(57)【要約】【課題】本願発明は、目的遺伝子の発現ベクターを軸索又は軸索終末付近にから神経細胞に確実に導入させる方法を提供することを課題とする。【解決手段】組換えウイルスベクターを高濃度の塩化ナトリウム含有緩衝液に懸濁させてから注入するというきわめて簡単な操作で、確実に軸索又は軸索終末付近から組み換えウイルスベクターを神経細胞に導入し、導入された目的遺伝子を神経細胞内で従来見られないほどの高能率で発現させることが出きることを見出して、本願発明を完成させた。【選択図】図1
2007020541.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的遺伝子で組換えたウイルスベクターを高濃度の塩を含有する溶液に懸濁した注射液を、ヒト以外の動物の神経細胞が存在する部位に注射し、神経細胞内へ目的遺伝子を導入する方法。
【請求項２】
目的遺伝子で組換えたウイルスベクターを高濃度の塩を含有する溶液に懸濁した注射液を、ヒト以外の動物の軸索又は軸索終末が存在する部位に注射し、軸索又は軸索終末から神経細胞内へ目的遺伝子を導入する方法。
【請求項３】
ウイルスベクターがエンベロープを有さないウイルスベクターである請求項1又は２記載の方法。
【請求項４】
ウイルスベクターが複製能を欠損したアデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターである請求項３記載の方法。
【請求項５】
高濃度の塩が３００mＭ以上の塩化ナトリウム溶液である請求項1-４いずれか1項記載の方法。
【請求項６】
目的遺伝子がレポーター遺伝子である請求項1-５いずれか1項記載の方法。
【請求項７】
ヒト以外の動物がラット、マウスから選択される実験動物である請求項1-６いずれか1項記載の方法。
【請求項８】
目的遺伝子で組換えたウイルスベクター及び高濃度の塩を有効成分として含有する、アクソン近傍から神経細胞へ遺伝子を導入するための、遺伝子導入用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、神経細胞に遺伝子導入する技術分野に関する。さらに、本願発明は、神経細胞の病変に起因するニューロン病の治療薬を開発するためのスクリーニング方法の技術分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
１．神経疾患、精神疾患の遺伝子治療
神経疾患・精神疾患においても遺伝子の異常によることが明らかにされているもの、更に遺伝子異常と疑われているものが、見出されている。例えば、パーキンソン病では、α-synuclein(シヌクレイン)、UCH-1,parkinなどの遺伝子が関与しているものと考えられている。更に、パーキンソン病では、L-dopa の補充療法をより効率を上げるための、対症療法的アプローチとして、ドーパミン合成酵素遺伝子を導入する方法、更にはパーキンソン病の進行を遅らせるためにニューロン保護作用をもつ神経栄養因子の遺伝子を用いる方法などが検討されている。パーキンソン病以外にも、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、ALS、てんかんなどに関与する遺伝子が特定され、遺伝子治療の可能性が検討されている。また、他の神経疾患、精神疾患においても、原因候補遺伝子が特定され始めている。
【０００３】
２．神経細胞への遺伝子導入技術
２−１．ベクター系
ところで、これらの神経変性疾患又は精神疾患を遺伝子治療するためには、神経細胞に遺伝子導入する技術を確立することが必要である。神経細胞への遺伝子導入ベクターが研究開発されてきた。
【０００４】
まずは、他の遺伝子治療に利用されていたウイルスベクターの利用が研究されたが、例えば、レトロウイルスは、細胞分裂後の神経細胞では複製できないため、主として発生学的な研究に限られて用いられた（非特許文献１：EMBO J. 1986 December 1; 5(12): 3133-3142.）。アデノウイルスも、コクサッキーウイルス／アデノウイルス受容体（CAR）を介して、細胞内に侵入するが、CARは胎児期では多くの細胞で発現が見られるものの、成獣においては発現が減少している。そのため、感染効率が悪いとされていた。しかしながら、複製欠損株を用いた組換えアデノウイルスベクターにより、グリア細胞、アストロ細胞、神経細胞に遺伝子導入することが報告され（非特許文献2：Science. 1993 Feb 12;259(5097):988-90。）、更に、例えば、特許文献1では、小脳のプルキンエ細胞又はオリゴデンドロサイトに特異的に発現する神経特異的アデノウイルスベクターが記載されている。
【０００５】
また、組換えアデノ随伴ウイルスを用いて、神経細胞に遺伝子導入することもなされており中枢神経系への局所的な導入に有用なベクターであると報告されている。（Brain Res. 1998 May 18;793(1-2):169-75.）また、パッケージング系を欠損したヘルペスウイルスを用いる系（PRONAS  Vol.87,pp.8950-8954）、さらに、疑狂犬病ウイルスを用いる系も開発されている（Science. 2001 Mar 30;291(5513):2608-13）。
【特許文献１】特開平９−２８３７８号
【非特許文献１】EMBO J. 1986 December 1; 5(12): 3133-3142
【非特許文献２】Science. 1993 Feb 12;259(5097):988-90
【非特許文献３】Brain Res. 1998 May 18;793(1-2):169-75.
