(57)【要約】      （修正有）【課題】野生型ホタルルシフェラーゼと比較して、発光強度が増大した変異型ホタルルシフェラーゼの提供。【解決手段】野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、少なくとも下記（ａ）の置換が生じた変異アミノ酸配列からなり、当該野生型ホタルルシフェラーゼの発光強度よりも大きい発光強度を有する変異型ホタルルシフェラーゼ。  （ａ）北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の４１９〜４２８位と同等の位置のアミノ酸のうちの少なくとも一つのアミノ酸の、当該アミノ酸の分子量以上の分子量を有する非極性アミノ酸への置換。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、少なくとも下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の置換が生じた変異アミノ酸配列からなり、
前記野生型ホタルルシフェラーゼの発光強度よりも大きい発光強度を有する変異型ホタルルシフェラーゼ。
（ａ）北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の４１９〜４２８位と同等の位置のアミノ酸のうちの少なくとも一つのアミノ酸の、当該アミノ酸の分子量以上の分子量を有する非極性アミノ酸への置換
（ｂ）北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の４３５〜４４１位と同等の位置のアミノ酸のうちの少なくとも一つのアミノ酸の、当該アミノ酸の分子量より小さい分子量を有し、グリシン、アラニン及びセリンより選ばれるアミノ酸への置換
（ｃ）北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の５２３〜５３２位と同等の位置のアミノ酸のうちの少なくとも一つのアミノ酸の、当該アミノ酸の等電点より大きい等電点を有する正電荷アミノ酸への置換
【請求項２】
前記変異アミノ酸配列が、前記野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、少なくとも前記（ａ）及び（ｂ）の置換が生じたものである、請求項１に記載の変異型ホタルルシフェラーゼ。
【請求項３】
前記変異アミノ酸配列が、前記野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、少なくとも前記（ａ）及び（ｃ）の置換が生じたものである、請求項１に記載の変異型ホタルルシフェラーゼ。
【請求項４】
前記変異アミノ酸配列が、前記野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、少なくとも前記（ｂ）及び（ｃ）の置換が生じたものである、請求項１に記載の変異型ホタルルシフェラーゼ。
【請求項５】
前記変異アミノ酸配列が、前記野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、少なくとも前記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の置換が生じたものである、請求項１に記載の変異型ホタルルシフェラーゼ。
【請求項６】
前記変異アミノ酸配列が、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異型ホタルルシフェラーゼ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異型ホタルルシフェラーゼをコードする遺伝子。
【請求項８】
請求項７に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の組換えベクターを保有する形質転換体。
【請求項１０】
請求項９に記載の形質転換体を培養して、培養物を得る培養ステップと、当該培養物から前記変異型ホタルルシフェラーゼを採取する採取ステップと、を備える変異型ホタルルシフェラーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異型ホタルルシフェラーゼ、遺伝子、組換えベクター、形質転換体、及び変異型ホタルルシフェラーゼの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホタルルシフェラーゼは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、マグネシウムイオン及び酸素の存在下でホタルルシフェリンの酸化を触媒し、これを発光させる酵素である。そのため、ホタルルシフェラーゼは、飲食料中の細菌等の検出を目的とするＡＴＰの検出に広く利用されている。
【０００３】
ＡＴＰの検出におけるホタルルシフェラーゼの利用性を高めるために、これまで様々な変異型ホタルルシフェラーゼが作製されてきた。そのような変異型ホタルルシフェラーゼとしては、熱安定性が向上したもの(例えば、下記特許文献１〜４参照）、基質親和性が向上したもの（例えば、下記特許文献５〜７参照）、発光波長が変化したもの（例えば、下記特許文献８及び９参照）、発光の持続性が向上したもの（例えば、下記特許文献１０参照）、界面活性剤耐性を有するもの（例えば、下記特許文献１１参照）等が知られている。
【特許文献１】特許第３０４８４６６号公報
【特許文献２】特開２０００−１９７４８７号公報
【特許文献３】特表平９−５１０６１０号公報
【特許文献４】特表２００３−５１８９１２号公報
【特許文献５】国際公開第９９／０２６９７号パンフレット
【特許文献６】特表平１０−５１２７５０号公報
【特許文献７】特表２００１−５１８７９９号公報
【特許文献８】特許第２６６６５６１号公報
【特許文献９】特表２００３−５１２０７１号公報
【特許文献１０】特開２０００−１９７４８４号公報
【特許文献１１】特開平１１−２３９４９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来、野生型ホタルルシフェラーゼと比較して、発光強度が増大した変異型ホタルルシフェラーゼは知られていなかった。このような変異型ホタルルシフェラーゼが提供されれば、より微量のＡＴＰの検出が可能になり、飲食料中の細菌等の検出にも有用である。
【０００５】
そこで、本発明は、野生型ホタルルシフェラーゼと比較して、発光強度が増大した変異型ホタルルシフェラーゼを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記目的を達成するべく鋭意研究したところ、野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸を特定の異なるアミノ酸に置換することにより、発光強度が増大することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、少なくとも下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の置換が生じた変異アミノ酸配列からなり、
前記野生型ホタルルシフェラーゼの発光強度よりも大きい発光強度を有する変異型ホタルルシフェラーゼを提供する。
（ａ）北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の４１９〜４２８位と同等の位置のアミノ酸のうちの少なくとも一つのアミノ酸の、当該アミノ酸の分子量以上の分子量を有する非極性アミノ酸への置換
（ｂ）北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の４３５〜４４１位と同等の位置のアミノ酸のうちの少なくとも一つのアミノ酸の、当該アミノ酸の分子量より小さい分子量を有し、グリシン、アラニン及びセリンより選ばれるアミノ酸への置換
（ｃ）北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の５２３〜５３２位と同等の位置のアミノ酸のうちの少なくとも一つのアミノ酸の、当該アミノ酸の等電点より大きい等電点を有する正電荷アミノ酸への置換
【０００８】
本明細書において、「北米ホタルルシフェラーゼ」とは、特に断らない限り、野生型の北米ホタル（Photinus pyralis）ルシフェラーゼを意味する。また、例えば、「ヘイケホタルルシフェラーゼ」及び「ゲンジホタルルシフェラーゼ」とは、特に断らない限り、それぞれ、野生型のヘイケホタル（Luciola lateralis）ルシフェラーゼ及びゲンジホタル（Luciola cruciata）ルシフェラーゼを意味する。
【０００９】
また、ホタルルシフェラーゼの「発光強度」とは、特に断らない限り、当該ホタルルシフェラーゼを、ＡＴＰ、２価金属イオン及び酸素の存在下でホタルルシフェリンと反応させた場合におけるピーク時の発光強度を意味する。なお、「発光強度」が大きいほど、当該ホタルルシフェラーゼのホタルルシフェラーゼ活性が強いと判断することができる。
【００１０】
また、野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における、「北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の４１９〜４２８位と同等の位置」、「北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の４３５〜４４１位と同等の位置」、及び「北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の５２３〜５３２位と同等の位置」とは、野生型ホタルルシフェラーゼが北米ホタルルシフェラーゼである場合は、それぞれ、当該野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における４１９〜４２８位、４３５〜４４１位、及び５２３〜５３２位であり、野生型ホタルルシフェラーゼが北米ホタルルシフェラーゼでない場合は、それぞれ、当該野生型ホタルルシフェラーゼ及び北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列をそれらの重なりの程度が最大となるようにアラインメント（並置）したときに、当該野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の４１９〜４２８位、４３５〜４４１位、及び５２３〜５３２位に対応する位置である。なお、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列は、配列番号１に示すとおりである。
【００１１】
また、「非極性アミノ酸」とは、側鎖に非極性基を有するアミノ酸を意味する。「正電荷アミノ酸」とは、生理的ｐＨ（ｐＨ７．４）において正に荷電しているアミノ酸を意味する。
【００１２】
上記変異型ホタルルシフェラーゼを用いてルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を行うと、野生型ホタルルシフェラーゼを用いた場合と比較して、発光強度を増大させることができる。これは、上述したアミノ酸の置換により、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の反応速度が大きくなるためである。
【００１３】
上記変異型ホタルルシフェラーゼにおいて、変異アミノ酸配列としては、野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、少なくとも上記（ａ）及び（ｂ）の置換、上記（ａ）及び（ｃ）の置換、又は上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の置換が生じたものが好ましい。このような変異アミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼを用いてルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を行うと、各置換が単独で生じた場合と比較して、発光強度を更に増大させることができる。これは、上記（ａ）及び（ｂ）の置換、上記（ａ）及び（ｃ）の置換、又は上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の置換が組み合わされることにより、各置換が単独で生じた場合と比較して、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の反応速度が更に大きくなるためである。なお、変異アミノ酸配列としては、野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、少なくとも前記（ｂ）及び（ｃ）の置換が生じたものでもよい。
【００１４】
また、上記変異型ホタルルシフェラーゼにおいて、変異アミノ酸配列としては、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列に対して６０％以上の相同性を有するものが好ましい。北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列との相同性が６０％未満であると、６０％以上の場合と比較して、発光強度が小さくなる傾向がある。
【００１５】
上記変異型ホタルルシフェラーゼは、当該変異型ホタルルシフェラーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保有する形質転換体を培養し、得られる培養物から当該変異型ホタルルシフェラーゼを採取することにより得ることができる。
【００１６】
すなわち、本発明はまた、上記変異型ホタルルシフェラーゼをコードする遺伝子、当該遺伝子を含有する組換えベクター、及び当該組換えベクターを保有する形質転換体を提供する。また、本発明は更に、上記形質転換体を培養して、培養物を得る培養ステップと、当該培養物から上記変異型ホタルルシフェラーゼを採取する採取ステップと、を備える変異型ホタルルシフェラーゼの製造方法を提供する。
【００１７】
上記遺伝子、上記組換えベクター、上記形質転換体、及び上記変異型ホタルルシフェラーゼの製造方法により、上記変異型ホタルルシフェラーゼを効率的に生産することができる。
【００１８】
また、上記遺伝子をレポーター遺伝子として用いると、野生型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を用いた場合と比較して、レポーターアッセイをより高感度に行うことができる。そのようなレポーターアッセイは、上記組換えベクターにより可能となる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、野生型ホタルルシフェラーゼと比較して、発光強度が増大した変異型ホタルルシフェラーゼが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。
【００２１】
