(57)【要約】      （修正有）【課題】臨床応用可能なＡＲ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡの提供。【解決手段】ＡＲ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡであって、１９塩基対と２塩基の３’末端オーバーハングとからなる２１塩基の二本鎖ｓｉＲＮＡ、又は、２７塩基対からなるブラントエンドの二本鎖ｓｉＲＮＡであり、該１９塩基対の配列が、特定の配列であり、該２７塩基対の配列が、特定の配列である二本鎖ｓｉＲＮＡ。該二本鎖ｓｉＲＮＡは、オフターゲット効果及びインターフェロン応答を回避しつつ、ＡＲ遺伝子に特異的なＲＮＡｉを媒介できるため、例えば、臨床応用が可能であり、ＡＲを標的分子とした医療や医薬組成物の分野、例えば、前立腺癌を含む癌治療に関する治療や医薬組成物の分野で有用である。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンドロゲン受容体（ＡＲ）遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡであって、
１９塩基対と２塩基の３’末端オーバーハングとからなる２１塩基の二本鎖ｓｉＲＮＡ、又は、２７塩基対からなるブラントエンドの二本鎖ｓｉＲＮＡであり、
前記１９塩基対の配列が、配列表の配列番号１から３のいずれかであり、
前記２７塩基対の配列が、配列表の配列番号４又は５である二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項２】
前記３’末端オーバーハング部分の２塩基の配列が、ＴＴである請求項１記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項３】
前記配列表の配列番号１から５の配列において、１又は数個の塩基が修飾され、又は置換、付加若しくは欠失し、かつ、ＡＲ遺伝子特異的なＲＮＡ干渉を誘導する請求項１又は２に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項４】
ＡＲ特異的阻害剤であって、請求項１から３のいずれか一項に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡを含み、ＲＮＡ干渉によりＡＲ遺伝子の発現を特異的に阻害するＡＲ特異的阻害剤。
【請求項５】
癌治療用の医薬組成物であって、請求項１から３のいずれか一項に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡを含む医薬組成物。
【請求項６】
さらに、アテロコラーゲンを含む請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記癌が、前立腺癌である請求項５又は６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンドロゲン受容体（ＡＲ）遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌は、欧米では男性が罹患する最も頻度の高い癌である。日本においても、食生活の欧米化及び人口の高齢化に伴い、前立腺癌患者数が年々増加している。一般に前立腺癌細胞の増殖は、アンドロゲンにより刺激される。そのため、切除不能な進行前立腺癌の治療においては、アンドロゲンの産生及び機能を阻害するホルモン療法がしばしば行われる。その奏効率は、極めて高い。しかしながら、数年以内にアンドロゲン非依存性前立腺癌として再燃をきたす。したがって、前立腺癌治療においては、アンドロゲン非依存性癌の制御が最も重要な課題となる。
【０００３】
アンドロゲン依存性前立腺癌から非依存性癌への進行の詳細な分子メカニズムは明らかではないが、アンドロゲン受容体（ＡＲ）の関与が示唆されている。すなわち、アンドロゲン非依存性癌は、ＡＲの変異あるいは増幅により、超低濃度のアンドロゲン、抗アンドロゲン剤、その他のステロイドホルモンなどに感受性を示すことが明らかにされている（特許文献１、非特許文献１〜５参照）。また、数種類の増殖因子によるＡＲの活性化も報告されている（非特許文献６参照）。そこで、ＡＲ拮抗剤などによる前立腺癌の治療が試みられている（特許文献２参照）。
【０００４】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ＲＮＡｉ）技術は、生命科学研究に頻繁に利用され、その有用性は広く確認されている。ＲＮＡｉとは、二本鎖ＲＮＡによって、その配列特異的にｍＲＮＡが分解され、その結果遺伝子の発現が抑制される現象をいう。２００１年に２１塩基の低分子二本鎖ＲＮＡが哺乳動物細胞内でＲＮＡｉを媒介できることが報告されてより（非特許文献７参照）、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｃｅ  ＲＮＡ）は、標的遺伝子の発現抑制方法として頻用されている。また、より高いＲＮＡｉ効果を得るためのｓｉＲＮＡの配列選択基準についても報告されている（非特許文献８参照）。ＲＮＡｉ技術は、医薬品への応用や、癌を含む種々の難治性疾患の治療への応用が期待されている。
【０００５】
しかしながら、ｓｉＲＮＡを臨床応用する場合、インターフェロン応答の問題がある。すなわち、高濃度の合成ｓｉＲＮＡを細胞内に導入したり、細胞内において高濃度にｓｉＲＮＡを発現させたりすると、インターフェロン応答が誘導され非特異的な発現阻害や非特異的な細胞増殖阻害が起こる。現在では、１０ｎＭ以上の合成ｓｉＲＮＡを細胞内導入するとインターフェロン応答が誘導されることが知られている。
【０００６】
さらに、ｓｉＲＮＡを臨床応用する場合、オフターゲット効果の問題がある。すなわち、ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を抑制できる優れた技術ではあるが、標的遺伝子以外の類似標的配列を有する遺伝子の発現も抑制してしまう場合があることが明らかにされている（非特許文献９参照）。
【０００７】
これまでに、ＡＲ遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡであって、上述したインターフェロン応答やオフターゲット効果などの問題を回避できる臨床応用可能なｓｉＲＮＡは報告されていない。
【特許文献１】特開2004-57180号公報
【特許文献２】特開2003-252854号公報
【非特許文献１】Taplin MEら、「Mutation of the androgen-receptor gene in metastatic androgen-independent prostate cancer.」 N Engl J Med 332: 1393-1398, 1995.
