(57)【要約】【課題】画像歪みや位置ずれが殆ど発生せず、異なる波長のレーザ光によるそれぞれの蛍光画像を一度の二次元走査で取得可能なレーザ走査顕微鏡を提供すること。【解決手段】異なる波長のレーザ光を射出するレーザ１，２，３と、前記レーザ光を標本９上で二次元に走査する走査手段３０と、前記標本上のほぼ同一の走査線位置上を往復走査するとき、往路のレーザ光と復路のレーザ光の波長を選択する波長選択手段５を有するレーザ走査顕微鏡。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の波長を含むレーザ光を射出するレーザ光源あるいは互いに波長の異なるレーザ光を射出する複数のレーザ光源と、
前記レーザ光を標本上で二次元に走査する走査手段と、
前記標本上のほぼ同一の走査線位置上を往復走査するとき、前記レーザ光源から射出されたレーザ光のうち往路を走査するレーザ光と復路を走査するレーザ光の波長を波長が互いに異なる様にそれぞれ選択する波長選択手段を有することを特徴とするレーザ走査顕微鏡。
【請求項２】
前記複数の波長又は前記複数のレーザ光源が３つ以上の奇数個の場合は、
前記往復走査するとき、
最後の復路の走査は、レーザ光を遮断した状態で走査することを特徴とする請求項１に記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項３】
前記往復走査後、前記走査線位置にほぼ直交する方向に所定距離移動して前記往復走査を繰り返すことを特徴とする請求項１から２のいずれか１項に記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項４】
前記標本からの蛍光光を検出する検出手段と、
前記往復走査で検出されたそれぞれの蛍光光に基づく画像を形成する画像処理手段を更に有することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載のレーザ走査顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ走査顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、レーザ走査顕微鏡では、二次元走査により水平方向と垂直方向にレーザ光を走査して画像を取得する。このとき、水平方向の走査は、往路または復路のどちらか一方向のみレーザ光を標本に照射して各励起波長毎に一枚の画像取得することが通常行われている。また、一枚の画像取得時間を短縮するためにレーザ光を水平方向に往復走査して一枚の画像を取得することも行われている（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】特開平９−２１９７０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、レーザ走査顕微鏡で用いられるメカニカルスキャナ（例えば、ガルバノスキャナやレゾナントスキャナ等）はミラー等を往復駆動してレーザ光を走査するため、往路と復路との相対的誤差が発生し、一度の二次元走査において往路と復路の両方の走査で得られる一枚の画像には位置ずれや画像歪みが発生すると言う問題がある。
【０００４】
本発明は、上記課題に鑑みて行われたものであり、画像歪みや位置ずれがほとんど発生せず、異なる波長のレーザ光によるそれぞれの蛍光画像を一度の二次元走査で取得可能なレーザ走査顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するために、本発明は、複数の波長を含むレーザ光を射出するレーザ光源あるいは互いに波長の異なるレーザ光を射出する複数のレーザ光源と、前記レーザ光を標本上で二次元に走査する走査手段と、前記標本上のほぼ同一の走査線位置上を往復走査するとき、前記レーザ光源から射出されたレーザ光のうち往路を走査するレーザ光と復路を走査するレーザ光の波長を波長が互いに異なる様にそれぞれ選択する波長選択手段を有することを特徴とするレーザ走査顕微鏡を提供する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、画像歪みや位置ずれが殆ど発生せず、異なる波長のレーザ光によるそれぞれの蛍光画像を一度の二次元走査で取得可能なレーザ走査顕微鏡を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明の一実施の形態に関し図面を参照しつつ説明する。
