(57)【要約】【課題】種々の測定を自動化するのに適する反応容器キットを提供する。【解決手段】反応容器キットは、平板状の板状基板９の同じ側に試薬収容部１４及び不揮発性液体収容部１６が凹部として形成された反応容器１０と、分注プローブの先端に装着して液の吸入・吐出を行なうための分注チップ７０ａ，７０ｂを備えている。分注チップ７０ａ，７０ｂは反応容器１０を構成する基板９の端部に可動部材を介して取り付けられた保持部材４２に脱着可能に保持されている。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
平板状の基板の一面にサンプルに反応を起こさせるための反応部が少なくとも１つ形成された反応容器と、
分注機構の分注プローブに装着されて前記反応容器の反応部にサンプル及び／又は試薬を分注するための分注チップと、
前記分注チップを脱着可能に保持する保持部材と、
前記保持部材に保持された前記分注チップが前記反応容器の基板の平板面に沿って配置された状態の反応容器と分注チップの組を包装する包装部材と、を備えている反応容器キット。
【請求項２】
前記保持部材は、保持した分注チップが反応容器の基板の平板面に対し沿った状態と立ち上がった状態との間で変位できるように可動部材を介して反応容器に取り付けられている請求項１に記載の反応容器キット。
【請求項３】
前記保持部材は反応容器の先端部に取り付けられ、包装された状態では分注チップが反応容器側にくるように折り曲げられている請求項２に記載の反応容器キット。
【請求項４】
前記保持部材は反応容器の中間部に取り付けられ、包装された状態では分注チップが折り曲げられる側の基板の平板面で盛り上がりの小さい側にくるように折り曲げられている請求項２に記載の反応容器キット。
【請求項５】
前記保持部材は、前記分注チップを保持したときに少なくとも分注チップの先端部を覆う収納部を備えており、その収納部の内部に液を吸収する吸収材を備えている請求項１から４のいずれかに記載の反応容器キット。
【請求項６】
前記基板又は保持部材の先端側には把持部が形成されている請求項１から５のいずれかに記載の反応容器キット。
【請求項７】
前記反応容器は、前記基板に凹部として形成され、反応液よりも比重の低い不揮発性液体を収容しフィルムで封止された不揮発性液体収容部を備えている請求項１から６のいずれかに記載の反応容器キット。
【請求項８】
前記反応容器は、前記基板に凹部として形成され、前記サンプルの反応に使用される試薬を収容しフィルムで封止された少なくとも１つの試薬収容部をさらに備えてサンプルの反応用試薬キットを構成している請求項７に記載の反応容器キット。
【請求項９】
前記試薬収容部として複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を収容したタイピング試薬収容部を含み、
前記反応部として前記複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に保持した複数のプローブ配置部を含み、
遺伝子多型診断用試薬キットを構成している請求項８に記載の反応容器キット。
【請求項１０】
前記試薬収容部として複数の多型部位それぞれを挟んで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅試薬を収容した遺伝子増幅試薬収容部をさらに含み、
前記反応部として前記遺伝子増幅試薬とサンプルとの混合液に対して遺伝子増幅反応を行なわせる増幅反応部をさらに含んでいる請求項９に記載の反応容器キット。
【請求項１１】
前記反応容器と分注チップの組には反応容器１つに対して分注チップを２つ備えている請求項１から１０に記載の反応容器キット。
【請求項１２】
前記包装部材内には前記反応容器と分注チップの組が複数組収容されて包装されている請求項１から１１に記載の反応容器キット。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれかに記載の反応容器キットの反応容器を装着する反応容器装着部と、前記反応容器キットの分注チップが先端部に装着された分注プローブによる吸引及び吐出のための機構を備えて液を移送して分注する分注部と、
前記分注部の分注動作を少なくとも制御する制御部と、を備えた反応容器処理装置。
【請求項１４】
請求項２から１２のいずれかに記載の反応容器キットの反応容器をその基板の平板面が水平方向になり、反応容器に保持された分注チップが垂直方向になる状態で装着する反応容器装着部と、分注プローブによる吸引及び吐出のための機構を備えて液を移送して分注する分注部と、前記分注部の分注動作を少なくとも制御する制御部と、を備えた反応容器処理装置であって、
前記制御部は、前記分注プローブを前記分注チップに向かって下降させて分注チップに差し込み、上昇させることによりその分注チップを前記保持部材から脱着させて分注プローブの先端に装着する操作も制御する反応容器処理装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は化学反応を初め、現場において各種自動解析、例えば遺伝子解析の研究や臨床を行なうのに適する反応容器キットと、それを用いて人間を初めとする動物や植物のゲノムＤＮＡの多型、例えばＳＮＰ（一塩基多型）などを検出するための反応容器処理装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子多型を利用して病気の罹りやすさなどを予測する方法又は装置として、下記のようなものが提案されている。
患者が敗血症に罹りやすいか否か及び／又は敗血症に急速に進行しやすいか否かを決定するために、患者から核酸サンプルを採取し、該サンプル中におけるパターン２対立遺伝子、又はパターン２対立遺伝子と連鎖不平衡であるマーカー遺伝子を検出し、パターン２対立遺伝子又はパターン２対立遺伝子と連鎖不平衡であるマーカー遺伝子が検出されれば該患者が敗血症に罹りやすいと判定する（特許文献１参照。）。
【０００３】
ヒトのｆｌｔ−１遺伝子中の１又はそれ以上の単一ヌクレオチド多型性の診断のために、ヒトの核酸の１又はそれ以上の位置：１９５３、３４５３、３８８８（各々ＥＭＢＬ受理番号Ｘ５１６０２中の位置に従う）、５１９、７８６、１４２２、１４７０（各々ＥＭＢＬ受理番号Ｄ６４０１６中の位置に従う）、４５４（配列番号３に従う）及び６９６（配列番号５に従う）の配列を決定し、ｆｌｔ−１遺伝子中の多型性を参照することにより、そのヒトの体質を決定する（特許文献２参照。）。
【０００４】
ＳＮＰ部位の塩基を判別する、いわゆるタイピングについては多くの手法が報告されている。そのうちの代表的なものは次の方法である。
比較的に少量の核酸を用いて数十万箇所に及ぶＳＮＰ部位についてタイピングを行なうために、少なくとも一つの一塩基多型部位を含む複数の塩基配列を、核酸及び複数対のプライマーを用いて同時に増幅し、増幅した複数の塩基配列を用いて、当該塩基配列に含まれる一塩基多型部位の塩基をタイピング工程により判別する。そのタイピング工程として、インベーダ法又はタックマンＰＣＲ法を用いる（特許文献３参照。）。
【特許文献１】特表２００２−５３３０９６号公報
【特許文献２】特開２００１−７０９３６６号公報
【特許文献３】特開２００２−３００８９４号公報
【特許文献４】特許第３４５２７１７号公報
【非特許文献１】Hsu T. M., Law S. M, Duan S, Neri B. P., Kwok P. Y., "Genotyping single-nucleotide polymorphisms by the invader assay with dual-color fluorescence polarization detection", Clin. Chem., 2001 Aug;47(8):1373-7
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
化学反応や遺伝子解析などの分析を行うための反応容器を反応処理装置に装着し、その反応容器上でサンプルに試薬を分注して反応を行わせる際、分注プローブで試薬を分注するが、分注プローブの先端部にはディスポーザブル（使い捨て可能）な分注チップを装着して試薬の吸引と吐出を行う。その際、反応容器をディスポーザブルなものとすると、分注プローブに装着する分注チップもディスポーザブルなものとしてその反応容器とともに交換するようにするのが一般的である。その際、分注チップは分析を行おうとする反応容器の数だけは少なくともセットしておかなければならない。もし分注チップの数が少なかったり、セットするのを忘れたりすると、ディスポーザブルなはずの分注チップが複数のサンプルで繰り返し使用される事態が生じて分析精度が低下する。特に、ＰＣＲ工程に含まれている場合はコンタミニネーションが増幅されて検査結果に与える影響が大きくなる。
【０００６】
