(57)【要約】  【課題】多種類の機能性原子団と多種類のジンクフィンガーモチーフを有する多種類のナノ素子が、チオールエステル基とシステインとのケミカルライゲーション反応を用いるだけで、同一化学反応を用いて統一的に容易に製造することができる新規機能性原子団含有チオールエステル化合物を提供する。  【解決手段】機能性を有する原子団の末端に、アミノ酸３〜１０個有する第１のアミノ酸配列、および、アミノ酸１〜４個有するアミノ酸配列で、その末端にチオールエステル基を有する第２のアミノ酸配列、を有する機能性原子団含有チオールエステル化合物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性を有する原子団の末端に、アミノ酸３〜１０個有する第１のアミノ酸配列、および、アミノ酸１〜４個有するアミノ酸配列で、その末端にチオールエステル基を有する第２のアミノ酸配列、を有する機能性原子団含有チオールエステル化合物。
【請求項２】
前記機能性原子団含有チオールエステル化合物が下記式（１）で示されることを特徴とする請求項1記載の機能性原子団含有チオールエステル化合物。
式（１）
【化１】
2007084468.tif 000018
［式中、Ｘは、ＹまたはＦであり、Ｒｌは水素原子、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、またはカルバモイル基であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい、アルキル基、アリール基、または複素環基であり、Ｒ３は、水素原子またはアルキル基で、Ｍは、Ｒｕｎ＋、Ｏｓn＋、Ｆｅn＋，またはＣｏn＋であり、ここでnは、１〜３の整数である。（なお、ＴＧＥＫＰ−ＸＧ−は、それぞれＴ、Ｇ、Ｅ、Ｋ、Ｐ、とＸ、Ｇアミノ酸一文字表記からなるアミノ酸配列を示し、以下、同様に表記する。）］
【請求項３】
式（１）中、ＭがＲｕｎ＋（ｎ＝１，２，３）又はＯｓｎ＋（ｎ＝１，２，３）である、請求項２記載の機能性原子団含有チオールエステル化合物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の機能性原子団含有チオールエステル化合物のチオールエステル基と、二重鎖ＤＮＡの特定の標的塩基配列に特異的に結合するジンクフィンガーモチーフを有しＮ末がＣｙｓ（三文字表記アミノ酸、以下同様に表記する。）であるポリペプチドとを反応させる、機能性原子団−ジンクフィンガーモチーフ含有ポリペプチドの製造方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、以下の配列番号のポリペプチドである請求項４記載の機能性原子団−ジンクフィンガーモチーフ含有ポリペプチドの製造方法。
配列番号１：CRICGRNFSRSDDLTRHIRTHTGEKPYG-CRICGRNFSRSDHLTRHIRTHTG
配列番号２：
CRICGRNFSRSDDLTRHIRTHTGEKPYG-CRICGRNFSRSDDLTRHIRTHTGEKPYG
配列番号３：CRICGRNFSRSDDLTRHIRTHTG
配列番号４：CRICGRNFSRSDDLTRHIRTHTGEKPYG
【請求項６】
前記ポリペプチドが、ジンクフィンガーモチーフを２または３個有する請求項４または５記載の機能性原子団−ジンクフィンガーモチーフ含有ポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジンクフィンガーモチーフ（以下、ＺＦと表記することがある）と二重鎖ＤＮＡとの相互作用を用いてエネルギー原子団をナノメータースケールの大きさで配列させたナノ素子を製造する技術に関する。特に、機能の中心となる電子移動性原子団、色素原子団等の機能性原子団に特定のリンカーが結合した新規化合物と、機能性原子団−ジンクフィンガーモチーフ含有ポリペプチドを製造する方法とに関するものである。
【０００２】
本発明の化合物、製造方法を用いれば、電子移動性原子団、色素原子団等の機能性原子団を、二重鎖ＤＮＡ上の標的塩基配列には結合するが、当該ＤＮＡ上でも標的塩基配列以外の配列には結合しないＤＮＡ結合モチーフを含むポリペプチドに結合させたＤＮＡ結合分子であるナノ素子を容易に製造できる。
【背景技術】
【０００３】
ジンクフィンガーモチーフを利用してＤＮＡを部位特異的に切断する人工制限酵素が開発されている。ＤＮＡ切断能を有する原子団としてニッケル（例えば、非特許文献１参照。）が用いられている。
また、色素原子団を、金属および半導体電極を始めとする基板に垂直方向に積み上げることによってナノ素子を製造する研究は、ラングミュアー・ブロジェット法を用いて広くおこなわれ、ＳＴＭを利用して基板上に原子レベルの大きさで文字を書く技術や、ＡＰＴＥＳ（２−Aminopropyl triethoxysilane）等を介して共有結合によって電子移動原子団、色素原子団等の機能性錯体原子団を金属オキサイド基板に垂直に積み上げる技術はよく知られている。
【０００４】
核酸塩基に色素原子団を直接共有結合させ、色素原子団を二重鎖ＤＮＡ上に配列してフオトニック・ワイヤ（photonic wire）を形成した例がある（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００５】
【非特許文献１】M. Nagaoka et al., “A novel zinc finger-based DNA cutter: Biosynthetic design and highly selective DNA ckeavage. J. Am. Chem. Soc, 1994, 116, 4085-4086.
【非特許文献２】Heilemann, M.; Tinnefeld, P; Sanchez Mosteiro, G.; Garcia Parajo, M.; VIan Hulst, N・F; Sauer M. J. Am. Chem. 2004, 124, 6514・6615.
