(57)【要約】【課題】膨潤や収縮を生じることなく親水性を高めてタンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することができ、更にこれらの性能を長期間にわたって維持することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法、並びに、該イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法を用いて製造されるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤、及び、糖化ヘモグロビン分析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を提供する。【解決手段】イオン交換基を有する充填剤粒子表面を溶存オゾンガス濃度が２０ｐｐｍ以上のオゾン水を用いて洗浄することにより親水化する親水化工程を有するイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法であって、前記親水化工程において、促進酸化法による処理を行うイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオン交換基を有する充填剤粒子表面を溶存オゾンガス濃度が２０ｐｐｍ以上のオゾン水を用いて洗浄することにより親水化する親水化工程を有するイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法であって、前記親水化工程において、促進酸化法による処理を行うことを特徴とするイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項２】
促進酸化法による処理として、オゾン水のｐＨを７以上とし、かつ、超音波の照射を行うことを特徴とする請求項１記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項３】
周波数が２０ｋＨｚ〜１ＭＨｚの超音波を照射することを特徴とする請求項２記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項４】
促進酸化法による処理として、紫外線の照射を行うことを特徴とする請求項１記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項５】
紫外線は、２５４ｎｍの波長を含むことを特徴とする請求項４記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項６】
促進酸化法による処理を２０℃以上で行うことを特徴とする請求項１、２、３、４又は５記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項７】
イオン交換基がスルホン酸基であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５又は６記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項８】
請求項１、２、３、４、５、６又は７記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されたものであることを特徴とするイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項９】
請求項１、２、３、４、５、６又は７記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されたものであることを特徴とする糖化ヘモグロビン分析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膨潤や収縮を生じることなく親水性を高めてタンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することができ、更にこれらの性能を長期間にわたって維持することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法、並びに、該イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法を用いて製造されるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤、及び、糖化ヘモグロビン分析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
イオン交換液体クロマトグラフィー法は、各種生体関連物質の分離分析に極めて有効な方法として知られている。なかでも、近年では糖化ヘモグロビン類（以下、ヘモグロビンＡ１ｃともいう）の分析方法として注目されている。
ヘモグロビンＡ１ｃは、血液中の糖がヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端と化学的に結合したものであり、ヘモグロビン中に占めるヘモグロビンＡ１ｃが占める割合、すなわち、ヘモグロビンＡ１ｃと非糖化ヘモグロビンとの合計に対するヘモグロビンＡ１ｃの割合は、１〜２ヶ月の期間の血糖値の平均を反映するものと言われている。そのため、ヘモグロビンＡ１ｃが占める割合を示すヘモグロビンＡ１ｃ値（％）は、一時的に大きく変動し得る血糖値に代えて、糖尿病診断の指標として広く用いられるようになってきている。
【０００３】
