(57)【要約】      （修正有）【課題】標的核酸と特異的に結合するプローブ核酸とのハイブリダイゼーション方法および装置に関し、標的核酸を効率良く検出する方法を提供する。【解決手段】標的核酸と、該標的核酸と特異的に結合可能な、基体に固定されたプローブ核酸１０３とをハイブリダイゼーションさせる方法であって、前記試料溶液に含まれる標的核酸をプローブ核酸１０３に反応させる工程と、前記反応工程を経た試料溶液を回収する回収工程と、前記回収された試料溶液を前記標的核酸の変性温度以上にする加熱工程と、前記加熱工程後の前記試料溶液に含まれる標的核酸をプローブ核酸１０３に反応させる工程とを有することを特徴とするハイブリダイゼーション方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸と、該標的核酸と特異的に結合可能な、基体に固定されたプローブ核酸とをハイブリダイゼーションさせる方法であって、
前記試料溶液に含まれる標的核酸を前記プローブ核酸に反応させる工程と、
前記反応工程を経た試料溶液を回収する回収工程と、
前記回収された試料溶液を前記標的核酸の変性温度以上にする加熱工程と、
前記加熱工程後の前記試料溶液に含まれる標的核酸を前記プローブ核酸に反応させる工程と
を有することを特徴とするハイブリダイゼーション方法。
【請求項２】
前記プローブ核酸に供給時の前記試料溶液の温度は、ハイブリダイゼーション温度に制御されている請求項１に記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項３】
前記試料溶液には増幅試薬が含まれ、前記回収行程と前記反応させる行程との間に前記標的核酸の増幅工程が含まれる請求項１に記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項４】
前記反応させる工程は、更に前記試料液体をハイブリダイゼーション温度に制御する工程を含むことを特徴とする請求項１に記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項５】
前記基体はガラスプレートである請求項１に記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項６】
前記試料溶液中には、前記標的核酸と相補的な一本鎖核酸が含まれている請求項１に記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項７】
前記反応させる工程において前記試料溶液を前記プローブ核酸に供給する流速は、前記ハイブリダイゼーション温度に制御された前記試料液体を前記プローブ核酸に到達させるまでの時間＜前記試料溶液中の一本鎖核酸状態である標的核酸が半減する時間、を満たすように設定されている請求項６に記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項８】
標的核酸と、該標的核酸と特異的に結合可能な、基体に固定されたプローブ核酸とをハイブリダイゼーションさせる装置であって、
前記基体を設置する設置部と、
前記標的核酸を含む試料溶液を前記基体に供給する供給路と、
前記供給された試料溶液を回収する回収機構と、
前記回収機構により回収された試料溶液を変性温度以上に加熱する加熱器とを有し、
前記回収機構は、前記加熱後の試料溶液を再び前記基体に供給するように構成されていることを特徴とするハイブリダイゼーション装置。
【請求項９】
前記回収機構は、前記反応チャンバーに対して循環路を構成し、前記加熱器は前記循環路の途中に配置されている請求項８に記載のハイブリタイゼーション装置。
【請求項１０】
前記試料溶液には増幅試薬が含まれ、前記回収機構には前記試料溶液中の標的核酸を増幅させる増幅器が含まれる請求項８に記載のハイブリダイゼーション装置。
【請求項１１】
前記回収機構は、前記試料溶液をハイブリタイゼーション温度に制御する温調手段を有する請求項８に記載のハイブリダイゼーション装置。
【請求項１２】
前記回収機構による再供給時における前記試料溶液の流速は、前記ハイブリダイゼーション温度に制御された前記試料液体を前記プローブ核酸に到達させるまでの時間＜前記試料溶液中の一本鎖核酸状態である標的核酸が半減する時間、を満たすように設定されている請求項１１に記載のハイブリダイゼーション装置。
【請求項１３】
前記回収機構はポンプを含み、該ポンプにより前記試料溶液の回収及び再供給を行なう請求項８に記載のハイブリダイゼーション装置。
【請求項１４】
標的核酸と特異的に結合可能なプローブ核酸が固定されたカートリッジにおいて、
前記プローブ核酸を収納する反応チャンバーと、前記反応チャンバーに前記標的核酸を含む試料溶液を供給するための供給口と、前記反応チャンバーに供給された前記試料溶液を回収するための回収室とを有することを特徴とするカートリッジ。
【請求項１５】
前記回収部は、前記反応チャンバーに対して前記試料溶液を循環させる循環路を構成している請求項１４に記載のカートリッジ。
【請求項１６】
請求項１４に記載のカートリッジを用いて、標的核酸とプローブ核酸とをハイブリダイゼーションさせる装置であって、
前記カートリッジを設置する設置部と、
前記カートリッジの供給口から前記試料溶液を供給する供給機構と、
前記反応チャンバーに供給された試料溶液を前記回収室に回収させる回収機構と、
前記回収された試料溶液を変性温度以上に加熱する加熱器とを有し、
前記回収機構は、前記加熱後の試料溶液を前記回収室から再び反応チャンバーに供給するように構成されていることを特徴とするハイブリタイゼーション装置。
【請求項１７】
標識化された標的核酸と、該標的核酸と特異的に結合可能な、基体に固定されたプローブ核酸とをハイブリダイゼーションさせると共に、前記基体上に存在する標識を検出する分析装置において、
