(57)【要約】【課題】血栓性疾患の早期診断および罹患危険率判定を可能にする手段の提供。【解決手段】ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを同定し、かつ該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位（ここで、本位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたゲノム塩基配列における位置として定義するが、本位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたゲノム塩基配列における第１５２３７７５２５位に相当する）の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とする、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法、該検出方法を利用した疾患罹患危険率検査方法、血小板の脱感作を誘導する化合物の同定方法、並びに前記検出方法および前記検査方法に用いるポリヌクレオチドおよび試薬キット。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを同定し、かつ該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とし、該手段が下記工程を含む、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法（ここで、ゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたゲノム塩基配列における位置として定義するが、本位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたゲノム塩基配列における第１５２３７７５２５位に相当する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプを判別し得る１塩基変異部位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片、および該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列をシークエンス法で決定する、または、前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について上記位置の塩基をタイピング法で決定する工程。
【請求項２】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることおよび／または第１５２５３９２９６位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することにより同定し、かつ該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とし、該手段が下記工程を含む、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法（ここで、ゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位、第１５２５３９２９６位および第１５２５３９３１４位はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたゲノム塩基配列における位置として定義するが、これら位置はそれぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたゲノム塩基配列における第１５２３７９３５０位、第１５２３７７５０７位および第１５２３７７５２５位に相当する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位および／または第１５２５３９２９６位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片、および該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列をシークエンス法で決定する、または、前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について上記位置の塩基をタイピング法で決定する工程。
【請求項３】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることおよび／または第１５２５３９２９６位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することにより同定し、かつ該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とし、該手段が、下記工程によりヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを含む、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法（ここで、ゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位、第１５２５３９２９６位および第１５２５３９３１４位はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたゲノム塩基配列における位置として定義するが、これら位置はそれぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたゲノム塩基配列における第１５２３７９３５０位、第１５２３７７５０７位および第１５２３７７５２５位に相当する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号１７および配列番号３４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２５４１１３９位に相当する位置の塩基を、配列番号４１または配列番号４３に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程。
【請求項４】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることおよび／または第１５２５３９２９６位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することにより同定し、かつ該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とし、該手段が、下記工程によりヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９２９６位がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することを含む、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法（ここで、ゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位、第１５２５３９２９６位および第１５２５３９３１４位はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたゲノム塩基配列における位置として定義するが、これら位置はそれぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたゲノム塩基配列における第１５２３７９３５０位、第１５２３７７５０７位および第１５２３７７５２５位に相当する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９２９６位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号２３および配列番号４０に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２５３９２９６位に相当する位置の塩基を、配列番号４２に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程。
【請求項５】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることおよび／または第１５２５３９２９６位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することにより同定し、かつ該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とし、該手段が、下記工程によりヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを含む、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法（（ここで、ゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位、第１５２５３９２９６位および第１５２５３９３１４位はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたゲノム塩基配列における位置として定義するが、これら位置はそれぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたゲノム塩基配列における第１５２３７９３５０位、第１５２３７７５０７位および第１５２３７７５２５位に相当する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号２３および配列番号４０に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２５３９３１４位に相当する位置の塩基を、配列番号５０または配列番号５５に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程。
【請求項６】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることおよび／または第１５２５３９２９６位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することにより同定し、かつ該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とし、該手段が、下記工程によりヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを含む、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法（ここで、ゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位、第１５２５３９２９６位および第１５２５３９３１４位はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたゲノム塩基配列における位置として定義するが、これら位置はそれぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたゲノム塩基配列における第１５２３７９３５０位、第１５２３７７５０７位および第１５２３７７５２５位に相当する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号５および配列番号６に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号１８および配列番号３４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシークエンス法により決定する工程。
【請求項７】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることおよび／または第１５２５３９２９６位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することにより同定し、かつ該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とし、該手段が、下記工程によりヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９２９６位がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することを含む、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法（ここで、ゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位、第１５２５３９２９６位および第１５２５３９３１４位はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたゲノム塩基配列における位置として定義するが、これら位置はそれぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたゲノム塩基配列における第１５２３７９３５０位、第１５２３７７５０７位および第１５２３７７５２５位に相当する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９２９６位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号７または配列番号５１に記載のポリヌクレオチド、および、配列番号８または配列番号５２に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号２４または配列番号５３に記載のポリヌクレオチド、および、配列番号４０または配列番号５４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシークエンス法により決定する工程。
【請求項８】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることおよび／または第１５２５３９２９６位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することにより同定し、かつ該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とし、該手段が、下記工程によりヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを含む、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法（ここで、ゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位、第１５２５３９２９６位および第１５２５３９３１４位はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたゲノム塩基配列における位置として定義するが、これら位置はそれぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたゲノム塩基配列における第１５２３７９３５０位、第１５２３７７５０７位および第１５２３７７５２５位に相当する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号７または配列番号５１に記載のポリヌクレオチド、および、配列番号８または配列番号５２に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号２４または配列番号５３に記載のポリヌクレオチド、および、配列番号４０または配列番号５４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシークエンス法により決定する工程。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１項に記載の冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法を用いることを特徴とする冠状動脈疾患の罹患危険率検査方法。
【請求項１０】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子であってそのハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子によりコードされるアミノ酸配列で表される蛋白質を保持する血小板（血小板Ａ）と、対照血小板（血小板Ｂ、ここで血小板Ｂは、次の群から選ばれるいずれか１のＰ２Ｙ１２受容体遺伝子によりコードされるアミノ酸配列で表される蛋白質を保持する血小板である：（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子であってそのハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列第１５２５３９３１４位の遺伝子型がＣ／ＴまたはＴ／Ｔである；（ｉｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子であってそのハプロタイプがＨ１／Ｈ２ハプロタイプ  ヘテロ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列第１５２５３９３１４位の遺伝子型がＣ／Ｃ、Ｃ／Ｔ、またはＴ／Ｔである；および（ｉｉｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子であってそのハプロタイプがＨ２ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列第１５２５３９３１４位の遺伝子型がＣ／Ｃ、Ｃ／Ｔ、またはＴ／Ｔである）とを、それぞれある化合物の存在下でヒトＰ２Ｙ１２受容体作動薬と接触させて血小板凝集反応を惹起し、ついで血小板Ａによる血小板凝集反応の用量依存性曲線と血小板Ｂによる血小板凝集凝集反応の用量依存性曲線を比較することを含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体作動薬に対する血小板の脱感作を誘導する化合物の同定方法（ここで、ゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたゲノム塩基配列における位置として定義するが、本位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたゲノム塩基配列における第１５２３７７５２５位に相当する）。
【請求項１１】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体作動薬が、アデノシン  ５´ジホスフェートである請求項１０に記載の化合物の同定方法。
【請求項１２】
配列表の配列番号５０から配列番号５５のいずれか１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列表の配列番号５０から配列番号５５のいずれか１に記載のポリヌクレオチドを含む試薬キット。
【請求項１４】
配列表の配列番号５０から配列番号５５のいずれか１に記載のポリヌクレオチドと、配列表の配列番号１から配列番号４９のいずれか１に記載のポリヌクレオチドとを含む試薬キット。
【請求項１５】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号５８に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることおよび／または該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第６９番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することにより同定し、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とし、該手段が下記工程を含む、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号５８に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位および／または該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第６９番目のヌクレオチドに相当する部位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片、および、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列をシークエンス法で決定する、または、前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について上記位置の塩基をタイピング法で決定する工程。
【請求項１６】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号５８に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることおよび／または該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第６９番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することにより同定し、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とし、該手段が下記工程によりヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号５８に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを含む、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号５８に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号１７および配列番号３４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号５８に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の塩基を、配列番号４１または配列番号４３に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程。
【請求項１７】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号５８に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることおよび／または該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第６９番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することにより同定し、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とし、該手段が下記工程によりヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第６９番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することを含む、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第６９番目のヌクレオチドに相当する部位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号２３および配列番号４０に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第６９番目のヌクレオチドに相当する部位の塩基を、配列番号４２に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程。
【請求項１８】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号５８に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることおよび／または該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第６９番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することにより同定し、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とし、該手段が下記工程によりヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを含む、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号２３および配列番号４０に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の塩基を、配列番号５０または配列番号５５に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程。
