(57)【要約】【課題】新しい特性や機能発現を行う固相膜を提供する。【解決手段】血清アルブミンにポリ（エチレングリコール）基を共有結合した表面修飾血清アルブミン、または金属ポルフィリンを包接した血清アルブミンにポリ（エチレングリコール）基を共有結合した表面修飾血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体からなる固相膜。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清アルブミンにポリ（エチレングリコール）基を共有結合した表面修飾血清アルブミンからなる固相膜。
【請求項２】
金属ポルフィリンを包接した血清アルブミンにポリ（エチレングリコール）基を共有結合した表面修飾血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体からなる固相膜。
【請求項３】
血清アルブミン分子に存在するリジン残基のアミノ基をイミノチオランによりチオレート基へ変換し、それに末端マレイミド基を有するポリ（エチレングリコール）を反応させることにより得た表面修飾血清アルブミンまたは表面修飾血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体からなる請求項１または２記載の固相膜。
【請求項４】
血清アルブミン分子に存在するリジン残基のアミノ基に末端スクシンイミド基を有するポリ（エチレングリコール）を反応させることにより得た表面修飾血清アルブミンまたは表面修飾血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体からなる請求項１または２記載の固相膜。
【請求項５】
アルブミンがヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、組換えヒト血清アルブミン、アルブミン多量体である請求項３または４に記載の固相膜。
【請求項６】
請求項５に記載の表面修飾血清アルブミンまたは表面修飾血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体からなる固相膜を有機溶媒に溶解し、その均一溶液から有機溶媒を揮発させることにより調製した固相膜。
【請求項７】
アルブミン１分子当りのポリ（エチレングリコール）の平均結合本数が１〜２０である請求項５または６に記載の固相膜。
【請求項８】
金属ポルフィリンが、一般式［Ｉ］：
【化１】
2007209543.tif 000006
（ここで、Ｒ1は置換基を有してもよい直鎖または脂環式炭化水素基、Ｒ2はアルキレン基、Ｒ3はイミダゾリル基の中心遷移金属イオンＭ（周期律表第４〜５周期の遷移金属イオン）への配位を許容する基、Ｘ-はハロゲン化物イオン、Ｘ-の個数ｎは前記遷移金属イオンＭの価数から２を差し引いた数）で示される請求項２〜４のいずれか１項に記載の固相膜。
【請求項９】
金属ポルフィリンのＲ1が１位に置換基を有する直鎖または脂環式炭化水素基であり、Ｒ2がＣ1〜Ｃ10アルキレン基であり、Ｒ3が水素原子またはメチル基、エチル基もしくはプロピル基である請求項８に記載の表面修飾血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体。
【請求項１０】
金属ポルフィリンのＲ1が１，１−二置換Ｃ1〜Ｃ10アルキル基、１−置換シクロプロピル基、１−置換シクロペンチル基、１−置換シクロヘキシル基、２−置換ノルボルニル基（これら基における置換基は、メチル基、アルキルアミド基、アルキルエステル基またはアルキルエーテル基）、１−メチル−２−シクロヘキセニル基、または１−アダマンチル基である請求項９に記載の固相膜。
【請求項１１】
金属ポルフィリンが、一般式［II］：
【化２】
2007209543.tif 000007
（ここで、Ｒ4は置換基を有してもよい直鎖または脂環式炭化水素基、Ｒ5はアルキレン基、Ｒ6はアルキル基、Ｍは中心遷移金属イオン（周期律表第４〜５周期の遷移金属イオン）、Ｘ-はハロゲン化物イオン、Ｘ-の個数ｎは前記遷移金属イオンＭの価数から２を差し引いた数）で示される金属ポルフィリン錯体である請求項２〜４のいずれか１項に記載の固相膜。
【請求項１２】
金属ポルフィリンのＲ4が１位に置換基を有する直鎖または脂環式炭化水素基であり、Ｒ5がＣ1〜Ｃ6アルキレン基であり、Ｒ6がＣ1〜Ｃ6アルキル基である請求項１１に記載の固相膜。
【請求項１３】
金属ポルフィリンのＲ4が１，１−二置換Ｃ1〜Ｃ10アルキル基、１−置換シクロプロピル基、１−置換シクロペンチル基、１−置換シクロヘキシル基、２−置換ノルボルニル基（これら基における置換基は、メチル基、アルキルアミド基、アルキルエステル基またはアルキルエーテル基）、１−メチル−２−シクロヘキセニル基、または１−アダマンチル基である請求項１２に記載の固相膜。
【請求項１４】
金属ポルフィリンが、一般式［III］：
【化３】
2007209543.tif 000008
（ここで、Ｒ7は置換基を有してもよい直鎖または脂環式炭化水素基、Ｒ8はアルキレン基、Ｒ9はイミダゾリル基の中心遷移金属イオンＭ（周期律表第４〜５周期の遷移金属イオン）への配位を許容する基、Ｘ-はハロゲン化物イオン、Ｘ-の個数ｎは前記遷移金属イオンＭの価数から２を差し引いた数）で示される請求項２〜４のいずれか１項に記載の固相膜。
【請求項１５】
金属ポルフィリンのＲ7が１位に置換基を有する直鎖または脂環式炭化水素基であり、Ｒ8がＣ1〜Ｃ10アルキレン基であり、Ｒ9が水素原子またはメチル基、エチル基もしくはプロピル基である請求項１４に記載の固相膜。
【請求項１６】
金属ポルフィリンのＲ10が１，１−二置換Ｃ1〜Ｃ10アルキル基、１−置換シクロプロピル基、１−置換シクロペンチル基、１−置換シクロヘキシル基、２−置換ノルボルニル基（これら基における置換基は、メチル基、アルキルアミド基、アルキルエステル基またはアルキルエーテル基）、１−メチル−２−シクロヘキセニル基、または１−アダマンチル基である請求項１５に記載の固相膜。
【請求項１７】
金属ポルフィリンが、一般式［IV］：
【化４】
2007209543.tif 000009
（ここで、Ｒ10は水素または炭化水素基、Ｒ11はアルキル基、Ｒ12はアルキレン基、Ｒ13はイミダゾリル基の中心遷移金属イオンＭ（周期律表第４〜５周期の遷移金属イオン）への配位を許容する基、Ｘ-はハロゲン化物イオン、Ｘ-の個数ｎは前記遷移金属イオンＭの価数から２を差し引いた数）で示される請求項２〜４のいずれか１項に記載の固相膜。
【請求項１８】
金属ポルフィリンのＲ10が水素原子、ビニル基、エチル基、ホルミル基、もしくはアセチル基であり、Ｒ11がＣ1〜Ｃ10アルキレン基であり、Ｒ12がＣ1〜Ｃ10アルキレン基でありＲ13が水素原子またはメチル基、エチル基もしくはプロピル基である請求項１７に記載の固相膜。
【請求項１９】
金属ポルフィリンを包接した血清アルブミンが、金属ポルフィリンの結合をもたらすアミノ酸を遺伝子組み換え技術により少なくとも一つ導入された組換えヒト血清アルブミンに、金属ポルフィリンを軸配位結合させて得た組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体で示される請求項２〜４のいずれか１項に記載の固相膜。
