(57)【要約】【課題】染色体などの新規な伸長技術を提供する。【解決手段】染色体などの直鎖状化合物を含む高分子可塑性物質（たとえば光硬化樹脂）を平板の上に静置する。次に、この平板を回転することにより生じる遠心力により、高分子可塑性物質を層状にするとともに、高分子可塑性物質内の直鎖状化合物をファイバー状態に伸長する。そして、伸長された状態の直鎖状化合物を含む高分子可塑性物質の層を固化して、高分子フィルムを形成する。または、直鎖状化合物を含む液体を平板の上に静置し、次に、平板を回転させることにより生じる遠心力により、液体内の直鎖状化合物をファイバー状態に伸長する。そして、伸長された状態の直鎖状化合物を平板に固定する。【選択図】図１
2007325511.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ファイバー化可能であるが、ファイバー化されていない直鎖状化合物を含む高分子可塑性物質を平板の上に静置し、
次に、この平板をその平面に垂直な回転軸のまわりに回転することにより生じる遠心力により、高分子可塑性物質を層状にするとともに高分子可塑性物質内の前記直鎖状化合物をファイバー状態に伸長し、
次に、ファイバー状態の直鎖状化合物を含む前記高分子可塑性物質の層を固化して、高分子フィルムを形成する
直鎖状化合物伸長方法。
【請求項２】
高分子可塑性物質を平板上に静置するとき、まず前記平板の上に前記高分子可塑性物質を載せ、次に、その中に前記直鎖状化合物およびこの直鎖状化合物を弛緩させる弛緩液を注入することを特徴とする請求項１に記載された直鎖状化合物伸長方法。
【請求項３】
高分子可塑性物質を平板上に静置するとき、まず前記平板の上に前記直鎖状化合物を固定し、次に、前記直鎖状化合物を弛緩させ、次に、その上に前記高分子可塑性物質を滴下することを特徴とする請求項１に記載された直鎖状化合物伸長方法。
【請求項４】
前記直鎖状化合物が２本鎖ＤＮＡであり、高分子可塑性物質を平板上に静置するとき、前記直鎖状化合物を可視化するための可視化剤を添加することを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載された直鎖状化合物伸長方法。
【請求項５】
前記直鎖状化合物が１本鎖ＤＮＡとその相補性化合物とからなる交雑分子であり、前記相補性化合物は標識を有することを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載された直鎖状化合物伸長方法。
【請求項６】
前記高分子可塑性物質が光硬化樹脂であり、光照射により前記光硬化樹脂の層を固化することを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載された直鎖状化合物伸長方法。
【請求項７】
前記高分子可塑性物質が熱硬化樹脂であり、熱を加えることにより前記熱硬化樹脂の層を固化することを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載された直鎖状化合物伸長方法。
【請求項８】
伸長された直鎖状化合物と、
伸長された前記直鎖状化合物が埋め込まれて保持されている固体高分子層と
からなる、伸長された直鎖状化合物を保持するフィルム。
【請求項９】
前記直鎖状化合物が２本鎖ＤＮＡであり、可視化部位を有することを特徴とする請求項８に記載されたフィルム。
【請求項１０】
前記直鎖状化合物が１本鎖ＤＮＡとその相補性化合物とからなる交雑分子であり、前記相補性化合物は標識を有することを特徴とする請求項８に記載されたフィルム。
【請求項１１】
ファイバー化可能であるが、ファイバー化されていない直鎖状化合物を含む液体を平板の上に静置し、
次に、この平板をその平面に垂直な回転軸のまわりに回転することにより生じる遠心力により、前記液体内の直鎖状化合物をファイバー状態に伸長し、
次に、伸長された状態の前記直鎖状化合物を前記平板に固定する
直鎖状化合物伸長方法。
【請求項１２】
前記液体を平板上に静置するとき、まず前記平板の上に前記直鎖状化合物を固定し、次に、前記直鎖状化合物の上にこの直鎖状化合物を弛緩させる弛緩液を滴下することを特徴とする請求項１１に記載された直鎖状化合物伸長方法。
【請求項１３】
前記直鎖状化合物が２本鎖ＤＮＡであり、直鎖状化合物を含む液体を平板上に静置するとき、さらに、可視化剤を加えて前記直鎖状化合物を可視化することを特徴とする請求項１１または１２に記載された直鎖状化合物伸長方法。
【請求項１４】
前記直鎖状化合物が１本鎖ＤＮＡとその相補性化合物とからなる交雑分子であり、前記相補性化合物は標識を有することを特徴とする請求項１１または１２に記載された直鎖状化合物伸長方法。
【請求項１５】
前記平板に固定した後に、さらに、もう１枚の平板との間に退色剤を封入することを特徴とする請求項１１から１４のいずれかに記載された直鎖状化合物伸長方法。
【請求項１６】
直鎖状化合物を含む液体を滴下した平板を回転させ、その平面上において遠心力を発生することが可能な回転装置、および
