(57)【要約】      （修正有）【課題】長鎖高度不飽和脂肪酸を構成要素として含む、リン脂質の製造方法を提供する。【解決手段】モルティエレラ属に属する微生物であるモルティエレラ・アルピナを、当該微生物の菌体中にリン脂質が蓄積する条件で培養し、その培養物からリン脂質を得る。ここで、当該培養物に含まれるすべてのリン脂質の構成要素として含まれる脂肪酸の総量における、分岐型脂肪酸であるイソパルミチン酸の組成比は５％以下である。この方法により得られるリン脂質として、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピンなどのグリセロリン脂質が挙げられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
長鎖高度不飽和脂肪酸を構成要素として含むリン脂質（ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬ）の製造方法であって、以下：
（ｉ）モルティエレラ属に属する微生物を、当該微生物の菌体中にＬＣＰＵＦＡ−ＰＬが蓄積する条件で培養し；そして
（ｉｉ）その培養物からＬＣＰＵＦＡ−ＰＬを得る、ここで、当該培養物に含まれるすべてのリン脂質（ＰＬ）の構成要素として含まれる脂肪酸の総量における分岐型脂肪酸であるイソパルミチン酸の組成比は５％以下である；
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
モルティエレラ属に属する微生物がモルティエレラ亜属である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
モルティエレラ属に属する微生物がモルティエレラ・アルピナである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
菌体中にＬＣＰＵＦＡ−ＰＬが蓄積する条件で培養することが、ｐＨ４〜ｐＨ１０の初発ｐＨを含む条件で培養することを含む、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
菌体中にＬＣＰＵＦＡ−ＰＬが蓄積する条件で培養することが、ｐＨ４〜ｐＨ６のｐＨを維持するように制御しながら培養することを含む、請求項１ないし４いずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
菌体中にＬＣＰＵＦＡ−ＰＬが蓄積する条件で培養することが、３．７ｍＭ〜１４７ｍＭのリン酸塩を含む培地中で培養することを含む、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
菌体中にＬＣＰＵＦＡ−ＰＬが蓄積する条件で培養することが、８．３以上の最大所要攪拌動力（ＫＬＡ＝（Ｐ／Ｖ）０．９５・Ｖｓ０．６７）で攪拌しながら培養することを含む、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
菌体中にＬＣＰＵＦＡ−ＰＬが蓄積する条件で培養することが、菌体を増殖させた後、１０〜２５℃で４〜１８時間培養することを含む、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
菌体中にＬＣＰＵＦＡ−ＰＬが蓄積する条件で培養することが、２８℃で２日間〜２０日間培養した後、１０〜２５℃で４〜１８時間培養することを含む、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
菌体中にＬＣＰＵＦＡ−ＰＬが蓄積する条件で培養することが、
（ａ）ｐＨ４〜ｐＨ１０の初発ｐＨを含む条件で培養すること；
（ｂ）ｐＨ４〜ｐＨ６のｐＨを維持するように制御しながら培養すること；
（ｃ）３．７ｍＭ〜１４７ｍＭのリン酸塩を含む培地中で培養すること；
（ｄ）８．３以上の最大所要攪拌動力（ＫＬＡ＝（Ｐ／Ｖ）０．９５・Ｖｓ０．６７）で攪拌しながら培養すること；および
（ｅ）菌体を増殖させた後または２８℃で２日間〜２０日間培養した後、１０〜２５℃で４〜１８時間培養すること；
からなる群から選択されるすくなくとも２つの培養条件を含む、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
培養物が、培養液もしくは滅菌処理した培養液、または、それらから集菌した培養菌体もしくはその乾燥菌体を含む、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸およびカルジオリピンからなる群より選択される少なくとも１種のグリセロリン脂質を含む、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
オメガ６系高度不飽和脂肪酸、オメガ３系高度不飽和脂肪酸、および、オメガ９系高度不飽和脂肪酸からなる群より選択される長鎖高度不飽和脂肪酸（ＬＣＰＵＦＡ）を構成要素として含むＬＣＰＵＦＡ−ＰＬを製造するための、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
オメガ６系高度不飽和脂肪酸が、１１，１４−エイコサジエン酸（２０：２、ω６）、８，１１，１４−エイコサトリエン酸（ジホモ−γ−リノレン酸；２０：３、ω６）、５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸（アラキドン酸；２０：４、ω６）、１３，１６−ドコサジエン酸（２２：２、ω６）、７，１０，１３，１６−ドコサテトラエン酸（２２：４、ω６）、および４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸（２２：５、ω６）からなる群より選択される１以上の脂肪酸である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
オメガ３系高度不飽和脂肪酸が、１１，１４，１７−エイコサトリエン酸（α−リノレン酸；２０：３、ω３）、８，１１，１４，１７−エイコサテトラエン酸（２０：４、ω３）、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸（２０：５、ω３）、７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸（２２：５、ω３）、および４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（２２：６、ω３）からなる群より選択される１以上の脂肪酸である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
オメガ９系高度不飽和脂肪酸が、５，８，１１−エイコサトリエン酸（ミード酸；２０：３、ω９）、７，１０，１３−ドコサトリエン酸（２２：３、ω９）、および４，７，１０，１３−ドコサテトラエン酸（２２：４、ω９）からなる群より選択される１以上の脂肪酸である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
アラキドン酸（５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸）およびドコサヘキサエン酸（４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸）からなる群より選択されるＬＣＰＵＦＡを構成要素として含むＬＣＰＵＦＡ−ＰＬを製造するための、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
分子中に少なくとも１つの共役二重結合を有するＬＣＰＵＦＡを構成要素として含むＬＣＰＵＦＡ−ＰＬを製造するための、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
培養物に含まれるすべてのリン脂質（ＰＬ）の構成要素として含まれる脂肪酸の総量における分岐型脂肪酸であるイソパルミチン酸の組成比が５％以下であり、かつ、当該脂肪酸の総量におけるアラキドン酸の組成比が１３％以上である、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
培養物に含まれるすべてのリン脂質（ＰＬ）の構成要素として含まれる脂肪酸の総量における分岐型脂肪酸であるイソパルミチン酸の組成比が５％以下であり、かつ、当該脂肪酸の総量におけるアラキドン酸の組成比に対する該イソパルミチン酸の組成比が１／６以下である、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬが、アラキドン酸を含むリン脂質を含み、そして培養物に含まれるすべてのリン脂質中のアラキドン酸量が、乾燥菌体１ｇあたり１１．８ｍｇ以上であることを特徴とする、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬが、ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）を含むリン脂質を含み、そして培養物に含まれるすべてのリン脂質中のＤＧＬＡ量が、乾燥菌体１ｇあたり１．５ｍｇ以上であることを特徴とする、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬが、アラキドン酸を含むホスファチジルコリンを含み、そして、培養物に含まれるすべてのホスファチジルコリンの構成要素として含まれるアラキドン酸量が、乾燥菌体１ｇあたり１．０ｍｇ以上であることを特徴とする、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬが、アラキドン酸を含むホスファチジルエタノールアミンを含み、そして、培養物に含まれるすべてのホスファチジルエタノールアミンの構成要素として含まれるアラキドン酸量が、乾燥菌体１ｇあたり０．５ｍｇ以上であることを特徴とする、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬが、アラキドン酸を含むホスファチジルセリンを含み、そして、培養物に含まれるすべてのホスファチジルセリンの構成要素として含まれるアラキドン酸量が、乾燥菌体１ｇあたり０．０５ｍｇ以上であることを特徴とする１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
培養物が、アラキドン酸を構成要素として含むリン脂質およびアラキドン酸を構成要素として含むトリグリセリドを含むが、ここで、リン脂質の構成要素として存在するアラキドン酸量のトリグリセリドの構成要素として存在するアラキドン酸量に対する比が０．２以上であることを特徴とする、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、長鎖高度不飽和脂肪酸を構成要素として含むリン脂質（long-chain poly-unsaturated fatty acid - phospholipid：ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬ）の製造方法であって、モルティエレラ属に属する微生物を、当該微生物の菌体中にＬＣＰＵＦＡ−ＰＬが多く蓄積する条件で培養を行い、そして当該微生物の培養物からＬＣＰＵＦＡ−ＰＬを抽出して得ることを含むことを特徴とする前記方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リン脂質（ＰＬ）には、脳機能改善効果や抗ストレス効果、コレステロール低下作用など様々な生理機能が知られている。ＰＬにはいくつか種類が知られており、主なものとしては、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）等が挙げられる。これらＰＬはそれぞれ異なった機能および物性を有している。
【０００３】
