(57)【要約】      （修正有）【課題】効率の良い栄養源、特に窒素の取り込み機能を有する作物の開発に有用であり、ファイトレメディエーションにも有用である、新たな遺伝子プロモーター、および該プロモーターを用いた、植物育成の制御方法の提供。【解決手段】イネにおいてプロモーター活性を有するOsAMT1;2プロモーターおよびOsAMT1;3プロモーター。該プロモーターおよび該プロモーターの下流にあるレポーター遺伝子を含むキメラ遺伝子。該キメラ遺伝子を含む形質転換植物。該キメラ遺伝子を含む形質転換植物をアンモニウムイオンの存在下または不存在下で育成し、レポーター遺伝子の発現を制御した形質転換植物の育成方法。該キメラ遺伝子を含む形質転換植物をアンモニウムイオンの存在下または不存在下で育成し、レポーター遺伝子の発現を制御した形質転換植物の育成方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(1)配列表の配列番号1で示されるDNA、
(2)配列番号１の塩基配列における9位から4031位までのDNA、または
(3)配列番号1の塩基配列または配列番号１の塩基配列において9位から4031位までの塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつイネにおいてプロモーター活性を有するDNA
からなるOsAMT1;2プロモーター。
【請求項２】
(1)配列表の配列番号2で示されるDNA、
(2)配列番号2の塩基配列における9位から4126位までのDNAまたは
(3)配列番号2の塩基配列または配列番号２の塩基配列における9位から4126位までの塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつイネにおいてプロモーター活性を有するDNA
からなるOsAMT1;3プロモーター。
【請求項３】
請求項１に記載のプロモーターおよびこのプロモーターの下流にあるレポーター遺伝子を含むキメラ遺伝子。
【請求項４】
レポーター遺伝子が、栄養素輸送体遺伝子または汚染物質輸送遺伝子である請求項３に記載のキメラ遺伝子。
【請求項５】
請求項２に記載のプロモーターおよびこのプロモーターの下流にあるレポーターを含むキメラ遺伝子。
【請求項６】
レポーター遺伝子が、栄養素輸送体遺伝子または汚染物質輸送遺伝子である請求項５に記載のキメラ遺伝子。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれか１項に記載のキメラ遺伝子を含む形質転換植物。
【請求項８】
植物がイネである請求項７に記載の形質転換植物。
【請求項９】
請求項３または４に記載のキメラ遺伝子を含む形質転換植物をアンモニウムイオンの存在下または不存在下で育成し、レポーター遺伝子を発現させた、または発現させない状態にすることを含む、レポーター遺伝子の発現を制御した形質転換植物の育成方法。
【請求項１０】
請求項５または６に記載のキメラ遺伝子を含む形質転換植物をアンモニウムイオンの存在下または不存在下で育成し、レポーター遺伝子を発現させない、または発現させた状態にすることを含む、レポーター遺伝子の発現を制御した形質転換植物の育成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イネの根特異的プロモーターおよびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球規模での人口の増加に伴い、食料の増産の必要性が言われてきている。国連では国際コメ年などを設けて稲作などの作物の増産を推進してきている。作物の作付け面積の拡大と同時に、作物の品種改良や作物の生産性の向上が必要とされてきている。現代では、農業技術の発達によって作物生産性が急激に上昇してきており、その一端を担っているものに化学肥料の進歩があげられる。その反面，過剰な施肥が土壌環境・地球環境を悪化させてきたことは否定しがたい事実である。今日、人類総人口の爆発的増加、地球環境の悪化が深刻と指摘される状況下で、今後の育種日標として、環境汚染を伴わずに持続的かつ限られた農地で高い生産効率を維持した作物の生産が重要であるとされている。そのため現代の農業が目指すべき理想の姿は、低施肥条件下でも高い効率を維持した持続的な作物生産であると考えられることから、効率の良い栄養源、特に窒素の取り込み機能を有する作物の開発が重要な課題となっている。
【０００３】
そこで、本発明者らは、効率の良い栄養源、特に窒素の取り込み機能を有する作物の開発を目的として、種々の検討をしてきた。その結果、イネの根に特異的に発現するアンモニウムトランスポーター遺伝子を見いだし、この遺伝子の発現を制御することで、窒素の取り込み機能を強化した作物の開発を目指している。(非特許文献1および2)
【０００４】
また、近年、人間活動の急激な増加に伴って、窒素・リンなど栄養塩類の湖沼・河川あるいは閉鎖性水域などへの負荷量が増加し、藻類や植物プランクトンなどが大量発生することによる湖水の有機汚濁化、いわゆる富栄養化が顕在化している。さらには、カドミウムなどに代表される汚染物質（重金属、有機塩素系残留農薬、放射性同位元素および環境ホルモン）による土壌汚染が大きな社会問題となっている。従来、これらの汚染物質は高価で特殊技術を要する物理的あるいは化学的な手法によって除去されてきた。しかし、近年これらの汚染環境の浄化や修復に植物が秘める能力を利用するファイトレメディエーション（phytoremediation）が脚光を浴びつつある。
【０００５】
植物を用いた環境汚染のレメディエーションのメリットとして、
１）エネルギーの投与が少なく低コストである、
２）生態系に与える影響が少なく、環境にやさしく持続的な環境浄化・修復が可能である、
３）気圏・水圏・地圏の幅広い環境に応用が可能である、
４）除去する汚染物質も幅広い適用が可能である、
などがあげられる。(非特許文献3〜7)
【非特許文献１】Sonoda, Y., Ikeda, A., Saiki, S., Von Wiren, N., Yamaya, T. and Yamaguchi J. (2003) Distinct expression and function of three ammonium transporter genes (OsAMT1;1-1;3) in rice. Plant and Cell Physiol. Vol. 44, pp. 726-734.
【非特許文献２】Sonoda, Y., Ikeda, A., Saiki, S., Yamaya, T. and Yamaguchi, J. (2003) Feedback regulation of the ammonium transporter genefamily AMT1 by glutamine in rice. Plant and Cell Physiol. Vol. 44, pp. 1396-1402.
【非特許文献３】Eapen S, D'Souza SF. (2005) Prospects of genetic engineering of plants for phytoremediation of toxic metals. Biotechnol Adv. vol.23, pp. 97-114
【非特許文献４】Suresh B, Ravishankar GA. (2004) Phytoremediation-a novel and promising approach for environmental clean-up. Crit. Rev. Biotechnol. vol.24, pp. 97-124
【非特許文献５】Salt DE, Smith RD, Raskin I. (1998) PHYTOREMEDIATION. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. vol.49, p643-668.