前記ステージの上に高分子可塑性物質を供給する高分子可塑性物質供給装置
を備える直鎖状化合物伸長装置。
【請求項１７】
さらに、前記高分子可塑性物質が光硬化樹脂である場合に前記ステージ上の平板上の液体に硬化用の光を照射可能な光照射装置を備えることを特徴とする、請求項１６に記載された直鎖状化合物伸長装置。
【請求項１８】
さらに、前記ステージを観察する顕微鏡を備え、前記光照射装置は前記顕微鏡の光源として兼用されることを特徴とする、請求項１７に記載された直鎖状化合物伸長装置。
【請求項１９】
さらに、前記高分子可塑性物質が熱硬化樹脂である場合に前記ステージ上の平板上の液体を加熱可能な加熱装置を備えることを特徴とする、請求項１６から１８のいずれかに記載された直鎖状化合物伸長装置。
【請求項２０】
さらに、前記平板上の直鎖状化合物の像を結像する光学系を含む光学装置を備えることを特徴とする、請求項１６から１９のいずれかに記載された直鎖状化合物伸長装置。
【請求項２１】
さらに、前記平板上の直鎖状化合物の像を結像する光学系およびその光学系の結像位置に設けた光検出素子を含む光学装置を備えることを特徴とする、請求項１６から１９のいずれかに記載された直鎖状化合物伸長装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、染色体などの直鎖状化合物の伸長技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
染色体は、遺伝情報を保持する巨大分子であるＤＮＡを含んでいるが、自然状態では直径数μmの大きさに凝集している。ＤＮＡの配列や遺伝子を決定する従来の手法では、ＤＮＡを断片化してシーケンスを決定するので、解析により得られた各配列がうまくつながらないという問題や、全シーケンスを決定するとき時間と費用がかかるという問題があった。染色体をファイバー状に伸長できれば、ＤＮＡについての各種の解析が容易になる。このため、ＤＮＡの伸長や、伸長したＤＮＡ（ＤＮＡファイバー）についての解析が報告されている。また、ＤＮＡファイバーを用いたＦＩＳＨ（蛍光・イン・シトゥ・ハイブリダイゼーション法）も報告されている。
【０００３】
たとえば、ContiおよびBensimonの論文（Genomics 80, 135 (2002))では、ＤＮＡファイバーを得るため、ＤＮＡを含む溶液にスライドガラスを沈めて、続いて引き上げる。このとき、スライドガラスの表面に付着したＤＮＡの端部が乾燥して表面上に固定される。さらにスライドガラスを引き上げていくと、端部に続く部分が表面上に伸長され固定されていく。これにより０．２４ｍｍの長さの繊維状のＤＮＡ断片が得られている。
【０００４】
また、ガラス板上に固定された染色体を電気浸透流の中におくことによりＤＮＡをたとえば約０．８ｍｍの長さまで伸長できる。しかし、この方法では、電気浸透流がない状態では、ＤＮＡは元のように折りたたまれてしまう。また、電気浸透流を用いるための専用の機材が必要であった。また、専用機材の中の電気浸透流における伸長ＤＮＡは、顕微鏡の視野内に収まらないため観察が困難であった。
【非特許文献１】C. Conti & A. Bensimon, Genomics 80, 135 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のContiおよびBensimonのＤＮＡファイバー化技術では、スライドガラスの上にＤＮＡファイバーを採取する段階でＤＮＡファイバーが断片化されていた。これは風乾によりＤＮＡファイバーが切れやすいためである。ＤＮＡを長く伸長するにはメニスカスでの表面張力について職人的技術が必要であり、この方法によるファイバー化は再現性が低かった。
【０００６】
本発明の目的は、上述の問題点がない染色体などの新規な伸長技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明では、直鎖状化合物を含む、高分子可塑性物質などの液体を回転することにより、直鎖状化合物に液体の回転による剪断力を作用させて、直鎖状化合物を線状に（ファイバー状態に）伸長する。そして、伸長された直鎖状化合物を平面上に固定する。直鎖状化合物は、たとえば、染色体や、１本鎖のＤＮＡ分子と標識された相補性分子との交雑化合物である。
【０００８】
本発明に係る第１の直鎖状化合物伸長方法では、ファイバー化可能であるが、ファイバー化されていない直鎖状化合物を含む高分子可塑性物質（たとえば光硬化樹脂）を平板の上に静置する。次に、この平板をその平面に垂直な回転軸のまわりに回転する際に伴う遠心力により、高分子可塑性物質を層状にするとともに高分子可塑性物質内の前記直鎖状化合物をファイバー状態に伸長する。そして、ファイバー状態の直鎖状化合物を含む前記高分子可塑性物質の層を固化して、高分子フィルムを形成する。
【０００９】
