(57)【要約】      （修正有）【課題】ダイズ貯蔵タンパク質の一つである７Ｓグロブリンαサブユニット欠失ダイズの高感度な検出方法の提供。【解決手段】ダイズ由来の核酸試料について、ＣＧ−２遺伝子（７Ｓα遺伝子）の第１エキソンの第２１５位〜第２１７位の配列ＡＡＡ中への４個のアデニン塩基の挿入を検出することを特徴とする、７Ｓグロブリンαサブユニット欠失ダイズの検出方法。更に、上記検出方法のための、特定な配列からなるプライマーセットの提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダイズ由来の核酸試料について、ＣＧ−２遺伝子の第１エキソンの第２１５位〜第２１７位の配列ＡＡＡ中への４個のアデニン塩基の挿入を検出する工程を特徴とする、７Ｓグロブリンαサブユニット欠失ダイズの検出方法。
【請求項２】
ＣＧ−２遺伝子の第１エキソンが、配列番号１で示す塩基配列からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検出工程が、配列番号３で示す塩基配列上の第２１５〜第２２１位の配列ＡＡＡＡＡＡＡを含む少なくとも１５塩基の連続した配列からなるDNAをプライマー又はプローブとして用いて検出する工程である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記検出工程が、配列番号３で示す塩基配列上の第２１５〜第２２１位の配列ＡＡＡＡＡＡＡを含む１５〜５０塩基の連続した配列又はそれに相補的な配列からなるポリヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ増幅により検出する工程である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記プライマーが、配列番号１２で示す塩基配列からなるポリヌクレオチドプライマーである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
配列番号１２で示す塩基配列からなるポリヌクレオチドプライマーとともに、配列番号１４で示す塩基配列からなるポリヌクレオチドプライマーをＰＣＲ増幅に用いる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
７Ｓグロブリンαサブユニット欠失ダイズが、「ゆめみのり」、「ゆめみのり」の兄弟系統、又はそれらの子孫系統である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法において、前記プライマーとともに、ＣＧ−１遺伝子特異的プライマーセットをＰＣＲ増幅に用いることを特徴とする、ダイズの７Ｓグロブリンαサブユニット欠失性及び７Ｓグロブリンα’サブユニット欠失性の同時判定方法。
【請求項９】
ＣＧ−１遺伝子特異的プライマーセットが、配列番号１５で示す塩基配列からなるポリヌクレオチドプライマーと、配列番号１６で示す塩基配列からなるポリヌクレオチドプライマーとからなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の方法で得られた判定結果に基づいて、異系統のダイズの混在の有無を判定することを特徴とする、ダイズの混入検査法。
【請求項１１】
配列番号３で示す塩基配列上の第２１５〜第２２１位の配列ＡＡＡＡＡＡＡを含む少なくとも１５塩基の連続した配列からなるDNA。
【請求項１２】
配列番号３で示す塩基配列上の第２１５〜第２２１位の配列ＡＡＡＡＡＡＡを含む１５〜５０塩基の連続した配列又はそれに相補的な配列からなるポリヌクレオチドプライマー。
【請求項１３】
配列番号１２で示す塩基配列からなるポリヌクレオチドプライマーと、配列番号１４で示す塩基配列からなるポリヌクレオチドプライマーとからなる、プライマーセット。
【請求項１４】
配列番号１２〜１４で示す塩基配列の各々からなる３種のポリヌクレオチドプライマーを含むキット。
【請求項１５】
配列番号１２〜１６で示す塩基配列の各々からなる５種のポリヌクレオチドプライマーを含むキット。
【請求項１６】
配列番号１７及び１８で示す塩基配列の各々からなる２種のポリヌクレオチドプライマーをさらに含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
「ゆめみのり」、「ゆめみのり」の兄弟系統、又はそれらの子孫系統である７Ｓグロブリンαサブユニット欠失ダイズを検出するための、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、７Ｓグロブリンαサブユニット欠失ダイズを検出する方法、及びその方法に用いるプライマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
ダイズ貯蔵タンパク質のひとつである７Ｓグロブリン（別名：β-コングリシニン）は、α’、α及びβの３種類のサブユニットで構成されている。そのうち、７Ｓグロブリンのαサブユニット（以下、７Ｓαとも略記する）は、ダイズ陽性のアトピー性皮膚炎患者のうち２５％の患者の血清によって検出された主要アレルゲンである。
【０００３】
ダイズ貯蔵タンパク質には、７Ｓグロブリンの他、２Ｓグロブリン、１１Ｓグロブリン、及び１５Ｓグロブリンが知られている。７Ｓグロブリンは、アレルゲンであるだけでなく、１１Ｓグロブリンに比べて栄養価や加工適性が劣るとされる。ダイズの７Ｓグロブリン含量は１１Ｓグロブリンの含量との間で負の相関が認められることから、７Ｓグロブリンαサブユニット及びα’サブユニットを欠失させることによって相対的に１１Ｓグロブリンの含量を高めることができる。そのため、７Ｓグロブリンαサブユニット及びα’サブユニットを欠失させて機能性を強化したダイズ品種の開発が進められている。
【０００４】
７Ｓグロブリンのサブユニット変異体として、７Ｓグロブリンα’サブユニット（７Ｓα’）を欠失した「毛振（Keburi）」、７Ｓグロブリンαサブユニット及びβサブユニットの生成量が低下した「秣食豆公503（Moshidou Gong 503）」、秣食豆公503の７Ｓα及びβの低下性と毛振の７Ｓα’欠失が導入された「刈系434号（Kari-kei 434）」、刈系434号のγ線照射により作出された７Ｓα欠失品種「ゆめみのり（Yumeminori）」などを含む多様なダイズ品種・系統が知られている。これらのダイズ品種・系統の研究から、Region Cと呼ばれるダイズ染色体領域内のCG-1遺伝子が７Ｓグロブリンα’サブユニットをコードする遺伝子であること、及びRegion Aと呼ばれるダイズ染色体領域内のCG-2遺伝子及びCG-3遺伝子が７Ｓグロブリンαサブユニットをコードする遺伝子であることが明らかになった（非特許文献１及び２）。「毛振」ではCG-1遺伝子及びCG-2遺伝子が欠失していることが示されており（非特許文献２及び３）、「秣食豆公503」の７Ｓα低下性がCG-3遺伝子の欠失に起因することも報告されている（非特許文献３）。このようにダイズ７Ｓグロブリンサブユニットに関する研究は確実に進んできている。
【０００５】
しかしながら、７Ｓグロブリンサブユニット変異の検出には、現在でも、手間を要するタンパク質レベルの手法が使用されている。そのような手法では、分析試料として、ダイズ種子粉末あるいは未分解のタンパク質を含むダイズ加工物の調製が必要である。また例えばタンパク質の検出の際に用いられるSDS-PAGEはゲルの作成に熟練を要するし、SDS-PAGEに続いて行うCBB法による検出は、感度が低いため異品種の僅かな混入などを検出できない場合がある。一方、SDS-PAGEに続いて行う銀染色法は、感度は高いが操作が煩雑であるため多数サンプルの分析が困難である。
【０００６】
以上のような背景から、７Ｓグロブリンαサブユニット及びα’サブユニット欠失ダイズ品種の効率的な育成やそれらダイズ品種に関する異品種混入検査などに利用できる高感度な簡易判定技術の開発が求められている。
【０００７】
【非特許文献１】Harada J.J. et al., Plant Cell (1989) 1: p.415-425
【非特許文献２】Ladin B.F. et al., J. Mol. Appl. Genet. (1984) 2: p.372-380
【非特許文献３】Yoshino et al., Breed Sci. (2002) 52: p.285-292
