(57)【要約】【課題】ヘリコバクター・ピロリの胃粘膜への接着を阻害する物質を有効成分とするヘリコバクター・ピロリ接着阻害剤を提供すること。【解決手段】アスコフィラム  ノドサム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｎｏｄｓｕｍ）の抽出物を有効成分として含有することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ接着阻害剤。【選択図】なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスコフィラム  ノドサム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｎｏｄｓｕｍ）の抽出物を有効成分として含有することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ接着阻害剤。
【請求項２】
請求項１に記載の抽出物の精製物を有効成分として含有することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ接着阻害剤。
【請求項３】
飲食品である請求項１または２に記載のヘリコバクター・ピロリ接着阻害剤。
【請求項４】
ヘリコバクター・ピロリに起因する胃炎、胃潰瘍および十二指腸潰瘍の治療・予防を目的とする健康食品または特定保健用食品である請求項３に記載のヘリコバクター・ピロリ接着阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は海藻抽出物、詳しくは褐藻類の一種であるアスコフィラム  ノドサム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｎｏｄｓｕｍ）の抽出物を有効成分として含有するヘリコバクター・ピロリ接着阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｈｙｌｏｒｉ）は、一端に数本の鞭毛をもつ螺旋形のグラム陰性桿菌であり、ヒトの胃粘膜に生息する。この菌は、１９８３年オーストラリアのＷａｒｒｅｎ  Ｊ．Ｒ．とＭａｒｓｈａｌｌ  Ｂ．Ｊ．によって発見され、その後の研究で、胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍などの発症に関与することが強く推察されている。
【０００３】
ヘリコバクター・ピロリによる上記症状を治療する方法として、現在抗生物質とプロトンポンプ阻害剤の併用が試みられている。しかし、この治療法は多量の抗生物質を長期投与する必要があるため、副作用や耐性菌の出現などの問題が生じる。そこで、より副作用の少ない予防及び治療法として、ヘリコバクター・ピロリの胃粘膜への接着を阻害する方法が開発されており、ヘリコバクター・ピロリ接着阻害剤として、例えばフコイダンを有効成分とするヘリコバクター・ピロリの定着阻害剤（特許文献１参照）、グルクロン酸含有フコイダンを有効成分とするヘリコバクター・ピロリの接着阻害剤（特許文献２参照）などが提案されている。
【０００４】
一方アスコフィラム  ノドサムの抽出物については、アスコフィラム  ノドサムの抽出物を有効成分として含有するリパーゼ阻害剤（特許文献３参照）、アスコフィラム  ノドサムの抽出物を有効成分として含有する糖質加水分解酵素阻害剤（特許文献４参照）などが知られているが、ヘリコバクター・ピロリが胃粘膜に接着するのを阻害する作用があることはこれまで知られていない。
【０００５】
【特許文献１】特開平７−１３８１６６号公報、請求項５
【特許文献２】特開平１０−２８７５７１号公報
【特許文献３】特開２００５−１７０８３６号公報
【特許文献４】特開２００５−１７０８３７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ヘリコバクター・ピロリの胃粘膜への接着を阻害する物質を有効成分とするヘリコバクター・ピロリ接着阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題に対して鋭意・検討を行った結果、アスコフィラム  ノドサム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｎｏｄｓｕｍ）の抽出物が、胃癌細胞株（ＭＫＮ４５細胞）に対するヘリコバクター・ピロリの接着を強く阻害することを見いだし、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
すなわち、本発明は、
（１）アスコフィラム  ノドサムの抽出物を有効成分として含有することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ接着阻害剤、
（２）前記１に記載の抽出物の精製物を有効成分として含有することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ接着阻害剤、
（３）飲食品である前記１または２に記載のヘリコバクター・ピロリ接着阻害剤、