（変異型ホタルルシフェラーゼ）
本発明の変異型ホタルルシフェラーゼは、
野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、少なくとも下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の置換が生じた変異アミノ酸配列からなり、
前記野生型ホタルルシフェラーゼの発光強度よりも大きい発光強度を有する変異型ホタルルシフェラーゼである。
（ａ）北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の４１９〜４２８位と同等の位置のアミノ酸のうちの少なくとも一つのアミノ酸（アミノ酸Ａ）の、当該アミノ酸Ａの分子量以上の分子量を有する非極性アミノ酸への置換
（ｂ）北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の４３５〜４４１位と同等の位置のアミノ酸のうちの少なくとも一つのアミノ酸（アミノ酸Ｂ）の、当該アミノ酸Ｂの分子量より小さい分子量を有し、グリシン、アラニン及びセリンより選ばれるアミノ酸への置換
（ｃ）北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の５２３〜５３２位と同等の位置のアミノ酸のうちの少なくとも一つのアミノ酸の（アミノ酸Ｃ）、当該アミノ酸Ｃの等電点より大きい等電点を有する正電荷アミノ酸への置換
【００２２】
野生型ホタルルシフェラーゼとしては、北米ホタル（Photinus pyralis）ルシフェラーゼ、ヘイケホタル（Luciola lateralis）ルシフェラーゼ、ゲンジホタル（Luciola cruciata）ルシフェラーゼ、東ヨーロッパホタル（Luciola mingrelica）ルシフェラーゼ、ツチホタル（Lampyris noctiluca）ルシフェラーゼ等が挙げられる。なお、各種の野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列は、データベース（例えば、EMBL-EBI Database（http://www.ebi.ac.uk/queries/））で検索することができる。
【００２３】
野生型ホタルルシフェラーゼが北米ホタルルシフェラーゼでない場合は、当該野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における、「北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の４１９〜４２８位と同等の位置」、「北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の４３５〜４４１位と同等の位置」、及び「北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の５２３〜５３２位と同等の位置」は、アミノ酸配列の相同性解析ソフト（例えば、Micro GenieTM（ベックマン社製））等を用いて、当該野生型ホタルルシフェラーゼ及び北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の相同性を解析することにより決定することができる。なお、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列は、配列番号１に示すとおりである。
【００２４】
野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における、「北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の４１９〜４２８位と同等の位置」、「北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の４３５〜４４１位と同等の位置」、及び「北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の５２３〜５３２位と同等の位置」は、例えば、野生型ホタルルシフェラーゼがヘイケホタルルシフェラーゼ又はゲンジホタルルシフェラーゼの場合、それぞれ、当該野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における４２１〜４３０位、４３７〜４４３位、及び５２５〜５３４位である。なお、ヘイケホタルルシフェラーゼ及びゲンジホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２及び３に示すとおりである。
【００２５】
非極性アミノ酸としては、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン及びトリプトファンが挙げられ、疎水性の高さの点で、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン及びトリプトファンが好ましく、ロイシン及びメチオニンがより好ましい。正電荷アミノ酸としては、アルギニン、リシン及びヒスチジンが挙げられ、正電荷の強さの点で、アルギニン及びリシンが好ましく、アルギニンがより好ましい。
【００２６】
図１は、ホタルルシフェラーゼの立体構造を模式的に示す図である。図１に示すように、ホタルルシフェラーゼ１０は、Ｎ末端側ドメイン１、Ｃ末端側ドメイン３、及びそれらを連結する可動性の連結部２からなる。また、Ｎ末端側ドメイン１には、Ｃ末端側ドメイン３に対向して、酵素の活性部位１ｂが存在する。
【００２７】
Ｎ末端側ドメイン１と連結部２とが接合する接合部１ａは、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の４１９〜４２８位と同等の位置のアミノ酸配列部分に相当し、連結部２は、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の４３５〜４４１位と同等の位置のアミノ酸配列部分に相当し、Ｃ末端側ドメイン３の先端部３ａは、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の５２３〜５３２位と同等の位置のアミノ酸配列部分に相当する。このようなホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列と立体構造との関係は、立体構造解析ソフト（例えば、Bio Package（Molsoft社製））を用いて確認することができる。
【００２８】
上記変異型ホタルルシフェラーゼを用いてルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を行うと、野生型ホタルルシフェラーゼを用いた場合と比較して、発光強度を増大させることができる。これは、上述したアミノ酸の置換により、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の反応速度が大きくなるためである。
【００２９】
ホタルルシフェラーゼとホタルルシフェリンとが反応するには、Ｎ末端側ドメイン１がＣ末端側ドメイン３に接近する必要があると考えられる。上記（ａ）の置換が生じた変異型ホタルルシフェラーゼにおいては、Ｎ末端側ドメイン１中の接合部１ａを構成するアミノ酸のいずれかが、当該被置換アミノ酸の分子量以上の分子量を有する非極性アミノ酸に置換されていることにより、野生型ホタルルシフェラーゼと比較して、接合部１ａの疎水性がより強くなり、Ｎ末端側ドメイン１がＣ末端側ドメイン３に接近しやすくなっていると推測される。また、上記（ｂ）の置換が生じた変異型ホタルルシフェラーゼにおいては、可動性の連結部２を構成するアミノ酸のいずれかが、当該被置換アミノ酸の分子量より小さい分子量を有し、グリシン、アラニン及びセリンより選ばれるアミノ酸に置換されていることにより、野生型ホタルルシフェラーゼと比較して、連結部２の可動性がより大きくなり、Ｎ末端側ドメイン１がＣ末端側ドメイン３に接近しやすくなっていると推測される。
【００３０】
また、ホタルルシフェラーゼとホタルルシフェリンとが反応するには、ホタルルシフェリン及びＡＴＰがホタルルシフェラーゼの活性部位１ｂに取り込まれる必要がある。上記（ｃ）の置換が生じた変異型ホタルルシフェラーゼにおいては、Ｃ末端側ドメイン３の先端部３ａを構成するアミノ酸のいずれかが、当該被置換アミノ酸の等電点より大きい等電点を有する正電荷アミノ酸に置換されていることにより、先端部３ａがより正に帯電し、負電荷のホタルルシフェリン及びＡＴＰが酵素の活性部位１ｂに取り込まれやすくなっていると推測される。
【００３１】
上記変異型ホタルルシフェラーゼの変異アミノ酸配列としては、野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、少なくとも上記（ａ）及び（ｂ）の置換、上記（ａ）及び（ｃ）の置換、又は上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の置換が生じたものが好ましい。このような変異アミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼを用いてルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を行うと、各置換が単独で生じた場合と比較して、発光強度を更に増大させることができる。これは、上記（ａ）及び（ｂ）の置換、上記（ａ）及び（ｃ）の置換、又は上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の置換が組み合わされることにより、各置換が単独で生じた場合と比較して、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の反応速度が更に大きくなるためである。なお、変異アミノ酸配列としては、野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、少なくとも前記（ｂ）及び（ｃ）の置換が生じたものでもよい。
【００３２】
また、上記変異型ホタルルシフェラーゼの変異アミノ酸配列としては、発光強度の点で、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列との相同性が６０％以上のものが好ましい。上記相同性は、より好ましくは６５％以上、更に好ましくは７０％以上、更に好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上である。
【００３３】
上記変異型ホタルルシフェラーゼの変異アミノ酸配列は、野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の置換以外の変異（アミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加）が更に生じたものであってもよい。例えば、熱安定性を高める変異(例えば、上記特許文献１〜４参照）、基質親和性を高める変異（例えば、上記特許文献５〜７参照）、発光波長を変化させる変異（例えば、上記特許文献８及び９参照）、発光の持続性を高める変異（例えば、上記特許文献１０参照）、又は界面活性剤耐性を与える変異（例えば、上記特許文献１１参照）が更に導入されていてもよい。
【００３４】
本発明の変異型ホタルルシフェラーゼは、野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、少なくとも上記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の置換が生じた変異アミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼのうち、当該野生型ホタルルシフェラーゼの発光強度よりも大きい発光強度を有するものである。上記変異アミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼが本発明の変異型ホタルルシフェラーゼであるかどうかは、当該変異型ホタルルシフェラーゼを、ＡＴＰ、二価金属イオン（例えば、マグネシウムイオン）及び酸素の存在下でホタルルシフェリンと反応させ、発光強度を測定することにより確認することができる。上記野生型ホタルルシフェラーゼと比較して、発光強度が増大していれば、本発明の変異型ホタルルシフェラーゼであると判断することができる。なお、ホタルルシフェリンとしては、北米ホタル（Photinus pyralis）、ヘイケホタル（Luciola lateralis）、ゲンジホタル（Luciola cruciata）、東ヨーロッパホタル（Luciola mingrelica）、ツチホタル（Lampyris noctiluca）等に由来するものが挙げられる。
【００３５】
下記（１）〜（７）の変異型ホタルルシフェラーゼは、各々、本発明の変異型ホタルルシフェラーゼの好適な一態様である。
（１）野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の４１９〜４２８位と同等の位置のうちの少なくとも一つの位置で、アミノ酸が、当該アミノ酸の分子量以上の分子量を有する非極性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
（２）野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の４３５〜４４１位と同等の位置のうちの少なくとも一つの位置で、アミノ酸が、当該アミノ酸の分子量より小さい分子量を有し、グリシン、アラニン及びセリンより選ばれるアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
（３）野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の５２３〜５３２位と同等の位置のうちの少なくとも一つの位置で、アミノ酸が、当該アミノ酸の等電点より大きい等電点を有する正電荷アミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
（４）野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の４１９〜４２８位と同等の位置のうちの少なくとも一つの位置で、第一のアミノ酸が、当該第一のアミノ酸の分子量以上の分子量を有する非極性アミノ酸に置換され、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の４３５〜４４１位と同等の位置のうちの少なくとも一つの位置で、第二のアミノ酸が、当該第二のアミノ酸の分子量より小さい分子量を有し、グリシン、アラニン及びセリンより選ばれるアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
