(57)【要約】【課題】標的ＳＮＰ塩基の３’側にすぐ隣接する塩基がＡであり、もう一塩基隣の塩基がＣであるときに、擬陽性の可能性が極めて低く、かつ明確にＳＮＰ判別が可能なアレル特異性プライマーを提供する。【解決手段】３’末端塩基をＳＮＰ対応塩基とし、かつ３’末端から２番目の塩基はＣとし、かつ３’末端から３番目の塩基はＡかＴかＣのいずれかとし、かつ３’末端から４番目の塩基から５’末端の塩基までの塩基配列を、標的ＳＮＰ塩基から３’側に対して三塩基隣の塩基から所望の塩基までの配列に対して完全に相補的に設計する。【選択図】図２
2007097570.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡが有する標的塩基を判別する方法であって、
前記方法は、
（１）  Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣの４種類の塩基の中から前記標的塩基として予想される塩基と相補的な塩基を３’末端に有するアレル特異性プライマーを前記ＤＮＡに結合させてＤＮＡ伸長反応を生じさせるＤＮＡ伸長工程、および
（２）  前記ＤＮＡ伸長工程の効率を調べ、高効率であれば前記標的塩基は前記予想された塩基と同一であると判別され、低効率であれば前記標的塩基は前記予想された塩基とは異なると判別される判別工程
を有し、
前記ＤＮＡにおいて、前記標的塩基の３’末端側にすぐ隣接する塩基がＡであり、もう一塩基隣の塩基がＣであり、
前記アレル特異性プライマーの３’末端塩基が前記標的塩基であると予想される塩基と相補的であり、
前記アレル特異性プライマーの３’末端から２番目の塩基がＣであり、
前記アレル特異性プライマーの３’末端から３番目の塩基がＡかＴかＣのいずれかであり、かつ
前記アレル特異性プライマーの３’末端から４番目の塩基と５’末端の塩基との間の塩基配列が、前記アレル特異性プライマーの３’末端から４番目の塩基に対応する前記ＤＮＡ側の塩基と前記アレル特異性プライマーの５’末端の塩基に対応する前記ＤＮＡ側の塩基との間の塩基配列に相補的に結合する、方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡ伸長反応がプライマー伸長反応である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プライマー伸長反応により産生されるピロリン酸の濃度を調べることによって前記効率を調べる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ピロリン酸の濃度を発光強度として検出する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡ伸長反応がＰＣＲ反応である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＣＲ反応により産生された増幅ＤＮＡの濃度を、電気泳動法により測定することによって前記効率を調べる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＤＮＡが有する標的塩基を判別するためのアレル特異性プライマーであって、
前記ＤＮＡにおいて、前記標的塩基の３’末端側にすぐ隣接する塩基がＡであり、もう一塩基隣の塩基がＣであり、
前記アレル特異性プライマーの３’末端塩基が、Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣの４種類の塩基の中から前記標的塩基として予想される塩基と相補的であり、
前記アレル特異性プライマーの３’末端から２番目の塩基がＣであり、
前記アレル特異性プライマーの３’末端から３番目の塩基がＡかＴかＣのいずれかであり、かつ
前記アレル特異性プライマーの３’末端から４番目の塩基と５’末端の塩基との間の塩基配列が、前記標的塩基から３’末端側に３塩基隣の塩基から３’末端側の塩基配列に対して相補的に結合する、アレル特異性プライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡが有する標的塩基を判別する方法およびそれに用いられるアレル特異性プライマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＳＮＰは遺伝子多型の中で最も高頻度で現れる多型であり、ヒトゲノム中において約０．１％の頻度で現れると考えられている。
【０００３】
実際、これまでに３００万を超える数のＳＮＰの存在が明らかになってきており、このことはＳＮＰが遺伝子検査のマーカーとして非常に有用であることを示している。
【０００４】
これまでのＳＮＰと疾病の関連付けの研究によって、糖尿病や高血圧症などの疾病とＳＮＰが深く関連していることが明らかになってきている。
【０００５】
ＳＮＰ判別を行う技術として、アレル特異性プライマーによるプライマー伸長反応（ＰＣＲ反応を含む）を利用する技術が知られている。
【０００６】
アレル特異性プライマーとは、標的とするＳＮＰの塩基種に依存してプライマー伸長反応効率に著しい差が生じるプライマーのことを言う。
【０００７】
従って、例えばアレル特異性プライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、そのＰＣＲ産物量を解析することで簡単に標的ＳＮＰ塩基種を特定できる。
【０００８】
通常、アレル特異性プライマーは特に何の修飾もされていない単なるオリゴＤＮＡである。
【０００９】
ＰＣＲ産物量の解析にはいわゆる通常の電気泳動法を用いればよいため、アレル特異性プライマーによるＳＮＰ判別技術は、コストや反応時間、操作の簡便性といった面において非常に有利と言える。
【００１０】
解析方法については、上記の電気泳動法のみならず、固相系の反応を行えばＱＣＭやＳＰＲによって検出することも可能である。
【００１１】
さらに近年では、プライマー伸長反応の副産物であるＰＰｉ（ピロリン酸）を、ルシフェラーゼ反応を利用して検出する方法も開発されており、アレル特異性プライマーによるＳＮＰ判別の簡便化や迅速化は世界中において精力的に取り組まれている。
【００１２】
アレル特異性プライマーの配列設計は、そのＳＮＰ判別能において非常に重要なファクターである。
【００１３】
最も古典的な例は、３’末端塩基が標的ＳＮＰ塩基に対応しており（すなわち予想される標的ＳＮＰ塩基種のいずれかに相補的となる）、かつそれ以外の配列は標的ＤＮＡ配列に対して完全に相補的であるという例である。
【００１４】
しかし、この場合においては、その反応時間や温度、あるいは反応に用いるｄＮＴＰｓ濃度、またＰＣＲ法を用いるのであればサイクル数などの反応条件を厳密に規定しなければ、擬陽性の問題が生じる。
【００１５】
すなわち、本来であれば、プライマー３’末端のＳＮＰ対応塩基がサンプルの標的ＳＮＰ塩基と非相補的である場合は、そこからのプライマー伸長反応は起きてはいけないのだが、多くの場合において起きてしまう。
【００１６】
上述の擬陽性の問題を解決するために、これまでに幾つかの新規アレル特異性プライマーが開発されている。
【００１７】
特許文献１にて提案されたアレル特異性プライマーは、３’末端塩基がＳＮＰ対応塩基であり、かつ３’末端から３番目の塩基を、標的ＳＮＰ塩基から３’側に二塩基隣の塩基に対して意図的に非相補的にしたアレル特異性プライマーを開発している。
【００１８】
特許文献２では、３’末端から２番目の塩基がＳＮＰ対応塩基であり、かつ３’末端から３番目の塩基を、標的ＳＮＰ塩基から３’側に隣接している塩基に対して意図的に非相補的にしたアレル特異性プライマーが提案されている。この場合、３’→５’ｅｘｏ＋ポリメラーゼであるＫＯＤポリメラーゼを用いるのが特徴である。
【００１９】
特許文献３では、３’末端塩基がＳＮＰ対応塩基であり、かつ３’末端から２番目および３番目の塩基をそれぞれ、標的ＳＮＰ塩基から３’側に隣接する塩基と、もう一塩基隣の塩基に対して意図的に非相補的にしたアレル特異性プライマーが提案されている。これらの中で、特許文献３で提案されたアレル特異性プライマーは特に擬陽性の可能性が低い。
【００２０】
すなわち、上記のとおり設計された特許文献３のアレル特異性プライマーは、図１に示すように、その３’末端に位置するＳＮＰ対応塩基（図中では「Ｓ’」と示した）が標的ＳＮＰ塩基（図中では「Ｓ」と示した）と相補的である場合、３’末端から２番目および３番目の塩基のみが標的ＤＮＡ配列に対して非相補的となり（図中では、非相補的な塩基対を×と示した）、ループのような構造をとり得る（図１（ａ））。
【００２１】
その結果、ポリメラーゼは効率良く結合し、プライマー伸長反応を行う。
【００２２】
逆に、その３’末端に位置するＳＮＰ対応塩基が標的ＳＮＰ塩基と非相補的である場合、３’末端の三塩基全てが非相補的となり、枝分かれのような構造になると考えられる（図１（ｂ））。
【００２３】
この場合、プライマー伸長反応はほとんど起こらない。
【００２４】
ポリメラーゼの結合効率が極めて低くなるためと考えられるからである。
【００２５】
したがって特許文献３で提案されたアレル特異性プライマーは、上述のとおり擬陽性の可能性は極めて低くなる。
【００２６】
その他、本発明に関連する文献として、以下の文献を挙げることができる。
【００２７】
特許文献４には、イネの品種識別のために、３’末端が判別すべきＳＮＰ部位に対応し、３’末端から３番目の塩基が、アニールする鋳型配列と相補的な配列から置換されており、当該置換がＧからＡ、ＡからＣへ、ＴからＧへ、またはＣからＡへの置換であるＰＣＲプライマーが開示されている。
【００２８】
さらに、この特許文献４の段落番号００４０には、「１つの局面において、本発明は、３’末端から１番目、２番目、３番目、または４番目の塩基が置換されたプライマーを提供する。この置換は、１つのみであっても、２つ以上の組み合わせでもよい。好ましくは、３’末端から３番目の塩基のみが置換される。このプライマーの置換は、任意の置換であってよいが、好ましくは、ＧからＴ、ＡからＣへ、ＴからＧ、またはＣからＡの置換である。」と開示されている。
【特許文献１】米国特許公開第２００３／００４９６２８号
【特許文献２】米国特許公開第２００３／０１４８３０１号
【特許文献３】米国特許公開第２００４／０１９７８０３号
【特許文献４】特開２００４−２４８６３５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
特許文献３で提案されたアレル特異性プライマーは、その３’末端に位置するＳＮＰ対応塩基が標的ＳＮＰ塩基と非相補的である場合のプライマー伸長反応効率は極めて悪い。その結果、擬陽性の問題が解消されるため正確なＳＮＰ判別が可能となる。
【００３０】
しかし、３’末端に位置するＳＮＰ対応塩基が標的ＳＮＰ塩基と相補的である場合のプライマー伸長反応効率は、３’末端から２番目および３番目の塩基種および、それに対応する標的ＤＮＡ側の塩基種条件（より具体的には、標的ＳＮＰ塩基から３’側に隣接する塩基と、もう一塩基隣の塩基の塩基種条件）によってばらつく問題があった。
【００３１】
より具体的には、例えば、標的ＤＮＡ配列中の標的ＳＮＰ塩基種がＡ（アデニン）かＧ（グアニン）であり、そのＳＮＰ塩基の３’側にすぐ隣接する塩基種をＣ（シトシン）、もう一塩基隣の塩基種をＴ（チミン）とした場合、特許文献３で提案されたアレル特異性プライマーの３’末端塩基はＳＮＰ対応塩基であるため、Ｔ（Ａと相補的とする場合）かＣ（Ｇと相補的とする場合）とすれば良い。
【００３２】
一方、その３’末端から２番目および３番目の塩基は、標的ＤＮＡ配列に対して非相補的でないといけないため、２番目はＡ、Ｔ、Ｃのいずれかであり、また３番目はＴ、Ｇ、Ｃのいずれかとなる。
【００３３】
したがって、特許文献３で提案されたアレル特異性プライマーは、一種類の標的ＤＮＡ配列に対して、その３’末端から２番目および３番目の塩基種の組み合わせは合計９通りとなる。
【００３４】
いずれも非相補的であるという観点から、これらの９種類のアレル特異性プライマーは、ＳＮＰ判別に際してほぼ同じ効率を示すと思われる。
【００３５】
しかし、本発明者らは、これらの９種類のアレル特異性プライマーのうち、特定のアレル特異性プライマーが、他のアレル特異性プライマーと比較して、ＳＮＰ判別に際して非常に高い効率を示すという知見を見出し、本発明を完成させた。
【００３６】
すなわち、本発明は、擬陽性の可能性が少なく、かつ明確に判別することができるＤＮＡが有する標的塩基を判別する方法およびそれに用いられるアレル特異性プライマーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００３７】
本発明は、ＤＮＡが有する標的塩基を判別する方法であって、
この方法は、
（１）  Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｇ（グアニン）、およびＣ（シトシン）の４種類の塩基の中から前記標的塩基として予想される塩基と相補的な塩基を３’末端に有するアレル特異性プライマーをＤＮＡに結合させてＤＮＡ伸長反応を生じさせるＤＮＡ伸長工程、および
（２）  ＤＮＡ伸長工程の効率を調べ、高効率であれば標的塩基は予想された塩基と同一であると判別され、低効率であれば標的塩基は予想された塩基とは異なると判別される判別工程
を有し、
ＤＮＡにおいて、標的塩基の３’末端側にすぐ隣接する塩基がＡであり、もう一塩基隣の塩基がＣであり、
アレル特異性プライマーの３’末端塩基が標的塩基であると予想される塩基と相補的であり、
