(57)【要約】【課題】間接リウマチを処置するための化合物の新規治療用組合せ剤の提供。【解決手段】本発明は、Ｎ−［４−［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸又はその薬学的に許容される塩、及びＮ−［（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−プロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−ベンズアミドから本質的に成る組合せで関節リウマチを処置する方法、及び関連する組合せ及び医薬組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１量のＮ−［４−［［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸又は薬学的に許容されるその塩又はその混合物及び第２量のＮ−［（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−プロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−ベンズアミドから本質的になる治療上有効な量の組合せを含む、関節リウマチ処置を必要とする患者における関節リウマチの治療用医薬組成物。
【請求項２】
前記患者がヒトであり、そして前記第１量が１ｍｇ〜３０ｍｇであり、そして前記第２量が１ｍｇ〜３０ｍｇである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
Ｎ−［４−［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸又は薬学的に許容されるその塩がＮ−［４−［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸ナトリウムであり、そして前記第１量が１ｍｇ〜２０ｍｇ又は１ｍｇ〜２５ｍｇである、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記第２量が１ｍｇ〜１５ｍｇである、請求項３の記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記第２量が１ｍｇ〜８ｍｇである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記第２量が２ｍｇ、４ｍｇ、又は８ｍｇである、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記第２量が１日１回投与で２ｍｇ、４ｍｇ又は８ｍｇであるか又は１日２回投与で１ｍｇ、２ｍｇ又は４ｍｇである、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
Ｎ−［（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−プロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−ベンズアミドがＮ−［（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−プロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−ベンズアミドの多形体第ＩＶ型である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は一般に、関節リウマチを処置するための化合物の治療用組合せ及び該組合せの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
メトトレキサートナトリウムという一般名を有するＮ−［４−［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸ナトリウムが、米国食品医薬品局により、人間の患者における或る種の腫瘍性疾患、乾癬及び関節リウマチを処置するものとして適応されている。
【０００３】
ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路は、Ｒａｓ及びＲａｆ突然変異体表現型といったような成長因子及び発癌性因子からの免疫調整、炎症及び増殖性及び抗アポトーシスシグナリングを媒介する。マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）及び細胞外調節型キナーゼ（ＥＲＫ例えばＥＲＫ1及びＥＲＫ2）は、或る種の細胞プロセスを制御することに関与する酵素である。各々のＭＡＰＫは、一連の３つの細胞質キナーゼすなわちＭＡＰＫ、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）から成る。ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ（ＭＥＫ）酵素は、ＥＲＫを活性化する２重特異性キナーゼである。ＭＥＫ酵素（例えばＭＥＫ1及びＭＥＫ2）は、例えば、関節リウマチ、癌及び再狭窄に関与する。
【発明の開示】
【０００４】
発明の概要
本発明の１つの態様は、患者における関節リウマチを処置する方法において、基本的に第１の量のＮ−［４−［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸又は薬学的に許容される塩又はその混合物、及び第２の量のＮ−［（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−プロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−ベンズアミドで構成される治療上有効な量の組合せを、関節リウマチ処置を必要とする患者に対して投与する段階を含む方法である。好ましいのは、患者がヒトであり、第１の量が１ｍｇ〜３０ｍｇであり、第２の量が１ｍｇ〜３０ｍｇである方法である。より好ましいのは、患者がヒトであり、Ｎ−［４−［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸又は薬学的に許容される塩がＮ−［４−［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸ナトリウムであり、第１の量が１ｍｇ〜２０ｍｇ又は１ｍｇ〜２５ｍｇである、該方法の上述の態様のうちのいずれか１つである。さらに一層好ましいのは、患者がヒトであり第２の量が１ｍｇ〜１５ｍｇである、該方法の上述の態様のうちのいずれか１つであり、さらに一層好ましいのは、患者がヒトであり第２の量が１ｍｇ〜８ｍｇである態様である。より一層好ましいのは、患者がヒトであり、第２の量が２ｍｇ、４ｍｇ又は８ｍｇである該方法の上述の態様のうちのいずれか１つであり、さらに一層好ましいのは、患者がヒトであり、第２の量が一日一回投与で２ｍｇ、４ｍｇ又は８ｍｇ又は一日２回投与で１ｍｇ、２ｍｇ又は４ｍｇである態様である。さらに一層好ましいのは、Ｎ−［（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−プロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−ベンズアミドがＮ−［（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−プロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−ベンズアミドの多形体第ＩＶ型である、該方法の上述の態様のうちの１つである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
詳細な説明
Ｎ−［４−［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸の構造は以下の通りである：
【化１】
2007106762.tif 000002
この化合物は同様に、メトトレキサート；（Ｓ）−２−｛４−［（２，４−ジアミノ−プテリジン−６−イルメチル）−メチル−アミノ］−ベンゾイルアミノ｝−ペンタン二酸；Ｎ−［ｐ−［［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］−Ｌ−（＋）−グルタミン酸；（＋）−アメトプテリン；Ｌ−アメトプテリン；アメトプテリン；アメトプテリン；４−アミノ−１０−メチル葉酸；４−アミノ−Ｎ10−メチル葉酸；４−アミノ−Ｎ10−メチルプテロイルグルタミン酸；アンチフォラン；ＣＬ−１４３７７；ＥＭＴ−２５２９９；エムテキサート；Ｌ−メトトレキサート；レダートレキサート；メトレキサート；メタトレキサン；メトトレキサート−エブヴェ；メチルアミノプテリン；メキサート；及びＮＳＣ−７４０；Ｒ−９９８５という名称でも知られている。PHEUMATREX（登録商標）（American Cyanamid Company Corp., Wayne, New Jersey）はメトトレキサートナトリウム錠剤のブランド名である。
【０００６】
Ｎ−［（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−プロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−ベンズアミド（化合物（Ｉ））の構造は、以下の通りである：
【化２】
2007106762.tif 000003
この化合物は同様に（Ｒ）−Ｎ−（２，３−ジヒドロキシ−プロポキシ）−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−ベンズアミドという名称と［３９１２１０−１０〜９］のケミカルアブストラクト登録番号を有している。化合物（Ｉ）は、非晶質であっても結晶質であってもよい。化合物（Ｉ）の結晶質形態には、多形体Ｉ、ＩＩ、及びＩＶ型が含まれる。化合物（Ｉ）は、酵素ＭＥＫ１及びＭＥＫ２のきわめて特異的な非ＡＴＰ競合的阻害物質である。
【０００７】
本書で使用されている一部の頭文字の定義は以下の通りである：
ＡＥ−有害事象
ＡＲ−累積比
ＡＵＣ−血漿薬物濃度−時間曲線下の面積
ＡＵＣ(0~24)−投薬から０〜２４時間後の血漿薬物濃度−時間曲線下の面積
ＡＵＣ(o-t last)−時間０から最後に記録された観察までの血漿薬物濃度−時間曲線下の面積
ＡＵＣ％Ｉｎｈ−曲線下面積由来の阻害百分率
ＡＴＰ−アデノシン三リン酸
ＢＩＤ−ビス・イン・ディエイ（すなわち１日２回）  
Ｃ0−時間０における薬物濃度
Ｃｍａｘ−最大血漿薬物濃度
Ｃｓｓ，ａｖｇ−定常状態平均血漿薬物濃度
Ｃtrough−投薬前血漿薬物濃度
ＣＶ％−パーセンタイル単位の変動係数
ＤＬＴ−用量規制毒性
ＥＣＧ−心電図
ＥＤＴＡ−エチレンジアミン四酢酸