【請求項２０】
金属ポルフィリンのＭがＦｅまたはＣｏで示される請求項１０、１３、１６、１８または１９に記載の固相膜。
【請求項２１】
Ｆｅの価数が＋２価または＋３価である請求項２０記載の固相膜。
【請求項２２】
Ｃｏの価数が＋２価である請求項２０記載の固相膜。
【請求項２３】
請求項２１または２２の固相膜からなる酸素吸着膜。
【請求項２４】
請求項５、６、７または２３に記載の固相膜からなる人工皮膚、各種コーティング剤、表面改質（親水化処理）剤、人工血管表面処理剤、人工臓器表面処理剤、医療器具表面処理剤、細胞シート、または薄膜として携帯できる人工血漿増量剤もしくは人工酸素運搬体。
【請求項２５】
請求項２３に記載の酸素吸着膜を構成成分とする酸素富化膜、酸素透過膜、酸素除去膜、またはガス選択分離膜。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血清アルブミン、または金属ポルフィリンを包接した血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体に、ポリ（エチレングリコール）基を共有結合して得た表面修飾血清アルブミン、または表面修飾血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体からなる固相膜と、それを構成成分とする機能性膜に関する。
【背景技術】
【０００２】
生命活動に必要不可欠な酸素運搬の役割を演じるヘム蛋白質ヘモグロビンの機能を合成化学的手法により再現し、これを実用化しようとする研究、すなわち人工赤血球の開発に関する研究は、１９７０年代から精力的に開始された。初期の目標は、ヘモグロビンの酸素吸着席であるヘム、すなわち鉄（II）ポルフィリンの誘導体を合成し、酸素結合能を発現できる構造要件を解明することであった。多くのヘム誘導体が調製され、その酸素結合能が評価された結果、５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルロイルアミノフェニル）ポルフィリン鉄（II）錯体（以下、FeTpivPP錯体と呼ぶ）（非特許文献１）が、室温下で安定な酸素錯体を形成できることが明らかとなった。FeTpivPP錯体は、軸塩基、例えば、１−アルキルイミダゾール、１−アルキル−２−メチルイミダゾールなどを共存させると、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどの有機溶媒中、分子状酸素を可逆的に結合解離できる。多くの研究例は、非特許文献２、非特許文献３などに詳細にまとめられており、最近の開発動向は非特許文献４、非特許文献５などに記載されている。
【０００３】
しかし、実際に人工赤血球としての利用を指向した場合、それらのヘム誘導体を溶解する溶媒は生理塩水溶液でなければならないことはいうまでもない。鉄ポルフィリンが可逆的な酸素配位活性を発現できるのは、その中心鉄が２価の状態にある場合のみで、中心鉄が酸化し、鉄（III）錯体になると酸素配位活性は失われる。一般的に水溶液中では中心鉄（II）の酸化反応が加速されるため、得られる酸素錯体の安定度は著しく低下する。本発明者らは、FeTpivPP錯体をリン脂質から成る二分子膜小胞体の疎水的な分子空間に包接させることにより、この問題を克服し、生理条件下（水相系、ｐＨ７．４、３７℃）でも同様の酸素吸脱着機能を発揮させることに成功した（例えば、非特許文献６など）。
【０００４】
さらに本発明者らは、鉄（II）ポルフィリンの分子内へ置換基として、例えばアルキルイミダゾール誘導体を共有結合したFeTpivPP類縁体を合成し（特許文献１、非特許文献７）、これをヒト血清アルブミンに包接させた系について、可逆的な酸素の吸脱着反応を明らかにしている（特許文献２、３）。この場合は、酸素配位に必要不可欠でありながら毒性を有するイミダゾール配位子の添加が必要最低限に抑えられるので、生体への安全性がきわめて高くなる。実際にヒト血清アルブミンに分子内塩基結合型FeTpivPPを包接させて得た血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体が、生体内で酸素輸送のできる人工赤血球として作用することが実証されている（非特許文献８）。また、分子状ヘモグロビン製剤に見られる血圧亢進などの副作用も全く認められない特徴も有する（非特許文献９）。
【０００５】
唯一、この血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体が改善を要すべき点としては、鉄（II）ポルフィリンの脱離を抑止することが挙げられる。それは、金属ポルフィリンの包接駆動力が、疎水性相互作用、すなわち非共有結合であるためにほかならない。上記血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体水溶液を赤血球の代替物として体内へ投与した場合、ある程度の期間血流中に留まり、酸素輸送体の役割を担ってくれることが望ましいが、アルブミン−金属ポルフィリン複合体を血中に投与すると、しばらくして金属ポルフィリンはアルブミンから解離してしまう。そこで、本発明者らは長い血中半減期を実現するため、血清アルブミンの分子表面をポリ（エチレングリコール）基で表面修飾することにより、表面修飾血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体を調製し、従来、金属ポルフィリンをアルブミンの疎水領域へ包接しただけの血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体に比べ、金属ポルフィリンがアルブミン内部に留まる率を高め、結果として血中半減期を延長できることを明らかにした（特許文献４）。
【０００６】
ポリ（エチレングリコール）基で表面修飾した蛋白質の研究例は多く、表面修飾後に蛋白質の特性や機能が大きく変化することも広く知られている（非特許文献１０など）。そこで、ポリ（エチレングリコール）基で表面を化学修飾された血清アルブミンや血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体についても、機能改変のみならず、全く新しい特性や機能発現の可能性について、その探索と開発が期待されていたのが現状であった。
【非特許文献１】J. P. Collman, et al., J. Am. Chem. Soc., 97, 1427 (1975)
【非特許文献２】J. P. Collman, Acc. Chem. Res., 10, 265 (1977)
【非特許文献３】F. Basolo, B. M. Hoffman, J. A. Ibers, Acc. Chem. Res., 8, 384 (1975)
【非特許文献４】Momentau et al., Chem. Rev., 110, 7690 (1994)
【非特許文献５】J. P. Collman, Chem. Rev., 104, 561 (2004)
【非特許文献６】E. Tsuchida et al., J. Chem. Soc., Dalton Trans., 1984, 1147 (1984)
