(57)【要約】    【課題】  従来のexpression cloning法において繰り返しを必要とした煩雑な操作を簡便化するとともに、候補遺伝子の機能予測を可能にして、より効率的な膜機能蛋白質のスクリーニングを可能にすること。    【解決手段】  卵母細胞を用いた各種膜機能蛋白質のアッセイ系に、DNAチップ等の遺伝子固相化試料を用いた解析技術を導入することで効率的な候補遺伝子の絞込みを行う。また、特定mRNAの機能の阻害作用を有するsiRNAやanti-sense RNA技術、あるいはSOSUI、MEMSAT及びTopPred等の膜貫通域検索システムを利用することにより、候補遺伝子の機能予測を行う。    【選択図】  図１
2007060995.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、新規膜機能蛋白質のスクリーニング方法：
１）mRNAを含む複数の試料分画をそれぞれ卵母細胞に注入し、前記mRNAを強制発現させた卵母細胞の活性を測定して、活性分画と非活性分画に分類する、
２）遺伝子固相化試料を用いて、前記活性分画でのみ特異的に発現している遺伝子を候補遺伝子として選択する、
３）前記候補遺伝子のmRNA又はcRNAを別な卵母細胞に注入し、前記mRNA又はcRNAを強制発現させた卵母細胞の活性を測定することにより、新規膜蛋白遺伝子を同定する。
【請求項２】
前記工程３）において、さらに前記候補遺伝子のsiRNA又はアンチセンスRNAを注入することにより当該候補遺伝子の絞り込み又は機能予測を行うことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程２）において、既知の膜機能蛋白質の遺伝子配列データを参照することにより、前記候補遺伝子の絞り込み又は機能予測を行うことをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記卵母細胞の活性測定が、電気的信号、放射性同位元素の取り込みの計測、あるいは質量分析によって行われることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記膜機能蛋白質が、受容体、イオンチャンネル、又はトランスポーター蛋白質である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記受容体がＧ蛋白質共役受容体である、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規膜機能蛋白質のスクリーニング方法に関する。より詳しくは、卵母細胞発現系にDNAチップ等の遺伝子固相化試料を用いた解析、siRNA技術、ならびにSOSUI、MEMSAT及びTopPred等の膜貫通域検索システムを併用した新規膜機能蛋白質の効率的スクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒトをはじめとする各種生物のゲノム塩基配列情報が集積され、遺伝子のアミノ酸配列からコンピューター上で膜貫通領域を予測することが可能となった。膜機能蛋白質にはＧ蛋白質共役受容体（GPCR）等の受容体蛋白質、イオンチャネルあるいはトランスポーター等があり、なかでも創薬のターゲットとなり得る受容体蛋白質は3,000−10,000あるとも言われている。これまでにも卵母細胞を用いたexpression cloning法により、マウスの脳下垂体の甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（TRH）の受容体遺伝子がマウスの癌細胞から（非特許文献１）、ヒスタミンH1受容体遺伝子が牛の副腎髄質から（非特許文献２）、またオリゴペプチド トランスポーター（PepT1）遺伝子がウサギの小腸から（非特許文献３）、分離・同定されてきた。これらは、組織由来のmRNAを卵母細胞に注入し、活性分画からcDNAライブラリーを構築し、数万から数十万個のcDNAクローンのプールを同様の操作を繰り返すことにより、数段階を経て、最終的には１クローンに絞り込むという、極めて多大な時間とコストを要する1990年代初頭の技術によって達成された。
【０００３】
一方、ヒトゲノム解析が完了し、ヒト全遺伝子を網羅的に搭載したDNAチップが容易に入手可能となった。しかし、動物の組織や培養細胞からは、比較的容易にmRNAを得ることができるが、ヒトの組織からmRNAを得ることは人道的問題から容易ではない。
