(57)【要約】  【課題】  より多くの収量が期待できる細胞製造方法を開発することを課題とするものである。  【解決手段】  培養容器１は、袋状である。培養容器１に細胞２１を播種した後、培養容器１を平置きし、一定時間放置する。しばらく時間が経過すると、播種された細胞２１が沈降し、地側の内壁面２６に細胞が接する。そしてさらにしばらく時間が経過すると、細胞が内壁面２６に接着する。一定時間が経過した後、培養容器１を天地反転させる（姿勢変更工程）。そして天地を逆転させた状態で静置する（第二静置工程）。しばらく時間が経過すると、残余の細胞２１が沈降し、地側の内壁面２８に細胞が接する。その後、平置きした状態を維持させ、内壁面２６，２８に接着した細胞を増殖させる（増殖工程）。【選択図】  図４
2007097407.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞が播種された培地で満たされた培養容器を使用し、前記培養容器内で細胞を培養する細胞の製造方法において、培養容器の一部又は全部がガス透過性樹脂で作られており、培養容器の姿勢を特定の姿勢に維持した状態で静置させる静置工程と、培養容器の姿勢を変更する姿勢変更工程と、姿勢変更後にさらに静置させる工程を有することを特徴とする細胞製造方法。
【請求項２】
細胞が播種された培地で満たされた培養容器を使用し、前記培養容器内で細胞を培養する細胞の製造方法において、培養容器の一部又は全部がガス透過性樹脂で作られており、培養容器を反転する姿勢変更工程を含むことを特徴とする細胞製造方法。
【請求項３】
培養容器は大面積の表裏面を持つことを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞製造方法。
【請求項４】
培養容器内は実質的に培地で満たされていて気相は存在しないことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の細胞製造方法。
【請求項５】
細胞が播種された培地で満たされた培養容器を使用し、前記培養容器の内表面の一部又は全部に細胞を付着させて細胞を培養する細胞の製造方法において、培養容器の一部又は全部がガス透過性樹脂で作られており、培養容器内は実質的に培地で満たされていて気相は存在せず、培養中に培養容器の姿勢を変更して細胞を付着させる内表面の略全部が一旦下方向となる様にすることを特徴とする細胞製造方法。
【請求項６】
細胞が播種された培地で満たされた培養容器を使用し、前記培養容器内で細胞を培養する細胞の製造方法において、培養容器の一部又は全部がガス透過性樹脂で作られており、培養容器内は実質的に培地で満たされていて気相は存在せず、培養中に培養容器の姿勢を変更して培養容器の略全ての内表面が一旦下方向となる様にすることを特徴とする細胞製造方法。
【請求項７】
培養容器は常時は静置させていることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の細胞製造方法。
【請求項８】
培養容器の表裏面の一方を天方向に向け、他方を地方向に配置して姿勢を保つ第一静置工程を実施し、培養容器の地方向の内面に細胞が接着した後に姿勢変更工程を実施して培養容器の表裏面を天地反転し、さらに天地反転後の姿勢を保つ第二静置工程を実施することを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の細胞製造方法。
【請求項９】
培養容器は袋状であることを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の細胞製造方法。
【請求項１０】
培養容器の内面は親水性であることを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載の細胞製造方法。
【請求項１１】
播種される細胞は付着依存性細胞であることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載の細胞製造方法。
【請求項１２】
細胞が播種された培地で満たされた培養容器を使用し、前記培養容器内で細胞を培養する細胞の製造方法において、培養容器は袋状であってその一部または全部がガス透過性樹脂で作られており、培養容器の内面は親水性であり、培養容器内は実質的に培地で満たされていて気相は存在せず、播種される細胞は付着性細胞であり、培養容器の表裏面の一方を天方向に向け、他方を地方向に配置して姿勢を保つ第一静置工程を実施し、培養容器の地方向の内面に細胞が接着した後に姿勢変更工程を実施して培養容器の表裏面を天地反転し、さらに天地反転後の姿勢を保つ第二静置工程を実施して新たに地方向となった培養容器の内面に細胞を接着させることを特徴とする細胞製造方法。
【請求項１３】
細胞が播種された培地で満たされた培養容器を保持する保持手段と、培養容器の姿勢を変更する姿勢変更手段を有することを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１４】
細胞が播種された培地で満たされた培養容器を保持する保持手段と、培養容器の姿勢を天地反転する姿勢反転手段を有することを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１５】
保持手段は、大面積の表裏面を持つ培養容器を保持可能であり、培養容器は表裏面の一方を天方向に向け、他方を地方向に向けて保持されることを特徴とする請求項１３又は１４に記載の細胞培養装置。