【０００６】
上記公知の技術とは異なり、本発明者は、電子移動原子団、色素原子団等の機能性原子団を、二重鎖ＤＮＡ基体上の特定の位置に所望の順序で複数個配列させることができ、これら原子団をＮＡ基体上にÅ（オングストローム）オーダーで所望の近接した位置に定位することができるナノ素子およびその製造方法を出願しているが、これらは公知ではない（特願２００４−１９５０４８号、特願２００４−１９５０７１号、これらの明細書を引用し、本発明の内容とする）。
【０００７】
このようなナノ素子の製造は、それぞれのナノ素子の構造と特徴に応じて１つ１つ製造されるものであり、特にジンクフィンガーモチーフを利用するナノ素子では、機能性原子団等の化合物とポリペプチドとの反応を個々の化合物やポリペプチドの構造に応じて、多種類の化学反応を組み合わせて用いてそれぞれ製造する必要があり、製造が非常に煩雑である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記の従来技術における問題点を解決し、ナノ素子を簡便・容易に製造するために有用な新規な機能性原子団含有チオールエステル化合物を提供し、該化合物を用いる機能性原子団−ジンクフィンガーモチーフ含有ポリペプチドの製造方法を提供することを目的とする。
ナノ素子は、電子移動原子団、色素原子団等の機能性原子団を、二重鎖ＤＮＡ基体上の特定の位置に所望の順序で複数個配列させることができ、これら原子団をＤＮＡ基体上にÅ（オングストローム）オーダーで所望の近接した位置に定位しているので電子産業の分野において高密度配線や高集積回路を実現するための開発・研究に有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち本発明は、以下の化合物とそれを用いる製造方法を提供する。
（１）機能性を有する原子団の末端に、アミノ酸３〜１０個有する第１のアミノ酸配列、および、アミノ酸１〜４個有するアミノ酸配列で、その末端にチオールエステル基を有する第２のアミノ酸配列、を有する機能性原子団含有チオールエステル化合物。
すなわち、
Ｆａｇ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３で表され、
ここで、Ｆａｇ：機能性を有する原子団
Ｌ１：２価の連結基
Ｌ２：アミノ酸３〜１０個有する第１のアミノ酸配列
Ｌ３：アミノ酸１〜４個有するアミノ酸配列で、その末端にチオールエステル基を有する第２のアミノ酸配列である。
（２）上記Ｌ２：第１のアミノ酸配列が、ＴＧＥＫＰ（配列番号５）であり、
上記Ｌ３：第２のアミノ酸配列が、ＸＧ−チオールエステル基
である、上記（１）に記載の機能性原子団含有チオールエステル化合物。
（ここでＴＧＥＫＰ−ＸＧ−は、それぞれＴ、Ｇ、Ｅ、Ｋ、Ｐ、とＸ、Ｇアミノ酸一文字表記からなるアミノ酸配列を示し、Ｘは、ＹまたはＦ（一文字表記アミノ酸）であり、以下、同様の表記とする。）。
【００１０】
（３）前記機能性原子団含有チオールエステル化合物が下記式（１）で示される上記（1）に記載の機能性原子団含有チオールエステル化合物。
式（１）
【００１１】
【化２】
2007084468.tif 000002
［式中、Ｘは、ＹまたはＦであり、Ｒｌは水素原子、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、またはカルバモイル基であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい、アルキル基、アリール基、または複素環基であり、Ｒ３は、水素原子またはアルキル基で、Ｍは、Ｒｕｎ＋、Ｏｓn＋、Ｆｅn＋，またはＣｏn＋であり、ここでnは、１〜３の整数である。］
【００１２】
（４）上記式（１）中、ＭがＲｕｎ＋（ｎ＝１，２，３）又はＯｓｎ＋（ｎ＝１，２，３）である、上記（２）記載の機能性原子団含有チオールエステル化合物。
【００１３】
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の機能性原子団含有チオールエステル化合物のチオールエステル基と、二重鎖ＤＮＡの特定の標的塩基配列に特異的に結合するジンクフィンガーモチーフを有しＮ末がＣｙｓ（三文字表記アミノ酸、以下同様に表記する。）であるポリペプチドとを反応させる、機能性原子団−ジンクフィンガーモチーフ含有ポリペプチドの製造方法。
【００１４】
（６）上記（５）のポリペプチドが、以下の配列番号のポリペプチドである上記（５）記載の機能性原子団−ジンクフィンガーモチーフ含有ポリペプチドの製造方法。
配列番号１：CRICGRNFSRSDDLTRHIRTHTGEKPYG-CRICGRNFSRSDHLTRHIRTHTG
配列番号２：
CRICGRNFSRSDDLTRHIRTHTGEKPYG-CRICGRNFSRSDDLTRHIRTHTGEKPYG
配列番号３：CRICGRNFSRSDDLTRHIRTHTG
配列番号４：CRICGRNFSRSDDLTRHIRTHTGEKPYG
【００１５】
（７）上記ポリペプチドが、ジンクフィンガーモチーフを２または３個有する上記（５）または（６）に記載の機能性原子団−ジンクフィンガーモチーフ含有ポリペプチドの製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
