(57)【要約】【課題】清浄環境下でも発症し、さらにその発症の程度がマウスの遺伝系列に左右されないアトピー性皮膚炎のモデルマウス、およびそれを用いた医薬品のスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】（１）生後１１週で耳皮膚の発赤及び肥厚、掻痒行動が確認され、（２）生後１２週で血清ＩｇＡ値及びＩｇＥ値が高く、（３）生後１６週で耳皮膚並びに眼及び口の周囲の皮膚の肥厚、激しい掻痒行動が観察され、さらに血清ＩｇＧ１値が高いという特性を劣性遺伝形式で有する、アトピー性皮膚炎マウスおよびその子孫；該マウスおよびその子孫から単離されてなる臓器、組織又は細胞；ならびに該マウスおよびその子孫を用いる医薬品のスクリーニング方法など。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記特性を劣性遺伝形式で有する、アトピー性皮膚炎マウス：
（１）生後１１週で耳皮膚の発赤及び肥厚、掻痒行動が確認される、
（２）生後１２週で血清ＩｇＡ値及びＩｇＥ値が高い、
（３）生後１６週で耳皮膚並びに眼及び口の周囲の皮膚の肥厚、激しい掻痒行動が観察され、さらに血清ＩｇＧ１値が高い。
【請求項２】
さらに生後１２週齢で血清ＩｇＧ１値が高い、請求項１記載のアトピー性皮膚炎マウス。
【請求項３】
生後２０週で耳皮膚の発赤及び肥厚、掻痒行動が確認されるという特性を劣性遺伝形式で有する、アトピー性皮膚炎マウス。
【請求項４】
生後３０週で耳皮膚の発赤及び肥厚、掻痒行動が確認されるという特性を、劣性遺伝形式で有する、アトピー性皮膚炎マウス。
【請求項５】
Ｃ５７ＢＬ/６マウス由来である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアトピー性皮膚炎マウス。
【請求項６】
ＳＰＦ環境下で臨床症状を呈する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアトピー性皮膚炎マウス。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のアトピー性皮膚炎マウスの子孫。
【請求項８】
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスとの雑種である、請求項７記載のアトピー性皮膚炎マウスの子孫。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のアトピー性皮膚炎マウス又は請求項７又は８記載のアトピー性皮膚炎マウスの子孫から単離されてなる臓器、組織又は細胞。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のアトピー性皮膚炎、請求項７又は８記載のアトピー性皮膚炎マウスの子孫、又は請求項９記載の臓器、組織もしくは細胞から得られる細胞株。
【請求項１１】
該細胞又は細胞株がＴ細胞もしくはＢ細胞、又はそれらの細胞株である、請求項９又は１０記載の細胞又は細胞株。
【請求項１２】
請求項１１に記載の細胞又は細胞株を免疫不全マウスに移入することを特徴とするアトピー性皮膚炎マウスの作出方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の作出方法により得られたアトピー性皮膚炎マウス。
【請求項１４】
請求項１〜７及び１３のいずれか１項に記載のアトピー性皮膚炎マウス、又は請求項７又は８記載のアトピー性皮膚炎マウスの子孫を用いることを特徴とする医薬品のスクリーニング方法。
【請求項１５】
医薬品が、アトピー性皮膚炎の予防、治療及び／又は診断用である、請求項１４記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
請求項１〜７及び１３のいずれか１項に記載のアトピー性皮膚炎マウス又は請求項７又は８記載のアトピー性皮膚炎マウスの子孫に対して、被検物質を投与し、アトピー性皮膚炎の改善効果を検定することを含む、アトピー性皮膚炎の予防、治療及び／又は診断に有用な物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアトピー性皮膚炎マウスに関し、より詳しくは、清浄環境下でも発症し得るアトピー性皮膚炎のモデルマウスに関する。
【背景技術】
【０００２】
アトピー性皮膚炎（Ａｔｏｐｉｃ  Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ、以下ＡＤと記す）は、主に外的刺激に対する炎症性皮膚病であり、掻痒性、慢性反復性、遺伝的背景を有し、血清中において高いＩｇＥレベルを伴うことを特徴とする。ＡＤ発症のメカニズムは未だ完全には解明されていないが、活性化Ｔ細胞、好塩基球あるいは肥満細胞上のＦｃεＲに結合したイムノグロブリン（以下、Ｉｇと記す）Ｅ分子の架橋によって誘導された好塩基球と肥満細胞との活性化の結果、Ｔｈ２に関連したサイトカインとケミカルメディエーターの生成が起こることが重要と考えられる。上記サイトカインとは、インターロイキン（以下、ＩＬと記す）−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−５であり、ケミカルメディエーターとはヒスタミン、セロトニン等である。特に好塩基球と肥満細胞の活性化には抗原特定的ＩｇＥが重要な役割を果たすものである（獲得型のアレルギー性反応）。
