(57)【要約】      （修正有）【課題】レオウイルス科に属するウイルスについてリバースジェネティクスの系を提供する。【解決手段】以下のステップ（１）〜（４）を含む方法で組換えウイルスを調製する：（１）レオウイルス科のウイルス（第１ウイルス）の外殻タンパク質遺伝子分節をコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡコンストラクトを宿主細胞にトランスフェクトする；（２）ヘルパーウイルスとして、第１ウイルスと同属のウイルス（第２ウイルス）を宿主細胞に感染させる；（３）第１ウイルスの外殻タンパク質遺伝子分節がコードする外殻タンパク質に対応する、第２ウイルスの外殻タンパク質を特異的に認識して中和する抗体を、宿主細胞から産生されるウイルスに接触させる；（４）ｃＤＮＡ由来の外殻タンパク質遺伝子分節を保有する組換えウイルスを回収する。【選択図】図５
2007215466.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ（１）〜（４）を含む、組換えウイルスの調製法：
（１）レオウイルス科のウイルス（第１ウイルス）の外殻タンパク質遺伝子分節をコードするcDNAが、DNA依存性RNAポリメラーゼが認識するプロモーター制御下に配置されたDNAコンストラクトを宿主細胞にトランスフェクトするステップ（但し、宿主細胞には、トランスフェクト操作の前又は後に前記プロモーターに対応するDNA依存性RNAポリメラーゼを発現する核酸コンストラクトが導入される）；
（２）ステップ（１）の後、ヘルパーウイルスとして、前記第１ウイルスと同属のウイルス（第２ウイルス）を前記宿主細胞に感染させるステップ；
（３）ステップ（２）の後、前記第１ウイルスの前記外殻タンパク質遺伝子分節がコードする外殻タンパク質に対応する、前記第２ウイルスの外殻タンパク質を特異的に認識して中和する抗体を、前記宿主細胞から産生されるウイルスに接触させるステップ；及び
（４）ステップ（３）の後、前記cDNA由来の外殻タンパク質遺伝子分節を保有する組換えウイルスを回収するステップ。
【請求項２】
前記第１ウイルスがロタウイルス属のウイルスであることを特徴とする、請求項１に記載の調製法。
【請求項３】
前記第１ウイルスがサルロタウイルスであり、前記第２ウイルスがヒトロタウイルスであることを特徴とする、請求項１に記載の調製法。
【請求項４】
前記サルロタウイルスがSA11株であり、前記ヒトロタウイルスがKU株であることを特徴とする、請求項３に記載の調製法。
【請求項５】
前記外殻タンパク質がVP4であることを特徴とする、請求項３又は４に記載の調製法。
【請求項６】
前記DNA依存性RNAポリメラーゼがT7 RNAポリメラーゼであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の調製法。
【請求項７】
前記核酸コンストラクトが、T7 RNAポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルスであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の調製法。
【請求項８】
前記宿主細胞がCOS-7細胞であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の調製法。
【請求項９】
前記DNAコンストラクトとして、保持するcDNAがコードする外殻タンパク質の種類がDNAコンストラクト毎に異なる、複数のDNAコンストラクトが使用される、請求項１〜８のいずれかに記載の調製法。
【請求項１０】
前記DNAコンストラクトが、外来遺伝子をコードする配列を更に含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の調製法。
【請求項１１】
前記ステップ（３）をトリプシン及び／又はキモトリプシン存在下で実施することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の調製法。
【請求項１２】
前記ステップ（３）が、以下のステップ（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択されるいずれかのステップからなることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の調製法：
（ａ）ステップ（２）の後、前記抗体の存在下で前記宿主細胞を培養するステップ；
（ｂ）ステップ（２）の後、前記抗体の存在下で前記宿主細胞を培養し、産生されたウイルスを回収し、別の宿主細胞（第２宿主細胞）に感染させ、前記抗体の存在下で第２宿主細胞を培養するステップ；
（ｃ）ステップ（２）の後、産生されたウイルスを回収し、別の宿主細胞（第２宿主細胞）に感染させ、前記抗体の存在下で第２宿主細胞を培養するステップ；
（ｄ）ステップ（２）の後、産生されたウイルスを回収し、別の宿主細胞（第２宿主細胞）に感染させ、前記抗体の存在下で第２宿主細胞を培養し、産生されたウイルスを回収し、さらに別の宿主細胞（第３宿主細胞）に感染させ、前記抗体の存在下で第３宿主細胞を培養するステップ。
【請求項１３】
ステップ（ａ）〜（ｄ）において、培養操作の少なくとも一部が回転培養で実施されることを特徴とする請求項１２に記載の調製法。
【請求項１４】
前記第２宿主細胞がMA104細胞又はCV-1細胞である、請求項１２又は１３に記載の調製法。
【請求項１５】
5’末端側から3’末端側に向かって順に、T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列、ロタウイルスのVP4遺伝子分節をコードするcDNA、リボザイム配列、及びT7 RNAポリメラーゼターミネータ配列が配置されてなることを特徴とする、組換えロタウイルス調製用のDNAコンストラクト。
【請求項１６】
前記リボザイム配列がD型肝炎ウイルス（HDV）のリボザイムをコードする配列であることを特徴とする、請求項１５に記載のDNAコンストラクト。
【請求項１７】
前記ロタウイルスがサルロタウイルスであることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載のDNAコンストラクト。
【請求項１８】
外来遺伝子をコードするcDNA配列を含むことを特徴とする、請求項１５〜１７のいずれかに記載のDNAコンストラクト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はレオウイルス科のウイルスのリバースジェネティクス系及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ロタウイルスによる冬季乳幼児嘔吐下痢症は５歳までにほぼ１００％の乳幼児で起こる。感染力の高さゆえ、衛生状態の改善では、本ウイルス感染を制御し得ない。世界的にみると、開発途上国を中心に毎年約５０万人の死亡例が報告される一方で、開発国においては入院例が多いために医療経済的見地から本ウイルスの感染予防が重要な課題となっている。また、嘔吐下痢症以外にも、脳炎・脳症、１型糖尿病、胆道閉鎖、筋炎、乳児突然死などに本ウイルスが直接的又は間接的に関連することが示唆されている。成人において、免疫不全、臓器移植患者におけるロタウイルス感染は下痢の長期化による体力消耗を引き起こす。実際、成人での致死的なケースも報告されている。
ヒトロタウイルスに対する世界初のワクチンとして1998年にRotaShieldが開発されたが、重篤な副作用（腸重積）が原因で1998年には本ワクチンは市場から撤退した。現在、数種の生ワクチンが開発中（臨床試験段階）ではあるが、それらはいずれも重症化を防ぐことに主眼が置かれたものであり、感染の阻止に有効なワクチンが開発される目処は立っていない。ヒトロタウイルスの抗原系は多様であり、Ｇタイプ、Ｐタイプともに約１０種の血清型が存在する。これら多数の血清型に広く効果的なワクチンの開発は困難を極める。
ポリオウイルスを始めとし、多くのウイルスにおいてゲノムに人工的な変異を加えてウイルスの形質を変化させるリバースジェネティクスの系が開発されている。リバースジェネティクスの系は、部位特異的変異、欠失や挿入、再編などにより、cDNAのレベルでウイルスゲノムを人工的に操作することを可能にする。２本鎖RNAウイルス（レオウイルス科、ビルナウイルス科、シストウイルス科を含む）におけるリバースジェネティクスの系は、現在までのところ、少数の分節した2本鎖RNAウイルスについてのみ開発されている（２本の分節dsRNAからなるビルナウイルス（非特許文献１、２）及び３本の分節dsRNAからなるシストウイルス（非特許文献３）。一方、１０〜１２本の分節したゲノムを持つレオウイルス科のウイルスについては、レオウイルスを除いて、リバースジェネティクスの系の開発は困難を極めている。RonerとJoklik (非特許文献４〜６)によって開発されたレオウイルスのリバースジェネティクスの系は極めて複雑なものであり、他の研究室において当該方法で成功したとの報告はなく、またレオウイルス科に属する他のウイルスへの応用例も報告されていない。尚、ウイルスのリバースジェネティクスの系として、Palese博士ら（特許文献１、非特許文献７、８）により開発されたインフルエンザウイルスの系が知られている。
【０００３】
【特許文献１】特許第３２９３６２０号公報
【非特許文献１】Mundt, E. & Vakharia, V. N. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11131-11136.
