(57)【要約】【課題】タンパク質間相互作用の効率的な制御を可能とする手段および方法の提供【解決手段】標的タンパク質の機能を調節し得る分子および自己凝集分子が融合してなり、かつ標的タンパク質の機能の調節能および自己凝集能を併有する、自己凝集型調節分子：該自己凝集型調節分子が凝集してなる複合体：標的タンパク質の機能を調節し得る分子および自己凝集分子が融合してなり、かつ標的タンパク質の機能の調節能および自己凝集能を併有する自己凝集型調節ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター：自己凝集型調節分子が凝集してなる複合体を標的タンパク質に接触させることを含む、タンパク質間相互作用の制御方法など【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的タンパク質の機能を調節し得る分子および自己凝集分子が融合してなり、かつ標的タンパク質の機能の調節能および自己凝集能を併有する、自己凝集型調節分子。
【請求項２】
標的タンパク質に対するアゴニスト作用またはアンタゴニスト作用を有する、請求項１記載の分子。
【請求項３】
標的タンパク質の機能を調節し得る分子および自己凝集分子がリンカーを介して連結している、請求項１または２記載の分子。
【請求項４】
標的タンパク質の機能を調節し得る分子および自己凝集分子がそれぞれペプチドまたは非ペプチド性有機低分子のいずれかである、請求項１〜３のいずれか１項記載の分子。
【請求項５】
標的タンパク質の機能を調節し得る分子が、該標的タンパク質と相互作用するタンパク質の部分ペプチド、該標的タンパク質に対する抗体の可変領域の部分ペプチド、あるいはそれらの誘導体である、請求項１〜３のいずれか１項記載の分子。
【請求項６】
自己凝集分子が錯体を形成可能な有機低分子である、請求項１〜３のいずれか１項記載の分子。
【請求項７】
自己凝集分子がコイルドコイル形成ペプチドである、請求項１〜３のいずれか１項記載の分子。
【請求項８】
標的タンパク質の機能を調節し得る分子および自己凝集分子が融合してなり、かつ標的タンパク質の機能の調節能および自己凝集能を併有する自己凝集型調節分子が凝集してなる、複合体。
【請求項９】
標的タンパク質の機能を調節し得る分子および自己凝集分子が融合してなり、かつ標的タンパク質の機能の調節能および自己凝集能を併有する自己凝集型調節ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項１１】
以下（ａ）〜（ｃ）のいずれかを含む、タンパク質間相互作用制御剤：
（ａ）標的タンパク質の機能を調節し得る分子および自己凝集分子が融合してなり、かつ標的タンパク質の機能の調節能および自己凝集能を併有する、自己凝集型調節分子；
（ｂ）該（ａ）の分子が凝集してなる複合体；
（ｃ）標的タンパク質の機能を調節し得る分子および自己凝集分子が融合してなり、かつ標的タンパク質の機能の調節能および自己凝集能を併有する自己凝集型調節ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項１２】
医薬品または試薬である、請求項１１記載の剤。
【請求項１３】
タンパク質間相互作用の制御方法であって、
自己凝集型調節分子が凝集してなる複合体を標的タンパク質に接触させることを含み、
該自己凝集型調節分子が、該標的タンパク質の機能を調節し得る分子および自己凝集分子が融合してなり、かつ該標的タンパク質の機能の調節能および自己凝集能を併有する分子である、方法。
【請求項１４】
自己凝集型調節分子の設計方法であって、
標的タンパク質の機能の調節能および自己凝集能を併有するように調製された、標的タンパク質の機能を調節し得る分子および自己凝集分子が融合してなる自己凝集型調節分子について活性を検討することを含む、方法。
【請求項１５】
自己凝集型調節分子の活性の検討が、塩の有無および濃度、ｐＨ変化、温度変化、金属イオンの有無および濃度からなる群より選ばれる１以上の条件の変更下で行われる、請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己凝集型調節分子、それが凝集してなる複合体、およびそれらの製造方法、ならびに該物質または複合体を含むタンパク質間相互作用制御剤などを提供する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質間相互作用を標的とする医薬品開発は、疾患との関連が明らとなっているタンパク質が多数あるにもかかわらず成功例が少ない。一般的にタンパク質間相互作用面は広く平坦であることから、有機低分子でその相互作用を制御することは困難であると考えられている。
【０００３】
しかしながら、タンパク質間相互作用面にはホットスポットと呼ばれる結合に重要な局所的領域が存在し、そのホットスポットに強く結合する有機低分子は、いまだ十分ではないが、タンパク質相互作用自体をも制御可能だという事例が報告されている（非特許文献１）。
【０００４】
通常、タンパク質間相互作用を制御する方法として、抗体、生物製剤などの高分子が広く利用されている。抗体医薬では、乳癌を対象としたハーセプチン（一般名：トラスツズマブ）、生物製剤では、糖尿病を対象としたインスリンなどがその代表として挙げることができる。抗体、生物製剤の有効性は立証されてはいるが、標的として狙えるタンパク質の制限、経口投与が不可能であること、製造コストなど、多くの問題点を抱えていることも事実である。
【０００５】
したがって、有機低分子によるタンパク質間相互作用の制御は、抗体及び生物製剤の抱える問題点を一掃でき、さらには、これまで標的として狙うことの不可能であった多くの疾患関連タンパク質を標的として狙うことが可能となることから、多くの製薬企業がその方法論の出現を切望している。しかしながら、有機低分子をホットスポットに強く結合させるだけでは、タンパク質間相互作用の制御に十分ではないという問題がある。また、抗体及び生物製剤(高分子化合物)のようにタンパク質間相互作用面に広く強く結合することも、有機低分子では事実上不可能であり、十分な薬効が得にくいという問題がある。
【非特許文献１】Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. (2004) Nat. Rev. Drug Discov. 3, 301-317
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明は、上記の問題が解消されたタンパク質間相互作用制御方法、およびそれに必要な手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記問題点を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、自己凝集作用を有する分子（自己凝集分子）と、標的タンパク質のホットスポットに結合する分子（調節分子）とを結合させることにより、ある条件化で自律的に形成される自己凝集型調節分子を用いることで、タンパク質間相互作用を制御できることを見出した。このような自己凝集型調節分子は、その調節分子領域において標的タンパク質のホットスポットに結合し、かつその自己凝集作用領域において自律的に凝集することから、結果として、標的タンパク質と自己凝集型調節分子からなる巨大な複合体分子を形成することにより、タンパク質間相互作用を効率的に制御し得る。本発明者らはまた、自己凝集型調節分子と標的タンパク質分子との巨大な複合体の形成に伴う幾何学的立体障害に起因する、標的タンパク質へのタンパク質（リガンドタンパク質、パートナー分子など）の結合に対する阻害効果が自己凝集型調節分子により生ずることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、下記の通りである：
