(57)【要約】【課題】新規な肥満治療剤および肥満予防剤をスクリーニングする方法の提供。【解決手段】被験物質の、ＴＵＳＣ５遺伝子またはＴＵＳＣ５タンパク質の発現抑制活性に基づき、ＴＵＳＣ５遺伝子発現抑制物質またはＴＵＳＣ５タンパク質発現抑制物質を肥満治療剤または肥満予防剤として選択することを特徴とする、肥満治療剤または肥満予防剤のスクリーニング方法が提供される。この方法は、熱産生が亢進する際、前記ＴＵＳＣ５遺伝子の発現が抑制されるという知見に基づく。【選択図】  図５
2007097547.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肥満治療剤または肥満予防剤のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下、ＴＵＳＣ５遺伝子の発現を抑制する物質を探索する工程を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２】
前記物質を探索する工程が、以下の工程（Ｉ）から（ＩＩＩ）を含む請求項１に記載のスクリーニング方法。
（Ｉ）ＴＵＳＣ５遺伝子を発現可能な細胞と、前記被験物質とを接触させる工程、
（ＩＩ）前記被験物質を接触させた前記細胞における、前記ＴＵＳＣ５遺伝子の発現量を測定する工程、および
（ＩＩＩ）前記発現量を前記被験物質に接触させない対照細胞における前記ＴＵＳＣ５遺伝子の発現量と比較して、前記ＴＵＳＣ５遺伝子の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【請求項３】
前記ＴＵＳＣ５遺伝子が、配列番号１、３、５または６に記載の塩基配列からなる遺伝子である請求項１または２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記肥満治療剤または肥満予防剤が、熱産生促進剤である請求項１〜３のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のスクリーニング方法に使用する肥満治療剤または肥満予防剤のスクリーニング用キットであって、前記キットが、ＴＵＳＣ５タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むキット。
【請求項６】
肥満治療剤または肥満予防剤のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下、ＴＵＳＣ５タンパク質の発現を抑制する物質を探索する工程を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項７】
前記物質を探索する工程が、以下の工程（Ｉ）および（ＩＩ）を含む請求項６に記載のスクリーニング方法。
（Ｉ）ＴＵＳＣ５タンパク質と、前記被験物質とを接触させる工程、
（ＩＩ）前記ＴＵＳＣ５タンパク質と、前記被験物質との結合を検出し、前記ＴＵＳＣ５タンパク質と結合する被験物質を選択する工程。
【請求項８】
前記物質を探索する工程が、以下の工程（Ｉ）から（ＩＩＩ）を含む請求項６に記載のスクリーニング方法。
（Ｉ）ＴＵＳＣ５タンパク質を発現可能な細胞または前記細胞から調製した細胞画分と、前記被験物質とを接触させる工程、
（ＩＩ）前記被験物質を接触させた前記細胞または前記細胞画分における、前記ＴＵＳＣ５タンパク質の発現量を測定する工程、および
（ＩＩＩ）前記発現量を前記被験物質に接触させない対照細胞または前記対照細胞から調製した対照細胞画分における前記ＴＵＳＣ５タンパク質の発現量と比較して、前記ＴＵＳＣ５タンパク質の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【請求項９】
前記ＴＵＳＣ５タンパク質が、配列番号２、４または７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項６〜８のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記肥満治療剤または肥満予防剤が、熱産生促進剤である請求項６〜９のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
請求項６〜１０のいずれか一項に記載のスクリーニング方法に使用する肥満治療剤または肥満予防剤のスクリーニング用キットであって、前記キットが、ＴＵＳＣ５タンパク質を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肥満治療剤または肥満予防剤のスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、糖尿病、高血圧症、高脂血症、動脈硬化症、虚血性心疾患等を引き起こす、主要な原因の一つである。近年では、その治療法および予防法としては、摂取エネルギーの調整から、エネルギー消費の調整へと、ターゲットが変わりつつある。特に、褐色脂肪細胞は、エネルギー消費に関連するとして、近年、注目を集めている。
【０００３】
褐色脂肪細胞は、（ｉ）熱を作り出して、心臓や肝臓を寒さから守り、体温を維持する働き、（ｉｉ）脳の満腹中枢からの刺激によって、食事から摂取した過剰なエネルギーを燃やすという働きの２つの働きが知られている。また、褐色脂肪細胞中の褐色脂肪細胞中の熱産生タンパク質（ＵＣＰ：uncoupling protein）は、脂肪を直接取り込んで、これをもとに、局所的に熱を放散（熱産生）することが可能である。従って、この熱産生タンパク質の発現を増加させれば、エネルギー消費量を増加させることができ、その結果、肥満を解消または予防することが可能と考えられている。
【０００４】