この第１の直鎖状化合物伸長方法において、高分子可塑性物質を平板上に静置するとき、たとえば、まず前記平板の上に前記直鎖状化合物を固定し、次に、前記直鎖状化合物の上にこの直鎖状化合物を弛緩させる弛緩液を滴下し、次に、その上に前記高分子可塑性物質を滴下する。または、まず前記平板の上に前記高分子可塑性物質を載せ、次に、その中に前記直鎖状化合物およびこの直鎖状化合物を弛緩させる弛緩液を注入する。弛緩液とは、直鎖状化合物のもつ堅牢な剛性を柔軟な屈曲性に変換するものであり、たとえば高いイオン強度の塩、核酸を分解する酵素を不活性化するキレート剤、不純なタンパク質を変性させる界面活性剤、pHを調整する緩衝剤などから成る。これにより、平板上に直鎖状化合物を固定しないで直鎖状化合物を伸長する。あるいは、これにより、平板上に直鎖状化合物を固定した状態で直鎖状化合物を伸長してもよい。または、たとえば、さらに、前記直鎖状化合物を可視化するための可視化剤たとえば染色剤を添加する。これにより、伸長の前に直鎖状化合物を可視化しておく。
【００１０】
本発明に係る高分子フィルムは、伸長された直鎖状化合物と、伸長された前記直鎖状化合物が埋め込まれて保持されている固体高分子層とからなる。たとえば、前記直鎖状化合物が２本鎖ＤＮＡであり、可視化部位を有する。可視化の例には、たとえば、染色剤の添加とその後の顕微鏡観察、あるいは、放射性同位元素の標識とその後のオートラジオグラフィー、あるいは、蛍光物質の標識とその後のスキャナー読み取りがある。または、前記直鎖状化合物が１本鎖ＤＮＡとその相補性化合物とからなる交雑分子であり、前記相補性化合物は標識を有する。
【００１１】
本発明に係る第２の直鎖状化合物伸長方法では、ファイバー化可能であるが、ファイバー化されていない直鎖状化合物を含む液体を平板の上に静置し、次に、この平板をその平面に垂直な回転軸のまわりに回転することにより生じる遠心力により、前記液体内の直鎖状化合物をファイバー状態に伸長する。そして、伸長された状態の前記直鎖状化合物を前記平板に固定する。
【００１２】
この第２の直鎖状化合物伸長方法では、たとえば、液体を平板上に静置するとき、まず前記平板の上に前記直鎖状化合物を固定し、次に、前記直鎖状化合物の上にこの直鎖状化合物を弛緩させる弛緩液を滴下する。これにより、平板上に直鎖状化合物を固定した状態で直鎖状化合物を伸長する。
【００１３】
また、第２の直鎖状化合物伸長方法では、たとえば、直鎖状化合物を含む液体を平板上に静置するとき、さらに、可視化剤たとえば染色剤を加えて前記直鎖状化合物を可視化する。
【００１４】
また、第２の直鎖状化合物伸長方法では、たとえば、前記平板に固定した後に、さらに、もう１枚の平板との間に退色剤を封入する。
【００１５】
本発明に係る直鎖状化合物伸長装置は、直鎖状化合物を含む液体を滴下した平板を回転させ、その平面上において遠心力を発生することが可能な回転装置（たとえば直鎖状化合物を含む液体を滴下した平板を載せることが可能なステージを備える回転装置）、および、この平板上に高分子可塑性物質を供給する高分子可塑性物質供給装置を備える。この直鎖状化合物伸長装置は、好ましくは、さらに、前記平板に光を照射する光照射装置を備える。これにより、光硬化樹脂を用いる場合に、前記平板の上で光硬化樹脂を硬化できる。また、好ましくは、前記平板を加熱するための加熱装置を備える。これにより、熱硬化樹脂を用いる場合に、前記平板の上で熱硬化樹脂を硬化できる。好ましくは、さらに、平板上の直鎖状化合物の像を結像する光学系を含む光学装置、たとえば顕微鏡を備える。または、平板の像を結像する光学系および光学系の結像位置に設けた光検出素子を含む光学装置を備える。
【発明の効果】
【００１６】
直鎖状化合物を含む液体の回転により直鎖状化合物にずり応力（剪断力）が作用するので、直鎖状化合物が従来より長く伸長される。液体の中のずり応力は比較的穏やかであるので、直鎖状化合物は伸長の際に断片化されにくい。また、直鎖状化合物を含む液体の回転による剪断力の大きさの制御は容易であるため、直鎖状化合物の伸長は、高い再現性で実行でき、また、直鎖状化合物は長く伸長される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、添付の図面を参照して発明の実施の形態を説明する。
２本鎖のＤＮＡ分子を含む染色体は、ファイバー化可能であるが、自然状態ではファイバー状態でない直鎖状化合物の１例である。また、イン・シトゥ・ハイブリダイゼーション法（ＩＳＨ)では、１本鎖のＤＮＡ分子とそれと相補性のある標識分子との交雑化合物（複合体）が得られる。たとえば、蛍光・イン・シトゥ・ハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ)では、蛍光標識付きの相補性分子との交雑化合物が得られる。また、ＤＮＡ合成酵素連鎖反応法（ＰＣＲ）では、放射性同位元素で標識された相補性分子との交雑化合物が得られる。これらの交雑化合物も、自然状態では凝集状態にある直鎖状化合物である。本発明の実施の形態では、そのような直鎖状化合物を含む液体を回転させることにより直鎖状化合物を伸長する。