(57)【要約】【課題】骨質の正確な評価を行うことのできる評価キット，評価方法，更にはこの評価方法を用いて、骨質の劣化予防又は改善剤をスクリーニングする方法，及びそのスクリーニング用キットを提供すること【解決手段】骨細胞，骨細胞産生物質の少なくともいずれかを指標として、骨質を評価する方法，骨細胞又は骨細胞産生物質に対する抗体，或いは骨細胞産生物質の遺伝子に対する遺伝子プローブを含むことを特徴とする、骨質の評価キット，骨細胞及び／又は骨細胞産生物質の有無を指標とすることを特徴とする、骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニング方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨細胞，骨細胞産生物質の少なくともいずれかを指標として、骨質を評価する方法。
【請求項２】
骨細胞産生蛋白質又はその遺伝子の少なくともいずれかを指標として、骨質を評価する方法。
【請求項３】
血清中の骨細胞産生蛋白質又はその遺伝子を指標とする、請求項１又は２記載の評価方法。
【請求項４】
骨細胞産生蛋白質が、FGF-23，MEPE，DMP1のいずれかであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の評価方法。
【請求項５】
骨細胞又は骨細胞産生物質に対する抗体，或いは骨細胞産生物質の遺伝子に対する遺伝子プローブを含むことを特徴とする、骨質の評価キット。
【請求項６】
骨細胞産生物質が、FGF-23，MEPE，DMP1のいずれかであることを特徴とする請求項５記載のキット。
【請求項７】
下記(1)〜(4)のいずれかの非ヒト動物を用い、骨細胞及び／又は骨細胞産生物質を指標とすることを特徴とする、骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニング方法。
(1)グルココルチコイドを投与した、ヒトのステロイド骨粗鬆症のような症状を呈するモデル動物
(2)加齢したモデル動物
(3)卵巣摘除などによってエストロゲン欠乏にしたモデル動物
(4)尾部懸垂や微小重力下においた骨粗鬆症モデル動物
【請求項８】
骨細胞，骨細胞産生物質の少なくともいずれかを指標とする、骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
骨細胞又は骨細胞産生物質に対する抗体，或いは骨細胞産生物質の遺伝子に対するプローブを含むことを特徴とする、骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニング用キット。
【請求項１０】
骨細胞産生物質が、FGF-23，MEPE，DMP1のいずれかであることを特徴とする請求項９記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨密度とは別個に骨強度を測定することのできる、骨質を評価する方法，骨質の評価キット，及びこれを利用した骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニング方法，及び骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニング用キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨折・寝たきりは、大きな社会問題である。骨折の原因として、骨の脆弱性、すなわち骨粗鬆症が重要である。骨の強度は、骨の量と質によって規定される。現在、骨粗鬆症の診断、治療の必要性の判断、治療効果の評価は、骨密度の測定，あるいはこれに代用される骨の量の推定に頼っている。
【０００３】
しかしながら、骨密度が骨粗鬆症域にまで低下していなくても骨折を起こす等の現象が明らかにされつつあり、骨密度による評価には限界があることが分かってきた。そこで、骨密度以外の指標を用いて、より正確に骨質を評価する方法の確立が求められており、わが国でも2004年ガイドラインが策定されたところである。
【０００４】
一方、エストロゲン欠乏やステロイドの投与による骨細胞の減少が知られており、とくにステロイドによる骨粗鬆症は、1000万人以上と言われる骨粗鬆症患者の２０％を占め、200万人に相当する。少量のステロイドでも、また数ヶ月の短期間の服用で骨折が発生し、服用患者は例外なく必ず骨粗鬆症になることが知られている。
【０００５】
しかしながら、骨細胞の数そのものが、骨質に影響していることは報告されていなかった。
【０００６】
以前に本発明者等は、”誘導的に骨細胞を欠失させることのできるトランスジェニック動物”を開発した（下記特許文献１参照）。このマウスは、ジフテリア毒素の受容体が骨細胞にのみ発現しており、毒素を投与することによって、任意の時期に骨細胞のみを欠失させることができるようにデザインされている。
【０００７】
今回新たに、このマウスにおいて骨細胞をablateすると、皮質骨内の多孔性が高まり、微少骨破壊（microcrack）が生じて、骨の強度が低下することが明らかになった。