【請求項１６】
保持手段は、培養容器の表裏面を通気可能な状態で培養容器を保持可能であることを特徴とする請求項１３乃至１５のいずれかに記載の細胞培養装置。
【請求項１７】
タイマー機能を備えた制御手段を備え、制御手段によって培養容器の表裏面の一方を天方向に向け、他方を地方向に向けた姿勢を一定時間維持し、その後姿勢反転手段によって培養容器の姿勢を天地反転し、さらの天地反転後の姿勢を一定時間維持することを特徴とする請求項１４乃至１６のいずれかに記載の細胞培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞を培養して動物細胞を製造する方法に関するものであり、特に付着依存性の高い細胞の製造に適するものである。また本発明は、細胞培養装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
動物細胞の培養技術は、バイオテクノロジー分野における重要な技術の一つである。例えば種々のタンパク医薬が組み換え動物細胞を培養することによって生産されている。
一方、近年、いわゆる再生医療が注目され、実用化に向けて日々研究が行われている。ここで再生医療とは、体の一部が死滅したり失われてしまった様な場合に、細胞を利用してその失われた機能の取り戻しを図る医療である。
再生医療の実用化や実験研究には、幹細胞等の動物細胞の培養が欠かせない。ここで近年、人の骨髄組織中に、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、筋肉細胞（心筋・骨格筋）等に分化する能力を持つ間葉系幹細胞が存在することが報告されており、研究者の間では、この間葉系幹細胞を如何にして培養するかという点に注目が集まっている。
【０００３】
ここで間葉系幹細胞は、付着依存性があり、壁面等に付着した状態で増殖・分化する性質を持つので、間葉系幹細胞の培養は例えば次の方法によって行うことができる。
即ち人体から取り出した骨髄液から間葉系幹細胞を分離し、これをフラスコ内に培地と共に入れる（播種）。なお間葉系幹細胞は市販されているが、提供者の同意を得て当該提供者から採取する場合もある。
そして細胞をフラスコの底面に付着した状態で増殖させる。細胞は、二次元的に増殖し、フラスコ底面を覆ってゆく。
フラスコ底面に培養可能な余地面積が少なくなると、トリプシン等によって細胞を剥離・分離し、新たなフラスコに分離した間葉系幹細胞を播種し、増殖させてゆく。
この方法では、フラスコ底面からの細胞の剥離や、新たなフラスコへの播種に手間が掛かる。またこれらの作業は、多くの場合、手作業で行われるので作業中にコンタミネーションが起こる危険がある。
【０００４】
上記したフラスコを使用する方法に代わって、培養バッグを使用する方法が特許文献１，２に開示されている。
特許文献１，２に開示された方法は、ガス透過性を有する樹脂で作られた培養バッグを使用するものである。特許文献１，２に開示された方策では、培養バッグの中に培地と共に細胞を播種し、培養バッグの内面に細胞を接着させて増殖させる。
【特許文献１】特開平６−９８７５６号公報
【特許文献２】特開平３−１６０９８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１，２に開示された方策によると、培養バッグの内面に細胞が接着して増殖するので、フラスコを使用する方法に比べてより効率のよい培養が期待できる。
しかしながら、本発明者らの実験によると、培養バッグの部位によって回収される細胞の量にばらつきがあり、全体的な収量は少ないものであった。
即ち培養バッグを縦置き（つり下げ状態）にして細胞を培養すると、培養バッグの底部側に細胞が集中的に増殖し、上部側からは少しの細胞しか回収することができない。
また培養バッグを平置きにして細胞を培養すると、天側となった壁面と地側となった壁面との間で収量に大きな開きがあった。具体的には、地側となった壁面には増殖した細胞が付着していたが、天側となった壁面には少しの細胞しか付着していなかった。
【０００６】
そこで本発明は、従来技術の上記した問題点に注目し、より多くの収量が期待できる細胞製造方法を開発することを課題とするものである。併せて本発明は、細胞を効率よく培養することができる細胞培養装置の開発を課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記した課題を解決するための請求項１に記載の発明は、細胞が播種された培地で満たされた培養容器を使用し、前記培養容器内で細胞を培養する細胞の製造方法において、培養容器の一部又は全部がガス透過性樹脂で作られており、培養容器の姿勢を特定の姿勢に維持した状態で静置させる工程と、培養容器の姿勢を変更する工程と、姿勢変更後にさらに静置させる工程を有することを特徴とする細胞製造方法である。
【０００８】
本発明の細胞製造方法では、培養容器の一部又は全部がガス透過性樹脂で作られているから、培養容器を密閉状態にして細胞を培養することができる。また本発明では、培養容器の姿勢を特定の姿勢に維持した状態で静置させる工程を有し、この時に播種された細胞が沈下し、当該姿勢における下部側に細胞が接着する。