具体的には、直鎖状化合物を含む液体をたとえばスライドガラスの上に静置する。そして、スライドガラスを回転装置のステージに載せ、スライドガラスの平面に垂直な回転軸のまわりに高速で回転させる。このとき、スライドガラス上の液体に遠心力が作用し、液体中にずり応力が発生して、液体中の直鎖状化合物をファイバー状（線状）に伸長させる。次に、このように伸長された直鎖状化合物をその状態で固定する。液体に含められる直鎖状化合物の数は、目的に応じて適当に選択すればよい。または、直鎖状化合物を含む液体として粘性のある高分子可塑性化合物を用いる場合、回転の際に、液体が平らな薄い層になるとともに、液体中の直鎖状化合物がファイバー状（線状）に伸長される。この層状の液体を固化することにより、直鎖状化合物が高分子フィルムの中に伸長された状態で保存される。
【００１８】
図１は、直鎖状化合物の伸長の１例を図式的に示す。スライドガラス１０の上に、１本鎖のＤＮＡ分子と識別標識を持つ相補性化合物との交雑化合物１２が載せられ、そのスライドガラス１０が回転装置１４のステージの上に載せられる。さらに、交雑化合物１２に光硬化樹脂１６（たとえば約０．５ｍｌ）が滴下され、交雑化合物１２は光硬化樹脂１６に包まれる。次に、ステージをたとえば３０００ｒｐｍで３０秒回転する。これにより、図の上側に示すように、スライドガラス１０の上で樹脂１６がたとえば２００μｍ以下の厚さの層になり、その樹脂層の中で交雑化合物１２が伸長される。次に、樹脂層を硬化することにより、フィルム１６’が得られ、その中で交雑化合物１２’がほぼ直線状に伸長された状態で固定される。図式的に示すようにスライドガラス上の交雑化合物１２に２つの標識が付加されていたとすると、フィルム１６’を観察すると、その位置が直線状のＤＮＡにそって離れていることがわかる。なお、ガラス板は平板の１例であり、その代わりに、直鎖状化合物などと反応しない他の適当な材料からなる平板を用いてもよい。
【００１９】
ここで、直鎖状化合物のファイバー化すなわち伸長についてさらに説明すると、これは液体中のずり応力（剪断力）によるものと考えられる。液体を載置しているステージが回転されるとき、ガラス板上で、直鎖状化合物を含む液体も回転され、回転による遠心力が液体に対してガラス板の平面に平行な方向に作用する。遠心力は回転中心からの距離および回転速度の自乗に比例する。回転につれて液体は層状に薄くなっていく。流体力学において知られているように、液体には粘性があるため、流体の流れ速度の大きさがガラス板の平面に直交する方向に変化する。流れ速度は、ガラス板から離れるにつれしだいに大きくなり、十分離れると一定になる。この速度の差をなくそうとして、粘性に応じて、ずり応力と呼ばれる力が流れの方向に生ずる。ずり応力は、ガラス板の表面では０であるが、ガラス表面から離れるにつれ大きくなり、ガラス表面から十分離れると一定になる。凝集状態にある１つの直鎖状化合物についてみると、その直鎖状化合物に作用するずり応力はガラス板に近い側と遠い側で大きさが異なり、剪断力として作用する。このため、回転に伴い、自然状態では折りたたまれていた直鎖状化合物がほぐされていき、遠心力の方向にファイバー状に伸長される。
【００２０】
直鎖状化合物の位置は、回転の前に回転中心の近傍にあることが望ましい。ずり応力は回転中心の近くでは小さく、回転中心から離れるにつれ大きくなる。伸長の際に、直鎖状化合物は、その一端は回転中心の近傍にあって小さなずり応力を受けるが、他端は回転中心から離れていき、より大きなずり応力を受ける。直鎖状化合物の他端の位置が回転中心から離れているほど、回転による遠心力が大きいため、回転中心から離れていきやすい。これにより、直鎖状化合物が伸長される。なお、直鎖状化合物は、回転の前に、必ずしもその一部がガラス板上に固定されていなくてもよい。
【００２１】
実際には、直鎖状化合物は、エタノールなどの溶媒の中に界面活性剤などを含む弛緩液とともに含まれる。界面活性剤などは、折りたたまれた直鎖状化合物を弛緩させやすくするものであり、弛緩液は、直鎖状化合物を弛緩させるために用いられる液体である。また、直鎖状化合物を可視化する場合には、液体に、さらに直鎖状化合物を可視化するための可視化剤たとえば染色剤が含められる。染色剤により染色された直鎖状化合物は、たとえば顕微鏡で可視化される。可視化の他の例には、たとえば、放射性同位元素の標識とその後のオートラジオグラフィー、あるいは、蛍光物質の標識とその後のスキャナー読み取りがある。なお、ＩＳＨ法では、相補性化合物の側に可視化のための標識が付加されているので、染色剤は使用しない。標識が放射性同位元素に由来する場合は、直鎖状化合物はオートラジオグラフィーで可視化される。直鎖状化合物がＦＩＳＨ法により蛍光可視化された染色体の場合、遺伝子診断やマッピングが可能である。また、平板に固定された染色体にＰＣＲ用の試薬を加えてから、その平板に対して所定の加温と冷却を繰り返し行うことにより、ＰＣＲ（この場合、試験管ＰＣＲではなく、スライドＰＣＲ法）が可能である。このとき染色体は可視化されている必要はない。また、固定された染色体は、ＰＣＲのみならず、制限、転写、複製などの酵素反応の基質としても、また、タンパク質のＤＮＡ上における結合位置の分布を探索するための目印としても、汎用される。