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、７Ｓグロブリンαサブユニット欠失ダイズの高感度な検出方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。その結果、７Ｓグロブリンαサブユニット（７Ｓα）を欠失したダイズ品種「ゆめみのり」において７Ｓα遺伝子であるCG-2遺伝子の第１エキソンに４個のアデニン塩基が挿入された変異が生じていることを見出した。「ゆめみのり」ではその４個のアデニン塩基の挿入によってCG-2遺伝子にフレームシフトが生じ、ごく早期に終止コドンが現れるようになっていることから、この挿入変異によって７Ｓグロブリンαサブユニットが生成されなくなったと考えられた。これらの知見に基づき、本発明者らは、「ゆめみのり」において見出されたCG-2遺伝子の第１エキソン中の４塩基のアデニンの挿入をダイズ核酸について検出することによって、７Ｓグロブリンαサブユニット欠失ダイズを検出する手法を開発し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は以下の通りである。
【００１１】
[1]  ダイズ由来の核酸試料について、ＣＧ−２遺伝子の第１エキソンの第２１５位〜第２１７位の配列ＡＡＡ中への４個のアデニン塩基の挿入を検出する工程を特徴とする、７Ｓグロブリンαサブユニット欠失ダイズの検出方法。
この方法では、ＣＧ−２遺伝子の第１エキソンは、配列番号１で示す塩基配列からなるものであることが好ましい。
またこの方法の前記検出工程は、好ましくは、配列番号３で示す塩基配列上の第２１５〜第２２１位の配列ＡＡＡＡＡＡＡを含む少なくとも１５塩基の連続した配列からなるDNAをプライマー又はプローブとして用いて検出する工程である。
【００１２】
さらにその検出工程は、配列番号３で示す塩基配列上の第２１５〜第２２１位の配列ＡＡＡＡＡＡＡを含む１５〜５０塩基の連続した配列又はそれに相補的な配列からなるポリヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ増幅により検出する工程であることが好ましい。
そのようなプライマーとしては、配列番号１２で示す塩基配列からなるポリヌクレオチドプライマーが好適である。
さらに本発明では、配列番号１２で示す塩基配列からなるポリヌクレオチドプライマーとともに、配列番号１４で示す塩基配列からなるポリヌクレオチドプライマーをＰＣＲ増幅に用いることも好ましい。
この方法で検出される７Ｓグロブリンαサブユニット欠失ダイズは、好ましくは「ゆめみのり」、「ゆめみのり」の兄弟系統、又はそれらの子孫系統である。
【００１３】
[2]  上記[1]に記載の方法において、前記プライマーとともに、ＣＧ−１遺伝子特異的プライマーセットをＰＣＲ増幅に用いることを特徴とする、ダイズの７Ｓグロブリンαサブユニット欠失性及び７Ｓグロブリンα’サブユニット欠失性の同時判定方法。
この方法で用いるＣＧ−１遺伝子特異的プライマーセットとしては、配列番号１５で示す塩基配列からなるポリヌクレオチドプライマーと、配列番号１６で示す塩基配列からなるポリヌクレオチドプライマーとからなる組み合わせが好適である。
【００１４】
[3]  上記[2]に記載の方法で得られた判定結果に基づいて、異系統のダイズの混在の有無を判定することを特徴とする、ダイズの混入検査法。
【００１５】
[4]  配列番号３で示す塩基配列上の第２１５〜第２２１位の配列ＡＡＡＡＡＡＡを含む少なくとも１５塩基の連続した配列からなるDNA。
【００１６】
[5]  配列番号３で示す塩基配列上の第２１５〜第２２１位の配列ＡＡＡＡＡＡＡを含む１５〜５０塩基の連続した配列又はそれに相補的な配列からなるポリヌクレオチドプライマー。
【００１７】
[6]  配列番号１２で示す塩基配列からなるポリヌクレオチドプライマーと、配列番号１４で示す塩基配列からなるポリヌクレオチドプライマーとからなる、プライマーセット。
【００１８】
[7]  配列番号１２〜１４で示す塩基配列の各々からなる３種のポリヌクレオチドプライマーを含むキット。このキットは、好適には、「ゆめみのり」、「ゆめみのり」の兄弟系統、又はそれらの子孫系統である７Ｓグロブリンαサブユニット欠失ダイズを検出するためのキットである。
【００１９】
[8]  配列番号１２〜１６で示す塩基配列の各々からなる５種のポリヌクレオチドプライマーを含むキット。このキットは、配列番号１７及び１８で示す塩基配列の各々からなる２種のポリヌクレオチドプライマーをさらに含むことが好ましい。このキットは、好適には、「ゆめみのり」、「ゆめみのり」の兄弟系統、又はそれらの子孫系統である７Ｓグロブリンαサブユニット欠失ダイズを検出するためのキットである。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の方法は、「ゆめみのり」、「ゆめみのり」の兄弟系統、又はそれらの子孫系統などの７Ｓグロブリンαサブユニットを欠失したダイズ系統を、高感度にかつ簡便に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
１．７Ｓグロブリンαサブユニット欠失ダイズの検出
１）検出すべき変異
本発明の方法において検出すべき変異、すなわちダイズCG-2遺伝子の第１エキソン中への４個のアデニン塩基の挿入変異は、最初に、ダイズ品種「ゆめみのり」において見出されたものである。
【００２２】
「ゆめみのり」は、ダイズの主要アレルゲンである７Ｓグロブリンαサブユニット（７Ｓα）が欠失しており、栄養価の高い１１Ｓグロブリンの含有量が向上した、低アレルゲン性のダイズ品種である。「ゆめみのり」は、「毛振」の７Ｓα’欠失形質（すなわち、７Ｓα’が生成されない）と「秣食豆公503」の７Ｓα低下形質（すなわち、７Ｓαの生成量が低下する）とを導入した「刈系434号」に、γ線照射（200Gy）することによって得られた７Ｓα欠失変異体から確立した１系統に基づいて、品種登録された。図１に、ダイズ品種「ゆめみのり」の系譜を示す。「ゆめみのり」は、７Ｓα欠失形質（７Ｓαが生成されない）と７Ｓα’欠失形質（７Ｓα’が生成されない）の両方を示す。なおダイズ品種「ゆめみのり」は、独立行政法人  農業・生物系特定産業技術研究機構  東北農業研究センターから入手することができる。
【００２３】
本発明者らは、「ゆめみのり」において７Ｓα遺伝子の１つであるCG-2遺伝子の第１エキソン中に４個のアデニン塩基の挿入が生じていること、その結果CG-2遺伝子にフレームシフトが起き、さらに終止コドンが早期に生じていることを見出した。「ゆめみのり」のCG-2遺伝子の第１エキソン配列を原品種「刈系434号」と比較すると、この４個のアデニン塩基の挿入箇所は、「刈系434号」のCG-2遺伝子第１エキソンの第215位〜第217位に位置する３アデニン配列（配列ＡＡＡ）内に相当する。「ゆめみのり」においてはその３アデニン配列が、４個のアデニン塩基が挿入されたことにより、７アデニン配列（配列ＡＡＡＡＡＡＡ）となっている（「ゆめみのり」のCG-2遺伝子の第１エキソンの第215位〜第221位）。「ゆめみのり」はもう１つの７Ｓα遺伝子であるCG-3遺伝子を完全欠失（遺伝子構造自体を完全に喪失）しているので、「ゆめみのり」の７Ｓα欠失形質が、CG-2遺伝子の第１エキソン中に４個のアデニン塩基が挿入された結果として引き起こされたことは明らかである。本発明では、第１エキソンの第215位〜第217位に位置する３アデニン配列（配列ＡＡＡ）内に４個のアデニン塩基が挿入されたCG-2遺伝子を、便宜的に、欠失型CG-2遺伝子と呼ぶ。
【００２４】
「ゆめみのり」のCG-2遺伝子の第１エキソン中への４個のアデニン塩基の挿入は、もともとは、「ゆめみのり」の育種過程で「刈系434号」にγ線照射（200Gy）することによって得られた７Ｓα欠失変異体に生じた変異である。この７Ｓα欠失変異体からは「ゆめみのり」と同様の形質をもった系統が他にも作成されており、それらの系統でもそのようなCG-2遺伝子の第１エキソン中への４個のアデニン塩基の挿入が認められる。本発明では、７Ｓα欠失変異体から作成したこれらの系統を便宜的に『「ゆめみのり」の兄弟系統』と呼ぶ。
【００２５】
CG-2遺伝子の第１エキソン中への４個のアデニン塩基の挿入は、「ゆめみのり」又は「ゆめみのり」の兄弟系統の子孫系統にも受け継がれる。本発明において「ゆめみのり」又は「ゆめみのり」の兄弟系統の子孫系統とは、「ゆめみのり」又は「ゆめみのり」の兄弟系統を育種の母本として用いて、例えば突然変異誘発処理や他のダイズ系統・品種との交配によって作製された、後代のダイズを言う。「ゆめみのり」又は「ゆめみのり」の兄弟系統の子孫系統は、CG-2遺伝子の第１エキソン中への上記の４個のアデニン塩基の挿入をヘテロ接合又はホモ接合で有し得る。
【００２６】
