(57)【要約】【課題】高度な技術と経験を要することなく、しかも従来のＤＮＡマーカーで判別できなかった品種にも適用することのできるＰＣＲマーカーを用いたジャガイモシストセンチュウ抵抗性検定法を提供することにある。【解決手段】下記の特定配列で表されるジャガイモシストセンチュウ抵抗性検定用プライマーよりなる。“5'-AACACCAATCAACAAAGTAC-3'”の20塩基の合成プライマーから構成され、また“5'-GGAACAATGTTGAATGCAAG-3'”の20塩基の合成プライマーから構成される。【選択図】        図１
2007215461.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１及び配列番号２で表されるジャガイモシストセンチュウ抵抗性検定用プライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、バレイショの重要病虫害であるジャガイモシストセンチュウに抵抗性を持つ品種育成を効率的に進めるため、交配によって得た雑種後代の抵抗性の有無を判別する検定法であって、特に、ジャガイモシストセンチュウ抵抗性遺伝子（Ｈ１）に連鎖し、ジャガイモシストセンチュウ抵抗性または感受性を判別するＰＣＲマーカーを用いたジャガイモシストセンチュウ抵抗性検定法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ジャガイモシストセンチュウ(以下ＰＣＮと略す)の根部寄生により、栽培されているバレイショは養分吸収が阻害され、下葉が黄化してしおれ、収量や品質が低下する。ＰＣＮは、土中では卵を内蔵したシストを形成し10年以上の長期間生存が可能なため、汚染圃場での撲滅は困難となっている。このため、抵抗性品種の育成が望まれている。
育種現場において、育成系統のＰＣＮ抵抗性検定は、汚染圃場等へ栽培し植物の根への寄生の有無によって判別する方法がなされているが、結果を得るまでに３〜５ヶ月の期間と、多くの労力を要する。また、汚染圃場での検定は気象やシストの密度によって影響されるため、結果を得るまでに長期間かかり、多くの労力を要する。また、人や車による他の地域への汚染の拡大を防ぐ必要がある。
ところで、育成個体の早期世代でＤＮＡマーカーを用いた抵抗性個体の選抜が可能になると、今まで以上に多くの個体を取り扱うことができ、新品種育成を効率的に行うことができる。平成１４年にＰＣＮ抵抗性遺伝子(Ｈ１遺伝子)に連鎖するＤＮＡマーカー(従来のＤＮＡマーカー「特開２００４−５７０２５」)を開発したが、これは特殊な反応条件でのみ検出可能なため高度な技術と経験を要する。また、ＰＣＮ抵抗性を持たない十数品種でも従来のＤＮＡマーカーが検出され、交配組合せに制約がある。
【特許文献１】特開２００４−５７０２５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、平成１４年度に開発した特開２００４−５７０２５によるＰＣＮ抵抗性遺伝子(Ｈ１遺伝子)に連鎖するＤＮＡマーカー(従来のＤＮＡマーカー)は特殊な反応条件でのみ検出可能なため高度な技術と経験を要する。また、ＰＣＮ抵抗性を持たない十数品種でも従来のＤＮＡマーカーが検出され、交配組合せに制約がある等の課題があった。
【０００４】
この発明は、上記のような課題に鑑み、その課題を解決すべく創案されたものであって、その目的とするところは、高度な技術と経験を要することなく、しかも従来のＤＮＡマーカーで判別できなかった品種にも適用することのできるＰＣＲマーカーを用いたジャガイモシストセンチュウ抵抗性検定法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
以上の目的を達成するために、この発明は、配列番号１及び配列番号２で表されるジャガイモシストセンチュウ抵抗性検定用プライマーよりなる。
ここで、配列番号１は“5'-AACACCAATCAACAAAGTAC-3'”の20塩基の合成プライマーから構成され、配列番号２は“5'-GGAACAATGTTGAATGCAAG-3'”の20塩基の合成プライマーから構成される。