【非特許文献６】今中忠行 他、（2000）植物による環境負荷低減技術：ファイトレメディエーション、エヌ・ティー・エス
【非特許文献７】S. フィオレンツァ 他（2001）ファイトレメディエーション：植物による土壌汚染の修復、シュプリンガー・フェアラーク
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
効率の良い栄養源、特に窒素の取り込み機能を有する作物の開発のためには、アンモニウムトランスポーター遺伝子のみでは不十分であり、導入した目的遺伝子の発現を制御できる機構が必要である。目的遺伝子の発現を制御できる機構としては、遺伝子プロモーターが挙げられ、例えば、コウジカビの一種であるアスペルギルス・ニドランス(Aspergillus nidulans)から得られるアルコールデヒドロゲナーゼI遺伝子のプロモーターアルデヒドalcRは、低濃度のエタノール処理によって、一過的に目的遺伝子の発現を誘導する。しかし、一般の植物にこのような機構(遺伝子プロモーター)は知られていない。
【０００７】
また、ファイトレメディエーションについては、以下のようなデメリットがあることが知られている。
１）その効果を植物の生長に依存しているため、実質的な成果が得られるまでに時間がかかる。
２）植物のレメディエーション作用の研究がまだ発展途上であり、実用化のためには基礎研究の充実が必要である。
【０００８】
ファイトレメディエーションにも、目的遺伝子の発現誘導を制御できる機構が有用であるが、上述のように、そのような機構(遺伝子プロモーター)は知られていない。
【０００９】
そこで本発明の目的は、効率の良い栄養源、特に窒素の取り込み機能を有する作物の開発に有用であり、また、ファイトレメディエーションにも有用である、新たな遺伝子プロモーターの提供にある。
【００１０】
さらに本発明の目的は、上記新たな遺伝子プロモーターを用いた、植物育成の制御方法の提供にある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、以下の通りである。
[請求項１]
(1)配列表の配列番号1で示されるDNA、
(2)配列番号１の塩基配列における9位から4031位までのDNA、または
(3)配列番号1の塩基配列または配列番号１の塩基配列において9位から4031位までの塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつイネにおいてプロモーター活性を有するDNA
からなるOsAMT1;2プロモーター。
[請求項２]
(1)配列表の配列番号2で示されるDNA、
(2)配列番号２の塩基配列における9位から4126位までのDNAまたは
(3)配列番号2の塩基配列または配列番号２の塩基配列における9位から4126位までの塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつイネにおいてプロモーター活性を有するDNA
からなるOsAMT1;3プロモーター。
[請求項３]
請求項１に記載のプロモーターおよびこのプロモーターの下流にあるレポーター遺伝子を含むキメラ遺伝子。
[請求項４]
レポーター遺伝子が、栄養素輸送体遺伝子または汚染物質輸送遺伝子である請求項３に記載のキメラ遺伝子。
[請求項５]
請求項２に記載のプロモーターおよびこのプロモーターの下流にあるレポーターを含むキメラ遺伝子。
[請求項６]
レポーター遺伝子が、栄養素輸送体遺伝子または汚染物質輸送遺伝子である請求項５に記載のキメラ遺伝子。
[請求項７]
請求項３〜６のいずれか１項に記載のキメラ遺伝子を含む形質転換植物。
[請求項８]
植物がイネである請求項７に記載の形質転換植物。
[請求項９]
請求項３または４に記載のキメラ遺伝子を含む形質転換植物をアンモニウムイオンの存在下または不存在下で育成し、レポーター遺伝子を発現させた、または発現させない状態にすることを含む、レポーター遺伝子の発現を制御した形質転換植物の育成方法。
[請求項１０]
請求項５または６に記載のキメラ遺伝子を含む形質転換植物をアンモニウムイオンの存在下または不存在下で育成し、レポーター遺伝子を発現させない、または発現させた状態にすることを含む、レポーター遺伝子の発現を制御した形質転換植物の育成方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の遺伝子プロモーターは、様々な栄養素輸送体遺伝子を結合した農作物、工芸作物ないし飼料作物を作製することで、その改良作物の養分吸収能を高めることが可能である。このことは土壌への化学肥料の投与量を最小限度に抑えることができ、環境への負担を軽減させうる。加えて本発明の遺伝子プロモーターは、低濃度の窒素添加よって、その機能発現を“オン”にし、窒素を取り除くことで“オフ”にすることができる「遺伝子スイッチ」の機能を有する。すなわち適切な時期に適切な機能を持つ遺伝子の発現が可能となる。
【００１３】
本発明の遺伝子プロモーターは、ファイトレメディエーションの発展の一端を担う可能性を有する。その例として、本発明の遺伝子プロモーターにカドミウム、リン酸などの輸送遺伝子を結合させた改良作物を作製し、近年環境汚染や富栄養化の原因となっている重金属や放射能物質を植物に吸収させ、環境汚染を改良することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
[プロモーター]
本発明のプロモーターの第1の態様は、
(1)配列表の配列番号1で示されるDNA、または
(2)配列番号1の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつイネにおいてプロモーター活性を有するDNA
からなるOsAMT1;2プロモーターである。
【００１５】
本発明のプロモーターの第2の態様は、
(1)配列表の配列番号2で示されるDNA、または
(2)配列番号2の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつイネにおいてプロモーター活性を有するDNA
からなるOsAMT1;3プロモーターである。
【００１６】
イネのゲノムには３種類のＯｓＡＭＴ１遺伝子（OsAMT1；1、1；2、及び1；3）が存在していることが知られている。(非特許文献1および２参照)。
【００１７】
本発明者らは、上記３種類のＯｓＡＭＴ１遺伝子から、プロモーター領域と推定される領域(候補領域)を選択した。そして、それらプロモーター候補領域の下流にレポーター遺伝子としてβ-グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子を融合させたキメラ遺伝子を作製し、これらのキメラ遺伝子を導入した形質転換イネを作成し、これら形質転換イネからGUS活性を検出し、これをプロモーター活性（組織局在性および窒素誘導性）として、各候補領域が、プロモーターとして機能するか否かについて検討した。その結果、配列表の配列番号1で示される約4 kbのDNAからなるOsAMT1;2の遺伝子、および配列表の配列番号2で示される約4 kbのDNAからなるOsAMT1;3の遺伝子が、プロモーターとして機能することを見いだした。
【００１８】
