(57)【要約】【課題】捕集から遺伝子分析に至るまでの操作を短時間で、かつ精度よく微生物の検知を可能とする。【解決手段】分析チップの中で遺伝子の抽出から検出までの処理が行われる微生物検知システムにおいて、分析チップ３００は、試料溜め３１５と、遺伝子結合担体が充填された遺伝子抽出エリア３２０と、吸収剤が充填された廃液槽３３０と、洗浄液を保管する洗浄液保管槽３４０と、遺伝子溶離液を保管する溶離液保管槽３７０と、遺伝子増幅試薬を保管する遺伝子増幅試薬保管槽３８０と、遺伝子の増幅・検出を行う反応槽３９５と、がそれぞれ流路で形成され、少なくとも試料溜め３１５及び試薬保管槽３８０いずれかに流路幅が縮小して拡大する堰部を備える。【選択図】図７
2007289054.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
捕集機に設置され捕集材に微生物を捕集した後、前記捕集機から取り出し分析装置にセットされる捕集チップと、前記捕集チップで処理された液の一部を分析チップへ移され、前記分析装置の送液手段により前記分析チップの中で遺伝子の抽出から検出までの処理が行われる微生物検知システムにおいて、
前記分析チップは、
試料溜めと、遺伝子結合担体が充填された遺伝子抽出エリアと、吸収剤が充填された廃液槽と、洗浄液を保管する洗浄液保管槽と、遺伝子溶離液を保管する溶離液保管槽と、遺伝子増幅試薬を保管する遺伝子増幅試薬保管槽と、遺伝子の増幅・検出を行う反応槽と、がそれぞれ流路で形成され、少なくとも前記試料溜め及び前記試薬保管槽いずれかに流路幅が縮小して拡大する堰部を備えたことを特徴とする微生物検知システム。
【請求項２】
請求項１に記載のものにおいて、前記拡大する角度をθ2 として、前記試料または前記試薬と前記分析チップとの接触角αとの関係が、α−θ2 ＞０とされたことを特徴とする微生物検知システム。
【請求項３】
請求項１に記載のものにおいて、前記堰部の流路幅の縮小は、流路幅に対して１／４以下１／１０以上とされたことを特徴とする微生物検知システム。
【請求項４】
請求項１のものにおいて、前記遺伝子増幅試薬保管槽に連通する流路は、前記遺伝子増幅試薬保管槽よりも上方に配置されたことを特徴とする微生物検知システム。
【請求項５】
請求項１に記載のものにおいて、前記縮小する角度θ1 は、１０°以上８０°以下とされたことを特徴とする微生物検知システム。
【請求項６】
請求項１に記載のものにおいて、前記拡大する角度θ2 は、５°以上８０°以下とされたことを特徴とする微生物検知システム。
【請求項７】
請求項１に記載のものにおいて、前記試料は、前記遺伝子抽出エリアへ間欠的に送液されることを特徴とする微生物検知システム。
【請求項８】
捕集機に設置され捕集材に微生物を捕集した捕集チップで処理された液の一部を移され、分析装置の送液手段に遺伝子の抽出から検出までの処理が行われる分析チップにおいて、
試料溜めと、遺伝子結合担体が充填された遺伝子抽出エリアと、吸収剤が充填された廃液槽と、洗浄液を保管する洗浄液保管槽と、遺伝子溶離液を保管する溶離液保管槽と、遺伝子増幅試薬を保管する遺伝子増幅試薬保管槽と、遺伝子の増幅・検出を行う反応槽と、がそれぞれ流路で形成され、正面に開口された試料注入口と、背面に開口されたチップポートと、少なくとも前記試料溜め及び前記試薬保管槽いずれかに設けられた流路幅が縮小して拡大する堰部と、を備えたことを特徴とする分析チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大気中に浮遊する微生物を捕集し、微生物中の遺伝子を抽出して微生物の遺伝子検査を行う微生物検知システムおよび分析チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
取り扱いが容易で安価、かつ試料から遺伝子の抽出・分析までが一括して自動化可能とするため、遺伝子を含む試料が供給される注入口と、注入口に供給された試料に導入される溶解液を保管する溶解液保管部と、試料と溶解液とを混合した液が導入され、遺伝子と結合する遺伝子結合担体を備える遺伝子抽出部と、遺伝子抽出部に導入される洗浄液を保管する洗浄液保管部と、遺伝子抽出部に導入される溶離液を保管する溶離液保管部と、溶離液により溶離された遺伝子が導入される反応部と、を備えた遺伝子処理チップを用いることが、特許文献１に記載されている。
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−６５６０７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記従来技術に記載の分析装置に用いられる遺伝子処理チップは、遺伝子処理に必要な試薬が予めチップ内に保管されている形態であるものの、試薬を所定の場所へ留めておくことが考慮されていないため、遺伝子処理チップの持ち運び時や、分析装置へのセット時などに、試薬が誤流出してしまう恐れがある。そのため、遺伝子処理チップの取り扱いが煩わしく、また、誤流出により流体制御などの遺伝子処理操作が不安定となり、検査精度が低下する恐れがあった。
【０００５】
本発明の目的は、上記従来技術の課題を解決し、捕集から遺伝子分析に至るまでの操作を短時間で、かつ精度よく微生物の検知を可能なものとすることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するため、本発明は、捕集機に設置され捕集材に微生物を捕集した後、前記捕集機から取り出し分析装置にセットされる捕集チップと、前記捕集チップで処理された液の一部を分析チップへ移され、前記分析装置の送液手段により前記分析チップの中で遺伝子の抽出から検出までの処理が行われる微生物検知システムにおいて、前記分析チップは、試料溜めと、遺伝子結合担体が充填された遺伝子抽出エリアと、吸収剤が充填された廃液槽と、洗浄液を保管する洗浄液保管槽と、遺伝子溶離液を保管する溶離液保管槽と、遺伝子増幅試薬を保管する遺伝子増幅試薬保管槽と、遺伝子の増幅・検出を行う反応槽と、がそれぞれ流路で形成され、少なくとも前記試料溜め及び前記試薬保管槽いずれかに流路幅が縮小して拡大する堰部を備えたものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、遺伝子の抽出から検出までの処理が行われる分析チップにおいて、少なくとも試料溜め及び試薬保管槽いずれかに堰部を設けたので、試薬の誤流出がなく、精度よく、安定した微生物の検知が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の実施例を以下に説明する。  
芽胞を形成した細菌を大気中から捕集し、芽胞を処理した後に細菌から遺伝子を抽出し、ポリメラーゼ連鎖反応により遺伝子を増幅させることで、対象の細菌が存在するか否かを検出する例を説明する。ここで芽胞を形成する細菌とは、バチルス属菌，クロストリディウム属菌等の細菌である。