ＰＬの中でも、炭素数２０以上の長鎖高度不飽和脂肪酸（ＬＣＰＵＦＡと略す）を構成要素とするリン脂質（説明の便宜上、ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬと略称する）は、脳機能改善効果が高く、ＬＣＰＵＦＡを構成要素としないリン脂質（説明の便宜上、ｎｏｎ−ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬと略称する）よりも高い効果を有している（非特許文献１参照）。なお、ＬＣＰＵＦＡの具体的な例としては、例えば、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）やアラキドン酸（ＡＲＡ）等を挙げることができる。
【０００４】
また、リン脂質型でないＬＣＰＵＦＡ誘導体にも脳機能改善効果があることが知られている（特許文献１参照）。ただし、リン脂質型でないＬＣＰＵＦＡ誘導体の脳機能改善効果は、上記ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬやｎｏｎ−ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬ等のリン脂質とは異なり、大脳の海馬に対する作用に基づくと考えられている。
【０００５】
ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬの脳機能改善効果が優れている理由としては、（１）脳内で実際に存在している構造であり、（２）脳血管関門を通過することができ、（３）肝臓を経由せずに吸収されるため肝臓で捕捉または修飾されずに脳等の組織に到達するという各理由が挙げられる。
【０００６】
各理由について具体的に説明する。まず、（１）の理由については、脳内のＬＣＰＵＦＡはほとんどリン脂質の形で存在することが知られている。より具体的には、ＬＣＰＵＦＡは、主として上記ＰＣ、ＰＳ、ＰＥ、ＰＩ等の化合物として存在しており、脳内で様々な機能を発揮している。次に、（２）の理由については、標識したリン脂質を経口摂取すると、脳組織で標識したリン脂質が検出されることから、リン脂質が脳組織へ到達することがわかっている（非特許文献２参照）。さらに、（３）の理由については、リン脂質が吸収される際には、消化器官内で、構成する２つの脂肪酸のうち、１つが加水分解されてリゾリン脂質が生じる。このリゾリン脂質が小腸から吸収され、小腸細胞内でリン脂質に再構成された後、リンパ管から吸収される（非特許文献３参照）。それゆえ、ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬは肝臓を経由せずに生体の全身に運ばれることになる。
【０００７】
ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬは、従来から、これを多く含む動物の臓器や卵等から調製または精製することで生産されている。具体的には、牛脳からの調製や、豚肝臓あるいは魚卵からのリン脂質画分の精製等を挙げることができる（特許文献２および３参照）。また、ある種の海洋細菌がＬＣＰＵＦＡ−ＰＬを生産することや（非特許文献４参照）、アラキドン酸生産能を有する糸状菌が、アラキドン酸含有リン脂質を菌体内に含有していることも知られている（非特許文献５参照）。
【０００８】
現在のリン脂質の工業的な生産法としては、一般的に、原料からトリグリセリドを主成分とする油脂を抽出する際に、当該油脂とともに抽出される。抽出時の溶媒としてはヘキサン等が用いられる。抽出された油脂にはガム質が含まれているが、このガム質は油脂の着色、泡立ちの原因となる。そこで、ガム質を脱ガム工程で除去することになるが、この工程でほとんどのリン脂質がガム質に移行するので、当該ガム質を精製することによりリン脂質を製造する。
【０００９】
しかしながら、上記従来の技術で提供される、ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬはその供給量が不安定となる上に、品質は必ずしも安定していない。具体的には、現在入手できるＬＣＰＵＦＡ−ＰＬは、一般的には、上述した動物の臓器や卵黄、魚卵等を由来としている。これら動植物油由来の供給源においては、気象条件による供給量やＬＣＰＵＦＡ含量の変動、さらに環境汚染による影響などの問題がある。さらには、牛脳をはじめとする動物臓器については、狂牛病の流行以降、利用が非常に困難な状況となっている。それゆえ、ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬを効率的かつ安定的に製造することが困難であるという問題を有している。
【００１０】
微生物を用いた技術の場合、海洋細菌由来のＬＣＰＵＦＡ−ＰＬは、ヒトや動物にはほとんど見られず細菌特有の脂肪酸である分岐型脂肪酸を主要な成分として含んでおり、栄養組成物としては適さない。
【００１１】
一方でアラキドン酸を生産する糸状菌の一つであるコニディオボラス属（Conidiobolus sp.）を用いたＬＣＰＵＦＡ−ＰＬの生産が提案されているが（特許文献４参照）、この菌株はイソミリスチン酸（iso myristic acid）（ｉｓｏ１４：０）やイソパルミチン酸（iso palmitic acid）（ｉｓｏ１６：０）等の分岐型脂肪酸を多く含んでいることが報告されている（非特許文献６、非特許文献７参照）。その上一部の菌では、エントモフトラ目（entomophthorales）特有の真菌症（エントモフトラ症（entopmophthorosis）と呼ばれる真菌症の一種で鼻腔内粘膜に初発し、咽頭、鼻腔内の気道上、顔面一帯へ拡大する）の原因菌となることもあり、健康人に感染症を起こす能力（バイオセーフティレベル２）を有するものもある（非特許文献８、非特許文献９参照）。また昆虫その他の小動物への寄生性を有しており（非特許文献１０参照）、人体・環境に与える悪影響という観点から工業的に用いる微生物としては不適当である。
【００１２】
また現在、アラキドン酸含有トリグリセリドの工業生産に用いられているモルティエレラ属（Mortierella sp.）においては、アラキドン酸生産ための種々の条件検討が積極的に行われており、なかでも各種ミネラル塩の添加や、培地のｐＨ、培養温度などによりアラキドン酸の生産性が向上することが報告されている。具体的には、各種ミネラル塩の添加が、菌体内に蓄積されるＬＣＰＵＦＡ含有トリグリセリドとＬＣＰＵＦＡ−ＰＬの生産性に影響することが分かっている（非特許文献１１）。また初発ｐＨに関しては、（１）培養の初発ｐＨが６．０〜６．６が至適であること(非特許文献１１)、（２）培養後期ではｐＨを上げることにより、アラキドン酸含有トリグリセリドの生産量が上がること（特許文献５）が知られているが、リン脂質画分に関して最適化された知見はない。更に培養温度に関しては、低温で５日以上培養することによりリン脂質中ＬＣＰＵＦＡ含有量が増加することが知られている（非特許文献１２）。しかしながらこのような長期の低温培養はコスト面からも工業生産としては不向きである上、上記の条件は何れもトリグリセリドの構成要素として存在するＬＣＰＵＦＡ生産に注目した培養条件であり、ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬの生産に特化した培養条件は未だ検討されていないのが実情である。このような培養方法で生産した菌体内では、ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬは著量のトリグリセリドに混入した微量成分として検出されているものの、その含有量は微量である上（１１．７ｍｇ／ｇ 乾燥菌体  非特許文献５参照）、トリグリセリド生産の副産物であるため品質や供給量が安定ではなく、ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬの十分な利用が期待できない。  
【００１３】
以上のことから、より安全に、安定的に食品や動物飼料に利用することが可能なＬＣＰＵＦＡ−ＰＬ含有油脂の開発が望まれている。
【特許文献１】特開２００３−４８８３１号公報（２００３年（平成１５）２月２１日公開）
【特許文献２】特開平１１−３５５８７号公報（１９９９年（平成１１）２月９日公開）
【特許文献３】特開平８−５９６７８号公報（１９９６年（平成８）３月５日公開）
【特許文献４】特公平６−２０６８号公報（１９９４年（平成６）１月１２日公告）
【特許文献５】特表平１０−５１２４４４号公報（１９９８年（平成１０）１２月２日公表）
【非特許文献１】A. Bruni, et al., Nature, Vol.260, p331-333（1976）
【非特許文献２】G. Toffano, et al. Clinical Trials Journal, Vol.24, p18-24（1987）
【非特許文献３】今泉勝巳、臨床栄養、第67巻、p119（1985）
【非特許文献４】矢澤一良ら、油科学、第44巻、p787-793（1995）
【非特許文献５】S. Shimizu, et al., JAOCS, Vol.68, No.4, p254-258 (1991)
【非特許文献６】D. Tyrrell, Can. J. Microbiol., Vol.17, p1115-1118 (1971)
【非特許文献７】D. Tyrrell, et al., Can. J. Microbiol., Vol.22, p1058-1060 (1976)
【非特許文献８】G. S. de Hoog, et al., ATLAS OF CLINICAL FUNGI, 2nd edition, p.118-123
【非特許文献９】日本細菌学会、病原細菌に関するバイオセーフティ指針、改定第２版、p7 （２００２年）
【非特許文献１０】長谷川武治ら、微生物の分類と同定、p19-20、東京大学出版会  （１９７５年）
【非特許文献１１】K. Higashiyama, et al., JAOCS, Vol.75, p1501-1505 (1998)
【非特許文献１２】S. Jareonkitmongkol, et al., Arch. Microbiol., Vol.161, p316-319 (1994)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明では分岐脂肪酸の含有量が低く、かつ長鎖高度不飽和脂肪酸を構成要素として含むリン脂質（ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬ）を高含量蓄積する微生物の培養物を得ることにより、より安心して食品や動物飼料に用いることができ、品質の安定したＬＣＰＵＦＡ−ＰＬを、効率的かつ安定的に供給することが可能な技術の提供を目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は上記課題を解決するため、分岐型脂肪酸含有量が少なく、そして、効率的なＬＣＰＵＦＡ−ＰＬの製造方法を求めた結果、長鎖高度不飽和脂肪酸（ＬＣＰＵＦＡ）含有脂質を生産する脂質生産菌としてモルティエレラ属が当該事項に好適であることを見出した。
【００１６】
しかも生体膜構成要素であるＬＣＰＵＦＡ−ＰＬは、菌体内合成が厳密に制御されていると予想されるにも関わらず、菌体あたりのＬＣＰＵＦＡ−ＰＬ量が顕著に増える条件を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１７】
すなわち本発明は、分岐型脂肪酸含量が少なく、かつＬＣＰＵＦＡを構成要素として含むリン脂質（ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬ）の製造方法であって、上記脂質生産菌菌体中にＬＣＰＵＦＡ−ＰＬを多く蓄積させる培養を行うことを特徴としている。上記製造法においては、さらに、上記脂質生産菌培養工程の後段で実施され、ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬの供給原料となる乾燥菌体を得ることや、菌体からＬＣＰＵＦＡ−ＰＬ含有油脂を抽出する油脂抽出工程も含まれる。
【００１８】
したがって、本発明の方法は、
（ｉ）モルティエレラ属に属する微生物を、当該微生物の菌体中にＬＣＰＵＦＡ−ＰＬが蓄積する条件で培養し；そして