【非特許文献２】Koivisto Pら、「Androgen receptor gene amplification: a possible molecular mechanism for androgen deprivation therapy failure in prostate cancer.」 Cancer Res 57: 314-319, 1997.
【非特許文献３】Gregory CWら、「Androgen receptor stabilization in recurrent prostate cancer is associated with hypersensitivity to low androgen.」Cancer Res 61: 2892-2898, 2001.
【非特許文献４】Zhao XYら、「Glucocorticoids can promote androgen-independent growth of prostate cancer cells through a mutated androgen receptor.」 Nat Med 6: 703-706, 2000.
【非特許文献５】Tan Jら、「Dehydroepiandrosterone activates mutant androgen receptors expressed in the androgen-dependent human prostate cancer xenograft CWR22 and LNCaP cells.」 Mol Endocrinol 11: 450-459, 1997.
【非特許文献６】Culig Zら、「Androgen receptor activation in prostatic tumor cell lines by insulin-like growth factor-I, keratinocyte growth factor, and epidermal growth factor.」 Cancer Res 54: 5474-5478, 1994.
【非特許文献７】Elbashir SMら、「Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.」 Nature 411 (6836): 494-498, 2001.
【非特許文献８】Reynolds Aら、「Rational siRNA design for RNA interference.」 Nat Biotechnol 22 (3): 326-330, 2004.
【非特許文献９】Jackson ALら、「Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.」 Nat Biotechnol 21 (6): 635-637, 2003.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明は、アンドロゲン受容体（ＡＲ）遺伝子を標的とする臨床応用可能なｓｉＲＮＡの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明のｓｉＲＮＡは、ＡＲ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡであって、１９塩基対と２塩基の３’末端オーバーハングとからなる２１塩基の二本鎖ｓｉＲＮＡ、又は、２７塩基対からなるブラントエンドの二本鎖ｓｉＲＮＡであり、前記１９塩基対の配列が、配列表の配列番号１から３のいずれかであり、前記２７塩基対の配列が、配列表の配列番号４又は５である二本鎖ｓｉＲＮＡである。なお、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、いずれも、ＡＲ遺伝子に特異的なＲＮＡｉを媒介するという共通の活性を共有し、かつ、この共通の活性に不可欠な重要な構造要素、すなわち、ＲＮＡｉを媒介するためのＡＲ遺伝子に対応する共通した重要な構造要素を共有する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明者らは、前立腺癌のアンドロゲン依存性から非依存性への進行におけるＡＲの役割に着目し、ＡＲ遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡについて鋭意研究を重ねた。その結果、１ｎＭという使用濃度であっても十分にＲＮＡｉ効果を発揮し、他の遺伝子にホモロジーを示さない二本鎖ｓｉＲＮＡを見出し、本発明に到達した。
【００１１】