【発明の効果】
【０００６】
この発明によれば、四倍体間の交配組合せで得られた後代集団のＰＣＮ抵抗性有無の判別が、従来のＤＮＡマーカーを使うよりも容易な条件で反応を行うことが可能となった。また、従来のＤＮＡマーカーで判別できなかった品種にも使用できるようになり、汎用性が高まった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
Ｈ１遺伝子に強く連鎖するＡＦＬＰマーカーのSacI Selective primer(SacI−ＡＧＡ)の塩基配列を基に10塩基のプライマー４種類(CM１+A：5'-GAGCTCAGAA-3'、CM１+G：5'-GAGCTCAGAG-3'、CM１+C：5'-GAGCTCAGAC-3'、CM１+T：5'-GAGCTCAGAT-3')を設計・合成した。「アトランチック」由来二倍性半数体の抵抗性個体10個体および感受性個体10個体から抽出したＤＮＡをそれぞれ等量ずつ混ぜて抵抗性および感受性ＤＮＡ混合試料とし、作製したプライマー１種類あたり10塩基ランダムプライマー37種類の組合せの計148組合せでＲＡＰＤ分析を行った。
CM１+G：5'-GAGCTCAGAG-3'とOPB-03：5'-CATCCCCCTG-3'の組合せにおいて、抵抗性ＤＮＡ混合試料にのみ、約490塩基のバンド(GB03-490)が検出された(図１)。GBO3-490をＳＴＳ化するためGB03-490の塩基配列を決定し、ＰＣＮ抵抗性遺伝子に特異的な約320塩基のＤＮＡバンド(H1-320)のみを検出できるプライマー(Ｈ１ＳＰ−Ｓ４：5'-AACACCAATCAACAAAGTAC-3'・Ｈ１ＳＰ−Ａ６：5'-GGAACAATGTTGAATGCAAG-3')を設計・合成した(図２)。このプライマーを使用したＰＣＲ反応でＰＣＮ抵抗性個体を選抜できるＰＣＲマーカーを開発した。
我が国のバレイショ50品種におけるH1-320の有無を調査したところ、H1-320の有無がＨ１遺伝子(ＰＣＮ抵抗性)の有無に一致し、従来のＤＮＡマーカーでは判別不能であった品種のほとんどでＰＣＮ抵抗性が判別可能となった。
【実施例】
【０００８】
〔バイレショＤＮＡ簡易抽出法（ＣＴＡＢ−ＬｉＣｌ法）〕
(1)0.05g組織を1.5mlチューブに入れ、ペッスルですりつぶす。
(2)175μlの２％CATB液と175μl８M LiClを加えて、撹拌する。
(3)65℃、５分間インキュベート（時々撹拌する）。
(4)350μlクロロホルム／イソアミルアルコール（24：１）を加えて、10分間振盪する。
(5)12,000rpmで３分間遠心分離する。
(6)上澄み300μlを新しい1.5mlチューブに移す。
(7)210μlの冷イソプロパノールを加えて、優しく撹拌する。
(8)−30℃で15分間放置する。
(9)12,000rpmで10分間、４℃で遠心分離する。
(10)１mlの70%冷エタノールを加えて、すぐに吸い出す。
(11)１mlの冷エタノールを加えて、すぐに吸い出す。
(12)遠心濃縮機で５分間乾燥する。
(13)50μlの滅菌水（10μg／ml RNaseAを含む）を加え、55℃で溶解する。
【０００９】
〔抽出ＤＮＡ濃度測定〕
(1)２ml Low Range(A)液（0.1μg／mlH33258、0.2M NaCl２、10mM Tris−HCl、１mM EDTA;pH7.4）をガラスセルに入れ、「ZERO」を押し、０点調整を行う。
(2)λＤＮＡ液（100μg／ml）を２μl加えて撹拌し、「CALIB」を押し、「ｌ」「０」「０」と入力後、「ENTER」を押す。
(3)Calibration終了後、ガラスセルの液を捨て、新しい２ml Low Range(A)液を入れ、「ZERO」を押し０点調整後、抽出ＤＮＡサンプルの２μlを加えて撹拌し、濃度を測定する。
ここで、使用機器は、DyNA Quant 200（ファルマシア製）を用いた。
【００１０】
〔ジャガイモシストセンチュウ抵抗性を判別するＰＣＲマーカー反応液組成〕