【０００３】
ＡＤモデルマウスとして報告されたものには自然発症のもの５系統〔ＮＣ/Ｎｇａ、ＮＯＡ、ＤＳ−Ｎｈ、ＭＡＤ（以上、非特許文献１参照）、ｎａｄ/ｎａｄ（特許文献１参照）〕、遺伝子操作されたもの７系統〔ＩＬ−４  Ｔｇ、ＣＡＳＰ１  Ｔｇ、ＩＬ−１８  Ｔｇ、ＩＬ−３１  Ｔｇ、Ｒｅ１Ｂ−ＫＯ（以上、非特許文献１参照）、ＣａｔＥ−ＫＯ（特許文献２、非特許文献１参照）、ＭＡＩＬ−ＫＯ（特許文献３、非特許文献２参照）〕、抗原塗布等による皮膚炎誘発モデルが４種類、さらにヒト化マウスにＡＤ患者の血液成分を移植して作成された例等が報告されている。さらに特許文献４にはエピレグリン遺伝子欠損動物が、特許文献５にはＧＡＴＡ−３遺伝子導入アトピー性皮膚炎モデル動物が開示されている。これらはそれぞれ一長一短があり、ＡＤモデルマウスとして使用する上で幾つかの制限を受けている。
【０００４】
自然発症の最初の４系統のモデルマウス全て及び遺伝子操作されたマウスの一部（ＣａｔＥ−ＫＯ）では、感染の起こりにくいＳＰＦ環境で飼育した場合はＡＤを発症せず、清浄度のコントロールされていないコンベンショナルな環境で飼育する必要がある。ＡＤを含めたアレルギー性疾患は一般に遺伝的素因と環境素因（獲得型のアレルギー性応答）の複合で発症すると考えられていることから、ヒトの生活環境に近いと思われるコンベンショナルな環境でのみＡＤを発症する方が一見すると合理的である。
【０００５】
しかし、研究、診断薬の評価をする上では大きな問題となる。なぜならコンディショナルな飼育環境は地域や施設、あるいは個々の飼育ケージによっても大きく異なっており、発症を誘発もしくは増悪させる環境条件を一致させることが極めて困難なため、薬剤有効性等の評価が難しいからである。
【０００６】
自然発症の系統であるｎａｄ／ｎａｄマウスではＳＰＦでも発症するなど、この点は克服されている。しかしながら、もともと郡山市で捕獲された野生マウスに由来する突然変異マウスであるため、遺伝的な背景が複雑である。Ｃ５７ＢＬ／６系統に移植された場合はその症状が著しく弱まり、掻痒行動等の臨床症状が認められない。また、症状が明瞭に認められるもともとの遺伝子背景や、アレルギー症状の出やすいＢＡＬＢ／ｃ系統に交配した場合は性的に成熟する前の早い段階から劇的な皮膚病変が形成され、１２週齢にいたる頃にはほとんどが感染症等で死んでしまう。
【０００７】
遺伝子操作により作製されたＡＤモデルとして報告されたモデルの幾つかはＩｇＥの有無に関係なく（ＣＡＳＰ１  ＴｇとＩＬ−１６  Ｔｇ）、あるいはＩｇＥの数値に変動がない（ＩＬ−３１  Ｔｇ）、あるいはＩｇＥが上昇する個体としない個体がある（ＩＬ−４  Ｔｇ）などの特徴を持つことからＩｇＥが上昇するというＡＤの定義とは少し異なる疾患モデルであると考えられる。他にＲｅｌＢ−ＫＯマウスは掻痒症状を呈さない、ＭＡＩＬ（ＩｋＢζ）−ＫＯマウスは周産期致死率が非常に高く、皮膚炎症症状が激烈であるなどの点でＡＤモデルとしては不完全である。エピレグリンのＫＯマウスでは糸球体腎炎、関節炎や炎症性腸炎等の全身性の自己免疫症状を呈することから、アレルギー性皮膚炎モデルとしては特殊なものである。
ＯＶＡ、あるいはＤＮＦＢ等の反復塗布によるＡＤモデルは作製のための操作に労力がかかり、かつ実験操作者の手技による変動があることから、大量の個体数を必要とするような薬剤試験には不向きであると考えられる。ＧＡＴＡ−３トランスジェニックマウスもこの点においては同様であり、抗原刺激を必要とするなどの点が煩雑である。
【特許文献１】特開２００４−１０５１１３号公報
【特許文献２】特開２００４−０４１１２３号公報
【特許文献３】特開２００４−３２１１１２号公報
【特許文献４】特開２００４−２９００３８号公報
【特許文献５】特開２００４−１６６６９６号公報
【非特許文献１】Gutermuth J, Ollert M, Ring J, Behrendt H, Jakob T. Mouse models of atopic eczema critically evaluated. Int Arch Allergy Immunol. 2004, 135, 262-276
【非特許文献２】Shiina T, Konno A, Oonuma T, Kitamura H, Imaoka K, Takeda N, Todokoro K, Morimatsu M. Targeted disruption of MAIL, a nuclear IkappaB protein, leads to severe atopic dermatitis-like disease. J Biol Chem. 2004, 279, 55493-55498
