(57)【要約】【課題】定量ＰＣＲや定量ＲＴ−ＰＣＲを用いることなく、マイクロアレイ等における検出値を標準化し、異なる条件で検出した場合においても互換性のあるデータを得る方法を提供する。【解決手段】本発明は、担体に固定された核酸関連物質であるプローブと、検出対象であり且つ核酸関連物質であるターゲットとをハイブリダイズさせ、当該ハイブリダイゼーション反応に基づくシグナル強度を測定することにより、被検試料中で発現している目的遺伝子のｍＲＮＡを定量するに際し、前記被検試料についての前記ハイブリダイゼーション反応に基づくシグナル強度の測定に加え、前記ターゲットとして、前記目的遺伝子の一部に対応し且つ前記プローブにハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドを既知量加えて反応させ、前記シグナル強度の測定を行うことにより、前記被検試料中の目的遺伝子のｍＲＮＡ量を補正して定量することを特徴とする目的遺伝子のｍＲＮＡの定量方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体に固定された核酸関連物質であるプローブと、検出対象であり且つ核酸関連物質であるターゲットとをハイブリダイズさせ、当該ハイブリダイゼーション反応に基づくシグナル強度を測定することにより、被検試料中で発現している目的遺伝子のｍＲＮＡを定量するに際し、前記被検試料についての前記ハイブリダイゼーション反応に基づくシグナル強度の測定に加え、前記ターゲットとして、前記目的遺伝子の一部に対応し且つ前記プローブにハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドを既知量加えて反応させ、前記シグナル強度の測定を行うことにより、前記被検試料中の目的遺伝子のｍＲＮＡ量を補正して定量することを特徴とする目的遺伝子のｍＲＮＡの定量方法。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドが、前記目的遺伝子に対応する完全長ａＲＮＡの断片であり、当該完全長ａＲＮＡの量が既知である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
完全長ａＲＮＡを含む標準試料であって、当該完全長ａＲＮＡの含有量が既知である標準試料と、被検試料から調製したａＲＮＡを含有するａＲＮＡ被検試料とを、各々、同一の方法で処理してａＲＮＡを断片化する工程（ａ）、双方の試料各々について、工程（ａ）で得られた断片を前記プローブとハイブリダイズさせる工程（ｂ）、双方の試料各々について、前記断片と前記プローブとのハイブリダイゼーションに基づくシグナル強度を測定する工程（ｃ）、及び、双方の試料各々について得られたシグナル強度を比較することにより、ａＲＮＡ被検試料中のａＲＮＡの絶対量を算出する工程（ｄ）を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドが合成オリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドを含む標準試料であって、当該オリゴヌクレオチドの含有量が既知である標準試料を用意する工程（Ａ−ｉ）、被検試料から調製したａＲＮＡを含有するａＲＮＡ被検試料を処理してａＲＮＡを断片化する工程（Ａ−ｉｉ）、工程（Ａ−ｉ）で用意された標準試料中のオリゴヌクレオチドと、工程（Ａ−ｉｉ）で得られた断片を、各々、前記プローブとハイブリダイズさせる工程（Ｂ）、前記オリゴヌクレオチドと前記プローブとのハイブリダイゼーションに基づくシグナル強度（ｉ）と、前記断片と前記プローブとのハイブリダイゼーションに基づくシグナル強度（ｉｉ）とを測定する工程（Ｃ）、及び、シグナル強度（ｉ）とシグナル強度（ｉｉ）とを比較することにより、ａＲＮＡ被検試料中のａＲＮＡの絶対量を算出する工程（Ｄ）を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記プローブがマイクロアレイ上のプローブである、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記プローブが本来測定対象としている遺伝子以外の遺伝子を目的遺伝子とするクロスハイブリダイゼーションの測定である、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
核酸関連物質であるプローブが固定されたマイクロアレイのロット間で、又は、商品間で、それらのマイクロアレイを用いて測定された測定値を比較する方法であって、前記プローブに、検出対象であり且つ核酸関連物質であるターゲットをハイブリダイズさせ、当該ハイブリダイゼーション反応に基づくシグナル強度を測定する工程を含み、ここにおいて、測定の目的である遺伝子の一部に対応し且つ前記プローブにハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドを前記ターゲットとして既知量含有する試料を用いて前記シグナル強度の測定を行い、マイクロアレイのロット間で、又は、商品間で、測定値を比較することを特徴とする、前記方法。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドが、前記目的遺伝子に対応する完全長ａＲＮＡの断片であり、当該完全長ａＲＮＡの量が既知である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドが合成オリゴヌクレオチドである、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
プローブとターゲットとのハイブリダイゼーションを利用して、被検試料中で発現している目的遺伝子のｍＲＮＡを定量する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物の発生過程や病気などのメカニズムの解明、診断、創薬への活用などのために、すべての遺伝子を記載しようというゲノム研究から発展し、特定の時点、状態に置かれた個体・器官・組織・細胞の中で発現されている遺伝子の種類と発現量をｍＲＮＡのレベルで解析する発現プロファイル解析が行われるようになった。発現プロファイル解析は、異なる試料を時系列、異なる条件下あるいは異種生物間で調べ比較するのに有効な手段で、対象とするｍＲＮＡの種類が少ない場合は定量ＲＴ−ＰＣＲ、ｍＲＮＡの種類が多い場合（網羅的解析）にはマイクロアレイが主に用いられている。マイクロアレイとは、担体として平板を用い、その上に位置を決めて核酸またはオリゴヌクレオチドを配列・固定化させたものであり、これに対して相補的配列を持つＲＮＡ、即ちａＲＮＡ、またはｃＤＮＡをハイブリッド形成させ、色素等によりその結合量を定量的に測定するものであるが、担体として平板の代わりに糸状の物体を用いる場合や、識別可能なビーズ（粒子）群を用いる場合もある。
【０００３】
この際にマイクロアレイ等において得られるデータは定性的または相対的である上に、使用する機器や技法に依存するので、ｍＲＮＡ量を絶対値で求めることができず、また、異なるマイクロアレイ等を用いた実験間で発現量の比較を行うことも不可能である。例えば、同一遺伝子から異なる領域を選んでデザインしたオリゴヌクレオチドをプローブに用いた場合、その遺伝子のｍＲＮＡまたはその誘導体は、異なるプローブに対して異なるハイブリダイズ効率を示す。また、前記ｍＲＮＡは、試料の処理法や、ハイブリダイズの条件により異なるハイブリダイズ効率を示し、異種ｍＲＮＡ等とクロスハイブリする可能性等も異なる。マイクロアレイ等による遺伝子発現の計測にとってこれは著しく不都合である。そのため、遺伝子発現量について定量的なデータを得るには、発現量の変化を検出しようとする遺伝子を選択し、いちいち定量ＲＴ−ＰＣＲを実施するのが一般的であった。
【０００４】
定量ＰＣＲや定量ＲＴ−ＰＣＲにおける標準化の精度を上げるために、個々の遺伝子に対して標準物質を作製し、それを利用して測定の精度を高める方法がとられている。しかし、多数の遺伝子発現情報の入手を目的に使われるマイクロアレイ等においては、個々の遺伝子につきマイクロアレイ等による解析の後に定量ＲＴ−ＰＣＲを実施することは、実用的でない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来のマイクロアレイ等を用いた解析においては、例えば投薬効果を見るためにはリファレンス（無処置試料）から得たｍＲＮＡのセットと、投薬試料から得たｍＲＮＡのセットを比較し、各遺伝子について発現量の増減を相対的に求めることが通常であった。この際、試料中に実際どれくらいのｍＲＮＡが含まれているかを正確に知ることは現実的問題とされず、また、異なる製造者によるマイクロアレイ等を用いたデータには互換性がない。