〔１〕標的タンパク質の機能を調節し得る分子および自己凝集分子が融合してなり、かつ標的タンパク質の機能の調節能および自己凝集能を併有する、自己凝集型調節分子；
〔２〕標的タンパク質に対するアゴニスト作用またはアンタゴニスト作用を有する、上記〔１〕の分子；
〔３〕標的タンパク質の機能を調節し得る分子および自己凝集分子がリンカーを介して連結している、上記〔１〕または〔２〕の分子；
〔４〕標的タンパク質の機能を調節し得る分子および自己凝集分子がそれぞれペプチドまたは非ペプチド性有機低分子のいずれかである、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかの分子。
〔５〕標的タンパク質の機能を調節し得る分子が、該標的タンパク質と相互作用するタンパク質の部分ペプチド、該標的タンパク質に対する抗体の可変領域の部分ペプチド、あるいはそれらの誘導体である、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかの分子。
〔６〕自己凝集分子が錯体を形成可能な有機低分子である、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかの分子。
〔７〕自己凝集分子がコイルドコイル形成ペプチドである、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかの分子。
〔８〕標的タンパク質の機能を調節し得る分子および自己凝集分子が融合してなり、かつ標的タンパク質の機能の調節能および自己凝集能を併有する自己凝集型調節分子が凝集してなる、複合体。
〔９〕標的タンパク質の機能を調節し得る分子および自己凝集分子が融合してなり、かつ標的タンパク質の機能の調節能および自己凝集能を併有する自己凝集型調節ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
〔１０〕上記〔９〕のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
〔１１〕以下（ａ）〜（ｃ）のいずれかを含む、タンパク質間相互作用制御剤：
（ａ）標的タンパク質の機能を調節し得る分子および自己凝集分子が融合してなり、かつ標的タンパク質の機能の調節能および自己凝集能を併有する、自己凝集型調節分子；
（ｂ）該（ａ）の分子が凝集してなる複合体；
（ｃ）標的タンパク質の機能を調節し得る分子および自己凝集分子が融合してなり、かつ標的タンパク質の機能の調節能および自己凝集能を併有する自己凝集型調節ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
〔１２〕医薬品または試薬である、上記〔１１〕の剤。
〔１３〕タンパク質間相互作用の制御方法であって、
自己凝集型調節分子が凝集してなる複合体を標的タンパク質に接触させることを含み、
該自己凝集型調節分子が、該標的タンパク質の機能を調節し得る分子および自己凝集分子が融合してなり、かつ該標的タンパク質の機能の調節能および自己凝集能を併有する分子である、方法。
〔１４〕自己凝集型調節分子の設計方法であって、
標的タンパク質の機能の調節能および自己凝集能を併有するように調製された、標的タンパク質の機能を調節し得る分子および自己凝集分子が融合してなる自己凝集型調節分子について活性を検討することを含む、方法。
〔１５〕自己凝集型調節分子の活性の検討が、塩の有無および濃度、ｐＨ変化、温度変化、金属イオンの有無および濃度からなる群より選ばれる１以上の条件の変更下で行われる、上記〔１４〕の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の分子は、複合体を形成することにより、標的タンパク質の機能を調節し得る。従って、本発明の分子は、標的タンパク質の機能の調節が所望される疾患、例えば癌、自己免疫疾患の治療などに有用である。本発明はまた、このような有用性を有する複合体、発現ベクター、ならびに本発明の分子および／または複合体を用いるタンパク質間相互作用の制御方法、自己凝集型調節分子の設計方法などを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、自己凝集型調節分子を提供する。
【００１１】
本発明における「自己凝集型調節分子」とは、ある条件化で自律的に形成された該分子の複合体を通じて標的タンパク質と直接的に相互作用し、その標的タンパク質の機能を調節し得る物質をいう。従って、本発明の分子は、標的タンパク質の機能を調節し得る分子と自己凝集分子との融合物を含み得る。
【００１２】
「標的タンパク質の機能を調節し得る分子」における「標的タンパク質」としては、例えば、レセプター（例、細胞膜上レセプター、核内レセプター）、分泌タンパク質、チャネル、転写因子、トランスポーター、酵素（例、プロテアーゼ、キナーゼ、トランスフェラーゼ）、制御因子（例、トランスデューサー、レギュレーター、アダプター、シャトル）を含む任意のタンパク質が挙げられるが、なかでも上記タンパク質のうちタンパク質間相互作用を示すタンパク質が好ましい。詳細には、本発明の適用が所望され得る標的タンパク質としては、ＩＡＰファミリー（例、ＸＩＡＰ、ＭＬ−ＩＡＰ、サバイビン(Survivin)）、Ｂｃｌ−２ファミリー（例、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂａｘ、Ｂａｄ、Ｂａｋ）、Ｆａｓ、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＩＬＲ、ＮＦｋＢ、ＡＢＣトランスポーター、カスパーゼ（例、カスパーゼ１−１４）、プロテアソーム、セクレターゼβ、セクレターゼγ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＧＳＫ−３β、カルニシューリン、Ｒａｓ、Ｒａｆが挙げられる。
【００１３】
「標的タンパク質の機能を調節し得る分子」は、上記の標的タンパク質との直接的な相互作用によりその機能を調節し得るものである限り特に限定されないが、例えば、ペプチドおよびタンパク質（天然、非天然ペプチドおよびタンパク質を含む）、非ペプチド有機低分子、核酸分子（オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含む）、糖鎖、脂質、糖ペプチド、核酸ペプチド、脂質ペプチド及びそれらの複合体分子が挙げられる。
【００１４】
