(57)【要約】      （修正有）【課題】蛋白質に代表される生体高分子の結晶核の形成及び結晶化の成功率と作業効率を高められる結晶成長方法及び装置を提供する。【解決手段】蛋白質の単結晶を蒸気拡散法等によって結晶成長させる装置において、蛋白質を含有する溶液１を結晶化装置ＡまたはＢの溶液保持部に立体的に保持し、通電用配線１８に電流を通し、蛋白質溶液を局所的に加温と非加温を繰り返すことによって、その個所の過飽和度を変動させ、低過飽和度溶液中でも結晶核の形成を促進する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体高分子の結晶成長装置において、生体高分子を含む溶液を立体的に保持するための保持部を有し、当該保持部には前記生体高分子溶液の所定の部分及びまたは全体を昇温するための加温部が具備されており、前記加温部が加温及び非加温を少なくとも１回行うことによって生体高分子の結晶化を促進させることを特徴とする生体高分子の結晶成長装置。
【請求項２】
溶液保持部が、リング状または逆円錐形である請求項１に記載の生体高分子の結晶成長装置。
【請求項３】
溶液保持部が、絶縁性フイルムを部材とする請求項１または２に記載の生体高分子の結晶成長装置。
【請求項４】
加温部が、ＮｉＣｒ／Ｃｕの金属材料を主体とし、表面に絶縁膜を塗布される請求項１または２または３に記載の生体高分子の結晶成長装置。
【請求項５】
生体高分子の結晶成長装置において、生体高分子を含有する溶液を、局所的に加温及び非加温を少なくとも１回行うことによって、前記加温した溶液の過飽和度を変動させ、生体高分子の濃度が１０ｍｇ／ｍｌ以上３０ｍｇ／ｍｌ以下の低過飽和度溶液中でも結晶核の製造を促進することを特徴とする生体高分子の結晶製造方法。
【請求項６】
溶液保持部材によって囲まれた内側に設けた加温部を備える生体高分子の結晶成長装置の結晶製造方法において、溶液保持部材に保持された生体高分子を含有する溶液の所定の部分だけを、前記加温部を２５℃ないし７０℃以下から選択される温度において１分以上２時間以下の加温し、次いで１分以上２時間以下の非加温することを少なくとも１回行うことによって、結晶核の製造を促進することを特徴とする生体高分子の結晶製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質をはじめとする生体高分子を、凝集、吸着、分離する方法に係り、より詳細には生体高分子を結晶成長させる結晶成長方法、並びに、その方法を実施する結晶成長装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質に代表される生体高分子の三次元立体構造を明らかにすることは、その分子の生体中における生理機能を明らかにできるばかりでなく、合理的な医薬品の開発（ドラッッグデザイン）を進める上でも極めて有用であると考えられている。この生体高分子の三次元立体構造を解析する実用的な手法には、ＮＭＲ（核磁気共鳴）法とＸ線結晶構造解析法とがあるが、解析上分子量に制限が無いＸ線結晶構造解析法が、今後特に有効であると考えられている。
Ｘ線結晶構造解析法では、多結晶や双晶などでは解析が困難なため、単結晶を作製しなければならない。更に、結晶構造解析の分解能などの精度を向上させるために、良質な結晶性の良い単結晶を作製する必要がある。
しかし、この結晶化がボトルネックとなっていて、迅速で高精度の結晶構造解析を妨げているのが実状である。
【０００３】
生体高分子の単結晶作製法としては図１に示すような方法が現在主に採用されている。すなわち、図１の（ａ）、（ｂ）に示す蒸気拡散法と図１（ｃ）に示すバッチ法である。図１の（ａ）と（ｂ）に示す蒸気拡散法では少量の蛋白質を含む水溶液１をガラス板２の下面あるいは溶液保持部１１上に滴下し、さらにリザーバー５の底部には沈殿剤を入れておき、容器を密閉する。これにより蛋白質を含む溶液はやがて前記容器内において過飽和状態となり、この蛋白質を含む溶液中で結晶が析出する。また、図１（ｃ）では蛋白質を含む溶液１と沈殿剤４とを等量ウエル内に分注し、さらにその上部にパラフイン等のオイル５ａを入れて封入する。結晶は蛋白質を含む溶液中で過飽和状態となり析出する。
【０００４】