（４）ヘリコバクター・ピロリに起因する胃炎、胃潰瘍および十二指腸潰瘍の治療・予防を目的とする健康食品または特定保健用食品である前記３に記載のヘリコバクター・ピロリ接着阻害剤、
からなっている。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のヘリコバクター・ピロリ接着阻害剤は、ヘリコバクター・ピロリに起因すると推察される胃粘膜の炎症の予防と治療に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
アスコフィラム  ノドサム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｎｏｄｓｕｍ）（以下「アスコフィラム」という）は、褐藻類ヒバマタ目、ヒバマタ科に属する海藻であり、主にノルウェーのリアス式海岸の岩礁地帯に生育している。本発明において、アスコフィラムは、そのいずれの組織、部位も用いることができるが、好ましくは葉茎部である。アスコフィラムからの抽出に際し、海から収穫された全藻もしくは葉茎部をそのまま、またはそれらを裁断、細断もしくは磨砕したもの、更にそれらを乾燥したもの、または全藻もしくは葉茎部を乾燥後に裁断、細断もしくは粉砕したものを用いることができ、好ましくは生のものを乾燥し、粉砕したものである。乾燥は、例えば天日乾燥、通風乾燥、真空乾燥、真空凍結乾燥など、自体公知の方法で行ってよい。
【００１０】
抽出溶剤としては、有機溶剤または有機溶剤と水の混合液が好ましく用いられる。有機溶剤としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノールおよびｔｅｒｔ−ブタノールなどの炭素数１〜４の低級アルコール、ジメチルケトン、メチルエチルケトン、アセトンおよびメチルイソブチルケトンなどのケトン類などの極性有機溶剤、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、並びにジエチルエーテルなどの非極性有機溶剤が挙げられる。更に、これら極性有機溶剤と非極性有機溶剤を適宜組み合わせてもよい。
【００１１】
これらの抽出溶剤の内、極性有機溶剤または極性有機溶剤と水の混合液が好ましく用いられる。該極性有機溶剤としては、メタノール、エタノールまたはアセトンが特に好ましい。極性有機溶剤と水の混合液の混合比率は、通常、極性有機溶剤／水が５／９５〜１００／０（ｖ／ｖ）の範囲内である。例えば、極性有機溶剤としてメタノールまたはエタノールを用いる場合、極性有機溶剤／水の比率は通常５／９５〜１００／０（ｖ／ｖ）の範囲内であり、好ましくは３０／７０〜７０／３０（ｖ／ｖ）である。また極性有機溶剤としてアセトンを用いる場合、前記比率は通常５／９５〜１００／０（ｖ／ｖ）の範囲内であり、好ましくは３０／７０〜８０／２０（ｖ／ｖ）である。これらの比率は、抽出効率、抽出物量および抽出物のヘリコバクター・ピロリ接着阻害活性などを考慮して決められるのが好ましい。
【００１２】
本発明において、抽出物を得るための抽出方法に特に制限はなく、浸漬による抽出、加熱抽出、連続抽出および超臨界抽出など、自体公知の方法を用いることができる。抽出に用いられる抽出溶剤の量に特に制限はないが、抽出溶剤量／アスコフィラム乾燥物の割合が２／１〜１００／１（ｖ／ｗ）の範囲が好ましく、５／１〜１０／１（ｖ／ｗ）の範囲がより好ましい。具体的には、抽出は、例えばアスコフィラムを乾燥し、粉砕した抽出原料１００ｇに対して抽出溶剤約２００ｍＬ〜１０Ｌ、好ましくは約５００ｍｌ〜１Ｌを用い、静置または緩やかに撹拌しながら行われる。抽出温度は室温（約１〜３０℃）から常圧下での溶剤の沸点以下の範囲とするのが作業上有利である。また抽出時間は抽出温度などによって異なるが、通常数分から７日間の範囲であり、約３０分〜２４時間とするのが好ましい。
【００１３】
抽出操作終了後、ろ過または遠心分離など自体公知の方法で固形物（抽残）が除かれ、抽出液が得られる。抽出液は自体公知の方法で濃縮され、黒〜褐色油状またはペースト状の濃縮された抽出物が得られる。更に、抽出液または濃縮された抽出物を例えば通風乾燥、真空乾燥、真空凍結乾燥など自体公知の方法で乾燥することにより、粉末または固形状の乾燥された抽出物が得られる。
抽出液、抽出液の濃縮物、または抽出液の乾燥物を有機溶剤および／または水に溶解した溶液を、例えば限外ろ過、分配クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、分子排斥クロマトグラフィーあるいは液液抽出などの方法により精製することが好ましく行われる。精製方法としては、とりわけ吸着クロマトグラフィーが好ましい。このようにして得られる抽出物の精製物もまた、アスコフィラム抽出物として本発明に用いることができる。
本発明に係る抽出物は低分化型胃癌細胞株（ＭＫＮ４５細胞）に対するヘリコバクター・ピロリの接着を強く阻害することから、ヘリコバクター・ピロリ接着阻害剤として有用である。
【００１４】