本発明においては、限定するものではないが上述の「ゆめみのり」、「ゆめみのり」の兄弟系統、及びそれらの子孫系統のように、CG-2遺伝子の第１エキソンの第215位〜第217位に位置する３アデニン配列内への４個のアデニン塩基の挿入によってそのCG-2遺伝子の７Ｓグロブリンαサブユニット産生機能が失われたダイズを、「７Ｓグロブリンαサブユニット欠失ダイズ（７Ｓα欠失ダイズ）」と呼ぶ。７Ｓα欠失ダイズは、そのCG-2遺伝子中への４個のアデニン塩基の挿入変異をヘテロ接合又はホモ接合で有していてもよい。CG-2遺伝子とCG-3遺伝子は密接に連鎖していることから、この７Ｓグロブリンαサブユニット欠失ダイズは、通常は、「ゆめみのり」と同様にCG-3遺伝子を完全欠失している。
【００２７】
多くのダイズ品種が、７Ｓグロブリンαサブユニット遺伝子としてCG-2およびCG-3の２つを保持している。しかし、「毛振」はCG-2遺伝子を完全欠失しており、７Ｓα遺伝子としてはCG-3遺伝子を保持する。一方、「秣食豆公503」及び「刈系434号」は、CG-3遺伝子を完全欠失しており、７Ｓα遺伝子としてはCG-2遺伝子を保持する。後述の実施例に示されるように、「毛振」のCG-3遺伝子と「刈系434号」のCG-2遺伝子とは、少なくとも開始コドンから終止コドンまでのゲノム配列領域内では同一の塩基配列を有しており、「ゆめみのり」のようなCG-2遺伝子における４個のアデニン塩基の挿入は含まない。本発明では、「ゆめみのり」で認められた上記の４個のアデニン塩基の挿入を含まない７Ｓα遺伝子、例えば「毛振」のCG-3遺伝子及び「刈系434号」のCG-2遺伝子などを、便宜的に、野生型７Ｓα遺伝子と呼ぶ。
【００２８】
従って本発明では、ダイズ由来の核酸試料について、その核酸中に含まれるダイズ７Ｓα遺伝子であるCG-2遺伝子の第１エキソンの第215位〜第217位に位置する３アデニン塩基配列（配列ＡＡＡ）中の４個のアデニン塩基の挿入を検出することにより、７Ｓグロブリンαサブユニット欠失ダイズを検出することができる。
【００２９】
本発明におけるダイズのCG-2遺伝子は、限定するものではないが、例えばGenBank登録番号AB051865（ダイズ品種「Forrest」のゲノム配列；配列番号５）、同登録番号X17698（mRNA配列）、同登録番号AB030839（mRNA配列）に示された配列を有するものでありうる。本発明のダイズCG-2遺伝子は、便宜的には、登録番号AB051865に記載された塩基配列（配列番号５）の開始コドンから終止コドンまでの配列（第490位〜第2855位）を含むゲノムDNA領域、又は登録番号X17698（mRNA配列）の開始コドンから終止コドンまでの配列（第1位〜第1818位）を含むmRNA又はcDNA、あるいはそれらの塩基配列と非常に高い相同性（好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上）を有する配列からなるゲノムDNA、mRNA又はcDNAとみなすこともできる。
【００３０】
ダイズCG-2遺伝子は、通常はゲノム上で第１エキソン〜第６エキソンを含む。その第１エキソン（上記４アデニン塩基が挿入される）は、ダイズCG-2遺伝子中、登録番号AB051865に示す塩基配列（配列番号５）の第490位〜第1273位の領域に相当する。登録番号AB051865に示す塩基配列の第490位〜第1273位の領域は、「毛振」のCG-3遺伝子や「刈系434号」のCG-2遺伝子とも完全に一致していたことから、その領域を「野生型７Ｓα第１エキソン」と呼び、その野生型７Ｓα第１エキソンの塩基配列を配列番号１に示す。これに対し、「ゆめみのり」の、上記４アデニン塩基挿入部位を含む、CG-2遺伝子中の野生型７Ｓα第１エキソンに相当する領域（便宜的に、「挿入変異型７Ｓα第１エキソン」と呼ぶ）の塩基配列を、配列番号３に示す。
【００３１】
２）挿入変異の検出
本発明では、７Ｓグロブリンαサブユニット欠失ダイズを検出するため、上記１）で述べたダイズCG-2遺伝子における挿入変異（CG-2遺伝子の第１エキソン中への４個のアデニン塩基の挿入）を、ダイズ由来の核酸を被験試料として検出する。
【００３２】
この検出に供するダイズ（Glycine max Merrill）は、任意の品種又は系統のものであってよく、例えば、以下に限定するものではないが、「タチユタカ（Glycine max cv. Tachiyutaka）」、「毛振（Glycine max cv. Keburi）」、「秣食豆公503（Glycine max cv. Moshidou Gong 503」、「ゆめみのり（Glycine max cv. Yumeminori）」、「刈系434号（Glycine max, line Kari-kei434）」などが挙げられる。上記検出に供するダイズは、ダイズのゲノムを少なくとも１セット含む限り、例えばダイズと他の植物とのハイブリッド植物や遺伝子組換え植物などであってもよい。
【００３３】
本発明において「ダイズ由来の核酸試料」とは、上記のような供試ダイズの植物体の一部（葉など）又は種子等から調製されたダイズ核酸（DNA又はRNA）を意味する。核酸試料を調製するためのダイズ試料の形態は特に限定されず、一般的に用いられている種子粉末等のタンパク質調製に適した試料だけでなく、ダイズから採取した葉（幼葉）、茎、花などの核酸抽出可能な任意の試料を用いることができる。本発明では、ダイズ由来の核酸試料として、ダイズから抽出されたゲノムDNA又はゲノムDNAをクローン化したゲノムライブラリーを用いることが好ましい。あるいは本発明におけるダイズ由来の核酸試料として、ダイズから抽出したmRNAから逆転写PCRによって合成されたcDNA、又はそのcDNAを組み込んだcDNAライブラリーを用いてもよい。本発明におけるダイズ由来の核酸試料は、PCR法などによって増幅した核酸増幅断片であってもよい。ダイズからの核酸の抽出、精製、調製などの実験手順は、分子生物学の分野で慣用されている手法に従えばよい。
【００３４】
CG-2遺伝子中の挿入変異の検出は、SNP、塩基多型又は塩基変異を検出するために当業者が利用可能な公知の様々な方法を行うことができる（Orita et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 2766-2770等を参照されたい）。
【００３５】
そのような変異検出法としては、より具体的には、例えば、dCAPS法〔Plant J 14, 381-385 (1998)〕、CAPS（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）法〔「モデル植物の実験プロトコール」細胞工学別冊  植物細胞工学シリーズ１５、2001年４月２日発行、秀潤社、p.69-76〕、PCRダイレクトシークエンス法〔Biotechniques, 11, 246-249 (1991)〕、AP-PCR（Arbitrarily Primed-PCR）法〔Nucl. Acids Res., 18, 7213-7218 (1990)〕、PCR-SSCP（一本鎖DNA高次構造多型）法〔Biotechniques, 16,296-297 (1994), Biotechniques, 21, 510-514 (1996)〕、ASO（Allele Specific Oligonucleotide）ハイブリダイゼーション法〔Clin. Chim. Acta, 189, 153-157 (1990)〕、ARMS（Amplification Refracting Mutation System）法〔Nuc. Acids. Res., 19, 3561-3567 (1991), Nuc. Acids. Res., 20,4831-4837 (1992)〕、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis； ＤＧＧＥ）法〔Biotechniqus, 27, 1016-1018 (1999)〕、RNaseA切断法〔DNA Cell. Biol., 14, 87-94 (1995)〕、化学切断法〔Biotechniques, 21, 216-218 (1996)〕、DOL（Dye-labeled Oligonucleotide Ligation）法〔Genome Res., 8, 549-556 (1998)〕、MALDI-TOF/MS（Matrix Assisted Laser Desorption-time of Flight/Mass Spectrometry）法〔Genome Res., 7, 378-388 (1997), Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 35, 545-548 (1997)〕、TDI（Template-directed Dye-terminator Incorporation）法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10756-10761 (1997)〕、パドロック・プローブ（Padlock Probe）法〔Nat. Genet., 3, p225-232 (1998)、遺伝子医学, 4, p50-51 (2000)〕、モレキュラー・ビーコン（Molecular Beacons）法〔Nat. Biotechnol.