(57)【要約】【課題】ＤＮＡの塩基配列、特にＤＮＡ固定化担体に固定されたＤＮＡの塩基配列を、短時間で簡便な処理によって解析するための手段を提供することを目的とする。【解決手段】ＤＮＡの５´末端のリン酸基に、一般式（Ｉ）で表されるＣｅ４＋配位子を結合させて、前記ＤＮＡの５´末端の塩基と該塩基に隣接する塩基との間のホスホジエステル結合を切断し、切断された末端塩基を、質量分析法により解析することを特徴とするＤＮＡの塩基配列解析方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡの５´末端のリン酸基に、一般式（Ｉ）
【化１】
2007060969.tif 000004
で表されるＣｅ４＋配位子を結合させて、前記ＤＮＡの５´末端の塩基と該塩基に隣接する塩基との間のホスホジエステル結合を切断し、切断された末端塩基を、
質量分析法により解析することを特徴とするＤＮＡの塩基配列解析方法。
【請求項２】
ＤＮＡの５´末端のリン酸基に、一般式（Ｉ）
【化２】
2007060969.tif 000005
で表されるＣｅ４＋配位子を結合させて、前記ＤＮＡの５´末端の塩基と該塩基に隣接する塩基との間のホスホジエステル結合を切断し、切断された末端塩基を質量分析法により解析し、
続いて切断されたＤＮＡの５´末端に上記Ｃｅ４＋配位子を結合させて、前記切断されたＤＮＡの５´末端の塩基と該塩基に隣接する塩基との間のホスホジエステル結合を切断し、
切断された末端塩基を、質量分析法により解析し、
この操作を、ＤＮＡの所定の塩基と該塩基に隣接する３´末端の塩基との間が切断されるまで順次続けることを特徴とするＤＮＡの塩基配列解析方法。
【請求項３】
ＤＮＡが、基体に固定されてなるものである請求項１又は２記載のＤＮＡの塩基配列解析方法。
【請求項４】
ＤＮＡが、マグネシウムイオンを含むＤＮＡ溶液中に基体を浸漬することにより基体に固定されてなるものである請求項３記載のＤＮＡの塩基配列解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、塩基配列解析方法に関し、詳しくは、短時間で簡便な処理のみで、ＤＮＡ固定化担体に固定されたＤＮＡの塩基配列を正確な解析を可能にする塩基配列解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡチップ（マイクロアレイ）やＤＮＡビーズアレイなどのＤＮＡ固定化担体は、疾病診断、治療のほか、ゲノム解析などにも広く用いられている。このＤＮＡ固定化担体に所望のＤＮＡが固定化されているかどうかを確認するため、種々の塩基配列解析方法が開発されている（例えば、特許文献１および非特許文献１参照）。
しかし、これらの方法では、二次構造がハイブリダイゼーションを阻害し、かつ配列の反復が正しい解析を妨げる、あるいは、３位で修飾された塩基により、ポリメラーゼの組み込み反応が妨げられるといった問題があった。
【０００３】
また、ＤＮＡの塩基配列を解析するにあたり、特定の塩基配列を認識する制限酵素によりＤＮＡを短く切断してから調べる方法もあるが、これらの酵素が認識する塩基配列は、限られた４〜６塩基のみであるなどの限界があり、正確に特定の部位でＤＮＡを切断する方法が必要とされていた。
酵素を使わずにＤＮＡを切断する方法としては、加水分解による方法が提案されている。例えば、特許文献２には、１本鎖ＤＮＡの塩基配列認識部位にＤＮＡ断片（末端に切断反応の触媒が結合）を結合させ、該触媒部位で１本鎖ＤＮＡを切断のセリウム（Ｃｅ，ＩＶ）と、ポリアミン−Ｎ−ポリカルボン酸あるいはその誘導体よりなる錯体を用いた加水分解による切断方法が提案されている。
また、非特許文献２には、１本鎖ＤＮＡの塩基配列認識部位にＤＮＡ断片を２つ結合させ、Ｃｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡを作用させて該ＤＮＡ断片の間部分で１本鎖ＤＮＡを切断する方法が提案されている。
しかし、これらの方法は、いずれも加水分解による切断のみに対応したものであり、他の切断方法が想定されたものではなかった。また、加水分解反応に多大な時間がかかるなどの問題点があった。
【０００４】
一方、ＤＮＡ固定化担体の製造は、基体に所望のＤＮＡを固定化して行われ、従来はリガーゼなどの酵素を利用する酵素的ＤＮＡ固定化法が用いられていた（特許文献３および４参照）。
酵素的ＤＮＡ固定化法では、基体を活性化した後、まず２本鎖の短いオリゴヌクレオチドをチップ上に固定して、その後で所望のオリゴヌクレオチドを制限酵素末端を利用して、ＤＮＡリガーゼを利用して固定化させていた。
しかし、この方法では、ＤＮＡを基体に確実に固定化することが困難であったほか、多くの工程を経る必要があり、多くの試薬や機器が必要なほか、処理に相当の長時間を要するという問題点があった。
【０００５】
このような状況下、ＤＮＡの塩基配列、特にＤＮＡ固定化担体に固定されたＤＮＡの塩基配列をより正確、迅速、かつ簡便に解析する方法の開発が望まれていた。
【０００６】
【特許文献１】特許公表２００４−５２９６５０号公報