【０００９】
（細菌検知の流れ）  
細菌検知は大きく分けて、細菌の捕集工程，細菌芽胞に発芽促進剤を添加して細菌芽胞を発芽させる工程と、発芽した細菌から遺伝子を抽出する工程，遺伝子を増幅・検出する工程とからなる。遺伝子の抽出は、一般的に知られる固相抽出法により行う。固相抽出法とは、まず固体表面に遺伝子を特異的に結合させ、次に他物質と区別して遺伝子のみを水溶液に溶離させることで抽出する方法である。図１を参照して、細菌の検知方法を説明する。  
ステップ１・・・衝突法による細菌の捕集  
衝突法は、ノズルの上から空気を吸引してノズル下方に高速で噴出させ、ノズルの下に設けた衝突板に細菌を捕集する方法である。空気中の細菌はその粒径の２乗に比例した慣性力を得て、衝突板に付着する。フィルタ法のように目詰まりを起こさず、細菌が濃縮されて集まるという利点がある。
ステップ２・・・芽胞の発芽  
細菌芽胞に発芽促進剤を加え、一定時間を経過すると細菌芽胞が発芽を開始する。発芽する段階で、細菌は自ら芽胞を壊すので、発芽により細菌の細胞壁がむき出しの状態になる。
ステップ３・・・細胞膜の溶解  
試料にカオトロピックイオン（分子の直径が大きい−１価の陰イオン）を含む溶液を混合し、細菌の細胞膜をカオトロピックイオンの働きにより破壊する。またカオトロピックイオンは、同時に試料中に含まれる多くの蛋白質を変性し、ヌクレアーゼ（核酸を分解する酵素）の働きを阻害する。
ステップ４・・・遺伝子の捕獲  
溶解後の混合物にシリカが加わると、カオトロピックイオンの働きにより、遺伝子とシリカが特異的に結合する。一般的には混合物をガラスフィルタに通す方法が用いられる。
ステップ５・・・遺伝子の洗浄  
試料に含まれる蛋白質や、カオトロピックイオンが抽出物に混入すると、遺伝子増幅による遺伝子の検出を阻害するので、遺伝子−シリカを洗浄する操作が必要となる。通常では高濃度のエタノールにより洗浄する。遺伝子はこれらの溶液に溶解しにくい性質を持っているため、シリカに吸着している遺伝子はこの過程で溶離しない。
ステップ６・・・遺伝子の溶離  
洗浄後、水もしくは低塩濃度の溶液を遺伝子−シリカに加え、遺伝子をシリカから溶離する。  
ステップ７・・・遺伝子の検出  
溶離した遺伝子にプライマー（目的とするＤＮＡ領域の両末端の２０塩基ほどと同じ塩基配列をもつ一本鎖ＤＮＡ），ＤＮＡ合成酵素(ポリメラーゼ)と四種類の基質(ｄＮＴＰ)等を加え、温度サイクル「熱変性−アニーリング−相補鎖の合成」をかけることで遺伝子は増幅する（ポリメラーゼ連鎖反応）。ここで上記試薬に加え、蛍光色素を予め注入しておき、励起光を照射しながら温度サイクルをかけることで、遺伝子の増幅をリアルタイムに検出することができる。
【００１０】
（分析システムの構成）
図２を参照して分析システムの構成を説明する。分析システムは捕集機１００，捕集チップ２００，分析装置４００，分析チップ３００の４つから構成される。大気中に浮遊する細菌を捕集機１００により吸引し、捕集機１００に設置された捕集チップ２００の捕集材２０１（図５および図６参照）に細菌を捕集する。捕集チップ２００を捕集機１００から取り出し、捕集チップ２００の捕集材収納部２０３（図５および図６参照）の開口をシール材で閉塞し、あるいはこの捕集チップ２００の開口をシール材で閉塞してから捕集機１００から取り出し、分析装置４００にセットする。すなわち、捕集材に微生物が付着した状態で前記開口部をシール材で封止してなる捕集チップ２００を分析装置４００にセットする。捕集チップ２００の開口をシール材で閉塞して取り扱うことにより、捕集チップ２００を安全に取り扱うことができる。分析装置４００には送液手段が備えられており、捕集チップ２００を分析装置４００にセットした状態で、捕集チップ２００内の試薬を送液し、捕集チップ２００の中で細菌芽胞の発芽および細胞膜の溶解の処理を行う。
【００１１】
複数の試薬が予め内蔵された捕集チップ２００を用いて細菌を捕集し、細菌を捕集した捕集チップ２００をそのまま用いて次の複数の微生物検知処理に移行できるので、使い勝手良く捕集から微生物検知処理まで移行できる。  
次いで、捕集チップ２００を分析装置４００から取り出し、捕集チップ２００で処理された液（既に細菌は溶解して破壊されているため、触れても汚染されることはない）の一部を分析チップ３００に移す。  
分析チップ３００を分析装置４００にセットする。分析チップ３００は捕集チップ200がセットされた部位と同じ場所にセットされるようになっている。ここで、分析チップ
３００には図１のステップ４（遺伝子の捕獲）からステップ７（遺伝子の検出）までの試薬が予め内蔵されている。分析チップ３００を分析装置４００にセットした状態で、分析装置４００の送液手段により分析チップ３００内の試薬を送液し、分析チップ３００の中で遺伝子の抽出から検出までを行う。そして分析終了後、分析チップ３００を分析装置
４００から取り出し、分析チップ３００を廃棄する。
【００１２】
２種類の微生物検知チップ（捕集チップ２００，分析チップ３００）の中に、細菌の前処理から検出に至るまでの工程に必要な試薬が全て内蔵されており、煩雑な試薬操作を省略することができる。２種類のチップ２００，３００間での試料の受け渡しの工程以外は、試料がチップから出ることはなく、閉じられた系において分析がおこなわれるため、非常に安全である。また廃棄物はチップ２００，３００のみとすることができ、このチップ２００，３００を焼却可能な素材にしておくことで、二次汚染の危険性を低減することができる。  
さらに、２種類のチップ２００，３００に内蔵される試薬は、一検査分のみであり、チップ２００，３００は使い切りとすることができることから、屋外で簡便に遺伝子レベルの高精度な細菌検査を行うことができる。
【００１３】
試薬を内蔵した２種類のチップ２００，３００を細菌の捕集から溶解までを処理するチップ２００とそれ以降の分析処理をするチップ３００とに分けているので、捕集から溶解までの処理が同一である試料を用いて複数回の分析が容易となり、安全性を確保しつつ、分析精度の向上を容易に図ることができる。
【００１４】
（捕集機の構成）  
図３は捕集機１００の透視斜視図、図４（ａ）は捕集機１００の蓋部１１０およびチップ支持部１３０を開いた状態を示す図、図４（ｂ）は捕集チップ２００を装着して支持部１３０を閉じた状態を示す図である。  
捕集機１００は、蓋部１１０，ノズル部１２０，一次フィルタ１２１，チップ支持部
１３０，二次フィルタ１４０，支持板１５０，ファンモータ１６０，排出口１７０，制御部１８０，表示部１８１，バッテリ１８５およびケーシング１９０を有する。蓋部１１０はノズル部１２０を有する正方形または短形の部材からなり、両側面に固定手段を有する。
