(57)【要約】      （修正有）【課題】  ラクトバチラス属細菌のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質、並びに当該タンパク質をコードする核酸を提供する。【解決手段】  天然のアミノ酸配列において１またはそれより多くのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置換されており、溶液における保存安定性が向上しており、以下の群から選択される核酸によってコードされる。（ａ）特定の配列を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸；（ｂ）特定の塩基配列を有する核酸；（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸；及び、（ｄ）特定の配列を有するアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列含むタンパク質であって、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異型のラクトバチラス属細菌のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質をコードする核酸であって、ここにおいて、前記変異型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質は、天然のアミノ酸配列において１またはそれより多くのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置換されており、そして、溶液における保存安定性が向上しているタンパク質である、前記核酸。
【請求項２】
前記変異型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質は、配列番号１の９番目、１５６番目、１９５番目、２７５番目、２８６番目及び３４０番目に相当するアミノ酸残基からなるグループから選択される１またはそれより多くのアミノ酸残基が、天然のアミノ酸残基とは別のアミノ酸残基に置換されている、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記変異型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質が、以下のいずれかの条件の１またはそれより多くを満たす：
１）配列番号１の９番目に相当するアミノ酸残基がグリシンに置換されている；
２）配列番号１の１５６番目に相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換されている；
３）配列番号１の１９５番目に相当するアミノ酸残基がシステインに置換されている；
４）配列番号１の２７５番目に相当するアミノ酸残基がリシンに置換されている；
５）配列番号１の２８６番目に相当するアミノ酸残基がバリンに置換されている；及び
６）配列番号１の３４０番目に相当するアミノ酸残基がリシンに置換されている
請求項１又は２に記載の核酸。
【請求項４】
前記変異型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質が、配列番号１の１９５番目に相当するアミノ酸残基グリシンがシステインに置換されている、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
前記ラクトバチラス属細菌が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＮＢＲＣ１４５１１であり、Ｄ−乳酸脱水素酵素タンパク質の天然のアミノ酸配列が配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項６】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項７】
請求項６の発現ベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項８】
大腸菌である、請求項７に記載の形質転換体。
【請求項９】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の核酸を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、そして、核酸の発現を可能にする条件下で形質転換細胞を培養する、ことを含む、変異型のラクトバチラス属細菌のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質の製造方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法によって製造された変異型のラクトバチラス属細菌のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質。
【請求項１１】
変異型のラクトバチラス属細菌のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質であって、天然のアミノ酸配列において１またはそれより多くのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置換されており、そして、溶液における保存安定性が向上している、前記変異型のラクトバチラス属細菌のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質。
【請求項１２】
配列番号１の９番目、１５６番目、１９５番目、２７５番目、２８６番目及び３４０番目に相当するアミノ酸残基からなるグループから選択される１またはそれより多くのアミノ酸残基が、天然のアミノ酸残基とは別のアミノ酸残基に置換されている、請求項１０又は１１に記載の変異型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質。
【請求項１３】
以下のｐＨ安定性及び／又は熱安定性を示す、請求項１０ないし１２のいずれか１項に記載の変異型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質。
ｐＨ安定性：５．５−８．５（２５℃、７日間）
熱安定性：＜３７−５５℃（ｐＨ９．０、１５分）。
【請求項１４】
請求項１０−１３のいずれか１項に記載の変異型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質、使用説明書を含む、アラニンアミノトランスフェラーゼ活性測定用キット。
【請求項１５】
以下の：
（ａ）  配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸；
（ｂ）  配列番号２の塩基配列を含む核酸；
（ｃ）  （ａ）又は（ｂ）の核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸；及び
（ｄ）  配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列含むタンパク質であって、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる群から選択される、Ｄ−乳酸脱水素酵素タンパク質をコードする核酸。
【請求項１６】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＮＢＲＣ１４５１１由来のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質をコードする、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１７】
（ａ）  配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸；又は
（ｂ）  配列番号２の塩基配列を含む核酸；
である、請求項１５又は１６に記載の核酸。
【請求項１８】
請求項１５ないし１７のいずれか１項に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載の発現ベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項２０】
以下の：
（ａ）  配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸；
（ｂ）  配列番号２の塩基配列を含む核酸；
（ｃ）  （ａ）又は（ｂ）の核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸；及び
（ｄ）  配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列含むタンパク質であって、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる群から選択される核酸によってコードされる、Ｄ−乳酸脱水素酵素タンパク質。
【請求項２１】
配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトバチラス属細菌のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質、前記タンパク質をコードする核酸、前記タンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸脱水素酵素は、特に臨床検査において、アラニンアミノトランスフェラーゼ活性測定に共役酵素としての有用性が着目されている。乳酸には、Ｄ体とＬ体の天然の光学異性体が知られており、Ｄ−乳酸脱水素酵素はＤ体の乳酸にのみ、そして、Ｌ−乳酸脱水素酵素はＬ体にのみ作用する。
【０００３】
従来既知のＤ−乳酸脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．２８）はＬ−乳酸脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．２７）と比較して、アラニンアミノトランスフェラーゼ活性測定試薬におけるα−ヒドロキシグルタレートデヒドロゲナーゼ（α−Ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）活性に由来すると考えられるブランク反応がほとんど無い点で優れている。しかしながら、従来公知のＤ−乳酸脱水素酵素は溶液中における安定性が低く、臨床検査用試薬として使用する場合において溶液中での長期保存が難しかった。更に、ピルビン酸に対するＫｍ値が高いことから、高濃度域が測定できなかった。
【０００４】
以上のことから、溶液中での長期保存安定性に優れており、好ましくは、ピルビン酸に対するＫｍ値が低いＤ−乳酸脱水素酵素が望まれてきた。
【特許文献１】特許第２７３９４７３号
【特許文献２】特許第３５５５９５０号
【特許文献３】特開平０９−０００２４７号
【特許文献４】特開平１０−０８４９４６号
【特許文献５】特開平１０−０８４９５２号
【特許文献６】特開２００２−１３６２９３
【非特許文献１】Microbiological Reviews、Vol.44、p.106-139(1980)、 Garvie EI.
【非特許文献２】Methods in Enzymology、Vol.89、p.35-40(1982)、 Brandt RB.