そこで、反応容器の数だけの分注チップは必ず反応容器処理装置内に持ち込まれるようにしておくのが望ましい。
本発明の第１の目的は、化学反応の測定や遺伝子多型検出を自動化するのに適する反応容器キットを提供することである。
【０００７】
本発明の第２の目的は、本発明の反応容器キットを用いて化学反応測定や遺伝子多型検出を自動化する装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の反応容器キットは、平板状の基板の一面にサンプルに反応を起こさせるための反応部が少なくとも１つ形成された反応容器と、分注機構の分注プローブに装着されて前記反応容器の反応部にサンプル及び／又は試薬を分注するための分注チップと、前記分注チップを脱着可能に保持する保持部材と、前記保持部材に保持された前記分注チップが前記反応容器の基板の平板面に沿って配置された状態の反応容器と分注チップの組を包装する包装部材とを備えている。なお、「サンプル及び／又は試薬」の語は「サンプル及び試薬」と「サンプル又は試薬」の両方を含む意味で使用している。
【０００９】
反応容器と分注チップが包装された状態において、分注チップを保持した保持部材は反応容器と一体化されていてもよく、別体であってもよい。
保持部材と反応容器が一体化されている場合は、その保持部材は保持した分注チップが反応容器の基板の平板面に対し沿った状態と立ち上がった状態との間で変位できるように可動部材を介して反応容器に取り付けられていることが好ましい。
【００１０】
保持部材が反応容器に取り付けられている場合、その取付け位置は特に限定されるものではないが、１つの形態は、保持部材が反応容器の先端部に取り付けられたものである。その場合、包装された状態では分注チップが反応容器側にくるように保持部材が折り曲げられる。
【００１１】
保持部材が反応容器に取り付けられている取付け位置の他の形態は、保持部材が反応容器の中間部に取り付けられたものである。その場合、包装された状態では、分注チップが折り曲げられる側の基板の平板面で盛り上がりの小さい側にくるように折り曲げられる。
【００１２】
使用後の分注チップは再び保持部材に保持して反応容器とともに破棄するのが好ましい。その際、分注チップの先端部に付着したサンプルや試薬を他のものに付着したり飛び散ったりすることがないように、保持部材が分注チップを保持したときに少なくとも分注チップの先端部を覆う収納部を備え、その収納部の内部に液を吸収する吸収材を備えていることが好ましい。このような吸収材として、例えばろ紙などを挙げることができる。
反応容器を包装部材から取り出し、折り曲げられた保持部材を伸ばして分注チップが反応容器の基板の平板面に対し立ち上がった状態とする作業を容易にするために、基板又は保持部材の先端側に把持部が形成されていることが好ましい。
【００１３】
本発明の反応容器キットにおける反応容器には、同じ基板に凹部として形成され、反応液よりも比重の低い不揮発性液体を収容しフィルムで封止された不揮発性液体収容部をさらに備えていてもよい。
また、反応容器は同じ基板に凹部として形成され、サンプルの反応に使用される試薬を収容しフィルムで封止された少なくとも１つの試薬収容部をさらに備えてサンプルの反応用試薬キットを構成していてもよい。
【００１４】
フィルムで封止された試薬や不揮発性液体は、本発明の反応容器処理装置内において、分注プローブの先端に装着した分注チップを、そのフィルムを貫通して挿入することにより、又はそのフィルムを剥がした後に分注チップを挿入することにより、その分注チップに吸入し、反応部などの他の場所に移送することができる。
【００１５】
この反応容器は、化学反応、生化学反応を初め、種々の反応の測定に用いられるものである。この反応容器を反応用試薬キットとした場合の１つの用途として、遺伝子多型検出を挙げることができる。遺伝子多型検出用の反応容器とした場合の第１の形態は、生体サンプルとして遺伝子増幅反応がなされたものをこの反応容器に注入して遺伝子多型を検出する反応容器である。その第１の形態の反応容器は、試薬収容部として複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を収容したタイピング試薬収容部を含み、反応部として前記複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に保持した複数のプローブ配置部を含んで遺伝子多型診断用試薬キットを構成しているものである。
【００１６】
遺伝子多型検出用の反応容器とした場合の第２の形態は、上記の第１の形態の反応用試薬キットに、試薬収容部として複数の多型部位それぞれを挟んで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅試薬を収容した遺伝子増幅試薬収容部をさらに含み、反応部として遺伝子増幅試薬とサンプルとの混合液に対して遺伝子増幅反応を行なわせる増幅反応部をさらに含んだものである。
このような場合、反応容器キットに含まれる反応容器と分注チップの組として反応容器１つに対して分注チップを２つ備えておれば、一方を遺伝子増幅反応前の増幅反応液を扱うように使用し、他方は遺伝子増幅反応終了後の増幅反応終了液を扱うように使用することができる。
包装部材内には反応容器と分注チップの組が複数組収容されて包装されているようにしてもよい。
【００１７】
本発明による多型検出の対象は特に限定されないが、例えばｃＤＮＡ、ヒトを含む様々な生物の遺伝子、ウイルス及び細菌を含む様々な微生物の遺伝子などが挙げられる。したがって、これら核酸の配列をもつものを核酸増幅のための鋳型核酸とすることができる。また、これら多型検出の対象となる遺伝子としては、ＤＮＡの遺伝子であるかＲＮＡの遺伝子であるかを問わない。
これらの遺伝子を含むサンプルも特に限定されない。すなわち、生体試料、生体由来試料、抽出核酸試料などに対して多型検出を行なうことができる。ここで、生体試料や生体由来試料は、核酸の抽出操作を行なわず、核酸包含体（例えば細胞、真菌、細菌、ウイルスなど、核酸を内部に含有する膜構造体）を維持した形態の試料である。生体試料の例としては、臓器、組織、体液、排泄物などが挙げられる。体液には、血液試料、髄液、唾液、乳などが含まれる。血液試料には、全血、血漿、血清などが含まれる。排泄物には、尿、便などが含まれる。生体由来試料は、生体試料から回収した核酸包含体である。核酸包含体の回収方法は特に限定されないが、遠心・超遠心操作、ポリエチレングリコールなどの共沈剤、吸着担体などを用いた方法が挙げられる。抽出核酸試料は、核酸の抽出操作を行なった試料であり、抽出後さらに核酸を精製した試料であってもよい。抽出方法としては、酵素、界面活性剤、カオトロピック剤などを用いた方法が挙げられる。精製方法としては、フェノール／クロロホルム、イオン交換樹脂、ガラスフィルター、ガラスビーズ、磁気ビーズ、タンパク凝集作用を有する試薬などを用いた方法が挙げられる。
本発明で検出できる多型は、特に限定されず、ＳＮＰ及び複数ヌクレオチドからなる配列にわたる多型の両方を含む。本発明においては、多型にはさらに変異も含む。具体的には、本発明で検出できる多型の例としては、ＳＮＰ、挿入多型、欠失多型、反復配列多型などが挙げられる。
ここで、多型部位とプライマーの関係を示すと、１つの多型部位を増幅するためにはその多型部位をはさんで結合する一対のプライマーが必要になる。対象となる生体サンプルには複数種類の多型部位が存在するので、それらの多型部位が互いに離れた位置に存在する場合には多型部位の種類の数の２倍の種類のプライマーが必要になる。しかし、２つの多型部位が接近している場合には、それらの多型部位それぞれをはさんでプライマーを結合させて増幅することも、またそれらの２つの多型部位の間にはプライマーを結合させず、２つの多型部位の配列の両側にのみプライマーを結合させて増幅することもできる。したがって、必要なプライマーの種類は必ずしも多型部位の種類の数の２倍になるわけではない。本発明における「複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマー」とは一対のプライマーが１つの多型部位をはさんで結合する場合だけでなく、２又はそれ以上の多型部位をはさんで結合する場合も含めて、複数の多型部位を増幅するのに必要な種類のプライマーという意味で使用している。
遺伝子増幅試薬の一例はＰＣＲ反応試薬である。
【００１８】
ＳＮＰのタイピングには増幅工程に入る段階でゲノムＤＮＡの調整が必須であり、そこに手間とコストがかかる。核酸を増幅するＰＣＲ法だけに着目すれば、前処理なしで血液などのサンプルから直接ＰＣＲ反応を行なわせる方法も提案されている。そこでは、サンプル中の目的とする遺伝子を増幅する核酸合成法において、遺伝子を含むサンプル中の遺伝子包含体、すなわち生体由来試料、もしくは遺伝子を含むサンプルそのもの、すなわち生体試料を遺伝子増幅反応液に添加して、添加後の該反応液のｐＨが８.５−９.５（２５℃）で遺伝子を含むサンプル中の目的とする遺伝子を増幅する（特許文献４参照。）。