ＦＤＡ−米国食品医薬品局
ＨＥＲＧ−ヒトエーテル・ア・ゴー・ゴー（ether-a-go-go）関連遺伝子
ＨＰＭＣ−ヒドロキシプロピルメチルセルロース
ＩＰ−腹腔内
ＩＶ−静脈内
Ｋｉapp−酵素−阻害物質複合体の見かけ解離定数
ＬＣ／ＭＳ−液体クロマトグラフィ−質量分析
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ−液体クロマトグラフィ−質量分析−質量分析
ＬＰＳ−リポ多糖類
ＭＡＤ−最大投与用量
ＭＡＰ−マイトジェン活性化タンパク質
ＭＴＤ−最大許容用量
ＰＤ−薬力学
ＰＫ−薬物動態
ＰＯ−口腔用（すなわち経口）
ｐＴｓＯＨ−ｐ−トルエンスルホン酸
ＱＤ−クアク・ディエ（すなわち１日１回）
ＱＴｃ−補正済みＱＴ−間隔
Ｔmax−Ｃmaxの発生時間
ＵＳＰ−米国薬局方
ｖ／ｖ−体積／体積
【０００８】
本発明のもう１つの態様は、Ｎ−［４−［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸及び薬学的に許容される塩又はその混合物及びＮ−［（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−プロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−ベンズアミドから本質的に成る組合せにある。好ましいのは、Ｎ−［４−［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸及びＮ−［（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−プロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−ベンズアミドから本質的に成る組合せである。同様に好ましいのは、Ｎ−［４−［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム及びＮ−［（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−プロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−ベンズアミドから本質的に成る組合せである。より好ましいのは、Ｎ−［（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−プロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−ベンズアミドがＮ−［（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−プロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−ベンズアミドの多形体第ＩＶ型である組合せのうちのいずれか１つである。
【０００９】
「組合せ」には、混和された構成要素、各構成要素を含有するパッケージ、及び患者に対する該組合せの構成要素の投与により患者の体内でインビボで調製される組合せが含まれる。好ましいのは、混和された構成要素の組合せである。
【００１０】
本発明の組合せに言及するとき「〜から本質的に成る」という語句は、その組合せがメトトレキサート又は薬学的に許容される塩又はその混合物及び化合物（Ｉ）に加えて、薬理学的に不活性な構成要素を含有することができるが、該組合せは先行技術において薬理学的活性をもつものと断言されている付加的な構成要素を含有し得ないことを意味している。
【００１１】
「又はその混合物」という語句は、本発明の組合せが任意には化合物（Ｉ）及び：（ｉ）メトトレキサートとその１つ以上の塩好ましくは２つ以下のその塩の混合物又は（ｉｉ）メトトレキサートの２つ以上の塩、好ましくは２つ以下のその塩の混合物から本質的に成り得ることを意味している。該発明の組合せは、その構成要素の不均質な及び均質な混合物を内含する。該組合せは化合物（Ｉ）の非晶質形態、結晶質形態及び非晶質形態と結晶質形態の混合物を内含する。
【００１２】
「処置（治療）する」という用語は、予防的処置、すなわち、疾病の発症を遅延させること又は姑息的処置を意味し、この姑息的処置は、処置対象の疾病のいずれかの単数又は複数の病状又は症候を一部分又は全体的に緩和する、又はその進行を阻害する、又はそのさらなる進行を妨げるか、又はその進行を逆転させる。好ましいのは姑息的処置である。ヒトの患者における関節リウマチの臨床処置の効果は、抗関節リウマチ薬の規制認可のための主要な結果の指標を用いて当業者である医師によって査定され得る。米国リウマチ学会（ＡＣＲ）／世界保健機構（ＷＨＯ）応答者指数、ＡＣＲ−２０、規格は、複合評点として表わされた多数の指標における２０％の改善である；例えばFelson, David T., et al., ACR、関節リウマチにおける改善の予備的定義、関節炎＆リウマチ、１９９５年６月：３８（６）；７２７−７３５を参照のこと。我々の規格には、ＡＣＲ−５０％及びＡＣＲ−７０％が含まれる。医師は、ＡＣＲ−２０基準などを用いて患者の徴候及び症候の臨床的評価の時点でヒトの患者における関節リウマチの診断を下すことができる。関節リウマチの臨床的徴候及び症候としては、指関節、ひざなどといった関節における苦痛、膨れ、硬直、及び機能喪失が含まれる。本件の目的では、ＡＣＲ−２０％規格が、好ましい主要な結果の指標である。当該技術分野の通常の技量をもつ獣医師であれば非ヒト患者において関節リウマチを診断することが可能である。関節リウマチの予防的処置を必要とするヒト患者は、関節リウマチの家族歴、関節リウマチの発生についての遺伝子マーカー又は関節リウマチの早期臨床徴候及び症候をもつ者として医師により同定され得る。獣医は、同様に関節リウマチの予防的処置を必要とする非ヒト患者を同定することができる。
【００１３】
本発明の組合せに適用される「投与する」という用語は、異なる薬理学的に活性な構成要素の同時の又は実質的に同時の投与、及び１つの薬理学的に活性の化合物が投与され次に一定の待機期間の後もう１つの薬理学的に活性の化合物が投与される逐次的投与を内含する。該待機期間は、医師又は獣医によって容易に決定され得る。該組合せの薬学的に活性な構成要素は、任意の順で投与され得る。例えば、第１の量の１つの薬学的に活性な構成要素を第２の量のもう１つの薬学的に活性な構成要素の投与の前に、又はそれと同時に又はその後に投与することができる。
【００１４】
量、医薬組成物などに言及する場合「第１」及び「第２」という用語は、ここでは便宜上使用されており、該用語は本発明の方法においてその量、医薬組成物などを使用する順番又は順序を意味するわけではない。第１及び第２の量は同じであっても異なっていてもよい。
【００１５】
「患者」という用語は、哺乳動物を意味し、ヒト、コンパニオンアニマル例えばネコ、イヌなど、サル、チンパンジーなどの霊長類、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジなどの家畜、及びネコ、イヌ、ラット、マウス、モルモット、ハムスタ、ウサギ、サル、ブタなどの実験動物を含む。好ましい患者はヒトである。本発明のもう１つの態様においては、患者は非ヒト哺乳動物である。好ましい非ヒト哺乳動物はネコ、イヌ及びウマである。より好ましい非ヒト哺乳動物はネコ及びイヌである。
【００１６】
「関節リウマチ処置を必要とする患者」というのは、関節リウマチの予防的処置を必要とするすなわち、関節リウマチの発症を遅延させる必要があるか又は患者における関節リウマチのいずれかの単数又は複数の病状又は症候を緩和するか、その進行を阻害するか又はそのさらなる進行を妨げるか又は進行を逆転させる関節リウマチの姑息的処置を必要とする患者を意味する。
【００１７】
「組合せの治療上有効な量」というのは、処置対象の疾病を処置するために有効である該組合せの量である。関節リウマチの処置のために処置上有効な量には、患者の臨床的徴候及び症候又はＡＣＲ−２０評価のうちの１つの改善を一時的にでももたらすのに充分な量が含まれる。この量は、個々の構成要素での疾病の単療法治療に必要とされる量よりも少ない該組合せの個々の構成要素の量を含み得る。
【００１８】
メトトレキサートは、酸付加及び塩基付加塩を含む薬学的に許容される塩を形成する能力をもつ。メトトレキサートの全ての薬学的に許容される塩形態が、本発明の範囲内に含み入れられる。科学文献では、薬学的に許容される塩のタイプ及びその一般的調製が記述されている。例えばBerge, S. M. et al., 「薬学的塩」J. of Pharma. Sci. １９７７：６１：１を参照のこと。
【００１９】
メトトレキサートの薬学的に許容される酸付加塩としては塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、フッ化水素酸、リン酸などといった無機酸から誘導された塩、並びに脂肪族モノ及びジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、アルカンニ酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族スルホン酸などの有機酸から誘導された塩が含まれる。従ってかかる塩には、硫酸塩、ピロ流酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜流酸塩、硝酸塩、リン酸塩、モノリン酸水素塩、ジリン酸水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、プロピオン酸塩、カプリル酸塩、イソ酪酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、フタル酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩などが含まれる。同様に考慮されているのは、アルギン酸塩といったようなアミノ酸及びグルコン酸塩、ガラクツロン酸塩とのメトトレキサート塩である。
【００２０】
メトトレキサートの酸付加塩は従来の要領で塩を生成するのに充分な量の所望の酸とメトトレキサートを接触させることによって調製可能である。塩基と酸付加塩を接触させ従来の要領でメトトレキサートを単離することによって、酸付加塩をメトトレキサートへと転換し戻すことができる。
【００２１】
メトレキサートの薬学的に許容される塩基付加塩には、ナトリウムカチオン（Ｎａ+）、カリウムカチオン（Ｋ+）、マグネシウムカチオン（Ｍｇ2+）、カルシウムカチオン（Ｃａ2+）及び同様の塩そしてＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、クロリン、ジエタンエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン及びプロカインといった適切なアミンとの塩が含まれる。メトレキサートのモノナトリウム及びジナトリウム塩など、及び２価の金属カチオン対メトレキサートの比が１：１又は１：２であるメトレキサートの２価金属カチオン塩が考慮されている。
