(57)【要約】【課題】  幹細胞，および幹細胞を含む骨髄、末梢血，臍帯血等，体より採取した検体を凍結せずに、短期間，安定に保存するに適した保存基材と保存方法を得る。【解決手段】  ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドからなるブロック共重合体を、高分子基材上に物理吸着あるいは直接共有結合で表面固定化させた保存基材で，幹細胞あるいは幹細胞を含む骨髄、末梢血，臍帯血等，体より採取した検体を低温で保存することを特徴とする。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドからなるブロック共重合体を高分子基材上に物理吸着あるいは直接共有結合で表面固定化させた，幹細胞あるいは血液の保存基材。
【請求項２】
ポリエチレンオキシドをＡ、ポリプロピレンオキシドをＢとした時に、ＡＢＡまたはＢＡＢまたは(ＡＢ)n、（nは繰り返し単位であり、１から１０までの整数）となるように、ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドがエーテル結合、アミド結合、エポキシ結合、エステル結合等を含む分子量１００以下の結合部位により結合されているブロック共重合体を高分子基材上に物理吸着あるいは直接共有結合で表面固定化させた，幹細胞あるいは血液の保存基材。
【請求項３】
分子量が１,０００以上２０,０００以下のポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドからなるブロック共重合体を用いることを特徴とする請求項１または請求項２記載の，幹細胞あるいは血液の保存基材。
【請求項４】
請求項１、請求項２、または請求項３記載の、幹細胞あるいは血液保存基材を用いて、幹細胞あるいは血液を２０℃以下で保存する方法。
【請求項５】
請求項１、請求項２、または請求項３記載の幹細胞あるいは血液の保存基材上で保存された細胞
【請求項６】
請求項４記載の方法で得られた細胞
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療、医薬、生化学関連産業の分野における幹細胞あるいは血液の保存基材並びにその保存方法に関するものである。詳しくは人あるいは所定の動物の骨髄、末梢血又は臍帯血等の，体より採取した幹細胞および幹細胞を含む検体の保存に適した保存基材と、その保存基材を用いた幹細胞および幹細胞を含む検体の保存方法並びにその保存方法より得られる細胞に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
臍帯血中の造血幹細胞は、ドナー侵襲皆無の造血幹細胞移植ソースとして注目を集めており、欧米諸国を中心にさかんに臨床応用が試みられている。再生不良性貧血や白血病などの造血機能が障害された疾患においては、骨髄や臍帯血中に含まれる造血幹細胞を移植することにより治療することが可能である。この際、患者にはＨＬＡ（Human leukocyte associated:ヒト白血球付随）抗原が一致した細胞を移植する必要がある。ここで、骨髄移植においては、患者の近親者や骨髄バンク登録者からドナーの選定が行われているものの、ＨＬＡ抗原の多様性からＨＬＡ抗原の一致したドナーを見出すことは極めて困難である。
【０００３】
さらに、骨髄移植の場合にはドナーの負担がかなり大きいことが、骨髄バンクへの登録者数を大幅に増やすことができない原因にもなっている。一方、臍帯血は入手が容易であるとともにドナーへの負担もほとんど無いことから、多様なＨＬＡ抗原を持つ臍帯血をかなり容易に確保できる。但し、骨髄細胞移植の場合と比較すれば、臍帯血から得られる造血幹細胞数が少ないために、臍帯血移植は、小児などの治療に限定されてきた。しかしながら、造血幹細胞の培養技術に関する近年の進歩は著しく、造血幹細胞を生体外で増殖させる技術が近い将来確立されると期待されている。したがって、かかる際には、臍帯血移植が成人にとっても有効な治療法となることが期待される。
【０００４】
臍帯血幹細胞は、他の造血幹細胞移植、即ち、骨髄移植あるいは末梢血幹細胞移植のようにドナーから採取されてすぐ患者に移植されることはまれであるので、採取時から使用時まで保存しておくことが必要である（特に非血縁者間移植の場合）。
特公平８−６９号公報には臍帯血を凍結保存後、解凍して移植に用いることが開示されている。造血幹細胞を保存する従来の方法としては、例えば、「Collection, separation and cryopreservation of umbilical cord blood for use in transplantation in Bone Marrow Translation, 1994, No. 13, pp135-143」などにおいて、臍帯血単核細胞を所定の培地中に浮遊させた状態で直接的に冷却し、冷凍して保存することが記載されている。特開平２００３−４７４６４号公報では、造血幹細胞などの動物細胞を効率よく凍結保存し、高い効率で回復させることのできる保存方法を開示している。上記のいずれの場合も、幹細胞を凍結して保存を行っている。しかしながら，細胞の凍結，融解にともなって，細胞の生存度は低くなるので，頻回の凍結，融解操作は避けなければならない。
【０００５】
臍帯血を採取する医療施設では，凍結保存の設備を必ずしも整えていないので，医療施設から凍結処理のできる施設，例えば臍帯血バンク施設まで，凍結せずに安定に保存させながら輸送する必要がある。産科の医療施設から臍帯血バンク施設までは，従来，プラスチックバッグなどに通常入れられ4℃で保存され輸送されていた。この輸送中に幹細胞の生存度が低下しては目的が達成されない。