，1, p49-53 (1998)、遺伝子医学、4, p46-48(2000)〕、TaqMan PCR法〔Genet. Anal., 14, 143-149 (1999), J. Clin. Microbiol., 34, 2933-2936 (1996)〕、インベーダー法〔Science, 5109, 778-783(1993), J. Biol. Chem., 30, 21387-21394 (1999), Nat. Biotechnol., 17, 292-296 (1999)〕、ダイナミック・アレル−スペシフィック・ハイブリダイゼーション（Dynamic Allele-Specific Hybridization (DASH)）法〔Nat. Biotechnol.，1, p87-88, (1999)、遺伝子医学, 4, p47-48 (2000)〕、UCAN法〔タカラ酒造株式会社ホームページ（http://www.takara.co.jp）参照〕、及びＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイを用いる方法〔Genomics 4, (1989), Drmanae, R., Labat, I., Brukner, I. and Crkvenjakov, R., p114-128、Bio Industry Vol.17 No.4, 「DNAチップ技術」 p5-11 (2000)〕等が挙げられるが、これらの方法に限定されるものではない。
【００３６】
これらの方法において好適に用いられる本発明に係る挿入変異を検出するためのプライマー又はプローブは、上記挿入変異を含むCG-2遺伝子と、変異を含まない野生型７Ｓα遺伝子とを特異的に識別できるように、野生型７Ｓα第１エキソンの配列（配列番号１）及び「ゆめみのり」の挿入変異型７Ｓα第１エキソンの配列（配列番号３）に基づいて任意に設計することができる。プライマー又はプライマー対の設計は、当業者には公知の方法に従って行えばよい。プライマーの設計には、例えば、オンラインソフトウェアNetPrimer（PREMIER Biosoft International、http://www.premierbiosoft.com/）を利用することもできる。さらに本発明では、上記挿入変異を含む配列に特異的にハイブリダイズするプライマー又はプローブを設計して用いることがより好ましい。例えば、配列番号３で示す塩基配列上の第215〜第221位の配列ＡＡＡＡＡＡＡを含む少なくとも１５塩基（１５塩基〜７８３塩基）、例えば１５塩基〜５０塩基（プライマー用など）又は３０塩基〜５００塩基（プローブ用など）の連続した配列からなるDNAを、プライマー又はプローブとして好適に用いることができる。また、本発明の方法をより簡便な判定法とするためには、配列番号３で示す塩基配列上の第215〜第221位の配列ＡＡＡＡＡＡＡを含む１５〜５０塩基の連続した配列又はそれに相補的な配列からなるポリヌクレオチドプライマーを用いたPCR増幅を利用してその増幅断片の有無に基づいて検出することも好ましい。
【００３７】
本発明においてPCR増幅を用いた検出法を用いる場合、配列番号３で示す塩基配列上の第215〜第221位の配列ＡＡＡＡＡＡＡを３'末端付近に含む、１５〜５０塩基、より好ましくは１８〜４０塩基の連続した配列又はそれに相補的な配列からなるポリヌクレオチドプライマーを用いることが特に好ましい。このようなプライマーは、CG-2遺伝子において上記挿入変異を有するダイズ核酸のみを高感度に増幅することができる。
【００３８】
配列ＡＡＡＡＡＡＡを３'末端付近に含むこのようなプライマーを用いた好適なプライマーセットとして、実施例に記載した欠失型CG-2特異的プライマーセット（プライマーCG2MF［配列番号１２］及びCG23R［配列番号１４］）が挙げられる。この欠失型CG-2特異的プライマーセットを用いた場合、上記挿入変異を含むCG-2遺伝子のみが増幅され、上記挿入変異を含まないCG-2遺伝子やCG-3遺伝子（野生型７Ｓα遺伝子）は増幅されない。従って、この欠失型CG-2特異的プライマーセットを用いれば、CG-2遺伝子の上記挿入変異のみを特異的に検出することができる。さらにこのような検出において、挿入変異を含まない野生型７Ｓα遺伝子を特異的に検出できる、実施例に記載の野生型７Ｓα特異的プライマーセット（プライマーCG23F［配列番号１３］及びCG23R［配列番号１４］）をコントロール試薬として用いることも好ましい。
【００３９】
PCR増幅を用いた本発明の好適な検出法の具体例は、後述の実施例に記載している。
【００４０】
本発明において用いるゲノムDNA及びmRNAの抽出及び精製、cDNAの作製（RT-PCR）、PCR、ベクター中へのライゲーション、細胞の形質転換及びライブラリーの作製、DNAの塩基配列決定、プライマーの合成、突然変異誘発、タンパク質の抽出などの分子生物学的・生化学的実験法は、基本的には、通常の実験書の記載に従って行うことができる。そのような実験書として、例えば、SambrookらのMolecular Cloning, A laboratory manual, 2001, Eds., Sambrook, J. & Russell, DW. Cold Spring Harbor Laboratory Pressを挙げることができる。
【００４１】
３）７Ｓα欠失ダイズの検出及び識別
本発明の方法においては、以上のようにしてCG-2遺伝子の第１エキソン中への上記４アデニン塩基の挿入（挿入変異）を検出した結果から、ダイズの７Ｓα欠失性が示される。すなわち、CG-2遺伝子の第１エキソン中への上記４アデニン塩基の挿入が確認された場合、試験したダイズでは、少なくとも１つのCG-2遺伝子がフレームシフトを起こして７Ｓαタンパク質産生能を失っており、そのため７Ｓαタンパク質を（少なくとも部分的に）欠失していることが示される。
【００４２】
従って、本発明の方法において、単一の品種又は系統のダイズ由来の核酸試料について、CG-2遺伝子の第１エキソン中への上記４アデニン塩基の挿入（挿入変異）が確認された場合には、そのダイズは７Ｓαタンパク質欠失ダイズであると判断することができる。
【００４３】
また、本発明の方法において、複数の品種又は系統のダイズ由来の核酸を含む核酸試料について、CG-2遺伝子の第１エキソン中への上記４アデニン塩基の挿入（挿入変異）が確認された場合には、それらのダイズの一部が、７Ｓαタンパク質欠失ダイズであると判断することができる。
【００４４】
本発明の方法においては、野生型７Ｓα遺伝子の特異的検出を並行して行うことにより、ダイズの７Ｓα欠失性をさらに詳細に判定することもできる。例えば、上記４アデニン塩基の挿入変異の存在が示され、かつ野生型７Ｓα遺伝子の存在が示されない場合は、供試ダイズは７Ｓαタンパク質を完全に欠失していると判定される。またこの場合、野生型７Ｓα遺伝子の存在が示されないことから、供試ダイズはCG-2遺伝子中の挿入変異についてホモ接合性であると判断できる。さらに、例えば「ゆめみのり」を交配親として作製した「ゆめみのり」の子孫系統について、上記の４アデニン塩基の挿入変異が検出され、かつ野生型７Ｓα遺伝子の存在が示されない場合には、その子孫系統は、７Ｓαを完全に欠失しており、「ゆめみのり」の７Ｓα欠失性の導入に成功したものと判断することができる。
【００４５】
また、上記４アデニン塩基の挿入変異の存在が示される一方、野生型７Ｓα遺伝子の存在も示される場合には、７Ｓαタンパク質は部分的に欠失している。この場合、通常は、供試ダイズはCG-2遺伝子の挿入変異についてヘテロ接合性であると判定される。
【００４６】
このように本発明では、ダイズの７Ｓα欠失性を判定した結果に基づいて、７Ｓグロブリンαサブユニット欠失ダイズを識別することもできる。本発明の方法を用いることにより、「ゆめみのり」、「ゆめみのり」の兄弟系統、又はそれらの子孫系統を用いて例えば７Ｓα欠失ダイズを育種しようとする際に、７Ｓα欠失形質を有するダイズを早期に選抜することもできる。そのため本発明は、７Ｓα欠失形質を有するダイズの効率的育種方法にも有用である。
【００４７】