１）機能性原子団を含むチオールエステル化合物、Ｎ末にシステインを有するジンクフィンガーモチーフ含有ポリペプチドをそれぞれ合成しておき、それぞれのグループから任意の1つを選択して室温で混合することにより、ケミカルライゲーション法により機能性原子団を有するジンクフィンガーポリペプチドを合成できる。２）このケミカルライゲーション法では、ジンクフィンガーポリペプチドはフリーであっても、または、すでにＤＮＡに結合している状態でもかまわないので、末端にシステイン残基を有するジンクフィンガーポリペプチドを先にＤＮＡに結合しておき、後で本発明の機能性原子団を有するチオールエステル化合物を反応させて、ＤＮＡに機能性原子団を導入できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、機能性原子団にリンカーが結合した機能性原子団含有チオールエステル化合物とその用途に関する。本発明の機能性原子団含有チオールエステル化合物と、ジンクフィンガーモチーフ含有ポリペプチドを、それぞれ合成しておき、それぞれのグループから任意の1つを選択して容易に所望の、多種類の機能性原子団と多種類のジンクフィンガーモチーフを有する多種類のナノ素子が、チオールエステル基とシステインとのケミカルライゲーション反応を用いるだけで、同一化学反応を用いて統一的に容易に製造することができる。
【００１８】
＜本発明の機能性原子団含有チオールエステル化合物＞
本発明の新規化合物は、機能性を有する原子団の末端に、アミノ酸３〜１０個有する第１のアミノ酸配列、および、アミノ酸１〜４個有するアミノ酸配列で、その末端にチオールエステル基を有する第２のアミノ酸配列、を有する機能性原子団含有チオールエステル化合物である。すなわち、
Ｆａｇ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３で表され、
ここで、Ｆａｇ：機能性を有する原子団、
Ｌ１：２価の連結基
Ｌ２：アミノ酸３〜１０個有する第１のアミノ酸配列、ここでアミノ酸３〜１０個有する、ＴＧＥＫＰ（配列番号５）、ＴＧＱＫＰ（配列番号１０）、ＴＧＥＲＰ（配列番号１１）、ＴＧＥＫＫ（配列番号１２）、ＴＧＩＫＰ（配列番号１３）配列が例示され、
Ｌ３：アミノ酸１〜４個有するアミノ酸配列で、その末端にチオールエステル基を有する第２のアミノ酸配列であり、末端はＣ末であるのが好ましい。Ｌ３として好ましくは、アミノ酸を２個有するアミノ酸配列ＸＺが挙げられ、ＸはＮ末端でＬ２に結合するアミノ酸ＹまたはＦを表し、ＺはヘリックスのＣ端キャッピング（ヘリックスのＣ端カルボニルへ水素結合することにより、ヘリックス安定化に寄与するもの）に関与する残基、例えばＧ、Ｑ、Ａ、Ｍ、Ｋ等が挙げられる。
ここで、Ｌ１で表される２価の連結基としては、単結合、炭素数１〜１０のアルキレン基、炭素数６〜１２のアリーレン基、炭素数１〜１０の２価の複素環基、−Ｏ−、−ＣＯ−、−Ｎ（Ｒａ）−およびこれらの組み合わせからなる２価の連結基が挙げられ、Ｒａは水素原子または炭素数１〜１０のアルキル基を表す。
【００１９】
特に、Ｆａｇ：電子移動性原子団または色素原子団、
上記Ｌ１：２価の連結基
上記Ｌ２：第１のアミノ酸配列が、ＴＧＥＫＰであり、
上記Ｌ３：第２のアミノ酸配列が、ＸＧ−チオールエステル基
である、機能性原子団含有チオールエステル化合物であり、
Ｆａｇ−Ｌ１−ＴＧＥＫＰ−ＸＧ−である。（ここで、Ｘは、ＹまたはＦである。）。
【００２０】
Ｆａｇで表される機能性原子団は、ナノ素子とした場合に機能を発揮する金属を含有する原子団であり、電子移動性原子団または色素原子団が例示でき、機能性原子を持つ錯体原子団が好ましい。以下の具体例で示す、トリスビピリジン化合物や、Ｃｄ，Ｐｔ，Ｈｇ，Ａｇ，Ｆｅ，Ｎｉ，Ｃｏ，Ｚｎを含む原子団が挙げられ、特願２００４−１９５０７１号明細書に記載されている。機能性原子団は例えばＴｂｐＭが例示でき、ＴｂｐＭは、Ｃ末端にカルボキシル基を有する機能性原子団を表し、Ｍは機能性原子団の有する金属原子を表し、後に記載するＴｂｐＲｕ（II）、ＴｂｐＯｓ（II）等に含まれる機能性原子団が挙げられる。
【００２１】
本発明の新規な機能性原子団含有チオールエステル化合物は、以下の特性を有する。
１）機能性原子団（例えば、ＴｂｐＭ）が嵩高い場合でも、数個のアミノ酸からなる配列（第１のアミノ酸配列および第2のアミノ酸配列）を有するので、直接ZFに結合させてもジンクフィンガーモチーフのフォールディングに悪影響を与えることがない。
２）チオールエステル基を末端に有するのでケミカルライゲーション反応で容易に機能性原子団−ジンクフィンガーモチーフポリペプチドのＮ末のＣｙｓと結合することができる。
３）第１のアミノ酸配列としてＴＧＥＫＰのようなカノニカルリンカーを有すれば、このカノニカルリンカー部がジンクフィンガーモチーフの基本フォールデイングであるββα構造の中で、βシートの重要な構成部分となることができる。
４）チオールエステル基に隣接するアミノ酸がGlｙ（三文字表記アミノ酸）であればケミカルライゲーションの反応性を良くすることができる。
【００２２】
＜本発明の機能性原子団含有チオールエステル化合物の製造方法＞
後に説明するように、本発明の新規な機能性原子団含有チオールエステル化合物は、タンパク質（ポリペプチド）のレジンを用いる自動合成法で製造することができる。
【００２３】
＜本発明の機能性原子団含有チオールエステル化合物の具体例＞
下記式（１）で示される機能性原子団含有チオールエステル化合物。
式（１）
【００２４】
【化３】
2007084468.tif 000003
（式中、Ｒｌは水素原子、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、またはカルバモイル基であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい、アルキル基、アリール基、または複素環基であり、Ｒ３は、水素原子またはアルキル基で、Ｍは、Ｒｕｎ＋、Ｏｓn＋、Ｆｅn＋，またはＣｏn＋であり、ここでnは、１〜３の整数である。）
