(57)【要約】【課題】            無細胞タンパク質合成系において、細部破壊という操作及びＡＴＰ等のエネルギー物質の添加は不可欠であるが、これらの操作によって真核細胞抽出液中のｅＩＦ２αがリン酸化され、タンパク質合成反応の翻訳効率が低下する。【解決手段】        真核細胞から調製した抽出液と、エネルギー物質と、真核生物翻訳開始因子２αサブユニット（ｅＩＦ２α）のリン酸化阻害剤及び／又はリン酸化されたｅＩＦ２αの脱リン酸化促進剤とを含むことを特徴とする、真核生物無細胞タンパク質合成用組成物を提供する。【選択図】            図１
2007060993.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞から調製した抽出液と、エネルギー物質と、真核生物翻訳開始因子２αサブユニット（ｅＩＦ２α）のリン酸化阻害剤及び／又はリン酸化されたｅＩＦ２αの脱リン酸化促進剤とを含むことを特徴とする、真核生物無細胞タンパク質合成用組成物。
【請求項２】
改善されたタンパク質合成活性を有することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記リン酸化阻害剤が、プロテインキナーゼＰＫＲ、ＰＥＲＫ又はＧＣＮ２の基質類似物を含む請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記リン酸化阻害剤が、ｅＩＦ２αのＮ末端から９０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド断片若しくはその相同体、又はその誘導体を含む請求項１〜３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記相同体が、ワクシニアウイルスのＫ３Ｌタンパク質、粘液腫ウイルスのＭ１５６Ｒタンパク質、ＳＦウイルスの８．２Ｒタンパク質、豚痘ウイルスのＣ８Ｌタンパク質、及び天然痘ウイルスのＣ３Ｌタンパク質からなる群より選択される何れかである請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記脱リン酸化促進剤が、ホスホリラーゼＰＰ１をリン酸化されたｅＩＦ２αへ引き寄せる補助因子である請求項１〜５の何れか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記脱リン酸化促進剤が、ＧＡＤＤ３４タンパク質若しくはその相同体、又はそれらの誘導体を含む請求項１〜６の何れか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記誘導体が、ＧＡＤＤ３４タンパク質のカルボキシ末端から少なくとも１００個のアミノ酸残基からなるポリペプチド断片、又はそれと少なくとも７０％の相同性を有し、かつ、ホスホリラーゼＰＰ１をリン酸化されたｅＩＦ２αへ引き寄せる機能を有するポリペプチド断片である請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記真核細胞が、哺乳動物細胞である請求項１〜８の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記真核細胞が、培養細胞である請求項１〜８の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れか一項に記載の組成物を含むことを特徴とする無細胞タンパク質合成キット。
【請求項１２】
請求項１〜１０の何れか一項に記載の組成物と、鋳型ＤＮＡ又はｍＲＮＡとを用いることを特徴とする無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の製造方法。
【請求項１３】
真核生物無細胞タンパク質合成系によるタンパク質合成用組成物の製造方法であって、少なくとも細胞破壊によって生じるｅＩＦ２αのリン酸化を抑止する手段を含むことを特徴とする、真核生物無細胞タンパク質合成用組成物の製造方法。
【請求項１４】
さらに組換え体真核生物翻訳開始因子を添加することを特徴とする請求項１３に記載の真核生物無細胞タンパク質合成用組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核生物無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の製造方法に関し、より詳しくは、真核生物翻訳開始因子２αサブユニット（ｅＩＦ２α）のリン酸化を抑止し、及び／又は脱リン酸化を促進することによる改善されたタンパク質の製造方法に関する。さらに本発明は、前記改善された真核生物無細胞タンパク質合成系においてタンパク質を製造するための抽出液組成物及びその製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞由来の無細胞タンパク質合成系は、真核生物遺伝子産物の解析や、翻訳の制御の研究に重要である。最も一般的には、ウサギ網状赤血球の抽出液(reticulocyte lysate)が用いられており、この系で発現された多くのタンパク質は正しいフォールディングやプロセシングが起こり、正常なインビボでの活性が発現される（例えば、非特許文献１参照）。例えば、アセチル化、イソプレニル化、リン酸化などの翻訳後の修飾がタンパク質の機能や活性に必要な場合がある。また、シグナルペプチドの切断や糖鎖の付加のような翻訳後修飾（プロセッシング）は、上記翻訳反応液にイヌのミクロゾーム膜を添加することによって行われている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００３】
植物由来の小麦胚芽抽出液も真核生物タンパク質の発現、解析に用いられているが、小麦胚芽細胞の破壊に伴って内因性トリチンが活性化され、自己リボソームを不活性化してタンパク質合成活性を低下させることが知られている。このタンパク質合成活性の低下を抑えるために、抗トリチン抗体を用いてトリチン活性を除去、中和することによりタンパク質合成反応を効率化する方法が報告されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
一方、真核細胞翻訳開始因子ｅＩＦ２は三つのサブユニットα、β、γから成り、αユニットがリン酸化されるとｅＩＦ２は不活性化され、タンパク質合成が抑制される。細胞がウイルス感染、アミノ酸欠乏等のストレス状況下に陥った場合、ＰＥＲＫ、ＰＫＲ、ＧＣＮ２などのプロテインキナーゼが活性化され、ｅＩＦ２αをリン酸化し、それによりタンパク質合成が抑制され、ウイルスの増殖等を阻止していると考えられる（図１及び非特許文献３参照）。
【０００５】
具体的に説明すると、翻訳開始の最初の段階は、ｅＩＦ２、ＧＴＰ及び開始Ｍｅｔ−ｔＲＮＡの三元複合体の４０Ｓリボソームユニットへの結合である。この４３Ｓプレ開始複合体が他の補助因子と共にｍＲＮＡに結合する。リボソームがｍＲＮＡを走査して開始ＡＵＧコドンを見つけると、ｅＩＦ２に結合していたＧＴＰがＧＤＰに加水分解され、不活性なＧＤＰ結合体としてリボソームから放出される。ＧＤＰはグアニンヌクレオチド交換因子であるｅＩＦ２ＢによってＧＴＰに置き換えられ、活性型のｅＩＦ２が再生される。ここで、例えば細胞にウイルスが進入すると、これに応答してキナーゼＰＫＲが活性化され、ｅＩＦ２αをリン酸化して上記グアニンヌクレオチド交換反応を阻害する。ｅＩＦ２αの５１番目のセリン残基がリン酸化されると、ＧＤＰ結合型ｅＩＦ２αのｅＩＦ２Ｂへの親和性が高まり、不活性な複合体を形成してｅＩＦ２Ｂを補足する。その結果ｅＩＦ２Ｂ濃度が低下してグアニンヌクレオチド交換反応が進行せず翻訳開始反応全体が阻害される。これを回避するために、ワクシニアウイルスのＫ３Ｌ遺伝子産物は、細胞内におけるｅＩＦ２αのリン酸化酵素の偽基質として働き、ｅＩＦ２αのリン酸化を阻害する（非特許文献４参照）。粘液腫ウイルスの免疫調節性タンパク質Ｍ１５６Ｒ等の他のウイルスタンパク質にも同様の作用があることが報告されている（例えば、非特許文献５参照）。
【０００６】
一方、細胞内のシグナル伝達機構の調節タンパク質であるＧＡＤＤ３４（別名ＭＹＤ１１６とも呼ばれる。）は、細胞内においてリン酸化されたｅＩＦ２αの脱リン酸化を促進し、細胞のタンパク質合成活性の停止を回復させることも知られている（例えば、非特許文献６参照）。
【０００７】
【特許文献１】特開平７−２０３９８４
【非特許文献１】Pelham, HR. and Jackson, RJ. "An efficient mRNA-dependent translation system from reticulocyte lysates." (1976) Eur J Biochem. Vol. 67, pp. 247-256.
