(57)【要約】      （修正有）【課題】ＧＪ（ギャップジャンクション）による細胞間情報伝達およびコネキシン４３発現の促進剤または皮膚の老化予防改善皮膚外用剤の提供。【解決手段】分子量５００以上２０００以下のペプチド及び／またはＡｒｇ、Ａｌａ及びＡｓｐからなる配列を含むペプチドを含有する組成物。その一例としてのペプチドはアミノ酸配列１：Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａが示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子量が５００以上２０００以下のペプチドを含有することを特徴とする細胞間連絡亢進剤。
【請求項２】
Ａｒｇ、Ａｌａ及びＡｓｐからなる配列を含むペプチド（以下、総称してＲＡＤペプチドと記す）を含有することを特徴とする細胞間連絡亢進剤。
【請求項３】
分子量５００以上２０００以下のＲＡＤペプチドを含有することを特徴とする細胞間連絡亢進剤。
【請求項４】
下記のアミノ酸配列１を有する、ペプチドを含有することを特徴とする細胞間連絡亢進剤。
アミノ酸配列１：Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ
【請求項５】
平均分子量が５００以上２０００以下のコラーゲンペプチドを含有することを特徴とする細胞間連絡亢進剤。
【請求項６】
前記の細胞間連絡の亢進が、ギャップジャンクション機能の亢進による請求項１〜４いずれか一項記載の細胞間連絡亢進剤。
【請求項７】
コネキシンの発現を増強することを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項記載の細胞間連絡亢進剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項記載の細胞間連絡亢進剤を含有する老化予防皮膚外用剤。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項記載の細胞間連絡亢進剤を含有する光老化予防皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗老化に関する技術分野の発明であり、特に細胞間連絡や、コネキシン発現を亢進する、分子量５００以上２０００以下のペプチド及び／またはＡｒｇ、Ａｌａ及びＡｓｐからなる配列を含むペプチド（以下、総称してＲＡＤペプチドと記す）、その一例として下記のアミノ酸配列１を有するペプチド、またはコラーゲンペプチドを有効成分とする細胞間連絡亢進剤や老化予防改善皮膚外用剤に関する。
アミノ酸配列１：Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ
【背景技術】
【０００２】
細胞同士は、細胞間接着により結合している。この細胞間接着の１つがギャップジャンクション（以下「ＧＪ」と略記する）である。ＧＪは、隣接する細胞同士を結合させるだけでなく、細胞間の情報伝達にも関与している（非特許文献１）。隣接する細胞間で分子量約１０００Ｄａ以下の分子を通過させることにより、情報が伝達されており、これが正常に行われないと各組織の機能異常が引き起こされる。
ＧＪを構成しているのは、細胞膜タンパク質コネキシンである。このコネキシンが６分子結合したコネクソンと呼ばれるチャネルが、隣接する細胞間で会合することによってＧＪが形成される（非特許文献２）。コネキシンは、各々組織特異的に発現するが、ケラチノサイト中の主要なコネキシンタンパク質が、コネキシン２６、４３などである（非特許文献３）。
【０００３】
【非特許文献１】Ｊ．Ｅ．Ｔｒｏｓｋｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３，５３，１−１９
【非特許文献２】Ｇｏｏｄｅｎｏｕｇｈ  ＤＡ，  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９６，６５，４７５−５０２
【非特許文献３】Ｄｅｎｉｓ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９８８，８２，２４８−２５４
【０００４】
ＧＪを介した細胞間の情報伝達やコネキシンの発現量が、加齢と共に低下すること、紫外線によりケラチノサイトのＧＪ機能、コネキシン発現量が低下することが分かっている。したがって、ＧＪの機能やコネキシンの発現の亢進は、加齢や紫外線による肌の老化を防止することとなり、肌老化予防においてＧＪやコネキシンの制御は有効であると考えられている（非特許文献４、特許文献１）。
【０００５】
【非特許文献４】Ｈｉｒｏａｋｉ  Ｉ，ＦＲＡＧＲＡＮＣＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ，２００３，１２，１００−１０５
【特許文献１】特表２００２−５４１０８４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
優れた肌の老化改善効果を副作用なく、安全にもたらす皮膚外用剤の開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
このような事情により、本発明者らは皮膚の老化抑制を目的に鋭意検討した結果、分子量５００以上２０００以下のペプチド及び／またはＡｒｇ、Ａｌａ及びＡｓｐからなる配列を含むペプチド（ＲＡＤペプチド）、その一例として下記のアミノ酸配列１を有するペプチド、またはコラーゲンペプチドがＧＪ機能促進作用及びコネキシン発現亢進作用を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
アミノ酸配列１：Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ
【０００８】
すなわち、本発明は、ＧＪ機能促進作用及びコネキシン発現亢進作用を有することから、皮膚の老化及び光老化予防改善効果が期待される。
【０００９】
本発明にて用いられるＲＡＤペプチドは、Ａｒｇ、Ａｌａ及びＡｓｐの３種のアミノ酸からなる配列を含むペプチドである。その利用においては、常法により合成し、利用することができる。
【００１０】
