(57)【要約】【課題】  メタボリック症候群のリスク検出法等を提供すること。【解決手段】  １７８８名の日本人について、メタボリック症候群とコントロール者とについて、１３４個の候補遺伝子に関し１５８個の遺伝子多型をＰＣＲ、配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ、およびサスペンション・アレイ・テクノロジー（ＳＡＴ）を用いて検出した。その結果、ＡＰＯＡ５の−１１３１Ｔ→Ｃ、ＧＣＫの−３０Ｇ→Ａ、Ｆ７の１１４９６Ｇ→Ａ、ＬＰＬの１５９５Ｃ→Ｇ、ＳＬＣ２６Ａ８のＡ→Ｇ、ＡＰＯＡ１の−７５Ｇ→Ａ、ＬＩＰＣの−２５０Ｇ→Ａ、ＣＸ３ＣＲ１の９２６Ｃ→Ｔ、ＧＣＬＣの−１２９Ｃ→Ｔ、ＧＹＳ１の２６０Ａ→Ｇ、ＳＲＥＢＦ１の−３６／３Ｇ→２Ｇ、ＥＮＧの１６９１Ｃ→Ｇ、ＡＧＥＲの２６８Ｇ→Ａ、ＬＴＡの８０４Ｃ→Ａ、ＳＡＨのＡ→Ｇのうちの少なくとも１個または２個以上の遺伝子多型と、性差、喫煙の有無とを評価因子とすることにより、メタボリック症候群のリスク検出を行えることが分かった。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＰＯＡ５の−１１３１Ｔ→Ｃ、ＧＣＫの−３０Ｇ→Ａ、Ｆ７の１１４９６Ｇ→Ａ、ＬＰＬの１５９５Ｃ→Ｇ、ＳＬＣ２６Ａ８のＡ→Ｇ、ＡＰＯＡ１の−７５Ｇ→Ａ、ＬＩＰＣの−２５０Ｇ→Ａ、ＣＸ３ＣＲ１の９２６Ｃ→Ｔ、ＧＣＬＣの−１２９Ｃ→Ｔ、ＧＹＳ１の２６０Ａ→Ｇ、ＳＲＥＢＦ１の−３６／３Ｇ→２Ｇ、ＥＮＧの１６９１Ｃ→Ｇ、ＡＧＥＲの２６８Ｇ→Ａ、ＬＴＡの８０４Ｃ→Ａ、ＳＡＨのＡ→Ｇのうちの少なくとも１個または２個以上の遺伝子多型と、性差、喫煙の有無とを評価因子とし、各評価因子のオッズ比を乗じた発症リスクを計算し、この発症リスクを平均と分散またはパーセント区分に応じて３つ以上の複数の群を作成し、各群に応じて発症のリスクを検出することを特徴とするメタボリック症候群のリスク検出法。
【請求項２】
ＡＰＯＡ５の−１１３１Ｔ→Ｃ、ＧＣＫの−３０Ｇ→Ａ、Ｆ７の１１４９６Ｇ→Ａ、ＬＰＬの１５９５Ｃ→Ｇ、ＳＬＣ２６Ａ８のＡ→Ｇ、ＡＰＯＡ１の−７５Ｇ→Ａ、ＬＩＰＣの−２５０Ｇ→Ａ、ＣＸ３ＣＲ１の９２６Ｃ→Ｔ、ＧＣＬＣの−１２９Ｃ→Ｔ、ＧＹＳ１の２６０Ａ→Ｇ、ＳＲＥＢＦ１の−３６／３Ｇ→２Ｇ、ＥＮＧの１６９１Ｃ→Ｇ、ＡＧＥＲの２６８Ｇ→Ａ、ＬＴＡの８０４Ｃ→Ａ、ＳＡＨのＡ→Ｇのうちの少なくとも１個または２個以上の遺伝子多型を検出することを特徴とするメタボリック症候群の遺伝的リスク検出法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メタボリック症候群の遺伝的リスク検出法等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
メタボリック症候群は、罹患者が非常に多い疾患であり、米国では約４人に１人の成人（全体では約４７００万人の成人）が罹患していると言われている（非特許文献１：本明細書中においては、関連文献は末尾にまとめて示す）。この症候群は、肥満、血中トリグリセリド濃度の上昇、血中ＨＤＬコレステロール濃度の減少、高血圧、及び空腹時血糖値の上昇の重複として定義され、糖尿病と心臓病の危険因子とされる（非特許文献２、３）。メタボリック症候群の病因は、遺伝因子と環境因子の相互作用によって決定されるため複雑である。喫煙、高カロリー食、および運動不足を含むいくつかの環境因子（非特許文献４）はメタボリック症候群の発症に影響しているが、代謝障害の根本的な原因はインスリン抵抗性にあると考えられている（非特許文献５、６）。米国のＡＴＰIII（Adult Treatment Panel III）は、メタボリック症候群の臨床診断ガイドラインを提示し（非特許文献７）、この症候群を評価するための指針を提供した。
【０００３】
ある個人がメタボリック症候群に罹りやすいかどうかに対して、遺伝的な因子が存在することが明らかとなっている（非特許文献８）。双生児と家族的集積に関する研究によれば、メタボリック症候群を構成する個々の異常については、重要な遺伝因子があることが分かった（非特許文献９）。さらに、全ゲノム研究によって、メタボリック症候群との連鎖が示唆される様々な染色体領域が特定されている（非特許文献１０〜１２）。虚血性心疾患を持つ対象について、１１０個の候補遺伝子から２０７個の多型を調べたところ、女性のメタボリック症候群患者において、ＬＤＬ受容体関連タンパク質関連タンパク１（LDL receptor-related protein-associated protein-1）の遺伝子中のアミノ酸変異を生じない多型との関連が示唆された（非特許文献１３）。更に男性において、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α（ＰＰＡＲα）遺伝子中のＬｅｕ１６２Ｖａｌ多型においてＶａｌ１６２対立遺伝子の頻度が増加すると、肥満、高トリグリセリド血症、高アポリポ蛋白Ｂ血症、およびＨＤＬコレステロール濃度の低下が認められた（非特許文献１４）。これらは、全てメタボリック症候群の要因である。また、ＰＰＡＲγ遺伝子のハプロタイプもまた、メタボリック症候群のリスク増加と関連している（非特許文献１５）。