【非特許文献２】Yao, T. & Vakharia, V. N. (1996) J. Virol. 72, 8913-8920.
【非特許文献３】Olkkonen, V. M., Gottlieb, P., Strassman, J., Qiao, X., Bamford, D. H. & Mindich, L. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9173-9177
【非特許文献４】Roner, M. R., Sutphin, L. A. & Joklik, W. K. (1990) Virology 179, 845-852.
【非特許文献５】Roner, M. R., Nepluev, I., Sherry, B. & Joklik, W. K. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 6826-6830.
【非特許文献６】Roner, M. R. & Joklik, W. K. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 8036-8041.
【非特許文献７】Enami, M., Luytjes, W., Krystal, M. & Palese, P. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3802-3805.
【非特許文献８】Enami, M. & Palese, P. (1991) Virology 185, 291-298.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、レオウイルス科に属するウイルスについてリバースジェネティクスの系を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
レオウイルス科に属するウイルスの中で、ヒトに重篤な病気を引き起こし、コモンなウイルスはロタウイルスのみであり、ロタウイルスにおけるリバースジェネティクスの系の開発は極めて重要と考えられる。ロタウイルスではその増殖過程において、ウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼによって個々のウイルスゲノムセグメントから転写されたmRNAが粒子に取り込まれ、マイナス鎖の合成のための鋳型としても使用され、粒子中でマイナス鎖が合成され２本鎖RNAが合成されることになる（Chen, D., Zeng, Q.-Y., Wenz, M. J., Gorziglia, M. Estes, M. K. & Ramig, R. F. (1994) J. Virol. 68, 7030-7039.、Patton, J. T. & Spencer, E. (2000) Virology 277, 217-225.）。従って理論的には、ウイルスmRNAに対応する、cDNA由来の人工的なプラス鎖RNAが宿主細胞内に導入されれば、それが粒子内にパッケージされ、ヘルパーウイルスによって供給されるウイルスRNA依存RNAポリメラーゼによってマイナス鎖が合成されて２本鎖RNAが生成し、最終的にcDNA由来の遺伝子分節を有する感染性のウイルスが得られるはずである。
本発明者らは、ロタウイルスのリバースジェネティクス系の開発を目的として検討を重ねる中で、ロタウイルスの外殻タンパク質に注目した。即ち、外殻タンパク質遺伝子をコードする遺伝子分節を組換えのターゲットとするとともに、外殻タンパク質に対する中和抗体を用いて組換えウイルスを選択するという戦略を採用した（詳細は後述の実験データを参照）。概要を示すと、(1)DNA依存性RNAポリメラーゼが認識するプロモーターの制御下にロタウイルス外殻タンパク質VP4をコードするcDNAが配置されたプラスミドを、DNA依存性RNAポリメラーゼが高発現するように操作された宿主細胞にトランスフェクトし、(2)宿主細胞にヘルパーロタウイルスを感染させ、(3)ヘルパーロタウイルスのVP4を特異的に認識する中和抗体の存在下で宿主細胞を培養して選択を行う、という方法を採用した。そして、当該方法によれば、cDNAに由来するVP4遺伝子分節を保有する組換えロタウイルスを取得できることを実験的に確認した。また、天然のVP4遺伝子に対応するcDNAだけでなく、変異を加えたcDNAを用いた実験を行い、人為的に変異されたVP4遺伝子分節を保有する組換えロタウイルスの取得にも成功し、上記リバースジェネティクスの系の有用性を確認した。
本リバースジェネティクスの系によれば、実験的に示されたようにロタウイルスのVP4遺伝子分節を人為的に組み換えることができることは勿論であるが、VP4をコードするcDNAとともに外来遺伝子を含むプラスミドの使用によって、外来遺伝子を保有する組換えウイルスを構築することも可能である。このように本リバースジェネティクスの系はロタウイルスをベクターとして利用することも可能にする。
一方、上記の通り、ロタウイルスのリバースジェネィクスの系を構築する上で、組換えターゲットとして外殻タンパク質遺伝子分節が有用であることが示された。このことからVP4遺伝子分節の他、VP7遺伝子分節も有効な組換えターゲットとして使用可能であるといえる。
ところで、レオウイルス科に属するウイルスはゲノム構造や複製機構が類似している。従って、ロタウイルスで確立された本リバースジェネティクスの系は広くレオウイルス科のウイルスに適用可能であるといえる。
【０００６】
本発明は主として以上の成果・知見に基づくものであり、以下に示す組換えウイルスの調製方法などを提供する。
［１］以下のステップ（１）〜（４）を含む、組換えウイルスの調製法：
（１）レオウイルス科のウイルス（第１ウイルス）の外殻タンパク質遺伝子分節をコードするcDNAが、DNA依存性RNAポリメラーゼが認識するプロモーター制御下に配置されたDNAコンストラクトを宿主細胞にトランスフェクトするステップ（但し、宿主細胞には、トランスフェクト操作の前又は後に前記プロモーターに対応するDNA依存性RNAポリメラーゼを発現する核酸コンストラクトが導入される）；
（２）ステップ（１）の後、ヘルパーウイルスとして、前記第１ウイルスと同属のウイルス（第２ウイルス）を前記宿主細胞に感染させるステップ；
（３）ステップ（２）の後、前記第１ウイルスの前記外殻タンパク質遺伝子分節がコードする外殻タンパク質に対応する、前記第２ウイルスの外殻タンパク質を特異的に認識して中和する抗体を、前記宿主細胞から産生されるウイルスに接触させるステップ；及び
（４）ステップ（３）の後、前記cDNA由来の外殻タンパク質遺伝子分節を保有する組換えウイルスを回収するステップ。
［２］前記第１ウイルスがロタウイルス属のウイルスであることを特徴とする、［１］に記載の調製法。
［３］前記第１ウイルスがサルロタウイルスであり、前記第２ウイルスがヒトロタウイルスであることを特徴とする、［１］に記載の調製法。
［４］前記サルロタウイルスがSA11株であり、前記ヒトロタウイルスがKU株であることを特徴とする、［３］に記載の調製法。
［５］前記外殻タンパク質がVP4であることを特徴とする［３］又は［４］に記載の調製法。
［６］前記DNA依存性RNAポリメラーゼがT7 RNAポリメラーゼであることを特徴とする、［１］〜［５］のいずれかに記載の調製法。
［７］前記核酸コンストラクトが、T7 RNAポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルスであることを特徴とする、［１］〜［５］のいずれかに記載の調製法。
［８］前記宿主細胞がCOS-7細胞であることを特徴とする、［１］〜［７］のいずれかに記載の調製法。
［９］前記DNAコンストラクトとして、保持するcDNAがコードする外殻タンパク質の種類がDNAコンストラクト毎に異なる、複数のDNAコンストラクトが使用される、［１］〜［８］のいずれかに記載の調製法。
［１０］前記DNAコンストラクトが、外来遺伝子をコードする配列を更に含むことを特徴とする、［１］〜［９］のいずれかに記載の調製法。
［１１］前記ステップ（３）をトリプシン及び／又はキモトリプシン存在下で実施することを特徴とする、［１］〜［１０］のいずれかに記載の調製法。
［１２］前記ステップ（３）が、以下のステップ（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択されるいずれかのステップからなることを特徴とする［１］〜［１１］のいずれかに記載の調製法：
（ａ）ステップ（２）の後、前記抗体の存在下で前記宿主細胞を培養するステップ；
（ｂ）ステップ（２）の後、前記抗体の存在下で前記宿主細胞を培養し、産生されたウイルスを回収し、別の宿主細胞（第２宿主細胞）に感染させ、前記抗体の存在下で第２宿主細胞を培養するステップ；
（ｃ）ステップ（２）の後、産生されたウイルスを回収し、別の宿主細胞（第２宿主細胞）に感染させ、前記抗体の存在下で第２宿主細胞を培養するステップ；
