(57)【要約】【課題】  優れた強度や移植時（使用時）の操作性、生体適合性および骨誘導性を備えているとともに、変形の抑制効果を向上させ、細胞や組織の侵入性を向上させ、薬剤の担持性を向上させ薬剤を効率よく移植部位（作用部位）に発現させることができ、少量の薬剤で骨組織の誘導を行うことができる新しい骨再建材と、この骨再建材を簡単な工程で、しかも手間とコストを抑えて製造できる新しい骨再建材の製造方法、さらには、新しい骨組織誘導方法を提供する。【解決手段】  第１に、水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維または水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維とゼラチンとの混合物と、緩衝液とを混合する工程；第２に、冷却処理する工程；第３に、凍結処理する工程；第４に、凍結乾燥し、多孔質複合体を作成する工程；および第５に、前記多孔質複合体に、骨再建促進能を有する薬剤を含浸させる工程；を含むことを特徴とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも次の工程
＜１＞水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維または水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維とゼラチンとの混合物と、緩衝液とを混合する工程；
＜２＞ゲル化する工程；
＜３＞凍結処理する工程；
＜４＞凍結乾燥し、多孔質複合体を作成する工程；および
＜５＞前記多孔質複合体に、骨再建促進能を有する薬剤を含浸させる工程；
を含むことを特徴とする骨再建材の製造方法。
【請求項２】
水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維は、水酸アパタイトのc軸が繊維軸方向に配向されているものであることを特徴とする請求項１の製造方法。
【請求項３】
前記凍結乾燥後に、さらに真空下で加熱処理することを特徴とする請求項１または２の製造方法。
【請求項４】
骨再建促進能を有する薬剤には、骨誘導能、血管誘導能および細胞増殖促進能の少なくともいずれかの機能を有することを特徴とする請求項１から３いずれかの製造方法。
【請求項５】
薬剤は、サイトカインおよび細胞成長因子の少なくともいずれかであることを特徴とする請求項４の製造方法。
【請求項６】
サイトカインは、骨形成因子であることを特徴とする請求項５の製造方法。
【請求項７】
さらに抗生物質を含有させることを特徴とする請求項１から６いずれかの製造方法。
【請求項８】
水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維または水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維とゼラチンとの混合物から構成され、骨再建促進能を有する薬剤を包含するとともに、気孔を有することを特徴とする骨再建材。
【請求項９】
水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維は、水酸アパタイトのc軸が繊維軸方向に配向されているものであることを特徴とする請求項８の骨再建材。
【請求項１０】
骨再建促進能を有する薬剤には、骨誘導能、血管誘導能および細胞増殖促進能の少なくともいずれかの機能を有することを特徴とする請求項８または９の骨再建材。
【請求項１１】
薬剤は、サイトカインおよび細胞成長因子の少なくともいずれかであることを特徴とする請求項１０の骨再建材。
【請求項１２】
サイトカインは、骨形成因子であることを特徴とする請求項１１の骨再建材。
【請求項１３】
さらに抗生物質を包含することを特徴とする請求項８から１２いずれかの骨再建材。
【請求項１４】
気孔率８０％以上であることを特徴とする請求項８から１３いずれかの骨再建材。
【請求項１５】