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、アトピー性皮膚炎の分子生物学的な研究や診断のために、清浄環境下でも発症し、さらにその発症の程度がマウスの遺伝系列に左右されない、新しいアトピー性皮膚炎のモデルマウスの提供を目的とする。さらに本発明はそれらを用いた医薬品のスクリーニング方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題に鑑み、新規なアトピー性皮膚炎マウスの作製を試みた。化学変異原ＥＮＵ（エチルニトロソウレア）によりランダムな点突然変異を誘導し、その子孫を兄妹交配することで劣性遺伝形式のミュータントを作製し、その表現型をアトピー性皮膚炎症状に絞って検索するという手法を用いてスクリーニングを行った結果、従来にない表現型を有するアトピー性皮膚炎マウスを得ることに成功した。すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕下記特性を劣性遺伝形式で有する、アトピー性皮膚炎マウス：
（１）生後１１週で耳皮膚の発赤及び肥厚、掻痒行動が確認される、
（２）生後１２週で血清ＩｇＡ値及びＩｇＥ値が高い、
（３）生後１６週で耳皮膚並びに眼及び口の周囲の皮膚の肥厚、激しい掻痒行動が観察され、さらに血清ＩｇＧ１値が高い；
〔２〕さらに生後１２週齢で血清ＩｇＧ１値が高い、上記〔１〕のアトピー性皮膚炎マウス；
〔３〕生後２０週で耳皮膚の発赤及び肥厚、掻痒行動が確認されるという特性を劣性遺伝形式で有するアトピー性皮膚炎マウス；
〔４〕生後３０週で耳皮膚の発赤及び肥厚、掻痒行動が確認されるという特性を、劣性遺伝形式で有する、アトピー性皮膚炎マウス；
〔５〕Ｃ５７ＢＬ/６マウス由来である、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかのアトピー性皮膚炎マウス；
〔６〕ＳＰＦ環境下で臨床症状を呈する、上記〔１〕〜〔５〕のいずれかのアトピー性皮膚炎マウス；
〔７〕上記〔１〕〜〔６〕のいずれかのアトピー性皮膚炎マウスの子孫；
〔８〕Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスとの雑種である、上記〔７〕のアトピー性皮膚炎マウスの子孫；
〔９〕上記〔１〕〜〔６〕のいずれかのアトピー性皮膚炎マウス又は上記〔７〕又は〔８〕のアトピー性皮膚炎マウスの子孫から単離されてなる臓器、組織又は細胞；
〔１０〕上記〔１〕〜〔６〕のいずれかのアトピー性皮膚炎、上記〔７〕又は〔８〕のアトピー性皮膚炎マウスの子孫、又は上記〔９〕の臓器、組織もしくは細胞から得られる細胞株；
〔１１〕該細胞又は細胞株がＴ細胞もしくはＢ細胞、又はそれらの細胞株である、上記〔９〕又は〔１０〕の細胞又は細胞株；
〔１２〕上記〔１１〕の細胞又は細胞株を免疫不全マウスに移入することを特徴とするアトピー性皮膚炎マウスの作出方法；
〔１３〕上記〔１２〕の作出方法により得られたアトピー性皮膚炎マウス；
〔１４〕上記〔１〕〜〔７〕及び〔１３〕のいずれかのアトピー性皮膚炎マウス、又は上記〔７〕又は〔８〕のアトピー性皮膚炎マウスの子孫を用いることを特徴とする医薬品のスクリーニング方法；
〔１５〕医薬品が、アトピー性皮膚炎の予防、治療及び／又は診断用である、上記〔１４〕のスクリーニング方法；
〔１６〕上記〔１〕〜〔７〕及び〔１３〕のいずれかのアトピー性皮膚炎マウス又は上記〔７〕又は〔８〕のアトピー性皮膚炎マウスの子孫に対して、被検物質を投与し、アトピー性皮膚炎の改善効果を検定することを含む、アトピー性皮膚炎の予防、治療及び／又は診断に有用な物質のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のアトピー性皮膚炎マウスを用いることにより、
（１）アトピー性皮膚炎を引き起こす遺伝子変異を同定することができる、
（２）アトピー性皮膚炎の発症時期を左右する遺伝子変異を同定することができる、
（３）清浄環境下でアトピー性皮膚炎を自然発症するモデルマウス系統を利用することができる、
等の研究・開発が可能であり、アトピー性皮膚炎の発症メカニズムの解明、発症を左右する遺伝子の解明、薬剤開発の為の生体モデルとしての利用等に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本明細書において、アトピー性皮膚炎マウスとは、下記の特性を劣性遺伝形式で有する限り、アトピー性皮膚炎の原因となる遺伝子変異をホモ又はヘテロのいずれの状態で有していてもよい。本発明のアトピー性皮膚炎マウスは、その特徴的な症状（病態）を発症する時期により大きく２群に分けることができる。その特性としては以下の通りである。
