(57)【要約】【課題】本発明は、ＮＧＦと同様なＭＡＰキナーゼ活性化作用を有し、細胞の分化誘導作用、神経細胞の神経突起伸長作用、さらには脳神経細胞の外傷性障害、代謝性要因による障害、β−アミロイド蛋白質による障害または脳虚血性障害に対して予防あるいは治癒する作用を持つ素材を提供する。【解決手段】 既知の方法で調製したリゾホスファチジルエタノールアミンを含有することを特徴とするＭＡＰキナーゼ活性化物質を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リゾホスファチジルエタノールアミンを含有することを特徴とするＭＡＰキナーゼ活性化物質。
【請求項２】
細胞死抑制作用、細胞の分化誘導作用、神経細胞の神経突起伸長作用、さらには脳神経細胞の外傷性障害、代謝性要因による障害、β−アミロイド蛋白質による障害または脳虚血性障害を予防あるいは治癒する作用を有する請求項１に記載のＭＡＰキナーゼ活性化物質。
【請求項３】
シグナル伝達系タンパク質であるＡｋｔのリン酸化を促進する作用を有する請求項１〜２に記載のＭＡＰキナーゼ活性化物質。
【請求項４】
シグナル伝達系タンパク質であるマイトジェン活性化キナーゼのリン酸化を促進する作用を有する請求項１〜２に記載のＭＡＰキナーゼ活性化物質。
【請求項５】
請求項１〜４に記載のＭＡＰキナーゼ活性化物質を有効成分として配合してなる医薬用組成物。
【請求項６】
請求項１〜４に記載のＭＡＰキナーゼ活性化を有効成分として配合してなる食用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリゾホスファチジルエタノールアミンを含有することを特徴とするマイトジェン活性化キナーゼ（以下ＭＡＰキナーゼ）を活性化する物質（以下ＭＡＰキナーゼ活性化物質）とその利用法に関する。また、本発明のＭＡＰキナーゼ活性化物質は細胞の分化誘導作用、神経細胞の神経突起伸長作用を有し、さらに脳神経細胞の外傷性障害、代謝性要因による障害、β−アミロイド蛋白質による障害または脳虚血性障害を予防あるいは治癒する作用を有する。さらに、本発明のＭＡＰキナーゼ活性化物質を有効成分とする医薬組成物や食用組成物を調製することができる。
【背景技術】
【０００２】
これまで、ＭＡＰキナーゼを制御する方法として、４−イミダゾリン−２−オン化合物（特許文献１）、アゾール化合物（特許文献２）、１，３−チアゾール化合物（特許文献３）、５−メチル−１−フェニル−２−（１Ｈ）−ピリドン（特許文献４）等の化合物を用いる方法や、ローヤルゼリー中の５７ｋＤの糖タンパク質を用いる方法（特許文献５）、さらには、ＭＡＰキナーゼ活性制御遺伝子が挿入された組み替え発現ベクターを用いる方法（特許文献６）が知られている。また、抗腫瘍作用を示す微小管作用剤とＥＲＫ、ＭＡＰキナーゼカスケード素阻害剤を併用することにより抗腫瘍剤としての効果を改善する技術（特許文献７）が知られている。一方、ＭＡＰキナーゼを活性化すると肝細胞が保護されるという知見がある（特許文献５）。
【特許文献１】特開２００４−３３９２１０号公報
【特許文献２】特開２００２−３０２４４５号公報
【特許文献３】特開２００１−１１４６９０号公報
【特許文献４】ＷＯ０１／０５８４４８号公報
【特許文献５】特開２００３−６１６４９号公報
【特許文献６】特開２００３−２１９８８９号公報
【特許文献７】ＷＯ００／４０２６８号公報
【０００３】
一方、リゾホスファチジルエタノールアミンのＭＡＰキナーゼ活性化作用に関する先行技術は知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記のＭＡＰキナーゼの制御方法は、毒性やコスト、実際に人に投与した際に効果が十分でなかった等の理由で、実用化が遅れている。また、リゾホスファチジルエタノールアミンを、ＭＡＰキナーゼ活性化物質として利用する先行技術は知られていない。