【請求項１９】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号５８に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることおよび／または該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第６９番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することにより同定し、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とし、該手段が下記工程によりヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号５８に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを含む、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号５８に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号５および配列番号６に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号１８および配列番号３４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシークエンス法により決定する工程。
【請求項２０】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号５８に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることおよび／または該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第６９番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することにより同定し、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とし、該手段が下記工程によりヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第６９番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することを含む、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第６９番目のヌクレオチドに相当する部位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号７または配列番号５１に記載のポリヌクレオチド、および、配列番号８または配列番号５２に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号２４または配列番号５３に記載のポリヌクレオチド、および、配列番号４０または配列番号５４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシークエンス法により決定する工程。
【請求項２１】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号５８に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることおよび／または該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第６９番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することにより同定し、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とし、該手段が下記工程によりヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを含む、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号７または配列番号５１に記載のポリヌクレオチド、および、配列番号８または配列番号５２に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号２４または配列番号５３に記載のポリヌクレオチド、および、配列番号４０または配列番号５４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシークエンス法により決定する工程。
【請求項２２】
請求項１５から２１のいずれか１項に記載の冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法を用いることを特徴とする冠状動脈疾患の罹患危険率検査方法。
【請求項２３】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子であってそのハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子によりコードされるアミノ酸配列で表される蛋白質を保持する血小板（血小板Ａ）と、対照血小板（血小板Ｂ、ここで血小板Ｂは、次の群から選ばれるいずれか１のＰ２Ｙ１２受容体遺伝子によりコードされるアミノ酸配列で表される蛋白質を保持する血小板である：（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子であってそのハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／ＴまたはＴ／Ｔである；（ｉｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子であってそのハプロタイプがＨ１／Ｈ２ハプロタイプ  ヘテロ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃ、Ｃ／Ｔ、またはＴ／Ｔである；および（ｉｉｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子であってそのハプロタイプがＨ２ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃ、Ｃ／Ｔ、またはＴ／Ｔである）とを、それぞれある化合物の存在下でヒトＰ２Ｙ１２受容体作動薬と接触させて血小板凝集反応を惹起し、ついで血小板Ａによる血小板凝集反応の用量依存性曲線と血小板Ｂによる血小板凝集凝集反応の用量依存性曲線を比較することを含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体作動薬に対する血小板の脱感作を誘導する化合物の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＰ２Ｙ１２受容体をコードする遺伝子（以下、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子と称する）の１塩基変異部位の解析による、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法に関する。より詳しくは、本発明は、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを同定し、かつ該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とする、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法に関する（ここで、ゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたゲノム塩基配列における位置として定義するが、本位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたゲノム塩基配列における第１５２３７７５２５位に相当する）。本発明はまた、前記検出方法を利用する冠状動脈疾患罹患危険率の検査方法に関する。本発明はさらに、血小板の脱感作を誘導する化合物の同定方法に関する。本発明はまた、前記検出方法および前記検査方法に用いるポリヌクレオチドおよび試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｐ２Ｙ１２受容体は、アデノシン  ５´ジホスフェート（以下、ＡＤＰと略称する）と結合することにより、血小板を活性化させる受容体である（非特許文献１および非特許文献２）。血小板活性化は止血に関わる重要な生理現象である一方、血栓形成にも関わり血管閉塞や虚血性ダメージを引き起こす。
【０００３】
ＡＤＰは血小板中の濃染顆粒に含まれており、血小板活性化に伴い細胞外に放出される。放出されたＡＤＰは周辺の血小板表面に存在する２種類のＡＤＰ受容体（Ｐ２Ｙ１受容体およびＰ２Ｙ１２受容体）に結合することにより血小板凝集を促進する。Ｐ２Ｙ１受容体は三量体Ｇ蛋白質であるＧｑと共役しており、細胞内カルシウム濃度の上昇を介して形態変化等の血小板凝集の初期反応に関与している。Ｐ２Ｙ１２受容体はＧ蛋白質であるＧｉと共役しており、低分子量Ｇ蛋白質のＲａｐ１ｂやセリンスレオニンキナーゼのＡｋｔの活性化を介して血小板凝集塊の成長や安定化に関与している。
【０００４】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子は、第３染色体ｑ２４−ｑ２５遺伝子座に存在する遺伝子である。該遺伝子は２つのエキソンを含み、その全長は約３．１ｋｂであり、３４２アミノ酸からなる蛋白質をコードしている。
【０００５】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子にはＨ１ハプロタイプおよびＨ２ハプロタイプと呼ばれる遺伝子多型が報告されている（特許文献１、非特許文献３および非特許文献４）。Ｈ１ハプロタイプは、アリル頻度が高く、正常遺伝子型であると考えられる。一方、Ｈ２ハプロタイプを有する個体ではＡＤＰ誘起血小板凝集能が亢進していること、およびＨ２ハプロタイプが末梢動脈障害発症の危険因子となることが報告されている（非特許文献３および非特許文献４）。Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプを有する個体で血小板凝集能が亢進するメカニズムについては明らかになっていない。恐らく、細胞表面のＰ２Ｙ１２受容体数が増加しているのではないかと推測されている。
【０００６】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプには、４種類の１塩基変異が存在する（表１）。以下、これら１塩基変異を既知１塩基変異と称する。これら既知１塩基変異を同定することにより、Ｈ２ハプロタイプを特定できることが開示されている（特許文献１）。また、Ｈ２ハプロタイプと末梢動脈疾患（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ａｒｔｅｒｉａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ、以下ＰＡＤと略称することがある）との間に高い相関性が存在することが開示されている（特許文献１）。さらに、Ｈ２ハプロタイプの特定により、アテローム性血栓症の罹患危険率およびチエノピリジン抗血栓薬（例えばＰ２Ｙ１２受容体をターゲットとするクロピドグレルやチクロピジン等）に対する低感受性の検出を実施できると考えられることが開示されている（特許文献１）。
【０００７】
【表１】
2007097569.tif 000002
【０００８】
表１において、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異の位置を、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が存在する第３染色体のゲノム塩基配列における位置として表した。
【０００９】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が存在する第３染色体の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３として、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）公開データベースに開示されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３に開示されている塩基配列は、版の改訂が平成１６年８月２４日に行われた。平成１６年８月２４日以前の版はＮＣ＿０００００３．８［ｇｉ：４２４０６２２０］（ＮＣ＿０００００３．８と称する）であり、それ以降の版はＮＣ＿０００００３．９［ｇｉ：５１５１１４６３］（ＮＣ＿０００００３．９と称する）である。
【００１０】
したがって、表１において、１塩基変異が存在する位置を、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が存在する第３染色体の塩基配列、すなわちＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列における位置、およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列における位置として表した。
【００１１】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異にはその他、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子ゲノム塩基配列第１５２５３９３１４位（本位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたゲノム塩基配列における位置として定義するが、本位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたゲノム塩基配列における第１５２３７７５２５位に相当する）の塩基のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への変異が知られている。本１塩基変異は、クロピドグレル治療を受けている末梢動脈疾患患者における脳血管イベントの増加に関連していることが報告されている（非特許文献５）。具体的には、クロピドグレル治療を受けている末梢動脈疾患患者において、神経系の副作用を示す患者、例えば虚血性脳梗塞を発症する患者や、頚動脈ステント留置または動脈硬化切開術を行った患者が、本１塩基変異を有する患者では本１塩基変異を有さない患者と比較して約４倍高いことが報告されている。一方、本１塩基変異を有する患者の血小板凝集能が本１塩基変異を有さない患者と比較して低く、また心筋梗塞の危険性が低くなっているという報告もある（非特許文献６）。また、本１塩基変異は、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ１／Ｈ２ハプロタイプとは連鎖していないと考えられること（非特許文献３および非特許文献７）、および本１塩基変異とＡＤＰ誘起血小板凝集との関連はないと考えられること（非特許文献３）が報告されている。
【００１２】
止血機構は、生体内で血管が損傷した場合、血管の機能、血小板機能、凝固・線溶系等の密接な相互作用のもとに働く生理的機構である。止血機構の異常は各種の出血性疾患や血栓性疾患等の原因になる。病的生理条件では、例えばアテローム斑の破裂により病的な血小板活性化が惹起され、その結果、動脈血栓が形成され、ひいては心筋梗塞、虚血性脳卒中、および末梢動脈疾患が引き起こされる可能性がある。
【００１３】
血栓性疾患は、血栓による血管の狭窄あるいは閉塞に起因する疾患であり、血栓症と塞栓症とに分類できる。血栓症は、血栓がその形成箇所で血流を部分的にあるいは完全に閉塞することにより起こる症状であり、塞栓症は血栓がその形成箇所から剥がれて血流により移動し、他の箇所で血流を部分的にあるいは完全に閉塞することにより起こる症状をいう。向血栓性の血液凝固異常を伴う疾患として冠動脈疾患、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、脳梗塞、および深部静脈血栓症が例示できる。
【００１４】
冠動脈疾患（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ、以下ＣＡＤと略称することがある）は、冠状動脈の閉塞による疾患として知られている。ＣＡＤは虚血性心疾患（ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）とも呼ばれ、心筋への血液供給が著しく減少するため、心筋梗塞、狭心症あるいは不整脈等の症状が引き起こされる。
【００１５】
虚血性脳卒中は虚血性脳血管障害であり、脳梗塞や一過性脳虚血発作等が含まれる。脳梗塞は、脳卒中のなかに占める割合が高い。脳梗塞はその原因により２つ、すなわち脳血栓によるものと脳塞栓によるものとに大別される。脳血栓は脳の血管が動脈硬化等の変化により狭窄し、血流が悪くなって血栓を形成することに起因する。脳塞栓は心臓内や頚動脈において形成された血栓が血流により脳血管に運ばれた結果、脳血管の閉塞を起こすことに起因する。脳梗塞は心原性と非心原性に分類される。心原性脳梗塞では抗凝固薬、非心原性脳梗塞では抗血小板薬が特に有効であることが示されている。
【００１６】
末梢動脈の閉塞による疾患として末梢動脈疾患（ＰＡＤ）が知られている。ＰＡＤは、ほとんどの患者ではアテローム性動脈硬化が基礎にあり、ＣＡＤおよび心原性を除く脳梗塞と病態生理学的には極めて近いと考えられている。急性の虚血は近位の動脈硬化性プラークの破裂、先在するアテローム性動脈硬化による急性血栓症、心臓、大動脈または他の大型の脈管から飛来した塞栓、動脈瘤解離が原因である。慢性の虚血はアテローム斑が徐々に拡大することにより起こるとされている。この病態では、抗血小板薬が有効とされている。
【００１７】
静脈血栓症は全身の表在性や深部のどの静脈にも起こり得るが、下腿静脈、大腿静脈、骨盤内深在静脈等の深部静脈血栓症（Ｄｅｅｐ  Ｖｅｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、以下ＤＶＴと略称することがある）は頻度も多く、致命的となり得る肺塞栓を生じる可能性があり臨床的に重要である。ＤＶＴでは、血管内皮細胞の傷害によりコラーゲンが露出し、組織トロンボブラスチンが放出され、ここにうっ血を伴うと血液凝固が亢進して血栓が形成すると考えられている。この病態では、抗凝固薬（ヘパリンやワーファリン等）や抗血小板薬（アスピリン等）が血栓の形成や拡大の防止に有効であることが知られている。
【００１８】
【特許文献１】国際特許公開ＷＯ２００４／０３５８２６号パンフレット。
【非特許文献１】ドーサム（Ｄｏｒｓａｍ，Ｒ．Ｔ）ら、「ザ  ジャーナル  オブ  クリニカル  インベスティゲーション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」、２００４年、第１１３巻、第３号、ｐ．３４０−３４５。
【非特許文献２】クナプリ（Ｋｕｎａｐｕｌｉ，Ｓ．Ｐ．）ら、「バイオケミカル  ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ）」、１９９８年、第３３６巻、ｐ．５１３−５２３。
【非特許文献３】フォンタナ（Ｆｏｎｔａｎａ，Ｐ．）ら、「サーキュレーション（Ｃｉｒｃｌａｔｉｏｎ）」、２００３年、第１０８巻、ｐ．９８９−９９５。
【非特許文献４】フォンタナ（Ｆｏｎｔａｎａ，Ｐ．）ら、「サーキュレーション（Ｃｉｒｃｌａｔｉｏｎ）」、２００３年、第１０８巻、ｐ．２９７１−２９７３。
【非特許文献５】ジーグラー（Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｓ．）ら、「ストローク（ＳＴＲＯＫＥ）」、２００５年、第３６巻、ｐ．１３９４−１３９９。
【非特許文献７】フォン  ベッケラス（Ｖｏｎ  Ｖｅｃｋｅｒａｔｈ  Ｎ．）ら、「ブラッド  コアギュレーション  フィブリノリシス（Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ）」２００５年、第１６巻、ｐ．１９９−２０４。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
血栓形成における初期反応である血小板凝集に中心的役割を果たすヒトＰ２Ｙ１２受容体をコードする遺伝子には、Ｈ１ハプロタイプおよびＨ２ハプロタイプと呼ばれる遺伝子多型が報告されている。Ｈ２ハプロタイプを有する個体では、血小板凝集能の亢進が認められている（非特許文献３および非特許文献４）。さらに、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子ゲノム塩基配列第１５２５３９３１４位（本位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたゲノム塩基配列における位置として定義するが、本位置はＮＣ＿０００００３．８に記載されたゲノム塩基配列においては第１５２３７７５２５位に相当する）の塩基のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への変異が、クロピドグレル治療を受けているＰＡＤ患者における脳血管イベントの増加に関連していることが報告されている（非特許文献５）。
【００２０】
しかしながら、これらハプロタイプや１塩基変異等の複合的な要素と血小板反応性の関連性、およびこれらハプロタイプや１塩基変異等の複合的な要素と血栓形成に起因する疾患の関連性については明らかにされていない。
【００２１】
血栓形成に起因する血栓性疾患、例えば冠動脈疾患や脳卒中はヒトの死因において多くの割合を占める疾患である。冠動脈疾患や脳卒中は、これら疾患の発症リスクを高める因子、例えば喫煙、高血圧、高脂肪／高コレステロール食習慣、肥満およびストレス等の是正により予防することができる。これら疾患の発症リスクの回避、早期治療、治療法の選択および薬物の用量設定を可能にするため、当該疾患の早期診断が望まれる。
【００２２】
本発明の課題は、血栓性疾患と関連するヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型を明らかにし、それにより該疾患の早期診断および罹患危険率判定を可能にする手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明者らは、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型と血小板凝集能および血栓性疾患との関連を解析し、冠状動脈疾患と高い関連性を有すると考えることができるヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型を見出して本発明を完成した。
【００２４】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型の解析は、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプおよび該遺伝子内の１塩基変異部位のヌクレオチドを同定することにより行った。
【００２５】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプおよび該遺伝子内の１塩基変異部位のヌクレオチドの同定は、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のテンプレートとして、遺伝子変異およびハプロタイプが考慮されていないＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３遺伝子配列（第３染色体塩基配列であり、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム配列を含む）を用い、日本人のゲノム試料を母集団として実施した。このテンプレート配列を参照配列と呼称することがある。本明細書において、１塩基変異部位は、参照配列における塩基の位置として定義する。
【００２６】
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３として、ＮＣＢＩ公開データベースに開示されている塩基配列は、版の改訂が平成１６年８月２４日に行われた。平成１６年８月２４日以前の版はＮＣ＿０００００３．８［ｇｉ：４２４０６２２０］（ＮＣ＿０００００３．８と称する）であり、それ以降の版はＮＣ＿０００００３．９［ｇｉ：５１５１１４６３］（ＮＣ＿０００００３．９と称する）である。
【００２７】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子を含む領域の位置は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に開示された塩基配列ではＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されたものと比較して１６１７８９ｂｐ下流にシフトしている。したがって、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に開示された塩基配列におけるヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子を含む領域内の各塩基の位置は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列における当該各塩基の位置と比較して、１６１７８９ｂｐ下流に位置する。