本発明に用いられるＲＡＤのアミノ酸残基数はいくつでも合成可能であるが、その中でも皮膚浸透性が高いＲＡＤ４（ＲＡＤ配列を４個含む）〜ＲＡＤ１６（ＲＡＤ配列を１６個含む）が好ましい。ＲＡＤの配合量は、特に限定されていないが、本発明における皮膚外用剤の全量に対し、固形分に換算して０．０００１〜５重量％が好ましく、さらに好ましくは０．００１〜１重量％である。０．０００１重量％未満では十分な効果は発揮され難い。５重量％を越えて配合した場合、効果の増強は少なく不経済である。また、添加の方法については、予め加えておいても、製造途中で添加しても良く、作業性を考えて適宜選択すれば良い。
【００１１】
本発明に係るコラーゲンペプチドの出発原料であるコラーゲン成分またはゼラチン成分は、牛、豚、鳥などの骨、皮、腱またはヒラメ、カレイ、鮭、鯛、鮪、鮫などの骨、皮、腱、鱗、浮き袋等を用いることが可能である。これらの原料からのコラーゲン成分またはゼラチン成分の抽出・精製は、通常公知の方法を用いて行うことができる。
【００１２】
コラーゲンペプチドを得るための、これらの加水分解は、タンパク分解酵素のような酵素を使用して行うことができる。加水分解物の調製に用いる酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、ズブチリシン、エラスターゼ、プロリン特異性プロテアーゼ、ストレプトコッカス属の微生物が産生するプロテアーゼ、アスペルギルス属の微生物が産生するプロテアーゼ、ストレプトミセス属の微生物が産生するプロテアーゼ、リゾープス属の微生物が産生するプロテアーゼ、バチラス属の微生物が産生するプロテアーゼ、乳酸菌が産生するプロテアーゼ、パパイン、ブロメライン、ククミシン、ペプシン、サーモリシン等が利用できる。また、クロストリジューム属、ストレプトミセス属などの細菌、放線菌あるいは真菌由来のコラゲナーゼも利用可能である。また、遺伝子組み換え技術により他の菌体に産生させたプロテアーゼであっても問題なく、これらの微生物により発酵させることも可能である。さらに、複数の酵素を混合して使用しても良い。中でも、プロクターゼ、プロメライン、パパイン、コラゲナーゼ、ペプシンなどがよい。
【００１３】
加水分解に使用する酵素量は、原料に対して重量比０．０１％〜１０％程度、好ましくは１％程度が良く、温度条件は室温〜９０℃、好ましくは３７℃〜５５℃、反応時間は１〜２４時間、好ましくは１〜８時間処理する。またｐＨ条件は酵素添加前に最適ｐＨに調整する。加水分解終了後、加熱して酵素を失活させ、冷却後必要に応じてろ過、脱色、脱臭、脱塩、濃縮、乾燥を行うと良い。
【００１４】
本発明のコラーゲンペプチドは、酵素の種類、濃度、反応時間等、反応条件を調整することで得ることができる。コラーゲンペプチドの平均分子量は５００〜２０００が好ましく、特に平均分子量８００〜１０００が好ましい。酵素による加水分解物は、ゲルろ過クロマトグラフィー等の公知の方法を用いて特定の分子量の分画物を得ることができる。
【００１５】
本発明に用いるコラーゲンペプチドの配合量は特に限定されないが、本発明の老化防止剤全量に対し、乾燥物に換算して０．０００１〜５重量％の範囲が好ましく、さらに好ましくは０．００１〜１重量％である。この配合量が、０．０００１重量％以下ではシワの形成予防・改善効果が低く、また５重量％を超えても効果に大きな増強はみられにくく、効率的でない。また、添加の方法については、予め加えておいても製造途中で添加しても良く、作業性を考えて適宜選択すれば良い。
【００１６】
本発明の皮膚外用剤には、成分の効果を損なわない範囲内で、通常の化粧品及び医薬部外品に用いられる成分である油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、キレート剤等の成分を配合することもできる。
【００１７】
本発明の皮膚外用剤は、化粧品、医薬部外品または医薬品のいずれにも用いることができ、その剤型としては、例えば、化粧水、クリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、エッセンス、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション、打粉、口紅等が挙げられる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の細胞間連絡亢進剤及び老化予防皮膚外用剤は、ギャップジャンクションを介した細胞間連絡を亢進させ、コネキシンの発現を増強し、さらにタルミの改善に優れた効果を発揮した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
次に本発明を詳細に説明するため、実施例として本発明に用いるペプチドや抽出物の製造例、処方例および実験例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例に示す配合量は重量％を示す。
【実施例１】
【００２０】
製造例１  ＲＡＤの合成
ペプチド合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｚｅｒ  ４３１Ａ）により、アミノ酸残基数３〜４８のＲＡＤ（ＲＡＤ３〜ＲＡＤ４８）を合成し、ＨＰＬＣにより精製した。
【００２１】
製造例２  ペプシン加水分解によるコラーゲンペプチド１
コラーゲンタンパクとして、ヒラメ皮より調製したゼラチン３０ｇを蒸留水３００ｍＬに加温溶解した。ペプシン（日本バイオコン社製）３００ｍｇを加え、酸にてｐＨ３．５に調製した後５０℃で１時間放置した。反応終了後、反応液を中和し、１００℃で１５分間加熱して酵素を失活させた。次いで活性炭素処理後、凍結乾燥し、平均分子量５０００のコラーゲンペプチドを得た。
【００２２】
製造例３  ペプシン加水分解によるコラーゲンペプチド２
製造例１における活性炭素処理液を蒸留水で平衡化したＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−２（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）によるゲル濾過クロマトグラフィーを行い、平均分子量が２８０、５００、１０００の画分を凍結乾燥した。
【００２３】
製造例４  パパイン加水分解によるコラーゲンペプチド３
コラーゲンタンパクとして、鮭皮より調製したゼラチン３０ｇを蒸留水３００ｍＬに加温溶解した。パパイン（天野エンザイム社製）３００ｍｇを加え、アンモニア水にてｐＨ７．０に調製した後５０℃で１時間放置した。反応終了後、反応液を１００℃で１５分間加熱し、酵素を失活させた。次いで活性炭素処理後、凍結乾燥し、平均分子量１００００のコラーゲンペプチドを得た。
【００２４】
製造例５  パパイン加水分解によるコラーゲンペプチド４