前記褐色脂肪細胞の表面に存在するβ３アドレナリン受容体に、アドレナリンが結合すると、褐色脂肪細胞が活性化され、熱産生タンパク質の発現が増加し、その結果、脂肪が燃焼されることが知られている。このメカニズムの観点から、β３アドレナリン受容体アゴニストが、肥満治療剤として働くことが示唆されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
このように前記褐色脂肪細胞を活性化させることをメカニズムとする、肥満治療剤および肥満予防剤の開発が、検討されていたが、従来、有効な効果を有するものは、見出されていなかった。
【特許文献１】特開２００４−３２３５１９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、新規な肥満治療剤および肥満予防剤をスクリーニングする方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、褐色脂肪細胞中の熱産生を調節する遺伝子を同定すべく鋭意検討した結果、熱産生が亢進する際、ＴＵＳＣ５遺伝子の発現が抑制されることを見出した。本発明は、この知見を元に、完成したものである。すなわち、本発明の第一の肥満治療剤または肥満予防剤のスクリーニング方法は、被験物質の存在下、ＴＵＳＣ５遺伝子の発現を抑制する物質を探索する工程を含むことを特徴とするスクリーニング方法である。また、本発明の第二の肥満治療剤または肥満予防剤のスクリーニング方法は、被験物質の存在下、ＴＵＳＣ５タンパク質の発現を抑制する物質を探索する工程を含むことを特徴とするスクリーニング方法である。
【発明の効果】
【０００８】
ＴＵＳＣ５（Tumor suppressor candidate 5）の遺伝子配列は、ＬＯＳＴ１とも呼ばれており、ヒトおよびマウスに関して、GenBankに登録されている。このＴＵＳＣ５遺伝子は、肺ガン試料の６９％で、ＴＵＳＣ５の発現が減少することが知られており、このことから、ＴＵＳＣ５の発現が肺ガンにおいて重要な役割を果たしていることが示唆されている（Hiroyuki Konishiら、「ヒト肺ガンでの末端１７ｐ１３．３における腫瘍抑制座候補に対応するホモ接合体削除領域の詳細な同定（Detailed characterization of a homozygously deleted region corresponding to a candidate tumor suppressor locus at distal 17p13.3 in human lung cancer）」、Oncogene, 2003, 22, 1892-1905参照）。また、ＴＵＳＣ５タンパク質に関しては、国際公開ＷＯ０２／０９６３５５号パンフレットおよび国際公開ＷＯ０２／０９７０３６号パンフレット等においても、報告されている。
【０００９】
本発明者らは、ラット正常組織において、ＴＵＳＣ５遺伝子が、脂肪組織でのみ、高発現されていることを見出した。そこで、本発明者らは、３Ｔ３−Ｌ１細胞において、ＴＵＳＣ５遺伝子の発現を検討したところ、３Ｔ３−Ｌ１細胞の成熟脂肪細胞への分化と共に、発現が増加していることを見出した。さらに、本発明者らは、ラットの各脂肪組織においてＴＵＳＣ５遺伝子が、健常ラットでは、腸間膜脂肪組織を除く内臓組織で強く発現しており、一方、肥満ラットでは、腸間膜脂肪組織を含む内臓組織で強く発現していることを見出した。このような知見を元に、ラットを寒冷暴露したところ、健常ラットにおいては、褐色脂肪組織でのＴＵＳＣ５遺伝子の発現の低下を、一方、肥満ラットにおいては褐色脂肪組織でのＴＵＳＣ５遺伝子の発現が変化しないことを、本発明者らは見出した。
【００１０】
寒冷暴露されたラットは、体温維持のため、褐色脂肪細胞において熱産生が促進されると考えられている。よって、健常ラットにおいて、寒冷暴露により、ＴＵＳＣ５遺伝子の発現が低下したという前記知見より、熱産生の促進とＴＵＳＣ５遺伝子の発現の抑制に、本発明者らは関連を見出した。また、前記のように、熱産生が促進されると、肥満が治療または防止される。従って、ＴＵＳＣ５遺伝子またはＴＵＳＣ５タンパク質の発現量を指標にすることにより、肥満治療剤または肥満防止剤をスクリーニングすることが可能になることを見出し、本発明に到達した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
まず、本発明の第１の肥満治療剤または肥満予防剤のスクリーニング方法は、被験物質の存在下、ＴＵＳＣ５遺伝子の発現を抑制する物質を探索する工程を含むことを特徴とするスクリーニング方法である。
【００１２】
本発明の第１のスクリーニング方法において、前記物質を探索する工程は、以下の工程（Ｉ）から（ＩＩＩ）を含むのが好ましい。
（Ｉ）ＴＵＳＣ５遺伝子を発現可能な細胞と、前記被験物質とを接触させる工程、
（ＩＩ）前記被験物質を接触させた前記細胞における、前記ＴＵＳＣ５遺伝子の発現量を測定する工程、および
（ＩＩＩ）前記発現量を前記被験物質に接触させない対照細胞における前記ＴＵＳＣ５遺伝子の発現量と比較して、前記ＴＵＳＣ５遺伝子の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【００１３】
この際、前記ＴＵＳＣ５遺伝子は、配列番号１、３、５または６に記載の塩基配列からなる遺伝子であるのが好ましい。
【００１４】
本発明の第１のスクリーニング方法においては、前記肥満治療剤または前記肥満予防剤は、熱産生促進剤であるのが好ましい。
【００１５】
本発明のスクリーニング用キットは、本発明の第１のスクリーニング方法に使用する肥満治療剤または肥満予防剤のスクリーニング用キットであって、ＴＵＳＣ５タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むスクリーニング用キットである。
【００１６】
