(57)【要約】【課題】マイコプラズマ・ガリセプティカム培養用培地のタンパク源として、動物由来原料を使用しないことで、動物由来原料使用に起因する病原微生物の伝播や物質汚染やＢＳＥ病原体混入の危険を回避し、以って、肉及び卵などの生産物を介してヒトが摂食して病原体に曝露される危険性をなくすること。【解決手段】タンパク源が植物由来タンパク質であることを特徴とするマイコプラズマ・ガリセプティカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）培養用培地。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク源が植物由来タンパク質であることを特徴とするマイコプラズマ・ガリセプティカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）培養用培地。
【請求項２】
植物由来タンパク質が大豆タンパク質であることを特徴とする請求項１記載のマイコプラズマ・ガリセプティカム培養用培地。
【請求項３】
寒天を加えて固形化したことを特徴とする請求項１又は２記載のマイコプラズマ・ガリセプティカム培養用培地。
【請求項４】
精製水中に、大豆精製物及び／又は脱脂大豆を微生物由来酵素で処理したタンパク質０．１〜１０重量％、粉末酵母エキス０．１〜１０重量％、塩化ナトリウム０．１〜１０重量％、ブドウ糖０．１〜１０重量％及び動物血清１〜２０容積％を存在させ、弱酸性から弱アルカリ性（ｐＨ６．０〜８．０）となるように調整したことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のマイコプラズマ・ガリセプティカム培養用培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク源が植物由来タンパク質であるマイコプラズマ・ガリセプティカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）培養用培地に関する。当該培地は、マイコプラズマ・ガリセプティカムの純粋培養及び生菌数計測（集落数計測）に有用である。
【背景技術】
【０００２】
家禽等の鳥類に感染するマイコプラズマ・ガリセプティカムを培養するための培地には、従来、タンパク源として獣肉エキス、鶏肉ブイヨン、牛乳由来カゼイン等の動物由来原料を含むペプトン水に、マイコプラズマ・ガリセプティカムの成育に必須の血清成分を含めた添加物として、動物血清、酵母エキス、塩類及び糖類を加えた液体培地や寒天固化培地が用いられてきた（例えば、非特許文献１参照。）。マイコプラズマ・ガリセプティカムを培養する培地にタンパク源として添加されてきた、これらの獣肉エキス、鶏肉ブイヨン、牛乳由来カゼイン等は、動物の生産物や臓器から浸出あるいは抽出した物質である。培養したマイコプラズマ・ガリセプティカムは、それが家禽等の鳥類に感染して当該鳥類が発病するのを防止及び軽減するためのワクチンを製造するためにも使用されるほか、ヒトや動物の診断薬等にも使用される。
【非特許文献１】農林省家畜衛生試験場  外１監修「技術の手引き６  鶏の呼吸器                      性マイクロプラズマ病  再版」（昭和４７年１月３０日）日本獣                      医師会ｐ．５０−５３
【０００３】
ところが近年、前記のタンパク源としての原料が由来する動物特に反芻動物から人に伝播性がある牛海綿状悩症（ＢＳＥ）病原体が発見された。そして、ＢＳＥ病原体を含む動物原料を培地として培養されたマイコプラズマ・ガリセプティカムから製造されたワクチンには、ＢＳＥ病原体混入のおそれがあって、それが家禽等にワクチンとして接種されると、肉及び卵などの生産物を介してヒトが摂食して病原体に曝露される危険性がある。さらに、動物由来原料には、一般的にみて、病原微生物の伝播や物質汚染の危険性が大きい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明の目的は、マイコプラズマ・ガリセプティカム培養用培地のタンパク源として、動物由来原料を使用しないことで、動物由来原料使用に起因する病原微生物の伝播や物質汚染やＢＳＥ病原体混入の危険を回避し、以って、肉及び卵などの生産物を介してヒトが摂食して病原体に曝露される危険性をなくすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は、マイコプラズマ・ガリセプティカム培養用培地にタンパク源として存在させるタンパク質を、従来の動物原料由来タンパク質から植物原料由来タンパク質に代替しても、従来のものと同等以上にマイコプラズマ・ガリセプティカムが良好に増殖することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、タンパク源が植物由来タンパク質であることを特徴とするマイコプラズマ・ガリセプティカム培養用培地に関するものである。