アレル特異性プライマーの３’末端から２番目の塩基がＣであり、
アレル特異性プライマーの３’末端から３番目の塩基がＡかＴかＣのいずれかであり、かつ
前記アレル特異性プライマーの３’末端から４番目の塩基と５’末端の塩基との間の塩基配列が、前記アレル特異性プライマーの３’末端から４番目の塩基に対応する前記ＤＮＡ側の塩基と前記アレル特異性プライマーの５’末端の塩基に対応する前記ＤＮＡ側の塩基との間の塩基配列に相補的に結合する。
【００３８】
ＤＮＡ伸長反応はプライマー伸長反応であることが好ましい。ＤＮＡ伸長反応は、上記アレル特異性プライマーのみからのプライマー伸長反応であることがより好ましい。
【００３９】
プライマー伸長反応により産生されるピロリン酸の濃度を調べることによって効率を調べることが好ましい。なお、ピロリン酸の濃度を発光強度として検出することが好ましい。
【００４０】
ＤＮＡ伸長反応はＰＣＲ反応であることも好ましい。ＤＮＡ伸長反応が、前記アレル特異性プライマーともう一つの異なるプライマーからなるＰＣＲ反応であることがより好ましい。
【００４１】
この場合、ＰＣＲ反応により産生された増幅ＤＮＡの濃度を、電気泳動法により測定することによって効率を調べることが好ましい。
【００４２】
上記方法に用いられるアレル特異性プライマーもまた、本発明の趣旨に包含される。
【発明の効果】
【００４３】
本発明により、擬陽性の可能性が極めて低く、かつ明確にＳＮＰ判別などが可能なＤＮＡが有する標的塩基を判別する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
以下本発明の実施の形態について図２〜図４を用いて説明する。
【００４５】
（実施の形態１）
本実施の形態１では、本発明におけるアレル特異性プライマーの塩基種条件について図２を用いて説明する。
【００４６】
本発明では、図２に示すように、標的ＤＮＡ配列として、標的塩基（以下、「標的ＳＮＰ塩基」という）が５’末端に存在し、かつ５’末端から２番目の塩基がＡであり、かつ５’末端から３番目の塩基がＣであるときを対象としている。
【００４７】
本発明の理解を容易にするために、図２では、標的ＳＮＰ塩基が５’末端に存在すると仮定している。しかし、一般的には、図１に示すように、標的ＳＮＰ塩基は標的ＤＮＡ配列のどこかに存在すれば良く、標的ＤＮＡ配列の５’末端に存在する必要はない。
【００４８】
アレル特異性プライマーの３’末端塩基はＳＮＰ対応塩基であるため、予想される標的ＳＮＰ塩基種が二種類（図２ではＳ１、Ｓ２と示した）である場合、そのいずれかと相補的であるように設計する。図２では、このＳＮＰ対応塩基をＳ１’とし、Ｓ１と相補的であるとしている。
【００４９】
さらにアレル特異性プライマーの３’末端から２番目の塩基はＣであり、かつ３’末端から３番目の塩基はＡかＴかＣのいずれかである。
【００５０】
アレル特異性プライマーの３’末端から４番目の塩基と５’末端の塩基との間の塩基配列（以下、「残余の塩基配列」または「アレル特異性プライマーの残余の塩基配列」ということがある）は、アレル特異性プライマーの３’末端から４番目の塩基に対応する標的ＤＮＡ側の塩基とアレル特異性プライマーの５’末端の塩基に対応する標的ＤＮＡ側の塩基との間の塩基配列（以下、「残余の塩基配列」または「標的ＤＮＡ側の残余の塩基配列」ということがある）と相補的であり、これらは結合する。
【００５１】
図２では、アレル特異性プライマーの３’末端から４番目の塩基から５’末端の塩基までの塩基配列は、標的ＤＮＡ配列中の５’末端から４番目の塩基から３’末端の塩基までの塩基配列に対して相補的である。
【００５２】
なお、アレル特異性プライマーの残余の塩基配列と標的ＤＮＡ側の残余の塩基配列との間は、完全に相補的であることが望ましいが、ＳＮＰ判別に悪影響を与えない限り、完全に相補的である必要はない。
【００５３】
本発明において、アレル特異性プライマーのＳＮＰ対応塩基が標的ＳＮＰ塩基と相補的な場合は、図２（ａ）のような関係になり、逆に、本発明におけるアレル特異性プライマーのＳＮＰ対応塩基が標的ＳＮＰ塩基と非相補的な場合は、図２（ｂ）のような関係になる。
【００５４】
なお、図２（および図１）において、符号「Ｘ」は、当該符号Ｘを間に挟む２つの塩基が結合しないことを意味する。
【００５５】
符号「Ｘ」が間に挟まれない２つの塩基（例えば、図１（ａ）、図２（ａ）の塩基Ｓ１および塩基Ｓ１’）は結合する。
【００５６】
このようなアレル特異性プライマーと標的ＤＮＡの配列条件下で、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性のないポリメラーゼを用いてＤＮＡ伸長反応（すなわち、代表的にはプライマー伸長反応またはＰＣＲ反応）を行うと、図２（ａ）の場合は非常に効率良く反応が進むのに対して、図２（ｂ）の場合はほとんど進まない。
【００５７】
このような効率の差からＤＮＡが有する標的ＳＮＰ塩基を判別することができる。
【００５８】
すなわち、ＤＮＡ伸長工程の効率を調べ、高効率であれば前記標的ＳＮＰ塩基は前記予想された塩基と同一であると判別され、低効率であれば前記標的ＳＮＰ塩基は前記予想された塩基とは異なると判別される。
【００５９】
その結果、擬陽性の可能性が極めて低く、かつ明確なＳＮＰ判別が可能となる。
【００６０】
（実施の形態２）
本実施の形態２では、本発明におけるアレル特異性プライマーを用いてプライマー伸長反応を行うことでＳＮＰを判別する方法について説明する。
【００６１】
図３に示すように、まず標的ＤＮＡ配列を含む二本鎖ＤＮＡについて、プライマー伸長反応を行えるように調製する。
【００６２】
ここで標的ＤＮＡ配列条件は、実施の形態１と同じく、標的ＳＮＰ塩基が５’末端に存在し、かつその５’末端から２番目の塩基がＡであり、かつその５’末端から３番目の塩基がＣである。
【００６３】
したがって、標的ＤＮＡ配列の相補鎖配列は、その３’末端塩基が標的ＳＮＰ塩基と相補的であり、かつその３’末端から２番目の塩基がＴであり、かつその３’末端から３番目の塩基がＧである。
【００６４】
このような配列条件を満たす二本鎖ＤＮＡを、上記のとおりプライマー伸長反応が行える状態に調製して、実施の形態１で示した配列条件を満たすアレル特異性プライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、ｄＮＴＰｓと、バッファーと、必要に応じて所望の塩を加えてプライマー伸長反応を行えばよい。
【００６５】
プライマー伸長反応の工程についてはこれまで知られている手順で良く、具体的には下記のとおりである。
【００６６】
すなわち、まず上記二本鎖ＤＮＡを変性させるために高温状態に置いた後、本発明におけるアレル特異性プライマーと標的ＤＮＡ配列が結合できるように温度を下げる。
【００６７】
その後、ＤＮＡポリメラーゼが伸長反応を行うことが可能な温度条件に設定すればよい。
【００６８】
この結果、アレル特異性プライマーの３’末端に位置するＳＮＰ対応塩基が標的ＳＮＰ塩基と相補的であれば、このアレル特異性プライマーからのプライマー伸長反応は効率良く行われる。
【００６９】
逆に、アレル特異性プライマーの３’末端に位置するＳＮＰ対応塩基が標的ＳＮＰ塩基と非相補的であれば、このアレル特異性プライマーからのプライマー伸長反応効率は著しく悪い。
【００７０】
したがって、このプライマー伸長反応の最中、あるいは反応後に、プライマー伸長反応の結果放出されるピロリン酸量を測定するなどしてそのプライマー伸長反応効率を調べればよい。
【００７１】
これによって、擬陽性の可能性が極めて低く、かつ明確なＳＮＰ判別が可能となる。プライマー伸長反応効率を調べる手段としてはピロリン酸量を測定する方法に限られない。
【００７２】
例えば、本発明におけるアレル特異性プライマーの５’末端側を水晶発振子上に固定した状態で、上記プライマー伸長反応を行い、その振動数変化を解析してプライマー伸長反応をモニタリングすることで、プライマー伸長反応効率を調べてもよい。
【００７３】
あるいは本発明におけるアレル特異性プライマーの５’末端側を金表面に固定した状態で、上記プライマー伸長反応を行い、その表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象を解析してプライマー伸長反応をモニタリングすることで、プライマー伸長反応効率を調べてもよい。
【００７４】
いずれにしてもプライマー伸長反応効率を調べることができればよい。
【００７５】
ここで、プライマー伸長反応を行う具体的手順は上記の手順に限られることはない。
【００７６】
すなわち、上記の手順では予め必要な試薬類を全て反応液中に混合した上でプライマー伸長反応を行わせるが、例えば、まず標的ＤＮＡ配列を含む二本鎖ＤＮＡおよびアレル特異性プライマーを溶かしたバッファー液（必要に応じて所望の塩を加えればよい）を用意し、高温による変性工程およびアレル特異性プライマーによる標的ＤＮＡ配列への結合を行った後、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓを順次加えることで反応を行わせてもよい。いずれにしてもプライマー伸長反応を行える工程とすればよい。
【００７７】
またここで、標的ＤＮＡ配列を含むＤＮＡがもともと一本鎖の場合、上記した二本鎖の場合と異なり、二本鎖ＤＮＡを変性させるという意味での高温条件下におく工程は必要ない。
【００７８】
しかし、この一本鎖ＤＮＡとアレル特異性プライマーの結合反応を制御する意味において、これら両者がまず十分解離した状態を調整する必要があるので、そのための高温条件下におく工程が、アレル特異性プライマーと標的ＤＮＡ配列との結合工程の前にあることがより好ましい。
【００７９】
ここで、上記ＤＮＡポリメラーゼは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が弱いか無いことがより好ましい。その方がよりＳＮＰ判別が正確となる。
【００８０】
さらに、上記ＤＮＡポリメラーゼは、上記プライマー伸長反応の手順によっては高温にさらされる場合がある。
【００８１】
その場合は、例えばＰＣＲに用いられるような耐熱性のものを用いる必要があるが、そのような高温にさらされることがない手順でプライマー伸長反応を行う場合は特にその必要はない。
【００８２】
ピロリン酸量を測定する方法については、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２００１，  Ｖｏｌ．２９，  Ｎｏ．１９  ｅ９３やＷＯ  ０３／０７８６５５  Ａ１や特開２００４−１４１１５８号公報などで提案されている方法がある。
【００８３】
しかしこれらに限られることはなく、ピロリン酸量が測定できればよい。
【００８４】
（実施の形態３）
本実施の形態３では、本発明におけるアレル特異性プライマーを用いてＰＣＲを行うことでＳＮＰを判別する方法について説明する。
【００８５】
図４に示すように、まず標的ＤＮＡ配列を含む二本鎖ＤＮＡについて、ＰＣＲ反応を行えるように調製する。ここで標的ＤＮＡ配列条件は、実施の形態１と同じく、標的ＳＮＰ塩基が５’末端に存在し、かつその５’末端から２番目の塩基がＡであり、かつその５’末端から３番目の塩基がＣである。
【００８６】
したがって、標的ＤＮＡ配列の相補鎖配列は、その３’末端塩基が標的ＳＮＰ塩基と相補的であり、かつその３’末端から２番目の塩基がＴであり、かつその３’末端から３番目の塩基がＧである。
【００８７】
このような配列条件を満たす二本鎖ＤＮＡを、上記のとおりＰＣＲ反応が行える状態に調製して、実施の形態１で示した配列条件を満たすアレル特異性プライマーと、このアレル特異性プライマーとフォワードプライマー／リバースプライマーの関係になる第二のプライマーと、ＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼと、ｄＮＴＰｓと、Ｍｇイオンと、バッファー、また必要であれば所望の塩を加えてＰＣＲ反応を行えばよい。
【００８８】
この結果、アレル特異性プライマーの３’末端に位置するＳＮＰ対応塩基が標的ＳＮＰ塩基と相補的であれば、このアレル特異性プライマーと第二のプライマーによって挟まれた領域のテンプレートＤＮＡは効率良く増幅される。
【００８９】
逆に、アレル特異性プライマーの３’末端に位置するＳＮＰ対応塩基が標的ＳＮＰ塩基と非相補的であれば、このアレル特異性プライマーと第二のプライマーによって挟まれた領域のテンプレートＤＮＡはほとんど増幅されない。
【００９０】
したがって、上記ＰＣＲ反応の後に、電気泳動などの方法によってこのテンプレートＤＮＡの増幅量を調べれば、擬陽性の可能性が極めて低く、かつ明確なＳＮＰ判別が可能となる。
【００９１】
あるいは、上記ＰＣＲ反応の最中、あるいは後に、ＰＣＲ反応の結果放出されるピロリン酸量を測定してもよい。この場合においても、擬陽性の可能性が極めて低く、かつ明確なＳＮＰ判別が可能である。
【００９２】
上記ＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が弱いか無いことがより好ましい。
【００９３】
テンプレートＤＮＡの増幅量を測定する方法は特に限られず、上記の電気泳動法以外でもよい。
【００９４】
ピロリン酸量を測定する方法については、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２００１，  Ｖｏｌ．２９，  Ｎｏ．１９  ｅ９３やＷＯ  ０３／０７８６５５  Ａ１や特開２００４−１４１１５８号公報などで提案されている方法がある。
【００９５】
