(57)【要約】    【課題】  カーボンナノチューブに蛋白質が被覆した構造を有する炭素繊維、その製造方法及びその用途を提供する。    【解決手段】カーボンナノチューブの表面を、ポリペプチド鎖内に疎水性残基を有するアミノ酸残基が含まれた蛋白質で被覆した水分散性蛋白質-カーボンナノチューブ複合体、その製造方法及びその用途。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カーボンナノチューブの表面を、ポリペプチド鎖内に疎水性残基を有するアミノ酸残基が含まれた蛋白質で被覆した水分散性蛋白質-カーボンナノチューブ複合体。
【請求項２】
蛋白質が、卵白リゾチーム、トリプシン類、アルブミンから選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする請求項１記載の水分散性蛋白質-カーボンナノチューブ複合体。
【請求項３】
蛋白質分子表面に疎水性相互作用可能な部位を有する蛋白質を用いた請求項１又は２に記載の水分散性蛋白質-カーボンナノチューブ複合体。
【請求項４】
蛋白質によるカーボンナノチューブの被覆率が９０％以上である、請求項１乃至３のいずれかに記載の水分散性蛋白質-カーボンナノチューブ複合体。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかひとつに示された水分散性カーボンナノチューブ表面の蛋白質を化学修飾した水分散性蛋白質-カーボンナノチューブ複合体。
【請求項６】
ポリペプチド鎖内に疎水性残基を有するアミノ酸残基が含まれた蛋白質の蛋白質濃度が０．１〜１０重量％である水溶液に、カーボンナノチューブを添加し、超音波により分散させ、カーボンナノチューブの表面をポリペプチド鎖内に疎水性残基を有するアミノ酸残基が含まれた蛋白質で被覆させることを特徴とする水分散性蛋白質-カーボンナノチューブ複合体の製造方法。
【請求項７】
請求項１乃至６何れかに記載の水分散性蛋白質-カーボンナノチューブ複合体を用いたドラッグデリバリーシステム。
【請求項８】
請求項１乃至６何れかに記載の水分散性蛋白質-カーボンナノチューブ複合体からなる蛋白質による分子結合を認識する光学センサー。
【請求項９】
請求項１乃至６何れかに記載の水分散性蛋白質-カーボンナノチューブ複合体からなるフィルター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カーボンナノチューブを用いたデバイス、薬剤作製の基礎となる技術であり、カーボンナノチューブの化学修飾、および、蛋白質によって被覆された炭素繊維の機能発現に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
カーボンナノチューブは炭素原子のみで構成されており、生体との親和性が高いために、生体分子と融合してバイオミメティックな機能を発現させるデバイス、および、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素等のターゲット分子に選択的に結合する薬剤への応用に期待されている。特に、カーボンナノチューブが有する導体、半導体といった電子物性は、生体内における分子間電子移動などの機能を発現させるためには欠かせない性質である。上記のデバイスや薬剤の機能を発現させるためには、カーボンナノチューブのグラフェンシートを破壊しない化学修飾、および、水溶液に分散させる技術が必要である。
界面活性剤による溶解は、カーボンナノチューブを単分散させることが可能であるが、界面活性剤のミセル内に取り込まれるために水溶液状態での化学修飾が困難であるため、機能材料を作製する際の設計指針が限られてしまう（非特許文献１参照）。また、カーボンナノチューブを分散させるように設計された両親媒性ペプチドによる水への溶解が報告されている（非特許文献２参照）。しかし、上記のようなカーボンナノチューブに相互作用するように設計されたペプチドの場合、他の機能を付与するには至っていない。したがって、天然の蛋白質を結合させ、その機能を利用したカーボンナノチューブを含む複合材料の作製が試みられている。
【０００３】
