(57)【要約】【課題】  所望の一本鎖核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）を、断片化、分断化が行われることなく簡易かつ高精度に取得できる技術を提供すること。【解決手段】  取得目的の一本鎖核酸Ｙ１と相補的な塩基配列を少なくとも有する中央核酸領域Ｘａとこの中央核酸領域Ｗａの両側に連結された異種核酸から構成された端部核酸領域Ｘｂ，Ｘｃとからなり、例えば、ＲＮＡ-ＤＮＡ-ＲＮＡの構造を備えるキメラ一本鎖核酸Ｘ１を用いる。このキメラ一本鎖核酸Ｘ１と一本鎖ＲＮＡＹ１との間で二本鎖Ｗを形成させる。次に、前記二本鎖核酸Ｗの余剰な一本鎖核酸部分Ｚ，Ｚと前記キメラ一本鎖核酸Ｘ１の前記端部核酸領域Ｘｂ，Ｘｃに形成されたＲＮＡ/ＲＮＡ二本鎖部分を、所定のヌクレアーゼ活性を有する酵素によって分解する。そして、前記工程を経て残った二本鎖核酸を解離させて、所望の一本鎖ＲＮＡを取得する。【選択図】  図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
取得目的の一本鎖核酸と相補的な塩基配列を少なくとも有する中央核酸領域とこの中央核酸領域の両側に連結された異種核酸から構成された端部核酸領域とからなり、ＲＮＡ-ＤＮＡ-ＲＮＡ又はＤＮＡ-ＲＮＡ-ＤＮＡの構造を備えるキメラ一本鎖核酸と、一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡと、の間で二本鎖を形成させる第１工程と、
前記二本鎖核酸の余剰な一本鎖核酸部分と前記キメラ一本鎖核酸の前記端部核酸領域に形成された二本鎖部分を、ヌクレアーゼ活性を有する酵素によって分解する第２工程と、
前記第２工程を経て残った二本鎖核酸を解離させて、一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡを取得する第３工程と、
を行う一本鎖核酸取得方法。
【請求項２】
前記第３工程に入る前のいずれかの段階で、前記キメラ一本鎖核酸の中央核酸領域を固相上へ固定しておくことを特徴とする請求項１記載の一本鎖核酸取得方法。
【請求項３】
前記第２工程後に、反応場の洗浄工程を行うことを特徴とする請求項１記載の一本鎖核酸取得方法。
【請求項４】
前記第２工程と前記第３工程の間の段階で、前記酵素の阻害剤を反応場へ添加することを特徴とする請求項１記載の一本鎖核酸取得方法。
【請求項５】
前記中央核酸領域は、ＤＮＡチップに利用するプローブ核酸の塩基配列領域と、ｃＤＮＡ合成用プライマー領域とが連結されたＤＮＡ領域であることを特徴とする請求項１記載の一本鎖核酸取得方法。
【請求項６】
前記中央核酸領域は、さらにｃＤＮＡ合成用終点領域を有することを特徴とする請求項５記載の一本鎖核酸取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的の塩基配列を備える一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡを、前記塩基配列に分断等がない状態で取得するための技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
何らかのアッセイ系において使用する目的で、特定の塩基配列を備える一本鎖核酸を正確に合成することが求められる場合がある。この場合、当該塩基配列部分が断片化されたり、分断されたりして、所望の一本鎖核酸の取得が困難となる。
【０００３】
例えば、一本鎖ＲＮＡは、自己ループ構造を形成し易いという性質を有するので、所望の長鎖ＲＮＡを人工的に固相上で合成することは本来的に難しく、限界がある。
【０００４】
また、近年、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、本願では「ＤＮＡチップ」と総称。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されるようになり、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、進化の研究、法医学その他の分野において広範囲に活用され始めている。
【０００５】