【非特許文献１】Straub R.E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87, p9514-9518, 1990
【非特許文献２】Yamashita M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88, p11515-11519, 1991
【非特許文献３】Fei Y-J. et al., Nature, 368, p563-566, 1994
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、従来のexpression cloning法において繰り返しを必要とした煩雑な操作を簡便化するとともに、候補遺伝子の機能予測を可能にして、より効率的な膜機能蛋白質のスクリーニングを可能にすることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するために、本発明では、卵母細胞を用いた各種膜機能蛋白質のアッセイ系に、ヒト全遺伝子を網羅的に搭載したDNAチップを用いた解析技術を導入することで候補遺伝子の絞込みを行う。また、特定mRNAの機能の阻害作用を有するsiRNAやanti-sense RNA技術、あるいはSOSUI、MEMSAT及びTopPred等の膜貫通域検索システムを利用することにより、候補遺伝子の絞り込みと機能予測を行う。
【０００６】
具体的には、上記目的は、以下の構成とすることによって達成される。
（１）組織又は組織特異的細胞より直接、総RNA又はmRNAを分離・抽出する。
（２）総RNAを遠心分離してサイズ別の分画を得るかあるいはmRNAからcDNAを合成し、ゲルろ過カラムによりサイズ分画する。
（３）特定の大きさのRNA分画を適当な数に均一に分画する。
（４）各分画を卵母細胞にそれぞれ注入し、その膜上に遺伝子産物を発現させる。
（５）遺伝子産物である膜機能蛋白質を発現した細胞に、当該膜機能蛋白質に作用する薬剤等を添加し、膜機能を測定する。
（６）活性を有する分画と活性を示さない分画に由来するcDNA分画から標識化cRNAを合成し、全遺伝子搭載DNAチップ等の遺伝子固相化試料上で競合ハイブリダイゼーションを行う。
（７）活性分画に特異的に発現している遺伝子をリストアップし、遺伝子を分類する。
（８）機能未知の遺伝子については、その塩基配列から既知ソフトあるいは新規ソフト（たとえば、SOSUI、MEMSAT及びTopPred等の膜貫通域検索システム）により、機能を予測する。
（９）また、遺伝子の塩基配列をもとに、siRNA候補配列又はアンチセンスRNAを設計、合成し、その阻害効果から候補遺伝子の機能を予測する。
（１０）膜機能蛋白質と予測される遺伝子について、上記した卵母細胞活性測定系を用いて、スクリーニングを行う。
（１１）候補遺伝子数が多数（100以上）ある場合は、（６）のmRNA分画とsiRNA候補配列又はアンチセンスRNAのプール分画を同時に、卵母細胞に注入することにより、活性を測定する。
（１２）繰り返し操作により、活性阻害を有するプール分画中のsiRNA候補配列又はアンチセンスRNAの数を絞込み、当該siRNA候補配列又はアンチセンスRNAに対応する膜機能蛋白質候補遺伝子を特定する。
（１３）特定された遺伝子について、PCR法によりcDNAクローンを取得する。
（１４）培養細胞系等を用いて、取得したcDNAクローンがそれに対応するsiRNA候補配列又はアンチセンスRNAにより、機能阻害を受けるか否かを確認する。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の工程を含む、新規膜機能蛋白質のスクリーニング方法を提供する：
１）mRNAを含む複数の試料分画をそれぞれ卵母細胞に注入し、前記mRNAを強制発現させた卵母細胞の活性を測定して、活性分画と非活性分画に分類する。
２）遺伝子固相化試料を用いて、前記活性分画でのみ特異的に発現している遺伝子を候補遺伝子として選択する。
３）前記候補遺伝子のmRNA又はcRNAを別な卵母細胞に注入し、前記mRNA又はcRNAを強制発現させた卵母細胞の活性を測定することにより、新規膜蛋白遺伝子を同定する。
【０００８】
