(57)【要約】      （修正有）【課題】葯の裂開を抑制した植物体の作成方法ならびに作成された植物体を提供すること。さらに葯の裂開は抑制されているが、花粉自体の成熟は抑制せずに稔性を有した状態で提供すること。また葯を人為的に裂開して花粉を採取することによって、本植物体を母本とした容易な交雑育種を提供すること。【解決手段】  “キク品種：秀芳の力”からシステインプロテアーゼ遺伝子を単離し、この遺伝子をタバコに導入した。そしてタバコ自身のシステインプロテアーゼ遺伝子の発現を抑制させることによって花粉の稔性を保持したまま、葯の裂開のみを抑制した植物体を作成した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載の塩基配列の全部若しくは一部において１若しくは複数の塩基が挿入、付加、欠失若しくは置換された塩基配列。
【請求項２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列の全部若しくは一部において１若しくは複数のアミノ酸が挿入、付加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列。
【請求項３】
植物にシステインプロテアーゼ遺伝子を導入し、葯の裂開を抑制した組換え植物の作成方法。
【請求項４】
葯の裂開の抑制を目的として植物のシステインプロテアーゼの発現を抑制した組換え植物の作成方法。
【請求項５】
植物からシステインプロテアーゼ遺伝子を単離し、葯の裂開の抑制を目的として使用する、請求項３記載の作成方法。
【請求項６】
配列番号１に記載の塩基配列の全部もしくは一部において１若しくは複数の塩基が挿入、付加、欠失若しくは置換された塩基配列を葯の裂開の抑制を目的として使用する、請求項３記載の作成方法。
【請求項７】
配列番号１に記載の塩基配列の全部もしくは一部をコードするＲＮＡ分子を葯の裂開の抑制を目的として使用する、請求項３記載の作成方法。
【請求項８】
配列番号１に記載のアミノ酸配列の全部もしくは一部において１若しくは複数のアミノ酸が挿入、付加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列を葯の裂開の抑制を目的として使用する、請求項３記載の作成方法。
【請求項９】
請求項３から８のいずれか１項に記載の作成方法によって得られた植物細胞、植物組織または植物体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はシステインプロテアーゼ遺伝子を植物に形質転換することによって、葯の裂開が抑制された植物体を作成する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、雑種強勢を利用することにより、耐病性、環境ストレスへの対応、収量の増加、均一性など優良な形質を持った品種を育種する方法が取られている。また、第二世代以降で形質の分離やバラツキが起こることから、種子供給者側にとっても非常に有効な育種方法となっている。この雑種強勢を利用した雑種第一代の種子を確保する方法として遺伝的な雄性不稔性を利用した技術が取られている。また、他にも人為的に除雄するといった方法、細胞融合や自家不和合性による方法も取られてきた。さらに、近年の分子生物学を利用した葯や花粉の形成、成熟に関与する遺伝子の発現を抑えることによって雄性不稔の植物体を作成する方法も有効として行われてきている。
【０００３】
一方、分子生物学の進歩は、従来の交配育種とは別に近縁種以外の生物からも優良な形質を短期間で植物に導入する遺伝子組換え方法を可能とした。しかし、この遺伝子組換え方法を利用した植物を栽培することによって花粉の飛散による遺伝子の拡散、近縁種や野生種との交雑など様々な環境への問題が懸念されている。これらの問題解決に対しても様々な雄性不稔性を利用した方法が幾つかの例で試みられている。
【０００４】
だが、これらの雄性不稔性を利用した場合、その植物体自身の花粉の稔性も失われることから当該植物を母本として利用した交雑育種が不可能となっている。導入した遺伝子によっては稔性を回復させる方法があり、ジャスモン酸やリノレン酸などで処理することもあるが（特許文献１参照）手間のかかる作業が必要とされる。また、葯の裂開に関与している遺伝子が発見され、この遺伝子を植物に形質転換することによって、葯の裂開を抑制する方法もあるが（特許文献２、特許文献３参照）、いずれの場合も花粉の成熟を抑制してしまい、その稔性が失われることから当該植物を母本として利用する交雑育種が不可能であった。
【特許文献１】特開２０００−３００２７３号公報
【特許文献２】特開平７−５９５７３号公報
【特許文献３】特開平１１−１１３５７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、葯の裂開を抑制した植物体の作成方法ならびに作成された植物体を提供することにある。さらに葯の裂開は抑制されているが、花粉自体の成熟は抑制せずに稔性を有した状態で提供することにある。また葯を人為的に裂開して花粉を採取することによって、本植物体を母本とした容易な交雑育種を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記問題を解決するために、“キク品種：秀芳の力”からシステインプロテアーゼ遺伝子を単離し、この遺伝子をタバコに導入した。そしてタバコ自身のシステインプロテアーゼ遺伝子の発現を抑制させることによって花粉の稔性を保持したまま、葯の裂開のみを抑制した植物体を作成するに至った。