標的タンパク質の機能を調節し得る分子としてペプチドを用いる場合、例えば、該標的タンパク質と相互作用するタンパク質の部分ペプチド、該標的タンパク質に対する抗体の可変領域の部分ペプチド、または該部分ペプチドのアミノ酸をＤ体アミノ酸、非天然アミノ酸に置換した変異ペプチド、あるいはそれらの誘導体を使用できる。
【００１５】
詳細には、標的タンパク質の機能を調節し得る分子として、ＡＸＰＸ［ここでＸは任意のアミノ酸を示す］（配列番号１）を使用できる（例えば、Oost, T. K., et al, Discovery of potent antagonists of the antiapoptotic protein XIAP for the treatment of cancer. (2004) J. Med. Chem. 47, 4417-4426参照）。ＡＸＰＸとしては、例えば、ＡＴＰＦ（配列番号２）、ＡＶＰＩ（配列番号３）、ＡＶＰＦ（配列番号５）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１６】
また、標的タンパク質の機能を調節し得る分子として、式（Ｉ）：
Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−Ｐ４  （Ｉ）
［式中、Ｐ１は非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ２は非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ３は非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ４はＣ末端が任意のアミノ酸を示す。］で表されるペプチドを使用することもできる。
【００１７】
一般式（Ｉ）中、Ｐ１で示される「非塩基性側鎖を有するアミノ酸」としては、酸性側鎖を有するアミノ酸、中性側鎖を有するアミノ酸が挙げられる。Ｐ１における酸性側鎖を有するアミノ酸としてはグルタミン酸が好ましい。一方、Ｐ１における中性側鎖を有するアミノ酸としては、極性側鎖を有するアミノ酸、非極性側鎖を有するアミノ酸が挙げられる。Ｐ１における極性側鎖を有するアミノ酸としては、セリンが好ましい。また、Ｐ１における非極性側鎖を有するアミノ酸としてはトリプトファンが好ましい。最も好ましくは、Ｐ１で示される非塩基性側鎖を有するアミノ酸はトリプトファンである。
【００１８】
一般式（Ｉ）中、Ｐ２で示される「非塩基性側鎖を有するアミノ酸」としては、酸性側鎖を有するアミノ酸、中性側鎖を有するアミノ酸が挙げられる。Ｐ２における酸性側鎖を有するアミノ酸としてはグルタミン酸が好ましい。一方、Ｐ２における中性側鎖を有するアミノ酸としては、極性側鎖を有するアミノ酸が好ましく、なかでもグリシンがより好ましい。最も好ましくは、Ｐ２で示される非塩基性側鎖を有するアミノ酸はグルタミン酸である。
【００１９】
一般式（Ｉ）中、Ｐ３で示される「非塩基性側鎖を有するアミノ酸」としては、酸性側鎖を有するアミノ酸、中性側鎖を有するアミノ酸が挙げられる。Ｐ３における酸性側鎖を有するアミノ酸としてはアスパラギン酸が好ましい。一方、Ｐ３における中性側鎖を有するアミノ酸としては、非極性側鎖を有するアミノ酸が好ましく、なかでもトリプトファンがより好ましい。最も好ましくは、Ｐ３で示される非塩基性側鎖を有するアミノ酸はアスパラギン酸又はトリプトファンである。
【００２０】
一般式（Ｉ）中、Ｐ４で示される「任意のアミノ酸」としては、塩基性側鎖を有するアミノ酸、中性側鎖を有するアミノ酸、酸性側鎖を有するアミノ酸が挙げられるが、例えば、塩基性側鎖を有するアミノ酸、中性側鎖を有するアミノ酸であり得る。Ｐ４における塩基性側鎖を有するアミノ酸としてはヒスチジンが好ましい。一方、Ｐ４における中性側鎖を有するアミノ酸としては、極性側鎖を有するアミノ酸が好ましく、なかでも、グルタミン、アスパラギン、スレオニンが好ましい。最も好ましくは、Ｐ４で示される任意のアミノ酸はアスパラギン又はスレオニンである。
【００２１】
別の局面では、本発明のペプチドは、上記式（Ｉ）においてＰ１がＷを、Ｐ２がＥを、Ｐ３がＤを、Ｐ４がＴを示すＷＥＤＴ（配列番号１２）、又はそのアミノ酸置換により得られる変異体であり得る。アミノ酸置換を施したペプチドは、上記４つのアミノ酸からなるペプチドにおいて１〜４個のアミノ酸を置換したペプチドであり得るが、３個以下のアミノ酸を置換したペプチドが好ましく、２個以下のアミノ酸を置換したペプチドがより好ましい。最も好ましくは、１個のアミノ酸を置換したペプチドである。
【００２２】
本発明におけるアミノ酸の置換としては、特定のアミノ酸が他の任意のアミノ酸で置換される限り特に限定されず、保存的アミノ酸置換、非保存的アミノ酸置換が挙げられる。
【００２３】
「保存的アミノ酸置換」とは、特定のアミノ酸を、そのアミノ酸の側鎖と同様の性質の側鎖を有するアミノ酸で置換することをいう。詳細には、保存的アミノ酸置換では、特定のアミノ酸は、そのアミノ酸と同じグループに属する他のアミノ酸により置換される。一方、「非保存的アミノ酸置換」とは、特定のアミノ酸を、そのアミノ酸の側鎖と異なる性質の側鎖を有するアミノ酸で置換することをいう。詳細には、非保存的アミノ酸置換では、特定のアミノ酸は、そのアミノ酸と異なるグループに属する他のアミノ酸により置換される。同様の性質の側鎖を有するアミノ酸のグループは、当該分野で公知である。例えば、このようなアミノ酸のグループとしては、塩基性（即ち、正に荷電している）側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性（即ち、負に荷電している）側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、中性（即ち、荷電していない）側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）が挙げられる。また、中性側鎖を有するアミノ酸は、さらに、極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、及び非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）に分類することもできる。また、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸の他のグループとして、例えば、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン）、水酸基（アルコール性水酸基、フェノール性水酸基）を含む側鎖を有するアミノ酸（例えば、セリン、トレオニン、チロシン）なども挙げることができる。
【００２４】
ＷＥＤＴの１箇所のアミノ酸を置換したペプチドは、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４の各該当部位のアミノ酸の置換により分類することができる。
【００２５】
ＷＥＤＴのＰ１部位（即ち、Ｗ）を置換したペプチドとしては、ＳＥＤＴ（配列番号１３）、ＥＥＤＴ（配列番号１４）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられるが、ＳＥＤＴ（配列番号１３）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。