【非特許文献３】Appl. Environ. Microbiol. 37 :379-382 (1979)
【非特許文献４】Appl. Environ. Microbiol. 65 (9), 4002-4007 (1999)
【非特許文献５】Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (11), 3906-3912 (2005)
【非特許文献６】Eur. J. Biochem. 208 (3), 799-805 (1992)
【非特許文献７】J. Biol. Chem. 267 (12), 8499-8513 (1992)
【非特許文献８】FEBS Lett. 290 (1-2), 61-64 (1991)
【非特許文献９】J. Biol. Chem. 266 (19), 12588-12594 (1991)
【非特許文献１０】Submitted (05-DEC-2003) Microbiology, College of Life Science, Nankai University, 94 Weijin Road, Tianjin, Tianjin 300071, PRC
【非特許文献１１】Appl. Environ. Microbiol. 70 (10), 6290-6295 (2004)
【非特許文献１２】Clin.Chem.Acta,237:43-58,1995
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本願発明は、変異型のラクトバチラス属細菌のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質をコードする核酸を提供することを目的とする。ここにおいて、前記変異型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質は、天然のアミノ酸配列において１またはそれより多くのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置換されており、そして、溶液における保存安定性が向上しているタンパク質である。
【０００６】
本発明の１態様において、変異型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質は、配列番号１の９番目、１５６番目、１９５番目、２７５番目、２８６番目及び３４０番目に相当するアミノ酸残基からなるグループから選択される１またはそれより多くのアミノ酸残基が、天然のアミノ酸残基とは別のアミノ酸残基に置換されている。
【０００７】
本発明において、好ましくは、前記変異型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質は、配列番号１の１９５番目に相当するアミノ酸残基グリシンがシステインに置換されている。
本発明はまた、上記本発明の核酸を含む発現ベクター、当該発現ベクターで形質転換された形質転換体、を提供することを目的とする。
【０００８】
本発明はさらに、変異型のラクトバチラス属細菌のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質の製造方法、を提供することを目的とする。本発明の製造方法は、上記本発明の核酸を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、そして、核酸の発現を可能にする条件下で形質転換細胞を培養する、ことを含む。
【０００９】
本発明はさらにまた、上記本発明の方法によって製造された変異型のラクトバチラス属細菌のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質を提供することを目的とする。
本発明はまた、変異型のラクトバチラス属細菌のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質であって、天然のアミノ酸配列において１またはそれより多くのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置換されており、そして、溶液における保存安定性が向上している、前記変異型のラクトバチラス属細菌のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質を提供することを目的とする。本発明のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質は、好ましくは以下のｐＨ安定性及び／又は熱安定性を示す
ｐＨ安定性：５．５−８．５（２５℃、７日間）
熱安定性：＜３７−５５℃（ｐＨ９．０、１５分）。
【００１０】
本発明また、上記本発明の変異型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質、使用説明書を含む、アラニンアミノトランスフェラーゼ活性測定用キットを提供することを目的とする。
本発明は別の一態様において、天然型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質をコードする核酸を提供することを目的とする。本発明の核酸は、
以下の：
（ａ）  配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸；
（ｂ）  配列番号２の塩基配列を含む核酸；
（ｃ）  （ａ）又は（ｂ）の核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸；及び
（ｄ）  配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列含むタンパク質であって、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる群から選択される。
【００１１】
本発明の核酸は好ましくは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＮＢＲＣ１４５１１由来のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質をコードする。
本発明はまた、本発明の核酸を含む発現ベクター、本発明の発現ベクターによって形質転換された形質転換体を提供することを目的とする。
【００１２】
本発明はさらにまた、以下の：
（ａ）  配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸；
（ｂ）  配列番号２の塩基配列を含む核酸；
（ｃ）  （ａ）又は（ｂ）の核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸；及び
（ｄ）  配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列含むタンパク質であって、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる群から選択される核酸によってコードされる、天然のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、上記問題解決のために鋭意・研究に努めた結果、本願発明を想到した。
具体的には、先ず、既知の乳酸菌１０種を選択し比較検討した結果、Ｄ−乳酸脱水素酵素よりピルビン酸に対するＫｍ値が低い酵素が得られる菌の候補として、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＮＢＲＣ１４５１１（独立行政法人 製品評価技術基盤機構（NITE）  菌株登録番号、同法人より入手可能）（Suzuki, K., Benno, Y., Mitsuoka, T., Takebe, S., Kobashi, K. & Hase, J. （1979）．Appl. Environ. Microbiol. 37 ：379-382）を採用した。
【００１４】
当該菌から、新規のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質をコードする遺伝子（核酸）を単離した（配列番号２）。さらに、当該核酸を用いて、Ｄ−乳酸脱水素酵素タンパク質（配列番号１）を遺伝子工学的に発現させて活性を確認し、本発明を想到した。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＮＢＲＣ１４５１１由来の新規Ｄ−乳酸脱水素酵素タンパク質は、ピルビン酸に対するＫｍ値が公知のタンパク質よりも低いという利点を有するものである。
【００１５】
さらに、本発明者らは、Ｄ−乳酸脱水素酵素の溶液における保存安定性を向上させるために本研究を続けた。そして、Ｄ−乳酸脱水素酵素の天然のアミノ酸配列より、ランダムに１個もしくは２個以上のアミノ酸を別のアミノ酸に置換させることで、溶液中における安定性が向上した変異型Ｄ−乳酸脱水素酵素活性を有する蛋白質を得ることに成功し、本発明を想到した。
【００１６】
変異型のラクトバチラス属細菌のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質をコードする核酸
よって、本発明は一側面において、変異型のラクトバチラス属細菌のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質をコードする核酸であって、ここにおいて、前記変異型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質は、天然のアミノ酸配列において１またはそれより多くのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置換されており、そして、溶液における保存安定性が向上しているタンパク質である、前記核酸、を提供する。
【００１７】
「Ｄ−乳酸脱水素酵素タンパク質」とは、Ｄ−乳酸から水素を除く触媒活性を有する酵素タンパク質であり、一般に以下のような反応を可逆的に促進する。
反応：  Ｄ−乳酸  ＋  ＮＡＤ＋    ⇔  ピルビン酸  ＋  ＮＡＤＨ  ＋  Ｈ＋
また、限定されるわけではないが、以下のような生化学的性質を有する。
【００１８】
分子量：  約４３，０００−４５，０００（好ましくは、約４４，０００）
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  サブユニットあたり）
Ｋｍ値：  ピルビン酸  約０．１４−約０．３０ｍＭ
ＮＡＤＨ  約０．１０−約０．１５ｍＭ
至適ｐＨ：  約６．５−約７．５
「Ｄ−乳酸脱水素酵素タンパク質」の酵素活性の測定方法は限定されず、公知の方法を用いて調べることができる。限定するわけではないが、例えば、測定温度２５℃、測定波長３４０ｎｍで、この反応条件における１分間あたりの１μｍｏｌのＮＡＤ＋生成量を１単位とし、上記酵素活性をＤ−乳酸脱水素酵素活性と定義してもよい。これにより、上記反応式の逆反応により生成される、ＮＡＤ＋の量が測定される。
【００１９】
活性測定用の反応液としては、例えば、基質としてピルビン酸及びＮＡＤＨを含む、リン酸カリウムバッファーを用いることができる。バッファーの組成は特に限定されず、実施例では下記の組成が採用された。
【００２０】
ＬＤＨ活性測定用バッファー組成      最終濃度
リン酸カリウムバッファー          ０．１Ｍ
（ｐＨ７．０）
ピルビン酸                        ２ｍＭ
ＮＡＤＨ                          ０．２２ｍＭ
または、酵素活性は、ＮＡＤ＋と同様に逆反応により生成されるＤ−乳酸の量を測定してもよい。あるいは、正反応によるピルビン酸又はＮＡＤＨを測定してもよい。当業者は公知の測定方法を適宜採用することが可能である。
【００２１】
「ラクトバチラス属細菌」は、乳酸杆菌、耐性乳菌、ともいい、種は特に限定されない。例えば、以下に示すラクトバチラス属の種由来のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質が知られている。
【００２２】
１）Lactobacillus johnsonii
ACCESSION  AF071558
AUTHORS  Lapierre,L., Germond,J.E., Ott,A., Delley,M. and Mollet,B.
TITLE  D-Lactate dehydrogenase gene (ldhD) inactivation and resulting  metabolic effects in the Lactobacillus johnsonii strains La1 and  N312
JOURNAL  Appl. Environ. Microbiol. 65 (9), 4002-4007 (1999)
PUBMED  10473408
２）Lactobacillus acidophilus NCFM
ACCESSION  CP000033
AUTHORS  Altermann,E., Russell,W.M., Azcarate-Peril,M.A., Barrangou,R., Buck,B.L., McAuliffe,O., Souther,N., Dobson,A., Duong,T., Callanan,M., Lick,S., Hamrick,A., Cano,R. and Klaenhammer,T.R.
TITLE  Complete genome sequence of the probiotic lactic acid bacterium Lactobacillus acidophilus NCFM
JOURNAL  Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (11), 3906-3912 (2005)
PUBMED  15671160
３）L.helveticus
ACCESSION  X66723
AUTHORS  Kochhar,S., Hottinger,H., Chuard,N., Taylor,P.G., Atkinson,T., Scawen,M.D. and Nicholls,D.J.
TITLE  Cloning and overexpression of Lactobacillus helveticus D-lactate dehydrogenase gene in Escherichia coli
JOURNAL  Eur. J. Biochem. 208 (3), 799-805 (1992)
PUBMED  1396685
４）Lactobacillus delbrueckii  （Lactobacillus delbrueckii-2）
ACCESSION  M85224
AUTHORS  Kochhar,S., Hunziker,P.E., Leong-Morgenthaler,P. and Hottinger,H.
TITLE  Primary structure, physicochemical properties, and chemical modification of NAD(+)-dependent D-lactate dehydrogenase. Evidence for the presence of Arg-235, His-303, Tyr-101, and Trp-19 at or near the active site
JOURNAL   J. Biol. Chem. 267 (12), 8499-8513 (1992)
PUBMED  1569100
５）L.delbrueckii subsp. Bulgaricus  （Lactobacillus delbrueckii）
ACCESSION  X60220
AUTHORS  Bernard,N., Ferain,T., Garmyn,D., Hols,P. and Delcour,J.
TITLE  Cloning of the D-lactate dehydrogenase gene from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus by complementation in Escherichia coli
JOURNAL  FEBS Lett. 290 (1-2), 61-64 (1991)
PUBMED  1915894
６）Lactobacillus plantarum
ACCESSION  D90339
AUTHORS  Taguchi,H. and Ohta,T.
TITLE  D-lactate dehydrogenase is a member of the D-isomer-specific 2-hydroxyacid dehydrogenase family. Cloning, sequencing, and expression in Escherichia coli of the D-lactate dehydrogenase gene of Lactobacillus plantarum
JOURNAL  J. Biol. Chem. 266 (19), 12588-12594 (1991)
PUBMED  1840590
７）Lactobacillus sp. MD-1
ACCESSION  AY496011
REFERENCE  1  (bases 1 to 996)
AUTHORS  Li,J., Liu,R., Liang,F. and Zhang,X.