また、本発明の第２の肥満治療剤または肥満予防剤のスクリーニング方法は、被験物質の存在下、ＴＵＳＣ５タンパク質の発現を抑制する物質を探索する工程を含むことを特徴とするスクリーニング方法である。
【００１７】
本発明の第２のスクリーニング方法において、前記物質を探索する工程は、以下の工程（Ｉ）および（ＩＩ）を含むのが好ましい。
（Ｉ）ＴＵＳＣ５タンパク質と、前記被験物質とを接触させる工程、
（ＩＩ）前記ＴＵＳＣ５タンパク質と、前記被験物質との結合を検出し、前記ＴＵＳＣ５タンパク質と結合する被験物質を選択する工程。
【００１８】
また、本発明の第２のスクリーニング方法において、前記物質を探索する工程は、以下の工程（Ｉ）から（ＩＩＩ）を含むのが好ましい。
（Ｉ）ＴＵＳＣ５タンパク質を発現可能な細胞または前記細胞から調製した細胞画分と、前記被験物質とを接触させる工程、
（ＩＩ）前記被験物質を接触させた前記細胞または前記細胞画分における、前記ＴＵＳＣ５タンパク質の発現量を測定する工程、および
（ＩＩＩ）前記発現量を前記被験物質に接触させない対照細胞または前記対照細胞から調製した対照細胞画分における前記ＴＵＳＣ５タンパク質の発現量と比較して、前記ＴＵＳＣ５タンパク質の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【００１９】
この際、前記ＴＵＳＣ５タンパク質は、配列番号２、４または７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であるのが好ましい。
【００２０】
本発明の第２のスクリーニング方法においては、前記肥満治療剤または肥満予防剤は、熱産生抑制剤であるのが好ましい。
【００２１】
また、本発明のスクリーニング用キットは、本発明の第２のスクリーニング方法に使用する肥満治療剤または肥満予防剤のスクリーニング用キットであって、ＴＵＳＣ５タンパク質を含むスクリーニング用キットである。
【００２２】
本発明において、配列番号１に示すヒトＴＵＳＣ５遺伝子、配列番号３に示すマウスＴＵＳＣ５遺伝子および配列番号５に示すラットＴＵＳＣ５遺伝子は、公知であり、GenBan Accession No.は、それぞれ、ＮＭ＿１７２３６７．１、ＮＭ＿１７７７０９．２およびＸＭ＿３４０８５５である。配列番号１に示すヒトＴＵＳＣ５遺伝子の取得方法は、例えば、S. Katayamaら、Science, 2005, 309, 1564-6頁に、配列番号３に示すマウスＴＵＳＣ５遺伝子の取得方法は、例えば、H. Konishi, Oncogene, 2003, 22, 1892-1905頁等に記載されるように公知である。
【００２３】
配列表の配列番号６のラットＴＵＳＣ５遺伝子は、本発明者が見出した新規遺伝子である。
【００２４】
本発明における前記ＴＵＳＣ５遺伝子には、特定の塩基配列（配列番号１、３、５および６）で示される遺伝子のみならず、これらによりコードされるタンパク質と生物学的機能が同等であるタンパク質（例えば、同族体等）をコードする遺伝子が含まれる。具体的には、ＴＵＳＣ５遺伝子には、以下のような遺伝子が含まれる。
（Ａ）配列番号１、３、５および６のいずれかの塩基配列で示される遺伝子
（Ｂ）前記（Ａ）の塩基配列において、１個〜３０個、好ましくは１個〜１０個、より好ましくは１個〜５個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつ、熱産生抑制活性を有するＴＵＳＣ５タンパク質をコードする遺伝子
（Ｃ）  前記（Ａ）の塩基配列において１個〜３０個、好ましくは１個〜１０個、より好ましくは１個〜５個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、前記（Ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子
（Ｄ）  前記（Ａ）の塩基配列において１個〜３０個、好ましくは１個〜１０個、より好ましくは１個〜５個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、前記配列番号１、３、５および６の塩基配列との相同性が少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９５％以上である遺伝子
（Ｅ）  前記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子
前記（Ｃ）において、ハイブリダイズのストリンジェントな条件とは、例えば、当該技術分野における標準の条件があげられるが、例えば、温度条件は、各配列番号で示された塩基配列のTm値の±５℃、好ましくは±２℃、より好ましくは±１℃である。条件の具体例として、５×ＳＳＣ溶液、１０×Denhardt溶液、１００μｇ/ｍｌサケ精子ＤＮＡおよび１％ＳＤＳ中、６５℃でのハイブリダイゼーション、０．２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、６５℃、３０分の洗浄（２回）、続いて、０．２×ＳＳＣおよび0.1％ＳＤＳ中、６５℃、３０分の洗浄（２回）があげられる。
【００２５】
なお、本発明において、配列表の配列番号２のタンパク質は、配列表の配列番号１の遺伝子にコードされるものであり、配列表の配列番号４のタンパク質は、それぞれ、配列表の配列番号３の遺伝子にコードされるものであり、配列表の配列番号７のタンパク質は、配列表の配列番号５および６の遺伝子にコードされるものである。
【００２６】
本発明において、用語「タンパク質」には、特定のアミノ酸配列で示されるタンパク質のみならず、これらと生物学的機能が同等である、断片、同族体、誘導体および変異体を含む。例えば、前記ＴＵＳＣ５タンパク質には、配列番号２、４および７に示すタンパク質のみならず、その相同体や変異体も含む。具体的には、前記ＴＵＳＣ５タンパク質には、以下のようなタンパク質が含まれる。