【非特許文献４】PRONAS  Vol.87,pp.8950-8954
【非特許文献５】Science. 2001 Mar 30;291(5513):2608-13
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来より、前述したようにウイルスベクターを用いた神経細胞への遺伝子導入は、試みられていたものの、次のような問題があった。
（１）例えば、遺伝子導入しようとする標的細胞が存在する脳領域が個体に非常に重要な領域であるが、遺伝子導入ベクターの注入により脳の神経細胞に損傷を与える可能性がある。又は標的としない他の細胞に遺伝子を混入する可能性がある。このように、標的とする神経細胞は、脳内など直接的に遺伝子を注射することが難しいところに位置していることが多い。ところで、神経細胞は、通常、樹状突起、細胞体、軸索、軸索終末からなっており、ひとつの神経細胞の軸索終末と、他の神経細胞の樹状突起との間でシナプスを形成することにより、神経回路を形成している。細胞体が、遺伝子注射困難な位置に存在しているとしても、軸索終末が注射可能な位置にある場合、例えば、軸索終末付近から神経細胞に遺伝子を注入することにより、神経細胞内に遺伝子導入できる。例えば、筋肉神経は、骨髄から筋肉に達し、軸索終末は筋肉側に存在している。
【０００７】
そこで、本願発明は、目的遺伝子の発現ベクターを神経細胞の軸索又は軸索終末から導入し、神経細胞内で目的遺伝子を確実に導入し、発現させる方法並びにそのための試薬及びキットの開発を第１の課題とする。
【０００８】
（２）神経細胞の軸索終末に遺伝子導入する場合は、神経細胞内での遺伝子発現機構は細胞体に局在していることから、導入遺伝子を、遺伝子発現の場である細胞体へ逆行性輸送により、組換えベクターを軸索(アクソン)又は軸索終末付近から細胞体へ輸送させる必要がある。ところで、現在までのウイルスベクターによる神経細胞への導入は、細胞体への直接の導入が大多数であり、軸索終末からの逆行性輸送の報告は、再現性に乏しいか、特定の神経細胞に限られるものであり、汎用性に乏しいものであった。例えば、前記特許文献1には、アデノウイルスベクター用いて導入された遺伝子であるβガラクトシダーゼ活性は、注入部位に限局されたと記載されており、非特許文献3には、アデノ随伴ベクターを用いた場合も注入部位で形質転換されたが、実際上逆行性輸送はされていないと報告している。
【０００９】
そこで、本願発明は、遺伝子組み換えベクターを軸索又は軸索終末の近傍に注入して神経細胞内に導入し、逆行性輸送により遺伝子組み換えベクターを細胞体などに輸送し、目的遺伝子を発現させ、遺伝子産物を神経細胞内に十分いきわたらせることを目的とする。
【００１０】
（３）最近では、神経細胞の変形と精神疾患との関係が明らかとされている。そこで、神経細胞の詳細にわたり可視化し、これを用いた神経細胞の変形を阻害又は神経細胞の変形を回復する神経疾患治療薬候補のスクリーニング方法の開発を第３の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、種々の条件で、組換えウイルスを神経軸索からの逆行性輸送による発現の検証に勤めたところ、意外にも、組換えウイルスベクターを高濃度の塩化ナトリウム含有緩衝液に懸濁させてから注入するというきわめて簡単な操作で、確実に軸索又は軸索終末付近から組み換えアデノウイルスを神経細胞に導入し、導入された目的遺伝子を神経細胞内で従来見られないほどの高能率で発現させることが出きることを見出して、本願発明を完成させた。
【発明の効果】
【００１２】