本発明において、７Ｓαの「欠失性」は、生成される７Ｓαタンパク質自体の欠失の有無だけでなく、７Ｓαを生成できない７Ｓα遺伝子、特に、「ゆめみのり」において認められる、第１エキソン中に４アデニン塩基の挿入変異を有し７Ｓαを産生できないCG-2遺伝子（「欠失型CG-2遺伝子」と呼ぶ）の有無として、理解してもよい。また、後述の７Ｓα’の「欠失性」も、同様に、生成される７Ｓα’タンパク質自体の欠失の有無だけでなく、７Ｓα’を生成できない７Ｓα’遺伝子、特に、その遺伝子構造全体が欠失しているために７Ｓα’を産生できないCG-1遺伝子（「欠失型７Ｓα’遺伝子」と呼ぶ）の有無として、理解することもできる。
【００４８】
なお本発明において、ダイズの「系統」とは、品種登録されている純系のダイズ系統、及び品種登録されていない純系のダイズ系統を含むだけでなく、まだ純系として確立されていない育種過程にあるダイズ個体をも含む。
【００４９】
２．７Ｓα欠失性及び７Ｓα’欠失性の同時判定、並びにダイズの混入検査法
本発明は、CG-2遺伝子の第１エキソン中への４アデニン塩基の挿入を検出する際に、７Ｓα’遺伝子の完全欠失（遺伝子構造自体の完全な喪失）の検出も同時に行う方法にも関する。７Ｓα’遺伝子の完全欠失の検出法としては、上記のCG-2遺伝子における挿入変異の検出と同様の検出手法を利用すればよいが、PCR増幅を利用して行う場合には、７Ｓα’遺伝子中の領域を特異的に増幅するプライマーセットを用いることによって行うことができる。例えば、７Ｓα’遺伝子の完全欠失は、７Ｓα’遺伝子を特異的に増幅可能なプライマー又はプローブを公知の７Ｓα’遺伝子（CG-1遺伝子）の塩基配列（例えばGenBank登録番号AB030838；配列番号１１）に基づいて設計し、それを、CG-2遺伝子の第１エキソン中への４アデニン塩基の挿入を検出する工程において、その挿入変異を特異的に検出するためのプライマー又はプローブとともに（好ましくは混合して）使用して、検出することができる。
【００５０】
７Ｓα’遺伝子を特異的に増幅可能なプライマーを含む特に好適なプライマーセットとしては、後述の実施例３に示したCG-1遺伝子特異的プライマーセット（CG1F［配列番号１５］及びCG1R［配列番号１６］）が挙げられる。
【００５１】
限定するものではないが、７Ｓα欠失性及び７Ｓα’欠失性の同時判定には、実施例３及び図７に記載したＡセット及びＢセットのプライマーセットが特に有用である。これらのプライマーセットを用いた同時判定法の手順は、実施例に詳述されている。
【００５２】
７Ｓα欠失性及び７Ｓα’欠失性の同時判定法を用いれば、７Ｓα欠失性及び７Ｓα’欠失性の点で異なる性質を持つダイズ系統を、容易に識別することができる。このことは、７Ｓαの欠失による低アレルゲン性、及び７Ｓαと７Ｓα’の欠失による栄養価の高い１１Ｓグロブリン含量の増加という有用な性質に関して、望ましい性質を持つダイズ系統を識別できることを意味する。
【００５３】
さらに本発明は、７Ｓα及び７Ｓα’の欠失性が異なるダイズ系統の混入を、上記の同時判定試験を利用して検査する方法にも関する。ダイズ由来の核酸試料について、７Ｓα欠失性及び７Ｓα’欠失性の判定結果が、目的のダイズに関する結果と異なっていた場合には、その核酸試料の由来するダイズに、７Ｓα及び７Ｓα’の欠失性が異なる系統のダイズが混入していることが分かる。本発明のダイズの混入検査法は、検出限界が低く、高感度である。この混入検査法における検出限界は、核酸試料におけるDNA重量に換算した場合、混入率0.1％以上、好ましくは0.5％以上、好ましくは1％以上である。
【００５４】
３．その他の実施形態
本発明は、CG-2遺伝子の第１エキソン中への４アデニン塩基の挿入変異を特異的に検出可能なDNA断片にも関する。これらのDNA断片は、プライマー又はプローブとして有用に用いることができる。
【００５５】
具体的には、そのようなDNA断片は、「ゆめみのり」に見出されたCG-2遺伝子の挿入変異を含むDNAであって、配列番号３で示す塩基配列上の第215〜第221位の配列ＡＡＡＡＡＡＡを含む少なくとも１５塩基（１５塩基〜７８８塩基）、例えば１５塩基〜５０塩基（プライマー用など）又は３０塩基〜５００塩基（プローブ用など）の連続した配列からなるDNAであってよい。
【００５６】
本発明は、「ゆめみのり」に見出されたCG-2遺伝子の挿入変異を含むプライマーであって、配列番号３で示す塩基配列上の第215〜第221位の配列ＡＡＡＡＡＡＡを含む１５〜５０塩基の連続した配列又はそれに相補的な配列からなるポリヌクレオチドプライマー、特に、配列番号３で示す塩基配列上の第215〜第221位の配列ＡＡＡＡＡＡＡを３'末端に含む、１５〜５０塩基、より好ましくは１８〜４０塩基の連続した配列又はそれに相補的な配列からなるポリヌクレオチドプライマーにも関する。この配列ＡＡＡＡＡＡＡを３'末端付近（３'末端又はその数塩基５'側に当たる３'末端近傍）に含むプライマーは、上記挿入変異を有するダイズ核酸のみを高感度に増幅することができるため、とりわけ有用である。このようなプライマーを用いた、欠失型CG-2特異的プライマーセット（プライマーCG2MF［配列番号１２］及びCG23R［配列番号１４］）も本発明に含まれる。
【００５７】
また本発明では、CG-2遺伝子中の挿入変異を特異的に検出できるプライマーに加えてコントロールプライマー等をさらに含む、検出に便利に使用できるプライマーセットにも関する。例えば、実施例３に記載した欠失型CG-2特異的プライマーセットと野生型７Ｓα特異的プライマーセットは、2回のPCRによって７Ｓαの有無を判定できる便利な共優性マーカーとして用いることができる。これらのマーカーを用いることによって、育種選抜において重要であるが従来のタンパク質での分析では検出不可能な、上記４アデニン塩基の挿入変異を有し７Ｓαを産生できないCG-2遺伝子（欠失型CG-2遺伝子）についてヘテロ接合であるダイズ系統を識別することができる。またこれらのマーカーを用いることによって、７Ｓα欠失ダイズ系統が野生型ダイズ系統に混入した場合の検出なども高感度に行うことができる。
【００５８】
本発明は、CG-2遺伝子の上記挿入変異の有無と７Ｓα’遺伝子の有無をマルチプレックスPCRによって同時に検出することができる、実施例３に記載したCG-1特異的プライマーセットと欠失型CG-2特異的プライマーセットを含むプライマーセットにも関する。このプライマーセットには、実施例３に記載のようにさらにポジティブコントロール用プライマーセットを含んでもよい（実施例３のセットＡ）。本発明は、この検出のコントロール実験用に有用な、実施例３に記載の野生型７Ｓα特異的プライマーセットとポジティブコントロール用プライマーセットとを含むプライマーセット（実施例３のセットＢ）にも関する。これらのプライマーセットを用いて同時検出を行えば、欠失型CG-2遺伝子の有無と７Ｓα’遺伝子の有無が重要となる、７Ｓグロブリンαサブユニット変異体を利用した育種やダイズアレルゲン性の分析などにおいて、分析コストや労力を顕著に節減することができる。
【００５９】
さらに、これらのプライマーセットは、ダイズの７Ｓα欠失性や７Ｓα’欠失性の検出用のキット、ダイズの識別用キット、ダイズの異系統混入検査キットなどに含めて提供することもありうる。このような各種キットも、本発明の範囲に含まれる。
【００６０】
なお上記のようなDNA断片、並びにプライマー及びプローブなどは、当業者に公知の核酸調製法、例えば、限定するものではないが、化学合成法（液相法、固相法、カラム法及びバッチ法等）、クロマトグラフィー法による精製抽出法、PCR法、制限酵素消化等を利用して製造することができる。Applied Biosystems 3400 DNA合成機（Applied Biosystems）などの核酸合成装置も市販されている。
【００６１】
４．配列の説明
・配列番号１: GenBank登録番号AB051865の配列中の、ダイズ７Ｓα遺伝子の第１エキソンに相当する塩基配列。野生型７Ｓα第１エキソンである。
【００６２】
・配列番号２: 配列番号１の野生型７Ｓα第１エキソンにコードされるアミノ酸配列。
【００６３】
・配列番号３: 「ゆめみのり」のダイズCG-2遺伝子（７Ｓα遺伝子）の、第１エキソンに相当する塩基配列。第215位〜第221位に挿入変異を含む配列ＡＡＡＡＡＡＡが存在し、その結果この第１エキソン領域内に終止コドンが生じている。
【００６４】
・配列番号４: 配列番号３の配列にコードされるアミノ酸配列。
【００６５】
・配列番号５: GenBank登録番号AB051865の塩基配列。ダイズ７Ｓα遺伝子を含むゲノム配列である。
【００６６】
・配列番号６: 配列番号５の配列にコードされるアミノ酸配列。
【００６７】
