(57)【要約】      （修正有）【課題】超微量の生体物質の検出を可能とする極めて検出感度の高いバイオセンサーチップを提供する。【解決手段】蛍光法を検出原理とするバイオセンサーチップであって、特異的結合物質（X）の固定部（A）、及び固定部（A）の一部を被覆するフォトニック結晶（B）を設置することを特徴とする。蛍光をフォトニック結晶（B）間において反射増幅させて、増強した蛍光を蛍光分析装置にて測定することを特徴とする生体分子の検出方法を採用したバイオセンサーチップ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光法を検出原理とするバイオセンサーチップであって、特異的結合物質（X）の固定部（Ａ）を被覆するフォトニック結晶（B）を設置したバイオセンサーチップ。
【請求項２】
特異的結合物質（X）の固定部（A）が、平板状セル（C）内に存在する請求項1に記載のバイオセンサーチップ。
【請求項３】
平板状セル（C）を、2個の平板状のフォトニック結晶（B）が挟み込んだサンドイッチ構造を有する請求項2に記載のバイオセンサーチップ。
【請求項４】
平板状セル（C）が、マイクロ流路（D）を有する請求項2又は3に記載のバイオセンサーチップ。
【請求項５】
特異的結合物質（X）の固定部（A）が、マイクロ流路（D）の流路内に存在する請求項4に記載のバイオセンサーチップ。
【請求項６】
特異的結合物質（X）の固定部（A）の一部をフォトニック結晶（B）が被覆し、固定部（A）の一部を反射板が被覆した構造を有する請求項1〜5のいずれか１項に記載のバイオセンサーチップ。
【請求項７】
フォトニック結晶（B）が微粒子の集積体からなる請求項1〜6のいずれか１項に記載のバイオセンサーチップ。
【請求項８】
特異的結合物質（X）が免疫蛋白質である請求項1〜7のいずれか１項に記載のバイオセンサーチップ。
【請求項９】
請求項1〜8のいずれか１項に記載のバイオセンサーチップに励起光を照射して生体物質を検出する蛍光法であって、蛍光シグナルをフォトニック結晶（B）間において反射増幅させて、増強した蛍光シグナルを蛍光分析装置にて測定することを特徴とする生体物質の検出方法。
【請求項１０】
蛍光シグナルをフォトニック結晶（B）及び反射板間において反射増幅させる請求項9に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサーチップに関する。特に、臨床診断用途に使用できる検出感度の高いバイオセンサーチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、遺伝子解析や蛋白質の機能解明等の基礎研究、解析したデーターを利用する新薬開発、更には癌、ホルモン、心筋梗塞などの臨床診断などの目的でDNAチップ、蛋白チップ、免疫試薬等が様々な研究機関や医療機関において使用されている。
生体分子の検出原理としては、比濁法、凝集法、表面プラズモン法、蛍光法、発光法などが開発されているが、検出感度等の観点から、蛍光法、発光法が主流となっており、蛍光法、発光法いずれも血液等のサンプル中に含まれる極めて微量の生体物質まで検出することができる。
【０００３】
蛍光法とは、蛍光色素等の蛍光物質を固定化した生体分子を標識として使用し、レーザーなどの励起光によって蛍光物質を蛍光発光させ、可視化又は蛍光強度から物理量を計測する手法である。検出感度は発光法よりやや劣るものの、試薬の安定性が高く、取扱いが容易であり、また、分析装置も比較的安価であることから広く使用されている方法である。
【０００４】
蛍光法、発光法の検出感度は、現状でも非常に高いものと言えるが、検出感度向上のニーズは未だに強い。検出感度が更に向上すれば、従来の方法では検出することができない超微量の生体分子の検出が可能となり、新たな診断マーカー等が発見されることが期待できるからである。また、大幅なサンプル量の減少や測定時間の短縮、測定精度の向上といった効果もある。特に、前述の優れた特徴を有する蛍光法に関して、検出感度の更なる向上が強く望まれている。
【０００５】
検出感度を向上させる方法として、例えば、固相を用いる抗体の免疫測定法に於いて、試料中の抗体に、固相用担体に固定化したビオチン化高分子物質にアビジンあるいはストレプトアビジンおよびそれらの誘導体を結合させてなる固相、ビオチン化ペプチド抗原および標識ペプチド抗原を同時に反応させることを特徴とする抗体の免疫測定方法（特許文献1）や、光導波路の表面において抗原抗体反応を観測する蛍光免疫測定方法であって、前記光導波路と検体を接触させ前記光導波路の表面に検体中の測定対象物を捕捉する捕捉工程と、該捕捉工程で捕捉された前記測定対象物に蛍光 性発色団を有する標識抗体を結合させる結合工程と、前記光導波路内に励起光を導入して内部全反射光とし、前記光導波路の表面にエバネッセント波を発生させ該蛍光 性発色団を励起する励起工程と、前記光導波路内を伝播して収集される光を観測する観測工程とから成る一連の工程を少なくとも２回繰り返し、前記光導波路と前記検体との接触時間に対する観測光量の変化率を測定することを特徴とする蛍光免疫測定方法が提案されている（特許文献2）。
【０００６】
しかし、これらの方法は、いずれも蛍光シグナルを直接的に増強する方法ではなく、検出感度の大幅な向上は期待できない。
【特許文献１】特開平９−１７８７４７
【特許文献２】特開２００４−２０５２８６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
即ち、本発明の目的は、従来の方法では検出することができない超微量の生体物質の検出を可能とする極めて検出感度の高いバイオセンサーチップを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明のバイオセンサーチップは、蛍光法を検出原理とするバイオセンサーチップであって、特異的結合物質（X）の固定部（A）、及び固定部（A）の一部を被覆するフォトニック結晶（B）を設置することを特徴とする。蛍光をフォトニック結晶（B）間において反射増幅させて、増強した蛍光を蛍光分析装置にて測定することを特徴とする生体物質の検出方法を採用したバイオセンサーチップである。