（ｄ）ステップ（２）の後、産生されたウイルスを回収し、別の宿主細胞（第２宿主細胞）に感染させ、前記抗体の存在下で第２宿主細胞を培養し、産生されたウイルスを回収し、さらに別の宿主細胞（第３宿主細胞）に感染させ、前記抗体の存在下で第３宿主細胞を培養するステップ。
［１３］ステップ（ａ）〜（ｄ）において、培養操作の少なくとも一部が回転培養で実施されることを特徴とする［１２］に記載の調製法。
［１４］前記第２宿主細胞がMA104細胞又はCV-1細胞である、［１２］又は［１３］に記載の調製法。
［１５］5’末端側から3’末端側に向かって順に、T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列、ロタウイルスのVP4遺伝子分節をコードするcDNA、リボザイム配列、及びT7 RNAポリメラーゼターミネータ配列が配置されてなることを特徴とする、組換えロタウイルス調製用のDNAコンストラクト。
［１６］前記リボザイム配列がD型肝炎ウイルス（HDV）のリボザイムをコードする配列であることを特徴とする、［１５］に記載のDNAコンストラクト。
［１７］前記ロタウイルスがサルロタウイルスであることを特徴とする、［１５］又は［１６］に記載のDNAコンストラクト。
［１８］外来遺伝子をコードするcDNA配列を含むことを特徴とする、［１５］〜［１７］のいずれかに記載のDNAコンストラクト。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明はリバースジェネティクスの手法を利用した組換えウイルスの調製法に関する。本発明の調製法では、以下で詳細に説明するステップ（１）〜（４）が実施される。理解を容易にするために本発明の調製法の一例を図５、６に示す。
尚、以下で特に言及しない事項（条件、操作方法など）については常法に従えばよく、例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)、Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）（以上、分子生物学的手法に関して）、Urasawa, T., Urasawa, S. & Taniguchi，K.(1981)Microbiol. Immunol. 25,1025-1035.（以上、ヒトロタウイルスの培養条件に関して）、Horimoto, T. &  Kawaoka, Y.(1994) J. Virol. 68, 3120-3128. Barclay, W. & Palese, P. (1995) J. Virol. 69, 1275-1279.(以上、抗体による選択に関して)等を参考にすることができる。
１．ステップ（１）
このステップでは、所定のDNAコンストラクトを宿主細胞にトランスフェクトする。DNAコンストラクトとしては、レオウイルス科のウイルス（第１ウイルス）の外殻タンパク質遺伝子分節をコードするcDNAが、DNA依存性RNAポリメラーゼが認識するプロモーター制御下に配置されたものが使用される。
以下の説明では、便宜上、「外殻タンパク質遺伝子分節をコードするcDNA」を「外殻タンパク質cDNA」ともいう。同様に、「DNA依存性RNAポリメラーゼ」を「RNAポリメラーゼ」ともいう。また、「DNA依存性RNAポリメラーゼが認識するプロモーター」を「RNAポリメラーゼプロモーター」ともいう。
【０００８】
レオウイルス科は、哺乳動物に感染するウイルスとしては、レオウイルス属、ロタウイルス属、オルビウイルス属、コルチウイルス属に分類される。レオウイルス科に属するウイルスは、複数に分節した二本鎖RNAというユニークなゲノム構造を有する。本発明では、好ましくはロタウイルス属のウイルス（ロタウイルス）の外殻タンパク質cDNAが使用されるが、これに限られるものではない。ロタウイルスを選択した場合、その外殻タンパク質であるVP4（外殻スパイクタンパク質）又はVP7（外殻糖タンパク質）の遺伝子分節をコードするcDNAが使用されることになる。
【０００９】
変異が導入された（即ち一部の配列が改変された）外殻タンパク質cDNAを使用することもできる。このようなcDNAを含むDNAコンストラクトを用いれば、外殻タンパク質に変異を有する組換えウイルスを得ることが可能である。当該ウイルスは外殻タンパク質の機能の研究に有用であり、またワクチンへの利用も期待される。外殻タンパク質cDNAへの変異の導入はKunkel法、Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法で行うことができる。市販の変異導入用キット（例えば、QuikChange XLsite-directed mutagenesis kit（Stratagene社製）、Mutan-K（TAKARA社製）、LA-PCR in vitro mutagenesis Kit（TAKARA社製）Mutan-Express Km（TAKARA社製））を利用すれば簡便な操作で変異を導入することができる。
【００１０】
ヒトロタウイルス、サルロタウイルス、ウシロタウイルスなどのロタウイルスを第１ウイルスとすることができる。本発明の好ましい態様では、ロタウイルスの中でもサルロタウイルス（例えばSA11株、RRV株など）が第１ウイルスとして採用される。サルロタウイルスの外殻タンパク質遺伝子分節は転写・合成効率が一般に高い。従って、サルロタウイルスの外殻タンパク質cDNAを利用することによって高い転写・合成効率を期待できる。転写・合成効率を高めることは、使用した外殻タンパク質cDNA由来の遺伝子分節を保有する組換えウイルスの回収効率の向上につながる。
【００１１】
DNAコンストラクトにおいて外殻タンパク質cDNAは、RNAポリメラーゼが認識するプロモーター（RNAポリメラーゼプロモーター）制御下に配置される。このような構成によって、宿主細胞にトランスフェクトされた後、RNAポリメラーゼがDNAコンストラクト内のRNAポリメラーゼプロモーターを認識し、外殻タンパク質cDNAを鋳型とした転写が行われる。例えば、RNAポリメラーゼとしてT7ファージ由来のT7 RNAポリメラーゼを利用することにすれば、T7 RNAポリメラーゼに対応するプロモーター（即ち、T7 RNAポリメラーゼによって認識され、その下流域に配置された配列の転写を促すプロモーター）がDNAコンストラクト内に配置される。T7 RNAポリメラーゼを利用する系は高い転写効率を得るために有効である。本発明ではT7 RNAポリメラーゼに限らず、様々なRNAポリメラーゼを利用できる。RNAポリメラーゼの例としてT3 RNAポリメラーゼ、Sp6 RNAポリメラーゼなどを挙げることができる。尚、T7 RNAポリメラーゼが認識するプロモーターの配列の一例を配列番号７に示す。
【００１２】
典型的には１種類のDNAコンストラクトが使用されるが、２種類以上のDNAコンストラクトを併用してもよい。このように複数のDNAコンストラクトを使用する場合は通常、保持するcDNAがコードする外殻タンパク質の種類がDNAコンストラクト毎に異なるように各DNAコンストラクトを設計する。複数のDNAコンストラクトを使用すれば、複数の遺伝子分節がDNAコンストラクトに由来する組換えウイルスが得られる。
【００１３】
本発明の一態様ではDNAコンストラクトが、外来遺伝子をコードする配列を更に含む。かかるDNAコンストラクトを使用することによって外来遺伝子が組み込まれた組換えウイルスを得ることができる。このようにして得られた組換えウイルスは外来遺伝子を発現するベクターとして利用可能であり、例えば腸管細胞への外来タンパク質を供給する手段などへの応用が期待される。一方、外来遺伝子の発現産物が外殻タンパク質と結合するようにDNAコンストラクトを設計すれば、ヘルパーウイルス（第２ウイルス）と抗原性の異なる組換えウイルスを得ることが可能である。このような組換えウイルスはワクチンへの利用が期待される。
尚、複数の外来遺伝子をコードする配列を含むようにDNAコンストラクトを設計・構築することにしてもよい。
【００１４】
本発明のDNAコンストラクトは公知のプラスミド等を利用して構築することができる。例えば、T7 RNAポリメラーゼプロモーターを使用したDNAコンストラクトであれば、T7発現ベクターを骨格として、これに必要な遺伝子操作（外殻タンパク質cDNAなどの挿入）を施すことによって目的のDNAコンストラクトを構築可能である。多種多様のT7発現ベクターが入手可能な状態で提供されている。入手可能なT7発現ベクターの例として市販のpBluescriptII SK(+/-)（Stratagene社）、pCRII（Invitrogen社）、pGEM（Promega社）、pET（Novagene社）、pcDNA（Invitorgen社）を挙げることができる。尚、T7 RNAポリメラーゼ以外のRNAポリメラーゼを利用する場合において本発明のDNAコンストラクトの構築に利用できるベクターとして、pBluescriptIISK(+/-)、pCRII、pGEM等を例示できる。