【００１５】
ノズル部１２０の内径は捕集効率に大きく関係する。ノズルの内径を１０［mm］より小さくするほど、細菌を濃縮して捕集することができるが、ノズル部１２０を通過する空気流速が増大するため、圧力損失が増加する。圧力損失は、空気流速の２乗に比例して増加する。それにより、ファンモータ１６０の負荷が増加し、バッテリ１８５の電圧が低下する。例えば、ノズル部１２０の内径を３［mm］以下とすると、可搬型の細菌捕集機１００に搭載可能なバッテリ１８５（リチウム−水素）で駆動可能な仕事量を超える。従って、ノズル部１２０の内径Ｗは４〜１５［mm］が適当である。より好ましくは、ノズル部120の内径Ｗを８〜１２［mm］にすると良い。これにより、高い捕集効率を得ながら、ノズル部１２０の直下に細菌を濃縮して捕集することができる。
【００１６】
ノズル部１２０には一次フィルタ１２１が装着されている。一次フィルタ１２１は、大気中の粗大粒子をトラップするために設ける。したがって、その目開きは１００〜２００μｍが望ましい。花粉の飛散量が増加する時期には、目開きが１０〜１００μｍであることが望ましい。それにより、粒子径１０μｍ以上の花粉と粒子径１０μｍ未満の細菌とを簡便に分級することができる。一次フィルタ１２１は、蓋部１１０から着脱可能で、洗浄と高温滅菌が容易なステンレス製または４フッ化エチレンを重合して作った合成樹脂製が好ましい。
【００１７】
チップ支持部１３０は二次フィルタ１４０の上（前方）に設置される。チップ支持部
１３０は開閉式になっており（図４）、捕集チップ２００を挟んで蓋を閉めることで捕集チップ２００を容易に捕集機１００にセットすることができる。チップ支持部１３０は捕集チップ２００のいわば外周に相当するため、細菌が付着しやすい。よって、チップ支持部１３０は二次フィルタ１４０から着脱可能で、洗浄と高温滅菌が容易なステンレス製またはフッ素樹脂製が好ましい。
【００１８】
二次フィルタ１４０は支持板１５０に設置され、捕集チップ２００で捕集できなかった細菌等の微粒子が排出口１７０から大気中に放出されることを防止するために設ける。二次フィルタ１４０には、０.３μｍ以上の微粒子を９９.９７％以上捕集可能なＨＥＰＡ
（High Efficiency Particulate Air）フィルタを使用することが好ましい。  
０.１〜０.２μｍの微粒子を９９.９９９％以上捕集可能なＵＬＰＡ（Ultra Low 
Penetration Air ）フィルタを使用することが更に好ましい。ＵＬＰＡを用いることにより、排出口１７０から大気に放出する空気の清浄度を更に上げることができる。ケーシング１９０内には、制御部１８０，表示部１８１、およびバッテリ１８５が設けられている。ケーシング１９０の上面には掴み部１９１が設けられている。
【００１９】
次に、捕集機１００の動作を説明する。ファンモータ１６０を駆動すると、大気はノズル部１２０に吸引される。吸引された大気はノズルによって加速され、一次フィルタ121を通過する。このとき、一次フィルタ１２１によって空気中の粗大粒子が除去される。蓋部１１０内に導入された空気中の微粒子は、捕集チップ２００の中央に設けた捕集材に慣性衝突して付着する。蓋部１１０内に導入された空気は二次フィルタ１４０を通過し、ファンモータ１６０の下部の排出口１７０より外部へ排出される。二次フィルタ１４０によって、捕集チップ２００に捕集されなかった微粒子が除去される。
【００２０】
（捕集チップの構成，動作）  
図５，図６を参照して捕集チップ２００の例を説明する。図５は捕集チップ２００の正面図、図６は捕集チップ２００の縦断面図である。  
【００２１】
捕集チップ２００は、図１におけるステップ１（細菌の捕集）からステップ３（細胞膜の溶解）までを担う。すなわち、まず捕集チップ２００を捕集機１００にセットして細菌を捕集したのち（ステップ１）、捕集チップ２００を捕集機１００から取り外し、捕集チップ２００を後述の分析装置４００にセットして、ステップ２（芽胞の発芽）からステップ３（細胞膜の溶解）までの工程を行う。
【００２２】
捕集チップ２００は、チップの構成要素をかたどるパターンをフォトリソグラフィー技術により作製し、このパターンを樹脂に転写成形して成型したものである。パターンの大部分は、微細流路である。すなわち、２枚の樹脂を張り合わせることで、樹脂に刻まれたパターンが流路となる。チップの材料として、加工費用が高くまた割れやすいガラスよりも、廃棄処理性に優れる樹脂のほうが好ましい。樹脂の種類は特に限定されるものではないが、以下の優れた特性を有するポリジメチルシロキサンを使用した。本チップには以下の特性を備えることが好ましい。  
生体適合性良好（通常のシリコンゴムは生理的に不活性）  
サブミクロンの精度で型の転写が可能（硬化前は低粘度で流動性に富むため、複雑な形状の細部まで良好に浸透）  
低コスト（８円／１グラム。従来の汎用マイクロデバイス材料であるパイレックス（登録商標）ガラスは１ｋ円／１グラムであり１／１００以下）  
焼却により容易に廃棄可能  
捕集チップ２００は、大気中から微生物（芽胞を形成した細菌）を付着して捕集する捕集材２０１と、捕集材２０１を装着した薄い板状の基板２０２とを備えて構成されている。捕集チップ２００は、捕集材２０１を収納する捕集材収納部２０３と、複数の試薬保管槽（２１０，２２０，２３０，２４０）、チップ背面に開口されたチップポート２１１，２２１，２３１，２４１と、チップ正面に開口された空気穴２５０とを有している。
【００２３】
複数の試薬保管槽は、発芽促進剤を保管する発芽促進剤保管槽２１０と、２種類の細胞壁溶解液を保管する酵素Ａ保管槽２２０と、酵素Ｂ保管槽２３０と、カオトロピックイオンを保管するカオトロピック保管槽２４０とを有している。複数の試薬保管槽２１０〜
２４０は、捕集材収納部２０３の周囲を取り囲むように配置されている。これにより、基板２０２をコンパクトなものとすることができる。
【００２４】
試薬保管槽２１０〜２４０は細長い流路によって構成されている。いずれの試薬保管槽も、流路形状が好ましい。試薬保管槽内２１０〜２４０の試薬を送液するために、試薬保管槽２１０〜２４０の背後から気体を試薬保管槽２１０〜２４０に送る。このとき、試薬保管槽２１０〜２４０が細長い流路形状でなかった場合、気体の通り抜けやすい部位のみ試薬が押し出され、その他の部位の試薬が試薬保管槽に残るためである。消費する試薬の量を減らすために、試薬保管槽２１０〜２４０を流路形状にするのは効果的である。流路の断面形状は特に限定されないが、横／縦１０以下が好ましい。横／縦が１０以上となると、流路天井部の樹脂がたわんで流路の矩形構造が崩れる恐れがある。試薬保管槽２１０〜２４０の細長い流路は、蛇行状に形成されている。これにより、基板２０３における流路の占有面積を小さなものとしつつ、流路における試薬の保管容量を確保することができる。