前記基体を設置する設置部と、
前記標的核酸を含む試料液体を前記基体に供給する供給路と、
前記試料液体を回収する回収機構と、
前記回収機構により回収された試料溶液を変性温度以上に加熱する加熱器と、
前記標識を検出する検出器とを有し、
前記回収機構は、前記加熱後の試料溶液を再び基体に供給するように構成されていることを特徴とする分析装置。
【請求項１８】
前記装置は、更に、前記試料溶液を増幅する増幅器を含む請求項１７に記載の分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基板上に固定されたプローブ核酸と、試料中に含まれる核酸とのハイブリダイゼーション反応により、標的核酸の量または有無を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムシーケンスプロジェクトの進展に伴って、ゲノム上の特定遺伝子の検出、ＳＮＰＳ解析、発現解析等がポストゲノムの課題として注目されている。そのため、最近の医療、分子生物学の分野では、標的配列を検出する方法として、マイクロアレイハイブリダイゼーション法や、インサイチュハイブリダイゼーション法などの解析方法の重要性が高まっている。マイクロアレイハイブリダイゼーション法やインサイチュハイブリダイゼーション法では、標的物質と特異的に結合する核酸プローブを基板上に固定し、該核酸プローブと試料とをハイブリダイゼーションさせることにより、試料中の標的物質の存在を解析する。
【０００３】
一般に、これらのハイブリダイゼーション反応は、核酸プローブを固定した基板に試料を含むハイブリダイゼーション溶液を滴下することで行なわれる。この際に、ハイブリダイゼーション溶液が蒸発しないようにカバーガラスで覆い、湿箱内や密閉されたカセット内にその基板を置いて、長時間（４〜５０時間）、基板を一定温度に保持している。
【０００４】
しかし、上記カバーガラスで覆う方法では、基板上のハイブリダイゼーション溶液の移動がほとんどなく、基板に固定されたプローブと溶液中の試料の衝突頻度が低く、ハイブリダイゼーション効率が非常に低い。そのため、ハイブリダイゼーション反応には長時間を要し、また不均一なハイブリダイゼーションに起因するデータの信頼性に課題があった。
【０００５】
ハイブリダイゼーション効率の向上および均一性の向上のために、シーソー式やローラーボトル式の溶液振盪機能を持つハイブリダイゼーションオーブンが用いられているものの、その効果は低いものである。
【０００６】
そこで、反応時間の短縮化や均一性の向上を目指したハイブリダイゼーション装置が近年開発されている。
【０００７】
このような装置の一つとして、特許文献１に開示されている装置がある。本装置では、反応層として保持されるハイブリダイゼーション溶液を、空気によりアジテーション（液の往復振盪）することにより、ハイブリダイゼーション効率を向上させている。しかし、特許文献１の装置のようなアジテーションによる攪拌では、基板全体の均一性を保つことが難しく、また一度気泡が混入すると排除できないために、ハイブリダイゼーションの不均一性の原因となっている。
【０００８】
そこで、特許文献２で開示されているように、基板を含む流路に反応液を還流させるハイブリダイゼーション装置が開発されている。特許文献２では、還流によってプローブと試料との衝突頻度が増し、ハイブリダイゼーション効率の向上、ハイブリダイゼーションの均一化の効果が記載されている。
【０００９】
しかし、いずれの方法を用いても反応処理の効率化という観点では満足いくものではなかった。それは上述の方法はいずれも、試料溶液中の相補鎖がハイブリダイゼーション反応に影響しないという前提のもとで行われているためである。すなわち、標的核酸の相補鎖核酸を相対的に減少させる工程を必要としている。この処理は、片鎖プライマーによる非対称性ＰＣＲ法や、特許文献３のように相補鎖をカラムにより特異的に捕捉する方法などがあるが、これらはいずれも時間と手間のかかる処理であった。
【特許文献１】米国特許第６２３８９１０号明細書
【特許文献２】特開２００３−３１５３３７号公報
【特許文献３】特開平１０−２３９３３０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、従来のハイブリダイゼーション反応前の相補鎖除去工程を不要とし、プローブ核酸による標的核酸の捕捉を効率的に行うことのできる新規なハイブリダイゼーション方法およびその装置を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の目的を達成するため本発明に係る方法は、
標的核酸と、該標的核酸と特異的に結合可能な、基体に固定されたプローブ核酸とをハイブリダイゼーションさせる方法であって、
前記試料溶液に含まれる標的核酸を前記プローブ核酸に反応させる工程と、
前記反応工程を経た試料溶液を回収する回収工程と、
前記回収された試料溶液を前記標的核酸の変性温度以上にする加熱工程と、
前記加熱工程後の前記試料溶液に含まれる標的核酸を前記プローブ核酸に反応させる工程と
を有することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明に係る装置は、
標的核酸と、該標的核酸と特異的に結合可能な、基体に固定されたプローブ核酸とをハイブリダイゼーションさせる装置であって、
前記基体を設置する設置部と、
前記標的核酸を含む試料溶液を前記基体に供給する供給路と、
前記供給された試料溶液を回収する回収機構と、
前記回収機構により回収された試料溶液を変性温度以上に加熱する加熱器とを有し、
前記回収機構は、前記加熱後の試料溶液を再び前記基体に供給するように構成されていることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明に係るカートリッジは、
