(57)【要約】【課題】  ＳＴ合剤およびそれを含む薬剤投与の副作用の危険性を判定する方法の提供。【解決手段】  最尤法を用いＮＡＴ２遺伝子の個人のディプロタイプ形の確率を計算する事によりＳＴ合剤およびそれを含む薬剤投与の副作用の危険性を判定する方法を提供できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、個人についてのＳＴ合剤の副作用の危険性を判定する方法。
（ａ）Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）遺伝子における個人のディプロタイプ形を決定する工程
（ｂ）工程（ａ）によって決定したディプロタイプ形において、Ｍ／Ｍのディプロタイプ形の個人に対して、ＳＴ合剤の副作用の危険性があるものと判定する工程
【請求項２】
ディプロタイプ形の決定が以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む方法によって行われる請求項１に記載の方法。
（ａ）集団における各個人のＮ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）遺伝子についての遺伝子型情報から、該集団におけるハプロタイプ頻度を算出する工程
（ｂ）工程（ａ）により算出されるハプロタイプ頻度、および各個人の遺伝子型情報から、各個人のディプロタイプ形を決定する工程
【請求項３】
ハプロタイプ頻度の算出が、ＥＭアルゴリズムにより行われる請求項２に記載の方法。
【請求項４】
遺伝子型情報が一塩基多型（ＳＮＰ）からなる群より選択される多型である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
ＳＴ合剤がＮ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）により主に代謝される場合についての請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の方法によりＳＴ合剤の副作用の危険があると判定された個人に、スルファメトキサゾール（ｓｕｌｆａｍｅｔｈｏｘａｚｏｌｅ）の量を減量して投与する手法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニューモシスティス肺炎などの予防薬および治療薬として有効なＳＴ合剤（ｓｕｌｆａｍｅｔｈｏｘａｚｏｌｅ-ｔｒｉｍｅｔｈｏｐｒｉｍ合剤）、およびそれを含む薬剤投与の副作用の危険性を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＳＴ合剤（ｓｕｌｆａｍｅｔｈｏｘａｚｏｌｅ−ｔｒｉｍｅｔｈｏｐｒｉｍ合剤、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、商品名バクタ、バクトラミン等、以下ＳＴ合剤とする）は、ニューモシスティス肺炎（ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）の有効な予防薬および治療薬である（非特許文献１−９）。さらにＳＴ合剤のニューモシスティス肺炎以外の細菌感染症の治療薬としての有効性も示されている（非特許文献１０）。ニューモシスティス肺炎は、例えば後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の患者、臓器移植を行われた患者、副腎皮質ステロイド薬などの免疫抑制効果を持つ薬物を投与された膠原病、あるいは自己免疫疾患などの患者、悪性腫瘍の患者、抗腫瘍薬を投与された患者等の免疫力の低下した個体がしばしば罹患する疾患であり、場合によっては致命的である。これらの、免疫力の低下した個体には日和見感染が起きやすいが、中でもニューモシスティス肺炎はもっとも罹患しやすい感染症の一つで、しかも致命度が高い。ニューモシスティス肺炎と診断されたり、あるいはその疑いが強いとされた患者には第一選択としてＳＴ合剤が投与されたりすることが多い。また、例えば、後天性免疫不全症、臓器移植後、副腎皮質ステロイドを投与された患者等の免疫力の低下した患者においてニューモシスティス肺炎発生の予防のためにＳＴ合剤が投与されることもしばしばある。
【０００３】
しかし、ＳＴ合剤を投与された患者に皮疹、造血障害、肝障害、低血糖、横紋筋融解、高カリウム、低ナトリウム血症等の副作用が起きることがある。ＳＴ合剤は二つの異なった化合物、トリメトプリム（ｔｒｉｍｅｔｈｏｐｒｉｍ）とスルファメトキサゾール（ｓｕｌｆａｍｅｔｈｏｘａｚｏｌｅ）の合剤である。副作用は後者のサルファ剤であるスルファメトキサゾールに起因するものが多い。
スルファメトキサゾールはＮＡＴ２（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ２、Ｎ−アセチル化転移酵素２）により体内でアセチル化され、無毒化されると考えられる。そして、ヒトにはＮＡＴ２活性の低い個体の存在が知られており、これらの個体ではスルファメトキサゾールの無毒化が障害され、副作用が出やすい可能性が考えられる。しかし、これらの可能性を確かめるためには、実際にＮＡＴ２の低下した個体でスルファメトキサゾールの副作用が多いことを示す必要がある。