【０００５】
そこで、本発明は、ＮＧＦと同様なＭＡＰキナーゼ活性化作用を有し、細胞の分化誘導作用、神経細胞の神経突起伸長作用、脳神経細胞の外傷性障害、代謝性要因による障害、β−アミロイド蛋白質による障害または脳虚血性障害に対して予防あるいは治癒する作用を持つ素材を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、リゾホスファチジルエタノールアミンを含む抽出物がＭＡＰキナーゼを活性化することを見いだし、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は次の［１］〜［１０］である。
［１］リゾホスファチジルエタノールアミンを含有することを特徴とするＭＡＰキナーゼ活性化物質。
［２］細胞死抑制作用、細胞の分化誘導作用、神経細胞の神経突起伸長作用、さらには脳神経細胞の外傷性障害、代謝性要因による障害、β−アミロイド蛋白質による障害または脳虚血性障害を予防あるいは治癒する作用を有する［１］に記載のＭＡＰキナーゼ活性化物質。
［３］シグナル伝達系タンパク質であるＡｋｔのリン酸化を促進する作用を有する［１］〜［２］に記載のＭＡＰキナーゼ活性化物質。
［４］シグナル伝達系タンパク質であるマイトジェン活性化キナーゼのリン酸化を促進する作用を有する［１］〜［２］に記載のＭＡＰキナーゼ活性化物質。
［５］［１］〜［４］に記載のＭＡＰキナーゼ活性化物質を有効成分として配合してなる医薬用組成物。
［６］［１］〜［４］に記載のＭＡＰキナーゼ活性化を有効成分として配合してなる食用組成物。
【０００７】
すなわち、本発明は、リゾホスファチジルエタノールアミンを含有することを特徴とするＭＡＰキナーゼ活性化物質とその利用法に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、リゾホスファチジルエタノールアミンを含有することを特徴とする、ＭＡＰキナーゼ活性化作用、細胞の分化誘導作用、神経細胞の神経突起伸長作用、さらには脳神経細胞の外傷性障害、代謝性要因による障害、β−アミロイド蛋白質による障害または脳虚血性障害を予防あるいは治癒する作用のあるＭＡＰキナーゼ活性化物質を提供できる。
【発明の実施の形態】
【０００９】
以下、本発明について詳細に説明する。本発明で使用するリゾホスファチジルエタノールアミン(lysophosphatidylethanolamine)は、動植物の細胞中に存在し、特に卵黄や脳細胞に多く含有されている。リゾホスファチジルエタノールアミンは、細胞膜に存在するリン脂質の一種であるホスファチジルエタノールアミンから生合成される。ホスファチジルエタノールアミンは、卵黄や大豆レシチンに含まれるリン脂質の一種で、２つの脂肪酸を分子内に含有している。生体内では、ホスファチジルエタノールアミンがリン脂質加水分解酵素であるホスホリパーゼ(Phospholipase)Ａ２作用を受けて、ｓｎ−２位置にある１つの脂肪酸が除去されることによって、リゾホスファチジルエタノールアミンに変換される。
また、動植物中にもっとも多く見いだされるホスファチジルコリンを出発物質としてホスフォリパーゼＤを用いた塩基交換反応でホスファチジルエタノールアミンとし、次にホスフォリパーゼＡ２によりリゾホスファチジルエタノールアミンを調製することができる。本発明に用いるリゾホスファチジルエタノールアミンは上記の天然物中に含まれるものやホスフォリパーゼＡ２を使用して調製したものを単独または適宜組み合わせたものである。
【００１０】
本発明では、リゾホスファチジルエタノールアミンの含有量を上げる目的で、クロマト処理を行うことができる。また、得られた分画物は、そのまま、あるいは凍結乾燥法、スプレードライなどの方法を用いて、固体化、粉末化して用いることが出来る。