このＤＮＡチップの一典型例は、特定の疾病の発症に係わるような遺伝子の塩基配列を備えるｃＤＮＡ（complementary DNA）を基板表面に予め固定化して集積しておき、このｃＤＮＡと生体から抽出されたｍＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションの有無を蛍光検出などの光学的手段等で検出し、疾病の診断や予測に利用するというものである。このｃＤＮＡは、ｍＲＮＡを鋳型として合成されるので、ＤＮＡチップの量産化には、このｃＤＮＡの高精度合成技術が重要なる。
【０００６】
また、ＤＮＡチップなどを用いたハイブリダイゼーション検出で用いられるｍＲＮＡは、生体から取得された長鎖ｍＲＮＡを予め断片化したものである。しかし、ＤＮＡチップ用途に特に限らなくても、長鎖ｍＲＮＡの断片化の作業を部位特異的に実施し、重要な塩基配列が分断されずに一連一体で残るように簡易にコントロールすることは現技術では難しい。
【０００７】
なお、特許文献１には、ＤＮＡやＲＮＡ分子内の任意の部位を部位特異的に切断したり、末端から規定数のヌクレオチドを加水分解したりできるヌクレアーゼが開示されている。
【特許文献１】特表平６−５１０９０１号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明は、所望の一本鎖核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）を、断片化、分断化が行われることなく簡易かつ高精度に取得できる技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下の第１〜３の工程を少なくとも行う一本鎖核酸取得方法である。
【００１０】
（１）第１工程。この工程では、取得目的の一本鎖核酸と相補的な塩基配列を少なくとも有する中央核酸領域とこの中央核酸領域の両側に連結された異種核酸から構成された端部核酸領域とからなり、ＲＮＡ-ＤＮＡ-ＲＮＡ又はＤＮＡ-ＲＮＡ-ＤＮＡの構造を備えるキメラ一本鎖核酸を用いる。そして、このキメラ一本鎖核酸と一本鎖ＲＮＡとの間、又はキメラ一本鎖核酸と一本鎖ＤＮＡとの間で、二本鎖を形成させる。この結果、得られる二本鎖は、以下の４通りである。なお、本明細書において「／」は、その左右に記載された核酸が相補結合し、二本鎖を形成していることを意味する（以下、同様）。
【００１１】
ａ）ＲＮＡ-ＤＮＡ-ＲＮＡ／ＲＮＡ。
ｂ）ＲＮＡ-ＤＮＡ-ＲＮＡ／ＤＮＡ。
ｃ）ＤＮＡ-ＲＮＡ-ＤＮＡ／ＲＮＡ。
ｄ）ＤＮＡ-ＲＮＡ-ＤＮＡ／ＤＮＡ
【００１２】
（２）第２工程。この工程では、前記第１工程で取得された二本鎖核酸の余剰の一本鎖核酸部分と前記キメラ一本鎖核酸の前記端部核酸領域に形成された二本鎖部分を、ヌクレアーゼ活性を有する酵素によって分解する。使用する酵素は、余剰の一本鎖核酸部分と端部核酸領域に形成された二本鎖部分のいずれかを選択的に分解する酵素を併用し、あるいは、これら両部分を同時に選択的に分解する酵素を使用して行う。
【００１３】
なお、本発明では、この第２工程後に、反応場の洗浄工程を行うことで、次の第３工程に入る前に、反応場に添加した酵素やその酵素分解物を反応場から除去する工程を加えるのが望ましい。また、前記第２工程と前記第３工程の間の段階で、前記酵素の阻害剤を反応場へ添加しておくことで、次の第３工程で得られる目的の一本鎖核酸が、反応場に残存するかもしれない前記酵素によって分解を受けてしまうことを未然に防止する。この阻害剤の添加は、洗浄工程を行った場合でも実施することが望ましい。
【００１４】
（３）第３工程。この工程では、反応場の環境条件を変更して、前記第２工程における酵素処理を経て残った二本鎖核酸（中央核酸領域に形成された二本鎖核酸）を解離させ、一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡを取得する。この取得された一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡは、反応場の反応溶液から回収できる。
【００１５】
なお、本発明では、この第３工程に入る前のいずれかの段階で、本発明で用いるキメラ一本鎖核酸の中央核酸領域を固相上へ予め固定しておくことによって、回収溶液中への前記中央核酸領域の一本鎖核酸の混入を回避することができる。