即ち、本発明はシステインプロテアーゼ遺伝子を植物に導入することによって、導入した植物自身のシステインプロテアーゼ遺伝子の発現を抑制することにある。それによって葯の裂開を抑制しつつ、花粉の稔性は保持した状態の植物を作成する方法である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、葯の裂開を抑制した植物体の作成方法ならびに作成された植物体を提供することができる。さらに葯の裂開は抑制されているが、花粉自体の成熟は抑制せずに稔性を有した状態で提供することができ、また葯を人為的に裂開して花粉を採取することによって、本植物体を母本とした容易な交雑育種を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の遺伝子組換え技術は、周知の技術、例えばMolecular  Cloning：Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Pressに記載されている方法で行うことができる。
本発明におけるシステインプロテアーゼ遺伝子は“キク品種、秀芳の力”から全ＲＮＡを抽出し、一般に公開されているＤＮＡデータベースに登録されているシステインプロテアーゼ遺伝子の塩基配列情報に基づいてディジェネレートプライマーを設計し、ＲＴ−ＰＣＲ法により、目的の候補となる遺伝子断片を単離すればよい。なお、システインプロテアーゼ遺伝子は配列番号１で示される塩基配列と６０％以上の相同性を有し、かつシステインプロテアーゼ活性を発揮しうる遺伝子であってもよい。また、６０％以下の相同性であっても、システインプロテアーゼ活性を発揮しうる遺伝子であればよい。
【０００９】
候補遺伝子断片はベクターにクローニングするが、塩基配列決定が可能なベクターであれば良い。例えばｐＵＣ系やｐＧＥＭ系ベクター等を用いることができる。
また、本遺伝子の一部に少数の塩基配列を改変した場合であっても、当該活性が維持されうることは周知の事実であり、このような改変は、例えば部分特異的変異導入方法などの周知の技術を利用して行うことができる。従って、本発明に使用するシステインプロテアーゼ遺伝子は、システインプロテアーゼ活性を有する遺伝子をコードする限り、配列番号１に記載の塩基配列の全部もしくは一部において１若しくは複数の塩基配列が挿入、付加、欠失若しくは置換によって改変された塩基配列からなるＤＮＡ分子及びそれをコードするＲＮＡ分子も含まれる。
【００１０】
上記本発明で調整したシステインプロテアーゼ遺伝子を植物に導入して植物自身のシステインプロテアーゼ遺伝子の発現を抑える場合、システインプロテアーゼ遺伝子をアンチセンスの方向で導入することで発現を抑えられる。この場合、全長若しくは一部のみのＤＮＡ分子またはそれをコードするＲＮＡ分子を導入すればよい。さらに、配列番号１に示すＤＮＡ分子又はそれをコードするＲＮＡ分子の導入する方向、塩基数、配列部位は、遺伝子を導入する植物体自身のシステインプロテアーゼ遺伝子の発現抑制を発揮しうる遺伝子であればよい。また、本発明は葯の裂開を目的として植物体のシステインプロテアーゼ遺伝子の発現を抑制した植物体も含む。
【００１１】
上記本発明で調整したシステインプロテアーゼ遺伝子を植物に導入して植物自身のシステインプロテアーゼ遺伝子の発現を抑制する場合、植物発現用に開発された公知のベクターに導入し、アグロバクテリウムに挿入する。例えば、汎用されているｐＢＩ１２１やｐＢＩ２２１などの植物発現用に開発されたベクターのマーカー部分を制限酵素を用いて切り出し、これに換えてシステインプロテアーゼ遺伝子を導入する。
【００１２】
また、近年開発されたＲＮＡ  interference（ＲＮＡｉ）法を用いて植物のシステインプロテアーゼ遺伝子の発現を抑制する方法もある。この場合、導入するシステインプロテアーゼ遺伝子の方向、塩基数、配列部位は、遺伝子を導入する植物自身のシステインプロテアーゼ遺伝子の発現抑制を発揮しうる遺伝子であればよい。さらにシステインプロテアーゼ遺伝子の５’もしくは３’末端非翻訳領域を用いてもよい。
【００１３】
以上によって構築したベクターは、公知の方法によりアグロバクテリウムに導入すればよい。作成したアグロバクテリウムは、公知のアグロバクテリウムによる遺伝子導入法に使用できて、植物細胞への遺伝子導入に使用できる。アグロバクテリウム法では、ｐＢＩ１２１由来のベクターを好適に用いることができ、ベクターを導入する植物細胞の形態としては、組織、器官、カルスの何れの形態でもよい。本研究で作成したアグロバクテリウムベクターがシステインプロテアーゼ遺伝子導入をする植物細胞の種類としては、特に制限はなく、双子葉植物であっても単子葉植物であってもよい。
【００１４】