（５）野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の４１９〜４２８位と同等の位置のうちの少なくとも一つの位置で、第一のアミノ酸が、当該第一のアミノ酸の分子量以上の分子量を有する非極性アミノ酸に置換され、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の５２３〜５３２位と同等の位置のうちの少なくとも一つの位置で、第二のアミノ酸が、当該第二のアミノ酸の等電点より大きい等電点を有する正電荷アミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
（６）野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の４３５〜４４１位と同等の位置のうちの少なくとも一つの位置で、第一のアミノ酸が、当該第一のアミノ酸の分子量より小さい分子量を有し、グリシン、アラニン及びセリンより選ばれるアミノ酸に置換され、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の５２３〜５３２位と同等の位置のうちの少なくとも一つの位置で、第二のアミノ酸が、当該第二のアミノ酸の等電点より大きい等電点を有する正電荷アミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
（７）野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の４１９〜４２８位と同等の位置のうちの少なくとも一つの位置で、第一のアミノ酸が、当該第一のアミノ酸の分子量以上の分子量を有する非極性アミノ酸に置換され、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の４３５〜４４１位と同等の位置のうちの少なくとも一つの位置で、第二のアミノ酸が、当該第二のアミノ酸の分子量より小さい分子量を有し、グリシン、アラニン及びセリンより選ばれるアミノ酸に置換され、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の５２３〜５３２位と同等の位置のうちの少なくとも一つの位置で、第三のアミノ酸が、当該第三のアミノ酸の等電点より大きい等電点を有する正電荷アミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼ
【００３６】
上記（１）の変異型ホタルルシフェラーゼは、野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において上記（ａ）の置換が生じた変異アミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼである。上記（２）の変異型ホタルルシフェラーゼは、野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において上記（ｂ）の置換が生じた変異アミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼである。上記（３）の変異型ホタルルシフェラーゼは、野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において上記（ｃ）の置換が生じた変異アミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼである。上記（４）の変異型ホタルルシフェラーゼは、野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において上記（ａ）及び（ｂ）の置換が生じた変異アミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼである。上記（５）の変異型ホタルルシフェラーゼは、野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において上記（ａ）及び（ｃ）の置換が生じた変異アミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼである。上記（６）の変異型ホタルルシフェラーゼは、野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において上記（ｂ）及び（ｃ）の置換が生じた変異アミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼである。上記（７）の変異型ホタルルシフェラーゼは、野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の置換が生じた変異アミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼである。
【００３７】
上記（１）〜（７）の変異型ホタルルシフェラーゼは、いずれも、元の野生型ホタルルシフェラーゼと比較して、十分に大きい発光強度を有する。特に、上記（４）、（５）及び（７）の変異型ホタルルシフェラーゼは、元の野生型ホタルルシフェラーゼと比較して、顕著に大きい発光強度を有する。上記（１）〜（７）の変異型ホタルルシフェラーゼのいずれにおいても、元の野生型ホタルルシフェラーゼとしては、発光強度の点で北米ホタルルシフェラーゼが好ましい。
【００３８】
本発明の変異型ホタルルシフェラーゼの更に好適な一態様としては、例えば、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４１９〜４２８位のうちの少なくとも一つの位置で、第一のアミノ酸が、当該第一のアミノ酸の分子量以上の分子量を有する非極性アミノ酸に置換され、５２３〜５３２位のうちの少なくとも一つの位置で、第二のアミノ酸が、当該第二のアミノ酸の等電点より大きい等電点を有する正電荷アミノ酸に置換され、４７位のイソロイシンがスレオニンに置換され、５０位のアスパラギンがセリンに置換され、５９位のメチオニンがスレオニンに置換され、２５２位のスレオニンがセリンに置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼを挙げることができる。この変異型ホタルルシフェラーゼは、上記（１）〜（７）の変異型ホタルルシフェラーゼと比較して、更に大きい発光強度を有する。
【００３９】
（遺伝子）
本発明の遺伝子は、本発明の変異型ホタルルシフェラーゼをコードする変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子である。ここで、「遺伝子」は、ＤＮＡ又はＲＮＡからなる。
【００４０】
上記変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子は、野生型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を改変することにより得ることができる。遺伝子改変は、部位特異的変異導入、ランダム変異導入、有機合成等、当業者に周知の方法により行うことができる。
【００４１】
部位特異的変異導入又はランダム変異導入は、野生型ホタルルシフェラーゼ遺伝子又はこれを含有する組換えベクターを鋳型として行う。野生型ホタルルシフェラーゼ遺伝子又はこれを含有する組換えベクターは、当業者に周知の方法（例えば、「遺伝子工学実験ノート」（羊土社）、特開平１−５１０８６号公報、特許第３０４８４６６号公報等に記載の方法）により調製することができる。また、市販のものを用いてもよい。
【００４２】
部位特異的変異導入は、選択プライマー及び変異誘発プライマーを用いてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼにより合成する方法等、当業者に周知の方法により行うことができる。野生型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有する組換えベクターを鋳型とし、選択プライマー及び変異誘発プライマーを用いて部位特異的変異導入を行う場合は、例えば、上記組換えベクター内に存在する制限酵素認識配列と一塩基異なる配列を含有するＤＮＡ断片を選択プライマーとして用いると、変異が導入されなかった組換えベクターには上記制限酵素認識配列がそのまま存在するので、対応する制限酵素で切断処理することにより、変異が導入されなかった組換えベクターを選択除去することができる。
【００４３】
ランダム変異導入は、例えば、マンガン及びｄＧＴＰの添加によりfidelityを低下させて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う方法、薬剤（ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等）を接触させる方法、紫外線を照射する方法等、当業者に周知の方法により行うことができる。ランダム変異導入を行った場合は、変異導入を行った遺伝子の塩基配列を決定することにより、目的の変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子又はこれを含有する組換えベクターを選択することができる。
【００４４】
変異導入を行った遺伝子の塩基配列の決定は、ジデオキシ法等、当業者に周知の方法により行うことができる。なお、各種の野生型ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列は、データベース（例えば、EMBL Nucleotide Sequence Database（http://www.ebi.ac.uk/embl/））で検索することができる。
【００４５】
（組換えベクター）
本発明の組換えベクターは、本発明の変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有する組換えベクターである。
【００４６】
上記組換えベクターは、当業者に周知の方法に従って、上記変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子をプラスミド、バクテリオファージ等、宿主細胞中で複製可能なベクターに挿入することにより得ることができる。ベクターへの上記変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子の挿入は、当該変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子に適当な制限酵素認識配列を付加したＤＮＡ断片を、対応する制限酵素で消化し、得られた遺伝子断片をベクターの対応する制限酵素認識配列、又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結することにより行うことができる。
【００４７】
上記組換えベクターはまた、前述したように、野生型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有する組換えベクターに変異を導入することによっても得ることができる。
【００４８】
プラスミドとしては、大腸菌由来のプラスミド（pET28a(+)、pGL2、pBR322、pUC18、pTrcHis、pBlueBacHis等）、枯草菌由来のプラスミド（pUB110、pTP5等）、酵母由来のプラスミド（YEp13、YEp24、YCp50、pYE52等）等が挙げられ、バクテリオファージとしては、λファージ等が挙げられる。
【００４９】
宿主細胞内で上記変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現させるには、当該変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流に、宿主細胞内で機能する適当なプロモーターを配置する必要がある。また、必要に応じて、エンハンサー、ターミネーター、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を配置することができる。
【００５０】
上記変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として用いると、レポーターアッセイを十分に高感度に行うことができる。そのようなレポーターアッセイは、上記変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有する上記組換えベクターにより可能となる。
【００５１】
（形質転換体）
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを保有する形質転換体である。
【００５２】
上記形質転換体は、当業者に周知の方法に従って、上記組換えベクターを、宿主細胞中に導入することにより得ることができる。上記組換えベクターの宿主細胞への導入は、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法等、当業者に周知の方法により行うことができる。
【００５３】
宿主細胞としては、細菌（大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）等）、酵母（サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等）、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞（Sf19、Sf21等）等が挙げられるが、生育が速く、また、取り扱いが容易である大腸菌が好ましい。
【００５４】
大腸菌を宿主細胞とする場合、上記組換えベクター中に配置するプロモーターとしては、trpプロモーター、lacプロモーター、Ｔ７プロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等が挙げられる。
【００５５】
（変異型ホタルルシフェラーゼの製造方法）
本発明の変異型ホタルルシフェラーゼの製造方法は、本発明の形質転換体を培養して、培養物を得る培養ステップと、当該培養物から本発明の変異型ホタルルシフェラーゼを採取する採取ステップと、を備える変異型ホタルルシフェラーゼの製造方法である。この製造方法により、本発明の変異型ホタルルシフェラーゼを得ることができる。
【００５６】
培養ステップは、本発明の形質転換体を培養して、培養物を得るステップである。ここで、「培養物」は、培養上清、培養細胞及び細胞破砕物のいずれであってもよい。上記形質転換体は、当業者に周知の方法により培養することができる。上記形質転換体の培養に用いる培地は、例えば、宿主細胞が大腸菌、酵母等の微生物である場合は、微生物が資化しうる炭素源（グルコース、スクロース、ラクトース等）、窒素源（ペプトン、肉エキス、酵母エキス等）、無機塩類（リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩等）等を含有し、宿主細胞を効率的に培養しうる培地であれば、天然培地及び合成培地のいずれであっても、また、液体培地及び固体培地のいずれであってもよい。振盪培養、撹拌培養、静置培養等のいずれを行うか、及びその他の培養条件（培養温度、培地のｐＨ、培養時間等）は、用いる宿主細胞、培地等に応じて適宜決定することができる。例えば、宿主細胞が大腸菌である場合、培養温度は通常、３０〜４２℃、好ましくは３７℃である。培地のｐＨは通常、６．４〜８．０、好ましくは７．０〜７．４である。培養温度が３７℃である場合、培養時間は通常、前培養では８〜２０時間、好ましくは１２〜１６時間であり、発現誘導前の本培養では２〜８時間、好ましくは２〜４時間である。但し、最適な培養時間は、培養温度及び培地のｐＨに応じて決定される。