【００２５】
試薬保管槽２１０〜２４０の一端は捕集材収納部２０３に接続され、試薬保管槽２１０〜２４０の他端にはチップポート（２１１〜２４１）が連通して接続されている。試薬保管槽２１０〜２４０の一端側および他端側にそれぞれ堰２０４が設けられている。これにより、各試薬保管槽２１０〜２４０の保管される試薬の流出をより確実に防止することができる。チップポート２１１〜２４１は、外部の流路との接点を構成する。発芽促進剤保管槽２１０と、酵素Ａ保管槽２２０と、酵素Ｂ保管槽２３０と、カオトロピック保管槽
２４０はいずれも、捕集材収納部２０３と連通している。従って、捕集材収納部２０３は、発芽促進剤保管槽２１０と、酵素Ａ保管槽２２０と、酵素Ｂ保管槽２３０と、カオトロピック保管槽２４０、およびチップポート２１１〜２４１を介して外部の流路に接続されている。なお、試薬保管槽２１０〜２４０の流路幅を５０〜１００μｍまで狭めることで、捕集材収納部２０３の側からの空気の流入を防ぐことができる。
【００２６】
発芽促進剤保管槽２１０の体積は２０〜１００μＬ、酵素Ａ保管槽２２０の体積は２０〜１００μＬ、酵素Ｂ保管槽２３０の体積は５〜２０μＬ、カオトロピック保管槽２４０の体積は４００〜８００μＬが好ましい。カオトロピックイオンの体積が、発芽促進剤と２種類の細胞壁溶解液の体積の和の２倍以上とすることで、細胞膜の破壊が促進される。より好ましくは４倍以上、最適なのは、８倍以上である。
【００２７】
捕集材２０１として寒天が好適である。寒天の特徴は、ゲル表面の自由水（ゲル網目間の水）由来の「付着性」を有することである。寒天濃度は２〜５％にするのが好適であり、寒天濃度３〜４％が最適である。寒天濃度が２％未満では水分が多いため、高速の空気が当たり続ける捕集材２０１として強度不足である。一方、寒天濃度が６％より大きいと、寒天表面の水分（自由水）が少なくなり、付着性が著しく低下する。
【００２８】
寒天の強度を上げ、かつ水分の蒸発を防止するため、アルコール類を添加すると良い、このアルコール類は凍結防止，乾燥防止，ゲル強化剤として作用する。具体的には、エチルアルコール，イソプロピルアルコール、１，３−ブタンジオール，エチレングリコール，プロピレングリコール，グリセリンなどが挙げられる。アルコール類の添加量は、寒天の４０〜８０％、好ましくは５０〜７０％が好ましい。アルコール類が４０％未満では、水分の蒸発防止が十分でない。また、８０％を超えると寒天表面の水分（自由水）が少なくなり、付着性が低下する。
【００２９】
捕集チップ２００の使用方法の一例を説明する。捕集チップ２００を捕集機１００のチップ支持台に取り付けて、一定時間大気を吸引する。大気の吸引量は、例えば約１０００Ｌである。大気中の細菌は捕集チップ２００の捕集材２０１表面に付着する。次に、捕集チップ２００をチップ支持台から外し、捕集チップ２００の捕集材収納部２０３の開口面をシールで封止した後に捕集チップ２００を分析装置４００にセットする。捕集材収納部２０３の封止は、手動でも良いが、捕集機にシール機構がついていることがより好ましい。捕集材収納部２０３の封止により、細菌が捕集チップ２００の外部に露出することがなくなり、より安全となる。
【００３０】
捕集チップ２００の試薬保管槽２１０〜２４０はチップポート（２１１〜２４１）を介して分析装置４００の流路と接続されているので、分析装置４００の流路側から所定の制御動作で気体をチップポート２１１〜２４１を介して供給することにより、試薬保管槽
２１０〜２４０に予め封入された発芽促進剤，細胞壁溶解液，細胞膜溶解液、およびカオトロピックイオンが所定時間ごとに捕集材収納部２０３内（捕集材２０１上）に送液される。捕集材収納部２０３の上正面は封止されているが、空気穴２５０が捕集材収納部203の一部に連通しており、空気穴２５０は大気開放となっているので、試薬の送液の際に捕集材２０１の上に存在する空気は空気穴２５０より放出される。
【００３１】
試薬保管槽２１０〜２４０から捕集材２０１へ試薬を送液することについての詳細を説明する。  
捕集材２０１に発芽促進剤を１００μＬ送液する。ここで発芽促進剤としては、アラニン，アデノシン，グルコースを含むブイヨンが好ましい。特にＬ−アラニンを１ｍＭ〜
１０ｍＭ含有するブイヨンが最適である。そして１０分以上を経過すると細菌芽胞が発芽を開始し、３０分間経過すると、全体の５０％以上が発芽する。よって、芽胞の発芽処理は３０分以上が好ましい。細菌芽胞を発芽させるのにより好ましいのは３５〜４０℃であり、最も好ましいのは３５〜３７℃である。細菌芽胞が発芽する段階で細菌は自ら芽胞を壊すので、発芽により細菌の細胞壁がむき出しの状態になる。
【００３２】
次に、細菌の細胞壁を壊す２種類の蛋白質変性酵素を順次捕集材２０１に送液し、至適温度に一定時間保持する。酵素処理の時間はそれぞれ１０分以上が望ましく、３０分が好適である。ここで蛋白質変性酵素としては、リゾチーム（至適温度：３７℃）１００μＬとプロテアーゼＫ（至適温度：５５〜６０℃）２０μＬが好適である。これらの酵素処理により、捕集チップ２００内の細菌は細胞膜がむき出しの状態になる。なお、発芽促進剤とリゾチームは同じタイミングで注入して処理することも可能であるが、リゾチームとプロテアーゼＫを同時に添加することは酵素活性が低下するため好ましくない。
【００３３】
最後に、カオトロピックイオン８００μＬを捕集材２０１に送液すると、細菌の細胞膜が破壊され、細菌の遺伝子が細胞外部に放出される。ここでカオトロピックイオンとしては、グアニジンチオシアン酸塩，グアニジン塩酸，ヨウ化ナトリウム，臭化カリウムが挙げられる。チップの使用方法として、チップの冷蔵あるいは冷凍により試薬の活性を長期間維持する方法が考えられる。よって、チップに封入し、冷蔵あるいは冷凍をした際に組成の変化が極めて少ないグアニジン塩酸が好適である。
【００３４】
またカオトロピック塩に界面活性剤や緩衝剤を含有させることが好ましい。緩衝剤としては、トリス−塩酸塩，リン酸２水素カリウム―４ホウ酸ナトリウム等が良い。
【００３５】
以上の工程により、捕集チップ２００に捕集した細菌の芽胞および細胞壁を処理することができる。すなわち、図１におけるステップ２〜３までをチップ上で自動化することができるため、試薬の分注操作を省略することができる。捕集チップ２００は細菌の捕集から前処理までの工程を担い、分析チップ３００は細菌遺伝子の分析工程を担う。分析の精度を上げるために、同一の試料に対して複数回の分析、或いはターゲットの細菌を複数設定するためには、１枚の捕集チップ２００で処理したサンプルを複数の分析チップ３００に分配したほうが好適であり、２種類のチップ２００，３００を供している。  
なお、この捕集チップ２００を凍結した状態でユーザーに提供し、ユーザーが０℃で捕集チップ２００を凍結保存することで、試薬の活性は１ヶ月保たれる。また、−２０℃で凍結保存しておけば、半年以上試薬の活性を保つことが可能である。