【非特許文献２】Walter, P. and Blobel, G. (1983) Method. Enzymol., Vol. 96, pp.84
【非特許文献３】Kaufman, R.J. "Stress signaling from the lumen of the endoplasmic reticulum: coordination of gene transcriptional and translational controls." (1999) Genes & Development 13, 1211-1233.
【非特許文献４】Carroll, K., Elroy-Stein, O., Moss, B. and Jagus, R. "Recombinant Vaccinia virus K3L gene product prevents activation of double-stranded RNA-dependent, initiation factor 2α-specific protein kinase" (1993)  The Journal of Biological Chemistry, Vol. 268, pp.12837-12842
【非特許文献５】Ramelot, TA. Et al., "Myxoma virus immunomodulatory protein MR156R is a structural mimic of eukaryotic translation initiation factor eIF2α”, (2002) J. Mol. Biol., Vol.322, pp.943-954.
【非特許文献６】Novoa, I., Zeng, H., Harding, HP., and Ron, D. "Feedback inhibition of the unfolded protein response by GADD34-mediated dephosphorylation of eIF2α”  (2001) The Journal of Cell Biology, vol. 153, pp.1011-1021.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
無細胞タンパク質合成系において、タンパク質合成のエネルギー源としてＡＴＰやクレアチンリン酸等のエネルギー物質が添加される。ＡＴＰはタンパク合成のエネルギー源であり、クレアチンリン酸はクレアチンキナーゼによりそのリン酸基がＡＤＰに転移され、ＡＴＰ合成の基質となる。これらの添加物はタンパク質の合成反応を進行させるために必須である。しかしながら、本発明者らはこれらのエネルギー物質の添加により細胞抽出液中のｅＩＦ２αがリン酸化され、タンパク質合成反応の翻訳効率を低下させることを発見した。その添加混合物の中でＡＴＰとクレアチンリン酸（最終的にはＡＴＰ）がｅＩＦ２αのリン酸化を引き起こす物質であることをつきとめた。そのメカニズムとしては、細胞破壊というストレスにより、ＰＥＲＫ、ＰＫＲ、ＧＣＮ２等のｅＩＦ２αキナーゼがある程度活性化しており、これらのプロテインキナーゼの基質であるＡＴＰが添加されることによってさらに活性化が起こり、ｅＩＦ２αがリン酸化されると考えられる。無細胞タンパク質合成系において、細部破壊という操作及びＡＴＰ等のエネルギー物質の添加は不可欠であるため、何らかの処置を行わない限りｅＩＦ２αのリン酸化は避けることができない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、かかる課題を解決するためになされたものであって、真核生物由来の無細胞タンパク質合成系において、ｅＩＦ２αのリン酸化を阻害することにより翻訳効率の低下を抑止し、タンパク質合成活性を向上させて無細胞タンパク質合成系を効率化するものである。
【００１０】
すなわち、第一の側面において、本発明の真核生物無細胞タンパク質合成用組成物は、真核細胞から調製した抽出液と、エネルギー物質と、真核生物翻訳開始因子２αサブユニット（ｅＩＦ２α）のリン酸化阻害剤とを含むことを特徴とする。前記リン酸化阻害剤には、プロテインキナーゼＰＫＲ、ＰＥＲＫ又はＧＣＮ２の基質類似物等が含まれる。好ましい実施形態において、前記リン酸化阻害剤は、ｅＩＦ２αのＮ末端から９０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド断片若しくはその相同体、又はその誘導体を含む。また、前記相同体とは、ワクシニアウイルスのＫ３Ｌタンパク質、粘液腫ウイルスのＭ１５６Ｒタンパク質、ＳＦウイルスの８．２Ｒタンパク質、豚痘ウイルスのＣ８Ｌタンパク質、及び天然痘ウイルスのＣ３Ｌタンパク質からなる群より選択される何れかのタンパク質であることが好ましい。
【００１１】
第二の側面において、本発明の真核生物無細胞タンパク質合成用組成物は、真核細胞から調製した抽出液と、エネルギー物質と、リン酸化されたｅＩＦ２αの脱リン酸化促進剤とを含むことを特徴とする。前記脱リン酸化促進剤とは、ホスホリラーゼＰＰ１をリン酸化されたｅＩＦ２αへ引き寄せる補助因子であり、ＧＡＤＤ３４タンパク質若しくはその相同体、又はそれらの誘導体等が含まれる。好ましい実施形態において、前記誘導体は、ＧＡＤＤ３４タンパク質のカルボキシ末端から少なくとも１００個のアミノ酸残基からなるポリペプチド断片、又はそれと少なくとも７０％の相同性を有し、かつ、ホスホリラーゼＰＰ１をリン酸化されたｅＩＦ２αへ引き寄せる機能を有するポリペプチド断片である。本発明の組成物は、前記ｅＩＦ２αのリン酸化阻害剤と、リン酸化されたｅＩＦ２αの脱リン酸化促進剤とを別々にあるいは同時に含むことができ、いずれの場合においても従来よりもタンパク質合成活性の改善された無細胞タンパク質合成用組成物を提供することができる。
【００１２】
本発明の他の側面において、前記組成物を含むことを特徴とする無細胞タンパク質合成キット及び前記組成物又はキットを用いるタンパク質の製造方法が提供される。
【００１３】
本発明はまた真核生物無細胞タンパク質合成用組成物の製造方法を提供するものであり、当該製造方法は、少なくとも細胞破壊によって生じるｅＩＦ２αのリン酸化を抑止する手段を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の無細胞タンパク質合成系によれば、細胞破壊とＡＴＰ等のエネルギー物質の添加によるｅＩＦ２αのリン酸化を阻害することにより翻訳効率の低下を抑止して、従来のタンパク質合成率を２〜３倍にも効率化することができる。本発明の方法は、市販されているウサギ網状赤血球の抽出液等にも適用することができ、真核生物由来の無細胞タンパク質合成系の効率化に大きく寄与するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
[定義]
本発明の方法において、「無細胞タンパク質合成系」とは、タンパク質の翻訳に必要なタンパク質因子を細胞抽出液として取り出し、試験管内でこの反応を再構成することで目的とするタンパク質を合成させる系である。さまざまな生物種に由来する抽出液を利用して無細胞系を構成することができ、例えば、大腸菌や好熱性細菌等の細菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、マウスＬ−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞及び出芽酵母、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞等の、高いタンパク質合成活性の状態の真核細胞、及び原核細胞の抽出液を用いることができる(Clemens, M.J., Transcription and Translation - A Practical Approach, (1984), pp. 231-270, Henes, B.D. et al. eds., IRL Press, Oxford)。