イオン交換液体クロマトグラフィー法に用いられる充填剤としては、例えば、シリカ系化合物からなる基剤にイオン交換基を導入したもの、有機合成高分子からなる架橋性粒子にイオン交換基含有化合物を反応して得られたもの（特許文献１等）、架橋性単量体とイオン交換基含有化合物とを反応させて得られたもの（特許文献２、特許文献３等）等が知られている。
【０００４】
これらのイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤は、イオン交換基と基材とからなるが、基剤部分には、膨潤したり収縮したりしないことが求められている。このため、例えば、基材として樹脂を用いる場合には、架橋度の高い樹脂が用いられている。しかし、架橋度の高い樹脂は、親水性が低いことからタンパク質等の非特異吸着を引き起し、測定精度が低下するという問題があった。このような非特異吸着を抑制する方法として、基材樹脂に親水性単量体を多く含有させる方法等が検討されているが、親水性を高めると基材の膨潤や収縮が生じやすくなり、高流速下における分析ができなくなったり、複数の溶離液を用いた場合の平衡化が遅れたりし、測定の遅延を招くという問題があった。
【０００５】
これに対して特許文献４には、イオン交換基を有する充填剤粒子表面を親水化処理した、具体的には、イオン交換基を有する充填剤粒子表面にタンパク質等の親水基を有する化合物を吸着して親水化したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤が開示されている。このようなイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤では、基材が膨潤したり収縮したりしない一方で、親水性表面によりタンパク質等の非特異吸着を効果的に防止することができる。しかしながら、このように物理吸着により親水性化合物が固定化されている場合、使用初期の段階では高い性能を発揮できるものの、長期間使用しているうちに充填剤粒子の表面から親水性化合物が脱離してしまい、保持時間や測定値が変動することがあるという問題があった。また、吸着させる親水性化合物のロット間差によっても保持時間や測定値が変動するという問題点もあった。
【特許文献１】特開平１−２６２４６８号公報
【特許文献２】特公昭６３−５９４６３号公報
【特許文献３】特公平８−７１９７号公報
【特許文献４】特開２００１−９１５０５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記現状に鑑み、膨潤や収縮を生じることなく親水性を高めてタンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することができ、更にこれらの性能を長期間にわたって維持することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法、並びに、該イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法を用いて製造されるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤、及び、糖化ヘモグロビン分析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、イオン交換基を有する充填剤粒子表面を溶存オゾンガス濃度が２０ｐｐｍ以上のオゾン水を用いて洗浄することにより親水化する親水化工程を有するイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法であって、前記親水化工程において、促進酸化法による処理を行うイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法である。
以下に本発明を詳述する。
【０００８】
本発明者らは、これまでに、イオン交換基を有する充填剤粒子表面をオゾン水により洗浄することにより、充填剤粒子の表面のみが親水化され、水系媒体中でも膨潤や収縮を生じることなく、タンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することが可能なイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を製造できることを見出した。
しかしながら、このような方法を用いた場合であっても、得られるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の表面が充分に親水化されないことがあった。
そこで、更に鋭意検討した結果、オゾン水を用いた親水化工程において、促進酸化法による処理を行うことにより、溶存オゾンの分解が促進され、分解によって生じるヒドロキシラジカルによって、親水化処理の効果を更に高めることが可能となることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法では、イオン交換基を有する充填剤粒子表面を溶存オゾンガス濃度が２０ｐｐｍ以上のオゾン水を用いて洗浄することにより親水化する親水化工程を行うことにより、充填剤粒子の表面のみを親水化する。上記オゾン水には強力な酸化作用があり、また、溶存オゾンガスは徐々に分解し、残留性がないことから、特開２００１−３３０６９号公報に記載の半導体のレジスト除去や、特開２００３−０２４４６４号公報に記載の有害物質の分解処理等多岐に渡って利用されている。
従って、このような方法により親水化処理を行った場合には、オゾン水が直接触れた表面部分のみが親水化されることから、水系媒体中でも膨潤したり収縮したりすることがなく、一方、その親水化表面にはタンパク質等が非特異吸着することもない。更に、化学的な親水化処理であることから、物理的な親水化処理方法のように親水性化合物が脱落したりすることもなく、長期間にわたって親水性を維持することができる。