【００５７】
培地には、必要に応じて、発現誘導物質を添加することができる。そのような発現誘導物質としては、例えば、上記組換えベクターがlacプロモーターを含有する場合はイソプロピルβ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）等が、また、trpプロモーターを含有する場合はインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等が挙げられる。
【００５８】
抗生物質（カナマイシン、アンピシリン等）に耐性を有するベクターを用いて上記組換えベクターを作製した場合は、当該抗生物質を培地に添加しておくことにより、抗生物質耐性を上記形質転換体の選択マーカーとして利用することができる。
【００５９】
採取ステップは、培養ステップで得られた培養物から本発明の変異型ホタルルシフェラーゼを採取するステップである。上記変異型ホタルルシフェラーゼは、当業者に周知の方法、例えば、遠心分離により培養物から形質転換体を回収し、これに対して凍結融解処理、超音波破砕処理、又はリゾチーム等の溶菌酵素による処理を行うことにより、採取することができる。なお、採取された上記変異型ホタルルシフェラーゼは、溶液の状態で存在してもよい。
【００６０】
上記製造方法では、採取ステップの後に、更に、採取ステップで得られた上記変異型ホタルルシフェラーゼ（粗酵素）を精製する精製ステップを実施するのが好ましい。粗酵素は、例えば、硫安沈澱、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を各々単独で、又は適宜組み合わせて実施することにより、精製することができる。
【００６１】
本発明の変異型ホタルルシフェラーゼが得られたかどうかは、ＡＴＰ、二価金属イオン（例えば、マグネシウムイオン）及び酸素の存在下でホタルルシフェリンと反応させ、発光強度を測定することにより確認することができる。変異を導入した元の野生型ホタルルシフェラーゼと比較して、発光強度が増大していれば、本発明の変異型ホタルルシフェラーゼが得られたと判断することができる。
【００６２】
本発明の遺伝子、組換えベクター、形質転換体、及び変異型ホタルルシフェラーゼの製造方法は、本発明の変異型ホタルルシフェラーゼの効率的な生産を可能にする。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例及び比較例に基づいて、本発明をより具体的に説明する。但し、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００６４】
（実施例１）
以下のようにして、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２３位のイソロイシン（Ile）がロイシン（Leu）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼを製造し、そのホタルルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。
【００６５】
（変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有する組換えプラスミドの作製）
まず、北米ホタル（Photinus pyralis）ルシフェラーゼ遺伝子（ｃＤＮＡ）（塩基配列は配列番号４に示すとおりである。）を含有するプラスミド（pGL2-Basic Vector（プロメガ社製））を鋳型とし、プライマーとして、制限酵素NcoI認識配列を含有する塩基配列：5'-gactccatggaagacgccaaaaac-3'（配列番号５）からなるＤＮＡ、及び制限酵素XhoI認識配列を含有する塩基配列：5'-gacactcgagcaatttggactttccgcc-3'（配列番号６）からなるＤＮＡを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液としては、Diversify PCR Random Mutagenesis Kit（Clontech社製）添付の TITANIUM Taq ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ Mix 及び TITANIUM Taq バッファーに、各プライマーＤＮＡを０．２μＭ、鋳型ＤＮＡを５０ｎｇ／５０μＬとなるように加えて調製した溶液を用いた。GeneAmp PCR System 2700（Applied Biosystems 社製）を用いて、「９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１２０秒」のサイクルを２５回繰り返して反応を行い、北米ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を得た。塩基配列は、DTCS Quick Start Master Mix キット及び泳動解析装置CEQ8000（いずれも Beckman Coulter 社製）を用いて決定した。上記の二種の制限酵素認識配列が付加されている上記ＤＮＡ断片をNcoI及びXhoI（いずれも New England Biolabs 社製）で切断し、これを、予めNcoI及びXhoIで切断したプラスミド（pET-28a(+) plasmid DNA（Novagen社製））に、DNA Ligation Kit（BioDynamics Laboratory 社製）を用いて組み込んだ。なお、pET-28a(+) は、Ｔ７プロモーター及びＴ７ターミネーターを含有する。また、発現する目的タンパク質のＣ末端側にヒスチジンタグが付加されるように、クローニング部位の近傍に、ヒスチジンタグをコードする遺伝子を含有する。また、pET-28a(+) はカナマイシン耐性を有する。
【００６６】
次に、得られた組換えプラスミドを鋳型として、Transformer部位特異的突然変異誘発キット（Clontech社製）を用いて部位特異的変異導入を行った。選択プライマーとしては、pET-28a(+) 中の制限酵素FspI認識配列と一塩基異なる配列を含有する塩基配列：5'-cacgatcatgagcacccgtgg-3'（配列番号７）からなるＤＮＡを用いた。変異誘発プライマーとしては、塩基配列：5'-ggctacattctggagacttagcttactgggacg-3'（配列番号８）からなるＤＮＡを用いた。いずれのプライマーも、予めＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（TOYOBO社製）で５’末端をリン酸化した。Transformer部位特異的突然変異誘発キット添付のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて、組換えプラスミドを合成した。FspIで切断処理した後、FspIで切断されなかった組換えプラスミドを大腸菌のミスマッチ修復欠損株BMH71-18mutSに導入し、大腸菌を培養した。得られた組換えプラスミドを更にFspIで切断処理し、FspIで切断されなかった組換えプラスミドを、変異が導入された組換えプラスミドとして選択した。
【００６７】
変異が導入された組換えプラスミド中の変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ＤＮＡ）の塩基配列は、DTCS Quick Start Master Mix キット及び泳動解析装置CEQ8000（いずれも Beckman Coulter 社製）を用いて決定した。塩基配列は、配列番号９に示すとおりであった。これにより、組換えプラスミド中の変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子が、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２３位のイソロイシン（Ile）がロイシン（Leu）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼをコードしていることが確認された。
【００６８】
（形質転換大腸菌の作製）
変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有する組換えプラスミドを、塩化カルシウム法により、ゲノムＤＮＡ中にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子が組み込まれている大腸菌（HMS174(DE3)（Novagen社製））に導入し、この大腸菌を、３０μｇ／ｍＬ カナマイシンを含有する選択寒天培地上で平板培養し、形質転換大腸菌を選択した。
【００６９】
（変異型ホタルルシフェラーゼの採取及び精製）
形質転換大腸菌を、振盪培養機（高崎科学器械社製）を用いて、３７℃の下、２００ｍＬの２×ＹＴ培地（３０μｇ／ｍＬ カナマイシンを含有する。）中で２．５時間振盪培養した後、培地中のＩＰＴＧ濃度が０．１ｍＭになるように１００ｍＭ ＩＰＴＧを２００μＬ加え、２５℃で６時間発現誘導を行った。なお、ＩＰＴＧは、lacリプレッサーによる発現抑制を解除し、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを誘導する発現誘導物質である。
【００７０】
培養液を８０００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより大腸菌の菌体を回収し、−２０℃で凍結し、保存した。凍結菌体を結合バッファー（５００ｍＭ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ イミダゾールを含有する２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４））５ｍＬで融解、懸濁後、超音波で破砕した。菌体破砕液を９０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清として変異型ホタルルシフェラーゼ（粗酵素）の溶液を得た。
【００７１】
発現した変異型ホタルルシフェラーゼのＣ末端側にヒスチジンタグが付加されていることから、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーを用いて、粗酵素の精製を行った。まず、Ni Sepharose 6 Fast Flow（アマシャムバイオサイエンス社製）０．５ｍＬをカラム（PIERCE社製 Disposable Polystyrene Column）に充填し、結合バッファーで平衡化した。次に、粗酵素の溶液５ｍＬをカラムに加え、結合バッファーで洗浄後、溶出バッファー（５００ｍＭ ＮａＣｌ及び５００ｍＭ イミダゾールを含有する２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４））２．５ｍＬで変異型ホタルルシフェラーゼを溶出させた。更に、PD-10 Desalting column（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて、溶出バッファーを反応バッファー（１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））３．５ｍＬに置換した。こうして、精製した変異型ホタルルシフェラーゼを得た。
【００７２】
（変異型ホタルルシフェラーゼの発光強度の測定）
得られた変異型ホタルルシフェラーゼのタンパク質定量は、Bradford法に基づく Bio-Rad Protein Assay（BIORAD社製）を用いて、ＩｇＧを標準として行った。変異型ホタルルシフェラーゼ（２０μｇ／ｍＬ）を含有する反応バッファー５０μＬを９６穴ウェルプレート（Nunc社製 ルミヌンクプレート）に加えた後、マイクロプレートリーダー（Perkin-Elmer社製 ARVO MX）付属のインジェクターを用いて、基質バッファー（２×１０−６Ｍ Ｄ−ホタルルシフェリン（和光純薬工業社製）、２×１０−７Ｍ ＡＴＰ及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））５０μＬを加えた。そして、上記マイクロプレートリーダーで発光強度を測定した。北米ホタルルシフェラーゼ（野生型）についても、変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有する組換えプラスミドの代わりに、北米ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｃＤＮＡ）を含有する組換えプラスミド（pET-28a(+)）を用いたこと以外は、変異型ホタルルシフェラーゼと同様にして、形質転換大腸菌を作製し、酵素の採取及び精製を行い、酵素の発光強度を測定した。そして、北米ホタルルシフェラーゼの発光強度に対する変異型ホタルルシフェラーゼの発光強度の比（発光強度比）を求めた。
【００７３】
（実施例２、３及び比較例１〜８）
以下のようにして、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２３位のイソロイシン（Ile）がメチオニン（Met）（実施例２）、フェニルアラニン（Phe）（実施例３）、バリン（Val）（比較例１）、アラニン（Ala）（比較例２）、グリシン（Gly）（比較例３）、セリン（Ser）（比較例４）、グルタミン（Gln）（比較例５）、アルギニン（Arg）（比較例６）、リシン（Lys）（比較例７）又はグルタミン酸（Glu）（比較例８）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼを製造し、そのホタルルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。
【００７４】
部位特異的変異導入における変異誘発プライマーとして、下記塩基配列からなるＤＮＡを用いたこと以外は、実施例１と同様にして、精製した変異型ホタルルシフェラーゼを得、その発光強度を測定した。そして、実施例１で測定された北米ホタルルシフェラーゼの発光強度を用いて、北米ホタルルシフェラーゼの発光強度に対する変異型ホタルルシフェラーゼの発光強度の比（発光強度比）を求めた。なお、実施例１と同様にして、組換えプラスミド中の変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ＤＮＡ）の塩基配列を決定し、当該遺伝子が目的の変異型ホタルルシフェラーゼをコードしていることを確認した。