すなわち、骨細胞の存在が、骨質の維持にきわめて重要であり、骨質のより正確な評価指標となり得るとのはじめての証拠を得た。
【０００８】
現在、骨の質を規定する因子は不明であり、またそれを臨床的に評価する方法もない。現時点では、骨の質の評価に関しては、Ｘ線やMRIを用いた画像解析が主で、大部分は摘出骨を用いた侵襲的・破壊的検査が研究目的で行われているのが現状であり、非侵襲的・非破壊的に血液や尿サンプルを用いて骨の質を評価する方法はまったく存在しない（非特許文献１，２参照）。
【０００９】
【特許文献１】特開2005−245255号公報
【非特許文献１】J Bone Miner Res 20:1828-36, 2005
【非特許文献２】Osteoporos Int 10:231-9, 1999
【００１０】
ところで、骨細胞産生蛋白質としては、後述する(a)FGF-23，(b)MEPE，(c)DMP1等が知られている。このうち、FGF-23は、腎に作用して、尿細管からのリンの再吸収抑制、ビタミンDの活性化を抑制して骨軟化症を起こす原因遺伝子として知られている。
【００１１】
このFGF23は、くる病や骨軟化症の患者のリン低下によって引き起こされる疾病患者の血清中において、健常人の数百〜数千倍量検出されることから、これら疾病のマーカーとして、用いられている。
【００１２】
しかしながら、本願発明者が目的とするような、リンが正常な値であるにも拘わらず骨質に変調を来しているような症状において、FGF-23と骨質の関係を示唆するものは無かった。
【００１３】
また、(b)MEPE，(c)DMP1等についても、同様に骨質との関係を示唆するものは知られていない。
【００１４】
本発明者等は、上記マウスにジフテリア毒素を投与して骨細胞を破壊すると、骨細胞産生物質である蛋白質のｍRNA量や、蛋白質そのものの量が減少すること、すなわち、骨細胞産生物質量が、骨細胞の数と密接に関連していることをも、初めて見出した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
発明者は、上記問題に鑑み、鋭意研究の結果、骨細胞が、骨質を規定する要因であり、骨強度と密接に関連すること，及び、骨細胞が産生する蛋白質やその遺伝子等の量が、骨細胞の量，つまりは骨質を正確に反映していることを初めて見出し、本発明に到達したものであって、その目的とするところは、骨質の正確な評価を行うことのできる評価キット，評価方法，更にはこの評価方法を用いて、骨質の劣化予防又は改善剤をスクリーニングする方法，及びそのスクリーニング用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上述の目的は、下記の発明によって達成される。
【００１７】
（第一の発明）
骨細胞，骨細胞産生物質の少なくともいずれかを指標として、骨質を評価する方法である。
【００１８】
（第二の発明）
骨細胞産生蛋白質又はその遺伝子の少なくともいずれかを指標として、骨質を評価する方法である。
【００１９】
（第三の発明）
血清中の骨細胞産生蛋白質又はその遺伝子を指標とする、第一又は第二の発明の評価方法である。
【００２０】
（第四の発明）
骨細胞産生蛋白質が、FGF-23，MEPE，DMP1のいずれかであることを特徴とする第一乃至第三の発明のいずれかの評価方法である。
【００２１】
（第五の発明）
骨細胞又は骨細胞産生物質に対する抗体，或いは骨細胞産生物質の遺伝子に対する遺伝子プローブを含むことを特徴とする、骨質の評価キットである。
【００２２】
（第六の発明）
骨細胞産生物質が、FGF-23，MEPE，DMP1のいずれかであることを特徴とする第五の発明のキットである。
【００２３】
（第七の発明）
下記(1)〜(4)のいずれかの非ヒト動物を用い、骨細胞及び／又は骨細胞産生物質を指標とすることを特徴とする、骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニング方法である。
(1)グルココルチコイドを投与し、ヒトのステロイド骨粗鬆症のような症状を呈するモデル動物
(2)加齢したモデル動物
(3)卵巣摘除などによってエストロゲン欠乏にしたモデル動物
(4)尾部懸垂や微小重力下においた骨粗鬆症モデル動物
【００２４】
（第八の発明）
骨細胞，骨細胞産生物質の少なくともいずれかを指標とする、骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニング方法である。
【００２５】
（第九の発明）
骨細胞又は骨細胞産生物質に対する抗体，或いは骨細胞産生物質の遺伝子に対するプローブを含むことを特徴とする、骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニング用キットである。
【００２６】
（第十の発明）
骨細胞産生物質が、FGF-23，MEPE，DMP1のいずれかであることを特徴とする第九の発明のキットである。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の骨質評価方法又は骨質評価キットを用いることによって、骨質の正確な評価が可能となる。特に、血清中の骨細胞産生物質量を指標とする評価方法の場合には、骨組織の摘出が不要な非破壊的な検査であることから、患者負担が少ないという利点を有している。
