(57)【要約】【課題】  細胞賦活剤を提供する。【解決手段】  ヒアルロナンを有効成分として含有する薬剤である。ヒアルロナンとしては-Ｄ-グルクロン酸-β-１,３-D-Ｎ-アセチルグルコサミン-β-１,４-を１単位とし、これを２個含む４糖（HA4）であることが好ましい。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロナンを有効成分とする細胞賦活剤。
【請求項２】
上記ヒアルロナンは、-Ｄ-グルクロン酸-β-１,３-D-Ｎ-アセチルグルコサミン-β-１,４-を１単位とし、これを２個含む４糖であることを特徴とする請求項１記載の細胞賦活剤。
【請求項３】
経口投与剤であることを特徴とする請求項１記載の細胞賦活剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロナンを有効成分とする細胞賦活剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロナンは、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとの２糖繰り返し単位から構成されている長鎖の多糖であり、一方、オリゴ糖も知られている。ヒアルロナンは鶏冠、さい体、皮膚、関節液などの生体組織からの抽出液、またはストレプトコッカス属の細菌を用いる発酵法などにより製造され、毒性学的および免疫学的作用が存在しないため、薬剤や化粧品として利用されており、例えばヒアルロナンの関節内注射による関節炎の治療がよく知られている。以下の説明において、４糖のヒアルロナンをHA4と記載する。
【０００３】
HA4には、臓器保存、肝障害および胃潰瘍に対する治療・抑制効果があることが報告されている（特許文献１参照）。また、HA4には、ストレス蛋白発現増強作用および細胞死抑制作用があることが知られている（非特許文献１参照）。
【０００４】
一方、細胞賦活状態とは、細胞の活性状態を意味する。また、疾患のなかには細胞賦活状態が低下しているものや、細胞に変性が認められるものがあり細胞賦活状態の改善により、これら疾患の治療効果を期待することができる。細胞賦活状態は、Rhodamine123の染色性を指標に判断することができる。ミトコンドリアはエネルギー代謝の中枢であるが、Rhodamine123の蛍光光度は、ミトコンドリアの膜電位に依存的に増加する。したがって、Rhodamine123の染色性はミトコンドリア活性の指標すなわち細胞の活性度の指標となる（非特許文献２参照）。
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００２／００４４７１
【非特許文献１】Xu H, Ito T, Tawada A, Maeda H, Yamanokuchi H, Isahara K, Yoshida K, Uchiyama Y, Asari A. Effect of hyaluronan oligosaccharides on the expression of heat shock protein 72. J Biol Chem. 2002 10;277(19):17308-14.
【非特許文献２】Kim M, Cooper DD, Hayes SF, Spangrude GJ. Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux. Blood. 1998 Jun 1;91(11):4106-17.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新規な細胞賦活剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述した目的を達成した本発明に係る細胞賦活剤は、ヒアルロナンを有効成分として含有する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に係る細胞賦活剤は、ヒアルロナンを有効成分とするものであるから、比較的安価にかつ容易に大量生産できる利点がある。また、ヒアルロナンは毒性や抗原性がほとんどないこと、生体が元来有している治療作用や疾患の防止作用を増強することから副作用の極めて少ない治療剤として期待される。このように、本発明によれば、細胞活性の低下に起因する疾患の治療に有効な新規な薬剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明に係る細胞賦活剤は、細胞の活性を向上させる機能を有する薬剤である。細胞の活性を向上させるとは、細胞の生理活動を亢進させること、あるいは、細胞の生理活動の低下を抑制することを意味する。細胞の活性を向上させることにより、細胞の活性を低下している疾患や、細胞に変性が認められる疾患を治療又は改善することができる。
【００１０】
以下の説明において、本発明に係る細胞賦活剤を単に薬剤と称する。