【０００４】
ＳＴ合剤の副作用と、患者のアセチル化表現型との関係を調べた研究として、ヒトには肝臓におけるＮＡＴ２の活性が高いタイプ（ｒａｐｉｄ ａｃｅｔｙｌａｔｏｒ）と低いタイプ（ｓｌｏｗ ａｃｅｔｙｌａｔｏｒ）の違いにより、ｓｌｏｗ ａｃｅｔｙｌａｔｏｒでは抗結核薬イソニアジッド（ＩＮＨ）などの代謝が遅延することがわかっている（非特許文献１１）。しかし、多くの人で肝臓を採取し、その酵素を測定することは困難である。従って、ｒａｐｉｄ ａｃｅｔｙｌａｔｏｒとｓｌｏｗ ａｃｅｔｙｌａｔｏｒを個人レベルで調べるためにはＩＮＨあるいは、より簡便にカフェイン（非特許文献１２）などを投与して尿中の代謝物の濃度を測定し確かめる必要があった。
【０００５】
また、個人ごとのアセチル化型表現型の違いはゲノム上の配列の違いであるＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）によることがわかっている（非特許文献１３−１６）。そこで、肝臓以外の細胞の遺伝子を調べることにより容易にアセチル化型表現型がわかると考えられた。
ゲノムのＮＡＴ２遺伝子のアミノ酸のコード領域には表１に示すような多型座位がある。ヌクレオチド１９１位でＧからＡ（ＳＮＰ１、アルギニンからグルタミン酸）、ヌクレオチド２８２位でＣからＴ（ＳＮＰ２、チロシンで変化無し）ヌクレオチド３４１位でＴからＣ（ＳＮＰ３、イソロイシンからトレオニン）、ヌクレオチド４８１位でＣからＴ（ＳＮＰ４、ロイシンで変化無し）、ヌクレオチド５９０位でＧからＡ（ＳＮＰ５、アルギニンからグルタミン）、ヌクレオチド８０３位でＡからＧ（ＳＮＰ６、リジンからアルギニン）、およびヌクレオチド８５７位でＧからＡ（ＳＮＰ７、グリシンからグルタミン酸）である（非特許文献１７−２０）。
【０００６】
【表１】
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【０００７】
これらの７箇所のＳＮＰについて、酵素活性が正常のＮＡＴ２をコードしている遺伝子（野生型遺伝子）はＳＮＰ１２３４５６７の順にＧＣＴＣＧＡＧの塩基で構成されている。このように塩基を各ＳＮＰ座位に持った遺伝子を一般に「アレル」といい、ＮＡＴ２＊３、ＮＡＴ２＊４などの記号で示す。そして、酵素活性が正常のＮＡＴ２をコードしている遺伝子（すなわち、ＧＣＴＣＧＡＧを各ＳＮＰに持った遺伝子）をＮＡＴ２＊４という記号で示す。これを野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）の「アレル」という。これまで遺伝情報からアセチル化表現型を調べるために取られたほとんどの方法は、ＮＡＴ２遺伝子の上記の複数の座位においてＲＦＬＰ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）などの方法で遺伝子型を調べ、これまで存在が確認されている「アレル」をもとに直感的に個人を構成する二つの「アレル」を推定する手法であった。これまで存在が確認されている「アレル」とは、ヒトのＮＡＴ２遺伝子をクローニングし、その配列を決定すること、あるいはＲＦＬＰなどによりＳＮＰを確認することにより行われた一つの染色体上の配列をさす。これまでのいくつかの研究から、被検者に少なくとも１つのｗｉｌｄ−ｔｙｐｅの「アレル」が存在すれば、速いアセチル化表現型となるが、ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ「アレル」が一つもなければ、遅いアセチル化表現型となることが報告されている（非特許文献１７−２０）。
【０００８】
なお、これまでのＮＡＴ２遺伝子に関する論文で用いられている「アレル」という表現は、遺伝学上はハプロタイプと称されるべきものであった。すなわち、これまでＮＡＴ２に関係する他の論文で用いられているＮＡＴ２＊３、ＮＡＴ２＊４、ＮＡＴ２＊５などの記号はそれらの論文では「アレル」の名前として用いられているが、実際にはハプロタイプの名前である。そこで本発明においては、混乱を避けるため、遺伝学上の用語と概念の方法でアレルとハプロタイプを用いる。すなわち、アレル（ａｌｌｅｌｅ）とは一つの座位を占めることの出来る遺伝情報であるが、ハプロタイプは連鎖した複数の座位について、一つの配偶子に由来するアレルのリストである。座位とは染色体上の多型部位で、この場合は一つのＳＮＰを一つの座位とする。すなわち、表１にリストされた一つ一つのＳＮＰが座位である。例えば、前述のＮＡＴ２遺伝子のｗｉｌｄ ｔｙｐｅの遺伝子（ＮＡＴ２＊４）は７つの座位、ＳＮＰ１２３４５６７の順にＧＣＴＣＧＡＧの７つのアレルを持つものである。この中の、Ｇ、Ｃなど一つ一つがアレルであり、ＧＣＴＣＧＡＧのリストはハプロタイプである。