本願発明により、効果的に、簡易な手段で、目的とする神経細胞に、目的とする遺伝子を導入することができるようになった。例えば、本願発明により、標的遺伝子の作用を阻害するためのRNAiをコードする遺伝子などを効率的に神経細胞に導入し、異常の原因となる遺伝子の発現を阻害することができるようになる。また、神経細胞の病変の組織学的確認、さらには、神経回路の確認が、本件発明の効果的な遺伝子導入法により、たとえば蛍光遺伝子を導入することにより、従来染色が不十分であった樹状突起の細部までも、明瞭に染色できるようになった。これにより、神経細胞の形態的変化に起因するとされている種々の精神疾患、神経疾患の治療薬及び／又は予防薬の候補化合物のスクリーニングを、神経細胞の形態変化を基準できるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本願発明は、神経細胞への効果的な遺伝子導入法及びそのための組成物に関する。更に本願発明は、神経細胞に、蛍光遺伝子などのレポーター遺伝子を導入することにより、神経回路を明瞭に視覚化する方法を包含する。更に、本発明は、本発明の方法で遺伝子が導入された遺伝子組み換え動物、例えば、蛍光遺伝子などレポーター遺伝子を導入することにより、神経回路を視覚化された実験動物を包含する。
【００１４】
１．神経細胞への効果的な遺伝子導入法
本願発明の神経細胞への効果的な遺伝子導入法は、目的遺伝子で組換えたウイルスベクターを高濃度の塩を含有する溶液に懸濁して、ヒト以外の動物の神経細胞の存在する部位、好適には、アクソン若しくはアクソン終末近傍部位に注入することによる、神経細胞へ目的遺伝子を導入する方法を包含する。また、本願発明で用いるウイルスベクターとしては、好適には、細胞内への侵入が、エンドサイトーシス後の膜融合によるものではなく、そのまま細胞膜を通過する、エンベロープを有さない組換えウイルスベクターが挙げられる。本願発明で用いるエンベロープを有さないウイルスベクターとしては、パポバウイルス(Papovavirus)、デンソウイルス（Densovirus）、エンテロウイルス（Enterovirus）、カリシウイルス(Calicivirus)などのウイルスベクター、好適には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴性ウイルスベクターを挙げることができる。
【００１５】
１−１．ウイルスベクターの構築
アデノウイルスとしては、５型又は２型のアデノウイルスを用いることができ、好適には複製能を欠損させたものが好ましい。具体的には、５型のアデノウイルスの複製に必要な領域であるE1a及びE1bを欠失させたものをあげることができ、好適には、さらにE3領域も欠失させたものをあげることができる。このような欠損アデノウイルスは、例えば、神経細胞への導入目的遺伝子の両側にアデノウイルス由来配列を有する組換えプラスミドと、アデノウイルスを、細胞において共感染させ、相同組換えにより調整させることができる。また、最近では、Cre−Lox系を用いて、組み込みを簡易化された複製能欠損アデノウイルスベクタープラスミドも開発されており、これらを利用することもできる。欠損組換えアデノウイルスは、例えば、ヒト胎児の腎臓細胞株２９３細胞（J.Gen.Virol.Vol.36,p.59）又はCRIP株に、前記プラスミドを感染させ増殖させ組換え感染性ウイルスとして回収し、塩化セシウム密度遠心勾配で精製し濃縮することができる。
【００１６】
得られた複製能欠損組換えウイルスは、例えば、1X１０７pfu/ml以上、好適には、1X１０９pfu/ml、更に好適には、１X１０１２pfu/mlとして用いることができる。
【００１７】
アデノ随伴ウイルスは、1本鎖DNAウイルスで、その増殖には、アデノウイルスやヘルペスウイルスの重感染を必要としている。染色体に組み込まれるウイルスベクターであることから、長期間の発現を必要とする遺伝子治療の候補である。
【００１８】
