(57)【要約】【課題】  プルラナーゼ活性が低下しているイネ変異体および改変されたデンプンを合成するイネ変異体の生産方法ならびに当該イネ変異体により合成されるデンプンを提供する。【解決手段】  活性化されたトランスポゾンをイネのゲノムに導入し、当該トランスポゾンがＰＵＬ遺伝子に挿入されているイネ変異体を選抜する。得られたイネ変異体は改変されたデンプンを合成する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＵＬ遺伝子に変異を有し、野生型と比較してプルラナーゼ活性が低下していることを特徴とするイネ変異体。
【請求項２】
トランスポゾンがＰＵＬ遺伝子に挿入されているイネ変異体であって、野生型と比較してプルラナーゼ活性が低下していることを特徴とする請求項１に記載のイネ変異体。
【請求項３】
トランスポゾンは、ＰＵＬ遺伝子のエキソン１０またはイントロン１６に挿入されていることを特徴とする請求項２に記載のイネ変異体。
【請求項４】
トランスポゾンは、配列番号１に示されるイネ由来のＰＵＬ遺伝子において、５４５７番目の塩基と５４５８番目の塩基との間、または、９９０７番目の塩基と９９０８番目の塩基との間に挿入されていることを特徴とする請求項２または３に記載のイネ変異体。
【請求項５】
上記トランスポゾンはレトロトランスポゾンであることを特徴とする請求項２ないし４のいずれか１項に記載のイネ変異体。
【請求項６】
上記レトロトランスポゾンはＴｏｓ１７であることを特徴とする請求項５に記載のイネ変異体。
【請求項７】
改変されたデンプンを合成することを特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項に記載のイネ変異体。
【請求項８】
改変されたデンプンが、野生型が合成するデンプンと比較して、低下した糊化温度を有することを特徴とする請求項７に記載のイネ変異体。
【請求項９】
改変されたデンプンを合成するイネ変異体を生産するための方法であって、
活性化されたトランスポゾンをイネゲノムに導入する工程と、
当該トランスポゾンがＰＵＬ遺伝子に挿入されているイネ変異体を選抜する工程とを含むことを特徴とするイネ変異体の生産方法。
【請求項１０】
活性化されたトランスポゾンは、Ｔｏｓ１７であることを特徴とする請求項９に記載のイネ変異体の生産方法。
【請求項１１】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載のイネ変異体により合成されるデンプン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プルラナーゼ活性が低下しているイネ変異体およびイネ変異体の生産方法ならびに当該イネ変異体により合成されるデンプンに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
植物のデンプン合成には、基質を供給する酵素ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＤＰglucose pyrophosphorylase）、α-1,4グルコシド鎖を伸長するスターチシンターゼ（Starch synthase(ＳＳ)）、α-1,6グルコシド鎖を作る枝作り酵素（Branching enzyme(ＢＥ)）が関与することが知られていたが、１９９０年以降のイネやトウモロコシのsugary-1(sug-1)変異体の研究から、さらにα-1,6グルコシド結合によって作られた枝を切る枝切り酵素（Debranching enzyme(ＤＢＥ)）も関連することが明らかになっている（例えば、非特許文献１、２等参照。）。かかるＤＢＥには、その基質特異性から、イソアミラーゼ(ＩＳＡ)とプルラナーゼ(ＰＵＬ、別名R-enzyme、Limit dextrinase)が存在し、前者は、アミロペクチンとグリコーゲンに作用することができるが、プルランには反応できず、後者はプルランとアミロペクチンには作用できるが、グリコーゲンにはほとんど反応しない（例えば、非特許文献３等参照。）。sug-1変異体は、胚乳にデンプンではなく分岐頻度の高いフィトグリコーゲンを蓄積する変異体であるが、この変異体の原因遺伝子はＩＳＡであることが明らかになっている（例えば、非特許文献４等参照。）。ところが、sug-1変異体は、ＩＳＡ遺伝子の破壊に伴いＩＳＡ活性を著しく低下しているのに加えて、ＰＵＬ活性も低下している（例えば、非特許文献５等参照。）。イネのsug-1変異体には、デンプンとフィトグリコーゲンの比がさまざまな割合で蓄積する（この中にはフィトグリコーゲンが１００％であるものも含まれる。）アレリック変異体が存在し（例えば、非特許文献５等参照。）、これらのアレリック変異体間でデンプンの蓄積量が少ないものほどＰＵＬ活性が低下している（例えば、非特許文献５、６等参照。）。これらの現象は、ＩＳＡのみならず、ＰＵＬがデンプン合成に重要な役割を果たしていることを予感させる。ＩＳＡに関しては、人工的にＩＳＡを低下させるとフィトグリコーゲン様のポリグルカンが蓄積するようになったり（例えば、非特許文献７等参照。）、その遺伝子をsug-1変異体に組み換えるとデンプンが合成されるようになる（例えば、非特許文献８等参照。）ことなどから、デンプン合成に重要な役割を果たすことは明確になってきている。現在のところ、ＩＳＡは、アミロペクチン構造に必須のクラスター構造を維持するために、正常な場所に付かなかった枝をトリミングする機能をもつと考えられている（例えば、非特許文献１等参照。）。一方、ＰＵＬはＩＳＡの機能を一部補助すると予想されるもののその明確な機能は不明のままである。トウモロコシでは、既にＰＵＬ変異体が得られており（例えば、非特許文献９等参照。）、１）ＰＵＬ変異体の胚乳アミロペクチンの構造は野生型と変化がないが、可溶性ポリグルカンに分岐性のものを蓄積している、２）葉身のデンプン分解速度がやや遅くなっており、葉身アミロペクチンの構造は短鎖が減少している、３）ＩＳＡとの二重変異体は、sug-1より激しい表現系を示す、などの知見が得られている。また、ＰＵＬは穀類の発芽時に強い発現があり、α-amylaseとともにデンプン分解に関与していると考えられている（例えば、非特許文献１０等参照。）。
【０００３】
ところで、デンプンは、植物のエネルギー貯蔵物質であり、α−１，４グルコシド結合のＤ−グルカンを主鎖とする多糖で、α−１，４グルコシド結合のＤ−グルカンであるアミロースとこれにα−１，６グルコシド結合の側鎖が加わったアミロペクチンとからなっている。デンプンは穀物の主成分として、食品や飼料に使用される他、デキストリン、オリゴ糖、異性化糖などに加工されて加工食品として利用され、また、糊や添加剤として工業製品やその原材料としても利用されている。
【０００４】
デンプンは、その由来により、鎖長分布、結晶性、糊化温度特性等の諸物性が異なり、用途に応じて使い分けられてきた。このようなデンプンの物性の違いは、デンプンの化学構造の相違によるものであり、特に、枝分かれ構造を有するアミロペクチンの化学構造の相違によるところが大きいとされている。
