(57)【要約】【課題】  本発明は、タンパク質分泌・輸送機構に関与する分泌・輸送機構関連タンパク質の同定・機能解析方法を提供することを目的とする。【解決手段】  本発明のタンパク質分泌・輸送機構に関与する分泌・輸送機構関連タンパク質の同定・機能解析方法は、  （ａ）分泌・輸送機構関連タンパク質をコードする遺伝子を含む一群の対象遺伝子の塩基配列情報、あるいは分泌・輸送機構関連タンパク質を含む一群の対象タンパク質のアミノ酸配列情報に基づいて、前記対象遺伝子及び／又は対象タンパク質の機能を阻害する阻害物質を調製し、そして  （ｂ）前記阻害物質を、前記対象タンパク質を発現する細胞に導入し、当該細胞の表現型の変化に基づいて前記分泌・輸送機構関連タンパク質を同定・機能解析する工程を含むことを特徴とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質分泌・輸送機構に関与する分泌・輸送機構関連タンパク質の同定・機能解析方法であって、
（ａ）小胞体の構造及び／または機能に関与する一群の小胞体関連タンパク質をコードする一群の対象遺伝子の塩基配列情報、あるいは小胞体の構造及び／または機能に関与する一群の小胞体関連タンパク質（対象タンパク質）のアミノ酸配列情報に基づいて、前記対象遺伝子及び／又は対象タンパク質の機能を阻害する阻害物質を調製し、そして
（ｂ）前記阻害物質を、前記対象タンパク質を発現する細胞に導入し、当該細胞の表現型の変化に基づいて前記分泌・輸送機構関連タンパク質を同定・機能解析する
工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記阻害物質が以下のものから選択される、請求項１又は２に記載の方法
１）遺伝子プロモータのリプレッサー及びアクチベーター阻害因子からなるグループから選択される、転写レベルでの発現阻害物質；
２）リボザイム、アンチセンスＲＮＡ前駆体、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡからなるグループから選択される、翻訳レベルでの発現阻害物質；あるいは
３）抗体及び低分子化合物からなるグループから選択される、タンパク質レベルでの発現阻害物質。
【請求項３】
前記阻害物質が核酸である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記阻害物質が、前記対象遺伝子を標的遺伝子としてＲＮＡ干渉を生じさせるＲＮＡ干渉核酸である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記（ａ）阻害物質を調製する工程は、ＲＮＡ干渉核酸を選択する工程を含み、当該ＲＮＡ干渉核酸選択工程では、前記標的遺伝子たる対象タンパク質のコード遺伝子の塩基配列情報中から取得される下記（１）〜（５）の規則に従う規定配列と同一の塩基配列を含むＲＮＡ干渉核酸を選択する、請求項４に記載の方法。
（１）  ３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルであり；
（２）  ５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンであり；
（３）  ３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからな
る群より選ばれる一種または二種以上の塩基がリッチであり；
（４）  塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数であり；
（５）  前記阻害物質が導入される細胞の全遺伝子の塩基配列のうち、前記標的遺伝子以外の他の遺伝子の塩基配列中に、前記規定配列と９０％以上の同一性を有する配列が含まれない。
【請求項６】
タンパク質分泌・輸送機構に関与する分泌・輸送機構関連タンパク質の同定・機能解析に用いるＲＮＡ干渉核酸であって、小胞体の構造及び／または機能に関与する一群の小胞体関連タンパク質をコードする一群の対象遺伝子を標的遺伝子とし、当該標的遺伝子の塩基配列中に含まれる下記（１）〜（５）の規則に従う規定配列と同一の塩基配列を含むセンス鎖と、当該センス鎖に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖とが二重鎖を形成して構成されることを特徴とする、ＲＮＡ干渉核酸。
（１）  ３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルであり；
（２）  ５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンであり；
（３）  ３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからな
る群より選ばれる一種または二種以上の塩基がリッチであり；
（４）  塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数であり；
（５）  当該ＲＮＡ干渉核酸が導入される細胞の全遺伝子の塩基配列のうち、前記標的遺伝子以外の他の遺伝子の塩基配列中に、当該記規定配列と９０％以上の同一性を有する配列が含まれない。
【請求項７】
図１に示す小胞体関連タンパク質をコードする遺伝子を前記標的遺伝子とする、請求項６に記載のＲＮＡ干渉核酸。
【請求項８】
前記センス鎖および前記アンチセンス鎖が、図１に示す配列番号７−９９、あるいは、配列番号１００−１９２の塩基配列のいずれかを有する、請求項７に記載のＲＮＡ干渉核酸。
【請求項９】
前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の二重鎖領域における少なくとも一方の鎖が、ＲＮＡとＤＮＡとからなり、当該一方の鎖の上流側９〜１３ヌクレオチドがＲＮＡである、請求項６〜８のいずれか一項に記載のＲＮＡ干渉核酸。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか一項に記載のＲＮＡ干渉核酸を含むことを特徴とする、タンパク質分泌・輸送機構に関与する分泌・輸送機構関連タンパク質の同定・機能解析用キット。
【請求項１１】
下記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の分泌・輸送機構関連タンパク質；
（１）配列番号１記載のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（２）配列番号１記載のアミノ酸配列において一または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、分泌・輸送機構に関与する生物学的機能を奏するタンパク質；
（３）配列番号２記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質；並びに
（４）配列番号２記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列において一または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、分泌・輸送機構に関与する生物学的機能を奏するタンパク質。
【請求項１２】
下記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の分泌・輸送機構関連タンパク質；
（１）配列番号３記載のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（２）配列番号３記載のアミノ酸配列において一または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、分泌・輸送機構に関与する生物学的機能を奏するタンパク質；
（３）配列番号４記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質；並びに
（４）配列番号４記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列において一または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、分泌・輸送機構に関与する生物学的機能を奏するタンパク質。
【請求項１３】
下記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の分泌・輸送機構関連タンパク質；
（１）配列番号５記載のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（２）配列番号５記載のアミノ酸配列において一または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、分泌・輸送機構に関与する生物学的機能を奏するタンパク質；
（３）配列番号６記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質；並びに
（４）配列番号６記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列において一または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、分泌・輸送機構に関与する生物学的機能を奏するタンパク質。
【請求項１４】
図２に示す９種類の小胞体関連タンパク質の機能阻害を抑制することを含む、タンパク質分泌・輸送機構の制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞外へのタンパク質分泌・輸送機構（以下、単なるタンパク質分泌・輸送機構あるいはタンパク質分泌系と呼ぶことがある）に関与する分泌・輸送機構関連タンパク質、ならびにこれらの同定・機能解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞の膜系タンパク質や分泌系タンパク質は、小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ; 以下、ＥＲと表記する場合がある）で生合成された後、膜小胞に包まれてゴルジ体に輸送される。そして、ゴルジ体において糖鎖の付加やジスルフィド結合等の修飾を受け、その後、機能を発現する目的地（具体的には細胞外やオルガネラ）に輸送される。これらのタンパク質が目的地で確実に機能を発現するためには、分泌するタンパク質の選別、膜小胞への包み込み、当該膜小胞の目的地への輸送等が適切に制御される必要がある。言い換えると、タンパク質の分泌には、輸送される分泌系タンパク質（これをカーゴタンパク質と呼ぶことがある）の成熟化制御と、輸送等を担う膜系タンパク質の制御とが密接に絡み合い、これらが統合されて機能する必要がある。このように、タンパク質分泌は、極めて複雑な分子機構を必要とする。以下においては、このような分子機構を、タンパク質分泌・輸送機構と呼ぶ。タンパク質分泌・輸送機構には種々の分子が関与するが、ここでは当該分子のうち、特に、タンパク質分泌・輸送機構に関与するタンパク質について説明する。
【０００３】
以下においては、生合成され、小胞体の機能による成熟化を受け、最終目的地に運ばれるタンパク質を、「カーゴ分泌系タンパク質」と呼び、「膜系タンパク質」と区別する。「カーゴ分泌系タンパク質」は、小胞体からゴルジ体に排出されてその後に細胞外やオルガネラ等の目的地に分泌されるタンパク質であり、言い換えれば、小胞体で処理される全てのタンパク質（折畳まれていないもの、Ｎ型糖鎖を含む）である。また、「膜系タンパク質」とは、内膜系に局在するタンパク質である。ここでは特に、内膜系の一種である小胞体に関連する膜系タンパク質を、「小胞体関連タンパク質」と呼ぶ。小胞体関連タンパク質は、カーゴ分泌系タンパク質が有さない小胞体残留シグナル（具体的には、「ＫＤＥＬ」、「ＨＤＥＬ」など）を有しており、当該シグナルによって、小胞体関連タンパク質がカーゴ分泌系タンパク質とは異なる挙動を示す（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
小胞体は、真核細胞の細胞質内に広がる細胞内膜系の一種であり、膜系タンパク質で構成される膜経路と、当該膜経路で囲まれた閉塞空間である管腔経路とを有する。小胞体膜の表面ではタンパク質が機能的に発現しており、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）受容体、トランスロコン（Ｔｔｒａｎｓｌｏｃｏｎ；いわゆる小胞体の「タンパク質輸送チャンネル」または「タンパク質透過チャンネル」）、シグナルペプチダーゼ等が存在する。そして、これらのタンパク質の機能によって、分泌系タンパク質の膜透過、シグナル鎖の切断、オリゴ糖トランスフェラーゼによるＮ結合型糖鎖の付加等が行われて品質管理やトランスロケーションが実現される。
【０００５】
小胞体の機能について説明すると、例えば、リボソームで合成された分泌系タンパク質は、小胞体において折り畳まれて立体構造（高次構造）を形成する。このような立体構造の形成は、フォールディング（ｆｏｌｄｉｎｇ）と呼ばれる。立体構造を形成したタンパク質のうち、正しく折り畳まれた（すなわち「フォールド（ｆｏｌｄ）」された）ものが、小胞体から輸送小胞として出芽しゴルジ体に到達する。一方、折り畳みに失敗して正しい構造が形成されなかったもの（すなわち「ミスフォールド（ｍｉｓｆｏｌｄ）」した異常タンパク質）は、小胞体に停留し管腔経路内に蓄積する。小胞体では、ミスフォールドした異常タンパク質が蓄積すると、小胞体では、１）小胞体内のシャペロンタンパク質により正しい立体構造が改めて形成されるようにフォールディングに関与する分子の誘導を行う（これを「ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ；  ＵＰＲ」と呼ぶ）か、２）タンパク質の翻訳を停止させるか、３）異常タンパク質を細胞質に排出してユビキチン・プロテアソーム系により分解する（これを「ＥＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ; ＥＲＡＤ」と呼ぶ）、のいずれかの反応が生じ、異常タンパク質の蓄積による小胞体の負荷の低減化が図られる。このように、小胞体には、正常なタンパク質と異常なタンパク質とを識別し適宜適切に処置する機構が存在している。当該機構は、小胞体におけるタンパク質の品質管理機構（いわゆる「ＥＲ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｙｓｔｅｍ」）と呼ばれる（例えば、非特許文献２参照）。
【０００６】
例えば、細胞が過度な小胞体ストレスを受けると、タンパク質分泌・輸送機構に制御不全が生じる。それにより、小胞体で生合成されるタンパク質の多くはミスフォールドし、場合によってはこれらが凝集する。また、遺伝子疾患などでタンパク質のアミノ酸配列に異常が生じる場合にも、当該異常の為に正しくフォールドできないことがある。これらの場合、このようにミスフォールドした異常タンパク質が小胞体に顕著に蓄積すると、小胞体において上記１）〜３）の品質管理機構が充分に機能せず、その結果、細胞はアポトーシス（細胞死）する。特に、近年では、立体構造の変化により生じる異常タンパク質に起因したいわゆる「コンフォメーション疾患」（または「フォールディング疾患」）の概念が提唱されており、具体的には、神経変性疾患と小胞体ストレスとの関係が注目されている。神経変性疾患としては、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病（具体的例としてハンチントン病等）、家族性筋萎縮性側索硬化症、多系統萎縮症、プリオンタンパク質の蓄積が関与する疾患等が挙げられる（例えば、非特許文献３および非特許文献４参照）。小胞体におけるタンパク質の立体構造形成機構や品質管理機構を解明することは、これらの疾患の予防、治療等においても有効である。また、小胞体におけるこられの機構を医療分野へ応用する発明に関し種々の出願がされている（例えば、特許文献１〜特許文献４参照）。
【０００７】
タンパク質分泌に関与する分子機構は、相互に関連する複数の機能単位からなり、かかる分子機構については、例えば、７０年代後半から米国でＲ．Ｓｈｅｃｋｍａｎが、分泌に関与するタンパク質をコードする遺伝子の研究を開始した。当該研究では、タンパク質の分泌異常を生じたパン酵母（Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａ）の変異株を正常に戻す遺伝子を探索し、その結果から、タンパク質の分泌（具体的には、輸送）に関与する分子を網羅的に解明している（例えば、非特許文献５参照）。当該研究で解明されたタンパク質分泌の基本となる分子機構は、酵母のような下等真核生物から哺乳類のような高等真核生物までの間で良好に保存されており、それゆえ、現在に至るまで、遺伝子産物（タンパク質）の分子レベルで貴重な知見をもたらしている。
【０００８】
しかしながら、タンパク質分泌の分子機構については、未だに解明されていない部分が多く残されており、特に、タンパク質の立体構造形成と小胞体からの輸送との関連については、更なる解明が望まれている。また、タンパク質の生合成、成熟、および輸送に重要な役割を果たす小胞体に関しては、物理的に不安定な小胞体の網状構造の保持を可能にする機構についてほとんど解明されておらず、小胞体の構造異常がタンパク質分泌・輸送機構に悪影響を及ぼす可能性を鑑みると、小胞体自体の構造およびそれを実現する為の分子機構についても解明が望まれる。
【０００９】
タンパク質分泌・輸送機構について未解明な部分が多く残る一因として、種属間、具体的には下等真核生物と高等真核生物との間における分子機構の相違が挙げられる。例えば、前述の小胞体における品質管理機構は、パン酵母から哺乳類に至る真核細胞に普遍的に存在するが、当該機構を構成する反応にはこれらの種間で相違を有する。具体的に、哺乳類の小胞体品質管理機構では、カルネキシン（以下、ＣＮＸと略す）／カルレティキュリン（以下、ＣＲＴ略す）によるモノグルコシル化糖鎖の認識が行われ、ＣＮＸ／ＣＲＴがいわゆる糖鎖依存的な分子シャペロンとして機能して高次構造不全糖タンパク質の凝集を防ぐとともに正常な高次構造の獲得を促進する。このようなＣＮＸ／ＣＲＴで実現される反応系は、カルネキシンサイクルと呼ばれる。一方、パン酵母の小胞体品質管理機構では、ＣＮＸのオルソログにモノグルコシル糖鎖を認識する能力がなく、哺乳類のようなカルネキシンサイクルは存在しない。また、哺乳類では、小胞体における品質管理機構のＥＲＡＤにより分解されるタンパク質が細胞質に排出され、当該タンパク質の糖鎖部分がＦｂｓ１／２（Ｆｂｘ２とそのパラログ）と呼ばれるユビキチンリガーゼによって認識されるとともに、プロテアソームによる分解の認識タグであるユビキチン化が起こるが、一方、下等真核細胞では、この経路に関する明確なオルソログが見当たらない（非特許文献６および非特許文献７）。さらに、小胞体自体の構造についても、パン酵母と哺乳類とでは大きく異なっている。このように、種属間における分子機構の相違が存在していることから、前述のパン酵母の研究結果およびそれから取得される知見以外に、個々の種についてそれぞれ解析を行うことが望ましい。特に、哺乳類のタンパク質分泌・輸送機構に関与する分子の解明は、前述のコンフォメーション疾患との関連から、創薬等につながる知見を与えるので有効である。これまでのところ、上記のパン酵母変異体解析以外に、哺乳類細胞核オルガネラでのプロテオミックな解析が進行しているが（例えば、非特許文献８参照）、充分な解析結果が得られていない。
【特許文献１】特表２００２−５２８４１２号
【特許文献２】特開２００４−８１１４３号
【特許文献３】特開２００５−６５６９２号
【特許文献４】特開２００５−２０４５１６号
【非特許文献１】Ｍｕｎｒｏ，Ｓ．：Ｃｅｌｌ  ４８，８９９（１９８７）
【非特許文献２】Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｙ．：Ｎｅｕｒｏｎ  ２９，１５−３２（２００１）
【非特許文献３】Ｒａｏ，Ｒ．Ｖ  ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，３３８６９−３３８７４（２００１）
【非特許文献４】Ｉｍａｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．：Ｃｅｌｌ  １０５，８９１−９０２（２００１）
【非特許文献５】Ｎｏｖｉｃｋ，Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．：Ｃｅｌｌ  ２１，２０５−２１５（１９８０）
【非特許文献６】Ｓｐｉｒｏ ＲＧ：  Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６１，１０２５−１０４１（２００４）
【非特許文献７】Ｈｅｌｅｎｉｕｓ  Ａ，Ａｅｂｉ  Ｍ  ：Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７３，１０１９−１０４９（２００４）
【非特許文献８】Ｙａｔｅｓ  ＩＩＩ  ｅｔ  ａｌ．：Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，６（９），（２００５）
【非特許文献９】Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＤＮＡ  Ｒｅｓ．  ３  （５），  ３１１−３２０  （１９９６）
【非特許文献１０】Ｋａｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２７２，  ２４５７２−２４５７８，  （１９９７）