請求項８から１４いずれかの骨再建材を生体内に移植して、移植箇所およびその近傍において骨組織を誘導することを特徴とする骨組織誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、骨再建材の製造方法および骨組織誘導能と弾性とを有する骨再建材、ならびに、この骨再建材を利用した骨組織誘導方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、再生医療の分野では、損傷を受けた組織や器官に代わる種々の人工生体材料の研究開発が盛んに進められている。また、骨欠損部の治療においては、人工骨材や人工骨充填材等のインプラントが用いられる。このようなインプラントには生体骨に類似の機械的特性はもちろん、生体適合性や骨誘導性が求められる。この骨誘導性とは、生体適用後に徐々に吸収されて、骨再生サイクルに取り込まれ、自身の骨に置換していく性質のことをいう。
【０００３】
脊椎動物の骨は、リン酸カルシウムの一種である水酸アパタイトと、タンパク質であるコラーゲンとからなる複合体である。これらは、生体骨中で水酸アパタイトが、そのｃ軸方向にコラーゲン繊維に沿って配向した特有の構造を形成し、この構造が骨に特有の機械的性質を与えていることが知られている。
【０００４】
そこで、硬いが脆くインプラント後に崩壊をきたすという強度の問題や、使用時の操作性が悪い等の問題を有していた、既存のリン酸カルシウムを使用した多孔体人工骨に代わって、上記のような生体骨に類似の構造組成を有する、水酸アパタイトとコラーゲンからなる複合生体材料が提案されている（たとえば、特許文献１、特許文献２）。この複合生体材料は、水酸アパタイト、コラーゲンおよびアルギン酸塩を含んでおり、水酸アパタイトのｃ軸がコラーゲン繊維に沿うように配向した微小多孔質構造を有するように製造することができるとしている。このような構成を有するため、この複合生体材料は、スポンジ状の弾力性を有し、従来の強度の問題や、使用時の操作性の問題を解消することはもちろん、生体適合性および骨誘導性にも優れた複合生体材料であるとされている。
【特許文献１】ＷＯ  ２００３／０３５１２８号公報
【特許文献２】特開２００３−１９０２７１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来の上記特許文献１および特許文献２のような複合生体材料は、部位によっては周囲組織につぶされて変形するという強度の問題が依然として解消できないでいた。また、気孔の連通性が少ないため、細胞や組織の侵入性が不十分な場合があった。さらに、このような問題を解決しようとすると、たとえば、つなぎ材としてのコラーゲンを別途添加する工程や、ゲル化剤として、たとえば水酸化ナトリウムを添加する工程等が必要になる等、製造工程がさらに煩雑となり、手間とコストがかかるという問題があった。
【０００６】
また、骨再建材として利用する場合においては、骨組織誘導する薬剤を担持する薬剤担体として優れた性質と、力学的強度との両立が困難であった。すなわち、たとえば、薬剤担体として優れた性質を有していても、力学的強度が不足してしまい、形状保持性が悪いという問題、あるいは、力学的に高強度でも薬剤担体としての性質が不十分であるという問題があった。さらには、ゴムの様な弾性を有しないため、骨欠損部に合わせてインプラントの形状を微細に調整する手間がかかること、力学的強度が低い場合は、移植後に変形して望んだ形状に骨が再生されないこと、上記のように力学的強度が高くとも薬剤担持性が悪い場合には、多量の薬剤をインプラントに導入しなければならないということ、その結果薬剤がインプラント外に多量に放出されてしまうため、インプラントと同形状の骨組織を誘導することは困難であったということ等、多くの問題があった。すなわち、薬剤を効率よく骨再建材の移植部位（作用部位）およびその近傍に発現させ、かつ移植後も元の形状を維持できるような骨再建用の多孔質複合体（骨再建材）が求められているが、未だに開発されていないのが実状であった。なお、本願発明におけるインプラントとは、一般に、人工物を生体に埋め込む（移植する）こと、また、その埋め込む人工物（たとえば、人工歯根等）の総称である。
【０００７】
そこで、本願発明は、以上のとおりの背景から、従来の問題点を解決すべく、優れた強度や移植時（使用時）の操作性、生体適合性および骨誘導性を備えているとともに、変形の抑制効果を向上させ、細胞や組織の侵入性を向上させ、薬剤の担持性を向上させ薬剤を効率よく移植部位（作用部位）に発現させることができ、少量の薬剤で骨組織の誘導を行うことができる新しい骨再建材と、この骨再建材を簡単な工程で、しかも手間とコストを抑えて製造できる新しい骨再建材の製造方法を提供することを課題としている。
【０００８】