【非特許文献１】Nakamura Y (2002) Plant Cell Physiol 43: 718-725
【非特許文献２】Smith et al. (1997) Annu Rev Plant Physiol Mol Biol 48: 67-87
【非特許文献３】Nakamura Y (1996) Plant Sci. 121: 1-18
【非特許文献４】James et al. (1997) Plant Cell 7: 417-429
【非特許文献５】Nakamura et al. (1997) Plant J. 12: 143-153
【非特許文献６】Kubo et al. (1999) Plant Physiol. 121: 399-409
【非特許文献７】Fujita et al. (2003) Plant Cell Physiol 44: 607-618
【非特許文献８】Kubo et al. (2005) Plant Physiol 137: 43-56
【非特許文献９】Dinges et al. (2003) Plant Cell 15: 666-680
【非特許文献１０】Smith  et al. (2005) Annu. Rev. Plant. Biol. 56: 73-98
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述したように、トウモロコシでは、既にＰＵＬ変異体が得られているが、イネではＰＵＬ変異体は未だ得られていない。トウモロコシとイネとの間で、sug-1変異体を比較すると、トウモロコシではイネのように、デンプンを全く蓄積できなくなるsug-1変異体は存在しない。また、トウモロコシでは、デンプンの蓄積量とＰＵＬ変異体の活性との関係はイネのように明確ではない。そのため、ＰＵＬの機能を解明するためには、ＰＵＬ遺伝子が破壊されプルラナーゼ活性が低下しているイネ変異体を単離しその解析を行うことが望まれる。
【０００６】
また、ＰＵＬ遺伝子が破壊されているイネ変異株が、改変された新規なデンプンを合成する場合には、かかる新規なデンプンは新しいデンプン素材として利用することができ、デンプンの種類を豊富化と、目的や用途に応じた物性を有するデンプンの提供を可能とすることができる。
【０００７】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、プルラナーゼ活性が低下しているイネ変異体およびイネ変異体の生産方法ならびに当該イネ変異体により合成されるデンプンを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係るイネ変異体は、上記課題を解決するために、ＰＵＬ遺伝子に変異を有し、野生型と比較してプルラナーゼ活性が低下していることを特徴としている。
【０００９】
上記の構成によれば、本発明に係るイネ変異体は、ＰＵＬ遺伝子が変異を有しプルラナーゼ活性が低下しているイネ変異体として初めて単離されたものであり、ＰＵＬ遺伝子の機能の解明や、将来的にはさらにかかる機能の制御への可能性が期待される。
【００１０】
本発明に係るイネ変異体は、トランスポゾンがＰＵＬ遺伝子に挿入されているイネ変異体であって、野生型と比較してプルラナーゼ活性が低下しているイネ変異体であることが好ましい。
【００１１】
上記の構成によれば、本発明に係るイネ変異体は、ＰＵＬ遺伝子が破壊されプルラナーゼ活性が低下しているイネ変異体として初めて単離されたものであり、ＰＵＬ遺伝子の機能の解明や、将来的にはさらにかかる機能の制御への可能性が期待される。
【００１２】
本発明に係るイネ変異体では、上記トランスポゾンは、ＰＵＬ遺伝子のエキソン１０またはイントロン１６に挿入されていることが好ましい。また、本発明に係るイネ変異体では、上記トランスポゾンは、例えば、配列番号１に示されるイネ由来の野生型ＰＵＬ遺伝子において、５４５７番目の塩基と５４５８番目の塩基との間、または、９９０７番目の塩基と９９０８番目の塩基との間に挿入されていることが好ましい。
【００１３】
本発明に係るイネ変異体では、上記トランスポゾンはレトロトランスポゾンであることが好ましい。
【００１４】
上記トランスポゾンがレトロトランスポゾンであることにより、かかるトランスポゾンの制御がしやすく、安全性が高いというさらなる効果を奏する。
【００１５】
本発明に係るイネ変異体では、上記レトロトランスポゾンは、Ｔｏｓ１７であることが好ましい。
【００１６】
上記トランスポゾンがＴｏｓ１７であることにより、トランスポゾンの活性を人為的に制御することができ、また、誘発された変異は比較的安定であるという効果を奏する。
【００１７】
本発明に係るイネ変異体は、改変されたデンプンを合成することができる。
【００１８】
上記イネ変異体が改変されたデンプンを合成することにより、合成された新規なデンプンを新しいデンプン素材として利用することができるというさらなる効果を奏する。
【００１９】
本発明に係るイネ変異体では、上記改変されたデンプンは、野生型が合成するデンプンと比較して、低下した糊化温度を有することが好ましい。
【００２０】
本発明に係るイネ変異体の生産方法は、改変されたデンプンを合成するイネ変異体を生産するための方法であって、活性化されたトランスポゾンをイネゲノムに導入する工程と、当該トランスポゾンがＰＵＬ遺伝子に挿入されているイネ変異体を選抜する工程とを含むことが好ましい。
【００２１】
上記イネ変異体の生産方法がトランスポゾンを利用する選抜方法であることにより、形態上は見つかりにくい改変されたデンプンを合成する変異体の選抜に非常に有効であるという効果を奏する。
【００２２】
本発明に係るイネ変異体の生産方法では、上記トランスポゾンは、Ｔｏｓ１７であることが好ましい。
【００２３】
本発明に係るデンプンは、上記イネ変異体により合成されることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２４】
本発明に係るイネ変異体は、以上のように、ＰＵＬ遺伝子に変異を有し、野生型と比較してプルラナーゼ活性が低下している構成を備えているので、本発明に係るイネ変異体は、ＰＵＬ遺伝子に変異を有しプルラナーゼ活性が低下しているイネ変異体として初めて単離されたものであり、ＰＵＬ遺伝子の機能の解明や、将来的にはさらにかかる機能の制御への可能性が期待される。
【００２５】
また、本発明に係るイネ変異体の生産方法は、以上のように、改変されたデンプンを合成するイネ変異体を生産するための方法であって、活性化されたトランスポゾンをイネのゲノムに導入する工程と、当該トランスポゾンがＰＵＬ遺伝子に挿入されているイネ変異体を選抜する工程とを含む構成を備えているので、上記イネ変異体の生産方法がトランスポゾンを利用する選抜方法であることにより、形態上は見つかりにくい改変されたデンプンを合成する変異体の選抜に非常に有効であるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２７】
（１）本発明に係るイネ変異体
