(57)【要約】【課題】カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAを分別して定量する新しい測定技術及びそのためのプライマー対及びプローブを提供することにある。【解決手段】上記カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAの測定に用いられるプローブであって、遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；該プローブ、及び遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーとリバースプライマーとのプライマー対の組合せから選ばれる、カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAの測定キット；並びに該測定キットを用いる、カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAの測定方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カニクイザルにおける下記代謝関連酵素をコードするmRNAの測定に用いられるプローブであって、下記(1)〜(30)の各領域のそれぞれにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドから選ばれることを特徴とするプローブ。
(1)GAPDH遺伝子の183-209の領域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号AB158631での位置）
(2)β-actin遺伝子の236-265の領域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号U20576での位置）
(3)HPRT遺伝子の460-486の領域
(4)B2M遺伝子の53-82の領域
(5)PGK1遺伝子の1138-1160の領域
(6)CYP1A1遺伝子の1313-1347の領域
(7)CYP1A2遺伝子の927-955の領域
(8)CYP2D17遺伝子の431-454の領域
(9)CYP2E1遺伝子の714-742の領域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号S55205での位置）
(10)CYP3A8遺伝子の154-186の領域
(11)MRP1遺伝子の1447-1474の領域
(12)GSS遺伝子の774-801の領域
(13)CTH遺伝子の155-178の領域
(14)albumin遺伝子の91-115の領域域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号AB158629での位置）
(15)MDR1遺伝子の1438-1470の領域
(16)MRP1遺伝子の749-778の領域
(17)PEPT1遺伝子の215-240の領域
(18)OATP1B3遺伝子の1533-1564の領域
(19)UGT1A01遺伝子の619-644の領域
(20)UGT1A06遺伝子の437-464の領域
(21)UGT1A08遺伝子の274-298の領域
(22)UGT1A09遺伝子の279-304の領域
(23)UGT2B18遺伝子の277-315の領域
(24)UGT2B20遺伝子の183-224の領域
(25)UGT2B30遺伝子の681-650の領域
(26)HST遺伝子の250-281の領域
(27)PST遺伝子の742-767の領域
(28)GSTM1遺伝子の495-524の領域
(29)GSTM2遺伝子の498-523の領域
(30)CES1遺伝子の468-491の領域
【請求項２】
リポーター色素とクエンチャー色素とが結合している請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
塩基配列の長さが２０〜４５である請求項１に記載のプローブ。
【請求項４】
配列番号１〜配列番号１４および配列番号４３〜配列番号５８に示される配列のいずれかを含むものである請求項１〜３のいずれかに記載のプローブ。
【請求項５】
配列番号１〜配列番号１４および配列番号４３〜配列番号５８に示される配列のいずれかである請求項１〜３のいずれかに記載のプローブ。
【請求項６】
カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードする遺伝子の下記各領域にそれぞれハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーとリバースプライマーとのプライマー対およびプローブのセットの少なくとも１つを含むカニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAの検出および定量キットであって、上記両プライマー対およびプローブが(1)〜(30)に示される遺伝子の各領域にそれぞれハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドであるキット。
(1)プライマー対；GAPDH遺伝子の157-175領域及び248-228領域、プローブ；183-209領域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号AB158631での位置）
(2)プライマー対；β-actin遺伝子の207-225領域及び289-271領域、プローブ；236-265領域ジーンバンク(GenBank)の登録番号U20576での位置）
(3)プライマー対；HPRT遺伝子の438-458領域及び507-488領域、プローブ；460-486領域
(4)プライマー対；B2M遺伝子の26-46領域及び105-86領域、プローブ；53-82領域
(5)プライマー対；PGK1遺伝子の1096-1116領域及び1183-1163領域、プローブ；1138-1160領域
(6)プライマー対；CYP1A1遺伝子の1284-1304領域及び1385-1365領域、プローブ；1313-1347領域
(7)プライマー対；CYP1A2遺伝子の904-924領域及び982-962領域、プローブ；927-955領域