特性１：
（１）生後１１週で耳皮膚の発赤及び肥厚、掻痒行動が確認される。
（２）生後１２週で血清ＩｇＡ値及びＩｇＥ値が高い。
（３）生後１６週で耳皮膚並びに眼及び口の周囲の皮膚の肥厚、激しい掻痒行動が観察され、さらに血清ＩｇＧ１値が高い。
特性１において、好ましくは生後１２週で血清ＩｇＧ１値が高い。
特性１において、本発明のアトピー性皮膚炎マウスの生後１２週におけるＩｇＡ値及びＩｇＥ値は、好ましくは、野生型マウスの平均値±標準偏差の２倍の数値を上回っている。
特性２：
生後２０週で耳皮膚の発赤及び肥厚、掻痒行動が確認される。
特性２において、本発明のアトピー性皮膚炎マウスでは生後１６週目では臨床症状が観察されない。
特性２において、好ましくは生後１６週におけるＩｇＧ１値は野生型マウスの平均値±標準偏差の２倍を上回っている。
特性３：
生後３０週もしくはそれ以降で耳皮膚の発赤及び肥厚、掻痒行動が確認される。
【００１２】
上記、特性１〜３を発症する時期の特定は、後述の実施例に詳述するスクリーニング方法にのっとって、胎生期、生後１２週目、生後１６週目での各種の検査によって導きだされたものであるので、例えば生後１１週、生後１２週、生後１６週、生後２０週、生後３０週と定義づけられる場合であってもその前後１４日程度の変動を含むものである。
【００１３】
前記特性の原因となる遺伝子変異をホモ又はヘテロの状態で有する限り、そのマウスの種類（系統）、すなわちその遺伝的背景としてのマウスの種類自体は特に制限されないが、本発明は、Ｔリンパ球のヘルパー細胞の志向性がＴｈ１に大きく傾いていて既存のアレルギーモデルマウスでは殆どアレルギー性疾患を発症することがなかったＣ５７ＢＬ／６系統のマウスにおいて顕著な臨床症状を呈することから、本発明のアトピー性皮膚炎マウスの遺伝子背景として好ましくはＣ５７ＢＬ／６系統マウスである。
【００１４】
Ｃ５７ＢＬ／６系統マウスは、近交系で免疫学的に解析が最も進んでいるマウスのひとつで、野生型のみならずさまざまな遺伝子操作動物がこの系統にバッククロスして解析されており、免疫系解析の情報量が最も多い実験動物系統であると言える。従って、それらの遺伝子操作動物との交配実験が容易である。
また、この系統ではＴｈ志向性がＴｈ１方向によっていることから、本来であればアレルギー症状やアレルギーが起きにくい系統である。この系統でアレルギー疾患を探索することで、「ＢＡＬＢ／ｃ系統本来が持つ遺伝子変異との協調作用で疾患が発生するために原因遺伝子の特定が難しい」といった、アレルギー疾患を起こしやすいＢＡＬＢ／ｃ系統等で生じる問題も回避しやすいと推定される。
【００１５】
本明細書において、ホモ接合体とは、上記特性の原因となる遺伝子変異をホモの状態で有するマウスを意味し、ヘテロ接合体とは該遺伝子変異をヘテロの状態で有するマウスを意味する。本発明のアトピー性皮膚炎マウスにはアトピー性皮膚炎を自然発症するホモ接合体、及び皮膚炎を発症しないヘテロ接合体のいずれもが包含される。ヘテロ接合体は、無症状で正常マウスと同等の寿命を有するため、扱いやすく、継代や遺伝子変異の運搬等を行う場合に有利である。
【００１６】
本発明のアトピー性皮膚炎マウスは具体的には以下のような方法によって作製することができる。
Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）という化学変異原物質を成熟した初代（Ｇ０）の雄マウスに投与し、その精子にランダムな点突然変異を生じさせる。この雄と野生型雌から生まれた第１世代（Ｇ１）マウスから優性突然変異マウスを得る。得られたＧ１雄マウスと野生型雌マウスとを交配し第２世代（Ｇ２）マウスを得る。優性突然変異が遺伝しているＧ２マウスを兄妹交配することで第３世代（Ｇ３）マウスを得る。Ｇ３マウスから得られる、１／１６の頻度で発生されると推定される劣性突然変異マウスをその表現型をアトピー性皮膚炎症状に絞って検索する。
【００１７】
ＥＮＵを用いる上記方法は、方法自体は１９６０年代には開発されていたが、発明の目的に対してはいくつかの点で非常に優れている。
既存の技術では自然発症ミュータントか遺伝子操作による外来遺伝子導入によってアトピー性皮膚炎マウスが探索されていた。しかし自然発症ミュータントの出現率は著しく低い。これに対して本方法では１家系のゲノムに３０００箇所、遺伝子をコードしている領域に限っても１００箇所の点突然変異が見込める。年間３０家系のスクリーニングにより３０００種類の遺伝子変異マウスの検索が理論上可能である。又、遺伝子操作による特定遺伝子欠損マウスではしばしば致死性もしくは予測しない表現型の出現が問題となるが、この方法では点突然変異を誘発した上で生存個体を検索するものであり、欠損すれば致死的になる遺伝子の変異による表現型も期待できる。
【００１８】
スクリーニング内容としては以下の手段が例示される。各手段を適当な発生段階にあるＧ３マウスに適用することによってスクリーニングが実施され得る。