前記工程２）の候補遺伝子の選択は、前記活性分画と非活性分画との競合ハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。
【０００９】
ある実施形態において、前記工程３）では、さらに前記候補遺伝子のsiRNA又はアンチセンスRNAを注入することにより当該候補遺伝子の絞り込み又は機能予測を行ってもよい。
【００１０】
また、別な実施形態において、前記工程２）では、既知の膜機能蛋白質の遺伝子配列データ（遺伝子情報に基づくアミノ酸配列データ）を参照することにより、前記候補遺伝子の絞り込み又は機能予測を行ってもよい。
【００１１】
なお、卵母細胞の活性測定は、予測される膜機能蛋白質に作用する薬剤等を添加した上で、電気的信号、放射性同位元素の取り込みを計測することにより、あるいは質量分析をすることによって行われる。
【００１２】
本発明において、スクリーニング対象となる膜機能蛋白質は、細胞膜表面に発現され、細胞機能に関与する蛋白質を意味し、具体的には、受容体、イオンチャンネル、又はトランスポーター蛋白質を挙げることができる。特に受容体としては、Ｇ蛋白質共役受容体（GPCR）を挙げることができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、これまで機能解析の困難であった膜貫通蛋白質について、未知遺伝子の機能解明が容易に行える。また、創薬ターゲットとして期待されるオーファン受容体遺伝子について、そのリガンドの解明と、リードコンパウンドのスクリーニングが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、図１を参照しながら本発明の実施の形態について説明する。
１．サンプルRNAの調製
標的となる特定組織よりmRNAを抽出し、mRNAから5’末端にSp6プロモーター、3’末端T7プロモーター配列を持つcDNAを合成する。次いで、カラムによりサイズ分画した後、各サイズ分画についてSp6 RNAポリメラーゼを用いてcRNAを合成する。
【００１５】
２．卵母細胞アッセイ系
合成したcRNAを卵母細胞にインジェクトし、cRNAを強制発現させる。遺伝子を導入した各細胞における発現遺伝子の膜の機能を調べるために、当該膜機能蛋白質に作用する薬剤等を添加し、電気的信号、放射性同位元素の取り込みの計測、あるいは質量分析を行うことにより、活性分画を選別する。
【００１６】
具体的には、受容体であればリガンドとなる薬剤（物質）を添加して、リガンド−受容体結合による電気的信号、すなわちイオン電流の流れ（Clチャネル応答）を測定する。特に、Ｇ蛋白質共役受容体（GPCR）の場合は、候補遺伝子とともにGx（Gq, Gi, Gs）を共発現させ、同様にリガンドを添加してイオン電流の流れを測定する。
【００１７】
電位依存性に開口するイオンチャンネルの場合はイオン電流の測定により、またリガンド結合によって開口するイオンチャンネルの場合は、上記同様リガンドを添加してイオン電流を測定すればよい。
【００１８】
トランスポーターの場合は、放射性ラベルした基質の取り込みを、当該放射性同位元素の取り込みを指標として計測するか、輸送により起電性があるトランスポーターであれば、薬剤（基質）を添加して、上記同様イオン電流を測定すればよい。
【００１９】
また、放射性同位体がない薬剤の場合は、質量分析によりトランスポーターにより取り込まれた薬剤の分子量を指標として活性を評価してもよい。
【００２０】
なお、イオン電流の測定は、２極膜電位固定法やパッチクランプ法等、常法に基づいて行うことができる。
【００２１】
３．遺伝子固相化試料による解析
選別された分画に対応するcDNA分画からDNAチップ等の遺伝子固相化試料（できれば、ヒト全遺伝子を網羅的に搭載したDNAチップ（Agilent Oligo Whole Human Genome）にハイブリダイズする蛍光体をラベルしたRNAを合成する。具体的には、活性分画と非活性分画に由来するcDNAからｃRNAを合成し、それぞれ異なる蛍光体（Cy3とCy5等）で標識した後、前記した競合ハイブリダイゼーションを行い、チップ解析結果より、活性分画で特異的に発現している遺伝子より膜機能蛋白質に対応するものをリストアップし、候補遺伝子とする。
【００２２】
４．siRNAあるいはanti-sense RNAによる機能予測