・配列番号７: GenBank登録番号X17698の塩基配列。野生型ダイズ７Ｓα遺伝子のmRNA配列である。
【００６８】
・配列番号８: 刈系434号及び毛振の７Ｓα遺伝子を含むゲノム配列。
【００６９】
・配列番号９: 刈系434号及び毛振の７Ｓα遺伝子にコードされるアミノ酸配列。
【００７０】
・配列番号１０:「ゆめみのり」のCG-2遺伝子（７Ｓα遺伝子）を含むゲノム配列。
【００７１】
・配列番号１１: GenBank登録番号AB051838の塩基配列。ダイズ７Ｓα’遺伝子（CG-1遺伝子）のmRNA配列である。
【００７２】
・配列番号１２: CG2MFプライマー
・配列番号１３: CG23Fプライマー
・配列番号１４: CG23Rプライマー
・配列番号１５: CG1Fプライマー
・配列番号１６: CG1Rプライマー
・配列番号１７: 30KFプライマー
・配列番号１８: 30KRプライマー
・配列番号１９: CG2TFプライマー
・配列番号２０: CG2TRプライマー
【実施例】
【００７３】
以下、実施例及び図面を参照して本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７４】
以下の実施例では、γ線照射によって７Ｓグロブリンα’サブユニット（７Ｓα’）および７Ｓグロブリンαサブユニット（７Ｓα）を欠失したダイズ品種「ゆめみのり」、「ゆめみのり」の原品種「刈系434号」、「ゆめみのり」の反復親「タチユタカ」、遺伝資源より見出された７Ｓサブユニットの変異体「毛振」および「秣食豆公503」を供試した。
【００７５】
各品種における、７Ｓα’およびαをコードする遺伝子の有無は次の通りである。
【００７６】
【表１】
2007000053.tif 000002
【００７７】
表１中、表現型について「欠失」とは、当該タンパク質の生成量がほぼゼロである完全欠失を意味し、「低下」とは当該タンパク質の生成量が野生型に比べて減少していることを意味し、「正常」とは当該タンパク質の生成量が野生型と同等であることを意味する。
【００７８】
なお各品種の育成については、以下の文献で報告されている。
【００７９】
- 秣食豆公503［ダイズ遺伝資源由来］：  Kitamura, K. et al. Mutant strains with low level of subunits of 7S globulin in soybean (Glycine max Mell.) seed. (1981) Japan. J. Breed. 31(4)：353-359
- 毛振［ダイズ遺伝資源由来］：  Kitamura, K. et al. Mutant strains with low level of subunits of 7S globulin in soybean (Glycine max Mell.) seed. (1981) Japan. J. Breed. 31(4)：353-359
- タチユタカ：  橋本鋼二ほか．ダイズ新品種「タチユタカ」の育成．東北農試研報．77：27-44（1988）
- 刈系434号［(毛振//大館１号/秣食豆公503)/タチユタカ×2に由来］：  Ogawa, T. et al. Genetic improvement of seed storage proteins using three variant alleles of 7S globulin subunits in soybean (Glycine max L.). (1989) Jpn. J. Breed. 39(2)：137-147 
- ゆめみのり［γ線照射した刈系434号に由来］：  Takahashi, K. et al. Inheritance of α-subunit deficiency of β-conglycinin in soybean (Glycine max L. MERRILL) line induced by γ-ray irradiation. (1996) Breed.Sci. 46：251-255 
【００８０】
実施例１: ダイズ７Ｓグロブリンαサブユニット遺伝子の塩基配列解析
「刈系434号」、「毛振」及び「ゆめみのり」のそれぞれの幼葉約100mgから、PhytoPure DNA extraction kit（アマシャムバイオサイエンス）を用いて添付のプロトコールに従って、ゲノムDNAを抽出した。
【００８１】
調製したゲノムDNAをテンプレートDNAとして、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法によりDNA断片を増幅した。このPCRにおいては、国際塩基配列データベース（DDBJ/EMBL/GenBank）から登録番号AB051865（ゲノム配列；ダイズ品種「Forrest」由来）により入手できる７Ｓα遺伝子の既知塩基配列（配列番号５）に基づいて７Ｓα遺伝子全長を増幅するように設計された、以下のプライマーを用いた。
【００８２】
・フォワードプライマー CG2TF: 5'-GGGTCATCGGGAACTAGTTCA-3'（AB051865の塩基配列上の第430位〜第452位の配列に相当；配列番号１９）
・リバースプライマ−   CG2TR: 5'-TTCATAGATGAAGCTCTAGTCATAGTTAC-3'（AB051865の塩基配列上の第2,919位〜第2,947位の配列に相当；配列番号２０）
【００８３】
PCR反応には、終濃度で1×バッファー、各0.2mM dNTP、1.5mM MgCl2、設定濃度のプライマー、1.25U DNAポリメラーゼ（ExTaq、TAKARA BIO INC.）、50〜100ngテンプレートDNAを含む25μlの反応液を用いた。PCR反応では、GeneAmp PCR system 9700（アプライドバイオシステムズ）を用いて、95℃で5分間の変性反応、続いて、95℃で30秒、62℃で30秒、72℃で1分を32回繰り返し、最後に72℃で7分間の伸長反応を行った。
【００８４】
PCR反応後、反応物中のPCR増幅断片を、１％アガロースゲル（L03「TAKARA」、TAKARA BIO INC.）を用いて100Vで50分間の電気泳動によって分離し、エチジウムブロマイドによるゲル染色後、紫外線下で可視化した。サイズマーカーとしては2-Log DNA Ladder（New England BioLabs）を使用した（以下の実験でも同様）。
【００８５】
電気泳動の結果、いずれの品種・系統でも、AB051865の配列（ゲノム配列）から予測される通りの約2.5kbの増幅断片が確認された（図２）。図２中、Ｍ：サイズマーカー、１：「刈系434号」、２：「毛振」、３：「ゆめみのり」を示す。
【００８６】
得られたDNA増幅断片を、核酸抽出キットQIAquick gel extraction kit（キアゲン）を用いてゲルから抽出し、それについてシークエンシング試薬BigDye terminatior v1.1 Cycle Sequencing kitおよびシークエンサーABI Prism 310 genetic analyzer（アプライドバイオシステムズ）を用いて、直接塩基配列を決定した。決定した配列については、オンラインソフトウェアCLUSTAL W（DNA Data Bank of Japan、http://www.ddbj.nig.ac.jp/）を用いて配列解析を行った。
【００８７】
表１に示す通り、７Ｓグロブリンαサブユニット遺伝子として「刈系434号」はCG-2遺伝子のみを有し、「毛振」はCG-3遺伝子のみを有することから、本実施例で決定された塩基配列は「刈系434号」ではCG-2遺伝子、「毛振」ではCG-3遺伝子のものである。しかし配列解析の結果、「刈系434号」と「毛振」について決定された塩基配列は、全く同一であった。従って、本実施例で配列決定されたαサブユニット遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを含む領域では、CG-2遺伝子とCG-3遺伝子は塩基配列上同一であった。
【００８８】
さらに、「刈系434号」及び「毛振」について決定した配列は、AB051865（ダイズ品種「Forrest」）の第482位から第2,908位までの配列と、１塩基を除いて完全に一致しており、その違いは「刈系434号」及び「毛振」の配列においてAB051865の配列の2,564塩基目に当たるシトシンがアデニンに置換しているのみであった（図３）。
【００８９】