本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡによれば、例えば、１ｎＭという低濃度であっても十分にＲＮＡｉ効果を発揮できるから、インターフェロン応答を回避して使用できる。また、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、他の遺伝子にホモロジーを示さない配列を標的配列として選択された配列であるから、ＡＲ遺伝子に特異的であり、オフターゲット効果を回避して使用できる。したがって、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、臨床応用可能であり、例えば、癌の治療、癌治療の医薬組成物、ＡＲ特異的阻害剤などに利用できる。なかでも、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡがＲＮＡｉ効果を発揮するＡＲ遺伝子は、前立腺癌における治療標的分子となりうるから、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、好ましくは、前立腺癌の治療や、前立腺癌の医薬組成物などに利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の２１塩基オーバーハング二本鎖ｓｉＲＮＡにおいて、前記３’末端オーバーハング部分の２塩基の配列は、ＴＴ（チミン・チミン）であることが好ましい。
【００１３】
本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、その他の態様として、前記配列表の配列番号１から５の配列において、１又は数個の塩基が修飾され、又は置換、付加若しくは欠失し、かつ、ＡＲ遺伝子特異的なＲＮＡ干渉を誘導する二本鎖ｓｉＲＮＡである。
【００１４】
本発明のＡＲ特異的阻害剤は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によりＡＲ遺伝子の発現を特異的に阻害するＡＲ特異的阻害剤であって、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡを含む。
【００１５】
本発明の医薬組成物は、癌治療用の医薬組成物であって、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡを含む医薬組成物である。本発明の医薬組成物は、さらに、アテロコラーゲンを含むことが好ましい。本発明の医薬組成物において、治療用途の対象となる癌は、特に制限されないが、例えば、前立腺癌であることが好ましい。
【００１６】
次に、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡについて詳しく説明する。
【００１７】
まず、本発明において、「アンドロゲン受容体（ＡＲ）遺伝子」とは、前述のとおり、前立腺癌への関与が知られている遺伝子であって、アンドロゲンの受容体（レセプター）をコードする遺伝子である。アンドロゲンとは、男性ホルモン作用を持つステロイドホルモンの総称であり、精巣で合成されるテストステロンや、副腎皮質で合成されるデヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオンなどが挙げられる。
【００１８】
本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡの標的となるＡＲ遺伝子としては、好ましくは、ヒトＡＲ遺伝子である。そのｍＲＮＡの配列は、例えば、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅデータベースの登録番号ＮＭ＿００００４４などから入手可能である。また、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡの標的となるＡＲ遺伝子は、一塩基多型（ＳＮＰ）、その他の多型、及び、変異体を含む。本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡの標的配列は、公知のＳＮＰの部位や、ＭｃＧｉｌｌのＡＲ遺伝子変異データベース（http://www.androgendb.mcgill.ca/）に登録されているＡＲ遺伝子の多型及び変異部位を含まないから、これらのＡＲ遺伝子の多型に対してもＲＮＡｉ効果を発揮できる。
【００１９】
本発明において、「ｓｉＲＮＡ」とは、ＲＮＡｉを媒介可能な短鎖のＲＮＡ分子であって、一般には、２１塩基〜２７塩基の二本鎖低分子ＲＮＡをいう。
【００２０】
本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、２つの態様があり、第１の態様が、１９塩基対と２塩基の３’末端オーバーハングとからなる３種類の２１塩基の二本鎖ｓｉＲＮＡであり、第２の態様が、２７塩基対からなる２種類のブラントエンドの二本鎖ｓｉＲＮＡである。前記１９塩基対及び前記２７塩基対の配列を、下記表１に示す。同表において、左欄が、それぞれのｓｉＲＮＡのコードネームであり、右欄が、ＳｅｑＩＤ、すなわち、配列表の配列番号である。
【００２１】
【表１】
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本発明の２１塩基オーバーハング二本鎖ｓｉＲＮＡにおいて、前記３’末端のオーバーハングとは、５’末端から１９ｍｅｒが相補的な配列である２本の２１ｍｅｒのＲＮＡ鎖が対合して二本鎖を形成したとき１９塩基対の両端から突出する３’末端の２ｍｅｒの部分をいう。前記３’末端オーバーハングの２塩基の配列は、例えば、両端とも、ＴＴ（チミン・チミン）が好ましい。なお、前記３’オーバーハングの２塩基の配列は、これに制限されず、ＲＮＡｉ効果や細胞増殖抑制効果に実質的に影響を及ぼさない範囲であれば、任意の天然核酸塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシシル）、並びに、天然及び人工の公知の修飾塩基であってもよい。また、前記３’末端オーバーハング部分のヌクレオチドは、通常、リボヌクレオチドを使用できるがこれに制限されず、ＲＮＡｉ効果や細胞増殖抑制効果に実質的に影響を及ぼさない範囲であれば、デオキシリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、その他の公知のヌクレオチド類似体を使用してもよい。さらに、本発明の２１塩基オーバーハング二本鎖ｓｉＲＮＡは、必要に応じて、前記３’末端オーバーハングに代えて、５’末端オーバーハングとしてもよい。