（ｉｉ）その培養物からＬＣＰＵＦＡ−ＰＬを得る、ここで、当該培養物に含まれるすべてのリン脂質（ＰＬ）の構成要素として含まれる脂肪酸の総量における分岐型脂肪酸であるイソパルミチン酸の組成比は５％以下である；
ことを含む、ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬの製造方法である。
【００１９】
また、本発明の方法は、
（ｉ）モルティエレラ属に属する微生物を、当該微生物の菌体中にＬＣＰＵＦＡ−ＰＬが蓄積する条件で培養し；
（ｉｉ）その培養物から脂質成分を総脂質画分として抽出し、さらにトリグリセリド画分およびリン脂質画分に分画し；そして
（ｉｉｉ）当該リン脂質画分からＬＣＰＵＦＡ−ＰＬを得る、ここで、当該培養物に含まれるすべてのリン脂質（ＰＬ）の構成要素として含まれる脂肪酸の総量における分岐型脂肪酸であるイソパルミチン酸の組成比は５％以下である；
ことを含む、ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬの製造方法である。
【００２０】
本発明の方法で用いる微生物
本発明の方法で用いる微生物は、モルティエレラ属に属し、ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬを生成し得る微生物であれば特に限定されるものではない。本発明の方法で用いるモルティエレラ属の微生物は、モルティエレラ亜属であることが好ましい。モルティエレラ亜属の微生物としては、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）、モルティエレラ・ポリセファラ（Mortierella polycephala）、モルティエレラ・エキシグア（Mortierellaexigua）、モルティエレラ・フィグロフィラ（Mortierella hygrophila）、モルティエレラ・エロンガタ（Mortierellaelongata）等が含まれる。より好ましくは、本発明の方法で用いるモルティエレラ属の微生物は、モルティエレラ・アルピナである。
【００２１】
モルティエレラ属に属する微生物は、ＬＣＰＵＦＡとしてアラキドン酸（ＡＲＡ）を構成要素として含むＬＣＰＵＦＡ−ＰＬ（ＡＲＡ−ＰＬと略す）の生産能を有する種や株が多く知られている。ＡＲＡ−ＰＬの生産能を有するモルティエレラ属を選択する場合には、当該モルティエレラ属の微生物がモルティエレラ亜属であることが好ましい。モルティエレラ亜属の微生物としては、モルティエレラ・アルピナ、モルティエレラ・ポリセファラ、モルティエレラ・エキシグア、モルティエレラ・フィグロフィラ、モルティエレラ・エロンガタ等を挙げることができる。
【００２２】
ＡＲＡ−ＰＬの生産能を有するモルティエレラ亜属の微生物のより具体的な菌株としては、例えば、モルティエレラ・ポリセファラ（M. polycephala）ＩＦＯ６３３５、モルティエレラ・エロンガタ（M.elongata）ＣＢＳ１２５．７１、モルティエレラ・エキシグア（M. exigua）ＩＦＯ８５７１、モルティエレラ・ベルヤコバ（M.beljakovae）ＣＢＳ６０１．６８、モルティエレラ・スクムケリ（M. schmuckeri）ＮＲＲＬ２７６１、モルティエレラ・フィグロフィラ（M.hygrophila）ＩＦＯ５９４１、モルティエレラ・アルピナ（M. alpina）ＩＦＯ８５６８、ＡＴＣＣ１６２６６、ＡＴＣＣ３２２２１、ＡＴＣＣ４２４３０、ＣＢＳ２１９．３５、ＣＢＳ２２４．３７、ＣＢＳ２５０．５３、ＣＢＳ３４３．６６、ＣＢＳ５２７．７２、ＣＢＳ５２９．７２、ＣＢＳ６０８．７０、ＣＢＳ７５４．６８等を挙げることができる。これらの菌株は、何れも大阪市の財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）米国のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection, ＡＴＣＣ）および、Centrralbureau voor Schimmelcultures（ＣＢＳ）等から何ら制限なく入手することができる。さらに、ＡＲＡ−ＰＬの生産能を有するモルティエレラ亜属の他の菌株としては、本発明者らを含む研究グループが土壌から分離した菌株モルティエレラ・エロンガタ（M.elongata）ＳＡＭ０２１９（微工研菌寄第８７０３号）（微工研条寄第１２３９号）を挙げることもできる。
【００２３】
また、ＬＣＰＵＦＡとしてジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）を構成要素として含むＬＣＰＵＦＡ−ＰＬ（ＤＧＬＡ−ＰＬと略す）の生産能を有する微生物のより具体的な菌株としては、本発明者らを含む研究グループが土壌から分離した菌株モルティエレラ・エロンガタ（M. elongata）ＳＡＭ１８６０（微工研菌条第３５８９号）を挙げることができる。
【００２４】
そして、ＬＣＰＵＦＡとしてミード酸を構成要素として含むＬＣＰＵＦＡ−ＰＬ（ミード酸−ＰＬと略す）の生産能を有する微生物のより具体的な菌株としては、本発明者らを含む研究グループが土壌から分離した菌株モルティエレラ・アルピナ（M. alpina）ＳＡＭ２０８６（８生寄文第１２３５号、ＦＥＲＭＰ−１５７６６）を挙げることができる。
【００２５】
本発明の方法で用いるモルティエレラ属に属する微生物は、生産されるＬＣＰＵＦＡの種類に応じた菌株を１種のみを選択してもよいし、２種以上を組み合わせて選択してもよい。
【００２６】
本明細書において、本発明の方法に用いる微生物を、脂質生産菌または菌と記載することがある。本明細書においては、これらは同義である。
【００２７】
本発明の方法における微生物培養工程
本発明の方法に使用する微生物の培養条件は特に限定されるものではなく、培養しようとする菌株の種類に応じて適宜設定してよい。
【００２８】
本発明に使用される上記菌株を含む微生物を培養する為には、その菌株の胞子、菌糸、または予め培養して得られた前培養液を、液体培地または固体培地に接種し培養する。液体培地の場合に、炭素源としてはグルコース、フラクトース、キシロース、サッカロース、マルトース、可溶性デンプン、糖蜜、グリセロール、マンニトール等の一般的に使用されているものが、いずれも使用できるが、これらに限られるものではない。窒素源としてはペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸、コーンスティープリカー、大豆タンパク、脱脂ダイズ、綿実カス等の天然窒素源の他に、尿素等の有機窒素源、ならびに硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素源を用いることができるが、特に大豆から得られる窒素源、具体的には大豆、脱脂大豆、大豆フレーク、食用大豆タンパク、おから、豆乳、きな粉等が挙げられる。また、脱脂大豆に熱変性を施したもの、より好ましくは脱脂大豆を約７０〜９０℃で熱処理し、さらにエタノール可溶成分を除去したものを単独または複数で、あるいは前記窒素源と組み合わせて使用することができる。実用上、一般的には、炭素源の総添加量は０．１〜４０重量％の範囲内であることが好ましく、１〜２５重量％の範囲内がより好ましい。また、窒素源の総添加量は０．０１〜１０重量％の範囲内が好ましく、０．１〜１０重量％の範囲内がより好ましい。さらに、培地流加する場合には、初発の炭素源の添加量を１〜５重量％の範囲内とするとともに、初発の窒素源の添加量を０．１〜６重量％の範囲内とすることが好ましい。培養途中に流加する培地の成分は、炭素源および窒素源の双方であればよいが、より好ましくは炭素源のみを流加すればよい。
【００２９】
上記炭素源・窒素源以外の成分も特に限定されるものではなく、必要に応じて、公知の微量栄養源等を適宜選択して添加することができる。微量栄養源としては、例えば、リン酸イオン、カルシウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン等のアルカリ金属またはアルカリ土類金属のイオン；鉄、ニッケル、コバルト、マンガン等のＶＩＩＢ〜ＶＩＩＩ族の金属イオン；銅、亜鉛等のＩＢ〜ＩＩＢ族の金属イオン；各種ビタミン類；等を挙げることができる。液体培地における上述した各成分の含有率（添加率）は特に限定されるものではなく、本発明の方法に用いる微生物の生育を阻害しない濃度であれば、公知の範囲内とすればよい。
【００３０】
特にリン脂質の生産性においてはリン酸塩を添加するのが好適である。添加するリン酸塩は、例えば、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等が挙げられる。添加するリン酸塩の濃度は、本発明の方法に用いる微生物の成育を阻害しない濃度であれば特に限定されないが、３．７ｍＭ〜１４７ｍＭの範囲内であることが好ましく、３．７ｍＭ〜４４ｍＭの範囲とすることがより好ましく、２２ｍＭ〜４４ｍＭの範囲内が特に好ましい。これにより脂質生産菌体内のリン脂質含量を高めることができる。
【００３１】
培養液のｐＨは、本発明の方法に用いる微生物の生育を阻害しない範囲であれば特に限定されるものではない。例えば、初発ｐＨは、ｐＨ４〜ｐＨ１０の範囲であればよく、好ましくは弱酸性であるｐＨ４〜６であり、さらに好ましくはｐＨ４〜５に調製する。培養中のｐＨは制御しても、制御しなくてもよい。本発明の方法の好ましい態様においては、培養中のｐＨを制御する。本発明に用いるモルティエレラ属を液体培地で培養を行った場合、培養後期、特に炭素源の枯渇後に培養液中のｐＨが上昇する。このｐＨ上昇を抑え、培養開始から培養期間を通してｐＨ４〜６、好ましくはｐＨ４〜５．５の低い範囲内のｐＨを維持するよう制御して培養することにより、菌体内に蓄積するリン脂質の量を高めることができ、それにより菌体あたりのＬＣＰＵＦＡ−ＰＬ量を増やすことができる。
【００３２】
培養温度は、本発明の方法に用いる微生物の生育を阻害しない温度であれば特に限定されるものではないが、一般的には、５〜４０℃の範囲内であればよく、２０〜３０℃の範囲内が好ましい。培養期間も特に限定されるものではないが、通常は、２〜２０日間の範囲内であればよく、工業的には３〜１０日間の範囲内が好ましく、３〜６日間の範囲内がより好ましい。
【００３３】
また、好ましい態様において本発明の方法の培養温度および培養期間は以下のように制御する。先に一般的な糸状菌の最適生育温度である２８℃前後の比較的高温範囲内で、２〜２０日間、好ましくは３〜１０日間、より好ましくは３〜６日間、さらに好ましくは２〜４日間、最も好ましくは４日間培養して菌体を増殖させた後、最初の培養温度よりも低温となる温度範囲で培養すれば、生産される不飽和脂肪酸中の高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の割合を高めることができる。このときの低温の温度範囲としては１０〜２５℃が好ましく、１５〜２５℃がより好ましいが、実用的観点からは２０〜２５℃が特に好ましい。またこのような低温培養を行う期間は特に限定されるものではないが、４時間〜１８時間の範囲内が好ましく、１２時間〜１８時間の範囲がより好ましい。このような短時間の温度制御により、コストを抑えて得られるリン脂質中のＬＣＰＵＦＡの割合を高めることができる。
【００３４】
培養中に培地に施す外的な処理も特に限定されるものではなく、通気攪拌培養、振盪培養、静置培養等の公知の培養方法を適宜選択すればよい。特に通気攪拌培養においては、攪拌により培養液の流動性を高めることでＬＣＰＵＦＡ−ＰＬの生産性を上げることができ、その場合の最大所要攪拌動力ＫＬＡ（＝（Ｐ／Ｖ）０．９５  Ｖｓ０．６７）は８．０以上、好ましくは８．３以上である。
【００３５】
上述した培養条件、すなわち、初発ｐＨ、培養中のｐＨの制御、培地中に添加するリン酸塩の濃度、培養温度および期間、ならびに攪拌力、等の条件は単独で、または組み合わせて使用することにより、目的とするＬＣＰＵＦＡ−ＰＬを菌体内に多量に蓄積させることができる。
【００３６】
