(57)【要約】  【課題】アレイ利用型核酸ハイブリダイゼーションのための新規な方法および組成物を提供する。  【解決手段】次のステップ：(ａ)複数の固定化核酸セグメントを含む複数の核酸プローブを得るステップ；(ｂ)検出可能な部分で標識されたゲノム核酸の断片を含む標的核酸のサンプルを得るステップであって、該標識化断片はそれぞれ約200塩基未満の長さからなる、上記ステップ；ならびに(ｃ)ステップ(ｂ)のゲノム核酸とステップ(ａ)の固定化プローブとを、該標的核酸と該プローブ核酸とがハイブリダイズ可能な条件下で接触させるステップを含む、ゲノムDNA標的と固定化核酸プローブとのハイブリダイゼーションによりゲノムDNAの分子プロフィールを作成する方法を提供する。【選択図】図１
2007050010.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムDNA標的と固定化核酸プローブとのハイブリダイゼーションによりゲノムDNAの分子プロフィールを作成する方法であって、以下のステップ：
（ａ）複数の固定化核酸セグメントを含む複数の核酸プローブを得るステップ；（ｂ）検出可能な部分で標識されたゲノム核酸断片を含む標的核酸のサンプルを得るステップであって、各標識化断片は約200塩基未満の長さからなる、上記ステップ；および
（ｃ）ステップ（ｂ）のゲノム核酸とステップ（ａ）の固定化プローブとを、該標的核酸と該プローブ核酸とがハイブリダイズ可能な条件下にて接触させるステップ；
を含む、上記方法。
【請求項２】
各標識化断片が約150塩基以下の長さからなるものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
各標識化断片が約100塩基以下の長さからなるものである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
各標識化断片が約50塩基以下の長さからなるものである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
各標識化断片が約30塩基以下の長さからなるものである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
各標識化断片が約30塩基〜約150塩基の長さからなるものである、請求項３記載の方法。
【請求項７】
標的ゲノム核酸のサンプルが、ゲノム核酸のサンプルのランダムプライミング、ニックトランスレーション、増幅、またはその等価の手法を含む手法を使用して標的ゲノム核酸のセグメントを作製し、その後、該セグメントの断片化または酵素消化、あるいはその両方を含むステップにより約200塩基未満のサイズからなる標的ゲノム核酸のサンプルを生成することにより調製されるものである、請求項１記載の方法。
【請求項８】
標的ゲノム核酸のセグメントを作製するための、ゲノム核酸のサンプルのランダムプライミング、ニックトランスレーション、増幅、またはその等価な手法が、検出可能な標識を付加した塩基対を該セグメント中に組み込むものである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
検出可能な標識がCy3TMもしくはCy5TMまたはその等価物を含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
標的ゲノム核酸のサンプルが、セグメントのDNase酵素またはその等価物を用いた消化による約200塩基未満のサイズへのゲノムDNAの断片化を含む手法を用いて調製されるものである、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
標的ゲノム核酸のサンプルが、ゲノムDNAを断片化するのに十分な剪断力を適用することによる約200塩基未満のサイズへのゲノムDNAの断片化と、続いて剪断したDNAのDNase酵素またはその等価物による消化を含む手法を用いて調製されるものである、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
標的核酸とプローブ核酸とがハイブリダイズ可能な条件がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を含むものである、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が約60℃〜約65℃の温度を含むものである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
標的核酸がヒト由来のDNAから本質的に構成されるものである、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
標的ゲノム核酸のサンプルが染色体の所定の一部または実質的に全体を表す配列を含むものである、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
標的ゲノム核酸のサンプルがゲノムの実質的に全体を表す配列を含むものである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
染色体またはゲノムがヒトに由来するものである、請求項１５または１６記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１つの検出可能な部分で標識されたゲノム核酸の断片を含む標的核酸のサンプルを含む組成物であって、各標識化断片は約200塩基未満の長さを有し、該標識化標的ゲノム核酸のサンプルは、染色体の所定の一部もしくは実質的に完全な染色体または実質的に完全なゲノムを表す配列を含むものである、上記組成物。
【請求項１９】
標的核酸がヒト由来のDNAから本質的に構成されるものである、請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
染色体またはゲノムが哺乳動物由来のDNAである、請求項１８記載の組成物。
【請求項２１】
DNAがヒト由来のDNAである、請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
各標識化断片が約100塩基以下の長さからなるものである、請求項１８記載の組成物。
【請求項２３】
各標識化断片が約50塩基以下の長さからなるものである、請求項２２記載の組成物。
【請求項２４】
各標識化断片が約50塩基以下の長さからなるものである、請求項２３記載の組成物。
【請求項２５】
各標識化断片が約30塩基〜約100塩基の長さからなるものである、請求項２２記載の組成物。
【請求項２６】
検出可能な標識がCy3TMもしくはCy5TMまたはその等価物を含むものである、請求項１８記載の組成物。
【請求項２７】
標的核酸のサンプルおよび印刷物を含むキットであって、該標的核酸は検出可能な部分で標識されたゲノム核酸の断片を含み、各標識化断片は約200塩基未満の長さからなり、該標識化標的ゲノム核酸のサンプルは、染色体またはゲノムの実質的に全体を表す配列を含み、該印刷物は標的核酸のサンプルと核酸アレイとのハイブリダイゼーションに関する説明書を含む、上記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府支援研究に関する表明
本発明は、国立保健研究所からの助成金番号R21 CA83211の下、政府の支援を得て成された。本発明に関して、政府は一定の権利を有し得る。
技術分野
本発明は、分子生物学、遺伝子診断、および核酸アレイ、すなわち「バイオチップ」技術に関する。特に、本発明は、アレイ利用型核酸ハイブリダイゼーションのための新規な方法および組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
背景
ゲノムDNAマイクロアレイを利用する比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)は、個々の中期染色体に対する比較ハイブリダイゼーションに依存する従来のCGH法の多くの限界を解決する可能性を持っている。中期CGHでは、ゲノムDNAの異なるサンプルの多メガベース（Mb）の断片(例えば、既知正常のもの、対、被験体(例えば、可能性のある腫瘍))を標識化し、固定化された染色体とハイブリダイズさせる(例えば非特許文献１及び２を参照)。既知サンプルと被験サンプルとのシグナルの差を検出および測定する。このようにして、「正常」と比べた場合に被験サンプルにおいて欠損している配列、増幅している配列、またはユニークな配列を、正常対照対被験ゲノムDNAの蛍光比により検出できる。中期CGHでは、(固定化染色体上の)標的部位は、過剰量の可溶性標識化ゲノムDNAにより飽和される。
【０００３】
固定化ゲノムDNAが中期に存在するものである中期CGHと対照的に、アレイ利用型CGH法では、例えばバイオチップまたはマイクロアレイプラットフォーム上に固定化核酸がアレイとして配置される。別の違いは、アレイ利用型CGHでは、標識化(被験および対照)ゲノム核酸のコピー数と比べて固定化ゲノムDNAがモル量で過剰であることである。このような条件下では、固定化DNA上での反復ゲノム配列および交差ハイブリダイゼーションを抑制することが、正常対照サンプルと被験サンプルとのコピー数の差の信頼性のある検出および定量のために非常に有益である。しかし、従来のプロトコールを使用すると、このような抑制は、最適には達しない。さらに、ゲノムDNAは、30％を上回る反復配列、およびさらに未知の割合の関連性のある配列を含む雑多な混合物である。これらの配列は、従来のプロトコールを用いて被験およびサンプルDNAをアレイへのハイブリダイゼーションのために調製した場合に交差ハイブリダイズする可能性がある。
【非特許文献１】Breen (1999) J. Med. Genetics 36:511-517
【非特許文献２】Rice (2000) Pediatric Hematol. Oncol. 17:141-147
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
概要
本発明は、ゲノムDNA標的と固定化核酸プローブとのハイブリダイゼーションによりゲノムDNAの分子プロフィールを作成する方法であって、次のステップ：(ａ)複数の固定化核酸セグメントを含む複数の核酸プローブを得るステップ；(ｂ)検出可能な部分で標識されたゲノム核酸の断片を含む標的核酸のサンプルを得るステップであって、該標識化断片はそれぞれ約200塩基未満の長さからなる、上記ステップ；ならびに(ｃ)ステップ(ｂ)のゲノム核酸とステップ(ａ)の固定化プローブとを、該標的核酸と該プローブ核酸とがハイブリダイズ可能な条件下で接触させるステップ、を含む方法を提供する。
【０００５】
代替的な実施形態では、各標識化断片は、約175塩基以下；150塩基以下；約125塩基以下；約100塩基以下；約75塩基以下；約50塩基以下；約40塩基以下；約30塩基以下；および約25塩基以下の長さからなる。別の実施形態では、各標識化断片は、約25から約30塩基〜約100塩基の長さからなる。これらの標的ゲノム核酸のサンプルは、ゲノム核酸のサンプルのランダムプライミング、ニックトランスレーション、または増幅を含む手法を使用して標的ゲノム核酸のセグメントを作製し、その後、セグメントの断片化または酵素消化を含むステップにより約200塩基未満のサイズからなる標的ゲノム核酸のサンプルを生成することにより調製できる。他の実施形態では、標的ゲノム核酸のサンプルをさらに、ゲノム核酸(ニックトランスレーション、ランダムプライミングまたは増幅により作製された標識化核酸を含む)の機械的断片化(例えば、剪断)もしくは酵素的消化(例えばDNase酵素)またはその等価の消化を含む手法を使用して、約200塩基未満、または約175塩基；約150塩基；約125塩基；約100塩基；約75塩基；約50塩基；約40塩基；約30塩基；もしくは約25塩基未満のサイズに(例えば断片化して)調製する。別の実施形態では、ゲノムDNAを断片化するのに十分な剪断力をかけることにより約200塩基未満のサイズにゲノムDNAを断片化すること、その後、剪断されたDNAをDNaseまたはその等価物の酵素消化により約200塩基未軟、または約150塩基；約125塩基；約100塩基；約75塩基；約50塩基；約40塩基；約30塩基；もしくは約25塩基未満のサイズにすることを含む手法を使用することにより、標的ゲノム核酸のサンプル(ニックトランスレーション、ランダムプライミングまたは増幅により作製された標識化標的核酸を含む)を調製する。
