(57)【要約】【課題】生体組織の再生に好適な治療材料を提供する。特に、神経細胞に適用することによって良好な神経細胞増殖促進作用および神経突起の伸長作用を有し、損傷、欠損などの生じた部位の神経回路を再生することのできる生体組織再生用材料を提供する。【解決手段】神経細胞２と、神経細胞２を培養する細胞培養基材３とを備えた生体組織再生用材料１であって、細胞培養基材３の培養表面には、神経細胞２よりも直径の小さい複数の凸部３１を有することを特徴とする生体組織再生用材料１である。【選択図】図１
2007229348.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経細胞と、前記神経細胞を培養する細胞培養基材とを備えた生体組織再生用材料であって、
前記細胞培養基材の培養表面は、前記神経細胞よりも直径の小さい複数の凸部を有することを特徴とする生体組織再生用材料。
【請求項２】
前記神経細胞は、神経前駆細胞と神経幹細胞の何れかを含むことを特徴とする請求項１に記載の生体組織再生用材料。
【請求項３】
前記神経細胞は、前記細胞培養基材の前記培養表面に接着していることを特徴とする請求項１に記載の生体組織再生用材料。
【請求項４】
前記細胞培養基材は、生分解性物質を含んでなることを特徴とする請求項１に記載の生体組織再生用材料。
【請求項５】
前記細胞培養基材は、多糖類、多糖類の塩、架橋多糖類、架橋多糖類の塩、酸性多糖類エステル、蛋白質、ポリペプチド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ（ε−カプロラクトン）、グリコール酸／乳酸共重合体、グリコール／カーボネート共重合体、ポリジオキサノンおよびシアノアクリレート系共重合体から選ばれる１種の生分解性物質、または、これらのブレンドを含むことを特徴とする請求項１に記載の神経再生用材料。
【請求項６】
前記複数の凸部は、前記神経細胞よりも相当直径の小さい複数の凸部からなり、
前記複数の凸部は、前記細胞培養基材と一体化していることを特徴とする請求項１に記載の生体組織再生用材料。
【請求項７】
前記複数の凸部は、前記神経細胞よりも直径の小さい複数の凸部からなり、
前記凸部の相当直径を前記神経細胞の直径よりも小さく規定することによって、前記神経細胞と前記細胞培養基材との密着性および細胞体形状の制御を行うことを特徴とする請求項１に記載の生体組織再生用材料。
【請求項８】
前記複数の凸部は、前記神経細胞よりも直径の小さい複数の凸部からなり、
前記凸部の相当直径および前記凸部間の間隔を前記神経細胞から伸長する神経突起の直径よりも小さく規定することによって、前記神経細胞の前記神経突起の太さを太く、かつ前記神経突起の分岐数を多くする制御を行うことを特徴とする請求項１に記載の生体組織再生用材料。
【請求項９】
前記複数の凸部は、前記神経細胞よりも直径の小さい複数の凸部からなり、
前記凸部間の間隔が前記神経細胞から伸長する神経突起の直径よりも大きく規定することによって、前記神経細胞から伸長する前記神経突起の伸長方向を制御することを特徴とする請求項１に記載の生体組織再生用材料。
【請求項１０】
前記複数の凸部は、前記神経細胞よりも直径の小さい複数の凸部からなり、
前記凸部間の間隔を前記神経細胞の直径の０．６倍から２倍までの範囲に規定することによって、前記神経細胞の成長を抑制制御することを特徴とする請求項１に記載の生体組織再生用材料。
【請求項１１】
前記細胞培養基材が、前記神経細胞の培養表面に複数の凸部が形成されてなる前記神経細胞の成長形態を制御する培養制御領域を有しており、
前記培養制御領域は、
（ａ）  前記凸部の相当直径および前記凸部間の間隔が、培養する前記神経細胞の直径、および前記神経細胞から伸長する神経突起の直径よりも小さい複数の凸部により形成された少なくとも１つの領域、
（ｂ）  前記凸部の相当直径および前記凸部間の間隔が培養する前記神経細胞の直径よりも小さく、かつ、前記凸部間の間隔が前記神経細胞から伸長する神経突起の直径よりも大きい複数の凸部により形成された少なくとも１つの領域、
（ｃ）  前記培養制御領域における前記凸部の相当直径が前記神経細胞の直径よりも小さく、前記凸部間の間隔が前記神経細胞の直径の０．６倍から２倍までの範囲である複数の凸部により形成された少なくとも１つの領域
より成る群から選択された少なくとも１つの領域を含むことを特徴とする請求項１に記載の生体組織再生用材料。
【請求項１２】
前記細胞培養基材は、単層シート状であって、前記凸部を含む厚さが０．０１ｍｍから３ｍｍであることを特徴とする請求項１に記載の生体組織再生用材料。
【請求項１３】
前記細胞培養基材は、単層シートの積層体であることを特徴とする請求項１に記載の生体組織再生用材料。
【請求項１４】
前記細胞培養基材は、単層シートの積層体であって、少なくとも１組の隣り合う前記単層シートの間に前記神経細胞を保持することを特徴とする請求項１に記載の生体組織再生用材料。
【請求項１５】
前記細胞培養基材は、直径０．２ｍｍから直径１０ｍｍの筒状であることを特徴とする請求項１に記載の生体組織再生用材料。
【請求項１６】
前記細胞培養基材は、筒状であって、内面に前記神経細胞を保持することを特徴とする請求項１に記載の生体組織再生用材料。
【請求項１７】
前記細胞培養基材の培養表面に前記神経細胞の接着を促進する表面処理がなされていることを特徴とする請求項１に記載の生体組織再生用材料。
【請求項１８】
前記細胞培養基材の表面または内部の少なくとも一部に前記神経細胞の成長形態を制御する化学物質を含むことを特徴とする請求項１に記載の生体組織再生用材料。
【請求項１９】
神経細胞よりも直径の小さい複数の凸部を表面に有する細胞培養基材上で、前記神経細胞を培養して一体化することを特徴とする生体組織再生用材料の製造方法。
【請求項２０】
神経細胞よりも直径の小さい複数の凸部を培養表面に有する細胞培養基材を形成する工程と、前記神経細胞を前記細胞培養基材の培養表面に配する工程とを含むことを特徴とする生体組織再生用材料の製造方法。
【請求項２１】
前記神経細胞を、前記細胞培養基材の培養表面で１時間以上、３０日以下培養する工程を含むことを特徴とする請求項２０に記載の生体組織再生用材料の製造方法。
【請求項２２】
前記細胞培養基材を形成する工程において、前記複数の凸部の形状に対応する金型を用いることを特徴とする請求項２０に記載の生体組織再生用材料。
【請求項２３】