【非特許文献１１】Ｈｕａ，Ｘ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ８７  （３），  ４１５−４２６  （１９９６）
【非特許文献１２】Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ａ．  Ｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｈｅｌｌｅ  Ａ．  Ｐｏｉｒｉｅｒ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．  ６（１１）  ｐｐ８９１−８９８  （２００５）
【非特許文献１３】Ｂｒｉｄｇｅｓ  ＪＰ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，  ２７８（５２），  ｐｐ．５２７３９−５２７４６  （２００３）
【非特許文献１４】Ｂａｎｎｏ  Ｔ，  Ｋｏｈｎｏ  Ｋ．  Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．，  Ｊｕｎ  ３；３６９（３）：４６２−７１  （１９９６）
【非特許文献１５】Ｆｌｏｒｅｓ−Ｄｉａｚ  ＭＪ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，  ２７９（２１）：２１７２４−３１  （２００４）
【非特許文献１６】Ｔｏｙｏｆｕｋｕ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，  Ｏｃｔ；１５（１２）：２１４９−６１  （２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、タンパク質分泌・輸送機構に関与する分泌・輸送機構関連タンパク質、ならびにこれらの同定・機能解析方法を提供することを目的する。特に、タンパク質分泌・輸送機構に関与するタンパク質として、小胞体構造自体および／または小胞体の機能に関与するタンパク質を同定・機能解析の対象とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、タンパク質分泌機能の探求において、タンパク質分泌・輸送機構には特に小胞体が深く関与していることに着目した。そして、小胞体の構造および／または機能に関与するタンパク質（すなわち小胞体関連タンパク質）がタンパク質分泌・輸送機構の一端を担うとの知見の下、種々の小胞体関連タンパク質について網羅的に発現阻害実験を行いこの時の表現型解析を行った。そして、鋭意検討の結果、以下の本発明に至った。
【００１２】
本発明は、以下の態様１−１４を含む。
態様１：  タンパク質分泌・輸送機構に関与する分泌・輸送機構関連タンパク質の同定・機能解析方法であって、
（ａ）小胞体の構造及び／または機能に関与する一群の小胞体関連タンパク質をコードする一群の対象遺伝子の塩基配列情報、あるいは小胞体の構造及び／または機能に関与する一群の小胞体関連タンパク質（対象タンパク質）のアミノ酸配列情報に基づいて、前記対象遺伝子及び／又は対象タンパク質の機能を阻害する阻害物質を調製し、そして
（ｂ）前記阻害物質を、前記対象タンパク質を発現する細胞に導入し、当該細胞の表現型の変化に基づいて前記分泌・輸送機構関連タンパク質を同定・機能解析する
工程を含むことを特徴とする方法。
【００１３】
態様２：  前記阻害物質が以下のものから選択される、態様１又は２に記載の方法
１）遺伝子プロモータのリプレッサー及びアクチベーター阻害因子からなるグループから選択される、転写レベルでの発現阻害物質；
２）リボザイム、アンチセンスＲＮＡ前駆体、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡからなるグループから選択される、翻訳レベルでの発現阻害物質；あるいは
３）抗体及び低分子化合物からなるグループから選択される、タンパク質レベルでの発現阻害物質。
【００１４】
態様３：  前記阻害物質が核酸である、態様１又は２に記載の方法。
態様４：  前記阻害物質が、前記対象遺伝子を標的遺伝子としてＲＮＡ干渉を生じさせるＲＮＡ干渉核酸である、態様１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【００１５】
態様５：  前記（ａ）阻害物質を調製する工程は、ＲＮＡ干渉核酸を選択する工程を含み、当該ＲＮＡ干渉核酸選択工程では、前記標的遺伝子たる対象タンパク質のコード遺伝子の塩基配列情報中から取得される下記（１）〜（５）の規則に従う規定配列と同一の塩基配列を含むＲＮＡ干渉核酸を選択する、態様４に記載の方法。
（１）  ３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルであり；
（２）  ５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンであり；
（３）  ３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからな
る群より選ばれる一種または二種以上の塩基がリッチであり；
（４）  塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数であり；
（５）  前記阻害物質が導入される細胞の全遺伝子の塩基配列のうち、前記標的遺伝子以外の他の遺伝子の塩基配列中に、前記規定配列と９０％以上の同一性を有する配列が含まれない。
【００１６】
態様６：  タンパク質分泌・輸送機構に関与する分泌・輸送機構関連タンパク質の同定・機能解析に用いるＲＮＡ干渉核酸であって、小胞体の構造及び／または機能に関与する一群の小胞体関連タンパク質をコードする一群の対象遺伝子を標的遺伝子とし、当該標的遺伝子の塩基配列中に含まれる下記（１）〜（５）の規則に従う規定配列と同一の塩基配列を含むセンス鎖と、当該センス鎖に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖とが二重鎖を形成して構成されることを特徴とする、ＲＮＡ干渉核酸。
（１）  ３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルであり；
（２）  ５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンであり；
（３）  ３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからな
る群より選ばれる一種または二種以上の塩基がリッチであり；
（４）  塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数であり；
（５）  当該ＲＮＡ干渉核酸が導入される細胞の全遺伝子の塩基配列のうち、前記標的遺伝子以外の他の遺伝子の塩基配列中に、当該記規定配列と９０％以上の同一性を有する配列が含まれない。
【００１７】
態様７：  図１に示す小胞体関連タンパク質をコードする遺伝子を前記標的遺伝子とする、態様６に記載のＲＮＡ干渉核酸。
態様８：  前記センス鎖および前記アンチセンス鎖が、図１に示す配列番号７−９９、あるいは、配列番号１００−１９２の塩基配列のいずれかを有する、態様７に記載のＲＮＡ干渉核酸。
【００１８】
態様９：  前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の二重鎖領域における少なくとも一方の鎖が、ＲＮＡとＤＮＡとからなり、当該一方の鎖の上流側９〜１３ヌクレオチドがＲＮＡである、態様６〜８のいずれか一項に記載のＲＮＡ干渉核酸。
【００１９】
態様１０：  態様６〜９のいずれか一項に記載のＲＮＡ干渉核酸を含むことを特徴とする、タンパク質分泌・輸送機構に関与する分泌・輸送機構関連タンパク質の同定・機能解析用キット。
【００２０】
態様１１：  下記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の分泌・輸送機構関連タンパク質；
（１）配列番号１記載のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（２）配列番号１記載のアミノ酸配列において一または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、分泌・輸送機構に関与する生物学的機能を奏するタンパク質；
（３）配列番号２記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質；並びに
（４）配列番号２記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列において一または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、分泌・輸送機構に関与する生物学的機能を奏するタンパク質。
【００２１】
態様１２：  下記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の分泌・輸送機構関連タンパク質；
（１）配列番号３記載のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（２）配列番号３記載のアミノ酸配列において一または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、分泌・輸送機構に関与する生物学的機能を奏するタンパク質；
（３）配列番号４記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質；並びに
（４）配列番号４記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列において一または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、分泌・輸送機構に関与する生物学的機能を奏するタンパク質。
【００２２】
態様１３：  下記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の分泌・輸送機構関連タンパク質；
（１）配列番号５記載のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（２）配列番号５記載のアミノ酸配列において一または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、分泌・輸送機構に関与する生物学的機能を奏するタンパク質；
（３）配列番号６記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質；並びに
（４）配列番号６記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列において一または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、分泌・輸送機構に関与する生物学的機能を奏するタンパク質。
【００２３】
態様１４：  図２に示す９種類の小胞体関連タンパク質の機能阻害を抑制することを含む、タンパク質分泌・輸送機構の制御方法。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によればタンパク質分泌・輸送機構に関与するタンパク質、特に、小胞体の構造および／または機能に関与するタンパク質とその機能の同定・機能解析が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
実施の形態および実施例に特に説明がない場合には、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ,  Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ  （Ｅｄ．），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  （３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）， Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ （２００１）;  Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．  Ｂｒｅｎｔ，  Ｒ．  Ｅ．  Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，  Ｄ．  Ｄ．  Ｍｏｏｒｅ，  Ｊ．Ｇ．  Ｓｅｉｄｍａｎ， Ｊ．  Ａ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ｋ．  Ｓｔｒｕｈｌ  （Ｅｄ．），  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ ＆  Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ．などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００２６】
なお、本発明の目的、特徴、利点、およびそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態および具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示または説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００２７】
本明細書中、「タンパク質分泌・輸送機構」、「カーゴ分泌系タンパク質」、「膜系タンパク質」、「小胞体関連タンパク質」の定義は、背景技術において前述した通りである。
【００２８】
また、「小胞体関連タンパク質」のうち、特に、小胞体膜に関連するタンパク質を「小胞体膜関連タンパク質」と呼ぶ。ここで、「小胞体膜に関連する」とは、小胞体の構造（例えば、網状構造の形成や保持等）や、小胞体の膜経路における機能（例えば、品質管理機構やトランスロケーション等）に関連する意である。例えば、実施例では、後述のように、Ｈｅｒａデータベースに登録されている４９９種のタンパク質が「小胞体関連タンパク質」に相当し、そのうちの９３種の膜系タンパク質（ここでは、シグナルアンカー膜タンパク質とそれ以外の膜タンパク質とを含む）が「小胞体膜関連タンパク質」に相当する。また、チロシナーゼ（以下、Ｔｙｒ−ＹＦＰと略す）が「カーゴ分泌系タンパク質」に相当する。
【００２９】
また、「真核細胞」とは、特に断りがない限り、酵母や原生生物といった下等な単細胞真核生物の細胞から、菌類、植物、動物といった高等な多細胞真核生物の細胞を包含する。また、「分泌系タンパク質の成熟」とは、生合成された分泌系タンパク質が目的地で所望の機能を発現可能な状態になることであり、例えば、小胞体における糖鎖付加等の修飾や立体構造の形成、ゴルジ体における修飾等により成熟する。小胞体において成熟した分泌系タンパク質は、小胞体膜からなる膜小胞に取り込まれ、ゴルジ体に向け細胞質内（すなわち、小胞体―ゴルジ体中間区画）を輸送される。そして、ゴルジ体に到達すると糖鎖付加等の修飾が適宜行われ、更に、細胞外やオルガネラの所望の場所に輸送（分泌）される。
また、「ＲＮＡ干渉」とは、機能阻害したい遺伝子の特定領域と相同な、好ましくは同一の塩基配列を有するセンス鎖と、当該センス鎖と相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖とからなる二本鎖ＲＮＡが標的遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの相同な部分を干渉破壊するという現象である。
【００３０】
＜１．タンパク質分泌・輸送機構に関与する分子の同定・機能解析方法＞
以下においては、本発明に係る、タンパク質分泌・輸送機構に関与する分泌・輸送機構関連タンパク質の同定・機能解析方法について説明する。
【００３１】
本発明の方法は、
（ａ）小胞体の構造及び／または機能に関与する一群の小胞体関連タンパク質をコードする一群の対象遺伝子の塩基配列情報、あるいは小胞体の構造及び／または機能に関与する一群の小胞体関連タンパク質（対象タンパク質）のアミノ酸配列情報に基づいて、前記対象遺伝子及び／又は対象タンパク質の機能を阻害する阻害物質を調製し、そして
（ｂ）前記阻害物質を、前記対象タンパク質を発現する細胞に導入し、当該細胞の表現型の変化に基づいて前記分泌・輸送機構関連タンパク質を同定・機能解析する
工程を含むことを特徴とする。
【００３２】
本明細書において、「分泌機構関連タンパク質」とは、細胞内において小胞体で生合成された種々の分泌系タンパク質を成熟化し目的地に運搬する、という上述したタンパク質分泌及び／又は輸送のための機構を維持及び／又は制御する機能を有するタンパク質を意味する。後述するように、「分泌・輸送機構関連タンパク質」には、「膜系タンパク質」（より具体的には、前述の「小胞体膜関連タンパク質」）が一例として包含される。一方、「カーゴ分泌系タンパク質」は、分泌・輸送機構関連タンパク質の作用機序により取得される産生物に相当する。
【００３３】
本発明の方法は、解析対象とする分泌・輸送機構関連タンパク質を発現可能な系であれば、いずれの発現系にも適用可能である。例えば、発現系は、下等真核細胞から哺乳動物細胞に至る全ての真核細胞に対して適用可能であり、パン酵母、線虫、昆虫、哺乳類等の細胞に任意に適用可能である。
【００３４】
また、解析対象は特には限定されず、分泌・輸送機構関連タンパク質をコードする遺伝子を含む（と予測される）一群の遺伝子又は分泌・輸送機構関連タンパク質を含む（と予測される）一群のタンパク質が対象となる。好ましくは、分泌・輸送機構関連タンパク質を高い確率で含むと予測される、小胞体の構造及び／または機能に関与する一群の小胞体関連タンパク質、またはこれらのタンパク質をコードする遺伝子が対象となる。
【００３５】
本明細書において後述する実施例では、分泌・輸送機構関連タンパク質の一例として、小胞体関連タンパク質（より詳細には、小胞体膜関連タンパク質）を対象としている。かかる対象となる分泌・輸送機構関連タンパク質は、機能が未知および既知のいずれであってもよい。機能未知のものを対象とした場合には、新たに機能を同定することが可能となり、一方、機能既知のものを対象とした場合には、機能の確認および本発明の方法の有効性の実証が可能となる。
【００３６】
本発明に係る方法の一態様について説明すると、まず、公開されているデータベース等の情報源から、分泌・輸送機構関連タンパク質をコードする遺伝子を含む一群の対象遺伝子（対象タンパク質コード遺伝子）の塩基配列情報、あるいは分泌・輸送機構関連タンパク質を含む一群の対象タンパク質のアミノ酸配列情報を取得する。情報源は任意であり、例えば、対象タンパク質のアミノ酸配列または塩基配列に関する情報を格納したデータベース等を用いることができる。これらの情報が得られたタンパク質又は遺伝子のうち１つ又は複数を、分泌・輸送機構関連タンパク質の候補である対象タンパク質又は対象タンパク質コード遺伝子（対象遺伝子）として、本発明の解析の対象とする。
【００３７】
本発明の方法では、このような情報源を利用して対象タンパク質又は対象遺伝子の配列情報、例えば対象遺伝子のＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列を取得する。本発明においては、対象タンパク質コード遺伝子の少なくとも一部の領域の塩基配列を取得できればよく、当該一部の領域は、一つのコード領域であっても複数のコード領域であってもよい。例えば、＜２＞で後述するＲＮＡ干渉核酸を発現阻害物質として利用する場合、取得される対象タンパク質コード遺伝子の塩基配列情報は、後述するように、ＲＮＡ干渉核酸の標的となる規定配列を取得可能であれば塩基長、位置等について特には限定されず、スプライシング前および後のいずれの塩基配列に関するものであってもよい。
【００３８】
例えば、後述の実施例では、分泌・輸送機構関連タンパク質を含みうるソース（対象タンパク質）として、一群の小胞体関連タンパク質を解析した。この場合、例えば、ＭｃＧｉｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙが提供する、ヒト細胞の小胞体関連タンパク質に関する公共のデータベース「Ｈｕｍａｎ  ＥＲ  Ａｐｅｒｃｕ  （Ｈｅｒａ）」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｃｂ．ｍｃｇｉｌｌ．ｃａ／〜ｈｅｒａ／ ｄｂ＿ａｃｃｅｓｓ／参照）を利用しうる。かかるデータベースは、ヒト細胞の小胞体に存在する４９９種の小胞体関連タンパク質に関する情報を格納している。実施例では、図１に示すように、Ｈｅｒａに収納された小胞体関連タンパク質のうち、特に、小胞体膜関連タンパク質９３種を解析の対象としている。そして、これらについて解析を行った結果、特に、図２に示す９種の小胞体関連膜タンパク質がタンパク質分泌・輸送機構へ関与することが明らかとなった。
【００３９】
あるいは、小胞体関連タンパク質以外を本発明の解析方法の対象とする場合には、例えば、以下のような情報源から、対象タンパク質または対象遺伝子の配列情報を得ることができる。
【００４０】