【非特許文献７】E. Tsuchida et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1995, 747 (1995)
【非特許文献８】E. Tsuchida et al., Bioconjugate Chem. 11, 46 (2000)
【非特許文献９】E. Tsuchida et al., J. Biomed. Mater. Res. 64A, 257 (2003)
【非特許文献１０】M. J. Roberts, et al. Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 459 (2002)64A, 257 (2003)
【特許文献１】特開平０６−２７１５７７号公報
【特許文献２】特開平０８−３０１８７３号公報
【特許文献３】特開２００３−０４０８９３号公報
【特許文献４】特願２００４−２３２５１９号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明は、ポリ（エチレングリコール）鎖により表面修飾された血清アルブミン、または血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体について、新しい特性や機能発現を明らかにすることを目的としている。具体的には、本発明は、水溶液（水系分散液）として調製されたポリ（エチレングリコール）修飾血清アルブミンや血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体の分散媒（水）を乾燥除去することにより固相膜を調製し、安定なフィルム状の薄膜として提供できること、ポリ（エチレングリコール）修飾血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体の場合には、それが酸素を可逆的に結合解離できる酸素吸着膜として提供できること、さらにこれらの固相膜が有機溶媒にも可溶で、溶媒を乾燥除去すると同等の固相膜が再度提供できることなどを開示する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ポリ（エチレングリコール）修飾血清アルブミンまたは血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体の新機能発現について鋭意研究を重ねた結果、分散媒である水を除々に揮発させ濃縮していくと、最終的には水を含まない均一な固相薄膜が得られ、金属ポルフィリンを包接したポリ（エチレングリコール）修飾血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体の場合には、酸素を可逆的に結合解離できるフィルム状の酸素吸着膜が提供できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、第１の側面によれば、血清アルブミンにポリ（エチレングリコール）基を共有結合した表面修飾血清アルブミンからなる固相膜が、第２の側面によれば金属ポルフィリンを包接した血清アルブミンにポリ（エチレングリコール）基を共有結合した表面修飾血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体からなる固相膜が提供される。
【００１０】
また、第３の側面によれば、金属ポルフィリンが、一般式［Ｉ］：
【化５】
2007209543.tif 000002
【００１１】
（ここで、Ｒ1は置換基を有してもよい直鎖または脂環式炭化水素基、Ｒ2はアルキレン基、Ｒ3はイミダゾリル基の中心遷移金属イオンＭ（周期律表第４〜５周期の遷移金属イオン）への配位を許容する基、Ｘ-はハロゲン化物イオン、Ｘ-の個数ｎは前記遷移金属イオンＭの価数から２を差し引いた数）で示されるか、一般式［II］：
【化６】
2007209543.tif 000003
【００１２】
（ここで、Ｒ4は置換基を有してもよい直鎖または脂環式炭化水素基、Ｒ5はアルキレン基、Ｒ6はアルキル基、Ｍは中心遷移金属イオン（周期律表第４〜５周期の遷移金属イオン）、Ｘ-はハロゲン化物イオン、Ｘ-の個数ｎは前記遷移金属イオンＭの価数から２を差し引いた数）で示されるか、一般式［III］：
【化７】
2007209543.tif 000004
【００１３】
（ここで、Ｒ7は置換基を有してもよい直鎖または脂環式炭化水素基、Ｒ8はアルキレン基、Ｒ9はイミダゾリル基の中心遷移金属イオンＭ（周期律表第４〜５周期の遷移金属イオン）への配位を許容する基、Ｒはメチレン基またはエチレン基、Ｘ-はハロゲン化物イオン、Ｘ-の個数ｎは前記遷移金属イオンＭの価数から２を差し引いた数）で示されるか、一般式［IV］：
【化８】
2007209543.tif 000005
【００１４】
（ここで、Ｒ10は炭化水素基、Ｒ11はアルキル基、Ｒ12はアルキレン基、Ｒ13はイミダゾリル基の中心遷移金属イオンＭ（周期律表第４〜５周期の遷移金属イオン）への配位を許容する基、Ｘ-はハロゲン化物イオン、Ｘ-の個数ｎは前記遷移金属イオンＭの価数から２を差し引いた数）で示される表面修飾血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体からなる固相膜が提供される。
【００１５】
本発明の第４の側面によれば、金属ポルフィリンを包接した血清アルブミンが、金属ポルフィリンの結合をもたらすアミノ酸を遺伝子組み換え技術により少なくとも一つ導入された組換えヒト血清アルブミンに、金属ポルフィリンを軸配位結合させて得た組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリンで示される表面修飾血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体からなる固相膜が提供される。
【００１６】
さらに、本発明の第５の側面によれば、本発明の表面修飾血清アルブミン、または表面修飾血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体からなる固相膜から構成される人工皮膚、各種コーティング剤、表面改質（親水化処理）剤、人工血管表面処理剤、人工臓器表面処理剤、医療器具表面処理剤、細胞シート、薄膜として携帯できる人工血漿増量剤もしくは人工酸素運搬体、酸素吸着膜、酸素富化膜、酸素透過膜、酸素除去膜、またはガス選択分離膜が提供される。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の表面修飾血清アルブミンまたは表面修飾血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体からなる固相膜は、アルブミン分子の表面がポリ（エチレングリコール）基で充分に被覆されているため、溶媒である水を乾燥除去してもアルブミン自身の高次構造が安定に保持されている。さらにその内部に金属ポルフィリンが包接されている場合には、包接分子もアルブミンの内部に安定に存在できるために、酸素分子を可逆的に結合解離できる特徴を持つ。つまり、本発明の表面修飾血清アルブミン、または表面修飾血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体からなる固相膜は、水相系で発現できた酸素結合能を保持したまま、フィルム状薄膜として実用に耐える酸素吸着膜として提供できる。また、本発明の表面修飾血清アルブミン、または表面修飾血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体からなる固相膜は、酸素吸着膜のほかにも、人工皮膚、各種コーティング剤、表面改質（親水化処理）剤、人工血管表面処理剤、人工臓器表面処理剤、医療器具表面処理剤、細胞シート、薄膜として携帯できる人工血漿増量剤もしくは人工酸素運搬体、または酸素富化膜、酸素透過膜、酸素除去膜、ガス選択分離膜として提供される有用な材料である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
