(57)【要約】      （修正有）【課題】  細胞内の活性酸素除去系に関与する新規な遺伝子を提供する。また、この新規な遺伝子を植物に導入し、活性酸素ストレス耐性を付与した組換え植物を提供する。【解決手段】  タバコより新たに単離された、特定のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、特定の塩基配列を有するＤＮＡ、あるいはこれらのＤＮＡの類縁体を、上記細胞内の活性酸素除去系に関与する遺伝子として使用する。また、これらの遺伝子を植物の染色体ＤＮＡ中に導入する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列に対し、少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換、及び／もしくは、付加されているアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、かつ、宿主細胞の染色体ＤＮＡに導入された場合に、該宿主細胞に過酸化水素耐性を付与するＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号１又は配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号１又は配列番号３に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、宿主細胞の染色体ＤＮＡに導入された場合に、該宿主細胞に過酸化水素耐性を付与するＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１〜４に記載のＤＮＡを有する、遺伝子導入用ベクター。
【請求項６】
請求項１〜４に記載のＤＮＡが、その染色体ＤＮＡ中に導入された形質転換細胞。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換細胞が増殖及び分化することにより得られる形質転換植物個体。
【請求項８】
請求項１〜４に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレス耐性に関与する遺伝子、特に、活性酸素ストレス耐性に関与し、過酸化物、重金属塩、高塩濃度、乾燥等の各種環境ストレスに対する耐性を植物に付与することができる遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物を始めとする生物は、重金属、高塩濃度、乾燥等の環境ストレスを受けると、タンパク質、脂質、核酸などの高分子物質にダメージを与える活性酸素の生成が、その細胞内で増大する（非特許文献１）。こうした活性酸素の増大によって引き起こされる、細胞内の様々な反応は活性酸素ストレスと呼ばれ、生物の細胞は、活性酸素除去系を備えることで、これに対抗しており、これまでに、この活性酸素除去系に働く種々の酵素、及び、これらの酵素をコードする遺伝子が報告されている。
【０００３】
中でも、酵母（Saccharomyces cerevisiae、以下、単に酵母と記載する。）から、ＡＰ‐１転写因子と類似のＤＮＡ結合活性を持つ転写因子として分離されたＹＡＰ１遺伝子は、上記活性酸素除去系において、中心的な役割を果たしていることが知られており、例えば、チオレドキシン遺伝子(ＴＲＸ２)やγ‐グルタミルシステイン合成酵素遺伝子(ＧＳＨ１)など、活性酸素除去系に関連すると考えられる２０種類以上の遺伝子が、ＹＡＰ１遺伝子により制御されていることが判明している（非特許文献２）。
【０００４】
従って、ＹＡＰ１遺伝子を破壊した酵母は、過酸化水素等の過酸化物、ジアミド等の還元型グルタチオン酸化剤、及び／又は、ジエチルマレイン酸等の親電子性物質など、活性酸素ストレスの誘引物質に感受性となる一方、正常な酵母では、これらの物質の存在下において、この遺伝子の発現量の上昇が観察される。また、シロイヌナズナのｃＤＮＡライブラリーを酵母用発現ベクターに挿入して、ＹＡＰ１遺伝子を破壊した酵母細胞に導入し、チオール酸化剤ジアミド耐性を指標としてスクリーニングした結果、得られた耐性株より、ＮＡＤＰＨオキシドレダクターゼが分離されたとの報告もされている（非特許文献３）。
【０００５】
さらに、ＹＡＰ１遺伝子の相同遺伝子としてＹＡＰ２遺伝子も分離されており、ＹＡＰ１遺伝子及びＹＡＰ２遺伝子の両方を破壊した株（二重破壊株）は、過酸化水素や重金属に対して高い感受性を示すことも明らかになっている（非特許文献４）。
【０００６】
こうした知見の蓄積に伴い、近年では、上記活性酸素除去系に関与する遺伝子を植物に導入し、活性酸素ストレス耐性を備えた植物を作出することも試みられ、例えば、高等植物において活性酸素除去系に働く酵素であるグアイアコールペルオキシダーゼ（ＧＰＸ）の遺伝子を導入されたハイブリッドアスペンが、活性酸素ストレス耐性を獲得することで、除草剤パラコートに対し耐性を示す個体が得られたとの報告もされている（非特許文献５）
【非特許文献１】森田等、「蛋白質 核酸 酵素」、1999、vol.44、p.2232‐2238
【非特許文献２】リー等（Lee et al.）、「生物化学誌（Journal of Biological Chemistry）」、（米国）、1999、vol.274、p.16040‐16046
【非特許文献３】ベビチュック等（Babiychuk et al.）、「生物化学誌（Journal of Biological Chemistry）」、（米国）、1995、vol.270、p.26224‐26231
【非特許文献４】ヒラタ等（Hirata et al.）、「分子及び一般遺伝学（Molecular and General Genetics）」、（ドイツ）、1994、vol.242、p.250−256
【非特許文献５】河岡等、「植物生理学（Plant Physiol.）」、（米国）、2003、vol.132、p.1177‐1185
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、細胞内の活性酸素除去系に関与する新規な遺伝子を単離すること、また、単離されたこの遺伝子を植物に導入し、活性酸素ストレス耐性を付与した組換え植物を新たに作出することを目的として行われた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するため、鋭意研究を行い、ＹＡＰ１遺伝子及びＹＡＰ２遺伝子の双方を破壊した二重遺伝子破壊株の過酸化物及び重金属に対する耐性を回復させる新規な遺伝子ＣＤＲ１及びＣＤＲ２を、タバコ（Nicotiana tabacum）から単離することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、配列番号２もしくは配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、これらのアミノ酸配列に対し、少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換、及び／もしくは、付加されているアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、かつ、宿主細胞の染色体ＤＮＡに導入された場合に、該宿主細胞に過酸化水素耐性を付与するＤＮＡに関する。また、本発明は、配列番号１もしくは配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡ、又は、これらの塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、宿主細胞の染色体ＤＮＡに導入された場合に、該宿主細胞に過酸化水素耐性を付与するＤＮＡに関する。さらに、本発明は、上記ＤＮＡを有する遺伝子導入用ベクター、上記ＤＮＡが染色体ＤＮＡに導入された形質転換細胞、この形質転換細胞が増殖及び分化することにより得られる形質転換植物個体、及び、上記ＤＮＡによりコードされるタンパク質に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、細胞内の活性酸素除去系に関与する新規な遺伝子ＣＤＲ（Nicotiana tabacum cadmium-resistant）１及びＣＤＲ２が提供される。このＣＤＲ１遺伝子又はＣＤＲ２遺伝子を細胞の染色体ＤＮＡに導入することで、活性酸素ストレス耐性を備え、過酸化物、重金属塩、高塩濃度、乾燥等の各種環境ストレスに対する耐性を示す形質転換細胞、及び／又は、形質転換個体を得ることができる。加えて、このＣＤＲ１遺伝子及び／又はの構造や機能を更に解析することで、細胞内における活性酸素除去系の機構について、有用な情報を得ることができる。