【０００６】
この方法において、標的核酸とプローブ核酸とがハイブリダイズ可能な条件は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件、あるいはまた、ストリンジェントな洗浄条件も含むことができる。代替的な実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約55℃から約60℃から約65℃の温度を含み得る。別の実施形態では、ハイブリダイゼーションの温度は、ハイブリダイゼーションステップの間に少なくとも１回(または複数回)変更する。また、以下に記載するように、ハイブリダイゼーションを行う湿度(すなわち水蒸気)量を、ハイブリダイゼーションステップの間に少なくとも１回または数回変更してもよい。温度および/または湿度の変化は、段階的であっても徐々に行ってもよい。変化は、ハイブリダイゼーション手順の間、または任意の一部のハイブリダイゼーションステップにわたって継続し得る。
【０００７】
一実施形態では、ゲノム核酸のサンプルのランダムプライミング、ニックトランスレーションまたは増幅(例えば、変性プライマーを使用して行う)を使用して、検出可能に標識化された塩基対をセグメント中に組み入れた標的ゲノム核酸のセグメントを生成する。あるいはまた、検出可能な部分を塩基対に付着させるように、組み込まれる塩基対が修飾塩基であってもよいしまたは合成類似塩基対であってもよい。一実施形態では、検出可能な標識は、蛍光色素、例えばCy3TMもしくはCy5TMまたはその等価物、ローダミン、フルオレセイン、またはアリール置換型4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン色素もしくはその等価物を含む。
【０００８】
一実施形態では、標的核酸は、ヒト由来のDNAから本質的に構成される。標的ゲノム核酸のサンプルは、染色体の所定の断片、または実質的に１つ以上の染色体全体を表す配列を含み得る。標的ゲノム核酸のサンプルは、実質的にゲノム全体を表す配列を含むことができる。代替的な実施形態では、標的またはプローブ核酸が誘導されるDNAは、マウスまたはヒトゲノムなどの哺乳動物に由来する。
【０００９】
本発明はまた、少なくとも１つの検出可能な部分で標識化されたゲノム核酸の断片を含む標的核酸のサンプルを含む組成物を提供し、該標識化された断片はそれぞれ約200塩基未満の長さからなり、該標識化標的ゲノム核酸のサンプルは、実質的に完全な染色体または実質的に完全なゲノムを表す配列を含むものである。代替的な実施形態では、標的ゲノム核酸は、約175塩基；約150塩基；約125塩基；約100塩基；約75塩基；約50塩基；約40塩基；約30塩基；または約25塩基未満のものである。別の実施形態では、それぞれの標識化断片は、約30塩基〜約150塩基の長さからなる。一実施形態では、組成物の標的核酸は、ヒト由来のDNAから本質的に構成される。標的ゲノム核酸のサンプルは、染色体の所定の断片または実質的に１つ以上の染色体全体を表す配列を含むことができる。標的ゲノム核酸のサンプルは、実質的にゲノム全体を表す配列を含むことができる。代替的な実施形態では、ゲノムは、マウスまたはヒトゲノムなどの哺乳動物ゲノムを含む。代替的な実施形態では、組成物は任意の検出可能な標識を含むことができる(例えば、Cy3TMまたはCy5TMを含むことができる)。
【００１０】
本発明はまた、標的核酸のサンプルおよび印刷物を含むキットを提供し、該標的核酸は検出可能な部分で標識されたゲノム核酸の断片を含み、各標識化断片はそれぞれ約200塩基未満の長さからなり、該標識化標的ゲノム核酸のサンプルは染色体またはゲノムの所定の一部または実質的に全体を表す配列を含み、該印刷物は該標的核酸のサンプルと核酸アレイとのハイブリダイゼーションについての説明書を含むものである。代替的な実施形態では、キットの標的ゲノム核酸は、約175塩基、約150塩基；約125塩基；約100塩基；約75塩基；約50塩基；約40塩基；約30塩基；または約25塩基未満のものである。代替的な実施形態では、標的またはプローブが誘導されるゲノムDNAは、マウスまたはヒトゲノムなどの哺乳動物由来のゲノムを含む。
【００１１】
本発明は、標識化核酸標的のサンプルと複数の核酸プローブとをハイブリダイズさせる方法を提供し、該方法は、(ａ)蛍光標識化核酸断片を含む核酸標的のサンプルおよび複数の核酸プローブを得るステップであって、該蛍光標識は酸化を受け易いものである、上記ステップ；ならびに(ｂ)ステップ(ａ)の核酸標的と核酸プローブとを、該サンプルと該プローブとがハイブリダイズ可能な条件下で接触させるステップであって、該ハイブリダイゼーション条件は、少なくとも１種の抗酸化剤を含むハイブリダイゼーション溶液の使用を含む、上記ステップを含み、上記溶液中の抗酸化剤の量は該ハイブリダイゼーション条件下で蛍光標識の酸化を阻害するのに十分な量である。一実施形態では、蛍光標識はCy5TMまたはその等価物を含む。代替的な実施形態では、蛍光色素はローダミン、フルオレセイン、またはアリール置換型4,4,-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン色素またはその等価物を含む。
【００１２】
本発明はまた、Cy5TM標識化核酸標的のサンプルと複数の核酸プローブとをハイブリダイズさせる方法を提供し、該方法は、(ａ)Cy5TM標識化核酸断片を含む核酸標的のサンプルおよび複数の核酸プローブを得るステップ；ならびに(ｂ)ステップ(ａ)の核酸標的と核酸プローブとを、該サンプルと該プローブとがハイブリダイズ可能な条件下で接触させるステップであって、該ハイブリダイゼーション条件は、少なくとも１種の抗酸化剤を含むハイブリダイゼーション溶液の使用を含むものである、上記ステップを含み、上記溶液中の抗酸化剤の量はハイブリダイゼーション条件下でCy5TMの酸化を阻害するのに十分な量である。本発明は、少なくとも１種の抗酸化剤を含むCy5TM標識化核酸を含む洗浄溶液を提供し、該溶液中の抗酸化剤量はハイブリダイゼーション条件下でCy5TMの酸化を阻害するのに十分な量である。
【００１３】
本発明は、少なくとも１つの抗酸化剤を含む溶液中にCy5TM標識化核酸のサンプルを含む組成物を提供する。
【００１４】
本発明はまた、少なくとも１つの抗酸化剤を含む溶液中の蛍光標識化核酸のサンプルと、別の核酸とのハイブリダイゼーション反応における該標識化核酸の使用に関する説明書を含む印刷物とを含むキットを提供する。代替的な実施形態では、蛍光色素はローダミン、フルオレセイン、またはアリール置換型4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン色素またはその等価物を含む。本発明はまた、少なくとも１つの抗酸化剤を含む溶液中のCy5TM標識化核酸のサンプルと、別の核酸とのハイブリダイゼーション反応における該Cy5TM標識化核酸の使用に関する説明書を含む印刷物とを含むキットも提供する。本キットは、少なくとも１つの抗酸化剤を含む洗浄溶液などの洗浄溶液をさらに含んでいてもよい。
【００１５】
代替的な実施形態では、溶液(例えば、ハイブリダイゼーション溶液、洗浄溶液および/または他の溶液)中に抗酸化剤が、約25 mM〜約１M、約50 mM〜約750 mM、約50 mM〜約500 mM、および約100 mM〜約500 mMの濃度で存在する。
【００１６】
上記組成物および方法において、代替的な実施形態では、抗酸化剤は、メルカプト含有化合物またはその等価物、例えば、2-メルカプト-エチルアミン、チオールN-アセチルシステイン、オボチオール、4-メルカプトイミダゾールなどを含む。別の実施形態では、抗酸化剤は、アスコルビン酸(ビタミンＣ)、またはトコフェロール(ビタミンＥ)、またはその等価物などの抗酸化性ビタミン含有化合物を含む。別の実施形態では、抗酸化剤は、ｎ-没食子酸プロピルなどの没食子酸プロピル、またはその等価物を含む。別の実施形態では、抗酸化剤はβカロチンまたは等価物を含む。別の実施形態では、抗酸化剤は、ブチルヒドロキシトルエン(BHT)もしくはブチルヒドロキシアニソール(BHA)、またはその等価物を含む。
【００１７】
本発明は、核酸標的のサンプルと複数の固定化核酸プローブとをハイブリダイズさせる方法を提供し、該方法は、(ａ)核酸標的のサンプルおよび複数の固定化核酸プローブを得るステップ；ならびに(ｂ)ステップ(ａ)の核酸標的と核酸プローブとを、該サンプルと該プローブとがハイブリダイズ可能な条件下で接触させるステップであって、該ハイブリダイゼーション条件は、不飽和湿度環境を含む制御されたハイブリダイゼーション環境を含むものである。代替的な実施形態では、不飽和湿度環境を、約90％の湿度、約80％の湿度、約70％の湿度、約60％の湿度、約50％の湿度、約40％の湿度、約30％の湿度、および約20％の湿度に制御する。
【００１８】
一実施形態では、制御された環境の湿度を、ステップ(ｂ)のハイブリダイゼーションの間に周期的に変化させる。変化は、段階的でも徐々であってもよい。湿度は、任意の回数かつ任意の時間の長さで変化させることができる。代替的な実施形態では、湿度は、約３時間間隔、約２時間間隔、約１時間間隔、約30分間隔、約15分間隔もしくは約５分間隔、またはそれらの組合せで周期的に変化させる。
【００１９】
一実施形態では、ハイブリダイゼーション条件は、制御された温度環境を含む。制御された環境の温度は、ステップ(ｂ)のハイブリダイゼーションの間に周期的に変化させることができる。変化は、段階的でも徐々であってもよい。温度は、任意の回数かつ任意の時間の長さで変化させうる。代替的な実施形態では、温度は、約３時間間隔、約２時間間隔、約１時間間隔、約30分間隔、約15分間隔もしくは約５分間隔、またはそれらの組合せで周期的に変化させる。
【００２０】
本発明は、ハウジング中の湿度を測定および制御するためのコンポーネントを含むハウジング中の固定化核酸のアレイを含む組成物を提供する。一実施形態では、ハウジングは、ハウジング中の温度を測定および制御するためのコンポーネントをさらに含む。ハウジングは、湿度および温度の制御をプログラム化または初期設定することが可能なコンポーネントをさらに含んでもよい。
【００２１】
本発明は、湿度制御されたハウジング中の固定化プローブ核酸のアレイを提供し、該ハウジングは、該プローブとハイブリダイゼーション水溶液中の標的とのハイブリダイゼーションの間に該ハウジング中の湿度量を制御するための手段を含むものである。
【００２２】
本発明は、湿度制御されたハウジング中の固定化プローブ核酸のアレイを提供し、該ハウジングは、該プローブとハイブリダイゼーション水溶液との接触の間に該ハウジング中の湿度量を制御可能な加湿コンポーネントを含むものである。
【００２３】