すなわち、本発明は、蛍光法を検出原理とするバイオセンサーチップであって、特異的結合物質（X）の固定部（Ａ）を被覆するフォトニック結晶（B）を設置したバイオセンサーチップ、及び該バイオセンサーチップを使用した生体物質の検出方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のバイオセンサーチップは、フォトニック結晶（B）により蛍光シグナルを直接的に増強することで、極めて検出感度が高く、従来の方法では検出することができない超微量の生体分子の検出を可能にする。蛍光分析装置を使用しないと定性分析できなかったものが可視化できるようになり、新規な診断マーカーも利用できるようになる等の優れた効果が期待できる。大幅なサンプル量の減少や測定時間の短縮、測定精度の向上も可能になる。
また、蛍光法を検出原理とするため、試薬の安定性が高く、取扱いが容易であり、分析装置も比較的安価といった蛍光法のメリットもある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の蛍光法としては、一般的に行われている公知の蛍光法を適用することができ、蛍光物質を固定化した生体分子を標識として使用し、励起光によって蛍光物質を蛍光発光させ、可視化又は蛍光強度から物理量を計測する手法である。
蛍光物質としては、市販の蛍光物質を使用することができる。例えば、フルオレセイン、ローダミンBイソチオシアネート、リサミン-ローダミンBスルホニルクロライド、アニリノナフタレンスルホン酸、2-メトキシ2，4-ジフェニル3（2H）フラノン、メチルウンベリフェロン、ダンシルクロライド、ルシファーイエロー、エリスロシン、ピレン、テキサスレッド、エオシン、フルオレサミン、クロロフィルなどの蛍光色素が挙げられる。
【００１１】
標識に使用する生体物質は、ターゲット物質、即ち、後述の特異的結合物質（X）に特異的に結合する物質と特異的に結合する生体物質を使用する。
蛍光物質の前記生体物質への固定化は、公知の方法により行うことができる。
励起光としては、公知の励起光を使用することができ、キセノンランプや各種レーザー光を使用することができる。検出感度向上等の観点から、レーザー光を励起光として使用することが好ましい。
励起光の照射方法は、固定部（A）に照射できるのであれば、種々の方向から照射することが可能であるが、フォトニック結晶（B）により被覆されている面から照射することが好ましい。
【００１２】
なお、後述のように、フォトニック結晶による反射増幅により蛍光シグナルを増強するため、励起光が反射されないように、蛍光物質の光吸収と蛍光の波長が近い場合には、2光子吸収により励起することが好ましい。2光子吸収とは、2つの光子を励起に利用する方法であり、フォトニック結晶（B）にて反射されない長波長の励起光を使用することができる。2光子吸収の他にも、後述するフォトニックバンドよりも低波長の励起光を使用する方法が挙げられる。
蛍光強度の測定は、市販の蛍光分析装置などを使用することができる。例えば、高感度蛍光分析装置（タイヨー電機社製）、分光蛍光光度計（日立ハイテク社製）などを使用することができる。
【００１３】
本発明において、特異的結合物質（X）は血液等のサンプル中に含まれるターゲット物質と特異的に結合する物質であれば制限なく使用でき、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチド若しくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
ここで血液等のサンプルとしては、血液（血清、血漿）、尿、大便、喀痰、髄液等が挙げられる。
サンプル中に含まれる特異的結合物質（X）と特異的に結合するターゲット物質とは、特異的結合物質（X）と同様のものであって、例えば（X）が抗体の場合、ターゲット物質は、その抗体が認識する抗原であり、例えば（X）が糖鎖の場合、ターゲット物質は、レクチン、例えば（X）が遺伝子の場合、ターゲット物質は、相補的な遺伝子である。
【００１４】
免疫蛋白質としては、抗原、抗体やハプテンを例示することができる。抗体としては、次の抗原に対する抗体が使用でき、該抗原としては、薬剤、低分子ホルモン、腫瘍マーカー、ウイルス、高分子ホルモン、サイトカイン、各種グロスファクター等が挙げられる。薬剤としては、例えば、テオフィリン、フェニトイン、バルプロ酸などが挙げられる。低分子ホルモンとしては、例えば、サイロキシン、エストロゲン、エストラジオールなどが挙げられる。腫瘍マーカーとしては、例えば、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＣＡ１９−９などが挙げられる。ウイルスとしては、例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶなどが挙げられる。高分子ホルモンとしては、例えば、甲状腺刺激ホルモン、インシュリンなどが挙げられる。サイトカインとしては、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６などが挙げられる。各種グロスファクターとしては、例えば、ＥＧＦ、ＰＤＧＦなどが挙げられる。これらの抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよく、さらに抗体の分解物であるＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂであってもよい。
【００１５】
