(57)【要約】      （修正有）【課題】ポリケチド化合物を産生する渦鞭毛藻由来のポリケチド合成酵素遺伝子を提供する。【解決手段】Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ属の渦鞭毛藻からクローニングした、下記のａ）またはｂ）から選ばれるＤＮＡａ）特定な配列で表される核酸配列からなるＤＮＡ；ｂ）特定な配列で表される核酸配列の１以上の塩基が欠失、置換もしくは付加された核酸配列からなり、かつポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）を発現することのできるＤＮＡの提供。本発明のＤＮＡは、既知のＰＫＳに共通する特徴である活性ドメイン構造を一定の順序で有する蛋白質をコードしている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のａ）またはｂ）から選ばれるＤＮＡ
ａ）配列番号１に表される核酸配列からなるＤＮＡ；
ｂ）配列番号１に表される核酸配列の１以上の塩基が欠失、置換もしくは付加された核酸配列からなり、かつポリケチド合成酵素を発現することのできるＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡを含む組み換えベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Amphidinium属の渦鞭毛藻からクローニングしたポリケチド合成酵素遺伝子を含む約36kbのＤＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
渦鞭毛藻と称される微生物は、興味深い化学構造や生物活性を有する化合物を生産する生物資源の一種である。特に、扁形動物の体内から分離されたAmphidinium属の数種の渦鞭毛藻が、動物細胞に対し抗腫瘍性を示すマクロライド系化合物であるAmphidinolide類を産生するという事実（非特許文献１）から、渦鞭毛藻はいわゆるポリケチド化合物を産生することのできる生物種として、近年注目を集めている。
【０００３】
ポリケチド化合物は、主に放線菌、糸状菌、植物などから生産される二次代謝産物の総称名である。代表的な化合物としては、テトラサイクリンやエリスロマイシンなどの抗生物質、ダウノマイシンなどの抗ガン剤、ＦＫ５０６、ＦＫ−５２０、ラパマイシンなどの免疫抑制剤、モネンシンやアベルメクチンなどの獣医学用薬物が知られている。特に、ある種の渦鞭毛藻が産生するAmphidinolide類は、動物実験において強い抗腫瘍活性を示す、従来の抗腫瘍剤とは異なった化学構造を有するポリケチドであり、新しい作用機序を持った抗腫瘍剤のリード化合物として期待されている。
【０００４】
ポリケチド化合物は、酢酸などの低級脂肪酸を基に、２個の炭素原子を一単位とした炭素アシル鎖の伸張反応を中心とした一連の縮合反応および修飾反応を通じて生合成される、化学構造的に多様な化合物を包含する。この炭素アシル鎖の伸長過程では、基本的には（１）アシル基転移、（２）縮合、（３）ケト還元、（４）脱水ならびに（５）エノイル還元の５つの基本反応が行われることが明らかにされている。このうち、（１）アシル基転移と（２）縮合はポリケチド化合物の生合成に必須の反応ステップとして理解されているが、その他の反応である（３）ケト還元、（４）脱水ならびに（５）エノイル還元は必ずしも必須ではなく、むしろこれらの幾つかを欠くことが、ポリケチド化合物の化学構造に多様性をもたらす一員となっていると理解されている。
【０００５】
このポリケチド化合物の生合成に関する一連の反応は、Ｉ型とＩＩ型とに大別されるポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）と呼ばれる酵素によって触媒される。Ｉ型（モジュラー型とも呼ばれる）ＰＫＳは、エリスロマイシンのような１２員環、１４員環または１６員環マクロライド抗生物質の生成に関与している酵素であり、糸状菌ならびに放線菌でその存在が確認されている。これまで糸状菌からクローニングされたＰＫＳ遺伝子としては、Aspergillusterreusの６−メチルサリチル酸合成 酵素（非特許文献２）、Aspergillus  nidulansの胞子色素合成酵素ＷＡ（非特許文献３）、その他がある。