【００２８】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子を含む領域は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列の第１５２５４４０８９位から第１５２５３７７８３位に相当する。一方、本領域は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３８２３００位から第１５２３７５９９４位に相当する。
【００２９】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子を含む領域、すなわちＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列の第１５２５４４０８９位から第１５２５３７７８３位の塩基配列と、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３８２３００位から第１５２３７５９９４位の塩基配列は、完全に一致している。したがって、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３の版の改訂前後において、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の塩基配列は変化していない。
【００３０】
このように、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子を含む領域は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８とＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９とでその位置が相違するのみであることから、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されたヒト第３染色体塩基配列における位置として表示したヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の１塩基変異の位置を該位置に相当するＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に開示されたヒト第３染色体塩基配列における位置として表示したとき、位置を示す塩基番号は異なるが、それぞれの塩基番号により特定されるのは同じ１塩基変異である。
【００３１】
本明細書においては、特に定義しない限り、参照配列としてＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列を用い、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の各塩基の位置は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列における位置として示した。これら各塩基は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列においては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列における位置の１６１７８９ｂｐ下流に位置する。すなわち、これら各塩基の位置は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列においては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列における塩基番号に１６１７８９を加算した塩基番号で表すことができる。
【００３２】
後述するヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の各塩基の位置について、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列における位置と、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列における位置とを対比して、表２−１、表２−２、表２−３および表２−４に示す。
【００３３】
【表２−１】
2007097569.tif 000003
【００３４】
【表２−２】
2007097569.tif 000004
【００３５】
【表２−３】
2007097569.tif 000005
【００３６】
【表２−４】
2007097569.tif 000006
【００３７】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の各塩基の位置を示す塩基番号は、上述のように、ヒト第３染色体塩基配列を開示しているＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３の版により、その版におけるヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子を含む領域の位置がシフトすることがあるため、異なることがある。また、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の各塩基の位置を示す塩基番号は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３に開示されている塩基配列とは別の塩基配列を参照配列として用いる場合、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３に開示されている塩基配列におけるものとは異なることがある。
【００３８】
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８またはＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列とは別の塩基配列を参照配列として用いる場合、該参照配列におけるヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異部位は、次に示すように特定することができる。まず、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８またはＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列の部分塩基配列であって該１塩基変異部位のヌクレオチドを含む部分塩基配列を指標として用い、該部分塩基配列と相同な塩基配列を参照配列中に見出し、さらに該部分塩基配列と参照配列中の該部分塩基配列と相同な塩基配列とを比較して、参照配列における該１塩基変異部位を特定することにより決定することができる。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８またはＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列の部分塩基配列と相同な塩基配列を参照配列において検索することは、自体公知の相同性検索法、例えばブラストサーチ（ＢＬＡＳＴ  ｓｅａｒｃｈ）により実施できる。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８またはＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列の部分塩基配列と、参照配列中の該部分塩基配列と相同な塩基配列は、完全に相同である必要はなく、参照配列中に複数の該部分塩基配列と相同な塩基配列が存在しない限りにおいて、１ないし数個の塩基が異なっていてもよい。
【００３９】
具体的には、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３７７５２５位は、該塩基配列とは別の塩基配列を参照配列として用いる場合、該参照配列における位置を次に示すように特定することができる。まず、配列表の配列番号６２に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の部分塩基配列）を指標として用いて該塩基配列と相同な塩基配列を参照配列中に見出す。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３７７５２５位は、配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する。したがって、配列表の配列番号６２に記載の塩基配列と参照配列中の該塩基配列と相同な塩基配列とを比較することにより、参照配列中の該塩基配列と相同な塩基配列中で、配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位を特定でき、さらに該特定された部位の参照配列における位置を決定することができる。
【００４０】
また、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３７９３５０位は、該塩基配列とは別の塩基配列を参照配列として用いる場合、該参照配列における位置を次に示すように特定することができる。まず、配列表の配列番号５８に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の部分塩基配列）を指標として用いて該塩基配列と相同な塩基配列を参照配列中に見出す。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３７９３５０位は、配列表の配列番号５８に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する。したがって、配列表の配列番号５８に記載の塩基配列と参照配列中の該塩基配列と相同な塩基配列とを比較することにより、参照配列中の該塩基配列と相同な塩基配列中で、配列表の配列番号５８に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位を特定でき、さらに該特定された部位の参照配列における位置を決定することができる。
【００４１】
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３７７５０７位は、該塩基配列とは別の塩基配列を参照配列として用いる場合、該参照配列における位置を次に示すように特定することができる。まず、配列表の配列番号６２に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の部分塩基配列）を指標として用いて該塩基配列と相同な塩基配列を参照配列中に見出す。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３７７５０７位は、配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第６９番目のヌクレオチドに相当する。したがって、配列表の配列番号６２に記載の塩基配列と参照配列中の該塩基配列と相同な塩基配列とを比較することにより、参照配列中の該塩基配列と相同な塩基配列中で、配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第６９番目のヌクレオチドに相当する部位を特定でき、さらに該特定された部位の参照配列における位置を決定することができる。
【００４２】
参照配列におけるヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異部位の決定に有用な塩基配列情報、すなわちＮＣ＿０００００３．８またはＮＣ＿０００００３．９に開示されている塩基配列の部分塩基配列情報と、該部分塩基配列情報におけるヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異部位を表３に示す。
【００４３】
【表３】
2007097569.tif 000007
【００４４】
表３中、「＊」にて表示したＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３７８４９５位は、表１に示すように、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型がＨ２ハプロタイプである場合、その位置のヌクレオチドの塩基はＡであるが、Ｈ１ハプロタイプである場合、その位置のヌクレオチドは欠失している。このような場合、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の第１５２３７８４９５位（目的の塩基の位置と称することがある）は、該塩基配列とは別の塩基配列を参照配列として用いるとき、該参照配列における位置を、次に示すように特定することができる。まず、配列表の配列番号６０に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列の部分塩基配列）を指標として用いて該塩基配列と相同な塩基配列を参照配列中に見出す。次いで、配列表の配列番号６０に記載の塩基配列の第１０７番目から第１０８番目のヌクレオチド（ＡＡ）に相当する部位を指標にして、参照配列における目的の塩基の位置を特定できる。
【００４５】
本発明者らは、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型の解析を該遺伝子のハプロタイプおよび該遺伝子内の１塩基変異部位のヌクレオチドを同定することにより行った結果、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列においてエキソン２より上流に存在する４種類の１塩基変異が該遺伝子のＨ２ハプロタイプと連鎖していることを明らかにした。
【００４６】
また、ヒト血小板の低濃度ＡＤＰに対する凝集能を解析した結果、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位（本位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたゲノム塩基配列における位置として定義するが、本位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたゲノム塩基配列における第１５２３７７５２５位に相当する）の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型である個体由来の血小板は、これら遺伝子型を有さない個体由来の血小板と比較して、血小板凝集能が低いことを見出した。一方、高濃度ＡＤＰに対する凝集能は、前者由来の血小板と後者由来の血小板との間で、ほとんど差異は認められなかった。
【００４７】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位（本位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたゲノム塩基配列における位置として定義するが、本位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたゲノム塩基配列における第１５２３７７５２５位に相当する）の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型である個体由来の血小板は、上記のようにＡＤＰ刺激時の凝集能が低く、そのため生体血管内で絶えず生成されている微量のＡＤＰでは活性化・脱感作されにくい。脱感作とは血小板がＡＤＰ等のＰ２Ｙ１２受容体作動薬により刺激された後、該作動薬で再度刺激しても充分に反応（凝集）できない状態を意味する。これに対し、上記のような遺伝子型を有さない個体由来の血小板は、ＡＤＰに対する反応性が高いため、生体血管内で生成される微量ＡＤＰに絶えず反応し、脱感作された状態に陥りやすい。
【００４８】
冠状動脈疾患発症時に血小板は高濃度ＡＤＰに暴露される。このとき、脱感作された血小板はＡＤＰに充分反応できず、脆弱で小さい血栓を形成するのに対し、脱感作されにくい血小板はＡＤＰに敏感に反応し、強固で大きな血栓を形成して冠動脈疾患の発症ならびにその悪化に寄与すると考えられる。
【００４９】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位（本位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたゲノム塩基配列における位置として定義するが、本位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたゲノム塩基配列における第１５２３７７５２５位に相当する）の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型である個体由来の血小板は、低濃度ＡＤＰに対する凝集能が低いため、生体血管内で生成されている微量のＡＤＰでは脱感作されにくく、その結果、冠状動脈疾患発症時に暴露される高濃度ＡＤＰに敏感に反応し、強固で大きな血栓を形成して冠動脈疾患の発症ならびにその悪化に寄与すると考えられる。
【００５０】
実際、冠状動脈疾患患者において、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列第１５２５３９３１４位（本位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたゲノム塩基配列における位置として定義するが、本位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたゲノム塩基配列における第１５２３７７５２５位に相当する）の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型である頻度が、健常人における該頻度と比較して、有意に高いことを本発明において見出した。
【００５１】
本発明者らは、これら知見から、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列第１５２５３９３１４位（本位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたゲノム塩基配列における位置として定義するが、本位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたゲノム塩基配列における第１５２３７７５２５位に相当する）の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型を有する個体は、このような遺伝子型を有さない個体と比較して冠状動脈疾患を引き起こす可能性が高いと考えている。そして、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ１ハプロタイプの同定、および、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位の遺伝子型の検出を、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法に利用すること、並びに該疾患の早期診断および罹患危険率判定のための検査方法に利用することにより本発明を完成した。
【００５２】
すなわち、本発明は、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを同定し、かつ該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とし、該手段が下記工程を含む、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法に関する（ここで、ゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたゲノム塩基配列における位置として定義するが、本位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたゲノム塩基配列における第１５２３７７５２５位に相当する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプを判別し得る１塩基変異部位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片、および該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列をシークエンス法で決定する、または、前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について上記位置の塩基をタイピング法で決定する工程。
【００５３】
本発明はまた、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることおよび／または第１５２５３９２９６位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することにより同定し、かつ該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とし、該手段が下記工程を含む、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法に関する（ここで、ゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位、第１５２５３９２９６位および第１５２５３９３１４位はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたゲノム塩基配列における位置として定義するが、これら位置はそれぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたゲノム塩基配列における第１５２３７９３５０位、第１５２３７７５０７位および第１５２３７７５２５位に相当する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位および／または第１５２５３９２９６位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片、および該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列をシークエンス法で決定する、または、前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について上記位置の塩基をタイピング法で決定する工程。
【００５４】
本発明はさらに、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることおよび／または第１５２５３９２９６位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することにより同定し、かつ該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とし、該手段が、下記工程によりヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを含む、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法に関する（ここで、ゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位、第１５２５３９２９６位および第１５２５３９３１４位はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたゲノム塩基配列における位置として定義するが、これら位置はそれぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたゲノム塩基配列における第１５２３７９３５０位、第１５２３７７５０７位および第１５２３７７５２５位に相当する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号１７および配列番号３４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２５４１１３９位に相当する位置の塩基を、配列番号４１または配列番号４３に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程。
【００５５】
本発明はさらにまた、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることおよび／または第１５２５３９２９６位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することにより同定し、かつ該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とし、該手段が、下記工程によりヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９２９６位がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することを含む、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法に関する（ここで、ゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位、第１５２５３９２９６位および第１５２５３９３１４位はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたゲノム塩基配列における位置として定義するが、これら位置はそれぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたゲノム塩基配列における第１５２３７９３５０位、第１５２３７７５０７位および第１５２３７７５２５位に相当する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９２９６位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号２３および配列番号４０に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２５３９２９６位に相当する位置の塩基を、配列番号４２に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程。