天然の蛋白質の場合、化学結合による蛋白質のクロスリンク（非特許文献３参照）、大豆ペルオキシターゼ、および、キモトリプシンの吸着（非特許文献４参照）、グルコース酸化酵素を結合させたカーボンナノチューブが報告されている。（非特許文献５参照）また、蛍光標識したウシ血清アルブミン、ストレプトアビジン、および、シトクロムｃを、酸を用いることによって切断されたカーボンナノチューブに吸着させ、ヒト細胞にこれらの蛋白質を送り込むことを可能にしている。（非特許文献６参照）上記の研究では、蛋白質がカーボンナノチューブ表面の一部に吸着されていることのみ原子間力顕微鏡により観測されている。しかし、水溶性の蛋白質で被覆され、かつ、水溶液中に分散したカーボンナノチューブは作製されておらず、ドラッグデリバリーをはじめとする産業分野に応用することができなかった。
【０００４】
【非特許文献１】「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  ＵＳＡ」誌，ｖｏｌ．１２５，２００３（２００３年４月２９日発行），ｐ４９８４
【非特許文献２】「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ」誌，ｖｏｌ．１２５，２００４（２００４年４月１６日発行），ｐ４４２６
【非特許文献３】「Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ」誌，ｖｏｌ．２，２００２（２００２年４月２日発行），ｐ３１１
【非特許文献４】「Ｌａｎｇｍｕｉｒ」誌，ｖｏｌ．２，２００４（２００４年４月６日発行），ｐ３３８
【非特許文献５】「Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌ」誌，ｖｏｌ．２，２００５（２００５年４月６日発行），ｐ３３８
【非特許文献６】「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ」誌，ｖｏｌ．１２６，２００５（２００５年４月１６日発行），ｐ６０２１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで本発明は上記問題点を解決すべく、水溶液中で蛋白質とカーボンナノチューブ間において、静電的あるいは疎水的相互作用を利用して自己組織的にカーボンナノチューブに蛋白質が被覆した構造を有する複合体を提供することをその目的とするものである。天然状態、あるいは変性状態にある蛋白質に溶解させた際、カルボキシル基、アミノ基、および、チオール基が溶媒と接するために、カーボンナノチューブの物性に関わるグラフェンシートを破壊せずに蛋白質の残基に化学修飾できる。また、グラフェンシートが化学修飾されずに保存されているために、これらの複合体では、可視および近赤外領域におけるカーボンナノチューブの光学特性を利用することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、前期課題を解決すべく鋭意検討した結果、カーボンナノチューブを超音波処理することにより、天然状態、あるいは、変性状態にある蛋白質に溶解させ単分散できることを見出し本発明に到達した。
すなわち本発明は、カーボンナノチューブの表面を、ポリペプチド鎖内に疎水性残基を有するアミノ酸残基が含まれた蛋白質で被覆した水分散性蛋白質-カーボンナノチューブ複合体である。
また、本発明は、蛋白質を、卵白リゾチーム、トリプシン類、アルブミンから選ばれた少なくとも１種とすることができる。
さらに、本発明は、蛋白質分子表面に疎水性相互作用可能な部位を有する蛋白質を用いることができる。
また、本発明は、蛋白質によるカーボンナノチューブの被覆率が９０％以上とすることができる。
さらに、本発明では、水分散性蛋白質-カーボンナノチューブ複合体の表面に存在する蛋白質を化学修飾した水分散性蛋白質-カーボンナノチューブ複合体とすることができる。
また、ポリペプチド鎖内に疎水性残基を有するアミノ酸残基が含まれた蛋白質の蛋白質濃度が０．１〜１０重量％である水溶液に、カーボンナノチューブを添加し、超音波により分散させ、カーボンナノチューブの表面をポリペプチド鎖内に疎水性残基を有するアミノ酸残基が含まれた蛋白質で被覆させることを特徴とする水分散性蛋白質-カーボンナノチューブ複合体の製造方法である。
さらに、本発明は、本発明の水分散性蛋白質-カーボンナノチューブ複合体を用いたドラッグデリバリーシステムである。
また、本発明は、水分散性蛋白質-カーボンナノチューブ複合体からなる蛋白質による分子結合を認識する光学センサーである。