一つの個体は二つの配偶子を受け取るので、一つの領域について一つの個体は二つのハプロタイプを持ち、この二つのハプロタイプの組み合わせをディプロタイプ形という。上記の表現型と「アレル」の関係を遺伝学上の表現に直せば、ディプロタイプ形を形成する二つのハプロタイプの内、一つでもＮＡＴ２＊４であれば個体はｒａｐｉｄ ａｃｅｔｙｌａｔｏｒ、それ以外はｓｌｏｗ ａｃｅｔｙｌａｔｏｒ表現型を取るのである。従って、個体がＮＡＴ２＊４を持っているかどうかを正確に判定できるテストがあればよい。しかし、これが極めて困難である。なぜなら、ハプロタイプは一般に観察できず、分子生物学的に可能であるが現状では実際的ではないからである（非特許文献２１、２２）。
【０００９】
同一集団から得られた多くの個人のサンプルにより集団のハプロタイプ頻度が推定できる。連鎖した複数の座位の遺伝子型情報を多くの個人に対し決定することにより集団のハプロタイプ頻度を決定できるのである。その手法としては、分析的解決法（非特許文献２３、２４）、逐次的ハプロタイプ推測アルゴリズム（非特許文献２５）、最尤法（非特許文献２６−２９）を挙げることができる。
また、集団のハプロタイプ頻度だけではなく、個人のディプロタイプ形を推定する手法も開発されている（非特許文献２５，２６）。いずれも最尤法により個人のディプロタイプ形、すなわち二つのハプロタイプの組み合わせを推定する。個人の遺伝子情報について、実際に観察できる遺伝情報のデータは遺伝子型である。これは各座位における二つのアレルの組み合わせである。しかし、例えば前述の７つの座位についての個体のすべてのＳＮＰ座位の遺伝子型がわかっても、ディプロタイプ形を決定することは、少なくとも２箇所以上のＳＮＰ座位でヘテロ接合のときは不可能である。すなわち、２箇所以上のＳＮＰ座位でヘテロ接合の場合は、すべての座位について全く同じ遺伝子型を持つ二人の個体が異なったディプロタイプ形を持つ可能性があるのである。しかし、それぞれのディプロタイプ形の可能性が同じ確率であるのではなく、大きく偏りがある事が多い。集団の同じ座位の遺伝子型データが大量にあれば、極めて効率よく個人のディプロタイプ形を推定することが可能なのである（非特許文献３０、３１）。
【００１０】
同一集団の複数の連鎖した座位の遺伝子型データから個人のディプロタイプ形を推定する方法として優れた方法は最尤法（ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｍｅｔｈｏｄ）である。既に、最尤法を用いて多数の個体のＮＡＴ２遺伝子の複数の座位の遺伝子型データから個人のディプロタイプ形を推定し、ＮＡＴ２遺伝子のディプロタイプ形と関節リウマチ患者に投与されるスルファサラジンの副作用の間に関連があるか検定する方法が田中他（非特許文献３２）により発表されている。この方法によれば、関節リウマチ患者のＮＡＴ２遺伝子の４または５個のＳＮＰと多数の同一集団内の個体のデータを用いて、それぞれの関節リウマチ患者のディプロタイプ形を推定でき、スルファサラジンの副作用が多いかどうかを推定できる。その結果、ＮＡＴ２＊４のハプロタイプを持たない個体は持つ個体に比べ７．７３倍（Ｐ＜０．００１）副作用が起きやすいことが報告されている。Ｓａｂｂａｇｈ  Ａ他はＥＭアルゴリズムを含めた複数の方法によりＮＡＴ２のハプロタイプをアルゴリズムにより推定し、正確な推定ができたことを報告した（非特許文献３３）。しかし、この報告ではＮＡＴ２遺伝子のハプロタイプは推定したが、表現型との関連は検討していない。
ＳＴ合剤の副作用についてもＮＡＴ２遺伝子との関係が報告されている。すなわち、ｓｌｏｗ ａｃｅｔｙｌａｔｏｒはｒａｐｉｄ ａｃｅｔｙｌａｔｏｒに比較してＳＴ合剤により副作用が起きやすい（非特許３４−３６）。しかし、これらの発表ではＮＡＴ２遺伝子に関して適当なハプロタイプとしての処理をしていない。従来の方法と同様に、既に存在すると確認されたハプロタイプの情報と、個人の遺伝子型の情報から直感的に個人のディプロタイプ形を推定しているのである。
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ＳＴ合剤およびそれを含む薬剤投与の副作用の危険性を判定する方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、ＳＴ合剤の副作用の起こしやすさが、これまでのような直感的なディプロタイプ形推定法ではなく、最尤法を用いたディプロタイプ形推定法により推定する方法で、より正確に判定できるのではないかと考え鋭意研究を行った。その結果、最尤法を用いＮＡＴ２遺伝子の個人のディプロタイプ形の確率を計算する事によりＳＴ合剤の副作用がよりよく推定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、ＮＡＴ２遺伝子についての個人のディプロタイプ形を決定することにより、個人のＳＴ合剤の副作用の危険性を判定する方法に関し、より具体的には、次の（１）〜（６）に関する。
