(57)【要約】      （修正有）【課題】半翅目昆虫、特に半翅目害虫の１種であるツマグロヨコバイの脱皮を調節する化合物（エクダイソン活性調節物質）を検出する系を提供する。【解決手段】以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる蛋白質。（ａ）特定の配列で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質；（ｂ）特定の配列で表わされるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエクダイソンリセプターとしての機能を有する蛋白質。該タンパク質、もしくはツマグロヨコバイ由来細胞系を使用して脱皮調節物質を検出する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる蛋白質。
（ａ）配列表の配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列表の配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエクダイソンリセプターとしての機能を有する蛋白質。
【請求項２】
請求項１記載の蛋白質の部分ポリペプチドであって、エクダイソン類との結合に必要な領域に対応する部分アミノ酸配列を含有する部分ポリペプチド。
【請求項３】
請求項２において、エクダイソン類との結合に必要な領域に対応する部分アミノ酸配列が以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる部分ポリペプチド。
（ａ）配列表の配列番号１で表わされるアミノ酸配列の２０３番目から５０６番目の部分配列；
（ｂ）配列表の配列番号１で表わされるアミノ酸配列の２０３番目から５０６番目の部分配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエクダイソン類と結合するアミノ酸配列。
【請求項４】
請求項２または請求項３に記載の部分ポリペプチドと直接または間接に以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなるＧＡＬ４活性化領域とが結合している融合ポリペプチド。
（ａ）配列表の配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号２で表わされるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項５】
請求項２または請求項３に記載の部分ポリペプチドと直接または間接に以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなるＧＡＬ４ＤＮＡ結合領域が結合している融合ポリペプチド。
（ａ）配列表の配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号３で表わされるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項６】
請求項１記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
以下の（ａ）ないし（ｃ）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号４で表わされる塩基配列からなる新規エクダイソンリセプターをコードするＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号４で表わされる塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された新規エクダイソンリセプターをコードする塩基配列；
（ｃ）配列番号４で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする新規エクダイソンリセプターをコードするＤＮＡ。
【請求項８】
請求項２記載の部分ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項９】
以下の（ａ）ないし（ｃ）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号４で表わされる塩基配列の７９２番目から１７０６番目の部分配列からなるエクダイソン類との結合能を有する部分ポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号４で表わされる塩基配列の７９２番目から１７０６番目の部分配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたエクダイソン類との結合能を有する部分ポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号４で表わされる塩基配列の７９２番目から１７０６番目の部分配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするエクダイソン類との結合能を有する部分ポリペプチドをコードするＮＡ。
【請求項１０】
請求項２または請求項３に記載の蛋白質の部分ポリペプチドと直接または間接に以下の（ａ）ないし（ｃ）のいずれかの塩基配列からなる、ＧＡＬ４活性化領域が結合している融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号５で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号５で表わされる塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列；
（ｃ）配列表の配列番号５で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項２または請求項３に記載の蛋白質の部分ポリペプチドと直接または間接に以下の（ａ）ないし（ｃ）のいずれかの塩基配列からなる、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合領域が結合している融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号６で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号６で表わされる塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列；
（ｃ）配列表の配列番号６で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項１２】
以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる蛋白質。
（ａ）配列表の配列番号７で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列表の配列番号７で表わされるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつウルトラスピラクルとしての機能を有する蛋白質。
【請求項１３】
請求項１２記載の蛋白質の部分ペプチドであって、エクダイソンレセプターとの複合体形成に必要な領域に対応する部分アミノ酸配列を含有する部分ペプチド。
【請求項１４】
請求項１３において、エクダイソンレセプターとの複合体形成に必要な領域に対応する部分アミノ酸配列が以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる部分ポリペプチド。
（ａ）配列表の配列番号７で表わされるアミノ酸配列の１４３番目から３９３番目の部分配列；
（ｂ）配列表の配列番号７で表わされるアミノ酸配列の１４３番目から３９３番目の部分配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエクダイソンレセプターと複合体を形成するアミノ酸配列。
【請求項１５】
請求項１３または請求項１４に記載の部分ポリペプチドと直接または間接に以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなるＧＡＬ４活性化領域が結合している融合ポリペプチド。
（ａ）配列表の配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号２で表わされるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１３または請求項１４に記載の部分ポリペプチドと直接または間接に以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなるＧＡＬ４ＤＮＡ結合領域が結合している融合ポリペプチド。
（ａ）配列表の配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号３で表わされるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１２記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項１８】
以下の（ａ）ないし（ｃ）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号８で表わされる塩基配列からなる新規ウルトラスピラクルをコードするＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号８で表わされる塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された新規ウルトラスピラクルをコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号８で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする新規ウルトラスピラクルをコードするＤＮＡ。
【請求項１９】
請求項１３記載の部分ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項２０】
以下の（ａ）ないし（ｃ）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号８で表わされる塩基配列の７９４番目から１５４９番目の部分配列からなるエクダイソンレセプターとの複合体形成能を有する部分ポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号８で表わされる塩基配列の７９４番目から１５４９番目の部分配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたエクダイソンレセプターとの複合体形成能を有する部分ポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号８で表わされる塩基配列の７９４番目から１５４９番目の部分配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするエクダイソンレセプターとの複合体形成能を有する部分ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項２１】
請求項１３または請求項１４に記載の蛋白質の部分ポリペプチドと直接または間接に以下の（ａ）ないし（ｃ）のいずれかの塩基配列からなる、ＧＡＬ４活性化領域が結合している融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号５からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号５で表わされる塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号５で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項２２】
請求項１３または請求項１４に記載の蛋白質の部分ポリペプチドと直接または間接に以下の（ａ）ないし（ｃ）のいずれかの塩基配列からなる、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合領域が結合している融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号６からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号６で表わされる塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号６で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項２３】
請求項６ないし請求項１１のいずれか一項に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項２４】
請求項１７ないし請求項２２のいずれか一項に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項２５】
請求項２３記載の組換えベクターと請求項２４記載の組み換えベクターを同時にもしくはどちらか一方を用いて形質転換させた形質転換体。
【請求項２６】
請求項２５記載の形質転換体を用いた半翅目昆虫の脱皮を制御する化合物のスクリーニング方法。
【請求項２７】
請求項１ないしは請求項５のいずれか一項に記載の蛋白質または部分ポリペプチドまたは融合ポリペプチドを用いた半翅目昆虫の脱皮を制御する化合物のスクリーニング方法。
【請求項２８】
請求項１記載の蛋白質または請求項２または請求項３に記載の部分ポリペプチドおよび、請求項１２記載の蛋白質または請求項１３または請求項１４記載の部分ポリペプチドを用いた半翅目昆虫の脱皮を制御する化合物のスクリーニング方法。
【請求項２９】
請求項２６ないし請求項２８のいずれか一項に記載のスクリーニング方法で得られる半翅目昆虫の脱皮を制御する化合物もしくはその塩。
【請求項３０】
請求項２９記載の半翅目昆虫の脱皮を制御する化合物を主な成分とする殺虫剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な半翅目昆虫由来のエクダイソンリセプターおよびウルトラスピラクル、それらをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡを含有する組み換えベクター、それらを発現する形質転換体ならびにそれらを用いた殺虫剤のスクリーニング系に関する。
【背景技術】
【０００２】
昆虫におけるエクダイソン類は脱皮ホルモンとして知られている（非特許文献１）。２０−ヒドロキシエクダイソンが代表的なものであり、ほぼ全ての昆虫において脱皮ホルモンとして作用する。エクダイソン類の脱皮ホルモン活性の本質は、昆虫細胞内に存在するリガンド依存性転写因子であるエクダイソンリセプターおよびウルトラスピラクルを介した標的遺伝子群の活性化であることが解明されている（非特許文献２）。
【０００３】
また、非特許文献３には、鱗翅目、双翅目、甲虫目、ダニ目の節足動物由来のエクダイソンリセプター遺伝子の構造比較がされており、昆虫各目間でその受容体の構造が異なることが明らかになっている。エクダイソンレセプターおよびウルトラスピラクルはいずれも、核内受容体スーパーファミリーに属する。エクダイソンリセプターはＡ／Ｂ領域、Ｃ領域、Ｄ領域、Ｅ領域、Ｆ領域からなる。ＤＮＡとの結合に関与する領域（ＤＮＡ結合領域）はＣ領域で、エクダイソン類等のリガンドとの結合に関与する領域（リガンド結合領域）はＥ領域である（非特許文献３）。また、ウルトラスピラクルはＡ／Ｂ領域、Ｃ領域、Ｄ領域、ＥＦ領域からなる。ＤＮＡ結合領域はＣ領域で、リガンド結合領域はＥＦ領域である。エクダイソンレセプターとウルトラスピラクルはヘテロダイマーを形成しＤＮＡ上にあるエクダイソン応答配列に結合し、そしてエクダイソン類等の化学物質に応答して標的遺伝子の転写の活性化に関与する（非特許文献４）。
【０００４】
２０−ヒドロキシエクダイソンは、ほぼ全ての昆虫において脱皮ホルモンとして作用する一方で、非ステロイド系エクダイソンアゴニストの中には受容体構造の違いを反映して、高い選択性を示すものが存在する。例えば、クロマフェノジド（Ｎ’−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ−Ｎ’−（３，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｙｌ）−５−ｍｅｔｈｙｌ−６−ｃｈｒｏｍａｎｅｃａｒｂｏｈｙｄｒａｚｉｄｅ）などジベンゾイルヒドラジン誘導体は、鱗翅目昆虫に対して高い脱皮ホルモン活性を示すものの、他の目の昆虫に対してはその活性を示さない（非特許文献５）。
【０００５】
非特許文献６には、ジベンゾイルヒドラジン誘導体が昆虫目間で高い選択性を示すひとつの理由として、エクダイソンリセプターのアミノ酸配列の違いが挙げられている。これらのことから目的とする種類の昆虫に対して特異的に作用するエクダイソン活性調節物質を検出するためには、その昆虫由来のエクダイソンリセプターを使用する必要がある。
【０００６】
他の昆虫種からも多くのエクダイソンリセプターのアミノ酸配列が明らかにされている。例えば直翅目昆虫Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ由来のＥｃＲ（ｇｉ：４４０５７９９、非特許文献７）などが挙げられる。
【０００７】
他の昆虫種からも多くのウルトラスピラクルのアミノ酸配列が明らかにされている例えば直翅目昆虫Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ由来のウルトラスピラクル（ｇｉ：３３９４３１７８）などが挙げられる。
【０００８】
エクダイソン活性調節物質をインビトロの系でスクリーニングする方法に関しては、エクダイソン応答配列、プロモーター、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだレポータープラスミドＤＮＡを昆虫細胞に導入し、エクダイソン活性物質により発現されるルシフェラーゼを検出することにより、高感度かつ簡便に活性を有する物質を検出する方法が、特許文献１に記載されている。しかしながら、目的とする種類の昆虫に対して特異的に作用するエクダイソン活性調節物質を検出するためには、その昆虫由来の細胞系を使用する必要がある。
【０００９】
【非特許文献１】Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇ．Ｈｏｒｍ．Ｒｅｓ．，２２，４７３−５０２（１９６６）
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ，３６６，４７６−４７９（１９９３）
【非特許文献３】Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２９，９１５−９３０（１９９９）
【非特許文献４】Ｄｅｖ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｅｖｏｌ．，２０９，５６４−５７１（１９９９）
【非特許文献５】Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  Ｓａｎｋｙｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  ５３，１−４９（２００１）
【非特許文献６】Ｎａｔｕｒｅ，４２６，９１−９６（２００３）
【非特許文献７】Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１４３，９１−９９（１９９８）
【特許文献１】特開２００２−２９１４８９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記のように、目的とする種類の昆虫に対して特異的に作用するエクダイソン活性調節物質を検出するためには、その昆虫由来のエクダイソンリセプターを使用するか、もしくはその昆虫由来の細胞系を使用する必要がある。
【００１１】
本発明の目的は、半翅目昆虫、特に半翅目害虫の１種であるツマグロヨコバイの脱皮を調節する化合物（エクダイソン活性調節物質）を検出する系を提供することである。現在、ツマグロヨコバイ由来のエクダイソンリセプターおよびウルトラスピラクルは公知ではなく、またツマグロヨコバイ由来の細胞系には使用可能なものはない。そこでツマグロヨコバイ由来のエクダイソンリセプター遺伝子およびそのヘテロダイマーであるウルトラスピラクル遺伝子を明らかにし、それらを利用し、スクリーニング系を構築することを本発明の課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者等は前記課題を解決すべく鋭意研究の結果、ツマグロヨコバイより新規エクダイソンリセプター遺伝子および新規ウルトラスピラクル遺伝子のクローニングに成功し、さらにそれらを利用しての脱皮を調節する化合物のスクリーニング系を構築することに成功した。そしてこのスクリーニング系を実施することにより、ツマグロヨコバイにおけるエクダイソン活性調節物質を検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
即ち、本発明は以下の（１）〜（３０）に関するものである。
（１）以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ａ）配列表の配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列表の配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエクダイソンリセプターとしての機能を有する蛋白質。