酵素としては、酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、ターゲット物質がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、ターゲット物質がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等をターゲット物質とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
【００１６】
核酸としては、ターゲットとする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡの化学合成は、市販の合成装置を用いて行うことができるし、市販されているＤＮＡプローブをそのまま使用することもできる。
【００１７】
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【００１８】
特異的結合物質（X）は、固定部（A）に固定化されており、固定化する方法としては、化学的に結合する方法、物理吸着による方法など公知の方法が使用できる。
特異的結合物質（X）が免疫蛋白質や酵素等の蛋白質である場合、化学的に結合する方法としては、固定部（A）にアミノ基、スルフヒドリル基などの官能基を導入し、特異的結合物質（X）のアミノ基、スルフヒドリル基などの官能基をグルタルアルデヒド、サクシンアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロサクシンイミドエステル、ｏ−フェニレンビスマレイミドなどで架橋する方法が使用できる（例えば、米国特許第４２８０９９２号、米国特許第３６５２７６１号に記載されている。）。
他にも、固定部（A）にカルボキシル基を導入し、カルボジイミドを介して特異的結合物質（X）のアミノ基と結合する方法が挙げられる。固定部（A）の材料として、カルボキシル基を表面に有するポリスチレン樹脂を使用する場合について具体的に説明する。まず、カルボキシル基とカルボジイミドとを室温で約１時間反応させた後、未反応のカルボジイミドを十分に洗浄除去する。次に、AFP抗体等の蛋白質を加え、約２時間反応させた後、未反応の蛋白質を洗浄除去することにより、蛋白質を化学的に固定化することができる。
【００１９】
物理吸着による方法としては、例えば、固定部（A）がポリスチレンの場合、特異的結合物質（X）を０．００１〜０．０４％（Ｗ／Ｖ）含む炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に固定部（A）を適当時間浸漬する方法が使用できる（例えば、バイオシム・バイオフィズ・アクタ、２５１巻、４２７頁、１９７１年に記載されている。）。
特異的結合物質（X）が核酸である場合、物理的に結合する方法としては、固定部（A）に正電荷を付与し、電気的引力により結合するものである。この方法は、DNA が負電荷を有していることを利用するものであり、ポリリジンを表面にコートする方法やアミノシランを固定部（A）に反応させアミノ基を導入する方法など、公知の方法を使用することができる。
固定化する方法としては、検出感度向上等の観点から、化学的に結合する方法が好ましい。
【００２０】
特異的結合物質（X）が固定化される固定部（A）とは、ターゲット物質と特異的結合物質（X）との反応を行う部分であり、かつ、励起光が照射され、蛍光シグナルが発生する部分である。具体的には、固定部（A）では、次のような操作が行われる。まず、固定部（A）に、ターゲット物質を含有するサンプルを供給すると、ターゲット物質と固定化されている特異的結合物質（X）が反応し、ターゲット物質以外のものは、通過する又は洗浄操作により除去される。次に、蛍光物質を固定化したターゲット物質のみと特異的結合する蛍光標識物質を供給して、ターゲット物質の存在する場所のみに選択的に蛍光標識物質を結合させる。又は、蛍光標識物質とサンプルを予め反応させておいてもよい。結合した蛍光物質に励起光を照射することにより、蛍光シグナルが発生する。
【００２１】
従って、固定部（A）には、前述の操作を行うことができる形態でなければならない。具体的には、固定部（A）は、液体状のサンプルが供給されるため、チューブや流路、微細な容器などを有する分析セル内に存在することが好ましい。ここで分析セルとは、サンプルの供給、ターゲット物質と特異的結合物質（X）との反応、サンプルの排出といった一連の分析操作を行うその内部で行うことができるセルを意味する。サンプルのろ過や濃縮といった操作が可能な分析セルも使用することができる。
【００２２】
分析セルとしては、種々の形状、大きさのセルを使用することができるが、後述のフォトニック結晶（B）の被覆の観点から、平板状のセル（C）であることが好ましい。平板状セル（C）の大きさとしては、1辺が0.1〜10cm、厚みが0.1〜1000μmであることが好ましく、更に好ましくは、1辺が0.5〜5cm、厚みが0.3〜100μm、特に好ましくは、1辺が1〜3cm、厚みが0.5〜10μmである。
分析セルの内部形態としては、前述の薄膜構造に対応できる形態であり、かつ、サンプル量の減少、反応効率の向上といった観点から、流路の径が1000〜1μm程度のマイクロ流路（D）構造であることが好ましい。
マイクロ流路（D）は、ナノインプリント法等により作製することができる。
【００２３】
本発明のバイオセンサーチップは、固定部（A）を被覆するフォトニック結晶（B）を設置する構造であり、即ち、固定部（A）はフォトニック結晶（B）に被覆されていなければならない。
フォトニック結晶（B）は、蛍光シグナルの増幅の観点から、固定部（A）を広く被覆することが好ましく、分析セルの固定部（A）のみを被覆してもよいし、蛍光シグナルの取出口を確保した上で分析セルの全てを被覆してもよい。フォトニック結晶による被覆は、固定部（A）の特定の部分（面）及び固定部（A）を挟んでその特定の部分(面)と逆側にある部分(面)に対して行う必要があり、2個以上のフォトニック結晶を準備し、固定部（A）又は固定部（A）を含む分析セルを挟み込む方法（図1）、又は、フォトニック結晶（B）の中に固定部（A）を設置する方法などが挙げられる。  