製造例４の活性炭素処理液を蒸留水で平衡化したＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−２（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）によるゲル濾過クロマトグラフィーを行い、平均分子量が５００、２０００の画分を凍結乾燥した。
【００２５】
製造例６  コラゲナーゼ加水分解によるコラーゲンペプチド５
コラーゲンタンパクとして、鯛鱗より調製したゼラチン３０ｇを蒸留水３００ｍＬに加温溶解した。コラゲナーゼタイプＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ製）３００ｍｇを加え、アンモニア水にてｐＨ７．５に調製した後３７℃で１時間放置した。反応終了後、反応液を１００℃で１５分間加熱し、酵素を失活させた。次いで活性炭素処理後、凍結乾燥し、平均分子量１０００のコラーゲンペプチドを得た。
【００２６】
製造例７  コラゲナーゼ加水分解によるコラーゲンペプチド６
製造例６の活性炭素処理液を蒸留水で平衡化したＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−２（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）によるゲル濾過クロマトグラフィーを行い、平均分子量４００の画分を凍結乾燥した。
【００２７】
製造例８  パパインおよびバチラス属の微生物が産生するプロテアーゼ加水分解によるコラーゲンペプチド７
コラーゲンタンパクとして、カレイ皮より調製したゼラチン３０ｇを蒸留水３００ｍＬに加温溶解した。パパイン（天野エンザイム社製）、バチラス属の微生物が産生するプロテアーゼ（天野エンザイム社製）を各３００ｍｇ加え、アンモニア水にてｐＨ７．５に調製した後５０℃で３時間放置した。反応終了後、反応液を１００℃で１５分間加熱し、酵素を失活させた。次いで活性炭素処理後、凍結乾燥し、平均分子量３０００のコラーゲンペプチドを得た。
【００２８】
製造例９  パパインおよびバチラス属の微生物が産生するプロテアーゼ加水分解によるコラーゲンペプチド８
製造例７の活性炭素処理液を蒸留水で平衡化したＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−２（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）によるゲル濾過クロマトグラフィーを行い、平均分子量８００の画分を凍結乾燥した。
【実施例２】
【００２９】
処方例１  クリーム１
処方                                                              配合量
１．ＲＡＤ１６                                                  ０．５部
２．スクワラン                                                  ５．５  
３．オリーブ油                                                  ３．０  
４．ステアリン酸                                                ２．０  
５．ミツロウ                                                    ２．０  
６．ミリスチン酸オクチルドデシル                                ３．５  
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）            ３．０  
８．ベヘニルアルコール                                          １．５  
９．モノステアリン酸グリセリン                                  ２．５  
１０．香料                                                        ０．１  
１１．１，３−ブチレングリコール                                  ８．５  
１２．パラオキシ安息香酸エチル                                    ０．０５
１３．パラオキシ安息香酸メチル                                    ０．２  
１４．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分３〜１０を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１、２及び１２〜１５を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃にて成分１１を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。
【００３０】
処方例２  クリーム２
処方例１において、１のＲＡＤ１６をコラーゲンペプチド（平均分子量５００、製造例３）に置き換えたものをクリーム２とした。
【００３１】
比較例１  従来のクリーム１
処方例１において、１を精製水に置き換えたものを従来のクリーム１とした。
【００３２】
処方例３  化粧水
処方                                                              配合量
１．コラーゲンペプチド（平均分子量１０００、製造例５）          １．０部
２．１，３−ブチレングリコール                                  ８．０  
３．グリセリン                                                  ２．０  
４．キサンタンガム                                              ０．０２
５．クエン酸                                                    ０．０１
６．クエン酸ナトリウム                                          ０．１  
７．エタノール                                                  ５．０  