【０００６】
これは、（１）製造者により、ｃＤＮＡやオリゴヌクレオチドなど全く異なるプローブを選択していること、（２）オリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合に、その設計が異なること、（３）マイクロアレイ等の上に固定化されている各プローブの量が一定でないこと、（４）プローブと反応させるターゲットとして用いるｍＲＮＡの誘導体であるａＲＮＡやｃＤＮＡなどが示すハイブリダイゼーションの効率がプローブや技法により異なること、（５）実験者により用いる技法が異なり、それによるハイブリダイゼーションの効率が異なること、（６）さらに、プローブの一部が、異なる遺伝子の転写産物と（一部）クロスハイブリダイズする可能性が十分排除されていないこと、などによる。
【０００７】
従って、本発明の目的は、定量ＰＣＲや定量ＲＴ−ＰＣＲを用いることなく、マイクロアレイ等における検出値を標準化し、異なる条件で検出した場合においても互換性のあるデータを得る方法を提供することである。換言すれば、本発明の目的は、ｍＲＮＡを定量する方法と、異なるマイクロアレイを用いて測定された値を比較する方法とを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、担体に固定されたプローブに、標準物質としての、その量が既知の、目的遺伝子の一部に対応する配列を含むオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、当該ハイブリダイゼーションに基づくシグナル強度を測定し、被検試料についての前記ハイブリダイゼーション反応に基づくシグナル強度の測定値を、前記標準物質を用いて測定したシグナル強度と比較することにより、被検試料中で発現している目的遺伝子のｍＲＮＡ量を補正して定量できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、以下のとおりである。
（１）担体に固定された核酸関連物質であるプローブと、検出対象であり且つ核酸関連物質であるターゲットとをハイブリダイズさせ、当該ハイブリダイゼーション反応に基づくシグナル強度を測定することにより、被検試料中で発現している目的遺伝子のｍＲＮＡを定量するに際し、前記被検試料についての前記ハイブリダイゼーション反応に基づくシグナル強度の測定に加え、前記ターゲットとして、前記目的遺伝子の一部に対応し且つ前記プローブにハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドを既知量加えて反応させ、前記シグナル強度の測定を行うことにより、前記被検試料中の目的遺伝子のｍＲＮＡ量を補正して定量することを特徴とする目的遺伝子のｍＲＮＡの定量方法。
【００１０】
（２）前記オリゴヌクレオチドが、前記目的遺伝子に対応する完全長ａＲＮＡの断片であり、当該完全長ａＲＮＡの量が既知である、（１）に記載の方法。
（３）完全長ａＲＮＡを含む標準試料であって、当該完全長ａＲＮＡの含有量が既知である標準試料と、被検試料から調製したａＲＮＡを含有するａＲＮＡ被検試料とを、各々、同一の方法で処理してａＲＮＡを断片化する工程（ａ）、双方の試料各々について、工程（ａ）で得られた断片を前記プローブとハイブリダイズさせる工程（ｂ）、双方の試料各々について、前記断片と前記プローブとのハイブリダイゼーションに基づくシグナル強度を測定する工程（ｃ）、及び、双方の試料各々について得られたシグナル強度を比較することにより、ａＲＮＡ被検試料中のａＲＮＡの絶対量を算出する工程（ｄ）を含む、（２）に記載の方法。
（４）前記オリゴヌクレオチドが合成オリゴヌクレオチドである、（１）に記載の方法。
【００１１】
（５）前記オリゴヌクレオチドを含む標準試料であって、当該オリゴヌクレオチドの含有量が既知である標準試料を用意する工程（Ａ−ｉ）、被検試料から調製したａＲＮＡを含有するａＲＮＡ被検試料を処理してａＲＮＡを断片化する工程（Ａ−ｉｉ）、工程（Ａ−ｉ）で用意された標準試料中のオリゴヌクレオチドと、工程（Ａ−ｉｉ）で得られた断片を、各々、前記プローブとハイブリダイズさせる工程（Ｂ）、前記オリゴヌクレオチドと前記プローブとのハイブリダイゼーションに基づくシグナル強度（ｉ）と、前記断片と前記プローブとのハイブリダイゼーションに基づくシグナル強度（ｉｉ）とを測定する工程（Ｃ）、及び、シグナル強度（ｉ）とシグナル強度（ｉｉ）とを比較することにより、ａＲＮＡ被検試料中のａＲＮＡの絶対量を算出する工程（Ｄ）を含む、（４）に記載の方法。
（６）前記プローブがマイクロアレイ上のプローブである、（１）乃至（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記プローブが本来測定対象としている遺伝子以外の遺伝子を目的遺伝子とするクロスハイブリダイゼーションの測定である、（１）乃至（６）のいずれかに記載の方法。
【００１２】
（８）核酸関連物質であるプローブが固定されたマイクロアレイのロット間で、又は、商品間で、それらのマイクロアレイを用いて測定された測定値を比較する方法であって、前記プローブに、検出対象であり且つ核酸関連物質であるターゲットをハイブリダイズさせ、当該ハイブリダイゼーション反応に基づくシグナル強度を測定する工程を含み、ここにおいて、測定の目的である遺伝子の一部に対応し且つ前記プローブにハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドを前記ターゲットとして既知量含有する試料を用いて前記シグナル強度の測定を行い、マイクロアレイのロット間で、又は、商品間で、測定値を比較することを特徴とする、前記方法。
（９）前記オリゴヌクレオチドが、前記目的遺伝子に対応する完全長ａＲＮＡの断片であり、当該完全長ａＲＮＡの量が既知である、（８）に記載の方法。
（１０）前記オリゴヌクレオチドが合成オリゴヌクレオチドである、（８）に記載の方法。
【００１３】
上記本発明は、以下の発明をも包含する。
（i）プローブとターゲットとのハイブリダイゼーションを検出することにより被検試料における目的遺伝子の発現によるｍＲＮＡ量を測定する方法であって、
該目的遺伝子に対応する完全長ａＲＮＡを標準物質として用いることによりハイブリダイゼーションに基づくシグナル強度の検出値を標準化することを特徴とする、前記方法。
【００１４】
（ii）完全長ａＲＮＡを既知量で含む標準試料と被検試料から調製したａＲＮＡ被検試料とを、それぞれ同一の方法で処理することによりａＲＮＡを断片化する工程、
それぞれの試料に含まれる断片化ａＲＮＡをプローブとハイブリダイズさせる工程、および
双方の試料について得られるハイブリダイゼーションに基づくシグナル強度を検出して比較することにより、被検試料に含まれるａＲＮＡの絶対量を算出する工程
を含む、（i）記載の方法。
【００１５】
（iii）プローブが担体に固定化されている、（i）または（ii）記載の方法。
（iv）プローブがマイクロアレイ上のプローブである、（iii）記載の方法。
（v）プローブと、該プローブが対象とする遺伝子以外の被検遺伝子に由来する核酸とのクロスハイブリダイゼーションを検出する方法であって、該被検遺伝子に対応する完全長ａＲＮＡを用いることを特徴とする、前記方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、定量ＰＣＲや定量ＲＴ−ＰＣＲといった手法を用いることなく、マイクロアレイ等の簡便な方法で、被検試料中で発現している目的遺伝子のｍＲＮＡを定量することが出来る。
【００１７】
標準物質として完全長ａＲＮＡを用いる場合には、測定できる目的遺伝子の種類がわかっていれば、プローブの塩基配列が不明であっても、目的遺伝子のｍＲＮＡを定量することが出来る。
【００１８】
プローブの塩基配列が明らかな場合には、標準物質として合成オリゴヌクレオチドを用いることも出来、その場合には、完全長ａＲＮＡを用いる場合に比べ、より確実且つ簡便な方法で使用するオリゴヌクレオチドを入手できるという利点がある。
【００１９】