【００１１】
本発明のＭＡＰキナーゼ活性化物質の作用は、リゾホスファチジルエタノールアミンが細胞膜のレセプターを活性化し、次いで、例えば、ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）であるＲａｆ、ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）であるＭＥＫ１／２、ＭＡＰＫであるＥＲＫ１／２を活性化する。
【００１２】
本発明のＭＡＰキナーゼ活性化物質は、リゾホスファチジルエタノールアミンを０．０１から５０％、好ましくは０．１から３０％、より好ましくは１から１０％含有する。リゾホスファチジルエタノールアミンの含有量が０．０１％未満ではＭＡＰキナーゼ活性化作用が認められない。また。リゾホスファチジルエタノールアミン含有量が５０％より多くしても、活性の顕著な増加は認められない。
【００１３】
次に、本発明のＭＡＰキナーゼ活性化物質を配合してなる医薬用組成物および食用組成物について説明する。本発明のＭＡＰキナーゼ活性化物質を配合してなる製剤は、これをそのまま、あるいは慣用の医薬製剤担体とともに医薬用組成物となし、動物およびヒトに投与することができる。医薬用組成物の剤形としては特に制限されるものではなく、必要に応じて適宜に選択すればよいが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤、注射剤、坐剤等の非経口剤があげられる。
【００１４】
本発明において錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤としての経口剤は、例えば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を用いて常法に従って製造される。これらの製剤中の本発明のＭＡＰキナーゼ活性化物質の配合量は０．０１から５０％、好ましくは０．１から３０％、より好ましくは１から１０％含有する。ＭＡＰキナーゼ活性化物質の含有量が０．０１％未満ではＭＡＰキナーゼ活性化作用が認められない。また。ＭＡＰキナーゼ活性化物質の含有量が５０％より多くしても、活性の顕著な増加は認められない。この種の製剤には本発明のＭＡＰキナーゼ活性化物質の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を適宜に使用することができる。
【００１５】
上記のＭＡＰキナーゼ活性化物質を含有する医薬用組成物は懸濁液、エマルション剤、シロップ剤、エリキシル剤としても投与することができ、これらの各種剤形には、矯味矯臭剤、着色剤を含有させてもよい。
【００１６】
本発明のＭＡＰキナーゼ活性化物質は食用組成物としても利用可能である。すなわち、前述のようにして得られるリゾホスファチジルエタノールアミンを有効成分としてなるＭＡＰキナーゼ活性化物質は、これをそのまま液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキミックス、粉末状または液状の乳製品、パン、クッキー等に添加したり、必要に応じてデキストリン、乳糖、澱粉等の賦形剤や香料、色素等とともにペレット、錠剤、顆粒等に加工したり、またゼラチン等で被覆してカプセルに成形加工して健康食品や栄養補助食品等として利用できる。
【００１７】
これらの食品類あるいは食用組成物における本発明のＭＡＰキナーゼ活性化物質の配合量は、当該食品や組成物の種類や状態等により一律に規定しがたいが、約０．０１〜５０重量％、より好ましくは０．１〜３０重量％である。配合量が０．０１重量％未満では経口摂取による所望の効果が小さく、５０重量％を超えると食品の種類によっては風味を損なったり当該食品を調製できなくなる場合がある。なお、本発明のＭＡＰキナーゼ活性化物質は、原料が食品であれば、これをそのまま食用に供してもさしつかえない。
