(57)【要約】【課題】アルカリ性に対し耐性のない微生物に対し、アルカリ性耐性遺伝子を解明或いは遺伝子導入する事なく、あるいは、突然変異を導入しアルカリ性耐性微生物を作製する。【解決手段】所望の形質を生物に迅速に付与する方法およびシステムを用いて変異を導入し、所望のアルカリ性存在下で培養することによって、アルカリ性耐性を有する生物であって、該生物は、該生物の天然型が有する耐性よりも高い耐性を有する、生物、好ましくは、アルカリ性耐性微生物を作製することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルカリ性耐性を有する生物であって、該生物は、該生物の天然型が有する耐性よりも高い耐性を有する、生物。
【請求項２】
前記耐性は増殖能を保持した耐性である、請求項１に記載の生物。
【請求項３】
前記耐性は、ｐＨ８．０での耐性である、請求項１に記載の生物。
【請求項４】
前記耐性は、ｐＨ８．５での耐性である、請求項１に記載の生物。
【請求項５】
前記耐性は、ｐＨ９．０での耐性である、請求項１に記載の生物。
【請求項６】
前記耐性は、ｐＨ９．５での耐性である、請求項１に記載の生物。
【請求項７】
前記耐性は、ｐＨ９．８での耐性である、請求項１に記載の生物。
【請求項８】
前記耐性は、ｐＨ９．８で増殖能を保持した耐性である、請求項１に記載の生物。
【請求項９】
前記耐性は、アルカリ性環境において少なくとも１８時間以上生存することを包含する、請求項１に記載の生物。
【請求項１０】
前記耐性は、アルカリ性環境において少なくとも４日以上生存することを包含する、請求項１に記載の生物。
【請求項１１】
前記生物は、真核生物である、請求項１に記載の生物。
【請求項１２】
前記生物は、酵母である、請求項１に記載の生物。
【請求項１３】
前記生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓに属する生物である、請求項１に記載の生物。
【請求項１４】
前記生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項１に記載の生物。
【請求項１５】
アルカリ性に対する耐性が改善された生物を作製するための方法であって、該方法は：
Ａ）目的の生物を、該アルカリ性について、正常状態での最大許容ｐＨで培養する工程；
Ｂ）該目的の生物を、該アルカリ性について、改善について所望のｐＨで培養する工程；および
Ｃ）生存する生物を選択し再生産する工程、
を包含する、方法。
【請求項１６】
前記培養工程Ｂ）の前に、Ａ’）ｐＨ濃度を前記培養工程Ａ）から０．１〜０．２ずつｐＨを上げながら前記生物の培養を行うことを包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記工程Ａ’）において、各ｐＨにおける培養期間は、１〜２日である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記工程Ａ’）において、各ｐＨにおける培養期間は、増殖能を有することが確認できるに十分な期間である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
Ｄ）前記生物の遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を調節する工程をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記エラープローン頻度を調節する工程は、前記生物のＤＮＡポリメラーゼのエラープローン頻度を調節することを包含する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、真核細胞におけるＤＮＡポリメラーゼα、ＤＮＡポリメラーゼβ、ＤＮＡポリメラーゼγ、ＤＮＡポリメラーゼδおよびＤＮＡポリメラーゼεならびにそれらに対応するＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される少なくとも１つのポリメラーゼを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、真核細胞におけるＤＮＡポリメラーゼδおよびＤＮＡポリメラーゼεならびにそれに対応するＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される少なくとも１つのポリメラーゼを包含する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記生物は、真核生物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記生物は、分離した細胞の状態で存在する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記生物は、動物、植物、真菌または酵母の細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記生物は、真核生物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
前記生物は、酵母である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
前記生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓに属する生物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
前記生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項１５に記載の方法。
【請求項３０】
前記生物は、所望の形質の変換後も、野生型と実質的に同じ成長を示す、請求項１５に記載の方法。
【請求項３１】
前記所望のｐＨは、前記最大許容ｐＨよりも高いｐＨである、請求項１５に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１６〜３１のいずれか１項に記載の方法によって生産された生物。
【請求項３３】
生物のアルカリ性耐性能を評価する方法であって、
Ａ）該生物を、該生物が通常生育する条件下で生育させる工程；
Ｂ）該アルカリ性存在下または不存在下で該生物を生育させる工程；および
Ｃ）該生物が死滅する該アルカリ性のｐＨを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３４】
前記生物が死滅しているか否かの決定は、その細胞が形を維持している細胞かどうかを判定基準として用いることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
菌学的性質は、アルカリ性耐性以外は野生型と同じである生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアルカリ耐性に優れた生物およびアルカリ耐性に優れた生物の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高アルカリ条件が、生物に対し過酷な環境である大きな原因の一つが金属イオンの問題である。アルカリ金属イオンであるＮａ＋は、細胞内に高ｐＨ存在すると細胞毒あるのに対し、同じアルカリ金属イオンであるＫ＋は、細胞内において細胞体積の調節、細胞内ｐＨ調節、タンパク質合成、酵素活性化などの様々な生理的機能に重要な役割を果たしている。
【０００３】
極限環境から分離された好アルカリ性微生物は、主に三つの方法で細胞内のＫ＋／Ｎａ＋比を最適に維持してアルカリ耐性になっていると考えられる。
【０００４】
第一の方法は、細胞壁のペプチドグリカン層が厚くなり、細胞膜には分岐・不飽和脂肪酸を多く含み、テイコ酸やジアシルグリセロールを特徴的に含んでアルカリ耐性に寄与している。
【０００５】
第二の方法は、細胞膜でのＮａ＋流入の制限や積極的なＮａ＋排出である。例えば、酵母では、Ｎａ＋に比べＫ＋に対し親和性の高い細胞膜トランスポーター（Ｎｈａ１）が、細胞内Ｋ＋ｐＨを高く（２００〜３００ｍＭ）維持し、Ｎａ＋の細胞内への流入を制限している。また、細胞膜Ｎａ＋／ＡＴＰａｓｅ（ＥＮＡ１／Ｐｍｒ２）が、Ｎａ＋を能動輸送によって細胞内から積極的に細胞外へ排出している。
【０００６】
第三の方法として、細胞の構成成分であるタンパク質が変異してアルカリ耐性を獲得している。その他の方法として、液胞を持つ生物、例えば、酵母の場合、液胞膜Ｎａ＋／Ｈ＋  エクスチェンジャー（ＮＨＸ１）が細胞内に残ったＮａ＋を液胞内に貯蔵して細胞内Ｋ＋／Ｎａ＋比を最適に維持している。
アルカリ耐性微生物の作成の一般的方法としては、以下に説明する方法が利用されているが、（１）を除いて、他の方法では、わずかなアルカリ耐性の付与しか達成出来ていないのが現状である。
【０００７】
（１）第一の方法は、極限環境から新規にアルカリ耐性微生物を分離し利用するもので、ｐＨ１０以上の高アルカリ耐性微生物を得た報告は多数ある。しかし、産業利用するには遺伝子組み換えのためのベクター系の新規開発、遺伝子導入方法の確立などが必要で、ベクター系が確立可能かどうかは検討しないと分からない問題がある。例えば、ｐＨ１０．０で生育するアルカリ耐性酵母として、高塩耐性酵母Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ  ＩＦＯ１０９３９  （非特許文献１＝Ｋｕｒｉｔａ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５（４），２７７−２８０，  ２００２）やＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ（非特許文献２＝Ｍａｒｖａｔ  Ａ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１（７），  ６０６−６０９，２００１）、好アルカリ酵母Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（非特許文献３＝Ｚｖｙａｇｉｌｓｋａｙａ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ，５０（２），１５１−１５５，２０００）が報告されているがベクター系や遺伝子導入法は確立していない。  
【０００８】
