(57)【要約】【課題】癌の治療、診断等に使用可能である、甲状腺などの癌に対する抗原認識部位を有するポリペプチドを提供すること、および該ポリペプチドを産生するために用いられる該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。【解決手段】本発明者らは、甲状腺癌を特異的に認識する抗原認識部位を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド塩基配列を決定した。さらに、該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を推定した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
甲状腺癌組織で産生される癌関連抗原と反応するポリペプチドの抗原認識部位に含まれる、下記の群より選ばれるポリペプチド；
（１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（２）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において甲状腺癌組織で産生される抗原との反応性を失わずにアミノ酸の欠失、置換、付加などの変異を有するポリペプチド、
（３）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも約70%の相同性を有し、かつ抗原との反応性を示すアミノ酸配列で表されるポリペプチド。
【請求項２】
甲状腺癌組織で産生される癌関連抗原と反応するポリペプチドの抗原認識部位に含まれる、下記の群より選ばれるポリペプチド；
（１）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（２）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において抗原との反応性を失わずにアミノ酸の欠失、置換、付加などの変異を有するアミノ酸配列で表されるポリペプチド、
（３）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約70%の相同性を有し、かつ抗原との反応性を示すアミノ酸配列で表されるポリペプチド。
【請求項３】
下記の群より選ばれるポリペプチドを抗原認識部位に含む、甲状腺癌組織で産生される癌関連抗原と反応するポリペプチド；
（１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド、および
（２）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において抗原との反応性を失わずアミノ酸の欠失、置換、付加などの変異を有するアミノ酸配列で表されるポリペプチド、
（３）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも約70%の相同性を有し、かつ抗原との反応性を示すアミノ酸配列で表されるポリペプチド。
【請求項４】
下記の群より選ばれるポリペプチドを抗原認識部位に含む、甲状腺癌組織で産生される癌関連抗原と反応するポリペプチド；
（１）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド、
（２）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において抗原との反応性を失わずアミノ酸の欠失、置換、付加などの変異を有するアミノ酸配列で表されるポリペプチド、
（３）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列に少なくとも約70%の相同性を有し、かつ抗原との反応性を示すポリペプチド。
【請求項５】
抗原認識部位に請求項３に記載のポリペプチドかつ請求項４に記載のポリペプチドを含む、甲状腺癌組織で産生される癌関連抗原と反応するポリペプチド。
【請求項６】
抗体の部分配列である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
抗体の軽鎖可変領域である、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項８】
抗体の重鎖可変領域である、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項９】
軽鎖可変領域が請求項３に記載のポリペプチドであり、重鎖可変領域が請求項４に記載のポリペプチドである、請求項６〜８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
抗体がヒト化抗体、ヒトとのキメラ抗体、一本鎖抗体又はＦab化抗体である、請求項６〜９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
抗体が甲状腺癌に対する抗体である、請求項６〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
甲状腺癌以外の組織で産生される同一の癌関連抗原と反応する、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１４】
癌治療薬である請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドを、抗癌剤、毒素、光線、音響及び／又は放射線増感剤の運搬体として使用する医薬組成物。
【請求項１６】
甲状腺癌又は請求項１〜１２のいずれか1項に記載のポリペプチドが認識することができる癌の治療薬である、請求項１４又は１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む診断用試薬。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドを、標識化合物の運搬体として使用する診断用試薬。
【請求項１９】
甲状腺癌又は請求項１〜１２のいずれか1項に記載のポリペプチドが認識することができる癌の診断用試薬である、請求項１７又は１８に記載の診断用試薬。
【請求項２０】
請求項１又は２に記載のポリペプチドの一をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２１】
下記の群より選ばれる甲状腺癌組織で産生される癌関連抗原と反応するポリペプチドに含まれるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドであって、抗体の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと少なくとも約７０％の相同性を示し、かつ抗体の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、および