植物細胞へのシステインプロテアーゼ遺伝子の導入方法としては、アグロバクテリウム法に限らず、エレクトロポレーション法やパーティクルガン法などの直接法を用いることもできる。
アグロバクテリウム法によりベクターを導入した植物細胞は、一般に、形質転換細胞を選抜する抗生物質とアグロバクテリウムを除菌するための抗生物質、及び植物体再生用の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニンなど）を含む組織培養用の培地で培養し、植物体の再生を行うことができる。エレクトロポレーション法及びパーティクルガン法でベクターを導入した植物細胞は、一般に、形質転換細胞を選抜する抗生物質と植物体再生用の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニンなど）を含む組織培養用の培地で培養し、植物体の再生を行うことができる。
【００１５】
導入遺伝子の確認は、ゲノムサザン解析により、挿入したシステインプロテアーゼ遺伝子が核内に組み込まれたかどうかを解析することによって行える。また、ノーザン解析により核内に組み込まれたシステインプロテアーゼ遺伝子によって植物体自身のシステインプロテアーゼ遺伝子のmＲＮＡ発現量が抑えられたかどうかを解析することによって確認できる。さらに、導入した植物体自身のシステインプロテアーゼ活性を公知の方法で測定することによって確認できる。また、導入したシステインプロテアーゼ遺伝子が核内に組み込まれたかどうかをゲノムＰＣＲによる遺伝子断片の有無を解析することによって解析できる。
以上、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
【実施例１】
【００１６】
“キク品種：秀芳の力”からの全ＲＮＡの抽出
“キク品種：秀芳の力”の葉100mgを液体窒素中で摩砕した後、全ＲＮＡを抽出した（RNeasy  Plant  Mini  Kit、キアゲン社製を使用）。次いで以下に示すディジェネレートプライマーを設計し、全ＲＮＡ５μgを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った（SuperScript  First-Strand  Syntheses  System  for  RT-PCR、インビトロジェン社製を使用）。得られたファーストストランドｃＤＮＡからディジェネレートプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ（94℃、５分→（94℃、１分→50℃、1分→72℃、２分）×35サイクル→72℃、10分）を行った。
５’側ディジェネレートプライマー：GGRWGTTGYTGGGCRTTYTC
３’側ディジェネレートプライマー：CRKAWCCAATMGCWGYWACA
配列記号：R=A,G、W=A,T、Y=T,C、K=T,G、M=A,C
【００１７】
ＲＴ−ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動にかけた結果、約550bpの増幅バンドを確認した。アガロースゲルから回収し、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（pGEM-T Vector Systems、プロメガ社製を使用）へクローニングした後、大腸菌JM-109株（E.coliJM109  Competent  Cells、タカラ社製を使用）へ形質転換し、アンピシリン及びlacZによる青／白スクリーニングにて選抜を行った。得られた形質転換体JM-109株をLB培地にて37℃で終夜振とう培養し、プラスミドを抽出（QIAprep  Spin  Miniprep  Kit、キアゲン社製を使用）した後、インサートの塩基配列を確認した。塩基配列の確認はジデオキシターミネーター法を用いて行った。
【実施例２】
【００１８】
単離した遺伝子の塩基配列をもとに特異的プライマーを設計し、５’側と３’側の全長を取得するためにＲＡＣＥ−ＰＣＲ法（5'RACE  System  for  Rapid  Amplification  of  cDNA  Ends  version  2.0および3'RACE  System  for  Rapid  Amplification  of  cDNA  Ends、インビトロジェン社製を使用）を行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、得られた約600bp（5'RACE側）及び約1100bp（3'RACE側）の増幅バンドを回収した後、ｐＧＥＭ−Ｔベクターへクローニングし、塩基配列を実施例1の方法に従って確認した。その結果、システインプロテアーゼ遺伝子の全長を単離した。
【実施例３】
【００１９】