【０００６】
Ｉ型ＰＫＳは、一つの酵素蛋白質がポリケチド化合物の生合成に関与する複数の反応を触媒する、多機能型酵素であり、各反応に必要とされる活性中心を含むドメインを１つのポリペプチド上に持つ（非特許文献４）。例えば、放線菌のＩ型ＰＫＳは、１単位のアシル鎖伸長反応を触媒するために必要なケトアシル合成酵素（ＫＳ）ドメイン、アシル基転移酵素（ＡＴ）ドメイン、デヒドラターゼ（ＤＨ）ドメイン、エノイル還元酵素（ＥＲ）ドメイン、ケト還元酵素（ＫＲ）ドメイン、およびアシルキャリアープロテイン（ＡＣＰ）ドメインなどが並ぶモジュールと呼ばれる単位を有し、このモジュール単位がさらに複数存在する構造（モジュール型構造）を有している。Ｉ型ＰＫＳによって生合成されるポリケチド化合物の構造的多様性は、これらのＰＫＳ中の活性ドメインの数及び種類の多様性に依存していると考えられている。
【０００７】
これに対してＩＩ型（反復型とも呼ばれる）ＰＫＳは、前述の各酵素活性を担う酵素蛋白質が１つずつ独立に存在し、これらの酵素が複合体を形成して機能すると考えられている（非特許文献５）。
【０００８】
化学合成的な方法論により産業的に有望なポリケチド化合物を製造することは、その化合物自体の広範かつ複雑な化学構造故に極めて困難であり、また、野生型の生物細胞を用いた生物学的なポリケチド生産もまた、野生型細胞の低いポリケチド生産能を考えると、有効な手段であるとは言い難い。そのため、特に遺伝子工学的に改良された生物細胞を用いたポリケチド化合物の製造技術の開発が望まれている。
【０００９】
渦鞭毛藻に関しては、放線菌や粘菌に由来するポリケチド合成酵素のＫＳドメインに共通して保存されているアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドを用い、渦鞭毛藻のｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてPCRを行うことにより、既知のＫＳドメインをコードする遺伝子の部分配列と相同性を持つDNA断片が増幅されることが報告されている（非特許文献６）。しかし、渦鞭毛藻由来のポリケチド合成酵素に存する他の活性ドメインに関する配列情報、ポリケチド合成酵素全体をコードするＤＮＡ、あるいはポリケチド化合物の化学構造修飾に関与する酵素蛋白質をコードするＤＮＡについては、何の情報も得られていない状況にある。
【００１０】
【非特許文献１】Kobayashiら、2002年、Amphidinolides, Bioactive Macrolides from Symbiotic Marine Dinoflagellates. Nat. Prod. Rep. 第21巻、第77-93頁
【非特許文献２】Fujiiら，1996年、Mol.  Gen.  Genet.,  第253巻，第１-10頁
【非特許文献３】Mayorgaら、1992年、Mol.  Gen.  Genet.,  第235巻、第205-212頁
【非特許文献４】MacNeil,D.J.ら、Gene、1992年、第115−119頁
【非特許文献５】Fernandez-Moreno,M.A.ら、J.Biol.Chem.、1992年、第267−278頁
【非特許文献６】Snyder, R. V.ら、2003年、Polyketide  Synthase  Genes  from  Marine  Dinoflagellate. Mar. Biotechnol. 第5巻、第1-12頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、新しい作用機序を持った抗腫瘍剤のリード化合物として期待されるAmphidinolide類を産生する渦鞭毛藻の一種である、Amphidinium sp.（Y-42株）から、Amphidinolide類の生合成に関与するＰＫＳをコードする遺伝子（ＰＫＳ遺伝子）をクローニングすることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、渦鞭毛藻の一種であるAmphidinium sp.（Y-42株）のゲノムから、縮重プライマーを用いたＰＣＲ法によって、ＰＫＳ遺伝子を含むｃＤＮＡのクローニングに成功し、以下に記載の本発明を完成した。
