(57)【要約】【課題】フェルラ酸およびフェルラ酸糖エステルの新たな用途を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、フェルラ酸糖エステルを有効成分として含有することを特徴とする腫瘍壊死因子産生抑制剤およびフェルラ酸を有効成分として含有することを特徴とする腫瘍壊死因子産生抑制剤に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェルラ酸糖エステルを有効成分として含有することを特徴とする腫瘍壊死因子産生抑制剤。
【請求項２】
フェルラ酸を有効成分として含有することを特徴とする腫瘍壊死因子産生抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素を用いたフェノール酸糖エステルの製造法、及びフェノール酸の一種であるフェルラ酸又はフェルラ酸糖エステルを有効成分として含有する腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）産生抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
フェノール酸エステルは種々の生理活性を有する。例えば、代表的なフェノール酸エステルであるフェルラ酸エステルには間脳の機能を調整する作用があることが知られている（特公昭43-1972 号公報）。また、フェルラ酸自体についても抗酸化作用（Toda S.,Kimura M. and Ohnishi M.:Planta Medical 57,8-10(1990) ）、抗炎症活性があることが知られている（Chawla,A,S.et al.Indian J.Exp.Biol）。
【０００３】
フェルラ酸糖エステルを製造する方法としては、タケノコや米ぬかなどの天然物から抽出する方法や、フェルラ酸と糖を脱水縮合させて合成する方法などが知られている。しかし、天然物から抽出する方法では、天然物中に含まれるフェルラ酸糖エステルが微量であるため、十分な量のフェルラ酸糖エステルを得るには大量の天然物原料が必要である。また、化学的に合成する方法は、収率が悪く、また、食品素材として使用するのに適していない。
【０００４】
糖エステルの合成法として、アルコールエステルと糖を水の少ない条件でリパーゼ等を作用させて合成する、いわゆるエステル交換法が知られている（特開昭62-195292 号公報、特開昭60-70094号公報、特開平5-168489号公報、特開60-227687 号公報）。しかし、フェルラ酸のカルボニル炭素の陰荷電圧が低いなどの理由から、未だにエステル置換法によりフェルラ酸糖エステルを含めフェノール酸糖エステルの合成に成功した例は知られていない。
【０００５】
ところで、炎症反応は、正常な状態では生体にとって必要な生体防御反応であるが、その行き過ぎは病的な状態をもたらすことになる。ＴＮＦは、当初腫瘍に対して傷害を与える物質として発見されたが、最近炎症反応に重要な役割を担っていることがわかった（山崎正利，炎症 10,163 ）。従って、ＴＮＦの産生を抑制することにより、病的な炎症状態を緩和することが可能である。このため、種々の物質についてＴＮＦ産生抑制活性が調べられてきたが、このような活性を有する物質は少なく、わずかにシソ抽出液やショウガ抽出液に見出されているにすぎない（特開平4-79852 号公報、山崎正利，食品の生体調節機能，423-430 頁，学会出版センター発行）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、種々の生理活性を有するフェノール酸糖エステルの効率的な製造法を提供するとともに、該化合物の一種であるフェルラ酸糖エステルの新たな用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、種々の反応条件を工夫することによりエステル交換法によりフェノール酸糖エステルを製造することに成功し、また、このフェノール酸糖エステルの一種であるフェルラ酸糖エステルが、ＴＮＦの産生を強く抑制することを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、エステル置換反応を利用したフェノール酸糖エステルの新規な製造法を提供する。また、本発明は、フェルラ酸又はフェルラ酸糖エステルを有効成分とする新規なＴＮＦ産生抑制剤を提供する。ＴＮＦは、人体における炎症に関連するサイトカインであるので、この産生を抑制する本抑制剤は、抗炎症剤として利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
