(57)【要約】  【課題】  患者から採取した組織の性質を判定するための試薬キットであって、各試薬の取り扱いを容易にした試薬キットを提供する。  【解決手段】  患者から採取した組織に含まれるサイクリン依存性キナーゼの発現量を測定するための複数の試薬、およびサイクリン依存性キナーゼの活性値を測定するための複数の試薬を備え、これらの試薬のうち第1の保存条件で保存される試薬を含む第1試薬セットと、第1の保存条件とは異なる第2の保存条件で保存される試薬を含む第2試薬セットと、を備える。  【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から採取された組織の性質を判定するための試薬キットであって、前記組織中のサイクリン依存性キナーゼ（CDK）の発現量を測定するために用いられる複数の試薬、および前記組織中のCDKの活性値を測定するために用いられる複数の試薬を備え、これらの試薬のうち第1の保存条件で保存される試薬を含む第1試薬セットと、第1保存条件とは異なる第2の保存条件で保存される試薬を含む第2試薬セットを備えたことを特徴とする試薬キット。
【請求項２】
前記第1保存条件が冷蔵保存であり、前記第2保存条件が冷凍保存である請求項１記載の試薬キット。
【請求項３】
前記第1試薬セットが、標識されたCDK抗体（標識CDK抗体）、CDK抗体を固定した担体、前記CDKの基質およびアデノシン５’−三リン酸（ATP）を備え、前記第2試薬セットが前記CDKの作用によるATPと前記基質との反応生成物に結合可能な標識物質を備える請求項２記載の試薬キット。
【請求項４】
前記第１試薬セットは、前記CDK抗体を固定した担体を含むカラムを備える請求項3に記載の試薬キット。
【請求項５】
前記第２試薬セットは、既知の濃度のCDKを備える請求項２〜４の何れか１項に記載の試薬キット。
【請求項６】
前記試薬キットが、前記組織中のCDKの発現量及び活性値を測定し、得られたCDKの発現量及び活性値のデータに基づいて、前記組織の性質を判定するための組織性質判定装置に用いられる請求項1〜5の何れか１項に記載の試薬キット。
【請求項７】
前記組織性質判定装置が、前記組織中のCDKの発現量を反映する第1データを取得する第1データ取得手段と、前記組織中のCDKの活性値を反映する第2データを取得する第2データ取得手段と、前記第1データ及び第2データにより得られる値に基づいて前記組織の性質に関する情報を取得する解析手段と、を備える請求項6に記載の試薬キット。
【請求項８】
患者から採取された組織の性質を判定するための試薬キットであって、前記組織中の第1のサイクリン依存性キナーゼ（CDK）の発現量を測定するために用いられる複数の試薬、第1CDKの活性値を測定するために用いられる複数の試薬、第２のCDKの発現量を測定するために用いられる複数の試薬、および第２CDKの活性値を測定するために用いられる複数の試薬を備え、これらの試薬のうち第1の保存条件で保存される試薬を含む第1試薬セットと、第1保存条件とは異なる第2の保存条件で保存される試薬を含む第2試薬セットを備えたことを特徴とする試薬キット。
【請求項９】
前記第1保存条件が冷蔵保存であり、前記第2保存条件が冷凍保存である請求項８記載の試薬キット。
【請求項１０】
前記第1試薬セットが、第1の標識物質によって標識された第1のCDK抗体（第1標識CDK抗体）、第2の標識物質によって標識された第2のCDK抗体（第2標識CDK抗体）、第1CDK抗体を固定した第1の担体、第２CDK抗体を固定した第２の担体、前記第1CDK及び第2CDKの基質およびアデノシン５’−三リン酸（ATP）を備え、前記第2試薬セットが前記各CDKの作用によるATPと前記基質との反応生成物に結合可能な第3標識物質を備える請求項9記載の試薬キット。
【請求項１１】
前記第１試薬セットは、前記第1担体を含む第1カラムおよび前記第２担体を含む第２カラムを備える請求項10に記載の試薬キット。
【請求項１２】
前記第２試薬セットは、既知の濃度の第1CDKおよび既知濃度の第2ＣＤＫを備える請求項9〜11の何れか1項に記載の試薬キット。
【請求項１３】
前記試薬キットが、前記組織中の第1CDK及び第2CDKの発現量及び活性値を測定し、得られた第1CDK及び第2CDKの発現量及び活性値のデータに基づいて、哺乳動物組織の性質を判定するための組織性質判定装置に用いられる請求項8〜12の何れか1項に記載の試薬キット。
【請求項１４】
前記組織性質判定装置が、前記第1CDKの発現量を取得する第1発現量取得手段と、前記第2CDKの発現量を取得する第2発現量取得手段と、前記第1CDKの活性値を取得する第１活性値取得手段と、前記第2CDKの活性値を取得する第2活性値取得手段と、前記第1発現量、第2発現量、第3活性値及び第4活性値に基づいて、前記組織の性質に関する情報を取得する解析手段と、を備える請求項13に記載の試薬キット。
【請求項１５】
前記第２試薬セットは、ハウスキーピング遺伝子によってコードされる、既知の濃度のタンパク質を備え、前記第1試薬セットは、前記タンパク質に対する標識された抗体を備える請求項2〜7および9〜14の何れか１項に記載の試薬キット。
【請求項１６】
前記第2試薬セットは、既知の濃度の哺乳動物細胞の細胞質及び核内タンパク質を含む溶液を備える請求項2〜7および9〜15の何れか１項に記載の試薬キット。
【請求項１７】
前記第2試薬セットは、前記組織を可溶化して組織溶液を調製するための組織可溶化溶液を備える請求項2〜7および9〜16の何れか１項に記載の試薬キット。
【請求項１８】
前記第2試薬セットは、既知の濃度のサイクリン依存性キナーゼインヒビターを備え、前記第1試薬セットは、このサイクリン依存性キナーゼインヒビターに対する抗体を備える請求項2〜7および9〜17の何れか１項に記載の試薬キット。
【請求項１９】
前記第1試薬セットは、バックグラウンドを低減するためのタンパク質を含む試薬を備える請求項2〜7および9〜18の何れか１項に記載の試薬キット。
【請求項２０】
前記組織の性質が、組織に含まれる細胞の増殖能、細胞の抗癌剤に対する感受性、または組織の悪性度である請求項1〜19の何れか1項に記載の試薬キット。
【請求項２１】
第1および第2保存条件とは異なる第３の保存条件で保存される試薬を含む第３試薬セットを備える請求項１〜20のいずれか１項に記載の試薬キット。
【請求項２２】
前記第3保存条件が常温保存である請求項21に記載の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者から採取された組織中のサイクリン依存性キナーゼの発現量と活性値を測定して比活性を求め、組織の性質を判定するための試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物の細胞増殖を司る細胞周期調節因子として、正の調節因子であるサイクリン依存性キナーゼ（以下、CDKと略す）が存在する。CDKは、リン酸化等の活性化を受け、サイクリンというタンパク質と結合してCDKとサイクリンの複合体（以下、活性型CDKと略すことがある）となることにより、CDKの種類に応じた細胞周期の特定段階で活性を示している。また、負の調節因子であるサイクリン依存性キナーゼインヒビター（以下、CDKインヒビターと略す）が、CDK及び／またはサイクリン・CDK複合体に結合して、CDKの活性を阻害することも知られている。
【０００３】
CDKのような細胞調節因子の発現量や活性値のデータは、細胞周期の制御に関連した疾患の種類や悪性度など、患者から採取された組織の性質を判定するよい指標となり得る。例えば、CDKは、一般には細胞内で一定量発現しているものの、増殖因子によって増殖が誘導される細胞においてはその発現が高いことが知られている。しかし、上述したように、CDKの活性化の仕組みは、CDK、サイクリン、CDKインヒビターの密接な関係により複雑であることから、単なるCDK、サイクリン、CDKインヒビターの発現量のデータのみでも、CDKの活性値のデータのみでも組織の性質を判定する指標としては不十分である。
【０００４】
ここで、発現量とは、組織から調製された組織溶液から測定される目的のタンパク質量（分子個数に対応する単位）であって、タンパク質混合物から目的のタンパク質量を測定する従来公知の方法で測定できる。発現量は、例えば、ELISA法、ウェスタンブロット法、特許文献1に開示の方法等を用いて測定することができる。目的のタンパク質は、特異的抗体を用いて捕捉することができ、例えばCDK1を捕捉する際には、抗CDK1抗体を用いることにより、前記組織溶液中に存在するCDK1の全て（CDK1単体、CDK1とサイクリン及び／またはCDKインヒビターの複合体、CDK1とその他の化合物との複合体を含む）を捕捉できる。
【０００５】
また、CDK活性値とは、特定のサイクリンと結合して、どれだけの基質（例えば、活性型CDK1、活性型CDK2はヒストンH1、活性型CDK4及び活性型CDK6はRb（網膜芽細胞腫タンパク、Retinoblastoma protein））をリン酸化するかというキナーゼ活性のレベル（単位をU（ユニット）で表す）をいう。CDK活性値は、従来公知の、放射性物質を標識として用いた酵素活性測定法で測定できる。具体的には、32P標識したアデノシン５’−O−(3−トリホスフェート)（γ−〔32P〕−ATP）を用いて、32P標識したATP由来のモノリン酸基を該基質に取り込ませ、該基質に取り込まれた32P量をオートラジオグラフィーまたはシンチレーションカウンターで検出することにより、リン酸化された該基質の量が測定され、その該基質の量からCDKの活性が算出される。また、特許文献2では、放射性物質を標識として用いない測定法が開示されている。具体的には、アデノシン５’−O−(3−チオトリホスフェート)（ATP−γS）と基質とを反応させ、基質に取り込まれたモノチオリン酸基の有する硫黄原子に標識物質を結合させて、標識量（例えば、標識蛍光物質を用いた場合は蛍光量）を測定する方法である。
【０００６】
現在、患者から採取された組織の性質の判定は、臨床現場において、癌の悪性度（転移のしやすさ、再発のしやすさ、予後の悪さ）を診断するという重要な役割を担っている。例えば、腫瘍マーカー、バイオプシー（生検）による組織診・細胞診、TNM（T：原発腫瘍の大きさ、N：リンパ節転移のレベル、M：遠隔転移）分類、蛍光表示式セルソーターを用いたDNA含量の測定等から得られる情報を用いて癌の診断が行われている。しかし、それぞれの方法において、診断感度が低い、最終判定が観察者自らの経験に基づくため診断が難しい、診断時の病態は把握できても予後を正確に予測するに至らない、熟練した技術が必要である等、個々人の判断や医療機関の判定方法の差が反映されるため、結果的に、癌の悪性度の診断にばらつきを生じさせる要因となり得る。
【０００７】
また、組織に含まれる細胞の刺激物質に対する感受性も、組織の性質を判定する要素の一つであるが、癌の治療方針を決定する場合において、刺激物質に対する感受性、すなわち、抗癌剤などの薬剤の有効性を診断することも、悪性度の診断と同様に重要である。この場合、インビトロで腫瘍細胞の抗癌剤感受性試験を行う方法があり、MTT（3−(4,5ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイ法やDISC（differential staining cytotoxicity）法が知られているが、いずれの方法も陽性予測率は70％未満であり、抗癌剤治療を行なうか否かの判断指標としては不十分である（非特許文献1）。
【０００８】
【特許文献１】特開2003−130871
【特許文献２】特開2002−335997
【非特許文献１】Weisenthal,L.M. and Nygren.P (2002) Current status of cell culture drug resistance testing (CCDRT)、http:／／weisenthal.org／
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上のように、患者から採取された組織中のCDKの発現量の測定方法は特許文献1に、CDKの活性値の測定方法は特許文献2に開示されているが、CDKの発現量と活性値に基づいて組織の性質判定を行うための試薬キットについては、未だ開発されていない。また、CDK発現量の測定およびCDK活性値の測定には、それぞれ多数の試薬を用いる必要があり、これらの試薬は保存条件の異なるものが混在しておりその取扱が煩雑である。