以上のような従来法は、蛋白質溶液中で偶発的に結晶核の形成と成長が引き起こされるもの（均一核形成反応）である。そのため、結晶化の成功の可否は、数多くの溶液の作製条件、すなわち、蛋白質を溶解させる緩衝溶液の種類、ｐＨ、イオン濃度、初期の蛋白質濃度、更には沈殿剤の種類や濃度など、諸々の条件に左右されてしまう。
また現状では、生化学的特性の異なる個々の蛋白質に対して、有効な結晶化条件をあらかじめ予測した上で結晶化実験を進める手法は確立されていない。そのため、結晶化の初期には、スクリーニングによって結晶化条件を網羅的に探索する方法が一般的に行われている。
【０００５】
一般に、蛋白質の結晶化では、その初期過程において蛋白質溶液中で結晶核が生成され、更にそれが安定して溶液中で一定時間存続することが必須である。
溶液中で蛋白質の結晶核を作製する手段は、従来から様々なものが提案されている。
代表的な方法の一つは不均一核形成法である。これは、固体物質等の表面上で結晶核形成を行う方法であり、化学熱力学的な理由から低過飽和度の溶液条件下での結晶化では、結晶核形成が起こりやすいことが知られている（非特許文献１）。これを蛋白質の結晶成長に適用することも可能である。
【０００６】
また、上記の固体表面での不均一核形成法と原理は異なるが、固体表面の場を利用した蛋白質等の微小粒子の二次元的な結晶成長法が報告されている（特許文献１、非特許文献２）。
この方法は、シリコン等の原子レベルで平滑な固体表面上に蛋白質等の微粒子を、液膜の乾燥時の溶液に対する駆動力を応用して、溶液端部から二次元薄膜として集積化するというものである。
【０００７】
更に、上記の不均一核形成法を利用せずに、外部から集光された高エネルギーでかつ極短パルス幅（フェムト秒程度）のレーザー光を、低過飽和度の蛋白質溶液に照射して結晶核及び結晶を作製する方法もある（非特許文献３〜５）。
【０００８】
蛋白質に代表される生体高分子の結晶核形成及び結晶成長に関しては、以上述べたような方法が提案され、用途に応じて用いられている。
しかし、これら従来技術には、実用上、次のような問題点がある。
（１）  固体基板上に不均一核形成反応を利用して蛋白質の結晶成長を行った場合、結晶は固体表面上に吸着した状態で成長してしまう。従って、サイズの大きな結晶にまで成長させた場合、結晶の下面が基板と密着しているため、結晶を取り出そうとすると、結晶が割れたり結晶内にクラックが入ったりしてしまい、解析に使用できなくなるといった問題が生じる。
（２）  固体基板表面に蛋白質分子の二次元結晶核を成長させる方法の場合、二次元結晶のドメインサイズは大きくできず、更には引き続き乾燥させずに三次元結晶にまで成長させることは不可能である。
（３）  蛋白質溶液にレーザー光を照射する方法は、装置が特殊で大型になるため汎用性が無くなり、更に非常に高価であるため、多くの施設において結晶化に供せられるものではない。また、結晶化の条件は、スクリーニングによりあらかじめ決定された条件の近傍でかつ低過飽和度下で行われなければならず、結晶核形成条件の設定が難しい。
【非特許文献１】Ｗ．  Ｔｉｌｌｅｒ，  "Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ：  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎａ"，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献２】Ｎ．  Ｄ．  Ｄｅｎｋｏｖ  他、Ｌａｎｇｍｕｉｒ，  Ｖｏｌ．８，  Ｎｏ．１２  （１９９２）  ｐ３１８３  "  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｗｏ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｌａｔｅｘ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ"
【非特許文献３】Ｈ．  Ａｄａｃｈｉｔａ他、Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．  ４２，  Ｌ７９８  （２００３）
【非特許文献４】安達宏昭他、日本結晶学会誌  ２９，  ４４５  （２００２）
【非特許文献５】安達宏昭他、日本結晶学会誌  ４６，  ２３８  （２００４）