（２）前記（１）記載の蛋白質の部分ポリペプチドであって、エクダイソン類との結合に必要な領域に対応する部分アミノ酸配列を含有する部分ポリペプチド、
（３）前記（２）において、エクダイソン類との結合に必要な領域に対応する部分アミノ酸配列が以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる部分ポリペプチド、
（ａ）配列表の配列番号１で表わされるアミノ酸配列の２０３番目から５０６番目の部分配列；
（ｂ）配列表の配列番号１で表わされるアミノ酸配列の２０３番目から５０６番目の部分配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエクダイソン類と結合するアミノ酸配列。
（４）前記（２）または（３）に記載の部分ポリペプチドと直接または間接に以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなるＧＡＬ４活性化領域とが結合している融合ポリペプチド、
（ａ）配列表の配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号２で表わされるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（５）前記（２）または（３）に記載の部分ポリペプチドと直接または間接に以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなるＧＡＬ４ＤＮＡ結合領域が結合している融合ポリペプチド、
（ａ）配列表の配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号３で表わされるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（６）前記（１）記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、
（７）以下の（ａ）ないし（ｃ）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ、
（ａ）配列表の配列番号４で表わされる塩基配列からなる新規エクダイソンリセプターをコードするＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号４で表わされる塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された新規エクダイソンリセプターをコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号４で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする新規エクダイソンリセプターをコードするＤＮＡ。
（８）前記（２）記載の部分ポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（９）以下の（ａ）ないし（ｃ）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ、
（ａ）配列表の配列番号４で表わされる塩基配列の７９２番目から１７０６番目の部分配列からなるエクダイソン類との結合能を有する部分ポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号４で表わされる塩基配列の７９２番目から１７０６番目の部分配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたエクダイソン類との結合能を有する部分ポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号４で表わされる塩基配列の７９２番目から１７０６番目の部分配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするエクダイソン類との結合能を有する部分ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（１０）前記（２）または（３）に記載の蛋白質の部分ポリペプチドと直接または間接に以下の（ａ）ないし（ｃ）のいずれかの塩基配列からなる、ＧＡＬ４活性化領域が結合している融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ａ）配列表の配列番号５で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号５で表わされる塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号５で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
（１０）前記（２）または（３）に記載の蛋白質の部分ポリペプチドと直接または間接に以下の（ａ）ないし（ｃ）のいずれかの塩基配列からなる、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合領域が結合している融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ａ）配列表の配列番号６で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号６で表わされる塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号６で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
（１２）以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ａ）配列表の配列番号７で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列表の配列番号７で表わされるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつウルトラスピラクルとしての機能を有する蛋白質。
（１３）前記（１２）記載の蛋白質の部分ペプチドであって、エクダイソンレセプターとの複合体形成に必要な領域に対応する部分アミノ酸配列を含有する部分ペプチド、
（１４）前記（１３）において、エクダイソンレセプターとの複合体形成に必要な領域に対応する部分アミノ酸配列が以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる部分ポリペプチド、
（ａ）配列表の配列番号７で表わされるアミノ酸配列の１４３番目から３９３番目の部分配列；
（ｂ）配列表の配列番号７で表わされるアミノ酸配列の１４３番目から３９３番目の部分配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエクダイソンレセプターと複合体を形成するアミノ酸配列。
（１５）前記（１３）または（１４）に記載の部分ポリペプチドと直接または間接に以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなるＧＡＬ４活性化領域が結合している融合ポリペプチド、
（ａ）配列表の配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号２で表わされるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（１６）前記（１３）または（１４）に記載の部分ポリペプチドと直接または間接に以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなるＧＡＬ４ＤＮＡ結合領域が結合している融合ポリペプチド、
（ａ）配列表の配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号３で表わされるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（１７）（１２）記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、
（１８）以下の（ａ）ないし（ｃ）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ、
（ａ）配列表の配列番号８で表わされる塩基配列からなる新規ウルトラスピラクルをコードするＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号８で表わされる塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された新規ウルトラスピラクルをコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号８で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする新規ウルトラスピラクルをコードするＤＮＡ。
（１９）前記（１３）記載の部分ポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（２０）以下の（ａ）ないし（ｃ）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ、
（ａ）配列表の配列番号８で表わされる塩基配列の７９４番目から１５４９番目の部分配列からなるエクダイソンレセプターとの複合体形成能を有する部分ポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号８で表わされる塩基配列の７９４番目から１５４９番目の部分配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたエクダイソンレセプターとの複合体形成能を有する部分ポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号８で表わされる塩基配列の７９４番目から１５４９番目の部分配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするエクダイソンレセプターとの複合体形成能を有する部分ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（２１）前記（１３）または（１４）に記載の蛋白質の部分ポリペプチドと直接または間接に以下の（ａ）ないし（ｃ）のいずれかの塩基配列からなる、ＧＡＬ４活性化領域が結合している融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ａ）配列表の配列番号５からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号５で表わされる塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号５で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
（２２）前記（１３）または（１４）に記載の蛋白質の部分ポリペプチドと直接または間接に以下の（ａ）ないし（ｃ）のいずれかの塩基配列からなる、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合領域が結合している融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ａ）配列表の配列番号６からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号６で表わされる塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号６で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
（２３）前記（６）ないし（１１）のいずれか一項に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター、
（２４）前記（１７）ないし（２２）のいずれか一項に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター、
（２５）前記（２３）記載の組換えベクターと（２４）記載の組み換えベクターを同時にもしくはどちらか一方を用いて形質転換させた形質転換体、
（２６）前記（２５）記載の形質転換体を用いた半翅目昆虫の脱皮を制御する化合物のスクリーニング方法、
（２７）前記（１）ないしは（５）のいずれか一項に記載の蛋白質または部分ポリペプチドまたは融合ポリペプチドを用いた半翅目昆虫の脱皮を制御する化合物のスクリーニング方法、
（２８）前記（１）ないしは（３）に記載の蛋白質または部分ポリペプチドおよび、（１２）ないしは（１４）記載の蛋白質または部分ポリペプチドを用いた半翅目昆虫の脱皮を制御する化合物のスクリーニング方法、
（２９）前記（２６）ないし（２８）のいずれか一項に記載のスクリーニング方法で得られる半翅目昆虫の脱皮を制御する化合物またはその塩、
（３０）（２９）記載の半翅目昆虫の脱皮を制御する化合物を主な成分とする殺虫剤、
に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、ツマグロヨコバイ由来の新規エクダイソンリセプター遺伝子および新規ウルトラスピラクル遺伝子が提供される。さらにそれらを利用して構築したスクリーニング系は、ツマグロヨコバイに作用するエクダイソン活性調節物質を検出する際に有用である。ツマグロヨコバイに作用するエクダイソン活性調節物質（非ステロイド系化合物）はいまだに報告事例はなく、本スクリーニング系を用いて選抜された活性調節物質は新規殺虫剤として利用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下本発明をより具体的に説明する。
【００１６】
本発明のエクダイソンリセプター（ＥｃＲ）は配列表の配列番号１に示される新規な蛋白質である。この蛋白質は、半翅目昆虫の１種ツマグロヨコバイ（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ  ｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓ）に由来する。一番相同性が高いものが前記直翅目昆虫Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ由来のＥｃＲ（ｇｉ：４４０５７９９）で、Ｅ領域のアミノ酸配列の相同性は７８．２％である。
【００１７】
また、本発明のエクダイソンリセプターは配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列及び、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列から、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質を含む。ここで「１もしくは数個」とは、通常１〜３０個、好ましくは１〜１５個である。このアミノ酸の欠失、挿入、および置換は、蛋白質の活性または機能を失わせるものではない。エクダイソンリセプターとしての機能を有する蛋白質であるかの判断は、本発明のスクリーニング系により評価することが出来る。すなわち、リセプターがリガンドに結合する、ＤＮＡと相互作用する、ウルトラスピラクルと相互作用するまたは転写を活性化する能力によって評価され得る。
【００１８】
エクダイソン類との結合に必要な領域に対応する部分アミノ酸配列を含有する本発明の部分ポリペプチドとは、少なくとも本発明のエクダイソンリセプターのＥ領域（配列表の配列番号１の２８４番〜５０３番のアミノ酸配列）を含む配列番号１に示されるアミノ酸配列の部分ポリペプチドであるか、もしくはＥ領域を完全に含まなくてもエクダイソン類との結合が出来るポリペプチドであれば良い。エクダイソン類との結合が出来るかどうかの判断は、本発明に含まれるスクリーニング系により評価することが出来る。すなわち、リセプターがリガンドに結合する、ウルトラスピラクル共存下ＤＮＡと相互作用する、ウルトラスピラクルと相互作用する、または転写を活性化する能力によって評価され得る。なお、エクダイソン類とは、２０−ヒドロキシエクダイソン、ポナステロンＡ、ムリステロンＡ等のステロイド骨格を持ち昆虫脱皮ホルモン活性を有する化合物群のことを言う。
【００１９】
本発明の部分ポリペプチドのその他の具体例は、例えば、本発明のエクダイソンリセプターのＣＤＥＦ領域（配列表の配列番号１の１３７番〜５０６番）、ＤＥＦ領域（配列表の配列番号１の２０３番〜５０６番）、ＥＦ領域（配列表の配列番号１の２８４番〜５０６番）、ＤＥ領域（配列表の配列番号１の２０３番〜５０３番）、ＣＤＥ領域（配列表の配列番号１の１３７番〜５０３番）が挙げられる。この中ではＤＥＦ領域、ＥＦ領域を含む部分ポリペプチドが好ましい。
【００２０】
本発明の部分ポリペプチドとＧＡＬ４活性化領域の融合ポリペプチドにおいて、使用される部分ポリペプチドは、例えば本発明のエクダイソンリセプターのＥ領域（配列表の配列番号１の２８４番〜５０３番のアミノ酸配列）、ＣＤＥＦ領域（配列表の配列番号１の１３７番〜５０６番）、ＤＥＦ領域（配列表の配列番号１の２０３番〜５０６番）、ＥＦ領域（配列表の配列番号１の２８４番〜５０６番）、ＤＥ領域（配列表の配列番号１の２０３番〜５０３番）、ＣＤＥ領域（配列表の配列番号１の１３７番〜５０３番）が挙げられる。この中ではＤＥＦ領域、ＥＦ領域を含む部分ポリペプチドが好ましい。また、ＧＡＬ４活性化領域の具体例としては、配列表の配列番号２で表わされるアミノ酸配列が挙げられる。配列表の配列番号２で表わされるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドも用いることが出来るが、転写活性化の機能を失わせるものではない。本発明の部分ポリペプチドとＧＡＬ４活性化領域は、直接結合していても良いが、間に１〜５０個アミノ酸が結合していても良い。連結部分のアミノ酸の具体例としては、ＧＧＳＮＱＴＳＬＹＫＫＡＧＳＡＡＡＰＦＴが挙げられる。
【００２１】
本発明の部分ポリペプチドとＧＡＬ４ＤＮＡ結合領域の融合ポリペプチドにおいて、使用される本発明の部分ポリペプチドは、例えば本発明のエクダイソンリセプターのＥ領域（配列表の配列番号１の２８４番〜５０３番のアミノ酸配列）、ＣＤＥＦ領域（配列表の配列番号１の１３７番〜５０６番）、ＤＥＦ領域（配列表の配列番号１の２０３番〜５０６番）、ＥＦ領域（配列表の配列番号１の２８４番〜５０６番）、ＤＥ領域（配列表の配列番号１の２０３番〜５０３番）、ＣＤＥ領域（配列表の配列番号１の１３７番〜５０３番）が挙げられる。この中ではＤＥＦ領域、ＥＦ領域を含む部分ポリペプチドが好ましい。また、ＤＮＡ結合領域の具体例としては、配列表の配列番号３で表わされるアミノ酸配列が挙げられる。配列表の配列番号３で表わされるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＧＡＬ４−ＵＡＳ配列に結合する配列を用いることが出来る。本発明の部分ポリペプチドとＧＡＬ４ＤＮＡ結合領域は、直接結合していても良いが、間に１〜５０個アミノ酸が結合していても良い。連結部分のアミノ酸の具体例としては、ＳＮＱＴＳＬＹＫＫＡＧＳＡＡＡＰＦＴが挙げられる。
【００２２】
本発明のＤＮＡとは配列番号１で表わされるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエクダイソンリセプターとしての機能を有する蛋白質コードするＤＮＡである。このＤＮＡは、半翅目昆虫の１種ツマグロヨコバイ（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ  ｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓ）に由来する。一番相同性が高いものが前記直翅目昆虫Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ由来のＥｃＲ（ｇｉ：４４０５７９９）で、Ｅ領域の塩基配列の相同性は７０．８％である。その具体例としては、例えば配列表の配列番号４のヌクレオチド配列で表わされるＤＮＡが挙げられる。配列番号４で表わされるＤＮＡは、ツマグロヨコバイ由来のエクダイソンリセプターの全長ｃＤＮＡ配列（配列表の配列番号９）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に相当する。本発明のＤＮＡには配列番号４で表わされる塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつエクダイソンリセプターとしての機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、配列番号４で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡに示される新規なＤＮＡも含まれる。
【００２３】
塩基の欠失、置換もしくは付加の程度は、もとの塩基配列との相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上のものが許容し得る。
【００２４】