さらに本発明の細胞製造方法では、培養容器の姿勢を変更する工程と、姿勢変更後にさらに静置させる工程を有する。そのため変更後の姿勢で細胞が沈下し、当該姿勢における下部側に細胞が接着する。そのため本発明の細胞製造方法では、より多くの容器表面に細胞が接着し、培養容器の内面を有効に利用することができる。
培地に播種される細胞は、何らかの前処理が施されている場合が多いが、例えば骨髄液等をそのまま培地に入れてもよい。
【０００９】
請求項２に記載の発明は、細胞が播種された培地で満たされた培養容器を使用し、前記培養容器内で細胞を培養する細胞の製造方法において、培養容器の一部又は全部がガス透過性樹脂で作られており、培養容器を反転する姿勢変更工程を含むことを特徴とする細胞製造方法である。
【００１０】
本発明の細胞製造方法では、培養容器を反転する姿勢変更工程を含むので、培養容器を反転した状態で下部に位置する部位の壁面にも細胞を接着することができる。
【００１１】
請求項３に記載の発明は、培養容器は大面積の表裏面を持つことを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞製造方法である。
【００１２】
本発明の細胞培養方法では、培養容器は大面積の表裏面を持つ。そのため沈下した細胞が大面積の内面に接着する。
【００１３】
請求項４に記載の発明は、培養容器内は実質的に培地で満たされていて気相は存在しないことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の細胞製造方法である。
【００１４】
本発明の細胞製造方法では、培養容器の中に気相が存在しないので、培養容器の姿勢を変更する際や反転する際に接着した細胞が気相に晒されることがない。
【００１５】
請求項５に記載の発明は、細胞が播種された培地で満たされた培養容器を使用し、前記培養容器の内表面の一部又は全部に細胞を付着させて細胞を培養する細胞の製造方法において、培養容器の一部又は全部がガス透過性樹脂で作られており、培養容器内は実質的に培地で満たされていて気相は存在せず、培養中に培養容器の姿勢を変更して細胞を付着させる内表面の略全部が一旦下方向となる様にすることを特徴とする細胞製造方法である。      
【００１６】
本発明の細胞製造方法では、培養中に培養容器の姿勢を変更して細胞を付着させる内表面の略全部が一旦下方向となる様にする。そのため希望する面に細胞を接着させることができる。また培養容器の中に気相が存在しないので、培養容器の姿勢を変更する際に接着した細胞が気相に晒されることがない。
【００１７】
請求項６に記載の発明は、細胞が播種された培地で満たされた培養容器を使用し、前記培養容器内で細胞を培養する細胞の製造方法において、培養容器の一部又は全部がガス透過性樹脂で作られており、培養容器内は実質的に培地で満たされていて気相は存在せず、培養中に培養容器の姿勢を変更して培養容器の略全ての内表面が一旦下方向となる様にすることを特徴とする細胞製造方法である。
【００１８】
本発明の細胞製造方法では、培養中に培養容器の姿勢を変更して培養容器の略全ての内表面が一旦下方向となる様にする。そのため略全ての内表面に細胞を接着させることができる。また培養容器の中に気相が存在しないので、培養容器の姿勢を変更する際に接着した細胞が気相に晒されることがない。
【００１９】
請求項７に記載の発明は、培養容器は常時は静置させていることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の細胞製造方法である。
【００２０】
本発明の細胞培養方法では、培養容器は常時は静置させている。そのため培養される細胞が刺激されず、細胞が傷むことがない。
【００２１】
請求項８に記載の発明は、培養容器の表裏面の一方を天方向に向け、他方を地方向に配置して姿勢を保つ第一静置工程を実施し、培養容器の地方向の内面に細胞が接着した後に姿勢変更工程を実施して培養容器の表裏面を天地反転し、さらに天地反転後の姿勢を保つ第二静置工程を実施することを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の細胞製造方法である。
【００２２】
本発明の細胞製造方法では、培養容器の表裏面の一方を天方向に向け、他方を地方向に配置して姿勢を保つ第一静置工程を実施するので、地方向となった内表面に細胞を接着させることができる。また培養容器の地方向の内面に細胞が接着した後に姿勢変更工程を実施して培養容器の表裏面を天地反転し、さらに天地反転後の姿勢を保つので、この反転後に地方向となった側の内表面にも細胞を接着させることができる。
【００２３】
請求項９に記載の発明は、培養容器は袋状であることを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の細胞製造方法である。
【００２４】
「袋状」とはバッグを含む概念である。本発明の培養容器は、袋状であるから、収納場所を要さない。また輸送も便利である。
【００２５】
請求項１０に記載の発明は、培養容器の内面は親水性であることを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載の細胞製造方法である。
【００２６】
本発明の細胞培養方法では、培養容器の内面が親水性であるから細胞が接着しやすい。
【００２７】
請求項１１に記載の発明は、播種される細胞は付着依存性細胞であることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載の細胞製造方法である。
【００２８】