本発明に係るイネ変異体は、ＰＵＬ遺伝子に変異を有し、野生型と比較してプルラナーゼ活性が低下しているものである。
【００２８】
ここでＰＵＬ遺伝子とは、デンプンのα-1,6グルコシド結合によって作られた枝を切る枝切り酵素（Debranching enzyme(ＤＢＥ)）の１つであるプルラナーゼ（ＰＵＬタンパク質）をコードする遺伝子であればよい。
【００２９】
本発明においては、ＰＵＬ遺伝子はイネ由来のプルラナーゼをコードする遺伝子であればよく、コードするＰＵＬタンパク質がプルラナーゼとしての機能を有する限りその変異体も含まれる。イネのＰＵＬ遺伝子は、図１に示されるように、２５のイントロンと、２６のエキソンとから構成される。図１中、黒く塗りつぶしたボックスはエキソン、斜線で表されるボックスはイントロンを示す。なお、図１の左下に示すスケールバーは、１ｋｂの塩基長を示す。
【００３０】
かかるＰＵＬ遺伝子としては、例えば、配列番号２に示される塩基配列からなる遺伝子をオープンリーディングフレームとして有するＰＵＬ遺伝子を挙げることができる。なお、配列番号２に示される塩基配列は、イネＰＵＬ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッションナンバーＤ５０６０２）である。また、ＰＵＬ遺伝子は、配列番号２に示される塩基配列と必ずしも同一の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する必要はなく、プルラナーゼ活性を有する酵素またはその断片をコードする遺伝子であれば、その変異体も含まれる。このような変異体としては、上記配列番号２に示される塩基配列からなる遺伝子をオープンリーディングフレームとして有するＰＵＬ遺伝子の塩基配列において１または複数個の塩基が欠失、置換、または付加した変異体が挙げられる。
【００３１】
また、かかるＰＵＬ遺伝子としては、例えば、配列番号１に示される塩基配列からなる遺伝子を挙げることができる。なお、配列番号１に示される塩基配列からなる遺伝子は、イネＰＵＬ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッションナンバーＡＢ０１２９１５）である。また、ＰＵＬ遺伝子は、配列番号１に示される塩基配列と必ずしも同一の塩基配列からなる必要はなく、プルラナーゼ活性を有する酵素またはその断片をコードする遺伝子であれば、その変異体も含まれる。このような変異体としては、上記配列番号１に示される塩基配列において１または複数個の塩基が欠失、置換、または付加した変異体が挙げられる。
【００３２】
本発明のイネ変異体は、かかるＰＵＬ遺伝子に変異を有することにより、野生型と比較してプルラナーゼ活性が低下している。「ＰＵＬ遺伝子に変異を有する」とは、野生型と比較してプルラナーゼ活性が低下されるように変異を有していれば、特に限定されるものではなく、いかなる変異であってもかまわない。係る変異としては、例えば、トランスポゾンの挿入による突然変異誘発法、化学突然変異源処理、放射線やイオンビーム等の照射による変異誘発等の方法によって誘発された変異を挙げることができる。これらにより誘発された変異を有することにより、単離された変異体はいわゆる組換え植物として扱わなくて良いため、一般圃場での栽培が可能となる。
【００３３】
中でも、上記変異は、トランスポゾンがＰＵＬ遺伝子に挿入されていることによるものであることが好ましい。すなわち、本発明に係るイネ変異体は、トランスポゾンがＰＵＬ遺伝子に挿入されているイネ変異体であって、野生型と比較してプルラナーゼ活性が低下しているものであることが好ましい。かかるイネ変異体では、ＰＵＬ遺伝子にトランスポゾンが挿入されていることにより、プルラナーゼ活性が低下している。
【００３４】
トランスポゾンは転移性遺伝要素の一種であり、染色体上を転移し、異なる場所に挿入する。多くの植物において、多種類のトランスポゾンが複製された状態で存在する。また、内在性のトランスポゾンが存在することも知られている。トウモロコシでは、１０種類以上の転移活性を有する内在性のトランスポゾンが知られている。このようなトランスポゾンに対応する配列は、イネゲノム上にも存在することが知られているが、これらのトランスポゾンのほとんどの配列は転移活性を失っている。
【００３５】
本発明に係るイネ変異体に利用可能なトランスポゾンは、植物に存在するトランスポゾンであれば特に限定されるものではない。すなわち、公知のトランスポゾンのみならず、今後新たに見出されるトランスポゾンも利用することができる。かかるトランスポゾンとしては、例えば、イネのＴｏｓ１７、タバコのＴｎｔ１、トウモロコシのＢｓ１、Ａｃ／Ｄｓ、Ｅｎ−Ｓｐｍ、Ｍｕ等を挙げることができる。中でも、本発明に係るイネ変異体に利用可能なトランスポゾンは、イネゲノム上に存在するトランスポゾンであることがより好ましい。また、かかるトランスポゾンはレトロトランスポゾンであってもよい。レトロトランスポゾンは、いったんＲＮＡに転写された遺伝情報が、逆転写酵素の働きで相補的なＤＮＡに逆転写され、それがさらにＤＮＡ中に挿入された転移性遺伝因子の一種をいう。レトロトランスポゾンは、制御のしやすさや安全性の高さから本発明において好適に用いることができる。植物では多くのレトロトランスポゾンが存在し、イネでは４０種類以上が存在していることが知られている。これらのレトロトランスポゾンのうち、その一部は培養によって活性化されている。かかるレトロトランスポゾンの具体的な一例としては、例えば、イネのＴｏｓ１７、タバコのＴｎｔ１、トウモロコシのＢｓ１等を挙げることができる。本発明に係るイネ変異体に利用可能なトランスポゾンとしては、このように培養によって活性化されたものを好適に用いることができる。なかでも、カルス培養等、培養した時のみに活性化され、ゲノム中の別の部位に新たに転移して遺伝子を破壊後、カルスを植物体に戻すと不活化されるようなトランスポゾンであることが好ましい。これにより、トランスポゾンとしての活性を人為的に制御することが可能となり、また、転移したトランスポゾンは後代まで維持することが可能となる。
【００３６】
本発明のイネ変異体は、ＰＵＬ遺伝子に変異を有することにより野生型と比較してプルラナーゼ活性が低下している。ここで、野生型と比較してプルラナーゼ活性が低下しているとは、野生型と比較してＰＵＬ遺伝子の発現が減少することによりプルラナーゼ活性が低下していること、および／または、野生型イネと比較して不活性なプルラナーゼが合成されることによりプルラナーゼ活性が低下していることをいう。なお、本発明のイネ変異体は、ＰＵＬ遺伝子に変異を有することにより、上述した意味で野生型と比較してプルラナーゼ活性が低下していればよいが、上記変異が、トランスポゾンがＰＵＬ遺伝子に挿入されていることによるものである場合は、野生型と比較してプルラナーゼ活性が低下しているとは、野生型と比較してＰＵＬ遺伝子の発現が減少することによりプルラナーゼ活性が低下していることをいう。
【００３７】