配列表の配列番号４で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつエクダイソンリセプターとしての機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断片の変異、欠失、連結などにより部分ＤＮＡ配列が変化したものが挙げられる。これらのＤＮＡ変異体が配列番号４に示すＤＮＡとハイブリダイズする程度としては、ストリンジェントな条件下、例えば、ハイブリダイゼーション溶液（５０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ドデシル硫酸ナトリウム、１０％デキストラン硫酸、０．２  ｍｇ／ｍＬ酵母ＲＮＡ、０．２  ｍｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ）中で、遺伝子を結合したメンブランを６５℃にて、４時間保温し、プレハイブリダイゼーションとし、次に放射性標識した遺伝子断片を放射性同位体量にして１００万ｄｐｍ／ｍＬとなるように添加し、６５℃にて、１６時間保温することにより、ハイブリダイゼーションを行い、続いて、このメンブランを、０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含む２×ＳＳＣ溶液（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ  クエン酸三ナトリウム）中で、６５℃にて、３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーで解析した際に、Ｘ線フイルム上でハイブリダイズが確認されるものである。
【００２５】
また、本発明には、本発明の部分ポリペプチドをコードするＤＮＡ、本発明の融合ポリペプチドを指し、本発明の蛋白質、本発明の部分ポリペプチドならびに本発明の融合ポリペプチドをコード可能な全てのＤＮＡをも含む。さらに、これらのＤＮＡを構成する塩基配列は１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されていてもよく、また、これらのＤＮＡを構成する塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡも含まれる。塩基の欠失、置換もしくは付加の程度及びストリンジェントな条件は前記と同様である。
【００２６】
本発明の部分ポリペプチドとＧＡＬ４活性化領域が、間接的に結合している場合、その連結部分のヌクレオチドは、フレームシフトを起こさないか、終止コドンをコードしなければいずれでも良い。連結部分の数は３〜１５０個である。連結部分のポリヌクレオチドの具体例としては、ＧＧＴＧＧＧＴＣＧＡＡＴＣ ＡＡＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＴＴＣＡＣが挙げられる。
【００２７】
本発明の部分ポリペプチドとＧＡＬ４ＤＮＡ結合領域が、間接的に結合している場合、その連結部分のヌクレオチドは、フレームシフトを起こさないか、終止コドンをコードしなければいずれでも良い。連結部分の数は３〜１５０個である。連結部分のポリヌクレオチドの具体例としては、ＴＣＧＡＡＴＣＡＡＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＴＴＣＡＣＣが挙げられる。
【００２８】
本発明のウルトラスピラクルは配列表の配列番号７に示される新規な蛋白質である。この蛋白質は、半翅目昆虫の１種ツマグロヨコバイ（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ  ｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓ）に由来する。一番相同性の高いものが前記直翅目昆虫Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ由来のウルトラスピラクル（ｇｉ：３３９４３１７８）で、ＥＦ領域のアミノ酸配列の相同性は７８．５％である。
【００２９】
また、本発明のウルトラスピラクルは配列表の配列番号７に示されるアミノ酸配列から、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質を含む。ここで「１もしくは数個」とは、通常１〜３０個、好ましくは１〜１５個である。このアミノ酸の欠失、挿入、および置換は、蛋白質のの活性または機能を失わせるものではない。ウルトラスピラクルとしての機能を有する蛋白質であるかの判断は、本発明のスクリーニング系により評価することが出来る。すなわち、その蛋白質が、エクダイソンリセプター共存下ＤＮＡと相互作用する、エクダイソンリセプターと相互作用する、または転写を活性化する能力によって評価され得る。
【００３０】
本発明の部分ポリペプチドとは正常エクダイソンレセプターとの複合体形成に必要な領域に対応する部分アミノ酸配列とは、少なくとも本発明のウルトラスピラクルのＥＦ領域（配列表の配列番号７の１６６番〜３９３番のアミノ酸配列に相当）を含む部分ポリペプチドであるか、もしくはＥＦ領域を完全に含まなくても正常エクダイソンレセプターとの複合体形成が出来るポリペプチドであれば良い。正常エクダイソンレセプターとの複合体形成が出来る蛋白質であるかの判断は、本発明のスクリーニング系により評価することが出来る。すなわち、該部分ポリペプチドが、エクダイソンリセプター共存下ＤＮＡと相互作用する、エクダイソンリセプターと相互作用する、または転写を活性化する能力によって評価され得る。
【００３１】
正常エクダイソンレセプターとの複合体形成に必要な領域に対応する部分アミノ酸配列を少なくとも含有する本発明の部分ポリペプチドのその他の具体例は、例えば、本発明のウルトラスピラクルのＣＤＥＦ領域（配列表の配列番号７の７７番〜３９３番）、ＤＥＦ領域（配列表の配列番号７の１４３番〜３９３番）が挙げられる。好ましくはＤＥＦ領域を含む部分ポリペプチドが好ましい。
【００３２】
本発明の部分ポリペプチドとＧＡＬ４活性化領域の融合ポリペプチドにおいて、使用される本発明の部分ポリペプチドは、例えば本発明のウルトラスピラクルのＥＦ領域（配列表の配列番号７の１６６番〜３９３番のアミノ酸配列に相当）、ＣＤＥＦ領域（配列表の配列番号７の７７番〜３９３番）、ＤＥＦ領域（配列表の配列番号７の１４３番〜３９３番）が挙げられる。この中ではＤＥＦ領域、ＥＦ領域を含む部分ポリペプチドが好ましい。また、ＧＡＬ４活性化領域の具体例としては、配列表の配列番号２で表わされるアミノ酸配列が挙げられる。配列表の配列番号２で表わされるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドも用いることが出来るが、転写活性化の機能を失わせるものではない。本発明の部分ポリペプチドとＧＡＬ４活性化領域は、直接結合していても良いが、間に１〜５０個アミノ酸が結合していても良い。
【００３３】
本発明の部分ポリペプチドとＤＮＡ結合領域の融合ポリペプチドにおいて、使用される本発明の部分ポリペプチドは、例えば本発明のウルトラスピラクルのＥＦ領域（配列表の配列番号７の１６６番〜３９３番のアミノ酸配列に相当）、ＣＤＥＦ領域（配列表の配列番号７の７７番〜３９３番）、ＤＥＦ領域（配列表の配列番号７の１４３番〜３９３番）が挙げられる。この中ではＤＥＦ領域、ＥＦ領域を含む部分ポリペプチドが好ましい。また、ＤＮＡ結合領域の具体例としては、配列表の配列番号３で表わされるアミノ酸配列が挙げられる。配列表の配列番号３で表わされるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＧＡＬ４−ＵＡＳ配列に結合する配列を用いることが出来る。本発明の部分ポリペプチドとＧＡＬ４結合領域は、直接結合していても良いが、間に１〜５０個アミノ酸が結合していても良い。
【００３４】
本発明のＤＮＡとは配列表の配列番号７で表わされるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、配列番号７で表わされる塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつウルトラスピラクルとしての機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡである。このＤＮＡは、半翅目昆虫の１種ツマグロヨコバイ（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ  ｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓ）に由来する。一番相同性が高いものが前記直翅目昆虫Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ由来のウルトラスピラクル（ｇｉ：３３９４３１７８）で、ＥＦ領域の塩基配列の相同性は６５．６％である。その具体例としては、例えば、配列表の配列番号８のヌクレオチド配列で表わされるＤＮＡが挙げられる。配列表の配列番号８で表わされるＤＮＡは、ツマグロヨコバイ由来のウルトラスピラクルの全長ｃＤＮＡ配列（配列表の配列番号１０）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に相当する。本発明のＤＮＡには配列番号８で表わされる塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつエクダイソンリセプターとしての機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、配列番号８で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡに示される新規なＤＮＡも含まれる。
【００３５】
これらの塩基の欠失、置換もしくは付加の程度は、もとの塩基配列との相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上のものが許容し得る。
ツマグロヨコバイ
【００３６】
配列表の配列番号８で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつウルトラスピラクルとしての機能を有する蛋白質を発現せしめるＤＮＡも本発明の範囲内のものである。このようなハイブリダイズするＤＮＡ変異体としては、部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断片の変異、欠失、連結などにより部分ＤＮＡ配列が変化したものが挙げられる。これらのＤＮＡ変異体が配列番号８に示すＤＮＡとハイブリダイズする程度としては、ストリンジェントな条件下、例えば、ハイブリダイゼーション溶液（５０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ドデシル硫酸ナトリウム、１０％デキストラン硫酸、０．２  ｍｇ／ｍＬ酵母ＲＮＡ、０．２  ｍｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ）中で、遺伝子を結合したメンブランを６５℃にて、４時間保温し、プレハイブリダイゼーションとし、次に放射性標識した遺伝子断片を放射性同位体量にして１００万ｄｐｍ／ｍＬとなるように添加し、６５℃にて、１６時間保温することにより、ハイブリダイゼーションを行い、続いて、このメンブランを、０．１％  ドデシル硫酸ナトリウムを含む２×ＳＳＣ溶液（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ  クエン酸三ナトリウム）中で、６５℃にて、３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーで解析した際に、Ｘ線フイルム上でハイブリダイズが確認されるものである。
【００３７】
また、本発明には本発明の部分ポリペプチドをコードするＤＮＡ、本発明の融合ポリペプチドをも指し、は、該本発明の蛋白質、該本発明の部分ポリペプチド、本発明の融合ポリペプチドをコード可能な全てのＤＮＡをも含む。さらに、これらのＤＮＡを構成する塩基配列は１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されていてもよく、また、これらのＤＮＡを構成する塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡも含まれる。塩基の欠失、置換もしくは付加の程度及びストリンジェントな条件は前記と同様である。
【００３８】
本発明の部分ポリペプチドとＧＡＬ４活性化領域が、間接的に結合している場合、その連結部分のヌクレオチドは、フレームシフトを起こさないか、終止コドンをコードしなければいずれでも良い。連結部分の数は３〜１５０個である。連結部分のポリヌクレオチドの具体例としては、ＧＧＴＧＧＧＴＣＧＡＡＴＣ ＡＡＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＴＴＣＡＣが挙げられる。
【００３９】
本発明の部分ポリペプチドとＧＡＬ４ＤＮＡ結合領域が、間接的に結合している場合、その連結部分のヌクレオチドは、フレームシフトを起こさないか、終止コドンをコードしなければいずれでも良い。連結部分の数は３〜１５０個である。連結部分のポリヌクレオチドの具体例としては、ＴＣＧＡＡＴＣＡＡＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＴＴＣＡＣＣが挙げられる。
【００４０】
本発明の蛋白質は、それを天然で発現する細胞または昆虫から得るか、それを発現するように改変された（すなわち、組換え）細胞から得るか、無細胞タンパク合成により得るか、または当該分野で周知の蛋白質合成技術を使用して合成され得る。好ましくは、組換え細胞から得る方法、無細胞タンパク合成によって産生される。これらの方法については、後述する。
【００４１】
本発明の組換えベクターから合成される蛋白質には、本発明のＤＮＡによってコードされる蛋白質、本発明の部分ポリペプチドおよび本発明の融合ポリペプチド及びが含まれる。これらの蛋白質、部分ポリペプチドおよび融合ポリペプチドは、作動可能に連結されていてもよく、または作動可能に連結されていなくてもよい。作動可能な連結の例は、単一の蛋白質が翻訳に際して産生されるようなインフレームの融合である。このような融合蛋白質は、例えば、組換え蛋白質の精製を容易にする。別の実施態様において、融合蛋白質は、特定の宿主細胞からのその分泌を容易にする、Ｎ末端の異種シグナル配列を含み得る。蛋白質の発現および分泌は、異種シグナル配列の使用によって増大され得る。また、前記ＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域との融合蛋白質、前記ＧＡＬ４の活性化領域との融合蛋白質も含む。
【００４２】
本発明のＤＮＡはそれを含む組換え体プラスミドを構築することで、該ＤＮＡを大腸菌などに安定に保持させることが可能であり、この際ベクターとしては、一般に使われるものはすべて使用可能であるが、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（＋）、ｐＧＥＭ−Ｔベクター、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター、ｐＥＮＴＲ  ＴＯＰＯベクター等がある。以後に述べる実施例では、ｐＧＥＭ−Ｔベクター、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター、ｐＥＮＴＲ  ＴＯＰＯベクター使った例が示されている。これらプラスミドを必要に応じて適当な制限酵素などで切断した後、適当なベクターに接続し、昆虫細胞用、酵母用、動物細胞用、無細胞系蛋白質合成用、トランスジェニック動物作成用、トランスジェニック昆虫作成用、トランスジェニック植物用等のベクターとすることが出来る。
【００４３】
本発明で用いることのできるベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
【００４４】
本発明で用いることのできるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどがあげられる。これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモータープロモーターとしては、ＯｐＩＥ２プロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、フィブロイン遺伝子プロモーター、セリシン遺伝子プロモーター、アクチン遺伝子プロモーター、ミオシン遺伝子プロモーターなどが挙げられるが、その中でもヒートショックプロモーター、ＯｐＩＥ２プロモーター、アクチン遺伝子プロモーターが好ましい。
【００４５】
発現ベクターには、以上の他に、必要に応じてエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子等を用いることができる。また、市販されているベクターも使用可能である。
【００４６】
昆虫細胞用としては、ｐＭＴ／Ｖ５−Ｈｉｓベクター、ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−Ｈｉｓベクター、ｐＭＴ／ＢｉｏＥａｓｅ−ＤＥＳＴベクター、ｐＡｃ５．１／Ｖ５−Ｈｉｓベクター、ｐＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓベクター、ｐＩＺ／Ｖ５−Ｈｉｓベクター、ｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓベクター、ｐＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯベクター、ｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＤＥＳＴベクター（以上インビトロジェン社製）等が挙げられる。
【００４７】
酵母用としては、ｐＤＥＳＴ２２ベクター、ｐＤＥＳＴ３２ベクター（以上インビトロジェン社製）、ｐＧＢＫＴ７ベクター、ｐＧＡＤＴ７ベクター（以上クロンテック社製）等が挙げられる。
【００４８】
動物細胞用としては、ｐＳＩベクター、ｐＣＩベクター（以上プロメガ社製）、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０ベクター、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯベクター、ｐＣＲ３．１ベクター（以上インビトロジェン社製）等が挙げられる。
【００４９】
無細胞系蛋白質合成用としては、ｐＴＮＴベクター（プロメガ社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（＋）（ストラタジーン社製）等が挙げられる。
【００５０】
このようにして構築された本発明のＤＮＡを含有するベクターを用いて、本発明の形質転換体を製造することができる。本発明の形質転換体の宿主としては、例えば、使用するプラスミドに合わせて、大腸菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
【００５１】
宿主として形質転換可能な大腸菌は使用出来る、の具体例としては、ＪＭ１０３株、ＤＨ５α株、ＪＡ２２１株、ＨＢ１０１株、ＪＭ１０９株などが用いられる。
【００５２】
酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２、ＡＨ２２Ｒ-、ＮＡ８７−１１Ａ、ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１２、ＭａＶ１０３、ＭａＶ２０３、ＹＲＧ−２、Ｙ１９０、ＳＦＹ５２６等が使用可能であるが、ツーハイブリッドアッセイの宿主として考えた場合には、ＭａＶ１０３、ＭａＶ２０３、ＹＲＧ−２、Ｙ１９０、ＳＦＹ５２６が好ましい。
【００５３】
昆虫細胞としては、例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来のＳｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉＭＧ１細胞、Ｈｉｇｈ  ＦｉｖｅＴＭ  細胞、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ由来のＢｍＮ細胞、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ由来のＳ２細胞、Ｋｃ細胞などが用いられる。
【００５４】
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる。
【００５５】
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞と略記）、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞などが用いられる。
【００５６】
大腸菌を形質転換するには、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）やＧｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
【００５７】
酵母を形質転換するには、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
【００５８】
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
【００５９】