【特許文献２】特開２００１−８９４３０号公報
【特許文献３】国際特許公開ＷＯ０１−６８３６８号公報
【特許文献４】国際特許公開ＷＯ０１−４０１７３号公報
【非特許文献１】Nucleosides & Nucleotides : 1999 Feb; 18(2): 197-201
【非特許文献２】Chem.Letters:2004;33,300-301
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記従来の問題に鑑みて、ＤＮＡの塩基配列、特にＤＮＡ固定化担体に固定されたＤＮＡの塩基配列を、短時間で簡便な処理によって解析するための手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、特定の構造を有するＣｅ４＋配位子を５´末端のリン酸基に結合させると、５´末端塩基と隣接する塩基との間のホスホジエステル結合の切断が容易になり、その結果、切断された塩基をひとつひとつ解析していくことによりＤＮＡの塩基配列を解析できることを見出した。
また、本発明者らは、マグネシウムイオンを利用したＤＮＡ固定化担体の製造方法の発明を開発したが、かかる製造方法により得られる強固に固定化されたＤＮＡであっても、ごく短時間で正確に塩基解析できることを見出し、本発明に到達した。
【０００９】
本発明の請求項１に記載のＤＮＡの塩基配列解析方法は、ＤＮＡの５´末端のリン酸基に、一般式（Ｉ）
【化３】
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で表されるＣｅ４＋配位子を結合させて、前記ＤＮＡの５´末端の塩基と該塩基に隣接する塩基との間のホスホジエステル結合を切断し、切断された末端塩基を、質量分析法により解析することを特徴とする。
請求項２に記載のＤＮＡの塩基配列解析方法は、ＤＮＡの５´末端のリン酸基に、一般式（Ｉ）で表されるＣｅ４＋配位子を結合させて、前記ＤＮＡの５´末端の塩基と該塩基に隣接する塩基との間のホスホジエステル結合を切断し、切断された末端塩基を質量分析法により解析し、続いて切断されたＤＮＡの５´末端に上記Ｃｅ４＋配位子を結合させて、前記切断されたＤＮＡの５´末端の塩基と該塩基に隣接する塩基との間のホスホジエステル結合を切断し、切断された末端塩基を、質量分析法により解析し、この操作を、ＤＮＡの所定の塩基と該塩基に隣接する３´末端の塩基との間が切断されるまで順次続けることを特徴とする。
請求項３に記載の本発明のＤＮＡの塩基配列解析方法は、上記請求項１又は２に記載の塩基配列解析方法において、ＤＮＡが、基体に固定されてなるものであることを特徴とする。
請求項４に記載の本発明のＤＮＡの塩基配列解析方法は、上記請求項３に記載の塩基配列解析方法において、ＤＮＡが、マグネシウムイオンを含むＤＮＡ溶液中に基体を浸漬することにより基体に固定されてなるものであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の塩基配列解析方法によれば、短時間で簡便な処理のみで、ＤＮＡ固定化担体に固定されたＤＮＡの塩基配列を正確に解析することが可能となる。
また、従来日単位であったＤＮＡ塩基配列の解析を時単位にすることが可能になり、電気泳動方式に比べ測定感度も桁違いに向上し、使用するＤＮＡ量も少量ですみ、それに伴いコストも抑えることができる。
さらに、１塩基ずつ切断しては測定するということで測定可能なＤＮＡ鎖長に限界がなくなる。さらにまた、修飾塩基であっても１塩基ずつ測定しているのでどの部分が修飾されているのか判別するのも容易となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の塩基配列解析方法は、ＤＮＡの塩基を５´末端から１つ、あるいは複数の塩基を５´末端から順次解析する方法である。すなわち、本発明の塩基配列解析方法は、ＤＮＡの５´末端のリン酸基に、一般式（Ｉ）で表されるＣｅ４＋配位子を結合させて、前記ＤＮＡの５´末端の塩基と該塩基に隣接する塩基との間のホスホジエステル結合を切断し、切断された末端塩基を、質量分析法により解析することを特徴とする。
【００１２】
一般式（Ｉ）で表されるＣｅ４＋配位子は、図１に示すように、ＤＮＡの５´末端のリン酸基に特異的に結合する。
一般式（Ｉ）で表されるＣｅ４＋配位子の基本骨格は、後述の製造例１で記載するように、m−キシレンα，α´−ジアミンを原料とする有機合成反応を進めることにより得ることができる。
一般式（Ｉ）で表されるＣｅ４＋配位子は、Ｃｅを保持するサイトを有しているので、機能的蛍光色素として有用である。
【００１３】
本発明の塩基配列解析方法においては、まず、上記したようなＤＮＡの５´末端のリン酸基に、一般式（Ｉ）で表されるＣｅ４＋配位子を結合させる。
一般式（Ｉ）で表されるＣｅ４＋配位子の結合は、例えば、ＤＮＡ断片を、ｄＨ２Ｏ等に溶かした溶液と、これに適当な緩衝液と共にＣｅ４＋配位子をＤＭＳＯ等の溶媒で濃度を１〜１００ｍＭに適宜調製した後、ｄＨ２Ｏ等と混合し、２０〜３５℃で一晩穏やかに振盪反応後、エタノール沈殿等により精製する。