【００２４】
後者の方法では、フォトニック結晶中にレーザー加工技術等を使用して流路等の構造体を作製する必要がある。一方、前者の方法は、レーザー加工等を必要とせず、生産性が高く、より好ましい方法といえる。
2個以上のフォトニック結晶を準備し、固定部（A）又は固定部（A）を含む分析セルを挟み込む方法としては、後述の方法により作成した平板状又はフィルム状のフォトニック結晶（B）を、平板状のセル（C）を使用して、これを挟み込むように設置し、熱接着させる又は接着剤を使用して密着する。
【００２５】
本バイオセンサーチップは、フォトニック結晶により蛍光シグナルを反射増幅することにより、シグナル強度を増加させて検出感度を飛躍的に向上させることができる。ここでフォトニック結晶とは、光の波長程度の周期性があり、フォトニックバンドギャップという光の禁止帯を有する構造体である。
従って、蛍光シグナルの波長に対応する周期構造を有するフォトニック結晶を使用して、固定部（A）の特定の部分（面）及び固定部（A）を挟んでその特定の部分（面）と逆側にある部分（面）を被覆すれば、蛍光シグナルを反射させることが可能になり、反転分布・誘導放出・反射増幅という光増幅の条件を達成することができる。
【００２６】
増強された蛍光シグナルは、固定部（A）のフォトニック結晶に被覆されていない部分から取出され、蛍光分析装置により測定される。
フォトニック結晶に被覆されていない部分を銀等の反射率が高い金属などの反射板を設置とすることにより、蛍光シグナルの取出し効率を更に高めることができる。この場合、全ての部分を被覆してしまうと蛍光シグナルが取り出せなくなるので、一部分は被覆しないことが重要である。具体的には、図1のような分析セルを上下からフォトニック結晶で被覆した場合には、残りの4面のうち、1面は反射板を設置しないことが好ましい。
金属などの被覆による反射板の設置は、バイオセンサーチップを形成後に、金属などを含有するフィルムを貼り付けること等により行うことができる。
また、これら反射板を、固定部（A）を挟んでフォトニック結晶の反対側に設置することもできる。この場合、フォトニック結晶（B）と反射板との間で、蛍光シグナルが増幅されることになる。
【００２７】
フォトニック結晶の構造としては、六方最密充填構造、立方最密充填構造、体心立方充填構造、ログパイル構造、ダイヤモンド構造等が挙げられる。
これらの構造のうち、生産性等の観点から微粒子を構成単位として使用することができる、六方最密充填構造、立方最密充填構造が好ましい。
【００２８】
微粒子としては、形状が真球状であり、数平均粒子径が100〜1000nmであることが好ましく、更に好ましくは150〜800nm、特に好ましくは200〜700nmである。平均粒子径がこの範囲内であると、蛍光シグナルを効率よく反射増幅することができる。
また、微粒子の粒度分布はシャープなものであることが好ましく、具体的には変動係数が10％以下であることが好ましく、7％以下が更に好ましく、5％以下が特に好ましい。粒度分布がこの範囲内であると、増幅効率の高いフォトニック結晶を作製することができる。ここで変動係数とは、標準偏差を平均値で除した値の百分率を意味する。不定形の粒子であったり、粒度分布がブロードであったりするとフォトニック結晶中に粒子が集積されていない欠陥が存在する等、高感度のバイオセンサーチップに適したフォトニック結晶を作製することができない。
【００２９】
微粒子の組成としては、スチレン、メチルメタクリレートを主要成分とするポリマーや金属酸化物が好ましく、これらの組成からなる微粒子は、公知の方法により合成することができる。例えば、スチレンを主要成分とする場合、乳化重合法、懸濁重合法、ソープフリー乳化重合法等が挙げられ、シリカの場合、ゾルゲル法等が挙げられる。これらの組成からなり、上記の好ましい平均粒子径及び粒度分布を有する微粒子は数多く市販されており、それらの市販品を使用することもできる。
【００３０】
フォトニック結晶の作製方法としては、マイクロマニュピュレーター等を使用して構成単位を1個ずつ集積する方法や構成単位として微粒子を使用し、重力や遠心力、毛細管力、液架橋力等により集積する方法が挙げられる。
前者の方法としては、構成単位、具体的には、公知の微細加工技術（リソグラフィー及びエッチング、レーザー加工等）により作製した金属化合物や合成ポリマーからなる柱状体や板状体を電子顕微鏡等で確認しながら1個ずつ集積していく方法が挙げられる。この方法によれば、フォトニックバンドギャップを容易に得ることができるログパイル構造を作製することができる。
【００３１】
一方、後者の方法は、電子顕微鏡等で確認しながら集積する必要がなく、集積ドライビングフォースを適切に選択すれば、極めて容易に大量生産することができるため前者の方法よりも好ましい。後者の方法によれば、フォトニック結晶の構造は六方最密充填構造及び／又は立方最密充填構造となる。後述のように、ある特定形状のテンプレートを使用する場合には、選択的に立方最密充填構造が得られる。
ここで立方最密充填構造及び六方最密充填構造とは、いずれも最密充填構造であって、充填率は74体積％である。
【００３２】
立方最密充填構造は、面心立方格子構造とも呼ばれ、正四角形の単位格子の各頂点および各面の中心に粒子が位置し、最稠密面をABCABCABCの順に重ねた構造となっている。
六方最密充填構造は、単位格子を正六角柱で表し、この正六角柱の上面および底面の各角および中心と、六角柱の内部で高さ 1/2 のところに 3 つの粒子が存在する。底面の中心に位置する原子は、底面の角の 6 粒子および上下の各3粒子（計 12 粒子）と接しており、最稠密面をABABABの順に重ねた構造となっている。