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。昆虫細胞もしくは動物細胞を形質転換する方法の中で、操作が簡便で特別な機器を必要とせず、高いトランスフェクション効率と高い再現性を示す等の理由からリポフェクション法が好ましい。用いうるトランスフェクション試薬としては市販されている陽電荷脂質試薬等を用いることができ、例えばＴｆｘ−２０（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、Ｔｒａｎｓ  ｆａｓｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（インビトロジェン社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（インビトロジェン社製）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（インビトロジェン社製）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（生化学工業）等が挙げられ、好ましくはＴｆｘ−２０（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（インビトロジェン社製）である。
【００６０】
このようにして、本発明の形質転換体が得られる。
【００６１】
宿主が大腸菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００６２】
大腸菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地や、ＬＢ培地、ＳＯＣ培地が挙げられ、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
【００６３】
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、ＹＰＡＤ培地、ＳＣ培地を使用することが可能である。ＳＣ培地は特定のアミノ酸を除くことにより栄養要求性の培地とすることも出来る。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００６４】
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、例えば、Ｇｒａｃｅ培地、ＩＰＬ−４１培地、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地、ＴＣ−１００培地、ＴＣ−１０培地、ＩＰＬ−４１培地、ＴＭＮ−ＦＨ培地、ＭＭ培地、ＭＧＭ４４３培地、ＭＧＭ４４８培地、ＥＸ−ＣＥＬＬ４０５培地、Ｍ３（ＢＦ）培地等の使用が可能であり、必要に応じて１〜３０％、好ましくは３〜２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加することができる。その他、ＳＦ−９００ＩＩＳＦＭ培地、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ＳＦＭ培地、Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｆｉｖｅ  ＳＦＭ培地等の無血清培地を用いることも可能である。また、必要に応じてアミノ酸類、糖類、塩類、イーストレイト、ラクトアルブミン水解物等、様々な栄養物を添加することも可能である。さらに、ゲンタマイシン、アンピシリン、アンホテリシンＢ、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を添加することも可能である。培地のｐＨは約６〜７に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００６５】
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、１９９培地などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００６６】
以上のようにして、形質転換体の細胞内または細胞外に本発明の蛋白質を生成せしめることができる。
【００６７】
また、本発明の蛋白質は無細胞蛋白合成系を用いることにより生成させることができる。無細胞系タンパク合成とは、無細胞系で転写・翻訳機能を有した溶液中、発現プラスミドを加え、その溶液中で蛋白質を合成させるものである。転写・翻訳機能を有した溶液とは、例えばウサギ網状赤血球ライセート、小麦胚芽ライセート等が挙げられるが、ウサギ網状血球ライセートが好ましい。市販品としては、例えば、ＴＮＴ  Ｔ７  Ｑｕｉｃｋ−ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ(プロメガ社製)、ＴＮＴ  ＳＰ６  Ｑｕｉｃｋ−ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ(プロメガ社製)、ＰＲＯＴＥＩＮｓｃｒｉｐｔＩＩ  Ｋｉｔ(アンビオン社製)等がある。発現プラスミドは、例えば、前述のｐＴＮＴベクター（プロメガ社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（＋）(ストラタジーン社製)等に目的の蛋白質をコードするＤＮＡを挿入することにより構築が可能である。
【００６８】
本発明の蛋白質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により本発明の蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トライトン−Ｘ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。このようにして得られた本発明の蛋白質の粗抽出液の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。蛋白質の精製については、例えば「タンパク質実験ハンドブック」（羊土社）記載がある。
【００６９】
本発明の形質転換体を用いた半翅目昆虫の脱皮を制御する化合物のスクリーニング方法は、形質転換体を用いてできるスクリーニング方法であれば良いが、例えばレポータージーンアッセイ、ツーハイブリッドアッセイ等が含まれる。
【００７０】
本発明のスクリーニング方法におけるレポータージーンアッセイは、エクダイソン活性調節物質による転写活性化、転写抑制を指標に行う殺虫剤のスクリーニング系として使用が可能である。例えば、エクダイソンリセプターを発現するベクター、ウルトラスピラクルを発現するベクターおよびレポーターベクターを同時に宿主細胞に導入し、その後、化合物を投与し、一定時間後発現したレポーター蛋白質の活性を測定することにより、エクダイソン様活性調節物質を発見することができる。また、宿主細胞が昆虫細胞である場合、エクダイソンリセプターを発現するベクター、およびレポーターベクターを同時に宿主細胞に導入し、その後、化合物を投与し、一定時間後発現したレポーター蛋白質の活性を測定することにより、エクダイソン様活性調節物質を発見することができる。また、あらかじめ当該の発現ベクターを宿主細胞に導入し作製した形質転換細胞を、選択薬剤とともに培養することによってスクリーニング用ベクターを含む細胞のみを使用することも可能である。これらの細胞はこのままスクリーニングに用いても良いし、クローニングすることによって、単一の細胞株として調製した後、スクリーニングに用いても良い。宿主細胞は昆虫細胞もしくは動物細胞が好ましい。本実施例においては昆虫細胞を使用した例が示してある。
【００７１】
宿主細胞として昆虫細胞を用いた場合、昆虫細胞もその昆虫細胞由来のエクダイソンリセプターを産出している場合がある。この場合でも、導入された発現ベクター由来（つまり、ツマグロヨコバイ由来）のエクダイソンリセプターの方が多く発現しているために、その昆虫細胞はレポータージーンアッセイに使用できる。また、それは使用した昆虫細胞にレポーターベクターのみを導入した時のレポーター蛋白質活性との比較をすることにより判断することが可能である。
【００７２】
本発明のスクリーニング方法に使用できるレポーターベクターは、例えば特開２００２−２９１４８９号公報記載のようにエクダイソン応答配列（ＥｃＲＥ）、プロモーターおよびレポーター遺伝子を有するベクターが使用できる。レポーター遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等が利用できるが、検出感度が高いルシフェラーゼのほうが好ましい。エクダイソン応答配列とはエクダイソン類−エクダイソンリセプター−ウルトラスピラクルからなる複合体が認識することのできるＤＮＡ配列を指す。例えばＧＧＴＴＣＡ−Ａ−ＴＧＣＡＣＴであり、この配列を含むＤＮＡフラグメントは既知の合成法によって容易に合成することができる。
【００７３】
本スクリーニングに供することのできる化合物は、例えば合成した化合物をでも良いし、微生物二次代謝産物であってもよい。また低分子化合物であっても良いし、ポリペプチドのような高分子化合物であってもよい。
【００７４】
本発明のスクリーニング方法におけるツーハイブリッドアッセイは、エクダイソン活性調節物質によるエクダイソンレセプターとウルトラスピラクルの相互作用への影響を指標に行う半翅目昆虫の脱皮を制御する化合物のスクリーニング系である。宿主細胞として例えば酵母、昆虫細胞、動物細胞を用いることができる。例えば、ＰｒｏＱｕｅｓｔ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  Ｇａｔｅｗａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（インビトロジェン社製）、ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  ＧＡＬ４  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ３（クロンテック社製）、ＨｙｂｒｉＺＡＤ  ２．１  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｅｒ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＤｕｐＬＥＸ−Ａ  酵母  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ社製）等市販されているキットを使用してもアッセイ系の構築が可能である。以下に述べる実施例においては、宿主細胞として酵母を使用した例が示してある。酵母ツーハイブリッドアッセイは「タンパク質実験ハンドブック」（羊土社）、「バイオ実験イラストレイテッド７使おう酵母できるＴｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ」（秀潤社）記載の方法に従うことにより実施可能である。
【００７５】
具体的には以下の例を挙げることができる。
（Ａ）ＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域と本発明のエクダイソンリセプターの部分ポリペプチドであるＤＥＦ領域（配列番号１の２０３番〜５０６番）、もしくはＥＦ領域（配列番号１の２８４番〜５０６番）、もしくはＤＥ領域（配列番号１の２０３番〜５０３番）、もしくはＥ領域（配列番号１の２８４番〜５０３番のアミノ酸配列）との融合蛋白質を発現するベクターを構築する。（例えば、ｐＤＥＳＴ３２（インビトロジェン社製）に当該部分ポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込むことにより構築可能である。）；
（Ｂ）ＧＡＬ４の活性化領域とウルトラスピラクルのＤＥＦ領域（配列番号７の１４３番〜３９３番）、もしくはＥＦ領域（配列番号７の１６６番〜３９３番のアミノ酸配列に相当）との融合蛋白質を発現するベクターを構築する。（例えば、ｐＤＥＳＴ２２（インビトロジェン社製）に当該部分ポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込むことにより構築可能である。）；
（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）の発現ベクターを、ＧＡＬ４誘導性のレポーター遺伝子が組み込んである宿主酵母（例えば、ＭａＶ１０３、ＭａＶ２０３（共にインビトロジェン社製）に導入し、形質転換酵母を作製する。プラスミド導入方法はプロトプラスト法、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法等があるが、酢酸リチウム法が望ましい。
（Ｄ）試験化合物共存下、（Ｃ）の形質転換酵母を一定時間培養後、発現したレポーター蛋白質の活性を測定することにより、エクダイソン様活性調節物質を発見することができる。レポーター遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等が利用できる。；
【００７６】
（Ｅ）ＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域とウルトラスピラクルのＤＥＦ領域（配列番号７の１４３番〜３９３番）、もしくはＥＦ領域（配列番号７の１６６番〜３９３番のアミノ酸配列に相当）との融合蛋白質を発現するベクターを構築する。（例えば、ｐＤＥＳＴ３２（インビトロジェン社製）に当該部分ポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込むことにより構築可能である。）；
（Ｆ）ＧＡＬ４の活性化領域と本発明のエクダイソンリセプターの部分ポリペプチドであるＤＥＦ領域（配列番号１の２０３番〜５０６番）、もしくはＥＦ領域（配列番号１の２８４番〜５０６番）、もしくはＤＥ領域（配列番号１の２０３番〜５０３番）、もしくはＥ領域（配列番号１の２８４番〜５０３番のアミノ酸配列）との融合蛋白質を発現するベクターを構築する。（例えば、ｐＤＥＳＴ２２（インビトロジェン社製）に当該部分ポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込むことにより構築可能である。）；
【００７７】
（Ｇ）（Ａ）、（Ｂ）の発現ベクターを、ＧＡＬ４誘導性のレポーター遺伝子が組み込んである宿主酵母（例えば、ＭａＶ１０３、ＭａＶ２０３（共にインビトロジェン社製）に導入し、形質転換酵母を作製する。プラスミド導入方法はプロトプラスト法、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法等があるが、酢酸リチウム法が望ましい。；
（Ｈ）試験化合物共存下、（Ｃ）の形質転換酵母を一定時間培養後、発現したレポーター蛋白質の活性を測定することによっても、エクダイソン様活性調節物質を発見することができる。本スクリーニングに供することのできる化合物は、例えば合成した化合物をでも良いし、微生物二次代謝産物であってもよい。また低分子化合物であっても良いし、ポリペプチドのような高分子化合物であってもよい。
【００７８】
また、上記のＧＡＬ４システムを利用したツーハイブリッドシステムの代わりに、ＬｅｘＡ−Ｂ４２システムも同様に使用することが可能である。
【００７９】
本発明のエクダイソンリセプター、エクダイソンリセプターの部分ペプチドまたは融合ポリペプチドを用いた半翅目昆虫の脱皮を制御する化合物のスクリーニング方法としては、例えばリガンドバインディングアッセイも含まれる。リガンドバインディングアッセイは、例えば、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０，４０９５−４１０４（２００３）記載の方法により実施可能である。試験化合物と競合させる放射性同位元素でラベルされたリガンドとしては、放射性同位元素でラベルされたエクダイソン、２０−ヒドロキシエクダイソン、ポナステロンＡ、ムリステロンＡ等があるが、例えばトリチウムでラベルされたポナステロンＡが使用可能である。
【００８０】
本発明の蛋白質及び部分ポリペプチドを用いた半翅目昆虫の脱皮を制御する化合物のスクリーニング方法としては、例えばゲルシフトアッセイが含まれる。
【００８１】
本発明のスクリーニング方法に使用する本発明の蛋白質、部分ポリペプチドは前記の無細胞系蛋白質合成、形質転換した宿主細胞からの抽出、ツマグロヨコバイ虫体からの抽出等により得ることが可能である。粗精製のままであっても良いし、精製後の蛋白質またはポリペプチドを使用しても良い。
【００８２】
ゲルシフトアッセイについては、例えば「タンパク質実験ハンドブック」（羊土社）、Ｎａｔｕｒｅ，３６６，４７６〜４７９（１９９３）記載の方法等により行うことが可能である。また、ＬｉｇｈｔＳｈｉｆｔ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ＥＭＳＡ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を利用することも出来る。本発明におけるゲルシフトアッセイはエクダイソンリセプターもしくはその部分ポリペプチドと、ウルトラスピラクルもしくはその部分ポリペプチドをバッファー中で相互作用させ、次いでラベル化したエクダイソン応答配列、場合によっては同時に非ラベル化エクダイソン応答配列を加えて結合反応をさせ、その後電気泳動により分画し、ラベル化エクダイソン応答配列を検出するものである。エクダイソン応答配列が蛋白質に結合すれば、電気泳動での移動が遅くなり、そこにバンドシフトが現れる。
【００８３】
エクダイソンリセプターもしくはその部分ポリペプチドはいずれもゲルシフトアッセイに使用可能であるが、好ましくはエクダイソンリセプターを用いるのが良い。ウルトラスピラクルもしくはその部分ポリペプチドはいずれもゲルシフトアッセイに使用可能であるが、好ましくはウルトラスピラクルを用いるのが良い。
【００８４】
ゲルシフトアッセイにおいて使用するエクダイソン応答配列はエクダイソンリセプター−ウルトラスピラクル複合体と結合する配列であればなんでも良いが、例えば、以下に示すｈｓｐ２７、Ｐａｌ−１、ＤＲ−４が使用可能である。またこれらのエクダイソン応答配列は、検出のために放射性同位体でラベルする、もしくはビオチンでラベルすること等が可能である。
【００８５】
ｈｓｐ２７：ＡＣＧＣＧＴＧＡＣＡＡＧＴＧＣＡＴＴＧＡＡＣＣＣＴＴＧＴＣ
Ｐａｌ−１：ＧＡＴＣＴＡＧＡＧＡＧＧＴＣＡＡＴＧＡＣＣＴＣＧＴＣＣ
ＤＲ−４：ＧＡＴＣＣＧＴＡＧＧＧＧＴＣＡＣＧＡＡＡＧＧＴＣＡＣＴＣＧＡ
【００８６】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、昆虫生体内においてはエクダイソン類により誘導される遺伝子発現の発現量を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（イ）エクダイソン類により誘導される遺伝子発現の発現量を増加させることにより、脱皮等昆虫の成育を制御する化合物、（ロ）エクダイソン類により誘導される遺伝子発現の発現量を低下させることにより、脱皮等昆虫の成育を制御する化合物である。
【００８７】
該化合物としては、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【００８８】
本発明の蛋白質、部分ポリペプチド、部分ペプチド、ＤＮＡ、ベクターを使用すれば、宿主生物内において目的の外因性遺伝子もしくは内因性遺伝子の発現を調節する方法を提供することができる。例えば、
（ｉ）エクダイソン応答配列と外因性遺伝子もしくは内因性遺伝子を含むベクター、
（ｉｉ）本発明のエクダイソンリセプター、もしくはそのＤＮＡ結合領域およびそのリガンド結合領域を含む部分ポリペプチドのいずれかを発現するベクター、及び
（ｉｉｉ）ウルトラスピラクル、もしくはそのＤＮＡ結合領域およびそのリガンド結合領域を含む部分ポリペプチドのいずれかを発現するベクター
を宿主生物に導入し、エクダイソンリセプターに作用する化合物を投与することにより、目的の外因性遺伝子もしくは内因性遺伝子の発現を調節する方法が含まれる。エクダイソンリセプターに作用する化合物を宿主生物に投与すると、導入した（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のベクターにより宿主生物内で発現している（ＩＩ）エクダイソンリセプター、もしくはそのＤＮＡ結合領域およびリガンド結合領域を含む部分ポリペプチドと（ＩＩＩ）ウルトラスピラクル、もしくはそのＤＮＡ結合領域およびそのリガンド結合領域を含む部分ポリペプチドとの複合体が、投与された化合物と結合し活性化する。活性化した複合体は、その状態で導入した（ｉ）のベクター上にあるエクダイソン応答配列に結合することにより、エクダイソン応答配列の下流に存在する外因性遺伝子もしくは内因性遺伝子の発現を増大させる。該化合物としては特に制限はないが、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【００８９】
さらに、本発明のエクダイソンリセプター、またはそのＤＮＡ結合領域及びリガンド結合領域を含む部分ポリペプチドに特異的に作用する化合物を使用すれば、本発明のエクダイソンリセプターに依存した特異的な遺伝子調節システムを提供することができる。該化合物としては特に制限はないが、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【００９０】
本発明の半翅目昆虫の脱皮を制御する化合物を使用するに際しては、本発明の化合物それ自体で用いてもよいが、農薬補助剤として製剤化に一般的に用いられる担体、界面活性剤、およびその他補助剤を配合して、乳剤、懸濁剤、粉剤、粒剤、錠剤、水和剤、水溶剤、液剤、フロアブル剤、顆粒水和剤、エアゾール剤、ペースト剤、油剤、乳濁剤等の種種の形態に製剤することができる。これらの配合割合は通常、有効成分０．１〜９．０質量部で農薬補助剤１０〜９９．９質量部である。
【００９１】
ここにいう製剤化に際して用いられる担体としては、固体担体と液体担体に分けられる。固体担体としては、例えば澱粉、活性炭、大豆紛、小麦粉、木紛、魚粉、粉乳等の動植物性粉末、タルク、カオリン、ベントナイト、炭酸カルシウム、ゼオライト、珪藻土、ホワイトカーボン、クレー、アルミナ等の鉱物性粉末が挙げられる。液体担体としては、例えば水、イソプロピルアルコール、エチレングリコール等のアルコール類、シクロヘキサン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジオキサン、テトラヒドロフラン等のエーテル類、ケロシン、軽油等の脂肪族炭化水素類、キシレン、トリメチルベンゼン、テトラメチルベンゼンメチルナフタレン、ソルベントナフサ等の芳香族炭化水素類、クロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素類、ジメチルアセトアミド等の酸アミド類、脂肪酸のグリセリンエステル等のエステル類、アセトニトリル等のニトリル類ジメチルスルホキシド等の含硫化合物類等が挙げられる。