また、ＰＵＬ遺伝子の発現が減少するとは、対応する野生型イネと比較して、内在性のＰＵＬ遺伝子の転写産物の量、または、翻訳産物であるＰＵＬタンパク質の量が減少することをいう。また、減少するとは、野生型イネにおける転写産物または翻訳産物の量を１００％としたときに、イネ変異体におけるＰＵＬ遺伝子の転写産物の量、または、翻訳産物であるＰＵＬタンパク質の量が、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは１５％以下、特に好ましくは１０％以下に減少していることをいう。したがって、上記ＰＵＬ遺伝子の転写産物の量、または、翻訳産物であるＰＵＬタンパク質の量が５％以下に減少している場合や、全く生産されない場合をも含む。ＰＵＬ遺伝子の転写産物の量、または、翻訳産物の量の減少を決定するための方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。かかる方法としては、転写産物の量の減少を決定するためには、例えば、ノーザンブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲ等を用いることができる。また、翻訳産物の量の減少を決定するためには、例えば、ウエスタンブロット法、SDS-PAGE等を用いることができる。ＰＵＬタンパク質は約１００ｋＤａであり、胚乳抽出液等の抽出液をSDS-PAGEし、例えばＣＢＢ染色しただけで、バンドを検出することができる。
【００３８】
また、合成されたプルラナーゼ酵素の活性の低下を決定するための方法も、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。かかる方法としては、例えば、プルランを基質にして反応させ還元末端をSomogy-Nelson法で定量する方法（例えば、非特許文献５参照。）、Native-PAGE/DBE活性染色法（例えば、非特許文献６参照。）等を挙げることができる。また、酵素活性の低下とは、野生型イネにおける酵素活性より低下していればよいが、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは１５％以下、特に好ましくは５％以下に酵素活性が低下することをいう。したがって、合成されたプルラナーゼ酵素の活性が０である場合も含む。
【００３９】
本発明に係るイネ変異体は、ＰＵＬ遺伝子に変異を有することにより、プルラナーゼ活性が低下しているものである限り、かかる変異をＰＵＬ遺伝子のどの位置に有していてもよく、イントロン領域であってもよいし、エキソン領域であってもよい。
【００４０】
また、本発明に係るイネ変異体が、ＰＵＬ遺伝子に上述したようなトランスポゾンが挿入されていることにより、プルラナーゼ活性が低下しているものである場合、プルラナーゼ活性が低下しているものである限り、トランスポゾンはＰＵＬ遺伝子のどの位置に挿入されていてもよく、イントロン領域であってもよいし、エキソン領域であってもよい。
【００４１】
中でも、本発明に係るイネ変異体は、上記変異を、例えば、ＰＵＬ遺伝子のエキソン１０またはイントロン１６に有していることが好ましい。これにより、プルラナーゼ活性を低下させることができる。
【００４２】
また、上記トランスポゾンは、例えば、ＰＵＬ遺伝子のエキソン１０またはイントロン１６に挿入されていることが好ましい。トランスポゾンが、ＰＵＬ遺伝子のかかる位置に挿入されていることにより、プルラナーゼ活性を低下させることができる。
【００４３】
例えば、後述する実施例に示す、プルラナーゼ活性が低下しているイネ変異体では、トランスポゾンは、エキソン１０の６０番目の塩基と６１番目の塩基との間、または、イントロン１６の７１９番目の塩基と７２０番目の塩基との間に挿入されている。また、いいかえれば、後述する実施例に示す、プルラナーゼ活性が低下しているイネ変異体では、トランスポゾンは、配列番号１に示す塩基配列からなるＰＵＬ遺伝子において、５４５７番目の塩基と５４５８番目の塩基との間、または、９９０７番目の塩基と９９０８番目の塩基との間に挿入されていてもよい。もちろん、トランスポゾンが挿入されている位置は、これらに限定されるものではなく、プルラナーゼ活性を有する酵素またはその断片をコードするＰＵＬ遺伝子の変異体における対応する位置に挿入されていてもよい。このようなＰＵＬ遺伝子の変異体としては、上記配列番号１に示される塩基配列において１または複数個の塩基が欠失、置換、または付加した変異体が挙げられる。
【００４４】
また、本発明に係るイネ変異体では、プルラナーゼの活性が低下し、且つ、プルラナーゼ以外の他のデンプン合成系の酵素の活性は低下していないことが好ましい。これにより、変異体を用いてＰＵＬの機能を解析する場合、プルラナーゼ活性の減少のみを考慮に入れて実験結果を考察することができる。かかるプルラナーゼ以外の他のデンプン合成系の酵素としては、特に限定されるものではないが、例えば、イネのホスホリラーゼ、スターチシンターゼ（ＳＳ）、枝作り酵素（ＢＥ）、枝切り酵素（ＤＢＥ）等を挙げることができる。より具体的には、枝作り酵素（ＢＥ）としては、ＢＥのアイソザイムであれば特に限定されるものではないが、例えば、ＢＥＩ、ＢＥＩＩａ、ＢＥＩＩｂ等を挙げることができる。また、スターチシンターゼ（ＳＳ）としては、ＳＳのアイソザイムであれば特に限定されるものではないが、例えば、ＳＳＩ、ＳＳＩＩａ、ＳＳＩＩＩａ、ＧＢＳＳＩ等を挙げることができる。また、枝切り酵素（ＤＢＥ）としても、ＤＢＥのアイソザイムであれば特に限定されるものではないが、例えば、ＩＳＡ１、ＩＳＡ２等を挙げることができる。
【００４５】
また、本発明者らは、ＰＵＬ遺伝子に変異を有することにより、あるいは、その一例として、上述したようなトランスポゾンが挿入されていることにより、プルラナーゼ活性が低下しているイネ変異体は、野生型と比較して、改変されたデンプンを合成することを見出した。これにより、本発明に係るイネ変異体に、かかる改変されたデンプンを合成させることにより、新規なデンプン材料を提供することが可能となる。また、合成されたデンプンの鎖長分布、種子の形態・重量、胚乳デンプン粒の形態・大きさ・結晶性、糊化温度特性等の諸特性を解析することにより、ＰＵＬ遺伝子の機能を明らかにするための研究に資することができる。
【００４６】
上記改変されたデンプンとは、少なくとも、野生型が合成するデンプンと比較して糊化温度が低下したものであることが好ましい。ここで、糊化温度とは、糊化が開始する温度である糊化開始温度であってもよいし、糊化がピークに達する温度である糊化ピーク温度であってもよいし、糊化が終了する温度である糊化終了温度であってもよい。かかる糊化温度の低下の程度、すなわち、本発明のイネ変異体により合成されるデンプンの糊化温度と野生型が合成するデンプンの糊化温度との差は、０より大きく８℃以下であることが好ましく、１℃以上５℃以下であることがより好ましく、１℃以上３℃以下であることがさらに好ましい。従来から、糊化温度が野生型イネと比較して、低下または上昇したデンプンを合成するイネ変異体の例についての報告がいくつかあるが、本発明における上述した糊化温度の低下の程度は、低下の程度が非常に小さい部類に入る。例えば、野生型と変異体との糊化温度の差が大きい例としては、Nakamura et al. (2002) starch 54: 117-131（最大２０℃）やTakaka et al. (2004) Plant Biotech. J. 507-516（最大２５℃）がある。それゆえ、本発明に係るイネ変異体は、野生型イネが合成するデンプンと比較して、糊化温度の低下の程度が比較的小さいデンプンを提供することができ、デンプン材料の種類の豊富化が実現できるという効果を奏する。