(8)プライマー対；CYP2D17遺伝子の403-421領域及び544-524領域、プローブ；431-454領域
(9)プライマー対；CYP2E1遺伝子の692-712領域及び775-757領域、プローブ；714-742領域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号S55205での位置）
(10)プライマー対；CYP3A8遺伝子の122-142領域及び221-201領域、プローブ；154-186領域
(11)プライマー対；MRP1遺伝子の1422-1440領域及び1494-1476領域、プローブ；1447-1474領域
(12)プライマー対；GSS遺伝子の751-771領域及び880-860領域、プローブ；774-801領域
(13)プライマー対；CTH遺伝子の130-150領域及び203-183領域、プローブ；155-178領域
(14)プライマー対；albumin遺伝子の61-81領域及び168-148領域、プローブ；91-115領域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号AB158629での位置）
(15)プライマー対；MDR1遺伝子の1414-1434領域及び1500-1480領域、プローブ；1438-1470領域
(16)プライマー対；MRP1遺伝子の714-737領域及び800-782領域、プローブ；749-778領域
(17)プライマー対；PEPT1遺伝子の194-213領域及び262-242領域、プローブ；215-240領域
(18)プライマー対；OATP1B3遺伝子の1507-1531領域及び1587-1570領域、プローブ；1533-1564領域
(19)プライマー対；UGT1A01遺伝子の593-613領域及び678-658領域、プローブ；619-644領域
(20)プライマー対；UGT1A06遺伝子の414-434領域及び496-476領域、プローブ；437-464領域
(21)プライマー対；UGT1A08遺伝子の253-272領域及び333-304領域、プローブ；274-298領域
(22)プライマー対；UGT1A09遺伝子の253-271領域及び353-325領域、プローブ；279-304領域
(23)プライマー対；UGT2B18遺伝子の252-275領域及び352-330領域、プローブ；277-315領域
(24)プライマー対；UGT2B20遺伝子の144-166領域及び287-258領域、プローブ；183-224領域
(25)プライマー対；UGT2B30遺伝子の609-634領域及び709-685領域、プローブ；681-650領域
(26)プライマー対；HST遺伝子の215-235領域及び302-283領域、プローブ；250-281領域
(27)プライマー対；PST遺伝子の716-734領域及び788-769領域、プローブ；742-767領域
(28)プライマー対；GSTM1遺伝子の471-491領域及び638-617領域、プローブ；495-524領域
(29)プライマー対；GSTM2遺伝子の460-480領域及び644-622領域、プローブ；498-523領域
(30)プライマー対；CES1遺伝子の441-461領域及び548-528領域、プローブ；468-491領域
【請求項７】
プローブが、更にリポーター色素とクエンチャー色素とを結合させたものである請求項６に記載の測定キット。
【請求項８】
下記(1)〜(30)に示されるセットの、各配列番号で示される配列を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマー対とプローブとの組合せから選ばれる、請求項７に記載の測定キット。
(1)プライマー対；配列番号１５及び１６、プローブ；配列番号１
(2)プライマー対；配列番号１７及び１８、プローブ；配列番号２
(3)プライマー対；配列番号１９及び２０、プローブ；配列番号３
(4)プライマー対；配列番号２１及び２２、プローブ；配列番号４
(5)プライマー対；配列番号２３及び２４、プローブ；配列番号５
(6)プライマー対；配列番号２５及び２６、プローブ；配列番号６
(7)プライマー対；配列番号２７及び２８、プローブ；配列番号７
(8)プライマー対；配列番号２９及び３０、プローブ；配列番号８
(9)プライマー対；配列番号３１及び３２、プローブ；配列番号９
(10)プライマー対；配列番号３３及び３４、プローブ；配列番号１０
(11)プライマー対；配列番号３５及び３６、プローブ；配列番号１１
(12)プライマー対；配列番号３７及び３８、プローブ；配列番号１２
(13)プライマー対；配列番号３９及び４０、プローブ；配列番号１３
(14)プライマー対；配列番号４１及び４２、プローブ；配列番号１４
(15)プライマー対；配列番号５９及び６０、プローブ；配列番号４３
(16)プライマー対；配列番号６１及び６２、プローブ；配列番号４４
(17)プライマー対；配列番号６３及び６４、プローブ；配列番号４５
(18)プライマー対；配列番号６５及び６６、プローブ；配列番号４６
(19)プライマー対；配列番号６７及び６８、プローブ；配列番号４７
(20)プライマー対；配列番号６９及び７０、プローブ；配列番号４８
(21)プライマー対；配列番号７１及び７２、プローブ；配列番号４９
(22)プライマー対；配列番号７３及び７４、プローブ；配列番号５０
(23)プライマー対；配列番号７５及び７６、プローブ；配列番号５１
(24)プライマー対；配列番号７７及び７８、プローブ；配列番号５２
(25)プライマー対；配列番号７９及び８０、プローブ；配列番号５３
(26)プライマー対；配列番号８１及び８２、プローブ；配列番号５４
(27)プライマー対；配列番号８３及び８４、プローブ；配列番号５５
(28)プライマー対；配列番号８５及び８６、プローブ；配列番号５６
(29)プライマー対；配列番号８７及び８８、プローブ；配列番号５７
(30)プライマー対；配列番号８９及び９０、プローブ；配列番号５８
【請求項９】