本発明は、ハウジング中の固定化核酸のアレイと、印刷物とを含むキットを提供し、該ハウジングは該ハウジング中の湿度量を制御するためのコンポーネント、該ハウジング中の温度を制御するためのコンポーネント、ならびに湿度および温度の制御を初期設定またはプログラム化するためのコンポーネントを含み、該印刷物は該ハウジング中の条件を初期設定またはプログラム化して、核酸ハイブリダイゼーションステップの間の湿度および温度の変動を含む制御されたハイブリダイゼーション条件下で標的とアレイの固定化核酸とをハイブリダイズさせるための説明書を含むものである。
【００２４】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細については、添付の図面および以下の記載において説明する。本発明の他の特徴、目的および利点は、詳細な説明、図面および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００２５】
ここで、本明細書で引用する全ての文献、特許、特許出願、GenBank配列、およびATCC寄託物は全てあらゆる目的のために参照により本明細書に援用する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
詳細な説明
本発明は、アレイ利用型核酸ハイブリダイゼーションのための新規な方法および組成物を提供する。例えば、「アレイ利用型比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)」におけるように、ゲノムDNAから誘導した標的核酸と固定化核酸プローブとのハイブリダイゼーションにより、ゲノムDNAの分子プロフィールを作成するための新規な方法および組成物を提供する。
【００２７】
一実施形態では、本発明は、ゲノムDNAから誘導された標的核酸と、例えばアレイ形式の固定化核酸プローブとのハイブリダイゼーションにより、１つ以上のゲノム、またはゲノムの所定の一部(例えば、染色体または染色体の一部)の分子プロフィールを作成する方法を提供する。本方法は、固定化核酸セグメント(例えば、クローン化DNA)と、検出可能な部分で標識されたゲノム核酸の断片を含む標的核酸のサンプルとを接触させることを含む。標識化断片はそれぞれ、約200塩基未満の長さからなる。この小さいサイズに限定された標識化ゲノムDNAを使用することで、例えばアレイ利用型CGHにおける分子プロフィール分析の解像度が有意に改善される。例えば、このような小さい断片を使用することによって、固定化核酸上での反復配列および他の所望でない「バックグラウンド」交差ハイブリダイゼーションを有意に抑制することが可能となる。反復配列ハイブリダイゼーションの抑制は、コピー数の差(例えば、増幅もしくは欠失)の検出またはユニークな配列の検出の信頼性を非常に高める。
【００２８】
標識化ゲノムDNAは、30％を上回る反復配列、およびさらに未知の割合の関係の近い配列を含む雑多な混合物である。従来のプロトコール、特にCGH法は、本発明の組成物および方法の(約200塩基未満の)断片よりも有意に長い標識化ゲノム断片を使用して、固定化ゲノムDNA(例えば、固定化中期染色体または核酸アレイ)とハイブリダイズさせる。これらの長い配列は、反復配列および関係の近い配列との無視できない量の所望でない交差ハイブリダイゼーションを生じさせる。約200塩基未満の標識化標的ゲノム核酸を使用して本発明の方法を実施することで、従来のプロトコールを使用した場合に見とめられる反復配列ハイブリダイゼーションおよび関係の近い配列からの交差ハイブリダイゼーションの量が有意に減少する。解像度も有意に高くなり得る。
【００２９】
本発明は、特定の作用メカニズムに限定されるものではないが、本発明の方法の優れた有効性は、小さいサイズ(すなわち、約200残基未満)に断片化されたDNAプローブが、中程度またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件(例えば、アレイ利用型CGHで典型的に使用される条件)下で、関係の近い配列に部分的にハイブリダイズする可能性が低いことに帰するかもしれない。標的配列が十分に小さい場合、特にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では、完全に適合した配列のみが特定のハイブリダイゼーション温度においてハイブリダイズする。例えば、一つの計画例では、２つの200塩基DNA分子が、65℃にて100塩基が対合して二重らせん分子を形成する；２本の100塩基一本鎖ぶら下がり端部が残る。これらの「ぶら下がり」一本鎖端部は、他のDNA分子にさらにハイブリダイズする可能性がある。しかし、分子の一方または両方のサイズが200塩基未満になるに伴い(ハイブリダイズするセグメントは100塩基のままで)、「ぶら下がり端部」のサイズは小さくなり、非ハイブリダイズ端部がさらに別のDNA断片とハイブリダイズする(そして「凝集ハイブリダイゼーション」を生じる)可能性も比例して減少する。アレイ利用型CGHなどのマイクロアレイハイブリダイゼーションでは、この「凝集ハイブリダイゼーション」は、ハイブリダイゼーションの定量性を低くするだけではなく、高いバックグラウンドも生じる。従って、本発明の組成物および方法は、約200塩基未満(例えば、約25から約30〜約150塩基、または約50〜約100塩基)の範囲のサイズの断片化DNAプローブを提供する。一実施形態では、ゲノムDNAから誘導した標識化核酸の断片を、まず、ランダムプライミング、ニックトランスレーション、増幅、またはその等価な手法により調製する。その後、約200塩基未満、約25〜約30塩基程度の小さいサイズに断片化する。ランダムプライミング、ニックトランスレーション、または変性プライマーを用いた増幅は、典型的に約200〜約500塩基のサイズにわたる標識化断片を生成する。剪断力を用いて、この標識化核酸を断片化できる。しかし、剪断により、DNAを200塩基未満のサイズに断片化することは非常に難しい。従って、追加の技術(例えばDNaseによる酵素消化まは等価な手法)を使用して、本発明の方法および組成物における標的として使用する小さい標識化断片を生成する。
【００３０】
固定化アレイDNAとハイブリダイズさせるために用いる標識化ゲノム核酸のサイズを制御することに加えて、本発明はまた、溶液中(特にハイブリダイゼーション溶液中)での酸化を受け易い核酸−標識コンジュゲートの安定性を高める組成物および方法も提供する。フリーラジカルを含む酸化剤に感受性を有する標識としては、多数の蛍光色素(特にCy5TM)が挙げられる。蛍光色素の酸化は、その検出可能なシグナルを伝達する能力を弱める。従って、色素を酸化させることができる組成物または条件の存在は、ハイブリダイゼーション反応の結果に悪影響を与え得る。これは、ハイブリダイゼーションシグナルを定量的に検出および分析する場合に特に重要である。従って、本発明の組成物および方法における抗酸化剤およびフリーラジカル形成阻害剤の使用により、例えば蛍光体(fluor)からの検出可能なシグナルのレベルを有意に高めることができる。非常に低いまたは少量の蛍光体を検出する必要がある場合にはさらに少量の蛍光体の保護が重大となり得る。
【００３１】
比較ハイブリダイゼーション(CGH)の現行の体系の１つとして、蛍光色素Cy3TMおよびCy5TMを使用して、２つのサンプルからの核酸断片(例えば対照対被験細胞または組織から得た核酸)を区別をつけて（示差的に）標識化することがある。Cy3TMおよびCy5TMは、それらの優れたスペクトル特性および安定性のために、現行の比較ハイブリダイゼーションプロトコールにおいてほぼ独占的に使用されている。多くの市販の機器がこれらの２つの色素の検出に適応するように設計されている。
【００３２】
しかし、Cy5TMは、現在使用されているほとんどのハイブリダイゼーション溶液中で安定しない。本発明の以前は、標識化反応におけるCy5TMシグナルの損失は、Cy5TM取り込み率が低いせいだと誤って考えられていた。Cy5TM利用コンジュゲートの核酸断片への取込みは、典型的にゲノムDNAサンプルのプライマー伸長により生じる。本発明は、任意の特定の作用メカニズムに限定されるものではないが、本発明者らは、高い温度における(例えばアレイ利用型CGHハイブリダイゼーションおよび他のストリンジェントなハイブリダイゼーション手順において使用する温度における)Cy5TMの不安定性は、ラジカル攻撃を受け易い分子骨格にある長い不飽和炭素鎖によるものであることを見出した。Cy5TMもしくは蛍光色素または他の酸化を受けやすい化合物の安定性を高めるために、本発明は、ハイブリダイゼーション混合物(一実施形態では、ハイブリダイゼーションおよび洗浄溶液)に、抗酸化剤およびフリーラジカルスカベンジャーを取り込む方法および組成物を提供する。本発明の方法および組成物を用いれば、Cy5TMシグナルが劇的に高まり、より長いハイブリダイゼーション時間が可能になる。
【００３３】
ハイブリダイゼーション感度をさらに高めるために、本発明は、新規なハイブリダイゼーション形式、すなわち方法を提供する。本発明の一実施形態では、制御された不飽和湿度環境においてハイブリダイゼーションを行う(現行の方法/プロトコールは、典型的に100％またはほぼ飽和状態の湿度を使用する、例えばShalon(1996) Genome Res. 6:639-6450を参照)。本発明のこの実施形態では、ハイブリダイゼーション効率が、湿度が飽和状態でない場合に有意に改善された。
【００３４】
本発明の別の実施形態では、湿度が動的に制御された場合に(すなわち、ハイブリダイゼーションの間に湿度が変化した場合に)、ハイブリダイゼーション効率がさらに改善される。動的に均衡化した湿度環境では物質伝達が促進されうる。ハイブリダイゼーション環境における湿度は、段階的または継続的に調節され得る。ハウジングと、ハイブリダイゼーション前段階、ハイブリダイゼーション段階、洗浄段階および/または検出段階の間に操作者が湿度を制御できるようにする制御器とを含むアレイ装置も提供する。一実施形態では、本装置は、検出コンポーネント、制御コンポーネントおよびメモリコンポーネントを有して、ハイブリダイゼーション前ステップ、ハイブリダイゼーションステップ、洗浄ステップ、および検出ステップを含む全手順サイクルの間の湿度(ならびに温度(以下参照)および他のパラメータ)の前もったプログラム化を可能にする。
【００３５】
本発明の新規なハイブリダイゼーション方法はまた、温度変動を含むハイブリダイゼーション条件を提供する。湿度が制御可能に変化する場合に見とめられるのと同様に、物質伝達は動的に均衡化された温度環境においても促進される。ハイブリダイゼーションは、温度が正確または比較的一定(例えば、大半の市販の炉のように±２〜３℃ほど)のレベルに設定されている条件に比べて、温度変化環境においてより良い効率を有する。本発明は、任意の特定の作用メカニズムに限定されるものではないが、温度または湿度変動のいずれかにより生じる混合（mixing）はハイブリダイゼーション効率を高める。上記したように、本発明はまた、正確に制御された環境(温度、湿度および他の要素の動的制御を含む)条件下でアレイ利用型ハイブリダイゼーションを行うための装置も提供する。反応チャンバー温度は、例えば炉もしくは温度変化を作れる他の装置により変動的に変えられ得る。
【００３６】
本発明の新規ハイブリダイゼーション方法は、浸透変動を含むハイブリダイゼーション条件も提供する。ハイブリダイゼーション効率(すなわち、平衡に対する時間)も、高/低張性の変化(例えば溶質勾配)を含むハイブリダイゼーション環境により向上され得る。一実施形態では、装置内で溶質勾配を作る。装置の一例では、低塩濃度ハイブリダイゼーション溶液をアレイハイブリダイゼーションチャンバーの一方の側に入れ、それよりも高い塩濃度の緩衝液を他方の側に入れて、チャンバー内に溶質勾配を作る。
定義
特に定義しない限り、本明細書中で使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解される意味を有する。本明細書に使用する場合、以下の用語は、特に明示しない限り与えられた意味を有する。