また、構成単位を使用しない方法、即ち、一定の形態を有さない樹脂材料等をレーザーにより直接加工する方法もフォトニック結晶の作製方法として挙げることができる。具体的な方法としては、感光性レジストに短パルスレーザーを照射することによりレーザーを照射した部分のみを選択的に硬化させて周期構造を得る方法（特開2004-126312に記載の方法）などが挙げられる。
【００３３】
微粒子を使用し、重力や遠心力、毛細管力、液架橋力等により集積する方法では、何らかのテンプレート基板(Q)が必要である。テンプレートの機能を有する基板(Q)としては、微粒子を規則的に集積できる基板であれば種々の基板を使用することができ、凹凸のない平面基板、穴が形成された基板、溝が形成された基板等を使用することができる。これら基板の形状や大きさにより、得られるフォトニック結晶（B)の形状や大きさが決定されるため、精度良く穴や溝のサイズが揃った基板が必要であり、穴が形成された基板、溝が形成された基板等を使用することが好ましい。これらの基板(Q)を使用すれば、極めて欠陥の少なく規則性の高いフォトニック結晶を作製することができ、バイオセンサーチップの感度が更に良好なものとなる。
基板(Q)を構成する材料としては、シリコンやシリカ、酸化チタン等の無機化合物からなるものやアクリル樹脂、エポキシ樹脂、ポリイミド樹脂や感光性樹脂などの合成ポリマー等からなるものを使用することができる。
【００３４】
穴が形成された基板としては、図2のような基板が挙げられる。図2に示す穴の形状は基板表面に対して正確に54.7°の角度をなす逆ピラミッド型であり、このような極めて精度良くサイズの揃った穴を有する基板は、光や電子線を使用したリソグラフィー及びエッチング等の公知の微細加工技術により作製することができる。
例えば、図2に示す逆ピラミッド型基板は、電子線リソグラフィーと異方性エッチングにより作製することができる。具体的には、シリコン基板状に塗布したレジスト膜を電子線によりパターンニング（電子線リソグラフィー）した後、水酸化カリウム水溶液にて100面を選択的に溶解（異方性エッチング）することにより作製できる。逆ピラミッド型の穴を形成した基板を使用して、ピラミッドの先端部より順に微粒子を集積すれば、立方最密充填構造のみからなる周期構造を作製することもできる。
この方法を使用すれば、逆ピラミッド型の穴だけでなく、断面がV字型のアスペクト比が高い溝も精度良く作製することができるし、同様の微細加工技術を利用して、円柱型、柱状型の穴等も作製することができる。
【００３５】
その他、無機化合物等からなる平面基板に電子線リソグラフィー等により作製したレジスト膜のパターン自体を基板(Q)とすることもできるし、微細加工技術により金型基板を作製し、これを熱軟化点以上に加熱した熱可塑性樹脂等に押しつけパターンを転写する方法（ナノインプリント法）により作製した樹脂製の基板も使用することができる。
1つの穴の大きさ（μm）としては、直径が1〜1000であることが好ましく、更に好ましくは5〜500、特に好ましくは10〜100である。
【００３６】
溝が形成された基板としては、図3のような基板が挙げられ、同様の微細加工技術により作製することができる。ここで溝とは穴よりもアスペクト比（長径/短径、短径とは基板表面の断面の直径）が高い線状のものを意味し、具体的には、アスペクト比が10倍以上のものである（アスペクト比が10倍未満のものを穴とする）。
溝の断面の形状としては、四角形や図3のようなＶ字型等が挙げられる。
1つの溝の大きさ（μm）としては、短径が1〜1000、長径が10〜50000であることが好ましく、更に好ましくは短径が5〜500、長径が50〜20000、特に好ましくは短径が10〜100、長径が100〜10000である。
これらの溝としては、溝の両端が切り出されているもの、即ち、基板の端部に溝の両端が存在するものや片端だけが切り出されているもの、又は両端とも切り出されていないものを使用することができる。
【００３７】
これらの基板（Q）に微粒子を重力や遠心力、毛細管力、液架橋力等により集積する方法としては公知の方法等を使用することができる。
重力による微粒子の集積方法は、自然沈降法とも呼ばれ、基板（Q）に微粒子のスラリーを滴下し、重力を集積ドライビングフォースとして微粒子を集積する方法である。ここで集積ドライビングフォースとは、微粒子を基板（Q）に集積させるために働かせる力を意味する。
液架橋力による微粒子の集積方法（液架橋力法）は、基板（Q）に微粒子のスラリーを滴下し、溶媒の蒸発によって発生する液架橋力を集積ドライビングフォースとして微粒子を集積する方法である。
【００３８】
遠心力を使用した集積方法は、集積ドライビングフォースとして遠心力を使用することにより、フォトニック結晶の生産効率を高め、更に従来の方法では作製することが困難である均一性の高い周期構造単位の小さなフォトニック結晶を作製することが可能な方法である。例えば、遠心力を10Ｇ加えると、集積速度が10倍となる。また、5000Ｇ程度の強い遠心力を加えると、粒子径が300nm程度の小さな粒子も容易に集積することが可能であり、バイオセンサーチップに適した構造単位の小さなフォトニック結晶を作製することができる。また、フォトニック結晶の均一性を向上させる方法として、集積条件の最適化が難しい液架橋力を働かせないことが好ましい。具体的な操作としては、集積処理中に溶媒の蒸発を行わないことが挙げられる。
【００３９】
遠心力とは、遠心力中心から外へと向かう方向の慣性力であり、次式で与えられる。  
F  =  ｍｒω２
ここで、ｍは真球状粒子（P）の質量、ｒは遠心場の中心から真球状粒子（P）までの距離、ωは角速度（回転数×2π）である。ｒは、正確には遠心場の中心（遠心機の中心）から真球状粒子（P）までの距離であるが、粒子は常に移動するので、便宜上遠心機の中心から基板（Q）までの距離として扱う。