【００１０】
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、患者から採取された組織の性質の判定を実施するための試薬キットであって、各試薬の取扱を容易にした試薬キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の試薬キットは、患者から採取された組織の性質を判定するための試薬キットであって、組織中のサイクリン依存性キナーゼ（CDK）の発現量の測定に用いられる複数の試薬、および組織中のCDKの活性値の測定に用いられる複数の試薬を備え、これらの試薬のうち第1の保存条件で保存される試薬を含む第1試薬セットと、第1保存条件とは異なる第2の保存条件で保存される試薬を含む第2試薬セットを備える。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、患者から採取された組織の性質の判定を行うために用いられる多数の試薬類を、その保存条件毎に容易に識別して保存を行うことが可能となる。
【００１３】
ここで、患者から採取された組織の性質とは、組織に含まれる細胞の増殖能、組織に含まれる細胞の抗癌剤等の薬剤に対する感受性、および組織の悪性度（転移のしやすさ、再発のしやすさ、予後の悪さ）である。これらの性質を判定することにより、癌の予後診断及び薬剤耐性試験が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の試薬キットの実施形態について説明する。しかし、本発明が、この実施形態に限定されるわけではない。
【００１５】
本試薬キットは、以下に記すCDK発現量測定に用いられる各種の試薬及びCDK活性値測定に用いられる各種の試薬を備えている。
【００１６】
（発現量測定試薬群）
発現量測定試薬群は、測定対象とするCDKに対する、標識されたCDK抗体（以下、標識CDK抗体と略す）を備える。標識CDK抗体は、CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、サイクリンA依存性キナーゼ、サイクリンB依存性キナーゼ、サイクリンD依存性キナーゼ、およびサイクリンE依存性キナーゼからなる群より選択されるサイクリン依存性キナーゼに対する抗体から選択できる。標識CDK抗体の標識物質としては、蛍光物質、酵素、またはラジオアイソトープを用いることができる。
【００１７】
上述した蛍光物質としては、フルオレセイン、クマリン、エオシン、フェナントロリン、ピレン、ローダミン等が挙げられる。このうち、フルオレセインが好ましい。標識酵素としては、βガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ等が挙げられる。このうち、ペルオキシダーゼが好ましい。ラジオアイソトープとしては、32Pが挙げられる。
【００１８】
また、発現量測定試薬群は、既知の濃度のCDKと、ハウスキーピング遺伝子によってコードされる、既知の濃度のタンパク質と、このタンパク質に対する標識された抗体と、前記CDKに対する、既知の濃度のサイクリン依存性キナーゼインヒビター（CDKインヒビター）、及び該CDKインヒビターに対する抗体と、を備えることが好ましい。
【００１９】
また、発現量測定試薬群は、標識CDK抗体と結合したCDKに標識CDK抗体以外の化学物質等が結合することを防止するブロッキング溶液を備えることが好ましい。
【００２０】
上述した既知の濃度のCDK、ハウスキーピング遺伝子によってコードされる、既知の濃度のタンパク質、既知の濃度のCDKインヒビターは、それぞれの発現量を求めるのに必要な検量線を作成するために用いられる。このため、発現量測定試薬群は、例えば、第1の濃度のＣＤＫと、第1濃度とは異なる第2濃度のＣＤＫのように、それぞれ異なる2種の濃度の試薬を備えることが好ましい。
【００２１】
ハウスキーピング遺伝子は、正常な細胞の生存に不可欠であり、ほとんどの細胞で発現している遺伝子群から選択することができる。例えば、GAPDH（glyceraldehyde−3−phosphate dehydrogenase）やβ−actinなどが挙げられる。
【００２２】
CDKインヒビターは、測定対象とするCDKによって適宜選択し得る。例えば、測定対象とするCDKがCDK1であればp21、CDK2であればp21またはp27、CDK4及び／またはCDK6であればp16またはp27が挙げられる。
【００２３】
ブロッキング溶液は、Block Ace（Block Ace powderを精製水に溶解したもの）（大日本製薬社）、TBS−T（Tris Buffered Saline Tween）、BSA（ウシ血清アルブミン；Bovine Serum Albumin）等を用いることができる。また、タンパク質としては、アルブミンの他にガゼインを用いることもできる。
【００２４】
さらに、発現量測定試薬群は、バックグラウンド補正を行うため、CDK以外の、既知濃度のタンパク質溶液を備えることが好ましい。このようなタンパク質の例としては、BSAが挙げられる。
【００２５】
（活性値測定試薬群）
活性値測定試薬群は、CDK抗体（以下、固定CDK抗体と略す）を固定した担体と、この担体に捕捉されたCDKのうち、サイクリンと複合体を形成したもの（活性型CDK）によってリン酸化され得る基質と、この基質と反応し得るアデノシン５’−三リン酸（ATP）と、活性型CDKの作用によるATPと基質との反応生成物に結合可能な標識物質と、を備える。
【００２６】
固定CDK抗体は、CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、サイクリンA依存性キナーゼ、サイクリンB依存性キナーゼ、サイクリンD依存性キナーゼ、およびサイクリンE依存性キナーゼからなる群より選択されるサイクリン依存性キナーゼに対する抗体から選択できる。
【００２７】
固定CDK抗体を固定する担体としては、モノリスシリカゲル、プロテインAセファローズビーズ、プロテインＧセファローズビーズ等が挙げられる。
【００２８】
担体に固定されたCDK抗体に捕捉されたCDKのうちの活性型CDKによってリン酸化され得る基質は、測定対象のCDKによって適宜選択され得る。具体的には、CDKがCDK1及び／またはCDK2であればヒストンH1が、上記CDKがCDK4及び／またはCDK6であればRb（網膜芽細胞腫；Retinoblastoma protein）が好ましい。
【００２９】
標識物質及びATPは、適宜選択することができる。例えば、標識物質がラジオアイソトープの場合、32P標識したアデノシン５’−O−(3−トリホスフェート（γ−〔32P〕−ATP）が挙げられる。標識物質が蛍光物質または酵素の場合、アデノシン５’−O−(3−チオトリホスフェート)（ATP−γS）が挙げられる。
【００３０】
さらに、活性値測定試薬群は、CDK抗体を固定した担体を含むカラム、CDK抗体を固定していない担体を含むカラム（ブランクカラム）、患者から採取された組織から調製された組織溶液中に含まれるCDKと該担体に固定されたCDK抗体との反応を良好に行なうための緩衝液、担体に捕捉されなかった非吸着物質を洗い流すための2種類のカラム用洗浄液、既知の濃度の哺乳動物細胞の細胞質及び核内タンパク質を含む溶液、及びバックグラウンドを低減するためのタンパク質を含む溶液、を備えることが好ましい。
【００３１】
上述したカラムは、担体を保持する部分と、溶液を貯留する部分と、を有することが望ましい。また、ブランクカラムは、活性値の測定結果に対してバックグラウンド補正を行なうために用いることができる。
【００３２】
担体に固定されたCDK抗体と、組織溶液中に含まれるCDKとの反応を良好に行なうための緩衝液は、Nonidet−P40などの界面活性剤とTris−HCl pH7.4を含む溶液を用いることができる。
【００３３】
非吸着物質を洗い流すための2種類のカラム用洗浄液は、1）Nonidet−P40などの界面活性剤、Tris−HCl pH7.4、NaClを含む溶液、2）Tris−HCl pH7.4などが用いられる。担体にCDKを捕捉させた後、1）で1回洗浄し、さらに2）で1回洗浄することが望ましい。
【００３４】
既知の濃度の哺乳動物細胞の細胞質及び核内タンパク質を含む溶液は、測定対象であるCDKを含むことが望ましい。さらにこのCDKは、単にCDK抗体との結合部位を有するだけでなく、本来組み込まれるべき全てのアミノ酸配列からなり、且つ本来とるべき三次元構造（コンフォメーション）を構築して存在していることが望ましい。
【００３５】
バックグラウンドを低減するためのタンパク質を含む溶液は、発現量活性試薬群に含まれるブロッキング液と同様の組成のものを用いることができる。具体的には、50% Block Ace（Block Ace powderを精製水に溶解したもの）（大日本製薬社）、TBS−T（Tris Buffered Saline Tween）、4%BSA（ウシ血清アルブミン；Bovine Serum Albumin）等を用いることができる。また、タンパク質としては、アルブミンの他にガゼインを用いることもできる。
【００３６】
さらに、本試薬キットには、発現量測定と活性値測定に共通して用いる試薬として、可溶化液、測定用チップ、及び洗浄液を備えることが好ましい。可溶化液は、患者から採取した組織を可溶化して組織溶液を調製するために用いる。測定用チップは、組織溶液中に含まれるタンパク質を吸着（固相形成）し得る膜を有し、発現量及び活性値を測定するために用いられる。洗浄液は、測定用チップの膜の洗浄等に用いられる。
【００３７】
可溶化溶液は、界面活性剤、タンパク質分解酵素阻害剤及び脱リン酸化酵素阻害剤を含有する緩衝液であることが望ましい。
【００３８】
界面活性剤は、細胞膜や核膜を破壊して細胞内物質を取り出すために用いられる。ただし、活性型CDKを分解させない程度の界面活性を有するものが用いられる。例えば、Nonidet−P40、Triton X−100、デオキシコール酸、CHAPSが挙げられる。界面活性剤濃度は1w／v％以下が望ましい。
【００３９】
タンパク質分解酵素阻害剤は、細胞膜や核膜を破壊した後、細胞内物質が混在する時に、タンパク質であるCDKやサイクリンが、分解酵素によって破壊されるのを防ぐために用いられる。例えば、EDTA、EGTAのようなメタロプロテアーゼ阻害剤、PMSF、トリプシンインヒビター、キモトリプシンのようなセリンプロテアーゼ阻害剤及び／またはヨードアセトアミド、E−64のようなシステインプロテアーゼ阻害剤の混合物や、シグマ社のプロテアーゼ阻害剤カクテルのような、予めタンパク質分解酵素阻害剤が混合された市販品が挙げられる。
【００４０】
脱リン酸化酵素阻害剤は、タンパク質である活性型CDK自体のリン酸基が加水分解されて活性が変動するのを防ぐために用いられる。例えば、セリン／スレオニン脱リン酸化酵素阻害剤としてはフッ化ナトリウム（NaF）が、チロシン脱リン酸化酵素阻害剤としてはオルトバナジン酸ナトリウム（Na3VO4）が挙げられる。
【００４１】
測定用チップは、ウエルを1以上有するものが好ましい。1以上設けられていると、異なる試料を一度に測定することも、同一試料を異なる濃度で測定することもできる。
【００４２】
ウエル底部の膜は、疎水性多孔質膜を用いることが望ましい。疎水性多孔質膜としては、タンパク質と疎水結合することができるもの、具体的には、PVDF（ポリビニリデンフロライド）疎水性メンブレン、ナイロン（荷電処理済み）メンブレン、ニトロセルロース等が挙げられる。疎水性多孔質膜の孔は、0.1〜10μｍ、好ましくは0.1〜0.5μmである。なお、疎水性多孔質膜は、メタノールへの浸透等の初期化処理を行なったものを用いるのが好ましい。
【００４３】
以上に説明した各試薬の具体例並びに保存条件を、表2〜7に示す。表2〜4には発現量測定試薬群を、表5〜6には活性値測定試薬群を、表7には発現量測定と活性値測定に共通して用いられる試薬群を示している。また、溶媒について特に記載のないものは、精製水を溶媒として使用している。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
【表２】
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【００４６】
【表３】
