(57)【要約】      （修正有）【課題】哺乳類における血管外傷又は疾病に続く狭窄を阻害するための方法の提供。【解決手段】治療的有効量の持効性形のサイトカラシンＢ、タキソール等の細胞骨格インヒビターを生物分解性被膜等に含み、さらに血管平滑筋細胞の細胞表面と特定の態様で会合する血管平滑筋結合タンパク質を含む、管内ステント。当該管内ステントを宿主に投与することを含んで成る、哺乳類における血管外傷又は疾病に続く狭窄を阻害するための方法。【選択図】図１４
2007075623.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
管内ステントの配置に続いて、狭窄を阻害し、又は再狭窄を減じるのに有効な量の細胞骨格インヒビターを含んで成る管内ステント。
【請求項２】
管内ステントの配置に続いて、狭窄を阻害し、又は再狭窄を減じるのに有効な量の平滑筋増殖インヒビターを含んで成る管内ステント。
【請求項３】
前記細胞骨格インヒビターがサイトカラシンＢ又はその類似体を含んで成る請求の範囲第１項記載の管内ステント。
【請求項４】
前記細胞骨格インヒビターがタキソール又はその類似体を含んで成る請求の範囲第１項記載の管内ステント。
【請求項５】
平滑筋細胞増殖のインヒビターをさらに含んで成る請求の範囲第１項記載の管内ステント。
【請求項６】
前記ステントが細胞骨格インヒビターをさらに含んで成る請求の範囲第２項記載の管内ステント。
【請求項７】
前記細胞骨格インヒビターがサイトカラシンＢ又はその類似体を含んで成る請求の範囲第６項記載の管内ステント。
【請求項８】
前記細胞骨格インヒビターがタキソール又はその類似体を含んで成る請求の範囲第６項記載の管内ステント。
【請求項９】
持効性形での前記細胞骨格インヒビターを含んで成る請求の範囲第１又は６項記載の管内ステント。
【請求項１０】
前記細胞骨格インヒビターがサイトカラシンＢ又はその類似体を含んで成る請求の範囲第９項記載の管内ステント。
【請求項１１】
前記細胞骨格インヒビターがタキソール又はその類似体を含んで成る請求の範囲第９項記載の管内ステント。
【請求項１２】
前記細胞骨格インヒビターの持効性形が、平滑筋細胞、支質細胞、又は平滑筋細胞を取り囲む間質マトリックスに特異的に結合することができる結合ペプチド又はタンパク質を含んで成る請求の範囲第９項記載の管内ステント。
【請求項１３】
前記ステントが、細胞骨格インヒビターを含んで成る生物分解性被膜、又は多孔性又は浸透性非生物分解性被膜を含んで成る請求の範囲第１又は６項記載の管内ステント。
【請求項１４】
前記被膜が生物分解性である請求の範囲第13項記載の管内ステント。
【請求項１５】
前記被膜が多孔性である請求の範囲第13項記載の管内ステント。
【請求項１６】
前記被膜が前記細胞骨格インヒビターの持効性形を含んで成る請求の範囲第13項記載の管内ステント。
【請求項１７】
前記細胞骨格インヒビターがサイトカラシンＢ又はその類似体を含んで成る請求の範囲第16項記載の管内ステント。
【請求項１８】
前記細胞骨格インヒビターがタキソール又はその類似体を含んで成る請求の範囲第16項記載の管内ステント。
【請求項１９】
金属又はプラスチックを含んで成る請求の範囲第１又は２項記載の管内ステント。
【請求項２０】
生物分解性材料を含んで成る請求の範囲第１又は２項記載の管内ステント。
【請求項２１】
生物分解性材料から実質的に成る請求の範囲第20項記載の管内ステント。
【請求項２２】
外傷を与えられた哺乳類管を処理するための方法であって、移植片管の手術による切除又は単離に続いて、その移植片管の移植に続いての移植片管の管腔領域における管の縮小を減じ又は妨げるのに有効な量での治療剤に前記移植片管を暴露することを含んで成る方法。
【請求項２３】
前記治療剤への暴露が前記管の注入を通してである請求の範囲第22項記載の方法。
【請求項２４】
前記注入が、約 0.2〜１大気圧で約２〜４分の時間での圧力注入により成される請求の範囲第23項記載の方法。
【請求項２５】
前記治療剤が細胞骨格インヒビターを含んで成る請求の範囲第22項記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞骨格インヒビターがサイトカラシンＢ又はその類似体を含んで成る請求の範囲第25項記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞骨格インヒビターがタキソール又はその類似体を含んで成る請求の範囲第25項記載の方法。
【請求項２８】
前記投与される治療剤の量が、前記外傷を与えられた管の狭窄又は再狭窄を阻害するのに十分である請求の範囲第22項記載の方法。
【請求項２９】
管腔領域を維持するための方法であって、血管内ステントの配置に対しての狭窄又は再狭窄を減じるのに有効な量の細胞骨格インヒビターを含んで成る血管内ステントを、哺乳類の管中に挿入することを含んで成る方法。
【請求項３０】
前記細胞骨格インヒビターが持効性形で存在する請求の範囲第29項記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞骨格インヒビターが、サイトカラシンＢ又はその類似体を含んで成る請求の範囲第30項記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞骨格インヒビターがタキソール又はその類似体を含んで成る請求の範囲第30項記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞骨格インヒビターの持効性形が、平滑筋細胞、支質細胞、又は平滑筋細胞を取り囲む間質マトリックスに特異的に結合することができる結合ペプチド又はタンパク質を含んで成る請求の範囲第30項記載の方法。
【請求項３４】
前記管内ステントが、細胞骨格インヒビターを含んで成る生物分解性被膜、又は多孔性又は浸透性非生物分解性被膜を含んで成る請求の範囲第30項記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞骨格インヒビターが、サイトカラシンＢ又はその類似体を含んで成る請求の範囲第34項記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞骨格インヒビターが、タキソール又はその類似体を含んで成る請求の範囲第34項記載の方法。
【請求項３７】
前記管が、ステント配置の前、血管形成法にゆだねられる請求の範囲第29項記載の方法。
【請求項３８】
前記管を、さらなる処理上の管外傷にゆだねることをさらに含んで成る請求の範囲第37項記載の方法。
【請求項３９】
哺乳類における管腔領域を維持するのに有効な管内ステントを調製するための方法であって、前記管の狭窄又は再狭窄を減じ又は阻害するのに有効な量の細胞骨格インヒビターを含んで成る持効性投与形を含んで成る被膜により管内ステントを被覆することを含んで成る方法。
【請求項４０】
前記ステントが生物分解性材料を含んで成る請求の範囲第39項記載の方法。
【請求項４１】
前記ステントがプラスチック又は金属を含んで成る請求の範囲第39項記載の方法。
【請求項４２】
前記ステントが、平滑筋細胞増殖のインヒビターである治療剤をさらに含んで成る請求の範囲第40又は41項記載の方法。
【請求項４３】
前記ステントが、細胞骨格インヒビターである治療剤をさらに含んで成る請求の範囲第40又は41項記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞骨格インヒビターがサイトカラシンＢ又はその類似体を含んで成る請求の範囲第43項記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞骨格インヒビターがタキソール又はその類似体を含んで成る請求の範囲第43項記載の方法。
【請求項４６】
前記被膜が生物分解性である請求の範囲第39項記載の方法。
【請求項４７】
前記被膜が多孔性又は浸透性である請求の範囲第39項記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞骨格インヒビターがサイトカラシンＢ又はその類似体を含んで成る請求の範囲第39項記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞骨格インヒビターがタキソール又はその類似体を含んで成る請求の範囲第39項記載の方法。
【請求項５０】
哺乳類における管腔領域を維持するのに効果的な管内ステントを調製するための方法であって、前記管の狭窄又は再狭窄を減じ又は阻害するのに有効な量の細胞骨格インヒビターを、管内ステントのマトリックス中に導入することを含んで成る方法。
【請求項５１】
前記ステントが、細胞骨格インヒビターを含んで成る持効性投与形を含んで成る被膜をさらに含んで成る請求の範囲第50項記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞骨格インヒビターがサイトカラシンＢ又はその類似体を含んで成る請求の範囲第51項記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞骨格インヒビターがタキソール又はその類似体を含んで成る請求の範囲第51項記載の方法。
【請求項５４】
前記被膜が生物分解性である請求の範囲第51項記載の方法。
【請求項５５】
前記被膜が多孔性又は浸透性である請求の範囲第51項記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞骨格インヒビターがサイトカラシンＢ又はその類似体を含んで成る請求の範囲第50項記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞骨格インヒビターがタキソール又はその類似体を含んで成る請求の範囲第50項記載の方法。
【請求項５８】
哺乳類における管腔領域を維持するのに効果的な管内ステントを調製するための方法であって、前記管の狭窄又は再狭窄を減じ又は阻害するのに有効な量の、平滑筋細胞増殖のインヒビターである治療剤を、管内ステントのマトリックス中に導入することを含んで成る方法。
【請求項５９】
前記ステントが、細胞骨格インヒビターを含んで成る持効性投与形を含んで成る被膜をさらに含んで成る請求の範囲第58項記載の方法。
【請求項６０】
前記細胞骨格インヒビターがサイトカラシンＢ又はその類似体を含んで成る請求の範囲第59項記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞骨格インヒビターがタキソール又はその類似体を含んで成る請求の範囲第59項記載の方法。
【請求項６２】
前記被膜が生物分解性である請求の範囲第59項記載の方法。
【請求項６３】
前記被膜が多孔性又は浸透性である請求の範囲第59項記載の方法。
【請求項６４】
前記ステントがプラスチック又は金属を含んで成る請求の範囲第29，50又は58項記載の方法。
【請求項６５】
前記ステントが生物分解性材料である請求の範囲第29，50又は58項記載の方法。
【請求項６６】
前記ステントが生物分解性材料から実質的に成る請求の範囲第65項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病状、たとえば血管外傷又は疾病に続く狭窄症、癌、体細胞機能亢進又は過形成に起因する疾病、及び免疫系エフェクター細胞により介在される疾病を特に治療するために、一定の標的細胞集団、たとえば平滑筋細胞、癌細胞、疾病状態を回復せしめるために調整を必要とする体細胞、及び免疫系のエフェクター細胞に向けられた結合パートナーの手術による又は静脈内導入を包含する治療法に関する。平滑筋タンパク質の増殖又は移動又は収縮を変えることができる活性剤の手術による又は静脈内導入もまた記載されている。本発明はまた、血管腔の拡張及び固定（生物学的ステント効果）をもたらす血管平滑筋細胞への治療剤の直接的又は標的化された供給にも関する。殺細胞接合体、及び血管平滑筋細胞インヒビターの持効性投与形の組合された投与がまた開示される。
【背景技術】
【０００２】
経皮経管動脈形成（PTCA）は、冠状動脈治療疾患を有する多くの患者においての一次治療法として広く使用されている。PTCAは、管腔閉塞を減じ、そして冠状流を改良することによって冠状動脈疾患を有する患者における心筋虚血を軽減することができる。この手術方法の使用は急速に増大しており、そして39,000件の処置が1983年に実施されており、1987年には、ほぼ 150,000件の処置、1988年には 200,000件の処置、1989年には 250,000件の処置が実施され、そして１年当たり 500,000件以上のPTCAが1994年までに推定される（１，２，３）。PTCAに続く狭窄が重要な問題として残り、患者の25％〜35％で狭窄が１〜３カ月以内に進行する。狭窄は実質的な病的状態及び死亡をもたらし、そしてさらなる介在、たとえば反復した血管形成又は冠状バイパス手術を時折り必要とする。手術の介在又は手術後処置（今日まで）が、狭窄を防ぐのに有効であることは証明されていない。
【０００３】
PTCAの後の狭窄を担当する過程は、完全には理解されていないが、しかしいくつかの異なった生物学的剤及び経路の間で複雑な相互作用をもたらすことができる。組織学的切片を観察すると、狭窄性病変は、血管の内膜層における平滑筋細胞の過剰増殖を有する（３）。PTCAの後の平滑筋細胞増殖についてのいくつかの可能な機構が提案されている（１，２，４，５）。
【０００４】
インビトロでの平滑筋増殖を抑制すると言われる化合物（４，６，７）は、インビボで使用される場合、不所望の薬理学的副作用を有する。ヘパリンは、インビトロでの平滑筋細胞の増殖を阻害すると言われるが、しかしインビボで使用される場合、凝集を阻害する実質的に悪い副作用を有すると言われるそのような化合物の例である。ヘパリンペプチドは、減じられた抗凝集活性を有するが、短い薬理学的半減期を有する不所望の薬理学的性質を有する。血管形成部位での治療剤の局部供給のためにダブルバルーンカテーテルを用いることによって（たとえば８；アメリカ特許第 4,824,436号）、及び短い半減期の問題を補うために薬物により含浸された生物分解性材料を用いることによって（たとえば９；アメリカ特許第 4,929,602号）、そのような問題を解決するための試みが行なわれて来た。
【０００５】
ベルカリン及びロリジンは、土壌菌マイロセシウム・ベルカリア（Myrothecium verrucaria）及びマイロセシウム・ロリジウム（Myrothecium roridium）により二次代謝物として生成されるトリコテセン薬物である。ベルカリンは巨環状トリエステルである。ロリジンはベルカロールの巨環状ジエステルである（10）。グループとして、トリコテセンは、いくつかの種の菌類により生成され、そして12，13−エポキシトリコテ−９−セン基本構造により特徴づけられるセスキテルペノイド  マイコトキシンに構造的に関連している。真核細胞に対するそれらの細胞毒性活性は、細胞を結合し、それを内在化し、そして細胞におけるタンパク質及び高分子合成を阻害するそれらの能力に密接に相互関連している。
【０００６】
少なくとも５種の考慮すべき事がらが、平滑筋細胞の過剰増殖に起因する狭窄を妨げるためへの阻害性薬物の使用を除外すると思われる。第一に、阻害剤は、心血管疾患を有する患者のための許容できないレベルの危険性を創造する全身性毒性を有する。第二に、阻害剤は、手術後の血管創傷治療を妨げ、そしてそれは治癒を遅らせ、又は新しく治癒された血管壁の構造弾性を弱くする。第三に、平滑筋細胞を殺害する阻害剤は、周囲の内皮及び／又は他の内部平滑筋細胞に損傷を与える。死亡細胞及び死にかかっている細胞はまた、さらなる平滑筋細胞の増殖を刺激し、そして狭窄を悪化せしめるマイトジエン剤を放すことができる。
【０００７】
第四に、治療的に有効なレベルの阻害剤の供給は、次のいくつかの観点から問題を有する：すなわちａ）平滑筋細胞間の細胞間空間中への多くの分子の供給が、治療的に有効な量の分子の細胞膜の通過を可能にする好ましい条件を確立するために必要であり；ｂ）その作用が作用をする適切な細胞内区画中への阻害薬物の指図は調節するのに困難であり；そしてｃ）たとえば隣接する細胞への薬物の細胞間再分布を最少にしながら、その細胞内標的物、たとえばリポソームとのその阻害薬物の関連性を最適にすることは困難である。第五に、平滑筋細胞の増殖は数週間にわたって起こるので、その阻害薬物もまた、有効な効果を生成するためには、数週間にわたって、たぶん連続して投与されるべきであると思われる。
【０００８】
前述から明らかなように、平滑筋細胞の増殖を効果的に処置するためへの阻害薬物、たとえば細胞毒性剤の使用に関して解決されるべき多くの問題が残存している。血管の手術の間に生じる、血管への外傷に続いての血管平滑筋細胞の増殖による狭窄を阻害するための新しい方法を開発することがひじょうに好都合である。さらに、血管平滑筋細胞に対して拡張された期間、阻害効果を生成する化合物の供給が好都合である。そのような持効性化合物の局部投与はまた、標的細胞集団がそのような投与により影響されやすい他の状態の処置においても有用である。
【発明の開示】
【０００９】
本発明の１つの観点においては、哺乳類宿主における血管平滑筋細胞を阻害するための新規治療方法及び治療接合体が供給される。治療接合体は、血管平滑筋細胞の細胞膜に特定の態様で結合する平滑筋結合タンパク質又はペプチド、又は細胞の活性を阻害する治療剤と対をなして、動脈壁の間質マトリックス（たとえばコラーゲン）に特定の態様で結合する間質性マトリックス結合タンパク質／ペプチドを含む。１つの態様において、細胞活性の阻害は、血管形成又は他の血管手術過程の後の狭窄の低下、遅延又は排除をもたらす。本発明の治療接合体は、平滑筋細胞中に転換することができる血管平滑筋細胞及び血管周囲細胞と関連することによってそれらの好都合な効果を達成する。
【００１０】
本発明の治療接合体は、（１）細胞代謝を変更し、又はタンパク質合成、細胞増殖もしくは細胞移動のインヒビターである治療剤；（２）形態又は細胞体積の増大に影響を及ぼす、微小管及びミクロフィラメントインヒビター；及び／又は（３）細胞外マトリックス又は分泌のインヒビターを含むことができる。１つの代表的な態様においては、接合体はセスキテルペノイドマイコトキシン、たとえばベルカリン又はロリジンである細胞毒性治療剤を含む。他の態様は、タンパク質合成に対して最少の効果を有する用量で DNA合成及び増殖を阻害する細胞増殖抑制性治療剤、たとえばタンパク質キナーゼインヒビター（たとえばスタウロスポリン）、スラミン、及び酸化窒素開放性化合物（たとえばニトログリセリン）又はそれらの類似体又は機能的同等物を包含する。
【００１１】
さらに、平滑筋の収縮又は移動を阻害し、そしてたとえば“血管形成外傷に続いて拡張された管腔部分を維持する治療剤（たとえばサイトカラシン、たとえばサイトカラシンＢ、サイトカラシンＣ、サイトカラシンＤ又は同様のもの）もまた、本発明に従って使用され得る。本発明の他の観点は、血管平滑筋細胞の膜上に発現されるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）と特異的に関連する血管平滑筋結合タンパク質に関し、そして好ましい態様においては、このCSPGは約 250ｋダルトンの分子量を有する。好ましい態様において、血管平滑筋結合タンパク質は、少なくとも10-4Ｍの会合定数を伴って、細胞表面上のCSPG標的に結合する。もう１つの好ましい態様においては、血管平滑筋結合タンパク質は、モノクローナル抗体NR−AN−01の Fab, FvもしくはCDR(相補的決定領域）、又はそれらの機能的同等物に見出されるアミノ酸の配列を含む。
【００１２】
本発明の他の観点は、たとえば哺乳類宿主における血管形成の後に狭窄を、治療的有効量の本発明の治療接合体をそのような処置の必要なヒト又は動物対象に投与することによって阻害するための方法を包含する。１つの代表的な態様においては、治療接合体の用量は、血管における投与の部位で前記治療接合体の10-3Ｍ〜10-12 Ｍ濃度を達成するよう注入カテーテルにより投与され得る。
【００１３】
本発明はまた、標的細胞への治療剤の持効性放出を包含する治療法及び治療投与形にも関する。好ましくは、標的細胞は、血管平滑筋細胞、癌細胞、疾病状態を緩らげるために調整を必要とする体細胞、及び投与形の局部投与により接近できる、免疫系−介在の疾病に包含される細胞である。結果的に、本発明のこの観点の方法及び投与形は、細胞の活性（たとえば増殖、収縮、移動、又は同様のもの）を阻害するが、しかし血管平滑筋細胞結合タンパク質を殺さない治療剤を用いて、哺乳類宿主における血管平滑筋細胞を阻害するために有用である。
【００１４】
また、本発明の観点の方法及び投与形は、増殖を阻害し、又は標的細胞及び標的細胞結合タンパク質に対して細胞毒性である治療剤を用いて、標的細胞の増殖を阻害し、又はそのような標的細胞を殺すためにも有用である。さらに、本発明のこの観点の方法及び用量形は、標的細胞結合タンパク質を用いて、その投与形の局部投与により接近することができる、標的細胞、たとえば免疫系のエフェクター細胞に、細胞増殖抑制性、細胞殺害性又は代謝調整性治療剤を供給するために有用である。最後に、本発明の投与形は、正常組織（すなわち体細胞）の病理学的増殖又は過剰活性を減じ又は排除するために有用である。
【００１５】
たとえば、本発明の１つの治療法は、治療剤を含んで成る、金属性、プラスチック性又は生物分解性血管内ステントのインビボ置換を包含する。また、治療剤を含んで成るステントもまた供給される。本発明の好ましい態様は、治療剤、たとえば細胞骨格（cytoskeletal）インヒビター、又は平滑筋細胞増殖のインヒビターを含んで成るステントである。本発明の好ましい細胞骨格インヒビターは、サイトカラシン、たとえばサイトカラシンＢ、又は機能的に等しいその構造的類似体である。本発明のもう１つの好ましい細胞骨格インヒビターは、タキソール、又は機能的に等しいその構造的類似体である。
【００１６】
ステントは、生物分解性被膜、又は多孔性又は透過性非生物分解性被膜を含んで成る。本発明の好ましい態様は、治療剤を含んで成る、生物分解性被膜又は多孔性／透過性非生物分解性被膜を含んで成るステントである。本発明のより好ましい態様は、治療剤の持効性用量形を含んで成る、生物分解性被膜、又は多孔性又は透過性非生物分解性被膜を含んで成るステントである。
【００１７】
もう１つの態様において、ステント、たとえば生物分解性ステントはまた、ステントマトリックスに含浸された治療剤も有することができる。治療剤の持効性用量形を含んで成る、生成分解性被膜、又は多孔性又は非生物分解性被膜によりさらに被覆される、ステントに含浸される治療剤を有する生物分解性ステントの使用にも関する。本発明のこの態様は、治療剤の示差開放速度を付与し、すなわち被膜からの治療剤の早い開放、続いてステントマトリックスの分解に基づいてそのステントマトリックスに含浸される治療剤の遅延された開放が存在する。
【００１８】
血管内ステントは、細胞骨格インヒビター、たとえばステントマトリックスに開放可能に包埋されるサイトカラシンＢ又はタキゾールの生物学的ステント作用を通して提供される機械的手段の他に、血管の管腔領域の上昇を付与する機械的手段を提供する。さらに、平滑筋細胞増殖のインヒビターである治療剤を含んで成る血管内ステントの配置は、内膜増殖を減じ又は妨げることによって高められた効能を提供する。内膜平滑筋細胞及びその平滑筋により生成される支質（stroma）のこの阻害は、血管ステントの介在配置に続いてより急速且つ完全な再−内皮形成を可能にする。ステントの配置に続く、血管壁の再−内皮形成及び安定化の早められた速度は、管腔領域の低下、及び血管ステントの不良の主要原因である遅れた血液流を減じることができる。
【００１９】
本発明の投与形は、好ましくは、非分解性微粒子又は超微粒子(nanoparticles）、又は生物分解性微粒子又は超微粒子のいづれかである。より好ましくは、微粒子又は超微粒子は、ランダムな非酵素的加水分解性切断により生物分解するポリマー含有マトリックスから形成される。特に好ましい構造体は、熱可塑性ポリエステル（たとえばポリアクチド又はポリグリコリド）の混合物、又はラクチド及びグリコリド(glycolide）成分のコポリマーから形成される。ラクチド／グリコリド構造体は、その生物分解性が乳酸及びグリコール酸（両者は哺乳類の通常の代謝生成物である）を形成するさらなる利点を有する。
【００２０】
微粒子又は超微粒子内に分散される好ましい治療剤は、標的細胞の殺害を伴わないで治療的に有意な標的細胞活性の阻害、又は標的細胞殺害活性の阻害を示すものである。血管平滑筋細胞の再狭窄の処置のためには、有用な治療剤は、標的細胞を殺さないで、標的細胞活性（たとえば増殖又は移動）を阻害する。このための好ましい治療成分は、タンパク質キナーゼインヒビター（たとえばスタウロスポリン又は同様のもの）、平滑筋移動及び／又は収縮インヒビター（たとえば、サイトカラシン、たとえばサイトカラシンＢ、サイトカラシンＣ、サイトカラシンＤ又は同様のもの）、メラミン、及び酸化窒素−開放化合物、たとえばニトログリセリン、又はその類似体又は機能的同等物である。癌治療においては、有用な治療剤は増殖を阻害し、又は標的細胞に対して細胞毒性である。この目的のための好ましい治療成分は、ロリジン（Roridin)Ａ及びシュードモナス(Pseudomonas）外毒素（exotoxin）、又はそれらの類似体又は機能的同等物である。
【００２１】
免疫系−制御された疾病、たとえば関節炎の処置のためには、有用な治療剤は、投与形の局部的な投与により接近することができる標的細胞に、細胞増殖抑制性、殺細胞性又は代謝調節治療剤を供給する。この目的のための好ましい治療成分は、 RoridinＡ、シュードモナス外毒素、スラミン及びタンパク質キナーゼインヒビター（たとえばスタウロスポリン）、スフィンゴシン、又はそれらの類似体、又は機能的類似体である。
【００２２】
本発明の投与形は、結合タンパク質又はペプチドにより対応する標的細胞集団に標的化される。本発明の好ましい結合タンパク質／ペプチドは、血管平滑筋細胞結合タンパク質、腫瘍細胞結合タンパク質及び免疫系エフェクター細胞結合タンパク質である。好ましい血管平滑筋細胞結合タンパク質は、血管平滑筋細胞の膜上に発現されるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）に特に会合し、そして好ましい態様において、このCSPGは、約 250ｋダルトンの分子量を有する。好ましい態様において、血管平滑筋結合タンパク質は、少なくとも10-4Ｍの会合定数を伴って細胞表面上のCSPG標的に結合する。他の好ましい態様においては、血管平滑筋結合タンパク質は、モノクローナル抗体NR−AN−01又はその機能的同等物の Fab, Fv又はCDR(相補性決定領域）のアミノ酸配列を含む。
【００２３】
本発明のこの態様において有用な他の好ましい結合ペプチドは、細胞間支質、及び血管平滑筋細胞間に位置するマトリックスに局在するものを包含する。このタイプの好ましい結合タンパク質は、コラーゲン、細網繊維、又は他の細胞間マトリックス化合物と特に会合する。好ましい腫瘍細胞結合タンパク質は、標的腫瘍細胞集団により発現される表面細胞マーカー又はその細胞質エピトープと会合する。好ましい免疫系−調節された標的細胞結合タンパク質は、標的免疫系エフェクター細胞の細胞表面マーカー又はその細胞質エピトープと会合する。本発明の結合ペプチド／タンパク質はまた、病理学的に増殖する正常な組織を標的化する。
【００２４】
本発明はまた、標的細胞への遊離（すなわち、標的化されない又は非結合パートナー会合された）治療剤の投与を包含する、治療法及び治療投与形を提供する。好ましくは、標的細胞は血管平滑筋細胞であり、そして治療剤は血管平滑筋細胞収縮のインヒビターであり、それは正常な流体静力学的圧力による血管腔の拡張を可能にする。そのような収縮の阻害はアクチン阻害により達成され、これは好ましくは、タンパク質合成を阻害するために必要な用量よりも低い用量レベルで達成でき且つ維持できる。結果的に、血管平滑筋細胞は、マイナーな細胞外傷を修復するために必要とされるタンパク質を合成し、そして間質マトリックスを分泌し、それにより、その最大の収縮期直径に近い拡張された状態での血管腔の固定化を促進する。
【００２５】