【００２５】
式（１）において、Ｒｌは水素原子、アシル基（炭素数１〜１０のアシル基で、例えば、ホルミル、アセチル、プロパノイル、ブチリル、トリフルオロアセチル、クロロアセチル）、アルコキシカルボニル基（炭素数２〜１０のアルコキシカルボニル基で、例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル）、アリールオキシカルボニル基（炭素数７〜１５のアリールオキシカルボニル基で、例えば、フェノキシカルボニル、クレジルオキシカルボニル）、またはカルバモイル基（炭素数１〜１０のカルバモイル基で、例えば、カルバモイル、Ｎ−メチルカルバモイル、Ｎ−エチルカルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジメチルカルバモイル、モルホリノカルボニル）を表す。Ｒ２は、アルキル基（炭素数１〜１０のアルキル基で、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル）、アリール基（炭素数６〜１５のアリール基で、例えば、フェニル、トリル、１−ナフチル）、または複素環基（炭素数１〜１０の複素環基で、例えば、２−ピリジル、４−ピリジル、２−フリル、４−ピペリジニル、２−チエニル、２−イミダゾリル、３−ピラゾリル、インドール−３−イル）を表す。Ｒ３は、水素原子またはアルキル基（炭素数１〜１０のアルキル基で、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル）を表す。
【００２６】
チオールエステルはグリシンのカルボニル基とともに−ＣＯ−ＳＲ２を形成していることを表し、Ｒ２は置換基を有していてもよい、アルキル基、アリール基、または複素環基を表す。
【００２７】
Ｒ２は、置換基を有していてもよく、置換基としては、ハロゲン原子、アルキル基（シクロアルキル基を含む）、アルケニル基（シクロアルケニル基を含む）、アルキニル基、アリール基、複素環基、シアノ基、水酸基、ニトロ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、シリルオキシ基、複素環オキシ基、アシルオキシ基、カルバモイルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシカルボニルオキシ基、アミノ基（アニリノ基を含む）、アシルアミノ基、アミノカルボニルアミノ基、アルコキシカルボニルアミノ基、アリールオキシカルボニルアミノ基、スルファモイルアミノ基、アルキルスルホニルアミノ基、アリールスルホニルアミノ基、メルカプト基、アルキルチオ基、アリールチオ基、複素環チオ基、スルファモイル基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、カルバモイル基、アリールアゾ基、複素環アゾ基、イミド基、ホスフィノ基、ホスフィニル基、ホスフィニルオキシ基、ホスフィニルアミノ基及びシリル基が挙げられる。
【００２８】
式（１）において、Ｒ１は好ましくは、水素原子、ｔ−ブトキシカルボニル基または（９−フルオレニル）メトキシカルボニル基を表す。Ｒ３は、好ましくは、水素原子又はメチル基を表す。Ｍは、好ましくは、Ｒｕ２＋またはＯｓ２＋である。
【００２９】
好ましくはＲ２は、下記式（ａ）で表される基を表す。
（ａ）  −｛Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）｝ｋ−ＣＯ−ＡＡ
上記式（ａ）中、ＲａおよびＲｂは、水素原子または炭素数１〜５のアルキル基を表し、ｋは１〜５の整数を表し、ＡＡはＣ末端が−ＣＯＮＨ２で、式（ａ）中のカルボニル基にＮ末端で結合するアミノ酸もしくはオリゴペプチドを表す。
【００３０】
＜二重鎖ＤＮＡの特定の標的塩基配列に特異的に結合するジンクフィンガーモチーフを有しＮ末がＣｙｓであるポリペプチド＞
二重鎖ＤＮＡの特定の標的塩基配列に特異的に結合するジンクフィンガーモチーフを有しＮ末がＣｙｓであるポリペプチド（以下、Ｎ末がＣｙｓであるポリペプチドということがある。）は、ジンクフィンガーモチーフは、２または３個有することが好ましい。この理由はナノ素子とするときに二重鎖ＤＮＡへのアニーリングの際の位置選択性が高く、得られるナノ素子の安定性も高いからである。
以下のポリペプチドが例示できるが、これらに限定されない。
配列番号１：CRICGRNFSRSDDLTRHIRTHTGEKPYG-CRICGRNFSRSDHLTRHIRTHTG
配列番号２：
CRICGRNFSRSDDLTRHIRTHTGEKPYG-CRICGRNFSRSDDLTRHIRTHTGEKPYG
配列番号３：CRICGRNFSRSDDLTRHIRTHTG
配列番号４：CRICGRNFSRSDDLTRHIRTHTGEKPYG
【００３１】
＜本発明の機能性原子団含有チオールエステル化合物とＮ末がＣｙｓであるポリペプチドとの反応＞
本発明の機能性原子団含有チオールエステル化合物、は、Ｎ末がＣｙｓであるポリペプチドといずれも保護基を有さない状態で、化学的に反応して連結されることができ（下記のケミカルライゲーション法）、機能性原子団−ジンクフィンガーモチーフ含有ポリペプチドが得られる。
機能性原子団−ジンクフィンガーモチーフ含有ポリペプチドは、それが有するジンクフィンガーのアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するよう設計された二重鎖ＤＮＡと水溶液中で混合することにより、前記二重鎖ＤＮＡに付与された塩基配列情報に従って、電子移動性原子団、色素原子団等の機能性原子団をＤＮＡ上の標的位置に自律凝集に基づいて特異的に配列・定位させることができるので、前記機能性錯体原子団をＤＮＡ上の所望の位置及び順序で複数個、Å〜ｎｍスケール程度の間隔で配列させたナノ素子を容易に製造できる。