またさらに、本発明は、水分散性蛋白質-カーボンナノチューブ複合体からなるフィルターである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の水分散性蛋白質-カーボンナノチューブ複合体は、カーボンナノチューブが有する電子物性を失わずに、化学修飾可能という特長を有しており、環境調和型のカーボンナノチューブの電子物性を利用したデバイス、および、細胞内に導入した際のプローブを有する薬剤作製の基礎技術となる。さらに、吸着する分子の選択性を有するフィルターおよび分子センサーが構築可能となる。このような薬剤の吸着性質を利用した環境浄化系への応用も期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の蛋白質を用いた水溶性カーボンナノチューブ複合炭素繊維の作製方法を具体的に述べる。
本発明において、カーボンナノチューブを蛋白質に溶解させる際、約１時間超音波処理することによって、両者を水溶液中に分散させた。得られた水溶液を１６０００×ｇで遠心分離し、不溶物を取り除いた。最後に、カーボンナノチューブと相互作用していないペプチドあるいは蛋白質と複合体とを分離することにより、水溶性複合炭素繊維の割合を増加させた。カーボンナノチューブと相互作用していないペプチドあるいは蛋白質を複合体から分離する方法としては、クロマトグラフィー法、透析法あるいは塩を加えて複合体を凝集させる方法が挙げられる。
【０００９】
上記の手法で得られたカーボンナノチューブと蛋白質の複合体は、蛋白質残基のアミン、カルボキシル、あるいは、チオール基に、蛍光標識に代表されるような種々の化合物を結合することにより、ドラッグデリバリーシステム等に応用が可能な機能性分子とすることができる。また、各蛋白質によって結合する物質が異なることを利用して、この特異的結合性を利用した分子センサーおよび吸着フィルターへの応用も可能である。
本発明において使用する蛋白質としては、その表面に疎水性コアを有しカーボンナノチューブとの間に疎水的相互を構築できる蛋白質であればどのようなものでも良い。代表的な具体例としては、リゾチーム、ウシ血清およびヒトアルブミンなどのアルブミン等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
本発明において、水分散性カーボンナノチューブ表面の蛋白質を化学修飾することが出来るが、化学修飾するのに用いられる薬品類は、ピレン骨格を有する蛍光標識物質等である。
典型的な、化学修飾の例は、ピレンブチル酸（4-(1-pyrene)butyric acid）のカルボン酸およびアルブミン表面に存在するリジンのアミノ基とのアミド結合によるピレン骨格分子の蛍光標識化である。
以下、本発明を実施例に基づき、さらに具体的に説明する。ただし、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１０】
重水２０ｇ（和光純薬製、試薬特級、以下同じ）に重量パーセント１％になるようにのリゾチーム０．１ｇ（和光純薬製）を溶解させ、この溶液にカーボンナノチューブ１ｍｇを加えた。超音波ホモジナイザ（ビブラセル社製  Ｍｉｃｒｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ７５０  Ｗａｔｔ  Ｍｏｄｅｌ）を用いて水への溶解を行った後、この溶液を遠心分離機（日立工機製、ｈｉｍａｃ  ＣＴ１３）で１３０００ｒｐｍの条件で遠心分離を１時間行い、不溶物を取り除くことにより上澄みを分取した。得られた上澄み液の写真および電子吸収スペクトルを図１および図２に示す。得られたスペクトルから、この溶液にリゾチームで被覆されたカーボンナノチューブによって構成された繊維が存在することが示唆された。また、ＡＦＭ像（図３）からは、直径１ｎｍのカーボンナノチューブが直径約３〜５ｎｍの球状蛋白質に皮膜されていることが示された。
【実施例２】
【００１１】
ヒト血清アルブミン０．５ｇ（和光純薬製）を用いる以外は、実施例１と同様の組成の下、超音波ホモジナイザによるカーボンナノチューブの分散を３０分間行った後に、超音波洗浄機（ブランソン社製、１２１０Ｊ）で３時間程処理することにより、カーボンナノチューブのバンドル成分を減少させた。この溶液を超遠心分離機（日立工機製、ｈｉｍａｃ  ＣＰ１００ＭＸ、以下同じ）で３６０００ｒｐｍ１時間の条件で遠心分離を行い、不溶物およびバンドル成分を沈降させることにより、可溶化部分を分取した。その結果、蛋白質で被覆された単分散状態のカーボンナノチューブによって構成された繊維が得られた。
【実施例３】
【００１２】