【００１６】
以上の工程を経て、回収された取得目的の一本鎖核酸の用途は、特に限定されない。一例を挙げると、本方法において用いる上記キメラ一本鎖核酸の中央核酸領域部分を、ＤＮＡチップに利用されるプローブ核酸の塩基配列領域とｃＤＮＡ合成用プライマー領域とが連結されたＤＮＡ領域とする。
【００１７】
即ち、（ｃＤＮＡ合成用プライマー領域）-（プローブ核酸の塩基配列領域）という構成のＤＮＡ領域とし、さらには、ｃＤＮＡ合成用終点領域を有するＤＮＡ領域、即ち、（ｃＤＮＡ合成用プライマー領域）-（プローブ核酸の塩基配列領域）-（ｃＤＮＡ合成用終点領域）としてもよい。
【００１８】
ここで、本発明に関連する主たる技術用語について説明する。
【００１９】
「核酸」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体（ヌクレオチド鎖）を意味し、プローブＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃプローブＤＮＡ）、ＲＮＡ、ポリアミドヌクレオチド誘導体（ＰＮＡ）等を広く含む。
【００２０】
「異種核酸」とは、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸、deoxyribonucleic acid）に対するＲＮＡ（リボ核酸、ribonucleic acid）、またはその逆の関係を意味する。
【００２１】
「キメラ一本鎖核酸」とは、そのヌクレオチド鎖中にＤＮＡとＲＮＡが混在している一本鎖状態の核酸を意味する。本発明では、ＲＮＡ-ＤＮＡ-ＲＮＡとＤＮＡ-ＲＮＡ-ＤＮＡという構造を想定する。
【００２２】
「中央核酸領域」とは、前記キメラ一本鎖核酸がＲＮＡ-ＤＮＡ-ＲＮＡである場合ではＲＮＡ間に介在するＤＮＡ部分、前記キメラ一本鎖核酸がＤＮＡ-ＲＮＡ-ＤＮＡである場合ではＤＮＡ間に介在するＲＮＡ部分を意味する。
【００２３】
「端部核酸領域」とは、前記キメラ一本鎖核酸がＲＮＡ-ＤＮＡ-ＲＮＡである場合ではＤＮＡの両側に位置するＲＮＡ部分、前記キメラ一本鎖核酸がＤＮＡ-ＲＮＡ-ＤＮＡである場合ではＲＮＡの両側に位置するＤＮＡ部分を意味する。
【００２４】
「ヌクレアーゼ活性」は、核酸を消化分解する酵素活性を意味する。本発明では、このヌクレアーゼ活性を有する酵素を、分解対象の核酸種に応じて選択して使用する。
【００２５】
「反応場」は、本発明に係る方法を構成する各工程における反応が進行する場所、領域、空間を意味し、「洗浄」とは、この反応場に存在している不要物質を除去するための工程を意味する。
【００２６】
「ＤＮＡチップ」は、ガラス基板やシリコン基板上に多種・多数のＤＮＡオリゴ鎖やｃＤＮＡ等のプローブ核酸が集積されていることから、ハイブリダイゼーションの網羅的解析が可能となる点が特徴とされている。ＤＮＡマイクロアレイと称される場合もある。
【００２７】
「プローブ核酸」とは、反応領域に貯留又は保持された媒質中に存在し、当該分子と特異的に相互作用するターゲット分子を検出するための探り針（検出子）として機能する核酸分子であって、ハイブリダイゼーションの場となる反応領域中に遊離状態で存在したり、基板やビーズなどの固相表面にその一端が固定されて存在したりする。例えば、ＤＮＡプローブなどのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが代表的である。
【００２８】
「ｃＤＮＡ合成用プライマー領域」は、ｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡ（complementary DNA）を合成する際に、逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）のプライマーとして機能し得る塩基配列領域を意味する。例えば、ｍＲＮＡの３′末端に位置するポリＡ配列に相補的なオリゴｄＴ、あるいはランダムヘキサマー（random 6-mer:ランダムな配列をもった６塩基ＤＮＡの混合物）などを挙げることができる。
【００２９】