請求項１２に記載の発明は、細胞が播種された培地で満たされた培養容器を使用し、前記培養容器内で細胞を培養する細胞の製造方法において、培養容器は袋状であってその一部または全部がガス透過性樹脂で作られており、培養容器の内面は親水性であり、培養容器内は実質的に培地で満たされていて気相は存在せず、播種される細胞は付着性細胞であり、培養容器の表裏面の一方を天方向に向け、他方を地方向に配置して姿勢を保つ第一静置工程を実施し、培養容器の地方向の内面に細胞が接着した後に姿勢変更工程を実施して培養容器の表裏面を天地反転し、さらに天地反転後の姿勢を保つ第二静置工程を実施して新たに地方向となった培養容器の内面に細胞を接着させることを特徴とする細胞製造方法である。
【００２９】
本発明の細胞培養方法は、前述した各発明の特徴部分を取り入れたものであり、より多くの容器内表面に細胞が接着し、培養容器の内面を有効に利用することができる。
【００３０】
また製造装置に関する請求項１３に記載の発明は、細胞が播種された培地で満たされた培養容器を保持する保持手段と、培養容器の姿勢を変更する姿勢変更手段を有することを特徴とする細胞培養装置である。
【００３１】
本発明の細胞培養装置は、培養容器の姿勢を変更する姿勢変更手段を有するので、培養容器内面の多くの面積部分に細胞を接着させることができる。
姿勢変更手段には、例えば培養容器を短時間の内に天地反転するものや、揺動するもの、長時間をかけてゆっくりと回転させるもの、転がすもの等が考えられる。
【００３２】
請求項１４に記載の発明は、細胞が播種された培地で満たされた培養容器を保持する保持手段と、培養容器の姿勢を天地反転する姿勢反転手段を有することを特徴とする細胞培養装置である。
【００３３】
本発明の細胞培養装置は、培養容器の姿勢を天地反転する姿勢反転手段を有するので、培養容器内面の天地両側に細胞を接着させることができる。
【００３４】
請求項１５に記載の発明は、保持手段は、大面積の表裏面を持つ培養容器を保持可能であり、培養容器は表裏面の一方を天方向に向け、他方を地方向に向けて保持されることを特徴とする請求項１３又は１４に記載の細胞培養装置である。
【００３５】
本発明の細胞培養装置は、大面積の表裏面を持つ培養容器を利用することができ、この培養容器内面の両側に細胞を接着させることができる。
【００３６】
請求項１６に記載の発明は、保持手段は、培養容器の表裏面を通気可能な状態で培養容器を保持可能であることを特徴とする請求項１３乃至１５のいずれかに記載の細胞培養装置である。
【００３７】
本発明の細胞培養装置では、培養容器の表裏面が通気可能な状態で保持されるので、培地に必要な酸素等を供給することができる。また炭酸ガスを取り込むことにより、水素イオン濃度を維持することもできる。
【００３８】
請求項１７に記載の発明は、タイマー機能を備えた制御手段を備え、制御手段によって培養容器の表裏面の一方を天方向に向け、他方を地方向に向けた姿勢を一定時間維持し、その後姿勢反転手段によって培養容器の姿勢を天地反転し、さらの天地反転後の姿勢を一定時間維持することを特徴とする請求項１４乃至１６のいずれかに記載の細胞培養装置である。
【００３９】
本発明の細胞培養装置では、培養容器の表裏面の一方を天方向に向け、他方を地方向に向けた姿勢を一定時間維持するので、地方向となった内面に細胞を接着させることができる。また天地反転後の姿勢を一定時間維持するので、この時に地方向となった内面にも細胞を接着させることができる。本発明では、これらの一連の動作をタイマーで制御することができるので、細胞培養を自動化することができる。
【発明の効果】
【００４０】
本発明の細胞製造方法では、培養容器の内面のより広い範囲に細胞を接着させることができるので、より大量の細胞を回収することができる。
また本発明の細胞培養装置は、細胞培養の機械化、自動化に寄与することができる効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
以下さらに本発明の実施形態について説明する。
図１は、本発明の細胞製造方法で使用する培養容器の斜視図である。図２は、図１の培養容器に培地を充填し、平置き状態においた状態を示す斜視図である。図３は、図２に示す状態における培養容器の断面図である。
【００４２】
本実施形態の細胞製造方法では、図１に示す様な培養容器１を使用する。
培養容器１は、袋状である。培養容器１は、後記する単層又は積層シートによって作られたものであり、平面視が長方形である。即ち培養容器１は、長方形のシートを二枚重ね、周囲を接合したものであり、４辺２，３，４，５を備え、各辺２，３，４，５においては、気密性を確保する様に二枚のシートが接合されている。従って培養容器１は、表面６と裏面７が大面積であり、側面は線状であって実質的に面積を持たない。
【００４３】
培養容器１の短辺たる辺２には、孔８が設けられている。孔８は、培養後の細胞を取り出す際等に、培養容器１を吊り下げることができる様に設けられたものである。孔８は必須ではない。
【００４４】
また前記した辺２と対向する辺４には、短管１０，１１，１２が取り付けられている。短管１０，１１，１２は、培養容器１の内外を連通するものであり、培養容器１に培地を充填する際や、培地を取り替える際、或いは播種する際や、培地に添加物等を添加する際等に活用される。また短管１０，１１，１２から培養後の細胞を取り出してもよい。
【００４５】
