(57)【要約】【課題】蛍光性タンパク質を別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる新規な方法を提供すること。【解決手段】発光性タンパク質Ｘβからの所定波長βの発光エネルギーの転移に基づいて、外部からの光照射を行うことなく、蛍光性タンパク質Ｙｇを、蛍光色ｇから蛍光色ｒを示す構造へと変化させる方法を提供する。この方法を用いることでモニタリングが容易で、かつ生体等への侵襲が少ない、物質間相互作用検出、タンパク質挙動追跡、生体マーキング、及び薬剤スクリーニングが可能である。【選択図】図１
2007325538.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発光性タンパク質Ｘからの所定波長の発光エネルギーの転移に基づいて、
外部からの光照射を行うことなく、蛍光性タンパク質Ｙを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法。
【請求項２】
前記発光性タンパク質Ｘは、発光基質又はその化学構造を人為的に変化させた発光基質誘導体によって、前記所定波長の発光を示す発光特性へ改変されたものであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記発光基質は、次の化学式１のセレンテラジン（Coelenterazine）であることを特徴とする請求項２記載の方法。
【化１】
2007325538.tif 000007
【請求項４】
前記発光基質誘導体は、次の化学式２のセレンテラジン（Coelenterazine）誘導体であることを特徴とする請求項２記載の方法。
【化２】
2007325538.tif 000008
【請求項５】
前記発光性タンパク質Ｘと前記蛍光性タンパク質Ｙとからなるタンパク質複合体に、前記発光基質又は前記発光基質誘導体を作用させることで、前記タンパク質Ｙを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記蛍光性タンパク質は、フォトコンバージョン又はフォトクロミズム特性を有するタンパク質であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記発光性タンパク質ＸはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（配列番号１）であり、
前記蛍光性タンパク質ＹはＫａｅｄｅ（配列番号２）、Ｋａｅｄｅの変異体（配列番号３）、ＫｉｋＧＲ（配列番号４）、Ｄｒｏｎｐａ（配列番号５）の中から選択された一のタンパク質であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
請求項１記載の方法を用いて物質間の相互作用を検出することを特徴とする相互作用検出方法。
【請求項９】
前記相互作用は、発光性タンパク質Ｘによってラベルされた物質Aと蛍光性タンパク質Ｙによってラベルされた物質Bとの間の相互作用であることを特徴とする請求項８記載の相互作用検出方法。
【請求項１０】
前記物質Ａと前記物質Ｂとの間の相互作用は、物質Ａあるいは物質Ｂに他の物質Ｃが相互作用することによって作動するものであることを特徴とする請求項９記載の相互作用検出方法。
【請求項１１】
リアルタイムにモニタリングを行うことなく、所定時間経過後に相互作用履歴が検出できることを特徴とする請求項８から１０のいずれか一項に記載の相互作用検出方法。
【請求項１２】
前記物質Ａと前記物質Ｂとの相互作用又は前記物質Ａあるいは前記物質Ｂに他の物質Ｃが相互作用することにより作動した前記物質Ａと前記物質Ｂとの相互作用を細胞内で進行させ、該相互作用によって別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化した前記蛍光性タンパク質Ｙにラベルされた物質Ｂの細胞内での挙動を追跡することを特徴とするタンパク質挙動追跡方法。
【請求項１３】
前記発光性タンパク質Ｘと前記蛍光性タンパク質Ｙとからなるタンパク質複合体を生体内の所定の細胞又は組織内に存在又は発現させておき、
前記発光性タンパク質Ｘの発光波長を前記所定波長の発光波長へ改変させる発光基質又は発光基質誘導体を前記生体内へ導入し、前記タンパク質Ｙを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造へ変化させることによって、前記細胞又は組織をマーキングする方法。
【請求項１４】
前記発光性タンパク質Ｘと前記蛍光性タンパク質Ｙとからなるタンパク質複合体を生体内の所定の細胞又は組織内へ存在又は発現させておき、
前記発光性タンパク質Ｘの発光波長を前記所定波長の発光波長へ改変させる発光基質又は発光基質誘導体を生体内へ導入し、前記タンパク質Ｙを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造へ変化させた後の前記蛍光性タンパク質Ｙの構造変化が起こっているかの有無を観察又は検出することによって行う、生体内異物侵入の制御を担うタンパク質を対象とする機能阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項１５】
発光性タンパク質Ｘと、
該発光性タンパク質Ｘからの所定波長の発光エネルギーの転移により別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化し得る蛍光性タンパク質Ｙと、
から構成されたタンパク質複合体。
【請求項１６】
前記蛍光性タンパク質は、フォトコンバージョン又はフォトクロミズム特性を有するタンパク質であることを特徴とする請求項１５記載のタンパク質複合体。
【請求項１７】
前記発光性タンパク質ＸはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（配列番号１）であり、
前記蛍光性タンパク質ＹはＫａｅｄｅ（配列番号２）、Ｋａｅｄｅの変異体（配列番号３）、ＫｉｋＧＲ（配列番号４）、Ｄｒｏｎｐａ（配列番号５）の中から選択された一のタンパク質であることを特徴とする請求項１５記載のタンパク質複合体。
【請求項１８】
請求項１７記載のタンパク質複合体をコードする塩基配列を少なくとも有する組み換えベクター。
【請求項１９】
請求項１８記載の組み換えベクターを導入した細胞。
【請求項２０】
Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをコードする塩基配列（配列番号６）を有するベクターと、
Ｋａｅｄｅ（配列番号７）、Ｋａｅｄｅの変異体（配列番号８）、ＫｉｋＧＲ（配列番号９）、Ｄｒｏｎｐａ（配列番号１０）の中から選択された一のタンパク質をコードする塩基配列を有するベクターと、
Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの発光特性を改変し得る発光基質又は発光基質誘導体と、
を少なくとも含むキット。
【請求項２１】
請求項１８記載の組み換えベクター又は請求項１９記載の細胞と、
Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの発光特性を改変し得る発光基質又は発光基質誘導体と、
を少なくとも含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光性タンパク質を別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法に関する。より詳しくは、蛍光性タンパク質Ｙを、発光性タンパク質Ｘからの所定波長の発光エネルギー転移に基づいて、別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法、蛍光性タンパク質を用いる方法、及びタンパク質複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、光を発することができるタンパク質を使って所定の物質をラベルし、可視化することが広く一般に行われている。特に、生体内の特定部分をマーキングしたり、情報伝達物質などの検出や定量、及びその動態等を調べたりする場合において、生体への侵襲が少ないことから、該タンパク質の利用が注目を集めている。更に、特定の遺伝子の検出、薬剤等の特定物質のスクリーニングにおいても、該タンパク質が利用され始めている。
【０００３】
例えば、特許文献１では、蛍光蛋白質を細胞内に導入することにより、細胞分裂を視覚化できる細胞分裂可視化細胞及びその作成方法、それを用いた細胞分裂の可視化方法、遺伝子や薬剤の細胞分裂への影響の評価方法、細胞分裂へ影響する遺伝子や薬剤のスクリーニング方法が開示されている。