標的核酸と特異的に結合可能なプローブ核酸が固定されたカートリッジにおいて、
前記プローブ核酸を収納する反応チャンバーと、前記反応チャンバーに前記標的核酸を含む試料溶液を供給するための供給口と、前記反応チャンバーに供給された前記試料溶液を回収するための回収室とを有することを特徴とする。
【００１４】
また、本発明に係る分析装置は、
標識化された標的核酸と、該標的核酸と特異的に結合可能な、基体に固定されたプローブ核酸とをハイブリダイゼーションさせると共に、前記基体上に存在する標識を検出する分析装置において、
前記基体を設置する設置部と、
前記標的核酸を含む試料液体を前記基体に供給する供給路と、
前記試料液体を回収する回収機構と、
前記回収機構により回収された試料溶液を変性温度以上に加熱する加熱器と、
前記標識を検出する検出器とを有し、
前記回収機構は、前記加熱後の試料溶液を再び基体に供給するように構成されていることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のハイブリダイゼーション方法および装置により、ＰＣＲ増幅処理などによって増幅された２本鎖核酸を含有する試料を、相補鎖を除去する必要なく、ハイブリダイゼーション反応に供することができる。これにより、従来よりも効率よく標的核酸の検出が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明していく前に、本発明に関する用語を以下のように定義する。
【００１７】
変性温度とは、２本鎖核酸のダブルへリックス構造が壊れてそれぞれ一本鎖に乖離する温度と定義する。２本鎖ＤＮＡを９０℃以上に加熱すると、構造変化に起因する物理的性質の変化が見られる。狭義には物理的性質変化の中点が変性温度と定義されることもあるが、その物理的性質の変化はかなり狭い温度範囲で起こる。このため本発明ではその変化の立ち上がりの温度も変性温度に含めてよい。
【００１８】
ハイブリダイゼーション温度とは、ハイブリダイゼーション反応を生じさせるための温度であり、好適な温度条件は対象核酸の塩基長、使用される試薬等の諸条件に基づいて適宜設定される。
【００１９】
以下、本発明に係わるハイブリダイゼーション方法および装置の具体的な実施の形態を説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２０】
（第１の実施形態）
図１は本発明のハイブリダイゼーション装置の好適な一例を示す模式図である。図１において、１０１はプローブ核酸を固定するための基板、１０２は標的核酸が含まれた反応液を保持するための微小空間を形成するチャンバー（反応チャンバー）、１０３は標的核酸と特異的に結合するプローブ核酸である。チャンバー１０２には、反応液の流出口１０５と流入口１０６を具備し、流出口１０５と流入口１０６を還流手段としての流路１０４が連結している。流路１０４には、供給手段および回収手段としてのポンプ１０９が具備され、不図示の反応液を循環させる。また、流路１０４には、第一温度制御手段１０７、第二温度制御手段１０８が具備され、循環する反応液の温度を制御する。また、基板１０１に対しても不図示のヒータ等によって温度を制御することも可能である。
【００２１】
図２を用いてハイブリダイゼーション法の概要を示す。図２は標的核酸が２本鎖ＤＮＡの例であるが、それ以外でも各種ＲＮＡ、ｃＤＮＡ等の１本鎖ＤＮＡ等がある。２１０Ａが２本鎖状態の標的核酸であり、標的核酸２１０は互いに塩基配列が相補的なセンス鎖２１１とアンチセンス鎖２１２が結合して構成されている。例えば、標的核酸２１０のうちの片鎖であるアンチセンス鎖２１２と、相補的な塩基配列を持つプローブ核酸２０３が基板２０１に固定されている。標的核酸２１０が含まれたハイブリダイゼーション溶液を、プローブ核酸２０３が固定された基板２０１に接触させる。その後、反応液を９５℃程度に加熱し、２本鎖核酸をセンス鎖２１１とアンチセンス鎖２１２に解離し、Ｂの状態になる。その後、ハイブリダイゼーション至適温度に反応液を制御することによって、標的核酸のアンチセンス鎖２１２と、プローブ核酸２０３が結合しＣの状態となる。至適温度はプローブ核酸２０３の種類によって異なるが、概ね３０〜６０℃程度である。至適温度で数時間反応させた後、適当な洗浄液で洗浄し、プローブ核酸２０３と結合していない標的核酸２１０等を除去する。その後、基板上に残存した標的核酸２１２を検出することによって、標的配列の有無を確認する。検出方法としては、標的核酸２１０に蛍光色素や放射性物質で標識しておき、ハイブリダイゼーション後にその蛍光色素や放射性物質を観察する方法や、ＣＹＢＥＲ−ＧＲＥＥＮ等のインターカレータ色素を用いてプローブ核酸２０３とのハイブリダイゼーション結合を観察する方法がある。また、共焦点顕微鏡を用いれば、標識物質がチャンバー内を浮遊した状態であっても液層中で検出することもできる。
【００２２】
プローブ核酸とは、特定のターゲット（標的）によって特異的に認識され得るもので、しばしばリガンドと呼ばれるものである。更に、このプローブには、特定の標的によって認識され得るオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチド、あるいはその他のポリマーなどが含まれる。用語「プローブ」は、個々のポリヌクレオチド分子などのプローブ機能を有するプローブ分子そのものを意味する場合と、分散した状態等で担体表面に固定された同じ配列のポリヌクレオチドなどの同じプローブ機能を有するプローブ分子の集団を意味する場合がある。また、プローブは、リガンド−抗リガンド対の一部として標的と結合し得るか、または結合するようになり得るものである。本発明におけるプローブ及び標的は、天然において見出されるような塩基、またはそのアナログを含み得る。