【００４７】
また、上記改変されたデンプンは、野生型が合成するデンプンと比較して糊化温度が低下したものであることが好ましいが、これはアミロペクチンの化学構造の相違によるものである可能性が高いと考えられる。
【００４８】
また、本発明に係るプルラナーゼ活性が低下しているイネ変異体は、野生型と比較して改変されたデンプンを合成することが好ましいが、本発明のイネ変異体は、野生型と比較して改変されたデンプンを合成し、且つ、他の形質については改変されていないイネ変異体であることが好ましい。これにより、本発明のイネ変異体を育種母本として用いた場合、他の形質についての好ましくない改変を改善する労力を軽減することが可能となる。ここで、上記他の形質としては、特に限定されるものではないが、例えば、種子重量、開花日、胚乳デンプン粒の形態、胚乳デンプンの結晶性、これらのうちの２以上の組み合わせ等を挙げることができる。
【００４９】
なお、本発明におけるイネ変異体には、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれる。つまり、本発明では、最終的に植物個体まで成育させることができる状態のものであれば、全てイネ変異体に含める。また、上記植物細胞には、種々の形態の植物細胞が含まれる。かかる植物細胞としては、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片等が含まれる。これらの植物細胞を増殖・分化させることにより植物体を得ることができる。なお、植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて、従来公知の方法を用いて行うことができる。
【００５０】
また、本発明に係るプルラナーゼ活性が低下しているイネ変異体は、さらに他の形質を改変させる操作を行うことにより、他の１以上の形質についても改変されている二重変異体等の多重変異体であってもよい。かかる多重変異体を用いることにより、ＰＵＬ遺伝子あるいは他の遺伝子の機能をより明確にすることが可能となる。
【００５１】
また、本発明に係るデンプンは、上記イネ変異体により合成されるデンプンである。かかるデンプンは、上述したように改変されたデンプンであって、新規なデンプン材料を提供するものである。本発明のデンプンは、本発明のイネ変異体が合成するものであれば、いかなる部分から得られるものであってもよいが、例えば、胚乳デンプンであることが好ましい。
【００５２】
（２）改変されたデンプンを合成するイネ変異体の生産方法
本発明に係るイネ変異体の生産方法としては、特に限定されるものではないが、例えば活性化されたトランスポゾンをイネのゲノムに導入し、当該トランスポゾンがＰＵＬ遺伝子に挿入されているイネ変異体を選抜することにより生産することができる。
【００５３】
すなわち、本発明に係るイネ変異体の生産方法は、活性化されたトランスポゾンをイネのゲノムに導入する工程と、当該トランスポゾンがＰＵＬ遺伝子に挿入されているイネ変異体を選抜する工程とを含む。
【００５４】
また、本発明者らは、例えば、かかる方法によって得られたイネ変異体が、改変されたデンプンを合成することを見出した。したがって、本発明には、改変されたデンプンを合成するイネ変異体の生産方法も含まれる。以下、活性化されたトランスポゾンをイネのゲノムに導入する工程と、当該トランスポゾンがＰＵＬ遺伝子に挿入されているイネ変異体を選抜する工程の順に説明する。
【００５５】
活性化されたトランスポゾンをイネのゲノムに導入する工程は、活性化されたトランスポゾンをイネのゲノムに導入することができる方法であれば、特に限定されることなく、従来公知のトランスポゾンの導入法を用いることができる。かかる方法としては、例えば、細胞工学別冊  植物細胞工学シリーズ４１  植物のゲノム研究プロトコール（秀潤社）P66-67, 73-75に記載されている方法等を挙げることができる。
【００５６】
また、用いるトランスポゾンについては、上記（１）で説明した通りであるので、ここでは説明を省略する。
【００５７】
また、活性化されたトランスポゾンをイネのゲノムに導入する工程を省いて、すでに作成されているミュータントパネルを用いてもよい。かかるミュータントパネルとしては、トランスポゾンがイネ遺伝子に挿入され、遺伝子が破壊されたミュータント集団であれば特に限定されるものではない。
【００５８】
上記トランスポゾンがＰＵＬ遺伝子に挿入されているイネ変異体を選抜する工程としては、例えば、ＰＵＬ遺伝子の領域に上記トランスポゾンが挿入されているイネ変異体を選抜する方法を用いることができる。ＰＵＬ遺伝子の領域に上記トランスポゾンが挿入されているか否かを検出する方法としては特に限定されるものではなく、公知の方法を適宜選択して用いればよく、例えば、核酸増幅反応を好適に用いることができる。かかる方法の一例としては、細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ２、植物のPCR実験プロトコールのP153-156に記載されている方法を用いることができる。
【００５９】
核酸増幅反応を用いる方法としては、例えば、使用するトランスポゾンの塩基配列に基づいて設計されるプライマーと、ＰＵＬ遺伝子上の塩基配列に基づいて設計されるプライマーとのセットを用いて、ＤＮＡを鋳型として核酸増幅反応を行い、増幅産物の有無を確認する方法を挙げることができる。
【００６０】
ここで、ＰＵＬ遺伝子上の塩基配列に基づいて設計されるプライマーとしては、特に限定されるものではないが、使用するトランスポゾンの塩基配列に基づいて設計されるプライマーとのセットで、ＰＵＬ遺伝子全体をサーベイできるように、複数のプライマーを設計することが好ましい。また、ＰＵＬ遺伝子上の塩基配列に基づいて設計されるプライマーと、トランスポゾンの塩基配列に基づいて設計されるプライマーとは、これらを組み合わせたプライマーセットにより核酸増幅が可能な向きに設計されていればよい。
【００６１】
核酸増幅反応の鋳型ＤＮＡは活性化されたトランスポゾンがゲノムに導入されたイネの個体から調製したＤＮＡである。また、活性化されたトランスポゾンがゲノムに導入されたイネの個体からＤＮＡを調製する方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法を用いればよい。
【００６２】