【特許文献１】特開平９―９２６１７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このように従来の生体高分子の結晶核形成及び結晶成長における技術は非効率的で、労力を多く要するものであった。本発明の目的は、生体高分子の結晶形成及び結晶化の成功率と作業効率を高め、生体高分子の単結晶作成を容易にすることのできる結晶成長装置及びその方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するため、本発明の生体高分子の結晶成長方法は、生体高分子を蒸気拡散法等によって結晶成長させる装置において、生体高分子を含有する溶液を立体的に保持し、局所的に加温と非加温を少なくとも１回行うことによって、前記加温した溶液の過飽和度を変動させ、低過飽和度溶液中でも結晶核の形成を促進し、良質な単結晶を容易に形成することを特徴とする。
なお、過飽和度は温度のみ依存するため、溶液保持部材によって保持された生体高分子を含有する溶液の所定の部分を加温することにより、加温された部分の過飽和度が変動する。
また、生体高分子の低下飽和度溶液の濃度の例としては、１０ｍｇ／ｍｌ以上３０ｍｇ／ｍｌ以下の濃度が挙げられる。
【００１１】
このような方法を実施する本発明の生体高分子の結晶成長装置は、生体高分子を蒸気拡散法等によって結晶成長させる装置において、生体高分子を含む溶液を保持するための保持部を有し、当該部材表面には前記生体高分子溶液の所定の部分及び／または全体を昇温するための加熱部が具備されており、前記加温部が加温と非加温を少なくとも１回行うことによって蛋白質溶液の結晶化を促進させることを特徴とする。
【００１２】
ここで、溶液保持部が、リング状または逆円錐形のほうが好適である。
【００１３】
また、溶液保持部が、絶縁性フイルムの部材を用いたほうが好ましい。
【００１４】
加熱部が、ＮｉＣｒ／Ｃｕの金属材料を主体とするが、表面にも絶縁膜を塗布するほうが好ましい。
【００１５】
また、本発明の結晶製造方法は、溶液保持部材によって囲まれた内側に設けた加温部を備える生体高分子の結晶成長装置の結晶製造方法において、溶液保持部材に保持された生体高分子を含有する溶液の所定の部分だけを、前記加温部を２５℃ないし７０℃以下から選択される温度において１分以上２時間以下の加温し、次いで１分以上２時間以下の非加温することを少なくとも１回行うことによって、結晶核の製造を促進することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によると、低過飽和度の条件下で結晶化が困難な場合でも、生体高分子を立体的に保持した状態で局所的に加温、非加温を繰り返すことによって、良好な単結晶を得ることが可能となる。これにより、今後大量の蛋白質を迅速に結晶化と構造解析を行う必要がある場合および、高分解能の単結晶を作製する必要がある場合には、本発明は非常に有効となることが期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下に、図面を基に本発明の実施形態を説明する。
なお、加温とは溶媒の沸点まで到達しない温度に加熱することを言う。
また、非加温とは加温しないことを言う。
【００１８】
図２は、本発明の結晶化装置Ａの構造図である。
図２に示す本発明の結晶化装置はあらゆる結晶化方法（例えば蒸気拡散法）に適用が可能である。図２（ａ）に示すように、本発明の結晶化装置Ａはフレキシブルな絶縁性フイルムを部材とする溶液保持部１１と配線部１２とから主に構成されている。溶液保持部１１はリング状であり、この部分に蛋白質溶液が表面張力により保持される。ここで、溶液保持部１１は蛋白質溶液が表面張力により保持することができれば、その形状は問わない。また配線部１２は、溶液保持部で囲まれる空間の内部にある加温部１０に電流を供給するために設けられており、配線の種類とサイズにより、配線６，配線７、および配線８とから構成されている。配線６はＮｉＣｒ／Ｃｕの金属材料から成っており、配線７はＮｉＣｒのみから成っている。そして、配線８はＮｉＣｒのみであるが、その線幅が他の配線と比較して非常に細くかつ長くなっており、抵抗あるいは熱抵抗が非常に高くなるようになっている。これにより、配線６に通電した場合、配線８が設置してある加温部１０のみでほとんど発熱することになる。