血清アルブミン、または金属ポルフィリンを包接した血清アルブミンの分子表面にポリ（エチレングリコール）基を共有結合して得た、表面修飾血清アルブミン、または表面修飾血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体の水溶液から分散媒である水を徐々に乾燥除去して濃縮することにより、表面修飾血清アルブミン、または表面修飾血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体からなる固相膜が得られる。好ましくは、ポリ（エチレンオキシド）基が血清アルブミンのリジン残基のアミノ基を介して結合した表面修飾血清アルブミン、または表面修飾血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体が望ましい。血清アルブミンはヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、組換えヒト血清アルブミン、アルブミン多量体が好ましい。また、アルブミン１分子当りのポリ（エチレングリコール）の平均結合本数は１〜２０が好ましい。
【００１９】
包接される金属ポルフィリンは、上記式［Ｉ］、［II］、［III］、または［IV］で示されるものが好ましい。上記式［Ｉ］で示される金属ポルフィリンは、特開平０６−２７１５７７号公報および特開２００３−０４０８９３号公報に、式［II］で示される金属ポルフィリンは、特開２００２−１２８７８１号公報に、式［III］で示される金属ポルフィリンは、特開２００４−１９０１８９号公報に、式［IV］で示される金属ポルフィリンは、特開２００３−０６９７６０号公報に、それぞれ開示されている。
【００２０】
式［Ｉ］において、Ｒ1は置換基を有してもよい直鎖または脂環式炭化水素基である。Ｒ1は１位に置換基を有する直鎖または脂環式炭化水素基が好ましい。そのような直鎖または脂環式炭化水素基の例を挙げると、１，１−二置換Ｃ1〜Ｃ10アルキル基、１−置換シクロプロピル基、１−置換シクロペンチル基、１−置換シクロヘキシル基、２−置換ノルボルニル基（これら基における置換基は、メチル基、アルキルアミド基（Ｒ’ＣＯＮＨ−）、アルキルエステル基（Ｒ’ＯＯＣ−）またはアルキルエーテル基（Ｒ’Ｏ−））、１−メチル−２−シクロヘキセニル基、または１−アダマンチル基などである。ここでＲ’で表されるアルキル基としてはＣ1〜Ｃ6アルキル基が好ましい。
【００２１】
式［Ｉ］において、Ｒ2はアルキレン基であり、好ましくはＣ1〜Ｃ10アルキレン基である。
【００２２】
式［Ｉ］において、Ｒ3はイミダゾリル基の中心遷移金属イオンＭ（周期律表第４〜５周期の遷移金属イオン）への配位を許容する基である。かかるＲ3の例を挙げると、水素原子またはメチル基、エチル基もしくはプロピル基である。Ｘ-は塩化物イオン、臭化物イオンなどのハロゲン化物イオンを示し、Ｘ-の個数ｎは前記遷移金属イオンＭの価数から２を差し引いた数である。
【００２３】
式［II］において、Ｒ4は置換基を有してもよい直鎖または脂環式炭化水素基である。Ｒ4は１位に置換基を有する直鎖または脂環式炭化水素基が好ましい。そのような直鎖または脂環式炭化水素基の例を挙げると、１，１−二置換Ｃ1〜Ｃ10アルキル基、１−置換シクロプロピル基、１−置換シクロペンチル基、１−置換シクロヘキシル基、２−置換ノルボルニル基（これら基における置換基は、メチル基、アルキルアミド基（Ｒ’ＣＯＮＨ−）、アルキルエステル基（Ｒ’ＯＯＣ−）またはアルキルエーテル基（Ｒ’Ｏ−））、１−メチル−２−シクロヘキセニル基、または１−アダマンチル基などである。ここでＲ’で表されるアルキル基としてはＣ1〜Ｃ6アルキル基が好ましい。
【００２４】
式［II］において、Ｒ5はアルキレン基、好ましくはＣ1〜Ｃ6アルキレン基である。
【００２５】
式［II］において、Ｒ6はアルキル基、好ましくはＣ1〜Ｃ6アルキル基である。
【００２６】
式［II］において、Ｍは中心遷移金属イオン（周期律表第４〜５周期の遷移金属イオン）である。Ｘ-は塩化物イオン、臭化物イオンなどのハロゲン化物イオンを示し、Ｘ-の個数ｎは前記遷移金属イオンＭの価数から２を差し引いた数である。
【００２７】
式［III］において、Ｒ7は置換基を有してもよい直鎖または脂環式炭化水素基である。Ｒ7は１位に置換基を有する直鎖または脂環式炭化水素基が好ましい。そのような直鎖または脂環式炭化水素基の例を挙げると、１，１−に置換Ｃ1〜Ｃ10アルキル基、１−置換シクロプロピル基、１−置換シクロペンチル基、１−置換シクロヘキシル基、２−置換ノルボルニル基（これら基における置換基は、メチル基、アルキルアミド基（Ｒ’ＣＯＮＨ−）、アルキルエステル基（Ｒ’ＯＯＣ−）またはアルキルエーテル基（Ｒ’Ｏ−））、１−メチル−２−シクロヘキセニル基、または１−アダマンチル基などである。ここで、Ｒ’で表されるアルキル基としてはＣ1〜Ｃ6アルキル基が好ましい。
【００２８】
式［III］において、Ｒ8はアルキレン基、好ましくはＣ1〜Ｃ10アルキレン基である。
【００２９】
式［III］において、Ｒ9はイミダゾリル基の中心遷移金属イオンＭ（周期律表第４〜５周期の遷移金属イオン）への配位を許容する基、好ましくは水素原子またはメチル基、エチル基もしくはプロピル基であり、Ｒはメチレン基またはエチレン基である。Ｘ-は塩化物イオン、臭化物イオンなどのハロゲン化物イオンを示し、Ｘ-の個数ｎは前記遷移金属イオンＭの価数から２を差し引いた数である。
【００３０】
式［IV］において、Ｒ10は水素または炭化水素基である。Ｒ10は水素原子、ビニル基、エチル基、ホルミル基、アセチル基が好ましい。
【００３１】
式［IV］において、Ｒ11はアルキル基であり、好ましくはＣ1〜Ｃ10アルキル基である。
【００３２】
式［IV］において、Ｒ12はアルキレン基であり、好ましくはＣ1〜Ｃ10アルキレン基である。
【００３３】
式［IV］において、Ｒ13はイミダゾリル基の中心遷移金属イオンＭ（周期律表第４〜５周期の遷移金属イオン）への配位を許容する基である。かかるＲ13の例を挙げると、水素原子またはメチル基、エチル基もしくはプロピル基である。Ｘ-は塩化物イオン、臭化物イオンなどのハロゲン化物イオンを示し、Ｘ-の個数ｎは前記遷移金属イオンＭの価数から２を差し引いた数である。
【００３４】