【００２６】
ＷＥＤＴのＰ２部位（即ち、Ｅ）を置換したペプチドとしては、ＷＧＤＴ（配列番号１５）、ＷＰＤＴ（配列番号１６）、ＷＴＤＴ（配列番号１７）、ＷＮＤＴ（配列番号１８）、ＷＣＤＴ（配列番号１９）、ＷＬＤＴ（配列番号２０）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられるが、ＷＧＤＴ（配列番号１５）、ＷＰＤＴ（配列番号１６）、ＷＴＤＴ（配列番号１７）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが好ましく、ＷＧＤＴ（配列番号１５）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドがより好ましい。
【００２７】
ＷＥＤＴのＰ３部位（即ち、Ｄ）を置換したペプチドとしては、ＷＥＷＴ（配列番号２１）、ＷＥＧＴ（配列番号２２）、ＷＥＴＴ（配列番号２３）、ＷＥＩＴ（配列番号２４）、ＷＥＦＴ（配列番号２５）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられるが、ＷＥＷＴ（配列番号２１）、ＷＥＧＴ（配列番号２２）、ＷＥＴＴ（配列番号２３）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが好ましく、ＷＥＷＴ（配列番号２１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドがより好ましい。
【００２８】
ＷＥＤＴのＰ４部位（即ち、Ｔ）を置換したペプチドとしては、ＷＥＤＮ（配列番号２６）、ＷＥＤＱ（配列番号２７）、ＷＥＤＨ（配列番号２８）、ＷＥＤＦ（配列番号２９）、ＷＥＤＭ（配列番号３０）、ＷＥＤＣ（配列番号３１）、ＷＥＤＲ（配列番号３２）、ＷＥＤＷ（配列番号３３）、ＷＥＤＶ（配列番号３４）、ＷＥＤＥ（配列番号３５）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられるが、ＷＥＤＮ（配列番号２６）、ＷＥＤＱ（配列番号２７）、ＷＥＤＨ（配列番号２８）、ＷＥＤＦ（配列番号２９）、ＷＥＤＭ（配列番号３０）、ＷＥＤＣ（配列番号３１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが好ましく、ＷＥＤＮ（配列番号２６）、ＷＥＤＱ（配列番号２７）、ＷＥＤＨ（配列番号２８）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドがより好ましく、ＷＥＤＮ（配列番号２６）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが最も好ましい。
【００２９】
標的タンパク質の機能を調節し得る分子として、上記（Ｉ）で表されるペプチドを使用する場合、詳細については、例えば、特開2005-213160号公報を参照のこと。
【００３０】
また、標的タンパク質の機能を調節し得る分子として、上述の通り非ペプチド有機低分子を用いることもできる。本明細書中で使用される場合、非ペプチド有機低分子とは、分子量１０００未満、好ましくは分子量５００未満程度の有機化合物であり、例えば、医薬品として通常使用し得る有機化合物、有機合成法等を駆使して製造される化合物、天然由来の化合物およびそれらの誘導体が挙げられる。
【００３１】
また、標的タンパク質の機能を調節し得る分子として、標的タンパク質の機能を阻害し得る分子、標的タンパク質の機能を調節し得るタンパク質の機能を模倣し得る分子（例、標的タンパク質を活性化する分子）を用いることができる。このような分子としては多くの分子が公知である。
【００３２】
「自己凝集分子」は、自身が複合体化してマルチマー（例、ダイマー、トリマー、テトラマー）を形成し得るものである限り特に限定されず、例えば、ペプチドおよびタンパク質（天然、非天然ペプチドおよびタンパク質を含む）、非ペプチド有機低分子、核酸分子（オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含む）、糖鎖、脂質、糖ペプチド、核酸ペプチド、脂質ペプチド及びそれらの複合体分子が挙げられる。
【００３３】
自己凝集分子としてペプチドを用いる場合、生体内で複合体を形成し得るタンパク質の相互作用領域、例えば、コイルドコイル（例、ロイシンジッパー、人工的に改変したコイルドコイル）を使用できる（例えば、J. Mol. Biol. 318: 901-910 (2002); Protein Science 8: 84-90 (1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102:12656-12661 (2005) 参照）。
【００３４】
詳細には、自己凝集分子としてペプチドを用いる場合、特にコイルドコイルにおいては、アミノ酸７残基がα-Helix２回転に対応し、７つの位置はa、b、c、d、e、f、gで表され、a、d 位置はヘリックス間の相互作用に重要な疎水性アミノ酸、e、g 位置はヘリックス間の相互作用に重要な塩橋結合という特徴が、自己凝集能の発揮に重要である（図１参照）。
【００３５】
また、自己凝集分子として非ペプチド有機低分子を用いる場合、錯体を形成可能な有機低分子（例、Ｚｎ２＋キレーター、Ｃａ２＋キレーター、Ｆｅ２＋キレーター）を使用できる（例えば、Sci. STKE. 223, PL7 (2004)参照）。
【００３６】
自己凝集分子としての、錯体を形成可能な有機低分子は、金属原子に配位し、錯体を形成することにより凝集するものであり得る。錯体の形成に用いられる金属原子は特に限定されず、例えば、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｆｅ、Ｃａ、Ｃｕ、Ｍｇが挙げられる。錯体を形成可能な有機低分子としては、例えば、下記錯体を形成可能なベンゼン−１，２−ジオールが挙げられる。
【００３７】
【化１】
2007097417.tif 000002
（Ｍｎ存在下でトリマーを形成する錯体分子。Ｒ部位に調節分子または調節分子＋リンカーを付加することにより、自己凝集型調節分子として機能し得る。）
【００３８】
また、錯体を形成可能な他の有機低分子としては、例えば、ビス(サリチラト)鉄(III)酸、ビス(1,10-フェナントロリン)銅(I)、ビス(エチルアセトアセタト)銅(II)、トリス（2,2’−ビピリジン）マンガン(II)を形成可能なものが挙げられる。
【００３９】
また、自己凝集分子として適切な分子を選択することにより、複合体化の程度を決定することもできる。例えば、コイルドコイルはその構造を適切に設定することでダイマーおよびトリマーを形成することが知られている（例えば、J. Mol. Biol. 318: 901-910 (2002) 参照）。錯体を形成可能な有機低分子および／または金属（価数）の適切な選択もまた、複合体化の程度の決定に役立ち得る。
【００４０】