また、本願発明は、上記骨再建材によって、薬剤を効率よく移植部位（作用部位）に発現させることで、少量の薬剤で骨組織の誘導を行うことができる、新しい骨組織誘導方法を提供することをも課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明は、前記の課題を解決するものとして、以下のことを特徴とする、骨再建材の製造方法、骨再建材および骨組織誘導方法を提供する。
【００１０】
第１には、骨再建材の製造方法として、少なくとも次の工程
＜１＞水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維または水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維とゼラチンとの混合物と、緩衝液とを混合する工程；
＜２＞ゲル化する工程；
＜３＞凍結処理する工程；
＜４＞凍結乾燥し、多孔質複合体を作成する工程；および
＜５＞前記多孔質複合体に、骨再建促進能を有する薬剤を含浸させる工程；
を含むこと。
【００１１】
第２には、水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維は、水酸アパタイトのc軸が繊維軸方向に配向されているものであること。
【００１２】
第３には、前記凍結乾燥後に、さらに真空下で加熱処理すること。
【００１３】
第４には、骨再建促進能を有する薬剤には、骨誘導能、血管誘導能および細胞増殖促進能の少なくともいずれかの機能を有すること。
【００１４】
第５には、薬剤は、サイトカインおよび細胞成長因子の少なくともいずれかであること。
【００１５】
第６には、サイトカインは、骨形成因子であること。
【００１６】
第７には、さらに抗生物質を含有させること。
【００１７】
第８には、骨再建材として、水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維または水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維とゼラチンとの混合物から構成され、骨再建促進能を有する薬剤を包含するとともに、気孔を有すること。
【００１８】
第９には、水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維は、水酸アパタイトのc軸が繊維軸方向に配向されているものであること。
【００１９】
第１０には、骨再建促進能を有する薬剤には、骨誘導能、血管誘導能および細胞増殖促進能の少なくともいずれかの機能を有すること。
【００２０】
第１１には、薬剤は、サイトカインおよび細胞成長因子の少なくともいずれかであることを特徴とする。
【００２１】
第１２には、サイトカインは、骨形成因子であること。
【００２２】
第１３には、さらに抗生物質を包含すること。
【００２３】
第１４には、気孔率８０％以上であること。
【００２４】
第１５には、骨組織誘導方法として、上記第８の発明から第１４いずれかの発明の骨再建材を生体内に移植して、移植箇所およびその近傍において骨組織を誘導すること。
【発明の効果】
【００２５】
本願第１から第７の発明によれば、優れた強度や移植時（使用時）の操作性、生体適合性および骨誘導性を備えているとともに、変形の抑制効果を向上させ、細胞や組織の侵入性を向上させ、薬剤の担持性を向上させ薬剤を効率よく移植部位（作用部位）に発現させることができ、少量の薬剤で骨再建の促進を行うことができる骨再建材を、簡単な工程で、しかも手間とコストを抑えて製造できる。
【００２６】
第８から第１４の発明によれば、優れた強度や移植時（使用時）の操作性、生体適合性および骨誘導性を備えているとともに、変形の抑制効果を向上させ、細胞や組織の侵入性を向上させ、薬剤の担持性を向上させ薬剤を効率よく移植部位（作用部位）に発現させることができ、少量の薬剤で骨組織の誘導を行うことができる。
【００２７】
第１５の発明によれば、薬剤を効率よく移植部位（作用部位）に発現させることで、少量の薬剤で骨組織の誘導を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本願発明は、上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について詳しく説明する。
【００２９】