ＤＮＡ断片は、予めエタノール沈殿、ＲＰＣカラム、ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ等により精製しておくことが好ましい。
ＤＮＡの５´末端のリン酸基と、一般式（Ｉ）で表されるＣｅ４＋配位子色素との結合率は、９０％以上となることが好ましい。
【００１４】
本発明の塩基配列解析方法においては、次に、前記ＤＮＡの５´末端の塩基と該塩基に隣接する塩基との間のホスホジエステル結合を切断する。切断の一例を模式図で説明すると、図２のとおりである。
切断方法については特に限定されず、加水分解やレーザーによる切断を挙げることができる。例えば、加水分解により切断する場合には、一般式（Ｉ）で表されるＣｅ４＋配位子とＤＮＡとを反応させた後は、ＤＮＡにＣｅ４＋を導入して金属錯体化すると共に加水分解する。具体的には例えば、反応後の試料をｄＨ２Ｏ等に溶解させた後、（ＮＯ２）２Ｃｅ（ＮＨ４）２水溶液を加え、２０〜３５℃で６〜２４時間穏やかに振盪反応を行うことができる。振盪反応終了後、必要に応じて、エタノール沈殿等により精製させ、ｄＨ２Ｏに溶解させておくことができる。
一方、反応時間短縮のためレーザー照射により切断する場合には、一般式（Ｉ）で表されるＣｅ４＋配位子とＤＮＡとを反応させた後、ＤＮＡにＣｅ４＋を導入してレーザー照射する。具体的には例えば、反応後の試料をｄＨ２Ｏ等に溶解させた後、（ＮＯ２）２Ｃｅ（ＮＨ４）２水溶液を加え、レーザー照射後、必要に応じて、エタノール沈殿等により精製させ、ｄＨ２Ｏに溶解させておくことができる。ここで、レーザーとしてはＹＡＧレーザー、色素レーザー等を用いて、照射量を１〜１００ｍＷで１０〜６０秒の照射条件とすることができる。
【００１５】
本発明の塩基配列解析方法においては、上記切断反応により切断された末端塩基を質量分析により確認する。５´末端の塩基と該塩基に隣接する塩基との間のホスホジエステル結合が切断されたかどうかをも確認することができる。
質量分析は、ＴＯＦ／ＭＳ、電気泳動，ＨＰＬＣ等質量分析に通常用いられる方法を用いることができるが、このうち正確さ、簡便さ等の点、さらには測定にかかる時間の短縮という点でＴＯＦ／ＭＳが好ましい。ＴＯＦ／ＭＳの場合、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ装置などを用いることができる。
ＴＯＦ／ＭＳによる測定は、例えば、以下のようにして行うことができる。マトリックスとして３−ヒドロキシピコリン酸（３−ＨＰＡと略す）溶液を、切断確認の対象たるＤＮＡとマイクロプレート上で混合し、真空中徐々に溶媒除去し、混晶を形成させる。この混晶に、レーザーを照射しマトリックス援用レーザー脱離質量分析により分子量分析し、ピーク同士の質量差から配列決定し、当初のＤＮＡよりも５´末端の一塩基が少ないことを確認する。
【００１６】
本発明の塩基配列解析方法は、上記の操作を特定の部位まで続けることにより、所望のＤＮＡ、特に固定化担体上に固定されたＤＮＡの塩基配列を得るために用いることができる。すなわち、ＤＮＡの５´末端のリン酸基に、上記一般式（Ｉ）で表されるＣｅ４＋配位子を結合させて、前記ＤＮＡの５´末端の塩基と該塩基に隣接する塩基との間のホスホジエステル結合を切断し、続いて切断されたＤＮＡの５´末端に上記Ｃｅ４＋配位子を結合させて、前記切断されたＤＮＡの５´末端の塩基と該塩基に隣接する塩基との間のホスホジエステル結合を切断し、この操作を、所定の塩基と該塩基に隣接する３´末端の塩基との間が切断されるまで順次続けることにより、もとのＤＮＡから、５´末端から何塩基かが切り離されたＤＮＡを得ることができる。
このような本発明の切断方法は、例えば、ＰＣＲなどに用いられるプライマーやプローブなどの塩基配列を一部に含むＤＮＡに適用することにより、その塩基配列部分のみを正確に切り出すことができる。
【００１７】
このような本発明のＤＮＡの塩基配列解析方法の対象であるＤＮＡは、基体に固定されてなるものであること、すなわち、ＤＮＡチップ（マイクロアレイ）やＤＮＡビーズアレイなどのＤＮＡ固定化担体が好ましい。
ここで、基体としては、素材及び形状のいずれも特に限定されない。素材としては、ガラス、ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボンなどを挙げることができる。また、形状としては、チップ状、ビーズ状などのいずれであっても良い。中でも、いわゆるＤＮＡチップとして用いられている素材及び形状であれば、特に限定されない。
【００１８】
本発明のＤＮＡの塩基配列解析方法の好ましい対象であるＤＮＡ固定化担体の製法は、特に限定されないが、ＤＮＡをマグネシウムイオンを含むＤＮＡ溶液中に基体を浸漬することにより基体に固定させる方法が最も好ましい。マグネシウムイオンをＤＮＡ溶液中に溶解させておくことにより、ＤＮＡの立体構造を安定化し、基体との結合を効率よく媒介することができる。
【００１９】