【００１６】
用語「真核生物の翻訳開始因子（ｅＩＦ）」とは、真核生物のタンパク質合成の開始に必要なタンパク質因子であって、例えば、リボソームサブユニットへ結合するｅＩＦ３、ｅＩＦ４Ｃ及びｅＩＦ６、ｍＲＮＡへの結合に関与するｅＩＦ４Ｂ、ｅＩＦ４Ｅ、ｅＩＦ４Ａ及びｅＩＦ４Ｇ、開始ｔＲＮＡの運搬に関与するｅＩＦ２及びｅＩＦ２Ｂ、他の因子を解離させるｅＩＦ５等が含まれる。
【００１７】
［ｅＩＦ２αのリン酸化阻害剤］
本発明の真核生物無細胞タンパク質合成用組成物は、真核細胞から調製した抽出液やエネルギー物質等と共に、真核生物翻訳開始因子２αサブユニット（ｅＩＦ２α）のリン酸化阻害剤を含む。この「ｅＩＦ２αのリン酸化阻害剤」とは、ｅＩＦ２αの５１番目のセリン残基のリン酸化を阻害する因子のことをいう。例えば、ウイルス感染やアミノ酸欠乏等のストレス状況下に陥った場合に活性化されるＰＥＲＫ、ＰＫＲ、ＧＣＮ２などのプロテインキナーゼの基質類似物である。ここで、基質類似物としては、例えば、これらのプロテインキナーゼとＡＴＰとの結合を特異的に阻害する低分子化合物や、ｅＩＦ２αの相同体(homologs)又は誘導体(derivatives)等が含まれる。本発明において、ｅＩＦ２αの相同体とは、ｅＩＦ２αのＮ末端から９０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド断片若しくはその相同体を含む。なお、真核生物のｅＩＦ２αは既知であり、例えば、ヒトｅＩＦ２α(GenBank Accession No.NM_004094)の塩基配列及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１及び２に示す。種々のウイルス遺伝子産物が宿主細胞の抗ウイルス防御機構を回避するためにｅＩＦ２αＮ末端断片の相同体を発現することが知られている（非特許文献５参照）。具体的には、ワクシニアウイルス(Vaccinia virus)のＫ３Ｌタンパク質、粘液腫ウイルス(Myxoma virus)のＭ１５６Ｒタンパク質、ＳＦウイルス(Shope fibroma virus)の８．２Ｒタンパク質、豚痘ウイルス(Swinepox virus)のＣ８Ｌタンパク質、及び天然痘ウイルス(Variola virus)のＣ３Ｌタンパク質などが挙げられるがこれらに限定されない。アミノ酸配列の相同性をＢＬＡＳＴｐプログラムで比較すると、ヒトｅＩＦ２αのＮ末端から９０個のポリペプチド断片と、上記Ｋ３Ｌタンパク質又はＣ８Ｌタンパク質との相同性は２７〜２８％である。一方、Ｍ１５６Ｒタンパク質との相同性（同一性）はさらに低く約１９％であるにもかかわらず、何れの相同体もインターフェロン誘導性二本鎖ＲＮＡ依存のプロテインキナーゼＰＫＲの阻害剤として作用することが報告されている。その理由は、これらのタンパク質の立体構造が極めて類似しているからでると考えられる。これらの相同体は、５つのアンチパラレルβ−鎖から構成され、そのうち４つの鎖がギリシャキーモチーフを示すオリゴヌクレオチド／オリゴサッカライド結合（ＯＢ）フォールドを形成することが報告されている。一般的に、ヒトｅＩＦ２αや大腸菌のポリヌクレオチドホスホリラーゼのＳ１ドメイン等のＯＢフォールドを有するタンパク質は一次構造上の相同性が低いにもかかわらず、極めて類似した立体構造を示すことが知られている。例えば、Ｍ１５６Ｒタンパク質と、ヒトｅＩＦ２αの立体構造を重ね合わせると、主鎖の根平均二乗変位（ＲＳＭＤ）は約２Åである。
【００１８】
従って、本発明に係るｅＩＦ２αの相同体は、ｅＩＦ２αのＮ末端から９０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド断片と相同な立体構造を形成することによって、ｅＩＦ２αキナーゼの基質類似物として機能するものである。
【００１９】
また、本発明に係るｅＩＦ２αの誘導体とは、ｅＩＦ２αのＮ末端から９０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド断片、ワクシニアウイルスのＫ３Ｌタンパク質、粘液腫ウイルスのＭ１５６Ｒタンパク質、ＳＦウイルスの８．２Ｒタンパク質、豚痘ウイルスのＣ８Ｌタンパク質、及び天然痘ウイルス(Variola virus)のＣ３Ｌタンパク質の何れかの断片であって、上記各タンパク質間で保存されているｅＩＦ２αのＮ末端側約３分の１の構造と類似する立体構造を有するポリペプチド断片である。
【００２０】
［リン酸化ｅＩＦ２αの脱リン酸化促進剤］
本発明の真核生物無細胞タンパク質合成用組成物はまた、前記ｅＩＦ２αのリン酸化阻害剤と共に、又は単独でリン酸化されたｅＩＦ２αの脱リン酸化促進剤とを含む。そこで、本発明に係る「リン酸化ｅＩＦ２αの脱リン酸化促進剤」について以下に説明する。
【００２１】
ｅＩＦ２αのリン酸化によって抑制された真核細胞のタンパク質合成を正常に戻すための重要なステップとして、リン酸化されたｅＩＦ２αの脱リン酸化反応が挙げられる。本発明の好ましい実施形態において、該脱リン酸化促進剤には、ホスホリラーゼＰＰ１をリン酸化されたｅＩＦ２αへ引き寄せる補助因子が含まれる。このような補助因子として、ＧＡＤＤ３４(Growth Arrest and DNA Damage)タンパク質がある。ＧＡＤＤ３４タンパク質は、ストレスに対する増殖抑制やＤＮＡ損傷に対する複製阻止の役割を果たすと考えられる細胞内タンパク質であり癌抑制遺伝子の作用を有する。ＧＡＤＤ３４タンパク質のアミノ末端側ドメインはアポトーシス誘導作用と関連があり、一方、カルボキシ末端側のドメインは、マウス骨髄分化タンパク質Ｍｙｄ１１６及び単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）由来のタンパク質ＩＣＰ３４．５と相同性を有する。該ＩＣＰ３４．５タンパク質の一つの機能は、ウイルス感染時に宿主細胞のタンパク質合成の遮断を阻害することによってＨＳＶ感染細胞の生存とウイルス複製を可能とすることにあると考えられている。
【００２２】
本発明において、ＧＡＤＤ３４タンパク質の相同体とは、ヒトＧＡＤＤ３４相同体、マウス骨髄分化タンパク質ＭｙＤ１１６、又は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のタンパク質ＩＣＰ３４．５を含む。該相同体はまた、ＧＡＤＤ３４タンパク質又はその特定領域のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の相同性を有するポリペプチド配列を含む。
【００２３】
ＧＡＤＤ３４タンパク質の誘導体とは、ＧＡＤＤ３４、ＭｙＤ１１６、及びＩＣＰ３４．５の何れかのタンパク質の断片であって、ＧＡＤＤ３４のカルボキシ末端領域に存在し、上記各タンパク質間で保存されている６３アミノ酸残基と実質的に相同な配列を含むポリペプチド断片を含む。該ポリペプチド断片の長さは少なくとも１００アミノ酸、好ましくは１５０、２００、又は２５０アミノ酸残基長である。
【００２４】
これらのＧＡＤＤ３４タンパク質の相同体又はその誘導体は、いずれもホスホリラーゼＰＰ１と結合し、ＰＰ１をリン酸化されたｅＩＦ２αへリクルートする機能を有するポリペプチド断片である。
【００２５】