本発明の方法では、先ず、工程（ａ）において、小胞体の構造及び／または機能に関与する一群の小胞体関連タンパク質をコードする一群の対象遺伝子の塩基配列情報、あるいは小胞体の構造及び／または機能に関与する一群の小胞体関連タンパク質（対象タンパク質）のアミノ酸配列情報に基づいて、前記対象遺伝子及び／又は対象タンパク質の機能を阻害する阻害物質を調製する。そして、対象タンパク質の発現系（具体的には細胞）にこの阻害物質を導入して当該遺伝子由来のタンパク質の機能を阻害し、かかる阻害により生じる表現型の変化を解析する。このようにして得られた表現型の結果に基づいて、解析対象とした分泌・輸送機構関連タンパク質の機能を同定する。
【００４１】
阻害物質は、対象タンパク質コード遺伝子又は対象タンパク質の発現又は生物学的機能の発揮を阻害可能な物質であれば特には限定されない。塩基配列情報及び／又はアミノ酸配列の情報が入手できれば、当業者は、公知の手法を用いて当該配列を有する遺伝子またはタンパク質に特異的な阻害物質を調製することが可能である。阻害物質は、例えば下記のものから選択することが可能である：
１）遺伝子プロモータのリプレッサー及びアクチベーター阻害因子からなるグループから選択される、転写レベルでの発現阻害物質；
２）リボザイム、アンチセンスＲＮＡ前駆体、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡからなるグループから選択される、翻訳レベルでの発現阻害物質；あるいは
３）抗体及び低分子化合物からなるグループから選択される、タンパク質レベルでの発現阻害物質。
【００４２】
これらの組成物は、公知技術を適宜用いることによって調製したものを利用することができる。転写レベルでの発現阻害物質である遺伝子プロモータのリプレッサー及びアクチベーター阻害因子は、対象遺伝子の塩基配列情報を利用し、公知の方法を用いて調製することができる。翻訳レベルでの発現阻害物質である、例えばリボザイム、アンチセンスＲＮＡ前駆体等は例えば、対象遺伝子の塩基配列情報を利用し、公知の方法を用いて調製することができる。ＲＮＡ干渉核酸であるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡは本明細書において後述する方法を用いて調製することができる。また、タンパク質レベルでの発現阻害物質である抗体及び低分子化合物は、対象タンパク質のアミノ酸配列情報を利用し、公知の方法を用いて調製することができる。
【００４３】
調製が比較的簡便に可能であること、一度に多種、多数の対象を解析できることから、阻害物質は好ましくは核酸である。特に、本発明に係る方法で用いる阻害物質は、阻害効果が高く取り扱いが簡便であり、かつ対象タンパク質コード遺伝子に特異的である（言い換えれば、解析対象以外のタンパク質への阻害効果、すなわちｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果が低い）点から、対象遺伝子を標的遺伝子としてＲＮＡ干渉を生じさせる、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等のＲＮＡ干渉核酸である。このような発現阻害物質たるＲＮＡ干渉核酸については、詳細を＜２＞で説明するが、特に、以下のようなＲＮＡ干渉核酸選択工程により選択したＲＮＡ干渉核酸を用いることが好ましい。それにより、発現抑制効果が高くｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果が低い、特に優れたＲＮＡ干渉核酸を発現阻害物質として用いることが可能となる。
【００４４】
ＲＮＡ干渉核酸の選択について具体的に説明する。ここでは、前記阻害物質を用意する工程が、ＲＮＡ干渉核酸選択工程を含み、当該ＲＮＡ干渉核酸選択工程では、前に工程で取得した対象タンパク質コード遺伝子の情報（ここではＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列情報）の中からさらに選択的に取得される後述の「規定配列」と相同な、好ましくは同一の塩基配列を含むＲＮＡ干渉核酸を選択する。具体的には、この「規定配列」と相同な、好ましくは同一の塩基配列を含むセンス鎖と、当該センス鎖に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖とが二重鎖を形成してなるＲＮＡ干渉核酸を選択する。
【００４５】
ここで、「規定配列」とは、対象タンパク質コード遺伝子の塩基配列中に含まれる塩基配列であって、下記（１）〜（５）の規則； 
（１）  ３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルであり；
（２）  ５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンであり；
（３）  ３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからな
る群より選ばれる一種または二種以上の塩基がリッチであり；
（４）  塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である
に従う規定配列と相同な、好ましくは同一の塩基配列からなり；
前記阻害物質が導入される細胞の全遺伝子の塩基配列のうち、ＲＮＡ干渉の標的である対象タンパク質コード遺伝子（すなわち標的遺伝子）以外の他の遺伝子の塩基配列中に、当該規定配列と９０％以上の同一性を有する配列が含まれない、に従う配列である。
【００４６】
かかる規定配列は、ＲＮＡ干渉の標的となる塩基配列である。規定配列については、＜２＞で詳述するので、ここでは説明を省略する。なお、ＲＮＡ干渉核酸の構造、「同一性」や「相補」の定義等の詳細についても、＜２＞において述べるので、ここでは省略する。
【００４７】
本発明の方法は、次いで工程（ｂ）において、調製された阻害物質を、前記対象タンパク質を発現する細胞に導入し、当該細胞の表現型の変化に基づいて前記分泌・輸送機構関連タンパク質を同定・機能解析する
本発明の方法において、阻害物質の発現系（細胞）への導入は、阻害物質の種類等に応じ、常法から適切な方法を適宜選択できる。例えば、実施例のように、阻害物質としてＲＮＡ干渉核酸（具体的にはｓｉＲＮＡ）を導入する場合には、常法に従い、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクションなどによってＲＮＡ干渉核酸を直接細胞内に取り込ませてもよい。また、転写産物としてｓｉＲＮＡを与えることが可能な発現ベクターを作製し、同様の方法によって細胞内に導入することもできる（ＷＯ０１／３６６４６、ＷＯ０１／４９８４４）。
【００４８】
阻害物質がＲＮＡ干渉核酸以外の核酸の場合も、同様にトランスフェクション等によって細胞内へ導入することが可能である。
阻害物質がタンパク質の場合は、阻害物質タンパク質の細胞の培養系への直接の添加、阻害物質タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターを用いた細胞の形質転換等によって阻害物質を細胞内へ導入することができる。
【００４９】
阻害物質は、対象遺伝子及び／又は対象タンパク質の機能を阻害することができる物質であれば特に限定されない。「対象遺伝子及び／又は対象タンパク質の機能を阻害する」とは、対象遺伝子の発現を阻害する、対象タンパク質の発現を阻害する、及び／又は対象タンパク質の機能を阻害することを含む。
【００５０】
「対象遺伝子の発現を阻害する」とは、対象遺伝子の転写及び／又は翻訳を阻害し、結果として、対象タンパク質の発現を減少または阻止することを意味する。「対象タンパク質の発現を阻害する」とは、対象遺伝子の発現を阻害することまたは翻訳後の適切な修飾を阻害することによってタンパク質の発現を減少または阻止することを意味する。「対象タンパク質の機能を阻害する」とは、発現した対象タンパク質の生物学的機能を減少または阻止することを意味する。好まし態様としては、対象遺伝子または対象タンパク質の発現を阻害することにより、細胞内における生物学的に活性な対象タンパク質の存在量を減少させることを意味する。
【００５１】
例えば、通常、阻害対象となる対象タンパク質コード遺伝子由来のｍＲＮＡ量が減少すれば、当該タンパク質自身の生成が抑制（阻害）されることから、ｍＲＮＡ量が実質的に減少していれば、その変化の幅の大小にかかわらず、対象タンパク質の発現阻害が実現されているとみなせる。本発明の一態様として、詳細は実施例で後述するが、対象タンパク質コード遺伝子に対する発現阻害物質を導入すると、図３〜５に示すように、当該遺伝子由来のｍＲＮＡ量が減少して当該遺伝子の発現が阻害された。それにより、解析対象であるタンパク質の機能が阻害され、図７および８に示すように発現系において表現型に変化が生じる場合がある。
【００５２】
阻害物質の被導入体である発現系（細胞）において、その変化を解析すべき表現型は特には制限されない。例えば、被導入体の形態、被導入体内物質量、被導入体が分泌する物質量、被導入体内物質の動態、被導入体間接着、被導入体の運動、被導入体の寿命等を解析してもよい。
【００５３】
阻害物質の導入により、これらのいずれかの表現型が変化する場合には、阻害物質の標的となった対象タンパク質を、分泌・輸送機構関連タンパク質と同定する。さらに、表現型の変化の種類、程度等に応じて、分泌・輸送機構関連タンパク質と同定されたタンパク質の機能を解析することが可能である。限定されるわけではないが、分泌・輸送機構関連タンパク質であるとの同定は、例えば、その分子のＲＮＡ干渉法による発現抑制によりカーゴ分泌系タンパク質（ＴＹＲ−ＹＦＰあるいはゴルジ膜タンパク質）が小胞体に蓄積した時、あるいは、下記に記する通り、小胞体ネットワークの三叉構造の減少として定義される。
【００５４】
各表現型を解析する手段としては、表現型の変化を検出して変化の有無を確認・評価し、それにより、対象タンパク質の機能阻害の影響および効果を評価可能であれば、特には限定されない。各表現型に応じて、適切な従来のアッセイ方法を適宜用いることが可能である。例えば、後述の実施例では、表現型として、発現系（細胞）における小胞体の網状構造の変化と、カーゴ分泌系タンパク質（Ｔｙｒ）の動態変化とを見ている。これらの変化は、蛍光プローブを用いその蛍光シグナルを利用して顕微鏡あるいは肉眼により検出可能である。例えば、実施例のように、共焦点レーザ顕微鏡により検出を行ってもよい。図７、８および１０に示すように、解析対象タンパク質の阻害物質であるｓｉＲＮＡ導入体で現れる表現型の変化は、対象タンパク質コード遺伝子の発現阻害およびそれに伴う解析対象タンパク質の機能阻害の結果生じるものである。したがって、当該変化から、解析対象タンパク質の機能がその表現型に関与するものであると同定することが可能である。
【００５５】
表現型の解析には、検出および評価の精度向上や簡便化等の為、プローブ等を適宜用いることが好ましい。例えば、小胞体構造の変化を顕微鏡観察により検出する場合には、蛍光プローブや発光プローブを用いこれらのシグナルを検出して表現型の変化を解析してもよい。プローブとして、例えば、公知の蛍光タンパク質や発光タンパク質を用いることができる。より具体的には、実施例のようにＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）を用いてもよく、あるいは、ＥＧＦＰ（強化緑色蛍光タンパク質）、ＨｃＲｅｄ（近赤外蛍光タンパク質）、Ｌｕｃ（ルシフェラーゼタンパク質）等を用いてもよい。これらのプローブのシグナル検出および解析には、従来のアッセイ方法を適用することが可能である。
【００５６】
実施例１では、図６〜８に示すように、小胞体の構造変化検出の為のプローブとしてＹＦＰを用いている。また、実施例２では、図１０に示すように、分泌系タンパク質の動態変化検出の為のプローブとしてＹＦＰを用いている。実施例１および実施例２では、ＹＦＰを安定発現するＨｅＬａ細胞およびＣＯＳ細胞が発現系として用いられる。これらの発現系は、ＹＦＰをコードするＤＮＡが挿入されるとともにプロモータ等の領域を適切に有するベクターを導入することにより得られる。導入に使用するベクターや導入方法については、従来のものを適用可能である。例えば、ベクターは被導入体である細胞に応じて適宜選択できるが、レトロウィルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ＥＢウイルスベクター、パピローマウイルスベクターフォーミーウイルスベクター等や、カチオニックリポソーム、リガンドＤＮＡ複合体、ジーンガン等の非ウイルスベクター等が挙げられる。また、ウイルスベクターではなく、ダンベル型ＤＮＡ、ヌクレアーゼ耐性を有する修飾ＤＮＡ、またはｎａｋｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄも好適に用いることができる。なお、これらのベクターは、＜２＞で後述するＲＮＡ干渉核酸（具体的にはｓｈＲＮＡ）の作製にも使用可能である。
【００５７】
実施例１で後述するが、ＹＦＰを安定発現するＨｅＬａ細胞では、図６〜９に示すように、細胞内で発現したＹＦＰが小胞体膜に取り込まれ、それにより、小胞体が蛍光を発する。ここでは、小胞体膜に取り込まれ小胞体膜において発現するＹＦＰをＥＲｍ−ＹＦＰと呼ぶ。ＥＲｍ−ＹＦＰが発現するＨｅＬａ細胞において、図１に示す小胞体膜関連タンパク質の機能を阻害するｓｉＲＮＡをそれぞれ導入すると、解析対象である小胞体膜関連タンパク質の発現が阻害されその機能が抑制される。そして、図６〜９に示すように、機能が阻害されたタンパク質が分泌・輸送機構に関与するタンパク質である場合には、小胞体の構造、特に網状構造に変化が生じ、当該変化をＥＲｍ−ＹＦＰの蛍光シグナルにより視覚的に検出することが可能となる。「網状構造の変化」とは、ｓｉＲＮＡの導入前後を比較して認められる任意の形態変化であり、例えば、網状構造自体の消失、管腔経路の狭小化または閉塞化、網状構造の基本単位となる三叉構造の切断（消失）による網密度の低下等が挙げられる。
【００５８】
また、実施例２ではＣＯＳ細胞を用い、カーゴ分泌系タンパク質であるチロシナーゼ（Ｔｙｒ）がＹＦＰと一体的に発現する発現系を実現している。ここでは、このように一体的に発現するタンパク質をＴｙｒ−ＹＦＰと呼ぶ。このようなＴｙｒ−ＹＦＰを安定発現する細胞は、ＴｙｒをコードするＤＮＡとＹＦＰをコードするＤＮＡとが挿入されるとともにプロモータ等の領域を適切に有するベクターを導入することにより得られる。この場合のベクターや導入方法については、上記のＥＲｍ−ＹＦＰ導入の場合と同様である。Ｔｙｒ−ＹＦＰが発現するＣＯＳ細胞においては、非許容温度（３９度以上４２度以下）での培養により、Ｔｙｒ−ＹＦＰはミスフォールディングして小胞体に繋留する。この状態で、図１に示す小胞体膜関連タンパク質の発現を阻害するｓｉＲＮＡ（配列番号７−９９）をそれぞれ導入すると、解析対象である小胞体膜関連タンパク質の発現が阻害されその機能が抑制される。そして、許容温度（３７度以下２０度以上）では、未処理の細胞ではＴｙｒ−ＹＦＰのフォールディングが完了して小胞体から出て、リソソーム系に移行する。図１０に示すように、機能阻害されたタンパク質が分泌・輸送機構に関与するタンパク質である場合には、Ｔｙｒ−ＹＦＰの動態、具体的には分布（局在状態）に変化が生じ、当該変化をＴｙｒ−ＹＦＰの蛍光シグナルにより視覚的に検出することが可能となる。また、分泌・輸送機構に関与するタンパク質が機能阻害されると、Ｔｙｒ−ＹＦＰの成熟、特に、小胞体における立体構造形成や品質管理機構に異常が生じ、小胞体管腔経路ないにＹＦＰが蓄積する。そして、それに伴い、小胞体構造（特に網状構造）に変化が生じる。
【００５９】
上記のように、小胞体の網状構造の変化、すなわち、小胞体膜関連タンパク質の機能阻害による小胞体網状構造の異常は、その発生要因に応じて、以下の二つに大別することができる。まず一つは、機能阻害する小胞体膜関連タンパク質が、小胞体の網状構造の形成および保持に直接的に関与するタンパク質であり、当該タンパク質の機能阻害が直接的に小胞体構造に影響して異常を生じる場合である。一方、小胞体の網状構造の形成および保持に直接的には関与しないが、分泌系タンパク質の立体構造形成等の成熟過程や輸送過程において制御等で関与する小胞体膜関連タンパク質であり、当該タンパク質の機能阻害により分泌系タンパク質の成熟過程や輸送過程に異常が生じ、その二次的結果として、小胞体において構成成分の形態や局在に異常が生じて小胞体構造に異常を生じる場合である。
【００６０】
小胞体網状構造の変化を検出する方法の一つに、例えば、三叉構造の定量に基づく検出方法が挙げられる。「三叉構造」とは、分岐して異なる三方向に延在する小胞体の三つの管腔経路が一点で交わって形成される構造であり、このような三叉構造が複数存在することによって、複雑に分岐した網状構造が形成される。例えば、実施例１および実施例２において、小胞体膜関連タンパク質の機能を阻害した場合（すなわちｓｉＲＮＡを導入した場合）と機能を阻害しない場合（すなわちｓｉＲＮＡを導入しないコントロールの場合に相当する）とについて、顕微鏡で観察される小胞体（すなわち、図６〜８、１０において蛍光を示す部分）の所定領域における三叉の数をそれぞれ定量し、各々の場合における三叉の数を比較する。コントロールにおける三叉の数を基準とし、当該コントロールと比較して三叉の数が有意に減少していたら、小胞体の網状構造に異常が生じていると判断する。有意な減少とは、例えば、コントロールに対して４０％減少、好ましくは５０％減少、より好ましくは６０％減少している場合をさす。このような三叉構造に基づく構造異常の検出・評価では、複数の前記「所定領域」について三叉を定量することが好ましい。例えば、小胞体を直径５μｍの円で５〜１０つの領域に区画し、各領域における三叉の数を定量することが好ましい。定量の方法は特には限定されないが、例えば、目視、計算機による処理等を用いることが可能であり、視覚的検査および数学的計算により実現される。
【００６１】
また、本発明の方法では、上記のような蛍光シグナルの検出において、蛍光消光回復法（ＦＲＡＰ法）や蛍光相関分光法（ＦＣＳ法）を利用することが可能である。ＦＲＡＰ法やＦＣＳ法により、細胞内での分子の拡散状態を解析することが可能となる。例えば、これらの方法を用いて、構造異常の分泌系タンパク質（例えば、実施例２におけるミスフォールドしたＴｙｒ−ＹＦＰ）の検出を行ってもよい。なお、ＦＲＡＰ法やＦＣＳ法による拡散解析の手法については、「ＦＣＳとＦＲＡＰによる細胞内分子の拡散、結合解析」、著：和田他、羊土社「バイオイメージングがわかる（２００５）」、Ｋａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，J．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ，２７９（２０）２１５３３−２１５４２，２００４、Ｋａｔｏ−Ｈｏｍｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０２（４３），１５６８８−１５６９３，２００５に記載された公知の手法を用いることができ、ここでは説明を省略する。本発明ではこれらの方法を常法に従って利用することができる。
【００６２】
例えば、小胞体の網状構造の変化が三叉構造の切断によるものであるか否かを解析するのにＦＲＡＰ法を利用してもよい。ＦＲＡＰ法では、まず、ＹＦＰを発現した細胞の一部にレーザ光を照射して不可逆的に蛍光を消失させていわゆるブリーチ領域を形成する。そして、ブリーチ後におけるＹＦＰの移動に伴う当該ブリーチ領域での蛍光の回復を検出することにより、ＹＦＰの拡散状態を解析する。三叉構造が切断されずに正常に形成されていれば、小胞体の網状構造に沿ってＹＦＰが移動するので、蛍光強度はブリーチ前の強度に回復する。一方、三叉構造が切断されていれば、ＹＦＰが移動不可（ｉｍｍｏｂｉｌｅ）である為、蛍光強度の回復は少なくなる。したがって、ＦＲＡＰ法の結果に基づき、小胞体網状構造の異常が三叉構造の切断によるものである否かを検出することが可能となる。例えば、後述するオルファクトメジン（ＯＬＦＭ）（Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｎｅｒｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｏｍｐｉｌｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ＤＮＡ  Ｒｅｓ．  ３  （５），  ３１１−３２０  （１９９６））の機能阻害による小胞体網状構造の異常では、ブリーチ後の蛍光強度がブリーチ前の蛍光強度と同程度に回復することから、ＹＦＰの移動が可能な状態、すなわち三叉構造が切断されていない状態であると解される。したがって、網状構造の異常は、三叉構造の切断以外の要素に起因すると推察される。
【００６３】
あるいは、カーゴ分泌系タンパク質の成熟化異常を検出するために、ゴルジ膜タンパク質の局在を利用しても良い。ゴルジ膜タンパク質は、検出を容易にするためにＧＦＰと融合させたものを細胞に発現させたものを用いる。正常な成熟化が起きる場合には、核の近傍に特有のリボン状構造を作る。これが正しい成熟化が起こらない場合には、小胞体への滞留が起きる（図１５、１６）。
【００６４】