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【００４７】
【表４】
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【００４８】
【表５】
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【００４９】
【表６】
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【００５０】
また、本試薬キットには、組織中に含まれるCDKの発現量及び活性値を測定するため、上述したように、多くの種類の試薬が含まれる。特に抗原等のタンパク質を含む溶液については、変性を防ぐため、保存条件に注意して取り扱う必要がある。このことから、各試薬に含まれる物質によって、適した保存条件で保存することが必要である。したがって、それぞれ保存条件の共通する試薬を1つのセットにすることにより、正しい保存条件で保存することが容易になり、本試薬キットを安定した状態で用いることができる。なお、各試薬の保存条件は、表2〜7に示すとおりである。
【００５１】
図1に試薬群のパッケージの例を示す。i）は、本試薬キットに含まれる試薬のパッケージを、保存条件（冷蔵保存、冷凍保存）によって分けた例である。ii）は、保存条件によってパッケージを分けた試薬を、さらに発現量測定試薬群と活性値測定試薬群に分けた例である。また、iii）は、保存条件が同じ試薬は、同一のパッケージ内に収容し、そのパッケージ内に発現量測定試薬群のスペースと、活性値測定試薬群のスペースとを設けた例である。ii）及びiii）のように、発現量測定試薬群と活性値測定試薬群を分けることにより、前記組織性質判定装置に試薬を設置する際、設置場所の誤りを防ぐこともできる。発現量測定及び活性値測定に共通して用いられる試薬である組織可溶化液（試薬番号3001）については、ii）及びiii）の場合、冷凍保存試薬群のどちらのパッケージまたはスペースに収容してもよい。また、保存条件が常温である洗浄液（試薬番号3002）及び測定用チップ（試薬番号3003）については、iv）のように別のパッケージに収容することが好ましい。
【００５２】
本試薬キットは、用手法による測定に用いることが可能であるが、全工程を自動化して行なう装置に搭載することが好ましい。
【００５３】
このような装置の例として、患者から採取された組織中のCDKの発現量を反映する第1データを取得する第1データ取得手段と、患者から採取された組織中のCDKの活性値を反映する第2データを取得する第2データ取得手段と、前記第1データ及び第2データにより得られる値に基づいて組織の性質に関する情報を取得する解析手段と、を備える組織性質判定装置を挙げることができる。
【００５４】
ここで、本試薬キットは、患者から採取された組織に対して、2種以上のCDKの発現量及び活性値を測定し、測定データから組織の性質の判定を行なうことにより、組織に含まれる細胞の増殖能、組織に含まれる細胞の抗癌剤に対する感受性、及び組織の悪性度、を診断することができる。
【００５５】
増殖能とは、細胞の増殖活性レベルで、増殖の制御機構に以上をきたしているか否か（癌化の有無）、さらには、異数倍体性などに関する情報が該当する。
【００５６】
また、抗癌剤に対する感受性とは、抗癌剤治療に対する効果の有無のことである。抗癌剤としては、乳癌に対しては、例えばCMF群（シクロフォスファミド、メトトレキシエート、フルオロウラシルの3剤を併用して投与する療法）、ドセタキセル、パクリタキセル等のタキサン系抗癌剤、CE（シクロフォスファミド、エピルビシンの2剤を併用して投与する療法）、AC（ドキソルビシン、シクロフォスファミドの２剤を併用して投与する療法）、CAF（フルオロウラシル、ドキソルビシン、シクロフォスファミドの３剤を併用して投与する療法）、FEC(フルオロウラシル、エピルビシン、シクロフォスファミドの3剤を併用して投与する療法)、トラスツズマブとパクリタキセルの2剤を併用して投与する療法、カペシタビン等が挙げられ、胃癌に対しては、例えばFAM（フルオロウラシル、ドキソルビシン、マイトマイシンCの3剤を併用して投与する療法）、FAP（フルオロウラシル、ドキソルビシン、シスプラチンの3剤を併用して投与する療法）、ECF（エピルビシン、シスプラチン、フルオロウラシルの3剤を併用して投与する療法）、マイトマイシンCとテガフールの2剤を併用して投与する療法、フルオロウラシルとカルムスチンの2剤を併用して投与する療法等が挙げられ、大腸癌に対しては、例えばフルオロウラシルとロイコボリンの2剤を併用して投与する療法、マイトマイシンとフルオロウラシルの2剤を併用して投与する療法等が挙げられ、卵巣癌に対しては、例えばTP（パクリタキセル、シスプラチンの2剤を併用して投与する療法）、TJ（パクリタキセル、カルボプラチンの2剤を併用して投与する療法）、CP（シクロフォスファミド、シスプラチンの2剤を併用して投与する療法）、CJ（シクロフォスファミド、カルボプラチンの2剤を併用して投与する療法）等が挙げられる。
【００５７】
悪性度とは、具体的には、転移のしやすさ、再発のしやすさ、予後の悪さなどが挙げられる。再発とは、悪性腫瘍を摘出するために臓器を部分切除した後、残存臓器に同じ悪性腫瘍が再現する場合、及び原発巣から腫瘍細胞が分離して遠隔組織（遠隔臓器）へ運ばれ、そこで自立的に増殖する場合（転移再発）をいう。一般に5年以内に再発が認められる場合に「再発しやすい」という。また、ステージ分類では、ステージIIIは再発率50%であり、ステージII（再発率20%）に比して再発しやすい。予後とは、疾病の経過及び終末を予知することで、5年または10年後の死亡率が高いほど予後は悪く、例えばステージIIIは死亡率50%で、ステージII（20%）より予後が悪い。
【００５８】
２種類以上のCDKの発現量と活性値を測定し、各CDKにおけるこれらの比（以下に記した式で表されるCDK比活性またはその逆数）を求めて、患者から採取した組織の性質の判定を行なうことができる。
【００５９】
CDK比活性＝CDK活性値／CDK発現量
上記式により算出されるCDK比活性は、細胞内に存在しているCDKのうち、活性を示すCDKの割合に相当し、判定対象である組織に含まれる細胞の増殖状態に基づくCDK活性レベルといえる。2種類以上のCDKの比活性、例えば第1のCDK（第1CDK）の比活性と、第2のCDK（第2CDK）の比活性との比より、いずれのCDK活性が優位になっているかを知ることができ、これにより細胞周期のいずれかの時期にある細胞の割合がどの程度であるか、またはいずれの時期の細胞の割合が優位であるか等を知ることができる。
【００６０】
ここで、CDKとは、サイクリンと結合して活性化される酵素群の総称で、その種類に応じて、細胞周期の特定時期で機能している。また、CDKインヒビターとは、サイクリン・CDK複合体に結合し、その活性を阻害する因子群の総称である。CDKは、通常細胞内では不活性型単体として細胞質に存在し、CDK自体がリン酸化等の活性化を受けて、核内に移動する。核内では、CDKは核内に存在するサイクリン分子と結合して活性型CDKとなり、細胞周期のさまざまな段階において、細胞周期の進行を正に調節する。一方CDKインヒビターは、CDK単体または活性型CDKと結合することにより、CDKを不活性とし、細胞周期の進行を不に調節する。従って、細胞内には、CDK単体、CDKとサイクリン及び／またはCDKインヒビターとの複合体（以下、CDK群と略すことがある）が存在することとなる。
【００６１】
本試薬キットの測定対象となるCDKは、CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、サイクリンA依存性キナーゼ、サイクリンB依存性キナーゼ、サイクリンD依存性キナーゼおよびサイクリンE依存性キナーゼからなる群より選ばれることが好ましい。サイクリンA依存性キナーゼは、サイクリンAと結合して活性を示すCDKのことで、現在判明しているところでは、CDK１及びCDK2の双方が該当する。また、サイクリンB依存性キナーゼとは、サイクリンBと結合して活性を示すCDKのことで、現在判明しているところでは、CDK1が該当する。サイクリンD依存性キナーゼとは、サイクリンDと結合して活性を示すCDKのことで、現在判明しているところでは、CDK4及びCDK6の双方が該当する。サイクリンE依存性キナーゼは、サイクリンEと結合して活性を示すCDKのことで、現在判明しているところでは、CDK2が該当する。
【００６２】
これらのCDKは、現在判明しているところ、表1に示すように、それぞれ対応するサイクリンと結合したサイクリン・CDK複合体（活性型CDK）となって、表1に示すような細胞周期の特定時期を活性化している。例えば、CDK1はサイクリンAまたはBと、CDK2はサイクリンAまたはEと、CDK4及びCDK6はサイクリンD1、D2、またはD3と結合して活性型となる。一方、CDK活性は表1に示すようなCDKIによって活性が阻害されることもある。例えば、p21はCDK1、2を阻害、p27はCDK2、4、6を阻害、p16はCDK4、6を阻害する。
【００６３】
【表７】
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【００６４】
ここで、細胞が増殖を開始し、DNA複製、染色体の分配、核分裂、細胞質分裂などの事象を経て、2つの娘細胞となって出発点に戻るまでのサイクルである細胞周期は、図2に示すように、G1期、S期、G2期、M期の4期に分けられる。S期はDNAの複製期であり、M期は分裂期である。G1期は有糸分裂の完了からDNA合成の開始までの間で、M期に入るための準備点検期である。G1期にある臨界点（動物細胞ではRポイント）を過ぎると、細胞周期は始動し、通常止まることなく一巡する。G2期は、DNA合成の終了から有糸分裂の開始の間である。細胞周期の主なチェックポイントは、G1期からS期に入る直前、G2 期から有糸分裂への入り口である。特に、G1期チェックポイントはS期開始の引き金を引くため、重要なステップである。なぜなら、G1期のある点を過ぎると、細胞は増殖シグナルがなくなっても、増殖を停止することなく、S→G2→M→G1と細胞周期を進行させるからである。なお、増殖を停止した細胞で、G1期のDNA含量を持った休止期（G0）があり、細胞周期から外れた状態にある。増殖誘導により、細胞周期のG1期よりやや長い時間の後にS期へ進行することができる。
【００６５】
一般に、癌細胞は、正常な増殖制御を逸脱して増殖が活発に行なわれていることから、S期、G2期にある細胞の割合が高いと考えられる。また、このような癌は進行が早く、悪性であるといえる。さらに、異数倍体性が起こるのは、異常なM期を経過したか、またはM期を経ずにG１期へ進んで、S期に入った場合であると考えられているため、M期に存在する細胞の割合が少ないことも悪性度を判定する指標となる。したがって、発現量及び活性値の測定対象として、第1のCDKとして、G2期からM期に活性化して作用するCDK1、第2のCDKとして、G1期からS期に活性化して作用するCDK2を選択し、測定結果から得られる比活性の比を、所定の閾値と比較することにより、細胞の増殖能や癌の悪性度の指標として用いることができる。
【００６６】
また、上述した比活性の比は、細胞の薬剤に対する感受性についても適用できる。例えば、近年指摘されている、患者の遺伝的体質による抗癌剤等の薬物の効き方の違いが、細胞の薬剤に対する感受性の違いに起因する。つまり、細胞が本来持っている性質には、薬剤に対して感受性があるか、非感受性であるかといった性質も含まれ、2種類のCDKの比活性の比は、薬剤に対する感受性とも関連している。2種類のCDKの発現量及び活性値の測定結果から得られた比活性の比を、所定の閾値と比較することにより、細胞の薬剤に対する感受性を判定することができる。
【００６７】
なお、組織の性質の判定方法及び薬剤（抗癌剤）に対する感受性の判定方法についての詳細は、特願2004−375639、WO2004／076686、特願2004−375639、及び特願2005−158373に記載されている。
【００６８】
本試薬キットが測定対象とする哺乳動物は特に限定しないが、ヒト、特に臨床状態、より具体的には癌についての状態の判定が求められているヒトに有効である。
【００６９】