ＤＮＡをマグネシウムイオンを含むＤＮＡ溶液中に基体を浸漬することにより基体に固定させる方法を、一例を挙げて以下に説明する。ＤＮＡ溶液に含ませるＤＮＡは、基体に固定させたいＤＮＡであれば良く、鎖長、１本鎖か２本鎖の別、直鎖状か環状を問わないが、特に鎖長については３ｂｐ以上、中でも２０ｂｐ〜１００ｋｂｐであることが好ましい。また、ＤＮＡの由来や調製方法も特に限定されず、動植物、微生物、ウイルスなど天然の生物由来のものであっても良いし人工的に合成したものであっても良い。更に、ＤＮＡは、予め制限酵素処理がなされたものであっても良いし、ＰＣＲ増幅産物などであっても良い。
また、ＤＮＡ溶液には１種類のＤＮＡだけでなく複数種類のＤＮＡを含ませることもでき、この場合には、ＤＮＡライブラリーなど、塩基配列の異なる複数種類のＤＮＡを固定化させたＤＮＡ固定化担体を得ることができる。
【００２０】
ＤＮＡ溶液において、ＤＮＡの濃度は、基体自身の固定化の上限によって適宜調整することができ、基本的に高い方が固定化量も増え、具体的には０．０５μｇ／μＬ以上とすることが好ましい。ＤＮＡの量が０．０５μｇ／μＬ未満であると、ＤＮＡを十分量基体に固定させることができないので好ましくない。一般に、用いる基体の大きさにより結合するＤＮＡ量の上限は決まるので、基本的には０．０５μｇ／μＬ以上であれば問題ないが、好ましい上限は１μｇ／μＬ以下とすることができる。例えば、実施例で用いた基体のサイズの場合、もっとも好ましいＤＮＡの濃度は、０．５〜１μｇ／μＬ、特に０．７〜１μｇ／μＬである。
【００２１】
一方、ＤＮＡ溶液に含ませるマグネシウムイオンとしては、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、（ＣＨ３ＣＯＯ）２Ｍｇ等のマグネシウム塩があるが、扱いやすさ、手に入れやすさ等の理由からＭｇＣｌ２を用いることが好ましい。なお、マグネシウム塩であっても水溶性でない場合は、ＤＮＡ溶液中に溶解させることが困難となり、本発明の目的が十分に達成されないことから、好ましくない。
【００２２】
一方、ＤＮＡ溶液におけるマグネシウムイオンの濃度は、１ｍＭ以上とすることが好ましい。１ｍＭ未満であると本発明の目的が十分達成されないので好ましくない。もっとも好ましいマグネシウムイオンの濃度は、１０〜２０ｍＭである。
マグネシウムイオンを含むＤＮＡ溶液は、上記マグネシウムイオン及びＤＮＡをｄＨ２Ｏなどと混合撹拌して作成することができる。ＤＮＡ溶液の量は、基体のサイズなどによって適宜調製することができる。
マグネシウムイオンを含むＤＮＡ溶液中に基体を浸漬する際の浸漬時間や浸漬温度は、適宜設定することができる。一般に、浸漬時間は３０分〜４８時間、好ましくは３０分〜２４時間とすることができ、温度は２０〜７０℃、好ましくは３０〜６０℃とすることができる。
【００２３】
ここで、上記したＤＮＡ固定化工程に先立って、基体を水溶性カルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドを含む活性化反応液に浸漬する基体活性化工程を、ＤＮＡ固定化工程に先立って行っておくと、より効率よくＤＮＡの固定を進めることができるので好ましい。
活性化反応液には、水溶性カルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドの両方を含ませておく必要がある。水溶性カルボジイミドのみとした場合には、活性基が不安定で分解しやすく、一方、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのみとした場合には、活性化エステル基を生成しないので、好ましくない。
活性化反応液における水溶性カルボジイミドの濃度は、１〜５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは５〜４０ｍｇ／ｍＬ、特に好ましくは１０〜３０ｍｇ／ｍＬとすることができる。一方、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの濃度は、０．０１〜３０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．１〜２０ｍｇ／ｍＬ、特に好ましくは０．５〜１０ｍｇ／ｍＬとすることができる。上記数値範囲を下回ると、基体活性化工程を行う意味がなく、一方、上記数値範囲を超えると、目的の活性基が得られないとなるので好ましくない。
活性化反応液は、水溶性カルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドを、リン酸緩衝液等の一般的な緩衝液に溶解させることにより調製される。
【００２４】
基体にＤＮＡが固定化したかどうかの確認は、ＰＣＲを利用して行うことができる。すなわち、目的のＤＮＡを増幅させるように設計したプライマーを用いて、ＤＮＡを固定化させた基体を直接鋳型としたＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅産物を電気泳動等により視覚化して確認することができる。