上述したｅＩＦ２α、及びＧＡＤＤ３４タンパク質の相同体又はその誘導体は、組換えＤＮＡ技術により容易に入手することができる。例えば、これらをコードする遺伝子をクローン化し、適当なベクターに連結(挿入)することにより発現ベクターを作製する。次いで、この発現ベクターを適当な宿主細胞に形質転換し、得られた形質転換細胞を培養することによってそれぞれのポリペプチド断片を製造することができる。なお、これらのポリペプチド断片等には精製しやすいようにヒスチジンタグやＦＬＡＧタグなどが付加されていてもよい。
【００２６】
さらに好ましい実施形態において、本発明の組成物は、哺乳動物の培養細胞から調製された抽出液に、組換え体真核生物翻訳開始因子を添加することによってさらにタンパク質の合成活性を向上させることができる。真核生物翻訳開始因子の添加による無細胞タンパク質合成系の改善は、すでに本発明者らにより見出され、特願２００４−３３３２５０号として出願されており、その内容は参照により本願に組み込まれるものとする。
【００２７】
［無細胞タンパク質合成用組成物の調製］
本発明の方法に用いる真核細胞の抽出液は、ウサギ網状赤血球の抽出液や小麦胚芽抽出液等の市販の細胞抽出液を用いることができるが、好ましくは哺乳動物細胞を培養し、これを回収して破砕することにより抽出液を調製する。哺乳動物細胞としては特に制限されないが、タンパク質合成活性の高い細胞が好ましく、例えば、マウスＬ−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞などを用いることができる。ＨｅＬａＳ３細胞はＨｅＬａ細胞から派生した浮遊細胞であり、細胞培養が容易であり増殖しやすいため特に好ましい。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞は、糖タンパク質である抗体分子を分泌することから糖鎖の付加機構である細胞内の小胞体やゴルジ体などの膜器官がよく発達していると考えられる。これらの細胞は、例えばホモジナイザー等の公知の方法を用いて機械的に破砕することができる。抽出液はミクロコッカスヌクレアーゼ及びＣａＣｌ２処理して内因性ｍＲＮＡを破壊し、その結果バックグラウンド翻訳を減少させて最小にする。次いで、ＥＧＴＡを加えてＣａＣｌ２をキレートさせ、それによってヌクレアーゼを不活化する。
【００２８】
本発明の１つの実施形態において、上記哺乳動物の培養細胞を圧縮した不活性ガス（例えば、窒素ガス）に接触させて圧力をかけ、続いて減圧（除圧）することによって破砕する。このための装置として、例えば、Ｍｉｎｉ−Ｂｏｍｂ細胞破砕チャンバがＫＯＮＴＥＳ社から販売されている。この方法は、機械的な方法や超音波処理の場合などに見られる温度の上昇を伴わず、細胞は膨張するガスによって冷却される。圧力や平衡時間を変えることによって細胞の破砕の程度を調節できる。例えば、中程度の圧力で短時間処理することによって細胞内の小器官を壊すことなく外部の細胞膜のみを破砕することもできる。この装置を用いて昆虫細胞の抽出液を調製することによって、高い糖タンパク質合成活性が得られることが報告されている(Tarui, H. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. Vol.55, pp.446-453, 2001参照)。
【００２９】
この抽出液はタンパク質合成に必要な成分を含有しており、例えばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アミノ酸並びに開始因子、延長及び終結因子が含まれる。さらに、ホスホクレアチンキナーゼ及びホスホクレアチンからなるエネルギー再生系を添加することによってｍＲＮＡ翻訳が最適化される。さらにアミノ酸混合物を添加してもよい。酢酸カリウム及び酢酸マグネシウムは翻訳反応に適した濃度となるように調整して添加される。本発明の方法によれば、これらの抽出液へ上記ｅＩＦ２αのリン酸化阻害剤及び／又はリン酸化されたｅＩＦ２αの脱リン酸化促進剤を添加することによってｍＲＮＡの翻訳活性をさらに増強することができる。添加するリン酸化阻害剤又は脱リン酸化促進剤の濃度は適宜最適化することができるが、例えば、Ｋ３Ｌタンパク質やＧＡＤＤ３４タンパク質の場合には、０．０１〜１０μＭ、好ましくは０．１〜１μＭである。
【００３０】
これらの無細胞タンパク質合成用反応混合物は、それぞれの構成成分ごとに別々に、若しくはあらかじめ混合した状態で、使用しやすいように一定量ごと分注して製品として配送することができる。これらの製品は凍結又は乾燥状態で保存することができ、保存及び輸送に適した容器に収容してキットとして販売される。キットには取扱説明書や陽性コントロールＤＮＡ、ベクターＤＮＡ等を添付することができる。
【００３１】
［真核生物由来無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の製造］
無細胞タンパク質合成用の鋳型ｍＲＮＡは、発現したい所望のタンパク質をコードするものであれば特に限定されないが、細胞から直接ｍＲＮＡを単離するか、前記タンパク質をコードするＤＮＡをＲＮＡポリメラーゼプロモータを有するベクターにクローン化してインビトロ転写反応を行うことにより合成することができる。ファージポリメラーゼプロモータの後ろにクローン化されたＤＮＡのインビトロ転写方法が知られている(Krieq, P. and Melton, D., Nucl. Acids Res., Vol.12, p.7057, 1984)。この方法は、発現したい遺伝子を、ＳＰ６、Ｔ７、及びＴ３ＲＮＡポリメラーゼのいずれか１つのプロモーターを有するベクターにクローン化する。次いで、このベクターのクローン化された遺伝子の３’末端で制限酵素を使用して線状化され、インビトロ転写反応によってｍＲＮＡへの転写を行う。ＳＰ６、Ｔ７及びＴ３ＲＮＡポリメラーゼプロモータを有する多数のベクターは市販されており、容易に入手可能である。このようにして合成した鋳型ｍＲＮＡは、５’末端にキャップ構造を有するか、又は有しないもののいずれでもよい。５’末端にキャップを付加する場合は、キャップアナログと呼ばれるキャップ類似体を基質にして、ＲＮＡポリメラーゼの酵素反応でキャップを持ったｍＲＮＡを合成することができる。
【００３２】
本発明は、以下の実施例によりさらに詳細に説明されるが、これらの実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００３３】
[細胞培養]
シャーレを用いたＨＦ１０Ｂ４細胞（ハイブリドーマ）（RIKEN BRC）の培養は、炭酸ガスインキュベーター（ＣＯ２濃度５％、３７℃）内にて行った。培地はＥ−ＲＤＦ培地（極東）に加熱処理を施した１０％子ウシ血清（ICN Biomedicals, Inc）、２ｍＭのＬ−グルタミン溶液を添加したものを用いた。１Ｌスケールでの攪拌培養は、細胞培養コントローターシステム（セルマスター、モデル１７００和研薬社）を取り付けたスピンナーフラスコを用いて行った。温度、ｐＨ、溶存酸素濃度、攪拌スピードは、それぞれ３７℃、ｐＨ７．０、６．７ｐｐｍ、２０ｒｐｍに設定した。
【００３４】
ＨｅＬａ  Ｓ３細胞のシャーレでの培養にも炭酸ガスインキュベーター（ＣＯ２濃度５％、３７℃）を用いた。培地には、イーグルＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ）に、加熱処理を施した１０％子ウシ血清（ICN Biomedicals, Inc）、２ｍＭのＬ−グルタミン溶液、１ユニット／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したものを用いた。攪拌培養は、ｐＨ、攪拌スピードをそれぞれｐＨ７．２、５０ｒｐｍに設定した点以外はＨＦ１０Ｂ４細胞と同様の方法で行った。