一方、「ゆめみのり」の配列には、「刈系434号」の配列と比較して、４個のアデニン塩基の挿入が生じていた（図３）。その挿入位置は、AB051865配列の第704位〜第706位の３アデニン配列内に相当する。AB051865配列の第704位〜第706位は、AB051865配列にコードされる７Ｓα遺伝子の第１エキソン（野生型７Ｓα第１エキソン；配列番号１）の第215位〜第217位［第１エキソンの5'端の開始コドン「ATG」のAを第１位とした場合］に当たる。そして、このような４個のアデニン塩基の挿入により生じた塩基配列ＡＡＡＡＡＡＡ、すなわち、「ゆめみのり」のCG-2遺伝子上の第１エキソンに相当する領域（挿入変異型７Ｓα第１エキソン；配列番号３）の第215位〜第221位の７アデニン配列は、「毛振」にもAB051865配列にも存在しなかった。
【００９０】
次に、「ゆめみのり」について決定した配列から、それにコードされるアミノ酸配列を推定した。その結果、「ゆめみのり」の７Ｓαサブユニット遺伝子であるCG-2遺伝子においては、上記のような４個のアデニン塩基の挿入によりフレームシフトが生じ、第１エキソン中に終止コドンが生じていることが示された（図４、配列番号３及び４）。従って、この４塩基のアデニンの挿入が、「ゆめみのり」における７Ｓグロブリンαサブユニットの欠失の原因であると考えられた。
【００９１】
実施例２: ７Ｓグロブリンαサブユニットの欠失性の検出
実施例１で確認された「ゆめみのり」のCG-2遺伝子（７Ｓグロブリンαサブユニット遺伝子）における４個のアデニン塩基の挿入の検出を、PCR増幅により行った。
【００９２】
まず「タチユタカ」、「毛振」、「秣食豆公503」、「ゆめみのり」、「刈系434号」の幼葉から、実施例１と同様にしてゲノムDNAを調製し、それをテンプレートDNAとした。PCRには、以下のプライマーを設計して用いた。
【００９３】
・欠失型CG-2特異的フォワードプライマー CG2MF:
5'-GAAGAATGTGAAGAAGGTGAAAAAAAT-3'［配列番号１２］
（AB051865の塩基配列上の第685位〜第707位の配列＋４アデニン塩基挿入に相当）
・CG-2/CG-3共通フォワードプライマー CG23F: 
5'-AAGAAGAATGTGAAGAAGGTGAAAT-3'［配列番号１３］
（AB051865の塩基配列上の第683位〜第707位の配列に相当）
・CG-2/CG-3共通リバースプライマー CG23R: 
5'-GAATGCGACCATATGGTTTTTGA-3'［配列番号１４］
（AB051865の塩基配列上の第1,109位〜第1,132位の配列に相当）
【００９４】
ここで、欠失型CG-2特異的フォワードプライマー CG2MFは、４個のアデニン塩基の挿入配列を3'端に含む、欠失型CG-2遺伝子に特異的なプライマーである。
【００９５】
PCR増幅は２つの反応系で行った。欠失型CG-2特異的フォワードプライマー CG2MFとCG-2/CG-3共通リバースプライマー CG23Rとを組み合わせたプライマーセット（欠失型CG-2特異的プライマーセット）を、１つ目のPCR増幅に用い、またCG-2/CG-3共通フォワードプライマー CG23FとCG-2/CG-3共通リバースプライマー CG23Rとを組み合わせたプライマーセット（野生型７Ｓα特異的プライマーセット）を、２つ目のPCR増幅に用いた。
【００９６】
PCR反応には、終濃度で1×バッファー、各0.2mM dNTP、1.5mM MgCl2、各0.2μMのプライマー、1.25U DNAポリメラーゼ（ExTaq、TAKARA BIO INC.）、50〜100ngテンプレートDNAを含む25μlの反応液を用いた。PCR反応では、GeneAmp PCR system 9700（アプライドバイオシステムズ）を用いて、95℃で5分間の変性反応、続いて、95℃で30秒、62℃で30秒、72℃で1分を32回繰り返し、最後に72℃で7分間の伸長反応を行った。
【００９７】
PCR反応後、４％アガロースゲルを用いて、その他は実施例１と同様にしてPCR増幅産物を電気泳動により分離し、可視化した。その結果を図５及び図６に示す。図５及び図６中、Ｍ：サイズマーカー、２：「タチユタカ」、３：「毛振」、４：「秣食豆公503」、５：「ゆめみのり」、６：「刈系434号」を示す。
【００９８】
図５に示す通り、プライマーCG2MFとCG23Rを用いて行ったPCR増幅では、「ゆめみのり」のみ増幅断片が検出された。得られた増幅断片の長さは450bpであった。一方、プライマーCG23FとCG23Rを用いて行ったPCR増幅では、「ゆめみのり」以外の全品種・系統で、448bpの増幅断片が検出された（図６）。
【００９９】
以上の通り、「ゆめみのり」のCG-2遺伝子内の４アデニン塩基挿入部位に設計した欠失型CG-2特異的プライマーセットおよび野生型７Ｓα特異的プライマーセットにより、「ゆめみのり」に認められるような７Ｓα欠失の有無を２回のPCRで判定できる共優性のマーカーを、開発することができた。
【０１００】
実施例３: マルチプレックスPCRによる７Ｓα欠失性及び７Ｓα’欠失性の同時判定
ダイズ１１Ｓグロブリンの含量を増加させるためには、７Ｓαと７Ｓα’を同時に欠失させることが有効である。そこで、７Ｓα’をコードするCG-1遺伝子に特異的なプライマーを設計して優性マーカーとし、実施例２で用いた７ＳαのマーカーとのマルチプレックスPCRにより７Ｓαと７Ｓα’の欠失の有無を同時に判定する方法を検討した。
【０１０１】
図７には、マルチプレックスPCRによる７Ｓα欠失性及び７Ｓα’欠失性の同時判定法の一例として行った以下の実験の具体的手順の概要を示す。
【０１０２】
まず、７Ｓグロブリンαサブユニット遺伝子のmRNA配列として報告されているGenBank登録番号X17698の塩基配列（配列番号７）と、７Ｓグロブリンα’サブユニット遺伝子（CG-1遺伝子）のmRNA配列として報告されているGenBank登録番号AB030838の塩基配列（配列番号１１）とをアラインメントした（図８）。このアラインメントでは９１％の高い相同性が示された。そこで、このアラインメントに基づき、CG-1遺伝子を特異的に増幅する以下のプライマーセット（CG-1特異的プライマーセット）を設計した。
【０１０３】
・CG-1特異的フォワードプライマー CG1F: 
5'-GTCACAACAAGTGCCTCCGA-3'［配列番号１５］
（AB030838の塩基配列上の第158位〜第177位の配列に相当）
・CG-1特異的リバースプライマー CG1R: 
5'-GGTGCTTTTCCTGCTTGTG-3'［配列番号１６］
（AB030838の塩基配列上の第547位〜第565位の配列に相当）
【０１０４】
マルチプレックスPCRには、このCG-1特異的プライマーセットに加えて、実施例２で用いた欠失型CG-2特異的プライマーセットを用いた。さらに、増幅断片が得られない場合にPCR反応自体が不成功に終わった可能性を除くため、ダイズタンパク質Gly-m Bd 30Kをコードする遺伝子の一部を増幅するプライマーセットも、ポジティブコントロールとして反応液に加えた。なおダイズタンパク質Gly-m Bd 30Kは、ダイズ貯蔵タンパク質に含まれる主要なアレルゲンであり、これまでの大規模なスクリーニングによっても欠失体は得られていない。このポジティブコントロール用プライマーセットは、以下のプライマーからなる。
【０１０５】
・ポジティブコントロール・フォワードプライマー30KF:
5'-AGCTCACTAATCACTATATATACGACATGCT-3'［配列番号１７］
（GenBank登録番号AB013289の塩基配列上の第4,562位〜第4,592位の配列に相当）
・ポジティブコントロール・リバースプライマー30KR:
5'-CACAGCCCCCTTGGTACTTTAC-3'［配列番号１８］
（GenBank登録番号AB013289の塩基配列上の第5,094位〜第5,115位の配列に相当）
【０１０６】
以上のCG-1特異的プライマーセット（CG1F及びCG1R）、欠失型CG-2特異的プライマーセット（CG2MF及びCG23R）、及びポジティブコントロール用プライマーセット（30KF及び30KR）は、まとめてプライマーセット（Ａセット）として検出用に用いた。
【０１０７】
さらに、実施例２で用いた野生型７Ｓα特異的プライマーセット（CG23F及びCG23R；上記挿入変異を含まない野生型７Ｓα遺伝子を増幅する）と、上記ポジティブコントロール用プライマーセット（30KF及び30KR）を、まとめてプライマーセット（Ｂセット）としてコントロール用に用いた。
【０１０８】
表２には、本実施例におけるプライマーとその使用形態をまとめた。
【０１０９】
【表２】
2007000053.tif 000003
【０１１０】