【００３２】
機能性原子団−ジンクフィンガーモチーフ含有ポリペプチドとしては、ジンクフィンガーモチーフを２または３個有するものが好ましい。ジンクフィンガーモチーフを２または３個有するものは、二重鎖ＤＮＡとのアニーリングの選択性に優れ、ナノ素子とした後の安定性にも優れるからである。
【００３３】
＜ケミカルライゲーション法＞
【化４】
2007084468.tif 000004
本発明のチオールエステル化合物    Ｎ末がＣｙｓであるポリペプチド
【００３４】
本発明において、Ｒ１１は上記式中のカルボニル基にＮ末端で結合するポリペプチド残基を表す。Ｒ１２は置換基を有していてもよい、アルキル基、アリール基、または複素環基を表し、Ｒ１３はＦａｇ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３に相当する基を表す。ここで、Ｒ１３が結合しているカルボニル基は、第２のアミノ酸配列Ｌ３のＣ末のカルボキシル基に由来するカルボニル基を表す。
【００３５】
詳細には、本発明は、好ましくはＣ末にＴＧＥＫＰ−ＸＧ−チオールエステル基を有する機能性原子団含有チオールエステル化合物をまず製造すれば、これは二重鎖ＤＮＡ上の特定の複数の標的塩基配列部位（２個以上の標的配列が異なっていても同じであってもよい。）に結合するようにアミノ酸配列が設計されたＤＮＡ結合ポリペプチドでＮ末がＣｙｓであるポリペプチドに、Ｎ末がＣｙｓであるポリペプチドのポリペプチド部分が異なっても容易に結合することができ、ナノ素子を簡易に、効率的に製造できることを知見し、発明を完成した。
【００３６】
本発明の機能性原子団含有チオールエステル化合物は、Ｎ末がＣｙｓであるポリペプチドのポリペプチド部分が異なっても容易に機能性原子団含有化合物と結合し、機能性原子団−ジンクフィンガーモチーフ含有ポリペプチドとすることができるので、［Ｒｕ（ｂｐｙ）３］２＋、［Ｏｓ（ｂｐｙ）３］２＋を始とする種々の色素・電子移動単位・反応単位である機能性原子団を、予め準備したＮ末がＣｙｓであるポリペプチドに、その有するジンクフィンガーが固相法などの合成的手法により準備したジンクフィンガー単位と、バイオテクノロジカルに発現・単離・精製して得たジンクフィンガー単位とを問わず、後から簡便に導入することができる。このため本発明の機能性原子団含有チオールエステル化合物は、ジンクフィンガーによるＤＮＡの精密認識作用を介して分子の機能をＤＮＡ上に自由配列するナノ素子技術を開発する上で、重要な進展となる。
【００３７】
このようにして得られる機能性原子団含有化合物−ジンクフィンガーモチーフ含有ポリペプチドからなる特異的ＤＮＡ結合機能性原子団は、それが有するジンクフィンガーのアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するよう設計された二重鎖ＤＮＡと混合することにより、前記二重鎖ＤＮＡに付与された塩基配列情報に従って、電子移動性原子団、色素原子団等の機能性原子団をＤＮＡ上の標的位置に自律凝集に基づいて特異的に配列・定位させることができるので、前記機能性錯体原子団をＤＮＡ上の所望の位置及び順序で複数個、Å〜ｎｍスケール程度の間隔で配列させたナノ素子を容易に製造できる。
【００３８】
＜機能性原子団−ジンクフィンガーモチーフ含有ポリペプチド＞
本発明の製造方法で得られる機能性原子団−ジンクフィンガーモチーフ含有ポリペプチドは、多種類の機能性原子団からなる群と、多種類のジンクフィンガーモチーフ群とから、それぞれ適切な所望の機能性原子団とジンクフィンガーモチーフとの組み合わせを持つポリペプチドとして容易に得られるので、ジンクリンガーモチーフのそれぞれのＤＮＡ結合能を用いて任意の所望のナノ素子が製造できる。
【００３９】
＜ナノ素子＞
本発明の機能性原子団含有化合物を用いて簡易・効率的に製造できるナノ素子は、ナノメータースケールの大きさで、ナノ素子の機能の中心となる電子移動性原子団、色素原子団等の機能性物質をＤＮＡを担体として任意の配列で定位させたものである。すなわち、機能性錯体原子団がＤＮＡに上に並べられ、少なくとも２つの機能性錯体原子団の位置が数１００Å以内である素子を総称してナノ素子という。
詳細には、特願２００４−１９５０４８号明細書、特願２００４−１９５０７１号明細書に記載されている。本明細書はこれらを引用し、明細書の記載とする。
【００４０】
具体的には、以下が例示される。
【化５】
2007084468.tif 000005
ここで、Ｆ１は、ＧＣＲＩＣＧＲＮＦＳＲＳＤＤＬＴＲＨＩＲＴＨ  （配列番号１４）であり、Ｆ２は、ＣＲＩＣＧＲＮＦＳＲＳＤＨＬＴＲＨＩＲＴＨＴＧ  （配列番号１５）である。
【００４１】
また、ＴｂｐＲｕ（II）、ＴｂｐＯｓ（II）は、以下である。
ＴｂｐＲｕ（II）                                      ＴｂｐＯｓ（II）
【００４２】
【化６】
2007084468.tif 000006
【００４３】
本明細書において、ＴｂｐＲｕ（II）、ＴｂｐＯｓ（II）等の記載は上記の構造もしくはそのアミノ末端がＨを有した構造を表す。(Boc) ＴｂｐＲｕ（II）またはBoc-ＴｂｐＲｕ（II）等の記載はアミノ末端がBoc（ｔ−ブトキシカルボニル基）で保護されていることを表す。
【００４４】
本発明の機能性原子団含有チオールエステル化合物の合成法