しかしながら、メタボリック症候群の遺伝要因については、未だ十分解明されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、上記の事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、メタボリック症候群について、遺伝的リスクを判断するための一材料を得るための遺伝子検出法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、メタボリック症候群に関し、１７８８名の日本人について、１３４遺伝子中の１５８カ所の遺伝子多型に関する大規模研究である。本研究の目的は、メタボリック症候群に関与する遺伝子多型を同定し、この知見に基づいて、ある者に対してメタボリック症候群を予防するための有用な情報を与えることである。
【０００６】
上記課題を解決するための第１の発明に係るメタボリック症候群のリスク検出法は、ＡＰＯＡ５の−１１３１Ｔ→Ｃ、ＧＣＫの−３０Ｇ→Ａ、Ｆ７の１１４９６Ｇ→Ａ、ＬＰＬの１５９５Ｃ→Ｇ、ＳＬＣ２６Ａ８のＡ→Ｇ、ＡＰＯＡ１の−７５Ｇ→Ａ、ＬＩＰＣの−２５０Ｇ→Ａ、ＣＸ３ＣＲ１の９２６Ｃ→Ｔ、ＧＣＬＣの−１２９Ｃ→Ｔ、ＧＹＳ１の２６０Ａ→Ｇ、ＳＲＥＢＦ１の−３６／３Ｇ→２Ｇ、ＥＮＧの１６９１Ｃ→Ｇ、ＡＧＥＲの２６８Ｇ→Ａ、ＬＴＡの８０４Ｃ→Ａ、ＳＡＨのＡ→Ｇのうちの少なくとも１個または２個以上の遺伝子多型と、性差、喫煙の有無とを評価因子とし、各評価因子のオッズ比を乗じた発症リスクを計算し、この発症リスクを平均と分散またはパーセント区分に応じて３つ以上の複数の群を作成し、各群に応じて発症のリスクを検出することを特徴とする。
このとき、群を形成するときに使用する分散については、統計上の分散値、或いは標準偏差値（ＳＤ）、パーセントによる区分などを用いることができる。なお、遺伝子多型については、必ずしも上記１５個には限られず、これら１５個の多型のうちの任意の１個〜１４個、或いは本明細書中で示される上記１５個の他の多型を含む１６個以上で実施することもできる。
【０００７】
本明細書中において、多型の記載方法は、次の通りである。原則として、各遺伝子について、「多型が生じている位置、データベースに登録されている塩基（Ａ：アデニン、Ｇ：グアニン、Ｃ：シトシン、Ｔ：チミン）→多型塩基」の順で記載する。例えば、「ＡＰＯＡ５の−１１３１Ｔ→Ｃ」は、ＡＰＯＡ５遺伝子について、−１１３１位のＴがＣとなっている多型を意味している。但し、挿入あるいは欠失多型については、「多型が生じている位置／データベースに登録されている数とその塩基→塩基数及び塩基」の順で記載する。例えば、「ＳＲＥＢＦ１の−３６／３Ｇ→２Ｇ」は、ＳＲＥＢＦ１遺伝子について、−３６位の３個の連続するＧが、２個の連続するＧとなる多型を意味している。また、場所の指定がない多型（例えば、ＳＬＣ２６Ａ８のＡ→Ｇ）については、表１〜表５に記載のｄｂＳＮＰのアクセス番号から、その内容を容易に理解することができる。
なお、ＡＰＯＡ５の−１１３１Ｔ→Ｃについては、ｄｂＳＮＰのｒｓ番号（ｒｓ６６２７９９）を見ると、順方向（forward strand）に読んでＡ／Ｇ多型として記録されているが、逆方向（reverse strand）で読むとＴ／Ｃ多型となる。多くの文献について、このＳＮＰは「−１１３１Ｔ／Ｃ」多型として記載されているので、本明細書においても上記の通りに記載する。
【０００８】
一般に多型は、集団（例えば、日本人集団、西洋人集団など）が異なると、その種類・頻度が異なることが知られている。このため、日本人以外の集団において、脳血管障害との関係が指摘されている多型であっても、必ずしも日本人集団においてそのような関連が認められるわけではない。このため、従来の報告については、国または疾患が異なる場合には、必ずしも日本人における多型およびメタボリック症候群との関連が裏付けられるわけではない。
【０００９】
また、第２の発明に係るメタボリック症候群の遺伝的リスク検出法は、ＡＰＯＡ５の−１１３１Ｔ→Ｃ、ＧＣＫの−３０Ｇ→Ａ、Ｆ７の１１４９６Ｇ→Ａ、ＬＰＬの１５９５Ｃ→Ｇ、ＳＬＣ２６Ａ８のＡ→Ｇ、ＡＰＯＡ１の−７５Ｇ→Ａ、ＬＩＰＣの−２５０Ｇ→Ａ、ＣＸ３ＣＲ１の９２６Ｃ→Ｔ、ＧＣＬＣの−１２９Ｃ→Ｔ、ＧＹＳ１の２６０Ａ→Ｇ、ＳＲＥＢＦ１の−３６／３Ｇ→２Ｇ、ＥＮＧの１６９１Ｃ→Ｇ、ＡＧＥＲの２６８Ｇ→Ａ、ＬＴＡの８０４Ｃ→Ａ、ＳＡＨのＡ→Ｇのうちの少なくとも１個または２個以上の遺伝子多型を検出することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、メタボリック症候群について、遺伝的リスクおよび発症リスクを判断するための検出法等が提供される。この発明を用いることにより、メタボリック症候群に対する予防が可能となり、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
【００１２】
＜試験方法＞
研究対象
研究対象は、１７８８名（男性１０３３名、女性７５５名）の日本人であった。彼らは、研究参加施設（岐阜県立岐阜病院、岐阜県立多治見病院、岐阜県立下呂温泉病院、弘前大学病院、黎明郷リハビリテーション病院）に、２００２年１０月から２００５年３月までに来院した者であった。メタボリック症候群の診断は、ＡＴＰIIIによって提供されたメタボリック症候群の定義（非特許文献７）を一部変更した改訂版に基づいて行った。この改訂版は、西スコットランド冠状動脈血栓症防止研究（非特許文献１６）及び女性の健康研究（非特許文献１７）で使用されたものであり、「腰回り長さ」に代えて「肥満指数（ＢＭＩ）」が用いられている。日本人およびアジア人において肥満を評価するためのＢＭＩ基準に関する最近の改訂に基づき（非特許文献１８）、ＢＭＩとして２５ｋｇ／ｍ２以上を肥満と定義した。