オルファクトメジン（ＯＬＦＭ）の場合と同様に、ＰＡＰ２Ｂ（Ｋａｉ，  Ｍ．，  Ｗａｄａ，  Ｉ．，  Ｉｍａｉ，  Ｓ．，  Ｓａｋａｎｅ，  Ｆ．  ａｎｄ  Ｋａｎｏｈ，  Ｈ．  （１９９７）  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｈｕｍａｎ  ｉｓｏｚｙｍｅｓ  ｏｆ  Ｍｇ２＋−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２７２，  ２４５７２−２４５７８）の発現抑制によっても、ＴＹＲ−ＹＦＰの成熟化の異常と、ゴルジ膜タンパク質の小胞体への滞留が認められる。  以上のように、本発明に係る方法によれば、タンパク質分泌・輸送機構における様々なレベルでの異常を検出することが可能となる。この方法では、従来のようなタンパク質分泌の有無やアポトーシス発生の有無に基づきその分子のタンパク質分泌・輸送機構への関与を二者択一的に解析する方法とは異なり、精度が高くより詳細な解析を実現することが可能となる。また、本発明の方法では、既存のデータベースを利用しその情報に基づき全てのタンパク質分泌・輸送機構関連タンパク質について解析することが可能である為、容易に効率良くかつ網羅的に解析を行うことが可能となる。本発明は、一群の対象タンパク質の中から、分泌機能関連タンパク質を新たに同定することが可能であるだけでなく、既に、分泌機能に関連することが示唆されているタンパク質について、より具体的な生物学的機能の解析も可能にするものである。よって、分泌・輸送機構関連タンパク質として公知のタンパク質の機能解析も本発明の範囲に含まれる。
【００６５】
なお、上記においては小胞体膜関連タンパク質を解析対象とする場合を説明したが、これ以外のタンパク質について本発明を適用可能であることは言うまでもない。また、本発明の方法で使用するデータベースは、上記のＨｅｒａ以外でも適用可能であることは言うまでもない。
【００６６】
また、本発明の方法は、発現量の少ないタンパク質であっても解析対象とすることが可能であり、それゆえ、発現量が少ない解析対象に対して見落としが生じるマイクロアレイ等に比べて、より精度の高い良好な解析が可能となる。また、本発明の方法によれば、分泌・輸送機構に関与するタンパク質の一つ一つについて各々独立別個に解析を行うことができるので、各タンパク質の個別の機能について同定が可能になるとともに、種々のタンパク質について網羅的に解析を行うことにより、分泌・輸送機構におけるタンパク質相互の関連を解析することが可能となる。また、例えば、複数のタンパク質の機能を同時にまたはタイミングをずらして阻害することにより、タンパク質相互の関連を明らかにすることが可能となり、その結果、分子同士が相互に複雑に機能して実現されるタンパク質分泌・輸送機構をより詳細に解明することが可能となる。例えば、ＲＮＡ干渉核酸を被導入体である細胞に一種単独で導入した場合には、当該ＲＮＡ干渉核酸の標的となる分泌・輸送機構関連タンパク質を同定し、個別に機能を解析することが可能となる。一方、それぞれ異なるタンパク質を標的とするＲＮＡ干渉核酸複数種類を、同時またはタイミングをずらして導入した場合には、複数種類の分泌・輸送機構関連タンパク質を総括的に機能阻害することが可能となり、その結果、分泌・輸送機構関連タンパク質の相互作用を解析することが可能となる。
【００６７】
さらに、本発明の方法は、下等な真核細胞から高等な真核細胞に至るまで所望の細胞に適用可能である為、例えばパン酵母から哺乳動物に至るまで幅広い種の各々についてそれぞれタンパク質分泌・輸送機構を解析することが可能である。したがって、これまでは種属間の相違から有意な知見が得られていなかったタンパク質分泌・輸送機構についても有意な知見の取得が可能となる。
【００６８】
本発明の方法により得られたタンパク質分泌・輸送機構に関する知見は、種々の用途に用いることが可能である。例えば、疾患に関連する分泌系タンパク質の機構について得られた知見は、疾患の予防や治療に有意である。特に、疾患との関連性が深いフォールディングに関する知見は、背景技術において前述したフォールディング異常に関わる各種疾患における創薬につながるブレークスルーとなり得るので有意である。
【００６９】
＜２＞タンパク質分泌・輸送機構に関与する分泌・輸送機構関連タンパク質の同定・機能解析に用いるＲＮＡ干渉核酸
本発明に係るタンパク質分泌・輸送機構に関与する分泌・輸送機構関連タンパク質の同定・機能解析に用いる阻害物質は、好ましくはＲＮＡ核酸である。本発明のＲＮＡ干渉核酸は、分泌・輸送機構関連タンパク質をコードする遺伝子を標的遺伝子とし、当該標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、下記（１）〜（５）の規則に従う規定配列と相同な、好ましくは同一の塩基配列を含むセンス鎖と、当該センス鎖に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖とが二重鎖を形成して構成される。
（１）  ３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルであり；
（２）  ５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンであり；
（３）  ３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからな
る群より選ばれる一種または二種以上の塩基がリッチであり；
（４）  塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数であり；
（５）  当該ＲＮＡ干渉核酸が導入される細胞の全遺伝子の塩基配列のうち、前記標的遺伝子以外の他の遺伝子の塩基配列中に、当該規定配列と９０％以上の同一性を有する配列が含まれない。
【００７０】
ＲＮＡ干渉核酸は、ｓｉＲＮＡ等の二本鎖型であってもよく、ヘアピン構造を有するＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ：ｓｈＲＮＡ）等の一本鎖型であってもよい。ｓｈＲＮＡは、二重鎖領域における一方の鎖の３'末端と、当該二重鎖領域における他方の鎖の５'末端とがループ部で連結して一本鎖を構成するものである。かかるｓｈＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡの５'末端または３'末端に一重鎖の状態で突出したオーバーハング部を有していても良い。このようなｓｈＲＮＡは、ＷＯ０１／４９８４４等、公知の手法に従って設計することができる。
【００７１】
なお、これらの核酸は、その名称にＲＮＡが含まれることに関わらず、ＲＮＡから成っていても、ＤＮＡから成っていても、ＲＮＡとＤＮＡの両方から成っていてもよい。そして、天然のヌクレオチドあるいは人工のヌクレオチドのいずれから構成されてもよく、また、これらの核酸の複数種類の混成であってもよい。人工のヌクレオチドとしては、例えば、天然のヌクレオチドの塩基の一部に化学修飾がなされているような核酸アナログでもよい。化学修飾としては、例えば、リン酸結合、リボース、核酸塩基、３’および／または５’末端等の化学修飾が挙げられる。
【００７２】
ＲＮＡ干渉の標的となる標的遺伝子の塩基配列は、分泌・輸送機構関連タンパク質をコードする遺伝子から転写される転写産物が有する塩基配列であって、上記（１）〜（５）の規則を満たすものであれば、遺伝子のどの部分でもかまわない。ここで、転写産物は、スプライシング前のｈｎＲＮＡでも、スプライシング後のｍＲＮＡでもよい。本発明に係るＲＮＡ干渉核酸に関し、特に二重鎖領域におけるヌクレオチド構成は、ＲＮＡ型、ＤＮＡ型、ハイブリッド型、キメラ型のいずれであってもよい。ここで、「ＲＮＡ型」は、ＲＮＡからなる核酸、「ＤＮＡ型」は、ＤＮＡからなる核酸、「ハイブリッド型」は核酸が二重鎖領域を有するとき、二重鎖領域における一方の鎖がＲＮＡで、もう一方の鎖がＤＮＡから成る核酸、「キメラ型」は、二重鎖領域においてＲＮＡとＤＮＡが同一鎖に含まれている核酸をいう。例えば、ハイブリッド型構造は、被導入体に導入した際に標的遺伝子の発現を抑制する活性を有するものであれば構造は特には限定されないが、センス鎖がＤＮＡで構成されアンチセンス鎖がＲＮＡで構成された二本鎖ポリヌクレオチドであることが好ましい。
【００７３】
また、キメラ型構造は、被導入体に導入した際に標的遺伝子の発現を抑制する活性を有するものであれば構造は特には限定されない。ＲＮＡ干渉に用いられる核酸は、構造上、機能的なアシンメトリー性（非対称性）を有する傾向が認められることから、ＲＮＡ干渉を生じさせるという目的からすると、センス鎖の５'末端側の半分、アンチセンス鎖の３'末端側の半分はＲＮＡで構成されることが望ましい。キメラ構造を有する核酸では、被導入体内おける安定性や製造コスト等の点から、ＲＮＡの含量をできるだけ少なくすることが好ましい。そこで、高い標的遺伝子の発現抑制効果を維持しつつＲＮＡ含量を低減可能なＲＮＡ干渉核酸について鋭意検討したところ、二重鎖領域において、センス鎖の５’末端から９〜１３ポリヌクレオチドの部分、およびアンチセンス鎖の３’末端から９〜１３ポリヌクレオチドの部分（例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖の前記各末端から１１ポリヌクレオチド、好ましくは１０ポリヌクレオチド、さらに好ましくは９ポリヌクレオチドの部分）はＲＮＡで構成されることが望ましく、特に、アンチセンス鎖の３’末端側が当該構成を有することが望ましい。なお、センス鎖のＲＮＡ部分とアンチセンス鎖のＲＮＡ部分とは、必ずしも、その位置が一致して相補的に結合していなくてもよい。このようなＲＮＡ干渉核酸に関しては、ＷＯ０３／０４４１８８で詳細を開示している。
【００７４】
本明細書中では、規定配列がＤＮＡの配列であればチミンが、ＲＮＡの配列であればウラシルが対応する。また、「相補的な配列」とは、水素結合によって結合できる塩基対の並びによって構成される配列である。例えば、グアニンとシトシンとの相補的な水素結合（Ｇ−Ｃ水素結合）においては三つの水素結合部位が形成されるのに対し、アデニンとチミンまたはウラシルとの相補的水素結合（Ａ−（Ｔ／Ｕ）水素結合）においては二つの水素結合部位が形成される。このため、Ｇ−Ｃ水素結合に対し、Ａ−（Ｔ／Ｕ）水素結合のほうが結合力は弱い。上述のように、「相補的な配列」には、これらの天然の塩基によって構成される配列だけでなく、イノシンや塩基アナログなどの人工的な塩基によって構成される配列も含む。したがって、相補的な水素結合は、二つあるいは三つに限らず、一つでも四つ以上でも構わない。なお、本発明において、センス鎖とアンチセンス鎖とが「相補である」とは、両鎖の塩基配列間で全ての配列が水素結合を形成する完全相補状態はもちろんのこと、ここでは、ＲＮＡ干渉を生じさせるという機能を失わない範囲であれば、両鎖間に部分的に水素結合を形成しない領域が存在する状態も含める（言い換えれば、対合するセンス鎖およびアンチセンス鎖の二重鎖領域は、完全に対合しているものに限定されず不対合部分を含む）。具体的に、例えば、一方の鎖の塩基と相補でない塩基が他方の鎖の相当部分に含まれるいわゆるミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）場合や、一方の鎖の塩基に相当する塩基が存在しないいわゆるバルジ（対応する塩基が欠失している）場合等が挙げられる。
【００７５】
また、「規定配列と相同な塩基配列」とは、標的遺伝子配列（またはその一部）に中程度または高程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な塩基配列のことであり、規定配列を有する遺伝子に対し、その配列を有するポリヌクレオチドがＲＮＡ干渉を生じさせることができることが好ましい。
【００７６】
「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，第６−７章，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃、６×ＳＳＣのハイブリダイゼーション条件を含む。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度および／または低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、約６５℃、６×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣ、好ましくは６×ＳＳＣ、より好ましくは２×ＳＳＣ、最も好ましくは０．２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション）および／または洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、およびおよそ６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間行う。
【００７７】
当業者に知られていて、以下にさらに記載するように、ハイブリダイゼーション反応と二本鎖の安定性を支配する基本原理を適用することによって望ましい度合いのストリンジェンシーを達成するためには、洗浄温度と洗浄塩濃度を必要に応じて調整することが可能であると理解すべきである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１を参照されたい）。核酸を未知配列の標的核酸へハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さはハイブリダイズする核酸のそれであると仮定される。既知配列の核酸をハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さは核酸の配列を並列し、最適な配列相補性をもつ単数または複数の領域を同定することによって決定可能である。５０塩基対未満の長さであることが予測されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５−２５℃低くなければならず、Ｔｍは、以下の等式により決定される。長さ１８塩基対未満のハイブリッドに関して、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基数）。１８塩基対を超える長さのハイブリッドに関しては、Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋４１（モル分率［Ｇ＋Ｃ］）−０．６３（％ホルムアミド）−５００／ｎであり、ここで、Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、そして［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度である（１×ＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。
【００７８】
核酸の解離温度は、例えばその核酸の長さや核酸を構成する各塩基の割合等に依存するため、ストリンジェントな条件は、用いる核酸によって、個々に決定されなければならないが、当業者であれば、その条件を容易に決定することが可能である。
【００７９】
通常、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズする配列は、規定配列と５０〜１００％の同一性を有する。ＲＮＡ干渉を生じさせるという機能を失わない範囲であれば、塩基配列の一部に欠失、置換、挿入などの変異を含んでもよい。なお、許容される変異の程度としての同一性を算出する場合、同一の検索アルゴリズムを用いて算出された数値どうしを比較することが望ましい。検索アルゴリズムは特に限定されないが、局所的な配列の検索に適したものが好適であり、より具体的にはＢＬＡＳＴ  ｓｅａｒｃｈなどを好適に用いることができる。
【００８０】
より詳細には、核酸（ポリヌクレオチド）の同一性は、視覚的検査および数学的計算によって決定することが可能である。またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マジソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７）。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、および非同一物について０の値を含む）一元（ｕｎａｒｙ）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Ａｔｌａｓ ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ａｎｄ Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６の加重アミノ酸比較マトリックス；または他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；またはヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：および（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、国立医学ライブラリーのウェブサイｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌｓ．ｈｔｍｌにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎのＳＥＧプログラム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）により決定され；ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ，「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｂｉａｓｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ)」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：５４４−７１，  １９９６も参照されたい）、または、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ＣｌａｖｅｒｉｅおよびＳｔａｔｅｓ（ＣＯＭＰＵＴＥＲＳ5  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、および（Ｂ）データベース配列に���する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ−スコア（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。
【００８１】
好ましくは、センス鎖は下記（１）〜（５）の規則に従う規定配列と同一の塩基配列を含む。
規則（３）において、「リッチ」とは特定の塩基が現れる頻度が高いことを意味し、規定配列における３'末端側の５〜１０塩基、好ましくは７塩基の配列中にアデニン、チミンおよび／またはウラシルからなる群より選ばれる一種または二種以上が、少なくとも４０％以上、より好ましくは５０％以上含まれることを意味する。例えば約１９塩基程度の規定配列の場合を例に挙げると、３'末端側の７塩基のうち好ましくは少なくとも３塩基以上、より好ましくは４塩基以上、特に好ましくは５塩基以上が、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる一種または二種以上である。
【００８２】
規則（４）について、規定配列の鎖長は、数塩基から転写産物の全長まで、いずれの長さであってもよい。しかし、生物種などの条件により、塩基数があまりに大きすぎる核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）が細胞毒性を生じるため、極端に長い核酸は使えない場合がある。規定配列の塩基数の上限は、ＲＮＡ干渉を生じさせようとする生物の種類などにより異なるが、例えば、ｓｉＲＮＡの場合、哺乳動物由来の細胞においては、３０塩基数以上の鎖長を有するｓｉＲＮＡを導入するとインターフェロン応答が生じるため、ｓｉＲＮＡの塩基数は、３０以下、より好ましくは２８以下である。さらに好ましくは２４以下、より好ましくは２２以下、さらに好ましくは２０以下である。また、下限は、ＲＮＡ干渉を生じさせる核酸を取得可能な限りにおいて特に制限されるものではないが、好ましくは１３以上、より好ましくは１５以上、さらに好ましくは１８以上、より好ましくは２０以上である。よって、規則（４）において、標的遺伝子の規定配列は塩基数が１３〜２８であることが好ましい。特に、哺乳動物由来の細胞等に導入する場合には、１３〜２８、好ましくは１５〜２３、さらに好ましくは１９〜２１塩基数である。標的遺伝子の規定配列は、かかる上限および下限をふまえた塩基数であることが特に好ましく、最も好ましくは１９塩基である。この１９塩基中、（３）の規則に鑑みると、規定配列の３’末端側の７塩基のうち好ましくは少なくとも３塩基以上、より好ましくは４塩基上、特に好ましくは５塩基以上が、Ａ、Ｔおよび／またはＵである。
【００８３】
本発明に係るＲＮＡ干渉核酸において、二重鎖領域の両端は平滑末端であっても、オーバーハング部を有していてもよいが、両端に３’末端が突出したオーバーハング部を有しているのが好ましい。オーバーハング部とは、二重鎖領域の端に存在する、一本鎖の状態で突出する部分である。オーバーハング部は、生物種などにもよるが、塩基数２であることが好ましい。オーバーハング部の塩基配列は、基本的には任意であるが、例えば、ＴＴあるいはＵＵ等が好適に用いられる。
【００８４】
さらに、本発明の核酸において、標的遺伝子の規定配列は、さらに下記（５）の規則：
（５）当該ＲＮＡ干渉核酸が導入される細胞の全遺伝子の塩基配列のうち、前記標的遺伝子以外の他の遺伝子の塩基配列中に、当該規定配列と９０％以上の同一性を有する配列が含まれない