請求項１ないし請求項１８のいずれか一項に記載の生体組織再生用材料を、神経疾患を有する動物に移植する工程を含むことを特徴とする神経疾患を有する動物の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体組織の再生に用いられる生体組織再生用材料に係り、特に、神経細胞を主とする細胞と、細胞を培養する細胞培養基材とを含んで構成される生体組織再生用材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、再生医療や移植医療等、医療分野において、細胞培養の技術が適用される機会が増加している。例えば、現在、細胞培養の技術は皮膚の移植の際に適用されている。さらに、技術の進歩にともなって、その適用範囲は、角膜、歯、骨、さらには臓器等複雑な器官へと広がりつつある。
【０００３】
特に、神経細胞に対しては、欠損した神経の治療や神経の自己組織性を利用した神経回路の形成等を目的として広く研究が進められている。このような神経回路の再生はパーキンソン病、アルツハイマー病の治療に有効とされている。
【０００４】
そこで、神経回路の再生に用いられる材料として、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）のメッシュ状チューブにコラーゲンを塗布した材料が非特許文献１に開示されている。非特許文献１に開示される材料によれば、チューブを神経突起伸長のガイドとして特に末梢神経の再生を促進することができる。
【０００５】
また、生体吸収性ポリマーおよび神経幹細胞よりなる神経再生用材料、それを生体吸収性材料からなるチューブに充填した神経再生材が特許文献１に開示されている。特許文献１に開示される神経再生材によればチューブによって神経の欠損部を繋ぎ、神経の機能を回復することができる。
【特許文献１】特開２００２−７８７９２号公報（実施例１，２）
【非特許文献１】Ｊ．Ａrtif．Ｏrgans，２７，４９０−４９４（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、非特許文献１に記載の神経再生材は、治療に充分な神経再生効果を示さない。
また、特許文献１に記載のチューブによれば、一次元的に神経を繋ぐことはできるものの、中枢神経および末梢神経の末端部における複雑な神経回路を再生するにはチューブを用いて複雑な回路を再現する必要があり、そのチューブを繋ぎ合わせるには、困難な操作が要求される。
【０００７】
そこで、本発明の目的は、生体組織の再生に好適な治療材料を提供することである。特に、神経細胞に適用することによって良好な神経細胞増殖促進作用および神経突起の伸長作用を有し、損傷、欠損などの生じた部位の神経回路を再生することのできる生体組織再生用材料を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するために、本発明の生体組織再生用材料は、神経細胞と、前記神経細胞を培養する細胞培養基材とを備えた生体組織再生用材料であって、前記細胞培養基材の培養表面には、前記神経細胞よりも直径の小さい複数の凸部を有することを特徴とする生体組織再生用材料である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、生体組織の再生に好適な治療材料を提供することができる。特に、神経細胞に適用することによって良好な神経細胞増殖促進作用および神経突起の伸長作用を有し、損傷、欠損などの生じた部位の神経回路を再生することのできる生体組織再生用材料を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を実施するための最良の形態（以下「実施形態」という）について、適宜図面を参照しながら詳細に説明する。なお、参照する図面において、同一の機能を有する構成要素に対しては同一の符号を付すことによって説明をしているが、形状、大きさ等においては必ずしも同一であるとは限らない。
【００１１】
本発明は、生体組織再生用材料の構成要素である細胞培養基材に、培養用培地と神経細胞とを配して、前記神経細胞を対応する培養条件下で培養するに当たって、前記細胞培養基材の培養表面に、所定の形状と間隔を有する複数の凸部が設けられた細胞培養基材を用いると、神経細胞の成長形態を制御して培養を行うことができるという知見に基づいて創作されたものである。
【００１２】
ここで、「神経細胞の成長形態」とは、細胞培養基材を用いて神経細胞を培養するに当たって、前記神経細胞が成長する種々の形態を意味するものである。例えば、神経細胞の成長形態としては、神経細胞と細胞培養基材との密着性、細胞体の大きさ、形状（扁平、球状、紡錘状等）、神経突起の太さ、長さ、枝分かれ様式（枝分かれ数、枝分かれ位置）、伸長方向、神経細胞成長の促進、神経細胞成長の抑制（特に、成長停止）等が含まれる。
なお、本実施形態において、「神経突起」は、樹状突起および軸索を含む。
【００１３】
<<生体組織再生用材料の構成>>
図１は、本実施形態の生体組織再生用材料の概略構成を示す斜視図である。図１に示すように、生体組織再生用材料１は、神経細胞２と、神経細胞２が培養される培養表面に複数の凸部３１を有する細胞培養基材３とを主に含んで構成される。神経細胞２は細胞体２１と神経突起２２とを含む。
なお、図１において、培養表面は、単層シート状に形成された細胞培養基材３の上面側を示しているが、後記するように、細胞培養基材３の形状および細胞培養基材３における培養表面の位置はこれに限定されるものではない。
【００１４】
[神経細胞２]
神経細胞２は、細胞培養基材３で培養できるものであれば、特に限定されるものではなく、従来公知の神経細胞２から適宜選択できる。例えば、ヒトを対象とした再生治療に適用する場合には、神経細胞２は、主にヒト由来の神経細胞２であって、患者の患部に適応する組織由来の神経細胞２が選択される。また、神経細胞２は、例えば、生体組織から単離したものであっても、幹細胞から神経細胞２に分化誘導したものであっても、さらには、これらを継代培養後に使用するものであってもよい。また、神経細胞２の分裂能の有無は問わず、本発明の神経細胞２は、例えば、胎児由来であっても、成人由来であってもよい。
【００１５】
とりわけ、再生治療の対象となる個体自身の神経細胞２（特に、神経幹細胞が好ましい）を用いれば、移植の際に免疫抑制処理を施す必要が無いために最適である。個体自身から対応する神経細胞２を得ることができない場合、または緊急を要する場合には、個体と同種のドナー由来の神経細胞２（特に、神経幹細胞が好ましい）を用いることができる。この場合は拒絶反応が小さくなるようなドナーの選択と、移植をする際の免疫抑制が必要となる。そして、これらの神経細胞２は細胞培養基材３上で培養し、接着した状態で移植治療に供される。
換言すると、入手可能な神経細胞２から目的に応じて好適なものを適宜選択して、本実施形態に適用可能である。
【００１６】
[細胞培養基材３]
細胞培養基材３は、神経細胞２を培養するための基材であって、神経細胞２が培養される培養表面には所定の形状と間隔を有する複数の凸部３１が形成されている。そして、この複数の凸部３１は、細胞培養基材３で神経細胞２が培養される際に、神経細胞２の成長形態を制御するものである。