配列番号1で示される約4 kbのDNAからなるOsAMT1;2の遺伝子は、4037塩基からなる。配列番号１の塩基配列において1位〜8位までの塩基配列、および4032位〜4037位までの塩基配列はクローニングに用いた制限酵素部位である。したがって、配列番号１の塩基配列において9位から4031位までのDNAがプロモーター配列である。
【００１９】
配列番号2で示される約4 kbのDNAからなるOsAMT1;3の遺伝子は、4132塩基からなる。配列番号２の塩基配列において1位〜8位までの塩基配列、および4127位〜4132位までの塩基配列はクローニングに用いた制限酵素部位である。したがって、配列番号２の塩基配列において9位から4126位までのDNAがプロモーター配列である。
【００２０】
さらに、実施例に示すように、配列番号1で示される約4 kbのDNAの3'末端側の約2 kbのDNA、および配列番号2で示される約4 kbのDNAの3'末端側の約2 kbのDNAについても、プロモーターとして機能するか否か試験した。その結果、これら約2 kbのDNAは、プロモーターとして機能しなかった。OsAMT1;2の遺伝子およびOsAMT1;3の遺伝子のいずれについても、約4 kb未満で、3'末端側を含む約2 kbを超える配列を有するDNAについて、細かく、プロモーターとして機能するか否かを検討していない。しかし、配列番号1で示される約4 kbのDNAおよび配列番号2で示される約4 kbのDNAの一部の塩基配列を欠失し、あるいは置換したDNAもプロモーターとして機能する蓋然性は高い。特に、5'末端側の約2 kbのDNAの一部の塩基配列を欠失し、あるいは置換したDNAについて、プロモーターとして機能する蓋然性は高い。
【００２１】
したがって、本発明は、配列番号1の塩基配列、または配列番号１の塩基配列における9位から4031位までの塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつイネにおいてプロモーター活性を有するDNAからなるOsAMT1;2プロモーター、並びに
配列番号2の塩基配列、または配列番号２の塩基配列における9位から4126位までの塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつイネにおいてプロモーター活性を有するDNAからなるOsAMT1;3プロモーターを包含する。
【００２２】
本明細書で言う「１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から４０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。以下においても同様である。
【００２３】
上記本発明の欠失、置換及び／又は付加を有するDNAが、イネにおいてプロモーター活性を有するDNAであることは、このDNAおよびその下流にレポーター遺伝子としてβ-グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子を融合させたキメラ遺伝子を作製し、これらのキメラ遺伝子を導入した形質転換イネを作成し、これら形質転換イネからGUS活性を検出し、これをプロモーター活性（組織局在性および窒素誘導性）として検定することで、決定できる。
【００２４】
本発明のプロモーターは、イネ（日本晴）の第2番染色体ゲノム上に存在する、イネ遺伝子OsAMT1;2〔DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）： アクセッション番号AK107204〕またはイネ遺伝子OsAMT1;3〔DDBJ： アクセッション番号AF289478〕の塩基配列に基づき、当該遺伝子（以下、本明細書において「OsAMT1;2遺伝子およびOsAMT1;3遺伝子」という）の5'上流ゲノム領域（あるいは配列）を単離することによって取得できる。プロモーター領域を単離する方法としては、特に限定されないが、例えば、インバースPCR、ゲノムDNAライブラリーから単離する方法等を例示することができる。
【００２５】
インバースPCRによる場合は、上記OsAMT1;2遺伝子およびOsAMT1;3遺伝子の塩基配列情報に基づいて一対のプライマーを合成し、これら一対のプライマーと所定の制限酵素で処理した後にセルフライゲーションさせたゲノムDNA断片とを用いてPCRを行うことによって、OsAMT1;2遺伝子およびOsAMT1;3遺伝子の上流領域を増幅することができる。その後、OsAMT1;2遺伝子およびOsAMT1;3遺伝子の上流領域をクローニングし塩基配列を決定することによって、OsAMT1;2遺伝子およびOsAMT1;3遺伝子のプロモーター領域の単離、および塩基配列（配列番号１、２）の決定を行うことができる。
【００２６】
また、ゲノムDNAライブラリーから単離する場合には、OsAMT1;2遺伝子およびOsAMT1;3遺伝子を含むcDNAをプローブとして、定法に従って調製したゲノムDNAライブラリーからOsAMT1;2遺伝子およびOsAMT1;3遺伝子を含むゲノムDNAをスクリーニングする。その後、スクリーニングしたゲノムDNAの塩基配列を決定することによってOsAMT1;2遺伝子およびOsAMT1;3遺伝子の上流領域に存在するプロモーター領域を特定することができ、さらに、該プロモーター領域のみをPCR等によって増幅してクローニングすることによって単離することができる。
【００２７】
一旦、本発明のプロモーターの塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、あるいはその塩基配列の一部からなるDNAをプライマーとして合成し、イネの全DNAを鋳型として用いて、該プライマーを用いるPCRによって容易に得ることができる。
【００２８】
さらに、単離したプロモーター領域（配列番号１、２）の一部を用いてプロモーター活性を測定することによって、単離したプロモーター領域（配列番号１、２）において、プロモーター活性に寄与している領域を特定することができる。プロモーター領域の一部は、該プロモーター領域の一部をPCRによって増幅する方法、プロモーター領域を所定の制限酵素で処理して断片化する方法等を適宜使用して得ることができる。
【００２９】
上記したプローブ又はプライマーの調製、ゲノムDNAライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニング、PCR法などの操作は当業者に既知であり、例えば、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989（以下、モレキュラークローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００３０】
［キメラ遺伝子］