【００１３】
次の５個の因子のうち３個以上を有している者をメタボリック症候群であると定義した。５個の因子は、（１）ＢＭＩが２５ｋｇ／ｍ２以上、（２）トリグリセリド（triglycerides）の血清濃度が１５.５ｍｍｏｌ／Ｌ（１５０ｍｇ／ｄＬ）以上、（３）ＨＤＬコレステロールの血清濃度が、男性では１.０４ｍｍｏｌ／Ｌ（４０ｍｇ／ｄＬ）未満、女性では１.３０ｍｍｏｌ／Ｌ（５０ｍｇ／ｄＬ）未満、（４）最高血圧が１３０ｍｍＨｇ以上であり、最低血圧が８５ｍｍＨｇ以上、及び（５）空腹時血漿グルコース濃度が６.０５ｍｍｏｌ／Ｌ（１１０ｍｇ／ｄＬ）以上とした。これらの基準に基づいて、１０１７名の対象者(男性６３４名、女性３８３名）がメタボリック症候群であると診断された。
【００１４】
コントロール者は、毎年の健康診断のために参加病院の外来を受診した者であり、７７１名（男性３９９名、女性３７２名）から構成されていた。コントロール者については、肥満、高脂血症、血清脂質異常、高血圧症、または糖尿病のいずれの既往歴もなく、上記５個の要因のいずれにも当てはまらない者であった。研究プロトコールはヘルシンキ宣言に従い、三重大学医学部、弘前大学医学部、岐阜県国際バイオ研究所、および参加病院の倫理委員会によって承認された。各参加者に対しては書面によるインフォームドコンセントを得た。
【００１５】
多型の選択
公開データベースの使用および本発明者の鋭意検討により、肥満、高脂血症、血清脂質異常、高血圧、および糖尿病に関する包括的な検討に基づき、メタボリック症候群に関連する可能性のある１３４個の候補遺伝子を選択した。本発明者は、これら１３４個の遺伝子について、１５８個の多型を選択した。これらの多型の多くは、プロモーター領域、エクソン、イントロンのスプライシングの供与部位或いは受容部位に多く位置しており、多型の結果として、コードされたタンパク質の機能または発現に変化を与える可能性があるものであった。これら１５８個の多型は、下記表１〜表５に示した。なお、表中においては、左欄から順に、座位（Locus）、遺伝子名（Gene）、簡易記載（Symbol）、多型（Polymorphism）、多型データベース登録番号（dbSNP）を示している。なお、多型データベース登録番号が無い場合には、ＮＣＢＩ遺伝子バンクに登録されている番号を示した。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
【表２】
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【００１８】
【表３】
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【００１９】
【表４】
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【００２０】
【表５】
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【００２１】
遺伝子多型の検出方法
７ｍＬの静脈血を５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ(ジナトリウム塩)を含むチューブに採取し、ゲノムＤＮＡをキット(ゲノミックス社製)によって分離した。１６４個の多型の遺伝子型は、ＰＣＲと配列特異的オリゴヌクレオチドプローブをサスペンジョン・アレイ・テクノロジー（ＳＡＴ：Ｌｕｍｉｎｅｘ  １００）と組み合わせて使用する方法によって決定した（Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社）。プライマー、プローブ、その他の条件は、下表６に示した。表６は左から順に、遺伝子表記（Gene Symbol）、多型（Polymorphism）、センスプライマー（Sense primer）、アンチセンスプライマー（Antisense primer）、プローブ１（Probe 1）、プローブ２（Probe 2）、アニーリング温度（Annealing）、およびサイクル数（Cycles）を示した。また、詳細な方法については、既報のもの（非特許文献１９）を基本として、適宜に増幅条件を変えて行った。なお、メタボリック症候群との関連が認められなかった多型を検出するための条件については記載を省略した。
【００２２】
【表６】
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【００２３】
ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法
方法の詳細については、非特許文献１９に記載の通りである。以下には、この方法の概要について説明する。