臍帯血移植がさらに普及されるためには、医療施設で採取された臍帯血は、造血幹細胞の生存度を高く保持して、臍帯血バンク施設、幹細胞バンク施設，病院，細胞処理施設，あるいは研究所に輸送する必要がある。この輸送中，造血幹細胞の生存度を高く保持できる保持基材並びに保存方法が開発される必要がある。
【０００６】
造血幹細胞および他の幹細胞を安定に保存する過程としては，１）幹細胞および幹細胞を含む検体を人体から採取して，凍結保存施設や，臍帯血バンク施設、幹細胞バンク施設，病院，細胞処理施設あるいは研究所に輸送するまでの間，２）幹細胞を増殖させた後，臍帯血バンク、幹細胞バンク，病院，細胞処理施設，あるいは研究所に輸送するまでの間，３）幹細胞および幹細胞を含む検体を凍結から融解して，投与を受ける患者のいる病院へ搬送する過程等が考えられる。臍帯血移植を初めとする幹細胞移植において、幹細胞を凍結せずに短期間安定に保持する幹細胞の保存材料並びにその方法が社会より切望されていた。
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−４７４６４号公報
【０００８】
【特許文献２】特公平８−６９号公報
【０００９】
【非特許文献１】D.T.Harris et al., Collection, separation and cryopreservation of umbilical cord blood for use in transplantation in Bone Marrow Transplant., 1994, No. 13, pp135-143
【非特許文献２】E.P. Orringer et al., Purified poloxamer 188 for treatment of acute waso-occlusive orisis of sickle cell disease: A randomized controlled trial. JAMA, The Journal of the American Medical Association, アメリカ合衆国，2001年11月7日発行  286巻，17号, 2099-2106ページ
【非特許文献３】M. Morishita et al., Pluronic F-127 gels incorporating highly purified unsaturated fatty acids for buccal delivery of insulin. Int. J. Pharm., 2001年1月16日発行  212巻，2号, 289-293ページ
【非特許文献４】A. Higuchi et al., Photon-modulated changes of cell attachments on poly(spiropyran-co-methyl methacrylate) membranes. Biomacromolecules, 2004年9月発行  ５巻，5号, 1770-1774ページ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
医療、医薬、生化学関連産業の分野において、幹細胞および幹細胞を含む骨髄、末梢血，臍帯血ほか，体より採取した検体を凍結せずに短期間安定に保持する幹細胞保存材料並びにその方法が社会より切望されていた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、以上のような点に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドからなるブロック共重合体を高分子基材上に直接共有結合で表面固定化された高分子基材を幹細胞保存基材に利用することを見出した。
ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドから構成される分子量１,０００以上２０,０００以下のブロック共重合体は既に医療の分野で使用されていて,その生体に対する安全性については，公表されている。例えば、ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドのブロック共重合体であるポロキサマー１８８(プルロニックF-68)は鎌状赤血球貧血の急性血管閉塞症の治療として用いられている（Orringer et al., JAMA, 286(17), 2099-2106（2001）
）。また、プルロニックは薬物の除放容器としてＦＤＡから認可されており、人体への使用が認められている（M. Morishita et al., Int. J. Pharm., 212(2)，289-293（2001））。      
【００１２】
ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドから構成される分子量１,０００以上２０,０００以下のブロック共重合体を高分子基材上に表面固定化した高分子基材上で、造血幹細胞を含む臍帯血を低温で保存させると、造血幹細胞数が、３日以上の長期的に維持できることを見出し、本発明に至った。
【００１３】