本発明は、上記本発明のプロモーターと、このプロモーターの下流にあるレポーター遺伝子を含むキメラ遺伝子を包含する。レポーター遺伝子には特に制限はなく、キメラ遺伝子の利用目的に応じて、適宜選択することができる。キメラ遺伝子の利用目的が、効率の良い栄養源の取り込み機能を有する作物の作出である場合、レポーター遺伝子は、栄養素輸送体遺伝子であることができる。栄養素輸送体遺伝子としては、例えば、アンモニウムイオン輸送遺伝子、硝酸イオン輸送遺伝子、リン酸輸送遺伝子、硫酸輸送遺伝子、アミノ酸輸送遺伝子ショ糖輸送遺伝子、カリウム輸送遺伝子、鉄輸送遺伝子、ホウ素輸送遺伝子などを挙げることができる。より具体的には、アンモニウムイオン輸送遺伝子としてAtAMT1;1, AtAMT1;2, AtAMT1;3, LeAMT1;1, LeAMT1;2, LeAMT1;3, AtAMT2などを挙げることができる。硝酸イオン輸送遺伝子として、OsNRT1, AtNRT1.2, AtNRT1.3, AtNRT1.4, BrNRT1.2, LeNRT1.1, LeNRT1.2, OsNRT2, AtNRT2.1, AtNRT2.2, AtNRT2.3, AtNRT2.4, AtNRT2.5, AtNRT2.6, AtNRT2.7, BnNRT2, GmNRT2, HvNRT2.1, LeNRT2.1, TaNRT2.1などを挙げることができる。リン酸輸送遺伝子として、LePT1, LePT2, LePT3, StPT1, StPT2, StPT3, Pht1;1, Pht1;2, Pht1;3, Pht1;4, Pht1;5 Pht1;6, Pht1;7, Pht1;8, Pht1;9, Pht2;1などを挙げることができる。硫酸輸送遺伝子として、Sultr1;1, Sultr1;2, Sultr1;3, Sultr2;1, Sultr2;2, Sultr3;1, Sultr3;2, Sultr3;3, Sultr3;4, Sultr4;1, Sultr4;2, Sultr5;1, Sultr5;2などを挙げることができる。アミノ酸輸送遺伝子として、AtAAP1, AtAAP2, AtAAP3, AtAAP4, AtAAP5, AtAAP6, AtProT1, AtProT2, AtANT1, LeProT1などを挙げることができる。ショ糖輸送遺伝子として、OsSUT1, OsSUT2, OsSUT3, OsSUT4, OsSUT5, AtSUC1, AtSUC2, AtSUT2などを挙げることができる。カリウム輸送遺伝子として、OsHKT1, OsHKT2, AtHKT1などを挙げることができる。鉄輸送遺伝子として、OsIRT1, AtIRT1, AtIRT2, AtIRT3, AtIRT4, AtIRT5, LeIRT1, LeIRT2などを挙げることができる。ホウ素輸送遺伝子としてBOR1を挙げることができる。
【００３１】
キメラ遺伝子の利用目的が、ファイトレメディエーションに用いる作物の作出である場合、レポーター遺伝子は、汚染物質輸送遺伝子であることができる。汚染物質輸送遺伝子としては、例えば、カドミウムもしくは亜鉛などの輸送遺伝子としてZntA1およびYCF1、カドミウムもしくはマンガンなど輸送遺伝子としてAtCAX2、亜鉛輸送体遺伝子としてZAT1、ニッケルもしくは鉛輸送遺伝子としてNtCBP4、その他重金属輸送遺伝子としてNRAMP1およびNRAMP2、を挙げることができる。
【００３２】
プロモーターとレポーター遺伝子とを含むキメラ遺伝子は、常法により、プロモーターとレポーター遺伝子とをライゲーションすることで作製することができる。
【００３３】
本発明のキメラ遺伝子は、上記プロモーターおよびレポーター遺伝子以外の遺伝子を含むことができ、そのような遺伝子は例えば、土壌からのカドミウム浄化に効果が期待されるGlutathione synthetase遺伝子(GS, GHS)、土壌からの鉛浄化に効果が期待されるPhytochelatin synthase遺伝子（PCS）などである。
【００３４】
［形質転換植物］
本発明は、上記本発明のキメラ遺伝子を含む形質転換植物を包含する。形質転換される植物は、特に制限はないが、例えば、イネであることができる。イネ以外には例えば、タバコ、ヨシ、トウモロコシ、トマト、ポテト、シロイヌナズナ等を挙げることができる。
【００３５】
形質転換植物の作製は、上記本発明キメラ遺伝子を用い、例えば、アグロバクテリウム法によって行うことができる。
【００３６】
［形質転換植物の育成方法］
本発明の形質転換植物の育成方法の第１の態様は、OsAMT1;2プロモーターを含むキメラ遺伝子で形質転換された植物をアンモニウムイオンの存在下または不存在下で育成し、レポーター遺伝子を発現させた、または発現させない状態にすることを含む、レポーター遺伝子の発現を制御した形質転換植物の育成方法である。
【００３７】
OsAMT1;2プロモーターは、根で特異的に発現し、かつアンモニウムの添加により初めて発現が誘導される。したがって、形質転換植物をアンモニウムイオンの存在下で育成するとレポーター遺伝子は発現する。また、形質転換植物をアンモニウムイオンの不存在下で育成するとレポーター遺伝子を発現させない状態にすることができる。アンモニウムイオンの存在下とは、例えば、アンモニウムイオンの濃度が3μMから30 mMの範囲である。また、アンモニウムイオンの不存在下とは、アンモニウムイオンが全く存在しない状況およびアンモニウムイオンの濃度が3μM未満である場合も含む。上記アンモニウムイオンの濃度は、形質転換植物を植えた土壌中のアンモニウムイオンの濃度である。土壌溶液中のアンモニウムイオン濃度は、例えばキャピラリー電気泳動システム（Agilent Technology社）を用いることで測定できる。[Soga, T. and Imaizumi, M. (2001) Capillary electrophoresis method for the analysis of inorganic anions, organic acids, amino acids, nucleotides, carbohydrates and other anionic compounds. Electrophoresis vol.22, pp.3418-3425.、Soga, T. and Ross, G.A. (1999) Simultaneous determination of inorganic anions, organic acids, amino acids and carbohydrates by capillary electrophoresis. J. Chromatogr. vol.837, pp231-239.参照]
【００３８】
OsAMT1;2プロモーターは、アンモニウムイオンの存在下で、発現誘導されるが、硝酸に対してはほとんど応答せず、水田といった還元土壌に育成が適したイネ特有に存在する遺伝子であると考えられる。
【００３９】
キメラ遺伝子の利用目的が、効率の良い栄養源の取り込み機能を有する作物の作出である場合、レポーター遺伝子は、上述のように栄養素輸送体遺伝子であることができる。そして、OsAMT1;2プロモーターおよび栄養素輸送体遺伝子をレポーター遺伝子として含むキメラ遺伝子を有する形質転換植物をアンモニウムイオンの存在下(または不存在下)で育成することで、栄養素輸送体遺伝子の発現を誘導することができる。より具体的には、硝酸アンモニウム、あるいは硫酸アンモニウムなどを水田などの圃場へ投与することで、栄養素輸送体遺伝子の発現を促進できる。
【００４０】
キメラ遺伝子の利用目的が、ファイトレメディエーションに用いる作物の作出である場合、レポーター遺伝子は、上述のように汚染物質輸送遺伝子であることができる。そして、OsAMT1;2プロモーターおよび汚染物質輸送遺伝子をレポーター遺伝子として含むキメラ遺伝子を有する形質転換植物をアンモニウムイオンの存在下(または不存在下)で育成することで、汚染物質輸送遺伝子の発現を誘導することができる。より具体的には、硝酸アンモニウム、あるいは硫酸アンモニウムを汚染土壌へ投与することで、汚染物質輸送遺伝子を発現促進できる。