【００２２】
上述の液体は、塑性流動性をもち固化可能な高分子可塑性物質（樹脂またはプラスチック）であってもよい。上述の光硬化樹脂はその１例である。ガラス板の上の直鎖状化合物に高分子可塑性物質を滴下してもよいし、高分子可塑性物質の中に直鎖状化合物（を含む液体）を注入してもよい。この状態で回転装置により液体を回転すると、遠心力により、高分子可塑性物質の液滴が層状に拡がり、その際に、ずり応力により直鎖状化合物がファイバー化される。回転後に高分子可塑性物質を固化させ、ファイバー状態の直鎖状化合物をその中に保存する。たとえば、高分子可塑性物質が光硬化樹脂である場合は、回転の後に、光硬化樹脂に所定の波長の光を照射すると、光硬化樹脂の低分子量の分子が反応を起こし高分子化して固化する。また、熱硬化性樹脂を用いてもよい。この場合は、伸長後に、樹脂を加熱して硬化する。このように固化された層状高分子可塑性物質すなわち高分子フィルムのなかに、直鎖状化合物は伸長された状態で包まれ埋められて（すなわち包埋されて）保存されている。なお、ファイバー状態の直鎖状化合物は、微視的に見ると、遠心力の方向に沿って完全に直線状に伸張しているが、一方で巨視的に見ると、微視的観察では検出されなかった極微な遠心力方向からの偏差が蓄積するために、ガラス板に対して垂直方向に多少は湾曲している。フィルムの厚さは、ファイバー状態の直鎖状化合物が埋め込み可能な適当な値であればよい。フィルムの厚みは、樹脂の粘度、および、樹脂が受ける遠心力（回転数と時間）に依存しており、これら粘度と遠心力を調節することにより自在のフィルム厚を得ることが可能である。所望のフィルムの厚さは、たとえば、光硬化樹脂の硬化深度を考慮して４００μｍ以下であり、１例として顕微鏡により染色体を可視化する場合、好ましくは顕微鏡の焦点深度たとえば１５０μｍ以下である。上述のとおり、回転条件の制御は容易であり、フィルムは容易に作成できる。さらに、フィルムをガラス板からはがすことにより、はがされたフィルムだけを取り扱うこともできる。
【００２３】
この直鎖状化合物を包埋したフィルムは、以上に説明したように、直鎖状化合物の（１）回転による伸長と（２）高分子物質の中への包埋という２つの新規な手法を組み合わせて作製が可能になったものである。フィルム製造は容易であり、このフィルム製造法は汎用性が高い。得られたフィルムでは、直鎖状化合物が、ファイバー形状で保存され提供される。染色体を従来よりはるかに長く伸ばした状態で保存できる。フィルムは、長期間にわたり保管できる。直鎖状化合物は、高分子物質の中に外部の雰囲気にさらされずに保存されるので、取り扱いが容易である。したがって、フィルムの内部に直鎖状化合物を伸長状態で包埋できることから、取り扱い簡単な顕微鏡観察用標本が提供できる。直鎖状化合物自身が伸長された状態で保存されているので、その長さ、太さ、分岐数などの構造の特徴が、顕微鏡で観察するだけで容易にわかる。また、フィルムは、標本ライブラリーとして頒布できる。また、可視化されたＤＮＡがファイバー化されて保存できるので、染色体診断（遺伝子の多型解析やＦＩＳＨマッピング）用プレパラートが、高価な装置を用いずに、確実かつ容易に調製、保管、配布できる。上述の直鎖状化合物を包埋したフィルムは、一方で、簡単に切砕することが出来る。たとえば、染色体を包埋したフィルムを切砕すると内部の染色体も共に断片化される。切砕後のフィルム片を溶液中に浸漬すると、断片化された染色体はフィルム片内部から外部の溶液中へと拡散する。溶液としてＰＣＲ用の試薬が用いられた場合、ＤＮＡの増幅が可能である。
【００２４】
上述の液体が高分子可塑性物質を含まない場合、直鎖状化合物は、エタノールなどの溶媒の中に弛緩液、染色剤などとともに含まれる。ガラス板上の液体が回転装置により回転されると、液体中の直鎖状化合物が、ファイバー化された状態でガラス板に固定され、他の粘性が小さい成分は遠心力によりガラス板の外に飛散する。これにより顕微鏡観察用のプレパラートが得られる。
【００２５】
直鎖状化合物の伸長は、回転速度や回転時間にはあまり依存しない。いいかえれば、回転条件（回転速度、回転時間など）は広い範囲内で設定でき、回転の制御は容易である。したがって、直鎖状化合物の伸長は、高い再現性で実行できる。回転条件は広い範囲内に設定できるので、半導体製造に用いられるスピンコーターが使用できるほか、所望の回転速度で回転させるための簡易な回転装置も使用できる。回転により生じるずり応力は比較的穏やかであり、直鎖状化合物は伸長の際に断片化されにくい。従来は０．２４ｍｍの長さのＤＮＡファイバーが報告されていたが、この方法では、後で示すように、染色体をそれよりもはるかに長く伸長できた。
【００２６】
また、染色体を含む光硬化樹脂を回転する場合、その後に所定の波長の光を照射することにより層状の樹脂を硬化させて、伸長した直鎖状化合物を高分子フィルムの中に保存する。光照射には、適当な光照射装置（たとえば紫外線照射用のマスクアライナー、トランスイルミネータなど）を用いる。