８．パラオキシ安息香酸メチル                                    ０．１  
９．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．）              ０．１  
１０．香料                                                        適量
１１．精製水にて全量を１００とする。
［製造方法］成分１〜６および１１と、成分７〜１０をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合し濾過して製品とする。
【００３３】
処方例４  乳液
処方                                                              配合量
１．ＲＡＤ１２                                                  ０．２部
２．スクワラン                                                  ５．０  
３．オリーブ油                                                  ５．０  
４．ホホバ油                                                    ５．０  
５．セタノール                                                  １．５  
６．モノステアリン酸グリセリン                                  ２．０  
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）            ３．０  
８．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（２０Ｅ．Ｏ．）  ２．０  
９．香料                                                        ０．１  
１０．プロピレングリコール                                        １．０  
１１．グリセリン                                                  ２．０  
１２．パラオキシ安息香酸メチル                                    ０．２  
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１および１１〜１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃にて成分１０を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。
【００３４】
処方例５  ゲル剤
処方                                                              配合量
１．ＲＡＤ８                                                    １．０部 
２．エタノール                                                  ５．０  
３．パラオキシ安息香酸メチル                                    ０．１  
４．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．）              ０．１  
５．香料                                                        適量
６．１，３−ブチレングリコール                                  ５．０  
７．グリセリン                                                  ５．０  
８．キサンタンガム                                              ０．１  
９．カルボキシビニルポリマー                                    ０．２  
１０．水酸化カリウム                                              ０．２  
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜５と、成分６〜１１をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合して製品とする。
【００３５】
処方例６  パック
処方                                                              配合量
１．ＲＡＤ１０                                                  ０．００１部
２．ポリビニルアルコール                                      １２．０  
３．エタノール                                                  ５．０  
４．１，３−ブチレングリコール                                  ８．０  
５．パラオキシ安息香酸メチル                                    ０．２  
６．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（２０Ｅ．Ｏ．）              ０．５  
７．クエン酸                                                    ０．１  
８．クエン酸ナトリウム                                          ０．３  
９．香料                                                        適量
１０．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜１０を均一に溶解し製品とする。
【００３６】
処方例７  ファンデーション