（Ａ）配列番号２、４および７のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）前記（Ａ）のアミノ酸配列において、１個〜３０個、好ましくは１個〜１０個、より好ましくは１個〜５個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、熱産生抑制活性を有するタンパク質
（Ｃ）  前記（Ａ）のアミノ酸配列において１個〜３０個、好ましくは１個〜１０個、より好ましくは１個〜５個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、前記配列番号１、３、５および６のアミノ酸配列との相同性が少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９５％以上であるタンパク質
配列番号２に示すアミノ酸配列からなるヒトＴＵＳＣ５タンパク質、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるマウスＴＵＳＣ５タンパク質および配列番号７に示すアミノ酸配列からなるラットＴＵＳＣ５タンパク質は、公知であり、GenBan Accession No.は、それぞれ、ＮＰ＿７５８９５５．１、ＮＰ＿８０８３７７．１およびＸＰ＿３４０８５６である。配列番号２に示すヒトＴＵＳＣ５遺伝子の取得方法は、例えば、S. Katayamaら、Science, 2005, 309, 1564-6頁に、配列番号４に示すマウスＴＵＳＣ５遺伝子の取得方法は、例えば、H. Konishi, Oncogene, 2003, 22, 1892-1905頁等に記載されるように公知である。
【００２７】
前記タンパク質の調製方法は、特に制限されないが、例えば、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、適当な発現ベクターに組み込み、大腸菌等の原核生物、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞等の真核生物細胞、又は、インビトロで前記タンパク質を発現させ、単離する方法が挙げられる。これらの方法は、当業者であれば、適宜選択して実施できる。
【００２８】
以下に、本発明のスクリーニング方法の一例を具体的に説明する。
【００２９】
（１）ＴＵＳＣ５遺伝子の発現抑制活性を指標とする肥満治療剤または肥満抑制剤のスクリーニング方法
まず、本発明の第１のスクリーニング方法を説明する。第１のスクリーニング方法は、前記のように、被験物質の存在下、ＴＵＳＣ５遺伝子の発現を抑制する物質を探索する工程を含むスクリーニング方法である。
【００３０】
前記スクリーニング方法において、前記物質を探索する工程は、以下の工程（Ｉ）から（ＩＩＩ）を含むのが好ましい。
（Ｉ）ＴＵＳＣ５遺伝子を発現可能な細胞と、前記被験物質とを接触させる工程、
（ＩＩ）前記被験物質を接触させた前記細胞における、前記ＴＵＳＣ５遺伝子の発現量を測定する工程、および
（ＩＩＩ）前記発現量を前記被験物質に接触させない対照細胞における前記ＴＵＳＣ５遺伝子の発現量と比較して、前記ＴＵＳＣ５遺伝子の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【００３１】
前記スクリーニング方法に用いられるＴＵＳＣ５遺伝子は、前記のように、配列番号１、３、５または６に記載の塩基配列からなる遺伝子であるのが好ましい。
【００３２】
前記スクリーニングに用いられる細胞としては、ＴＵＳＣ５遺伝子を発現可能な細胞であれば、特に限定はないが、例えば、脂肪組織から調製した細胞が挙げられる。前記脂肪組織としては、例えば、褐色脂肪組織、皮下脂肪組織、副睾丸脂肪組織、腎臓周囲脂肪組織、腸間膜脂肪組織等が挙げられる。
【００３３】
前記被験物質となり得るものとしては、特に制限されないが、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物などが挙げられる。前記スクリーニングは、これらの被験物質となり得る物質を含む試料（被験試料）を上記細胞と接触させて行うことができる。前記被験試料としては、特に制限されないが、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられる。
【００３４】
前記工程（Ｉ）において、ＴＵＳＣ５遺伝子は、発現可能な細胞と例えば、３７℃で、５分から７２０時間の間で、至適温度で接触させることができる。
【００３５】
前記細胞と前記被験物質との接触は、前記細胞が成育可能な条件下で培養しながら行うことができる。また、前記細胞と前記被験物質とを接触させる条件は、特に制限されないが、前記細胞が死なないように、その培養条件（ｐＨ、温度、培地等）を選択することができる。
【００３６】
前記被験物質と接触させる際の前記細胞の細胞数は、例えば、９８ウェルプレートを用いる場合、例えば１．０×１０3〜１．０×１０4個／ウェル、好ましくは１．０×１０4〜１．０×１０5個／ウェル、より好ましくは１．０×１０5〜１．０×１０6個／ウェルである。
【００３７】
前記対照細胞とは、前記工程（Ｉ）で用いられるＴＵＳＣ５遺伝子を発現可能な細胞において、前記被験物質を接触させない場合の前記細胞を意味する。被験物質を接触させない場合とは、前記被験物質の代わりに前記被験物質と同量の溶媒（ブランク）を添加する場合、ＴＵＳＣ５遺伝子の発現に影響を与えないコントロール物質を添加する場合などがある。
【００３８】