本発明に係る薬剤に含まれるヒアルロナンとしては、基本的にはβ−Ｄ−グルクロン酸の１位とβ−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンの３位とが結合した２糖単位を少なくとも１個含む２糖以上のものでかつβ−Ｄ−グルクロン酸とβ−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンとから基本的に構成されるものであれば、２糖単位が１個または複数個結合したものにそれらの要素が結合した糖であってもよく、またこれらの誘導体、例えば、アシル基等の加水分解性保護基を有したもの等も使用し得る。該糖は不飽和糖であってもよく、不飽和糖としては、非還元末端糖、通常、グルクロン酸の４，５位炭素間が不飽和のもの等が挙げられる。本発明で使用するヒアルロナンとしては、具体的には動物等の天然物から抽出されたもの、微生物を培養して得られたもの、化学的もしくは酵素的に合成されたものなどいずれも使用することができる。例えば鶏冠、さい体、皮膚、関節液などの生体組織から公知の抽出法と精製法によって得ることができる。またストレプトコッカス属の細菌等を用いた発酵法によっても製造できる。
【００１１】
本発明においては、ヒアルロナンオリゴ糖もヒアルロナンに包含され、上記２糖単位１個からなる２糖およびその誘導体のような低分子量のヒアルロナンから、重量平均分子量４００万程度の高分子量のヒアルロナンまで使用することができる。好ましくは組織における浸透性などの点で優れる重量平均分子量３８０程度〜９００，０００程度のヒアルロナンが挙げられ、より好ましくは２〜２０糖程度のヒアルロナンを挙げることができる。
【００１２】
ヒアルロナンのうち分子量の低いものは、具体的には、酵素分解法、アルカリ分解法、加熱処理法、超音波処理法(Biochem., 33(1994)p6503-6507)等の公知の方法によってヒアルロナンを低分子化する方法、化学的もしくは酵素的に合成する方法(Glycoconjugate J., (1993)p435-439、WO93/20827) などで製造することが好ましい。例えば酵素分解法としては、ヒアルロナン分解酵素（ヒアルロニダーゼ（睾丸由来）、ヒアルロニダーゼ（Streptomyces由来）、ヒアルロニダーゼＳＤなど）、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＡＣII、コンドロイチナーゼＡＣIII 、コンドロイチナーゼＡＢＣなどのヒアルロナンを分解する酵素をヒアルロナンに作用させてヒアルロナンオリゴ糖を生成する方法（新生化学実験講座「糖質II−プロテオグリカンとグリコサミノグリカン−」p244-248、1991年発行、東京化学同人 参照）などが挙げられる。
【００１３】
また、アルカリ分解法としては、例えばヒアルロナンの溶液に１Ｎ程度の水酸化ナトリウム等の塩基を加え、数時間加温して、低分子化させた後、塩酸等の酸を加えて中和して、低分子量のヒアルロナンを得る方法などが挙げられる。本発明で用いるヒアルロナンは、塩の形態を包含し、製剤上の必要に応じて、その薬学上許容できる塩を用いることができる。例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、トリ（ｎ−ブチル）アミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、アミノ酸塩等のアミン塩などであることができる。
【００１４】
本発明の薬剤は、ある分子量のヒアルロナン単独又は種々の分子量のヒアルロナンを組み合わせたものなど特に限定することなく使用できる。本発明の薬剤は、ヒアルロナンを有効成分とするものであり、その有効量をヒトを含む哺乳動物に投与することによって生体に悪影響を与えることなく、細胞の活性低下を抑制及び/又は細胞を活性化することができる。
【００１５】
本発明の薬剤は、ヒアルロナン又はその塩を、そのまままたは必要に応じて担体、賦形剤、その他の添加物と共に、経口的あるいは非経口的に投与（関節内投与、静脈内、筋肉内、皮下などの組織内投与（注射）、経腸投与、経皮投与など）するための医薬品として、任意の剤形に製剤化することが可能であり、任意の投与方法で患者に投与される。特に、本発明に係る薬剤は、経口製剤とすることが好ましい。
【００１６】
経口製剤としては、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤等の固形製剤；シロップ剤、エリキシル剤、乳剤等の液状製剤を挙げることができる。散剤は、例えば、乳糖、デンプン、結晶セルロース、乳酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、無水ケイ酸等の賦形剤と混合して得ることができる。顆粒剤は、上記賦形剤のほか、必要に応じ、例えば白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤や、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の結合剤や、カルボキシメチルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤をさらに加え、湿式又は乾式で造粒して得ることができる。