図１には、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００フローサイトメトリーで検出するマイクロビーズの微細構造と特徴を示した。マイクロビーズ（図中の符号（Ａ））は、直径が約５.５μｍ程度であり、ポリスチレン製である。ビーズ表面には、特異的な塩基配列を認識するプローブが結合されている。各ビーズには、一種類のプローブが結合されている。このマイクロビーズには、赤色色素と赤外色素との割合を変化させることにより、図中の符号（Ｂ）に示すように、最大で１００種類のものを混合した状態で、各ビーズの同定が行えるようになっている。複数種類のプローブを備えたマイクロビーズ（但し、各マイクロビーズには一種類のプローブのみ）を適当な割合で混合し、１００ビーズ／μＬとなるようにしたビーズミックスを調製した（図中の符号（Ｃ））。
【００２４】
図２には、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法の手順の概要を示した。
＜増幅反応（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）＞
目的とするＤＮＡを増幅するＰＣＲ反応には、５’末端をビオチンでラベルしたプライマーを用いた。１.５ｍＭ塩化マグネシウムを含む１ｘＰＣＲ溶液（５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.３）、２％ＤＭＳＯ、０.２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、及び０.１μＭ〜１０μＭプライマーセットを混合し、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（５０Ｕ／ｍＬ）と５０ｎｇ〜１００ｎｇのゲノムＤＮＡを加えて２５μＬとした。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間処理の後、９４℃で２０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒間の伸長を１サイクルとし、これを５０サイクル繰り返した。機器としてＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いた。
【００２５】
＜ハイブリダイゼーション（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）＞
増幅したＤＮＡを変性した後、ビーズミックスとハイブリダイズさせた。９６ウエルプレートの各ウエルに、５μＬの増幅反応後のＰＣＲ増幅液、５μＬのビーズミックス、及び４０μＬのハイブリダイズ用緩衝液（３.７５Ｍ  ＴＭＡＣ、６２.５ｍＭ  ＴＢ（ｐＨ８.０）、０.５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０.１２５％  Ｎ−ラウロイルザルコシン）を添加し、全量５０μＬとした。この混合液を添加した９６ウエルプレートについて、９５℃で２分間の変性、及び５２℃で３０分間のハイブリダイゼーションを行った（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラーを用いた。）。
図２中には、増幅したＤＮＡを認識するプローブを有するビーズ（１）のみが、ＤＮＡと結合する様子が示されている。
【００２６】
＜ストレプトアビジン−フィコエリトリン反応（ＳＡ−ＰＥ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）＞
次に、上記ビーズミックス−ＤＮＡをＳＡ−ＰＥと反応させた。ハイブリダイゼーション反応の後、各ウエルに１００μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（１ｘＰＢＳ（ｐＨ７.５）、０.０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を添加し、１０００ｘｇで５分間の遠心を行い、上清を取り去ることで、マイクロビーズを洗浄した。各ウエルに残ったマイクロビーズに、それぞれ７０μＬのＳＡ−ＰＥ溶液（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにより、市販品（Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社製）を１００倍希釈したもの）を添加し混合した後、５２℃で１５分間の反応を行った（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラーを用いた。）。
図２中には、ビーズ（１）のプローブにのみビオチン化ＤＮＡが結合しているので、そのビオチンにＳＡ−ＰＥが結合する様子が示されている。
【００２７】
＜測定（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）＞
次に、反応後のサンプルはＬｕｍｉｎｅｘ１００を用いて、ビーズ種類の同定と、そのビーズにＰＥが結合しているか否かを判定した。測定は２種類のレーザを使用して行い、ビーズの種類は６３５ｎｍレーザにより同定し、ＰＥ蛍光は５３２ｎｍレーザを用いて定量した。オリゴビーズに結合したＤＮＡは１測定あたり各々のビーズを最低５０個ずつ測定し、定量されたＰＥの蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を使用した。