前記スクリーニングで用いられる前記ＴＵＳＣ５遺伝子の発現量の測定方法としては、前記細胞から調製したＲＮＡまたはＲＮＡから転写された相補的なポリヌクレオチドを用いる、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、ドットプロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ等のほか、マイクロアレイを用いる方法、リアルタイムＰＣＲ法等のＰＣＲを利用する方法、前記ＲＮＡ鎖を直接測定する方法等の迅速な測定が可能な方法が挙げられる。
【００３９】
前記のように検出・定量したＴＵＳＣ５遺伝子の発現レベルに基づき、ＴＵＳＣ５遺伝子発現抑制物質を選択することができる。すなわち、被験物質を添加した細胞におけるＴＵＳＣ５遺伝子の発現が、前記被験物質を添加しない対照細胞での発現量と比較して、７０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは１０％以下であれば、前記被験物質は、発現抑制物質として選択することができる。
【００４０】
（２）ＴＵＳＣ５タンパク質の発現抑制活性を指標とする肥満治療剤または肥満抑制剤のスクリーニング方法
次に、本発明の第２のスクリーニング方法について説明する。第２のスクリーニング方法は、前記のように、被験物質の存在下、ＴＵＳＣ５タンパク質の発現を抑制する物質を探索する工程を含むスクリーニング方法である。
【００４１】
本発明の第２のスクリーニング方法において、前記物質を探索する工程は、以下の工程（Ｉ）および（ＩＩ）を含むのが好ましい。
（Ｉ）ＴＵＳＣ５タンパク質と、前記被験物質とを接触させる工程、
（ＩＩ）前記ＴＵＳＣ５タンパク質と、前記被験物質との結合を検出し、前記ＴＵＳＣ５タンパク質と結合する被験物質を選択する工程。
【００４２】
前記ＴＵＳＣ５タンパク質と、前記被験物質との結合を検出する方法としては、例えば、前記ＴＵＳＣ５タンパク質に特異的な抗体を用いた免疫学的測定方法が挙げられる。前記免疫学的測定方法としては、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、サンドウィッチＥＬＩＳＡ等が挙げられる。前記抗体は、前記ＴＵＳＣ５タンパク質を用いた従来公知の方法で作製でき、ポリクローナルであっても、モノクローナルであってもよい。前記ＴＵＳＣ５タンパク質の調製方法は、特に制限されないが、例えば、前記ＴＵＳＣ５タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、適当な発現ベクターに組み込み、大腸菌等の原核生物、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞等の真核生物細胞、又は、インビトロで前記ポリペプチドを発現させ、単離する方法が挙げられる。これらの方法は、当業者であれば、適宜選択して実施できる。
【００４３】
また、本発明の第２のスクリーニング方法において、前記物質を探索する工程は、以下の工程（Ｉ）から（ＩＩＩ）を含むのが好ましい。
（Ｉ）ＴＵＳＣ５タンパク質を発現可能な細胞または前記細胞から調製した細胞画分と、前記被験物質とを接触させる工程、
（ＩＩ）前記被験物質を接触させた前記細胞または前記細胞画分における、前記ＴＵＳＣ５タンパク質の発現量を測定する工程、および
（ＩＩＩ）前記発現量を前記被験物質に接触させない対照細胞または前記対照細胞から調製した対照細胞画分における前記ＴＵＳＣ５タンパク質の発現量と比較して、前記ＴＵＳＣ５タンパク質の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【００４４】
前記スクリーニング方法に用いられる細胞は、前記ＴＵＳＣ５タンパク質を発現することが可能な細胞であれば、限定されない。具体的には、前記（１）に記載された細胞を用いることができる。
【００４５】
前記スクリーニング方法に用いられるＴＵＳＣ５タンパク質は、前記のように、配列番号２、４または７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であるのが好ましい。
【００４６】
前記ＴＵＳＣ５タンパク質の発現は、ＴＵＳＣ５遺伝子の発現産物であるタンパク質を検出することにより、確認することができる。
【００４７】
前記ＴＵＳＣ５タンパク質を検出する方法としては、特に制限されないが、例えば、前記ＴＵＳＣ５タンパク質に特異的な抗体を用いた免疫学的測定方法が挙げられる。前記免疫学的測定方法としては、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、サンドウィッチＥＬＩＳＡ等が挙げられる。前記抗体は、前記ＴＵＳＣ５タンパク質を用いた従来公知の方法で作製でき、ポリクローナルであっても、モノクローナルであってもよい。前記ＴＵＳＣ５タンパク質の調製方法は、特に制限されないが、例えば、前記ＴＵＳＣ５タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、適当な発現ベクターに組み込み、大腸菌等の原核生物、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞等の真核生物細胞、又は、インビトロで前記ポリペプチドを発現させ、単離する方法が挙げられる。これらの方法は、当業者であれば、適宜選択して実施できる。
【００４８】
前記被験物質としては、前記（１）と同じものが挙げられる。また、前記対照細胞は、前記（１）と同義である。
【００４９】
つぎに、本発明のスクリーニング用キットについて説明する。本発明のキットは、肥満治療剤または肥満予防剤のスクリーニングに使用するキットである。
【００５０】