10×ＰＣＲ  Buffer(MgCl２ free）      10μl（最終濃度：１×）
25mM  MgCl２                          ８μl（最終濃度：２mM）
2.5mM  dNTP Mixture                  ４μl（最終濃度：0.1mM）
50μM  Ｈ１ＳＰ−Ｓ４                 １μl（最終濃度：0.5μM）
50μM  Ｈ１ＳＰ−Ａ６                 １μl（最終濃度：0.5μM）
５units／μl Taq ＤＮＡ Polymerase  0.5μl（最終量：2.5u）
鋳型ＤＮＡ（５ng／μl）               20μl（最終量：100ng）
滅菌水                              55.5μl                
計                       100μl
ここで、Taq  ＤＮＡ  Polymeraseは宝酒造社のrTaqを使用。10×Buffer、MgCl２はキット添付のもの。
【００１１】
〔ＰＣＮ抵抗性を識別するＰＣＲマーカー反応温度条件〕
94℃３分を１サイクル
94℃30秒→64.0℃30秒→72℃１分を35サイクル
72℃５分を１サイクル
【００１２】
〔電気泳動〕
(1)アガロース0.42gを耐熱ビンに入れ、１×TAE buffer（40mM Tris、40mM氷酢酸、１mM EDTA、pH8.0）30mlを加えて電子レンジで加熱し撹拌しながら完全に溶かす。
(2)溶液の温度が約40℃に冷えたら、ゲルトレイに注ぎコームを差し込む。ゲルが固まったら泳動槽にセットする。
(3)Loading buffer（0.25％bromophenol blue、0.25％xylene cyanol FF、lmM  EDTA、30％グリセロール）１μl取り、ＰＣＲ反応させたチューブに直接加えて混合し、そこから5μ1取る。
(4)5μlのサンプルを泳動槽にセットしたアガロースゲルの注入穴に静かに注入する。
(5)100Ｖで30分間電気泳動後、0.5μg／mlエチジウムブロマイド（臭化エチジウム）を含む１×TAE bufferに浸して15分間ゆっくり振盪し、ゲルをトランスイルミネーターにのせ、紫外線を照射してカメラで撮影する。
【００１３】
「アトランチック」由来二倍性半数体集団において、ＰＣＮポット接種検定結果とＰＣＲマーカー検定結果との間には92.6％の相関(表１)が、また、「西海30号(♀)×サクラフブキ(♂)」の後代集団において、ＰＣＮ汚染圃場検定結果とＰＣＲマーカー検定結果との間には82.8％の相関が認められ、有効性が確認された(表２)。
【００１４】
【表１】
2007215461.tif 000003
【００１５】
【表２】
2007215461.tif 000004
【００１６】
さらに、我が国のバレイショ50品種におけるＰＣＮ抵抗性の有無と検出されるＰＣＲマーカーの有無を調査したところ、50品種すべて相関が見られた(表３、図３)。
【００１７】
【表３】
2007215461.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＲＡＰＤ分析で得られた「アトランチック」のジャガイモシストセンチュウ抵抗性遺伝子に連鎖したＤＮＡバンド(矢印で表示)を示す図である。
【図２】開発したジャガイモシストセンチュウ抵抗性判別用のＰＣＲプライマーを示す図である。
【図３】バレイショ品種におけるプライマー(Ｈ１ＳＰ−Ｓ４、Ｈ１ＳＰ−Ａ６)を使ったＰＣＲによるジャガイモシストセンチュウ抵抗性の判別(矢印で表示)を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００１９】
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
【図１】
2007215461.tif 000006
【図２】
2007215461.tif 000007
【図３】
2007215461.tif 000008
【配列表】
2007215461000001.xml