【０００６】
本発明において使用される植物原料由来タンパク質の原料としては種々のものがあるが、大豆、そら豆、えんどう豆等の豆類が特に好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明の具体的な実施形態を説明する。
【０００８】
精製水中に、非加熱ニワトリ血清が１〜２０容積％、大豆精製物を微生物由来酵素で分解した「ポリペプトンＮ」（日本製薬社製）及び／又は脱脂大豆を微生物由来酵素で分解した「ポリペプトンＮＳ」（日本製薬社製）が合計で０．１〜１０重量％、粉末酵母エキスが０．１〜１０重量％、塩化ナトリウムが０．１〜１０重量％、ブドウ糖が０．１〜１０重量％となるように加え、それに水酸化ナトリウムを加えて弱酸性から弱アルカリ性（ｐＨ６．０〜８．０）となるように調整し、ろ過あるいは高圧蒸気滅菌した液体、ないしは、これに寒天を加えて固形化したものを、マイコプラズマ・ガリセプティカム培養用培地とする。本発明において、重量％はｗ／ｖ％を表すものとする。
【０００９】
１．液体培地における増殖性の比較
＜材料と方法＞
本発明培地、本発明培地の「ポリペプトンＮ」に替えて牛乳カゼイン由来タンパクを酵素分解した「ポリペプトン」（日本製薬社製）を同濃度で加えた培地（以下「動物原料培地」ということがある。）及び２０容積％ウマ血清加変法ＰＰＬＯ培地（ウシ心臓浸出液を含む栄研化学社製ハートインフュージョンブイヨン２５．０ｇ／１，０００ｍＬ、粉末酵母エキス０．５重量％、ブドウ糖０．５重量％、以下「ＰＰＬＯ培地」ということがある。）に、それぞれ、１０重量％水酸化ナトリウムを加えて、ｐＨ７．３±０．１及びｐＨ７．８±０．１に調整したものを被検培地とした。なお、「変法」の語句を付加したのは、本発明培地と比較するために、通常のウマ血清加ＰＰＬＯ培地ではブドウ糖０．１重量％とされるところ、ブドウ糖０．５重量％としたためである。
【００１０】
マイコプラズマ・ガリセプティカム１ＲＦ株種菌をｐＨ７．３±０．１に調整した本発明培地に接種した。
【００１１】
３７℃で２４時間静置培養して元培養菌液を作成した。元培養菌液をそれぞれの被検培地に１／１００量を接種した。
【００１２】
接種後１６時間目と２４時間目、以後１２時間目ごとに培養液を採取し、生菌数を測定した。
【００１３】
具体的な操作は下記のとおりである。
０．２μｍのフィルターでろ過滅菌した本発明培地の２倍濃厚液体培地を調製した。この培地と別途１２１±２℃で滅菌した２重量％バクト寒天（Ｂａｃｔｏ  Ａｇａｒ）とをそれぞれ恒温槽において４５〜５０℃に保温した後等量混合し、混合液を直径６０ｍｍのプラスチック製ディスポ滅菌ペトリ皿に５ｍＬを注いで固化した。固化後クリーンベンチ内に蓋を開いて転倒して１時間置いて乾燥し、生菌数計測寒天培地とした。
【００１４】
採取した培養液を本発明液体培地で１０−５まで１０倍階段希釈し、各希釈１０μＬを５滴に分けて生菌数計測寒天培地上に滴下して接種した。階段希釈ごとにこれを２群作成し、接種した液が寒天に吸収された後、ペトリ皿を転倒して５容積％炭酸ガスインキュベータに収納した。収納後１０日目に実体顕微鏡下で１滴当り１０〜１００個の集落を形成した希釈倍率の１群５滴の集落数を計測して合計し、１０μＬ当りの集落数を求めた。同希釈倍率のもう１群の集落数を同様に求め、２群の集落数の平均を生菌数とした。
【００１５】
＜結果＞
表１、表２、図１及び図２に生菌数の成績を示した。表１及び図１は、本発明培地、動物原料培地及びＰＰＬＯ培地のｐＨ７．３における増殖性を比較した表及び図面であり、表２及び図２は、本発明培地、動物原料培地及びＰＰＬＯ培地のｐＨ７．８における増殖性を比較した表及び図面である。
【００１６】
【表１】
2007060975.tif 000002
【００１７】
【表２】
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【００１８】
ｐＨ７．３の本発明培地で培養するとき、接種後３６時間目に最大生菌数４．５×１０８  ｃｆｕ／ｍＬとなった。動物原料培地では６０時間目に１．９×１０８  ｃｆｕ／ｍＬ、ＰＰＬＯ培地では７２時間目に１．１×１０９  ｃｆｕ／ｍＬであった。
【００１９】
ｐＨ７．８の本発明培地で培養するとき、接種後４８時間目に最大生菌数９．３×１０８  ｃｆｕ／ｍＬとなった。動物原料培地では６０時間目に３．１×１０８  ｃｆｕ／ｍＬ、ＰＰＬＯ培地では９６時間目に２．１×１０９  ｃｆｕ／ｍＬであった。
【００２０】