【００２３】
なお、本発明の方法に採用されるプローブは、その使用目的に応じて、適宜選択されるものであるが、本発明の方法を好適に実施する上では、プローブとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）、ＰＮＡ、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、その他の核酸のいずれかであることが好ましく、必要に応じてこれらの２種以上を組合せて用いることができる。
【００２４】
ハイブリダイゼーション法のプローブ核酸としては、人工的に合成されたオリゴＤＮＡや、バクテリア等のベクターで合成したＢＡＣ  ＤＮＡ、ｃＤＮＡ等が用いられる。プローブ核酸の塩基長は、短鎖のオリゴＤＮＡで２０〜６０ｍｅｒ程度、長鎖のＢＡＣＤＮＡで数ｋｍｅｒ程度が好適に用いられる。
【００２５】
プローブ２０３は、不図示のリンカーを介して基板２０１に固定化されていることが多い。リンカーとしては、アミノ修飾オリゴヌクレオチドの場合は、ポリ−Ｌ−リジンの利用がよく知られている。また、ＳＨ基修飾オリゴヌクレオチドの場合は、例えば、スライドガラス表面をアミノシランカップリング剤により処理した上で、ＥＭＣＳ（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）などの二価性試薬を介して固相化することができる。また、作成したプローブ核酸を基板に結合させる方法以外にも、フォトリソグラフィー技術によって、基板上で核酸を合成する方法もある。
【００２６】
基板２０１は石英や硼珪酸等のガラスや、樹脂で形成されていることが多く、不織布等の場合もある。図１では板状の基板であるが、これに限定される物ではなく、円筒形の流路を形成するものや、反応液を透過させるフィルター状のものでも良い。さらに、プローブ核酸１０３を固定した粒子状の基板を複数チャンバー１０２に内包する構成でも良い。
【００２７】
チャンバー１０２は、基板上１０１上に反応液を保持できる形状であればどのような形状、素材であっても良い。またチャンバー１０２を通して基板１０１の状態を観察する構成ならば、該観察手段に適切な素材を使用する。基板自体がチャンバーを兼ねる形状であっても良い。チャンバー１０２は、流出口１０５と流入口１０６を通して流路１０４が連結されている。流出口１０５や流入口１０６の形状は反応液が所望の流速で流れる物であれば特に限定されない。さらに、チャンバー１０２には、反応液を外部から注入するための注入口や、基板１０１の温度を制御するための温度管理機能を有すことが望ましい。
【００２８】
流路１０４は、チャンバー１０２の流出口１０５と流入口１０６を連結できる物であればどのような形状や素材でも良い。流路１０４内では、ポンプ１０９によって反応液が循環する。流路１０４の断面を部位によって異形とすることにより、反応液の流速を調整することも可能である。さらに、流路中にバッファー領域を設けて、一時的に反応液を滞留させる構成も可能である。
【００２９】
本実施形態の特徴となるのが、流路１０４上の適切な位置に配置された、第一温度制御手段１０７と第二温度制御手段１０８である。これらの温度制御手段は、流路内の反応液の温度を上下できる物であれば、どのような機構、形状でも良い。例えば、流路外周にペルチェ素子を配置する構成が使用できる。第一の温度制御手段１０７においては、反応液を標的核酸の２本鎖乖離に必要な温度（変性  温度）に、必要な時間制御するための形状とする必要がある。第二の温度制御手段１０８においては、反応液をプローブ核酸と標的核酸のハイブリダイゼーションに至適な温度に制御するための形状にする必要がある。さらに、第二の温度制御手段１０８を通過した反応液が、基板１０１に到達する時間が、標的核酸の２本鎖形成反応の平衡状態に達するよりも短い必要がある。例えば、２本鎖ＤＮＡはｔｍ（溶解温度）においては、半分が１本鎖ＤＮＡの状態となる。１本鎖状態のＤＮＡの半分が２本鎖状態となる時間は以下の式で示される。
１本鎖の半減時間＝ＬＮ２／（結合速度定数×標的核酸初期濃度＋解離速度定数）                                                                          （式１）
ＤＮＡの構成にも左右されるが、一般的にｔｍよりも低い温度における結合速度定数は約１０４〜７Ｍ−１ｓ−１である。初期濃度を１０ｎＭ、解離を無視（解離速度＝０）すると、半減期は７秒である。実際は拡散（拡散定数１０−１１ｍ２／Ｓ程度）の影響があり、逆反応である解離反応も進むので、さらに数桁半減時間は長くなる。よって例えば、第二の温度制御手段１０８から基板１０１まで、反応液が７秒以内に到達するように流路の形状と流速を設定すればよい。
【００３０】
図３を用いて、本実施形態のハイブリダイゼーション方法の流れを説明する。図３は本実施形態のハイブリダイゼーション装置の一例であり、構成は図１とほぼ同様である。まず、標的核酸を蛍光色素で標識する。標識された標的核酸を適当な配合のハイブリダイゼーション溶液に調整する。ハイブリダイゼーション溶液組成の一例としては、ＳＳＰＥ等のバッファー、フォルムアミド等の変性剤、消泡剤がある。標的核酸と相補的な配列を持った、オリゴＤＮＡをプローブ核酸３０３として基板上３０１に固定する。基板３０１をチャンバー３０２に接合する。流路上３０４の注入口３１４のバルブ３１５、空気抜き３１３のバルブ３１６を開放する。前記ハイブリダイゼーション溶液を注入口３１４を通して流路３０４中に注入する。注入過程において、ハイブリダイゼーション溶液は流路３０４およびチャンバー３０２をハイブリダイゼーション溶液で満たし、空気穴３１３から流出する。