【００１３】
１） 下記のａ）またはｂ）から選ばれるＤＮＡ
ａ）配列番号１に表される核酸配列からなるＤＮＡ；
ｂ）配列番号１に表される核酸配列の１以上の塩基が欠失、置換もしくは付加された核酸配列からなり、かつＰＫＳを発現することのできるＤＮＡ。
【００１４】
２）１）に記載のDNAを有する組み換えベクター。
【発明の効果】
【００１５】
渦鞭毛藻由来のＰＫＳ遺伝子を含むｃＤＮＡの提供は、かかるｃＤＮＡを利用したポリケチド化合物を多量に生産する変異細胞やポリケチド化合物の誘導体を生産する変異株の作製を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
(AmpY42PKSの構造的特徴)
本発明のＤＮＡは、配列番号１に示す塩基配列からなり、渦鞭毛藻由来のＰＫＳを発現することのできる全長約３６ｋＤａのｃＤＮＡ（以下、AmY42PKSと称する）である。
【００１７】
配列番号１の塩基配列について、６通りのフレーム（アミノ酸読み取り枠）でアミノ酸情報に翻訳し、それぞれについてBLASTによるホモロジー検索を行なった結果、AmY42PKSは６つのエキソン（エキソン１〜６）を含んでいることが明らかとなった。さらに、各エキソンにコードされているアミノ酸配列と他の微生物由来の既知のＰＫＳのアミノ酸配列との相同性を相同性検索プログラムBLASTを用いて確認したところ、以下のような関係が確認された。
【００１８】
エキソン１−配列番号１の13911番目から14627番目
Stigmatella aurantiaca由来のStiG
（Protein ID CAD19091：ＰＫＳのＫＳドメイン）と52％
エキソン２−14587番目から15816番目
Stigmatella aurantiaca由来のStiA
（Protein ID CAD19085：ＰＫＳのＫＳドメイン及びＡＴドメイン）
と51％
エキソン３−配列番号１の15818番目から16972番目
Nocardia farcinica IFM 10152由来のPutative PKS
（Protein ID YP_120537：ＰＫＳのＡＴドメインおよびＤＨドメイン）
と44 ％
エキソン４−配列番号１の20908番目から22746番目
Polyangium cellulosum由来の EPOS C
（Protein ID AAF26921：ＰＫＳのＫＲドメインおよびＡＣＰドメイン）
と44 ％
エキソン５−配列番号１の23733番目から24074番目
Planktothrix agardhii由来のMcy T
（Protein ID CAD29792：typeII thioesteraseドメイン）と54％
エキソン６−配列番号１の24508番目から24924番目
Nonomuraea sp. ATCC39727のORF36
（Protein ID CAD91231：thioesteraseドメイン）と44％
この様に、AmY42PKSは、既知のＰＫＳについてその存在が報告されている活性ドメインであるＫＳドメイン、ＡＴドメイン、ＤＨドメイン、ＫＲドメイン、ＡＣＰドメインに加え、typeII thioesteraseドメインならびにthioesteraseドメインとそれぞれ相同性の高いアミノ酸配列をコードするエキソン領域を、この順序で有していることが明らかとなった。
【００１９】
Ｉ型ＰＫＳにおける活性ドメインの出現順序は、これまでに報告されている殆ど全てのＩ型ＰＫＳで保存されていることが知られている。すなわち、必要とされる活性ドメインが１つのモジュール内に全て存在する場合、そのモジュール内のＮ末端からＣ末端までの活性ドメインの順序は、常にＫＳ、ＡＴ、ＤＨ、ＥＲ、ＫＲ、ＡＣＰとなる。あるモジュールでは、いくつか活性ドメインが失われている場合があるが、その様な場合でもモジュール内に存在する活性ドメインの順序は、報告された殆どの事例で同一である。