標的タンパク質の機能を調節し得る分子と自己凝集分子とは、リンカーを介して、あるいは介さずに融合し得る。標的タンパク質の機能を調節し得る分子と自己凝集分子とがリンカーを介して融合している場合、リンカーは、適正なサイズである限り特に限定されず、例えば、ペプチド、非ペプチド性有機化合物、糖、ヌクレオチド、脂質が挙げられる。標的タンパク質の機能を調節し得る分子および自己凝集分子がペプチドである場合、リンカーとしてペプチドを使用することもまた好ましい。
【００４１】
本発明の分子が、標的タンパク質の機能を調節し得る分子および自己凝集分子のいずれか一方、または双方としてペプチド部分を含む場合、ペプチド部分のＮ末端、Ｃ末端のいずれで融合していてもよい。詳細には、標的タンパク質の機能を調節し得る分子がペプチドである場合、該分子はそのＮ末端側またはＣ末端側で自己凝集分子に融合してもよく、自己凝集分子がペプチドである場合、該分子はそのＮ末端側またはＣ末端側で標的タンパク質の機能を調節し得る分子に融合してもよい。
【００４２】
また、本発明の分子が、標的タンパク質の機能を調節し得る分子および自己凝集分子のいずれか一方、または双方としてペプチド部分を含む場合、融合に使用されていないそのＮ末端およびＣ末端のアミノ酸は未保護でも、保護されていてもよい。
【００４３】
Ｎ末端が未保護であるアミノ酸は、Ｎ末端が−ＮＨ２、又はＮＨ３＋であるアミノ酸であり得る。Ｎ末端が保護されたアミノ酸は、Ｎ末端が−ＮＨ２、又はＮＨ３＋以外であるアミノ酸であり得、例えば、−ＮＨＲ１、−ＮＨ２Ｒ１＋、−ＮＲ１Ｒ２、−ＮＨＲ１Ｒ２＋であるアミノ酸であり得る。Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ、アミノ酸又はペプチド化学の分野において常用されている保護基を意味する。詳細には、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ同一又は異なって、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、オキサリル基、スクシニル基、ピバロイル基、２−クロロアセチル基、２−ブロモアセチル基、２−ヨードアセチル基、２，２−ジクロロアセチル基、２，２，２−トリクロロアセチル基、２，２，２−トリフルオロアセチル基、フェニルアセチル基、フェノキシアセチル基、ベンゾイル基、４−クロロベンゾイル基、４−メトキシベンゾイル基、４−ニトロベンゾイル基、ナフチルカルボニル基、アダマンチルカルボニル基、フタロイル基、ピロリドンカルボニル基等のアシル基；メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ペンチルオキシカルボニル基、イソペンチルオキシカルボニル基、シクロヘキシルオキシカルボニル基、２−クロロエトキシカルボニル基、２−ヨードエトキシカルボニル基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、２，２，２−トリクロロ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンズヒドリルオキシカルボニル基、ビス−（４−メトキシフェニル）メトキシカルボニル基、フェナシルオキシカルボニル基、２−トリメチルシリルエトキシカルボニル基、２−トリフェニルシリルエトキシカルボニル基、フルオレニル−９−メトキシカルボニル基等のアルコキシカルボニル基；ビニルオキシカルボニル基、２−プロペニルオキシカルボニル基、２−クロロ−２−プロペニルオキシカルボニル基、３−メトキシカルボニル−２−プロペニルオキシカルボニル基、２−メチル−２−プロペニルオキシカルボニル基、２−ブテニルオキシカルボニル基、シンナミルオキシカルボニル基等のアルケニルオキシカルボニル基；ベンジルオキシカルボニル基、４−ブロモベンジルオキシカルボニル基、２−クロロベンジルオキシカルボニル基、３−クロロベンジルオキシカルボニル基、３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、４−メトキシベンジルオキシカルボニル基、２−ニトロベンジルオキシカルボニル基、４−ニトロベンジルオキシカルボニル基、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、３，４，５−トリメトキシベンジルオキシカルボニル基、フェネチルオキシカルボニル基等のアラルキルオキシカルボニル基；トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基等の低級アルキルシリル基；エチレンビス（ジメチルシリル）基、プロピレンビス（ジメチルシリル）基、エチレンビス（ジエチルシリル）基等のアルキレンビス（ジアルキルシリル）基；メチルチオカルボニル基、エチルチオカルボニル基、ブチルチオカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブチルチオカルボニル基等のアルキルチオカルボニル基；ベンジルチオカルボニル基等のアラルキルチオカルボニル基；ジシクロヘキシルホスホリル基、ジフェニルホスホリル基、ジベンジルホスホリル基、ジ−（４−ニトロベンジル）ホスホリル基、フェノキシフェニルホスホリル基等のホスホリル基；ジエチルホスフィニル基、ジフェニルホスフィニル基等のホスフィニル基；カルバモイル基、メチルカルバモイル基、エチルカルバモイル基、ジメチルカルバモイル基、ベンジルカルバモイル基、フェニルカルバモイル基、ピリジルカルバモイル基等のカルバモイル基であり得る。また、Ｒ１、Ｒ２としては、後述のＲ３、Ｒ４と同様のものを用いることもできる。
【００４４】
Ｃ末端が未保護であるアミノ酸は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、又はアルデヒド型（−ＣＨＯ）のいずれかに該当するアミノ酸であり得る。Ｃ末端が保護されたアミノ酸は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、又はアルデヒド型（−ＣＨＯ）のいずれかに該当しないアミノ酸であり得、例えば、アミド（−ＣＯＮＨＲ３、−ＣＯＮＲ３Ｒ４）、カルボキシ（−ＣＯＲ３）、エステル（−ＣＯＯＲ３）であり得る。Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ、アミノ酸又はペプチド化学の分野において常用されている保護基を意味する。詳細には、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ同一又は異なって、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基及び当該Ｃ１−６アルキル基のハロゲン化物（例えば、−ＣＨ２Ｆなど）；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基及び当該Ｃ３−８シクロアルキル基のハロゲン化物；例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基及び当該Ｃ６−１２アリール基のハロゲン化物；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基及び当該Ｃ７−１４アラルキル基のハロゲン化物；並びに経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。また、Ｒ３、Ｒ４としては、前述のＲ１、Ｒ２と同様のものを用いることもできる。