TITLE  Cloning and sequence analysis of D-Lactate dehydrogenase gene in Lactobacillus sp. MD-1
JOURNAL   Unpublished
REFERENCE  2  (bases 1 to 996)
AUTHORS  Li,J., Liu,R., Liang,F. and Zhang,X.
TITLE  Direct Submission
JOURNAL  Submitted (05-DEC-2003) Microbiology, College of Life Science, Nankai University, 94 Weijin Road, Tianjin, Tianjin 300071, PRC
８）Lactobacillus sp. MONT4
ACCESSION  AY301012
AUTHORS  Weekes,J. and Yuksel,G.U.
TITLE  Molecular Characterization of Two Lactate Dehydrogenase Genes with a Novel Structural Organization on the Genome of Lactobacillus sp. Strain MONT4
JOURNAL  Appl. Environ. Microbiol. 70 (10), 6290-6295 (2004)
PUBMED  15466577
本発明において、「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡの他に合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡを含む。さらにはこれらを含むベクターなども本発明の「核酸」の範囲内である。特に言及しない限り、二本鎖、一本鎖のいずれかの態様も含む。二本鎖の場合、本明細書で塩基配列に言及する場合、その相補的な塩基配列も含めて意図する。１つの好ましい態様において、核酸は、実質的に、混入する内因性成分を含まない。核酸分子は、好ましくは、少なくとも１度は、実質的に純粋な形で、そして標準的生化学法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）に概略されるものなど）によって、その成分ヌクレオチド配列の同定、操作および回収を可能にする量または濃度で単離されているＤＮＡまたはＲＮＡに由来している。
【００２３】
本発明は、変異型のラクトバチラス属細菌のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質をコードする核酸に関する。ここにおいて、前記変異型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質は、１）天然のアミノ酸配列において１またはそれより多くのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置換されていること、そして、２）溶液における保存安定性が向上していること、を特徴とする。
【００２４】
上述したように、天然の（野生型の）ラクトバチラス属細菌のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質が知られており、そのアミノ酸配列および塩基配列も公知である。本発明は天然のアミノ酸配列において、１またはそれより多くのアミノ酸残基を、天然のアミノ酸残基とは異なる別のアミノ酸残基に置換することによって、Ｄ−乳酸脱水素酵素タンパク質の溶液における保存安定性を向上させることに成功したことに基づく。
【００２５】
本明細書において後述する実施例は、ランダム変異導入を用いて、ラクトバチラス属細菌のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質のアミノ酸配列にランダムに変異が導入された変異型を作成し、熱安定性及び／又はｐＨ安定性を測定し、天然のタンパク質よりも残存活性が高いものを、本発明の好ましい変異体として選択した。このように、ランダム変異導入を用いてより多くの変異型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質を作成し、溶液における保存安定性が向上している、即ち、熱安定性及び／又はｐＨ安定性が向上しているものを、繰り返し選択することにより、さらに別の変異体を得ることが可能である。実施例４では、４０℃、１５分の条件下で野生型よりも溶液における保存安定性（溶液安定性）が向上した変異体を選択した。スクリーニングの条件を変更することにより、選定する温度条件を緩める、あるいは保存時間を長くする、等により、さらに変異体を得ることが可能である。当業者は、本明細書の開示により本発明のアミノ酸が置換される部位及び数の好ましい態様を把握することが可能である。
【００２６】
あるいは、配列中の特定の部位を標的して変異体を製造する場合には、公知の部位特異的変異導入を採用することができる。
本発明において、Ｄ−乳酸脱水素酵素タンパク質の「熱安定性」が向上したとは、限定されるわけではないが、例えば、実施例６に記載されたように、ｐＨ９．０において１５分間処理した場合に、残存活性７５％が保たれる温度が、野生型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質の場合よりも高くなることを意味する。具体的には、表１に示したように、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＮＢＲＣ１４５１１由来の野生型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質は、残存活性７５％が保たれる温度（熱安定性）が３０℃であった。これに対し、本発明の変異型は、いずれも３７℃から５５℃まで安定であった。
【００２７】
本発明において、Ｄ−乳酸脱水素酵素タンパク質の「熱安定性」が向上したとは、限定されるわけではないが、例えば、実施例６に記載されたように、２５℃で７日間保存した場合に、残存活性９０％が保たれるｐＨ範囲が、野生型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質の場合よりも広くなることを意味する。具体的には、表１に示したように、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＮＢＲＣ１４５１１由来の野生型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質は、残存活性９０％が保たれる範囲（ｐＨ安定性）は、ｐＨ５．５−８．０であった。これに対し、本発明の変異型は、いずれも少なくともｐＨ５．５−８．５でより高いｐＨでも安定であった。より好ましくは、ｐＨ５．５−９．５で、さらに好ましくはｐＨ５．５−１０．０で安定であった。
【００２８】
また、「溶液における保存安定性」には、「熱安定性」及び／又は「ｐＨ安定性」の他に、通常の条件下（例えば２５℃、ｐＨ７．０等の至適ｐＨ）で長時間保存場合の安定性等が含まれる。
【００２９】
図１及び図２は、本発明の態様として実施例において作製された、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＮＢＲＣ１４５１１由来の変異型のＤ−乳酸脱水素酵素の熱安定性及びｐＨ安定性を示す。変異体「Ｇ１９５Ｃ」は、配列番号１において１９５番目のグリシンがシステインに置換されている変異体である。変異体「Ｅ９Ｇ／Ｅ２７５Ｋ／Ｉ２８６Ｖ」は、配列番号１において９番目のグルタミン酸がグリシンに、２７５番目のグルタミン酸がリシンに、そして２８６番目のイソロイシンがバリンに各々置換されている変異体である。変異体「Ｉ２８６Ｖ］は、２８６番目のイソロイシンがバリンに置換されている変異体である。「Ｋ１５６Ｒ／Ｎ３４０Ｋ」は、１５６番目のリシンがアルギニンに、そして３４０番目のアスパラギンがリシンに置換されている変異体である。いずれの変異体も、同種由来の野生型のＤ−乳酸脱水素酵素と比較して「熱安定性」及び／又は「ｐＨ安定性」が向上している。
【００３０】
よって、本発明において、非限定的に、好ましくは、変異型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質は、配列番号１の９番目、１５６番目、１９５番目、２７５番目、２８６番目及び３４０番目に相当するアミノ酸残基からなるグループから選択される１またはそれより多くのアミノ酸残基が、天然のアミノ酸残基とは別のアミノ酸残基に置換されている。配列番号１は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ．ｓｐ．（ＮＢＲＣ１４５１１）の天然型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質のアミノ酸配列である。当該タンパク質は、配列番号２の塩基配列を有する核酸によってコードされている。「配列番号１の９番目、１５６番目、１９５番目、２７５番目、２８６番目及び３４０番目に相当するアミノ酸残基」とは、好ましくは配列番号１におけるこれらのアミノ酸残基を意味する。しかしながら、これに限定されず、他のラクトバチラス属の他の種の細菌由来の天然型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号１のアミノ酸配列と並列させた場合に、上記アミノ酸残基に相当する位置に存在するアミノ酸残基を同様に、天然のアミノ酸残基とは別のアミノ酸残基に置換させることにより、本発明の変異体タンパク質を得ることができる。
【００３１】
例えば、図３は、後述の実施例１でクローニングされたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ．ｓｐ．（ＮＢＲＣ１４５１１）の天然型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質のアミノ酸配列と、前記タンパク質をコードする遺伝子を単離するためのプローブ作製時に参照した、公知のラクトバチラス属由来のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質の５種のアミノ酸配列を、相同性が最大となるように並べたもの（アラインメント）である。図３に示されたように例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ．ｓｐ．（ＮＢＲＣ１４５１１）の配列番号１の１９５番目のアミノ酸残基は、他の種由来のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質では、１６７番目又は１６８番目に相当し、いずれもグリシンであることがわかる。
【００３２】
図４は、図３にさらに、  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ．ｓｐ．  ＭＤ−１及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ．ｓｐ．  ＭＯＮＴ４のラクトバチラス属由来の３種由来のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質のアミノ酸配列をアラインして並べたものである。相同性が最大となるようにアラインする都合上、例えば、配列番号１の１９５番目のアミノ酸残基グリシンは、図４では１９７番目のアミノ酸残基として表記されている。
【００３３】
好ましくは、前記変異型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質は、以下のいずれかの条件の１またはそれより多くを満たす：
１）配列番号１の９番目に相当するアミノ酸残基がグリシンに置換されている；
２）配列番号１の１５６番目に相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換されている；
３）配列番号１の１９５番目に相当するアミノ酸残基がシステインに置換されている；
４）配列番号１の２７５番目に相当するアミノ酸残基がリシンに置換されている；
５）配列番号１の２８６番目に相当するアミノ酸残基がバリンに置換されている；及び
６）配列番号１の３４０番目に相当するアミノ酸残基がリシンに置換されている
しかしながら、置換後のアミノ酸残基は上記に限定されない。当業者は本明細書の開示に基づいて、上記以外へのアミノ酸残基への置換も適宜採用することが可能である。