請求項８に記載の測定キットであって、(1)のセットがGAPDHの測定用で、(2)のセットがβ-actinの測定用で、(3)のセットがHPRTの測定用で、(4)のセットがB2Mの測定用で、(5)のセットがPGK1の測定用で、(6)のセットがCYP1A1の測定用で、(7)のセットがCYP1A2の測定用で、(8)のセットがCYP2D17の測定用で、(9)のセットがCYP2E1の測定用で、(10)のセットがCYP3A8の測定用で、(11)のセットがMRP1の測定用で、(12)のセットがGSSの測定用で、(13)のセットがCTHの測定用で、(14)のセットがalbuminの測定用で、(15)のセットがMDR1の測定用で、(16)のセットがMRP1（再設計分）の測定用で、(17)のセットがPEPT1の測定用で、(18)のセットがOATP1B3の測定用で、(19)のセットがUGT1A01の測定用で、(20)のセットがUGT1A06の測定用で、(21)のセットがUGT1A08の測定用で、(22)のセットがUGT1A09の測定用で、(23)のセットがUGT2B18の測定用で、(24)のセットがUGT2B20の測定用で、(25)のセットがUGT2B30の測定用で、(26)のセットがHSTの測定用で、(27)のセットがPSTの測定用で、(28)のセットがGSTM1の測定用で、(29)のセットがGSTM2の測定用で、(30)のセットがCES1の測定用である測定キット。
【請求項１０】
請求項８に記載の(1)〜(30)に示されるセットの、各配列番号で示される配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー対とプローブとの組合せから選ばれる、請求項９に記載の測定キット。
【請求項１１】
カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAを含む検体について、請求項６〜１０のいずれかに記載の測定キットを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、用いたプローブの加水分解の有無を測定することを特徴とするカニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAの測定方法。
【請求項１２】
加水分解の有無が、励起光照射による蛍光の発色の有無によりなされる請求項１１に記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カニクイザルにおける代謝関連酵素のｍＲＮＡの測定方法及びそのためのプローブ及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
新薬を開発する上で、カニクイザルを用いた試験は一般的に行なわれている。
【０００３】
上記新薬を開発する上では、該新薬を投与した際のカニクイザルにおける各種の代謝関連酵素（酵素）の働き（発現量の増減）を把握することは重要である。何故なら、カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素の変動が判らないと、該新薬と併用される併用薬剤の効力や副作用の増減或いは併用薬剤や他の摂取物による新薬の効力や副作用の起こる機構が予測できず、該新薬の安全性を確認することができないからである。
【０００４】
そこで、上記新薬開発等の分野においては、かかるカニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAに関する情報、特にこれら各カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAを区別して測定できる測定技術の開発が、要望されている。かかる技術が開発できれば、例えば、新薬の他剤との相互作用や特殊病態時における影響の機構解明が容易にでき、該新薬の副作用に関する有用な情報を得ることができ、かくして新薬の安全性を確保することができる。
【０００５】
一方、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）は、核酸の増幅法として広く知られており、例えばＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription-PCR）、コンペティティブＲＴ−ＰＣＲ等が微量のmRNAの検出、定量に威力を発揮している。
【０００６】
近年、ＰＣＲを利用したリアルタイム定量検出法が確立された（Taq Man PCR (Genome Res., 6(10), 986 (1996)), ABI PRISMTM Sequence Detection System (Applied Biosystems社)）。これは、特定の蛍光標識プローブ（TaqMan probe）を用いて核酸を測定する方法である。より詳しくは、例えば５’末端にリポーター色素及び３’末端にクエンチャー色素を付加して蛍光標識したプローブをターゲットＤＮＡにアニールさせた状態で、通常のＰＣＲ反応を行なわせると、伸長反応の進行に伴って、ＤＮＡポリメラーゼの有する５′−３′エキソヌクレアーゼ活性により、上記プローブが５’末端から加水分解される。その結果、５’末端のリポーター色素が３’末端のクエンチャー色素から離れ、これにより、当初一定の空間的距離を保っていたことによるＦＲＥＴ（Fluoresence Resonance Energy Transfer, 両蛍光色素の共鳴によるリポーター色素のエネルギー順位の低下に基づく蛍光強度の低下現象）効果がなくなり、クエンチャー色素により制御されていたリポーター色素の蛍光強度が増加し、かくして、該蛍光強度の増加を測定することによって、ターゲット核酸をリアルタイムに選択的に定量検出できるのである。この方法によれば、ＰＣＲ反応後に増幅物を例えばアガロースゲル電気泳動して、泳動パターンを解析する等の複雑な工程が不要となり、短時間で且つ同時に多種のサンプルを定量できる利点がある。
先に上記ＰＣＲによるリアルタイム検出法に着目し、これをヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素の検出に利用することが提案されている（特許文献１）。
【０００７】
本発明者らは、上記ＰＣＲによるリアルタイム検出法に着目し、これが、カニクイザルにおける代謝関連酵素をコードするmRNAの検出に利用できれば、同じ装置を用いて同時に同一のＰＣＲ条件で上記各mRNAを区別して測定、検出できるとの着想から、鋭意研究を重ねた。
【０００８】