候補遺伝子の中から各遺伝子に対応する遺伝子の塩基配列をもとに15-20塩基の相補的なsiRNAあるいはanti-sense RNA配列を設計合成し、卵母細胞にcRNAと同時に（あるいは時間差で）インジェクトした後、当該膜機能蛋白質に作用する薬剤等（たとえばリガンド）を添加し、活性阻害が認められることを確認する。この操作の繰り返しにより候補遺伝子を絞り込み、未知膜機能遺伝子の機能を予測することができる。
【００２３】
５．塩基配列からアミノ酸情報を基に膜貫通領域検索システムによる機能予測
塩基配列から既知ソフトあるいは新規ソフト（たとえば、SOSUI、MEMSAT、TopPred、TMHMM、PHDhtm等の膜貫通域検索システム）により、膜蛋白質か否かを判定するとともに、膜蛋白質の場合は、膜貫通部分やその機能を予測する。これらのソフトウエアは、アミノ酸の疎水性あるいは親水性の組成と頻度検索に基づき、リストされた未知膜機能遺伝子の機能予測を行い、早い段階での候補遺伝子の絞り込みを、迅速かつ簡便に行うことを可能にする。
【００２４】
６．従来法との比較
以下に、従来法と本発明の方法による膜機能蛋白質スクリーニングの比較を示す。
【００２５】
【表１】
2007060995.tif 000003
【００２６】
表１に示されるように、本発明の方法を用いることにより、DNAチップによるｍRNAあるいはｃDNAの解析から既知遺伝子を対象から除去して効率的スクリーニングが可能となるため、卵母細胞による繰り返しのスクリーニング操作が低減するため、必要な組織量あるいはｍRNA量は従来法の100分の1から30分の１程度、時間は３分の１以下に短縮される。さらに、膜貫通域検索システムを利用することにより、未知遺伝子の予測を行うと同時にその遺伝子に対するsiRNAやアンチセンスRNAを用いて、未知遺伝子の機能予測をすることも可能となるため、従来法では解明不可能であったオーファン受容体等の解明にも有力な手段となり得る。
【実施例】
【００２７】
実施例１：組織特異的mRNAのサイズ分画
１．ヒト心臓由来のmRNA  #M1234122（BIOCHAIN社）5 μgからcDNA合成キット#200401（Stratagene社）を用いてcDNAを合成した。
（1）上記mRNAを基に、まず一本鎖cDNAを合成した。
以下にfirst-strand反応液の組成を記す。
mRNA                                  8.6 μL  （5 μg）
10 x first-strand buffer              5 μL
hybrid oligo(dT)primer*               2 μL
ヌクレオチド混合液                    3 μL
DEPEC-treated water                   28.9μL
Rnase Block Ribonuclease Inhibitor    1 μL
StrataScriptRT                       1.5μL  
Total                                50 μL
Primerとしては、下記配列を別途合成したものを使用した。
5’-CGCTCGAGATAATACGACTCACTATAGGGAGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTV-3’（配列番号１）
上記反応液は42℃で1時間加温後、氷上に移した。
【００２８】
（2）次にsecond-strand反応液を加え、16℃で2.5時間インキュベートし、1本鎖cDNAを2本鎖cDNAとした。
以下にsecond-strand反応液の組成を記す。
first-strand反応液                      50 μL
10 x first-strand buffer                20 μL
ヌクレオチド混合液                       6 μL
DEPEC-treated water                    111 μL
RNase H                                  2 μL
DNA polymerase                          11 μL  
Total                                  200 μL
【００２９】