【００４５】
本発明の分子は、標的タンパク質の機能を調節し得る分子と自己凝集分子との融合物を含むことにより、標的タンパク質の機能の調節能および自己凝集能を併有し得る。例えば、本発明の分子は、複合体形成によって生じる、パートナー分子やリガンドに対する幾何学的立体障害によりアンタゴニスト作用を発揮し得る。本発明の分子はまた、複合体形成によってレセプター分子に対してシグナル伝達の惹起によりアゴニスト作用を発揮し得る。
【００４６】
本発明の分子は、自体公知の方法により作製できる。例えば、固相法、液相法等のペプチド合成法、あるいは有機化学的手法により合成できる。また、本発明の分子がポリペプチドである場合には、後述する本発明の発現ベクターを導入した形質転換体を用いることにより作製することもできる。本発明の分子が標的タンパク質の機能の調節能および自己凝集能を併有し得るか否かは、自体公知の方法により確認することができる。
【００４７】
本発明はまた、標的タンパク質の機能を調節し得る分子および自己凝集分子としてペプチドを有する自己凝集型調節ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【００４８】
発現ベクターとしては、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で本発明のポリペプチドを産生できるものであれば特に制限されないが、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターが挙げられる。発現ベクターを医薬として用いる場合、ヒト等の哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。
【００４９】
発現ベクターを医薬として使用する場合、動物細胞等の真核生物細胞を宿主細胞として利用可能な発現ベクターが用いられる。この場合、使用されるプロモーターは、投与対象である哺乳動物等の真核生物で機能し得るものであれば特に制限されず、例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター、並びにβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーターなどが挙げられる。発現ベクターは、選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含んでいてもよい。
【００５０】
本発明はさらに、本発明の分子が凝集してなる複合体を提供する。本発明の複合体は、同種または異種の自己凝集型調節分子が凝集したものであり得る。詳細には、本発明の複合体は、（ａ）標的タンパク質の機能を調節し得る分子および自己凝集分子としてそれぞれ同じ分子を有する自己凝集型調節分子が凝集してなる複合体、（ｂ）標的タンパク質の機能を調節し得る分子として異なる分子を有し、かつ自己凝集分子として同じ分子を有する自己凝集型調節分子が凝集してなる複合体、（ｃ）標的タンパク質の機能を調節し得る分子として同じ分子を有し、かつ自己凝集分子として異なる分子を有する自己凝集型調節分子が凝集してなる複合体、（ｄ）標的タンパク質の機能を調節し得る分子および自己凝集分子としてそれぞれ異なる分子を有する自己凝集型調節分子が凝集してなる複合体であり得る。また、本発明の複合体は、自己凝集分子として、錯体を形成可能な有機低分子を有する自己凝集型調節分子から構成される場合、該有機低分子が配位する金属を含み得る。
【００５１】
本発明はまた、本発明の分子、本発明の発現ベクターまたは本発明の複合体を含むタンパク質間相互作用制御剤、あるいはこれらを用いるタンパク質間相互作用の制御方法を提供する。
【００５２】
本発明の剤は医薬または試薬として使用し得る。本発明の剤が医薬である場合、医薬上許容され得る担体を含み得る。医薬上許容され得る担体としては、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の一つ以上を用いることにより、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬を調製することができる。これらの医薬は、本発明の分子の種類に応じて経口あるいは非経口的に投与することができる。
【００５３】
投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬に含有される活性成分の種類などにより異なるが、例えば、通常成人一人当たり、一回につき１μｇから５ｇ、好ましくは１０μｇから１ｇの範囲で投与することができる。しかしながら、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量より少ない量で十分な場合もあり、また上記の範囲を越える投与量が必要な場合もある。
【００５４】
とりわけ注射剤の場合には、例えば生理食塩水あるいは市販の注射用蒸留水等の非毒性の医薬上許容され得る担体中に溶解または懸濁することにより製造することができる。このようにして製造された注射剤は、処置を必要とするヒト患者に対し、例えば、上記用量において１日あたり１回〜数回投与することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射のような医療上適当な投与形態が例示できる。好ましくは静脈内注射である。
【００５５】
注射剤はまた、必要に応じて、非水性の希釈剤（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、バクテリア保留フィルターを通す濾過滅菌、殺菌剤の配合または照射により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。
【００５６】
本発明の剤は、自己凝集分子を有する本発明の分子、該分子の発現ベクターまたは該分子を含む複合体を含有する。自己凝集分子は、塩の有無及び濃度、ｐＨ変化、温度変化、金属イオンの有無及び濃度によりその自己凝集作用が変化することが知られているため、この作用を利用することにより、本発明の剤のドラッグデリバリーに応用できる。例えば、癌細胞に多く含まれる金属イオン（例、Ｚｎ２＋）に配位する分子を自己凝集分子として利用することにより、本発明の剤は癌細胞特異的に効果を発揮し得る。また、本発明の剤を投与する際においては、自己凝集作用がまだ発揮されないため、モノマーとして存在していることから、本発明の剤の腸管及び細胞等の吸収の促進効果、並びに体内動態の効率性の上昇という効果が発揮され得る。
【００５７】