【０００４】
また、蛍光物質間の蛍光共鳴エネルギー転移を用いて２種の物質の相互作用を検出する、いわゆるＦＲＥＴ法も多く利用されている。例えば、特許文献２では、ストークスシフトの小さい蛍光分子を利用して、ホモＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）に基づいた蛍光指示薬、及び分子間相互作用の可視化システムが開示されている。
【０００５】
上記の方法等に用いられる、光を発することのできるタンパク質には、ルシフェリンがルシフェラーゼの作用で酸化分解されることにより発光するものと、発光たんぱく質によるもの、外部からの照射により光を発する蛍光性タンパク質などがある。例えば、ホタルやミミズなどは、発光基質であるルシフェリンが酵素であるルシフェラーゼによって酸化されて発光する。一方、クラゲなどは、酵素−基質複合体に似た発光タンパク質イクオリンがカルシウムイオンと結合すると、酸化剤がなくても発光タンパク質内部で酸化的反応が起こることにより発光する。
【０００６】
発光タンパク質は自ら発光することができるので、その遺伝子を細胞に導入するだけで細胞をラベルすることができる。しかし、任意の時期に任意の細胞のみをラベルすることは困難である。蛍光性タンパクは自ら発光することができないが、特定波長の光照射により、それぞれ決められた光を発することができる。さらに、特定の波長の光によって、構造変化を伴って別の蛍光波長を発することができたり構造変化を伴って蛍光を発することを可能にしたりする特性を持った蛍光性タンパク質が開発されている。
【０００７】
例えば、特許文献３では、紫外線の照射により緑色から赤色に変化（フォトコンバージョン）するヒユサンゴ（Trachyphyllia geoffroyi）由来の蛍光蛋白質、及び紫外線の照射により緑色から赤色に変化（フォトコンバージョン）するアザミハナダカサンゴ（Scolymia Vitiensis）由来の蛍光性タンパク質が開示されている。これらの蛍光性タンパク質で特定の細胞をラベルしておくことにより、任意の時期に任意の細胞にのみ紫外線を照射すれば、その細胞の色のみが変化（フォトコンバージョン）するため、任意の時期に任意の細胞のみマーキングすることができる。
【０００８】
また、特許文献４では、波長５１８ｎｍ付近の光を照射すると蛍光が消え、３８０ｎｍ付近の光を照射すると蛍光が回復するフォトクロミズム現象を示すキッカサンゴ（Echinophyllia sp）由来の蛍光性タンパク質も開発されている。この様な蛍光性タンパク質で特定の細胞をラベルすれば、異なる波長の光を照射することによりラベルと脱ラベルを自在に制御することができる。
【特許文献１】特開２００４−１８７５３０号公報。
【特許文献２】特開２００４−１８７５４４号公報。
【特許文献３】ＷＯ２００４／０１８６７１号パンフレット
【特許文献４】ＷＯ２００５／１１３７７２号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
蛍光の変化を検出することにより物質間の相互作用を検出できるＦＲＥＴ法では、蛍光共鳴エネルギー転移が起きる距離に両物質が近づいたときにのみ、蛍光の変化が起こる。即ち、蛍光の変化をリアルタイムに取得する必要があるため、蛍光変化がどのタイミングで起こるか不明な場合など、長時間、モニタリングし続ける必要がある。
【００１０】
一方、フォトコンバージョンやフォトクロミズムなどを行う蛍光性タンパク質は、その構造を変化させることで別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に移行するため、一旦、別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に移行すれば、その構造が変化しない限り、いつでも、測定者によって定められる任意の時間後（所定時間後）に前記構造変化が起こっているかを検出することができる。
【００１１】
しかし、フォトコンバージョンやフォトクロミズムを行うには、特定波長の外部からの光照射が必要である。従って、生体内の深奥部の細胞をマーキング等する場合、光照射用ファイバーを外科的に誘導する必要があり、生体への外科的侵襲による悪影響が考えられる。また、波長の長短によっては、細胞毒性を示す場合があり、生体への光侵襲による悪影響が考えられる。
【００１２】
そこで、本発明は、モニタリングが容易で、かつ生体への侵襲が少ない、蛍光性タンパク質を別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本願発明者は、蛍光性タンパク質を、フォトコンバージョン又はフォトクロミズムなどの別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造へ変化させる方法について鋭意研究した結果、光照射を行わなくても、蛍光性タンパク質を前記の構造へ変化させることができる新規方法を見出した。
【００１４】
本発明ではまず、発光性タンパク質Ｘからの所定波長の発光エネルギーの転移に基づいて、外部からの光照射を行うことなく、蛍光性タンパク質Ｙを、別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法を提供する。本来、フォトコンバージョン又はフォトクロミズムなどを起こす蛍光性タンパク質Ｙは、光照射を行わなければ、前記構造に変化しないが、本願発明者は発想を大きく変換し、別の発光性タンパク質Ｘの発光により、その発光エネルギーを蛍光性タンパク質Ｙへ転移させることで、蛍光タンパク質Yを、前記構造に変化させることに成功した。
【００１５】
本発明に係る方法では、蛍光性タンパク質Ｙを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させるために、蛍光性タンパク質Ｙの構造を変化させ得る所定波長の発光特性を有する発光性タンパク質Ｘを選択する。このとき、発光基質又はその化学構造を人為的に変化させた発光基質誘導体により、所定波長の発光を示す発光特性へ改変された発光性タンパク質Ｘを選択することもできる。
【００１６】
前記発光基質、及び発光基質誘導体は、発光性タンパク質Ｘの発光特性を改変し得るものであれば特に限定されない。一例を挙げると、セレンテラジン（Coelenterazine）、セレンテラジン（Coelenterazine）誘導体などが挙げられる。セレンテラジン（Coelenterazine）の化学式を化学式１に、セレンテラジン（Coelenterazine）誘導体の化学式を化学式２に示す。
【化１】
2007325538.tif 000003
【化２】
2007325538.tif 000004
【００１７】
また、本発明では、上記の方法を応用して、発光性タンパク質Ｘと蛍光性タンパク質Ｙとからなるタンパク質複合体に、発光基質又は発光基質誘導体を作用させることで、タンパク質Ｙを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法を提供する。
【００１８】
本発明に係る方法に用いる発光性タンパク質Ｘは、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に基づく発光をするタンパク質であっても、自身が発光する発光タンパク質であってもよく、発光を示すタンパク質であれば、特に限定されない。一例としては、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（配列番号１）が挙げられる。
【００１９】
また、本発明に係る方法に用いる蛍光性タンパク質Ｙは、発光性タンパク質Ｘからの所定波長の発光エネルギー転移に基づいて別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化するタンパク質であれば、特に限定されないが、例えばフォトコンバージョン又はフォトクロミズム特性を有するタンパク質が好ましい。具体例としては、フォトコンバージョン特性を有するＫａｅｄｅ（配列番号２）又はＫａｅｄｅの変異体（配列番号３）、ＫｉｋＧＲ（配列番号４）、フォトクロミズム特性を有するＤｒｏｎｐａ（配列番号５）などが挙げられる。
【００２０】
本発明では次に、蛍光性タンパク質Ｙを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法を利用した以下の方法を提供する。
【００２１】