【００３７】
「抗酸化剤」という用語は、水溶液中での蛍光色素(特に蛍光色素Cy5TM)などの第２の化合物の酸化を阻害または防止することが可能なあらゆる化合物を含む。従って、この用語はまた、抗フリーラジカル保護作用を示す全ての化合物を含む。抗酸化剤およびフリーラジカルスカベンジャーは以下に詳細に記載する。ハイブリダイゼーションの間に酸化を受けやすい化合物に対して任意の程度の保護効果を有する(すなわち、ハイブリダイゼーション手順の間に酸化されるCy5TM蛍光色素が少ない)場合に、ある化合物は、抗酸化剤またはフリーラジカル阻害剤として有効であると考えられる。
【００３８】
本明細書で使用する「アリール置換型4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン色素」という用語は、全ての「ボロンジピロメテンジフルオリド蛍光色素(蛍光団)」すなわち「BODIPY」色素および「ジピロメテンボロンジフルオリド色素」(例えば米国特許第4,774,339号を参照)またはその等価物を含み、ハイブリダイゼーション反応において使用された場合に核酸の検出のために核酸を標識化するのに一般的に使用される蛍光色素のクラスである。例えばChen(2000) J. Org Chem. 65:2900-2906: Chem (2000) J. Biochem. Biophys. Methods 42:137-151を参照。米国特許第6,060,324号；同第5,994,063号；同第5,614,386号；同第5,248,782号；同第5,227,487号；同第5,187,288号も参照のこと。
【００３９】
「シアニン５」または「Cy5TM」および「シアニン３」または「Cy3TM」という用語は、以下に詳細に記載するAmersham Pharmacia Biotech(Piscataway, NJ)(Amersham Life Sciences, Arlignton Heights, IL)製の蛍光シアニン色素、またはその等価物を指す。米国特許第6,027,709号；同第5,714,386号；同第5,268,486号；同第5,151,507号；同第5,047,519号を参照。これらの色素は、典型的に、Cy5TMまたはCy3TMに結合した5-アミノ-プロパギル-2'-デオキシシチジン5'-トリホスフェートの形式で核酸に取り込まれる。図１を参照のこと。
【００４０】
本明細書で使用する「蛍光色素」という用語は、ローダミン色素(例えば、テトラメチルローダミン、ジベンゾローダミン、例えば米国特許第6,051,719号を参照)；フルオレセイン色素；「BODIPY」色素および等価物(例えばジピロメテンボロンジフルオリド色素、例えば米国特許第5,274,113号を参照)；1-[イソインドリル]メチレン-イソインドールの誘導体(例えば米国特許第5,433,896号を参照)；ならびに全ての等価物を含む、全ての公知の蛍光色素を含む。米国特許第6,028,190号；同第5,188,934号も参照のこと。
【００４１】
本明細書で使用する「と特異的にハイブリダイズする」、「特異的なハイブリダイゼーション」および「と選択的にハイブリダイズする」という用語は、核酸分子が、ストリンジェントな条件下で、特定のヌクレオチド配列と優先的に結合、二重らせん化、またはハイブリダイズすることを指す。「ストリンジェントな条件」という用語は、プローブがその標的サブ配列に優先的にハイブリダイズし、他の配列には低い程度でまたは全くハイブリダイズしない条件を指す。核酸ハイブリダイゼーションの文脈(例えば、アレイ、サザンまたはノーザンハイブリダイゼーション)における「ストリンジェントな条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列に依存的であり、異なる環境パラメータ下で異なる。本発明の範囲内の核酸を同定するために使用できるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、例えば、50％ホルムアミド、5×SSC、および１％SDSを含む緩衝液中で42℃でのハイブリダイゼーション、または5×SSC、および１％SDSを含む緩衝液中で65℃でのハイブリダイゼーション(両方とも0.2×SSCおよび0.1％SDSで65℃での洗浄を伴う)が挙げられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、40％ホルムアミド、1M NaClおよび１％SDSの緩衝液中で37℃でのハイブリダイゼーション、ならびに1×SSC中45℃での洗浄も挙げられる。あるいはまた、0.5 M NaHPO4、７％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、１mM EDTA中で65℃でのフィルタ結合DNAへのハイブリダイゼーション、および0.1×SSC/0.1％SDS中で68℃での洗浄を使用して、本発明の範囲内の核酸を同定および単離できる。当業者であれば、代替的だが匹敵するハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を利用して、同様のストリンジェンシーの条件を得ることができることを容易に理解するであろう。しかし、ハイブリダイゼーション形式の選択は重大ではなく、当該分野において知られているように、核酸が本発明の範囲内にあるか否かを決定する条件を示すのは洗浄条件のストリンジェンシーである。本発明の範囲内にある核酸を同定するために使用する洗浄条件としては、例えば、約0.02モルで、pH 7の塩濃度、および少なくとも約50℃または約55℃〜約60℃の温度；約0.15 M NaClの塩濃度で72℃にて約15分間；約0.2×SSCの塩濃度で少なくとも約50℃または約55℃〜約60℃の温度で、約15〜約20分間；ハイブリダイゼーション複合体を、0.1％SDSを含む約２×SSCの塩濃度の溶液で室温にて15分間２度洗浄し、その後、0.1％SDSを含む0.1×SSCで68℃にて15分間２度洗浄すること；または等価な条件が挙げられる。洗浄のためのストリンジェントな条件はまた、例えば、0.2×SSC/0.1％SDSで42℃であってもよい。核酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド(「オリゴ」)である場合、ストリンジェントな条件は、6×SSC/0.05％ピロリン酸ナトリウム中で37℃(14塩基オリゴの場合)、48℃(17塩基オリゴの場合)、55℃(20塩基オリゴの場合)、および60℃(23塩基オリゴの場合)での洗浄を含み得る。等価なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の詳細な説明、ならびに試薬および緩衝液(例えばSSC緩衝液ならびに等価な試薬および条件)についてはSambrook, AusubelまたはTijssen(以下で引用)を参照のこと。
【００４２】
本明細書で使用する「検出可能な組成物での標識（化）」または「検出可能な部分での標識（化）」という用語は、以下に詳細に記載するような検出可能な組成物(すなわち標識)を付加した核酸を指す。これには、例えばニックトランスレーション、ランダムプライマー伸長、変性プライマーを用いた増幅などによる核酸への標識化塩基(または検出可能な標識に結合可能な塩基)の取込みが挙げられる。標識は、例えば、可視的、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、物理的または化学的手段などの任意の手段により検出できる。
【００４３】
「ゲノムDNAの分子プロフィール」という用語は、DNAの対照(例えば、「正常」)サンプルと比べて、ゲノムDNAを表す核酸の被験サンプルにおける増幅、欠失および/またはユニークな配列の領域の検出を意味する。
【００４４】
本明細書で使用する「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを指す。この用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。この用語はまた、合成骨格を有する核酸様構造も含む。本発明が提供するDNA骨格類似体としては、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルホスホトリエステル、スルファメート、3'-チオアセタール、メチレン(メチルイミノ)、3'-N-カルバメート、モルホリノカルバメート、およびペプチド核酸(PNA)が挙げられる；Oligonucleotides and Analogues, a Practical Approach, F.Eckstein編, IRL Press at Oxford University Press (1991)；Antisense Strategies, Annals of the New York Academy of Sciences, Volume 600, BasergaおよびDenhardt編(NYAS 1992)；Milligan (1993) J. Med. Chem. 36:1923-1937；Antisense Research and Applications (1993, CRC Press)を参照。PNAは、N-(2-アミノエチル)グリシンユニットなどの非イオン性骨格を含む。ホスホロチオエート連結は、例えば、米国特許第6,031,092号；同第6,001,982号；同第5,684,148号に記載されている；WO 97/03211；WO 96/39154；Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197も参照のこと。この用語により包含される他の合成骨格としてはメチル-ホスホネート連結または代替的なメチルホスホネートおよびホスホジエステル連結(例えば、米国特許第5,962,674号；Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698を参照)、ならびにベンジルホスホネート連結(例えば、米国特許第5,532,226号；Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156を参照)を包含する。核酸という用語は、遺伝子、DNA、RNA、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチドプライマー、プローブおよび増幅産物と互換的に用いる。
【００４５】
本明細書で使用する「アレイ」、「マイクロアレイ」、「DNAアレイ」、「核酸アレイ」または「バイオチップ」という用語は、複数の標的エレメントであり、各標的エレメントは、以下に詳細に記載するようにサンプル核酸とのハイブリダイゼーションのために固相表面に固定化された所定の量の１つ以上の核酸分子、またはプローブ(以下に定義)を含む。本明細書で使用する「プローブ」または「核酸プローブ」という用語は、標的核酸のサンプルとのハイブリダイゼーション(以下に定義)が検出され得る１つ以上の核酸断片(例えば固定化核酸、例えば核酸アレイ)の集合として定義される。
【００４６】