また、神経細胞２は、細胞体２１と神経突起２２とを含む。神経細胞２と細胞培養基材３とは、一体化されている状態であり、単に神経細胞２が細胞培養基材３に載置されているだけでもよいが、好ましくは、細胞培養基材３に神経細胞２が接着されている状態である。また、細胞培養基材３に一体化される神経細胞２の数は、特に制限されず、少なくとも１個以上であればよい。
【００１７】
本実施形態に適用可能な細胞培養基材３の代表例として、例えば、本願出願人が先に出願した特開２００４−１７０９３５号公報に記載の機能性基板が挙げられる。すなわち、特開２００４−１７０９３５号公報に記載の機能性基板は、有機ポリマー製の第１の基体と、該基体から伸びた有機ポリマー製の柱状微小突起群を有し、該柱状微小突起群の相当直径が１０ｎｍから５００μｍ、高さが５０ｎｍから５０００μｍであって、該柱状微小突起群の高さ(Ｈ)に対する相当直径(Ｄ）の比（Ｈ／Ｄ）が４以上であることを特徴とする柱状微小突起群を備えた機能性基板である。
本実施形態の細胞培養基材３は、このような柱状微小突起群（本実施形態において、複数の凸部３１に対応する）を備えた機能性基板を、神経細胞２の成長形態を制御する目的で、所望する成長形態に応じて凸部３１の形状および凸部３１間の間隔を規定することによって、実現することができる。なお、アスペクト比（Ｈ／Ｄ）は特に限定されるものではなく、神経細胞や所望する成長形態に応じて適宜規定すればよい。
【００１８】
細胞培養基材３の主成分は、少なくとも所定の形状に加工できる程度の剛性が要求される。そのうえで、加工、保存、患者への移植中や移植後等の、製造環境および使用環境を考慮して適宜適切な材料が選択される。
【００１９】
特に、細胞培養基材３は、その使用時に患者の体内に神経細胞２と一体に埋入されることから、生物学的安全性が高い材料により構成される。生物学的安全性に関して、細胞培養基材３は、神経組織の再生とともに体内で分解吸収されて消失する生分解性物質（水解性物質を含む）によって構成されることがより好ましい。
【００２０】
例えば、細胞培養基材３の主成分は、アルギン酸、架橋アルギン酸、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、架橋ヒアルロン酸、セルロース、デンプン、架橋デンプンおよびこれらの誘導体等の多糖類；ゼラチン、架橋ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、フィブリン、アルブミン等の蛋白質；ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリリジン等のポリペプチド；ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ（ε−カプロラクトン）、グリコール酸／乳酸共重合体、グリコール酸／カーボネート共重合体、ポリジオキサノン、シアノアクリレート系重合体等の合成高分子材料；水酸アパタイト、リン酸三カルシウム、炭酸カルシウム等の無機材料等を挙げることができる。なかでも、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ（ε−カプロラクトン）、グリコール酸／乳酸共重合体等の合成高分子材料を主成分とする細胞培養基材３は、剛性、安定性、柔軟性、透明性、耐熱性、耐湿熱性等の点で優れているため、好適である。
また、細胞培養基材３に所望の物性、例えば、剛性、安定性、柔軟性、透明性、耐熱性、耐湿熱性等や生分解時間（体内に移植された際に分解されるまでの時間）を得るために、複数の生分解性物質を所定の比率でブレンドしてもよい。
【００２１】
このような細胞培養基材３は、移植する目的の部位に応じて適宜決定することも可能である。例えば、脳等の生命に重大な影響を与える部位には生分解性の材料を選択し、そして比較的生命に重大な影響を与えない部位には、シリコーンに代表される長期的に生体に悪影響や強い刺激も与えない生体適合材料を選択することも考慮される。
【００２２】
さらに、細胞培養基材３は、前記した主成分に加えて、神経細胞に対する誘導物質や抑制物質等を副成分として含む構成としてもよい。このような構成とすることで、細胞培養基材３の主成分として生分解性物質を選択した場合には、細胞培養基材３の生分解にともなって誘導物質や抑制物質等の副成分を放出させることができる。そして、この放出のタイミングは、細胞培養基材３内に副成分の濃度分布を形成することによって制御することができる。
【００２３】
誘導物質や抑制物質等の副成分を細胞培養基材３に含ませる方法は特に限定しないが、例えば、前記副成分を早い時期に放出させたい場合には、一旦、細胞培養基材３全体を主成分のみで形成し、その表面を副成分、または、主成分と副成分との混合物により被覆することで実現できる。その反対に、例えば、前記副成分を遅い時期に放出させたい場合には、一旦、細胞培養基材３全体を主成分と副成分との混合物で形成し、その表面を主成分のみで被覆することで実現できる。
【００２４】
図２は、細胞培養基材３の構成を示す斜視図であって、(ａ)は全体図、（ｂ）は(ａ)で示したＡ領域の部分拡大図である。図２(ａ)に示すように、細胞培養基材３は、基材ベース３２と、この基材ベース３２と一体的に形成される複数の凸部３１とを含んで構成される。図２においては、基材ベース３２は、平板状に形成されているが、所望する細胞培養基材３の形状に応じて基材ベース３２の形状も変わりうる。
【００２５】
図２（ｂ）に示すように、凸部３１は、基材ベース３２の上面３２Ａに、基材ベース３２と一体的に複数形成されて、後記する制御領域（例えば、後記する実施形態例１〜３を参照）を構成する。そして、凸部３１は、その最上面３１Ａにおいて所定の相当直径ｒを有し、所定の間隔ｇで配列している。
【００２６】
凸部３１の配列の様式は、所定の間隔ｇを満たす範囲において、様々に規定することができる。例えば、複数の凸部３１の配列の様式は、同一の制御領域における効果の均一性を保持するために、２次元正方格子状や千鳥格子状であることが好ましい。
【００２７】
凸部３１の最上面３１Ａの形状は、必ずしも円形である必要はない。従って、本実施形態においては、最上面３１Ａの大きさを規定する場合に、円形のみを想定した「直径」等の表現は用いず、「相当直径」として記載する。
ここで、「相当直径」とは、凸部３１の最上面３１Ａの直径または直径に相当する長さであって、最上面３１Ａの形状が円形の場合にはその直径、矩形である場合にはその一辺の長さ、また、そのいずれにも該当しない場合には、例えば、円相当径を用いることができる。円相当径は、必ずしも円形ではない最上面３１Ａの形状を、円形とみなしてその直径を規定するものである。例えば、円相当径として、最上面３１Ａの面積と同じ面積を持つ円の直径とみなす面積円相当径、最上面３１Ａの周長と同じ長さの円の直径とみなす周長円相当径、最上面３１Ａの形状に外接する円の直径とみなす外接円相当径、最上面３１Ａの形状に内接する円の直径とみなす内接円相当径等が挙げられ、最上面３１Ａの形状に応じて適宜選択することができる。