【００２０】
一方、AmY42PKSには、ＫＳ、ＫＳ、ＫＳ、ＡＴ、ＤＨ、ＫＲならびにＡＣＰの各活性ドメインが、この順序で存在している。従って、本発明のAmY42PKSは、既知のＩ型ＰＫＳに認められる活性ドメインの種類と出現順序に関する特徴を備えており、渦鞭毛藻由来のＰＫＳをコードする遺伝子を含んでいると言うことができる。
【００２１】
また後述するように、Amphidinolideを生産する渦鞭毛藻であるAmphidinium sp.（Y-42株）から調製したゲノムＤＮＡに対して、AmY42PKSに対して特異的にハイブリダイズする配列からなるプライマーDNAを用いたPCRを行うとポジティブバンドが観察される一方、Amphidinolide類の生産が確認されていない渦鞭毛藻から調製したゲノムDNAについては、同様の操作を行ってもポジティブバンドは観察されなかった。さらに、Y-42株から調製した全ｍＲＮＡに対して、同プライマーDNAを用いたRT-PCRを行うとポジティブバンドが観察された。従って、AmY42PKCは、Amphidinolide類の生合成に関与する酵素である渦鞭毛藻由来のＰＫＳをコードする遺伝子を発現可能に含むｃＤＮＡであると推察される。
【００２２】
なお、配列番号１に示される塩基配列において、１以上の核酸が欠失、付加あるいは置換されることによって、配列番号１に示された塩基配列とは異なる配列とはなっても、かかる配列からなるＤＮＡがＰＫＳを発現し得るＤＮＡである限り、本発明に含まれると解されるべきである。この様な変異ＤＮＡとしては、例えばエキソン１〜６にコードされるアミノ酸配列に変化を与えない範囲もしくはＰＫＳ活性を失わない範囲でエキソン中の塩基配列が変異したＤＮＡや、配列番号１に示された塩基配列からイントロンと想定される部分が欠失したＤＮＡなどを挙げることができる。
【００２３】
特に、かかる変異ＤＮＡとしては、ストリンジェントなハイブリダイズ条件で、配列番号１に示される塩基配列を有し、ＰＫＳを発現することのできるＤＮＡが好ましい。ストリンジェントな条件の設定は、温度、イオン濃度などの条件を考慮して当業者が適宜決定することができるが、典型的には、ハイブリダイゼーション後に50℃の6×SSC、5×Denhardt's、0．1％SDS、25℃ないし68℃中でメンブレンを洗浄する条件（1×SSCは0.15M NaCl、0.015M クエン酸ナトリウムである）のサザンハイブリダイゼーションで、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡにハイブリダイズする程度であればよい。
【００２４】
(AmpY42PKSの調製)
本発明のAmY42PKCは、渦鞭毛藻から調製したゲノムｃDNAライブラリーを基に、配列番号１に示された塩基配列あるいはその部分配列からなるDNAをプローブとしたハイブリダイゼーション法や、適当な長さを持つ部分配列をプライマーとしたPCR法等を利用し、下記の段階を経て入手することができる。
【００２５】
１）ゲノムＤＮＡライブラリーの作製
渦鞭毛藻からのゲノムＤＮＡの抽出は、Sambrookら（MOLECULAR  CLONING：A  LABORATORY  MANUAL，３rd  edition  （2001））の方法に準じて行うことができる。具体的には適当な培地で培養した藻を緩衝液中、ＳＤＳ及びプロテアーゼＫで処理して破壊し、フェノール／クロロホルムを加えて遠心分離を行う。上澄を回収し、３Ｍ酢酸ナトリウムと冷エタノールを加え、析出したゲノムDNAを回収することができる。
【００２６】
