(57)【要約】【課題】イソプレノイド系化合物の新規な製造方法の提供。【解決手段】カボチャ植物のカルスを形成せしめ、当該カルスと、出発イソプレノイド系化合物とを接触せしめて、当該出発イソプレノイド系化合物を重合せしめることを特徴とする目的イソプレノイド化合物の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カボチャ植物のカルスを形成せしめ、当該カルスと、出発イソプレノイド系化合物とを接触せしめて、当該出発イソプレノイド系化合物を重合せしめることを特徴とする目的イソプレノイド化合物の製造方法。
【請求項２】
前記出発イソプレノイド系化合物が、イソプレニル二リン酸、ゲラニル二リン酸及びファルネシル二リン酸から成る群から選択される少なくとも１種類のイソプレノイド系化合物であり、そして前記目的イソプレノイド系化合物が、ゲラニル二リン酸、ファルネシル二リン酸及びゲラニル二リン酸、ファルネシル二リン酸及びゲラニルゲラニル二リン酸から成る群から選択される少なくとも１種類のイソプレノイド化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記出発イソプレノイド系化合物がイソプレニル二リン酸及びゲラニル二リン酸であり、そして前記目的イソプレノイド系化合物がファルネシル二リン酸及びゲラニルゲラニル二リン酸である、請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能性イソプレノイド類（イソプレノイド系化合物）の新規な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イソプレノイド系化合物としては、イソプレノール（炭素原子数５個）、並びに当該イソプレノールを単量体とする重合体であるゲラニオール（炭素原子数10個）、ファルネソール（炭素原子数15個）及びゲラニルゲラニオール（炭素原子数20個）などのほか、炭素数が５の倍数である更に高分子の化合物が知られており、それらの生理活性のために医薬活性物質などとしての用途が有望視されている。
【０００３】
イソプレノイド系化合物を出発材料とし、これらを重合せしめることにより更に高分子量のイソプレノイド系化合物を得る方法としては、微生物培養系を用いる方法が知られている。
他方、カルス培養など、植物の組織培養により有用物質を製造する方法が種々知られている。しかしながら、本発明でいうイソプレノイド系化合物については、それらが植物細胞内に取り込まれ難いため、組織培養系によるイソプレノイド系化合物の製造は困難であると考えられていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、本発明は、植物の組織培養、特にカルス培養を用いてイソプレノイド系化合物を製造する方法を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の発明者は、上記の課題を解決すべく種々検討した結果、カボチャ植物の組織培養により形成されたカルスはイソプレノイド系化合物を細胞内に取り込むことができ、更に取り込んだイソプレノイド系化合物を重合して、より炭素原子数の多いイソプレノイド系化合物を合成することができるという、新規な知見を得て本発明を完成させた。
従って、本発明は、カボチャ植物のカルスを形成せしめ、当該カルスと、出発イソプレノイド系化合物とを接触せしめて、当該出発イソプレノイド系化合物を重合せしめることを特徴とする目的イソプレノイド化合物の製造方法を提供する。
【０００６】
上記の方法において、例えば、前記出発イソプレノイド系化合物は、イソプレニル二リン酸、ゲラニル二リン酸及びファルネシル二リン酸から成る群から選択される少なくとも１種類のイソプレノイド系化合物であり、そして前記目的イソプレノイド系化合物は、ゲラニル二リン酸、ファルネシル二リン酸及びゲラニル二リン酸、ファルネシル二リン酸及びゲラニルゲラニル二リン酸から成る群から選択される少なくとも１種類のイソプレノイド化合物である。