【００９２】
界面活性剤としては、例えばアルキルベンゼンスルホン酸金属塩、ジナフチルメタンジスルホン酸金属塩、アルコール硫酸エステル塩、アルキルアリールスルホン酸塩、リグニンスルホン酸塩、ポリオキシエチレングリコールエーテル、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノアルキレート等が挙げられる。
【００９３】
その他の補助剤としては、例えば、カルボキシジメチルセルロース、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、グアーガム、トラガントガム、ポリビニルアルコール等の固着剤あるいは増粘剤、金属石鹸等の消泡剤、脂肪酸、アルキルリン酸塩、シリコーン、パラフィン等の物性向上剤着色剤等を用いることができる。
【００９４】
これら製剤の実際の使用に際しては、そのまま使用するか、又は水等の希釈剤で所定濃度に希釈して使用することができる。本発明化合物を含有する種々の製剤、又はその希釈剤の施用は、通常一般的に行われている施用方法、即ち、散布（例えば、噴霧、ミスティング、アトマイジング、散紛、散粒、水面施用、箱施用等）、土壌施用（例えば、混入、灌注等）、表面施用（例えば、塗布、紛衣、被覆等）、浸漬、毒餌等により行うことができる。また、家畜に対して前記有効成分を資料に混合して与え、その排泄物での有害虫、特に有害昆虫の発生、生育を防除することも可能である。又いわゆる超高濃度少量散布法により施用することもできる。この方法においては、有効成分を１００％含有することが可能である。
【００９５】
本発明の半翅目昆虫の脱皮を制御する化合物の施用は、一般的に０．１〜５００００ｐｐｍ、望ましくは１〜１００００ｐｐｍの有効成分濃度で行う。
【００９６】
有効成分濃度は製剤の形態および施用する方法、目的、時期、場所及び有害生物の発生状況によって適当に変更できる。例えば、水生有害生物の場合、上記濃度範囲の薬液を発生場所に散布しても防除できることから、水中での有効成分濃度は上記以下である。１０アール当たり、有効成分化合物として０．１〜５０００ｇ、好ましくは１〜１０００ｇが使用されるが、これらに限定されるものではない。
【００９７】
尚、本発明の化合物は単独でも十分有効であることはいうまでもないが、必要に応じて他の肥料及び農薬、例えば殺虫剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、殺菌剤、抗ウィルス剤、誘引剤、除草剤、植物調整剤などと混用、併用することができ、この場合に一層優れた効果を示すこともある。
【００９８】
本発明の化合物は、例えば、半翅目害虫、鱗翅目害虫、鞘翅目害虫、双翅目害虫、膜翅目害虫、直翅目害虫、シロアリ目害虫、アザミウマ目害虫、ハダニ類及び植物寄生性線虫類に対して優れた防除効果を示す。また、本発明化合物は、その他有害動物、不快動物、衛生害虫及び寄生虫に対しても優れた防除効果を示し、殺虫剤として利用可能である。
【００９９】
半翅目害虫として、例えば、ホソヘリカメムシ（Ｒｉｐｔｏｒｔｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ）、ミナミアオカメムシ（Ｎｅｚａｒａ  ｖｉｒｉｄｕｌａ）、カスミカメムシ類（Ｌｙｇｕｓ  ｓｐ．）、アメリカコバネナガカメムシ（Ｂｌｉｓｓｕｓ  ｌｅｕｃｐｔｅｒｕｓ）、ナシグンバイ（Ｓｔｅｐｈａｎｉｔｉｓ  ｎａｓｈｉ）等のカメムシ類（異翅類；Ｈｅｔｅｒｏｐｔｅｒａ）、ツマグロヨコバイ（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ  ｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓ）、ヒメヨコバイ（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｓｐ．，Ｅｒｙｔｈｒｏｎｅｕｒａ  ｓｐ．，Ｃｉｒｃｕｌｉｆｅｒ  ｓｐ．）等のヨコバイ類、トビイロウンカ（Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａｌｕｇｅｎｓ）、セジロウンカ（Ｓｏｇａｔｅｌｌａ  ｆｕｒｃｉｆｅｒａ）、ヒメトビウンカ（Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘ  ｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ）等のウンカ類、Ｐｓｙｌｌａ  ｓｐ．等のキジラミ類、タバココナジラミ（Ｂｅｍｉｓｉａ  ｔａｂａｃｉ）、オンシツコナジラミ（Ｔｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ  ｖａｐｏｒａｒｉｏｒｕｍ）、等のコナジラミ類、ブドウネアブラムシ（Ｖｉｔｅｕｓｖｉｔｉｆｏｌｉｉ）、モモアカアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ）、リンゴアブラムシ（Ａｐｈｉｓ  ｐｏｍｉ）、ツマグロヨコバイ（Ａｐｈｉｓｇｏｓｓｙｐｉｉ）、Ａｐｈｉｓ  ｆａｂａｅ、ニセダイコンアブラムシ（Ｌｉｐｈｉｓ  ｅｒｙｓｉｍｉ）、ジャガイモヒゲナガアブラムシ（Ａｕｌａｃｏｒｔｈｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）、ムギミドリアブラムシ（Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓｇｒａｍｉｎｕｍ）等のアブラムシ類、クワコナカイガラムシ（Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｍｓｔｏｃｋｉ）、ルビーロウムシ（Ｃｅｒｏｐｌａｓｔｅｓｒｕｂｅｎｓ）、サンホーゼカイガラムシ（Ｃｏｍｓｔｏｃｋａｓｐｉｓ  ｐｅｒｎｉｃｉｏｓａ）、ヤノネカイガラムシ（Ｕｎａｓｐｉｓ  ｙａｎｏｎｅｎｓｉｓ）等のカイガラムシ及びサシガメ（Ｒｈｏｄｎｉｕｓ  ｓｐ．）が挙げられる。
【０１００】
鱗翅目害虫として、例えば、チャハマキ（Ｈｏｍｏｎａ  ｍａｇｎａｎｉｍａ）、コカクモンハマキ（Ａｄｏｘｏｐｈｙｅｓ  ｏｒａｎａ）、テングハマキ（Ｓｐａｒｇａｎｏｔｈｉｓ  ｐｉｌｌｅｒｉａｎａ）、ナシヒメシンクイ（Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ  ｍｏｌｅｓｔａ）、マメシンクイガ（Ｌｅｇｕｍｉｎｉｖｏｒａ  ｇｌｙｃｉｎｉｖｏｒｅｌｌａ）、コドリンガ（Ｌａｓｐｅｙｒｅｓｉａｐｏｍｏｎｅｌｌａ）、Ｅｕｃｏｓｍａ  ｓｐ．、Ｌｏｂｅｓｉａ  ｂｏｔｒａｎａ等のハマキガ類、ブドウホソハマキ（Ｅｕｐｏｅｃｉｌｌｉａ  ａｍｂｉｇｕｅｌｌａ）、等のホソハマキガ類、Ｂａｍｂａｌｉｎａ  ｓｐ．等のミノガ類、コクガ（Ｎｅｍａｐｏｇｏｎ  ｇｒａｎｅｌｌｕｓ）、イガ（Ｔｉｎｅａｐｅｌｌｉｏｎｅｌｌａ）等のヒロズコガ類、ギンモンハモグリガ（Ｌｙｏｎｅｔｉａ  ｐｒｕｎｉｆｏｌｉｅｌｌａ）等のハモグリガ類、キンモンホソガ（Ｐｈｙｌｌｏｎｏｒｙｃｔｅｒ  ｒｉｎｇｏｎｉｅｌｌａ）等のホソガ類、ミカンハモグリガ（Ｐｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ  ｃｉｔｒｅｌｌａ）等のコハモグリガ類、コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）、Ｐｒａｙｓ  ｃｉｔｒｉ等のスガ類、ブドウスカシバ（Ｎｏｋｏｎａ  ｖｅｇａｌｅ）、Ｓｙｎａｎｔｈｅｄｏｎ  ｓｐ．等のスカシバ類、ワタアカミムシ（Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ）、ジャガイモガ（Ｐｈｔｈｏｒｉｍａｅａｏｐｅｒｃｕｌｅｌｌａ）、Ｓｔｏｍｏｐｔｅｒｙｘ  ｓｐ．等のキバガ類、モモシンクイガ（Ｃａｒｐｏｓｉｎａ  ｎｉｐｏｎｅｎｓｉｓ）等のシンクイガ類、イラガ（Ｍｏｎｅｍａ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）等のイラガ類、ニカメイガ（Ｃｈｉｌｏ  ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ）、コブノメイガ（Ｃｎａｐｈａｌｏｃｒｏｃｉｓ  ｍｅｄｉｎａｌｉｓ）、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、アワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｆｕｒｎａｃａｌｉｓ）、ハイマダラノメイガ（Ｈｅｌｌｕｌｌａ  ｕｎｄａｌｉｓ）ハチミツガ（Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）、Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ、Ｌｏｘｏｓｔｅｇｅ  ｓｔｉｃｔｉｃａｌｉｓ等のメイガ類、モンシロチョウ（Ｐｉｅｒｉｓ  ｒａｐａｅ）等のシロチョウ類、ヨモギエダシャク（Ａｓｃｏｔｉｓ  ｓｅｌｅｎａｒｉａ）等のシャクガ類、オビカレハ（Ｍａｌａｃｏｓｏｍａｎｅｕｓｔｒｉａ）等のカレハガ類、Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ等のスズメガ類、チャドクガ（Ｅｕｐｒｏｃｔｉｓ  ｐｓｅｕｄｏｃｏｎｓｐｅｒｓａ）、マイマイガ（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ  ｄｉｓｐａｒ）等のドクガ類、アメリカシロヒトリ（Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ  ｃｕｎｅａ）等のヒトリガ類、タバコバッドワーム（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、ボールワーム（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）、シロイチモジヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ）、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ）、ハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａ）、ヨトウガ（Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、タマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ）、アワヨトウ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｓｅｐａｒａｔａ）及びイラクサキンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）等のヤガ類が挙げられる。
【０１０１】
鞘翅目害虫として、例えば、ドウガネブイブイ（Ａｎｏｍａｌａ  ｃｕｐｒｅａ）、マメコガネ（Ｐｏｐｉｌｌｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、ヒメコガネ（Ａｎｏｍａｌａ  ｒｕｆｏｃｕｐｒｅａ）、Ｅｕｔｈｅｏｌａｒｕｇｉｃｅｐｓ等のコガネムシ類、ワイヤーワーム（Ｎｃｒｉｃｏｔｅｓ  ｓｐ．）、Ｃｏｎｏｄｅｕｓ  ｓｐ．等のコメツキムシ類、ニジュウヤホシテントウ（Ｅｐｉｌａｃｈｎａ  ｖｉｇｉｎｔｉｏｃｔｏｐｕｎｃｔａｔａ）、インゲンテントウムシ（Ｅｐｉｌａｃｈｎａ  ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ）等のテントウムシ類、コクヌストモドキ（Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ  ｃａｓｔａｎｅｕｍ）等のゴミムシダマシ類、ゴマダラカミキリ（Ａｎｏｐｌｏｐｈｏｒａ  ｍａｌａｓｉａｃａ）、マツノマダラカミキリ（Ｍｏｎｏｃｈａｍｕｓ  ａｌｔｅｒｎａｔｕｓ）等のカミキリムシ類、インゲンマメゾウムシ（Ａｃａｎｔｈｏｓｃｅｌｉｄｅｓ  ｏｂｔｅｃｔｕｓ）、アズキゾウムシ（Ｃａｌｌｏｓｏｂｒｕｃｈｕｓ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）等のマメゾウムシ類、コロラドハムシ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅ  ｍＬｉｎｅａｔａ）、コーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｓｐ．）、イネドロオイムシ（Ｏｕｌｅｍａ  ｏｒｙｚａｅ）、テンサイトビハムシ（Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ  ｃｏｎｃｉｎｎａ）、Ｐｈａｅｄｏｎ  ｃｏｃｈｌｅａｒｉａｓ、Ｏｕｌｅｍａ  ｍｅｌａｎｏｐｕｓ、Ｄｉｃｌａｄｉｓｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ等のハムシ類、Ａｐｉｏｎ  ｇｏｄｍａｎｉ等のホソクチゾウムシ類、イネミズゾウムシ（Ｌｉｓｓｏｒｈｏｐｔｒｕｓ  ｏｒｙｚｏｐｈｉｌｕｓ）、ワタミゾウムシ（Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）等のゾウムシ類、コクゾウムシ（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｚｅａｍａｉｓ）等のオサゾウムシ類、キクイムシ類、カツオブシムシ類及びシバンムシ類が挙げられる。
【０１０２】
双翅目害虫として、例えば、キリウジガガンボ（Ｔｉｐｕｌａ  ａｉｎｏ）、イネユスリカ（Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、イネシントメタマバエ（Ｏｒｓｅｏｌｉａ  ｏｒｙｚａｅ）、チチュウカイミバエ（Ｃｅｒａｔｉｔｉｓ  ｃａｐｉｔａｔａ）、イネミギワバエ（Ｈｙｄｒｅｌｌｉａ  ｇｒｉｓｅｏｌａ）、オウトウショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｓｕｚｕｋｉｉ）、フリッツフライ（Ｏｓｃｉｎｅｌｌａ  ｆｒｉｔ）、イネカラバエ（Ｃｈｌｏｒｏｐｓ  ｏｒｙｚａｅ）、インゲンモグリバエ（Ｏｐｈｉｏｍｙｉａ  ｐｈａｓｅｏｌｉ）、マメハモグリバエ（Ｌｉｒｉｏｍｙｚａ  ｔｒｉｆｏｌｉｉ）、アカザモグリハナバエ（Ｐｅｇｏｍｙａ  ｅｘｉｌｉｓ）、タネバエ（Ｄｅｌｉａ  ｐｌａｔｕｒａ）、ソルガムフライ（Ａｔｈｅｒｉｇｏｎａ  ｓｏｃｃａｔａ）、イエバエ（Ｍｕｓｃａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、ウマバエ（Ｇａｓｔｒｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐ．）、サシバエ（Ｓｔｏｍｏｘｙｓ  ｓｐ．）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）、アカイエカ（Ｃｕｌｅｘ  ｐｉｐｉｅｎｓ）、シナハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｓｌｎｅｎｓｉｓ）及びコガタアカイエカ（Ｃｕｌｅｘ  ｔｒｉｔａｅｎｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ）が挙げられる。
【０１０３】
膜翅目害虫として、例えば、クキバチ類（Ｃｅｐｈｕｓ  ｓｐ．）、カタビロコバチ（Ｈａｒｍｏｌｉｔａ  ｓｐ．）、カブラハバチ（Ａｔｈａｌｉａ  ｒｏｓａｅ）、スズメバチ（Ｖｅｓｐａ  ｍａｎｄａｒｉｎａ）及びファイアーアント類が挙げられる。
【０１０４】
直翅目害虫として、例えば、チャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｔｅｌｌａ  ｇｅｒｍａｎｉｃａ）、ワモンゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）、ケラ（Ｇｒｙｌｌｏｔａｌｐａ  ａｆｒｉｃａｎａ）、バッタ（Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉｏｄｅｓ）及びＭｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓが挙げられる。
【０１０５】
アザミウマ目害虫として、例えば、チャノキイロアザミウマ（Ｓｃｉｒｔｏｔｈｒｉｐｓ  ｄｏｒｓａｌｉｓ）、ミナミキイロアザミウマ（Ｔｈｒｉｐｓ  ｐａｌｍｉ）、クロトンアザミウマ（Ｈｅｌｉｏｔｈｒｉｐｓ  ｈａｅｍｏｒｒｈｏｉｄａｌｉｓ）、ミカンキイロアザミウマ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）及びイネクダアザミウマ（Ｈａｐｌｏｔｈｒｉｐｓａｃｕｌｅａｔｕｓ）が挙げられる。
【０１０６】
ハダニ類として、例えば、ナミハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｕｒｔｉｃａｅ）、カンザワハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｋａｎｚａｗａｉ）、ミカンハダニ（Ｐａｎｏｎｙｃｈｕｓ  ｃｉｔｒｉ）、リンゴハダニ（Ｐａｎｏｎｙｃｈｕｓ  ｕｌｍｉ）、イエローマイト（Ｅｏｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｃａｒｐｉｎｉ）、テキサスシトラスマイト（Ｅｏｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｂａｎｋｓｉ）、ミカンサビダニ（Ａｃｕｌｏｐｓ  ｐｅｌｅｋａｓｓｉ）、チャノホコリダニ（ｐｏｌｙｐｈａｇｏｔａｒｓｏｎｅｍｕｓ  ｌａｔｕｓ）、ヒメハダニ（Ｂｒｅｖｉｐａｌｐｕｓ  ｓｐ．）、ロビンネダニ（Ｒｈｉｚｏｇｌｙｐｈｕｓ  ｒｏｂｉｎｉ）及びケナガコナダニ（Ｔｙｒｏｐｈａｇｕｓ  ｐｕｔｒｅｓｃｅｎｔｉａｅ）が挙げられる。
【０１０７】
植物寄生性線虫類として、例えば、サツマイモネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）、ネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｓｐ．）ダイズシストセンチュウ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ）、イネシンガレセンチュウ（Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ  ｂｅｓｓｅｙｉ）及びマツノザイセンチュウ（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ  ｌｉｇｎｉｃｏｌｕｓ）が挙げられる。
【０１０８】
その他有害動物、不快動物、衛生害虫及び寄生虫として、例えば、スクリミンゴガイ（Ｐｏｍａｃｅａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌａｔａ）、ナメクジ（Ｉｎｃｉｌａｒｉａ  ｓｐ．）、アフリカマイマイ（Ａｃｈａｔｉｎａ  ｆｕｌｉｃａ）等の腹足網類（Ｇａｓｔｒｏｐｏｄａ）、ダンゴムシ（Ａｒｍａｄｉｌｌｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、ワラジムシ、ムカデ等の等脚目類（Ｉｓｏｐｏｄａ）、Ｌｉｐｏｓｃｅｌｉｓ  ｓｐ．等のチャタテムシ類、Ｃｔｅｎｏｌｅｐｉｓｍａ  ｓｐ．等のシミ類、Ｐｕｌｅｘ  ｓｐ．、Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ  ｓｐ．等のノミ類、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｃｔｅｓ  ｓｐ．等のハジラミ類、Ｃｉｍｅｘ  ｓｐ．等のトコジラミ類、オウシマダニ（Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｌｕｓ）、フタトゲチマダニ（Ｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｉｓ  ｌｏｎｇｉｃｏｒｎｉｓ）等の動物寄生性ダニ類及びヒョウヒダニ類等が挙げられる。
【実施例】
【０１０９】
以下実施例により本発明を更に詳細に説明する。実施例において部は重量部を、％は重量％をそれぞれ意味する。プライマーはインビトロジェン社より入手した。また、プライマーの配列中、ＹはＣまたはＴ、ＲはＡまたはＧ、Ｎは４種の塩基いずれか、ＫはＡまたはＣ、Ｉはイノシン残基を示す。
【０１１０】
実施例１  ツマグロヨコバイ（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ  ｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓ）由来のエクダイソンリセプター（ＥｃＲ）の全長配列の決定