【００３６】
（分析チップの構成，動作）  
図７から図９を参照して分析チップ３００を具体的に説明する。  
分析チップ３００は、図１におけるステップ４（遺伝子の捕獲）からステップ７（遺伝子の検出）までを担う。捕集チップで処理された液の一部を移した状態の分析チップ分析装置４００にセットする。分析チップ３００には、図１のステップ４（遺伝子の捕獲）からステップ７（遺伝子の検出）までの処理に用いられる試薬が予め内蔵されている。分析チップ３００を分析装置４００にセットした状態で、分析装置４００には送液手段を動作させて分析チップ３００内の試薬を送液し、分析チップ３００の中で遺伝子の抽出から検出までの処理を行う。分析チップ３００の素材は捕集チップ２００と同様の樹脂である。
【００３７】
分析チップ３００にはチップ正面に開口された試料注入口３１０と、試料溜め３１５と、遺伝子結合担体を流路に充填した遺伝子抽出エリア３２０と、廃液槽３３０と、洗浄液Ｉを保管する洗浄液Ｉ保管槽３４０と、洗浄液IIを保管する洗浄液II保管槽３５０と、洗浄液IIIを保管する洗浄液III保管槽３６０と、遺伝子溶離液を保管する溶離液保管槽370と、遺伝子増幅試薬Ｉを保管する遺伝子増幅試薬Ｉ保管槽３８０と、遺伝子増幅試薬IIを保管する遺伝子増幅試薬II保管槽３９０と、遺伝子の増幅・検出を行う反応槽３９５と、チップ背面に開口されたチップポート３１１，３３１，３４１，３５１，３６１，３７１，３８１，３９１とを有している。反応槽３９５とチップポート３９９の間には、液溜め３９８が設けられている。液溜め３９８を設けることで、誤って反応槽３９５からチップポート３９９を通り抜け分析装置４００内部へ試薬が侵入することを防止できる。
【００３８】
試薬保管槽３４０〜３９０の断面形状は、捕集チップと同様に横／縦１０以下が好ましい。横／縦が１０以上となると、流路天井部の樹脂がたわんで流路の矩形構造が崩れる恐れがある。図のものでは横２mm，縦３mmで形成している。  
試薬保管槽３４０〜３８０以外の流路の断面は、試薬保管槽３４０〜３９０よりも小さいことが好ましく断面積として１／４以下が好ましい。分析チップ３００は、光造形法によって作成した樹脂の型から転写して作成する。光造形法によって作成する樹脂は滑らかな曲線で構成するのが困難であるため、矩形構造を基本としている。よって、矩形構造の樹脂型から転写される分析チップの流路断面も必然と矩形構造となる。矩形構造の流路に試薬を流すと、流路の四隅に試薬が付着しやすく、残存する。流路に残存した試薬が次に流れてきた試薬と混じっていくため、分析精度を悪化させていく。そこで、流路の断面を小さくすることで、流路壁面への試薬の付着を抑制し、試薬のキャリーオーバーを防止している。具体的には、横０.５mm，縦０.５mmで形成した。
【００３９】
試料溜め３１５および試薬保管槽３４０〜３９０の両端の少なくとも一方は、図９(ａ)に示すように流路幅が縮小し、再び急拡大する部分として堰部が設けてある。図９（ｂ）に堰部における試薬と堰に働く表面張力の関係を示す。試薬と流路との接触角をα，堰の縮小の角度をθ1，堰の拡大の角度をθ2，試薬の表面張力をＴ，表面張力の鉛直成分をＦ，流路の周囲長をＬとし、Ｆ′＝Ｆ×Ｌとする。このとき、Ｆ，α，θ1，θ2，Ｔの関係は
Ｆ＝Ｔsin（α−θ2）
となる。したがって、Ｆ＞０つまりα−θ2＞０ のとき、Ｆ′は試薬の流出を防止する抑止力として働き、α−θ2 が９０°に近いほどＦ′は大きくなる。α−θ2 が９０°のとき試薬を防止する抑止力は最大となる。例えば、遺伝子溶離液を水とし、θ2 ＝４５°の場合を考える。水とＰＤＭＳとの接触角α＝８５°であるので、θ2 が小さいほどＦ′は大きくなる。しかし一方、θ2が小さいと残液が生じやすくなる。ここでは、θ2＝４５°の場合を考えると、α−θ2＝４０°となる。水の表面張力Ｔ＝７.２６×１０-4［Ｎ／cm］(２０℃) であるので、表面張力の鉛直成分Ｆ＝７.２６×１０-4×sin４０°＝４.６７×１０-4［Ｎ／cm］となる。ここで、例えば溶離液保管槽のくびれ部の周囲長をＬ＝２×(０.５＋３) ＝７［mm］とすると、抑止力Ｆ′＝４.６７×１０-4×７×１０-1＝３.２６×１０-4［Ｎ］となる。遺伝子溶離液の体積を約２０［μＬ］とすると、遺伝子溶離液に働く重力は約２.００×１０-4［Ｎ］ である。したがって、この場合、重力による溶離液の流出を防止する十分な力が働いていると考えられる。試薬の表面張力，試薬とＰＤＭＳとの接触角、また、残液を考慮しながら堰部の形状の最適化が図られる。この堰を設けることで、表面張力を利用して試薬の誤流出を防止することが可能となる。
分析チップ３００を縦置きにして使用する場合、図９（ａ）に示すように、各試薬保管槽に連通する流路を、各試薬保管槽に保管される想定最大液量の液面ｔ1，ｔ2よりも、一度上方に配置することにより、誤ってその先の流路へ試薬が流出することを防ぐことができる。
【００４０】
流路の急拡大部と、試薬保管槽に連通する流路を液面より上方に配置する流路構造を組み合わせることで、複雑な機構を必要とせずに試薬の誤流出を高確率で防ぐことが可能となる。試薬の誤流出を防止することにより、チップの取り扱いに特別な配慮が必要なくなり、チップの扱いやすさが向上する。また、試薬の流動制御も安定して実行することが可能となり、遺伝子検出精度を向上させることができる。
【００４１】
また、縮小の角度θ1 は小さいと液が残りやすくなるため、１０°以上８０°以下が好適である。また、拡大の角度θ2 は大きいと、試薬の表面張力による抑止力が小さくなり（α−θ2＞０の場合）、もしくは表面張力による推進力が大きくなる（α−θ2＜０の場合）ため、８０°以下が好適である。また、拡大の角度θ2 は大きいと試薬の表面張力による推進力も大きくなるため、４５°以下が好適である。また、拡大の角度θ2 は小さすぎると液が残りやすくなるため、５°以上が好適である。本例では、直線的に流路幅が縮小し、直線的に流路幅が拡大しているものを示しているが、曲線的に流路幅が縮小し、拡大しても良い。さらに、光造型による型を転写して本チップを作製する場合は、縦／横が１０以下であることが好ましい。縦／横が１０以上になると、型からチップをはがすことが困難となる。また、縦／横が１０以下であっても、型からチップをはずすことが困難な場合は、型に若干のテーパー（例えば５°のテーパー）をつけるとはずしやすくなり好適である。
【００４２】
試料溜め３１５，廃液槽３３０、および試薬保管槽３４０〜３９０の一端にはチップポートが形成されている。チップポートは、外部である分析装置４００の流路との接点を構成する。試薬保管槽３４０〜３９０内の試薬を送液するために、チップポートを介してチップの外部である分析装置４００から気体を試薬保管槽３４０〜３９０に送る。このときの気体としては、酸素は試薬を酸化させ、また二酸化炭素は試薬のｐＨを変化させる恐れがあることから、不活性な窒素，ヘリウム，アルゴン等が望ましい。