【００３５】
[細胞抽出液の調製]
細胞濃度１．０〜１．５×１０６個／ｍｌに達した時点で、培養液中のＨＦ１０Ｂ４細胞を３６０×ｇ、４℃、１０分間の遠心によって回収した。培地は、アスピレーターを用いて除き、培養液１Ｌ分から得られた細胞に対して８０ｍｌのバッファー［３５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５、２５℃）、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１１ｍＭグルコース］で軽く懸濁した後、２本の５０ｍｌチューブに移し替え、３６０×ｇ、４℃、５分間の遠心を行った。この操作を３回繰り返した後、細胞容積の１．０倍量の抽出バッファー［２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５、２５℃）、４５ｍＭ酢酸カリウム、４５ｍＭのＫＣｌ、１．８ｍＭ酢酸マグネシウム］を加え、細胞濃度が約２．５×１０８個／ｍｌになるように懸濁したものをMini-Bomb cell disruption chamber (KONTES)に封入した。細胞の破砕は、窒素ガス圧１．０Ｍｐａ、氷中にて静置した状態で行った。３０分後、アウトレットポートをゆっくりと開口し、流速約３〜１０滴／秒にて細胞破砕液を回収した。得られた細胞破砕液は、７００×ｇ、４℃、５分間の遠心を２回繰り返し、沈澱画分を除いたもの（２〜２．５ｍｌ）を、予め２５ｍｌの抽出バッファーにて平衡化しておいたＰＤ−１０カラム（アマシャム社）へ添加した。自然落下にてサンプルをカラム内に入り込ませた後、さらに抽出バッファーを添加し、カラム下から落下している溶液が透明から乳白色に変わった時点で、約１．７〜２．０ｍｌまで採取したものを細胞抽出液とした。得られた抽出液は均等に小分けし、液体窒素で瞬間凍結後、マイナス８０℃にて保存した。ＨｅＬａ  Ｓ３細胞の抽出液は、ＨＦ１０Ｂ４細胞と同様の方法で調製した。
【００３６】
[プラスミドとｍＲＮＡの調製]
ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ、ＥＭＣＶ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａの合成には、プラスミドｐＳＰ７２−ＥＭＣＶ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａ(Yuri Svitkin, et al. (2001) RNA  7: 1743-1752参照)を用いた。また、ＨＩＶ由来のｇｐ１２０エンベロープタンパク質をコードするＥＭＣＶ−ＨＩＶｇｐ１２０−ＨＡ−ｐｏｌｙＡ、及びヒト絨毛性性腺刺激ホルモンβ（ｈＣＧβ）をコードするｍＲＮＡ、ＥＭＣＶ−ｈＣＧβ−ＨＡ−ｐｏｌｙ−Ａを合成するために、それぞれプラスミドｐＳＰ７２−ＥＭＣＶ−ＨＩＶｇｐ１２０−ＨＡ−ｐｏｌｙＡ、ｐＵＣＴ７−ＥＭＣＶ−ｈＣＧβ−ＨＡ−ｐｏｌｙ−Ａを以下の通り作製した。
【００３７】
ｐＳＰ７２−ＥＭＣＶ−ＨＩＶｇｐ１２０−ＨＡ−ｐｏｌｙＡ：プラスミドｐＮＭ３ｒＭ(Kuwata, T., et al.(1995) J. Gen. Virol. 76: 2181-2191参照)をテンプレートにして、プライマー：5'-CCGGGAGCTCCAGAGTGAAGGAGAAGTATCAGCACTTG-3'（配列番号３）と5'-TCTCGATATCTCATCTTTTTTCTCTCTGCACCACTCTTCT-3'（配列番号４）とを用いてｇｐ１２０をコードするＤＮＡフラグメント（ｇｐ１６０の２〜５０９までのアミノ酸に相当する）をＰＣＲ法によって増幅した。次に、そのＤＮＡフラグメントをプラスミドｐＳＰ７２−ＥＭＣＶ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙ−Ａのルシフェラーゼをコードする領域と入れ替える操作を行った。さらに５０９番目のアミノ酸の下流にＨＡ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＧ：配列番号５）をコードするＤＮＡフラグメントを挿入した。作製したｐＳＰ７２−ＥＭＣＶ−ＨＩＶｇｐ１２０−ＨＡ−ｐｏｌｙ−Ａの構造を概略的に表わしたものを図２に示した。
【００３８】
ｐＵＣＴ７−ＥＭＣＶ−ｈＣＧβ−ＨＡ−ｐｏｌｙ−Ａ：逆転写ＰＣＲ法を用い、ｈＣＧβｃＤＮＡをヒト胎盤ポリ（Ａ）ＲＮＡ（クロンテック社）より得た。用いたプライマーはGenBank No. NM_000737の情報に基づき決定した。
逆転写用プライマー： 5'-GCGGATTGAGAAGCCTTTATTGTG-3'（配列番号６）
ＰＣＲ用プライマー： 5'-CTTCCATGGGAGAGATGTTCCAGGGGCTGCTG-3'（配列番号７）5'-CTTGAATTCTTATTGTGGGAGGATCGGGGTGTC-3'（配列番号８）
【００３９】
得られたｈＣＧβｃＤＮＡのＣ−末端にＨＡをコードするシークエンスを付加しｈＣＧβ−ＨＡｃＤＮＡを作製した。ＰＵＣ１１９プラスミドにＴ７−プロモーター、ＥＭＣＶ−ＩＲＥＳ、ｈＣＧβ−ＨＡ、ｐｏｌｙ−Ａを挿入し、ｐＵＣＴ７−ＥＭＣＶ−ｈＣＧβ−ＨＡ−ｐｏｌｙ−Ａを作製した。ｐＵＣＴ７−ＥＭＣＶ−ｈＣＧβ−ＨＡ−ｐｏｌｙ−Ａの構造を概略的に表わしたものを図２に示した。
【００４０】
各ｍＲＮＡの合成は、プラスミド内のポリＡ配列の３’側を制限酵素ＢａｍＨＩで切断したものを鋳型とし、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたRiboMAX Large Scale RNA Production Systems（プロメガ社）の方法に従って行った。合成した各ｍＲＮＡは、波長２６０ｎｍの吸光度から濃度を定量した後、マイナス８０℃にて保存した。
【００４１】
[組み換えタンパク質の発現と精製]
ＧＡＤＤ３４及びＫ３Ｌを大腸菌で発現、精製するためにそれらをコードするプラスミドｐＧＥＸ−６Ｐ−１−ＧＡＤＤ３４−ＦＬＡＧを作製した。各プラスミドの作製法および発現、精製法は以下の通りである。
（１）組み換えＧＡＤＤ３４
（１．１）ＧＡＤＤ３４遺伝子のクローニングとｐＧＥＸ−６Ｐ−１−ＧＡＤＤ３４−ＦＬＡＧの作製：炭酸ガスインキュベーター（ＣＯ２濃度５％、３７℃）内のシャーレにて培養したＨｅＬａ  Ｓ３細胞にツニカマイシン（終濃度２μｇ／ｍｌ）を加え、同インキュベーターにて６時間インキュベーションした。その後細胞を回収し、トータルＲＮＡ画分を抽出、さらにポリ（Ａ）−ＲＮＡ画分をｍＲＮＡ精製キットPoly(A)Pure (Ambion)を用いて精製した。次にポリ（Ａ）−ＲＮＡとプライマー：5'-TAGGCAAACCAGTTGGTCTC-3'（配列番号９）（ＧＡＤＤ３４の終止コドン以降の配列）を用いて逆転写反応を行い、その後さらに２種のプライマー：5'-CCGGAATTCATGGCCCCAGGCCAAGCACCCCAT-3'（配列番号１０）、及び5'-GGCCTCGAGTCAGCCACGCCTCCCACTGAGGTC-3'（配列番号１１）を用いてＧＡＤＤ３４の全長をコードするＤＮＡフラグメントをＰＣＲ法によって増幅した。用いたプライマーはGenBank No. NM_014330の情報（配列番号１２）に基づき決定した。ＤＮＡフラグメントは、プラスミドｐＧＥＸ６Ｐ−１へ組み込んだ後、さらにＦＬＡＧペプチド（ＤＹＫＤＤＤＤＫ：配列番号１４）をコードするＤＮＡフラグメントをＧＡＤＤ３４の終止コドン手前に組み込んだ。
【００４２】