即ち、本発明は、フェノール酸アルコールエステルと糖とを、エステル結合を切断し得る酵素を用いて溶媒中で反応させることを特徴とするフェノール酸糖エステルの製造法である。また、本発明は、フェルラ酸糖エステル又はフェルラ酸を有効成分として含有することを特徴とするＴＮＦ産生抑制剤である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
１．フェノール酸糖エステルの製造法
本発明では、フェノール酸アルコールエステルと糖とを、酵素を用いて溶媒中で反応させることによりフェノール酸糖エステルを製造する。
ここで用いるフェノール酸アルコールエステルは、どのようなものでもよいが、エステルのフェノール酸相当部位は、フェルラ酸残基、ｐ−クマール酸残基、カフェー酸残基、シナピン酸残基又はケイヒ酸残基が好ましく、フェルラ酸残基が特に好ましい。また、エステルのアルコール相当部位は炭素数が１〜４の置換又は非置換のアルキル基が好ましく、特に炭素数が１〜４のハロゲン置換又は非置換のアルキル基が好ましい。ハロゲン置換アルキル基としては、フェノール酸とエステル結合し得るものであればどのようなものでもよいが、ハロゲン置換メチル基及びハロゲン置換エチル基が好ましく、特にハロゲン置換エチル基が好ましい。ハロゲン置換メチル基及びハロゲン置換エチル基としてはＣＣｌ３−、ＣＨＣｌ２−、ＣＨ２Ｃｌ−、ＣＦ３−、ＣＨＦ２−、ＣＨ２Ｆ−、ＣＢｒ３−、ＣＨＢｒ２−、ＣＨ２Ｂｒ−、ＣＣｌ３ＣＨ２−、ＣＨＣｌ２ＣＨ２−、ＣＨ２ＣｌＣＨ２−、ＣＦ３ＣＨ２−、ＣＨＦ２ＣＨ２−、ＣＨ２ＦＣＨ２−、ＣＢｒ３ＣＨ２−、ＣＨＢｒ２ＣＨ２−、ＣＨ２ＢｒＣＨ２−等を例示することができ、これらの中でも特にＣＣｌ３ＣＨ２−が好ましい。非置換アルキル基としては、ＣＨ３−、Ｃ２Ｈ５−、Ｃ３Ｈ７−、Ｃ４Ｈ９−等を例示することができ、これらの中でも特にＣ４Ｈ９−が好ましい。フェノール酸アルコールは、フェノール酸とアルコールを硫酸存在下で脱水縮合させることにより合成できる。
【００１１】
本発明における糖とは、ポリアルコールのアルデヒド、ケトン、酸、さらにポリアルコール自身や、それらの誘導体、縮合体などをいい、単糖、オリゴ糖、多糖のいずれも含む。具体的には、アラビノース、キシロース、グルコース、フラクトース、マンノース、フコース、ガラクトースのような中性単糖、デキストリン、サイクロデキストリン、マルトース、マルトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、ラクトシュクロース、イソマルトオリゴ糖、セロオリゴ糖、セロビオースのような中性オリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、セルロース、マンナンのような中性多糖、アスコルビン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコールノイラミン酸のような酸性単糖、ポリシアル酸、ペクチン、アルギン酸、カラギーナンのような酸性多糖、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミンのようなアミノ糖、キトオリゴ糖、キトサンオリゴ糖、のようなアミノ糖のオリゴ糖、キチン、キトサンのようなアミノ糖の多糖などを例示することができる。
【００１２】