本発明の塩基配列解析方法は、試料輸送・分析部を接続したμＴＡＳ装置のように、塩基の切断から質量分析までの過程をすべて自動で行うことができる装置を用いるとより簡易に行うことができるので、好ましい。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明する。
［製造例１］（Ｃｅ４＋配位子の基本骨格の合成）
出発原料として、ｍ−キシレンα，α´−ジアミン及びジ−ｔｅｒｔ−ブチルカルボン酸を用いて、下記の図５で示す合成経路にて、以下の手順に従い、Ｃｅ４＋配位子の基本骨格の合成を行った。
【００２６】
（１）出発原料からの化合物２の合成
先ず、図５に示すように、ｍ−キシレンα，α´−ジアミン（和光純薬製）０．５０００ｍＬ（３．７９ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのｄｒｙＴＨＦに溶かし、これにジ−ｔｅｒｔ−ブチルカルボン酸（和光純薬製）０．４２５ｍＬ（１．８５ｍｍｏｌ）の２０ｍＬ  ｄｒｙＴＨＦ溶液を氷水浴上で４０分かけてゆっくり滴下した。室温で約１５時間攪拌した後、反応液にｄｉｌ  ＮａＯＨａｑ．を加えて、酢酸エチルで抽出した。有機層は飽和食塩水で洗った後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。
【００２７】
得られた粗生成物（４１０ｍｇ）を５ｍＬのｄｒｙＴＨＦに溶かし、これに１，１´−カルボニルジイミダゾール３９１ｍｇ（２．４７ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２時間攪拌した後、溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、Ｍｅｒｋ７０−２３０ｍｅｓｈ、３０ｇ、酢酸エチル、Ｒｆ＝０．４）で精製したところ、化合物２が３１７ｍｇ（５２％、２ｓｔｅｐｓ）得られた（図５で示す２を参照）。化合物２をＮＭＲで構造解析したところ、以下のとおりであった。
【００２８】
（化合物２のＮＭＲ結果）
化合物２のＮＭＲ結果を示すと、以下のようであった。すなわち、ＮＭＲ（６０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１．３９（ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ），４．０−４．５（ｔｗｏ  ｂｄ，４Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２−），５．７（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−），６．９１，７．５８，８．０３（ｅａｃｈ  ｓ，３ＩＩ，ｉｍｉｄａｚｏｌｅ−Ｈ）、７．１９（ｓ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ），８．７１（ｂｔ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−）
【００２９】
（２）化合物３の合成
ジアミド（図５で示す２を参照）３１７ｍｇ（０．９６ｍｍｏｌ）を３ｍＬのＴＨＦに溶かし、これにｄｉｅｔｈｙｌｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔａｔｅ  ０．１８０ｍＬ（１．００ｍｍｏｌ）を加えた。室温で４０時間（又は５０−６０℃で２時間）後、溶媒を減圧留去し、粗生成物５５０ｍｇを得た。得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、Ｍｅｒｃｋ７０−２３０ｍｅｓｈ、２５ｇ、酢酸エチル、Ｒｆ＝０．６）で精製したところ、化合物３が３９６ｍｇ（９１％）得られた（図５で示す３を参照）。化合物３をＮＭＲで構造解析したところ、以下のとおりであった。
【００３０】
（化合物３のＮＭＲ結果）
化合物３のＮＭＲ結果を示すと、以下のようであった。すなわち、ＮＭＲ（６０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１．２４（ｔ，Ｊ＝７  Ｈｚ，６Ｈ，−ＣＨ３），１．４４（ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ），４．１０（ｓ，４Ｈ，−ＣＨ２ＣＯ２−），４．０−４．４（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２−，−ＣＯ２−ＣＨ２−），５．３（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−），５．９（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−），７．１９（ｓ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）
【００３１】
（３）化合物４の合成