【００２２】
金属カチオン塩を提供するためには例えばアルカリ又はアルカリ土類金属カチオンの水酸化物といった金属カチオン水酸化物のような充分な量の所望の塩基と、又アミン塩を提供するためにはアミン特に有機アミンとメトレキサートを接触させることにより、従来の要領で塩基付加塩を調製することができる。塩基付加塩と酸を接触させ従来の要領でメトレキサートを単離させることにより、メトレキサートの塩基付加塩をメトレキサートに転換し戻すことができる。
【００２３】
好ましいのはメトレキサートである。さらに好ましいのはメトレキサートナトリウムである。
【００２４】
メトレキサート、又はその薬学的に許容される塩、又はその混合物及び化合物（１）は、水和形態及び部分溶媒和形態（すなわち化合物対溶媒のモル比１：１でない、すなわち１より大きいか又は小さい形態）を含めた、未溶媒和形態ならびに溶媒和形態で存在し得る。好ましい溶媒和物は、化合物対溶媒のモル比が１より大きいか又は１に等しい溶媒和物である。未溶媒和及び水和形態が好まれる。溶媒和形態及び未溶媒和形態は全て本発明の範囲内に包含され、その中で有用である。
【００２５】
本発明は、通常自然界に見られる原子質量又は質量数と異なる（すなわち天然に豊富な原子質量又は質量数と異なる）原子質量又は質量数をもつ原子によって単数又は複数の原子が置換されているという点を除いて、上述の「未標識」メトレキサート、その塩又は化合物（Ｉ）と同一である同位体標識された化合物（Ｉ）の、及び同位体標識されたメトレキサート又はその薬学的に許容される塩又はその混合物の使用を内含する。考慮されている同位体の例としては、2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、31P、32P、35S、18F及び36Ｃｌなどといった水素、炭素、窒素、酸素、リン、フッ素及び塩素の同位元素が含まれる。同位体標識された化合物、例えば3Ｈ及び14Ｃといった放射性同位体が中に取込まれているものは、薬物及び／又は基質組織分布検定において有用である。トリチウム化すなわち3Ｈ及び炭素−１４すなわち14Ｃ同位体は、それらの調製及び検出可能性の容易さのために特に好ましい。さらに、重水素すなわち2Ｈといったようなさらに重い同位体での置換は、例えばインビボ半減期の増大又は投薬量必要条件の低減といった、代謝安定性の増大の結果としての或る種の治療上の利点を提供することができ、従って一部の状況下で好まれ得る。一般に、化合物を調製する従来の方法において同位体標識されていない試薬に代わって容易に入手可能な同位体標識された試薬を置換することにより、同位体標識された化合物を調製することができる。
【００２６】
本発明の医薬組成物は、均質な及び不均質な混合物を内含する。本発明の方法は、あらゆる剤形のメトレキサート又はその薬学的に許容される塩、又はその混合物又は化合物（Ｉ）又はその両方を利用し得る。好ましいのは、化合物（Ｉ）の経口剤形であり、より好ましいのは、錠剤又はカプセル剤形である。好ましいのは、メトレキサート又はその薬学的に受容可能な塩又はその混合物の経口又は注射用剤形である。さらに好ましいのは、経口剤形である、さらに一層好ましいのは、錠剤又はカプセル経口剤形である。
【００２７】
薬学的に許容される賦形剤には、薬学的に許容される希釈剤、担体、安定剤及びカプセルシェル例えばゼラチンカプセルシェルといったその他の構成要素が含まれる。薬学的に許容される賦形剤の例としては砂糖例えば乳糖及び蔗糖；デンプン例えばコーンスターチ及びポテトスターチといった；セルロース誘導体例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、メチルセルロース及び酢酸フタル酸アセテート；ゼラチン；タルク；ステアリン酸；ステアリン酸マグネシウム；植物油例えばピーナツ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及びカカオ脂；プロピレングリコール、グリセリン；ソルビトール；ポリエチレングリコール；水；寒天；アルギン酸；等張食塩水及びリン酸緩衝溶液ならびに薬学的処方物中で通常用いられるその他の相容性ある物質が含まれる。本発明において利用されるべき組成物は、着色剤、着香剤及び／又は防腐剤といったようなその他の構成要素をも含有し得る。これらのその他の構成要素は、それが存在する場合、通常比較的少量で使用される。適切な薬学的に許容される担体は炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、乳糖、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ロウ、ココナツバターなどである。
【００２８】
本発明のもう１つの態様は、（ｉ）メトレキサート又はその薬学的に許容される塩又はその混合物及び第１の薬学的に許容される賦形剤を含む第１の医薬組成物、（ｉｉ）化合物（Ｉ）及び第２の薬学的に許容される賦形剤を含有する第２の医薬組成物及び（ｉｉｉ）関節リウマチ処置を必要とする患者において関節リウマチを処置するために該第１及び第２の医薬組成物を使用するための説明書、を含むパッケージにおいて、第１の医薬組成物と第２の医薬組成物がその他の薬理学的に活性な構成要素を全く含んでいないパッケージにある。該パッケージにおいて、第１の薬学的に許容される賦形剤及び第２の薬学的に許容される賦形剤は同じ又は異なるものであり得、第１の医薬組成物及び第２の医薬組成物は、同じ又は異なるものである投与経路に適するものであってよい。
【００２９】
本発明のもう１つの態様は、メトレキサート又はそのＮ−［４−［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸又はその混合物、化合物（Ｉ）及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物において、その他の薬理学的に活性な構成要素を全く含んでいない医薬組成物である。
【００３０】
本発明のもう１つの態様は、患者の体内の関節リウマチを処置する方法において、第１の量のメトレキサート又はその薬学的に許容される塩又はその混合物、第２の量の化合物（Ｉ）及び薬学的に許容される賦形剤を含む治療上有効な量の医薬組成物を関節リウマチの処置を必要としている患者に投与する段階を含む方法にある。本発明の好ましい態様は、メトレキサート又はその薬学的に許容される塩又はその混合物及び化合物（Ｉ）が本発明の組合せ又は方法の好ましい態様のうちのいずれか１つにおいて本書で記述されている通りのものである、関節リウマチの処置方法にある。
【００３１】
本発明のもう１つの態様は、患者の体内の関節リウマチを処置する方法において、第１の薬学的に許容される賦形剤及び第１の治療上有効な量のメトレキサート又はその薬学的に許容される塩又はその混合物を含む第１の医薬組成物、及び第２の薬学的に許容される賦形剤及び第２の治療上有効な量の化合物（Ｉ）を含む第２の医薬組成物を、関節リウマチ処置を必要とする患者に別々に投与する段階を含む方法にある。この方法においては、第１の薬学的に許容される賦形剤及び第２の薬学的に許容される賦形剤は同じであっても異なるものであってもよく、第１の医薬組成物及び第２の医薬組成物は、同じ時点又は異なる時点でそして同じ又は異なる経路で患者に投与されてよい。本発明の好ましい態様は、関節リウマチの処置方法において、メトレキサート又はその薬学的に許容される塩又は混合物及び化合物（Ｉ）が本発明の組合せ又は方法の好ましい態様のうちのいずれか１つの中で本書に記載されているとおりのものである方法にある。
【００３２】
本発明のもう１つの態様は、基本的に第１の量Ｎ−［４−［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸又はその薬学的に許容される塩又はその混合物、及び第２の量のＮ−［（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−プロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−ベンズアミドから成る組合せの、患者の体内の関節リウマチを処置するための薬剤の製造における使用にある。好ましい使用は、患者がヒトである場合である。
【００３３】
本発明の方法に従ったヒトの患者における関節リウマチの処置方法の中でのメトレキサートナトリウムの治療上有効な量は標準的に、平均体重のヒトの患者において１ｍｇ〜３０ｍｇである。かかる処置用のメトレキサートナトリウムの好ましい量は２．５ｍｇ、５．０ｍｇ、７．５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ又は３０ｍｇであり、同様に好ましいのは１ｍｇ〜２５ｍｇ又は１ｍｇ〜２０ｍｇである。ヒトの関節リウマチを処置するためのメトレキサート又はそのナトリウム以外の薬学的に許容される塩又はその混合物の好ましい治療上有効な量は、０．００５０モル、０．０１０モル、０．０１５モル、０．０２０モル、０．０３０モル、０．０４０モル又は０．０６０モルのメトレキサート又はその塩又はその混合物を提供することになる量である。かかる治療上有効な量は、好ましくは、週毎の投与向けである。週間量は分割して７日間にわたり複数分量で投与することができる。例えば一週１７．５ｍｇの用法・用量を７回２．５ｍｇずつの投薬量に分割し、これらをその一週間にわたり毎日投与することができる。分割された週間量はさらに、任意の２４時間周期にわたるサブ分量の投与用に細分割され得る。例えば、一週１５ｍｇの投薬量を３日おきの投与のための２回７．５ｍｇ分量に分割し、各７．５ｍｇ部分を１２時間毎の投与用に３回２．５ｍｇ分量に細分割し、かくして各７．５ｍｇ分量がそれ自体の２４時間周期以内で投与されるようにすることができ、この２４時間周期は３日おきである。メトレキサートからの休薬日が、本発明の中に含み入れられている。非ヒト患者を処置する場合、週間投与されるメトレキサートナトリウムの治療上有効な出発量は０．１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇである。その後、獣医は任意には、特定の処置対象の非ヒト患者についての最適な量を見い出すためにメトレキサートナトリウムの量を増大させることができ、この最適な量は最高１０ｍｇ／ｋｇ／週であり得る。獣医は非ヒト患者を処置する上で、任意にはメトレキサート又はそのもう１つの薬学的に許容される塩の治療上有効な出発モル等量を使用することができる。
【００３４】