（１）以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、個人についてのＳＴ合剤の副作用の危険性を判定する方法。
（ａ）Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）遺伝子における個人のディプロタイプ形を決定する工程
（ｂ）工程（ａ）によって決定したディプロタイプ形において、Ｍ／Ｍのディプロタイプ形の個人に対して、ＳＴ合剤の副作用の危険性があるものと判定する工程
（２）ディプロタイプ形の決定が以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む方法によって行われる上記（１）に記載の方法。
（ａ）集団における各個人のＮ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）遺伝子についての遺伝子型情報から、該集団におけるハプロタイプ頻度を算出する工程
（ｂ）工程（ａ）により算出されるハプロタイプ頻度、および各個人の遺伝子型情報から、各個人のディプロタイプ形を決定する工程
（３）ハプロタイプ頻度の算出が、ＥＭアルゴリズムにより行われる上記（２）に記載の方法。
（４）遺伝子型情報が一塩基多型（ＳＮＰ）からなる群より選択される多型である、上記（２）または（３）に記載の方法。
（５）ＳＴ合剤がＮ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）により主に代謝される場合についての上記（１）から（４）のいずれかに記載の方法。
（６）上記（１）から（５）のいずれかに記載の方法によりＳＴ合剤の副作用の危険があると判定された個人に、スルファメトキサゾール（ｓｕｌｆａｍｅｔｈｏｘａｚｏｌｅ）の量を減量して投与する手法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によって提供された個人についてのＳＴ合剤の副作用の危険性を判定する方法により、医療の現場において、患者個人のＳＴ合剤の投与可否や投与量等を適切に判断することができ、患者にとって有効な治療を施すことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明においてディプロタイプ形の決定を行うＮＡＴ２遺伝子は、公知の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセションナンバーＡＦ３４８０７４；ＭＩＭナンバーＭＩＭ２４３４００）を用いることが好ましい。本発明の方法により副作用の危険性の判定が可能な薬剤はＳＴ合剤であるが、この薬剤は二つの化合物の合剤である。この二つの内、本発明によって判定される危険性がどちらの副作用に関係するか完全にはわからない。しかし、ｓｕｌｆａｄｉａｚｉｎｅ、ｓｕｌｆａｍｅｔｈａｚｉｎｅ、ｓｕｌｆａｓａｌａｚｉｎｅなど、一般にサルファ剤がアセチルトランスフェラーゼによるアセチル化により主として代謝されるという報告から（参考文献１−３）、ｔｒｉｍｅｔｈｏｐｒｉｍではなくｓｕｌｆａｍｅｔｈｏｘａｚｏｌｅの副作用判定にＮＡＴ２遺伝子のハプロタイプ推定が有効であると考えられる。なお、本発明の副作用の危険性の判定方法において、上記薬剤の投与形態は、特に限定されるものではない。
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参考文献３； Evans, D. A. P.; White, T. A. Human acetylation polymorphism. J. Lab. Clin. Med. 63: 394-403, 1964.
【００１６】
本発明の副作用の危険性の判定の対象となる疾患はニューモシスティス肺炎に限られるものではない。種々の細菌による尿路感染症にも用いられるので、ＳＴ合剤が用いられるすべての疾患の患者にＳＴ合剤が投与された場合も本発明による副作用予測が関係する。患者としては、例えば後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の患者、臓器移植を行われた患者、副腎皮質ステロイド薬などの免疫抑制効果を持つ薬物を投与された膠原病、あるいは自己免疫疾患などの患者、悪性腫瘍の患者、抗腫瘍薬を投与された患者等も本発明の副作用の危険性の判定の対象に含まれる。
【００１７】
本発明の上記工程におけるＮＡＴ２遺伝子における個人のディプロタイプ形の決定は、例えば、複数の個人の遺伝子型情報からハプロタイプ頻度を算出し、それに基づいて個人のディプロタイプ形を決定する方法、集団の遺伝子型情報を基にして既に算出されたハプロタイプ頻度を基に個人のディプロタイプ形を決定する方法などにより行うことができる。