【００１５】
ところで、宿主細胞にはトランスフェクト操作の前又は後に、上記DNAコンストラクトに組み込まれたRNAポリメラーゼプロモーターに対応するDNA依存性RNAポリメラーゼ（RNAポリメラーゼ）を発現する核酸コンストラクトが導入される。従って、DNAコンストラクトのトランスフェクション及び核酸コンストラクトの導入の結果、宿主細胞内では、核酸コンストラクトが供給するRNAポリメラーゼによって、DNAコンストラクト内の外殻タンパク質遺伝子分節をコードするcDNAを鋳型としてウイルスmRNA（プラス鎖）が転写される。
好ましくは、核酸コンストラクトの導入時期をDNAコンストラクトのトランスフェクト操作の前とする。これによって、速やか且つ効率的にウイルスmRNAが転写される環境を作り出すことができる。
【００１６】
レオウイルス科のウイルスのmRNAは5’末端にキャップ構造を持ち、3’末端にポリAを有さないという特徴を有する。効率的なゲノムの複製と翻訳にはこれらの構造が重要であることが判明している。この事実を考慮し、本発明のDNAコンストラクト内の外殻タンパク質cDNAに由来する遺伝子分節を保有する組換えウイルスを効率的に得ようとすれば、本発明のDNAコンストラクトからの転写によって生じたウイルスmRNAにキャッピング酵素が効率的に作用する環境が提供されることが好ましい。そこで本発明の好ましい一態様では、RNAポリメラーゼを供給するために使用する核酸コンストラクト内にキャッピング酵素をコードする配列を発現可能な状態で配置しておく。かかる核酸コンストラクトが導入されることによって宿主細胞内にはRNAポリメラーゼとキャッピング酵素が供給され、その結果、本発明のDNAコンストラクトから転写されたmRNAを効率的に成熟化させることができる。
RNAポリメラーゼとキャッピング酵素を同時に供給可能な核酸コンストラクトとして、RNAポリメラーゼを発現するように遺伝子改変された組換えワクシニアウイルスを用いることができる。例えば後述の実験例に示されるようにT7 RNAポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルスを利用すれば、本発明のDNAコンストラクトから成熟したウイルスmRNAを高率で生成させ、もって目的の組換えウイルスの回収効率の向上を図れる。
尚、本発明の核酸コンストラクトとは別のコントラクトによってキャッピング酵素を供給することにしてもよい。例えば、キャッピング酵素をコードする遺伝子を保持した発現ベクターを宿主細胞に別途導入することによってキャッピング酵素を供給することが可能である。
【００１７】
宿主細胞は、本発明のDNAコンストラクト及び核酸コンストラクトの宿主として機能し得る限り、その種類は特に限定されない。例えばCOS-7細胞、MA104細胞、CV-１細胞、293T細胞、Vero細胞等を宿主細胞として利用することができる。COS-7細胞は、高いトランスフェクション効率が得られ、しかも取扱易いことから好適な宿主細胞といえる。一方、MA104細胞はロタウイルスの増殖率が高い点において好適な宿主細胞である。
【００１８】
２．ステップ（２）
ステップ（１）の後、ヘルパーウイルスとして、第１ウイルスと同属のウイルス（第２ウイルス）を宿主細胞に感染させるステップを実施する。例えば第１ウイルスとしてロタウイルスを使用した場合には第２ウイルスにもロタウイルスを使用する。但し、第１ウイルスと第２ウイルスは、以降のステップ（３）での抗体による選択を可能にするため、少なくとも外殻タンパク質に関して相違する必要がある。そこで例えば第１ウイルスと第２ウイルスの組合せとして、サルロタウイルスとヒトロタウイルスの組合せを採用することができる。上述のように、転写・合成効率の観点から第１ウイルスをサルロタウイルスとすることが好ましい。このことを考慮して、好ましい一態様では第１ウイルスをサルロタウイルスとし、第２ウイルスをヒトロタウイルス（例えばヒトロタウイルスKU株）とする組合せを採用する。サルロタウイルスの二つの株の組合せや、ヒトロタウイルスの二つの株の組合せを使用するなど、株のレベルで異なる二種類のウイルスの組合せを採用することにしてもよい。
尚、天然に存在する野生型又は変異型のウイルスの他、人為的に遺伝子改変を施した組換えウイルスを第２ウイルスとして使用することもできる。
【００１９】
ロタウイルスを利用した系の場合（即ち第１ウイルス及び第２ウイルスとしてロタウイルスが使用される場合）には通常、第２ウイルス（ヘルパーウイルス）の宿主細胞への感染を促すため、トリプシン又はキモトリプシンの存在下で感染操作を実施する。ロタウイルスの宿主への感染には、外殻タンパク質VP4が特定位置で切断されることが必要と考えられており、トリプシン等はこの感染に必要なVP4の切断を行う。
【００２０】
ステップ（２）を実施した宿主細胞内では、ステップ（１）でトランスフェクトしたDNAコンストラクト内の外殻タンパク質cDNAに由来する外殻タンパク質遺伝子分節と、その他の遺伝子分節として第２ウイルスに由来するものを保有したウイルス（目的の組換えウイルス）が構築される（図５を参照）。一方で、第２ウイルスに由来する遺伝子分節のみを保有するウイルスも構築される。そこで以降のステップ（３）では、このように構築されたウイルスの中から目的の組換えウイルスを選択することが行われる。
【００２１】
３．ステップ（３）
本発明では、目的の組換えウイルスを選択するために抗体を利用する。具体的には、ステップ（１）で使用するDNAコンストラクトにおける外殻タンパク質cDNAがコードする外殻タンパク質に対応する、第２ウイルスの外殻タンパク質を特異的に認識し中和する抗体を、宿主細胞から産生されるウイルスに接触させる。このように本発明では、第２ウイルス（ヘルパーウイルス）に由来する外殻タンパク質を有するウイルスを中和することによって目的の組換えウイルスを選択的に増殖させる（図６を参照）。例えば、DNAコンストラクトに使用する外殻タンパク質cDNAとしてサルロタウイルスのVP4をコードするcDNAを採用し、第２ウイルスとしてヒトロタウイルスを採用した場合、ヒトロタウイルスのVP4を選択的に中和する抗体（中和抗体）が使用される。
【００２２】
ウイルスと中和抗体との接触は例えば以下のステップ（ａ）〜（ｄ）のいずれかによって実施される。
ステップ（ａ）：ステップ（２）の後、中和抗体の存在下で宿主細胞を培養する。
ステップ（ｂ）：ステップ（ａ）と同様の手順で宿主細胞の培養を行った後、産生されたウイルスを回収し、別の宿主細胞（第２宿主細胞）に感染させる。続いて、中和抗体の存在下で第２宿主細胞を培養する。
ステップ（ｃ）：ステップ（２）の後、産生されたウイルスを回収し、別の宿主細胞（第２宿主細胞）に感染させる。続いて、中和抗体の存在下で第２宿主細胞を培養する。
ステップ（ｄ）：ステップ（ｃ）と同様の手順で第２宿主細胞の培養までを行った後、産生されたウイルスを回収し、別の宿主細胞（第３宿主細胞）に感染させる。続いて、中和抗体の存在下で第３宿主細胞を培養する。
【００２３】
ステップ（ｂ）〜（ｄ）においてウイルスの回収は、培養後の培養液及び／又は細胞破砕液を回収することによって行うことができる。一方、回収された培養液及び／又は細胞破砕液を宿主細胞（第２宿主細胞、第３宿主細胞）に添加（接種）することによって、ウイルスの宿主への感染を行うことができる。
【００２４】
ステップ（ａ）〜（ｄ）において、培養操作の少なくとも一部を回転培養で実施することが好ましい。ここでの「回転培養」とは、細胞を試験管などの培養容器に播種した後、培養容器を回転させながら培養することをいう。回転培養では、培養液の移動が生ずるとともに、細胞表層に接触する培養液の量が少なくなる状態（細胞の表層の湿潤度合が低下する状態）をつくることができ、これによってウイルスの宿主への感染効率の向上を期待できる。回転培養のための専用の装置が市販されており（例えば、タイテック社、ローテーター  RT-550、試験管用培養ホルダー利用）、このような市販の装置を利用してここでの回転培養を実施することができる。操作方法は装置に添付の取り扱い説明書に従えばよい。回転速度について例えば、培養容器が１回転するのに要する時間が30秒〜2分の範囲内となるように調節することができる。
【００２５】
以上のステップにおける第２宿主細胞、第３細胞としては例えばMA104細胞、CV-１細胞、293T細胞、Vero細胞等を使用することができる。
ステップ（ｄ）では宿主細胞を２段階に変更して選択操作を行う例を示したが、勿論、宿主細胞を３段階変更することにしてもよい。
尚、宿主細胞、第２宿主細胞、又は第３宿主細胞の培養の際、必要に応じて継代する。また、中和抗体による選択の効果を高めるために継代培養も中和抗体の存在下で実施することが好ましい。
【００２６】