前記化合物３（図５で示す３を参照）３９６ｍｇ（０．８８ｍｍｏｌ）にＣＦ３ＣＯＯＨを０．５００ｍＬ加えて、室温で２時間攪拌したところ、直ちに発泡した。過剰のＣＦ３ＣＯＯＨを減圧留去し、粗生成物として化合物４を得た（図５で示す４を参照）。
【００３２】
（化合物４のＮＭＲ結果）
化合物４をＮＭＲで構造解析したところ、以下のとおりであった。すなわち、ＮＭＲ（６０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１．２５（ｔ，Ｊ＝７  Ｈｚ，６Ｈ，−ＣＨ３），４．０−４．４（ｍ，１０Ｈ，−ＣＨ２−），４．６３（ｂｓ，２Ｈ，−ＣＨ２−），７．３２（ｓ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ），７．６（ｍ，３Ｈ，−ＮＨ３＋）
【００３３】
（４）化合物６の合成
前記化合物４（図５で示す４を参照）の一部を酢酸エチルに溶かして分液漏斗に移し、ｄｉｌＮａＯＨａｑ、次いで飽和食塩水で洗い、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去すると化合物６が得られた（図５で示す６を参照）。尚、化合物５（図５で示す５を参照）は容易に分子内環化して化合物６に変化するように思われた。
【００３４】
（化合物６のＮＭＲ結果）
化合物６をＮＭＲで構造解析したところ、以下のとおりであった。すなわち、ＮＭＲ（６０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１．２７（ｔ，Ｊ＝７  Ｈｚ，３Ｈ，−ＣＨ３），１．７５（ｂｓ，２Ｈ，−ＮＨ２），３．８４−４．４１（ｍ，８Ｈｒ，−ＣＨ２−），４．９６（ｓ，２Ｈ，−ＣＨ２−），７．３０（ｓ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）
【００３５】
（５）化合物８の合成（図６を参照）
実際に合成する化合物としては化合物６までであるが、ここから後の工程は化合物６とＤＮＡを結合させ環を開化させＣｅを配位させ、一連の流れでＤＮＡを切断させる工程に移行する。
以下の経路にて、化合物６を環化しない方向に変換させた。即ち、下記の実施例２の（１）に従って、ＤＮＡ断片（実施例２で用いたものと同じもの）の５´リン酸基に化合物６を結合させた後、０．５Ｍ  ＮａＯＨを用いて加水分解を行って開環し、次いで実施例２の（２）に従ってＣｅ錯体として、環化させない化合物を得た（これも、最終反応物のようにＣｅを錯化する箇所を有している蛍光色素の場合、同様に機能的蛍光色素として使える）。
【００３６】
［製造例２］（マグネシウムイオンを用いたＤＮＡチップの製造）
（１）ダイヤモンドチップの活性化
まず、リン酸緩衝液（０．１Ｍ  リン酸二水素カリウム及び０．０１Ｍ  リン酸水素二カリウム）１ｍＬ中に、水溶性カルボジイミド１５．５ｍｇ及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド２．３ｍｇを含む活性化反応液を調製した。
この活性化反応液中に、ダイヤモンドチップを時々撹拌しながら３０分浸した。その後、チップを取り出し、蒸留水で３〜５回洗浄して、活性化ダイヤモンドチップを得た。
【００３７】
（２）ＤＮＡの固定化
λＤＮＡをＥｃｏＲＩ処理して得られる２１ｋｂｐのＤＮＡ断片を固定化するＤＮＡ試料として用いた。
すなわち、この２１ｋｂｐのλＤＮＡ断片（１μｇ／μＬ）１μＬと、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２２５μＬ及びｄＨ２Ｏ７４μＬとを混合し、全量１００μlにしてＤＮＡ固定化溶液を調製した。このＤＮＡ固定化溶液中に活性化ダイヤモンドチップを挿入し、室温で６０分反応させた。その後、チップを取り出し、蒸留水で３〜５回洗浄した。
【００３８】
（３）固定化の確認のためのＰＣＲ
まず、プライマー（センス：配列表の配列番号１記載の塩基配列参照）１μＬ、プライマー（アンチセンス：配列表の配列番号２記載の塩基配列参照）１μＬ、１０ｘＰＣＲバッファー（Applied Biosystem社製）５μＬ、ｄＮＴＰ溶液５μＬ、ＤＮＡポリメラーゼ０．２５μＬ、ｄＨ２Ｏ３７．７５μlを加えて全量５０μＬとして、ＰＣＲ反応液を調製した。なお、上記プライマーは、上記ＤＮＡ試料である２１ｋｂｐＤＮＡ断片内の５００ｂｐ断片が増幅されるように設計されたものである。
このＰＣＲ反応液にＤＮＡ固定化チップを挿入し、ＰＣＲにて２サイクル増幅した。ＰＣＲ条件は、（９５℃３０秒−６５℃１分−７２℃１分）×１２サイクルとした。
【００３９】
ＰＣＲ終了後、ＤＮＡ固定化チップを取り出し、蒸留水で３〜５回洗浄した。洗浄したチップを、７０％エタノール中、４℃で保存した。
ＰＣＲ反応液は、固定化したチップを取り出した後で残り１０サイクル分ＰＣＲを行い、その後アガロースゲル電気泳動で解析した。結果を図３のレーン２に示す。
なお、対照として上記（２）においてＭｇＣｌ２を添加しないＤＮＡ固定化溶液にて反応を行ったほかは、同様の処理を行った。結果を図３のレーン１に示す。