（３）配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにおいて、1ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異を有し、かつ抗体の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２２】
下記の群より選ばれる甲状腺癌組織で産生される癌関連抗原と反応するポリペプチドに含まれるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（１）配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドであって、抗体の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、
（２）配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと少なくとも約７０％の相同性を示し、かつ抗体の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、および
（３）配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにおいて、1ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異を有し、かつ抗体の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２３】
抗体の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドが請求項２１に記載のポリヌクレオチドであり、かつ、抗体の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドが請求項２２に記載のポリヌクレオチドである、甲状腺癌抗原を認識するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２４】
甲状腺癌に対する抗体である、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
請求項２０から２４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む組み換えベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載の組み換えベクターにより形質転換された細胞。
【請求項２７】
細胞が哺乳動物又は昆虫由来の細胞である請求項２６に記載の細胞。
【請求項２８】
請求項２７に記載の細胞を培養し、発現されたポリペプチド、ポリペプチドを含むタンパク質又は組換え抗体を回収する工程を含む、ポリペプチド、ポリペプチドを含むタンパク質又は組換え抗体の調製方法。
【請求項２９】
原核生物、昆虫、哺乳類及び植物細胞から選択される無細胞発現系によるポリペプチド、ポリペプチドを含むタンパク質又は組換え抗体の発現と、発現されたポリペプチド、ポリペプチドを含むタンパク質又は組換え抗体を回収する工程を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチド、ポリペプチドを含むタンパク質又は組換え抗体の調製方法。
【請求項３０】
請求項３又は４に記載のポリペプチドの認識性を利用する免疫原のスクリーニング方法。
【請求項３１】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドを用いる、ヒト化抗体、ヒトとのキメラ抗体、一本鎖抗体又はＦａｂ化抗体の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、甲状腺癌抗原を特異的に認識する新規のポリペプチドに関する。より詳しくは、甲状腺癌の癌組織が産生する抗原に対して選択的に反応する抗原認識部位を有するポリペプチドに関する。同じ抗原は他の癌でも産生されることがありこの場合ではこのポリペプチドは甲状腺癌組織が産生する抗原と同じように選択的に反応する。
【背景技術】
【０００２】
甲状腺乳頭癌は甲状腺癌の約90%を占める最多のものであり、その予後は一般的に良好であるが、その約10〜15%の症例で肺、骨、縦隔リンパ節などに転移を生じる。この転移の治療には癌細胞を特異的に認識する抗体を用いた治療が有効である。
【０００３】
抗体を得る方法として、細胞融合の技術（非特許文献１）を用いた方法が用いられている。当該方法により様々な抗体が作製されており、各種腫瘍に対する抗体が、診断、治療に役立てる試みがなされてきた（非特許文献２）。甲状腺領域においても、甲状腺濾胞コロイドに対するサイログロブリン（非特許文献３）、髄様癌に関連したカルシトニン、CEAなどが利用されている（非特許文献４および５）。
【０００４】
しかしながら、通常抗体は他の動物細胞由来であり免疫原性を伴うため、抗体を用いた治療の有効性は抗体の免疫原性応答の影響を受けやすい、という問題がある。そのため、遺伝子工学的手法を利用した、キメラ抗体やヒトの抗体に構造が類似した抗体の作成などの様々な取り組みがなされている。
【０００５】
以下に本明細書において引用した文献を列記する。
【非特許文献１】Kohler, G., Milstein, C.「Nature」1998年,第265巻, p.495-497
【非特許文献２】米島学、服部信、澤武紀夫、「腫瘍マーカー．癌の臨床」1988年、第34巻、1209-1215頁
【非特許文献３】Van H, A. J. et al., 「J. Clin. Invest.」1973年, 第52巻, p. 1320-1327
【非特許文献４】Melvin, K. et al.,「N. Engl. J. Med.」1971年，第285巻, p. 1115
【非特許文献５】Keiser, R., 「Ann. Intern. Med.」1973年, 第78巻, p. 561
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、甲状腺癌の治療、診断等に使用可能である、甲状腺癌に対する抗原認識部位を有するポリペプチドを提供すること、および該ポリペプチドを産生するために用いられる該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために鋭意検討した結果、本発明者らは甲状腺癌を特異的に認識する抗原認識部位を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのクローニングに成功し、その塩基配列を決定し、アミノ酸配列を推定した。
【０００８】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．甲状腺癌組織で産生される癌関連抗原と反応するポリペプチドの抗原認識部位に含まれる、下記の群より選ばれるポリペプチド；