本発明の表面修飾血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体からなる固相膜において、金属ポルフィリンを包接した血清アルブミンは、金属ポルフィリンの結合をもたらすアミノ酸を遺伝子組み換え技術により少なくとも一つ導入した組換えヒト血清アルブミンに、金属ポルフィリンを軸配位結合させて得た組換えヒト血清アルブミン−金属ポルフィリン錯体であってもよい。導入されるアミノ酸はヒスチジンが好ましく、導入位置はサブドメインＩＢが好ましい。この場合の金属ポルフィリンは、軸塩基配位子を分子内に持っていない金属プロトポルフィリン、金属デューテロポルフィリン、金属ジアセチルデューテロポルフィリン、金属メソポルフィリン、金属ジホルミルポルフィリン、金属テトラフェニルポルフィリン、金属オクタエチルポルフィリンが好ましい。
【００３５】
本発明の表面修飾血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体からなる固相膜において、中心遷移金属イオンＭは、好ましくはＦｅまたはＣｏである。Ｆｅの原子価は＋２価または＋３価であり得、Ｃｏの原子価は＋２価であり得る。
【００３６】
表面修飾血清アルブミン、または表面修飾血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体からなる固相膜は、柔軟性の高い薄膜として得られるので、加工しやすく応用の範囲はきわめて広い。また、血清アルブミンから構成されるため、生体適合性はきわめて高く、体内表面への直接塗布、直接添付などの利用にも適している。
【００３７】
一例ではあるが、血清アルブミンからなるフィルム状固相膜は、人工皮膚、各種コーティング剤、表面改質（親水化）剤、人工血管表面処理剤、人工臓器表面処理剤、医療器具表面処理剤、細胞培養シートのほか、薄膜として携帯できる人工血漿増量剤もしくは人工酸素運搬体などとしての応用が期待される。
【００３８】
表面修飾血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体からなる固相膜の場合は、酸素を可逆的に結合解離できるので、酸素吸着膜、酸素富化膜、酸素透過膜、酸素除去膜、ガス選択分離膜として提供される。ポルフィリンが例えば第４〜５周期に属する金属イオンの錯体である場合、酸化還元反応、酸素酸化反応または酸素添加反応の触媒としての付加価値も高い。もちろん、中心金属に配位結合する気体分子としては、酸素のほかに、一酸化炭素、一酸化窒素、二酸化窒素、シアン化物などがある。
【００３９】
血清アルブミンには上記した金属ポルフィリンの他に、様々な低分子化合物が非特異的に包接されることが広く知られている。つまり、金属ポルフィリン以外の低分子化合物や機能分子を包接させた表面修飾血清アルブミンを調製し、それを同様な方法で乾燥濃縮して得た表面修飾血清アルブミン−機能分子からなる固相薄膜も医療利用などにきわめて有用であることはいうまでもない。
【００４０】
本発明の表面修飾血清アルブミンの製造方法に制限はないが、例えば次の方法により合成される。
【００４１】
ヒト血清アルブミン（アルブミン濃度：０．１〜１０重量％、好ましくは０．５〜５．０重量％）のリン酸緩衝生理塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に、例えばイミノチオラン（ピアス ケミカル製、イミノチオラン／アルブミン：３〜４０（モル／モル）、好ましくは１０〜３０）を加え、室温で１〜１２時間、好ましくは２〜６時間攪拌する。続いて片末端マレイミド片末端メチル−ポリ（エチレングリコール）、例えば、サンブライトメマール５０−Ｈ（Ｍｗ:５，２０７、日本油脂製、ポリ（エチレングリコール）／アルブミン：３〜４０（モル／モル）、好ましくは１０〜３０）を添加し、同条件で０．５〜６時間、好ましくは１〜３時間反応させる。得られた混合物を限外濾過装置（アドバンテック製、ＵＨＰ−７６Ｋ、限外分子量膜：５ｋＤａ）を用い、数リットルのＰＢＳ溶液で濃縮・洗浄を繰り返す。得られた表面修飾血清アルブミン水溶液を０．４５μｍの除菌フィルター（アドバンテック社製ＤＩＳＭＩＣ  ２５ＣＳ０４５ＡＳ）を通過させた後、上記限外濾過装置を用い、数リットルの純水で希釈・濃縮を繰り返し、脱塩する。表面修飾血清アルブミンの濃度は、ブロモクレゾールグリーン法（和光純薬社製、アルブミンテストワコー）により測定できる。さらに、表面修飾血清アルブミンのマトリックス支援レーザー脱離イオン化法−質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）（島津製作所製ＫＲＡＴＯＳ  ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ）により、分子量を測定できる。以上の実験結果から、アルブミン表面に結合したポリ（エチレングリコール）鎖の本数は１〜２０本であることがわかる。
【００４２】
この表面修飾血清アルブミン水溶液を固体基板上、例えばガラス板、石英板に塗布し、室温下で１〜４８時間、好ましくは２〜２４時間自然乾燥させると、表面修飾血清アルブミンからなる固相膜が得られる。
【００４３】
一方、本発明の表面修飾血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体からなる固相膜の製造方法に制限はないが、例えば次の方法により合成される。
【００４４】
特開２００３−０４０８９３号公報に記載の方法により合成された、例えば２−（Ｎ−(８−(２−メチルイミダゾリル)オクタノイルオキシ))メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−（１−メチルシクロヘキサンアミド）フェニル）ポルフィナト鉄（II）（一酸化炭素）錯体を包接したヒト血清アルブミン複合体（アルブミン濃度：０．１〜１０重量％、好ましくは０．５〜５．０重量％、鉄（II）ポルフィリン／アルブミン：１〜８（モル／モル））のリン酸緩衝生理塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に、例えばイミノチオラン（ピアス・ケミカル製、イミノチオラン／アルブミン：３〜４０（モル／モル）、好ましくは１０〜３０）を加え、室温で１〜１２時間、好ましくは２〜６時間攪拌する。続いて片末端マレイミド片末端メチル−ポリ（エチレングリコール）、例えば、サンブライトＭＥ−０２０ＭＡ（Ｍｗ: ２，３３３、日本油脂製、ポリ（エチレングリコール）／アルブミン：３〜４０（モル／モル）、好ましくは１０〜３０）を添加し、同条件で０．５〜６時間、好ましくは１〜３時間反応させる。得られた混合物を限外濾過装置（アドバンテック製、ＵＨＰ−７６Ｋ、限外分子量膜：５ｋＤａ）を用い、数リットルのＰＢＳ溶液で濃縮・洗浄を繰り返す。得られた赤色の表面修飾血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体水溶液を０．４５μｍの除菌フィルター（アドバンテック社製ＤＩＳＭＩＣ  ２５ＣＳ０４５ＡＳ）を通過した後、上記限外濾過装置を用い、数リットルの純水で希釈・濃縮を繰り返し、脱塩する。
【００４５】