本願発明の骨再建材の製造方法は、水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維（以下、ＨＡｐ／Ｃｏｌとすることがある）、または、このＨＡｐ／Ｃｏｌとゼラチンとの混合物（以下、ＨＡｐ／Ｃｏｌ混合物とすることがある）と、緩衝液とを混合し、均一になるまで十分に混練し、これを任意の型に注入し、加温処理および冷却処理の少なくともいずれかの処理を行なってゲル化させ、さらに凍結処理を行い、その後、凍結乾燥することで、多孔質複合体を作成する。そして、この多孔質複合体に、骨再建促進能を有する薬剤を含浸させることで、骨再建材を得る。
【００３０】
なお、本願発明におけるＨＡｐ／Ｃｏｌの混合比率は、たとえば、吸着水の重量を除いた重量比で、９０／１００〜６０／４０、さらに好ましくは、８５／１５〜７０／３０の範囲である。この吸着水の重量を除いた重量比とは、大気下の熱重量測定によって、昇温速度２０℃/分において、室温（通常は、２５℃）〜２００℃の範囲の重量減少を吸着水、２００〜６００℃の範囲の重量減少をコラーゲン、残りを水酸アパタイトとして算出される。
【００３１】
上記の加温処理、冷却処理は、ゲル化させる工程において重要な処理である。また、たとえば、冷却処理の条件としては、温度条件は４〜１５℃、時間条件は１〜２４時間の範囲であることが好ましい。ここで、冷却処理の時間条件については、通常、温度条件が低くなるほど、短い時間で行うことができる。一方、加温処理の条件としては、温度条件は、たとえば、２３〜４２℃、好ましくは３０〜４０℃、時間条件は、たとえば、６〜７２時間、好ましくは１２〜４８時間が採用できる。ここで、加温処理における時間条件は、通常は、温度条件が高くなるほど、短い時間でもよい。
【００３２】
なお、冷却処理と加温処理ではゲル化のメカニズムが異なり、上記のようにゲル化の温度依存性が反対になる。具体的には、上記の冷却処理は、ＨＡｐ／Ｃｏｌに元来含まれるゼラチン、あるいは、添加ゼラチンをゲル化させるための処理である。ゼラチン分子は、冷却下でコラーゲンの構造を部分的に回復し、その過程で分子の絡み合いを引き起こすことによってゲル化が生じると考えられていることから、ゼラチンは、低温条件であるほど活発にゲル化する性質を有している。一方、上記の加温処理は、ＨＡｐ／Ｃｏｌ中のコラーゲンをゲル化させるための処理である。コラーゲン分子は、生体温度付近で繊維を形成する性質を有し、成長した繊維がネットワークを形成することによってゲル化が生じることから、コラーゲン分子の繊維化は、生体内温度を超えない範囲で、高温条件であるほど活発に生じる性質を有している。
【００３３】
前記凍結処理は、上記の加温処理、冷却処理後のゲル化させたＨＡｐ／ＣｏｌまたはＨＡｐ／Ｃｏｌ混合物と、緩衝液との混合物（以下、ゲル化させた混合物とすることがある）を凍結固化する処理である。
【００３４】
具体的には、冷凍庫内に静置する等の通常の凍結方法、もしくは、このゲル化させた混合物の任意の特定箇所（実際的には、この混合物が注入された容器の特定箇所）を冷却して、ゲル化させた混合物全体を凍結する方法が利用できる。
【００３５】
この特定箇所を冷却して、全体を凍結する方法は、ＨＡｐ／Ｃｏｌ、もしくは、ＨＡｐ／Ｃｏｌ混合物の構成成分の氷結晶の成長サイズ、および、成長方向を制御することができ、冷却した特定箇所（冷却面）から氷結晶が一方向に成長させることができ、凍結乾燥後に一方向の連通性が高い気孔を有する多孔質複合体を効率よく得ることができる。この特定箇所は、底面や側面等、特に限定されない。さらには、前記ゲル化させた混合物内（もしくは、混合物が注入された容器内）に冷却板や冷却棒を挿入し、これを冷却して前記ゲル化させた混合物を凍結してもよい。
【００３６】
「氷結晶の成長サイズ、および、成長方向を制御」について説明すると、具体的には、まず、「サイズ」については、冷却面の温度によって制御できる。たとえば、−１００℃では気孔横断面の短軸長さが５〜２０μｍ、−３０℃では気孔横断面の短軸長さが３０〜６０μｍとすることができる。次に、「方向」については、冷却面の設定によって制御できる。たとえば、前記ゲル化させた混合物の底面（実際的には、混合物が注入されている容器の底面）のみを冷却すると、鉛直方向の一方向性連通気孔が形成され、また、前記ゲル化させた混合物の側面（実際的には、混合物が注入されている円筒容器の側面）の場合は、側面から中心に向かって収束する一方向性連通気孔が形成される。
【００３７】