本実施形態では、長辺３，５は、接着されているが、一枚のシートを折り重ねて培養容器を製造してもよく、この場合には一方の辺だけが接合辺となる。
またシートを筒状に押し出して培養容器を製造してもよく、この場合には長辺３，５は接合面とはならない。
【００４６】
前記した様に、培養容器１は、表面６と裏面７が大面積であり、側面は線状であって実質的に面積を持たないので、内部に培地を充填すると図２，３の様な状態となる。即ち、培養容器１の表裏面６，７の内、下側となった方は、床面に接触し、上側となった面は盛り上がる。
【００４７】
本実施形態の培養容器１は、ガス透過性を備えたシート素材によって作られている。また、培養容器１の内面は親水性である。このようなシート素材の例としては、ポリオレフィン系樹脂、及びエラストマーが挙げられる。さらに、ポリオレフィン系樹脂の例としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、及びエチレンプロピレンコポリマーが挙げられる。ポリスチレンを使用することもできる。
また、エラストマーの例としては、スチレンブタジエン熱可塑性樹脂が挙げられる。さらに、該シート素材は、２種類以上のポリマーの混合物であるポリマーアロイでもよい。該ポリマーアロイの例としては、ポリエチレンとポリプロピレンの混合物、スチレンブタジエン熱可塑性樹脂とエチレンプロピレンコポリマーの混合物、及び、スチレン−エチレン−ブタジエン−スチレンブロックコポリマー（ＳＥＢＳ）とビニルアセテートとポリプロピレンの混合物が挙げられる。またさらに、細胞がより確実に付着できるように、培養容器１の内面は荷電処理されていてもよい。
【００４８】
次に本発明の細胞製造方法を工程を追って説明する。
図４は、本発明の細胞製造方法の各工程における培養容器内の様子を示す説明図である。図５は、本発明の他の実施形態における細胞製造方法の各工程における培養容器内の様子を示す説明図である。図６は、本発明のさらに他の実施形態における細胞製造方法の各工程における培養容器内の様子を示す説明図である。
【００４９】
本発明の細胞培養方法では、前述した培養容器１を使用し、準備段階として培養容器１に図４（ａ）の様に培地２０を充填する。培地の充填は、短管１０，１１，１２を利用する。ここで注意すべき事項は、培養容器１に空気が入らない様にする点である。即ち培養容器内は実質的に培地２０で満たされていて気相は存在しない状態とする。
【００５０】
そして図４（ｂ）の様に培養容器１に細胞２１を播種する。なお培地２０に予め細胞を分散しておき、この培地を培養容器１に充填してもよい。播種される細胞は、何らかの前処理が施されるのが常態であるが、例えば採取された骨髄液等をそのまま入れる場合もある。
播種された細胞は、培養容器１内において拡散する。この時、細胞の拡散を助けるために培養容器１を揺らせてもよい。
この状態で培養容器１を平置きし、一定時間放置する。即ち大面積の表面６を天側に向け、裏面７を地側に向けて設置する。
なお培養容器１を平置きする床面２２は、図３に示すように開口２５を有し、通気性がある。従って培養容器１の下面側からも培養に必要な酸素等を取り込むことができる。また炭酸ガスを取り込むことにより、水素イオン濃度を維持することもできる。
【００５１】
培養容器１を平置き状態で設置し、その状態で静置する（第一静置工程）。第一静置工程の際には、培養容器１に極力振動等を与えない。
しばらく時間が経過すると、播種された細胞２１が沈降し、図４（ｃ）の様に地側の内壁面２６に細胞が接する。そしてさらにしばらく時間が経過すると、細胞が内壁面２６に接着する。この間の時間は、１時間から数日程度である。
【００５２】
上記した一定時間が経過した後、図４（ｄ）の様に培養容器１を天地反転させる（姿勢変更工程）。即ち培養容器１を裏返し、大面積の表面６を地側に向け、裏面７を天側に向ける図４（ｅ）。そして天地を逆転させた状態で静置する（第二静置工程）。第二静置工程の際にも、培養容器１に極力振動等を与えない。
【００５３】
しばらく時間が経過すると、残余の細胞２１が沈降し、図４（ｆ）の様に地側の内壁面２８に細胞が接する。即ち先程天側にあった面であって細胞が未接着の面に残余の細胞２１が接着する。この間の時間についても、１時間から数日程度である。
【００５４】
そしてその後、平置きした状態を維持させ、内壁面２６，２８に接着した細胞を増殖させる（増殖工程）。
この時、必要に応じて培地を入れ換える。また培養容器１が設置される環境を細胞の増殖に適するように環境を維持する。また増殖工程においては、培養容器１内の培地を移動させる場合もある。例えば培養容器１に悪影響を与えない程度の振動を与えたり、回転させたり傾斜させる場合がある。
本実施形態では、培養容器１の内面の略全域に細胞が接着しているので、細胞は培養容器１の内面全域で増殖する。
そして培養容器１内の細胞が充分に増殖したならば公知の手段によって培養容器１から細胞を取り出す。
【００５５】
以上説明した実施形態では、培養容器１を平置きした状態で細胞を増殖させたが、増殖工程における培養容器１の姿勢は任意である。
図５は、培養容器１を縦置きあるいはつり下げ状態に保持して細胞を増殖させた場合の説明図である。
【００５６】
また上記した実施形態では、第一静置工程及び第二静置工程は、いずれも細胞を接着させることだけを目的としており、比較的短い時間であるが、これらの時間を長くすることによってある程度細胞を増殖させてもよい。
