(57)【要約】【課題】アスタキサンチンを高濃度で含む藻類を提供すること。【解決手段】シスト化した緑藻を、栄養培地にて、二酸化炭素の供給下、２５０００μｍｏｌ−ｐｈｏｔｏｎ／ｍ３／ｓ以上の光合成有効光量子束投入量で光照射しながら培養することにより、アスタキサンチンを７００ｐｇ／細胞以上の濃度で含む緑藻、アスタキサンチンを５質量％以上の濃度で含む緑藻乾燥物、およびアスタキサンチンを１５０ｍｇ／Ｌ培養液の濃度で含む緑藻培養液が得られる。好ましい緑藻は、ヘマトコッカス属に属する緑藻である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シスト化した緑藻を、栄養培地にて、二酸化炭素の供給下、２５０００μｍｏｌ−ｐｈｏｔｏｎ／ｍ３／ｓ以上の光合成有効光量子束投入量で光照射しながら培養する工程を含む、緑藻の製造方法。
【請求項２】
前記栄養培地が、独立栄養培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記光合成有効光量子束投入量が、７５００００μｍｏｌ−ｐｈｏｔｏｎ／ｍ３／ｓ以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記緑藻がアスタキサンチンを７００ｐｇ／細胞以上の量で含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記緑藻が、湿藻体あたりアスタキサンチンを１．２質量％以上の濃度で含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
アスタキサンチンを７００ｐｇ／細胞以上の量で含む、緑藻。
【請求項７】
湿藻体あたりアスタキサンチンを１．２質量％以上の濃度で含む、緑藻。
【請求項８】
前記緑藻がヘマトコッカス属に属する単細胞藻類である、請求項６に記載の緑藻。
【請求項９】
前記緑藻がヘマトコッカス・プルビアリスである、請求項８に記載の緑藻。
【請求項１０】
シスト化した緑藻を、栄養培地にて、二酸化炭素の供給下、２５０００μｍｏｌ−ｐｈｏｔｏｎ／ｍ３／ｓ以上の光合成有効光量子束投入量で光照射しながら培養する工程；および得られた緑藻を乾燥する工程を含む、緑藻乾燥物の製造方法。
【請求項１１】
前記栄養培地が、独立栄養培地である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記光合成有効光量子束投入量が、７５００００μｍｏｌ−ｐｈｏｔｏｎ／ｍ３／ｓ以下である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記乾燥物がアスタキサンチンを５質量％以上の濃度で含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
アスタキサンチンを５質量％以上の濃度で含む、緑藻乾燥物。
【請求項１５】
前記緑藻がヘマトコッカス属に属する単細胞藻類である、請求項１４に記載の緑藻乾燥物。
【請求項１６】
前記緑藻がヘマトコッカス・プルビアリスである、請求項１５に記載の緑藻乾燥物。
【請求項１７】
シスト化した緑藻を、栄養培地にて、二酸化炭素の供給下、２５０００μｍｏｌ−ｐｈｏｔｏｎ／ｍ３／ｓ以上の光合成有効光量子束投入量で光照射しながら培養する工程を含む、培養液１Ｌあたりアスタキサンチンを１５０ｍｇ以上の濃度で含む緑藻培養液の製造方法。
【請求項１８】
前記栄養培地が、独立栄養培地である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記光合成有効光量子束投入量が、７５００００μｍｏｌ−ｐｈｏｔｏｎ／ｍ３／ｓ以下である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
培養液１Ｌあたり、アスタキサンチンを１５０ｍｇ以上の濃度で含む、緑藻培養液。
【請求項２１】
前記緑藻がヘマトコッカス属に属する単細胞藻類である、請求項２０に記載の緑藻培養液。
【請求項２２】
前記緑藻がヘマトコッカス・プルビアリスである、請求項２１に記載の緑藻培養液。
【請求項２３】