（１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（２）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において甲状腺癌組織で産生される抗原との反応性を失わずにアミノ酸の欠失、置換、付加などの変異を有するポリペプチド、
（３）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも約70％の相同性を有し、かつ抗原との反応性を示すアミノ酸配列で表されるポリペプチド。
２．甲状腺癌組織で産生される癌関連抗原と反応するポリペプチドの抗原認識部位に含まれる、下記の群より選ばれるポリペプチド；
（１）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（２）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において抗原との反応性を失わずにアミノ酸の欠失、置換、付加などの変異を有するアミノ酸配列で表されるポリペプチド、
（３）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約70％の相同性を有し、かつ抗原との反応性を示すアミノ酸配列で表されるポリペプチド。
３．下記の群より選ばれるポリペプチドを抗原認識部位に含む、甲状腺癌組織で産生される癌関連抗原と反応するポリペプチド；
（１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド、および
（２）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において抗原との反応性を失わずアミノ酸の欠失、置換、付加などの変異を有するアミノ酸配列で表されるポリペプチド、
（３）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも約70%の相同性を有し、かつ抗原との反応性を示すアミノ酸配列で表されるポリペプチド。
４．下記の群より選ばれるポリペプチドを抗原認識部位に含む、甲状腺癌組織で産生される癌関連抗原と反応するポリペプチド；
（１）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド、
（２）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において抗原との反応性を失わずアミノ酸の欠失、置換、付加などの変異を有するアミノ酸配列で表されるポリペプチド、
（３）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列に少なくとも約70%の相同性を有し、かつ抗原との反応性を示すポリペプチド。
５．抗原認識部位に前項３に記載のポリペプチドかつ前項４に記載のポリペプチドを含む、甲状腺癌組織で産生される癌関連抗原と反応するポリペプチド。
６．抗体の部分配列である、前項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
７．抗体の軽鎖可変領域である、前項３に記載のポリペプチド。
８．抗体の重鎖可変領域である、前項４に記載のポリペプチド。
９．軽鎖可変領域が前項３に記載のポリペプチドであり、重鎖可変領域が前項４に記載のポリペプチドである、前項６〜８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
１０．抗体がヒト化抗体、ヒトとのキメラ抗体、一本鎖抗体又はＦab化抗体である、前項６〜９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
１１．
抗体が甲状腺癌に対する抗体である、前項６〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
１２．甲状腺癌以外の組織で産生される同一の癌関連抗原と反応する、前項１１に記載のポリペプチド。
１３．前項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
１４．癌治療薬である前項１３に記載の医薬組成物。
１５．前項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドを、抗癌剤、毒素、光線、音響、及び／又は放射線増感剤の運搬体として使用する医薬組成物。
１６．甲状腺癌又は前項１〜１２のいずれか1項に記載のポリペプチドが認識することができる癌の治療薬である、前項１４又は１５に記載の医薬組成物。
１７．前項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む診断用試薬。
１８．前項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドを、標識化合物の運搬体として使用する診断用試薬。
１９．甲状腺癌又は前項１〜１２のいずれか1項に記載のポリペプチドが認識することができる癌の診断用試薬である、前項１７又は１８に記載の診断用試薬。
２０．  前項１又は２に記載のポリペプチドの一をコードするポリヌクレオチド。
２１．下記の群より選ばれる甲状腺癌組織で産生される癌関連抗原と反応するポリペプチドに含まれるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドであって、抗体の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと少なくとも約70%の相同性を示し、かつ抗体の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、および
（３）配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにおいて、1ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異を有し、かつ抗体の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド。
２２．下記の群より選ばれる甲状腺癌組織で産生される癌関連抗原と反応するポリペプチドに含まれるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（１）配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドであって、抗体の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、
（２）配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと少なくとも約70%の相同性を示し、かつ抗体の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、および