用いる酵素は、フェノール酸アルコールエステルのエステル結合を切断し得るものであればどのようなものでもよく、例えば、リパーゼ、エステラーゼ、セリンプロテアーゼ等を使用することができる。リパーゼとしては、Wheat germ由来のリパーゼ、Porcine pancreas由来のリパーゼ、Candida cylindracea 由来のリパーゼ、Pseudomonas species 由来のリパーゼ（以上、Sigma 社製）、Aspergillus niger 由来のリパーゼ、Mucor javanicus 由来のリパーゼ、Candida rugosa由来のリパーゼ、Rhizopus species由来のリパーゼ（以上、天野製薬社製）、Candida cylindracea 由来のリパーゼ（名糖産業社製）、Rhizopus japonicus由来のリパーゼ（長瀬産業社製）などを用いることができる。エステラーゼとしては、Porcine liver 由来のエステラーゼ（Sigma 社製）、Streptomyces rochei 由来のカルボキシルエステラーゼ（和光純薬社製）、Candida cylindracea 由来のコレステロールエステラーゼ（生化学工業社製）、Bovine pancreas 由来のコレステロールエステラーゼ、Porcine liver 由来のコレステロールエステラーゼ、Pseudomonas species 由来のコレステロールエステラーゼ（以上Sigma 社製）等を用いることができる。セリンプロテアーゼとしては、Bacillus thermoproteolyticus由来のサーモリシン、Bovine pancreas 由来のキモトリプシン、Bacilluslicheniformis由来のズブチリシン（以上Sigma 社製）、Bacillus subtilis 由来のプロテアーゼ（天野製薬社製）等を用いることができる。また、上記酵素は、対ｐＨ及び温度、有機溶媒安定性改良、活性維持、再使用などを目的として適当な担体に固定化することもできる。固定化用担体としては、セルロース、デキストラン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコース、イオン交換樹脂、磁性体、活性炭、アルミナ、光架橋体樹脂、アルギン酸塩、セライトなどを使用することができる。
【００１３】
用いる溶媒は、どのようなものでもよいが、水を溶媒とした場合、フェノール酸アルコールエステルが加水分解し、フェノール酸糖エステルの収率が悪くなる。また、ヘキサンのような無極性の溶媒では、フェノール酸アルコールエステル、フェノール酸糖エステルのいずれも溶解しにくいので好ましくない。従って、本発明においては、極性を有する溶媒を使用するのが好ましい。具体的には、メタノール、エタノール、イソプロパノール、イソブタノール、アセトン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ピリジン、ジメチルスルホキシド、２−ピロリドン、tert- アミルアルコール、エチルエーテル、イソプロピルエーテル等を挙げることができる。
【００１４】
フェノール酸アルコールエステルと糖の混合比は特に限定されないが、例えば、溶媒としてピリジンを用いた場合には、１０：１〜１：１０とするのが好ましく、３：１〜１：３とするのが更に好ましい。反応に使用する酵素の量は、フェノール酸アルコールエステル１g あたり、１００〜１００００００U とするのが好ましく、１０００〜１０００００U とするのが更に好ましい。反応温度は、用いる酵素の最適温度となるように設定すればよく、例えば、酵素としてPseudomonas species 由来のリパーゼ又はAspergillus niger 由来のリパーゼを用いた場合であれば２０〜５０℃が好ましく、４０〜４５℃が更に好ましい。反応時間は、酵素の量、反応温度等により反応速度が異なるので、反応の進み具合に応じて決めればよいが、通常、４８〜７２時間程度で十分な量のフェノール酸糖エステルが生成する。
【００１５】
得られた反応液からフェノール酸糖エステルを単離精製するには、まず、反応液を遠心分離（例えば、１５０００rpm ，５min ）し、上清を孔径０．２２μm程度のフィルターで、酵素等の不溶物を除去する。次に、得られた溶液を濃縮乾固し、蒸留水を加え、水溶性画分を分離する。この水溶液画分から、例えば、InertsilＯＤＳカラムを用いた（溶出液３０％メタノール）ＨＰＬＣで、フェノール酸糖エステル画分を分離することができる。
【００１６】
２．フェルラ酸又はフェルラ酸糖エステルを有効成分とするＴＮＦ産生抑制剤
本発明のＴＮＦ産生抑制剤は、フェルラ酸又はフェルラ酸糖エステルを有効成分として含有する。