シスト化した緑藻を、栄養培地にて、二酸化炭素の供給下、２５０００μｍｏｌ−ｐｈｏｔｏｎ／ｍ３／ｓ以上の光合成有効光量子束投入量で光照射しながら培養する工程、得られた緑藻を乾燥させる工程、および得られた緑藻乾燥物からアスタキサンチンを抽出する工程を含む、アスタキサンチンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アスタキサンチンの効率的な生産に関する。さらに詳しくは、アスタキサンチン含有量が高い緑藻およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アスタキサンチンは、赤色のカロチノイドの一種であり、強力な抗酸化作用を有することが知られている。そのため、食材用色素、化粧品、健康食品、医薬品などとして使用されている。アスタキサンチンは、化学合成されるものの他、天然物由来のものがある。天然物由来のアスタキサンチンは、オキアミ、アマエビなどのエビ類、ファフィア酵母、藻類などから抽出されている。しかし、オキアミなどのエビ類あるいは酵母からは、アスタキサンチン含有量が低いため、効率よくアスタキサンチンを生成できない。
【０００３】
他方、藻類は、外部環境の変化の結果としてシスト化し、藻体内にアスタキサンチンを蓄積する。そのため、藻類によるアスタキサンチンの生産研究が行われている。非特許文献１には、ヘマトコッカスの栄養細胞を、１日に培養液の１０〜４０％を交換しながら培養を行い（すなわち、半回分培養）、さらに光を照射しながら１５日間回分培養することによる、２段階培養方法が記載されている。特許文献１には、培養末期に培地成分の炭素と窒素との比率を変えてヘマトコッカスを培養することにより、アスタキサンチンを生産することが記載されている。また、特許文献２には、金属塩を添加した培地で藻類を培養し、アスタキサンチンを生産する方法が記載されている。しかし、これらの文献には、藻体中のアスタキサンチンの含有量についての記載はない。
【０００４】
特許文献３にはアスタキサンチンの藻体内含有量として、乾燥藻体あたり０．３〜１０質量％の値が記載されているが、藻体を窒素制限下、４００００ルクスの培養条件で培養した実施例においては、アスタキサンチン含量は２質量％程度であり、実際に１０質量％あるいはこれを超えるアスタキサンチン濃度の藻体は得られていない。さらに、特許文献４には、屋外培養池で培養したヘマトコッカスは藻体当たり４．５質量％のアスタキサンチンを有していたことが記載されている。
【０００５】
藻体内のアスタキサンチン含量についても検討されており、例えば、特許文献５および非特許文献２には、培養温度を３０℃とし、鉄イオンと酢酸との存在下で培養して、約６００ｐｇ／細胞のアスタキサンチンが生産されたことが記載されている。さらに、特許文献６には、アスタキサンチンを約７００ｐｇ／細胞以上の量まで上げることは可能であると記載されている。しかし、実際にはそのような高濃度でアスタキサンチンを含有する藻類は得られておらず、特許文献６に記載された実施例中の最高値でも、１５６ｐｇ／細胞にすぎない。
【０００６】
特許文献７には、キサントフィルを含有する微細藻類、例えば、シスト化した微細藻類を栄養培地に接種して栄養細胞として増殖させ、さらにシスト化させることにより、効率的にキサントフィルを製造する方法が開示されている。この特許文献７の実施例において、乾燥藻体中のキサントフィル（アスタキサンチン）の最高含量は、３．５質量％である。
【０００７】
アスタキサンチンの効率的な製造のため、より高濃度でアスタキサンチンを含有する藻類が望まれている。
【特許文献１】特表平２−５０１１８９号公報
【特許文献２】特開平１−１８７０８２号公報
【特許文献３】特開平３−８３５７７号公報
【特許文献４】特開２０００−６０５３２号公報
【特許文献５】特開平７−３９３８９号公報
【特許文献６】特開２００４−１２９５０４号公報
【特許文献７】国際公開第２００５／１１６２３８号パンフレット
【非特許文献１】Fabregasら、J. Biotech., 89, p66, (2001)
【非特許文献２】Tjahjonoら、BIOTECHNOLOGY LETTERS, vol.16, p133-138, (1994)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、細胞内のアスタキサンチン濃度が高い緑藻類を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、シスト化した緑藻を、栄養培地にて、二酸化炭素の供給下、２５０００μｍｏｌ−ｐｈｏｔｏｎ／ｍ３／ｓ以上の光合成有効光量子束投入量で光照射しながら培養する工程を含む、緑藻の製造方法を提供する。
【００１０】
本発明は、また、アスタキサンチンを７００ｐｇ／細胞以上の量で含む緑藻を提供する。