本願発明におけるＨＡｐ／Ｃｏｌは、たとえば、水酸アパタイトのｃ軸がコラーゲン繊維軸に沿うように配向されている生体骨に類似の微小多孔質構造を有する複合繊維体（たとえば、特開平１１−１９９２０９号公報参照）であることが望ましく、これをさらに凍結乾燥したものを使用することが、緩衝液の混合が容易となり、さらに望ましい。このような複合繊維体は、たとえば、水酸化カルシウム溶液とコラーゲンを含むリン酸塩水溶液を反応容器中に同時滴下し、生じた沈澱物を乾燥することにより得ることができる。ここで、用いられるコラーゲンは、特に限定されないが、分子量が大きいと立体障害のために複合体の強度が不十分となるため、単分子なコラーゲンを用いることが好ましい。特に、ペプシン処理したアテロコラーゲンはモノメリックであることに加え、抗原性が低いため、好ましい。
【００３８】
水酸アパタイトは、一般組成をCa5(PO4)3OH、とする化合物であり、その反応の非化学量論性によって、CaHPO4 、Ca3(PO4)2、Ca4O(PO4)2、Ca10(PO4)6(OH)2、CaP4O11、Ca(PO3)2、Ca2P2O7、Ca(H2PO4)2・H2O等、リン酸カルシウムと称される１群の化合物を含んでいる。また、水酸アパタイトは、Ca5(PO4)3OH、またはCa10(PO4)6(OH)2の組成式で示される化合物を基本成分とするもので、Ca成分の一部分は、Sr、Ba、MG、Fe、Al、Y、La、Na、K、H等から選ばれる１種以上で置換されてもよい。また、(PO4)成分の一部分が、VO4、BO3、SO4、CO3、SiO4等から選ばれる１種以上で置換されてもよいし、さらに、(OH)成分の一部分が、F、Cl、O、CO3等から選ばれる１種以上で置換されてもよい。また、これらの各成分の一部が欠失していてもよい。
【００３９】
なお、水酸アパタイトは、通常の微結晶や非晶質、結晶体の他に、同型固溶体、置換型固溶体、侵入型固溶体であってもよく、非量子論的欠陥を含むものであってもよい。
【００４０】
コラーゲンは、現在では２０種類程度の分子種の異なるものが、哺乳動物に限らず、魚類を含む広範な動物の生体組織中に存在することが知られている。本願発明で用いられるコラーゲンは、その出発原料とする動物の種、組織部位、年齢等は特に限定されず、任意のものを用いることができるが、一般的には、哺乳動物（たとえば、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ネズミ等）や鳥類（たとえば、ニワトリ等）の皮膚、骨、軟骨、腱、臓器等から得られるコラーゲンが用いられる。また、魚類（たとえば、タラ、ヒラメ、カレイ、サケ、マス、マグロ、サバ、タイ、イワシ、サメ等）の皮、骨、軟骨、ひれ、うろこ、臓器等から得られるコラーゲン様蛋白質を出発原料として用いてもよい。さらには、上記のような動物組織からの抽出ではなく、遺伝子組み替え技術によって人工的に得られたコラーゲンを用いてもよい。
【００４１】
本願発明で用いられるコラーゲンは特に限定されないが、たとえば、Ｉ型コラーゲン、コラーゲンタンパク質のアミノ酸残基を、アセチル化、コハク化、マレイル化、フタル化、ベンゾイル化、エステル化、アミド化、グアニジノ化等といった化学修飾したものを用いてもよい。
【００４２】
本願発明で用いられるゼラチンは、熱により３重らせん構造が壊れたコラーゲンのことであり、一般に流通する上記コラーゲンを由来とするゼラチンをそのまま使用することができる。ゼラチンは、コラーゲンと同様の動物や部位からコラーゲンに比べて高収率、低コストで製造されるため、安価に入手できる。その形状は、通常、粒状もしくは板状である。
【００４３】
ゼラチンをＨＡｐ／Ｃｏｌに混合する場合、用いられる緩衝液にあらかじめ溶解させてから混合しても良いし、ＨＡｐ／Ｃｏｌと緩衝液とを混合してからゼラチン水溶液を別途加えてもよい。このように、ＨＡｐ／Ｃｏｌにゼラチンを加えることで、得られる骨再建材の機械的強度を高めることができる。加えるゼラチンの濃度は、混合物の容積に対して１〜２０（ｗ/ｖ）％の範囲であることが好ましい。ゼラチンの濃度が、１（ｗ/ｖ）％未満であると、機械的強度を高める効果が不十分であり好ましくなく、ゼラチンの濃度が２０（ｗ/ｖ）％を超えると、混合時の粘度が高くなりすぎて成形性が悪化するため好ましくない。また、インプラント後に炎症反応を惹起する場合があり、好ましくない。好ましくは緩衝液に対して１〜２０（ｗ/ｖ）％の範囲である。
【００４４】