目的遺伝子としては、神経細胞内で発現させようとする任意の遺伝子、又は神経細胞内に存在する遺伝子であってその発現を低減させようとする遺伝子に対するRNAiを引き起す、例えば、siRNA を発現させることができる遺伝子などをあげることができる。
【００１９】
神経細胞内で発現させる遺伝子としては、AP (アルカリフォスファターゼ)、GFP,LacZなどをあげることができる。また、これら、目的遺伝子は、適宜なプロモーターの制御下におくことができ、好適には、神経細胞特異的なプロモーター、具体的には、プロモーターとしてシナプシンを用いることもできる。
【００２０】
１−２．高濃度の塩溶液
塩としては、1価の金属塩のハロゲン化合物が望ましく、具体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウムが上げられる。塩の濃度としては、好適には、３００mＭ以上、さらに好適には、６００mＭ程度から１０００mＭ程度の範囲内をあげることができる。
【００２１】
１−３．高濃度の塩溶液に懸濁された組換えウイルスの動物への注入
高濃度の塩溶液に懸濁された組換えウイルスの動物への注入量としては、0.5μl以上、好適には、1.5μｌを注入する。脳へ注入する場合であれば、脳定位固定装置を用い、ハミルトンシリンジで、同じ速度で時間をかけ、例えば10分間で、脳に注入することができる。動物としては、任意の動物に適用できるが、好適には、実験動物、更に好適には、成獣ラット、成獣マウスに適用できる。
【００２２】
注入箇所としては、標的となる細胞の細胞体、樹状突起が存在する部位はもちろんのこと、本願発明の方法では、特に、標的となる神経細胞からの軸索が延びている領域、軸索末端領域に注入することもできる。既に神経回路について非常によく研究されており、標的のなる神経細胞の細胞体からの軸索がどの位置に投射されているかも知られており、これらに従い注入位置を選択することができる。たとえば。注入部位は大脳皮質に関してはprelimbic area (Bregmaから吻側+2.2 mm, 側方+0.5 mm, 脳表面から-4.0 mm)、海馬に関してはCA1領域（Bregmaから吻側-4.16 mm, 側方+2.0 mm, 脳表面から-3.0 mm）、視床に関してはPosterior thalamic nucleus (Bregmaから吻側-4.16 mm, 側方+2.0 mm, 脳表面から-5.1 mm)の位置に注入部位とすることもできる。また、筋肉細胞近辺に存在する軸索、軸索終末に注射することもできる。
【００２３】
Plelimbic area(PrL)と連絡を作っている部位は帯状皮質、島皮質、視床（背側内側核）、海馬（CA1）、二次視覚野、内嗅皮質、鼻周囲皮質が主な領域であり、これらについては連絡されていることが本方法により確認出来た。CA1領域と連絡を作っている部位は内嗅皮質、鼻周囲皮質が主な領域であり、これらについては連絡されていることが本方法により確認出来た。Posterior thalamic nucleusと連絡を作っている部位は大脳皮質の第５層aと第６層が主な領域であり、これらについては連絡されていることが本方法により確認出来た。
【００２４】
注入された組換えアデノウイルスは、高頻度で、神経細胞に感染し、神経細胞内で遺伝子を発現させることができる上、遺伝子注入に伴う細胞への障害は見られない。
【００２５】
１−４．試薬及びキット
本願発明には、神経細胞への目的遺伝子を導入するための、上記目的遺伝子を組み込んだ組換え発現ウイルス、例えば目的遺伝子組み換えウイルスベクター、を高濃度の塩溶液に懸濁した注射液、又は試薬も包含される。
【００２６】