第１に、前記方法を利用した物質間の相互作用を検出する方法を提供する。例えば、発光性タンパク質Ｘによってラベルした物質Ａと、蛍光性タンパク質Ｙによってラベルした物質Ｂとが相互作用すると、前記発光性タンパク質Ｘと蛍光性タンパク質Ｙが発光エネルギー転移の可能な程度にまで接近する。そして、前記発光性タンパク質Ｘからの発光エネルギーの転移により、蛍光性タンパク質Ｙが別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化する。この構造変化を確認することで、物質Ａと物質Ｂとの相互作用を検出することができる。
【００２２】
前記の相互作用は、物質Ａあるいは物質Ｂに他の物質Ｃが相互作用することにより、物質Ａと物質Ｂが相互作用するものであってもよい。物質Ａと物質Ｂがそのままの状態では相互作用しない場合は、両物質をラベルしている発光性タンパク質Ｘと蛍光性タンパク質Ｙが発光エネルギー転移の可能な程度にまで接近しないため、蛍光性タンパク質Ｙが別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化することはない。しかし、物質Ａあるいは物質Ｂに他の物質Ｃが相互作用することにより、物質Ａと物質Ｂが相互作用する場合は、物質Ｃを作用させた時点で、物質Ａと物質Ｂが相互作用し、発光性タンパク質Ｘと蛍光性タンパク質Ｙは接近する。そして、発光性タンパク質Ｘの発光エネルギーが、蛍光性タンパク質Ｙへ転移するため、蛍光性タンパク質Ｙは別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化する。
【００２３】
このとき、物質Ｃは、物質Ａに相互作用するものであっても、物質Ｂに相互作用するものであっても、更には、物質Ａ、Ｂの両方に相互作用するものであってもよい。このようにして、蛍光性タンパク質Ｙの別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造への変化が起こっているかを確認をすることで、物質Ａと物質Ｂの相互作用の検出に加え、物質Ａと物質Ｃ、物質Ｂと物質Ｃ、又は物質Ａ、Ｂと物質Ｃの相互作用の検出することも可能である。
【００２４】
本発明に係る方法に用いる蛍光性タンパク質Ｙは、発光性タンパク質Ｘによって別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化するため、一旦、別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化すれば、その構造が再度変化しない限り、いつでも構造変化が起こっているかを検出することができる。従って、前記相互作用の検出を行う際、相互作用時、リアルタイムにモニタリングを行う必要がなく、測定者によって定められる任意の時間後（所定時間後）に相互作用履歴を検出することができる。
【００２５】
例えば、前記物質Ａと前記物質Ｂとが、所定時間内に一旦結合し、その後分離するような場合であっても、長時間モニタリングし続ける必要がなく、所定時間経過後に前記物質Ａ若しくは前記物質Ｂをラベルした蛍光性タンパク質Ｙの別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造への変化が起こっているかの有無を確認すれば、相互作用履歴を検出することができる。
【００２６】
第２に、蛍光性タンパク質Ｙを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法を利用したタンパク質挙動追跡方法を提供する。本方法では、まず、前記物質Ａと前記物質Ｂとの相互作用又は前記物質Ａあるいは前記物質Ｂに他の物質Ｃが相互作用することにより作動した前記物質Ａと前記物質Ｂとの相互作用を細胞内で進行させ、該相互作用によって蛍光性タンパク質Ｙを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる。そして、該構造変化後の蛍光性タンパク質Ｙを追跡することにより、物質Ｂの挙動を追跡することができる。
【００２７】
第３に、蛍光性タンパク質Ｙを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法を利用した、生体マーキング方法を提供する。本方法では、まず、前記発光性タンパク質Ｘと前記蛍光性タンパク質Ｙとからなるタンパク質複合体を生体内の所定の細胞又は組織内に存在又は発現させておく。そして、前記発光性タンパク質Ｘの発光波長を所定波長の発光特性へ改変させる発光基質又は発光基質誘導体を生体内へ導入する。すると、発光性タンパク質Ｘが所定波長の発光特性へ改変されるため、複合体を構成する蛍光性タンパク質Ｙへ発光エネルギーが転移し、蛍光性タンパク質Ｙが別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化する。このようにして、生体内の所定の細胞又は組織をマーキングすることができる。
【００２８】
第４に、蛍光性タンパク質Ｙを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法を利用した薬剤スクリーニング方法を提供する。本方法では、まず、前記生体マーキング方法と同様に、前記発光性タンパク質Ｘと前記蛍光性タンパク質Ｙとからなるタンパク質複合体を生体内の所定の細胞又は組織内に存在又は発現させておく。そして、前記発光性タンパク質Ｘの発光波長を所定波長の発光特性へ改変させる発光基質又は発光基質誘導体を生体内へ導入する。
【００２９】
このとき、生体内異物侵入の制御を担うタンパク質が正常に機能すると、前記発光基質の導入も阻害されてしまう。そのため、タンパク質複合体を構成する蛍光性タンパク質Ｙの前記構造変化は起こらない。しかし、前記タンパク質を対象とする機能阻害剤を生体内へ投与すれば、前記発光基質又は発光基質誘導体の生体内への導入は阻害されず、前記発光基質又は発光基質誘導体は生体内の発光性タンパク質Ｘに作用する。
【００３０】
その結果、発光性タンパク質Ｘは、所定波長の発光特性を示すようになり、蛍光性タンパク質Ｙへ所定波長の発光エネルギーが転移し、蛍光性タンパク質Ｙは別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化する。そして、蛍光性タンパク質Ｙの前記構造変化が起こっているかを観察又は検出することによって、前記機能阻害剤をスクリーニングすることができる。
【００３１】
本発明では更に、発光性タンパク質Ｘと、該発光性タンパク質Ｘからの所定波長の発光エネルギーの転移により別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化し得る蛍光性タンパク質Ｙとから構成されたタンパク質複合体を提供する。このタンパク質複合体は、例えば、前記マーキング方法や前記薬剤スクリーニング方法などに用いることができる。
【００３２】
タンパク質複合体を構成する発光性タンパク質Ｘは、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に基づく発光をするタンパク質であっても、自身が発光する発光タンパク質であってもよく、発光を示すタンパク質であれば、特に限定されない。一例としては、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（配列番号１）が挙げられる。
【００３３】
タンパク質複合体を構成する蛍光性タンパク質Ｙは、発光性タンパク質Ｘからの所定波長の発光エネルギー転移に基づいて別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化するタンパク質であれば、特に限定されないが、例えば、フォトコンバージョン又はフォトクロミズム特性を有するタンパク質が好ましい。具体例としては、フォトコンバージョン特性を有するＫａｅｄｅ（配列番号２）又はＫａｅｄｅの変異体（配列番号３）ＫｉｋＧＲ（配列番号４）、フォトクロミズム特性を有するＤｒｏｎｐａ（配列番号５）などが挙げられる。
【００３４】
また、本発明では、前記タンパク質複合体をコードする塩基配列を少なくとも有する組み換えベクター、及び該組み換えベクターを導入した細胞を提供する。これらは、例えば、前記マーキング方法や前記薬剤スクリーニング方法などの際、前記タンパク質複合体を、生体内の所定の細胞又は組織へ発現又は存在させる場合に用いることができる。
【００３５】
加えて、本発明では、本発明に係る方法に用いることができる以下のキットを提供する。
【００３６】
まず、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをコードする塩基配列（配列番号６）を有するベクターと、Ｋａｅｄｅ（配列番号７）、Ｋａｅｄｅの変異体（配列番号８）、ＫｉｋＧＲ（配列番号９）、Ｄｒｏｎｐａ（配列番号１０）の中から選択された一のタンパク質をコードする塩基配列を有するベクターと、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの発光特性を改変し得る発光基質又は発光基質誘導体と、を少なくとも含むキットを提供する。このキットは、例えば、前記相互作用検出や前記タンパク質挙動追跡などに利用することができる。