なお、本発明にかかる製造方法においては、ＬＣＰＵＦＡを含む不飽和脂肪酸の収率を増加させる目的で、不飽和脂肪酸の前駆体や基質を培地中に加えてもよい。不飽和脂肪酸の前駆体や基質としては、具体的には、例えば、ヘキサデカン、オクタデカン等の炭化水素；オレイン酸、リノール酸、ドコサヘキサエン酸等の脂肪酸またはその塩；エチルエステル、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル等の脂肪酸エステル；オリーブ油、大豆油、なたね油、綿実油、ヤシ油、魚油等の油脂類；等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。これらは、単独で用いてもよいし、２種類以上を適宜組み合わせて用いてもよい。上記不飽和脂肪酸の前駆体や基質の添加量は特に限定されるものではないが、一般的には、培地全重量に対して０．００１〜１０％の範囲内であればよく、０．５〜１０％の範囲内であることが好ましい。また、これらを唯一の炭素源として脂質生産菌を培養してもよい。このように適当な基質を培地に添加することにより、目的脂肪酸をリン脂質内に効率よく取り込ませることができる。
【００３７】
本発明の方法におけるＬＣＰＵＦＡ−ＰＬの抽出および精製工程
本発明にかかる製造方法では、上記のようにして培養した培養物からＬＣＰＵＦＡ−ＰＬを得るため、リン脂質（ＰＬ）抽出工程を必須の工程として有する。このＰＬ抽出工程において、菌体からＰＬを抽出する方法は特に限定されるものではないが、抽出媒による抽出を用いることが好ましい。
【００３８】
本発明の方法においてＬＣＰＵＦＡ−ＰＬを抽出する培養物とは、上記のようにして培養した、培養液そのものであってもよく、滅菌処理した培養液であってもよい。または、培養物は、培養液から集菌した後そのままの培養菌体、すなわち生菌のまま用いることができるし、生菌を滅菌処理したものを用いることもできる。また、上記の培養液は培養途中の培養液であってもよく、培養終了時の培養液であってもよい。集菌した菌体は、塊状のまま用いてもよいし、板状、ひも状、粒状、粉末状など任意の形状に加工してから用いてもよい。菌体の集菌方法も特に限定されるものではなく、培養した菌体が少量の場合には、一般的な遠心分離機を用いて遠心分離すればよい。大量の場合には、連続遠心分離により分離することが好ましいが、これに膜等による濾過を組み合わせてもよい。また、集菌した菌体は湿菌体のままでもよいし、湿菌体を乾燥させた乾燥菌体として用いてもよい。特に本発明では、乾燥菌体を用いることが好ましい。これにより、効率的に油脂を抽出することができる。湿菌体の乾燥方法は特に限定されるものではなく、送風、熱処理、減圧処理、凍結乾燥等の公知の乾燥処理を挙げることができる。
【００３９】
上記抽出媒による抽出としては、用いられる抽出媒は特に限定されるものではないが、一般的には、脂肪族系有機溶媒および水の少なくとも何れかの抽出液、または、超臨界炭酸ガスを挙げることができる。上記抽出液のうち、脂肪族有機溶媒としては、具体的には、例えば、ヘキサン、石油エーテル等の飽和炭化水素；アセトン等のケトン類；メタノール、エタノール等のアルコール類；酢酸エチル等のエステル類；クロロホルム等のハロゲン化炭化水素；アセトニトリル等のシアン化炭化水素；ジエチルエーテル等のエーテル類；等を挙げることができる。これら抽出液は１種類のみを用いてもよいし、２種類以上を適宜選択して用いてもよい。上記抽出液の中でも、リン脂質を効率的に抽出するための脂肪族系有機溶媒としては、飽和炭化水素、アルコール、飽和炭化水素とアルコールとの混合溶媒、または、ハロゲン化炭化水素とアルコールとの混合溶媒が用いられることが好ましい。飽和炭化水素としてはヘキサンが用いられることが好ましく、アルコールとしてはエタノールが用いられることが好ましく、飽和炭化水素とアルコールとの混合溶媒としては、ヘキサン／エタノール混合溶媒が用いられることが好ましく、ハロゲン化炭化水素とアルコールとの混合溶媒としては、クロロホルム／メタノール混合溶媒が用いられることが好ましい。上記各有機溶媒の中でも、特に、食品に用いる場合には、ヘキサンおよび／またはエタノールを用いることが好ましい。なお、ヘキサンおよびエタノールの混合溶媒やエタノールを用いる場合には、これに少量の水を加えてもよい。
【００４０】
上記抽出媒による抽出処理は、バッチ式で行ってもよいし連続式で行ってもよい。また、抽出媒による抽出の条件も特に限定されるものではなく、抽出しようとするＰＬの種類や、菌体の量（体積や重量）に応じて適切な温度、適切な抽出媒の量、適切な時間で抽出すればよい。抽出時には、菌体を抽出媒に分散させた上で緩やかに攪拌することが好ましい。これにより効率的な抽出が可能となる。
【００４１】
本発明の方法により得られるＬＣＰＵＦＡ−ＰＬは、高濃度のＬＣＰＵＦＡを含有する液状油脂（トリグリセリドなど）に溶解した組成物として抽出されてもよい。高濃度のＬＣＰＵＦＡを含有する液状油脂（トリグリセリドなど）としては、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、脂肪酸、脂肪酸アルコールエステルなどを挙げることができる。高濃度のＬＣＰＵＦＡを含有する液状油脂（トリグリセリドなど）を構成するＬＣＰＵＦＡとしては、炭素数２０以上で二重結合を有する不飽和構造の脂肪酸であればよく、特に限定されるものではない。また、本発明の方法により得られるＬＣＰＵＦＡ−ＰＬは、ステロール、ステロールエステル、糖脂質、スフィンゴ脂質、ワックス、色素、カロテノイド、トコフェロール類などの脂溶性物質を含む組成物として抽出されてもよい。
【００４２】
ＰＬ精製工程の具体的な方法、すなわち上記ＰＬ抽出工程で得られた粗ＰＬを精製する方法は特に限定されるものではなく、公知の精製方法、例えば、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、カラムクロマトグラフィー法、アセトン分画等の溶媒分画法等を用いることができる。クロマトグラフィーに用いられる担体は特に限定されるものではなく、公知のものを好適に用いることができる。溶媒分画法に用いられる溶媒も特に限定されるものではなく、公知の溶媒を好適に用いることができる。
【００４３】
本発明の方法により製造される脂質
本発明の方法により製造されるリン脂質は、長鎖高度不飽和脂肪酸（ＬＣＰＵＦＡ）を構成要素として含むものである。本明細書においてＬＣＰＵＦＡとは、炭素数２０以上で二重結合を有する不飽和構造の脂肪酸をいう。
【００４４】
本発明の方法により得られる乾燥菌体中に含まれるリン脂質は、構成要素としてＬＣＰＵＦＡが含まれているもの（ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬ）であれば特に限定されるものではなく、公知のすべてのリン脂質、例えばグリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質、リゾリン脂質等、を挙げることができる。具体的には、例えば、グリセロリン脂質としては、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、カルジオリピン（ＣＬ）、等；スフィンゴリン脂質としては、スフィンゴミエリン（ＳＰ）等；リゾリン脂質としては、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、リゾホスファチジルセリン（ＬＰＳ）、リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）、リゾホスファチジルイノシトール（ＬＰＩ）、リゾホスファチジルグリセロール（ＬＰＧ）、ホスファチジン酸、等；が挙げられる。これらリン脂質の中でも、ＰＣ、ＰＳ、ＰＥ、ＰＩ、ホスファチジン酸およびＣＬが好ましい。
【００４５】
本発明の方法により製造されるリン脂質に構成要素として含まれるＬＣＰＵＦＡとしては、炭素数２０以上で二重結合を有する不飽和構造の脂肪酸であればよく、特に限定されるものではない。好ましくは、オメガ９（ω９）系高度不飽和脂肪酸、オメガ６（ω６）系高度不飽和脂肪酸、およびオメガ３（ω３）系高度不飽和脂肪酸からなる群より選択されるＬＣＰＵＦＡである。ここで、ω９系、ω６系、ω３系とは、不飽和脂肪酸の二重結合の位置に応じた系統である。具体的には、ω９系、ω６系、ω３系とは、脂肪酸のカルボキシル基と反対側の炭素から番号付けをしたときに、それぞれ、９位、６位、３位に二重結合を有する不飽和脂肪酸の系統を意味する。具体的なＬＣＰＵＦＡとしては、例えば、ω９系高度不飽和脂肪酸では、５，８，１１−エイコサトリエン酸（ミード酸；２０：３、ω９）；７，１０，１３−ドコサトリエン酸（２２：３、ω９）；４，７，１０，１３−ドコサトリエン酸（２２：４、ω９）等を挙げることができる。また、ω６系高度不飽和脂肪酸では、１１，１４−エイコサジエン酸（２０：２、ω６）；８，１１，１４−エイコサトリエン酸（ジホモ−γ−リノレン酸；２０：３、ω６）；５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸（アラキドン酸；２０：４、ω６）；１３，１６−ドコサジエン酸（２２：２、ω６）；７，１０，１３，１６−ドコサテトラエン酸（２２：４、ω６）；４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸（２２：５、ω６）等を挙げることができる。ω３系高度不飽和脂肪酸では、１１，１４，１７−エイコサトリエン酸（α−リノレン酸；２０：３、ω３）；８，１１，１４，１７−エイコサテトラエン酸（２０：４、ω３）；５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸（２０：５、ω３）；７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸（２２：５、ω３）；４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（２２：６、ω３）、等を挙げることができる。なお、上記の各ＬＣＰＵＦＡの名称の後のかっこ内でコロンを間に挟んだ２つの数字は、脂肪酸の炭素鎖長および不飽和度を表すものであり、「（炭素鎖長）：（二重結合の数）」を示している。上記ＬＣＰＵＦＡの中でも、アラキドン酸（ＡＲＡ）および／または４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）がより好ましく用いられる。これらのＬＣＰＵＦＡは、ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬの構成要素として１種類のみ含まれてもよいし、２種類以上含まれてもよい。
【００４６】
上記ＬＣＰＵＦＡにおいては、構造中に含まれる炭素−炭素二重結合構造（−Ｃ＝Ｃ−）のうち、少なくとも１つが共役二重結合となっていてもよい。この共役二重結合は、カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）と共役しているものであってもよいし、互いに隣接する炭素−炭素二重結合同士で共役しているものであってもよい。
【００４７】
したがって、本発明の方法は、上記に詳述したＬＣＰＵＦＡ−ＰＬを製造するための方法である。また、本発明の製造方法により製造されるリン脂質も本発明の範囲内である。
【００４８】
本発明の方法により製造されるリン脂質は、上述したリン脂質が少なくとも１種含まれていればよく、２種類以上のリン脂質が含まれていてもよい。また、精製工程を経ない粗リン脂質である場合には、各種微量成分を含んでいてもよい。このような微量成分としては、脂質生産菌由来のリン脂質以外の脂質成分（油脂等）を挙げることができる。
【００４９】
本発明の方法により得られるリン脂質の組成の特色
本発明の方法により得られるＬＣＰＵＦＡ−ＰＬの組成は、当業者に公知のいずれかの手法によって測定することができる。例えば、リン脂質の脂肪酸部分の定性および定量は、当業者に公知の塩酸メタノール法によりリン脂質の構成要素である脂肪酸をメチルエステルに誘導してガスクロマトグラフィーで評価することにより行うことができる。リン脂質の親水基部分の分析は、公知の分離法、例えば、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、カラムクロマトグラフィー法、質量分析法、アセトン分画等の溶媒分画法、等を用いて行うことができる。