チャンバー３０２および流路３０４がハイブリダイゼーション溶液で満たされた時点で、バルブ３１５および３１６を閉める。基板３０１をハイブリダイゼーションに至適な温度であるｔ１に制御する。ハイブリダイゼーションに至適な温度ｔ１はプローブ核酸３０３や標的核酸によって異なるが、概ね５０℃程度である。第一の温度制御手段３０７は標的核酸の変性温度であるｔ２に制御する。変性温度ｔ２は標的核酸によって異なるが、概ね９５℃程度である。第二の温度制御手段３０８は、ハイブリダイゼーションに至適な温度ｔ１に制御する。ポンプ３０９を作動させ、流路３０４中にハイブリダイゼーション溶液を図上時計回りに循環させる。図中の黒い矢印はハイブリダイゼーション溶液の循環方向を示している。標的核酸は第一の温度制御手段３０７で１本鎖に乖離され、直ちに第二の温度制御手段３０８によってｔ１に制御される。標的核酸自身の２本鎖が形成される前にチャンバー３０２に到達し、プローブ核酸３０３に接触して、ハイブリダイゼーション反応が進行する。ハイブリダイゼーション反応の過程で、標的核酸同士が２本鎖形成しても、流路を循環することにより、また第一の温度制御手段３０７で１本鎖に乖離されて１本鎖状態となり、プローブ核酸３０３と再度接触してハイブリダイゼーション反応が進行する。このように、本発明を用いれば、従来の技術ではハイブリダイゼーション反応に寄与しない２本鎖状態の標的核酸が、再度ハイブリダイゼーション可能な状態でプローブ核酸３０３に接触させることが可能となり、ハイブリダイゼーション効率、感度が向上する。１〜５０時間程度経た後に、ポンプ３０９を停止し、基板３０１を取り出す。基板３０１上のプローブ核酸３０３に結合した標的核酸の蛍光色素を、適当な顕微鏡で観察する。
【００３１】
また、流路１０４を用いた試料溶液の循環系以外の構成も採用できる。例えば、図７に示すように反応チャンバーとポンプとの連結する流路に温度制御機構を設ける。これにより、回収および供給を反復して行うことができる。この場合、ポンプはシリンジポンプを用いることができる。
【００３２】
一般的に標的核酸とその相補鎖が存在する状態では、標的核酸は相補鎖との２本鎖を形成しており、プローブ核酸と結合することが可能な１本鎖核酸の比率は非常に少ない。このため、プローブとのハイブリダイゼーション反応が起こりにくい。通常は、標的核酸はプローブ核酸よりも長鎖なので、平衡状態においては、プローブ核酸とのハイブリダイゼーション反応が生じる確率（量）は更に非常に少ない。ハイブリダイゼーションの前段階で２本鎖が解離する温度まで反応液を加熱しても、ハイブリダイゼーションの至適温度まで低下させると、再度２本鎖が形成されてしまう。これにより結局、プローブとのハイブリダイゼーション反応に寄与する１本鎖は少なく、反応速度が非常に遅かった。この問題を本実施形態は解決することができるので、ハイブリダイゼーションの効率化、高感度化が達成される。
【００３３】
（第２の実施形態）
次に、本発明のもう一つの実施の形態を、図４を用いて説明する。図４は、標的核酸の増幅と同時にハイブリダイゼーション反応を行う装置の例を示している。図４において、４０１はプローブ核酸を固定するための基板、４０２は標的核酸およびＰＣＲ試薬が含まれた反応液を保持するための微小空間を形成するチャンバー、４０３は標的核酸と特異的に結合するプローブ核酸である。チャンバー４０２には、反応液の流出口４０５と流入口４０６を具備し、流出口４０５と流入口４０６を流路４０４が連結している。流路４０４には、ポンプ４０９が具備され、不図示の反応液を循環させる。また、流路４０４には、第一温度制御手段４０７、第二温度制御手段４０８が具備され、循環する反応液の温度を制御する。そして、本装置で特徴となるのが、循環する反応液をＰＣＲの各工程に最適な温度に制御するための、第三の温度制御手段４１７、第四の温度制御手段４１８、第五の温度制御手段４１９である。
【００３４】
以下に図４の装置を用いた場合のハイブリダイゼーション方法の流れを説明する。標的核酸を、ＰＣＲに必要な試薬を含む、適当な配合のハイブリダイゼーション溶液に調整する。ＰＣＲ試薬とは、ＰＣＲ反応に利用される試薬であり、一例として以下を含む。
１．標的配列の増幅部位の両端に特異的に結合するプライマ−ＤＮＡ
２．標的核酸に結合したプライマ−から標的配列に相補的にＤＮＡを合成するＤＮＡポリメラーゼ
３．ＤＮＡ合成に必要な各種ヌクレオチド
４．塩化マグネシウムや塩化カリウム等の塩類
５．トリス等のバッファー
ハイブリダイゼーション溶液組成の一例としては、バッファー、フォルムアミド等の変性剤、消泡剤があるが、前記のＰＣＲ試薬の機能を阻害しないものが望ましい。また、ハイブリダイゼーションの検出のために、標識プライマ−や、ＣＹＢＥＲＧＲＥＥＮ等のインターカレータ、標識ヌクレオチドを含む場合もある。プローブ核酸４０３を固定した基板上４０１を、チャンバー４０２に接合する。前記実施の形態と同様にして、流路４０４中に前記ハイブリダイゼーション溶液を注入する。基板４０１をハイブリダイゼーションに至適な温度であるｔ１に制御する。ハイブリダイゼーションに至適な温度ｔ１はプローブ核酸４０３や標的核酸によって異なるが、概ね５０℃程度である。第一の温度制御手段４０７は標的核酸の変性温度であるｔ２に制御する。変性温度ｔ２は標的核酸によって異なるが、概ね９５℃程度である。第二の温度制御手段４０８は、ハイブリダイゼーションに至適な温度ｔ１に制御する。第三、第四、第五の温度制御手段は、ＰＣＲの各工程に最適な温度に制御する。ＰＣＲの各工程としては、標的２本鎖の変性温度としては９５℃程度、１本鎖標的核酸とプライマ−とのアニーリング温度として６０℃程度、伸長反応温度として７２℃程度が好適である。第三、第四、第五の温度制御手段を上記のように９５℃、６０℃、７２℃程度に制御し、ポンプ４０９を作動させて流路４０４中にハイブリダイゼーション溶液を図上時計回りに循環させる。