（１．２）リコンビナントＧＡＤＤ３４の発現：形質転換は大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（コンピテントセル）を用いて行った。またコロニーの振とう培養には１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだχ−Ｂｒｏｔｈを用いた。培養液の６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）が０．５〜０．７に達したら、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．１ｍＭ添加し、２０℃にて培養することでリコンビナントＧＡＤＤ３４の発現を誘導した。一晩培養後、培養液中の細胞を５ｋｒｐｍの遠心で沈澱させた。沈澱は、洗浄バッファー［２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５、２５℃）、１５０ｍＭのＮａＣｌ］にて懸濁し、再度５ｋｒｐｍの遠心を行った後、上清を除いた状態でマイナス２０℃にて一時保存した。
【００４３】
（１．３）リコンビナントＧＡＤＤ３４の精製：予め以下に挙げるバッファーを調製した。０．１ＭのＫＣｌバッファー［２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５、２５℃）、１００ｍＭのＫＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール］、抽出バッファー［５０ｍｌの０．１Ｍ  ＫＣｌバッファーにＥＤＴＡ−Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｒｏｃｈｅ）を１ｔａｂｌｅｔ添加、さらにＤＴＴ、ＥＤＴＡ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の終濃度がそれぞれ１０ｍＭ、１０ｍＭ、０．５％（ｖ／ｖ）になるよう各試薬を添加した］、平衡化バッファー−１［０．１ＭのＫＣｌバッファーに２−メルカプトエタノール、ＥＤＴＡ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の終濃度がそれぞれ５ｍＭ、１ｍＭ、０．１％（ｖ／ｖ）になるよう各試薬を添加した］、平衡化バッファー−２［０．１Ｍ  ＫＣｌバッファーに２−メルカプトエタノール、ＥＤＴＡの終濃度がそれぞれ５ｍＭ、０．１ｍＭになるよう各試薬を添加した］。
【００４４】
精製はまず、大腸菌沈澱（培養液２リットル分に相当）へ抽出バッファーを５０ｍｌ加え、ゆるやかに懸濁した後、１０秒間、２回の超音波処理を行った。さらに３５ｋｒｐｍの遠心を４５分間行い、その上清を抽出液とした。次に、平衡化バッファー−１で平衡化済みのグルタチオン−セファロース４Ｂ（アマシャム社）カラム（ベッドボリューム２．０ｍｌ）へ抽出液を充填、続いて２０倍溶の平衡化バッファー−１で洗浄した後、カラム出口にキャップをはめ、PreScission Protease（アマシャム社、３０ユニット）を含んだ平衡化バッファー１．５ｍｌを加え軽く懸濁し、１２時間静置した。その後、キャップをはずして得られた溶出画分（ＧＡＤＤ３４−ＦＬＡＧを含む）は、新たに用意したグルタチオン−セファロース４Ｂカラム（ベッドボリューム１．０ｍｌ）へ充填し、素通り画分を回収した。さらにその画分を平衡化バッファー−２で平衡化済みのＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ２−Ａｇａｒｏｓｅ（ＳＩＧＭＡ）カラム（ベッドボリューム０．３ｍｌ）へ充填、続いて２０倍容の平衡化バッファー−２で洗浄した後、１００μｇ／ｍｌのＦＬＡＧペプチド（ＳＩＧＭＡ）を含んだ２００μｌの平衡化バッファー−２を加え、溶出、サンプル採取する操作を３回繰り返した。各フラクションのタンパク質濃度を測定し、最も高いものを０．１ＭのＫＣｌバッファーで透析を行った後、マイナス８０℃にて保存した。以上の操作は４℃にて行った。
【００４５】
（２）リコンビナントＫ３Ｌ：
（２．１）Ｋ３ＬｃＤＮＡのクローニング
ワクシニアウイルスに感染したＨｅＬａ細胞からＲＮＡを抽出し、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によりＫ３ＬｃＤＮＡを得た。使用したプライマーはGenBank Accession No. AY772448の情報（配列番号１５）を基に設計した。
【００４６】
逆転写用プライマー：5'-CCGCTCGAGTTATTGATGTCTACACATCCTTTTGTAATTGACATCTATATATCCTTTTGTATAATCAACTCT-3'（配列番号１７）
ＰＣＲ用プライマー：5'-CCGGGATCCATGCTTGCATTTTGTTATTCGTTGCCC-3'（配列番号１８）及び5'-CCGCTCGAGTTATTGATGTCTACACATCCTTTTGTAATTGACATCTATATATCCTTTTGTATAATCAACTCT-3'（配列番号１９）
【００４７】
ＲＴ−ＰＣＲによって増幅されたＫ３ＬｃＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで処理した後、ｔａｃプロモーターを用いた発現ベクターにＨｉｓタグと共に組み入れｐＴａｃ−Ｈｉｓ−Ｋ３Ｌを作製した。
【００４８】
（２．２）リコンビナントＫ３Ｌの発現はＧＡＤＤ３４と同様に行った。発現プラスミドにはｐＴａｃ−Ｈｉｓ−Ｋ３Ｌを用いた。
【００４９】
（２．３）リコンビナントＫ３Ｌの精製：Ｋ３Ｌを発現させた大腸菌沈澱（培養液２リットル分に相当）へ抽出バッファー［２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５、２５℃）、０．５ＭのＫＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、ＥＤＴＡ−Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｒｏｃｈｅ）１錠、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（０．１％）］を５０ｍｌ加え、懸濁した後、１０秒間、３回の超音波処理を行った。３０ｋｒｐｍの遠心を一時間行い、その上清を抽出液とし、イミダゾールを２０ｍＭになるように加えた。Ｎｉ−ＮＴＡ−アガロース（５００μｌ、キアゲン）と４℃にて一時間混和し、Ｎｉ−ＮＴＡに結合していないタンパク質を除去するために、空のカラムに流し込んだ。素通りした抽出液はもう一度カラムにかけ、結合を確実にした。抽出バッファー３０ｍｌで洗浄した後、２５０ｍＭ、又は５００ｍＭイミダゾールを含むバッファー［２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５、２５℃）、０．１ＭのＫＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール］で溶出した。溶出液を０．２ｍｌのＳｐ−セファロース（アマシャム社）カラムに３回通し、バッファー［２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５、２５℃）、０．１ＭのＫＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（０．１％）］（３０ｍｌ）で洗浄した。０．５ＭのＫＣｌまたは１ＭのＫＣｌの入った同バッファー（各々６００μｌ）で溶出し、バッファー［２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５、２５℃）、０．１ＭのＫＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭのＥＤＴＡ］で透析し、マイナス８０℃にて保存した。以上の操作は４℃にて行った。