核酸増幅反応は、公知の核酸増幅手段を適宜選択して用いればよい。具体的には、例えば、ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＵＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、プライマーエクステンション法等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。中でもＰＣＲ法が、本原料品種判定方法に用いる増幅方法として好適である。
【００６３】
もちろん、上記トランスポゾンがＰＵＬ遺伝子に挿入されているイネ変異体を選抜する方法としては、これに限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。
【００６４】
以上のようにして選抜された、イネ変異体は、例えば、カルスを再分化させることにより、植物個体として得ることができる。多くのトランスポゾンはこの再分化の段階で活性を失う。それゆえ転移したトランスポゾンは後代まで維持することが可能となる。
【実施例１】
【００６５】
〔実施例１：ミュータントパネルからのＰＵＬ遺伝子にＴｏｓ１７トランスポゾンが挿入されている系統の選抜〕
ミュータントパネルは、（独）農業生物資源研究所によって開発された日本晴のノックアウトイネ集団であり（細胞工学別冊  植物細胞工学シリーズ41  植物のゲノム研究プロトコール（秀潤社）P66-67, 73-75）、このミュータントパネルから、ＰＵＬ遺伝子にＴｏｓ１７トランスポゾンが挿入されている系統を選抜した。
【００６６】
まず、イネＰＵＬ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッションナンバーＡＢ０１２９１５）に基づいて、イネＰＵＬ遺伝子のゲノムＤＮＡ上のプライマーを８箇所（１０Ｆ、１１Ｆ、９Ｒ、１３Ｒ、５Ｆ、６Ｆ、１Ｒ、２Ｒ）設計した。設計したイネＰＵＬ遺伝子上のプライマーの塩基配列およびＰＵＬ遺伝子ゲノムＤＮＡ（ＡＢ０１２９１５）上の番号を以下の表１に示す。また、Ｔｏｓ１７配列上のプライマーとして、両端のＬＴＲ配列に外向きに２箇所（Ｔ１Ｆ、Ｔ２Ｆ）プライマーを設計した。設計したＴｏｓ１７配列上のプライマーの塩基配列を以下の表２に示す。また、イネＰＵＬ遺伝子の構造を示す図１に、用いたプライマーのイネＰＵＬ遺伝子上およびＴｏｓ１７配列上の位置を模式的に示す。
【００６７】
【表１】
2007020475.tif 000002
【００６８】
【表２】
2007020475.tif 000003
【００６９】
ミュータントパネル約４万個体の葉身ＤＮＡプールをテンプレートにして、イネＰＵＬ遺伝子上のプライマーとＴｏｓ１７配列上のプライマーとを用いてネステッドＰＣＲを行った。プライマーの組み合わせとしては、Ｔ１Ｆ、Ｔ２Ｆ／１０Ｆ、１１Ｆと、Ｔ１Ｆ、Ｔ２Ｆ／１Ｒ、２Ｒとを用いた。すなわち、Ｔ１Ｆ、Ｔ２Ｆ／１０Ｆ、１１Ｆを用いることで、ＰＵＬ遺伝子の５’側半分をサーベイし、Ｔ１Ｆ、Ｔ２Ｆ／１Ｒ、２Ｒを用いることで、ＰＵＬ遺伝子の３’側半分をサーベイした。
【００７０】
Ｔ１Ｆ、Ｔ２Ｆ／１０Ｆ、１１Ｆ、および、Ｔ１Ｆ、Ｔ２Ｆ／１Ｒ、２Ｒをプライマーとして用いたネステッドＰＣＲで、それぞれ増幅が検出されたので、それぞれの増幅断片につき、さらにそれぞれ、ＰＵＬ遺伝子断片プローブＡ（配列番号２に示されるＰＵＬ ｃＤＮＡ塩基配列の1-1396番目の塩基）およびプローブＢ（配列番号２に示されるＰＵＬ ｃＤＮＡ塩基配列の1972-2892番目の塩基）をプローブとしてサザンブロッティングを行い、ＰＣＲによって増幅した断片がＰＵＬ遺伝子を含んでいるかどうかを確認した。なお、プローブＡおよびプローブＢのＰＵＬ遺伝子上の位置を図１に示す。
【００７１】
また、上記ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を、Ｔｏｓ１７上のプライマーからシークエンスし、Ｔｏｓ１７のＰＵＬ遺伝子上の挿入位置を決定した。その結果、図１に示すように、Ｔｏｓ１７は、イネＰＵＬ遺伝子のエキソン１０およびイントロン１６に挿入されていることが判った。以上のようにして、Ｔｏｓ１７が挿入されているイネ変異体の候補系統（ＮＣ６３５３およびＮＦ６４６９）を選抜することができた。
【００７２】
〔実施例２：イネ変異体ホモ個体の選抜〕
ＰＵＬ遺伝子のエキソン１０にＴｏｓ１７が挿入されている系統（以下本明細書において、e10系統と略称することがある。）およびＰＵＬ遺伝子のイントロン１６にＴｏｓ１７が挿入されている系統（以下、本明細書においてi16系統と略称することがある。）の再分化世代（Ｍ０）に稔った種子（Ｍ１種子）２０粒を播種した。幼植物の葉身からゲノミックＤＮＡを抽出し、これを鋳型にしてイネＰＵＬ遺伝子ゲノムＤＮＡ上の上記プライマーを用いてＰＣＲを行うことでＴｏｓ１７の挿入と非挿入を確認した。確認は、e10系統については、挿入ホモをプライマーＴ１Ｆ、Ｔ２Ｆ／１０Ｆ、１１Ｆで、非挿入ホモを１０Ｆ、１１Ｆ／１３Ｒ、９ＲでＰＣＲを行い、それぞれの個体の遺伝子型（挿入ホモを-/-、非挿入ホモを+/+と示す）を決定した。また、i16系統については、挿入ホモをプライマーＴ１Ｆ、Ｔ２Ｆ／１Ｒ、２Ｒで、非挿入ホモを５Ｆ、６Ｆ／１３Ｒ、９ＲでＰＣＲを行い、それぞれの個体の遺伝子型（挿入ホモを-/-、非挿入ホモを+/+と示す）を決定した。開花後、これらの植物を温室に移動し、登熟種子および完熟種子を採取した。
【００７３】
〔実施例３：ＰＵＬ活性の測定と他酵素への影響の調査〕
実施例２で選抜したイネ変異体ホモ個体の登熟種子１粒のＰＵＬ活性を、Native-ＰＡＧＥ／ＤＢＥ活性染色法およびＰＵＬ活性染色法を用いて行った。開花後１０日ないし１５日経過後の登熟種子１粒のもみ、胚および果皮を除去し、４倍体積の抽出バッファー(50 mM Imidazol-HCl、 pH 7.4、 12.5％ glycerol、 8 mM MgCl2、 500 mM 2-mercaptoethanol)を加え、マイクロチューブ内でプラスチック製ホモジナイザー（グライナー社製）を用いてホモジナイズし、15000 rpm、10 min、４℃で遠心分離して得た上清にNative-ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（0.3 M Tris-HCl (pH7.0)、 0.1％ ブロモフェノールブルー、50％グリセロール）を１／２体積加えて電気泳動に用いた。電気泳動においては、ＤＢＥ活性染色用にはジャガイモアミロペクチンを、ＰＵＬ活性染色の場合はレッドプルランを60℃で溶かし込んだ7.5％アクリルアミドゲルを用いた．フロントが濃縮ゲルを通過するまでは7.5 mA、通過してからは15 mAの定常電流で４℃下で電気泳動し，フロントが出てから30分で電流を止めた。その後，反応液（50 mMクエン酸、 pH 6.0、 50 mM 2-mercaptoethanol）で２回洗浄し（各5分）、反応液を加えて30℃でシーソーで振とうしながら2時間反応させた。反応後，ヨードヨードカリ液（1％KI/0.1％I2）で染色した。さらに、ＢＥ活性染色（Nishi et al. (2001) Plant Physiol. 127:459-472）およびＳＳ活性染色（Nishi et al. (2001) Plant Physiol. 127:459-472）も行い、デンプン合成に関連する他の酵素へのＰＵＬ活性低下の影響を調べた。