回収したゲノムDNAからは、さらに適当な制限酵素で切断してライブラリー作成用のベクターに組み込むことで、ゲノムDNAライブラリーを調製することができる。使用可能なベクターとしては、λファージベクター、プラスミドベクター、コスミドなどを挙げることができる。これらの中から、当業者は、ベクターへのライゲーション効率、予想されるゲノム中に挿入すべきゲノムサイズ、大腸菌中での増殖の容易性、などの条件に基づいて、これらのいずれを選択すべきかを容易に決定することができる。
【００２７】
例えば、渦鞭毛藻のゲノムＤＮＡライブラリーを作製する場合には、大腸菌および糸状菌または放線菌の両方で選択可能なマーカー遺伝子を有するベクターを使用して、ゲノムＤＮＡライブラリーを構築することができる。具体的には、大腸菌および糸状菌または放線菌の両方で選択可能なマーカー遺伝子を有するベクターとして、pANsCos1コスミドベクター（Osiewacz, H., D.ら、1994年、Curr.  Genet.,  第26巻，第87−90頁）、pOJ446コスミドベクター（Bierman, M.ら、1992年、Gene,  第116巻，第43頁）を挙げることができる。
【００２８】
この様なベクターと、抽出したゲノムＤＮＡを同一の制限酵素または同一の末端を生成する他の制限酵素により切断して得られるＤＮＡ断片をライゲーションした後、in vitroパッケージングして大腸菌に感染させればよい。この大腸菌を、使用したベクターに適合した薬剤を含むプレートに植菌してコロニーを形成させることで、ゲノムＤＮＡライブラリーを作製することができる。
【００２９】
２）プローブＤＮＡ及び／またはプライマーＤＮＡの設計
上記のようにして調製したゲノムDNAまたはゲノムDNAライブラリーに対して使用するハイブリダイゼーション用のプローブＤＮＡあるいはＰＣＲ用のプライマーＤＮＡは、既知のＰＫＳのアミノ酸配列あるいは該ＰＫＳをコードする遺伝子の塩基配列を基にして設計することができる。また、本発明で開示された配列番号１に示される塩基配列もしくはその部分配列からなるＤＮＡを、プローブＤＮＡ及び／またはプライマーＤＮＡとして用いてもよい。
【００３０】
既知の配列を基にしたプローブＤＮＡ及び／またはプライマーＤＮＡとしては、既知のＩ型ＰＫＳのＫＳドメインに共通して保存されているアミノ酸配列を基に設計したデジェネレート（縮重）プローブＤＮＡ／プライマーＤＮＡの利用が好ましい。この様なプローブＤＮＡまたはプライマーＤＮＡは、Amphidinium sp.（Y-42株）のみならず、他の渦鞭毛藻からＩ型ＰＫＳをコードする遺伝子を含むＤＮＡをクローニングする場合にも有用である。
【００３１】
ここで設計の基となる既知のＰＫＳ遺伝子としては、Amycolatopsis mediterranei由来のrifamycin生合成酵素（Rif1、Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A、1999年、第96巻、第9051−9056頁）、Polyangium cellulosum由来のepothilone生合成酵素（Epo1、Gene, 2000年、第249巻、第153−160頁）、Polyangium cellulosum由来のsoraphen生合成酵素（Sor１、Gene, 2002年、第285巻、第257−267頁）、Actinosynnema pretiosum由来のansamitocin生合成酵素（Ans、Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A、2002年、第99巻、第7968−7973頁）などを利用することができる。上記の既知のPKS中の保存性の高いアミノ酸配列は、既知配列間で適当な用いた相同性検索により選択することができ、これらの配列情報を基に、縮重配列を設計してもよい。
【００３２】
塩基配列が決定されたプローブＤＮＡまたはプライマーＤＮＡは、ＤＮＡシンセサイザー等を用いた通常の操作により、合成、精製することができる。
【００３３】
３）PCR法によるスクリーニング
１）で調製されるゲノムＤＮＡに対して、２）で設計、調製したプライマーＤＮＡを用いて第１のＰＣＲ反応を行う。、ＰＣＲ操作は、例えばSambrookら（前記）に記載されるような当業者に周知な方法であり、プライマーの配列、長さ、ＧＣ含量などの性質、使用する試薬などの種々の条件も、当業者は一般的なプロトコルに基づいて適宜決定し、あるいは変更することができる。