【００１１】
本発明は、また、湿藻体あたりアスタキサンチンを１．２質量％以上の濃度で含む緑藻を提供する。
【００１２】
また、本発明は、シスト化した緑藻を、栄養培地にて、二酸化炭素の供給下、２５０００μｍｏｌ−ｐｈｏｔｏｎ／ｍ３／ｓ以上の光合成有効光量子束投入量で光照射しながら培養する工程；および得られた緑藻を乾燥する工程を含む、緑藻乾燥物の製造方法を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、アスタキサンチンを５質量％以上の濃度で含む緑藻乾燥物を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、シスト化した緑藻を、栄養培地にて、二酸化炭素の供給下、２５０００μｍｏｌ−ｐｈｏｔｏｎ／ｍ３／ｓ以上の光合成有効光量子束投入量で光照射しながら培養する工程を含む、培養液１Ｌあたりアスタキサンチンを１５０ｍｇ以上の濃度で含む緑藻培養液の製造方法を提供する。
【００１５】
本発明は、また、培養液１Ｌあたり、アスタキサンチンを１５０ｍｇ以上の濃度で含む緑藻培養液を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、シスト化した緑藻を、栄養培地にて、二酸化炭素の供給下、２５０００μｍｏｌ−ｐｈｏｔｏｎ／ｍ３／ｓ以上の光合成有効光量子束投入量で光照射しながら培養する工程、得られた緑藻を乾燥させる工程、および得られた緑藻乾燥物からアスタキサンチンを抽出する工程を含む、アスタキサンチンの製造方法を提供する。
【００１７】
１つの実施態様では、上記の方法において、上記栄養培地は、独立栄養培地である。
【００１８】
１つの実施態様では、上記の方法において、上記光合成有効光量子束投入量は、７５００００μｍｏｌ−ｐｈｏｔｏｎ／ｍ３／ｓ以下である。
【００１９】
１つの実施態様では、上記緑藻はヘマトコッカス属に属する単細胞藻類であり、好ましくはヘマトコッカス・プルビアリスである。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、細胞あたりのアスタキサンチン含有量が７００ｐｇ（７００ｐｇ／細胞）以上の緑藻が提供される。この緑藻は、細胞あたりのアスタキサンチン含有量が高いので、この緑藻を用いることによりアスタキサンチンの生産効率が従来よりも向上する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の緑藻は、アスタキサンチンを７００ｐｇ／細胞以上の量で、好ましくは１０００ｐｇ／細胞以上の量で含む。このような緑藻は、光照射培養条件下、シスト化を誘発して得られる。好ましくは、シスト化した緑藻を栄養培地に接種し、栄養培地中への通気下、強い光照射条件で培養することにより得られる。このような培養方法により、乾燥藻体あたり５質量％（５０ｍｇ／ｇ乾燥藻体）以上、好ましくは乾燥藻体の６質量％（６０ｍｇ／ｇ乾燥藻体）以上のアスタキサンチン含量の緑藻乾燥物が得られる。さらに、培養液の単位容量あたりのアスタキサンチン量も１５０ｍｇ／Ｌ以上、好ましくは２００ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは２５０ｍｇ／Ｌに達する。
【００２２】
以下、アスタキサンチンを７００ｐｇ／細胞以上の量で含む緑藻；アスタキサンチンを５質量％（５０ｍｇ／ｇ乾燥藻体）以上の濃度で含む緑藻乾燥物；および、アスタキサンチンを１５０ｍｇ／Ｌ培養液の濃度で含む緑藻培養液について説明する。
【００２３】
本発明の方法は、アスタキサンチンを含有する緑藻、好ましくはシスト化した緑藻を増殖培地に接種して増殖させ、さらに光照射下、シスト化させることを特徴とする。アスタキサンチンを含有する緑藻、好ましくはアスタキサンチンを多く蓄積しているシスト化した緑藻を、増殖培地に接種して増殖させた場合、シスト化した緑藻は、アスタキサンチンを含有する遊走子を放出する。この遊走子は、アスタキサンチンを維持したまま、栄養細胞となる。そして、このアスタキサンチンを含有する緑藻（栄養細胞）をさらにシスト化することにより、さらなるアスタキサンチンが緑藻内で生産され、蓄積される。したがって、本発明の方法でシスト化した緑藻中には、もともと緑藻内に存在するアスタキサンチンに加えて、新たに生産されたアスタキサンチンが含まれるので、アスタキサンチン含量が高くなる。
【００２４】
（緑藻）