また、本発明のスクリーニング方法又はスクリーニング用キットを用いて、骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニングを行うことができる。
【００２８】
しかも、本発明の骨質評価は、血清リン濃度が正常範囲内であっても起こっている骨の変化を、その評価対象としている。
このため、骨軟化症やくる病等の低リン血症に起因する特異な骨疾患に罹患していない、極めて健常人に近い人の、骨の劣化のみを、純粋に予測・診断することができる。つまり、低リン血症の特定の患者のみならず、例えば、老人や閉経後の女性等の、骨の劣化すなわち骨粗鬆症が心配され、骨折のリスクが予想される対象者についても、正確に骨の質、ひいては骨折のリスクを予測・診断できることを意味しており、その意義は極めて大きい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３０】
〈本発明の骨質の評価方法〉
本発明において用いられる骨細胞（osteocyte）とは、骨芽細胞が終末分化した細胞である。骨細胞は、休止期にあって増殖せず、硬組織に埋没している。そのため、理論上は、細胞突起などの形態学的な特徴に基づいて、骨細胞を単離することができるものの、実際の単離は極めて困難である。また、一般にin vitroでの遺伝子の発現パターンはin vivoとは異なるため、骨細胞の単離が可能であったとしても、in vivoにおける骨細胞の生物学的特性を分析することは困難であった。そのため従来は、特異的な遺伝子産物も知られておらず、in vivoでの機能も解明されていない。本発明者等の作製した、生体内で骨細胞のみを除去できるマウス（上記特許文献１等参照）を用いた本発明によって、骨細胞と骨質の間に、密接な関係があること，及び、従来知られていたある種の蛋白質（FGF-23等）が、骨細胞が特異的に産生していたこと、骨細胞の欠乏によってその血清濃度が低下することが、今回初めて明らかとなった。
【００３１】
本発明において用いられる骨細胞産生物質とは、骨細胞産生蛋白質の他、骨細胞が産生又は放出する蛋白質等であるが、骨細胞が特異的に産生するものが好ましい。
【００３２】
骨細胞が特異的に産生する骨細胞産生蛋白質としては、後述する(a)FGF-23，(b)MEPE，(c)DMP1，等が挙げられる。
【００３３】
(a)FGF-23(Fibroblast Growth Factor 23)とは、FGFファミリーに属する分子量約30kDa，アミノ酸残基数251の公知の蛋白質である。尚、このFGF-23は、生体内ではN末端側の24残基がシグナルペプチドとして脱落した後、227アミノ酸から成る分泌蛋白質が活性体として存在することが知られており、また、活性は消失しているものの179残基と180残基の間をプロテアーゼによって切断された断片も生体内に存在することが知られている。
【００３４】
FGF-23は、心臓および肝臓で産生され、hypマウス（XLH（X-linked hypophosphatemic rickets）症候群モデルマウス）などのリン代謝異常を示す変異マウスの解析から、リン代謝を調節する新規のホルモン様分子であることがわかっている。この蛋白質は、骨組織においても発現が確認されているが、従来、産生細胞は特定されていなかった。本発明者等の作製した、生体内で骨細胞のみを除去できるマウス（上記特許文献１等参照）を用いた本発明によって、骨細胞がFGF-23の主要な産生細胞であり、かつ骨細胞の存在が血清中のFGF-23濃度に大きく寄与することが今回はじめて証明された。つまりFGF-23も、骨細胞の数と同様、骨質の評価に使用できると考えられる。
【００３５】
本発明の骨質評価においてFGF-23を指標とする際には、上述のN末端が脱落した活性型が望ましい。本発明の評価では、骨細胞の存在が推定できれば、良いが、活性を有するFGF-23であることが好ましい。尚、mRNAを指標として検出する際には、成熟前のmRNA，及びスプライシングを受けた後の成熟mRNAのいずれも指標として用いることができる。
【００３６】
(b)MEPE(Matrix extracellular phosphoglycoprotein）とは、公知の細胞外基質リン酸化糖タンパク質で、OF45とも呼ばれる。XLHと同じく、低リン血症と骨軟化症をきたす腫瘍性骨軟化症（TIO: tumor-induced osteomalacia）患者の腫瘍から同定されたものであり、SIBLING（インテグリン結合性の糖タンパク質）と呼ばれるファミリーの一員である。ヒトMEPEは、525アミノ酸、マウスは433アミノ酸から成る（The Journal of Clinical Investigation，September 2003，Volume 112，Number 5等参照）。
【００３７】
MEPEは、石灰化に関わることを示唆する実験結果が得られているが、その機能は明らかになっていない。また、MEPEは、骨（主に骨芽細胞）で産生されるという報告はあるが、骨細胞が産生するか、また、主な産生細胞が何であるか等については不明であった（Genomics 74:342-351, 2001）。