【００１１】
また、本発明によれば、上記ＣＤＲ１遺伝子又はＣＤＲ２遺伝子を有するベクターが提供される。このベクターを細胞内に導入することで、活性酸素除去系に関与する新規な遺伝子が細胞の染色体ＤＮＡに導入され、活性酸素ストレス耐性を備え、過酸化物、重金属塩、高塩濃度、乾燥等の各種環境ストレスに対する耐性を示す形質転換細胞、及び／又は、形質転換個体を得ることができる。
【００１２】
また、本発明によれば、上記ＣＤＲ１遺伝子又はＣＤＲ２遺伝子が、その染色体ＤＮＡ中に導入された形質転換細胞が提供される。この形質転換細胞を増殖させ、分化させることで、活性酸素ストレス耐性を備え、過酸化物、重金属塩、高塩濃度、乾燥等の各種環境ストレスに対する耐性を示す形質転換個体を得ることができる。
【００１３】
また、本発明によれば、上記形質転換細胞が増殖及び分化することにより得られる、形質転換植物個体が提供される。従って、活性酸素除去系に関与する新規な遺伝子が細胞の染色体ＤＮＡに導入され、活性酸素ストレス耐性を備え、過酸化物、重金属塩、高塩濃度、乾燥等の各種環境ストレスに対する耐性を示す形質転換植物個体を得ることができる。かかる形質転換植物は、塩類集積土壌や乾燥地など、従来、植物の生育が困難とされていた環境下でも生育するので、荒地や砂漠の拡大防止、これらの土地の緑化や植林、さらには地球温暖化の防止に大きな役割を果たすことができる。
【００１４】
また、本発明によれば、上記ＣＤＲ１遺伝子又はＣＤＲ２遺伝子によりコードされるタンパク質が提供される。このタンパク質を細胞内で機能させることにより、その細胞及びその細胞が増殖・分化して生じる個体に、活性酸素ストレス耐性を付与し、ひいては、過酸化物、重金属塩、高塩濃度、乾燥等の各種環境ストレスに対する耐性を付与することができる。加えて、このタンパク質の構造や機能を更に解析することで、細胞内における活性酸素除去系の機構について、有用な情報を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
本発明に係るＤＮＡは、配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。上記活性酸素除去系に関与する新規な遺伝子ＣＤＲ１は、この配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなり、一方、遺伝子ＣＤＲ２は配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなっている。かかるＤＮＡは、植物等の細胞より、ＤＮＡとして単離しても、ＲＮＡとして単離した後、このＲＮＡからｃＤＮＡを逆転写して得てもよい。ＲＮＡとして単離する場合は、予め過酸化水素等の活性酸素ストレスに暴露した細胞を材料として用いてもよい。もっとも、上記ＤＮＡは、化学合成して得ることもできる。細胞からのＤＮＡやＲＮＡの単離方法、及び、ＤＮＡの化学合成法としては、当業者に公知の方法を使用することができる。
【００１７】
例えば、配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡを、タバコ細胞よりＲＮＡとして単離した後、このＲＮＡからｃＤＮＡを逆転写して得るには、まず、タバコ全草、又は、タバコの葉、茎、根、花やカルス等の組織もしくはその一部を、液体窒素で凍結した後、乳鉢などで摩砕して、この摩砕物より、酸グアニジンフェノールクロロホルム法、グアニジンチオシナネート‐塩化セシウム法、グリオキザール法、塩化リチウム‐尿素法、プロテイナーゼＫ‐デオキシリボヌクレアーゼ法等を用いて粗ＲＮＡ画分を抽出し、得られた粗ＲＮＡ画分を、オリゴｄＴ‐セルロースやセファロース２Ｂを担体とするポリＵ‐セファロース等を用いたアフィニティーカラム法又はバッチ法にて精製し、ｍＲＮＡ（ポリＡ＋ｍＲＮＡ)を得る。このｍＲＮＡは、更に、ショ糖密度勾配遠心法等を行って分画してもよい。
【００１８】
次いで、上記のようにして得られた精製ｍＲＮＡから、例えば、Hoffman法等を用い、ｃＤＮＡを逆転写する。具体的には、市販のキット（例えば、ZAP-cDNA Synthesis KitやHybriZAP 2.1 XR Vector Cloning Kit（いずれもStratagene社製）等）を利用し、上記精製ｍＲＮＡに、オリゴｄＴをプライマーとして付加した上で、逆転写酵素を作用させてＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成させた後、ＲＮＡ鎖をＲＮａｓｅＨにより分解してから、ＤＮＡポリメラーゼＩを作用させることにより、上記精製ｍＲＮＡが逆転写された二本鎖ｃＤＮＡを得ることができる。
【００１９】
配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、上記二本鎖ｃＤＮＡの両端に、ＥｃｏＲＩ‐ＮｏｔＩ‐ＢａｍＨＩアダプター等のアダプターを適宜付加した後、例えばHybriZAP  2.1  XRベクター(Stratagene社製)等のクローニングベクターに連結してファージ粒子にパッケージングし、ｃＤＮＡライブラリーを作製して、このライブラリー化されたｃＤＮＡに対し、ＹＡＰ遺伝子を破壊した酵母を宿主とする相補試験を行うことにより、スクリーニングして得ることができる。
【００２０】
すなわち、上記ライブラリー化されたｃＤＮＡを、酵母にて自律複製可能で、かつ、有効な転写活性化ドメイン（例えば、ＧＡＬ４活性化ドメイン等）を有するプラスミド、例えば、pAD-GAL4プラスミドの該転写活性化ドメインの下流に連結した上で、これをＹＡＰ１遺伝子及び／又はＹＡＰ２遺伝子を破壊した酵母に、酢酸リチウム法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法等を用いて導入し、導入処理後の酵母を、４ｍＭ過酸化水素又は１５０μＭカドミウムイオンを含む培地で培養する。ＹＡＰ１遺伝子及び／又はＹＡＰ２遺伝子を破壊した酵母は、上記濃度の過酸化水素やカドミウムイオンを含む培地では生育が阻害されるので、かかる培地にて正常な生育を示す株には、導入されたｃＤＮＡによって、破壊されたＹＡＰ１遺伝子及び／又はＹＡＰ２遺伝子の働きが補完され、過酸化水素やカドミウムイオンの存在により引き起こされる活性酸素ストレスに対抗するための、活性酸素除去系が回復したものと考えられる。従って、このような株を選抜して、導入したｃＤＮＡを回収すれば、細胞内の活性酸素除去系に関与する遺伝子ＣＤＲ１又はＣＤＲ２、即ち、配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる。
【００２１】
なお、上記スクリーニングに用いる酵母としては、ＹＡＰ１遺伝子及びＹＡＰ２遺伝子の両者を破壊した株を用いるのが好ましい。ＹＡＰ１遺伝子又はＹＡＰ２遺伝子のどちらか一方のみを破壊した株では、過酸化水素やカドミウム添加培地で培養した場合でも、これらの遺伝子を両方とも保持している正常な株との間に、十分な生育の差を検出することが難しいからである（Hirata等、Mol．Gen．Genet．、Vol242、p．250−256、1994）。ＹＡＰ１遺伝子及び／又はＹＡＰ２遺伝子を破壊した酵母は、予め、ＨＩＳ３遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子又はＴＲＰ１遺伝子等が挿入され、その機能が破壊されたＹＡＰ１構造遺伝子及び／又はＹＡＰ２構造遺伝子を、正常な酵母の染色体ＤＮＡ中のＹＡＰ１構造遺伝子及び／又はＹＡＰ２構造遺伝子と、相同的組換え等を利用して置き換えることにより得ることができる。