しかるに、カニクイザルにおける代謝関連酵素をコードするmRNAは、それぞれのmRNAの配列は知られているものの、これらをターゲット遺伝子として、同一ＰＣＲ条件で充分に増幅し得、更に、該ターゲット遺伝子の特定位置にハイブリダイズし得る各プライマー対としてのオリゴヌクレオチドの検索自体困難であると考えられた。また、かかるプライマー対に挟まれた特定領域に、同一ＰＣＲ条件下にこれらのプライマーよりも早くハイブリダイズし得、しかもカニクイザルにおける特異的なプローブの構築もまた、同様に困難であると考えられた。特に、ヌクレオチド配列が既知の２つの核酸のハイブリダイズのし易さは、融点（Ｔｍ）の計算によりある程度推定することはできるものの、この推定によって選択したプライマーとプローブとの組合せが、必ずしもＤＮＡ測定において好結果をもたらすわけではないことが知られていることより、現在知られているカニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAについて、これらを同時に区別して測定可能な、上記ＰＣＲによるリアルタイム検出用の各プライマー対とプローブとの組合せの選択には、熟練者の試行錯誤による多大な実験等が必要となると予想された。
【特許文献１】特開２００２−８５０６６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAのＰＣＲによる測定法、特にリアルタイム検出法の確立と、そのためのプローブ及びプライマー対を提供することにある。
【００１０】
本発明者らは、上記目的よりカニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAについて、更に、多大な実験、研究を繰返し行った結果、１４種類の各カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAに対する目的のプライマー対及びプローブの組合せを提供することに成功し、ここに下記要旨の本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明によれば、カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAの測定に用いられるプローブであって、下記(1)〜(30)の各領域のそれぞれにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドから選ばれることを特徴とするプローブ；特にリポーター色素とクエンチャー色素とが結合している該プローブ；塩基配列の長さが２０〜４５である該プローブ；配列番号１〜配列番号１４および配列番号４３〜配列番号５８に示される配列のいずれかを含む該プローブ；並びに配列番号１〜配列番号１４および配列番号４３〜配列番号５８に示される配列のいずれかである該プローブが提供される。
(1)GAPDH遺伝子の183-209の領域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号AB158631での位置）
(2)β-actin遺伝子の236-265の領域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号U20576での位置）
(3)HPRT遺伝子の460-486の領域
(4)B2M遺伝子の53-82の領域
(5)PGK1遺伝子の1138-1160の領域
(6)CYP1A1遺伝子の1313-1347の領域
(7)CYP1A2遺伝子の927-955の領域
(8)CYP2D17遺伝子の431-454の領域
(9)CYP2E1遺伝子の714-742の領域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号S55205での位置）
(10)CYP3A8遺伝子の154-186の領域
(11)MRP1遺伝子の1447-1474の領域
(12)GSS遺伝子の774-801の領域
(13)CTH遺伝子の155-178の領域
(14)albumin遺伝子の91-115の領域域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号AB158629での位置）
(15)MDR1遺伝子の1438-1470の領域
(16)MRP1遺伝子の749-778の領域
(17)PEPT1遺伝子の215-240の領域
(18)OATP1B3遺伝子の1533-1564の領域
(19)UGT1A01遺伝子の619-644の領域
(20)UGT1A06遺伝子の437-464の領域
(21)UGT1A08遺伝子の274-298の領域
(22)UGT1A09遺伝子の279-304の領域
(23)UGT2B18遺伝子の277-315の領域
(24)UGT2B20遺伝子の183-224の領域
(25)UGT2B30遺伝子の681-650の領域
(26)HST遺伝子の250-281の領域
(27)PST遺伝子の742-767の領域
(28)GSTM1遺伝子の495-524の領域
(29)GSTM2遺伝子の498-523の領域
(30)CES1遺伝子の468-491の領域
ここで、上記(1)〜(5)の遺伝子は、代謝に直接関与する酵素をコードするものではないが、所謂ハウスキーピング遺伝子として知られており、各酵素の発現量を定量するための比較対象として、これらの発現量を測定することが重要である。また、上記(6)〜(10)の遺伝子は、薬物代謝酵素Ｐ４５０の各分子種をコードする遺伝子であり、これらの発現量を定量することは極めて重要である。更に、(11)〜(18)の遺伝子も薬物の代謝、輸送などに関与する遺伝子であり、薬の安全性を確認するためには、これらの発現量を定量することは大きな意義がある。また、(19)〜(29)の遺伝子は、薬物代謝の第II相反応に関与する酵素の各分子種をコードする遺伝子であり、これらの発現量を定量することは極めて重要である。(30)の遺伝子はカルボン酸エステルやアミド及びチオエステルを基質とする加水分解酵素であるカルボキシエステラーゼの分子種の１つをコードする遺伝子であり、この発現量を定量することも極めて重要である。
【００１２】