図２中には、各ビーズ（１）〜（３）が同定され、かつビーズ（１）にのみＰＥが測定されたことから、ビーズ（１）に結合させたプローブが認識するＤＮＡが増幅された様子が示されている。
【００２８】
統計解析
臨床データは、メタボリック症候群（metabolic syndrome）とコントロール群との間で、対応のないスチューデントt検定により比較した。３群間のデータの比較は、一元配置分散分析とダネットのポストホックテスト（Dunnett's post hoc test）を行った。質的データは、カイ二乗検定によって比較した。対立遺伝子頻度は遺伝子カウント法によって概算し、ハーディ・ワインベルク平衡にあてはまるかどうかを判断するためにカイ二乗検定を使った。各常染色体上の遺伝子多型における遺伝子型分布は、メタボリック症候群とコントロール群との間でカイ二乗検定(３ｘ２)によって比較した。Ｘ染色体上にある遺伝子多型については、対立遺伝子頻度をカイ二乗検定(２ｘ２)によって比較した。
【００２９】
メタボリック症候群と関連（Ｐ＜０.０７）する多型は、交絡因子を含む多項ロジスティック回帰分析法により解析した。このとき、交絡因子については、年齢（age）、性別(gender：女性＝０、男性＝１)、喫煙状態(smoking：非喫煙者＝０、喫煙者＝１)、および各遺伝子型を独立変数とし、メタボリック症候群を従属変数とした。各遺伝子型は、優性、劣性、および２つの付加（付加１および２）遺伝モデルに従って評価し、Ｐ値、オッズ比、および９５％信頼区間を計算した。
【００３０】
各遺伝モデルは２つの群から成る。優性モデルは「変異型のホモ接合体とヘテロ接合体の結合群」対「野生型のホモ接合体」、劣性モデルは「変異型のホモ接合体」対「野生型のホモ接合体とヘテロ接合体の結合群」、付加１モデルは「ヘテロ接合体」対「野生型のホモ接合体」、付加２モデルは「変異型のホモ接合体」対「野生型のホモ接合体」である。また、メタボリック症候群に対する遺伝子型または他の交絡因子の効果を確認するために、ステップワイズ変数増加法により解析を行った。モデルへの包含の基準レベルを０.２５とし、モデルからの除外の基準レベルを０.１とした。
【００３１】
メタボリック症候群と遺伝子型の多重比較の結果を得る際に、タイプＩエラーを避けるために統計的有意性（Ｐ＜０.００１)の厳密な基準を採用した。その他の臨床的バックグラウンドデータについては、危険率５％未満（Ｐ＜０.０５）は統計的に有意であると見なした。統計的有意性は、両側検定によって試験した。統計解析は、ＪＭＰソフトウェア・バージョン５.１（ＳＡＳインスティテュート社製）によって実行した。
【００３２】
＜試験結果＞
１７８８名の研究対象に関する背景データを表７に示した。表には、左欄より順に、特徴（Characteristics）、メタボリック症候群（Metabolic syndrome）、およびコントロール者（Controls）を示している。また、特徴欄は、上より順に、者数（No. of subjects）、年齢（Age）、性別（男性／女性）（Sex(male/female)）、現在または過去の喫煙率（Current or former smoker）、肥満指数（Body mass index）、最高血圧（Systolic blood pressure）、最低血圧（Diastolic
blood pressure）、総コレステロール（Total cholesterol）、トリグリセリド（Triglycerides）、ＨＤＬ−コレステロール（HDL-cholesterol）、及び空腹時血糖（Fasting plasma glucose）を示している。
【００３３】
【表７】
2007209297.tif 000008
【００３４】
データは、平均±ＳＤで示した。喫煙率については、一日あたり１０本以上を吸った場合を喫煙とした。また表中、「＊」はコントロールとの間でＰ＜０.００１を意味している。
年齢、男性の割合、及び喫煙率については、メタボリック症候群は、コントロールに比べて有意に高かった。ＢＭＩ、最高血圧、最低血圧、血清総コレステロール・トリグリセリド、空腹時血糖値についても、メタボリック症候群がコントロールに比べて有意に高かった。一方、血清ＨＤＬコレステロールについては、メタボリック症候群がコントロールに比べて、有意に低値であった。
次に、メタボリック症候群のリスク診断を行うために必要な因子を抽出するため、遺伝子多型および年齢・性別・喫煙について、ステップワイズ変数増加法による解析を行った（詳細については後述する）。その結果、次に説明するように、メタボリック症候群に関するリスク診断を行えることが分かった。
【００３５】
＜メタボリック症候群のリスク診断システム＞
表８には、メタボリック症候群のリスク診断システムに関する詳細を示した。表には、左欄より順に、因子（Variable）、Ｐ値（P value）、オッズ比（９５％信頼区間）（OR(95%CI)）を示した。また、最下段には、従来の危険因子（Conventional risk factors）と、今回の研究で見出された遺伝因子（Genetic risk factors）のオッズ比を乗じた総合リスク（Total risk）を示した。
【００３６】
【表８】