【００４１】
本発明の形質転換植物の育成方法の第２の態様は、OsAMT1;3プロモーターを含むキメラ遺伝子で形質転換された植物をアンモニウムイオンの存在下または不存在下で育成し、レポーター遺伝子を発現させない、または発現させた状態にすることを含む、レポーター遺伝子の発現を制御した形質転換植物の育成方法である。
【００４２】
OsAMT1;3プロモーターは、根で特異的に発現し、かつアンモニウムの添加により発現が抑制される。したがって、形質転換植物をアンモニウムイオンの不存在下で育成するとレポーター遺伝子は発現する。また、形質転換植物をアンモニウムイオンの存在下で育成するとレポーター遺伝子を発現させない状態にすることができる。アンモニウムイオンの不存在下とは、アンモニウムイオンが全く存在しない状況およびアンモニウムイオンの濃度が300μM未満である場合も含む。また、アンモニウムイオンの存在下とは、例えば、アンモニウムイオンの濃度が300μM以上の範囲である。
【００４３】
キメラ遺伝子の利用目的が、効率の良い栄養源の取り込み機能を有する作物の作出である場合、レポーター遺伝子は、上述のように栄養素輸送体遺伝子であることができる。そして、OsAMT1;3プロモーターおよび栄養素輸送体遺伝子をレポーター遺伝子として含むキメラ遺伝子を有する形質転換植物をアンモニウムイオンの不存在下(または存在下)で育成することで、栄養素輸送体遺伝子の発現を誘導することができる。より具体的には、硝酸アンモニウム、あるいは硫酸アンモニウムなどの水田などの圃場への投与により、栄養素輸送体遺伝子の発現抑制ができる。またアンモニウム態窒素の少ない圃場での栽培による発現促進ができる。
【００４４】
キメラ遺伝子の利用目的が、ファイトレメディエーションに用いる作物の作出である場合、レポーター遺伝子は、上述のように汚染物質輸送遺伝子であることができる。そして、OsAMT1;3プロモーターおよび汚染物質輸送遺伝子をレポーター遺伝子として含むキメラ遺伝子を有する形質転換植物をアンモニウムイオンの不存在下(または存在下)で育成することで、汚染物質輸送遺伝子の発現を誘導することができる。より具体的には、アンモニウム態窒素の少ない汚染土壌の栽培することで、汚染物質輸送遺伝子を発現促進できる。
【実施例】
【００４５】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
形質転換体の作出
OsAMT1;2のプロモーター領域（2 kbおよび4 kb）およびOsAMT1;3遺伝子のプロモーター領域（2 kbおよび4 kb）の下流にレポーター遺伝子としてβ-グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子を融合させたキメラ遺伝子を作製した。
OsAMT1;2およびOsAMT1;3遺伝子のプロモーター領域（2 kbおよび4 kb）は、以下の方法により入手した。
【００４６】
(1) OsAMT1;2プロモーター（4 kb）の取得
イネOsAMT1;2遺伝子（DDBJ: アクセッション番号AF289479およびAK107204）の5'上流域に位置するプロモーター配列の単離をゲノミックPCR法にて行った。イネ（品種：日本晴）幼植物体の緑葉よりDNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社）を使って抽出したゲノムDNAを鋳型とし、DDBJ（アクセッション番号AP004059）に登録されているイネゲノム配列情報から設計されたプライマーOsAMT1;2-5-4k［5'-ATGCCCTGCAGGCGGCCTATTATGACCGCTTG-3'（配列番号5）下線部はSbfI制限酵素認識部位）]とOsAMT1;2-3 [5'-ATGCCCATGGTCGCCGCCTCGACGCGCGCTCAACACAGACTGT-3' （配列番号6）（下線部は、NcoI制限酵素認識部位）]をプライマーとして用い、PCRを行った。プライマーは、OsAMT1;2遺伝子のmRNAの情報から予測される翻訳開始コドンATGの5'側3塩基上流までに位置する4023塩基対［配列番号１において9位（1位〜8位はSbfI認識配列）の塩基から4031位（4032位〜4037位はNcoI認識配列）までの塩基に対応］の配列を増幅するように設計した。また、プライマーは増幅断片のクローニングを容易にするため、増幅断片の5'末端（OsAMT1;2-5-4k）及び3'末端（OsAMT1;2-3）に、それぞれ唯一のSbfI及びNcoI制限酵素認識部位を導入した。
【００４７】
PCR後、増幅断片（約4.0 kb）をEx Taqポリメラーゼ（Takara）を用いてdATP存在下で72℃、5分間処理して末端にAを付加し、Promega社のpGEM-T easy vector systemを用いてpGEM-T easyベクターにクローニングした。
【００４８】
クローニング後、インサートの塩基配列を解読し、上記の登録イネゲノム配列情報と同一であることを確認した。配列番号１にその塩基配列を示す。なお、配列番号１の塩基配列において1位〜8位までの塩基配列、4032位〜4037位までの塩基配列がクローニングに用いた制限酵素部位である。
【００４９】
(２) OsAMT1;2プロモーター（2 kb）の取得
イネOsAMT1;2遺伝子（DDBJ: アクセッション番号AF289479およびAK107204）の5'上流域に位置するプロモーター配列の単離をゲノミックPCR法にて行った。イネ（品種：日本晴）幼植物体の緑葉よりDNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社）を使って抽出したゲノムDNAを鋳型とし、DDBJ（アクセッション番号AP004059）に登録されているイネゲノム配列情報から設計されたプライマーOsAMT1;2-5-2k［5'-ATGCCCTGCAGGTCACGTGTTTGATCATTCGTC-3' （配列番号7）（下線部はSbfI制限酵素認識部位）]とOsAMT1;2-3 [5'-ATGCCCATGGTCGCCGCCTCGACGCGCGCTCAACACAGACTGT-3' （配列番号6）（下線部は、NcoI制限酵素認識部位）]をプライマーとして用い、PCRを行った。プライマーは、OsAMT1;2遺伝子のmRNAの情報から予測される翻訳開始コドンATGの5'側3塩基上流までに位置する2023塩基対［配列番号3において9位（1位〜8位はSbfI認識配列）の塩基から2031位（2032位〜2037位はNcoI認識配列）までの塩基に対応］の配列を増幅するように設計した。また、プライマーは増幅断片のクローニングを容易にするため、増幅断片の5'末端（OsAMT1;2-5-2k）及び3'末端（OsAMT1;2-3）に、それぞれ唯一のSbfI及びNcoI制限酵素認識部位を導入した。
【００５０】
PCR後、増幅断片（約2.0kb）をEx Taqポリメラーゼ（Takara）を用いてdATP存在下で72℃、5分間処理して末端にAを付加し、Promega社のpGEM-T easy vector systemを用いてpGEM-T easyベクターにクローニングした。
【００５１】
クローニング後、インサートの塩基配列を解読し、上記の登録イネゲノム配列情報と同一であることを確認した。配列番号3にその塩基配列を示す。なお、配列番号3の塩基配列において1位〜8位までの塩基配列、2032位〜2037位までの塩基配列がクローニングに用いた制限酵素部位である。