この現象は、初期工程後の血管造影図に基づいて分類された血管形成工程の25％までで生じる所望しない反動機構を減じ又は防ぐ生物学的ステント効果を構成する。サイトカラシン（血管平滑筋細胞の移動及び収縮を阻害するＧ−〜Ｆ−アクチンの重合化を阻害する）は、本発明のこの態様への使用のための好ましい治療剤である。このタイプの遊離治療剤方法は、血管形成又は他の血管手術工程の後の狭窄の低下、遅延又は排除をもたらす。好ましくは、自由治療剤は、血管平滑筋組織に直接、又は実質的に直接、投与される。そのような投与は好ましくは、血管における投与の部位で10-3Ｍ〜10-12 Ｍ濃度の前記治療剤を達成するために注入カテーテルによりもたらされる。
【００２６】
たとえば、本発明の１つの態様は、血管移植片のために使用されるべき単離された血管（動脈又は静脈）の壁中へのサイトカラシンＢ溶液のインビボ又はエクスビボ注入を含んで成る。本発明のこの態様においては、移植片として作用する血管が、切断され、又は単離され、そして続いて、好ましくは圧力注入による治療剤の溶液の注入により拡張される。好ましくは、治療剤は、サイトカラシンであり、そして最とも好ましくは、使用される治療剤はサイトカラシンＢ、又はその機能的に同等の類似体であろう。この方法は、血管移植片がそれらの近位及び遠位位置に吻合された後、時折、生じる収縮又は痙縮を妨げることによって、より大きな管腔領域をもたらすであろう。
【００２７】
本発明のもう１つの態様は、血管狭窄に包含される血管平滑筋細胞の増殖を破壊するために細胞毒性標的化接合体の投与を組込む。この生物学的動脈筋切除の後に施されるマイトジエン剤が、本発明の抗収縮（抗−移動）又は抗−増殖持効性剤の投与により、血管を増殖し、そして再狭窄する、残存する生存血管平滑筋細胞の刺激を妨げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本明細書に使用される場合、次の用語は、下記に示されるような意味を有する：
“治療接合体”とは、治療剤に結合された（たとえば、場合によっては、リンカーを通して）血管平滑筋又は間質マトリックス結合タンパク質を意味する。
【００２９】
“標的”及び“マーカー”は、血管平滑筋細胞又はマトリックス構造体の細胞表面膜上に発現される、マトリックス又は血管平滑筋結合タンパク質、たとえば抗原、ポリペプチド又は細胞表面炭水化物（たとえば糖脂質、糖タンパク質又はプロテオグリカン）により特定の態様で認識される分子を意味し、そして本発明の接合体観点を記載する上で交換可能的に使用される。
【００３０】
“エピトープ”は、マトリックス又は平滑筋結合タンパク質、たとえば３個又はそれ以上のアミノ酸の配列又はサッカリドにより結合される“標的”分子内の特定の部位を言及するために使用される。
“結合される”とは、治療剤によるマトリックス又は血管平滑筋結合タンパク質の共有又は非共有化学的会合（すなわち、ファン・デル・ワール力又は電荷−電荷相互作用を通してのように疎水性）を意味するために使用される。使用される治療剤の性質により、その結合タンパク質は通常、共有結合により治療剤と会合されるであろう。
【００３１】
“リンカー”とは、治療剤にマトリックス又は平滑筋結合タンパク質を結合する剤、たとえば有機化学カップラーを意味する。
平滑筋細胞の“移動”とは、血管の内部層から内膜へのインビボにおけるそれらの細胞の移動を意味し、そしてまた、１つの位置からもう１つの位置への細胞の運動に従ってインビトロで研究され得る（たとえば、時間にわたっての組織における定義さた領域からの平滑筋細胞移動の、低速度撮影性映画撮影法又はビデオレコーダー及び手動計数法を用いて）。
【００３２】
平滑筋細胞又は癌細胞の“増殖”とは、細胞の有系分裂による細胞数の増加を意味する。
“発現された”とは、細胞によるポリペプチドの合成グリコシル化及び／又は分泌、たとえば血管平滑筋細胞又は周細胞により合成されたCSPGを伴ってのmRNAの転写及び翻訳を意味する。
【００３３】
“巨環状トリコテセン”とは、いくつかの菌種により生成され、そして12，13−エポキシトリコテ−９−セン基本構造、たとえば土壌菌、マイロセシウム・ベルカリア、及びマイロセシウム・ロリジウムにおける二次代謝の生成物であるベルカリン及びロリジンにより特徴づけられる、構造的に関連するセスキテルペノイド巨環状マイコトキシンのグループのいづれかの１つを意味する。
“持効性”とは、約３〜約21日の間の期間、治療剤を放すように企画された投与型を意味する。長期間にわたっての開放はまた、本発明の“持効形”投与形としても向けられる。
【００３４】
“投与形”とは、遊離（標的化されていない又は非結合パートナー会合された）治療剤配合物、及び持効性治療配合物、たとえば標的細胞集団にそこに分散される治療成分を供給するために１又は複数の結合タンパク質又はペプチドを結合することができる、微粒状又は超微粒状／生物分解性又は非生物分解性ポリマー材料を組込む配合物を意味する。
“スタウロスポリン”は、下記式で表わされるタンパク質キナーゼＣインヒビター：
【００３５】
【化１】
2007075623.tif 000003
、及び下記一般構造の１つを有するジインドールアルカロイドを包含する：
【００３６】
【化２】
2007075623.tif 000004
【００３７】
より特定には、用語“スタウロスポリン”は、Ｋ−252(たとえば日本特許出願第62,164,626号）、 BMY−41950(アメリカ特許第 5,015,578号）、 UCN−01（アメリカ特許第 4,935,415号）、 TAN−999(日本特許出願第01,149,791号）、 TAN−1030A(日本特許出願第01,246,288号）、RK−286C（日本特許出願第02,258,724号）及びそれらの機能的同等物及び誘導体を包含する。スタウロスポリンの誘導体は、日本特許出願第 03,72,485号；第01,143,877号；第 02,09,819号及び第03,220,194号、及び PCT国際出願WO8 907,105 及びWO91 09,034 、並びにヨーロッパ特許出願 EP410,389及び EP296,110に論ぜられるものを包含する。
【００３８】
Ｋ−252 、すなわち天然の生物の誘導体は知られている。たとえば、日本特許出願第63,295,988号；第62,240,689号；第61,268,687号；第62,155,284号；第62,155,285号；第62,120,388号及び第63,295,589号、及び PCT国際出願WO88 07,045 並びにヨーロッパ特許出願EP323,171 を参照のこと。
【００３９】
“サイトカラシン”は、標的細胞代謝に対する阻害効果、たとえば血管平滑筋細胞の収縮又は移動の防止を示す菌類代謝物を包含する。好ましくは、サイトカラシンは、ポリマー形（Ｆ−アクチン）へのモノマーアクチン（Ｇ−アクチン）の重合を阻害し、それにより細胞質ミクロフィラメントを必要とする細胞機能を阻害する。サイトカラシンは典型的には、フェニルアラニン（サイトカラシン）、トリプトファン（カエトグロボシン）又はロイシン（アスポカラシン）に由来し、ここでそれらは、置換されたペルヒドロイソインドール−１−オン成分（下記式Ｖ又はVI）の位置Ｃ−３で、それぞれベンジル、インドール−３−イルメチル又はイソブチル基をもたらす：
【００４０】
【化３】
2007075623.tif 000005
【００４１】
ペルヒドロイソインドールは、位置Ｃ−８及びＣ−９に結合される11−，13−又は14−原子の炭素環式−又は酸素含有環を含む。すべての天然に存在するサイトカラシンは、Ｃ−５でメチル基；Ｃ−12でメチル又はメチレン基；及びＣ−14又はＣ−16でメチル基を含む。
【００４２】
代表的な分子は、サイトカラシンＡ、サイトカラシンＢ、サイトカラシンＣ、サイトカラシンＤ、サイトカラシンＥ、サイトカラシンＦ、サイトカラシンＧ、サイトカラシンＨ、サイトカラシンＪ、サイトカラシンＫ、サイトカラシンＬ、サイトカラシンＭ、サイトカラシンＮ、サイトカラシンＯ、サイトカラシンＰ、サイトカラシンＱ、サイトカラシンＲ、サイトカラシンＳ、カエトグロボシン（chaetoglobosin）Ａ、カエトグロボシンＢ、カエトグロボシンＣ、カエトグロボシンＤ、カエトグロボシンＥ、カエトグロボシンＦ、カエトグロボシンＧ、カエトグロボシンＪ、カエトグロボシンＫ、デオキサフォミン(deoxaphomin）、プルキシフォミン(proxiphomin）、プロトフォミン(protophomin）、ズイゴスポリン（zygosporin）Ｄ、ズイゴスポリンＥ、ズイゴスポリンＦ、ズイゴスポリンＧ、アスポカラシン（aspochalasin）Ｂ、アスポカラシンＣ、アスポカラシンＤ及び同様のもの、並びにそれらの機能的同等物及び誘導体を包含する。
【００４３】
一定のサイトカラシン誘導体は、日本特許第7201,925号；第7214,219号；第7208,533号；第7223,394号；第7201,924号；及び第7204,164号に示される。サイトカラシンＢは、基本型サイトカラシンとしてこの記載において使用される。
【００４４】
本明細書に言及される場合、平滑筋細胞及び周細胞（pericyte）は、外傷、たとえばPTCAの間に引き起こされる外傷に続いて、内膜過形成血管部位において増殖する血管の内膜及び外膜に由来する細胞を包含する。
【００４５】
平滑筋細胞の特徴は、筋原質に存在する核及び筋原線維と共に細胞の中央に位置する橋円形の核を有する紡錘形状の組織学的形態（光顕微鏡試験下で）を包含する。電子顕微鏡試験下で、平滑筋細胞は、核の近くの筋原質（sarcoplasm）における長く細いミトコンドリア、粒状小胞体における少数の管状要素、及び遊離リボソームの多くのクラスターを有する。小さなゴルジ体がまた、核の１つの極近くに位置する。筋原質の大部分は、筋細胞の長軸に配向される薄くて平行な筋フィラメントにより支配されている。それらのアクチン含有筋原線維は、それらの間に散在するミトコンドリアと束になって配置されている。楕円形の濃い部分がまた、細胞の収縮性物質を通して分散され、そして類似する濃い部分が細胞膜の内相にそって時々、分布されている。
【００４６】
周細胞の特徴は、不規則な細胞形状により特徴づけられる組織学的形態（光顕微鏡下で）を包含する。周細胞は、血管内皮細胞を取り囲む基底膜内に見出され、そしてそれらの同定は、α平滑筋アクチン（たとえば抗−α−sm１，Biomakur, Rehovot, Israel), HMW-MAA 及び周細胞ガングリオシド抗原、たとえばMAb 3G5(11) に対して特異的な抗体による陽性免疫−染色；及びサイトケラシン（すなわち上皮及び線維芽細胞マーカー）及びvon Willdebrand 因子（すなわち、内皮マーカー）に対する抗体による陰性免疫染色により確かめられ得る。血管平滑筋細胞及び周細胞の両者は、NR−AN−01モノクローナル抗体により免疫染色することによって陽性である。
【００４７】
本発明の治療接合体及び投与形は、血管平滑筋細胞の活性を阻害するために、たとえば血管形成に続く狭窄を減じ、遅延せしめ、又は排除するために有用である。本発明で使用される場合、用語“減じる”とは、動物又はヒトにおいて、血管形成に続く平滑筋細胞増殖の刺激に起因する内膜の肥厚化を下げることを意味する。“遅延せしめる”とは、血管形成に続く眼に見える内膜過形成の開始（たとえば組織学的に、又は血管造影試験により観察される）までの時間を遅らせることを意味し、そしてまた、“減じられた”再狭窄を伴うかも知れない。
【００４８】
血管形成に続く再狭窄を“排除すること”は、手術的に介在することを、すなわち反復血管形成、アテローム解剖、又は冠動脈バイパス手術により血管を通して適切な血液流を再確立することをもはや必要としなくする程度に、患者における内膜過形成を完全に“減じ”、そして／又は完全に“遅延せしめる”ことを意味する。狭窄を減じ、遅延せしめ、又は排除することの効果は、当業者に知られている方法、たとえば血管造影法、超音波評価、透視イメージング法、ファイバー光学内視鏡試験又は生検法及び組織学により決定され得るが、但しこれらだけには限定されない。本発明の治療接合体は、平滑筋細胞及び周細胞の細胞膜に対して特異的に結合することによってそれらの好都合な効果を達成する。
【００４９】
本発明の治療接合体は、治療剤に血管平滑筋結合タンパク質を結合することによって得られる。治療接合体においては、血管平滑筋結合タンパク質は、血管平滑筋細胞又は周細胞に対して治療接合体を標的化する機能を実施し、そして治療剤は平滑筋細胞又は周細胞の細胞活性を阻害する機能を実施する。
【００５０】
本発明の治療投与形（持効性タイプ）は、長期間にわたって標的細胞に治療剤を供給する能力を示す。本発明のこの観点の治療投与形は、この目的のために適切ないづれかの形態のものであり得る。好ましい持効性治療投与形は、次の特徴の１つ又は複数を示す：
【００５１】
−微粒子（約 0.5μｍ〜約 100μｍの直径、より好ましくは約 0.5μｍ〜約２μｍの直径）又は超微粒子（たとえば約 1.0nm〜約1000nmの直径、より好ましくは約50〜約 250nmの直径）のさらさらした粉末構造体；
−約３〜約 180日、より好ましくは約10〜約21日間にわたって生物分解するよう企画された生物分解性構造体、又は約３〜約 180日、より好ましくは約10〜約21日間にわたって治療剤の拡散を可能にするよう企画された非生物分解性構造体；
【００５２】
−投与形が投与される標的組織及び局部の生理学的環境と生物適合できる生成物、たとえば生物適合性生物分解生成物；
−次の経路：（１）投与形を通しての治療剤の拡散（治療剤が投与形を形成するポリマー又はポリマー混合物に可溶性である場合）；又は（２）投与形が生物分解するにつれて治療剤の開放、の１つ又は両者を通して生じる活性治療剤を有する治療剤−ポリマーマトリックスを形成するために、そこにおける治療剤の安定性で且つ再生可能な拡散を促進する性質；及び
【００５３】
−約１〜約10,000の結合タンパク質／ペプチド−投与形結合、より好ましくは、粒子表面積150(オングストローム) ２  当たり最大約１つの結合ペプチド−投与形を有する、１又は複数の細胞及び／又は間質マトリックスエピトープと結合する能力。結合される合計数は使用される粒子サイズに依存する。結合タンパク質又はペプチドは、本明細書に示されるような共有リガンドサントイッチ又は共有様式を通して粒状治療投与形に結合することができる。
【００５４】
本発明の好ましい態様の超微粒状持効性治療投与形は、生物分解でき、そして血管平滑筋細胞に結合し、そして主にエンドサイト−シスによりそのような細胞に侵入する。そのような超微粒物の生物分解は、プレリソソーム小胞及びリソソームにおいて一定の期間（たとえば10〜21日）にわたって生じる。本発明の好ましい大きな微粒子治療投与形は、選択された結合タンパク質又はペプチドに依存して標的細胞表面又は間質マトリックスに結合し、そして続く標的細胞摂取のための治療剤を開放し、そして少数の小さな微粒子のみがファーゴサイト−シスにより細胞中に侵入する。実施者は、標的細胞が本発明の投与形を同化し、そして代謝する正確な機構がそれらの細胞の形態学、生理学及び代謝工程に依存することを認識するであろう。
【００５５】
標的化された持効性治療粒状投与形の大きさはまた、細胞同化の態様に関しても重要である。たとえば、より小さな超微粒子は細胞間の間質液体と共に流れることができ、そしてそれが、結合するタンパク質／ペプチドが標的物に対して選択される、正常又は腫瘍性組織に結合するまで、浸出された組織に侵入することができる。この特徴は重要である。なぜならば、超微粒子は浸出された一次腫瘍性病巣からのリンパ排出チャネルに従がい、リンパ管にそって転移病巣を標的化するからである。より大きな微粒子は、浸出された一次組織の間質に容易に取り込まれる傾向がある。
【００５６】
本発明の好ましい持効性投与形は、生物分解性微粒子又は超微粒子である。より好ましくは、生物分解性微粒子又は超微粒子は、治療剤を放すためにランダムな非酵素性加水分解切断により生物分解するポリマー含有マトリックスから形成され、それにより、粒状構造体内に孔を形成する。
【００５７】
αヒドロキシカルボン酸及び関連するラクトンの縮合に由来するポリマーは、本発明への使用ために好ましい。特に好ましい成分は、熱可塑性ポリエステル（たとえばポリラクチド又はポリグリコリド）の混合物又はラクチド及びグリコリド成分のコポリマー、たとえばポリ（ラクチド−コ−グリコリド）から形成される。典型的な構造体、すなわちランダムポリ（DL−ラクチド−コ−グリコリド）は下記に示されており、ここで、ｘ及びｙの値は、所望する微粒子又は超微粒子性質を達成するために当業者により操作できる：
【００５８】
【化４】
2007075623.tif 000006
【００５９】
本発明の粒状投与形を形成するために適切な他の剤は、ポリオルトエステル及びポリアセタール(Polymer Letters, 18；293, 1980)及びポリオルトカーボネート（アメリカ特許第 4,093,709号）並びに同様のものを包含する。
【００６０】
本発明の好ましい乳酸／グリコール酸ポリマー含有マトリックス粒質物は、変性された溶媒抽出工程を構成するエマルジョンに基づく方法、たとえばCowsarなど.,“Poly (Lactide-Co-Glycolide) Microcapsules for Controlled Release of Steroids," Methods Enzymology, 112：101-116, 1985(微粒子へのステロイドの取り込み）；Eldridgeなど., "Biodegradable and Biocompatible Poly (DL-Lactide-Co-Glycolide) Microspheres as an Adjuvant for Staphylococcal Enterotoxin B Toxoid Which Enhances the Level of Toxin-Neutralizing Antibodies," Infection and Immunity, 59 ：2978-2986, 1991(トキソイド取り込み）；Cohen など., "Controlled Delivery Systems for Proteins Based on Poly (Lactic/Glycolic Acid) Microspheres," Pharmaceutical Research, 8(6)：713-720, 1991(酵素取り込み）；及びSanders など.,"Controlled Release of a Luteinizing Hormone-Releasing Hormone Analogue from Poly (D,L-Lactide-Co-Glycolide) Microspheres," J.Pharmaceutical Science, 73(9) ：1294-1297, 1984(ペプチド取り込み）により記載される方法により調製される。
【００６１】
一般的には、本発明の粒状投与形を形成するための方法は、ハロゲン化された炭化水素溶媒にポリマーを溶解し、そこに治療剤溶液（好ましくは水性）を分散し、そして前記ポリマーのためではなく、前記ハロゲン化された炭化水素溶媒のための溶媒として作用する追加の剤を添加することができる。ポリマーが、治療剤含有溶液の液滴上にポリマー−ハロゲン化された炭化水素溶液から沈殿し、そして治療剤を取り込み。好ましくは、治療剤は、本発明の持効性投与形内では実質的に均等に分散される。粒質物形成に続いて、それらは有機溶媒により洗浄され、そして硬化される。水洗浄及び水性非イオン性界面活性剤洗浄に続いて、室温で真空下で乾燥せしめる。
【００６２】
生物適合性目的のためには、マトリックス形でそこに分散される治療剤により特徴づけられる粒状投与形は、包装、貯蔵又は投与の前、滅菌とされる。滅菌は、いづれかの便利な手段で行なわれ得る。たとえば、粒質物はγ線により照射され、但し、そのような放射線への照射は、治療剤−ポリマーマトリックスに分散されても治療剤又はそこに結合される結合タンパク質／ペプチドの構造又は機能に悪影響を与えるべきではない。治療剤又は結合タンパク質／ペプチドが悪影響を与えられる場合、粒状投与形は、滅菌条件下で生成され得る。
【００６３】
本発明の粒状投与形からの治療剤の開放は、拡散及び粒状マトリックス侵食の両者の結果として生じ得る。生物分解速度は、治療剤開放運動等に直接的に影響を与える。生物分解速度は、持効性投与形の組成又は構造の変更により調節できる。たとえば、本発明の好ましい投与形におけるラクチド／グリコリド比の変更は、Ticeなど., "Biodegradable Controlled-Release Parenteral Systems," Pharmaceutical Techmology, 26-35p, 1984 により記載されているようにして；Kentなど.,“Microsncapsulation of Water Soluble Actiue Polypeptides,”アメリカ特許第 4,675,189号により記載のようにして、ポリマー加水分解変性剤、たとえばクエン酸及び炭酸ナトリウムの包含により；ラクチド／グリコリドポリマーにおける治療剤の充填量を変更することにより（ここで分解速度はそこに含まれる治療剤の量に反比例する）及び前記コア充填量を変更するために異なった能力を示す治療剤の通常の種類の適切な類似体の分別ある選択により；及びBeckなど.,“Poly (DL-Lactide-Co-Glycolide) /Norethisturune Microcapsules : An Injectable Bioradable Contraceptive," Biol. Reprod., 28 ：186-195, 1983 により記載されるような粒質物のサイズの変更により；又は同様の手段により実施され得る。生物分解速度を調製する前述のすべての方法は、ポリマー含有マトリックスの固有粘度に影響を及ぼし、それによりその水和化の速度を変更する。
【００６４】
好ましいラクチド／グリコリド構造体は、哺乳類の生理学的環境と生物適合性である。また、それらの好ましい持効性投与形は、その生物分解が乳酸及びグリコール酸（両者とも哺乳類の通常の代謝生成物である）を形成する利点を有する。
【００６５】
粒子にタンパク質／ペプチド−粒状投与形を結合するために必要とされる官能基は、非分解性又は生物分解性ポリマー−単位と共に、粒状構造体に任意に包含さる。この目的のために利用できる官能基は、ペプチドと反応性である基、たとえばカルボキシル基、アミン基、スルフヒドリル基、及び同様の基を包含する。好ましい結合増強成分は、好ましい（ラクチド−グリコリド）ポリマー含有マトリックスの末端カルボキシル基又は同様のものを包含する。
【００６６】
有用な血平滑筋タンパク質は、隣接した間質マトリックスへの治療剤の細胞外的な開放、及び残る損なわれていない平滑筋細胞中への治療剤の続く拡散、及び／又は治療剤の供給を可能にする、標的化された生物分解性の全成分の細胞内区画中への細胞による内在化を可能にするような態様で、損なわれていないか又は破壊された血管平滑筋細胞の表面成分上の標的又はマーカーに結合することができる、ポリペプチド、ペプチド又は類似する化合物（下記のような）である。
【００６７】
有用な血管平滑筋結合タンパク質の代表的な例は、抗体（たとえばモノクローナル及びポリクローナルアフィニティ精製された抗体、F(ab′)２、Fab ′、Fab 、及びFvフラグメント及び／又は抗体の相補性決定領域(CDR）又はその機能的同等物（たとえば結合ペプチド及び同様のもの))；成長因子、サイトカイン、及びポリペプチドホルモン及び同様のもの；及び高分子認識細胞外マトリックスレセプター（たとえばインテグリン及びフィプロネクチンレセプター及び同様のもの）を包含する。
【００６８】
本発明の投与形態様を標的化するのに有用な他の好ましい結合ペプチドは、血管平滑筋細胞間に位置する細胞間支質及びマトリックスに局在するものを包含する。そのような結合ペプチドは、標的細胞間の間質空間に治療材を供給する。治療材は、血管平滑筋細胞による続く摂取のためにそのような間質空間に開放される。このタイプの好ましい結合ペプチドは、コラーゲン、細胞外糖タンパク質、たとえばテナスシン、小網及び弾性繊維、及び他の細胞間マトリックス材料上のエピトープと会合される。
【００６９】
好ましい腫瘍細胞結合ペプチドは、 myc, ras, bcr／Ab1, erbB及び同様の遺伝子生成物のエピトープ、並びにムチン、サイトカインレセプター、たとえばIL−６，EGF, TGF及び同様のもの（これらの結合ペプチドは一定のリンパ腫(myc）、癌、たとえば結腸癌(ras）、癌腫（erbB）、線癌（ムチン）、乳癌及び肝癌（IL−６レセプター）、及び乳癌(EGF及びTGF)にそれぞれ会合される。好ましい免疫系エフェクター細胞結合ペプチドは、それぞれ、活性化されたＴ細胞及びマクロファージに局在する、抗−TAC 、IL−２及び同様のものである。本発明の実施において有用な他の好ましい結合タンパク質／ペプチドは、病理学的に増殖する正常組織、たとえば変性眼疾患に関連する眼内脈管構造の周細胞に局在することができる。
【００７０】
本発明の治療剤は、血管ペプチド細胞の細胞活性、たとえば増殖、移動、細胞体積の上昇、細胞外マトリックス合成の上昇（たとえばコラーゲン、プロテオグリカン及び同様のもの）、又は細胞による細胞外マトリックス物質の分泌を阻害するために選択される。好ましくは、治療剤は、ａ)DNAの複製を阻害することにより（たとえば薬物、アドリアマイシン、スタウロスポリン又は同様のもの）又は紡錘繊維形成を阻害することにより（たとえば薬物、コルキシン）、増殖細胞の細胞分裂を妨げ又は遅延する“細胞増殖抑制剤”及び同様のものとして；又はｂ）内部壁から内膜中への血管平滑筋細胞の移動のインヒビター、たとえば“抗−移動剤”、たとえばサイトカラシンとして；又はｃ）細胞体積の細胞内上昇のインヒビター（すなわち、細胞により占有される組織体積；“細胞骨格インヒビター”又は“代謝インヒビター”）として又はｄ）細胞タンパク質の合成及び／又は細胞外マトリックスの分泌又は構成を阻止するインヒビター（すなわち、“抗−マトリックス剤”）として作用する。
【００７１】
“細胞増殖抑制剤”の代表的な例は、たとえば変性されたトキシン、メトトレキセート、アドリアマイシン、放射性核種（たとえばFritzberg などのアメリカ特許第 4,897,255号に開示されるようなもの）、タンパク質キナーゼインヒビター（たとえば、スタウロスポリン）、特定酵素（たとえば  酵素 DNAトポイソメラーゼII及び DNAポリメラーゼ、 RNAポリメラーゼ、アデニルグアニルシクラーゼ）のインヒビター、スーパーオキシドジスムターゼインヒビター、末端デオキシスクレオチジルトランスフェラーゼ、逆転写酵素、平滑筋細胞の増殖を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び同様のものを包含し、これらが適切な用量で細胞区画中に供給される場合、それらは細胞を殺害しないで平滑筋細胞又は周細胞の増殖を減ずるように作用するであろう。
【００７２】
“細胞増殖抑制剤”の他の例は、平滑筋細胞又は周細胞の増殖を誘発することができる（たとえば、細胞外マトリックスの存在下で）細胞因子、サイトカイン（たとえばインターロイキン、たとえばIL−１）、成長因子（たとえばPDGF,  TGF−α又はβ、腫瘍壊死因子、平滑筋及び内皮−由来の成長因子、すなわちエンドセリン、FGF)、ホルモンレセプター（たとえばインテグリン）のペプチド又は類似するインヒビター（すなわちアンタゴニスト、アゴニスト又は競争性又は非競争性インヒビター）を含有する。平滑筋増殖のための細胞増殖抑制剤のこのカテゴリーにおける有用な治療剤の代表的な例は、ヘパリンのサブフラグメント、トリアゾロピリミジン（Trapidil ; PDGF アンタゴニスト）、ロバスタチン及びプロスタグランジンＥ１又はＩ２を包含する。
【００７３】
“抗−移動剤”の代表的な例は、走化性因子及びそれらのレセプター（たとえば補体ケモタクシン、たとえばC5a, C5a desarg 又はC4a ; 細胞外マトリックス因子、たとえばコラーゲン分解フラグメント）、又は運動に関与する細胞内細胞骨格タンパク質（たとえばアクチン、細胞骨格要素、及び運動に関与するホスファターゼ及びキナーゼ）のインヒビター（すなわちアゴニスト及びアンタゴニスト、並びに競争又は非競争インヒビター）を包含する。抗−移動剤のこのカテゴリーにおける有用な治療剤の代表的な例は、コーヒー酸誘導体及びニルバジピン（カルシウムカンタゴニスト）及びステロイドホルモンを包含する。好ましい抗−移動治療剤は、サイトカラシンである。