実施例２：5'-ggctacattctggagacatggcttactgggacg-3'（配列番号１０）
実施例３：5'-ggctacattctggagactttgcttactgggacg-3'（配列番号１１）
比較例１：5'-ggctacattctggagacgtagcttactgggacg-3'（配列番号１２）
比較例２：5'-ggctacattctggagacgcagcttactgggacg-3'（配列番号１３）
比較例３：5'-ggctacattctggagacggagcttactgggacg-3'（配列番号１４）
比較例４：5'-ggctacattctggagactcagcttactgggacg-3'（配列番号１５）
比較例５：5'-ggctacattctggagaccaagcttactgggacg-3'（配列番号１６）
比較例６：5'-ggctacattctggagacagagcttactgggacg-3'（配列番号１７）
比較例７：5'-ggctacattctggagacaaagcttactgggacg-3'（配列番号１８）
比較例８：5'-ggctacattctggagacgaagcttactgggacg-3'（配列番号１９）
【００７５】
実施例１〜３及び比較例１〜８の結果を表１に示す。なお、上記各アミノ酸の分子量、及び極性若しくは電荷は表１に示すとおりである。表１において、「極性」及び「非極性」は、アミノ酸が側鎖にそれぞれ極性基及び非極性基を有することを示し、「正電荷」及び「負電荷」は、アミノ酸が生理的ｐＨ（ｐＨ７．４）でそれぞれ正及び負に荷電していることを示す（後述の表２及び３においても同様である）。
【００７６】
【表１】
2007097577.tif 000002
【００７７】
表１から明かなように、４２３位のイソロイシン（Ile）をロイシン（Leu）、メチオニン（Met）及びフェニルアラニン（Phe）に置換することにより、北米ホタルルシフェラーゼと比較して、発光強度がそれぞれ４．３倍、３．５倍及び１．２倍に増大した。この結果より、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２３位のアミノ酸を、当該アミノ酸の分子量以上の分子量を有する非極性アミノ酸に置換すると、北米ホタルルシフェラーゼと比較して、発光強度が十分に増大することが判明した。
【００７８】
（実施例４〜６及び比較例９〜１１）
以下のようにして、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４３６位のアスパラギン酸（Asp）がグリシン（Gly）（実施例４）、アラニン（Ala）（実施例５）、セリン（Ser）（実施例６）、アスパラギン（Asn）（比較例９）、グルタミン酸（Glu）（比較例１０）又はバリン（Val）（比較例１１）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼを製造し、そのホタルルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。
【００７９】
部位特異的変異導入における変異誘発プライマーとして、下記塩基配列からなるＤＮＡを用いたこと以外は、実施例１と同様にして、精製した変異型ホタルルシフェラーゼを得、その発光強度を測定した。そして、実施例１で測定された北米ホタルルシフェラーゼの発光強度を用いて、北米ホタルルシフェラーゼの発光強度に対する変異型ホタルルシフェラーゼの発光強度の比（発光強度比）を求めた。なお、実施例１と同様にして、組換えプラスミド中の変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ＤＮＡ）の塩基配列を決定し、当該遺伝子が目的の変異型ホタルルシフェラーゼをコードしていることを確認した。
実施例４：5'-cacttcttcatagttggccgcttgaagtc-3'（配列番号２０）
実施例５：5'-cacttcttcatagttgcccgcttgaagtc-3'（配列番号２１）
実施例６：5'-cacttcttcatagttagccgcttgaagtc-3'（配列番号２２）
比較例９：5'-cacttcttcatagttaaccgcttgaagtc-3'（配列番号２３）
比較例１０：5'-cacttcttcatagttgaacgcttgaagtc-3'（配列番号２４）
比較例１１：5'-cacttcttcatagttgtccgcttgaagtc-3'（配列番号２５）
【００８０】
実施例４〜６及び比較例９〜１１の結果を表２に示す。なお、上記各アミノ酸の分子量、及び極性若しくは電荷は表２に示すとおりである。
【００８１】
【表２】
2007097577.tif 000003
【００８２】
表２から明らかなように、４３６位のアスパラギン酸（Asp）をグリシン（Gly）、アラニン（Ala）及びセリン（Ser）に置換することにより、北米ホタルルシフェラーゼと比較して、発光強度がそれぞれ１２．１倍、６．３倍及び２．３倍に増大した。この結果より、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４３６位のアミノ酸を、当該アミノ酸の分子量より小さい分子量を有し、グリシン、アラニン及びセリンより選ばれるアミノ酸に置換すると、北米ホタルルシフェラーゼと比較して、発光強度が十分に増大することが判明した。
【００８３】
（実施例７〜９及び比較例１２〜１９）
以下のようにして、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、５３０位のロイシン（Leu）がアルギニン（Arg）（実施例７）、リシン（Lys）（実施例８）、ヒスチジン（His）（実施例９）、バリン（Val）（比較例１２）、イソロイシン（Ile）（比較例１３）、アラニン（Ala）（比較例１４）、プロリン（Pro）（比較例１５）、フェニルアラニン（Phe）（比較例１６）、アスパラギン酸（Asp）（比較例１７）、セリン（Ser）（比較例１８）又はチロシン（Tyr）（比較例１９）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼを製造し、そのホタルルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。
【００８４】
部位特異的変異導入における変異誘発プライマーとして、下記塩基配列からなるＤＮＡを用いたこと以外は、実施例１と同様にして、精製した変異型ホタルルシフェラーゼを得、その発光強度を測定した。そして、実施例１で測定された北米ホタルルシフェラーゼの発光強度を用いて、北米ホタルルシフェラーゼの発光強度に対する変異型ホタルルシフェラーゼの発光強度の比（発光強度比）を求めた。なお、実施例１と同様にして、組換えプラスミド中の変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ＤＮＡ）の塩基配列を決定し、当該遺伝子が目的の変異型ホタルルシフェラーゼをコードしていることを確認した。
実施例７：5'-ccggaaaacgcgacgcaag-3'（配列番号２６）
実施例８：5'-ggtcttaccggaaaaaaggacgcaag-3'（配列番号２７）
実施例９：5'-ccggaaaacacgacgcaag-3'（配列番号２８）
比較例１２：5'-ggtcttaccggaaaagtcgacgcaag-3'（配列番号２９）
比較例１３：5'-ggtcttaccggaaaaatcgacgcaag-3'（配列番号３０）
比較例１４：5'-ggtcttaccggaaaagccgacgcaag-3'（配列番号３１）
比較例１５：5'-ggtcttaccggaaaacccgacgcaag-3'（配列番号３２）
比較例１６：5'-ggtcttaccggaaaattcgacgcaag-3'（配列番号３３）
比較例１７：5'-ggtcttaccggaaaagacgacgcaag-3'（配列番号３４）
比較例１８：5'-ggtcttaccggaaaaagcgacgcaag-3'（配列番号３５）
比較例１９：5'-ggtcttaccggaaaatacgacgcaag-3'（配列番号３６）
【００８５】
実施例７〜９及び比較例１２〜１９の結果を表３に示す。なお、上記各アミノ酸の等電点、及び極性若しくは電荷は表３に示すとおりである。
【００８６】
【表３】
2007097577.tif 000004
【００８７】
表３から明らかなように、５３０位のロイシン（Leu）をアルギニン（Arg）、リシン（Lys）及びヒスチジン（His）に置換することにより、北米ホタルルシフェラーゼと比較して、発光強度がそれぞれ１１．８倍、３．３倍及び２．３倍に増大した。この結果より、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、５３０位のアミノ酸を、当該アミノ酸の等電点より大きい等電点を有する正電荷アミノ酸に置換すると、北米ホタルルシフェラーゼと比較して、発光強度が十分に増大することが判明した。
【００８８】
（実施例１０）
以下のようにして、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２３位のイソロイシン（Ile）がロイシン（Leu）に置換され、４３６位のアスパラギン酸（Asp）がグリシン（Gly）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼを製造し、そのホタルルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。
【００８９】
実施例４で変異が導入された組換えプラスミド、すなわち、４３６位のアスパラギン酸（Asp）がグリシン（Gly）に置換された変異型ホタルルシフェラーゼをコードする遺伝子を含有する組換えプラスミドを、制限酵素NcoI及びXhoI（いずれも New England Biolabs 社製）で切断し、アガロースゲル電気泳動により分離後、４３６位のアスパラギン酸（Asp）がグリシン（Gly）に置換された変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片のみを回収した。そして、当該ＤＮＡ断片を、予めNcoI及びXhoIで切断したプラスミド（pET-28a(+) plasmid DNA（Novagen社製））に、DNA Ligation Kit（BioDynamics Laboratory 社製）を用いて組み込んだ。こうして得られた組換えプラスミドを部位特異的変異導入における鋳型としたこと以外は、実施例１と同様にして、精製した変異型ホタルルシフェラーゼを得、その発光強度を測定した。そして、実施例１で測定された北米ホタルルシフェラーゼの発光強度を用いて、北米ホタルルシフェラーゼの発光強度に対する変異型ホタルルシフェラーゼの発光強度の比（発光強度比）を求めた。
【００９０】
なお、変異が導入された組換えプラスミド中の変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列は、実施例１と同様にして決定した。塩基配列は、配列番号３７に示すとおりであった。これにより、組換えプラスミド中の変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子が、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２３位のイソロイシン（Ile）がロイシン（Leu）に置換され、４３６位のアスパラギン酸（Asp）がグリシン（Gly）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼをコードしていることが確認された。
【００９１】
４２３位のイソロイシン（Ile）のロイシン（Leu）への置換と、４３６位のアスパラギン酸（Asp）のグリシン（Gly）への置換とが組み合わされた変異型ホタルルシフェラーゼでは、発光強度が、北米ホタルルシフェラーゼと比較して１８倍に、また、４３６位のアスパラギン酸のグリシンへの置換が単独で生じた変異型ホタルルシフェラーゼ（実施例４）と比較して１．５倍に増大した。この結果より、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２３位のアミノ酸を、当該アミノ酸の分子量以上の分子量を有する非極性アミノ酸に置換し、４３６位のアミノ酸を、当該アミノ酸の分子量より小さい分子量を有し、グリシン、アラニン及びセリンより選ばれるアミノ酸に置換すると、北米ホタルルシフェラーゼと比較して、発光強度が顕著に増大することが判明した。
【００９２】
（実施例１１）
以下のようにして、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２３位のイソロイシン（Ile）がロイシン（Leu）に置換され、５３０位のロイシン（Leu）がアルギニン（Arg）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼを製造し、そのホタルルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。
【００９３】
実施例７で変異が導入された組換えプラスミド、すなわち、５３０位のロイシン（Leu）がアルギニン（Arg）に置換された変異型ホタルルシフェラーゼをコードする遺伝子を含有する組換えプラスミドを、制限酵素NcoI及びXhoI（いずれも New England Biolabs 社製）で切断し、アガロースゲル電気泳動により分離後、５３０位のロイシン（Leu）がアルギニン（Arg）に置換された変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片のみを回収した。そして、当該ＤＮＡ断片を、予めNcoI及びXhoIで切断したプラスミド（pET-28a(+) plasmid DNA（Novagen社製））に、DNA Ligation Kit（BioDynamics Laboratory 社製）を用いて組み込んだ。こうして得られた組換えプラスミドを部位特異的変異導入における鋳型としたこと以外は、実施例１と同様にして、精製した変異型ホタルルシフェラーゼを得、その発光強度を測定した。そして、実施例１で測定された北米ホタルルシフェラーゼの発光強度を用いて、北米ホタルルシフェラーゼの発光強度に対する変異型ホタルルシフェラーゼの発光強度の比（発光強度比）を求めた。
【００９４】
なお、変異が導入された組換えプラスミド中の変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列は、実施例１と同様にして決定した。塩基配列は、配列番号３８に示すとおりであった。これにより、組換えプラスミド中の変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子が、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２３位のイソロイシン（Ile）がロイシン（Leu）に置換され、５３０位のロイシン（Leu）がアルギニン（Arg）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼをコードしていることが確認された。