まず、本発明のキットは、第１の形態のスクリーニング方法に使用する肥満治療剤または肥満予防剤のスクリーニング用キットであって、ＴＵＳＣ５タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むキットが挙げられる。前記キットは、例えば、前記キットに含まれるプローブの中から選択的に使用してマイクロアレイを製造する場合や、リアルタイムＰＣＲ法により検出する場合に使用できる。
【００５１】
また、本発明のキットは、スクリーニング方法に使用する肥満治療剤または肥満予防剤のスクリーニング用キットであって、ＴＵＳＣ５タンパク質を含むキットが挙げられる。前記キットには、さらに、ＴＵＳＣ５タンパク質に特異的な抗体等を含んでもよい。
【００５２】
以下、実施例を用いて本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００５３】
（ラット由来のＴＵＳＣ５遺伝子のクローニング）
３〜５週齡の雄ウィスターラットをエーテルにて麻酔し、断頭した。頭蓋内より脳組織を摘出し細かく切り刻んだ。次に、50%等張性percoll溶液に細胞を浮遊させた。超遠心にて分離された中間第３層に含まれ、γGTPに高い活性を示す画分が脳血管内皮細胞である。γGTP活性はIatroset kit (Iatron)にて測定した。該細胞を回収し、PBSで何度か洗い、20%FBS、150μg/ml ECGF、penicillin-streptomycin mixture (50U/ml)、ブタヘパリン(10U/ml)を添加したDMEM培地にて培養した。
【００５４】
一方、大動脈内皮細胞は３〜５週齡の雄ウィスターラットの胸部大動脈より単離した。胸部大動脈を摘出しシート状に切り開いた。ディスパーゼ、コラゲナーゼ溶液中で内腔をかき取り、内皮細胞を回収した。10%FBS、50μg/ml Endothelial growth supplement、penicillin-streptomycin mixture (50U/ml)、ブタヘパリン(10U/ml)を添加したM199培地にて培養した。いずれの細胞も３７℃、5% CO2の条件下で培養した。
【００５５】
以下に、Suppression Subtractive Hybridization (SSH)法にて脳血管内皮細胞に優位に発現する遺伝子の検出方法と、検出されたラットBEC-1遺伝子断片について説明する。
【００５６】
脳血管内皮細胞に優位に発現する遺伝子を解析するために、Suppression subtractive hybridization (SSH)法を選択した（Diatchenko L et al, 1996）。
【００５７】
上記方法にて分離培養した脳血管内皮細胞、大動脈内皮細胞を用意した。両方からISOGEN (Nippongene)にてtotal RNAを抽出した。Oligotex-dT30 (TaKaRa)にてpoly A＋ RNAを抽出した。5μgのpoly A＋ RNAをSuperScript II reverse transcriptase (Gibco)にて逆転写反応させcDNAライブラリを作製した。SSHにはPCR-Select cDNA subtraction kit (Clontech)を使用した。脳血管内皮cDNAをテスター、大動脈内皮cDNAをドライバーとして、両方を制限酵素RsaI消化し短い平滑末端のDNA断片に消化した。
【００５８】
次に、テスターを等量に分けてそれぞれにアダプター１，アダプター２Ｒを付加した。アダプター１付加テスターと十分量のドライバーとをハイブリダイズした（98℃1.5分、68℃８時間）。同様にアダプター２Ｒ付加テスターと十分量のドライバーとをハイブリダイズした。さらに両テスターおよび十分量のドライバーをハイブリダイズした（68℃、16時間）。これによりSubtracted cDNA libraryが完成した。
【００５９】
これをテンプレートとしてFirst PCR 30サイクル（94℃30秒、66℃30秒、72℃1.5分）、Second PCR 14サイクル（94℃30秒、68℃30秒、72℃1.5分）を施行することにより、脳血管内皮細胞に優位に発現する遺伝子のみが増幅した。酵素はLA-Taq (TaKaRa)を使用した。PCRプロダクトをpCR2.1-TOPO (Invitrogen)にてサブクローニングし、TOP10F'コンピテントセル (Invitrogen)にトランスフォーメーションしてLacZ非発現細胞（脳血管内皮に優位に発現する遺伝子断片が組み込まれたベクター陽性の細胞）をX-galにて検出してピックアップした。LB培地にて大量培養し、BioRobot (QIAGEN)にてプラスミド抽出した。
【００６０】
さらに、96well dot-blot system (BIO-RAD)にてHybond N+ (Amersham)にプラスミドをブロッティングした。PCR-Select Differential Screening kit (Clontech)を用いてメンブレンと32Pで標識したテスター、ドライバーcDNAプローブとを各々ハイブリした。ホットスポットをSTORM imaging analyzer (Amersham)で定量化し、脳血管内皮に３倍以上多く発現している遺伝子断片を陽性として選択した。3700 Sequencing system (Applied Biosystems)にて遺伝子断片の塩基配列を決定し、BLAST (NCBI, NIH)にてホモロジー検索を行った。
【００６１】
前記のようにして、２４の機能既知遺伝子、７のESTを含む２０の配列公知機能未知遺伝子、新規遺伝子断片G6を検出した。
【００６２】
ラット脳血管内皮細胞から検出した新規遺伝子断片G6について、Marathon-Ready rat Kidney cDNA (Clontech)をテンプレートとして5'-RACEにて5'側の未知部分をクローニングした。
（5'-RACE）