【００４３】
試料溜め３１５と、洗浄液Ｉ保管槽３４０と、洗浄液II保管槽３５０と、洗浄液III 保管槽３６０と、溶離液保管槽３７０はいずれも遺伝子抽出エリア３２０に連通している。溶離液に試料や洗浄液Ｉ，洗浄液IIが混入すると遺伝子の検出に阻害をおこすため、溶離液保管槽３７０は試料溜め３１５と洗浄液Ｉ保管槽３４０，洗浄液II保管槽３５０から離れた位置に配置することが好ましい。  
遺伝子増幅試薬Ｉ保管槽３８０と、遺伝子増幅試薬II保管槽３９０は反応槽３９５に連通している。遺伝子増幅試薬Ｉ保管槽３８０から反応槽３９５に送られた遺伝子増幅試薬Ｉ、および遺伝子増幅試薬II保管槽から反応槽３９５に送られた遺伝子増幅試薬IIが一度反応槽３９５に入ったのち、反応槽３９５から逆流しないように、遺伝子増幅試薬Ｉ保管槽３８０および遺伝子増幅試薬II保管槽３９０は反応槽３９５の上方から連通しているのが好ましい。
【００４４】
試料溜め３１５の体積は１００〜２００μＬ、遺伝子抽出エリア３２０の体積は１００〜２００μＬ、洗浄液Ｉ保管槽３４０の体積は２００〜３００μＬ、洗浄液II保管槽350の体積は５０〜１５０μＬ、洗浄液III 保管槽３６０の体積は３０〜１００μＬ、溶離液保管槽３７０の体積は１０〜３０μＬ、遺伝子増幅試薬Ｉ保管槽３８０の体積は２０〜
４０μＬ、遺伝子増幅試薬II保管槽３９０の体積は１０〜２０μＬが好ましい。
【００４５】
遺伝子抽出エリア３２０に充填する遺伝子結合担体として、石英ウール，ガラスウール，ガラスファイバー，ガラスビーズが適用可能である。ガラスビーズ適用の際は、接触面積を大きくするためにビーズサイズを５０μｍ以下とするのが好ましく、流路への堰き止めを考慮すると２０〜３０μｍが最適である。
【００４６】
（分析装置の構成，動作）  
図１０から図１３を参照して本発明による分析装置４００の構成，動作を具体的に説明する。図１０は分析装置４００の主要な構成を、図１１は分析装置４００の断面構成、図１２は分析装置４００の基板４１０を示す図である。  
分析装置４００は大きくわけて、チップ設置部，流体系，温調系、そして光学検出系の４つから構成される。まず捕集チップ２００および分析チップ３００がセットされるのは、前蓋４０１の内側に設けられた基板４１０である。本実施例では両チップを縦置きにセットするので、基板４１０の下部には、チップを止めるチップストッパ４１１が備えられる。チップを基板４１０にセットして前蓋４０１を閉めると、チップは基板４１０とチップホールダ４２０の間に固定される。基板４１０とチップホールダ４２０には、チップの温度を最適化するための温度制御機構４１５が内蔵されている。温度制御機構４１５としては、様々な発熱体が適用可能であるが、例えば、好ましいのはペルチェである。ペルチェを使用した場合、印加電流の向きを変えるだけでチップの昇温・冷却操作を簡便に行うことができる。
【００４７】
チップをセットする基板４１０には、基板流路４１２が設置されており、基板流路412の一端はチップのポートに連通し、基板流路４１２の他端は装置内流路４０２に連通している。基板４１０に予め複数の基板流路４１２が設置されることで、捕集チップ２００および分析チップ３００のいずれのチップポートにも対応することでき、分析装置４００は捕集チップ２００と分析チップ３００のプラットフォームとなり得る。
【００４８】
装置内流路４０２は、それぞれバルブ４３０を介してポンプ４４０に接続される。チップ内のある試薬槽の試薬を送液するには、バルブ４３０を切り替えてその試薬槽に連通する流路のみに送風を行う。すなわち、ポンプ４４０によって送られた気体は選択された装置内流路４０２および基板４１０流路を経てチップ内に到達し、試薬槽の試薬を送液する。試薬槽に予め所定量の試薬のみ内蔵されているので、試薬槽内の試薬をすべて時間管理で排出するのみでよく、ポンプ４４０の送液精度は求められない。よって、ポンプ４４０は、送風のみで吸引を行わない、簡素で小型なものを使用することができる。流体を制御するバルブ４３０をチップの内部ではなく、分析装置４００側に設けることが好ましい。これにより、チップ１０１には機械部品がなくなり、小型化・ディスポーザブル化を実現することができる。
【００４９】
光検出系は、チップ反応槽３９５内の遺伝子に励起光を照射する光源４５０と、励起光の特定の波長のみを透過する励起フィルタ４５５と、チップ反応槽３９５から生じた蛍光の光路を変更するミラー４６０と、蛍光の特定の波長のみを透過する検出フィルタ４７５と蛍光を測定する光検出器４７０から構成される。光源４５０は様々な波長領域のものが使用可能であるが、波長領域の広いキセノンランプを用いることが良い。波長が限定される場合には、ＬＥＤを使うことが望ましい。光検出器４７０としてはＣＣＤカメラ，光電子倍増管，フォトダイオード等が良いが、装置を小型化するにはフォトダイオードが好ましい。光検出器４７０によって検出された遺伝子の光信号は光信号変換機４８０によってデジタル化され、データ表示画面４９０に信号強度が表示される。
【００５０】
分析装置４００には各制御を行う制御機構を備える。分析装置４００に、バルブ４３０を制御するバルブ制御機構４３１，ポンプ４４０を制御するポンプ制御機構４４１，光源４５０を制御する光源制御機構４５１，光検出器４７０を制御する光検出器制御機構471が搭載される。以上より、機械部品を内蔵しない小型の分析チップを基板上に置いて簡便な光検出器を組み合わせるだけの、小型で可搬の分析装置とすることが出来る。
【００５１】
（分析の手順）  
分析チップ３００と分析装置４００を用いた分析の手順を図７，図１１，図１３を参照しながら説明する。図１３は実施例１の流体ハンドリングのプロファイルを示す図である。
【００５２】
捕集チップ２００で細胞壁が溶解された細菌試料を分析チップ３００に注入し、分析チップ３００内においてこの細菌試料を遺伝子保持担体が充填された流路に送液する。そして、試料に含まれる蛋白質等を洗浄する洗浄液を前記遺伝子保持担体が充填された流路に送液する。
【００５３】
次に、遺伝子保持担体に吸着された遺伝子を溶離する溶離液を前記遺伝子保持担体が充填された流路に送液し、さらに遺伝子を検出する反応槽へと送液する。その後、分析対象の遺伝子の有無を検出する。以下に一例を具体的に説明する。
【００５４】
６種類の試薬、すなわち洗浄液Ｉ，洗浄液II，洗浄液III ，遺伝子溶離液，遺伝子増幅試薬Ｉ，遺伝子増幅試薬IIがそれぞれ洗浄液Ｉ保管槽３４０，洗浄液II保管槽３５０，洗浄液III 保管槽３６０，溶離液保管槽３７０，遺伝子増幅試薬Ｉ保管槽３８０，遺伝子増幅試薬II保管槽３９０に内蔵され、冷蔵あるいは冷凍保存しておいた分析を室温で解凍する。分析チップ３００に予め１検査分のみの試薬を内蔵してユーザーに提供することで、分析チップ３００を１検査の使い切りとしても試薬の無駄がなく、経済性が向上する。