本願発明に用いられる緩衝液は、イオン種やイオン強度を制御した溶媒であり、たとえば、イオン種が、無機イオンであるリン酸緩衝液等、あるいは、有機イオンであるトリス緩衝液や酢酸緩衝液等、各種の緩衝液を使用することができる。また、イオン強度は、たとえば、上記のとおりペースト状にした水酸アパタイト／コラーゲン複合物の場合、この複合体中の値として、０．０１〜１．０の範囲、特に０．０５〜０．５の範囲であることが好ましい。
【００４５】
また、本願発明は、上記凍結乾燥における凍結温度を制御することで、多孔質複合体の気孔形状および気孔サイズを制御することができ、たとえば、気孔率を８０％以上にした骨再建材とすることができる。具体的には、たとえば、凍結温度が−２０℃（通常のフリーザー）の場合、多孔質複合体の気孔サイズを１００〜５００μｍとすることができ、また、たとえば、凍結温度が−８０℃（細胞等の保存に用いられるディープフリーザー）の場合、気孔サイズを５０〜２００μｍとすることができ、凍結温度が−１９６℃（液体窒素に浸漬）の場合、気孔サイズを５〜５０μｍとすることができる。このように、凍結時の温度が低いほど気孔サイズを小さくすることができる。なお、気孔の形状は、球状あるいは紡錘状とすることができる。
【００４６】
さらに、この凍結乾燥後に、真空炉を使って減圧下で行う熱処理（真空熱処理）することで、脱水縮合を生じさせ、効率よく架橋を生成することができ、より弾性に富み、安定した多孔質複合体を製造することができる。真空熱処理の実施条件としては、コラーゲンにおける効率のよい架橋生成を考慮すると、温度は９０〜１７０℃の範囲、より好ましくは１００〜１５０℃の範囲であり、圧力（真空度）は気圧２０Ｐａ以下の減圧状態が好ましい。そして、処理時間は、温度によって変化する。具体的には、たとえば、処理温度が９０〜１１０℃の範囲の場合、処理時間は７２〜１６８時間が好ましく、処理温度が１１０〜１３０℃の範囲の場合、処理時間は２４〜１２０時間が好ましく、また、処理温度が１３０〜１５０℃の範囲の場合、処理時間は８〜４８時間以上が好ましく、さらに、処理温度が１５０〜１７０℃の範囲の場合、処理時間は３〜２４時間が好ましい。そして、コラーゲンの熱分解の進行をできるだけ抑制するために、コラーゲンに架橋が導入された後はできるだけ短時間に上記熱処理を終えることが好ましい。
【００４７】
そして、本願発明における骨再建促進能を有する薬剤の含浸について説明すると、本願発明における多孔質複合体に薬剤を含浸させる方法としては、（Ａ）薬剤の水溶液に多孔質複合体を浸漬して薬剤を吸着させる方法、（Ｂ）薬剤の水溶液を多孔質複合体に滴下する方法、もしくは（Ｃ）多孔質複合体内部にシリンジ等を用いて薬剤の水溶液を注入する方法を利用することができる。
【００４８】
ここで、上記の含浸方法（Ａ）の浸漬時間については、多孔質複合体が薬剤の水溶液を吸収した後（すなわち薬剤の導入後）であれば特に限定されるものではなく、上記の含浸方法（Ｂ）（Ｃ）の滴下・注入後の静置時間についても特に限定されるものではない。上記（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）いずれの含浸方法においても、薬剤水溶液の導入後すぐにインプラント可能である。また、温度条件としては、薬剤の失活温度（タンパク質の変成温度）以下であれば特に限定されないが、具体的には、２０℃〜薬剤の失活温度の範囲であることが好ましい。２０℃未満では多孔質複合体への薬剤の吸着に時間がかかり好ましくない。さらに、薬剤の水溶液は、リン酸緩衝液、生理食塩水、精製水等の生体内に安全に導入できる公知の溶媒を用いて作成することができる。また、上記方法（Ｂ）（Ｃ）の場合、薬剤の放出速度を抑えるために、薬剤をヒアルロン酸、コラーゲンゲル、フィブリノゲン等と混合して滴下もしくは注入することも可能である。
【００４９】
そして、本願発明における骨再建促進能を有する薬剤とは、骨誘導能、血管誘導能および細胞増殖促進能の少なくともいずれかの機能を有する薬剤である。具体的には、たとえば、本願発明における薬剤は、細胞成長因子、サイトカインの少なくともいずれかであり、これら薬剤は骨再建材に担持される。サイトカインについては、骨誘導能を有する骨形成因子（Bone Morphogenetic Protein；BMP）を使用することで、極めて優れた骨組織の誘導を実現できる。この骨形成因子（BMP）は、骨誘導因子ともいわれており、出願時点において、たとえば、BMP1〜9がクローニングされ、いずれも本願発明にて使用することができる。また、細胞成長因子は、たとえば、血管誘導能を有する（細胞増殖促進能を有する場合もある）、たとえば、血管内皮細胞増殖因子：Vascular Endothelial Growth Factor（VEGF）、肝細胞増殖因子：Hepatocyte Growth Factor（HGF）、線維芽細胞増殖因子：Fibroblast Growth Factor（FGF）等の血管新生因子も使用することもできる。