【００５６】
本発明はまた、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることおよび／または第１５２５３９２９６位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することにより同定し、かつ該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とし、該手段が、下記工程によりヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを含む、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法に関する（ここで、ゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位、第１５２５３９２９６位および第１５２５３９３１４位はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたゲノム塩基配列における位置として定義するが、これら位置はそれぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたゲノム塩基配列における第１５２３７９３５０位、第１５２３７７５０７位および第１５２３７７５２５位に相当する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号２３および配列番号４０に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、第１５２５３９３１４位に相当する位置の塩基を、配列番号５０または配列番号５５に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程。
【００５７】
本発明はさらに、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることおよび／または第１５２５３９２９６位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することにより同定し、かつ該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とし、該手段が、下記工程によりヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを含む、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法に関する（ここで、ゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位、第１５２５３９２９６位および第１５２５３９３１４位はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたゲノム塩基配列における位置として定義するが、これら位置はそれぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたゲノム塩基配列における第１５２３７９３５０位、第１５２３７７５０７位および第１５２３７７５２５位に相当する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号５および配列番号６に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号１８および配列番号３４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシークエンス法により決定する工程。
【００５８】
本発明はさらにまた、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることおよび／または第１５２５３９２９６位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することにより同定し、かつ該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とし、該手段が、下記工程によりヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９２９６位がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することを含む、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法に関する（ここで、ゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位、第１５２５３９２９６位および第１５２５３９３１４位はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたゲノム塩基配列における位置として定義するが、これら位置はそれぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたゲノム塩基配列における第１５２３７９３５０位、第１５２３７７５０７位および第１５２３７７５２５位に相当する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９２９６位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号７または配列番号５１に記載のポリヌクレオチド、および、配列番号８または配列番号５２に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号２４または配列番号５３に記載のポリヌクレオチド、および、配列番号４０または配列番号５４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシークエンス法により決定する工程。
【００５９】
本発明はまた、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることおよび／または第１５２５３９２９６位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することにより同定し、かつ該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とし、該手段が、下記工程によりヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを含む、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法に関する（ここで、ゲノム塩基配列の第１５２５４１１３９位、第１５２５３９２９６位および第１５２５３９３１４位はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたゲノム塩基配列における位置として定義するが、これら位置はそれぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたゲノム塩基配列における第１５２３７９３５０位、第１５２３７７５０７位および第１５２３７７５２５位に相当する）：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号７または配列番号５１に記載のポリヌクレオチド、および、配列番号８または配列番号５２に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号２４または配列番号５３に記載のポリヌクレオチド、および、配列番号４０または配列番号５４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシークエンス法により決定する工程。
【００６０】
本発明はさらに、前記いずれかの冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法を用いることを特徴とする冠状動脈疾患の罹患危険率検査方法に関する。
【００６１】
本発明はさらにまた、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子であってそのハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子によりコードされるアミノ酸配列で表される蛋白質を保持する血小板（血小板Ａ）と、対照血小板（血小板Ｂ、ここで血小板Ｂは、次の群から選ばれるいずれか１のＰ２Ｙ１２受容体遺伝子によりコードされるアミノ酸配列で表される蛋白質を保持する血小板である：（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子であってそのハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列第１５２５３９３１４位の遺伝子型がＣ／ＴまたはＴ／Ｔである；（ｉｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子であってそのハプロタイプがＨ１／Ｈ２ハプロタイプ  ヘテロ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列第１５２５３９３１４位の遺伝子型がＣ／Ｃ、Ｃ／Ｔ、またはＴ／Ｔである；および（ｉｉｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子であってそのハプロタイプがＨ２ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列第１５２５３９３１４位の遺伝子型がＣ／Ｃ、Ｃ／Ｔ、またはＴ／Ｔである）とを、それぞれある化合物の存在下でヒトＰ２Ｙ１２受容体作動薬と接触させて血小板凝集反応を惹起し、ついで血小板Ａによる血小板凝集反応の用量依存性曲線と血小板Ｂによる血小板凝集凝集反応の用量依存性曲線を比較することを含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体作動薬に対する血小板の脱感作を誘導する化合物の同定方法に関する（ここで、ゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたゲノム塩基配列における位置として定義するが、本位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたゲノム塩基配列における第１５２３７７５２５位に相当する）。
【００６２】
本発明はまた、ヒトＰ２Ｙ１２受容体作動薬が、アデノシン  ５´ジホスフェートである前記化合物の同定方法に関する。
【００６３】
本発明はさらに、配列表の配列番号５０から配列番号５５のいずれか１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに関する。
【００６４】
本発明はさらにまた、配列表の配列番号５０から配列番号５５のいずれか１に記載のポリヌクレオチドを含む試薬キットに関する。
【００６５】
本発明はまた、配列表の配列番号５０から配列番号５５のいずれか１に記載のポリヌクレオチドと、配列表の配列番号１から配列番号４９のいずれか１に記載のポリヌクレオチドとを含む試薬キットに関する。
【００６６】
本発明はさらに、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号５８に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることおよび／または該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第６９番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することにより同定し、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とし、該手段が下記工程を含む、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法に関する：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号５８に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位および／または該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第６９番目のヌクレオチドに相当する部位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片、および、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列をシークエンス法で決定する、または、前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について上記位置の塩基をタイピング法で決定する工程。
【００６７】
本発明はさらにまた、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号５８に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることおよび／または該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第６９番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することにより同定し、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とし、該手段が下記工程によりヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号５８に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを含む、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法に関する：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号５８に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号１７および配列番号３４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号５８に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の塩基を、配列番号４１または配列番号４３に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程。
【００６８】
本発明はまた、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号５８に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることおよび／または該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第６９番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することにより同定し、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とし、該手段が下記工程によりヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第６９番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することを含む、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法に関する：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第６９番目のヌクレオチドに相当する部位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号２３および配列番号４０に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第６９番目のヌクレオチドに相当する部位の塩基を、配列番号４２に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程。
【００６９】
本発明はさらに、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号５８に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることおよび／または該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第６９番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することにより同定し、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とし、該手段が下記工程によりヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを含む、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法に関する：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号２３および配列番号４０に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物について、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の塩基を、配列番号５０または配列番号５５に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてタイピング法により決定する工程。
【００７０】
本発明はさらにまた、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号５８に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることおよび／または該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第６９番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することにより同定し、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とし、該手段が下記工程によりヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号５８に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを含む、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法に関する：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号５８に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号５および配列番号６に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号１８および配列番号３４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシークエンス法により決定する工程。
【００７１】
本発明はまた、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号５８に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることおよび／または該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第６９番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することにより同定し、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とし、該手段が下記工程によりヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第６９番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することを含む、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法に関する：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第６９番目のヌクレオチドに相当する部位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号７または配列番号５１に記載のポリヌクレオチド、および、配列番号８または配列番号５２に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号２４または配列番号５３に記載のポリヌクレオチド、および、配列番号４０または配列番号５４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシークエンス法により決定する工程。
【００７２】
本発明はさらに、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号５８に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることおよび／または該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第６９番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であることを検出することにより同定し、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とし、該手段が下記工程によりヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを含む、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法に関する：
（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位のヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を、配列番号７または配列番号５１に記載のポリヌクレオチド、および、配列番号８または配列番号５２に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、
および
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られたＰＣＲ産物の配列を、配列番号２４または配列番号５３に記載のポリヌクレオチド、および、配列番号４０または配列番号５４に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして用いてシークエンス法により決定する工程。
【００７３】
本発明はさらにまた、前記いずれかの冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法を用いることを特徴とする冠状動脈疾患の罹患危険率検査方法に関する。
【００７４】
本発明はまた、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子であってそのハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子によりコードされるアミノ酸配列で表される蛋白質を保持する血小板（血小板Ａ）と、対照血小板（血小板Ｂ、ここで血小板Ｂは、次の群から選ばれるいずれか１のＰ２Ｙ１２受容体遺伝子によりコードされるアミノ酸配列で表される蛋白質を保持する血小板である：（ｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子であってそのハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／ＴまたはＴ／Ｔである；（ｉｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子であってそのハプロタイプがＨ１／Ｈ２ハプロタイプ  ヘテロ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃ、Ｃ／Ｔ、またはＴ／Ｔである；および（ｉｉｉ）ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子であってそのハプロタイプがＨ２ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列において、該ゲノム塩基配列の部分塩基配列であって配列表の配列番号６２に記載の塩基配列の第５１番目のヌクレオチドに相当する部位の遺伝子型がＣ／Ｃ、Ｃ／Ｔ、またはＴ／Ｔである）とを、それぞれある化合物の存在下でヒトＰ２Ｙ１２受容体作動薬と接触させて血小板凝集反応を惹起し、ついで血小板Ａによる血小板凝集反応の用量依存性曲線と血小板Ｂによる血小板凝集凝集反応の用量依存性曲線を比較することを含む、ヒトＰ２Ｙ１２受容体作動薬に対する血小板の脱感作を誘導する化合物の同定方法に関する。