【００１９】
既に構築されているタイピングシステムは、タイピングしようとする複数のＳＮＰ領域をＰＣＲ法で増幅するために、最初に採取する核酸量は少なくてすむが、ＰＣＲ法で増幅する前に予め生体サンプルから核酸を抽出しておくという前処理が必要である。そのためにその前処理に時間と手間がかかる。
【００２０】
直接ＰＣＲ法とタイピング方法を結びつけたときに、タイピングを目的とする複数のＳＮＰ部位について同時に増幅を行なうような自動化システムはこれまで構築されていなかった。
タイピング工程はインベーダ法やタックマンＰＣＲ法を使用することができる。その場合、タイピング試薬はインベーダ試薬又はタックマンＰＣＲ試薬である。
【００２１】
図１５は本発明の反応容器を遺伝子多型診断用試薬キットとして使用して遺伝子多型を検出する際の検出方法を概略的に示したものである。ここでは、増幅工程にはＰＣＲ法、タイピング工程にはインベーダ法を使用するものとして説明する。
ＰＣＲ工程では血液などの生体サンプル２にＰＣＲ反応試薬４を添加するか、逆にＰＣＲ反応試薬４に生体サンプル２を添加する。
【００２２】
ＰＣＲ反応試薬４は予め調整されたものであり、測定しようとするＳＮＰ部位のための複数のプライマーを含み、それにｐＨを調整するためのｐＨ緩衝液、４種類のデオキシリボヌクレオチド類、熱安定性合成酵素、及びＭｇＣｌ2、ＫＣｌ等の塩類などの必要な試薬が添加されている。その他に、界面活性剤や蛋白などの物質を必要に応じて添加することができる。本発明で用いることのある増幅工程のＰＣＲ法は、目的とする複数のＳＮＰ部位を同時に増幅させるものである。生体サンプルは核酸抽出操作を施しているものであってもよく、核酸抽出操作を施していないものであってもよい。ここで、核酸抽出操作を施していない生体サンプルとは、上述した生体試料、生体由来試料、及び、加熱処理又は凍結処理などの操作によって核酸包含体の膜構造を破壊した状態の生体試料若しくは生体由来試料を含む。核酸抽出操作を施していない生体サンプルから直接ＰＣＲ法によりそれらのＳＮＰ部位を含む複数のゲノムＤＮＡを増幅させる場合には、それらのＳＮＰ部位のための複数のプライマーを含む遺伝子増幅反応試薬を生体サンプルに作用させ、サンプル２と混合したときに２５℃でのｐＨが８.５−９.５となる条件下でＰＣＲ反応を起こさせる。
【００２３】
ｐＨ緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと塩酸、硝酸、硫酸等の鉱酸の組合せのほか、種々のｐＨ緩衝液を使用することができる。ｐＨ調整された緩衝液は、ＰＣＲ反応試薬の中で１０ｍＭから１００ｍＭの間の濃度で使用するのが好ましい。
プライマーはＰＣＲ反応によるＤＮＡ合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは合成したものであってもよく、生物界から単離したものであってもよい。
【００２４】
合成酵素はプライマー付加によるＤＮＡ合成用の酵素であり、化学合成系も含む。適切な合成酵素としては、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ．litoralis ＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、Hot Start Taq ポリメラーゼ、KOD ＤＮＡポリメラーゼ、EX TaqＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などがあるが、これらに限定されるものではない。「熱安定性」は、高温下、好ましくは６５−９５℃でもその活性を保持する化合物の性質を意味する。
【００２５】
ＰＣＲ工程では、生体サンプル２とＰＣＲ反応試薬４との混合液を所定の温度サイクルに従ってＰＣＲ反応を行なわせる。ＰＣＲ温度サイクルは、変性、プライマー付着（アニーリング）及びプライマー伸長の３工程を含み、そのサイクルを繰り返すことによりＤＮＡを増幅させる。各工程の一例は、変性工程が９４℃で１分間、プライマー付着工程が５５℃で１分間、プライマー伸長が７２℃で１分間である。生体サンプルは核酸抽出操作を施したものであってもよいが、ここでは核酸抽出操作を施していないものを使用する。核酸抽出操作を施していない生体サンプルであっても、ＰＣＲ温度サイクルの高温下で核酸が血球や細胞から遊離し、ＰＣＲ反応に必要な試薬が核酸に接触して反応が進む。
【００２６】
ＰＣＲ反応終了後、タイピング試薬としてインベーダ試薬６が添加される。インベーダ試薬６には蛍光を発するフレット（FRET）プローブ及びクリベース（Cleavase：構造特異的ＤＮＡ分解酵素）が含まれている。フレットプローブはゲノムＤＮＡと全く無関係な配列をもつ蛍光標識オリゴであり、ＳＮＰの種類によらず配列は共通であることが多い。
【００２７】
次に、インベーダ試薬６が添加された反応液を複数のプローブ配置部８に添加して反応をさせる。各プローブ配置部８には、複数のＳＮＰ部位のそれぞれに対応してインベーダプローブとレポータープローブが個別に保持されており、反応液がインベーダプローブと反応し、そのレポータープローブに対応するＳＮＰが存在すれば蛍光を発する。
【００２８】
インベーダ法については、特許文献３の段落［0032］から［0034］に詳しく記載されている。
各レポータープローブはそれに対応したＳＮＰの塩基に応じて２種類のものを用意すれば、そのＳＮＰがホモ接合体であるかヘテロ接合体であるかを判別することができる。
【００２９】
タイピング工程で使用するインベーダ法は、アレル特異的オリゴとタイピング対象のＳＮＰを含むＤＮＡとをハイブリダイゼーションすることによりＳＮＰ部位をタイピングする方法であり、タイピング対象のＳＮＰを含むＤＮＡと、タイピング対象のＳＮＰのそれぞれのアレルに特異的な２種類のレポータープローブ及び１種類のインベーダプローブと、ＤＮＡの構造を認識して切断するという特殊なエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素とを用いる方法である（特許文献３参照。）。
【００３０】
反応部のうち少なくとも不揮発性液体が分注されるものはその不揮発性液体を保持できる凹部となっていることが好ましい。
【００３１】
同じ基板に凹部として形成され、サンプルを注入するためのサンプル注入部をさらに備えていてもよい。
少なくとも反応部は、使用前は剥離可能なシール材で被われていることが好ましい。
タイピング試薬はインベーダ試薬又はタックマンＰＣＲ試薬である。
【００３２】
第２の目的を達成するための本発明の反応容器処理装置は、本発明の反応容器キットの反応容器を装着する反応容器装着部と、本発明の反応容器キットの分注チップが先端部に装着された分注プローブによる吸引及び吐出を行うための機構を備えて液の移送と分注を行なう分注部と、その分注部の分注動作を制御する制御部とを備えたものである。このような反応容器処理装置の好ましい形態の一例は、図１に示されるように、先端に分注チップ７０ａ,７０ｂを装着する２つの分注プローブ２８ａ,２８ｂを備えた分注部１１２と、分注部１１２の分注動作を制御する制御部１１８とを備えているものである。ここに示した反応容器処理装置は、例えば遺伝子増幅反応などの反応処理を反応容器で行なう場合に、反応処理前の液と反応処理終了後の液との間のコンタミネーションを防止するために、反応処理前の液を扱う分注プローブ２８ａと、反応処理終了後の液を扱う分注プローブ２８ｂを備えたものである。このような反応容器処理装置では、２つの分注チップ７０ａ,７０ｂを備えた反応容器キットを用いる。しかし、本発明の反応容器処理装置としては、分注プローブを１つだけ備えたものであってもよい。この場合は、分注チップを１つだけ備えた反応容器キットを用いればよい。
【００３３】
この反応容器処理装置の好ましい形態では、本発明の反応容器キットの反応容器を、その基板の平板面が水平方向になり、分注チップが垂直方向になる状態で装着する反応容器装着部と、分注プローブによる吸引及び吐出のための機構を備えて液を移送して分注する分注部と、分注部の分注動作を少なくとも制御する制御部とを備え、さらに制御部は、反応容器の保持部材に保持されている分注チップの基端側が上になっている状態で、分注プローブを分注チップに向かって下降させて分注チップに差し込み、上昇させることによりその分注チップを反応容器から脱着させて分注プローブの先端に装着する操作も制御するものである。
この反応容器処理装置は反応部の温度を制御する反応温度制御部１１０，１２０をさらに備え、制御部１１６は反応温度制御部の温度制御も行なうようにすることができる。
【００３４】