本明細書で使用する「核酸標的のサンプル」または「核酸のサンプル」という用語は、他の核酸、ポリペプチドもしくはそれらの組合せ(例えば固定化プローブ)へのハイブリダイゼーションに適した形態の(例えば、可溶性水溶液としての)DNAもしくはRNA、または天然由来源から単離されたDNAもしくはRNAを表す核酸を含むサンプルを指す。核酸は単離、クローニングまたは増幅されたものとしうる。例えば、実質的にゲノム全体、特定の染色体の実質的に全体もしくは一部、または選択された配列(例えば特定のプロモーター、遺伝子、増幅もしくは制限断片、cDNAなど)から得るゲノムDNA、mRNA、もしくはcDNAであり得る。核酸サンプルは、特定の細胞または組織から抽出され得る。核酸サンプルが調製される細胞または組織サンプルは、典型的に、ゲノム核酸塩基置換、増幅、欠失および/または転座を伴う遺伝子欠陥または遺伝子関連病状もしくは状態(例えば、癌)を有すると疑われる患者から採取される。細胞および組織サンプルを単離する方法は、当業者に周知であり、吸引、組織切片、針生検などが挙げられるがこれらに限定されない。サンプルは、組織学的目的のために採られた冷凍切片またはパラフィン切片などの組織切片を含む、患者から得たサンプルである「臨床サンプル」であることが多い。サンプルは、細胞培養物由来の(細胞の)上清または細胞自体、染色体異常を検出するかもしくはアンプリコンのコピー数を決定することが望ましい組織培養物および他の培地由来の細胞からも誘導され得る。場合により、ハイブリダイゼーションの前にPCRなどの標準的技術を用いて核酸は増幅され得る。代替的な実施形態では、標的核酸は、未標識であるかまたは(例えば本明細書に記載するように)標識化されて、プローブ(例えば、アレイに固定化されたオリゴヌクレオチドまたはクローン)への結合を検出できるようにしてもよい。プローブは、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅産物の集合、実質的に染色体全体もしくは染色体断片、または実質的にゲノム全体の１つ以上の特定(予め選択された)部分から得た核酸の供与源から生成され、該供与源を集合的に表し得る(例えばクローンの集合として、例えばBAC、PAC、YACなど(以下参照))。プローブまたはゲノム核酸サンプルは、なんらかの手法(例えば反復核酸のブロッキングもしくは除去、または選択核酸での富化)により処理されていてもよい。
核酸の生成および操作
本発明は、核酸アレイを含む組成物、および核酸ハイブリダイゼーション反応を行う方法を提供する。本明細書に記載するように、分析のための標識化標的核酸、およびアレイ上の固定化核酸は、染色体の所定の部分もしくは全体、またはゲノム全体を含むゲノムDNAを表し得る。いくつかの実施形態では、本発明のアレイおよび方法は、アレイ上での比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)反応を含む比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)反応において使用される(例えば、米国特許第5,830,645号；同第5,976,790号を参照)。これらの反応は、被験サンプルと対照サンプルとの遺伝子組成を比較する。例えば、「陰性」対照(例えば「正常」野生型遺伝子型)または「陽性」対照(例えば公知の癌細胞もしくは公知の欠陥(例えば転座もしくは増幅など)を有する細胞)と比べて、(例えば遺伝子欠陥を有すると疑われる細胞から得た)ゲノムDNAの被験サンプルが、増幅、欠失または突然変異を有するセグメントを含むか否かを比較する。
【００４７】
他の実施形態では、被験サンプルは、染色体もしくはゲノムの所定の部分、またはゲノム全体を表す核酸の断片を含む。被験サンプルは、例えば検出可能な部分(例えば蛍光色素)により標識化され得る。典型的に、被験サンプル核酸は蛍光色素で標識化され、対照(例えば「正常」)サンプルは第２の色素(例えばCy3TMおよびCy5TM)で標識化される。被験および対照サンプルを両方とも、(例えばアレイ上の)固定化プローブにアプライし、ハイブリダイゼーションおよび洗浄後に、各色素の位置(例えばアレイ上のスポット)および量を読み取る。固定化核酸は、染色体またはゲノムの任意の部分または全体を表し得る。アレイに固定化される場合、この核酸は、本明細書に記載するようにクローンDNAの形態(例えばYAC、BAC、PACなど)であり得る。アレイ技術の典型として、アレイ上の各「スポット」は既知の配列(例えばゲノムまたは他の配列の既知のセグメント)を有している。本発明は、科学文献および特許文献に明確に記載されている当該分野で公知の任意の方法、プロトコールまたは装置で実施され得る。
全般的技術
本発明を実施する際に使用する核酸は、RNA、cDNA、ゲノムDNA、ベクター、ウイルスまたはそれらのハイブリッドに関わらず、様々な供与源から単離され、遺伝子操作され、増幅され、および/または組換え発現/組換え生成され得る。細菌細胞に加えて、例えば哺乳動物、酵母、昆虫または植物細胞発現系などを含む任意の組換え発現系を使用できる。
【００４８】
あるいはまた、これらの核酸は、例えば、Carruthers (1982) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418；Adams (1983) J.Am.Chem. Soc. 105:661；Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444；Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380；Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896；Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90；Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109；Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859；米国特許第4,458,066号に記載されるような周知の化学合成技術によりin vitroで合成されたものであってもよい。その後、相補鎖を合成して適切な条件下で鎖を互いにアニーリングするか、またはプライマー配列と共にDNAポリメラーゼを用いて相補鎖を付加させるかのいずれかにより二本鎖DNA断片を得てもよい。
【００４９】
例えば、サブクローニング、プローブの標識化(例えば、クレノウポリメラーゼを用いたランダムプライマー標識化、ニックトランスレーション、増幅)、配列決定、ハイブリダイゼーションなどの核酸を操作するための技術は、科学文献および特許文献に明確に記載されている。例えば、Sambrook編, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL(第２版), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel編 John Wiley and Sons, Inc., New York (1997)；LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen編 Elsevier, N.Y. (1993)を参照のこと。
【００５０】
本発明の組成物および方法において使用される核酸を得て、操作するための別の有用な手段は、ゲノムサンプルからクローニングすることであり、必要であれば、例えばゲノムクローン、cDNAクローンまたは完全ゲノムDNAの他の供与源から単離(または増幅)されたインサートをスクリーニングおよび再クローニングすることである。従って、本発明の方法および組成物において使用されるゲノム核酸の形態(アレイおよび被験サンプルを含む)は、例えば哺乳動物人工染色体(例えば、Ascenzioni (1997) Cancer Lett. 118:135-142；米国特許第5,721,118号；同第6,025,155号を参照)(ヒト人工染色体を含む、例えば、Warburton (1997) Nature 386:553-555；Roush (1997) Science 276:38-39；Rosenfeld (1997) Nat.Genet.15:333-335を参照)；酵母人工染色体(YAC)；細菌人工染色体(BAC)；P1人工染色体(例えば、Woon (1998) Genomics 50:306-316；Boren (1996) Genome Res. 6:1123-1130を参照)；PAC(バクテリオファージP1由来ベクター、例えばIoannou (1994) Nature Genet. 6:84-89；Reid (1997) Genomics 43:366-375；Nothwang (1997) Genomics 41:370-378；Kern (1997) Biotechniques 23:120-124を参照)；コスミド、プラスミドもしくはcDNAに含まれるかそれから全体的に構成されるゲノムまたはcDNAライブラリーを含む。BACは、120 Kb以上のインサートを含むベクターである。BACは、大腸菌Ｆ因子プラスミド系に基づき、マイクログラムの量での操作および精製が簡単である。BACプラスミドは、細胞当たり１〜２コピーに維持されているため、本方法でも採用され得るYACで見とめられる再配置の問題が無くなる；例えば、Asakawa (1997) Gene 69-79；Cao (1999) Genome Res. 9:763-774を参照。BACベクターは、例えばルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質遺伝子などのマーカー遺伝子を含んでもよい(例えば、Baker (1997) Nucleic Acids Res 25:1950-1956を参照)。YACも使用でき、80〜700 kbのサイズにわたるインサートを含むことができる(例えば、Tucker (1997) Gene 199:25-30；Adam (1997) Plant J.11:1349-1358；Zeschnigk (1999) Nucleic Acids Res. 27:21を参照)。P1は、75〜100 KbのDNAインサートを含み得る大腸菌に感染するバクテリオファージであり(例えば、Mejia (1997) Genome Res 7:179-186；Ioannou (1994) Nat Genet 6:84-89を参照)、λライブラリーとほぼ同様にスクリーニングされる。Ashworth (1995) Analytical Biochem. 224:564-571；Gingrich (1996) Genomics 32:65-74も参照のこと。配列、インサート、クローン、ベクターなどは、ATCCもしくはGenBankライブラリーなどの供与源または市販の供与源から得られる天然由来源から単離され得るか、または合成もしくは組換え方法により調製される。
核酸の増幅