（３）配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにおいて、1ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異を有し、かつ抗体の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド。
２３．抗体の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドが前項２１に記載のポリヌクレオチドであり、かつ、抗体の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドが前項２２に記載のポリヌクレオチドである、甲状腺癌抗原を認識するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
２４．甲状腺癌に対する抗体である、前項２１〜２３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
２５．前項２０から２４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む組み換えベクター。
２６．前項２５に記載の組み換えベクターにより形質転換された細胞。
２７．細胞が哺乳動物又は昆虫由来の細胞である前項２６に記載の細胞。
２８．前項２７に記載の細胞を培養し、発現されたポリペプチド、ポリペプチドを含むタンパク質又は組換え抗体を回収する工程を含む、ポリペプチド、ポリペプチドを含むタンパク質又は組換え抗体の調製方法。
２９．原核生物、昆虫、哺乳類及び植物細胞から選択される無細胞発現系によるポリペプチド、ポリペプチドを含むタンパク質又は組換え抗体の発現と、発現されたポリペプチド、ポリペプチドを含むタンパク質又は組換え抗体を回収する工程を含む、前項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチド、ポリペプチドを含むタンパク質又は組換え抗体の調製方法。
３０．前項３又は４に記載のポリペプチドの認識性を利用する免疫原のスクリーニング方法。
３１．前項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドを用いる、ヒト化抗体、ヒトとのキメラ抗体、一本鎖抗体又はＦａｂ化抗体の作製方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により甲状腺癌組織で産生される癌関連抗原と反応する抗原認識部位を有するポリペプチドが得られた。本発明で得られたポリペプチドを用いることにより、甲状腺癌組織を選択的に認識する、免疫原性の少ない甲状腺癌治療薬、甲状腺癌診断薬を提供することができる。また、本発明で得られた甲状腺癌組織で産生される癌関連抗原と反応するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、遺伝子工学的手法を用いた甲状腺癌特異的な抗体の工業的規模の大量生産に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本明細書中において、「ポリペプチド」とはペプチド結合又は修飾されたペプチド結合により互いに結合している2個以上のアミノ酸を含むものである。また、本明細書において「甲状腺癌抗原」とは、甲状腺癌組織で産生される癌関連抗原をいう。
【００１１】
本発明のポリペプチドは、甲状腺癌組織で産生される癌関連抗原、好ましくは甲状腺乳頭癌関連抗原をと反応するポリペプチドである。本発明のポリペプチドが認識する抗原蛋白質としては、細胞骨格フィラメント、好ましくは糖鎖等で修飾されたフィブロネクチンを例示することができる。
【００１２】
本発明のポリペプチドは、甲状腺癌組織で産生される癌関連抗原と反応するポリペプチドの抗原認識部位に含まれる、以下より選ばれるポリペプチドである；１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド、２）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において甲状腺癌組織で産生される抗原との反応性を失わずにアミノ酸の欠失、置換、付加などの変異を有するポリペプチド、３）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも約70%の相同性を有し、かつ抗原との反応性を示すアミノ酸配列で表されるポリペプチドである。
【００１３】
また、本発明のポリペプチドは、甲状腺癌組織で産生される癌関連抗原と反応するポリペプチドの抗原認識部位に含まれる、以下より選ばれるポリペプチドである；１）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド、２）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において抗原との反応性を失わずにアミノ酸の欠失、置換、付加などの変異を有するアミノ酸配列で表されるポリペプチド、３）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約70%の相同性を有し、かつ抗原との反応性を示すアミノ酸配列で表されるポリペプチドである。
【００１４】
さらに、本発明のポリペプチドは、以下より選ばれるポリペプチドを抗原認識部位に含む、甲状腺癌組織で産生される癌関連抗原と反応するポリペプチド；１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド、２）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において抗原との反応性を失わずアミノ酸の欠失、置換、付加などの変異を有するアミノ酸配列で表されるポリペプチド、３）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも約70%の相同性を有し、かつ抗原との反応性を示すアミノ酸配列で表されるポリペプチドである。
【００１５】
さらにまた、本発明のポリペプチドは、以下より選ばれるポリペプチドを抗原認識部位に含む、甲状腺癌組織で産生される癌関連抗原と反応するポリペプチド；１）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド、２）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において抗原との反応性を失わずアミノ酸の欠失、置換、付加などの変異を有するアミノ酸配列で表されるポリペプチド、３）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約70%の相同性を有し、かつ抗原との反応性を示すアミノ酸配列で表されるポリペプチドである。
【００１６】