本発明のヘリコバクター・ピロリ接着阻害剤は、上記抽出物または精製物をそのまま、あるいは抽出物または精製物に製薬学的に許容される添加物、食品素材および食品添加物などを必要に応じて適宜混合し、自体公知の方法で液剤、散剤、顆粒剤、錠剤、マイクロカプセル、ソフトカプセルおよびハードカプセルなどの製剤として製造することができる。また、飲食品として、固形食品、クリーム状またはジャム状の半流動食品、ゲル状食品、飲料などあらゆる食品形態にすることができる。このような飲食品としては、例えば、清涼飲料、コーヒー、紅茶、乳飲料、乳酸菌飲料、ドロップ、キャンディー、チューインガム、チョコレート、グミ、ヨーグルト、アイスクリーム、プリン、水羊羹、ゼリー、菓子およびクッキーなどが挙げられる。これら各種製剤および飲食品は、胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍などの予防、治療を目的とする健康食品または特定保健用食品として有用である。
【００１５】
上記製剤および飲食品の製造に用いられる製薬学的に許容される添加物、食品素材および食品添加物としては、例えば賦形剤（乳糖、デキストリン、コーンスターチ、結晶セルロースなど）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、ショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステルなど）、崩壊剤（カルボキシメチルセルロースカルシウム、無水リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウムなど）、結合剤（澱粉糊液、ヒドロキシプロピルセルロース液、アラビアガム液など）、溶解補助剤（アラビアガム、ポリソルベート８０など）、乳化剤（グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルなど）、酸化防止剤（ＢＨＴ、ＢＨＡ、アスコルビン酸、トコフェロールなど）、保存料（ソルビン酸、パラオキシ安息香酸メチル、亜硫酸ナトリウムなど）、増粘安定剤（アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウムなど）、甘味料（砂糖、果糖ブドウ糖液糖、ハチミツ、アスパルテームなど）、酸味料（クエン酸、乳酸、ＤＬ−リンゴ酸など）、調味料（ＤＬ−アラニン、５´−イノシン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン酸ナトリウムなど）、着色料（β−カロテン、食用タール色素、リボフラビンなど）、香料（ハッカ、ストロベリー香料など）などを使用することができる。
【００１６】
上記各種製剤および飲食品１００質量％中に配合される本発明抽出物の量は、固形分換算量で、通常約０．００１〜５０質量％、好ましくは約０．００１〜２０質量％、より好ましくは約０．０１〜１０質量％である。
【００１７】
これら各種製剤および飲食品を経口的に摂取する場合、本発明抽出物の成人一日当たりの用量は、固形分換算量で、約１〜３０００ｍｇ／ｋｇの範囲である。この用量を、１回乃至数回に分けて摂取するとよい。但し、実際の用量は、目的や摂取者の状況（性別、年齢、症状など）を考慮して決められるべきである。
【００１８】
以下に、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００１９】
［製造例１］
アスコフィラム乾燥粉末約８００ｇに、エタノール−水〔５０：５０（ｖ／ｖ）〕混合液８Ｌを加え、緩やかに攪拌しながら室温で１時間抽出した。抽出液を遠心管に移し、遠心分離により上澄み液と沈殿に分け、沈殿に上記エタノール−水混合液８Ｌを加え、１回目と同様にして１時間抽出した。抽出液を１回目と同様にして上澄み液と沈殿に分け、１回目と２回目の上澄み液を合わせて吸引ろ過し、ろ液として計約１６Ｌの抽出液を得た。この抽出液を、分画分子量１万の限外ろ過膜（商品名：ＦＢ０２−ＶＣ−ＦＵＳＯ１８１；ダイセンメンブレンシステムズ社製）を用いて限外ろ過し、濃縮液量が５Ｌになった時点で水５Ｌを加えてろ過を続け、濃縮液量が再び５Ｌになった時点で限外ろ過を終了した。濃縮液をロータリーエバポレーターを用いて減圧下、約６０℃で濃縮し、次に濃縮物を凍結乾燥して黒褐色粉末状の抽出物約７３ｇを得た。このものの乾燥減量は約５質量％であった。
【００２０】
［試験例１］
製造例１で得たアスコフィラム抽出物添加による、ＭＫＮ４５細胞（ＲＣＢ１００１株；ＲＩＫＥＮ  ＢＲＣ）に対するヘリコバクター・ピロリの接着阻害効果を試験した。
【００２１】
［ヘリコバクター・ピロリ菌液の調整］
ヘリコバクター・ピロリ（ＡＴＣＣ４３５０４株）をＣＤＣ嫌気性菌用羊血液寒天培地（ＢＢＬ社製）を用いて、３７℃、微好気条件下で５日間培養した。培養には、脱酸素剤（商品名：アネロパック・ヘリコＡ−２６；三菱ガス化学社製）を入れた角型ジャーを使用した。発育したコロニーを掻きとってＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）に懸濁し、菌数を約１×１０8ＣＦＵ／ｍＬに調整した。
【００２２】
［細胞浮遊液の調整］