（１）発生学的観察
胎生１７日目で胎仔を実体顕微鏡下で観察することにより、体長、外表奇形や内臓発達について観察する。
（２）臨床症状観察
生後４週目より毎週、以下の項目について目視にて確認する。
・外表記系の有無、歩行行動や反射行動の異常の有無
・眼瞼、口唇、顔面、耳皮膚等における表皮のあれ、表皮の肥厚、浮腫の有無
・眼瞼や口周囲の湿疹及び脱毛の有無
・反復、持続する掻痒行動の有無
・皮膚炎により病変部皮膚の症状の進行により皮膚剥離、落屑、滲出、血痂、びらん等の有無
（３）病理組織学的観察
当分野で実施されている種々の方法を用いることができる。例えば、適当な皮膚検体を切出し、ホルマリンで固定した後にポリエステルワックスに包埋することにより作製したブロックを薄切した切片標本を適宜所望する検査に付し観察する。例えばヘマトキシリン−エオシン染色により表皮の肥厚や末梢神経の肥大、掻破による組織の損傷、さらには単核細胞ならびに皮膚に浸潤した好中球及び抗酸球等の顆粒球の数を測定する。トルイジンブルー染色により、皮膚に浸潤した肥満細胞の数を測定する。免疫組織染色により皮膚に浸潤したＴ細胞、Ｂ細胞及びそれらの分類・同定を行う。
（４）リンパ器官分化の判定
当分野で実施されている種々の方法を用いることができる。例えば、胎仔においては腸管及び腎臓、大動脈を取り出してホールマウント免疫染色を行うことによりパイエル板及びリンパ節原基の形成を確認することができる。胸腺、肝臓の組織の一部より組織を取り出して病理組織学的観察を行うと同時に、別の一部から細胞を取り出してフローサイトメーター(FACSCaliburなど)を用いて白血球の表面マーカーを観察し、白血球プロファイルを調べる。成体においては胸腺、脾臓、リンパ節、パイエル板などのサイズを測定して比較する。
（５）血液細胞の分化能力の判定
胎仔肝臓より取り出した白血球を様々なサイトカイン存在下で培養し、コロニー形成能や分化能力を判定する。また、成体骨髄より採取した細胞を動揺に様々なサイトカインやリガンド存在下で培養し、肥満細胞、マクロファージ、樹状細胞などへの分化能力を観察する。
（６）血液細胞の試験管内での増殖・分化能力の判定
当分野で実施されている種々の方法を用いることができる。例えば、脾臓の中からＣＤ４陽性Ｔ細胞を取り出してＩＬ−２で増殖刺激する、あるいは系統の異なるマウスの脾細胞と混合培養することで増殖を誘導することができる。増殖の判定に関してはブロモデオキシウリジンの細胞への取り込みなどを測定する。
（７）末梢血検査による血球計算
当分野で実施されている種々の方法を用いることができる。例えば、被検マウスから採血し（採血時には凝固を防ぐためにＥＤＴＡ−２Ｋ等を添加）、自動分析装置ＡＤＶＩＡ１２０(バイエル社製)等を用いて白血球や赤血球の分類を行い、それぞれの分画について数を測定する。また、血小板数やヘモグロビン値やヘマトクリット値等を測定する。
（８）免疫グロブリン値測定
当分野で実施されている種々の方法を用いることができる。例えば、被検マウスから採取した血液（血清）中のＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３）、ＩｇＭ、ＩｇＡの濃度を以前に報告されたＥＬＩＳＡ法に基づいて測定する。
（９）フローサイトメトリーによる白血球プロファイルの検査
当分野で実施されている方法を用いることができる。例えば、被検マウスから得た胸腺細胞と脾臓細胞とを、モノクローナル抗体の様々な組み合わせで染色し、染色された細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ）、ＦＡＣＳａｌｉａ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）等の装置を使用して分析する。得られたデータは、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｏｍｙ  Ｄｉｇｉｔａｌ）等を用いて処理する。
（１０）抗核抗体検査
抗核抗体とは、真核細胞の種々の核成分を特異抗原とする自己抗体で、全身性エリテマトーデス、種々の自己免疫疾患患者の血清中に出現する。抗核抗体には、対応する特異抗原によって種々のものが同定されているが、疾患特異性の高い抗体も多く、また、抗体価が疾患の病態を反映する場合も多い。そのため、抗核抗体の測定は、自己免疫疾患等の臨床検査として有用性が高い。
抗核抗体は（ｉ）蛍光抗体法、（ｉｉ）ゲル内沈降法、（ｉｉｉ）ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＰＨＡ等により検査することができる。
（ｉ）蛍光抗体法
広く普及している測定法であり、抗核抗体群のすべてを一括してスクリーニングできるため、一次スクリーニングに適している。本検査で陽性が判明すれば、次の段階として、どの種類の特異的抗核抗体が陽性であるかを、特異抗原を使った検査法で確かめる。特異抗原によっては、染色パターンによってある程度まで対応抗原を推定することもできる。