【００２２】
上記スクリーニングの結果回収されたｃＤＮＡの塩基配列の確認は、このｃＤＮＡを制限酵素で切断し、適当なプラスミドに再連結してサブクローニングした後、マキサム‐ギルバートの化学修飾法やジデオキシヌクレオチド鎖終結法（F．Sanger等、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、vol．74、P．5463-5469、1977）等の手法により、市販の自動塩基配列決定機（例えばBECKMAN社製CEQ2000 DNAシークエンサー等）も適宜利用して行うことができる。
【００２３】
配列番号１又は配列番号３に示すＤＮＡの塩基配列は、以上のようにして決定されたものである。このＤＮＡは、配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列をコードしており、細胞内の活性酸素除去系に関与し、過酸化物や重金属等による活性酸素ストレス耐性を付与すると考えられる。
【００２４】
もっとも、生物の遺伝子は、同じ機能を果たすもの同士でも、各種ごと、また、各個体ごとに、その塩基配列はある程度相違するのが、むしろ普通である。従って、上記アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するタンパク質を与えなくとも、又は、上記ＤＮＡの塩基配列と同一でなくとも、本発明に係るＤＮＡは、これが導入された宿主細胞に過酸化水素耐性を付与する限り、配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列に対し、少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換、及び／もしくは、付加されているアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするものであってもよく、あるいは、配列番号１又は配列番号３に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであってもよい。なお、この場合において、過酸化水素耐性の付与を要件とするのは、前記酵母のＹＡＰ１遺伝子及びＹＡＰ２遺伝子に関する研究より明らかなように、活性酸素除去系に関与する遺伝子は、活性酸素ストレスの誘引物質である過酸化水素等、過酸化物への耐性を付与すると考えられるからである。
【００２５】
配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列に対し、少なくとも１個のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、本発明のＤＮＡとしては、配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列に対し、１〜２０個程度のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列をコードするＤＮＡが好ましく、特に、１〜５個程度のアミノ酸が欠失しているアミノ酸配列をコードするＤＮＡが好ましい。
【００２６】
また、配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列に対し、少なくとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、本発明のＤＮＡとしては、配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列に対し、１〜１６０個程度のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列をコードするＤＮＡが好ましく、特に、１〜４０個程度のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列をコードするＤＮＡが好ましい。
【００２７】
さらに、配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列に対し、少なくとも１個のアミノ酸が付加されているアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、本発明のＤＮＡとしては、配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列に対し、１〜２０個程度のアミノ酸が付加されているアミノ酸配列をコードするＤＮＡが好ましく、特に、１〜５個程度のアミノ酸が付加されているアミノ酸配列をコードするＤＮＡが好ましい。
【００２８】
一方、配列番号１又は配列番号３に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、本発明のＤＮＡとしては、例えば、ホルムアミド濃度が３０〜５０Ｗ／Ｖ％、好ましくは５０Ｗ／Ｖ％、温度が３７〜５０℃、好ましくは４２℃の条件下で、配列番号１又は配列番号３に示す塩基配列とハイブリダイズするＤＮＡが好ましい。
【００２９】
上記、配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列に対し、少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換、及び／もしくは、付加されているアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは、配列番号１又は配列番号３に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡは、例えば、配列番号２もしくは配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、配列番号１もしくは配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして、タバコ細胞その他の植物の細胞を始め、微生物の細胞、動物の細胞より単離したＤＮＡ又はｃＤＮＡと、上記ハイブリダイズ条件、即ち、ホルムアミド濃度３０〜５０％Ｗ／Ｖ、好ましくは５０Ｗ／Ｖ％、温度３７〜５０℃、好ましくは４２℃にてハイブリダイゼーションを行うことにより、取得できる。
【００３０】
また、上記、配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列に対し、少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換、及び／もしくは、付加されているアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは、配列番号１又は配列番号３に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡは、例えば、配列番号２もしくは配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、配列番号１もしくは配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡに、Kunkel法やGapped duplex法などの公知の手法又はこれに準ずる方法を用い、人為的に部位特異的突然変異を導入して作製することもできる。このような部位特異的突然変異の導入を簡便に行うための変異導入用キットも市販されている（例えば、TAKARA社製、Mutant-K、Mutant-G、又は、LA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキット等）。
【００３１】