本試薬キットが測定対象とする検体組織としては、増殖の制御機構に以上をきたしている腫瘍細胞を含む組織のように、病理的情報を得たい検体組織に好適である。さらに、患者の肉体的・精神的ダメージや、抗癌剤治療に要する高額な費用等を考慮し、抗癌剤治療を施すか否かの指針を得たい場合にも、本試薬キットは好適である。組織としては、乳、肺、肝臓、胃、大腸、膵臓、皮膚、子宮、精巣、卵巣、甲状腺、副甲状腺、リンパ系統、骨髄などのが好適な対象となる。また、癌の種類としては、乳癌、胃癌、大腸癌、食道癌、前立腺がんなどが挙げられる。
【実施例】
【００７０】
以下、本発明の試薬キットと、試薬キットを搭載することのできる組織性質判定装置を用いて、患者から採取した組織に含まれるサイクリン依存性キナーゼ（以下、CDKと略す）の発現量及び活性値を測定し、得られた測定結果に基づいて、ヒトの癌の悪性度の判定や抗癌剤の有効性（感受性）を判定する方法を具体的に説明する。
【００７１】
まず、組織性質判定装置について説明する。図3は、本試薬キットを搭載することのできる組織性質判定装置A（以下、判定装置Aと略す）の斜視説明図である。判定装置Aは、装置本体部20の前方部分に配設された検出部4、チップセット部1、第1試薬セット部5及び第2試薬セット部6、装置本体部20の後方に配設された活性測定ユニット2、廃液を収容するための廃液槽7及びピペットを洗浄するためのピペット洗浄槽8、装置本体部20の情報に配設されており、ピペットを3方向（X方向、Y方向及びZ方向）に移動させることができる分注機構部3、装置本体部20の背部に配設された流体部9及び電子基板部10、並びに前記検出部4及び電子基板部10と通信可能に接続された制御手段であるパーソナルコンピュータ12とで主に構成されている。また、判定装置Aには、純水タンク13、洗浄液タンク14、廃液タンク15、及び空圧源11が設けられている。純水タンク13は、測定終了時の流路洗浄用純水を貯留し、配管21により流体部9に接続されており、洗浄液タンク14はピペットを洗浄する洗浄液を貯留し、配管22によりピペット洗浄槽8に接続されており、廃液を収容するための廃液タンク15は配管23により廃液槽7に接続されている。さらに、判定装置Aは、組織から判定装置Aで処理可能な測定試料を得るための可溶化装置Bが並設されている。
【００７２】
可溶化装置Bは、判定装置Aによる処理に先立って、組織から、判定装置Aで処理可能な液状の検体を調製するものであり、筐体部30、この筐体部30の前面上方に配置された操作部31、前記組織を押し付けたり、すりつぶしたりするための一対のペッスル34を備えた駆動部32、及び前記組織が収容されるエッペンドルフチューブ35がセットされる検体セット部33とで構成されている。
【００７３】
駆動部32は、ペッスル34を上下動させるとともに及び回転運動を与えることができ、これによりエッペンドルフチューブ35内に注入された生体試料が押し付けられたり、すりつぶされたりする。そして前記筐体部30内には、かかる駆動部32の動作を制御する制御部（図示せず）が内蔵されている。
【００７４】
操作部31には、操作ボタン31a、運転ランプ31b、装置の状態やエラーメッセージ等を表示するための表示部31cが配設されている。また、検体セット部33内には、図示しない冷却手段が配設されており、該検体セット部33上面の凹所にセットされたエッペンドルフチューブ内の生体試料を一定の温度に保っている。可溶化装置Bにより可溶化され、さらに図示しない遠心分離機により遠心分離処理された生体試料の上澄み液は、所定の検体容器に採取されて判定装置Aの第1試薬セット部5にセットされる。
【００７５】
第1試薬セット部5内には、検体セット部33と同様に図示しない冷却手段が配設されており、第1試薬セット部5上面の凹所にセットされるスクリューキャップ等の容器内の検体や、各種蛍光ラベルCDK抗体溶液、各種CDK抗原溶液等を一定の温度に保っている。本実施形態に用いられる組織性質判定装置では、縦5列、横4列、合計20箇所の凹所が設けられており、最大20個のスクリューキャップ等の容器をセットすることができるようになっている。
【００７６】
第1試薬セット部5の隣には、第2試薬セット部6が配置されている。この第2試薬セット部6には、第1試薬セット部5と同様に複数の凹所が形成されており、これら凹所内にバッファー、基質溶液、蛍光増強試薬等が入れられたエッペンチューブやスクリューキャップ等の容器がセットされる。また、判定装置Aによる処理に先立って、チップセット部1に測定用チップがセットされるとともに、活性測定ユニット2にカラムがセットされる。
【００７７】
チップセット部1は、アルミニウム製のブロックからなっており、図4〜5に示すように、上面に測定用チップ121を載置するための凹分132を有するとともに、底部に吸引口135を有している。より詳細には、チップセット部1は、上面に長方形の第1凹部132と、この第1凹部132の底部に同じく長方形の第2凹部133とを備えている。第1凹部132の底面には、第2凹部133の周縁に長方形の枠状のゴム製弾性ガスケット137が配設されている。
【００７８】
第2凹部133は、その底部に、十字型の溝134と、底部中心に吸引口135とを備え、溝134の溝底には第2凹部133の周縁から中心に向かって深くなるように傾斜している。吸引口135は、外部の吸引ポンプ（図示せず）へ接続するために設けられたニップル136と連通している。そして、後に詳述する測定用チップ121は、第1凹部132の底面ガスケット137を介して水平に装填される。測定用チップ121の各ウエルにタンパク含有試料液が注入又は滴下された後、ニップル136に接続された図示しない吸引ポンプが作動する。これにより、測定用チップ121が第１凹部132の底面へガスケット137を介して気密的に吸着されるとともに、各ウエル内の試料液が後述する疎水性多孔性膜を介して吸引され、測定目的のタンパクが該膜に固相形成される。この場合、測定用チップ121を第1凹部132の底面に押し付けて固定する固定部材をチップセット部1に設けてもよい。
【００７９】
測定用チップ121は、疎水性多孔質膜122と、疎水性多孔質膜122を狭持するため上テンプレート101及び下テンプレート111とで構成されている（図10に断面図を示す）。このタンパク固相用チップ121が、サイクリン依存性キナーゼ抗体を含む抗体溶液と、検体とを接触させる第2接触手段として機能する。疎水性多孔質膜122は、Millipore社のImmobilon−FL （PVDF membrane、ポアサイズ0.45μm）を使用した。
【００８０】
上テンプレート101を図6〜7に示す。長方形の板状の上テンプレート101には、マトリックス状に4行10列に配列された40個の長方形の貫通孔102が穿設されている。上テンプレート101の下面には、前記40個の貫通孔102の周囲を一周する溝（凹部）104が形成されている。この溝104により、その内側に長方形の疎水性多孔質膜設置領域103が区画される。また、溝104の底には8つの治具貫通孔105が穿設されている。
【００８１】
一方、図8〜9に示す長方形の板状の下テンプレート111には、前記上テンプレート101の貫通孔102に対応する位置にそれぞれマトリックス状に4行10列に配列された40個の長円形の貫通孔112が形成されている。貫通孔112は、貫通孔102と同じ形状及び断面積を有している。
【００８２】
下テンプレート111の上面には、40個の貫通孔112の周囲を1周する畝上の凸部114が前記溝104に対応する位置に形成されている。そして、この凸部114によりその内側に長方形の疎水性多孔質膜設置領域113が区画される。また、下テンプレート111の周縁には６つの切り欠き部115が形成されている。なお、上テンプレート101及び下テンプレート111は、例えば塩化ビニル樹脂で作成することができる。
【００８３】
図10は測定用チップ121の断面を示しており、上テンプレート101と下テンプレート111とは、図に示すように重ねられる。溝104に凸部114が離脱可能に圧入され、各貫通孔102と各貫通孔112が互いに同軸となる。そして使用時には、疎水性多孔質膜領域103と113との間に長方形状の疎水性多孔質膜122が装填され、前記凸部114の溝104への圧入により均一に圧縮される。これにより、疎水性多孔質膜122が各貫通孔102により水密的に区画され、貫通孔102の数だけのウエル（液溜め）が形成される。
【００８４】
活性測定ユニット2は、図11〜14に示すように、それぞれがカラム201及び流体マニホールド213を備えた複数の試料調製部211からなっており、CDK活性値を測定するのに用いられる。図11に示されるカラム201は、塩化ビニル樹脂で作製された円筒体からなっており、内部には液体試料中の目的物質を単離するために用いる担体206を保持する担体保持器202と、この担体保持器202に液体試料を受け入れて貯留するための液体貯留部204とを有している。カラム201が、所定の基質を含む基質溶液と、検体とを接触させる第1接触手段を構成している。
【００８５】
カラム201の液体貯留部204は、外部から液体試料を注入または採取可能な開口205を上部に備えている。担体206は、液体試料中のCDK1またはCDK2を捕捉するため、CDK1抗体またはCDK2抗体を固定した円柱形のモノリスシリカゲルからなっている。このモノリスシリカゲルは、粒子担体とは異なり、3次元ネットワーク状の骨格とその空隙が一体となった構造を有している。担体206はカラム201の下部開口から担体保持器202に挿入され、Oリング207を介して、固定用パイプ208により弾性的に押圧されて支持される。なお、固定用パイプ208は、カラム201の下部開口から圧入され、固定用パイプ208とOリング207の孔が液体導入部203を形成する。
【００８６】
また、カラム201の下端にはカラム201を試料調製部211に装填して固定するための装填用フランジ209が形成されている。このフランジ209は、直径Dの円盤状のフランジの両側を幅W（W＜D）になるように平行に切り欠いて形成された小判型のフランジである。図12は試料調製部211の斜視図であり、同図に示されるように、試料調製部211は、L字型の支持プレート212を備え、この支持プレート212には流体マニホールド213と、シリンジポンプ214と、減速機付きステッピングモータ215とが固定されている。
【００８７】
ステッピングモータ215の出力軸にはスクリューシャフト216が接続されている。そして、このスクリューシャフト216に螺合する駆動アーム217がシリンジポンプ214のピストン218の先端に接続されている。ステッピングモータ215によりスクリューシャフト216が回転すると、ピストン218が上下運動するようになっている。シリンジポンプ214と流体マニホールド213とは、コネクタ219、220を介して送液チューブ250により接続されている。また、シリンジポンプ214は、コネクタ220aを介して送液チューブ220bにより、流路を満たすための液体（洗浄液）が収容されているチャンバ234（図14）と接続されている。
【００８８】
図13〜14に示すように、流体マニホールド213は、カラム201の液体導入部203が接続されるカラム接続部221と、液体試料を受け入れる液体試料受入部222とを備えている。流体マニホールド213は、内部に流路223を備え、下面に、液体受入部222と流路223との間を開閉する電磁バルブ224と、流路223とカラム接続部221との間を開閉する電磁バルブ225とを備えている。また、流体マニホールド213は、側面にコネクタ220を接続するためのコネクタ接続用ねじ穴226を有しており、このねじ穴226は流路223に接続されている。
【００８９】
図15は試料調製部211の流体回路図であり、流体マニホールド213にシリンジポンプ214がコネクタ220aを介して接続された状態を示している。そして、シリンジポンプ214には、電磁バルブ233を介してチャンバ234が接続され、チャンバ234には陽圧源235から陽圧が印加されている。
【００９０】
ここで、カラム201を流体マニホールド213に装填する方法を説明する。図13〜14に示すように、流体マニホールド213の上面には、カラム201の下端を受け入れるカラム受入凹部227が形成され、この凹部227の底部の中心がカラム接続部に貫通するとともに底部の円周にOリング228が装着されている。また、流体マニホールド213の上面には2枚の断面L字型押さえ板229、230がカラム装填用凹部227を中心として前記幅Wより広くDより狭い間隔で平行に固定されている。