ＭＫＮ４５細胞を１０％牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を用いて、３７℃、５％ＣＯ2内で５日間培養した。培養後、０．２５％トリプシン１ｍＭ  ＥＤＴＡ処理にて細胞を剥離し、遠心加速度３００×ｇ、２０℃で５分間遠心して培地を除き、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）による懸濁と遠心を繰り返し、合計２回細胞を洗浄した。次に細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．０）に懸濁し、細胞数を約１×１０6個／ｍＬに調整した。
【００２３】
［抗ヘリコバクター・ピロリ抗体の調整］
ヘリコバクター・ピロリ（ＡＴＣＣ４３５０４株）をＣＤＣ嫌気性菌用羊血液寒天培地（ＢＢＬ社製）を用いて、３７℃、微好気条件下で５日間培養した。発育したコロニーを掻きとって、１％ホルマリン含有生理食塩水に懸濁し、菌数を約１．８×１０8ＣＦＵ／ｍＬに調整し抗原液とした。該抗原液０．５ｍＬをＮＺＷウサギ（日本エスエルシー社）雄２匹に静脈注射し、以降丸４日経過毎に、１．０ｍＬ、２．０ｍＬ、４．０ｍＬ、４．０ｍＬの順に計５回注射した。最後の注射から７日後に試採血し、十分な抗体の産生が認められることを確認後、ウサギの頚動脈から全採血した。採取した血液は、室温で数時間放置した後４℃で一晩静置し、翌日遠心して血清を分離し、抗ヘリコバクター・ピロリ抗体とした。
【００２４】
［ヘリコバクター・ピロリの接着阻害試験］
（１）製造例１のアスコフィラム抽出物（粉末）を乾燥物換算で１０．０ｍｇを正確に量り、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）に溶かして全量を１０ｍＬとし、０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過し、アスコフィラム抽出物試験液（１ｍｇ／ｍＬ）とした。次に、この試験液１ｍＬを正確に量り、ＲＰＭＩ１６４０培地に溶かして全量をそれぞれ１０ｍＬ、５０ｍＬおよび１００ｍＬとし、アスコフィラム抽出物試験液（０．１ｍｇ／ｍＬ、０．０２ｍｇ／ｍＬおよび０．０１ｍｇ／ｍＬ）とした。
（２）ヘリコバクター・ピロリ菌液０．５ｍＬを小遠沈管に入れ、遠心加速度３００×ｇ、２０℃で１０分間遠心して上澄みを除き、（１）のアスコフィラム抽出物試験液１．０ｍＬを加え、約３７℃で１８時間インキュベートした。その後、遠心加速度３００×ｇ、２０℃で１０分間遠心して上澄みを除き、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）０．５ｍＬを加え、ヘリコバクター・ピロリ菌懸濁液を調製した。
（３）（２）のヘリコバクター・ピロリ菌懸濁液に細胞浮遊液０．５ｍＬを加え、約３７℃で１時間振とうした。その後、１５％スクロース水溶液５．０ｍＬに重層し、遠心加速度３００×ｇ、２０℃で１０分間遠心して上澄みを除き、更にＰＢＳ（ｐＨ７．０）による懸濁と遠心を繰り返し、合計２回細胞を洗浄した。
（４）洗浄後、抗ヘリコバクター・ピロリ抗体（５０００倍希釈）１００μＬを加え、約３７℃で６０分間放置し、その後、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）による懸濁と遠心を繰り返し、合計２回細胞を洗浄した。
（５）洗浄後、８０倍希釈のＦＩＴＣラベル抗ウサギ抗体（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）１００μＬを加え、遮光下、室温で３０分間放置し、その後、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）による懸濁と遠心を繰り返し、合計２回細胞を洗浄した。
（６）（５）で得た細胞を０．５〜１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．０）に懸濁し、１％パラホルムアルデヒド１００μＬを加えて固定し、フローサイトメーター（型式：Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００；ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社製）にて細胞の蛍光強度を測定した。
（７）上記試験（２）のアスコフィラム抽出物試験液１．０ｍＬに替えて精製水１．０ｍＬを加える以外は同様に実施し、対照とした。
【００２５】
［試験結果］
フローサイトメーターで測定された総細胞数に対する蛍光強度が０〜１１０までの範囲に検出された細胞数の百分率を計算し、ヘリコバクター・ピロリ低接着細胞率（％）とした。結果を表１に示した。
【００２６】
【表１】
2007284361.tif 000002
【００２７】
表１から、ヘリコバクター・ピロリをアスコフィラム抽出物試験液と接触させることによりＭＫＮ４５細胞に対するヘリコバクター・ピロリの接着が阻害され、その効果はアスコフィラム抽出物試験液の濃度に依存して増加することが明らかである。