【００５０】
本発明の方法による培養物から得られるリン脂質は、その構成要素として含まれる、イソミリスチン酸（iso myristic acid）（ｉｓｏ１４：０）やイソパルミチン酸（iso palmitic acid）（ｉｓｏ１６：０）等の分岐型脂肪酸が少ないことを特徴としている。分岐型脂肪酸の含有率は、例えば、イソパルミチン酸の含有率で評価することができる。具体的には、分岐型脂肪酸が少ないとは、すべてのＰＬ中の構成要素として含まれる総脂肪酸の総量におけるイソパルミチン酸の組成比が５％以下であることを意味し、好ましくは０．５％以下、より好ましくは０．１％以下であることを意味する。
【００５１】
また、本発明の方法により得られるＬＣＰＵＦＡ−ＰＬを含むリン脂質は、培養物に含まれるすべてのリン脂質の構成要素として含まれる脂肪酸の総量における分岐型脂肪酸であるイソパルミチン酸の組成比が５％以下であり、かつ、当該脂肪酸の総量におけるアラキドン酸の組成比が１３％以上であってよい。好ましくは、イソパルミチン酸の組成比は０．５％以下または０．１％以下であってよく、アラキドン酸の組成比は２０％以上または２５％以上であってもよい。
【００５２】
さらに、本発明の方法により得られるＬＣＰＵＦＡ−ＰＬを含むリン脂質は、培養物に含まれるすべてのリン脂質の構成要素として含まれる脂肪酸の総量における分岐型脂肪酸であるイソパルミチン酸の組成比が５％以下であり、かつ、当該脂肪酸の総量におけるアラキドン酸の組成比に対する該イソパルミチン酸の組成比が１／６以下であってよい。好ましくは、イソパルミチン酸の組成比は０．５％以下または０．１％以下であってよく、アラキドン酸の組成比に対するイソパルミチン酸の組成比は１／１０以下または１／２０以下であってもよい。
【００５３】
本発明にかかる製造方法で得られるリン脂質について、乾燥菌体１ｇ中に含まれるすべてのリン脂質の構成要素として含まれる脂肪酸量は、特に限定されるものではないが、３４．７ｍｇ以上であることが好ましく、３６．３ｍｇ以上であることがより好ましく、４７．７ｍｇ以上であることがさらに好ましく、６５．２ｍｇ以上であることが特に好ましい。
【００５４】
本発明の方法で得られるＬＣＰＵＦＡ−ＰＬの構成要素のＬＣＰＵＦＡとしてアラキドン酸（ＡＲＡ）が含まれている場合、乾燥菌体１ｇ中に含まれるすべてのリン脂質の構成要素として含まれるＡＲＡ量は、特に限定されるものではないが、１２．１ｍｇ以上であることが好ましく、１５．１ｍｇ以上であることがより好ましく、１９．９ｍｇ以上であることがさらに好ましい。
【００５５】
また、本発明の方法で得られるＬＣＰＵＦＡ−ＰＬの構成要素のＬＣＰＵＦＡとしてジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）が含まれている場合、乾燥菌体１ｇ中に含まれるすべてのリン脂質の構成要素として含まれるＤＧＬＡ量は、特に限定されるものではないが、１．５ｍｇ以上であることが好ましく、１．８ｍｇ以上であることがより好ましく、２．０ｍｇ以上であることがさらに好ましい。
【００５６】
本発明の方法で得られるＬＣＰＵＦＡ−ＰＬがフォスファチジルコリン（ＰＣ）である場合、乾燥菌体１ｇ中に含まれるすべてのＰＣの構成要素として含まれる脂肪酸量は、特に限定されるものではないが、５．９９ｍｇ以上、好ましくは１０．０ｍｇ以上、より好ましくは１５．０ｍｇ以上、さらに好ましくは２０．０ｍｇ以上である。また、本発明の方法で得られるＬＣＰＵＦＡ−ＰＬがフォスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）である場合、乾燥菌体１ｇ中に含まれるすべてのＰＥの構成要素として含まれる脂肪酸量は、特に限定されるものではないが、７．６２ｍｇ以上、好ましくは１０．０ｍｇ以上、より好ましくは１５．０ｍｇ以上、さらに好ましくは２０．０ｍｇ以上である。さらに、本発明の方法で得られるＬＣＰＵＦＡ−ＰＬがフォスファチジルセリン（ＰＳ）である場合、乾燥菌体１ｇ中に含まれるすべてのＰＳの構成要素として含まれる脂肪酸量は、特に限定されるものではないが、１．０９ｍｇ以上、好ましくは２．０ｍｇ以上、より好ましくは３．０ｍｇ以上である。
【００５７】
本発明の方法により得られるＬＣＰＵＦＡ−ＰＬに、アラキドン酸（ＡＲＡ）を構成要素として含むフォスファチジルコリン（ＡＲＡ−ＰＣ）が含まれる場合、すべてのホスファチジルコリンの構成要素として含まれるアラキドン酸量は、特に限定されるものではないが、乾燥菌体１ｇあたり１．０ｍｇ以上、好ましくは１．０８ｍｇ以上、より好ましくは４．０ｍｇ以上、さらに好ましくは５．０ｍｇ以上である。また、本発明の方法により得られるＬＣＰＵＦＡ−ＰＬに、ＡＲＡを構成要素として含むフォスファチジルエタノールアミン（ＡＲＡ−ＰＥ）が含まれる場合、すべてのホスファチジルエタノールアミンの構成要素として含まれるアラキドン酸量は、特に限定されるものではないが、乾燥菌体１ｇあたり０．５ｍｇ以上、好ましくは１．３５ｍｇ以上、より好ましくは２．０ｍｇ以上、さらに好ましくは３．０ｍｇ以上、特に好ましくは５．０ｍｇ以上である。さらに、本発明の方法により得られるＬＣＰＵＦＡ−ＰＬに、ＡＲＡを構成要素として含むフォスファチジルセリン（ＡＲＡ−ＰＳ）が含まれる場合、すべてのホスファチジルセリンの構成要素として含まれるアラキドン酸量は、特に限定されるものではないが、乾燥菌体１ｇあたり０．０５ｍｇ以上、好ましくは０．０６ｍｇ以上、より好ましくは０．１５ｍｇ以上、さらに好ましくは０．３ｍｇ以上、特に好ましくは０．４ｍｇ以上である。
【００５８】
本発明の方法により得られるＬＣＰＵＦＡ−ＰＬに、ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）を構成要素として含むフォスファチジルコリン（ＤＧＬＡ−ＰＣ）が含まれる場合、すべてのホスファチジルコリンの構成要素として含まれるＤＧＬＡ量は、特に限定されるものではないが、乾燥菌体１ｇあたり０．１１ｍｇ以上、好ましくは０．３ｍｇ以上、より好ましくは０．６ｍｇ以上である。本発明の方法により得られるＬＣＰＵＦＡ−ＰＬに、ＤＧＬＡを構成要素として含むフォスファチジルエタノールアミン（ＤＧＬＡ−ＰＥ）が含まれる場合、すべてのホスファチジルエタノールアミンの構成要素として含まれるＤＧＬＡ量は、特に限定されるものではないが、乾燥菌体１ｇあたり０．１ｍｇ以上、好ましくは０．３ｍｇ以上、より好ましくは０．５ｍｇ以上である。
【００５９】
また、本発明の方法により得られる培養物は、ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬの他にＬＣＰＵＦＡを構成要素として含むトリグリセリドを含んでおり、含まれる割合も特に限定されないが、本発明の方法により培養された培養物はそれ以外の方法により培養された培養物と比較してＬＣＰＵＦＡ−ＰＬの含有率が高められている。培養物中のＬＣＰＵＦＡ−ＰＬの含有率が高められていることは、例えば、リン脂質の構成要素として含まれるアラキドン酸（ＡＲＡ−ＰＬ）とトリグリセリドの構成要素として含まれるアラキドン酸（ＡＲＡ−ＴＧ）の比を評価することで行うことができる。本発明の方法により得られる培養物においては、例えば、ＡＲＡ−ＰＬとＡＲＡ−ＴＧの比（ＡＲＡ−ＰＬ／ＡＲＡ−ＴＧ）は、０．２以上であり、好ましくは０．８４以上であり、より好ましくは１．０５以上であり、さらに好ましくは１．７０以上である。
【発明の効果】
【００６０】
本発明にかかる製造方法を用いてＬＣＰＵＦＡを構成要素として含むリン脂質（ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬ）を生成し得るモルティエレラ属を培養することにより、短期間でＬＣＰＵＦＡ−ＰＬを上記菌体内に多量に蓄積させることができる。その上、本発明にかかる培養法で製造された菌体中のリン脂質は、分岐脂肪酸の含有量が少ない。それ故、その菌体を供給原料としてＬＣＰＵＦＡ−ＰＬを抽出することにより、これまで限られた供給源から少量しか得られないため、供給量も不安定で、品質も必ずしも安定していなかったＬＣＰＵＦＡ−ＰＬを、より安心して食品や動物飼料に用いることができる高品質の工業製品として効率的かつ安定的に提供することが可能となる。
【実施例】
【００６１】
以下、本発明を比較例、実施例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。また以下比較例、実施例にて示されるリン脂質とは、シリカゲルカラムにおいて、クロロホルム洗浄では溶出されず、その後のメタノール溶出によって回収される画分、または、ヘキサン：ジエチルエーテル＝７：３を展開溶媒としたシリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）において、スポット位置から全く移動しない画分と定義する。
実施例１：分岐脂肪酸（イソパルミチン酸(iso16：0)）の生産性
酵母エキス１％、グルコース４％を含む培地（ｐＨ６．３）２０ｍＬを１００ｍＬのマイヤーフラスコに作製し１２０℃で２０分間殺菌した。コニディオボラス属に属する２菌株、コニディオボラス・スロモボイデス（Conidiobolus thromoboides）ＣＢＳ１８３．６０、およびコニディオボラス・ナノデス（Conidiobolusnanodes）ＣＢＳ１５４．５６、ならびに、表１に示すモルティエレラ属に属する菌株Ａ〜Ｅを培地に１白金耳接種し、往復振盪１２０ｒｐｍ、温度２８℃の条件にて７日間培養した。培養終了後、濾過により菌体を回収し、十分水洗した後、凍結乾燥で一晩乾燥させ乾燥菌体を得た。
【００６２】
得られた乾燥菌体に４ｍＬのクロロホルム／メタノール＝２：１混合溶媒を加え、７０℃で１時間緩やかに攪拌し有機溶媒層を回収後、再び４ｍＬの上記混合溶媒を加えて有機溶媒層をすべて集めた。この有機溶媒を遠心エバポレーターで留去することにより総脂質画分を得た。得られた総脂質画分は、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にて、トリグリセリド（ＴＧ）およびリン脂質（ＰＬ）に分画した。展開溶媒はヘキサン：エチルエーテル＝７：３（ｖ／ｖ）の混合溶媒とした。両画分をそれぞれかき取り、塩酸メタノール法でメチルエステルに誘導してガスクロマトグラフィーにより脂肪酸の定性および定量を行った。内部標準にはペンタデカン酸を用いた。
【００６３】
その結果を表２に示す。なお、表２中の重量はすべて乾燥菌体１ｇあたりの量を示す。
【００６４】
【表１】
2007209272.tif 000002
【００６５】
【表２】
2007209272.tif 000003
【００６６】
モルティエレラ属では、アラキドン酸を高割合で含み、かつコニディオボラス属に比較して分岐型脂肪酸の含有率の低いリン脂質を蓄積することが確認できた。
実施例２：モルティエレラ属におけるＬＣＰＵＦＡ含有リン脂質組成
酵母エキス１％、グルコース４％を含む培地（ｐＨ６．３）４ｍＬを２０ｍＬのマイヤーフラスコに作製し１２０℃で２０分間殺菌した。表１に示す菌株Ａ、Ｂ、ＤおよびＥを培地に１白金耳接種し、往復振盪１２０ｒｐｍ、温度２８℃の条件にて７日間培養を行い、乾燥菌体Ａ’、Ｂ’、Ｄ’およびＥ’を得た。またソーヤフラワー１％、グルコース１．５％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．３％を含む培地（ｐＨ５．０）４ｍｌを２０ｍｌのマイヤーフラスコに作製後、表１に示す菌株Ｃを植菌し、上記と同様に培養を行い乾燥菌体Ｃ’を得た。
【００６７】