図６は、第一静置工程及び第二静置工程の際に細胞を増殖させる例を示すものである。  即ち前記した実施形態と同様の培養容器１を使用し、培養容器１に図６（ａ）の様に培地２０を充填し、さらに図６（ｂ）の様に培養容器１に細胞２１を播種する。そして培養容器１を平置きし、一定時間放置する（第一静置工程）。この時の時間は、前記した実施形態よりも長い。
【００５７】
その結果、播種された細胞２１が沈降し、図６（ｃ）の様に地側の内壁面２６に細胞が接し、さらにしばらく時間が経過すると、細胞が内壁面２６に接着する。そしてさらに時間が経過すると、図６（ｄ）の様に地側の内壁面２６に接着した細胞が増殖する。
【００５８】
上記した一定時間が経過した後、図６（ｅ）の様に培養容器１を天地反転させる（姿勢変更工程）。そして天地を逆転させた状態で静置する（第二静置工程）。その結果、残余の細胞２１が沈降し、図６（ｆ）の様に地側の内壁面２８に細胞が接し、接着する。
【００５９】
そしてその後、一定の環境下で培養容器１を静置すると、内壁面２６，２８に接着した細胞が増殖し（増殖工程）、所望量の細胞を回収することができる。
【００６０】
また上記した実施形態では、培養容器１を一回だけ反転させて表裏面の両面に細胞を接着させたが、反転を二回以上行ってもよい。ただし反転を繰り返すと折角接着した細胞が剥がれる場合もあるので、過度に反転を繰り返すことは好ましくない。研究過程ではあるが、細胞によって接着しやすい細胞や剥がれやすい細胞があると予想される。反転や姿勢変更の回数や速度は、細胞の性質によって変更するべきである。
【００６１】
また上記した実施形態では、単に細胞を培養するだけに培養容器１を使用したが、培養容器１の中で細胞を分化誘導させてもよい。
一般に細胞の分化誘導を行う場合は、それ専用の培地を使用する。そこで培養容器１内で幹細胞を増殖しておき、培養容器１内の培地を分化誘導用培地に置換すれば単一の培養容器１を使用して分化誘導まで進めることができる。
【００６２】
また培養容器１等を二以上連結して使用してもよい。
【００６３】
次に、上記した細胞製造方法に使用する培養装置について説明する。
図７は、本発明の培養装置の第一の実施形態を示す斜視図である。図８は、図７に示す培養装置の載置台の断面斜視図であり、（ａ）は内部に培養容器が設置された状態を示し、（ｂ）は内部に培養容器が無い状態を示す。図９は、図７に示す培養装置の動作を示すフローチャートである。
【００６４】
本実施形態の培養装置３０は、載置台（保持手段）３１と回転用モータ（姿勢反転手段）３２によって構成されている。また載置台（保持手段）３１は図示しないインキュベータに内蔵されており、雰囲気温度や雰囲気ガス温度を調整可能である。
【００６５】
載置台３１は、平板状の台本体３３と、台本体３３の上に着脱自在に取り付けられた押さえ部材３５によって構成されている。即ち台本体３３は、平板状であり、その両端に回転軸３９が取り付けられている。回転軸３９は、軸受け３６によって回転可能に支持されている。
押さえ部材３５は、金網によって作られており、箱状をしている。押さえ部材３５の形状は任意であり、例えば板状であってもよい。また帯やベルト状であって、台本体３３の一部と当接するものであってもよい。
【００６６】
台本体３３の一部であって、押さえ部材３５の取付け部位には開口が設けられ、金網３７が設置されている。
回転用モータ３２はギャードモータであり、極めて低速で回転する。
回転用モータ３２は台本体３３に設けられた回転軸３９に接続されている。回転用モータ３２は制御装置（制御手段）３８によって駆動・停止が切り換えられる。
制御装置（制御手段）３８は図示しないＣＰＵ等を内蔵し、タイマー機能を備える。
本実施形態の培養装置３０では、図１に示す様な培養容器１を台本体３３の中央に設置し、その上から押さえ部材３５を被せる。
【００６７】
次に本実施形態の培養装置３０の機能を図９のフローチャートに従って説明する。
本実施形態の培養装置３０には、播種を終えた培養容器１が設置される。なお播種作業を培養装置３０上で実施してもよい。
播種作業を培養装置３０上で実施する場合には、細胞の拡散を助けるために培養装置３０の台本体３３を揺動させ、培養容器１を揺らせてもよい。また台本体３３を揺動させる工程を予めプログラムしておいてもよい。
【００６８】
培養容器１の設置を終えると、載置台３１を水平姿勢に維持し、タイマーの計時を開始する（ステップ２）。ここでタイマーは、第一静置工程の所要時間を計測するものである。培養装置３０では、タイマーの計時が終了するまで載置台３１を水平姿勢に保つ。
この間に播種された細胞２１が沈降し、細胞が内壁面２６に接着する。
【００６９】
そしてステップ３で第一静置工程に要する時間が経過したことが確認されると、ステップ４に移行し、回転用モータ３２を１８０°回転し、載置台３１を裏返す。
ここで本実施形態では、載置台３１の上に押さえ部材３５が取り付けられており、押さえ部材３５によって培養容器１が保持されるから、載置台３１を反転しても培養容器１が落下することはなく、培養容器１は、天地逆姿勢となる。
【００７０】
続いて再度タイマーの計時を開始する。このタイマーが計時する時間は、先のタイマーに比べて著しく長く、第二静置工程の所要時間と増殖に要する時間を計時する。ここで増殖に要する時間は、第一静置工程の所要時間に比べて著しく長いので、実際上は、増殖に要する時間をタイマーに入力すれば足る。
【００７１】