に従う配列であることが好ましい。言い換えると、（５）の規則は、標的遺伝子と関係のない遺伝子におけるＲＮＡ干渉（これをオフターゲット効果と呼ぶ）を抑制するために、標的遺伝子の上記（１）〜（４）に従う規定配列は、これと同一または類似の配列が他の遺伝子に含まれていない塩基配列であることが好ましいことを規定したものである。かかる規則を満たす規定配列を選択することにより、標的遺伝子のみに特異的にＲＮＡ干渉を生じさせることができ、オフターゲット効果の低いＲＮＡ干渉を実現することが可能となる。規定配列またはその相補配列と同一／類似の配列を検索する方法としては、一般的なホモロジー検索を行うソフトウェア等を用いた方法が挙げられる。
【００８５】
例えば、ＢＬＡＳＴ等を利用して標的遺伝子の規定配列と同一または類似の配列を他の遺伝子について検索し、当該他の遺伝子に塩基配列のミスマッチ数が小さい類似配列が存在するという検索結果が得られた場合には、このような標的遺伝子の規定配列は除外する。
【００８６】
それにより、標的遺伝子に対する特異性の高い配列を選別することができる。具体的に、標的遺伝子の規定配列の塩基数が１９である場合には、他の遺伝子にミスマッチが２塩基以下、より好ましくは３塩基以下、さらに好ましくは４塩基以下の類似配列が存在する配列を規定配列から除外することが好ましい。類似性判断の閾値となるミスマッチ数の値の増加に伴って、特異性が高くなる。また、標的遺伝子の規定配列のみならずこれと相補的な配列の両方についても検索を行うことにより、さらに特異性の高い配列が得られる。
【００８７】
便宜上、塩基配列の類似性を判断する基準となるミスマッチ数を同一性で規定し、（５）の規則に従う配列であるかどうか、検索することにより類似性を判断して塩基配列を選別することが好ましい。かかる同一性は適宜設定されるものであり、当業者は、所望により規定配列と８５％以上、８０％以上、７５％以上のように適宜設定することが可能である。ここで、規定配列との同一性を低く設定するほど標的配列と類似する他の遺伝子が存在しないこととなる。
【００８８】
さらに、センス鎖のセンス配列は、上記（１）〜（４）あるいは（１）〜（５）の規則の他、下記（６）の規則に従う標的遺伝子の規定配列に相同な、好ましくは同一の塩基配列を有することが好ましい。
【００８９】
（６）１０塩基以上ＧまたはＣが連続する配列を含まない。ここで、当該（６）の規則において、１０塩基以上グアニンおよび／またはシトシンが連続するというのは、例えば、グアニンまたはシトシンの一方のみが連続する場合と、グアニンおよびシトシンとが混在する配列となっている場合の双方を含み、具体的には、ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号１９７）、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ（配列番号１９８）のほか、ＧおよびＣの混合配列であるＧＣＧＧＣＣＣＧＣＧ（配列番号１９９）なども含まれる。
【００９０】
なお、前述のように、上記（１）〜（４）の規則は、Ｕｉ−Ｔｅｉらによるガイドラインに基づくものであり、ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１４８９３（ＷＯ２００４／０４８５６６）にも詳細に記載されている。また、上記（５）および（６）の規則については、ＰＣＴ／ＩＢ２００３５／００１６４７明細書に、詳細に記載されている。
【００９１】
標的遺伝子の規定配列は、上記のような塩基配列上の規則だけでなく、これ以外の点に鑑みて適宜選択されてもよい。例えば、上記（１）〜（６）等の規則を満たす規定配列を標的遺伝子から複数選択した後、さらに、当該選択された規定配列の中から、別の条件を付加して配列の選択を行ってもよい。本発明に係る核酸を設計するための規定配列の検索および選択は、例えば、上記の（１）〜（６）の規則に従う部分を検索可能なプログラムを搭載するコンピュータを用いることにより、効率的な検出および選択が実行可能である。このような核酸の設計により、ＲＮＡ干渉効果の高い核酸分子を、高い確率でしかも容易に設計することができる。なお、本発明に係るＲＮＡ干渉核酸は、遺伝子組み換え技術（具体的な一例としては、所定の配列を有するＤＮＡ鎖を作製し、これを鋳型として転写酵素を用いて一本鎖ＲＮＡを合成し、一本鎖ＲＮＡを二本鎖化するなどの手法）、化学的または酵素的合成等の公知技術を適宜用いることによって製造することができる。
【００９２】
ＲＮＡ干渉核酸の塩基配列設計に関しては、種々ガイドラインが公表されているが、上記構成を有する本発明のＲＮＡ干渉核酸によれば、標的遺伝子である対象タンパク質コード遺伝子に対し効率よくＲＮＡ干渉を生じさせることができる為、効率よく、また簡便に当該タンパク質の発現を阻害することが可能となる。そして、ひいては、かかる発現阻害により、当該タンパク質の機能を阻害することが可能となる。このような効果を奏する本発明のＲＮＡ干渉核酸を用いて上記＜１＞記載の方法を実施することにより、＜１＞で前述したように分泌・輸送機構関連タンパク質について種々の有意な知見を取得することが可能となる。また、分泌・輸送機構関連タンパク質の過剰発現によりタンパク質分泌・輸送機構に異常が生じる場合には、本発明のＲＮＡ干渉核酸を導入することにより、過剰発現する当該タンパク質の機能阻害を実現でき、それによってタンパク質分泌・輸送機構を正常な状態に制御することが可能となる。
【００９３】
本発明のＲＮＡ干渉核酸の標的となる対象タンパク質コード遺伝子は、タンパク質分泌・輸送機構に関与する分泌・輸送機構関連タンパク質の候補遺伝子あれば任意である。例えば、小胞体関連タンパク質コード遺伝子が好ましい。一例として、後述の実施例では、図１および２に示すように、小胞体膜関連タンパク質をコードする遺伝子を標的としており、当該標的に対して図１および２に示す塩基配列を有するｓｉＲＮＡを用いている。これらのｓｉＲＮＡでは、１９塩基数のセンス配列の３’末端に２塩基のオーバーハング部が設けられて２１塩基から成るセンス鎖が構成され、１９塩基数のアンチセンス配列の３’末端に２塩基のオーバーハング部が設けられて２１塩基から成るアンチセンス鎖が構成されている。
【００９４】
図３〜５に示すように、これらのｓｉＲＮＡをＨｅＬａ細胞に導入することにより、図１および２の小胞体膜関連タンパク質の発現および機能を抑制することが可能となる。その結果、図７および８に示すように、ｓｉＲＮＡを導入した細胞の表現型が変化する場合が観察されうる。例えば、小胞体膜関連タンパク質の機能阻害により小胞体構造自体に異常が発生すると、図７に示す小胞体の収縮（すなわち内腔の容積減少）や、図８に示す小胞体網状構造の変化または三叉構造の減少等が表現型における変化として観察される。また、図１０に示すように、ｓｉＲＮＡをＣＯＳ細胞に導入することにより、分泌系タンパク質の成熟過程における異常、例えば、当該タンパク質の立体構造の異常や輸送プロセスにおける異常が生じると、図１０に示すように、小胞体の形態変化および／または膜系構成成分の局在異常として表現型に現れる。したがって、＜１＞で前述したように、このような表現型の変化を検出して解析することにより、ＲＮＡ干渉核酸の標的となった図１および２の小胞体膜関連タンパク質の機能解析を行うことが可能となる。
【００９５】
よって、本発明のＲＮＡ干渉核酸において、好ましくは、センス鎖は図１に示す配列番号７−９９のいずれかであり、アンチセンス鎖は配列番号１００−１９２の塩基配列のいずれかの塩基配列を有する。
【００９６】
好ましくは、センス鎖およびアンチセンス鎖の二重鎖領域における少なくとも一方の鎖が、ＲＮＡとＤＮＡとからなり、当該一方の鎖の上流側９〜１３ヌクレオチドがＲＮＡである。
【００９７】
なお、実施例では本発明に係るＲＮＡ干渉核酸をヒトＨｅＬａ細胞およびサルＣＯＳ細胞に適用する場合について説明したが、本発明のＲＮＡ干渉核酸は、様々な生物種、例えば、酵母、菌類、植物、動物に適用可能であり、また、細胞、組織、器官、個体のいずれにも適用可能である。そして、これらのいずれにおいても、上述の優れたＲＮＡ干渉効果を奏することが可能である。
【００９８】
＜３．タンパク質分泌・輸送機構に関与する分泌・輸送機構関連タンパク質の同定・機能解析用キット＞
本発明に係るタンパク質分泌・輸送機構に関与する分泌・輸送機構関連タンパク質の同定・機能解析用キットは、本発明の分泌・輸送機構関連タンパク質の同定・機能解析に使用可能な、対象遺伝子及び／又は対象タンパク質の機能を阻害する阻害物質を含む。
【００９９】
本発明のキットは好ましくは、上記＜２＞記載の本発明に係るＲＮＡ干渉核酸を含む。キットに含まれるＲＮＡ干渉核酸は、一種類および複数種類のいずれであってもよい。このような本発明のキットによれば、上記＜１＞記載の本発明に係る方法を実現することが可能となる。すなわち、ＲＮＡ干渉核酸により解析対象である対象タンパク質及び又は遺伝子の発現および機能を阻害する。かかる阻害により生じる表現型の変化に基づいて分泌関連タンパク質の同定及び／又は分泌関連タンパク質機能解析を実現できる。
【０１００】
本発明のキットの構成は、前述の作用機序により解析を実現できる構成であれば特には限定されず、ＲＮＡ干渉核酸以外の構成要素を適宜含んでもよい。例えば、表現型における変化を検出する為のプローブ等を含んでもよく、あるいは、実施例のように、各種プローブ（例えば、ＹＦＰ）を安定して発現可能な発現系（具体的には細胞）を含むキットであってもよい。また、ＲＮＡ干渉核酸によるタンパク質の機能阻害を検出するための手段として、酵素標識抗体および／または該酵素の基質を含んでもよく、あるいは、当該タンパク質のｍＲＮＡ量を測定するための試薬、例えばＰＣＲの場合、ＴＡＱポリメラーゼおよび／またはプライマーを含んでもよい。さらに、かかるキットは、バッファー等の試薬類を含んで構成される。
【０１０１】
本発明のキットに含まれるＲＮＡ干渉核酸の標的となる対象遺伝子は、分泌・輸送機構関連タンパク質をコードする遺伝子を含む１又は複数の遺伝子であれば特に限定されず、任意である。例えば、本発明に係るキットの具体的な一態様として、図１に示すｓｉＲＮＡをＲＮＡ干渉核酸として含む構成であってもよい。これらのｓｉＲＮＡは、ヒトＨｅＬａ細胞の小胞体膜関連タンパク質をＲＮＡ干渉の標的とするものであり、当該タンパク質の発現阻害ひいては機能阻害によって、タンパク質分泌・輸送機構における当該タンパク質の機能を網羅的に同定・解析することが可能となる。
【０１０２】
＜４．分泌・輸送機構関連タンパク質＞
本発明はまた、本発明の方法によって同定及び／又は機能解析された分泌機能関連タンパク質を提供する。
【０１０３】
本発明の分泌機能関連タンパク質は、好ましくは、小胞体構造に関与するタンパク質である。
後述の実施例１及び２において、下記の９種類の小胞体関連タンパク質が、小胞体の構造に関与するタンパク質として同定された。よって本発明の分泌機能関連タンパク質は、好ましくは下記の９種類のタンパク質である。
【０１０４】
（１）Ｓｅｃ６３Ｌ、（２）ＧｌｕｃｏｓｉｄａｓｅＩ、（３）ＰＡＰ２Ｂ、（４）ＥＲｄｊ５、（５）ＯＬＦＭ、（６）ＳＳＲ２、（７）ＧｌｕｃｏｓｉｄａｓｅＩＩ、（８）ＳＣＡＰ、及び（９）ＥＤＥＭ。
【０１０５】
本発明の一態様において、分泌機能関連タンパク質は、下記（１）〜（４）のいずれか１つから選択される：
（１）配列番号１記載のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（２）配列番号１記載のアミノ酸配列において一または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、分泌・輸送機構に関与する生物学的機能を奏するタンパク質；
（３）配列番号２記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質；並びに
（４）配列番号２記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列において一または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、分泌・輸送機構に関与する生物学的機能を奏するタンパク質。
【０１０６】
上記（１）のタンパク質は、ヒトのいわゆるオルファクトメジン１（Ｏｌｆａｃｔｏｍｅｄｉｎ１：以下、「ＯＬＦＭ」と表記することがある）である（Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｎｅｒｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｏｍｐｉｌｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ＤＮＡ  Ｒｅｓ．  ３  （５），  ３１１−３２０  （１９９６））。ＯＬＦＭについて、そのアミノ酸配列（配列番号１）がＮＣＢＩ  ｒｅｆｓｅｑ：ＮＰ＿０５５０９４として登録されており、また、これをコードする塩基配列（配列番号２）を含むｍＲＮＡの塩基配列がＮＭ＿０１４２７９．２として登録されている。
【０１０７】
ＯＬＦＭは、小胞体に局在するタンパク質として、あるいは、脳で顕著に発現するタンパク質として知られているが、その機能については、これまでのところ未知であった。ＯＬＦＭの由来となる生物種としては、例えば、哺乳動物（ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ等）、酵母、昆虫等が挙げられる。なお、本発明では、登録された公知のＯＬＦＭと機能的に同等なタンパク質を包含する。このようなタンパク質には、例えば、ＯＬＦＭの変異体、アレル、バリアント、ホモログ、オルファクトメジンの部分ペプチド、または他のタンパク質との融合タンパク質等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０８】
ＯＬＦＭの変異体としては、配列番号１記載のアミノ酸配列において一若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる天然由来のタンパク質であって、配列番号１記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を挙げることができる。また、配列番号２記載の塩基配列でコードされるタンパク質であって、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質も、ＯＬＦＭの変異体として挙げることができる。ここでは、変異するアミノ酸数は限定されないが、通常、３０アミノ酸以内であり、好ましくは１５アミノ酸以内であり、さらに好ましくは５アミノ酸以内（例えば、３アミノ酸以内）であると考えられる。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えば、アミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｗ，Ｙ，Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ，Ｄ，Ｎ，Ｃ，Ｅ，Ｑ，Ｇ，Ｈ，Ｋ，Ｓ，Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｐ）,水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ，Ｔ，Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ，Ｍ）、カルボン酸およびアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ，Ｎ，Ｅ，Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ，Ｆ，Ｙ，Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字を表す）。あるアミノ酸配列に対する一または複数個のアミノ酸残基の欠失、付加および／または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することは当業者に公知である。また、「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、ＯＬＦＭと同等の生物学的機能や生化学的機能を有することを意図する。
【０１０９】
ＯＬＦＭの変異体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列と、少なくとも約７０％、好ましくは約８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。
【０１１０】
アミノ酸の同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算により決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．及びＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３，１９７０）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
【０１１１】
当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５．，ｐ．３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる相同性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。
【０１１２】
本発明において、好ましくは、ＯＬＦＭは、配列番号１又は配列番号１と少なくとも７０％の同一のアミノ酸配列を有しており、そして、当該ＯＬＦＭの生物学的機能を有する。
【０１１３】
同一の機能を有するタンパク質であっても、由来する品種の相違によって、そのアミノ酸配列に相違が存在しうることは当業者にとって周知の事実である。ＯＬＦＭの機能を有する限り、ＯＬＦＭ遺伝子は配列番号２の塩基配列のこのような相同体、変異体も含みうる。よって、ＯＬＦＭは、配列番号２記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質、あるいは配列番号２記載の塩基配列と、少なくとも約７０％、好ましくは約８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列でコードされるアミノ酸配列を含み、ＯＬＦＭの生物学的機能を奏するタンパク質を含む。塩基配列の同一性（相同性）の算出手法は、ＲＮＡ干渉核酸について上述した通りである。
【０１１４】
「ＯＬＦＭの機能」とは、具体的には、発明者が見出した、分泌・輸送機構に関与する機能、特に、当該タンパク質の小胞体網状構造形成および／または維持に関する機能である。実施例で後述する図８および１０に示すように、ＯＬＦＭの発現および機能を阻害すると、小胞体の網状構造に異常が生じる。この場合の網状構造の異常とは、視覚的に網密度の減少や空隙率の増加等として確認できる。さらに、カーゴ分泌系タンパク質の正しい細胞内移行及び分泌が妨げられる。
【０１１５】
別の態様において本発明に係るタンパク質の分泌・輸送機構に関与する小胞体関連タンパク質は、下記（１）〜（４）のいずれか１つから選択される：
（１）配列番号３記載のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（２）配列番号３記載のアミノ酸配列において一または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、分泌・輸送機構に関与する生物学的機能を奏するタンパク質；
（３）配列番号４記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質；並びに
（４）配列番号４記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列において一または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、分泌・輸送機構に関与する生物学的機能を奏するタンパク質。
【０１１６】
上記（１）のタンパク質は、ヒトホスファチジル酸ホスファターゼ２Ｂ型（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｔｙｐｅ  ２Ｂ：以下、「ＰＡＰ２Ｂ」と表記することがある）である（Ｋａｉ，  Ｍ．，  Ｗａｄａ，  Ｉ．，  Ｉｍａｉ，  Ｓ．，  Ｓａｋａｎｅ，  Ｆ．  ａｎｄ  Ｋａｎｏｈ，  Ｈ．  （１９９７）  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｈｕｍａｎ  ｉｓｏｚｙｍｅｓ  ｏｆ  Ｍｇ２＋−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２７２，  ２４５７２−２４５７８）。ＰＡＰ２Ｂについて、そのアミノ酸配列（配列番号３）がＮＣＢＩ  ｒｅｆｓｅｑ：ＮＰ＿００３７０４として登録されており、また、これをコードする塩基配列（配列番号４）を含むｍＲＮＡの塩基配列がＮＭ＿００３７１３．３として登録されている。
【０１１７】
ＰＡＰ２Ｂは、小胞体に局在するタンパク質であり、リン脂質ヒドロラーゼファミリーのメンバーであり、親油性化合物に対して幅広い基質特異性を示す。この幅広い基質スペクトラムのため、細胞内及び細胞間のシグナル伝達におけるその機能が示唆されている。しかしながら本発明前は、その生理学的な機能は長年の研究にかかわらず明らかにされていなかった。
【０１１８】
ＰＡＰ２Ｂの由来となる生物種としては、例えば、哺乳動物（ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ等）、酵母、昆虫等が挙げられる。なお、本発明では、登録された公知のＰＡＰ２Ｂタンパク質と機能的に同等なタンパク質を包含する。このようなタンパク質には、例えば、ＰＡＰ２の変異体、アレル、バリアント、ホモログ、オルファクトメジンの部分ペプチド、または他のタンパク質との融合タンパク質等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