実施例１と同様にして得た総脂質画分を、クロロホルム：メタノール：酢酸：水＝５０：３７．５：３．５：２（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）の展開溶媒を用いたＴＬＣを行い、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、カルジオリピン（ＣＬ）の各リン脂質画分に分画し、実施例１と同様の方法により脂肪酸の定性および定量を行った。
【００６８】
その結果を表３に示す。なお表３中の重量はすべて乾燥菌体１ｇあたりの量を示す。
【００６９】
【表３】
2007209272.tif 000004
【００７０】
実施例３：リン酸塩添加培養
ソーヤフラワー１％、グルコース３％、更に表４に示す６種類の濃度のＫＨ２ＰＯ４を含む培地（ｐＨ６．３）４ｍＬを２０ｍＬのマイヤーフラスコに作製し、１２０℃で２０分間殺菌した。モルティエレラ・スクムケリ（Mortierella schmuckeri）ＮＲＲＬ２７６１とモルティエレラ・アルピナ（Mortierellaalpina）ＣＢＳ２２４．３７の胞子懸濁液を上記培地に植菌し、往復振盪１２０ｒｐｍ、温度２８℃の条件にて５日間培養した。培養終了後、実施例１と同様の方法にて凍結乾燥菌体より総脂質を抽出し、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｐｌｕｓカラムクロマトグラフィーによりトリグリセリド（ＴＧ）およびリン脂質（ＰＬ）に分画した。溶出溶媒としてはトリグリセリド溶出にクロロホルム、リン脂質溶出にメタノールを用い、この有機溶媒を遠心エバポレーターで留去することにより各画分を得た。分画後は、塩酸メタノール法でメチルエステルに誘導してガスクロマトグラフィーにより脂肪酸の定性および定量を行った。内部標準にはペンタデカン酸を用いた。
【００７１】
その結果を表４に示す。なお表４中の重量はすべて乾燥菌体１ｇあたりの量を示す。
【００７２】
【表４】
2007209272.tif 000005
【００７３】
培地中にリン酸塩を添加することによって、菌体あたりのリン脂質量、リン脂質中ＬＣＰＵＦＡ量が増えること、またその効果は、トリグリセリドよりもリン脂質において有効であることを確認した。
実施例４：初発低ｐＨ培養
ソーヤフラワー１％、グルコース１．５％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．３％を含む培地の初発ｐＨを７種類のｐＨ（ｐＨ４．０、ｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．３、ｐＨ７．０、ｐＨ８．０）に調整し、その培地４ｍＬを２０ｍＬのマイヤーフラスコに入れて１２０度で２０分殺菌した。モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）ＣＢＳ２２４．３７の胞子懸濁液を上記培地に植菌し、往復振盪１２０ｒｐｍ、温度２８℃の条件にて５日間培養した。培養終了後、実施例３と同様の方法にて凍結乾燥菌体より総脂質を抽出し、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｐｌｕｓカラムクロマトグラフィーによりトリグリセリド（ＴＧ）およびリン脂質（ＰＬ）に分画後、脂肪酸の定性および定量を行った。
【００７４】
その結果を表５および図１に示す。なお表５中の重量はすべて乾燥菌体１ｇあたりの量を示す。
【００７５】
【表５】
2007209272.tif 000006
【００７６】
初発ｐＨを下げることにより、リン脂質中のＬＣＰＵＦＡ割合の増加と、特に菌体あたりのリン脂質量、リン脂質中のＬＣＰＵＦＡ量の顕著な増加が認められた。
実施例５：培養後期の低ｐＨ制御
ソーヤフラワー１．５％、グルコース２％、ＫＨ２ＰＯ４０．３％を含む培地（ｐＨ５．０）５Ｌを１０Ｌジャーファメンターに入れ、１２０度で２０分殺菌した（培地Ｉ）。またソーヤフラワー１．５％、グルコース２％を含む培地（ｐＨ４．５）５Ｌを１０Ｌジャーファメンターに入れ、同様に１２０度で２０分殺菌した（培地ＩＩ）。モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）ＣＢＳ２２４．３７を接種し、通気量１ｖｖｍで６日間通気攪拌培養を行った。攪拌は、培養開始時は３００ｒｐｍで培養２日目より５００ｒｐｍに上げて行い、培養温度は、培養開始時は２８℃で培養３日目より２０℃に下げて行った。培養１日目に１．０％、２日目に０．７５％のグルコースを添加した。また培地ＩＩのみ、培養６日間を通して培地のｐＨが５．０以下となるよう、０．５ＮのＨ２ＳＯ４で制御を行った。培養終了後、実施例３と同様の方法にて総脂質の抽出、トリグリセリド（ＴＧ）およびリン脂質（ＰＬ）の分画、脂肪酸の定性および定量を行った。
【００７７】
培養５日目での結果を表６に示す。なお表６中の重量はすべて乾燥菌体１ｇあたりの量を示す。また、培養中のｐＨ変動を図２ａに、抽出されたリン脂質量の変化についてのｐＨ制御の効果を図２ｂに示す。
【００７８】
【表６】
2007209272.tif 000007
【００７９】
培養後半のｐＨ上昇を抑えた培養法（培地ＩＩ）の方が、乾燥菌体あたりのＬＣＰＵＦＡ量、特に培地あたりの生産性が優れており、１０Ｌジャーファーメンターで、培養後期のｐＨ上昇を抑制するｐＨ制御法が有効であることが分かった。
実施例６：攪拌制御
ソーヤフラワー１．０％、グルコース２％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．３％を含む培地（ｐＨ５．０）５Ｌを１０Ｌジャーファメンターに入れ、１２０度で２０分殺菌した。モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）ＣＢＳ２２４．３７を接種し、培養温度２８℃、通気量１ｖｖｍにて７日間通気攪拌培養を行った。攪拌は表７に示すように、培養２日目に４種類に変更して培養を継続し、２日目には０．５％のグルコースを添加した。培養終了後、実施例３と同様の方法にて総脂質の抽出、トリグリセリド（ＴＧ）およびリン脂質（ＰＬ）の分画、脂肪酸の定性および定量を行った。
【００８０】
培養４日目での結果を表７に示す。なお表７中の重量はすべて乾燥菌体１ｇあたりの量を示す。また、表７に示す攪拌パラメータＫＬＡとは単位液量あたりの所要攪拌動力Ｐ／Ｖ  （Ｗ／ｍ３）と通気線速度パラメータＶｓ（ｍ／ｓｅｃ）から定義される最大所要攪拌動力ＫＬＡ（＝（Ｐ／Ｖ）０．９５  Ｖｓ０．６７）［（Ｗ／ｍ３）０．９５（ｍ／ｓｅｃ）０．６７］を表す。
【００８１】
【表７】
2007209272.tif 000008
【００８２】
ＫＬＡを上げて培養液の流動性を高めることにより、リン脂質画分中のアラキドン酸割合、乾燥菌体あたりのアラキドン酸量ともに増加させることができた。
実施例７：低温培養
ソーヤフラワー１％、グルコース１．５％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．３％を含む培地（ＰＨ５．０）２０ｍＬを１００ｍＬのマイヤーフラスコに入れて１２０度で２０分殺菌した。モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）ＣＢＳ２２４．３７の胞子懸濁液を上記培地に植菌し、往復振盪１２０ｒｐｍ、温度２８℃で４日間培養後、培養温度を６種類（１０℃、１６℃、２０℃、２４℃、２８℃、３２℃）に変えて更に往復振盪１２０ｒｐｍで１８時間培養した。培養終了後、実施例３と同様の方法にて総脂質の抽出、トリグリセリド（ＴＧ）およびリン脂質（ＰＬ）への分画、脂肪酸の定性および定量を行った。その結果を表８および図３に示す。
【００８３】
また上記と同様の培地に、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）ＣＢＳ２２４．３７の胞子懸濁液を上記培地に植菌し、往復振盪１２０ｒｐｍ、温度２８℃で４日間培養後、培養温度を２０℃に下げ、さらに２時間、４時間、８時間、１２時間、１４時間、１８時間、培養した。培養終了後、実施例３と同様の方法にて総脂質の抽出、トリグリセリド（ＴＧ）およびリン脂質（ＰＬ）への分画、脂肪酸の定性および定量を行った。その結果を表９および図４に示す。
【００８４】
なお表８、表９中の重量はすべて乾燥菌体１ｇあたりの量を示す。
【００８５】
【表８】
2007209272.tif 000009
【００８６】
【表９】
2007209272.tif 000010
【００８７】
培養途中で低温へシフトさせることにより、リン脂質画分中のアラキドン酸割合、乾燥菌体あたりのアラキドン酸量ともに大きく増加し（表８、図３ａ）、その効果は４時間の低温培養から見られており、非常に短時間で有効であることが確認された（表９、図４）。また、アラキドン酸増加の効果は、トリグリセリド画分よりもリン脂質画分の方が大きく、「ＡＲＡ−ＰＬ／ＡＲＡ−ＴＧ」比の大きい油脂を菌体内に蓄積させることができた（表８、図３ｂ）。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】図１ａは、初発ｐＨと抽出されたリン脂質量の相関を示すグラフである。図１ｂは、初発ｐＨと抽出されたリン脂質中のアラキドン酸量の相関を示すグラフである。
【図２】図２ａは、培地Ｉおよび培地ＩＩの培養中のｐＨ変動を示すグラフである。●は培地Ｉ（ｐＨ制御なし）、■は培地ＩＩ（ｐＨ制御あり）を示す。図２ｂは、培養日数と抽出されたリン脂質量の相関を示すグラフである。○は培地Ｉ（ｐＨ制御なし）、□は培地ＩＩ（ｐＨ制御あり）を示す。
【図３】図３ａは、培養４日目に温度変更後の、リン脂質画分総脂肪酸中のアラキドン酸（ＡＲＡ）の割合を示すグラフである。図３ｂは、培養４日目に温度変更後の、トリグリセリド画分に存在するアラキドン酸に対するリン脂質画分に存在するアラキドン酸の比を示すグラフである。
【図４】図４は、培養４日目に２０℃に温度をシフトした後の培養時間に対するリン脂質画分総脂肪酸中のアラキドン酸（ＡＲＡ）の割合を示すグラフである。
【図１】
2007209272.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年2月8日(2007.2.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
長鎖高度不飽和脂肪酸を構成要素として含むリン脂質（ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬ）の製造方法であって、以下：
（ｉ）モルティエレラ属に属する微生物を、当該微生物の菌体中にＬＣＰＵＦＡ−ＰＬが蓄積する条件で培養し；そして
（ｉｉ）その培養物からＬＣＰＵＦＡ−ＰＬを得る、ここで、当該培養物に含まれるすべてのリン脂質（ＰＬ）の構成要素として含まれる脂肪酸の総量における分岐型脂肪酸であるイソパルミチン酸の組成比は５％以下である；
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
モルティエレラ属に属する微生物がモルティエレラ亜属である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
モルティエレラ属に属する微生物がモルティエレラ・アルピナである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
菌体中にＬＣＰＵＦＡ−ＰＬが蓄積する条件で培養することが、ｐＨ４〜ｐＨ１０の初発ｐＨを含む条件で培養することを含む、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
菌体中にＬＣＰＵＦＡ−ＰＬが蓄積する条件で培養することが、ｐＨ４〜ｐＨ６のｐＨを維持するように制御しながら培養することを含む、請求項１ないし４いずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
菌体中にＬＣＰＵＦＡ−ＰＬが蓄積する条件で培養することが、３．７ｍＭ〜１４７ｍＭのリン酸塩を含む培地中で培養することを含む、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