ロタウイルスを利用した系の場合には特に、ウイルスの宿主細胞への感染を促すため、感染操作の際にウイルスをトリプシン又はキモトリプシンで活性化することが好ましい。レオウイルスなどを利用した系の場合においても、トリプシン等による活性化は感染価の向上に有効である。トリプシン等によるウイルスの活性化を行うには、ウイルス液にトリプシンを加えてウイルスを活性化し、さらに、培養液にトリプシン等を添加した状態で宿主細胞（第２宿主細胞、第３宿主細胞）を培養すればよい。尚、必要に応じて培養中にトリプシン等を追加で添加することが好ましい。
【００２７】
ターゲットの外殻タンパク質を特異的に認識して中和する活性を有する限り、中和抗体の形態や由来などは特に限定されない。中和抗体はポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体（数種〜数十種の抗体の混合物）、及びモノクローナル抗体のいずれでもよい。ポリクローナル抗体又はオリゴクローナル抗体としては、動物免疫して得た抗血清由来のIgG画分のほか、抗原によるアフィニティー精製抗体を使用できる。中和抗体が、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv抗体などの抗体断片であってもよい。
必要な中和反応のみを引き起こすことで高い選択効率を得るために、中和抗体としてモノクローナル抗体を使用することが好ましい。また、２種類以上の中和抗体を併用することも選択効率の向上に有効である。
【００２８】
中和抗体は、免疫学的手法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法などを利用して調製することができる。免疫学的手法によるポリクローナル抗体の調製は次の手順で行うことができる。抗原（ターゲットの外殻タンパク質又はその一部）を調製し、これを用いてマウスやウサギ等の動物に免疫を施す。抗原の具体例として目的の外殻タンパク質を発現する精製ロタウイルス、ロタウイルスのVP4、VP5*、VP7、VP8*又はこれらの一部を挙げることができる。外殻タンパク質からなる抗原はウイルスからの精製、又は配列が同定されている場合は遺伝子組換え技術を利用した方法によって調製することができる。免疫惹起作用を増強するために、キャリアタンパク質を結合させた抗原を用いてもよい。キャリアタンパク質としてはKLM（Keyhole Light Hemocyanin）、BSA（Bovine Serum Albumin）、OVA（Ovalbumin）などが使用される。キャリアタンパク質の結合にはカルボジイミド法、グルタルアルデヒド法、ジアゾ縮合法、MBS（マレイミドベンゾイルオキシコハク酸イミド）法などを使用できる。一方、ターゲットの外殻タンパク質（又はその一部）を、GST、βガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク、又はヒスチジン（His）タグ等との融合タンパク質として発現させた抗原を用いることもできる。このような融合タンパク質は、汎用的な方法により簡便に精製することができる。
【００２９】
必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で採血し、遠心処理などによって血清を得る。得られた抗血清をアフィニティー精製し、ポリクローナル抗体とする。
一方、モノクローナル抗体については次の手順で調製することができる。まず、上記と同様の手順で免疫操作を実施する。必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で免疫動物から抗体産生細胞を摘出する。次に、得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合してハイブリドーマを得る。続いて、このハイブリドーマをモノクローナル化した後、目的タンパク質に対して高い特異性を有する抗体を産生するクローンを選択する。選択されたクローンの培養液を精製することによって目的の抗体が得られる。一方、ハイブリドーマを所望数以上に増殖させた後、これを動物（例えばマウス）の腹腔内に移植し、腹水内で増殖させて腹水を精製することにより目的の抗体を取得することもできる。上記培養液の精製又は腹水の精製には、プロテインG、プロテインA等を用いたアフィニティークロマトグラフィーが好適に用いられる。また、抗原を固相化したアフィニティークロマトグラフィーを用いることもできる。更には、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、硫安分画、及び遠心分離等の方法を用いることもできる。これらの方法は単独ないし任意に組み合わされて用いられる。なお、精製せずに腹水のままでも、酵素抗体法（ELISA）用の試薬として、ウイルスを中和することなどに使用可能である。
【００３０】
４．ステップ（４）
このステップでは、ステップ（３）によって選択的に増殖した目的の組換えウイルスを回収する。培養後の培養液及び／又は細胞破砕液を回収することによって行うことができる。但し、ステップ（３）においてCV-1などを使用してプラーク純化を行った場合は形成されたプラークより目的の組換えウイルスを回収する。回収された組換えウイルスは必要に応じて精製される。分画遠心法、密度勾配超遠心法（ナイコデンツ、塩化セシウムなどを利用）、カラムクロマトグラフィーなどを適宜組み合わせてウイルスの精製を行うことができる。
【実施例】
【００３１】
以下において、ゲノムが10〜12本の2本鎖RNAからなり、レオウイルス科に属するロタウイルスのリバースジェネティクス系の開発に成功したことを報告する。この系は、細胞質中に人工的なウイルスmRNAを供給するために、組換えワクシニアウイルス由来のT7 RNAポリメラーゼを利用する。ヘルパーウイルス（ヒトロタウイルスKU株）の重感染によって、細胞質中でcDNAより転写されたサルロタウイルスSA11株の完全長VP4 mRNAよりVP4遺伝子分節が合成され、そして当該遺伝子分節を含むKU株ベースのトランスフェクタントウイルス（組換えウイルス）が構築される。真正のSA11 株VP4遺伝子分節を有するトランスフェクタントウイルスに加え、SA11株VP4ゲノム中の遺伝子マーカーとして、２つの制限酵素切断部位の両方または一方を破壊するサイレント変異を導入した感染性ロタウイルストランスフェクタントを３種、構築することにも成功した。
【００３２】
１．材料と方法
（１）ウイルス
ヒトロタウイルスKU株(Urasawa, S., Urasawa, T., Taniguchi, K. & Chiba, S. (1984) Arch. Virol. 81, 1-12.)とサルロタウイルスSA11株(SA11-L2)(Taniguchi, K., Nishikawa, K., Kobayashi, N., Urasawa, T., Wu, H., Gorziglia, M. & Urasawa, S. (1994) Virology 198, 325-330.)はトリプシン（10 μg/ml、シグマ製）で前処理し、MA104細胞を用い、トリプシン（1μg/m）存在下で増殖させた。組換えワクシニアウイルスrDIs-T7pol(Ishii, K., Ueda, Y., Matuo, K., Matsuura. Y., Kitamura, T., Kato, K., Izumi, Y., Someya, K., Ohsu, T., Honda, M. & Miyamura, T. (2001) Virology 302, 433-444.)は松浦善治先生（大阪大学微生物病研究所）から分与を受けた。本ウイルスはT7 RNAポリメラーゼを発現するように操作されており、ニワトリ胚線維芽細胞で増殖させた。
【００３３】
（２）細胞培養と感染
COS-7（サル腎臓上皮細胞）、MA104細胞、CV-1細胞は、5%ウシ胎児血清を添加したイーグル基礎培地（MEM）で培養した。
単層細胞に37℃で30分、トリプシン（10 μg/ml）で前処理したロタウイルスを接種した。37℃、1時間の吸着の後、ウシ胎仔血清を含まないMEM（不完全培地）で感染細胞を洗浄した後、回収まで、トリプシン（1μg/m）含有の不完全培地で培養した。培養液（細胞も含む）を凍結融解処理（３回）に供した後、細胞片を除くために低速で遠心した。上清を実験に使用した。
【００３４】
（３）SA11株の真正なVP4遺伝子cDNAの構築（図２）