Ｈｅｐ２培養細胞をスライドガラス上に固定し、希釈した被検マウスの血清を反応させる。洗浄後、蛍光標識した抗マウス免疫グロブリン抗体を反応させ、核成分に結合した抗核抗体の有無を判定する。染色は、核の辺縁部に強い蛍光を認めるパターンと、核全体に均一な蛍光を認めるパターンと、核に斑紋状の蛍光が観察されるパターン等に大別され、それらの染色パターンによって対応する抗原を推定することができる。
（１１）便検査・尿検査
潰瘍性大腸炎、慢性腎炎などの免疫機構破綻に伴う自己免疫疾患の有無を判定するために便・尿での潜血および尿タンパクの有無を調べる。方法は広く普及しているグアヤック法、あるいは市販の尿検査用テストテープを用いる。
【００１９】
本発明のアトピー性皮膚炎マウスの特性は、劣性遺伝形質であり、本発明によるマウスのアトピー性皮膚炎は、その原因となる遺伝子変異をホモの状態で有する場合（ホモ接合体の場合）において発症する。一方、ヘテロ接合体の外観は正常であり、なんら臨床症状を示さず、血中ＩｇＥ値も正常である。
【００２０】
本発明によるマウスの繁殖は、近交系動物の繁殖に通常用いられているように、兄妹交配によって増殖を行って、必要なマウス数を確保することができる。
例えば雌のヘテロ接合体個体と雄のヘテロ接合体個体とを用いて交配させ、生まれる子の中から、前記したような判別手段を用いてホモ接合体個体を選択することによって、目的とする個体を得ることができる。
【００２１】
本発明によるアトピー性皮膚炎マウスの飼育条件は、特に制限はなく慣用のマウス飼育法に従って飼育することができる。例えば、飼育条件は、室温２３〜２５℃、湿度４０〜６０％のコンベンショナルな環境下で、あるいはＳＰＦ環境下で、飼料として、普通飼料（ＳＰＦ環境では滅菌済）を不断給餌し、水は水道水（ＳＰＦ環境では滅菌済）を自由摂取させることである。また、マウスは木製チップを床敷きにした、あるいは紙製の床敷を用いたプラスチックケージあるいはアルミケージ、もしくは紙性のケージ内で飼育してもよい。
本発明によるアトピー性皮膚炎マウス（ホモ接合体）は、ＳＰＦ環境下においてもアトピー性皮膚炎を自然発症することができる。これに対して従来のアトピー性皮膚炎のモデルマウスであるＮＣ／Ｎｇａマウスは、ＳＰＦ環境下では全く発症せず、ダニ感染もしくはダニ抗原塗布による人為的発症処理を別途必要とする。本発明のマウスによれば、ＳＰＦ環境下でも皮膚炎を発症するため、実験処理を簡便にすることができ、また実験精度を高めることができる。このような既知モデルマウスにはない利点を本発明のアトピー性皮膚炎マウスが有することにより、好ましくは、本発明のアトピー性皮膚炎マウスはＳＰＦ環境下で飼育する。
【００２２】
本発明の別の態様によれば、前記したアトピー性皮膚炎マウスと任意のラボラトリーマウスとを交配させて得られる交雑マウスや、本発明のアトピー性皮膚炎マウス（前記特性の原因となる遺伝子変異を有する個体又は系統）に特定の近交系を用いて戻し交配することによって作製されるコンジェニック系マウスが包含される。
【００２３】
本発明は、前記アトピー性皮膚炎マウスから単離された臓器、組織又は細胞またはゲノムＤＮＡ及びそれに由来する転写、翻訳産物に関する。これらの単離物は、適当な条件下で流通、保存することができ、アトピー性皮膚炎の原因の解明を分子レベルで解析するためのツールとして有用であり、治療法の確立の検証にも役立つ。
前記臓器又は組織としては、肝臓、肺、腎臓、心臓、膵臓、胃、小腸、大腸、生殖器等の臓器、又は脳組織、神経組織、皮膚、皮下組織、上皮組織、骨、筋、毛、爪、骨髄、血管、血液、リンパ組織、リンパ液等の組織が含まれるが、これらに限定されるものではない。前記細胞としては、前記モデル動物から直接単離した細胞又は前記臓器もしくは組織から得られるあらゆる細胞またはゲノムＤＮＡ及びそれに由来する転写、翻訳産物が含まれる。
【００２４】
又、本発明は、前記臓器、組織又は細胞から得られる細胞株に関する。前記細胞株は、由来する臓器、組織又は細胞に応じて不死化することにより、あるいは自然発生的に得られるものであり、継代培養することができるので、好ましい。
【００２５】
前記細胞又は細胞株の中での、上記特性の原因となる遺伝子変異を有しているＴ細胞もしくはＢ細胞又はそれらの細胞株、好ましくはＴ細胞又はその細胞株が特に有用である。さらに、本発明は、前記細胞を免疫不全マウス、好ましくは同系の免疫不全マウスに移入することを特徴とするアトピー性皮膚炎マウスの作出方法に関する。前記細胞又は細胞株を免疫不全マウスに移入する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、皮内、皮下又は静脈から注入する方法が挙げられる。
【００２６】
本発明のアトピー性皮膚炎マウスを利用して医薬品、特にアトピー性皮膚炎の予防、治療用及び／又は診断用の医薬品をスクリーニングすることができる。
