴平底プレートに１０×１０4ずつ分配し、ＴＳＬＰ（50ng/ml）、ＢＣＧ（MOI=10）、ＴＳＬＰ（50ng/ml）＋ＢＣＧ（MOI=10）、ＴＳＬＰ（50ng/ml）＋ＬＰＳ（1μg/ml）を入れ３７℃で４８時間（Day2）および９６時間(Day4)刺激した。刺激したＣＤ１１ｃ＋ＤＣをＥＤＴＡおよび２％ＦＢＳ含有のＰＢＳにて回収し、同緩衝液で２回洗浄後ＰＥ標識抗ＯＸ４０Ｌ抗体および抗mouse ＩｇＧ１抗体にて染色し、FACScan flow cytometer（Becton Dickinson社）にて分析した（図１１）。
図１１より、ＴＳＬＰで刺激されたＤＣのＯＸ４０Ｌの発現は時間依存性に増加するが、ＴＳＬＰと同時にＢＣＧまたはＬＰＳを添加したＤＣではＯＸ４０Ｌの発現を認めなかった。すなわち、ＢＣＧとＬＰＳは、ＴＳＬＰによるＯＸ４０Ｌの発現を抑制することが明らかになった。
【００６１】
（１６）ＴＳＬＰ±ＢＣＧで刺激したＣＤ１１ｃ＋ＤＣにおけるＯＸ４０Ｌ発現のＲＴ−ＰＣＲによる解析
上記（２）で末梢血から採取したＣＤ１１ｃ＋ＤＣを、１０％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ １６４０に再懸濁し、９６穴平底プレートに１０×１０4ずつ分配し、ＴＳＬＰ（50ng/ml）、ＴＳＬＰ（50ng/ml）＋ＢＣＧ（MOI=10）を入れ３７℃で９６時間刺激した。刺激したＣＤ１１ｃ+細胞をＥＤＴＡおよび２％ＦＢＳ含有のＰＢＳにて回収し、同緩衝液で２回洗浄後、ＯＸ４０Ｌの発現をＲＴ−ＰＣＲ法を用いて測定した。ＰＣＲ法の温度プロファイルは以下の通りであった。初期熱変性は９４℃５分、次に９４℃１分の熱変性、５５℃１分のアニーリング、７２℃３０秒の伸長反応を３６サイクル施行したのち、最終伸長反応を７２℃７分施行した。プライマーのシークエンスは、ＯＸ４０Ｌが
forward:5’-CCCAGATTGTGAAGATGGAA-3’（配列番号：１）、
reverse:5’-GCCTGGTTTTAGATATTGCC-3’（配列番号：２）であり、β−ａｃｔｉｎが
forward:5’-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3’（配列番号：３）、
reverse:5’-AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA-3’（配列番号：４）であった。結果を図１２に示す。
図１２より、ＴＳＬＰ単独刺激ではＯＸ４０Ｌの発現を認めるが、ＢＣＧ添加したＤＣではＯＸ４０Ｌの発現をほとんど認めなかった。すなわち、ＢＣＧは、ＴＳＬＰによるＯＸ４０Ｌの発現をｍＲＮＡのレベルで抑制することが明らかになった。
【００６２】
（１７）ＴＳＬＰ＋ＢＣＧ刺激したＣＤ１１ｃ＋ＤＣと抗ＯＸ４０Ｌブロッキング抗体存在下でのアロＣＤ４＋ナイーブＴ細胞との共培養によるＴ細胞産生サイトカインの測定（細胞内サイトカイン染色法）
上記（２）で末梢血から採取したＣＤ１１ｃ＋ＤＣを、１０％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ １６４０に再懸濁し、９６穴平底プレートに１０×１０4となるように分配し、ＴＳＬＰ（50ng/ml）＋ＢＣＧ（MOI=10）を加えて３７℃で２４時間刺激した。２４時間刺激後、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣを１０％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ １６４０にて回収し、同培養液で２回洗浄後再び同培養液にて懸濁し、９６穴平底プレートに１×１０４となるように分配し、これにアロＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を５×１０4ずつ加え、更にmediumもしくは抗ヒトＯＸ４０Ｌ抗体を加え３７℃、６日間共培養した。６日間共培養したのち、Ｔ細胞を１０％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ １６４０にて回収し、同培養液で２回洗浄した。洗浄後の細胞をＰＭＡ（75ng/ml）、Ionomycine（2μg/ml）で３７℃、４時間刺激した後、ＢＦＡ（10μg/ml）を加えて更に３７℃、２時間刺激した。合計６時間刺激後のＴ細胞をＰＢＳにて２回洗浄後、FIX&PERM cell permeabilization reagentsおよびＦＩＴＣ標識抗ヒトＩＦＮ−γ抗体、ＰＥ標識抗ヒトＩＬ−４抗体およびＴＮＦ−α抗体にて細胞内サイトカインを染色し、FACScan flow cytometer（Becton Dickinson社）にて分析した（図１３）。