この反応容器処理装置を遺伝子多型検出装置として使用する場合には、その第１の形態は、反応容器としてタイピング試薬を収容したタイピング試薬収容部をさらに備え、反応部として複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に保持した複数のプローブ配置部を備えた遺伝子多型診断用反応容器を使用する。そして、図１に示されるように、反応温度制御部としてプローブ配置部の温度をサンプルとタイピング試薬との反応液をプローブと反応させる温度に制御するタイピング反応温度制御部１１０を備え、この反応容器処理装置は各プローブ配置部に励起光を照射して蛍光を検出する蛍光検出部６４をさらに備える。制御部１１８はタイピング反応温度制御部１１０の温度制御及び蛍光検出部６４の検出動作も制御するものとなる。
タイピング反応としてインベーダ反応を使用する場合は、タイピング反応温度制御部１１０はインベーダ反応のための温度調節部となる。
【００３５】
この反応容器処理装置を遺伝子多型検出装置として使用する第２の形態は、反応容器として複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅試薬を収容した遺伝子増幅試薬収容部をさらに備え、反応部として遺伝子増幅試薬とサンプルとの混合液に対して遺伝子増幅反応を行なわせる増幅反応部をさらに備えた遺伝子多型診断用反応容器を使用する。そして、図１に示されるように、反応温度制御部として増幅反応部の温度をサンプルと遺伝子増幅試薬との反応液内でＤＮＡを増幅させる遺伝子増幅のための温度に制御する増幅反応温度制御部１２０をさらに備え、制御部１１８は増幅反応温度制御部１２０の温度制御も行なうものとなる。
【００３６】
遺伝子増幅反応としてＰＣＲ反応を使用する場合は、増幅反応温度制御部１２０はＰＣＲ反応のための温度サイクル用の温度調節部となる。
制御部１１８を外部から操作したり検査結果を表示したりするために、制御部１１８にパーソナルコンピュータ（ＰＣ）１２２を接続してもよい。
【００３７】
分注プローブの一例は、先端に使い捨て可能なチップを脱着可能に装着したものである。反応容器の液体収容部がフィルムで封止されていて、そのフィルムで封止された状態で反応容器処理装置に装着される場合には、そのチップにより反応容器のフィルムを貫通して液の吸入を行なうものとなる。
【発明の効果】
【００３８】
本発明の反応容器キットは、反応容器と分注チップを備えているので、反応容器の数だけの分注チップは必ず反応容器処理装置に取り込まれ、分注チップが不足することに伴うコンタミネーションの恐れはなくなる。
ところで、分注チップは分注を行う試薬などの吸入量よりも大きな容量をもつものとするのが一般的であるため、その長さは長くなる。したがって、長い分注チップが、反応容器の反応部が形成されている面を上にしたときに、分注チップの基端側が上になるように保持部材に保持された状態であると、反応容器キットが大きくなり、反応容器キットを収納するのに大きな領域が必要となって、消耗品である反応容器キットの運送コストや保管場所が大きくなるという問題が生じる。
【００３９】
そこで、本発明の反応容器キットでは、保持部材に保持された分注チップを反応容器の基板の平板面に沿って配置された状態で包装部材により反応容器と分注チップをともに包装するようにしたので、反応容器キット自体の大きさをコンパクトにすることができる。
【００４０】
本発明の反応容器キットにおいて、保持した分注チップが反応容器の基板の平板面に対し沿った状態と立ち上がった状態との間で変位できるように可動部材を介して保持部材が反応容器に取り付けられているようにすれば、反応容器を包装部材から取り出し、処理装置に装着して分注チップが反応容器の基板の平板面に対して立ち上がった状態とするのが容易になる。この操作は手動で行なうことも自動的に行なうこともできる。この反応容器キットでは、使用時に反応容器処理装置内で分注チップが反応容器の基板の平板面に垂直に立ち上がっているようにして、分注プローブを分注チップに対して上から降下させて分注チップに差し込むことで、分注プローブの先端部に分注チップを装着することができる。
【００４１】
保持部材が反応容器に取り付けられている場合、保持部材が反応容器の先端部に取り付けられ、包装された状態では分注チップが反応容器側にくるように折り曲げられているようにすれば、包装された状態での反応容器キットの大きさをコンパクトにすることができる。
【００４２】
また、保持部材が反応容器の中間部に取り付けられている場合においても、包装された状態では分注チップが折り曲げられる側の基板の平板面で盛り上がりの小さい側にくるように折り曲げられているようにすれば、包装された状態での反応容器キットの厚みを小さくすることができる。
【００４３】
反応容器の保持部材が分注チップを保持したときに少なくとも分注チップの先端部を覆う収納部を備えて、その内部に液を吸収する吸収材を備えているようにすれば、使用済みの分注チップに残った液が飛び散ったり他の部材に付着したりするのを防止することができ、コンタミネーションを避けることができる。
基板又は保持部材の先端側に把持部が形成されていれば、分注チップを立ち上げるための手動操作が容易になる。
【００４４】
反応部が設けられている同じ基板に反応液よりも比重の低い不揮発性液体を収容するようにすれば、反応部で反応液の表面を不揮発性液体で被うことにより、反応液が反応部で加熱されても反応液が蒸発してしまう事態をさけることができる。
さらに試薬収容部も備えたものは、サンプルの反応用試薬キットとなって、試薬を別途配置する煩わしさがなくなる。
【００４５】
この反応容器を遺伝子多型診断用試薬キットとして使用する第１の形態は、タイピング試薬収容部、不揮発性液体収容部及びプローブ配置部を一体的に備えているので、複数の多型部位が増幅されたＤＮＡサンプルについてそれらの多型部位を同時にタイピングすることができ、多型のタイピングを簡単な工程で短時間に行なうことができる。
【００４６】
また、この反応容器を遺伝子多型診断用試薬キットとして使用する第２の形態は、さらに遺伝子増幅試薬収容部と増幅反応部まで一体的に備えているので、生体サンプルから目的とする複数の多型部位を同時に増幅させた後に、それらの多型部位を同時にタイピングすることができ、多型のタイピングを簡単な工程で短時間に行なうことができる。
【００４７】
反応部が凹部となっていて不揮発性液体を保持できるようになっておれば、反応部での反応液の蒸発をより効果的に防ぐことができる。
反応部を剥離可能なシール材で被っておけば、使用前はシール材で被っておき、使用時にシール材を剥離することにより、使用前に埃や汚れの付着を防止することができる。
【００４８】
増幅反応部を備えている反応容器においては、増幅反応部の液分注用ポートを分注プローブに装着された分注チップの先端形状に対応した開口形状にして分注チップの先端に密着できる弾性素材で構成しておけば、増幅反応部への混合液の注入動作、及び増幅反応部からの反応液の回収を容易に行なうことができるようになる。
【００４９】
本発明の反応容器キットにおいて、２つの分注チップを備え、一方は遺伝子増幅反応前の増幅反応液を扱うものであって、他方は遺伝子増幅反応終了後の増幅反応終了液を扱うものであるようにすれば、遺伝子増幅反応前の増幅反応液と遺伝子増幅反応終了後の増幅反応終了液とが分注チップを介して混合されることがなくなるので、コンタミネーションの発生を防止することができる。
【００５０】
本発明の反応容器処理装置では、分注プローブにより液の移送を行なうので、簡単な機構で分注動作を行なうことができる。
反応容器処理装置が、反応容器装着部に反応容器が、分注チップがそれぞれの基端部が上になっている状態で装着され、分注プローブを分注チップに向かって下降させてその先端部に分注チップを装着するものとすれば、分注チップを装着するための機構が簡単である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
反応液よりも比重の低い不揮発性液体としては、ミネラルオイル（鉱油）、植物油、動物油、シリコーンオイル又はジフェニルエーテルなどを用いることができる。ミネラルオイルはペトロラタムから蒸留により得られる液体の炭化水素混合物であり、流動パラフィン、流動ペトロラタム、ホワイト油などとも呼ばれ、低比重の軽油も含む。動物油としてはタラの肝油、オヒョウ油、ニシン油、オレンジラフィー油又はサメの肝油などを用いることができる。また、植物油としてはカノーラ油、扁桃油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ピーナツ油、ベニバナ油、ゴマ油、大豆油などを用いることができる。
【００５２】
最初に反応容器キットの実施例を説明する。以下に説明する反応容器キットは、図１に示すように、液の移送や分注を行なうための分注プローブを２つ備えた反応容器処理装置に対して用いるために、２つの分注チップを備えたものである。なお、本発明の反応容器キットはこの実施例のものに限定されず、分注チップを１つだけ備えたものであってもよい。