このような医薬品としては、例えば、本発明のアトピー性皮膚炎マウスが呈する上記特性（耳皮膚の発赤及び肥厚、掻痒行動、血清中のＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＧ１濃度の上昇）を改善する、あるいは通常レベルへの回復が可能な化合物であって、（１）抗ヒスタミン剤、抗アレルギー製剤、オピオイド受容体拮抗薬などの掻痒治療剤、（２）ステロイド製剤、ＦＫ５０６、サイクロスポリンなどの免疫抑制剤、（３）アレルギー疾患全般及びアトピー性皮膚炎発症過程に関わるサイトカイン、例えばＩＬ−４、ＩＬ−５やＩＦＮ−γ、それらの信号伝達分子のＳＴＡＴ−６などの、転写翻訳制御を標的としたｓｉＲＮＡ製剤、（４）表皮バリア機能の保護を目的とした保湿製剤や保護シート、（５）体質そのものを総合的に改善する漢方薬などの診断・治療薬としての検査に有用である。
これらの製剤のうち、（１）〜（３）に関してはアレルギー反応が臨床症状の本体であると思われるスギなどの花粉症や、食物アレルギー、接触性皮膚炎、気管支喘息などの疾患のために開発された薬剤の薬効を診断する実験動物としても有用である。
また、病理学的検査から疾患部位における表皮バリア機能異常により様々な細菌やウイルスへの易感染性も予想され、それらの感染によって起こる膿痂疹、水痘様発疹などの治療研究のモデルマウスとしての利用にも有用であると考えられる。
本発明のスクリーニング方法は具体的には、被検物質の投与条件下と非投与条件下で本発明のアトピー性皮膚炎マウスを飼育し、該被検物質のアトピー性皮膚炎の予防、治療及び／又は診断用の医薬品あるいはアトピー性皮膚炎の予防、治療及び／又は診断に有用な物質としての効果を評価することによって行う。評価は、例えば、耳皮膚の発赤及び肥厚、掻痒行動等の臨床症状の発現の有無、抗核抗体の出現レベル、血清中のＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＧ１の濃度上昇等を指標として行うことができる。こうした各指標の検査や測定は、上記方法を含めて、当該技術分野で公知の方法により実施することができ、例えば上記した本発明のアトピー性皮膚炎マウスを選別してくるときに用いた各種方法が利用できる。
より具体的には、本発明のアトピー性皮膚炎マウスに被検物質を投与することにより、アトピー性皮膚炎の症状が改善されれば、当該被検物質はアトピー性皮膚炎の治療薬候補として有用であると判定される。
【００２７】
「通常レベルへの回復」とは、本発明のアトピー性皮膚炎マウスで観察される、耳皮膚の発赤及び肥厚、掻痒行動等の臨床症状が見られなくなるか、又は殆ど見られず、さらに血清中のＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＧ１のレベルの上昇が抑制されているか、又は殆ど抑制されることを意味している。
【００２８】
「被検物質」は、任意の化合物あるいはその混合物であり得る。被検物質は、公知の化合物であっても今後開発される新規な化合物であってもよい。公知のものであれば商業的に入手可能であるか、各報告文献に従って採取、製造、精製等の工程を経て得ることができる。これらは、天然由来であっても、また遺伝子工学的に調製されるものであってもよく、また半合成等によっても得ることができる。
【００２９】
被検物質は、高分子、例えば生物学的ポリマーであり、有機分子、金属含有化合物、炭水化物、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物、糖タンパク質、リポタンパク質、核酸、抗体等が例示される。
【００３０】
受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６３０で表されるアトピー性皮膚炎マウスの受精卵は、茨城県つくば市東１−１−１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託されている（受託日：平成１７年８月１９日）。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例にそって本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。本出願全体を通して引用されたすべての刊行物は参照として本明細書に組み入れられる。また、本発明において使用する試薬や装置、材料は特に言及されない限り、商業的に入手可能である。
【００３２】
実施例１：ＥＮＵを用いたアトピー性皮膚炎マウスの作製
（１）ＥＮＵ投与用溶液の調製