使用する遠心力の強さとしては、粒子径や粒子の比重により好ましい強さは異なるが、生産速度向上の観点からは強い方がよい。但し、規則性の高い均一な真球状粒子（P）の集積体を作製するためには、遠心力の強さだけでなく、処理時間、粒子スラリーの濃度、溶媒の蒸発速度等のパラメーターを最適化する必要がある。
【００４０】
例えば、微粒子として数平均粒子径が500nmのポリスチレン粒子、基板（Q）として直径が10μｍの正方形の穴径を有し、深さが12μｍの図2に示す逆ピラミッド型の穴が形成された基板を使用した場合のこれらパラメーターの好ましい範囲は、生産効率及び得られるフォトニック結晶（B)の均一性等の観点から以下の通りである。
遠心力の強さとしては、10〜10000Ｇであることが好ましく、更に好ましくは100〜8000Ｇ、特に好ましくは500〜5000Ｇである。
処理時間としては、遠心力の強さによっても異なるが、5〜3600分であることが好ましく、更に好ましくは10〜1000分、特に好ましくは15〜120分である。
微粒子スラリーの濃度としては、粒子スラリーの量によっても異なるが、0.01〜20重量%であることが好ましく、更に好ましくは0.02〜15重量%、特に好ましくは0.05〜10重量%である。微粒子スラリーの調製方法としては、微粒子を水等に界面活性剤や超音波分散機を使用して分散することにより調整できるが、水中にて原料モノマー等からソープフリー乳化重合等により微粒子を合成して、そのまま微粒子スラリーとして用いることが好ましい。
溶媒の蒸発は、前述のように、集積処理中に行わないことが好ましい。
【００４１】
具体的な製造方法としては、基板（Q）に形成した穴又は溝に、微粒子のスラリーを充填し、基板（Q）の表面に対して垂直に遠心力を加えて穴又は溝に微粒子を集積する方法である。
微粒子をそのまま使用するのではなく、溶媒に分散したスラリーとして使用するのは、粒子に機動性を持たせるためである。溶媒がない場合又は溶媒が蒸発してなくなった場合、粒子間や粒子と基板間において直ちに固着が起こり、粒子の機動性が無くなるため、均一性の高いフォトニック結晶（B)を作製することができない。
【００４２】
ここで溶媒とは、微粒子を溶解せず、分散させることができるものであれば発明の構成上特に限定されず、水やアルコール、アセトンやトルエンなどの有機溶剤等を使用することができる。クリーンプロセス等の観点から、溶媒として水、低級アルコール又はこれらの混合溶媒を使用することが好ましい。
粒子のブラウン運動は規則的な集積を促進するため、遠心力の強度を定期的に増減させる、温度を高くする、何らかの振動を与える等に粒子に更に機動性を付与する方法は、均一性の高いフォトニック結晶（B)を作製する方法として有効である。
基板（Q）の表面に対して垂直に遠心力を加えるとは、微粒子が  基板（Q）の表面、穴や溝が形成された基板であれば、穴や溝の底部に対して垂直な力によって集積されることを意味する。具体的な方法としては、遠心力の増加に伴って基板（Q）を設置した遠心管の角度が変化する、所謂、スイングローター型の遠心機を使用する方法（図4）や遠心力が強い場合であって、遠心力がかかる方向に対して垂直に基板（Q）を設置することができる遠心機を使用する方法等が挙げられる。後者の方法において、遠心力が強い場合とは大凡500Ｇ以上の遠心力を加える場合を意味する。遠心力が大きくなると重力の影響が無視できるからである。
【００４３】
これらの方法に使用できる遠心機としては、市販されている多くの遠心機を使用することができる。例えば、冷却高速遠心機H2600、H923，H2000B、小型卓上遠心機H11NA、H19FMR（コクサン社製）、高速冷却遠心機GRX250、SRX201（トミー精工社製）などを使用することができる。使用できるローター（遠心管）としては、前者の方法の場合は、RF109Ｌ、RF127（H19FMR用）やSH1（H2600用）などが使用でき、後者の方法の場合は、DWH1（H2600用）などが使用できる。
【００４４】
遠心力を基板（Q）の表面に対して垂直ではなく平行にかける方法によってもフォトニック結晶（B)を作製することができる。
この方法は、基板（Q）に形成した溝に必要により上部カバーを設置し、遠心場の外側に位置する溝の片端又はその片端直上の上部カバーに液量調整部を設け、溝に微粒子のスラリーを充填した後、基板（Q）の表面に対して平行の方向に遠心力を加えて、必要により液量調整部を調整しながら、溝に微粒子を集積する方法である。この方法に使用する装置の概念図を図5に示す。
【００４５】
上部カバーとは、微粒子のスラリーの排出を防止する目的で基板（Q）に形成した溝又は基板（Q）全面の上部に設置されるカバーであり、排出のおそれがある場合には設置することが好ましい。
遠心場の外側に位置する溝の片端又はその片端直上の上部カバーに設置した液量調整部とは、溶媒のみを排出し微粒子を透過させないフィルターや弁等であって、溶媒の排出速度を任意に調整できることが好ましい。微粒子が集積された後において、閉じていた弁を開き溶媒を排出してもよいし、フィルターや適当に開いた弁を使用して微粒子の集積過程において溶媒を排出してもよい。但し、フォトニック結晶の均一性向上等の観点から、微粒子の集積が完了するまで、溶媒を完全に排出しないことが好ましい。
溝に微粒子のスラリーを充填した後、基板（Q）の表面に対して平行の方向に遠心力を加えるとは、基板に形成した遠心場の外側に位置する溝の片端断面に対して垂直に遠心力をかけることを意味する。従って、微粒子は遠心場外側に位置する溝の片端より順に集積されることになる。
【００４６】
前述の方法において、基板（Q）の表面に対して平行の方向に遠心力を加えた状態で、微粒子のスラリーを遠心場の内側の片端から充填することによりフォトニック結晶（B）を製造することもできる。この方法によれば生産効率が更に高くなり、連続的な製造方法として極めて有効である。