本発明の遺伝子導入用ベクターは、本発明のＤＮＡ、即ち、上記した、配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列に対し、少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換、及び／もしくは、付加されているアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、配列番号１又は配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡ、あるいは、配列番号１又は配列番号３に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有する。
【００３２】
このようなベクターは、上記ＤＮＡを適当な制限酵素にて切断した上で、このＤＮＡを、本発明の目的達成のために必要とされる各種公知のＤＮＡ要素、例えばプロモーター、エンハンサー等のシスエレメント、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、ターミネーター、選抜マーカー遺伝子などと共に、これらを導入しようとする宿主細胞において複製可能な公知のベクターの制限酵素部位、又はマルチクローニングサイトに連結することにより、作製できる。
【００３３】
なお、プロモーターは、上記ＤＮＡを発現させることができるものであれば、どのようなものであってもよいが、大腸菌を宿主とする場合には、大腸菌やファージに由来するｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の他、これらのプロモーターを人為的に改変して得られた、ｔａｃプロモーター等のプロモーターを用いることが好ましい。酵母を宿主とする場合には、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が好ましい。また、植物細胞を宿主とする場合は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）に由来する３５Ｓプロモーター、レンゲ萎縮ウイルスに由来するＭＣ８プロモーター、ｒｂｃＳプロモーター、ユビキチンプロモーター、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子のプロモーター、オクトピン（ＯＣＴ）合成酵素遺伝子のプロモーター等が好ましい。さらに、動物細胞を宿主とする場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が好ましい。動物細胞においては、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いることもできる。
【００３４】
本発明のＤＮＡ、及び、上記プロモーター等のＤＮＡ要素を連結するための公知のベクターとしては、例えば、λファージ等のファージＤＮＡや、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119等の大腸菌用プラスミドＤＮＡ、pUB110、pTP5等の枯草菌用プラスミドＤＮＡ、YEp13、YEp24、YCp50等の酵母用プラスミドＤＮＡ、pBI101、pBI121、pBI2113、pBI2113Not、pBI221、pBIG、pGA482、pGAH等のバイナリーベクター系の植物細胞用プラスミドＤＮＡ、又はpLGV23Neo、pMON200、pNCAT等の中間ベクター系の植物細胞用プラスミドＤＮＡなどを例示することができる。また、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクター、レトロウイルス、ワクシニアウイルス等の動物ウイルスベクターも、上記ＤＮＡを連結するためのベクターとして用いることができる。なお、バイナリーベクター系の植物細胞用プラスミドＤＮＡをベクターとして植物細胞への遺伝子導入を行う場合は、その境界配列ＬＢ及びＲＢ間、即ちＴ-ＤＮＡ領域に上記ＤＮＡを連結する必要がある。
【００３５】
本発明の形質転換細胞は、本発明のＤＮＡを宿主細胞の染色体に導入することにより、取得できる。この場合において、典型的な宿主細胞としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）Hms174（DE3）株、K12株もしくはDH1株、枯草菌（Bacillus subtilis）MI 114株、207-21株、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens、以下、Ａ．チュメファシエンスと略記する）C58株、LBA4404株、EHA101株、EHA105株もしくはC58C1RifR株、アグロバクテリウム・リゾジェネス（Agrobacterium rhizogenes）又はリゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）等の細菌類、酵母（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Shizosaccharomyces pombe）又はピキア・パストリス（Pichia pastoris）等の酵母類、シロイヌナズナ、タバコ、トウモロコシ、イネ、ニンジン、ペチュニア、ポプラ、ユーカリ、アカシア、スギ又はマツ等の植物細胞、Ｓｆ９細胞又はＳｆ２１細胞等の昆虫細胞、あるいは、サル細胞COS-7もしくはVero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスＬ細胞、ラットGH3細胞又はヒトFL細胞等の動物細胞を挙げることができる。もっとも、本発明において、宿主細胞に特に制限はない。本発明のＤＮＡを発現し得るものであれば、何であれ、このＤＮＡを染色体に導入することで、本発明の形質転換細胞を取得できる。
【００３６】
また、本発明のＤＮＡを上記宿主細胞の染色体に導入するには、前記したように、宿主細胞に応じて選択したプロモーター等のＤＮＡ要素及びベクターに本発明のＤＮＡを連結して、本発明の遺伝子導入用ベクターを作製し、これを、公知の遺伝子導入法を用いて各宿主細胞に導入すればよい。遺伝子導入法としては、例えば、細菌を宿主細胞とする場合には、カルシウムイオン法（Cohen et al．、Proc．Natl．Acad．Sci．、USA、69：2110-2114、1972）、エレクトロポレーション法（Becker et al．、Methods． Enzymol．、194：182‐187、1990) 、凍結融解法、三者接合法（M.BevanNucleic Acids Research、12：8711、1984）等を、酵母を宿主細胞とする場合には、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、プロトプラスト法、スフェロプラスト法（Hinnen et al．、Proc．Natl．Acad．Sci．、USA、75：1929‐1933、1978）、酢酸リチウム法（Itoh、J．Bacteriol．、153：163‐168、1983）等を、植物細胞を宿主細胞とする場合には、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法（Abel et al．、Plant J．、5:421‐427、1994）、パーティクルガン法、リポソーム法、マイクロインジェクション法等を、動物細胞や昆虫細胞を宿主細胞とする場合には、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を、用いることができる。
【００３７】
本発明の形質転換植物個体は、植物細胞の染色体に本発明のＤＮＡを導入して得た形質転換細胞を増殖、分化させることにより得ることができる。
【００３８】
植物細胞の染色体に本発明のＤＮＡを導入するにあたっては、上記したように、植物細胞用に選択したプロモーター等のＤＮＡ要素及びベクターに本発明のＤＮＡを連結して、本発明の遺伝子導入用ベクターを作製し、これを、公知の遺伝子導入法を用いて各宿主細胞に導入すればよい。
【００３９】