オリゴヌクレオチドプライマーを用いた増幅を利用して、本発明の組成物および方法で使用される核酸を生成し、アレイにハイブリダイズした被験サンプルまたは対照サンプルのレベルを検出または測定できる。(典型的に変性プライマーを用いた)増幅も、検出可能なプローブ(例えば、Cy5TM-またはCy3TM-シトシンコンジュゲート)を、固定化ゲノムDNAとハイブリダイズさせるのに使用する被験または対照ゲノムDNAを表す核酸に取り込むために有用である。当業者であれば、適切なオリゴヌクレオチド増幅プライマーを選択および設計できる。増幅方法も当該分野で周知であり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、すなわちPCR(PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Innis編, Academic Press, N.Y. (1990)およびPCR STRATEGIES (1995), Innis編, Academic Press, Inc., N.Y., リガーゼ連鎖反応(LCR)(例えば、Wu (1989) Genomics 4:560；Landegren (1988) Science 241:1077；Barringer (1990) Gene 89:117を参照)；転写増幅(例えば、Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173を参照)；ならびに自己維持配列複製(例えば、Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874を参照)；Ｑβレプリカーゼ増幅(例えば、Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35:1477-1491を参照)、自動化Ｑ-βレプリカーゼ増幅アッセイ(例えば、Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10:257-271を参照)、ならびに他のRNAポリメラーゼ仲介型技術(例えば、NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario)を参照；Berger (1987) Methods Enzymol. 152:307-316；Sambrook; Ausubel；米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号；Sooknanan (1995) Biotechnology 13:563-564も参照)が挙げられる。例えば、増幅プライマーにおけるポリアミド核酸誘導体(PNA)の使用を記載する米国特許第6,063,571号を参照のこと。
核酸のハイブリダイゼーション
本発明の方法を実施し、本発明の組成物を使用する際に、核酸の被験および対照サンプルを、(例えばアレイ上の)固定化プローブ核酸とハイブリダイズさせる。一実施形態では、ハイブリダイゼーション条件および/または洗浄条件は中程度からストリンジェントな条件下で実施される。核酸のハイブリダイゼーションについての広範囲にわたる手引きは、例えば、Sambrook、Ausubel、Tijssenで見つけることができる。一般的に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、所定のイオン強度およびpHにおける特定の配列の熱融解温度(Ｔｍ)よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、50％の標的配列が完全に適合したプローブとハイブリダイズする(所定のイオン強度およびpH下での)温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブのＴｍと等しくなるように選択される。サザンまたはノーザンブロットにおいてアレイまたはフィルタ上に100を上回る相補性残基を有する相補核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、標準ハイブリダイゼーション溶液(例えば、Sambrookを参照)を42℃で使用し、ハイブリダイゼーションを一晩かけて行うことである。高度にストリンジェントな洗浄条件の一例は、0.15 M NaClで72℃にて15分間である。ストリンジェントな洗浄条件の一例は、0.2×SSC洗浄を65℃で15分間行うことである(例えば、Sambrookを参照)。しばしば、高度にストリンジェントな洗浄は、バックグラウンドプローブシグナルを無くすために中程度または低度にストリンジェントな洗浄の後に行われる。例えば100ヌクレオチドを上回る二重らせんのための中程度にストリンジェントな洗浄の一例は、1×SSCで45℃にて15分間である。例えば100ヌクレオチドを上回る二重らせんの低度にストリンジェントな洗浄の一例は、4×〜6×SSCで40℃にて15分間である。
検出可能に標識された核酸
一部の実施形態では、本発明の方法および組成物は、検出可能な部分にコンジュゲートしたゲノムDNAを表すか、検出可能な部分(例えばCy3TMまたはCy5TM)(あるいはまた、それ自体が検出可能な組成物に結合可能な部分)にコンジュゲートしたヌクレオシド塩基が取り込まれている核酸を使用する。被験サンプルは、染色体の一部もしくは全体、またはゲノム全体を表す核酸の標識化断片を含み得る。一実施形態では、被験サンプル核酸をある標識とコンジュゲートさせ、対照サンプルを第２の標識とコンジュゲートさせる。各標識は、区別されて（示差的に）検出できる(例えば、異なるシグナルを発する)。被験および対照サンプルを両方とも、(例えばアレイ上の)固定化プローブにアプライし、ハイブリダイゼーションおよび洗浄後に、各標識の位置(例えば、アレイ上のスポット)および量を同時にまたは逐次読み取る。
【００５１】
有用な標識としては、32P、35S、3H、14C、125I、131I；蛍光色素(例えば、Cy5TM、Cy3TM、FITC、ローダミン、ランタニド蛍光体、テキサスレッド)、高電子密度試薬(例えば、金)、例えばELISAで一般的に使用されるような酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ)、比色標識(例えば、コロイド金)、磁気標識(例えば、DynabeadsTM)、ビオチン、ジオキシゲニン(dioxigenin)、または抗血清もしくはモノクローナル抗体が入手可能なハプテンおよびタンパク質が挙げられる。標識は、検出対象の核酸もしくは他の標的化合物に直接取り込まれるか、または標的とハイブリダイズもしくは結合するプローブもしくは抗体に付加できる。ペプチドは、二次リポーター(例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、転写アクチベーターポリペプチド、金属結合ドメイン、エピトープタグ)により認識される所定のポリペプチドエピトープを(例えば、ヌクレオシド塩基に)取り込むことにより検出可能にできる。標識は、様々な長さのスペーサーアームに付着されて、他の有用なまたは所望の特性に対する潜在的な立体障害または衝突を減少させることができる。例えば、Mansfield (1995) Mol Cell Probes 9:145-156を参照のこと。アレイ利用型CGHでは、典型的に、蛍光体は互いに対合する(一方は標識化対照および他方は被験核酸)。例えば、ローダミンおよびフルオレセイン(例えば、DeRisi (1996) Nature Genetics 14:458-460を参照)、もしくはリサミン(lissamine)コンジュゲート核酸類似体およびフルオレセインコンジュゲートヌクレオチド類似体(例えば、Shalon (1996)前掲を参照)；スペクトルレッド(Spectrum Red)TMおよびスペクトルグリーン(Spectrum Green)TM(Vysis, Downers Grove, IL)、またはCy3TMおよびCy5TM(以下参照)。
【００５２】
シアニンおよび関連する色素(メロシアニン、スチリルおよびオキソノル色素など)は、特に強力な光吸収性および高い発光性を有する(例えば、米国特許第4,337,063号；同第4,404,289号；同第6,048,982号を参照)。一実施形態では、Cy3TMおよびCy5TMは共に使用され、両方ともAmersham Life Sciences (Arlington Heights, IL)製の蛍光シアニン色素である。これらは、ゲノムDNAのサンプルの転写により(例えば、クレノウポリメラーゼを用いたランダムプライマー標識化、「ニックトランスレーション」、増幅、またはそれらの等価な手法により)、「標的」核酸に取り込まれ得る。ここで、これらの反応は、未標識化dCTPと混合されたCy3TM-またはCy5TM-dCTPコンジュゲートを取り込む。製造元の説明書に従い、PCRにより標識化標的を生成する場合、33％改変dCTP対66％非改変dCTPの混合物により標識の最大取り込みが達成される。改変dCTPが50％以上を占める場合、PCR反応は阻害される。Cy5TMは、典型的に、HeNeレーザの633 nm線により励起され、発光は680 nmで採取される。例えば、Bartosiewicz (2000) Archives of Biochem. Biophysics 376:66-73；Schena (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619；Pinkel (1998) Nature Genetics 20:207-211；Pollack (1999) Nature Genetics 23:41-46も参照のこと。
【００５３】
蛍光色素で核酸を標識化する方法、および複数の蛍光団(fluorophore)を同時検出する方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第5,539,517号；同第6,049,380号；同第6,054,279号；同第6,055,325号を参照のこと。例えば、分光写真器は、光検出器の二次元アレイ上に発光スペクトルを画像化できる。従って、アレイの完全なスペクトル的に解像された画像が得られる。蛍光団の光物理(例えば蛍光量子収量および光破壊収量)、ならびに検出器の感度は、オリゴヌクレオチドアレイの読取り時間パラメータである。十分なレーザ出力光、ならびにより低い光破壊収量を有するCy5TMおよび/またはCy3TMを使用した場合、アレイは５秒未満で読み取ることができる。
【００５４】
(例えばCGHにおけるように)Cy3TMおよびCy5TMなどの２つの蛍光体を一緒に使用する場合、両方の蛍光体の合成画像を作成する必要がある。２つの画像を得るために、アレイを同時にまたは逐次走査できる。電荷結合デバイスすなわちCCDが、マイクロアレイ走査システムにおいて一般的に使用される。
【００５５】
データ分析は、例えば、基板位置の関数としての蛍光強度を決定するステップ、「孤立値」(所定の統計的分布から逸脱するデータ)を除去するステップ、または残ったデータから標的の相対結合親和性を計算するステップを含むことができる。得られるデータは、発光または標的とプローブとの結合親和性により異なる色を各領域につけて画像として表示され得る。例えば、米国特許第5,324,633号；同第5,863,504号；同第6,045,996号を参照のこと。本発明はまた、支持体上に位置するサンプル上の標識化マーカーを検出するための装置を採用することができる。例えば、米国特許第5,578,832号を参照のこと。
標識化ゲノム核酸の断片化および消化
本発明は、約200塩基未満から約25〜約30塩基程度に小さい標識化ゲノム断片を用いた方法および組成物を提供する。典型的なCGHプロトコールは、かなり大きい標識化核酸を使用する。実際、一部のプロトコールは、ハイブリダイゼーションの強度および一貫性を改善するために長い断片の使用を推奨している(例えば、Kalloniemi (1994) Genes, Chromosomes and Cancer 10:231-243を参照)。
【００５６】
上述したように、標的標識化核酸のサイズが200塩基未満になると、ハイブリダイズしていない「ぶら下がり端部」のサイズが小さくなり、ハイブリダイズしていない端部が別のDNA断片にさらにハイブリダイズして「凝集ハイブリダイゼーション」を生じる確率も低くなる。アレイ利用型CGHなどのマイクロアレイハイブリダイゼーションの場合、この「凝集ハイブリダイゼーション」は、ハイブリダイゼーションの定量性を低くするだけではなく、高いバックグラウンドの原因となる。従って、本発明の組成物および方法は、断片化DNAプローブを約200塩基未満から約30塩基程度に小さい範囲のサイズとする。
【００５７】