【００２８】
凸部３１の相当直径ｒは、神経細胞２との接触面積を減らすために神経細胞２の直径（細胞体２１の直径）よりも小さくすることが好ましい。このような構成とすることにより、神経細胞２が凸部３１の最上面３１Ａ上に載置される場合には、神経細胞２の底面と培地との接触面積が増加し、神経細胞２と培地間の栄養物質や老廃物との交換を促進することができるため、神経細胞２の成長形態の制御に所定の効果を奏する。
【００２９】
本実施形態において、凸部３１間の間隔ｇは、凸部３１の最上面３１Ａ外周から当該凸部３１に隣接する凸部３１の最上面３１Ａ外周までの最短距離として規定する。
例えば、図２に示すように、凸部３１の配列の様式が２次元正方格子状の場合には、凸部３１間の間隔はｇの長さである。
【００３０】
凸部３１の高さは、凸部３１の下方、すなわち、基材ベース３２の上面３２Ａに細胞体２１や神経突起２２が入り込み可能に設定することが好ましい。例えば、凸部３１の高さは、通常の神経細胞２に対しては、０．１μｍ程度あれば充分にその効果を得ることは可能であるが、０．１μｍ以上の高さに形成することによって、凸部３１の効果をより明確にすることができる。
なお、凸部の高さ方向の形状は、特に限定されるものではなく、例えば、柱状、錐状、逆錐状等であってもよく、また、その外周部の形状や修飾等は、特に限定されるものではない。
【００３１】
また、基材ベース３２の底面から凸部３１の最上面３１Ａの高さまでの細胞培養基材３の厚さｌは、０．０１〜３ｍｍの範囲内であることが好ましく、外科手術等における使用のしやすさ等の点から、０．１〜１ｍｍの範囲内であるのがより好ましい。
【００３２】
凸部３１や基材ベース３２の上面３２Ａを含む細胞培養基材３の培養表面は、目的に応じて、様々な処理を施すことができる。
例えば、神経細胞２の接着性の制御や表面保護のためのタンパク質等の生体高分子、金属薄膜等による表面被覆、プラズマ処理やＵＶ照射、撥水処理剤、加熱等による親水・撥水化や、ヒドロキシル基、アミノ基、スルホン基、チオール基、カルボキシル基等特定の官能基付加、酸化剤等による表面粗化等から１種類以上の表面処理を施すことができる。特に凸部３１への神経細胞２の接着促進にはポリリジン、アルブミン、コラーゲン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、ビトロネクチン、ラミニン等のタンパク被覆が効果的である。
また、これらの表面修飾は、細胞培養基材３の表面全体に渡って施してもよいし、限定した領域であってもよい。例えば、一部の凸部３１と、その他の凸部３１とに対し、異なる表面修飾を施してもよいし、凸部３１と、それ以外の部位とに対し、異なる表面修飾を施してもよい。また、凸部３１の最上面３１Ａと、当該凸部３１の外周面とに対し、異なる表面修飾を施してもよい。
【００３３】
<<生体組織再生用材料の製造方法>>
次に、生体組織再生用材料１の製造方法を図面を参照して説明する。神経細胞２および細胞培養基材３を主に含んで構成される生体組織再生用材料１の製造方法は、細胞培養基材３の製造方法と、製造された細胞培養基材３に神経細胞２を培養する培養方法とを含んでいる。
【００３４】
[細胞培養基材の製造方法]
まず、生体組織再生用材料１の製造方法における、細胞培養基材３の製造方法を図面を参照して説明する。
図３は、細胞培養基材３の製造方法の一例であるナノインプリント法による製造工程を説明するための図である。
まず、図３（ａ）に示すように、細胞培養基材３の原料である基材原料４と金型５を用意する。基材原料４は、前記した細胞培養基材３の主成分を含む材料であって、適宜副成分が混合されている。金型５の材質は、金属、カーボンやシリコン等の無機物、および樹脂組成物等から、基材原料４の材質や凸部３１の加工精度に応じて適切に選択される。金型５表面への金型凹部６の形成法は、切削加工、光リソグラフィ法、電子線直接描画法、粒子線ビーム加工法、走査プローブ加工法等の微細加工法や微粒子の自己組織化、又はこれらの手法によって形成されたマスタからのナノインプリント法、キャスト法、射出成型法に代表される成型加工法、めっき法等から適切に選択される。
【００３５】
次に、図３（ｂ）に示すように、基材原料４の少なくとも表面を軟化し、金型凹部６が形成された金型５を押し付けることによって、金型凹部６の形状を基材原料４に転写する。
そして、図３（ｃ）に示すように、金型５を引き剥がすことによって、基材ベース３２の培養表面に凸部３１が一体的に形成された細胞培養基材３を得ることができる。
【００３６】
そして、形成された凸部３１を含む細胞培養基材３の表面に対し、必要に応じて、浸漬法、スピンコート法、蒸着法、プラズマ重合法、インクジェット法、スクリーン印刷法のように新たに層を付加する手法や、加熱、光照射、電子線照射、プラズマ処理、浸漬処理等によって、表面修飾を施すこともできる。なお、この表面修飾処理は、凸部３１の形成後に限らず、例えば、形成前の基材原料４または金型凹部６の表面にあらかじめ表面処理を施し、凸部３１の形成と同時に凸部３１を含む細胞培養基材３の表面に修飾処理を施すこととしてもよい。
【００３７】
なお、細胞培養基材３の製造方法は前記したナノインプリント法に限定されず、例えば、切削加工法や印刷法、イオンビーム加工法、電子ビーム加工法、レーザ加工法、光リソグラフィ法、キャスト法、射出成型法による加工法等から、基材原料４の材質や凸部３１の加工精度に応じて適切に選択される。また、キャスト法や射出成型法で製造する場合には、前記した形成法により形成した金型５を用いることができる。
【００３８】
[神経細胞の培養方法]
次に、生体組織再生用材料１の製造方法における神経細胞２の培養方法を図面を参照して説明する。
本実施形態の神経細胞２の培養条件については、選択された神経細胞２に対応する従来公知の培養条件の中から、適宜適切な条件を適用することができる。この選択された神経細胞２に対応する培養条件は、当業者であれば、容易に選択し、選択した培養条件に基づいて培養を実施することができる。
【００３９】
使用する培地は、神経細胞２の培養に適切とされる従来公知の組成のものでよく、例えば、製造メーカにより提供される神経細胞培養用の培地を使用することができる。このとき、培地には、神経細胞２の細胞培養基材３への定着（接着）補助を目的として、１０％程度のウシ胎児血清等の血清を添加してもよい。また、別途誘導物質や抑制物質等を添加してもよい。