「ｃＤＮＡ合成用終点領域」は、ｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡ（complementary DNA）を合成する際に、当該合成の終了位置として機能し得る塩基配列領域を意味する。例えば、脱塩基部位（Abasic site）を挿入することによって、ｃＤＮＡ合成用終点領域として機能させることができる。
【００３０】
「相補結合」は、相補的な塩基配列構造を備える間の相補鎖（二本鎖）形成反応を意味する。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によれば、所望の塩基配列、所望の鎖長の一本鎖ＲＮＡや一本鎖ＤＮＡを簡易、かつ確実に取得できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明を実施するための好適な形態について、添付図面を参照しながら説明する。なお、添付図面に示された各実施形態は、本発明に係わる方法の代表的な実施形態を例示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００３３】
まず、図１から図４に基づいて、本発明に係る一本鎖核酸取得方法で用いるキメラ一本鎖核酸の基本的な形態概念について説明する。まず、図１は、該キメラ一本鎖核酸の第１実施形態の概念を示す図である。なお、以下の図面では、理解の容易化のため、ＤＮＡは太線、ＲＮＡは細線で示す。
【００３４】
図１に符号Ｘ１で示されたキメラ一本鎖核酸は、これに相補的な所望の一本鎖核酸を作製するために調製されたオリゴ核酸又はポリ核酸であり、中央核酸領域Ｘａと、この中央核酸領域Ｘａの両側末端に連結された端部核酸領域Ｘｂ及びＸｃを備えている。
【００３５】
この実施形態例では、中央核酸領域Ｘａは、取得目的の塩基配列部分を少なくとも備えるＤＮＡであり、端部核酸領域Ｘｂ，ＸｃはＲＮＡである。即ち、前記キメラ一本鎖核酸Ｘ１は、図１に示すように、ＲＮＡ-ＤＮＡ-ＲＮＡのヌクレオチド構造を備えている。なお、本キメラ一本鎖核酸Ｘ１の全体の鎖長や中央核酸領域Ｘａ、あるいは端部核酸領域Ｘｂ，Ｘｃの鎖長は、概念的には、特に限定されない（以下、同様）。
【００３６】
図２は、前記キメラ一本鎖核酸Ｘ１に対してＲＮＡが相補結合して、二本鎖を形成した状態が模式的に示されている。即ち、このＲＮＡからなる一本鎖Ｙ１は、キメラ一本鎖核酸Ｘ１の塩基配列と相補的な塩基配列を備えており、加えて、その両側末端には、余剰な一本鎖核酸部Ｚ，Ｚを有している（図２参照）。
【００３７】
次に、図３は、本発明に係る一本鎖核酸取得方法で用いるキメラ一本鎖核酸の第２実施形態の概念を示す図である。
【００３８】
この図３に符号Ｘ２で示されたキメラ一本鎖核酸は、これに相補的な所望の一本鎖核酸を作製するために調製されたオリゴ核酸又はポリ核酸であり、前記キメラ一本鎖核酸Ｘ１と同様に、中央核酸領域Ｘａと、この中央核酸領域Ｘａの両側末端に連結された端部核酸領域Ｘｂ及びＸｃを備えている。
【００３９】
この実施形態例では、中央核酸領域Ｘａは、取得目的の塩基配列部分を少なくとも備えるＲＮＡであり、端部核酸領域Ｘｂ，ＸｃはＤＮＡである。即ち、キメラ一本鎖核酸Ｘ２は、図３に示すように、ＤＮＡ-ＲＮＡ-ＤＮＡのヌクレオチド構造を備えている。
【００４０】
図４は、前記キメラ一本鎖核酸Ｘ２に対してＲＮＡが相補結合して二本鎖を形成した状態が模式的に示されている。即ち、このＤＮＡからなる一本鎖Ｙ２は、キメラ一本鎖核酸Ｘ２の塩基配列と相補的な塩基配列を備えており、加えて、両側末端には、余剰な一本鎖核酸部Ｚ，Ｚを有している（図４参照）。
【００４１】
以下、図５〜９を参照しながら、本発明に係る一本鎖核酸取得方法の好適な一実施形態例について説明する。なお、この実施形態例は、図１、図２に示されているキメラ一本鎖核酸Ｘ１を用いる方法のより具体的な例である。
【００４２】
まず、図５には、本方法で用いるキメラ一本鎖核酸Ｘ１の具体的構成の一例が示されている。このキメラ一本鎖核酸Ｘ１は、その中央核酸領域Ｘａにおいて、ＤＮＡチップなどのマイクロアレイ基板上に固定化して積載する場合などに使用されるｃＤＮＡに係わる塩基配列部分（以下、「プローブ領域Ｘａ１」と称する）と、該ｃＤＮＡ合成時に利用される（逆転写酵素の）プライマー（Primer）領域Ｘａ２と、該ｃＤＮＡ合成時に利用される合成終結点（End Point）の標識として利用されるオリゴＤＮＡ領域Ｘａ３と、を備えている（図５参照）。