【００３４】
配列番号１の９番目、１５６番目、１９５番目、２７５番目、２８６番目及び３４０番目に相当するアミノ酸残基において、置換は１箇所でもよく、あるいは、任意の複数箇所（最大６箇所）で生じてよい。このましい置換箇所の例は、１９５番目単独、２８６番目単独、あるいは、９番目／２７５番目／２８６番目の組み合わせ、又は、１５６番目／３４０番目の組み合わせである。
【００３５】
好ましくは、配列番号１の１９５番目に相当するアミノ酸残基が単独で置換されている変異体である。より好ましくは、配列番号１の１９５番目に相当するアミノ酸残基がシステインに置換されている。最も好ましくは、配列番号１の１９５番目に相当するアミノ酸残基グリシンがシステインに置換されている。
【００３６】
本発明の変異体の基礎となる天然のＤ−乳酸脱水素酵素
本発明は一態様において、「天然」のラクトバチラス細菌のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質において、天然のアミノ酸配列において１またはそれより多くのアミノ酸残基を別のアミノ酸残基に置換することによって、その溶液における保存安定性が向上した変異型のタンパク質を提供するものである。本明細書において、「天然」のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質とは、ラクトバチラス細菌に天然に存在することが実際に確認されているもののみならず、確認されているタンパク質のアミノ酸配列と、活性に関与しない一部のアミノ酸配列が相違するが酵素の溶液安定性が変化しない相同体タンパク質も含む。
【００３７】
限定されるわけではないが、本発明において、好ましくは、前記ラクトバチラス属細菌が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＮＢＲＣ１４５１１であり、Ｄ−乳酸脱水素酵素タンパク質の天然のアミノ酸配列が配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する。即ち、好ましくは、本発明の変異体は配列番号１に記載の天然のアミノ酸配列からの変異体である。Ｄ−乳酸脱水素酵素タンパク質の天然のアミノ酸配列は、好ましくは配列番号２の塩基配列によってコードされる。即ち、好ましくは、本発明の変異体をコードする核酸は、配列番号２に記載の天然の塩基配列からの変異体である。
【００３８】
１つ以上のコドンが同一のアミノ酸をコードする場合があり、遺伝暗号の縮重と呼ばれている。このため、配列番号２と完全には一致していないＤＮＡ配列が、配列番号１と全く同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードすることがあり得る。こうした縮重ＤＮＡ配列は、サイレント（ｓｉｌｅｎｔ）突然変異（例えば、ＰＣＲ増幅中に発生する）から生じてもよいし、または天然配列の意図的な突然変異誘発の産物であってもよい。縮重ＤＮＡ配列は、天然の配列番号２と同様に配列番号１のアミノ酸配列をコードするため、本発明の変異型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質（変異体）をコードする核酸を作製するための基礎となりうる。
【００３９】
配列番号１以外にも、例えば、図３及４に記載した公知のラクトバチラス属細菌の天然のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質のアミノ酸配列も、本発明の変異体を作製するための基礎となりうる。しかしさらに、これらに限定されず天然の配列において、１またはそれ以上のアミノ酸配列が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列であっても、酵素の溶液安定性が変化しない相同体であれば、「天然のアミノ酸配列」として、本発明の変異体作製の基礎となりうる。このような「アミノ酸変異」は１から複数個、好ましくは、１ないし２０個、より好ましくは１ないし１０個、最も好ましくは１ないし５個である。
【００４０】
これらの相同体は、天然のアミノ酸配列、例えば配列番号１と、少なくとも約７０％、好ましくは約８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。
【００４１】
アミノ酸の同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算により決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．及びＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３，１９７０）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
【００４２】
当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５．，ｐ．３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる相同性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。
【００４３】
本発明の変異体の作製の基礎となる相同体をコードする核酸はまた、天然の塩基配列を有する核酸、例えば、配列番号２にストリンジェントな条件下、例えば、中程度又は高程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であり、かつ、溶液安定性のＤ−乳酸脱水素酵素活性を示す相同体タンパク質をコードする核酸を含む。
【００４４】
「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，第６−７章，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃、６×ＳＳＣのハイブリダイゼーション条件を含む。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度および／または低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、約６５℃、６×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣ、好ましくは６×ＳＳＣ、より好ましくは２×ＳＳＣ、最も好ましくは０．２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション）および／または洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、およびおよそ６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間行う。
【００４５】
当業者に知られていて、以下にさらに記載したように、ハイブリダイゼーション反応と二本鎖の安定性を支配する基本原理を適用することによって望ましい度合いのストリンジェンシーを達成するためには、洗浄温度と洗浄塩濃度を必要に応じて調整することが可能であると理解すべきである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１を参照されたい）。核酸を未知配列の標的核酸へハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さはハイブリダイズする核酸のそれであると仮定される。既知配列の核酸をハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さは核酸の配列を並列し、最適な配列相補性をもつ単数または複数の領域を同定することによって決定可能である。５０塩基対未満の長さであることが予測されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５−２５℃低くなければならず、Ｔｍは、以下の等式により決定される。長さ１８塩基対未満のハイブリッドに関して、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基数）。１８塩基対を超える長さのハイブリッドに関しては、Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋４１（モル分率［Ｇ＋Ｃ］）−０．６３（％ホルムアミド）−５００／ｎであり、ここで、Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、そして［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度である（１×ＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。好ましくは、こうしたハイブリダイズする核酸は各々、少なくとも８ヌクレオチド（または、より好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチド、または少なくとも２０ヌクレオチド、または少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも３０ヌクレオチド、または少なくとも４０ヌクレオチド、または最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド）、またはそれがハイブリダイズする核酸の長さの少なくとも１％（より好ましくは少なくとも２５％、または少なくとも５０％、または少なくとも７０％、そして最も好ましくは少なくとも８０）である長さを有し、それがハイブリダイズする核酸と少なくとも５０％（より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも  ７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、または少なくとも９９％、そして最も好ましくは少なくとも９９．５％）の配列同一性を有する。ここで配列同一性は、上記により詳しく記載されるように、重複部分と同一性を最大化する一方、配列ギャップを最小化するように並列された、ハイブリダイズする核酸の配列を比較することによって決定される。
【００４６】
核酸の同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、２つの核酸配列のパーセント同一性は、目視検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マジソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの核酸配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、および非同一物について０の値を含む）一元（ｕｎａｒｙ）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ＳｅｑｕｅｎｃｅおよびＳｔｒｕｃｔｕｒｅ）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６の加重アミノ酸比較マトリックス；または他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；またはヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：および（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、国立医学ライブラリーのウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌｓ．ｈｔｍｌにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎのＳＥＧプログラム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）により決定され；ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ，１９９６「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｂｉａｓｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：５４４−７１も参照されたい）、または、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ＣｌａｖｅｒｉｅおよびＳｔａｔｅｓ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、および（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ−スコア（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。