【００５０】
さらには、本願発明では、ペニシリン系やセフェム系、マクロライド系、テトラサイクリン系等の各種抗生物質を含有させることも可能であり、これによって抗菌機能をも発揮させることができる。
【００５１】
なお、上記の骨再建促進能を有する薬剤や抗生物質の濃度は、使用する薬剤、抗生物質の種類や適用部位によって異なるため、適宜に濃度を調整することができる。
【００５２】
以上のような製造方法によって、優れた強度や移植時（使用時）の操作性、生体適合性および骨誘導性を備えているとともに、変形の抑制効果を向上させ、細胞や組織の侵入性を向上させ、薬剤の担持性を向上させ薬剤を効率よく移植部位（作用部位）に発現させることができ、少量の薬剤で骨組織の誘導を行うことができる骨再建材を、簡単な工程で、しかも手間とコストを抑えて製造することができる。
【００５３】
そして、このような製造方法で製造された骨再建材をはじめとする、本願発明の骨再建材は、生体骨類似体として、たとえば、骨欠損部の治療における人工骨材や人工骨充填材、人工歯根等のインプラントに活用することができる。
【００５４】
以下に、実施例を例示しながら、さらに詳しく本願発明の骨再建材の製造方法および骨再建材、骨組織誘導方法について説明する。もちろん、以下の例によって本願発明が限定されることはない。
【実施例】
【００５５】
実施例１：骨形成因子を包含する骨再建材の検証
＜試験例と比較例＞
１−Ａ．多孔質複合体の作成と、骨再建材の作成
（１）  水酸アパタイト／コラーゲン複合繊維体（ＨＡｐ／Ｃｏｌ）の粉末１ｇと、リン酸緩衝液（１００ｍＭ, ｐＨ６．８）８ｍＬとを混合し、均一になるまで十分に混練し、加温処理して、ゲル化した。
（２）  このゲル化した混合物を、任意の型（たとえば、細胞培養用Φ５３ｍｍのポリスチレンディッシュや細胞培養用２４穴プレート等、適宜に選択することができる）に注入し、氷冷して、ゼリー状に硬化させた。
（３）  次いで、冷却速度を制御しながら、ゲル内に氷晶を成長させ凍結させた。
（４）  凍結完了後、凍結乾燥を行い、多孔質複合体を作成した。
（５）  さらに、この多孔質複合体に、１４０℃、１２時間の条件で、真空下で加熱処理（真空熱処理）を行って脱水縮合を生じさせ、より弾性を有する多孔質複合体、すなわち、多孔質のＨＡｐ／Ｃｏｌ複合体を作成した。
（６）そして、上記（５）で得られた多孔質複合体に、骨再建促進能を有する薬剤として、骨誘導能を有するサイトカインである骨形成因子（BMP-2）を含浸させて、本願発明の骨再建材を作成した。
１−Ｂ．比較対照物の作成
作成条件は、上記１−Ａ．の「多孔質複合体の作成と、骨再建材の作成」とほぼ同じであるが、サイトカインである骨形成因子（BMP-2）を含浸させていない点で相違する。
２．骨再建材の生体への移植と、その結果観察
作成した本願発明のBMP2含有の骨再建材（以下、骨再建材（BMP-2包含）とする）と、比較対照であるBMP2不含の骨再建材（以下、骨再建材（BMP-2なし）とする）それぞれを、ラットの背部筋層下に移植した。
【００５６】
結果は、図１および２に示したとおりであった。図１は、本願発明の骨再建材（BMP-2包含）をマウスに移植した際の、移植箇所およびその近傍における骨形成の様子を示した図であり、（１）検証１回目、（２）検証２回目、（３）検証３回目である。図２は、図１の検証１回目における組織の要部拡大図であり、（１）は０．０８μｇのBMP-2を包含、（２）は０．４μｇのBMP-2を包含、（３）は２μｇのBMP-2を包含している。図３は、比較対照である骨再建材（BMP-2なし）をマウスに移植した際の、移植箇所およびその近傍における骨形成の様子を示した図であり、（１）検証１回目、（２）検証２回目、（３）検証３回目である。
【００５７】