錠剤は、上記散剤又は顆粒剤をそのまま、或いはステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤を加えて打錠して得ることができる。また、上記錠剤又は顆粒剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタアクリル酸メチルコポリマー等の腸溶性基剤で被覆し、或いはエチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油等で被覆し、これらを腸溶性或いは持続性製剤にすることができる。硬カプセル剤は、上記散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填して得ることができる。また軟カプセル剤は、ヒアルロナン又はその塩を、グリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油等に混合し、これをゼラチン膜で被覆して得ることができる。シロップ剤は、白糖、ソルビトール、グルセリン等の甘味剤とヒアルロナン又はその塩とを、水に溶解して得ることができる。また、甘味剤及び水のほかに、精油、エタノール等を加えてエリキシル剤とするか、或いはアラビアゴム、トラガカント、ポリソルベート８０、カルボキシメチルセルロースナトリウム等を加えて乳剤又は懸濁剤にすることができる。またこれらの液状製剤には必要に応じ、矯味剤、着色剤、保存剤等を加えることができる。
【００１７】
非経口製剤としては、注射剤、直腸投与剤、ペッサリー、皮膚外用剤、吸入剤、エアゾール剤、点眼剤等を挙げることができる。注射剤は、ヒアルロナン又はその塩に塩酸、水酸化ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等のｐＨ調節剤；塩化ナトリウムウム、ブドウ糖等の等張化剤；及び注射用蒸留水を加え、滅菌濾過した後、アンプルに充填して得ることができる。また、更にマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチン等を加えて真空凍結乾燥し、用時溶解型の注射剤とすることができる。またヒアルロナン又はその塩にレシチン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の乳化剤を加えた後、水中で乳化された注射用乳剤とすることもできる。
【００１８】
直腸投与剤は、ヒアルロナン又はその塩にカカオ脂肪酸のモノ、ジ又はトリグリセリド、ポリエチレングリコール等の坐剤用基剤を加えた後、加温して溶解し、これを型に流し込んで冷却するか、或いはヒアルロナン又はその塩をポリエチレングリコール、大豆油等に混合した後、ゼラチン膜で被覆して得ることができる。皮膚外用剤は、ヒアルロナン又はその塩に、白色ワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、ポリエチレングリコール等を加え、必要に応じて加温し、混練して得ることができる。テープ剤は、ヒアルロナン又はその塩を、ロジン、アクリル酸アルキルエステル重合体等の粘着剤と混練し、これを不織布等に展延して得ることができる。吸入剤は、例えば薬学的に許容される不活性ガス等の噴射剤に、ヒアルロナン又はその塩を溶解又は分散し、これを耐圧容器に充填して得ることができる。
【００１９】
（投与方法）本発明のヒアルロナンを有効成分とする薬剤の投与方法は、特に限定されないが、静脈内投与、経口投与および関節内投与を挙げることができる。
【００２０】
（投与量）投与量は、対象とする疾患、患者の年令、健康状態、体重等に応じ適宜決定するが、一般には０．０５〜５０mg/kg を１日１回あるはそれ以上に分けて投与する。
【００２１】
（毒性）本発明で使用するヒアルロナンは、医薬としての生物活性を示す投与量において細胞毒性はほとんどもしくは全く認められなかった。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明に係る薬剤を、実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２３】
〔実施例１〕
本実施例では、本発明に係る薬剤による細胞活性化能をRhodamine123を用いて測定した。Rhodamine123は、エネルギー代謝の中枢であるミトコンドリアの膜電位に依存的に、その蛍光光度が増加する。したがって、Rhodamine123の染色性はミトコンドリア活性の指標、すなわち細胞の活性度の指標となる（非特許文献２参照）。
【００２４】
賦活対象細胞
本実施例では、賦活する対象の細胞としてK562（ヒト赤白血病細胞或いはヒト赤芽球様白血病細胞と呼ばれる）を使用した。K562は理化学研究所より入手可能である。
【００２５】
被検物質の調製
本実施例では、100ng/mlのHA4を調整した。具体的に、HA4は、Tawadaらの方法（Tawada A, Masa T, Oonuki Y, Watanabe A, Matsuzaki Y, Asari A. Large-scale preparation, purification, and characterization of hyaluronan oligosaccharides from 4-mers to 52-mers. Glycobiology. 2002; 12(7):421-6.）により調製し、生理食塩水で濃度を調節した。