【発明の効果】
【００７５】
本発明において、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを同定し、かつ該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位（本位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたゲノム塩基配列における位置として定義するが、本位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたゲノム塩基配列における第１５２３７７５２５位に相当する）の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とする、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法を提供できる。
【００７６】
冠状動脈疾患患者では、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位（本位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたゲノム塩基配列における位置として定義するが、本位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたゲノム塩基配列における第１５２３７７５２５位に相当する）の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型である頻度が、健常者と比較して有意に高いことを本発明において明らかにした。
【００７７】
したがって、前記検出方法により、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位（本位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたゲノム塩基配列における位置として定義するが、本位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたゲノム塩基配列における第１５２３７７５２５位に相当する）の遺伝子型がＣ／Ｃであると特定された場合、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有すると判定できる。
【００７８】
本発明においては、前記検出方法を用いる冠状動脈疾患の罹患危険率検査方法を提供できる。さらに、前記検出方法および前記検査方法に用いるポリヌクレオチドおよび試薬キットを提供できる。
【００７９】
本発明により冠状動脈疾患の罹患危険率が高いと判定された場合、発症する前にそれらの危険因子、例えば喫煙、高血圧、高脂肪／高コレステロール食習慣、肥満およびストレス等の是正を行なうことができる。
【００８０】
また、本発明においては、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子であってそのハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２５３９３１４位（本位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．９に記載されたゲノム塩基配列における位置として定義するが、本位置はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に記載されたゲノム塩基配列における第１５２３７７５２５位に相当する）の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であるヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子によりコードされるアミノ酸配列で表される蛋白質を保持する血小板を用いて、Ｐ２Ｙ１２受容体作動薬、例えばＡＤＰに対する血小板の脱感作を誘導する化合物の同定方法を提供できる。本同定方法で同定された化合物は、ＡＤＰに対する血小板の脱感作を誘導できるため、冠状動脈疾患等の血栓性疾患の発症時に見られる高濃度ＡＤＰに対する血小板の凝集反応を低下させることができ、その結果、血栓の形成を阻害または低減できる。このような化合物は、血小板の脱感作誘導剤、血栓の形成阻害剤、および冠状動脈疾患等の血栓性疾患の防止剤および治療剤の有効成分として用いることができる。また、これら薬剤を用いて血栓性疾患の防止および治療を実施できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８１】
本発明においては、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型と血小板凝集能および血栓性疾患との関連を解析し、その結果、冠状動脈疾患と高い関連性を有すると考えることができるヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型を見出した。
【００８２】
ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型の解析は、該遺伝子のハプロタイプおよび該遺伝子内の１塩基変異部位のヌクレオチドを同定することにより行った。
【００８３】
以下においてヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の各塩基の位置を示すときには、特に定義しない限り、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列における位置として示す。
【００８４】
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子とは、以下、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子を意味する。
【００８５】
「遺伝子型」とは、１つの遺伝座について、１つの個体に存在する２つの対立遺伝子の組合わせを意味する。
【００８６】
「対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）」とは、同一遺伝子座に起こったＤＮＡ塩基配列の差に基づく差異を有する２個以上の遺伝子を意味する。
【００８７】
「ハプロタイプ」とは、１本の染色体（ハプロイド；半数体）上の複数の遺伝子座の対立遺伝子の組合わせのタイプ、または同一遺伝子上の複数の１塩基変異部位の組合わせのタイプを意味する。
【００８８】
「Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプ」とは、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子上の複数の１塩基変異部位の組合わせのタイプを意味する。Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子にはＨ１ハプロタイプおよびＨ２ハプロタイプと呼ばれる遺伝子多型が報告されている（特許文献１、非特許文献３および非特許文献４）。Ｈ１ハプロタイプは、アリル頻度が高く、正常遺伝子型であると考えられる。一方、Ｈ２ハプロタイプを有する個体ではＡＤＰ誘起血小板凝集能が亢進していること、およびＨ２ハプロタイプが末梢動脈障害発症の危険因子となることが報告されている（非特許文献３および非特許文献４）。
【００８９】
「１塩基変異部位」とは、遺伝子の塩基配列内において１塩基変異が生じている位置を意味する。１塩基変異とは、置換、欠失および挿入といった変異による単一塩基の別の塩基への変化を意味する。
【００９０】
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型と血小板凝集能および血栓性疾患との関連を解析した結果、具体的には、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることが、冠状動脈疾患と関連することが明らかになった。
【００９１】
より具体的には、健常人由来の血小板を用い、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型である個体由来の血小板と、これら遺伝子型を有さない個体由来の血小板について、ＡＤＰに対する血小板凝集能を比較した結果、前者由来の血小板は後者由来の血小板と比較して、低濃度ＡＤＰに対する凝集能が低いことが判明した。一方、高濃度ＡＤＰに対する凝集能は、前者由来の血小板と後者由来の血小板との間で、ほとんど差異は認められなかった。
【００９２】
「ホモ接合体」は、同型接合体とも称され、ある遺伝子座で、同じかまたは実験的に区別のつかない対立遺伝子を持つ接合体をいう。これに対し、ある遺伝子座で、別の対立遺伝子を持つ接合体をヘテロ接合体と称する。
【００９３】
「Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体である」とは、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子の対立遺伝子が両方共に、Ｈ１ハプロタイプのＰ２Ｙ１２受容体遺伝子であることを意味する。
【００９４】
「第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型である」とは、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子の対立遺伝子の両方において、第１５２３７７５２５位のヌクレオチドの塩基がシトシン（Ｃ）であることを意味する。
【００９５】
本明細書において、「Ｈ１  ｈｏｍｏ  ＆  １５２３７７５２５  Ｃ／Ｃ」という記載は、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを意味する。
【００９６】
「Ｏｔｈｅｒｓ」という記載は、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体ではないことおよび／または該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型ではないことを意味する。「Ｏｔｈｅｒｓ」には、次の例が含まれる：（１）Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／ＴまたはＴ／Ｔである；（２）Ｈ１／Ｈ２ハプロタイプ  ヘテロ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃ、Ｃ／Ｔ、またはＴ／Ｔである；および（３）Ｈ２ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃ、Ｃ／Ｔ、またはＴ／Ｔである。
【００９７】
一方、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型である個体由来の血小板と、該部位の遺伝子型がＣ／Ｃ以外の遺伝子型である個体由来の血小板について、ＡＤＰに対する血小板凝集能を比較した結果、前者由来の血小板は後者由来の血小板と比較して、ＡＤＰの濃度に拘らず凝集能が低いことが判明した。
【００９８】
本明細書において、「１５２３７７５２５  Ｃ／Ｃ」という記載は、Ｐ２Ｙ１２受容体のハプロタイプに拘らず、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを意味する。
【００９９】
「１５２３７７５２５  Ｔ  ｃａｒｒｉｅｒｓ」という記載は、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプに拘らず、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃ以外の遺伝子型であることを意味する。「１５２３７７５２５  Ｔ  ｃａｒｒｉｅｒｓ」には、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｔである例またはＴ／Ｔである例が含まれる。
【０１００】
これに対して、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体である個体由来の血小板と、該遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体以外のハプロタイプである個体由来の血小板について、ＡＤＰに対する血小板凝集能を比較した結果、ＡＤＰの濃度に拘らず、両者の凝集能にほとんど差異は認められなかった。
【０１０１】
本明細書において、「Ｈ１  ｈｏｍｏ」という記載は、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型に拘らず、該遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを意味する。
【０１０２】
「Ｈ２  ｃａｒｒｉｅｒｓ」という記載は、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型に拘らず、該遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体ではないことを意味する。「Ｈ２  ｃａｒｒｉｅｒｓ」には、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型がＨ１／Ｈ２ハプロタイプ  ヘテロ接合体である例またはＨ２ハプロタイプ  ホモ接合体である例が含まれる。
【０１０３】
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型である個体由来の血小板は、上記のようにＡＤＰ刺激時の凝集能が低く、そのため生体血管内で絶えず生成されている微量のＡＤＰでは活性化・脱感作されにくい。脱感作とは血小板がＡＤＰ等のＰ２Ｙ１２受容体作動薬により刺激された後、該作動薬で再度刺激しても充分に反応（凝集）できない状態を意味する。これに対し、上記のような遺伝子型を有さない個体由来の血小板は、ＡＤＰに対する反応性が高いため、生体血管内で生成される微量ＡＤＰに絶えず反応し、脱感作された状態に陥りやすい。
【０１０４】
冠状動脈疾患発症時に血小板は高濃度ＡＤＰに暴露される。このとき、脱感作された血小板はＡＤＰに充分反応できず、脆弱で小さい血栓を形成するのに対し、脱感作されにくい血小板はＡＤＰに敏感に反応し、強固で大きな血栓を形成して冠動脈疾患の発症ならびにその悪化に寄与すると考えられる。
【０１０５】
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型である個体由来の血小板は、低濃度ＡＤＰに対する凝集能が低いため、生体血管内で生成されている微量のＡＤＰでは脱感作されにくく、その結果、冠状動脈疾患発症時に暴露される高濃度ＡＤＰに敏感に反応し、強固で大きな血栓を形成して冠動脈疾患の発症ならびにその悪化に寄与すると考えられる。
【０１０６】
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型と疾患との関連性を、冠状動脈疾患患者および健常人それぞれに由来するゲノム試料（以下、それぞれＣＡＤ群およびコントロール群と称することがある）を用いてケース−コントロール研究により解析した結果、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型である頻度が、冠状動脈疾患患者において有意に高いことが判明した。
【０１０７】
解析は、単変量解析および多変量解析により実施した。単変量解析は遺伝子の１塩基多型を独立変数として行った。多変量解析は、遺伝子の１塩基多型、高脂血症、高血圧、糖尿病の有無、喫煙の既往、および体格指数（ＢＭＩ値）といった因子を独立変数に用い、単変量解析により有意差が検出された場合に実施した。
【０１０８】
具体的には、ＣＡＤ群およびコントロール群それぞれの、「Ｈ１  ｈｏｍｏ  ＆  １５２３７７５２５  Ｃ／Ｃ」および「Ｏｔｈｅｒｓ」の例数を基に、単変量解析および多変量解析を実施した結果、単変量解析および多変量解析の両解析で高いオッズレシオ（ＯＲ）が得られ、また得られたＯＲは９５％信頼区間（９５％  ＣＩ）の値から信頼性があると判定できた。本結果により、「Ｈ１  ｈｏｍｏ  ＆  １５２３７７５２５  Ｃ／Ｃ」はＣＡＤと関連することが信頼性をもって実証された。
【０１０９】
一方、ＣＡＤ群およびコントロール群それぞれの、「１５２３７７５２５  Ｃ／Ｃ」および「１５２３７７５２５  Ｔ  ｃａｒｒｉｅｒｓ」の例数を基に、単変量解析および多変量解析を実施したときは、単変量解析および多変量解析の両解析で得られたＯＲは低く、また得られたＯＲは９５％  ＣＩの値から信頼性がないことが判明した。本結果から、「１５２３７７５２５  Ｃ／Ｃ」がＣＡＤと関連する可能性は低いと考えられる。
【０１１０】
また、ＣＡＤ群およびコントロール群それぞれの、「Ｈ１  ｈｏｍｏ」および「Ｈ２  ｃａｒｒｉｅｒｓ」の例数を基に、単変量解析および多変量解析を実施したときは、単変量解析および多変量解析の両解析で高いＯＲが得られたが、得られたＯＲは９５％  ＣＩの値から信頼性がないことが判明した。本結果から、「Ｈ１  ｈｏｍｏ」がＣＡＤと関連する可能性は低いと考えられる。
【０１１１】
このように、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型は、その頻度が冠状動脈疾患患者において健常人と比較して有意に高いことから、冠状動脈疾患の発症と強く関連していると本発明者らは考えている。上記多変量解析で独立変数として用いた高血圧、高コレステロール、糖尿病、喫煙が冠状動脈疾患の独立危険因子であることは、多くのケース−コントロール研究で確認されている。本発明における多変量解析において、高血圧、高コレステロール、糖尿病、喫煙が独立危険因子であることが上記全ての解析で確認された。このことは、本解析における標本サンプリングならびに解析が妥当に行われていることを意味し、ゆえに、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることが冠状動脈疾患の危険因子であることを強く支持するものである。
【０１１２】
本発明の１態様は、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることを同定し、かつ該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることを検出することを手段とする、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法に関する。
【０１１３】
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であることは、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子についてＨ１ハプロタイプとＨ２ハプロタイプの判別を行うことにより実施できる。
【０１１４】
ヒト由来のゲノム試料において、Ｈ１ハプロタイプのＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が検出され、かつＨ２ハプロタイプのＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が検出されない場合、該試料中のＰ２Ｙ１２受容体遺伝子はＨ１ハプロタイプのホモ接合体であると判定できる。これに対し、ヒト由来のゲノム試料において、Ｈ２ハプロタイプのＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が検出され、かつＨ１ハプロタイプのＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が検出されない場合、該試料中のＰ２Ｙ１２受容体遺伝子はＨ２ハプロタイプのホモ接合体であると判定できる。また、ヒト由来のゲノム試料において、Ｈ１ハプロタイプのＰ２Ｙ１２受容体遺伝子およびＨ２ハプロタイプのＰ２Ｙ１２受容体遺伝子がいずれも検出された場合、該試料中のＰ２Ｙ１２受容体遺伝子はＨ１／Ｈ２ハプロタイプのヘテロ接合体であると判定できる。
【０１１５】
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ１ハプロタイプとＨ２ハプロタイプの判別は、これらハプロタイプを特定し得る１塩基変異部位のヌクレオチドの種類を同定することにより実施できる。
【０１１６】
Ｈ２ハプロタイプに存在する１塩基変異は、既に４種類が報告されており（表１）、これら既知１塩基変異を同定することにより、Ｈ２ハプロタイプを特定できることが開示されている（特許文献１）。これら既知１塩基変異は、白色人種健常人由来のゲノム試料において見出されたものである。また、欧米人においてＨ１ハプロタイプおよびＨ２ハプロタイプのアリル頻度は、それぞれ８６．２％および１３．８％であることが報告されている（非特許文献３）。
【０１１７】
本発明においては、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム配列において、Ｈ２ハプロタイプと連鎖している４種類の新たな１塩基変異が、該遺伝子のゲノム配列においてエキソン２より上流に存在することを見出した（実施例１および表７参照）。
【０１１８】
また、本発明において、表１に示した既知１塩基変異のうち、エキソン２に存在する１塩基変異（第１５２３７７５０７位のＧからＴへの変異）が認められないＨ２ハプロタイプを有する５例を日本人健常人由来のゲノム試料において見出した。これらの例においては、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子に、本発明において見出した４種類の１塩基変異（表７参照）が認められ、さらに表１に示した４種類の既知１塩基変異のうちエキソン２に存在する１塩基変異を除いた３種類の１塩基変異が認められた。このように、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のエキソン２に存在する１塩基変異（第１５２３７７５０７位のＧからＴへの変異）が従来のＨ２ハプロタイプと異なる遺伝子型を示す例が存在することが明らかになった（表８参照）。ここで見出したＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型をＨ２´ハプロタイプと呼称する（例数＝５）。Ｈ２´ハプロタイプの存在は日本人のゲノム試料を用いた解析で判明したが、既報のハプロタイプが日本人にも全く同位置に存在することから、Ｈ２´ハプロタイプは欧米人にも存在すると推察する。Ｈ２´ハプロタイプは、表１に示した既知１塩基変異のうち、エキソン２に存在する１塩基変異（第１５２３７７５０７位のＧからＴへの変異）が認められないが、本発明に係るＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異の４種類すべてが認められた。Ｈ２´ハプロタイプは、Ｈ２ハプロタイプと１箇所の１塩基変異の有無が異なるのみであることから、Ｈ２ハプロタイプと同様に血小板凝集能の亢進に関連すると考える。
【０１１９】
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ１ハプロタイプの特定は、具体的には、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子の下記１塩基変異部位のヌクレオチドの１つまたは２つ以上を検出することにより実施できる：
（１）第１５２３８１６７３位の塩基がグアニン（Ｇ）、
（２）第１５２３８０１８８位の塩基がチミン（Ｔ）、
（３）第１５２３７９３５０位の塩基がシトシン（Ｃ）、
（４）第１５２３７９１５６位の塩基がシトシン（Ｃ）、
（５）第１５２３７８５５１位の塩基がチミン（Ｔ）、
（６）第１５２３７８４９５位の塩基に挿入変異がない、
（７）第１５２３７８０８４位の塩基がチミン（Ｔ）、
（８）第１５２３７７５０７位の塩基がグアニン（Ｇ）。
【０１２０】
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ１ハプロタイプの同定は、好ましくは、第１５２３７９３５０位の塩基がシトシン（Ｃ）であること、および／または、第１５２３７７５０７位の塩基がグアニン（Ｇ）であることを検出することにより実施できる。該同定は、より好ましくは、第１５２３７９３５０位の塩基がシトシン（Ｃ）であること、および、第１５２３７７５０７位の塩基がグアニン（Ｇ）であることを検出することにより実施できる。
【０１２１】
ヒト由来のゲノム試料において、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ１ハプロタイプとＨ２ハプロタイプを特定し得る上記１塩基変異部位の１つまたは２つ以上がＨ１ハプロタイプに存在するヌクレオチドのみで表される遺伝子型である場合、該試料中のＰ２Ｙ１２受容体遺伝子はＨ１ハプロタイプのホモ接合体であると判定できる。