ＤＮＡ要素については、既に例示したように、植物細胞用のプロモーターとして、上記３５ＳＲＮＡプロモーター、ＭＣ８プロモーター、ｒｂｃＳプロモーター、ユビキチンプロモーター、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子のプロモーター、オクトピン（ＯＣＴ）合成酵素遺伝子のプロモーター等を用いることができる。また、ターミネーターとして、カリフラワーモザイクウイルス由来のターミネーターやノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーター等を、選抜マーカー遺伝子として、カナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴＩＩ遺伝子）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｔｐ遺伝子）、ビアラホス(bialaphos)に対する抵抗性を付与するホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）遺伝子等から選ばれる１つ以上の遺伝子を使用することができる。さらに、これらのＤＮＡ要素に加え、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、β‐グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）遺伝子等を、レポーター遺伝子として使用してもよい。
【００４０】
ベクター、宿主細胞、及び遺伝子導入法についても、既に例示したように、ベクターとしては、pBI101、pBI121、pBI2113、pBI2113Not、pBI221、pBIG、pGA482、pGAH、pLGV23Neo、pMON200、pNCAT等を、宿主細胞としては、シロイヌナズナ、タバコ、トウモロコシ、イネ、ニンジン、ペチュニア、ポプラ、ユーカリ、アカシア、スギ又はマツ等を、遺伝子導入法としては、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法、リポソーム法、マイクロインジェクション法等を用いることができる。なお、上記宿主細胞は、植物のいずれの器官（例えば、葉、花弁、茎、根、根茎、種子等）又は組織（例えば、表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）の細胞を用いてもよい。
【００４１】
もっとも、以上のＤＮＡ要素、ベクター、宿主細胞、遺伝子導入法以外でも、本発明のＤＮＡを染色体に導入し、これを発現させて形質転換細胞を作製でき、更に、この形質転換細胞を増殖、分化させて形質転換植物個体を作製できるものであれば、本発明においては何であれ用いることができる。また、選抜マーカー遺伝子は、本発明のＤＮＡと共に単一のベクターに組込んでもよいし、２つ以上のベクターにそれぞれ別個に組み込んでもよい。
【００４２】
遺伝子導入後の宿主細胞は、その植物細胞の増殖・分化に適した公知の培地及び環境条件で培養する。この過程で、本発明のＤＮＡと共に導入した選抜マーカー遺伝子の発現を指標として、形質転換細胞を選抜し、これを増殖・分化させて植物個体を再分化させれば、本発明の形質転換植物個体を得ることができる。こうして得られた形質転換植物個体又はその後代の個体の染色体への本発明のＤＮＡの導入は、当該個体の細胞から定法に従ってＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーション法等、公知の手法を用いて解析を行うことにより、確認できる。
【００４３】
一方、本発明の形質転換植物個体又はその後代の個体における本発明のＤＮＡの発現は、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ウエスタンブロッティング法等の公知の手法によって確認し、評価することができる。すなわち、当該個体に、例えば乾燥及び／又は低温ストレスを与えた後、このようなストレスを与えなかった他は同条件で育成した形質転換植物個体もしくはその後代、及び／又は、非形質転換植物個体と共に、これらの手法によって、そのＲＮＡ（ＲＴ−ＰＣＲ法もしくはノーザンハイブリダイゼーション法を用いる場合）又は遺伝子産物（ウエスタンブロッティング法を用いる場合）を解析すれば、本発明のＤＮＡの発現レベルを知ることができる。なお、培養容器内で育成されている植物個体であれば、乾燥ストレスは、寒天培地等から植物体を抜き取り、ろ紙上で１０分〜２４時間乾燥させることにより、また、低温ストレスは、植物体を−４〜１５℃の環境下に１０分〜２４時間置くことにより、与えることができる。一方、地植えの植物個体であれば、乾燥ストレスは、乾燥環境下に１〜２週間程度置くことにより、低温ストレスは、上記低温環境下に、やはり１〜２週間程度置くことにより、与えればよい。一般に、染色体に導入された遺伝子は、その導入位置によって発現レベルが異なるので、上記の手法により解析を行うことで、本発明のＤＮＡがより強く発現している形質転換植物個体及びその後代を選抜できる。
【００４４】
また、本発明の形質転換植物個体又はその後代の個体における本発明のＤＮＡの発現は、当該個体の酸化ストレス耐性を調査することで、最終的に確認し、評価することができる。このような調査は、例えば、本発明の形質転換植物個体又はその後代の個体を、非形質転換個体と共に、高濃度の塩類を含む培養土で２〜４週間栽培する等して酸化ストレスを与えたときの生育状況を観察することによって、行えばよい。
【００４５】
本発明のタンパク質は、本発明のＤＮＡ、即ち、上記した、配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列に対し、少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換、及び／もしくは、付加されているアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、配列番号１又は配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡ、あるいは、配列番号１又は配列番号３に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされる。かかるタンパク質は、本発明の形質転換細胞の培養物より取得することができる。ここで培養物とは、本発明の形質転換細胞を培養した結果得られる、細胞、組織、器官、個体及び／又は培地等を意味する。本発明の形質転換細胞の培養は、その宿主とした細胞の培養において公知の方法を用いて行うことができる。
【００４６】
例えば、大腸菌や酵母等の微生物を宿主として得られた形質転換細胞を培養する場合は、炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有する天然培地又は合成培地を用い、通常は好気的条件下、３７℃で６〜２４時間、振盪培養又は通気攪拌培養を行えばよい。
【００４７】
この場合において、例えば、炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を、窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、その他の含窒素化合物、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーを、無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムを、１種又は２種以上組合わせて用いることができる。また、植物細胞を宿主として得られた形質転換細胞を培養する場合は、チアミン、ピリドキシン等のビタミン類を、動物細胞を宿主として得られた形質転換細胞を培養する場合は、ＲＰＭＩ１６４０等の血清を、上記成分に加え、必要に応じ適宜添加すればよい。培地のｐＨは７．０〜７．５に調整・保持することが好ましい。培地のｐＨは、無機酸もしくは有機酸、及び／又はアルカリ溶液等を用いて調整することができる。
【００４８】