ただし、本実施形態においては、細胞培養基材３による神経細胞２の成長形態の制御効果を明確に説明する必要性に鑑み、定着を除く培養中の培地には神経細胞２の成長形態を誘導・抑制する物質を特に含有していない培地で培養を行うことを前提として説明する。
【００４０】
神経細胞２の培養に使用するインキュベータは、一般的な細胞の培養に使用するものと同様のＣＯ2インキュベータを使用することができる。通常、ＣＯ2インキュベータは、ＣＯ2濃度５％、温度３７℃、相対湿度８０％に設定されている。
【００４１】
ここで、神経細胞２の培養手順を図４を参照しながら説明する。図４は、神経細胞２の培養手順を説明するための図であって、細胞培養基材３上で培養されている神経細胞を示す縦断面図である。
まず、細胞培養基材３を培養容器７内部に設置し、神経細胞２を培地８とともに培養容器７内部の細胞培養基材３上に播種する。このとき、細胞培養基材３の培養表面は培地８により浸漬され、培地８中の神経細胞２は、細胞培養基材３上へと沈降する。
そして、培地８および神経細胞２が播種された細胞培養基材３をＣＯ2インキュベータ内で所定期間静置する。
この過程で、神経細胞２は、細胞培養基材３上に定着（接着）し、培養されるが、定着後には、所定の間隔毎に培地８を交換してもよい。培養に使用する培地８は、血清培地、無血清培地、サプリメントやサイトカイン添加培地でも良く、例えば、無血清培地の場合、１日もしくは２日毎に培地８を交換することが好適である。
そして、前記所定期間経過後、神経細胞２の観察や使用を行う。この所定期間は、特に限定されるものではなく、所望する神経細胞２の成長形態に対応して延長または短縮して調節することができるが、特に、１時間以上、３０日以下であることが好ましい。
なお、本実施形態においては、例えば、播種７日後に神経細胞２の成長形態の検証等を行っている。
【００４２】
以上、本実施形態に係る神経細胞２の培養方法を説明したが、細胞培養基材３に形成される凸部３１の相当直径ｒおよび間隔ｇを様々に規定することにより、神経細胞の成長形態を多様に制御することができる。
ここで、凸部３１の相当直径ｒおよび間隔ｇを規定した３種類の細胞培養基材３を使用して、神経細胞２を３通りに制御した場合の３つの実施形態例を、図面を参照して詳細に説明する。
【００４３】
[実施形態例１]
図５は、実施形態例１の神経細胞２の培養方法を説明するための図である。なお、図５において、培養容器７と培地８は省略している。
図５に示すように、実施形態例１で用いる細胞培養基材３は、培養表面に形成された凸部３１の相当直径ｒおよび凸部３１間の間隔ｇが、培養する神経細胞２の直径、および神経細胞２から伸長する神経突起２２の直径よりも小さく形成されている。
このように構成された細胞培養基材３を用いて培養することにより、神経細胞２の細胞体２１は、凸部３１のない平坦な基板上における培養時に比べて平坦化し、直径が大きくなる。また、神経細胞２から伸長する神経突起２２は、凸部３１の頂点に沿って伸長し、直径が大きく、分岐数が多くなる。
【００４４】
ここで、実施形態例１で用いる細胞培養基材３の表面における所定の凸部３１から構成される制御領域を、領域１と記載する。すなわち、図５に示す領域１で神経細胞２を培養することによって、神経細胞２と凸部３１との密着を強め、神経細胞２の神経突起２２の太さを太く、かつ、前記神経突起２２の分岐数を多くする制御を行いつつ、神経細胞２を培養することができる。
【００４５】
[実施形態例２]
図６は、実施形態例２の神経細胞２の培養方法を説明するための図である。なお、図６において、培養容器７と培地８は省略している。
図６に示すように、実施形態例２で用いる細胞培養基材３は、培養表面に形成された凸部３１の相当直径ｒおよび凸部３１間の間隔ｇが培養する神経細胞２の直径よりも小さく、かつ、凸部３１間の間隔ｇが神経細胞２から伸長する神経突起２２の直径よりも大きく形成されている。
このように構成された細胞培養基材３を用いて培養することにより、神経細胞２から伸長する神経突起２２は、凸部３１の間隔に沿って、凸部３１の配列している方向に沿って伸長し、凸部３１のない平坦な基板上での培養に比べると長くなる。
ここで、実施形態例２で用いる細胞培養基材３の表面における所定の凸部３１から構成される制御領域を、領域２と記載する。すなわち、図６に示す領域２で神経細胞２を培養することによって、神経細胞２を萎縮させ、神経細胞２から伸長する神経突起２２の伸長方向を制御しつつ、神経細胞２を培養することが可能となる。
【００４６】
[実施形態例３]
図７は、実施形態例３の神経細胞の培養方法を説明するための図である。なお、図７において、培養容器７と培地８は省略している。
図７に示すように、実施形態例３で用いる細胞培養基材３は、表面に形成された凸部３１の相当直径ｒが神経細胞２の直径よりも小さく、凸部３１間の間隔ｇが神経細胞２の直径の０．４倍から２倍までになるように形成されている。
このように構成された細胞培養基材３を用いて培養することにより、神経細胞２からの神経突起２２の伸長が阻害され、細胞体２１は萎縮する。
ここで、実施形態例３で用いる細胞培養基材３の表面における所定の凸部３１から構成される制御領域を、領域３と記載する。すなわち、図７に示す領域３で神経細胞２を培養することによって、神経細胞２の成長を抑制（または停止）しつつ、神経細胞２を培養することが可能となる。
【００４７】
[領域１〜３の組み合わせ等]
前記した実施形態例１〜実施形態例３で示した神経細胞の培養方法は、それぞれ適用する培養条件は同じであって、用いる細胞培養基材３のみが異なるため、それぞれの細胞培養基材３を一つの培養容器７に配設することによって、同時に適用することができる。すなわち、２以上の制御領域を有する細胞培養基材３を用いて、神経細胞２を培養する神経細胞２の培養方法および細胞培養基材３が提供される。
ここで、図８〜図１０は、領域１〜領域３と、任意の領域である領域４とを組み合わせて形成した細胞培養基材３の上面図である。
【００４８】
具体的には、図８に示すように、領域１を領域３で囲んだ細胞培養基材３を形成することができる。図８の細胞培養基材３を用いる神経細胞２の培養方法によれば、細胞培養基材３の中央部に限定して、太い神経突起２２と大きい細胞体２１を有する神経細胞２を培養することができる。
【００４９】
また、図９に示すように、領域２を領域３で囲んだ細胞培養基材３を形成することができる。図９の細胞培養基材３を用いる神経細胞２の培養方法によれば、中央に限定して格子状の神経ネットワークを形成することができる。
【００５０】
また、図１０に示すように、領域３で分離された２つの部位を持つ細胞培養基材３を形成することができる。図１０において、任意の領域である領域４は、領域１、領域２のいずれの領域であってもよく、また、凸部３１が形成されない平坦な領域であってもよい。さらには、領域４は、例えば、特表平１０−５０００３１号公報に記載の溝からなる構造であってもよい。図１０の細胞培養基材３を用いる神経細胞２の培養方法によれば、領域３は外部から伸長してくる神経突起２２は妨げないために、分離された２つの領域（領域４と領域４）に位置する神経細胞２同士を、それぞれの神経細胞２から伸長した神経突起２２のみで繋ぐことができる。