ＰＡＰ２Ｂの変異体としては、配列番号３記載のアミノ酸配列において一若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる天然由来のタンパク質であって、配列番号３記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を挙げることができる。また、配列番号４記載の塩基配列でコードされるタンパク質であって、配列番号４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質も、ＰＡＰ２Ｂの変異体として挙げることができる。変異するアミノ酸数、アミノ酸の種類等は、ＯＬＦＭと同様である。
【０１２０】
あるアミノ酸配列に対する一または複数個のアミノ酸残基の欠失、付加および／または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することは当業者に公知である。また、「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、ＰＡＰ２Ｂと同等の生物学的機能や生化学的機能を有することを意図する。
【０１２１】
ＰＡＰ２Ｂの変異体は、配列番号３に記載のアミノ酸配列と、少なくとも約７０％、好ましくは約８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。アミノ酸の同一性パーセントの算出手法は上述した通りである。
【０１２２】
本発明において、好ましくは、ＰＡＰ２Ｂは、配列番号３又は配列番号３と少なくとも７０％の同一のアミノ酸配列を有しており、そして、当該ＰＡＰ２Ｂの生物学的機能を有する。
【０１２３】
同一の機能を有するタンパク質であっても、由来する品種の相違によって、そのアミノ酸配列に相違が存在しうることは当業者にとって周知の事実である。ＰＡＰ２Ｂの機能を有する限り、ＰＡＰ２Ｂ遺伝子は配列番号４の塩基配列のこのような相同体、変異体も含みうる。よって、ＰＡＰ２Ｂは、配列番号４記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質、あるいは配列番号４記載の塩基配列と、少なくとも約７０％、好ましくは約８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列でコードされるアミノ酸配列を含み、ＰＡＰ２Ｂの生物学的機能を奏するタンパク質を含む。塩基配列の同一性（相同性）の算出手法は、ＲＮＡ干渉核酸について上述した通りである。
【０１２４】
「ＰＡＰ２Ｂの機能」とは、具体的には、発明者が見出した、分泌・輸送機構に関与する機能である。具体的には例えば、実施例で後述するように、ＰＡＰ２Ｂの発現及び活性阻害においても、ＯＬＦＭと同様に、ＴＹＲ−ＹＦＰの３２度での小胞体への蓄積と、ゴルジ膜タンパク質の小胞体への局在が起きる。
【０１２５】
また別の態様において本発明に係るタンパク質の分泌・輸送機構に関与する小胞体関連タンパク質は、下記（１）〜（４）のいずれか１つから選択される：
（１）配列番号５記載のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（２）配列番号５記載のアミノ酸配列において一または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、分泌・輸送機構に関与する生物学的機能を奏するタンパク質；
（３）配列番号６記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質；並びに
（４）配列番号６記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列において一または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を含み、分泌・輸送機構に関与する生物学的機能を奏するタンパク質。
【０１２６】
上記（１）のタンパク質は、ＳＲＥＢＰ切断活性化タンパク質（ＳＲＥＢＰ  ｃｌｅａｖａｇｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ：以下、「ＳＣＡＰ」と表記することがある）である（Ｈｕａ，Ｘ．，  Ｎｏｈｔｕｒｆｆｔ，Ａ．，  Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｓ．Ｓｔｅｒｏｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒａｃｅｄ  ｔｏ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＳＲＥＢＰ  ｃｌｅａｖａｇｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  Ｃｅｌｌ  ８７  （３），  ４１５−４２６  （１９９６））。ＳＣＡＰについて、そのアミノ酸配列（配列番号５）がＮＣＢＩ  ｒｅｆｓｅｑ：ＮＰ＿０３６３６７として登録されており、また、これをコードする塩基配列（配列番号６）を含むｍＲＮＡの塩基配列がＮＭ＿０１２２３５．２として登録されている。
【０１２７】
ＳＣＡＰは、小胞体に局在するタンパク質であり、コレステロール合成に必要な一群の遺伝子のための膜固着転写因子であるＳＲＥＢＰのためのエスコートタンパク質である。ＳＣＡＰは、小胞体膜中におけるコレステロールの濃度を、コレステロールに結合して構造を直接変化させ、次いでＳｅｃ２４に対するその親和性を減ずることによって探知する。この膜タンパク質は、合成直後にＳＲＥＢＰと作用し、Ｓｅｃ２４に結合する。ＳＣＰＡの助けで運び出されたＳＲＥＢＰは、タンパク質分解によって加工され、次いで放出された転写因子が核内に入りコレステロール合成を活性化する。
【０１２８】
ＳＣＡＰの由来となる生物種としては、例えば、哺乳動物（ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ等）、酵母、昆虫等が挙げられる。なお、本発明では、登録された公知のＳＣＡＰタンパク質と機能的に同等なタンパク質を包含する。このようなタンパク質には、例えば、ＳＣＡＰの変異体、アレル、バリアント、ホモログ、オルファクトメジンの部分ペプチド、または他のタンパク質との融合タンパク質等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２９】
ＳＣＡＰの変異体としては、配列番号５記載のアミノ酸配列において一若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる天然由来のタンパク質であって、配列番号５記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を挙げることができる。また、配列番号６記載の塩基配列でコードされるタンパク質であって、配列番号６記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質も、ＳＣＡＰの変異体として挙げることができる。変異するアミノ酸数、アミノ酸の種類等は、ＯＬＦＭ等と同様である。
【０１３０】
あるアミノ酸配列に対する一または複数個のアミノ酸残基の欠失、付加および／または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することは当業者に公知である。また、「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、ＳＣＡＰと同等の生物学的機能や生化学的機能を有することを意図する。
【０１３１】
ＳＣＡＰの変異体は、配列番号５に記載のアミノ酸配列と、少なくとも約７０％、好ましくは約８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。アミノ酸の同一性パーセントの算出手法は上述した通りである。
【０１３２】
本発明において、好ましくは、ＳＣＡＰは、配列番号５又は配列番号５と少なくとも７０％の同一のアミノ酸配列を有しており、そして、当該ＳＣＡＰの生物学的機能を有する。
【０１３３】
同一の機能を有するタンパク質であっても、由来する品種の相違によって、そのアミノ酸配列に相違が存在しうることは当業者にとって周知の事実である。ＳＣＡＰの機能を有する限り、ＳＣＡＰ遺伝子は配列番号６の塩基配列のこのような相同体、変異体も含みうる。よって、ＳＣＡＰは、配列番号６記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質、あるいは配列番号６記載の塩基配列と、少なくとも約７０％、好ましくは約８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列でコードされるアミノ酸配列を含み、ＳＣＡＰの生物学的機能を奏するタンパク質を含む。塩基配列の同一性（相同性）の算出手法は、ＲＮＡ干渉核酸について上述した通りである。
【０１３４】
「ＳＣＡＰの機能」とは、具体的には、発明者が見出した、分泌・輸送機構に関与する機能、特に、当該タンパク質の小胞体網状構造形成および／または維持に関する機能である。具体的には例えば、実施例で後述するように、ＳＣＡＰの発現及び活性阻害においても、ＯＬＦＭと同様に、ＴＹＲ−ＹＦＰの３２度での小胞体への蓄積が起きる。
【０１３５】
＜５．タンパク質分泌・輸送機構の制御方法＞
本発明に係るタンパク質分泌・輸送機構の制御方法は、本発明において同定された分泌・輸送機構関連タンパク質の機能阻害を抑制することを含む。好ましくは、図２に示す９種類の小胞体膜関連タンパク質のうちいずれかの機能阻害を抑制するものである。
【０１３６】
実施例で後述するが、図２に示す小胞体膜関連タンパク質の機能が阻害されると、当該小胞体膜関連タンパク質の発現系では、＜１＞で前述したように、小胞体自体の構造（具体的には、網状構造）の形成および保持に関わる機構や、分泌系タンパク質の成熟（具体的には、立体構造形成や輸送等）に関わる機構に異常が生じる。その結果、図７、８および１０に示すように、当該異常に起因する表現型の変化、具体的には小胞体構造の異常、が生じる。このような小胞体膜関連タンパク質の機能阻害に伴う異常は、タンパク質分泌・輸送機構に負の影響を与え、機構の制御不全等が生じて正常なタンパク質分泌が行われなくなる。そして、このような分泌異常は、疾患を引き起こすおそれもある。
【０１３７】
例えば、「小胞体膜関連タンパク質の機能障害」として広く知られた疾患の例は、アルツハイマーやパーキンソンやハンチングトン病等の神経変性疾患である（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ａ．  Ｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｈｅｌｌｅ  Ａ．  Ｐｏｉｒｉｅｒ．  Ｗｈａｔ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ？  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．  ６（１１）  ｐｐ８９１−８９８，（２００５））。神経系以外でも間質性肺炎（Ｂｒｉｄｇｅｓ  ＪＰ，  Ｗｅｒｔ  ＳＥ、  Ｎｏｇｅｅ  ＬＭ，  Ｗｅａｖｅｒ  ＴＥ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｌｕｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｓ  ｌｕｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００３；２７８（５２）：５２７３９−５２７４６）等、分泌がうまく起こらず細胞内に蓄積する疾患の多くと関連している。これらは主に特定遺伝子に凝集しやすい変異が起きることで引き起こされる場合である、あるいは、虚血、即ち、血液循環不全によっても、小胞体の構造自体に変化が起こり（Ｂａｎｎｏ  Ｔ，  Ｋｏｈｎｏ  Ｋ．  Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．  １９９６  Ｊｕｎ  ３；３６９（３）：４６２−７１．  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｏｆ  ｓｍｏｏｔｈ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｂｒｉｅｆ  ａｎｏｘｉａ  ｉｎ  ｒａｔ  Ｐｕｒｋｉｎｊｅ  ｃｅｌｌｓ．）、分泌不全を引き起こす事（例えばＪ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００４  ２７９（２１）：２１７２４−３１．  Ａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｃａｕｓｅｓ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ／ｏｘｙｇｅｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｓｔｒｅｓｓ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ．  Ｆｌｏｒｅｓ−Ｄｉａｚ  Ｍ，  Ｈｉｇｕｉｔａ  ＪＣ，  Ｆｌｏｒｉｎ  Ｉ，  Ｏｋａｄａ  Ｔ，  Ｐｏｌｌｅｓｅｌｌｏ  Ｐ，  Ｂｅｒｇｍａｎ  Ｔ，  Ｔｈｅｌｅｓｔａｍ  Ｍ，  Ｍｏｒｉ  Ｋ，  Ａｌａｐｅ−Ｇｉｒｏｎ  Ａ．）等が知られている。また、本明細書の実施例で用いたチロシナーゼ自体も、メラニン合成異常疾患（眼・皮膚白皮症）の原因遺伝子で、これらの疾患では小胞体へのチロシナーゼの蓄積が起こる（Ｔｏｙｏｆｕｋｕ  Ｋ，  Ｗａｄａ  Ｉ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ  ＪＣ，  Ｋｕｓｈｉｍｏｔｏ  Ｔ，  Ｆｅｒｒａｎｓ  ＶＪ，  Ｈｅａｒｉｎｇ  ＶＪ．  Ｏｃｕｌｏｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ａｌｂｉｎｉｓｍ  ｔｙｐｅｓ  １  ａｎｄ  ３  ａｒｅ  ＥＲ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ  ｏｒ  Ｔｙｒｐ１  ｃａｎ  ａｆｆｅｃｔ  ｔｈｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  ｍｕｔａｎｔ  ａｎｄ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２００１  Ｏｃｔ；１５（１２）：２１４９−���１．）。
【０１３８】
本発明では、機能阻害によりタンパク質分泌・輸送機構に異常を生じさせるような、図２の小胞体膜関連タンパク質の機能阻害について、その機能阻害を抑制し、当該タンパク質機能の正常化を図る。それにより、タンパク質分泌・輸送機構を正常な状態に調整することが可能となり、タンパク分泌の正常化が図られる。このような効果を奏する本発明の方法は、例えば、タンパク質分泌・輸送機構の異常に起因する疾患の予防および治療等に応用することができる。
【０１３９】
タンパク質機能の阻害を抑制する手段は、特には限定されず、公知手段の中から適切な手段を適宜用いることができる。例えば、タンパク質の機能阻害は、当該タンパク質をコードする遺伝子の異常（欠失、置換、付加等）により、タンパク質が発現が喪失または減少する、あるいはタンパク質の生物学的機能が喪失する、ことによって生じうる。このような場合、正常なアミノ酸配列を有する分泌・輸送機構関連タンパク質を発現可能なように、正常な遺伝子を含む構成された発現ベクター等により導入してもよい。組換えタンパク質の発現は公知の方法によって行うことが可能である。ベクターの導入によりタンパク質を正常に発現および機能させることが可能となり、それにより、タンパク質分泌・輸送機構の正常化が図られる。あるいは、本発明の組換えタンパク質を、好ましくは医薬組成物として、分泌・輸送機構タンパク質の生物学的機能が喪失することに起因する疾患を予防又治療するために、対象に投与してもよい。
【０１４０】
＜６．医薬組成物＞
本発明によって、タンパク質分泌・輸送機構に関与する分泌・輸送機構関連タンパク質及び当該タンパク質をコードする遺伝子が、新たに同定された。本発明のタンパク質及び／又は遺伝子は、医薬組成物として使用可能である。
【０１４１】
本発明の医薬組成物は、例えば、上述したような＜５．タンパク質分泌・輸送機構の制御方法＞に記載したような、タンパク質分泌・輸送機構の異常に起因する疾患を、予防および治療する方法のために使用することができる。
【０１４２】
本発明の医薬組成物は、分泌・輸送機構関連タンパク質を含んでよく、あるいは、組換え分泌・輸送機構関連タンパク質を発現させるために、分泌・輸送機構関連タンパク質をコードする遺伝子を含んだ発現ベクターを含んでもよい。
【０１４３】
本発明の医薬組成物は、全身または局所的に、好ましくは静脈内、皮下、皮内、筋肉内に非経口的に、あるいは経口的に投与しうる。非経口的に投与可能な本発明の医薬組成物の調製は、ｐＨ、等張性、安全性等を考慮し、当業者の技術範囲内において行い得る。
【０１４４】
本発明の医薬組成物の用量用法は、医薬組成物の作用、例えば、患者の症状の性質および／または重度、体重、性別、食事、投与の時間、並びに他の臨床的作用を左右する種々の因子を考慮し、診察する医師により決定される。当業者は、これらの要素に基づき、本発明の組成物の用量を決定することができる。
【０１４５】
本発明の医薬組成物は、所望により医薬的に受容可能な希釈剤、担体、賦形剤等を含んでよい。例えば、これらは液体希釈剤および／または担体を含む組成物、例えばしばしば非経口投与の為に注射可能な形態をとり、そしてその為に滅菌され発熱物質を含まない、水性又は油性の溶液、懸濁液若しくは乳液として適用しても良い。経口投与目的の医薬組成物は、液体希釈剤若しくは担体を含んでいても良いが、固体、例えば澱粉、ラクトース、デキストリン若しくはステアリン酸マグネシウムのような慣用された固体担体物質、を使用するのが更に一般的である。このような固体組成物は、例えば錠剤、カプセル（スパンスルを含む）等のように、適宜に成型されたものであっても良い。本発明の医薬組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散別または安定化剤（例えばアルギニン、アスパラギン酸など）などの補助剤を含んでいてもよい。
【０１４６】
このようにして得られる医薬組成物の剤形としては、使用する用途に応じて決めればよく、上記のような添加物と混合し、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、液剤、乳剤等の形態により添付することができる。
【０１４７】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらも本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１４８】
以下、実施例に基づき、本発明についてさらに詳細に説明する。なお、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１
実施例１では、蛍光プローブであるＹＦＰを膜構成成分として含む小胞体を有するＨｅＬａ細胞（ヒトの子宮頸癌細胞）を発現系として用いた。当該細胞において、図１に示すように、ｓｉＲＮＡにより、各種の小胞体膜関連タンパク質の機能阻害を行った。そして、かかる機能阻害により生じる表現型の変化（具体的には、小胞体の構造変化）から、小胞体膜関連タンパク質の機能の同定・解析を行った。以下、詳細を述べる。
【０１４９】
＜１＞ＥＲｍ−ＹＦＰを発現するＨｅＬａ細胞の調製
ＹＦＰをコードする遺伝子（以下、「ＹＦＰ遺伝子」と呼ぶ）が外部から導入され当該ＹＦＰ遺伝子を安定発現するＨｅＬａ細胞を発現系として用いた。このＨｅＬａ細胞では、導入したＹＦＰ遺伝子由来のＹＦＰが、小胞体の膜構成タンパク質として発現する。ＹＦＰを発現するＨｅＬａ細胞の調製に際しては、ｐＥＹＦＰベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅおよびＰｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてＨｅＬａ細胞に導入した。
【０１５０】
＜２＞細胞培養
上記＜１＞で得られたＹＦＰを発現するＨｅＬａ細胞の培養は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）で培養した。この培地は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ社製）、ＭＥＭ  Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、および炭酸水素ナトリウム（ナカライテスク社製）を混合して調製される。このような培地中で、ＨｅＬａ細胞を３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。
【０１５１】
＜３＞ｓｉＲＮＡの作製