【００７４】
図２にＤＢＥ活性測定およびＰＵＬ活性測定の結果を示す。図２中、（ａ）、（ｂ）ではアクリルアミドゲルにアミロペクチンを、（ｃ）ではレッドプルランを溶かし込んで用いた。図２（ａ）は、e10系統の挿入ホモ（-/-）、非挿入ホモ（+/+）、および日本晴の登熟種子の可溶性画分のNative-ＰＡＧＥを行い、その後、ＤＢＥ活性染色を行った結果を示す図である。図２（ａ）中の数字は、可溶性画分のアプライ量（単位：μｌ）を示す。図２（ａ）に示すように、日本晴および非挿入ホモ（+/+）では、ＰＵＬ活性を示すバンドが認められるが、挿入ホモ（-/-）ではこのバンドが欠失していることが判る。すなわち、ＰＵＬ遺伝子のエキソン10にＴｏｓ１７が挿入されることで、ＰＵＬ活性は完全に失活した。
【００７５】
図２（ｂ）は、i16系統の挿入ホモ（-/-）および日本晴の登熟種子の可溶性画分のNative-ＰＡＧＥを行い、その後、ＤＢＥ活性染色を行った結果を示す図である。なお、図２（ｂ）中、挿入ホモ（-/-）の４レーンは異なる種子に由来する。図２（ｂ）に示すように、i16系統の挿入ホモ（-/-）では、ＰＵＬ活性を示すバンドは、わずかに残っていることが判る。
【００７６】
図２（ｃ）は、i16系統の挿入ホモ（-/-）、非挿入ホモ（+/+）、および日本晴の登熟種子の可溶性画分のNative-ＰＡＧＥを行い、その後、ＰＵＬ活性染色を行った結果を示す図である。図２（ｃ）中、数字は可溶性画分のアプライ量（単位：μｌ）を示す。ＰＵＬバンドは、プルランを分解できるため無色のバンドとなって現われる。図２（ｃ）に示すように、i16系統の挿入ホモ（-/-）は、非挿入ホモ（+/+）と比べて、ＰＵＬ活性が１／１６（約６％）に低下していた。すなわち、ＰＵＬ遺伝子のイントロンi16にＴｏｓ１７が挿入されていることで、ＰＵＬ活性が6％にまで低下することが明らかになった。
【００７７】
一方、Native-ＰＡＧＥ／ＢＥ活性染色およびNative-ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色を行った結果、ＰＵＬ活性の低下は、これらの方法で検出されるアイソザイム、即ち、BEI、BEIIa、BEIIb、Phosphorylase、SSI、およびSSIIIa活性には影響を与えないことが明確になった。
【００７８】
図３（ａ）にNative-ＰＡＧＥ／ＢＥ活性染色の結果を示す。イネには３つのＢＥアイソザイムが存在し、Native-ＰＡＧＥ／ＢＥ活性染色によって、これら３種類のアイソザイムとホスホリラーゼ（Phosphorylase）の活性を検出することができる。図３（ａ）に示すように、e10系統の挿入ホモ（-/-）（e10変異体）では、いずれのアイソザイムの活性も日本晴や非挿入ホモ（+/+）と比較して変わらなかった。これに対して、トウモロコシのＰＵＬ変異体では、BEIIa活性が低下することが知られており（非特許文献９）、この点は、イネがトウモロコシと異なる点である。
【００７９】
図３（ｂ）にNative-ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色の結果を示す。イネには多数のＳＳアイソザイムが存在し、そのうち、胚乳の可溶性画分に検出される主要なアイソザイムはSSIおよびSSIIIaである。図３（ｂ）に示すように、e10系統の挿入ホモ（-/-）（e10変異体）では、いずれのアイソザイムの活性も非挿入ホモ（+/+）と比較して殆ど変化が見られなかった。
【００８０】
〔実施例４：ＰＵＬ変異体の解析〕
＜４−１：胚乳アミロペクチンの鎖長分布解析＞
ＰＵＬ変異体および非挿入ホモ（+/+）の胚乳デンプンのアミロペクチンの鎖長分布を比較した。胚乳デンプンのアミロペクチンの鎖長分布は、O'Shea and Morell（1996. Electrophoresis, 17, 681-688）の方法を参考に以下のようにして解析を行った。ＰＵＬ変異体および非挿入ホモ（+/+）のＭ２種子１粒から外内穎および胚を取り除き、ペンチで胚乳を粉砕した後、エッペンドルフチューブ内でプラスチック製ホモジナイザー（グライナー社製）を用いてさらに磨砕し、5 mlのメタノールを加え、10分間煮沸した。2500 x gで10分間遠心分離し、上清を除去し、90％ メタノールを5 ml加え2度洗浄した。沈殿に15 μlの5 N 水酸化ナトリウムを加え、5分間煮沸してデンプンを糊化させた。糊化液を氷酢酸9.6μlで中和した後、蒸留水1089 μl、0.6 M 酢酸緩衝液（pH 4.4）100μl、2％ アジ化ナトリウム 15μl、P. amyloderamosa イソアミラーゼ（EC 3.2.1.68, 林原生物化学研究所）3μl（約210 unit）を加え、スターラーバーで撹拌しながら37℃、8時間以上反応した。さらにイソアミラーゼ 3μlを追加して8時間以上反応した後、常温で10000 x gで遠心分離し、上清を脱イオンカラム（AG501-X8(D), Bio-Rad）で濾過した。α-グルカン鎖の非還元末端を蛍光標識するため、Hizukuriら（1981. Carbohydrate Reserch, 94, 205-213）の方法により試料中の糖含量を定量し5 nmol相当の還元末端をもつα-グルカン鎖を遠心濃縮機で乾燥させ、2μlの1-アミノピレン-3,6,8-三硫酸塩（APTS）溶液（2.5％ APTS, 15％ 酢酸）、2μlのシアン化ホウ素ナトリウム溶液（1 M シアン化ホウ素ナトリウム, 100％ テトラヒドロフラン）を添加し、55℃で90分間反応させた。分析時には12.5倍に蒸留水で希釈して用いた。鎖長分布解析は、キャピラリー電気泳動装置（P/ACE MDQ, Beckman Coulters）を用いて行った。グルコース重合度(DP)3以上の各ピーク面積を数値化し、DP50までのピーク面積の合計を100％としたときの各DPの割合(Area ％)を算出した。
【００８１】
図４に、ＰＵＬ変異体および非挿入ホモ（+/+）の胚乳デンプンのアミロペクチンの鎖長分布を比較した結果を示す。図４（ａ）に示ように、ＰＵＬ変異体のe10-/-およびi16-/-をそれぞれのコントロールであるe10+/+およびi16+/+と比較したところ、胚乳アミロペクチンの鎖長分布に差はほとんど見られなかった。差を明確にするため、-/-から+/+を引いたグラフを図４（ｂ）に示したが、やはり差はほとんど見られなかった。これに対して、ＰＵＬと同じＤＢＥであるＩＳＡの変異体であるsug-1変異体(EM914)から野生型(T65)を引いたグラフを図４（ｂ）に示したが、ＩＳＡ変異体は、野生型よりDP10以下の短鎖が大幅に増加している。以上のことから、ＰＵＬ活性の低下が胚乳アミロペクチンの鎖長分布に影響を与えないことが明確になった。
【００８２】
＜４−２：胚乳デンプンの糊化温度特性の測定＞