【００１０】
本発明では、上記親水化工程において、促進酸化法による処理を行う。
本明細書において、促進酸化法とは、オゾン水の酸化作用を増強させる方法のことをいい、紫外線照射、超音波照射、アルカリ水添加等の溶存オゾンの分解を促進する方法を単独で用いるか又は２種以上を併用することをいう。
このような促進酸化法による処理を行うことで、溶存オゾンの分解が促進され、オゾンの分解によって生じるヒドロキシラジカルの生成量を増加する。このようにして生成したヒドロキシラジカルは、オゾンよりも更に高い酸化力を有するため、親水化処理の効果を更に高めることが可能になるものと考えられる。上記促進酸化法を利用した場合、充填剤粒子の表面における親水基（−ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨ等）の生成を更に促進することが可能となる。
【００１１】
上記促進酸化法による処理としては、オゾン水のｐＨを７．０以上とし、かつ、超音波を照射する方法を用いることが好ましい。
上記オゾン水のｐＨは通常４．０〜５．０の低い値を示すが、ｐＨが高くなると溶解性が不安定になり、分解が促進される。また、オゾン水に超音波を照射することにより、超音波照射時に発生するキャビテーション作用により、一段とヒドロキシラジカルの生成を促進できる。従って、これらを組み合わせることで、親水化処理の効果をより一層高めることが可能となる。
【００１２】
上記オゾン水のｐＨを７．０以上に調整する方法としては、特に限定されないが、例えば、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物の水溶液を添加する方法等を用いることができる。
【００１３】
上記促進酸化法による処理において、超音波を照射する場合は、超音波の周波数の好ましい下限は２０ｋＨｚ、好ましい上限は１ＭＨｚである。キャビテーションが低周波数側で発生しやすいことを考えると、より好ましい上限は５００ｋＨｚ、更に好ましい上限は１００ｋＨｚである。
なお、超音波の照射を行う際の超音波照射装置としては、上記周波数を有する超音波を照射できるものであれば、特に限定されない。
【００１４】
また、上記促進酸化法による処理としては、オゾン水に紫外線の照射を行うことも好適である。
【００１５】
上記促進酸化法による処理として、紫外線照射を行う場合は、紫外線の波長の好ましい下限は１６０ｎｍ、好ましい上限は２８０ｎｍである。波長領域がこの範囲にある紫外線を照射することにより、促進酸化処理を行うことができる。
また、紫外線は、波長２５４ｎｍを含むことが特に好ましい。波長２５４ｎｍの紫外線はオゾン分子に直接作用し、分解する働きがある。この分解過程において、ヒドロキシラジカルが発生するため、親水化処理の効果を一段と高めることが可能となる。
【００１６】
上記紫外線照射の際に使用する紫外線ランプとしては特に限定されないが、上述したように波長２５４ｎｍを含む紫外線を照射できるものが好ましく、例えば、低圧水銀ランプ、高圧水銀ランプ、メタルハライドランプ等が挙げられる。
【００１７】
上記紫外線の照射強度及び照射時間としては特に限定されず、適宜調整すればよいが、波長２５４ｎｍの照射強度０．５〜２００ｍＷ／ｃｍ２で１〜１２００秒間照射することが好ましく、６０〜６００秒間照射することがより好ましい。照射強度が小さすぎたり、照射時間が短すぎたりすると、充填剤粒子表面の親水化が不充分でタンパク質等の非特異吸着を充分に防止できないことがあり、照射強度が強すぎたり、照射時間が長すぎたりする場合には、充填剤粒子の強度低下を招く恐れがある。
【００１８】
上記促進酸化法による処理を行う場合は、２０℃以上で行うことが好ましい。より好ましい上限は８０℃である。８０℃を超えると、溶存オゾンガスがそのまま気泡化される可能性が高くなり、逆に、反応効率の低下を招く恐れがある。
【００１９】
上記充填剤粒子としては、従来からイオン交換液体クロマトグラフィー法の充填剤粒子として用いられているものを用いることができ、例えば、シリカ、ジルコニア等の無機系粒子；セルロース、ポリアミノ酸、キトサン等の天然高分子からなる有機系粒子；ポリスチレン、ポリアクリル酸エステル等の合成高分子からなる有機系粒子等が挙げられる。なかでも、合成高分子からなる有機系粒子は、架橋度等を調整することにより高い耐圧性や耐膨潤性を得ることができることから好ましい。
【００２０】
上記イオン交換基としては特に限定されず、陽イオン交換基であっても、陰イオン交換基であってもよい。上記陽イオン交換基としては特に限定されず、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等が挙げられる。上記陰イオン交換基としては特に限定されず、例えば、３級アミノ基、４級アミノ基等が挙げられる。なかでも、スルホン酸基を用いる場合には、長期間にわたって性能を維持することができ、また、ヘモグロビンＡ１ｃの分析にも高い効果が得られることから好適である。
【００２１】
上記イオン交換基を有する充填剤粒子は、粒子の表面にイオン交換基を導入したり、イオン交換基を有する単量体を含む単量体混合物を重合して粒子としたりする方法により調製することができる。
上記粒子の表面にイオン交換基を導入する方法としては特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。例えば、高分子からなる有機系粒子の場合では、官能基を有する高分子からなる粒子を調製した後、該官能基にイオン交換基を有する化合物を化学的に反応させる方法等が挙げられる。