【００３７】
また、前記タンパク質複合体をコードする塩基配列を少なくとも有する組み換えベクター又は該組み換えベクターを導入した細胞と、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの発光特性を改変し得る発光基質又は発光基質誘導体と、を少なくとも含むキットを提供する。このキットは、例えば、前記マーキング方法や前記薬剤スクリーニング方法などに利用することができる。
【００３８】
ここで、本発明における技術用語を定義する。「発光性タンパク質」とは、自ら発光するタンパク質、及び何らかの作用により発光するタンパク質の両方を含む。例えば、自ら発光する発光タンパク質、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に基づき発光するタンパク質、を含む。「蛍光性タンパク質」とは特定波長の光照射により、蛍光特性を変化させるもの、例えばフォトコンバージョン又はフォトクロミズムなどを起こすタンパク質を含む。
【００３９】
「別の蛍光波長を発することができる構造変化」とは、タンパク質がフォトコンバージョンなどにより、色を変化させることを意味する。「蛍光を発することが可能な構造変化」とは、タンパク質がフォトクロミズムなどにより、光を発することが可能な状態を意味する。「フォトコンバージョン」とは、特定の波長に光照射によって、蛍光色が変化する蛍光性タンパク質の特性を意味する。「フォトクロミズム」とは、異なる２つの波長の光照射によって、蛍光と退色を行う蛍光性タンパク質の特性を意味する。
【発明の効果】
【００４０】
本発明では、フォトコンバージョン又はフォトクロミズムなどを起こす蛍光性タンパク質を、光照射を行わないで、別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させることが可能である。従って、例えば本発明の方法により生体内物質をラベル等する場合、生体への外科的侵襲及び光侵襲による悪影響がない。また、光照射に影響を受け易い物質であっても、前記タンパク質でラベルすることができる。加えて、前記蛍光タンパク質は別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化したまま、その構造を維持するため、該構造変化に伴う蛍光のモニタリングを容易に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
以下、本発明の概念について図面を参照しながら説明する。各概念において一実施形態を挙げるが、この実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明が限定されることはない。なお、以下の実施形態の説明においては、本発明に係る方法等に使用する蛍光性タンパク質Ｙについて、便宜上、フォトコンバージョンを起こす蛍光性タンパク質を例に挙げて説明しているが、いずれの実施形態においても、フォトクロミズム、フォトアクチベーションなどを起こす蛍光性タンパク質を選択することは自由である。
【００４２】
図１は、蛍光性タンパク質Ｙｇを、発光性タンパク質Ｘβによって別の蛍光波長を発することができる構造に変化させる方法の概略図である。蛍光性タンパク質Ｙｇは、波長βの光照射により蛍光色ｇから蛍光色ｒを示す構造へ変化する性質を有する蛍光性タンパク質である。以下、構造変化を伴って別の蛍光波長を発する蛍光性タンパク質を符号Ｙｒで示す。
【００４３】
蛍光性タンパク質Ｙｇは、発光性タンパク質Ｘβが発光する波長βの発光エネルギーの転移により、蛍光色ｇから蛍光色ｒを示す構造へと変化する。本発明では、光照射を行わないで蛍光性タンパク質Ｙｇを別の蛍光波長を発することができる構造に変化させることができる。そのため、例えば生体内の深奥部の細胞又は組織内で蛍光性タンパク質Ｙｇの蛍光色を変化させる場合、生体は、光照射用ファイバーによる外科的侵襲や光侵襲による悪影響を受けることがないというメリットがある。
【００４４】
本発明に係る方法に用いる発光性タンパク質Ｘβは、蛍光性タンパク質Ｙｇを別の蛍光波長を発することができる構造に変化させ得る波長βの発光を示すタンパク質であれば特に限定されない。例えば、所定波長βの発光特性を有するように変異させた発光性タンパク質Ｘβ変異体であってもよい。また、人為的に波長βの発光を示す発光特性へ改変されたタンパク質であってもよい。図２を参照しながら詳しく説明する。
【００４５】
本来、発光基質Ｃαとの反応により波長αの発光特性を有するタンパク質Ｘαを、化学構造を人為的に変化させた発光基質誘導体Ｃβに変更することで波長βの発光特性に改変できるタンパク質がある（図２中（I）参照）。以下、波長αの発光特性を有するタンパク質を「タンパク質Ｘα」と、波長βの発光特性を有するタンパク質を「タンパク質Ｘβ」と称する。このタンパク質Ｘαを予め基質Ｃβとの反応により波長βの発光特性を有するタンパク質Ｘβとしておく。そして、この発光タンパク質Ｘβの波長βの発光エネルギーを、目的の蛍光性タンパク質Ｙｇへ転移させることで、蛍光性タンパク質Ｙｇを蛍光色ｇから蛍光色ｒを示す構造へと変化させることができる（図２中（II）参照）。
【００４６】
前記発光基質Ｃα、及び発光基質誘導体Ｃβは、発光性タンパク質Ｘαの発光特性を改変し得るものであれば特に限定されない。一例を挙げると、セレンテラジン（Coelenterazine、化学式１参照）、セレンテラジン（Coelenterazine、化学式２参照）誘導体などが挙げられる。
【００４７】
図３は、前記方法を応用した、タンパク質Ｙｇを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法を示す図である。本方法では、予め発光性タンパク質Ｘαと蛍光性タンパク質Ｙｇから構成されたタンパク質複合体を形成する。タンパク質Ｘαは、通常の基質Ｃαとの反応では波長αの発光エネルギーを示す発光特性を示す。そして、蛍光性タンパク質Ｙｇは、波長βの光照射により蛍光色ｇから蛍光色ｒを示す構造へと変化するタンパク質である。従って、発光性タンパク質Ｘαと蛍光性タンパク質Ｙｇが複合体を形成しても、蛍光性タンパク質Ｙｇの構造は変化しない。
【００４８】
しかし、このタンパク質複合体に発光基質誘導体Ｃβを反応させることで、タンパク質複合体を構成する発光性タンパク質Ｘαは波長βの発光エネルギーを示す発光特性へと改変される。そして、発光性タンパク質Ｘβに結合する蛍光性タンパク質Ｙｇは、蛍光色ｇから蛍光色ｒを示す構造へと変化する。
【００４９】
以上説明した方法に用いる発光性タンパク質Ｘβは、発光性を示すタンパク質であれば特に限定されない。例えば、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に基づく発光をするタンパク質であっても、自身が発光する発光タンパク質であってもよい。一例としては、ウミシイタケ由来のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（配列番号１）が挙げられる。それ以外のルシフェラーゼとして、例えば、ホタル由来、クリックビートル由来、鉄道虫由来、ウミホタル由来などのルシフェラーゼなどを用いることも自由である。また、これらのタンパク質を所定波長の発光特性を有するように人工的に変異させた変異体を、発光性タンパク質Ｘβとして用いることも可能である。
【００５０】
また、蛍光性タンパク質Ｙｇは、発光性タンパク質Ｘからの所定波長の発光エネルギー転移に基づいて別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化するタンパク質であれば、特に限定されないが、例えばフォトコンバージョン又はフォトクロミズム、フォトアクチベーションなどの特性を有するタンパク質が好ましい。具体例を挙げると、フォトコンバージョンを起こすＫａｅｄｅ（配列番号２）又はＫａｅｄｅの変異体（配列番号３）、ＫｉｋＧＲ（配列番号４）、ＰＳ−ＣＦＰ、ＰＳ−ＣＦＰ２、ＥｏｓＦＰ、ｍＥｏｓＦＰなど、又はフォトクロミズムを起こすＤｒｏｎｐａ（配列番号５）、ＹＦＰなど、フォトアクチベーションを起こすＰＡ−ＧＦＰなど、その他の蛍光性タンパク質としてＢＦＰ−ａｑなどが挙げられる。
【００５１】