cDNA：Marathon-Ready cDNA rat Kidney (Clontech)
primer(5'→3')
G6-R4      tcaagtcccgataaggataacgtgc（配列番号８）
G6-R2      ctgggttggccatgttgact（配列番号９）
Anchor primer(5'→3')
AP1      ccatcctaatacgactcactatagggc（配列番号１０）
AP2      actcactatagggctcgagcggc（配列番号１１）
AP1とG6-R2の組み合わせでPCRを行い、そのPCR産物を鋳型にしてAP2とG6-R4でnested PCRを行い、得られた断片の塩基配列を決定した。一方3'側はRat Adipose Tissue 3'-RACE cDNA (Biochain)をテンプレートとしてクローニングした。
（3'-RACE）
cDNA：3'-RACE cDNA rat Adipose (Biochain)
primer(5'→3')
G6-F12      tggagcagaatggtcacagcctac（配列番号１２）
LOST1-F1      gatcctggcttcagactgttag（配列番号１３）
Anchor primer(5'→3')      ggatccactgcagtggaattc（配列番号１４）
G6-F12とAnchor primerの組み合わせでPCRを行い、さらにLOST1-F1 primerとAnchor primerとの組み合わせでnested PCRにより得られた断片にポリA配列を確認した。その結果、全長3410bpの配列を得た（配列番号６）。ORFはその配列中に完結しており、522bpであった。推測されたアミノ酸配列は173アミノ酸残基であった。この遺伝子はBLASTにてhuman TUSC5遺伝子（GenBank Accession Number: NM_172367）と非常に高いホモロジーを示した（Identity 85%）。またこのORFは上記２種類のcDNAライブラリからPCRで増幅できたことも併せて、ラットのTUSC5遺伝子であると判断した。また、3410bpの3'末端にはpoly Aサイトも検出できたことから、配列はラットTUSC5 mRNAの全長である可能性が高いことが確認できた。
【００６３】
（ラット正常組織における、ＴＵＳＣ５遺伝子の発現）
１．プライマーセット
GAPDHとしては、TaqMAN Rodent GAPDH Control Reagents(Applied Biosystems社)同封のプライマーセットを用いた。
【００６４】
TUSC５は、配列番号６（ラットTUSC5）をもとにプローブ検索ソフトPrimer Express （Applied Biosystems社）によりリアルタイム定量PCR用プライマーを選択した。TUSC5のPCR用プライマーとして配列番号１５及び配列番号１６のプライマーセット（Amasham Pharmacia社により製造された）を用いた。
【００６５】
２．TaqMAN Probe
TaqMAN Probeは、末端をクエンチャー物質（TAMRA）で修飾した。
【００６６】
GAPDHは、TaqMAN Rodent GAPDH Control Reagents(Applied Biosystems社)同封のプローブを用いた。レポーターとして、VICを用いた。
【００６７】
TUSC5は、Primer Expressで設計した配列番号１７のプローブ（Applied Biosystems社により製造された）を用いた。レポーターとしてFAMを用いた。
【００６８】
３．cDNA
脂肪細胞としては、3'-RACE cDNA Rat Tissue Adipose (Biochain社)を用いた。
【００６９】
脳、心臓、腎臓肝臓、肺、骨格筋、脾臓および精巣細胞としては、はRAT MTC PanelＩ（CLONTECH社製）を用いた。
【００７０】
４．TaqMAN反応液の調製
GAPDH、TUSC5それぞれについて表１に示す組成の反応液を作った。この反応液を、５０℃で２分間、９５℃で2分間処理した後、９５℃１５秒、６０℃１分の反応を４０サイクル行って、この反応液からＰＣＲ産物を得た。PCR反応及び蛍光測定は、ABI PRISM 7000 Sequence Detection System（Applied Biosystems社製）にて行った。
【００７１】
【表１】
2007097547.tif 000003
【００７２】
各細胞におけるＴＵＳＣ５遺伝子の発現結果を、図１に示す。図１のグラフはGAPDHで補正したTUSC5の発現量を相対値（ΔCt (GAPDH−TUSC5)）で示した。リアルタイム定量PCRでは、増幅産物の電気泳動と融解曲線を作製することにより目的の一種類のみ増幅されていることを確認した。図１に示すように、ラット正常組織においてTUSC5 mRNAの発現は偏在していたが、特に脂肪組織において顕著な高発現が確認された。
【００７３】
（３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化誘導時のＴＵＳＣ５遺伝子の発現）
6-wellプレートに3T3-L1細胞をまき、100%コンフルエントになるまで培養した。培養液は10％牛血清を含むDulbecco's Modified Eagle Medium(D-MEM)を用いた。その後、前記培養液を、脂肪細胞への分化誘導のための培養液(D-MEM, 10% 胎児牛血清, 0.25 nM dexamethasone, 0.5 mM IBMX, 10 μg/ml insulin)に交換し、さらに、48時間後に細胞維持培養液(D-MEM, 10% 胎児牛血清, 5 μg/ml insulin)に交換し、培養細胞を維持した。