【００５５】
ユーザーは試薬を各試薬保管槽に分注する手間を省くことができ、時間が短縮されるだけでなく、汚染を防ぐことも出来る。さらに、この分析チップ３００を凍結した状態でユーザーに提供し、ユーザーが０℃で分析チップ３００を凍結保存することで、試薬の活性は１ヶ月保たれる。また、−２０℃で凍結保存しておけば、半年以上試薬の活性を保つことが可能である。使い捨て可能な分析チップ３００に予め１検査分のみの試薬を内蔵し、分析チップ３００を冷蔵あるいは冷凍した状態でユーザーに提供することで、簡便な分析環境を作ることができる（ステップ１０１）。
【００５６】
分析チップ３００の解凍後、捕集チップ２００の処理液を分析チップ３００の試料注入口３１０に約１００μＬ移す（ステップ１０２）。
【００５７】
試料注入口３１０にカバーをして穴を塞ぐ。カバーは、分析チップ３００と同素材の薄い樹脂シートが好ましい。樹脂同士の密着性が良く、また安価であるため使い捨てに好適である。試料注入口３１０をカバーする工程は、手動でもよいが、分析装置４００側に試料注入口３１０を覆う機構が備わっているとより好ましい（ステップ１０３）。
【００５８】
分析装置４００の前蓋４０１を開いて、前蓋４０１に設けられたチップガイドに沿って分析チップ３００を分析装置４００にセットした後、分析装置４００の前蓋４０１を閉める。これにより、分析チップ３００が基板４１０に固定され、チップポートと装置内流路４０２が連通する。なお分析チップ３００は横置き，縦置きいずれでも可能であるが、ここでは縦置きの場合について述べる（ステップ１０４）。
【００５９】
分析装置４００内のバルブ４３０を切り替えてチップポート３１１にのみポンプ４４０から流体を流す（ポート３１１，３３１：開、他のポート：閉）。ここで使用する流体は空気や窒素など試薬と接した時に試薬の活性が損なわれない気体であればよい。試料溜め
３１５内の試料は遺伝子抽出エリア３２０に移動する。試料中のカオトロピックイオンの働きにより、試料中の細菌遺伝子は、遺伝子抽出エリア３２０に充填された遺伝子結合担体に結合する。細菌遺伝子と遺伝子結合担体との結合を促進するために、試料が遺伝子抽出エリア３２０を通過する時間は１０分以上が好ましい。そして遺伝子抽出エリア３２０を通過した試料は廃液槽３３０に貯まる。送液用の気体は、チップポート３３１に抜ける。なお、チップを縦置きにすることで、試料がチップポート３３１から漏れるのを防ぐことができる（ステップ１０５）。
【００６０】
遺伝子検査を安定して高精度で行うためには、遺伝子と遺伝子結合担体が確実に結合する必要がある。遺伝子と遺伝子結合担体を確実に結合させるには遺伝子と遺伝子結合担体が確実に一定時間以上接触する必要がある。そこで、遺伝子と遺伝子結合担体を確実に一定時間以上接触させる方法として、試料を間欠的に送液する方法が好適である。つまり、チップポート３１１の開閉を繰り返しながら試料を送液することが良い。例えば、２９秒間試料ポートを閉じ、１秒間試料ポートを空ける、この動作を例えば２０〜４０回繰り返すことにより試料溶液は１０〜２０分間かけて確実に遺伝子結合担体部を通過し、遺伝子と遺伝子結合担体を確実に結合させることが可能となる。チップポート３１１の開閉を制御するだけであるので、複雑な流体制御機構が必要なく、簡易な装置で実行することが可能となる。
【００６１】
分析装置４００内のバルブ４３０を切り替えてチップポート３１１を閉じ、チップポート３４１を開く。そしてチップポート３４１にのみポンプ４４０から流体を流す（ポート３３１，３４１：開、他のポート：閉）。洗浄液Ｉ保管槽３４０内の洗浄液Ｉ２００μＬは、流体によって遺伝子抽出エリア３２０に送液される。ここで洗浄液Ｉとしては、グアニジンチオシアン酸塩，グアニジン塩化水素，ヨウ化ナトリウム，臭化カリウム等のカオトロピックイオンが好ましい。この洗浄液Ｉにより、遺伝子抽出エリア３２０に残留する蛋白質が除去される。そして遺伝子抽出エリア３２０を通過した洗浄液Ｉは廃液槽３３０に貯まる（ステップ１０６）。
【００６２】
分析装置４００内のバルブ４３０を切り替えてポート３４１を閉じ、洗浄液IIポート
３５１を開く。そして洗浄液IIポート３５１にのみポンプ４４０から流体を流す（ポート３３１，３５１：開、他のポート：閉）。洗浄液II保管槽３５０内の洗浄液II１５０μＬは、流体によって遺伝子抽出エリア３２０に送液される。洗浄液IIとしては、５０％以上の高濃度エタノールや酢酸カリウム溶液が好ましい。洗浄液IIにより、遺伝子抽出エリア３２０に残留するカオトロピックイオンが除去される。そして遺伝子抽出エリア３２０を通過した洗浄液IIは廃液槽３３０に貯まる（ステップ１０７）。
分析装置４００内のバルブ４３０を切り替えてポート３５１を閉じ、洗浄液III ポート３６１を開く。そして洗浄液III ポート３６１にのみポンプ４４０から流体を流す（ポート３３１，３６１：開、他のポート：閉）。洗浄液III保管槽３６０内の洗浄液III８０
μＬは、流体によって遺伝子抽出エリア３２０に送液される。ここで洗浄液III としては、洗浄液IIより低濃度のエタノールや洗浄液IIより低濃度の酢酸カリウム溶液、または純水が好ましい。この洗浄液III により、遺伝子抽出エリア３２０に残留するカオトロピックイオンおよび洗浄液II（高濃度エタノール，酢酸カリウムなど）などの遺伝子増幅を阻害する物質を高確率で除去することが可能となり、安定して、精度のよい遺伝子検出が可能となる。そして、遺伝子抽出エリア３２０を通過した洗浄液III は廃液槽３３０に溜まる（ステップ１０８）。
【００６３】
分析装置４００内のバルブ４３０を切り替えてポート３３１，ポート３６１を閉じ、チップポート３７１およびチップポート３９９を開く。そしてチップポート３７１にのみポンプ４４０から流体を流す（ポート３７１，３９９：開、他のポート：閉）。溶離液保管槽３７０内の溶離液１０μＬは、流体によって遺伝子抽出エリア３２０に送液される。ここで溶離液としては、滅菌蒸留水，ＴＲＩＳ−ＥＤＴＡやＴＲＩＳ−アセテート等のバッファ溶液が使用可能である。この溶離液により、遺伝子抽出エリア３２０の遺伝子結合担体に捕獲されていた遺伝子が溶離する。溶離した遺伝子は反応槽３９５に送液される（ステップ１０９）。
【００６４】
遺伝子検査を安定して高精度で行うためには、遺伝子結合担体に結合した遺伝子が確実に溶離し、反応槽３９５に送液される必要がある。遺伝子結合担体に結合した遺伝子を確実に溶離させるには遺伝子結合担体に結合した遺伝子と溶離液が確実に一定時間以上接触する必要がある。そこで、遺伝子結合担体に結合した遺伝子と溶離液を確実に一定時間以上接触させる方法として、溶離液を間欠的に送液する方法が好適である。チップポート