【００１８】
本発明の医薬用組成物および食用組成物は、ＭＡＰキナーゼ活性化をねらいとして利用するものであれば、それを使用する上で何ら制限を受けることなく適用される。
【実施例１】
【００１９】
以下、本発明を実施例を用いて具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２０】
実験例１  加水分解反応によるリゾホスファチジルエタノールアミンの製造例
大豆リン脂質（ツルーレシチン製、ホスファチジルコリン７５％、ホスファチジルエタノールアミン１４％、その他１１％）８０ｇを８０ｍＬのアセトンに溶かした。シリカゲル（Ｍｅｒｃｋ、７０−２３０ｍｅｓｈ）４５０ｇを１，０００ｍｌのアセトンに加えた後、７０ｍｍｘ７００ｍｍのガラスカラムに充填した。このカラムに、上記で溶解したリン脂質溶液を投入した後、アセトン５００ｍｌ、アセトン：エタノール混合溶液（９５：５）１０００ｍｌ、アセトン：エタノール混合溶液（９０：１０）１，５００ｍｌ、アセトン：エタノール混合溶液（８５：１５）２，０００ｍｌで溶出しながら、溶出されるリゾホスファチジルエタノールアミンを薄層クロマトグラフィーで調べた。ホスファチジルエタノールアミンが溶出される分画だけを集めて、ロータリーエバポレータで濃縮した。得られたホスファチジルエタノールアミンをＨＰＬＣ(カラム：シリカゲル６０  野村化学製、溶離液  クロロホルム：メタノール＝９０：１０)で分析した結果、純度６０％のホスファチジルエタノールアミン（ホスファチジルコリン２２％含有）２０ｇが得られた。
【００２１】
得られた純度６０％のホスファチジルエタノールアミン（ホスファチジルコリン２２％含有）１５ｇを１５０ｍｌのジエルエーテルに溶かした後、ここにＣａＣｌ2が１００ｍＭ含有された酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６、１００ｍＭ）２０ｍＬを添加した。この溶液に５ｍｌのレシターゼ（１０，０００ＩＵ／ｍｌ、Ｎｏｖｏ
Ｎｏｒｄｉｓｋ社）を添加し、３０℃で１３時間激しく攪拌しながら反応した。溶液を静置させた後、上澄み液を除去した。すなわち、溶媒及び生成された脂肪酸を除去した。沈殿部分を常温で２００ｍＬのヘキサン：エタノール：水（１：１：０．３）の混合溶液で抽出した。下部の水層を除去し、ここに５０ｍｌのエタノールを添加して、常温でろ過した。ろ過物にさらにヘキサン：エタノール（１：１）溶液を１００ｍＬ処理し、ろ過し、乾燥した。得られた乾燥物について液体クロマトグラフィーでリゾホスファチジルエタノールアミンを定量した結果、純度は９０％、収量は５ｇであった。
【００２２】
実験例２  粗抽出物の調製例
乾燥全卵（キューピー製）１ｋｇを攪拌槽に仕込み、そこにエタノール２Ｌと水０．４Lを加え、常温で５時間撹拌した。その後、濾過により抽出液と残渣を分離した。抽出液をエバポレーターにより濃縮し、茶褐色の粗抽出物２５０ｇを得た。粗抽出物中のリゾホスファチジルエタノールアミン含量は１１％であった。
【００２３】
実験例３  ＭＡＰキナーゼ活性化物質の調製例
上記の粗抽出物１０ｇを、分取用高速液体クロマトグラフィー（ギルソン社製、モデル３０３）で分画した。カラムとしてデベロシル６０−１０  φ５０ｍｍ×５００ｍｍ（野村化学製）を用い、検出波長は２１０ｎｍ、溶媒はクロロホルム：メタノール＝９０：１０、溶媒流量を５０ｍL／分とした。分画に際し、５分ごとに溶離液を分取し、分取物に含まれる溶媒をロータリーエバポレーターで乾燥して、乾固した分画物を得た。画分各物中のリゾホスファチジルエタノールアミン含量を上記の方法で測定し、最も含量が高かった分画物すなわち９０％品をＭＡＰキナーゼ活性化物質とした。
【実施例２】
【００２４】