図１３より、抗ＯＸ４０Ｌブロッキング抗体非存在下では、ＴＳＬＰ＋ＢＣＧ刺激のＤＣではＩＬ−４およびＴＮＦ−α産生性のＴｈ２細胞を誘導しているが、抗体存在下ではＴｈ２細胞が減少した。
【００６３】
図１１から図１３までの結果より、ＴＳＬＰ−ＤＣによるＴｈ２細胞の誘導には樹状細胞膜上にアップレギュレーションされるＯＸ４０Ｌが重要であること、そしてＢＣＧによるＴＳＬＰ−ＤＣのＴｈ２誘導能の抑制はＯＸ４０Ｌのダウンレギュレーションに基づくことが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、ＢＣＧ（10MOI）で刺激したＣＤ１１ｃ＋ＤＣにおける細胞表面の共刺激分子の発現をＦＡＣＳで解析した結果である。左列は末梢血中から採取直後の未成熟な状態のＤＣ、右列はＢＣＧで２４時間刺激したＤＣで、白のヒストグラムはisotype control（anti mouse IgG1）、グレーのヒストグラムはＣＤ４０（上段）およびＣＤ８６（下段）の発現である。
【図２】図２は、ＢＣＧまたはＬＰＳで２４時間刺激したＣＤ１１ｃ＋ＤＣからのサイトカイン産生をＥＬＩＳＡで測定した結果である。
【図３】図３は、ＢＣＧ（10MOI）で２４時間刺激したＣＤ１１ｃ＋ＤＣをＣＤ４＋ナイーブＴ細胞と６日間共培養し、Ｔ細胞からのサイトカイン産生を細胞内サイトカイン染色法で染色してＦＡＣＳで解析した結果である。コントロールとしてmediumまたはＧＭ−ＣＳＦのみでＤＣを刺激した場合を示す。
【図４】図４は、ＴＳＬＰ（50ng/ml）±ＢＣＧ（10MOI）で２４時間刺激したＣＤ１１ｃ＋ＤＣをアロＣＤ４＋ナイーブＴ細胞と６日間共培養し、Ｔ細胞からのサイトカイン産生を細胞内サイトカイン染色法で染色してＦＡＣＳにて解析した結果である。
【図５】図５は、図４におけるＤＣとアロＣＤ４＋ナイーブＴ細胞（5ｘ10４個）との共培養の実験で、共培養６日後におけるＩＬ−４−、ＩＦＮ−γ-およびＴＮＦ−α−産生性のＴ細胞の絶対数を示したものである。
【図６】図６は、ＴＳＬＰ（50ng/ml）±ＢＣＧ（10MOI）で２４時間刺激したＣＤ１１ｃ＋ＤＣをアロＣＤ４＋ナイーブＴ細胞と６日間共培養し、Ｔ細胞からのサイトカイン産生を培養上清のＥＬＩＳＡで解析した結果を示す。
【図７】図７は、ＴＳＬＰ（50ng/ml）で２４時間刺激したＣＤ１１ｃ＋ＤＣとアロＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を共培養する際にＢＣＧを添加し、６日間培養後Ｔ細胞からのサイトカイン産生を細胞内サイトカイン染色法で解析した結果を示す。
【図８】図８は、図７におけるＤＣとアロＣＤ４＋ナイーブＴ細胞（5ｘ104個）との共培養の実験で、共培養６日後におけるＩＬ−４−、ＩＦＮ−γ− およびＴＮＦ−α−産生性のＴ細胞の絶対数を示したものである。
【図９】図９は、ＴＳＬＰ（50ng/ml）±ＢＣＧ（10MOI）で２４時間刺激したＣＤ１１ｃ＋ＤＣからのＩＬ−１０産生をＥＬＩＳＡにて解析した結果である。
【図１０】図１０は、ＴＳＬＰ（50ng/ml）±ＢＣＧ（10MOI）で２４時間刺激したＣＤ１１ｃ＋ＤＣをアロＣＤ４＋ナイーブＴ細胞と６日間共培養する際、抗ＩＬ−１０ブロッキング抗体を加え、ＴＳＬＰ−ＤＣのＴｈ２誘導能がＢＣＧにより変化するかどうか細胞内サイトカイン染色にて調べた結果である。
【図１１】図１１は、ＢＣＧ（10MOI）で４８時間または９６時間刺激したＣＤ１１ｃ＋ＤＣの細胞表面のＯＸ４０Ｌの発現をＦＡＣＳで解析した結果である。
【図１２】図１２は、ＴＳＬＰ±ＢＣＧで９６時間刺激したＣＤ１１ｃ＋ＤＣのＯＸ４０Ｌの発現をＲＴ−ＰＣＲにより調べた結果である。
【図１３】図１３は、ＴＳＬＰ＋ＢＣＧで２４時間刺激したＣＤ１１ｃ＋ＤＣを抗ＯＸ４０Ｌブロッキング抗体の非存在下および存在下でＣＤ４＋ナイーブＴ細胞と６日間共培養し、Ｔ細胞からのサイトカイン産生を細胞内サイトカイン染色法で染色してＦＡＣＳで解析した結果である。
【図１】
2007022930.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１２】
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【配列表】
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