【００２２】
上記イオン交換基を有する単量体を含む単量体混合物を重合して粒子とする方法としては、例えば、イオン交換基を有する単量体と架橋性単量体とを混合し、重合開始剤の存在下で重合する方法等が挙げられる。また、特公平８−７１９７号公報に記載された方法ように、架橋性重合体粒子を調製した後、イオン交換基を有する単量体を添加し、重合体粒子の表面付近にイオン交換基を有する単量体を重合させる方法；（メタ）アクリル酸メチルや（メタ）アクリル酸エチル等の重合性エステル化合物を架橋性単量体等と混合し、重合開始剤の存在下で重合した後、得られた粒子を加水分解処理し、エステル化合物を陽イオン交換基に変換する方法等も用いることができる。
【００２３】
上記イオン交換基を有する充填剤粒子の平均粒子径としては特に限定されないが、好ましい下限は０．１μｍ、好ましい上限は２０μｍである。０．１μｍ未満であると、カラム内が高圧になりすぎ分離不良を起こすことがあり、２０μｍを超えると、カラム内のデッドボリュームが大きくなりすぎて分離不良を起こすことがある。
【００２４】
上記イオン交換基を有する充填剤粒子の粒度分布について、粒子径のＣＶ値の好ましい上限は４０％である。４０％を超えると、カラム内のデッドボリュームが大きくなりすぎ分離不良を起こすことがある。より好ましい上限は１５％である。
【００２５】
本発明において用いられるオゾン水は、溶存オゾンガス濃度の下限が２０ｐｐｍである。２０ｐｐｍ未満であると、充分な親水化処理を施せずにタンパク質の非特異吸着を充分に防止できない。好ましい下限は５０ｐｐｍである。なお、溶存オゾンガス濃度の上限は特にない。
このような高濃度のオゾン水は、例えば、特開２００１−３３０９６９号公報等に記載されているように、原料水とオゾンガスとを気体のみ通し液体の透過を阻止するオゾンガス透過膜を介して接触させる方法等により調製することができる。
【００２６】
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤は、オゾン水が直接接触した表面部分のみが親水化されていることから、水系媒体中でも膨潤したり収縮したりすることがなく、また、タンパク質等が非特異吸着することもないことから極めて正確な測定を行うことができる。また、長期間にわたってこのような性能を維持することができ、長期間の使用後でも保持時間や測定値のバラツキが少ない。更に、ロット間差による保持時間や測定値のバラツキも極めて少ない。
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されたものであるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤もまた、本発明の１つである。
【００２７】
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の水の接触角は６０°以下であることが好ましい。
ここで、接触角測定は、高分子材料をはじめ、表面の親水性、疎水性を評価する方法として用いられ、水の接触角が小さいほど親水性が高いと判断される。
本発明においては、タンパク質等の測定対象物質の非特異吸着を充分に抑制することが必要となり、上記範囲が好ましい。より好ましくは５０°以下である。
【００２８】
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されてなるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤は、とりわけ糖化ヘモグロビンの分析に好適に用いることができる。
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法により製造されてなる糖化ヘモグロビン分析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤もまた、本発明の１つである。
また、本発明の糖化ヘモグロビン分析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いる糖化ヘモグロビンの分析方法もまた、本発明の１つである。
具体的には、例えば、本発明の糖化ヘモグロビン分析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を公知のカラムに充填した後、得られたカラムに所定の条件で溶離液及び測定試料を送液することにより、糖化ヘモグロビンを分析することができる。
【００２９】
上記溶離液としては、従来公知のものを使用することができ、例えば、有機酸、無機酸、又は、これらの塩類を成分とする液等を用いることができる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、膨潤や収縮を生じることなく親水性を高めてタンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することができ、更にこれらの性能を長期間にわたって維持することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法、並びに、該イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法を用いて製造されるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤、及び、糖化ヘモグロビン分析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００３２】