本発明培地はいずれのｐＨでも、動物原料及びＰＰＬＯ培地と比べ速やかな増殖が認められた。最大生菌数はＰＰＬＯ培地には及ばないものの良好に増殖することが認められた。
【００２１】
２．寒天培地における検出感度の比較
＜材料と方法＞
寒天培地を得るために、まず、０．２μｍのフィルターでろ過滅菌した本発明培地、動物原料培地及びＰＰＬＯ培地それぞれの２倍濃厚液体培地を調製した。この培地と別途１２１±２℃で滅菌した２重量％Ｂａｃｔｏ  Ａｇａｒとをそれぞれ恒温槽において４５〜５０℃に保温した後等量混合した。混合液を直径６０ｍｍのプラスチック製ディスポ滅菌ペトリ皿に５ｍＬを注いで固化した後、クリーンベンチ内に蓋を開いて転倒して１時間置いて乾燥し、生菌数計測寒天培地とした。
【００２２】
マイコプラズマ・ガリセプティカム１ＲＦ株種菌をｐＨ７．３±０．２に調整した本発明培地に接種し、３７℃で２４時間静置培養して元培養菌液を作成した。元培養菌液を本発明培地に１／１００量を接種し、１６時間目、以後４時間目ごとに２８時間目まで、次いで３６時間目、以後６時間目ごとに４８時間目まで採取した培養液を試料とした。
【００２３】
試料を本発明液体培地で１０−５まで１０倍階段希釈し、各希釈１０μＬを５滴に分けて各寒天培地上に滴下して接種した。階段希釈ごとにこれを２群作成し、接種した液が寒天に吸収された後、ペトリ皿を転倒して５容積％炭酸ガスインキュベータに収納した。収納後１０日目に実体顕微鏡下で１滴当り１０〜１００個の集落を形成した希釈倍率の１群５滴の集落数を計測して合計し、１０μＬ当りの集落数を求めた。同希釈倍率のもう１群の集落数を同様に求め、２群の集落数の平均を生菌数とした。
【００２４】
＜結果＞
表３及び図３に生菌数の成績を示した。図３は、本発明培地、動物原料培地及びＰＰＬＯ培地の菌数測定培地検出感度を比較した図面である。
【００２５】
【表３】
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【００２６】
本発明培地は動物原料培地及びＰＰＬＯ培地と比べて、統計学的な差は認められないものの集落が多く観察され、検出感度が優れていることを確認した。
【００２７】
３．マイコプラズマ・ガリセプティカムの他の２株（ＫＰ−１３株及びＳ６株）の増殖性
＜材料と方法＞
マイコプラズマ・ガリセプティカムＫＰ−１３及びＳ６株について本発明液体培地における増殖性を確認した。
各株をｐＨ７．３±０．２に調整した本発明の液体培地に種菌を接種し、３７℃で２４時間静置培養して元培養菌液を作成した。それぞれ元培養した菌液を連続して同培地に１／１００量を接種した。
【００２８】
接種後１８時間目以降６時間ごとに培養液を採取して生菌数を測定した。
【００２９】
０．２μｍのフィルターでろ過滅菌した本発明２倍濃厚液体培地及び別途１２１±２℃で滅菌した２重量％バクト寒天をそれぞれ恒温槽において４５〜５０℃に保温した後等量混合した。混合液を直径６０ｍｍのプラスチック製ディスポ滅菌ペトリ皿に５ｍＬを注いで固化した後、クリーンベンチ内に蓋を開いて転倒して１時間置いて乾燥し、生菌数計測寒天培地とした。
【００３０】
採取した培養液を本発明液体培地で１０−５まで１０倍階段希釈し、各希釈１０μＬを５滴に分けて生菌数計測寒天培地上に滴下して接種した。階段希釈ごとにこれを２群作成し、接種した液が寒天に吸収された後、ペトリ皿を転倒して５容積％炭酸ガスインキュベータに収納した。収納後７日目に実体顕微鏡下で１滴当り１０〜１００個の集落を形成した希釈倍率の１群５滴の集落数を計測して合計し、１０μＬ当りの集落数を求めた。同希釈倍率のもう１群の集落数を同様に求め、２群の集落数の平均を生菌数とした。
【００３１】
【表４】
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【００３２】
本発明培地において、マイコプラズマ・ガリセプティカムＫＰ−１３株及びＳ６株においても増殖することを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明培地、動物原料培地及びＰＰＬＯ培地のｐＨ７．３における増殖性を比較した図面である。
【図２】本発明培地、動物原料培地及びＰＰＬＯ培地のｐＨ７．８における増殖性を比較した図面である。
【図３】本発明培地、動物原料培地及びＰＰＬＯ培地の菌数測定培地検出感度を比較した図面である。
【図４】本発明培地におけるマイコプラズマ・ガリセプティカムＫＰ−１３株及びＳ６株の増殖性を示した図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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