フェルラ酸は試薬として市販されているので、それを用いることができる。フェルラ酸糖エステルは、上記のようにフェルラ酸糖エステルと糖から酵素を用いて製造できるほか、米ぬかのようなフェルラ酸糖エステルを含む天然物から抽出することもできる。米ぬかからフェルラ酸糖エステルを抽出する方法は、例えば、Ishii and Hiroi の方法（Ishii T. and Hiroi T.:Carbohydr.,206,297,1990）に従って行うことができる。この方法では、ホモジナイズした米ぬかを脱脂した後、ドリセラーゼで処理し、カラムクロマトグラフィーによりフェルラ酸糖エステルを単離精製する。
【００１７】
フェルラ酸及びフェルラ酸糖エステルは、ＴＮＦの産生を抑制する作用を持つ。前述の如くＴＮＦは、炎症反応と密接に関係するので、フェルラ酸又はフェルラ酸糖エステルを製剤化して人体に投与することにより病的な炎症を抑制することができる。
【００１８】
本ＴＮＦ産生抑制剤の人体への投与方法は、特に制限されず、経口、非経口、又は吸引により投与されるが、経口投与が一般的に好ましい。また、クリームなどに製剤化して皮膚炎症部に塗布する外用薬としても用いることができる。
【００１９】
本ＴＮＦ産生抑制剤は、フェルラ酸又はフェルラ酸糖エステルに、薬理的に許容しうる固体又は液体の製剤担体を配合することができる。製剤化されたＴＮＦ産生抑制剤は、注射剤、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、水剤、シロップ剤、懸濁剤、又は乳剤等の形態を採ることができる。製剤担体としては、かかる形態に通常用いられる、賦形剤、結合剤、滑沢剤、被覆剤、溶解補助剤、乳化剤、懸濁剤、安定化剤、溶剤等を挙げることができる。製剤中におけるフェルラ酸又はフェルラ酸糖エステルの濃度は、その製剤形態に応じて決めればよい。本ＴＮＦ産生抑制剤の人体への投与量は、製剤形態、治療すべき症状等により異なるが、通常は成人一日当たり、５〜２０mg/kg （体重）が適当である。
【実施例】
【００２０】
〔実施例１〕フェルラ酸糖エステルの製造
＜フェルラ酸トリクロロエチルの合成＞
フェルラ酸（築野食品工業社製）３．８８g をベンゼン１５０ml中に懸濁し、トリクロロエタノール８．９６g 、硫酸０．５ml、そしてモレキュラーシーブ４Ａ（和光純薬社製）を５g 加え、１時間還流した。冷後、反応液を精製水１００mlで２回ずつ洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去した。この残渣をシリカゲル（１０g ）カラムクロマトグラフィーに負荷し、クロロホルムで溶出し、フェルラ酸トリクロロエチル３．２mlを得た。
【００２１】
＜フェルラ酸ブチルの合成＞
フェルラ酸１０g をｎ−ブタノール２００mlに溶解し、この混合液に濃硫酸６mlを加え、沸石を少量加えて、冷却管をセットしたナスフラスコ内で１時間還流加熱する。反応液は炭酸ナトリウムで中和後、生成したフェルラ酸ブチルを酢酸エチルで抽出し、濃縮乾固した。このようにして得られたフェルラ酸ブチルの収量は１１．９g であった。
【００２２】
＜フェルラ酸糖エステルの合成＞
あらかじめ８０℃以上に加温したピリジン１mlに糖を８０mg溶解させ、冷後、上記で得られたフェルラ酸アルコールエステル２００mgを溶解させ、次いで、Pseudomonas species 由来のリパーゼ（２５U/mg，シグマ社製）２４mg又はAspergillus niger 由来のリパーゼ（６０U/mg，天野製薬社製）２００mgを加えて、４０℃、１〜７日撹拌し、反応を行った。反応に用いた糖、フェルラ酸アルコールエステル及びリパーゼの組み合わせは、下記の通りである。
【００２３】
反応液Ａ：フェルラ酸トリクロロエチル＋Ｄ−グルコース＋Aspergillus niger 由来のリパーゼ
反応液Ｂ：フェルラ酸トリクロロエチル＋Ｄ−グルコース＋Pseudomonas species 由来のリパーゼ
反応液Ｃ：フェルラ酸トリクロロエチル＋Ｌ−アラビノース＋Aspergillus niger 由来のリパーゼ
反応液Ｄ：フェルラ酸トリクロロエチル＋Ｄ−キシロース＋Aspergillus niger 由来のリパーゼ
反応液Ｅ：フェルラ酸ブチル＋Ｄ−グルコース＋Aspergillus niger 由来のリパーゼ