【００２７】
また、高分子可塑性物質として熱硬化性樹脂を用いてもよい。この場合、回転により直鎖状化合物を伸長した後で、伸長された直鎖状化合物を含む層状の樹脂を加熱することによりフィルム化する。これにより、伸長された直鎖状化合物が高分子フィルムの中に保存される。加熱には、適当な加熱器（たとえばヒートブロック、赤外線照射装置など）を用いればよい。
【００２８】
上述の直鎖状化合物の伸長は、汎用の回転装置、光照射装置などを使用して実現できるが、伸長処理を１つの装置で行えるようにすると、作業が簡易に進められる。図２〜図４は、そのような染色体伸長装置の１例を示す。この装置は、ガラス板を回転するための回転装置２０、回転部のケースの側部に垂直に設けた支柱３０、ガラス板に樹脂（ここでは紫外光硬化樹脂）を供給するための樹脂供給装置４０、支柱の上端に、回転部に対向して設けられた蛍光顕微鏡５０および光学系検出装置と反対側に設けられたランプハウス６０からなる。回転部１０において、ガラス板２２を載置するための平面を備えるステージ（回転盤）２４は、ケース２６の内部に設けられるモーター２８の回転シャフトに取り付けられ、モーター２８の回転は回転制御装置２９により制御される。ステージ２４は時計回り方向にも反時計回り方向にも回転可能である。また回転制御装置２９に対して回転時間も設定できる。回転装置の回転数は所定値であってもよいし、変更できるようにしてもよい。必要に応じて、ステージ２４の周囲に、回転に伴って飛散する物質を遮る障壁が設けられる。また、ステージ２４の上に向かって光硬化樹脂を滴出するためのノズル４２が、支柱３０にそって設けられる。ノズル４２は、必要に応じてガラス板２２上に位置を移動可能な構造を備えている。樹脂を供給する際には、ノズル４２の出射口がステージ２４の上に移動され、次に、所要量の樹脂がノズル４２を通してガラス板２２上の直鎖状化合物の上に滴下される。支柱３０の内部には、ノズル４２へ樹脂を供給するための樹脂供給機構および滴出量と滴出時間を設定するための制御機構（図示しない）を含む樹脂容器４４が配置される。ステージ２４に対向して設けられる蛍光顕微鏡５０は、光学系結像レンズ（たとえば対物レンズ）５２と光検出装置（たとえば接眼レンズ、カメラ、モニタ）５４からなる。ランプハウス６０の内部には、紫外光硬化樹脂を硬化させる波長を含む紫外光を発生する電球６２とその電源６４が設けられる。この電球６２は、蛍光顕微鏡５０による観察のための光源としても、紫外光硬化樹脂の光照射用の光源としても、使用される。いずれの使用方法に関しても光の照射量と照射時間を設定できる。紫外線は、図示しない光路を経て、ガラス板２２の方へ案内される。なお、観察用光源と光照射用光源及びそれらの光路は別々に設けてもよい。作業者は、樹脂の硬化の際には、顕微鏡５０でステージ上での硬化状況を監視する。
【００２９】
なお、光照射装置の電球６２は、ステージ２４の下側に設けてもよい。電球により発生された光をステージの下側から照射する場合は、ステージ２４は照射光に透明な材料から作成される。
【００３０】
また、光硬化樹脂の代わりに熱硬化樹脂を用いる場合は、図４に示すように加熱器４６を用意し、ステージ２４の上側または下側に配置すればよい。加熱器４６はたとえば赤外線ヒーターであるが、冷却機能を併せもつことも可能である。このとき、加温と冷却のための温度と時間を設定することができる。加熱器４６を制御する温度管理装置４８は、加熱器４６に接続される。また、光硬化と熱硬化を同時に行ってもよい。この場合、電球６２と加熱器４６がともに備えられ、使用される。
【００３１】
なお、上述の染色体伸長装置の種々の構成部分は、必ずしも一体化されなくてもよく、一部が分離されていてもよい。また、目的に応じて一部の構成部分を省いてもよい。
【００３２】
以下に、直鎖状化合物伸長の具体例を説明する。
まず、ＤＮＡファイバー包埋樹脂フィルムの製造の１例について説明する。
（１）ガラス板（たとえば５２×７６ｍｍの長方形）の上にエポキシ系光硬化樹脂（たとえば紫外線光硬化樹脂ＳＣＲ７０１）を滴下する。
（２）次に、図５に示すように、樹脂の中に、染色体サンプル、この染色体サンプルを弛緩させる弛緩液（たとえば界面活性剤である０．１％ＳＤＳ（ｎ−ドデシル硫酸ナトリウム）、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液）（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸)を含む）およびＤＮＡ染色液（たとえばヨウ化プロピジウム）を入れる。
（３）次に、ガラス板を回転装置により３０００ｒｐｍで３０秒回転する。これにより、染色体サンプルを含む樹脂が層状になり、その内部で染色体が伸長される。