【０００８】
図１は、本発明の実施の形態にかかるレーザ走査顕微鏡の構成ブロック図である。図２は、図１に示すレーザ走査顕微鏡における、標本上のレーザ光の走査と波長毎のレーザ光の走査を模式的に示す。図３は、図１に示すレーザ走査顕微鏡の制御信号例を示す。
【０００９】
図１において、第１の波長のレーザ光を射出するレーザ１、第２の波長のレーザ光を射出するレーザ２、及び第３の波長のレーザ光を射出するレーザ３から射出されたそれぞれのレーザ光は、ダイクロイックミラー群４により一つの光軸に結合される。
【００１０】
ダイクロイックミラー群４から射出したレーザ光は、走査制御回路２７からの指令に基づき波長選択装置５（例えば、ＡＯＴＦ等）で波長選択される。波長選択されたレーザ光は、第１のダイクロイックミラー６に入射する。
【００１１】
第１のダイクロイックミラー６でレーザ光は二次元走査手段３０（例えば、ガルバノミラースキャナやレゾナントスキャナ）方向に反射され、二次元走査手段３０中のＸスキャナ７およびＹスキャナ８によってＸ−Ｙ方向の二次元に走査され、ステージ１０に載置された標本９に照射される。
【００１２】
標本９には複数の色素が前もって含まれており、照射されたレーザ光に対応する色素が励起され、標本９から蛍光が発生する。この蛍光は光路を逆行して、二次元走査手段３０のＹスキャナ８およびＸスキャナ７でデスキャニングされたのち、第１のダイクロイックミラー６を透過する。
【００１３】
第１のダイクロイックミラー６を透過した蛍光は、第２のダイクロイックミラー１１、および第３のダイクロイックミラー１２で蛍光をそれぞれの波長で分岐し、光検出器１３（例えば、フォトマルチプライヤーチューブ）、および光検出器１４（例えば、フォトマルチプライヤーチューブ）で検出する。また、第２および第３のダイクロイックミラー１１、１２をそれぞれ透過した波長の蛍光は光検出器１５（例えば、フォトマルチプライヤーチューブ）で検出される。光検出器１３、１４、および１５で検出されたそれぞれの蛍光は、電気信号に変換され出力される。
【００１４】
光検出器１３、１４、および１５からの電気信号は、それぞれの増幅回路１６、１７、および１８で必要な大きさまで増幅され、Ａ／Ｄ変換器１９、２０、および２１にそれぞれ導かれ、走査制御回路２７からのＸスキャナ７およびＹスキャナ８に同期したサンプリングクロックでデジタルデータに変換され、フレームメモリ２２、２３、および２４にそれぞれ格納される。
【００１５】
標本９からの蛍光像をモニター２６に表示する場合、表示したい画像のデジタルデータが格納されているフレームメモリ２２、２３、または２４からデジタルデータを読み出し、Ｄ／Ａ変換器２５でアナログ信号に変換してモニター２６に出力する。画像処理手段４０は、増幅器１６，１７，１８、Ａ／Ｄ変換器１９，２０，２１、フレームメモリ２２、２３、２４、およびＤ／Ａ変換器２５で構成されている。このようにして、本発明の実施の形態にかかるレーザ走査顕微鏡が構成されている。
【００１６】
次に図２を参照しつつレーザ光の走査の制御について説明する。
【００１７】
図２の（ａ）に示すように、レーザ光はＸスキャナ７で水平走査、Ｙスキャナ８で垂直走査され、標本９を二次元走査する。本実施の形態にかかるレーザ走査顕微鏡では、Ｘスキャナ７は往路と復路で共に画像を取得するためのレーザ光を走査する。
【００１８】