2007209297.tif 000009
【００３７】
後述のステップワイズ変数増加法で危険率が０.０５未満（P <0.05）であった遺伝子多型群および年齢・性別・喫煙を独立因子（交絡因子）とし、メタボリック症候群を従属因子として多項ロジスティック回帰分析を行い、Ｐ値、オッズ比、９５％信頼区間を各因子について算出した。したがってこれらの因子は独立したものであり、オッズ比の積（かけ算）により総合的な疾患発症リスクを予測することができる。多項ロジスティック回帰分析の結果、従来の危険因子としては性別（男性の方が高リスク）および喫煙が、遺伝因子としては、ＡＰＯＡ５、Ｆ７、ＬＩＰＣ、ＬＰＬ、ＧＣＫ、ＧＹＳ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＡＰＯＡ１、ＬＴＡ、ＥＮＧ、ＳＬＣ２６Ａ８、ＡＧＥＲ、ＳＲＥＢＦ１、ＳＡＨ、ＧＣＬＣの各遺伝子多型がメタボリック症候群の発症に関連した。従来の危険因子では最小オッズ比が１.００で最大オッズ比が２.０３、遺伝因子では最小オッズ比が０.００５で最大オッズ比が８.２１であった。したがって、従来の危険因子と遺伝因子を総合すると、最小オッズ比が０.００５で最大オッズ比が１６.６６であり、３３３２倍の差が認められた。
【００３８】
本研究成果の臨床的な意義について以下に述べる。病院、クリニックまたは健診センターにおいて希望者に対して従来の危険因子と今回の遺伝因子に関する検査を行い、メタボリック症候群の発症リスクの予測を行う。従来の危険因子と遺伝因子全体のオッズ比の積の分布からリスクの程度を３段階以上（例えば、５段階）に分ける。例えば、平均±１ＳＤの範囲を平均的リスク群とし、平均＋１ＳＤから平均＋２ＳＤをやや高リスク群、平均＋２ＳＤ以上を高リスク群とする。また、平均−１ＳＤから平均−２ＳＤをやや低リスク群、平均−２ＳＤ以下を低リスク群とする。
実際に本研究において、リスク値の分布は、リスクが高い群では疾患群が８８．８％でコントロール群が５．７％、リスクがやや高い群では疾患群が３．７％でコントロール群が９．９％、平均的リスクの群では疾患群が７．５％でコントロール群が８４．４％、リスクがやや低い群では疾患群が０％でコントロール群が０％、リスクが低い群では疾患群が０％でコントロール群も０％であった。また、平均±０．５ＳＤの範囲を平均的リスク群とし、平均＋０．５ＳＤから平均＋１．５ＳＤをやや高リスク群、平均＋１．５ＳＤ以上を高リスク群とし、平均−０．５ＳＤから平均−１．５ＳＤをやや低リスク群、平均−１．５ＳＤ以下を低リスク群とした場合、リスクが高い群では疾患群が９０．０％でコントロール群は８．６％、リスクがやや高い群では疾患群が４．７％でコントロール群が１１．８％、平均的リスクの群では疾患群が４．５％でコントロール群が３５．７％、リスクがやや低い群では疾患群が０．８％でコントロール群が４３．９％、リスクが低い群では疾患群が０％でコントロール群も０％であった。他の方法として、コントロール群のリスク値の大きい順に全体を５％、２０％、５０％、２０％、５％に区分し、リスク値の最も大きい５％の群をリスクが高い群、次の２０％の群をリスクがやや高い群、次の５０％の群を平均的リスクの群、次の２０％の群をリスクがやや低い群、リスク値が最も小さい５％の群をリスクが低い群とする。実際に本研究における疾患群の分布は、リスクが高い群は８７．８％（コントロール群は４．７％）、リスクがやや高い群は８．０％（コントロール群は２０．４％）、平均的リスクの群は４．０％（コントロール群は５０．０％）、リスクがやや低い群は０．２％（コントロール群は２０．０％）、リスクが低い群は０％（コントロール群は４．９％）であった。本研究では有意な関連が認められなかったが、一般的に加齢もメタボリック症候群の危険因子と考えられているので、この因子を含めることもできる。
【００３９】
結果については、医師等の有資格者の判断を含めてカウンセリングを行い、とりわけ高リスク群またはやや高リスク群に属する場合には生活習慣の改善（禁煙・食事療法・運動療法・肥満の軽減・ストレス解消・睡眠不足解消など）や、危険因子の早期治療（高血圧・糖尿病・高脂血症の治療など）を行うことによりメタボリック症候群の一次・二次予防を積極的に推進する。遺伝因子は変更できないが、従来の危険因子は軽減・治療可能であるため、これらの因子を治療した場合に発症リスクがどの程度減少するかについても予測し（表８から算出することができる）、クライアントに説明する。特にメタボリック症候群や肥満・高脂血症・糖尿病・高血圧の家族歴のある人への適用が有効である。本システムによりメタボリック症候群のオーダーメイド予防が可能になり、その結果、メタボリック症候群に起因する心筋梗塞や脳梗塞の罹患率を減少させ、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【００４０】
＜統計解析＞
次に、上記リスク判断システムを開発するに至った統計解析の結果について説明する。
カイ二乗検定により、１６個の遺伝子多型がメタボリック症候群との関連を示した（Ｐ＜０.０７）。詳細を表９示した。表においては、左欄より順に、遺伝子表記（Gene symbol）、多型（Polymorphism）、および危険率（Ｐ）を示している。
【００４１】
【表９】
2007209297.tif 000010
【００４２】