反応液Ｆ：フェルラ酸ブチル＋Ｄ−グルコース＋Pseudomonas species 由来のリパーゼ
【００２４】
上記で得られた反応液を薄層板の一端にスポットし、薄層クロマトグラフィーにより、フェルラ酸糖エステルの生成を確認した。薄層板は、Merck 社製のＲＰ−１８Ｆ254s（０．２５mm,glass）プレートを使用し、３０％メタノールを移動相に用いて展開を行った。スポットの確認は、検出波長２５４nmおよび３６５nmで行い、糖の検出は、アニリン、ジフェニルアミン、リン酸、アセトン（４ml：４g ：３０ml：２００ml）の混合液を噴霧し、ホットプレート上で加熱して発色させた。
【００２５】
結果を図１、図２、及び図３に示す。図１は糖を発色させた場合、図２は検出波長を３６５nmとした場合、図３は検出波長を２５４nmとした場合を示す。図中の番号は下記のものを示す。
１：後述するFr.5、２：後述するFr.6、３：フェルラ酸、４：反応液Ａ、５：反応液Ｂ、６：反応液Ｃ、７：反応液Ｄ、８：反応液Ｅ、９：反応液Ｆ
【００２６】
図１が示すように、レーン４〜９において、フェルラ酸よりも極性の高い位置に糖の発色で検出されるスポットが確認された。この物質は、図２及び図３が示すように２５４nm及び３６５nmの波長の光でも検出することができた。各レーンのＲｆ値は、レーン１が０．２５、レーン２が０．１４、レーン３が０．１０、レーン４が０．１９、レーン５が０．１９、レーン６が０．１２、レーン７が０．１２、レーン８が０．１６、レーン９が０．１６であった。以上の結果から、反応液Ａ、Ｂ、Ｅ、及びＦではフェルラ酸グルコースが、反応液Ｃではフェルラ酸アラビノースが、反応液Ｄではフェルラ酸キシロースが、それぞれ生成していたことが確認された。
【００２７】
〔実施例２〕
＜フェルラ酸糖エステルの分離精製＞
市販の米ぬかに、その６倍量の蒸留水を加え、ホモジナイズし、ステンレス製の分析ふるい（４０−６０メッシュ）上で濾過した。さらに２４倍量の蒸留水で洗浄後、６倍量のエタノールで洗浄した。残渣に６倍量のベンゼン：エタノール（２：１）を加え、室温で、１７〜２０時間脂質を抽出した。分析ふるいを用いて脂質抽出液を除去した後、残渣を３倍量のベンセン：エタノール（２：１）、次に６倍量のアセトンで洗浄し、脱脂米ぬかを調製した。
【００２８】
得られた脱脂米ぬかに５０倍量の蒸留水を加え懸濁後、精製ドリセラーゼを１８０mg/lの割合で添加し、酢酸でｐＨを５に調整した。３０℃、１５時間インキュベート後、１００℃、１５分間の加熱で反応を停止させた。サラシ布を用いてろ液を分離し、エバポレーターにて濃縮した。濃縮液に５倍量のエタノールを加え、一晩放置後ろ紙で不溶物を除去した。なお、精製ドリセラーゼは、協和醗酵より購入したドリセラーゼをFry の方法（Fry S.C.:Biochem.J.203,493,1982）で精製して調製した。また、このとき、ドリセラーゼのセルラーゼ活性及びキシラナーゼ活性を、アビセル及びキシランを基質として、精製した還元糖量測定して求めた（Somogyi M.:J.Biol. Chem.,195,19,1952, Nelson N.:J.Biol. Chem.,153,375,1944）。
【００２９】
得られたエタノール可溶性物質をSephadex LH-20（φ２．６×９０cm）で分画した。溶出液は、蒸留水を用いた。ピークの検出は３２０nmのＵＶ吸収でフェノール酸を検出し、フェノール硫酸法（Dubois M.et al.:Anal.Chem.,28,350,1956）によって処理反応後４９０nmで糖の検出を行った。この分画操作で、フェルラ酸糖エステル画分フラクション５（Fr.5）及びフラクション６（Fr.6）を分離した。
【００３０】
＜腫瘍壊死因子産生抑制試験＞
７週令の近交系Ｃ３Ｈ／Ｈｅ雌マウス（日本生物材料（株）より購入）に下記の各試験液０．４mlとムラミルジペプチド２７mg/kg を同時に経口投与した。
（１）１％フェルラ酸、（２）５％フェルラ酸、（３）シソエキス（アミノアップ化学製）、（４）１％Fr.5、（５）１％Fr.6、（６）５％Fr.6、（７）蒸留水
（対照）３時間後、リポポリサッカロイド２５μg を静脈内投与した。そして、２時間後、心臓より採血を行い、血清を分離した。血清の採取には、各試験液ごと３匹のマウスを使用した。