図４は、蛍光性タンパク質Ｙを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法を利用し物質間の相互作用を検出する方法の概念図である。物質Ａをタンパク質Ｘβでラベルし、物質Ｂを蛍光性タンパク質Ｙｇでラベルしておく。そして、物質Ａと物質Ｂが相互作用すると、発光性タンパク質Ｘβと蛍光性タンパク質Ｙｇが発光エネルギー転移の可能な程度に接近する。その結果、発光性タンパク質Ｘβの発光エネルギーが、蛍光性タンパク質Ｙｇへ転移し、蛍光性タンパク質Ｙｇは蛍光色ｇから蛍光色ｒを示す構造へと変化する。このようにタンパク質Ｘβ、及び蛍光性タンパク質Ｙｇで各物質Ａ、Ｂをラベルし、蛍光性タンパク質Ｙｇの構造変化を確認することにより、物質Ａ、Ｂ間の相互作用の検出をすることができる。
【００５２】
図４に示した物質間の相互作用の検出方法の具体例を図５に示す。図５は、ハイブリダイゼーションの検出方法の概念図である。例えば、ＤＮＡチップのように、基板１上にＤＮＡプローブ２を固定し、このＤＮＡプローブ２を発光性タンパク質Ｘβでラベルしておく（図５中（I）参照）。そして、サンプル液３内の核酸４を蛍光性タンパク質Ｙｇでラベルしておく。
【００５３】
サンプル液３内にＤＮＡプローブ２の塩基配列と相補性のある塩基配列を有する核酸４が存在すれば、ハイブリダイゼーションが起き、発光性タンパク質Ｘβと蛍光性タンパク質Ｙｇが発光エネルギー転移の可能な程度に接近する。その結果、蛍光性タンパク質Ｙｇは、蛍光色ｇから蛍光色ｒを示す構造へと変化する（図５中（II）参照）。この方法を利用すれば、例えば遺伝子病に関与する特定遺伝子の検出などが可能である。なお、ＤＮＡプローブ２を蛍光性タンパク質Ｙｇでラベルし、サンプル液３中の核酸４を発光性タンパク質Ｘβでラベルしてもよい。
【００５４】
図６は、図４に示す方法を応用した物質間の相互作用検出方法の概念図である。物質ａは、そのままでは物質Ｂと相互作用しない物質であるが、物質Ｄが物質ａに何らかの作用をすることにより、物質Ｂと相互作用する物質Ａへと変化する物質である（図６中（I）参照）。物質ａを発光性タンパク質Ｘβでラベルし、物質Ｂを蛍光性タンパク質Ｙｇでラベルしておく。物質Ｄが物質ａに作用すれば、物質ａが物質Ａへと変化し、物質Ａと物質Ｂが相互作用するようになる。そして、発光性タンパク質Ｘβと蛍光性タンパク質Ｙｇが発光エネルギー転移の可能な程度に接近する。その結果、蛍光性タンパク質Ｙｇは、蛍光色ｇから蛍光色ｒを示す構造へと変化する（図６中（II）参照）。
【００５５】
蛍光性タンパク質Ｙｇの構造変化の有無を確認することで、物質Ｄが物質ａに作用したか否かを検出することができる。なお、物質ａを蛍光性タンパク質Ｙｇでラベルし、物質Ｂを発光性タンパク質Ｘβでラベルしてもよい。
【００５６】
図７は、図６で示した概念の生態内での一例を示す図である。細胞５内に存在する物質Ａｒを発光性タンパク質Ｘβでラベルし、細胞５に存在する受容体Ｒを蛍光性タンパク質Ｙｇでラベルする（図７中（I）参照）。物質Ａｒは、細胞５外の特定のリガンド６が受容体Ｒを刺激することにより、シグナル伝達を受け、受容体Ｒに結合する性質を持つ物質である（図７中（II）参照）。特定のリガンド６が受容体Ｒを刺激すると、物質Ａｒが受容体Ｒと結合するため、タンパク質Ｘβと蛍光性タンパク質Ｙｇが発光エネルギー転移の可能な程度に接近する。その結果、蛍光性タンパク質Ｙｇは、蛍光色ｇから蛍光色ｒを示す構造へと変化する（図７中（III）参照）。蛍光性タンパク質Ｙｇの別の蛍光波長を発することができる構造であるかの有無を確認することで、リガンド６が受容体を刺激したか否かを調べることができる。なお、物質Ａｒを蛍光性タンパク質Ｙｇでラベルし、受容体Ｒを発光性タンパク質Ｘβでラベルしてもよい。
【００５７】
この方法の具体例を挙げる。細胞５内に存在するβ−アレスチンを発光性タンパク質Ｘβでラベルし、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を蛍光性タンパク質Ｙｇでラベルしておく。特定リガンド６がＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を刺激すると、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）が活性化し、シグナル伝達調整をするβ−アレスチンがＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に結合する。すると、発光性タンパク質Ｘβと蛍光性タンパク質Ｙｇが発光エネルギー転移の可能な程度に接近する。その結果、蛍光性タンパク質Ｙｇは、蛍光色ｇから蛍光色ｒを示す構造へと変化する。
【００５８】
このように、蛍光性タンパク質Ｙｇの別の蛍光波長を発することができる構造であるかを確認することで、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の活性化を検出することができる。この方法は、オーファン受容体のリガンド探しや、ひいては薬物スクリーニングにも応用できる。
【００５９】
本発明に係る各方法に用いる蛍光性タンパク質Ｙは、発光性タンパク質Ｘによって別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化するため、一旦、該構造に変化すれば、その構造が再度変化しない限り、いつでも構造変化が起こっているかを検出することができる。従って、前記相互作用の検出を行う際、相互作用時、リアルタイムにモニタリングを行う必要がなく、測定者によって定められる任意の時間後（所定時間後）に相互作用履歴を検出することができる。
【００６０】
例えば、β−アレスチンがＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に結合し、その後再び離れるような場合であっても、長時間モニタリングし続ける必要がなく、所定時間経過後にＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）をラベルした蛍光性タンパク質Ｙｇの構造変化の有無を確認すれば、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の活性化の履歴を検出することができる。
【００６１】
図８は、物質間の相互作用前後の該物質の挙動を追跡する方法の概念図である。細胞５内に存在する物質Ｇを蛍光性タンパク質Ｙｇでラベルし、細胞５に存在する受容体Ｒを発光性タンパク質Ｘβでラベルする（図８中（I）参照）。この物質Ｇは、特定のリガンド６が受容体Ｒを刺激することにより、受容体Ｒ上で活性化し、その後、何らかの動きをする物質である。特定のリガンド６が受容体Ｒを刺激すると物質Ｇは受容体Ｒ上へ移動するため（図８中（II）参照）、発光性タンパク質Ｘβと蛍光性タンパク質Ｙｇが発光エネルギー転移の可能な程度に接近する。その結果、蛍光性タンパク質Ｙｇは、蛍光色ｇから蛍光色ｒを示す構造へと変化する（図８中（III）参照）。従って、蛍光性タンパク質Ｙｇの別の蛍光波長を発することができる構造であるかを確認することで、第一に、物質Ｇの活性化を検出できる。
【００６２】
そして、物質Ｇは受容体Ｒ上で活性化された後、何らかの動きをするが、物質Ｇをラベルする蛍光タンパク質Ｙｇは、その蛍光色ｇから蛍光色ｒを示す構造へと変化した蛍光性タンパク質Ｙｒとなっているため、蛍光色ｒの動きを追跡することで、第二に活性化後の物質Ｇの挙動を追跡することもできる。
【００６３】
物質Ｇをラベルする蛍光性タンパク質Ｙｇは、前記のとおり、フォトコンバージョンを起こす蛍光性タンパク質でもフォトクロミズムを起こす蛍光性タンパク質でもよいが、フォトコンバージョンを起こす蛍光性タンパク質の場合、物質Ｇの活性前と活性後で異なる蛍光色ｇ、ｒを示すため、物質Ｇの活性化の検出、活性化後の物質Ｇの挙動の追跡に加え、第３に活性化前の物質Ｇの挙動も確認することができる。
【００６４】
この方法の具体例を挙げる。Ｇタンパク質を蛍光性タンパク質Ｙｇでラベルし、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を発光性タンパク質Ｘβでラベルする。特定のリガンド６がＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を刺激すると、Ｇタンパク質がＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）へ引きつけられ、活性化される。このとき発光性タンパク質Ｘβと蛍光性タンパク質Ｙｇが発光エネルギー転移の可能な程度に接近する。その結果、蛍光性タンパク質Ｙｇは、蛍光色ｇから蛍光色ｒを示す構造へと変化する。
【００６５】