これらの多型については、メタボリック症候群との関連について更に詳細に分析した。年齢、性別、および喫煙頻度を補正した多項ロジスティック回帰分析を行ったところ、特にアポリポプロテインＡ−Ｖ遺伝子（ＡＰＯＡ５）の−１１３１Ｔ→Ｃ多型が全てのモデルにおいてメタボリック症候群の罹患率に有意に（Ｐ＜０.００１）関連した。またこのとき、ＡＰＯＡ５の−１１３１Ｃ対立遺伝子は、メタボリック症候群に対する危険因子となっていた。詳細を表１０に示した。
【００４３】
【表１０】
2007209297.tif 000011
【００４４】
表においては、左欄より順に、遺伝子表記（Gene symbol）、多型（Polymorphism）、優性モデル（Dominant）における危険率（P）・オッズ比（OR）・９５％信頼区間（95% CI）、劣性モデル（Recessive）における危険率（P）・オッズ比（OR）・９５％信頼区間（95% CI）、付加１モデル（Additive 1）における危険率（P）・オッズ比（OR）・９５％信頼区間（95% CI）、付加２モデル（Additive 2）における危険率（P）・オッズ比（OR）・９５％信頼区間（95% CI）をそれぞれ示している。多項ロジスティック回帰分析は、年齢、性別、および喫煙の有無について補正して行った。また、表中、危険率が０.００１未満（Ｐ＜０.００１）のデータについては、太字で示した。メタボリック症候群との関連が最も強いＡＰＯＡ５の−１１３１Ｔ→Ｃ多型では、メタボリック症候群においては、ＴＴ遺伝子型が３７.５％、ＴＣ遺伝子型が４７.４％、ＣＣ遺伝子型が１５.１％であり、コントロールにおいては、ＴＴ遺伝子型が４８.６％、ＴＣ遺伝子型が４１.７％、ＣＣ遺伝子型が９.７であった
【００４５】
次に、メタボリック症候群に対する１６個の多型の遺伝子型、年齢、性別、および喫煙の影響について、ステップワイズ変数増加法により解析した。結果を表１１に示した。表中には、左欄より順に、因子（Variable）、Ｐ値（P value）、寄与率（R2）を示している。
【００４６】
【表１１】
2007209297.tif 000012
【００４７】
統計的有意性が高い順に、ＡＰＯＡ５遺伝子型（優性モデル）、年齢、および性別が有意であり（Ｐ＜０.００１）、各要因が独立してメタボリック症候群に影響を与えることが分かった。
メタボリック症候群とコントロールとにおいて、ＡＰＯＡ５の−１１３１Ｔ／Ｃ遺伝子多型の各遺伝子型について、臨床的特徴を比較した。詳細を表１２に示した。
【００４８】
【表１２】
2007209297.tif 000013
【００４９】
データは平均±ＳＤで示した。表中、(a)はＴＴ＋ＴＣとの間でＰ＝０.０１８、(b)はＴＴとの間でＰ＜０.００１、ＴＣとの間でＰ＝０.００２、(c)はＴＴとの間でＰ＝０.０１４、(d)はＴＣとの間でＰ＝０.０４９、ＣＣとの間でＰ＜０.００１、(e)はＴＴとの間でＰ＝０.０１７、(f)はＴＴとの間でＰ＝０.０３２であったことを意味している。
メタボリック症候群では、ＣＣ遺伝子型は、血清トリグリセリド値が、他の遺伝子型（ＴＴ、またはＴＣ）の値よりも高かった。また、ＴＴ遺伝子型は、ＨＤＬ−コレステロール値が、他の遺伝子型（ＣＣまたはＴＣ）の値よりも高かった。ＴＣ遺伝子型は、空腹時血糖値がＴＴ遺伝子型の値よりも高かった。
また、コントロールにおいては、血清トリグリセリドとＨＤＬ−コレステロール値について、メタボリック症候群と同様の傾向が認められたものの、ＡＰＯＡ５の−１１３１Ｔ／Ｃ遺伝子多型の各遺伝子型の間で見られる差は、メタボリック症候群ほど高くなかった。
【００５０】
＜考察＞
本発明者は、メタボリック症候群との関連が疑われる１３４個の候補遺伝子について、１５８カ所の多型を調べた。１７８８人の被験者について大規模研究を行ったところ、ＡＰＯＡ５の−１１３１Ｔ→Ｃ多型が、日本人のメタボリック症候群の罹患率と有意に関係していた。ＡＰＯＡ５（１１ｑ２３）を含んでいる染色体領域については、これまでメタボリック症候群との関連が指摘されたことはなかった（非特許文献１０〜１２）。また、ＡＰＯＡ５遺伝子についても、メタボリック症候群との関連は指摘されていない。
【００５１】
ＡＰＯＡ５は、２００１年になって同定された新しいアポリポタンパク質であり、血漿トリグリセリド濃度との関連が指摘されている（非特許文献２０）。ＡＰＯＡ５遺伝子は、１１ｑ２３中の良く知られたＡＰＯＡ１−ＡＰＯＡ３−ＡＰＯＡ４遺伝子クラスターの約２７ｋｂ上流に位置している（非特許文献２１）。ヒトＡＰＯＡ５は、４つのエクソンから構成されており、３６９個のアミノ酸をコードしている（アポリポタンパク質Ａ−Ｖ）（非特許文献２０）。マウスを使った機能解析によれば、ＡＰＯＡ５発現量を変化させると、血漿トリグリセリド濃度に影響を与えることが示されている。ヒトＡＰＯＡ５を過剰発現させたトランスジェニックマウスでは、血漿トリグリセリド濃度が、コントロールマウスのそれに比べると１／３となったのに対し、ＡＰＯＡ５のノックアウトマウスでは、トリグリセリド濃度は、コントロールマウスのそれに比べ４倍となった（非特許文献２０）。マウスを用い、アデノウイルスを使ってマウスＡＰＯＡ５を過剰に発現させると、血漿トリグリセリド濃度が６０％〜７０％も減少することが示され、そのトリグリセリド濃度の減少の大部分は、ＶＬＤＬ画分の減少であった（非特許文献２２）。