（3）second-strand反応後の液にヌクレオチド混合液 23 μL及びPfu DNAポリメラーゼ 2 μL加え、72℃で30分加温し、末端を平滑化した。反応終了後等容量の200 μLフェノール・クロロフォルム混液を加え、攪拌後、マイクロフュージで2分遠心し、上清に同量のクロロフォルムを加え、同様の操作を繰り返した。上清20 μLの3 M 酢酸ナトリウム及び2倍容量の400 μLの特級エタノールを加え、ドライアイスエタノールバス上で凍結させた。解凍後マイクロフュージで30-60分遠心し、沈殿を得た。得られた沈殿は70%エタノールで洗浄した。
【００３０】
２．リンカーの付加
（1）沈殿を9 μLのSp6プロモーター配列（5’-GGCATTTAGGTGACACTATAGAAGAGGCACGAGG -3’（配列番号２））を含むリンカーDNA液に溶かし、4℃で30分放置後、10 x ライゲース液、10mM rATP, T4 ライゲースを各１μL加え、8℃で一夜インキュベートした。
（2）70℃で、30分加温失活後、XhoIを加え、37℃、1.5時間反応後、10 x STEと125 μLエタノールを加え、沈殿させた。
【００３１】
３．ゲルろ過カラムによるサイズ分画
（1）沈殿を14 μLの1 x STE液に溶かし、3.5 μLの色素液を添加した。
（2）カラムにSepharose CL-2Bを充填し、1 x STEで洗浄、平衡化後、cDNAサンプルをアプライした。
（3）1 x STEを添加し、滴下する液を各分画当たり3滴、約100 μL収集し、12分画とした。
（4）各分画の一部を分取し、バイオアナライザーにより、サイズ及び量を確認した。
（5）残りの分画液は１.（3）と同様に等量のフェノール・クロロフォルム混液及びクロロフォルム液にて抽出後、エタノール沈殿を得た。
【００３２】
実施例２：卵母細胞への遺伝子導入
１．cRNA合成
（1）上記cDNA分画を1 kb以下、1-2 kb、2 kb以上の３分画にプール後、0.5 μg /μLに調製し、MMESSAGEキット（Amibion社）を用いてcRNAを合成した。反応液は以下の組成とし、37℃で2時間加温後、DNase Iを添加し、さらに15分加温した。
反応液組成                              
2 x NTP/CAP                      10 μL
10 x 反応液                       2 μL
酵素液                            2 μL
DNA液                            2 μL 
DEPEC水                         14 μL  
Total                            20 μL
【００３３】
（2）合成RNAの精製はRNA精製キットMEGAclear（Amibion社）を使用し、フィルターカートリッジ精製し、UV（OD260/280吸光度測定）により濃度を測定した。
【００３４】
２．卵母細胞の選別と遺伝子導入
（1）カエルの卵塊より、分離した卵母細胞をコラーゲナーゼ処理、洗浄操作を繰り返した後、実体顕微鏡（型式SZ40、オリンパス社）下で観察しながら、黒白の鮮明な細胞を選別し、16℃で一晩培養した。
（2）遺伝子導入装置の針に上記cRNAを充填後、卵母細胞当たり、50ngを自動操作により導入し、16 ℃で、2日培養した。
【００３５】
３．リガンド作動性の計測
（1）遺伝子を導入した卵母細胞は計測用トレイに移し、試薬液を所定の配置に注入した。試薬液はノルエピネフィリン（SigmaA7257）及びエンドセリン（SigmaE7764）を1 μMに調製したものを使用した。計測装置の各種パラメーターを設定後、電気生理活性を測定した。
（2）試薬液添加により活性の認められた作動RNA画分ならびに活性の認められない未作動RNA画分を選別した。
【００３６】
実施例３：DNAチップによるRNAの発現解析
１．チップ解析用cRNA合成
（1）上記作動画分及び未作動画分に対応する各々のcDNA分画のDNA １μgを分注し、MEGAscript invitro transcriptionキット（Amibion社）を用いて、cRNA合成を行った。
（2）合成したcRNAはRNeasy Mini(250)キット（QUAGEN社）を用いて精製し、希釈液の吸光度を測定した。