しかしこれらに限られることはなく、ピロリン酸量が測定できればよい。
【００９６】
（実施の形態４）
本実施の形態４では、本発明におけるアレル特異性プライマーを含むＳＮＰ判別用キットについて説明する。
【００９７】
使用者らは、ここで説明するＳＮＰ判別用キットを用いてプライマー伸長反応およびピロリン酸測定反応を行うことで、各自のサンプル中の標的ＳＮＰ塩基種を擬陽性の可能性が極めて低く、かつ正確に判別可能となる。
【００９８】
本実施の形態４におけるＳＮＰ判別用キットは、標的ＤＮＡ配列に対して実施の形態１に示した本発明におけるアレル特異性プライマーを含むアレル特異性プライマー試薬チューブと、ＤＮＡポリメラーゼを含むＤＮＡポリメラーゼ試薬チューブと、必要に応じて所望の塩が添加されたバッファーを含むバッファー試薬チューブと、ｄＮＴＰｓを含むｄＮＴＰｓ試薬チューブと、ピロリン酸測定用試薬を含むピロリン酸試薬チューブからなる。
【００９９】
したがって使用者らは、まず各自の標的ＤＮＡ配列を含む一本鎖ＤＮＡあるいは二本鎖ＤＮＡのサンプルについて、プライマー伸長反応を行える状態に調製した後、上記アレル特異性プライマー試薬チューブに含まれたアレル特異性プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼ試薬チューブに含まれたＤＮＡポリメラーゼおよびバッファー試薬チューブに含まれたバッファーおよびｄＮＴＰｓ試薬チューブに含まれたｄＮＴＰｓを用いて、実施の形態２で説明した方法に従ってプライマー伸長反応を行えばよい。
【０１００】
プライマー伸長反応の過程で反応液中に放出されたピロリン酸は、上記ピロリン酸試薬チューブに含まれたピロリン酸測定用試薬を用いて測定することができる。
【０１０１】
したがってその測定結果によって標的ＳＮＰ塩基種を擬陽性の可能性が極めて低く、かつ正確に判別可能となる。
【０１０２】
ピロリン酸測定用試薬は、ピロリン酸測定ができるものであれば特に限定されないが、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２００１，  Ｖｏｌ．２９，  Ｎｏ．１９  ｅ９３で示されたようにルシフェラーゼによる発光反応を用いるのであれば、ピロリン酸をＡＴＰに変換するためのＡＴＰスルフリラーゼおよび、ＡＴＰと反応して発光反応（波長５２０ｎｍ）を行うルシフェリンおよび、その反応を触媒するルシフェラーゼを含む。
【０１０３】
これらは一本のチューブに混合された状態であってもよいし、それぞれ別々のチューブに含まれていてもよい。
【０１０４】
いずれにしても使用者らは、上記プライマー伸長反応の過程で放出されるピロリン酸をこれらのピロリン酸測定用試薬を用い、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２００１，  Ｖｏｌ．２９，  Ｎｏ．１９  ｅ９３で示された方法に準じて光学的にピロリン酸を測定することができる。
【０１０５】
さらにこの場合、プライマー伸長反応で未反応のまま残ったｄＡＴＰがルシフェリンと反応してしまうため、より好ましくは、これら未反応ｄＡＴＰを分解するための酵素を含むチューブもキットの一部として含まれる。
【０１０６】
この酵素は、上記のルシフェラーゼによる反応の前か、あるいはピロリン酸からＡＴＰへの変換反応の前において、プライマー伸長反応液に加えられｄＡＴＰ分解反応が行われることが好ましい。
【０１０７】
ピロリン酸測定用試薬については、ＷＯ  ０３／０７８６５５  Ａ１で示されたピロリン酸の電気化学的測定法を用いるのであれば、ピロリン酸をリン酸に加水分解するためのピロホスファターゼおよび、このリン酸と反応するＧＡＰ（グリセルアルデヒド３−リン酸）とＮＡＤおよび、このリン酸−ＧＡＰ−ＮＡＤの反応を触媒するＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ）および、このリン酸−ＧＡＰ−ＮＡＤの反応より得られるＮＡＤＨと反応する電子メディエータ（酸化型）および、このＮＡＤＨと電子メディエータとの反応を触媒するジアホラーゼを含む。
【０１０８】
これらは一本のチューブに混合された状態であってもよいし、それぞれ別々のチューブに含まれていてもよい。いずれにしても使用者らは、上記プライマー伸長反応の過程で放出されるピロリン酸をこれらのピロリン酸測定用試薬を用い、ＷＯ  ０３／０７８６５５  Ａ１で示された方法に準じて電気化学的にピロリン酸を測定することができる。
【０１０９】
ピロリン酸測定用試薬については、特開２００４−１４１１５８号公報で示されたピロリン酸の電気化学的測定法を用いるのであれば、ピロリン酸をリン酸に加水分解するとともに、Ｈ＋を輸送するＨ＋−ＰＰａｓｅ（Ｈ＋−ピロホスファターゼ）を含む膜および、Ｈ＋濃度に依存して光学的特性が変わる色素を含む。
【０１１０】
これらは一本のチューブに混合された状態であってもよいし、それぞれ別々のチューブに含まれていてもよい。いずれにしても使用者らは、上記プライマー伸長反応の過程で放出されるピロリン酸をこれらのピロリン酸測定用試薬を用い、特開２００４−１４１１５８号公報で示された方法に準じて光学的にピロリン酸を測定することができる。
【０１１１】
ピロリン酸を測定する方法に関しては、ここで挙げたもの以外にも数多くの方法が知られている。したがって、もちろんピロリン酸測定用試薬についてもここに挙げたものに限られることなく、ピロリン酸測定に必要な試薬全てあるいは一部を含む構成となっていればよい。
【０１１２】
ピロリン酸測定用試薬の代わりに、サイバーグリーンＩのように二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光指示薬が本実施の形態４のキットに含まれる構成としてもよい。
【０１１３】
すなわち、サイバーグリーンＩに代表される二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光指示薬存在下でプライマー伸長反応を行わせると、その蛍光をモニタリングすることでプライマー伸長反応過程をリアルタイムで解析することが可能であり、この解析結果からＳＮＰ判別を行うことができる。
【０１１４】
サイバーグリーンＩに代表される二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光指示薬は、単独で一本のチューブに含まれていてもよいし、あるいはバッファー試薬チューブなどに含まれている構成としてもよく、この蛍光指示薬をプライマー伸長反応液に混合できるキット構成とすればよい。
【０１１５】
同様に、ピロリン酸測定用試薬の代わりに、ＴａｑＭａｎプローブが実施の形態４のキットに含まれる構成としてもよい。
【０１１６】
すなわちプライマー伸長反応が進む配列中の所望の領域に結合するようにＴａｑＭａｎプローブを設計しておけば、このＴａｑＭａｎプローブに依存した蛍光をモニタリングすることでプライマー伸長反応過程をリアルタイムで解析することが可能であり、この解析結果からＳＮＰ判別を行うことができる。
【０１１７】
そのように設計されたＴａｑＭａｎプローブは、単独で一本のチューブに含まれていてもよいし、あるいはバッファー試薬チューブなどに含まれている構成としてもよく、ＴａｑＭａｎプローブをプライマー伸長反応液に混合できるキット構成とすればよい。
【０１１８】
またここで、上記ＤＮＡポリメラーゼは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が弱いか無いことがより好ましい。その方がよりＳＮＰ判別が正確となる。またさらに、上記ＤＮＡポリメラーゼは、耐熱性のものである方がより好ましい。
【０１１９】
（実施の形態５）
本実施の形態５では、本発明におけるアレル特異性プライマーを含むＳＮＰ判別用キットについて説明する。使用者らは、ここで説明するＳＮＰ判別用キットを用いることで、各自のサンプル中の標的ＳＮＰ塩基種を擬陽性の可能性が極めて低く、かつ正確に判別するためのＰＣＲ反応を行うことができる。
【０１２０】
本実施の形態５におけるＳＮＰ判別用キットは、標的ＤＮＡ配列に対して実施の形態１に示した本発明におけるアレル特異性プライマーおよびこのアレル特異性プライマーとフォワードプライマー／リバースプライマーの関係になる第二のプライマーを含むプライマー試薬チューブと、ＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼ試薬チューブと、Ｍｇイオンと必要に応じて所望の塩が添加されたバッファーを含むバッファー試薬チューブと、ｄＮＴＰｓを含むｄＮＴＰｓ試薬チューブからなる。
【０１２１】
したがって使用者らは、まず各自の標的ＤＮＡ配列を含む二本鎖ＤＮＡのサンプルについて、ＰＣＲ伸長反応を行える状態に調製した後、上記プライマー試薬チューブに含まれたアレル特異性プライマーと第二のプライマーおよび、ＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼ試薬チューブに含まれたＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼおよび、バッファー試薬チューブに含まれたバッファーおよび、ｄＮＴＰｓ試薬チューブに含まれたｄＮＴＰｓを用いて、実施の形態３で説明した方法に従ってＰＣＲ反応を行えばよい。
【０１２２】
本実施の形態５におけるキットは、ＰＣＲ反応効率を調べるための試薬を含んでいることがより好ましい。ＰＣＲ反応効率を調べるための試薬としては、実施の形態３同様に、ピロリン酸測定用試薬や、サイバーグリーンＩのように二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光指示薬や、ＴａｑＭａｎプローブが挙げられる。
【０１２３】
ここで、ピロリン酸測定用試薬は、ＰＣＲ反応の過程で反応液中に放出されたピロリン酸を測定することができる。したがってその測定結果によって標的ＳＮＰ塩基種を擬陽性の可能性が極めて低く、かつ正確に判別可能となる。ピロリン酸測定用試薬の種類については、実施の形態４と同じであり、ピロリン酸測定に必要な試薬全てあるいは一部を含む構成となっていればよい。
【０１２４】
サイバーグリーンＩのように二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光指示薬や、ＴａｑＭａｎプローブについては、これらの存在下でＰＣＲ反応を行うことで、ＰＣＲ反応の過程をリアルタイムでモニタリングでき、その結果によって標的ＳＮＰ塩基種を擬陽性の可能性が極めて低く、かつ正確に判別できる。
【０１２５】
したがって、これらは単独で一本のチューブに含まれていてもよいし、あるいはバッファー試薬チューブなどに含まれている構成としてもよく、これらの試薬をＰＣＲ反応液に混合できるキット構成とすればよい。
【０１２６】
以上、上記実施の形態１〜５を通じて、本発明におけるアレル特異性プライマーおよび、このアレル特異性プライマーを用いたＳＮＰ判別方法および、このアレル特異性プライマーを含むＳＮＰ判別用キットについて説明した。
【０１２７】
これらは特にＳＮＰに限られることなく、突然変異による一塩基の違いの判別や、あるいは人工的にある特定の塩基に変異を起こさせた場合の一塩基の違いの判別についても全く同様の効果を示すことは言うまでもない。
【実施例】
【０１２８】
本発明のより具体的な実施例について以下に記す。
【０１２９】
（実施例１）
本実施例１では、本発明におけるアレル特異性プライマーを用いたプライマー伸長反応によってλＤＮＡ中の標的塩基種判別を行った。
【０１３０】
すなわち、まずλＤＮＡ（タカラバイオ(株)製）中の６７５７番目のＴ／Ａ塩基対について人工的にＣ／Ｇ塩基対に置換した変異型λＤＮＡ−６７５７−ＣＧを作成した。
【０１３１】
そしてこれら塩基対の置換の判別を、
５’−ＧＡＴＣＣＧＡＡＡＧＧＣＴＧＧＧＣＧＣＴＡＣＴ−３’（λ−ＡＣＴ）、
５’−ＧＡＴＣＣＧＡＡＡＧＧＣＴＧＧＧＣＧＣＴＴＣＴ−３’（λ−ＴＣＴ）、および
５’−ＧＡＴＣＣＧＡＡＡＧＧＣＴＧＧＧＣＧＣＴＣＣＴ−３’（λ−ＣＣＴ）
からなる三種類のプライマーを用いて行うこととした。
【０１３２】
上記三種類のプライマーを順に、λ−ＡＣＴ、λ−ＴＣＴ、λ−ＣＣＴと呼ぶ。
【０１３３】
ここで、上記三種類のプライマーの３’末端塩基Ｔは、野生型λＤＮＡの６７３５〜６７５７番目からなる二本鎖ＤＮＡ配列５’−ＧＡＴＣＣＧＡＡＡＧＧＣＴＧＧＧＣＧＣＴＧＴＴ−３’／５’−ＡＡＣＡＧＣＧＣＣＣＡＧＣＣＴＴＴＣＧＧＡＴＣ−３’のうち、５’−ＡＡＣＡＧＣＧＣＣＣＡＧＣＣＴＴＴＣＧＧＡＴＣ−３’の５’末端塩基Ａと相補的である。
【０１３４】
上記三種類のプライマーの３’末端から２番目の塩基Ｃは、同様に５’−ＡＡＣＡＧＣＧＣＣＣＡＧＣＣＴＴＴＣＧＧＡＴＣ−３’の５’末端から２番目の塩基ＡとＣ／Ａの非相補的な関係である。
【０１３５】
上記三種類のプライマーの３’末端から３番目の塩基種は全て異なるが（λ−ＡＣＴの場合はＡ、λ−ＴＣＴの場合はＴ、λ−ＣＣＴの場合はＣ）、同様に５’−ＡＡＣＡＧＣＧＣＣＣＡＧＣＣＴＴＴＣＧＧＡＴＣ−３’の５’末端から３番目の塩基Ｃと非相補的な関係である。
【０１３６】
上記三種類のプライマーの３’末端から４番目の塩基から５’末端の塩基までの配列は、同様に５’−ＡＡＣＡＧＣＧＣＣＣＡＧＣＣＴＴＴＣＧＧＡＴＣ−３’の５’末端から４番目の塩基から３’末端の塩基までの配列に対して完全に相補的である。
【０１３７】