本発明のポリペプチドは抗体の構成物として用いることができる。詳しくは、本発明のポリペプチドは甲状腺癌に対する抗体の構成物として用いることができる。また、ポリペプチドには甲状腺癌以外の組織で産生される同一の癌関連抗原と反応するポリペプチドも含まれる。本発明の「抗体」として、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体などの慣用的ハイブリドーマ法により調製されうる抗体、ヒトとのキメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体及びFab化抗体等の遺伝子工学的手法により調製されうる抗体が好適に例示される。遺伝子工学的手法により調製されうる抗体は、免疫グロブリン不変領域の前部又は一部を欠く抗体断片であってもよい。本発明の抗体はヒト抗体であることが好ましい。また、本発明の抗体は好ましくは甲状腺癌を特異的に認識する抗体であり、より好ましくは甲状腺乳頭癌を特異的に認識する抗体である。
【００１７】
一般に抗体は、重鎖と軽鎖からなり、これらはともに定常領域と可変領域からなる。重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が相対してジスルフィド結合および非共有結合によって結合することにより、抗原認識部位が形成される。
【００１８】
本発明のポリペプチドには、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を抗原認識部位として有する、甲状腺癌抗原を認識するポリペプチドが軽鎖可変領域である抗体が含まれる。該抗体の軽鎖可変領域以外は他の抗体由来であっても構わない。また、前記他の抗体にはヒト以外の生物由来の抗体も含まれるが、副作用低減の観点からはヒト由来のものが好ましい。
【００１９】
また、本発明のポリペプチドには、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を抗原認識部位として有する、甲状腺癌抗原を認識するポリペプチドが重鎖可変領域である抗体が含まれる。該抗体の重鎖可変領域以外は他の抗体由来であっても構わない。また、前記他の抗体にはヒト以外の生物由来の抗体も含まれるが、副作用低減の観点からはヒト由来のものが好ましい。
【００２０】
本発明の好適なポリペプチドは、軽鎖可変領域が配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列であり、かつ、重鎖可変領域が配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列である、甲状腺癌抗原を認識する抗体である。該抗体の可変領域以外は他の抗体由来であっても構わない。また、前記他の抗体にはヒト以外の生物由来の抗体も含まれるが、副作用低減の観点からはヒト由来のものが好ましい。
【００２１】
本発明のポリペプチドは、甲状腺癌組織で産生される癌関連抗原と反応するという特性を有する限り、配列表の配列番号２および／又は４に記載のアミノ酸配列において、1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などの変異を有するポリペプチドであってもよい。ここで数個とは好ましくは、2〜5個、より好ましくは2個又は3個、特に好ましくは2個を意味する。当該変異を有するポリペプチドは天然に存在するものであってよく、また変異を導入したものであってもよい。
【００２２】
欠失、置換、付加又は挿入等の変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマー（Ulmer）の技術（K. M. Ulmer,「Science」1983年, 第219巻,p.666-671）を利用できる。このような変異の導入において、当該ポリペプチドの基本的な性質（物性、機能又は免疫学的活性等）を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互置換は容易に想定される。さらに、これら利用できるポリペプチドは、その構成アミノ基又はカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。
【００２３】
上記ポリペプチドは、ペプチド化学において知られる一般的な方法で製造できる。例えば、成書（「ペプチド合成」丸善株式会社、1975年および「Peptide Synthesis」Interscience, New York, 1996年）に記載の方法が例示されるが、これらに限らず公知の方法が広く利用可能である。具体的には、通常の液相法および固相法によるペプチド合成法、例えばＦｍｏｃ法等を挙げることができる。又は市販のアミノ酸合成装置を用いて製造可能である。
【００２４】
また、本発明のポリペプチドは遺伝子工学的手法により取得することもできる。例えば、目的とするポリペプチドをコードする遺伝子（例えば配列番号１および／又は３に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチド）を含む宿主細胞中で発現可能な組換えベクターを作成し、これを適当な宿主細胞にトランスフェクションして形質転換した後に該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から目的とするポリペプチドを回収することにより製造可能である。
【００２５】
本発明の医薬組成物は、本発明のポリペプチドを有効成分としてその有効量を含み、通常は、１種又は複数の医薬上許容されうる医薬用担体を用いて製造することが好ましい。本発明の医薬組成物は癌治療薬、好ましくは甲状腺癌の治療薬、さらに好ましくは甲状腺乳頭癌の治療薬として利用可能である。また、本発明の医薬組成物は本発明のポリペプチドが認識することができる癌の治療薬として利用することができる。
【００２６】
本発明の特に好適な医薬組成物は、本発明のポリペプチドを抗癌剤、毒素、光線、音響、および／または放射線増感剤の運搬体として使用する医薬組成物である。例えば、音響増感剤としてマイクロ又はナノバブル、光線増感剤としてフォトフリンなどを本発明のポリペプチドに結合させて癌組織にターゲッティングさせるものである。
【００２７】
本発明の医薬組成物中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択されるが、通常約0.00001〜70重量%程度の範囲とするのが適当である。
【００２８】
医薬用担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤や賦形剤等を例示でき、これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択使用される。
【００２９】
本発明の医薬組成物の製剤化には、脱水法、凍結乾燥法、安定化剤を加え液剤として用いる方法などの公知の製剤化のための方法を用いることができる。本発明の医薬組成物は、血管内投与法、腹腔内等の局所投与法などで用いることができ、その投与量は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等応じて適宜選択される。
【００３０】