菌体中にＬＣＰＵＦＡ−ＰＬが蓄積する条件で培養することが、８．３以上の最大所要攪拌動力（ＫＬＡ＝（Ｐ／Ｖ）０．９５・Ｖｓ０．６７）で攪拌しながら培養することを含む、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
菌体中にＬＣＰＵＦＡ−ＰＬが蓄積する条件で培養することが、菌体を増殖させた後、１０〜２５℃で４〜１８時間培養することを含む、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
菌体中にＬＣＰＵＦＡ−ＰＬが蓄積する条件で培養することが、２８℃で２日間〜２０日間培養した後、１０〜２５℃で４〜１８時間培養することを含む、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
菌体中にＬＣＰＵＦＡ−ＰＬが蓄積する条件で培養することが、
（ａ）ｐＨ４〜ｐＨ１０の初発ｐＨを含む条件で培養すること；
（ｂ）ｐＨ４〜ｐＨ６のｐＨを維持するように制御しながら培養すること；
（ｃ）３．７ｍＭ〜１４７ｍＭのリン酸塩を含む培地中で培養すること；
（ｄ）８．３以上の最大所要攪拌動力（ＫＬＡ＝（Ｐ／Ｖ）０．９５・Ｖｓ０．６７）で攪拌しながら培養すること；および
（ｅ）菌体を増殖させた後または２８℃で２日間〜２０日間培養した後、１０〜２５℃で４〜１８時間培養すること；
からなる群から選択されるすくなくとも２つの培養条件を含む、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
培養物が、培養液もしくは滅菌処理した培養液、または、それらから集菌した培養菌体もしくはその乾燥菌体を含む、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸およびカルジオリピンからなる群より選択される少なくとも１種のグリセロリン脂質を含む、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
オメガ６系高度不飽和脂肪酸、オメガ３系高度不飽和脂肪酸、および、オメガ９系高度不飽和脂肪酸からなる群より選択される長鎖高度不飽和脂肪酸（ＬＣＰＵＦＡ）を構成要素として含むＬＣＰＵＦＡ−ＰＬを製造するための、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
オメガ６系高度不飽和脂肪酸が、１１，１４−エイコサジエン酸（２０：２、ω６）、８，１１，１４−エイコサトリエン酸（ジホモ−γ−リノレン酸；２０：３、ω６）、５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸（アラキドン酸；２０：４、ω６）、１３，１６−ドコサジエン酸（２２：２、ω６）、７，１０，１３，１６−ドコサテトラエン酸（２２：４、ω６）、および４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸（２２：５、ω６）からなる群より選択される１以上の脂肪酸である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
オメガ３系高度不飽和脂肪酸が、１１，１４，１７−エイコサトリエン酸（α−リノレン酸；２０：３、ω３）、８，１１，１４，１７−エイコサテトラエン酸（２０：４、ω３）、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸（２０：５、ω３）、７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸（２２：５、ω３）、および４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（２２：６、ω３）からなる群より選択される１以上の脂肪酸である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
オメガ９系高度不飽和脂肪酸が、５，８，１１−エイコサトリエン酸（ミード酸；２０：３、ω９）、７，１０，１３−ドコサトリエン酸（２２：３、ω９）、および４，７，１０，１３−ドコサテトラエン酸（２２：４、ω９）からなる群より選択される１以上の脂肪酸である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
アラキドン酸（５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸）およびドコサヘキサエン酸（４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸）からなる群より選択されるＬＣＰＵＦＡを構成要素として含むＬＣＰＵＦＡ−ＰＬを製造するための、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
分子中に少なくとも１つの共役二重結合を有するＬＣＰＵＦＡを構成要素として含むＬＣＰＵＦＡ−ＰＬを製造するための、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
培養物に含まれるすべてのリン脂質（ＰＬ）の構成要素として含まれる脂肪酸の総量における分岐型脂肪酸であるイソパルミチン酸の組成比が５％以下であり、かつ、当該脂肪酸の総量におけるアラキドン酸の組成比が１３％以上である、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
培養物に含まれるすべてのリン脂質（ＰＬ）の構成要素として含まれる脂肪酸の総量における分岐型脂肪酸であるイソパルミチン酸の組成比が５％以下であり、かつ、当該脂肪酸の総量におけるアラキドン酸の組成比に対する該イソパルミチン酸の組成比が１／６以下である、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬが、アラキドン酸を含むリン脂質を含み、そして培養物に含まれるすべてのリン脂質中のアラキドン酸量が、乾燥菌体１ｇあたり１１．８ｍｇ以上であることを特徴とする、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬが、ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）を含むリン脂質を含み、そして培養物に含まれるすべてのリン脂質中のＤＧＬＡ量が、乾燥菌体１ｇあたり１．５ｍｇ以上であることを特徴とする、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬが、アラキドン酸を含むホスファチジルコリンを含み、そして、培養物に含まれるすべてのホスファチジルコリンの構成要素として含まれるアラキドン酸量が、乾燥菌体１ｇあたり１．０ｍｇ以上であることを特徴とする、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬが、アラキドン酸を含むホスファチジルエタノールアミンを含み、そして、培養物に含まれるすべてのホスファチジルエタノールアミンの構成要素として含まれるアラキドン酸量が、乾燥菌体１ｇあたり０．５ｍｇ以上であることを特徴とする、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬが、アラキドン酸を含むホスファチジルセリンを含み、そして、培養物に含まれるすべてのホスファチジルセリンの構成要素として含まれるアラキドン酸量が、乾燥菌体１ｇあたり０．０５ｍｇ以上であることを特徴とする請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
培養物が、アラキドン酸を構成要素として含むリン脂質およびアラキドン酸を構成要素として含むトリグリセリドを含むが、ここで、リン脂質の構成要素として存在するアラキドン酸量のトリグリセリドの構成要素として存在するアラキドン酸量に対する比が０．２以上であることを特徴とする、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
また現在、アラキドン酸含有トリグリセリドの工業生産に用いられているモルティエレラ属（Mortierella sp.）においては、アラキドン酸生産のための種々の条件検討が積極的に行われており、なかでも各種ミネラル塩の添加や、培地のｐＨ、培養温度などによりアラキドン酸の生産性が向上することが報告されている。具体的には、各種ミネラル塩の添加が、菌体内に蓄積されるＬＣＰＵＦＡ含有トリグリセリドとＬＣＰＵＦＡ−ＰＬの生産性に影響することが分かっている（非特許文献１１）。また初発ｐＨに関しては、（１）培養の初発ｐＨが６．０〜６．６が至適であること(非特許文献１１)、（２）培養後期ではｐＨを上げることにより、アラキドン酸含有トリグリセリドの生産量が上がること（特許文献５）が知られているが、リン脂質画分に関して最適化された知見はない。更に培養温度に関しては、低温で５日以上培養することによりリン脂質中ＬＣＰＵＦＡ含有量が増加することが知られている（非特許文献１２）。しかしながらこのような長期の低温培養はコスト面からも工業生産としては不向きである上、上記の条件は何れもトリグリセリドの構成要素として存在するＬＣＰＵＦＡ生産に注目した培養条件であり、ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬの生産に特化した培養条件は未だ検討されていないのが実情である。このような培養方法で生産した菌体内では、ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬは著量のトリグリセリドに混入した微量成分として検出されているものの、その含有量は微量である上（１１．７ｍｇ／ｇ 乾燥菌体  非特許文献５参照）、トリグリセリド生産の副産物であるため品質や供給量が安定ではなく、ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬの十分な利用が期待できない。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
本発明の方法で用いる微生物
本発明の方法で用いる微生物は、モルティエレラ属に属し、ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬを生成し得る微生物であれば特に限定されるものではない。本発明の方法で用いるモルティエレラ属の微生物は、モルティエレラ亜属であることが好ましい。モルティエレラ亜属の微生物としては、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）、モルティエレラ・ポリセファラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｐｏｌｙｃｅｐｈａｌａ）、モルティエレラ・エキシグア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅｘｉｇｕａ）、モルティエレラ・フィグロフィラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）、モルティエレラ・エロンガタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅｌｏｎｇａｔａ）等が含まれる。より好ましくは、本発明の方法で用いるモルティエレラ属の微生物は、モルティエレラ・アルピナである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