以下に本発明の機能性原子団含有チオールエステル化合物の合成法をＴｂｐＭ−ＴＧＥＫＰ−ＸＧ−チオールエステルをその一例として説明する。
＜ＴｂｐＭ−ＴＧＥＫＰ−ＸＧ−チオールエステルの合成法＞
ＴｂｐＭ−ＴＧＥＫＰ−ＸＧ−チオールエステルを合成するには、以下の３方法が例示でき、Ｘが、Ｙの場合で説明する。
【００４５】
１）ＴＧＥＫＰ−ＹＧ−チオールエステルをBoc法を用いて準備して(Boc)TbpＭを液相法でTGEKPのＮ端に導入する方法
＜スキーム＞
(Boc)TGEKP-YG-OH + HS-R → (Boc)TGEKP-YG-チオールエステル → H2N-TGEKP-YG-チオールエステル
(Boc)TbpM-OH + H2N-TGEKP-YG-チオールエステル → (Boc)TbpM-TGEKP-YG-チオールエステル →
TbpM-TGEKP-YG-チオールエステル
【００４６】
金属がＲｕである場合で説明すれば、Boc -TbpＲｕを固相法でペプチドＮ端に導入する研究はすでに行われている（論文：Inorganic  Chemistry,２００２,４１,３７９-３８６.）。この論文に基づき（Resin 1当量、(Boc)ＴｂｐＲｕ（II）−ＯＨ  ２当量、HATU ２当量、PyBOP ２当量、DIEA ２当量を用い、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、５０℃で２４時間反応させる）を用いて、(Boc)TbpRuとH2N-TGEKP-YG-TAMPAL-resinをカップリングさせる反応を行うが、例えば、HATU等の比較的強力なカップリング試薬を用いる。カップリング反応時間中に、相本三郎等（Tetrahedron  Letter,１９９８,３９,８６６９-８６７２.）の報告にあるように、チオールエステル基部分が塩基であるDIEAの働きで加水分解され、目的物が得られない可能性もあるので、チオールエステル基部分が加水分解されないように注意する。
【００４７】
(Boc)ＴｂｐＲｕ（II）−ＯＨ：
【化７】
2007084468.tif 000007
【００４８】
HATU: O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate
PyBOP: benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate
DIEA: diisopropylethylamine
TAMPAL: trityl-associated mercapto-propionic acid leucine
【００４９】
２）特定のresin（例えば、TAMPAL-resin、trityl-associated mercapto-propionic acid leucine resin）を用い、resin上で全てを伸長させてから最後に切り出す固相法による方法
＜スキーム＞
(Boc)TbpM-OH + H2N-TGEKP-YG-チオールエステル-resin → (Boc)TbpM-TGEKP-YG-チオールエステル-resin
(Boc)TbpM-TGEKP-YG-チオールエステル-resin → (Boc)TbpM-TGEKP-YG-チオールエステル
(Boc)TbpM-TGEKP-YG-チオールエステル → TbpM-TGEKP-YG-チオールエステル
【００５０】
３）特定のresin（例えば、TAMPAL-resin）上でTGEKP-YGまで伸長させ、これを切り出してTGEKP-YG-チオールエステル(下記スキーム中のH2N-TGEKP-YG-チオールエステル)を作り出し、最後に液相でTbpＭとカップリングさせる方法
＜スキーム＞
H2N-TGEKP-YG-チオールエステル-resin → H2N-TGEKP-YG-チオールエステル
(Boc)TbpM-OH + H2N-TGEKP-YG-チオールエステル → (Boc)TbpM-TGEKP-YG-チオールエステル →TbpM-TGEKP-YG-チオールエステル
【実施例】
【００５１】
（実施例1）
前記２）の「resin上で全てを伸長させてから最後に切り出す固相法による方法」により本発明の下記化合物を合成した。
【００５２】
【化８】
2007084468.tif 000008
【００５３】
（１）TAMPAL-resin（trityl-associated mercapto-propionic acid leucine resin）の合成      
１−１．MBHA-resinの膨潤：予め硫酸、硝酸、発煙硝酸で洗浄しておいたペプチド合成用反応容器に、MBHA-resin・HCl（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製）を８７．７ｍｇ（０．０５ mmol）入れた。その中にＤＭＦを１ｍl加え、６００rpmで１０分間攪拌した。ＤＭＦを捨て、再びＤＭＦを１ｍl加え、６００rpmで１０分間攪拌した。この操作を計３回行った。
【００５４】
【化９】
2007084468.tif 000009
式１．TAMPAL-resinの合成
【００５５】
反応容器内のＤＭＦを捨て、そこに前もって用意しておいたBoc-Leuカップリング溶液［１０mlサンプル管にBoc-Leu-OH・H2Oを６８．５６ｍｇ（０．２７５ｍｍｏｌ）、HBTUを９４．８３ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）入れ、ＤＭＦ０．６６ｍlとDIEA７１．２５μl（０．４ ｍｍｏｌ）を加え、２分間攪拌した溶液］を入れた。反応溶液は、黄色になった。２０分間６００rpmで攪拌した後、溶液をアスピレーターで除去した。反応容器内にＤＭＦを１ｍl入れ、１分間６００rpmで攪拌した。溶液をアスピレーターで除去し、再びＤＭＦを１ｍｌ入れ、１分間６００rpmで攪拌した。この操作を5回行った。その後、この操作をCH2Cl2で5回行った。