さらに、本願発明には、そのような注射液を調製するための（１）上記目的遺伝子を組み込んだ組換え発現ウイルス、及び（２）高濃度の塩を含有する緩衝溶液を含むキットも含まれる。具体的には、（１）目的遺伝子を組み替えたアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、（２）３００mmＭ以上、好適には、６００mＭから１MのNaClを含有する緩衝液、たとえば、６００mＭのNaClを含有するリン酸バッファー、を含むキットも含まれる。
【００２７】
２．本願発明は、レポーター遺伝子を組み込んだウイルスベクター又はレポーター遺伝子を含む核酸を高濃度の塩を含有する溶液に懸濁して、ヒト以外の動物の神経細胞の存在部位、好適にはアクソン又はアクソン終末近傍に注入することによる、神経細胞へレポーター遺伝子を導入し、神経細胞を可視化する方法を包含する。
【００２８】
具体的には、レポーター遺伝子として、大腸菌βガラクトシダーゼ（LacZ）、又は緑色蛍光蛋白質（GFP）、若しくは高性能緑色蛍光蛋白質(EGFP)をコードする遺伝子を上げることができる。
【００２９】
使用することができる組換えウイルスベクター、高濃度の塩、及び高濃度の塩溶液に懸濁された組換えウイルスの動物への注入については、それぞれ、上記１．神経細胞への効果的な遺伝子導入法に準じて行うことができる。
【００３０】
本発明の方法で、レポーター遺伝子を神経細胞に導入することにより、発現したレポーター分子が、神経細胞の隅々まで行渡るので、従来は、検出が難しかった、樹状突起の突起部分の詳細にいたるまで、簡単に確認することができる（図２参照）。
【００３１】
３．神経細胞の変形を阻害又は神経細胞の変形を回復する神経疾患治療薬候補のスクリーニング方法
本願発明の方法で、EGFP遺伝子等のリポーター遺伝子を神経細胞に導入された実験動物は、樹状突起の変形が関与する神経疾患・精神疾患の治療薬候補のスクリーニングに使用することができる。
【００３２】
例えば、神経細胞の形態が変形していることが知られているハンチントン病病態モデルマウス（J.Neurophysiology  Vol.86,pp.2667-2677）を用いて、神経細胞にEGFP遺伝子を導入し、ハンチントン病治療薬候補を神経細胞の変形を回復させる程度により、例えば、変形の程度が対照に比較し回復しているものを、ハンチントン病治療薬候補として選抜することができる。
【実施例１】
【００３３】
１．シナプシン-EGFPのフラグメントの調製
オーバーラップエクステンションPCR法によりシナプシン-EGFPのフラグメントを作成した。具体的にはシナプシン（マウス  Bac cloneよりシナプシンの開始コドンより上流５００bpを用いた）、EGFP(クロンテックから購入)各々を下記のプライマーでPCRを使って増幅した。Syn, 5’- TAAGCTTCGTGGGAGGGAGTTTCGTT-3’ and 5’-TGCTCACCATGGTGGCGGCGTGGGGCAGGG-3’; EGFP, 5’-CGCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’ and 5’-GAGGTTGATTTATGGCTGATTATGATCTAG-3’
【００３４】
これらPCR産物を電気泳動で精製し、各々10 ngを次のオーバーラップエクステンションPCRに用いた。Synapsin-EGFPの融合DNAフラグメントを得るために各PCR産物をPCRチューブに混ぜ、Syn, 5’- TAAGCTTCGTGGGAGGGAGTTTCGTT-3’ とEGFP, 5’-GAGGTTGATTTATGGCTGATTATGATCTAG-3’（Synapsin-EGFPの融合DNAの両端のプライマー）を用いて、PCRを行なった。
【００３５】
２．シナプシン-EGFPのフラグメント組換えヒトアデノウイルスベクター