【００５２】
(3) OsAMT1;3プロモーター（4 kb）の取得
一方、イネOsAMT1;3遺伝子（DDBJ: アクセッション番号AF289478）の5'上流域に位置するプロモーター配列の単離をゲノミックPCR法にて行った。イネ（品種：日本晴）幼植物体の緑葉よりDNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社）を使って抽出したゲノムDNAを鋳型とし、DDBJ（アクセッション番号AP004059）に登録されているイネゲノム配列情報から設計されたプライマーOsAMT1;3-5-4k［5'-ATGCCCTGCAGGATGGTCCATGGCAACTAGCC-3' （配列番号8）（下線部はSbfI制限酵素認識部位）]とOsAMT1;3-3 [5'-ATGCTCTAGAGTGGCAAGGTTTTGTGCTGC-3' （配列番号9）（下線部は、XbaI制限酵素認識部位）]をプライマーとして用い、PCRを行った。プライマーは、OsAMT1;3遺伝子のmRNAの情報から予測される翻訳開始コドンATGの5'側22塩基上流までに位置する4118塩基対［配列番号2において9位（1位〜8位はSbfI認識配列認識配列）の塩基から4126位（4127位〜4132位はXbaI認識配列）までの塩基に対応］の配列を増幅するように設計した。また、プライマーは増幅断片のクローニングを容易にするため、増幅断片の5'末端（OsAMT1;3-5-4k）及び3'末端（OsAMT1;3-3）に、それぞれ唯一のSbfI及びXbaI制限酵素認識部位を導入した。
【００５３】
PCR後、増幅断片（約4.1 kb）をEx Taqポリメラーゼ（Takara）を用いてdATP存在下で72℃、5分間処理して末端にAを付加し、Promega社のpGEM-T easy vector systemを用いてpGEM-T easyベクターにクローニングした。
【００５４】
クローニング後、インサートの塩基配列を解読し、上記の登録イネゲノム配列情報と同一であることを確認した。配列番号2にその塩基配列を示す。なお、配列番号2の塩基配列において1位〜8位までの塩基配列、4127位〜4132位までの塩基配列がクローニングに用いた制限酵素部位である。
【００５５】
(4) OsAMT1;3プロモーター（2 kb）の取得
イネOsAMT1;3遺伝子（DDBJ:アクセッション番号AF289478）の5'上流域に位置するプロモーター配列の単離をゲノミックPCR法にて行った。イネ（品種：日本晴）幼植物体の緑葉よりDNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社）を使って抽出したゲノムDNAを鋳型とし、DDBJ（アクセッション番号AP004059）に登録されているイネゲノム配列情報から設計されたプライマーOsAMT1;3-5-2k［5'-ATGCCCTGCAGGCAGAGTACTCAGTAGTCAGC-3' （配列番号10）（下線部はSbfI制限酵素認識部位）]とOsAMT1;3-3 [5'-ATGCTCTAGAGTGGCAAGGTTTTGTGCTGC-3' （配列番号9）（下線部は、XbaI制限酵素認識部位）]をプライマーとして用い、PCRを行った。プライマーは、OsAMT1;3遺伝子のmRNAの情報から予測される翻訳開始コドンATGの5'側22塩基上流までに位置する1922塩基対［配列番号4において9位（1位〜8位はSbfI認識配列認識配列）の塩基から1930位（1931位〜1936位はXbaI認識配列）までの塩基に対応］の配列を増幅するように設計した。また、プライマーは増幅断片のクローニングを容易にするため、増幅断片の5'末端（OsAMT1;3-5-2k）及び3'末端（OsAMT1;3-3）に、それぞれ唯一のSbfI及びXbaI制限酵素認識部位を導入した。
【００５６】
PCR後、増幅断片（約1.9kb）をEx Taqポリメラーゼ（Takara）を用いてdATP存在下で72℃、5分間処理して末端にAを付加し、Promega社のpGEM-T easy vector systemを用いてpGEM-T easyベクターにクローニングした。
【００５７】
クローニング後、インサートの塩基配列を解読し、上記の登録イネゲノム配列情報と同一であることを確認した。配列番号4にその塩基配列を示す。なお、配列番号４の塩基配列において1位〜8位までの塩基配列、1931位〜1936位までの塩基配列がクローニングに用いた制限酵素部位である。
【００５８】
OsAMT1;2のプロモーター領域（4 kb）は配列番号１、2 kbの領域は配列番号３で示される。この2 kbの領域(配列番号３)は、プロモーター領域（4 kb）(配列番号１)の5'末端側の2 kbの領域と重複する。また、OsAMT1;3遺伝子のプロモーター領域（4 kb）は配列番号２で示され、2 kbの領域は配列番号４で示される。この2 kbの領域(配列番号４)はプロモーター領域（4 kb）(配列番号２)の5'末端側の2 kbの領域と重複する。
【００５９】
上記のプロモーター配列をイネに導入するために、植物形質転換用バイナリーTiプラスミドベクターpSMAHdN627-M2GUSを構築した（図21）。図21に示すように、本バイナリーベクターには、T-DNA上に植物用選抜マーカー遺伝子として、アグロバクテリウムTiプラスミド由来nos（ノパリン合成酵素遺伝子）プロモーター：：大腸菌由来hpt（ハイグロマシン耐性）遺伝子のコード領域：：Tiプラスミド由来iaaM（トリプトファンモノオキシゲナーゼ遺伝子）ターミネーターを配置し、形質転換された植物体がハイグロマイシンB耐性を示すようにした。また、その隣接部位にベータグルクロニダーゼ（gusA）遺伝子のコード領域：：Tiプラスミド由来nosターミネーターから構成されるキメラ遺伝子を配置し、gusA遺伝子の5'上流側にプロモーター配列を挿入できるようにマルチクローニング部位を設けた。また、left border（LB）配列とright border（RB）の配列の外側には、微生物細胞で機能し得るスペクチノマイシン耐性（SpR）遺伝子、大腸菌で機能するpBR322由来（ColE1型）複製開始領域、アグロバクテリウム細胞内においてプラスミドが安定に保持されるための配列sta、及び複製開始領域repを設けた。
【００６０】
pGEM-T easyベクターをSbfI及びNcoIで二重消化することにより、OsAMT1;2遺伝子プロモーター断片を、SbfI及びXbaIで二重消化することにより、OsAMT1;3遺伝子プロモーター断片をそれぞれ切り出し、（２）で構築したpSMAHdN627-M2GUSベクターの対応する部位にクローニングした。得られたプラスミドをpSMAHdN627-OsAMT1;2GUS、pSMAHdN627-OsAMT1;3GUSとそれぞれ命名し、バイオラッド社のE. coliパルサーを用いたエレクトロポレーション法（0.2 cmキュベット、パルス条件：2.4kV/cm、25μF、200Ω）により、アグロバクテリウムEHA105系統に導入した。
【００６１】
イネの形質転換