本発明の方法に従ってヒトの患者の体内の関節リウマチを処置する方法における化合物（Ｉ）の治療上有効な量は、標準的に１ｍｇ〜３０ｍｇである。化合物（Ｉ）の好ましい治療上有効な量は、１ｍｇ〜２０ｍｇ、１ｍｇ〜１５ｍｇ、又は１ｍｇ〜８ｍｇである。化合物（Ｉ）のより好ましい治療上有効な量は２ｍｇ、４ｍｇ又は８ｍｇである。かかる治療上有効な量は好ましくは、毎日の投与向けである。一日量を分割して２４時間周期にわたる分量で投与することができる。好ましいのは、ＢＩＤ投与である；より好ましいのはＱＤ投与であるが、より回数の多い又は少ない投与も本発明の範囲内に入る。化合物（Ｉ）の休薬日が、本発明の中に含み込まれている。例えば、化合物（Ｉ）のための投薬計画は、２１日間のＢＩＤ投与とそれに続く７日間の休薬日となり、医師が適切と判断するだけの長さで反復できる２８日の投薬計画を得ることができる。代替的には、化合物（Ｉ）は、処置が中止されるまで中断無く連続して投与可能である。化合物（Ｉ）は、絶食した患者（例えば投与前後２時間以内に飲食無し）に対して、又は好ましくは絶食していない（すなわち摂食した）患者に対して投与可能である。一日一回の治療上有効な量の化合物（Ｉ）の投与は、ＱＤ投薬を意味し、一方一日２回の治療上有効な量の化合物（Ｉ）の投与は、ＢＩＤ投薬を意味する。非ヒト患者を処置する場合には、化合物（Ｉ）の治療上有効な出発量は体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇ〜０．１ｍｇである。その後、獣医が、処置対象の特定の非ヒト患者にとっての最適な量を発見するべく化合物（Ｉ）の量を任意で増加させることができ、この最適な量は最高１ｍｇ／ｋｇ／日であり得る。
【００３５】
メトレキサート及び化合物（Ｉ）の両方からの休薬日が本発明の中に含み入れられる。例えば、投薬計画は化合物（Ｉ）のＢＩＤ投薬と２１日間のメトレキサートナトリウムの週２回投薬、そしてそれに続く７日間の化合物（Ｉ）及びメトレキサートナトリウムの両方からの休薬日となり、医師が適切と判断するだけ長く反復できる２８日の投薬計画を得ることができる。
【００３６】
何が本発明の方法における治療上有効な量を構成するかを見極めるにあたっては、一般に医師又は獣医は自らの経験をかんがみ、数多くの要因を考慮することになる。これらの要因には、例えば、ＦＤＡ指針、公開された臨床研究結果、処置対象の特定の患者、その患者の年令、性別、体重及び全身的健康状態ならびに処置中の疾病のタイプ及び程度、該当する場合には患者によるその他の薬物療法の使用、利用されている特定の処方物及び投与経路が含まれる。従って、投与された用量は、本書に記されている範囲内に入ってもよいし、或いは又これらの範囲を下回っても又は上回ってもよい。特定の状況のための適切な用量の決定は、日常的作業であり、医師又は獣医の通常の技量の範囲内に入る。一般に、特定の患者について最適よりも低い薬理学的に活性な構成要素のより少ない投薬量を用いて処置を開始することができる。その後、この投薬量を、この状況下での受容可能な効果が達成されるまで少ない増分で増加させることができる。
【００３７】
メトレキサート又はその薬学的に許容される塩又はその混合物、及び化合物（Ｉ）は、バルク形態又は単位剤形で処方可能である。好ましくは、本発明の医薬組成物は単位剤形をしている。単位剤形で、薬学調製物は、薬理学的に活性な構成要素（単複）を適量含有する単位用量に細分割される。単位剤形は、包装された調製物であり得、この包装は、小包錠剤、カプセル及びバイアル又はアンプル中の粉末といった離散的量の調整物を収納している。同様に、単位剤形は、カプセル、錠剤、カシュ剤又は口中錠自体であり得、又は包装された形態での適切な数のこれらのいずれかであり得る。単位投薬量処方物は、処置対象の疾病又は障害のための薬理学的に活性な構成要素を治療上有効な量より少ない量だけ収納しており、かくして１つの疾病を処置するために患者に対し２つ以上の単位投薬量の投与を必要とする可能性がある。投薬量単位形態のいくつかの例としては錠剤、カプセル、丸薬、粉末、水溶液及び非水性経口溶液及び懸濁液、及び、１つ又はいくつかのより多数の投薬量単位を収納し個々の用量に細分割できるコンテナに包装された非経口溶液がある。
【００３８】
本発明の医薬組成物においては、薬理学的に活性な構成要素の合計百分率は広い限界内で変動し得るが、実践的な目的では、好ましくはそれは固体組成物中では少なくとも約５重量％、一次液体組成物中では少なくとも２重量％である。最も満足のいく組成物は、薬理学的に活性の構成要素がはるかに高い割合例えば約９５重量％で存在する組成物である。異なる投与経路は、異なる量、投薬量又は百分率を必要とする可能性がある。
【００３９】
経口投与に適している本発明の薬学組成物としては、錠剤、カプセル、粉末、丸薬、口中錠、水性懸濁液又は水溶液、溶融処方物などが含まれる。好ましいのは錠剤又はカプセルである。該薬学組成物は、薬理学的に活性な構成要素（単複）がその他の担体を伴って又は伴わずにカプセルシェルによってとり囲まれているカプセルを提供する、カプセルシェルといったような封入材料を伴う薬理学的に活性な構成要素（単複）の処方物を内含する。固体形態の調製物が好ましい。
【００４０】
注射による投与に適した薬物組成物としては、水溶液、無菌水又は生理食塩水中で溶解させることのできる凍結乾燥された粉末などが含まれる。獣医用途では、イヌのための好ましい治療組成物としては、任意には処置対象のイヌの食物又は飲料水に対し添加すべき、溶液、懸濁液、エマルジョン、逆エマルジョン、エリキシル剤、抽出物、チンキ剤及び濃縮物から成る群から選択された摂食可能な液体経口的剤形が含まれる。既定量の水の中に溶解させるように濃縮物液体形態を処方することができ、この溶液からアリコート量をひき出してイヌに直接投与するか又はイヌの食物又は飲料水に対し添加することができる。
【００４１】
その他の好ましい医薬組成物は、薬理学的な活性な成分の遅延、持続及び／又は制御放出を提供する。制御放出形態は、異なる半減期をもつ薬理学的に活性な構成要素を有する本発明の組合せを処方する場合に特に有用である。薬理学的に活性な構成要素の各々について異なる放出時間を有する制御放出形態を調製することができ、この形態は比較的均等な投薬を可能にする。
【００４２】
非ヒト患者の場合には、医薬組成物は同様に、薬理学的に活性な構成要素が飼料組成物中に一緒に存在する薬用飼料剤形をも内含する。
【００４３】
医薬組成物を調製するための方法は当業者にとっては既知であるか、又は本開示に照らし合わせて明白となり日常的に決定されることであろう。例えば、本発明の医薬組成物を調製するための方法は、Remington's Phamaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 第１９版（１９９５年）及び６巻シリーズ中、Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations, CRC Press, Boca Raton, Florida（２００４）の中で記述されているものの中から適合させることができる。
【００４４】
粉末、錠剤、丸薬、カプセル、カシュ剤、座薬、口中錠及び分散性顆粒などの固体形態調製物を固体担体で処方することができる。固体担体は、希釈剤、着香剤、可溶化剤、潤滑剤、懸濁剤、結合剤、防腐剤、錠剤崩壊剤又は封入材料として作用しうる単数又は複数の物質であり得る。錠剤中では薬理学的に活性の構成要素は、適切な割合で必要な結合特性をもつ担体と混合され、所望の形状及びサイズに圧縮される。粉末中では、担体は、細かく分割された薬理学的に活性の構成要素との混合物の形をした細かく分割された固体である。
【００４５】
経口用途に適した水溶液は、水中に薬理学的に活性な構成要素を溶解させ、適切な着色料、芳香剤、安定化剤及び増粘剤を所望通りに添加することにより調製可能である。
【００４６】
経口用途に適した水性懸濁液は、天然又は合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びその他の周知の懸濁剤といった粘性材料と共に水中に細かく分割した薬理学的に活性の構成要素を分散させることにより作ることができる。
【００４７】
液体形態の調製物としては例えば水、生理食塩水又は水プロピレングリコール溶液といった溶液、懸濁液及びエマルジョンが含まれる。非経口注射のためには、生理食塩水及び水性ポリエチレングリコール溶液といったような溶媒を用いて、液体調製物を処方することができる。静脈内投与又は注射による投与に適した粉末を凍結乾燥させることができる。同様に含まれているのは、注射又は経口投与のための液体形態調製物へと使用直前に転換するよう意図された固体形態調製物である。かかる液体形態には、溶液、懸濁液及びエマルジョンが含まれる。これらの調製物は、薬理学的に活性の構成要素（単複）に加えて、着色料、芳香剤、安定剤、懸濁液、人口及び天然甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤などを含有し得る。
【００４８】
メトレキサート又はその薬学的に許容される塩又はその混合物及び化合物（Ｉ）は、錠剤、カプセル、粉末、溶液などの経口摂取又は注射すなわち静脈内、筋内、皮内、皮下、十二脂腸内又は腹腔内注射などといった異なる経路によって投与可能である。外科的に移植されたポンプからの動脈内輸液といったような連続的投与も考慮される。
【００４９】
メトレキサート、又はそのＮ−［４−［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸又はその混合物の好ましい投与経路は、経口又は注射によるものである。さらに好ましいのは経口である。化合物（Ｉ）の好ましい投与経路は経口である。しかしながら、処置対象の特定の身体条件に応じて化合物の別の投与経路が好まれる可能性もある。経皮パッチによる局所投与は、例えば持続全身性投薬を行なうことが望まれる場合に好まれる可能性がある。
【００５０】
さらに本発明に従うと、メトレキサート又はその薬学的に許容される塩又はその混合物及び化合物（Ｉ）の実質的に同時の投与又は逐次的投与が提供されている。逐次的投与は、任意の順序でかつ異なるものの規則的かつ連続的な投薬スケジュールに従って実施することができ、かくして個々の複数の構成要素が患者に対し同時に投与されなくても、処置対象患者の体内でこれらの薬理学的に活性の構成要素の治療上有効な血漿レベルが維持されることになる。
【００５１】
メトレキサートはSigma-Aldrich Company., からSigmaカタログ品番Ｍ９９２９（ＵＳＰグレード、無水）及び品番Ａ６７７０（（＋）−アメトプテリン三水和物）として市販されている。
【００５２】
化合物（Ｉ）の調製については、現在許可されている米国特許出願公開第２００４／００５４１７２号及びその対応する米国特許出願公開第１０／３３３，３９９号の中で記述されている。化合物（Ｉ）の調製は、同様に２００５年６月１４日に出願された米国仮特許出願第６０／６９０，６２０号の中でも記述されている。