本発明により、マイクロアレイ等の商品の、ロット間及び商品間での測定値の比較が可能となる。但し、標準物質として合成オリゴヌクレオチドを用いる場合であって、商品間の比較を行う場合には、それらの商品において、プローブの塩基配列が共通部分を含むことが必要である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、担体に固定された核酸関連物質であるプローブと、検出対象であり且つ核酸関連物質であるターゲットとをハイブリダイズさせ、当該ハイブリダイゼーション反応に基づくシグナル強度を測定することにより、被検試料中で発現している目的遺伝子のｍＲＮＡを定量するに際し、前記被検試料についての前記ハイブリダイゼーション反応に基づくシグナル強度の測定に加え、前記ターゲットとして、前記目的遺伝子の一部に対応し且つ前記プローブにハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドを既知量加えて反応させ、前記シグナル強度の測定を行うことにより、前記被検試料中の目的遺伝子のｍＲＮＡ量を補正して定量することを特徴とする目的遺伝子のｍＲＮＡの定量方法に関する。
【００２１】
ターゲットとして、目的遺伝子の一部に対応し且つプローブにハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドを既知量加えて反応させるとは、言い換えれば、当該オリゴヌクレオチドを既知量含む試料を標準試料として用いることをさす。本発明において、目的遺伝子の一部に対応し且つプローブにハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドは、好ましくは、目的遺伝子に対応する完全長ａＲＮＡの断片、または合成オリゴヌクレオチドである。すなわち、本発明において好ましくは、目的遺伝子に対応する完全長ａＲＮＡ、または目的遺伝子の一部に対応し且つプローブにハイブリダイズする配列を含む合成オリゴヌクレオチドを標準物質として用いる。
【００２２】
標準物質とは、通常、標準物質に対する測定値を基準として被検試料中の被検物質の定量を行うこと、より具体的には、標準物質を既知量含む試料を基準として被検試料に含まれる被検物質の相対量を求めることにより、被検試料に含まれる被検物質を定量するための物質をいう。好ましくは標準物質を既知量含む試料を用いて検量線を作成することにより、被検試料に含まれる被検物質を定量するための物質をいう。
【００２３】
一態様において本発明は、プローブとターゲットとのハイブリダイゼーションを検出することにより被検試料における目的遺伝子の発現量、より詳しくは被検試料に含まれるｍＲＮＡ量を測定する方法であって、該目的遺伝子に対応する完全長ａＲＮＡを標準物質として用いることによりハイブリダイゼーションに基づくシグナル強度の検出値を標準化することを特徴とする方法に関する。
【００２４】
本発明の一態様においては、目的遺伝子に対応する完全長ｃＤＮＡから作製した完全長ａＲＮＡを標準物質として用いる。この標準物質は目的遺伝子のコード領域の全長をカバーし且つその上流（５’）、下流（３’）の非コード領域を含むことから、該遺伝子の任意の部分を代表するオリゴヌクレオチドや変性させたｃＤＮＡ断片からなるプローブとハイブリダイズする部分を含む。プローブはその性質や構成等により、ターゲットとのハイブリダイゼーション効率は異なるが、標準物質を含む標準試料と被検試料とを同一のプロトコールに従って操作するかぎり、各プローブに対応する標準物質を既知量含む標準試料は、マイクロアレイ等の製法、性質、使用法のいかんを問わず、ハイブリダイゼーションに基づくシグナル強度の検出値を標準化するための補正曲線を与えるので、これに基づき被検試料中のｍＲＮＡの絶対量を求めることができる。
【００２５】
また、プローブの塩基配列が既知の場合には、標準物質として、目的遺伝子の一部に対応し且つプローブにハイブリダイズする相補配列を含む合成オリゴヌクレオチドを用いることも出来る。この場合には、標準物質として完全長ａＲＮＡが使用される場合と比べて、被検試料から調製したａＲＮＡを含有するａＲＮＡ被検試料についてはａＲＮＡの断片化処理が行われるが、合成オリゴヌクレオチドを含む標準試料は断片化処理に供されないという相違がある。
【００２６】
標準物質としての合成オリゴヌクレオチドは、目的遺伝子の一部に対応しプローブにハイブリダイズする配列を含むが、被検試料から調製したａＲＮＡを含有するａＲＮＡ被検試料についてａＲＮＡ断片化処理を行ったときに得られるａＲＮＡ断片と同じ配列を有するように設計することが好ましい。合成オリゴヌクレオチドの塩基長は、プローブの配列や塩基長に応じて適宜決定されるが、通常、７０ｍｅｒ以下、好ましくは２５乃至５０ｍｅｒである。
【００２７】
合成オリゴヌクレオチドは、当技術分野で通常用いられる方法により製造することができる。そのような製造方法の例として、例えば、ジエステル法、トリエステル法、ホスファイト法、アミダイト法、Ｈ−ホスホネート法（S. L. Beaucage et al., Tetrahedron, 48, 2223 (1992); H. Koster et al., Tetrahedron Lett., 40, 103 (1984); Ｊ． Stawinski et al., Acta Biochim. Pol., 45, 907 (1998)）などが挙げられる。市販の核酸自動合成機を用いて合成することもできる。
【００２８】
本発明においてプローブは、当技術分野で通常用いられる意味を有する。すなわち、目的遺伝子を検出するために用いられる核酸関連物質、好ましくは核酸であって、該遺伝子に対応する核酸またはその断片と特異的にハイブリダイズする核酸等をさす。プローブとしては、通常、マイクロアレイ等の担体上に固定化された合成オリゴヌクレオチド、変性されたｃＤＮＡ断片またはゲノムＤＮＡ断片等が用いられる。オリゴヌクレオチドプローブの場合、通常数十塩基長（２０〜７０ｍｅｒ）の長さを有する。
【００２９】
本発明において核酸関連物質は、核酸、その断片、合成オリゴヌクレオチド、変性されたｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ断片、およびそれらの誘導体、ならびにそれらに標識が付加されたものを包含する。また、担体に固定化するために反応性の官能基が付加された核酸等も包含する。
【００３０】
本発明において核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。オリゴヌクレオチドも包含する。遺伝子に対応する核酸は、少なくとも遺伝子の全コード領域に対応する核酸、通常は遺伝子の全コード領域並びにｍＲＮＡとして不可欠なその上流（５’）及び下流（３’）の非コード領域に対応する核酸をさし、完全長ｃＤＮＡ、完全長ｍＲＮＡ、完全長ａＲＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびそれらの断片を包含する。ｃＤＮＡは、メッセンジャー（ｍ）ＲＮＡに対して相補的な配列を持つＤＮＡを酵素的に合成し、さらにその相補鎖を合成して二本鎖にした分子をさす。ＤＮＡは互いに逆方向の極性を持ち配列が相補的な二本のポリヌクレオチド鎖から成るが、ｍＲＮＡと同じ極性を持つ鎖はセンス鎖と呼ばれ、これに対してｍＲＮＡと反対の極性を持つものはアンチセンス鎖と呼ばれている。そして、ａＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）は、ｍＲＮＡと反対の極性を持つＲＮＡをさす。現行の手法でオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合には、センス配列を持ったオリゴヌクレオチドをプローブとして固定化に用い、アンチセンス配列を持った核酸、例えばａＲＮＡをターゲットに用いるか、ｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを変性させて用いてハイブリダイズさせる場合が多い。しかし、変性させたｃＤＮＡをプローブとして用いる場合もある。また、各遺伝子の５’末端にある転写開始点から転写の終結による３’ポリＡ末端までの領域を含むｍＲＮＡを完全長ｍＲＮＡと称し、それを基に作製されたｃＤＮＡを完全長ｃＤＮＡと称し、該完全長ｃＤＮＡを基に作製されたａＲＮＡを完全長ａＲＮＡと称する。
【００３１】