図中の黒い矢印はハイブリダイゼーション溶液の循環方向を示している。標的核酸は第三の温度制御手段４１７で１本鎖に乖離され、第四の温度制御手段４１８でアニール温度に制御され、反応液中のプライマ−核酸とアニールされる。そして、第五の温度制御手段４１９において前記プライマ−から伸長反応が進み、標的核酸は増幅される。増幅されて２本鎖状態となった標的核酸は、第一の温度制御手段４０７で再度１本鎖に乖離され、直ちに第二の温度制御手段４０８によってｔ１に制御される。標的核酸自身の２本鎖が形成される前にチャンバー４０２に到達し、プローブ核酸４０３に接触して、ハイブリダイゼーション反応が進行する。チャンバー４０２を通過した反応液は、再度第三、第四、第五の温度制御手段によって核酸増幅されて、チャンバー４０２に循環する。１〜５０時間程度経た後に、ポンプ４０９を停止し、基板４０１を取り出す。基板４０１上のプローブ核酸４０３に結合した標的核酸の蛍光色素等を、適当な顕微鏡で観察する。このように、ハイブリダイゼーション反応とＰＣＲ反応が同時に進行することにより、微小検体においても感度良く標的核酸の有無を検出することが可能となる。また、ＰＣＲ反応およびハイブリダイゼーション反応中の状態を観察する構成も可能である。
【００３５】
次に、本実施形態のハイブリダイゼーション検出方法について、図５を用いて説明する。５０１基板に、プローブ核酸５０３が固定されている。プローブ核酸５０３は、標的核酸５１２と特異的に結合する核酸配列を持っている。本実施形態の特徴となるのが、プローブ核酸５０３に標識されている第一の色素５２０と、標的核酸５１２に標識されている第二の色素５２１である。第一の色素５２０と第二の色素５２１は、この両者においてＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：蛍光共鳴エネルギー移動）を起こすことが出来る１対の蛍光色素である。第一の色素５２０および、第二の色素５２１は、プローブ核酸５０３もしくは標的核酸５１２のどの位置に結合されていても良いが、結合時に両者がＦＲＥＴ現象を起こせる距離であることが必要である。ＦＲＥＴとは、ある蛍光分子（ドナー分子）から他の分子（アクセプター分子）へ励起エネルギーが移動する現象である。ＦＲＥＴ現象が起こるのは、ドナー分子とアクセプター分子が近い場合（通常５０−１００Å以内）に限られるため、両化合物の距離に応じて外部から観察される蛍光強度が変化することになる。図５のように、プローブ核酸５０３にドナー色素として第一の色素５２０を、標的核酸５１２にアクセプター色素として第二の色素５２１を結合させておくと、プローブ核酸５０３と標的核酸５１２が結合しているときのみＦＲＥＴ現象が起こり、蛍光が発せられる。プローブ核酸５０３に結合していない標的核酸５１２においては、ＦＲＥＴ現象が起こらないため発光しない。よって、標識された標的核酸を含有した反応液中においても、未結合の標的核酸の影響を排除でき、正確にプローブ核酸と標的核酸の結合を検出することが可能となる。
【００３６】
本実施形態の構成においては、従来別の構成で行なわれていたＰＣＲ増幅工程とハイブリダイゼーション工程を同一の構成で実現する点に特徴がある。これにより、各工程間の液体移動に伴う混液（コンタミネーション）の影響を減ずるなどの効果を有する。
【００３７】
従って、微量サンプルにおいても核酸増幅の前処理が不要となり、操作の簡便化、汚染の危険性排除、所要時間の短縮が可能となる。
【００３８】
さらに、本発明のもう一つのハイブリダイゼーション検出方法について、図６を用いて説明する。６０１基板に、プローブ核酸６０３が固定されている。プローブ核酸６０３は、標的核酸６１２と特異的に結合する核酸配列を持っている。６２２が標識プローブであり、標的核酸６１２のプローブ核酸６０３結合部位に近接した部位と特異的に結合する構成となっている。本実施形態の特徴となるのが、プローブ核酸５０３に標識されている第一の色素５２０と、標識プローブ６２２に標識されている第三の色素６２３である。第一の色素６２０と第三の色素６２３は、この両者においてＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：蛍光共鳴エネルギー移動）を起こすことが出来る１対の蛍光色素である。第一の色素６２０および、第三の色素６２３は、プローブ核酸６０３もしくは標識プローブ６２２のどの位置に結合されていても良いが、結合時に両者がＦＲＥＴ現象を起こせる距離であることが必要である。プローブ核酸６０３と標的核酸６１２が結合しているときのみ、第一の色素６２０と第三の色素６２３間でＦＲＥＴ現象が起こり、蛍光が発せられる。標的核酸６１２がプローブ核酸６０３に結合していない場合には、ＦＲＥＴ現象が起こらないために発光しない。よって、標的核酸を標識する必要がなく、正確にプローブ核酸と標的核酸の結合を検出することが可能となる。
【００３９】
（第３の実施形態）
また、第３の実施形態として、上記の実施形態の装置構成における反応チャンバー部分の構成をカートリッジ化させたハイブリダイゼーションシステムをも提供する。
【００４０】
すなわち、標的核酸と特異的に結合可能なプローブ核酸が固定されたカートリッジにおいて、プローブ核酸を収納する反応チャンバーと、反応チャンバーに標的核酸を含む試料溶液を供給するための供給口と、前記反応チャンバーに供給された試料溶液を回収するための回収室とを有するように構成する。
【００４１】
この回収部は、図８に示すように反応チャンバーに対して試料溶液を循環させる循環路を構成している構成が好ましい。
【００４２】
例えば図８に示すように、流路、プローブ基板を含む部分をカートリッジとして構成し、温度制御手段、供給手段を別体の装置として構成する系も本発明に含まれる。
【００４３】