【００１９】
図２（ｂ），（ｃ）に示すように蛋白質溶液１はリング状の溶液保持部１１に表面張力によって保持されるが、加温部１０が保持された蛋白質溶液のほぼ中央に位置することになる。このため、蛋白質溶液１のほぼ中央部のみが加温部１０により加温されることが期待される。
【００２０】
図３は本発明の別の形態である結晶化装置Ｂの構造図である。図３（ａ）、（ｂ）はそれぞれ断面図と上面図である。本発明の別の形態の装置において、溶液保持部１２ａは逆円錐形に加工されており、その底面には微細な貫通孔１３が形成されている。そしてこの底面にはさらに薄膜配線等により加温部１４が設けられている。結晶化に際しては、上記の逆円錐形に加工されたウエルに蛋白質溶液１を保持し、さらに加温部１４に通電することによって、蛋白質溶液の底面の一部が加温される構造となっている。
【００２１】
図４に本発明の結晶化装置の使用方法を示す。
図４（ａ）  は本発明の結晶化装置Ａの使用法を示している。ウエルプレート３内に本発明の結晶化装置Ａを設置し、リザーバー５には所望の結晶化用沈殿剤４を分注する。結晶化時には溶液の蒸発を防止するために、ウエルの開口上部をテープ２ｂ等でシールを行う。結晶化装置に通電するために、本発明の結晶化装置に接続されている通電用配線１８をウエル外部に導き、図示しない電源から電流を供給する。
図４（ｂ）は本発明の結晶化装置Ｂの使用法を示している。ウエルプレート３内に本発明の結晶化装置Ｂを設置するし、リザーバー５には所望の結晶化用沈殿剤４を分注する。ウエルの開口上部をテープ２ｂ等でシールを行い、結晶化装置に接続されている通電用配線１８をウエル外部に導き、図示しない電源から電流を供給する。
【００２２】
図５に本発明の結晶化装置Ａの一般的な製造方法を示す。結晶化装置Ａの基板として使用されるフイルムは、絶縁性でかつ化学的に安定であり、加工性に優れる素材であればどのようなものでもよく、多用されるものとしてガラス繊維や絶縁性の樹脂フイルム（ポリイミドフイルム）等があげられる。これらフイルムの厚みは、通常は１μｍ〜１００ｍｍ、より望ましくは１０μｍ〜１０ｍｍ程度が良い。
【００２３】
加工方法を図５（ａ）‐（ｉ）のプロセスで示す。図５に示す如く、フイルム９に、蒸着あるいはスパッタリング等により、ＮｉＣｒと  Ｃｕ  の積層薄膜を形成させ、半導体微細加工技術であるホトリソグラフイーにより高寸法精度で加工を行う（ｂ）。これらの膜厚は基板との密着性や電気伝導性等を考慮して決定されるが、通常は１００Å〜１００μｍ、より望ましくは５０００Å程度が良い。形成された金属薄膜は化学エッチングあるいはドライエッチングにより所望の形状に加工される（ｃ）。その後、エッチングされたＮｉＣｒと  Ｃｕの電極をマスクとして、フイルムをドライエッチング等により加工する。これにより所望の形状のフイルムのパターン、即ち図２に示すようなリング状フイルム枠が形成される（ｄ）。さらにフイルム表面に残っているＮｉＣｒと  Ｃｕの電極のうち、電極取り出し部以外の個所にあるＣｕをエッチングにより除去する（ｅ）。また配線部及び加温部のみに所望のパターンが残るようにＮｉＣｒ配線のエッチングを行う（ｆ）。
【００２４】
形成された配線パターンを保護するために、配線の表面に絶縁膜を塗布する（ｇ）。塗布する絶縁膜としてはホトレジスト、感光性ポリイミド等の有機系樹脂が主に用いられる。このような絶縁性樹脂の塗布膜厚としては、通常は１００ｎｍ〜１００ｍｍ、より望ましくは１μｍ〜１０００μｍ程度が良い。その後、電極パッド部の絶縁性樹脂を除去して開口部を設ける（ｈ）。この際に、絶縁性樹脂が感光性であれば開口部はホトリソグラフイーを用いることにより容易に作製できる。
それから、電極パッド部に電解Ｎｉ，  Ａｕメッキを行い電極を形成する（ｉ）。この電極の厚みは電解Ｎｉ，  Ａｕメッキそれぞれ、１０ｎｍ〜１０００μｍ、より望ましくは１００ｎｍ〜１００μｍ程度が良い。
【００２５】