遺伝子の一部に対応する配列を含むオリゴヌクレオチドには、遺伝子の塩基配列の一部に対応する配列を有する、完全長ｃＤＮＡの断片、完全長ｍＲＮＡの断片、完全長ａＲＮＡの断片、ゲノムＤＮＡの断片およびこれらに相当する配列を有する合成オリゴヌクレオチドが包含される。
【００３２】
核酸の誘導体の例としては、リン酸ジエステル部位を修飾した人工核酸；フラノース部位のグリコシル結合やヒドロキシル基を修飾した人工核酸；核酸塩基部位を修飾した人工核酸；および糖・リン酸骨格以外の構造を利用した人工核酸などが挙げられ、より具体的には、リン酸部位の酸素原子を硫黄原子で置換したホスホロチオエート型、ホスホロジチオエート型、ホスホロジアミデート型、メチルホスホネート型またはメチルホスホノチオエート型の人工核酸；フラノース環上の置換基修飾型、糖環骨格が１炭素増炭したピラノース型、または多環式糖骨格型の人工核酸；ピリミジンＣ−５位修飾塩基型、プリンＣ−７位修飾塩基型、又は環拡張修飾塩基型の人工核酸などが挙げられる。
【００３３】
プローブを固定化する担体は、その形状や材料は特に制限されない。例えば、マイクロアレイ等の平板状のもの、ビーズ等の粒子状のもの、および糸状のものが挙げられる。本発明においては、プローブとして、好ましくはマイクロアレイ上のプローブを用いる。マイクロアレイとしては、平板上にプローブを二次元にスポットしたものが広く用いられており、通常、特定の遺伝子を代表させるために化学的に合成したオリゴヌクレオチドや、生物試料から抽出し変性により一本鎖としたｃＤＮＡが、基板上にプローブとしてスポット状に固定化されている。マイクロアレイを用い、被検試料より抽出したｍＲＮＡを基にして酵素的に合成したｃＤＮＡを変性処理により一本鎖に分離させたものやｃＤＮＡを鋳型として合成させたａＲＮＡ（それらの断片を含む）であって色素等の標識を結合させたものをプローブに対してハイブリダイズさせて、特異的結合の生じたスポットの種類と結合量から、被検試料中に存在する遺伝子転写産物の分子種や量を測定することができる。そして被検試料に含まれるｍＲＮＡの量をもって、目的遺伝子の発現量とする。
【００３４】
本発明においてターゲットは、当技術分野で通常用いられる意味を有し、検出対象である核酸関連物質をさす。ターゲットは標的と称される場合もある。通常、プローブにハイブリダイズさせる被検試料由来の核酸およびそれを基にして酵素的に合成した核酸、具体的には、ｍＲＮＡ、変性させたｃＤＮＡ、ａＲＮＡ、ならびにそれらの断片をさす。また、標準物質としてのターゲットは、ａＲＮＡ、その断片、及び合成オリゴヌクレオチドを包含する。ターゲットとして、前記核酸関連物質そのものを用いる場合もあるし、標識分子と核酸関連物質とを予め結合させたものを用いる場合もある。
【００３５】
ハイブリダイズまたはハイブリダイゼーションは、当技術分野で通常用いられる意味を有し、相補的な配列を持つ一本鎖のＤＮＡ同士、一本鎖のＲＮＡ同士、または一本鎖のＤＮＡと一本鎖のＲＮＡが適切な条件下で二本鎖を形成することをいう。
【００３６】
本発明の一態様では、目的遺伝子に対応する完全長ａＲＮＡを標準物質として用いる。目的遺伝子に対応する完全長ａＲＮＡとは、ゲノム配列に基づき、または完全長ｃＤＮＡ収集成果（例えば、Suzuki, Y. et al., Nucleic Acids Res. 30:328, 2002）を活用して作製された、遺伝子の全コード領域（タンパク質に翻訳される遺伝子の領域）並びにその上流（５’）、下流（３’）の非コード領域に対応するａＲＮＡをさす。標準物質としては、特定の遺伝子に対応する完全長ａＲＮＡを単独で用いてもよいし、または複数の遺伝子に対応する完全長ａＲＮＡを組み合わせて用いてもよい。そして、標準物質である完全長ａＲＮＡを既知量で含む試料を標準試料と称する。複数の遺伝子に対応する完全長ａＲＮＡをそれぞれ既知量で含む試料をプール標準試料と称する。
【００３７】
該標準試料に含まれる完全長ａＲＮＡを断片化してなる試料を、断片化ａＲＮＡ標準試料と称する。断片化ａＲＮＡ標準試料は、既知量の完全長ａＲＮＡに相当する量で断片化ａＲＮＡを含むことになる。複数の遺伝子に対する断片化ａＲＮＡ標準試料の混合物、または複数の遺伝子に対応する完全長ａＲＮＡをそれぞれ既知量で含むプール標準試料を断片化処理に付すことにより得られる試料を、断片化ａＲＮＡプール標準試料と称する。
【００３８】
一般にプローブは、遺伝子の全長から一部分のみを選んだオリゴヌクレオチドまたは変性させたｃＤＮＡ断片からなるが、完全長ａＲＮＡを断片化した試料は遺伝子の全長を代表するので、いずれのプローブを搭載するマイクロアレイを用いた場合であっても、該マイクロアレイ上の特定のプローブとハイブリダイズする断片を必ず含んでいるのが特徴である。
【００３９】
本発明の他の態様では、標準物質として、目的遺伝子の一部に対応し且つ前記プローブにハイブリダイズする配列を含む合成オリゴヌクレオチドを用いる。この場合、標準物質である合成オリゴヌクレオチドを既知量で含む試料を標準試料と称する。使用する合成オリゴヌクレオチドは、一種類であっても複数種類であってもよい。すなわち、標準試料は、複数の遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドの混合物を含んでいてもよい。このような合成オリゴヌクレオチドの混合物を含む試料をプール標準試料と称する。
【００４０】
標準化とは、特定の条件下で測定された検出値を、異なる条件下で測定された検出値と比較可能にすること、より具体的には、特定の条件下で測定された被検試料に対する検出値を、同一の条件下で測定された標準試料に対する検出値と比較することにより、該被検試料における絶対値を算出することをいう。
【００４１】
標準化とは、標準物質として完全長ａＲＮＡを用いる場合は、例えば、被検試料から調製した特定の遺伝子のｍＲＮＡに由来するａＲＮＡを含むａＲＮＡ被検試料における検出値を、同一遺伝子の完全長ａＲＮＡを既知量で含む標準試料における検出値と比較することにより、被検試料から調製したａＲＮＡ被検試料に含まれるａＲＮＡの絶対量（例えば、ｍｏｌ濃度や分子数）を算出することをいう。さらには、被検試料から調製したａＲＮＡ被検試料に含まれるａＲＮＡの絶対量から、その由来するｃＤＮＡの量、ひいてはそれが由来するｍＲＮＡの量を、異なる条件下で測定された場合と比較可能にすること、好ましくは上記ｍＲＮＡ量を絶対量で求めることを包含する。
【００４２】
標準化とは、標準物質として合成オリゴヌクレオチドを用いる場合は、例えば、被検試料から調製した特定の遺伝子のｍＲＮＡに由来するａＲＮＡを含むａＲＮＡ被検試料における検出値を、同一遺伝子の一部に対応する合成オリゴヌクレオチドを既知量で含む標準試料における検出値と比較することにより、被検試料から調製したａＲＮＡ被検試料に含まれるａＲＮＡの絶対量（例えば、ｍｏｌ濃度や分子数）を算出することをいう。さらには、被検試料から調製したａＲＮＡ被検試料に含まれるａＲＮＡの絶対量から、その由来するｃＤＮＡの量、ひいてはそれが由来するｍＲＮＡの量を、異なる条件下で測定された場合と比較可能にすること、好ましくは上記ｍＲＮＡ量を絶対量で求めることを包含する。
【００４３】
特定の条件とは、例えば、用いるプローブの種類、プローブの設計、マイクロアレイの種類、固定化されているプローブの量、プローブとターゲットとのハイブリダイゼーション効率、検出・測定方法、標識方法、およびその他温度やｐＨなどの測定条件をさし、異なる条件とは、上記のような条件の１つ以上が異なることをいう。
【００４４】
検出値とは、プローブとターゲットとのハイブリダイゼーションを示すシグナルの強度についての検出値をいい、得られるシグナルおよびその強度は、ハイブリダイゼーションの検出方法、標識方法や標識の種類によって異なる。
【００４５】