また、本発明によれば、カニクイザルにおける各種の蛋白質をコードする遺伝子の下記各領域にそれぞれハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーとリバースプライマーとのプライマー対およびプローブのセットの少なくとも１つを含むカニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAの検出および定量キットであって、上記両プライマー対およびプローブが(1)〜(30)に示される遺伝子の各領域にそれぞれハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドであるキット。
(1)プライマー対；GAPDH遺伝子の157-175領域及び248-228領域、プローブ；183-209領域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号AB158631での位置）
(2)プライマー対；β-actin遺伝子の207-225領域及び289-271領域、プローブ；236-265領域ジーンバンク(GenBank)の登録番号U20576での位置）
(3)プライマー対；HPRT遺伝子の438-458領域及び507-488領域、プローブ；460-486領域
(4)プライマー対；B2M遺伝子の26-46領域及び105-86領域、プローブ；53-82領域
(5)プライマー対；PGK1遺伝子の1096-1116領域及び1183-1163領域、プローブ；1138-1160領域
(6)プライマー対；CYP1A1遺伝子の1284-1304領域及び1385-1365領域、プローブ；1313-1347領域
(7)プライマー対；CYP1A2遺伝子の904-924領域及び982-962領域、プローブ；927-955領域
(8)プライマー対；CYP2D17遺伝子の403-421領域及び544-524領域、プローブ；431-454領域
(9)プライマー対；CYP2E1遺伝子の692-712領域及び775-757領域、プローブ；714-742領域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号S55205での位置）
(10)プライマー対；CYP3A8遺伝子の122-142領域及び221-201領域、プローブ；154-186領域
(11)プライマー対；MRP1遺伝子の1422-1440領域及び1494-1476領域、プローブ；1447-1474領域
(12)プライマー対；GSS遺伝子の751-771領域及び880-860領域、プローブ；774-801領域
(13)プライマー対；CTH遺伝子の130-150領域及び203-183領域、プローブ；155-178領域
(14)プライマー対；albumin遺伝子の61-81領域及び168-148領域、プローブ；91-115領域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号AB158629での位置）
(15)プライマー対；MDR1遺伝子の1414-1434領域及び1500-1480領域、プローブ；1438-1470領域
(16)プライマー対；MRP1遺伝子の714-737領域及び800-782領域、プローブ；749-778領域
(17)プライマー対；PEPT1遺伝子の194-213領域及び262-242領域、プローブ；215-240領域
(18)プライマー対；OATP1B3遺伝子の1507-1531領域及び1587-1570領域、プローブ；1533-1564領域
(19)プライマー対；UGT1A01遺伝子の593-613領域及び678-658領域、プローブ；619-644領域
(20)プライマー対；UGT1A06遺伝子の414-434領域及び496-476領域、プローブ；437-464領域
(21)プライマー対；UGT1A08遺伝子の253-272領域及び333-304領域、プローブ；274-298領域
(22)プライマー対；UGT1A09遺伝子の253-271領域及び353-325領域、プローブ；279-304領域
(23)プライマー対；UGT2B18遺伝子の252-275領域及び352-330領域、プローブ；277-315領域
(24)プライマー対；UGT2B20遺伝子の144-166領域及び287-258領域、プローブ；183-224領域
(25)プライマー対；UGT2B30遺伝子の609-634領域及び709-685領域、プローブ；681-650領域
(26)プライマー対；HST遺伝子の215-235領域及び302-283領域、プローブ；250-281領域
(27)プライマー対；PST遺伝子の716-734領域及び788-769領域、プローブ；742-767領域
(28)プライマー対；GSTM1遺伝子の471-491領域及び638-617領域、プローブ；495-524領域
(29)プライマー対；GSTM2遺伝子の460-480領域及び644-622領域、プローブ；498-523領域
(30)プライマー対；CES1遺伝子の441-461領域及び548-528領域、プローブ；468-491領域
【００１３】
上記キットを構成するプライマー対とプローブとの組合せ（セット）の好ましいものとしては、下記(1)〜(30)から選ばれる各配列番号で示される配列を含むもの、より好ましくは各配列番号で示される配列のものを挙げることができる。
(1)プライマー対；配列番号１５及び１６、プローブ；配列番号１
(2)プライマー対；配列番号１７及び１８、プローブ；配列番号２
(3)プライマー対；配列番号１９及び２０、プローブ；配列番号３
(4)プライマー対；配列番号２１及び２２、プローブ；配列番号４
(5)プライマー対；配列番号２３及び２４、プローブ；配列番号５
(6)プライマー対；配列番号２５及び２６、プローブ；配列番号６
(7)プライマー対；配列番号２７及び２８、プローブ；配列番号７
(8)プライマー対；配列番号２９及び３０、プローブ；配列番号８
(9)プライマー対；配列番号３１及び３２、プローブ；配列番号９
(10)プライマー対；配列番号３３及び３４、プローブ；配列番号１０
(11)プライマー対；配列番号３５及び３６、プローブ；配列番号１１
(12)プライマー対；配列番号３７及び３８、プローブ；配列番号１２
(13)プライマー対；配列番号３９及び４０、プローブ；配列番号１３
(14)プライマー対；配列番号４１及び４２、プローブ；配列番号１４
(15)プライマー対；配列番号５９及び６０、プローブ；配列番号４３
(16)プライマー対；配列番号６１及び６２、プローブ；配列番号４４
(17)プライマー対；配列番号６３及び６４、プローブ；配列番号４５