一方、上記三種類のプライマーの３’末端の三塩基は、変異型λＤＮＡ−６７５７−ＣＧの６７３５〜６７５７番目からなる二本鎖ＤＮＡ配列５’−ＧＡＴＣＣＧＡＡＡＧＧＣＴＧＧＧＣＧＣＴＧＴＣ−３’／５’−ＧＡＣＡＧＣＧＣＣＣＡＧＣＣＴＴＴＣＧＧＡＴＣ−３’のうち、５’−ＧＡＣＡＧＣＧＣＣＣＡＧＣＣＴＴＴＣＧＧＡＴＣ−３’の５’末端の三塩基に対して非相補的である（下線部が変異導入部位）。
【０１３８】
実験は下記のとおりであった。
【０１３９】
まず、
２０μＭの上記野生型λＤＮＡあるいは変異型λＤＮＡ−６７５７−ＣＧ、
１０μＭのλ−ＡＣＴあるいはλ−ＴＣＴあるいはλ−ＣＣＴのいずれか、
０．５Ｕ／μＬのＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（タカラバイオ(株)製）、
１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、
５０ｍＭのＫＣｌ、
１．５ｍＭのＭｇＣｌ２および、
各１ｍＭのｄＮＴＰｓ
を含む反応溶液１０μＬを調製した。
【０１４０】
この反応溶液をＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製サーマルサイクラーであるＤＮＡ  ｅｎｇｉｎｅを用いて９５℃で１分間インキュベートした後、５８℃で５分間インキュベートし、最後に７２℃で１０分間インキュベートした。
【０１４１】
インキュベート後の反応液については、ルシフェラーゼの反応系を利用することで含まれているピロリン酸量を解析した。
【０１４２】
より具体的にはＫａｍｂａｒａらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２００１，  Ｖｏｌ．２９，  Ｎｏ．１９  ｅ９３）に準じて、ピロリン酸量を発光強度に変換して解析した。
【０１４３】
解析結果を図５に示す。
【０１４４】
これらの結果は、野生型λＤＮＡについてλ−ＡＣＴによってプライマー伸長反応を行った場合の発光強度を１００％としたときの、それぞれの場合における比較発光強度を示している。
【０１４５】
図５より、上記λ−ＡＣＴ、λ−ＴＣＴ、λ−ＣＣＴのいずれに関しても、変異型λＤＮＡ−６７５７−ＣＧの場合より野生型λＤＮＡの場合のほうが、明らかに発光強度が大きいことが分かる。
【０１４６】
すなわち、上記λ−ＡＣＴ、λ−ＴＣＴ、λ−ＣＣＴによって明確に本実施例における一塩基の違いを判別できたと言える。
【０１４７】
（比較例１）
本比較例１では、上記実施例１の比較実験として、上記実施例１の野生型λＤＮＡと変異型λＤＮＡ−ＣＧの一塩基の違いについて、以下の三種類のプライマーを用いて判別を試みた。
【０１４８】
すなわち、
５’−ＧＡＴＣＣＧＡＡＡＧＧＣＴＧＧＧＣＧＣＴＡＡＴ−３’（λ−ＡＡＴ）
５’−ＧＡＴＣＣＧＡＡＡＧＧＣＴＧＧＧＣＧＣＴＡＧＴ−３’（λ−ＡＧＴ）、および
５’−ＧＡＴＣＣＧＡＡＡＧＧＣＴＧＧＧＣＧＣＴＣＡＴ−３’（λ−ＣＡＴ）
の配列からなる三種類のプライマーを用いて、実施例１と同様の実験を行った。
【０１４９】
これら三種類のプライマーを順に、λ−ＡＡＴ、λ−ＡＧＴ、λ−ＣＡＴと呼ぶ。
【０１５０】
これらは、その３’末端から２番目および３番目の塩基が、５’−ＡＡＣＡＧＣＧＣＣＣＡＧＣＣＴＴＴＣＧＧＡＴＣ−３’の５’末端から２番目および３番目の塩基と非相補的であるという点で、実施例１で用いたλ−ＡＣＴ、λ−ＴＣＴ、λ−ＣＣＴと同じである。
【０１５１】
解析結果を図６に示す。
【０１５２】
これらの結果は、図５と同様に野生型λＤＮＡについてλ−ＡＣＴによってプライマー伸長反応を行った場合の発光強度を１００％としたときの、それぞれの場合における比較発光強度を示している。
【０１５３】
これら三種類のプライマーと野生型λＤＮＡの組み合わせの場合における発光強度は、図５に示されているλ−ＡＣＴやλ−ＴＣＴやλ−ＣＣＴと野生型λＤＮＡの組み合わせの場合に比べると明らかに小さく（図５および図６の縦軸の大きさに注意）、これによりλ−ＡＣＴ、λ−ＴＣＴ、λ−ＣＣＴの判別能がより優れていることが分かる。
【０１５４】
これらの実施例１および比較例１から理解されるように、標的ＳＮＰ塩基の３’末端側にすぐ隣接する塩基がＡであり、もう一塩基隣の塩基がＣである場合には、アレル特異性プライマーの３’末端から２番目の塩基がＣであり、３番目の塩基がＡかＴかＣのいずれかであれば、非常に高い判別能を得ることができる。
【０１５５】
（実施例２）
本実施例２では、本発明におけるアレル特異性プライマーを用いたＰＣＲ反応によってλＤＮＡ中の標的塩基種判別を行った。
【０１５６】
まず、λＤＮＡ（タカラバイオ(株)製）中の６６５４番目のＧ／Ｃ塩基対について人工的にＡ／Ｔ塩基対に置換した変異型λＤＮＡ−６６５４−ＡＴを作成した。
【０１５７】
そしてこれら塩基対の置換の判別を、
５’−ＧＧＣＧＧＣＡＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＣＡＡＧＣＡＣＧ−３’（λ−ＡＣＧ）、
５’−ＧＧＣＧＧＣＡＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＣＡＡＧＣＴＣＧ−３’（λ−ＴＣＧ）、および
５’−ＧＧＣＧＧＣＡＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＣＡＡＧＣＣＣＧ−３’（λ−ＣＣＧ）
からなる三種類のプライマーをフォワードプライマーとして用いたＰＣＲ反応によって行うこととした。
【０１５８】
上記三種類のプライマーを順に、λ−ＡＣＧ、λ−ＴＣＧ、λ−ＣＣＧと呼ぶ。
【０１５９】
ここで、上記三種類のプライマーの３’末端塩基Ｇは、野生型λＤＮＡの６６３０〜６６５４番目からなる二本鎖ＤＮＡ配列５’−ＧＧＣＧＧＣＡＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＣＡＡＧＣＧＴＧ−３’／５’−ＣＡＣＧＣＴＴＧＣＴＣＣＡＣＴＣＣＧＴＧＣＣＧＣＣ−３’のうち、５’−ＣＡＣＧＣＴＴＧＣＴＣＣＡＣＴＣＣＧＴＧＣＣＧＣＣ−３’の５’末端塩基Ｃと相補的である。
【０１６０】
上記三種類のプライマーの３’末端から２番目の塩基Ｃは、同様に５’−ＣＡＣＧＣＴＴＧＣＴＣＣＡＣＴＣＣＧＴＧＣＣＧＣＣ−３’の５’末端から２番目の塩基ＡとＣ／Ａの非相補的な関係である。
【０１６１】
上記三種類のプライマーの３’末端から３番目の塩基種は全て異なるが（λ−ＡＣＧの場合はＡ、λ−ＴＣＧの場合はＴ、λ−ＣＣＧの場合はＣ）、同様に５’−ＣＡＣＧＣＴＴＧＣＴＣＣＡＣＴＣＣＧＴＧＣＣＧＣＣ−３’の５’末端から３番目の塩基Ｃと非相補的な関係である。
【０１６２】
上記三種類のプライマーの３’末端から４番目の塩基から５’末端の塩基までの配列は、同様に５’−ＣＡＣＧＣＴＴＧＣＴＣＣＡＣＴＣＣＧＴＧＣＣＧＣＣ−３’の５’末端から４番目の塩基から３’末端の塩基までの配列に対して完全に相補的である。
【０１６３】
一方、上記三種類のプライマーの３’末端の三塩基は、変異型λＤＮＡ−６６５４−ＡＴの６６３０〜６６５４番目からなる二本鎖ＤＮＡ配列５’−ＧＧＣＧＧＣＡＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＣＡＡＧＣＧＴＡ−３’／５’−ＴＡＣＧＣＴＴＧＣＴＣＣＡＣＴＣＣＧＴＧＣＣＧＣＣ−３’のうち、５’−ＴＡＣＧＣＴＴＧＣＴＣＣＡＣＴＣＣＧＴＧＣＣＧＣＣ−３’の５’末端の三塩基に対して非相補的である（下線部が変異導入部位）。
【０１６４】
リバースプライマーとしては、５’−ＧＡＡＴＣＡＣＧＧＴＡＴＣＣＧＧＣＴＧＣＧＣＴＧＡ−３’からなるＤＮＡを用いた。
【０１６５】
このリバースプライマーは、λＤＮＡの７４０６〜７４３０番目からなる二本鎖ＤＮＡ配列５’−ＴＣＡＧＣＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴＡＣＣＧＴＧＡＴＴＣ−３’／５’−ＧＡＡＴＣＡＣＧＧＴＡＴＣＣＧＧＣＴＧＣＧＣＴＧＡ−３’のうち、５’−ＴＣＡＧＣＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴＡＣＣＧＴＧＡＴＴＣ−３’と完全に相補的である。
【０１６６】
仮に上記λ−ＡＣＧ、λ−ＴＣＧ、λ−ＣＣＧとのＰＣＲ反応によって良好に反応が進めば、７０１ｂｐのＤＮＡ増幅産物が得られるはずである。
【０１６７】
実験は下記のとおりである。
【０１６８】
まず、
Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉキット（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）の酵素ミクスチャーを２μ
Ｌおよび、１０μｇ／ｍＬの上記野生型λＤＮＡあるいは変異型λＤＮＡ−６６５４−ＡＴ、
１μＭのλ−ＡＣＧあるいはλ−ＴＣＧあるいはλ−ＣＣＧのいずれか、
１μＭの上記リバースプライマー、
１．６ｍＭのＭｇＣｌ２
を含む反応溶液２０μＬを調製した。
【０１６９】
この反応溶液をロシュ・ダイアグノスティクス社製サーマルサイクラーであるＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒを用いて、変性工程：９４℃、１０秒間、アニーリング工程：５８℃、１０秒間、伸長工程：７２℃、１０秒間、サイクル数：２０サイクルとしてＰＣＲ反応を行った。
【０１７０】
各ＰＣＲ反応結果については、アジレント・テクノロジーズ社製のＤＮＡ電気泳動用システムであるＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００を用いて解析した。
【０１７１】
解析結果を図７に示す。
【０１７２】
これらの結果は、各ＰＣＲ反応後における目的のＤＮＡ断片の濃度（ｎＭ）を示している。
【０１７３】
この結果より、上記λ−ＡＣＧ、λ−ＴＣＧ、λ−ＣＣＧのいずれをフォワードプライマーとして用いた場合も、変異型λＤＮＡ−ＣＧの場合においては目的のＤＮＡ断片は検出されなかった。
【０１７４】
一方、野生型λＤＮＡの場合は全て、目的のＤＮＡ断片は４０ｎＭ以上であった。
【０１７５】
すなわち、上記λ−ＡＣＧ、λ−ＴＣＧ、λ−ＣＣＧをフォワードプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行うことによって明確に本実施例における一塩基の違いを判別できたと言える。
【０１７６】
（比較例２）
本比較例２では、上記実施例２の比較実験として、上記実施例２の野生型λＤＮＡと変異型λＤＮＡ−６６５４−ＡＴの一塩基の違いについて、以下の三種類のプライマーを用いて判別を試みた。
【０１７７】
すなわち、
５’−ＧＧＣＧＧＣＡＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＣＡＡＧＣＡＡＧ−３’（λ−ＡＡＧ）、
５’−ＧＧＣＧＧＣＡＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＣＡＡＧＣＡＧＧ−３’（λ−ＡＧＧ）、および
５’−ＧＧＣＧＧＣＡＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＣＡＡＧＣＴＡＧ−３’（λ−ＴＡＧ）
の配列からなる三種類のプライマーを用いて、実施例２と同様の実験を行った。
【０１７８】
これら三種類のプライマーを順に、λ−ＡＡＧ、λ−ＡＧＧ、λ−ＴＡＧと呼ぶ。
【０１７９】
これらは、その３’末端から２番目および３番目の塩基が、５’−ＣＡＣＧＣＴＴＧＣＴＣＣＡＣＴＣＣＧＴＧＣＣＧＣＣ−３’の５’末端から２番目および３番目の塩基と非相補的であるという点で、実施例２で用いたλ−ＡＣＧ、λ−ＴＣＧ、λ−ＣＣＧと同じである。
【０１８０】
解析結果を図８に示す。
【０１８１】
これらの結果は、図７と同様に各ＰＣＲ反応後における目的のＤＮＡ断片の濃度（ｎＭ）を示している。
【０１８２】
これより、まずλ−ＡＡＧ、λ−ＡＧＧ、λ−ＴＡＧのいずれにおいても、野生型λＤＮＡの場合は４．７ｎＭ以上の目的ＤＮＡ断片がわずかながら検出されているのに対して、変異型λＤＮＡ−６６５４−ＡＴの場合は全く検出されていない。
【０１８３】
これら三種類のプライマーと野生型λＤＮＡの組み合わせの場合における目的のＤＮＡ断片の濃度（図７および図８の縦軸の大きさに注意）は、λ−ＡＣＧやλＴＣＧやλＣＣＧと野生型λＤＮＡの組み合わせの場合に比べると約７分の１ほどであり、明らかに小さく、これよりλ−ＡＣＧ、λ−ＴＣＧ、λ−ＣＣＧの判別能がより優れていることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１８４】
本発明により、擬陽性の可能性が極めて低く、かつ明確にＳＮＰ判別などが可能なＤＮＡが有する標的塩基を判別する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０１８５】
【図１】従来技術におけるテンプレートＤＮＡとアレル特異性プライマーの関係を模式的に示した図
【図２】本発明におけるテンプレートＤＮＡとアレル特異性プライマーの関係を模式的に示した図
【図３】実施の形態２のＳＮＰ判別方法のフローチャート図
【図４】実施の形態３のＳＮＰ判別方法のフローチャート図
【図５】実施例１の実験結果を表したグラフ
【図６】比較例１の実験結果を表したグラフ
【図７】実施例２の実験結果を表したグラフ
【図８】比較例２の実験結果を表したグラフ
【符号の説明】
【０１８６】
１：従来技術におけるアレル特異性プライマー
２：従来技術におけるテンプレートＤＮＡ
３：本発明におけるアレル特異性プライマー
４：本発明におけるテンプレートＤＮＡ