【００３４】
さらに、第１のＰＣＲ反応で増幅されたＰＣＲ産物の塩基配列を決定し、この決定された塩基配列を利用して新たにプライマーＤＮＡを合成し、これを用いて１）で調製したゲノムＤＮＡライブラリーに対して第２のＰＣＲを行うことで、所望のＤＮＡを含むクローンを選抜することができる。
【００３５】
また、縮重プライマー、あるいは第１のＰＣＲによる増幅産物をプローブとして、ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングしてもよい。スクリーニング操作におけるライブラリークローンの増殖、メンブレンへの転写、プローブのラベル化、ハイブリダイゼーション条件等の個々の方法は、上述したSambrookらの方法を使用して行うことができる。
【００３６】
このハイブリダイゼーションによって確認されたポジティブクローンからDNAを回収し、様々な制限酵素で切断し、サザンハイブリダイゼーションにより解析することにより、これらのクローンがどのようなインサートを有しているか、さらには具体的にインサートＤＮＡの塩基配列を決定して、所望のＤＮＡを含むクローンを選抜することができる。
【００３７】
この様なクローニング操作の具体的な条件は、いずれも前述したSambrookらに記載の方法に準じて行えばよい。
【００３８】
４）ＰＫＳ遺伝子発現ベクターの構築
上述した方法によりクローニングされたＰＫＳ遺伝子を含むｃＤＮＡを適当なベクターに組み込むことで、渦鞭毛藻由来のＰＫＳの発現が可能な発現ベクターを構築することができる。
【００３９】
例えば、pET（Novagen社）、pPRO（Clontech社）、pCAL（Stratagene社）などを挙げることができる。ｃＤＮＡの発現ベクターへの組み込み、同ベクターを用いた宿主の形質転換方法、宿主細胞の培養方法等は、当該技術分野において既知の方法に準じて行うことができる。
【００４０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４１】
＜実施例１＞  AmY42PKSのクローニング
１）渦鞭毛藻 Amphidinium  sp.（Y-42株）のゲノムＤＮＡの調製
カブ型フラスコ（３L）に２Lの海水を入れて120℃で20分間オートクレーブ滅菌を行った後、滅菌フィルター（STERIVEX−GS，0.22 mm Filter unit;Millipore Co.）で濾過したProvasoliの海水補強栄養剤２０ｍｌを加えた。
【００４２】
20mLのES培地１％を加えた平底試験管で予備培養していた藻体を上記の培地に加え、蛍光灯を光源として静置培養を行った。培養条件は25℃で16時間明期、8時間暗期を繰り返すものである。
【００４３】
培養開始から２週間後、暗期のうちに培地上清を吸引して除き、得られた残渣を遠心分離（3500rpm，10min）により回収し、Y-42株の藻２５ｇを得た。
【００４４】
藻体0.4ｇを0.1 M NaCl，1 mM Ｎａ２EDTA，and 50 mM Tris−HCl（pH 7.5）を含む緩衝液15ｍｌに懸濁し、sodium dodecyl sulfate （75 mg）およびproteinase K（1.5 mg）をさらに加えて穏やかに混合した。懸濁液を 50℃で6 時間インキュベートした後、等量のフェノール／クロロホルムを加えて穏やかに混合した。この混合液を氷上で30分インキュベートした後、4000rpmで20分間遠心し、上清を別の容器に移した。上清に1/15量の3M sodium acetate（pH 5.2）と2倍量の冷エタノールを加え穏やかに混合した後、析出したゲノムDNAをガラス棒に巻取った。巻取られたゲノムDNAは70%エタノールですすぎ、4℃で5 mLのTE溶液に溶解させた。
【００４５】
２）ゲノムＤＮＡに対するPCR