【００７４】
“細胞骨格インヒビター”の代表的な例は、コルヒシン、ビンブラスチン、サイトカラシン、タキソール、及び細胞内の微小管及びマイクロフィラメント網状構造に対して作用する同様のものを包含する。
【００７５】
“代謝インヒビター”の代表的な例は、スタウロスポリン、トリコテセン、及び変性されたジフテリア及びリシントキシン、プソイドモナス外毒素及び同様のものを包含する。好ましい態様において、治療接合体は、単純なトリコテセン又は高分子環式トリコテセン、たとえばベルカリン又はロリジンである治療剤により構成される。トリコテセンは、ファンジ  インペルフェクチ（Fangi imperfecti）の土壌菌に生成されるか、又はバッカラス  メガポタミカ（Baccharus megapotamica）から単離された薬物である（Bamburg, J.R. Proc. Molec. Subcell. Biol. 8 : 41-110, 1983, Jarvis & Mazzola, Acc. Chem. Res. 15 : 338-395, 1982) 。それらは、炭素、水素及び酸素のみを含む最とも毒性の分子であるように思える（Tamm, C. Fortschr. Chem. Org. Naturst. 31 : 61-117, 1974）。それらは、阻害、拡張又は終結相でタンパク質合成のインヒビターとしてリボソームのレベルで作用することが報告されている。
【００７６】
次の２種の広い種類のトリコテセンが存在する：中央のセスキテルペノイド構造のみを有するもの及び追加の高分子環式環を有するもの（それぞれ、単純な及び高分子環式トリコテセン）。単純なトリコテセンは、アメリカ特許第 4,744,981号及び第 4,906,452号（引用により本明細書に組込まれる）に記載されるように、３種のグループ（すなわちグループＡ，Ｂ、及びＣ）に細分化され得る。
【００７７】
グループＡの単純なトリコテセンの代表的な例は、スシルペン（scirpene）、ロリジン(Roridin）Ｃ、ジヒドロトリコテセン（dihydrotrichothecene）、スシルペン−４，８−ジオール、ベルカロール、スシルペントリオール、Ｔ−２テトラオール、ペンタヒドルキシスシルペン、４−デアセチルネオゾラニオール、トリコデルミン、デアセチルカロネクトリン、カロネクトリン、ジアセチルベルカロール、４−モノアセトキシスシルペノール、４，15−ジアセトキシスシルペノール、７−ヒドロキシジアセトキシスシルペノール、８−ヒドロキシジアセトキシ−スシルペノール(Neosolaniol）、７，８−ジヒドロキシジアセトキシスシルペノール、７−ヒドロキシ−８−アセチルジアセトキシスシルペノール、８−アセチルネオゾラニオール、NT−１，NT−２，HT−２，Ｔ−２及びアセチルＴ−２トキシンを包含する。
【００７８】
グループＢの単純なトリコテセンの代表的な例は、トリコテセン、トリコテシン、デオキシニバレノール、３−アセチルデオキシニバレノール、５−アセチルデオキシニバレノール、３，15−ジアセチルデオキシニバレノール、ニバレノール、４−アセチルニバレノール(Fnsarenon-X）、４，15−イデセチルニバレノール、４，７，15−トリアセチルニバレノール、及びテトラ−アセチルニバレノールを包含する。グループＣの単純なトリコテセンの代表的な例は、クロトコール及びクロトシンである。
【００７９】
代表的な高分子環式トリコテセンは、ベルカリン（Verrucarin）Ａ、ベルカリンＢ、ベルカリンＪ（サトラトキシンＣ）、ロリジンＡ、ロリジンＤ、ロリジンＥ（サトラトキシン（Satratoxin）Ｄ）、ロリジンＨ、サトラトキシンＦ、サトラトキシンＧ、サトラトキシンＨ、ベルチスポリン(Vertisporin）、マイトキシン(Mytoxin）Ａ、マイトキシンＣ、マイトキシンＢ、マイロトキシン(Myrotoxin）Ａ、マイロトキシンＢ、マイロトキシンＣ、マイロトキシンＤ、ロリトキシン(Roritoxin）Ａ、ロリトキシンＢ及びロリトキシンＤを包含する。
【００８０】
さらに、一般的な“トリコテセン”セスキテルペノイド環構造は、高等植物バッカラス・メガポタミカから単離された“バッカリン”と称す化合物にも存在し、そしてそれらは、Jarvisなど．(Chemistry of Alleopathy, ACS Symposium Series Ho. 268 : ed.A.C.Thempson, 1984, p149-159）により開示されるような文献に記載される。
【００８１】
“抗−マトリックス剤”の代表的な例は、マトリックス合成、分泌及び集合、組織的な架橋（たとえばトランスグルタミナーゼ架橋コラーゲン）、及びマトリックス再造形（たとえば創傷の治癒に続いて）のインヒビター（すなわちアゴニスト及びアンタゴニスト、並びに競争及び非競争インヒビター）を包含する。抗−マトリックス剤のこのカテゴリーにおける有用な治療剤の代表的な例は、コルヒチン、すなわち細胞外マトリックスの分泌のインヒビターである。
【００８２】
本発明の持効性投与形態様のためには、治療剤は好ましくは、細胞を殺害しないで血管平滑筋細胞活性を阻害するもの（すなわち細胞増殖抑制治療剤）である。この目的のための好ましい治療剤は、１又は複数の次の能力を示す：タンパク質合成阻害の前、 DNA合成を示す能力又は内膜中への血管平滑筋細胞の移動を阻害する能力。それらの治療剤は、タンパク質合成を実質的に阻害せず（すなわち、標的細胞を殺害しない）、そして従って、平滑筋細胞増殖を減じることによって、血管形成により引き起こされる血管壁外傷を安定化する細胞修復及びマトリックス生成を促進する。
【００８３】
そのような好ましい治療剤の例は、タンパク質キナーゼインヒビター、たとえばスタウロスポリン（スタウロスポリンはSigma Chemical Co., St. Louis, Missouri から入手できる）、サイトカラシン、たとえばサイトカラシンＢ (Sigma Chemical Co.）、及びスラミン（FBA Pharmaceaticals, West Haven, Connecticat）、並びにニトログリセリン(DaPont Pharmaceaticals, Inc., Nanuti, Puerto Rico) 、又はそれらの類似体又は機能的同等物である。それらの化合物は細胞増殖抑制剤であり、そして有意な DNA合成阻害が生じる濃度で最少のタンパク質合成阻害及び細胞毒性を行使することが示されている（例８及び図10Ａ−10Ｄを参照のこと）。本発明の持効性投与形態様において有用な治療剤を同定するための有用な手段は、たとえば例８に示されている。
【００８４】
当業者は、異なった標的細胞集団、たとえば付着性単層標的細胞型についてそのような同定を行なうために実質的に同等の実験手段を企画することができる。本発明の他の態様は、癌細胞に対して細胞毒性である剤を包含する。それらの態様のための好ましい剤は、ロリジンＡ、プソイドモナス外毒素、及び同様のもの又はそれらの類似体又は機能的同等物である。そのような治療剤、たとえば放射性同位体及び同様のものの多血症は、同定されており、そして当業界において知られている。さらに、細胞毒性成分の同定のための手段は、当業界において知られており、そして通常に使用されている。
【００８５】
免疫性介在の疾病エフェクター細胞の調節はまた、本発明の持効性投与形を用いて達成され得る。そのような転形は好ましくは、局部用持効性投与形の投与を通して接近することができるエフェクター細胞集団を有する疾病に対して行なわれる。関節炎（動脈内投与）、スペルー（経口投与）、ブドウ膜炎及び眼内炎（眼内投与）、及び角膜炎（結膜下投与）の処置におけるリンパ性網膜症細胞に対して必要な転形活性、たとえば細胞毒性、細胞増殖抑制性、代謝転形又は同様の活性を有する治療成分は、当業界において知られている技法を用いて同定できる。それらの剤はまた、複数の障害をもたらす、上皮腺及び内分泌器官の機能亢進を減じるためにも使用され得る。それらの態様のための好ましい剤は、ロリジンＡ、プソイドモナス外毒素、スラミン、タンパク質キナーゼインヒビター（たとえばスタウロスポリン）及び同様のもの、又はそれらの類似体又は機能的同等物を包含する。
【００８６】
本発明の実施において有用な他の好ましい治療剤は、正常な組織の病理学的増殖、移動又は機能亢進を減じ又は排除することができる成分を含む。そのような治療剤の例は、過形成又は低められた血管腔領域に起因する変性眼疾患に付随する眼内脈管構造の平滑筋細胞又は周細胞の病理学的増殖又は延長された収縮性、及び角膜上皮及び支質の機能亢進を減じ又は排除することができるものである。このための好ましい剤は、スタウロスポリン及びサイトカラシンＢである。
【００８７】
本発明の血管平滑筋結合タンパク質は、血管平滑筋細胞の表面上の標的物に結合する。血管平滑筋細胞の細胞膜と会合する、特定の標的物、たとえばポリペプチド又は炭水化物、プロテオグリカン及び同様のものが、特定の血管平滑筋結合タンパク質を適切に選択し（たとえば、クローニングにより）、又は構成する（たとえば遺伝子構築又は化学合成により）ために有用であることが理解されるであろう。特に有用な“標的物”は、たとえば膜構成抗原のターンオーバーが再生において生じるにつれて、平滑筋細胞により内在化される。細胞による内在化はまた、ファゴリソソーム、クラスリン−被覆されたピット、レセプター介在の再分布又はエンドサイト−シス及び同様の手段を包含する機構により行なわれ得る。
【００８８】
好ましい態様において、そのような“標的物”は、血管平滑筋細胞により合成されるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）により例示され、そして約 250kDの見掛分子量を有するCSPG分子の別の部分（本明細書においてはエピトープと称す）が特に好ましい。 250kDの標的物は、大きな 400kDのプロテオグリカン複合体の成分であるＮ−連結された糖タンパク質である（14）。本発明の１つの現在好ましい態様においては、血管平滑筋結合タンパク質が、血管平滑筋CSPG標的分子におけるエピトープに結合するNR−AN−01モノクローナル抗体（NR−ML−05の継代培養）により供給される。
【００８９】
NR−ML−05と称するモノクローナル抗体は、黒色腫細胞により合成される 250kDのCSPGを結合する（Morgonなどによるアメリカ特許第 4,897,255号）。平滑筋細胞及び周細胞は、また 250kDのCSPG及び他のCSPGと合成するらしい（11）。平滑筋細胞に結合するNR−ML−05は開示されている（Fritzberなどのアメリカ特許第 4,879,225号）。モノクローナル抗体NR−ML−05及び継代培養物NR−ML−05 No.85−41−4I−A2、凍結番号Ａ2106は両者とも、ATCC (Rockville, MD)に寄託され、そしてそれぞれHB−5350及びHB−9350の受託番号を得た。
【００９０】
NR−ML−05は、本明細書に開示されるサブクローンNR−AN−01の親であり、そしてそれに構造的且つ機能的に等しい。NR−AN−01は、 400kDのCSPG標的物と特異的に会合する血管平滑筋結合タンパク質の１つの例であり、そしてこの標的物と会合する他の結合タンパク質及びこの標的物における他のエピトープ（14）がまた本発明の治療接合体及び方法においても有用であることが理解されるであろう。本発明の場合、６種のネズミモノクローナル抗体及び２種のヒトキメラ性モノクローナル抗体がまた、本明細書に記載されるようにして選択され、ここで前記抗体は、血管平滑筋細胞の 250kDのCSPGを特異的に標的化する。
【００９１】
前記抗体はまた、細胞膜への結合に続いて、平滑筋細胞により内在化されるようにも見える。免疫反応性研究はまた、45人のヒト正常組織及び30の異なった癌腫において 250kDの抗原へのネズミ MAbの結合を示しており、そしてそれらの結果のいくつかは、これまでに開示されている（アメリカ特許第 4,897,225号）。この開示及び他のヒト臨床研究においては、CSPGの 250kD抗原に対して向けられた MAbがインビボにおいて血管平滑筋細胞に局在化した。
【００９２】
さらに、CSPGマーカー抗原エピトープとNR−AN−01モノクローナル抗体との複数点運動会合に関与するアミノ酸残基（すなわち、相補的決定領域を構成するアミノ酸）は、コンピューター助力の分子モデリング及び変更された抗体結合親和性を有する変異体の使用により決定されることが理解されるであろう。NR−AN−01抗原結合部位の結合部位アミノ酸及び三次元モデルは、血管平滑筋細胞及び周細胞により合成されるCSPGについての結合親和性を有する、機能的同等物、たとえば短いポリペプチド（“最少ポリペプチド”）を構成するための分子モデルとして作用する。
【００９３】
血管手術方法、たとえばPTCAに続いて狭窄を処置するための本発明の好ましい態様においては、本発明の実施において使用するための選択された結合タンパク質、たとえば抗体又はフラグメントは、血管平滑筋の 250kDのCSPGについて10４  ｌ／モル以上の結合親和性、及びまた、平滑筋細胞又は周細胞に結合される及びそれにより内在化される能力を有する。
【００９４】
三次元モデリングはまた、その抗原性エピトープへのNR−AN−01の結合性を模倣する他の機能的同等物、たとえばCSPG標的抗原におけるそのエピトープに結合するNR−AN−01の三次元観点を模倣する“擬似”化合物を構成するためにも有用である。本明細書で使用される場合、“最少ポリペプチド”とは、少なくとも６個の長さのアミノ酸のアミノ酸鳩配列を言及する。本明細書で使用される場合、用語“擬似”とは、血管平滑筋細胞又は周細胞により合成されるNR−AN−01 CSPG 標的物のアミノ酸に結合するための適切な空間を達成するよう構成された有機化学ポリマーを言及する。
【００９５】
本発明者はまた、ヒトモノクローナル抗体又は“ヒト適合化された”ネズミ抗体の、それらの発明の治療接合体における平滑筋結合タンパク質としての利用性をも企画することが理解されるであろう。たとえば、ネズミモノクローナル抗体は、ヨーロッパ特許出願第 0,411,893A2号に開示される態様に類似する態様で、ヒト不変ドメイン領域及びFc領域をコードするヌクレオチド配列によりネズミFv領域（すなわち、抗原結合部位を含む）をコードするヌクレオチド配列を遺伝子的に組換えることによって“キメラ化”され得る。ヒト適合化された血管平滑筋結合パートナーは、宿主受容体における抗体又はポリペプチドの免疫反応性を低める利点を有することが認識され、それにより、インビボ半減期を高め、そして悪影響の免疫反応の可能性を低めるために有用である。
【００９６】
血管平滑筋細胞間に位置する細胞間支質及びマトリックスに局在するペプチドは、本発明の再狭窄処理用持効性投与形のための有用な結合ペプチドとしても企画される。そのような結合ペプチドは、標的細胞間の間質空間に治療剤を供給する。治療剤は、血管平滑筋細胞による続く摂取のためにそのような間質空間中に開放される。このタイプの好ましい結合ペプチドは、コラーゲン、細胞外糖タンパク質、たとえばテナスシン、小網及び弾性繊維、サイトケラチン及び他の細胞間マトリックス成分上のエピトープと会合される。
【００９７】
細胞間支質及びマトリックスに局在する、最少ペプチド、擬似有機化合物、ヒト又はヒト適合化されたモノクローナル抗体及び同様のものはまた、本発明のこの態様における結合ペプチドとしても有用である。そのような結合ペプチドは、既知の技法に従って同定され、そして構成され、又は単離され得る。本発明の好ましい態様においては、間質性マトリックス結合タンパク質は、少なくとも約10−４Ｍの会合定数を有する標的エピトープに結合する。
【００９８】
本発明の癌処置態様のための有用な結合ペプチドは、癌細胞の細胞膜及び細胞質エピトープ及び同様のものと会合されるものを包含する。それらの結合ペプチドはそれぞれ、損なわれていない細胞の表面積及び破壊された細胞の内部エピトープに局在し、そして標的細胞中に同化のための治療剤を供給する。必要な腫瘍細胞型に局在する、最少ペプチド、擬似有機化合物、及びヒト又はヒト適合化された抗体はまた、本発明の結合ペプチドとしても有用である。そのような結合ペプチドは、既知の技法に従って、同定され、そして構成され、又は単離され得る。本発明のそれらの態様の好ましい結合ペプチドは、少なくとも約10−６Ｍの会合定数を有する標的エピトープに結合する。
【００９９】
免疫系−介在の疾病エフェクター細胞、たとえばリンパ性細胞システムの細胞を免疫化するために局在する、膜及び細胞質エピトープに対する結合ペプチド及び同様のものはまた、本発明の持効性投与形を供給するためにも有用である。治療剤は、そのような持効性投与形によりそこにおける内在化のために標的細胞に供給される。必要なエフェクター細胞型に局在する、最少ペプチド、擬似有機化合物、及びヒト又はヒト適合化された抗体はまた、本発明の結合ペプチドとしても有用である。そのような結合ペプチドは、既知の技法に従って、同定され、そして構成され、又は単離され得る。本発明のそれらの態様の好ましい結合ペプチドは、少なくとも約10−６Ｍの会合定数を有する標的エピトープに結合する。
【０１００】
本発明の実施において有用な他の好ましい結合タンパク質又はペプチドは、病理学的に増殖する正常組織、たとえば変性眼疾患に付随する眼内脈管構造の周細胞に局在することができる。内在化のために標的細胞に供給される。必要病理学的に増殖する正常細胞型に局在する、最少ペプチド、擬似有機化合物、及びヒト又はヒト適合化された抗体はまた、本発明の結合ペプチドとしても有用である。そのような結合ペプチドは、既知の技法に従って、同定され、そして構成され、又は単離され得る。本発明のそれらの態様の好ましい結合ペプチドは、少なくとも約10−６Ｍの会合定数を有する標的エピトープに結合する。
【０１０１】
血管平滑筋結合タンパク質に共有又は非共有結合を通して治療剤を結合するための代表的な“結合”方法は、治療剤における反応基（たとえばヒドロキシル、アミノ、アミド又はスルフヒドリル基）と血管平滑筋結合タンパク質における他の反応基（類似する性質の）との間に結合を形成するよう反応する、化学架橋剤及びヘテロ二官能価架橋化合物（すなわち“リンカー”）を包含する。この結合はたとえば、ペプチド結合、ジスルフィド結合、チオエステル結合、アミド結合、チオエーテル結合及び同様のものである。
【０１０２】
１つの例示的な例においては、薬物とモノクローナル抗体との接合体は、Morgan and Fuun (Monoclonal Antibody Therapy to Cancer : Preclinical Models and Investigations, Basic and Clinical Tumor Immunology, Vol.2, Kluwer Academic Publishers, Hingham, MA)により及びUhr (J. of Immunol. 133 : i-vii, 1984)により要約されている。放射性核種細胞増殖抑制剤を、接合体が含むもう１つの例示的な例において、引用により本明細書に組込まれるアメリカ特許第 4,897,255号（Frstzberg など.,）は有用である結合方法を教授する。１つの現在、好ましい態様においては、治療接合体は、トリコテセン薬物に共有結合される血管平滑筋結合タンパク質を含む。
【０１０３】
この場合、この結合の共有結合は、血管平滑筋結合タンパク質の１又は複数のアミノ、スルフヒドリル又はカルボキシル基と、ａ）トリコテセン自体；ｂ）トリコテセンヘミスクシネートカルボン酸；ｃ）トリコテセンヘミスクシネート（HS）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミデートエステル；又はｄ）ポリ−Ｌ−リシン又はいづれかのポリマーキャリヤーとのトリコテセン複合体との間に形成され得る。トリコテセン治療剤を含む治療接合体を調製するための結合方法の代表的な例は、アメリカ特許第 4,906,452号及び第 4,744,981号に記載されている。結合タンパク質とトリコテセンとの間にシッフ塩基結合を形成するためにヒドラジドを用いる他の例が、継続出願のアメリカ特許出願第07／415,154 号に開示されている。
【０１０４】
結合方法の選択は、血管平滑筋結合タンパク質又はペプチド、間質性マトリックス結合タンパク質又はペプチド、及び治療剤の選択により、及びまた、たとえば貯蔵寿命安定性のような物質により、及び／又はたとえば細胞及び血液における半減期、細胞内区画化路及び同様のもののような生物学的性質により影響されるであろう。たとえば、１つの現在、好ましい治療接合体においては、ロリジンＡ治療剤のヘミスクシネート接合体は、ベルカリンＡのそれよりも一層、長い血清半減期を有し、そしてこの高められた安定性は、有意に高められた生物学的活性をもたらす。
【０１０５】
本発明の持効性態様は、非生物分解性又は生物分解性ポリマー構造体内に分散される治療剤を含む。そのような分散は、下記文献に記載される方法に従って行なわれる：Cowsarなど., "Poly (Lactide-Co-Glycolide) Microcapsale for Controlled Relcase of Steroids," Methods Enzymology, 112 : 101-116, 1985 ; Eldridgeなど., "Biodegradable and Biocompatible Poly (DL-Lactide-Co-Glycolide) Microspheres as an Adjuvant for Staphylococcal Enterotoxin B Toxoid Which Enhances the Level of Toxin-Neutralizing Antibodies," Infection and Immunity, 59 : 2978-2986, 1991; Cohenなど., "Controlled Delivery Systems for Proteins Based on Poly (Lactic/Glycolic Acid) Microspheres," Pharmaceutical Research, 8(6) : 713-720, 1991 ;及びSanders など., "Controlled Release of a Luteinizing Hormone-Releasing Hormone Analogue from Poly (D,L-Lactide-Co-Glycolide) Microspheres," J.Pharmaceutical Science, 73(9) : 1294-1297, 1984。
【０１０６】
本発明の持効性投与形の物理的及び化学的性質は、結合タンパク質又はペプチドへの結合のいくつかの態様に従う。本発明の投与形（持効性型）は、たとえば共有結合、中間リガンドサンドイッチ結合又は非共有吸着又は部分的取り込みを通して結合タンパク質／ペプチドに結合することができる。好ましいポリ−乳酸／グリコール酸粒質物がそこに分散される治療剤により形成される場合、荷電されていないポリマー主鎖が、大部分の末端カルボキシ基にそって内部へ（そこに含まれる擬似親油性治療剤と共に）及び外部に配向される。
【０１０７】
それらの表面カルボキシ基は、たとえばカルボジイミドにより活性化される場合、結合タンパク質／ペプチドの求核性基のための共有結合部位として作用することができる。そのような求核性基は、リシンイプシロンアミノ基（アミド結合）、セリンヒドロキシル基（エステル結合）又はシステインメルカプタン基（チオエステル結合）を包含する。特定の基との反応は、pH及び反応状態の還元状態に依存する。
【０１０８】
たとえば、末端カルボン酸基を有するポリ−乳酸／グリコール酸粒質物は、式Ｒ−Ｎ＝Ｃ−Ｎ−Ｒ′（式中、Ｒは３−ジメチルアミノプロピル基又は同様の基であり、そしてＲ′はエチル基又は同様の基である）で表わされる水溶性カルボジイミドの存在下でＮ−ヒドロキシベンズトリアゾールと反応される。次に、ベンズトリアゾール誘導体化された粒質物（すなわち、活性化されたイミデート−担持の成分）は、タンパク質／ペプチド求核性成分、たとえば利用できるイプシロンアミノ成分と反応せしめられる。他方では、ｐ−ニトロフェノール、テトラフルオロフェノール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド又は同様の分子は、カルボジイミドの存在下でポリ−乳酸／グリコール酸粒質物の末端カルボキシ基と活性エステルを形成するために有用である。
【０１０９】
他の結合タンパク質／ペプチド求核成分は、セリンのヒドロキシル基、システインの内因性遊離チオール、この目的のために通常、使用される還元剤を用いての結合タンパク質／ペプチドジスルフィド架橋の還元に起因するチオール基（たとえばシステイン、ジチオトレイトール、メルカプトエタノール及び同様のもの）及び同様なものを包含する。さらに、ポリ−乳酸／グリコール酸粒質物の末端カルボキシ基は、塩化アシル誘導体化された成分を形成するために塩化チオニルとの反応により活性化できる。次に、誘導体化された粒質物は、本発明の標的化された投与形を形成するために結合ペプチド／タンパク質求核基と反応せしめられる。
【０１１０】
直接的な持効性投与形−結合タンパク質又はペプチド接合は、結合タンパク質／ペプチド標的細胞認識を破壊することができる。リガンドサンドイッチ結合技法は、持効性投与形−結合タンパク質／ペプチド結合を達成するために有用なもう１つの技法である。そのような技法は、標的細胞集団に結合しないタンパク質を用いての一次ペプチド又はタンパク質シェルの形成を包含する。次に、結合タンパク質／ペプチドが、官能結合タンパク質／ペプチドを有する粒質物を供給するために前記一次ペプチド又はタンパク質シェルに結合される。
【０１１１】
典型的なリガンドサンドイッチアプローチは、“直接的な”結合アプローチに関して上記に記載されるような官能基を通しての粒質物へのアビジン又はストレプタビジンの共有結合を包含する。結合タンパク質又はペプチドは、官能化されたビチオン（たとえば活性エステル、ヒドラジド、ヨードアセタール、マレイミジル又は同様の官能基を通して）により、好ましくは最少に誘導体化される。アビジン／ストレプタビジン一次タンパク質シェルの利用できるビオチン結合部位へのリガンド（すなわち、結合ペプチド又はタンパク質／官能価されたビオチン）の結合は、飽和量のビオチニル化されたタンパク質／ペプチドの使用を通して生じる。
【０１１２】
たとえば、末端カルボン残基を有するポリ−乳酸／グリコール酸粒質物が、カルボジイミドにより活性化され、そして続いて、アビジン又はストプレタビジンと反応せしめられる。結合タンパク質又はペプチドは、ビオチニル化された結合タンパク質／ペプチドを形成するために、結合タンパク質／ペプチドに対するビオチン−含有化合物の１〜３モル割合で、ビオチンアミドカプロエートＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応せしめられる。モル過剰のビオチニル化された結合タンパク質／ペプチドが、本発明の標的化された投与形を形成するためにアビジン−誘導体化された粒質物と共にインキュベートされる。
【０１１３】
他方では、粒状カルボキシ基がビオチニル化される（たとえば、カルボキシ基のカルボジイミド活性化及びアミノアルキルビオチンアミドとの続く反応を通して）。次に、ビオチニル化され粒質物が、遊離ビオチン結合部位を有する、タンパク質被覆された粒質物を形成するために飽和濃度（すなわち、モル過剰）のアビジン又はストプレタビジンと共にインキュベートされる。次に、そのような被覆された粒質物は、上記のようにして形成された、モル過剰のビオチニル化された結合タンパク質と反応することができる。もう１つの選択は、ビオチニル化された粒質物へのアビジン又はストレプタビジン結合の結合ペプチド又はタンパク質の結合を包含する。
【０１１４】
さらに、結合タンパク質／ペプチド−粒質物の結合は、粒質物の部分的に暴露されたポリマー主鎖非イオン特性に起因する、粒質物への結合ペプチドの吸着により達成され得る。高いイオン強度条件（たとえば 1.0モルのNaCl）下では、水素及び疎水性粒質物−結合タンパク質／ペプチドの結合が好ましい。
【０１１５】