本発明に用いられる緑藻は、アスタキサンチンを生産し得る能力がある緑藻であれば、特に制限はない。例えば、ヘマトコッカス（Haematococcus）属に属する単細胞藻類が好ましく用いられる。好ましい緑藻としては、ヘマトコッカス・プルビアリス（H. pluvialis）、ヘマトコッカス・ラクストリス（H. lacustris）、ヘマトコッカス・カペンシス（H. capensis）、ヘマトコッカス・ドロエバケンシ（H. droebakensi）、ヘマトコッカス・ジンバブエンシス（H. zimbabwiensis）などが挙げられる。
【００２５】
ヘマトコッカス・プルビアリス（H. pluvialis）としては、独立行政法人国立環境研究所に寄託されているＮＩＥＳ１４４株、米国テキサス大学藻類保存施設に寄託されているＵＴＥＸ２５０５株、デンマークのコペンハーゲン大学のScandinavian Culture Center for Algae and Protozoa, Botanical Instituteに保存されているＫ００８４株などが挙げられる。
【００２６】
ヘマトコッカス・ラクストリス（H. lacustris）としては、ＡＴＣＣに寄託されているＡＴＣＣ３０４０２株および同３０４５３株、東京大学分子細胞生物学研究所に寄託されているＩＡＭ  Ｃ−３９２株、同Ｃ−３９３株、同Ｃ−３９４株および同Ｃ−３３９株、あるいはＵＴＥＸ  １６株および同２９４株などが挙げられる。
【００２７】
ヘマトコッカス・カペンシス（H. capensis）としては、ＵＴＥＸ  ＬＢ１０２３株などが挙げられる。
【００２８】
ヘマトコッカス・ドロエバケンシ（H. droebakensi）としては、ＵＴＥＸ  ５５株が挙げられる。
【００２９】
ヘマトコッカス・ジンバブエンシス（H. zimbabwiensis）としては、ＵＴＥＸ  ＬＢ１７５８株などが挙げられる。
【００３０】
中でも、ヘマトコッカス・プルビアリスが好ましく用いられる。
【００３１】
（シスト化）
本発明においては、アスタキサンチンを含有する上記の緑藻が用いられる。緑藻は、例えば、栄養飢餓状態、酸化物の存在など、生育環境からのストレスを受けると、細胞内にアスタキサンチンを蓄積し、休眠胞子化する。この休眠状態に入ることをシスト化という。本明細書では、シスト化とは、休眠状態に入りアスタキサンチンを蓄積し始めた状態から完全にシスト化し休眠胞子となった状態までのいずれかの状態をいう。アスタキサンチン含量を高める観点からは、できるだけシスト化が進行し、アスタキサンチンを多く蓄積した緑藻を用いることが好ましい。なお、「シスト化した緑藻を培養する」というときには、緑藻がシスト化の状態に達した後に栄養培地で生育したアスタキサンチンを含有する緑藻を接種する過程も含むものとする。本明細書において、「緑藻」は、シスト化した緑藻を含むことも意図する。
【００３２】
（培地）
緑藻の培養に用いる培地としては、特に制限がない。一般に、増殖に必要な窒素、微量金属の無機塩（例えば、リン、カリウム、マグネシウム、鉄など）、ビタミン類（例えば、チアミンなど）などを含む培地が用いられる。例えば、ＶＴ培地、Ｃ培地、ＭＣ培地、ＭＢＭ培地、ＭＤＭ培地などの培地（これらは、藻類研究法  千原光雄・西澤一俊編、共立出版（１９７９）を参照のこと）、ＯＨＭ培地（非特許文献１を参照のこと）、ＢＧ−１１培地、およびこれらの改変培地などが用いられる。本発明においては、雑菌の混入を防止できる点で、有機炭素源を実質的に含まない独立栄養培地を用いることが好ましい。
【００３３】
これらの培地は、増殖、シスト化などの目的に応じて選択することができる。例えば、緑藻の増殖を目的とする場合は、窒素源となる成分の多い培地（富栄養培地：窒素として、少なくとも０．１５ｇ／Ｌを含む培地）を用いる。シスト化を目的とする場合は、窒素源となる成分が少ない培地（シスト化培地：窒素として、０．０２ｇ／Ｌ未満）を用いる。あるいは、その中間の濃度の窒素源を含む培地（低栄養培地：窒素として、０．０２ｇ／Ｌ以上で、０．１５ｇ／Ｌ未満）を用いてもよい。
【００３４】
培地中の窒素源濃度、リン濃度などは、接種する緑藻の量に依存して決めればよい。例えば、１０５オーダーの数の緑藻が接種される場合、低栄養培地を用いると、ある程度まで緑藻は増殖するが、窒素源の量が少ないため、増殖はすぐに止まる。このような低栄養培地は、後述するように、一段階で（回分的に）増殖とシスト化を連続して行うに適した培地である。さらに、Ｎ／Ｐモル比を１０〜３０、好ましくは１５〜２５の値に調整することにより、シスト化へ導くこともできる。