表面修飾血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体の鉄イオン濃度は、誘導プラズマ発光分析（ＩＣＰ、セイコーインスツルメンツ製ＳＰＳ７０００Ａ）を用いて測定し、ヘム濃度の指標とできる。また、ブロモクレゾールグリーン法により、アルブミン濃度を測定できる。さらに、表面修飾血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳにより、分子量を測定できる。以上の実験結果から、アルブミン表面に結合したポリ（エチレングリコール）鎖の本数は１〜２０本であることがわかる。
【００４６】
この表面修飾血清アルブミン水溶液を固体基板上、例えばガラス板、石英板に塗布し、室温下で１〜４８時間、好ましくは２〜２４時間自然乾燥させると、表面修飾血清アルブミンからなる固相膜が得られる。この固相膜は酸素と接触すると速やかに安定な酸素錯体を生成し、その酸素結合解離は酸素分圧に依存して可逆的に繰り返し生起することができ、酸素吸着膜として作用する。
【００４７】
以上のようにして得られる表面修飾血清アルブミンまたは表面修飾血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体からなる固相膜を有機溶媒に溶解し、その均一溶液から有機溶媒を揮発させることにより調製した固相膜も同様の機能を発現する。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、クロロホルム、ジクロロメタン、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等を挙げることができる。
【００４８】
本発明の表面修飾血清アルブミンからなる固相膜は、人工皮膚、各種コーティング剤、表面改質（親水化）剤、人工血管表面処理剤、人工臓器表面処理剤、医療器具表面処理剤、細胞シートのほか、携帯できる人工血漿増量剤などとしての応用が可能である。また、表面修飾血清アルブミン−金属ポルフィリン複合体からなる固相膜は、特に鉄（II）またはコバルト（II）錯体の場合、有効な酸素吸着膜、酸素富化膜、酸素透過膜、酸素除去膜、ガス選択分離膜として、さらにポルフィリンが例えば第４〜５周期に属する金属イオンの錯体である場合、酸化還元反応、酸素酸化反応または酸素添加反応の触媒としての応用価値も高い。
【実施例】
【００４９】
以下、この発明を実施例により詳細に説明する。なお、本発明が実施例のものに限定されないことは、いうまでもないことである。
【００５０】
例１
ヒト血清アルブミン（アルブミン濃度：５重量％）のリン酸緩衝生理塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、４８ｍＬ）に７２ｍｇのイミノチオラン（ピアス・ケミカル製、イミノチオラン／アルブミン：１５（モル／モル））を加え、室温でゆっくりと３時間攪拌した。続いて片末端マレイミド片末端メチル−ポリ（エチレングリコール）（サンブライトメマール５０−Ｈ、Ｍｗ：５，２０７、日本油脂製、３．６ｇ）を添加し、同条件で２時間反応させた。得られた混合物を限外濾過装置（アドバンテック製、ＵＨＰ−７６Ｋ、限外分子量膜：５ｋＤａ）を用い、１ＬのＰＢＳ溶液で濃縮・洗浄を繰り返し、最終的には４８ｍＬに濃縮した。得られた表面修飾血清アルブミン水溶液を０．４５μｍの除菌フィルター（アドバンテック製ＤＩＳＭＩＣ  ２５ＣＳ０４５ＡＳ）を通過させた後、上記限外濾過装置を用い、数リットルの純水で希釈・濃縮を繰り返し、脱塩した。
【００５１】
得られた表面修飾血清アルブミンの濃度は、ブロモクレゾールグリーン法（和光純薬社製、アルブミンテストワコー）により測定した。さらに、表面修飾血清アルブミンのマトリックス支援レーザー脱離イオン化法−質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）（島津製作所製ＫＲＡＴＯＳ  ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ）により、分子量を測定した。以上の実験結果から、アルブミン濃度は５．０重量％、分子量は９５ｋＤａ、アルブミン表面に結合したポリオキシエチレン鎖の本数は平均６本であることがわかった。
【００５２】
この表面修飾血清アルブミン水溶液を１ｃｍ×３ｃｍ（厚さ０．５ｍｍ）のガラス板に塗布し、室温下で１２時間自然乾燥させると、表面修飾血清アルブミンからなる透明の固相膜が得られた。
【００５３】
例２
特開２００３−０４０８９３号に記載の方法により合成した２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリル）オクタノイルオキシ））メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−（１−メチルシクロヘキサンアミド）フェニル）ポルフィナト鉄（II）（一酸化炭素）錯体を包接したヒト血清アルブミン複合体（アルブミン濃度：５重量％、鉄（II）ポルフィリン／アルブミン：４（モル／モル））のリン酸緩衝生理塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、４８ｍＬ）に７２ｍｇのイミノチオラン（ピアス・ケミカル製、イミノチオラン／アルブミン：１５（モル／モル））を加え、室温でゆっくりと３時間攪拌した。続いて片末端マレイミド片末端メチル−ポリ（エチレングリコール）（サンブライトＭＥ−０２０ＭＡ、Ｍｗ：２，３３３、日本油脂製、１．４４ｇ）を添加し、同条件で２時間反応させた。得られた混合物を限外濾過装置（アドバンテック製、ＵＨＰ−７６Ｋ、限外分子量膜：５ｋＤａ）を用い、１ＬのＰＢＳ溶液で濃縮・洗浄を繰り返し、最終的には４８ｍＬに濃縮した。得られた赤色の表面修飾血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体水溶液を０．４５μｍの除菌フィルター（アドバンテック製ＤＩＳＭＩＣ  ２５ＣＳ０４５ＡＳ）を通過させた後、上記限外濾過装置を用い、数リットルの純水で希釈・濃縮を繰り返し、脱塩した。得られた表面修飾血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体の鉄イオン濃度を誘導プラズマ発光分析（ＩＣＰ、セイコーインスツルメンツ製ＳＰＳ７０００Ａ）を用いて測定し、ヘム濃度の指標とした。また、ブロモクレゾールグリーン法（和光純薬社製、アルブミンテストワコー）により、アルブミン濃度を測定した。さらに、表面修飾血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体のマトリックス支援レーザー脱離イオン化法−質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）（島津製作所製ＫＲＡＴＯＳ  ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ）により、分子量を測定した。以上の実験結果から、鉄（II）ポルフィリン濃度は３．０ｍＭ、アルブミン濃度は５．０重量％、分子量は８０ｋＤａ、アルブミン表面に結合したポリオキシエチレン鎖の本数は平均６本であることがわかった。
【００５４】
この表面修飾血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体の水溶液を１ｃｍ×３ｃｍ（厚さ０．５ｍｍ）のガラス板に塗布し、室温下で１２時間自然乾燥させると、表面修飾血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体からなる赤色の固相膜が得られた。