それから反応容器ごと真空乾燥した。次に反応容器内に５０％トリフルオロ酢酸(TFA)/CH2Cl22mlを入れ、１０分間６００rpmで攪拌した。溶液をアスピレーターで除去し、再び５０％TFA/CH2Cl22mlを入れた。４０分間６００rpmで攪拌した後、溶液をアスピレーターで除去した。その後前回と同じ操作でCH2Cl2、ＤＭＦの順に樹脂を洗浄した。
反応容器内に予め準備しておいたＳ−トリチルメルカプトプロピオン酸カップリング溶液［１０ｍｌサンプル管にＳ−トリチルメルカプトプロピオン酸を２６．１４ｍｇ（０．０７５ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵを２５．６０ｍｇ（０．０６８ｍｍｏｌ）入れ、ＤＭＦ０.６６ｍｌとＤＩＥＡ２６．７３μl（０．１５ｍｍｏｌ）を加え、２分間攪拌した溶液］を入れた。その後の操作は、反応容器ごと真空乾燥するところまではＢｏｃ−Ｌｅｕのカップリング時と同様なので割愛する。この操作を計２回行った（ダブルカップリング）。
HBTU: 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate
【００５６】
（キャッピング）
反応容器内にＺ（２−Ｃｌ）−ＯＮＳｕ溶液［Ｚ（２−Ｃｌ）−ＯＮＳｕ１４．１８５ｍｇ（０．０５ｍｏｌ）をＤＭＦ０．６６ｍｌに溶かした溶液］を入れ、ＤＩＥＡ２６．７３μｌ（０．１５ｍｍｏｌ）を加えて１０分間６００ｒｐｍで攪拌した。その後上記の操作で洗浄、乾燥した。
【００５７】
Ｚ（２−Ｃｌ）−ＯＮＳｕ
【化１０】
2007084468.tif 000010
【００５８】
（２）H2N-TGEKP-YG-TAMPAL-resinの合成：
反応容器内にトリフルオロ酢酸(TFA)溶液（ＴＦＡ：ＴＩＰＳ：Ｈ2Ｏ＝９５：２．５：２．５）を１ｍｌ入れ、２分間６００ｒｐｍで攪拌した。この時溶液は濃い赤紫色になった。この反応を反応式にすると以下のようになる。
TIPS:Triisopropylsilane
【００５９】
【化１１】
2007084468.tif 000011
式２．Trityl基の除去
【００６０】
溶液を除去し、再びＴＦＡ溶液を１ｍｌ入れ、５分間６００ｒｐｍで攪拌した。溶液を除去し、ＣＨ2Ｃl2、ＤＭＦで洗浄後、Boc-Glyカップリング溶液［１０ｍｌサンプル管にBoc-Glyを２６．２８ｍｇ（０．１５ｍｏｌ）、PyBOPを７８．０５ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔを２０．２７ｍｇ（０．１５ｍｏｌ）入れ、ＤＭＦ０．６６ｍｌとＤＩＥＡ４３．５５μｌ（０．２５ｍｏｌ）を加え、２分間攪拌した溶液］を入れた。反応溶液は、黄褐色になった。この反応は以下に示される反応式で表される。
【００６１】
【化１２】
2007084468.tif 000012
【００６２】
式３．TAMPAL- resinを用いたペプチド合成
HOBt:1-hydroxybenzotriazole
PyBOP: benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate
DIEA: diisopropylethylamine
【００６３】
１時間６００ｒｐｍで攪拌した後、溶液をアスピレーターで除去した。その後前回と同じ操作でＤＭＦ、CH2Cl2の順に樹脂を洗浄した。乾操後、反応容器内に５０％TFA/CH2Cl2１mlを入れ、１０分間６００ｒｐｍで攪拌した。溶液を除去し、再び５０％TFA/ CH2Cl2１mlを入れた。４０分間６００ｒｐｍで攪拌した後、溶液を除去した。その後前回と同じ操作でCH2Cl2、ＤＭＦの順に樹脂を洗浄した。
反応容器内にBoc-Tyr（２-Ｂｚ-Ｚ）カップリング溶液［１０ｍｌサンプル管にBoc-Tyr（２-Ｂｚ-Ｚ）を７４．１５ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰを７８．０５ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ、ＨＯＢｔを２０．２７ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）入れ、ＤＭＦ０．６６ｍｌとＤＩＥＡ４３．５５μｌ（０．２５ｍｍｏｌ）を加え、２分間攪拌した溶液）を入れた。以降の操作はBoc-Glyの時と同様なので割愛する。同様の操作をBoc-Pro、Boc-Lys（2-Cl-Z）、Boc-Glu（OBzl）、Boc-Gly、Boc-Thr（Bzl）の順で行い、H2N-TGEKP-YG-TAMPAL-resinを合成した。
【００６４】
（３）Boc-TbpRu-TGEKP-YG-TAMPAL-resinの合成
H2N-TGEKP-YG-TAMPAL-resinを１６．１３ｍｇ（６μｍｏｌ）秤量し、これを小スケール反応容器に入れた。ここに(Boc) ＴｂｐＲｕ（II）−ＯＨカップリング溶液［１０ｍｌサンプル管に(Boc) ＴｂｐＲｕ（II）−ＯＨを９．２ｍｇ（１２μｍｏｌ）、PyBOPを６．２４ｍｇ（１２μｍｏｌ）、ＨＡＴＵを４．５６ｍｇ（１２μｍｏｌ）入れ、ＤＭＦ０．４ｍｌとＤＩＥＡ４．１８μｌ（２４μｍｏｌ）を加えた溶液］を入れた。２４時間、５０℃で攪拌した。反応溶液をパスツールピペットで除去し、ＤＭＦ０．４ｍｌを入れて１分間攪拌後、その溶液を捨てた。この操作を７回行った。次にCH2Cl2でこの操作を７回行った後、真空乾燥した。