（実施例１）
（１）イオン交換基を有する充填剤粒子の調製
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸２００ｇ、ジエチレングリコールジメタクリレート４００ｇ、２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプロパン８０ｇ、及び、ベンゾイルパーオキサイド１．５ｇを混合し、２．５Ｌの４重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。これを窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で８時間重合した後、洗浄・分級して、スルホン酸基を有する充填剤粒子を得た。
得られた充填剤粒子についてレーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測定したところ、平均粒子径は８μｍ、ＣＶ値は１４％であった。
【００３３】
（２）オゾン水による親水化処理
得られた充填剤粒子１０ｇを溶存オゾンガス濃度１５０ｐｐｍのオゾン水３００ｍＬに浸漬し、撹拌しながら１ＮのＮａＯＨ（和光純薬工業社製）を滴下し、溶液のｐＨを１１．０に調整した。ｐＨを調整後、速やかに水槽内の温度を５０℃に設定した超音波照射装置（アズワン社製ＵＳＤ−２）内で周波数が２８ｋＨｚの超音波を３０分間照射した。
超音波照射後、遠心分離機（日立製作所社製Ｈｉｍａｃ  ＣＲ２０Ｇ）を用いて遠心分離し、上澄みを除去した。この操作を２回繰り返し親水化処理を施し、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
なお、オゾン水は、内径１５ｃｍ×長さ２０ｃｍの円柱形を有する外套内に、パーフルオロアルコキシ樹脂からなる内径０．５ｍｍ×厚さ０．０４ｍｍ×長さ３５０ｃｍの中空管状のオゾンガス透過膜４００本収容されたオゾン溶解モジュールを含むオゾン水製造システム（積水化学工業社製）を用いて調製した。
【００３４】
（比較例１）
実施例１で調製したスルホン酸基を有する充填剤粒子を、オゾン水による親水化処理を行わずにそのままイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤とした。
【００３５】
（比較例２）
オゾン水による親水化処理において、溶存オゾンガス濃度を１０ｐｐｍとした以外は実施例１と同様にして親水化処理を行い、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
【００３６】
（比較例３）
オゾン水による親水化処理において、ｐＨ調整及び超音波照射の操作を行わなかった以外は、実施例１と同様にして親水化処理を行い、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
【００３７】
（比較例４）
実施例１で調製したスルホン酸基を有する充填剤粒子１０ｇにリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）に溶解させた０．２重量％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）２００ｍＬを加え、２分間超音波処理し、８０℃の恒温水槽中で２４時間ゆるやかに撹拌したのち、恒温水槽から取り出し、室温になるまで放置した。その後、遠心分離にて上清を除去し、リン酸緩衝液（ｐＨ８．５）を２００ｍＬ添加し、再度遠心分離により上清を除去した。次いで、リン酸緩衝液（ｐＨ５．７）を２００ｍＬ添加し、再々度遠心分離にて上清を除去し、物理吸着によるＢＳＡが固定されたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
【００３８】
＜評価＞
実施例１及び比較例１〜４で得られたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤について以下の評価を行った。
【００３９】
（１）ヘモグロビンＡ１ｃ測定における初期測定値の評価
実施例１及び比較例１〜３で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を液体クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。一方、グリコＨｂコントロールレベル２（国際試薬社製、参考数値１０．４±０．５％）を２００μＬの注射用水で溶解した後、希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを調製し、測定試料とした。
得られたカラムを用いて、下記の条件により測定試料中のヘモグロビンＡ１ｃ量及び非糖化ヘモグロビン量を測定し、ヘモグロビンＡ１ｃと非糖化ヘモグロビンとの合計に対するヘモグロビンＡ１ｃの割合（ヘモグロビンＡ１ｃ値（％））を求めた。測定は１０検体連続で行い、その後半５検体の平均値を測定値とした。
結果を表１に示した。
システム：送液ポンプ  ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラー  ＡＳＵ―４２０（積水化学工業社製）
検出器  ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：第１液  １７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
第２液  ３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