我々の骨細胞のないマウスでは、骨におけるMEPE mRNAの発現が低下し、骨細胞とMEPE産生には相関関係があること示していることから、MEPEは、主に骨細胞が産生しており、本発明の骨質評価に使用し得ることが分かった。
【００３８】
(c)DMP1(dentin matrix protein 1)とは、もともと歯の象牙質のcDNA ライブラリーから同定された、分泌性の酸性リン酸化蛋白質である。その遺伝子はヒト染色体では4q21に位置し、その近傍に位置するオステオポンチンや、(b)のMEPEや、骨シアロタンパク質などの遺伝子とともに、遺伝子ファミリーを形成している。近年では、DMP1 の骨組織における発現がクローズアップされ、DMP1 のin situ hybridizationと免疫組織染色から、DMP1は骨芽細胞では産生されず、骨細胞で特異的に産生されることが明らかとなった（J Bone Miner Res 16:2017-26, 2001）。従って、DMP1は骨細胞の特異的マーカーと考えることができる。つまり、本発明において、骨細胞と同様、骨質の評価に使用できると考えられる。
【００３９】
本発明の評価方法において評価する骨質とは、骨強度（曲げや圧迫、ねじれなどに対する強度等）を決定する要因で、微少亀裂（Microcrack）や骨梁構造の変化、骨の材質等を意味する。
【００４０】
つまり、骨細胞や骨細胞産生物質を指標とし、例えばその量や発現部位を測定又は観察等することによって、骨の強度が予測・推定できるのである。
【００４１】
本発明の骨質評価方法において、骨細胞や骨細胞産生物質の量を測定する為の方法としては、骨組織を取り出して用いる破壊的な方法と、骨組織から放出される物質を非破壊的に測定する方法が挙げられるが、非破壊的な方法が好ましい。非破壊的な方法は、患者負担が少ないからである。また、局所の骨の情報だけが得られる破壊検査と違って、血液や尿の生化学検査に代表される非破壊的な方法では、全身の骨の状態が反映されるので、全身性の骨代謝疾患である骨粗鬆症における骨質評価、骨強度の評価という見地からは望ましいからである。
【００４２】
これらの破壊的・非破壊的な方法のいずれにおいても、骨細胞や骨細胞産生物質の検出は、生体抽出材料を用い、顕微鏡による観察方法の他、遺伝子発現やタンパク質の公知の解析方法等を、必要に応じて併用することによって実施する。
【００４３】
破壊的な方法としては、たとえば、取り出した骨組織をパラフィン等で包埋し、ヘマトキシリン・エオシン(H＆E)染色（Hematoxylin and eosin stain）等した後、顕微鏡で観察することにより、骨細胞の有無が判定できる。骨細胞は、lacuna（ラクナ）と呼ばれる空洞中に存在するため、空になった空洞や異常な形態の骨細胞の数を計測することによっても、骨細胞の減少，ひいては骨質の劣化を推定することが可能である。
【００４４】
また、取り出した骨組織から、常法に従い蛋白質や遺伝子（骨細胞産生蛋白質遺伝子のmRNA）を検出することによっても、骨細胞の有無，ひいては骨質の劣化を推定することが可能である。
【００４５】
非破壊的な方法では、被験者から非破壊的に抽出した後述の検体を用い、蛋白質や遺伝子の測定に用いる。
【００４６】
非破壊的に測定可能な検体としては、尿や血漿、血清、全血、脳脊髄液、精液等の体液等が挙げられるが、被験者からの抽出が容易である点や、局所の骨の情報だけが得られる破壊検査と違って、全身の骨の状態が反映され、全身性の骨代謝疾患である骨粗鬆症における骨質評価、骨強度の評価が可能であると言う点から、血清が好ましい。
【００４７】
蛋白質の測定方法としては、（１）ウェスタンブロット分析や（２）ELISA法等の酵素免疫測定法，（３）放射免疫測定法のほか、（４）蛋白質に結合している糖鎖を検出する方法等、蛋白質の検出・定量に用いられている一般的な方法を用いることができるが、測定精度の点では、ELISA法が好ましい。
【００４８】
ELISA法とはenzyme-linked immunosorbent assayの頭文字をとったもので、EIA法 ( Enzyme Immune Assay：酵素抗体法，酵素免疫測定法)とも言われるものである。
【００４９】
測定は、常法に従い、目的とする蛋白質（骨細胞の細胞膜上の受容体蛋白質や、FGF-23，MEPE，DMP-1等の骨細胞が産生・分泌する蛋白質）等に対する抗体や、当該目的蛋白質の遺伝子に対する、遺伝子プローブを用いて行うことができる。
【００５０】
骨細胞の細胞膜上の受容体蛋白質や、FGF-23，MEPE，DMP-1等の骨細胞が産生・分泌する蛋白質に特異的な抗体は、常法に従い、マウスやウサギ等にこれらの蛋白質を免疫する方法等により調製することができる。
【００５１】
抗体としては、ポリクローナル抗体，モノクローナル抗体が挙げられる。
【００５２】
また、抗体は、哺乳動物由来の抗体、キメラ抗体または擬人化抗体，ヒト化抗体のいずれであっても良い。ヒトのタンパク質に対する抗体であれば何でもよく、検出用抗体自体はヒト化である必要はない。