この反応の反応式は式５のようになる。ここで、Boc-(Bpy)3Ru-aaは(Boc) ＴｂｐＲｕ（II）−ＯＨを表す。ＴｂｐＲｕ（II）−ＯＨはインオーガニック・ケミストリー、４１巻（２００２年）、３７９〜３８６頁（Inorg. Chem. 2002, 41, 379-386.）に記載の方法に従って合成した。
【００６５】
【化１３】
2007084468.tif 000013
【００６６】
(Boc)TbpRuの付加
HATU: O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate
PyBOP: benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate
DIEA: diisopropylethylamine
【００６７】
（４） Boc-TbpRu-TGEKP-YG-チオールエステルのBoc-TbpRu-TGEKP-YG-TAMPAL-resinからの切り出し、上記のように合成したBoc-TbpRu-TGEKP-YG-TAMPAL-resinから、切り出しを行い、ＲＰ一ＨＰＬＣで分析した。
すなわち、攪拌子の入ったシュレンクにBoc-TbpRu-TGEKP-YG-TAMPAL-resinを８．４８ｍｇ（３．１６μｍｏｌ）入れ、チオアニソール：ＥＤＴ＝２：１の溶液を０．２ｍｌ加えた。シュレンクを氷浴につけ、１０分間攪拌した。その中にトリフルオロ酢酸(TFA)１ｍｌを加え、１０分間氷浴下で攪拌した。その後、TFMSAを０．２ｍｌ加え、氷落下で３時間攪拌した。反応溶液の色は、黒、黒紫、薄いこげ茶の順に変化した。この反応式を以下に示す。
【００６８】
【化１４】
2007084468.tif 000014
Boc-TbpRu-TGEKP-YG-チオールエステルの合成（TAMPAL-resinからの切り出し）
TFMSA:トリフルオロメタンスルホン酸
EDT:１，２−エタンジチオール
【００６９】
反応溶液を、氷で冷やしておいたジエチルエーテル２０ｍｌの中に入れ、ペプチドを沈殿させた。よく攪拌した後、遠心分離を３０００ｒｐｍで５分間行った。デカンテーションし、再びジエチルエーテルを加えた。この操作を５回行い、ペプチドを洗浄した。そのＨＰＬＣチヤートを以下に示す。
【００７０】
【化１５】
2007084468.tif 000015
合成したTbpRu-TGEKP-YG-チオールエステルのＨＰＬＣチヤート（分析カラム）
【００７１】
ＨＰＬＣ測定条件（検出波長：２１０ｎｍ、流速：０．８ｍｌ/ｍｉｎ、pumpA：０．０５％TFA：H2O、pumpB：０．０５％TFA AN、gradient：B conc.１０-８０％,６０分間、column：資生堂ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫＣ１８ＵＧ１２０４．６×２５０ｍｍＮｏ．１）、測定機器：Shimadzu ＬＣ−６Ａ）。
【００７２】
（３）TbpRu-TGEKP-YG-チオールエステルのＨＰＬＣ分取
合成したTbpRu-TGEKP-YG-チオールエステルを３．７ｍｇ秤量し、それをＲＰ-ＨＰＬＣで分取した。そのときのＨＰＬＣチャートを以下に示す。測定条件は上と同様である。
【００７３】
【化１６】
2007084468.tif 000016
【００７４】
TbpRu-TGEKP-YG-チオールエステルの分取前（左）、分取後（右）のチャート
分画したところ、メインピークの立ち上がり（吸光度；０．０６）から項点を越えて頂点（吸光度；０．８８）の０．２０５倍のところまでを分取するときれいなものが得られることが分かった。分取は合計で２回行った。
分取後のTbpRu-TGEKP-YG-チオールエステルのＨＰＬＣチャートを図３に示した。純度は９９．９％である。
この化合物のＵＶ-ｖｉｓスペクトルを測定したところ、以下のようになった。Michael Y. Ogawa et al.Ｊ. Am Chem. Soc. ，１１８，５７８３−５７９０（１９９６）の論文を参照したシグナルの帰属は以下のとおりである。
【００７５】
【化１７】
2007084468.tif 000017
TbpRu- TGEKP-YG -thioesterのＵＶ-ｖｉｓスペクトル
【００７６】
２４５ｎｍ（ｂ）、２８５ｎｍ（ｃ）、４５５ｎｍ（ｅ）の吸収は［Ru（bpy）3］２＋特有のものである。また、このペプチドにはTyrが含まれているため、その側鎖の吸収である２８０ｎｍ付近のもの（ｃ）が重なっている。２１０ｎｍ付近の吸収（ａ）はペプチド結合に帰属される。［Ru（bpy）3］２＋の〜４５０ｍｎに見られるＳ0→Ｓ1遷移の吸収極大（ｅ）は、Ｒｕのｄπ軌道原子がｂｐｙ配位子のπ*軌道に励起されるＭＬＣＴ遷移によるものである。
【００７７】
上記で合成したH2N-TGEKP-YG-TAMPAL-resinから、前記「（４） Boc-TbpRu-TGEKP-YG-チオールエステルのBoc-TbpRu-TGEKP-YG-TAMPAL-resinからの切り出し」と同様の条件でH2N-TGEKP-YG-チオールエステルを切り出し、前記「（３）Boc-TbpRu-TGEKP-YG-TAMPAL-resinの合成」と同様に(Boc) ＴｂｐＲｕ（II）−ＯＨと縮合することによりBoc-TbpRu-TGEKP-YG-チオールエステルを合成することができ、これを脱保護することによりTbpRu-TGEKP-YG-チオールエステルを合成することができる。
【配列表】
2007084468000001.app