（２）第二の方法は、放射線照射やニトロソグアニジンなどの突然変異誘発剤で変異処理する古典的方法である。この方法の問題は、アルカリ耐性変異体を得るために、多大な労力と時間を要するが、わずかなアルカリ耐性の増強のみでｐＨ１０以上の大幅なアルカリ耐性度の改質獲得にはいたっていない。例えば、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞膜Ｈ＋／ＡＴＰａｓｅの１アミノ酸置換（Ｇｌｕ３６７→Ｌｙｓ）によってＮＨＸ１の液胞内へのＮａ＋貯蔵能が高まり、わずかなアルカリ耐性能が付与されたと報告されている（非特許文献４＝Ｎａｓｓ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（４２）２６１４５−２６１５２，１９９７）。また、アルカリに応答して発現の増加する転写因子Ｒｉｍ１０１が、前述の３つの酵素（Ｎｈａ１、ＥＮＡ１／Ｐｍｒ２、ＮＨＸ１）の発現調節に関与している（非特許文献５＝Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２３（２），６７７−６８６，２００３）ので、  Ｒｉｍ１０１を構成的活性化する変異が導入できれば、更に高いアルカリ耐性を付与可能性が考えられる。
【０００９】
（３）第三の方法は、アルカリ耐性微生物のアルカリ耐性機構を解明し、アルカリ耐性を付与したい生物にアルカリ耐性遺伝子を導入するものである。アルカリ耐性は、前述したように多数の遺伝子群が関与していると予想されており、現状ではアルカリ耐性機構の解明が不十分で、遺伝子導入で高いアルカリ耐性能を付与可能出来ていないのが問題である。例えば、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅについて４，８２５種のハプロイド欠失変異体解析、及び、高コピー数のプラスミド・ライブラリーのスクリーニングをおこない、アルカリ耐性に関与する遺伝子を解析した結果、ＦＥＴ４（低親和性銅、鉄、亜鉛トランスポーター）とＣＴＲ１（高親和性銅トランスポーター）遺伝子を高発現させ、弱アルカリ（ｐＨ７．７）での増殖能が付与されることが報告されている（非特許文献６＝Ｓｅｒｒａｎｏ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（１９），１９６９８−１９７０４，２００４）。
食品分野ではアルカリ条件下で発酵可能な酵母や乳酸菌などの実用化された例はなく、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに対しアルカリ耐性能の付与が求められているが、前述した方法ではｐＨ１０以上の高アルカリ耐性を付与できていない。Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅはパン酵母として人類の長い歴史の中で伝統的食品として、安全性や有用性が証明されている。実験的には、遺伝子組み換え技術で、わずかなアルカリ耐性を付与した例はある。例えば、アルカリ耐性酵母であるＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓのアルカリ耐性に関わるセレブロシド合成酵素遺伝子をＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのパン酵母には含有していないが、セレブロシドの産生能を付与するとアルカリ耐性が強化できる可能性が示されている（非特許文献７＝斉藤勝一、文部科学省・若手任期付研究員支援、好アルカリ発酵微生物の機能解析とその利用、研究期間：平成１３年〜１５年度＝http://www.mext.go.jp/b_menu/houdou/16/12/04121501/pdf/028_26.pdf）。
【非特許文献１】Ｋｕｒｉｔａ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５（４），２７７−２８０，  ２００２
【非特許文献２】Ｍａｒｖａｔ  Ａ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１（７），  ６０６−６０９，２００１
【非特許文献３】Ｚｖｙａｇｉｌｓｋａｙａ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ，５０（２），１５１−１５５，２０００
【非特許文献４】Ｎａｓｓ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（４２）２６１４５−２６１５２，１９９７
【非特許文献５】Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２３（２），６７７−６８６，２００３
【非特許文献６】Ｓｅｒｒａｎｏ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（１９），１９６９８−１９７０４，２００４
【非特許文献７】斉藤勝一、文部科学省・若手任期付研究員支援、好アルカリ発酵微生物の機能解析とその利用、研究期間：平成１３年〜１５年度<URL: http://www.mext.go.jp/b_menu/houdou/16/12/04121501/pdf/028_26.pdf>
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、アルカリ耐性の低い実験微生物に対して、低コスト、短時間で、効率よく、高アルカリに対して耐性に優れた形質を付与する方法を提供することである。
【００１１】
また、本発明の別の目的は、アルカリ耐性に優れた形質を付与した微生物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の上記目的は、鋭意検討の結果、遺伝子の複製において正確さに欠ける生物を用いて、通常では生育しないアルカリ条件下で培養し、生育する微生物を単離することを特徴とする高アルカリ耐性微生物の作製方法によって達成された。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、アルカリに対して、耐性に優れた微生物作製が可能となる。この微生物にはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに代表されるパン酵母も含まれる。また、本発明は、従来の方法に比べ、アルカリ耐性機構を解明、新規ベクター開発、遺伝子導入方法の確立などのためのコストが全く発生しない。また、これまでに遺伝子解析が終了した実験微生物のゲノム情報や開発されたベクター系が有効活用されることになる。
【００１４】
特に、パン酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに対し本発明の方法を用いてアルカリ耐性を付与できた場合、アルカリ発酵によって新食品加工技術へ広く応用されることが期待される。例えば、研究段階の報告であるが、ヨーグルト由来の好アルカリ細菌Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｌｖｏｒｕｍ  Ｂ８を中華麺に応用した結果、発酵産物の成分の効果により、防腐・防カビや品質改善効果として色調改善が達成されている（特願２００３−０３５０９２）。また、アルカリ条件下で特異的に発酵を行うことが見出され酵母Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓは、通常の製パン工程にかん粉を添加しアルカリ条件で発酵させると、生地の操作性や製パン適性が向上し、従来にない風味や食感のパンを製造可能となっている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００１６】
（用語）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００１７】
本明細書において「生物」とは、当該分野における最も広義に用いられ、生命現象を営むものをいい、代表的には、細胞構造、増殖（自己再生産）、成長、調節性、物質代謝、修復能力など種々の特性を有し、通常、核酸のつかさどる遺伝と、タンパク質のつかさどる代謝の関与する増殖を基本的な属性として有する。生物には、ウイルス、原核生物、真核生物（酵母のような単細胞生物、植物、動物のような多細胞生物など）などが包含される。本発明の方法は、グラム陽性細菌、および真核生物などの高等生物を含む、どのような生物であっても適用され得ることが理解される。本明細書では、サイズの小さな生物を「微生物」とも呼ぶが、有機溶媒耐性という点では同一であるので、本明細書では、生物と微生物とは交換可能に使用され得ることが理解される。
【００１８】
本明細書において「真核生物」とは、当該分野において通常用いられる意味と同様に用いられ、核膜のある、明確な核構造を持つ細胞からなる生物をいう。真核生物としては、例えば、酵母のような単細胞生物、イネ、コムギ、トウモロコシ、ダイズのような植物、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、サルのような動物、ハエ、カイコなどの昆虫が挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、酵母、線虫、ショウジョウバエ、カイコ、イネ、コムギ、ダイズ、トウモロコシ、シロイヌナズナ、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、カエル、魚類（例えば、ゼブラフィッシュ）などがモデルとして使用され得るがそれらに限定されない。
【００１９】
本明細書において「原核生物」とは、当該分野において通常用いられる意味と同様に用いられ、明確な核構造を持たない細胞からなる生物をいう。原核生物としては、例えば、大腸菌、サルモネラ菌のようなグラム陰性細菌、枯草菌、放線菌、ブドウ球菌のようなグラム陽性細菌、藍藻類、水素細菌などが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、代表的に、大腸菌以外に、グラム陽性細菌、として使用され得るがそれに限定されない。
【００２０】
本明細書において「動物」は、当該分野において最も広義で用いられ、脊椎動物および無脊椎動物（例えば、節足動物）を含む。動物としては、哺乳綱、鳥綱、爬虫綱、両生綱、魚綱、昆虫綱、蠕虫綱などが挙げられるがそれらに限定されない。動物は、好ましくは、脊椎動物（例えば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）であり得るが、それらに限定されない。ある一つの実施形態では、動物は、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）であり得るがそれらに限定されない。さらに好ましくは、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）または他のモデル動物となり得る種（例えば、奇蹄類、偶蹄類、マウスなどの齧歯類、ウサギ目など）であり得るがそれらに限定されない。本発明の方法は、生物であればどのようなものであっても適用できることが本発明において初めて解明されたことから、どのような生物であっても、対象とされ得ることが理解されるべきである。