【００７４】
ＴＵＳＣ５ｍＲＮＡ測定のための培養細胞からのＲＮＡの採取は、分化誘導直前を０時間として、４８時間後、７２時間後、９６時間後、１２０時間後及び１４４時間後に行った。その結果を図２に示す。
【００７５】
図２に示すように、分化誘導４８時間後に著明なＴＵＳＣ５ｍＲＮＡの発現増加が認められ、その増加は１４４時間まで持続したことを確認した。
【００７６】
（ラットの各脂肪組織におけるＴＵＳＣ５遺伝子の発現）
Wistarラットの脂肪組織でのTUSC5 mRNAの発現
10週齢オスWistarラットの褐色脂肪(BAT)、皮下脂肪(Subcutaneous)、副睾丸脂肪(Epididymal)、腎臓周囲脂肪(Perirenal)、腸間膜脂肪(Mesenteric)のTUSC5 mRNAを測定した。ラットを断頭で殺し、各脂肪組織を採取した。その組織をドライアイスで凍結させ、アッセイまで-80℃で保存した。mRNAの測定は、以下のようにして行った。まず、各脂肪組織をポリトロンでホモジネートした後、RNA抽出キットでmRNAを抽出した。その後、リアルタイムPCR法によってTUSC5とβ-actinのmRNAを測定した。その測定結果は、両者のサイクル数の差(β-actin−TUSC5)で表示した(図３)。図３に示すように、褐色脂肪、皮下脂肪、副睾丸脂肪及び腎臓周囲脂肪でTUSC5 mRNAの高発現が認められ、一方、これらの部位と比較して腸間膜脂肪での発現量は低値であることを確認した。
【００７７】
（健常ラットと肥満ラットの脂肪組織におけるＴＵＳＣ５遺伝子の発現）
Zucker leanラット及びZucker fattyラットの脂肪組織でのTUSC5 mRNAの発現
10週齢オスZucker leanラット及びZucker fattyラットから前述の各脂肪組織を採取し、ラットの各脂肪組織におけるｍＲＮＡ測定方法と同様の方法で前記組織中のmRNAを測定した。測定結果はTUSC5 ｍＲＮＡ／β-actin mRNAの比で表示した(図４)。図４に示すように、褐色脂肪、皮下脂肪、副睾丸脂肪、腎臓周囲脂肪及び心臓周囲脂肪でのTUSC5 mRNA発現量はleanラットとfattyラット間で差は確認できなかった。しかし、図４に示すように、fattyラットの腸間膜脂肪(Mesenteric)でのTUSC5 mRNAの発現量は、leanラットと比較して、明らかな増加を確認した。
【００７８】
（健常ラットと肥満ラットの褐色脂肪組織におけるＴＵＳＣ５遺伝子の発現）
Zucker leanラット及びZucker fattyラットの褐色脂肪組織でのTUSC5 mRNAの発現
10週齢オスZucker leanラット及びZucker fattyラットを寒冷暴露（4℃、6時間）後、褐色脂肪組織を採取し、前記組織中のTUSC5 mRNAを前述の方法で測定した。その結果を図５に示す。図５に示されるように、leanラットでは寒冷暴露によりTUSC5 mRNAは有意に減少したことを確認した。また、fattyラットではTUSC5 mRNAの減少傾向を確認した。さらに、寒冷暴露後ではleanラットと比較してfattyラットのTUSC5 mRNA発現量が有意に高いことを確認した。
【００７９】
前記のように、健常ラットにおいて、寒冷暴露により、ＴＵＳＣ５遺伝子の発現が低下したという前記知見より、熱産生の促進とＴＵＳＣ５遺伝子の発現の抑制との間に関連が認められる。また、前記のように、熱産生が促進されると、肥満が治療または防止される。従って、ＴＵＳＣ５遺伝子の発現量を指標にすることにより、肥満治療剤または肥満防止剤をスクリーニングすることができる。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
以上、説明したとおり、本発明のスクリーニング方法は、肥満治療剤または肥満予防剤を提供できるので、例えば、肥満の治療および予防の分野で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】ラット正常組織におけるＴＵＳＣ５遺伝子の発現を示した図である。
【図２】３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化誘導時のＴＵＳＣ５遺伝子の発現を示した図である。
【図３】ラットの各脂肪組織におけるＴＵＳＣ５遺伝子の発現を示した図である。
【図４】健常ラットと肥満ラットの各脂肪組織におけるＴＵＳＣ５遺伝子発現を示した図である。
【図５】寒冷暴露後の、健常ラットと肥満ラットの褐色脂肪組織におけるＴＵＳＣ５遺伝子発現を示した図である。
【配列表フリーテキスト】
【００８２】
配列番号１  ＴＵＳＣ５遺伝子（ヒト）
配列番号２  ＴＵＳＣ５タンパク質（ヒト）
配列番号３  ＴＵＳＣ５遺伝子（マウス）
配列番号４  ＴＵＳＣ５タンパク質（マウス）
配列番号５  ＴＵＳＣ５遺伝子（ラット）
配列番号６  ＴＵＳＣ５遺伝子（ラット）
配列番号７  ＴＵＳＣ５タンパク質（ラット）
配列番号８  ５’−ＲＡＣＥ用プライマー
配列番号９  ５’−ＲＡＣＥ用プライマー
配列番号１０  ５’−ＲＡＣＥ用アンカープライマー
配列番号１１  ５’−ＲＡＣＥ用アンカープライマー
配列番号１２  ３’−ＲＡＣＥ用プライマー
配列番号１３  ３’−ＲＡＣＥ用プライマー
配列番号１４  ３’−ＲＡＣＥ用アンカープライマー
配列番号１５  ＰＣＲ用プライマー
配列番号１６  ＰＣＲ用プライマー
配列番号１７  プローブ
【図１】
2007097547.tif 000004
【図２】
2007097547.tif 000005
【図３】
2007097547.tif 000006
【図４】
2007097547.tif 000007
【図５】
2007097547.tif 000008
【配列表】
2007097547000001.app