ここではまず、データベース「Ｈｅｒａ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｃｂ．ｍｃｇｉｌｌ．ｃａ／〜ｈｅｒａ／ ｄｂ＿ａｃｃｅｓｓ／参照）より、図１に示す小胞体膜関連タンパク質情報、特に、当該タンパク質をコードする遺伝子の情報を取得した。そして、得られた遺伝子情報に基づき、本発明のＲＮＡ干渉核酸である図１のｓｉＲＮＡ（株式会社ＲＮＡｉ社製）を用意した。具体的には、図１に示すように、各小胞体膜関連タンパク質について、ＲＮＡ干渉の最適標的である規定配列を選択し、かかる規定配列に基づいて、図１の塩基配列を有するセンス鎖およびアンチセンス鎖から構成されるｓｉＲＮＡを用意した。また、ネガティブコントロール（以下、単に「コントロール」と呼ぶ）として、下記塩基配列を有するｓｉＲＮＡを用意するとともに、ＹＦＰに対してＲＮＡ干渉を生じさせる下記塩基配列を有するｓｉＲＮＡ（ＹＦＰ−ｓｉＲＮＡ）を用意した。
【０１５２】
ネガティブコントロールｓｉＲＮＡ
センス鎖（５’→３’）
ＧＵＡＣＣＧＣＡＣＧＵＣＡＵＵＣＧＵＡＵＣ  （配列番号１９３）
アンチセンス鎖（５’→３’）
ＵＡＣＧＡＡＵＧＡＣＧＵＧＣＧＧＵＡＣＧＵ  （配列番号１９４）
ＹＦＰに対するｓｉＲＮＡ
センス鎖（５’→３’）
ＧＡＣＧＵＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＵＵＣ  （配列番号１９５）
アンチセンス鎖（５’→３’）
ＡＣＵＵＧＵＧＧＣＣＧＵＵＵＡＣＧＵＣＧＣ  （配列番号１９６）
使用するｓｉＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖とを、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭのＮａＣｌ反応溶液中、９０℃で３分間加熱し、そして、３７℃で１時間インキュベートした後に、室温になるまで放置して会合させることにより作製した。これらのｓｉＲＮＡについては、２％アガロースゲルで電気泳動させることにより、センス鎖とアンチセンス鎖との会合を確認した。
【０１５３】
＜４＞ｓｉＲＮＡのＨｅＬａ細胞への導入
各ｗｅｌｌの底部にカバーガラスを予め配置した２４ｗｅｌｌプレートに、ＨｅＬａ細胞を５×１０４細胞／ｗｅｌｌの密度で播いた。そして、１／１０００コラーゲンを含む上記の１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地を用い、前述の細胞培養条件でＨｅＬａ細胞を２４時間培養した。その後、培地を置換して２時間維持し、１ｗｅｌｌにつき、２５ｎＭのｓｉＲＮＡを導入した。導入に際しては、導入試薬としてＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、当該試薬とｓｉＲＮＡとを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を細胞培地へ添加して３７℃で３日間培養した。
【０１５４】
＜５＞リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法による解析
ｓｉＲＮＡ導入から２４時間後に細胞を回収し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により、図１の各小胞体膜関連タンパク質をコードする遺伝子（すなわち対象タンパク質コード遺伝子）の発現を調べた。ここでは、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と適切なプライマー対とを用いて、逆転写により対象タンパク質コード遺伝子由来のｃＤＮＡを取得してＰＣＲで増幅させて発現を測定した（９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒を４０ｃｙｃｌｅ）。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおける測定データの収集および分析は、ＡＢＩ  ＰＲＩＺＭ７９００ＨＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｙｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、これらをマニュアルに従って操作し定量的ＰＣＲを行った。この場合、ＨｅＬａ細胞の内在遺伝子であるＧＡＰＤＨを内部コントロールとして利用し、ＧＡＰＤＨについて対象タンパク質コード遺伝子の場合と同様の操作を行った。そして、ＧＡＰＤＨの検出結果に基づき、対象タンパク質コード遺伝子の測定結果を標準化した。
【０１５５】
＜６＞顕微鏡観察
ｓｉＲＮＡ導入から３日後の細胞を回収し、当該細胞を、共焦点レーザ顕微鏡（ＬＳＭ５１０ＭＥＴＡ  ＣｏｎｆｏＣｏｒ２：Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社製）を用いた蛍光顕微鏡観察に供した。この場合、プレートのｗｅｌｌ底部に配置したカバーガラスに付着させた状態でカバーガラスごと細胞を回収し、当該カバーガラスと別途用意したカバーガラスとの間に細胞を挟持させて顕微鏡観察を行った。観察では、励起波長４５８ｎｍ、蛍光波長５１４ｎｍの下、ＹＦＰが生じる蛍光シグナルを検出することにより行った。
【０１５６】
＜７＞結果
図３〜図５は、ｓｉＲＮＡ導入後に実施したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。詳細には、図３はＢＡＰについて、図４はＫｉｎｅｃｔｉｎ１（ＫＴＮ１）について、図５はＯｌｆａｃｔｏｍｅｄｉｎ（ＯＬＦＭ）についてそれぞれ示している。図３〜図５において、縦軸は、コントロールにおけるｍＲＮＡ量を１とした相対値を示す。図３〜図５に示すように、対象タンパク質コード遺伝子であるＢＡＰ、ＫＴＮ１およびＯＬＦＭは、ｓｉＲＮＡ導入により、当該遺伝子に由来するｍＲＮＡが顕著に減少する。このことから、これらの対象タンパク質コード遺伝子、ひいては小胞体膜関連タンパク質は、ｓｉＲＮＡによりその発現が阻害されることが明らかとなった。
【０１５７】
また、後述の実施例３及び図１３に示すように、ＢＡＰ、ＫＴＮ１およびＯＬＦＭ以外の図１記載の小胞体膜関連タンパク質８種についても、ｍＲＮＡ量の減少が顕著に確認された。
【０１５８】
以上のことから、図１、図１３に示すように、配列番号７〜配列番号９９に示す各ｓｉＲＮＡは、対応する小胞体膜関連タンパク質について、その発現を有意に阻害することが明らかとなった。
【０１５９】
図６〜図８は、ｓｉＲＮＡ導入後に実施した顕微鏡観察の結果を示す図である。図６はＢＡＰについて示しており、図７はＫＴＮ１について示しており、図８はＯＬＦＭについて示している。これら各図において、左図（ａ）は、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡを導入した場合を示しており、一方、右図（ｂ）は、各対象タンパク質コード遺伝子ＢＡＰ、ＫＴＮ１、ＯＬＦＭに対応するｓｉＲＮＡを導入した場合について示している。これらの図において、白く表示されている部分が蛍光で現れている部分である。前述のように、蛍光シグナルは小胞体膜で発現するＹＦＰに由来するものであることから、蛍光シグナルを検出することにより、小胞体の形態、具体的には、小胞体網状構造や小胞体管腔経路の状態等を可視化して視覚的にとらえることが可能となる。また、図中において、蛍光を示す小胞体に囲まれ黒く表示されている略円形の部分は、各細胞の核である。ここでは、蛍光シグナルから把握される小胞体の形態を、コントロールの場合（左図（ａ）参照）と目的タンパク質阻害の場合（右図（ｂ）参照）とで比較することにより、ＢＡＰ、ＫＴＮ１およびＯＬＦＭの発現を阻害した場合に生じる小胞体の形態変化（言い換えれば、表現型の変化）が明らかとなる。
【０１６０】
図６（ａ）および（ｂ）に示すように、ＢＡＰについては、その発現阻害の有無に関わらず、有意な小胞体の形態変化が見られなかった。かかる結果と、図３で前述したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの発現阻害結果、ならびに、小胞体構造の変化が小胞体構造の形成・維持の異常または分泌系タンパク質の成熟過程の異常に起因することをふまえると、小胞体膜関連タンパク質の一つであるＢＡＰは、小胞体構造の形成・維持や分泌系タンパク質の成熟過程への関与が少ないことが示唆された。
【０１６１】
一方、図７（ａ）および（ｂ）に示すように、ＫＴＮ１については、その発現を阻害すると、小胞体の縮小（具体的には、網状構造の広がりの抑制や管腔経路の縮小・閉塞等）が有意に生じた。したがって、小胞体膜関連タンパク質の一つであるＫＴＮ１は、小胞体構造の形成・維持に関与する分子であることが示唆された。
【０１６２】
また、図８（ａ）および（ｂ）に示すように、ＯＬＦＭについては、その発現を阻害すると、小胞体網状構造に異常（具体的には、網状構造における網密度の減少や空隙率の増加等）が有意に生じた。したがって、小胞体膜関連タンパク質の一つであるＯＬＦＭは、小胞体構造の形成・維持や分泌系タンパク質の成熟過程に関与する分子であることが示唆される。
【０１６３】
ところで、ここではＹＦＰの蛍光シグナルに基づいて小胞体の形態を検知することから、蛍光シグナルの分布状態や消失の有無は、非常に重要である。例えば、解析対象とするタンパク質の発現阻害により小胞体構造に異常が生じて蛍光シグナルが消失するのであれば、当該消失に基づき小胞体構造へのタンパク質の関与を確認することができるが、解析対象とするタンパク質の発現阻害とは関係無く蛍光シグナルの消失が生じると、当該消失にゆえに小胞体構造へのタンパク質の関与を誤判断するおそれがある。例えば、目的タンパク質の阻害の為に導入したｓｉＲＮＡが当該タンパク質以外にＹＦＰに対しても阻害（いわゆるｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果）を生じる場合には、蛍光シグナルから検出される小胞体構造の変化が目的タンパク質の阻害効果を正確に反映せず、よって、当該タンパク質の機能を正確に同定・解析することができない。
【０１６４】
そこで、ＹＦＰ蛍光シグナルの分布の変化・消失が、阻害を目的とする小胞体膜関連タンパク質のＲＮＡ干渉に起因するものであるか否かを確認する為、ＹＦＰ自体に対応するｓｉＲＮＡを用いてＹＦＰの発現阻害を行った。図９は、ＹＦＰの発現を阻害した場合の顕微鏡観察結果を示す図である。図９に示すように、ｓｉＲＮＡによりＹＦＰの発現を阻害すると（下図）、ＹＦＰに対する阻害を行わない場合（上図：ここでは、ネガティブコントロールを導入した場合に相当）に比べて、蛍光が顕著に消失する。このＹＦＰ発現阻害による蛍光の消失は、図６（ｂ）、図７（ｂ）および図８（ｂ）に示す前述のＢＡＰ、ＫＴＮ１およびＯＬＦＭの発現阻害による蛍光状態の変化とは明らかに異なっている。このことから、ＢＡＰ、ＫＴＮ１およびＯＬＦＭの発現阻害による蛍光状態の変化は、ＹＦＰ発現阻害の影響を受けない、ＢＡＰ、ＫＴＮ１およびＯＬＦＭの小胞体構造への関与に起因するものであることが確認された。
【０１６５】
なお、ここでは結果の図示を省略しているが、図１記載の９３種の小胞体膜関連タンパク質についてｓｉＲＮＡによる発現阻害およびそれに伴う小胞体構造の変化の観察を行ったところ、特に、ＯＬＦＭ及びＫＴＮ１の発現を阻害した場合に、小胞体構造に有意な変化が生じることが明らかとなり、その他９１種タンパク質の発現阻害による表現型の変化は見出されなかった。このことから、これらのタンパク質は、タンパク質分泌・輸送機構における小胞体構造の形成・維持に関与するタンパク質であることが示唆された。特に、ＯＬＦＭの発現を阻害した場合に小胞体網状構造に生じる異常が顕著であることが明らかとなった。このように、本発明により、これまでは機能が未知であったＯＬＦＭが、小胞体構造に関与してタンパク質分泌機能を担うことが示唆された。
【０１６６】
実施例２
実施例２では、蛍光プローブであるＹＦＰと一体的にチロシナーゼ（Ｔｙｒ）が発現するよう構築された、ＣＯＳ細胞（サルの腎臓細胞）を発現系として用いた。当該細胞において、実施例１の場合と同様、図１に示すように、各ｓｉＲＮＡにより各小胞体膜関連タンパク質の機能阻害を行った。そして、かかる機能阻害により生じる表現型の変化（具体的には、Ｔｙｒの細胞内局在部位）から小胞体膜関連タンパク質の機能の同定・解析を行った。図１２に、本実施例の模式図を示す。
【０１６７】
以下、詳細を述べる。
＜１＞Ｔｙｒ−ＹＦＰを発現するＣＯＳ細胞の調製
一体的に発現するよう構築したＹＦＰをコードする遺伝子（以下、「ＹＦＰ遺伝子」と呼ぶ）とＴｙｒをコードする遺伝子（以下、「Ｔｙｒ遺伝子」と呼ぶ）とを、ＣＯＳ細胞に外部から導入し、ＹＦＰとＴｙｒとが一体的に発現する、言い換えれば、蛍光プローブであるＹＦＰが付加されたＴｙｒ（以下、「Ｔｙｒ−ＹＦＰ」と表す）を安定発現するＣＯＳ細胞を調製した。Ｔｙｒ−ＹＦＰを発現するＣＯＳ細胞の調製に際しては、ベクターを用いてＹＦＰ遺伝子およびＴｙｒ遺伝子の導入を行った。
【０１６８】
具体的には、まず、Ｔｙｒ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ：Ｍ２７１６０）のコード領域における５０３−２０９２に相当する塩基配列をｐＥＹＥＰベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）も挿入して構築した。
【０１６９】
続いて、構築したベクターを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてＣＯＳ細胞に導入した。
＜２＞細胞培養
上記＜１＞で得られたＹＦＰ−Ｔｙｒを発現するＣＯＳ細胞の培養は、実施例１の＜２＞細胞培養で前述した培地により培養を用いた。培養条件は、３９℃、５％ＣＯ２存在下とした。
【０１７０】
＜３＞ｓｉＲＮＡの作製
実施例１と同様、図１に示す小胞体膜関連タンパク質の発現をそれぞれ抑制する各ｓｉＲＮＡ、ネガティブコントロールのｓｉＲＮＡ、ＹＦＰに対するｓｉＲＮＡを用いた。これらのｓｉＲＮＡの作製については、実施例１の＜３＞で前述した通りである。
【０１７１】
＜４＞ｓｉＲＮＡのＣＯＳ細胞への導入
ｓｉＲＮＡの導入については、以下の点を除いて、実施例１の＜４＞で前述した通りである。異なる点のみ説明すると、実施例２では、導入試薬としてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、当該試薬とｓｉＲＮＡとを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を細胞培地へ添加して３９℃で３日間培養した。そして、当該培養後、さらに３２℃で５時間培養した。
【０１７２】
＜５＞リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法による解析
上記３２℃での５時間培養後に細胞を回収し、実施例１と同様にしてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法による解析を行った。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法の操作等については、実施例１の＜５＞で前述した通りである。
【０１７３】
＜６＞顕微鏡観察
上記３２℃での５時間培養後に細胞を回収し、実施例１と同様にして蛍光顕微鏡観察を行った。観察方法の詳細については、実施例１の＜６＞で前述した通りである。
【０１７４】
＜７＞結果
図１０は、ｓｉＲＮＡ導入後に実施した顕微鏡観察の結果を示す図である。図１０の「Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ」は、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡの結果を示している。また、図１０のその他は、小胞体膜関連タンパク質に対応するｓｉＲＮＡの結果を示しており、具体的には、順に、ＣＬＮ８、ＥＤＥＭ、ＥＲｄｊ５、ＧｌｕｃｏｓｉｄａｓｅＩ、ＧｌｕｃｏｓｉｄａｓｅＩＩ、Ｏｌｆａｃｔｏｍｅｄｉｎ１（ＯＬＦＭ）、ＰＡＰ２Ｂ、ＳＣＡＰ、Ｓｅｃ６３Ｌ、及びＳＳＲ２の結果である。
【０１７５】
これらの図において、白く表示されている部分が蛍光で現れている部分である。また、図中において、蛍光を示す小胞体に囲まれそのほぼ中央に黒く表示されている円形の部分は、各細胞の核である。前述のように、蛍光シグナルはＴｙｒと一体的に発現するＹＦＰ、すなわち、分泌系タンパク質たるＴｙｒ−ＹＦＰに由来するものである。このようなＴｙｒ−ＹＦＰは、リボゾームで生合成され、小胞体で立体構造形成等の処理を受けた後、小胞を形成して出芽する。出芽した小胞は、細胞質内を輸送されてゴルジ体に到達し、さらにここで糖修飾等の処理を適宜受ける。このような生合成後の一連の工程は成熟工程（あるいは成熟化）と呼ばれ、成熟したものは分泌顆粒として細胞膜へ到達し、さらに細胞外へ分泌される。小胞体膜関連タンパク質の発現が阻害されずそれゆえタンパク質分泌・輸送機構が正常に機能すると、Ｔｙｒ−ＹＦＰは正常な生合成、成熟および分泌工程を経る。
【０１７６】
ここでは、いずれの小胞体膜関連タンパク質の発現も阻害しない場合、すなわちネガティブコントロールｓｉＲＮＡを用いた場合を、タンパク質分泌・輸送機構が正常に機能した（言い換えれば、正常にＴｙｒ−ＹＦＰが分泌されリソソームへ移行した）と判断する。そして、この場合のＴｙｒ−ＹＦＰの蛍光シグナルの状態を基準とし、当該基準に基づいて、目的タンパク質の発現阻害を行った場合における相違を検出する。ここでは、蛍光シグナルより検出されるＴｙｒ−ＹＦＰの局在状態の変化が、表現型の変化に相当する。
【０１７７】
具体的には、正常にＴｙｒ−ＹＦＰが分泌されるネガティブコントロールｓｉＲＮＡの場合、Ｔｙｒ−ＹＦＰの蛍光シグナルは、図１０の左上に示す分布となる。詳細には、タンパク質分泌・輸送機構が正常に機能してＴｙｒ−ＹＦＰが正常に分泌されると、リソソームへ移行し、核の周辺領域に明らかなドット状の蛍光シグナルとして、Ｔｙｒ−ＹＦＰが観察される。ここでは、図１０のネガティブコントロールｓｉＲＮＡに示す蛍光シグナルの状態を基準とし、当該基準との比較に基づいて、以下のように小胞体膜関連タンパク質の機能を同定・解析している。
【０１７８】
例えば、図１０中の、小胞体膜関連タンパク質の一つであるＣＬＮ８を発現阻害した場合では、図１０のネガティブコントロールｓｉＲＮＡの蛍光シグナル状態に近い結果が示された。この結果から、ＣＬＮ８を発現阻害しても、タンパク質分泌・輸送機構は正常に機能することが示唆され、よって、ＣＬＮ８のタンパク質分泌・輸送機構への関与は少ないことが示唆された。
【０１７９】
これに対して、図１０の他の９種の小胞体膜関連タンパク質、即ち、ＥＤＥＭ、ＥＲｄｊ５、ＧｌｕｃｏｓｉｄａｓｅＩ、ＧｌｕｃｏｓｉｄａｓｅＩＩ、Ｏｌｆａｃｔｏｍｅｄｉｎ１（ＯＬＦＭ）、ＰＡＰ２ｂ、ＳＣＡＰ、Ｓｅｃ６３Ｌ、及びＳＳＲ２の各々を発現阻害した場合では、図１０のネガティブコントロールｓｉＲＮＡとは視覚的に明らかに異なる、細胞核周辺を取り囲む蛍光シグナル状態が示された。このような蛍光シグナルの状態は、Ｔｙｒ−ＹＦＰの小胞体内（具体的には、小胞体管腔経路内）への蓄積および局在化に起因すると推定される。図１０の結果から、上記各小胞体膜関連タンパク質を発現阻害すると、タンパク質分泌・輸送機構が正常に機能しなくなると推定され、よって、これらの小胞体膜関連タンパク質がタンパク質分泌・輸送機構へ有意に関与することが示唆された。
【０１８０】
ここでは結果の図示を省略しているが、図１記載の９３種の小胞体膜関連タンパク質についてｓｉＲＮＡによる発現阻害を行って顕微鏡観察したところ、図２記載の９種の小胞体膜関連タンパク質以外の発現阻害については、Ｔｙｒ−ＹＦＰの分布に有意な変化が見られなかった。したがって、当該９種以外の小胞体膜関連タンパク質は、当該９種類に比べて、タンパク質分泌・輸送機構への有意な関与が少ないことが示唆された。
【０１８１】
なお、図１記載の９３種の小胞体膜関連タンパク質のうちの数種について、ｓｉＲＮＡによる発現阻害（具体的には、ｍＲＮＡ量の減少）をＲＴ−ＰＣＲ法で調べたところ、図１記載の各ｓｉＲＮＡにより各タンパク質の発現が有意に阻害されることが明らかとなった（実施例３、図１３）。
【０１８２】
以上のことから、Ｔｙｒ−ＹＦＰの細胞内移行異常（すなわちタンパク質分泌・輸送機構の異常）は、上記９種の各小胞体膜関連タンパク質の発現阻害により生じるタンパク質の機能阻害によるものであることが明らかとなった。したがって、これら９種の小胞体膜関連タンパク質は、タンパク質分泌・輸送機構（より詳細には、当該機構のＴｙｒ成熟工程）に有意に関与することが明らかとなった。
【０１８３】
Ｔｙｒ−ＹＦＰの分泌が正常に行われない要因としては、例えば、小胞体膜関連タンパク質の機能阻害により、１）小胞体構造自体の異常（網状構造が正常に形成または維持されない）、２）タンパク質の立体構造形成が正常に行われない、３）ミスフォールドしたタンパク質の分解が正常に行わない、４）小胞体からのタンパク質排出が正常に行われない、のいずれかに起因してＴｙｒ−ＹＦＰの成熟が正常に行われない等が挙げられる。また、２）〜４）については、小胞体膜関連タンパク質の機能阻害により、例えば分子シャペロンや酵素等の機能が阻害されるためと推定される。
【０１８４】
また、実施例２においても、実施例１と同様に、ＹＦＰ蛍光シグナルの分布の変化・消失が、阻害を目的とする小胞体膜関連タンパク質のｓｉＲＮＡに起因するものでないか否かを確認する為、ＹＦＰ自体に対応したｓｉＲＮＡを用いてＹＦＰの発現阻害を行った。図１１（ａ）〜（ｃ）は、ＹＦＢの発現阻害における顕微鏡観察結果を示す図である。図１１（ａ）および（ｂ）に示すように、ｓｉＲＮＡによりＹＦＰの発現を阻害すると（（ａ）図）、当該阻害を行わない場合（（ｂ）図）に比べて、蛍光が顕著に消失する。図１１（ｂ）に示すＹＦＰ発現阻害による蛍光の消失は、図１０（ネガティブコントロール、ＣＬＮ８以外）に示す前述の各小胞体膜関連タンパク質の発現阻害による蛍光状態とは明らかに異なっている。このことから、これらの各小胞体膜関連タンパク質の発現阻害による蛍光状態は、ＹＦＰの発現阻害の影響を受けない、小胞体膜関連タンパク質の関与に起因するものであることが確認された。