さらに、結合タンパク質／ペプチドは、その形成に基づいて、粒状ポリマーマトリックスに一部、取り込まれ得る。それらの環境下で、そのような取り込まれた結合タンパク質／ペプチドは、粒質物に残基選択結合特性を付与する。穏やかな粒質物形成条件、たとえばCohen など,. Pharmaceutical Research 8 : 713-729 (1991) により使用される条件が、本発明のこの態様のために好ましい。そのような取り込まれた結合タンパク質はまた、エキソサイト−シスを受けた、部分的に分解された粒質物の標的細胞再結合においても有用である。異なった暴露された官能基を有する他のポリマー粒状投与形（たとえば非生物分解性投与形）は、上記原理に従って、結合タンパク質又はペプチドに結合され得る。
【０１１６】
本発明の実施において有用な典型的な非生物分解性ポリマーは、ポリスチレン、ポリプロピレン、スチレンアクリル酸コポリマー及び同様のものである。そのような非生物分解性ポリマーは、結合タンパク質／ペプチドの結合のための官能基、たとえばカルボン酸基、脂肪族第一アミノ基、芳香族アミノ基及びヒドロキシル基を組込み、又はそれらの基を組込むために誘導体化され得る。
【０１１７】
カルボン酸官能基は、たとえばポリ−乳酸／グリコール酸生物分解性ポリマー粒状投与形について上記で示される反応機構を用いて、結合タンパク質又はペプチドに結合される。第一アミノ官能基は、たとえば、上記のような結合ペプチド／タンパク質に結合され得る末端カルボキシ成分を形成するために無水琥珀酸とその反応により結合される。さらに、第一アノミ基は、臭化シアンにより活性化され得、そして結合タンパク質／ペプチド第一アミノ基とのグアニジン連鎖を形成する。
【０１１８】
芳香族アミノ官能基、結合タンパク質／ペプチドチロシンと反応するジアゾニウム成分を形成するために亜硝酸によりジアゾ化され、それにより、非生物分解性粒質物と結合タンパク質／ペプチドとの間にジアゾ結合を生成する。ヒドロキシル官能基は、たとえばそのヒドロキシル成分を末端のカルボン酸官能基に転換することによって、結合タンパク質／ペプチド第一アミノ基に結合される。そのような転換は、クロロ酢酸との反応、続くカルボジイミドとの反応を通して達成され得る。生物分解性粒質物に関して上記で論ぜられた、サンドイッチ、吸着及び取り込み技法は、非生物分解性粒質物−結合タンパク質／ペプチド付加に同様に適用できる。
【０１１９】
好ましい態様においては、標的化は、たとえば血管形成に続いての傷つけられた血管部位の内膜領域における高められた平滑筋をもたらす潜在的に増殖する細胞、たとえば周細胞及び血管平滑筋細胞に対して特異的である。本発明の観点は、本発明の治療接合体が血管形成、たとえばPTCA、アテローム切除、及び経皮間腔冠状回転アテローム切除）percutaneous transluminal coronalrotational atheroblation ）の後、平滑筋増殖を遅延せしめ、減じ又は排除するために使用される治療様式に関する。
【０１２０】
もう１つの好ましい態様においては、標的化は、局部投与を受けることができる一次又は転移性腫瘍病巣、たとえば側後切開により浸潤のために暴露される腫瘍、又は透視又はコンピューター化された断層撮影法のために眼に見える腫瘍、及び哺乳類動物内の小さな領域又は腔に制限される内部腫瘍病巣又は腫瘍、たとえば腹部に位置する卵巣癌、病巣性又は多病巣性肝臓腫瘍又は同様のものへの注入針投与のために眼に見える腫瘍に対して特異的である。本発明のこの態様の観点は、治療剤が標的細胞に対して細胞毒性であり、又は細胞を代謝的に転形し、化学療法及び／又は放射線治療に対するそれらの感度を高める治療様式を包含する。
【０１２１】
もう１つの態様において、標的化は、免疫系−介在の疾病、たとえば関節炎、眼内免疫系−介在の疾病又はスプルーに包含される局所投与接近性エァフェクター細胞集団に対して特異的である。本発明のこの態様の観点は、治療剤が細胞毒性であり、又は治療目的をもたらすために標的細胞の生物学的応答を変性する治療様式を包含する。
【０１２２】
もう１の態様においては、標的化は、たとえば変性眼疾患、角膜パンヌス、機能亢進性内分泌腺又は同様のものに包含される、局所投与接近性の病理学的に増殖し又は機能亢進性の正常細胞集団に対して特異的である。本発明のこの態様の観点は、治療剤が標的細胞集団の増殖又は機能亢進を減じ又は排除する治療様式を包含する。
【０１２３】
外傷又は疾病血管部位の処置のためには、本発明の治療接合体又は投与形は、たとえばC.R.Band Inc., Billerica, MAにより製造される注入用カテーテル、又はWolinsky（７：アメリカ特許第 4,824,436号）又はSpears（アメリカ特許第 4,512,762号）により開示されるカテーテルを用いて宿主に投与され得る。この場合、治療接合体の治療的に有効な用量は、典型的には、カテーテルのバルーン間の流体空間における接合体の濃度が約10-3〜10-12 Ｍの範囲で存在する場合に達成されるであろう。
【０１２４】
本発明の治療接合体は、治療抗−増殖接合体に、管腔をおおう内膜又は中膜細胞の隣接する（６〜９個）細胞層を暴露するのに十分な抗−増殖治療用量で供給されることを単に必要とするが、ところが抗−収縮性治療用量は全中膜を暴露することを必要とし、そしてさらに、この用量は、たとえばａ）適切な動物モデル系からの血管に注入し、そして接合体及びその効果（たとえば下記例に例示される）を検出するための免疫組織学的方法を用いて；及びｂ）下記例３，４及び５に例示されるような適切なインビトロ研究を行なうことによって実験的に決定され得ることが、本明細書に提供される例から認識されるであろう。
【０１２５】
代表的な例において、この治療的有効な用量は、 200μｇ／mlの治療接合体溶液10mlを調製することによって達成され、ここで血管平滑筋タンパク質結合タンパク質はNR−AN−01であり、そして治療剤はロリジンＡ、すなわちトリコテセン薬物である。たとえば手術又は疾病（たとえば下記を参照のこと）に起因する血管外傷を処理するためには治療接合体が注入カテーテルにより投与される場合、10mlがそのカテーテルを満たすための十分な体積であり、そして血管壁における１〜３の外傷性病変中に１〜 1.5mlを注入する。
【０１２６】
本発明の治療接合体の所望する治療的に有効な用量は、いくつかの要因、たとえばａ）治療接合体への血管平滑筋結合タンパク質の結合親和性；ｂ）注入の間に適用される周囲圧力；ｃ）投与される治療接合体が血管部位で残留する時間；ｄ）使用される治療剤の性質；及び／又はｅ）血管外傷及び所望する治療の性質に依存することが当業者により認識されるであろう。治療的に有効な用量で薬物を供給するよう訓練された当業者は（たとえば、患者における薬物レベルをモニターし、そして臨床効果を観察することによって）、経験及び専門的判断に基づいて個々の患者のために最適な用量を決定するであろう。
【０１２７】
好ましい態様においては、血管壁に対して直接的に、15秒〜３分間、適用される約0.3atm（すなわち、300mmHg)〜約３atmの圧力が、哺乳類動脈壁の平滑筋層中へのNR−AN−01結合タンパク質を含む治療接合体の浸潤を達成するためには適切である。当業者は、所望するヒト血管壁の内膜層中への治療接合体の浸潤がたぶん可変性であり、そして個人に基づいて決定される必要があることを認識するであろう。
【０１２８】
本発明の態様の持効性投与形は、管腔をおおう中膜平滑筋細胞の隣接する（６〜９個）細胞層をその投与形に暴露するのに十分な抗−増殖性治療用量で供給される必要がある。この用量は、たとえばａ）投与形及びその効果を検出するめに、適切な動物モデルシステムからの血管に注入し、そして免疫組織化学的、蛍光又は電子顕微鏡方法を用いて；そしてｂ）適切なインビトロ研究を実施することによって、実験的に決定することができる。
【０１２９】
代表的な例において、この治療的に有効な用量は、連続した暴露で、毒性用量と最小効果用量との間で治療効果をもたらす細胞周囲剤用量を平滑筋細胞組織培養において決定することによって達成される。この治療レベルは、この細胞周囲治療用量を維持するために動脈壁の平滑筋細胞間に注入される粒質物について必要とされる、大きさ、数及び治療剤濃度及び開放速度を決定することによってインビボで得られる。投与形は、次の典型的な治療剤の細胞周囲用量に近づく速度で治療剤を開放すべきである：約0.01〜約 100μｇ／mlのニトログリセリン、約 1.0〜約1000μｇ／mlのスラミン、約 0.001〜約 100μｇ／mlのサイトカラシン及び約0.01〜約105 ng／mlのスタウロスポリン。
【０１３０】
本発明の持効性投与形の所望する治療的有効量は、いくつかの要因、たとえばａ）投与形と会合される結合タンパク質の結合親和性；ｂ）周囲圧力及び注入の持続期間；ｃ）投与される投与形が標的部位で残留する時間；ｄ）粒状投与形からの治療剤開放の速度；ｅ）使用される治療剤の性質；ｆ）外傷及び／又は所望する治療の性質；及び／又はｇ）粒状投与形の細胞間及び／又は細胞内局在化に依存することが当業者により認識されるであろう。治療的に有効な用量で薬物を供給するよう訓練された当業者は（たとえば、患者における薬物レベルをモニターし、そして臨床効果を観察することによって）、経験及び専門的判断に基づいて個々の患者のために最適な用量を決定するであろう。
【０１３１】
好ましい態様においては、動脈壁に対して15秒〜３分間、適用される約0.3atm（すなわち、300mmHg)〜約３atm の圧力が、哺乳類動脈壁の平滑筋層中へのNR−AN−01結合タンパク質に結合される持効性投与形の浸潤を達成するためには適切である。Wolinskyなど.,“Direct Intraarterial Wall Injetion of Microparticles Via a Catheter : A Potential Drug DeliveryStrategy Following Angioplasty," Am Heart Jour. 122(4) :1136-1140, 1991 を参照のこと。当業者は、標的細胞集団中への持効性投与形の浸潤がたぶん可変性であり、そして個人に基づいて決定される必要があることを認識するであろう。
【０１３２】
リボソーム又は DNA代謝に基づいてその効果を細胞内に行使する治療剤の選択は、治療的に有効な用量を達成するために必要とされる用量及び時間に対して影響を及ぼし、そしてこの方法は、治療接合体又は投与形が血管形成に続く狭窄を遅延し、減じ又は妨げるその効果を達成するために投与されるべき濃度の範囲を見出すために、下記例に記載されているようにインビトロ及び動物研究においてモデル化され得ることがまた認識されるであろう。既知の比活性（たとえば、ｍモル又はmgのタンパク質当たりのミリキューリー）のα−，β−又はγ−エミッターにより放射性ラベルされた治療接合体は、その治療手段により必要とされる治療接合体の濃度を決定するための組織学的な組織断片の定量イメージング又はオートラジオグラフィーにより動物研究及びヒト試験にそれらを用いて治療的に有効な量を決定するために有用である。
【０１３３】
治療接合体又は投与形の治療的有効量は、少なくとも３種の条件が満たされる場合、すなわち、（１）治療接合体又は投与形が外傷的に傷つけられた血管の内膜層に分布され；（２）治療接合体又は投与形が平滑筋細胞の所望する細胞内区画内、すなわち治療剤の作用の必要な区画内に分布され、又は投与形から細胞外に放される治療剤がその相応の細胞内区画内に分布され；そして（３）治療剤が、血管平滑筋細胞の所望する細胞活性、たとえば増殖、移動、高められた細胞体積、マトリックスの合成、細胞収縮、及び同様のことを阻害する場合に達成されるであろう。
【０１３４】
治療接合体又は投与形が注入カテーテルにより供給される場合、治療接合体又は投与形のための所望する阻害活性を達成するための必要とされる治療用量はまた、インビトロ研究の使用を通して予想され得ることが理解されるであろう。好ましい観点においては、その注入カテーテルは、便利には、浸透膜を有する二重バルーン又は四重バルーンカテーテルであり得る。１つの代表的な態様において、治療接合体又は投与形の治療的有効量は、疾病（たとえばアテローム硬化症、動脈瘤又は同様のもの）又は血管手術工程、たとえば血管形成、アテローム切除、ステントの配置（たとえば血管に）、血栓摘出及び移植に起因する血管外傷を処理するために有用である。
【０１３５】
アテローム切除は、たとえば、手術による切開、超音波又はレーザー処理、又は高圧流体流により実施され得る。移植は、たとえば、天然又は合成材料を用いての血管移植、又は器官移植の間、血管の手術による吻合である。当業者は、一定の血管手術方法（上記）のための適切な治療量は、インビトロ及びインビボ動物モデル研究、及びヒト症状発現前研究において決定されることを理解されるであろう。下記例においては、ロリジンＡ及びNR−AN−01を含む治療接合体は、放射性ラベルされたアミノ酸の組込みにより判断される場合、インビトロでの試験細胞における細胞タンパク質合成を少なくとも５〜50％阻害する濃度で、インビボにおける治療的有効量を達成した。
【０１３６】
抗−移動又は抗−マトリックス治療剤を含む接合体又は投与形中の治療剤の場合、それぞれインビトロアッセイでの細胞移動及び細胞付着は、治療的有効量が血管壁における注入カテーテルにより創造される流体空間に達する濃度で決定するために使用され得る。
【０１３７】
本発明の１つの代表的な態様は注入カテーテルを用いての治療法に関するが、薬物供給のための他の方法又は投与の経路はまた、移植された浸透ポンプ又は他の腔内路による静脈内、リンパ内、クモ膜下内、動脈内局部供給による注入のために有用であることが認識されるであろう。静脈内投与のためには、本発明の超微粒子投与形が好ましい。超微粒子の静脈内投与は、たとえば血管透過性が漏れのために腫瘍において、特に間質流体中への粒子の漏れを可能にする傷つけられた血管を有する腫瘍の壊死領域において高められる場合、及び動脈壁が露出され、そして外傷を与えられ、中膜の間質領域への粒子の侵入を可能にされる場合、有用である。
【０１３８】
好都合には、結合されていない血管平滑筋細胞結合タンパク質（たとえば遊離NR−AN−01抗体）は、交差反応部位に非特異的結合の遮断薬を供給するために、治療剤接合体又は投与形の投与の前に投与される。そのような部位の遮断は、血管平滑筋細胞結合タンパク質は一般的に、所望する平滑筋細胞以外の組織における細胞とのいくらかの低レベルの交差反応性を有するので、重要である。そのような遮断は、たとえばより多くの治療接合体の細胞への利用性を可能にすることによって、特定の血管部位での治療接合体又は投与形の局在化を改良することができる。
【０１３９】
例としては、結合されていない血管平滑筋結合タンパク質が、治療接合体又は投与形の投与の、約５分〜約48感前、最とも好ましくは約５分〜約30分前に投与される。本発明の１つの好ましい態様においては、ラベルされていない特定の“遮断薬”は、一価又は二価形の抗体（たとえば完全な抗体又は抗体のF(ab)2′、Fab 、Fab ′、又はFvフラグメントである）抗体の一価形は、非特異的な交差反応部位の遮断を最大にすると共に、治療接合体又は投与形の置換を最小にする利点を有する。
【０１４０】
結合されていない血管平滑筋細胞結合タンパク質は、患者における非特異的交差反応部位の少なくとも一部の結合を遮断するのに有効な量で投与される。その量は、患者の体重及び結合タンパク質の性質のような要因に従って変えることができる。一般的に、約0.06mg〜0.20mg／kg体重又はそれ以上のラベルされていない特異的な遮断薬がヒトに投与される。
【０１４１】
さらに、第２の無関係な血管平滑筋細胞結合タンパク質が、組織への治療接合体又は投与形の非特異的結合を減じるために、その治療接合体又は投与形の投与の前、患者に任意に投与され得る。好ましい態様におていは、その無関係な結合タンパク質は、抗原特異的結合を通して患者における部位に結合しないが、しかし代わりに、たとえばFcレセプター結合網内細胞、asialo−レセプター結合及びコビキチン−発現細胞への結合を通して、非特異的態様で結合する抗体であり得る。その無関係な“遮断薬”は、治療接合体又は投与形の非特異的結合を低め、そして従って、副作用、たとえば治療接合又は投与形の使用に関連する細胞毒性を減じる。
【０１４２】
その無関係な“遮断薬”は、好都合には、治療接合体又は投与形の投与の、５分〜48時間前、最とも好ましくは15分〜１時間前に投与されるが、但し、その時間はその治療接合体、及び注入の経路又は方法に依存して変えることができる。無関係な“遮断薬”の代表的な例は、ヒト組織及びレセプター、又は試験される場合、ヒト細胞膜標的物に特定の態様（たとえば、Ka＜103 Ｍ-1を有する）で結合しないことが見出されている、動物源からなる調製された細胞性及び血清タンパク質と反応性である抗体を包含する。
【０１４３】
本発明の接合体及び投与形は、血管形成に続いての治療のためへの使用には制限されないが；むしろ、治療接合体及び投与形の有用性は、血管壁における平滑筋細胞及び周細胞の細胞活性を阻害するそれらの能力により規制されることが認識されるであろう。従って、本発明の他の観点は、アテローム硬化性プラーク及び血管壁肥大及び／又は過形成の領域を減じ、遅延せしめ、又は排除する（そしてさらに、逆転する）ための初期治療介入において有用な、治療接合体及び投与形並びに手段を包含する。本発明の治療接合体及び投与形はまた、プレ−アテローム硬化性状態への初期介入のためにも利用でき、たとえばそれらはアテローム硬化症を進行せしめる高い危険性での患者、又は血管壁の肥大による血管のアテローム硬化性変化又は血管狭窄に起因する高血圧の徴候を有する患者において有用である。
【０１４４】
たとえば、本発明のもう１つの態様においては、治療接合体及び投与形は、血管形成が遮断された動脈を開くために十分ではない情況、たとえば血管内ステントの挿入を必要とする情況において使用され得る。本発明のこの態様においては、治療剤を含んで成る、金属、プラスチック又は生物分解性血管内ステントが使用される。有用な治療剤は、細胞骨格インヒビター及び平滑筋細胞増殖のインヒビターを包含する。好ましい細胞骨格インヒビターは、サイトカラシン、たとえばサイトカラシンＢ、又は機能的同等物であるその類似体である。もう１つの好ましい本発明の細胞骨格インヒビターは、サキソール、又は機能的同等物であるその類似体である。
【０１４５】
ステントは好ましくは、治療剤を含んで成る、生物分解性被膜は又は多孔性又は透過性非生物分解性被膜を含んで成る。本発明のより好ましい態様は、その被膜が治療剤の持効性投与形を含んで成る、被覆されたステントである。もう１つの態様においては、生物分解性ステントはまた、そこに、すなわちステントマトリックスに含浸される治療剤を有することができる。
【０１４６】
そこに分散された治療剤の持効性投与形を有する、生物分解性被膜又は多孔性非生物分解性被膜によりさらに被覆される、そこに含浸された治療剤を有する生物分解性ステントもまた、本発明の態様である。このステントは、治療剤の異なった開放速度を提供し、すなわち被膜からの治療剤のより早い開放性、続くステントマトリックスの分解に基づいて、そのステントマトリックスに含浸される治療剤の遅延された開放性が存在する。好ましくは、本発明のこの態様においては、被膜中の治療剤は、サイトカラシン又はタキソールであり、そして最とも好ましくはサイトカラシンＢ又はタキソール、又は機能的に同等であるそれらの類似体である。従って、この血管内ステントは、骨格インヒビター、たとえばそこに開放できるように包埋されたサイトカラシンＢ又はタキソールの生物学的ステント作用を通して提供される手段の他に、血管の管腔領域の上昇を提供する機械的手段を提供する。
【０１４７】
さらに、平滑筋細胞の増殖のインヒビターである治療剤を含んで成る血管内セントの配置は、内膜増殖の低下又は防止により高められた効能を提供することができる。従って、平滑筋細胞中に転換することができ、そして内膜の肥大に寄与することができる、周細胞の増殖及び移動を阻害するためにさらにサイトカラシンを含んで成るステントもまた、本発明の態様である。その平滑筋及び周細胞により生成される、内膜の平滑筋細胞及び支質のこの阻害は、血管ステントの静脈内配置に続いて、より急速で且つ完全な再内皮形成を可能にすることができる。ステントの配置に続く血管壁の再内化形成及び安定化の早められた速度は、血管ステントの不全の主な原因である、管腔領域の損失及び遅められた血流を減じることができる。
【０１４８】
好ましくは、本発明の態様の実施において、治療剤を含む生物分解性微粒子は約１〜50ミクロンである。さらに好ましくは、その微粒子は、30〜 120日にわたって生物分解性であり、サイドゾル中での約0.05μｇ／ml〜約0.25μｇ／mlの維持された細胞濃度のサイトカラシンＢを中膜及び内膜中に開放し、従って、ステント／血管壁の界面に隣接する細胞に対して、毒性を与えないで、治療レベルのサイトカラシンＢの拡散を提供する。
【０１４９】
本発明の治療接合体及び投与形はまた、傷つけられた血管組織及び多くの種類の創傷部位、たとえば上皮創傷において内皮細胞の再成長を増強するための治療様式にも使用され得る。それらの治療様式においては、本発明の治療接合体及び投与形は、平滑筋細胞又は周細胞の移動及び／又は増殖を阻害することに使用される。平滑筋細胞及び周細胞は、内皮細胞の増殖を阻害するインビトロでの因子の生成に包含され、そしてそれらの増殖はまた、連続した内皮の確立に対する物理的な障壁をもたらすことができる。従って、本発明の治療接合体及び投与形は、たとえば創傷の治癒、血管移植及び続く血管手術の間、新生脈管形成及び高められた再内皮形成化を促進することに使用される。その投与形はまた、損傷を受けた血管壁の再内皮形成化を刺激し、又は早める治療様式を放すことができる。この目的のための典型的な治療剤は、血管浸透性因子である。
【０１５０】
本発明のさらに他の観点は、血管部位における損傷治癒を増強し、そして治癒された血管組織の構造及び弾性性質を改良する治療様式にも関する。血管壁における平滑筋細胞又は周細胞の移動及び増殖を阻害するために本発明の治療接合体又は投与形を用いるそれらの治療様式においては、血管壁の治癒の強さ及び性質が改良される。血管創傷部位における平滑筋細胞は、創傷の治癒を促進する、創傷部位の収縮の正常な工程に寄与する。平滑筋細胞の移動及び増殖、及び形質転換された平滑筋細胞によるマトリックス分泌は、この通常の工程から取り去ることができ、そして治癒された血管の長期の構造的及び弾性性質を減じる。従って、本発明の他の観点は、平滑筋及び周細胞の増殖及び移動並びに形態学的転換を阻害し、そして治癒された脈管構造の性質を改良する、治療接合体及び投与形を提供する。
【０１５１】
たとえば、本発明の１つの態様は、血管移植片のために使用される単離された血管（動脈又は静脈）の壁中への治療剤、たとえばサイトカラシンＢの溶液のインビボ又はエクスビボ注入を包含する。本発明のこの態様においては、移植片として作用する予定である血管が切除され、そして分離され、そして続いて、治療剤の溶液の注入により広げられる。好ましくは、その注入は、約 0.2〜１大気圧で約２〜約４分間にわたって行なわれる。この注入法は、血管壁の平滑筋細胞への効果的量の治療剤の透過をもたらす。好ましくは、治療剤は、注入物１ml当たり約 0.1μｇ／ml〜約 0.8μｇ／mlの濃度で存在するであろう。好ましくは、治療剤はサイトカラシンであり、そして最とも好ましくは、使用される治療剤はサイトカラシンＢ、又はその機能的に同等の類似体であろう。
【０１５２】
他の末梢部位における血管移植片のために又は冠動脈バイパス移植片に使用される末梢血管は、手術後の狭窄のために役に立たないことは当業者に知られている。サイトカラシンＢの注入はその生物学的なステント活性により手術的に外傷を受けた血管の血管腔領域を維持するので、この工程におけるその投与は、血管の収縮する能力を遅らせ、より大きな管腔領域をもたらす。さらに、この態様でのサイトカラシンＢの投与は、全体的な不全でなければ、血管移植片の欠陥機能を導びくことができる、血管移植片がそれらの近位及び遠位位置に吻合された後に時折、生じる狭窄又は収縮を防ぐであろうことは、本発明のこの態様の利点である。従って、サイトカラシンＢにより生成される血管ステントは、移植工程後、数日〜数カ月で生じる収縮の発生率を低めるべきである。
【０１５３】
本発明はまた、細胞殺害性治療接合体及び細胞増殖抑制剤を含む組合せ治療法を提供する。その細胞殺害性接合体は、血管平滑筋細胞に特異的に局在することができる結合パートナー（たとえばタンパク質又はペプチド）、及びそのような細胞を殺害することができる活性剤を含む。その細胞殺害性接合体は好ましくは、静脈内又はそのために便利ないづれかの他の経路から投与され、標的の平滑筋細胞に局在し、そして狭窄又は再狭窄の出来事に関与する増殖細胞を破壊する。
【０１５４】
この細胞破壊はミトゲン及び他の代謝物の開放を引き起こし、ここで前記代謝物は一般的に、血液平滑筋細胞の増殖を導く。本発明の持効性抗−増殖又は抗−収縮投与形が次に、好ましくは、注入カテーテル又はそのために便利ないづれかの投与形を通して投与される。その持効性投与形は、血管平滑筋細胞の増殖及び／又は移動、並びに収縮を早め、それにより管腔の直径を維持する。この処理法は、血管平滑筋細胞の過形成及び同様のものに起因する狭窄性血管において有用な生物学的動脈筋切除（arteromyectomy）を構成する。
【０１５５】
本発明はまた、標的化された粒状投与形の局所投与を通して癌及び免疫系−介在の疾病の処理方法も提供する。その粒状投与形は、たとえば、癌性標的細胞の一次及び／又は転移性病巣中に局部投与される。局部投与は好ましくは、腫瘍組織の細胞間領域又は腫瘍細胞を取り囲む管腔流体に粒状投与形を注入する、注入針又は管腔内投与路を用いて行なわれる。
【０１５６】
一次病巣への導入は好ましくは、哺乳類内の限定された領域に一般的には、位置する標的細胞、たとえば腹腔内に位置する卵巣癌に関して行なわれる。本発明の投与形は、標的細胞集団に結合し、そして場合によっては、長時間の治療剤の開放のためにそこに内在化される。そのような一次病巣への本発明の投与形の局部投与は、他の敏感な器官、たとえば骨髄及び腎臓のその治療剤への限定された暴露を伴って、そのような標的細胞に対して局在化された効果をもたらす。
【０１５７】
転移性病巣が標的細胞集団を構成する場合、投与される微粒子及び多量の超微粒子は主に、注入部位近くに位置する標的細胞に結合され、そして場合によっては、治療剤の開放のために内在化され、それにより、注入部位を直接的に取り囲む標的細胞に対して著しく且つ局在化された効果を生成する。さらに、小さな超微粒子は、間質流体の流れ又はリンパ排出チャネルに従い、そして注入部位とは遠位にある標的細胞に結合し、そしてリンパ性転移を受ける。
【０１５８】
本発明のこの態様の標的化された投与形は、より通常使用される免疫接合治療と組合して使用され得る。この態様においては、免疫接合体は、全身性毒性の範囲内で全身性効果を達成し、そして本発明の投与形は、一次及び転移性病巣に、濃縮されそして持効量の治療剤を供給し、ここで前記病巣は、そのような“全身性”免疫接合体投与のみからの不十分な治療量をしばしば受け、そして全身性毒性効果を回避し、又は最少にする。
【０１５９】
標的細胞集団が局部投与により接近せしめられ得る場合、本発明の投与形は、免疫系−介在の疾病を制御するために使用される。典型的なそのような疾病は、関節炎、スプルー、ブドウ膜炎、眼内炎、角膜炎及び同様のものである。本発明のそれらの態様に包含される標的細胞集団は、体腔又は体空間、たとえばそれぞれ、関節包、胸膜及び腹腔、眼及び結膜下空間に制限される。局部投与は好ましくは、胸膜内、腹膜内、眼内又は角膜下投与路のための注入針を用いて行なわれる。
【０１６０】
本発明のこの態様は、全身性免疫系細胞に対しての最少の効果を伴って、免疫系細胞のより集中的な、局在化された転形を提供する。任意には、免疫系の全身性細胞は、結合タンパク質又はペプチドに接合される化学療法剤により同時に処理できる。そのような接合体は好ましくは、血管腔から標的の免疫系細胞に侵入する。
【０１６１】
局部投与された粒状投与形はまた、増殖することを刺激された正常な組織に局在化し、それにより、そのような病理学的（すなわち機能亢進性）状態を減じ又は排除する。本発明のこの態様の例は、新生脈管形成組織の周細胞及び平滑筋細胞に局在化する結合タンパク質又はペプチドにより被覆された粒状投与形の眼内投与を包含する。それらの周細胞の増殖が変性眼疾患を引き起こす。本発明の好ましい投与形は、標的細胞集団の病理学的増殖を抑制することができる化合物を開放する。好ましい投与形はまた、血管腔領域及び血流を高め、この減じられた血液供給により生成される病理学的変更を減じる化合物を開放する。