【００４０】
［比較製造例１］（酵素的ＤＮＡ固定化法（従来法）によるＤＮＡチップの製造）
（１）ダイヤモンドチップの活性化
実施製造例１の１．と同様の条件で活性化反応液中にダイヤモンドチップを時々攪拌しながら室温で３０分間浸し、蒸留水で３〜５回洗浄して、活性化ダイヤモンドチップを得た。
【００４１】
（２）オリゴヌクレオチドの固定化
５´末端に（ｄＡ）３とＥｃｏＲＩ部位に対応した塩基配列を含むオリゴヌクレオチド溶液を調製し、この０．５μＭオリゴヌクレオチド溶液中に、上記活性化ダイヤモンドチップを室温で３０〜６０分浸してから（液量１００μＬでチップ２枚浸漬が可能である）、蒸留水で３〜５回洗浄して、オリゴヌクレオチド固定化チップを得た。
【００４２】
（３）相補的オリゴヌクレオチドのハイブリダイズ
上記のオリゴヌクレオチドに相補的な０．５μＭオリゴヌクレオチド溶液中に、上記のオリゴヌクレオチド固定化チップを４℃で３０分間浸してから（液量１００μＬでチップ２枚の浸漬が可能である）、氷冷蒸留水で３〜５回洗浄して、制限酵素部位固定化チップを得た。
【００４３】
（４）二本鎖ＤＮＡの固定化（酵素反応）
上記実施製造例１の（２）と同様のＤＮＡ試料（λＤＮＡをＥｃｏＲＩ処理して得られる２１ｋｂｐのＤＮＡ断片）を用いた。
ライゲーション反応緩衝液、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ及び制限酵素処理された二本鎖ＤＮＡ溶液とを混合してライゲーション固定化溶液を得た。ライゲーション固定化溶液は、６６ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、０．１ｍＭ  ＡＴＰ、３００ｎｇの二本鎖ＤＮＡ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ  ３５ｕｎｉｔｓが入った計５０μＬの水溶液である。
ライゲーション固定化溶液中に上記の制限酵素部位固定化チップを１６℃で１６時間浸した。その後、蒸留水で３〜５回洗浄した。
【００４４】
（５）固定化の確認のためのＰＣＲ
実施製造例１の３．と同様の条件でＰＣＲを行い、固定化が行われたかどうか確認した。その結果を図３のレーン３に示す。
【００４５】
図３から、ＭｇＣｌ２を利用した実施製造例１（図３のレーン２参照）は、酵素を使用した従来法による比較製造例１（図３のレーン３参照）と比較して、濃いバンドの出現が確認されたことが明らかである。
また、比較製造例１の従来法は全工程１８〜２０時間を要したのに対し、実施製造例１の方法では、全工程６０〜９０分を要したに過ぎなかった。
このことから、本発明のＤＮＡ固定法では、水溶性マグネシウム塩を利用することにより、従来法に比較してＤＮＡを基体に効率よく、しかもごく短時間に処理を済ませることができることが明らかとなった。
【００４６】
［実施例１］（ＤＮＡの塩基配列解析方法）
（１）ＤＮＡ試料との結合
配列表の配列番号３記載の塩基配列（ggttatcgaa atcagccaca gcgcg）からなる１本鎖ＤＮＡ断片（５´リン酸化プライマー）を、ｄＨ２Ｏに溶かし１００μＭとして、ＤＮＡ試料とした。このＤＮＡ試料１０μＬを、２×Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（０．２４Ｍ  １−メチルイミダゾール（０．３２Ｍ  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを含む。）水溶液をｐＨ９．０に調整したもの）５０μＬ、機能的蛍光色素、すなわち、実施例２で得た化合物６をＤＭＳＯにて５０ｍＭに調製したもの（５０ｍＭ配位子）２０μＬ、及びｄＨ２Ｏ  ２０μＬとを混合し、室温で一晩穏やかに振盪反応後、エタノール沈殿により精製した。色素との結合率は９０％以上であった。
【００４７】
（２）ＤＮＡ試料の金属錯体化（Ｃｅ４＋配位子の導入）及び特異的部位切断
上記（１）にて機能的蛍光色素と反応し、精製処理のなされたＤＮＡ試料をｄＨ２Ｏ  １０μＬに溶解させた。このＤＮＡ試料に、１ｍＭ（ＮＯ２）２Ｃｅ（ＮＨ４）２水溶液１０μＬを加え、室温で一晩穏やかに振盪反応後、エタノール沈殿により精製し、ｄＨ２Ｏ１０μＬに溶解した。
【００４８】
（３）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによる測定
上記（２）にて切断後のＤＮＡ試料１μＬについて、切断された塩基の確認を行った。
マトリックスとして３−ヒドロキシピコリン酸（３−ＨＰＡと略す）３０ｍｇを水１００μＬ、０．１Ｍ二水素クエン酸アンモニウム水溶液に溶解させた。そのうちの１μＬを、ＤＮＡ試料１μＬと共に、マイクロプレート上で直接混合した。真空中徐々に溶媒除去し、混晶を形成させた。この混晶に、波長３３７ｎｍのレーザーを照射しマトリックス援用レーザー脱離質量分析により解析した。分子量比較用の試料として、未反応のＤＮＡ試料と蛍光色素を結合させたＤＮＡ試料を同様に測定した。
解析の結果検出されたピーク同士の質量差から配列決定した。結果を、図４に示す。