【００５１】
<<細胞培養基材の形状に関する変形例>>
以下に、本実施形態の細胞培養基材３の形状に関する変形例を示す。
細胞培養基材３の形状は、図１で示した単層のシート状のものに限定されず、例えば、曲面を有する形状としたり、球形、柱形、積層体、筒状等の立体的な形状としたりすることができる。また、一旦、神経細胞２を細胞培養基材３で培養した後に、積層や曲げ加工等によって立体的な形状に加工することもできる。
また、培養表面も、図１で示した細胞培養基材３の上面側に限定されるものではなく、例えば、下面側、側面側、内面側、これらの組み合わせ等、所望する神経細胞２の配置に応じて、培養表面の位置を適宜変更することができる。
以下、図面を参照して、具体的な細胞培養基材３の形状に関する変形例の説明をする。
【００５２】
[変形例１：積層体]
図１１は、積層体として形成された細胞培養基材３の概略構成を示す斜視図である。
図１１に示すように、細胞培養基材３は、図１を参照して説明した単層シート状の細胞培養基材３を積層した構成となっている。そして、各層の上面側は培養表面となっており、複数の凸部３１が形成されている。また、各層の縁部は、スペーサ３Ａを介して連結している。
細胞培養基材３を積層体とする際には、積層体の縁部に対して開口している部位と封止される部位とを形成することができる。また、積層体の形態は表面に神経細胞２の直径より小さい凸部３１が形成できるならば特に制限されず、例えば、前記したような主成分からなるフィルム、シート、マット、スポンジ等を用いて積層したもの等を挙げることができる。積層体の厚さは、０．０１〜３ｍｍの範囲内であることが好ましく、外科手術等における使用のしやすさ等の点から、０．１〜１ｍｍの範囲内であるのがより好ましい。また、積層体の面積等は特に制限されず、用途、患部の状態、外科手術の方法等に応じて種々調節することができる。
【００５３】
[変形例２：筒状]
図１２は、筒状として形成された細胞培養基材３の概略構成を示す斜視図である。図１２に示すように、細胞培養基材３は、図１を参照して説明した単層シート状の細胞培養基材３の一組の対向する二辺３Ｂを接続して筒状とした構成となっている。
細胞培養基材３を筒状とする際には、両側の端部３Ｃ，３Ｃが開口していることが好ましい。また、チューブの形態は表面に神経細胞２の直径より小さい凸部３１が形成できるならば特に制限されず、例えば、前記したような主成分からなるフィルム、シート、マット、スポンジ等を用いて管状に形成したもの等を挙げることができる。チューブの内径は、０．２〜１０ｍｍの範囲内であることが好ましく、外科手術等における使用のしやすさ等の点から、１〜１０ｍｍの範囲内であるのがより好ましい。チューブの厚さ、長さ等は特に制限されず、用途、患部の状態、外科手術の方法等に応じて種々調節することができる。
また、筒状に形成された細胞培養基材３の一端から他端まで心材を挿通し、細胞培養基材３の強度を補強する構成としてもよい。
【００５４】
<<その他>>
以上、本実施形態によれば、次のような効果を得ることができる。
生体組織再生用材料１を、細胞培養基材３と、細胞培養基材３により培養された神経細胞２とを一体に構成したことにより、再生治療に供する際に移植される神経細胞２の形態を保持し、組織に定着するまでの間は外力から保護することができる。
【００５５】
また、所望する神経細胞２の成長形態に応じて、細胞培養基材３の培養表面に形成する凸部３１の形状を適宜規定することができる。従来、このように細胞形状を変化させるには特定のサイトカイン等の試薬添加が必要であったが、本実施形態においてはこのような試薬添加が不要であり、試薬の副次的な効果を考慮に入れる必要が無い。また、本実施形態を適用することにより、細胞培養基材３上に局所的に異なる効果を有する処理を実現できるために、神経細胞２の成長形態の複雑かつ高次な制御に適用することができる。
【００５６】
また、細胞培養基材３を生分解性物質により構成することで、生体組織の再生後に細胞培養基材を体内で分解することができ、移植した細胞の組織への一体化に寄与することができる。さらに、細胞培養基材３を生分解性物質により構成することで、細胞培養基材３に神経細胞２の誘導物質や抑制物質等の副成分を含浸させ、細胞培養基材３の分解とともに副成分を徐々に放出させることができる。その結果、神経細胞２の成長形態の制御を、凸部３１の形状や間隔で行うのと並行して、副成分の放出により行うことができる。
【００５７】
以上のことから、本実施形態の生体組織再生用材料１は、神経の再生に好適に用いることができる。すなわち、本実施形態の生体組織再生用材料１によれば、例えば、アルツハイマー症、パーキンソン症、ハンチントン症、筋萎縮性側索硬化症等の中枢神経疾患や、末梢神経における障害を包含する神経疾患の治療に好適に利用できる。また、例えば、脊椎疾患、頭部外傷や卒中等の脳血管疾患のような外傷性疾患に対しても有効である。
【００５８】
なお、本発明は前記実施形態に限定されるものではなく、その技術思想のおよぶ範囲で様々の変更実施を行うことができる。
例えば、本発明は、本発明の生体適合性材料を神経疾患を有する動物に移植する工程を含む神経疾患を有する動物の治療方法も包含する。この場合の動物とは、当該動物に移植可能な神経細胞を入手可能な動物であれば特に限定されるものではなく、ヒト、家畜（ブタ、ウシ、ウマ等）、ペット用哺乳類（イヌ、ネコ等）、両生類、鳥類等種々の動物が挙げられる。
【００５９】
また、本実施形態においては、細胞培養基材３に複数の凸部３１を形成することによって神経細胞２の成長形態を制御する構成としたが、細胞培養基材３に複数の凹部、または、凸部３１と凹部とを組み合わせた凹凸構造を形成することによって神経細胞２の成長形態を制御することも可能である。
【実施例】
【００６０】
次に、本発明のより具体的な例を実施例によって説明する。
【００６１】
[実施例１]
実施例１は、細胞培養基材３に形成される凸部３１の相当直径および間隔と、神経細胞２の成長形態の制御効果との関係を検証した実施例である。
（１）細胞培養基材３の製造
図１２は、実施例１で作成した細胞培養基材３の上面図である。
細胞培養基材３の原料である基材原料４は、分子量85,000-160,000のポリ−L−乳酸（シグマ・アルドリッチ・ジャパン製）の厚み０．２ｍｍのシートである。
また、凸部３１の成形に用いた金型５の材質は、結晶方位（１００）、２０ｍｍ角、厚み０．７ｍｍの単結晶シリコンであって、金型凹部６は、光リソグラフィ法によって形成されたものである。
【００６２】