本発明の診断用試薬として、本発明のポリペプチドの甲状腺癌特異性を利用する診断試薬が挙げられる。本発明の好適な診断用試薬として、本発明のポリペプチドを標識化合物の運搬体として使用する診断用試薬が挙げられる。また、本発明のポリペプチド、その二次抗体および検出基質等からなる診断用試薬が好適に挙げられる。本発明の診断用試薬は甲状腺癌の診断用試薬として利用可能である。また、本発明の診断用試薬は、本発明のポリペプチドが認識することができる癌の診断用試薬として利用することができる。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、例えば、本発明のポリヌクレオチドとして、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする配列、又は配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などの変異を有するアミノ酸をコードする配列を含む、甲状腺癌組織で産生される癌関連抗原と反応するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
【００３２】
また、本発明のポリヌクレオチドとして、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする配列、又は配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などの変異を有するアミノ酸をコードする配列を含むポリヌクレオチド、甲状腺組織で産生される癌関連抗原と反応するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
【００３３】
本発明の好適なポリヌクレオチドは、軽鎖可変領域をコードする領域が配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表される、甲状腺癌組織で産生される癌関連抗原と反応するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。当該ポリヌクレオチドは甲状腺癌組織で産生される癌関連抗原と反応するポリペプチドであるという特性を有する限り、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと少なくとも約70%の相同性を示すポリヌクレオチド、又は配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにおいて、1ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異を有するポリヌクレオチドであってもよい。
【００３４】
また、本発明の好適なポリヌクレオチドは、重鎖可変領域をコードする領域が配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表される、甲状腺癌抗原を認識するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。該ポリヌクレオチドは甲状腺癌組織で産生される癌関連抗原と反応するポリペプチドであるという特性を有する限り、配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと少なくとも約70%の相同性を示すポリヌクレオチド、又は配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにおいて、1ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異を有するポリヌクレオチドであってもよい。
【００３５】
本発明の特に好適なポリヌクレオチドは、軽鎖可変領域をコードする領域が配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする配列を含み、かつ、重鎖可変領域をコードする領域が配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする配列を含む、甲状腺癌組織で産生される癌関連抗原と反応するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。その中でも、より好適な本発明のポリヌクレオチドは、軽鎖可変領域をコードする領域が配列表の配列番号１に記載の塩基配列を含み、および／又は重鎖可変領域をコードする領域が配列表の配列番号３に記載の塩基配列を含む、甲状腺癌組織で産生される癌関連抗原を認識するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００３６】
本発明のポリヌクレオチドは、ヒトcDNAライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。当該ポリヌクレオチドを含有するベクターは、当該ポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに自体公知の遺伝子工学的手法で導入することにより得られる。
【００３７】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも１つを含有する組換えベクター並びに該組換えベクターを含有する形質転換体を提供する。前記形質転換体を培養し、発現されたポリペプチド、ポリペプチドを含むタンパク質又は組換え抗体を回収する工程を含む、本発明のポリペプチド、ポリペプチドを含むタンパク質又は組換え抗体の調製をすることができる。得られたポリペプチド、ポリペプチドを含むタンパク質又は組み換え抗体は、プロテインＡカラム、プロテインGカラム及び抗ヒトイムノグロブリン抗体アフィニティーカラム等を用いて精製し、医療用途等に適用することができる。
【００３８】
前記組換えベクターは、原核細胞において発現可能なベクターであってもよいが、真核細胞において発現可能なベクターが好ましく、哺乳動物、昆虫細胞又は植物細胞由来の細胞において発現可能なベクターがより好ましい。また、前記組換えベクターを導入する形質転換体は、大腸菌のような原核細胞であってもよいが、真核細胞が好ましく、哺乳動物、昆虫細胞又は植物細胞由来の細胞がより好ましい。哺乳動物由来の細胞としては、例えば、CHO細胞、COS細胞、繊維芽細胞（例えば、3T3）などを挙げることができる。形質転換には、リポフェクチン法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、DEAE-Dextran法などが好適に用いられる。
【００３９】
本発明のポリペプチド、ポリペプチドを含むタンパク質又は組換え抗体は無細胞系にて発現させることができる。無細胞系とは、in vitro（インビトロ）で蛋白質を合成する系をいう。無細胞系として、鋳型としてのmRNAからの翻訳を行わせるインビトロ翻訳系、又は鋳型としてのDNAから転写及び翻訳を行わせるインビトロ転写翻訳系が挙げられる。これら無細胞系としては、転写、若しくは転写及び翻訳に必要な成分を人工的に混合することにより構築されたもの、細胞抽出物からなる無細胞蛋白質合成系、又は両者を混合することにより構築されたものを用いることができる。無細胞系による蛋白質の合成は、通常、25〜37℃にて約1.5〜4時間反応させることにより行うことができる。