図１および図２の矢印で示したとおり、移植２週間後でBMP-2の使用量（０．０８μｇ、０．４μｇ、２μｇ）に関わらず、どの群でもインプラントに沿った骨形成が認められた。また、再現性を示すため、同条件の検証（同じ条件でのインプラント間での比較検証）を３回行ったところ、いずれの検証でも骨形成が認められた。なお、図２（１）の黒矢印は、異所性誘導骨である骨髄様組織を示す。
【００５８】
すなわち、移植後のインプラントが形状を維持しており、かつ、そのインプラントに沿って骨形成が生じ、これによって、インプラントと同形状の骨組織が誘導できたことが確認できた。しかも、上記のとおり、たとえば、０．０８μｇという微量のBMP2含有量でも、骨形成を誘導することができた。
【００５９】
一方、図３では、BMP2を使用せずに移植した骨再建材は、移植時は弾力性のあるスポンジ状であったが、硬化し、移植２週間後と比べ、移植４週間後においても移植前の形状、および多孔質構造をほぼ維持していた。しかしながら、BMP2不含のため、移植部位およびその近傍において、効率のよい骨形成は誘導されていなかった。
実施例２：血管誘導性の細胞増殖因子を包含する骨再建材の検証
１．骨再建材の作成と、検証方法
（１）  実施例１の１−Ａで得られた多孔質複合体（サイズ：３×１０×１０ｍｍ）に、以下の群の血管誘導性の細胞増殖因子溶液を滴下して、骨再建材を作成した。この骨再建材を、フィッシャーラットの背部皮下に移植した。
Ａ群：繊維芽再考増殖因子（rhFGF-2）、0.25μg/ml(50ng/implant)
Ｂ群：繊維芽再考増殖因子（rhFGF-2）、2.5μg/ml(500ng/implant)
Ｃ群：血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、2.5μg/ml(500ng/implant)
Ｄ群：コントロール（増殖因子なし）
（２）  移植２週間後に骨再建材を摘出した。摘出した骨再建材の中央部の切片を抗ＣＤ３１抗体、抗平滑筋アクチン抗体による免疫染色を行った。それぞれの群の血管面積を測定し（切片中央の幅５００μｍの範囲）、骨再建材中に占める割合を算出した。
２．結果
骨再建材中の血管の占める割合（血管占有率）は、図４に示したとおり、コントロールであるＤ群と比べて、増殖因子を加えたＡ群〜Ｃ群は血管占有率が有意に高かった。
【００６０】
具体的には、それぞれＡ群：3.35%、Ｂ群：3.73%、Ｃ群：4.45%、Ｄ群：1.44%であった。したがって、増殖因子を加えたＡ群〜Ｃ群は、コントロールのＤ群に比べて血管占有率が有意に高かったことを確認することができた（p＜0.05 relative to control）。また、コントロールでは血管の官空構造が乏しかった。
【００６１】
骨折部において血液の供給が不足すると骨折の治癒は遅れ、最終的には偽関節を生じることもある。骨折の治癒には血液の供給が不可欠で、人工骨を用いる場合も同様に十分に血管が浸潤し、いかに骨を形成する細胞が供給され、そこに定着するかが重要となる。このことと、以上の結果から、本願発明の骨再建材は、血管誘導性増殖因子の担体としても有用で、BMP等の骨形成因子と組み合わせることで、骨形成が促進されることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本願発明の骨再建材（BMP-2包含）をマウスに移植した際の、移植箇所およびその近傍における骨形成の様子を示した図であり、（１）検証１回目、（２）検証２回目、（３）検証３回目である。
【図２】図１の検証１回目における骨組織の拡大図であり、（１）は０．０８μｇのBMP-2を包含、（２）は０．４μｇのBMP-2を包含、（３）は２μｇのBMP-2を包含している。
【図３】比較対照である骨再建材（BMP-2なし）をマウスに移植した際の、移植箇所およびその近傍における骨形成の様子を示した図であり、（１）検証１回目、（２）検証２回目、（３）検証３回目である。
【図４】本願発明の骨再建材（血管誘導性の細胞増殖因子を包含）をマウスに移植した際の、移植箇所およびその近傍における骨形成の様子を示した図であり、Ａ群は0.25μg/mlのrhFGF-2、Ｂ群は2.5μg/mlのrhFGF-2、Ｃ群は2.5μg/mlのVEGF、Ｄ群はコントロール（増殖因子なし）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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