（４）さらに光硬化樹脂ＳＣＲ７０１を滴下し、ガラス板を回転装置により１０００ｒｐｍで１５秒回転する。これにより、フィルム形成のための光硬化樹脂の量を増加して、コートする樹脂の厚みを増す。得られたフィルムの厚さは１００μｍ以下、たとえば５０μｍ、である。
（５）次に、フィルムを紫外線（３６５ｎｍ）で照射して、層状になっている光硬化樹脂を硬化させる。こうして樹脂溶媒を固化させることにより、ファイバー化した染色体ＤＮＡを透明なフィルム内に包埋する。
（６）次に、９９％エタノール中で、硬化した樹脂フィルムをガラス板からはがし、別のガラス板上で乾燥させる（室温）。こうして、ＤＮＡファイバーを包埋した樹脂フィルムが得られる。
【００３３】
こうして作成された樹脂フィルムは取り扱いが容易である。樹脂フィルムに対して、たとえば蛍光顕微鏡（Ｙ励起）による観察と撮影をおこなう。伸長された直鎖状化合物の長さが顕微鏡の視野より長くても、樹脂フィルムの位置を変えて観察が容易に行える。
【００３４】
図６Ａは、ＤＮＡファイバーが包埋されている樹脂フィルムの全体像を示し、図６Ｂは、図６Ａの樹脂フィルムを蛍光顕微鏡（Ｙ励起）で撮影した写真を示す。いずれも硬化の３日後に撮影している。図６Ｂにおける白のバーは１００μｍの長さを示す。図６Ａでは、線上の像が、数十ｍｍまで伸長されたＤＮＡファイバーを示す。図６Ｂで焦点が合っていない部分があるのは、ＤＮＡファイバーが樹脂フィルム中で立体的に湾曲しているためである。
【００３５】
次に、ＤＮＡファイバー包埋樹脂フィルムの製造の他の１例について説明する。
（１）−２０℃で７０％エタノール中に保存されていたたとえば１μｌの染色体サンプル（カルノア固定済み）をガラス板（たとえば５２ｍｍ×７６ｍｍの長方形）に滴下し、風乾して、ガラス板上に染色体を物理的に固定する。
（２）次に、染色体サンプル上に、界面活性剤である０．１％ＳＤＳ（ｎ−ドデシル硫酸ナトリウム）、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液(ｐＨ８．０)および５０ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）からなる弛緩液をサンプルの５倍量滴下して、染色体を弛緩させ、静置する。
（３）次に、染色体サンプルに染色剤（５ｍＭのＤＴＴ（ヂチオスレイトール）＋２０μＭの蛍光色素ＹＯ−ＰＲＯ）を１０μｌ滴下してＤＮＡを染色する。
（４）次に、図７に示すように、染色体サンプルの上から光硬化樹脂（ＳＣＲ７１０）を５００μｌ滴下する。
（５）次に、ガラス板を回転装置（たとえばスピンコーター）のステージに載せ、ガラス板を回転させて、ガラス板の上の光硬化樹脂に含まれる染色体を伸長させる。なお、回転速度と回転時間はたとえば６０００rpmと３０秒に設定する。
（６）次に、蛍光顕微鏡で観察しながら、紫外線照射装置（たとえばマスクアライナやトランスイルミネーター）によりサンプルにＵＶ励起光を照射して光硬化樹脂を硬化させる。
（７）次に、１００％エタノールで軽く攪拌しながら洗浄し、未硬化の樹脂を洗い流す（１分×２）。
こうして得られたフィルムは染色体を包埋しており、染色体はたとえば蛍光顕微鏡（Ｂ励起光）で観察される。
【００３６】
以上に説明した例では樹脂として光硬化樹脂を用いたが、熱硬化樹脂を用いてもよい。この場合、染色体をファイバー化した後で、加熱して樹脂を硬化させて、フィルムを作成する。また、光硬化と熱硬化とを併用してもよい。
【００３７】
次に、染色体伸長の他の例を説明する。この例では樹脂を用いない
（１）−２０℃で保存しておいたたとえば０．５ｍｌの染色体サンプル（カルノア固定済み、７０％エタノール中）をガラス板（たとえば５２ｍｍ×７６ｍｍの長方形）に滴下する。そして、風乾して、ガラス板上に染色体を物理的に固定する。
（２）次に、染色体サンプル上に、界面活性剤である０．１％ＳＤＳ（ｎ−ドデシル硫酸ナトリウム）、１００ｍＭのTris-HCL緩衝液(pH8.0)および５０ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）からなる溶解液をサンプルの５倍量滴下して、１分から３分静置する。これにより染色体を液体中で弛緩させる。
（３）次に、染色剤（５ｍＭのＤＴＴ（ヂチオスレイトール）＋２０μＭの蛍光色素ＹＯ−ＰＲＯ）を染色体サンプル量の５０倍量加えてＤＮＡを染色する。
（４）次に、ガラス板を回転装置（たとえばスピンコーター）のステージに載せ、ガラス板を回転させて、染色体をガラス板上で伸長させる。回転速度と回転時間を含む回転条件は適当に設定すればよい。たとえば、３０００rpmと６０００rpmの間の回転速度では、同様な伸長が行われ、また、５秒と３０秒の間の回転時間では、同様な伸長が行われている。ここで、液体の中の粘性の小さい成分はガラス板から飛散して失われるが、これが高分子可塑性物質を用いる場合との相違である
（５）次に、伸長されたＤＮＡにカルノア固定液（酢酸とメタノールを１：３で混合したもの）を滴下して、ＤＮＡを板の上に固定する。
（６）次に、風乾をする。これにより、ガラス板の上に、伸長されたＤＮＡが乾燥状態で固定される。