なお、上記培地には、雑菌による汚染防止のため、ペニシリン、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の抗生物質を添加してもよい。ただし、大腸菌は通常、このような抗生物質の存在下では生育しないので、大腸菌を宿主とする形質転換細胞を培養する場合には、これらの添加は避けるべきである。もっとも、選抜マーカー遺伝子として抗生物質耐性遺伝子を用い、この選抜マーカー遺伝子を本発明のＤＮＡと共に染色体に導入した場合には、当該形質転換細胞には、導入した抗生物質耐性遺伝子に対応した抗生物質耐性が付与されるので、大腸菌を宿主とする形質転換細胞であっても、上記抗生物質を培地に添加して培養することができる。
【００４９】
さらに、本発明のＤＮＡを制御するプロモーターとして化合物誘導性のプロモーターを用いた場合には、インデューサーとして当該化合物を、上記培地に添加することが好ましい。例えば、上記プロモーターとして、ｔｒｐプロモーターを用いた場合はインドールアクリル酸(ＩＡＡ)等を、ｌａｃプロモーターを用いた場合はイソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)等を培地に添加し、本発明の形質転換細胞を培養すれば、本発明のＤＮＡの発現が誘導されて、本発明のタンパク質が培養物中に蓄積されることとなる。
【００５０】
本発明のタンパク質は、本発明の形質転換細胞を上記のようにして培養し、得られた培養物について、適宜抽出・精製操作を行うことにより取得できる。なお、本発明のタンパク質が、主として培養後の形質転換細胞内に蓄積される場合には、その細胞の破壊操作を行った後に抽出操作を行うことが好ましく、主として上記培養後の培地中に溶解した状態で蓄積される場合には、当該培地についてそのまま、もしくは、遠心分離等により形質転換細胞その他の不要物を除去した後に抽出操作を行うことが好ましい。抽出後のタンパク質の精製は、タンパク質の単離精製法として公知の方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿法、ゲルクロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法等を、単独で又は適宜組合わせて用いることができる。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例になんら限定されるものではない。
【００５２】
［実施例１］
Ｉ．タバコｍＲＮＡの抽出及び精製
発芽後、温室にて約１ヶ月間生育させたタバコNicotiana tabacum L cv. SR-1の葉約１０ｇを採取し、液体窒素で凍結させてから摩砕した。この摩砕物より、酸グアニジンフェノールクロロホルム法（Chomcznski et al.、Anal. Biochem. 、Vol.162、p.156−159）を用いて粗ＲＮＡ画分を抽出し、得られた粗ＲＮＡ画分を二炭酸ジエチルで処理した滅菌水に溶解して、温度６５℃で５分間加熱した後、予め２倍当量のローディング緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．６、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１Ｗ／Ｖ％  ＳＤＳ）にて活性化させておいたオリゴｄＴ‐セルロースカラムにアプライした。精製ｍＲＮＡは、このカラムを、５〜１０倍当量の上記ローディング緩衝液にて洗浄し、次いで、２〜３倍当量の溶出緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５Ｗ／Ｖ％  ＳＤＳ）を溶離液として溶出させることにより得られた。なお、このとき得られた精製ｍＲＮＡの量は１０μｇであった。
【００５３】
ＩＩ．タバコｃＤＮＡファージライブラリーの作製
Ｉにて得られた精製ｍＲＮＡより、Stratagene社製HybriZAP 2.1 XR Vector Cloning Kitを用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成し、得られた二本鎖ｃＤＮＡをλファージ発現ベクターに連結した後、この発現ベクターをファージ粒子にパッケージングして、力価（タイター）１．０×１０６pfu/mlのタバコｃＤＮＡファージライブラリーを作製した。
【００５４】
なお、ファージ粒子へのパッケージングには、Stratagene社製インビトロ・パッケージングキット（GigapackII Gold packaging extract）を用いて行った。すなわち、タバコのｃＤＮＡを連結したλファージ発現ベクターに、溶解した直後のFreeze/Thaw extractを加えて氷上に置いた後、直ちにSonic extract１５μｌを加え、ピペッティングしてよく混合してから軽く遠心して、室温（２２℃）に２時間放置することにより行った。また、力価の測定は、この２時間放置後の反応液に、５００μｌのファージ希釈用緩衝液（Phage Dilution Buffer）及び２０μｌのクロロホルムを加えて混合した後、水層２μlを１８μｌのＳＭ緩衝液（１ｌ中、ＮａＣｌ５．８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２ｇ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５０ｍｌ、２Ｗ／Ｖ％ゼラチン５ｍｌ）にて希釈し、この希釈液１μｌとファージ原液１μｌとを、ＯＤ６００＝０．５の大腸菌PLK-F‘株の培養液２００μｌにそれぞれ混合し、３７℃で１５分培養してからトップアガー（４８℃）２〜３ｍｌに加え、直ちに、約３７℃に温めた直径１５０ｍｍのＮＺＹアガープレート（０．５Ｗ／Ｖ％  ＮａＣｌ、０．２Ｗ／Ｖ％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５Ｗ／Ｖ％酵母エキス、１．０Ｗ／Ｖ％  NZ-amine、１．５Ｗ／Ｖ％寒天）に重層して、３７℃、一晩培養後、出現したプラーク数を数えることにより行った。
【００５５】
ＩＩＩ．タバコｃＤＮＡファージライブラリーの増幅
ＩＩにて得られた、タバコｃＤＮＡを連結したλファージ発現ベクターがパッケージングされたファージ粒子（以下、単に組換えファージ粒子とも言う。）約５００００個を、ＯＤ６００＝０．５の大腸菌PLK-F‘株の培養液６００μｌに混合し、３７℃で１５分培養した後、この培養液にトップアガー（４８℃）６．５ｍｌを加え、約３７℃に温めた直径１５０ｍｍのＮＺＹアガープレートへ直ちに重層して、３７℃で５〜８時間培養した。次いで、この各プレートに１０ｍｌのＳＭ緩衝液を加えて、４℃で一晩ゆっくり振とうさせながら培養することにより、タバコｃＤＮＡのファージライブラリーを増幅した。この増幅後のライブラリーについて、上記ＩＩと同様にして測定した力価は、５．０×１０９pfu/mlであった。
【００５６】
増幅後のライブラリーはポリプロピレンチューブに集め、その全量の５Ｖ／Ｖ％に相当するクロロホルムを加えて混合し、室温で１５分放置してから、４０００ｇで５分遠心して上清を回収し、この上清に全量の０．３％に相当するクロロホルムを加えて、４℃で保存した。
【００５７】
ＩＶ．タバコｃＤＮＡファージライブラリーのプラスミドへの変換
タバコｃＤＮＡファージライブラリーのプラスミドへの変換は、ＩＩＩにて増幅されたタバコｃＤＮＡファージライブラリー２００μｌ（組換えファージ粒子１×１０５個以上を含む。）、ＯＤ６００＝０．１の大腸菌XL1-Blue培養液２００μｌ、及び、力価１×１０６pfu/ml以上のヘルパーファージR408  １μｌを混合し、３７℃で１５分培養した後、２倍希釈ＹＴ培地（０．８Ｗ／Ｖ％ポリペプトン、０．５Ｗ／Ｖ％酵母エキス、０．２５Ｗ／Ｖ％  ＮａＣｌ、１．５Ｗ／Ｖ％寒天）５ｍｌを加え、更に、３７℃で３時間振とう培養することにより行った。また、こうしてプラスミドに組込まれたタバコｃＤＮＡは、この培養液を７０℃で２０分熱処理してから、４０００ｇで５分遠心を行うことにより上清を回収した後、この上清を、再度、５０００ｇで５分遠心を行い精製した上で、その１００倍希釈液２０μｌとＯＤ６００＝０．１の大腸菌XL1-Blue培養液２００μｌとを混合して、３７℃で１５分培養を行うことにより、大腸菌に感染させた。