調製されたシナプシン-EGFPのフラグメントをBD Biosciences(BD adeno-X Expression system 1 Cat.No. 631513)から購入したヒトアデノウイルス５型に導入したプラスミドを作成した。このプラスミド5マイクログラムをPacIで制限酵素処理をし、エタノール沈澱した後に水で溶かした。次にプロトコールどおりにHEK293細胞にリン酸カルシウム法によりトランスフェクションするためにAmersham Biosciences社のCellPhect Transfection kit(Cat. No. 27-9268-01)を用いた。制限酵素処理されたプラスミドを0.12 mlの水に溶かし、0.12 mlバッファーA（上記kit付属）をこれに加え、10分後に0.24 mlバッファーB（上記kit付属）をこれに加え20分待ち、HEK293細胞に培養皿に加え、培養皿を軽く振る事で、まんべんなくDNAが行き渡るようにした。この2週間後に培養液と細胞の懸濁液をファルコンチューブに移し、freeze and thow  3回行ない、細胞を粉砕した。その後、3000rpm 10分の遠心で、上清を採取し、一次ウイルス液を得た。このウイルス液をHEK293に感染させて、高タイターの液（５〜７回ウイルス感染した）109PFU/mlのウイルス液を得た。その後、イオン交換膜 (Virapur社, Cat. No.003058)もしくはCsCl密度勾配法(Kanegae et.al., 1994)によりアデノウイルスを精製した。イオン交換膜での方法はウイルス液10 mlに対して、バッファーAを10 ml加え、これをイオン交換膜にアプライした。その後、バッファーBでイオン交換膜を洗い、最後に400 マイクロリットルのバッファーC（上記kit付属）で抽出した。CsCl密度勾配法はまず3つの溶液を用意する。2.2 M CsCl in 10 mM HEPES (pH 7.4) 、4.0 M CsCl in 10 mM HEPES (pH 7.4) 、飽和 CsCl in 10 mM HEPES (pH 7.4).まず超遠心チューブに 4.0 M CsCl 10 ml, 2.2 M CsCl 10 mlを加え、そこに高タイターのウイルス20 mlを加え、26,000rpmで2時間ベックマンの遠心機で遠心した。次に遠心されたチューブからウイルスバンドのみを取り、このサンプルに倍量の飽和CsClを加えて、遠心チューブに入れた。その後、4.0 M CsCl 2 ml, 2.2 M CsCl 3 mlを加え、35,000rpmで3時間遠心した。遠心されたチューブからウイルスバンドのみを取り、次の透析へと移った。ウイルス液を透析する事でバッファー交換し、最終的に150,600,又は1000 mMのNaCl/50mM Tris-HCl (pH 8.1) のバッファーに溶けた1012(PFU/ml)のアデノウイルス液を作成した。
【００３６】
３．アデノウイルスベクターの成獣ラットへの注入、試料の染色
このアデノウイルス液を成獣ラットの大脳皮質、海馬、視床（注入部位は大脳皮質に関してはprelimbic area (Bregmaから吻側+2.2 mm, 側方+0.5 mm, 脳表面から-4.0 mm)、海馬に関してはCA1領域（Bregmaから吻側-4.16 mm, 側方+2.0 mm, 脳表面から-3.0 mm）、視床に関してはPosterior thalamic nucleus (Bregmaから吻側-4.16 mm, 側方+2.0 mm, 脳表面から-5.1 mm)の位置に注入部位を作成した。）にハミルトンシリンジで注入した。1-2週間後にラットを4％パラホルムアルデヒドで固定した。ラット脳を30％スクロースに一晩浸透させ、マイクロトームで60 μmの厚みの切片を作成した。切片は1 μg/mlのウサギ抗EGFP抗体（0.25％トリトンX100、1％ヤギ血清/PBS）で一晩浸透し、PBSでリンス後、Alexa488付きの抗ウサギ抗体で2時間浸透した。