３７１の開閉を繰り返しながら試料を送液する方法である。例えば、２９秒間チップポート３７１を閉じ、１秒間チップポート３７１を空ける、この動作を例えば２０〜４０回繰り返すことにより溶離液は１０〜２０分間かけて確実に遺伝子結合担体部を通過し、遺伝子結合担体に結合した遺伝子と溶離液を確実に結合させることが可能となる。また、チップポート３７１の開閉を制御するだけであるので、複雑な流体制御機構が必要なく、簡易な装置で実行することが可能となる。
【００６５】
分析装置４００内のバルブ４３０を切り替えて、ポート３７１を閉じ、チップポート
３８１を開く。そしてチップポート３８１にのみポンプ４４０から流体を流す（ポート
３８１，３９９：開、他のポート：閉）。遺伝子増幅試薬Ｉ保管槽３８０内の遺伝子増幅試薬Ｉ１０μＬは、流体によって反応槽３９５に送液される。ここで遺伝子増幅試薬Ｉとしては、４種類のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ），バッファ
（ＴＲＩＳ塩酸，ＫＣｌ，ＭｇＣｌ2 など），プライマなどから構成される。送液用の気体は、チップポート３９９に抜ける（ステップ１１０）。
【００６６】
分析装置４００内のバルブ４３０を切り替えてポート３８１を閉じ、チップポート391を開く。そしてチップポート３９１にのみポンプ４４０から流体を流す（ポート３９１，３９９：開、他のポート：閉）。遺伝子増幅試薬II保管槽３９０内の遺伝子増幅試薬II
３０μＬは、流体によって反応槽３９５に送液される。ここで遺伝子増幅試薬IIとしては、ＤＮＡ合成酵素（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ，ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ，VentDNA ポリメラーゼ，サーモシーケナーゼなど），蛍光色素などから構成される(ステップ１１１)。
【００６７】
以上の手順により、分析チップ３００の反応槽３９５に細菌遺伝子と２種類の遺伝子増幅試薬が導入された。反応槽３９５内の細菌遺伝子を増幅・検出するために、温度制御機構４１５を駆動し、反応槽３９５の温度が下記の２種類の設定値を往復するように温度サイクルをかける（ステップ１１２）。
【００６８】
温度サイクル例としては、下記を実施する。  
「９０〜９５℃  １０〜３０秒⇔６５〜７０℃  １０〜３０秒」×３０〜４５回
好ましい一例として、以下の温度サイクルを実施する。  
「９４℃  ３０秒⇔６８℃  ３０秒」×４５回  
温度サイクルをかけながら、光源４５０からの励起光を反応槽３９５に照射する。遺伝子は、２本鎖の内部にインターカレートした蛍光色素を有する、吸収した光源４５０の光エネルギーを蛍光色素に渡す（エネルギー転移）。その結果、蛍光色素は励起されて蛍光を発する。すなわち、試料中に目的遺伝子が存在した場合、遺伝子が増幅するに従って発する蛍光量が増加する。よって、温度サイクルの間、光検出器１８１により反応槽３９５内の蛍光量をモニタすることで、図７に示されるように、目的遺伝子の有無をリアルタイムに検出可能となる。なお、分析チップ３００を分析装置４００に縦置きにセットすることにより、温度サイクル中の反応物質の一部が蒸発し、蒸気が反応槽３９５上部に滞留しても、蛍光を検出する反応槽３９５の側面は蒸気によって曇らない、よって検出感度が低下しない、という長所を有する（ステップ１１３）。
【００６９】
分析が完了した時、分析チップ３００を分析装置４００から取り出し、廃棄する。試料や試薬の後処理が必要ない上に、反応検出部の洗浄操作が必要ないため、簡便・迅速な分析を提供することができる（ステップ１１４）。
【００７０】
捕集チップおよび分析チップと、捕集機および分析装置を組み合わせて使用することで、細菌の捕集から細菌の検出までの工程が２種類の小型のチップ内で自動化される。細菌芽胞の処理や遺伝子抽出工程に人手を一切介さないため、誰でも安全に分析が可能である。さらに、細チップ内にバルブ等の機械部品が含まれないので、使い捨て用途に好適なチップが提供できる。また、反応槽や流路を微細加工により作製し容積を微小化した結果、試薬量が削減され低コストとなるだけでなく、温度制御が迅速，混合が迅速，反応が均一といった長所が得られる。さらにディスポーザブルなチップに予め１検査分のみの試薬を内蔵し、チップを冷蔵・冷凍した状態でユーザーに提供することで、極めて簡便・迅速な遺伝子の検出が可能、かつ分析後に試薬と共に処分しうる分析チップを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】本発明の一実施形態による細菌の検知方法の手順を示すフローチャート図。
【図２】一実施形態による細菌検知システムの構成を示す図。
【図３】一実施形態による捕集機を示す透視斜視図。
【図４】図３の捕集機に捕集チップを装着する方法を示す斜視図。
【図５】一実施形態による捕集チップを示す正面図。
【図６】図５の捕集チップの縦断面図。
【図７】一実施形態による分析チップの正面図。
【図８】図７のＡ−Ａ′断面図。
【図９】（ａ）図７のエリアＢの拡大図。（ｂ）堰部における接触角，表面張力の関係を示す図。
【図１０】一実施形態による分析装置の主要部の構成を示す図。
【図１１】図１０の分析装置の断面構成を示す図。
【図１２】図１０において基板の構成を示す図。
【図１３】一実施形態によるハンドリングのプロファイルを示す図。
【符号の説明】
【００７２】
１００…捕集機、１１０…蓋部、１２０…ノズル部、１２１…一次フィルタ、１３０…チップ支持部、１４０…二次フィルタ、１５０…支持板、１６０…ファンモータ、１７０…排出口、１８０…制御部、１８１…表示部、１８５…バッテリ、１９０…ケーシング、１９１…掴み部、２００…捕集チップ、２０１…捕集材、２１０…発芽促進剤保管槽、
２２０…酵素Ａ保管槽、２３０…酵素Ｂ保管槽、２４０…カオトロピック保管槽、２５０…空気穴、３００…分析チップ、３１０…試料注入口、３１１，３２１，３３１，３４１，３５１，３６１，３７１，３８１，３９１，３９９…チップポート、３１５…試料溜め、３２０…遺伝子抽出エリア、３３０…廃液槽、３４０…洗浄液Ｉ保管槽、３５０…洗浄液II保管槽、３６０…洗浄液III 保管槽、３７０…溶離液保管槽、３８０…遺伝子増幅試薬Ｉ保管槽、３９０…遺伝子増幅試薬II保管槽、３９５…反応槽、３９８…液溜め、400…分析装置、４０１…前蓋、４０２…装置内流路、４１２…基板流路。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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