【０１６２】
本発明のさらにもう１つの観点は、血管形成又は他の血管外傷に続いて、拡張された管腔体積を維持するための治療様式に関する。本発明のこの観点の１つの態様は、血管平滑筋細胞の収縮する能力を阻害できない治療剤の投与を包含する。本発明のこの観点の実施において有用な典型的な剤は、正常な血管の静水圧（すなわち血圧）がその弛緩性血管をその最大の生理学的直径に又はその近くに拡張するように、外傷を受けた動脈の血管正常状態の低下を引き起こすことができるものである。血管正常状態の低下は、収縮性タンパク質（たとえば、アクチン、ミオシン、トロポミオシン、カルデスモン、カルポニン、又は同様のもの）の形成又は機能を妨害する剤により引き起こされる。この妨害は、血管平滑筋細胞の収縮に関与する、カルシウム変性、リン酸化又は他の代謝経路の阻害を通して直接的又は間接的に行なわれ得る。
【０１６３】
細胞収縮の阻害（すなわち、血管正常状態の低下）は、血管狭窄の程度を減じるために２種の機構を通して作動することができる。第１には、長期間の細胞収縮の阻害が、中膜から内膜に移動する平滑筋細胞の数を限定する（前記膜の肥厚化が血管腔狭窄をもたらす）。第２には、細胞収縮の阻害がまた、正常な血管の静水圧（すなわち血圧）下で、平滑筋壁の弛緩及び拡張を引き起こす。
【０１６４】
治療剤、たとえばサイトカラシンは、外傷を与えられた血管形成後の又は他の手術的に又は疾病により損傷を受けた修復されるべき平滑筋細胞のために必要なタンパク質合成を破壊しないで、平滑筋細胞を阻害する。タンパク質合成はまた、マトリックスを分泌する平滑筋細胞のためには必要であり、ここで前記マトリックスは、血管病変が安定化するよう、その管腔をその最大の収縮期直径近くの状態に固定し、又は保持する（すなわち、生理学的に誘発されたステント効果を維持する）。
【０１６５】
この生物学的ステント効果は、拡張された血管腔領域、及び血管を通しての高められた血流速度をもたらすのみならず、また、血管形成に続く弾性反動を有意に減じる。弾性反動は、血管形成の間、バルーンカテーテルによる血管の過剰拡張に起因する外傷性ショックによる、血管痙攣又は筋肉壁の初期弛緩に関連する血管の急性閉鎖である。管腔領域の低下を導く中膜の収縮は、血管筋壁の正常状態への修復が生じるにつれて、バルーン拡張の後、数時間、数日、又は、数週間以内に生じる。
【０１６６】
アテローム切除検体の顕微鏡試験による最近の観察は、初期の後−血管造影図に基づけば、弾性反動が、成功したものとして分類される血管形成工程の25％までで生じることを示唆する。生物学的ステント法はバルーン血管形成に続いて動脈壁を弛緩するので、臨床医は、血管収縮又は弾性反動を減じ又は遅延せしめる手段として、過剰膨張及びその結果の外傷ショックを排除することができる。過剰膨張の低下又は排除は、血管の筋肉壁への外傷を減じ、それにより内膜における平滑筋細胞の増殖の決定因子を減じ、そして従って、再狭窄の発生率又は重度を減じる。
【０１６７】
生物学的ステントはまた、血栓の形成の発生率を低める。たとえば、サイトカラシンＢにより処理されたブタ大腿部動脈において、壁在性微小血栓の発生率は、治療剤により処理されていない、バルーン外傷を与えられた動脈に比較して、低められた。この現象は、外傷を与えられた血管を通しての高められた血流に起因する二次の利点であると思われ、ここで前記利点は、本発明の実施を通して得られる。
【０１６８】
サイトカラシンは、血管平滑筋細胞に対して生物学的ステント効果を生成することができる典型的な治療剤である。サイトカラシンは、アクチンと相互作用することによって血管平滑筋細胞の移動及び収縮を阻害すると思われる。サイトカラシンは、アクチンフィラメントの伸びを阻害するためにフィラメントアクチンの末端と相互作用する。低い量のサイトカラシン（たとえばサイトカラシンＢ）はまた、アクチンのマイクロフィラメント網状構造を破壊する。インビボデータは、血管平滑筋細胞がサイトカラシンＢをクリアランスした後、それらの細胞は、約24時間以内に移動を再開するために十分な重合されたアクチンを再生することを示唆する。インビボ評価は、血管平滑筋細胞が２〜４日以内に血管の正常状態を回復せしめることを示す。管腔直径の固定及び生物学的ステント効果が生じることがこの回復期間の間に存在する。
【０１６９】
治療剤は標的化され得るが、しかし好ましくは、血管形成又は他の外傷出来事に続いて、その外傷を与えられた血管に直接的に投与される。たとえば、サイトカラシンＢの生物学的ステント効果は、約 0.1μｇ／ml〜約 1.0μｇ／mlの範囲の用量濃度で、血管壁の傷つけられた領域中への治療剤の一回の投与により達成できる。
【０１７０】
血管平滑筋細胞移動（中膜から内膜への）の阻害が、同じ用量範囲で示された（例１))；しかしながら、治療剤への血管の維持された暴露は好ましくは、それらの抗−移動効果を最大にするためである。血管平滑筋細胞が内膜中に移動できない場合、それらはそこで増殖することはできない。血管平滑筋細胞が内膜に移動する場合、続いて投与される抗−増殖性持効性投与形が内膜増殖を阻害する。結果として、サイトカラシン又は他の抗−増殖性治療剤を組込む、本発明の持効性投与形が、遊離サイトカラシン治療剤と組合して投与され得る。この態様においては、生物学的ステント効果、及び抗−増殖又は抗−移動効果が、一回の投与手段で達成され得る。
【０１７１】
本発明の前記手段において有用な剤は、たとえば次の工程に従って、同定できる。遊離剤（すなわち、標的化されていない）投与のための可能性ある剤は、次の１又は複数の特徴を示す：
（ｉ）血管形成（たとえば、PTCA、経皮経管動脈形成(PTA）又は同様のもの）、又は他の外傷、たとえばアテローム切除（たとえばロートブラター、レーザー及び同様のもの）、冠動脈バイパス法、又は同様のもの；又は血管疾患（たとえばアテローム硬化症、血管狭窄又は萎縮に対する眼の二次疾患、脳血管狭窄疾患又は同様のもの）に起因する外傷に続いての拡張された管腔体積を維持し；
（ii）前記剤により促進された管腔領域の初期上昇が、管腔の慢性狭窄に起因せず、又はその狭窄を強調せず；
（iii ）標的細胞の収縮又は移動を阻害し；そして
（iv）細胞増殖抑制性である。
【０１７２】
好ましくは、本明細書に使用される治療剤は４つの性質を有するが、しかしながら、第１及び第３の性質が第２及び第４の性質よりも、本発明の実施のためにはより重要である。たとえば、サイトカラシンＢは、遊離治療剤手段への使用のための適合性を決定するために評価された。サイトカラシンＢの生物学的ステント効果は、約 0.1μｇ／ml〜約 1.0μｇ／mlの範囲の用量濃度での、血管壁の傷つけられた領域中への治療剤の一回の投与を用いて達成できる。本発明の持効性態様において有用な剤は、次の１又は複数の特徴を示す：
【０１７３】
（ｉ）血管形成（たとえば、PTCA、経皮経管動脈形成(PTA）又は同様のもの）、又は他の外傷、たとえばアテローム切除（たとえばロートブラター、レーザー及び同様のもの）、冠動脈バイパス法、又は同様のもの；又は血管疾患（たとえばアテローム硬化症、血管狭窄又は萎縮に対する眼の二次疾患、脳血管狭窄疾患又は同様のもの）に起因する外傷に続いての拡張された管腔体積を維持し；
（ii）標的細胞の増殖を阻害する（たとえば、剤への５分〜24時間の暴露に続いて、インビトロでの血管平滑筋組織培養は、 3Ｈ−チミジン摂取の阻害のレベルを示し、そして好ましくは 3Ｈ−ロイシン摂取の比較的低い阻害性を示す）；
【０１７４】
（iii ） DNA合成を阻害するのに十分な量で、軽い〜中位（たとえば、下記に示されるアッセイにおいて等級２又は３）の形態学的細胞毒性効果を生成し；
（iv）標的細胞の収縮を阻害し；そして
（ｖ）細胞増殖抑制性である。
１又は複数の前記特性を示す治療剤の同定に基づいて、前記剤は、治療剤への血管平滑筋細胞のより長い暴露を包含する第２の試験手段にゆだねられる。
【０１７５】
本発明の持効性態様において有用な剤は、次の特性を示す：
（ｉ）長期間（たとえば５日）の暴露に基づいて、前記剤は、血管平滑筋組織培養 DNA合成及びタンパク質合成に対するインビトロ効果において、上記５分〜24時間の暴露に関する効果と同じか又は類似する効果を示し；そして
（ii） DNA合成阻害についての長期間のインビトロアッセイにおける有効量で、前記剤は、長期間（たとえば10日）、軽い〜中位の形態学的細胞毒性効果を示す。
【０１７６】
本発明内の可能性ある抗−増殖剤のさらなる評価が、インビトロでのバルーンにより傷つけられたブタ大腿部動脈モデルにおいて行なわれる。好ましくは、そのような剤は、組織収集及び組織学的評価の前、１時間の“BRDUフラッシュラベリング”により示されるように、中膜血管平滑筋細胞の細胞増殖に対して50％又はそれ以上の阻害性を示す。剤が、一回の暴露により、内膜平滑筋増殖を50％又はそれ以上阻害するのに十分な時間、効果的である場合、それは、持効性投与形での投与を必要としない、本発明の範囲内の剤である。
【０１７７】
短い持続活性を有する剤は、全身性毒性及び可能性ある治療指数が静脈内投与での50％阻害性の達成を可能にするように思える場合、又は前記剤が効果的な抗−増殖量で持効性を伴って血管平滑筋細胞への局部供給に従がう場合、持効性として評価される。持効性剤は、用量最適化及び効能研究について持効性投与形において評価される。好ましくは、本発明の実施において有用な抗−増殖剤は、バルーンにより傷つけられたブタ大腿部動脈において血管狭窄を50％減じ、そしてより好ましくは、ブタ大腿部冠動脈において血管狭窄と類似する程度、低める。次に、そのような剤は、ヒト臨床試験において評価できる。
【０１７８】
細胞増殖（すなわち DNA合成）阻害は、剤の持効性についての一次特徴である。たとえば、スタウロスポリンは、それが投与される用量で細胞増殖抑制性であるように、 3Ｈ−ロイシンと 3Ｈ−チミジン摂取との間に示差を示す。より長い持続性の細胞毒性研究は、治療剤への延長された暴露は標的細胞に対して悪影響を与えることを示唆しなかった。さらに、BRDUパルスは、スタウロスポリンが標的細胞の増殖を阻害することを示した。しかしながら、細胞増殖を阻害する能力を評価するためのいづれかの便利な方法が代わりに用いられ得る。結果的に、スタウロスポリンは、拡張された管腔体積の保持において効果的である。
本発明は次の特定の例により一層良好に理解されるであろう。
【実施例】
【０１７９】
例１．インビボでの血管壁における血管平滑筋細胞への結合
図１は、NR−AN−01のi.v.投与の４日後、24才の男性患者の動脈の血管壁における平滑筋細胞に対するNR−AN−01（ネズミIgG2b MAb)の結合を示す。図１は、NR−AN−01の投与後、患者の動脈壁の内部領域を通して取られた組織学的断片の顕微鏡写真であり、ここで前記断片は HRP−接合のヤギ抗−マウス IgGとエクスビボで反応せしめられている。NR−AN−01 MAbと HRP−接合体との反応は、４−クロロ−１−ナフトール又は３，３′−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリドをペルオキシダーゼ基質（クロモゲン）として添加することによって可視化された。
【０１８０】
基質の反応生成物は、反応部位で不溶性の紫色又は暗カッ色の沈殿物を形成する（♯２、図１で示される）。対比染色を用いて、コラーゲン性細胞外マトリックス材料（♯２、図１で示される）又は細胞核（♯１、図１で示される）を可視化した。平滑筋細胞は、紫色に染色された細胞として顕微鏡試験下で可視化される。この顕微鏡写真は、インビボでヒト血管平滑筋に特異的に結合し、そして細胞により内在化され、そして拡張された期間、その細胞に残存する MAbの能力を示す。
【０１８１】
例２．トリコテセン治療剤を含む治療接合体
NR−AN−01及びロリジンＡの接合体を、NR−AN−01と称するモノクローナル抗体にトリコテセン細胞毒素のヘミスクシネート誘導体（下記に記載されるような）を化学的に結合することによって構築した。２種の接合体を調製し、１つはロリジンＡの２′位置で結合し、そして他の１つはその13′位置で結合している。２種のスキームが、図２及び３に示されるように、この合成に使用された。次に、接合体を、PD−10 SEPHAROSE（商標）カラムクロマトグラフィー（Pharmacia ; Piscataway, NJ）により未反応ロリジンＡから精製し、サイズ排除高圧液体クロマトグラフィーにより分析し、そしてカラム画分を SDS−PAGE及び等電点電気泳動により、下記のようにして特徴づけた。
【０１８２】
図２は、次の試薬、すなわち室温（RT）でジクロロメタン（CH2Cl2）中、無水琥珀酸、トリエチルアミン（NEt3）及びジメチルアミノピリジン（DMAP）；及びRTでCH2Cl2中、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(NHS）及びジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC）試薬による２種の工程を通してのロリジンＡ  ヘミスクシニル  スクシンイミデート（RA−HS−NHS)の合成についての第１の反応スキームを図的に示す。
【０１８３】
図３は、次の試薬、すなわち室温（RT）でジメチルホルムアミド(DMF）中、ｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（TBMS−Cl）及びイミダゾール；RTでジクロロメタン（CH2Cl2）中、無水酢酸、トリエチルアミン(TEA）及びジエチルアミノピリジン；RTで（CH2Cl2）中、無水琥珀酸、トリエチルアミン(TEA）及びジメチルアミノピリジン（DMAP）；及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド(NHS）及びジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC）試薬による５種の工程を通してのロリジンＡ  ヘミスクシニル  スクシンイミデート（RA−HS−NHS)の合成についての第２の反応スキームを図的に示す。
【０１８４】
２′ロリジンＡヘミ琥珀酸（２）の合成：
ロリジンＡ 0.5ｇ（0.94ｍモル）に、ジクロロメタン15mlを添加した。この溶液に、撹拌しながら、無水琥珀酸 0.104ｇ（1.04ｍモル）を添加した。この反応混合物に、ジクロロメタン５ml中、トリエチルアミン 0.2mlを添加した。その均質反応混合物に、触媒量のジメチルアミノピリジンを添加し、そして室温で15時間、撹拌した。反応の完結後、薄層クロマトグラフィー（CH2Cl2：CH3OH ＝ 9.7：0.3 、数滴の酢酸を伴う）処理した。反応の最後で、氷酢酸 0.3mlを添加し、そして溶媒を減圧下で除去した。
【０１８５】
乾燥された粗残留物を、水及び塩化メチレン間に分配した。組合された塩化メチレン抽出物（３×50ml）を無水硫酸ナトリウム上で乾燥せしめ、溶媒を真空下で除去し、そして乾燥せしめ、３種の化合物の粗混合物 0.575ｇ（96％）を得た。50％アセトニトリル−２％酢酸を含む水中、前記粗混合物の分離用Ｃ18 HPLC による分離；白色固形物として２を、0.36ｇ（60％）得た。
【０１８６】
スクシンイミジル２′−ロリジンＡヘミスクシネート（３）の合成：
ジクロロメタン30ml中、２′ロリジンＡヘミ琥珀酸 0.3ｇ(0.476ｍモル）に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド 0.055ｇ(0.478ｍモル）を添加した。この透明な反応混合物に、ジシクロヘキシルカルボジイミド 0.108ｇ(0.524ｍモル）を添加した。その反応混合物を室温で６時間撹拌した。反応の完結後、展開する溶媒として（CH2Cl2：CH3OH ＝ 9.7：0.3 、数滴の酢酸を伴う）を用いて TLC処理した。数滴の氷酢酸をその反応混合物に添加し、そして溶媒を減圧下で除去した。その乾燥された残留物に、ジクロロメタンを添加し、そして沈殿された DCUを濾過した。濾液からの溶媒を減圧下で除去し、白色固形物を得た。その粗生成物から、移動相として50％アセトニトリル及び２％酢酸の溶液を用いての分離用HPLCにより精製し、 0.208ｇ（60％）を得た。
【０１８７】
13′−ｔ−ブチルジメチルシリルロリジンＡ（４）の合成：
ジメチルホルムアミド 0.5ml中、ロリジンＡ72.3mg(0.136ｍモル）の溶液に、ｔ−ブチルジメチルシリルクロリド 0.055ｇ(0.367ｍモル）及びイミダゾール 0.025ｇ(0.368ｍモル）を添加した。その反応混合物を室温で15時間、撹拌した。反応の完結後、展開する溶媒として１％MeOH−CHCl3 を用いてシリカゲル薄層クロマトグラフィー処理した。反応混合物から溶媒を真空下で除去し、そして乾燥せしめた。粗生成物を、水及び塩化メチレン間に分けた。組合された塩化メチレン抽出物から溶媒を減圧下で除去し、そして乾燥せしめた。粗生成物を溶離溶媒としてEtOAc ：ヘキサン（１：３）を用いてのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。溶出液から溶媒を減圧下で除去し、固形物として４を0.66ｇ（75％）の収量で得た。
【０１８８】
13′−ｔ−ブチルジメチルシリル２′アセチルロリジンＡ（５）の合成：
ジクロロメタン10ml中、13′−ｔ−ブチルジメチルシリルロリジンＡ 0.1ｇ(0.155モル）に、無水酢酸 0.3ml、トリエチルアミン 0.2ml及びジメチルアミノピリジンの数個の結晶を添加し、そして室温で２時間、貯蔵した。反応の完結後、展開する溶媒として１％メタノール−塩化メチレンを用いて TLC処理した。溶媒を減圧下で除去し、そして溶離剤として１％メタノール−クロロホルムを用いてのシリカゲルカラムにより精製した。溶出液から溶媒を真空下で除去し、固形物として５を、 0.085ｇ（80％）の収量で得た。
【０１８９】
２′アセチルロリジンＡ（６）の合成：
テトラヒドロフラン５ml中、２′アセチル13′−ｔ−ブチルジメチルシリルロリジンＡ0.05ｇ(0.073ｍモル）に、 THF中、１Ｍのテトラブチル−弗化アンモニウム溶液 0.3mlを添加した。その反応混合物を室温で２時間、撹拌した。反応の完結後、展開する溶媒として１％MeOH−CHCl3 を用いてシリカゲル薄層クロマトグラフィー処理した。反応混合物から溶媒を減圧下で除去し、そして乾燥せしめた。粗生成物を、溶離溶液として１％ CH3OH−CHCl3 を用いてシリカゲルカラム上で精製した。組合された溶出液から溶媒を真空下で除去し、固形物として６を 0.020ｇ（48％）の収量で得た。
【０１９０】
２′−アセチル13′−ヘミスクシニルロリジンＡ（７）の合成：
ジクロロメタン１ml中、２′−アセチルロリジンＡ0.05ｇ(0.087ｍモル）に、無水琥珀酸 0.025ｇ（0.25ｍモル）及びトリエチルアミン35mlを添加した。ジメチルアミノピリジンの数個の結晶を触媒として添加した。その反応混合物を室温で24時間、撹拌した。反応の完結後、展開する溶媒として５％MeOH−CH2Cl2を用いて薄層クロマトグラフィーにより処理した。反応の最後で、氷酢酸30mlを添加した。反応混合物から溶媒を減圧下で除去し、そして乾燥せしめた。その粗生成物を、水及び酢酸エチル間に分けた。その組合された酢酸エチル画分から溶媒を減圧下で除去した。粗生成物を、シリカゲルカラムに通して精製し、白色固形物として７を 0.039ｇ（66％）の収量で得た。
【０１９１】
スクシンイミジル２′−アセチル13′−ロリジンＡヘミスクシネート（８）の合成：
ジクロロメタン２ml中、２′−アセチル13′−ロリジンＡヘミ琥珀酸 0.036ｇ（0.0050ｍモル）に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド 0.009ｇ（0.09ｍモル）を添加した。その撹拌された溶液に、ジシクロヘキシルカルボジイミド 0.012ｇ(0.059ｍモル）を添加した。その反応混合物を室温で８時間撹拌した。反応の完結後、展開する溶媒として５％MeOH−CH2Cl2を用いてシリカゲル薄層クロマトグラフィー処理した。数滴の氷酢酸をその反応混合物に添加した。その反応混合物から溶媒を減圧下で除去し、そして乾燥せしめた。その粗生成物を、溶離溶媒として５％MeOH−CH2Cl2を用いてシリカゲルカラム上で精製した。組合された溶出液から溶媒を真空下で除去し、白色固形物として８を 0.025ｇ（61％）の収量で得た。
【０１９２】
NR−AN−01完全抗体(MAb）に対するスクシンイミジル２′−ロリジンＡヘミスクシネート（３）及びスクシンイミジル２′−アセチル13′−ロリジンＡヘミスクシネート（８）の接合：
接合反応を、25％ジメチルスルホキシド（DMSO）溶媒の存在下で硼酸緩衝液において、 pH8.0及び室温で、軽く混合しながら、45分間、行ない、続いてゲル透過クロマトグラフィー処理した。トリコテセン薬物前駆体：抗体提供物のモル比は、それぞれ、２′及び13′ロリジンＡ類似体（３及び８）に関して、25：１及び40：１であった。抗体濃度は、接合反応の間、 0.9〜 1.0mg／mlであった。
【０１９３】
抗体25mgとの典型的な２′類似体（３）の反応は次の通りであった：
リン酸緩衝溶液（すなわち、 PBS；150mM のNaCl, 6.7mM のリン酸塩、pH7.3)中、 5.3mgのAb／mlの溶液 4.7mlに、PBS 10ml及び硼酸緩衝液(0.5Ｍ，pH8.0)５mlを添加した。軽く撹拌しながら、その反応混合物に、スクシンイミジル２′ロリジンＡヘミスクシネート（３）1.37mgを含むDMSO 6.3mlを、15秒間にわたって滴下した。
【０１９４】
精製：
精製するために、１mlの反応アリコートを、 PBSにより平衡化されたPharmacia PD−10 Sepharose（商標）カラムに適用した。溶出された接合体を、 2.4〜4.8ml の画分で集めた。次に、PD−10精製された接合体アリコートをプールし、そして Amicon PM−10 DiAflo （商標）濃縮機上で 2.0mlのAb／mlに濃縮し； 0.2μの Gelman Acrodisc（商標）を通して殺菌濾過し、そして５mlの体積の滅菌性ガラスバイアル中に満たした。
【０１９５】
２′接合体を液体窒素においてすばやく凍結し、そして次に、使用まで−70℃で貯蔵した。13′ロリジンＡ−NR−AN−01接合体を凍結又は冷蔵貯蔵した（すなわち５〜10℃）。
【０１９６】
接合体の特徴化：
タンパク質濃度を、銅試薬方法(Pierce Chemical Corp.）を用いて BCAアッセイにより決定した。
抗体誘導の程度の評価を、まず、 0.2Ｍの炭酸塩（pH10.3）にアリコートの接合体を４時間、加水分解し（２′接合体に関しては室温で、又は13′接合体に関しては37℃で）、続いてPM−30膜を通して濾過することによって行なった。次に、濾液を、それぞれ50：48：２の比の CH3CN： H2O：HOACの溶液を移動相として用いて、Ｃ−18逆相HPLC上でロリジンＡについてアッセイした。1.32の補正率を用いて、13′接合体の加水分解の間、極性生成物を付与する、相当の高分子環式環分解について補正した。
【０１９７】
Du Pont Zorbax（商標）HPLC上でのサイズ排除クロマトグラフィー及び Serva（商標）ゲルプレート（pH３〜10）を用いての等電点電気泳動をまた行なった。凝集の徴候は、HPLCにより観察されなかった。
【０１９８】
ロリジンＡ−抗体接合体のイムノアッセイを、ストレプタビジン／ペルオキシダーゼ検出を伴ってのピオチニル化された−Abを用いての競争 ELISA又は 125Ｉ−ラベルされた抗体を用いての競争細胞結合アッセイのいづれかにより行なった。他方では、免疫反応性を、細胞結合アッセイにより抗原飽和条件下で測定し、前記アッセイにおいては、抗体は、クロラミンＴ方法に従ってＩ−125 によりラベルされ、そして続いて、２′及び13′ロリジンＡ前駆体により誘導体化された最初の痕跡であった。
トリコテセンの構造式が下記に示される：
【０１９９】
【化５】
2007075623.tif 000007
【０２００】
例３．平滑筋細胞への結合の動力学
i.v.カテーテルによる投与のためには、本発明の治療接合体は、血流が患者において再確立され得るよう、３〜５分以下で投与されることが所望される。従って、 109ｌ／モル以上のKaを有する平滑筋結合タンパク質の結合動力学を決定するための研究を行なった。ヒト血管平滑筋細胞は培養物においてゆっくり増殖し、そしてバルーン平滑筋細胞は、ヒトCSPG細胞表面マーカーを発現することが見出されているので、BO54バルーン動脈平滑筋細胞及びヒトＡ375 Ｍ／Ｍ（黒色腫；ATCC♯CRL1619)細胞（CSPG表面マーカーを担持する）を、下記例に記載される研究の多くに使用した。
【０２０１】
結合動力学研究のために、Ａ375 Ｍ／Ｍ及びBO54細胞を、2500細胞／ウェルで、滅菌された96ウェルマイクロタイタープレートに接種した。プレートをアルミ箔で包装し、そして５％ CO2／95％空気の増湿化された雰囲気下で一晩、37℃でインキュベートした。約18時間後、インキュベーションプレートを除去し、そして細胞を0.05％グルタルアルデヒドにより５分間、固定し、膜のターンオーバーを防いだ。固定化に続いて、プレートを、 0.5％ Tween−20（商標）を含む PBSにより徹底的に洗浄した。
【０２０２】
ロリジンＡを含むNR−AN−01治療接合体の滅菌された２倍希釈溶液を、10mg／ml〜20ng／mlのタンパク質濃度で調製し、そして個々の希釈溶液を２つのウェル中にアリコートした。プレートを、NR−AN−01と共に４℃で５，15，30及び60分間インキュベートし、この後、結合されていないタンパク質を吸引により除去し、そしてCS緩衝液 100mlを個々のウェルに添加した(PBS中、５％鶏血清／ 0.5％ Tween−20（商標））。
【０２０３】
CS緩衝液を除去し、そして細胞に結合されたNR−AN−01治療接合体を、個々のウェルに 100mlの HRP−接合されたヤギ抗−マウスIgG(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)を添加し；４℃で１時間インキュベートし； PBS／0.05％ Tween（商標）により洗浄し、結合されていないヤギ IgGを除去し；そして２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸（ABTS）色素基質（すなわち HRPのための）を添加することによって可視化した。30分間のインキュベーションの後、細胞に結合されたNR−AN−01の量を、Compaqコンピューターによるデータ獲得のために備え付けられた ELISAプレートリーダーを用いて、 415nm及び 490nmでの吸光度を測定することにより定量化した。
【０２０４】
図４Ａは、インビトロ研究の結果をグラフ的に示しており、この研究においては、Ａ375 ｍ／ｍマーカー陽性細胞を、４℃で、異なった濃度のNR−AN−01（NRAN01μｇ／ml）と共に、５分間（空白の正方形、図４Ａ）、15分間（黒くぬりつぶされたひし形、図４Ａ）、30分間（黒くぬりつぶされた正方形、図４Ａ）又は60分間（空白のひし形、図４Ａ）維持した（すなわち、膜のターンオーバーを防ぐために）。Ａ375 細胞へのNR−AN−01抗体の結合を、結合されていない抗体を除去し、 HRP−接合されたヤギ抗−マウス IgGを添加し、細胞結合された MAbと反応せしめ、結合されていないヤギ第２抗体を洗浄し、そしてペルオキシダーゼのための基質２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸)(ABTS）を添加することによって定量化した。色の進行を、 415nm及び 490nm(ABS45,490）で30分間モニターした。
【０２０５】
図４Ｂは、図４Ａに関しての上記研究に類似する態様で行なわれたインビトロ研究の結果をグラフ的に示すが、但し、すなわちＡ375 ｍ／ｍ細胞の代わりに、BO54マーカー陽性平滑筋細胞を用いた。
図４Ａ及び４Ｂに表わされる結果は、20ng／mlの最底用量でさえ、４℃で５分以内でのＡ375 及びBO54細胞へのNR−AN−01の有意な結合性を示す。
【０２０６】
例４．ロリジンＡ及びRA−NR−AN−01接合体の効果