ツマグロヨコバイ（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ  ｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓ）より、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍｉｃｒｏ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて、そのプロトコールに従いｍＲＮＡ溶液を調製した。このｍＲＮＡ溶液から、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（クロンテック社製）のプロトコールに従い、キット付属の３'−ＣＤＳをプライマーとしてｃＤＮＡ合成を行い、３'−ＲＡＣＥ  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡを得た。この３'−ＲＡＣＥ  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡを鋳型とし、ＥｃＲｆ１プライマー（アミノ酸配列のＱＥＥＬＣＬＶをコード）およびＥｃＲｒ２プライマー（アミノ酸配列のＣＳＳＥＶＭＭを逆向きにコード）のデジェネレイトプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、酵素としてＥＸ  Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、９５℃で１分加熱後、９５℃（３０秒）、５２℃（３０秒）、７２℃（１分）を１サイクルとして、３５サイクル増幅するという条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００ＨＲ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてゲルろ過精製し、これを鋳型として再度ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＥｃＲｆ３プライマー（アミノ酸配列のＳＧＹＨＹＮＡをコード）およびＥｃＲｒ５プライマー（、アミノ酸配列のＣＱＥＣＲＬＫＫＣを逆向きにコード）のデジェネレイトプライマーを用い、酵素としてＥＸ  Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、９５℃で１分加熱後、９５℃（３０秒）、４８℃（３０秒）、７２℃（９０秒）を１サイクルとして、３５サイクル増幅するという条件で行った。このＤＮＡ溶液を、２．５％アガロース電気泳動により分画し、約１００〜２００ｂｐの部分を抽出、精製した。精製はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、プロトコールに従い行った。この精製ＤＮＡを、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  ＳｙｓｔｅｍＩ（プロメガ社製）を用いて、そのプロトコールに従いＴＡクローニングを行い、塩基配列（全塩基配列（配列表の配列番号９）の６３９番〜７４９番に相当）を決定した。次いで、決定した塩基配列中にプライマーを設計して、５'ＲＡＣＥおよび３'ＲＡＣＥを、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（クロンテック社）を用いて行い、さらにｐＧＥＭ−Ｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  ＳｙｓｔｅｍＩ（プロメガ社製）を用い、そのプロトコールに従い、ＴＡクローニングを行い、塩基配列を決定した。
【０１１１】
塩基配列の決定は以下のように行った。クローニング後に得られた形質転換大腸菌のコロニーを鋳型として、Ｍ１３ｆｏｒｗｏｒｄプライマー、Ｍ１３ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを用い、酵素としてＥＸｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）でダイレクトＰＣＲを行い（９０℃で10分加熱後、９５℃（３０秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（２分）を１サイクルとして３０回反応）、得られたＰＣＲ産物をＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００ＨＲ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてゲルろ過精製し、さらにＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を使用し、キット記載の条件にてシーケンシング反応を行い、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００ＤＮＡアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）にて塩基配列を決定した。使用したデジェネレイトプライマーおよびＭ１３ｆｏｒｗｏｒｄプライマー、Ｍ１３ｒｅｖｅｒｓｅプライマーの配列は以下に示すとおりである。
【０１１２】
ＥｃＲｆ１：ＣＡＲＧＡＲＧＡＲＴＴＲＴＧＹＹＴＮＣＴ
ＥｃＲｒ２：ＣＡＴＣＡＴＮＡＣＹＴＣＲＣＴＮＧＡＲＣＡ
ＥｃＲｆ３：ＴＣＳＧＧＮＴＡＹＣＡＹＴＡＹＡＡＹＧＣ
ＥｃＲｒ５：ＴＣＳＧＧＮＴＡＹＣＡＹＴＡＹＡＡＹＧＣ
Ｍ１３ｆｏｒｗｏｒｄ：ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ
Ｍ１３ｒｅｖｅｒｓｅ：ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ
【０１１３】
３'ＲＡＣＥは以下のような条件にて行った。すなわち１回目のＰＣＲは、鋳型として前述の３'−ＲＡＣＥ  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡを用い、プライマーとしてＮｃＥｃＲｆ１プライマー（全塩基配列（配列表の配列番号９）の６３６番〜６５５番に相当）およびキットに付属のＵＰＭプライマーを用い、酵素としてＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、９５℃で１分加熱後、９５℃（３０秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（３分）を１サイクルとして、３５サイクル増幅するという条件で行い、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲは鋳型としてＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００ＨＲ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてゲルろ過精製した１回目のＰＣＲ産物を用い、プライマーとしてＮｃＥｃＲｆ２プライマー（全塩基配列（配列表の配列番号９）の６７６番〜６９５番に相当）およびキットに付属のＮＵＰプライマーを用い、９５℃で１分加熱後、９５℃（３０秒）、５５℃（１分）、７２℃（３分）を１サイクルとして、３５サイクル増幅するという条件で行った。このＤＮＡ溶液を、１．５％アガロース電気泳動により分画し、約６００〜１０００ｂｐの部分を抽出、精製した。精製はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、プロトコールに従い行った。この精製ＤＮＡを、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  ＳｙｓｔｅｍＩ（プロメガ社製）を用いて、そのプロトコールに従いＴＡクローニングを行い、塩基配列（全塩基配列（配列表の配列番号９）の６９７番〜１３２９番に相当）を決定した。しかし、３'末端までの塩基配列情報が得られなかったため、再度３'ＲＡＣＥを行った。すなわち１回目のＰＣＲは、鋳型として前述の３'−ＲＡＣＥ  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡを用い、プライマーとしてＮｃＥｃＲｆ４プライマー（全塩基配列（配列表の配列番号９）の１２３５番〜１２５４番に相当）およびキットに付属のＵＰＭプライマーを用い、酵素としてＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、９５℃で１分加熱後、９５℃（３０秒）、４８℃（３０秒）、７２℃（２分３０秒）を１サイクルとして、２５サイクル増幅するという条件で行い、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲは鋳型としてＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００ＨＲ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてゲルろ過精製した１回目のＰＣＲ産物を用い、プライマーとしてＮｃＥｃＲｆ５プライマー（全塩基配列（配列表の配列番号９）の１２７２番〜１２９２番に相当）およびキットに付属のＮＵＰプライマーを用い、９５℃で１分加熱後、９５℃（３０秒）、４８℃（１分）、７２℃（２分３０秒）を１サイクルとして、３５サイクル増幅するという条件で行った。このＤＮＡ溶液を、１．５％アガロース電気泳動により分画し、約９００ｂｐの部分を抽出、精製した。精製はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、プロトコールに従い行った。この精製ＤＮＡを、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  ＳｙｓｔｅｍＩ（プロメガ社製）を用いて、そのプロトコールに従いＴＡクローニングを行い、塩基配列（全塩基配列（配列表の配列番号９）の１２９３番〜２１２２番に相当）を決定した。塩基配列の決定方法は、前述の通りである。使用したプライマーの配列を以下に示す。
【０１１４】
ＮｃＥｃＲｆ１：ＧＣＴＣＴＣＡＣＣＴＧＣＧＡＧＧＧＴＴＧ
ＮｃＥｃＲｆ２：ＧＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＡＣＧＣＧＧＴＧ
ＮｃＥｃＲｆ４：ＧＧＣＡＴＧＣＴＣＣＡＧＴＧＡＡＧＴＧＡ
ＮｃＥｃＲｆ５：ＧＣＡＧＧＴＡＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＣＧ
【０１１５】
５'ＲＡＣＥは以下のような条件にて行った。まず、ツマグロヨコバイより調製したｍＲＮＡ溶液を鋳型とし、ＮｃＥｃＲｒ１プライマー（全塩基配列（配列表の配列番号９）の７２２番〜７４６番の逆鎖に相当）をプライマーとし、キット付属のＳＭＡＲＴＩＩオリゴヌクレオチド共存下、酵素としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン社製）を用いて５'−ＲＡＣＥ  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡを合成した。これを鋳型とし、プライマーとしてＮｃＥｃＲｒ２プライマー（全塩基配列（配列表の配列番号９）の６８９番〜７１３番の逆鎖に相当）およびキットに付属のＵＰＭプライマーを用い、酵素としてＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、９５℃で１分加熱後、９５℃（３０秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（５分）を１サイクルとして、３５サイクル増幅するという条件で１回目のＰＣＲを行い、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲは鋳型としてＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００ＨＲ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてゲルろ過精製した１回目のＰＣＲ産物を用い、プライマーとしてＮｃＥｃＲｒ３プライマー（全塩基配列（配列表の配列番号９）の６６８番〜６９２番の逆鎖に相当）およびキットに付属のＮＵＰプライマーを用い、９５℃で１分加熱後、９５℃（３０秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（５分）を１サイクルとして、３５サイクル増幅するという条件で行った。このＤＮＡ溶液を、１．５％アガロース電気泳動により分画し、約６００〜１１００ｂｐの部分を抽出、精製した。精製はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、プロトコールに従い行った。この精製ＤＮＡを、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  ＳｙｓｔｅｍＩ（プロメガ社製）を用いて、そのプロトコールに従いＴＡクローニングを行い、塩基配列（全塩基配列（配列表の配列番号９）の１番〜６６７番に相当）を決定した。塩基配列の決定方法は、前記の通りである。使用したプライマーの配列を以下に示す。
【０１１６】
ＮｃＥｃＲｒ１：ＧＣＧＴＣＧＣＡＴＡＴＡＣＡＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣ
ＮｃＥｃＲｒ２：ＧＣＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＡＣＣＧＣＧ
ＮｃＥｃＲｒ３：ＣＧＣＧＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＴＧＣＴＴＣＧＴＣＴＧ
【０１１７】
以上のようにして得られた４本のクローンを重ね合わせて（Ｇｅｎｅｔｙｘ  ｖｅｒ．７）、ツマグロヨコバイ由来のエクダイソンリセプターｃＤＮＡの全長配列（配列表の配列番号９）を決定した。
【０１１８】
実施例２  ツマグロヨコバイ（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ  ｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓ）由来のエクダイソンリセプター（ＥｃＲ）遺伝子の調製
決定したツマグロヨコバイ由来のエクダイソンリセプターｃＤＮＡ全長配列から、他の昆虫のエクダイソンリセプターのアミノ酸配列（例えば、Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ由来のエクダイソンリセプター（ｇｉ：４４０５７９９））と比較してオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を推定し、以下に述べるプライマーを設計し２回のＰＣＲを経て、ツマグロヨコバイ（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ  ｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓ）由来のエクダイソンリセプター（ＥｃＲ）のＯＲＦクローンを得た。
【０１１９】
すなわち１回目のＰＣＲは、鋳型として実施例１に記載の３'−ＲＡＣＥ  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡを用い、プライマーとしてＮｃＥｃＲＯＲＦｆ１プライマー（全塩基配列（配列表の配列番号９）の１５６番〜１７５番に相当）およびＮｃＥｃＲＯＲＦｒ１プライマー（全塩基配列（配列表の配列番号９）の１７１３番〜１７３２番の逆鎖に相当）を用い、酵素としてＫＯＤｐｌｕｓポリメラーゼ（東洋紡社製）を用い、９５℃で１分加熱後、９５℃（３０秒）、５４℃（３０秒）、６８℃（２分３０秒）を１サイクルとして、３０サイクル増幅するという条件で行い、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲは鋳型としてＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００ＨＲ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて精製した１回目のＰＣＲ産物を用い、プライマーとしてＮｃＥｃＲＯＲＦｆ２プライマー（ＣＡＣＣの下流に全塩基配列（配列表の配列番号９）の１８６番〜２０５番に相当する塩基配列を付加）およびＮｃＥｃＲＯＲＦｒ２プライマー（ＧＣＧＧＣＣＧＣの下流に全塩基配列（配列表の配列番号９）の１６８９番〜１７０６番の逆鎖に相当する塩基配列を付加）を用い、酵素としてＫＯＤｐｌｕｓポリメラーゼ（東洋紡社製）を用い、９５℃で１分加熱後、９５℃（３０秒）、５８℃（３０秒）、６８℃（２分３０秒）を１サイクルとして、３０サイクル増幅するという条件で行った。このＤＮＡ溶液を、１．５％アガロース電気泳動により分画し、約１５００ｂｐの部分を抽出、精製した。精製はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、プロトコールに従い行った。得られた精製ＰＣＲ産物を９５℃で２０分処理し、冷却後、２ｍＭｄＡＴＰ溶液、ＥＸ  Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を加え、７０℃で１５分反応させアデニン残基を付加した。その後、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００ＨＲ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてゲルろ過精製した。使用したプライマーの配列を以下に示す。
【０１２０】
ＮｃＥｃＲＯＲＦｆ１：ＧＡＣＧＴＧＴＧＡＴＧＣＧＧＴＧＴＴＣＧ
ＮｃＥｃＲＯＲＦｒ１：ＧＣＡＧＴＧＣＧＧＴＡＧＣＡＧＡＴＧＡＣ
ＮｃＥｃＲＯＲＦｆ２：ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＴＧＡＣＧＣＡＴＧＡＴＣＣ
ＮｃＥｃＲＯＲＦｒ２：ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＧＧＣＧＴＣＡＣＧＴＣＣＣＡ
【０１２１】
得られたＰＣＲ産物１０  μＬを９５℃で２０分処理し、冷却後、２ｍＭ  ｄＡＴＰ溶液３  μＬ、ＥＸ  Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）０．２  μＬを加え、７０℃で１５分反応させアデニン残基を付加した。その後、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００ＨＲ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてゲルろ過精製した。
【０１２２】
次いで、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  ＳｙｓｔｅｍＩ（プロメガ社製）のプロトコールに従い、ＴＡクローニングを行い、塩基配列を確認しツマグロヨコバイエクダイソンリセプターＯＲＦ配列を含むｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ／ＮｃＥｃＲＯＲＦベクターを得た。塩基配列の確認方法は実施例１に同じである。
【０１２３】
実施例３  ツマグロヨコバイ（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ  ｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓ）由来のウルトラスピラクル（ＵＳＰ）の全長配列の決定
実施例１に記載の３'−ＲＡＣＥ  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡを鋳型とし、ＵＳＰｆ１プライマー（アミノ酸配列のＹＰＰＮＨＰＬをコード）およびＵＳＰｒ１プライマー（アミノ酸配列のＥＡＶＱＥＥＲを逆向きにコード）のデジェネレイトプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、酵素としてＥＸ  Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、９５℃で１分加熱後、９５℃（３０秒）、４８℃（３０秒）、７２℃（１分３０秒）を１サイクルとして、３５サイクル増幅するという条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００ＨＲ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてゲルろ過精製し、これを鋳型として再度ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＵＳＰｆ２プライマー（アミノ酸配列のＧＫＨＹＧＶＹをコード）およびＵＳＰｒ２プライマー（アミノ酸配列のＹＣＲＹＱＫＣを逆向きにコード）のデジェネネイトプライマーを用い、酵素としてＥＸ  Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、９５℃で１分加熱後、９５℃（３０秒）、４８℃（３０秒）、７２℃（１分３０秒）を１サイクルとして、３５サイクル増幅するという条件で行った。このＤＮＡ溶液を、２％アガロース電気泳動により分画し、約１００〜２００ｂｐの部分を抽出、精製した。精製はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、プロトコールに従い行った。この精製ＤＮＡを、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  ＳｙｓｔｅｍＩ（プロメガ社製）を用いて、そのプロトコールに従いＴＡクローニングを行い、塩基配列を決定した（全塩基配列（配列表の配列番号１０）の６４４番〜７５７番に相当）。次いで、決定した塩基配列中にプライマーを設計して、５'ＲＡＣＥおよび３'ＲＡＣＥを、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて行い、さらにｐＧＥＭ−Ｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  ＳｙｓｔｅｍＩ（プロメガ社製）に従い、ＴＡクローニングを行い、塩基配列を決定した（全塩基配列（配列表の配列番号１０）の６４４番〜７５７番に相当）。塩基配列の決定方法は、実施例１に同じである。使用したデジェネレイトプライマーの配列を以下に示す。次いで、決定した塩基配列中にプライマーを設計して、５'ＲＡＣＥおよび３'ＲＡＣＥを、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて行い、さらにｐＧＥＭ−Ｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  ＳｙｓｔｅｍＩ（プロメガ社製）に従い、ＴＡクローニングを行い、塩基配列を決定した。塩基配列の決定方法は、実施例１に同じである。