【０１２２】
「１塩基変異部位の１つまたは２つ以上がＨ１ハプロタイプに存在するヌクレオチドのみで表される遺伝子型である」とは、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子の対立遺伝子の両方において、該１塩基変異部位のヌクレオチドが、該遺伝子のＨ１ハプロタイプに存在するヌクレオチドであることを意味する。
【０１２３】
ヒト由来のゲノム試料において、Ｈ１ハプロタイプとＨ２ハプロタイプを特定し得る上記１塩基変異部位のヌクレオチドの１つまたは２つ以上がＨ１ハプロタイプに存在するヌクレオチドであるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が検出され、かつ該１塩基変異部位のヌクレオチドがＨ２ハプロタイプに存在するヌクレオチドであるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が検出されなかった場合、該試料中のＰ２Ｙ１２受容体遺伝子はＨ１ハプロタイプのホモ接合体であると判定できる。これに対し、該１塩基変異部位のヌクレオチドがＨ２ハプロタイプに存在するヌクレオチドであるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が検出され、該１塩基変異部位のヌクレオチドがＨ１ハプロタイプに存在するヌクレオチドであるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が検出されなかった場合、該試料中のＰ２Ｙ１２受容体遺伝子はＨ２ハプロタイプのホモ接合体であると判定できる。また、該１塩基変異部位のヌクレオチドがＨ１ハプロタイプに存在するヌクレオチドであるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子と該１塩基変異部位のヌクレオチドがＨ２ハプロタイプに存在するヌクレオチドであるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の両方が検出された場合、該試料中のＰ２Ｙ１２受容体遺伝子はＨ１／Ｈ２ハプロタイプ  ヘテロ接合体であると判定できる。
【０１２４】
例えば、ヒト由来のゲノム試料において、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子の第１５２３７９３５０位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であり、および／または、第１５２３７７５０７位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型である場合、該試料中のＰ２Ｙ１２受容体遺伝子はＨ１ハプロタイプのホモ接合体であると判定できる。
【０１２５】
「第１５２３７９３５０の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型である」とは、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子の対立遺伝子の両方において、第１５２３７９３５０位の塩基がシトシン（Ｃ）であることを意味する。「第１５２３７７５０７の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型である」とは、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子の対立遺伝子の両方において、第１５２３７７５０７位の塩基がグアニン（Ｇ）であることを意味する。
【０１２６】
ヒト由来のゲノム試料において、第１５２３７９３５０位の塩基がシトシン（Ｃ）であるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が検出され、かつ該１塩基変異部位の塩基がシトシン（Ｃ）以外の塩基であるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が検出されなかった場合、該試料中のＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型は第１５２３７９３５０位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であると判定できる。また、第１５２３７７５０７位の塩基がグアニン（Ｇ）であるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が検出され、かつ該１塩基変異部位の塩基がグアニン（Ｇ）以外の塩基であるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が検出されなかった場合、該試料中のＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型は第１５２３７７５０７位の遺伝子型がＧ／Ｇで表される遺伝子型であると判定できる。
【０１２７】
一方、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることは、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子の第１５２３７７５２５位のヌクレオチドの同定を行い、該ヌクレオチドの塩基がシトシン（Ｃ）であることを検出することにより決定できる。
【０１２８】
ヒト由来のゲノム試料において、第１５２３７７５２５位の塩基がシトシン（Ｃ）であるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が検出され、かつ該１塩基変異部位の塩基がシトシン（Ｃ）以外の塩基であるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が検出されなかった場合、該試料中のＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型は第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であると判定できる。
【０１２９】
上記のように、本発明に係る検出方法は、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において、該遺伝子のＨ１ハプロタイプとＨ２ハプロタイプを判別し得る１塩基変異部位、および該ゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位のヌクレオチドを検出し、その種類を同定することを手段とする。
【０１３０】
ヌクレオチドの検出およびその種類の同定は、自体公知の方法を使用して実施できる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略称する）により、所望の位置の塩基を含むＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の部分配列を増幅し、得られた増幅産物の塩基配列をシークエンス法、例えばダイレクトシークエンシング法により配列決定する方法を用いることができる。配列決定法としてはシークエンス法以外に、ハイブリダイゼーション法および制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）解析法等が利用できる。
【０１３１】
ヌクレオチドの検出およびその種類の同定は、具体的には以下のように実施できる。第１５２３７９３５０位のヌクレオチドの検出およびその種類の同定は、例えば、ゲノムＤＮＡについて、配列番号５および配列番号６に記載の各ポリヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物の塩基配列をシークエンス法により決定することにより実施できる。シークエンス法に用いるプライマー（以下、シークエンシング用プライマーと称する）として、配列番号１８および配列番号３４に記載の各ポリヌクレオチドを例示できる。第１５２３７７５０７位のヌクレオチドの検出およびその種類の同定は、例えば、ＰＣＲプライマーとして配列番号７または配列番号５１に記載の各ポリヌクレオチド、および、配列番号８または配列番号５２に記載の各ポリヌクレオチドを用い、シークエンシング用プライマーとして配列番号２４または配列番号５３に記載の各ポリヌクレオチド、および、配列番号４０または配列番号５４に記載の各ポリヌクレオチドを用いて、上記同様の方法で実施できる。第１５２３７７５２５位のヌクレオチドの検出およびその種類の同定は、例えば、ＰＣＲプライマーとして配列番号７または配列番号５１に記載の各ポリヌクレオチド、および、配列番号８または配列番号５２に記載の各ポリヌクレオチドを用い、シークエンシング用プライマーとして配列番号２４または配列番号５３に記載の各ポリヌクレオチド、および、配列番号４０または配列番号５４に記載の各ポリヌクレオチドを用いて、上記同様の方法で実施できる。第１５２３８１６７３位のヌクレオチドの検出およびその種類の同定は、例えば、ＰＣＲプライマーとして配列番号１および配列番号２に記載の各ポリヌクレオチドを用い、シークエンシング用プライマーとして配列番号１０および配列番号２８に記載の各ポリヌクレオチドを用いて、上記同様の方法で実施できる。第１５２３８０１８８位のヌクレオチドの検出およびその種類の同定は、例えば、ＰＣＲプライマーとして配列番号３および配列番号４に記載の各ポリヌクレオチドを用い、シークエンシング用プライマーとして配列番号３２に記載のポリヌクレオチドを用いて、上記同様の方法で実施できる。第１５２３７８０８４位のヌクレオチドの検出およびその種類の同定は、例えば、ＰＣＲプライマーとして配列番号７および配列番号８に記載の各ポリヌクレオチドを用い、シークエンシング用プライマーとして配列番号３９に記載のポリヌクレオチドを用いて、上記同様の方法で実施できる。第１５２３７９１５６位、第１５２３７８５５１位、第１５２３７８４９５位のヌクレオチドの検出およびその種類の同定も、適当なＰＣＲプライマーおよびシークエンシング用プライマーをＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の塩基配列に基づいて設計して取得し、これらプライマーを用いて上記同様の方法で実施できる。Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のこれら各位置を含む所望の領域を増幅するためのＰＣＲに用いるプライマーは上記例示したポリヌクレオチドに限定されず、該所望の領域を増幅し得るプライマーであればいずれも使用できる。また、シークエンシング用プライマーも上記例示したポリヌクレオチドに限定されず、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のこれら各位置を含む所望の領域の塩基配列を決定し得るプライマーであればいずれも使用できる。ＰＣＲおよびシークエンス法は、一般的に知られている方法に準じて実施できる。
【０１３２】
ヌクレオチドの種類の同定は、その他、公知の１塩基変異検出法を利用して実施できる。１塩基変異検出法として、例えば、ＳＮｕＰｅ法等の遺伝子タイピング法が挙げられる。ＳＮｕＰｅ法によるヌクレオチドの種類の同定は、具体的には、第１５２３７９３５０位のヌクレオチドを例にすると、該塩基を含むＤＮＡ断片を配列番号１７および配列番号３４に記載の各ポリヌクレオチドをプライマーとして用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅し、得られた増幅産物の標的位置の塩基の種類を配列番号４１または配列番号４３に記載のポリヌクレオチドをタイピング用プライマーとして用いてＳＮｕＰｅ法でタイピングすることにより実施できる（実施例参照）。第１５２３７７５０７位のヌクレオチドの種類の同定は、例えば、ＰＣＲプライマーとして配列番号２３および配列番号４０に記載の各ポリヌクレオチドを用い、タイピング用プライマーとして配列番号４２に記載のポリヌクレオチドを用いて、上記同様の方法で実施できる。第１５２３７７５２５位のヌクレオチドの種類の同定は、例えば、ＰＣＲプライマーとして配列番号２３および配列番号４０に記載の各ポリヌクレオチドを用い、タイピング用プライマーとして配列番号５０または配列番号５５に記載のポリヌクレオチドを用いて、上記同様の方法で実施できる。１５２３８１６７３位、第１５２３８０１８８位および第１５２３７８０８４位の塩基の決定も、同様に実施できる。これら位置の塩基のタイピングに用いるタイピング用プライマーは、該位置に隣接する上流または下流の塩基配列から適宜設計し取得できる。具体的には、第１５２３８１６７３位の塩基のタイピング用プライマーとして、配列番号４４または配列番号４５に記載のポリヌクレオチドを例示できる。第１５２３８０１８８位の位の塩基のタイピング用プライマーとして、配列番号４６または配列番号４７に記載のポリヌクレオチドを例示できる。第１５２３７８０８４位の塩基のタイピング用プライマーとして、配列番号４８または配列番号４９に記載のポリヌクレオチドを例示できる。第１５２３７９１５６位、第１５２３７８５５１位、第１５２３７８４９５位のヌクレオチドの種類の同定も、適当なＰＣＲプライマーおよびタイピング用プライマーをＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の塩基配列に基づいて設計して取得し、これらプライマーを用いて上記同様の方法で実施できる。Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のこれら各位置を含む所望の領域を増幅するためのＰＣＲに用いるプライマーは上記例示したポリヌクレオチドに限定されず、該所望の領域を増幅し得るプライマーであればいずれも使用できる。また、タイピング用プライマーも上記例示したポリヌクレオチドに限定されず、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のこれら各位置のヌクレオチドの種類を同定し得るプライマーであればいずれも使用できる。ＰＣＲおよび遺伝子タイピング法は、一般的に知られている方法に準じて実施できる。
【０１３３】
ヌクレオチドの検出およびその種類の同定は、その他、自体公知の１塩基変異解析方法を適用して実施できる。１塩基変異解析方法として、蛍光を用いる方法、例えばインベーダーアッセイ（リアミチェフ（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ，Ｖ．）ら、「ネイチャー  バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、１９９９年、第１７巻、ｐ．２９２−２９６）やルミネックス法（チェン（Ｃｈｅｎ，Ｊ．）ら、「ゲノム  リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２０００年、第１０巻、ｐ．５４９−５５７）を例示できる。また、マススペクトルを用いる方法、例えばプライマー伸張法を応用した方法を用いることもできる。このような方法として、ピンポイントアッセイ（ロス（Ｒｏｓｓ，Ｐ．）ら、「ネイチャー  バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、１９９８年、第１６巻、ｐ．１３４７−１３５１）やプローブ法（ブラウン（Ｂｒａｕｎ，Ａ．）ら、「クリニカル  ケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９７年、第４３巻、ｐ．１１５１−１１５８）等を例示できる。さらに、ドールアッセイ（ＤＯＬ  ａｓｓａｙ、チェン（Ｃｈｅｎ，Ｘ．）ら、「プロシーディング  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９９７年、第９４巻、ｐ．１０７５６−１０７６１）、スナイパーアッセイ（ピアテク（Ｐｉａｔｅｋ，Ａ．Ｓ．）ら、「ネイチャー  バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、１９９８年、第１６巻、ｐ．３５９−３６３）およびタグアレイ法（ファン（Ｆａｎ，Ｊ−Ｂ．）ら、「ゲノム  リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２０００年、第１０巻、ｐ．８５３−８６０）等も使用できる。これら方法は、これらが報告されている引用文献を参照することにより容易に実施することができる。また、蛍光共鳴エネルギー移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）やタックマン（Ｔａｑｍａｎ）法等、１塩基変異の検出方法としてよく知られた方法を用いることができる。
【０１３４】
ヌクレオチドの検出およびその種類の同定は、また、対立遺伝子特異的核酸プローブを用いて、それぞれハイブリダイゼーション法により実施できる。
【０１３５】
核酸プローブとしては、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列において上記１塩基変異部位を含む塩基配列またはその相補的塩基配列で表されるポリヌクレオチドの、当該１塩基変異部位を含む塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドが例示できる。「実質的に相補的な塩基配列を有する」とは、プローブとして使用したときに、調べようとする試料（以下、被検試料と称する）中において１塩基変異部位を含む塩基配列またはその相補的塩基配列を例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で検出することができることを意味する。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば成書に記載の方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー）等に従うことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件として具体的には、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳおよび５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリダイゼーションのシグナルが観察される条件を例示できる。
【０１３６】
プローブとして用いるポリヌクレオチドは、好ましくは８個ないし５０個のヌクレオチド、より好ましくは１７個ないし３５個のヌクレオチド、さらに好ましくは１７個ないし３０個のヌクレオチドからなる。プローブは、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子の塩基配列またはその相補的塩基配列に基づいて設計し、慣用の方法、例えば化学合成等により作製できる。得られたポリヌクレオチドから、上記１塩基変異部位を含む塩基配列または該塩基配列の相補的塩基配列で表されるポリヌクレオチドの、当該１塩基変異部位を含む塩基配列で表される遺伝子断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするものを選択することにより、目的とするプローブが得られる。プローブとして具体的には、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子の部分塩基配列であって本発明に係る１塩基変異のいずれか１を有する塩基配列またはその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドを例示できる。これらプローブは、検出のためのマーカー、例えば蛍光物質や放射性同位体等の標識体で標識されたものであってもよい。標識体はこれらに限らず、プローブとそれに対応するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが阻害されないものであればいずれも使用できる。上記１塩基変異の検出方法は例示に過ぎず、本発明において用いることのできる検出方法はこれらに限定されない。
【０１３７】
被検試料は、ヒト由来の血液、髄液、気管支肺胞洗浄液、痰、または他の体液、あるいは組織等から調製した核酸試料のいずれであってもよい。核酸試料の調製は、自体公知の核酸調製法により実施できる。核酸試料として、好ましくはゲノムＤＮＡを用いる。調製した核酸は直接検出に使用してもよく、あるいは分析前に所望の領域をＰＣＲまたはその他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅してもよい。
【０１３８】
本発明の１態様は、本発明に係る冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法を用いることを特徴とする冠状動脈疾患の罹患危険率の検査方法に関する。本発明に係る冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法を用いることにより、冠状動脈疾患の早期診断を実施できる。
【０１３９】
冠状動脈疾患の罹患危険率の検査方法は、具体的には、被検試料中のＰ２Ｙ１２受容体遺伝子について、ハプロタイプの同定を行い、かつ該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型を検出することにより実施できる。被検試料中のＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることが検出された場合、冠状動脈疾患の罹患危険率が高いと判定できる。
【０１４０】
本発明の１態様は、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子であってそのハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子によりコードされるアミノ酸配列で表される蛋白質を保持する血小板を用いることを特徴とする、Ｐ２Ｙ１２受容体作動薬に対する血小板の脱感作を誘導する化合物の同定方法に関する。
【０１４１】
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子であってそのハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子によりコードされるアミノ酸配列で表される蛋白質を保持する血小板（以下、血小板Ａと称することがある）は、対照血小板（以下、血小板Ｂと称することがある）と比較して、低濃度ＡＤＰに対する凝集能が低いことが明らかになった。一方、高濃度ＡＤＰに対する凝集能は、血小板Ａと血小板Ｂとの間で、ほとんど差異は認められなかった。血小板Ａは、ＡＤＰ刺激時の凝集能が低く、そのため生体血管内で絶えず生成されている微量のＡＤＰでは活性化・脱感作されにくい。これに対し、血小板Ｂは、ＡＤＰに対する反応性が高いため、生体血管内で生成される微量ＡＤＰに絶えず反応し、脱感作された状態に陥りやすい。ここで、対照血小板（血小板Ｂ）とは、血小板Ａが有するＰ２Ｙ１２受容体遺伝子とは異なる遺伝子型を有するＰ２Ｙ１２受容体遺伝子よりコードされるアミノ酸配列で表される蛋白質を保持する血小板を意味する。具体的には、血小板Ｂは、次の群から選ばれるいずれか１のＰ２Ｙ１２受容体遺伝子によりコードされるアミノ酸配列で表される蛋白質を保持する血小板である：（ｉ）Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子であってそのハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／ＴまたはＴ／Ｔである；（ｉｉ）Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子であってそのハプロタイプがＨ１／Ｈ２ハプロタイプ  ヘテロ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃ、Ｃ／Ｔ、またはＴ／Ｔである；および（ｉｉｉ）Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子であってそのハプロタイプがＨ２ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃ、Ｃ／Ｔ、またはＴ／Ｔである。
【０１４２】
冠状動脈疾患発症時に血小板は高濃度ＡＤＰに暴露される。このとき、脱感作された血小板、例えば上記血小板ＢはＡＤＰに充分反応できず、脆弱で小さい血栓を形成するのに対し、脱感作されにくい血小板、例えば上記血小板ＡはＡＤＰに敏感に反応し、強固で大きな血栓を形成して冠動脈疾患の発症ならびにその悪化に寄与すると考えられる。
【０１４３】
脱感作されにくい血小板、例えば上記血小板Ａの脱感作を誘導する化合物は、該血小板を脱感作された状態にすることができ、その結果、冠状動脈疾患発症時における高濃度ＡＤＰへの暴露に対する該血小板の反応を低減させ、血栓の形成を低減することができる。
このような化合物は、冠状動脈疾患の防止および／または治療剤の有効成分として使用できる。また、このような化合物を用いて、冠状動脈疾患の防止および／または治療方法を実施できる。
【０１４４】