【００５３】
図２は反応容器キットの第１の実施例である。（Ａ）は反応容器処理装置に装着時の正面図、（Ｂ）は平面図、（Ｃ）は未使用時の包装された状態での正面図である。
この反応容器キットは、平板状の板状基板９の同じ側に試薬収容部１４及び不揮発性液体収容部１６が凹部として形成された反応容器１０を備えている。不揮発性液体としてはミネラルオイルを使用し、以後、不揮発性液体収容部をミネラルオイル収容部と称す。基板９の同じ側にはさらに、反応部１８も形成されている。試薬収容部１４とミネラルオイル収容部１６はフィルム２０で封止されており、試薬とミネラルオイルを分注プローブで吸入して他の場所に移送する際には、そのフィルム２０を取り除いて分注プローブで吸入するか、又はそのフィルム２０を分注プローブで貫通可能なものとしておいて分注プローブを貫通させて分注プローブで吸入する。そのようなフィルム２０は、例えばアルミニウム箔、アルミニウムとＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）フィルムなどの樹脂フィルムとの積層膜などであり、容易に剥がれないように融着や接着により貼りつけられている。
【００５４】
反応容器１０の表面は、フィルム２０上から、試薬収容部１４、ミネラルオイル収容部１６及び反応部１８を被う大きさの剥離可能なシール材２２で被われている。このシール材２２もアルミニウム箔、アルミニウムと樹脂との積層膜などであるが、貼りつけ強度はフィルム２０よりは弱く、融着や粘着剤などにより剥離可能な程度に貼りつけられている。
【００５５】
この反応容器の具体的な用途の一例は、ＰＣＲ反応によりＤＮＡを増幅させたサンプル反応液を注入し、インベーダ反応によりＳＮＰを検出する遺伝子多型診断用試薬キットとなったものである。図２を参照して、その遺伝子多型診断用試薬キットとしての実施例を詳細に説明する。
【００５６】
平板状の基板９の同じ側にサンプル注入部１２、タイピング試薬収容部１４、及びミネラルオイル収容部１６が凹部として形成されている。基板９の同じ側にはさらに、反応部として複数のプローブ配置部１８も形成されている。
【００５７】
サンプル注入部１２はＰＣＲ反応によりＤＮＡを増幅させた生体サンプル反応液が注入されるものであるが、使用前の状態ではまだサンプルが注入されない空の状態で提供される。タイピング試薬収容部１４は複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を１０〜３００μＬ収容しており、ミネラルオイル収容部１６は反応液の蒸発を防ぐためのミネラルオイルを２０〜３００μＬ収容しており、これらのタイピング試薬収容部１４とミネラルオイル収容部１６は分注プローブで貫通可能なフィルム２０で封止されている。
【００５８】
各プローブ配置部１８は複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に保持しており、ミネラルオイル収容部１６からのミネラルオイルが分注されたときにそのミネラルオイルを保持できる凹部となっている。各プローブ配置部１８の凹部の大きさは、例えば直径が１００μｍ〜２ｍｍ、深さが５０μｍ〜１.５ｍｍの円形である。
【００５９】
基板９の表面は、フィルム２０上から、サンプル注入部１２、タイピング試薬収容部１４、ミネラルオイル収容部１６及びプローブ配置部１８を被う大きさの剥離可能なシール材２２で被われている。
【００６０】
基板９は底面側から蛍光を測定するために、低自蛍光性（それ自身からの蛍光発生が少ない性質のこと）で光透過性の樹脂、例えばポリカーボネートなどの素材で形成されている。基板１０の厚さは０.３〜４ｍｍ、好ましくは１〜２ｍｍである。低自蛍光性の観点から基板１０の厚さは薄い方が好ましい。
【００６１】
この反応容器キットは、分注プローブの先端に装着して液の吸入・吐出を行なうための分注チップ７０ａ，７０ｂを備えている。分注チップ７０ａ，７０ｂは平板状の保持部材４２に脱着可能に保持されている。保持部材４２には、分注チップ７０ａ，７０ｂを脱着可能に保持するために、分注チップ７０ａ，７０ｂ断面の最大径よりも小さい径をもつ円形の開口部４２ａ，４２ｂが形成されており、分注チップ７０ａ，７０ｂは開口部４２ａ，４２ｂに差し込まれている。
【００６２】
保持部材４２は反応容器１０の先端部に取り付けられている。保持部材４２は、保持した分注チップ７０ａ，７０ｂが反応容器１０の基板９の平板面に対し沿った状態と立ち上がった状態との間で変位できるように可動部材（図示は省略）を介して反応容器１０の基板９に取り付けられている。
【００６３】
基板９と保持部材４２の間の可動部材は、基板９と保持部材４２とともに同一の樹脂によって一体成型し、この可動部材部分の肉厚を薄くして屈曲可能にしたものでもよく、又は組み立てられたヒンジであってもよい。
【００６４】
この反応容器キットは、使用前の包装された状態では、図２（Ｃ）に示されるように、保持部材４２に保持された分注チップ７０ａ，７０ｂが反応容器１０側にくるように折り曲げられ、分注チップ４２ａ，４２ｂが反応容器１０の基板９の平板面に沿って配置された状態で、反応容器１０と分注チップ４２ａ，４２ｂがともに包装部材７４内に収納されて包装されている。このような状態にすることで、反応容器キットの厚みを薄くすることができるので、反応容器キットの収納や搬送に好都合になる。
包装部材７４は樹脂製又は樹脂にアルミニウムを被覆したフイルム製である。
【００６５】
この反応容器キットは、使用時は、図２（Ａ）に示されるように、包装部材７４から取り出され、保持部材４２が反応容器１０の基板９の平板面に平行な方向になり、保持部材４２に保持されている分注チップ７０ａ，７０ｂが基板９の平板面に垂直な方向になるように、保持部材４２を延ばす。この状態で反応容器１０が反応容器処理装置に装着されることにより、分注プローブ２８ａを上から下降させて分注チップ７０ａに差し込み、上に引き上げることで分注チップ７０ａが保持部材４２の開口部４２ａから引き抜かれて分注プローブ２８ａの先端部に装着される。同様に、分注プローブ２８ｂを上から下降させて分注チップ７０ｂに差し込み、上に引き上げることで分注チップ７０ｂが開口部４２ｂから引き抜かれて分注プローブ２８ｂの先端部に装着される。
分注チップ７０ａ及び７０ｂの先端は、反応容器１０の試薬保持部のフィルムを突き破ることができるように細くなっている。
【００６６】
保持部材４２は分注チップ７０ａ，７０ｂを保持しているときに少なくとも分注チップ７０ａ，７０ｂの先端部を覆う収納部４３ａ，４３ｂを備えている。収納部４３ａ，４３ｂ内には、使用済み分注チップ７０ａ，７０ｂに付着した液を吸収するために、ろ紙などの吸収材４４ａ，４４ｂが設けられている。これにより、分注チップ７０ａ又は７０ｂを使用後に収納部４３ａ，４３ｂ内に戻すことで、分注チップ７０ａ，７０ｂに付着した廃液を吸収材４４ａ，４４ｂに吸収することができる。使用ずみの分注チップ７０ａ，７０ｂは収納部４３ａ，４３ｂに戻された状態で廃棄することにより、廃液の液こぼれを防止することができ、コンタミネーションを避けることができる。
【００６７】
図２に示した反応容器キットは、保持部材４２が反応容器１０の端部に設けられているが、保持部材４２は反応容器１０の端部とは異なる位置に設けられていてもよい。図３では、基板９の中間部に保持部材４２を嵌め込むことができる開口部９ａが設けられており、保持部材４２周縁部の一部が開口部９ａの一部に折曲げ可能に取り付けられている。保持部材４２は、分注チップ７０ａ，７０ｂが折り曲げられる側の基板の平板面で盛り上がりの小さい側、この例ではプローブ配置部１８の裏面側、にくるように折り曲げられる。
【００６８】
使用前の包装された状態では、図３（Ｃ）に示されるように、分注チップ７０ａ，７０ｂがプローブ配置部１８の裏面側で基板の平板面に対して平行な方向になるように折り曲げられて包装されている。
この反応容器キットにおいても、保持部材４２が可動部材を介して基板９に取り付けられており、使用時には図３（Ａ）に示すように、分注チップ７０ａ，７０ｂが基板９の平板面に対して垂直な方向になるように立ち上げられて反応容器処理装置に装着される。
【００６９】
図３に示した反応容器キットの反応容器１０の端部に、複数の隆起形状からなる把持部１０ａが形成されていてもよい。把持部１０ａが形成されていることで、分注チップ７０ａ，７０ｂを立ち上げる際の手動操作が容易になる。
図２に示されている反応容器においても、保持部材４２の端部にこのような把持部１０ａを設けてもよい。
【００７０】