【００３１】
Ｌ９２９細胞（大日本製薬社製）を９６well平底プレートに、８．０×１０４個／１００μl ／wellになるようにまき、これに上記で得られた試料血清の１０〜１０８倍希釈液を５０μl 加えた。Ｌ９２９細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ニチレイ（株））を含むEagle's minimal essential medium（ＥＭＥＭ）で３〜４日おきに継代しているものを用いた。また、各wellには、感受性を増強させるためアクチノマイシンＤ（和光純薬社製）を培養液中に最終濃度が１μg/mlになるように加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて１８時間培養した。培地を除いた後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で１回洗浄し、０．５％クリスタルバイオレット−２０％メタノールを２５μl/well加え、２０分間染色した。そして、各wellをＰＢＳで洗い、乾燥してから、０．５％ＳＤＳを１００μl/well加え、マイクロミキサーにて振盪し、マイクロプレートレーダー（Bio-Rad 製）で５４０nmの吸光度を測定した。血清中の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の量（Ｕ）は、５０％の殺細胞活性濃度を１Ｕとして算出した。結果を図４に示す。
【００３２】
図４が示すように、従来からＴＮＦ産生抑制効果があることが知られていたシソエキスのみならず、フェルラ酸、Fr.5及びFr.6のいずれもＴＮＦ産生を抑制した。特にFr.6の場合は、５％濃度で投与したときには、ＴＮＦの産生量を８０％も抑制した。一方、フェルラ酸の場合は、５％まで濃度を上げても、Fr.6のような大きな抑制効果は認められなかった。
【００３３】
〔参考例１〕ポリエチレングリコール修飾酵素の調製
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾酵素の調製はInada らの方法（InadaY.et al:Biochemical and Biophysical Reseach Communications.,122,845,1984）に従って行った。まず、０．４M ホウ酸バッファー（ｐＨ１０）３．２mlにCandida cylindracea 由来のリパーゼ（名糖産業社製）１８mgを溶解し、この溶液に塩化シアヌルで活性化したメトキシポリエチレングリコール（活性化ＰＥＧ、シグマ社製）を０．８g 添加して３７℃、１時間撹拌した。０．１M ホウ酸バッファー（ｐＨ８．０）１００ml加えて反応を停止させた後、未反応のＰＥＧを限外濾過（Amicon PM30 メンブレン）により除去した。次に、蒸留水中で透析を行い、凍結乾燥して、白色の乾燥物を得た。
【００３４】
〔実施例３〕
＜フェルラ酸グルコースエステルの合成＞
フェルラ酸１００g をトリクロロエタノール５００g に溶解し、硫酸０．５ml、モレキュラーシーブ（ＭＳ）４Ａを加え、７０℃、１時間反応させた。冷後、トリクロロエタノールを留去し、残渣をシリカゲル（ワコーゲルC-200 、７５０g ）カラムクロマトグラフに負荷し、クロロホルム：メタノール（50：１）で反応成績体を溶出させ、約１００g のフェルラ酸トリクロロエチルを得た。生成物の純度は、Inertsil Silカラム（ＧＬサイエンス製）を用いたＨＰＬＣで分析した。また、生成物の分子量は、ガス質量分析器（島津QP-5000 ）で分析した。
【００３５】
無水硫酸ナトリウムで脱水したピリジン５００mlにＤ−グルコース４０g を溶解させ、この溶液に上記のフェルラ酸トリクロロエチルを４０g 溶解させた。次に、この溶液にリパーゼＡ６（天野製薬製）を添加し、４０℃で３日間反応させた。
【００３６】