蛍光色ｇの挙動を観察することにより、Ｇタンパク質がＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）へ引きつけられる様子を確認することができ、また、蛍光色ｇから蛍光色ｒへの変化により、Ｇタンパク質が活性化されたことが確認できる。さらに、蛍光色ｒの挙動を観察することで、活性化後のＧタンパク質の挙動を追跡することができる。
【００６６】
図９は、本発明に係る生体内の所定の細胞をマーキングする方法の概念図である。まず、前記発光性タンパク質Ｘαと前記蛍光性タンパク質Ｙｇとからなるタンパク質複合体を生体内の所定の細胞又は組織内に存在又は発現させておく（図９中（Ｉ）参照）。ここに、発光性タンパク質Ｘαの発光波長αを所定波長βの発光特性へ改変させ得る発光基質誘導体Ｃβを生体内へ導入する（図９中（II）参照）。すると、発光性タンパク質Ｘαの発光特性が、波長βの発光を示す発光特性へと改変される。そして、発光性タンパク質Ｘβから、所定波長βの発光エネルギーが蛍光性タンパク質Ｙｇへ転移し、蛍光性タンパク質Ｙｇは、蛍光色ｇから蛍光色ｒを示す構造へと変化する（図９中（III）参照）。この方法で、生体内の所定の細胞又は組織をマーキングすることができる。
【００６７】
図１０は、本発明に係る生体内異物侵入の制御を担うタンパク質を対象とする機能阻害剤スクリーニング方法の概念図である。細胞５内に、発光性タンパク質Ｘαと蛍光性タンパク質Ｙｇのタンパク質複合体を発現させておき、細胞５外から基質Ｃβを導入する。しかし、細胞５外からの異物侵入の制御を担うタンパク質Ｍが存在する場合は、細胞５外からの基質Ｃβの侵入も阻害されてしまう（図１０中（I）参照）。そのため、発光タンパク質Ｘαの発光特性を改変することができず、蛍光性タンパク質Ｙｇを、蛍光色ｇから蛍光色ｒを示す構造へと変化させることができない。
【００６８】
ここで、タンパク質Ｍの機能を阻害する物質Ｉでタンパク質Ｍの機能を阻害することができれば、細胞５内へ基質Ｃβが侵入できるようになる（図１０中（II）参照）。そして、発光性タンパク質Ｘαを所定波長βの発光特性の発光タンパク質Ｘβへ改変させることができる。その結果、蛍光性タンパク質Ｙｇを、蛍光色ｇから蛍光色ｒを示す構造へと変化させることができる（図１０中（III）参照）。このように蛍光性タンパク質Ｙｇの蛍光色の変化を指標として、タンパク質Ｍの機能を阻害し得る物質Ｉのスクリーニングを行うことができる。
【００６９】
この方法の具体例を挙げる。多剤耐性タンパク質であるＰ−糖タンパク質は、細胞表面に存在し、薬剤が細胞へ侵入する際、薬剤をくみ出す働きをしている。Ｐ−糖タンパク質は、基質Ｃβが細胞５内へ侵入するのも阻害するため、予め細胞５内にタンパク質複合体を発現させておき、基質Ｃβを細胞５内へ導入しようとしてもＰ−糖タンパク質により、阻害されてしまう。しかし、Ｐ−糖タンパク質阻害作用を有する物質ＩをＰ−糖タンパク質に作用させておけば、基質Ｃβを細胞５内へ導入することができ、発光性タンパク質Ｘαを所定波長βの発光特性の発光タンパク質Ｘβへ改変させることができる。その結果、タンパク質複合体を構成する蛍光性タンパク質Ｙｇを、蛍光色ｇから蛍光色ｒを示す構造へと変化させることができる。
【００７０】
このように、タンパク質複合体を構成する蛍光性タンパク質Ｙｇの蛍光色の変化を確認することで、物質ＩがＰ−糖タンパク質の機能を阻害し得る物質であるか否かを調べることができる。すなわち、蛍光性タンパク質Ｙｇの構造変化に伴う蛍光変化が確認できた場合は、物質ＩはＰ−糖タンパク質に対して阻害作用を示す物質であり、逆に蛍光性タンパク質Ｙｇの構造変化に伴う蛍光変化が確認できない場合は、物質ＩはＰ−糖タンパク質に対して阻害作用を有さない物質であることが分かる。このように、前記タンパク質複合体を使って、Ｐ−糖タンパク質阻害剤のスクリーニングができる。
【００７１】
近年、Ｐ−糖タンパク質が細胞表面に多く発現したがん細胞は、抗がん剤をくみ出してしまうため効果が期待できないことが問題となっている。本発明に係る薬剤スクリーニング方法を利用することにより、Ｐ−糖タンパク阻害剤をスクリーニングすることができれば、該阻害剤と抗がん剤とを併用し、抗がん剤の効果発現を上昇させることができると考えられる。
【００７２】
本発明に係る生体マーキング方法や薬剤スクリーニング方法などに用いるタンパク質複合体は、発光性を示すタンパク質Ｘαと、該発光性タンパク質Ｘαからの所定波長の発光エネルギーにより別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化し得る蛍光性タンパク質Ｙｇとからなるものであれば、特に限定されない。
【００７３】
前記タンパク質複合体を構成する発光性タンパク質Ｘαは、発光性を示すタンパク質であれば特に限定されない。例えば、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に基づく発光をするタンパク質であっても、自身が発光する発光タンパク質であってもよい。一例としては、ウミシイタケ由来のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（配列番号１）が挙げられる。それ以外のルシフェラーゼとして、例えば、ホタル由来、クリックビートル由来、鉄道虫由来、ウミホタル由来などのルシフェラーゼなどを用いることも自由である。また、これらのタンパク質を所定波長の発光特性を有するように人工的に変異させた変異体を、発光性タンパク質Ｘβとして用いることも可能である。
【００７４】
また、前記タンパク質複合体を構成する蛍光性タンパク質Ｙｇも、発光性タンパク質Ｘからの所定波長の発光エネルギー転移に基づいて別の蛍光波長を発することができる構造変化又は蛍光を発することが可能な構造に変化するタンパク質であれば、特に限定されないが、例えばフォトコンバージョン又はフォトクロミズム、フォトアクチベーションなどの特性を有するタンパク質が好ましい。具体例を挙げると、フォトコンバージョンを起こすＫａｅｄｅ（配列番号２）又はＫａｅｄｅの変異体（配列番号３）、ＫｉｋＧＲ（配列番号４）、ＰＳ−ＣＦＰ、ＰＳ−ＣＦＰ２、ＥｏｓＦＰ、ｍＥｏｓＦＰなど、又はフォトクロミズムを起こすＤｒｏｎｐａ（配列番号５）、ＹＦＰなど、フォトアクチベーションを起こすＰＡ−ＧＦＰなど、その他の蛍光性タンパク質としてＢＦＰ−ａｑなどが挙げられる。
【００７５】
本発明に係る生体マーキング方法や薬剤スクリーニング方法などを行う際、前記タンパク質複合体をコードする塩基配列を少なくとも有する組み換えベクター、及び該組み換えベクターを導入した細胞を利用して、生体内の所定の細胞又は組織へ前記タンパク質複合体を発現又は存在させることができる。
【００７６】
更に、本発明では、発光性タンパク質Ｘαをコードする塩基配列を有するベクター、蛍光性タンパク質Ｙｇをコードする塩基配列を有するベクター、及び発光基質Ｃα又は発光基質誘導体Ｃβを少なくとも含むキットを利用して、本発明に係る相互作用検出方法、タンパク質挙動追跡方法、生体マーキング方法、薬剤スクリーニング方法などを行うことができる。
【００７７】
上記キットに用いる発光性タンパク質Ｘαは、発光性を有するタンパク質であれば特に限定されないが、例えば、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に基づく発光をするタンパク質であっても、自身が発光する発光タンパク質であってもよい。一例としては、ウミシイタケ由来のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（塩基配列番号６）が挙げられる。それ以外のルシフェラーゼとして、例えば、ホタル由来、クリックビートル由来、鉄道虫由来、ウミホタル由来などのルシフェラーゼなどを用いることも自由である。また、これらのタンパク質を所定波長の発光特性を有するように人工的に変異させた変異体を、発光性タンパク質Ｘβとして用いることも可能である。
【００７８】
また、上記キットに用いる蛍光性タンパク質Ｙｇも、発光性タンパク質Ｘからの所定波長の発光エネルギー転移に基づいて別の蛍光波長を発することができる構造変化又は蛍光を発することが可能な構造に変化するタンパク質であれば、特に限定されないが、例えばフォトコンバージョン又はフォトクロミズム、フォトアクチベーションなどの特性を有するタンパク質が好ましい。具体例を挙げると、フォトコンバージョンを起こすＫａｅｄｅ（塩基配列番号７）又はＫａｅｄｅの変異体（塩基配列番号８）、ＫｉｋＧＲ（塩基配列番号９）、ＰＳ−ＣＦＰ、ＰＳ−ＣＦＰ２、ＥｏｓＦＰ、ｍＥｏｓＦＰなど、又はフォトクロミズムを起こすＤｒｏｎｐａ（塩基配列番号１０）、ＹＦＰなど、フォトアクチベーションを起こすＰＡ−ＧＦＰなど、その他の蛍光性タンパク質としてＢＦＰ−ａｑなどが挙げられる。