標識方法や標識の種類は、プローブとターゲットとのハイブリダイゼーションを検出できるものであれば、特に制限されない。例えば、ａＲＮＡを合成する際にビオチンやアミノアリル基などの標識を共有結合させた基質（主にＵＴＰ）を取り込ませ、その反応産物の標識部位に後から色素を結合させ、その色素によって、プローブとターゲットとのハイブリダイゼーションを検出することができる。本発明においてこのような標識方法をユニフォーム標識と称する。また、ａＲＮＡを断片化した後に各断片の末端に限定して有機化学的方法によりあるいは酵素的方法により同様の標識を付け、その後に色素等を結合させてもよい。このような標識方式を末端標識法と称する（Cole, K. et al., Nucleic Acids Res. 32, e86, 2004, Liang, R-Q., et al., Nucleic Acids Res. 33, e17, 2005）。標準物質としての合成オリゴヌクレオチドに関しては、その合成の際に、標識をとりこませることができる。標識に色素結合を行う際には、これをハイブリダイゼーション前に行ってもよいし、ハイブリダイゼーション後に行ってもよい。標識として、色素の他に、当技術分野で通常用いられるもの、例えば、放射性同位体、蛍光団、染料、化学ルミネッサー、ルミネッサーおよび感光剤等を使用することもできる。さらに、酵素、酵素断片、酵素阻害剤、抗体、触媒等を結合させてもよい。これらの標識を用い、ラジオイムノアッセイ法、酵素イムノアッセイ法に準じて検出・定量を行うことができる。
【００４６】
被検試料は、通常、目的遺伝子が発現している可能性のある試料をさし、好ましくは生きている物またはかつては生きていた物に由来する生物学的試料である。例えば、血液、血清、尿、涙、細胞、器官、組織、骨、骨髄、リンパ、リンパ節、滑液組織、軟骨細胞、滑液マクロファージ、内皮細胞、皮膚、これらの抽出物および破砕物、ならびに培養細胞、胚細胞、幹細胞、動物細胞抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物および真核単細胞抽出物等が挙げられる。被検試料には、上記の生物学的試料に由来する試料、例えば、特定の核酸が増幅された試料等も包含される。
【００４７】
本発明の一実施形態は、以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む方法である：
完全長ａＲＮＡを含む標準試料であって、当該完全長ａＲＮＡの含有量が既知である標準試料と、被検試料から調製したａＲＮＡを含有するａＲＮＡ被検試料とを、各々、同一の方法で処理してａＲＮＡを断片化する工程（ａ）、
双方の試料各々について、工程（ａ）で得られた断片を前記プローブとハイブリダイズさせる工程（ｂ）、
双方の試料各々について、前記断片と前記プローブとのハイブリダイゼーションに基づくシグナル強度を測定する工程（ｃ）、及び、
双方の試料各々について得られたシグナル強度を比較することにより、ａＲＮＡ被検試料中のａＲＮＡの絶対量を算出する工程（ｄ）。
【００４８】
この実施形態は、換言すれば、以下のようにいうことも出来る。
完全長ａＲＮＡを既知量で含む標準試料と被検試料から調製したａＲＮＡ被検試料とを、それぞれ同一の方法で処理することによりａＲＮＡを断片化する工程、
それぞれの試料に含まれる断片化ａＲＮＡをプローブとハイブリダイズさせる工程、および
双方の試料について得られるハイブリダイゼーションに基づくシグナル強度を検出して比較することにより、被検試料に含まれるａＲＮＡの絶対量を算出する工程
を含む方法。
【００４９】
本発明の別の実施形態は、以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）を含む方法である：
目的遺伝子の一部に対応し且つ前記プローブにハイブリダイズする配列を含む合成オリゴヌクレオチドを含む標準試料であって、該合成オリゴヌクレオチドの含有量が既知である標準試料を用意する工程（Ａ−ｉ）、被検試料から調製したａＲＮＡを含有するａＲＮＡ被検試料を処理してａＲＮＡを断片化する工程（Ａ−ｉｉ）、
工程（Ａ−ｉ）で用意された標準試料中のオリゴヌクレオチドと、工程（Ａ−ｉｉ）で得られた断片を、各々、前記プローブとハイブリダイズさせる工程（Ｂ）、
前記オリゴヌクレオチドと前記プローブとのハイブリダイゼーションに基づくシグナル強度（ｉ）と、前記断片と前記プローブとのハイブリダイゼーションに基づくシグナル強度（ｉｉ）とを測定する工程（Ｃ）、及び、
シグナル強度（ｉ）とシグナル強度（ｉｉ）とを比較することにより、ａＲＮＡ被検試料中のａＲＮＡの絶対量を算出する工程（Ｄ）。
【００５０】
ａＲＮＡ被検試料は、上記のような被検試料からｍＲＮＡを抽出し、続いてｃＤＮＡの合成およびａＲＮＡの合成を実施することにより調製する。調製方法は特に制限されず、常法により実施できる。
【００５１】
完全長ａＲＮＡまたはそれに近いａＲＮＡ被検試料中のａＲＮＡで分子量が大きいものはプローブにハイブリダイズさせる際に各種の問題を起こすが、ａＲＮＡを断片化することにより、プローブに効率的にハイブリダイズさせることができ、検出感度を高めることができる。完全長ａＲＮＡまたはそれに近いａＲＮＡ被検試料中のａＲＮＡの断片化は、当技術分野で通常用いられる方法で実施でき、例えば、酵素的に切断する方法、または化学的に切断する方法、例えば、Ｍｇ２＋などの金属イオン存在下に切断する方法などを使用できる。
【００５２】
標準試料として完全長ａＲＮＡ標準試料を用いる場合、完全長ａＲＮＡ標準試料とａＲＮＡ被検試料とは同一の断片化方法により処理する。標準試料として合成オリゴヌクレオチドを含む標準試料を用いる場合は、標準試料の断片化処理は行わない。従って、完全長ａＲＮＡ標準試料を用いる場合よりも工程が少なく簡便に実施できる。
【００５３】
ハイブリダイゼーションに基づくシグナルとは、プローブとターゲットとがハイブリダイズしたことを示すシグナルをさし、通常、ターゲットに付した標識に結合した色素あるいは抗体、酵素等を利用した反応生成物に由来するシグナルをさす。当該シグナルは、用いた標識に応じた方法により検出することができ、シグナル強度が大きいほど被検試料に含まれるターゲットの量が多いことを示す。
【００５４】
以下、本発明の方法の実施態様の一例について説明する。まず、標準物質として完全長ａＲＮＡを使用する実施態様の一例について説明する。
【００５５】
標準物質の作製と検量線の作成
（１）完全長ｃＤＮＡとそれを用いたａＲＮＡの合成および精製
遺伝子のコード領域全体並びにその上流（５’）と下流（３’）の非コード領域を転写したｍＲＮＡをコピーした完全長ｃＤＮＡクローンはヒトゲノム解析とともに大量に取得され、その塩基配列が決定され、ゲノムの配列情報と比較されている。
ｃＤＮＡクローンがすでに入手され、その５’端にＳＰ６などＲＮＡポリメラーゼが作用するプロモーター配列が付されている場合（プロモーター付完全長ｃＤＮＡ）には、これを用いて試験管内でＲＮＡポリメラーゼを作用させ、プロモーター部位から完全長ａＲＮＡを合成させる。
【００５６】
プロモーターのない完全長ｃＤＮＡクローンからは、その両端の配列を利用してＰＣＲを行い、その際にプロモーター配列のついたプライマーを使用することにより、プロモーター付完全長ｃＤＮＡを入手することができる。酵母菌や細菌などの遺伝子の場合にはｃＤＮＡクローンが無くても、イントロンが無い場合が多いので、既知ゲノム配列をもとに、各遺伝子のコード領域に対応するＤＮＡをＰＣＲ法により合成し、その一端にＳＰ６のプロモーターが付くようにプライマーを設計して上記と同様にｃＤＮＡクローンを入手することができる。これらプロモーター付完全長ｃＤＮＡをテンプレートに用いてＲＮＡポリメラーゼにより完全長ａＲＮＡを合成する。
【００５７】
（２）合成した完全長ａＲＮＡの濃度測定
合成終了後、完全長ａＲＮＡをカラムなどで精製し、その純度を検査する。次いで分光器により試料の紫外部吸光曲線を描き、２６０ｎｍ吸光度に基づき完全長ａＲＮＡの濃度を測定する。
【００５８】
（３）ユニフォーム標識完全長ａＲＮＡの合成
完全長ａＲＮＡ合成の際に、例えば、アミノアリルオリゴ化ＵＴＰまたはビオチン化ＵＴＰ（以下、ＵＴＰ誘導体と称する）をＵＴＰとともに取り込ませて完全長ａＲＮＡ配列中に存在するＵ（ウリジン）の一部に標識を入れることができる。生成物の濃度を測定後、ユニフォーム標識完全長ａＲＮＡとする（図１）。
【００５９】
（４）合成した標識完全長ａＲＮＡの断片化
上記（３）で合成したユニフォーム標識完全長ａＲＮＡをＲＮａｓｅＩＩＩなどにより酵素的に切断するか、またはＭｇ２＋などの金属イオン存在下に切断することにより断片化する。切断後、必要に応じて電気泳動などで切断を確認する。この断片を濃度既知のユニフォーム標識断片化ａＲＮＡ標準試料とする。ユニフォーム標識断片化ａＲＮＡはこの状態で、またはプローブ核酸とハイブリダイズさせた後に、色素と結合させる。
【００６０】
（５）末端標識完全長ａＲＮＡの合成