即ち本発明は、ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドから構成される分子量１,０００以上２０,０００以下のブロック共重合体を高分子基材上に表面固定化された高分子基材上にて、幹細胞あるいは血液を保存することを特徴とする高分子基材及びその保存法並びにその保存方法より得られる細胞あるいは血液を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドからなるブロック共重合体を高分子基材上に物理吸着あるいは直接共有結合で表面固定化させた基材上で低温で幹細胞や血液を保存すると、造血幹細胞等の幹細胞を3日以上生存度高く保持させることが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドから構成される分子量１,０００以上２０,０００以下のブロック共重合体を高分子基材上に表面固定化された幹細胞あるいは血液保存基材を本発明では用いる。ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドから構成される分子量１,０００以上２０,０００以下のブロック共重合体は、ある所定の水溶液中濃度において、低温（２０度以下）では、ポリマー鎖は、十分に水和されて、水溶液中に溶解している。従って、ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドから構成される分子量１,０００以上２０,０００以下のブロック共重合体を高分子基材上に表面固定化された高分子基材上で幹細胞あるいは血液を低温（２０度以下）で保存することが望ましい。
【００１６】
ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドから構成される分子量１,０００以上２０,０００以下のブロック共重合体を高分子基材上に表面固定化しているために、文献４で問題となっていた親水性ポリマーの水溶液への流出を防ぐことが本発明では可能となった。
ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドから構成される分子量１,０００以上２０,０００以下のブロック共重合体とは、ポリパラフィン、ポリエステル、ポリエーテル並びにこれらを含む共重合体である。例えば、ポリエチレンオキシドをＡ、ポリプロピレンオキシドをＢとした時に、ＡＢＡまたはＢＡＢまたは(ＡＢ)nとなるように、ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドがエーテル結合、アミド結合、エポキシ結合、エステル結合等を含む分子量１００以下の結合部位により結合されている分子量１,０００以上２０，０００以下のブロック共重合体が、一例として取り上げられる。ここで、nは繰り返し単位であり、１から１０までの整数である。上記(ＡＢ)nタイプ（ポリエチレンオキシドーポリプロピレンオキシドのブロック共重合体）の合成法は、文献（A. Sosnik, D. Cohn, Biomaterilas, 26, 349 (2005)）に記載されている。エチレンオキシドープロピレンオキシドブロック共重合体の他の例としては、プルロニックポリマーが市販品として知られている。例えば、エチレンオキシド１１量体プロピレンオキシド１６量体エチレンオキシド１１量体のプルロニックＬ３５（分子量１８５６）、エチレンオキシド８０量体プロピレンオキシド３０量体エチレンオキシド８０量体のプルロニックＦ６８（分子量８７８０）、エチレンオキシド１０６量体プロピレンオキシド７０量体エチレンオキシド１０６量体のプルロニックＦ１２７（分子量１３３８８）等であるが、ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドから構成される分子量１,０００以上２０,０００以下のブロック共重合体が高分子基材上に２nmol/cm2以上表面固定化されていればよく、これに限定されるものではない。ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドから構成されるブロック共重合体の分子量は、１,１００から１４,６００のものが入手可能であるので、本発明を実施するには、この範囲の分子量のポリマーを用いることは比較的簡便であるが、本発明はこの分子量範囲に縛られることはない。
【００１７】
また、上記ポリマーの高分子基材表面上への表面固定化量は、２nmol/cm2以上、１,０００nmol/cm2未満であることが望ましい。表面固定化量が、２nmol/cm2以上であると、本発明の高分子基材上で幹細胞ならびに血液を生存度高く保存することが可能である。これは、２０℃以下の低温にすることにより、上記表面固定化されたポリマーは、水和されてポリマー鎖が培地中で伸びきった形態を取るようになるためである。このために、幹細胞を未分化な状態で維持することが可能となっている。
一方、表面固定化量が、１,０００nmol/cm2以上であると、上記ポリマーが大過剰となり、表面に固定化されているもののみならずに、単に上記ポリマー同士が会合されているものも生じてくる。この上記ポリマー同士の会合体は、経時とともに血液あるいは水溶液中に容出してくることになる。
【００１８】
上記ブロック共重合体の表面存在量の確認は、Ｘ線光電子分析装置（ＸＰＳ、ＥＳＣＡ）により高分子基材表面の元素分析を行うことにより可能である。もし、上記ポリマーが単分子の櫛状に固定化された場合、高分子基材表面の数ナノから数十ナノに上記ポリマーが固定化されていることになるので、ＡＴＲ法を用いた赤外分光光度計測では、上記ポリマーの同定は困難であると予測される。逆に、本発明では、高分子基材表面上に固定化されたポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドから構成される分子量１,０００以上２０,０００以下のブロック共重合体の存在量は、ＡＴＲ法を用いた赤外分光光度計測では確認できないが、Ｘ線光電子分析測定で確認できるナノオーダーサイズのポリマー鎖が表面に固定化されているのが望ましい。
【００１９】
ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドから構成される分子量１,０００以上２０,０００以下のブロック共重合体を高分子基材上に表面固定化する方法としては、表面化学修飾法等が用いられる。
ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドから構成される分子量１,０００以上２０,０００以下のブロック共重合体の末端が水酸基である場合、末端を活性化させて、高分子基材に表面固定する必要がある。末端活性化法の一例としては、（１）臭化シアン活性化法を用いてアミノ基に改質する方法（A. Higuchi et al., J. Membrane Sci., 205, 203 (2002)参照）、（２）N,N'-カルボニルイミダゾール活性化法をもちいてイミダゾール基に改質する方法(H.-F. Lu et al., Biomaterials, 24, 4893 (2003))が一般的であるが、他の方法により上記ポリマーの末端を活性化させても良い。ベースとなる高分子基材も活性化されている必要があるが、すでにポリリジンやポリエチレンイミンがコートされているポリリジンコートディシュやポリエチレンイミンコートディシュを用いても良い。あるいは、高分子基材にガンマ線照射あるいはプラズマ照射して、その後アンモニアガス等化学処理を行い、表面に、アミノ基またはカルボン酸基を導入する方法もある。高分子基材表面にアミノ基が存在する場合には、ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドから構成される分子量１,０００以上２０,０００以下のブロック共重合体の末端と、1,6-ジメチルスベリイミデート（スクシンイミド）等を用いて高分子基材表面上に上記活性化ポリマーを表面結合させることが可能である。なお、スクシンイミドを用いた反応条件は、文献に記載されている（M. Hara,A. Higuchi et al., J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 14, 139 (2003)）。
上記ポリマーがイミダゾール基に改質されており、高分子基材表面にアミノ基が存在する場合には、メタノールに溶解させたイミダゾール化ポリマー溶液を高分子基材表面に接触させるだけで、イミダゾール化ポリマーを高分子基材表面に固定化することが可能である。代表的な本発明の反応例（実施例１で用いた反応）を図１に示すが、この反応に本発明は限定されることは無い。
【００２０】
高分子基材の形態は、板、糸、円柱、膜、中空糸、(多孔質)粒子、又は一般に血液保存等に用いられるプラスチックバッグや，細胞培養や細胞保存に従来用いられるプラスチックチューブや，プラスチックフラスコ，プラスチックボトル等いずれの形をしててもよい。
【００２１】
本特許は、さらに、上記の方法で作成された高分子基材を用いて、幹細胞または血液を保持すること、さらには、この方法により得られる細胞も本特許の請求範囲内である。
【００２２】
幹細胞と接触する内表面が本特許の方法で処理された高分子基材で臍帯血等を保存した場合には、非処理の場合に比べて，幹細胞の比較的高い生存度が可能となる。
【００２３】
以下、本発明を実施例により説明するが本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２４】
（実施例１）
２００mlの３口丸底フラスコに６０mlテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、和光純薬工業社製、203-13965）を入れた後、５.０４ｇ（０.３８ｍｍｏｌ）のエチレンオキシド１０６量体プロピレンオキシド７０量体エチレンオキシド１０６量体であるプルロニックＦ１２７（分子量１３３８８） (シグマーアルドリッチ社製、P-2443)を加えて、溶解させた。また、６０mlテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に、３.２４ｇ（２０ｍｍｏｌ）のN,N'-カルボイミダゾール（和光純薬工業社製、034-10491）を溶解させて、上記のプルロニックＦ１２７のＴＨＦ溶液中に、滴下ロートを用いて窒素パージ下で５時間かけて滴下させた。なお、この操作の間、溶液は室温で撹拌しながら操作を行った。その後、さらに２時間撹拌を続けた。その後、反応溶液をエバポレーターに移して、真空下で、溶媒であるテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を蒸発させて、２０ml前後まで濃縮させた。この濃縮反応液を１Ｌの三角フラスコに入れたジエチルエーテル（和光純薬工業社製、055-01155）５００ml中に滴下させた。白色沈殿物をろ過して、再沈精製を行った。真空乾燥機を用いて、このイミダゾール化プルロニックＦ１２７を乾燥させた。さらに、１０mlのテトラヒドロフラン中にイミダゾール化プルロニックＦ１２７を溶解させた後、１Ｌの三角フラスコに入れたジエチルエーテル５００ml中に滴下させた。白色沈殿物をろ過して、再沈精製を再度行った。真空乾燥機を用いて、このイミダゾール化プルロニックＦ１２７を乾燥させた（収量４.６ｇ）。本実施例の反応式を図１に示す。得られた生成物の元素分析の結果、Ｃは５８.８％、Ｈは９.７％Ｎは０.５１％であった。１００％イミダゾール基がプルロニックＦ１２７に結合した時の元素割合は、Ｃは６０.５％、Ｈは１０.０％、Ｎは０.４４％であるために、ほぼ１００％反応が進行したことが確認された。さらに、イミダゾール化プルロニックＦ１２７のＨ-ＮＭＲ測定を試みた。この結果を図２に示す。イミダゾール基に起因するプロトンのピークが７.１ppmと７.７ppmに観察された（図２中の右に示した拡大図参照）。これらのピーク強度と、プルロニック中のメチレン鎖中のピーク１.１ppmと３.６ppmのピーク強度とを比較することにより、１００％イミダゾール基がプルロニックＦ１２７に結合していることが考察された。