【００４７】
同様に、本発明のにおける天然の核酸には、１つまたは複数の塩基の欠失、挿入または置換のため、公知の天然の塩基配列、例えば、配列番号２とは異なるが、溶液安定性のＤ−乳酸脱水素酵素活性を示す相同体タンパク質をコードする核酸を含む。酵素の「溶液安定性」を維持する限り、欠失、挿入または置換される塩基の数は特に制限されないが、好ましくは１個ないし５００個、より好ましくは１個ないし２００個、最も好ましくは１個ないし１００個である。
【００４８】
既定のアミノ酸を、例えば同様の物理化学的特性を有する残基により置換してもよい。こうした保存的置換の例には、１つの脂肪族残基を互いに、例えばＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａを互いに置換するもの；ＬｙｓおよびＡｒｇ、ＧｌｕおよびＡｓｐ、またはＧｌｎおよびＡｓｎ間といった、１つの極性残基から別のものへの置換；あるいは芳香族残基の別のものでの置換、例えばＰｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを互いに置換するものが含まれる。他の保存的置換、例えば、同様の疎水性特性を有する領域全体の置換が、周知である。当業者は、周知の遺伝子工学的手法により、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）（上述）等に記載の、例えば部位特異的突然変異誘発法を使用して、所望の欠失、挿入または置換を施すことが可能である。
【００４９】
本発明の核酸を含む発現ベクター、形質転換体、並びに本発明の変異体タンパク質の製造方法
本発明はさらに、上記本発明の核酸を含む、発現ベクター、当該発現ベクターで形質転換された形質転換体を提供する。形質転換体は好ましくは大腸菌である。
【００５０】
本発明はまた、本発明の核酸を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、そして、核酸の発現を可能にする条件下で形質転換細胞を培養する、ことを含む、変異型のラクトバチラス属細菌のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質の製造方法を提供する。
【００５１】
本発明の変異型のラクトバチラス属細菌のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質を製造する方法を以下に記載する。本発明のタンパク質および断片の発現、単離および精製は、限定されず、いかなる適切な技術によって達成してもよい。
【００５２】
本発明の発現ベクターは、本発明の核酸の他に、一般的に、宿主における増殖のため、選択可能マーカーおよび複製起点を含むベクター内に含有されることが可能である。ベクターにはさらに、哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫遺伝子由来のものなどの、適切な転写または翻訳制御配列が、所望により本発明の核酸に連結されて、含まれる。
【００５３】
制御配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、並びに転写および翻訳開始および終結を調節する適切な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、制御配列が該ＤＮＡ配列に機能的に関連しているとき、機能可能であるように連結されている。したがって、プロモーターヌクレオチド配列は、該プロモーターヌクレオチド配列がＤＮＡ配列の転写を調節するならば、ＤＮＡ配列に、機能可能であるように連結されている。宿主細胞において複製する能力を与える複製起点、および形質転換体を同定する選択遺伝子が、一般的に発現ベクターに取り込まれている。選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。
【００５４】
本発明の変異型のラクトバチラス属細菌のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質をコードする核酸の適した宿主細胞には、原核生物、酵母、およびより高次の真核細胞が含まれ、この各々を以下に論じる。
【００５５】
こうした宿主細胞において発現しようとする本発明のタンパク質はまた、異種タンパク質由来の領域を含む融合タンパク質であることも可能である。例えば、タンパク質の分泌、安定性改善、精製促進、ターゲティング、またはオリゴマー化を可能にするため、こうした領域を含むことが可能である。例えば、適切なシグナルペプチドをコードする核酸配列を発現ベクターに取り込むことが可能である。シグナルペプチド（分泌リーダー）をコードする核酸配列を、本発明の核酸にインフレームで融合させて、シグナルペプチドを含む融合タンパク質として翻訳されるようにすることが可能である。意図する宿主細胞において機能するシグナルペプチドは、本は詰めのタンパク質の細胞外分泌を促進する。異種シグナルペプチドで天然シグナル配列を交換することが可能である。
【００５６】
本発明のタンパク質の発現に適した宿主細胞には、原核生物、酵母、およびより高次の真核細胞が含まれる。これらのタンパク質の発現に使用するのに適した原核宿主には、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１等）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の細菌とともに、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のメンバーが含まれる。原核細胞における、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のため、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子には、好ましくは、組換えタンパク質の発現を促進するＮ末端メチオニン残基が含まれる。Ｎ末端Ｍｅｔは、場合によって、発現されたタンパク質から切断されることが可能である。
【００５７】
細胞宿主で使用するための発現ベクターは、一般的に、１以上の表現型的に選択可能なマーカーを含んでなる。こうした遺伝子は、例えば抗生物質耐性を与えるタンパク質または独立栄養必要条件を供給するタンパク質をコードする。広い範囲のこうしたベクターは、商業的供給源から容易に入手可能である。例には、ｐＧＥＭベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＳＰＯＲＴベクター、およびｐＰＲＯＥＸベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールスバッド）、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、およびｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）が含まれる。
【００５８】
後述の実施例では、大腸菌における発現ベクターとしてｐＴＲＰ−ｌｄｈＤを用いた。ｐＴＲＰベクターの構成は、例えば、Uchida,K.，Kondoh,K.及びMatsuo，Y．（Clin．Chem．Acta，237：43-58，1995）に開示されている。
【００５９】
本発明のタンパク質はまた、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、およびクロイベロミセス属（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）を含む属由来の酵母宿主細胞で発現可能である。好ましい酵母宿主は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。酵母ベクターは、しばしば、２μ酵母プラスミド由来の複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択可能マーカー遺伝子を含有するであろう。酵母および大腸菌両方で複製可能なベクター（シャトルベクターと称する）もまた、使用可能である。酵母ベクターの上述の特徴に加え、シャトルベクターにはまた、大腸菌における複製および選択のための配列も含まれるであろう。酵母宿主で発現されるタンパク質の直接分泌は、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’端に、酵母α因子リーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含むことによって達成可能である。  べクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用べクター（例えば、プラスミドＤＮＡなど）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができるプラスミドなどのベクターに遺伝子のＤＮＡ断片を組み込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｄ．Ｗ．  （２００１）．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄ．  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。
【００６０】
ベクターを宿主細胞に導入する方法としては、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（２００１）（上述）に記載のリン酸カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
【００６１】
本発明のタンパク質の発現のため、昆虫宿主細胞培養系も使用可能である。本発明のタンパク質は、好ましくは、例えばＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（（１９８８），  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７）の概説に記載されるように、バキュロウイルス発現系を用いて発現される。
【００６２】
哺乳動物宿主細胞において、本発明のタンパク質を発現させることも可能である。適切な哺乳動物宿主細胞株の限定されない例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（Ｇｌｕｚｍａｎら（１９８１），  Ｃｅｌｌ  ２３：１７５−１８２）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｐｕｃｋら（１９５８），  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ６０：１２７５−１２８１）、ＣＶ−１（Ｆｉｓｃｈｅｒら（１９７０），  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ５：２１−２７）およびヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）が含まれる。
【００６３】
本発明のタンパク質の発現に適した発現ベクターの選択は、用いようとする特定の哺乳動物宿主細胞に応じるであろう。適切な発現ベクターの例には、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＣ４０９、およびｐＳＶＬが含まれる。哺乳動物宿主細胞で使用するための発現ベクターには、ウイルスゲノム由来の転写および翻訳調節配列が含まれることが可能である。タンパク質を発現するのに使用可能な、一般的に用いられるプロモーター配列およびエンハンサー配列には、限定されるわけではないが、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス２、ポリオーマウイルス、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のものが含まれる。哺乳動物発現ベクターの構築法は、例えば、ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ（（１９８２）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２：１６１−１７０）、Ｃｏｓｍａｎら（（１９８６）Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３：９３５−９４１）に開示される。