【００５０】
上記の方法により精製したリコンビナントＧＡＤＤ３４、及びＫ３Ｌの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果を図３に示す。各精製標品（ＧＡＤＤ３４：１．５μｇ、Ｋ３Ｌ：２．５μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ゲル濃度はＧＡＤＤ３４が１２．５％、Ｋ３Ｌが１５％）で分離後、ゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色した。図３に示したように、リコンビナントＧＡＤＤ３４、及びＫ３Ｌ共に、それぞれの分子量に相当する単一のタンパク質のバンドが検出された。
【００５１】
[ＧＡＤＤ３４、Ｋ３Ｌを用いた無細胞タンパク質合成]
翻訳反応を行う前に、ＨＦ１０Ｂ４細胞抽出液に含まれている内因性のＲＮＡの分解と除去を行った。方法については以下の通りである。抽出液１００μｌ（タンパク質濃度２０〜２６ｍｇ／ｍｌ）に対し、１μｌの７５００ユニット／ｍｌヌクレアーゼＳ７、１００ｍＭのＣａＣｌ２を添加し、５分間、２０℃の処理を施した後、８μｌの３０ｍＭのＥＧＴＡを加え反応を停止させたものを透析チャンバー（ＭＷＣＯ５０ｋＤａ、再生セルロース製）へ充填し、５ｍｌの外部液［１８ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５、２５℃）、４１ｍＭ酢酸カリウム、４１ｍＭのＫＣｌ、１．６ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭＥＧＴＡ、２．４５ｍＭのＤＴＴ、０．０５ｍＭアミノ酸溶液］に対し１．５〜３時間の透析を２３℃にて行った。次にその抽出液１６．４μｌへ、リコンビナントＧＡＤＤ３４（０．１ｍｇ／ｍｌ）、Ｋ３Ｌ（０．２ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれ２．２５μｌ（２．２５ｐｍｏｌ）、３μｌ（４８ｐｍｏｌ）添加し、２３℃にて３〜４分間静置した（通常の条件、Ｓｔｄ．の場合は０．１ＭのＫＣｌバッファーを添加した）。その後、エネルギーミックス溶液［１８４ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１３．２ｍＭのＡＴＰ、１．３２ｍＭのＧＴＰ、１９８ｍＭクレアチンリン酸、３．３ｍＭスペルミジン、１３．２ｍＭ酢酸マグネシウム］を２．５４μｌ、９．０ｍｇ／ｍｌ牛肝臓由来ｔ−ＲＮＡを０．２８μｌ、６．０ｍｇ／ｍｌクレアチンリン酸キナーゼを０．２８μｌ、２．０ＭのＫＣｌを１．０μｌ、５０ｍＭ酢酸マグネシウムを０．２８μｌ、最後にｍＲＮＡを２．０μｌ混合し（最終容量２８μｌ）、１時間、３１℃のインキュベーションを行った。
【００５２】
通常の条件の場合、反応液２８μｌ中に含まれる各組成の最終濃度は以下の通りである。１１〜１５ｍｇ／ｍｌＨＦ１０Ｂ４細胞抽出液由来タンパク質、２７ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、３０μＭアミノ酸、１．２ｍＭのＡＴＰ、１２０μＭのＧＴＰ、１８ｍＭクレアチンリン酸、０．３ｍＭスペルミジン、１．４ｍＭ酢酸マグネシウム、２５ｍＭ酢酸カリウム、１１０ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＥＧＴＡ、１．４５ｍＭのＤＴＴ、９０μｇ／ｍｌ牛肝臓由来ｔ−ＲＮＡ、６０μｇ／ｍｌクレアチンリン酸キナーゼ、７８μｇ／ｍｌのｍＲＮＡ。
【００５３】
ＨｅＬａ−Ｓ３細胞抽出液を用いた翻訳反応の場合、酢酸カリウムを１６０ｍＭ、ＫＣｌを１８ｍＭ、ｍＲＮＡを１００μｇ／ｍｌに変更した以外はＨＦ１０Ｂ４を用いた翻訳反応と同様の方法で行った。網状赤血球抽出液（Ｒｅｔｉｃ）や小麦胚芽抽出液はプロメガ社より購入し、添付された方法により翻訳反応を行った。
【００５４】
合成された糖タンパク質、およびｅＩＦ２αサブユニットのリン酸化レベルの確認のために翻訳反応後、それぞれの検体をポリアクリルアミドゲル濃度１４％のＳＤＳゲルにて電気泳動後、分離ゲル内のタンパク質をニトロセルロース膜へ転写、さらに各タンパク質に対する各抗体を用いたウェスタンブロット法によって検出を行った。ＨＡに対する抗体はＡｎｔｉ−ＨＡ（ＢａｂＣＯ）を、リン酸化されたｅＩＦ２αに対する抗体はＡｎｔｉ−ｅＩＦ２α［ｐＳ５２］（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）、ｅＩＦ２αをリン酸化状態に関わりなく検出できる抗体はＡｎｔｉ−ｅＩＦ−２α（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を使用した。合成されたルシフェラーゼについては反応後、反応液を直ちに氷冷し、一部をルシフェラーゼ活性測定に用いた。活性測定にはLuciferase Assay System (Promega)を使用した。
【００５５】
[ＡＴＰおよびクレアチンリン酸は翻訳に不可欠である一方、ｅＩＦ２αのリン酸化を
引き起こす]
ｅＩＦ２αサブユニットのリン酸化の原因を探るため、翻訳反応の系に含まれる添加物の一部をそれぞれ除いた条件で反応（容量２８μｌ）を行った。抽出液はハイブリドーマＨＦ１０Ｂ４、ｍＲＮＡはＥＭＣＶ−ＨＩＶｇｐ１２０−ＨＡ−ｐｏｌｙ−Ａ（ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１２０をコードする）を用い、３１℃、１時間のインキュベーションを行った（ｍＲＮＡ終濃度：７８μｇ／ｍｌ）。その結果を図４に示した。パネルＡの各レーンの試料は次のとおりである。Ｌａｎｅ１：添加物無し、Ｌａｎｅ２：［Ｓｔｄ．；１．２ｍＭのＡＴＰ、０．１２ｍＭのＧＴＰ、１．４５ｍＭのＤＴＴ、１８ｍＭクレアチンリン酸（ＣＰ）、０．３ｍＭスペルミジン（ＳＰ）全て含んだ通常の条件］、Ｌａｎｅ３−７：上記の添加物の中からそれぞれ１種類ずつを除いた。反応後、各サンプルについてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロットを行い、翻訳産物についてはａｎｔｉ−ＨＡ抗体、リン酸化を受けたｅＩＦ２α（Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＩＦ２α）は５１番目のセリンがリン酸化されたｅＩＦ２αを認識する抗体を用いて検出を行った。図４のパネルＡに示されたように、クレアチンリン酸を除くとタンパク質の翻訳反応及びｅＩＦ２αのリン酸化反応共に著しく抑制される。なお、ＡＴＰを除いてもある程度翻訳反応が起こり、ｅＩＦ２αのリン酸化も引き起こされる（Ａ：ｌａｎｅ３）のは、内因性のＡＤＰがＣＰとＣＰＫ（クレアチンキナーゼ）の作用によりＡＴＰに変換されるためと考えられる。
【００５６】
続いて、Ｃｏｎｔ．にＡＴＰ又はＣＰだけを添加して、ｅＩＦ２αのリン酸化の挙動を調べた結果をパネルＢに示した。Ｌａｎｅ１、３：添加物無し（Ｃｏｎｔ．）、Ｌａｎｅ２：Ｃｏｎｔ．に１．２ｍＭ  ＡＴＰを添加、Ｌａｎｅ４−７：Ｃｏｎｔ．にＣＰをそれぞれ３、６、１２、１８ｍＭ添加。反応後、パネルＡと同様、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロットを行った。その結果、ＡＴＰ又はＣＰだけを添加した場合でもｅＩＦ２αのリン酸化が認められ、またＣＰ添加量に依存してｅＩＦ２αのリン酸化が起こりやすいことが分かる。