【００５５】
例３
特開２００３−０４０８９３号公報に記載の方法により合成した２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリル）オクタノイルオキシ））メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−（１−メチルシクロヘキサンアミド）フェニル）ポルフィナト鉄（II）（一酸化炭素）錯体を包接したヒト血清アルブミン複合体（アルブミン濃度：５重量％、鉄（II）ポルフィリン／アルブミン：４（モル／モル））のリン酸緩衝生理塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、４８ｍＬ）に片末端スクシンイミド片末端メチル−ポリ（エチレングリコール）（サンブライトＭＥＧＣ−２０ＨＳ、Ｍｗ：２，３２５、日本油脂製、０．７２ｇ）を添加し、室温下で２時間反応させた。得られた混合物を限外濾過装置（アドバンテック製、ＵＨＰ−７６Ｋ、限外分子量膜：５ｋＤａ）を用い、１ＬのＰＢＳ溶液で濃縮・洗浄を繰り返し、最終的には４８ｍＬに濃縮した。得られた赤色の表面修飾血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体水溶液を０．４５μｍの除菌フィルター（アドバンテック製ＤＩＳＭＩＣ  ２５ＣＳ０４５ＡＳ）を通過させた後、上記限外濾過装置を用い、数リットルの純水で希釈・濃縮を繰り返し、脱塩した。得られた表面修飾血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体の鉄イオン濃度を誘導プラズマ発光分析を用いて測定し、ヘム濃度の指標とした。また、ブロモクレゾールグリーン法により、アルブミン濃度を測定した。さらに、表面修飾血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（島津製作所製ＫＲＡＴＯＳ  ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ）により、分子量を測定した。以上の実験結果から、鉄（II）ポルフィリン濃度は３．０ｍＭ、アルブミン濃度は５．０重量％、分子量は８０ｋＤａ、アルブミン表面に結合したポリオキシエチレン鎖の本数は平均６本であることがわかった。
【００５６】
この表面修飾血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体の水溶液を１ｃｍ×３ｃｍ（厚さ０．５ｍｍ）のガラス板に塗布し、室温下で１２時間自然乾燥させると、表面修飾血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体からなる赤色の固相膜が得られた。
【００５７】
例４
例２で使用した２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリル）オクタノイルオキシ））メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−（１−メチルシクロヘキサンアミド）フェニル）ポルフィナト鉄（II）（一酸化炭素）錯体を包接したヒト血清アルブミン複合体の代わりに、特開２００２−１２８７８１号に記載の方法により合成した２−（４−（O−メチル−Ｌ−ヒスチジルカルボニル）ブタノイルオキシ）メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバルアミドフェニル）ポルフィナト鉄（II）（一酸化炭素）錯体を包接したヒト血清アルブミン複合体（アルブミン濃度：５重量％、鉄（II）ポルフィリン／アルブミン：８（モル／モル））のリン酸緩衝生理塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、５０ｍＬ）を用いた以外は全く同様な方法に従って、表面修飾血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体水溶液を得た。アルブミン表面に結合したポリ（エチレングリコール）鎖の本数は平均６本であった。
【００５８】
この表面修飾血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体の水溶液を１ｃｍ×３ｃｍ（厚さ０．５ｍｍ）のガラス板に塗布し、室温下で１２時間自然乾燥させると、表面修飾血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体からなる赤色の固相膜が得られた。
【００５９】
例５
例２で使用した２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリル）オクタノイルオキシ））メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−（１−メチルシクロヘキサンアミド）フェニル）ポルフィナト鉄（II）（一酸化炭素）錯体を包接したヒト血清アルブミン複合体の代わりに、特願２００５−１９０１８９号に記載の方法により合成した５，１０，１５−トリス（α，α，α−ｏ−（１−メチルシクロヘキサンアミド）フェニル）−β−ｏ−６−（Ｎ−（２−メチル−１−イミダゾリル））ヘキサンアミドフェニルポルフィリン鉄（II）（一酸化炭素）錯体を包接したヒト血清アルブミン複合体（アルブミン濃度：５重量％、鉄（II）ポルフィリン／アルブミン：４（モル／モル））のリン酸緩衝生理塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、５０ｍＬ）を用いた以外は全く同様な方法に従って、表面修飾血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体水溶液を得た。アルブミン表面に結合したポリ（エチレングリコール）鎖の本数は平均７本であった。
【００６０】
この表面修飾血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体の水溶液を１ｃｍ×３ｃｍ（厚さ０．５ｍｍ）のガラス板に塗布し、室温下で１２時間自然乾燥させると、表面修飾血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体からなる赤色の固相膜が得られた。
【００６１】
例６
例２で使用した２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリル）オクタノイルオキシ））メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−（１−メチルシクロヘキサンアミド）フェニル）ポルフィナト鉄（II）（一酸化炭素）錯体を包接したヒト血清アルブミン複合体の代わりに、特願２００５−１９０１８９号に記載の方法により合成した５，１０，１５−トリス（α，α，α−ｏ−アダマンタンアミドフェニル）−β−ｏ−６−（Ｎ−（２−メチル−１−イミダゾリル））ヘキサンアミドフェニルポルフィリン鉄（II）（一酸化炭素）錯体を包接したヒト血清アルブミン複合体（アルブミン濃度：５重量％、鉄（II）ポルフィリン／アルブミン：４（モル／モル））のリン酸緩衝生理塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、５０ｍＬ）を用いた以外は全く同様な方法に従って、表面修飾血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体水溶液を得た。アルブミン表面に結合したポリ（エチレングリコール）鎖の本数は平均６本であった。