以下の方法により、ＮＡＴ２遺伝子における個人のディプロタイプ形を決定することができることが最も望ましい。まず、集団における各個人のＮ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）遺伝子についての遺伝子型情報から、該集団におけるハプロタイプ頻度を算出する。次いで、算出されるハプロタイプ頻度、および各個人の遺伝子型情報から、各個人のディプロタイプ形を決定する。本発明の方法における遺伝子型情報は、表１のＮＡＴ２遺伝子上の表１に示した多型部位に関する遺伝子型情報のうち、ＳＮＰ  ＩＤのいずれかまたはそのいずれの組み合わせであっても良いが、ＳＮＰ ＩＤが、２、４、５、７の４つであることが好ましい。
【００１８】
本発明における「集団」とは、遺伝子型情報を提供する個人の集まりを意味する。集団の人数は、本発明により決定されるディプロタイプ形の信頼性を高めるために、なるべく多くの人数から構成されることが好ましい。例えば、集団の人数が２５名（ハプロタイプ数は５０）以上であれば、希少なハプロタイプが集団に含まれない場合は、本発明の方法により比較的正確に個人のディプロタイプ形の決定を行うことができる。従って、本発明の集団は、２５名以上であることが好ましいが、集団を構成する人数は、特に制限されない。また、集団は均一（遺伝的背景が近接）であることが好ましい。例えば、ディプロタイプ形の決定を行う個人が日本人であるならば、遺伝子型情報を取得すべき「集団」は、日本人から構成される集団であることが好ましい。集団が均一か否かについては、それぞれの座位において、ハーディー・ワインバーグ平衡が達成されているか否かを検定することにより調べることができる。
【００１９】
ハプロタイプは狭い遺伝子領域に含まれる場合は、世代交代によっても変化することは少ない。ハプロタイプは、その遺伝子領域内に交差が起きることにより変化するが、狭い遺伝子領域内に交差が起きる確率は極めて低い（１世代あたり、１００，０００ｋｂに１回に過ぎない）からである。そのため特定の集団内、例えば日本人では、それぞれのハプロタイプの頻度が決まっている場合が多い。これをハプロタイプ頻度という。このハプロタイプ頻度は、集団ごとに異なる場合が多い。
【００２０】
本発明のハプロタイプ頻度の算出には、公知の方法を利用することができる。ハプロタイプ頻度の算出のための好ましい方法としては、例えば、分析的解決法（非特許文献２３、２４）、逐次的ハプロタイプ推測アルゴリズム（非特許文献２５）、ＥＭアルゴリズムを用いた最尤法（非特許文献２６−２９）等の方法を挙げることができる。
ＥＭアルゴリズムを使用した場合、遺伝子型情報からハプロタイプ頻度を、例えば以下のようにして算出することができる。これは変数が違っていても基本的には公知の方法である。
まず、集団のハプロタイプ頻度ベクトル（すべてのハプロタイプの頻度のベクトル）をΘとし、個人個人の複数の座位における遺伝子型をｇ１，ｇ２，…，ｇｋ，…，ｇＫとすると、尤度は
【００２１】
2007209286.tif 000003
この式の中で、ハプロタイプ頻度ベクトルΘの下で、ｋ番目の個人の遺伝子型ｇｋが得られる確率は、
【００２２】
2007209286.tif 000004
ただし、（ｉ，ｊ）はここでｉおよびｊ番目のハプロタイプで（この順番で）構成される順列ディプロタイプ形（ｏｒｄｅｒｅｄ  ｄｉｐｌｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）とする。ｉ≠ｊなら（ｉ，ｊ）≠（ｊ，ｉ）である。θｉ，θｊはｉおよびｊ番目のハプロタイプの頻度であり、Ｑｋはｇｋの遺伝子型に合致する順列ディプロタイプ形の集合である。以上より尤度関数は以下のようになる。
【００２３】
2007209286.tif 000005
これはΘの関数であるが、この関数をΘを動かすことにより最大化したものが最大尤度であり、その時のΘが最尤推定値のベクトルである。これが最尤推定された集団のハプロタイプ頻度である。
【００２４】
以上の最尤推定値を算出するためのＥｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ−Ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ（ＥＭ）アルゴリズムの手順は次の通りである。
１）ｋ番目の個人の与えられた座位（複数）の遺伝子型ｇｋから可能な順列ディプロタイプ形ｄ１，ｄ２，…，ｄＳを構成するハプロタイプをすべてリストアップする。
２）すべての個体についてリストアップされたハプロタイプの総数をＨとし、それぞれのハプロタイプに
【００２５】
2007209286.tif 000006
となるような適当な非負の実数
2007209286.tif 000007
を与える。
３）特定の個体ｋの特定の可能な順列ディプロタイプ形ｄＳが（ｉ，ｊ）であるとすると、その尤度は
2007209286.tif 000008
個体ｋの尤度は
【００２６】
2007209286.tif 000009
ただし、Ｑｋはｋ番目の個体で可能な順列ディプロタイプ形  （ｉ，ｊ）の集合である。個体ｋの可能なディプロタイプ形について含まれるｈ番目のハプロタイプの個数の期待値を以下の式で計算する。