【００４９】
その結果、図４から明らかなように、５´側のグアニンが切断されたと考えられるピーク（７３８９．５）をメインに、リン酸基のみが切断されたピーク（７６３６．９）、さらにはもう一つのグアニンも切断されたと考えられるピーク（７０６２．２）等が検出された。
このことから、本発明のＣｅ４＋配位子を用いる塩基配列解析方法により、ＤＮＡの５´末端の塩基を解析することができることが明らかとなった。
【００５０】
［実施例２］（ＤＮＡチップの塩基配列解析方法）
（１）ＤＮＡ試料との結合
製造例２で作成したＤＮＡチップの塩基配列の解析を行った。
すなわち、ＤＮＡチップをｄＨ２Ｏ  １００μＬに浸漬し、ＤＮＡチップ試料とした。このＤＮＡチップ試料中に、２×Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（０．２４Ｍ  １−メチルイミダゾール（０．３２Ｍ  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを含む。）水溶液をｐＨ９．０に調整したもの）５００μＬ、機能的蛍光色素（製造例１で得た化合物６）をＤＭＳＯにて５０ｍＭに調製したもの（５０ｍＭ配位子）４００μＬとを混合し、室温で一晩穏やかに振盪反応後、ＤＮＡチップを反応溶液中より取り出した。色素との結合率は９０％以上であった。
【００５１】
（２）ＤＮＡ試料の金属錯体化（Ｃｅ４＋  配位子の導入）及び特異的部位切断
上記（１）にて機能的蛍光色素と反応させたＤＮＡチップをｄＨ２Ｏ１００μＬに浸漬させた。このＤＮＡ試料に、１ｍＭ（ＮＯ２）２Ｃｅ（ＮＨ４）２  水溶液１００μＬを加え、レーザーを照射した。
【００５２】
（３）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによる測定
上記（２）にて切断後のＤＮＡ試料０．５μＬについて、切断された塩基の確認を行った。
マトリックスとして３−ヒドロキシピコリン酸（３−ＨＰＡと略す）５０ｍｇを水      ２００μＬ、アセトニトリル３００μＬ、０．１Ｍ二水素クエン酸アンモニウム水溶液５００μＬに溶解させた。そのうちの０．５μＬを、ＤＮＡ試料０．５μＬと共に、マイクロプレート上で直接混合した。真空大気圧中徐々に溶媒除去し、混晶を形成させた。この混晶に、波長３３７ｎｍのレーザーを照射しマトリックス援用レーザー脱離質量分析により解析した。実施例２に従って同様に金属錯体化、レーザー照射切断を繰り返し、その都度質量分析により得られた塩基を順番に並べ、配列決定した。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の塩基配列解析方法によれば、短時間で簡便な処理のみで、ＤＮＡ固定化担体に固定されたＤＮＡの塩基配列を正確に解析することが可能となる。
また、本発明により、より精密な遺伝子操作や遺伝子の解明へ応用の展開でき、迅速な遺伝子解析が可能となることで、医学分野においては、テーラーメイド医療の確立に、農水畜産分野においては、より良い形質を持ち合わせた品種を作り出すことといった遺伝子を扱う上で不可欠な配列解析のスピード化に寄与できる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】Ｃｅ４＋配位子がＤＮＡに結合した状態の模式図である。
【図２】本発明の切断方法によるＤＮＡの切断の模式図である。
【図３】ＤＮＡが固定化されたことを確認するための電気泳動結果である。
【図４】本発明の切断方法の結果切断されたＤＮＡの質量分析結果の一例である。
【図５】Ｃｅ４＋配位子の基本骨格の合成経路を示す概略図である。
【図６】化合物８の合成経路を示す概略図である。
【００５５】
（配列表）
SEQUENCE LISTING
<110>  株式会社日本パーカーライジング広島工場
<110>  独立行政法人科学技術振興機構
<120>  ＤＮＡの切断方法
<160>  3
<210>  1
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<400>  gatgagttcg tgtccgtaca actgg
<210>  2
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<400>  ggttatcgaa atcagccaca gcgcc
<210>  3
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<400>  ggttatcgaa atcagccaca gcgcg
【図１】
2007060969.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図２】
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【図３】
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