【００５３】
化合物（Ｉ）の多形体第Ｉ、ＩＩ及びＩＶ型の調製については以下で、及び米国特許出願公開第１０／９６９，６８１号及びその対応するＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ２００５／０４００９８号の中で記述されている。
【００５４】
調製物１：Ｎ−［（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−プロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−ベンズアミド（多形体第Ｉ型）
ステップＡ：窒素雰囲気下の乾燥テトラヒドロフラン（５００ｍＬ、０．２Ｍ）中の３，４−ジフルオロ−２（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）安息香酸（３９．３ｇ、１００．０ｍｍｏｌ）に対して、（Ｒ）−Ｏ−（２，２−ジメチル−［１．３］ジオキソラン−４−イルメチル）−ヒドロキシルアミン（１４．７ｇ、１００．０ｍｍｏｌ）とそれに続いてＮ−メチルモルホリン（２７．５mＬ、０．２５モル）を添加した。オレンジ色の溶液を氷水浴で冷却した。塩化ジフェニルホスフィン（２２．９ｍＬ、０．１２モル）を滴下により添加した。一定の固体が形成した。混合物を周囲温度まで暖め１８時間攪拌した。反応を急冷するために水を添加し、テトラヒドロフランを真空下で回転蒸発させた。残留した油を酢酸エチル（５００ｍＬ）中に溶解させ、飽和塩水及び飽和重炭酸ナトリウムの混合物（１：１）で２回洗浄した。酢酸エチルを除去し粗製油状固体をフラッシュクロマトグラフィ（シリカゲル、ヘキサン−アセトン／２：１）により精製して、２０時間４０℃の真空オーブン内で乾燥した後オフホワイトの固体としてＮ−（（Ｒ）−（２，２−ジメチル−［１，３］ジオキソラン−４−イルメトキシ）−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミド）−ベンズアミドを得た。４１．７ｇ（７９．８％）、ｍ．ｐ．（融点）１２４〜１２５℃。不純画分を組合せ同じ条件を用いて第２のカラムクロマトグラフィによって精製し、６．４ｇ（１２．３％）、ｍｐ１２４〜１２５℃、合計収量４８．１ｇ（９２．１％）の第２のバッチを得た。
【化３】
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【００５５】
ステップＢ：メタノール（２２３ｍＬ、１０ｍＬ／ｇ）中にＮ−（（Ｒ）−２，２−ジメチル−［１，３］ジオキソラン−４−イルメトキシ）−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミド）−ベンズアミド（２２．３ｇ、４２．７ｍｍｏｌ）を懸濁させ、水（２２．３ｍＬ）中のｐＴｓＯＨ・Ｈ2Ｏ（４．１ｇ、２１．３５ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。混合物を１８時間周囲温度で攪拌し、その間全ての固体が溶解して無色の透明溶液を得た。溶液を濃縮し、酢酸エチル（２×３００ｍＬ）で抽出した。有機溶液を重炭酸ナトリウムで洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させた。ろ過の後、ろ過物を濃縮し、ヘプタンで同時蒸発させて、発泡性固体を得た。この固体に対してヘキサン−ＣＨ2Ｃｌ2（１：１、１００ｍＬ）を添加し、混合物を３０分間攪拌した。白色固体が形成し、これをろ過しヘキサンで洗浄した。この固体をヘキサン−ＡｃＯＥｔから再結晶化させて、３日間６０℃の真空オーブンで乾燥させた後白色結晶、１３．５７ｇ（６５．９％）としてＮ−［（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−プロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−ベンズアミドを得た。同じ溶媒系からの再結晶化の後、母液から５．０５ｇの第２の収獲を得た。合計収量は１８．６２ｇ（９０．４％）：ｍ．ｐ．８９−９０℃（多形体第Ｉ型）であった。組合わされた結晶を乳鉢と乳棒セットで細かい粉末になるまですりつぶし、３日間真空オーブン内で６０℃で乾燥させた。融点１１７〜１１８℃（形態１）；［α］＝−２．０５°（ｃ＝１．１２、メタノール）；分析：Ｃ16Ｈ14Ｆ3Ｉ1Ｎ2Ｏ4についての計算値：Ｃ、３９．８５；Ｈ、２．９３；Ｎ、５．８１；Ｆ、１１．８２；Ｉ、２６．３２。実際値：Ｃ、３９．９５；Ｈ、２．７６；Ｎ、５．７２；Ｆ、１１．７１；Ｉ、２６．５３。
【化４】
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【００５６】
調製物２：Ｎ−［（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−プロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−ベンズアミド（多形体第ＩＩ型）
ステップＡ：−１５℃で窒素雰囲気下の乾燥テトラヒドロフラン中の３，４−ジフルオロ−２（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）安息香酸（２．２５ｇ、５．１０ｍｍｏｌ）に対して、塩化ジフェニルホスフィン（１．２６ｍＬ、６．６３モル）を滴下にて添加した。２０分間攪拌した後、Ｎ−メチルモルホリン（０．７０ｍＬ、６．３７５ｍｍｏｌ）を添加し、反応をさらに２０分攪拌した。（Ｒ）−Ｏ−（２，２−ジメチル−［１．３］ジオキソラン−４−イルメチル）−ヒドロキシルアミン（０．７４８ｇ、５．１ｍｍｏｌ）を添加し、反応を１時間攪拌し、その時点で、Ｎ−メチルモルホリン（０．７ｍＬ、６．３７ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を周囲温度まで暖め、１２時間攪拌した。真空下で反応を濃縮し、次にＥｔＯＡｃで希釈した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ3（２回）、塩水（１回）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、ろ過し、濃縮した。溶離剤として４：１のヘキサン／ＥｔＯＡｃを用いてシリカゲル上で粗製生成物を精製して、１．８２ｇ（６８％）のＮ−（（Ｒ）−２，２−ジメチル−［１，３］ジオキソラン−４−イルメトキシ）−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミド）−ベンズアミドを褐色がかった赤色固体として得た。
【００５７】
ステップＢ：１０：１のメタノール／Ｈ2Ｏ中でＮ−（（Ｒ）−２，２−ジメチル−［１，３］ジオキソラン−４−イルメトキシ）−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミド）−ベンズアミド（０．２１０ｇ、０．４０ｍｍｏｌ）を懸濁し、ｐＴｓＯＨ・Ｈ2Ｏ（０．００８ｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１８時間周囲温度で攪拌し、その間全ての固体が溶解して無色透明の溶液が得られた。溶液をＥｔＯＡｃで希釈させた。有機溶液を重炭酸ナトリウム（２回）と塩水（１回）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させた。ろ過の後、ろ過液を濃縮し、ＥｔＯＡｃ及びヘプタンから再結晶化させた。この固体をヘプタン−ＣＨ2Ｃｌ（１：１）で洗浄し、６０℃で真空下で乾燥させて、白色固体（０．１３６ｇ、７０％）としてＮ−［（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−プロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−ベンズアミド（多形体第ＩＩ型）を得た。生成物は９０．８℃で縮み、１１５〜１１７℃で融解する。分析は、Ｃ４０．９２、Ｈ３．１６、Ｎ５．４１、Ｆ１１．３０、Ｉ２３．９２（６．７５％  ＥｔＯＡｃ、０．９６％ヘプタン）を示している。
【００５８】
調製物３：Ｎ−［（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−プロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−ベンズアミド（多形体第ＩＶ型）
窒素雰囲気下で３，４−ジフルオロ−２（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）安息香酸（２．６ｋｇ、６．６ｍｏｌ）及びＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（１．１ｋｇ、６．８モル）の入ったフラスコに対し、１２Ｌの乾燥アセトニトリルを添加した。約９０分間２２°±５℃で攪拌した後、トルエン中の（Ｒ）−Ｏ−（２，２−ジメチル−［１，３］ジオキソラン−４−イルメチル）−ヒドロキシルアミン溶液を添加した（８．５Ｌの合計体積、約８モルのアミン）。２２°±５℃で少なくとも６時間溶液を攪拌した。塩酸水（９Ｌ、１．５モル）を添加し、約５分間攪拌した後、層を分離させた。残留最上層に塩酸水（９Ｌ、１．５モル）を添加し、約２０時間攪拌した後、層を分離した。減圧蒸留により残留最上層を濃縮し、その後１５Ｌのトルエン及び２Ｌのエタノールで希釈した。混合物を３５〜４５℃まで暖め、２０Ｌの温水で希釈し、次に０°〜５℃まで冷却した。ろ過により生成物を採集し２Ｌのトルエンで洗浄した。１２Ｌのトルエンと２Ｌのエタノール（５０°±５℃）の中で溶解させ、１０Ｌの水を添加し、０〜５℃まで冷却させることにより、生成物を再結晶化させた。ろ過により生成物を採集しトルエンで洗浄した後、生成物を真空オーブン内で乾燥させ、結果として２．６ｋｇのＮ−［（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−プロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−ベンズアミドを得た。異なる結晶形態の混合物であったこの化合物２４ｋｇを、２０〜３０時間３５±５℃で１Ｌのエタノール及び１０Ｌの水の混合物中で攪拌し、次に２５±５℃まで冷却した。生成物をろ過により採集し、１Ｌの水で洗浄し、次に６５℃で真空オーブン内で乾燥させた。この結果、９０％超が多形体第ＩＶ型である２．３ｋｇの材料が得られた。注：ＤＳＣ分析は、１１０℃での融解開始を示し、１１７℃での融解開始はピークの少量にすぎない。
【００５９】