細胞タンパク質合成（すなわち、 3Ｈ−ロイシンの組込みにより）及び代謝活性（すなわち、ミトコンドリアの MTTアッセイにより）に対するロリジンＡ（RA）及びRA−NR−AN−01接合体の効果を、下記例５及び６に詳細に記載される実験において試験した。例４における研究は、剤による長期間（すなわち24時間）処理の効果を決定するための実験を包含する。例５の研究は、細胞に対する“パルス”（すなわち５分）処理の効果を決定するための実験を包含する。
【０２０７】
両研究においては、効果の細胞特異性を、“標的”細胞（すなわち、CSPG“マーカー”を担持する細胞）及び非標的細胞を包含することによって評価した。比較目的のために、遊離−RA（すなわち、結合されていない）をまた、この研究に包含した。細胞タンパク質又は代謝活性に対する効果を、処理の直後に評価し、又は“回復期間”を、細胞集団に対する剤の長期効果を決定するために可能にした（すなわち、37℃で一晩の細胞のインキュベーションを包含する）。
【０２０８】
24時間の暴露の後の代謝効果：
モノクローナル抗体−薬物接合体は、インビボで使用される場合、マーカー抗原を担持する細胞に対してある程度の特異性を有することが知られているけれども、特に親油性である化合物による作用のインビトロ特異性を示すことは、多くのシステムにおいてより困難であることがわかっている。従って、NR−AN−01−ロリジンＡ接合体の阻害効果が標的及び非標的細胞に対して24時間にわたって試験される実験を行なった。RA−NR−AN−01に関する結果を、遊離ロリジンＡの効果に対して同じ24時間にわたって比較した。
【０２０９】
改良されたメチル−テトラゾリウムブルー(MTT）アッセイを、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(Sigma）を用いて行ない、細胞代謝活性を決定した。このアッセイは、細胞のミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ活性を測定すると思われる。それらの研究のいくつかのために、Ｍ14（黒色腫）及びBO54（平滑筋）細胞系を、マーカー陽性標的細胞として使用し、そしてHT29細胞（結腸癌；ATCC♯HTB38)を、非標的特異性対照として使用した。他の研究においては、Ａ375 をマーカー陽性細胞として使用した。
【０２１０】
HT29及びＭ14細胞を、 5.0×103 個の細胞／ウェルの濃度で、96−ウェルマイクロタイタープレートに接種し、そしてBO54細胞を 2.5×103 個の細胞／ウェルで接種した。遊離ロリジンＡ及び２′RA−HS−NR−AN−01（すなわち２′位置でNR−AN−01にカップリング剤ヘミスクシネート（HS）を通して結合されたロリジンＡ）の一連の２倍希釈溶液を、20mg／ml〜40pg／mlのタンパク質濃度範囲にわたってDMEMにおいて調製した。試験剤をマイクロタイターウェル(100ml／ウェル）に添加し（二重反復で）、そしてプレートをアルミ箔で包装し、そして５％ CO2／95％空気から成る湿潤化された雰囲気下で24時間、37℃でインキュベートした。
【０２１１】
24時間後、培地を除去し（吸引により）、新しいDMEMを添加し(100ml／ウェル）、そして細胞を戻し、さらに一晩（すなわち16〜18時間）の“回復期間”インキュベートした。“回復期間”の最後で、細胞代謝活性を、５mg／mlの MTT溶液20mlを個々のウェルに添加することによって決定した。プレートを被覆し、そして37℃で４時間インキュベートし、そして次に、反応を、10％ SDS／ 0.1Ｎの HClをウェル当たり 100mlで添加することによって進行せしめた。暗青色の溶解されたホルマザン反応生成物を、16〜18時間後、室温で進行せしめ、そして 570nmの吸光度で ELISAマイクロタイタープレートリーダーを用いて定量化した。
【０２１２】
図５Ａは、インビトロ研究の結果をグラフ的に示しており、ここで前記研究においては、BO54マーカー陽性平滑筋細胞を、異なった濃度のRA−NR−AN−01（NRAN01−RA；空白の正方形、図５Ａ）又は遊離ロリジンＡ（遊離RA；黒くぬりつぶされたひし形、図５Ａ）と共に、24時間インキュベートし、洗浄し、そして次に、戻し、さらなる16〜18時間一晩（ｏ／ｎ）の回復期間、培養し、その後、 MTTアッセイにより代謝活性を試験した。
【０２１３】
遊離RA及びRA−NR−AN−01の濃度を、アッセイにおいてロリジンＡの計算された濃度（対数縮尺に基づいてプロットされたmg／mlにおいて）として表わし（すなわち、アッセイにおけるNR−AN−01タンパク質の合計mg／mlよりもむしろ）、それにより、直接的な比較を行なうことができた。 MTTアッセイにおける細胞の代謝活性を、細胞の対照の未処理培養物において測定された代謝活性の％として表わす（すなわち、％対照）。
【０２１４】
図５Ｂは、図５Ａに関しての上記研究に類似する態様で行なわれたインビトロ研究の結果をグラフ的に示すが、但し、次の３種の異なった細胞型に対してのRA−NR−AN−01（NRAN01−RA）のみの効果を比較した：BO54マーカー陽性平滑筋細胞（BO54−NRAN01−RA；空白の正方形、図５Ｂ）；HT29マーカー陰性対照細胞（HT29−HRAN01−RA；黒くぬりつぶされたひし形、図５Ｂ）；及びＭ14マーカー陽性細胞（Ｍ14−NRAN01−RA；黒くぬりつぶされた正方形、図５Ｂ）。上記図５Ａにおけるようにして、本発明の実験の濃度を、ロリジンＡのμｇ／mlとして表わす。細胞の代謝活性を、図５Ａにおける活性に類似する態様で、すなわち細胞の未処理対照培養物において測定された活性の％として表わす（％対照）。
【０２１５】
図５Ａ及び５Ｂに示される結果は、 MTTアッセイにおいて測定された代謝活性が、遊離ロリジンＡ又は２′又は13′RA−NR−AN−01接合体のいづれかにおける24時間のインキュベーション後、16〜18時間経過後でされ、試験細胞のすべての集団において有意に低められたことを示す。RA−NR−AN−01接合体の効果は、標的（BO54及びＭ14）及び非標的（HT29）細胞に対して非特異的に阻害するように思えた（図５Ａ及び５Ｂ）。その阻害効果は、10ng／ml以上の遊離ロリジンＡ又はRA−接合体濃度で観察された。
【０２１６】
比較目的のために、細胞に対するプソイドモナス外毒素（PE）接合体の効果を類似する手段で評価する第２の研究を行なった。それらの研究のためには、標的及び非標的細胞をPE又はPE−NR−AN−01により24時間処理し、そして次に、“回復期間”を可能にし（上記のように）、その後、代謝活性を MTTアッセイにおいて試験した。
【０２１７】
図６Ａは、インビトロ研究の結果をグラフ的に示しており、ここで前記研究においては、図５Ａに関しての上記のような研究に類似する態様で行なったが、但し、RA−NR−AN−01よりもむしろPE−NR−AN−01（NRAN01−PE）の細胞に対する代謝活性を研究した。次の３種の異なった細胞型を利用した：BO54マーカー陽性平滑筋細胞（BO54；空白の正方形、図６Ａ）；HT29のマーカー陰性対照細胞（HT29；黒くぬりつぶされたひし形、図６Ａ）；及びＭ14マーカー陽性細胞；黒くぬりつぶされた正方形、図６Ａ）。この研究においては、接合体の濃度を、μｇ／mlのNR−AN−01タンパク質として表わし（対数縮尺に基づいてプロットされた）、そして代謝活性を、未処理の対照培養物において測定された MTT活性の％として表わす（％対照）。
【０２１８】
図６Ｂは、図６Ａに関して上記で論ぜられた研究に類似する態様で行なわれるインビトロ研究の結果をグラフ的に示す（但し、図６Ａとは異なって、PE−NR−AN−01により図６Ａにおけるようにして得られた効果と遊離PE（PE）により得られた効果とを比較した。細胞、培養条件、計算、及び結果の表示は、上記図６Ａにおけるのと同じである。
【０２１９】
図６Ａ及び６Ｂに表わされる結果は、PE−NR−AN−01又は遊離PEへの24時間の暴露が 100ng／mg以上の濃度で細胞に対して非特異的に阻害することを示す。
このタイプの非特異的阻害は生物学的アテローム切除のためには可能性ある値のものであると判断されるが、死亡及び死につつある細胞が平滑筋増殖を刺激する因子を放すことができる場合、それは血管形成に続く狭窄の処理のためには所望されるとは思われない。
【０２２０】
例５．細胞活性に対するパルス−処理の効果
さらなる研究が、細胞に対する、ロリジンＡ含有治療接合体への短時間、すなわち５分間の暴露の効果を評価するために行なわれた。これらの研究においては、代謝活性(MTTアッセイにおいて測定される）及び細胞タンパク質合成(3Ｈ−ロイシンの組込みにより測定される）の両者を評価した。
【０２２１】
５分間の暴露の後の効果：タンパク質合成
遊離ロリジンＡ（RA）又は治療接合体への５分間の暴露の効果を評価した。２′位置（２′RA−HS−NR−AN−01）又は13′位置（13′RA−HS−NR−AN−01）のいずれかでヘミスクシニル（HS）を通して結合されたロリジンＡ−NR−AN−01を使用した。（13′RA−HS−NR−AN−01の場合、ロリジンＡの２′位置がまたアセチル化された。）RA，２′又は13′RA−NR−AN−01接合体を、ロリジンＡの 400ng／ml〜 780pg／mlの濃度範囲にわたって滅菌されたDMEMにより２倍に希釈した。（試験サンプルをロリジンＡに対してすべて標準化し、その結果、直接的な比較が比較できる用量での効果からなされ得る。）サンプルを 100ml／ウェルでマイクロタイタープレート中に二重反復してアリコートし、そして室温で５分間インキュベートした。
【０２２２】
マーカー陽性Ａ375 及びマーカー陰性HT29細胞に対する試験サンプルの短期間及び長期間効果を決定した。短期間効果を研究するためには、 100ml／ウェルの〔 3Ｈ〕−ロイシン(0.5ｍCi／ml）を、接合体（又はRA）による５分間の処理の直後に添加し、そしてタンパク質合成を４時間にわたって評価した。長期間効果の決定のためには、細胞を５分間処理し、洗浄し、そして次に戻し、５％ NBS／５％  Serum Plus（商標）（すなわち、Ａ375 又はHT29細胞のための）又は10％ FBS（すなわち、BO54細胞のための）のいづれかを含むDMEM培地において24時間の“回復”期間の間、培養した。“回復”期間の最後で、インキュベーション培地を除去し（吸引により）、そして 3Ｈ−ロイシンを添加した（上記のようにして）。
【０２２３】
両者の場合（すなわち、短期間又は長期間）、細胞のタンパク質合成を、湿潤されたチャンバーにおいて37℃で４時間、前記細胞を 3Ｈ−ロイシンと共にインキュベートすることによって評価し、そしてすべての結果を、非処理細胞（すなわち 100％対照）との比較により計算する。４時間後、 3Ｈ−ロイシンを除去し、細胞を、トリプシン処理により基質から除去し、吸引し(PHDTM細胞収穫器(Cambridge Technology, Inc., Cambridge, MA))、そしてガラス繊維フィルター上での濾過により集めた。そのガラス繊維フィルターを乾燥せしめ、そして放射能を、 Beckman液体シンチレーションカウンターにおける液体シンチレーション分光法により定量化した。
【０２２４】
図７Ａは、インビトロ研究の結果をグラフ的に示しており、ここで前記研究は、異なった濃度のロリジンＡ（遊離RA；空白の正方形、図７Ａ）、又は２′RA−NR−AN−01（２′RA−NRAN01；黒くぬりつぶされた正方形、図７Ａ）又は13′RA−NR−AN−01（13′RA−NRAN01；黒くぬりつぶされた三角、図７Ａ）接合体への対照HT29マーカー陰性細胞の５分間の暴露に対する効果を調査するために行なわれた。
【０２２５】
遊離RA，２′RA−NR−AN−01又は13′NR−AN−01の濃度は、NR−AN−01タンパク質の合計μｇ／mlよりもむしろ、アッセイにおけるロリジンＡの計算された濃度として表わされ（対数縮尺に基づいてプロットされたμｇ／ml）、その結果、結果の直接的な比較がなされ得る。それらの研究のためには、細胞を５分間処理し、洗浄し、そして次に、戻し、４時間、培養し、この間、細胞タンパク質合成を、培養培地に 0.5ｍCi／mlの 3Ｈ−ロイシンを添加することによって評価した。前記４時間の最後で、細胞タンパク質を集め、そして放射能を測定した。その結果は、対照の（非処理された）HT29細胞培養物において記録される放射能の％として表わされる（すなわち、％対照）。
【０２２６】
図７Ｂは、図７Ａに関して、上記のようにして（但し、この実験においては、細胞を、４時間の 3Ｈ−ロイシンタンパク質合成アッセイにおいてのタンパク質合成を試験する前、16〜18時間の回復期間（すなわち、一晩；ｏ／ｎ）インキュベートされた）。遊離RA（空白の正方形、図７Ｂ）、２′RA−NRAN01（黒くぬりつぶされた正方形、図７Ｂ）又は13′RA−NRAN01（黒くぬりつぶされた三角、図７Ｂ）の異なった濃度への５分間の暴露の対照のHT29マーカー陰性細胞に対する効果を調査するインビトロ研究の結果をグラフ的に示している。その結果は、図７Ａにおける上記の態様に類似する態様で示される。
【０２２７】
図７Ａ及び７Ｂに表わされる結果は、HT29対照細胞によるタンパク質合成に対して、それぞれRA，２′RA−HS−NR−AN−01及び13′RA−HS−NR−AN−01の短期及び長期効果を示す。その結果は、HT29細胞において、RA−NR−AN−01によってではなく、遊離ロリジンＡにより細胞タンパク質合成の用量−応答阻害性を示す。５分間のインキュベーションの間にRAにより開始せしめられた阻害は、16〜18時間の回復期間の後でさえ明白である（図７Ｂ）。
【０２２８】
対照的に、２′RA−HS−NR−AN−01又は13′RA−HS−NR−AN−01による非標的HT29細胞の処理は、タンパク質合成の検出できる阻害性をもたらさなかった。従って、それらの結果（24時間にわたっての上記で得られた結果に対照すると）は、処理が５分間の“パルス”により供給される場合、NR−AN−01−接合体のインビトロ作用に対して驚くべき程度の特異性を示すように思える。しかしながら、NR−AN−01−接合体は不活性であり、そのような追加の実験が標的細胞に対するその接合体の効果を評価するために行なわれることもまた可能であった。
【０２２９】
図７Ｃは、図７Ａに関しての上記のようにして、異なった濃度の遊離RA（空白の正方形、図７Ｃ）、２′RA−NR−AN−01（黒くぬりつぶされた正方形、図７Ｃ）又は13′RA−NR−AN−01（黒くぬりつぶされた三角、図７Ｃ）への５分間のＡ375 ｍ／ｍマーカー陽性細胞の暴露に対する効果を調査するインビトロ研究の結果をグラフ的に示す。この研究においては、Ａ375 細胞を、試験の剤において５分間インキュベートし、洗浄し、そして培養培地への 0.5ｍCi／mlの 3Ｈ−ロイシンの添加により次の４時間にわたってタンパク質合成について試験した。この実験の結果は、図７Ａにおける上記の態様と類似する態様でプロットされる。
【０２３０】
図７Ｄは、図７Ｂに関しての上記のようにして、異なった濃度の遊離RA（空白の正方形、図７Ｄ）、２′RA−NRAN01（黒くぬりつぶされた正方形、図７Ｄ）又は13′RA−NRAN01（黒くぬりつぶされた三角、図７Ｄ）への５分間のＡ375 ｍ／ｍマーカー陽性細胞の暴露に対する効果を調査するインビトロ研究の結果をグラフ的に示す。この研究においては、Ａ375 細胞を、試験の剤において５分間インキュベートし、洗浄し、そして次に、戻し、16〜18時間の回復期間（すなわち一晩；ｏ／ｎ回復）、培養し、その後、タンパク質合成を、４時間の 3Ｈ−ロイシンタンパク質合成アッセイの間、評価した。この実験の結果は、図７Ａにおける上記の態様と類似する態様でプロットされる。
【０２３１】
図７Ｃ及び７Ｄに表わされる結果は、Ａ375 標的細胞によるタンパク質合成に対する、RA，２′RA−HS−NR−AN−01及び13′RA−HS−NR−AN−01のそれぞれの短期間及び長期間効果を示す。２′又は13′RA−NR−AN−01治療接合体による標的細胞の処理は、タンパク質合成の短期間阻害をもたらし、すなわち５分のパルス処理の直後に観察された（図７Ｃ）。それらの発見は、上記図７Ａ及び７Ｂにおける発見と組合される場合、RA−NR−AN−01接合体が活性的であり、そしてそれらが非標的細胞ではなく標的細胞を特異的に阻害することを示唆する。
【０２３２】
興味あることには、“パルス”処理された標的細胞が培養へ戻される場合、長期間の阻害効果は観察されなかった（図７Ｄ）。図７Ｃ及び７Ｄに表わされる結果は、ロリジンＡが試験細胞に対して非特異的に阻害し（すなわち、図７Ａ及び７Ｂに類似する態様で）、そして細胞に対するその効果が16〜18時間の回復期間の後でさえ明白であることを再び示す。従って、“パルス”処理の間、標的細胞に対するRA−NR−AN−01接合体の特異的効果は、NR−AN−01結合タンパク質の性質であるように思える。
【０２３３】
BO54動脈平滑筋細胞により得られる結果は、上記Ａ375 細胞により得られた結果に類似しており、すなわち、遊離ロリジンＡは、 200ng／ml， 100ng／ml及び50ng／mlで対照の60％，66％及び90％に等しい短期間でのタンパク質合成の用量応答阻害性を示し；そして長期間においては、タンパク質合成に対する効果は、同じ用量で対照の27％，46％及び98％に等しかった。対照的に、２′又は13′RA−NR−AN−01は、タンパク質合成に対する短期間又は長期間効果に関してわずか10〜20％の阻害性を示した（すなわち、対照の80％以上）。
【０２３４】
従って、その結果は、“パルス”処理として供給される場合、標的細胞に対するロリジンＡ−接合されたNR−AN−01の短期間特異的可逆性効果を示す。しかしながら、タンパク質合成のみがそれらの実験において評価されたので、細胞代謝活性は“パルス”処理の結果として細胞において影響されることが可能である。従って、細胞代謝活性が“パルス”処理に続いて評価される追加の研究が行なわれた。
【０２３５】
５分間の暴露の後の効果：代謝活性
MTTアッセイを、RA又はRA−NR−AN−01接合体への標的及び非標的細胞の５分間の暴露に続いて、48時間で行なった。それらの研究における標的細胞はBO54及びＡ375 を包含し、そして非標的細胞はHT29細胞を包含した。滅菌された96ウェルマイクロタイタープレートを2500個の細胞／ウェルで接種し、アルミ箔により包装し、そして５％ CO2／95％空気を含む湿潤されたチャンバーにおいて16〜18時間インキュベートした。ロリジンＡ（RA）、２′RA−HS−NR−AN−01及び13′RA−HS−NR−AN−01の一連の２倍希釈溶液を、 400ng／ml〜 780pg／mlから調製し、そしてその希釈溶液 100mlアリコートを、ウェル中に二重反復して分散した。
【０２３６】
試験サンプルへの５分間の暴露の後、細胞を洗浄し、試験サンプルを除去し、そして新しい培地を添加した。細胞を試験の前、48時間の回復を可能にし、すなわちプレートを48時間インキュベートし、そして次に、細胞の代謝活性を、５mg／ml MTT溶液の20ml／ウェルを添加することよって決定した。プレートを被覆し、そして37℃で４時間インキュベートし、そして次に、その反応を上記のようにして進行せしめた（上記例４を参照のこと）。暗青色の溶解されたホルマザン反応生成物を、16〜18時間のインキュベーションの後、室温で進行せしめた。サンプルを、 570nmの吸光度で ELISAマイクロタイタープレートリーダーを用いて定量化した。
【０２３７】
図８Ａは、異なった濃度のロリジンＡ（空白の正方形、図８Ａ）、２′RA−NR−AN−01（NRAN01−２′RA；黒くぬりつぶされたひし形、図８Ａ）又は13′RA−NR−AN−01（NRAN01−13′RA；黒くぬりつぶされた正方形、図８Ａ）への５分間の暴露のBO54マーカー陽性平滑筋細胞に対する効果を調査するインビトロ研究の結果を図的に示す。この実験は、図７Ｂに関しての上記態様に類似する態様で行なわれたが、しかし代謝活性は、図７Ｂにおけるようなタンパク質合成よりかむしろ MTTアッセイによりアッセイされ、そして細胞はまた、回復するのに48時間、与えられた（図７Ｂにおけるような24時間よりもむしろ）。この実験の結果は、図７に関しての上記の態様に類似する態様でプロットされた。
【０２３８】
図８Ｂは、異なった濃度のロリジンＡ（空白の正方形、図８Ｂ）、２′RA−NR−AN−01（NRAN01−２′RA；黒くぬりつぶされたひし形、図８Ｂ）、又は13′RA−NR−AN−01（NRAN01−13′RA；黒くぬりつぶされた正方形、図８Ｂ）への５分間の暴露のＡ375 ｍ／ｍマーカー陽性細胞に対する効果を調べるインビトロ研究をグラフ的に示す。その実験は、図８Ａに関しての上記の態様に類似する態様で行なわれた（そしてその結果はプロットされた）。
【０２３９】
図８Ｃは、異なった濃度のロリジンＡ（空白の正方形、図８Ｃ）、２′RA−NR−AN−01（NRAN01−２′RA；黒くぬりつぶされたひし形、図８Ｃ）又は13′RA−NR−AN−01（NRAN01−13′RA；黒くぬりつぶされた正方形、図８Ｃ）への５分間の暴露のHT29マーカー陰性細胞に対する効果を調べるインビトロ研究の結果をグラフ的に示す。その実験は、図８Ａに関しての上記態様に類似する態様で行なわれた（そしてその結果はプロットされた）。
【０２４０】
図８Ａ〜８Ｃに示される結果は、最高の用量で異なったRA−NR−AN−01接合体間でのわずかな差異を示しているが、しかしより低い用量では、２′及び13′RA−NR−AN−01は、長期間（すなわち48時間）にわたって標的細胞（すなわちBO54及びＡ375)又は非標的細胞（すなわちHT29）代謝活性を有意に阻害しなかった。従って、その結果は、標的細胞タンパク質合成の短期間阻害（上記図７Ｃ〜７Ｄ）が、 MTTアッセイにおいて測定可能なような、細胞に対する長期間代謝効果をもたらさないことを示す。それらのアッセイが５分間の暴露に起因する細胞の代謝変更を検出することができることは、遊離ロリジンＡにより得られた結果により明示される。この場合、遊離ロリジンＡは、細胞がわずか５分間、その剤に暴露され、そして次に48時間の回復期間のために培養物に戻される場合でさえ、標的及び非標的細胞型に対して非特異的に阻害性であった（図８Ａ〜８Ｃ）。
【０２４１】
従って、遊離ロリジンＡによる発見は、 MTTアッセイが５分間の暴露の間に誘発される代謝の変更を検出できることを示唆する。それらの発見を一緒に考慮すれば、RA−NR−AN−01接合体が、“パルス”処理で投与される場合、標的細胞活性（すなわちタンパク質合成）を特異的に阻害し、そしてそれらの効果がタンパク質合成又は細胞性代謝活性のいづれかに対しての有意な長期間効果を伴わないで可逆性であった(MTTアッセイにおいて測定される場合）ことが示唆される。RA−NR−AN−01接合体のそれらのインビトロ性質は、インビボでの平滑筋細胞の阻害のためにひじょうに有用であることがわかった。従って、動物モデルでの研究が、インビボでのそれらの治療接合体の効果を評価するために次に行なわれた。
【０２４２】
例６．動物モデルにおける注入条件の決定
本発明の治療接合体は、血管外傷又は疾病に続いての狭窄を阻害するために有用である。例証となる例においては、血管形成の間、誘発される血管外傷を、血管形成を行なうために使用されるカテーテルを除去し、そしてバルーン注入カテーテルを血管中に挿入することにより、手術工程の間、処理した。その注入カテーテルは、血管の傷つけられた領域における点滴注入口（又は他方では、浸透膜領域）に配置され、そして次に、圧力が治療接合体を導入するために適用される。
【０２４３】
たとえば、２つのバルーンを有する注入カテーテルが使用され得、そして１つのバルーンが外傷部位のいづれかの側上で膨張される場合、治療剤を含む適切な注入流体により満たされ得る流体空間が創造される。イヌ又はヒト冠動脈における 300mmHgで45秒間にわたってのホースラディシュペルオキシダーゼ(HRP）マーカー酵素の注入は、血管壁中への HRPの浸透をもたらすことは報告されている（６）。
【０２４４】
しかしながら、 HRPはNR−AN−01よりも小さな分子であり、そしてヒト及びイヌ冠動脈はまた、存在する家畜のブタモデルシステムにおける頸動脈又は大腿動脈よりも相当に小さい。従って、家畜のブタモデルシステムにおいて、頸動脈及び大腿動脈における血管平滑筋細胞への治療剤の供給のために適切な注入条件を決定するための実験を行なった。供給条件を、血管壁中への治療接合体の浸透性、及びその血管壁における平滑筋細胞への治療剤の特異的結合性を評価することによってモニターした。
【０２４５】
注入用カテーテルを用いて、家畜のブタ又は非ヒト霊長類の冠動脈及び大腿動脈に、約 0.4大気圧(300mmHg）〜３大気圧の範囲での多重圧力で約45秒〜３分間、NR−AN−01を注入した。注入の後、血管を滅菌した塩溶液によりフラッシュし、そして血管壁におけるNR−AN−01マウス IgGを検出するために HRP−接合されたヤギ抗−マウス IgGを用いて免疫組織化学法を調製した。３分後、３大気圧の圧力で、それらの血管壁中へのNR−AN−01の十分な注入が達成されたことが測定された。
【０２４６】
免疫組織学法を用いて、動物モデルシステムがNR−AN−01に対する標的抗原を発現するかを測定した。容易に入手できる実験動物種からの血管組織断片を、NR−AN−01に暴露し、洗浄し、そして HRP−接合されたヤギ抗−マウス IgGと反応せしめた。非ヒト霊長類及びブタのみが、ヒトと 250kDのNR−AN−01標的抗原を共有することが見出された。
【０２４７】
NR−AN−01がインビボにおいてその標的抗原に特異的態様で結合するかどうかを決定するために、家畜のブタの冠動脈及び大腿動脈に、注入カテーテルを用いて治療接合体を注入し、その注入部位を滅菌された塩溶液によりフラッシュし、次に手術部位を閉じ、そして動物をさらに３〜５日間、維持した。この時点の最後で、血管注入部位を切除し、そして免疫組織法のために調製し、再び、ヤギ抗−マウス IgGを用いて、NR−AN−01を同定した。NR−AN−01を、手術の後３〜５日で、ブタの冠動脈及び大腿動脈の血管壁において同定し、そしてNR−AN−01は血管平滑筋細胞とのみ会合すると思われた。それらの発見は、NR−AN−01がインビボでその標的抗原に特異的に結合することができることを示唆する。
【０２４８】
例７．血管平滑筋細胞のインビボでの阻害
バルーンカテーテル−誘発された外傷に続く内膜平滑筋増殖は、血管外傷に応答してのインビボでの平滑筋細胞活性、たとえば血管形成に続く再狭窄を阻害する接合体の治療効能を評価するために良好なモデルである。家畜のブタを用いて、NR−AN−01（すなわち、それらの研究においては、血管平滑筋結合タンパク質又は単純に VSMBPと称す）の効果を研究し；そしてロリジンＡを含む治療接合体は VSMBP−RAと称する）。ブタ動脈におけるバルーン血管形成に通常、伴う出来事は、これまで記載されている（12）。
【０２４９】
それらの研究においては、過大のバルーン（バルーン：動脈の比は約 1.5：１である）を用いての頸動脈の拡張が、長さ 1.5〜２cmの領域にわたって完全な内皮の変性をもたらした。この長さの外傷は血栓症を最少にする試みにおいて選択されたけれども、著しい血小板の沈着及び血栓の形成が存在した。その工程はまた、動脈媒体中への内部弾性板を通しての切開、及び中間部の平滑筋細胞の壊死をもたらした。平滑筋増殖による内膜の肥大は、損傷の後、７日で明らかであり、そして14日で85mmの平均最大厚に達した。この新生内膜の組織学的出現は、ヒト再狭窄の増殖性新生内膜組織にひじょうに類似する（13）。
【０２５０】
一回の用量試験法が、NR−AN−01−ロリジンＡ接合体により家畜のブタにおいて行なわれた。一時的なスリップ結紮により制限された外傷を受けた血管の領域中へのカテーテルを通しての試験接合体の局在化された投与が、標的の平滑筋細胞のために高レベルの暴露を提供しながら、全身性毒性を減じるよう企画された。動物モデル研究におけるこの動脈内投与路は、ヒト冠動脈におけるその提案された路を模倣する。この試験方法は、小動脈内の部位特異的にカテーテルにより投与された血管平滑筋結合タンパク質(VSMBP）接合体の初期インビボスクリーニングとして企画された。
【０２５１】
遊離薬物の毒性がまた、小動脈平滑筋細胞に対する病理学的効果のために評価された。ロリジンＡ−NR−AN−01接合体の治療的に有効な用量が、インビトロ研究において決定され、そして適切な小動脈内投与圧力が、例７に記載されるようにして、動物への遊離 MAb及び MAb接合体の投与により決定された。