【００４３】
また、図５に示すように、本実施形態では、キメラ一本鎖核酸Ｘ１の中央核酸領域Ｘａに対して、固相への固定化に利用できるビオチン（Biotin）などのリンカーＬを連結しておき、本方法の過程の好適なタイミングで、このリンカーＬを介して基板やビーズなどの固相表面にキメラ一本鎖核酸Ｘ１を固定化させておいてもよい。なお、この固定化のタイミングは、キメラ一本鎖核酸Ｘ１に相補結合した一本鎖核酸（ＲＮＡ）Ｙ１を解離させる工程（後述）に入る前の段階を選択する。
【００４４】
本方法では、上記構成のキメラ一本鎖核酸Ｘ１を用いて以下の工程を行う。
（１）第１工程。この第１工程は、所定の反応場Ｒに一本鎖核酸Ｙ１（ＲＮＡ）を供給し、該反応場Ｒで待ち受けているキメラ一本鎖核酸Ｘ１との間での相補結合を進行させ、選択された所定の反応条件で、二本鎖Ｗを形成させる工程である。
【００４５】
この工程で得られた二本鎖Ｗは、ＤＮＡ（符号Ｘａ領域に対応）-ＲＮＡからなる二本鎖部分と、その両側のＲＮＡ-ＲＮＡからなる二本鎖部分と、から構成され、さらには一本鎖核酸Ｙ１（ＲＮＡ）の余剰一本鎖部分Ｚ，Ｚを有している。図６には、図５に示されたキメラ一本鎖核酸Ｘ１に対してＲＮＡが相補結合して二本鎖を形成している様子が模式的に示されている。
【００４６】
（２）第２工程。次に、前記二本鎖Ｗが存在する反応場Ｒに対して、所定のヌクレアーゼ活性を有する酵素Ｅを添加し、選択的に余剰一本鎖部分Ｚ，ＺとＲＮＡ-ＲＮＡ二本鎖部分を分解（消化）して断片化する。図７には、酵素Ｅによって分解処理を受けたあとに残った二本鎖核酸の状態が示されている。
【００４７】
即ち、一本鎖ＲＮＡを選択的に分解する作用を備えるリボヌクレアーゼ（Ribonuclease，ＲＮase）とＲＮＡ-ＲＮＡ二本鎖部分を選択に分解する作用を備えるリボヌクレアーゼを併用する方法、あるいは、一本鎖ＲＮＡを選択的に分解するだけでなく、併せてＲＮＡ-ＲＮＡ二本鎖部分も分解できる作用を備えるＲＮase One Ribonucleaseなどのリボヌクレアーゼを使用する方法を採用できる。図７中の符号ｙは、上記酵素Ｅによって断片化されたＲＮＡを示している。
【００４８】
なお、本発明で利用可能なヌクレアーゼ活性を有する酵素は、分解対象となる核酸部位に反応特異性を有する酵素を適宜選択すればよく、例えば、S1 Nuclease、Mung Bean Nuclease、BAL31 Nuclease、ExonucleaseI、ExonucleaseIII、Micrococcal Nuclease,DeoxyribonucleaseI、Cloned DNaseI、RibonucleaseHなどを挙げることができる。
【００４９】
この第２工程では、ＤＮＡ-ＲＮＡ二本鎖部分は、上記核酸分解酵素Ｅの分解作用を受けずに、反応場Ｒ内に二本鎖を形成した状態で留まる（図７参照）。
【００５０】
次に、上記第２工程を行った後に、中央核酸領域Ｘａ（ＤＮＡ）に連結されているリンカーＬを介して、基板やビーズなどの固相表面Ｓに対して二本鎖Ｗ（のＤＮＡ側）を固定する。例えば、アビジン-ビオチン（Avidin-Biotin）結合により固定する。なお、この固定化工程の実施は、本タイミングに限定されることなく、既述したように、第１工程前から第２工程後に至る段階のいずれかのタイミングを選択して、自由に行うことができる。
【００５１】
この固定化工程に続いて、反応場Ｒに所定の洗浄用バッファー溶液を送液し、該反応場Ｒを洗浄する工程を行う。この洗浄工程によって、反応場Ｒ中に存在する核酸分解酵素Ｅ、断片化されたＲＮＡ、あるいは二本鎖形成に関与しなかった（関与できなかった）一本鎖ＲＮＡなどを該反応場Ｒから除去する。
【００５２】
さらには、図８に示すように、続く第３工程に備えて、反応場Ｒへリボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＮase阻害剤）Ｉを添加しておくようにする。これは、次の第３工程によって取得され得る一本鎖ＲＮＡが、前記洗浄工程を行ってもなお反応場Ｒ中に残存するかもしれない核酸分解酵素Ｅによって分解を受けないようにする未然の対策である。このリボヌクレアーゼ阻害剤Ｉは、使用した酵素Ｅの種類に応じて選択すればよいのであって、例えば、Proteinase KやRibonuclease Inhibitor系を採用することができる。