(18)プライマー対；配列番号６５及び６６、プローブ；配列番号４６
(19)プライマー対；配列番号６７及び６８、プローブ；配列番号４７
(20)プライマー対；配列番号６９及び７０、プローブ；配列番号４８
(21)プライマー対；配列番号７１及び７２、プローブ；配列番号４９
(22)プライマー対；配列番号７３及び７４、プローブ；配列番号５０
(23)プライマー対；配列番号７５及び７６、プローブ；配列番号５１
(24)プライマー対；配列番号７７及び７８、プローブ；配列番号５２
(25)プライマー対；配列番号７９及び８０、プローブ；配列番号５３
(26)プライマー対；配列番号８１及び８２、プローブ；配列番号５４
(27)プライマー対；配列番号８３及び８４、プローブ；配列番号５５
(28)プライマー対；配列番号８５及び８６、プローブ；配列番号５６
(29)プライマー対；配列番号８７及び８８、プローブ；配列番号５７
(30)プライマー対；配列番号８９及び９０、プローブ；配列番号５８
【００１４】
また、上記各セットはそれぞれ以下のカニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAの測定用であることができる。
(1)のセット；GAPDH測定用
(2)のセット；β-actin測定用
(3)のセット；HPRT測定用
(4)のセット；B2M測定用
(5)のセット；PGK1測定用
(6)のセット；CYP1A1測定用
(7)のセット；CYP1A2測定用
(8)のセット；CYP2D17測定用
(9)のセット；CYP2E1測定用
(10)のセット；CYP3A8測定用
(11)のセット；MRP1測定用
(12)のセット；GSS測定用
(13)のセット；CTH測定用
(14)のセット；albumin測定用
(15)のセット；MDR1の測定用
(16)のセット；MRP1（再設計分）の測定用
(17)のセット；PEPT1の測定用
(18)のセット；OATP1B3の測定用
(19)のセット；UGT1A01の測定用
(20)のセット；UGT1A06の測定用
(21)のセット；UGT1A08の測定用
(22)のセット；UGT1A09の測定用
(23)のセット；UGT2B18の測定用
(24)のセット；UGT2B20の測定用
(25)のセット；UGT2B30の測定用
(26)のセット；HSTの測定用
(27)のセット；PSTの測定用
(28)のセット；GSTM1の測定用
(29)のセット；GSTM2の測定用
(30)のセット；CES1の測定用
本発明によれば、更にカニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAを含む検体について、上記いずれかに記載の測定キットを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲを含む）を行い、用いたプローブの加水分解の有無を測定することを特徴とするヒトにおける核内レセプター、転写因子などの蛋白質をコードするmRNAの測定方法、特に上記加水分解の有無が、励起光照射による蛍光の発色の有無によりなされる上記測定方法が提供される。
【００１５】
より詳しくは、フォーワードプライマー及びリバースプライマーのプライマー対並びにレポーター色素とクエンチャー色素を有し上記両プライマーに挟まれた領域内で鋳型核酸とハイブリダイズするプローブを用いて、５′−３′エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼによりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって、ヒトにおけるレセプター関連の蛋白質をコードする遺伝子を測定するリアルタイム検出方法が提供される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係わるカニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAのリアルタイム検出方法は、同一ＰＣＲ乃至ＲＴ−ＰＣＲ反応条件下にリアルタイムで簡便且つ迅速に、各種、カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAを定量できるものであり、その確立は、臨床分野において非常に有益である。
【００１７】
また、カニクイザルより手術で摘出した組織やバイオプシーにより摘出した組織中のカニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNA発現を見る上で、迅速且つ多種の試料を処理でき、また、僅かな組織片から抽出した全ＲＮＡで検出可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明方法に利用するプローブ及びプライマー対につき詳述すれば、これら各プローブ及びプライマーは、上述した通り、カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードする遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドから選択される。
【００１９】
ここで「ハイブリダイズする」とは、後述するＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の条件でハイブリダイズすることをいう。
【００２０】
本発明に係わるプローブ及びプライマーに共通する要件としては、増幅生成物が５０〜４００塩基対の長さであること、プライマーとプローブができる限り近接していること、配列に含まれるＧ（グアニン）及びＣ（シトシン）の割合がなるべく５０％前後であること、Ｇ（グアニン）が４つ以上連続していないことを挙げることができる。また、その他の本発明プローブにみられる要件としてはＴｍ値が７０℃前後であることを挙げることができ、同様にプライマーにはＴｍ値が６０℃前後であることを挙げることができる。
【００２１】
それぞれのmRNA配列は公知であり、それぞれジーンバンク（GenBank）に以下の登録番号で登録されている。
(1)GAPDH遺伝子；AB158631
(2)β-actin遺伝子；U20576
(3)HPRT遺伝子；S43335
(4)B2M遺伝子；AF485817
(5)PGK1遺伝子；AB125189
(6)CYP1A1遺伝子；D17575