【００５３】
FGF-23抗体は、例えばJ Clin Endocrinol Metab 87:4957-4960, 2002に記載の方法等に従って作製することができる他、市販されているものもある（R and D社製 FGF-23モノクローナル抗体：MAB2604, MAB2629，及びサンタクルーズ社製FGF23抗体等）。市販品としては、R and D社製 FGF-23モノクローナル抗体が好ましい。
尚、血清中のFGF-23は、市販のELISAキット（FGF-23 ELISA Kit：カイノス社製）等によって測定することができる。
【００５４】
DMP1の抗体は、例えば、TaKaRa Code M176（抗DMP1ペプチド抗体，タカラバイオ社製）等として、入手することができる。
【００５５】
mRNAを測定する際には、ノザンブロット分析や後述する核酸増幅法が挙げられるが、同時に定量できることから核酸増幅法が好ましい。
【００５６】
ただし、mRNAは酵素分解を受けやすく不安定であることから、逆転写酵素を用いてmRNAをcDNAに変換した後にPCR分析を行うRT-PCR法を用いると、壊れやすいRNAに変わって安定したcDNAで測定できるので好ましい。
【００５７】
尚、mRNAの発現量は標識した遺伝子プローブを用いることによって定量することができる。
【００５８】
遺伝子プローブとは、日本語で検索子とも言い、相補的な塩基同士の結合により目的遺伝子と共に二本鎖構造を形成するポリヌクレオチドであって、目的遺伝子を探り出す為に用いる核酸断片である。
【００５９】
尚、本発明において遺伝子プローブに用いられるポリヌクレオチドは、アデニン（A），グアニン（G）等のプリン塩基や、チミン（T），ウラシル（U），シトシン（C）等のピリミジン塩基やそれらの修飾塩基を構成要素として含むものであり、一本鎖又は二本鎖のDNA，一本鎖又は二本鎖のRNA，一本鎖DNAと一本鎖RNAからなるハイブリッド体，RNAとDNAが結合して一本鎖となったキメラ体をも含むものである。通常、プライマーやプローブとしては、核酸分子の安定性の点等から、DNAが適しているが、等温遺伝子増幅法（ICAN法）にはキメラプライマー，リアルタイムPCR法のうち一種のサイクリングプローブ法には、キメラプローブが用いられる。
【００６０】
また、本発明において用いられる遺伝子プローブは、常法に従い、DNA合成装置等を用いて人工的に合成する，天然に存在するポリヌクレオチドを抽出する，天然からの抽出ポリヌクレオチドの塩基の一部を欠失，置換，付加する，目的とする配列と相補的な配列を用い、逆転写酵素やDNAポリメラーゼ，RNAポリメラーゼ等によって目的の配列のものを合成させることによって製造することができる。
【００６１】
遺伝子プローブは、目的とする遺伝子と相補的な配列を有し、同じ長さを有するものが好ましいが、必ずしも完全に相補的である必要はなく、プローブの機能を奏する限り、その一部の配列が欠失・置換・付加・削除されたものであっても良い。
【００６２】
抗体や遺伝子プローブ等には、必要に応じて蛍光物質等の標識を結合させることが好ましい。
【００６３】
標識としては、蛋白質や遺伝子の検出に一般に用いられているものであれば良いが、抗体に結合させる蛍光蛋白質としては、例えばGFP（Green Fluorescence Protein：オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク），YFP（Yellow Fluorescence Protein：黄色）、CFP（Cyan Fluorescence Protein：シアン）の他、珊瑚由来の赤色蛍光タンパク等が挙げられ、遺伝子プローブに結合させる標識としては、FAM（６−カルボキシフルオレセイン）のようなフルオレセイン系蛍光色素等の、蛍光色素，ビオチンやジゴキシゲニン（DIG），HRP（西洋わさびパーオキシダーゼ）、あるいはAP（アルカリフォスファターゼ）等が挙げられる。これらの標識を抗体や遺伝子プローブに結合させるには常法を用いることができる。
【００６４】
尚、測定対象が遺伝子の場合には、予め検体中の遺伝子を、核酸増幅法等により増幅させて測定する方法がある。
【００６５】
遺伝子検出に先だって行われる核酸増幅法としては、例えば、PCR法（ポリ核酸増幅法メラーゼ連鎖反応法，Polymerase Chain Reaction，EP200362等参照）やNASBA法（EP329822等参照），TAS法（WO88/10315等参照）のほか、等温遺伝子増幅法（ICAN法：Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids，タカラバイオ社）等が挙げられる。
【００６６】
これらのうち、主にPCR法が用いられているが、PCR法にも、色々な種類が開発されている。（１）遺伝子の量的な変化を追跡可能なリアルタイム−PCR法，（２）遺伝子を、一旦PCRで増幅した後に、更に別のプライマー対によってPCRを行う、nested-PCR法，（３）nested-PCR法とリアルタイムPCR法を組み合わせたnested-リアルタイムPCR法（二度目のPCRをリアルタイムPCR法で行う方法），及び、これらに、PCR法の実施前にRNAを逆転写する逆転写工程（Reverse Transcription : RT）を組み合わせた方法等が開発されている。