合成したイミダゾール化プルロニックＦ１２７を０、０.１、０.２５、０.５、１、２、５、１０、２０ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにメタノール中に溶解した。ポリリジンコートされた２４穴培養フラスコ（旭テクノグラス社製、4820-040）の各穴中に上記の溶液を３穴づつ各２ｍＬ導入した。２４穴培養フラスコをパラフィルムにて密閉させた後に、ドラフト内にてこのイミダゾール化プルロニックＦ１２７含有２４穴培養フラスコをシェーカー上で２４時間撹拌させた。その後、反応溶液を２４穴培養フラスコの各穴から吸引した後、メタノールで３回洗浄した。その後、超純水で５回洗浄した。上記の方法で、調製したプルロニックＦ１２７表面固定化２４穴培養フラスコを室温にて、真空乾燥させた。
プルロニックＦ１２７が、ポリリジンコートされた２４穴培養フラスコに表面固定化されたかどうかを確認するために、Ｘ線光電子分析装置（AXIS-NOVA、島津製作所）を用いて元素分析を行った。各イミダゾール化プルロニックＦ１２７濃度で表面反応させたポリリジンコート２４穴培養フラスコ表面の窒素/炭素、酸素/炭素の割合を表１に示す。ポリリジンの窒素/炭素の理論計算値並びに酸素/炭素理論計算値は０.３３４並びに０.１６７である。さらに、各イミダゾール化プルロニックＦ１２７がポリリジンに１００％反応が進行した場合の窒素/炭素の理論計算値並びに酸素/炭素理論計算値は０.００８６６並びに０.４９５７である。また、本発明で用いた、細胞培養器材のベースであるポリリジンコート２４穴培養フラスコ表面の窒素/炭素の実測値並びに酸素/炭素実測値は０.０３１８並びに０.１４６であった。このことから、ポリリジンへのイミダゾール化プルロニックＦ１２７の反応率を、表面元素分析値から算出した。この結果の値を表１に示す。また、表面修飾されたポリリジン存在量は、マイクロBCA法（フナコシ社製、23235）を用いて算出した結果、１１.５μg/cm2であった。この値とポリリジンへのイミダゾール化プルロニックＦ１２７の反応率との積よりプルロニックＦ１２７の２４穴培養フラスコ表面への固定化量を計算した。０.１ｍｇ／ｍＬのイミダゾール化プルロニックＦ１２７を用いてポリリジンコート２４穴培養フラスコ表面に反応を行った表面には、１.８nmol/cm2のプルロニックＦ１２７が固定化されていた。０.５ｍｇ／ｍＬのイミダゾール化プルロニックＦ１２７を用いて表面反応を行った場合には、４.２nmol/cm2のプルロニックＦ１２７が固定化されていた。さらに、１.０ｍｇ／ｍＬのイミダゾール化プルロニックＦ１２７を用いて表面反応を行った場合には、６.８nmol/cm2のプルロニックＦ１２７が固定化されていた。以上より、表面反応を用いて、培養フラスコ表面にプルロニックＦ１２７を固定化することが可能となった。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
（実施例２）
１０ｍｇ／ｍＬのイミダゾール化プルロニックＦ１２７を用いて実施例１の方法で、プルロニックＦ１２７固定化２４穴培養フラスコを調製した。その後、プルロニックＦ１２７固定化２４穴培養フラスコの各穴に４℃に保存した新鮮なヒト臍帯血を播種した。この時の臍帯血は、血液抗凝固剤（EDTA2Na）を１０.５mg充填された７mLプラスチック製真空採血管（テルモ株式会社製、ベノジェクト２真空採血管）を使用してヒト臍帯より臍帯血を採取した。４℃の冷蔵庫中で、上記のプルロニックＦ１２７固定化２４穴培養フラスコ上においてヒト臍帯血を保存した。一日置きに、ヒト臍帯血をフラスコから一部採取して、造血幹細胞の表面マーカーであるＣＤ３４の発現率をフローサイトメトリー法を用いて計測した。ＣＤ３４造血幹細胞数をフローサイトメトリーを用いて、文献（A. Higuchi et al., J. Biomed. Mater. Res., 68A, 34-42 (2004)）記載の常法により計測した。すなわち、ＣＤ３４造血幹細胞数は、Stem-Kit（ベックマン・コールター社製）を用いて、そのマニュアル（国際血液療法・移植学会  ISHAGEガイドライン）に従って行った。７日間の２０μL中のＣＤ３４造血幹細胞数を図３に示す。７日後においても、ＣＤ３４造血幹細胞数は、初日に計測された半分前後の細胞数が観察された。
同様に、ＣＤ３４抗体（555821、BDバイオサイエンス  ファーミゲン社製）並びにＣＤ１３３抗体（130-090-853、ミルテニバイオテック社製）を用いて、ＣＤ１３３陽性並びにＣＤ３４陰性細胞（図４中,ＣＤ１３３＋ＣＤ３４―と記載）数、ＣＤ１３３陽性並びにＣＤ３４陽性細胞（図４中,ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋と記載）数、ＣＤ１３３陰性並びにＣＤ３４陽性細胞（図４中,ＣＤ１３３―ＣＤ３４＋と記載）数を7日間計測した。７日間の２０μL中の各々の造血幹細胞数を図４に示す。プルロニックＦ１２７固定化２４穴培養フラスコ中のＣＤ１３３陽性ＣＤ３４陽性細胞は、７日後においても、初日に計測された半分前後の細胞数が観察された。プルロニックＦ１２７固定化２４穴培養フラスコ中のＣＤ１３３陽性ＣＤ３４陰性細胞は、７日後においても、初日に計測された細胞数が維持されていることが観察された。
すなわち、プルロニックＦ１２７固定化２４穴培養フラスコ中でヒト臍帯血を保存すると、ＣＤ３４造血幹細胞を未分化の状態で保存できることが明らかとなった。
【００２７】
（比較例１）
ポリスチレン製２４穴培養フラスコ（旭テクノグラス製、3820-024N）をプルロニックＦ１２７固定化２４穴培養フラスコの代わりに用いた以外は、実施例２と同様にして、ヒト臍帯血を保存した。一日置きに、ヒト臍帯血をポリスチレン製２４穴培養フラスコから上澄み液として採取して、造血幹細胞の表面マーカーであるＣＤ３４の発現率をフローサイトメトリー法を用いて計測した。７日間の２０μL中のＣＤ３４造血幹細胞数を図３に示す。ポリスチレン製２４穴培養フラスコ中で、ヒト臍帯血を保存すると、２日後には、ＣＤ３４造血幹細胞数は、初日に計測された１／４前後まで減少していることが観察された。