典型的に、ハイブリダイゼーション手順において使用される標識化核酸は、標準「ランダムプライミング」、「ニックトランスレーション」または変性PCR増幅によりゲノムDNAから作成される(例えば、Sambrook, Ausubel；Speicher (1993) Hum. Mol. Genet. 2:1907-1914を参照)。しかし、得られる断片は、平均すると約200〜400塩基以上である(例えば、ニックトランスレーションによりビオチンで標識された総ゲノムDNAが400〜2000塩基のサイズの断片を生成する。Heiskanen (2000) Cancer Res. 60:799-802を参照)。断片の長さは、ニックトランスレーション反応においてDNase対DNAポリメラーゼの比率を調節することにより変えられる。標準的なニックトランスレーションキットは典型的に300〜600塩基対の断片を生成する(例えば、Kalloniemi (1994)前掲を参照)。
【００５８】
標識化核酸を200塩基以下(約25〜30塩基程度の小ささ)のセグメントにさらに断片化するために、例えばDNAエンドヌクレオアーゼ、例えばDNase(例えばHerrera (1994) J. Mol. Biol. 236:405-411；Suck (1994) J. Mol. Recognit. 7:65-70を参照)、または二塩基制限エンドヌクレアーゼCviJI(例えば、Fitzgerald (1992) Nucleic Acids Res. 20:3753-3762を参照)および標準的プロトコール(例えば、他の断片化手順を伴うかまたは伴わないSambrook, Ausubelを参照)を用いてDNAのランダム酵素消化を行う。
【００５９】
ゲノムDNAを断片化するために、例えば、機械的剪断、超音波処理(例えばDeininger (1983) Anal. Biochem. 129:216-223を参照)など(例えばSambrook, Ausubel, Tijssenを参照)の他の手順も使用できる。例えば、１つの機械的技術は、DNAサンプルをシリンジポンプで小さい穴に強引に通した際に生じるポイント・シンク(point-sink)流体力学に基づく（例えば、Thorstenson (1998) Genome Res. 8:848-855を参照のこと）。また、Oefner (1996) Nucleic Acids Res. 24:3879-3886；Ordahl (1976) Nucleic Acids Res. 3:2985-2999も参照のこと。断片のサイズは、例えば、キャピラリー電気泳動において動的サイズふるい(size-sieving)ポリマー溶液を用いてDNA断片化を分析するSiles (1997) J.Chromatogr. A. 771:319-329によるもののようなサイジング(sizing)電気泳動、を含む様々な技術により評価できる。断片のサイズは、例えばマトリックス支援レーザ脱離/イオン化飛行時間質量分析によっても決定できる（例えば、Chiu (2000) Nucleic Acids Res. 28:E31を参照のこと）。
抗酸化剤およびフリーラジカルスカベンジャー
本発明は、多くのものが当該分野で知られている抗酸化剤およびフリーラジカルスカベンジャーを含む方法および組成物を提供する。例えば、一実施形態では、抗酸化剤は、メルカプト含有化合物またはその等価物、例えば、2-メルカプト-エチルアミン、チオールN-アセチルシステイン、オボチオール、4-メルカプトイミダゾールなどを含み得る。アスコルビン酸(ビタミンＣ)もしくはトコフェロール(ビタミンＥ)などのビタミン含有化合物、またはその等価物も使用できる。トコフェロールは、例えば、α-D-トコフェロール、α-DL-トコフェロール、α-D-酢酸トコフェロール、α-DL-酢酸トコフェロール、またはα-D-コハク酸トコフェロール（tocopherol acid succinate）などの改変形態および誘導形態を含むことができる(例えば、米国特許第6,048,891号；同第6,048,988号；同第6,056,897号を参照)。別の実施形態では、抗酸化剤は、ｎ-没食子酸プロピルなどの没食子酸プロピル、またはその等価物を含む。βカロチンもしくはその等価物、またはブチルヒドロキシトルエン(BHT)、ブチルヒドロキシアニソール(BHA)、もしくはその等価物も使用できる。
【００６０】
ペプチドおよびペプチド誘導体もまた抗酸化活性を有することが記載されている。例えば、ラクトフェリンの加水分解物の抗酸化活性を記載する米国特許第5,804,555号を参照のこと。2-メルカプトイミダゾールまたは4-メルカプトヒスチジン誘導体もまた抗酸化活性を有することが記載されている。例えば、それぞれ米国特許第6,056,965号および米国特許第4,898,878号を参照のこと。一部の環状ヒドロキシルアミンは、酸素中心フリーラジカルを捕捉(scavenging)するために有用である。例えば、米国特許第5,981,548号を参照のこと。アスコルビン酸6-パルミテート、ジヒドロリポ酸もまた抗酸化剤として記載されている。例えば、米国特許第5,637,315号を参照のこと。米国特許第5,162,366号も参照のこと。
【００６１】
CGHおよびアレイに使用されるハイブリダイゼーションおよび洗浄溶液は、当該分野で公知である。例えば、Cheung (1999) Nature Genetics Supp. 21:15-19を参照；上記定義の説明も参照のこと。これらの溶液中の抗酸化剤の濃度は、様々な要因(例えば、ハイブリダイゼーションまたは洗浄緩衝液の組成；酸化から「保護される」組成物(例えばCy5TM)の濃度、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件(例えば、時間の長さ、熱、湿度など))に依存する。従って、様々な実施形態では、ハイブリダイゼーション、洗浄または他の溶液中の抗酸化剤の量は、例えば、約25 mM〜約１M、約50 mM〜約750 mM、約50 mM〜約500 mM、ならびに約100 mM〜約500 mMの濃度であり得る。しかし、あらゆる適切な濃度の抗酸化剤またはフリーラジカルスカベンジャーを本発明を実施するために使用できる。
【００６２】
追加の有効な抗酸化剤およびフリーラジカルは容易に決定できる。例えば、薬剤開発の中間成形(preformulation)期における抗酸化剤の高速スクリーニングのための簡単な方法の開発が、例えばUgwu (1999) PDA J. Pharm. Sci. Technol. 53:252-259に記載されている。抗酸化剤の存在下および不在下での溶解酸素欠乏および薬剤消滅速度の同時測定により、テトラヒドロイソキノリン核を含有する酸化し易い薬剤物質を使用して、相対的な抗酸化能を決定できる。例えば、Methods Enzymol. 1990;186:1-766；米国特許第6,031,008号も参照のこと。
アレイ、または「バイオチップ」
本発明は、「アレイ」、「マイクロアレイ」、「DNAアレイ」、「核酸アレイ」または「バイオチップ」(例えば、GeneChips(登録商標), Affymetrix, Santa Clara, CA)の改良型変形形態を提供する。本発明のアレイは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄反応の間の湿度および温度を制御するためのコンポーネントを含むハウジングを含む。
【００６３】
アレイは、一般的に、サンプル核酸とのハイブリダイゼーションのために固相表面に固定化された所定の量の１つ以上の核酸分子またはプローブをそれぞれ含む複数の標的エレメントである。固定化核酸は、特異的なメッセージ(例えば、cDNAライブラリーとして)または遺伝子(例えば、ゲノムライブラリー)から得た配列を含むことができ、例えば、染色体の実質的に全体もしくは一部、またはヒトゲノムを含むゲノムの実質的に全体を含む。他の標的エレメントは、参照配列などを含み得る。アレイの標的エレメントは、異なるサイズおよび異なる密度で固相表面上に配置され得る。標的エレメントの密度は、標識の性質、固相支持体などの多数の要素に依存する。各標的エレメントは、実質的に同じ核酸配列、または異なる長さおよび/もしくは配列の核酸の混合物を含み得る。従って、例えば、標的エレメントは１コピー以上のDNAクローン断片を含んで、それぞれのコピーは本明細書に記載するように異なる長さの断片に切断され得る。標的エレメントに固定化された核酸の長さおよび複雑度は、本発明にとって重要ではない。アレイは、固相表面(例えば、ニトロセルロース、ガラス、石英、溶融シリカ、プラスチックなど)に固定化された核酸を含み得る。例えば、蛍光を測定する場合にシクロオレフィンポリマーを含むマルチウェルプラットフォームを記載する米国特許第6,063,338号を参照のこと。一部の実施形態では、本発明の方法は、例えば、米国特許第6,045,996号；同第6,022,963号；同第6,013,440号；同第5,959,098号；同第5,856,174号；同第5,770,456号；同第5,556,752号；同第5,143,854号に記載されるように、核酸のアレイ上で実施できる。例えば、WO 99/51773；WO 99/09217；WO 97/46313；WO 96/17958も参照のこと；例えば、Johnston (1998) Curr. Biol. 8:R171-R174；Schummer (1997) Biotechniques 23:1087-1092；Kern (1997) Biotechniques 23:120-124；Solinas-Toldo (1997) Genes, Chromosomes and Cancer 20:399-407；Bowtell (1999) Nature Genetics Supp. 21:25-32；Epstein (2000) Current Opinion in Biotech. 11:36-41も参照のこと。
ハイブリダイゼーションの間の湿度および温度の制御
本発明は、ハイブリダイゼーション条件が、制御されたハイブリダイゼーション環境、特に不飽和湿度環境を含む、方法および組成物を提供する。制御された環境の湿度および温度は、ハイブリダイゼーションステップの間、一定でもよいし、または周期的に変化させてもよい。変化は段階的な変化でも、徐々に変化であってもよい。代替的な実施形態では、不飽和湿度環境は、約90％の湿度、約80％の湿度、約70％の湿度、約60％の湿度、約50％の湿度、約40％の湿度、約30％の湿度、および約20％の湿度に制御される。代替的な実施形態では、湿度および/または温度を、約３時間間隔、約２時間間隔、約１時間間隔、約30分間隔、約15分間隔、約５分間隔、またはそれらの組合せで周期的に変化させる。
【００６４】
本発明はまた、湿度および/または温度が制御されたハウジング中の固定化プローブ核酸のアレイを提供する。一実施形態では、このハウジングは、ハイブリダイゼーションの間のハウジング中の湿度および/または温度の量を測定および制御するためのコンポーネントを含む。例えば、本発明の装置は、例えば温度を制御するためのペルチェ熱伝達装置を含む熱制御モジュール(これらはハウジングに組み込まれ得る)などの当該分野で公知の任意の温度検出または制御コンポーネントを含み得る。例えば、このような装置を電気泳動媒体において使用する米国特許第6,017,434号を参照のこと。あるいはまた、本発明の装置は、流体を導入し易いサーモスタット制御された密封チャンバー(例えば、米国特許第5,945,334号を参照)；液体の温度調節操作のためのシステム(例えば、米国特許第5,919,622号を参照)；流体密封式に高温度反応を行うための反応チャンバー(例えば、米国特許第5,882,903号を参照)；流体操作装置を有する生物学的チッププレート(例えば、米国特許第5,874,219号を参照)；または温度制御装置式の反応容器(例えば、米国特許第5,460,780号を参照)を含み得る。本発明の装置はまた、任意の湿度もしくは水蒸気を検出もしくは制御するためのコンポーネント、またはそれらの適合もしくは改変形態も含み得る。このような装置の多くは当該分野において公知である(例えば、ガラス表面上の水分状態を検出するための装置を記載する米国特許第4,436,674号；同第4,618,462号；同第4,921,642号；同第5,620,503号；同第5,806,762号；および同第6,064,059号)。