【図１】
2007097570.tif 000003
【図２】
2007097570.tif 000004
【図３】
2007097570.tif 000005
【図４】
2007097570.tif 000006
【図５】
2007097570.tif 000007
【図６】
2007097570.tif 000008
【図７】
2007097570.tif 000009
【図８】
2007097570.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成18年7月26日(2006.7.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡが有する標的塩基を判別する方法およびそれに用いられるアレル特異性プライマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＳＮＰは遺伝子多型の中で最も高頻度で現れる多型であり、ヒトゲノム中において約０．１％の頻度で現れると考えられている。
【０００３】
実際、これまでに３００万を超える数のＳＮＰの存在が明らかになってきており、このことはＳＮＰが遺伝子検査のマーカーとして非常に有用であることを示している。
【０００４】
これまでのＳＮＰと疾病の関連付けの研究によって、糖尿病や高血圧症などの疾病とＳＮＰが深く関連していることが明らかになってきている。
【０００５】
ＳＮＰ判別を行う技術として、アレル特異性プライマーによるプライマー伸長反応（ＰＣＲ反応を含む）を利用する技術が知られている。
【０００６】
アレル特異性プライマーとは、標的とするＳＮＰの塩基種に依存してプライマー伸長反応効率に著しい差が生じるプライマーのことを言う。
【０００７】
従って、例えばアレル特異性プライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、そのＰＣＲ産物量を解析することで簡単に標的ＳＮＰ塩基種を特定できる。
【０００８】
通常、アレル特異性プライマーは特に何の修飾もされていない単なるオリゴＤＮＡである。
【０００９】
ＰＣＲ産物量の解析にはいわゆる通常の電気泳動法を用いればよいため、アレル特異性プライマーによるＳＮＰ判別技術は、コストや反応時間、操作の簡便性といった面において非常に有利と言える。
【００１０】
解析方法については、上記の電気泳動法のみならず、固相系の反応を行えばＱＣＭやＳＰＲによって検出することも可能である。
【００１１】
さらに近年では、プライマー伸長反応の副産物であるＰＰｉ（ピロリン酸）を、ルシフェラーゼ反応を利用して検出する方法も開発されており、アレル特異性プライマーによるＳＮＰ判別の簡便化や迅速化は世界中において精力的に取り組まれている。
【００１２】
アレル特異性プライマーの配列設計は、そのＳＮＰ判別能において非常に重要なファクターである。
【００１３】
最も古典的な例は、３’末端塩基が標的ＳＮＰ塩基に対応しており（すなわち予想される標的ＳＮＰ塩基種のいずれかに相補的となる）、かつそれ以外の配列は標的ＤＮＡ配列に対して完全に相補的であるという例である。
【００１４】
しかし、この場合においては、その反応時間や温度、あるいは反応に用いるｄＮＴＰｓ濃度、またＰＣＲ法を用いるのであればサイクル数などの反応条件を厳密に規定しなければ、擬陽性の問題が生じる。
【００１５】
すなわち、本来であれば、プライマー３’末端のＳＮＰ対応塩基がサンプルの標的ＳＮＰ塩基と非相補的である場合は、そこからのプライマー伸長反応は起きてはいけないのだが、多くの場合において起きてしまう。
【００１６】
上述の擬陽性の問題を解決するために、これまでに幾つかの新規アレル特異性プライマーが開発されている。
【００１７】
特許文献１にて提案されたアレル特異性プライマーは、３’末端塩基がＳＮＰ対応塩基であり、かつ３’末端から３番目の塩基を、標的ＳＮＰ塩基から３’側に二塩基隣の塩基に対して意図的に非相補的にしたアレル特異性プライマーを開発している。
【００１８】
特許文献２では、３’末端から２番目の塩基がＳＮＰ対応塩基であり、かつ３’末端から３番目の塩基を、標的ＳＮＰ塩基から３’側に隣接している塩基に対して意図的に非相補的にしたアレル特異性プライマーが提案されている。この場合、３’→５’ｅｘｏ＋ポリメラーゼであるＫＯＤポリメラーゼを用いるのが特徴である。
【００１９】
特許文献３では、３’末端塩基がＳＮＰ対応塩基であり、かつ３’末端から２番目および３番目の塩基をそれぞれ、標的ＳＮＰ塩基から３’側に隣接する塩基と、もう一塩基隣の塩基に対して意図的に非相補的にしたアレル特異性プライマーが提案されている。これらの中で、特許文献３で提案されたアレル特異性プライマーは特に擬陽性の可能性が低い。
【００２０】
すなわち、上記のとおり設計された特許文献３のアレル特異性プライマーは、図１に示すように、その３’末端に位置するＳＮＰ対応塩基（図中では「Ｓ’」と示した）が標的ＳＮＰ塩基（図中では「Ｓ」と示した）と相補的である場合、３’末端から２番目および３番目の塩基のみが標的ＤＮＡ配列に対して非相補的となり（図中では、非相補的な塩基対を×と示した）、ループのような構造をとり得る（図１（ａ））。
【００２１】
その結果、ポリメラーゼは効率良く結合し、プライマー伸長反応を行う。
【００２２】
逆に、その３’末端に位置するＳＮＰ対応塩基が標的ＳＮＰ塩基と非相補的である場合、３’末端の三塩基全てが非相補的となり、枝分かれのような構造になると考えられる（図１（ｂ））。
【００２３】
この場合、プライマー伸長反応はほとんど起こらない。
【００２４】
ポリメラーゼの結合効率が極めて低くなるためと考えられるからである。
【００２５】
したがって特許文献３で提案されたアレル特異性プライマーは、上述のとおり擬陽性の可能性は極めて低くなる。
【００２６】
その他、本発明に関連する文献として、以下の文献を挙げることができる。
【００２７】
特許文献４には、イネの品種識別のために、３’末端が判別すべきＳＮＰ部位に対応し、３’末端から３番目の塩基が、アニールする鋳型配列と相補的な配列から置換されており、当該置換がＧからＡ、ＡからＣへ、ＴからＧへ、またはＣからＡへの置換であるＰＣＲプライマーが開示されている。
【００２８】
さらに、この特許文献４の段落番号００４０には、「１つの局面において、本発明は、３’末端から１番目、２番目、３番目、または４番目の塩基が置換されたプライマーを提供する。この置換は、１つのみであっても、２つ以上の組み合わせでもよい。好ましくは、３’末端から３番目の塩基のみが置換される。このプライマーの置換は、任意の置換であってよいが、好ましくは、ＧからＴ、ＡからＣへ、ＴからＧ、またはＣからＡの置換である。」と開示されている。
【特許文献１】米国特許公開第２００３／００４９６２８号
【特許文献２】米国特許公開第２００３／０１４８３０１号
【特許文献３】米国特許公開第２００４／０１９７８０３号
【特許文献４】特開２００４−２４８６３５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
特許文献３で提案されたアレル特異性プライマーは、その３’末端に位置するＳＮＰ対応塩基が標的ＳＮＰ塩基と非相補的である場合のプライマー伸長反応効率は極めて悪い。その結果、擬陽性の問題が解消されるため正確なＳＮＰ判別が可能となる。
【００３０】
しかし、３’末端に位置するＳＮＰ対応塩基が標的ＳＮＰ塩基と相補的である場合のプライマー伸長反応効率は、３’末端から２番目および３番目の塩基種および、それに対応する標的ＤＮＡ側の塩基種条件（より具体的には、標的ＳＮＰ塩基から３’側に隣接する塩基と、もう一塩基隣の塩基の塩基種条件）によってばらつく問題があった。
【００３１】
より具体的には、例えば、標的ＤＮＡ配列中の標的ＳＮＰ塩基種がＡ（アデニン）かＧ（グアニン）であり、そのＳＮＰ塩基の３’側にすぐ隣接する塩基種をＣ（シトシン）、もう一塩基隣の塩基種をＴ（チミン）とした場合、特許文献３で提案されたアレル特異性プライマーの３’末端塩基はＳＮＰ対応塩基であるため、Ｔ（Ａと相補的とする場合）かＣ（Ｇと相補的とする場合）とすれば良い。
【００３２】
一方、その３’末端から２番目および３番目の塩基は、標的ＤＮＡ配列に対して非相補的でないといけないため、２番目はＡ、Ｔ、Ｃのいずれかであり、また３番目はＴ、Ｇ、Ｃのいずれかとなる。
【００３３】
したがって、特許文献３で提案されたアレル特異性プライマーは、一種類の標的ＤＮＡ配列に対して、その３’末端から２番目および３番目の塩基種の組み合わせは合計９通りとなる。
【００３４】
いずれも非相補的であるという観点から、これらの９種類のアレル特異性プライマーは、ＳＮＰ判別に際してほぼ同じ効率を示すと思われる。
【００３５】
しかし、本発明者らは、これらの９種類のアレル特異性プライマーのうち、特定のアレル特異性プライマーが、他のアレル特異性プライマーと比較して、ＳＮＰ判別に際して非常に高い効率を示すという知見を見出し、本発明を完成させた。
【００３６】
すなわち、本発明は、擬陽性の可能性が少なく、かつ明確に判別することができるＤＮＡが有する標的塩基を判別する方法およびそれに用いられるアレル特異性プライマーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００３７】
本発明は、ＤＮＡが有する標的塩基を判別する方法であって、
この方法は、
（１）  Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｇ（グアニン）、およびＣ（シトシン）の４種類の塩基の中から前記標的塩基として予想される塩基と相補的な塩基を３’末端に有するアレル特異性プライマーをＤＮＡに結合させてＤＮＡ伸長反応を生じさせるＤＮＡ伸長工程、および
（２）  ＤＮＡ伸長工程の効率を調べ、高効率であれば標的塩基は予想された塩基と同一であると判別され、低効率であれば標的塩基は予想された塩基とは異なると判別される判別工程
を有し、
ＤＮＡにおいて、標的塩基の３’末端側にすぐ隣接する塩基がＡであり、もう一塩基隣の塩基がＣであり、
アレル特異性プライマーの３’末端塩基が標的塩基であると予想される塩基と相補的であり、
アレル特異性プライマーの３’末端から２番目の塩基がＣであり、
アレル特異性プライマーの３’末端から３番目の塩基がＡかＴかＣのいずれかであり、かつ
前記アレル特異性プライマーの３’末端から４番目の塩基と５’末端の塩基との間の塩基配列が、前記アレル特異性プライマーの３’末端から４番目の塩基に対応する前記ＤＮＡ側の塩基と前記アレル特異性プライマーの５’末端の塩基に対応する前記ＤＮＡ側の塩基との間の塩基配列に相補的に結合する。
【００３８】
ＤＮＡ伸長反応はプライマー伸長反応であることが好ましい。ＤＮＡ伸長反応は、上記アレル特異性プライマーのみからのプライマー伸長反応であることがより好ましい。
【００３９】
プライマー伸長反応により産生されるピロリン酸の濃度を調べることによって効率を調べることが好ましい。なお、ピロリン酸の濃度を発光強度として検出することが好ましい。
【００４０】
ＤＮＡ伸長反応はＰＣＲ反応であることも好ましい。ＤＮＡ伸長反応が、前記アレル特異性プライマーともう一つの異なるプライマーからなるＰＣＲ反応であることがより好ましい。
【００４１】
この場合、ＰＣＲ反応により産生された増幅ＤＮＡの濃度を、電気泳動法により測定することによって効率を調べることが好ましい。
【００４２】
上記方法に用いられるアレル特異性プライマーもまた、本発明の趣旨に包含される。
【発明の効果】
【００４３】
本発明により、擬陽性の可能性が極めて低く、かつ明確にＳＮＰ判別などが可能なＤＮＡが有する標的塩基を判別する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
以下本発明の実施の形態について図２〜図４を用いて説明する。
【００４５】
（実施の形態１）
本実施の形態１では、本発明におけるアレル特異性プライマーの塩基種条件について図２を用いて説明する。
【００４６】
本発明では、図２に示すように、標的ＤＮＡ配列として、標的塩基（以下、「標的ＳＮＰ塩基」という）が５’末端に存在し、かつ５’末端から２番目の塩基がＡであり、かつ５’末端から３番目の塩基がＣであるときを対象としている。
【００４７】
本発明の理解を容易にするために、図２では、標的ＳＮＰ塩基が５’末端に存在すると仮定している。しかし、一般的には、図１に示すように、標的ＳＮＰ塩基は標的ＤＮＡ配列のどこかに存在すれば良く、標的ＤＮＡ配列の５’末端に存在する必要はない。
【００４８】
アレル特異性プライマーの３’末端塩基はＳＮＰ対応塩基であるため、予想される標的ＳＮＰ塩基種が二種類（図２ではＳ１、Ｓ２と示した）である場合、そのいずれかと相補的であるように設計する。図２では、このＳＮＰ対応塩基をＳ１’とし、Ｓ１と相補的であるとしている。
【００４９】
さらにアレル特異性プライマーの３’末端から２番目の塩基はＣであり、かつ３’末端から３番目の塩基はＡかＴかＣのいずれかである。
【００５０】
アレル特異性プライマーの３’末端から４番目の塩基と５’末端の塩基との間の塩基配列（以下、「残余の塩基配列」または「アレル特異性プライマーの残余の塩基配列」ということがある）は、アレル特異性プライマーの３’末端から４番目の塩基に対応する標的ＤＮＡ側の塩基とアレル特異性プライマーの５’末端の塩基に対応する標的ＤＮＡ側の塩基との間の塩基配列（以下、「残余の塩基配列」または「標的ＤＮＡ側の残余の塩基配列」ということがある）と相補的であり、これらは結合する。
【００５１】