【００２１】
本明細書において用いられる「植物」とは、植物界に属する生物の総称であり、クロロフィル、かたい細胞壁、豊富な永続性の胚的組織の存在，および運動する能力がない生物により特徴付けられる。代表的には、植物は、細胞壁の形成・クロロフィルによる同化作用をもつ顕花植物をいう。「植物」は、単子葉植物および双子葉植物のいずれも含む。好ましい植物としては、有用植物、例えば、コムギ、トウモロコシ、イネ、オオムギ、ソルガムなどのイネ科に属する単子葉植物が挙げられるがそれらに限定されない。好ましい植物のほかの例としては、タバコ、ピーマン、ナス、メロン、トマト、サツマイモ、キャベツ、ネギ、ブロッコリー、ニンジン、キウリ、柑橘類、白菜、レタス、モモ、ジャガイモおよびリンゴが挙げられる。好ましい植物は作物に限られず、花、樹木、芝生、雑草なども含まれる。特に他で示さない限り、植物は、植物体、植物器官、植物組織、植物細胞、および種子のいずれをも意味する。植物器官の例としては、根、葉、茎、および花などが挙げられる。植物細胞の例としては、カルスおよび懸濁培養細胞が挙げられる。本発明の方法は、生物であればどのようなものであっても適用できることが本発明において初めて解明されたことから、どのような生物であっても、対象とされ得ることが理解されるべきである。
【００２２】
本明細書において、「遺伝子」とは、細胞中に存在する核酸の一定の長さの配列をいう。本発明において遺伝子は、遺伝形質を規定するものであっても規定しないものであってもよい。本明細書において、遺伝子は、通常ゲノムに存在するものをさすが、それに限定されず、染色体外の配列、ミトコンドリアの配列なども包含することが理解される。多くの遺伝子は、通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子（たとえば、プロモーター）という。本明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含する。したがって、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子というときは、通常、ＤＮＡポリメラーゼの構造遺伝子ならびにＤＮＡポリメラーゼのプロモーターなどの転写および／または翻訳の調節配列の両方を包含する。本発明では、構造遺伝子のほか、転写および／または翻訳などの調節配列もまた、本発明が対象とする遺伝子として有用であることが理解される。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」ならびに／または「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を指すことがある。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現された「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」ならびに／または「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を包含する。当業者であれば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて理解することができる。
【００２３】
本明細書において「遺伝子の複製」とは、遺伝物質であるＤＮＡまたはＲＮＡにおいて，親の核酸鎖を鋳型として，親核酸と同一の構造と機能を有する新しい核酸分子（ＤＮＡであればＤＮＡ、ＲＮＡであればＲＮＡ）を生成することをいう。真核細胞では，二本鎖ＤＮＡ分子上にある多数の複製開始点に複製酵素（ＤＮＡポリメラーゼα）を含む複製開始複合体が形成されることによって複製が開始され、複製反応が複製開始点から両方向へ進行する。複製開始は、細胞周期によって制御される。酵母における自立複製配列（ＡＲＳ＝ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は複製開始点とされる。大腸菌などの原核細胞では、ゲノムの二本鎖環状ＤＮＡ分子に１個の複製開始点（ｏｒｉ）が存在し、ｏｒｉに複製開始複合体が形成され、反応はｏｒｉから両方向に進行する。複製開始複合体は複製酵素（ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ）を含む１０種類以上のタンパク質因子を含む複雑な構造を有する。複製反応は、二本鎖ＤＮＡのらせん構造の部分的巻戻しに始まり、その後短いＤＮＡプライマーが合成され、３’−ＯＨ基から新たなＤＮＡ鎖が伸長され、相補鎖鋳型において岡崎フラグメントが合成され、岡崎フラグメントの連結、鋳型と照らし合わせる校正（プルーフリーティング）などの多段階の反応によって複製反応が進行する。
【００２４】
生物の遺伝情報であるゲノムＤＮＡの複製機構は、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  Ａ．ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ  Ｔ．，“ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｆｒｅｅｍａｎ，１９９２に詳述されている。代表的には、１つの１本鎖ＤＮＡを鋳型として相補的な鎖を合成し、その結果、１つの２本鎖ＤＮＡを生じる酵素（ＤＮＡ複製を行う酵素）を、ＤＮＡポリメラーゼという。ＤＮＡ複製には、少なくとも２つのＤＮＡポリメラーゼが必要である。通常、リーディング鎖およびラギング鎖の合成を同時に行わなければならないからである。ＤＮＡ複製は、ＤＮＡ上の決まった位置から開始されるが、その位置を複製開始点（ｏｒｉ）という。例えば、細菌では、通常、環状ゲノムＤＮＡに少なくとも１つの両方向性の複製開始点を有する。これらを総合すると、通常は、１つのゲノムＤＮＡ複製には、４つのＤＮＡポリメラーゼが同時に作用する必要があることになる。本発明では、好ましくは、リーディング鎖およびラギング鎖の一方のみの複製誤りが調節されることが有利であり得、あるいは、二本の鎖のあいだの複製誤りの頻度が異なることが有利であり得る。
【００２５】
本明細書において「複製誤り」とは、遺伝子（ＤＮＡなど）の複製の過程で生じるヌクレオチド取り込みの誤りをいう。複製誤りは、通常、生体では、その頻度は１０８〜１０１２回に１回程度できわめて低い。複製誤りの頻度が低い理由としては、ヌクレオチドの取り込みが鋳型ＤＮＡと取り込まれるヌクレオチドとが相補的な塩基対を形成することによって複製が起こること、ＤＮＡポリメラーゼδ、εなどの酵素の校正機能すなわち３’→５’エキソヌクレアーゼが，鋳型に相補性を示さないヌクレオチドが誤って取り込まれたときそれを察知し直ちに切り出す機能が存在することなどが挙げられる。従って、本発明において複製におけるエラープローン頻度の調節は、特異的塩基対形成の障害、校正機能の障害などによって行うことができる。
【００２６】
本明細書において「エラーフリー」とは、遺伝子（ＤＮＡなど）の複製にいて誤りがほとんどない、好ましくは実質的に全くない性質をいう。エラーフリーは、主に、校正機能を有する酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼδ、εなど）の校正機能の精度によって影響を受ける。
【００２７】
本明細書において「エラープローン」とは、遺伝子（ＤＮＡなど）の複製における誤り易い（すなわち、複製誤りの）性質をいう。エラープローンは、主に、校正機能を有する酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼδ、εなど）の校正機能の精度によって影響を受ける。
【００２８】
本明細書においてエラープローンとエラーフリーとは、絶対的に（すなわち、エラープローン頻度のレベルなどで決定する）分類することができ、あるいは相対的（２種類以上の遺伝子の複製を担う因子（例えば、ＤＮＡポリメラーゼなど）におけるエラープローン頻度について多いほうをエラープローンとし、少ないほうをエラーフリーとする）に分類することができる。
【００２９】
本明細書において「エラープローン頻度」とは、エラープローンの性質のレベルをいう。エラープローン頻度は、例えば、遺伝子配列における変異の絶対数（変異の数そのもの）または相対数（全長における変異の数の比率）で表現することができる。あるいは、ある生物または酵素について言及するとき、エラープローン頻度は、ある生物の生殖または分裂１回あたりの遺伝子配列における変異の絶対数または相対数で表現してもよい。特に言及しない場合、遺伝子配列における複製過程１回あたりの誤差の数で表される。エラープローン頻度は、逆の尺度として本明細書において「精度」ということがある。エラープローン頻度が均一であるとは、複数の遺伝子の複製を担う因子（ポリメラーゼなど）に言及するとき、互いのエラープローン頻度が実質的に等しいことをいう。他方、エラープローン頻度が不均一であるとは、有意な差異が複数の遺伝子の複製を担う因子（ポリメラーゼなど）に存在する場合をいう。
【００３０】
本明細書において「エラープローン頻度の調節」とは、エラープローン頻度を変化させることをいう。そのようなエラープローン頻度の調節には、エラープローン頻度の上昇および低減が含まれる。エラープローン頻度の調節のための手法としては、例えば、校正機能を有するＤＮＡポリメラーゼの改変、複製中に重合反応または伸長反応を阻害または抑制するような因子の挿入これらの反応を促進するような因子の阻害、抑制、単数または複数の塩基の欠損、ＤＮＡ修復酵素の欠損、異常塩基の除去修復因子機能を有する酵素の改変、ミスマッチ塩基対修復因子の改変、複製自体の精度の低減などが挙げられるがそれらに限定されない。エラープローン頻度の調節は、ＤＮＡの二本鎖の両方に対して行われてもよいし、片方のみに対して行われてもよい。好ましくは、片方のみに対して行われることが有利であり得る。有害な変異誘発が低減されるからである。
【００３１】
本明細書において「ＤＮＡポリメラーゼ」またはＰｏｌとは、４種類のデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸からピロリン酸を遊離してＤＮＡを重合する働きを有する酵素をいう。ＤＮＡポリメラーゼ反応には、鋳型となるＤＮＡ、プライマー分子、Ｍｇ２＋などが必要とされる。プライマーの３’−ＯＨ末端に鋳型に相補的なヌクレオチドを順次付加し分子鎖を伸長する。
【００３２】