【００２７】
2007209286.tif 000010
ただし、
2007209286.tif 000011
はディプロタイプ形（ｉ，ｊ）に含まれるｈハプロタイプの数（０、１、２）である。
４）引き続きｈ番目のハプロタイプのサンプルにおける個数の期待値は、
【００２８】
2007209286.tif 000012
であり、サンプル内のハプロタイプｈの割合の期待値は
【００２９】
2007209286.tif 000013
５）ハプロタイプ頻度をサンプルのハプロタイプの割合の期待値で更新する。
【００３０】
2007209286.tif 000014
６）ステップ（３）−（５）を収束するまで繰り返す。
７）収束したときの
2007209286.tif 000015
を最尤推定値
2007209286.tif 000016
とする。
上記の計算の結果として、集団内でのハプロタイプの頻度の最尤推定値が得られる。
【００３１】
これに基づき、個人ｋのディプロタイプ形を推定する。一般に、表現型との関連にとっては順列ディプロタイプ形より、組み合わせディプロタイプ形の方が有益である。ｉ番目とｊ番目のハプロタイプにより構成される組み合わせディプロタイプ形を［ｉ，ｊ］とする。［ｉ，ｊ］＝［ｊ，ｉ］である。
個人ｋの組み合わせディプロタイプ形［ｉ，ｊ］の事後確率を以下のように計算する。
ｉ≠ｊのとき
【００３２】
2007209286.tif 000017
ｉ＝ｊのとき
【００３３】
2007209286.tif 000018
これを個人ｋについて、すべての［ｉ，ｊ］について計算し、Ｐｉｊをｋのディプロタイプ分布とする。
【００３４】
一般にディプロタイプ分布は１つのディプロタイプ形に集中する場合が多いことが示されている。従って、上記工程（ｂ）により算出されるディプロタイプ分布が１つのディプロタイプ形に集中する場合には、個人の有するディプロタイプ形は、この１つに集中したディプロタイプ形であるものと決定される。ディプロタイプ形が１つに集中しない場合には、複数のディプロタイプ形のそれぞれについて、個人が有する確率がディプロタイプ分布として算出される。例えば、ある個人についてディプロタイプ形Ａを有する確率はＸであり、ディプロタイプ形Ｂを有する確率はＹであると算出される。
また本発明におけるディプロタイプ分布の算出には、上記の方法により集団における各個人の遺伝子型情報から算出されるハプロタイプ頻度を用いる以外に、既に推定または決定されたハプロタイプ頻度を用いることもできる。
本発明においては、次いで、工程（ａ）によって決定したディプロタイプ形において、野生型ハプロタイプＮＡＴ２＊４を持たない個人に対して、ＳＴ合剤の副作用の危険性があるものと判定する（工程（ｂ））。
【００３５】
本発明において、ＮＡＴ２遺伝子についての野生型ハプロタイプとは、ＮＡＴ２遺伝子の塩基配列において（１）１９１位がＧ、（２）２８２位がＣ、（３）３４１位がＴ、（４）４８１位がＣ、（５）５９０位がＧ、（６）８０３位がＡ、（７）８５７位がＧであるような配列を言う。野生型以外のハプロタイプとは、上記のいずれかの位置が野生型とは異なった塩基を持つような配列のことである。野生型ハプロタイプの有無を調べるためには日本人においては必ずしも７つのＳＮＰ全部を調べる必要は無く、４個（表１のＳＮＰ ２、４、５、７）で１００％近く推定できる。
ここで、野生型ハプロタイプをＷ、野生型ではないハプロタイプをＭとすると、個人におけるディプロタイプ形は、Ｗ／Ｗ、Ｗ／Ｍ、Ｍ／Ｍの３通りの可能性が考えられる。野生型ではないハプロタイプとは、上記の野生型ハプロタイプ以外のハプロタイプを言う。
【００３６】
本発明においては、上記の方法によって決定された個人のディプロタイプ形がＭ／Ｍ（野生型ハプロタイプを持たない）であった場合、該個人（野生型ハプロタイプを持たない個人）に対して、ＳＴ合剤の副作用の危険性があるものと判定される。個人のディプロタイプ形が一つに集中しなかった場合、その個体のディプロタイプ形の事後確率分布において、Ｍ／Ｍの事後確率が高いほどＲＡ治療薬の副作用の危険性が高いと判定される。この基準はＭ／Ｍの事後確率が５０％以上の場合に置くが、かならずしもその値に限定されるものではない。
【００３７】
本発明の上記判定方法によって、各個人のＳＴ合剤投与に対する副作用の危険性を予め知ることができる。従って、本発明の方法によって得られた情報を基に、ＳＴ合剤の投与の可否や、Ｍ／Ｍのディプロタイプ形を有する個人には少量の投与量を用いることで、投与量等を個人単位で適切に判断することが可能となる。これにより、個人の遺伝的基盤に応じて、ＳＴ合剤に対して副作用の少ない、有効な治療を施すことが可能となる。
【００３８】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【実施例１】
【００３９】
１．日本人集団におけるＮＡＴ２遺伝子多型