また、ポリスチレン製２４穴培養フラスコ中のＣＤ１３３陽性ＣＤ３４陽性細胞は、７日後においては、初日に計測された１／５以下まで減少していた（ 図５）。さらに、ポリスチレン製２４穴培養フラスコ中のＣＤ１３３陽性ＣＤ３４陰性細胞は、７日後においては、初日に計測された細胞数の約半分にまで減少していた（ 図５）。
【００２８】
（比較例２）
プルロニック細胞培養基板のかわりに、温度感受性ポリマー固定化細胞培養基板：（レプセルTM：セルシード製、窒素を化学構造式中に含む３２℃の下限臨界溶解温度を有するポリーN-イソプロピルアクリルアミドを用いて調製された温度感受性ポリマー固定化細胞培養基板），あるいは超親水性ポリマー固定化細胞培養基板（ハイドロセルTM：セルシード製、細胞非付着性の超親水性ポリマー固定化細胞培養基板）を用いた以外は、実施例２と同様にしてヒト臍帯血を保存した。なお、実施例２と比較例２は、同一のヒトより採取した臍帯血を用いた。一日置きに、ヒト臍帯血を温度感受性ポリマー固定化細胞培養基板レプセルTMあるいは超親水性ポリマー固定化細胞培養基板ハイドロセルTM中から採取して、造血幹細胞の表面マーカーであるＣＤ３４の発現率をフローサイトメトリー法を用いて計測した。７日間の２０μL中のＣＤ３４造血幹細胞数を図３に示す。レプセルTMあるいはハイドロセルTMフラスコ中で、ヒト臍帯血を保存すると、３日後には、ＣＤ３４造血幹細胞数は、１／４以下まで減少していることが観察された。
また、温度感受性ポリマー固定化細胞培養基板レプセルTMあるいはハイドロセルTMフラスコ中のＣＤ１３３陽性ＣＤ３４陽性細胞は、７日後においては、初日に計測された１／５以下まで減少していた（ 図6, 温度感受性ポリマー固定化細胞培養基板レプセルTM, 図７, 超親水性ポリマー固定化細胞培養基板ハイドロセルTM）。さらに、レプセルTMあるいはハイドロセルTMフラスコ中のＣＤ１３３陽性ＣＤ３４陰性細胞は、７日後においては、初日に計測された細胞数の約半分にまで減少していた（ 図6, 図７）。
実施例２、比較例１並びに比較例２より、ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドから構成される分子量１,０００以上２０,０００以下のブロック共重合体を細胞培養器材上に表面固定化された細胞培養支持体上で保存したヒト臍帯血中の造血幹細胞の発現率が高い、すなわち細胞機能が高く維持されていることが明らかとなった。
【００２９】
（実施例３）
カルチャーバッグ（オプティサイトバッグ、造血幹細胞培養用バッグ、ポリオレフィン製、宝バイオ社製）中に０.１ｗｔ％のポリリジン水溶液（和光純薬工業製、167-18651）を５ｍＬ入れ、２時間静置させた。その後、カルチャーバッグから、ポリリジン水溶液を抜き取り、ｐＨ７．２のリン酸緩衝水溶液で洗浄した。さらに、室温にて真空乾燥を１２時間行って、ポリリシジンコートされたカルチャーバッグを調製した。１０ｍｇ／ｍＬのイミダゾール化プルロニックＦ１２７のメタノール溶液をポリリジンコートされたカルチャーバッグに５ｍＬ入れた後に、２４時間静置させた。その後、カルチャーバッグ内からイミダゾール化プルロニックＦ１２７のメタノール溶液を抜き取り、ｐＨ７．２のリン酸緩衝水溶液で洗浄した。さらに、室温にて真空乾燥を１２時間行って、プルロニックＦ１２７が固定化されたカルチャーバッグを調製した。その後、プルロニックＦ１２７固定化カルチャーバッグの内に４℃に保存した新鮮なヒト臍帯血を播種した。この時の臍帯血は、血液抗凝固剤（EDTA2Na）を１０.５mg充填された７mLプラスチック製真空採血管（テルモ株式会社製、ベノジェクト２真空採血管）を使用してヒト臍帯より臍帯血を採取した。４℃の冷蔵庫中で、上記のプルロニックＦ１２７固定化カルチャーバッグ内においてヒト臍帯血を保存した。一日置きに、ヒト臍帯血をプルロニックＦ１２７固定化カルチャーバッグ内から採取して、造血幹細胞の表面マーカーであるＣＤ３４の発現率をフローサイトメトリー法を用いて計測した。ＣＤ３４造血幹細胞数をフローサイトメトリーを用いて、実施例２と同様にして計測した。３日間の２０μL中のＣＤ３４造血幹細胞数を図8に示す。
【００３０】
（比較例３）
未処理のカルチャーバッグ（オプティサイトバッグ、造血幹細胞培養用バッグ、ポリオレフィン製、宝バイオ社製）をプルロニックＦ１２７固定化カルチャーバッグの代わりに用いた以外は、実施例３と同様にして、ヒト臍帯血をバッグ内に保存した。なお、実施例３と比較例３は、同一のヒトより採取した臍帯血を用いた。一日置きに、ヒト臍帯血をカルチャーバッグから採取して、造血幹細胞の表面マーカーであるＣＤ３４の発現率をフローサイトメトリー法を用いて計測した。３日間の２０μL中のＣＤ３４造血幹細胞数を図８に示す。いずれの日の結果においても、プルロニックＦ１２７固定化バッグ中のヒト臍帯血は、未処理のバッグ中のヒト臍帯血よりもＣＤ３４造血幹細胞数は高く保持されていることが明らかとなった。
【００３１】
（実施例４）
ハイブリバッグ（Hardタイプ、内部はポリプロピレン製、コスモバイオ社製）を用いて、内寸法が縦８ｃｍ、横１０.５ｃｍの大きさになるようにシーラー（FV-802、白社製）を用いて、ハイブリバッグを加工した。この加工したハイブリバッグを用いて、実施例３と同様にして、プルロニックＦ１２７固定化ハイブリバッグを調製した。実施例３と同様にして、ヒト臍帯血をバッグ内に保存した。一日置きに、ヒト臍帯血をカルチャーバッグから採取して、造血幹細胞の表面マーカーであるＣＤ３４の発現率をフローサイトメトリー法を用いて計測した。３日間の２０μL中のＣＤ３４造血幹細胞数を図９に示す。
【００３２】
（比較例４）