【０１８５】
さらに、Ｔｙｒの温度感受性について調べた結果を説明する。図１１（ａ）は、ＣＯＳ細胞を３９℃で培養した場合の顕微鏡観察結果を示しており、図１１（ｃ）は、当該細胞を３２℃で培養した場合の顕微鏡観察結果を示している。図１１（ａ）と図１１（ｃ）との比較、ならびに、図１１（ａ）および図１１（ｃ）と図１０（ａ）との比較から明らかなように、Ｔｙｒは温度感受性が高く、それゆえ、Ｔｙｒの発現系であるＣＯＳ細胞を３９℃で培養すると、Ｔｙｒの立体構造形成が正常に行われず（いわゆるミスフォールド）、小胞体の管腔経路内に蓄積される（図１１（ａ））。この為、Ｔｙｒ−ＹＦＰが正常に分泌される図１０（ａ）の場合とは異なるＴｙｒ−ＹＦＰの蛍光シグナルを示す。一方、３９℃で培養したＣＯＳ細胞を３２℃の培養条件下に移すと、Ｔｙｒの立体構造が正常に形成し直され、小胞体からゴルジ体への速やかな排出が促進される。それゆえ、図１１（ｃ）に示すように、図１１（ａ）の場合に比べて、図１０（ａ）に示す正常な場合の分布に近くなる。
【０１８６】
実施例３  ｍＲＮＡ発現の定量
本実施例では、図１に記載の数種類のｓｉＲＮＡを用いた場合の、ｍＲＮＡの発現量を調べた。
【０１８７】
１）ＲＮＡは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ６７００  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、ＨｅＬａ細胞又はＣＯＳ７細胞から抽出した。ｃＤＮＡは、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はＨｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、ランダムヘキサマープライマーを用いて、全ＲＮＡから合成した。
【０１８８】
リアルタイムＰＣＲのために調製されたｃＤＮＡを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ（９５℃３０秒、６０℃３０秒、及び７２℃３０秒を４０サイクル）を使用して、リアルタイムＰＣＲ用試薬であるＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、３回実施した。本分析に使用したプライマー配列は下記の通りである。
【０１８９】
内部標準グリセルアルデヒド―３―ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ
ＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡ  （配列番号１９９）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ
ＣＡＴＧＧＧＴＧＧＡＡＴＣＡＴＡＴＴＧＧ  （配列番号２００）
ＢＡＰ
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ
ＣＣＡＧＣＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＡＧＡＧ  （配列番号２０１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ
ＣＣＣＡＴＴＧＡＴＣＡＣＣＡＣＴＴＧＡＡ  （配列番号２０２）
ＫＴＮ１
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ
ＣＡＡＧＴＴＣＧＴＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡ  （配列番号２０３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ
ＴＣＴＧＣＡＧＡＣＴＧＣＴＴＧＣＴＴＴＣ  （配列番号２０４）
ＯＬＦＭ
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ
ＣＡＧＡＣＧＴＣＧＧＡＡＧＡＡＡＣＴＣＣ  （配列番号２０５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ
ＣＡＴＴＧＣＣＴＣＧＣＣＴＣＴＴＴＡＧＴ  （配列番号２０６）
ＥＤＥＭ
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ
ＴＴＣＡＣＡＧＧＧＣＴＣＡＧＧＧＴＴＡＴ  （配列番号２０７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ
ＡＴＴＣＣＴＣＴＧＣＣＴＴＧＣＡＧＡＡＡ  （配列番号２０８）
ＥＲｄｊ５
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ
ＧＧＣＴＴＡＧＴＧＧＣＡＴＧＴＴＧＧＡＴ  （配列番号２０９）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ
ＴＧＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＴＡＡ  （配列番号２１０）
ＧｌｕｃｏｓｉｄａｓｅＩ
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ
ＣＣＡＣＴＣＴＧＧＣＴＣＴＧＡＡＧＧＡＣ  （配列番号２１１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ
ＡＧＧＧＣＴＡＴＧＴＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧ  （配列番号２１２）
ＧｌｕｃｏｓｉｄａｓｅＩＩ
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ
ＧＡＧＣＡＴＧＣＡＧＡＣＡＡＣＣＴＧＡＧ  （配列番号２１３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ
ＡＧＧＣＡＣＡＧＡＣＣＣＡＴＡＣＡＡＧＧ  （配列番号２１４）
ＰＡＰ２Ｂ
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ
ＴＣＡＧＡＡＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＡＡＧＣ  （配列番号２１５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ
ＧＧＣＴＣＡＡＣＣＣＣＡＡＧＡＣＡＡＴＡ  （配列番号２１６）
ＳＣＡＰ
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ
ＧＧＡＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＴＧＡＡＡＧＧ  （配列番号２１７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ
ＧＣＡＧＧＣＴＡＡＧＡＴＧＣＡＧＡＡＣＣ  （配列番号２１８）
Ｓｅｃ６３
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ
ＡＧＧＣＡＡＡＣＡＡＴＧＧＣＴＧＡＡＧＴ  （配列番号２１９）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ
ＴＣＴＧＴＴＧＣＣＡＴＣＣＴＣＣＴＴＴＴ  （配列番号２２０）
ＳＳＲ２
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ
ＡＧＧＴＧＣＴＴＴＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡＡ  （配列番号２２１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ
ＧＡＣＴＣＣＴＡＧＧＧＣＴＧＧＴＣＣＴＴ  （配列番号２２２）
結果を、図１３示す。図１３は、３回の実験の平均の結果を、標準誤差のバーとともに示してある。図１３に示したように、各ｓｉＲＮＡは有意に各遺伝子のｍＲＮＡの発現を抑制している。
【０１９０】
２）さらに、ＣＯＳ７細胞中のＯＬＦＭ  ｍＲＮＡの発現を、標準的なＰＣＲ方法によって手引き通りに行った。ＣＯＳ７細胞からのＲＮＡ抽出はＥＡＳＹｐｒｅｐ  ＲＮＡ（ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ，  Ｏｈｔｕｓ，  Ｊａｐａｎ）を使用した。標的ｃＤＮＡ（ＲＱ）の量の相対値（最低検出レベルのｎ倍として表現）を、比較サイクル閾値法を用いて計算し、そして、校正遺伝子、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼに対して標準化した。その結果、ＣＯＳ細胞中で、ＯＬＦＭが確かに発現していることが確認された。
【０１９１】
実施例４  Ｔｙｒ-ＹＦＰの成熟化に関するＦＲＡＰ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ａｆｔｅｒ  ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）分析
本実施例では、許容温度の３２℃において、タンパク質の折り畳みをモニターするために、小胞体中でのＴｙｒ-ＹＦＰの拡散運動を測定した。
【０１９２】
実施例２と同様、ＹＦＰとＴｙｒとが一体的に発現するＴｙｒ−ＹＦＰ発現ＣＯＳ細胞を使用した。細胞の調製については実施例２の＜１＞に前述した通りである。また、細胞の培養およびｓｉＲＮＡのＣＯＳ細胞への導入については、以下の点を除いて、実施例２＜４＞で前述した通りである。異なる工程は、実施例４では８ウェルチェンバープレートに、ＣＯＳ細胞を２．５×１０４細胞／ｗｅｌｌの密度となるように播いた点である。
【０１９３】
ネガティブコントロールｓｉＲＮＡを細胞へトランスフェクションし、３９℃で２日間培養した後、１０μＭ  ブレフェルディンＡ（ＢＦＡ）を添加し、３２℃で５時間インキュベーションした細胞をコントロールとして準備した。実施例２で分泌・輸送機構関連タンパク質と同定された９種類のｓｉＲＮＡの各々をトランスフェクトした細胞についても同様に３９℃で２日間培養した後、３２℃で５時間維持した。その後、Ｔｙｒ―ＹＦＰについてＦＲＡＰ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ａｆｔｅｒ  ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）分析を行った。ズームファクターを１５に設定し、レーザーの出力は最小、ピンホールセッティングは最大に調整してイメージを取得した。外部ヒーター（Ｂｉｏｐｔｅｃｈ）により温度制御した５％ＣＯ２チェンバー（Ｔｏｋａｉ  Ｈｉｔ，Ｆｕｊｉｎｏｍｉｙａ，Ｊａｐａｎ）を用いて、顕微鏡下で細胞を３７℃に維持した。赤外線温度計ＴＳ−１００（Ｔｏｈｓｉｎ，Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて、温度を維持した。１００のプレブリーチングイメージを記録した後に、選択された円状の領域（０．１３μｍのピクセルサイズの１４ピクセル直径）を５回、光ブリーチした。
【０１９４】
小胞体中のブリーチされた領域中の蛍光を定量化し、光ブリーチ直前に５０イメージの平均蛍光に対して標準化した。各実験において、これらの標準化されたデータを平均化し、拡散係数の概算及び最大回復率を計算した。標準化された平均回復率を標準誤差とともに示した。結果の一部を、図１４に示す。
【０１９５】
図１４に示したように、ＢＦＡで処理したコントロール細胞では、最大８７％の回復率を示した。調べた９種類のｓｉＲＮＡは、コントロールよりも有意に低い最大回復率を示した。特に５種類のｓｉＲＮＡ導入細胞におけるＴｙｒ−ＹＦＰの蛍光の最大回復率を図１４の右図に示した。その中でも、カルネキシンサイクルのメンバーであるＧｌｕｃｏｓｉｄａｓｅＩ（図１４、左図）およびＩＩ（データ未掲載）発現を阻害した細胞においては、Ｔｙｒ−ＹＦＰの小胞体内での凝集に起因するｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎにより、蛍光回復率が両者とも同等に最も低かった。またＥＲｄｊ５や、コレステロール生合成に関与するＳＲＥＢＰのエスコートタンパク質として知られるＳＣＡＰの発現をノックダウンした細胞においても、Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅと同等な蛍光回復率の著しい低下が観察され、小胞体からのＴｙｒ−ＹＦＰ輸送の遅延、Ｔｙｒ−ＹＦＰのｍｏｂｉｌｉｔｙ低下が示唆された（図１４、中図）。さらに、ＯＬＦＭおよびＰＡＰ２Ｂをターゲットとした発現抑制においても同様の結果が得られた。ここでは図を省略しているが、その他のｓｉＲＮＡ（ＥＤＥＭ、Ｓｅｃ６３およびＳＳＲ２）を導入したＴｙｒ−ＹＦＰ発現ＣＯＳ７細胞を使用したＦＲＡＰ解析においても、コントロール細胞と比較して最大回復率は顕著に低い値であった。
【０１９６】
これらの結果は、９種の小胞体膜タンパク質が、タンパク質の成熟（分泌・輸送）機構に必須の因子であることを強く示唆するものである。
実施例５  本発明の分泌・輸送機構関連タンパク質のゴルジ膜タンパク質への影響
本実施例では、ＯＬＦＭを含む本発明で同定された各種分泌・輸送機構関連タンパク質を、対応するｓｉＲＮＡによりノックダウンさせた細胞において、ゴルジ体が正しく構成されるかを調べた。
【０１９７】
先ず、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ−２１−１１４（ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２）−ＧＦＰ（ゴルジ膜タンパク質のＧＦＰ融合体）を安定的に発現するＨｅＬａ細胞を、ＯＬＦＭ  ｓｉＲＮＡ又はＧｌｕｃｏｓｉｄａｓｅＩおよび/またはＩＩ  ｓｉＲＮＡで処理した。具体的には、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２−ＧＦＰを発現しているＨｅＬａ細胞に、各ｓｉＲＮＡ（コントロールｓｉＲＮＡ、ＧｌｕｃｏｓｉｄａｓｅＩ  ｓｉＲＮＡ、ＧｌｕｃｏｓｉｄａｓｅＩＩ  ｓｉＲＮＡ、ＯＬＦＭ  ｓｉＲＮＡ）をトランスフェクトした。細胞を３７℃で４８時間培養した後、メタノールを添加することで固定し、マウス抗−ＧＭ１３０抗体（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ  社製）を添加した。マウス抗−ＧＭ１３０抗体の可視化は、Ａｌｅｘａ５９４−標識抗−マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。
【０１９８】
結果を図１５に示す。ＧｌｕｃｏｓｉｄａｓｅＩ ｓｉＲＮＡおよびＧｌｕｃｏｓｉｄａｓｅＩＩ ｓｉＲＮＡによる処理の場合、ゴルジ体の構造に変化は生じなかった。これに対し、ＯＬＦＭ  ｓｉＲＮＡによる処理の場合、有意な量のＧａｌＮＡｃ−Ｔ２−ＧＦＰが小胞体中に滞留した。ただし、ＧＭ１３０抗体による染色の結果、ゴルジ体のパターンは正常であった。これらの結果は、ＯＬＦＭノックダウンは、ゴルジ膜タンパク質の再分布を生じさせるが、ＯＬＦＭの機能が折り畳みではないことを明確に示唆する。
【０１９９】
本発明者らはさらに、Ｔｙｒ−ＹＦＰ成熟化の異常に関与する、本発明の他の分泌・輸送機構関連タンパク質の抑制が、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２−ＧＦＰの輸送に影響を与えるかを調べた。具体的には図１５の場合と同様に、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２−ＧＦＰを発現しているＨｅＬａ細胞にｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、表現型を調べた。
【０２００】
結果を図１６に示す。ＥＲｄｊ５及びＰＡＰ２Ｂのノックダウンは、小胞体中へのＧａｌＮＡｃ−Ｔ２−ＧＦＰの滞留を引き起こした。ＥＲｄｊ５ノックダウン細胞では、実施例４のＦＲＡＰ解析で示したように、Ｔｙｒ−ＹＦＰの顕著なｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎが観察されたので、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２−ＧＦＰに対しても同様な効果を示す可能性が考えられる。一方、Ｓｅｃ６３、ＳＳＲ２、ＳＣＡＰ又はＥＤＥＭのノックダウンは、明らかな表現型を示さなかった。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１ａ】図１は、本発明に係る分泌・輸送機構関連タンパク質の同定・機能解析方法に供する小胞体関連タンパク質、および、当該タンパク質の機能阻害に用いる本発明に係るＲＮＡ干渉核酸（ｓｉＲＮＡ）を示す図である。
【図１ｂ】図１は、本発明に係る分泌・輸送機構関連タンパク質の同定・機能解析方法に供する小胞体関連タンパク質、および、当該タンパク質の機能阻害に用いる本発明に係るＲＮＡ干渉核酸（ｓｉＲＮＡ）を示す図である。
【図１ｃ】図１は、本発明に係る分泌・輸送機構関連タンパク質の同定・機能解析方法に供する小胞体関連タンパク質、および、当該タンパク質の機能阻害に用いる本発明に係るＲＮＡ干渉核酸（ｓｉＲＮＡ）を示す図である。
【図２】図２は、本発明に係る分泌・輸送機構関連タンパク質の同定・機能解析方法によりタンパク質分泌・輸送機構への関与が明らかとなった小胞体膜関連タンパク質、および、当該タンパク質の機能を阻害する本発明に係るＲＮＡ干渉核酸（ｓｉＲＮＡ）を示す図である。
【図３】図３は、本発明の実施例１における、小胞体関連タンパク質ＢＡＰの発現抑制効果を示す図である。
【図４】図４は、本発明の実施例１における、小胞体関連タンパク質ＫＴＮ１の発現抑制効果を示す図である。
【図５】図５は、本発明の実施例１における、小胞体関連タンパク質ＯＬＦＭの発現抑制効果を示す図である。
【図６】図６は、本発明の実施例１における、小胞体関連タンパク質ＢＡＰの機能阻害によるＨｅＬａ細胞表現型の変化を示す図である。
【図７】図７は、本発明の実施例１における、小胞体関連タンパク質ＫＴＮ１の機能阻害によるＨｅＬａ細胞表現型の変化を示す図である。
【図８】図８は、本発明の実施例１における、小胞体関連タンパク質ＯＬＦＭの機能阻害によるＨｅＬａ細胞表現型の変化を示す図である。
【図９】図９は、本発明の実施例１における、ＹＦＰの機能阻害によるＨｅＬａ細胞表現型の変化を示す図である。
【図１０】図１０は、本発明の実施例２における、図２記載の小胞体膜関連タンパク質およびＣＬＮ８の機能阻害によるＨｅＬａ細胞表現型の変化を示す図である。
【図１１】図１１は、本発明の実施例２における、Ｔｙｒ温度感受性を示す図である。
【図１２】図１２は、本発明の実施例２の実施態様を模式的に示す図である。
【図１３】図１３は、各種ｓｉＲＮＡを用いた場合のｍＲＮＡの発現量を、リアルタイムＰＣＲの結果の相対値で示した図である。
【図１４】図１４は、各種ｓｉＲＮＡを用いた場合のノックダウン細胞における、Ｔｙｒ−ＹＦＰについてのＦＲＡＰ分析の結果を示す。右欄はフォトブリーチ後の蛍光最大回復率を数値化したものである。
【図１５】図１５は、ＯＬＦＭ及びＧｌｕｃｏｓｉｄａｓｅＩ及びＩＩのｓｉＲＮＡによるノックダウン細胞における、ゴルジ膜タンパク質への影響を示す。左欄は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２−ＧＦＰ、中欄は、抗ＧＭ１３０抗体により細胞を免疫染色した結果、右欄は、両者を重ね合わせた結果を示す。
【図１６】図１６は、本発明の分泌・輸送機構関連タンパク質のｓｉＲＮＡによるノックダウン細胞における、ゴルジ膜タンパク質への影響を示す。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２−ＧＦＰによる蛍光の結果である。
【図１ａ】
2007325525.tif 000002
【図１ｂ】
2007325525.tif 000003
【図１ｃ】
2007325525.tif 000004
【図２】
2007325525.tif 000005
【図３】
2007325525.tif 000006
【図４】
2007325525.tif 000007
【図５】
2007325525.tif 000008
【図６】
2007325525.tif 000009
【図７】
2007325525.tif 000010
【図８】
2007325525.tif 000011
【図９】
2007325525.tif 000012
【図１０】
2007325525.tif 000013
【図１１】
2007325525.tif 000014
【図１２】
2007325525.tif 000015
【図１３】
2007325525.tif 000016
【図１４】
2007325525.tif 000017
【図１５】
2007325525.tif 000018
【図１６】
2007325525.tif 000019
【配列表】
2007325525000001.app