【００３５】
接種する緑藻の数がさらに大きい場合、富栄養培地を用いて、上記培養を行うことができる。
【００３６】
このように、培地の組成は、種々の条件を考慮して決定することができる。なお、本発明で好適に用いられる培地、すなわち独立栄養培地には、酢酸、グルコースなどの有機炭素源がほとんど含まれないため、長期間にわたって培養を行っても、雑菌の混入はほとんどない。
【００３７】
（培養装置）
緑藻の培養装置は、二酸化炭素が供給でき、かつ培養液に光照射ができる装置であれば、特に制限はない。例えば、小スケールの場合は、扁平培養瓶が好ましく用いられる。大スケールの場合は、ガラス製、プラスチック製などの透明板で構成され、必要に応じて照明器および撹拌機を備えた培養槽が用いられる。このような培養槽としては、例えば、平板培養槽、チューブ型培養槽、エアドーム型培養槽、中空円筒型培養槽などが用いられる。また、いずれの場合も、密閉容器が好ましく用いられる。
【００３８】
（培養条件）
培養条件に特に制限はなく、一般に、緑藻の培養に用いられる温度、ｐＨなどが用いられる。緑藻の培養は、例えば１５〜３５℃で行われ、好ましくは２０〜２５℃で行われる。培養中のｐＨは、６〜８に保たれることが好ましい。二酸化炭素は、１〜３ｖ／ｖ％濃度の二酸化炭素を含有するガスを、例えば、０．２〜２ｖｖｍとなるように吹き込むことで、供給される。平板培養槽を用いる場合、この二酸化炭素の供給により、培養液が撹拌され、緑藻に対して光照射が均一に行われる。
【００３９】
（光照射）
本発明においては、緑藻の培養には、光合成有効光量子束投入量を２５０００μｍｏｌ−ｐｈｏｔｏｎ／ｍ３／ｓ（以下、この単位をμｍｏｌ−ｐ／ｍ３／ｓと略す）程度となるように光を照射するが、アスタキサンチンの生成量を増加させる観点からは、３００００μｍｏｌ−ｐ／ｍ３／ｓ以上であることが好ましく、４００００μｍｏｌ−ｐ／ｍ３／ｓ以上であることがより好ましい。また、強光によって光合成が阻害されると細胞の増殖が停止するため、光合成有効光量子束投入量は、７５００００μｍｏｌ−ｐ／ｍ３／ｓ以下であることが好ましい。このような光合成有効光量子束投入量で、培養開始時からシスト化までの培養過程全般に亘って照射することにより、アスタキサンチンの生産量が非常に大きくなる。
【００４０】
なお、光合成有効光量子束投入量は、まず、光合成有効光量子束密度（ＰＰＦＤ）を測定することにより、求められる。ＰＰＦＤは、培養装置の数箇所に平面光量子センサーＬＩ−１９０（LICOR Inc., Lincoln, USA）を配置し、光を照射して各箇所のＰＰＦＤを測定し、測定値を平均することにより、求めることができる。光源が複数存在する場合のＰＰＦＤは、それぞれの光源から受けるＰＰＦＤの合計となる。ガラス、アクリル樹脂などの透明板で構成された装置の場合、透明板を通過してくるＰＰＦＤを測定し、所定のＰＰＦＤに必要な光源の強さ、あるいは光源の距離を決定し、光源を配置すればよい。透明な２枚の平板から構成される培養槽を用い、両側から光照射する場合、それぞれの側からのＰＰＦＤの値を合計した値となる。
【００４１】
光合成有効光量子束投入量は以下の式により求められる。
【００４２】
【数１】
2007097584.tif 000002
【００４３】
（培養方法）
培養は、上記培地、培養装置、培養条件などを適宜選択して組合せて、光照射下、行われる。培養方法には、２つの方法がある。一つは、シスト化した緑藻を、連続して同一の培地で増殖させ、シスト化させる、１段階培養法である。他の一つは、培地をシスト化した緑藻を増殖させるための培地とシスト化させるための培地とが互いに異なっており、増殖とシスト化とを別々に行う２段階培養法である。
【００４４】
（１段階培養法）
１段階培養法は、シスト化した緑藻を栄養培地に接種してから培養終了までの間、培地を交換することなく連続的に培養する方法である。すなわち、所定の培地で、同一培養槽内で、緑藻の増殖およびシスト化を行う。この１段階培養法では、緑藻はいったん増殖し、培地中の栄養成分の消費による栄養飢餓ストレス、光照射によるストレスなどを受けて、シスト化状態にスムーズに移行する。この１段階培養法で得られたシスト化した緑藻は、さらに、次の１段階培養、あるいは後述の２段階培養の前培養培地に接種するために用いてもよい。
【００４５】