【００２２】
本発明の２１塩基オーバーハング二本鎖ｓｉＲＮＡの１９塩基対の配列は、上記表１に記載のとおり、ＡＲ１、ＡＲ２４及びＡＲ６１（それぞれ、配列表の配列番号１〜３）の３種類が使用できるが、好ましくは、ＡＲ１である。
【００２３】
本発明の２７塩基ブラントエンド二本鎖ｓｉＲＮＡは、２７ｍｅｒの相補的な２本のＲＮＡ鎖が対合して形成した二本鎖であるから、その末端は平滑である。本発明の２７塩基ブラントエンド二本鎖ｓｉＲＮＡの２７塩基対の配列は、上記表１に記載のとおり、ＡＲ１１６９及びＡＲ４２５７（それぞれ、配列表の配列番号４及び５）が使用できるが、好ましくは、ＡＲ４２５７である。
【００２４】
本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡの塩基対部分の配列（配列表の配列番号１〜５）は、ＡＲ遺伝子特異的なＲＮＡｉを誘導できる範囲において、１又は数個の塩基が修飾され、又は置換、付加若しくは欠失したものであってもよい。前記数個とは、例えば、２、３、４個である。
【００２５】
本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡの製造方法は、インビトロで化学的又は酵素的に合成しても、又は、インビボで合成してもよく、その製法は特に制限されないが、なかでも、従来公知の方法により化学合成して製造することが好ましい。合成二本鎖ｓｉＲＮＡであれば、濃度調節が容易となり臨床応用に際してインターフェロン応答の回避が容易となる。また、コンタミネーションの防止が容易であり安全性においても利点がある。例えば、本発明の２１塩基オーバーハング二本鎖ｓｉＲＮＡのＡＲ１を製造する場合、まず、配列表の配列番号１の配列の３’末端に２塩基のオーバーハングを加えた２１ｍｅｒのＲＮＡ鎖、及び、前記配列番号１の配列の相補配列の３’末端に２塩基のオーバーハングを加えた２１ｍｅｒのＲＮＡ鎖をそれぞれ化学合成する。次に、前記２本のＲＮＡ鎖が対合する条件で対合させ、本発明の２１塩基のオーバーハング二本鎖ｓｉＲＮＡを得る。使用に際しては、必要に応じて、従来公知の方法により適宜精製することが好ましい。
【００２６】
したがって、本発明は、その他の態様として、二本鎖ｓｉＲＮＡの製造方法であって、前記二本鎖ｓｉＲＮＡが、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡであり、配列表の配列番号１〜３のいずれかの配列及びその相補配列にそれぞれ２塩基のオーバーハングを加えた２本のＲＮＡ鎖、又は、配列表の配列番号４若しくは５の配列及びその相補配列の２本のＲＮＡ鎖を合成する合成工程と、合成した前記２本のＲＮＡ鎖を対合して二本鎖ＲＮＡとする対合工程とを含む製造方法を含む。
【００２７】
次に、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡの使用方法について説明する。本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ効果によるＡＲ遺伝子の発現抑制に使用することができる。本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、一種類でもＲＮＡｉ効果を発揮する。また、より高いＲＮＡｉ効果を得るために複数種類の本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡを混合して使用してもよい。前記混合としては、例えば、前記ＡＲ１、ＡＲ２４及びＡＲ６１の２１塩基オーバーハング二本鎖ｓｉＲＮＡ、並びに、前記ＡＲ１１６９及びＡＲ４２５７の２７塩基ブラントエンド二本鎖ｓｉＲＮＡからなる群から選択される２種類、３種類、４種類、５種類を含む混合が挙げられ、また、前記ＡＲ４２５７及び前記ＡＲ１を含む混合が挙げられる。
【００２８】
本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、インビトロにおいて細胞や組織に対して使用できることに加えて、ヒトに対して臨床応用可能である。ヒトへの投与方法は、特に制限されず、適宜、従来公知のデリバリーシステムを利用できる。例えば、アテロコラーゲンを用いた局所投与法、全身投与法が好ましい。前記アテロコラーゲンは、例えば、局所止血剤として既に臨床応用されており、また、前記アテロコラーゲンを用いたｓｉＲＮＡの局所投与法は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を分子標的とした動物実験でその有意性が示されている（Ｔａｋｅｉ  Ｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４（１０）：３３６５−３３７０、２００４）。