大腸菌にはＤＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩの少なくとも３種類の酵素が知られている。ＤＮＡポリメラーゼＩはＤＮＡ傷害の修復，遺伝的組換えおよびＤＮＡ複製に関与する。ＤＮＡポリメラーゼＩＩおよびＩＩＩは補助的機能を有するといわれる。この酵素は数種のタンパク質からなるサブユニット構造をとり，その構成からコア酵素およびホロ酵素の２つに分けられる。コア酵素は，α、εおよびθから構成され、ホロ酵素には、α、εおよびθサブユニットのほかに、τ、γ、δおよびβの成分がある。真核生物細胞も複数のＤＮＡポリメラーゼをもつことが知られており、高等生物ではＤＮＡポリメラーゼα、β、γ、δおよびεなど多種類存在する。動物では、ＤＮＡポリメラーゼα（核ＤＮＡの複製に関与、細胞増殖期のＤＮＡ複製に作用）、ＤＮＡポリメラーゼβ（核でのＤＮＡの修復に関与、増殖期、停止期のＤＮＡ傷害の修復などの作用を有する）、ＤＮＡポリメラーゼγ（ミトコンドリアＤＮＡの複製と修復に関与。エキソヌクレアーゼ活性をもつ）、ＤＮＡポリメラーゼδ（ＤＮＡの伸長に関与。エキソヌクレアーゼ活性をもつ）、ＤＮＡポリメラーゼε（ラギング鎖のすき間の複製に関与。エキソヌクレアーゼをもつ）などが知られている。
【００３３】
校正機能を担うＤＮＡポリメラーゼ（グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、真核生物など）では、ＥｘｏＩ用のアミノ酸配列が３’→５’エキソヌクレアーゼ活性中心を担うとされており、この部位が校正機能の精度に影響すると考えられている。
【００３４】
配列番号１：Ｐｏｌ  ＩＩＩ：３１７−ＩＭＳＦＤＩＥＣＡＧＲＩ−３２８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；
配列番号２：Ｐｏｌ  ＩＩ：２８６−ＶＭＡＦＤＩＥＴＴＫＰＰ−２９７（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；
変異型ｐｏｌ−３遺伝子発現株（ＡＭＹ１２８−１、以下ｐｏｌ−３変異株と略す）は、この配列を有しているものと推定される。ＡＭＹ１２８−１の代表例は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３０（変異型ｐｏｌ−３遺伝子発現株（１倍体株）（ＡＭＹ１２８−１））（寄託日平成１７年８月１９日）として寄託済みである。また、変異型ｐｏｌ−３遺伝子発現株（２倍体株）（ＢＹＤ５）は、受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１３１（寄託日平成１７年８月１９日）として寄託済みである。野生型ｐｏｌ−３遺伝子発現株（１倍体株）（ＡＭＹ５２−３Ｄ）は、受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９（寄託日平成１７年８月１９日）として寄託済みである。
【００３５】
ここで明らかなように、校正機能を有するＤＮＡポリメラーゼは、アスパラギン酸およびグルタミン酸がよく保存されている。本明細書において、このようなアスパラギン酸およびグルタミン酸を含む領域は、本明細書において校正機能活性部位ということがある。
【００３６】
１つの好ましい実施形態では、このような３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が破壊されるような変異を、ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子（ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子）に導入することにより、校正機能が低下した（すなわち、エラープローン頻度が増加した）ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸分子およびポリペプチドを産生することができる。なお、校正機能の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性は、単一のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（ＰｏｌＣ，ＰＯＬ２，ＣＤＣ２等）において、ＤＮＡ重合活性を担う分子中に含まれる場合（例えば、真核生物、グラム陽性細菌等）と、ＤＮＡ重合活性をコードする遺伝子（例えば、ｄｎａＥ）とは異なる遺伝子（例えば、ｄｎａＱ）にコードされる場合（例えば、グラム陰性細菌等）があることが知られており（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  Ａ．ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ  Ｔ．，“ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ”，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｆｒｅｅｍａｎ，１９９２）、当業者は、それらの特性を理解したうえで、本発明におけるエラープローン頻度の調節を適宜行うことができる。例えば、真核生物などでは、校正機能は変化するが、ＤＮＡ重合活性はほとんど変化させない変異をＤＮＡポリメラーゼに導入することが好ましい。この場合、上述のような校正機能に関与する２つの酸性アミノ酸（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ  ｅｔ．ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０，ｐｐ．１７−２４，Ｊａｎ．１９９１；  Ｆｉｊａｌｋｏｗｓｋａ  ａｎｄ  Ｓｃｈａａｐｅｒ，“Ｍｕｔａｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｘｏ  Ｉ  ｍｏｔｉｆ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｄｎａＱ：Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｅｒｒｏｒ  ｃａｔａｓｔｒｏｐｈｅ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｖｏｌ．９３，ｐｐ．２８５６−２８６１，Ａｐｒ．１９９６）を改変すること（好ましくは、保存されない置換（例えば、アラニン、バリンなどへの置換））が挙げられるがそれらに限定されない。
【００３７】
本明細書において「校正機能」とは、細胞が受けたＤＮＡ損傷および／または誤りを検知し補修する機能をいう。そのような機能は、脱プリン、脱ピリミジンがある場合はそのまま塩基が挿入されることによるか、あるいは、Ａ−Ｐエンドヌクレアーゼ（ａｐｕｒｉｎｉｃ−ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）で一本鎖切断が入れられたのち５’→３’エキソヌクレアーゼで除去されることによって達成され得る。除去部分は、ＤＮＡポリメラーゼでＤＮＡ合成され補充され、正常ＤＮＡとの連結はＤＮＡリガーゼが行う。このような反応は、除去修復といわれる。アルキル化剤による化学修飾，異常塩基，放射線，紫外線などによるＤＮＡ塩基傷害などは傷害部分をＤＮＡグリコシダーゼで取り除かれた上で上記の反応で修復される（不定期ＤＮＡ合成）。そのような校正機能を有するＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、真核生物におけるＤＮＡポリメラーゼδ、ＤＮＡポリメラーゼεなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、校正機能の程度を表すために、忠実度という用語もまた用いられ得る。この忠実度との用語は、ＤＮＡ複製の正確さを意味する。正常なＤＮＡポリメラーゼは、通常、忠実度が高いＤＮＡポリメラーゼであり、改変により校正機能が低下したＤＮＡポリメラーゼは、忠実度が低いＤＮＡポリメラーゼであり得る。
【００３８】
このようなＤＮＡポリメラーゼの校正機能については、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．：Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，１２８６６−１２８７４（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｓａｂｏｔｉｎｏ，Ｒ．Ｄ．＆  Ｂａｍｂａｒａ，Ｒ．Ａ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，４８６５−４８６９（１９８７）；Ｗｕ，Ｃ．Ｉ．＆  Ｍａｅｄａ，Ｎ．：Ｎａｔｕｒｅ，３２７，１６７−１７０（１９８７）；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．Ｄ．＆  Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａｌ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，７０６４−７０６８（１９８８）；Ｔｈｏｍａｓ，Ｄ．Ｃ．，Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｍ．Ｐ．＆  Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．：Ｂａｓｉｃ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，５２，２８７−２９７（１９９０）；Ｔｒｉｎｈ，Ｔ．Ｑ．＆  Ｓｉｄｅｎ，Ｒ．Ｒ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，５４４−５４７（１９９１）；Ｗｅｓｔｏｎ−Ｈａｆｅｒ，Ｋ．，＆  Ｂｅｒｇ，Ｄ．Ｅ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２７，６４９−６５５（１９９１）；Ｖｅａｕｔｅ，Ｘ．＆  Ｆｕｃｈｓ，Ｒ．ｐ．ｐ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１，５９８−６００（１９９３）；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｉｚｕｔａ，Ｓ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｄ．Ｃ．＆  Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．：Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２６９，１７１１−１７１７（１９９４）；Ｒｏｃｈｅ，Ｗ．Ａ．，Ｔｒｉｎｈ，Ｔ．Ｑ．＆  Ｓｉｄｅｎ，Ｒ．Ｒ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７，４３８５−４３９１（１９９５）；Ｋａｎｇ，Ｓ．