また、本発明の反応容器キットとしては、反応容器１０と保持部材が一体になっていないものであってもよい。例えば図４（Ａ）に示すように、包装部材７４に収納された状態では、分注チップ７０ａ，７０ｂが反応容器１０の基板の平板面に平行な方向に保持された状態で、包装部材７４に反応容器１０と分注チップ７０ａ，７０ｂが同封されているものである。この場合も、分注チップ７０ａ，７０ｂは、分注チップ７０ａ，７０ｂの先端部を少なくとも覆う収納部７１ａ，７１ｂを備えた保持部材７２に保持された状態で包装部材７４に封入されているのが好ましい。そして、収納部７１ａ，７１ｂ内には、分注チップ７０ａ，７０ｂに付着した液を吸収する吸収材７３ａ，７３ｂが設けられているのが好ましい。
【００７１】
保持部材７２は、図４（Ｂ）に示されるように、反応容器１０を扱う反応容器処理装置に設置できるようになっており、操作者が保持部材７２を反応容器処理装置の所定の箇所に設置する。使用済みの分注チップ７０ａ，７０ｂは反応容器処理装置内で自動的に保持部材７２に戻されて廃棄することができる。その際、使用済みの分注チップ７０ａ，７０ｂに付着した廃液の液こぼれを防止することができる。
【００７２】
次に、図２の実施例の反応容器の使用方法を示すが、他の実施例の反応容器についても同様である。
反応容器キットのチップ保持部材４２は、反応容器１０が処理装置に装着される前は図２（Ｃ）の状態に包装されている。反応容器１０が包装部材７４から取り出された後、図５に示されるように、シール材２２が剥がされる。タイピング試薬収容部１４とミネラルオイル収容部１６を封止しているフィルム２０は剥がされないでそのまま残っている。
【００７３】
サンプル注入部１２に外部でＰＣＲ反応によりＤＮＡが増幅されたサンプル反応液２４がピペット２６などにより２〜２０μＬ注入される。その後、反応容器キットが、操作者の手によって、又は自動的に、分注チップ７０ａ，７０ｂの基端部が上になるようにチップ保持部材４２が引き延ばされ、分注チップ７０ａ，７０ｂが反応容器１０の基板の平板面に垂直に立ち上がった状態となる（図２（Ａ）の状態）。
反応容器処理装置において、分注チップ７０ａが分注プローブ２８ａの先端部に装着され、分注チップ７０ｂが分注プローブ２８ｂの先端部に装着される。
【００７４】
図６に示されるように、分注プローブ２８ａの先端部に装着された分注チップ７０aがフィルム２０を貫通してタイピング試薬収容部１４に挿入されてタイピング試薬が吸入され、タイピング試薬はその分注プローブ２８ａによりサンプル注入部１２に移送される。サンプル注入部１２では分注プローブ２８ａの先端部に装着された分注チップ７０aによる吸入と吐出が繰り返されることにより、サンプル反応液とタイピング試薬が混合される。
【００７５】
その後、サンプル反応液とタイピング試薬との反応液が分注プローブ２８ｂの先端部に装着された分注チップ７０ｂにより各プローブ配置部１８へ分注される。各プローブ配置部１８には分注プローブ２８ｂの先端部に装着された分注チップ７０ｂによりミネラルオイル収容部１６からミネラルオイルが分注される。プローブ配置部１８へのミネラルオイルの分注は、プローブ配置部１８への反応液の分注前であってもよい。各プローブ配置部１８ではミネラルオイルが０.５〜１０μＬずつ分注されて、そのミネラルオイルが反応液の表面を被い、検出装置のタイピング反応温度制御部での加熱を伴なうタイピング反応時間中の反応液の蒸発を防止する。
各プローブ配置部１８では反応液がプローブと反応して所定のＳＮＰがあればそのプローブから蛍光が発せられる。蛍光は基板９の裏面側から励起光を照射することにより検出する。
【００７６】
図７は反応容器キットのさらに他の実施例である。（Ａ）は使用時の正面図、（Ｂ）は平面図、（Ｃ）は（Ｂ）のＸ−Ｘ線位置での拡大断面図、（Ｄ）は使用前の包装された状態の正面図である。
この反応容器は核酸抽出操作を施していない生体サンプルをサンプルとして注入し、ＰＣＲ反応によるＤＮＡの増幅と、インベーダ反応によるＳＮＰ検出を共に行なうものである。ただし、核酸抽出操作を施していない生体サンプルを注入してもよい。
【００７７】
この反応容器の平板状の基板７６の同じ側に、図２の実施例と同じサンプル注入部１２、タイピング試薬収容部１４、ミネラルオイル収容部１６、及び複数のプローブ配置部１８が形成されている。この反応容器では、さらに遺伝子増幅試薬収容部３０、ＰＣＲ終了液注入部３１、及び増幅反応部３２が基板７６の同じ側に形成されている。
【００７８】
この実施例の反応容器キットでも、図２の反応容器キットと同様に、分注チップ７０ａ，７０ｂを脱着可能に保持した保持部材４２を備えている。そして、図２の反応容器キットと同様、保持部材４２は基板７６の端部に可動部材（図示は省略）を介して取り付けられている。使用前は図７（Ｄ）に示されるように、分注チップ７０ａ，７０ｂが基板７６の平板面に平行な方向になるように折りたたまれており、使用時は図７（Ａ）に示すように、分注チップ７０ａ，７０ｂが基板７６の基板の平板面に垂直な方向になるように立ち上げられる。
【００７９】
遺伝子増幅試薬収容部３０も基板７６に凹部として形成され、複数の多型部位それぞれを挟んで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅試薬を収容している。遺伝子増幅試薬収容部３０はタイピング試薬収容部１４及びミネラルオイル収容部１６とともに、分注プローブで貫通可能なフィルム２０で封止されている。遺伝子増幅試薬収容部３０にはＰＣＲ反応試薬が２〜３００μＬ収容されている。タイピング試薬収容部１４には図２の実施例と同様に、タイピング試薬が１０〜３００μＬ収容されており、ミネラルオイル収容部１６には２０〜３００μＬのミネラルオイルが収容されている。
【００８０】
ＰＣＲ終了液注入部３１は増幅反応部３２でＰＣＲ反応を終了した反応液とタイピング試薬とを混合するためのもので、基板７６に凹部として形成され、使用前の状態では空の状態で提供される。
増幅反応部３２はＰＣＲ反応試薬とサンプルとの混合液に対して遺伝子増幅反応を行なわせるものである。
【００８１】
増幅反応部３２の部分の断面を拡大して図９に示す。図９は図７（Ｂ）のＹ−Ｙ線位置での断面図である。図９に示されるように、増幅反応部３２の液分注用ポート３４ａ，３４ｂは分注プローブ２８ａ，２８ｂの先端形状に対応した形状の開口３６ａ，３６ｂをもち、分注プローブ２８ａと２８ｂの先端部に装着された分注チップ７０ａ，７０ｂの先端に密着できるようにＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）やシリコーンゴムなどの弾性素材で構成されている。
【００８２】
増幅反応部３２は熱伝導率をよくするためにその部分の基板７６の下面側が、図７（Ｃ）、図９に示されるように肉厚が薄くなっている。その部分の肉厚は、例えば０．２〜０．３ｍｍである。
サンプル注入部１２は、この実施例では核酸抽出操作を施していない生体サンプルが注入されるが、使用前の状態ではまだサンプルが注入されない空の状態で提供される。
【００８３】
図２の実施例と同じく、タイピング試薬収容部１４は複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を収容しており、ミネラルオイル収容部１６は反応液の蒸発を防ぐためのミネラルオイルを収容している。
各プローブ配置部１８も図２の実施例と同じく、複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に保持しており、ミネラルオイル収容部１６からのミネラルオイルが分注されたときにそのミネラルオイルを保持できる凹部となっている。
【００８４】
基板７６の表面は、フィルム２０上から、サンプル注入部１２、ＰＣＲ終了液注入部３１、タイピング試薬収容部１４、ミネラルオイル収容部１６、遺伝子増幅試薬収容部３０、増幅反応部３２及びプローブ配置部１８を被う大きさの剥離可能なシール材２２で被われている。フィルム２０とシール材２２の材質及びその貼りつけ方法は図２の実施例と同じである。
基板７６も底面側から蛍光を測定するために、低自蛍光性で光透過性の樹脂、例えばポリカーボネートなどの素材で形成されている。基板７６の厚さは１〜２ｍｍである。
【００８５】
さらに他の実施例の反応容器キットとして、分注チップ７０ａ，７０ｂの保持部材４２が基板７６の中間部に取り付けられているものを図８に示す。プローブ配置部１８と増幅反応部３２の間に保持部材４２を嵌め込むことができる開口部７６ａが形成され、保持部材４２が開口部７６ａの内側に可動部材（図示は省略）を介して折曲げ可能に取り付けられている。使用前の包装された状態では、図８（Ｃ）に示されるように、分注チップ７０ａ，７０ｂがプローブ配置部１８の裏面側で基板７６の平板面に対して水平な方向になるように折りたたまれて包装部材７４内に収納され、使用時は図８（Ａ）に示されるように、分注チップ７０ａ，７０ｂが基板７６の平板面に対して垂直な方向になるように立ち上げられる。
【００８６】