脱感作されにくい血小板、例えば上記血小板Ａの脱感作を誘導する化合物の同定方法として、次のような同定方法が例示できる。まず、上記血小板Ａおよび上記血小板Ｂを、それぞれある化合物（以下、被検化合物と称する）の存在下でＰ２Ｙ１２受容体作動薬と接触させて血小板凝集反応を惹起する。血小板凝集反応は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で実施することもできるし、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で実施することもできる。好ましくは、血小板凝集反応はインビトロで実施する。ついで、血小板Ａによる血小板凝集反応の用量依存性曲線と血小板Ｂによる血小板凝集凝集反応の用量依存性曲線を作成し、両者を比較する。血小板Ａによる血小板凝集反応の用量依存性曲線と血小板Ｂによる血小板凝集反応の用量依存性曲線とに差がない化合物は、血小板Ａの脱感作を誘導すると判定できる。上記血小板Ａの調製は、例えば、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子であってそのハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型を有する個体由来の血液から、多血小板血漿または洗浄血小板を調製することにより実施できる。血液は、個体から抗凝固剤存在下に採血することにより取得できる。血液からの多血小板血漿または洗浄血小板の調製は汎用の方法により実施できる。上記血小板Ｂの調製は、例えば、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子であってそのハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型を有さない個体由来の血液を用いて上記同様の方法により実施できる。
【０１４５】
本発明の１態様は、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ１ハプロタイプおよびＨ２ハプロタイプを判別し得る１塩基変異部位のヌクレオチドの検出およびその種類の同定に用い得るプライマーや対立遺伝子特異的なプローブに関する。このようなプライマーおよびプローブとして、配列番号１から配列番号５５のいずれか１に記載のポリヌクレオチドが例示できる。より好ましくは、配列番号５０から５５のいずれか１に記載のポリヌクレオチドが例示できる。
【０１４６】
例えば、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７９３５０位を含む領域を増幅するためのプライマーとして、配列番号１７および配列番号３４に記載のポリヌクレオチドの組合わせを提供できる。また、該領域の塩基配列の決定に使用するためのプライマーとして配列番号２３および配列番号４０に記載のポリヌクレオチドの組合わせを提供できる。また、第１５２３７９３５０位の塩基のタイピングに使用し得るプライマーとして配列番号４１または配列番号４３に記載のポリヌクレオチドを提供できる。
【０１４７】
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７７５０７位を含む領域を増幅するためのプライマーとして、配列番号７または配列番号５１に記載のポリヌクレオチドと、配列番号８または配列番号５２に記載のポリヌクレオチドとの組合わせを提供できる。また、該領域の塩基配列の決定に使用するためのプライマーとして、配列番号２４または配列番号５３に記載のポリヌクレオチドと、配列番号４０または配列番号５４に記載のポリヌクレオチドとの組合わせを提供できる。また、第１５２３７９５０７位の塩基のタイピングに使用し得るプライマーとして配列番号４２に記載のポリヌクレオチドを提供できる。
【０１４８】
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７７５２５位を含む領域を増幅するためのプライマーとして、配列番号７または配列番号５１に記載のポリヌクレオチドと、配列番号８または配列番号５２に記載のポリヌクレオチドとの組合わせを提供できる。また、該領域の塩基配列の決定に使用するためのプライマーとして、配列番号２４または配列番号５３に記載のポリヌクレオチドと、配列番号４０または配列番号５４に記載のポリヌクレオチドとの組合わせを提供できる。また、第１５２３７７５２５位の塩基のタイピングに使用し得るプライマーとして配列番号５０または配列番号５５に記載のポリヌクレオチドを提供できる。
【０１４９】
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８１６７３位を含む領域を増幅するためのプライマーとして、配列番号１および配列番号２に記載のポリヌクレオチドの組合わせを提供できる。また、該領域の塩基配列の決定に使用するためのプライマーとして配列番号１０および配列番号２８に記載のポリヌクレオチドの組合わせを提供できる。また、第１５２３８１６７３位の塩基のタイピングに使用し得るプライマーとして配列番号４４または配列番号４５に記載のポリヌクレオチドを提供できる。
【０１５０】
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３８０１８８位を含む領域を増幅するためのプライマーとして、配列番号３および配列番号４に記載のポリヌクレオチドの組合わせを提供できる。また、該領域の塩基配列の決定に使用するためのプライマーとして配列番号３２に記載のポリヌクレオチドを提供できる。また、第１５２３８０１８８位の塩基のタイピングに使用し得るプライマーとして配列番号４６または配列番号４７に記載のポリヌクレオチドを提供できる。
【０１５１】
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子内の第１５２３７８０８４位を含む領域を増幅するためのプライマーとして、配列番号７および配列番号８に記載のポリヌクレオチドの組合わせを提供できる。また、該領域の塩基配列の決定に使用するためのプライマーとして配列番号３９に記載のポリヌクレオチドを提供できる。また、第１５２３７８０８４位の塩基のタイピングに使用し得るプライマーとして配列番号４８または配列番号４９に記載のポリヌクレオチドを提供できる。
【０１５２】
本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明により開示されたその具体的な塩基配列に関わる情報に基づいて、公知の遺伝子工学的手法（例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；および村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社等を参照）により容易に取得できる。
【０１５３】
プローブやプライマーは、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子の塩基配列またはその相補的塩基配列に基づいて設計し、慣用の方法、例えば化学合成等により作製できる。
【０１５４】
本発明の１態様は、上記ポリヌクレオチドを含む試薬キットに関する。本発明に係る試薬キットの範囲には、上記ポリヌクレオチドのうちの１種またはそれ以上を充填した、１個またはそれ以上の容器を含んでなる試薬キットも包含される。本発明に係る試薬キットとして、配列表の配列番号５０から配列番号５５のいずれか１に記載のポリヌクレオチドを含む試薬キットが好ましく例示できる。また、本発明に係る試薬キットとして、配列表の配列番号５０から配列番号５５のいずれか１に記載のポリヌクレオチドに加えて、配列番号１から配列番号４９のいずれか１に記載のポリヌクレオチドを含む試薬キットが例示できる。本試薬キットは、本発明に係る検出方法、検査方法、および化合物の同定方法の実施に必要とされる物質、例えば標識物質、緩衝液、並びに塩等を含むことができる。さらに、安定化剤および／または防腐剤等の物質を含んでいてもよい。製剤化にあたっては、使用する各物質、例えばポリヌクレオチドに応じた自体公知の製剤化手段を導入すればよい。このような試薬および試薬キットは、本発明に係る検出方法および検査方法に、検査剤並びに検査用キットとして使用できる。
【０１５５】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されない。本実施例においてＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の各塩基の位置を示すときには、特に定義しない限り、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列における位置として示す。
【実施例１】
【０１５６】
（Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム配列の解析）
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のエキソン１上流３ｋｂの地点からエキソン２の５´側約１５０ｂｐについて（全長約５ｋｂ）、ゲノム配列の解析により変異の検出を行なった。試料は１４１例の日本人健常人から供与を受けたゲノムＤＮＡを用いた。
【０１５７】
まず、２０例のゲノムＤＮＡを用い、ゲノムＤＮＡからＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の標的領域を増幅し、得られた増幅産物の塩基配列をダイレクトシークエンス法を用いて決定することにより変異の検出を実施した。
【０１５８】
標的領域の増幅はＰＣＲにより行なった。標的領域は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されたゲノム塩基配列を参照配列として、該ゲノム塩基配列に含まれるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム配列の４箇所に設定し、ＰＣＲ用プライマーは、該塩基配列に基づいて設計し作製した（表４）。ゲノムＤＮＡ試料２μｌを鋳型として、Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）またはＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いて、２０μｌの反応系でＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件は、各標的領域により異なる反応条件を用いた（表５）。
【０１５９】
【表４】
2007097569.tif 000008
【０１６０】
【表５】
2007097569.tif 000009
【０１６１】
ＰＣＲ反応条件Ａ
１）  ９４℃        ４分間
２）  ９４℃      ３０秒間
３）  ６２℃      ３０秒間
４）  ７２℃        ２分間
２）から４）の工程は４０サイクル行なった。
５）  ７２℃      １０分間
【０１６２】
ＰＣＲ反応条件Ｂ
１）  ９４℃        ４分間
２）  ９４℃      ３０秒間
３）  ５８℃      ３０秒間
４）  ７２℃        ２分間
２）から４）の工程は４０サイクル行なった。
５）  ７２℃      １０分間
【０１６３】
ＰＣＲ増幅産物をエキソサップ（Ｅｘｏ  ＳＡＰ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて精製し、シークエンス反応の鋳型として用いた。シークエンス反応は表６に示したプライマーおよびダイナミックＥＴダイターミネーターキット（ＤｙＥｎａｍｉｃ  ＥＴ  ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｋｉｔ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて行った。反応産物はセファデックス−５０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ−５０）を用いてゲルろ過法により精製した。シークエンサーは、メガベース１０００（ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用した。
【０１６４】
得られた配列データを用いて、フレッド／フラップ／ポリフレッド（Ｐｈｒｅｄ／Ｐｈｒａｐ／ＰｏｌｙＰｈｒｅｄ）ソフトウエアにより各塩基の精度（クオリティー値）の算出、アセンブルおよび変異の検出を行った。参照塩基配列および塩基位置として、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列および塩基位置を使用した。
【０１６５】
【表６】
2007097569.tif 000010
【０１６６】
塩基配列解析の結果、表７に示す４種類の１塩基変異がＨ２ハプロタイプと完全に連鎖していることが明らかになった。表７に示す４種類の１塩基変異が認められたゲノムＤＮＡにおいては、既知１塩基変異（表１）のうち、イントロン１に存在する３種類の１塩基変異が全て認められた。
【０１６７】
【表７】
2007097569.tif 000011
【０１６８】
また、塩基配列解析の結果、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプと連鎖していると報告されている既知１塩基変異（表１、特許文献１、非特許文献３および特許文献４）のうち、エキソン２に存在する１塩基変異（第１５２３７７５０７位のＧからＴへの変異）が認められないＨ２ハプロタイプを有する例を見出した。すなわち、エキソン２に存在するこの１塩基変異は、Ｈ２ハプロタイプと完全に連鎖していないと考える。この例においては、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子に、本発明において見出した４種類の１塩基変異（表７）が認められ、さらに表１に示した４種類の既知１塩基変異のうちエキソン２に存在する１塩基変異を除いた３種類の１塩基変異が認められた。
【０１６９】
このことから、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のエキソン２に存在する１塩基変異（第１５２３７７５０７位のＧからＴへの変異）が従来のＨ２ハプロタイプと異なる遺伝子型を示す例が存在することが明らかになった。ここで見出したＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型をＨ２´ハプロタイプと呼称する。Ｈ２´ハプロタイプは、Ｈ２ハプロタイプと１箇所の１塩基変異の有無が異なるのみであることから、Ｈ２ハプロタイプと同様に血小板凝集能の亢進に関連すると考える。
【０１７０】
Ｈ２ハプロタイプおよびＨ２´ハプロタイプと連鎖するＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の１塩基変異を表８にまとめて示す。
【０１７１】
【表８】
2007097569.tif 000012
【０１７２】
表８において、＃１、＃２、＃３および＃７に示した１塩基変異は、本発明においてＨ２ハプロタイプと完全に連鎖することを明らかにした１塩基変異である。＃４、＃５および＃６に示した１塩基変異は、既知１塩基変異（表１、特許文献１、非特許文献３および特許文献４）である。＃８に示した１塩基変異は、Ｈ２ハプロタイプと連鎖すると報告されている１塩基変異である（特許文献１、非特許文献３および特許文献４）が、日本人においてはこの１塩基変異が認められない数例を見出した。既報のハプロタイプが日本人にも全く同位置に存在することから、Ｈ２´ハプロタイプは欧米人にも存在すると推察する。
【０１７３】
（第１５２３７９３５０位の塩基および第１５２３７７５０７位の塩基の解析）
次に、１２１例の健常人のゲノムＤＮＡを用い、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプと完全に連鎖している１塩基変異、およびＨ２ハプロタイプとの連鎖が完全ではないと判明した第１５２３７７５０７位の１塩基変異について解析した。Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプと完全に連鎖している１塩基変異として、第１５２３７９３５０位の１塩基変異を解析した。第１５２３７９３５０位の１塩基変異を有するＰ２Ｙ１２受容体遺伝子はＨ２ハプロタイプであることから、第１５２３７９３５０位の１塩基変異が認められたゲノムＤＮＡにおいては、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ２ハプロタイプと完全に連鎖する他の１塩基変異（第１５２３８１６７３位、第１５２３８０１８８位、第１５２３７８０８４位の１塩基変異等）も存在する。
【０１７４】
これら２種類の１塩基変異の検出は、各ゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅したＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の検出を標的位置の塩基を含むＤＮＡ断片を用いて、ＳＮｕＰｅ反応により行った。ＰＣＲは、各ゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲプライマーを用いて行った。ＰＣＲプライマーは、第１５２３７９３５０位の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅のために、配列番号１７および配列番号３４に記載の各ポリヌクレオチドを用いた。また、第１５２３７７５０７位の塩基を含むＤＮＡ断片の増幅のために、配列番号２３および配列番号４０に記載の各ポリヌクレオチドを用いた。具体的には、各鋳型２μｌを使用し、Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ）を用いて１０μｌの反応系でＰＣＲを行った。なおポジティブコントロールは１０ｎｇ／μｌに調製したヒトゲノムＤＮＡ（クロンテック社製）を使用し、ネガティブコントロールには鋳型を加えずにＰＣＲを行った。
【０１７５】
ＰＣＲ反応条件は以下に示す。
１）  ９４℃        ４分間
２）  ９４℃      ３０秒間
３）  ５４℃      ３０秒間
４）  ７２℃      ４５秒間
２）から４）の工程は４０サイクル行なった。
５）  ７２℃        ４分間
【０１７６】
ＰＣＲ増幅産物は４℃で冷却後、セファデックス  Ｇ５０  ファイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いたゲルろ過法により精製し、ＳＮｕＰｅ反応に使用した。
【０１７７】
ＳＮｕＰｅ反応は、各１塩基変異が存在する位置の直前に設計したＳＮｕＰｅプライマー、鋳型である精製ＰＣＲ増幅産物およびメガベース  ＳＮｕＰｅ遺伝子タイピングキット（ＭｅｇａＢＡＣＥ  ＳＮｕＰｅ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｋｉｔ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、キットの添付資料に記載の方法に従って実施した。第１５２３７９３５０位および第１５２３７７５０７位の塩基のタイピング用ＳＮｕＰｅプライマーとしてそれぞれ表９に記載の各ポリヌクレオチドを用いた。なお、配列番号４２に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドは、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子ゲノム塩基配列の第１５２３７７５３２位から第１５２３７７５０８位までの２５ヌクレオチドからなる塩基配列に基づいて設計したポリヌクレオチドであるが、第１５２３７７５１９位のヌクレオチドを含まない２４ヌクレオチドからなるポリヌクレオチドである。
【０１７８】
【表９】
2007097569.tif 000013
【０１７９】
タイピング解析は９６ウエルプレートフォーマットのキャピラリーシークエンサー  メガベース１０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて行い、データ解析ソフトであるＳＮＰプロファイラーを用いてタイピングを行った。
【０１８０】
検討した１４１例（上記ダイレクトシークエンス法で解析した２０例を含む）において、Ｈ１ハプロタイプのホモ接合体は９４例であった。また、Ｈ１／Ｈ２ハプロタイプのヘテロ接合体、Ｈ１／Ｈ２´ハプロタイプのヘテロ接合体およびＨ２／Ｈ２´ハプロタイプのヘテロ接合体はそれぞれ、４２例、４例および１例であった。
【実施例２】
【０１８１】
（Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型と血小板反応性表現型の関連性解析）
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型のタイピングおよび血小板反応性表現型の測定を、２１７例の日本人健常人から供与を受けたゲノムＤＮＡについて実施した。
【０１８２】
遺伝子型のタイピングは、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ１ハプロタイプとＨ２ハプロタイプとを判別し得る１塩基変異部位、および該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の１塩基変異部位について実施した。
【０１８３】
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ１ハプロタイプとＨ２ハプロタイプの判別は、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７９３５０位および第１５２３７７５０７位の２つの１塩基変異部位について行った。Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプは、第１５２３７９３５０位および第１５２３７７５０７位がそれぞれＣおよびＧであるときＨ１ハプロタイプであり、これらがそれぞれＴおよびＴであるときＨ２ハプロタイプであると判定した。ゲノムＤＮＡにおいて、Ｈ１ハプロタイプのＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が検出され、かつＨ２ハプロタイプのＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が検出されない場合、該ゲノムＤＮＡ中のＰ２Ｙ１２受容体遺伝子はＨ１ハプロタイプのホモ接合体であると判定した。これに対し、ゲノムＤＮＡにおいて、Ｈ２ハプロタイプのＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が検出され、かつＨ１ハプロタイプのＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が検出されない場合、該ゲノムＤＮＡ中のＰ２Ｙ１２受容体遺伝子はＨ２ハプロタイプのホモ接合体であると判定した。また、ゲノムＤＮＡにおいて、Ｈ１ハプロタイプのＰ２Ｙ１２受容体遺伝子およびＨ２ハプロタイプのＰ２Ｙ１２受容体遺伝子がいずれも検出された場合、該ゲノムＤＮＡ中のＰ２Ｙ１２受容体遺伝子はＨ１／Ｈ２ハプロタイプのヘテロ接合体であると判定した。
【０１８４】
ゲノムＤＮＡ中のＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型は、該ゲノムＤＮＡにおいて、第１５２３７７５２５位の塩基がシトシン（Ｃ）であるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が検出され、かつ該１塩基変異部位の塩基がシトシン（Ｃ）以外の塩基であるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が検出されなかった場合、Ｃ／Ｃで表される遺伝子型であると判定した。ゲノムＤＮＡにおいて、第１５２３７７５２５位の塩基がシトシン（Ｃ）であるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子および該１塩基変異部位の塩基がチミン（Ｔ）であるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が検出された場合、該ゲノムＤＮＡのＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型は、Ｃ／Ｔで表される遺伝子型であると判定した。ゲノムＤＮＡにおいて、第１５２３７７５２５位の塩基がチミン（Ｔ）であるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子および該１塩基変異部位の塩基がシトシン（Ｃ）であるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子が検出された場合、該ゲノムＤＮＡのＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型は、Ｔ／Ｔで表される遺伝子型であると判定した。
【０１８５】
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７９３５０位、第１５２３７７５０７位、および第１５２３７７５２５位の遺伝子型の決定は、ＳＮｕＰｅ法により、次のように行った。まず、ゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、第１５２３７９３５０位の１塩基変異部位を含む領域１、並びに第１５２３７７５０７位および第１５２３７７５２５位の１塩基変異部位を含む領域２を増幅した。領域１の増幅用プライマーとして、配列番号１７および配列番号３４にそれぞれ記載された塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組合わせ（表１０）を用いた。領域２の増幅用プライマーとして、配列番号２３および配列番号４０にそれぞれ記載された塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組合わせ（表１０）を用いた。ＰＣＲは、各鋳型０．５〜１μｌを使用し、ＴｈｅｒｍｏＳｔａｒｔ、バッファー、およびデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）（いずれもＡＢ  ｇｅｎｅ社製）を用いて２０μｌの反応系で行った。ネガティブコントロールには鋳型を加えず、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件を以下に示す。