【００２６】
実験方法
先ず、K562を以下の条件で培養した。K562を培養するための培地は、RPMI-1640培地を使用した。本実施例では、以下のように１〜３群に分けてK562を培養した。各群の培養条件は下記の通りである。なお、３群の培地には、HA4（100ng/ml）を添加した。
１群  ３７℃８０分
２群  ４３℃２０分（熱処理）の後３７℃６０分
３群  ４３℃２０分（熱処理）の後３７℃６０分
【００２７】
次に、培養の後、RPMI培地に溶解したRhodamine123を、各群の培地に加えた。Rhodamine123の終濃度は1μg/mlとした。Rhodamine123を添加した後に３７℃で１０分インキュベートし、その後、RPMI培地にてK562を洗浄した。
【００２８】
次に、洗浄後のK562を１×１０４個/mlとなるように９６穴プレートに蒔き、蛍光顕微鏡（ニコン社製）にて撮影した。撮影した画像をAdobe Photoshop（アドビ・システム社製）に取り込み、細胞の蛍光強度を測定した。
【００２９】
結果
各群について撮影した画像を図１に示し、蛍光強度を測定した結果を図２に示す。図１及び図２に示した結果から、４３℃２０分の熱処理により、Rhodamine123の染色性は低下した（２群）が、HA4が存在するとその低下に抑制が認められた（３群）。また、２群と３群との間の蛍光強度の差は有意であった。
【００３０】
考察
上記の結果のように、HA4は、ミトコンドリアの膜電位の低下、すなわちミトコンドリア活性の低下を抑制した。このことは、HA4には、環境の悪化（熱処理）により低下するはずのミトコンドリア活性を低下させない作用、あるいは、低下したミトコンドリア活性を回復させる作用、すなわちミトコンドリア賦活作用があることを意味している。ミトコンドリアは細胞のエネルギー（ATP）を生み出す細胞内小器官であることから、HA4には、細胞賦活（活性化）作用があると言える。
【００３１】
参考文献：
１．Martin W, Hoffmeister M, Rotte C, Henze K. An overview of endosymbiotic models for the origins of eukaryotes, their ATP-producing organelles (mitochondria and hydrogenosomes), and their heterotrophic lifestyle. Biol Chem. 2001 Nov;382(11):1521-39.
２．Hatefi Y. ATP synthesis in mitochondria. Eur J Biochem. 1993 Dec 15;218(3):759-67.
【００３２】
〔実施例２〕
本実施例では、本発明に係る薬剤による細胞活性化能を、遺伝子の発現促進・発現抑制をモニターすることができるDNAチップを用いて評価した。
【００３３】
実験方法
先ず、１、２群に分けてK562を上記RPMI培地で培養した。両群は、42℃で20分、次いで37℃で30分インキュベートする培養条件とした。なお、２群の培地には、HA4（10ng/ml）を添加した。
【００３４】
次に、培養の後、1000rpmで遠心分離して培地を除去した。得られた細胞を-60℃ディープフリーザーにて保存した。保存した細胞から、次に、定法に従ってRNAを抽出した。抽出したRNAを用いてDNAチップにて遺伝子発現を解析した。DNAチップによる遺伝子発現解析はDNAチップ研究所に外注した。詳細には、DNAチップ研究所製、商品名：AceGene Human Oligo Chip 30K 1 Chip Versionを使用した。
【００３５】
結果
DNAチップによる発現解析の結果、HA4を含む培地で培養した細胞においては、表1にあげる、細胞の賦活に関する多くの遺伝子の発現プロファイルに有意な変化が観察された。
【００３６】
【表１】
2007084509.tif 000002
【００３７】
表１に示すように、HA4によって（１）アポトーシス関連遺伝子の発現が抑制され、（２）転写抑制関連遺伝子の発現が抑制され、（３）Heat shock protein関連遺伝子の発現が促進された。詳細には、HA4は、アポトーシスを誘導あるいは実行に関与する因子であるSTK17b（DRAK2）、pawr(Par-4)、Caspase2及びGranzyme Hの遺伝子発現を抑制した。また、HA4は、転写抑制をもたらす因子であるDNAJ2及びTAF9Lの遺伝子発現を抑制した。さらに、HA4は、Heat shock proteinであるdnaj(hsp40)homologの遺伝子発現を増強した。
【００３８】
考察