実施例４と同様に、ハイブリバッグ（Hardタイプ、内部はポリプロピレン製、コスモバイオ社製）を用いて、内寸法が縦８ｃｍ、横１０.５ｃｍの大きさになるようにシーラー（FV-802、白社製）を用いてハイブリバッグを加工した。この未処理のハイブリバッグをプルロニックＦ１２７固定化カルチャーバッグの代わりに用いた以外は、実施例３と同様にして、ヒト臍帯血をバッグ内に保存した。なお、実施例４と比較例４は、同一のヒトより採取した臍帯血を用いた。一日置きに、ヒト臍帯血をハイブリバッグから採取して、造血幹細胞の表面マーカーであるＣＤ３４の発現率をフローサイトメトリー法を用いて計測した。３日間の２０μL中のＣＤ３４造血幹細胞数を図９に示す。いずれの日の結果においても、プルロニックＦ１２７固定化ハイブリバッグ中のヒト臍帯血（実施例４）は、未処理のハイブリバッグ中のヒト臍帯血よりもＣＤ３４造血幹細胞数は高く保存されていることが明らかとなった。
【００３３】
（実施例５）
カルチャーバッグ（ニプロ社製）を用いて、内寸法が縦８ｃｍ、横１０.５ｃｍの大きさになるようにシーラー（FV-802、白社製）を用いてカルチャーバッグを加工した。この加工したカルチャーバッグを用いて、実施例３と同様にして、プルロニックＦ１２７固定化カルチャーバッグを調製した。実施例３と同様にして、ヒト臍帯血をバッグ内に保存した。一日置きに、ヒト臍帯血をカルチャーバッグから採取して、造血幹細胞の表面マーカーであるＣＤ３４の発現率をフローサイトメトリー法を用いて計測した。３日間の２０μL中のＣＤ３４造血幹細胞数を図１０に示す。
【００３４】
（比較例５）
実施例５と同様に、カルチャーバッグ（ニプロ社製）を用いて、内寸法が縦８ｃｍ、横１０.５ｃｍの大きさになるようにシーラー（FV-802、白社製）を用いてハイブリバッグを加工した。この未処理のカルチャーバッグをプルロニックＦ１２７固定化カルチャーバッグの代わりに用いた以外は、実施例３と同様にして、ヒト臍帯血をバッグ内に保存した。なお、実施例５と比較例５は、同一のヒトより採取した臍帯血を用いた。一日置きに、ヒト臍帯血をカルチャーバッグから採取して、造血幹細胞の表面マーカーであるＣＤ３４の発現率をフローサイトメトリー法を用いて計測した。３日間の２０μL中のＣＤ３４造血幹細胞数を図１０に示す。いずれの日の結果においても、プルロニックＦ１２７固定化カルチャーバッグ中のヒト臍帯血（実施例５）は、未処理のカルチャーバッグ中のヒト臍帯血よりもＣＤ３４造血幹細胞数は高く保存されていることが明らかとなった。
【００３５】
（実施例６）
カルチャーバッグ（Ｘ−フォードバッグ、宝バイオ社製）を用いて、実施例３と同様にして、プルロニックＦ１２７固定化カルチャーバッグを調製した。実施例３と同様にして、ヒト臍帯血をバッグ内に保存した。一日置きに、ヒト臍帯血をカルチャーバッグから採取して、造血幹細胞の表面マーカーであるＣＤ３４の発現率をフローサイトメトリー法を用いて計測した。3日間の２０μL中のＣＤ３４造血幹細胞数を図１１に示す。
【００３６】
（比較例６）
実施例６と同様に、カルチャーバッグ（Ｘ−フォードバッグ、宝バイオ社製）をプルロニックＦ１２７固定化カルチャーバッグの代わりに用いた以外は、実施例３と同様にして、ヒト臍帯血をバッグ内に保存した。なお、実施例６と比較例６は、同一のヒトより採取した臍帯血を用いた。一日置きに、ヒト臍帯血をカルチャーバッグから採取して、造血幹細胞の表面マーカーであるＣＤ３４の発現率をフローサイトメトリー法を用いて計測した。３日間の２０μL中のＣＤ３４造血幹細胞数を図１１に示す。いずれの日の結果においても、プルロニックＦ１２７固定化カルチャーバッグ中のヒト臍帯血（実施例６）は、未処理のカルチャーバッグ中のヒト臍帯血よりもＣＤ３４造血幹細胞数は高く保存されていることが明らかとなった。
【００３７】
（実施例７）
ハイブリバッグ（Hardタイプ、内部はポリプロピレン製、コスモバイオ社製）を用いて、縦１２ｃｍ、横２５ｃｍの大きさに切断して、一枚のシート状にした。真空ライン内に、ハイブリバッグを導入して、十分に、系内を真空引きした。アルゴンガスを０．２トールの圧力で流しながら、ハイブリバッグの入っている系内（直径１２ｃｍ，高さ２３ｃｍ、電極の間隔１２ｃｍ）にプラズマ照射装置（ＡＸ−３００，アドテック社製）を用いて５０Ｗ、２分間照射させた。プラズマ照射後、直ちにアルゴンガスの導入を停止して、その後、真空ラインを真空引きしてアルゴンガスを系内から除去した。真空ライン内にグリシジルメタクリレートを導入して１２０分間、ハイブリバッグ上にグリシジルメタクリレートを重合させた。その後、真空ラインを真空引きしてグリシジルメタクリレートガスを系内から除去した。その後、真空ライン内を大気中に開放して、表面グリシジルメタクリレート重合ハイブリバッグを取り出した。水―メタノール１：１溶液を用いて、十分に表面グリシジルメタクリレート重合ハイブリバッグを洗浄して、ハイブリバッグに物理吸着している未反応モノマー、並びにグリシジルメタクリレート重合体を除去した。その後、ハイブリバッグの内寸法が、縦８ｃｍ、横１０.５ｃｍの大きさになるようにシーラー（FV-802、白社製）を用いて、表面グリシジルメタクリレート重合ハイブリバッグを加工した。
0．１ mole/Lの水酸化ナトリウム水溶液３４ｍＬと３０％アンモニア水溶液１ｍＬを混合させて０．５mole/Lのアンモニア水溶液を調製した。この０．５mole/Lのアンモニア水溶液中に上記の表面グリシジルメタクリレート重合ハイブリバッグを３０度で６時間浸漬させて、表面アミノ基固定化ハイブリバッグを調製した。１０ｍｇ／ｍＬのイミダゾール化プルロニックＦ１２７のメタノール溶液を表面アミノ基固定化ハイブリバッグ内に５ｍＬ入れた後に、２４時間静置させた。その後、表面アミノ基固定化ハイブリバッグ内からイミダゾール化プルロニックＦ１２７のメタノール溶液を抜き取り、ｐＨ７．２のリン酸緩衝水溶液で洗浄した。さらに、室温にて真空乾燥を１２時間行って、表面プルロニックＦ１２７固定化ハイブリバッグを調製した。実施例３と同様にして、ヒト臍帯血をハイブリバッグ内に保存した。一日置きに、ヒト臍帯血をカルチャーバッグから採取して、造血幹細胞の表面マーカーであるＣＤ３４の発現率をフローサイトメトリー法を用いて計測した。９日目のＣＤ３４造血幹細胞数は、７３８細胞／２０μＬであり、初日の値の３０.４％であった。