アスタキサンチンを含有する緑藻（好ましくはシスト化した緑藻）が栄養培地に接種されると、アスタキサンチンを含む遊走子が２ｎ個（ｎ＝１〜４）放出される。この遊走子がアスタキサンチンを含んだまま栄養細胞となるので、アスタキサンチンを含む栄養細胞の数が増加する（言い換えれば、緑藻が増殖する）。このアスタキサンチンを含有する栄養細胞をシスト化することにより、もともと有していたアスタキサンチンに加えて、新たにアスタキサンチンが蓄積されることから、細胞内のアスタキサンチン含量が一層高められる。
【００４６】
ところで、栄養細胞が増殖を続けると、結果として栄養細胞内のアスタキサンチン濃度が低下すると考えられるので、増殖は、いくらかのアスタキサンチンが細胞内に残っている時点で停止させることが好ましい。
【００４７】
ある程度栄養細胞が増殖した時点で、緑藻の増殖を停止させるためには、培地を栄養飢餓になるように設計することが好ましい。そのため、１段階培養法では、培地として、窒素源濃度が比較的低い培地、例えば、上記低栄養培地が好ましく用いられる。多量のシスト化細胞を接種する場合は、窒素源濃度が高い培地、例えば、上記富栄養培地を用いてもよい。
【００４８】
なお、低栄養培地で緑藻の生育が不十分である場合、富栄養培地あるいは低栄養培地を追加して、所望の濃度まで緑藻を増殖させてもよい。
【００４９】
また、低栄養培地を用いる場合、Ｎ／Ｐモル比を１０〜３０、好ましくは１５〜２５の値に調整しておくと、増殖後スムーズにシスト化させることができる。
【００５０】
１段階培養法では、工程の管理が簡便であること、別の培養槽に移し替える必要がないため、雑菌の混入が防止できること、用いる培養槽が一つのみでよいことなどだけでなく、高濃度でアスタキサンチンを含有する緑藻を簡便に得ることができるという利点もある。
【００５１】
（２段階培養法）
２段階培養法は、シスト化した緑藻を栄養培地で増殖させ、ついで、栄養培地をシスト化培地に代えて、シスト化を行う培養方法である。すなわち、２段階培養法では、まず、シスト化した緑藻を栄養培地に、好ましくは富栄養培地に接種して緑藻を増殖させる第１工程と、この緑藻を回収して、窒素源をほとんど含まないシスト化培地に移して、シスト化する第２工程を含んでいる。
【００５２】
第１工程における緑藻の増殖は、アスタキサンチンが栄養細胞に残存している間に終了させる必要があるため、栄養培地での培養は短時間で行われる。培養の開始時に富栄養培地を用いて培養すると、栄養細胞の増殖速度が、低栄養培地で培養した場合の増殖速度よりも速いので、富栄養培地を用いることが好ましい。増殖終了後、緑藻は回収され、シスト化培地に移し替えられ、第２工程のシスト化が行われる。
【００５３】
この第１工程と第２工程とは、それぞれ、別の培養槽で回分的に行ってもよい。第１工程終了後、増殖した緑藻を洗浄、回収し、同一培養槽に戻して、第２工程を行ってもよい。
【００５４】
この２段階培養法でも、アスタキサンチン含量が高い緑藻が得られる。この２段階培養法は、１段階培養法に比べて、増殖工程が短時間ですむという利点があるが、途中で増殖した緑藻を移し替える操作が必要となる。
【００５５】
得られたシスト化緑藻の一部はアスタキサンチンの回収に、残りの一部は、再度、栄養培地への接種のために用いてもよい。
【００５６】
（アスタキサンチン量の測定）
上記の培養により、培養液１Ｌあたり、アスタキサンチン（フリー体として）を１５０ｍｇ以上の濃度で、好ましくは、１５０〜２５０ｍｇ／Ｌで、より好ましくは、２００〜２５０ｍｇ／Ｌの濃度で含む緑藻培養液が得られる。培養液あたりのアスタキサンチン量は、所定量の培養液を採取し、その中に含まれるアスタキサンチン量を測定することにより求められる。
【００５７】
試料中のアスタキサンチン量（フリー体として）は、例えば、以下の方法で測定される。まず、試料を一定量採取し、洗浄し、ビーズビーター専用のミクロチューブに採る。同チューブにジルコニアビーズを加えた後、アセトンを加え、ビーズビーターで破砕する。破砕後、試料を、遠心分離により上清と沈殿とに分け、上清（すなわち、アセトン画分）を回収する。沈殿には再びアセトンを加え上記と同様の操作を、沈殿の色がほぼ完全に白くなるまで繰り返す。回収したアセトン画分を合わせて、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で１００倍に希釈し、４９２ｎｍにおける吸光度（Ａ４９２）および７５０ｎｍにおける吸光度（Ａ７５０）を測定する。回収アセトン画分（試料）中のアスタキサンチン濃度は、以下の式を用いて算出され、この測定値から、培養液中のアスタキサンチン量が求められる。
【００５８】