溶出法：０〜３分は第１液を、３〜３．２分は第２液を、３．２〜４分は第１液にて溶出
流速：１．０ｍＬ／分
検出波長：４１５ｎｍ
資料注入量：１０μＬ
【００４０】
【表１】
2007178417.tif 000002
【００４１】
表１より実施例１で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には、極めて正確な測定ができたのに対して、比較例１で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には、想定される値よりもかなり低いヘモグロビンＡ１ｃ値（％）が得られた。これは、比較例１のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には、特にヘモグロビンＡ１ｃの割合が著しく低下したことによるものであり、即ち、ヘモグロビン成分が充填剤粒子表面に非特異吸着していることを示すものである。また、比較例２で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には、比較例１よりは改善されているものの、想定される値よりは低いヘモグロビンＡ１ｃ値（％）が得られた。即ち、溶存オゾンガス濃度が１０ｐｐｍでは、充分な親水化効果が得られないことを示すものである。更に、比較例３で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には、実施例１と同等のヘモグロビンＡ１ｃ値（％）が得られた。しかしながら、実施例１と比較して、ヘモグロビンＡ１ｃ値（％）を算出するヘモグロビンＡ１ｃ量と非糖化ヘモグロビン量がそれぞれ約１０％低下していることが分かった。従って、ヘモグロビンＡ１ｃ値（％）は同等であっても、ヘモグロビン成分が充填剤表面に非特異吸着していることを意味するものである。
【００４２】
（２）ヘモグロビンＡ１ｃ測定における測定値変動の評価（耐久性評価）
実施例１及び比較例４で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を液体クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。一方、グリコＨｂコントロールレベル２（国際試薬社製、参考数値１０．４±０．５％）を２００μＬの注射用水で溶解した後、希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを調製し、測定試料とした。また、負荷資料として、健常人血をＮａＦ採血し、溶血希釈液（０．１重量％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で溶血し、１５０倍に希釈したものを用いて、１日に３００検体を測定した。
各負荷検体数測定した後のカラムを用いて、下記の条件により測定試料中のヘモグロビンＡ１ｃ量及び非糖化ヘモグロビン量を測定し、ヘモグロビンＡ１ｃと非糖化ヘモグロビンとの合計に対するヘモグロビンＡ１ｃの割合（ヘモグロビンＡ１ｃ値（％））を求めた。測定は１０検体連続で行い、その平均値を測定値とした。また、ヘモグロビンＡ１ｃの保持時間も測定した。
結果を表２に示した。
システム：送液ポンプ  ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラー  ＡＳＵ―４２０（積水化学工業社製）
検出器  ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：第１液  １７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
第２液  ３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
溶出法：０〜３分は第１液を、３〜３．２分は第２液を、３．２〜４分は第１液にて溶出
流速：１．０ｍＬ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μＬ
【００４３】
【表２】
2007178417.tif 000003
【００４４】
表２より、実施例１で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には、４５００検体の負荷試験を行ったあとでも、ほとんどヘモグロビンＡ１ｃの保持時間に変化がなく、正確なヘモグロビンＡ１ｃ値（％）が可能であることが判った。一方、比較例４で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には、負荷検体数が増えるに従ってヘモグロビンＡ１ｃの保持時間が変化する傾向があり、得られたヘモグロビンＡ１ｃ値（％）も、実施例１の場合に比べてバラツキが大きいものであった。
【００４５】
（実施例２）
（１）イオン交換基を有する充填剤粒子の調製
攪拌機付き反応器中にて、３％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液に、テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）３００ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）１００ｇ、及び、過酸化ベンゾイル（キシダ化学社製）１．０ｇの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素雰囲気下にて８０℃１時間重合した。次に、イオン交換基を有する単量体として、２−メタクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東亜合成化学社製）１００ｇ、ポリエチレングリコールメタクリレート（日本油脂社製、エチレングリコール鎖ｎ＝４）１００ｇをイオン交換水に溶解した。この混合物を同じ反応器に添加して、同様にして、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃で２時間重合した。得られた重合組成物を水及びアセトンで洗浄することにより、イオン交換基としてスルホン酸基を有する充填剤粒子を得た。