【００５２】
ヒトＡＰＯＡ５のプロモーター領域における−１１３１Ｔ→Ｃ多型は、多くの人種において血漿トリグリセリド濃度に対して独立して影響を与えること、及びこのときにはＣ対立遺伝子が危険因子となることが知られている（非特許文献２０、２３〜２８）。この多型は、アジア人および白人において、トリグリセリド濃度とＨＤＬ−コレステロール濃度に影響を与えること、及びＣ対立遺伝子があるとＨＤＬ−コレステロール濃度が減少することが示された（非特許文献２４〜２８）。ＡＰＯＡ５のコード領域に認められる５６Ｃ→Ｇ（Ｓｅｒ１９Ｔｒｐ）多型は、アフリカ系アメリカ人、ラテンアメリカ人、および白人において、血漿トリグリセリド濃度に影響を与えることが知られている（非特許文献２９）。更に、この遺伝子の５５３Ｇ→Ｔ（Ｇｌｙ１８５Ｃｙｓ）変異は、台湾人において高トリグリセリド血症を起こすことが分かっている（非特許文献３０）。これらの知見によれば、ＡＰＯＡ５はヒトにおいて、トリグリセリドの代謝、及びおそらくＨＤＬ−コレステロールの代謝に重要な役割を持っていることが示唆される。
【００５３】
ＡＰＯＡ５の−１１３１Ｔ→Ｃ多型は、血漿トリグリセリド濃度を上昇させることにより、冠動脈疾患の罹患に関与していると報告されている（非特許文献３１〜３３）。本研究によれば、この多型は有意にメタボリック症候群に関与しており、このときＣ対立遺伝子が危険因子であることが分かった。また、本研究の知見として、Ｃ対立遺伝子が血清トリグリセリド濃度を上昇させ、ＨＤＬ−コレステロール濃度を減少させることが分かった。この知見から、この多型がメタボリック症候群に影響を与えるのは、ＡＰＯＡ５がトリグリセリドとＨＤＬ−コレステロール代謝に関与していることに依るものだと考えられる。これまでの報告から、この多型が血清トリグリセリドおよびＨＤＬ−コレステロール濃度に影響を与えることが分かっており（非特許文献２４〜２８）、これは今回の本発明者らの知見と整合するものである。メタボリック症候群が冠動脈疾患の主要な危険因子であることから、本発明者の知見は、この多型が冠動脈疾患に関与するというこれまでの報告（非特許文献３１〜３３）を支持している。
【００５４】
アポリポタンパク質Ａ−Ｖのトリグリセリド代謝に関する影響の分子機構については、依然として不明のままである。アポリポタンパク質Ａ−Ｖは、疎水性の境界面に対して、高親和性、低弾性、及び遅い結合速度を示す（非特許文献３４）。これらの性質は、トリグリセリドを多く含む粒子の構築を遅らせるかもしれない。ＡＰＯＡ５トランスジェニックマウスでは、ＶＬＤＬ−トリグリセリドが非常に減少するという知見に加え、組換えアポリポタンパク質Ａ−Ｖがリポタンパクリパーゼと結合し、その活性を上昇させるというインビトロ試験データがある（非特許文献３５）。アポリポタンパク質Ａ−Ｖは、肝臓でのＶＬＤＬの合成を減少させると共に、ＶＬＤＬの除去を進めることにより、ＶＬＤＬ−トリグリセリド濃度を減少させているのかも知れない。
【００５５】
ＡＰＯＡ５のプロモーター領域における−１１３１Ｔ→Ｃ多型は、この遺伝子の発現を調節することによって、血清アポリポタンパクＡ−Ｖ濃度に影響を与えているのかも知れない。ペルオキシソーム増殖因子応答配列（peroxisome proliferator response element：ＰＰＲＥ）が、ＡＰＯＡ５プロモーター領域に存在すると報告されている（非特許文献３６）。ＡＰＯＡ５の発現は、ＰＰＡＲαとＰＰＲＥの働きによって増加するとの報告がある（非特許文献３７）。ＡＰＯＡ５の−１１３１Ｔ→Ｃ多型は、ＰＰＡＲαのＰＰＲＥに対する親和性、あるいは未知の調節因子に対する転写因子の結合力を変化させることにより、遺伝子発現に影響を与えているのかも知れない。
【００５６】
本発明者が得た結果は、ＡＰＯＡ５が、日本人のメタボリック症候群に影響を与えることを示している。この多型の遺伝子型を決定することは、メタボリック症候群の遺伝的リスクを評価するために有益であり、この疾患の予防に資することになると考える。
このように本実施形態によれば、メタボリック症候群について、遺伝的リスクおよび発症リスクを判断するための検出法を提供することができる。この実施形態を用いることにより、メタボリック症候群の予防が可能となり、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【００５７】
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【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】Ｌｕｍｉｎｅｘ１００で検出するマイクロビーズの微細構造と特徴を示す図である。
【図２】ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法の手順の概要を示す図である。
【図１】
2007209297.tif 000014
【図２】
2007209297.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成18年9月25日(2006.9.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007209297000001.app