既知のポリケチド合成酵素であるRif1、Epo1、Sor１ならびにAnsのアミノ酸配列を対比させ、それらのＫＳドメイン中で共通して保存されているアミノ酸配列として、VEAHGTGT、G(TまたはA）NAHVI、（M又はI）DPQQR、E（A又はT）HGTGTを選択した。このアミノ酸配列をコードする塩基配列を、縮重コドンを考慮して決定し、TKKSF4、TKKSR4、TKKSF5、TKKSR5の4つのプライマーを合成した。
【００４６】
TKKSF4  ：  5’−TIGARGCICAYGGIACIGGIAC−3’
TKKSR4  ：  5’−ATIACRTGIGCRTTIGYICC−3’
TKKSF5  ：  5’−ATIGAYCCICARCARMG−3’
TKKSR5  ：  5’−GTICCIGTICCRTGIGYYTC−3’
（Iはイノシン、A又はG、RはA又はG、YはC又はT、MはA又はC）
TKKSF4、TKKSR4、TKKSF5、TKKSR5の4つのプライマーと、渦鞭毛藻Amphidinium sp. （Y-42株）のゲノムDNAを鋳型として用いたPCRを行った。PCRの条件は、94℃で5分、続いて94℃で1分、45〜60℃で30秒、72℃で1分を40〜48サイクル、更に72℃で5分である。この操作により、TKKSF4とTKKSR4を用いた反応から350 bpのDNA断片が、TKKSF5とTKKSR5を用いた反応から750 bpのDNA断片が、それぞれ増幅された。
【００４７】
PCRで増幅した断片をそれぞれpBluescript II SK（+）（Stratagene）にサブクローニングし、大腸菌を形質転換した。得られた形質転換体からプラスミドを精製し、インサートＤＮＡの塩基配列を解析した結果、既知のＫＳドメインをコードする塩基配列と高い相同性を示す塩基配列を含む２３種類のプラスミド（pY42−41，pY42−44，pY42−48，pY42−49，pY42−51，pY42−53，pY42−54，pY42−55，pY42−127，pY42−128，pY42−130，pY42−132，pY42−141，and pY42−143，pY42−56，pY42−63，pY42−64，pY42−68，pY42−71，pY42−72，pY42−79，pY42−81，pY42−121））を得た。
【００４８】
このうち、750 bpの増幅断片を含む１４クローン（pY42−41，pY42−44，pY42−48，pY42−49，pY42−51，pY42−53，pY42−54，pY42−55，pY42−127，pY42−128，pY42−130，pY42−132，pY42−141，pY42−143）および、350 bpの増幅断片を含む９種類のクローン（pY42−56，pY42−63，pY42−64，pY42−68，pY42−71，pY42−72，pY42−79，pY42−81，pY42−121）を選択し、これらに含まれるインサートＤＮＡの塩基配列を決定した。
【００４９】
３）ゲノムライブラリーの作製
渦鞭毛藻Amphidinium sp.（Y-42株）のゲノムライブラリーを以下のように構築した。ゲノムDNAをSau3AIでランダム消化し、約40 kbの断片をフォスミドベクターpCCFOS（Epicentre社）に組み込んだ。このライゲーション溶液をMaxPlaxLambda Packaging Extract（Epicentre社製キット）を用い、キットのマニュアルに基づいてin vitroパッケージングを行った。このパッケージングされたウィルス溶液の上清２５μｌを用いて、大腸菌DH10B株を形質転換した。さらに、形質転換された大腸菌を培養し、ゲノムライブラリーを作製した。プレート上で生育した約５００クローンを、一つのプールとしてまとめた。
【００５０】
４）ライブラリースクリーニング
２）で決定された塩基配列を基に、ＫＳドメインをコードする遺伝子の部分断片を特異的に増幅することのできるプライマーとして、以下の４種のプライマーＤＮＡを設計、合成した。
【００５１】
TKKSF6 ： 5'−CTTCATCAGCTTGAGCTGAG−3'
TKKSR16 ： 5'−TTCTCGAAGTGACTGCAGAG−3'