nested-PCR法は、２段階のPCRに基づく増幅により、より特異的に標的遺伝子内の特異配列DNAのみを増幅する事が可能である点で好ましい。
【００６７】
本発明の骨質評価方法においては、骨細胞量や骨細胞産生物質量が正常時よりも少ないと、微少亀裂が起こる（又は起こっている）可能性が高く、骨強度等に劣り、骨粗鬆症である（又はなっている）、骨折のリスクが高いとの判定することができる。
【００６８】
尚、健常人の骨の骨細胞量や血清中の骨細胞産生物質の量は、被験者の性別，年齢等によって異なり一概には限定できないが、例えば、FGF-23の場合、大凡8.2〜54.3 ng/Lの範囲であると考えられる。また、ヒト腸骨の生検では、（閉経後の健常な婦人では）、骨細胞の密度が、mean +/- SDで、188 +/- 22 (/mm2)、骨細胞がいない空のlacunaの密度が18 +/- 7 (/mm2)、合計したlacunaの密度が206 +/- 22(/mm2)という報告がある（J Bone Miner Res 18:1657-63, 2003）。
【００６９】
尚、低リン血症に起因する、くる病や骨軟化症の患者の血清中FGF-23は、健常人よりも多いので、本発明の骨質評価とは、明らかに区別される。
【００７０】
本発明の骨質評価方法によって得られた結果は、骨のサイズや，骨内部の微細構造，代謝回転速度，石灰化の程度等と併せて、総合的な骨質の判断のために用いることができる。
【００７１】
〈本発明の骨質評価キット〉
本発明の骨質評価キットには、上述の抗体や遺伝子プローブが含まれるが、更に、予め核酸増幅を行うための材料として、耐熱性ポリメラーゼ活性を有する酵素や、緩衝液等、PCRキットの基本物質や、RT-PCR等に用いられる逆転写酵素を含ませることもできる。
【００７２】
〈本発明の骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニング方法〉
上記の骨質評価方法は、この他、骨質の劣化予防又は改善剤のスクリーニング方法にも用いることができる。
【００７３】
このスクリーニングは、骨細胞培養物や後述のモデル動物へ、骨質劣化予防又は改善剤の候補物質を投与する前後で、上記の本発明の骨質評価を２度実施することで行うことができる。
【００７４】
本発明で言うスクリーニングには、骨質劣化予防又は改善剤の複数候補の中から、目的の予防又は治療剤等を選択するための、いわゆる一次スクリーニングの他、被験物の予防又は治療効果を確認するための、二次スクリーニング（再評価又は確認試験）も、含まれる。
【００７５】
〈本発明で骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニングに用いる非ヒト動物（モデル動物）〉
【００７６】
本発明において骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニングに用いられる非ヒト動物としては、下記の(1)〜(4)のモデル動物が挙げられる。
(1)グルココルチコイドを投与した、ヒトのステロイド骨粗鬆症のような症状を呈するモデル動物（Endocrinology 145:1835-41, 2004, J Clin Invest 102:274-82, 1998）
(2)加齢したモデル動物（J Bone Miner Res 17:1044-50, 2002）
(3)卵巣摘除などによってエストロゲン欠乏にしたモデル動物（Endocrinology 124:7-16, 1989）
(4)尾部懸垂や微小重力下においた骨粗鬆症モデル動物（J Bone Miner Res 17:1015-25, 2002）
以下、これらを総称してモデル動物と記載することがある。
【００７７】
モデル動物に用いられる非ヒト動物としては、ヒト以外の動物を用いることができるが、哺乳類が好ましい。哺乳類としては、マウス，ラット，ハムスター，モルモット，ネズミ，ウサギ等の齧歯類や、犬，猿等が挙げられるが、実験動物として取り扱い方法が確立されており、継代期間も短い等の点で、齧歯類が好ましく、特に、マウスが好ましい。
【００７８】
これらのモデル動物は、骨細胞が正常時よりも減少している，あるいは骨細胞の発現を自在にコントロールすることができるため、骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニングに使用することが可能である。
【００７９】
スクリーニングの対象である候補物質について、骨質劣化の予防効果を確認する際には、骨細胞を欠失させる前のモデル動物にあらかじめ候補物質を投与し、その後に骨細胞を欠失するような上記(1)〜(4)の操作を行い、骨細胞欠失が改善されたか否かを判断する。
このスクリーニングによって、骨細胞欠失後の、異常な破骨細胞の増殖や、骨芽細胞の減少を予防する物質を選択することが可能となる。
【００８０】