上記のカートリッジを用いて、標的核酸とプローブ核酸とをハイブリダイゼーションさせる装置は、カートリッジを設置する設置部と、カートリッジの供給口から試料溶液を供給する供給機構と、反応チャンバーに供給された試料溶液を前記回収室に回収させる回収機構と、回収された試料溶液を変性温度以上に加熱する加熱器とを有し、回収機構は、加熱後の試料溶液を回収室から再び反応チャンバーに供給するように構成されている構成にすればよい。
【００４４】
図８において、８０７、８０８は、それぞれ第１の被温度制御部、第２の被温度制御部であって、熱伝導性のよい部材により構成されており、それぞれ温度制御手段（不図示）により流路内の液体を温度制御できるように構成されている。８０９は、ポンプ手段接続部であり、外部のポンプ手段を接続可能に構成されている。具体的に例えば、該流路部分を弾性部材で構成し、外部のポンプ手段として弾性部材を一方向にしごく手段を用いることで、ポンプ作用により流路内の液体を移動させることができる。
【００４５】
このようなカートリッジは、樹脂成型技術やμ（マイクロ）−ＴＡＳ技術を使用すれば当業者において製造できる。
【００４６】
また、複数サンプルの一括処理のために、上記の反応系を複数保持したカートリッジ、またはカートリッジを複数保持できる装置の構成も本発明に含まれる。
【実施例】
【００４７】
以下に本発明のハイブリダイゼーション方法および装置の実施例を示すが、以下の実施例で本発明の内容が限定されるものではない。
【００４８】
（実施例１）
まず、プローブ核酸として、２００種の標的配列とそれぞれ特異的に結合する２０ｍｅｒの１本鎖ＤＮＡを２００種合成した。これら２００種のプローブ核酸を、特開平１１−１８７９００号公報で開示されている方法で、石英基板に固定した。
【００４９】
次に、前記基板を図１のような装置にセットした。第一の温度制御手段は９５℃に設定し、第二の温度制御手段は５０℃に設定した。また、基板が５０℃になるようにチャンバーを温度制御した。
【００５０】
全体の液量を１ｍｌとし、第一の温度制御において９５℃に制御されている時間が３０秒、第二の温度制御手段を通って反応液が５０℃になってからチャンバーに到達するまでの時間が３秒になるように流路とポンプを設定した。
【００５１】
前記２００種の標的核酸が含まれた試料を、Ｃｙ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）色素を用いて標識し、ハイブリダイゼーション溶液１ｍｌに調整した。ハイブリダイゼーション溶液の組成は、一般的に使用されている以下の組成を用いた。
６×ＳＳＰＥ／１０％ホルムアミド／０．０５％ＳＤＳ／標識化標的物質
（６×ＳＳＰＥ：ＮａＣｌ  ９００ｍＭ，ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ  ６０ｍＭ，ＥＤＴＡ６ｍＭ，ｐＨ７．４）
調整したハイブリダイゼーション溶液を、装置に投入し、ポンプを作動させた。２時間後にポンプを停止し、基板を取り出した。
【００５２】
取り出した基板を界面活性剤が含まれた適当なバッファー溶液で洗浄し、ＤＮＡアレイ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ）を用いで蛍光測定を行った。同様の操作で４時間反応させた基板に対しても、同様の測定を行った。また、標的核酸が含まれていない検体に関しても同様の操作を行った。
【００５３】
測定した２００種のプローブ核酸における、輝度の平均は以下のとおりであった。標的がない場合には輝度が検出されず、誤検出がないことが確認できた。また、４時間後の輝度に比較して、２時間後の輝度が１／２よりも大幅に大きく、２時間後で十分に検出可能な輝度に達していることが分かった。
【００５４】
【表１】
2007209236.tif 000003
【００５５】
（比較例１）
ハイブリダイゼーション反応を、市販のハイブリダイゼーション装置であるＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製  ＨｙｂＡｒｒａｙ２を使用してハイブリダイゼーションを行った。プローブ核酸、基板、標的核酸、ハイブリダイゼーション溶液の組成は、実施例１と全く同様である。
【００５６】
実施例１と同様に、２時間後と４時間後に蛍光輝度を測定し、さらに標的核酸が含まれていない検体に対しても測定した。測定した２００種のプローブ核酸における、輝度の平均は以下のとおりであった。
【００５７】
【表２】
2007209236.tif 000004
【００５８】
実施例１と比較して、２時間後および４時間後ともに、輝度が大幅に弱かった。また、２時間後と４時間後を比較すると概ね時間と輝度が比例しており、４時間まではまだ反応途中であることが予想される。
【００５９】
このように、本発明の装置を用いると、ハイブリダイゼーション反応に必要な時間が大幅に削減され、輝度も大幅に高いために検出感度が大幅に向上する。
【００６０】
（実施例２）
次に、本発明のもう一つの実施例を説明する。本例は図４のような装置を用いて、標的核酸を増幅しつつハイブリダイゼーションを行う方法を示す。
【００６１】
まず、実施例１と同様に、プローブ核酸が固定された基板を準備し、図４のような装置にセットした。標的核酸も実施例１と同様であるが、その濃度を１／１０００とした。ハイブリダイゼーション溶液の組成として、ＰＣＲ関連の試薬を含むのが特徴である。ＰＣＲ試薬としては、ＥｘＴａｑ酵素（ＴａＫａＲａ製）、ＭｇＣｌ２を含むバッファーを使用し、ハイブリダイゼーション溶液には有機溶剤は含まないようにした。また、ＰＣＲ試薬の一つであるヌクレオチドには、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）を含み、増幅産物をＣｙ３で標識する構成とした。