化合物（Ｉ）の多形体第ＩＶ型のＸ線回折パターンをＣｕＫα放射線でのRigaku Ultima＋回折計上で測定した。６位置のオートサンプラーを備えたＩＢＭコンパチブルインタフェースを伴うRigaku Ultima＋回折計、ソフトウェア＝Rig Meas  ｖ２．０（Rigaku, １９９５年１２月）及びＪＡＤＥ３．１（Materials Data, Inc）。ＣｕＫα放射線（４０ｍＡ、４０ｋＶ、λ＝１．５４１９Å）。０．５°のスリットＩ及びＩＩ、０．３°のスリットＩＩＩ。連続θ／２θ結合型走査：２θ内で３．００°〜４５．００°、走査速度０．２°／分：１５．０秒／０．０５°ステップ。試料はバイアルから引き出されアルミニウムホルダー内のゼロバックグラウンドシリコン上でプレスされる。試料幅５ｍｍ。試料は室温で保管し走行させた。試料をデータ収集中垂直軸のまわりで４０ｒｐｍでスピンさせた。
【００６０】
表１は、２シータ（「２θ」）で表わされた化合物（Ｉ）の多形体第ＩＶ型についてのＸ線粉末回折パターン、ｄ間隔又はｄ（Å）、及びＣｕＫα放射線を用いたRigaku Ultima＋回折計上で測定された１０％の相対強度でのピーク面積あたりの相対強度を列挙を列挙している。
【表１】
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【００６１】
実験１：活性化されたＭＥＫ１及びＭＥＫ２の阻害、及び酵素特異性
化合物（Ｉ）は、インビトロでＭＥＫ１及びＭＥＫ２の選択的阻害物質であることが示された。ＭＥＫ１の活性化形態ＭＥＫ１−Ｓ２１８Ｄ／Ｓ２２２Ｄについての化合物（Ｉ）のＫｉappは１．１±０．２ｎＭであり、一方ＭＥＫ２の活性化形態ＭＥＫ２−Ｓ２２２Ｄ／Ｓ２２６Ｄについての化合物（Ｉ）のＫｉappは０．７９±０．２ｎＭであった。化合物（Ｉ）は同様に、活性化Ｂ−Ｒａｆ、未活性化ＭＥ１及びＥＲＫ１が存在した「カスケード」検定の中でもテストされた。このカスケード検定では、活性化Ｂ−ＲａｆがＭＥＫ１をリン酸化し、活性化し、活性化されたＭＥＫ１が今度はＥＲＫ１をリン酸化する。読出しはＥＲＫ１のリン酸化である。ＭＥＫ１の未活性化又は活性化形態のいずれかに結合する阻害物質がこの検定を阻害し得る。化合物（Ｉ）についてのＫｉappは、カスケード検定において０．９０±０．０９ｎＭであった。化合物（Ｉ）のキナーゼ特異性は２７のキナーゼ酵素パネルに対比させて評価した。チロシンキナーゼならびに多数のセリン／トレオニンキナーゼで構成されたこのパネルは、１０μＭ濃度の化合物（Ｉ）による阻害に対して不応性であった。従って、化合物（Ｉ）は、その他のキナーゼに比べ特異性の非常に高いＭＥＫ１及びＭＥＫ２阻害物質であると思われる。
【００６２】
例２：化合物（Ｉ）の遺伝毒性学及び安全性
さまざまな遺伝毒性学及び安全性薬理学（心臓血管、中枢神経系（ＣＮＳ）及び肺）研究において、化合物（Ｉ）が検討されてきた。ラット、イヌ及びサルにおいて一般的毒物学研究が実施されてきた。大部分の研究は、強制飼養によるＱＤ経口投薬を使用したが、少数の研究ではＩＶ投与が用いられた。ラット及びイヌにおいて決定的な毒物学研究が実施され、ここでは化合物（Ｉ）が１カ月間強制飼養ＱＤにより経口投与され、その後１カ月の逆転期間が続いた。
【００６３】
ラット毒物学研究では、脈管構造及びさまざまな軟組織のその後の石化（すなわち全身的石化）を伴うカルシウム及びリンホメオスタシスの時間及び用量依存性の調節不全が観察された。この毒性は、致死的用量の投与、毒性を作り出したラット内のものを超える曝露及びＳＫｐＥＲＫレベル（ＭＥＫの基質）の７０％超の抑制、にもかかわらず、イヌ及びサルにおいては見られなかった。化合物（Ｉ）で処置されたラットの体内に見られた血清カルシウム及びリン代謝の調節不全は、全身的石化の開始前に起こり、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤの血漿濃度の著しい上昇と相関関係をもつと思われる。毒物学データに基づくと、ラットはこの毒性に対してのみ感作性をもつと思われる。胃腸管毒性はイヌ及びサルにおいて用量制限的であり、ヒトの患者においては化合物（Ｉ）の用量制限的毒性であると予測される。化合物（Ｉ）での第Ｉ相臨床試験における患者の安全性を確保するためには、プロトコルに、カルシウム及びリンの代謝における早期異常を検出することに焦点を合わせた集中的監視の計画が取り込まれ、血清リン及びカルシウム調節の有意な異常は全く見られなかった。
【００６４】
前臨床研究における一次的化合物（Ｉ）毒性は、胃腸管（ラット、イヌ及びサル）、皮膚（ラット、イヌ及びサル）、肝臓（ラット）、骨（ラット）、及び全身的石化（ラットのみ）に対するものであった。胃腸管の粘膜に対する損傷は、非ゲッ歯類において用量制限的毒性であった。安全性薬理学研究の結果は一般に平凡なものであった。化合物（Ｉ）は、ラットでのインビボ小核研究における染色体異常誘発性についての潜在性を示した。
【００６５】
化合物（Ｉ）の前臨床研究（化合物（Ｉ）を受けたイヌ及びサルのプルキニュの血管像及びＨＥＲＧインビトロ検定及びＥＣＧ査定）は、ＱＴ／ＱＴｃ延長又は不整脈のリスクを示さなかった。第Ｉ相研究内に取込まれた全身的ＥＣＧ評価は、有意なＱＴ／ＱＴｃ効果の証拠を全く実証しなかった。試験に登録した全ての患者には、ＥＣＧｓを実施することが求められる。ＭＥＫ阻害物質の試験に登録した少数の患者が、研究薬物に対する関係が未知である駆出分画の目覚しい減少を発生させた。この試験においては多重ゲート獲得走査での駆出分画の監視が行なわれた。
【００６６】
この研究の第Ｉ相部分の間に４０人の患者を化合物（Ｉ）で処置した。２８日のサイクルの中で１〜２１日目に１ｍｇＱＤから３０ｍｇＢＩＤに至る用量上昇が実施された。その後５６日についての連続投薬がテストされた。見られた薬物関連毒性は、座瘡様の発疹、粘膜炎、視界不良、意識混濁、浮腫、下痢及び疲労を含んでいた。グレード１〜３の座瘡様皮膚発疹は、用量関連型パターンで発生し、３０ｍｇＢＩＤでＤＬＴであった。発疹は一日につき５０〜１００ｍｇの塩酸ミノサイクリンで管理された。薬物関連のものでありうる２回の失神発作が発生し、３０ｍｇＢＩＤでＤＬＴとみなされた。視界不良及び後光を含めたグレード１〜２の過渡的かつ可逆的な視覚効果が、用量レベル又は患者の特徴に関連する識別可能なパターン無く見られた。これらは標準的に、薬物サイクルのさらに後期、サイクル間休薬日の間及び後続するサイクルの間ではさほど重症でなかった。１人の患者が片側性視覚減少を発生させ、対側眼の眼科検査では全く異常がないのに、一方の眼の中に同位性神経円板浮腫及び網膜内出血を有することがわかった。全ての用量レベルで、間欠的に、グレード１−２依存性の顔面浮腫が見られた。グレード１−２の下痢がみられた。下痢は、塩酸ロペラミド処置に対し良好に応答した。３０ｍｇＢＩＤの用量で２人の患者に、グレード１−２の意識混濁及び運動失調が見られたが、患者の同時疾患から見て、該意識混濁及び運動失調が薬物に関連するものであったか否かは明らかでない。１ｍｇＢＩＤでの予め存在したうっ血性心不全の悪化が１症例と、２０ｍｇＢＩＤでの新たに開始した最小限の症状しか示さないうっ血性心不全の１症例が見られ、それらは化合物（Ｉ）との関係が明らかでないものであった。
【００６７】
最大投与用量（ＭＡＤ）は３０ｍｇＢＩＤであり、ＭＴＤは、２８日サイクル内の２１日の投薬でＤＬＴグレード３の座瘡状皮膚発疹の６症例のうち１例に２次的に２０ｍｇＢＩＤそしてＤＬＴ失神（ＣＴＣ  ＡＥ３．０によるグレード３）の６症例のうちの２例が３０ｍｇＢＩＤにあるものと判定された。６人の付加的な患者のコホートが２回の２８日サイクル（合計５６日）内で２０ｍｇのＢＩＤ連続投薬のコホート上に取上げられた。このコホート内では、１人の患者がグレード３の座瘡状発疹のＤＬＴを発生させ、４人の患者が第２のサイクルの間の肝臓機能試験において上向きの傾向を示した。かくして、２０ｍｇのＢＩＤは連続投薬計画においてＭＴＤより上であるとみなされ、後続する患者は１５ｍｇＢＩＤの連続的投薬で処置された。
【００６８】
実験３：進行癌を有するヒトの患者における化合物（Ｉ）の第Ｉ相臨床研究
第Ｉ相／第ＩＩ相研究の間、４２人の癌患者が、化合物（Ｉ）で処置されてきた。乳癌、結腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）又はメラノーマを有する患者において２８日サイクルの１〜２１日目で１ｍｇＱＤから３０ｍｇＢＩＤに至る経口用量上昇を実施した。２８日サイクル内での連続的投薬についてその後テストした。
【００６９】
実験４で記述されているようにサイクル１の１５日目及びベースライン（ＢＬ）でのｐＥＲＫについて、及び実験５で以下に記述している通りＫｉ６７の量について、免疫組織化学（ＩＨＣ）により腫瘍組織を査定した。全ての患者において１日目及び２１日目に、又同様に両方向交差食物効果構成要素に参加する患者においてサイクル２の１日目に、薬物動態（ＰＫ）試料を得た。ラット体内で観察された対応する軟組織石化を伴う高い血漿リンに起因して、血清カルシウム、リン及び（Ｃａ×Ｐ）生成物が密に監視された。
【００７０】
見られた薬物関連毒性は、座瘡様の発疹、粘膜炎、視界不良、意識混濁、浮腫、下痢及び疲労を含んでいた。グレード１〜２の座瘡様皮膚発疹は、有意な一部分の患者において発生し、１５ｍｇＢＩＤ超の用量でグレード３の発疹が見られた。この発疹は、一日に５０〜１００ｍｇ与えられたミノサイクリンで管理された。薬物関連のものでありうる２回の失神発作が発生し、３０ｍｇＢＩＤでＤＬＴとみなされた。視界不良及び後光を含めたグレード１〜２の過渡的かつ可逆的な視覚効果が、報告された。これらは標準的に、薬物サイクルのさらに後期、サイクル間休薬日の間及び後続するサイクルの間ではさほど重症のものでなかった。全ての用量レベルで、間欠的に、グレード１−２依存性の顔面浮腫が見られた。グレード１−２の下痢が見られ、塩酸ロペラミドに対し良好に応答した。
【００７１】
ＭＡＤは、３０ｍｇＢＩＤであり、２８日サイクルの２１日間投薬した場合のＭＴＤは、ＤＬＴグレード３座瘡状皮膚発疹の６症例のうち１例に二次的に２０ｍｇＢＩＤ、そして２８日サイクルの２１日投薬でＤＬＴ失神（ＣＴＣ  ＡＥ３．０によるグレード３）の６症例のうちの２例が３０ｍｇＢＩＤにあるものと決定された。各々６人の患者のコホートがその後２０ｍｇｂｉｄ及び１５ｍｇｂｉｄで処置され、投薬は２８日サイクル全体にわたり連続的なものであった。各コホート内の１人の患者にＤＬＴが見られた（グレード３、座瘡状皮膚発疹）。
【００７２】
処置された４２人の患者のうち、２人の部分的応答（メラノーマ）及び安定した疾患をもつ１０人の患者が報告された。血清（Ｃａ×Ｐ）産物に対する顕著な効果は全くなかった。
【００７３】
実験４：化合物（Ｉ）での処置を受けた患者からの対合連続生検標本中のリン酸化ＥＲＫタンパク質（ｐ−ＥＲＫ）の免疫組織化学分析