【００９１】
そこで、カラム201をカラム装填用凹部227に、フランジ209が押さえ板229、230の間を通るように装填し、時計方向または反時計方向に90度だけ回転させる。これによって、フランジ209の直径Ｄの部分が押さえ板229、230に係合するとともに、Oリング228の弾性によりフランジ209が押さえ板229、230により固定される。なお、カラム201を除去する場合には、カラム201を押さえながら、左右いずれかの方向に90度だけ回転させればよい。
【００９２】
カラム201が試料調整部211の流体マニホールド213に装填されるとき、気泡混入を防止するため、流体マニホールド213の凹部227は流体で満たされているが、カラム201の先端を凹部227に挿入するとその体積によって流体が溢れ出す。この液体が周辺へ流出することを防止するために、カラム装着用凹部227の周囲に溢れ液貯留凹部231が設けられており、溢れ液貯留凹部231の一部にピペットにより溢れ液を吸引排出するための溢れ液排出凹部232が設けられている。各種の検体及び試薬は、ピペットを備えた分注機構部3によって、所定の箇所に、または所定の箇所から注入又は吸引される。ここで、液体試料受入部222に検体または試薬が注入された場合の動作について説明する。液体試料受入部222に検体または試薬が注入されると、まず電磁バルブ224が開き（電磁バルブ225と233は閉）、シリンジポンプ214が吸引動作をする。これによって、検体または試薬は、電磁バルブ224を通過し、シリンジポンプ214側に吸引される。次に、電磁バルブ224を閉じ、電磁バルブ225を開き、シリンジポンプ214が吐出動作をする。これによって、検体または試薬は、電磁バルブ225を通過し、カラム201中に送液される。
【００９３】
分注機構部3は、図3に示すように、ピペットX方向移動用のフレーム352と、ピペットY方向移動用のフレーム353と、ピペットZ方向移動用のプレート354とを備えている。フレーム352は、プレート354を矢印X方向に移動させるためのスクリューシャフト355と、プレート354を支持して摺動させるためのガイドバー356と、スクリューシャフト355を回転させるステッピングモータ357を備えている。フレーム353は、フレーム352を矢印Y方向に移動させるためのスクリューシャフト358と、フレーム352を支持して摺動させるためのガイドバー359と、スクリューシャフト358を回転させるステッピングモータ361とを備えている。また、プレート354は、ピペット361を支持するアーム368を矢印Z方向に移動させるためのスクリューシャフト367と、アーム368を支持して摺動させるためのガイドバー、スクリューシャフト367を回転させるステッピングモータ370とを備えている。
【００９４】
なお、本実施の形態に用いる組織性質判定装置では、分注機構部3が一対のピペット362を備えているので、同時に2つの検体容器に試薬等を注入したり、同時に2つの検体容器から内容物を吸引したりすることができ、測定処理を効率よく行うことができる。
【００９５】
装置本体部20の背部には、図3に示すように、前記ピペット362、ピペット洗浄槽8及び各試料調製部211等に接続されて流体を操作する流体部9が配設されている。この流体部9は、図14に示すように、各試料調製部211の電磁バルブ224、225、保冷液チャンバからシリンジ214に液体を充填する際に流体を制御する電磁バルブ233、ピペット362による液体の吸引、吐出の際に流体を制御する電磁バルブ、廃液槽7におけるピペット362から廃棄される液体を吸引する際に流体を制御する電磁バルブ、及びピペット洗浄槽8においてピペット362を洗浄する際に流体を制御する電磁バルブを備えている。
【００９６】
また、装置本体部20の背部には、各試料調製部211、ステッピングモータ357、361、370、流体部9等に駆動信号を供給するための電子基板部10が配設されている。
【００９７】
検出部4は、測定用チップ121の疎水性多孔質膜122に固相化したタンパク量を反映する蛍光物質量、及びリン酸基の量を反映する蛍光物質量を測定するものであり、測定用チップ121に励起光を照射し、発生する蛍光の量を検出して、検出した蛍光の強度に対応する大きさの電気信号を、電子基板部10に出力する。検出部4としては、一般に用いられている光源部、照明系及び受光系からなるものを適宜採用することができる。
【００９８】
制御手段であるパーソナルコンピュータ12は、図16に示すように、前記電気電子基板部10に接続される制御部77、この制御部77にデータ等を入力するための入力部78、及び分析結果等を表示する表示部79を備えている。制御部77が、解析手段、検量線を用いて蛍光強度から発現量を取得する第1（第2）発現量取得手段、及び検量線を用いて蛍光強度から活性値を取得する第1（第2）活性値取得手段を構成している。
【００９９】
制御部77は、図16に示すように、CPU91aと、ROM91bと、RAM91cと、入出力インターフェース91dと、画像出力インターフェース91eとを備えている。ROM91bは、オペレーティングシステム、装置の動作を制御するための制御プログラム、及び制御プログラムの実行に必要なデータが格納されている。CPU91aは、制御プログラムをRAM
91cにロードし、またはROM91bから直接実行することが可能である。このようにしてCPU
91aが処理した結果のデータは、入出力インターフェース91dを通じて電子基板部10に送信され、CPU91aの処理に必要なデータは、電子基板部10から入出力インターフェース91dを通じて受信される。CPU91aは制御プログラムを実行することにより、電子基板部10の制御を行なうことが可能となる。また、CPU91aは、検出部4で得られた蛍光強度に基づいて、サイクリン依存性キナーゼ（CDK）の発現量や活性値を取得し、取得した値に基づいて、組織に関する性質の情報を取得する役割を果たしている。そして、CDKの発現量や活性値を取得するために、前記RAM91cには、蛍光強度を発現量または活性値に変換するための変換データである検量線が記憶されている。
【０１００】
図17は、判定装置Aを制御する制御系のブロック図である。この制御系は、同図に示すように、分注機構部3の各部を駆動するためのドライバー回路を有する電子基盤部10と、この電子基板部10を制御するとともに検出部4からの検出結果を分析するための制御部77、この制御部77へデータ等を入力する入力部78、及び制御部77で分析された分析結果等を表示するための表示部79から構成されるパーソナルコンピュータ12とからなっている。
【０１０１】
制御部77は、電子基板部10を制御することにより、電子基板部10から各試料調製部211のステッピングモータ215を駆動するための駆動信号、第1試薬セット部5の温度調節をするための駆動信号、ステッピングモータ357、361、370を駆動するための駆動信号、及び流体部9にある電磁バルブを駆動するための駆動信号を出力する。また、制御部77は、検出信号を検出部4から電子基板部10を介して取り込む。
【０１０２】
次に、本試薬キット及び判定装置Aを用いて組織の性質を判定する方法について、ヒトの癌細胞の悪性度（再発リスクの高さ）及び抗癌剤の有効性（感受性）を判定する場合を例にとって説明する。
【０１０３】
なお、以下に記載の試薬番号は、表2〜7に記載の試薬に対応している。
【０１０４】
（1）可溶化装置による前処理
判定装置Aによる処理に先立って、可溶化装置Bを用いて、癌患者から摘出した組織から液状の検体を採取する方法について説明する。はじめに、癌患者から摘出した組織（約2mm3）を、ピンセットを用いて、組織可溶化溶液（試薬番号3001）の入ったテストチューブに投入し、このテストチューブを、図3に示す可溶化装置Bの検体セット部33にセットした。ついで、操作部31のスタートボタンを押すと、ペッスル34が所定位置まで下降し、テストチューブ内の組織をテストチューブの底部に押し付ける。この状態で、ペッスル34を回転させて組織をすりつぶした。所定時間経過後にペッスル34の駆動を停止させ、さらにペッスル34を上方に移動させた後に、テストチューブを検体セット部33から取り出した。ついで、可溶化されたテストチューブの内容物を遠心分離機にかけ、得られる上澄み液を検体としてマニュアルで採取した。
【０１０５】
（2）判定装置への発現測定用試料のセッティング
採取した上澄み液を2つの検体容器に入れ、互いに異なる希釈倍率で希釈した後、第1試薬セット部5の所定の位置にセットした。2つの検体のうち、一方は発現量測定用の検体であり、他方は活性値測定用の検体である。
【０１０６】
さらに、蛍光標識CDK1抗体溶液（試薬番号1001）、蛍光標識CDK2抗体溶液（試薬番号1002）、蛍光標識p21抗体溶液（試薬番号1003）、蛍光標識GAPDH抗体溶液（試薬番号1004）、CDK1抗原溶液1（試薬番号1005）、CDK1抗原溶液2（試薬番号1006）、CDK2抗原溶液1（試薬番号1007）、CDK2抗原溶液2（試薬番号1008）、p21抗原溶液1（試薬番号1009）、p21抗原溶液2（試薬番号1010）、GAPDH抗原溶液1（試薬番号1011）、GAPDH抗原溶液2（試薬番号1012）、及び活性用キャリブレータ溶液（試薬番号2011）を第1試薬セット部5の所定の位置にセットした。
【０１０７】
また、ブロッキング溶液（試薬番号1013）、免疫沈降（IP）バッファー（試薬番号2004）、反応前バッファー1（試薬番号2005）、反応前バッファー2（試薬番号2006）、基質溶液（試薬番号2007）、蛍光標識化溶液（試薬番号2008）、蛍光増強試薬（試薬番号2009）、及び反応停止液（試薬番号2010）を第2試薬セット部6の所定の位置にセットした。
【０１０８】
（3）判定装置による処理全体のフロー
ここで、図18に示した判定装置による処理の全体のフローについて説明する。なお、以下のフローチャート中の判断において、「Yes」及び「No」を図示しない場合は、下がYes、右（左）がNoである。また、以下に説明する処理は、すべて制御部77によって制御される処理である。
【０１０９】
まず、電源が投入されると、測定登録を受け付ける処理が実行される（ステップS1）。この処理では、検体番号等の測定に関する情報の入力を受け付ける。次に、予後予測モード（ヒトの癌細胞の悪性度（再発リスクの高さ）を判定するモード）および抗癌剤感受性モード（抗癌剤の有効性（感受性）を判定するモード）のいずれかの測定モードの選択を受け付ける処理が実行される（ステップS2）。具体的には、パーソナルコンピュータ12の表示部79に、２つのモードの入力ボタンが表示される。オペレータは、希望するモードの入力ボタンをクリックする。なお、本例では、抗癌剤感受性モードにおいて、タキサン系抗癌剤の感受性を判定している。また、上記2つのモードに加えて、予後予測・抗癌剤感受性モードを選択できるようにしてもよい。
【０１１０】
ついで、測定開始の指示を受け付けているか否かの判断をする（ステップS3）。YesならステップS4へ、NoならステップS8へ進む。次に、第1試薬セット部5にセットした検体容器から検体を吸引し、吸引した検体に所定の処理を施すことによって、蛍光検出用の試料を調製する（ステップS4）。このステップの処理には、後に詳述する発現量測定用試料の調製処理と活性値測定用試料の調製処理とが含まれ、これらの2つの処理は平行して実行される。
【０１１１】
蛍光検出用の試料を含む測定用チップ121（試薬番号3004）がセットされたチップセット部1を図3に示す位置から検出部4の中へ移動させ（ステップS5）、測定用チップの各ウエルに励起光を照射し、蛍光検出用の試料から放射される蛍光を検出する（ステップS6）。
【０１１２】
次に、パーソナルコンピュータ12の制御部77にて、蛍光強度を取得し、取得した蛍光強度から解析結果を出力させる（ステップS7）。判定装置をシャットダウンする指示を受け付けているか否かを判断し（ステップS8）、YesならステップS9に進み、NoならステップS1に戻る。最後にシャットダウン処理をし、電源をオフにする（ステップS9）。
【０１１３】
（4）発現量測定用試料の調製処理