破砕液（1% SDS, 0.1% 2-メルカプトエタノール, 60mM EDTA）で培養液を破砕後、フェノール−クロロホルムで抽出し、SA11ウイルスの2本鎖RNA(dsRNA)を得た。SA11ウイルスのVP4遺伝子のcDNAは、既述(Taniguchi, K., Kojima, K. & Urasawa, S. (1996) J. Virol. 70, 4125-4130.)のように、トリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（生化学工業）とプライマー1(配列番号１、図１)を使って、ビリオンdsRNAから合成した。KOD-plus (東洋紡)と、T7プロモーターの塩基配列およびSA11ウイルスのVP4遺伝子の5’末端配列に対応する塩基配列を含むプライマー1、2（配列番号１、２）とを用いてPCRを行い、完全長のVP4遺伝子（配列番号８、2.4 kb、GenBank Accession No. D16345）をコードするcDNAを増幅した。HindIIIで消化後、増幅したcDNAを、松浦善冶博士より分与され、元々はConzelmann KK 博士（Max-von Petterkofer Institute and Gene Center, Ludwig-Maximillians-University, ドイツ）により作製されたT7発現ベクターpX8dT(Schnell, M. J., Mebatsion, T. & Conzelmann, K. K. (1994) EMBO J. 13, 4195-4203.)のHindIII及びSmaIサイトにライゲートした。ここで調製されたプラスミドpT7/VP4(SA11)は、T7 RNAポリメラーゼプロモーターとD型肝炎ウイルス(HDV)リボザイム（さらに下流にはT7 RNAポリメラーゼターミネータが配置される）に挟まれる位置に、SA11の完全長のVP4遺伝子cDNAを含む。
【００３５】
（４）ロタウイルスゲノムへの遺伝子マーカーの導入（図２）
VP4遺伝子の操作はプラスミドpT7/VP4(SA11)を使用して行った。QuikChange XLsite-directed mutagenesis kit（Stratagene社製）を添付の説明書に従って使用し、ナンセンス変異を人工的な導入により、ユニークなPstIおよびHaeIIサイト（SA11のVP4遺伝子の塩基No. 1,364および塩基No. 1,569）を破壊した。手短に述べると、SA11のPstI及びHaeIIサイトの塩基配列に変異を加えるプライマー3、4（配列番号３、４）とプライマー5、6（配列番号５、６）を用いてpT7/VP4(SA11)を増幅した。鋳型として使用したpT7/VP4(SA11)を除去するため、DpnIで消化後、PCR産物で大腸菌コンピテント細胞をトランスフォームした。得られたプラスミドpT7/VP4(SA11)-ΔPstI及びpT7/VP4(SA11)-ΔHaeIIはそれぞれ、PstIサイト及びHaeIサイトにサイレント変異を有している。さらに、プラスミドpT7/VP4(SA11)-ΔPstI,ΔHaeIIを、鋳型としてのpT7/VP4(SA11)-ΔHaeIIとプライマー3、4（配列番号３、４）を用いて、上述と同様の方法で調製した。これはPstIサイトとHaeIIサイトの両方に変異を有する。このようにして新たに調製したプラスミドは全て、その塩基配列を確認することで、適切なクローンであることが確認された。
【００３６】
（５）リバースジェネティクス（図５、６）
COS-7細胞を60mmシャーレに80%ほど埋まる程度に増殖させた。rDIs-T7polを1時間前に感染多重度（MOI）３で感染させたCOS-7細胞に、TransIT-1(Mirus社製)を用いて、5μgのpT7/VP4(SA11)、pT7/VP4(SA11)-ΔPstI、pT7/VP4(SA11)-ΔHaeII又はpT7/VP4(SA11)-ΔPstI,ΔHaeIIをトランスフェクトした。トランスフェクション後、20時間目に細胞を不完全培地で2度洗浄し、続いてヘルパーウイルスとしてのKU株（KU株のVP4遺伝子の配列を配列番号９に示す。GenBank Accession No. M21014）を感染多重度３で重感染させた。ヘルパーウイルス感染後、24時間目に、培養液中の、SA11cDNA由来のVP4遺伝子を有するトランスフェクタントウイルスを下記の方法で選択した。
SA11cDNA由来のVP4遺伝子を有するトランスフェクタントウイルスを選択するために、回収したウイルスをトリプシンで活性化した後、60 mmシャーレに単層培養したMA-104細胞に接種した。1時間の吸着後、感染細胞を不完全培地で2度洗浄し、トリプシン（1 μg/ml）と、P[8]タイプのヘルパーウイルスKU株を特異的に中和する抗VP4中和モノクローナル抗体ST-1F2(Taniguchi, K., Morita, Y., Urasawa, T. & Urasawa, S. (1987) J. Virol. 61, 1726-1730.)及びYO-2C2(Taniguchi, K., Urasawa, S. & Urasawa, T. (1985) J. Gen. Virol. 66, 1045-1053.)の存在下、不完全培地中で培養した。ロタウイルスにより生じた細胞変性効果が現れたら培養細胞を回収し、継代培養に供した。こうして取り出したトランスフェクタントウイルスを3度MA104細胞で継代し、その後CV-1細胞でプラーク純化した(Taniguchi, K., Morita, Y., Urasawa, T. & Urasawa, S. (1987) J. Virol. 61, 1726-1730.)。
尚、中和モノクローナル抗体ST-1F2及びYO-2C2の調製法は次の通りである（詳細については、札幌医誌56(1)71〜85(1987)、Taniguchi, K., Morita, Y., Urasawa, T. & Urasawa, S. (1987) J. Virol. 61, 1726-1730.、Taniguchi, K., Urasawa, S. & Urasawa, T. (1985) J. Gen. Virol. 66, 1045-1053.を参照）。免疫原としては精製したヒトロタウイルスYO株（G serotype 3）、ST-3株（G serotype 4）（NIHのR.G.Wyatt博士より供与）を使用した。まず、精製ウイルス液(約108p・f・u/ml)0.1mlをBALB/cマウスに第1日目、第30日目、第45日目に腹腔内接種し免疫した。第48日目に免疫マウスの脾細胞とマウスの骨髄細胞P3-X63-Ag8・653細胞をポリエチレングリコール1540を用いて融合した。融合後20日ないし30日目に、ハイブリドーマ培養上清中の抗HRV中和活性を間接蛍光抗体法により検索し、中和モノクローナル抗体（N-mAb）産生の有無を確認した。N-mAbを産生すると判定されたハイブリドーマは、少なくとも2回、限界希釈法によりクローニングを行った。最終的にプリステインで前処理したBALB/cマウスに107個のハイブリドーマを腹腔内接種し、腹水を得た。各ハイブリドーマの産生する免疫グロブリンのアイソタイプの決定は、マウスIgG, IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b及びIgG3に対するウサギ抗血清(Miles Yeda, Rehorot, Israel)と、ハイブリドーマ培養上清の25倍濃縮液を使用し、Ouchterlony法により行った。以上の方法によって、KU株に対する中和モノクローナル抗体ST-1F2を産生するハイブリドーマ、及び同YO-2C2を産生するハイブリドーマを得た。
【００３７】
（６）回収ウイルスにおけるcDNA由来VP4遺伝子の同定
回収ウイルスのゲノムdsRNAを培養液から抽出した。沈殿させたビリオンdsRNAを用いて、(1)ポリアクリルアミド電気泳動（PAGE）、(2)RT-PCR制限酵素消化解析、(3)塩基配列決定を行なった。PAGEでは、dsRNAを2mm厚の10%アクリルアミドゲルで20 mA、室温の条件下、16時間泳動させ、銀染色で判定した。RT-PCR制限酵素消化解析では、プライマー1（配列番号１）を用い、SuperScript II RT (Invitrogen)でdsRNAをcDNAに変換し、完全長のVP4遺伝子をプライマー1、2（配列番号１、２）で増幅した。PCR産物をPstI又はHaeIIで消化し、得られた断片を1.25% アガロースゲルを用いた電気泳動で分離した。ゲルをエチジウムブロマイドで染色した。塩基配列決定では、DYEnamiic ET terminator cycle sequencing kit (Amersham Biosciences)を使用し、ABI PRISM 310自動配列決定装置によってPCR産物の配列を直接決定した。
【００３８】
２．結果
（１）SA11 VP4遺伝子cDNAの構造（図２）