東京女子医科大学においてすべて日本国籍の３３０人の関節リウマチ患者（ＮＡＴ２遺伝子多型と関節リウマチの間に関連があるという証拠は無いため、関節リウマチ患者におけるＮＡＴ２遺伝子多型データを日本人一般人におけるデータとみなした）から、インフォームドコンセントを得た後、末梢血試料を採取して、ウィザードゲノムＤＮＡ精製キット（プロメガ社、カタログ番号Ａ１６２０）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。配列表配列番号１および２のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを１回実施した。ＮＡＴ２遺伝子のヌクレオチド４８１位（ＳＮＰ４）、５９０位（ＳＮＰ５）、および８５７位（ＳＮＰ７）のＳＮＰ部位３箇所での遺伝子型は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）−制限断片長多形（ＲＦＬＰ）法を用いて決定した。
【００４０】
図１に第８番染色体に存在する、ヒトのＮＡＴ２遺伝子の構造を略図で示した。Ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎはコード領域を示し、Ｇ１９１Ａなどの文字はＳＮＰの場所を示す。ＰＣＲによって増幅した８１５ｂｐ ＤＮＡ断片にＫｐｎ Ｉ、Ｔａｑ Ｉ、またはＢａｍ ＨＩ消化のいずれかを行った。４８１位にＣを含むアレルは、Ｋｐｎ Ｉによって消化させると６５９ｂｐおよび１５６ｂｐ断片を生じ、一方Ｔを含むアレルは同じ酵素によって消化されなかった。８１５ｂｐ断片は、Ｇが５９０位に存在する場合、４１ｂｐ、２２６ｂｐ、１７０ｂｐ、および３７７ｂｐ断片に消化され、同じ位置にＡが存在する場合は４１ｂｐ、３９６ｂｐ、および３７７ｂｐ断片に消化された。８５７位でＧを有するアレルは、Ｂａｍ ＨＩ部位を生じ、この酵素による消化によって５３６ｂｐおよび２７９ｂｐ断片を生じたのに対し、同じ位置のＡは、消化に対してアレルを抵抗性にした。このようにして、ＮＡＴ２の４８１位、５９０位、および８５７位（ＳＮＰ４、５および７）での遺伝子型に関するデータを得た。３つのＳＮＰ部位の他に、さらに１つの部位（ＳＮＰ２）で遺伝子タイピングした。ヌクレオチド２８２位（ＳＮＰ２）での遺伝子型は、非特許文献３０に記載のカスコルビ（Ｃａｓｃｏｒｂｉ）らの方法に従ってＰＣＲによって増幅した１２１１ｂｐ ＤＮＡ断片を用いて決定した。このようにして、ＳＮＰ２、４、５、７の４つのＳＮＰ座位の遺伝子型を決定した。
【００４１】
この３３０名の４ＳＮＰ座位の遺伝子型の情報を前述のディプロタイプ形の確率を計算するためのアルゴリズムにかけたところ、全員でディプロタイプ形が決定できた。その計算法は、公知の方法であるＥＭアルゴリズムを用いた最尤法による個人のディプロタイプ形推定法である（非特許文献３０参照）。すなわち、上記のＥＭアルゴリズムをＣ言語により書かれたコンピュータプログラムに搭載し、ｌｉｎｕｘを用いたパーソナルコンピュータを用いて実行した。その結果ディプロタイプ形の決定ができたが、その内訳は３０９名がＮＡＴ２＊４、すなわち野生型のハプロタイプを持ち、２１名が野生型のハプロタイプを持たなかった。これにより３３０名の中の野生型ハプロタイプを持たない個人（すなわちＭ／Ｍの遺伝子型を持つ個人）の割合は２１／３３０＝６．４％であることがわかった。
【００４２】
２．ＳＴ合剤投与群におけるＮＡＴ２遺伝子多型
東京女子医科大学においてすべて日本国籍の59人のＳＴ合剤投与患者（全身性エリテマトーデス41名、皮膚筋炎ないし多発性筋炎12名、関節リウマチ2名、成人発症スティル病1名、強皮症1名、動脈炎症候群症候群1名、ウェジナー肉芽腫症1名）から、インフォームドコンセントを得た後、上記１と同様の方法でゲノムＤＮＡを抽出し、ＮＡＴ２遺伝子の４つのＳＮＰの遺伝子型（表１のＳＮＰ２、４、５、７）を決定した。
これらの患者は、原疾患の治療のためにプレドニゾロン等の免疫抑制効果を持った薬物を用いるため、免疫不全状態にあり、ニューモシスティス肺炎の予防と治療のためにＳＴ合剤を用いていた。ＳＴ合剤はスルファメトキサゾール400 mgとトリメトプリム80 mgを１錠に含有する合剤であり、予防のためには1回1錠、一日1-2回程度服用していた。このうち、ＳＴ合剤を服用中に重症の副作用を来たした患者が６名で、副作用を来たさなかった患者が５３名であった。
【００４３】
３．ＮＡＴ２遺伝子多型におけるディプロタイプ形
これらの遺伝子型データを、これまでＮＡＴ２の４つのＳＮＰの遺伝子型を調べた３３０名のＳＮＰの情報とあわせ解析することにより、すべての個体のディプロタイプ形の確率を計算した。この手法により各個体が野生型ハプロタイプＮＡＴ２＊４を保有している確率が算定された。ほとんどの個体でディプロタイプ形は一つに集中し、二つ以上のディプロタイプ形の可能性が示されなかった。しかし、一部の個体で二つ以上のディプロタイプ形の可能性が示唆されたが、一つのディプロタイプ形の確率が５０％以上あるときは、そのディプロタイプ形であると判断した。