図７に示した反応容器キットの使用方法を示す。
図１０に示されるように、使用時にシール材２２が剥がされる。タイピング試薬収容部１４、ミネラルオイル収容部１６及び遺伝子増幅試薬収容部３０を封止しているフィルム２０は剥がされないでそのまま残っている。
サンプル注入部１２にサンプル２５がピペット２６などにより０.５〜２μＬ注入される。図２の実施例では、注入されるサンプルは外部でＰＣＲ反応によりＤＮＡが増幅されたサンプル反応液であるが、この実施例で注入されるサンプルは核酸抽出操作を施していない生体サンプル、例えば血液である。サンプルは核酸抽出操作を施した生体サンプルであってもよい。サンプル注入後、この反応容器が検出装置に装着される。反応容器が検出装置に装着された状態では手動で又は自動的に分注チップ７０ａ，７０ｂが基板７６の平板面に対して垂直な方向になるように立ち上げられる。
【００８７】
反応容器処理装において、図１１に示されるように、分注プローブ２８ａの先端部に装着された分注チップ７０ａがフィルム２０を貫通して遺伝子増幅試薬収容部３０に挿入されてＰＣＲ反応試薬が吸入され、サンプル注入部１２に５〜２０μL移送される。サンプル注入部１２では分注プローブ２８ａの先端部に装着された分注チップ７０ａによる吸入と吐出が繰り返されることにより、サンプル反応液とＰＣＲ反応試薬が混合されてＰＣＲ反応液となる。
【００８８】
次に、図９（Ａ）に示されるように、そのＰＣＲ反応液が分注プローブ２８ａの先端部に装着された分注チップ７０ａにより増幅反応部３２へ注入される。このとき、増幅反応部３２での反応中にＰＣＲ反応液３８が蒸発するのを防ぐために、ＰＣＲ反応液３８の両端がミネラルオイル４０で閉じられた状態とする。また、注入されたＰＣＲ反応液３８が増幅部の遺伝子増幅反応温度制御領域にのみ配置される状態となることが好ましく、そのような状態になるように制御装置により分注装置でのＰＣＲ反応液３８とミネラルオイル４０の分注量が制御される。
【００８９】
増幅反応部３２にＰＣＲ反応液３８をこのような状態に分注する１つの方法として、分注プローブ２８ａの先端部に装着された分注チップ７０ａが増幅反応部３２の一方のポート３４ａに挿入されてそのＰＣＲ反応液３８が注入され、続いてポート３４ａ，３４ｂに分注プローブ２８ａの先端部に装着された分注チップ７０ａによりミネラルオイル４０が注入される。
【００９０】
増幅反応部３２にＰＣＲ反応液３８を分注する他の方法は、分注プローブ２８ａの先端部に装着された分注チップ７０ａによりミネラルオイル４０、ＰＣＲ反応液３８、ミネラルオイル４０の順に吸引し、分注チップ７０ａ内では上層にミネラルオイル３９、中間層にＰＣＲ反応液３８、下層にミネラルオイルの３層になる状態にする。その後、増幅反応部３２へ３層の液をそのまま注入する。
【００９１】
ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ反応終了液３８ａがポート３４ａ又は３４ａから分注プローブ２８ｂの先端に装着された分注チップ７０ｂにより回収される。このとき、ミネラルオイル４０／ＰＣＲ反応終了液３８ａ／ミネラルオイル４０の３層のまま、又はミネラルオイル４０／ＰＣＲ反応終了液３８ａの２層で回収される。ここで、回収を容易にするために、図９（Ｂ）に示されるように、増幅反応部３２の一方のポート３４ａからミネラルオイル４０が注入されてもよい。反応終了後のＰＣＲ反応終了液３８ａは他方のポート３４ｂに押しやられる。そこで、分注チップ７０ｂがポート３４ｂに挿入され、ＰＣＲ反応終了液３８ａが分注チップ７０ｂに吸入される。ＰＣＲ反応終了液３８ａの回収に際しては、分注チップ７０ｂにはミネラルオイル４０／ＰＣＲ反応終了液３８ａ／ミネラルオイル４０の３層を吸入してもよく、又はミネラルオイル４０／ＰＣＲ反応終了液３８ａの２層を吸入してもよい。ポート３４ａ，３４ｂはその開口３６ａ，３６ｂの形状が分注チップ７０ａ，７０ｂの形状に合わせて形成され、かつ弾性素材で形成されているので、分注チップ７０ａ，７０ｂがポート３４ａ，３４ｂに密着して液漏れを防ぎ、ＰＣＲ反応液の注入と回収の操作が容易である。
ここで、ポート３４ａから注入する液体はミネラルオイル４０に限らず、他の液体であってもよく、好ましくは比重が反応液と同じか反応液よりも低い液体である。
【００９２】
分注プローブ２８ｂの先端部に装着された分注チップ７０ｂにより増幅反応部３２から回収された反応終了後のＰＣＲ反応終了液３８ａはＰＣＲ終了液注入部３１に移送されて注入される。
ポート３４ａ，３４ｂはその開口３６ａ，３６ｂの形状が分注プローブ２８ａ，２８ｂの先端部に装着された分注チップ７０ａ，７０ｂの形状に合わせて形成され、かつ弾性素材で形成されているので、分注プローブ２８ａ，２８ｂの先端部に装着された分注チップ７０ａ，７０ｂがポート３４ａ，３４ｂに密着して液漏れを防ぎ、ＰＣＲ反応液の注入と回収の操作が容易である。
【００９３】
次に、分注プローブ２８ｂの先端部に装着された分注チップ７０ｂがフィルム２０を貫通してタイピング試薬収容部１４に挿入されてタイピング試薬が吸入され、タイピング試薬はその分注プローブ２８ｂの先端部に装着された分注チップ７０ｂによりＰＣＲ終了液注入部３１に移送されて注入される。ＰＣＲ終了液注入部３１では分注プローブ２８ｂの先端部に装着された分注チップ７０ｂによる吸入と吐出が繰り返されることにより、ＰＣＲ反応液とタイピング試薬が混合される。
【００９４】
その後、ＰＣＲ反応液とタイピング試薬との反応液が分注プローブ２８ｂの先端部に装着された分注チップ７０ｂにより各プローブ配置部１８へ０.５〜４μＬ分注される。各プローブ配置部１８には分注プローブ２８ｂの先端部に装着された分注チップ７０ｂによりミネラルオイル収容部１６からミネラルオイルが分注される。プローブ配置部１８へのミネラルオイルの分注は、プローブ配置部１８への反応液の分注前であってもよい。各プローブ配置部１８ではミネラルオイルが反応液の表面を被い、検出装置のタイピング反応温度制御部での加熱を伴なうタイピング反応時間中の反応液の蒸発を防止する。
各プローブ配置部１８では反応液がプローブと反応して所定のＳＮＰがあればそのプローブから蛍光が発せられる。蛍光は基板１０の裏面側から励起光を照射することにより検出する。
【００９５】
以下、各反応試薬の組成を示して、本発明を詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
ＰＣＲ反応試薬は既知のものであり、例えば特許文献３の段落［００４６］に記載されているような、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及びTaqStart （CLONTECH Laboratories社製）を含む反応試薬を使用することができる。また、ＰＣＲ反応試薬にはAmpDirect（島津製作所製）が混入されていてもよい。プライマーは、例えば、特許文献３の表１に記載されているＳＮＰ  ＩＤ１〜２０、配列番号を１〜４０などを使用することができる。
【００９６】
タイピング試薬としてインベーダ試薬を使用する。そのインベーダ試薬としては、インベーダーアッセイキット（Third Wave Technology社製）を使用する。例えば、シグナルバッファー、フレットプローブ、構造特異的ＤＮＡ分解酵素及びアレル特異的プローブを特許文献３の段落［００４６］に記載されているような濃度に調製されたものである。
【００９７】
図１２（Ａ）は図７を参照して説明した反応容器キットを用いて、生体サンプルのＳＮＰを検出するための簡易型反応容器処理装置の一実施例を示したものである。この実施例の反応容器処理装置は、遺伝子増幅反応前の増幅反応液を扱う分注プローブ２８ａと、遺伝子増幅反応終了後の増幅反応終了液を扱う分注プローブ２８ｂを備えている。分注プローブ２８ａの先端部には分注チップ７０ａが装着され、分注プローブ２８ｂの先端部には分注チップ７０ｂが装着される。
【００９８】
装置内に上下に一対のヒートブロック６０と６２が配置されて反応容器装着部を構成しており、本発明の反応容器４１にサンプルが注入されたものが５枚平行に下側ヒートブロック６０上に並べて設置される。これらのヒートブロック６０，６２は、矢印で示されるＹ方向に移動することができる。
上側のヒートブロック６２には分注プローブ２８ａ，２８ｂによる液の移送や吸入、吐出の際に蓋が開くように開閉可能な窓が設けられている。
【００９９】
下側のヒートブロック６０は増幅反応部３２の温度を所定の温度サイクルになるように制御する増幅反応温度制御部と、プローブ配置部１８の温度をＤＮＡとプローブとを反応させる温度に制御するタイピング反応温度制御部とを備えている。増幅反応温度制御部の温度は、例えば９４℃、５５℃及び７２℃の３段階にその順に変化させられ、そのサイクルが繰り返されるように設定されている。タイピング反応温度制御部の温度は、例えば６３℃に設定されている。