馬血清１０容量％、牛胎児血清５容量％を含むＤＭＥＭ培地（日水製薬）にＰＣ１２細胞（岐阜薬科大学から分与）を５万個／ｍＬ濃度で培養し、２４時間後に無血清のＤＭＥＭ培地に交換した。さらに２４時間後に本発明の実験例１のＭＡＰキナーゼ活性化物質を１００または５００μｇ／ｍL添加し、１０分後にＰＣ１２細胞の細胞質のタンパク質をリシスバッファーで採取した。採取したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、タンパク質をナイロンメンブレンにブロットした。ブロッキング後に抗ＭＡＰキナーゼラビットＩｇＧ抗体で反応後、アビジンービオチン化ホースラディッシュペルオキシダーゼコンプレックスで処理した。ペルオキシダーゼ活性をジアミノベンジディン−Ｈ２Ｏ２を用いて活性化されたＭＡＰキナーゼを可視化することにより、ＭＡＰキナーゼの活性化を測定した。陽性対象として、ＮＧＦβ（シグマ製）を２５ｎｇ／ｍL添加し同じ操作を行った。結果を表２に示した。同表中の記号は、ＭＡＰキナーゼの活性化について−：なし、＋：あり、＋＋および＋＋＋：顕著にありを意味する。
【実施例３】
【００２５】
既往の方法で、１８日齢のラット胎児から大脳ニューロンを採取し、馬血清１０容量％、牛胎児血清５容量％を含むＤＭＥＭ培地（日水製薬）で２４時間培養した。２４時間後に無血清のＤＭＥＭ培地に交換し、さらに２４時間後に実験例３のＭＡＰキナーゼ活性化物質を１００または５００μｇ／ｍL添加した。３０秒後に大脳ニューロンの細胞質のタンパク質をリシスバッファーで採取した。採取したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、タンパク質をナイロンメンブレンにブロットした。ブロッキング後に抗リン酸化ＡｋｔラビットＩｇＧ抗体で反応後、アビジンービオチン化ホースラディッシュペルオキシダーゼコンプレックスで処理した。ペルオキシダーゼ活性をジアミノベンジディン−Ｈ２Ｏ２を用いてリン酸化Ａｋｔを可視化することにより、Ａｋｔのリン酸を測定した。陽性対象として、ＮＧＦβ（シグマ製）を２５ｎｇ／ｍL添加し同じ操作を行った。結果を表２に示した。同表中の記号は、Ａｋｔのリン酸化について−：なし、＋：あり、＋＋および＋＋＋：顕著にありを意味する。
【比較例１】
【００２６】
1-フェニル-2-(3-ピリジル)エタノン（特許文献２の参考例２の方法で合成）、2-ブロモ-1-フェニル-2-(3-ピリジル)エタノン臭化水素酸塩（特許文献３の参考例６の方法で合成）、１−（４−フルオロフェニル）−５−（ピリジン−４−イル）−４−イミダゾリン−２−オン（特許文献１の実施例１の方法で合成）に関して実施例１の方法でＭＡＰキナーゼ活性化作用を測定した。結果を表１に示した。
【比較例２】
【００２７】
1-フェニル-2-(3-ピリジル)エタノン（特許文献２の参考例２の方法で合成）、2-ブロモ-1-フェニル-2-(3-ピリジル)エタノン臭化水素酸塩（特許文献３の参考例６の方法で合成）、１−（４−フルオロフェニル）−５−（ピリジン−４−イル）−４−イミダゾリン−２−オン（特許文献１の実施例１の方法で合成）に関して実施例２の方法でＭＡＰキナーゼ活性化を測定した。結果を表２に示した。
【００２８】
【表１】
2007022965.tif 000002
【００２９】
【表２】
2007022965.tif 000003
【００３０】
表１、２、に示されるように、本発明のＭＡＰキナーゼ活性化物質は、従来ＭＡＰキナーゼ活性化作用があると言われていた、1-フェニル-2-(3-ピリジル)エタノン、2-ブロモ-1-フェニル-2-(3-ピリジル)エタノン臭化水素酸塩、１−（４−フルオロフェニル）−５−（ピリジン−４−イル）−４−イミダゾリン−２−オンよりも格段に優れたＭＡＰキナーゼ活性化作用が認められる。また、陽性対象としたＮＧＦと同等のＭＡＰキナーゼ活性化作用を有していた。