（ＭＡＰキナーゼ又はＭＡＰＫとしても知られている）ＥＲＫタンパク質は、ＭＥＫキナーゼ活性のための基質であり、かくしてＥＲＫタンパク質のリン酸化の減少は、ＭＥＫ活性の減少の指標である。ＥＲＫのリン酸化状態は、リン酸化部位特異的抗体を利用して、抗体ベースの検出方法を通して査定可能である。化合物（Ｉ）での処置を受けた癌患者の臨床研究においては、処置開始直前及び化合物（Ｉ）での毎日の投薬の１４日目において生検標本が採集された。生検は、切除又はコア針生検手順のいずれかに敏感に反応する腫瘍病巣から採集され、組織標本は直ちに定着のため１０％の中性緩衝ホルマリン溶液内に入れられた（通常はホルマリン中で６〜８時間、ただし２４時間以内）。定着した組織は次に７０％のエタノール溶液に移され、ｐ−ＥＲＫ及び増殖マーカーＫｉ６７の免疫組織化学（ＩＨＣ）分析のため組織病理学検定実験所に提出された（実験５）。生検組織は、標準的な組織処理の後パラフィン包埋した。ｐ−ＥＲＫの検出のために用いられた抗体は、Sigma-Aldrich Co. によって製造されたマウスモノクローナル抗−ＭＡＰキナーゼ（活性化）抗体であった（カタログ番号：Ｍ８１５９）。この抗体は、ＭＡＲＫのジリン酸化形態（ＥＲＫ−１及びＥＲＫ−２の両方の形態）と特異的に反応する。パラフィンブロックから調製された組織切片を、検出手順に先立ち熱誘発型抗原賦活化条件（１２０℃で３分）で予備処理した。DAB Chromogenを色原体として、切片に結合した抗体の視覚化のためにDAKO Envisionプラスキットを使用した。（ヘマトキシリン対比染色での）染色手順においては、Biogenex Autostainer系を用いた。個々の切片中の染色の程度を、各切片内の腫瘍細胞内の相対的染色色強度に基づく評定を用い、病理学者の再検査により査定した（バイオマーカー評価に先立ち、各生検組織からのヘマトキシリン−エオシン染色したスライドを用いて、与えられた生検標本中に腫瘍細胞が存在したか否か及びどの程度まで存在したかを評価した；腫瘍含有量がほとんど又は全く観察されなかった組織は該分析中に含み入れられなかった）。染色強度は０〜３＋までのカテゴリにまとめられ、０はほとんど又は全く染色無しであり、３は最も高い染色であった。各切片についての最終的評点を、以下のように計算されたＨ評点の形で提供した：３×（３＋染色の細胞％）＋２×（２＋染色の細胞％）＋１×（１＋染色の細胞％）。各々の生検標本について、２つの切片を分析し、これらの平均をｐ−ＥＲＫＨ−評点としてとり上げた。Ｈ評点に加えて、陽性細胞の合計％も記録した。同じ患者からの処置後生検と処置前生検の比較を、以下の公式を用いＨ−評点に基づいて計算して［（（前−後）／前）×１００のマイナス］、化合物（Ｉ）での処置に付随するｐ−ＥＰＫの百分率差を得た。
【００７４】
実験５：化合物（Ｉ）での処置を受けたヒト癌患者からの対合連続生検標本における細胞増殖マーカーＫｉ６７の免疫組織化学分析
実験４で記述したｐ−ＥＰＫ染色のために分析されたものと同じ生検標本を同様に、免疫組織化学により検出可能なＫｉ６７の量について査定した。Ｋｉ６７マーカーは、細胞増殖の指標とみなされ、かくしてＫｉ６７染色レベルの減少を抗癌剤の腫瘍活性と相関させることが可能である。パラフィン包埋された生検組織からの組織切片を、Ｋｉ６７検出手順に先立ち、熱誘発型抗原賦活化（この場合、３分間の電子レンジ加熱）で前処理した。使用された抗体は、Novocastra Laboratories Ltd 製のマウスモノクローナルＫｉ６７／ＭＭ１であった（カタログ番号；ＮＣＬ−Ｋｉ６７−ＭＭ１）。DAB Chromogen を色原体として、切片に結合した抗体の視覚化のためにBiogenex Supersensitive DAB/HRP検出キットを使用した。（ヘマトキシリン対比染色での）染色手順においては、Biogenex Autostainer 系を用いた。個々の切片中の染色の程度を、各切片内の腫瘍細胞内の相対的染色色強度に基づく評定を用い、病理学者の再検査により査定した。染色強度の評定は、各切片について生成されるＨ−評点で、ｐ−ＥＲＫ検定の場合と同じ要領で実施した。Ｋｉ６７については、各々の生検標本について、１つの切片のみを検定した。ｐ−ＥＰＫの場合と同じ要領で、化合物（Ｉ）に付随するＫｉ６７評点の百分率差を計算した。
【００７５】
実験６：進行癌患者に対する多数回経口用量の後の化合物（Ｉ）の薬物動態（ＰＫ）、薬力学（ＰＤ）及び製品代謝
ヒト内での初めての第Ｉ相／第ＩＩ相試験では、さまざまな進行充実性腫瘍を有する患者が２８日サイクル内の２１又は２８日間にわたり化合物（Ｉ）（ＱＤ又はＢＩＤ）で経口にて処置される場合に開放標識、用量上昇設計が利用された。薬物動態データが最初の３８人の対象について提示される。用量上昇は、１ｍｇＱＤからそして１ｍｇＢＩＤから３０ｍｇＢＩＤに至るまで実施された。５６日間の２０ｍｇＢＩＤでの連続的投薬をその後テストした。
【００７６】
親化合物（Ｉ）、その主要代謝産物化合物（ＩＩ）、すなわち
【化５】
2007106762.tif 000007
及びＮ−［（Ｓ）−２，３−ジヒドロキシ−プロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−ベンズアミド（化合物（ＩＩＩ））すなわち、
【化６】
2007106762.tif 000008
である化合物（Ｉ）のＳ−鏡像異性体の薬物動態評価のため、サイクル１の１日目及び２１日目及びサイクル２の１日目に連続血液試料を採集した。化合物（Ｉ）のＰＫに対する食物の効果を１６人の患者について評価した（サイクル１及び２の１日目）。
【００７７】
ＥＤＴを抗凝血剤として用いてヒトの血漿中の化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩＩ）及び化合物（ＩＩ）を定量するためにタンデム質量分析検出を伴う液体クロマトグラフィ方法を使用した。化合物（Ｉ）及びその立体異性体化合物（ＩＩＩ）ならびに代謝産物化合物（ＩＩ）を液体／液体抽出によりＥＤＴＡ処置されたヒト血漿から単離させた。分析まで、血漿試料を２０℃で保管した。分析は、多重反応監視を用いて負イオンモードでＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより行なう。化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩＩ）及び化合物（ＩＩ）についての定量範囲は０．１００〜１００ｎｇ／ｍＬであった。この検定には、０．２００ｍＬの血漿アリコートが必要であった。以下の手順を用いることによって試料を抽出した。
【００７８】
試料の抽出：
０．６５０ｍＬの９５：５メチル−ｔ−ブチルエーテル／エチルアルコール、ｖ／ｖを添加した。
１分間マルチチューブボルテックスマシンを用いて渦流処理した。このステップをさらに３回反復した。
渦流処理ステップの後、４０００ｒｐｍで２０分間４℃で遠心分離した。
遠心分離の後、約０．５５０ｍＬを１ｍＬの９６ウェルのポリプロピレン平板に移した。
３０℃〜３５℃で窒素下にて乾燥するまで蒸発させた。
０．１％の酢酸を含む０．０７５ｍＬの７０：３０メタノール／水で試料を戻した。
１分間マルチチューブボルテックスマシンを用いて渦流処理した。
４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
液体クロマトグラフィ計器内に１〜１０μＬの試料抽出物を注入した。
【００７９】
クロマトグラフィ条件：
分析カラム：CHIRALPAK ＡＤ−ＲＨ、０．４６×１５ｃｍ、５μ。
ガードカラム：Meta Guard ２．０ｍｍ Polaris Ｃ１８−Ａ、５μ
移動相：移動相Ａ：水中０．１％の酢酸、ｖ／ｖ
移動相Ｂ：アセトニトリル／イソプロパノール、９０：１０、ｖ／ｖ
移動相Ａ／移動相Ｂ：１７：８３
ニードルフラッシュ溶媒：アセトニトリル／イソプロパノール／水／酢酸：３００：３００：４００：１、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ。
注入ループ：５０μＬ
ポンププログラム：定組成
流速：０．７５０ｍＬ／分
カラム温度：３５℃
注入体積：１〜１０μＬ
近似的保持時間：化合物（Ｉ）、２．６〜３．２分
化合物（ＩＩＩ）  ３．２〜３．８分
化合物（ＩＩ）  ２．７〜３．３分
【００８０】
質量分析法：
質量分析計：Sciex ＡＰＩ４０００
イオン化モード：ターボイオンスプレー／マイナスイオンモード
獲得モード：ＭＲＭ
休止時間：５ｍｓ
問題の質量：
【表２】
2007106762.tif 000009
実行時間：カラム条件に応じて６．０又は１２．０分
定量：
ピーク面積を測定するためにＰＥ  Sciex Analystソフトウェア（バージョン１．２）を使用した。データ削減のためにはWatson LIMS（バージョン６．４、０．０４、ＣＰＬ＃６３）を使用した。１／（濃度）2の加重回帰分析を適用することにより試料を定量する。
【００８１】
WINNONLINプロフェショナルエディション（バージョン４．１）を用いて非区画式方法により薬物動態パラメータを決定した。０〜２４時間（ＡＵＣ0-24）の濃度−時間曲線の下の面積を計算するために、ライナー台形方法を使用した。血漿濃度−時間曲線内の終末期の半減期（ｔ1/2）をｔ1/2＝０．６９３／λｚから計算した。なおλｚは、最後の３つの濃度データポイントを用いて線形回帰によって推定された（ｒ2＞０．９）。濃度データを検査することで最大観察濃度（Ｃmax）を得た。Ｃmaxへの到達時間は、Ｃmaxが観察されデータの検査によって得られる最初の時間であった。投薬前濃度（Ｃtrough）は、濃度データを検査することによって得られた。定常状態における平均濃度（Ｃｓｓ，ａｖｇ）は、毎日投薬間隔（２４時間）で２１日目のＡＵＣ0-24を除したものから計算された。
【００８２】
以下の結果は、公称採集時間及び品質管理されているが品質保証されていない生物分析データを用いて推定された、３８人の対象からの予備薬物動態パラメータに基づいている。
【００８３】
表２中に化合物（Ｉ）の予備血漿薬物動パラメータが提示されている。飢餓状態で投与された化合物（Ｉ）は急速に吸収され、ピーク血漿濃度は投薬後１〜２時間以内に発生する。飢餓条件の下で、ピーク血漿レベル（Ｃｍａｘ）及び曲線下面積（ＡＵＣ）は両方共、１ｍｇＱＤ又はＢＩＤ−３０ｍｇＢＩＤの範囲内でほぼ用量に比例していた。血漿濃度は、一般に５〜１４時間の範囲にある排除血漿半減期と共に減退した。２１日の多重経口ＢＩＤ投薬の後、化合物（Ｉ）のＡＵＣは１．１〜２．２の累積比でわずかに増加した。化合物（Ｉ）の薬物動態の対象間での変動性を、この対象集団において評価した。飢餓状態でのＡＵＣ（0-24）についての全体的変動係数（ＣＶ）は３９％であった。
【００８４】
【表３】
2007106762.tif 000010
【００８５】