この方法に使用する装置の概念図を図6に示す。遠心中心に微粒子のスラリーを滴下し一時的に溜めておくための凹部（WP）があり、その周囲に基板（Q）を設置する。基板装着部（QS）は凹部の壁が除去されており、基板（Q）に形成された溝の底部とWPの底部が同じ高さとなるように設計及び設置することが好ましい。本発明の構成上、基板装着部（QS）の数に制限はなく、多数も受けることにより、更に生産性が向上する。
上部カバーを設置する場合には、遠心中心に微粒子スラリーの供給部（WI）を設けておき、ここから遠心中心にスラリーを滴下することができる。
【００４７】
遠心力を基板（Q）の表面に対して平行にかける方法に使用できる遠心機としては、市販されているスピンコーター等を使用することができる。例えば、1Hシリーズ（ミカサ社製）、ACTシリーズ、ASSシリーズ（アクティブ社製）、K359シリーズ（共和理研社製）等が挙げられる。
スピンコーターの回転数としては、回転半径等によって好ましい回転数が異なるが、前述の強さの遠心力が加わるように調整することが好ましい。
【００４８】
毛細管力を使用した集積方法としては、細い管の中の溶媒が管の中を上昇する現象（毛細管現象）を集積ドライビングフォースとして真球状粒子を集積する方法である。
溶媒が上昇する高さは、溶媒の表面張力、管の濡れ易さ、溶媒の密度等によって決まり、次式により計算することができる。
h= 2Tcosθ/pgr
ここでTは表面張力(N/m)、θは接触角、pは溶媒の密度(kg/m3)、gは重力加速度(m/s2)
、rは管の半径(m)である。
溶媒中に分散されている微粒子は溶媒の上昇により一緒に上昇し、管の上から順に集積されていく。微粒子の集積は、溶媒が蒸発することにより発生する液架橋力によって最終的に行われるが、通常の液架橋力とは異なり力がほぼ垂直方向のみに働く。溶媒の蒸発が管の上から順に起こるため、通常の液架橋力のように四方八方に力が働くものではない。この点で液架橋力とは区別され、非常に集積条件を制御しやすく、均一性の高いフォトニック結晶（B)を作製することが可能な方法である。
【００４９】
この方法に使用できる基板（Q）としては、溝を形成した基板であって、溝の両端が切り出されているものに凹凸のない基板を設置したものや、2枚の基板の間に微小な空間を有するものなどを使用することができる。
具体的な方法としては、これらの基板を微粒子のスラリーに片端を浸漬するだけであるが、浸漬していない上部の片端から吸引する方法など生産効率の向上等を目的とした改良方法もある。また、基板表面の親疎水性を調整する等集積の条件を最適化することにより、更に均一性の高いフォトニック結晶（B)を作製することができる。
【００５０】
微粒子を使用し、重力や遠心力、毛細管力、液架橋力等により集積する方法としては、前述のように、公知の方法を使用することができるが、生産性を更に高め、かつ、バイオセンサーチップに適した欠陥のないフォトニック結晶（B)を作製する等の観点から、集積ドライビングフォースとして、遠心力、毛細管力を使用することが好ましい。
【００５１】
これらの方法により作成されたフォトニック結晶（B）は、テンプレート基板（Q）に充填された状態でバイオセンサーチップに使用することが好ましい。従って、基板（Q）は励起光を透過する樹脂製やガラス製などであることが好ましい。
また、フォトニック結晶（B）の形状としては、固定部（A）又は分析セルを被覆する観点等から、平板状又はフィルム状であることが好ましい。
【００５２】
[実施例]
次に本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明の主旨を逸脱しない限り本発明は実施例に限定されるものではない。なお、特記しない限り部は重量部、％は重量％を意味する。
【００５３】
＜基板（Q）の作製＞
外観；図2参照
穴の形状；逆ピラミッド型
穴のサイズ；一辺；10μmの正方形（断面）、深さ；12μm、ピラミッドの角度；54°
基板（Q）の大きさ；一辺1cmの正方形
作製方法；
一辺1cmのシリコン基板（基板（Q））を1000℃で1.5時間、大気中で加熱することにより酸化膜を形成した後、ピラニア液（硫酸と30%過酸化水素水を体積比1：9で混合したもの）にて洗浄して有機物を完全に除去した。
【００５４】
乾燥後、スピンコーターによりレジストを塗布し、約400nmの膜厚のレジスト膜をシリコン基板上に形成した（180℃で3分間プリベーク）。レジストはαメチルスチレン-αクロロアクリレート共重合体（ZEP520（ポジ型レジスト）、日本ゼオン社製）を使用した。
このレジスト膜に電子線描画装置にて上記の穴のサイズ等に対応するようにパターンを描画した後、現像液（ZEP-RD、日本ゼオン社製）に浸漬してマスクパターンを作製した。
BHF（フッ化アンモニウムとフッ酸を体積比1：9で混合したもの）に数分間浸漬して酸化膜のみを取り除いた後、水酸化カリウム（30％）とイソプロピルアルコール（12％）からなる水溶液に1時間浸漬して、異方性エッチングを行った。最後に、酸化膜をBHFにて取り除いて、ナノインプリント基板用の鋳型基板を作製した。
この鋳型基板を使用して、ニッケル製のナノインプリント基板を得た。厚みが20μmのポリスチレン薄膜をスピンコートにより作製し、インプリント基板により逆ピラミッド型の穴を一面に形成した後、1cm角に切断し、基板（Q）を得た。基板（Q）の端には、約8μmの高さの壁面が形成された。
【００５５】
＜実施例1＞    
基板（Q）に、平均粒子径270nm、Cv値1.8%の微粒子のスラリー（モリテックス社製3269A）0.1gを滴下し、遠心機（H30R、コクサン社製）を使って、4000Gにて10分間、基板（Q）の表面に対して垂直に遠心力を加えて微粒子を集積した。遠心機には、基板（Q）の表面に対して垂直に遠心力が加わるように、スイングローター（RF121）に図7に示す遠心管を設置した。遠心集積後、基板（Q）を遠心管から取り外し、余分なスラリーを除去し、フォトニック結晶（B-1）を得た。フォトニック結晶（B-1）の外観は、基板（Q）に充填されたフィルム状であり、立方最密充填構造からなる単一結晶構造が基板（Q）全体に形成されていた。