【００５８】
上記培養後、培養液１〜１００μｌを取分け、アンピシリンを含むＬＢプレート（１．０Ｗ／Ｖ％ポリペプトン、０．５Ｗ／Ｖ％酵母エキス、１．０Ｗ／Ｖ％  ＮａＣｌ、１．５Ｗ／Ｖ％寒天）にて３７℃で一晩培養を行い、出現した大腸菌のコロニーをランダムに選択し、グリセロールを加えて−８０℃で保存した。以下の操作に用いるタバコｃＤＮＡを組込んだプラスミドは、こうして保存しておいた大腸菌より、Qiagen社製のQIAfilter Plasmid Kit Maxiを用いて単離した。
【００５９】
すなわち、上記のようにして保存されていた大腸菌を、５ｍｌの２倍希釈ＬＢ培地にて３７℃、一晩培養し、次いで、１００ｍｌのＬＢ培地にて３７℃、一晩培養することにより増殖させた後、４℃、４０００ｇ、１５分遠心して菌体を回収し、回収した菌体にＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）１ｍｌを加え、ボルテックスにて撹拌してから、今度は、４℃、５０００ｇ、５分遠心することにより、再び菌体を回収した。そして、この菌体に、１０ｍｌのＰ１溶液（細胞懸濁用溶液）を加え、よく懸濁した上でミキサーにて２分間撹拌し、更に、１０ｍｌのＰ２溶液（細胞溶解用溶液）を加え、透明になるまで撹拌して菌体を溶解させた後、この溶液に１０ｍｌのＰ３溶液（中和用溶液）を加え、手で振って撹拌してから、１５０００ｇで１０分遠心して上清を回収した。この上清を、予めＱＢＴ溶液（カラム活性化溶液）１０ｍｌで活性化しておいたカラムQIAGEN-tip 500にアプライし、３０ｍｌのＱＣ溶液（カラム洗浄用溶液）にて二度洗浄した後、１５ｍｌのＱＣ溶液（カラム溶出用溶液）をカラムに流すことにより、タバコｃＤＮＡを組込んだプラスミドを溶出させ、得られた溶出液にイソプロパノール１０．５ｍｌを加えてこれを析出させ、１５０００ｇで３０分遠心することにより、沈殿させて回収した。この沈殿に７０％エタノール１ｍｌを加え、１５０００ｇで３分遠心し、再度回収してからエタノールを完全に除去し、デシケーター中で真空乾燥させた後、２０μｌの滅菌水に溶解し、−２０℃にて保存した。
【００６０】
Ｖ．活性酸素ストレス耐性遺伝子のスクリーニング
ＩＶにてタバコｃＤＮＡを組込んだプラスミドを、ＹＡＰ１遺伝子及びＹＡＰ２遺伝子の双方を破壊した酵母DHA 12-2c株（MATa ho yap1::HIS3 yap2::URA3 leu2 trp1 ade2 can1-100）に酢酸リチウム法を用いて導入し、この形質転換酵母１．２×１０６個を、最終濃度４ｍＭとなるように過酸化水素水を添加したＹＰＤ培地（１Ｗ／Ｖ％酵母エキス、２Ｗ／Ｖ％ポリペプトン、２Ｗ／Ｖ％デキストロース、２Ｗ／Ｖ％寒天）にて２８℃で４〜７日間培養することにより、活性酸素ストレス耐性遺伝子のスクリーニングを行った。
【００６１】
この結果、上記培地で生育し、活性酸素ストレス耐性を獲得したと考えられる形質転換酵母２株を得ることができた。
【００６２】
ＶＩ．活性酸素ストレス耐性遺伝子の塩基配列の決定
Ｖにて活性酸素ストレス耐性を示した形質転換酵母２株にそれぞれ由来する、２系統の形質転換酵母について、導入されたプラスミドを抽出し、その塩基配列を解析することにより、これらの酵母に活性酸素ストレス耐性を付与した、２種のタバコｃＤＮＡの塩基配列を決定し、ＣＤＲ１遺伝子及びＣＤＲ２遺伝子と命名した。ＣＤＲ１遺伝子の塩基配列を配列番号１に、ＣＤＲ２遺伝子の塩基配列を配列番号３に示す。
【００６３】
なお、酵母からのプラスミドの抽出は、ザイモリエース処理により細胞壁を溶解させた酵母菌体を、ＳＤＳ及びグアニジンチオシアネートにてタンパクを変性させた後、タンパク分解酵素及びＲＮＡ分解酵素にて処理することにより行った。また、ｃＤＮＡの塩基配列は、ベックマンコールター社製シーケンシングキット及びＤＮＡオートシーケンサー２０００ＸＬを用い、付属の説明書に従って操作することにより解析した。このときシーケンスプライマーとしては、上記シーケンシングキットのフォワードプライマー（Ｐ７）及びリバースプライマー（Ｐ８）を使用した。
【００６４】
上記ＣＤＲ１遺伝子及びＣＤＲ２遺伝子について、ＤＮＡ解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ‐ＷＩＮ（ソフトウェア開発株式会社製）を用い、ＧｅｎＢａｎｋのＤＮＡデータベースに基づきホモロジー検索を行ったところ、ＣＤＲ１遺伝子は、ヒトのインスリン分解酵素遺伝子と高い相同性（アミノ酸レベルで５６％）を有し、また、ＣＤＲ２遺伝子は、シロイヌナズナ由来の機能不明のタンパク質遺伝子と高い相同性（アミノ酸レベルで６９％）を有していた。
【００６５】
ＶＩＩ．活性酸素ストレス耐性遺伝子が導入された形質転換タバコの作製
活性酸素ストレス耐性を有する上記２系統の酵母に導入したプラスミドを、ＶＩと同様にして抽出し、ＣＤＲ１遺伝子又はＣＤＲ２遺伝子を含むＢａｍＨＩ断片を切取って、バイナリーベクター系植物細胞用プラスミドpBI121の３５Ｓプロモーターの下流に連結した後、エレクトロポーレ−ション法を用いて、このプラスミドをＡ．チュメファシエンスEHA105株に導入し、形質転換Ａ．チュメファシエンスEHA105（CDR1）又はEHA105（CDR2）を得た。
【００６６】
一方、播種後約４週間、無菌条件下で生育させたタバコNicotiana tabacum L cv. SR-1を形質転換タバコ作製の材料として用意し、その葉から中脈を取除き、約５ｍｍ角にカットして得られた葉片を、抗生物質カナマイシン（１００ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ培地にて２日間、２８℃で培養した上記Ａ．チュメファシエンスEHA105（CDR1）又はEHA105（CDR2）の培養液に約１〜３分浸してこれに感染させ、滅菌した紙タオル等で付着している菌液を除いてから、ＭＳ培地（T. Murashige and F. Skoog、Physiol. Plant.、15:473、1962）にナフタレン酢酸１ｍｇ／ｌ、ベンジルアデニン０．１ｍｇ／ｌ、ショ糖３Ｗ／Ｖ％及びゲランガム０．２５Ｗ／Ｖ％を添加したカルス誘導用培地に、葉の裏が上になるように置床して、２５℃、全明（特に記載されない限り、外植片及び植物組織・植物個体の培養はこの条件で行った。）で３日間培養を行った。
【００６７】
上記培養後の葉片を、ＭＳ培地にナフタレン酢酸０．１ｍｇ／ｌ、ベンジルアデニン１ｍｇ／ｌ、カルベニシリン５００ｍｇ／ｌ、カナマイシン１００ｍｇ／ｌ、ショ糖３Ｗ／Ｖ％及びゲランガム０．２５Ｗ／Ｖ％を添加したシュート形成用培地に移植して培養を続け、約４週間後、再分化してきた不定芽を切取り、この不定芽を、更に、ＭＳ培地にベンジルアデニン２ｍｇ／ｌ、ナフタレン酢酸０．１ｍｇ／ｌ、カルベニシリン５００ｍｇ／ｌ、カナマイシン１００ｍｇ／ｌ及び寒天０．８Ｗ／Ｖ％を添加した発根用培地に移植して培養することにより発根させて、２系統の形質転換タバコを得た。発根した個体は、発根用培地への移植から約４週間後に、バーミキュライト(日本耐火工業社)とピートモス(和泉農材)とを１：２に混合した培養土を入れたポットに植替え、２５℃の温室で生育させた。なお、上記２系統の形質転換タバコは、Ａ．チュメファシエンスEHA105（CDR1）感染後の葉片より再分化した系統をＮｔＣＤＲ１、EHA105（CDR2）感染後の葉片より再分化した系統をＮｔＣＤＲ２と、それぞれ命名した。
【００６８】
ＶＩＩＩ．形質転換タバコの解析
ＶＩＩにて作製した２系統の形質転換タバコＮｔＣＤＲ１及びＮｔＣＤＲ２について、以下の解析を行った。
【００６９】
Ａ．ＰＣＲ分析
上記２系統の形質転換タバコの葉より、ＣＴＡＢ法（Doyle JJ & Doyle JL、Focus、12:13、1988）を用いて染色体ＤＮＡを抽出し、このＤＮＡを鋳型として、プラスミドpBI121が保持するカナマイシン耐性遺伝子の所定位置に結合するよう設計された、一組のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析を行い、これらの形質転換タバコの染色体ＤＮＡに、プラスミドpBI121由来のカナマイシン耐性遺伝子が存在していることを確認した。