【０１２４】
ＵＳＰｆ１：ＴＡＹＣＣＮＣＣＮＡＡＹＣＡＹＣＣＩＹＴ
ＵＳＰｒ１：ＣＫＹＴＣＹＴＣＹＴＧＮＡＣＩＧＣＹＴＣ
ＵＳＰｆ２：ＧＧＮＡＡＲＣＡＹＴＡＹＧＧＮＧＴＩＴＡＹ
ＵＳＰｒ２：ＣＡＹＴＴＹＴＧＲＴＡＩＣＫＲＣＡＲＴＡ
【０１２５】
３'ＲＡＣＥは以下のような条件にて行った。すなわち１回目のＰＣＲは、鋳型として前述の３'−ＲＡＣＥ  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡを用い、プライマーとしてＮｃＵＳＰｆ１プライマー（全塩基配列（配列表の配列番号１０）の６７８番〜６９７番に相当）およびキット付属のＵＰＭプライマーを用い、酵素としてＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、９５℃で１分加熱後、９５℃（３０秒）、５０℃（１分）、７２℃（４分）を１サイクルとして、３５サイクル増幅するという条件で行い、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲは鋳型としてＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００ＨＲ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてゲルろ過精製した１回目のＰＣＲ産物を用い、プライマーとしてＮｃＵＳＰｆ２プライマー（全塩基配列（配列表の配列番号１０）の６９６番〜７１５番に相当）およびキット付属のＮＵＰプライマーを用い、９５℃（３０秒）、５５℃（１分）、７２℃（４分）を１サイクルとして、３５サイクル増幅するという条件で行った。。このＤＮＡ溶液を、１．５％アガロース電気泳動により分画し、約１２００ｂｐの部分を抽出、精製した。精製はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、プロトコールに従い行った。得られたＤＮＡ溶液をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  ＳｙｓｔｅｍＩ（プロメガ社製）に従い、ＴＡクローニングを行い、塩基配列（全塩基配列（配列表の配列番号１０）の７１６番〜１９０９番に相当）を決定した。塩基配列の決定方法は、実施例１に同じである。使用したプライマーの配列を以下に示す。
【０１２６】
ＮｃＵＳＰｆ１：ＣＡＧＴＴＣＧＣＡＡＡＧＡＣＴＴＧＡＣＧ
ＮｃＵＳＰｆ２：ＣＧＴＡＴＧＣＡＴＧＣＡＧＧＧＡＧＧＡＧ
【０１２７】
５'ＲＡＣＥは以下のような条件にて行った。まず、ツマグロヨコバイより調製したｍＲＮＡ溶液を鋳型とし、ＮｃＵＳＰｒ１プライマー（全塩基配列（配列表の配列番号１０）の７３１番〜７５０番の逆鎖に相当）をプライマーとし、キット付属のＳＭＡＲＴＩＩオリゴヌクレオチド共存下、酵素としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン社製）を用いて５'−ＲＡＣＥ  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡを合成した。これを鋳型とし、プライマーとしてＮｃＵＳＰｒ２プライマー（全塩基配列（配列表の配列番号１０）の７０８番〜７２７番の逆鎖に相当）およびキット付属のＵＰＭプライマーを用い、酵素としてＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、９５℃で１分加熱後、９５℃（３０秒）、５０℃（３０秒）、７２℃（１分３０秒）を１サイクルとして、２５サイクル増幅するという条件で１回目のＰＣＲを行い、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲは鋳型としてＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００ＨＲ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて精製した１回目のＰＣＲ産物を用い、プライマーとしてＮｃＵＳＰｒ３プライマー（全塩基配列（配列表の配列番号１０）の６９１番〜７１０番の逆鎖に相当）およびキット付属のＮＵＰプライマーを用い、９５℃で１分加熱後、９５℃（３０秒）、５０℃（３０秒）、７２℃（１分３０秒）を１サイクルとして、３５サイクル増幅するという条件で行った。このＤＮＡ溶液を、１．５％アガロース電気泳動により分画し、約６００〜８００ｂｐの部分を抽出、精製した。精製はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、プロトコールに従い行った。ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  ＳｙｓｔｅｍＩ（プロメガ社製）に従い、ＴＡクローニングを行い、塩基配列（全塩基配列（配列表の配列番号１０）の１番〜６９０番に相当）を決定した。塩基配列の決定方法は、実施例１に同じである。使用したプライマーの配列を以下に示す。
【０１２８】
ＮｃＵＳＰｒ１：ＣＴＧＴＴＣＣＴＣＴＧＣＣＴＣＴＴＧＴＣ
ＮｃＵＳＰｒ２：ＣＡＧＡＣＡＡＣＴＴＴＴＣＴＣＣＴＣＣＣ
ＮｃＵＳＰｒ３：ＣＣＣＴＧＣＡＴＧＣＡＴＡＣＧＴＣＡＡＧ
【０１２９】
以上のようにして得られた３本のクローンを重ね合わせて（Ｇｅｎｅｔｙｘ  ｖｅｒ．７）、ツマグロヨコバイ由来のウルトラスピラクルｃＤＮＡの全長配列（配列表の配列番号１０）を決定した。
【０１３０】
実施例４  ツマグロヨコバイ（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ  ｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓ）由来のウルトラスピラクル（ＵＳＰ）ＯＲＦクローンの取得
決定したツマグロヨコバイ由来のウルトラスピラクルｃＤＮＡ全長配列から、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を他の昆虫のウルトラスピラクルのアミノ酸配列（例えば、Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ由来のウルトラスピラクル（ｇｉ：３３９４３１７８））と比較して推定し、プライマーを設計した。２回のＰＣＲを経て、ツマグロヨコバイ（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ  ｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓ）由来のウルトラスピラクル（ＵＳＰ）ＯＲＦクローンを得た。
【０１３１】
すなわち１回目のＰＣＲは、鋳型として実施例１に記載の３'−ＲＡＣＥ  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡを用い、プライマーとしてＮｃＵＳＰＯＲＦｆ１プライマー（全塩基配列（配列表の配列番号１０）の２５０番〜２６９番に相当）およびＮｃＵＳＰＯＲＦｒ１プライマー（全塩基配列（配列表の配列番号１０）の１６１４番〜１６３６番の逆鎖に相当）を用い、酵素としてＫＯＤｐｌｕｓポリメラーゼ（東洋紡社製）を用い、９５℃で２分加熱後、９５℃（３０秒）、５４℃（３０秒）、６８℃（２分３０秒）を１サイクルとして、３０サイクル増幅するという条件で行い、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲは鋳型としてＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００ＨＲ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて精製した１回目のＰＣＲ産物を用い、プライマーとしてＮｃＵＳＰＯＲＦｆ２プライマー（配列番号３８：ＣＡＣＣの下流に全塩基配列（配列番号８）の３６８番〜３８８番に相当する塩基配列を付加）およびＮｃＵＳＰＯＲＦｒ２（ＧＣＧＧＣＣＧＣの下流に全塩基配列（配列表の配列番号１０）の１５３２番〜１５４９番の逆鎖に相当する塩基配列を付加）プライマーを用い、９５℃で２分加熱後、９５℃（３０秒）、５８℃（３０秒）、６８℃（２分３０秒）を１サイクルとして、３０サイクル増幅するという条件で行った。得られたＰＣＲ産物をＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００ＨＲ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてゲルろ過精製した。この精製ＤＮＡを、９５℃で２０分処理し、冷却後、２ｍＭ  ｄＡＴＰ溶液、ＥＸ  Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を加え、７０℃で１５分反応させアデニン残基を付加した。その後、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００ＨＲ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてゲルろ過精製した。次いで、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  ＳｙｓｔｅｍＩ（プロメガ社製）のプロトコールに従い、ＴＡクローニングを行い、塩基配列を確認し、ツマグロヨコバイウルトラスピラクルＯＲＦ配列を含むｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ／ＮｃＵＳＰＯＲＦベクターを得た。塩基配列の決定方法は、実施例１に同じである。使用したプライマーの配列を以下に示す。
【０１３２】
ＮｃＵＳＰＯＲＦｆ１：ＣＴＴＣＡＡＴＡＧＡＡＡＧＴＧＧＧＣＣＡ
ＮｃＵＳＰＯＲＦｒ１：ＣＴＣＴＴＴＴＣＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧＴＴＣ
ＮｃＵＳＰＯＲＦｆ２：ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＣＴＴＣＴＧＡＣＡＧＡＧＧＧ
ＮｃＵＳＰＯＲＦｒ２：ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＴＣＧＡＴＴＴＧＴＧＡＡＴＣ
【０１３３】
実施例５  ゲルシフトアッセイ
（１）ツマグロヨコバイＥｃＲのインビトロ転写・翻訳用発現ベクターの構築
ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ／ＮｃＥｃＲＯＲＦベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡社製）、ＮｏｔＩ（東洋紡社製）で切断し、次いで、１．５％アガロース電気泳動により分画し、ツマグロヨコバイ由来のエクダイソンリセプターのＯＲＦ配列を含む約１５００ｂｐの断片を抽出、精製した。精製はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、プロトコールに従い行った。（このＤＮＡ断片をＮｃＥｃＲＯＲＦ／ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩと表記する。）
【０１３４】
ｐＴＮＴベクター（プロメガ社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡社製）、ＮｏｔＩ（東洋紡社製）で切断し、次いで、１．５％アガロース電気泳動により分画し、約２８００ｂｐの断片を抽出、精製した。精製はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、プロトコールに従い行った。（このＤＮＡ断片をｐＴＮＴ／ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩと表記する。）
【０１３５】
ＮｃＥｃＲＯＲＦ／ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩとｐＴＮＴ／ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩをＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を使用し、プロトコールに従い接続し、氷上で３０分、次いで４２℃で３０秒処理した後、大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセル（東洋紡社製）の培地に添加し、大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルを培養した。形質転換されたクローンを青白判定によりクローニングし、得られたクローンからツマグロヨコバイＥｃＲのインビトロ転写・翻訳用発現ベクターｐＴＮＴ／ＮｃＥｃＲＯＲＦを得た。
【０１３６】
（２）ツマグロヨコバイＵＳＰのインビトロ転写・翻訳用発現ベクターの構築
ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ／ＮｃＵＳＰＯＲＦベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡社製）、ＮｏｔＩ（東洋紡社製）で切断し、次いで、１．５％アガロース電気泳動により分画し、ツマグロヨコバイ由来のＵＳＰのＯＲＦ配列を含む約１２００ｂｐの断片を抽出、精製した。精製はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、プロトコールに従い行った。（このＤＮＡ断片をＮｃＵＳＰＯＲＦ／ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩと表記する。）
【０１３７】
ｐＴＮＴベクター（プロメガ社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡社製）、ＮｏｔＩ（東洋紡社製）で切断し、次いで、１．５％アガロース電気泳動により分画し、約２８００ｂｐの断片を抽出、精製した。精製はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、プロトコールに従い行った。（このＤＮＡ断片をｐＴＮＴ／ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩと表記する。）
【０１３８】
ＮｃＵＳＰＯＲＦ／ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩとｐＴＮＴ／ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩをＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を使用し、プロトコールに従い接続し、前記実施例５（１）と同様に大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセル（東洋紡社製）を形質転換することにより、、ツマグロヨコバイＵＳＰのインビトロ転写・翻訳用発現ベクターｐＴＮＴ／ＮｃＵＳＰＯＲＦを構築した。
【０１３９】
（３）ツマグロヨコバイ由来エクダイソンリセプター蛋白質、ウルトラスピラクル蛋白質の合成
ＴＮＴ  Ｔ７  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いた。ｐＴＮＴ／ＮｃＥｃＲＯＲＦ１μｇ、ＴＮＴ  Ｔ７  Ｑｕｉｃｋ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ４０  μＬ、１ｍＭ  メチオニン１  μＬ、総反応液５０  μＬで、３０℃、８０分反応させ、ツマグロヨコバイ由来エクダイソンリセプター蛋白質の合成を行った。このまま、特別な精製をすること無しにゲルシフトアッセイに用いた。（この蛋白質をＮｃＥｃＲ蛋白質と表記する。）
【０１４０】
同様に、ｐＴＮＴ／ＮｃＵＳＰＯＲＦ１  μｇ、ＴＮＴ  Ｔ７  Ｑｕｉｃｋ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ４０  μＬ、１ｍＭメチオニン１  μＬ、総反応液５０  μＬで、３０℃、８０分反応させ、ツマグロヨコバイ由来ウルトラスピラクル蛋白質の合成を行った。このまま、特別な精製をすること無しにゲルシフトアッセイに用いた。（この蛋白質をＮｃＵＳＰ蛋白質と表記する。）
【０１４１】
（４）ゲルシフトアッセイ
ＬｉｇｈｔＳｈｉｆｔ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ＥＭＳＡ  ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を使用し、そのプロトコールに従ってゲルシフトアッセイを行った。すなわち表１の組成に従い、１０×Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ、５０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ｐｏｌｙ（ｄＩ／ｄＣ）、１％  ＮＰ−４０（以上キット付属品：以下ライセートという。）、滅菌水、ＮｃＥｃＲ蛋白質、ＮｃＵＳＰ蛋白質、２０ヒドロキシエクダイソン（２０Ｅ）、エタノールを混合し、室温で２０℃静置した後に、ビオチン化ｈｓｐ２７プローブ、非ビオチン化ｈｓｐ２７プローブを加え、室温で３０℃結合反応を行った。なお、ビオチン化ｈｓｐ２７プローブは、等量のビオチン化ポリヌクレオチドＢｉｏ−ｈｓｐ２７ｆとビオチン化ポリヌクレオチドＢｉｏ−ｈｓｐ２７ｒを、アニーリングバッファー（２０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中、８５℃で５分加熱後、１時間以上かけて４５℃まで冷却し、アニーリングさせることにより調製した。ｈｓｐ２７プローブもポリヌクレオチドｈｓｐ２７ｆとポリヌクレオチドｈｓｐ２７ｒを同様の方法によりアニーリングさせることにより調製した。ビオチン化ポリヌクレオチドＢｉｏ−ｈｓｐ２７ｆ、ビオチン化ポリヌクレオチドＢｉｏ−ｈｓｐ２７ｒ、ｈｓｐ２７ｆ及びポリヌクレオチドｈｓｐ２７ｒはインビトロジェン社より購入し、配列は以下に示すとおりである。
【０１４２】
Ｂｉｏ−ｈｓｐ２７ｆ：Ｂｉｏ−ＧＡＣＡＡＧＧＧＴＴＣＡＡＴＧＣＡＣＴＴＧＴＣ
Ｂｉｏ−ｈｓｐ２７ｒ：Ｂｉｏ−ＧＡＣＡＡＧＴＧＣＡＴＴＧＡＡＣＣＣＴＴＧＴＣ
ｈｓｐ２７ｆ：ＧＡＣＡＡＧＧＧＴＴＣＡＡＴＧＣＡＣＴＴＧＴＣ
ｈｓｐ２７ｒ：ＧＡＣＡＡＧＴＧＣＡＴＴＧＡＡＣＣＣＴＴＧＴＣ
【０１４３】
【表１】
2007097589.tif 000003
【０１４４】
結合反応終了後、それぞれにＬｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（キット付属品）５  μＬを加え４％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動にて分画した。次いでプロトコールに記載の方法により、ビオチン化プローブを検出した。その結果を図１に示す。電気泳動終了後、０．５×ＴＢＥ中、４０〜４５Ｖ（約２００ｍＡ）で１時間、ＨｙｂｏｎｄＮ＋（アマシャムバイオサイエンス社製）に転写した。
【０１４５】
得られた膜を１２０ｍＪ／ｃｍ2でクロスリンク後、ＬｉｇｈｔＳｈｉｆｔ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ中で１５分間、ゆっくり撹拌した。その後ＬｉｇｈｔＳｈｉｆｔ  ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ中で５分間の洗浄を４回行い、次いでＬｉｇｈｔＳｈｉｆｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ中で５分間ゆっくり撹拌した。次いでＬｉｇｈｔＳｈｉｆｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを作用させた後、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ（アマシャムバイオサイエンス社）に感光させ、図１に示す結果を得た。
【０１４６】
左から１レーン、２レーン、一番右が１２レーンである。ＮｃＥｃＲ蛋白質とＮｃＵＳＰ蛋白質が共存していないレーン１からレーン６まではゲルシフトは検出されず、ＮｃＥｃＲ蛋白質とＮｃＵＳＰ蛋白質を共存させたレーン７ではゲルシフトが検出され、さらにそこに２０−ヒドロキシエクダイソンを共存させるとバンドが濃くなることが明らかとなった（レーン９、１０、１１）。また、ビオチン化ｈｓｐ２７プローブに非ビオチン化ｈｓｐ２７プローブを共存させたレーン１２ではゲルシフトが検出されないことから、レーン７から１１に見られるシフトバンドは、ＮｃＥｃＲ蛋白質とＮｃＵＳＰ蛋白質が複合体を形成して、ｈｓｐ２７プローブに結合したものであることが証明された。