（3）上記RNA 3-5 μgを分注し、0.1 M sodium carbonateに溶解後、未作動画分由来のRNAにはCy3 NHSを作動画分由来RNAにはCy5 NHSを加え、遮光下で、1時間、攪拌後、RNase free waterを加え、さらに30分攪拌した。
（4）反応終了後、100 mM酢酸ナトリウムを添加し、RNeasy Mini(250)キット（QUAGEN社）を用いて精製し、吸光度を測定した。
【００３７】
２．ハイブリダイゼーション
（1）RNAサンプル210 μL に対して10 x control target、25 x fragmentation 液、2 x Hybridization 液を加え、反応液を調製後、チャンバーにセットしたチップ上、注入し、60℃のオーブン中で、回転しながら、17時間加温した。
（2）反応終了後、チップチャンバーごと容器に移し、チップ取り出し、専用洗浄液中で洗浄した。
（3）洗浄後、デシケーター中で乾燥後、データ解析用ケースに収納する。
【００３８】
３．チップデータ解析
（1）マイクロアレイスキャナー（Agilent社）を用いて、チップ上の蛍光強度を読み込み、Macroにより、発現遺伝子を確認した。
（2）さらに、上記発現遺伝子からup-regulationの見られる膜貫通遺伝子を選別した。
【００３９】
４．結果
（1）ノルエピネフリン添加時に作動した分画およぶ未作動分画のｃDNAから合成したｃRNAによる競合ハイブリダイゼーションの結果、up-regulationの見られたチップ上のプローブIDを検索したところ、A_23_p8938とA_23_p21929が得られ、アドレナリン受容体のα１Aとβ１Bのサブタイプに対応することが示された（表２参照）。
（2）エンドセリン添加時に作動した分画およぶ未作動分画のｃDNAから合成したcRNAによる競合ハイブリダイゼーションの結果、up-regulationの見られたチップ上のプローブIDを検索したところ、A_24_p217572とA_23_p2831が得られ、エンドセリン受容体のETAとETBのサブタイプに対応することが示された（表２参照）。
【００４０】
【表２】
2007060995.tif 000004
【００４１】
実施例４：低分子RNAによる活性阻害
１．低分子RNAの設計及び合成
ヒスタミン受容体遺伝子の蛋白質合成開始サイトを含む15塩基（5’-CCAATGAGCCTCCC-3’（配列番号３））のanti-sense phosphorothioate oligo (S-ODN)を合成し、HPLCにより精製したものを使用した。
【００４２】
２．卵母細胞における活性測定
上記実施例２の１と同様にしてヒスタミン受容体遺伝子のcRNAを合成した後、cRNAと上記anti-sense oligoを混合して卵母細胞に同時に導入後、同実施例２の２と同様にして、ヒスタミン添加時の電気生理活性を測定した。
【００４３】
３．結果
cRNAを導入した卵母細胞ではヒンスタミン添加時に電気生理活性は認められたが、cRNAとanti-sense oligoを混合して卵母細胞に同時導入した場合には、電気生理活性は認められず、anti-sense oligoによる阻害活性のあることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明によれば、GPCR等の受容体、イオンチャンネル、トランスポーター蛋白質など、これまで機能解析の困難であった膜機能蛋白質遺伝子のスクリーニングや、機能解明を短時間で容易に実施することができる。これらの遺伝子の中には、創薬ターゲットとして期待されるオーファン受容体遺伝子が含まれ、そのリガンドの解明と、リードコンパウンドのスクリーニングが可能となる。したがって、本発明は、基礎研究から製薬まで、幅広い応用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、本発明の方法のフローチャートを示す。
【配列表フリーテキスト】
【００４６】
配列番号１−人工配列の説明：プライマー（dVT(24) が本プライマーの3’末端に連結されている）
配列番号２−人工配列の説明：Sp6プロモーター配列
配列番号３−人工配列の説明：アンチセンスフォスフォチオエートオリゴ(S-ODN)
【図１】
2007060995.tif 000005
【配列表】
2007060995000001.app