【００９５】
４２３位のイソロイシン（Ile）のロイシン（Leu）への置換と、５３０位のロイシン（Leu）のアルギニン（Arg）への置換とが組み合わされた変異型ホタルルシフェラーゼでは、発光強度が、北米ホタルルシフェラーゼと比較して１８倍に、また、５３０位のロイシンのアルギニンへの置換が単独で生じた変異型ホタルルシフェラーゼ（実施例７）と比較して１．５倍に増大した。この結果より、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２３位のアミノ酸を、当該アミノ酸の分子量以上の分子量を有する非極性アミノ酸に置換し、５３０位のアミノ酸を、当該アミノ酸の等電点より大きい等電点を有する正電荷アミノ酸に置換すると、北米ホタルルシフェラーゼと比較して、発光強度が顕著に増大することが判明した。
【００９６】
（実施例１２）
以下のようにして、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４３６位のアスパラギン酸（Asp）がグリシン（Gly）に置換され、５３０位のロイシン（Leu）がアルギニン（Arg）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼを製造し、そのホタルルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。
【００９７】
実施例７で変異が導入された組換えプラスミド、すなわち、５３０位のロイシン（Leu）がアルギニン（Arg）に置換された変異型ホタルルシフェラーゼをコードする遺伝子を含有する組換えプラスミドを、制限酵素NcoI及びXhoI（いずれも New England Biolabs 社製）で切断し、アガロースゲル電気泳動により分離後、５３０位のロイシン（Leu）がアルギニン（Arg）に置換された変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片のみを回収した。そして、当該ＤＮＡ断片を、予めNcoI及びXhoIで切断したプラスミド（pET-28a(+) plasmid DNA（Novagen社製））に、DNA Ligation Kit（BioDynamics Laboratory 社製）を用いて組み込んだ。こうして得られた組換えプラスミドを部位特異的変異導入における鋳型としたこと以外は、実施例４と同様にして、精製した変異型ホタルルシフェラーゼを得、その発光強度を測定した。そして、実施例１で測定された北米ホタルルシフェラーゼの発光強度を用いて、北米ホタルルシフェラーゼの発光強度に対する変異型ホタルルシフェラーゼの発光強度の比（発光強度比）を求めた。
【００９８】
なお、変異が導入された組換えプラスミド中の変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列は、実施例１と同様にして決定した。塩基配列は、配列番号３９に示すとおりであった。これにより、組換えプラスミド中の変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子が、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４３６位のアスパラギン酸（Asp）がグリシン（Gly）に置換され、５３０位のロイシン（Leu）がアルギニン（Arg）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼをコードしていることが確認された。
【００９９】
４３６位のアスパラギン酸（Asp）のグリシン（Gly）への置換と、５３０位のロイシン（Leu）のアルギニン（Arg）への置換とが組み合わされた変異型ホタルルシフェラーゼでは、発光強度が、北米ホタルルシフェラーゼと比較して８倍に増大した。この結果より、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４３６位のアミノ酸を、当該アミノ酸の分子量より小さい分子量を有し、グリシン、アラニン及びセリンより選ばれるアミノ酸に置換し、５３０位のアミノ酸を、当該アミノ酸の等電点より大きい等電点を有する正電荷アミノ酸に置換すると、北米ホタルルシフェラーゼと比較して、発光強度が十分に増大することが判明した。
【０１００】
（実施例１３）
以下のようにして、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２３位のイソロイシン（Ile）がロイシン（Leu）に置換され、４３６位のアスパラギン酸（Asp）がグリシン（Gly）に置換され、５３０位のロイシン（Leu）がアルギニン（Arg）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼを製造し、そのホタルルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。
【０１０１】
実施例１２で変異が導入された組換えプラスミド、すなわち、４３６位のアスパラギン酸（Asp）がグリシン（Gly）に置換され、５３０位のロイシン（Leu）がアルギニン（Arg）に置換された変異型ホタルルシフェラーゼをコードする遺伝子を含有する組換えプラスミドを、制限酵素NcoI及びXhoI（いずれも New England Biolabs 社製）で切断し、アガロースゲル電気泳動により分離後、４３６位のアスパラギン酸（Asp）がグリシン（Gly）に置換され、５３０位のロイシン（Leu）がアルギニン（Arg）に置換された変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片のみを回収した。そして、当該ＤＮＡ断片を、予めNcoI及びXhoIで切断したプラスミド（pET-28a(+) plasmid DNA（Novagen社製））に、DNA Ligation Kit（BioDynamics Laboratory 社製）を用いて組み込んだ。こうして得られた組換えプラスミドを部位特異的変異導入における鋳型としたこと以外は、実施例１と同様にして、精製した変異型ホタルルシフェラーゼを得、その発光強度を測定した。そして、実施例１で測定された北米ホタルルシフェラーゼの発光強度を用いて、北米ホタルルシフェラーゼの発光強度に対する変異型ホタルルシフェラーゼの発光強度の比（発光強度比）を求めた。
【０１０２】
なお、変異が導入された組換えプラスミド中の変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列は、実施例１と同様にして決定した。塩基配列は、配列番号４０に示すとおりであった。これにより、組換えプラスミド中の変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子が、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２３位のイソロイシン（Ile）がロイシン（Leu）に置換され、４３６位のアスパラギン酸（Asp）がグリシン（Gly）に置換され、５３０位のロイシン（Leu）がアルギニン（Arg）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼをコードしていることが確認された。
【０１０３】
４２３位のイソロイシン（Ile）のロイシン（Leu）への置換と、４３６位のアスパラギン酸（Asp）のグリシン（Gly）への置換と、５３０位のロイシン（Leu）のアルギニン（Arg）への置換とが組み合わされた変異型ホタルルシフェラーゼでは、発光強度が、北米ホタルルシフェラーゼと比較して２０倍に増大した。この結果より、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２３位のアミノ酸を、当該アミノ酸の分子量以上の分子量を有する非極性アミノ酸に置換し、４３６位のアミノ酸を、当該アミノ酸の分子量より小さい分子量を有し、グリシン、アラニン及びセリンより選ばれるアミノ酸に置換し、５３０位のアミノ酸を、当該アミノ酸の等電点より大きい等電点を有する正電荷アミノ酸に置換すると、北米ホタルルシフェラーゼと比較して、発光強度が顕著に増大することが判明した。
【０１０４】
（実施例１４）
以下のようにして、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２３位のイソロイシン（Ile）がロイシン（Leu）に、５３０位のロイシン（Leu）がアルギニン（Arg）に置換され、更に、４７位のイソロイシン（Ile）がスレオニン（Thr）に、５０位のアスパラギン（Asn）がセリン（Ser）に、５９位のメチオニン（Met）がスレオニン（Thr）に、２５２位のスレオニン（Thr）がセリン（Ser）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼを製造し、そのホタルルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。
【０１０５】
まず、実施例１１で変異が導入された組換えプラスミド、すなわち、４２３位のイソロイシン（Ile）がロイシン（Leu）に、５３０位のロイシン（Leu）がアルギニン（Arg）に置換された変異型ホタルルシフェラーゼをコードする遺伝子を含有する組換えプラスミドを制限酵素NcoI及びXhoI（いずれも New England Biolabs 社製）で切断し、アガロースゲル電気泳動により分離後、４２３位のイソロイシン（Ile）がロイシン（Leu）に、５３０位のロイシン（Leu）がアルギニン（Arg）に置換された変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片のみを回収した。そして、当該ＤＮＡ断片を、予めNcoI及びXhoIで切断したプラスミド（pET-28a(+) plasmid DNA（Novagen社製））に、DNA Ligation Kit（BioDynamics Laboratory 社製）を用いて組み込んだ。こうして得られた組換えプラスミドを鋳型としたこと、及び、塩基配列：5'-gatgcacataccgaggtgaac-3'（配列番号４１）からなるＤＮＡを変異誘発プライマーとしたこと以外は、実施例１と同様にして、部位特異的変異導入を行った。
【０１０６】
次に、得られた組換えプラスミドを制限酵素NcoI及びXhoI（いずれも New England Biolabs 社製）で切断し、アガロースゲル電気泳動により分離後、４２３位のイソロイシン（Ile）がロイシン（Leu）に、５３０位のロイシン（Leu）がアルギニン（Arg）に、４７位のイソロイシン（Ile）がスレオニン（Thr）に置換された変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片のみを回収した。そして、当該ＤＮＡ断片を、予めNcoI及びXhoIで切断したプラスミド（pET-28a(+)）に、DNA Ligation Kit（BioDynamics Laboratory 社製）を用いて組み込んだ。こうして得られた組換えプラスミドを鋳型としたこと、及び、塩基配列：5'-catatcgaggtgagcatcacgtacgcg-3'（配列番号４２）からなるＤＮＡを変異誘発プライマーとしたこと以外は、実施例１と同様にして、部位特異的変異導入を行った。
【０１０７】
次に、得られた組換えプラスミドを制限酵素NcoI及びXhoI（いずれも New England Biolabs 社製）で切断し、アガロースゲル電気泳動により分離後、４２３位のイソロイシン（Ile）がロイシン（Leu）に、５３０位のロイシン（Leu）がアルギニン（Arg）に、４７位のイソロイシン（Ile）がスレオニン（Thr）に、５０位のアスパラギン（Asn）がセリン（Ser）に置換された変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片のみを回収した。そして、当該ＤＮＡ断片を、予めNcoI及びXhoIで切断したプラスミド（pET-28a(+)）に、DNA Ligation Kit（BioDynamics Laboratory 社製）を用いて組み込んだ。こうして得られた組換えプラスミドを鋳型としたこと、及び、塩基配列：5'-gcggaatacttcgaaacgtccgttcgg-3'（配列番号４３）からなるＤＮＡを変異誘発プライマーとしたこと以外は、実施例１と同様にして、部位特異的変異導入を行った。
【０１０８】
最後に、得られた組換えプラスミドを制限酵素NcoI及びXhoI（いずれも New England Biolabs 社製）で切断し、アガロースゲル電気泳動により分離後、４２３位のイソロイシン（Ile）がロイシン（Leu）に、５３０位のロイシン（Leu）がアルギニン（Arg）に、４７位のイソロイシン（Ile）がスレオニン（Thr）に、５０位のアスパラギン（Asn）がセリン（Ser）に、５９位のメチオニン（Met）がスレオニン（Thr）に置換された変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片のみを回収した。そして、当該ＤＮＡ断片を、予めNcoI及びXhoIで切断したプラスミド（pET-28a(+)）に、DNA Ligation Kit（BioDynamics Laboratory 社製）を用いて組み込んだ。こうして得られた組換えプラスミドを鋳型としたこと、及び、塩基配列：5'-ggaatgtttacttcactcgg-3'（配列番号４４）からなるＤＮＡを変異誘発プライマーとしたこと以外は、実施例１と同様にして、精製した変異型ホタルルシフェラーゼを得、その発光強度を測定した。そして、実施例１で測定された北米ホタルルシフェラーゼの発光強度を用いて、北米ホタルルシフェラーゼの発光強度に対する変異型ホタルルシフェラーゼの発光強度の比（発光強度比）を求めた。
【０１０９】
なお、変異が導入された組換えプラスミド中の変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列は、実施例１と同様にして決定した。塩基配列は、配列番号４５に示すとおりであった。これにより、組換えプラスミド中の変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子が、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２３位のイソロイシン（Ile）がロイシン（Leu）に、５３０位のロイシン（Leu）がアルギニン（Arg）に置換され、更に、４７位のイソロイシン（Ile）がスレオニン（Thr）に、５０位のアスパラギン（Asn）がセリン（Ser）に、５９位のメチオニン（Met）がスレオニン（Thr）に、２５２位のスレオニン（Thr）がセリン（Ser）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼをコードしていることが確認された。