【００３８】
（比較例７）
実施例４と同様に、ハイブリバッグ（Hardタイプ、内部はポリプロピレン製、コスモバイオ社製）を用いて、内寸法が縦８ｃｍ、横１０.５ｃｍの大きさになるようにシーラー（FV-802、白社製）を用いてハイブリバッグを加工した。この未処理のハイブリバッグをプルロニックＦ１２７固定化カルチャーバッグの代わりに用いた以外は、実施例３と同様にして、ヒト臍帯血をバッグ内に保存した。なお、実施例７と比較例７は、同一のヒトより採取した臍帯血を用いた。一日置きに、ヒト臍帯血をハイブリバッグから採取して、造血幹細胞の表面マーカーであるＣＤ３４の発現率をフローサイトメトリー法を用いて計測した。９日目のＣＤ３４造血幹細胞数は、２７０細胞／２０μＬであり、初日の値の８.９％であった。従って、プルロニックＦ１２７固定化ハイブリバッグ中のヒト臍帯血（実施例７）は、未処理のハイブリバッグ中のヒト臍帯血よりもＣＤ３４造血幹細胞数は、２.７倍高く保持されていることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本実施例に係るポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドから構成される分子量１,０００以上２０,０００以下のブロック共重合体を高分子基材上に表面固定化する反応例を示す図である。
【図２】実施例１に係るイミダゾール化プルロニックＦ１２７とプルロニックＦ１２７のプロトン核磁気共鳴（1H-NMR）スペクトルを示す図である。
【図３】実施例２に係るプルロニック固定化細胞培養基板上、比較例１に係わるポリスチレンフラスコ中、比較例２に係わるレプセルTM並びにハイドロセルTM中においてヒト臍帯血を７日間４℃で保存した時の造血幹細胞（ＣＤ３４陽性細胞）数の経時変化依存性を示す図である。
【図４】実施例２に係るプルロニック固定化細胞培養基板上においてヒト臍帯血を７日間４℃で保存した時の造血幹細胞｛ＣＤ１３３陽性ＣＤ３４陰性細胞（図４中，ＣＤ１３３＋ＣＤ３４―と記載）、ＣＤ１３３陽性ＣＤ３４陽性細胞（図４中，ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋と記載）、ＣＤ１３３陰性ＣＤ３４陽性細胞（図４中，ＣＤ１３３―ＣＤ３４＋と記載）｝数の経時変化依存性を示す図である。
【図５】比較例１に係わるポリスチレンフラスコ中においてヒト臍帯血を７日間４℃で保存した時の造血幹細胞｛ＣＤ１３３陽性ＣＤ３４陰性細胞（図５中，ＣＤ１３３＋ＣＤ３４―と記載）、ＣＤ１３３陽性ＣＤ３４陽性細胞（図５中，ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋と記載）、ＣＤ１３３陰性ＣＤ３４陽性細胞（図５中，ＣＤ１３３―ＣＤ３４＋と記載）｝数の経時変化依存性を示す図である。
【図６】比較例２に係わるレプセルTM中においてヒト臍帯血を７日間４℃で保存した時の造血幹細胞｛ＣＤ１３３陽性ＣＤ３４陰性細胞（図６中，ＣＤ１３３＋ＣＤ３４―と記載）、ＣＤ１３３陽性ＣＤ３４陽性細胞（図６中，ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋と記載）、ＣＤ１３３陰性ＣＤ３４陽性細胞（図６中，ＣＤ１３３―ＣＤ３４＋と記載）｝数の経時変化依存性を示す図である。
【図７】比較例２に係わるハイドロセルTM中においてヒト臍帯血を７日間４℃で保存した時の造血幹細胞｛ＣＤ１３３陽性ＣＤ３４陰性細胞（図７中，ＣＤ１３３＋ＣＤ３４―と記載）、ＣＤ１３３陽性ＣＤ３４陽性細胞（図７中，ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋と記載）、ＣＤ１３３陰性ＣＤ３４陽性細胞（図７中，ＣＤ１３３―ＣＤ３４＋と記載）｝数の経時変化依存性を示す図である。
【図８】実施例３に係るプルロニックＦ１２７固定化カルチャーバッグ並びに比較例３に係わる未修飾カルチャーバッグ中においてヒト臍帯血を３日間４℃で保存した時の造血幹細胞（ＣＤ３４陽性細胞）数の経時変化依存性を示す図である。
【図９】実施例４に係るプルロニックＦ１２７固定化ハイブリバッグ並びに比較例４に係わる未修飾ハイブリバッグ中においてヒト臍帯血を３日間４℃で保存した時の造血幹細胞（ＣＤ３４陽性細胞）数の経時変化依存性を示す図である。
【図１０】実施例５に係るプルロニックＦ１２７固定化カルチャーバッグ並びに比較例５に係わる未修飾カルチャーバッグ中においてヒト臍帯血を３日間４℃で保存した時の造血幹細胞（ＣＤ３４陽性細胞）数の経時変化依存性を示す図である。
【図１１】実施例６に係るプルロニックＦ１２７固定化カルチャーバッグ並びに比較例６に係わる未修飾カルチャーバッグ中においてヒト臍帯血を３日間４℃で保存した時の造血幹細胞（ＣＤ３４陽性細胞）数の経時変化依存性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2007209298.tif 000010
【図８】
2007209298.tif 000011
【図９】
2007209298.tif 000012
【図１０】
2007209298.tif 000013
【図１１】
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