上記（２）においてＵＴＰ誘導体の代わりに非誘導体のＵＴＰを用いれば標識のない完全長ａＲＮＡを合成できる。完全長ａＲＮＡの純度を検定、定量して非標識完全長ａＲＮＡとする。これを（４）と同様に切断して断片化した後、Ｓｈｒｉｍｐ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＳＡＰ）を用いて脱リン酸化する。カラム精製などで精製し、ビオチン化ドナーをＴ４  ＲＮＡリガーゼ存在下に反応させて（Cole, K. et al., Nucleic Acids Res., 32, e86, 2004）、末端をビオチンなどで標識する。あるいはLiang, R-Qら（Nucleic Acids. Res.前掲）に従って他の標識を入れることもできる。得られたものを末端標識断片化ａＲＮＡ標準試料とする（図２）。
【００６１】
（６）色素標識
（４）または（５）により得られた標識断片化ａＲＮＡを色素と結合させる。結合はハイブリダイゼーションを行う前に、またはハイブリダイゼーションを行った後に行う。
【００６２】
（７）切断および標識した断片化ａＲＮＡ標準試料の濃度調整
（４）または（５）で得られた断片化ａＲＮＡ標準試料の濃度を調整し、複数の濃度に段階希釈したセットを作る（検量線が引けるようにする）。また、複数種の完全長ａＲＮＡに由来する断片化ａＲＮＡを含む標準試料を用いる場合には、それぞれの濃度が既知の完全長ａＲＮＡ混合試料を断片化するか、それぞれの濃度が既知の完全長ａＲＮＡ標準試料を断片化した後一定の量ずつ混合することにより、断片化ａＲＮＡプール標準試料を調製し、段階希釈したセットを作る(図３)。
【００６３】
（８）検量線の作成
段階希釈した断片化ａＲＮＡ標準試料または断片化ａＲＮＡプール標準試料の各希釈液をマイクロアレイ上のプローブとハイブリダイズさせ、断片化前の標準試料における完全長ａＲＮＡ濃度に対して、色素標識由来のシグナル強度をプロットすることにより、検量線を描く（例えば、図４）。
【００６４】
被検試料の測定
被検試料から、当技術分野で通常用いられる方法によりｍＲＮＡを抽出する。それ以降の操作（ｃＤＮＡ合成、ａＲＮＡ合成、その断片化、標識、ハイブリダイズ、シグナル強度の検出）は、被検試料と標準試料とが同一プロトコールに従って処理されるようにする。
【００６５】
（１）ハイブリダイゼーション・洗浄・乾燥
利用するマイクロアレイに適した容量の断片化ａＲＮＡ標準試料または断片化ａＲＮＡプール標準試料の適切な希釈系列のメンバーそれぞれを、プロトコールに従って対象とする一群のマイクロアレイと個々にハイブリダイズさせ、その後、洗浄・乾燥を行う。希釈系列ごとに最低１個のマイクロアレイを用いる。ＵＴＰ誘導体と色素との結合はハイブリダイゼーション前に行ってもよいし、ハイブリダイゼーション後に行ってもよい。完全長ａＲＮＡの合成、断片化、標識方法、色素結合方法等は、被検試料の処理法と合致させる。
【００６６】
（２）ハイブリダイゼーションに基づくシグナル強度の測定
マイクロアレイの場合にはスキャナを用い、ビーズの場合には専用の計測装置を用い、解析ソフトウェアにより該当するプローブと結合した断片化ａＲＮＡに由来するシグナルの強度を検出する。使用する装置および使用条件は標準試料の場合と被検試料の場合で一致させる。
【００６７】
（３）補正係数（ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）の算出
各濃度の完全長ａＲＮＡ標準試料から得られた断片化ａＲＮＡ標準試料について、標準試料における完全長ａＲＮＡの各々の濃度に対して上記シグナル強度をプロットし、各プローブにつき補正係数を求める。補正係数は対象とする遺伝子ごとに異なり、また、使用するマイクロアレイや手法等により異なる。
【００６８】
【数１】
2007097574.tif 000002
【００６９】
また、マイクロアレイ等の使用条件により検量線が直線とならない場合には、検量線そのものを用いて被検試料中のａＲＮＡの絶対量を求めてもよい。
【００７０】
（４）被検試料におけるｍＲＮＡの測定
被検試料から、当技術分野で通常用いられる方法によりｍＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡ被検試料とする。それ以降の操作、すなわち、ｃＤＮＡの合成、ａＲＮＡの合成、その断片化、標識、ハイブリダイゼーション、洗浄、乾燥、およびシグナル強度の検出は、標準試料に対する上記プロトコールと同一のプロトコールに従って実施する。ｍＲＮＡ被検試料から出発して検出値を得るまでのプロトコールと、標準試料を使用して行うプロトコールは、使用機器を含めて完全に同一である。
【００７１】
（５）被検試料中のｍＲＮＡ量の算出
（３）で求めた補正係数を利用し、目的遺伝子に対応するａＲＮＡ断片または一群のａＲＮＡ断片とプローブとのハイブリダイゼーションに基づくシグナル強度の検出値から、被検試料中のａＲＮＡ濃度の絶対値、ひいてはｍＲＮＡ量を算出し、目的遺伝子の発現量を測定することができる。
【００７２】
被検試料中のｍＲＮＡの絶対量（ｍｏｌ）
＝補正係数（ｃ）×（シグナル強度−バックグラウンド値）
【００７３】
以上の操作を各プローブについて実施する。また、マイクロアレイ等の使用条件により検量線が直線とならない場合には、検量線そのものを用いて被検試料中のａＲＮＡ絶対量を求める。
【００７４】
（６）標準物質を用いるマイクロアレイデータの比較
上記操作を異なるマイクロアレイについて実行した場合、いずれの測定条件においても、被検試料に含まれる目的遺伝子に由来するｍＲＮＡの量を標準化できるので、異なる条件、例えば、異なる実験や異なる機器を用いて得たデータを比較することが可能となる。
【００７５】
本発明により、マイクロアレイ等のデータの標準化が可能になり、従来よりも簡便に遺伝子の発現に関する定量的データが得られる。その結果、異なるマイクロアレイを用いた場合や、異なる実験技法を用いた場合でも、データの比較検討が可能になるので、研究の効率的な推進が見込まれる。
【００７６】
ゲノム研究の進展によりほぼ全ての遺伝子配列を特定でき、さらに完全長ｃＤＮＡ収集の進捗（Suzuki, Y. et al., Nucleic Acids res. 30:328, 2002）により、今日では、任意の遺伝子に対する上記標準物質を作製することができる。これら標準物質を混合し、プールとして使用すれば、原理的にはマイクロアレイ等に搭載された全プローブに対してハイブリダイズする成分の検出値を標準化し、これを補正してその絶対量を求めることが可能である。
【００７７】
次に、標準物質として合成オリゴヌクレオチドを使用する実施態様の一例について説明する。
【００７８】
（１）オリゴヌクレオチドの合成
プローブの塩基配列（既知）に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを合成する。合成オリゴヌクレオチドは、プローブの塩基配列（既知）に相補的な配列すべてを含んでいてもよいし、プローブにハイブリダイズする限り、前記相補的な配列の一部のみを含むものであってもよい。合成オリゴヌクレオチドの長さは、通常は７０ｍｅｒ以下、好ましくは２５乃至５０ｍｅｒである。合成は、アミダイド試薬を用いた公知の方法で行えばよい。
【００７９】
オリゴヌクレオチドには、合成の際に標識（例えばアイソトープ標識）を組み込むか、又は、合成が終了した後に、リンカーを介してＣｙ５などの色素を直接共有結合させるか、又は末端にリンカーを介して標識となる物質（例えばビオチン）を結合させる（N.D. Sinha, S. Striepeke: in Oligonucleotides and Analogues [F. Eckstein ed., Oxford University Press (1991) p.p. 185-210]）。
【００８０】
（２）標準試料の調製
オリゴヌクレオチドの濃度が異なる一連の標準試料を調製する。複数種のオリゴヌクレオチドを含むプール標準試料を用いる場合には、オリゴヌクレオチド種ごとに濃度が既知の溶液を一定の比率で混合した後、段階希釈を行う。
【００８１】
（３）検量線の作成
濃度が異なる標準試料のそれぞれを用いて、オリゴヌクレオチドをマイクロアレイ上のプローブとハイブリダイズさせ、シグナルを検出し、そのシグナル強度をオリゴヌクレオチド濃度に対してプロットして検量線を作成する。
【００８２】