【００５６】
同じフォトニック結晶（B-1）フィルムを2個作製し、一方の背面にスピンコートにより、更に厚み1μmのカルボキシル基含有ポリメチルメタクリレート薄膜を形成し、ナノインプリントにより、流路径が500μmで、1μmの直径を有する円形ピラーが2μm間隔で形成されたマイクロ流路を作製した。このマイクロ流路を有する薄膜相が平板状のセルとなる。
平板状セルを挟み込むように他方のフォトニック結晶フィルムを設置し、80℃で10秒間熱処理することにより熱接着した。
マイクロ流路内に、0.2重量%の1-エチル-3ジメチルアミノプロピルカルボジイミド水溶液1μlを加え、室温で1時間反応させる。未反応の1-エチル-3ジメチルアミノプロピルカルボジイミドをリン酸緩衝液にて十分に洗浄除去した後、0.2重量%のAFP抗体を含有するリン酸緩衝液1μlを加えて室温で2時間反応させることによりカルボジイミドを介してAFP抗体をマイクロ流路の壁面及びビラーの表面に固定化した。未反応のAFP抗体をリン酸緩衝液にて十分に洗浄除去した後、マイクロ流路内にリン酸緩衝液を満たし、バイオセンサーチップ-1とした。バイオセンサーチップ-1の外観は、図-1のようである。AFP抗体（特定結合物質（X））の固定部（A）は、マイクロ流路全体であり、2個のフォトニック結晶フィルムにより、上下方向で完全に被覆されている。
【００５７】
＜実施例2＞
2個のフォトニック結晶（B-1）フィルムの1個のフォトニック結晶フィルムを鏡面処理したシリコン基板に変更した以外は、同様の方法により、バイオセンサーチップ-2を作製した。
【００５８】
＜実施例3＞
ボランティア3名（ｂ1、ｂ2、ｂ3）から採集した血液をそれぞれ遠心分離機にて10000rpmで15分間遠心処理して上澄みの血漿を採取し、これをサンプル（b1）、サンプル（b2）、サンプル（b3）とした。
サンプル（b1〜3）100μlに、AFP抗体濃度を20.0pg/mlに調整したリン酸緩衝液（AFP抗原リン酸緩衝液）100μlを添加混合して試験サンプル（AFPb1）、（AFPb2）、（AFPb3）を作製した。
【００５９】
バイオセンサーチップ-1を使用して以下の分析操作を行った。
試験サンプル（AFPb1）0.5μLをマイクロ流路に注入した後、リン酸緩衝液1μLを注入して洗浄した。次に、ローダミンBイソチオシアネートを固定化した標識抗体溶液を注入して、標識化を行った。
フォトニック結晶フィルムの面より、YAGレーザーを照射して、ローダミンBイソチオシアネートを励起し、蛍光シグナルを光電子増倍管（R2228、浜松ホトニクス社製）にて測定した。
測定値は、いずれの試験サンプルにおいても、15000〜15500カウント/秒（ｎ＝3で測定）であった。
AFP抗原リン酸緩衝液の濃度を減少させて、前述と同様の条件にて、検出下限濃度（pg/ml）を決定した。検出下限濃度は、蛍光シグナルが測定不可能になる濃度であり、ブランクシグナル（標識抗体溶液のみを注入した場合）と一致する濃度とした。
その結果、バイオセンサーチップ-1の検出下限濃度（pg/ml）は0.0005（0.5fg/ｍL ）であった。
【００６０】
＜実施例4＞
バイオセンサーチップ-2を使用して、実施例3と同様に検出下限濃度（pg/ml）を決定した。その結果、バイオセンサーチップ-1の検出下限濃度（pg/ml）は0.0003（0.3fg/ｍL ）であった。
【００６１】
＜比較例1＞
バイオセンサーチップ-1のフォトニック結晶フィルムを1個だけ使用しない以外は、実施例1と同様にして、バイオセンサーチップを作製した。実施例3と同様に検出下限濃度（pg/ml）を決定した。その結果、このバイオセンサーチップの検出下限濃度（pg/ml）は10であった。
フォトニック結晶フィルムが1個存在せず、反射増幅機能が発揮できない通常のマイクロ流路型のバイオセンサーチップは、検出下限濃度（pg/ml）が10であった。一方、2個のフォトニック結晶により固定部（A）を挟み込んだサンドイッチ構造のバイオセンサーチップ-1は、極めて検出感度が高く、検出下限濃度（pg/ml）は0.0005（0.5fg/ｍL ）であった。従って、フォトニック結晶による反射増幅効果が十分に機能していることが照明された。また、1個のフォトニック結晶フィルムの代わりに、シリコン製の反射板を用いたバイオセンサーチップ-2も同様の効果が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明のバイオセンサーチップは、極めて検出感度が高く、様々な用途に使用することができる。特に、蛋白質解析、遺伝子解析等の研究用途や、腫瘍検査、ウイルス検査等の臨床検査用途に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】バイオセンサーチップの外観。マイクロ流路（D）を有する平板状セル（C）を2個の平板状フォトニック結晶（B）にて挟み込んだサンドイッチ構造
【図２】穴が形成された基板（逆ピラミッド型基板）
【図３】溝が形成された基板（V字溝）
【図４】スイングローター用遠心管
【図５】概念図
【図６】概念図
【符号の説明】
【００６４】
ＰＣ：フォトニック結晶
ＡＣ：分析セル
Ｑ：基板（テンプレート）
Ｃ：上部カバー
ＳＱ：スピンコーター基板
ＤＩ：溝部
ＰＩＮ：固定用ビス
ＶＡ：液量調整部（調整弁）
ＱＳ：基板装着部
ＷＩ：粒子スラリー供給部
ＷＰ：粒子スラリー溜
ＣＷ：溶媒蒸発防止カバー
ＯＲ：オーリング
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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