そしてこの間、培養容器１は、天地逆姿勢が維持され、さらに図示しないインキュベータによって培養容器１の雰囲気が、増殖に適した環境に維持される。また本実施形態では、押さえ部材３５及び台本体３３の押さえ部材３５が金網で作られているから、培養容器１の表面側６及び裏面側７はいずれも通風可能な状態となっている。また培養容器１は、ガスを透過することができるから、培養に必要な酸素等が培養容器１の中に取り込まれる。
そのため培養容器１の中では、反転された初期の段階で細胞２１が沈降し、図４（ｆ）の様に地側の内壁面２８に細胞が接して接着し、さらに接着した細胞が増殖する。
タイマーが満了すると、ステップ７に移行し、回転用モータ３２を１８０°回転し、載置台３１を水平姿勢に戻す。作業者は、培養装置３０から培養容器１を取り外し、さらに増殖した細胞を取り出す。
なお細胞を増殖させる工程においては、必要に応じて培地を入れ換えるが、培養装置３０は、この作業を自動的に行うものであってもよい。また細胞の取り出しについても自動的に行えるものであることが推奨される。
細胞を増殖させる工程においては、定期的に載置台３１を揺動させてもよい。
【００７２】
以上説明した実施形態では、平板状の載置台３１を備えた培養装置３０を例示したが、載置台３１の形状やこれを回転するための機構は任意である。
以下、培養装置の変形例について説明する。
【００７３】
図１０、１１は、本発明の他の実施形態の培養装置の斜視図である。
図１０に示す培養装置４０は、半円柱状の部材を向き合わせに配置した載置台を採用している。
即ち培養装置４０は、半円柱状の部材４２，４３を有し、両者の間で培養容器１を挟んで固定する。なお培養容器１と半円柱状の部材４２，４３の表面との間には図示しないスペーサが挟まれており、培養容器１と半円柱状の部材４２，４３の表面との間には隙間がある。そのため培養容器１の表面は半円柱状の部材４２，４３と密接していない。
また半円柱状の部材４２，４３の間の空間４５は、密閉空間であり、この空間内に所望濃度のガスを導入することができる。前記した様に培養容器１の表面は半円柱状の部材４２，４３と密接していないので、培養容器１の表面は導入されたガスと接する。
また半円柱状の部材４２，４３は内部に温調水が通過可能な構成であり、半円柱状の部材４２，４３の間の空間４５は所望の温度に温調可能である。
【００７４】
半円柱状の部材４２，４３は、二つのロール４６，４７によって支持されている。そしてこの内の一方のロール４７は、図示しないモータによって回転し、他方のロール４６は空転ロールである。
【００７５】
本実施形態の培養装置４０では、半円柱状の部材４２，４３の間の空間４５に培養容器１を配置し、姿勢変更を行う際には、ロール４７を回転させてこれと接する半円柱状の部材４２，４３を回転する。その結果、半円柱状の部材４２，４３と共に培養容器１が回転し、天地が逆転する。
【００７６】
また図１１に示す培養装置５０の様に、平板状の部材５１，５２で培養容器１を挟む構成も採用可能である。なお培養容器１は通気性の雰囲気中に置く必要がある。そのための方策としては、平板状の部材５１，５２を網やパンチングメタル等の通気性を有する素材で製作したり、培養容器１と平板状の部材５１，５２の間に隙間を形成させることが考えられる。
【００７７】
本実施形態では、平板状の部材５２から突出した回転軸５４に円板５３が取り付けられ、この円板５３に摩擦車５５が係合している。本実施形態では、摩擦車５５を回転することによって平板状の部材５１，５２回転し、内部に保持された培養容器１を反転する。
本実施例で採用する円板５３と摩擦車５５を歯車列に置き換えてもよく、歯車とラック、あるいはスプロケットとチェーンに置き換えてもよい。
【００７８】
また上述した実施形態では、袋状であって大面積の表裏面を備えた培養容器１を例示したが、図１２に示すような風船状の培養容器６０や、他の形状の培養容器７０〜７３を採用することもできる。
すなわち図１２は、培養容器の変形例を示し、（ａ）は、培地が未充填の状態を示す正面図であり、（ｂ）は、培地が充填されて無重力状態に置かれた状態を想定した正面図であり、（ｃ）は、培地が充填されて床上に置かれたを状態を想定した図である。図１３は、さらに他の形状の培養容器を示す斜視図である。
【００７９】
図１２に示す培養容器６０は、風船状であり、内部に培地が充填されると球形となる（重力が無い状態であり実際には下向きに垂れた状態となる）。従って培養容器６０には表裏面の区別はない。
しかしながら培養容器６０を床面６１に置くと、内部の培地の重量によって床面６１との設置面が平坦となる。
【００８０】
図１２に示す様な培養容器６０を使用する場合には、細胞を播種した後に培養容器６０を転がして培養容器６０の姿勢を変更し、培養容器６０の略全ての内表面が一回は下方向となる様にする。その結果、培養容器６０の内面全域に細胞が接着する。そしてその後、培養容器６０を所定の姿勢で静置し、接着した細胞を増殖させる。
【００８１】
また上記した例以外に、図１３に示すような形状の培養容器７０〜７３が考えられる。図１３（ａ）に示した培養容器７０は、襠付き封筒の様な形をしたものであり、側面部に厚み形成部７５が設けられている。厚み形成部７５は、通常は、折り目７６によって折り込まれている。
図１３（ｂ）に示した培養容器７１は、箱状である。図１３（ｃ）に示した培養容器７２は、円筒状である。図１３（ｄ）に示した培養容器７３は、多角柱状である。
【００８２】