【００７９】
更に、上記キットに用いる発光基質Ｃα及び発光基質誘導体Ｃβは、発光性タンパク質Ｘαの発光特性を改変し得るものであれば特に限定されない。一例を挙げると、セレンテラジン（Coelenterazine、化学式１参照）、セレンテラジン（Coelenterazine、化学式２参照）誘導体などが挙げられる。
【実施例１】
【００８０】
実施例１では、Ｋａｅｄｅ-Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ融合タンパク質において、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの基質を、セレンテラジン（Coelenterazine、化学式２参照）誘導体であるDeepBlueCとした場合の蛍光色変化を検証した。
【００８１】
＜材料および方法＞
Ａ．ｃＤＮＡの調製
まず、蛍光タンパク質Ｋａｅｄｅの終止コドンの前に制限酵素Bgl IIによって認識される配列を挿入するため、オリゴDNA（配列番号１１、第２１番目から第４０番目はＫａｅｄｅをコードする部分）を合成した。合成したオリゴDNAとＫａｅｄｅの開始コドン近傍の配列をもつオリゴDNA（配列番号１２、第１７番目から第３６番目はＫａｅｄｅをコードする部分）とを用いて、東洋紡社のKOD＋によって３０サイクルのPCR反応を行い、終止コドンを持たないＫａｅｄｅをコードするDNA断片を調製した。別に、野生型遺伝子をコードするｃDNAを、遺伝子発現ベクター「pEB6CAG」に組み込んだベクターDNA用意した。ここで用いた遺伝子発現ベクター「pEB6CAG」とは、本願発明者が開発した、ヒト細胞中で安定に複製・維持される遺伝子発現ベクターである（Tanaka J, Miwa Y, Miyoshi K, Ueno A, Inoue H. Contruction of Epstein-Barr Virus-based expression vector containing mini-oriP. Biochem. Biophys. Res. Commun. 264: 938-943,1999）。そして、調整したDNA断片を制限酵素Age I  -Not Iによって切断した後に、ベクターDNAの当該部位と置換した。次に制限酵素Bgl IIにて切断し、Ｋａｅｄｅ cDNAの上流側のBamHI認識部位を切断したものと連結して、２つのＫａｅｄｅタンパク質がタンデムに連結したベクターを作成した。さらに制限酵素Bgl IIにて切断し、別に「pEB6CAG」に組み込んだＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをコードするcDNA断片の上流側のBamHI認識配列とタンパク質合成の翻訳の読み枠が合うように連結した（図１１参照）。
【００８２】
Ｂ．遺伝子発現ベクターの調製
構築した発現ベクターDNAは、Bio101社のRPMキットを用いて大腸菌から大量調製した。
【００８３】
Ｃ．形質転換細胞の作製および選択
このDNA0.5μgをバイオラッド社のリポフェクション試薬TransFectinを用いてヒト細胞株HEp-2に導入し、４日間1.5 mg/ml G418存在下で培養して、DNAが導入された細胞だけを選択した。この細胞を発光・蛍光顕微鏡（オリンパス社）を用いて観察した。緑の蛍光の観察にはバンドパスフィルター530/30を、赤の蛍光観察にはバンドパスフィルター630/55を使用した。
【００８４】
＜結果＞
発光に伴う蛍光波長の変化の解析
図１２〜１４は、Ｋａｅｄｅ-Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ融合タンパク質において、初めは緑の蛍光しか示さなかったＫａｅｄｅが、ＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼのDeepBlueCを基質とした発光後には赤い蛍光も示すようになった結果を示す図である。
【００８５】
発光基質であるDeepBlueCを添加する前は、緑の蛍光のみが観察され、赤い蛍光のシグナルはほとんど得られなかった（図１２参照）。
【００８６】
ここにDeepBlueCを終濃度10 μMになるように添加し、３７℃で２０分間の発光状態を撮影した。ほとんどの細胞で発光が起こっていることが確認された（図１３参照）。
【００８７】
２０分後に再び緑と赤の蛍光を観察したところ、多数の細胞において、赤い蛍光を示すようになったことが確認された（図１４参照）。
【００８８】
実施例１では、ＫａｅｄｅとＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼとからなるタンパク質複合体に、発光基質誘導体であるDeepBlueCを添加することにより、外部からの光照射を行うことなく、タンパク質複合体を構成するＫａｅｄｅの蛍光が緑から赤に変化した。従って、DeepBlueCの添加により、タンパク質複合体の内部において、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼから所定波長の発光エネルギーがＫａｅｄｅに転移し、外部から光照射を行うことなく、Ｋａｅｄｅの発色団のタンパク質構造を変化させることが分かった。Ｋａｅｄｅの緑色の状態時の発色団の構造式を化学式３に、Ｋａｅｄｅの赤色の状態時の発色団の構造式を化学式４に示す。
【化３】
2007325538.tif 000005
【化４】
2007325538.tif 000006
【実施例２】
【００８９】
実施例２では、ＫｉｋＧＲ-Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ融合タンパク質において、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの基質を、セレンテラジン（Coelenterazine、化学式２参照）誘導体であるDeepBlueCとした場合の蛍光色変化を検証した。
【００９０】
＜材料および方法＞
実施例１と同様の方法により、オリゴDNA（配列番号１３、第１０番目から第２９番目はＫｉｋＧＲをコードする部分）とＫｉｋＧＲの開始コドン近傍の配列をもつオリゴDNA（配列番号１４、第２７番目から第３８番目はＫｉｋＧＲをコードする部分）とを用いて、ＫｉｋＧＲ-Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ融合タンパク質をコードするcDNA断片を調製し、pEB6CAGベクターに組み込み細胞に導入した。
【００９１】
＜結果＞
発光に伴う蛍光波長の変化の解析
図１５は、ＫｉｋＧＲ-Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ融合タンパク質において、初めは緑の蛍光しか示さなかったＫａｅｄｅが、ＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼのDeepBlueCを基質とした発光後には赤い蛍光も示すようになった結果を示す図である。
【００９２】
発光基質であるDeepBlueCを添加する前は、緑の蛍光のみが観察され、赤い蛍光のシグナルはほとんど得られなかった（図１５参照）。
【００９３】
ここにDeepBlueCを終濃度10 μMになるように添加し、３７℃で２０分後に再び緑と赤の蛍光を観察したところ、多数の細胞において、赤い蛍光を示すようになったことが確認された（図１５参照）。
【実施例３】
【００９４】
実施例３では、Ｄｒｏｎｐａ-Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ融合タンパク質において、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの基質を、セレンテラジン（Coelenterazine、化学式２参照）誘導体であるDeepBlueCとした場合のＤｒｏｎｐａの蛍光を発する状態への変化を検証した。
【００９５】
＜材料および方法＞
実施例１と同様の方法により、オリゴDNA（配列番号１５、第１０番目から第３０番目はＤｒｏｎｐａをコードする部分）を合成した。合成したオリゴDNAとＤｒｏｎｐａの開始コドン近傍の配列をもつオリゴDNA（配列番号１６、第２７番目から第３８番目はＤｒｏｎｐａをコードする部分）とを用いて、Ｄｒｏｎｐａ-Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ融合タンパク質をコードするcDNA断片を調製し、pEB6CAGベクターに組み込み細胞に導入した。
【００９６】