より具体的な例において、前記出発イソプレノイド系化合物はイソプレニル二リン酸及びゲラニル二リン酸であり、そして前記目的イソプレノイド系化合物はファルネシル二リン酸及びゲラニルゲラニル二リン酸である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明において、イソプレノイド系化合物とは、イソプレノール（炭素原子数５個）、及び当該イソプレノールを単量体とする種々の重合体（炭素原子数が５の倍数）を意味し、当該重合体としては、ゲラニオール（炭素原子数10）、ファルネソール（炭素原子数15個）、ゲラニルゲラニオール（炭素原子数20個）、ゲラニルファルネソール（炭素原子数25）、ヘキサプレノール（炭素原子数30）などが挙げられる。
【０００８】
また、本発明のイソプレノイド系化合物には、上記のアルコール類のみならず、それらのエステル類、特に二リン酸エステル類も含まれる。例えば、イソプレニル二リン酸（炭素原子数５個）、ゲラニル二リン酸（炭素原子数10）、ファルネシル二リン酸（炭素原子数15個）、ゲラニルゲラニル二リン酸（炭素原子数20個）、ゲラニルファルネシル二リン酸（炭素原子数25）、ヘキサプレニル二リン酸（炭素原子数30）などである。カルス細胞内への取り込み、細胞内での酵素的重合反応の効率の観点から二リン酸エステルが特に重要である。しかしながら、一旦合成された後のイソプレノイド系化合物は、二リン酸が加水分解除去されたアルコールの形態でも得ることができる。
【０００９】
本発明によれば、イソプレニル二リン酸（炭素原子数５個）を出発イソプレノイド系化合物として、その重合体である、ゲラニル二リン酸（炭素原子数10）、ファルネシル二リン酸（炭素原子数15個）、ゲラニルゲラニル二リン酸（炭素原子数20個）などの目的イソプレノイド系化合物を得ることができる。また、イソプレニル二リン酸（炭素原子数５個）とゲラニル二リン酸（炭素原子数10個）を出発イソプレノイド系化合物として、ファルネシル二リン酸（炭素原子数15個）、ゲラニルゲラニル二リン酸（炭素原子数20個）などの目的イソプレノイド系化合物を得ることができる。また、ゲラニル二リン酸（炭素原子数10個）を出発イソプレノイド系化合物として、ゲラニルゲラニル二リン酸（炭素原子数20個）などの目的イソプレノイド系化合物を得ることができる。
【００１０】
カルスの形成
本発明の方法において使用するカルスは、カボチャ植物から得られる。培養の出発材料としては、カボチャ植物の葉、茎、頂部（新芽）などの切片が使用される。カルスの培養は、常法に従って行なうことができる。例えば、カボチャの葉や新芽を採り、これを70％エタノール及び１％次亜塩素酸ナトリウム溶液により消毒し、適当な大きさ、例えば5mm×5mmの切片を調製し、植物組織培養用固体培地、例えば固体MS培地上で培養する。培地には、植物の組織培養において通常用いられる植物ホルモン、例えば、2,4−ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）、カイネチンなどを添加することができる。
【００１１】
カルスの安定化
培養は、無菌状態で、24℃において行なわれる。１週間〜１箇月の培養によりカルスが形成される。このカルスは、そのまま使用することもできるが、継代培養を繰り返して安定なカルスを得てから使用するのが好ましい。
【００１２】
イソプレノイドの合成
次に、イソプレノイド系化合物の合成のため、上記のようにして得たカルスを、植物組織培養用液体培地に移して培養する。この培地としては、植物の組織培養のために常用される培地、例えばMS培地などを使用することができる。この培地には、植物の組織培養において通常用いられる植物ホルモン、例えば、2,4−ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）、カイネチンなどを添加することができる。
【００１３】
この培養に当っては、先ず、出発イソプレノイド系化合物を添加する。添加濃度は特に限定されないが、例えば0.1mM〜100mM、好ましくは１mM〜10mM程度である。しかしながら、カルスの能力によっては更に高濃度の出発イソプレノイド系化合物を添加することもできる。また、出発イソプレノイド系化合物は培養の最初に一度に加えてもよく、あるいは複数回に分割して培養中にも加えることができる。
【００１４】