以下の工程、即ち、被検試料からａＲＮＡを調製してそのａＲＮＡを含有するａＲＮＡ被検試料を得る工程、ａＲＮＡを断片化する工程（Ａ−ｉｉ）、標準試料中のオリゴヌクレオチドと、工程（Ａ−ｉｉ）で得られた断片を、各々、プローブとハイブリダイズさせる工程（Ｂ）、標準物質であるオリゴヌクレオチドとプローブとのハイブリダイゼーションに基づくシグナル強度（ｉ）と、被検試料に由来する断片とプローブとのハイブリダイゼーションに基づくシグナル強度（ｉｉ）とを測定する工程（Ｃ）、及び、シグナル強度（ｉ）とシグナル強度（ｉｉ）とを比較することにより、ａＲＮＡ被検試料中のａＲＮＡの絶対量を算出する工程（Ｄ）は、基本的に、標準物質として完全長ａＲＮＡを用いる実施態様と同様である。
【００８３】
本発明の目的遺伝子のｍＲＮＡの定量方法は、前記プローブが本来測定対象としている遺伝子以外の遺伝子を目的遺伝子とするクロスハイブリダイゼーションの測定にも適用できる。
【００８４】
換言すれば、本発明はまた、プローブと、該プローブが対象とする遺伝子以外の被検遺伝子に由来する核酸とのクロスハイブリダイゼーションを検出する方法であって、オリゴヌクレオチド、例えば該被検遺伝子に対応する完全長ａＲＮＡの断片や、該被検遺伝子の配列の一部に対応する合成オリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする方法に関する。
【００８５】
クロスハイブリダイゼーションとは、作製したターゲットをプローブにハイブリダイズさせた際に、該プローブが対象とする遺伝子以外の遺伝子に由来する核酸がプローブと非特異的な二本鎖を形成してしまう現象をいう。ターゲットとプローブの配列の一部に相補的な配列がある場合に起こりやすく、通常、ハイブリダイズや洗浄の条件を厳しくすることでこれを避けるようにしている。
【００８６】
通常のマイクロアレイは、目的遺伝子の配列の中から特定の部位を選び、一定の長さ（例えば、２５ｍｅｒや５０ｍｅｒ）で設計されたオリゴヌクレオチドプローブを搭載している。しかし、このプローブが異なる遺伝子の発現で生じたｍＲＮＡ由来の変性ｃＤＮＡやａＲＮＡ等またはその一部とクロスハイブリダイズする可能性が、常に排除されているわけではない。特に変性ｃＤＮＡをプローブに用いた場合には、この問題は深刻である。標準物質は、この問題の検定にも用いることができる。例えば、使用するマイクロアレイ等に対して、被検遺伝子に対応する完全長ａＲＮＡを断片化してなる断片化ａＲＮＡを反応させた場合、対応するプローブ以外に該断片化ａＲＮＡとハイブリダイズするプローブがあるときには、これを検出することができる。この方法は、クロスハイブリダイゼーションをモニターするだけでなく、その遺伝子の発現によるｍＲＮＡのみを検出し、他の遺伝子の発現によるｍＲＮＡを検出しない最適なプローブの設計にも応用できる。また、この方法により、異なる実験者間で食い違うデータが出た時、プローブの差異による影響の有無を判断することができる。
【００８７】
さらに、本発明は、核酸関連物質であるプローブが固定されたマイクロアレイのロット間で、又は、商品間で、それらのマイクロアレイを用いて測定された測定値を比較する方法であって、前記プローブに、検出対象であり且つ核酸関連物質であるターゲットをハイブリダイズさせ、当該ハイブリダイゼーション反応に基づくシグナル強度を測定する工程を含み、ここにおいて、測定の目的である遺伝子の一部に対応し且つ前記プローブにハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドを前記ターゲットとして既知量含有する試料を用いて前記シグナル強度の測定を行い、マイクロアレイのロット間で、又は、商品間で、測定値を比較することを特徴とする、前記方法にも関する。
【００８８】
前記オリゴヌクレオチドが、前記目的遺伝子に対応する完全長ａＲＮＡの断片であり、当該完全長ａＲＮＡの量が既知である場合には、この方法は、目的遺伝子を同じくするすべての商品間での感度の相違等の検証に使用することが出来る。
【００８９】
前記オリゴヌクレオチドが合成オリゴヌクレオチドである場合には、同じ商品のロット間の差異の検定や、固定されているプローブが同様又はほぼ同様である商品間における感度の相違等の検証に使用することが出来る。
【００９０】
この方法の実施のための具体的手法は、先に記載した標準物質についてのシグナル強度の測定方法と同様である。
【００９１】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明の範囲は実施例の範囲に限定されない。
【実施例１】
【００９２】
完全長ｃＤＮＡライブラリから８種類のクローンを選び、これらにつきユニフォーム標識完全長ａＲＮＡを調製し、断片化処理することにより、断片化ａＲＮＡの希釈系列を作り、検量線を作成した（図３〜５）。
【００９３】
１．ｃＤＮＡテンプレートの調製
完全長ｃＤＮＡを持つプラスミドクローンを常法により調製した（Suzuki, Y. et al., Nucleic Acids res. 30:328, 2002）。検量線作成のために８種類、マイクロアレイ間の誤差補正のために１種類、計９種類の完全長ｃＤＮＡを入手した。このために、ｐＳＰＯＲＴ１プラスミドにクローニングされたそれぞれのｃＤＮＡを、共通のプライマーを用いてＰＣＲ増幅に供した（このプラスミドには、アンチセンス鎖を増幅する方向にＳＰ６プロモータ配列が入っている）。ＰＣＲテンプレート（この場合は上記のプラスミド）の量が反応液中で１μｇ未満となるように希釈し、ＤＮＡポリメラーゼＴａｋａｒａ  ＥｘＴａｑ（ＴａＫａＲａ  ＣｏｄｅＰＲ００１Ａ）を用い、トータル反応液量１００μｌの条件下でＰＣＲ反応を実施した。予めＰＣＲテンプレートを除くＰＣＲ反応液を調製しておき、そこに１μｌのＰＣＲテンプレート溶液を加えることで反応を開始した。ＰＣＲは、９６℃で５分間加熱後、９６℃１５秒、５３℃１５秒、７２℃２分を３５サイクル繰り返し、最後に７２℃２分のインキュベートの後、４℃に放置し、反応を完成させた。
【００９４】
２．ＰＣＲ産物の精製
ＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用い、プロトコールに従って精製した。精製には遠心法を用い、５０μｌの蒸留水で溶出した。この生成物を、次のＲＮＡポリメラーゼによる完全長ａＲＮＡ合成用の完全長ｃＤＮＡテンプレートとして使用した。
【００９５】
３．ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼによる完全長ａＲＮＡ（標準物質）の合成
精製した完全長ｃＤＮＡをテンプレートとし、タカラバイオ株式会社のＳＰ６  ＲＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ  Ｃｏｄｅ２５２０Ａ）を用いて完全長ａＲＮＡの合成を行った。テンプレートＤＮＡは１００〜３００ｎｇ、ＳＰ６  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは５０Ｕとし、トータル反応液量２０μｌで３７℃で２時間インキュベートした後、ＤＮａｓｅ  Ｉを添加しさらに３０分間インキュベートした。本実施例では、ユニフォーム標識完全長ａＲＮＡを得る目的で、ＲＮＡポリメラーゼによる合成反応中にアミノアリルＵＴＰを加えた。反応生成物をカラム（Ａｍｂｉｏｎ社ａＲＮＡ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）で精製した。この完全長ａＲＮＡを含む溶液をＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＤＵ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ  ＤＵ８０に供し、紫外部の吸収曲線を得、２３０ｎｍ、２６０ｎｍ、２９０ｎｍにおける吸光度の比より核酸の純度を検定し、その２６０ｎｍの吸光度から完全長ａＲＮＡの濃度を決定した。また、必要に応じて電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ社２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）により低分子量核酸合成基質の混入が無いことを確認した。
【００９６】
４．標準物質（完全長ａＲＮＡ）の断片化
得られたユニフォーム標識完全長ａＲＮＡを、Ｍｇ２＋分解緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ，ｐＨ８．２，１００ｍＭ  ＫＯＡｃ，３０ｍＭ  ＭｇＯＡｃ）により切断した後、Ｓｈｒｉｍｐ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＳＡＰ；ＵＳＢ  Ｃｏｒｐ）を用いて脱リン酸化した（Cole, K. et al., Nucleic Acids res. 32,e86 (2004)）。