ステップS4における発現量測定用試料の調製処理のフローを図19に示す。まず、測定用チップ121（試薬番号3003）の各ウエルに予め貯留している保存液（TBS；25mM Tris、150mM NaCl、pH7.4）を排出し、各ウエル内を洗浄した（ステップS11）。洗浄は、分注機構部3のピペットを介して洗浄液（試薬番号3002）を上方から各ウエルに注入し、次いで測定用チップの下方から、注入された洗浄液を、疎水性多孔質膜を通して、陰圧により吸引することによって行なった。以下の洗浄工程も同様である。
【０１１４】
次に、第1試薬セット部5にセットされた検体容器から、発現量測定用に調製された検体をピペットで吸引し、この検体を所定のウエルに注入し、次いでこの検体を測定用チップ121（試薬番号3004）の下方から陰圧により吸引した。これにより、検体中に含まれるタンパク質は、疎水性多孔質膜との間の疎水結合等により保持され、固相化される（ステップS12）。次いで、ステップS11と同様に、前記所定のウエル内を洗浄した。これにより、タンパク質以外の成分を、測定用チップの疎水性多孔質膜から除去した（ステップS13）。
【０１１５】
その後、第1試薬セット部5にセットされたブロッキング溶液（試薬番号1014）をピペットで吸引して所定のウエルに注入し、15分以上（例えば30分間）放置した後、ウエル内に残っているブロッキング溶液を排出した（ステップS14）。これにより、タンパク質が固相化されていない疎水性多孔質膜の部位に、ついで注入する蛍光標識CDK1抗体溶液（試薬番号1001）、蛍光標識CDK2抗体溶液（試薬番号1002）、蛍光ラベルp21抗体溶液（試薬番号1003）、及び蛍光標識GAPDH抗体溶液（試薬番号1004）が固相化するのを防ぐことができる。次に、該蛍光標識CDK1抗体溶液、該蛍光標識CDK2抗体溶液、該蛍光標識p21抗体溶液、該蛍光標識GAPDH抗体溶液、およびバックグラウンド溶液（試薬番号1013）を、2つのウエルに注入した。20〜30分経過し、それぞれの蛍光標識抗体溶液と、疎水性多孔性膜に固相化されたタンパク質（CDK1、CDK2、p21、またはGAPDH）との反応が終了した後に、注入したそれぞれの蛍光標識抗体溶液を排出した（ステップS15）。最後に、ステップS13と同様に、所定のウエル内を洗浄した（ステップS16）。
【０１１６】
なお、ブロッキング溶液（試薬番号1014）の他、反応前バッファー1（試薬番号2005）、反応前バッファー2（試薬番号2006）、および蛍光増強試薬（試薬番号2009）を収容している2連動時アクセス可能容器については、分注機構部3の2つのピペットが同時に溶液を吸引することができる幅に設定した2つの液体貯留部を有する。
【０１１７】
（5）活性値測定用試料の調製処理
ステップS4における活性値測定用試料の調製処理のフローを図20に示す。なお、この活性値測定用試料の調製処理においては、図3に示される活性測定ユニット2として、図中手前側に4つの試料調製部211を備え、図中奥側にも4つの試料調製部211を備えたものを用いた。この活性測定ユニット2の各試料調製部211を、図中奥側の左から第1試料調製部（Ac1）、第２試料調製部（Ac2）、第3試料調製部（Ac3）、第4試料調製部（Ac4）とし、また、図中手前の左から第5試料調製部（Ac5）、第6試料調製部（Ac6）、第７試料調製部（Ac7）、第8試料調製部（Ac8）とする。
【０１１８】
まず、CDK1カラム（試薬番号2001）3本、CDK2カラム（試薬番号2002）3本、及びブランクカラム（試薬番号2003）2本の、合計8本のカラム（以下、各カラムと略すことがある）を、第1〜第8試料調製部（Ac1〜Ac8）に、図21に示すようにセットした後、第1〜第8試料調製部（Ac1〜Ac8）のそれぞれについて、液体試料受入部222に、分注機構部3のピペットで免疫沈降バッファー（試薬番号2004）を注入した。そして、第1〜第8試料調製部（Ac1〜Ac8）のそれぞれについて、シリンジポンプ214および電磁バルブ224、225が前述したように動作することにより、バッファーは、8本の該各カラムに送液される。全ての各カラム中の免疫沈降バッファーは、分注機構部3のピペットで吸引して廃棄した（ステップS21）。
【０１１９】
次に、免疫沈降（抗体とCDKの反応）をさせた（ステップS22）。検体を送液する順序を図21に示す。まず、第1試薬セット部5にセットした1つの検体容器から、活性値測定用の検体1を、分注機構部3の一方のピペットで、活性値測定用の検体2を他方のピペットで吸引した。  
検体容器から吸引された活性値測定用の検体1は、第1試料調製部（Ac1）の液体試料受入部222に注入され、これを介して、シリンジポンプ214および電磁バルブ224、225が前述したように動作することにより、第1試料調製部（Ac1）にセットしたブランクカラム（試薬番号2003）に送液される。その際、ピストン218を上下に1.5往復（排出−吸引−排出）させることにより、検体1を、ブランクカラムのモノリスシリカゲルからなる担体において1.5往復させた。
【０１２０】
一方、検体容器から吸引された活性値測定用の検体2は、まず、第5試料調製部（Ac5）の液体試料受入部222に注入され、これを介して上記と同様に、第5試料調製部（Ac5）にセットしたブランクカラム（試薬番号2003）に送液される。第1試料調製部（Ac1）および第5試料調製部（Ac5）の該ブランクカラムのモノリスシリカゲル担体には、CDK1の抗体もCDK2の抗体も固定されていない。従って、第1試料調製部（Ac1）および第5試料調製部（Ac5）では、CDK1およびCDK2は固相化されず、第1試料調製部（Ac1）にセットしたブランクカラムには、CDK1及びCDK2を含む検体1が貯留され、第5試料調製部（Ac5）にセットしたブランクカラムには、CDK1及びCDK2を含む検体2が貯留される。
【０１２１】
次に、第1試料調製部（Ac1）にセットしたブランクカラムに貯留された検体1は、分注機構部3のピペットによって吸引され、第3試料調製部（Ac3）の液体試料受入部222に注入され、これを介して、上記と同様に、第3試料調製部（Ac3）にセットしたCDK1カラム（試薬番号2001）に送液される。
【０１２２】
一方、第5試料調製部（Ac5）にセットしたブランクカラムに貯留された検体2は、分注機構部3のピペットによって吸引され、第4試料調製部（Ac4）の液体試料受入部222に注入され、これを介して、上記と同様に、第4試料調製部（Ac4）にセットしたCDK1カラム（試薬番号2001）に送液される。第3試料調製部（Ac3）及び第4試料調製部（Ac4）にセットしたCDK1カラムのモノリスシリカゲル担体には、CDK1の抗体が固定されている。従って、第3試料調製部（Ac3）および第4試料調製部（Ac4）では、CDK1は固相化されるが、CDK2は固相化されず、第3試料調製部（Ac3）にセットしたCDK1カラムには、CDK1を含まずCDK2を含む検体1が貯留され、第4試料調製部（Ac4）にセットしたCDK1カラムには、CDK1を含まずCDK2を含む検体2が貯留される。
【０１２３】
次に、第3試料調製部（Ac3）にセットしたCDK1カラム（試薬番号2001）に貯留された検体1は、分注機構部3のピペットによって吸引され、第7試料調製部（Ac7）の液体試料受入部222に注入され、これを介して、上記と同様に、第7試料調製部（Ac7）にセットしたCDK2カラム（試薬番号2002）に送液される。
【０１２４】
一方、第4試料調製部（Ac4）にセットしたCDKカラム（試薬番号2001）に貯留された検体2は、分注機構部3のピペットによって吸引され、第8試料調製部（Ac8）の液体試料受入部222に注入され、これを介して、上記と同様に、第8試料調製部（Ac8）にセットしたCDK2カラム（試薬番号2002）に送液される。第7試料調製部（Ac7）および第8試料調製部（Ac8）にセットしたCDK2カラムのモノリスシリカ担体には、CDK2の抗体が固定されている。従って、第7試料調製部（Ac7）および第8試料調製部（Ac8）では、CDK2が固相化されるので、第7試料調製部（Ac7）にセットしたCDK2カラムには、CDK1もCDK2も含まない検体1が貯留され、第8試料調製部（Ac8）にセットしたCDK2カラムには、CDK1もCDK2も含まない検体2が貯留される。第7試料調製部（Ac7）および第8試料調製部（Ac8）にセットしたCDK2カラムに貯留された検体1及び検体2は、それぞれ分注機構部3のピペットによって吸引され、廃液槽7に廃棄される。
【０１２５】
そして、第1試料調製部（Ac1）および第5試料調製部（Ac5）は、バックグラウンドの活性測定用に、第3試料調製部（Ac3）および第4試料調製部（Ac4）は、CDK1の活性測定用に、第7試料調製部（Ac7）および第8試料調製部（Ac8）は、CDK2の活性測定用に使用される。
【０１２６】
このように、カラム内に残った検体を他のカラムに注入することによって、少ない検体量で、バックグラウンド活性測定、CDK1活性測定およびCDK2活性測定が可能となる。
【０１２７】
なお、活性値の検量線を作成するため、上記と同様の手順で活性用キャリブレータ溶液（試薬番号2011）の活性値を測定した。
【０１２８】
ついで、検体中の不要成分を洗浄して取り除くために、反応前バッファー１（試薬番号2005）を各カラムに送液した（ステップS23）。その後、反応前バッファー１（試薬番号2005）はステップS25で実行される酵素反応に影響を与えることから、かかる酵素反応のためのコンディションを作ることを主目的に、反応前バッファー2（試薬番号2006）を各カラムに送液して、反応前バッファー1（試薬番号2005）の成分を洗い流した（ステップS24）。
【０１２９】
次に、基質溶液（試薬番号2007）を各カラムに注入し、ピストン219を5.5往復させた（ステップS25）。各カラム中に、各カラムの下側から押し出された液は、そのまま貯留される。このステップによって、CDK1又はCDK2を酵素として、基質溶液に含まれるHistonH1にリン酸基が導入される。そして、このリン酸基の量は、CDK1またはCDK2の酵素として働きの強さ（すなわち活性値）に左右されることから、前記リン酸基の量を測定することによって、CDK1またはCDK2の活性値を求めることができる。なお、図21に示される第１試料調製部（Ac1）および第5試料調製部（Ac5）を使用して求められるバックグラウンド活性値は、後述するように、バックグラウンド補正をするために用いた。
【０１３０】
ついで、蛍光標識化溶液（試薬番号2008）を、ピペットを用いて各カラムの上方より直接各カラム内に分注し、HistonH1に導入されたリン酸基に蛍光標識を結合させた（ステップS26）。その際、ピペットが、所定の時間、各カラム内の液体の分注及び吸入を繰り返すことにより各カラム内の液体を撹拌した。ステップS26の開始から所定時間（例えば、20分間）経過後に反応停止液（試薬番号2010）を蛍光標識化試薬と同様に各カラムに直接分注した。そして、ステップS26と同じく所定の時間、各カラム内の液体の分注及び吸入を繰り返すことにより各カラム内の液体を撹拌した（ステップS27）。これにより、蛍光標識の結合を停止させた。
【０１３１】
次に、第1試料調製部（Ac1）、第3試料調製部（Ac3）、第4試料調製部（Ac4）、第5試料調製部（Ac5）、第7試料調製部（Ac7）、および第8試料調製部（Ac8）の6本のカラム内の液体を、それぞれ測定用チップ121（試薬番号3004）の6つのウエルに分注した後に、測定用チップ121を下方から吸引した（ステップS28）。これによって、蛍光標識が結合したリン酸基を有するHistonH1が測定用チップ121の多孔質膜に固相化される。ついで、前記発現量測定用試料の調製処理におけるステップS11と同様に、洗浄液（試薬番号3002）を用いてウエルの洗浄を行った（ステップS29）。最後に、蛍光を活性化させるために、蛍光増強試薬（試薬番号2009）をウエルに分注し、排出する操作を6回繰り返した（ステップS30）。
【０１３２】
（6）解析処理
図22に示されるように、検出部で得られた蛍光強度から解析がなされ、その解析結果が出力される。まず、制御部77は、検出部4の受光系から電子基板部10を介して、CDK1の発現、CDK1の活性、CDK2の発現、CDK2の活性、p21の発現、バックグラウンドの発現、及びバックグラウンドの活性のそれぞれについて、２つずつ蛍光強度を取得する（ステップS31）。
【０１３３】