反応液は図７に記載された組成で全量25μlとして調製した。なおテンプレートDNAは実施例１と同様にして調製した。PCR反応は、GeneAmp PCR system 9700（アプライドバイオシステムズ）を用いて、以下の条件で行った：95℃で5分、続いて、95℃で30秒、62℃で30秒、72℃で1分を32サイクル、続いて72℃で7分の後、4℃で保持。
【０１１１】
PCR反応後、実施例２と同様にしてPCR増幅産物を電気泳動により分離し、可視化した。その結果を図９（Ａセット使用）及び図１０（Ｂセット使用）に示す。図９及び図１０中、Ｍ：サイズマーカー、１：「タチユタカ」、２：「毛振」、３：「秣食豆公503」、４：「ゆめみのり」、５：「刈系434号」を示す。
【０１１２】
図９に示すように、プライマーセットＡを用いて行ったPCR増幅では、450bpの増幅断片が「ゆめみのり」のみで得られ、この増幅断片長は欠失型CG-2特異的プライマーセットによる増幅サイズと一致していた。また「タチユタカ」及び「秣食豆公503」では、408bpの増幅断片が得られ、この増幅断片長はCG-1特異的プライマーセットによる増幅サイズと一致していた。さらに「毛振」及び「刈系434号」では、ポジティブコントロールプライマーによるもの以外の増幅断片は検出されなかった。なおポジティブコントロール用プライマーセットによる554bpの増幅断片は、全サンプルで検出された。
【０１１３】
一方、図１０に示すように、プライマーセットＢを用いて行ったコントロール用のPCR増幅では、「ゆめみのり」以外の品種で448bpの増幅断片が得られた。この増幅断片の長さは、野生型７Ｓグロブリンαサブユニット遺伝子を増幅する野生型７Ｓα特異的プライマーセットによる増幅サイズと一致していた。なおポジティブコントロール用プライマーセットによる554bpの増幅断片は、全サンプルで検出された。
【０１１４】
以上の結果は、上記表１に示した各品種・系統の特徴と完全に一致していた。このことから、これらのプライマーセットＡ、あるいはプライマーセットＡ及びＢをPCR増幅に用いることにより、７Ｓαの欠失性及び７Ｓα’の欠失性を同時に判定できることが示された。
【０１１５】
また、これらのプライマーセットＡ及びＢをPCR増幅に用いることにより、CG-1遺伝子の有無、野生型７Ｓα遺伝子の有無、欠失型CG-2遺伝子の有無から、ダイズ品種・系統が識別されることも示された。
【０１１６】
実施例４: ７Ｓα欠失性及び７Ｓα’欠失性の同時判定に基づくダイズの異品種・異系統混入検査
７Ｓグロブリンαサブユニット及びα’サブユニットの欠失性が異なるダイズ品種・系統の混入を、実施例３で述べた同時判定試験を利用して検査した。サンプルには、「ゆめみのり」（７Ｓα及び７Ｓα’の両方を欠失）のゲノムDNAに、「タチユタカ」（７Ｓα及び７Ｓα’の両方を有する）のゲノムDNAを混合した核酸試料を用いた。
【０１１７】
検出感度を確認するため、「ゆめみのり」のゲノムDNA量に対して0.1％、0.2％、0.5％、および1％となるように「タチユタカ」のゲノムDNAを加えたサンプルを用意し、それらをテンプレートDNAとした。
【０１１８】
各混入パーセンテージのテンプレートDNAを用い、実施例３と同様にして、Ａセット及びＢセットのプライマーセットを用いたPCR増幅を行った。PCR反応後、増幅産物を同様にして電気泳動し可視化した。その結果を図１１（Ａセット）及び図１２（Ｂセット）に示す。
【０１１９】
図１１に示される通り、プライマーセットＡを用いて検出を行った場合、DNA重量換算で0.1％以上の混入量で、CG-1遺伝子を示す408bpの増幅断片が認められた。またプライマーセットＢを用いて検出を行った場合、ゲノムDNA重量換算で0.2％以上の混入量で、野生型７Ｓα遺伝子を示す448bpの増幅断片が認められた（図１２）。
【０１２０】
この同時判定法では、７Ｓα及び７Ｓα’の欠失性が異なるダイズ品種の混入を、混入率（DNA重量換算）0.1〜0.2％程度でも検出することができたことから、この方法は検出限界が非常に低く、高感度であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１２１】
本発明の７Ｓグロブリンαサブユニット欠失ダイズの検出方法は、「ゆめみのり」又は「ゆめみのり」の兄弟系統、それらの子孫系統などの、７Ｓグロブリンαサブユニットを欠失したダイズ系統を簡便に検出するために使用することができる。この本発明の方法は、ダイズの混入検査法としても使用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】図１は、ダイズアレルゲン７Ｓα欠失ダイズ「ゆめみのり」の系譜を示す図である。
【図２】図２は、７Ｓα遺伝子全長を含むDNA増幅断片の電気泳動写真である。Ｍ: マーカー、レーン1: 「刈系434号」、レーン2: 「毛振」、レーン3: 「ゆめみのり」。
【図３−１】図３は、７Ｓα遺伝子について各品種・系統で決定したゲノム配列のアラインメントを示す図である。基準配列として７Ｓα遺伝子の既知配列である登録番号AB051865の配列を一緒に示した。図中、「ゆめみのり（Yumeminori）」のみ、AB051865の配列の第704位〜第706位に相当する位置に、４個のアデニン塩基の挿入が見られる。
【図３−２】図３は、７Ｓα遺伝子について各品種・系統で決定したゲノム配列のアラインメントを示す図である。図３−２は、図３−１の続きである。AB051865の配列の第2564位に相当する位置において、「刈系434号」、「毛振」及び「ゆめみのり」ではシトシン（Ｃ）からアデニン（Ａ）への置換が生じていた。
【図３−３】図３は、７Ｓα遺伝子について各品種・系統で決定したゲノム配列のアラインメントを示す図である。図３−３は、図３−１、図３−２の続きである。
【図４】図４は、「ゆめみのり」のCG-2遺伝子（７Ｓα遺伝子）においてフレームシフトが起こり、早期に終止コドンが生じたことを示す図である。
【図５】図５は、欠失型CG-2特異的プライマーセットを用いたPCR増幅の結果を示す電気泳動写真である。Ｍ: マーカー、レーン1: 「タチユタカ」、レーン2: 「毛振」、レーン3: 「秣食豆公503」、レーン4: 「ゆめみのり」、レーン5: 「刈系434号」。
【図６】図６は、野生型７Ｓα特異的プライマーセットを用いたPCR増幅の結果を示す電気泳動写真である。Ｍ: マーカー、レーン1: 「タチユタカ」、レーン2: 「毛振」、レーン3: 「秣食豆公503」、レーン4: 「ゆめみのり」、レーン5: 「刈系434号」。
【図７】図７は、７Ｓαと７Ｓα’の欠失性の同時判定方法の概要を示す図である。
【図８】図８は、登録番号X17698の配列とAB030838の配列とのアラインメントを示す図である。
【図９】図９は、プライマーセットＡを用いた７Ｓα’および７Ｓα遺伝子検出用のPCR増幅の結果を示す電気泳動写真である。Ｍ: マーカー、レーン1: 「タチユタカ」、レーン2: 「毛振」、レーン3: 「秣食豆公503」、レーン4: 「ゆめみのり」、レーン5: 「刈系434号」。
【図１０】図１０は、プライマーセットＢを用いたコントロール検出実験用のPCR増幅の結果を示す電気泳動写真である。Ｍ: マーカー、レーン1: 「タチユタカ」、レーン2: 「毛振」、レーン3: 「秣食豆公503」、レーン4: 「ゆめみのり」、レーン5: 「刈系434号」。
【図１１】図１１は、「ゆめみのり」への「タチユタカ」の混入を、プライマーセットＡを用いて検出した結果を示す電気泳動写真である。
【図１２】図１２は、「ゆめみのり」への「タチユタカ」の混入を、プライマーセットＢを用いて検出した結果を示す電気泳動写真である。
【配列表フリーテキスト】
【０１２３】
配列番号１２〜２０の配列はプライマーである。
【図１】
2007000053.tif 000004
【図２】
2007000053.tif 000005
【図３−１】
2007000053.tif 000006
【図３−２】
2007000053.tif 000007
【図３−３】
2007000053.tif 000008
【図４】
2007000053.tif 000009
【図５】
2007000053.tif 000010
【図６】
2007000053.tif 000011
【図７】
2007000053.tif 000012
【図８】
2007000053.tif 000013
【図９】
2007000053.tif 000014
【図１０】
2007000053.tif 000015
【図１１】
2007000053.tif 000016
【図１２】
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【配列表】
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