cDNA由来の新たな遺伝子セグメントを有する感染性のトランスフェクタントを作製するために、Palese博士ら（Enami, M., Luytjes, W., Krystal, M. & Palese, P. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3802-3805.、Enami, M. & Palese, P. (1991) Virology 185, 291-298.）がインフルエンザウイルスで最初に開発したヘルパーウイルスを使用したリバースジェネティクスの手法を一部改変して行なった。この手法では、培養液中のウイルスの大多数はヘルパーウイルスなので、cDNA由来の遺伝子を含むトランスフェクタントウイルスを得るためには強い選択系が要求される。そこで、SA11株のような、P[8]以外のタイプのVP4を有するウイルスの増殖には何ら影響を与えず、KU株のようなP[8]タイプのヒトロタウイルスを特異的に中和するVP4スパイク蛋白質に対する中和モノクロン抗体を利用する選択系を構築した。即ち、このような中和抗体の存在下で継代することにより、ヘルパーウイルスであるKU株のバックグラウンド下で、SA11のcDNA由来のVP4遺伝子分節を含むトランスフェクタントウイルスを選択的に増殖させることにした。この戦略は、SA11のVP4を有するロタウイルスではオリジナルのヒトロタウイルスよりも格段に良好な増殖を示すことからも（Greenberg, H. B., Kalica, A. R., Wyatt, R. G., Jones, R. W., Kapikian, A. Z. & Chanock, R. M. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 420-424.）、有利であると考えられる。
まず、T7 RNAポリメラーゼプロモーターとD型肝炎ウイルス（HDV）リボザイムに挟まれるように配置されたSA11ウイルス完全長VP4遺伝子（D型肝炎ウイルス（HDV）リボザイムの下流にはT7 RNAポリメラーゼターミネータが配置される）をクローン化した（図２）。このようにして得られたベクターpT7/VP4(SA11)は、真正のSA11 VP4 mRNAの末端に対応する正しい5’末端及び3’末端を有する2,362塩基のプラス鎖RNAを産生することになる。
【００３９】
（２）全長のSA11 VP4遺伝子をコードするcDNAのトランスフェクションとcDNA由来のVP4ゲノムを有するウイルスの回収（図５、６）
T7 RNAポリメラーゼを供給するために1時間前に組換えワクシニアウイルスを感染させたCOS-7細胞に対して、転写プラスミドpT7/VP4(SA11)をトランスフェクトした。トランスフェクション後1日目に、トランスフェクトした細胞にヘルパーウイルスとしてのKUウイルスを重感染させ、さらに24時間培養を続けた後、培養液を回収した。回収した培養液と及びKU株ヘルパーウイルスを特異的に中和する２種類の中和抗体ST-1F2、YO-2C2を、試験管内に培養したMA104細胞の培養液中に添加した後、試験管を回転培養機（ローテーター  RT-550、タイテック社、社製）に移し、２分/回転の条件下でMA104細胞を培養した。感染８日後、MA104細胞は細胞変性効果（CPE）を示し、cDNA由来のVP4遺伝子を取り込んだトランスフェクタントウイルスの生成が示唆された。
【００４０】
（３）回収ウイルスのRNA解析（図３）
選択実験で得られたウイルスをプラーク純化した後、プラークをMA104細胞で増幅した。ビリオンdsRNAをこの試料から抽出しPAGEで分析した。図３は、VP4遺伝子クローニングに使用したSA11（レーン１）、ヘルパーウイルスに使用したKU株（レーン３）、及び両方のウイルスの混合物（レーン５）からのdsRNAのパターンを示す。レーン２と４でのVP4遺伝子dsRNAは、SA11の対応するdsRNAと同じ位置（レーン１）に移動し、その移動度は、ヘルパーウイルスであるKU株のVP4遺伝子セグメントの移動度（レーン３）より遅かった。さらに、RT-PCR断片の塩基配列決定により、回収したウイルスのVP4遺伝子がSA11由来であることが示された（データ示さず）。以上のように、cDNAのトランスフェクション及びその後のヘルパーウイルスの重感染の結果として、cDNA由来のVP4遺伝子分節を含む感染性ロタウイルストランスフェクタント（KU//rVP4(SA11)ウイルス）が得られることが示された。
【００４１】
（４）感染性ロタウイルスのゲノムへの部位特異的変異の導入
次いで、PCRを利用した部位特異的変異法によって、プラスミドpT7/VP4(SA11)におけるVP4遺伝子のコーディング領域に遺伝子マーカーとしての４つのサイレント変異を導入した。cDNAでの４ヶ所の変異は、塩基No.1,365をTからAに変更するもの、塩基No.1,368をAからCに変更するもの、塩基No.1,569をGからAに変更するもの、及び塩基No.1,572をGからAへ変更するものであり、塩基No. 1,364のPstIサイトと塩基No. 1,569のHaeIIサイトをそれぞれ破壊する。このようにして新たに調製したプラスミドpT7/VP4(SA11)ΔPstI、pT7/VP4(SA11)ΔHaeII、及びpT7/VP4(SA11)-ΔPstI,ΔHaeIIはそれぞれ、PstIサイト、HaeIIサイト、及びこれら両サイトを破壊する変異を有している。すでに組換えワクシニアウイルスで感染したCOS-7細胞にそれぞれの変異を加えたプラスミドをトランスフェクションし、次いでヘルパーウイルスで重感染することにより、KU//rVP4(SA11)-ΔPstI、KU//rVP4(SA11)-ΔHaeII、及びKU//rVP4(SA11)-ΔPstI,ΔHaeIIと呼称するトランスフェクタントウイルスがヘルパーウイルス特異的中和モノクロン抗体の存在下で増殖した。培養液からビリオンdsRNAを抽出し、PAGEとVP4全塩基配列を対象としたRT-PCRを行なった。PAGEの結果、回収したウイルスの4番目の遺伝子分節の移動度は、SA11株の対応する遺伝子分節の移動度と同一であった（データ示さず）。RT-PCR制限酵素消化分析の結果では、KU//rVP4(SA11)の2,386塩基対の産物は、PstIによる消化によって1,392塩基対の断片と994塩基対の断片になり、HaeIIによる消化によって1,597塩基対の断片と789塩基対の断片となった（図４A）。一方、新たに回収されたトランスフェクタントウイルスからの対応するDNA断片は、予想された通り、PstI及び／又はHaeIIで切断されなかった（図４A）。さらに、PCR産物の直接塩基配列決定により、回収したウイルスのゲノム内にこれらのサイレント変異が確かに存在していた（図４B）。このように、組換えワクシニアウイルスのT7 RNAポリメラーゼを利用した系において、クローン化したcDNAのトランスフェクション及びそれに続くヘルパーウイルスの重感染により、ゲノム内に部位特異的変異を有する感染性ロタウイルスを回収することに成功した。
【００４２】
３．考察
以上のように、世界で初のロタウイルスのリバースジェネティクス系の構築に成功した。ここで示した手段では、T7 RNAポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルスの感染及びヘルパーウイルスの重感染を利用する。レオウイルス科に属するウイルスについては、RonerとJoklikがレオウイルスのトランスフェクタントを生成するリバースジェネティクス系を報告した(Roner, M. R., Sutphin, L. A. & Joklik, W. K. (1990) Virology 179, 845-852.、Roner, M. R., Nepluev, I., Sherry, B. & Joklik, W. K. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 6826-6830.、Roner, M. R. & Joklik, W. K. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 8036-8041.)。しかし、その系は極めて複雑であり、温度感受性変異株の調製、操作を加える遺伝子分節でコードされる特定のウイルス蛋白質を安定に発現するトランスフォーム細胞の調製といった極めて煩雑な準備を必要とする。そのため、他の研究室で利用されたという報告も、他のレオウイルス科のウイルスに応用されたという報告も聞かない。一方、我々の方法は、Palese博士ら（Enami, M., Luytjes, W., Krystal, M. & Palese, P. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3802-3805.、Enami, M. & Palese, P. (1991) Virology 185, 291-298.、特許第３２９３６２０号公報）により開発された慣習的なT7 RNAポリメラーゼ発現システムを利用したリバースジェネティクス系をロタウイルスに応用したものである。組換えワクシニアウイルスのT7 RNAポリメラーゼを利用することにより、野生型ロタウイルスmRNAに模倣した人工的なウイルスmRNAを細胞質内で極めて高度に発現させることができ、すべての複製サイクルが細胞質内で行なわれるという、ロタウイルスのリバースジェネティクス系の開発には好都合である。