【０１１０】
上記変異型ホタルルシフェラーゼでは、発光強度が、北米ホタルルシフェラーゼと比較して２１倍に、また、４２３位のイソロイシン（Ile）のロイシン（Leu）への置換、及び５３０位のロイシン（Leu）のアルギニン（Arg）への置換のみが生じた変異型ホタルルシフェラーゼ（実施例１１）と比較して１．２倍に増大した。この結果より、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２３位のアミノ酸を、当該アミノ酸の分子量以上の分子量を有する非極性アミノ酸に、５３０位のアミノ酸を、当該アミノ酸の等電点より大きい等電点を有する正電荷アミノ酸に置換し、更に、４７位のイソロイシンをスレオニンに、５０位のアスパラギンをセリンに、５９位のメチオニンをスレオニンに、２５２位のスレオニンをセリンに置換すると、北米ホタルルシフェラーゼと比較して、発光強度が顕著に増大することが判明した。
【０１１１】
（実施例１５）
以下のようにして、ヘイケホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２５位のイソロイシン（Ile）がロイシン（Leu）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼを製造し、そのホタルルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。
【０１１２】
ヘイケホタル（Luciola lateralis）の幼虫を液体窒素で凍結した後、乳鉢で破砕し、トータルＲＮＡ抽出キット（NucleoSpin RNA L（MACHEREY-NAGEL社製））を用いて、ヘイケホタルのトータルＲＮＡを抽出した。そして、制限酵素NdeI認識配列を含有する塩基配列：5'-gactcatatggaaaacatggagaacgatg-3'（配列番号４６）からなるＤＮＡ、及びXhoI認識配列を含有する塩基配列：5'-gacactcgagcatcttagcaactgg-3'（配列番号４７）からなるＤＮＡをプライマーとし、ＲＴ−ＰＣＲ用キット（SuperScriptIII One-Step RT-PCR System with Platinum Taq DNA Polymerase（Invitrogen社製））を用いて、ヘイケホタルルシフェラーゼｃＤＮＡ（塩基配列は配列番号４８に示すとおりである。）を作製した。得られたｃＤＮＡをNdeI及びXhoI（いずれも New England Biolabs 社製）で切断し、これを、予めNdeI及びXhoIで切断したプラスミド（pET-30a(+) plasmid DNA（Novagen社製））に、DNA Ligation Kit（BioDynamics Laboratory 社製）を用いて組み込んだ。なお、pET-30a(+) は、Ｔ７プロモーター及びＴ７ターミネーターを含有する。また、発現する目的タンパク質のＣ末端側にヒスチジンタグが付加されるように、クローニング部位の近傍に、ヒスチジンタグをコードする遺伝子を含有する。また、pET-30a(+) はカナマイシン耐性を有する。
【０１１３】
次に、得られた組換えプラスミドを鋳型として、Transformer部位特異的突然変異誘発キット（Clontech社製）を用いて部位特異的変異導入を行った。選択プライマーとしては、pET-30a(+) 中の制限酵素Bst1107I認識配列と一塩基異なる配列を含有する塩基配列：5'-gttaagccagtttacactccgc-3'（配列番号４９）からなるＤＮＡを用いた。変異誘発プライマーとしては、塩基配列：5'-ggttggttgcacacaggagatcttgggtattacg-3'（配列番号５０）からなるＤＮＡを用いた。いずれのプライマーも、予めＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（TOYOBO社製）で５’末端をリン酸化した。Transformer部位特異的突然変異誘発キット添付のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて、組換えプラスミドを合成した。Bst1107Iで切断処理した後、Bst1107Iで切断されなかった組換えプラスミドを大腸菌のミスマッチ修復欠損株BMH71-18mutSに導入し、大腸菌を培養した。得られた組換えプラスミドを更にBst1107Iで切断処理し、Bst1107Iで切断されなかった組換えプラスミドを、変異が導入された組換えプラスミドとして選択した。こうして得られた組換えプラスミドを大腸菌に導入したこと以外は、実施例１と同様にして、形質転換大腸菌を作製し、変異型ホタルルシフェラーゼの採取及び精製を行った。なお、実施例１と同様にして、組換えプラスミド中の変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ＤＮＡ）の塩基配列を決定し、当該遺伝子が目的の変異型ホタルルシフェラーゼをコードしていることを確認した。
【０１１４】
得られた変異型ホタルルシフェラーゼのタンパク質定量は、Bradford法に基づく Bio-Rad Protein Assay（BIORAD社製）を用いて、ＩｇＧを標準として行った。変異型ホタルルシフェラーゼ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含有する反応バッファー５０μＬを９６穴ウェルプレート（Nunc社製 ルミヌンクプレート）に加えた後、マイクロプレートリーダー（Perkin-Elmer社製 ARVO MX）付属のインジェクターを用いて、基質バッファー（１×１０−７Ｍ Ｄ−ホタルルシフェリン（和光純薬工業社製）、１×１０−６Ｍ ＡＴＰ及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））５０μＬを加えた。そして、上記マイクロプレートリーダーで発光強度を測定した。
【０１１５】
ヘイケホタルルシフェラーゼ（野生型）についても、変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有する組換えプラスミドの代わりに、上述のようにして得た、ヘイケホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｃＤＮＡ）を含有する組換えプラスミド（pET-30a(+)）を用いたこと以外は、変異型ホタルルシフェラーゼと同様にして、形質転換大腸菌を作製し、酵素の採取及び精製を行い、酵素の発光強度を測定した。そして、ヘイケホタルルシフェラーゼの発光強度に対する変異型ホタルルシフェラーゼの発光強度の比（発光強度比）を求めた。
【０１１６】
（実施例１６）
以下のようにして、ヘイケホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４３８位のアスパラギン酸（Asp）がグリシン（Gly）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼを製造し、そのホタルルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。
【０１１７】
部位特異的変異導入における変異誘発プライマーとして、塩基配列：5'-ctttatcgtgggtcgtttgaagtc-3'（配列番号５１）からなるＤＮＡを用いたこと以外は、実施例１５と同様にして、精製した変異型ホタルルシフェラーゼを得、その発光強度を測定した。そして、実施例１５で測定されたヘイケホタルルシフェラーゼの発光強度を用いて、ヘイケホタルルシフェラーゼの発光強度に対する変異型ホタルルシフェラーゼの発光強度の比（発光強度比）を求めた。なお、実施例１と同様にして、組換えプラスミド中の変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ＤＮＡ）の塩基配列を決定し、当該遺伝子が目的の変異型ホタルルシフェラーゼをコードしていることを確認した。
【０１１８】
（実施例１７）
以下のようにして、ヘイケホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、５３２位のイソロイシン（Ile）がアルギニン（Arg）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼを製造し、そのホタルルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。
【０１１９】
部位特異的変異導入における変異誘発プライマーとして、塩基配列：5'-ggtcttactggtaaaagggacggtaaagc-3'（配列番号５２）からなるＤＮＡを用いたこと以外は、実施例１５と同様にして、精製した変異型ホタルルシフェラーゼを得、その発光強度を測定した。そして、実施例１５で測定されたヘイケホタルルシフェラーゼの発光強度を用いて、ヘイケホタルルシフェラーゼの発光強度に対する変異型ホタルルシフェラーゼの発光強度の比（発光強度比）を求めた。なお、実施例１と同様にして、組換えプラスミド中の変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ＤＮＡ）の塩基配列を決定し、当該遺伝子が目的の変異型ホタルルシフェラーゼをコードしていることを確認した。
【０１２０】
（実施例１８）
実施例１５と同様にして、ヘイケホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２５位のイソロイシン（Ile）がロイシン（Leu）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼを製造し、そのホタルルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。北米ホタルルシフェラーゼ（野生型）についても、実施例１と同様にして、精製した酵素を得、その発光強度を測定した。そして、北米ホタルルシフェラーゼの発光強度に対する変異型ホタルルシフェラーゼの発光強度の比（発光強度比）を求めた。なお、実施例１と同様にして、組換えプラスミド中の変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ＤＮＡ）の塩基配列を決定し、当該遺伝子が目的の変異型ホタルルシフェラーゼをコードしていることを確認した。
【０１２１】
（実施例１９）
実施例１６と同様にして、ヘイケホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４３８位のアスパラギン酸（Asp）がグリシン（Gly）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼを製造し、そのホタルルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。そして、実施例１８で測定された北米ホタルルシフェラーゼの発光強度を用いて、北米ホタルルシフェラーゼの発光強度に対する変異型ホタルルシフェラーゼの発光強度の比（発光強度比）を求めた。なお、実施例１と同様にして、組換えプラスミド中の変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ＤＮＡ）の塩基配列を決定し、当該遺伝子が目的の変異型ホタルルシフェラーゼをコードしていることを確認した。
【０１２２】
（比較例２０）
実施例１７と同様にして、ヘイケホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、５３２位のイソロイシン（Ile）がアルギニン（Arg）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼを製造し、そのホタルルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。そして、実施例１８で測定された北米ホタルルシフェラーゼの発光強度を用いて、北米ホタルルシフェラーゼの発光強度に対する変異型ホタルルシフェラーゼの発光強度の比（発光強度比）を求めた。なお、実施例１と同様にして、組換えプラスミド中の変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ＤＮＡ）の塩基配列を決定し、当該遺伝子が目的の変異型ホタルルシフェラーゼをコードしていることを確認した。
【０１２３】
実施例１５〜１９及び比較例２０の結果を表４に示す。なお、ヘイケホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列と北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列との相同性は６８％である。
【０１２４】
【表４】
2007097577.tif 000005
【０１２５】
表４から明らかなように、ヘイケホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における、４２５位のイソロイシン（Ile）のロイシン（Leu）への置換、４３８位のアスパラギン酸（Asp）のグリシン（Gly）への置換、及び５３２位のイソロイシン（Ile）のアルギニン（Arg）への置換により、ヘイケホタルルシフェラーゼと比較して、発光強度がそれぞれ２．６倍、６．０倍及び１．２倍に増大した。この結果より、ヘイケホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の置換が生じた変異アミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼは、ヘイケホタルルシフェラーゼと比較して、十分に大きい発光強度を有することが判明した。
（ａ）４２５位のアミノ酸の、当該アミノ酸の分子量以上の分子量を有する非極性アミノ酸への置換
（ｂ）４３８位のアミノ酸の、当該アミノ酸の分子量より小さい分子量を有し、グリシン、アラニン及びセリンより選ばれるアミノ酸への置換
（ｃ）５３２位のアミノ酸の、当該アミノ酸の等電点より大きい等電点を有する正電荷アミノ酸への置換
【０１２６】
また、表４から明らかなように、ヘイケホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における、４２５位のイソロイシン（Ile）のロイシン（Leu）への置換、及び４３８位のアスパラギン酸（Asp）のグリシン（Gly）への置換により、北米ホタルルシフェラーゼと比較して、発光強度がそれぞれ１．４倍及び３．２倍に増大した。この結果より、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、少なくとも上記（ａ）又は（ｂ）の置換が生じ、かつ、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列に対して６８％の相同性を有する変異アミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼの中に、北米ホタルルシフェラーゼの発光強度より十分に大きい発光強度を有するものが存在することが判明した。