図２では、アレル特異性プライマーの３’末端から４番目の塩基から５’末端の塩基までの塩基配列は、標的ＤＮＡ配列中の５’末端から４番目の塩基から３’末端の塩基までの塩基配列に対して相補的である。
【００５２】
なお、アレル特異性プライマーの残余の塩基配列と標的ＤＮＡ側の残余の塩基配列との間は、完全に相補的であることが望ましいが、ＳＮＰ判別に悪影響を与えない限り、完全に相補的である必要はない。
【００５３】
本発明において、アレル特異性プライマーのＳＮＰ対応塩基が標的ＳＮＰ塩基と相補的な場合は、図２（ａ）のような関係になり、逆に、本発明におけるアレル特異性プライマーのＳＮＰ対応塩基が標的ＳＮＰ塩基と非相補的な場合は、図２（ｂ）のような関係になる。
【００５４】
なお、図２（および図１）において、符号「Ｘ」は、当該符号Ｘを間に挟む２つの塩基が結合しないことを意味する。
【００５５】
符号「Ｘ」が間に挟まれない２つの塩基（例えば、図１（ａ）、図２（ａ）の塩基Ｓ１および塩基Ｓ１’）は結合する。
【００５６】
このようなアレル特異性プライマーと標的ＤＮＡの配列条件下で、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性のないポリメラーゼを用いてＤＮＡ伸長反応（すなわち、代表的にはプライマー伸長反応またはＰＣＲ反応）を行うと、図２（ａ）の場合は非常に効率良く反応が進むのに対して、図２（ｂ）の場合はほとんど進まない。
【００５７】
このような効率の差からＤＮＡが有する標的ＳＮＰ塩基を判別することができる。
【００５８】
すなわち、ＤＮＡ伸長工程の効率を調べ、高効率であれば前記標的ＳＮＰ塩基は前記予想された塩基と同一であると判別され、低効率であれば前記標的ＳＮＰ塩基は前記予想された塩基とは異なると判別される。
【００５９】
その結果、擬陽性の可能性が極めて低く、かつ明確なＳＮＰ判別が可能となる。
【００６０】
（実施の形態２）
本実施の形態２では、本発明におけるアレル特異性プライマーを用いてプライマー伸長反応を行うことでＳＮＰを判別する方法について説明する。
【００６１】
図３に示すように、まず標的ＤＮＡ配列を含む二本鎖ＤＮＡについて、プライマー伸長反応を行えるように調製する。
【００６２】
ここで標的ＤＮＡ配列条件は、実施の形態１と同じく、標的ＳＮＰ塩基が５’末端に存在し、かつその５’末端から２番目の塩基がＡであり、かつその５’末端から３番目の塩基がＣである。
【００６３】
したがって、標的ＤＮＡ配列の相補鎖配列は、その３’末端塩基が標的ＳＮＰ塩基と相補的であり、かつその３’末端から２番目の塩基がＴであり、かつその３’末端から３番目の塩基がＧである。
【００６４】
このような配列条件を満たす二本鎖ＤＮＡを、上記のとおりプライマー伸長反応が行える状態に調製して、実施の形態１で示した配列条件を満たすアレル特異性プライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、ｄＮＴＰｓと、バッファーと、必要に応じて所望の塩を加えてプライマー伸長反応を行えばよい。
【００６５】
プライマー伸長反応の工程についてはこれまで知られている手順で良く、具体的には下記のとおりである。
【００６６】
すなわち、まず上記二本鎖ＤＮＡを変性させるために高温状態に置いた後、本発明におけるアレル特異性プライマーと標的ＤＮＡ配列が結合できるように温度を下げる。
【００６７】
その後、ＤＮＡポリメラーゼが伸長反応を行うことが可能な温度条件に設定すればよい。
【００６８】
この結果、アレル特異性プライマーの３’末端に位置するＳＮＰ対応塩基が標的ＳＮＰ塩基と相補的であれば、このアレル特異性プライマーからのプライマー伸長反応は効率良く行われる。
【００６９】
逆に、アレル特異性プライマーの３’末端に位置するＳＮＰ対応塩基が標的ＳＮＰ塩基と非相補的であれば、このアレル特異性プライマーからのプライマー伸長反応効率は著しく悪い。
【００７０】
したがって、このプライマー伸長反応の最中、あるいは反応後に、プライマー伸長反応の結果放出されるピロリン酸量を測定するなどしてそのプライマー伸長反応効率を調べればよい。
【００７１】
これによって、擬陽性の可能性が極めて低く、かつ明確なＳＮＰ判別が可能となる。プライマー伸長反応効率を調べる手段としてはピロリン酸量を測定する方法に限られない。
【００７２】
例えば、本発明におけるアレル特異性プライマーの５’末端側を水晶発振子上に固定した状態で、上記プライマー伸長反応を行い、その振動数変化を解析してプライマー伸長反応をモニタリングすることで、プライマー伸長反応効率を調べてもよい。
【００７３】
あるいは本発明におけるアレル特異性プライマーの５’末端側を金表面に固定した状態で、上記プライマー伸長反応を行い、その表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象を解析してプライマー伸長反応をモニタリングすることで、プライマー伸長反応効率を調べてもよい。
【００７４】
いずれにしてもプライマー伸長反応効率を調べることができればよい。
【００７５】
ここで、プライマー伸長反応を行う具体的手順は上記の手順に限られることはない。
【００７６】
すなわち、上記の手順では予め必要な試薬類を全て反応液中に混合した上でプライマー伸長反応を行わせるが、例えば、まず標的ＤＮＡ配列を含む二本鎖ＤＮＡおよびアレル特異性プライマーを溶かしたバッファー液（必要に応じて所望の塩を加えればよい）を用意し、高温による変性工程およびアレル特異性プライマーによる標的ＤＮＡ配列への結合を行った後、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓを順次加えることで反応を行わせてもよい。いずれにしてもプライマー伸長反応を行える工程とすればよい。
【００７７】
またここで、標的ＤＮＡ配列を含むＤＮＡがもともと一本鎖の場合、上記した二本鎖の場合と異なり、二本鎖ＤＮＡを変性させるという意味での高温条件下におく工程は必要ない。
【００７８】
しかし、この一本鎖ＤＮＡとアレル特異性プライマーの結合反応を制御する意味において、これら両者がまず十分解離した状態を調整する必要があるので、そのための高温条件下におく工程が、アレル特異性プライマーと標的ＤＮＡ配列との結合工程の前にあることがより好ましい。
【００７９】
ここで、上記ＤＮＡポリメラーゼは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が弱いか無いことがより好ましい。その方がよりＳＮＰ判別が正確となる。
【００８０】
さらに、上記ＤＮＡポリメラーゼは、上記プライマー伸長反応の手順によっては高温にさらされる場合がある。
【００８１】
その場合は、例えばＰＣＲに用いられるような耐熱性のものを用いる必要があるが、そのような高温にさらされることがない手順でプライマー伸長反応を行う場合は特にその必要はない。
【００８２】
ピロリン酸量を測定する方法については、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２００１，  Ｖｏｌ．２９，  Ｎｏ．１９  ｅ９３やＷＯ  ０３／０７８６５５  Ａ１や特開２００４−１４１１５８号公報などで提案されている方法がある。
【００８３】
しかしこれらに限られることはなく、ピロリン酸量が測定できればよい。
【００８４】
（実施の形態３）
本実施の形態３では、本発明におけるアレル特異性プライマーを用いてＰＣＲを行うことでＳＮＰを判別する方法について説明する。
【００８５】
図４に示すように、まず標的ＤＮＡ配列を含む二本鎖ＤＮＡについて、ＰＣＲ反応を行えるように調製する。ここで標的ＤＮＡ配列条件は、実施の形態１と同じく、標的ＳＮＰ塩基が５’末端に存在し、かつその５’末端から２番目の塩基がＡであり、かつその５’末端から３番目の塩基がＣである。
【００８６】
したがって、標的ＤＮＡ配列の相補鎖配列は、その３’末端塩基が標的ＳＮＰ塩基と相補的であり、かつその３’末端から２番目の塩基がＴであり、かつその３’末端から３番目の塩基がＧである。
【００８７】
このような配列条件を満たす二本鎖ＤＮＡを、上記のとおりＰＣＲ反応が行える状態に調製して、実施の形態１で示した配列条件を満たすアレル特異性プライマーと、このアレル特異性プライマーとフォワードプライマー／リバースプライマーの関係になる第二のプライマーと、ＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼと、ｄＮＴＰｓと、Ｍｇイオンと、バッファー、また必要であれば所望の塩を加えてＰＣＲ反応を行えばよい。
【００８８】
この結果、アレル特異性プライマーの３’末端に位置するＳＮＰ対応塩基が標的ＳＮＰ塩基と相補的であれば、このアレル特異性プライマーと第二のプライマーによって挟まれた領域のテンプレートＤＮＡは効率良く増幅される。
【００８９】
逆に、アレル特異性プライマーの３’末端に位置するＳＮＰ対応塩基が標的ＳＮＰ塩基と非相補的であれば、このアレル特異性プライマーと第二のプライマーによって挟まれた領域のテンプレートＤＮＡはほとんど増幅されない。
【００９０】
したがって、上記ＰＣＲ反応の後に、電気泳動などの方法によってこのテンプレートＤＮＡの増幅量を調べれば、擬陽性の可能性が極めて低く、かつ明確なＳＮＰ判別が可能となる。
【００９１】
あるいは、上記ＰＣＲ反応の最中、あるいは後に、ＰＣＲ反応の結果放出されるピロリン酸量を測定してもよい。この場合においても、擬陽性の可能性が極めて低く、かつ明確なＳＮＰ判別が可能である。
【００９２】
上記ＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が弱いか無いことがより好ましい。
【００９３】
テンプレートＤＮＡの増幅量を測定する方法は特に限られず、上記の電気泳動法以外でもよい。
【００９４】
ピロリン酸量を測定する方法については、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２００１，  Ｖｏｌ．２９，  Ｎｏ．１９  ｅ９３やＷＯ  ０３／０７８６５５  Ａ１や特開２００４−１４１１５８号公報などで提案されている方法がある。
【００９５】
しかしこれらに限られることはなく、ピロリン酸量が測定できればよい。
【００９６】
（実施の形態４）
本実施の形態４では、本発明におけるアレル特異性プライマーを含むＳＮＰ判別用キットについて説明する。
【００９７】
使用者らは、ここで説明するＳＮＰ判別用キットを用いてプライマー伸長反応およびピロリン酸測定反応を行うことで、各自のサンプル中の標的ＳＮＰ塩基種を擬陽性の可能性が極めて低く、かつ正確に判別可能となる。
【００９８】
本実施の形態４におけるＳＮＰ判別用キットは、標的ＤＮＡ配列に対して実施の形態１に示した本発明におけるアレル特異性プライマーを含むアレル特異性プライマー試薬チューブと、ＤＮＡポリメラーゼを含むＤＮＡポリメラーゼ試薬チューブと、必要に応じて所望の塩が添加されたバッファーを含むバッファー試薬チューブと、ｄＮＴＰｓを含むｄＮＴＰｓ試薬チューブと、ピロリン酸測定用試薬を含むピロリン酸試薬チューブからなる。
【００９９】
したがって使用者らは、まず各自の標的ＤＮＡ配列を含む一本鎖ＤＮＡあるいは二本鎖ＤＮＡのサンプルについて、プライマー伸長反応を行える状態に調製した後、上記アレル特異性プライマー試薬チューブに含まれたアレル特異性プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼ試薬チューブに含まれたＤＮＡポリメラーゼおよびバッファー試薬チューブに含まれたバッファーおよびｄＮＴＰｓ試薬チューブに含まれたｄＮＴＰｓを用いて、実施の形態２で説明した方法に従ってプライマー伸長反応を行えばよい。
【０１００】
プライマー伸長反応の過程で反応液中に放出されたピロリン酸は、上記ピロリン酸試薬チューブに含まれたピロリン酸測定用試薬を用いて測定することができる。
【０１０１】
したがってその測定結果によって標的ＳＮＰ塩基種を擬陽性の可能性が極めて低く、かつ正確に判別可能となる。
【０１０２】
ピロリン酸測定用試薬は、ピロリン酸測定ができるものであれば特に限定されないが、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２００１，  Ｖｏｌ．２９，  Ｎｏ．１９  ｅ９３で示されたようにルシフェラーゼによる発光反応を用いるのであれば、ピロリン酸をＡＴＰに変換するためのＡＴＰスルフリラーゼおよび、ＡＴＰと反応して発光反応（波長５２０ｎｍ）を行うルシフェリンおよび、その反応を触媒するルシフェラーゼを含む。
【０１０３】
これらは一本のチューブに混合された状態であってもよいし、それぞれ別々のチューブに含まれていてもよい。
【０１０４】
いずれにしても使用者らは、上記プライマー伸長反応の過程で放出されるピロリン酸をこれらのピロリン酸測定用試薬を用い、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２００１，  Ｖｏｌ．２９，  Ｎｏ．１９  ｅ９３で示された方法に準じて光学的にピロリン酸を測定することができる。
【０１０５】
さらにこの場合、プライマー伸長反応で未反応のまま残ったｄＡＴＰがルシフェリンと反応してしまうため、より好ましくは、これら未反応ｄＡＴＰを分解するための酵素を含むチューブもキットの一部として含まれる。
【０１０６】
この酵素は、上記のルシフェラーゼによる反応の前か、あるいはピロリン酸からＡＴＰへの変換反応の前において、プライマー伸長反応液に加えられｄＡＴＰ分解反応が行われることが好ましい。