処方                                                                配合量
１．ＲＡＤ７                                                      ０．１部 
２．ステアリン酸                                                  ２．４  
３．ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（２０Ｅ．Ｏ．）  １．０  
４．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）              ２．０  
５．セタノール                                                    １．０  
６．液状ラノリン                                                  ２．０  
７．流動パラフィン                                                ３．０  
８．ミリスチン酸イソプロピル                                      ６．５  
９．パラオキシ安息香酸ブチル                                      ０．１  
１０．カルボキシメチルセルロースナトリウム                          ０．１  
１１．ベントナイト                                                  ０．５  
１２．プロピレングリコール                                          ４．０  
１３．トリエタノールアミン                                          １．１  
１４．パラオキシ安息香酸メチル                                      ０．２  
１５．二酸化チタン                                                  ８．０  
１６．タルク                                                        ４．０  
１７．ベンガラ                                                      １．０  
１８．黄酸化鉄                                                      ２．０  
１９．香料                                                          適量
２０．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分 ２〜９を加熱溶解し、８０℃に保ち油相とする。成分２０に成分１０をよく膨潤させ、続いて、成分１および１１〜１４を加えて均一に混合する。これに粉砕機にて粉砕混合した成分１５〜１８を加え、ホモミキサーにて撹拌し、７５℃に保ち水相とする。この水相に油相をかき混ぜながら加え、冷却し、４５℃にて成分１９を加え、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。
【００３７】
処方例８  浴用剤
処方                                                            配合量
１．ＲＡＤ１８                                                ０．００１部
２．炭酸水素ナトリウム                                      ５０
３．黄色２０２号（１）                                        適量
４．香料                                                      適量
５．無水硫酸ナトリウムにて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜５を均一に混合し製品とする。
【００３８】
次に、本発明の効果を詳細に説明するため、実験例を挙げる。
【実施例３】
【００３９】
実験例１  ＲＡＤの皮膚保持効果の評価
皮膚浸透性評価の代表的な方法であるＦｒａｎｚ型拡散セル法を利用して、ＲＡＤの皮膚保持効果について評価した。すなわち、Ｙｕｃａｔａｎ  Ｍｉｃｒｏｐｉｇ皮膚をＦｒａｎｚ型拡散セルに装着し、５００μＬのＲＡＤ２％水溶液をドナー相に加え、パラフィルムにて密封した。レシーバー相には、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加した生理食塩水を加え、３７℃で撹拌し、ＲＡＤを皮膚に１２時間浸透させた。その後、ドナー相のＲＡＤ水溶液を生理食塩水に置換し、さらに２４時間撹拌を行った。１２時間撹拌により浸透したコラーゲンペプチドの量と除去２４時間後の皮膚に保持されているＲＡＤの量を比較して皮膚保持率を算出した。その結果、表１に示すように、分子量約５００から１７００のＲＡＤに優れた皮膚保持効果が認められた。
【００４０】
【表１】
2007039394.tif 000002
【００４１】
実験例２  細胞間連絡亢進効果
ＧＪによる細胞間連絡の評価は、Ｓｃｒａｐｅ−ｌｏａｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｙｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  （ＳＬＤＴ：色素移行）法により評価した（Ｊ．Ｕ．Ｐａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｍｅ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ．，２００２，６０，５４１−５４７）。まず、ヒトケラチノサイト由来細胞株ＨａＣａＴ細胞を１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地（以降、培地と記す）にて培養し、コンフルエントな状態になったら、アミノ酸配列１のＲＡＤ１６を最終濃度が０．００１、０．０１、０．１％となるように、またはコラーゲンペプチドを１％となるように培地に添加した。ＲＡＤ１６及びコラーゲンペプチド添加７日後に、シャーレの細胞が培養されている面に２７Ｇの注射針で線をひき、傷をつける。続いて、０．１％となるようにルシファーイエローを添加した培地にて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で５分間培養した。培地を除去し、ＰＢＳで３回細胞を洗い、蛍光顕微鏡でルシファーイエローの取り込みを測定した。すなわち、細胞間連絡が発達しているとルシファーイエローが多く取り込まれる。その結果、表２に示すように、ＲＡＤ１６を添加することにより、ルシファーイエローの取り込みが増加した。