【００６４】
特定のベクターへの挿入を促進する、核酸分子の修飾（例えば制限部位を修飾することによる）、特定の発現系または宿主における使用を容易にすること（例えば好ましい宿主コドンを用いる）などが知られ、そして本発明における使用のため、意図される。タンパク質を産生するための遺伝子操作法には、既知の方法にしたがった、細胞不含発現系における、細胞宿主における、組織における、そして動物モデルにおける、核酸分子の発現が含まれる。
【００６５】
本発明のタンパク質は、組換えタンパク質発現に適した培養条件下で、形質転換体（形質転換宿主細胞）を培養することによって、調製可能である。生じた発現タンパク質を次いで、多様な塩での選択的沈殿、ゲルろ過およびイオン交換クロマトグラフィーなどの、既知の精製法を用いて、こうした培養（すなわち培地または細胞抽出物）から精製することが可能である。タンパク質の精製はまた、タンパク質に結合するであろう剤を含有するアフィニティーカラム；コンカナバリンＡ−アガロース、Ｃｉｂａｃｒｏｍブルー３ＧＡセファロース（登録商標）のようなアフィニティー樹脂上の１以上のカラム工程；フェニルエーテル、ブチルエーテル、またはプロピルエーテルのような樹脂を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーを伴う１以上の工程；あるいは本発明のタンパク質の１以上のエピトープに特異的に結合する抗体を用いた免疫アフィニティークロマトグラフィーも含むことが可能である。あるいは、本発明のタンパク質はまた、精製を容易にするであろう型で発現することも可能である。例えば、融合タンパク質として発現することが可能であり、すなわち、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等と融合させることが可能である。タンパク質はまた、エピトープでタグ付けして、そして続いて、こうしたエピトープに対して向けられる特異的抗体を用いることによって、精製することも可能である。１つのこうしたエピトープ（「Ｆｌａｇ（登録商標）」）は、Ｋｏｄａｋ（コネティカット州ニューヘブン）から商業的に入手可能である。
【００６６】
最後に、疎水性逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）媒体、例えばペンダントメチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルを使用する、１以上のＲＰ−ＨＰＬＣ工程を使用して、タンパク質をさらに精製することが可能である。多様な組み合わせの前述の精製工程のいくつかまたはすべてを使用して、実質的に均一な単離組換えタンパク質を提供することもまた可能である。こうして精製したタンパク質は、他の哺乳動物タンパク質を実質的に含まず、そして本発明にしたがって、「単離タンパク質」と定義される；本発明のこうした単離タンパク質には、本発明のタンパク質に結合する単離抗体、断片、変異体、結合パートナー等が含まれる。
【００６７】
本発明のタンパク質はまた、既知の慣用的な化学合成によっても産生可能である。合成手段によって、本発明のタンパク質を構築する方法は当業者に知られる。合成によって構築されたタンパク質のアミノ酸配列は、遺伝子工学によって製造された本発明のタンパク質と一次、二次または三次構造および／またはコンホメーション特性を共有するため、酵素活性、溶液安定性を含め、本発明のタンパク質と共通の生物学的特性を所持する可能性がある。
【００６８】
変異型のラクトバチラス属細菌のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質
本発明はさらに、変異型のラクトバチラス属細菌のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質を提供する。本発明の変異型のラクトバチラス属細菌のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質は、天然のアミノ酸配列において１またはそれより多くのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置換されており、そして、溶液における保存安定性が向上している、ことを特徴とする。
【００６９】
本発明のタンパク質は、好ましくは、上述した本発明の核酸を用いた製造方法によって製造される。
本発明の変異型のラクトバチラス属細菌のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質は、「変異型のラクトバチラス属細菌のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質をコードする核酸」の項目において詳述した通りである。
【００７０】
本発明のタンパク質は、好ましくは、配列番号１の９番目、１５６番目、１９５番目、２７５番目、２８６番目及び３４０番目に相当するアミノ酸残基からなるグループから選択される１またはそれより多くのアミノ酸残基が、天然のアミノ酸残基とは別のアミノ酸残基に置換されている。
【００７１】
本発明の変異型タンパク質は、天然型よりも溶液における保存安定性が向上している。好ましくは、以下のｐＨ安定性及び／又は熱安定性を満たす。
ｐＨ安定性：５．５−８．５（２５℃、７日間）
熱安定性：＜３７−５５℃（ｐＨ９．０、１５分）。
【００７２】
より好ましくはｐＨ安定性：５．５−９．０、さらに好ましくは、ｐＨ安定性：５．５−９．５、さらにより好ましくはｐＨ安定性：５．５−１０．０である。
また、限定されるわけではないが、以下のような生化学的性質を有する。
【００７３】
分子量：  約４３，０００−４５，０００（好ましくは、約４４，０００）
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  サブユニットあたり）
Ｋｍ値：  ピルビン酸  約０．１４−約０．３０ｍＭ
ＮＡＤＨ  約０．１０−約０．１５ｍＭ
至適ｐＨ：  約６．５−約７．５
これらの分子量、Ｋｍ値、至適ｐＨは、野生型のラクトバチラス属細菌のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質と実質的に差異はなく共通する。
【００７４】
アラニンアミノトランスフェラーゼ活性測定用キット
本発明のＤ−乳酸脱水素酵素（Ｄ−ＬＤＨ）は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の共役酵素として機能しうる。具体的な反応は、下記の通りである。
Ｌ−アラニン  ＋  ２−オキソグルタル酸
→  ピルビン酸  ＋  Ｌ−グルタミン酸
ＡＬＴ
ピルビン酸  ＋  ＮＡＤＨ  ＋  Ｈ＋ 
→  Ｄ−乳酸  ＋  ＮＡＤ＋
Ｄ−ＬＤＨ
本発明のＤ−乳酸脱水素酵素を利用して、アラニンアミノトランスフェラーゼの活性を測定することができる。よって、本発明は、アラニンアミノトランスフェラーゼ活性測定用キットを提供する。本発明のキットは、変異型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質、使用説明書を含む。さらに、所望により、Ｔｒｉｓバッファー、Ｌ−アラニン、２−オキソグルタル酸、ＮＡＤＨ等を含んでもよい。
【００７５】
天然型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質、核酸等
本発明において、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＮＢＲＣ１４５１１より新規なＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質をコードする核酸が単離された。本発明において単離されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＮＢＲＣ１４５１１由来の核酸は、配列番号１に記載の塩基配列からなり、そして、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする。
【００７６】
本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＮＢＲＣ１４５１１由来のＤ−乳酸脱水素酵素は、最も近い公知のはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ由来のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質と、アミノ酸配列で７２．６％、そして核酸配列で６７．３％の同一性を有する。
【００７７】
よって、本発明は別の一態様において、天然型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質をコードする核酸を提供する。本発明の核酸は、
以下の：
（ａ）  配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸；
（ｂ）  配列番号２の塩基配列を含む核酸；
（ｃ）  （ａ）又は（ｂ）の核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸；及び
（ｄ）  配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列含むタンパク質であって、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる群から選択される。
【００７８】
「ストリンジェント条件下」の定義については、「本発明の変異体の基礎となる天然のＤ−乳酸脱水素酵素」の項目で説明したものと同様である。
「同一性」の定義についても「本発明の変異体の基礎となる天然のＤ−乳酸脱水素酵素」の項目で説明したものと同様である。より好ましくは、本発明の天然型のタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％同一のアミノ酸配列含む。本発明の天然型のタンパク質をコードする核酸は配列番号２の核酸と好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％同一の塩基配列を含む。
【００７９】
本発明の核酸は好ましくは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＮＢＲＣ１４５１１由来のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質をコードする。
より好ましくは、本発明の核酸は以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかである。
【００８０】
（ａ）  配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸；又は
（ｂ）  配列番号２の塩基配列を含む核酸。
本発明はまた、本発明の核酸を含む発現ベクター、本発明の発現ベクターによって形質転換された形質転換体を提供することを目的とする。「発現ベクター」及び「形質転換体」の定義については、「本発明の核酸を含む発現ベクター、形質転換体、並びに本発明の変異体タンパク質の製造方法」項目で説明したものと同様である。
【００８１】
本発明はさらにまた、天然のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質を提供する。本発明のタンパク質は、以下の：
（ａ）  配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸；
（ｂ）  配列番号２の塩基配列を含む核酸；
（ｃ）  （ａ）又は（ｂ）の核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸；及び