ＰＵＬ変異体および非挿入ホモ（+/+）の胚乳デンプンの糊化温度特性を比較した。胚乳デンプンの糊化温度特性は、以下の方法（非特許文献７）で測定した。ＰＵＬ変異体および非挿入ホモ（+/+）のＭ２種子のもみおよび胚を除去し、乳鉢で粉砕したものを105℃で2時間乾燥させた。乾燥させた粉末約3 mgに蒸留水9μlを加えたものをアルミ容器に入れて示差走査熱量測定（DSC、セイコーインスツルメンツ社製）に供した。昇温速度は3℃／minで5℃と100℃との間で測定した。
【００８３】
下表１にＰＵＬ変異体および非挿入ホモ（+/+）の胚乳デンプンの糊化開始温度、糊化ピーク温度、糊化終了温度を示す。
【００８４】
【表３】
2007020475.tif 000004
【００８５】
表３に示すように、ＰＵＬ変異体e10、 i16の糊化開始温度、糊化ピーク温度、糊化終了温度は、非挿入ホモ（+/+）よりそれぞれe10変異体が1.7℃、1.0℃、2.3℃、i16変異体が2.0℃、2.1℃、3.7℃低かった。一般に、糊化温度の変化はアミロペクチンの構造の変化が原因であると考えられており、DP10以上15以下の短鎖が多いと糊化温度が低下し、少ないと上昇する傾向にある（Nakamura et al. (2002) Starch 54: 117-131）。ＰＵＬ変異体の場合、胚乳アミロペクチンの鎖長分布に変化が見られないにもかかわらず、糊化温度に変化が見られたため、鎖長分布解析では明確にできないアミロペクチンの構造の違いがある可能性がある。
【００８６】
＜４−３：種子の形態と玄米重量の比較＞
ＰＵＬ変異体および非挿入ホモ（+/+）の種子の形態を比較した結果を図５に示す。図５に示すように、ＰＵＬ変異体はe10変異体、i16変異体ともに変化がなかった。日本晴と比べてe10変異体、 i16変異体ともに腹白が増加する傾向にあったが、非挿入ホモ（+/+）も同様に腹白が増加していたので、これはＰＵＬ活性の低下が原因ではないと考えられた。また、玄米１粒あたりの平均重量を下表４に示す。
【００８７】
【表４】
2007020475.tif 000005
【００８８】
表４に示すように、ＰＵＬ変異体と非挿入ホモ（+/+）の間に、玄米重量の顕著な差は見られなかった。なお表４中、ａを付した値は玄米５０粒の平均の重量を、ｂを付した値は玄米２０粒の平均の重量を示す。
【００８９】
＜４−４：胚乳デンプン粒のSEMによる形態観察およびX線回折による結晶性の観察＞
単離したＰＵＬ変異体および非挿入ホモ（+/+）の胚乳デンプンの形態と結晶性を走査電子顕微鏡(SEM)観察およびX線回折によって調べた。これらの分析のためのデンプン粒の調製法および分析法は以下の通りである。
【００９０】
種子50粒の籾を除き、精米器（パーレスト、Kett社）で胚と種子の外側を10％除去し、コーヒーミルで粉末にした。これをさらに乳鉢ですりつぶし、100％メタノールを加えた後、100μmのナイロンメッシュに通した。回収したデンプンを乾燥させ、20倍体積以上の2 ％ SDSを加えて20分間室温で撹拌し、3000 rpm、 20分間、室温で遠心分離し、上清を除去した。この操作を３回行い、除タンパクを行った。SDSを除去するため、蒸留水を加えて混合し、3000 rpm、 20分間、室温で遠心分離する操作を５回繰り返し、さらに100％アセトンで２回同様の操作を行った後、減圧乾燥させた。得られた粉末をSEM(JEOL-5600)で観察した。また、X線回折装置(RINT2000)で回折像を得た。
【００９１】
図６にＰＵＬ変異体および非挿入ホモ（+/+）の胚乳デンプン粒のSEMによる観察結果を示す。図６に示すように、ＰＵＬ変異体の胚乳デンプン粒の大きさ、形態は、非挿入ホモ（+/+）と比較して、顕著な違いは見られなかった。また、図７にＰＵＬ変異体および非挿入ホモ（+/+）の胚乳デンプン粒のX線回折による結晶性の観察結果を示す。図７に示すように、X線回折によるデンプンのピークは、非挿入ホモ（+/+）と比べて違いは見られなかった。以上のことから、イネのＰＵＬ活性の低下および欠失は、胚乳デンプン粒の形態、大きさやデンプンの結晶性に影響を与えないことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
このように、本発明では、ＰＵＬ遺伝子に変異を有し、野生型と比較してプルラナーゼ活性が低下しているイネ変異体を提供する。そしてかかるイネ変異体は改変されたデンプンを合成する。また、本発明はかかる改変されたデンプンを合成するイネ変異体の生産方法をも提供する。それゆえ、本発明は、各種農業やアグリビジネス、さらには農産物を加工する産業やデンプンを原料とする食品産業や医薬品産業、またはデンプンを糊や添加剤の原料として用いる化学工業などに利用可能であり、しかも非常に有用であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】イネＰＵＬ遺伝子の構造、実施例において用いたプライマー、トランスポゾンの挿入位置を模式的に示す図である。
【図２】e10変異体およびi16変異体のＤＢＥ活性測定およびＰＵＬ活性測定の結果を示す図であり、図２（ａ）は、e10系統の挿入ホモ（-/-）、非挿入ホモ（+/+）、および日本晴の登熟種子の可溶性画分のNative-ＰＡＧＥを行い、その後、ＤＢＥ活性染色を行った結果を示す図であり、図２（ｂ）は、i16系統の挿入ホモ（-/-）および日本晴の登熟種子の可溶性画分のNative-ＰＡＧＥを行い、その後、ＤＢＥ活性染色を行った結果を示す図であり、図２（ｃ）は、i16系統の挿入ホモ（-/-）、非挿入ホモ（+/+）、および日本晴の登熟種子の可溶性画分のNative-ＰＡＧＥを行い、その後、ＰＵＬ活性染色を行った結果を示す図である。
【図３】e10変異体のデンプン合成関連酵素の活性測定の結果を示す図であり、図３（ａ）はNative-ＰＡＧＥ／ＢＥ活性染色の結果を示す図であり、図３（ｂ）はNative-ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色の結果を示す図である。
【図４】ＰＵＬ変異体および非挿入ホモ（+/+）の胚乳デンプンのアミロペクチンの鎖長分布を比較した結果を示すグラフであり、図４（ａ）は、e10-/-およびi16-/-をそれぞれのコントロールであるe10+/+およびi16+/+と比較したグラフであり、図４（ｂ）は、-/-から+/+を引いたグラフである。
【図５】ＰＵＬ変異体および非挿入ホモ（+/+）の種子の形態を比較した結果を示す図である。
【図６】ＰＵＬ変異体および非挿入ホモ（+/+）の胚乳デンプン粒のSEMによる観察結果を示す図である。
【図７】ＰＵＬ変異体および非挿入ホモ（+/+）の胚乳デンプン粒のX線回折による結晶性の観察結果を示す図である。
【図１】
2007020475.tif 000006
【図４】
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【図７】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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