【００２９】
また、その他のデリバリーシステムとして、生体内での分解を防ぎ、細胞内透過性を高めるための化学修飾（Ｒｏｓｓｉ  ＪＪ．、Ｎａｔｕｒｅ  ４３２（７０１４）：１５５−１５６、２００４；  Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ  Ｊら、Ｎａｔｕｒｅ  ４３２（７０１４）：１７３−１７８、２００４）やカチオニックリポソーム（Ｙａｎｏ  Ｊら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０（２２）：７７２１−７７２６、２００４）を用いたデリバリーシステムを利用しても良い。さらに、必要に応じて、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡを発現するｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築し、遺伝子治療技術を利用したデリバリーシステムを利用することもできる。
【００３０】
本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、とりわけ、前立腺癌の治療や、前立腺癌の治療の用途に使用する医薬組成物に使用することが好ましい。すなわち、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡを使用してＲＮＡｉ効果によりＡＲ遺伝子の発現を阻害することで、前立腺癌細胞の細胞増殖を抑制できる。本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡによれば、アンドロゲン依存性及び非依存性双方の前立腺癌を治療できる。
【００３１】
なお、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、前立腺癌に限られず、例えば、ＡＲが関与する乳癌、唾液腺癌、頭頸部扁平上皮癌、腎臓癌、膀胱癌、胃癌、大腸癌、精巣癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌などの癌治療一般や、癌治療に使用する医薬組成物一般に使用できる。
【００３２】
前述したとおり、従来、ｓｉＲＮＡを臨床応用する上で大きな問題が２つあった。すなわち、インターフェロン応答が誘導される問題と、オフターゲット効果の問題である。前記インターフェロン応答を回避するには、細胞内導入濃度を少なくとも１０ｎＭ未満とする必要があるが、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、１ｎＭという超低濃度でＡＲ遺伝子に対して十分なＲＮＡｉ効果を発揮することができる。また、前記オフターゲット効果についても、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡの標的配列として、ＢＬＡＳＴサーチを駆使して、３塩基以下のミスマッチを有する遺伝子が存在しないもの、あるいは、交叉反応の可能性を有する遺伝子数が最小のものを選択することでオフターゲット効果を回避可能とした。このように、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、臨床応用における大きな２つの障壁をクリアしており、臨床応用可能である。なお、臨床応用においては、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、合成二本鎖ｓｉＲＮＡであることが好ましい。
【００３３】
したがって、本発明は、その他の態様として、ＲＮＡ干渉によりＡＲ遺伝子の発現を特異的に阻害するＡＲ特異的阻害剤であって、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡを含むＡＲ特異的阻害剤を含む。含有される本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、一種類であってもよく、複数種類であってもよい。複数種類であれば、より高い阻害効果を得ることができる。前記複数種類としては、例えば、前記ＡＲ１、ＡＲ２４、ＡＲ６１、ＡＲ１１６９及びＡＲ４２５７からなる群から選択される２種類、３種類、４種類、５種類が挙げられる。本発明のＡＲ特異的阻害剤は、細胞内のＡＲ遺伝子の発現を特異的にノックダウンする用途に、インビトロ及びインビボで使用できる。その剤形は、特に制限されない。
【００３４】
さらに、本発明は、その他の態様として、癌、好ましくは、前立腺癌の治療方法であって、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡを使用することを含む癌の治療方法を含む。また、さらにその他の態様として、本発明は、癌、好ましくは、前立腺癌の治療における二本鎖ｓｉＲＮＡの使用であって、前記二本鎖ｓｉＲＮＡが、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡである使用を含む。これらの使用における発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、一種類であってもよく、複数種類であってもよい。複数種類であれば、より高い治療効果を得ることができる。前記複数種類としては、例えば、前記ＡＲ１、ＡＲ２４、ＡＲ６１、ＡＲ１１６９及びＡＲ４２５７からなる群から選択される２種類、３種類、４種類、５種類が挙げられる。