本発明の剤は、標的タンパク質の機能を調節するため、あるいはそのような調節が所望される疾患の治療のために使用され得る。例えば、本発明の剤が、標的タンパク質の機能を調節し得る分子としてＡＸＰＸ（配列番号１）または式（Ｉ）で表されるペプチドを有し、かつ自己凝集分子としてダイマー以上のマルチマーを形成可能な分子を有する本発明の分子、該分子の発現ベクターまたは該分子を含む複合体を含有する場合、アポトーシス誘導のため、あるいは癌、自己免疫疾患からなる群より選ばれる疾患の治療のために使用され得る。
【００５８】
本発明はまた、本発明の剤の使用方法に対応するタンパク質間相互作用の制御方法を提供する。
【００５９】
本発明の制御方法は、自己凝集型調節分子が凝集してなる複合体を標的タンパク質に接触させることを含み得る。本発明の制御方法は、インビボまたはインビトロ（例、細胞系、タンパク質再構成系等の非細胞系）で行われ得る。本発明の制御方法は、塩の有無および濃度、ｐＨ変化、温度変化、金属イオンの有無および濃度からなる群より選ばれる１以上の条件を変更することをさらに含み得る。これにより、本発明の分子の凝集または本発明の複合体の脱凝集を調節すること、ひいては本発明の分子または複合体の活性を調節することが可能となる。
【００６０】
本発明はさらに、自己凝集型調節分子の設計方法を提供する。
【００６１】
本発明の設計方法は、より優れた自己凝集型調節分子を得るという観点から、標的タンパク質の機能の調節能および自己凝集能を併有するように調製された、標的タンパク質の機能を調節し得る分子および自己凝集分子が融合してなる自己凝集型調節分子について活性を検討することを含み得る。活性の検討はインビボまたはインビトロ（例、細胞系、タンパク質再構成系等の非細胞系）で行われ得る。また、至適化された自己凝集型調節分子を得るため、自己凝集型調節分子の活性の検討を、塩の有無および濃度、ｐＨ変化、温度変化、金属イオンの有無および濃度からなる群より選ばれる１以上の条件の変更下で行ってもよい。
【００６２】
本明細書中で挙げられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【００６３】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。
【実施例】
【００６４】
実施例１
アポトーシス抑制分子XIAPに対するアンタゴニストを、自己凝集型調節分子として創製した。XIAP はアポトーシスの実行因子であるカスパーゼ-3, -7, -9 と結合し、アポトーシスを抑制するタンパク質である。XIAP は、そのBIR2 ドメインでカスパーゼ-3, -7 と、BIR3 ドメインでカスパーゼ-9 と結合し（図２Ａ）、癌細胞におけるアポトーシスを強く抑制していることが示されている[Mol. Cancer Ther. 1: 1051-1058 (2002)]。したがって、XIAP アンタゴニストは、XIAP により抑制されたカスパーゼ活性を復活させ、癌細胞にアポトーシスを誘導する新しい医薬品として期待されている[Science 305: 1471-1474 (2004)]。
【００６５】
本実施例で設計した自己凝集型調節分子は、XIAP のBIR3 ドメインとカスパーゼ-9 (パートナー分子) 間のタンパク質間相互作用を阻害するアンタゴニストである。これまでに、BIR3 ドメイン上におけるカスパーゼ-9 との結合に重要なホットスポットは同定されており、そのホットスポットに強く結合するモチーフとして、AXPX（配列番号１）が知られている (X は任意のアミノ酸) [J. Med. Chem. 47: 4417-4426 (2004)]。カスパーゼ-9 はATPF（配列番号２）を、内在性のXIAP アンタゴニストであるSmac はAVPI（配列番号３）をモチーフとしてもっている[Apoptosis 7: 163-166 (2002)]。様々なアミノ酸置換実験の結果、AVPF が親和性の顕著に強い配列であった。この配列はショウジョウバエのIAP であるHID に存在する[Mol. Cell（2002）9, 459-470]。本実施例では、調節分子としてAVPF を用いた（表１）。
【００６６】
【表１】
2007097417.tif 000003
【００６７】
自己凝集分子として採用したコイルドコイルは、内在性タンパク質がもつモチーフの１つであり、繰り返し配列をもつαヘリックスが自己凝集し、複合体を形成することによりそのタンパク質の機能の一端を担っている[Protein Sci. 6: 1734-1745 (1997)]。さらに、コイルドコイルは、安定性の増強、それを形成するαヘリックス数の制御など、比較的単純な配列により形成されていることから、多くの人工的な改変が試みられている[J. Mol. Biol. 318: 901-910 (2002)]。本実施例では、自己凝集分子として、安定なコイルドコイルを形成する配列EELRRRIEELERRIR（配列番号９）[J. Mol. Biol. 318: 901-910 (2002)]を用い、調節分子と自己凝集分子をリンカーAQKGGG（配列番号１０）で接続したAVPFAQKGGGEELRRRIEELERRIR-NH2を自己凝集型調節分子として設計した（表１）。C 末は、アミド化により保護している。
【００６８】
該自己凝集型調節分子の効果を確認するために、293 細胞抽出液を用いてFunctional in vitro assay によるXIAP 阻害効果の検証を実施した。先ず、293 細胞抽出液を調製した。詳細には、293 細胞を0.02% EDTAで剥がして回収し，氷冷したPBS (-) で洗浄した後、これを氷冷したbuffer A (20 mM HEPES, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, pH 7.5) で洗浄し、細胞体積の2 倍量のbuffer A に懸濁し、氷上で20 分間放置した後インキュベートし、細胞懸濁液を26 ゲージの注射針に15 往復通すことによって細胞を破砕し、16000 g で30 分間遠心分離を行い、上清を細胞抽出液として回収した。細胞抽出液のタンパク質濃度を、プロテインアッセイで測定した。
【００６９】
上記の方法で調製した293 細胞抽出液を用い、Functional in vitro assay を行った。293 細胞抽出液40 mgに、XIAP アンタゴニスト、400 nM XIAP-BIR3、10 μM horse heart cytochrome c、1 mM dATP をそれぞれ添加し、30℃で60 分間インキュベートした。この溶液について、Ac-DEVD（配列番号１１）-MCA を基質として用いてDEVD 切断活性 (= Caspase 活性) を測定した。Caspase Assay buffer (50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM DTT, 0.1% CHAPS, 10% glycerol, pH 7.4) を80 μl とり、測定サンプル溶液10 μl と2 mM Ac-DEVD-MCA基質10 μl を添加して、Ex. 390 nm, Em. 460 nm での蛍光を、プレートリーダーで60 分間経時的に測定した。アンタゴニストを添加しない場合のDEVD 切断活性を100%として、相対的DEVD切断活性 (%) を算出した。
【００７０】