【０１０７】
ピロリン酸測定用試薬については、ＷＯ  ０３／０７８６５５  Ａ１で示されたピロリン酸の電気化学的測定法を用いるのであれば、ピロリン酸をリン酸に加水分解するためのピロホスファターゼおよび、このリン酸と反応するＧＡＰ（グリセルアルデヒド３−リン酸）とＮＡＤおよび、このリン酸−ＧＡＰ−ＮＡＤの反応を触媒するＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ）および、このリン酸−ＧＡＰ−ＮＡＤの反応より得られるＮＡＤＨと反応する電子メディエータ（酸化型）および、このＮＡＤＨと電子メディエータとの反応を触媒するジアホラーゼを含む。
【０１０８】
これらは一本のチューブに混合された状態であってもよいし、それぞれ別々のチューブに含まれていてもよい。いずれにしても使用者らは、上記プライマー伸長反応の過程で放出されるピロリン酸をこれらのピロリン酸測定用試薬を用い、ＷＯ  ０３／０７８６５５  Ａ１で示された方法に準じて電気化学的にピロリン酸を測定することができる。
【０１０９】
ピロリン酸測定用試薬については、特開２００４−１４１１５８号公報で示されたピロリン酸の電気化学的測定法を用いるのであれば、ピロリン酸をリン酸に加水分解するとともに、Ｈ＋を輸送するＨ＋−ＰＰａｓｅ（Ｈ＋−ピロホスファターゼ）を含む膜および、Ｈ＋濃度に依存して光学的特性が変わる色素を含む。
【０１１０】
これらは一本のチューブに混合された状態であってもよいし、それぞれ別々のチューブに含まれていてもよい。いずれにしても使用者らは、上記プライマー伸長反応の過程で放出されるピロリン酸をこれらのピロリン酸測定用試薬を用い、特開２００４−１４１１５８号公報で示された方法に準じて光学的にピロリン酸を測定することができる。
【０１１１】
ピロリン酸を測定する方法に関しては、ここで挙げたもの以外にも数多くの方法が知られている。したがって、もちろんピロリン酸測定用試薬についてもここに挙げたものに限られることなく、ピロリン酸測定に必要な試薬全てあるいは一部を含む構成となっていればよい。
【０１１２】
ピロリン酸測定用試薬の代わりに、サイバーグリーンＩのように二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光指示薬が本実施の形態４のキットに含まれる構成としてもよい。
【０１１３】
すなわち、サイバーグリーンＩに代表される二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光指示薬存在下でプライマー伸長反応を行わせると、その蛍光をモニタリングすることでプライマー伸長反応過程をリアルタイムで解析することが可能であり、この解析結果からＳＮＰ判別を行うことができる。
【０１１４】
サイバーグリーンＩに代表される二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光指示薬は、単独で一本のチューブに含まれていてもよいし、あるいはバッファー試薬チューブなどに含まれている構成としてもよく、この蛍光指示薬をプライマー伸長反応液に混合できるキット構成とすればよい。
【０１１５】
同様に、ピロリン酸測定用試薬の代わりに、ＴａｑＭａｎプローブが実施の形態４のキットに含まれる構成としてもよい。
【０１１６】
すなわちプライマー伸長反応が進む配列中の所望の領域に結合するようにＴａｑＭａｎプローブを設計しておけば、このＴａｑＭａｎプローブに依存した蛍光をモニタリングすることでプライマー伸長反応過程をリアルタイムで解析することが可能であり、この解析結果からＳＮＰ判別を行うことができる。
【０１１７】
そのように設計されたＴａｑＭａｎプローブは、単独で一本のチューブに含まれていてもよいし、あるいはバッファー試薬チューブなどに含まれている構成としてもよく、ＴａｑＭａｎプローブをプライマー伸長反応液に混合できるキット構成とすればよい。
【０１１８】
またここで、上記ＤＮＡポリメラーゼは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が弱いか無いことがより好ましい。その方がよりＳＮＰ判別が正確となる。またさらに、上記ＤＮＡポリメラーゼは、耐熱性のものである方がより好ましい。
【０１１９】
（実施の形態５）
本実施の形態５では、本発明におけるアレル特異性プライマーを含むＳＮＰ判別用キットについて説明する。使用者らは、ここで説明するＳＮＰ判別用キットを用いることで、各自のサンプル中の標的ＳＮＰ塩基種を擬陽性の可能性が極めて低く、かつ正確に判別するためのＰＣＲ反応を行うことができる。
【０１２０】
本実施の形態５におけるＳＮＰ判別用キットは、標的ＤＮＡ配列に対して実施の形態１に示した本発明におけるアレル特異性プライマーおよびこのアレル特異性プライマーとフォワードプライマー／リバースプライマーの関係になる第二のプライマーを含むプライマー試薬チューブと、ＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼ試薬チューブと、Ｍｇイオンと必要に応じて所望の塩が添加されたバッファーを含むバッファー試薬チューブと、ｄＮＴＰｓを含むｄＮＴＰｓ試薬チューブからなる。
【０１２１】
したがって使用者らは、まず各自の標的ＤＮＡ配列を含む二本鎖ＤＮＡのサンプルについて、ＰＣＲ伸長反応を行える状態に調製した後、上記プライマー試薬チューブに含まれたアレル特異性プライマーと第二のプライマーおよび、ＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼ試薬チューブに含まれたＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼおよび、バッファー試薬チューブに含まれたバッファーおよび、ｄＮＴＰｓ試薬チューブに含まれたｄＮＴＰｓを用いて、実施の形態３で説明した方法に従ってＰＣＲ反応を行えばよい。
【０１２２】
本実施の形態５におけるキットは、ＰＣＲ反応効率を調べるための試薬を含んでいることがより好ましい。ＰＣＲ反応効率を調べるための試薬としては、実施の形態３同様に、ピロリン酸測定用試薬や、サイバーグリーンＩのように二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光指示薬や、ＴａｑＭａｎプローブが挙げられる。
【０１２３】
ここで、ピロリン酸測定用試薬は、ＰＣＲ反応の過程で反応液中に放出されたピロリン酸を測定することができる。したがってその測定結果によって標的ＳＮＰ塩基種を擬陽性の可能性が極めて低く、かつ正確に判別可能となる。ピロリン酸測定用試薬の種類については、実施の形態４と同じであり、ピロリン酸測定に必要な試薬全てあるいは一部を含む構成となっていればよい。
【０１２４】
サイバーグリーンＩのように二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光指示薬や、ＴａｑＭａｎプローブについては、これらの存在下でＰＣＲ反応を行うことで、ＰＣＲ反応の過程をリアルタイムでモニタリングでき、その結果によって標的ＳＮＰ塩基種を擬陽性の可能性が極めて低く、かつ正確に判別できる。
【０１２５】
したがって、これらは単独で一本のチューブに含まれていてもよいし、あるいはバッファー試薬チューブなどに含まれている構成としてもよく、これらの試薬をＰＣＲ反応液に混合できるキット構成とすればよい。
【０１２６】
以上、上記実施の形態１〜５を通じて、本発明におけるアレル特異性プライマーおよび、このアレル特異性プライマーを用いたＳＮＰ判別方法および、このアレル特異性プライマーを含むＳＮＰ判別用キットについて説明した。
【０１２７】
これらは特にＳＮＰに限られることなく、突然変異による一塩基の違いの判別や、あるいは人工的にある特定の塩基に変異を起こさせた場合の一塩基の違いの判別についても全く同様の効果を示すことは言うまでもない。
【実施例】
【０１２８】
本発明のより具体的な実施例について以下に記す。
【０１２９】
（実施例１）
本実施例１では、本発明におけるアレル特異性プライマーを用いたプライマー伸長反応によってλＤＮＡ中の標的塩基種判別を行った。
【０１３０】
すなわち、まずλＤＮＡ（タカラバイオ（株）製）中の６７５７番目のＴ／Ａ塩基対について人工的にＣ／Ｇ塩基対に置換した変異型λＤＮＡ−６７５７−ＣＧを作成した。
【０１３１】
そしてこれら塩基対の置換の判別を、
５’−ＧＡＴＣＣＧＡＡＡＧＧＣＴＧＧＧＣＧＣＴＡＣＴ−３’（λ−ＡＣＴ：配列番号１）、
５’−ＧＡＴＣＣＧＡＡＡＧＧＣＴＧＧＧＣＧＣＴＴＣＴ−３’（λ−ＴＣＴ：配列番号２）、および
５’−ＧＡＴＣＣＧＡＡＡＧＧＣＴＧＧＧＣＧＣＴＣＣＴ−３’（λ−ＣＣＴ：配列番号３）
からなる三種類のプライマーを用いて行うこととした。
【０１３２】
上記三種類のプライマーを順に、λ−ＡＣＴ、λ−ＴＣＴ、λ−ＣＣＴと呼ぶ。
【０１３３】
ここで、上記三種類のプライマーの３’末端塩基Ｔは、野生型λＤＮＡの６７３５〜６７５７番目からなる二本鎖ＤＮＡ配列５’−ＧＡＴＣＣＧＡＡＡＧＧＣＴＧＧＧＣＧＣＴＧＴＴ−３’／５’−ＡＡＣＡＧＣＧＣＣＣＡＧＣＣＴＴＴＣＧＧＡＴＣ−３’（配列番号４）のうち、５’−ＡＡＣＡＧＣＧＣＣＣＡＧＣＣＴＴＴＣＧＧＡＴＣ−３’（配列番号４のアンチセンス鎖）の５’末端塩基Ａと相補的である。
【０１３４】
上記三種類のプライマーの３’末端から２番目の塩基Ｃは、同様に５’−ＡＡＣＡＧＣＧＣＣＣＡＧＣＣＴＴＴＣＧＧＡＴＣ−３’（配列番号４）の５’末端から２番目の塩基ＡとＣ／Ａの非相補的な関係である。
【０１３５】
上記三種類のプライマーの３’末端から３番目の塩基種は全て異なるが（λ−ＡＣＴの場合はＡ、λ−ＴＣＴの場合はＴ、λ−ＣＣＴの場合はＣ）、同様に５’−ＡＡＣＡＧＣＧＣＣＣＡＧＣＣＴＴＴＣＧＧＡＴＣ−３’（配列番号４）の５’末端から３番目の塩基Ｃと非相補的な関係である。
【０１３６】
上記三種類のプライマーの３’末端から４番目の塩基から５’末端の塩基までの配列は、同様に５’−ＡＡＣＡＧＣＧＣＣＣＡＧＣＣＴＴＴＣＧＧＡＴＣ−３’（配列番号４）の５’末端から４番目の塩基から３’末端の塩基までの配列に対して完全に相補的である。
【０１３７】
一方、上記三種類のプライマーの３’末端の三塩基は、変異型λＤＮＡ−６７５７−ＣＧの６７３５〜６７５７番目からなる二本鎖ＤＮＡ配列５’−ＧＡＴＣＣＧＡＡＡＧＧＣＴＧＧＧＣＧＣＴＧＴＣ−３’／５’−ＧＡＣＡＧＣＧＣＣＣＡＧＣＣＴＴＴＣＧＧＡＴＣ−３’（配列番号５）のうち、５’−ＧＡＣＡＧＣＧＣＣＣＡＧＣＣＴＴＴＣＧＧＡＴＣ−３’（配列番号５のアンチセンス鎖）の５’末端の三塩基に対して非相補的である（下線部が変異導入部位）。
【０１３８】
実験は下記のとおりであった。
【０１３９】
まず、
２０μＭの上記野生型λＤＮＡあるいは変異型λＤＮＡ−６７５７−ＣＧ、
１０μＭのλ−ＡＣＴあるいはλ−ＴＣＴあるいはλ−ＣＣＴのいずれか、
０．５Ｕ／μＬのＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（タカラバイオ（株）製）、
１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、
５０ｍＭのＫＣｌ、
１．５ｍＭのＭｇＣｌ２および、
各１ｍＭのｄＮＴＰｓ
を含む反応溶液１０μＬを調製した。
【０１４０】
この反応溶液をＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製サーマルサイクラーであるＤＮＡ  ｅｎｇｉｎｅを用いて９５℃で１分間インキュベートした後、５８℃で５分間インキュベートし、最後に７２℃で１０分間インキュベートした。
【０１４１】
インキュベート後の反応液については、ルシフェラーゼの反応系を利用することで含まれているピロリン酸量を解析した。
【０１４２】
より具体的にはＫａｍｂａｒａらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２００１，  Ｖｏｌ．２９，  Ｎｏ．１９  ｅ９３）に準じて、ピロリン酸量を発光強度に変換して解析した。
【０１４３】
解析結果を図５に示す。
【０１４４】
これらの結果は、野生型λＤＮＡについてλ−ＡＣＴによってプライマー伸長反応を行った場合の発光強度を１００％としたときの、それぞれの場合における比較発光強度を示している。
【０１４５】
図５より、上記λ−ＡＣＴ、λ−ＴＣＴ、λ−ＣＣＴのいずれに関しても、変異型λＤＮＡ−６７５７−ＣＧの場合より野生型λＤＮＡの場合のほうが、明らかに発光強度が大きいことが分かる。
【０１４６】
すなわち、上記λ−ＡＣＴ、λ−ＴＣＴ、λ−ＣＣＴによって明確に本実施例における一塩基の違いを判別できたと言える。
【０１４７】
（比較例１）
本比較例１では、上記実施例１の比較実験として、上記実施例１の野生型λＤＮＡと変異型λＤＮＡ−ＣＧの一塩基の違いについて、以下の三種類のプライマーを用いて判別を試みた。
【０１４８】
すなわち、
５’−ＧＡＴＣＣＧＡＡＡＧＧＣＴＧＧＧＣＧＣＴＡＡＴ−３’（λ−ＡＡＴ：配列番号６）
５’−ＧＡＴＣＣＧＡＡＡＧＧＣＴＧＧＧＣＧＣＴＡＧＴ−３’（λ−ＡＧＴ：配列番号７）、および
５’−ＧＡＴＣＣＧＡＡＡＧＧＣＴＧＧＧＣＧＣＴＣＡＴ−３’（λ−ＣＡＴ：配列番号８）
の配列からなる三種類のプライマーを用いて、実施例１と同様の実験を行った。
【０１４９】
これら三種類のプライマーを順に、λ−ＡＡＴ、λ−ＡＧＴ、λ−ＣＡＴと呼ぶ。
【０１５０】