（７）さらに、退色を防止するため、このガラス板ともう１枚のガラス板との間に退色防止剤を封入する。こうして得られたプレパラートはたとえば蛍光顕微鏡（Ｂ励起光）で観察される。
【００３８】
なお、上述の方法では、ガラス板の上に染色体を固定していた。しかし、染色体はかららずしも固定しなくてもガラス板を回転することにより伸長できる。伸長後に風乾することにより直鎖状化合物はガラス板に固定される。
【００３９】
図８Ａと図８Ｂは、伸長された染色体を示す。図８Ａに示す回転前の状態では、通常の凝集状態の多数の染色体が蛍光色素ＹＯ−ＰＲＯで着色された状態で観察されている。図８Ｂは、図８Ａの状態の染色体を弛緩液で弛緩し、スピンコーターで３０００rpmで回転させた後の状態を示す。染色体はすべてファイバー状に伸長されていることがわかる。これらの図において、バーは１０μｍの長さ（３万塩基対）を示す。
【００４０】
図９は、ファイバー化した染色体の顕微鏡写真の例を示す。ここで、太線のバーは１ｍｍの長さ（３００万塩基対）を示し、顕微鏡の視野に相当する。矢印で示されている染色体は、ほぼ２ｍｍを超える長さにまで伸長されている。なお、短いバーは、ContiおよびBensimonの論文に記載されていた実証例の長さ（０．２４ｍｍ）を示している。このように、染色体は、従来の実証例よりはるかに長く伸長できた。
【００４１】
以上に説明した例では、直鎖状化合物は染色体であったが、ＦＩＳＨで得られた、１本鎖のＤＮＡ分子と蛍光標識付きの相補性分子との交雑化合物も、同様に回転により伸長した状態で、樹脂フィルム内にまたガラス板上に固定できる。
【００４２】
図１０Ａと図１０Ｂは、伸長されたHeLa細胞（ヒト子宮頸がん由来の細胞）のＤＮＡを対象とするＦＩＳＨの適用例を示す。図１０Ａは、通常のHeLa細胞の染色体に対するＰＮＡ（ペプチド核酸）／ＤＮＡ＿ＦＩＳＨにより得られた交雑化合物を示す（ここで、白のバーは５μｍの長さを示す）。これに対し、図１０Ｂは、回転により伸長された状態のＦＩＳＨにより得られた直鎖状の交雑化合物を示す（ここで、白のバーは１０μｍの長さを示す）。具体的には、ガラス板の上のＤＮＡに対してＦＩＳＨ法を適用し、得られた交雑化合物を固定する。
【００４３】
第７染色体において、図１０Ｃに示すように、セントロメア（CEN）とＥＧＦＲは近接して存在している。通常のＦＩＳＨで得られた交雑化合物（図１０Ａ）では、ＤＮＡは凝集しているので、ＥＧＦＲのシグナル（赤）とセントロメアのシグナル（緑）は重なって見えるのみである。これに対し、伸長された交雑化合物（図１０Ｂ）では、多数のシグナルが線状に分布している。図１０Ｂの左側に存在する多数の緑のシグナルはセントロメアを示し、右側に存在する多数の赤のシグナルはＥＧＦＲを示す。したがって、ＤＮＡ鎖の上に、セントロメアのシグナル（緑）とＥＧＦＲのシグナル（赤）が離れて局在することが分かる。また、ＤＮＡ分子における２つの遺伝子の間の正確な距離が得られる。したがって、いままでは遺伝子の位置が近接しているために困難であった遺伝子診断も、長く伸長したＤＮＡファイバーを対象とすることにより容易に高解像度化できる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】染色体ファイバー化技術を説明するための図
【図２】染色体伸長装置の斜視図
【図３】染色体伸長装置の側面図
【図４】染色体伸長装置のブロック図
【図５】染色体サンプル、弛緩液およびＤＮＡ染色液を樹脂の中に注入する状況を示す図
【図６Ａ】ＤＮＡファイバーが包埋されている樹脂フィルムの全体像を示す顕微鏡写真
【図６Ｂ】図６Ａの樹脂フィルムを蛍光顕微鏡（Ｙ励起）で撮影した顕微鏡写真
【図７】染色体サンプルに光硬化樹脂を滴下する状況を示す図
【図８Ａ】回転前のサンプル染色体を示す図
【図８Ｂ】回転後のサンプル染色体を示す図
【図９】ファイバー化した染色体の１例の顕微鏡写真
【図１０Ａ】通常のＦＩＳＨ法による交雑化合物におけるセントロメア（CEN）とＥＧＦＲの位置を示す図
【図１０Ｂ】ファイバーＦＩＳＨ法による交雑化合物におけるセントロメアとＥＧＦＲの位置を示す図
【図１０Ｃ】第７染色体におけるセントロメアとＥＧＦＲの位置を示す図
【符号の説明】
【００４５】
１０  スライドガラス、    １２  直鎖状化合物、    １４  回転装置、    １６  光硬化樹脂、    １６’  フィルム、    ２０  回転装置、    ２２  ガラス板、    ２４  ステージ（回転盤）、    ３０  支柱、    ４０  樹脂供給装置、    ５０蛍光顕微鏡、    ５２  ノズル、    ６０  ライトハウス、    ６２  電球。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図１０Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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