【００３５】
次に、本発明の医薬組成物について説明する。本発明の医薬組成物は、癌治療用の医薬組成物であって、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡを含むものである。含有される本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、一種類であってもよく、複数種類であってもよい。複数種類であれば、より高い治療効果を得ることができる。前記複数種類としては、例えば、前記ＡＲ１、ＡＲ２４、ＡＲ６１、ＡＲ１１６９及びＡＲ４２５７からなる群から選択される２種類、３種類、４種類、５種類が挙げられる。本発明の医薬組成物は、さらに、アテロコラーゲンを含むことが好ましい。上述のとおり、本発明の医薬組成物の治療用途の対象となる癌は、特に制限されないが、前立腺癌であることが好ましい。
【００３６】
本発明の医薬組成物は、さらに、薬学的に許容されるキャリアを含んでもよい。前記薬学的キャリアとしては、特に制限されないが、例えば、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡが、標的の部位、組織、細胞などに侵入する効率を高めることができるキャリア、例えば、リポソーム、カチオンリポソームなどが挙げられる。本発明の医薬組成物の剤形は、特に制限されず、例えば、注射剤、クリーム剤、軟膏、錠剤、懸濁剤などが挙げられる。また、投与方法も特に制限されず、例えば、注射、経口、局所、鼻内、直腸投与などが挙げられる。
【００３７】
以下に、本発明を、実施例を用いて説明する。
【実施例１】
【００３８】
前記表１の３種類の２１塩基オーバーハング二本鎖ｓｉＲＮＡ（ＡＲ１、ＡＲ２４及びＡＲ６１；それぞれ、配列表の配列番号１〜３）と、２種類の２７塩基ブラントエンド二本鎖ｓｉＲＮＡ（ＡＲ１１６９及びＡＲ４２５７；それぞれ、配列表の配列番号４又は５）の５種類の二本鎖ｓｉＲＮＡを合成して調製し、それぞれの合成二本鎖ｓｉＲＮＡについて、１ｎＭの濃度で使用した場合のＡＲ遺伝子に対するＲＮＡｉ効果及び細胞増殖抑制効果を確認した。具体的には、以下のようにして行った。
【００３９】
合成二本鎖ｓｉＲＮＡの調製
前記３種類の２１塩基オーバーハング二本鎖ｓｉＲＮＡ（ＡＲ１、ＡＲ２４及びＡＲ６１）は、配列表の配列番号１〜３の１９塩基の配列及びその相補配列それぞれの３’末端にＴＴ配列からなる２塩基オーバーハング部分を加えたＲＮＡ鎖を、定法により化学合成し、それらを対合させて調製した。また、前記２種類の２７塩基ブラントエンド二本鎖ｓｉＲＮＡ（ＡＲ１１６９及びＡＲ４２５７）は、配列表の配列番号４又は５の配列及びその相補配列のＲＮＡ鎖を定法により化学合成し、それらを対合させて調製した。以下のＲＮＡｉ効果及び細胞増殖抑制効果の確認に際しては、適宜、ＨＰＬＣなどで精製したものを使用した。
【００４０】
細胞及び培養法
ＲＮＡｉ効果の確認には、ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ細胞を用いた。前記細胞の培養には、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．２５ｍｇ／ｍｌアンホテリシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を増殖培養液として用い、空気中に５％の割合で炭酸ガスを含む培養器内で、３７℃で行った。
【００４１】
合成二本鎖ｓｉＲＮＡの細胞内導入
６０ｍｍ径プラスチックペトリ皿（商標：Ｆａｌｃｏｎ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に、８×１０5個の前記ＬＮＣａＰ細胞を植え込み、２４時間培養後Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて２回洗浄し、１ｎＭの合成二本鎖ｓｉＲＮＡを含むＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）溶液を加えた。５時間後１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに培地交換した。
【００４２】
ウエスタンブロッティング法