スクリーニングの対象である候補物質について、骨質改善効果を確認する際には、上記のモデル動物に骨細胞を欠失するような上記(1)〜(4)の操作を行い、骨細胞の欠失を誘導した後の骨質と、その後、候補物質を投与した後の骨質を評価する。
【００８１】
尚、骨細胞を不活性化したモデル動物では、血清中のリンの量が正常であったことから、骨細胞量又は血清ＦＧＦ２３量等の骨細胞産生物質が、リン低下に起因する特殊な疾病とは無関係に、骨質の評価指標となることが分かった。
【００８２】
〈本発明の骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニング用キット〉
前述の骨質評価キットは、骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニング用キットとして用いることも可能である。すなわち、被験物の投与前後において、骨質評価キットを使用することで、骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニング用キットとなる。
【００８３】
〈骨への荷重を評価する方法〉
脱荷重状態におく前後の前記モデル動物の骨質を、前記の骨質評価方法と同様にして評価したところ、骨細胞量等に有意な差があることを見いだした。つまり、骨細胞又は骨細胞産生物質量の少なくともいずれかを指標とすることによって骨への荷重を評価することができる。
【００８４】
以下に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例により本発明は限定されるものではない。
【実施例】
【００８５】
実施例に変えて、以下に試験例を挙げて、骨細胞と骨質に関連性があることについて説明する。
【００８６】
試験例１［骨細胞欠失と骨質との関係］
【００８７】
（Tgマウスの作製）
特許文献１に記載した方法に従い、ジフテリア毒素（DT）の投与によって、誘導的に骨細胞を欠失させることのできるモデルマウス（Tgマウス）を作製した。
骨細胞で特異的に発現するDMP-1遺伝子のプロモーターの下流の適当な位置に、外部化合物の受容体をコードする遺伝子を結合させた遺伝子構造物又はそれを含むベクターを、宿主マウスに投与した。
【００８８】
具体的には、マウスDMP１遺伝子の9.6kbの５’末端領域，エクソン１，イントロン１，及びエクソン２の一部を、ポリＡシグナル遺伝子と共に、ヒトHB-EGF（ジフテリア受容体）のcDNAに融合した、トランスジェニックカセットを構築した。
親マウスは、C57BL/6マウスの受精卵に、上記カセットをマイクロインジェクションすることによって作成し、その子孫を、骨細胞の欠失を誘導可能なマウスとして下記実験に供した。
尚、導入遺伝子量は、サザンブロッティング分析及び尾から抽出したゲノムDNAのPCR分析によって確認した。
骨細胞欠失誘導は、マウス体重１kg当たり２−５０μgのDTを、PBSに溶解したものを、腹腔内注射することによって行った。
【００８９】
（骨芽細胞表面の状態，石灰化速度，骨形成速度）
野生型（WT）マウスとTgマウスの腹腔内へ、体重１kg当たり50μgのDTを投与した。
DT投与後８日の脛骨の海綿部分の骨の組織形態学的な分析は、骨芽細胞面に変化無く、顕著に抑制された石灰化速度（MAR：mineral apposition  rate）を示し（図１）、そのことは、骨芽細胞の分化・増加が変化せずに残っているにも係わらず、個々の骨芽細胞の石灰化機能が、骨細胞の除去から８日で、阻害されていることを示唆していた。尚、図中の＊＊は、Ｐ＜0.01（n＝5 each group）を表す。
海綿骨上の破骨細胞の数は、このとき変わっていなかった（データ示さず。）。
骨細胞除去後すぐの骨分析結果から、骨細胞は、石灰化と、とくに骨外膜からの骨吸収の異常な加速から守る点で重要な役割を担っていることが示唆された。
【００９０】
試験例２［骨の構造と骨強度の評価］
骨のリモデリングに及ぼす、長期間の骨細胞欠失の影響を調べるため、試験例１で作製したTgマウスに、DTを20μg／kgの濃度で一回投与後、20〜40日観察した。
【００９１】
（骨強度）
DT投与40日後のTgマウスの骨についての骨強度を測定した。
骨強度の評価方法としては、J Bone Miner Res 14:2159-66, 1999等に記載の４点曲げ試験方法等によって実施した。具体的には、骨を横にして、下から２点（端を）で支え、上から２点から（中央側から）力を加えて、骨折するまで、変位した長さと加えた外力を定量測定した。この結果、比較的長期間の骨細胞欠乏により、骨形成阻害と骨吸収を通じて、骨量が顕著に減少し、微細構造も悪化し、骨強度も弱められていることが分かった（図２）。尚、図中の＊は、Ｐ＜0.05（n＝3 each group）を表す。
【００９２】
試験例３［骨細胞欠失マウス血清中の骨細胞産生物質量］
（FGF-23量）
DT投与40日後の、野生型マウス及びTgマウスの、血清中のカルシウム量（Ca），リン酸（Pi），副甲状腺ホルモン(parathyroid hormone, PTH），及びFGF-23量を測定した結果を示す（図３）。血清中のカルシウム量，リン酸，副甲状腺ホルモンについては、骨細胞の有無による影響は無かったが、FGF-23については、Tgマウスの血清中の量が有意に減少した。尚、図中の＊は、Ｐ＜0.05（n＝5 each group）を表す。