ついで、制御部77は、各項目について2つずつ得られた蛍光強度の平均値を算出する（ステップS32）。次に、CDK1の発現の蛍光強度（平均値）からバックグラウンドの発現（平均値）を引くとともに、CDK2の発現の蛍光強度（平均値）からバックグラウンド発現（平均値）を引くことにより、CDK1発現、CDK2発現、およびp21発現についてバックグラウンド補正を行う。CDK1活性、CDK2活性、およびp21活性についても、同様にしてバックグラウンド補正を行う（ステップS33）。
【０１３４】
ついで、それぞれの項目について、検量線を用いて発現量および活性値を取得する（ステップS34）。なお、この検量線は、蛍光強度を発現量または活性値に変換するためのデータである。検量線の作成について、まず発現量の検量線は、先述したCDK1抗原溶液1（試薬番号1005）、CDK1抗原溶液2（試薬番号1006）、CDK2抗原溶液1（試薬番号1007）、CDK2抗原溶液2（試薬番号1008）、p21抗原溶液1（試薬番号1009）、p21抗原溶液2（試薬番号1010）、GAPDH抗原溶液1（試薬番号1011）、及びGAPDH抗原溶液2（試薬番号1012）の発現量測定結果を用いて作成した。また、活性値の検量線は、先述した活性用キャリブレータ溶液（試薬番号2011）の活性値測定結果を用いて作成した。これらの発現量及び活性値の検量線は、制御部77のRAM91cに記憶される。次に、以下の式に従い、CDK1比活性及びCDK2比活性を算出する（ステップS35）。
CDK1比活性＝CDK1活性値／CDK1発現量
CDK2比活性＝CDK2活性値／CDK2発現量
また、以下の式に従いCDK1比活性とCDK2比活性との比を算出する（ステップS36）。
CDK1比活性とCDK2比活性との比＝CDK2比活性／CDK1比活性
【０１３５】
ここでまず、CDK2比活性が第1の閾値以上であるか否かが判断され（ステップS37）、CDK2比活性が第1の閾値以上の場合は、癌の再発リスクが高いと判定する。CDK2比活性が第1の閾値より小さい場合は、CDK1比活性とCDK2比活性との比が、第2の閾値以上であるか否かが判断され（ステップS38）、比が第2の閾値以上の場合は、癌の再発リスクが高いと判定し、比が第2の閾値より小さい場合は、癌の再発リスクが低いと判定する。そして、再発リスクの大きさを決定する根拠となるCDK1発現量、CDK1活性値、CDK1比活性、CDK2発現量、CDK2活性値、CDK2比活性、CDK1比活性とCDK2比活性との比を表示するとともに、再発リスクの判定結果を表示する（ステップS39）。
【０１３６】
ここで、実際に本試薬キットを用いて乳癌組織の発現量及び活性値を測定し、再発リスクを判定した具体的な例を説明する。乳癌患者W、X、Y、及びZの3名からそれぞれ採取した検体組織について、上記方法を用いて再発リスクの判定を行なった。4名の乳癌患者の検体組織について、病理医の判定結果（TMN分類、リンパ節転移の状態、癌組織の大きさ、術後5年間の再発の有無、再発場所）を表8に示す。4名はいずれも早期乳癌（LNがa）であり、検体組織は冷凍保存されたものを用いた。
【０１３７】
表中「LN」は、手術時のリンパ節転移の状態を示し、「a」は所属リンパ節に転移が認められなかったもの、「b」は所属リンパ節のうち1〜3個に転移が認められたもの、「c」は所属リンパ節のうち4個以上に転移が認められたものに分類される。「T」は、手術時の原発巣のサイズを示し、腫瘍径2cm以下を「a」、腫瘍径2cm〜5cmを「b」、腫瘍径5cm以上を「c」で示す。
【０１３８】
乳癌患者4名から採取した検体組織について、前記試薬キット及び組織性質判定装置を用いてCDK1比活性、CDK2比活性を測定し、検体組織の再発リスクを判定した。乳がん患者W、X、Y、及びZから採取された検体組織のCDK1比活性とCDK2比活性との比をそれぞれ表8に示す。まず、第1の閾値を予め10000と設定し、CDK2比活性と比較した。比が第1の閾値（10000）以上である乳癌患者Xの検体組織は、癌の再発リスクが高いと判定された。ついで、第2の閾値を予め46と設定し、CDK1比活性とCDK2比活性との比と比較した。比が第2の閾値（46）以上である乳癌患者Zの検体組織は、癌の再発リスクが高いと判定され、比が第2の閾値よりも小さい乳癌患者W及びYの検体組織は、癌の再発リスクが低いと判定された。結果を表8に示す。
【０１３９】
【表８】
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【０１４０】
表8に示すように、悪性度が高くないと言われる早期乳癌においても、前記試薬キット及び組織性質判定装置を用いた測定結果において、患者X及びZの再発リスクは高いと判定され、実際に術後5年以内に再発を起こした。一方再発リスクが低いと判定された患者W及びYは再発を起こさなかった。
【０１４１】
図23は図22に示す解析処理の他の実施例のフローを示す図である。本例においては、ステップS40において、タキサン系抗癌剤の感受性を判定している。この実施例に示される解析処理において、ステップS31からステップS36は、図21に示される解析処理と同じである。
【０１４２】
ここでまず、前期CDK2比活性が第1の閾値以上であるか否かが判断され（ステップS40）、CDK2比活性が第1の閾値以上の場合は、抗癌剤に対する感受性が高い、すなわち抗癌剤が有効であると判定する。CDK2比活性が第1の閾値より小さい場合は、前記CDK1比活性とCDK2比活性との比が、第3の閾値以上であるか否かが判断され（ステップS41）、比が第3の閾値以上の場合は、抗癌剤に対する感受性が高いと判定し、比が第3の閾値より小さい場合は、抗癌剤に対する感受性が低いと判定する。
そして、以上の各判定をする根拠となるCDK1発現量、CDK1活性値、CDK1比活性、CDK2発現量、CDK2活性値、CDK2比活性、CDK1比活性とCDK2比活性との比を表示するとともに、抗癌剤の感受性の判定結果を表示する（ステップS42）。
【０１４３】
ここで、実際に本試薬キットを用いて乳癌組織の発現量及び活性値を測定し、上記タキサン系抗癌剤感受性を判定した具体的な例を説明する。乳癌患者O、P、Qから採取した検体組織について、上記方法を用いてタキサン系抗癌剤感受性の判定を行なった。3名の乳癌患者の検体組織について、病理医の判定結果（TMN分類、リンパ節転移の状態、癌組織の大きさ、抗癌剤治療の効果）を表9に示す。3名はいずれも進行癌（LNがcまたはb）であり、検体組織は生検のため採取されたものを用いた。
【０１４４】
抗癌剤治療を行なっていない3名の乳癌患者O、P、Qの検体組織について、試薬キット及び組織性質判定装置を用いてCDK1比活性、CDK2比活性を測定し、タキサン系抗癌剤感受性を判定した。乳癌患者O、P、Qから採取された検体組織のCDK1比活性とCDK2比活性との比をそれぞれ表9に示す。ここでまず、図21と同様に第1の閾値を予め10000と設定し、CDK2比活性と比較した。比が第1の閾値（10000）以上である乳癌患者P及びQの検体組織は、抗癌剤に対する感受性が高い、即ち抗癌剤が有効であると判定された。ついで、第3の閾値を予め48と設定し、CDK1比活性とCDK2比活性との比と比較した。該比が第3の閾値（48）以上である乳癌患者Oの検体組織も、抗癌剤に対する感受性が高いと判定された。結果を表9に示す。なお、表中「PR」（partial response）とは、計測できる病変の総和の50%以上の減少及び新病変が出現しなかったことを指す。
【０１４５】
【表９】
2007097448.tif 000011
【０１４６】
表9に示すように、抗癌剤感受性が高いと判定された検体組織において、抗癌剤治療の著名な効果が認められた。
【０１４７】
（7）判定結果の利用例
図22に示すステップS39、及び図23に示すステップS42で表示された判定結果を医師がどのように利用するのかを図24に示す。
【０１４８】
患者に対して画像診断で乳癌の可能性を確認し、バイオプシーによる病理組織診または細胞診で癌を確定する。病理組織診の結果、癌が早期癌であると診断された場合は、癌組織の摘出手術を行い、摘出された組織に対して判定装置Aによる組織性質の判定を行う。判定装置Aによる組織性質の判定の結果、癌がローリスク群に属する（判定装置Aに表示された判定結果が「再発リスクが低い」）と判明した場合は、医者により治療1（ホルモン療法剤の単独使用）が選択され、癌がハイリスク群に属する（判定装置Aに表示された判定結果が「再発リスクが高い」）と判明した場合は、タキサン系抗癌剤の感受性の判定を行なう。タキサン系抗癌剤の使用が有効であるタキサン感受性群（判定装置Ａに表示された判定結果が「抗癌剤感受性が高い」）に属する場合は、治療2（ホルモン療法剤とタキサン系抗癌剤の併用）が選択される。なお、判定装置Aに表示された判定結果が「抗癌剤感受性が低い」の場合は、タキサンが有効であるとは言い切れないため、医師の判断により、治療2（ホルモン療法剤とタキサン系抗癌剤の併用）または、治療3（ホルモン療法剤とタキサン以外の化学抗癌剤の併用）が選択される。
【０１４９】
また、病理組織診において、進行癌であると診断された場合は、患者のライフスタイルや乳房温存の希望、治療費等の事情を考慮し、医者と患者とで術前化学療法（摘出手術前の化学抗癌剤治療）を行うか否かが検討される。術前化学療法を行う場合には、抗癌剤（タキサン）に24時間浸漬したバイオプシーサンプルに対して判定装置Aによる抗癌剤感受性の判定を行う。判定装置Ａに表示された判定結果が「抗癌剤感受性が高い」の場合は、治療2（ホルモン療法剤とタキサン系抗癌剤の併用）が選択される。なお、判定装置Aに表示された判定結果が「抗癌剤感受性が低い」の場合は、タキサンが有効であるとは言い切れないため、医師の判断により、治療2（ホルモン療法剤とタキサン系抗癌剤の併用）または、治療3（ホルモン療法剤とタキサン以外の化学抗癌剤の併用）が選択される。このような判定結果を指針とし、術前化学療法を適切に行うことにより、癌組織を抗癌剤で縮小させた後に摘出することができる。
【０１５０】
化学療法を行わない場合には、摘出手術が行われ、摘出された癌組織に対して判定装置Aによる抗癌剤感受性の判定を行う。判定装置Aに表示された判定結果が「抗癌剤感受性が高い」の場合は、治療2（ホルモン療法剤とタキサン系抗癌剤の併用）が選択される。なお、判定装置Ａに表示された判定結果が「抗癌剤感受性が低い」の場合は、タキサンが有効であるとは言い切れないため、医師の判断により、治療2（ホルモン療法剤とタキサン系抗癌剤の併用）または、治療3（ホルモン療法剤とタキサン以外の化学抗癌剤の併用）が選択される。
【０１５１】
図25は、感受性の解析に関する他のフローを示している。このフローもタキサン系抗癌剤の感受性を判定しており、CDK2比活性と閾値である「400」との比較を行い（ステップS50）、CDK2比活性が400以上である場合は、感受性が高いタイプＩと判定し、CDK2比活性が400未満である場合は、p21の発現量と閾値である「8」との比較を行う（ステップS51）。P21の発現量が8以上のときは、感受性が低いタイプIIIと判定し、p21の発現量が8未満のときは、感受性が中位であるタイプIIと判定する。なお、この実施例において、CDK2比活性及びp21の発現量の各閾値は、予め蓄積された患者データ等に基づいて設定することができる。
【０１５２】
図26は、感受性の解析に関するさらに他の判定結果を示している。この結果では、サイクリン（Cyclin）Eの発現量と、CDK2の比活性とに基づいて、CE（抗癌剤）の感受性を判定している。具体的には、CDK2比活性とサイクリンEの発現量との比を所定の閾値と比較することによって、CEの感受性を判定している。なお、サイクリンEの発現量は、試薬を適宜変更することによって、CDK1の発現量と同様にして測定することができる。
【０１５３】
図27は、感受性の解析に関するさらに他の判定結果を示している。この結果では、CDK1比活性を所定の閾値と比較することによって、CMF（抗癌剤）の感受性を判定している。この結果において、患者No.1〜16は、摘出手術後CMFの投与治療を受けた結果癌の再発が認められなかった患者であり、患者No.17〜25は、CMFの投与治療にもかかわらず癌が再発した患者である。この場合、閾値として「90」を設定すると、CDK1比活性が90以上の8例（No.1、6、9、11〜15）はいずれも再発しなかった例となるので、90という閾値が適切であることが分かる。なお判定には、摘出されて冷凍保存されていた組織を用いた。
【０１５４】