合成二本鎖ｓｉＲＮＡを上述のとおり導入して４８時間培養した後に、細胞をＣｅｌＬｙｔｉｃ  Ｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて可溶化した。前記可溶化試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動）にて展開し、Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて、２時間ＰＤＶＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｕｏｅｉｄｅ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に転写した。転写後は、５％スキムミルク（和光純薬社製）を含むＴ−ＴＢＳ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）にて４℃、１晩ブロッキングした。さらに、一次抗体をブロッキング溶液にて希釈し、室温にて１時間反応させ、前記Ｔ−ＴＢＳ溶液にて３回洗浄後、二次抗体を同様に１時間反応させた。ＥＣＬｐｌｕｓキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）にて発色させた後、ＬＡＳ３０００（富士フィルム社製）を用いてデジタル画像化した。
【００４３】
細胞増殖評価法
前記ＬＮＣａＰ細胞に前記合成二本鎖ｓｉＲＮＡを導入した細胞を、６ウェルマイクロプレート（商標：Ｆａｌｃｏｎ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に５×１０4個植え込み、４日間培養した後、０．０５％トリプシン−０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて細胞を回収し、Ｚ１  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いて細胞数を計測した。
【００４４】
ＲＮＡｉ効果についての結果
前記５種類の合成二本鎖ｓｉＲＮＡを前記培養ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰに導入し、上述のとおり、ＲＮＡｉ効果をＡＲタンパク質の発現レベル(ウエスタンブロット)で評価した。その結果、前記５種類の全ての合成二本鎖ｓｉＲＮＡが、１ｎＭの濃度で標的ＡＲ遺伝子の発現を有意に抑制することが確認された。その結果の一例を図１に示す。同図において、一番左のレーンは、ＧＦＰ遺伝子に対する合成二本鎖ｓｉＲＮＡ（２１塩基オーバーハング）を導入した場合のコントロールである。同図に示すとおり、前記５種類の中でも、ＡＲ１、ＡＲ６１、ＡＲ１１６９及びＡＲ４２５７の４種類の合成二本鎖ｓｉＲＮＡは、８０％以上の顕著なＲＮＡｉ効果を示した。
【００４５】
細胞増殖抑制効果についての結果
前記５種類の合成二本鎖ｓｉＲＮＡを前記培養ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰに導入し、上述のとおり細胞増殖抑制効果を評価した。その結果、前記５種類の全ての合成二本鎖ｓｉＲＮＡが、１ｎＭの濃度で前記前立腺癌細胞の増殖を有意に抑制することが確認された。その結果の一例を図２に示す。同図において、ＧＦＰ１９は、ＧＦＰ遺伝子を標的とした２１塩基オーバーハングｓｉＲＮＡを導入した場合のコントロールであり、ＧＦＰ２７は、ＧＦＰ遺伝子を標的とした２７塩基ブラントエンドｓｉＲＮＡを導入した場合のコントロールである。また、同図において、縦軸は細胞数を示す。同図に示すとおり、前記５種類の中でも、ＡＲ４２５７の合成二本鎖ｓｉＲＮＡは、７０％以上の顕著な前立腺癌細胞の増殖抑制効果を示した。
【００４６】
上述のとおり、前記５種類の合成二本鎖ｓｉＲＮＡは、１ｎＭという超低濃度でも、有意なＡＲ遺伝子を標的としたＲＮＡｉ効果示し、かつ、前立腺癌細胞の増殖抑制効果を示した。そのなかでも、ＡＲ４２５７は、とりわけ優れたＲＮＡｉ効果及び細胞増殖抑制効果を示した。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
以上説明したとおり、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、オフターゲット効果及びインターフェロン応答を回避しつつ、ＡＲ遺伝子特異的なＲＮＡｉを媒介できるから、例えば、臨床応用が可能であり、ＡＲを標的分子とした医療や医薬組成物の分野、例えば、前立腺癌を含む癌治療に関する治療や医薬組成物の分野で有用である。その他、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、例えば、学術及び基礎医学的研究開発分野においても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡのＡＲ遺伝子を標的としたＲＮＡｉ効果をウエスタンブロットで確認した結果の一例である。
【図２】図２は、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡの細胞増殖抑制効果を確認した結果の一例である。
【配列表フリーテキスト】
【００４９】
配列番号１  オーバーハングｓｉＲＮＡ  ＡＲ１
配列番号２  オーバーハングｓｉＲＮＡ  ＡＲ２４
配列番号３  オーバーハングｓｉＲＮＡ  ＡＲ６１
配列番号４  ブラントエンドｓｉＲＮＡ  ＡＲ１１６９
配列番号５  ブラントエンドｓｉＲＮＡ  ＡＲ４２５７
【図１】
2007215481.tif 000004
【図２】
2007215481.tif 000005
【配列表】
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