【００４０】
前記無細胞系は、大腸菌等の原核細胞、酵母等の真核細胞、プロトプラスト等の植物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の細胞を主として脱核することにより得られ、転写及び翻訳に必要な各種成分が高含有されている。無細胞系として、大腸菌S30抽出物又は植物種子由来の胚芽抽出物を含有するもの、ウサギ網状赤血球の溶出系、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）抽出液、バキュロウィルスベクター蛋白質発現系、およびアフリカツメガエル卵母細胞抽出液等が好適に用いられる。
【００４１】
植物種子の一例として、コムギ、オオムギ、イネ、コーンおよびホウレンソウが挙げられる。また、非天然アミノ酸の導入に負に働く因子（例えば核酸分解酵素、蛋白質分解酵素、解離因子、酸化・還元酵素等）を破壊（欠損）、又は免疫沈降等により取り除いた大腸菌等の細胞抽出液も好適に用いられる。
【００４２】
また、本発明は、本発明のポリペプチドの認識性を利用する免疫原のスクリーニング方法を提供する。例えば、標識マーカーを結合した本発明のポリペプチドを被検体と反応させることにより、被検体中の免疫原をスクリーニングすることが可能である。
【００４３】
さらに、本発明は本発明のポリペプチドを用いる、ヒト化抗体、ヒトとのキメラ抗体、一本鎖抗体又はＦａｂ抗体の作製方法を提供する。
【実施例】
【００４４】
１．免疫原の調製
ヒト甲状腺癌組織を氷冷下で細切し、5% ショ糖（w/w）含有トリス塩酸（TNE）緩衝液〔0.01 M トリス−塩酸（pH 7.5）、0.15 M NaCl、0.003 M EDTA（pH 8.0）〕中で細胞破砕装置を用いてホモジナイズした。その際、前記トリス塩酸緩衝液は、癌組織1 g当たり5 mlの割合で加え、15秒間破砕後、30秒間冷却する操作を4回繰り返した。次いで、380xgで10分間遠心分離を行ない、細胞の粗塊を除いた後、さらに10,000 xgで10分間遠心分離を行ない目的とする免疫原成分を含む上清（SUP-1）を得た。
【００４５】
次に、SUP-1は50% ショ糖/TNE液上に重層した等量の25% ショ糖/TNE液の上に静かに重層し100,000 xgで遠心を行なった。遠心後、目的とする25% ショ糖と50% ショ糖の境界に薄い円筒状に形成された層（SUP-2）を集めた。さらにチューブ（日立16PA）一本あたり13 ml作製された20〜50%のショ糖連続密度勾配に、1.5 mlの前記上清（SUP-2）を重層し、日立分離用遠心機で4℃、25,000 rpm、12時間遠心分離を行った。遠心分離後、フラクションコレクターを用いて遠心チューブ（16PA）のそこより1.0 mlずつ分画した。分画後、フラクションごとに糖の密度を測定し、1.16〜1.21密度の分画を集め目的の膜分画免疫原とした。
【００４６】
２．マウス脾細胞の免疫化
6週齢のBALB/Cマウスの腹腔に、当量のフロインド完全アジュバントを含むPBS緩衝液 0.3 mlに溶解した前記１にて調製した免疫原100 μgを投与し、1週間後に、当量のフロイント不完全アジュバントを含むＰＢＳ緩衝液0.3 mlに溶解した上記免疫原100 μgを投与した。さらに2週間後、PBS緩衝液 0.3 mlに溶解した50 μgの上記免疫原を尾静脈より投与した。次いで3日後に脾臓を摘出し、ステンレスメッシュ上で分散し脾臓細胞の懸濁液とし、血清不含RPMI-1640培地：グルタミン 2 mM、ピルビン酸ソーダ 1 mM、フンギゾン 0.25 μg/ml、ストレプトマイシン 50 μg、ペニシリン 50 unit/ml添加（不完全培地）で2回洗浄後、全細胞を同培地で2x106 個/mlとなるように調製した。  
【００４７】
３．免疫化脾細胞とマウス骨髄腫細胞との融合
細胞融合に用いるマウス骨髄腫細胞は、BALB/Cマウス由来MOPC-21細胞から誘導されたP3/NS-1/1-Ag1（NS-1）を使用した。まず、RPMI-1640完全培地（グルタミン 2 mM、ピルビン酸ソーダ 1 mM、ファンギゾン 0.25 μg/ml、ストレプトマイシン 50 μg/ml、ペニシリン 50 unit/ml、ウマ血清 15%）で培養した対数増殖期のマウス骨髄腫細胞はRPMI-1640不完全培地で2回洗い、細胞数2x106 個/mlになるように調製した。次に前記２で調製した免疫化マウス脾細胞懸濁液と、上記マウス骨髄腫細胞懸濁液を4：1の割合で混合し、800xgで5分間遠心してペレットを形成させ、上清は完全に取り除いた。このペレットにあらかじめ37℃に加温しておいたポリエチレングリコール（PEG-1500）溶液（RPMI-1640不完全培地で50%濃度に調製した）1 mlを、攪拌しながら徐々に加え、さらに1分間攪拌を続けた。次に、攪拌を続けながら6 mlのRPMI-1640不完全培地を6〜7分間にわたり徐々に加えた。撹拌後、600 xgで5分間遠心分離し、上清を十分に除いた後、RPMI-1640完全培地を加えて細胞数2x106 個/mlの懸濁液とした。
【００４８】
４．ＨＡＴセレクション
前記３で調製した細胞懸濁液を、96穴の組織培養用プレートの各穴に0.1 mlずつ分注し、5% CO2、37℃の培養装置中で培養した。24時間後、各穴の培養液に0.1 mlのHAT培地（ヒポキサンチン、アミノブリテン、及びチミジン含有RPMI-1640完全培地（Littlefield, Science, 145, p.709-710, 1964）を加え培養を続けた。さらに培養開始より2、3、5、8、11、14の各日に、培養液の半量をHAT培地で置換する操作を繰り返した。このHATセレクションにより骨髄腫細胞は死滅し、融合細胞のみ生育可能となる。生育してきた融合細胞（ハイブリドーマ）はRPMI-1640完全培地で培養し、その培養上清を酵素免疫測定法（ELISAアッセイ）の分析試料とした。
【００４９】
５．酵素免疫測定法（ELISAアッセイ）による抗体のスクリーニング
前記１．の方法に従って、ヒト甲状腺癌組織、甲状腺癌のリンパ節転移組織並びにマウス細胞株3T3、T-47D及びKATOIII（ヒト癌細胞株）から調製したものを抗原としてELISAアッセイを行った。これらの抗原を炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリウム緩衝液（NaHCONa2CO3、pH 9.5）にて4 μg/ml濃度に希釈し、96穴のマイクロタイタープレートの各穴に、それぞれ0.1 mlずつ分注した。プレートはシールした後、4℃で一夜静置した。翌朝0.05% ポリオキシエチレンソルブタンモノラウレート（Tween20）を含むPBS緩衝液でよく洗った後、前記４で調製したハイブリドーマの培養液0.1 mlずつを各穴に加え、37℃で6時間あるいは一晩静置した。コントロールとして、抗体を産生していない細胞の培養上清を使用した。