得られた充填剤粒子について、レーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測定したところ、平均粒子径は８μｍ、ＣＶ値は１４％であった。
【００４６】
（２）オゾン水による親水化処理
得られた充填剤粒子１０ｇを溶存オゾンガス濃度１３０ｐｐｍのオゾン水３００ｍＬに浸漬し、撹拌しながら、波長２５４ｎｍを含む紫外線を照射できるスポットタイプＵＶ照射装置（アイグラフィックス社製ＵＰ−２００Ｇ）を用いて、１ｃｍの距離から照射強度９５ｍＷ／ｃｍ２で３００秒間紫外線を照射して親水化処理を施した。紫外線照射後、遠心分離機（日立製作所社製Ｈｉｍａｃ  ＣＲ２０Ｇ）を用いて遠心分離し、上澄みを除去した。この操作を２回繰り返し親水化処理を施し、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
なお、オゾン水は、内径１５ｃｍ×長さ２０ｃｍの円柱形を有する外套内に、パーフルオロアルコキシ樹脂からなる内径０．５ｍｍ×厚さ０．０４ｍｍ×長さ３５０ｃｍの中空管状のオゾンガス透過膜４００本収容されたオゾン溶解モジュールを含むオゾン水製造システム（積水化学工業社製）を用いて調製した。
【００４７】
（比較例５）
実施例２で調製したイオン交換基としてスルホン酸基を有する充填剤粒子を、オゾン水による親水化処理を行わずにそのままイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤とした。
【００４８】
（比較例６）
オゾン水による親水化処理において、溶存オゾンガス濃度を１０ｐｐｍとしたこと以外は、実施例２と同様にして親水化処理を行い、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
【００４９】
（比較例７）
オゾン水による親水化処理において、促進酸化法による処理を行わなかったこと以外は、実施例２と同様にして親水化処理を行い、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
【００５０】
（比較例８）
実施例２で調製したイオン交換基としてスルホン酸基を有する充填剤粒子１０ｇにリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）に溶解させた０．２重量％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）２００ｍＬを加え、２分間超音波処理し、８０℃の恒温水槽中で２４時間ゆるやかに撹拌したのち、恒温水槽から取り出し、室温になるまで放置した。その後、遠心分離にて上清を除去し、リン酸緩衝液（ｐＨ８．５）を２００ｍＬ添加し、再度遠心分離により上清を除去した。次いで、リン酸緩衝液（ｐＨ５．７）を２００ｍＬ添加し、再々度遠心分離にて上清を除去し、物理吸着によるＢＳＡが固定されたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
【００５１】
＜評価＞
実施例２及び比較例５〜８で得られたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤について以下の評価を行った。結果を表３〜５に示した。
【００５２】
（３）接触角測定
実施例２及び比較例５、７で得られた充填剤粒子について、接触角測定を行った。測定は、協和界面科学社製Ｄｒｏｐｍａｓｔｅｒ５００を用いて行った。乾燥させた充填剤粒子をスライドガラス上に貼付した両面テープ上に均一になるようにのせ、その後エアースプレーで余分な粒子を除去した。これにより、両面テープ上に充填剤粒子１層分を固定化した。この様子は、マイクロスコープで確認した。
イオン交換水１μＬの液滴を作製し、スライドガラス上に固定化した充填剤粒子上に着液させ、接触角をθ／２法により算出した。なお、接触角が９０°より小さい場合、着液後の水滴は濡れ広がろうとする。従って、着液後の接触角は、経時的に小さくなる。そこで、着液後０．５秒後の接触角値を用いて評価を行うこととした。
結果を表３に示した。
【００５３】
（４）ヘモグロビンＡ１ｃ測定によるヘモグロビン類（Ｈｂ）回収率の評価
実施例２及び比較例５〜７で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を液体クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。一方、グリコＨｂコントロールレベル２（国際試薬社製、参考数値１０．４±０．５％）を２００μＬの注射用水で溶解した後、希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを調製し、測定試料とした。
得られたカラムを用いて、下記の条件により測定試料中のヘモグロビンＡ１ｃ量及びヘモグロビンＡ１ｃと非糖化ヘモグロビンとの合計量をクロマトグラムのピーク面積で評価した。測定は１０検体連続で行い、その後半５検体のヘモグロビンＡ１ｃピークの面積値及びヘモグロビンＡ１ｃピークと非糖化ヘモグロビンピークとの面積値の平均値を測定値とした。