図６は示す本発明の結晶化装置Ｂの裏側にある加温部の製造方法を説明するものである。基板１６は熱伝導性が低く、化学的に安定であればどのような材質のものでも良く、ガラスが多用される。この基板の厚みは加工性や機械的強度を考慮して決定されるが、通常は１〜１０ｍｍ程度でよい。まず基板１７に加温用部材としてＮｉＣｒ薄膜を、さらに導体層としてＣｕ薄膜を形成する（ｂ）。ＮｉＣｒ薄膜やＣｕ薄膜の膜厚は基板との密着性や電気伝導性等を考慮して決定されるが、通常は１００Å〜１００μｍ、より望ましくは１０００〜１００００Å程度が良い。その後、全体が図６の最下段に示すような形状のパターンになるよう、化学エッチングによりこの金属膜をエッチング除去し、Ｃｕのパターン（ｃ）、ＮｉＣｒのパターンをそれぞれ形成し（ｄ）、最後に電極取出部にのみＮｉ，  Ａｕ電極を形成する（ｅ）。
この場合にはマスク蒸着あるいはマスクスパッタリング法によって、電極を形成するのが簡便であり、電極の厚みとしては共に１０ｎｍ〜１０００μｍ、より望ましくは１００ｎｍ〜１００μｍ程度が良い。このようにして作製された裏側加温部は、図６の最下段に示すように貫通部形成予定の場所１３を取り囲むように加温用配線部が形成され、さらに電極取り出し部１８（電極パッド）が周囲に一対形成された構造を有している。
【００２６】
図７は本発明の結晶化装置Ｂの本体部の製造方法を示す。図７において、基板１６の表面にフイルムレジスト１７を貼付し（ｂ）、ホトリソグラフイーにより画像パターンを作製する（ｃ）。その後ダイアモンドブラストにより基板をエッチングし、裏面に貫通孔が形成されるまでブラストを行う（ｄ）。形成される貫通孔１３のサイズは望ましくは１μｍ〜１０ｍｍ、より望ましくは１０μｍ〜１０ｍｍ程度が良い。
【００２７】
<装置製造実施例>
装置製造の具体的な実施例を次に示す。図５に示す製造方法に従って本発明の結晶化装置―１の作製を行った。厚みが５０μｍで１００ｍｍ角サイズのポリイミドフイルムを基板として用いた（ａ）。スパッタリング装置を用いて、ＮｉＣｒとＣｕの積層薄膜をそれぞれ１０００Åと５０００Å形成した（ｂ）。その後、化学エッチングによりこの金属電極をエッチング除去し、図２に示すような形状のフイルム枠を形成した（ｃ−ｄ）。溶液保持部の直径は２ｍｍ、配線１の部分の幅と長さはそれぞれ１ｍｍ，  １０ｍｍ、外枠のフイルム幅は０．１ｍｍであった。また配線２の部分の幅と長さはそれぞれ０．１ｍｍ，  ０．９５ｍｍであった。さらに配線３の部分の直径は０．１ｍｍであった。その後、配線２と配線３の部分に残っているＣｕを化学エッチングにより除去した（ｆ）。さらに配線２と配線３の部分を図２に示すパターンのようにエッチングを行った。エッチング後の配線２と配線３の線幅はそれぞれ８０μｍ，５μｍであった。配線のパターンを形成後、ネガレジストを塗布、乾燥して絶縁保護膜を形成した（ｅ）。膜厚は２μｍであった。なお、この際に電極パッド部を現像・除去して開口しておき（ｈ）電解Ｎｉ，Ａｕメッキを施した（ｉ）。メッキの厚みはそれぞれ１μｍ、３μｍであった。すべてのパターンを形成後、それぞれの装置―１をカッターで切断分離し、２４ウエルプレート内に固定して実験に供した。
【００２８】
図６、７に示す製造方法に従って本発明の結晶化装置―２の作製を行った。厚みが０．７ｍｍで１００ｍｍ角サイズのガラスを基板として用いた（図６ａ）。スパッタリング装置を用いて、ＮｉＣｒとＣｕの積層薄膜をそれぞれ１０００Åと５０００Å形成した（図６ｂ）。その後、化学エッチングによりこの金属電極をエッチング除去し、図６の最下段に示すような形状のパターンを形成した（図６ｃ）。１ユニットのサイズは５ｍｍ角であった。またパッド部のサイズは２ｍｍ角であった。その後、加温部のＣｕ配線をエッチング除去した。なお、加温部の線幅は５μｍであった。配線パターンを形成後、電極パッドとしてマスク蒸着によりＮｉ，  Ａｕ電極を形成した（図６ｄ）。これらの膜厚はそれぞれ１μｍ、３μｍであった。さらに円錐形の開口部を形成するため、加温パターンが形成されたガラス基板（図７ａ）の表面に５０μｍ厚みのフイルムレジストを貼付した（図７ｂ）。ホトリソグラフイーによりパターンを形成後（図７ｃ）、ダイアモンドブラストによりガラスのエッチングを行った（図７ｄ）。このようにして形成された円錐形の開口部のサイズは表面の直径が３ｍｍ，  貫通孔の直径が１００μｍであった。すべてのパターンを形成後、それぞれの装置―２をダイシングソーで切断分離し、２４ウエルプレート内に固定して実験に供した。
【００２９】
図２と図３に示した本発明の結晶化装置を用いた結晶化実験および比較実験を行った。