【００９７】
５．ユニフォーム標識断片化ａＲＮＡまたはユニフォーム標識断片化ａＲＮＡプールの作製と希釈
以降、ユニフォーム標識断片化ａＲＮＡプールについて行った結果を記載する。８種類の完全長ａＲＮＡ標準試料から得られた８種類の断片化ａＲＮＡ標準試料をそれぞれ完全長ａＲＮＡを基準に１０ｆｍｏｌとなるよう混合し、ユニフォーム標識断片化ａＲＮＡプール標準試料とした。このプール標準試料を段階希釈して、１ｆｍｏｌ、１００ａｍｏｌ、５０ａｍｏｌ、１０ａｍｏｌの希釈系列を調製した。
【００９８】
６．ハイブリダイゼーションおよび洗浄
上記５段階希釈のプール標準試料それぞれを、ＡｃｅＧｅｎｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｏｌｉｇｏ  Ｃｈｉｐ  ３０Ｋ  ｏｎｅ  ｃｈｉｐ  ｖｅｒｓｉｏｎ（日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社／ＤＮＡチップ研究所）に供し、プロトコールにそってハイブリダイゼーションおよび洗浄を行った。色素に基づくシグナル強度をＳｃａｎＡｒｒａｙ  ４０００で読み込み、ＤＮＡＳＩＳ  Ａｒｒａｙ（日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社）で数値化した。
【００９９】
７．検量線の作成
各遺伝子に対応する各濃度の標準試料について、完全長ａＲＮＡの濃度に対して、シグナル強度をプロットしてグラフ化することにより、検量線を作成した（図４）。
【０１００】
８．ハイブリダイゼーションに基づくシグナル強度の標準化
被検試料からｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡの合成、ａＲＮＡの合成、続いて、断片化、ハイブリダイゼーションおよびシグナル強度の検出等を上記標準物質に対するプロトコールと同様のプロトコールで実施した。そして、各遺伝子について、断片化ａＲＮＡがプローブにハイブリダイズしたことに基づくシグナル強度を検出し、上記で得られた検量線から、被検試料から調製したａＲＮＡの濃度の絶対値を求めた（図５および６）。
【０１０１】
被検試料としては、Ａｍｂｉｏｎ社より下記の物質を購入して使用した。試料名Ｌｉｖｅｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＨｅｐＧ２：ヒト肝がん由来培養細胞Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）カタログ番号７８４８。得られた測定値については、Ｑｉａｇｅｎ社のＱＲＴ−ＰＣＲキットを用いＳｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ法で正しいことを確かめた。
【実施例２】
【０１０２】
３種類の合成オリゴヌクレオチドを含むプール標準試料について、濃度の希釈系列を作り、検量線を作成した。
（１）オリゴヌクレオチドの合成
グリセルアルデヒド−３−ホスフェート  デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）、パラオキソナーゼ  ２（ＰＯＮ２）、及びシグナル  シークエンス  レセプター  デルタ（ＳＳＲ４）の遺伝子各々について、それらの一部の配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成した。
【０１０３】
それらの配列は、次のとおりである。
ＧＡＰＤオリゴヌクレオチド（ＡＳ−ＧＡＰＤＨ）：ＣＡＣＣＡＣＣＴＧＧＡＧＴＡＣＣＧＧＧＴＧＴＡＣＣＧＧＡＧＧ（配列番号１）
ＰＯＮ２オリゴヌクレオチド（ＡＳ−ＰＯＮ２）：ＧＴＡＡＡＧＡＴＡＣＧＧＴＧＴＴＴＡＣＴＧＧＴＧＡＴＧＡＡＧ（配列番号２）
ＳＳＲ４オリゴヌクレオチド（ＡＳ−ＳＳＲ４）：ＴＡＧＣＣＧＧＡＡＣＡＣＴＡＧＡＴＧＡＴＧＡＡＣＣＧＧＡＡＧ（配列番号３）
具体的には、シグマジェノシス社開発のＡｂａｃｕｓ（自動合成機）を用い、そのプロトコールに従って、オリゴヌクレオチドを合成し、精製した。
【０１０４】
合成後のオリゴヌクレオチドに、N.D. Sinha, S. Striepeke: in Oligonucleotides and Analogues [F. Eckstein ed., Oxford University Press (1991) p.p. 185-210]に記載の方法に従い、Ｃｙ３を結合させた。
【０１０５】
（２）希釈系列の作製
上記３種のオリゴヌクレオチドを、各々５００ｐＭ濃度で含有する混合物（塩化ナトリウム−クエン酸ナトリウム緩衝液）を調製した。それを希釈し、３種のオリゴヌクレオチドを、各々５０ｐＭ濃度、５ｐＭ濃度、０．５ｐＭで含有する混合物を調製した。調製したオリゴヌクレオチド混合物のそれぞれに、チップ間標準化対照として、ラクテート  デヒドロゲナーゼ  Ｂ（ＬＤＨＢ）の遺伝子の一部に対応するオリゴヌクレオチドを、５０ｐＭ濃度となるように添加した。なお、ＬＤＨＢオリゴヌクレオチドの配列は、以下のとおりである。
ＬＤＨＢオリゴヌクレオチド（ＡＳ−ＬＤＨＢ）：ＣＴＴＣＧＡＴＴＴＣＣＴＡＣＴＡＣＴＣＣＡＡＣＧＡＧＴＣＧＡ（配列番号４）
【０１０６】
（３）測定
（２）で作製した混合物の各々をＡｃｅＧｅｎｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｏｌｉｇｏ  Ｃｈｉｐ  ３０Ｋ  ｏｎｅ  ｃｈｉｐ  ｖｅｒｓｉｏｎ（日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社／株式会社ＤＮＡチップ研究所）に供し、そのプロトコールに従って、ハイブリダイゼーション及び洗浄を行った。次いで、プローブと結合して洗浄後も基板上に残っているＣｙ３の量を測定した。
以上の操作の概要は、図７に示した。
【０１０７】
（４）検量線の作成
各オリゴヌクレオチドについて、濃度に対してシグナル強度をプロットすることにより、検量線を作成した。結果を図８に示す。
【０１０８】
以上のように、マイクロアレイに固定されているプローブの塩基配列が既知である場合には、その配列に相補的な配列を有する合成オリゴヌクレオチドを標準物質として用いて検量線を作成することが出来、その検量線に基づき、被検試料中の目的遺伝子のｍＲＮＡを定量することが出来る。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
現在実用に供されているマイクロアレイの総数は１００万枚／年に近いと想定されている。これらのマイクロアレイを用いて得られたデータの過半数は、その使用条件を確認した上で、標識物質として完全長ａＲＮＡを用いたモニタリングによって、絶対値に補正することができる。その補正された値（絶対値）は、相互比較に供することができる。
【０１１０】
また、近年においては、マイクロアレイ上のプローブの塩基配列が公開されている場合も多い。そのようにプローブの塩基配列が既知の場合には、当該塩基配列に相補的な配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いれば、簡便に測定値を絶対値に補正することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】ユニフォーム標識完全長ａＲＮＡおよび断片化ａＲＮＡの合成方法を示す。
【図２】完全長ａＲＮＡおよび末端標識断片化ａＲＮＡの合成方法を示す。
【図３】標準物質を用いて検量線を作成する手順を示す。
【図４】各遺伝子について、実施例１で作製した標準物質を用いた検量線を示す。
【図５】図４の検量線を用いた、ハイブリダイゼーションに基づくシグナル強度の標準化方法を示す。
【図６】検量線に基づいて求めた、ａＲＮＡ被検試料におけるａＲＮＡ濃度の絶対値を示す。
【図７】標準物質として合成オリゴヌクレオチドを使用する場合の測定方法の概略を示す。
【図８】各合成オリゴヌクレオチドを標準物質として用いた場合の検量線を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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