アミノ酸配列１：Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ
【００４２】
【表２】
2007039394.tif 000003
【００４３】
実験例３  コネキシン４３のタンパク質発現亢進効果
ＨａＣａＴ細胞がコンフルエントな状態にて、ＲＡＤ１６を最終濃度が０．００１、０．０１、０．１％となるように、またはコラーゲンペプチドを１％となるように培地に添加した。ＲＡＤ１６添加７日後に、培地を除去し、ＰＢＳで２回細胞を洗い、総タンパク質の抽出を行った。このタンパク質２０μｇをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した後、トランスファーメンブレン（ミリポア）にブロッティングした。ブロッティング終了後、１次抗体としてＡｎｔｉ−Ｃｏｎｎｅｘｉｎ  ４３  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｚｙｍｅｄ）、２次抗体としてＡｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ＨＲＰ−Ｌｉｎｋｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（アマシャム）、検出試薬としてＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（アマシャム）を用いてコネキシン４３タンパク質をバンドとして検出した。これらのバンドをデンシトメーターにて定量化した。合成促進率の計算は、この例では、用いたデンシトメーターの数値を利用して、次式により計算した。その結果、表３に示すように、ＲＡＤ１６及びコラーゲンペプチドは、全タンパク質中のコネキシン４３タンパク質の合成促進効果を示した。
【００４４】
合成促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００    
Ａ：試料を添加した場合のデンシトメーターの数値
Ｂ：試料を添加しない場合のデンシトメーターの数値
【００４５】
【表３】
2007039394.tif 000004
【００４６】
実験例４  紫外線照射に対するコネキシン４３タンパク質防御効果
ＨａＣａＴ細胞がコンフルエントな状態にて、ＲＡＤ１６を最終濃度が０．００１、０．０１、０．１％となるように、またはコラーゲンペプチドを１％となるように培地に添加した。ＲＡＤ１６添加７日後に、培養液をＰＢＳに置換し、ＵＶＢを２５ｍＪ／ｃｍ２照射した。照射終了後、直ちにＰＢＳを培地に再び置換し、２４時間後に総タンパク質の抽出を行った。このタンパク質２０μｇをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した後、トランスファーメンブレン（ミリポア）にブロッティングした。ブロッティング終了後、１次抗体としてＡｎｔｉ−Ｃｏｎｎｅｘｉｎ  ４３  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｚｙｍｅｄ）、２次抗体としてＡｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ＨＲＰ−Ｌｉｎｋｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（アマシャム）、検出試薬としてＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（アマシャム）を用いてコネキシン４３タンパク質をバンドとして検出した。これらのバンドをデンシトメーターにて定量化した。合成促進率の計算は、この例では、用いたデンシトメーターの数値を利用して、次式により計算した。その結果、表４に示すように、ＲＡＤ１６は、紫外線によるコネキシン４３タンパク質の発現低下を抑制した。
【００４７】
【表４】
2007039394.tif 000005
【００４８】
コネキシン２６、コネキシン３２についても、同様にＲＡＤ１６及びコラーゲンペプチドによる発現亢進効果が認められた。また、ＲＡＤ１６以外に、ＲＡＤ３〜４８についてもコネキシンの発現亢進効果が認められた。
【００４９】
実験例５  抗老化作用の評価
３０週齢の老化促進マウス（ＳＡＭ  Ｐ１０）を雌雄５匹ずつ、対照群、ＲＡＤ１６投与群を設けた。対照群には生理食塩水を、ＲＡＤ１６投与群は、ＲＡＤ１６を０．１％となるように生理食塩水に溶解したものを、バリカンで刈毛したマウスの背部・皮内に投与した。投与１週間後に、刈毛したマウスの背部皮膚を、母指と人差指で挟んでつまみ上げ、直ちに離し、皮膚のシワが復元する秒数を測定した。その結果、表５に示すように、対照群に比べＲＡＤ１６投与群では、復元時間が有意に短くなった。
【００５０】
【表５】
2007039394.tif 000006
【００５１】
実験例６  タルミの改善効果
処方例１のクリーム１、処方例２のクリーム２、比較例１の従来のクリームを用いて、肌のタルミに悩む女性２０人（２５〜４０才）を対象に１ヶ月間の使用試験を行った。使用後、肌のタルミの改善効果をアンケートにより評価した。
【００５２】
これらの結果を表６に示した。その結果、ＲＡＤ１６を含有することを特徴とする皮膚外用剤は優れたタルミの改善効果を示した。
【００５３】
【表６】
2007039394.tif 000007
【００５４】
処方例３〜８で得られた皮膚外用剤はいずれも十分なタルミにおける改善効果を示した。また、皮膚トラブルも無く、安全であった。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の活用例として、化粧品、医薬部外品または医薬品のいずれにも用いることができ、細胞間連絡機能の低下に由来する肌の老化の改善効果が得られる。