【０２５２】
６匹の家畜用雑種のブタ(Duroc X）、すなわち約30ポンドの体重の離乳された肥育用ブタを、この実験において用いた。個々のブタが右及び左の頸動脈及び大腿動脈に分けられた４回の異なった処理（この処理の１つは PBS対照である）を有するような次の処理様式に、前記動物をランダムに割り当てた（下記表１〜４を参照のこと）。
【０２５３】
【表１】
2007075623.tif 000008
【０２５４】
手術方法：
試験接合体及び対照化合物を、バルーンカテーテルにより誘発された、内皮露出の外傷の部位で一回の動脈内注入として投与した。頸動脈及び大腿動脈の両者の内皮１〜２cmを、わずかな抵抗を生成するために塩溶液により十分に拡張された、23cmの長さのサイズ３（大腿）及びサイズ４（頸部）のUresil Vascu-Flo（商標）シリコーン閉鎖バルーンカテーテル（Uresil Technology Center, Skokie, IL）の管腔内通過により剥離した。この技法は、動脈のわずかな拡張を生成した。
【０２５５】
この処理に続いて、近位及び遠位のスリップ結紮の３−０絹糸を、前記剥離された領域の端近くに配置し、そして Inflation Pro（商標） (USCI, C.R.Bard, Inc., Billerica, MA)圧力注射器に結合されるサイズ８のFrench, Infant Feeding Catheter (Cutter-Resiflex, Berkeley, CA) を用いて、３大気圧下で３分間、その露出されたセグメントに直接的、試験接合体及び対照化合物を投与した。スリップ結紮を、３分間の暴露期間の後、除去し、そして動脈血流を再び確立した。
【０２５６】
これらの研究においては、大腿又は頸動脈の枝は、処理される領域に加圧される注入を達成するために必要とされる場合、00絹糸により連結された。大腿動脈の最大の遠位枝（伏在動脈）を切開し、そしてカテーテルのための侵入部位として使用し、次に主要大腿動脈中に通した。主要大腿動脈におけるこのカテーテル法に続いて、二次の枝を連結した。それらの場合、連結又は切開が、カテーテルの侵入を可能にするために用いられ、そして次に開口部を、５−０モノシラメンポリブトエステル（Novafil, D & G Monofil Inc., Monati, PR)の３〜４の縫合糸により閉じた。
【０２５７】
追従工程：
手術に続いて、ブタを、検疫及び手術回復期間の間、セメント製の床の３×５フィートの屋内飼育場で維持した。次に、それらを、組織学に関する組織の収集の前、残る５週間の治癒期間の間、屋内／屋外の畜舎に移した。
動物は、手術部位での出血又は炎症の形跡を伴わないで、手術から正常に回復した。すべての６匹の動物を、ドップラー聴診器により、処理後５〜６日で試験し、そして個々の動物におけるすべての動脈は開放していた。処理後、すべての動物は正常な食欲、活動及び体重の増加を有した。
【０２５８】
全体的な病理学及び組織学的評価：
動脈の外傷化及び処理に続いて５週間後、動物を、 0.6mlの Telazol（商標）（チレタミン塩酸塩；A.H.Robins Co., Richmond, VA）及び 0.5mlのキシラジン（Lloyd Laboratories, Shenandoah, IA)(それぞれ体重30ポンド当たり）による筋肉内注射により鎮静せしめ、ヘパリン化し（i.v.２mlのナトリウムヘパリン、1000単位／ml）、そしてi.v.ペントバルビタールにより安楽死せしめた。右及び左の頸動脈及び大腿動脈の両者を、処理されたセグメントに対して近位部分及び遠位部分の両者を含む正常な血管から除去した。動脈を測定し、そして結紮の位置及び全体的な異常性を注目した。
【０２５９】
動脈を２mm間隔で横断し、そしてO.C.T.（最適切断温度）化合物（Tissue Tek（商標）, Miles Laboratories Inc., Elkhart, IN）を含む極低温モールド(cryomolds）に順に配置し、そして液体窒素により凍結した。そのブロックを５ミクロンで切断し、そして形態学的な研究のために、H & E, Massons Trichrome and Movats Pontachrome により染色した。断片はまた、血管平滑筋の免疫組織学的染色のためにも使用された。
【０２６０】
動脈の段階的な断片の組織学的試験は、外傷を与えられ、そしてRA−NR−AN−01接合体により処理された領域における内膜平滑筋増殖の著しい阻害性を示した（表２）。この阻害は、血管の半全体的な評価でさえ明白であった。内膜平滑筋細胞の増殖の阻害は、動脈壁における平滑筋細胞の死の最少の又は存在しない組織学的形跡を伴って生成された。１つのそのような傷つけられた動脈の横断面が、図９Ａ及び９Ｂに提供されている。
【０２６１】
【表２】
2007075623.tif 000009
【０２６２】
図９Ａに示される結果は、血管形成の５週間後の処理されていない動脈の横断面を示す(160倍の倍率で）。その動脈の最とも有力な組織学的特徴は、明らかに、内膜平滑筋増殖（♯３、図９Ａを参照のこと）による、内部弾性板（♯２、図９Ａを参照のこと）からの内皮（♯１、図９Ａを参照のこと）の置換を包含する。
【０２６３】
図９Ｂに示される結果は、血管形成及びRA−NR−AN−01治療接合体の注入の５週間後の処理された動脈の横断面(160倍の倍率で）を示す。この断面における血管は、図９Ａに示される血管よりも高い機械的なストレスにゆだねられており、そして外部の弾性膜が破壊され、そして中膜の外部層における平滑筋細胞の関連する増殖が観察される複数の部位が存在する（すなわち、図９Ｂにおける♯４を参照のこと）。治療接合体による処理は、内部弾性板（図９Ｂの♯２を参照のこと）からの内皮（図９Ｂの♯１を参照のこと）の置換の欠如により明らかなように、内膜の肥大を阻害した。驚くべきことには、内膜平滑筋細胞に対するこの阻害効果は、外部弾性膜が破壊されている領域における中膜平滑筋細胞の肥大を阻害しないで達成された（図９Ｂの♯４を参照のこと）。
【０２６４】
これは、創傷の治癒が内膜過形成及び狭窄、又は中膜における平滑筋細胞の壊死の悪い結果を伴わないで、処理された血管において進行するので、ひじょうに幸運な結果である。
【０２６５】
それらの組織学的な研究において、13′接合体（すなわち、13′RA−HS−NR−AN−01）が２′接合体（すなわち２′RA−HS−NR−AN−01）よりも平滑筋細胞の内膜過形成を阻害する上でより活性的であると思われた発見により、２′及び13′−ロリジンＡ接合体の両者の有効性の比較がまた行なわれた。この研究においては、13′接合体の低圧注入が、高圧注入よりも、より効果的に平滑筋増殖を阻害するように思え、そして13′接合体はまた、２′接合体よりも一層効果的であるようにも思えた。
【０２６６】
図９Ｂにおいては、血管形成に続いてその部位で投与される治療接合体は、処理されていない血管（図９Ａ）の管腔を制限する平滑筋肥大の約95％の阻害性をもたらした。有意には、治療接合体は、内皮に影響を及ぼさないで、又は動脈壁の中膜層における平滑筋の壊死（すなわち細胞の死）のいづれの徴候も生成しないで、内膜中への中膜平滑筋層からの移動する平滑筋細胞に対してその効果を行使した。研究はまた、血管壁に対する毒性効果に起因するかも知れない単核性浸潤又は線維増多のいづれかの組織学的徴候を示すのには失敗した。
【０２６７】
また、眼に見える治癒の徴候が、処理された血管の内膜層に観察され、そして内皮の再増殖、すなわち内皮と内部弾性板（すなわち図９Ｂの♯１及び♯２を参照のこと）との間に存在する内膜における平滑筋細胞の薄層上に増殖する内皮細胞が観察された。それらの組合された組織学的観察は、血管の内膜層における平滑筋過形成を阻害する治療接合体による処理に続いての、創傷の治癒、内皮の再増殖、及び改良された血管の強さのひじょうに所望する特徴を示す。
【０２６８】
例８．血管平滑筋細胞における DNA及びタンパク質合成のインビトロ阻害
血管平滑筋細胞における DNA合成及びタンパク質合成を阻害する種々の治療剤の能力を試験した。 3Ｈ−ロイシン及び 3Ｈ−チミジン摂取及び細胞毒性アッセイを次の手段に従って行なった。
【０２６９】
５分間の暴露： 3Ｈ−ロイシンの摂取：
40,000個の細胞／mlでの平滑筋細胞を、１ml／ウェルで滅菌された24ウェルプレートに接種した。プレートを、湿潤された雰囲気（飽和）下で、37℃で、５％CO2 ／95％空気中で一晩インキュベートした。対象の治療剤の対数希釈溶液を、血管平滑筋細胞と共に５分又は24時間インキュベートした。治療剤のサンプルを、５％ウシ胎児血清（FBS, Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland）及び５％Serum Plus（商標）(JRH Biosciences, Lenexa, KS) を含むDMEM：Ｆ−12培地（Whittaker Bioproducts, Walkersville, Maryland)により希釈した。
【０２７０】
治療剤のインキュベーションに続いて、その溶液を吸引し、そして５％Serum Plus（商標）を含むロイシン−フリーのDMEM（グルベッコ変性イーグル培地）中、 0.5μCi／mlの 3Ｈ−ロイシン１mlをウェル当たりに添加した。プレートを湿潤化された雰囲気下で37℃で、５％CO2 中において一晩、再インキュベートした。細胞を、生存率及び細胞数を決定するために、評点尺度を用いて倒立顕微鏡により視覚的に分類した。１〜３の等級は、次のように、対照のウェルに比較しての細胞生存率及び細胞数の％に基づかれている：３＝ 100％，２＝70％〜 100％及び１＝０％〜70％。この評点の記録は、治療剤の即効性細胞毒性効果の決定を助けた。
【０２７１】
次に、培地を吸引し、そして細胞を５％冷 TCAにより２度、洗浄した。 0.4ＭのNaOH 400μｌをウェル当たりに添加し、そしてプレートを、回転プラットフォーム上で２時間、室温でインキュベートした。ウェル当たり 200μｌの細胞溶液を、プラスチック製シンチレーションバイアル（Bio-Red Laboratories）中に移し、そして４mlのBio-Safe（商標）II液体シンチレーション流体(Research Products Inter Corp., Mount Prospect, IL）を、振盪の前に添加した。バイアルを、Lotus 1-2-3 （商標）ファイルに転換するためのBeckman "Data Capture"  ソフトウェアをインターフェイス連結されたBeckman LS280 液体シンチレーションカウンター上で計数し、そしてLotus 1-2-3 （商標）を用いて分析した。
【０２７２】
５分間の暴露： 3Ｈ−チミジンの摂取：
血管平滑筋細胞を、滅菌されたウェルプレートにおいて、湿潤化された５％CO2 雰囲気下で37℃で一晩、５％FBS (Gibco）を含む完全培地においてインキュベートした。培地をウェルから吸引し、そして成長因子（DMEM：インスリン（５μｇ／ml）、トランスフェリン（５μｇ／ml）及び亜セレン酸ナトリウム（５ng／ml）を含む、成長因子カクテルを補充されたカタログ♯11884 のＦ−12基本培地；Sigma Chemical, St. Louis, Missouri から入手できる）により補充された血清フリー培地を添加した。
【０２７３】
細胞をこの培地において24時間インキュベートした。５分間の治療剤への暴露のために、治療剤の対数希釈溶液を、完全培地において前記細胞と共にインキュベートした。５分後及び培地を吸引した後、完全培地に分散された 1.0μCi／mlの 3Ｈ−チミジン１mlをウェル当たりに添加した。24時間の暴露は、完全培地に分散された 1.0μCi／mlの 3Ｈ−チミジン１mlと共に細胞のインキュベーションを包含し、そして治療剤の対数希釈溶液を試験した。両暴露試験においては、次に、細胞を、湿潤された５％CO2 雰囲気下で37℃で一晩インキュベートした。
【０２７４】
細胞を、生存性及び細胞数について視覚的に評点を付けた。細胞を洗浄し、そして 3Ｈ−ロイシン手段について記載されるようにしてプラスチック製シンチレーションバイアル中に移すために調製した。バイアルを、Lotus 1-2-3 （商標）ファイルに転換するためのBeckman "Data Capture"  ソフトウェアをインターフェイス連結されたBeckmanLS2800液体シンチレーションカウンター上で計数した。
【０２７５】
それらの手段は、他の標的細胞集団、特に付着性単層細胞型と共に使用することができる。
【０２７６】
形態学的細胞毒性評価−パルス暴露：
血管平滑筋細胞を、商業的調製された４個のウェルスライド(Nunc, Inc., Naperville, Ilinois）上のウェル当たり 4.0×104 個の細胞／ml培地で接種した。十分なスライドを、２つのパルスされた暴露の長さ（５分及び24時間）を提供するために接種し、そして増大評価点（２×時間〜 128時間）を規定した。すべてのスライドを二重反復試験し、アッセイ異常を示した。治療剤を、 3Ｈ−ロイシン及び 3Ｈ−チミジンアッセイに使用される同じ培地により希釈した。
【０２７７】
個々の４つのウェルスライドは、上記 3Ｈ−ロイシン及び 3Ｈ−チミジンアッセイにより決定されるように、最少有効濃度（ウェル“Ｃ”）の１対数高い濃度（ウェル“Ｂ”）及び１対数低い濃度（ウェル“Ｄ”）であった。正常な形態学のための対照として、１つのウェル（ウェル“Ａ”）は未処理のままであった（培地のみ）。インキュベーションは、37℃、５％CO2 の湿潤化されたインキュベーターにおいて行なわれた。個々の２種（５分及び24時間）の暴露点の後、治療剤培地を個々のウェル（未処理のウェルも包含する）から吸引した。
【０２７８】
次に、新鮮な培地１mlを、吸引された培地と交換して添加した。個々の増大された評価点が達成されるまで再インキュベートした。それらの点で、培地を吸引し、そして続いて、適切な固定化を可能にするために１時間、10％中性緩衝ホルマリン１mlにより置換した。それらの固定されたスライドを、形態学的評価及び等級付けするために、ヘマトキシリン（核）及びエオシン（細胞質）により染色した。
【０２７９】
結果：
24時間の 3Ｈ−ロイシンタンパク質阻害アッセイ及び24時間の 3Ｈ−チミジン DNA合成阻害アッセイの結果は、それぞれ、スラミン、スタウロスポリン、ニトログリセリン及びサイトカラシンＢについて図10Ａ−10Ｄに示されている。試験された化合物のすべては、利用できる治療範囲を示し（ 3Ｈ−ロイシンアッセイの曲線下の面積は 3Ｈ−チミジンアッセイに起因する面積よりも大きい）、これは、本発明の持効性投与形態様の実施においての有用性を示唆する。より特定には、それらの化合物は、それらが血管平滑筋細胞のタンパク質合成を阻害するよりも高い程度に、５％ FBSの存在下で DNA合成を行なう血管平滑筋細胞の能力を阻害した。５分及び24時間のパルスされた暴露の間の、スラミン、スタウロスポリン、ニトログリセリン及びサイトカラシンＢのタンパク質及び DNA合成阻害効果が、それぞれ図10Ａ−Ｄに示されている。
【０２８０】
例９．血管平滑筋細胞による標的化された粒子の特異的結合及び内在化
結合タンパク質又はペプチドにより被覆された粒子を結合し、そして内在化する血管平滑筋細胞の能力を、モノクローナル抗体（NR−AN−01）被覆された金ビーズにより、インビトロ及びインビボの両者で示した。血管平滑筋細胞組織培養物（BO54）、抗原陽性対照細胞系（Ａ375)及び抗原陰性対照細胞系（HT29）を、10nmの金ビーズと共にインキュベートし、ここで第１のビーズグループはNR−AN−01により被覆されており、そして第２のビーズグループは被覆されていない対照である。細胞を、単層及び細胞懸濁培養物としてビーズに暴露し、そして電子顕微鏡により、結合及び内在化について６時点（すなわち、１分、５分、15分、30分、60分及び24時間）で試験した。
【０２８１】
表３及び表４は、細胞表面に対する結合性が特異的であることを示す、実験の結果を示す。表３及び表４を通して使用される相対的グレート評価は、次のような粒子結合の主観的な評価を表わす：０＝なし；１＝最少；２＝少々；３＝中位い；及び４＝著しい。粒子の凝集体が平滑筋細胞及び対照細胞の両者の単層表面上に固定する場合、それらの粒子はマクロ及びミクロファーゴサイト−シスにより非特異的に内在化された。細胞が細胞懸濁液に維持される場合、非特異的な内在化は最少であるか又は不在であった。HT29細胞により生成される表面ムチンへのNR−AN−01を欠いている金ビーズの非特異的付着が観察され、これはその適度な非特異的内在化をもたらす。NR−AN−01により標的化された金ビーズの血管平滑筋細胞の摂取は、細胞懸濁培養物においてはひじょうに特異的であった。
【０２８２】
【表３】
2007075623.tif 000010
【０２８３】
【表４】
2007075623.tif 000011
【０２８４】
図11は、多くのエンドサイト−シス性小胞（これらのいくつかは、細胞により内在化される工程において抗体被覆の金ビーズを含む）により特徴づけられる平滑筋細胞の内部表面に平行な正接断面を示す。細胞表面抗原に結合される粒子を有するそれらのエンドサイト−シス性小胞は、正常な細胞表面膜再循環のための予測される速度よりも早い速度でリソソームと融合するために刺激された。内在化された粒子のその得られる著しい蓄積が24時点で観察され、そして図12に示される。
【０２８５】
標的化された金ビーズ平滑筋細胞表面結合性、内在化及びリソソーム濃縮物が同様にインビボで観察された。NR−AN−01被覆された金ビーズを、バルーン外傷の直後、スリップ結紮により近位的に及び遠位的に閉鎖された、処理される領域を開口されたブタ大腿動脈壁中に、血管内カテーテルを通して、３atm の圧力下で３分間、注入した。ビーズの内在化する速度は、バルーン外傷の間、血管平滑筋細胞により維持される損傷の程度に従って変化した。
【０２８６】
最少の又はまったくの損傷を受けなかった細胞は、エンドサイト−シス及びファゴサイト−シスにより粒子を急速に内在化し、その内在化された粒子はリソソームに濃縮した。外傷により殺害された細胞は、表面ビーズ結合を示した。外傷により損傷を受けたが、しかし生存している細胞は、遅延された内在化及びリソソーム濃縮と共に、ビーズ表面結合により特徴づけられる。図13は、ビーズ投与後１週間でのインビボでのリソソームにおける粒質物濃縮を示す。
【０２８７】
例10．スタウロスポリン及びサイトカラシンによる、血管平滑筋における DNA及びタン パク質合成のインビトロ阻害
血管平滑筋細胞における DNA及びタンパク質合成をインビトロで阻害するスタウロスポリン及びサイトカラシンの能力を試験した。 3Ｈ−ロイシン及び 3Ｈ−チミジン摂取及び細胞毒性アッセイを、次の方法に従って行なった。
【０２８８】
培養された細胞：
BO54細胞（ヒヒの平滑筋細胞）は、ヒヒの大動脈平滑筋細胞の外植片に由来した。細胞を、DMEM（ダルベッコ変性イーグル培地）：５％ウシ胎児血清（FBS, Gibco）及び５％Serum Plus（商標）(JRH Biologicals)(“完全培地”) を含むＦ−12培地（Whittaker Bioproducts, Walkersville, Maryland)において増殖し、そして細胞の種子ロットを、継代培養７での未来での使用のために液体窒素に凍結せしめた。
【０２８９】
５分間の暴露：タンパク質合成アッセイ：
40,000〜50,000個の細胞／mlでの血管平滑筋細胞を、上記例８、“５分間の暴露： 3Ｈ−ロイシン摂取”に記載のようにして、接種し、そして加工した。スタウロスポリンの対数希釈溶液(200ng／ml，20ng／ml，２ng／ml， 0.2ng／ml及び0.02ng／ml）を、完全培地に分散した。サイトカラシンＢに関しては、20μｇ／ml， 2.0μｇ／ml,  0.2μｇ／ml, 0.02μｇ／ml及び 0.002μｇ／mlの対数希釈溶液を、完全培地に分散した。次に、完全培地を対照のウェルに添加した。個々の治療剤希釈溶液１ml／ウェルを４重反復してウェルに添加し、そして対象の剤を血液平滑筋細胞と共に、滅菌された換気されたフード下で５分間、室温でインキュベートした。治療剤のインキュベーションに続いて、ウェルを、例８の“５分間の暴露； 3Ｈ−ロイシン摂取”に記載のようにして処理した。
【０２９０】
５分間の暴露： DNA合成アッセイ：
血管平滑筋（BO54）細胞を、上記の“５分間の暴露：タンパク質合成アッセイ”に記載されるようにして、24ウェルプレートに接種し、そして加工した。試験治療剤との５分間のインキュベーションの後、培地を吸引し、そして完全培地に分散される 1.0μCi／mlの 3Ｈ−チミジン(3Ｈ−ロイシンよりもむしろ）の１ml／ウェルを添加した。次に、細胞を、湿潤化された５％CO2 雰囲気下で、37℃で一晩インキュベートした。次に、治療剤の毒性効果を、上記“タンパク質合成アッセイ”に記載のようにして決定した。
【０２９１】
24及び 120時間の暴露：タンパク質合成アッセイ：
20,000個の細胞／mlでの血管平滑筋（BO54）細胞を、滅菌された24ウェルプレートに接種し、そして完全培地（１ml／ウェル）において、５％CO2 ／95％空気下で、湿潤された雰囲気（飽和）において37℃でインキュベートした。スタウロスポリンの対数希釈溶液(100ng／ml，10ng／ml，１ng／ml， 0.1ng／ml及び0.01ng／ml）を下記のようにして、２種の培地に連続的に分散した。サイトカラシンＢに関しては、10μｇ／ml， 1.0μｇ／ml,  0.1μｇ／ml, 0.01μｇ／ml及び 0.001μｇ／mlでの対数希釈溶液を、下記のようにして２種の培地に連続的に分散した：
培地（１）＝完全培地；及び
培地（２）＝ 0.5μCi／mlの 3Ｈ−ロイシンを含むDMEM（ロイシンフリー）。
【０２９２】
培地（２）は、この実験の最終の24時間のインキュベーション期間のために使用される。より特定には、24時間のアッセイにおいては、個々の治療剤を、上記のようにして、培地（２）に希釈した。培地（１）をウェルから吸引し、そして培地（２）中、治療剤希釈溶液のアリコートを、四重反復して、適切なウェルに添加した。次に、培地（２）を対照のウェルに添加した。
【０２９３】
120時間のアッセイにおいては、個々の治療剤を上記のようにして、培地（１）に希釈した。培地（１）をウェルから吸引し、そして培地（１）中、治療剤の希釈溶液のアリコートを、四重反復して、適切なウェルに添加した。次に、培地（１）を対照のウェルに添加した。培地を24時間ごとに変え、そして新鮮な治療剤を試験ウェルに添加した。96時間で（すなわち４日目）、個々の治療剤を上記のようにして、培地（２）に希釈した。培地（１）をウェルから吸引し、そして培地（２）中、治療剤希釈溶液のアリコートを、四重反復して、適切なウェルに添加した。次に、培地（２）を、対照のウェルに添加した。
【０２９４】
3Ｈ−ロイシン中、試験剤（及び対照）を、湿潤された雰囲気下で、５％CO2 において、37℃で一晩インキュベートした。次に、治療剤の毒性効果を、上記のような、“５分間の暴露：タンパク質合成アッセイ”に記載のようにして決定した。さらに、個々の希釈溶液での細胞の変化を、 320倍の Zeiss顕微鏡(Zeiss, West Germany）を用いて、写真を取った。次に、培地を吸引し、そして細胞を上記のようにして、 TCAにより加工した。
【０２９５】
24及び 120時間の暴露： DNA合成アッセイ：
このアッセイは、“24及び 120時間の暴露：タンパク質合成アッセイ”について記載される方法に従って行なわれた。但し、この24及び 120時間の DNA合成アッセイにおける培地（２）は次の通りである：
培地（２）＝ 1.0μCi／mlの 3Ｈ−チミジンを有する完全培地。培地（２）は、この実験の最後の24時間のインキュベーションにおいて使用される。
それらのタンパク質及び DNA合成アッセイは、他の標的細胞集団、特に付着性単層細胞型による使用のために適合できる。
【０２９６】
結果：
個々の剤の最少有効量(MED）を、培地のみにより処理された対照の％として決定し；対照値の50％は細胞毒性標線として選択された。５分間の暴露で、スタウロスポリンは、タンパク質合成アッセイにおいて 100ng／mlの MEDを示し、そして DNAアッセイにおいて１ng／mlの MEDを示した。スタウロスポリンのための24時間の MEDは、タンパク質合成において10ng／ml及び DNA合成アッセイにおいて１ng／mlであった。両アッセイは、スタウロスポリンの 120時間の暴露のために１ng／mlの MEDを付与した。
【０２９７】
５分間の暴露で、サイトカラシンＢは、タンパク質合成アッセイ及び DNAアッセイにおいて10μｇ／mlの MEDを示した。サイトカラシンＢのための24時間の MEDは、タンパク質合成アッセイにおいて 1.0μｇ／ml及び DNA合成アッセイにおいて１μｇ／mlであった。両アッセイは、スタウロスポリンの 120時間の暴露のために約 0.1μｇ／mlの MEDを付与した。
【０２９８】
サイトカラシンＣ及びサイトカラシンＤ治療剤を、上記サイトカラシンＢについて記載されるのと同じ希釈度を用いて24及び48時間の暴露で試験した。24時間で、サイトカラシンＣは、タンパク質合成アッセイにおいて 1.0μｇ／mlの MED及び DNA合成アッセイにおいて0.01μｇ／mlの MEDを示した。48時間で、サイトカラシンＣは、タンパク質合成アッセイにおいて 0.1μｇ／ml及び DNA合成アッセイにおいて0.01μｇ／mlの MEDを示した。サイトカラシンＤは、24時間のタンパク質合成アッセイにおいて 1.0μｇ／mlの MED及び24時間の DNA合成アッセイにおいて 0.1μｇ／mlの MEDを示した。サイトカラシンＤへの48時間の暴露は、タンパク質合成及び DNA合成アッセイの両者において、 0.1〜0.01μｇ／mlの範囲の MEDを付与した。
【０２９９】
例11．血管平滑筋細胞の移動の阻害
サイトカラシンＢによる平滑筋細胞移動阻害の程度を決定するためのスクラッチアッセイを、次の方法に従って行なった：
血管平滑筋細胞（BO54）は、例10に記載されるようなヒヒの大動脈平滑筋の移植片に由来した。細胞を、約５mlの培地を保持する、平底の６ウェル組織培養プレートにおいて増殖した。血管平滑筋細胞を、 200,000個の細胞／ウェルでプレートし、そして湿潤化された５％CO2 インキュベーターに、37℃で18時間、配置した。
【０３００】
次に、ウェルを、クランプ又はやっとこにより保持され、そして90度の角度でウェルの底と無菌状態で接触せしめられる単一刃先のレーザー刃の無菌部分によりスクラッチした。スクラッチにそっての小さな領域からの細胞を、無菌の綿を先端に有するアプリケーターにより除去し、ここで前記レーザー刃はウェルの底と接触したまま存在した。インキュベーションの後、“スクラッチされた”領域における細胞の存在が、スクラッチ線を横切って細胞移動の存在を示す。対照のインキュベーションは、有意な細胞移動を示し、そして治療剤に暴露される細胞の移動が比較される基準として作用する。
【０３０１】
手短に言及すれば、１mg／mlでのジメチルスルホキシド（DMSO）におけるサイトカラシンＢ（Sigma Chemical Co.）の原液を調製した。サイトカラシンＢ又は対照培地の試験希釈溶液を添加した。個々の実験は、次の２組のプレートを包含した：
Ａ組：１，３，６，８及び10日間のみの試験剤暴露；及び
Ｂ組：１，３，６，８及び10日間の試験剤暴露、続く対照培地による７日間の回復時間        。
【０３０２】
両組のプレートを、固定し(PBS中、10％ホルマリン）、そして一定時間の暴露の最後で染色した（0.02％クリスタルバイオレット）。サイトカラシンＢについての試験濃度は、１， 0.1及び0.01μｇ／mlであり、そして負の培地対照が包含された。新鮮な培地及び薬物は、週当たり３度、供給された。
【０３０３】
表５は、それらの実験の結果を示す。この表において、“Ｍ”は、次の移動等級を示し：−＝移動なし；＋１＝最少；＋２＝少々；＋３＝中位い；及び＋４＝著しい（最大密度；細胞接触阻害の限界）；ここで血管平滑筋細胞はスクラッチ部位に隣接する透明な領域中に移動する。この表において、“Ｔ”は次の形態学的毒性等級を示す：−＝毒性存在しない；＋１＝最少；＋２＝少々；＋３＝中位い；及び＋４＝著しい毒性。その移動結果は、“ウェルの透明な領域における等級／ウェルの妨害されていない領域における等級”として表わされる。その毒性値は、個々のウェルにおけるすべての細胞についての等級を表わす。