結晶化用として以下の蛋白質を準備した。蛋白質濃度は最終の過飽和度が変わるようにそれぞれ低濃度から高濃度まで蛋白質ごとに変えて結晶化を行った。また各蛋白質について既知の結晶化条件（沈殿剤濃度）を用いて結晶成長の様子を観察した。なお、比較実験としてシッテイングドロップ蒸気拡散法により同様の条件で結晶化を行った。この比較実験から結晶成長に必要な最低限の過飽和度（下限過飽和度）を求め、この条件付近で加温実験を行った。本発明の結晶化装置を使用する場合には、定電流を１０Ｖ，０〜３０ｍＡと変えて加温のＯＮ／ＯＦＦを１時間おきに２４時間継続して行い、その後は加温を止めて、４日間静置して実験を行った。
リザーバー中の沈殿剤は１ｍＬ、蛋白質と沈殿剤はそれぞれ２μＬを分注・混合した。結晶の観察は、結晶化後５日経過して後に観察を行った。
【００３０】
（１）    ニワトリ卵白由来リゾチーム（分子量：１４ＫＤａ）
標準的な結晶化条件：０．１Ｍ  酢酸Ｎａ  ｐＨ４．６，  １．５Ｍ  ＮａＣｌ
蛋白質濃度：５０ｍｇ／ｍＬ  （０．１Ｍ  酢酸Ｎａ  ｐＨ４．６  で溶解）
（２）ブタ膵臓由来エラスターゼ（分子量：２６ＫＤａ）
標準的な結晶化条件：０．１Ｍ  酢酸Ｎａ  ｐＨ４．６，  ２Ｍ  ＮａＣｌ
蛋白質濃度：３０ｍｇ／ｍＬ  （０．１Ｍ  酢酸Ｎａ  ｐＨ４．６  で溶解）
（３）ウシ肝臓由来カタラーゼ（分子量：２４０ＫＤａ）
標準的な結晶化条件：０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５，１０％  ＰＥＧ６，０００，  ５％  ＭＰＤ
蛋白質濃度：２５ｍｇ／ｍＬ  （０．１Ｍ  リン酸Ｎａ  ｐＨ８．０で溶解）
【００３１】
結晶化実験の各条件と結果を表１、２，３に示す。
表１    ニワトリ卵白由来リゾチームの結晶化条件と結果
【表１】
2007153650.tif 000003
表２    ブタ膵臓由来エラスターゼの結晶化条件と結果
【表２】
2007153650.tif 000004
表３    ウシ肝臓由来カタラーゼの結晶化条件と結果
【表３】
2007153650.tif 000005
【００３２】
これらの結果から、通常の蒸気拡散法において蛋白質濃度が低く低過飽和度下の条件でも適切な局所的加温により、結晶が成長することが判る。これは加温と非加温の効果により、通常は結晶核の形成が起こらない低過飽和度下でも結晶核が誘起され、さらにそれが成長して単結晶にまで成長してゆくことを示唆している。  
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明によると、結晶化が従来は困難であった低過飽和度の条件下でも、良好な単結晶を得ることが可能となった。これにより、大量の蛋白質等の生体高分子を迅速に結晶化して構造解析を行う場合や、高精度の構造解析に使用できる良質な単結晶を作製する場合などに有効であり、用途が広く産業上非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】従来の結晶化方法を説明する図
【図２】本発明の結晶化装置―１の構造を説明する図
【図３】本発明の結晶化装置―２の構造を説明する図
【図４】本発明の結晶化装置の使用方法を説明する図
【図５】本発明の結晶化装置―１の製造方法を説明する図
【図６】本発明の結晶化装置―２の製造方法を説明する図
【図７】本発明の結晶化装置―２の製造方法を説明する図
【符号の説明】
【００３５】
１：蛋白質溶液、２：ガラス板、２ａ：リッド（ふた）、２ｂ：シールテープ、３：ウエルプレート、４：沈殿剤、５：リザーバー、５ａ：パラフィンオイル、６：配線（Ｃｕ配線）、７：配線（ニクロム配線）、８：配線（別種ニクロム配線）、９：フィルム、１０：加温部、１１：溶液保持部、１２ｂ：溶液保持用部材、１３：貫通孔、１４：加温部、１５：円錐形の開口部、１６：ガラス基板、１７：フイルムレジスト、１８：通電用配線。
【図１】
2007153650.tif 000006
【図２】
2007153650.tif 000007
【図３】
2007153650.tif 000008
【図４】
2007153650.tif 000009
【図５】
2007153650.tif 000010
【図６】
2007153650.tif 000011
【図７】
2007153650.tif 000012