試料中のアスタキサンチン濃度（μｇ／ｍＬ）＝４．５×１００×（Ａ４９２−Ａ７５０）
【００５９】
（アスタキサンチンを含む湿藻体）
上記条件で培養を行うことにより、７００ｐｇ／細胞以上、好ましくは８００ｐｇ／細胞以上、より好ましくは９００ｐｇ／細胞以上、さらに好ましくは１０００ｐｇ／細胞以上の量のアスタキサンチン（フリー体として）を含む緑藻が得られる。本発明の方法では、アスタキサンチンを１１００ｐｇ／細胞の量、あるいはそれ以上の量（例えば、１２００ｐｇ／細胞）で含む緑藻が得られる。
【００６０】
ここで、「湿藻体」とは、藻体から水分が除去されておらず、藻体内が液体で満たされている藻体をいう。例えば、培養液中に存在している状態の緑藻である。
【００６１】
なお、細胞あたりのアスタキサンチン量は、所定量の緑藻を回収し、その細胞数および細胞より抽出されたアスタキサンチン量を測定することにより求められる。細胞数は、例えば、粒子径分布測定装置（ＳＹＳＭＥＸ  ＦＰＩ−３０００）で測定できる。
【００６２】
（アスタキサンチンを含む緑藻の乾燥物）
上記のアスタキサンチンを含む湿藻体を、当業者が通常用いる乾燥手段（ドラム乾燥、熱風式乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥など）によって乾燥させることにより、緑藻の乾燥物を得ることができる。
【００６３】
得られた緑藻の乾燥物は、アスタキサンチン（フリー体として）を５質量％以上の濃度で含む。好ましくは、５〜８質量％の濃度で含み、さらに好ましくは６〜７質量％の濃度で含む。なお、ここでいう乾燥物に含まれる水分量は７質量％以下、好ましくは５質量％、より好ましくは２質量％程度である。
【００６４】
（アスタキサンチンの製造方法）
得られた緑藻の乾燥物から、アスタキサンチンを抽出し、回収することによってアスタキサンチンを製造することができる。アスタキサンチンの抽出・回収方法に特に制限はなく、当業者が通常用いる方法が用いられる。例えば、緑藻の乾燥物を機械的に破壊した後に、アスタキサンチンが抽出される。抽出方法としては、クロロホルム、ヘキサン、アセトン、メタノール、エタノールなどの有機溶媒や食用油脂を用いて抽出する化学的抽出方法、あるいは緑藻の乾燥物の圧搾などによる物理的抽出方法が挙げられる。あるいは、超臨界抽出法を用いて抽出・回収してもよい。抽出後、濃縮・晶析、合成樹脂（例えば、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体など）による分画などの方法で、アスタキサンチンを精製することができる。
【実施例】
【００６５】
以下に、ヘマトコッカス・プルビアリスＫ００８４株を用いた実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこの実施例に制限されない。
【００６６】
なお、本実施例において、アスタキサンチン量および細胞数は、上記の方法で測定した。
【００６７】
緑藻の乾燥質量の測定方法は、以下の通りである。まず、所定量の培養液を採取し、ＧＣ５０ガラス繊維ろ紙（アドバンテック東洋株式会社製）上で吸引濾過し、無機塩類を溶解するため、ｐＨ４の塩酸水溶液５ｍＬで２回洗浄した。次いで、緑藻の付いたろ紙を、１０５℃の恒温乾燥機で３時間乾燥させ、真空デシケーター中で室温まで１時間冷却し、乾燥質量を測定した。なお、ＧＣ５０ガラス繊維ろ紙は、予め、上記恒温乾燥機で、１０５℃、１時間乾燥させて、その質量を測定しておいた。緑藻を吸着させた乾燥ろ紙の質量から、予め測定したろ紙の乾燥質量を差し引いて緑藻の乾燥質量を求めた。また、この所定量の培養液中のアスタキサンチン量の測定値より、乾燥質量あたりのアスタキサンチン量を求めた。
【００６８】
（実施例１）
（シスト化した緑藻の調製）
ヘマトコッカス・プルビアリスＫ００８４株を、以下の表１に記載の成分を含有する培地（低栄養培地）に接種した。
【００６９】
【表１】
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【００７０】
具体的には、１．５Ｌの扁平培養瓶に１Ｌの低栄養培地を入れ、シスト化したＫ００８４株を接種した。培養は、白色蛍光灯を用いて２５０００μｍｏｌ−ｐ／ｍ３／ｓの光合成有効光量子束投入量で光照射を行い、３容積％のＣＯ２を含む空気を０．５Ｌ／分の速度で吹き込みながら（すなわち、通気速度０．５ｖｖｍで）、２５℃にて７日間行った。７日後、シスト化したＫ００８４株を集め、低栄養培地で１．５×１０６個／ｍｌの濃度となるように調整した。