図28は図22に示される解析処理のさらに他のフローを示す図である。このフローに示される解析処理は、ステップS31からステップS36は、図22に示す解析処理と同じである。この例に示す解析処理では、ステップS43で、ステップS2で選択されたモードが、予後予測モードであるか、感受性モードであるかの判断をし、予後予測モードの場合は、前記CDK1比活性とCDK2比活性との比が第4の閾値以上であるか否かが判断され（ステップS44）、感受性モードの場合は、CDK2比活性が第5の閾値以上であるか否かが判断される（ステップS46）。ステップS44において、CDK1比活性とCDK2比活性との比が第4の閾値以上の場合は、再発リスクが高いと判定し、CDK1比活性とCDK2比活性との比が第4の閾値よりも小さい場合は、再発リスクが低いと判定する。そして、再発リスクが高いと判定された場合、感受性モードを実行するか否かを判断する処理が実行される（ステップS45）。具体的には、パーソナルコンピュータ12の表示部79上に、感受性モードを実行するか、再発リスクの判定結果のみを表示するかを選択するためのボタンを表示し、オペレータからの入力を受け付ける処理が実行される。ステップS45において、感受性モードを実行すると判断された場合は、処理はステップS46に進み、感受性モードを実行しない（再発リスクの判定結果のみを表示する）と判断された場合は、処理は、ステップS49に進む。また、ステップS46において、CDK2比活性が第5の閾値以上である場合は、感受性が高い、即ち抗癌剤が有効であると判定し、一方、CDK2比活性が第5の閾値よりも小さい場合は、p21発現量と第6の閾値との比較を行う（ステップS47）。
【０１５５】
そして、p21発現量が第6の閾値よりも小さい場合は、感受性が低いと判定し、p21発現量が第6の閾値以上である場合は、CDK1比活性と第7の閾値との比較を行う（ステップS48）。CDK1比活性が第7の閾値よりも小さい場合は、感受性がやや低いと判定し、CDK1比活性が第7の閾値以上である場合は、感受性が中位であると判定する。
【０１５６】
そして、以上の各判定をする根拠となるCDK1発現量、活性値、比活性、CDK2発
現量、活性値、比活性、CDK1比活性とCDK2比活性との比、及びp21発現量を表示するとともに、選択されている選択モードに応じて、再発リスクの判定結果又は感受性の判定結果を表示する（ステップS49）。
なお、第4から第7の閾値としては、PCT／JP2005／009847に記載されている閾値および特願2005−158373に記載されている閾値を使用することができる。また、第4の閾値としては、前述した第1の閾値と同じ値を用いることが好ましい。
【０１５７】
図29は図28に示される解析処理の他の実施例のフローを示す図である。このフローでは、図17におけるステップS1において、モードの選択を受け付ける処理は含まれず、ステップS61において再発リスクの判定を行って、再発リスクが高いと判定された検体についてのみ、抗癌剤の感受性の判定（ステップS62）が行われる。その他のステップについては、図28と同様である。
なお、上記のフローにおいては、判定装置Aは、再発リスクの判定および抗癌剤の感受性の判定が可能であるが、本発明はこれに限らず、いずれか一方のみが可能な判定装置に本試薬キットを適用してもよい。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】細胞周期を説明するための図である。
【図２】本発明の実施形態の試薬キットの説明図である。
【図３】本発明の実施形態の試薬キットを搭載して組織の性質を判定する判定装置の一例の斜視説明図である。
【図４】図3に示される判定装置におけるチップセット部の上面図である。
【図５】図4のA−A矢視断面図である。
【図６】図3に示される判定装置におけるチップセット部にセットされるタンパク固相用チップの上テンプレートの上面図である。
【図７】図6のB−B矢視断面図である。
【図８】図3に示される判定装置におけるチップセット部にセットされるタンパク固相用チップの下テンプレートの上面図である。
【図９】図9のC−C矢視断面図である．
【図１０】図6の上テンプレートと図６の下テンプレートの組立断面図である。
【図１１】図3に示される判定装置における活性測定ユニットの試料調製部のカラムの断面説明図である。
【図１２】図3に示される判定装置における活性測定ユニットの試料調製部の斜視図である。
【図１３】図12に示される試料調製部の流体マニホールドの上面図である。
【図１４】図13のD−D矢視断面図である。
【図１５】図12に示される試料調製部の流体回路図である。
【図１６】制御手段のハードウェア構成を示すブロック図である。
【図１７】判定装置を制御する制御系を示すブロック図である。
【図１８】判定装置による処理の全体フローを示す図である。
【図１９】発現量測定用試料の調製処理のフローを示す図である。
【図２０】活性値測定用試料の調製処理のフローを示す図である。
【図２１】活性値測定用試料の利用例を示す説明図である、
【図２２】判定装置による解析処理の一例の全体フローを示す図である。
【図２３】判定装置による解析処理の他の例の全体フローを示す図である。
【図２４】測定により得られた判定結果の利用例を示す図である。
【図２５】感受性の解析に関する他のフローを示す図である。
【図２６】感受性の解析に関するさらに他の判定結果を示す図である。
【図２７】感受性の解析に関するさらに他の判定結果を示す図である。
【図２８】判定装置による解析処理の他の例の全体フローを示す図である。
【図２９】判定装置による解析処理の他の例の全体フローを示す図である。
【符号の説明】
【０１５９】
1 チップセット部
2 活性測定ユニット
3 分注機構部
4 検出部
5 第１試薬セット部
6 第２試薬セット部
7 廃液槽
8 ピペット洗浄槽
9 流体部
10 電子基板部
11 空圧源
12 パーソナルコンピュータ（制御手段）
13 純水タンク
14 洗浄液タンク
15 廃液タンク
20 装置本体部
30 筐体部
31 操作部
32 駆動部
33 検体セット部
34 ペッスル
77 制御部
78 入力部
79 表示部
A 判定装置
B 可溶化装置
【図１】
2007097448.tif 000012
【図２】
2007097448.tif 000013
【図３】
2007097448.tif 000014
【図４】
2007097448.tif 000015
【図５】
2007097448.tif 000016
【図６】
2007097448.tif 000017
【図７】
2007097448.tif 000018
【図８】
2007097448.tif 000019
【図９】
2007097448.tif 000020
【図１０】
2007097448.tif 000021
【図１１】
2007097448.tif 000022
【図１２】
2007097448.tif 000023
【図１３】
2007097448.tif 000024
【図１４】
2007097448.tif 000025
【図１５】
2007097448.tif 000026
【図１６】
2007097448.tif 000027
【図１７】
2007097448.tif 000028
【図１８】
2007097448.tif 000029
【図１９】
2007097448.tif 000030
【図２０】
2007097448.tif 000031
【図２１】
2007097448.tif 000032
【図２２】
2007097448.tif 000033
【図２３】
2007097448.tif 000034
【図２４】
2007097448.tif 000035
【図２５】
2007097448.tif 000036
【図２６】
2007097448.tif 000037
【図２７】
2007097448.tif 000038
【図２８】
2007097448.tif 000039
【図２９】
2007097448.tif 000040
【手続補正書】
【提出日】平成17年10月11日(2005.10.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
以上に説明した各試薬の具体例並びに保存条件を、表1〜6に示す。表1〜3には発現量測定試薬群を、表4〜5には活性値測定試薬群を、表6には発現量測定と活性値測定に共通して用いられる試薬群を示している。また、溶媒について特に記載のないものは、精製水を溶媒として使用している。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
また、本試薬キットには、組織中に含まれるCDKの発現量及び活性値を測定するため、上述したように、多くの種類の試薬が含まれる。特に抗原等のタンパク質を含む溶液については、変性を防ぐため、保存条件に注意して取り扱う必要がある。このことから、各試薬に含まれる物質によって、適した保存条件で保存することが必要である。したがって、それぞれ保存条件の共通する試薬を1つのセットにすることにより、正しい保存条件で保存することが容易になり、本試薬キットを安定した状態で用いることができる。なお、各試薬の保存条件は、表1〜6に示すとおりである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
これらのCDKは、現在判明しているところ、表7に示すように、それぞれ対応するサイクリンと結合したサイクリン・CDK複合体（活性型CDK）となって、表7に示すような細胞周期の特定時期を活性化している。例えば、CDK1はサイクリンAまたはBと、CDK2はサイクリンAまたはEと、CDK4及びCDK6はサイクリンD1、D2、またはD3と結合して活性型となる。一方、CDK活性は表7に示すようなCDKIによって活性が阻害されることもある。例えば、p21はCDK1、2を阻害、p27はCDK2、4、6を阻害、p16はCDK4、6を阻害する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
なお、以下に記載の試薬番号は、表1〜6に記載の試薬に対応している。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５８】
【図１】本発明の実施形態の試薬キットの説明図である。
【図２】細胞周期を説明するための図である。
【図３】本発明の実施形態の試薬キットを搭載して組織の性質を判定する判定装置の一例の斜視説明図である。
【図４】図3に示される判定装置におけるチップセット部の上面図である。
【図５】図4のA−A矢視断面図である。
【図６】図3に示される判定装置におけるチップセット部にセットされるタンパク固相用チップの上テンプレートの上面図である。
【図７】図6のB−B矢視断面図である。
【図８】図3に示される判定装置におけるチップセット部にセットされるタンパク固相用チップの下テンプレートの上面図である。
【図９】図9のC−C矢視断面図である．
【図１０】図6の上テンプレートと図６の下テンプレートの組立断面図である。
【図１１】図3に示される判定装置における活性測定ユニットの試料調製部のカラムの断面説明図である。
【図１２】図3に示される判定装置における活性測定ユニットの試料調製部の斜視図である。
【図１３】図12に示される試料調製部の流体マニホールドの上面図である。
【図１４】図13のD−D矢視断面図である。
【図１５】図12に示される試料調製部の流体回路図である。
【図１６】制御手段のハードウェア構成を示すブロック図である。
【図１７】判定装置を制御する制御系を示すブロック図である。
【図１８】判定装置による処理の全体フローを示す図である。
【図１９】発現量測定用試料の調製処理のフローを示す図である。
【図２０】活性値測定用試料の調製処理のフローを示す図である。
【図２１】活性値測定用試料の利用例を示す説明図である、
【図２２】判定装置による解析処理の一例の全体フローを示す図である。
【図２３】判定装置による解析処理の他の例の全体フローを示す図である。
【図２４】測定により得られた判定結果の利用例を示す図である。
【図２５】感受性の解析に関する他のフローを示す図である。
【図２６】感受性の解析に関するさらに他の判定結果を示す図である。
【図２７】感受性の解析に関するさらに他の判定結果を示す図である。
【図２８】判定装置による解析処理の他の例の全体フローを示す図である。
【図２９】判定装置による解析処理の他の例の全体フローを示す図である。