TKKSF8 ： 5'−ACCAGCCCCAAACGAGTTCACAC−3'
TKKSR8 : 5'−AAAGAGGGGCGATCCAGTCGAG−3'
３）で調製した２００個のプールに対して、上記で調製したTKKSF6、TKKSR16、TKKSF8、TKKSR8をプライマーとして用いたPCRを行った。その結果、TKKSF6とTKKSR16を用いた反応から600bpのDNA断片を、TKKSF8とTKKSR8 を用いた反応から300bpのDNA断片をそれぞれ与えたプールを、ポジティブプールとした。さらにこのポジティブプールから、約100クローンを含む別のプールを作製し、さらにＫＳドメインをコードする塩基配列を含むプールを再スクリーニングした。同様の方法を繰り返すことにより、最終的に1つのポジティブクローンpY42-F1を取得した。
【００５２】
５）配列解析
ポジティブクローンpY42-F1のインサートＤＮＡの塩基配列（配列番号１）を、ショットガン法（マクロジェン社）によって決定した。このインサートＤＮＡのサイズは約36 kbで、GC %は47.4%であった。得られた塩基配列を6通りのフレームでアミノ酸情報に翻訳し、それぞれについて公共データベース（BLAST）によるホモロジー検索を行なったところ、次のエキソン１〜６が確認された（図１）。
【００５３】
エキソン１−配列番号１の１３９１１番目から１４６２７番目
Stigmatella aurantiaca由来のStiG
（Protein ID CAD19091：ＰＫＳのＫＳドメイン）と52％
エキソン２−１４５８７番目から１５８１６番目
Stigmatella aurantiaca由来のStiA
（Protein ID CAD19085：ＰＫＳのＫＳドメイン及びＡＴドメイン）
と51％
エキソン３−配列番号１の１５８１８番目から１６９７２番目
Nocardia farcinica IFM 10152由来のPutative PKS
（Protein ID YP_120537：ＰＫＳのＡＴドメインおよびＤＨドメイン）
と44 ％
エキソン４−配列番号１の２０９０８番目から２２７４６番目
Polyangium cellulosum由来の EPOS C
（Protein ID AAF26921：ＰＫＳのＫＲドメインおよびＡＣＰドメイン）
と44 ％
エキソン５−配列番号１の２３７３３番目から２４０７４番目
Planktothrix agardhii由来のMcy T
（Protein ID CAD29792：typeII thioesteraseドメイン）と54％
エキソン６−配列番号１の２４５０８番目から２４９２４番目
Nonomuraea sp. ATCC39727のORF36
（Protein ID CAD91231：thioesteraseドメイン）と44％
この各エキソンの順序ならびに塩基配列の相同性から、インサートDNAは、渦鞭毛藻Amphidinium sp.（Y-42株）のPKSをコードしているDNA断片であることが確認された。
【００５４】
また、Amphidinium sp.（Y-42株）から調製したゲノムＤＮＡに対して、前記のTKKSF6、TKKSR16、TKKSF8、TKKSR8をプライマーDNAとしてPCRを行うとポジティブバンドが観察される一方、Amphidinolide類の生産が確認されていない渦鞭毛藻から調製したゲノムDNAについては、同様の操作を行ってもポジティブバンドは観察されなかった。さらに、Y-42株から調製した全ｍＲＮＡに対して、同プライマーDNAを用いたRT-PCRを行うとポジティブバンドが観察された。従って、AmY42PKCは、Amphidinolide類の生合成に関与する酵素である渦鞭毛藻由来のＰＫＳをコードする遺伝子を発現可能に含むｃＤＮＡであると推察される。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、本発明のＤＮＡの構造的特徴を示す。
【図１】
2007000104.tif 000002
【配列表】
2007000104000001.app