レーザ１から射出される第１の波長のレーザ光が波長選択装置５で選択され、Ｘスキャナ７で第１の往路走査される（図２−（ｅ）（イ））。次にレーザ２から射出される第２の波長のレーザ光が波長選択装置５で選択され、Ｘスキャナ７で第１の復路走査される（図２−（ｅ）（ロ））。次にレーザ３から射出される第３の波長のレーザ光が波長選択装置５で選択され、Ｘスキャナ７で第２の往路走査される（図２−（ｅ）（ハ））。最後に各レーザの波長に対する走査方向を常に一致させるために、最後の第２の復路走査では波長選択装置５はすべてのレーザ光を遮断する（図２−（ｅ）（ニ））。これで第１の水平走査線位置（図２（ａ）の左欄に示す番号１）における二往復の走査が終了する。なお、第１の往路走査（イ）から第２の復路走査（ニ）までの走査線位置は、図２（ａ）では理解を容易にするために（イ）〜（ニ）の位置をずらして示しているが、実際にはほぼ同一の走査線上を走査するように走査制御回路２７で制御される。すなわち、（イ）〜（ニ）の走査期間中はＹスキャナ８は固定されている。上記の二往復の走査が終了したのち、Ｙスキャナ８を１ステップ駆動して第２の水平走査線位置（図２（ａ）の左欄に示す番号２）に移動する。以降、上述の水平走査と垂直走査とを標本９の所定の範囲をカバーするように繰り返し実行する。なお、Ｙスキャナ８の駆動方式はステップ状ではなくアナログ的な駆動でも可能である。アナログ的な駆動を行う場合、（イ）〜（ニ）の走査は僅かずつずれた位置となる。上述の走査を繰り返した結果（図２（ａ）の番号１、２、３、４・・）、各波長のレーザ光は図２の（ｂ）〜（ｄ）に示すように一定方向の水平走査（図２（ｂ）〜（ｄ）の番号１、２、３、４・・）のみで二次元走査されたと同等となり、それぞれの蛍光画像のデジタルデータがフレームメモリ２２〜２４にそれぞれ記憶される。
【００１９】
次に、それぞれのレーザ光の走査に同期した蛍光画像取得の制御について説明する。
【００２０】
標本９から発せられた蛍光は第２のダイクロイックミラー１１および第３のダイクロイックミラー１２でそれぞれ波長分離されて光検出器１３（ＣＨ１）、光検出器１４（ＣＨ２）、および光検出器１５（ＣＨ３）でそれぞれ検出される。具体的には、第１の波長のレーザ光で励起されて発せられた蛍光は光検出器１３で、第２の波長のレーザ光で励起されて発せられた蛍光は光検出器１４で、第３の波長のレーザ光で励起されて発せられた蛍光は光検出器１５でそれぞれ検出される。それぞれの光検出器１３、１４、および１５からの電気信号は、走査制御回路２７からの指令クロックによりＡ／Ｄ変換機でデジタルデータに変換される。なお、いずれの波長のレーザ光をどの光検出器で検出するかは、ダイクロイックミラー１１、１２等の波長特性によって変更可能である。
【００２１】
図３に示すように、Ｘスキャナ７に加えられる走査制御装置２７からの三角波でＸスキャナ７は一定の速度で往路走査される。第１の往路走査区間Ｔ１では、第１の波長のレーザ光（レーザ１）が波長選択装置５で選択されて標本９に照射され、このレーザ光で励起されて発せられた蛍光は光検出器１３（ＣＨ１）で検出され、ＣＨ１のＡ／Ｄクロックにより、光検出器１３の信号のみがＡ／Ｄ変換される。
【００２２】
次に、Ｘスキャナ７で復路走査される第１の復路区間Ｔ２では、第２のレーザ光（レーザ２）が波長選択装置５で選択されて標本９に照射され、このレーザ光で励起されて発せられた蛍光は光検出器１４（ＣＨ２）で検出され、ＣＨ２のＡ／Ｄクロックにより、光検出器１４の信号のみがＡ／Ｄ変換される。
【００２３】
次に、Ｘスキャナ７で往路走査される第２の往路走査区間Ｔ３では、第３のレーザ光（レーザ３）が波長選択装置５で選択されて標本９に照射され、このレーザ光で励起されて発せられた蛍光は光検出器１５（ＣＨ３）で検出され、ＣＨ３のＡ／Ｄクロックにより、光検出器１５の信号のみがＡ／Ｄ変換される。
【００２４】
次に、最後の第２の復路走査区間Ｔ４ではレーザ光を遮断して走査するため、Ａ／Ｄ変換は行わない。以上の二往復走査で第１の水平走査線位置（図２（ａ）の左欄に示す番号１）の走査が終了する。その後、Ｙスキャナ８の駆動して所定距離の垂直走査を行い、以後、上述の区間Ｔ１〜Ｔ４を繰り返す。