【００６２】
この表面修飾血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体の水溶液を１ｃｍ×３ｃｍ（厚さ０．５ｍｍ）のガラス板に塗布し、室温下で１２時間自然乾燥させると、表面修飾血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体からなる赤色の固相膜が得られた。
【００６３】
例７
例２で使用した２−（Ｎ−（８−（２−メチルイミダゾリル）オクタノイルオキシ））メチル−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−（１−メチルシクロヘキサンアミド）フェニル）ポルフィナト鉄（II）（一酸化炭素）錯体を包接したヒト血清アルブミン複合体の代わりに、特願２００３−０６９７６０号に記載の方法により合成した３，１８−ジビニル−８−（３−エトキシカルボニル）エチル−１２−（Ｎ−イミダゾリルプロピルアミド）−９−オキシメチル）カルボニル）エチル−２，７，１３，１７−テトラメチルポルフィナト鉄（II）（一酸化炭素）錯体を包接したヒト血清アルブミン複合体（アルブミン濃度：５重量％、鉄（II）ポルフィリン／アルブミン：１（モル／モル））のリン酸緩衝生理塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、５０ｍＬ）を用いた以外は全く同様な方法に従って、表面修飾血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体水溶液を得た。アルブミン表面に結合したポリ（エチレングリコール）鎖の本数は平均５本であった。
【００６４】
この表面修飾血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体の水溶液を１ｃｍ×３ｃｍ（厚さ０．５ｍｍ）のガラス板に塗布し、室温下で１２時間自然乾燥させると、表面修飾血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体からなる固相膜が得られた。
【００６５】
例８
例２で調製した表面修飾血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体からなる固相膜を固定したガラス板を光路長１ｃｍの石英製分光用セルに入れてセプタムラバーで密栓し、紫外可視吸収スペクトル測定を行うと、最大吸収波長λmaxが、４２７、５３７ｎｍに現れ、固相膜中に固定されている鉄（II）ポルフィリンが一酸化炭素錯体を形成していることがわかった。酸素を通気（フロー）しながら、ハロゲンランプ（５００Ｗ）で光照射（１０分）すると、吸収スペクトルのλmaxが４２６、５４８ｎｍにシフトし、固相膜中の鉄（II）ポルフィリンが酸素錯体へ移行したことが明らかとなった。さらに、窒素を通気しながら脱酸素を行うと、λmaxは４４３，５３７，５６３ｎｍに移動し、包接されている鉄（II）ポルフィリンが５配位高スピン錯体を形成していることがわかった。これは、ヘモグロビンのデオキシ体に相当する。この酸素−窒素の吹き込みに伴うスペクトルの変化は、酸素分圧に応答して観測されたことから、酸素の吸脱着が可逆的に生起することが明らかとなった。
【００６６】
例９
例５で調製した表面修飾血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体からなる固相膜を固定したガラス板を光路長１ｃｍの石英製分光用セルに入れてセプタムラバーで密栓し、紫外可視吸収スペクトル測定を行うと、最大吸収波長λmaxが、４２６、５３９Ｎｍに現れ、固相膜中に固定されている鉄（II）ポルフィリンが一酸化炭素錯体を形成していることがわかった。酸素を通気（フロー）しながら、ハロゲンランプ（５００Ｗ）で光照射（１０分）すると、吸収スペクトルのλmaxが、４２５、５４５ｎｍにシフトし、固相膜中の鉄（II）ポルフィリンが酸素錯体へ移行したことが明らかとなった。さらに、窒素を通気しながら脱酸素を行うと、λmaxは４４４，５３９，５６５ｎｍに移動し、包接されている鉄（II）ポルフィリンが５配位高スピン錯体となることがわかった。これは、ヘモグロビンのデオキシ体に相当する。この酸素−窒素の吹き込みに伴うスペクトルの変化は、酸素分圧に応答して観測されたことから、酸素の吸脱着が可逆的に生起することが明らかとなった。
【００６７】
例１０
例２で例示した表面修飾血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体からなる固相膜を石英製分光用セルの内部に全く同様な方法で作成し、例８で示したのと全く同様な測定を行い、酸素分子の吸脱着を確認した。石英セル内にエタノール３ｍＬを添加すると、固相膜が溶解し、赤色のエタノール溶液が得られた。そのエタノール溶液の円偏光二色性スペクトルを測定すると、λminが２０８、２２２ｎｍに現れ、それらのピーク強度比がアルブミンの水溶液中における値と変わらなかったことから、エタノール中でもアルブミンの二次構造、高次構造は保持されていることが明らかとなった。石英セルをセプタムラバーで密栓し、表面修飾血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体エタノール溶液の紫外可視吸収スペクトル測定を行うと、最大吸収波長λmaxが４２７、５３７ｎｍに現れ、鉄（II）ポルフィリンが一酸化炭素錯体を形成していることがわかった。酸素を通気（フロー）しながら、ハロゲンランプ（５００Ｗ）で光照射（１０分）すると、吸収スペクトルのλmaxが４２６、５４７ｎｍにシフトし、鉄（II）ポルフィリンが酸素錯体へ移行したことが明らかとなった。さらに、窒素を通気しながら脱酸素を行うと、λmaxは４４３，５３７，５６４ｎｍにシフトし、包接されている鉄（II）ポルフィリンが５配位高スピン錯体を形成していることがわかった。この酸素−窒素の吹き込みに伴うスペクトルの変化は、酸素分圧に応答して観測されたことから、エタノール中でも酸素の吸脱着が可逆的に生起することが明らかとなった。
【００６８】
さらに、この表面修飾血清アルブミン−鉄（II）ポルフィリン複合体エタノール溶液に一酸化炭素を吹き込み、鉄（II）ポルフィリンを一酸化炭素錯体にした後、エタノールのみを自然蒸発させると、石英セル表面に再度固相膜が調製できた。得られた固相膜の紫外可視吸収スペクトル測定では、最大吸収波長λmaxが、４２８、５３５ｎｍに現れ、固相膜中に固定されている鉄（II）ポルフィリンが一酸化炭素錯体を保持されていることがわかった。例８で開示したのと同様な測定を行い、この固相膜でも酸素の吸脱着が可逆的に生起することが確認された。