【００５０】
反応終了後のマイクロプレートはPBS（Tween20）でよく洗浄を行なった。次に、PBS緩衝液で希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG（ヤギ産生）を0.1 mlずつ加え、37℃、1時間反応させた。これに酵素基質（過酸化水素及びテトラメチルベンチジン/McIlvain緩衝液）を添加し、発色させた。0.4 N 硫酸による反応停止後、吸光度(A450)を測定し、甲状腺癌及び甲状腺癌のリンパ節転移癌組織から調製した抗原に反応し、マウス由来抗原3T3、および甲状腺癌以外のT47-D及びKATOIIIから調製した抗原に反応しないものを選び出した。ELISA陽性抗体ウエルは更に、病理組織切片染色法により、反応特異性があるクローンを選び、それらのクローンの限界希釈法によるクローニングを行った。
【００５１】
６．組織切片の染色法
ヒト甲状腺癌及び、甲状腺癌のリンパ節転移組織のホルマリン固定パラフィン切片は、キシレン、100%〜70% エタノール溶液に段階的に浸す脱パラフィン操作を行ない、最後にＰＢＳ緩衝液でよく洗浄した。
【００５２】
組織切片は内因性のペルオキシダーゼ反応を除くため、3% H2O2液中で30分間室温にて反応させた。その後、さらに10% ウマ血清を室温で20分間反応させ、非特異的な吸着をブロックした。
反応後はPBS緩衝液で静かに洗浄操作を行なった。組織切片上に前記５でスクリーニングした培養上清（モノクローナル抗体）100 μlを滴下し湿潤箱で4℃、一晩インキュベートした。
【００５３】
ＰＢＳ緩衝液で3回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG（ヤギ産生）（10% ヤギ血清含有PBS緩衝液で100倍に希釈したもの）を室温にて60分間作用させた。更にPBS緩衝液で洗浄後、過酸化水素を添加したDAB（3,3´−ジアミノベンジジン）溶液中に、室温で10分間浸して発色させた。反応後はPBS緩衝液で洗浄操作を行ない、後染色はヘマトキシリン・エオシンで行なった。組織切片は70%〜100%のエタノール、キシレンで段階的な脱水操作を行ない、エンテランでカバーグラス封入したものを抗体染色病理標本とした。
【００５４】
７．限界希釈法
前記５でスクリーニングしたハイブリドーマは単クローン化するための限界稀釈法を行なった。RPMI-1640完全培地で培養したハイブリドーマを、細胞数100 個/ml、50 個/ml、10 個/ml及び5 個/mlに培養液で希釈し、次に、各々の懸濁液を96穴組織培養用プレートに0.1 mlずつ分注し培養した。細胞増殖の認められた穴の培養液を、前記５の酵素免疫測定法（ELISAアッセイ）にしたがい、抗体産生の有無を調べた。この操作を２度繰り返して、単一クローン細胞を得た。
【００５５】
８．抗体の大量生産
BALB/Cマウスはあらかじめ、プリスタン（2, 6, 10, 14- テトラメチルペンタデカン）0.5 mlを腹腔内投与し前処理をしておく。投与20日後に前記７で得た単一クローン化ハイブリドーマ2x105 個をマウス腹腔内に接種した。約1〜3週間後より目的とするモノクローナル抗体を含む腹水が得られた。
【００５６】
９．抗体の精製
前記８より得られた抗体を含有する腹水10 mlに、当量のPBS緩衝液を加え、次いで、当量の飽和硫安溶液を加え、最終的に50% 硫安溶液とした。腹水の硫安溶液は10,000 rpmで15分間遠心分離した後、上清を除去し、抗体タンパク質の沈澱を得た。沈澱として得られたモノクローナル抗体は分子量約90万であり、クラスはIgMであった。得られたモノクローナル抗体をTJT-141と命名した。
【００５７】
１０．組織切片に対する反応性の検討
甲状腺癌、卵巣がん、膵臓癌、肺癌、胃癌、大腸癌のホルマリン固定組織標本、エタノール固定細胞標本を常法に従って調製した。これらの標本を、前記９で得られたモノクローナル抗体（濃度5 μg/ml）を一次抗体、抗マウスIgG-ペルオキシダーゼを二次抗体として用い、前記６で記載した方法従って免疫染色を行った。その結果、TJT-141抗体は甲状腺癌（乳頭癌、濾胞癌）において特に強い反応性が見られ、正常組織とは反応性がなかった。さらに、TJT-141抗体は、卵巣癌、膵臓癌などの内分泌性の腫瘍において反応が見られたが、肺癌、胃癌、大腸癌などにおいては抗原反応が認められなかった。
【００５８】
１１．ハイブリドーマからのＤＮＡ調製
TJT-141抗体産生ハイブリドーマから、QIAGEN社製、Rneasy Mini Kitを用いてトータルRNAを調製した。その後、100 μgのトータルRNAから、5´RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends（Invitrogen社製）を使用して製造元のプロトコールに従い、5´RACE法によりTJT-141抗体の軽鎖および重鎖の目的領域のＤＮＡ配列を得た。
【００５９】
5´RACE法のプライマー、GSP（Gene Specific Primer、遺伝子特異的プライマー）として以下のプライマーを用いた。
軽鎖のcDNA合成用GSP1：ggtgctgtctttgctgt（配列番号５）
軽鎖のcDNA合成用GSP2：ggacgccattttgtcgttcactgccatcaa配列番号６）
重鎖のcDNA合成用GSP1：ggtagttccaggtgaa（配列番号７）
重鎖のcDNA合成用GSP2：ggcagcccatggccaccagattcttatca（配列番号８）
【００６０】
増幅した軽鎖及び重鎖の可変領域ＤＮＡ断片は1% アガロースゲルで電気泳動した。目的の断片はゲラーゼ（エピセンターテクノロジー社製）を用いて精製した。その後、精製した各断片はBig Dye Terminator Cycle Sequenceing Ready Reaction Kit（アプライドバイオシステム社製）を用いてPCR法により蛍光を取り込ませ、アプライドバイオシステム社オートシークエンサー(Model 3700)で解析を行なった。得られた配列を配列表の配列番号１（軽鎖の可変領域）および配列番号３（重鎖の可変領域）に記載した。さらにこれらの各塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号２（軽鎖の可変領域）および配列番号４（重鎖の可変領域）に記載した。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明のポリペプチドを含む生物学的活性を有する甲状腺癌抗原を認識する改変抗体を作成することができる。また、標識マーカーを結合させた本発明のポリペプチドによる甲状腺癌の可視化・診断キットを作成することができる。さらに、本発明のポリペプチドを用いた治療薬の甲状腺癌組織への運搬が可能となり、医療の分野において非常に有用である。
【配列表】
2007061063000001.app