イネの形質転換は超迅速形質転換法〔WO 01/06844 A1 (2001)参照〕に準じて行った。イネ（品種：日本晴）種子を、70 ％エタノール、続いて次亜塩素酸ナトリウムで殺菌し、滅菌蒸留水ですすいで水を切った後、胚が上向きになるようN6D寒天培地〔N6 塩類およびビタミン〔Sci. Sinica, 18, 659-668 (1975)〕、30g/Lショ糖、0.3g/Lカザミノ酸、2.8g/Lプロリン、2mg/L 2,4-D、4g/Lゲルライト、pH5.7〕に置床し、30℃かつ明条件下で5日間培養した。
【００６２】
一方、OsAMT1遺伝子プロモーター断片を挿入した上述のプラスミドpSMAHdN627-OsAMT1;2GUS、pSMAHdN627-OsAMT1;3GUSをそれぞれ保持するアグロバクテリウムEHA105系統を、25mg/Lクロラムフェニコール、12.5mg/Lリファンピシンおよび100mg/Lスペクチノマイシンを含むLB寒天培地にて28℃で3日間培養した。続いて増殖した菌体をミクロスパーテルで少量かきとり、20mg/Lアセトシリンゴンを含むAAM液体培地〔Plant J., 6, 271-282 (1994)〕に懸濁した。このアグロバクテリウム懸濁液に、N6D培地で5日間培養したイネ発芽種子を浸し、菌液をよく切ったあと、20mg/Lアセトシリンゴンを含むAAM寒天培地に置床し、25℃の暗条件下で3日間培養した（共存培養）。共存培養後のイネ発芽種子を滅菌水、続いて500mg/Lカルベニシリンを含む滅菌水で洗浄し、滅菌ろ紙上で余分な水分を切った後、胚乳、根およびシュート上部を除去して残った組織（シュート基部）を500mg/Lカルベニシリンおよび30 mg/LハイグロマイシンBを含むN6D寒天培地に置床し、30℃の明条件下で14日間培養した。
【００６３】
その後、成長してきたハイグロマイシン耐性カルスを、組換え体再分化および選択培地〔植物体再分化培地：MS 無機塩類およびビタミン（Physiol. Plant, 15, 473-497 (1962)）、 30g/Lショ糖、30g/Lソルビトール、2g/Lカザミノ酸、0.02mg/L NAA、2mg/Lカイネチン、4g/Lゲルライト、pH5.8〕に、300mg/Lカルベニシリン＋30mg/LハイグロマイシンBを添加したもの〔Plant Mol. Biol. Rep., 15, 16-21 (1997) 参照〕に移し、30℃かつ明条件下で14日間培養し、さらにこの操作をもう一度繰り返し、ハイグロマイシン耐性を有する植物体を再分化させた。このようにして得られた再分化個体をMSホルモンフリー寒天培地〔MS無機塩類およびビタミン（前掲）、30g/Lショ糖、4g/Lゲルライト、pH5.8〕に移植し、30℃の明条件下で1〜2週間生育させ、シュート（地上部）の伸長、および発根とその伸長を促した。シャーレ（直径9cm）内で形質転換体のシュートおよび根の長さが約10cmあるいはそれ以上の長さに到達した際、培養土に移植し、遺伝子組換え体育成用グロースチャンバーにて明期14時間（30℃）および暗期10時間（25℃）のサイクルでさらに生育させた。
【００６４】
その結果、それぞれ約50系統の形質転換イネが得られた。これら形質転換イネの一部についてGUS活性を検出し、これをプロモーター活性（組織局在性および窒素誘導性）とした。
【００６５】
実験方法と結果
GUS活性の検出は各形質転換体の生育時期を区別して行った。栄養成長期ではアンモニウムイオンの有無にも着目した（調査１）。生殖成長期では詳細に生育時期を区別し、穂孕み期（出穂の約１週間前、形態的な目安として止め葉とその前の葉との様耳間長が１〜２cm程度）、開花期（出穂後１〜３日）および登熟期（出穂後約20日）で調査した（調査２）。
【００６６】
[調査１]−栄養成長期における各プロモーター活性の検討−
[実験方法]
形質転換次世代のイネ種子を水道水で1週間生育させた後、窒素無添加のイネ水耕液で２週間生育させ、一旦窒素飢餓状態とした。これらの形質転換イネを1 mMの硫酸アンモニウムを単一窒素源としたイネ水耕液に12時間処理を行った（アンモニウム処理区：+NH4）。また窒素源を含まないイネ水耕液を用いて，同様の処理をおこない実験に用いた（窒素無処理区：-N）。
【００６７】
[結果]
（１）OsAMT1;2プロモーター（2 kbおよび4 kb）について：
2 kbについては一切のGUS活性は認められない（図1および図2）。4 kbについては-Nでは一切のGUS活性は認められないが（図3）、+NH4にのみ根特異的にGUS活性が認められた（図4 AおよびB）。
（２）OsAMT1;3プロモーター（2 kbおよび4 kb）について：
2 kbについては一切のGUS活性は認められない（図5および図.6）。4 kbについては-Nにおいて根特異的にGUS活性が認められた（図7）。これに対し、+NH4では一切のGUS活性は認められなかった（図8）。
【００６８】
[調査２]−生殖成長期における各プロモーター活性の検討−
[実験方法]
形質転換体当代を実験材料として用いた。実験条件として、地上部（葉身，葉鞘，穎果など）の観察には，ポットで栽培した個体を用いた。また地下部（根）の観察には，1 mMの硫酸アンモニウムを窒素源として含む水耕液で栽培した個体を用いた（水耕液は２日に一度交換した）。それらの個体について，各組織のGUS活性を観察した。また調査部位は下記に示す。
１.穂孕み期（葉耳間長が1-2 cm）において、止め葉から下に数えて三番目の葉（完全抽出葉）の葉身および葉鞘、幼穂の穎花および枝梗
２．出穂後の開花期において、止め葉の葉身および葉鞘、第一および第二節間、穎花、葯および枝梗、根の基部および先端部
３．出穂後の登熟期において、登熟中の種子（穎果）と枝梗
【００６９】
[結果]
１・穂孕み期での各プロモーター活性：
（１）OsAMT1;2プロモーター（2 kbおよび4 kb）について：
2 kbおよび4 kbとも、一切のGUS活性は認められない（図9および図10）。
（２）OsAMT1;3プロモーター（2 kbおよび4 kb）について：
2 kbおよび4 kbとも、一切のGUS活性は認められない（図11および図12）。
２・開花期での各プロモーター活性：
（１）OsAMT1;2プロモーター（2 kbおよび4 kb）について：
2 kbについては一切のGUS活性は認められない（図13）。4 kbについては根で顕著なGUS活性が認められた（図14 HおよびI）。また約で若干のGUS活性が認められた。
（２）OsAMT1;3プロモーター（2 kbおよび4 kb）について：
2 kbについては一切のGUS活性は認められない（図15）。4 kbについては根で顕著なGUS活性が認められた（図16 HおよびI）
３・登熟期での各プロモーター：
本実験に供試したすべてのプロモーターにおいて、明瞭なGUS活性は認められなかった（図17, 18, 19および20）。
【００７０】
まとめ
（１）イネの根特異的発現プロモーターとして：
OsAMT1;2と1;3の約4 kbプロモーターは共に栄養成長期および生殖成長期の根で特異的に発現が認められた。すなわち、上記プロモーターに任意の機能的遺伝子を融合させた形質転換イネを作製すると、任意の機能的遺伝子を根に特異的に発現させることが可能である。また両プロモーターとも、2 kbでは活性は持たないのに対して、4 kbのプロモーターに根に特異的発現活性があった。
【００７１】
（２）アンモニウムイオンによる誘導性について