（ｄ）  配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列含むタンパク質であって、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる群から選択される核酸によってコードされる。
【００８２】
本発明のタンパク質は、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列を含む、本質的にからなる、あるいは、からなる。
本発明のタンパク質は、好ましくは、ピルビン酸へのＫｍ値が公知のものよりも低い、という利点を有する。非限定的に、ピルビン酸へのＫｍ値が、好ましくは０．２０ｍＭ以下、より好ましくは０．１８ｍＭ以下、である。
【００８３】
本発明はまた、本発明の新規Ｄ−乳酸脱水素酵素タンパク質の製造方法、を提供する。本発明の製造方法は、上記本発明の核酸を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、そして、核酸の発現を可能にする条件下で形質転換細胞を培養する、ことを含む。
【００８４】
本発明さらに、上記本発明の新規Ｄ−乳酸脱水素酵素タンパク質、使用説明書を含む、アラニンアミノトランスフェラーゼ活性測定用キットを提供する。
塩基の略号
本明細書中の説明及び配列表においてに、塩基配列中の記号は下記の塩基を意味する。
【００８５】
ａ：アデニン
ｇ：グアニン
ｃ：シトシン
ｔ：チミン
ｕ：ウラシル
ｒ：グアニン又はアデニン
ｙ：チミン／ウラシル又はシトシン
ｍ：アデニン又はシトシン
ｋ：グアニン又はチミン／ウラシル
ｓ：グアニン又はシトシン
ｗ：アデニン又はチミン／ウラシル
ｂ：グアニン又はシトシン又はチミン／ウラシル
ｄ：アデニン又はグアニン又はチミン／ウラシル
ｈ：アデニン又はシトシン又はチミン／ウラシル
ｖ：アデニン又はグアニン又はシトシン
ｎ：アデニン又はグアニン又はシトシン又はチミン／ウラシル、不明、又は他の塩基
【発明の効果】
【００８６】
本発明において、新規なＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質及び当該タンパク質をコードする核酸が提供される。
また、本発明の別の態様において、ランダム変異導入によりアルカリ溶液中での安定性が向上した変異型Ｄ−乳酸脱水素酵素タンパク質が得られ、当該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を明らかにした。それらの遺伝子を導入した発現ベクターを大腸菌に導入し、形質転換体を得た。更に得られた形質転換体を大量培養することにより、本タンパク質を大量、安定、且つ容易に生産することが可能になった。
【００８７】
また変異型Ｄ−乳酸脱水酵素は溶液中における安定性が高いことから、長期保存することが可能であり、特に、アラニンアミノトランスフェラーゼ活性測定のための共役試薬をとして有用である。
【実施例】
【００８８】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００８９】
実施例１  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＮＢＲＣ１４５１１由来Ｄ−乳酸脱水素酵素遺伝子のクローニング
１）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＮＢＲＣ１４５１１をＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で３７℃、１５時間、静置培養し、集菌した。
【００９０】
２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２．４．１  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，（１９８７−２０００）に従い、菌体よりゲノムＤＮＡを調製した。
【００９１】
３）公知のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属由来Ｄ−ＬＤＨ遺伝子５種の塩基配列を基に、設計した下記のプライマーを用いて、ディジェネレートＰＣＲを実施した。得られた約７００  ｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡ配列解析後、ＥＣＬ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてＤＮＡプローブを作製した。
【００９２】
センスプライマー（配列番号３）：
５’−ｇｇｃｔｃｇａｇｃｇｔａａｃｇｔｔｇｇｔｇｔｔｇａｙａａｃｗｔｂｇａｙｒｔｋｓ−３’
アンチセンスプライマー（配列番号４）：
５’−ｃｃｇｇａｔｃｃａｇｔｇｔａｇａａｒｇｃｖｇｔｒｔｇｔｇｇｗｇｔｗａｙｃａｒｗａｃ−３’
４）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＮＢＲＣ１４５１１より調製したゲノムＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製）で処理後アガロース電気泳動し、作製したＤＮＡプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを実施した。ＥＣＬ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて行った結果、約４ｋｂの位置にポジティブバンドを検出した。
【００９３】
５）約４ｋｂ付近のＤＮＡ断片をＧＦＸＴＭ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）により回収し、ＬＩＧＡＦＡＳＴＴＭ  ＲＡＰＩＤ  ＤＮＡ  ＬＩＧＡＴＩＯＮ  ＳＹＳＴＥＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、予め制限酵素ＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製）で処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋（２．９ｋｂ）ベクターに導入し、大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、ＬＢ寒天培地（１％  ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、１．４％  寒天、５０μｇ／ｍｌ  アンピシリン（ｐＨ７．４））に塗布し、３０℃、１８時間培養した。
【００９４】
６）生育したコロニーは、サザンハイブリダイゼーションで用いたＤＮＡプローブを使用してコロニーハイブリダイゼーションにより、Ｄ−乳酸脱水素酵素遺伝子を含む形質転換体を得た。
【００９５】
７）得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）により、Ｄ−乳酸脱水素酵素遺伝子配列及びアミノ酸配列を決定した。
【００９６】
実施例２  Ｄ−乳酸脱水素酵素遺伝子の発現系の構築
１）得られたＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子を含むプラスミドを鋳型に、５’末端側（センスプライマー）及び３’末端側（アンチセンスプライマー）にＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ制限酵素部位を設けた下記に示すプライマーを用いてＰＣＲを行い、アガロース電気泳動により約１．１ｋｂのＤＮＡ断片を確認した。ＰＣＲ反応組成は、（５０μｌあたり）１Ｕ  ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、１０ｐｇ  鋳型ＤＮＡ、３０μＭ  センスプライマー、３０μＭ  アンチセンスプライマー、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１×バッファーにて行った。ＰＣＲ反応は９４℃  ３０秒（変性）、６０℃  ３０秒（アニーリング）、６８℃  ２分（伸長）を３０サイクル繰返した。
【００９７】
センスプライマー（配列番号５）：
５’−ｇｇａａｇｃｔｔｇａａｔｔｃａｔｇｇｃａｇａａａｃａｇａｔｇｔｔａａｔｃｃａｇ−３’
アンチセンスプライマー（配列番号６）：
５’−ｃｃｇｇａｔｃｃｔｔａａｃｃａａｃｔｔｔａａｃｃｇｇｔｇｔａｔｃ−３’
２）得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で処理を行い、アガロース電気泳動後、ＧＦＸＴＭ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）により回収した。Ｄ−乳酸脱水素酵素遺伝子断片は、ＬＩＧＡＦＡＳＴＴＭ  ＲＡＰＩＤ  ＤＮＡ  ＬＩＧＡＴＩＯＮ  ＳＹＳＴＥＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、予め制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で処理した発現ベクターｐＴＲＰ（２．９ｋｂ）に導入した。
【００９８】
得られたプラスミドを鋳型に下記のプライマーを用いてＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔｓ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）により、Ｄ−乳酸脱水素酵素遺伝子中にあるＥｃｏＲＩ制限酵素部位を破壊し、発現プラスミドｐＴＲＰ−ｌｄｈＤを得た。次に大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、大腸菌組換え体ｐＴＲＰ−ｌｄｈＤ／ＪＭ１０９を得た。
【００９９】
センスプライマー（配列番号７）：
５’−ｃａｔｇｃｔｇｃｔａｔｔｃａａａｃａｇｃｔｃｇｃａｔｔｔｔａｃｇｃｃａａａｃｃａａｇｇｔｃ−３’
アンチセンスプライマー（配列番号８）：
５’−ｇａｃｃｔｔｇｇｔｔｔｇｇｃｇｔａａａａｔｇｃｇａｇｃｔｇｔｔｔｇａａｔａｇｃａｇｃａｔｇ−３’
実施例３  精製法
１）大腸菌組換え体ｐＴＲＰ−ｌｄｈＤ／ＪＭ１０９をＳｕｐｅｒ  ｂｒｏｔｈ（３．５％  ポリペプトン、２％  酵母エキス、０．５％  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５）１Ｌで３７℃、９時間培養後集菌した。
【０１００】
２）得られた湿菌体５．８ｇを３０ｍｌの抽出バッファー（２０ｍＭ  リン酸カリウムバッファー  ｐＨ７．５、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）で懸濁し、超音波破砕後（ＭＩＳＯＮＩＸ社製  ａｓｔｒａｓｏｎ  ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ  ＰＲＯＣＥＳＳＯＴＲ  ＸＬ）、遠心分離し（１８，０００×ｇ、１５分、４℃  ＢＥＣＫＭＡＮ社製  Ｍｏｄｅｌ  Ｊ２−２１  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）粗抽出液を調製した。得られた粗抽出液中のＤ−乳酸脱水素酵素の発現量は、約８００Ｕ／ｍｇタンパクであった。
【０１０１】
尚、ＬＤＨ活性測定には測定温度が２５℃、測定波長３４０ｎｍで、下記の表に記載の反応液組成にて測定を行った。またこの反応条件における１分間あたりの１μｍｏｌのＮＡＤ＋生成量を１単位とし、上記酵素活性をＤ−乳酸脱水素酵素活性と定義した。
【０１０２】
ＬＤＨ活性測定用バッファー組成      最終濃度
リン酸カリウムバッファー          ０．１Ｍ
（ｐＨ７．０）
ピルビン酸                        ２ｍＭ
ＮＡＤＨ                          ０．２２ｍＭ
３）その無細胞抽出液をバッファーＡ（１０ｍＭ  リン酸カリウムバッファー  ｐＨ７．５、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ  Ａ−５００（生化学工業株式会社製）に通じ、バッファーＡで洗浄後、０−０．３Ｍ  ＮａＣｌのリニアグラジエントで目的タンパク質を溶出させた。
【０１０３】