，Ｊａｗｏｒｓｋｉ，Ａ．，Ｏｈｓｈｉｒｎａ，Ｋ．＆  Ｗｅｌｌｓ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１０，２１３−２１８（１９９５）；Ｆｉｊａｌｋｏｗｓｋａ，Ｉ．Ｊ．，Ｊｏｎｃｚｙｋ，Ｐ．，Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋａ−Ｔｋａｃｚｙｋ，Ｍ．，Ｂｉａｌｏｓｋｏｒｓｋａ，Ｍ．＆  Ｓｃｈａａｐｅｒ，Ｒ．Ｍ．Ｐｒｏｃ．ＮａｔＪ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９５，１００２０−１００２５（１９９８）；Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋａ−Ｔｋａｃｚｙｋ，Ｍ．，Ｊｏｎｅｚｙｋ，Ｐ．，Ｂｉａｌｏｓｋｏｒｓｋａ，Ｍ．，Ｓｃｈａａｐｅｒ，Ｍ．＆  Ｆｉｊａｌｋｏｗｓｋａ，Ｉ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，１２６７８−  １２６８３（２０００）；Ｇｗｅｌ，Ｄ．，Ｊｏｎｅｚｙｋ，Ｐ．，Ｂｉａｌｏｓｋｏｒｓｋａ，Ｍ．，Ｓｃｈａａｐｅｒ，Ｒ．Ｍ．＆  Ｆｉｊａｌｋｏｗｓｋａ，Ｉ．Ｊ．：Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５０１，１２９−１３６（２００２）．Ｎｅｇａｔｉｖｅ；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｄ．Ｃ．＆  Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．：Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ］．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，３４６５−３４６９（１９９１）；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｄ．＆  Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；３２，４０８３−４０８９（１９９３）；Ｆｒａｎｃｉｎｏ，Ｍ．Ｐ．，Ｃｈａｃ，Ｌ．，Ｒｉｌｅｙ，Ｍ．Ａ．＆  Ｏｃｈｍａｎ，Ｈ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２，１０７−１０９（１９９６）；Ａ  Ｂｏｕｌｅｔ，Ｍ．Ｓｉｍｏｎ，Ｇ．Ｆａｙｅ，ＧＡ  Ｂａｕｅｒ  ＆  ＰＭ  Ｂｕｒｇｅｒｓ．ＥＭＢＯ  Ｊ，８，１８４９−１８５４，（１９８９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  Ａ，Ａｒａ��ｉ  Ｈ，Ｃｌａｒｋ  ＡＢ，Ｈａｍａｔａｋｅ  ＲＫ，＆  Ｓｕｇｉｎｏ  Ａ．Ｃｅｌｌ，６２（６），１１４３−１１５１，（１９９０）などを参照のこと。
【００３９】
本明細書において「ＤＮＡポリメラーゼδ」とは、真核生物のものをさす場合、ＤＮＡの伸長に関与する酵素であって、エキソヌクレアーゼ活性をもち、これに起因して校正機能を有するといわれる。このＤＮＡポリメラーゼδの校正機能の調節は、上記の校正機能に関連するアミノ酸配列に改変を導入することによって達成することができる。代表的なＤＮＡポリメラーゼδは、核酸配列およびアミノ酸配列として、ｐｏｌδ：Ｘ６１９２０  ｇｉ／１７１４１１／ｇｂ／Ｍ６１７１０．１／ＹＳＣＤＰＢ２［１７１４１１］に記載されている配列を有する。ＤＮＡポリメラーゼδは、Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０，２１６３−２１７０，１９９１に記載されており、その内容は本明細書において参考として援用される。
【００４０】
本明細書において「ＤＮＡポリメラーゼε」とは、真核生物のものをさす場合、ラギング鎖のすき間の複製に関与する酵素であって、エキソヌクレアーゼ活性をもち、これに起因して校正機能を有するといわれる。代表的なＤＮＡポリメラーゼεは、核酸配列およびアミノ酸配列として、ｐｏｌε：Ｍ６０４１６  ｇｉ／１７１４０８／ｇｂ／Ｍ６０４１６．１／ＹＳＣＤＮＡＰＯＬ［１７１４０８］に記載されている配列を有する。
【００４１】
ＤＮＡポリメラーゼδおよびεの分類は、ＨＵＧＯ分類によると別名はデルタがＰＯＬＤ１／ＰＯＬ３，イプシロンがＰＯＬＥ／ＰＯＬ２となっており、本明細書では、どの命名法をも用い得る。
【００４２】
その他ＤＮＡポリメラーゼの説明については、例えば、Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｃ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２２，１−２１，１９７８、Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｃ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ９２，３９７−４０８、Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｃ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．ＭＧＧ，１９５，４８７−４９０，１９８４、Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｃ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．ＭＧＧ．２００，８６−９１，１９８５（ＤＮＡポリメラーゼβおよびＤＮＡポリメラーゼζ）；Ｍａｈｅｒ  Ｖ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２６１，５９３−５９５，１９７６、ＭｃＧｒｅｇｏｒ，Ｗ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９，１４７−１５４、１９９９（ＤＮＡポリメラーゼη）；Ｓｔｒａｎｄ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６５，２７５−２７６，１９９３、Ｐｒｏｌｌａ  Ｔ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５，４０７−４１５，１９９４、Ｋａｔ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，６４２４−６４２８、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ  Ｎ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，６３１９−６３２３，１９９４、Ｆａｂｅｒ  Ｆ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．３，２５３−２５６，１９９４、Ｅｓｈｌｅｍａｎ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １０，３３−３７，１９９５、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，９４７３−９４７７，１９９１、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２，１４６７−１４７３，１９９３、Ｆｏｕｒｙ  Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１１，２７１７−２７２６，１９９２（ＤＮＡポリメラーゼλ、ＤＮＡポリメラーゼμなど）などに記載されており、その内容は本明細書において参考として援用される。
【００４３】
本明細書においてＤＮＡポリメラーゼなどの遺伝子および酵母などの生物の「野生型」は、もっとも広汎な定義では、天然に存在するＤＮＡポリメラーゼなどの遺伝子および酵母などの生物を含み、通常、天然に存在するＤＮＡポリメラーゼなどの遺伝子および酵母などの生物のうち、由来となる生物種においてもっとも広汎に存在するものをいう。従って、通常、ある種において最初に同定されるＤＮＡポリメラーゼなどの遺伝子および酵母などの生物の種は野生型といえる。野生型はまた、「天然標準型」ともいう。生物であれば、野生型は、酵素活性が正常であり得、形質が正常であり得、行動が正常であり得、生理が正常であり得、繁殖が正常であり得、ゲノムが正常であり得る。
【００４４】
本明細書において校正機能が「野生型のものよりも低い」とは、ある校正機能を有する酵素などについて言及するとき、その酵素の野生型よりも校正機能が低いこと（すなわち、その酵素での校正処理の後に残留する変異の数が野生型による校正処理の後に残留する変異の数よりも多いこと）をいう。そのような野生型との比較は、相対的または絶対的な表示によって行うことができる。そのような比較はまた、エラープローン頻度などによって行うことができる。
【００４５】
本明細書において「変異」とは、遺伝子について言及するとき、その遺伝子の配列の変化を生じることまたはその変化によって生じた遺伝子の（核酸またはアミノ酸）配列の状態をいう。本明細書では、例えば、変異は、校正機能について生じる遺伝子配列の変化について用いられる。本明細書では、特に言及しない場合は、変異は、改変と同義で用いられる。
【００４６】
有用な変異体を作製するためには、生物において変異誘発を行うことがもっとも一般的である。変異とは、通常、遺伝子をコードする塩基配列の変化をいい、ＤＮＡ配列の変化が包含される。変異は、それが発生した個体に与える影響により、大きく次の３種類に分けられる：Ａ）中立変異（ｎｅｕｔｒａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）：この変異は、ほとんどの変異が該当し、生物の成育および代謝にほとんど影響がない。Ｂ）有害変異（ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）：この変異は、中立変異よりは頻度は少ない。生物の成長または代謝を阻害する。有害変異には、生育に必須な遺伝子を破壊するような致死変異（ｌｅｔｈａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）も含まれる。微生物の場合、種によっても異なるが、通常全変異に占める有害変異の割合は、約１／１０〜１／１００とされている。Ｃ）有益変異（ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）：この変異は、生物の育種に有益な変異である。その発生頻度は中立変異と比較して極めて低い。したがって、有益変異が導入された生物個体を得るためには、大きな生物集団と、長い時間が必要となる。また、生物の育種の十分な効果は、単一の変異だけで現れることはまれであり、複数の有益変異の蓄積が必要であることが多い。従って、本発明は、有機溶媒耐性のみを付与する技術としては初めて提供されたことになる。