【００７０】
従って、これらの形質転換タバコには、Ａ．チュメファシエンスEHA105（CDR1）又はEHA105（CDR2）の感染を介して、その染色体ＤＮＡ中にpBI121由来の構造が導入されており、上記カナマイシン耐性遺伝子と共に、ＮｔＣＤＲ１の系統にはＣＤＲ1遺伝子が、また、ＮｔＣＤＲ２の系統にはＣＤＲ２遺伝子が導入されているものと考えられる。
【００７１】
Ｂ．ノーザンブロッティング分析
上記２系統の形質転換タバコ及び非形質転換タバコ（いずれも８週齢）の茎より、全ＲＮＡを酸グアニジンフェノールクロロホルム法にて抽出し、この全ＲＮＡ１０μｇについて、緩衝液として１×ＭＯＰＳ緩衝液(２０ｍＭ  ＭＯＰＳ／ｐＨ７．０、５ｍＭ酢酸ナトリウム、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ)、泳動ゲルとして終濃度０．６６Ｍホルムアルデヒドを含む１．２％アガロースゲルを用い、電圧６０Ｖで２時間、電気泳動を行った。なお、ここで非形質転換タバコとは、野生型Nicotiana tabacum L cv. SR-1のことを言う（以下同じ。）。
【００７２】
泳動後のゲルを、ナイロンメンブレンフィルター（Amersham Pharmacia Biotech 社製Hybond-N）にブロッティングし、ロッシュダイアゴノスティックス社のノンラジオアイソトープＤＩＧ‐核酸検出システムのプロトコールに従い調製したプローブを用いて、ハイブリダイゼーションを行ったところ、形質転換タバコＮｔＣＤＲ１ではＣＤＲ１遺伝子に対応するＲＮＡが、ＮｔＣＤＲ２ではＣＤＲ２遺伝子に対応するＲＮＡが、それぞれ高発現していることが明らかとなった。一方、非形質転換タバコにおいては、これらのＲＮＡの発現は認められなかった。
【００７３】
Ｃ．次世代における重金属塩耐性及び高塩濃度耐性の調査
上記２系統の形質転換タバコを自家受粉させて得られた種子及び非形質転換タバコの種子を、７０％エタノールで１分、１０％次亜塩素酸ナトリウム溶液で１５分殺菌処理し、更に、滅菌水で３回洗浄してから、塩化カドミウム（ＣｄＣｌ２）１００μＭ又は塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）２００ｍＭを含むＭＳ固形培地（０．８Ｗ／Ｖ％寒天）に播種し、２５℃、１６時間明期８時間暗期のサイクルで４週間培養後、発芽、生育してきた苗の茎と根の長さを測定した。結果を表１及び表２に示す。
【００７４】
【表１】
2007215513.tif 000002
【００７５】
【表２】
2007215513.tif 000003
【００７６】
表１及び表２より明らかなように、形質転換タバコＮｔＣＤＲ１及びＮｔＣＤＲ２の次世代は、非形質転換タバコと比べ、塩化カドミウム１００μＭを含む培地では、茎の長さにして１．５倍以上、根の長さにして２．０倍以上の成長性を、また、塩化ナトリウム２００ｍＭを含む培地では、茎の長さにして１．９倍以上、根の長さにして４．５倍以上の成長性を示し、これらの形質転換体が、その染色体ＤＮＡ中に導入した活性酸素ストレス耐性遺伝子ＣＤＲ１又はＣＤＲ２の働きにより、重金属塩耐性及び高塩濃度耐性を獲得していることが実証された。
【００７７】
［実施例２］
Ｉ．活性酸素ストレス耐性遺伝子が導入された形質転換タバコ培養細胞の作製
ＬＳ培地（Nagata Y．、Meth. Enzymol．、148:34-39、1987）にて、２５℃、１３０ｒｐｍで培養した植え継ぎ３日目のタバコNicotiana tabacum L cv. BY-2培養細胞４ｍｌに、３０℃で一晩培養した形質転換Ａ．チュメファシエンスEHA105（CDR1）又はEHA105（CDR2）１００μｌを加え、２５℃、暗所で、４８時間静置培養することにより、タバコ培養細胞にこれらのＡ．チュメファシエンスを感染させ、次いで、８００ｒｐｍで1分遠心して感染後のタバコ培養細胞を回収した。回収したタバコ培養細胞は、ＬＳ培地５ｍｌを加え、よく撹拌してから遠心し、上清を捨てるという洗浄操作を５回繰返した後、細胞量の１０倍量に相当するＬＳ培地を加えて懸濁させてから、そのうち１ｍｌを取分けて、これをＬＳ培地にカルベニシリン５００ｍｇ/ｌ、カナマイシン１００ｍｇ/ｌ及び０．８Ｗ／Ｖ％寒天を添加した固形培地上に均一に広げて、２５℃、暗所で静置培養した。そして２週間培養後、生じたコロニーを同組成の培地にて、２５℃、暗所で、更に２週間静置培養し、このとき生育した細胞を、形質転換タバコ培養細胞ＮｔＣＤＲ１−ＢＹ２及びＮｔＣＤＲ２−ＢＹ２として選抜した。なお、ここで形質転換タバコ培養細胞ＮｔＣＤＲ１−ＢＹ２は、Ａ．チュメファシエンスEHA105（CDR1）を感染させたタバコ培養細胞を培養して選抜された系統であり、ＮｔＣＤＲ２−ＢＹ２は、Ａ．チュメファシエンスEHA105（CDR2）を感染させたタバコ培養細胞を培養して選抜された系統である。
【００７８】
ＩＩ．形質転換タバコ培養細胞の解析
Ｉにて選抜した２系統の形質転換タバコ培養細胞ＮｔＣＤＲ１−ＢＹ２及びＮｔＣＤＲ２−ＢＹ２について、以下の解析を行った。
【００７９】
Ａ．ＰＣＲ分析
上記２系統の形質転換タバコ培養細胞より、ＣＴＡＢ法を用いて染色体ＤＮＡを抽出し、このＤＮＡを鋳型として、ＣＤＲ１遺伝子又はＣＤＲ２遺伝子の所定位置に結合するよう設計された、各一組のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ分析を行い、形質転換タバコ培養細胞ＮｔＣＤＲ１−ＢＹ２の染色体ＤＮＡにはＣＤＲ１遺伝子が、形質転換タバコ培養細胞ＮｔＣＤＲ２−ＢＹ２の染色体ＤＮＡにはＣＤＲ２遺伝子が、それぞれ存在していることを確認した。
【００８０】
Ｂ．重金属塩耐性の調査
上記２系統の形質転換タバコ培養細胞を、塩化カドミウム５０μＭ又は１００μＭを含むＬＳ固形培地（０．８Ｗ／Ｖ％寒天）に置床し、２５℃、暗所で３週間静置培養後、その新鮮重を測定し、塩化カドミウム無添加で同様に培養した場合の新鮮重を１００として、その成長性を比較した。
【００８１】
結果を表３に示す。なお、表３中、ＭＣ７−ＢＹ２は、β‐グルクロニダーゼ遺伝子のプロモーターとして、３５Ｓプロモーターの代わりにＭＣ７プロモーター（Shirasawa-Seo N．et al．、Plant Cell Rep．、24:155、2005）が連結されている他は、pBI121と同様の構造を有する植物細胞用プラスミドが導入された、形質転換Ａ．チュメファシエンスEHA105（MC-7）を用いて、また、ＹＡＰ１−ＢＹ２は、ＣＤＲ１遺伝子又はＣＤＲ２遺伝子の代わりに、酵母より分離されたＹＡＰ１構造遺伝子が３５Ｓプロモーターの下流に連結されている他は、やはり、pBI121と同様の構造を有する植物細胞用プラスミドが導入された、形質転換Ａ．チュメファシエンスEHA105（YAP-1）を用いて、いずれも、上記形質転換タバコ培養細胞ＮｔＣＤＲ１−ＢＹ２及びＮｔＣＤＲ２−ＢＹ２の場合と同様にして、タバコ培養細胞を感染し、得られた形質転換タバコ培養細胞である。
【００８２】
【表３】
2007215513.tif 000004
【００８３】
表３より明らかなように、形質転換タバコ培養細胞ＮｔＣＤＲ１−ＢＹ２及びＮｔＣＤＲ２−ＢＹ２は、活性酸素ストレス耐性遺伝子が導入されていない形質転換タバコ培養細胞ＭＣ７−ＢＹ２と比べ、いずれも、塩化カドミウムを含む培地で培養した場合の生育阻害が少なく、実施例１と同様に、これらの形質転換体も、その染色体ＤＮＡ中に導入した活性酸素ストレス耐性遺伝子ＣＤＲ１又はＣＤＲ２の働きにより、重金属塩耐性を獲得していることが実証された。しかも、ＮｔＣＤＲ２−ＢＹ２は、塩化カドミウム５０μＭを含む培地で培養した場合に、活性酸素除去系において中心的な役割を果たすＹＡＰ１遺伝子が導入された、形質転換タバコ培養細胞ＹＡＰ１−ＢＹ２に匹敵する重金属塩耐性を示していた。
【配列表】
2007215513000001.app