Functional in vitro assay の結果を図２Ｃ、Ｄに示す。AVPF、50μM 投与によるDEVD切断活性は53.6%であるのに対し、AVPF-Coil では、113.4%と劇的に上昇することが確認された。また、コイルドコイル (Coil) 自体にDEVD 切断活性の上昇効果がないこと、さらに、Coil をもたない調節分子+リンカー領域 (AVPF-L) にもDEVD 切断活性の上昇効果がないことも確認できた（図２Ｃ）。次に、50% DEVD 切断活性をもつ濃度をAVPF-Coil とAVPF-L で測定した結果、AVPF-Coil は7.5μM であるのに対し、AVPF-L は86.2 μM と十倍以上の差が確認できた（図２Ｄ）。この活性の差は、明らかにコイルドコイルにより生じていることが分かる。
以上より、自己凝集型調節分子 (AVPF-Coil) は、タンパク質間相互作用により結合するXIAP (BIR3) とカスパーセ-9（図２Ａ）を、自己凝集作用により生じる複合体形成により（図２Ｂ）、強く阻害することが示された。
【００７１】
自己凝集型調節分子 (AVPF-Coil) と標的タンパク質 (カスパーセ-9) との複合体形成によって生じる幾何学的障害によるアンタゴニスト作用をさらに裏づけるため、その幾何学的障害に影響されないであろうパートナー分子 (AVPF-TAMRA)（表１、図３Ａ）を用いて、自己凝集型調節分子 (AVPF-Coil) のアゴニスト効果を調べた。測定は、1 分子蛍光分析システムMF20 (OLYMPUS) を用いた蛍光偏光測定法 (FIDA2D) による競合阻害実験により実施した。bufferとしてPBS-0.05% Tween20 を用い、各アゴニストと400 nM ヒト組換えXIAP-BIR3 を混合して室温で10 分間インキュベートした。これに，1 nM のパートナー分子 (AVPFAQK-TAMRA) を蛍光プローブとして添加し、室温で30分間インキュベートした。これをガラスボトム384 ウェルプレートに入れ、1分子蛍光分析システムMF20 (OLYMPUS) で、蛍光偏光測定法 (FIDA2D) を用いた競合阻害測定を行った。アンタゴニストを添加しない場合のmP 値と，添加した場合のmP 値から，阻害 (%) を算出した。
【００７２】
蛍光偏光測定法 (FIDA2D) の結果を図３Ｃ、Ｄに示す。AVPF-L、400 nM 投与による阻害活性は30.9%であるのに対し、この自己凝集型調節分子、AVPF-Coil では、37.3%とほとんど差がないことが分かった（図３Ｃ、Ｄ）。また、コイルドコイル (Coil) 自体に阻害活性がないことも確認できた（図３Ｃ）。
【００７３】
以上より、自己凝集型調節分子 (AVPF-Coil) は、XIAP (BIR3) とパートナー分子(AVPF-TAMRA)との結合（図３Ａ）を自己凝集作用により生じる複合体形成により阻害する効果（図３Ｂ）はほとんどないことが示唆された（図３Ｃ、Ｄ）。さらに、Functional in vitro assay とは逆に自己凝集型調節分子(AVPF-Coil)は、AVPFペプチドよりもアンタゴニスト活性は弱いことが分かった（図３Ｃ）。パートナー分子であるAVPF-TAMRAは、AVPF と同じホットスポットのみに結合するため、両者は完全に競合する。一方、AVPF-Coil もAVPF-TAMRAと完全に競合するが、結合 (アンタゴニスト効果) に関与しない領域が21 残基もあることから、この領域のエントロピー的な負の効果がXIAP (BIR3) との親和性を結果的に減少させていると考えられる。
【００７４】
これまでの結果をまとめると、自己凝集型調節分子AVPF-Coil は、調節分子によるXIAP (BIR3) との結合及び自己凝集分子による複合体形成によって生じる幾何学的障害により、XIAP (BIR3) とカスパーゼ-9 との結合を強く阻害することが示唆された。一方、幾何学的障害をうけないと考えられるAVPF-TAMRAとXIAP (BIR3) との結合は、AVPF 単独よりも弱い阻害作用しか持たないことから、幾何学的障害は予測どおりAVPF-TAMRAには作用しないことが示された。したがって、本実施例で設計したAVPF-Coil は、自己凝集作用によって生じる幾何学的障害の付加により、標的分子とそのパートナー分子 (高分子化合物) とのタンパク質間相互作用を抑制するアンタゴニスト効果をもつことが示され、本発明の有効性が証明された。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】コイルドコイルを示す図である。
【図２−Ａ】XIAPのBIR3ドメインとカスパーゼ-9との相互作用の様式を示す図である。
【図２−Ｂ】自己凝集型調節分子AVPF-Coilによる、XIAPのBIR3ドメインとカスパーゼ-9との相互作用の阻害様式を示す図である。
【図２−Ｃ】自己凝集型調節分子AVPF-Coilを用いたFunctional in vitro assay の結果を示す図である。結果を相対百分率 (%)として示す。
【図２−Ｄ】自己凝集型調節分子AVPF-Coilを用いたFunctional in vitro assay の結果を示す図である。濃度依存性を評価した。
【図３−Ａ】XIAPのBIR3ドメインとパートナー分子AVPF-TAMRAとの相互作用の様式を示す図である。
【図３−Ｂ】自己凝集型調節分子AVPF-Coilによる、XIAPのBIR3ドメインとパートナー分子AVPF-TAMRAとの相互作用の阻害様式を示す図である。
【図３−Ｃ】自己凝集型調節分子AVPF-Coilによる、XIAPのBIR3ドメインとパートナー分子AVPF-TAMRAとの相互作用の競合阻害を示す図である。結果を相対百分率 (%)として示す。
【図３−Ｄ】自己凝集型調節分子AVPF-Coilによる、XIAPのBIR3ドメインとパートナー分子AVPF-TAMRAとの相互作用の競合阻害を示す図である。濃度依存性を評価した。
【図１】
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【図２−Ｃ】
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【図２−Ｄ】
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【図３−Ｃ】
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【図３−Ｄ】
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【図２−Ａ】
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【図２−Ｂ】
2007097417.tif 000010
【図３−Ａ】
2007097417.tif 000011
【図３−Ｂ】
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【配列表】
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