これらは、その３’末端から２番目および３番目の塩基が、５’−ＡＡＣＡＧＣＧＣＣＣＡＧＣＣＴＴＴＣＧＧＡＴＣ−３’（配列番号４）の５’末端から２番目および３番目の塩基と非相補的であるという点で、実施例１で用いたλ−ＡＣＴ、λ−ＴＣＴ、λ−ＣＣＴと同じである。
【０１５１】
解析結果を図６に示す。
【０１５２】
これらの結果は、図５と同様に野生型λＤＮＡについてλ−ＡＣＴによってプライマー伸長反応を行った場合の発光強度を１００％としたときの、それぞれの場合における比較発光強度を示している。
【０１５３】
これら三種類のプライマーと野生型λＤＮＡの組み合わせの場合における発光強度は、図５に示されているλ−ＡＣＴやλ−ＴＣＴやλ−ＣＣＴと野生型λＤＮＡの組み合わせの場合に比べると明らかに小さく（図５および図６の縦軸の大きさに注意）、これによりλ−ＡＣＴ、λ−ＴＣＴ、λ−ＣＣＴの判別能がより優れていることが分かる。
【０１５４】
これらの実施例１および比較例１から理解されるように、標的ＳＮＰ塩基の３’末端側にすぐ隣接する塩基がＡであり、もう一塩基隣の塩基がＣである場合には、アレル特異性プライマーの３’末端から２番目の塩基がＣであり、３番目の塩基がＡかＴかＣのいずれかであれば、非常に高い判別能を得ることができる。
【０１５５】
（実施例２）
本実施例２では、本発明におけるアレル特異性プライマーを用いたＰＣＲ反応によってλＤＮＡ中の標的塩基種判別を行った。
【０１５６】
まず、λＤＮＡ（タカラバイオ（株）製）中の６６５４番目のＧ／Ｃ塩基対について人工的にＡ／Ｔ塩基対に置換した変異型λＤＮＡ−６６５４−ＡＴを作成した。
【０１５７】
そしてこれら塩基対の置換の判別を、
５’−ＧＧＣＧＧＣＡＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＣＡＡＧＣＡＣＧ−３’（λ−ＡＣＧ：配列番号９）、
５’−ＧＧＣＧＧＣＡＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＣＡＡＧＣＴＣＧ−３’（λ−ＴＣＧ：配列番号１０）、および
５’−ＧＧＣＧＧＣＡＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＣＡＡＧＣＣＣＧ−３’（λ−ＣＣＧ：配列番号１１）
からなる三種類のプライマーをフォワードプライマーとして用いたＰＣＲ反応によって行うこととした。
【０１５８】
上記三種類のプライマーを順に、λ−ＡＣＧ、λ−ＴＣＧ、λ−ＣＣＧと呼ぶ。
【０１５９】
ここで、上記三種類のプライマーの３’末端塩基Ｇは、野生型λＤＮＡの６６３０〜６６５４番目からなる二本鎖ＤＮＡ配列５’−ＧＧＣＧＧＣＡＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＣＡＡＧＣＧＴＧ−３’／５’−ＣＡＣＧＣＴＴＧＣＴＣＣＡＣＴＣＣＧＴＧＣＣＧＣＣ−３’（配列番号１２）のうち、５’−ＣＡＣＧＣＴＴＧＣＴＣＣＡＣＴＣＣＧＴＧＣＣＧＣＣ−３’（配列番号１２のアンチセンス鎖）の５’末端塩基Ｃと相補的である。
【０１６０】
上記三種類のプライマーの３’末端から２番目の塩基Ｃは、同様に５’−ＣＡＣＧＣＴＴＧＣＴＣＣＡＣＴＣＣＧＴＧＣＣＧＣＣ−３’の５’末端から２番目の塩基ＡとＣ／Ａの非相補的な関係である。
【０１６１】
上記三種類のプライマーの３’末端から３番目の塩基種は全て異なるが（λ−ＡＣＧの場合はＡ、λ−ＴＣＧの場合はＴ、λ−ＣＣＧの場合はＣ）、同様に５’−ＣＡＣＧＣＴＴＧＣＴＣＣＡＣＴＣＣＧＴＧＣＣＧＣＣ−３’（配列番号１２）の５’末端から３番目の塩基Ｃと非相補的な関係である。
【０１６２】
上記三種類のプライマーの３’末端から４番目の塩基から５’末端の塩基までの配列は、同様に５’−ＣＡＣＧＣＴＴＧＣＴＣＣＡＣＴＣＣＧＴＧＣＣＧＣＣ−３’（配列番号１２）の５’末端から４番目の塩基から３’末端の塩基までの配列に対して完全に相補的である。
【０１６３】
一方、上記三種類のプライマーの３’末端の三塩基は、変異型λＤＮＡ−６６５４−ＡＴの６６３０〜６６５４番目からなる二本鎖ＤＮＡ配列５’−ＧＧＣＧＧＣＡＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＣＡＡＧＣＧＴＡ−３’／５’−ＴＡＣＧＣＴＴＧＣＴＣＣＡＣＴＣＣＧＴＧＣＣＧＣＣ−３’（配列番号１３）のうち、５’−ＴＡＣＧＣＴＴＧＣＴＣＣＡＣＴＣＣＧＴＧＣＣＧＣＣ−３’（配列番号１３のアンチセンス鎖）の５’末端の三塩基に対して非相補的である（下線部が変異導入部位）。
【０１６４】
リバースプライマーとしては、５’−ＧＡＡＴＣＡＣＧＧＴＡＴＣＣＧＧＣＴＧＣＧＣＴＧＡ−３’（配列番号１４）からなるＤＮＡを用いた。
【０１６５】
このリバースプライマーは、λＤＮＡの７４０６〜７４３０番目からなる二本鎖ＤＮＡ配列５’−ＴＣＡＧＣＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴＡＣＣＧＴＧＡＴＴＣ−３’（配列番号１５）／５’−ＧＡＡＴＣＡＣＧＧＴＡＴＣＣＧＧＣＴＧＣＧＣＴＧＡ−３’のうち、５’−ＴＣＡＧＣＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴＡＣＣＧＴＧＡＴＴＣ−３’（配列番号１５のセンス鎖）と完全に相補的である。
【０１６６】
仮に上記λ−ＡＣＧ、λ−ＴＣＧ、λ−ＣＣＧとのＰＣＲ反応によって良好に反応が進めば、７０１ｂｐのＤＮＡ増幅産物が得られるはずである。
【０１６７】
実験は下記のとおりである。
【０１６８】
まず、
Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉキット（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）の酵素ミクスチャーを２μ
Ｌおよび、１０μｇ／ｍＬの上記野生型λＤＮＡあるいは変異型λＤＮＡ−６６５４−ＡＴ、
１μＭのλ−ＡＣＧあるいはλ−ＴＣＧあるいはλ−ＣＣＧのいずれか、
１μＭの上記リバースプライマー、
１．６ｍＭのＭｇＣｌ２
を含む反応溶液２０μＬを調製した。
【０１６９】
この反応溶液をロシュ・ダイアグノスティクス社製サーマルサイクラーであるＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒを用いて、変性工程：９４℃、１０秒間、アニーリング工程：５８℃、１０秒間、伸長工程：７２℃、１０秒間、サイクル数：２０サイクルとしてＰＣＲ反応を行った。
【０１７０】
各ＰＣＲ反応結果については、アジレント・テクノロジーズ社製のＤＮＡ電気泳動用システムであるＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００を用いて解析した。
【０１７１】
解析結果を図７に示す。
【０１７２】
これらの結果は、各ＰＣＲ反応後における目的のＤＮＡ断片の濃度（ｎＭ）を示している。
【０１７３】
この結果より、上記λ−ＡＣＧ、λ−ＴＣＧ、λ−ＣＣＧのいずれをフォワードプライマーとして用いた場合も、変異型λＤＮＡ−ＣＧの場合においては目的のＤＮＡ断片は検出されなかった。
【０１７４】
一方、野生型λＤＮＡの場合は全て、目的のＤＮＡ断片は４０ｎＭ以上であった。
【０１７５】
すなわち、上記λ−ＡＣＧ、λ−ＴＣＧ、λ−ＣＣＧをフォワードプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行うことによって明確に本実施例における一塩基の違いを判別できたと言える。
【０１７６】
（比較例２）
本比較例２では、上記実施例２の比較実験として、上記実施例２の野生型λＤＮＡと変異型λＤＮＡ−６６５４−ＡＴの一塩基の違いについて、以下の三種類のプライマーを用いて判別を試みた。
【０１７７】
すなわち、
５’−ＧＧＣＧＧＣＡＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＣＡＡＧＣＡＡＧ−３’（λ−ＡＡＧ：配列番号１６）、
５’−ＧＧＣＧＧＣＡＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＣＡＡＧＣＡＧＧ−３’（λ−ＡＧＧ：配列番号１７）、および
５’−ＧＧＣＧＧＣＡＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＣＡＡＧＣＴＡＧ−３’（λ−ＴＡＧ：配列番号１８）
の配列からなる三種類のプライマーを用いて、実施例２と同様の実験を行った。
【０１７８】
これら三種類のプライマーを順に、λ−ＡＡＧ、λ−ＡＧＧ、λ−ＴＡＧと呼ぶ。
【０１７９】
これらは、その３’末端から２番目および３番目の塩基が、５’−ＣＡＣＧＣＴＴＧＣＴＣＣＡＣＴＣＣＧＴＧＣＣＧＣＣ−３’（配列番号１２）の５’末端から２番目および３番目の塩基と非相補的であるという点で、実施例２で用いたλ−ＡＣＧ、λ−ＴＣＧ、λ−ＣＣＧと同じである。
【０１８０】
解析結果を図８に示す。
【０１８１】
これらの結果は、図７と同様に各ＰＣＲ反応後における目的のＤＮＡ断片の濃度（ｎＭ）を示している。
【０１８２】
これより、まずλ−ＡＡＧ、λ−ＡＧＧ、λ−ＴＡＧのいずれにおいても、野生型λＤＮＡの場合は４．７ｎＭ以上の目的ＤＮＡ断片がわずかながら検出されているのに対して、変異型λＤＮＡ−６６５４−ＡＴの場合は全く検出されていない。
【０１８３】
これら三種類のプライマーと野生型λＤＮＡの組み合わせの場合における目的のＤＮＡ断片の濃度（図７および図８の縦軸の大きさに注意）は、λ−ＡＣＧやλＴＣＧやλＣＣＧと野生型λＤＮＡの組み合わせの場合に比べると約７分の１ほどであり、明らかに小さく、これよりλ−ＡＣＧ、λ−ＴＣＧ、λ−ＣＣＧの判別能がより優れていることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１８４】
本発明により、擬陽性の可能性が極めて低く、かつ明確にＳＮＰ判別などが可能なＤＮＡが有する標的塩基を判別する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０１８５】
【図１】従来技術におけるテンプレートＤＮＡとアレル特異性プライマーの関係を模式的に示した図
【図２】本発明におけるテンプレートＤＮＡとアレル特異性プライマーの関係を模式的に示した図
【図３】実施の形態２のＳＮＰ判別方法のフローチャート図
【図４】実施の形態３のＳＮＰ判別方法のフローチャート図
【図５】実施例１の実験結果を表したグラフ
【図６】比較例１の実験結果を表したグラフ
【図７】実施例２の実験結果を表したグラフ
【図８】比較例２の実験結果を表したグラフ
【符号の説明】
【０１８６】
１：従来技術におけるアレル特異性プライマー
２：従来技術におけるテンプレートＤＮＡ
３：本発明におけるアレル特異性プライマー
４：本発明におけるテンプレートＤＮＡ
【手続補正書】
【提出日】平成18年8月11日(2006.8.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡが有する標的塩基を判別する方法であって、
前記方法は、
（１）  Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣの４種類の塩基の中から前記標的塩基として予想される塩基と相補的な塩基を３’末端に有するアレル特異性プライマーを前記ＤＮＡに結合させてＤＮＡ伸長反応を生じさせるＤＮＡ伸長工程、および
（２）  前記ＤＮＡ伸長工程の効率を調べ、高効率であれば前記標的塩基は前記予想された塩基と同一であると判別され、低効率であれば前記標的塩基は前記予想された塩基とは異なると判別される判別工程
を有し、
前記ＤＮＡにおいて、前記標的塩基の３’末端側にすぐ隣接する塩基がＡであり、もう一塩基隣の塩基がＣであり、
前記アレル特異性プライマーの３’末端塩基が前記標的塩基であると予想される塩基と相補的であり、
前記アレル特異性プライマーの３’末端から２番目の塩基がＣであり、
前記アレル特異性プライマーの３’末端から３番目の塩基がＡかＴかＣのいずれかであり、かつ
前記アレル特異性プライマーの３’末端から４番目の塩基と５’末端の塩基との間の塩基配列が、前記アレル特異性プライマーの３’末端から４番目の塩基に対応する前記ＤＮＡ側の塩基と前記アレル特異性プライマーの５’末端の塩基に対応する前記ＤＮＡ側の塩基との間の塩基配列に相補的に結合する、方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡ伸長反応がプライマー伸長反応である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プライマー伸長反応により産生されるピロリン酸の濃度を調べることによって前記効率を調べる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ピロリン酸の濃度を発光強度として検出する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡ伸長反応がＰＣＲ反応である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＣＲ反応により産生された増幅ＤＮＡの濃度を、電気泳動法により測定することによって前記効率を調べる、請求項５に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡが有する標的塩基を判別する方法に関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】削除
【補正の内容】