【０１００】
図１３に示されるように、タイピング反応温度制御部を構成する上側のヒートブロック６２はプローブ配置部に対応する位置にのみ開口１５０をもち、下側のヒートブロック６０でタイピング反応温度制御部を構成する部分もプローブ配置部に対応する位置にのみ開口１５２をもっている。ヒートブロック６２上にはタイピング反応温度制御部カバー１５４が被せられており、そのカバー１５４にもヒートブロック６２の開口１５０の位置にのみ開口１５６が開けられている。開口１５０，１５６を介してノズル２８で反応容器４１のプローブ配置部へ反応液を分注する。
反応容器４１として図２の実施例のように増幅反応部を備えていないものを使用する場合には、増幅反応部の温度を制御する増幅反応温度制御部は不要である。
【０１０１】
ヒータブロック６０の下部には蛍光検出を行なう蛍光検出部６４が配置されており、蛍光検出部６４は反応容器４１の下面側からヒータブロック６０の開口１５２を介してプローブ配置部に励起光を照射し、反応容器４１の下面側でヒータブロック６０の開口１５２を介してプローブ配置部からの蛍光を検出する。蛍光検出部６４は図１０の矢印Ｘ方向に移動してブローブ配置部１８からの蛍光を検出する。反応容器装着部によるプローブ配置部１８のＹ方向移動と、蛍光検出部６４のＸ方向移動により各ブローブでの蛍光検出を行なう。
【０１０２】
図１２（Ａ）に戻って説明すると、分注プローブ２８ａ,２８ｂによる液の移送や吸入、吐出を行なうために、分注部として送液アーム６６が設けられており、送液アーム６６は２つの分注プローブ２８ａ,２８ｂを備えている。分注プローブ２８ａ,２８ｂはその先端に使い捨て可能な分注チップ７０ａ,７０ｂが脱着可能に装着される。
【０１０３】
ヒートブロック６０，６２、蛍光検出部６４及び送液アーム６６の動作を制御するために、それらの近くに制御部１１８が配置されている。制御部１１８はＣＰＵを備えて、動作のためのプログラムを保持している。制御部１１８は分注チップ７０ａを分注プローブ２８ａの先端部に、分注チップ７０ｂを分注プローブ２８ｂの先端部に装着する動作、ヒートブロック６０，６２により実現されるタイピング反応部１１０や増幅部１２０の温度制御、蛍光検出部６４の検出動作、及び分注部１１２の送液アーム６６の分注動作を制御する。
【０１０４】
反応容器４１として図２の反応容器のように遺伝子増幅反応部を備えていないものを使用する場合には、遺伝子増幅反応部の温度を制御する増幅部は必要ではなく、制御部１１８も増幅部の温度制御のための機能を備える必要がない。
【０１０５】
なお、この実施例の反応容器処理装置は２つの分注プローブ２８ａ，２８ｂが１つの送液アーム６６に取り付けられているが、図１２（Ｂ）に示されるように、２つの送液アーム６６−１，６６−２を設け、２つの分注プローブ２８ａ，２８ｂが別々の送液アーム６６−１，６６−２に取り付けられていてもよい。
【０１０６】
図１４は検出器６４を詳細に示したものである。検出器６４は励起光源として４７３ｎｍのレーザ光を発するレーザダイオード（ＬＤ）や発光ダイオード（ＬＥＤ）９２を備え、そのレーザ光を反応容器４１のプローブ配置部の底面に集光して照射する一対のレンズ９４，９６を備えている。レンズ９４はレーザダイオード９２からのレーザ光を集光して平行光にするものであり、レンズ９６は平行にされたレーザ光を反応容器４１の底面に収束させて照射する対物レンズである。対物レンズ９６はまた、反応容器４１から発生する蛍光を集光するレンズとしても作用する。一対のレンズ９４，９６の間にはダイクロイックミラー９８が設けられており、ダイクロイックミラー９８は励起光を透過させ、蛍光を反射させるように波長特性が設定されている。ダイクロイックミラー９８の反射光（蛍光）の光路上にはさらにダイクロイックミラー１００が配置されている。ダイクロイックミラー１００は５２５ｎｍの光を反射し６０５ｎｍの光を透過するように波長特性が設定されている。ダイクロイックミラー１００による反射光の光路上には５２５ｎｍの蛍光を検出するようにレンズ１０２と光検出器１０４が配置され、ダイクロイックミラー１００による透過光の光路上には６０５ｎｍの蛍光を検出するようにレンズ１０６と光検出器１０８が配置されている。この２つの検出器１０４，１０８による２種類の蛍光検出により、各プローブ配置位置に固定されたインベーダプローブに対応したＳＮＰの有無と、そのＳＮＰがホモ接合体であるかヘテロ接合体であるかが検知される。標識蛍光体としては、例えばＦＡＭ、ＲＯＸ、ＶＩＣ、ＴＡＭＲＡ、Redmond Redなどを使用することができる。
【０１０７】
図１４の検出器６４は１光源による励起光で励起し、２波長の蛍光を測定するように構成されているが、検出器６４としては２波長の蛍光測定のために異なる励起波長で励起できるように２光源を使用するように構成してもよい。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明は種々の化学反応の測定のほか、例えば遺伝子解析の研究や臨床分野において、種々の自動分析に利用することができ、例えば、人間を初めとして、動物や植物のゲノムＤＮＡの多型、特にＳＮＰなどを検出することができ、さらにその結果を用いて病気罹患率の診断や、投与薬剤の種類と効果及び副作用との関係などの診断のほか、動物や植物の品種判定、感染症診断（感染菌の型判定）などを行なうのにも利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】本発明を概略的に示すブロック図である。
【図２】反応容器キットの第１の実施例を示す図であり、（Ａ）は処理装置に装着する時の正面図、（Ｂ）は平面図、（Ｃ）は使用前の包装された状態の正面断面図である。
【図３】反応容器キットの第２の実施例を示す図であり、（Ａ）は使用時の正面図、（Ｂ）は平面図、（Ｃ）は使用前の包装された状態の正面断面図である。
【図４】反応容器キットの第３の実施例を示す図であり、（Ａ）は使用前の包装された状態の正面断面図、（Ｂ）は使用時の正面図である。
【図５】図２の実施例の反応容器キットを使用したＳＮＰ検出方法の工程の前半部を示す図であり、（Ａ）は正面図、（Ｂ）は平面図である。
【図６】同実施例の反応容器キットを使用したＳＮＰ検出方法の工程の後半部を示す図であり、（Ａ）は正面図、（Ｂ）は平面図である。
【図７】反応容器キットの第４の実施例を示す図であり、（Ａ）は使用時の正面図、（Ｂ）は平面図、（Ｃ）は（Ｂ）のＸ−Ｘ線位置での拡大断面図、（Ｄ）は使用前の包装された状態の正面断面図である。
【図８】反応容器の第５の実施例を示す図であり、（Ａ）は処理装置に装着時の正面図、（Ｂ）は平面図、（Ｃ）は使用前の包装された状態の正面断面図である。
【図９】図７の実施例での増幅反応部を図７（Ｂ）のＹ−Ｙ線位置での拡大断面図として示す図であり、（Ａ）は反応液が注入された状態、（Ｂ）は反応液を回収するため状態である。
【図１０】図７の実施例の反応容器を使用したＳＮＰ検出方法の工程の前半部を示す図であり、（Ａ）は正面図、（Ｂ）は平面図である。
【図１１】同実施例の反応容器を使用したＳＮＰ検出方法の工程の後半部を示す図であり、（Ａ）は正面図、（Ｂ）は平面図である。
【図１２】本発明の反応容器を試薬キットとして用い、生体サンプルのＳＮＰを検出するための簡易型反応容器処理装置の実施例を示す概略斜視図であり、（Ａ）は送液アームが１つの場合、（Ｂ）は送液アームが２つの場合である。
【図１３】同実施例におけるタイピング反応温度制御部を示す断面図である。
【図１４】同実施例における検出器を示す概略構成図である。
【図１５】本発明が関係することのあるＳＮＰ検出方法を概略的に示すフローチャート図である。
【符号の説明】
【０１１０】
２      サンプル
４      ＰＣＲ反応試薬
６      インベーダ試薬
８      プローブ配置部
９      基板
１０      反応容器
１２      サンプル注入部
１４      タイピング試薬収容部
１６      ミネラルオイル収容部
１８      プローブ配置部
２０      フィルム
２２      シール材
２８ａ，２８ｂ      分注プローブ
３０      遺伝子増幅試薬収容部
３１      ＰＣＲ終了液注入部
３２      増幅反応部
３４ａ，３４ｂ      増幅反応部のポート
３６ａ，３６ｂ      ポートの開口
４２，７２      保持部材
４３ａ，４３ｂ      収納部
４４ａ，４４ｂ      吸収材
６０，６２      ヒートブロック
６４      検出器
６６ａ，６６ｂ      送液アーム
７０ａ，７０ｂ      分注チップ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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