ＡＲＡ−ＰＬの生産能を有するモルティエレラ亜属の微生物のより具体的な菌株としては、例えば、モルティエレラ・ポリセファラ（Ｍ． ｐｏｌｙｃｅｐｈａｌａ）ＩＦＯ６３３５、モルティエレラ・エロンガタ（Ｍ． ｅｌｏｎｇａｔａ）ＣＢＳ１２５．７１、モルティエレラ・エキシグア（Ｍ． ｅｘｉｇｕａ）ＩＦＯ８５７１、モルティエレラ・ベルヤコバ（Ｍ． ｂｅｌｊａｋｏｖａｅ）ＣＢＳ６０１．６８、モルティエレラ・スクムケリ（Ｍ． ｓｃｈｍｕｃｋｅｒｉ）ＮＲＲＬ２７６１、モルティエレラ・フィグロフィラ（Ｍ． ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）ＩＦＯ５９４１、モルティエレラ・アルピナ（Ｍ． ａｌｐｉｎａ）ＩＦＯ８５６８、ＡＴＣＣ１６２６６、ＡＴＣＣ３２２２１、ＡＴＣＣ４２４３０、ＣＢＳ２１９．３５、ＣＢＳ２２４．３７、ＣＢＳ２５０．５３、ＣＢＳ３４３．６６、ＣＢＳ５２７．７２、ＣＢＳ５２９．７２、ＣＢＳ６０８．７０、ＣＢＳ７５４．６８等を挙げることができる。これらの菌株は、何れも大阪市の財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）米国のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection, ＡＴＣＣ）および、Centrralbureau voor Schimmelcultures（ＣＢＳ）等から何ら制限なく入手することができる。さらに、ＡＲＡ−ＰＬの生産能を有するモルティエレラ亜属の他の菌株としては、本発明者らを含む研究グループが土壌から分離した菌株モルティエレラ・エロンガタ（Ｍ． ｅｌｏｎｇａｔａ）ＳＡＭ０２１９（微工研菌寄第８７０３号）（微工研条寄第１２３９号）を挙げることもできる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
また、ＬＣＰＵＦＡとしてジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）を構成要素として含むＬＣＰＵＦＡ−ＰＬ（ＤＧＬＡ−ＰＬと略す）の生産能を有する微生物のより具体的な菌株としては、本発明者らを含む研究グループが土壌から分離した菌株モルティエレラ・エロンガタ（M. elongata）ＳＡＭ１８６０（微工研条寄第３５８９号）を挙げることができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
そして、ＬＣＰＵＦＡとしてミード酸を構成要素として含むＬＣＰＵＦＡ−ＰＬ（ミード酸−ＰＬと略す）の生産能を有する微生物のより具体的な菌株としては、本発明者らを含む研究グループが土壌から分離した菌株モルティエレラ・アルピナ（M. alpina）ＳＡＭ２０８６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７６６）を挙げることができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
上記炭素源・窒素源以外の成分も特に限定されるものではなく、必要に応じて、公知の微量栄養源等を適宜選択して添加することができる。微量栄養源としては、例えば、リン酸イオン、カルシウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン等のアルカリ金属またはアルカリ土類金属のイオン；鉄、ニッケル、コバルト、マンガン等のＶＩＩＢ〜ＶＩＩＩ族の金属イオン；銅、亜鉛等のＩＢ〜ＩＩＢ族の金属イオン；各種ビタミン類；等を挙げることができる。液体培地における上述した各成分の含有率（添加率）は特に限定されるものではなく、本発明の方法に用いる微生物の生育を阻害しない濃度であれば、公知の範囲内とすればよい。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
培養液のｐＨは、本発明の方法に用いる微生物の生育を阻害しない範囲であれば特に限定されるものではない。例えば、初発ｐＨは、ｐＨ４〜ｐＨ１０の範囲であればよく、好ましくは弱酸性であるｐＨ４〜ｐＨ６であり、さらに好ましくはｐＨ４〜ｐＨ５に調製する。培養中のｐＨは制御しても、制御しなくてもよい。本発明の方法の好ましい態様においては、培養中のｐＨを制御する。本発明に用いるモルティエレラ属を液体培地で培養を行った場合、培養後期、特に炭素源の枯渇後に培養液中のｐＨが上昇する。このｐＨ上昇を抑え、培養開始から培養期間を通してｐＨ４〜ｐＨ６、好ましくはｐＨ４〜ｐＨ５．５の低い範囲内のｐＨを維持するよう制御して培養することにより、菌体内に蓄積するリン脂質の量を高めることができ、それにより菌体あたりのＬＣＰＵＦＡ−ＰＬ量を増やすことができる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
培養中に培地に施す外的な処理も特に限定されるものではなく、通気攪拌培養、振盪培養、静置培養等の公知の培養方法を適宜選択すればよい。特に通気攪拌培養においては、攪拌により培養液の流動性を高めることでＬＣＰＵＦＡ−ＰＬの生産性を上げることができ、その場合の最大所要攪拌動力ＫＬＡ（＝（Ｐ／Ｖ）０．９５・Ｖｓ０．６７）は８．０以上、好ましくは８．３以上である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
本発明の方法により製造されるリン脂質に構成要素として含まれるＬＣＰＵＦＡとしては、炭素数２０以上で二重結合を有する不飽和構造の脂肪酸であればよく、特に限定されるものではない。好ましくは、オメガ９（ω９）系高度不飽和脂肪酸、オメガ６（ω６）系高度不飽和脂肪酸、およびオメガ３（ω３）系高度不飽和脂肪酸からなる群より選択されるＬＣＰＵＦＡである。ここで、ω９系、ω６系、ω３系とは、不飽和脂肪酸の二重結合の位置に応じた系統である。具体的には、ω９系、ω６系、ω３系とは、脂肪酸のカルボキシル基と反対側の炭素から番号付けをしたときに、それぞれ、９位、６位、３位に二重結合を有する不飽和脂肪酸の系統を意味する。具体的なＬＣＰＵＦＡとしては、例えば、ω９系高度不飽和脂肪酸では、５，８，１１−エイコサトリエン酸（ミード酸；２０：３、ω９）；７，１０，１３−ドコサトリエン酸（２２：３、ω９）；４，７，１０，１３−ドコサテトラエン酸（２２：４、ω９）等を挙げることができる。また、ω６系高度不飽和脂肪酸では、１１，１４−エイコサジエン酸（２０：２、ω６）；８，１１，１４−エイコサトリエン酸（ジホモ−γ−リノレン酸；２０：３、ω６）；５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸（アラキドン酸；２０：４、ω６）；１３，１６−ドコサジエン酸（２２：２、ω６）；７，１０，１３，１６−ドコサテトラエン酸（２２：４、ω６）；４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸（２２：５、ω６）等を挙げることができる。ω３系高度不飽和脂肪酸では、１１，１４，１７−エイコサトリエン酸（α−リノレン酸；２０：３、ω３）；８，１１，１４，１７−エイコサテトラエン酸（２０：４、ω３）；５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸（２０：５、ω３）；７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸（２２：５、ω３）；４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（２２：６、ω３）、等を挙げることができる。なお、上記の各ＬＣＰＵＦＡの名称の後のかっこ内でコロンを間に挟んだ２つの数字は、脂肪酸の炭素鎖長および不飽和度を表すものであり、「（炭素鎖長）：（二重結合の数）」を示している。上記ＬＣＰＵＦＡの中でも、アラキドン酸（ＡＲＡ）および／または４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）がより好ましく用いられる。これらのＬＣＰＵＦＡは、ＬＣＰＵＦＡ−ＰＬの構成要素として１種類のみ含まれてもよいし、２種類以上含まれてもよい。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
以下、本発明を比較例、実施例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。また以下比較例、実施例にて示されるリン脂質とは、シリカゲルカラムにおいて、クロロホルム洗浄では溶出されず、その後のメタノール溶出によって回収される画分、または、ヘキサン：ジエチルエーテル＝７：３を展開溶媒としたシリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）において、スポット位置から全く移動しない画分と定義する。
実施例１：分岐脂肪酸（イソパルミチン酸(iso16：0)）の生産性
酵母エキス１％、グルコース４％を含む培地（ｐＨ６．３）２０ｍＬを１００ｍＬのマイヤーフラスコに作製し１２０℃で２０分間殺菌した。コニディオボラス属に属する２菌株、コニディオボラス・スロモボイデス（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｔｈｒｏｍｏｂｏｉｄｅｓ）ＣＢＳ１８３．６０、およびコニディオボラス・ナノデス（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｎａｎｏｄｅｓ）ＣＢＳ１５４．５６、ならびに、表１に示すモルティエレラ属に属する菌株Ａ〜Ｅを培地に１白金耳接種し、往復振盪１２０ｒｐｍ、温度２８℃の条件にて７日間培養した。培養終了後、濾過により菌体を回収し、十分水洗した後、凍結乾燥で一晩乾燥させ乾燥菌体を得た。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
実施例３：リン酸塩添加培養
ソーヤフラワー１％、グルコース３％、更に表４に示す６種類の濃度のＫＨ２ＰＯ４を含む培地（ｐＨ６．３）４ｍＬを２０ｍＬのマイヤーフラスコに作製し、１２０℃で２０分間殺菌した。モルティエレラ・スクムケリ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｓｃｈｍｕｃｋｅｒｉ）ＮＲＲＬ２７６１とモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）ＣＢＳ２２４．３７の胞子懸濁液を上記培地に植菌し、往復振盪１２０ｒｐｍ、温度２８℃の条件にて５日間培養した。培養終了後、実施例１と同様の方法にて凍結乾燥菌体より総脂質を抽出し、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｐｌｕｓカラムクロマトグラフィーによりトリグリセリド（ＴＧ）およびリン脂質（ＰＬ）に分画した。溶出溶媒としてはトリグリセリド溶出にクロロホルム、リン脂質溶出にメタノールを用い、この有機溶媒を遠心エバポレーターで留去することにより各画分を得た。分画後は、塩酸メタノール法でメチルエステルに誘導してガスクロマトグラフィーにより脂肪酸の定性および定量を行った。内部標準にはペンタデカン酸を用いた。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
【表４】
2007209272.tif 000015
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
ＫＬＡを上げて培養液の流動性を高めることにより、リン脂質画分中のアラキドン酸割合、乾燥菌体あたりのアラキドン酸量ともに増加させることができた。
実施例７：低温培養
ソーヤフラワー１％、グルコース１．５％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．３％を含む培地（ｐＨ５．０）２０ｍＬを１００ｍＬのマイヤーフラスコに入れて１２０度で２０分殺菌した。モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）ＣＢＳ２２４．３７の胞子懸濁液を上記培地に植菌し、往復振盪１２０ｒｐｍ、温度２８℃で４日間培養後、培養温度を６種類（１０℃、１６℃、２０℃、２４℃、２８℃、３２℃）に変えて更に往復振盪１２０ｒｐｍで１８時間培養した。培養終了後、実施例３と同様の方法にて総脂質の抽出、トリグリセリド（ＴＧ）およびリン脂質（ＰＬ）への分画、脂肪酸の定性および定量を行った。その結果を表８および図３に示す。