＜結果＞
発光に伴う蛍光波長の変化の解析
図１６は、Ｄｒｏｎｐａ-Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ融合タンパク質において、初めはＤｒｏｎｐａの緑の蛍光は検出されなかったが、ＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼのDeepBlueCを基質とした発光後には蛍光を示すようになった結果を示す図である。
【００９７】
発光基質であるDeepBlueCを添加する前は、緑の蛍光のシグナルはほとんど得られなかった（図１６参照）。
【００９８】
ここにDeepBlueCを終濃度10 μMになるように添加し、３７℃で２０分後に再び蛍光を観察したところ、多数の細胞において、緑の蛍光を示すようになったことが確認された（図１６参照）。
【実施例４】
【００９９】
実施例４では、Ｋａｅｄｅ-bZipとbZip-Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを別々の分子として同時に細胞に発現させた場合において、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの基質を、セレンテラジン（Coelenterazine、化学式２参照）誘導体であるDeepBlueCとした場合の蛍光色変化を検証した。
【０１００】
＜材料および方法＞
実施例１にて作成したＫａｅｄｅ-Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ融合タンパク質をコードするcDNAを用いて、制限酵素Nco I-Bgl IIによりＫａｅｄｅのかわりにロイシンジッパーA配列をコードするDNA断片（配列番号１７）を挿入し、ZipA-ＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをコードするcDNAを調製し、これをpEB6CAG-SRZに組み込んだ。またＫａｅｄｅ-Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ融合タンパク質をコードするcDNAを用いて、制限酵素Bgl II-Not IによってＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをコードするDNA断片を除き、かわりにロイシンジッパーB配列をコードするDNA断片（配列番号１８）をBamHI-Not Iで切断したものを挿入し、Ｋａｅｄｅ-ZipBをコードするcDNAがpEB6CAGに組み込まれている状態にした。
【０１０１】
＜結果＞
発光に伴う蛍光波長の変化の解析
図１７は、Ｋａｅｄｅ-ZipB タンパク質とZipA-Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼタンパク質を同時に細胞内に発現させたときに初めは緑の蛍光しか示さなかったＫａｅｄｅが、ロイシンジッパー配列を介してＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼと相互作用し、DeepBlueCを基質とした発光後には赤い蛍光も示すようになった結果を示す図である。
【０１０２】
発光基質であるDeepBlueCを添加する前は、緑の蛍光のみが観察され、赤い蛍光のシグナルはほとんど得られなかった（図１７参照）。
【０１０３】
ここにDeepBlueCを終濃度5 μMになるように添加し３７℃で１０分後、さらに同量のDeepBlueCを追加して３７℃で１０分間反応させる操作を２回繰り返した。再び緑と赤の蛍光を観察したところ、多数の細胞において、赤い蛍光を示すようになったことが確認された（図１７参照）。
【０１０４】
実施例４では、ＫａｅｄｅとＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを別々に発現させた場合にも、DeepBlueCの添加により、Ｋａｅｄｅが赤い蛍光を示すことが確認できた。従って、本発明に係る方法は、ＫａｅｄｅとＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを別々の物質にラベルし、DeepBlueCの添加によるＫａｅｄｅの蛍光色を確認することで、該物質間の相互作用検出に利用できることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
本発明に係る方法は、フォトコンバージョン又はフォトクロミズムなどの特性を示す蛍光性タンパク質を、光照射を行うことなく、別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させることができるため、生体内等でも外科的侵襲、光侵襲による悪影響を気にすることなく、安全に行うことができる。また、光照射に影響を受け易い物質であっても、前記タンパク質でラベルすることができる。
【０１０６】
更に、前記蛍光タンパク質は別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化したまま、その構造を維持するため、長時間、モニタリングし続ける必要がなく、相互作用検出や薬剤スクリーニングなどにおいて、大幅な時間短縮、コストダウンなどを実現できる。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】蛍光性タンパク質Ｙｇを、発光性タンパク質Ｘβによって別の蛍光波長を発することができる構造へ変化させる方法の概略図である。
【図２】人為的に波長βの発光を示す発光特性へ改変された発光性タンパク質Ｘβによって、蛍光性タンパク質Ｙｇを別の蛍光波長を発することができる構造へ変化させる方法の概略図である。
【図３】図１とは異なるタンパク質Ｙｇを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法の概略図である。
【図４】物質間の相互作用を、発光性タンパク質Ｘβ及び蛍光性タンパク質Ｙｇを使って検出する方法の概念図である。
【図５】図４に示した物質間の相互作用の検出の一例を示す図である。
【図６】図４に示す方法を応用した物質間の相互作用検出方法の概念図である。
【図７】図６で示した概念の生態内での一例を示す図である。
【図８】物質間の相互作用前後の該物質の挙動を追跡する方法の概念図である。
【図９】本発明に係るタンパク質複合体を利用した生体マーキング方法の概念図である。
【図１０】本発明に係るタンパク質複合体を利用した、生体内異物侵入の制御を担うタンパク質を対象とする機能阻害剤スクリーニング方法の概念図である。
【図１１】実施例１で作製したＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼとＫａｅｄｅの融合蛋白質を模式的に表した図である。
【図１２】実施例１におけるDeepBlueCを添加する前のＫａｅｄｅの蛍光を示す図面代用写真である。
【図１３】実施例１におけるDeepBlueCを添加後、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ発光中の図面代用写真である。
【図１４】実施例１におけるＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ発光後のＫａｅｄｅの蛍光を示す図面代用写真である。
【図１５】実施例２におけるDeepBlueCを添加する前と後のＫｉｋＧＲの蛍光を示す図面代用写真である。
【図１６】実施例３におけるDeepBlueCを添加する前と後のＤｒｏｎｐａの蛍光を示す図面代用写真である。
【図１７】実施例４におけるDeepBlueCを添加する前と後のＫａｅｄｅの蛍光を示す図面代用写真である。
【符号の説明】
【０１０８】
Ｘα、Ｘβ、  蛍光性タンパク質Ｙｇ、Ｙｒ  蛍光性タンパク質
Ｃα  発光基質
Ｃβ  発光基質誘導体
Ａ、Ｂ、Ｄ  物質
１  基板１
２  ＤＮＡプローブ
３  サンプル液
４  核酸
５  細胞
６  リガンド
【図１】
2007325538.tif 000009
【図２】
2007325538.tif 000010
【図３】
2007325538.tif 000011
【図４】
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【図５】
2007325538.tif 000013
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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