図１３に示す培養容器７０〜７３の内、培養容器７０，７１の様に明確に表裏面を有する形状のものについては、培養容器７０，７１を反転して姿勢変更する方策が推奨される。これに対して明確な表裏面を持たない培養容器７２，７３については、培養容器７２，７３を回転したり揺動することにより、細胞を接着させたい面が一回は下方向となる様に姿勢変更する。
【００８３】
また上記した培養装置３０，４０，５０では、いずれも回転によって培養容器１の姿勢を変更した。回転によって培養容器１の姿勢を変更する方策は、培地の出入口を任意の最適の位置に移動させることができる点で推奨されるが、回転以外の方法によって培養容器１の姿勢を変更してもよい。
【００８４】
また上記した実施形態では、培養時（増殖工程時）に培養容器１等を静置したが、培養に悪影響を与えない程度に、培養容器１等を回転したり、揺動する等の姿勢変更を行いつつ、細胞を増殖させてもよい。
例えば図１３（ｃ）（ｄ）に示した培養容器７２，７３の様な明確な表裏面を持たない培養容器７２，７３を使用する場合には、静置することなく、常にゆっくりした回転速度で回転をし続けて細胞を増殖させてもよい。
【実施例】
【００８５】
以下の手順により、本発明の方法による体性幹細胞の培養実験を行った。ＣＯ2 インキュベーターの設定は、一般的な設定である温度３７℃、相対湿度９５％、ＣＯ2 ガス５％とした。
【００８６】
容量２００ｍＬのガス透過性バッグに、１０％仔ウシ血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（以下、「ＦＣＳ−ＤＭＥＭ」と称する。）約１５０ｍＬを充填し、密閉後、ＣＯ2 インキュベーター内でプレインキュベートした。一方、凍結保存された体性幹細胞を融解し、ＦＣＳ−ＤＭＥＭで洗浄した後、数ｍＬのＦＣＳ−ＤＭＥＭに懸濁した。１００個の細胞数に相当する量の細胞懸濁液を、プレインキュベートされたバッグ内のイーグル培地に添加した。バッグ内で細胞が均一に分散するようにバッグをゆっくり揺らした後、ＣＯ2 インキュベーター内に寝かせた状態で１〜２時間静置し、バッグの一方の内面に細胞を付着させた。次に、バッグを天地反転させて、さらに１〜２時間静置し、バッグの他方の内面にも細胞を付着させた。これにより、バッグの両面の内面に細胞が付着した。その後、バッグを縦に吊るし、ＣＯ2 インキュベーター内で約１か月間静置した。
【００８７】
静置後にバッグの状態を目視で観察したところ、バッグの両方の内面に増殖した細胞が一面に付着していた。バッグから培地を抜き取り、バッグ内面に付着した細胞をトリプシン処理により回収した。回収された細胞の数を計測し、得られた細胞数をバッグ内面の表面積で除し、細胞密度を算出した。その結果、３×１０００個／平方センチメートルの細胞密度が実現されていた。この細胞密度は、胚性幹細胞等の幹細胞の培養を目的とする場合にとって十分なものであった。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】本発明の細胞製造方法で使用する培養容器の斜視図である。
【図２】図１の培養容器に培地を充填し、平置き状態においた状態を示す斜視図である。
【図３】図２に示す状態における培養容器の断面図である。
【図４】本発明の細胞製造方法の各工程における培養容器内の様子を示す説明図である。
【図５】本発明の他の実施形態における細胞製造方法の各工程における培養容器内の様子を示す説明図である。
【図６】本発明のさらに他の実施形態における細胞製造方法の各工程における培養容器内の様子を示す説明図である。
【図７】本発明の培養装置の第一の実施形態を示す斜視図である。
【図８】図７に示す培養装置の載置台の断面斜視図であり、（ａ）は内部に培養容器が設置された状態を示し、（ｂ）は内部に培養容器が無い状態を示す。
【図９】図７に示す培養装置の動作を示すフローチャートである。
【図１０】本発明の他の実施形態の培養装置の斜視図である。
【図１１】本発明のさらに他の実施形態の培養装置の斜視図である。
【図１２】培養容器の変形例を示し、（ａ）は、培地が未充填の状態を示す正面図であり、（ｂ）は、培地が充填されて無重力状態に置かれた状態を想定した正面図であり、（ｃ）は、培地が充填されて床上に置かれたを想定した図である。
【図１３】さらに他の形状の培養容器を示す斜視図である。
【符号の説明】
【００８９】
１  培養容器
６  表面
７  裏面
２０  培地
２６，２８  内壁面
３０  培養装置
３１  載置台（保持手段）
３２  回転用モータ（姿勢反転手段）
３３  台本体
３５  押さえ部材
４０  培養装置
５０  培養装置
６０  培養容器
７０〜７３  培養容器
【図１】
2007097407.tif 000003
【図２】
2007097407.tif 000004
【図３】
2007097407.tif 000005
【図４】
2007097407.tif 000006
【図５】
2007097407.tif 000007
【図６】
2007097407.tif 000008
【図７】
2007097407.tif 000009
【図８】
2007097407.tif 000010
【図９】
2007097407.tif 000011
【図１０】
2007097407.tif 000012
【図１１】
2007097407.tif 000013
【図１２】
2007097407.tif 000014
【図１３】
2007097407.tif 000015