ＥＮＵ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｎｏ．３３８５、−２０℃で保存）１ｇに４ｍＬの１００％エタノールを加えてＥＮＵ粉末を懸濁し、さらにリン酸クエン酸バッファー（０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４，０．０５Ｍ  Ｎａ３Ｃ６Ｈ５Ｏ７  ｐＨ５）を７６ｍＬ加えてＥＮＵの粉末が完全に溶けるまでよく振り混ぜた。３９５ｎｍでの吸光度を測定して、ＥＮＵの濃度を決定した（１ＯＤ＝１ｍｇ／ｍＬ）。１０ｍｇ／ｍＬとなるように調製したＥＮＵ投与用溶液は、使用分ずつ褐色バイアルに分注し、−２０℃で使用時まで保存した。分注・凍結保存したＥＮＵ投与用保存溶液は使用直前に融解し、再度吸光度測定により濃度を確認してから以降の実験に用いた。
【００３３】
（２）ＥＮＵのマウスへの投与
マウスは、投与前日〜投与直前に体重測定し、投与液量を換算してＥＮＵをマウスの腹腔内に投与した。ＥＮＵ投与後のマウスは紙製ディスポーザブルケージ、ならびに微細な塵が出にくい紙製床敷を用いて、投与後２４時間まで安全キャビネット内あるいはクローズドラック内で飼育した。
本実施例ではＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統マウスの雄（日本クレア）に、一週間間隔で２回、８５ｍｇ／ｋｇ体重のＥＮＵを投与した。この投与量は、事前の検査から１家系のゲノムあたりに３０００箇所の、遺伝子をコードする部位に限れば１００箇所の突然変異が入る投与量である。
ＥＮＵは変異原性と共に強い細胞毒性を有しているため、投与された個体（Ｇ０マウス）では投与後一時的に不妊となる。不妊期間（通常約７〜１０週）が短すぎる場合、ＥＮＵの投与量が少なく、逆に投与量が多すぎると不妊期間が長くなる。そこで、ＥＮＵ投与後の雄マウスは投与４〜５週後まで単独で飼育し、その後ＩＣＲマウス(日本クレア)と同居させ、投与後１１週間までにＩＣＲマウスを妊娠させた雄マウスは適切にＥＮＵ投与がなされなかったものと判断し、以降のＧ１マウスの生産には使用しなかった。
【００３４】
（３）マウスの作製とスクリーニング
上記（２）で得られたＧ０マウスで、投与後１１週間までＩＣＲマウスを妊娠させなかったマウスを用いてＧ１マウスを作製した。すなわち該Ｇ０マウスをＥＮＵ投与後１１週以降にＣ５７ＢＬ６Ｊ系統の雌マウス（日本クレア）とＩＶＦ−ＥＴ（人工授精と胚移植）させることによってＧ１マウスを得た。
続いて、６〜８週齢のＧ１マウスを用いて、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統の雌マウスとＩＶＦ−ＥＴを行うことによってＧ２マウスを得、さらにＧ２マウス同士のＩＶＦにより同一家系において約２４０匹の同腹受精卵（胚）を得た。これらをＩＣＲマウスの代理母の子宮に移植することにより成長させ、半数を胎生期（胎生１７日目）の胎仔６４匹以上、生後１２週目の成体４８匹以上抜き出して、さらに同一成体での生後１６週目の再検査により総合的にスクリーニングを行い表現型を判定した。
スクリーニングは、以下（１）〜（１１）の項目を上述した通りに行った。
（１）発生学的観察
（２）臨床症状観察
（３）病理組織学的観察
（４）リンパ器官分化の判定
（５）血液細胞の分化能力の判定
（６）血液細胞の試験管内での増殖・分化能力の判定
（７）末梢血検査による血球計算
（８）免疫グロブリン値測定
（９）フローサイトメトリーによる白血球プロファイルの検査
（１０）蛍光抗体法による核抗体検査
（１１）便検査・尿検査
【００３５】
（４）アトピー性皮膚炎マウス
スクリーニングの結果、第８家系（識別番号ＩＭ３−６５）成体８１匹中の５匹でアトピー性皮膚炎のモデルマウスとなりうる表現型を発見した。
第８家系は個体ＩＤがＩＭ３−４６というＧ１雄マウスに由来する家系であり、Ｇ２同士のＩＶＦ−ＥＴによる兄妹交配で８１匹の同腹仔を得た。生後１１週頃の観察でこのうち３匹（雄１匹、雌２匹）で耳皮膚の発赤と肥厚、掻痒行動が確認された。１２週齢の検査でこれらは３匹共に血清ＩｇＡ値及びＩｇＥ値が平均＋標準偏差２倍を上回って高値を示し、２個体ではＩｇＧ１値も高値であった。これらのマウスでは、生後１６週の検査で、耳皮膚に加え眼や口の周囲の皮膚も肥厚し、掻痒行動はさらに激しいものとなった。血液検査ではＩｇＧ１値が高値を示した。ＩｇＥ値はやや下がったが高値であった。
生後１６週までの時点では臨床症状を呈さなかった個体で２個体（雄１匹、雌１匹）が、生後２０週を過ぎたあたりから上記３個体と同様の外見と掻痒行動等の臨床症状を呈し始めた。さらに、生後３０週を過ぎた時点から耳皮膚の発赤や掻痒行動等の臨床症状を呈する個体が１個体出現した（メス１匹）。
このように、同一家系中に発症時期が異なるＡＤ様個体が複数出現した。これらの発症時期の異なるそれぞれの雌について症状を持たない同腹仔、あるいは野生型雄と交配したが、出産仔にはＡＤ様症状を認めなかった。このことからこの家系におけるＡＤ様の表現型が劣性遺伝形式として発現していることが推定される。さらにその発症時期が異なることからその発症に係る修飾因子となる複数の突然変異を含むことが推定された。