【００９３】
試験例４［骨細胞欠失マウス血清中のFGF-23量］
上記試験例３の結果は、毒素を投与して40日がたっており、骨やミネラル代謝の変化を介した２次的な影響を見ている可能性もある。そこで、毒素の投与で骨細胞の死を誘導してから、48時間という短期で同じ実験を行った。その結果、図４に示すように、血清FGF-23濃度の低下が見られた。つまり、血清中のFGF-23量の低下は、骨・ミネラル代謝の変化を介した２次的な結果ではなく、骨細胞がなくなったことによる直接の結果と考えられる。尚、図中の＊＊は、Ｐ＜0.01（n＝3 each group）を表す。
【００９４】
試験例５［骨細胞欠失マウスの骨中の、骨細胞産生物質ｍRNA量］
【００９５】
（FGF-23のmRNA）
DT投与後８日目のTgマウスの骨から、常法に従いRNAを抽出し、RT-PCRによりFGF-23のmRNAを検出した。コントロールとしてGAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate. dehydrogenase）のmRNAを同時に検出した。これらの結果を、図５に示す。図５から分かる通り、DTを投与して骨細胞がなくなった骨においては、FGF-23 mRNAが著しく減少していた。従って、FGF-23が主に骨細胞で産生され、骨細胞の減少が、FGF-23の血清濃度の低下をもたらしたものと考えられる。
【００９６】
（MEPEのmRNA量）
DT投与後48時間後のTgマウスの骨から、常法に従いRNAを抽出し、RT-PCRによりMEPEのmRNAを検出した。コントロールであるGAPDHのmRNA発現量に対する、MEPEのmRNA量の比を図６に示す。図中、黒のボックスが、DT投与48時間後のmRNAを表す。白のボックスが、PBS投与48時間後のmRNAを表す。
【００９７】
（DMP1のmRNA量）
DT投与後48時間後のTgマウスの骨から、常法に従いRNAを抽出し、RT-PCRによりDMP1のmRNAを検出した。コントロールであるGAPDHのmRNA発現量に対する、MEPEのmRNA量の比を図７に示す。図中、黒のボックスが、DT投与48時間後のmRNAを表す。白のボックスは、PBS投与48時間後のmRNAを表す。尚、図中の＊＊は、Ｐ＜0.01（n＝3 each group）を表す。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明の骨質評価方法又は骨質評価キットを用いることによって、骨質の正確な評価が可能となる。特に、血清中の骨細胞産生物質量を指標とする評価方法の場合には、骨組織の摘出が不要な非破壊的な検査であることから、患者負担が少ないという利点を有している。
また、本発明のスクリーニング方法又はスクリーニング用キットを用いて、骨質劣化予防又は改善剤のスクリーニングを行うことができる。更には、本発明によって、骨への荷重を評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】DT投与後８日の脛骨の海綿骨部分の骨の組織形態学的な分析結果を表す図である。
【図２】DT投与40日後のTgマウスの骨についての骨強度を測定した結果を表す図である。
【図３】DT投与40日後の野生型マウス及びTgマウスの、血清中のカルシウム量（Ca），無機リン酸（Pi），副甲状腺ホルモン(parathyroid hormone, PTH)，及びFGF-23濃度を測定した結果を表す図である。
【図４】DT投与48時間後の、血清中のFGF-23量を測定した結果を表す図である。
【図５】DT投与後８日目のTgマウスの抽出骨から検出したFGF-23のmRNAを示す図である。
【図６】DT投与48時間後の、Tgマウスの抽出骨から検出したMEPEのmRNAを示す図である。
【図７】DT投与48時間後の、Tgマウスの抽出骨から検出したDMP1のmRNAを示す図である。
【符号の説明】
【０１００】
PBS：リン酸緩衝液
DT：ジフテリア毒素
WT：野生型マウス
Tg：ジフテリア毒素受容体を骨細胞のみに導入した、トランスジェニックマウス
Ob.S／BS（％）：（Osteoblast Surface／Bone Surface）骨表面積に対する骨芽細胞面の割合
MAR：石灰化速度（mineral apposition rate）
BFR：骨形成速度（Bone Formation Rate）
Max load: 骨折するまでに加えた外力
FGF-23：繊維芽細胞増殖因子(Fibroblast Growth Factor 23)
PTH：副甲状腺ホルモン(parathyroid hormone)
Pi：無機リン酸
Ca：カルシウム
GAPDH：glyceraldehyde-3-phosphate. Dehydrogenase
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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