【０１４７】
実施例６  酵母ツーハイブリッドアッセイ
（１）ツマグロヨコバイエクダイソンリセプターＤＥＦ領域を含むエントリーベクターの調製
ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ／ＮｃＥｃＲＯＲＦベクターを鋳型とし、プライマーとしてＮｃＥ  ｃＲＤＥＦｆ１プライマー（ＣＡＣＣの下流に全塩基配列（配列表の配列番号９）の７９２番〜８０７番に相当するヌクレオチドを付加）およびＮｃＥｃＲＯＲＦｒ２プライマー（ＧＣＧＧＣＣＧＣの下流に全塩基配列（配列表の配列番号９）の１６８９番〜１７０６番の逆鎖に相当する塩基配列を付加）を用い、酵素としてＫＯＤｐｌｕｓポリメラーゼ（東洋紡社製）を用い、９５℃（３０秒）、５０℃（３０秒）、６８℃（９０秒）を１サイクルとして、３０サイクル行うという条件で行い、ツマグロヨコバイエクダイソンリセプターのＤＥＦ領域がつながった配列を増幅した。次いで、１．５％アガロース電気泳動により分画し、ツマグロヨコバイ由来のエクダイソンリセプターのＤＥＦ領域を含む約９００ｂｐの断片を抽出、精製した。精製はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、プロトコールに従い行った。この約９００ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＥＮＴＲ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔｓ（インビトロジェン社製）を用いて、そのプロトコールに従い、キット付属のｐＥＮＴＲ  ＴＯＰＯ  ベクターに接続し、前記実施例５（１）と同様に大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセル（東洋紡社製）を形質転換することにより、、エントリーベクターにツマグロヨコバイエクダイソンリセプターＤＥＦ領域を挿入したｐＥＮＴＲ／ＮｃＥｃＲＤＥＦを得た。塩基配列の決定方法は、実施例１に同じである。使使用したプライマーの配列を以下に示す。
【０１４８】
ＮｃＥｃＲＤＥＦｆ１：ＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＧＡＧＴＧＣＧＴＴＧ
【０１４９】
（２）ツマグロヨコバイウルトラスピラクルＤＥＦ領域を含むエントリーベクターの調製
ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ／ＮｃＵＳＰＯＲＦベクターを鋳型とし、プライマーとしてＮｃＵＳＰＤＥＦｆ１プライマー（ＣＡＣＣの下流に全塩基配列（配列表の配列番号１０）の７９４番〜８０９番に相当するヌクレオチドを付加）およびＮｃＵＳＰＯＲＦｒ２プライマー（ＧＣＧＧＣＣＧＣの下流に全塩基配列（配列表の配列番号１０）の１５３２番〜１５４９番の逆鎖に相当する塩基配列を付加）を用い、酵素としてＫＯＤｐｌｕｓポリメラーゼ（東洋紡社製）を用い、９５℃（３０秒）、５０℃（３０秒）、６８℃（９０秒）を１サイクルとして、３０サイクル行うという条件で行い、ツマグロヨコバイウルトラスピラクルのＤＥＦ領域がつながった配列を増幅した。次いで、１．５％アガロース電気泳動により分画し、ツマグロヨコバイ由来のエクダイソンリセプターのＤＥＦ領域を含む約８００ｂｐの断片を抽出、精製した。精製はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、プロトコールに従い行った。この約８００ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＥＮＴＲ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔｓ（インビトロジェン社製）を用いて、そのプロトコールに従い、キット付属のｐＥＮＴＲ  ＴＯＰＯ  ベクターに接続し、前記実施例５（１）と同様に大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセル（東洋紡社製）を形質転換することにより、、エントリーベクターにツマグロヨコバイウルトラスピラクルＤＥＦ領域を挿入したｐＥＮＴＲ／ＮｃＵＳＰＤＥＦを得た。塩基配列の決定方法は、実施例１に同じである。使使用したプライマーの配列を以下に示す。
【０１５０】
ＮｃＵＳＰＤＥＦｆ１：ＣＡＣＣＡＡＧＡＧＧＧＡＧＧＣＴＧＴＧＣ
【０１５１】
（３）ツマグロヨコバイエクダイソンリセプターＤＥＦ領域とＧＡＬ４活性化領域の融合蛋白質発現用ベクターの調製
ＰｒｏＱｕｅｓｔ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  Ｇａｔｅｗａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（インビトロジェン社製）を用い、そのプロトコールに従い、ｐＤＥＳＴ２２（キットに付属）にツマグロヨコバイエクダイソンリセプターＤＥＦ領域を挿入した。すなわち、ｐＥＮＴＲ／ＮｃＥｃＲＤＥＦとｐＤＥＳＴ２２をＬＲバッファー中、ＬＲクロナーゼを２５℃で１時間作用させ、前記実施例５（１）と同様に大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセル（東洋紡社製）を形質転換することにより、、ツマグロヨコバイエクダイソンリセプターＤＥＦ領域とＧＡＬ４活性化領域の融合蛋白質発現用ベクターｐＤＥＳＴ２２／ＮｃＥｃＲＤＥＦを得た。
【０１５２】
（４）ツマグロヨコバイウルトラスピラクルＤＥＦ領域とＧＡＬ４ＤＮＡ結合領域の融合蛋白質発現用ベクターの調製
ＰｒｏＱｕｅｓｔ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  Ｇａｔｅｗａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（インビトロジェン社製）を用い、そのプロトコールに従い、ｐＤＥＳＴ３２（キットに付属）にツマグロヨコバイウルトラスピラクルＤＥＦ領域を挿入した。すなわち、ｐＥＮＴＲ／ＮｃＵＳＰＤＥＦとｐＤＥＳＴ３２をＬＲバッファー中、ＬＲクロナーゼを２５℃で１時間作用させ、前記実施例５（１）と同様に大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセル（東洋紡社製）を形質転換することにより、ツマグロヨコバイウルトラスピラクルＤＥＦ領域とＧＡＬ４ＤＮＡ結合領域の融合蛋白質発現用ベクターｐＤＥＳＴ３２／ＮｃＵＳＰＤＥＦを得た。
【０１５３】
（５）形質転換酵母の調製
ＰｒｏＱｕｅｓｔ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  Ｇａｔｅｗａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（インビトロジェン社製）を用い、そのプロトコールに従い、酵母ＭａＶ２０３コンピテントセル（インビトロジェン社製）にｐＤＥＳＴ２２／ＮｃＥｃＲＤＥＦ、ｐＤＥＳＴ３２／ＮｃＵＳＰＤＥＦを酢酸リチウム法でトランスフェクションし、酵母ツーハイブリッドアッセイ用形質転換酵母ＭａＶ２０５（ＤＢ−ＮｃＵＳＰＤＥＦ、  ＡＤ−ＮｃＥｃＲＤＥＦ）を得た。
【０１５４】
（６）酵母ツーハイブリッドアッセイの実施
Ｓｃ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ培地（Ｓｃ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ（Ｑ−ＢＩＯｇｅｎｅ社製）１．５９ｇ、Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ社製）６．７ｇ、Ｄ−グルコース（関東化学社製）２０ｇを蒸留水を加えて１ｌにし（ｐＨは６．０に調整）、滅菌して作製した。）で２５℃で１日振とう培養し、前培養液を作製した。本培養はＳｃ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ培地１  ｍＬに、前培養液２０  μＬ、試験サンプル溶液１０  μＬを加え、１６時間、２５℃、振とう培養という条件で行った。なお、サンプル添加は最終濃度の１００倍のエタノール溶液を培養液の１％を添加することにより行った。本培養終了後、ＯＤ６００値を測定し、以下のようにβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。８００  μＬの本培養液を１２，０００ｒｐｍで１０秒遠心分離し、上清を廃棄した。残渣を８００  μＬのＺバッファー（１６．１ｇ  Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ、５．５ｇ  ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ、０．７５ｇ  ＫＣｌ、０．２４６ｇ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏを蒸留水に溶解後、ｐＨ７．０に調整し、滅菌し作製した。）に縣濁させ、再度１２，０００ｒｐｍで１０秒遠心分離し、上清を廃棄した。この残渣に１００  μＬのＺバッファー、直径０．５ｍｍのガラスビーズ（シグマ社製）を加え、９０秒ボルテックスした。ここに、Ｚバッファー７００  μＬと２−メルカプトエタノール（ナカライテスク社製）１．９  μＬ、０．４％  ｏ−ニトロフェニル−β−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）含有Ｚバッファー１６０  μＬを加え、３０℃で反応させた。反応液が黄色くなってきたら、２００  μＬの１Ｍ  Ｎａ2ＣＯ3溶液を加え反応をストップさせた後に、ＯＤ４２０値を測定した。活性値はＯＤ４２０Ｘ１０００／（ＯＤ６００Ｘ反応時間（分）Ｘ使用本培養液量（ｍＬ））で表し、比活性はエタノール添加時の活性値を１として表した。試験サンプルはポナステロンＡ（和光純薬）、２０ヒドロキシエクダイソン（ＩＣＮ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、クロマフェノジド（日本化薬）を使用した。結果を表２に示す。
【０１５５】
【表２】
2007097589.tif 000004
【０１５６】
表２は酵母ツーハイブリッドアッセイの結果である。値はエタノールを投与した時の活性を１とした比活性で示してある。ポナステロンＡ、２０−ヒドロキシエクダイソン、クロマフェノジドを投与した時、いずれも濃度依存的に活性値が増加した。ポナステロンＡ、２０−ヒドロキシエクダイソンばかりでなくクロマフェノジドもエクダイソンリセプターとウルトラスピラクルの相互作用を強化する活性があることが明らかとなった。
【０１５７】
実施例７  レポータージーンアッセイ
（１）ツマグロヨコバイＥｃＲの発現ベクターの構築
ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ／ＮｃＥｃＲＯＲＦベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡社製）、ＮｏｔＩ（東洋紡社製）で切断し、次いで、１．５％アガロース電気泳動により分画し、ツマグロヨコバイ由来のエクダイソンリセプターのＯＲＦ配列を含む約１５００ｂｐの断片を抽出、精製した。精製はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、プロトコールに従い行った。（このＤＮＡ断片をＮｃＥｃＲＯＲＦ／ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩと表記する。）
【０１５８】
ｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓベクター（インビトロジェン社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡社製）、ＮｏｔＩ（東洋紡社製）で切断し、次いで、１．５％アガロース電気泳動により分画し、約３３００ｂｐの断片を抽出、精製した。精製はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、プロトコールに従い行った。（このＤＮＡ断片をｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ／ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩと表記する。）
【０１５９】
ＮｃＥｃＲＯＲＦ／ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩとｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ／ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩをＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を使用し、プロトコールに従い接続し、前記実施例５（１）と同様に大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセル（東洋紡社製）を形質転換することにより、、ツマグロヨコバイＥｃＲの発現ベクターｐＩＺＴ／ＮｃＥｃＲＯＲＦを得た。
【０１６０】
（２）ツマグロヨコバイＵＳＰの発現ベクターの構築
ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ／ＮｃＵＳＰＯＲＦベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡社製）、ＮｏｔＩ（東洋紡社製）で切断し、次いで、１．５％アガロース電気泳動により分画し、ツマグロヨコバイ由来のエクダイソンリセプターのＯＲＦ配列を含む約１２００ｂｐの断片を抽出、精製した。精製はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、プロトコールに従い行った。（このＤＮＡ断片をＮｃＵＳＰＯＲＦ／ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩと表記する。）
【０１６１】
ｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓベクター（インビトロジェン社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡社製）、ＮｏｔＩ（東洋紡社製）で切断し、次いで、１．５％アガロース電気泳動により分画し、約３３００ｂｐの断片を抽出、精製した。精製はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、プロトコールに従い行った。（このＤＮＡ断片をｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ／ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩと表記する。）
【０１６２】
ＮｃＵＳＰＯＲＦ／ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩとｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ／ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩをＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を使用し、プロトコールに従い接続し、前記実施例５（１）と同様に大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセル（東洋紡社製）を形質転換することにより、、ツマグロヨコバイＵＳＰの発現ベクターｐＩＺＴ／ＮｃＵＳＰＯＲＦを得た。
【０１６３】
（３）レポータージーンアッセイの実施
特開２００２−２９１４８９記載のレポータープラスミドｐＥｃＲＬＵＣ０．５μｇ、ｐＩＺＴ／ＮｃＥｃＲＯＲＦ５μｇにＳｃｈｎｅｉｄｅｒ'ｓ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地（インビトロジェン社製）を加え６００  μＬとし、ここにＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（インビトロジェン社製）２５  μＬを加え、数秒間ボルテックスにかけよく混合し、３０分間室温放置した。これをＳｃｈｎｅｉｄｅｒ'ｓ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地（インビトロジェン社製）に懸濁したＳ２細胞（約１０００００００細胞／ｍＬ）を４．４  ｍＬに加え、９６穴プレートに５０  μＬずつ分注し、２５℃で５時間培養した。次いで、最終濃度の１０倍濃度サンプル溶液（１％ＤＭＳＯ含有ＰＢＳ溶液）を１０  μＬ、１０％Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）含有Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ'ｓ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地を４０  μＬ加え、軽く混合し２５℃で１夜培養した。次に以下の方法でルシフェラーゼ活性の測定を行った。ウェル中の培地を除去し、３０μＬの細胞溶解試薬（２５ｍＭ  トリス−リン酸バッファー（ｐＨ７．８）、２ｍＭ  ジチオトレイトール、２ｍＭ  ＣＤＴＡ、０．２％トライトンＸ−１００、１０％グリセロール）を添加した後、時々攪拌しながら室温にて３０分間放置した。その後、−８０℃で１５分間凍結し、室温に戻し、この細胞溶解液２０  μＬを分取し、基質液（２０ｍＭ  トリシン−水酸化ナトリウム（ｐＨ７．８）、１．０７ｍＭ  塩基性炭酸マグネシウム、２．６７ｍＭ  硫酸マグネシウム、０．１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、３３．３ｍＭ  ジチオトレイトール、２７０μＭ  コエンザイムＡ、４７０μＭ  ルシフェリン、５３０μＭ  アデノシン三リン酸）２５  μＬを添加した後、ルミノメーター（アトー社製）にてその化学発光強度を測定した。試験サンプルはポナステロンＡ（和光純薬）、２０ヒドロキシエクダイソン（ＩＣＮ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、クロマフェノジド（日本化薬）を使用した。その結果を図２に示す。
【０１６４】
ポナステロンＡ、２０−ヒドロキシエクダイソンを添加した時には濃度依存的に活性の増加が見られたのに対し、ジベンゾイルヒドラジン系の化合物であり、鱗翅目用の殺虫剤として登録されているクロマフェノジドは１０００ｎＭにて、弱いながらも活性を示した。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】ゲルシフトアッセイの結果である。左から１レーン、２レーン、一番右が１２レーンである。ライセート、滅菌水及びビオチン化ｈｓｐ２７プローブは全てのレーンに含まれている。１レーン：ブランク１（ライセート＋ビオチン化ｈｓｐ２７プローブ＋滅菌水）；２レーン：ブランク２（ライセート＋ＴＮＴ  Ｔ７  Ｑｕｉｃｋ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ＋ビオチン化ｈｓｐ２７プローブ＋滅菌水）；３レーン：ＮｃＥｃＲ蛋白質；４レーン：ＮｃＥｃＲ蛋白質＋１×１０-3Ｍ  ２０−ヒドロキシエクダイソン；５レーン：ＮｃＵＳＰ蛋白質；６レーン：ＮｃＵＳＰ蛋白質＋１×１０-3Ｍ  ２０−ヒドロキシエクダイソン；７レーン：ＮｃＥｃＲ蛋白質＋ＮｃＵＳＰ蛋白質；８レーン：ＮｃＥｃＲ蛋白質＋ＮｃＵＳＰ蛋白質＋エタノール；９レーン：ＮｃＥｃＲ蛋白質＋ＮｃＵＳＰ蛋白質＋１×１０-5Ｍ  ２０−ヒドロキシエクダイソン；１０レーン：ＮｃＥｃＲ蛋白質＋ＮｃＵＳＰ蛋白質＋１×１０-4Ｍ  ２０−ヒドロキシエクダイソン；１１レーン：ＮｃＥｃＲ蛋白質＋ＮｃＵＳＰ蛋白質＋１×１０-3Ｍ  ２０−ヒドロキシエクダイソン；１２レーン：ＮｃＥｃＲ蛋白質＋ＮｃＵＳＰ蛋白質＋１×１０-3Ｍ  ２０−ヒドロキシエクダイソン＋非ビオチン化ｈｓｐ２７プローブ
【図２】レポータージーンアッセイの結果である。左から、白：コントロール、横線：ポナステロンＡ、縦線：２０−ヒドロキシエクダイソン、斜線：クロマフェノジド。各薬剤の濃度はいずれも左から１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１０００ｎＭ。
【配列表フリーテキスト】
【０１６６】
配列番号１：ツマグロヨコバイエクダイソンリセプターＯＲＦアミノ酸配列
配列番号２：ＧＡＬ４−活性化領域アミノ酸配列
配列番号３：ＧＡＬ４−ＤＮＡ結合領域アミノ酸配列
配列番号４：ツマグロヨコバイエクダイソンリセプターＯＲＦをコードするＤＮＡ
配列番号５：ＧＡＬ４−活性化領域ＤＮＡ
配列番号６：ＧＡＬ４−ＤＮＡ結合領域ＤＮＡ
配列番号７：ツマグロヨコバイウルトラスピラクルＯＲＦアミノ酸配列
配列番号８：ツマグロヨコバイウルトラスピラクルＯＲＦをコードするＤＮＡ
配列番号９：ツマグロヨコバイエクダイソンリセプター全長ｃＤＮＡ
配列番号１０：ツマグロヨコバイウルトラスピラクル全長ｃＤＮＡ
【図１】
2007097589.tif 000005
【図２】
2007097589.tif 000006
【配列表】
2007097589000001.app