【００３７】
４．結果
その結果、図１でも分かるように右側の注入部位でEGFP（緑色）の発現が強く観察出来る。これは注入部位でアデノウイルスが感染したという証拠である。次に注入部位反対側（左側）を観察すると150 mM NaCl（細胞外液の濃度）ではEGFPを発現している細胞が疎らに観察出来たが、高濃度の塩を含んだウイルス液を注入したサンプルではEGFP陽性細胞が顕著に多く観察出来た。この結果は他の注入部位でも同様の結果を得ている。
【００３８】
また、図３より、Plelimbic area(PrL)と連絡を作っている部位は島皮質、視床（背側内側核）、海馬（CA1）、二次視覚野、内嗅皮質、鼻周囲皮質が主な領域であるところ、島皮質、視床（背側内側核）、海馬（CA1）、内嗅皮質、及び鼻周囲皮質ついてEGFPの発現が確認出来た。
【００３９】
更に図４により、CA1領域と連絡を作っている部位は内嗅皮質、鼻周囲皮質が主な領域であり、内嗅皮質ついてもEGFPの発現が確認出来た。
【００４０】
また、図２により、Posterior thalamic nucleusと連絡を作っている部位は大脳皮質の第５層aと第６層が主な領域であり、これらについてもEGFPの発現が確認出来た。
【００４１】
上記いずれの結果は一般的に使われている逆行性トレーサーと同様の結果のため、組換えウイルスベクターは軸索又は軸索終末から取り込まれたと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】成獣ラットの大脳皮質にEGFP組換えアデノウイルスベクター（１５０mＭ,６００mＭ、又は１０００mＭのNaClを含有する50mM Tris-HCl (pH 8.1) のバッファーに溶けた1012(PFU/ml)の組換えアデノウイルス液）を右側に注入し、切片中のEGFPの発現をウサギ抗EGFP抗体Alexa488付きの抗ウサギ抗体で確認した。
【図２】視床にEGFP組換えアデノウイルスベクター（600 mMのNaCl/50mM Tris-HCl (pH 8.1) のバッファーに溶けた1012(PFU/ml)の組換えアデノウイルスベクター）を注入した例。A中で枠組みされている部分の拡大写真がBである。B中で枠組みされている部分の拡大写真がCである。C中の、a,b,c,d,e,及びfで示される枠組みされた部分が、それぞれ拡大され、Cの右横に掲げられている。
【図３】EGFP組換えアデノウイルスベクター（600 mMのNaCl/50mM Tris-HCl (pH 8.1) のバッファーに溶けた1012(PFU/ml)の組換えアデノウイルスベクター）を、Plelimbic area(PrL)に注入した例。連絡を作っている部位は帯状皮質、島皮質、視床（背側内側核）、海馬（CA1）、二次視覚野、内嗅皮質、鼻周囲皮質が主な領域であり、島皮質、視床（背側内側核）、海馬（CA1）、内嗅皮質、及び鼻周囲皮質についてEGFPの発現を確認出来た写真を示す。
【図４】EGFP組換えアデノウイルスベクター（600 mMのNaCl/50mM Tris-HCl (pH 8.1) のバッファーに溶けた1012(PFU/ml)の組換えアデノウイルスベクター）を、CA1領域に注入した例。連絡を作っている部位は内嗅皮質、鼻周囲皮質で、内嗅皮質にEGFPの発現が確認できた写真を示す。なお、右側の写真は、左側の写真中の囲み部分の拡大写真である。
【図１】
2007020541.tif 000003
【図２】
2007020541.tif 000004
【図３】
2007020541.tif 000005
【図４】
2007020541.tif 000006
【配列表】
2007020541000001.app