【００５７】
[ＧＡＤＤ３４、Ｋ３ＬによってｅＩＦ２αのリン酸化が減少し、タンパク質合成が促進される]（図５）
ＨｅＬａ−Ｓ３抽出液を使用してＧＡＤＤ３４及びＫ３Ｌの添加効果を調べた結果を図５に示した。翻訳反応の操作の前に、ＨｅＬａ−Ｓ３抽出液とリコンビナントＧＡＤＤ３４（２．２５ｐｍｏｌ）（ｌａｎｅ２）またはＫ３Ｌ（４８ｐｍｏｌ）（ｌａｎｅ３）を混合した後、添加物、ＥＭＣＶ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙＡ  ｍＲＮＡ（終濃度１００μｇ／ｍｌ）を加え１時間、３１℃の反応を行った（容量２８μｌ）。通常の条件（ｌａｎｅ１）ではリコンビナントタンパク質の溶媒である、０．１ＭのＫＣｌバッファーを混合した（上述参照）。反応後、各サンプルについてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロットを行い、リン酸化を受けたｅＩＦ２α（Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＩＦ２α）、またはリン酸化に関わりなくｅＩＦ２α（Ｔｏｔａｌ  ｅＩＦ２α）を認識する抗体を用いて目的のバンドを検出した（上パネル）。また、反応液の一部を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。各反応は３回繰り返し、通常の条件におけるルシフェラーゼ活性値を１．０としたときの各反応の活性値を比率で算出し、その平均値をグラフ化した。（下グラフ）。図５に示したように、ＧＡＤＤ３４又はＫ３Ｌの添加によりｅＩＦ２αのリン酸化が減少し、ルシフェラーゼタンパク質合成が促進されることが確認された。
【００５８】
[ＧＡＤＤ３４、Ｋ３ＬによってｅＩＦ２αのリン酸化が減少し、糖タンパク質合成が促進される]（図６）
ハイブリドーマＨＦ１０Ｂ４抽出液を使用してＧＡＤＤ３４及びＫ３Ｌの添加効果を調べた結果を図６に示した。翻訳反応の操作の前に、ＨＦ１０Ｂ４３抽出液とリコンビナントＧＡＤＤ３４（２．２５ｐｍｏｌ）（ｌａｎｅ３）またはＫ３Ｌ（４８ｐｍｏｌ）（ｌａｎｅ４）を混合した後、添加物、ＥＭＣＶ−ｈＣＧβ−ＨＡ−ｐｏｌｙＡ  ｍＲＮＡ（ｈＣＧβをコードする：終濃度７８μｇ／ｍｌ）を加え１時間、３１℃の反応を行った（容量２８μｌ）。通常の条件（ｌａｎｅ２）ではリコンビナントタンパク質の溶媒である、０．１ＭのＫＣｌバッファーを混合した（上述参照）。Ｌａｎｅ５：ＧＡＤＤ３４とＫ３Ｌを共に添加。反応後、各サンプルについてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロットを行い、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＩＦ２αまたはＨＡに対する抗体を用いて目的のバンドを検出した（それぞれ上パネル、下パネル）。さらに下パネルの糖タンパク質シグナル（←で示した）の定量化を行い、通常の条件での値を１．０に設定したときの各反応の相対値をグラフ化した（下グラフ）。図６に示したように、ＧＡＤＤ３４及び／又はＫ３Ｌの添加によりｅＩＦ２αのリン酸化が減少し、タンパク質合成が促進されることが確認された。なお、図中の＊は糖鎖が付加されていない翻訳産物である。
【００５９】
[Ｒｅｔｉｃ抽出液を用いた無細胞系翻訳反応におけるＧＡＤＤ３４、Ｋ３Ｌの効果]
リコンビナントＧＡＤＤ３４、Ｋ３Ｌの効果を市販されているＲｅｔｉｃ（ウサギ網状赤血球）抽出液を用いた翻訳反応で試した結果を図７Ａに示す。リコンビナントＧＡＤＤ３４は１．０ｐｍｏｌ（ｌａｎｅ２）、Ｋ３Ｌは２０ｐｍｏｌ（ｌａｎｅ３）をＲｅｔｉｃ抽出液と混合した後、ＥＭＣＶ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙＡ  ｍＲＮＡ（終濃度１６μｇ／ｍｌ）を加え、３０℃、１時間の反応を行った（容量１０μｌ）。通常の条件（ｌａｎｅ１）ではリコンビナントタンパク質の溶媒である、０．１ＭのＫＣｌバッファーを混合した。反応後、反応液の一部を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。各反応は２回繰り返し、通常の条件におけるルシフェラーゼ活性値を１．０としたときの各反応の活性値を比率で算出し、その平均値をグラフ化した。また、Ｒｅｔｉｃ抽出液は２種のロット（Ｌｏｔ１、２）を使用した。
【００６０】
[小麦胚芽抽出液を用いた無細胞系翻訳反応におけるＧＡＤＤ３４、Ｋ３Ｌの効果]
リコンビナントＧＡＤＤ３４、Ｋ３Ｌの効果を市販されている小麦胚芽(Wheat Germ)抽出液を用いた翻訳反応で試した結果を図７Ｂに示す。リコンビナントＧＡＤＤ３４は１．０ｐｍｏｌ（ｌａｎｅ２）、Ｋ３Ｌは２０ｐｍｏｌ（ｌａｎｅ３）を小麦胚芽抽出液と混合した後、ｃａｐ−Ｌｕｃ−ｐｏｌｙＡ  ｍＲＮＡ（終濃度４２μｇ／ｍｌ）を加え、２５℃、１時間の反応を行った（容量１０μｌ）。通常の条件（ｌａｎｅ１）ではリコンビナントタンパク質の溶媒である、０．１ＭのＫＣｌバッファーを混合した。反応後、反応液の一部を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。各反応は２回繰り返し、通常の条件におけるルシフェラーゼ活性値を１．０としたときの各反応の活性値を比率で算出し、その平均値をグラフ化した。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ｅＩＦ２を介した翻訳制御機構を描いたモデル図である。
【図２】実施例で作製した２つのプラスミドｐＳＰ７２−ＥＭＣＶ−ＨＩＶｇｐ１２０−ＨＡ−ｐｏｌｙＡ、及びｐＵＣＴ７−ＥＭＣＶ−ｈＣＧ−β−ＨＡ−ｐｏｌｙ−Ａの構造を概略的に表した図である。
【図３】組み換えＤＮＡ技術により調製し、精製を行ったＧＡＤＤ３４及びＫ３Ｌタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。
【図４】無細胞タンパク質合成系に添加したＡＴＰ及びクレアチンリン酸によるｅＩＦ２αのリン酸化をウェスタンブロッティングで調べた結果である。
【図５】ＨｅＬａＳ−３細胞抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系にＧＡＤＤ３４又はＫ３Ｌタンパク質を添加した時のｅＩＦ２αのリン酸化及びルシフェラーゼタンパク質合成量を示す。
【図６】ハイブリドーマ細胞抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系にＧＡＤＤ３４及び／又はＫ３Ｌタンパク質を添加した時のｅＩＦ２αのリン酸化及びｈＣＧβタンパク質合成量を示す。
【図７】Ａ：ウサギ網状赤血球抽出液、及びＢ：小麦胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系にＧＡＤＤ３４又はＫ３Ｌタンパク質を添加した時のルシフェラーゼタンパク質合成量を示す。
【図１】
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【図２】
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【図７】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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