栄養成長期において、OsAMT1;2の4 kbプロモーターではアンモニウムイオン存在下（+ NH4）でのみGUSの活性が認められた。これに対し、OsAMT1;3の4 kbプロモーターでは逆にアンモニウムイオン存在下（+ NH4）でGUSの抑制が認められた。すなわち、上記プロモーターに任意の機能的遺伝子を融合させた形質転換イネを作製すると、任意遺伝子を根特異的でありながら、アンモニウムイオンを添加することで発現の開始ないし停止が可能である。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明は、効率の良い栄養源の取り込み機能を有する作物の作出および汚染環境の浄化・修復（ファイトレメディエーション）に利用可能な作物の作出に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】栄養成長期における窒素無処理区下でのOsAMT1;2の2 kbプロモーターの活性。一次根（A）、二次根（B）、葉身上部（C）、葉身中間部（D）らを採取し、GUS活性（プロモーター遺伝子活性）を検出した。一切の活性は見られない。
【図２】栄養成長期におけるアンモニウム処理区下でのOsAMT1;2の2 kbプロモーターの活性。一次根（A）、二次根（B）、葉身上部（C）、葉身中間部（D）らを採取し、GUS活性（プロモーター遺伝子活性）を検出した。一切の活性は見られない。
【図３】栄養成長期における窒素無処理区下でのOsAMT1;2の4 kbプロモーターの活性。一次根（A）、二次根（B）、葉身上部（C）、葉身中間部（D）らを採取し、GUS活性（プロモーター遺伝子活性）を検出した。一切の活性は見られない。
【図４】栄養成長期におけるアンモニウム処理区下でのOsAMT1;2の4 kbプロモーターの活性。一次根（A）、二次根（B）、葉身上部（C）、葉身中間部（D）らを採取し、GUS活性（プロモーター遺伝子活性）を検出した。根（一次根および二次根）のみに活性が見られる。
【図５】栄養成長期における窒素無処理区下でのOsAMT1;3の2 kbプロモーターの活性。一次根（A）、二次根（B）、葉身上部（C）、葉身中間部（D）らを採取し、GUS活性（プロモーター遺伝子活性）を検出した。一切の活性は見られない。
【図６】栄養成長期におけるアンモニウム処理区下でのOsAMT1;3の2 kbプロモーターの活性。一次根（A）、二次根（B）、葉身上部（C）、葉身中間部（D）らを採取し、GUS活性（プロモーター遺伝子活性）を検出した。一切の活性は見られない。
【図７】栄養成長期における窒素無処理区下でのOsAMT1;3の4 kbプロモーターの活性。一次根（A）、二次根（B）、葉身上部（C）、葉身中間部（D）らを採取し、GUS活性（プロモーター遺伝子活性）を検出した。根（一次根の先端および二次根）のみに活性が見られる。
【図８】栄養成長期におけるアンモニウム処理区下でのOsAMT1;3の4 kbプロモーターの活性。一次根（A）、二次根（B）、葉身上部（C）、葉身中間部（D）らを採取し、GUS活性（プロモーター遺伝子活性）を検出した。根（一次根および二次根）のみに活性が見られる。
【図９】穂ばらみ期におけるOsAMT1;2の2 kbプロモーターの活性。葉身（A）、葉鞘（B）、未抽出の穎花（C）、枝梗（D）らを採取し、GUS活性（プロモーター遺伝子活性）を検出した。一切の活性は見られない。
【図１０】穂ばらみ期におけるOsAMT1;2の4 kbプロモーターの活性。一切の活性は見られない。葉身（A）、葉鞘（B）、未抽出の穎花（C）、枝梗（D）らを採取し、GUS活性（プロモーター遺伝子活性）を検出した。
【図１１】穂ばらみ期におけるOsAMT1;3の2 kbプロモーターの活性。葉身（A）、葉鞘（B）、未抽出の穎花（C）、枝梗（D）らを採取し、GUS活性（プロモーター遺伝子活性）を検出した。一切の活性は見られない。
【図１２】穂ばらみ期におけるOsAMT1;3の4 kbプロモーターの活性。葉身（A）、葉鞘（B）、未抽出の穎花（C）、枝梗（D）らを採取し、GUS活性（プロモーター遺伝子活性）を検出した。一切の活性は見られない。
【図１３】開花期におけるOsAMT1;2の2 kbプロモーターの活性。葉身（A）、葉鞘（B）、第一節間（C）、第二節間（D）、穎果（E）、枝梗、穂軸（F）、葯（G）、根（HおよびI）、らを採取し、GUS活性（プロモーター遺伝子活性）を検出した。一切の活性は見られない。
【図１４】開花期におけるOsAMT1;2の4 kbプロモーターの活性。根に活性が見られる。葉身（A）、葉鞘（B）、第一節間（C）、第二節間（D）、穎果（E）、枝梗、穂軸（F）、葯（G）、根（HおよびI）、らを採取し、GUS活性（プロモーター遺伝子活性）を検出した。葯にも僅かな活性が見られる個体もあった。
【図１５】開花期におけるOsAMT1;3の2 kbプロモーターの活性。葉身（A）、葉鞘（B）、第一節間（C）、第二節間（D）、穎果（E）、枝梗、穂軸（F）、葯（G）、根（HおよびI）、らを採取し、GUS活性（プロモーター遺伝子活性）を検出した。一切の活性は見られない。
【図１６】開花期におけるOsAMT1;3の4 kbプロモーターの活性。葉身（A）、葉鞘（B）、第一節間（C）、第二節間（D）、穎果（E）、枝梗、穂軸（F）、葯（G）、根（HおよびI）、らを採取し、GUS活性（プロモーター遺伝子活性）を検出した。根の先端で活性が見られる。
【図１７】登熟期におけるOsAMT1;2の2 kbプロモーターの活性。穎果と枝梗（AおよびB）を採取し、GUS活性（プロモーター遺伝子活性）を検出した。一切の活性は見られない。
【図１８】登熟期におけるOsAMT1;2の4 kbプロモーターの活性。穎果と枝梗（AおよびB）を採取し、GUS活性（プロモーター遺伝子活性）を検出した。一切の活性は見られない。
【図１９】登熟期におけるOsAMT1;3の2 kbプロモーターの活性。完熟した穎果（A）、完熟した外穎および内穎（B）、完熟した胚と胚乳（CおよびD）、登熟中の穎果（E）、登熟中の外穎および内穎（F）、完熟した胚と胚乳（GおよびH）、F、G、Hのクロロフィルを脱色したもの（それぞれI、J、K）。一切の活性は見られない。
【図２０】登熟期におけるOsAMT1;3の4 kbプロモーターの活性。完熟した穎果（A）、完熟した外穎および内穎（B）、完熟した胚と胚乳（CおよびD）、登熟中の穎果（E）、登熟中の外穎および内穎（F）、完熟した胚と胚乳（GおよびH）、F、G、Hのクロロフィルを脱色したもの（それぞれI、J、K）。一切の活性は見られない。
【図２１】植物形質転換用バイナリーTiプラスミドベクターpSMAHdN627-M2GUSの構造。SpR: Tn7由来スペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性遺伝子、sta: シュードモナス（Pseudomonas）プラスミド pVS1由来のプラスミド安定性に関与する領域、rep: アグロバクテリウム（Agrobacterium）内のプラスミド維持のためのpVS1由来複製開始点、ColE1 ori: pBR322 由来ColE1複製開始点、TiaaM:アグロバクテリウム（Agrobacterium）iaaM 遺伝子由来ポリアデニル化シグナル（ターミネーター）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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