結果を表４、図１に示した。実施例２で得られたヘモグロビンＡ１ｃピーク面積値及びヘモグロビンＡ１ｃと非糖化ヘモグロビンピークの面積値合計を１００％とし、比較例５〜７で得られた各ピーク面積を比較した。
システム：送液ポンプ  ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラー  ＡＳＵ―４２０（積水化学工業社製）
検出器  ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：第１液  １７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
第２液  ３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
溶出法：０〜３分は第１液を、３〜３．２分は第２液を、３．２〜４分は第１液にて溶出
流速：１．０ｍＬ／分
検出波長：４１５ｎｍ
資料注入量：１０μＬ
【００５４】
（５）ヘモグロビンＡ１ｃ測定における測定値変動の評価（耐久性評価）
実施例２及び比較例８で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を液体クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。一方、グリコＨｂコントロールレベル２（国際試薬社製、参考数値１０．４±０．５％）を２００μＬの注射用水で溶解した後、希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを調製し、測定試料とした。また、負荷試料として、健常人血をＮａＦ採血し、溶血希釈液（０．１重量％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で溶血し、１５０倍に希釈したものを用いた。
測定試料、負荷試料合わせて約１０００検体の測定を行い、任意の間隔で測定試料１０検体を連続で測定し、その平均値を用いて評価した。下記の条件により測定試料中のヘモグロビンＡ１ｃ量及び非糖化ヘモグロビン量を測定し、ヘモグロビンＡ１ｃと非糖化ヘモグロビンとの合計に対するヘモグロビンＡ１ｃの割合（ヘモグロビンＡ１ｃ値（％））を求めた。また、ヘモグロビンＡ１ｃの保持時間も測定した。
結果を表５に示した。
システム：送液ポンプ  ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラー  ＡＳＵ―４２０（積水化学工業社製）
検出器  ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：第１液  １７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
第２液  ３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
溶出法：０〜３分は第１液を、３〜３．２分は第２液を、３．２〜４分は第１液にて溶出
流速：１．０ｍＬ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μＬ
【００５５】
【表３】
2007178417.tif 000004
【００５６】
【表４】
2007178417.tif 000005
【００５７】
【表５】
2007178417.tif 000006
【００５８】
表３に示すように、実施例２では、比較例７に示したオゾン水処理のみの接触角よりも８°小さくなっており、促進酸化法による処理によって充填剤粒子の表面の親水性が向上していることがわかる。
表４、図１に示すように、促進酸化法による処理を行った実施例２が、Ａ１ｃＡｒｅａ、ＴｏｔａｌＡｒｅａともに比較例５〜７より大きいことがわかる。すなわち、充填剤粒子の表面へのヘモグロビンＡ１ｃ成分や他のヘモグロビン成分の吸着が抑制されていることがわかる。
表５に示すように、実施例２で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には、１０００検体測定の間、ヘモグロビンＡ１ｃ値（％）の変動、保持時間の変動がともに非常に小さく、正確な測定が可能であることがわかる。一方、比較例８の場合には、保持時間が大きく変動している。これは、親水性を向上させるためにコーティングしたタンパク質が測定中に脱離していることに起因していると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明によれば、膨潤や収縮を生じることなく親水性を高めてタンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することができ、更にこれらの性能を長期間にわたって維持することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法、並びに、該イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法を用いて製造されるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤、及び、糖化ヘモグロビン分析用イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】評価（４）における、ヘモグロビンＡ１ｃ測定によるヘモグロビン類（Ｈｂ）回収率の結果をグラフで示した図である。
【図１】
2007178417.tif 000007