ロタウイルスのmRNAは5’末端にキャップ構造を有し、3’末端にポリAを有さない（Imai, M., Akatani, K., Ikegami, N. & Furuichi, Y. (1983) J. Virol. 47, 125-136.、McCrae, M. A. McCorquodale, J. G. (1983) Virology 126, 204-212.）とユニークであり、効率的なゲノムの複製と翻訳にはこれらの構造が重要であることが明らかにされている（Patton, J. T., Wentz, M., Xiaobo, J. & Ramig, R. F. (1996) J. Virol. 70, 3961-3971.、Wentz, M. J., Patton, J. T. & Ramig, R. F. (1996) J. Virol. 70, 7833-7841.、Chizhikov, V. & Patton, J. T. (2000) RNA 6, 814-825.）。本実験で使用したコンストラクトでは、真正の5’末端及び3’末端構造がそれぞれ、ワクシニアウイルスによってコードされるキャッピング酵素と転写プラスミドに挿入されたD型肝炎ウイルスのリボザイム配列によって保たれている（図２）。組換えワクシニアウイルスT7 RNAポリメラーゼを利用して細胞質内で転写されたcDNA由来のウイルスmRNAが使用され、ヘルパーウイルスの重感染により、cDNA由来の新たな遺伝子分節を含む感染性ロタウイルスがレスキューされる。このようなトランスフェクタントウイルスの選択のために、レスキューウイルスにサルロタウイルスSA11様のVP4遺伝子の存在を要求する系を選んだ。この遺伝子を含むウイルスの増殖は、ヘルパーウイルス（ヒトロタウイルスKU株）由来のVP4を選択的に中和する中和モノクローナル抗体の存在下で制限されない。本実験において、プラスミドpT7/VP4(SA11)由来の真正SA11 VP4遺伝子を有するKU//rVP4(SA11)ウイルスを初めて回収することに成功した（図２）。KU//rVP4(SA11)ウイルスは、予想されるRNAパターン（図３）及びVP4遺伝子の塩基配列（図４）を示し、VP4遺伝子のクローニングに使用したSA11ウイルスの感染価とほぼ同程度にまで増殖した（データ示さず）。KU//rVP4(SA11)と、親株であるKUウイルスとの増殖の違いは、VP4蛋白質がロタウイルスの感染性に大きく貢献するという以前の知見から予測されていた（Patton, J. T. & Spencer, E. (2000) Virology 277, 217-225.、Kalica, A. R., Flores, J. & Greenberg, H. B. (1983) Virology 125, 194-205.、Offit, P. A., Blavat, G., Greenberg, H. B. & Clark, H. F. (1986) J. Virol. 57, 46-49.）。
【００４３】
我々はまた、プラスミドpT7/VP4(SA11)ΔPstI、pT7/VP4(SA11)ΔHaeII、及びpT7/VP4(SA11)-ΔPstI,ΔHaeII由来のVP4遺伝子において、遺伝子マーカーとして特定の制限酵素サイトが破壊されたサイレント変異を有する３種のトランスフェクタントウイルスを得ることに成功した（図２）。ビリオンdsRNAのRT-PCR制限酵素切断分析と塩基配列決定により、得られた変異ウイルスKU//rVP4(SA11)、KU//rVP4(SA11)ΔPstI、KU//rVP4(SA11)ΔHaeII及びKU//rVP4(SA11)-ΔPstI,ΔHaeIIにおける対応する変異の存在を立証した（図４）。これらの変異は、VP4蛋白質にアミノ酸の変化を起こさず、真正のSA11ウイルス由来VP4遺伝子を有するKU//rVP4(SA11)ウイルスの生物学的性状を変化させないと予想される。事実、レスキューした全ての変異ウイルスはKU//rVP4(SA11)ウイルスと同等の増殖を示した（データ示さず）。このようにして、ロタウイルスで開発されたリバースジェネティクス系の有用性が確認された。
【００４４】
ロタウイルスの生物学的性状を変化させる変異を導入できれば、非構造蛋白質を含め、全てのウイルス蛋白質の詳細な機能を明らかにすることができる。ゲノムの非翻訳領域については部位突然変異による研究も可能となるであろう。そうなれば、ウイルスRNAに存在する制御シグナルの理解がより深まるであろう。さらに、このリバースジェネティクスの系は、ロタウイルスゲノム内での弱毒マーカーを同定する機会を提供し、ワクチンベクターの候補として使用できる弱毒組換えウイルスの開発を促進するであろう。
ここで示したアプローチは、dsRNAの転写、複製とパッケージに関わるシグナルの研究、ウイルス蛋白質の機能の研究に有用であろう。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明が提供するリバースジェネティクスの系は、外殻タンパク質遺伝子分節が人為的に操作された、レオウイルス科に属するウイルスの調製を可能にする。従って、本発明を利用して、性状（例えば抗原性）の変化した組換えウイルスを調製することができる。特に、ワクチンとして使用され得る弱毒組換えウイルスを調製する手段として本発明は有効と考えられる。
一方、本発明を利用して、外来遺伝子を保有する組換えウイルスを構築することも可能である。このように本発明は、レオウイルス科のウイルスをベクターとして利用することも可能とする。
また、本発明によればウイルスゲノムを人為的に操作することが可能となり、レオウイルス科のウイルスの増殖や病原性に関する詳細な分析への貢献が期待される。
【００４６】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】プラスミドの構築に使用したPCRプライマーを示す表。プライマー、塩基配列位置、塩基配列（制限酵素サイト）の順に記載される。制限酵素サイトを下線で示した。また、イタリックはT7 RNAポリメラーゼプロモーター配列を示す。太字はSA11ウイルスのVP4遺伝子で置換した塩基配列を示す。プライマー２での小文字はプライマーの5’末端に付加された非ウイルス由来の塩基配列を示す。
【図２】SA11由来の完全長VP4遺伝子をコードする転写プラスミドの構造。プラスミドpT7/VP4(SA11)は、T7 RNAプロモーター、SA11の真正の完全長VP4遺伝子、D型肝炎ウイルスのリボザイム、T7 RNAターミネーターを含む。VP4遺伝子はT7 RNAプロモーターとD型肝炎ウイルスのリボザイムに挟まれる。サイレント変異（変異位置は、塩基配列の下に矢尻で示す）によるVP4遺伝子の操作は、pT7/VP4(SA11)を用いて行なった。変異プラスミドpT7/VP4(SA11)ΔPstI、pT7/VP4(SA11)ΔHaeII、及びpT7/VP4(SA11)-ΔPstI,ΔHaeIIは順に、ユニークなPstIサイト、ユニークなHaeIIサイト、及びこれら両方のサイトに破壊変異を含む。数値は、SA11 VP4遺伝子の塩基配列での塩基位置を示す。pT7、リボザイム、及びTT7は順に、T7 RNAポリメラーゼプロモーター、D型肝炎ウイルスのリボザイム、T7 RNAポリメラーゼターミネータを示す。
【図３】レスキューしたVP4遺伝子トランスフェクタントから抽出したdsRNAのポリアクリルアミド電気泳動の結果。レーン１、SA11からのdsRNA; レーン２と４、KU//rVP4(SA11)のVP4遺伝子を有する変異ウイルスからのdsRNA; レーン３、ヘルパーウイルスKU株のdsRNA; レーン５、SA11とKUのdsRNAの混合物。左側の数値は、SA11のゲノムdsRNAの順序を示す。
【図４】レスキューしたVP4遺伝子トランスフェクタントへ導入した部位特異的変異。各ウイルスの完全長VP4遺伝子はRT-PCRにより増幅し、2,386塩基の産生物を得た。(A) 増幅した断片をPstI あるいはHaeIIで消化し、1.25% アガロースゲルで分離した。KU//rVP4(SA11) (レーン１，２，３)、KU//rVP4(SA11)ΔPstI（レーン４，５，６）、KU//rVP4(SA11)ΔHaeII（レーン７，８，９）、KU//rVP4(SA11)-ΔPstI, ΔHaeII（レーン10, 11, 12）。2,386塩基の断片（レーン1, 4, 7, 10）はPstI （レーン2, 5, 8, 11）あるいは HaeII（レーン3, 6, 9, 12）で消化した。M, 1kb ラダーマーカー。(B) 2,386塩基の断片を直接、塩基配列の決定を行ない、感染性のVP4遺伝子トランスフェクタントのゲノム内導入した部位特異的変異を確認した。
【図５】リバースジェネティクスの系を利用した組換えロタウイルスの調製法を示す図。
【図６】リバースジェネティクスの系における組換えロタウイルスの選択操作を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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