得られた酵素合成反応液の不溶物を濾紙（Advantec 5A ）で除去した後、溶媒を留去し、メタノールに溶解した。メタノール可溶画分を蒸留水に再溶解して遠心分離後、上清をＣ−１８（ＧＬサイエンス製）カラムで精製した。蒸留水で溶出後、３０％エタノール、メタノールで順次溶出した。３０％メタノール溶出画分を濃縮した後、逆相ＨＰＬＣ（Inertsil ODS-80A：ＧＬサイエンス）で精製したところ、ピークａ〜ｄの４つのピークが認められた（図５）。これらの成分の中からピークａの成分のみを再び逆相ＨＰＬＣで分離したところ、ピークａとピークｃの２つの成分に分離した（図６）。このように２つのピークは、グルコースのアノマー構造の違いによるものと考え、ピークａとピークｃの成分を混合物のまま以下の構造解析を行った。
【００３７】
＜赤外吸収スペクトル（ＩＲ）測定＞
ＩＲ測定は、FTIR-8200PC （島津製作所製）によりＫＢｒ錠剤法で行った。測定の結果、３４００cm−１付近に−ＯＨ（伸縮）、２９４０cm−１付近に−ＣＨ（伸縮）と−ＣＨ２びＣＨ３（逆対称伸縮）、１６９２cm−１に−Ｃ＝Ｏ（伸縮）、１６３２cm−１に芳香族の−Ｃ＝Ｃ−（伸縮）、１５９９cm−１、１５１８cm−１に芳香族の−Ｃ＝Ｃ−（面内骨格振動）、指紋領域で９００〜８００cm−１に糖のタイプ吸収に由来する吸収体が認められた。フェルラ酸でみられた１６６７cm−１の吸収は、１６９２cm−１へと高波数側にシフトしていたことから、エステル結合の存在が考えられた。
【００３８】
＜ＦＡＢ−ＭＳ測定＞
ＦＡＢ−ＭＳ測定は、ZAB-HF質量分析計（ＶＧ社）で行った。マトリックスにはグリセロールを用い、イオン加速電圧は８．０kVで測定を行った。測定の結果、 positive ＦＡＢ−ＭＳはm/z 357(M+H)+ に（図７）、negative ＦＡＢ−ＭＳはm/z 355(M-H)-に（図８）、強い分子イオンピークが認められた。この結果より、合成物の分子量は、３５６であり、フェルラ酸とグルコースがエステル結合した分子量に等しいことが明らかとなった。
【００３９】
＜核磁気共鳴スペクトル測定＞
ＮＭＲ測定には、UNITY INOVA 600 型を使用した。1Ｈ−ＮＭＲの場合は、溶媒に５％ＣＤ3ＯＤを含むＤ2Ｏを使用し、ＨＤＯを内部標準として測定した。１３Ｃ−ＮＭＲは、内部標準としてＣＤ3ＯＤを使用した。また、ＤＱＦ−ＣＯＳＹ測定、ＨＭＱＣ（1Ｈ観測ＣＨ−ＣＯＳＹ）測定も行った。 1Ｈ−ＮＭＲの測定結果を表１に、１３Ｃ−ＮＭＲの測定結果を表２に示す。
【００４０】
【表１】
2007039469.tif 000002
【００４１】
【表２】
2007039469.tif 000003
【００４２】
1Ｈ−ＮＭＲより、グルコースのアノメリックプロトンの化学シフトが確認され、ピークａ、ｃはアノマー構造の違いによるものと考えられた。さらに結合定数Ｊ7.8 が15.9Hzであったことは、フェルラ酸がトランス体として存在していることを示している。また、１３Ｃ−ＮＭＲより、フェルラ酸の結合位置は、未置換のグルコースのＣ−６位の６２ppm シグナルが観察されず、６４．５ppm に低磁場シフトしていたので、フェルラ酸はグルコース残基のＣ−６位に結合していることが示された。すなわち、ピークａは６−Ｏ−フェルロイル−β−グルコピラノシドで、ピークｃは６−Ｏ−フェルロイル−α−グルコピラノシドということが明らかになった（図９）。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】酵素合成生成物の薄層クロマトグラムを表す写真である。
【図２】酵素合成生成物の薄層クロマトグラムを表す写真である。
【図３】酵素合成生成物の薄層クロマトグラムを表す写真である。
【図４】フェルラ酸糖エステル画分のマウスのＴＮＦ産生抑制効果を示す図である。
【図５】３０％メタノール溶出画分の逆相ＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。
【図６】ピークａの成分の逆相ＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。
【図７】ＦＡＢ−ＭＳスペクトル（正イオン）を示す図である。
【図８】ＦＡＢ−ＭＳスペクトル（負イオン）を示す図である。
【図９】フェルラ酸グルコースエステルの構造を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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