４）活性画分を最終濃度１．０Ｍになるように硫酸アンモニウムを加え、１時間攪拌した後、バッファーＢ（１０ｍＭ  Ｋ−リン酸バッファー  ｐＨ７．５、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．０Ｍ  硫酸アンモニウム）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ  ４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）に通じ、バッファーＢで洗浄後、１．０−０Ｍ  硫酸アンモニウムのリニアグラジエントで目的タンパク質を溶出させた。得られた活性画分をバッファーＡで透析後、比活性１，５００Ｕ／ｍｇタンパクである組換えタンパク質の精製標品を得た。この精製標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ＣＢＢＲ−２５０で染色した結果、約４４，０００のほぼ単一バンドを示した。
【０１０４】
実施例４  ランダム変異導入とスクリーニング
１）ｐＴＲＰ−ｌｄｈＤを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で処理し、Ｄ−乳酸脱水素酵素遺伝子をＧＦＸＴＭ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）により回収し、ＬＩＧＡＦＡＳＴＴＭ  ＲＡＰＩＤ  ＤＮＡ  ＬＩＧＡＴＩＯＮ  ＳＹＳＴＥＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、予め制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋（２．９ｋｂ）ベクターに導入し、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ｌｄｈＤを得た。
【０１０５】
２）得られたプラスミドをＤｉｖｅｒｓｉｆｙ  ＰＣＲ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてエラープローンＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応組成は、（５０μｌあたり）１×ＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、１ｎｇ  ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ｌｄｈＤ、０．２μＭ  センスプライマー、０．２μＭ  アンチセンスプライマー、１×Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ、０．０４ｍＭ  ｄＧＴＰ、０．１６ｍＭ  ＭｎＳＯ４、１×ＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ  バッファーにて行った。ＰＣＲ反応は９４℃  ３０秒（変性）、６８℃  ２分（伸長）を２５サイクル繰返し、アガロース電気泳動によりＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子に相当する約１．１ｋｂのＰＣＲ産物を確認した。
【０１０６】
センスプライマー（配列番号９）：
５’−ｇｔａａａａｃｇａｃｇｇｃｃａｇｔｇａｇｃｇ−３’
アンチセンスプライマー（配列番号１０）：
５’−ｃａｃｔａａａｇｇｇａａｃａａａａｇｃｔｇｇａｇ−３’
３）増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）処理し、ＧＦＸＴＭ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）により精製した。得られたＤＮＡ断片全量をＬＩＧＡＦＡＳＴＴＭ  ＲＡＰＩＤ  ＤＮＡ  ＬＩＧＡＴＩＯＮ  ＳＹＳＴＥＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、予め制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で処理した発現ベクターｐＴＲＰ（２．９ｋｂ）に導入後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、変異酵素ライブラリーを作製した。
【０１０７】
４）変異酵素ライブラリーより９６穴のディープウェル（Ｓｕｐｅｒ  ｂｒｏｔｈ（３．５％  ポリペプトン、２％  酵母エキス、０．５％  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５）０．６ｍｌ／ｗｅｌｌ）に植菌し、３７℃、１７時間振とう培養後、遠心分離により、集菌した。得られた菌体を抽出バッファー（精製時と同じ）に懸濁後、破砕、遠心分離し、粗抽出液を得た。
【０１０８】
５）各粗抽出液はバッファーＣ（０．１Ｍ  トリス−塩酸バッファー  ｐＨ９．０、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）で希釈し、４０℃、１５分間熱処理した後、ＬＤＨ活性を測定し、残存活性を算出した。
【０１０９】
６）その結果、野生型より安定性が向上した４クローンが選別された。得られた４クローンをＤＮＡ配列解析した結果、１９５番目のグリシンがシステインに置換した形質転換体（Ｇ１９５Ｃ）、９番目のグルタミン酸がグリシンに置換、２７５番目のグルタミン酸がリシンに置換、２８６番目のイソロイシンがバリンに置換した形質転換体（Ｅ９Ｇ／Ｅ２７５Ｋ／Ｉ２８６Ｖ）、２８６番目のイソロイシンがバリンに置換した形質転換体（Ｉ２８６Ｖ）、１５６番目のリシンがアルギニンに置換、３４０番目のアスパラギンがリシンに置換した形質転換体（Ｋ１５６Ｒ／Ｎ３４０Ｋ）であることを確認した。
【０１１０】
７）精製法は野生型と同じ。
５  ２０アミノ酸置換体の作製とスクリーニング
１）ｐＴＲＰ−ｌｄｈＤを鋳型に下記のプライマーを用いて、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔｓ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）により、１９５番目のグリシンに対して変異導入後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、別のアミノ酸に置換した２０種の置換体を作製した。
【０１１１】
センスプライマー（配列番号１１）：
５’−ｇｃａａａｔｔａｔｇｇａａｎｎｋｔｔｃｇｇｃｇｃｔａａｇｇｔａａｔｔｇｃａｔａｔｇａｃｃｃ−３’
アンチセンスプライマー（配列番号１２）：
５’−ｃｃｔｔａｇｃｇｃｃｇａａｍｎｎｔｔｃｃａｔａａｔｔｔｇｃａｔａｔａａａｃａｃｇｔｃｃ−３’
２）２０種のアミノ酸置換体を９６穴のディープウェル（Ｓｕｐｅｒ  ｂｒｏｔｈ（３．５％  ポリペプトン、２％  酵母エキス、０．５％  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５）  ０．６ｍｌ／ｗｅｌｌ）に植菌し、３７℃、１７時間培養後、遠心分離により、集菌した。得られた菌体を抽出バッファー（精製時と同じ）に懸濁後、破砕、遠心分離し、粗抽出液を得た。
【０１１２】
３）各粗抽出液はバッファーＣ（０．１Ｍ  トリス−塩酸バッファー  ｐＨ９．０、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）で希釈し、５５℃、６０分間熱処理した後、ＬＤＨ活性を測定し、残存活性を算出した。
【０１１３】
４）その結果、１９５番目のグリシンがシステインに置換された形質転換体が最も安定であった。
実施例６  本発明の変異型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質の理化学的性質
実施例で得られた理化学的性質を、以下の表１にまとめた。
【０１１４】
【表１】
2007075032.tif 000002
１）熱安定性に関して
本発明の酵素を１００ｍＭ  トリス−塩酸バッファー  ｐＨ９．０（０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む）中で２５−７０℃、１５分間熱処理後ＬＤＨ活性を測定し、残存活性を算出した。結果は図１・表１に示す通りで、野生型は３０℃まで安定であるのに対し、変異型は３７−５５℃まで安定であった。
【０１１５】
２）ｐＨ安定性に関して
本発明酵素を１００ｍＭ  リン酸カリウムバッファー  ｐＨ５．５−７．５、１００ｍＭ  トリス−塩酸バッファー  ｐＨ７．５−９．０、１００ｍＭ  グリシン−水酸化ナトリウムバッファー  ｐＨ９．０−１０．０（０．１％（ｗ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ８０を含む）中で２５℃、７日間保存後ＬＤＨ活性を測定し、残存活性を算出した。
【０１１６】
結果は図２・表１に示す通りで、野生型はｐＨ５．５−８．０まで安定であるのに対し、変異型は少なくとも約ｐＨ５．５−８．５まで安定であった。
３）Ｋｍ値に関して
０．１４−０．２９ｍＭ（ピルビン酸）、０．１０−０．１３ｍＭ（ＮＡＤＨ）であった。
【０１１７】
４）至適ｐＨに関して
約ｐＨ６．５−７．５であった。
５）分子量に関して
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果、分子量は約４４，０００であった。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】図１は、Ｄ−乳酸脱水素酵素タンパク質の熱安定性を示す。１００ｍＭ  トリス−塩酸バッファー  ｐＨ９．０（０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む）中で２５−７０℃，１５分間熱処理後ＬＤＨ活性を測定し，残存活性を算出した．  黒丸・実線は「Ｇ１９５Ｃ」、黒ダイヤ・点線は「Ｅ９Ｇ／Ｅ２７５Ｋ／Ｉ２８６Ｖ」、黒三角・実線は「Ｉ２８６Ｖ」、黒四角・点線は、「Ｋ１５６Ｒ／Ｎ３４０Ｋ」を表す。白丸・実線はコントロールの「野生型」を示す。
【図２】図２は、Ｄ−乳酸脱水素酵素タンパク質のｐＨ安定性を示す。１００ｍＭ  トリス−塩酸バッファー  ｐＨ７．５−９．０（０．１％（ｗ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ８０を含む）中で２５℃，７日間保存後ＬＤＨ活性を測定し，残存活性を算出した．  黒丸・実線は「Ｇ１９５Ｃ」、黒ダイヤ・点線は「Ｅ９Ｇ／Ｅ２７５Ｋ／Ｉ２８６Ｖ」、黒三角・実線は「Ｉ２８６Ｖ」、黒四角・点線は、「Ｋ１５６Ｒ／Ｎ３４０Ｋ」を表す。白三角・実線はコントロールの「野生型」を示す。
【図３】Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ．ｓｐ．（ＮＢＲＣ１４５１１）の天然型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質のアミノ酸配列と、前記タンパク質をコードする遺伝子を単離するためのプローブ作製時に参照した、公知のラクトバチラス属由来のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質の５種のアミノ酸配列を、相同性が最大となるように並べたものである。
【図４Ａ】Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ．ｓｐ．（ＮＢＲＣ１４５１１）の天然型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質のアミノ酸配列と、公知のラクトバチラス属由来のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質の８種のアミノ酸配列を、相同性が最大となるように並べたものである。
【図４Ｂ】Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ．ｓｐ．（ＮＢＲＣ１４５１１）の天然型のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質のアミノ酸配列と、公知のラクトバチラス属由来のＤ−乳酸脱水素酵素タンパク質の８種のアミノ酸配列を、相同性が最大となるように並べたものである。
【図１】
2007075032.tif 000003
【図２】
2007075032.tif 000004
【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【配列表】
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