確認した塩基配列を基に398bp〜1297bpの900塩基からなる遺伝子断片を増幅させるためにプライマーを設計した。また、５’側のプライマーには制限酵素SacＩサイトを、３’側のプライマーには制限酵素XbaＩサイトをそれぞれ付加し、全ＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ法を行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、約900bpの増幅バンドを回収した後、ｐＧＥＭ−Ｔベクターへクローニングし、塩基配列を実施例１の方法に従って確認した。約900bpからなるシステインプロテアーゼ遺伝子断片を保持するｐＧＥＭ−Ｔベクターから制限酵素SacＩとXbaＩを用いてインサートを切り出した。また植物発現用ベクターｐＢＩ１２１のＧＵＳ遺伝子領域を制限酵素SacＩとXbaＩを用いて切り出し、システインプロテアーゼ遺伝子断片をアンチセンス方向で35Ｓ  CaMVプロモーターの後ろに連結し、得られたベクターをpBI35S-CyPAntiとした（図1）。このプラスミドをアグロバクテリウムC58C1RifRにエレクトロポレーション法により形質転換した。形質転換したアグロバクテリウムC58C1RifRはカナマイシン100mg／Lを含むＬＢ培地にて培養して維持した。
【実施例４】
【００２０】
タバコ組換え体の作成
pBI35S-CyPAntiベクターを保持するアグロバクテリウムC58C1RifRをカナマイシン100mg／Lを含むLB培地にて28℃で振とう培養し、得られたアグロバクテリウム懸濁液から遠心により集菌し、OD600が0.2になるようにＭＳ培地に懸濁した。このアグロバクテリウム懸濁液を用いてリーフディスク法によりタバコに遺伝子導入した。遺伝子導入したタバコ葉片は0.1mg／Ｌ  １−ナフタレイン酢酸（ＮＡＡ）、1.0mg／Ｌベンジルアデニン（ＢＡ）を含むMS培地で3日間共存培養した。その後、1mg／L  NAA、1.0mg／L  BA、100mg／Lカナマイシンを含むＭＳ培地に移植し、２週間ごとに培地を交換しながら培養した。分化し、伸長したシュートを50mg／Lカナマイシンを含むＭＳ培地に移植し、根を形成した個体から形質転換体を選抜した。培養は、25℃、16時間照明の培養室で行った。
【実施例５】
【００２１】
組換えタバコの葯裂開及び花粉の稔性観察
発根培地で根を形成した形質転換体タバコを閉鎖系栽培室に順化し、開花させた。栽培条件は、25℃、16時間日長とした。開花後の葯の裂開及びその花粉の稔性を観察したところ、開花後でも葯が裂開せずに枯れ落ちる現象が確認された（図２）。また裂開しない葯から人為的に花粉を採取し、自殖もしくは除雄した野生株のタバコに人為的に受粉させたところ、種子を得ることができたことから、花粉は稔性を有していることが確認された。一方、野生株の花粉を組換え体に受粉したところ種子を得ることができたことから、胚珠は正常に発達していることが確認された。さらに得られた種子を播種して順化させたところ、植物体を得ることができた。
【実施例６】
【００２２】
組換え体タバコの解析
葯の裂開抑制が確認された組換えタバコ（形質転換体）と非組換えタバコ（非形質転換体）の葉からゲノムＤＮＡを抽出した（DNeasy  Plant  Maxi  Kit、キアゲン社製を使用）。35SCaMVプロモーター配列領域からフォワードプライマーを設計し、アンチセンスに導入したシステインプロテアーゼ配列領域からリバースプライマーを設計し、抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲにて導入遺伝子の確認を行った。ＰＣＲには下記のプライマーを用い、ＰＣＲ条件（94℃、5分→（94℃、１分→60℃、１分→72℃、90秒）×35サイクル→72℃、10分）にて行った。その結果、形質転換体からは推定サイズの遺伝子の断片を確認することができた。一方、非形質転換体からは、いずれの遺伝子断片も確認できなかった（図３）。さらに、増幅した遺伝子断片の塩基配列を決定した結果、導入遺伝子であることが確認できた。
フォワードプライマー：CTCGCCGTAAAGACTGGCGAACAG
リバースプライマー  ：GCCAGTGTAAGGGTAGTCTTCTTCA
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明にて作成された植物体を利用することにより、葯の裂開を抑制した植物が提供されるようになる。また、花粉自体の成熟は抑制されず稔性を有しているため、葯を人為的に裂開して花粉を採取すれば、本植物体を母本とした交雑育種を行うことも可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】実施例３におけるシステインプロテアーゼアンチセンスベクターの構築を示す図である。
【図２】実施例５においてシステインプロテアーゼ遺伝子をアンチセンスに導入したタバコの１：開花後の花、２：葯が裂開せずに枯れ落ちた花を示す図である。
【図３】実施例６においてゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲによる導入遺伝子の確認を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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