【００７１】
（本培養）
アクリル透明板を培養槽の内壁が３ｃｍの間隔となるように対向させて配置した扁平培養槽に、低栄養培地を９Ｌ入れ、１Ｌの上記シスト化したＫ００８４株を１．５×１０５個／ｍｌの濃度で植菌し、培養を開始した。培養は、扁平培養槽の両側に各６本の白色蛍光灯を設置し、２５０００μｍｏｌ−ｐ／ｍ３／ｓの光合成有効光量子束投入量で照射を行い、３容積％のＣＯ２を含む空気を５Ｌ／分の速度で吹き込みながら（すなわち、通気速度０．５ｖｖｍで）、２５℃にて２１日間行った。培養液中のアスタキサンチン含有量、細胞数、および培養液から採取した藻体の乾燥質量を、定期的に上述の方法で測定した。結果を図１〜６に示す。
【００７２】
生細胞数は、３日目には６．５×１０５個／ｍｌと約４倍になったが、以降、徐々に低下した（図示せず）。生細胞あたりのアスタキサンチン含有量は、図１に示すように、１４日目には６００ｐｇ／細胞に達し、１８日目には８００ｐｇ／細胞以上となり、１９日目には９００ｐｇ／細胞以上となり、さらには２１日目には１０００ｐｇ／細胞に達した。また、図２に示すように、細胞あたりのアスタキサンチンの生成速度は、培養７日目付近が最も高く、細胞あたり、１日約５４ｐｇであった。その後は、細胞あたり、１日約４５ｐｇを生産した。
【００７３】
図３に示すように、乾燥藻体あたりのアスタキサンチン含有量は、細胞が栄養増殖した３日目までは減少したが、シスト化開始後急激に増加し、７日目には６質量％（６０ｍｇ／ｇ乾燥藻体）に達した。さらに培養を続けると、藻体あたりのアスタキサンチン量は徐々に増加し続け、２１日目には、６．８質量％（６８ｍｇ／ｇ乾燥藻体）に達した。
【００７４】
図４は、培養液中のアスタキサンチン濃度の経時変化を示す。培養７日目には培養液１Ｌあたり、１５０ｍｇという高い濃度を示し、１０日を過ぎると２００ｍｇ／Ｌの濃度となり、２１日目には、２５０ｍｇ／Ｌの濃度となった。また、図５に示すように、培養液１ｍｌあたりの１日のアスタキサンチンの生成速度は、培養７日目付近が最も高く、培養液あたり、１日約１９ｍｇであった。その後は、アスタキサンチン生成速度はやや減少した。
【００７５】
図６に示すように、培養液中の固形分の質量は培養に伴って増加し、１３日目でピークに達し、以降、ほとんど変化はなかった。生細胞数が徐々に減少したことを考慮すると、固形分の質量増加は、シスト化による細胞の質量の増加に起因すると思われる。
【００７６】
（比較例１）
１２０００μｍｏｌ−ｐ／ｍ３／ｓの光合成有効光量子束投入量で光照射を行ったこと以外は、実施例１と同様に培養し、２１日目の湿藻体あたりのアスタキサンチン濃度、乾燥藻体中のアスタキサンチン濃度、および培養液１Ｌあたりのアスタキサンチン量を測定した。結果を表２に示す。
【００７７】
（比較例２）
非特許文献２に記載された、一般的なヘマトコッカスの培養に用いられる光合成有効光量子束投入量である８０００μｍｏｌ−ｐ／ｍ３／ｓの光合成有効光量子束投入量となるように光照射を行ったこと以外は、実施例１と同様に培養した。２１日目の湿藻体あたりのアスタキサンチン濃度、乾燥藻体中のアスタキサンチン濃度、および培養液１Ｌあたりのアスタキサンチン量を測定した。結果を表２に示す。
【００７８】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明の藻類は、従来公知の藻類に比べてアスタキサンチンを高濃度で含むので、抗酸化剤、食品、医薬品、化粧料などの分野で使用されているアスタキサンチンの生産効率を大きく向上させることができる。したがって、本発明の藻類は、アスタキサンチンの効率的な製造方法において、非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】細胞あたりのアスタキサンチン含有量の経時変化を示すグラフである。
【図２】細胞あたりのアスタキサンチンの生成速度の経時変化を示すグラフである。
【図３】乾燥藻体あたりのアスタキサンチン含有量の経時変化を示すグラフである。
【図４】培養液中のアスタキサンチン濃度の経時変化を示すグラフである。
【図５】培養液中のアスタキサンチンの生成速度の経時変化を示すグラフである。
【図６】培養液の単位容量あたりの固形分の乾燥質量の経時変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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