【０１８６】
【表１０】
2007097569.tif 000014
【０１８７】
領域１増幅のためのＰＣＲ反応条件
１）  ９４℃        ４分間
２）  ９４℃      ３０秒間
３）  ５５℃      ３０秒間
４）  ７２℃        ２分間
２）から４）の工程は４０サイクル行なった。
５）  ７２℃      ４分間
【０１８８】
領域２増幅のためのＰＣＲ反応条件
１）  ９４℃        ４分間
２）  ９４℃      ３０秒間
３）  ６５℃      ３０秒間
４）  ７２℃        ２分間
２）から４）の工程は４５サイクル行なった。
５）  ７２℃      ４分間
【０１８９】
ＰＣＲ増幅産物はＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いたゲルろ過法により精製し、その遺伝子型のタイピングをＳＮｕＰｅ法により行った。ＳＮｕＰｅ反応は、各１塩基変異部位の直前に設計したＳＮｕＰｅプライマー、鋳型である精製ＰＣＲ増幅産物およびメガベース  ＳＮｕＰｅ遺伝子タイピングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、キットの添付資料に記載の方法に従って実施した。第１５２３７９３５０位、第１５２３７７５０７位および第１５２３７７５２５の１塩基変異部位のタイピング用ＳＮｕＰｅプライマーとしてそれぞれ配列番号４１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチド、配列番号４２に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列番号５０に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドを用いた（表１１）。ＳＮｕＰｅ反応の産物は、セファデックス  Ｇ５０ファイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いたゲルろ過法により精製した。タイピング解析は、９６ウェルプレートフォーマットのキャピラリーシークエンサー  メガベース１０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて行い、データ解析ソフトであるＳＮＰプロファイラーを用いてタイピングを行った。
【０１９０】
【表１１】
2007097569.tif 000015
【０１９１】
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の１塩基変異部位についてのみ遺伝子型のタイピングを行う場合には、ダイレクトシークエンシングまたはＳＮｕＰｅ法を用いた。
【０１９２】
ダイレクトシークエンシングによるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型のタイピングは次のように実施した。まず、ゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号５１および配列番号５２に記載の各塩基配列で表される２つのポリヌクレオチド（表１２）をＰＣＲプライマーとして用いてＰＣＲを行い、第１５２３７７５２５位の１塩基変異部位を含む領域（１８１６ｂｐ）を増幅した。ＰＣＲは、各鋳型２μｌを使用し、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いて２０μｌの反応系で、以下の反応条件で行った。
【０１９３】
【表１２】
2007097569.tif 000016
【０１９４】
ＰＣＲ反応条件
１）  ９４℃        ４分間
２）  ９４℃      ３０秒間
３）  ５６℃      ３０秒間
４）  ７２℃        ２分間
２）から４）の工程は４０サイクル行なった。
５）  ７２℃      ４分間
【０１９５】
ＰＣＲ増幅産物はセファデックス  Ｇ５０ファイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて精製し、シークエンス反応の鋳型として用いた。シークエンス反応は、配列番号５３および配列番号５４に記載の各塩基配列で表される２つのポリヌクレオチド（表１３）をプライマーとして用い、ダイナミックＥＴダイターミネーターキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて行った。シークエンス反応の産物は、セファデックス  Ｇ５０ファイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて精製した。シークエンサーは、メガベース１０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた。
【０１９６】
【表１３】
2007097569.tif 000017
【０１９７】
得られた配列データを用いて、フレッド／フラップ／ポリフレッド  ソフトウエアにより各塩基の精度（クオリティー値）の算出、アセンブルおよび変異の検出を行った。参照塩基配列および塩基位置として、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列および塩基位置を使用した。
【０１９８】
ＳＮｕＰｅ法によるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型のタイピングは次のように実施した。まず、ゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２３および配列番号４０に記載の各塩基配列で表される２つのポリヌクレオチド（表１０）をＰＣＲプライマーとして用いてＰＣＲを行い、第１５２３７７５２５位の１塩基変異部位を含む領域（６９９ｂｐ）を増幅した。ＰＣＲは、各鋳型２ μｌを使用し、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いて２０μｌの反応系で、以下の反応条件で行った。
【０１９９】
ＰＣＲ反応条件
１）  ９４℃        ４分間
２）  ９４℃      ３０秒間
３）  ５４℃      ３０秒間
４）  ７２℃      ４５秒間
２）から４）の工程は４０サイクル行なった。
５）  ７２℃      ４分間
【０２００】
ＰＣＲ増幅産物はＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いたゲルろ過法により精製し、その遺伝子型のタイピングをＳＮｕＰｅ法により行った。ＳＮｕＰｅ反応は、ＳＮｕＰｅプライマーとして配列番号５５に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（表１４）を用いる他は、上記ＳＮｕＰｅ反応で行った方法と同様の方法で実施した。ＳＮｕＰｅ反応の産物は、セファデックス  Ｇ５０ファイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いたゲルろ過法により精製した。タイピング解析は、上記同様に実施した。
【０２０１】
【表１４】
2007097569.tif 000018
【０２０２】
血小板反応性表現型は多血小板血漿（ＰＲＰ）を用いて光学凝集測定法により評価した。凝集は２または５μｍｏｌ／Ｌ  ＡＤＰで誘導した。分析したパラメータは、最大凝集（％）および凝集曲線の０から６分までの領域の面積（ＡＵＣ）である。
【０２０３】
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型である個体由来の血小板と、このような遺伝子型を有さない個体由来の血小板と比較した結果、前者由来の血小板は後者由来の血小板に比べて、２μｍｏｌ／Ｌ  ＡＤＰで誘導された最大凝集およびＡＵＣが統計上有意に低かった（図１）。しかし、５μｍｏｌ／Ｌ  ＡＤＰで誘導された最大凝集およびＡＵＣは、前者由来の血小板と後者由来の血小板との間で、ほとんど差異は認められなかった（図１）。図１中、前者を「Ｈ１  ｈｏｍｏ  ＆  １５２３７７５２５  Ｃ／Ｃ」と表記し、後者を「Ｏｔｈｅｒｓ」と表記する。
【０２０４】
一方、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃである個体由来の血小板と、該１塩基変異部位の遺伝子型がＣ／Ｃ以外の遺伝子型である個体由来の血小板とを、該遺伝子のハプロタイプに拘らずに比較した結果、２または５μｍｏｌ／Ｌ  ＡＤＰで誘導された最大凝集およびＡＵＣは、前者由来の血小板は後者由来の血小板に比べて統計学上有意に低かった（図２）。図２中、前者を「１５２３７７５２５  Ｃ／Ｃ」と表記し、後者を「１５２３７７５２５  Ｔ  ｃａｒｒｉｅｒｓ」と表記する。
【０２０５】
これに対して、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体である個体由来の血小板と、ハプロタイプがＨ２ハプロタイプであるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子を有する個体由来の血小板とを、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型に拘らずに比較した結果、ＡＤＰの濃度に拘らず、最大凝集およびＡＵＣにほとんど差異は認められなかった（図３）。図２中、前者の遺伝子型を「Ｈ１  ｈｏｍｏ」と表記し、後者の遺伝子型を「Ｈ２  ｃａｒｒｉｅｒｓ」と表記する。
【実施例３】
【０２０６】
（Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型に関するケース−コントロール研究）
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型のタイピングを、ＣＡＤ患者および健常人それぞれから供与されたゲノムＤＮＡについて行い、それにより該遺伝子の遺伝子型と疾患との関連性を解析した。
【０２０７】
遺伝子型のタイピングは、ＣＡＤ患者１９４例（ＣＡＤ群）および健常人３２５例（コントロール群）について実施した。遺伝子型のタイピングは、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のＨ１ハプロタイプとＨ２ハプロタイプとを判別し得る１塩基変異部位（第１５２３７９３５０位および第１５２３７７５０７位）、および該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位について、実施例２に記載した方法と同様の方法で実施した。
【０２０８】
コントロール群とＣＡＤ群との間で、年齢構成および性別構成において差異が生じないようにするため、ＣＡＤ群のデータから女性に関するデータ、１０代のＣＡＤ患者に関するデータ、および５７歳以上の患者に関するデータを除外した。さらに、心臓カテーテルの正常例に関するデータも除外した。また、コントロール群のデータから４２歳以下の患者に関するデータを除外した。その結果、ケース−コントロール研究に用いたコントロール群およびＣＡＤ群の平均年齢はそれぞれ４８．６歳および４８．２歳であった。
【０２０９】
Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型と疾患との関連性の解析は、まず単変量解析を行い、単変量解析で有意差が検出された場合に、さらに多変量解析を実施した。単変量解析は遺伝子の１塩基多型を独立変数に用いて行った。多変量解析は、遺伝子の１塩基多型、高脂血症、高血圧、糖尿病の有無、喫煙の既往、および体格指数（ＢＭＩ値）といった因子を独立変数に用いて行った。単変量解析および多変量解析の両解析で得られたオッズレシオ（ＯＲ）に有意差が検出された場合に、本遺伝子の遺伝子型と疾患との間に関連性があると判定できる。有意差はＰ値により判定し、Ｐ＜０．０５であるとき、有意差があると判定した。また、両解析において、９５％  信頼区間（９５％  ＣＩ）を確定し、単変量解析および多変量解析の結果の信頼性を判定した。
【０２１０】
表１５に示すように、ＣＡＤ群およびコントロール群の間で、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型である例とこのような遺伝子型を有さない例について解析した結果、単変量解析におけるＯＲ値は１．９であり、このとき９５％  ＣＩ値は１．２−３．１であった。多変量解析におけるＯＲ値は２．０であり、このとき９５％  ＣＩ値は１．１−３．３であった。両解析における結果は、いずれも有意差が検出された。また、両解析において９５％  ＣＩ値がいずれも１以上であることから、両解析で得られたＯＲ値は信頼性が高いと判定した。すなわち、ＣＡＤ群では、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型である頻度が有意に高いことが信頼性をもって実証された。
【０２１１】
【表１５】
2007097569.tif 000019
【０２１２】
一方、ＣＡＤ群およびコントロール群の間で、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型である例と、該１塩基変異部位の遺伝子型がＣ／Ｃ以外の遺伝子型（Ｃ／ＴまたはＴ／Ｔ）である例について、該遺伝子のハプロタイプに拘らずに解析を行った結果、単変量解析におけるＯＲ値は１．４であり、このとき９５％  ＣＩ値は０．８−２．２であった（表１６）。多変量解析におけるＯＲ値は１．２であり、このとき９５％  ＣＩ値は０．７−２．２であった。両解析における結果は、いずれも有意差が検出されなかった。また、両解析における９５％  ＣＩ値がいずれも１を挟む値であることから、両解析で得られたＯＲ値は信頼性が低いと判定した（表１６）。
【０２１３】
【表１６】
2007097569.tif 000020
【０２１４】
また、ＣＡＤ群およびコントロール群の間で、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体である例と、Ｈ２ハプロタイプのＰ２Ｙ１２受容体遺伝子を有する例（Ｈ１／Ｈ２ヘテロ接合体またはＨ２／Ｈ２ホモ接合体）について、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型に拘らずに解析を行った結果、単変量解析におけるＯＲ値は１．６であり、このとき９５％  ＣＩ値は１．０−２．８であった（表１７）。多変量解析におけるＯＲ値は１．７であり、このとき９５％  ＣＩ値は０．９−３．１であった。両解析における結果は、いずれも有意差が検出されなかった。また、両解析における９５％  ＣＩ値がいずれも１を挟む値であることから、両解析で得られたＯＲ値は信頼性が低いと判定した（表１７）。
【０２１５】
【表１７】
2007097569.tif 000021
【０２１６】
上記結果から、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることと、ＣＡＤとの間には関連性があることが明らかになった。
【実施例４】
【０２１７】
（Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型とＣＡＤ重症度との関連性解析）
ＣＡＤ患者より供与されたゲノムＤＮＡを用い、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型であることとＣＡＤの重症度との関連性を解析した。
【０２１８】
ＣＡＤ患者より供与されたゲノムＤＮＡについての遺伝子型のタイピングのデータは実施例３で集積したデータを用いた。ＣＡＤの重症度は冠状動脈分枝数により分類した。すなわち、冠状動分枝数の数が多いほど重症と判断し、冠状動分枝数が３本である場合を重症度１、２本である場合を重症度２、１本である場合を重症度３として分類した。
【０２１９】
その結果、表１８に示すように、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型である例では、重症度１の例数が、このような遺伝子型を有さない例とを比較して、著しく高いことが判明した。
【０２２０】
【表１８】
2007097569.tif 000022
【０２２１】
この結果から、Ｐ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型である場合、ＣＡＤの症状が重症になる可能性があると考える。
【産業上の利用可能性】
【０２２２】
本発明によれば、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の遺伝子型を同定することにより、冠状動脈疾患を引き起こす可能性を有する遺伝子型を検出することができる。その結果、冠状動脈疾患の罹患危険率の判定および早期診断の実施が可能になる。本発明は、冠状動脈疾患の診断並びに当該疾患の防止および治療のための検査に有用であり、医薬分野において多大に寄与するものである。
【図面の簡単な説明】
【０２２３】
【図１】ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体であり、かつ、該遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型である（図中、Ｈ１  ｈｏｍｏ  ＆  １５２３７７５２５  Ｃ／Ｃと表記する）個体由来の血小板と、このような遺伝子型を有さない個体（図中、Ｏｔｈｅｒｓと表記する）由来の血小板について、ＡＤＰで誘導された最大凝集およびＡＵＣを比較した結果を示す図である。前者由来の血小板は後者由来の血小板に比べて、２μｍｏｌ／Ｌ  ＡＤＰで誘導された最大凝集およびＡＵＣが統計上有意に低かった。しかし、５μｍｏｌ／Ｌ  ＡＤＰで誘導された最大凝集およびＡＵＣは、前者由来の血小板と後者由来の血小板との間で、ほとんど差異は認められなかった。本図において、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の塩基の位置は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列における位置として示した。（実施例２）
【図２】ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のゲノム塩基配列の第１５２３７７５２５位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型である（図中、１５２３７７５２５  Ｃ／Ｃと表記する）個体由来の血小板と、該１塩基変異部位の遺伝子型がＣ／Ｃで表される遺伝子型以外の遺伝子型である（図中、１５２３７７５２５  Ｔ  ｃａｒｒｉｅｒｓと表記する）個体由来の血小板について、ＡＤＰで誘導された最大凝集およびＡＵＣを比較した結果を示す図である。２または５μｍｏｌ／Ｌ  ＡＤＰで誘導された最大凝集およびＡＵＣは、前者由来の血小板は後者由来の血小板に比べて統計学上有意に低かった。本図において、ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子の塩基の位置は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００３．８に開示されている塩基配列における位置として示した。（実施例２）
【図３】ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子のハプロタイプがＨ１ハプロタイプのホモ接合体である（図中、Ｈ１  ｈｏｍｏと表記する）個体由来の血小板と、ハプロタイプがＨ２ハプロタイプであるＰ２Ｙ１２受容体遺伝子を有する（図中、Ｈ２  ｃａｒｒｉｅｒｓと表記する）個体由来の血小板について、ＡＤＰで誘導された最大凝集およびＡＵＣを比較した結果を示す図である。ＡＤＰの濃度に拘らず、最大凝集およびＡＵＣにほとんど差異は認められなかった。（実施例２）
【配列表フリーテキスト】
【０２２４】
配列番号１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号７：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号８：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号９：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１０：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１７：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１８：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１９：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２０：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２７：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２８：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号２９：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３０：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３７：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３８：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号３９：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４０：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４７：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４８：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４９：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号５０：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号５１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号５２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号５３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号５４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号５５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。
配列番号５６：ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の１塩基変異の位置を特定するための配列情報。
配列番号５７：ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の１塩基変異の位置を特定するための配列情報。
配列番号５８：ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の１塩基変異の位置を特定するための配列情報。
配列番号５９：ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の１塩基変異の位置を特定するための配列情報。
配列番号６０：ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の１塩基変異の位置を特定するための配列情報。
配列番号６０：（３０）：（３０）ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴであり得る。
配列番号６０：（６８）：（６８）ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴであり得る。
配列番号６１：ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の１塩基変異の位置を特定するための配列情報。
配列番号６１：（１）：（６）ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴであり得る。
配列番号６２：ヒトＰ２Ｙ１２受容体遺伝子内の１塩基変異の位置を特定するための配列情報。
【図１】
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【図２】
2007097569.tif 000024
【図３】
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【配列表】
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