(7)CYP1A2遺伝子；D86474
(8)CYP2D17遺伝子；U38218
(9)CYP2E1遺伝子；S55205
(10)CYP3A8遺伝子；S53047
(11)MRP1遺伝子；AY146672
(12)GSS遺伝子；AB083314
(13)CTH遺伝子；AB125160
(14)albumin遺伝子；AB158629
(15)MDR1遺伝子；AF537134
(16)MRP1遺伝子；AY146672
(17)PEPT1遺伝子；AY289936
(18)OATP1B3遺伝子；AY787036
(19)UGT1A01遺伝子；AF104339
(20)UGT1A06遺伝子；AF104337
(21)UGT1A08遺伝子；AF104338
(22)UGT1A09遺伝子；AF104336
(23)UGT2B18遺伝子；AF016310
(24)UGT2B20遺伝子；AF072223
(25)UGT2B30遺伝子；AF401657
(26)HST遺伝子；D85521
(27)PST遺伝子；D85514
(28)GSTM1遺伝子；AF200709
(29)GSTM2遺伝子；AF200710
(30)CES1遺伝子；AB010633
【００２２】
本明細書において、カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAの特定領域の表示は、いずれも上記各登録番号で登録された遺伝子の開始コドンからの配列に従うものである。
【００２３】
これら各プライマー及びプローブ用のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド数は、少なくとも１５個、通常１５〜５０個、好ましくは２０〜４５個の範囲にあるのがよい。これらプライマー及びプローブのヌクレオチド数が上記よりあまりに多くなりすぎると、１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズしにくくなり、逆にあまりに小さすぎると、ハイブリダイゼーションの特異性が低下する。
【００２４】
プライマー及びプローブの特定のヌクレオチド配列の好ましい具体的配列の例は、前述したとおり、各分子種に応じてそれぞれ、配列番号１〜１４、４３〜５８（プローブの場合）並びに配列番号１５〜４２、５９〜９０（プライマーの場合）に示されるとおりである。
【００２５】
尚、例えば２０ヌクレオチドからなるプライマー又はプローブは、鋳型鎖との間に少数のミスマッチが存在してもハイブリダイズし、ＰＣＲのプライマーとして又は検出用プローブとして機能し得ることが知られている。従って本発明プライマー及びプローブもまた、上記の特定のヌクレオチド配列を有するものに限定されず、これをその一部として含むものや、この配列中の例えば２個以下のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は付加による修飾のなされた配列を包含することができる。
【００２６】
上記本発明プローブ及びプライマーとしての各オリゴヌクレオチドは、常法に従い、自動合成機、例えばＤＮＡシンセサイザー（パーキンエルマー社）等を用いて容易に合成することができ、得られるオリゴヌクレオチドは更に必要に応じて、市販の精製用カートリッジ等を用いて精製することもできる。
【００２７】
本発明のリアルタイム検出用プローブは、その一端、例えば５′−末端にレポーター色素を結合しており、そして他端、例えば３′−末端にクエンチャー色素を結合している。レポーター色素は、例えば励起光の照射によって蛍光を発する物質であり、クエンチャー色素は、該レポーター色素に距離的に接近して存在する場合レポーター色素に作用してその蛍光の発生を消去する作用を有するものであることができる。該レポーター色素の例としては、例えば６−カルボキシ−フルオレッセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＴＥＴ）、２，７−ジメトキシ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＪＯＥ）、ヘキソクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＨＥＸ）等が挙げられる。クエンチャー色素の例としては、例えば６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）等が挙げられる。
【００２８】
本発明プローブは、前記特定配列のプローブ用オリゴヌクレオチドにレポーター色素及びクエンチャー色素を結合させることにより調製できる。例えばプローブの５′側は、通常数個のメチレン鎖をリンカーとし、末端のリン酸基にＦＡＭ分子をリン酸エステルの形で結合させることができる。また、３′側には、下に示す構造単位を介してアミド結合によりＴＡＭＲＡ分子を結合させ得る。
【００２９】
【化１】
2007289142.tif 000002
【００３０】
以下、本発明プライマー対及びプローブを利用したＰＣＲによるリアルタイム検出法につき詳述する。
【００３１】
本発明方法は、前述した本発明プライマー対及びプローブを利用することを必須として、他は公知のＰＣＲ法（例えば、Science, 230, 1350 (1985)参照）、ＲＴ−ＰＣＲ（Genome Res., 6(10), 986 (1996)参照）等、特にリアルタイム検出法（例えばTaqMan PCR, ABI PRISMTM 7700 SEQUENCE DETECTION SYSTEM, Applied Biosystems, Ver1, June 1996参照）に従い実施することができる。
【００３２】
前記方法は、特に本発明が対象とするカニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAの発現量の測定方法として、mRNAを測定する場合に有用である。この場合、特定のカニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAを発現している生体組織を採取し、常法に従って全ＲＮＡを抽出し、次にそれに対して相補性のｃＤＮＡを常法に従って合成した後、本発明プライマー対とプローブとを用いて、ＰＣＲを行えばよい。また、常法に従って全ＲＮＡを抽出後、本発明プライマーとプローブとを用いて、直接ＲＴ−ＰＣＲを行なうこともできる。