【００４４】
ＳＴ合剤により重症の副作用を来たした６名の患者の病名とディプロタイプ形の内訳は表２に述べるとおりである。すなわち、ＳＴ合剤により重症の副作用を来たした６人の患者中３名がＮＡＴ２＊４ハプロタイプを持たず、ＳＴ合剤により副作用を来たす危険性があると判定された。これに比べ、ＳＴ合剤により副作用を来たさなかった５３名中４名がＮＡＴ２＊４ハプロタイプを持たず、ＳＴ合剤により副作用を来たす危険性があると判定された。
【００４５】
【表２】
2007209286.tif 000019
【００４６】
このデータに基づいてＳＴ合剤により重症副作用を来たした６名の患者と来たさなかった５３名の患者の間で、ＮＡＴ２＊４ハプロタイプを有さない個体の割合に違いがあるかを統計的に検定した。この検定の為には、表３のようなデータを作り、それをＦｉｓｈｅｒの正確確率検定法により検定した。その結果、重症副作用を起こすという属性と、ＮＡＴ２＊４ハプロタイプを有さないという属性の間に統計的に有意の違いがあることがわかった［Ｐ＝０．０２１、Ｆｉｓｈｅｒの正確法、ＯＲ（オッズ比）＝１１．５（９５％ＣＩ １．７−７７）］。ここで、９５％ＣＩはオッズ比の９５％信頼区間を示す。すなわち、重症副作用を起こした個体の間で、副作用を起こさなかった個体の間より、ＮＡＴ２＊４ハプロタイプを有さない個体（すなわちＭ／Ｍのディプロタイプ形の個体）の割合が統計的に有意に多かった。
【００４７】
【表３】
2007209286.tif 000020
【００４８】
また、ＳＴ合剤により重症の副作用を来たした６名の患者のＭ／Ｍディプロタイプ形の割合を、３３０名の関節リウマチ患者と比べても大きな違いがある事がわかった。これらの３３０名の関節リウマチの患者はＳＴ合剤を服用していないので、これにより副作用が出るかどうか不明である。しかし、もしＮＡＴ２のディプロタイプ形とＳＴ合剤の副作用との間に関連がないならば、この二つの集団の間にもＭ／Ｍディプロタイプ形の割合に違いは無いはずである。表４のようなデータを作り、それをＦｉｓｈｅｒの正確確率検定法により検定した。その結果、重症副作用を起こすという属性と、ＮＡＴ２＊４ハプロタイプを有さないという属性の間に統計的に有意の違いがあることがわかった［Ｐ＝０．００５６、Ｆｉｓｈｅｒの正確法、ＯＲ（オッズ比）＝１４．７（９５％ＣＩ ２．８−７７）。この結果は、前述の重症副作用を起こした６名の患者と起こさなかった５０名の患者の比較による結論を支持するものである。
【００４９】
【表４】
2007209286.tif 000021
【００５０】
以上のように、本発明者らにより、ＮＡＴ２遺伝子についての個人のディプロタイプ形において、そのディプロタイプ形を構成する２つのハプロタイプのうち、野生型ＮＡＴ２＊４のハプロタイプを持たない個人は、ＳＴ合剤に対して副作用の危険性が高いことが明らかとなった。従って、本発明は、ＮＡＴ２遺伝子についての個人のディプロタイプ形を決定することによる、個人のＳＴ合剤の副作用の危険性を判定する方法を提供する。Ｍ／Ｍのディプロタイプ形を有する患者にＳＴ合剤を投与する必要があるときは、通常より少量のスルファメトキサゾールを含んだ薬剤を投与することにより、有効性を保ち重症副作用を防ぐことが可能になる。
【実施例２】
【００５１】
全身性エリテマトーデスの患者に原病の治療のため一日６０ｍｇのプレドニン（プレドニゾロン）が投与された。プレドニンの投与は３ヶ月続けられたが末梢リンパ球数が低下し、免疫グロブリンが減少したためニューモシスティス肺炎の危険があると判断し、その予防のためにＳＴ合剤を投与することが検討された。そこで患者からＤＮＡを採取し、ＮＡＴ２遺伝子の４つのＳＮＰ（ＳＮＰ２、４、５、７）の遺伝型が上記の方法で決定された。この患者の遺伝子型の情報と、実施例１で用いた３３０人分のＮＡＴ２遺伝子の４つのＳＮＰの遺伝子型の情報を加え、ＥＭアルゴリズムを用いて患者のディプロタイプ分布が決定された。その結果、ＮＡＴ４＊４ハプロタイプを有することが判明し、ＳＴ合剤の副作用の危険性が低いと判断し、ＳＴ合剤（Ｓ４００ｍｇ, Ｔ８０ｍｇ）の毎日２錠（分２）の投与を開始した。副作用は出なかった。
【産業上の利用の可能性】
【００５２】
本発明により、個人についてのＳＴ合剤の副作用の危険性を判定する方法が提供された。本発明の判定方法によって、各個人のＳＴ合剤投与に対する副作用の危険性を予め知ることができる。従って、医師がＳＴ合剤を投与する前に、ＮＡＴ２遺伝子について遺伝子タイピングして、患者のディプロタイプ形を決定することにより、ＳＴ合剤の投与の可否や、投与量等を適切に判断することができる。これにより、副作用の危険を低下させることができ、患者にとって有効な治療を施すことが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ＮＡＴ２遺伝子の構造を模式的に示した図である（実施例１）。
【図１】
2007209286.tif 000022
【配列表】
2007209286000001.app