【００６２】
第一の温度制御手段は９２℃に設定し、第二の温度制御手段は５０℃に設定し、基板が５０℃になるようにチャンバーを温度制御した。そして、第三の温度制御手段を９２℃に、第四の温度制御手段を６５℃に、第五の温度制御手段を７２℃に設定した。全体の液量を１ｍｌとし、各各制御手段により制御されている時間を以下のようになるよう流路とポンプ（流路を流れる試薬の送液速度）を設定した。制御第三の温度制御手段において９２℃に制御されている時間が４５秒、第四の温度制御手段において６５℃に制御されている時間が４５秒、第五の温度制御手段において７２℃に制御されている時間が４５秒である。さらに、第一の温度制御において９５℃に制御されている時間が３０秒、第二の温度制御手段を通って反応液が５０℃になってからチャンバーに到達するまでの時間が３秒になるように流路とポンプを設定した。
【００６３】
調整したハイブリダイゼーション溶液を、装置に投入し、ポンプを作動させた。２時間後にポンプを停止し、基板を取り出した。
【００６４】
取り出した基板を界面活性剤が含まれた適当なバッファー溶液で洗浄し、ＤＮＡアレイ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ）を用いで蛍光測定を行った。また、標的核酸が含まれていない検体に関しても同様の操作を行った。さらに、増幅の効果を確認するために、ＰＣＲ試薬を含まないハイブリダイゼーション液で同様の実験を行った。
【００６５】
測定した２００種のプローブ核酸における、輝度の平均は以下のとおりであった。標的がない場合には輝度が検出されず、誤検出がないことが確認できた。また、ＰＣＲ試薬を含まない場合には、輝度が非常に低く、本実施例で検出された標的核酸が、本装置で増幅された物であることが確認できた。
【００６６】
【表３】
2007209236.tif 000005
【００６７】
（比較例２）
まず、実施例２と同じ標的核酸を、ＰＣＲ法によって増幅した。ＰＣＲ試薬およびＰＣＲ装置は市販されている一般のものを使用し、温度サイクルも実施例２と同様に、９５℃→６５℃→７２℃とした。上記サイクルを４０サイクル実行し、所要時間は２時間３０分であった。
【００６８】
その後、前記手順で増幅した標的核酸を、市販のハイブリダイゼーション装置を使用してハイブリダイゼーションを行った。プローブ核酸、基板、標的核酸、ハイブリダイゼーション溶液の組成は、実施例１と全く同様である。
【００６９】
実施例２と同様に、２時間後に蛍光輝度を測定し、さらに標的核酸が含まれていない検体に対しても同様の操作を行った後に蛍光測定した。測定した２００種のプローブ核酸における、輝度の平均は以下のとおりであった。
【００７０】
【表４】
2007209236.tif 000006
【００７１】
実施例２と比較して、輝度が大幅に弱かった。しかも、増幅工程を含めると作業時間は４時間３０分となり、実施例２の倍以上の時間がかかっている。また、標的核酸が含まれていない検体においても輝度が確認されており、作業時に何らかの異物の混入があったものと思われる。
【００７２】
このように、本発明の装置を用いると、非常に少ない標的核酸量であっても、感度良くハイブリダイゼーション反応を行うことが可能で、作業時間を短縮することが可能である。また、作業手順が少ないために、異物混入の影響のない、信頼性の高い反応を行うことが可能となる。
【００７３】
これら実施例の結果から、本発明の方法および装置をもちいると、効率良く高感度なハイブリダイゼーションが可能となることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】本発明の方法を行うのに好適な装置を示す模式図である。
【図２】ハイブリダイゼーション反応の概要を示す模式図である。
【図３】本発明の方法を行うのに好適な装置を示す模式図である。
【図４】本発明の方法を行うのに好適な装置を示す模式図である。
【図５】本発明の検出方法の概要を示す模式図である。
【図６】本発明の検出方法の概要を示す模式図である。
【図７】本発明の方法を行うのに好適な装置を示す模式図である。
【図８】本発明の方法を行うのに好適なカートリッジを示す模式図である。
【符号の説明】
【００７５】
１０１、２０１、３０１、４０１、５０１、６０１、７０１、８０１  基板
１０２、３０２、４０２、７０２、８０２  チャンバー
１０３、２０３、３０３、４０３、５０３、６０３、７０３、８０３  プローブ核酸
１０４、３０４、４０４、７０４、８０４  流路
１０５、３０５、４０５、７０５、８０５  流出口
１０６、３０６、４０６、７０６、８０６  流入口
１０７、３０７、４０７、７０７  温度制御手段１
１０８、３０８、４０８、７０８  温度制御手段２
１０９、３０９、４０９、７０９  ポンプ
８０７  第１被温度制御部
８０８  第２被温度制御部
８０９  ポンプ手段接続部
２１０  標的核酸
２１１  標的核酸センス鎖
２１２、５１２、６１２  標的核酸アンチセンス鎖
３１３  空気抜き
３１４  注入口
３１５  バルブ
３１６  バルブ
４１７  第三の温度制御手段
４１８  第四の温度制御手段
４１９  第五の温度制御手段
５２０、６２０  第一の色素
５２１  第二の色素
６２２  標識プローブ
６２３  第三の色素
【図１】
2007209236.tif 000007
【図２】
2007209236.tif 000008
【図３】
2007209236.tif 000009
【図４】
2007209236.tif 000010
【図５】
2007209236.tif 000011
【図６】
2007209236.tif 000012
【図７】
2007209236.tif 000013
【図８】
2007209236.tif 000014