【００３３】
ＰＣＲ反応、ＲＴ−ＰＣＲ反応は、基本的には公知の方法に従うことができる。それらの反応条件も公知の方法に準じて適宜決定することができ、特に異なるものではない。具体的には、後記実施例に示す条件を好ましく採用できる。
【００３４】
検出も、基本的には常法に従って、例えば、アルゴンレーザ光をＰＣＲ反応液に照射し、放射される蛍光をＣＣＤカメラを用いて検出することにより行なうことができる。
【００３５】
かくして、本発明方法の実施によって、所期のハウスキーピング遺伝子、薬物代謝酵素やトランスポーターなどの調節に関与する各カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAを容易且つ迅速に、しかも各カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNA毎に測定、検出することができる。
【００３６】
本発明は更に、上記方法の実施のためのキットをも提供する。このキットは上記プライマー対及びプローブを含んでなる。本発明キットには、対照として使用することのできる既知の核酸や、該核酸を測定するためのプライマー対及びプローブを更に含んでいてもよい。
【００３７】
本発明方法によれば、カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAをそのカニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNA毎に測定、検出できるため、これによって、カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAの定量が迅速に、精度よく行なうことができる。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を更に詳しく説明するため試験例及び実施例を挙げる。
【００３９】
[リアルタイム検出法による検量線の作成]
(1)試験方法
本試験で採用したリアルタイムワンステップＲＴ−ＰＣＲ法は、９６ウエルを用いて、最大９６の異なった反応を同時に実施して、一度に最大９６の検体を測定できるものである。また、１チューブ内でＲＴ反応とＰＣＲ反応とを行なうことができる。さらに、３８４ウエルでの測定も可能である。
【００４０】
本定量の原理は、隣接した２種類の蛍光色素を用いて、一方の色素（リポーター色素）の蛍光波長と他方の色素（クエンチャー色素）の励起光波長との間で、波長領域が重なる場合に生じるＦＲＥＴを利用したものである。ＦＲＥＴを生じる２種の蛍光色素を両末端に結合させたプローブ（TaqMan probe）がＰＣＲで増幅した特定のヒトにおける核内レセプター、転写因子などの蛋白質をコードするmRNA種由来のｃＤＮＡにハイブリダイゼーションし、この状態でＰＣＲの伸長反応が始まり、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの有する５’−３’エンドヌクレアーゼ活性によってＴａｑＭａｎプローブが加水分解され、リポーター色素が脱離し、クエンチャー色素との間の物理的距離が生じ、ＦＲＥＴによって抑制されていたリポーター色素の蛍光強度が増加し、この蛍光強度の増加はＰＣＲの増幅産物の増加量に比例するため、これをＰＣＲ反応毎に測定することによって、所望の定量が可能となる。
【００４１】
本試験では、プローブの５’末端側にはリポーター色素としてＦＡＭを、３’末端側にはクエンチャー色素としてＴＡＭＲＡを使用した。これら各色素の結合及びこれによるＴａｑＭａｎプローブの作成は、文献記載の方法（Genome Res., 6(10), 986 (1996)）に従って行なった。
【００４２】
また、各プライマー及びプローブとしてのオリゴヌクレオチドは、自動シンセサイザーとしてＡＢＩ社製のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を利用して、基質（ｄＮＴＰ）及び規定の試薬を用いて合成した。
【００４３】
検体ＲＮＡとしては、カニクイザルの肝臓より精製された全ＲＮＡを用いた。尚、これらの全ＲＮＡはカニクイザルの各組織よりRneasyR Mini kit（QIAGEN社製）を用いて調製した。
【００４４】
カニクイザルの肝臓プールより精製された全ＲＮＡは、ＲＮａｓｅフリーの水で希釈し、２０μｇ／ｍＬとし、検量線作成用とした。以後は、５０μｇ／ｍＬのイーストｔＲＮＡ（Yeast tRNA, GIBCO社製）を用いて、５倍公比で希釈した。測定には５μＬを使用した。
【００４５】
ＲＴ−ＰＣＲ反応は、３００ｎＭフォーワードプライマー、９００ｎＭリバースプライマー及び２００ｎＭ TaqManプローブを含むTaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit (PE Applied Biosystems)を用いて、５０μＬ／チューブの系で、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭTM７７００  Sequence Detection System（PE Applied Biosystems）にて行なった。
【００４６】
温度条件は、４８℃で３０分間、９５℃で１０分間で保温した後、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間のサイクルを５０回行い、各サイクルごとに蛍光強度を測定した。
【００４７】
下記表１に示す各カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAに対して各配列番号に示される配列のプライマー対及びプローブを用いて行った上記試験の結果（検量線）を表２に示す。
【００４８】
【表１】
2007289142.tif 000003
【００４９】
◎
【表２】
2007289142.tif 000004
【００５０】
上記表２より、１０００００ｐｇ全ＲＮＡ／５０μＬ反応液量から５倍公比で希釈された検量線を作成したところ、定量下限は１．２８ｐｇ全ＲＮＡ／５０μＬ反応液量から４０００ｐｇ全ＲＮＡ／５０μＬ反応液量であり、検量線の相関係数（ｒ）は全てにおいて０．９９以上であった。
【配列表】
2007289142000001.app