【００４７】
本明細書において「成長（または生長）」とは、ある生物について言及するとき、その生物の個体としての量的増大をいう。成長は、具体的には体長（身長）、体重などの計測値の増加で個体の量的増大を認識することができる。個体の量的増大は細胞の増大および細胞数の増加に依存する。
【００４８】
本明細書において「実質的に同じ成長（または生長）」とは、生物について言及するとき、その生物が、比較対象となる生物（例えば、遺伝形質の変換前の生物）と比較して、成長速度がほとんど変化しないことをいう。そのような成長速度がほとんど変化しない範囲には、例えば、通常の成長の統計分布における１偏差分以内に入ることなどが挙げられるがそれに限定されない。また、本発明の生物では、例えば、（１）子供の数が変わらない；（２）形態は変化するが、通常の人為的突然変異と違って、障害的ではなく、変異率が極めて高いにも拘わらず、見た目が“美しい”と予想される。（成長とは直接関係しないが、本発明の方法により創出された変異体の特徴だと考えられる）；（３）一度獲得した形質あるいは遺伝型あるいは表現型は後もどりしないなどの効果が得られる。
【００４９】
本明細書において生物の「生産」とは、ある生物について言及するとき、その生物の個体を作り出すことをいう。
【００５０】
本明細書において生物の「再生産」とは、ある生物について言及するとき、親個体から次の世代の新たな個体を作り出すことをいう。再生産には、生殖、繁殖など天然現象によるもの、クローン（核移植）技術などの人工技術などによるものが包含されるがそれらに限定されない。再生産に用いられる技術としては、例えば、植物の場合、１培養細胞から個体ができる；接木、挿し木などが挙げられるがそれらに限定されない。再生産によって生産された生物は、通常、親に由来する遺伝形質を有する。有性生殖によって再生産される生物では、再生産された生物は、通常２つの性にそれぞれ由来する遺伝形質を有する。通常、そのような由来遺伝形質は、２つの性に由来するものをほぼ等しい割合で有する。無性生殖によって再生される生物では、通常再生産された生物は、親に由来する遺伝形質を有する。
【００５１】
本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞）であってもよい。細胞の供給源としては、例えば、単一の細胞培養物であり得、あるいは、正常に成長したトランスジェニック動物の胚、血液、または体組織、または正常に成長した細胞株由来の細胞のような細胞混合物が挙げられるがそれらに限定されない。
【００５２】
本発明において使用される細胞は、どの生物由来の細胞（たとえば、任意の種類の単細胞生物（例えば、細菌、酵母）または多細胞生物（例えば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物）、植物（たとえば、単子葉植物、双子葉植物など）など））でもよい。例えば、脊椎動物（たとえば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）由来の細胞が用いられ、より詳細には、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）由来の細胞が用いられる。１つの実施形態では、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞、特にヒト由来の細胞が用いられるがそれに限定されない。本発明において用いられる細胞は、上記細胞は、幹細胞であってもよく体細胞であってもよい。そのような細胞は、移植目的に使用されるものであってもよい。あるいは、植物細胞としては、好ましくは、顕花植物（単子葉または双子葉）由来の細胞が用いられ、より好ましくは双子葉植物細胞が用いられ、より好ましくはイネ科、ナス科、ウリ科、アブラナ科、セリ科、バラ科、マメ科、ムラサキ科の植物由来の細胞が用いられる。さらに好ましくは、コムギ、トウモロコシ、イネ、オオムギ、ソルガム、タバコ、ピーマン、ナス、メロン、トマト、イチゴ、サツマイモ、アブラナ、キャベツ、ネギ、ブロッコリー、ダイズ、アルファルファ、アマ、ニンジン、キウリ、柑橘類、ハクサイ、レタス、モモ、ジャガイモ、ムラサキ、オウレン、ポプラおよびリンゴ由来の細胞が用いられる。植物細胞は、植物体の一部、器官、組織、培養細胞などであり得る。細胞、組織、器官または個体の形質転換法は、当該分野で周知である。そのような技術は、本発明において引用した文献などに十分記載されている。核酸分子の生物細胞への導入は、一過的であっても恒常的であってもよい。一過性または恒常性の遺伝子導入の技術はそれぞれ当該分野において周知である。本発明において用いられる細胞を分化させて形質転換植物を作出する技術もまた当該分野において周知であり、そのような技術は、本発明において引用した文献などに十分記載されていることが理解される。形質転換植物から種子を得る技術もまた、当該分野において周知であり、そのような技術は、本発明において引用した文献などに記載されている。
【００５３】
本明細書において「単離された」とは、通常の環境において天然に付随する物質が少なくとも低減されていること、好ましくは実質的に含まないことをいう。従って、単離された細胞とは、天然の環境において付随する他の物質（たとえば、他の細胞、タンパク質、核酸など）を実質的に含まない細胞をいう。核酸またはポリペプチドについていう場合、「単離された」とは、たとえば、組換えＤＮＡ技術により作製された場合には細胞物質または培養培地を実質的に含まず、化学合成された場合には前駆体化学物質またはその他の化学物質を実質的に含まない、核酸またはポリペプチドを指す。単離された核酸は、好ましくは、その核酸が由来する生物において天然に該核酸に隣接している（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列（即ち、該核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。
【００５４】
本明細書において、「樹立された」または「確立された」細胞とは、特定の性質（例えば、多分化能）を維持し、かつ、細胞が培養条件下で安定に増殖し続けるようになった状態をいう。
【００５５】
本明細書において「アルカリ性」とは、常温（２５℃）において、ｐＨが７．０より大きい状態をいう。
【００５６】
本明細書において「アルカリ性耐性」とは、アルカリ性に対して耐性を有することをいう。そのような耐性とは、微量のアルカリ性の存在に対して、死滅しないことを少なくとも意味するが、より好ましくは、アルカリ性の条件下で成長することを意味し得る。
【００５７】
本明細書において使用され得る、アルカリ性としては、少なくともｐＨ７．０、好ましくは、少なくともｐＨ７．５、好ましくは、少なくともｐＨ８．０、好ましくは、少なくともｐＨ８．５、好ましくは、少なくともｐＨ９．０、好ましくは、少なくともｐＨ９．５、好ましくは、少なくともｐＨ１０．０、好ましくは、少なくともｐＨ１０．５、好ましくは、ｐＨ１１．０などを挙げることができるがそれらに限定されず、それらの間の数値もまた、境界領域として挙げることができることが理解される。
【００５８】
アルカリ性耐性は以下のようにして決定する：試験するｐＨにおいて試験される生物が生存するかどうかを確認することによって行う。アルカリ耐性度を評価したい微生物を、通常の中性付近の培地で培養し、一晩培養液を準備する。各種ｐHの培地を準備し、一晩培養液を０．１〜１０％（ｖ／ｖ）添加し、一晩培養する。加える菌の体積は目的や菌の種類によって決める。一晩培養後の菌濃度を吸光光度計をもいる方法、寒天プレート法、トリパンブルー染色による生存率測定などで決定する。中性付近の培地を用いた場合と同等の増殖性が認められたｐHの数値（アルカリ性）を、そのpHのアルカリ耐性を持つと評価する。
【００５９】
本発明の方法において、微生物にアルカリ性溶液を加えて選択培養する工程は、寒天培地上に変異処理したアルカリ性溶液感受性微生物を塗布した上にアルカリ性溶液を目的の濃度比率で重層しても良く又は液体培養において変異処理したアルカリ性溶液感受性菌及び目的アルカリ性溶液を一緒に入れて培養しても良い。また、ｐＨ、温度及び通気の割合（通気する場合）等の条件も当業者によって容易に設定され得るが、好ましくは、その微生物が成育する条件が良いことは言うまでもない。
【００６０】
（一般生化学・分子生物学）
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔ  ＥＳ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【００６１】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【００６２】
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。
【００６３】
１つの局面において、本発明は、アルカリ性耐性を有する生物であって、該生物は、該生物の天然型が有する耐性よりも高い耐性を有する、生物を提供する。
【００６４】
１つの実施形態において、本発明において対象となるアルカリ性条件は、少なくともｐＨ７．０、好ましくは、少なくともｐＨ７．５、好ましくは、少なくともｐＨ８．０、好ましくは、少なくともｐＨ８．５、好ましくは、少なくともｐＨ９．０、好ましくは、少なくともｐＨ９．５、好ましくは、ｐＨ９．８、好ましくは、少なくともｐＨ１０．０、好ましくは、少なくともｐＨ１０．５、好ましくは、ｐＨ１１．０などを挙げることができる。
【００６５】
１つの実施形態において、本発明は、アルカリ性に対して耐性を有する生物を提供する。これまで、特に、酵母に関しては、ｐＨ８．０までしか耐性がある生物が存在していなかった。従って、本発明は、従来存在しなかった生物を提供するという顕著な効果を奏する。アルカリ性耐性は、生物によって変動する。従って、本発明は、少なくともｐＨ７．０、好ましくは、少なくともｐＨ７．５、好ましくは、少なくともｐＨ８．０、好ましくは、少なくともｐＨ８．５、好ましくは、少なくともｐＨ９．０、好ましくは、少なくともｐＨ９．５、好ましくは、ｐＨ９．８、好ましくは、少なくともｐＨ１０．０、好ましくは、少なくともｐＨ１０．５、好ましくは、ｐＨ１１．０に対して耐性を有する生物を提供するという意味で顕著な効果を奏する。アルカリ性に対する耐性は、その耐性とすべき環境中に少なくとも１８時間、通常、少なくとも１日間、好ましくは２日間、好ましくは３日間、好ましくは４日間、好ましくは４日間、さらに好ましくは６日間生存している（少なくとも生存率が１０％以上であり、好ましくは少なくとも生存率が２０％である。本発明では、生存率は、通常９０％という高い率が達成できるところもまた顕著であることに留意すべきである。）ことを意味する。培養工程Ｂ）の前に、Ａ’）ｐＨ濃度を培養工程Ａ）から０．１〜０．２ずつｐＨを上げながら前記生物の培養を行ってもよい。各ｐＨにおける培養期間は、１〜２日であることが通常であるが、増殖能を有することが確認できるに十分な期間であれば、１日未満であっても２日以上であってもよい。本発明の方法では、耐性を獲得しつつ、増殖能が保持された生物が提供されることが顕著である。