培養は好気的条件下で行われ、たとえばフラスコ内での振とう培養、培養槽中での通気培養など、植物組織の好気的液体培養に通常用いられる任意の培養方法を用いることができる。
培養期間は特に限定されないが、例えば、１週間〜２箇月程度である。
【００１５】
目的イソプレノイド系化合物の回収・生成
培養液から目的イソプレノイド系化合物を単離・精製するには、培養液を、水と混和しない疎水性有機溶媒、例えばペンタンなどにより抽出して、目的イソプレノイド系化合物を有機溶媒に移行させ、この有機溶媒からイソプレノイドを精製するための常法に従って回収・精製することができる。
具体的な一例を実施例に記載する。
【実施例】
【００１６】
実施例１. ファルネシル二リン酸及びゲラニルゲラニル二リン酸の製造
クリアジカボチャ植物（Cucurbrita maxima kuriaji）の葉又は新芽を採取し、70％エタノール及び１％次亜塩素酸ナトリウム溶液で消毒し、これを細切して約５mm×５mmの切片とし、下記のとおりに調製したMS（Murashige ＆ Skoog）固体培地に植えつけた。
MS培地に0.8％の寒天並びに３〜10μMの2,4-D及び0.3〜１μMのカイネチン又はゼアチンを加え、pHを5.7〜5.8に調整し0.8％の寒天を加え、100mlの三角フラスコに20mlを分注し、オートクレーブ殺菌することにより、上記のMS固体培地を調製した。１週間〜１箇月の静置培養によりカルスの形成が見られた。
【００１７】
上記のMS培地において寒天を加えない液体培地を100mlの三角フラスコに20mlを分注してオートクレーブ殺菌した後、上記のとおりに形成したカルスを植え付け、22日間振とう培養した。更に、2.5mMのゲラニル二リン酸（GPP）及び１mMのイソプレニル二リン酸（IPP）を添加した20日間振とう培養した。フラスコ２本分（培養液43ml）を200mlの分液ロート
に入れ、これにペンタン25mlを入れ、300回振り、30分間静置し、水相を抜き出してそれに更にペンタン25ml入れて300回振とうし、30分間静置し、水相と有機層とを分けた。
【００１８】
この操作を５回反復した後、有機層を分液ロートに入れ、これに飽和食塩水30mlを加えて30回振とうし、30分間静置して有機層と水相とを分離した。有機相に再蒸留水20mlをいれ、20回位、振とうし、静置して有機相と水相とに分けた。この操作を２回行なった後、有機相にMgSO4（無水）を加えて３時間脱水した。有機相をセライトで濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、0.1221gの抽出物を得た。これを質量分析にかけたところ、ファルネシル二リン酸及びゲラニルゲラニル二リン酸の生成が確認された。
【００１９】
図１は抽出物の液体クロマトグラフィーの結果を示し、図２は標準ゲラニルゲラニオールの結果を示し、図３は標準ファルネソールの結果を示し、図４は抽出物に標準ゲラニルゲラニオールを添加した試料の結果を示し、そして図５は抽出物の標準ファルネソールを添加した試料の結果を示す。これらの比較から、抽出物には、ファルネソール（ファルネシル二リン酸の脱リン酸型）とゲラニルゲラニオール（ゲラニルゲラニル二リン酸の脱リン酸型）が含まれることが確認される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、イソプレニル二リン酸及びゲラニル二リン酸と共にカボチャのカルスを培養した培養液の抽出物の液体クロマトグラフィーの結果を示すチャートである。
【図２】図２は、標準ゲラニルゲラニオールの液体クロマトグラフィーの結果を示すチャートである。
【図３】図３は、標準ファルネソールの液体クロマトグラフィーの結果を示すチャートである。
【図４】図４は、図１の抽出物に標準ゲラニルゲラニオールを添加した試料の液体クロマトグラフィーの結果を示すチャートである。
【図５】図５は、図１の抽出物に標準ファルネソールを添加した試料の液体クロマトグラフィーの結果を示すチャートである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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