【０３０４】
データは、サイトカラシンＢが、最少（−〜＋１）の形態学的毒性のみを伴って、 0.1μｇ／mlの用量で、スクラッチ部分に隣接する透明な領域中への血管平滑筋細胞の移動（＋１〜＋２）を阻害することを示す。データはまた、処理された細胞(0.1μｇ／ml）が、治療剤への10日間の連続した暴露後でさえ、治療剤の除去に続いて、移動する能力（＋３〜＋４）を再び得ることも示す。
【０３０５】
【表５】
2007075623.tif 000012
【０３０６】
例12．血管平滑筋細胞に対する治療剤の細胞毒性効果−パルス及び連続した暴露
血管平滑筋細胞を、２種の暴露形式の１つに従って治療剤に暴露した：
パルス暴露：
パルス暴露プロトコルは、上記例８に記載されている（“形態学的細胞毒性評価−パルスされた暴露”を参照のこと）。
【０３０７】
連続した暴露：
パルス暴露のための方法と同じ方法が、連続した暴露の形態学的細胞毒性評価のために使用される。但し、試験ウェルは、暴露期間の間、培地における治療剤に連続して暴露された。処理されていない対照のウェルを包含する個々のウェルから毎日、培地及び治療剤を吸引し、そして１mlの新鮮な培地及び治療剤（又は対照ウェルのためにのみ培地）により変換した。
【０３０８】
長期間の連続した暴露プロトコルの増大する個々の評価点が達成されるまで、再インキュベートした。それらの増大する評価時点は、６，24，48，72，96，120, 168, 216 及び264 時間であった。明示された時間で、適切な細胞を固定し、染色し、そしてパルス暴露プロトコルとして評価した。連続した暴露実験の結果は、スラミン、スタウロスポリン及びサイトカラシンＢについて表６に示される。表６に示される５分及び24時間のデータは、図10Ａ，10Ｂ及び10Ｃに含まれるデータに相互に関係する。
【０３０９】
【表６】
2007075623.tif 000013
【０３１０】
インビトロでの有効投与量で、サイトカラシンＢ（１μｇ／ml；抗−移動／収縮有効用量）及びスタウロスポリン（１ng／ml；抗−増殖有効用量）は、それぞれ、１（最少）及び２（少々）の細胞毒性等級を示した。独立した研究は、３（中位）又はそれ以下の等級が本発明の細胞増殖抑制性、抗−増殖剤のために好ましいことを示した。
【０３１１】
例13．インビボBRDUアッセイ：血管平滑筋細胞増殖の阻害BRDUアッセイ：
インビボ血管平滑筋増殖を、細胞 DNA合成及び増殖の間、 DNA中への塩基類似体５−ブロモ−２′−デオキシウリジン（BRDU, Sigma Chemical Co.から入手できる）の組込みを測定することによって定量化した。BRDU組込みは、市販の抗−BRDUモノクローナル抗体を用いて組織化学的に示された。１時間のパルスラベリングは、そのパルス期間の間、細胞分裂する細胞の数の評価を可能にする。
【０３１２】
上記BRDUパルスラベリングプロトコルを、インビボでのブタ血管研究に関する標準の評価技法として使用する。手術及び処理工程（たとえば、例７及び11に論じられる）、及び手術後回復期間に続いて、ブタを鎮静し、そしてBRDUによりパルスし、続いて、組織を集めた。
【０３１３】
手短に言及すれば、ブタをチレタミン塩酸塩及びキシラジン（例７、“全体的な病理学及び組織学的評価”におけるような）による筋肉内注射により鎮静せしめた。次に、BRDUを、側耳静脈を通して静脈内投与した。50mg／mlの濃度でのBRDU２mlを、個々の30〜40ポンドのブタに投与した。１時間後、ペントバルビタールの静脈内投与により、ブタを殺した。次に、試験動脈セグメントを除去した（セグメントは、処理された動脈セグメントに対して近位的に及び可能なら、遠位的に位置する正常な血管を含んだ）。動脈セグメントを２mm間隔で横断し；O.C.T.（最適切断温度）化合物（Tissue Tek（商標）, Miles Laboratories, Inc., Elkhart, IN)により超低温モールドにおいて順に配置し；そして液体窒素により凍結した。そのブロックを、５ミクロンの厚さで切断し、そして免疫組織学的に染色し、次の方法を用いてBRDUを検出した。
【０３１４】
BRDU−ラベルされた細胞の検出：
BRDU（17mlの滅菌された水及び３mlの１Ｎ NaOH に希釈されたBRDU１ｇ）パルスラベリング、試験動脈セグメントの除去及び断片化（上記のようにして）の後、抗−BRDUモノクローナル抗体による免疫組織化学的染色が、特定化された時間にわたって有系分裂指数を決定する可視化手段を提供する。免疫組織化学的染色法は次の通りに行なわれた：
【０３１５】
１）試験動脈の５μｍ切片を、冷アセトン（−20℃）において10分間、脱水し；
２）切片を顕微鏡用ガラススライド上に積層し、そしてスライドを37℃のオーブンにおいて10分間、乾燥せしめ；
３）スライドを PBSにおいて10分間、再水和化し；
４）スライドを１Ｎの HClを用いてFeulgen の酸加水分解にゆだね、ここで１Ｎの HClの２アリコートを、37℃及び60℃に予備加熱し；
５）スライドを、１ＮのHCl １mlにより37℃で１分間すすぎ；
６）スライドを、60℃の１Ｎの HClに15分間、移し；
７）スライドを、１ＮのHCl １mlにより37℃で１分間すすぎ；
８）スライドを、室温で PBSにより、５分間隔で３度洗浄し；
【０３１６】
９）切片上の内因性交差反応性部位を、正常なヤギ血清(PBS中、１：25）により20分間、ブロックし；
10）スライドを、段階８におけるように、 PBSにより洗浄し；
11）切片を、10μｇ／mlでのマウス抗−BRDU抗体（DAKO Corporation, Carpinteria, CA)と共に30分間インキュベートし；
12）スライドを、段階８におけるようにして PBSにより洗浄し；
13）切片を、ホースラディシュペルオキシダーゼ−ラベルされた（HRPC）ヤギ抗−マウスIgG 、（Jockson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA ; PBS により１：20に希釈された）及び４％ヒトAB血清と共に30分間インキュベートし；
14）スライドを、段階８におけるようにして PBSにより洗浄し；
【０３１７】
15）切片を、クロモゲン(PBS 200mlにおいて５mg／mlでの３，３′−ジアミノベンジジン(DAB；Sigma)) 及び 200μｌの30％H2O2と共に10分間インキュベートし；
16）スライドを、段階８におけるようにして PBSにより洗浄し；
17）サンプルを、GillＩヘマトキシリン（GillＩ Lerner Laboratories, Pittsburgh, PA ; 30 dips）により対比染色し；
18）スライドを、段階８におけるようにして PBSにより洗浄し；青み剤溶液（1500mlのdH2O中、１ｇの炭酸リチウム）によりすすぎ；脱イオン水により洗浄し；そして
19）次に、試験サンプルを脱水し、透明にし、そしてカバーガラスで被覆した。
【０３１８】
この工程の終結で、陽性の免疫組織学的染色は、反応の部位でカッ色を示す。
細胞殺害剤は、 PBS対照に対してBRDU摂取を阻害し；しかしながら、サイトカラシンＢ及びスタウロスポリンは、血管平滑筋細胞を殺害しないで、BRDU摂取（すなわち、細胞増殖）を阻害した。BRDUによりラベルされた血管平滑筋細胞の数を、次の通りにして、 400倍の倍率で等級を割り当てた：
【０３１９】
１＝＜１／高い力の領域（high power field (HPF)) ；
２＝２〜５／HPF ；
３＝＞５〜＜10／HPF ；及び
４＝＞10／HPF 。
【０３２０】
サイトカラシンＢ及びスタウロスポリンの両者は、バルーン外傷に続いて24時間、増殖を阻害し（等級１）、予備外傷基線の等級に等しいBRDUラベリング等級を生成する（等級１）。 PBS及びモノクローナル抗体対照は、同じ時間、 2.5〜４のBRDUラベリングを示した。外傷後４日で、サイトカラシンＢ又はスタウロスポリン、並びに PBS及びモノクローナル抗体対照により処理された動脈は、４のBRDUラベリング等級を示した。サイトカラシンＢ及びスタウロスポリンの抗−増殖性、非細胞殺害性質は、それらの剤が血管狭窄の低減のための持効性投与配合物に適合できることを示唆する。
【０３２１】
例14．パルーン外傷を与えられたブタ動脈のサイトカラシンＢを用いての生物学的ステ ンチング
サイトカラシンＢにより処理された、バルーンにより傷つけられたブタ動脈は、他の試験剤又は対照により処理された動脈に比較して、処理時点後、４日及び３週間で大きな管腔領域を示した。10の大腿動脈（例７に記載される単一用量プロトコルに従って処理された５匹のブタの個々から得られた２つの動脈）を、組織学的に評価した。
【０３２２】
個々の動脈の最大管腔領域を、BG System IVコンピューター化された体型測定分析システム(R & M Biometrics, Inc., Nashville, TN）によるデジタル化された顕微鏡像から測定し、そして計算した。この実験はさらに５匹のブタによりくり返えされた（ブタ当たり２つの動脈；サイトカラシンＢの用量＝ 0.1μｇ／ml，１atmの圧力で３分間、適用される；同じ時点）。それらの２つの実験から得られたデータを組合した。サイトカラシンＢ処理時点後、３週間での管腔領域の上昇が観察された。
【０３２３】
外傷を与えられ、そしてサイトカラシンＢ−処理された、動脈のセグメントの管腔領域をまた、その試験領域に近位の大腿動脈の正常な未処理領域の管腔領域と比較した。その結果は、試験領域における管腔領域が同じ動脈の正常な対照のセグメントの領域の約２倍大きかったことを示した。負の対照剤、 PBS及びモノクローナル抗体NR−AN−01は、同じ動脈の正常な対照セグメントに比較して、管腔領域の上昇を示さず、又はわずかな上昇を示した。
【０３２４】
次に、サイトカラシンＢの用量応答研究を、例７に記載される実験プロトコルに従って、10匹のブタに対して行なった。手短に言及すれば、２匹のブタの個々の両動脈を、次の用量のサイトカラシンＢの１つにより処理した： 0.0μｇ／ml（すなわち、 PBSの負の対照）；0.01μｇ／ml；0.10μｇ／ml； 1.0μｇ／ml；及び10.0μｇ／ml。剤は、１atm の圧力で３分間、管腔内カテーテルにより供給され、そして動脈は上記体型測定分析システムにより３週間後、評価された。
【０３２５】
近位の正常な動脈管腔領域に対する処理された動脈管腔領域の割合を、処理された領域対正常な領域の％変化として決定した。有意な閾値効果が、 0.1μｇ／ml（約 140％の上昇）〜 1.0μｇ／mlの用量で観察された（図14）。10μｇ／mlの用量は、血管平滑筋細胞に対して毒性であると思われた（データは示されていない）。閾値下の用量（0.01μｇ／ml）及び負の対照(PBS）は、管腔領域の±約20％の変化を示した。それらのデータは、サイトカラシンＢが、傷つけられた動脈に供給される場合、“生物学的ステント”として作用することを示唆する。
【０３２６】
例15．ラテックス粒子のカルボン酸官能基へのNR−AN−01抗体の直接的な接合
抗体−被覆されたラテックス粒子（抗体−被覆された、持効性投与形のモデル）を、次の無菌技法を用いて得ることができる：
接合：
0.01％の Tween−20（商標）（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、Sigma)を含む、0.05Ｍの硼酸ナトリウム溶液(pH8.5）４mlに、NR−AN−01モノクローナル抗体５mgを含むPBS 0.5ml を添加する。室温で、この溶液に、１μｍの直径のカルボキシル化されたラテックス粒子50mgを含む水性懸濁液 2.5mlを、振盪しながら添加する。その後すぐに、新しく溶解された１（３−ジメチル−アミノプロピル）３−エチルカルボジイミドHCl 100mg を含む水 0.5mlを添加する。
【０３２７】
次に、その溶液を、室温で１〜２時間、振盪しながらインキュベートする。次に、その反応混合物を、 0.2％ゼラチン安定剤を含む50mMのリン酸緩衝液(pH6.6)(リン酸／ゼラチン緩衝液）50mlにより希釈した。その混合物を、40,000×ｇで２時間、４〜10℃で遠心分離した。上清液をデカントし、そしてペレットを、10秒間の低レベルの音波処理を用いて、50mlのリン酸／ゼラチン緩衝液に再懸濁した。遠心分離をくり返し、そしてペレットを２度、再懸濁し、続いて、リン酸／ゼラチン緩衝液に再懸濁した。次に、接合された粒子を、標準のプロトコル及びソルビトール賦形剤を用いて凍結乾燥せしめる。
【０３２８】
特徴化：
（ａ）分粒：粒子サイズの均等性を、レーザー異方性により評価し、又は１μｍ以上の大きさの粒子に関しては、顕微鏡試験により評価した。
（ｂ）特異的結合の評価：平滑筋細胞への特異的結合を、インキュベーション混合物に含まれる遮断剤タンパク質／ペプチドを伴って、又はそれを伴わないで、接合された粒子と共にタンパク質／ペプチド接合体をインキュベートした後、組織又は細胞ペレットのミクロトームスライスの組織学的試験により測定する。好ましい検出技法は、第２抗体アッセイ（すなわち抗−マウスIg）又は競争アッセイ（すなわち、放射性ラベルされたタンパク質／ペプチド接合体に関するラジオシンチグラフィック検出）を包含する。
【０３２９】
（ｃ）タンパク質／ペプチドの誘導体化の程度の評価：この決定は、放射性ラベルされた抗体によりラテックス粒子を被覆し、続いて、その被覆された粒子に関連する放射能を検出することによって実施される。
抗体−被覆された粒子の特徴化は、下記表７に記載される。
【０３３０】
【表７】
2007075623.tif 000014
【０３３１】
抗体接合の間のpHの粒子凝集効果が表８に示される。
【表８】
2007075623.tif 000015
【０３３２】
それらのデータは、タンパク質又はペプチドが、本発明の持効性投与形と直接的に接合され得ることを示唆する。さらに特定には、末端カルボン酸基を有するポリ−乳酸／グリコール酸粒質物は、本明細書に記載される方法又は他の方法に従って接合され得るであろう。
【０３３３】
引用文献：
１．Popma, J.J. et al. 1990. Factors influencing restenosisafter coronary angioplasty. Amer. J. Med. 88: 16N-24N.
２．Fanelli, C. et al. 1990. Restenosis following coronary angioplasty. Amer. Heart Jour. 119: 357-368.
３．Johnson, D.E. et al. 1988. Coronary atherectomy: Light microscopic and immunochemical study of excised tissue (abstract). Circulation 78 (Suppl.II）: II-82.
４．Liu, M.W. et al. 1989. Restenosis after coronary angioplasty; Potential biologic determinants and role of intimal hyperplasia.Circulation 79: 1374-1387.
５．Clowes, A.W. et al. 1985. Significance of quiescent smooth muscle migration in the injured rat carotic artery. Circ. Res. 56: 139-145.
６．Goldman, B. et al. 1987. Influence of pressure on permeability of normal and diseased muscular arteries to horseradish peroxidase; A new catheter approach. Atherosclerosis 65:215-225.
７．Wolinsky, H. et al. 1990. Use of a perforated balloon catheter to deliver concentrated heparin into the wall of thenormal canine artery. JACC 15(2): 475-481.
８．Nabel, E.G. et al. 1989. Recombinant gene expression invivo within endothelial cells of the arterial wall. Science244: 1342-1344.
９．Middlebrook, J.L. et al. 1989. Binding of T-2 toxin to e ukaryotic cell ribosomes. Biochem. Pharm. 38(18): 3101-3110.
10． Barbacid, M. et al. 1974. Binding of [acetyl-14C] trichodermin to the peptidyl transferase center of eukaryotic ribosomes. Eur. J.Biochem 44: 437-444.
【０３３４】
11． Sclingemann et al. 1990. Am. J. Pathol. 136: 1393-1405.
12． Steele P.M., Chesebro J.H., Stanson A.W., et al. 1985.Balloon angioplasty: natural history of the pathophysiological response to injury in a pig model. Circ. Res. 57: 105-112.
13． Schwartz, R.S., Murphy J.G., Edwards W.D., Camrud A.R., Vliestra R.E., Holmes D.R. Restenosis after balloon angioplasty. A practical proliferative model in porcine coronary arteries. Circulaton 1990; 82: 2190-2200.
14． Bumol, T.F. and R.A. Reisfeld. 1982. Unique glycoprotein-proteoglycan complex defined by monoclonal antibody on human melanoma cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1245-1249.
【０３３５】
本発明の例は、例示のためにのみ示される。本発明の特許請求の範囲からはずれることなく、種々の態様が本発明の範囲内のものと理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０３３６】
【図１Ａ】図１Ａは、細胞表面及び膜に結合される血管平滑筋結合タンパク質を有する24才の男性患者の動脈における血管平滑筋細胞の顕微鏡写真である。患者は、動脈組織が組織学のために調製される４日前、ｉ．ｖ．投与により血管平滑筋結合タンパク質を受けた。
【図１Ｂ】図１Ｂは、細胞表面及び膜に結合される血管平滑筋結合タンパク質を有する24才の男性患者の動脈における血管平滑筋細胞の顕微鏡写真である。その断片は、 HRP−接合されたヤギ−抗−マウス IgGとエクソビボで反応せしめられた。この反応は、４−クロロ−１−ナフトールの添加により可視化された。その基質の反応生成物は、反応部位で不容性紫又は暗カッ色沈殿を形成する（♯２で示されている）。逆染色法を用いて、細胞核を可視化した（♯１で示される）。
【図２】図２は、血管平滑筋結合タンパク質への治療剤の化学的カップリングについての第１のスキームを示す。
【図３】図３は、血管平滑筋結合タンパク質への治療剤の化学的カップリングについての第２のスキームを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、マーカー陽性試験細胞への血管平滑筋結合タンパク質のインビトロでの急速な結合を示す実験データをグラフ的に示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、血管平滑筋細胞への血管平滑筋結合タンパク質のインビトロでの急速な結合を示す実験データをグラフ的に示す。
【図５Ａ】図５Ａは、血管平滑筋細胞がインビトロで24時間処理される場合、低レベルの治療接合体（すなわちRA−NR−AN−01）、及び遊離RA治療剤の所望しない細胞毒性を示す実験データをグラフ的に示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、マーカー陽性及びマーカー陰性細胞の代謝活性に対するRA−NR−AN−01治療接合体の効果を示す実験データをグラフ的に示す。このデータは、インビトロでの24時間の処置において、すべてのそれらの細胞について接合体の所望しない非特異的細胞毒性を示す。その非特異性は、遊離薬物に試験される細胞を暴露する場合、カップリングリガンドの細胞外加水分解に起因する。
【図６Ａ】図６Ａは、代謝活性を試験する前、24時間の処置に続いて、一晩の回復期間が伴ったとしても、その24時間のインビトロ処置の後、マーカー陽性及びマーカー陰性試験細胞に対するPE−NR−AN−01治療接合体の所望しない非特異的細胞毒性を示す実験データをグラフ的に示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、24時間のインビトロ処置の後のマーカー陽性及びマーカー陰性試験細胞に対する遊離治療剤の非特異的細胞毒性を示す実験データを示す。
【図７Ａ】図７Ａは、24時間の代わりに、短い５分間の“パルス”処置、続く〔３Ｈ〕ロイシンへの暴露を示す実験データをグラフ的に示しており、ここで遊離RA治療剤は対照のHT29マーカー陰性細胞に対しては非特異的に細胞毒性であるが、しかし対照的に、RA−NR−AN−01治療接合体はこの“パルス”処置において細胞毒性でない。
【図７Ｂ】図７Ｂは、遊離RA治療剤が、５分の“パルス”処置、続く24時間の回復期間の後においてさえ、対照のHT29マーカー陰性細胞に対して非特異的に細胞毒性であるが、しかし対照的に、RA−NR−AN−01治療接合体は細胞に対して細胞毒性ではないことを示す実験データをグラフ的に示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、RA−NR−AN−01治療接合体によるインビトロでの細胞の“パルス”処置は、タンパク質合成により測定される場合、マーカー陽性Ａ375 細胞において細胞活性を阻害することを示す実験の結果をグラフ的に示す。
【図７Ｄ】図７Ｄは、RA−NR−AN−01治療接合体によるインビトロでの細胞の“パルス”処置が、Ａ375 細胞におけるタンパク質合成が、その細胞がインビトロでの試験の前、一晩の回復期間を可能にされる場合、阻害されなかったので、マーカー陽性細胞における細胞活性に対して長く続く阻害効果を行使しなかったことを示す実験データをグラフ的に示す。
【図８Ａ】図８Ａは、遊離RA治療剤によるインビトロでの細胞の“パルス”処置は非特異的細胞毒性であるが、RA−NR−AN−01治療接合体は、試験の前、48時間の回復期間を可能にされたＢ054 細胞における代謝活性により明らかにされるように、血管平滑筋細胞における細胞活性に対して長く続く阻害効果を行使しなかったことを示す実験データをグラフ的に示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、上記のようにして、但し、第２のマーカー陽性細胞型、すなわちＡ375 を用いての図８Ａに示されるデータに類似する実験データをグラフ的に示しており、ここで前記データは、RA−NR−AN−01治療接合体による“パルス”処置が、試験の前、48時間の回復期間を可能にされたＡ375 細胞における代謝活性により測定されるように、細胞活性に対して長く続く阻害効果を行使しなかったことを示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、上記のようにして、但し、マーカー陰性対照細胞型、すなわちHT29を用いての図８Ａ及び８Ｂに示される結果に類似する結果をグラフ的に示す。その結果は、RA−NR−AN−01治療接合体による“パルス”処置が、試験の前、48時間の回復期間を可能にされたHT29細胞における代謝活性により測定されるように、マーカー陰性対照細胞の細胞活性に対して長く続く阻害効果を行使しなかったことを示す。
【図９Ａ】図９Ａは、動物モデルにおける血管形成の５週間後、処置されていない動脈の組織学的断片における内膜平滑筋細胞増殖による狭窄を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、動物モデルにおける血管形成後５週での治療接合体により処置された動脈の組織学的断片における狭窄の阻害を示す。
【図１０Ａ】図10Ａは、血管平滑筋細胞に関して、スラミンのタンパク質合成及び DNA合成阻害能力を比較する実験データをグラフ的に示す。
【図１０Ｂ】図10Ｂは、血管平滑筋細胞に関して、スタウロスポリンのタンパク質合成及び DNA合成阻害能力を比較する実験データをグラフ的に示す。
【図１０Ｃ】図10Ｃは、血管平滑筋細胞に関して、ニトログリセリンのタンパク質合成及び DNA合成阻害能力を比較する実験データをグラフ的に示す。
【図１０Ｄ】図10Ｄは、血管平滑筋細胞に関して、サイトカラシンＢのタンパク質合成及び DNA合成阻害能力を比較する実験データをグラフ的に示す。
【図１１】図11は、62,500倍に拡大され、そして多くのエンドサイト−シス性小胞（これらのいくつかは、インビトロにおいて細胞により内在化される過程において抗体被覆された金ビーズを含む）により特徴づけられる平滑筋細胞の内面に平行な接線断面を示す。
【図１２】図12は、62,500倍に拡大され、そしてインビトロにおいてビーズへの細胞の暴露に続いて24時間でのリソソームにおける金ビーズの著しい蓄積により特徴づけられる平滑筋細胞を示す。
【図１３】図13は、62,500倍に拡大され、そしてインビボにおいてリソソームにおける金ビーズの蓄積により特徴づけられる平滑筋細胞を示す。
【図１４】図14は、ブタ大腿部動脈の管腔領域に対するサイトカラシンＢの効果のインビボ用量応答研究を示す。
【図２】
2007075623.tif 000016
【図３】
2007075623.tif 000017
【図４Ａ】
2007075623.tif 000018
【図４Ｂ】
2007075623.tif 000019
【図５Ａ】
2007075623.tif 000020
【図５Ｂ】
2007075623.tif 000021
【図６Ａ】
2007075623.tif 000022
【図６Ｂ】
2007075623.tif 000023
【図７Ａ】
2007075623.tif 000024
【図７Ｂ】
2007075623.tif 000025
【図７Ｃ】
2007075623.tif 000026
【図７Ｄ】
2007075623.tif 000027
【図８Ａ】
2007075623.tif 000028
【図８Ｂ】
2007075623.tif 000029
【図８Ｃ】
2007075623.tif 000030
【図１０Ａ】
2007075623.tif 000031
【図１０Ｂ】
2007075623.tif 000032
【図１０Ｃ】
2007075623.tif 000033
【図１０Ｄ】
2007075623.tif 000034
【図１４】
2007075623.tif 000035
【図１Ａ】
2007075623.tif 000036
【図１Ｂ】
2007075623.tif 000037
【図９Ａ】
2007075623.tif 000038
【図９Ｂ】
2007075623.tif 000039
【図１１】
2007075623.tif 000040
【図１２】
2007075623.tif 000041
【図１３】
2007075623.tif 000042
【外国語明細書】
2007075623000001.pdf