【０１２７】
（実施例２０）
以下のようにして、ゲンジホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２５位のイソロイシン（Ile）がロイシン（Leu）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼを製造し、そのホタルルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。
【０１２８】
ゲンジホタル（Luciola cruciata）の幼虫を液体窒素で凍結した後、乳鉢で破砕し、トータルＲＮＡ抽出キット（NucleoSpin RNA L（MACHEREY-NAGEL社製））を用いて、ゲンジホタルのトータルＲＮＡを抽出した。そして、制限酵素NcoI認識配列を含有する塩基配列：5'-gactccatggaaaacatggaaaacgatg-3'（配列番号５３）からなるＤＮＡ、及びXhoI認識配列を含有する塩基配列：5'-gacactcgagcatcttagcaactgg-3'（配列番号４７）からなるＤＮＡをプライマーとし、ＲＴ−ＰＣＲ用キット（SuperScriptIII One-Step RT-PCR System with Platinum Taq DNA Polymerase（Invitrogen社製））を用いて、ゲンジホタルルシフェラーゼｃＤＮＡ（塩基配列は配列番号５４に示すとおりである。）を作製した。得られたｃＤＮＡをNcoI及びXhoI（いずれも New England Biolabs 社製）で切断し、これを、予めNcoI及びXhoIで切断したプラスミド（pET-28a(+) plasmid DNA（Novagen社製））に、DNA Ligation Kit（BioDynamics Laboratory 社製）を用いて組み込んだ。なお、pET-28a(+) は、Ｔ７プロモーター及びＴ７ターミネーターを含有する。また、発現する目的タンパク質のＣ末端側にヒスチジンタグが付加されるように、クローニング部位の近傍に、ヒスチジンタグをコードする遺伝子を含有する。また、pET-28a(+) はカナマイシン耐性を有する。
【０１２９】
次に、得られた組換えプラスミドを鋳型として、Transformer部位特異的突然変異誘発キット（Clontech社製）を用いて部位特異的変異導入を行った。選択プライマーとしては、pET-28a(+) 中の制限酵素Bst1107I認識配列と一塩基異なる配列を含有する塩基配列：5'-gttaagccagtttacactccgc-3'（配列番号４９）からなるＤＮＡを用いた。変異誘発プライマーとしては、塩基配列：5'-gcacaccggagatcttggatattatg-3'（配列番号５５）からなるＤＮＡを用いた。いずれのプライマーも、予めＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（TOYOBO社製）で５’末端をリン酸化した。Transformer部位特異的突然変異誘発キット添付のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて、組換えプラスミドを合成した。Bst1107Iで切断処理した後、Bst1107Iで切断されなかった組換えプラスミドを大腸菌のミスマッチ修復欠損株BMH71-18mutSに導入し、大腸菌を培養した。得られた組換えプラスミドを更にBst1107Iで切断処理し、Bst1107Iで切断されなかった組換えプラスミドを、変異が導入された組換えプラスミドとして選択した。こうして得られた組換えプラスミドを大腸菌に導入したこと以外は、実施例１と同様にして、形質転換大腸菌を作製し、変異型ホタルルシフェラーゼの採取及び精製を行った。なお、実施例１と同様にして、組換えプラスミド中の変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ＤＮＡ）の塩基配列を決定し、当該遺伝子が目的の変異型ホタルルシフェラーゼをコードしていることを確認した。
【０１３０】
得られた変異型ホタルルシフェラーゼのタンパク質定量は、Bradford法に基づく Bio-Rad Protein Assay（BIORAD社製）を用いて、ＩｇＧを標準として行った。変異型ホタルルシフェラーゼ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含有する反応バッファー５０μＬを９６穴ウェルプレート（Nunc社製 ルミヌンクプレート）に加えた後、マイクロプレートリーダー（Perkin-Elmer社製 ARVO MX）付属のインジェクターを用いて、基質バッファー（１×１０−７Ｍ Ｄ−ホタルルシフェリン（和光純薬工業社製）、１×１０−６Ｍ ＡＴＰ及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））５０μＬを加えた。そして、上記マイクロプレートリーダーで発光強度を測定した。
【０１３１】
ゲンジホタルルシフェラーゼ（野生型）についても、変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有する組換えプラスミドの代わりに、上述のようにして得た、ゲンジホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｃＤＮＡ）を含有する組換えプラスミド（pET-28a(+)）を用いたこと以外は、変異型ホタルルシフェラーゼと同様にして、形質転換大腸菌を作製し、酵素の採取及び精製を行い、酵素の発光強度を測定した。そして、ゲンジホタルルシフェラーゼの発光強度に対する変異型ホタルルシフェラーゼの発光強度の比（発光強度比）を求めた。
【０１３２】
（実施例２１）
以下のようにして、ゲンジホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４３８位のアスパラギン酸（Asp）がグリシン（Gly）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼを製造し、そのホタルルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。
【０１３３】
部位特異的変異導入における変異誘発プライマーとして、塩基配列：5'-ctttattgtcggtcgtttgaagtc-3'（配列番号５６）からなるＤＮＡを用いたこと以外は、実施例２０と同様にして、精製した変異型ホタルルシフェラーゼを得、その発光強度を測定した。そして、実施例２０で測定されたゲンジホタルルシフェラーゼの発光強度を用いて、ゲンジホタルルシフェラーゼの発光強度に対する変異型ホタルルシフェラーゼの発光強度の比（発光強度比）を求めた。なお、実施例１と同様にして、組換えプラスミド中の変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ＤＮＡ）の塩基配列を決定し、当該遺伝子が目的の変異型ホタルルシフェラーゼをコードしていることを確認した。
【０１３４】
（実施例２２）
以下のようにして、ゲンジホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、５３２位のイソロイシン（Ile）がアルギニン（Arg）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼを製造し、そのホタルルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。
【０１３５】
部位特異的変異導入における変異誘発プライマーとして、塩基配列：5'-ggtcttactggaaaaagggacggcagagc-3'（配列番号５７）からなるＤＮＡを用いたこと以外は、実施例２０と同様にして、精製した変異型ホタルルシフェラーゼを得、その発光強度を測定した。そして、実施例２０で測定されたゲンジホタルルシフェラーゼの発光強度を用いて、ゲンジホタルルシフェラーゼの発光強度に対する変異型ホタルルシフェラーゼの発光強度の比（発光強度比）を求めた。なお、実施例１と同様にして、組換えプラスミド中の変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ＤＮＡ）の塩基配列を決定し、当該遺伝子が目的の変異型ホタルルシフェラーゼをコードしていることを確認した。
【０１３６】
（実施例２３）
実施例２０と同様にして、ゲンジホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２５位のイソロイシン（Ile）がロイシン（Leu）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼを製造し、そのホタルルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。北米ホタルルシフェラーゼ（野生型）についても、実施例１と同様にして、精製した酵素を得、その発光強度を測定した。そして、北米ホタルルシフェラーゼの発光強度に対する変異型ホタルルシフェラーゼの発光強度の比（発光強度比）を求めた。なお、実施例１と同様にして、組換えプラスミド中の変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ＤＮＡ）の塩基配列を決定し、当該遺伝子が目的の変異型ホタルルシフェラーゼをコードしていることを確認した。
【０１３７】
（比較例２１）
実施例２１と同様にして、ゲンジホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４３８位のアスパラギン酸（Asp）がグリシン（Gly）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼを製造し、そのホタルルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。そして、実施例２３で測定された北米ホタルルシフェラーゼの発光強度を用いて、北米ホタルルシフェラーゼの発光強度に対する変異型ホタルルシフェラーゼの発光強度の比（発光強度比）を求めた。なお、実施例１と同様にして、組換えプラスミド中の変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ＤＮＡ）の塩基配列を決定し、当該遺伝子が目的の変異型ホタルルシフェラーゼをコードしていることを確認した。
【０１３８】
（比較例２２）
実施例２２と同様にして、ゲンジホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、５３２位のイソロイシン（Ile）がアルギニン（Arg）に置換されたアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼを製造し、そのホタルルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。そして、実施例２３で測定された北米ホタルルシフェラーゼの発光強度を用いて、北米ホタルルシフェラーゼの発光強度に対する変異型ホタルルシフェラーゼの発光強度の比（発光強度比）を求めた。なお、実施例１と同様にして、組換えプラスミド中の変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ＤＮＡ）の塩基配列を決定し、当該遺伝子が目的の変異型ホタルルシフェラーゼをコードしていることを確認した。
【０１３９】
実施例２０〜２３及び比較例２１〜２２の結果を表５に示す。なお、ゲンジホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列と北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列との相同性は６８％である。
【０１４０】
【表５】
2007097577.tif 000006
【０１４１】
表５から明らかなように、ゲンジホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における、４２５位のイソロイシン（Ile）のロイシン（Leu）への置換、４３８位のアスパラギン酸（Asp）のグリシン（Gly）への置換、及び５３２位のイソロイシン（Ile）のアルギニン（Arg）への置換により、ゲンジホタルルシフェラーゼと比較して、発光強度がそれぞれ４．７倍、３．５倍及び２．２倍に増大した。この結果より、ゲンジホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の置換が生じた変異アミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼは、ゲンジホタルルシフェラーゼと比較して、十分に大きい発光強度を有することが判明した。
（ａ）４２５位のアミノ酸の、当該アミノ酸の分子量以上の分子量を有する非極性アミノ酸への置換
（ｂ）４３８位のアミノ酸の、当該アミノ酸の分子量より小さい分子量を有し、グリシン、アラニン及びセリンより選ばれるアミノ酸への置換
（ｃ）５３２位のアミノ酸の、当該アミノ酸の等電点より大きい等電点を有する正電荷アミノ酸への置換
【０１４２】
また、表５から明らかなように、ゲンジホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列における、４２５位のイソロイシン（Ile）のロイシン（Leu）への置換により、北米ホタルルシフェラーゼと比較して、発光強度が１．１倍に増大した。この結果より、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、少なくとも上記（ａ）の置換が生じ、かつ、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列に対して６８％の相同性を有する変異アミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼの中に、北米ホタルルシフェラーゼの発光強度より大きい発光強度を有するものが存在することが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１４３】
本発明の変異型ホタルルシフェラーゼは、飲食料中の極微量の細菌等の検出に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】ホタルルシフェラーゼの立体構造を模式的に示す図である。
【符号の説明】
【０１４５】
１０…ホタルルシフェラーゼ、１…Ｎ末端側ドメイン、１ａ…接合部、１ｂ…活性部位、２…連結部、３…Ｃ末端側ドメイン、３ａ…先端部。
【図１】
2007097577.tif 000007
【配列表】
2007097577000001.app