【００６６】
別の実施形態において、本発明の生物は、任意の微生物であり、さらに好ましくは、真核生物であり、さらにより好ましくは酵母である。別の実施形態では、本発明の生物は、原核生物であり得る。酵母については、ｐＨ８．０でも耐性が獲得できていなかった。
【００６７】
別の局面において、本発明は、乳酸に対する耐性が改善された生物を作製するための方法を提供する。この方法は：Ａ）目的の生物を、該乳酸について、正常状態での最大許容ｐＨの濃度で培養する工程；Ｂ）該目的の生物を、アルカリ性について改善について所望のｐＨで培養する工程；およびＣ）生存する生物を選択し再生産する工程を包含する。このような再生産の方法には、当該分野において公知の技術を応用できることが理解される。一度最大許容ｐＨよりも低いｐＨで培養しておき、その後、所望の最大許容ｐＨより高いｐＨで培養することによって、より効率所望のｐＨで耐性を有する生物を効率よく獲得することができたことに特徴がある。
【００６８】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、Ｄ）生物の遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を調節する工程をさらに包含する。
【００６９】
別の実施形態において、本発明において使用されるエラープローン頻度を調節する工程は、生物のＤＮＡポリメラーゼのエラープローン頻度を調節することを包含することが好ましい。本発明において使用されるＤＮＡポリメラーゼは、真核細胞におけるＤＮＡポリメラーゼα、ＤＮＡポリメラーゼβ、ＤＮＡポリメラーゼγ、ＤＮＡポリメラーゼδおよびＤＮＡポリメラーゼεならびにそれらに対応するＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される少なくとも１つのポリメラーゼを含む。
【００７０】
好ましい実施形態において、本発明において使用されるＤＮＡポリメラーゼは、真核細胞におけるＤＮＡポリメラーゼδおよびＤＮＡポリメラーゼεならびにそれに対応するＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される少なくとも１つのポリメラーゼを包含する。
【００７１】
好ましい実施形態では、本発明において用いられる生物は、真核生物（例えば、動物、植物、真菌または酵母の細胞）であり、より好ましくは酵母である。酵母は、種々の環境因子に対して耐性を獲得しにくいという特徴があり、本発明では、これをアルカリ性に対する耐性獲得という形で従来不可能であった酵母の生産に結び付けたという点で顕著である。
【００７２】
別の実施形態では、本発明において用いられる生物は、分離した細胞の状態で存在する。
【００７３】
好ましい実施形態では、本発明において得られる生物は、所望の形質の変換後も、野生型と実質的に同じ成長を示す。古典的な変異誘発方法では、野生型と実施的に同じ成長を示すものはほとんど取れなかった。従って、本発明は、アルカリ性に対する耐性を持ちながら、かつ、野生型と実施的に同じ成長を呈する（正常型とほぼ同じ）性質を有する生物を提供するという点で従来技術では提供し得なかった生物を提供するという効果を奏する。
【００７４】
別の実施形態では、本発明の方法において用いられる所望のｐＨは、最大許容ｐＨよりも高いｐＨであることが好ましい。最大許容ｐＨは、本発明の方法を実施する直前に実際に測定してもよく、あるいは、文献などから既知の数値を入手して使用してもよい。
【００７５】
別の局面では、本発明は、本発明の方法によって生産された生物に関する。このような生物は、アルカリ性に対する耐性が従来技術にも増して増大しており、従来技術では入手できなかったアルカリ性耐性を有する生物であり得る。
【００７６】
別の局面において、本発明は、生物のアルカリ性耐性能を評価する方法を提供する。この方法は、Ａ）該生物を、該生物が通常生育する条件下で生育させる工程；Ｂ）該アルカリ性存在下または不存在下で該生物を生育させる工程；およびＣ）該生物が死滅する該アルカリ性のｐＨを決定する工程、を包含する。
【００７７】
１つの実施形態において、生物が死滅しているか否かの決定は、その細胞が形を維持している細胞かどうかを判定基準として用いることができる。形を維持しているだけの細胞は、生存しているかどうかが不明であることから、トリパンブルー染色などにより従来はさらなる測定をする必要があったが、本発明において、アルカリ性液中では、形を維持すること自体が生存の重要な指標であることが明らかになった。従って、この形の維持を指標とする評価方法は、従来技術に比して顕著に簡便な判定方法を提供する。
【００７８】
ここで、形を維持しているかどうかの判定は、形を維持している（細胞が生存している）と判断する基準は、きれいな球形で細胞の輪郭が明確な場合である。形を維持できていないと判断する基準は、きれいな球形でなく輪郭が薄くしわがよって、細胞内が薄く透けている場合である。
【００７９】
別の局面において、本発明は、生物の乳酸耐性能を評価する方法を提供する。この方法は、Ａ）該生物を、該生物が通常生育する条件下で生育させる工程；Ｂ）該乳酸存在下または不存在下で該生物を生育させる工程；およびＣ）該生物が死滅する該乳酸の濃度を決定する工程、を包含する。
【００８０】
１つの実施形態において、上記生物が死滅しているか否かの決定は、その細胞が形を維持している細胞かどうかを判定基準として用いてもよい。
【００８１】
別の局面では、本発明はまた、菌学的性質は、アルカリ性耐性以外は野生型と同じである生物を提供する。このような生物は、古典的な変異方法では、入手不可能であった。大腸菌については、アルカリ耐性の報告は無く、酵母は通常ｐＨ8.0ぐらいまで生存が可能であるが、それ以上のｐＨでの生存（特に増殖を伴う）のは難しかった。放線菌についてもアルカリ耐性の情報は皆無である。従って、真核生物（例えば、酵母）において高いｐＨでも生存し、増殖する生物を提供することができるということは、顕著であり特筆に値するというべきである。生物を単純に連続的にｐＨをすこしずつ上げた培地で２０日間ぐらい培養するだけで、所望のアルカリ耐性酵母を得ている。アルカリ耐性のメカニズムを調べることもなく、また、一般的なスクリーニングも全くすることなく、アルカリ耐性株を樹立できたことは、発明として大きな価値がある。
【００８２】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【００８３】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００８４】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。以下の実施例において用いられる試薬類、例外を除き、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ、和光純薬（大阪、日本）などから市販されるものを用いた。以下において使用した動物は、日本の大学において規定される飼育規準を遵守して飼育および実験した。以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
【００８５】
（実施例１：酵母株の至適ｐＨの測定）
（酵母株と試薬）
大阪市立大学の下田らから供与された変異型ｐｏｌ−３遺伝子発現株（ＢＹＤ５、以下ｐｏｌ−３変異株と略す。ＢＹＤ５は、受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１３１（寄託日平成１７年８月１９日）として〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センターに寄託済みである）と野生型ｐｏｌ−３遺伝子発現株（ＡＭＹ５２−３Ｄ、以下、野生株と略す。ＡＭＹ５２−３Ｄは、受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９（寄託日平成１７年８月１９日）として〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センターに寄託済みである。）を用いた。ＢＹＤ５の遺伝子型は、〔ｐｏｌ３−０１／ｐｏｌ３−０１、ＭＡＴａ／ＭＡＴα、ｌｙｓ１−１／ｌｙｓ１−１〕であり、ＡＭＹ５２−３Ｄの遺伝子型は、〔ＭＡＴα、ｕｒａ３−５２、ｌｅｕ２−１、ｌｙｓ１−１、ａｄｅ２−１、ｈｉｓ１−７、ｈｏｍ３−１０、ｔｒｐ１−２８９、ｃａｎＲ〕である。試験に用いた液体培地のＹＰＤ  ｍｅｄｉｕｍ（ｃａｔ．＃６３０４０９）および寒天培地のＹＰＤ  ａｇａｒ  ｍｅｄｉｕｍ（ｃａｔ．＃６３０４１０）はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入し、オートクレーブ（１２０℃、１５分）により滅菌した。培地のｐＨ調整は塩酸（ｃａｔ．＃０８３−０３４３５／和光純薬）および水酸化ナトリウム（ｃａｔ．＃１９５−０２１２５／和光純薬）を使用し、ｐＨ調整後０．４５μｍの滅菌フィルター（ｃａｔ．＃  ２５ＣＳ０４５ＡＳ／ＡＤＶＡＮＴＥＣ）で濾過滅菌して使用した。
【００８６】
（方法）
（１）ｐｏｌ−３変異株と野生株を寒天培地プレートに展開してコロニーを形成させ、このコロニーを白金耳でかきとり、ＹＰＤ培地４ｍＬを含む直径１８ｍｍの試験管に植菌した。これらを３０℃、１８０ｒｐｍで一晩（１６時間以上）振とう培養した。
【００８７】
（２）それぞれの培養液から一部をとり、血球計算盤を用いて１ｍＬあたりの細胞数、すなわち、細胞密度（単位：ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を測定した。
【００８８】
（３）ｐＨを７段階に調整した液体培地（ｐＨ  ４．０、ｐＨ  ５．０、ｐＨ  ６．０、ｐＨ  ７．０、ｐＨ  ８．０、ｐＨ  ９．０、ｐＨ  １０．０）を試験管に４ｍＬとり、ｐｏｌ−３変異株および野生株を約２．０×１０５（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）となるように植菌した。これらを３０℃、１８０  ｒｐｍで振とう培養した。
【００８９】