経口投与の後、化合物（Ｉ）の主要循環代謝産物は化合物（ＩＩ）であった。化合物（ＩＩ）のＡＵＣは、ヒトの血漿中の化合物（Ｉ）の一回投薬及び多数回投薬の後の親のおよそ６６％及び１２０％（中央値）であった。化合物（ＩＩ）の予備血漿薬物動態バラメータは表３に要約されている。飢餓条件下の化合物（Ｉ）の経口投与の後、化合物（ＩＩ）のＡＵＣ及びＣｍａｘは両方共、一般に、１ｍｇＱＤ又はＢＩＤ〜３０ｍｇＢＩＤの範囲内の用量で増大した。化合物（ＩＩ）の末期血漿半減期は、親薬物のものよりも長かった。２１日の多数回ＢＩＤ投薬の後、化合物（ＩＩ）のＡＵＣは２．０〜５．０倍増大した。
【００８６】
【表４】
2007106762.tif 000011
【００８７】
サイクル１の１日目（Ｃ１Ｄ１）及びサイクル２の１日目（Ｃ１Ｄ２）にパイロット食物効果評価を実施した。１６人の対象がパイロット食物評価を完了し、そのデータは表４に提示されている。化合物（Ｉ）が高脂肪食と共に摂取された場合、ピーク血漿レベルは、Ｃｍａｘの減少と共に約２〜７時間遅延された、これは化合物（Ｉ）の吸収速度が食物摂取により低減されることを示唆していた。しかしながら化合物（Ｉ）ＡＵＣに対する食物の効果は可変的であった。摂食状態でのＡＵＣ（0-24）についての変動係数（ＣＶ）は、７８％で、飢餓状態の場合の約２倍であり、このことは食物摂取が対象間薬物動態変動性を増大させることを示していた。
【００８８】
【表５】
2007106762.tif 000012
【００８９】
化合物（Ｉ）は、精製（Ｒ）−鏡像異性体として投薬された。（Ｒ）−（すなわち化合物（Ｉ））からＳ−鏡像異性体（すなわち化合物（ＩＩＩ））へのインビボ相互転換は、８つの異なる投薬計画を通して２４人の対象において評価された。サイクル１の２１日目におけるＡＵＣについての平均（Ｓ）対（Ｒ）比は低く０．０３（ＣＶ３８％）であった。これは、１ｍｇのＢＩＤコホートからの各々１２及び２１％の比をもつ２つの外れ値対象を除外している。
【００９０】
要約すると、癌患者における化合物（Ｉ）の血漿薬物動態は、投薬から１〜２時間以内にピーク濃度が発生する、急速な吸収、一般に用量に比例する曝露の変化及び５〜１６時間の排除半減期を特徴としている。食物は、化合物（Ｉ）のピーク血漿濃度を減少させると思われたが、ＡＵＣに対する効果は可変的であった。主要循環代謝産物化合物（Ｉ）についての血漿薬物動態は親に比べより長い半減期及び最高１２０％高い血漿曝露によって特徴づけられていた。
【００９１】
ＭＥＫ１／ＭＥＫ２活性（ｐＥＲＫ）及び細胞増殖（Ｋｉ６７）のＰＤマーカーは、ベースラインと１５日目（投薬から２〜４時間後）に得られた腫瘍生検における定量的免疫組織化学によって査定された。１ｍｇのＱＤ又はＢＩＤから３０ｍｇのＢＩＤまでの範囲内の異なる用量の投薬計画全体にわたり、強いＴＭｐＥＲＫ抑制が観察された。進行中の研究から収集されている結果において、平均ｐＥＲＫの減退は、ベースラインとの関係において全ての用量（Ｎ＝２３）にわたり６８％であり、２ｍｇのＢＩＤから３０ｍｇのＢＩＤ（Ｎ＝２０）まで７５％であった。ベースラインｐＥＰＫ評点が２０を超えるケースのみが考慮される場合、平均ｐＥＲＫの減退は、１ｍｇＱＤから３０ｍｇＢＩＤ（Ｎ＝１９）の全ての用量グループ全体にわたり６３％であり、２ｍｇＢＩＤから３０ｍｇＢＩＤ（Ｎ＝１４）までは７４％であった。この用量範囲全体にわたり同様にＫｉ６７が割当てられた。平均Ｋｉ６７の減退は、１ｍｇＱＤから３０ｍｇＢＩＤ（Ｎ＝２２）の用量範囲全体にわたり３１％であり、２ｍｇＢＩＤから３０ｍｇＢＩＤまで（Ｎ＝１９）は４６％であった。ベースラインＫｉ６７評点が２０を超えるケースのみが考慮される場合、平均Ｋｉ６７減退は全ての用量グループ（Ｎ＝１８）に全体にわたり３９％であり、２ｍｇＢＩＤから３０ｍｇＢＩＤグループ（Ｎ＝１３）にわたり４９％であった。腫瘍生検におけるｐＥＲＫのこれらの調査の結果として、化合物（Ｉ）がテストされた全ての用量、特に２ｍｇ以上の用量で腫瘍中のｐＥＲＫレベルの抑制を導くということが示された。増殖マーカーＫｉ６７は同様に、処置後の腫瘍の減退及び類似の用量を示した。表５は第Ｉ相／第ＩＩ相研究についてのデータを表わしている。
【００９２】
【表６】
2007106762.tif 000013
【００９３】
例１：関節リウマチのインビボ処置及び死に対する防御コラーゲンで誘発させた関節炎のマウスモデルを用いた実験において、メトレキサート、ＵＳＰ（Sigmaカタログ番号Ｍ−９９２９）及び化合物（Ｉ）は、浮腫を阻害し、臨床評点を改善させた。化合物（Ｉ）は、メトレキサート単独での処置を受けた一部のマウスについて見られた死から、該組合せで処置されたマウスを防御した。
【００９４】
この実験では、ウシＩＩ型コラーゲン（ユタ大学）を２ｍｇ／ｍＬの濃度まで０．０１Ｎの酢酸で希釈し、混合物を１ｍｇ／ｍＬのヒト型結核菌Ｈｒａ３７で補足された等体積のフロイント完全アシュバント（Difco, Detroit, Michigan）で乳化させた。年令をマッチングした（８〜１２週）雌のＤＢＡ／１マウス（Harlan, UK）を、尾の付け根の皮内で１００μＬのエマルジョン（１００μｇのコラーゲン）で０日目に免疫化した。２７日目にマウスの体重を測定した。メトレキサートと化合物（Ｉ）を用いた経口投薬は２７日目に開始し、４１日目又は４２日目まで続行した。メトレキサートを一週間に３回、つまり月曜、水曜及び金曜の予定で投与し、化合物（Ｉ）を投薬周期中にＱＤで投与した。媒質対照マウスには媒質（ＨＰＭＣ／Tween-80）のみを投与し、正常な対照マウスには何にも投与しなかった。免疫化後２８日目に、マウスに１００μＬの生理食塩水中で５０μｇのＬＰＳ（Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri）を腹腔内（ＩＰ）で投与した。以下の尺度を用いて各動物の各々の肢に臨床評点を与えることにより、２７、３１、３４、３７及び４１日目に関節炎の発生を査定した；（０）正常、（１）紅斑（すなわち異常な皮膚の発赤）及び浮腫（すなわち、流体の異常な収集に起因した膨れ）、（２）関節のねじれ又は（３）関節の硬直（すなわち関節の凝り又は固定）。前足及び後足上の浮腫の測定を、定張カリパスを用いて行なった（Dyer, Lancaster, Pennsylvania）。４２日目に再びマウスの体重を測定した。１０ｍｇのメトレキサートグループ（すなわちグループＮｏ．５）以外の全てのグループにおいて４２日目に、血漿試料を、４２日目の用量から１時間（３匹より）、３時間（２匹より）、７時間（２匹より）後に、そして４１日目の用量から２４時間後（２匹より）に採集した。１０ｍｇ／ｋｇのメトレキサートグループ内で４２日目までに、３匹の動物が死亡し、従って、４２日目の用量から１時間（２匹）、３時間（２匹）、７時間（１匹）後に、及び４１日目の用量から２４時間（１匹）後に血漿試料を採集した。２４時間の血漿試料を提供する動物には、４２日目に投薬しなかった。各々の残った生存マウスを安楽死させ、その肝臓を採集し、１つの前関節と１つの後関節を１０％の緩衝ホルマリン中で固定させ、１つの前関節と１つの後関節を液体窒素中で瞬間冷凍させた。同じくグループ毎の死亡数を報告する表６中で示されているマウスをグループにまとめた。
【００９５】
【表７】
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【００９６】
該実験からのデータは、図１〜１２にグラフによって表示され、又表６に数値的に示されている。図１〜４は同様に足の浮腫のＡＵＣ％Ｉｎｈについて記しており、図５〜８は２７日目から４１日目までについての平均合計臨床評点の減少のＡＵＣ％Ｉｎｈを記している。統計学的意義は、スチューデントｔ検定を用いて決定された。データは、化合物（Ｉ）とメトレキサートの組合せがマウスにおける関節リウマチの処置において有効であることを示し、かつ化合物（Ｉ）がメトレキサートで処置されたマウスを死から防御し、メトレキサートに関連した体重減少を阻害することを表わしている。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】化合物（Ｉ）単独、メトトレキサート単独、化合物（Ｉ）とメトトレキサートの組合せ及び媒質及び正常な対照を用いたマウスコラーゲン誘発型関節炎実験からの実験日数と足の浮腫の変化の関係をグラフ表示し、足の浮腫のＡＵＣ％Ｉｎｈを記している。
【図２】化合物（Ｉ）単独、メトトレキサート単独、化合物（Ｉ）とメトトレキサートの組合せ及び媒質及び正常な対照を用いたマウスコラーゲン誘発型関節炎実験からの実験日数と足の浮腫の変化の関係をグラフ表示し、足の浮腫のＡＵＣ％Ｉｎｈを記している。
【図３】化合物（Ｉ）単独、メトトレキサート単独、化合物（Ｉ）とメトトレキサートの組合せ及び媒質及び正常な対照を用いたマウスコラーゲン誘発型関節炎実験からの実験日数と足の浮腫の変化の関係をグラフ表示し、足の浮腫のＡＵＣ％Ｉｎｈを記している。
【図４】化合物（Ｉ）単独、メトトレキサート単独、化合物（Ｉ）とメトトレキサートの組合せ及び媒質及び正常な対照を用いたマウスコラーゲン誘発型関節炎実験からの実験日数と足の浮腫の変化の関係をグラフ表示し、足の浮腫のＡＵＣ％Ｉｎｈを記している。
【図５】化合物（Ｉ）単独、メトトレキサート単独、化合物（Ｉ）とメトトレキサートの組合せ及び媒質及び正常な対照を用いたマウスコラーゲン誘発型関節炎実験からの実験日数と平均合計臨床等級の変化の関係をグラフ表示し、平均合計臨床等級の減少のＡＵＣ％Ｉｎｈを記している。
【図６】化合物（Ｉ）単独、メトトレキサート単独、化合物（Ｉ）とメトトレキサートの組合せ及び媒質及び正常な対照を用いたマウスコラーゲン誘発型関節炎実験からの実験日数と平均合計臨床等級の変化の関係をグラフ表示し、平均合計臨床等級の減少のＡＵＣ％Ｉｎｈを記している。
【図７】化合物（Ｉ）単独、メトトレキサート単独、化合物（Ｉ）とメトトレキサートの組合せ及び媒質及び正常な対照を用いたマウスコラーゲン誘発型関節炎実験からの実験日数と平均合計臨床等級の変化の関係をグラフ表示し、平均合計臨床等級の減少のＡＵＣ％Ｉｎｈを記している。
【図８】化合物（Ｉ）単独、メトトレキサート単独、化合物（Ｉ）とメトトレキサートの組合せ及び媒質及び正常な対照を用いたマウスコラーゲン誘発型関節炎実験からの実験日数と平均合計臨床等級の変化の関係をグラフ表示し、平均合計臨床等級の減少のＡＵＣ％Ｉｎｈを記している。
【図９】マウスコラーゲン誘発型関節炎実験からの対照動物グループと各処置についての体重変化をグラフ表示する。
【図１０】マウスコラーゲン誘発型関節炎実験からの対照動物グループと各処置についての体重変化をグラフ表示する。
【図１１】マウスコラーゲン誘発型関節炎実験からの対照動物グループと各処置についての体重変化をグラフ表示する。
【図１２】マウスコラーゲン誘発型関節炎実験からの対照動物グループと各処置についての体重変化をグラフ表示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【外国語明細書】
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