【００５３】
（３）第３工程。続いて、この第３工程では、反応場Ｒ内に残っているＤＮＡ-ＲＮＡ二本鎖を温度操作等によって解離（Denature）させる。この工程では、ＤＮＡ（中央核酸領域Ｗａに相当）側は、固相表面Ｓに（リンカーＬを介して）固定されているので、一本鎖核酸（ＲＮＡ）Ｙ１のみを遊離させることができる（図９参照）。
【００５４】
そして、この反応場Ｒの反応溶液を回収することによって、目的の一本鎖核酸（ＲＮＡ）Ｙ１を取得することができる。この一本鎖核酸（ＲＮＡ）Ｙ１は、キメラ一本鎖核酸Ｘ１（図５、図６を主に参照）の中央核酸領域Ｘａと相補的であって、プローブ領域Ｘａ１に相補的な塩基配列が含まれている。このようにして、所望する塩基配列部分を含む一本鎖核酸（ＲＮＡ）Ｙ１を効率よく取得することができる。
【００５５】
なお、図３に示すようなＤＮＡ-ＲＮＡ-ＤＮＡのヌクレオチド構造を有するキメラ一本鎖核酸Ｘ２を用いる方法の場合では、該キメラ一本鎖核酸Ｘ２と一本鎖核酸（ＤＮＡ）Ｙ２との間で二本鎖を形成し（第１工程、図４参照）、その後、余剰の一本鎖ＤＮＡ部分Ｚ，Ｚや両側に位置するＤＮＡ-ＤＮＡ二本鎖を選択的に分解する酵素Ｅを反応場Ｒへ添加し、ＲＮＡ-ＤＮＡ二本鎖のみを作製する（第２工程）。続いて、既述したような固定化工程、洗浄工程、酵素阻害剤添加工程などを経た後、前記ＲＮＡ-ＤＮＡ二本鎖を解離させて、所望する塩基配列部分を含む一本鎖核酸（ＤＮＡ）Ｙ２（図４参照）を効率よく取得することができる。
【００５６】
以上のような方法によって取得された一本鎖ＲＮＡや一本鎖ＤＮＡには、所望の塩基配列部分が分断されることなく、一連一体で備わっている。取得された一本鎖ＲＮＡや一本鎖ＤＮＡの使用目的や用途は特に限定されない。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明は、様々なバイオアッセイ系において必要となる一本鎖ＲＮＡや一本鎖ＤＮＡを取得回収する技術として利用できる。例えば、ｃＤＮＡなどのＤＮＡを鋳型とする一本鎖ＲＮＡの合成、ＲＮＡやＤＮＡを鋳型とする一本鎖ＤＮＡや一本鎖ＲＮＡの合成に利用、あるいは応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明に係る一本鎖核酸取得方法で利用可能なキメラ一本鎖核酸の第１実施形態の概念を示す図である。
【図２】同キメラ一本鎖核酸（Ｘ１）に対してＲＮＡが相補結合して、二本鎖が形成された状態を模式的に示す図である。
【図３】本発明に係る一本鎖核酸取得方法で利用可能なキメラ一本鎖核酸の第２実施形態の概念を示す図である。
【図４】同キメラ一本鎖核酸（Ｘ２）に対してＲＮＡが相補結合して二本鎖が形成された状態が模式的に示す図である。
【図５】本方法で用いるキメラ一本鎖核酸Ｘ１のより具体的構成の一例を示す図である。
【図６】図５に示されたキメラ一本鎖核酸（Ｘ１）に対してＲＮＡが相補結合して二本鎖を形成している様子を模式的に示す図である。
【図７】ヌクレアーゼ活性を有する酵素（Ｅ）によって分解処理を受けた後に反応場に残った二本鎖核酸の状態を模式的に示す図である。
【図８】反応場（Ｒ）へ酵素のＲＮase阻害剤（Ｉ）を添加した状態を模式的に示す図である。
【図９】本発明に係る方法の第３工程において、一本鎖ＲＮＡが解離し、反応場（Ｒ）へ遊離する様子を模式的に示す図である。
【符号の説明】
【００５９】
Ｅ  ヌクレアーゼ活性を有する酵素
Ｉ  阻害剤
Ｌ  リンカー
Ｒ  反応場
Ｓ  固相表面
Ｗ  二本鎖核酸
Ｘａ  中央核酸領域
Ｘｂ，Ｘｃ  端部核酸領域
Ｙ１  取得目的の一本鎖核酸（ＲＮＡ）
Ｙ２  取得目的の一本鎖核酸（ＤＮＡ）
【図１】
2007020474.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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