実施例１と同様に調製した蛋白質カーボンナノチューブ複合炭素繊維水溶液に塩化ナトリウム（和光純薬製）を加えて上記炭素繊維を凝集させ、遠心沈降させることにより、複合繊維と蛋白質とを分離した。さらに、得られた複合繊維を透析チューブ（スペクトラポア社製）に入れて、緩衝液内で約４時間透析を行うことにより過剰な塩分を除去した。
サイズ排除クロマトグラフィー（アマシャムバイオサイエンス社製、Ｇ-１００）、あるいは、イオン交換クロマトグラフィー（アマシャムバイオサイエンス社製、ＨｉＴｒａｐ-ＳＰ）によっても、蛋白質と上記繊維とを分離できることを確認した。
【実施例４】
【００１３】
ピレン骨格を有する蛍光物質を標識したウシ血清アルブミンによって、水溶液中への分散を行った。実施例１あるいは２と同様の方法で作製することによって蛍光物質で標識された複合炭素繊維を得ることができた。また、この蛍光標識複合炭素繊維を昆虫細胞内へ導入できることも確認した。
【実施例５】
【００１４】
蛋白質カーボンナノチューブ複合炭素繊維におけるフィルターとしての性質を検証するために、アルブミン―カーボンナノチューブ複合炭素繊維による色素ブロモフェノール（ＢＰＢ）（和光純薬製）の吸着を試みた。シート状のカーボンナノチューブにアルブミンを吸着させることによって、フィルターを作製した。この後ＢＰＢ水溶液を、アルブミンを吸着させたフィルターを通して濾過したところ、フィルター表面にＢＰＢの色が確認されたことから、アルブミンによるＢＰＢの吸着が確認された。
【実施例６】
【００１５】
カーボンナノチューブは可視および近赤外光を吸収するために、この吸収を利用した分子認識センサーが構築できる。吸収と発光のピーク値および強度が蛋白質に結合した薬剤によって変化することを利用した光学センサーを構築するための基礎技術となる。そこで、分子選択的応答を示すセンサーに関する知見を得るために、複合炭素繊維による有機分子吸着実験を実施した。有機分子としては、ブロモフェノール、および、８-アニリノ-１-ナフタレンスルホン酸（和光純薬製）を薬剤モデル分子として用い、これらの有無による近赤外領域における吸収ピークのシフトを検討した。複合炭素繊維における蛋白質は、アルブミンおよびリゾチームを使用した。アルブミンはこれらの有機分子を吸着するが、リゾチームは吸着しない。吸収スペクトルを測定したところ、アルブミン複合炭素繊維ではカーボンナノチューブ由来の吸収ピークが５ｎｍレッドシフトすることが観測されたが、一方、リゾチーム複合炭素繊維では上記のシフトは観測されなかった。これらの結果より、このレッドシフトは蛋白質の吸着に由来することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００１６】
本発明の水分散性蛋白質-カーボンナノチューブ複合体は、カーボンナノチューブが有する電子物性を失わずに化学修飾可能という特長を有しており、環境調和型のカーボンナノチューブの電子物性を利用したデバイス、および、細胞内に導入した際のプローブを有する薬剤作製の基礎技術となる。さらに、吸着する分子の選択性を有するフィルターおよび分子センサーが構築可能となる。より具体的には、ドラッグデリバリーシステム、薬剤吸着システム、蛋白質による分子結合を認識する光学センサー、環境浄化システムなどが考えられ、産業上の利用可能性は高いものである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】超音波破砕後に得られた分散液、および、遠心分離後得られた上澄み液。（ａ）５％パパイン分散液  （ｂ）１％ペプシン分散液  （ｃ）１％卵白リゾチーム分散液  （ｄ）（ｃ）を遠心分離後に得られた上澄み液  （ｅ）５％ウシ血清アルブミン分散液  （ｆ）（ｅ）を遠心分離後に得られた上澄み液。
【図２】蛋白質で被覆された炭素繊維を含む水溶液の吸収スペクトル。（ａ）  遠心後５％ウシ血清アルブミン分散液、  （ｂ）１％卵白リゾチーム分散液、  （ｃ）  １％コール酸ナトリウム（界面活性剤）分散液の吸収スペクトル。
【図３】蛋白質で被覆された炭素繊維のＡＦＭ像。（A：誤差信号像、  B：形状像。）
【図２】
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【図１】
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【図３】
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