（４）１４時間および３８時間培養した後、それぞれの培養液から一部をとり、血球計算盤を用いて細胞密度を測定することによってｐＨによる細胞増殖への影響を比較した。
【００９０】
（結果）
ｐＨの異なる培地で１４時間（表１・図１）、３８時間（表２）培養したときの野性株およびｐｏｌ−３変異株の細胞密度を以下に記す。
【００９１】
（１）１４時間培養では、野生株およびｐｏｌ−３変異株ともにｐＨ  ４．０からｐＨ  ７．０で良好な増殖を示し、ｐＨによる増殖阻害は認められなかった（表１・図１）。
【００９２】
（２）ｐＨ  ８．０においてはｐＨ  ４．０〜ｐＨ  ７．０に比べて両株ともに細胞の増殖は抑えられ、ｐＨ  ９．０およびｐＨ  １０．０では細胞増殖は認められなかった（表１・図１）。
【００９３】
（３）両株のｐＨ  ８．０における細胞増殖は３８時間培養でほぼ飽和に達したが、ｐＨ  ９．０における細胞増殖は認められなかった（表２）。
【００９４】
以上の結果、野生株およびｐｏｌ−３変異株の至適ｐＨはｐＨ  ４．０〜ｐＨ  ８．０であることが分かり、ｐＨ  ９．０を超えると増殖できないことが判明した。
表１  各ｐＨにおける野生株およびｐｏｌ−３変異株の細胞増殖比較（１４時間後）
【００９５】
【表１】
2007061025.tif 000002
表２  ３８時間後のｐＨ  ８．０およびｐＨ  ９．０培地における細胞増殖の比較
【００９６】
【表２】
2007061025.tif 000003
（実施例２：アルカリ耐性酵母の作製方法）
ｐｏｌ−３変異株にアルカリ耐性を付与した方法を以下に記す。
【００９７】
（使用した酵母株）
実施例１に同じく、野生株およびｐｏｌ−３変異株（ＢＹＤ５）を使用した。
【００９８】
（方法）
（１）ｐｏｌ−３変異株のコロニーをかきとり、ｐＨ未調整ＹＰＤ培地４ｍＬ  を入れた試験管（直径１８ｍｍ）に植菌し、３０℃、１８０  ｒｐｍで一晩前培養した。
【００９９】
（２）ｐＨ  ８．０に調整したＹＰＤ培地４ｍＬを入れた試験管に培養液０．１ｍＬを移植し、３０℃、１８０  ｒｐｍで２日間培養した。細胞の増殖評価は、培養液の濁り具合や顕微鏡観察により判断した。
【０１００】
（３）ｐＨ  ８．２に調整した培地４ｍＬを入れた試験管にｐＨ  ８．０培養液０．１ｍＬを移植し、３０℃、１８０  ｒｐｍで一晩培養した。
【０１０１】
（４）ｐＨ  ８．５に調整した培地４ｍＬを入れた試験管にｐＨ  ８．２培養液０．２ｍＬを移植し、３０℃、１８０  ｒｐｍで一晩培養した。
【０１０２】
（５）ｐＨ  ９．０に調整した培地４ｍＬを入れた試験管にｐＨ  ８．５培養液０．２ｍＬを移植し、３０℃、１８０  ｒｐｍで２日間培養した。
【０１０３】
（６）ｐＨ  ９．２に調整した培地４ｍＬを入れた試験管にｐＨ  ９．０培養液０．２ｍＬを移植し、３０℃、１８０  ｒｐｍで２日間培養した。
【０１０４】
（７）ｐＨ  ９．３に調整した培地４ｍＬを入れた試験管にｐＨ  ９．２培養液０．２ｍＬを移植し、３０℃、１８０  ｒｐｍで２日間培養した。
【０１０５】
（８）ｐＨ  ９．４に調整した培地４ｍＬを入れた試験管にｐＨ  ９．３培養液０．２ｍＬを移植し、３０℃、１８０  ｒｐｍで一晩培養した。
【０１０６】
（９）ｐＨ  ９．５に調整した培地１０ｍＬを入れた５０ｍＬ容コニカルチューブ（ＢＤファルコン  ｃａｔ．＃３５２０７０）にｐＨ  ９．４培養液１．０ｍＬを移植し、３０℃、１８０  ｒｐｍで２日間培養した。
【０１０７】
（１０）ｐＨ  ９．６に調整した培地１０ｍＬを入れた５０ｍＬ容コニカルチューブにｐＨ  ９．５培養液１．０ｍＬを移植し、３０℃、１８０  ｒｐｍで２日間培養した。
【０１０８】
（１１）ｐＨ  ９．７に調整した培地１０ｍＬを入れた５０ｍＬ容コニカルチューブにｐＨ  ９．６培養液１．０ｍＬを移植し、３０℃、１８０  ｒｐｍで２日間培養した。
【０１０９】
（１２）ｐＨ  ９．７培養液中の細胞を５０００ｘｇで３分間遠心して全て回収した。これらの細胞をｐＨ  ９．８に調整した培地７０ｍＬを入れた２００ｍＬ容振とうフラスコ（ｃａｔ．＃  ４０７０ＦＫ  ２００／ＩＷＡＫＩ）に移植し、３０℃、１８０  ｒｐｍで２日間培養した。
【０１１０】
（１３）ｐＨ  ９．８培養液から全量の１／５量をとり、５０００ｘｇで３分間遠心して細胞を回収した。これらの細胞をｐＨ  ９．８に調整した培地７０ｍＬに再懸濁し、２００ｍＬ容振とうフラスコを用いて３０℃、１８０  ｒｐｍで培養した。
【０１１１】
（１４）前ｐＨ  ９．８培養液から全量の１／１０量とり、５０００ｘｇで３分間遠心して細胞を回収した。これらの細胞をｐＨ  ９．８に調整した培地７０ｍＬに再懸濁し、２００ｍＬ容振とうフラスコを用いて３０℃、１８０  ｒｐｍで培養した。
【０１１２】
（１５）（１４）の操作を毎日繰り返すことにより、ｐｏｌ−３変異株の増殖を継代培養し、細胞の増殖を安定化させた。
【０１１３】
（結果）
（１）ｐｏｌ−３変異株を徐々にアルカリ性に馴化させた結果、ｐＨ  ９．８条件下においても細胞の増殖が認められるようになった。
【０１１４】
（２）ｐＨ  ９．８培地における１回目の継代培養では、細胞が１日で約７倍、２回目の継代培養では約１２．３倍となり、速やかに増殖できることが判明した。
【０１１５】
（３）ｐＨ  １０．０以上の培地への馴化を試みたが、細胞増殖は認められなかった。
【０１１６】
（４）ｐｏｌ−３変異株の増殖可能な培地のｐＨがｐＨ  ８．０からｐＨ  ９．８まで向上した。
【０１１７】
以上の結果、本方法によりｐＨ  ９．８培地で速やかに増殖できるアルカリ耐性株を獲得した。
表３  アルカリ耐性株のｐＨ  ９．８培地による継代培養
【０１１８】
【表３】
2007061025.tif 000004
本実施例で得られた株の代表例は、〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１２１（寄託日：平成１７年７月２９日；アルカリ耐性（ＢＹＤ５−ＰＨ９８）  ｐＨ９．８のＹＰＤ培地中で増殖可能）として寄託済みである。
【０１１９】
（実施例３：アルカリ耐性酵母の培養特性）
作製したアルカリ耐性株の培養特性を検証した方法を以下に記す。
【０１２０】
（使用した酵母株）
実施例１に記した野生株および実施例２に記したｐＨ９．８培地で増殖できるｐｏｌ−３変異株（以下、アルカリ耐性株と記す）。
【０１２１】
（方法）
作製したアルカリ耐性株は７０ｍＬのｐＨ  ９．８培地を入れた２００ｍＬ容振とうフラスコを用いて３０℃、１８０  ｒｐｍで培養しており、全培養液の１／１０量の細胞を継代している。
【０１２２】
（１）野生株のコロニーをかきとり、４ｍＬ  のｐＨ未調整培地を入れた試験管（直径１８ｍｍ）に植菌し、３０℃、１８０  ｒｐｍで一晩前培養した。
【０１２３】
（２）ｐＨ未調整培地７０ｍＬを入れた２００ｍＬ容振とうフラスコに前培養液１ｍＬを移植し、３０℃、１８０  ｒｐｍで一晩前培養した。
【０１２４】
（３）培養した野生株およびｐＨ  ９．８培地で継代しているアルカリ耐性株の培養液１０ｍＬを１５ｍＬ容遠沈管（ｃａｔ．＃４３０７９１／コーニング）にとり、５０００ｘｇで３分間遠心して細胞を回収した。これらの細胞をｐＨ未調整の培地に再懸濁し、血球計算盤を用いて細胞密度を測定した。
【０１２５】
（４）計測した細胞密度をもとに、両株の全細胞数が等しくなるように１５ｍＬ容遠沈管にとり、１０００ｘｇで３分間遠心して細胞を回収した。
【０１２６】
（５）回収した細胞をｐＨ  ９．８に調整した培地７０ｍＬに懸濁して細胞密度を約２．０×１０７  ｃｅｌｌ／ｍＬとした。これらを３０℃、１８０ｒｐｍで振とう培養し、２４時間後および４８時間後の細胞密度を測定した。これらの培養は２００ｍＬ容振とうフラスコを使用した。
【０１２７】
（結果）
野生株およびアルカリ耐性株をｐＨ  ９．８培地で培養したときの細胞の増殖の比較（図３）および細胞密度（表４・図４）を以下に記した。
【０１２８】
（１）ｐＨ  ９．８培養の結果、アルカリ耐性株は野生株に比べて速やかに増殖していることが分かった（図３）。
【０１２９】
（２）野生株の細胞密度は培養を通して低下したことから、ｐＨ  ９．８培養では増殖できいことが判明した（表４）。
【０１３０】
（３）アルカリ耐性株は培養後速やかに増殖し、２４時間で飽和に達した。また、このときの細胞密度は培養開始直後の約８倍であった（表４）。
【０１３１】
以上の結果、本方法によって作製した株は、野生株に比べて高いアルカリ耐性を獲得していることが明らかになった。
【０１３２】
表４  ｐＨ  ９．８培養における野生株およびアルカリ耐性株の増殖比較
【０１３３】
【表４】
2007061025.tif 000005
本実施例で得られた株の代表例は、〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１２１（寄託日：平成１７年７月２９日；アルカリ耐性(BYD5-PH98)  ｐＨ９．８のＹＰＤ培地中で増殖可能）として寄託済みである。
【０１３４】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１３５】
産業応用されている酵素の約半数は、アルカリ条件下で触媒活性を示すものである。本発明のアルカリ耐性微生物は、アルカリ条件下で各種酵素反応であるバイオプロセスを実施させるための宿主として利用する。
【０１３６】
工業的な利用としては、例えば、モノカルボン酸の製造、Ｘ線フィルムのゼラチン分解による銀回収の効率化、キシラナーゼによるパルプ漂白の効率化などがある。
【０１３７】
また、食品分野では、ｐＨ９以上の高アルカリ条件下での発酵をおこなう新食品加工技術への応用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】図１は、各ｐＨにおける野生株およびｐｏｌ−３変異株の細胞増殖比較（１４時間後）である。
【図２】図２は、アルカリ耐性株のｐＨ  ９．８培地による継代培養である。
【図３】図３は、ｐＨ  ９．８培養における野生株およびアルカリ耐性株の増殖比較（４８時間後）である。
【図４】図４は、ｐＨ  ９．８培養における野生株およびアルカリ耐性株の増殖比較である。
【配列表フリーテキスト】
【０１３９】
（配列表の説明）
配列番号１は、酵母のポリメラーゼＰｏｌ  ＩＩＩの：３１７−３２８位アミノ酸情報（ＩＭＳＦＤＩＥＣＡＧＲＩ）を示す。
【０１４０】
配列番号２は、酵母のポリメラーゼＰｏｌ  ＩＩ：２８６−２９７位アミノ酸情報（ＶＭＡＦＤＩＥＴＴＫＰＰ）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図３】
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【配列表】
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