上記の結果において、アポトーシス関連遺伝子のなかでSTK17b（DRAK2）及びpawr(Par-4)は、アポトーシスを誘導あるいは促進の方向に向かわせる因子であることから、これらの遺伝子発現を抑制することは、アポトーシスを抑制することになることが分かる。STK17b（DRAK2）については、Sanjo H, Kawai T, Akira S. DRAKs, novel serine/threonine kinases related to death-associated protein kinase that trigger apoptosis. J Biol Chem. 1998 273(44):29066-71参照。pawr(Par-4)については、Johnstone RW, See RH, Sells SF, Wang J, Muthukkumar S, Englert C, Haber DA, Licht JD, Sugrue SP, Roberts T, Rangnekar VM, Shi Y. A novel repressor, par-4, modulates transcription and growth suppression functions of the Wilms' tumor suppressor WT1. Mol Cell Biol. 1996 16(12):6945-56及びMattson MP, Duan W, Chan SL, Camandola S. Par-4: an emerging pivotal player in neuronal apoptosis and neurodegenerative disorders. J Mol Neurosci. 1999 Aug-Oct;13(1-2):17-30参照。
【００３９】
また、Caspase2は、アポトーシス実行因子であることから、その遺伝子発現を抑制することは、アポトーシスを抑制することになることが分かる。Caspase2については、Zhivotovsky B, Orrenius S. Caspase-2 function in response to DNA damage. Biochem Biophys Res Commun. 2005 331(3):859-67参照。
【００４０】
Granzyme Hは、リンパ球が他の細胞にアポトーシスを誘導する因子であることから、その遺伝子発現抑制もアポトーシスを抑制することになることが分かる。Granzyme Hについては、Sedelies KA, Sayers TJ, Edwards KM, Chen W, Pellicci DG, Godfrey DI, Trapani JA Discordant regulation of granzyme H and granzyme B expression in human lymphocytes. J Biol Chem. 2004 279(25):26581-7. Epub 2004 Apr 6参照。
【００４１】
上記の結果において、DNAJ2及びTAF9Lの遺伝子発現を抑制することは、抑制の方向に向かう転写の活性を回復させることを意味することが分かる。DNAJ2については、Terada K, Mori M. Human DnaJ homologs dj2 and dj3, and bag-1 are positive cochaperones of hsc70. J Biol Chem. 2000 275(32):24728-34参照。TAF9Lについては、Chen Z, Manley JL. In vivo functional analysis of the histone 3-like TAF9 and a TAF9-related factor, TAF9L. J Biol Chem. 2003 278(37):35172-83参照。
【００４２】
本発明者は、HA4にはHeat shock protein 72(Hsp72)の発現増強作用があることを報告している（Xu H, Ito T, Tawada A, Maeda H, Yamanokuchi H, Isahara K, Yoshida K, Uchiyama Y, Asari A. Effect of hyaluronan oligosaccharides on the expression of heat shock protein 72. J Biol Chem, 2002 10;277(19):17308-14.）。本実施例においては、DNAチップを用いた解析で、新たに、HA4がHeat shock proteinであるdnaj(hsp40)homologの遺伝子発現を増強することが判明した。dnaj(hsp40)homologは、Hsp72と同様に、細胞内の蛋白変性抑制作用および細胞死の抑制作用を有する。
【００４３】
以上、本実施例の結果から、HA4は、アポトーシス抑制、転写活性回復及び蛋白変性抑制といった新規な機能を有することが判明した。これら機能は全て細胞賦活に繋がる現象であることから、HA4は細胞賦活作用を有すると結論付けることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】実施例１で調製した各群の細胞を撮像した写真である。
【図２】実施例１で調製した各群の細胞における蛍光強度を測定した結果を示す特性図である。
【図１】
2007084509.tif 000003
【図２】
2007084509.tif 000004