【００２５】
上述の水平走査と垂直走査とを繰り返すことによって、各波長のレーザ光で励起して得られるそれぞれの蛍光画像をそれぞれ一枚取得する（図２の（ｂ）〜（ｄ）に示す）。
【００２６】
この結果、本発明の実施の形態にかかるレーザ走査顕微鏡では、標本９を波長の異なる複数のレーザ光を、レーザ光毎に一方向にのみ走査して蛍光画像を取得することが可能になりる。
【００２７】
なお、励起するレーザの波長の数が偶数の場合には、最後の復路も標本にレーザ光を照射することで蛍光画像を取得することが可能である。また、レーザの数は上述の３個に限定されることはなく、検出する蛍光に必要なレーザを配置しても良い。また、検出する蛍光に対応するダイクロイックミラーからフレームメモリまでの部材は、測定する蛍光の数に応じて設置を増減することで励起波長数に相当する蛍光画像を取得することが可能になる。
【００２８】
このように、本発明の実施の形態にかかるレーザ走査顕微鏡では、複数のレーザ光による蛍光像を取得する際、一つの波長のレーザ光による蛍光画像が一方向の水平走査のみで取得できるため、画像の歪みや位置ずれの殆ど無い蛍光画像を取得することができる。
【００２９】
また、複数の波長の励起光によるそれぞれの蛍光画像を上述の水平方向の往復走査で取得できるため、従来の水平一方向走査による画像取得時間に比べ約半分の時間に短縮することが可能である。
【００３０】
また、従来のレーザ顕微鏡では、励起波長を順次切替えて蛍光画像を取得する際に、蛍光波長の重なり（蛍光のクロストークと言われる）が問題となるが、本発明の実施の形態にかかるレーザ走査顕微鏡では、第１の波長のレーザ光によって発生する蛍光の波長分布と第２の波長のレーザ光によって発生する蛍光の波長分布とが重ならないように励起レーザ光の波長を設定することで、蛍光のクロストークを防止することも可能である。
【００３１】
本発明によれば、画像歪みや位置ずれが殆ど発生せず、異なる波長のレーザ光によるそれぞれの蛍光画像を一度の二次元走査で取得可能なレーザ走査顕微鏡を提供することができる。
【００３２】
また、本発明によれば、第１の往路の波長のレーザ光によって発生する蛍光の波長分布と第１の復路の波長のレーザ光によって発生する蛍光の波長分布とが重ならないように励起レーザ光の波長を設定することで、蛍光のクロストークを防止することも可能である。
【００３３】
なお、上述の実施の形態は例に過ぎず、上述の構成や形状に限定されるものではなく、本発明の範囲内において適宜修正、変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明の実施の形態にかかるレーザ走査顕微鏡の構成ブロック図である。
【図２】図１に示すレーザ走査顕微鏡における、標本上のレーザ光走査と波長毎のレーザ光走査を模式的に示す図。
【図３】図１に示すレーザ走査顕微鏡の制御信号例を示す図。
【符号の説明】
【００３５】
１、２、３    レーザ
４      ダイクロイックミラー群
５      波長選択装置
６      第１のダイクロイックミラー
７      Ｘスキャナ
８      Ｙスキャナ
９      標本
１０    ステージ
１１    第２のダイクロイックミラー
１２    第３のダイクロイックミラー
１、１４、１５    光検出器
１６、１７、１８  増幅器
１９、２０、２１  Ａ／Ｄ変換器
２２、２３、２４  フレームメモリ
２５    Ｄ／Ａ変換器
２６    モニター
２７    走査制御回路
３０    二次元走査手段
【図１】
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【図２】
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【図３】
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