【００６５】
コンポーネントは、湿度、温度および他の環境パラメータを含むハイブリダイゼーション条件を予めプログラム化することが可能なメモリコンポーネントを含むことができる。
【００６６】
本明細書に記載する実施例および実施形態は、例示のみを目的としたものであり、それらを考慮した上の様々な改変または変更が当業者に示唆され、本明細書の精神および範囲、ならびに特許請求の範囲に含まれることが理解されよう。
【実施例】
【００６７】
以下の実施例は、特許請求する発明を例示するためのものであり、限定するものではない。
実施例１：アレイ利用型核酸ハイブリダイゼーション
以下の実施例は、本発明の方法が、アレイ利用型CGHを実施するための改良された効率的な手段を提供することを実証する。
BACマイクロアレイの作製：
50キロベース(50 kb)を上回り、約300 kbにおよぶBACクローンを、Terrificブロス培地中で成長させた(例えばクローンが300 kbを上回るより大きいインサート、または約１〜20 kbのより小さいインサートも使用できる)。改変アルカリ溶解(lysis)プロトコール(例えば、Sambrookを参照)によりDNAを調製した。米国特許第6,048,695号に記載のように、DNAを化学的に修飾した。次いで、米国特許第6,048,695号に記載されるように、修飾DNAを適切な緩衝液に溶解し、きれいなガラス表面上に直接印刷した。通常、各クローンに対して複数のスポットを印刷した。図２は、これらの調査において使用した不均衡な湿度ハイブリダイゼーション形式の模式図である。
プローブ標識化およびDNase酵素断片化：
標準的なランダムプライミング方法を使用して、ゲノムDNAを標識化した(例えば、Sambrookを参照)。Cy3TMまたはCy5TM標識化ヌクレオチドに共に、対応する標識していないヌクレオチドを0.0対約６(標識していないヌクレオチド対標識化ヌクレオチド)のモル比で添加した。標識化は、37℃にて２〜10時間かけて行った。標識化の後、反応混合物を95℃〜100℃まで３〜５分間加熱して、ポリメラーゼを不活化し、鋳型から新しく生成された標識化「プローブ」核酸を変性させた。
【００６８】
次いで、加熱サンプルを氷上で５分間冷やした。「較正された」DNase(DNAエンドヌクレアーゼ)酵素を加えて、(ランダムプライミングにより作製された)標識化鋳型を断片化した。「微量(trace)」のDNaseを添加して(最終濃度は0.2〜２ng/ml；インキュベーション時間は15〜30分間)、標識化核酸を約30〜約100塩基のサイズのセグメントに消化/断片化した。
Cot I DNAを使用した反復配列のブロッキング
Cot I DNAを、約40〜150塩基のサイズに断片化した。２〜20μgの断片化Cot I DNAを、10〜30μgの剪断サケ精子もしくは精巣DNA(約0.1〜２kbのサイズ)(担体DNA、他の無関係のDNAでもよい)と共に、0.2％〜10％塩基ハイブリダイゼーション緩衝液を含む２×〜６SSPEに溶解させた(例えば、Sambrookを参照)。混合物をアレイ領域にアプライし、その後カバースライドで覆った。アレイを、60℃にて２〜16時間、加湿チャンバーに入れた。
標識化プローブとアレイとのハイブリダイゼーション
(ヒトおよびマウスゲノムDNAの両方から誘導された)それぞれ10,000〜1,000,000ゲノム当量の２つのゲノム断片を、上述したようにCy3TMまたはCy5TM蛍光標識のいずれかを用いてそれぞれ標識化した。その後、これらを約２〜20μgのCot Iおよび約10〜30μgの担持されたDNAまたは約50〜100μgの酵母tRNAと同時沈降させた。混合物を、10〜20μlの塩基性ハイブリダイゼーション緩衝液に溶解させた(上記参照)。
ハイブリダイゼーション緩衝液に添加する抗酸化剤
抗酸化剤ジチオトレイトール(DTT)を、10〜500 mMの濃度で添加して、蛍光色素を安定化させた。他の有用な抗酸化剤としては、例えば、ｎ-没食子酸プロピル、アスコルビン酸(ビタミンＣ)、ビタミンＥ(トコフェロール)、2-メルカプトエチルアミン、または上述したような他のメルカプト含有化合物が挙げられる。混合物をアレイ領域にアプライして、その後カバースライドで覆った(図２を参照)。炉中約90〜95％の平均湿度で約+/-３℃の温度変動で60℃にて一晩加湿チャンバーにおいてハイブリダイゼーションを行った(温度変化自体が密封チャンバー中の湿度に変動を生じ得る)。
湿度状態の変動
実験はまた、不均衡湿度環境が、可溶性標識化核酸と固定化プローブとの間の平衡状態に達するのに必要な時間を有意に短くしたことを実証した。これらの実験において使用する装置の模式図を図２に示す。(「動的」湿度状態を得るための)「未密封」カバースライドおよび(制御100％湿度環境を得るための)密封カバースライドの両方を使用した。
【００６９】
カバースライドを封止して、水蒸気の交換(すなわち動的湿度環境)を防いだ場合、ハイブリダイゼーションの速度は有意に悪かった(平衡状態に達するのに有意に長い時間が必要であった)。アレイ上の固定化プローブにハイブリダイズしたCy3TMまたはCy5TM-生成蛍光の量(すなわち、標識化核酸の量)を測定することにより、ハイブリダイゼーションの速度を決定した。蛍光は、上述したように標準的な装置を用いて測定した。
ハイブリダイゼーション後洗浄
カバースライドを取った後に、アレイを高純度水で数回濯いだ。次いで、0.1〜２×SSCを0.1〜１％SDSおよび５〜10 mM DTT抗酸化剤と共に含む溶液中で、アレイを30〜60秒間洗浄した。次いで、アレイを高純度水で室温(RT)にて十分に濯いだ。
画像取得およびデータ処理：
マイクロアレイ上の蛍光シグナルを走査して画像ファイルを得た(GSI Lumonics (Oxnard, CA)から出ている二色レーザ共焦点スキャナ)。それぞれのアレイにつき、(Cy3TMおよびCy5TMについて)２枚の画像を取得した。プローブ混合物中での標的配列の相対量を表す相対蛍光レベルまたは蛍光比を、バックグラウンドを適切に引いた後に対応する個々のスポットの蛍光強度を比較することで分析した。アレイ上のクローンの位置情報および染色体を相関させた。簡単に見分できるように個々の染色体について比をプロットした。各サンプルにつき２つの実験を行った：(腫瘍DNAから誘導した)Cy5TM標識化核酸、対、(「正常」DNAから誘導した)Cy3TM標識化核酸、および(腫瘍DNAから誘導した)Cy3TM標識化核酸、対、(正常DNAから誘導した)Cy5TM標識化核酸。従って、個々の染色体についてCy5TM対Cy3TM比を共にプロットした場合、２本の比率曲線は互いに対して相互関係を示した。２つの相互実験を行うことで、あらゆる比率の人為産物も簡単に同定できる。
結果：
上記調査では、抗酸化剤を使用しないハイブリダイゼーション反応に比べて、抗酸化剤ジチオトレイトール(DTT)をハイブリダイゼーション緩衝液に添加した場合に、蛍光シグナルが有意に強いことが分かった。さらに、酸化に対する「保護」の程度(すなわち、蛍光色素Cy5TMの安定化)は、抗酸化剤の濃度が高まるにつれて(10 mMから500 mM)高まった。例えば、12時間のハイブリダイゼーションの後、DTTを使用した場合、Cy5TMシグナルは一定のままであった。48時間のハイブリダイゼーションの後、対照(抗酸化剤無し)サンプルは、Cy5TMシグナルの有意な低下を示した(すなわち、シグナルが検出されない非蛍光状態になる程度のCy5TMが酸化した)。対照的にDTT含有サンプルは、比較的一定のままであり、一部のサンプルでは、Cy5TM蛍光が実際に高まった。
【００７０】
上記調査においては、ハイブリダイゼーションの間の「不均衡な」または「動的に変化する」湿度および/または温度環境が、可溶性標識化核酸と固定化プローブ核酸との間の平衡状態に達するまでに必要な時間を有意に短くすることも分かった。
【００７１】
アレイハイブリダイゼーションチャンバー中の湿度が、チャンバー全体でハイブリダイゼーション緩衝液と同じ濃度を有した場合には、湿度はチャンバー全体で比較的一定のままであった。「動的」湿度条件下(すなわち、例えば図２に図示するように作られた環境のように不均衡湿度環境につながる環境)よりも、これらの一定の条件下では(可溶性核酸と固定化プローブとの間の)平衡状態に達するのにより長い時間が必要であった。この装置では、アレイハイブリダイゼーションチャンバーの一方の側に水を入れ、２×ハイブリダイゼーション緩衝液を他方の側に入れた。水を一方の側、２×緩衝液を他方の側に入れることで、湿度勾配をチャンバー内に作った。これにより、カバースライドの４つの端部の周りに湿度の交換が生じ、これは、アレイハイブリダイゼーションチャンバーの湿度を不均衡にした。図２に示す反応チャンバーも不完全に密封して(すなわち、「ゆるく」しか密封せずに)外部環境との湿度の交換を可能にした。
【００７２】
本発明は、特定の作用メカニズムに限定されるものではないが、動的湿度(および同様に、動的温度)状態により、可溶性標識化核酸の自己会合の量が低くなった。このような自己会合は、アレイ上の固定化プローブとのハイブリダイゼーション速度を低下させる。可溶性核酸の自己会合が少なければ、固定化プローブとの会合速度が加速して、平衡状態に達するのに必要な時間が短くなる。
【００７３】
不均衡湿度または温度はまた、可溶性サンプルの動きを高めて、ハイブリダイゼーション処理を加速させ得る。不変化湿度(または温度)環境の場合のように、溶液が比較的静的な場合、物質伝達プロセスは非常に遅い拡散メカニズムに限定される。ゆっくりかつ静的な条件下では、有意な量の可溶性核酸断片が、固定化アレイ標的部位と会合およびハイブリダイズする機会を持つ前に、他の可溶性核酸と会合する。
【００７４】
ハイブリダイゼーション効率(すなわち、平衡状態になるまでの時間)も、高/低張性を変化させること(例えば、溶質勾配)を含むハイブリダイゼーション環境により向上できる。従って、装置の代替的な実施形態では、溶質勾配を作り、別の実施形態では、ハイブリダイゼーション反応全体でこれを維持できる。一例の装置では、低塩濃度ハイブリダイゼーション溶液をアレイハイブリダイゼーションチャンバーの一方の側に入れ、高塩濃度緩衝液(例えば、２×ハイブリダイゼーション緩衝液)を他方の側に入れて、チャンバー内に溶質勾配を作ることができる。
【００７５】
(例えば炉または温度変化を作ることができる他の装置などで)反応チャンバー温度を変動的に変化させた場合に、ハイブリダイゼーション効率(すなわち、平衡状態になるまでの速度)も、制御された一定温度環境を用いて見とめられる速度と比べて大幅に向上した(向上させるための温度変化は、ほとんどの実験用炉に典型的な約+/-３℃の変化を上回る)。
【００７６】
本発明のいくつかの実施形態を記載した。それでもなお、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な改変が行い得ることが理解されるであろう。従って、他の実施形態もまた特許請求の範囲内にある。
【００７７】
各種図面において同じ参照符号は同様の構成要素を指す。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】本明細書に詳細に記載するCy5TMまたはCy3TMに結合した5-アミノ-プロパギル-2'-デオキシシチジン5'-トリホスフェートの模式図である。
【図２】本明細書の実施例１に詳細に記載する不均衡湿度ハイブリダイゼーション形式の模式図である。
【図１】
2007050010.tif 000003
【図２】
2007050010.tif 000004