そして、基材原料４を１２０℃に加熱して表面を軟化し、図１１に示す基材表面（凸部３１）に対応する金型凹部６が表面に形成された金型５を、５．０ＭＰａ程度の圧力で押し付けた。このプレス工程によって、金型凹部６に基材原料４を充填した。その後、１０℃まで冷却し、金型５を離すことによって、図１２に示す基材表面（凸部３１）を形成した細胞培養基材３を得ることができた。
引き続いて、細胞培養基材３をエタノール中に浸漬して乾燥し、３時間のＵＶ滅菌を施した後にポリリジン溶液（５０ｍｇ／０．１Ｍ  ホウ酸水溶液、ｐＨ＝８．３）に１時間浸漬後に純水で洗浄することによってポリリジンを凸部３１上を含む細胞培養基材３へ被覆した。以上の工程により、実施例１で用いる細胞培養基材３が作成された。
図１２に示すように、この細胞培養基材３には、所定の凸部３１から構成される１６箇所の制御領域が形成されている。各領域の大きさは３ｍｍ角である。各領域内において凸部３１は、２次元正方格子状に配列している。
凸部３１の高さは全て１μｍであるが、凸部３１の直径ｒは０．２５μｍから２５．０μｍに、凸部３１間の間隔ｇは直径ｒと同じ値の領域と２倍の値とした領域とを形成した。
ここで、実施例１で形成した細胞培養基材３上に形成した凸部３１の相当直径ｒと凸部３１間の間隔ｇの一覧を表１に示す。
【００６３】
【表１】
2007229348.tif 000003
【００６４】
（２）マウス神経細胞の取得および増殖
まず、実施例１において使用した神経細胞２の調製手順を以下に示す。
妊娠１４日目のマウスから胎児を取り出し脳を摘出した。さらに，大脳半球から大脳皮質のみを分離して、その組織片を培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、 ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））６が入っている１５ｍｌチューブに集め、先をバーナーの火で丸めたパスツールピペットを使いピペッティングによって細胞を分散させた。その後、血球計算盤を使用して細胞数を計測し、トリパンブルー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）染色によって適正なＶｉａｂｉｌｉｔｙを有していることを確認した。
実施例１で得られたポリリジンコート済みの細胞培養基材３を細胞培養用シャーレ等の培養容器７内に配置し、この上に胎生１４日目のマウス大脳皮質組織から採取した神経細胞２を２．０×１０4／ｃｍ2の密度に播種した。培地８は培養１日目のみ血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、  １０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、  ５５μＭ  ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）を使用し、細胞が定着した培養２日目以降は無血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、 Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、  ５５ｍＭ  ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）を用いた。培養はＣＯ2インキュベータ内（ＣＯ2濃度５％、温度３７℃、相対湿度８０％）で行った。７日間培養後に、細胞培養基材３に接着した神経細胞２の形状を倒立顕微鏡および走査電子顕微鏡観察によって評価した。
【００６５】
実施例１の領域ａ〜ｐに関し、それぞれ、細胞体２１の形状（表２では細胞体形状と記載）、１細胞あたりの神経突起２２の数（総数）、１細胞あたりの神経突起２２の分岐数（分岐数）、神経突起２２の長さ平均値（長さ）、神経突起２２の太さ平均値（太さ）、神経突起２２の伸長方向の配向率（配向率）、を評価した。
なお、伸長方向の配向率は、全ての神経突起数に対し、直進的に延伸する神経突起数の割合とした。
比較例として、凸部３１のない平坦なポリスチレンシャーレ上に神経細胞２を播種し、同じ条件で培養したものを評価した。
各評価結果を表２に示す。
【００６６】
【表２】
2007229348.tif 000004
【００６７】
表２に示すように、領域ａ、領域ｂ、領域ｉでは、細胞体２１が扁平状となった。神経突起２２は凸部３１の上を伝って多数分岐しながら伸長し、その太さは平坦な基材上での培養時に比べると大きい値を示した。通常のマウス神経細胞においては神経細胞２の直径（細胞体２１の直径）は２〜２０μｍであり、その神経突起２２の直径は０．３〜１．０μｍである。これらの領域では凸部３１の直径ｒ、および凸部３１間の間隔ｇが神経細胞２の直径、神経突起２２の直径よりも小さい値となっている。このように凸部３１を形成することよって、実施形態例１で示したように神経細胞２の成長形態を制御できることが示された。
【００６８】
領域ｃ、領域ｄ、領域ｅ、領域ｋ、領域ｌでは、細胞体２１が扁平状となった。しかし、神経突起２２の分岐数は平坦な基材上での培養時に比べると少なく、神経突起２２は分岐を抑えて成長方向を凸部３１の間を、凸部３１の配列方向に合わせて直線状に長く伸長した。前記したように通常のマウス神経細胞においては神経細胞２の直径は２〜２０μｍであり、その神経突起２２の直径は０．３〜１．０μｍである。これらの領域では凸部３１の直径ｒおよび間隔ｇが神経細胞２の直径よりも小さく、かつ、間隔ｇが伸長する神経突起２２の直径よりも大きい値となっている。このように凸部３１を形成することよって、実施形態例２で示したように神経細胞２の成長形態を制御できることが示された。
【００６９】
領域ｆ、領域ｇ、領域ｍ、領域ｎでは、細胞体２１が萎縮して通常時よりも小さい球形となった。神経突起２２は成長が抑制され、分岐数と長さは平坦な基材上での培養時に比べると小さい値となった。前記したように通常のマウス神経細胞においては神経細胞２の直径は２〜２０μｍであり、その神経突起２２の直径は０．３〜１．０μｍである。これらの領域では凸部３１の直径ｒが神経細胞２の直径よりも小さく、間隔ｇが神経細胞２の直径の０．４倍から２．０倍までの値となっている。このように凸部３１を形成することよって、実施形態例３で示したように神経細胞２の成長形態を制御できることが示された。
【００７０】
また、領域ｈ、領域ｌ、領域ｏでは、神経細胞２の形状に、平坦な基材における細胞形状との有意な差が見出せなかった。このことは、これらの領域では凸部３１の直径ｒ、間隔ｇが神経細胞２の直径よりも十分に大きく、各細胞にとっては凸部３１のない平坦な基材と実質的に同じ培養環境であったことを意味している。
【００７１】
以上のように、実施例１によれば、温度、培養時間、培地等の培養環境が共通であっても細胞培養基材３上の凸部３１の形状を規定することで、培養する神経細胞２の成長形態を制御できることを示した。すなわち、実施例１によれば、それぞれの特性を示す凸部３１を細胞培養基材３上に所望の形状にパターニングして成型した基材を用いることによって、あらゆる形状に神経細胞ネットワークを形成することができることを示した。
【００７２】
[実施例２]
実施例２は、生体組織再生用材料１の一例である、ラット脳神経の再生治療等に適用可能な生体組織再生用材料１の実施例である。
（１）細胞培養基材３の製造
図１３は、実施例２の生体組織再生用材料１の製造工程を示す図である。
図１３(ａ)に示すように、細胞培養基材３の原料である基材原料４は、分子量85,000-160,000のポリ−L−乳酸（シグマ・アルドリッチ・ジャパン製）の厚み０．２ｍｍのシートである。
また、凸部３１の成形に用いた金型５の材質は、結晶方位（１００）、２０ｍｍ角、厚み０．７ｍｍの単結晶シリコンであって、金型凹部６は、光リソグラフィ法によって形成されたものである。
【００７３】
基材原料４を実施例１と同様の条件でナノインプリント法を用いて加工し、図１３（ｂ）に示す細胞培養基材３を形成した。細胞培養基材３には図１３（ｂ）に示すように領域１を形成する凸部３１と、領域２を形成する凸部３１が形成されている。その後、細胞培養基材３を筒状に加工し、シートの一組の対抗する二辺３Ｂ，３Ｂを熱溶着することによって図１３（ｃ）に示す両側の端部３Ｃ，３Ｃが開口した筒状の細胞培養基材３を得た。さらにポリリジンによる被覆を細胞培養基材３に施した。以上の工程により実施例２で用いる筒状の細胞培養基材３が作成された。この筒状の細胞培養基材３は、長さ３０ｍｍ、直径５ｍｍ、厚み０．２ｍｍであった。また、筒状の細胞培養基材３の両側の端部３Ｃ，３Ｃ方向の内側には領域１を形成する直径５００ｎｍ、間隔１μｍ、高さ１μｍの凸部３１、中央部内側には領域２を形成する直径１μｍ、間隔２μｍ、高さ１μｍの凸部３１が形成された。
【００７４】
（２）マウス神経細胞の取得および増殖
細胞培養基材３を細胞培養用シャーレ等の培養容器７(図示せず)内に配置し、実施例１と同様に胎生１４日目のマウス大脳皮質組織から採取した神経細胞２を筒状の細胞培養基材３に播種した。培地８(図示せず)は培養１日目のみ血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、  １０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、  ５５μＭ  ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）を使用し、神経細胞が定着した培養２日目以降は無血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、 Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、  ５５ｍＭ  ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）を用いた。培養はＣＯ2インキュベータ内（ＣＯ2濃度５％、温度３７℃、相対湿度８０％）で行った。７日間培養後に、細胞培養基材３に接着した神経細胞２の形状を倒立顕微鏡で評価したところ、神経細胞２は細胞培養基材３の凸部３１全体に対して接着したが、図１３（ｄ）に示すように、両側の端部３Ｃ，３Ｃ方向に位置する領域１から神経突起２２が伸展し、互いに接続していることを確認することができた。中央部に位置する領域２は神経突起２２の進展を促進する効果が見られた。以上の工程により、実施例２で用いる生体組織再生用材料１が作成された。
【００７５】
以上のように、実施例２の生体組織再生用材料１によれば、筒状の細胞培養基材３内において両端から神経突起２２が伸展し接続した神経細胞２の形状が得られるため、再生医療に適用したときには、損傷、欠損などの生じた部位の神経回路の良好な再生効果が期待できる。また、実施例２において、図１３（ｂ）に示した領域１と領域２を組み合わせたパターンの細胞培養基材３を用いたが、領域１〜領域４のいずれかを組み合わせることで、他の神経細胞２の形状を制御することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本実施形態の生体組織再生用材料の概略構成を示す斜視図である。
【図２】細胞培養基材の構成を示す斜視図であって、(ａ)は全体図、（ｂ）は(ａ)で示したＡ領域の部分拡大図である。
【図３】細胞培養基材の製造方法の一例であるナノインプリント法による製造工程を説明するための図である。
【図４】神経細胞の培養手順を説明するための図であって、細胞培養基材上で培養されている神経細胞を示す縦断面図である。
【図５】実施形態例１の神経細胞の培養方法を説明するための図である。
【図６】実施形態例２の神経細胞の培養方法を説明するための図である。
【図７】実施形態例３の神経細胞の培養方法を説明するための図である。
【図８】領域１と領域３とを組み合わせて形成した細胞培養基材の上面図である。
【図９】領域２と領域３とを組み合わせて形成した細胞培養基材の上面図である。
【図１０】領域３と、任意の領域である領域４とを組み合わせて形成した細胞培養基材の上面図である。
【図１１】積層体として形成された細胞培養基材の概略構成を示す斜視図である。
【図１２】筒状として形成された細胞培養基材の概略構成を示す斜視図である。
【図１３】実施例２の生体組織再生用材料の製造工程を示す図である。
【符号の説明】
【００７７】
１      生体組織再生用材料
２      神経細胞
３      細胞培養基材
４      基材原料
５      金型
６      金型凹部
７      培養容器
８      培地
２１    細胞体
２２    神経突起
３１    凸部
３１Ａ  最上面
３２    基材ベース
３２Ａ  上面
【図１】
2007229348.tif 000005
【図２】
2007229348.tif 000006
【図３】
2007229348.tif 000007
【図４】
2007229348.tif 000008
【図５】
2007229348.tif 000009
【図６】
2007229348.tif 000010
【図７】
2007229348.tif 000011
【図８】
2007229348.tif 000012
【図９】
2007229348.tif 000013
【図１０】
2007229348.tif 000014
【図１１】
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【図１２】
2007229348.tif 000016
【図１３】
2007229348.tif 000017