(57)【要約】  【課題】  簡易かつ安全に行うことができ、自動化が容易であり、比較的小型の装置などにも適用できる核酸分離手段を提供すること。  【解決手段】  本発明では、生物試料を陽イオン性界面活性剤で処理した後、電気泳動を行うことにより、生物試料から核酸を分離する核酸分離方法を提供する。生物試料を陽イオン性界面活性剤で処理した後、電気泳動を行うことにより、電気泳動を行った際、核酸を所定の領域に留まらせ、タンパク質及び脂質を陰極側に移動させることができる。即ち、タンパク質及び／又は脂質を含有する生物試料から、核酸を分離することができる。本発明は、ＤＮＡチップなどを用いた遺伝子検出方法にも適用できる。  【選択図】  図２
2007020440.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物試料を陽イオン性界面活性剤で処理した後、電気泳動を行うことにより、生物試料から核酸を分離する核酸分離方法。
【請求項２】
タンパク質及び／又は脂質を含有する生物試料から、核酸を分離することを特徴とする請求項１記載の核酸分離方法。
【請求項３】
電気泳動を行った際、核酸を所定の領域に留まらせ、タンパク質を陰極側に移動させることを特徴とする請求項１記載の核酸分離方法。
【請求項４】
基板表面に複数のウエルが設けられ、前記ウエルには電極が設けられたＤＮＡチップを用いて、
少なくとも下記（１）〜（３）の手順を行うことにより、生物試料中に存在する特定の核酸を検出する核酸検出方法。
（１）各ウエルに生物試料と陽イオン性界面活性剤を供給する手順、
（２）各ウエルにおいて、前記電極間で直流電界を印加することにより電気泳動を行い、生物試料から核酸を分離する手順、
（３）ウエル内に保持又は固定された検出用核酸と、生物試料中に存在する核酸とのハイブリダイゼーションを検出する手順。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分離方法に関する。より詳細には、生物試料を陽イオン性界面活性剤で処理した後、電気泳動を行うことにより、生物試料から核酸を分離する核酸分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年のゲノム解析の進展などに伴い、遺伝子検査を医療現場などに導入する試みが行われている。
遺伝子検査は、生物試料から採取などした核酸について行う検査・解析のことである。遺伝子検査により、遺伝性疾患及びその発症リスク、感染症（病原微生物）、悪性腫瘍などを高精度に検出できる可能性がある。
【０００３】
例えば、人体などから血液や組織を採取し、遺伝子検査を行う場合、血液などの生物試料から、核酸のみを分離・精製する必要がある。
【０００４】
核酸の分離・精製方法としては、例えば、シリカ吸着法、アルカリ−ＳＤＳ法、ＡＧＰＣ法などが知られている。
シリカ吸着法は、核酸をシリカに吸着させて分離する方法である。この方法は、カオトロピックイオン存在下で、核酸がシリカ表面に選択的に吸着する性質を利用している。
アルカリ−ＳＤＳ法は、プラスミドＤＮＡの抽出などに用いられている方法である。まず、ＳＤＳを含むアルカリ性溶液で処理することにより核酸を一本鎖に変性させ、次に、酢酸ナトリウムなどを加えて、タンパク質ＳＤＳ複合体や高分子ＲＮＡなどを沈澱させる。プラスミドＤＮＡは、閉環構造であるため、変性せずに溶液中に残る。
ＡＧＰＣ（Ａｃｉｄ  Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）法は、ＲＮＡの抽出に用いられている方法である。酸性条件下でフェノール抽出を行うことにより、タンパク質を除去し、ＲＮＡを効率で回収することができる。
【０００５】
なお、先行文献として、例えば、特許文献１には、シリカを用いた核酸の精製方法が、特許文献２には、２相分配を利用する核酸の分離方法が、特許文献３には、陽イオン界面活性剤を用いる核酸の分離方法が、それぞれ記載されている。
【特許文献１】特開２００５−１１０５０３号公報
【特許文献２】特開２００３−３３９３７９号公報
【特許文献３】特開平２−９６６３０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来の核酸分離方法は、手順・操作が複雑であり、また、手順中に、遠心処理など比較的大型の装置を用いる必要がある場合が多かった。そのため、手順・操作の自動化が難しく、また、比較的小型の装置などに適用することが難しかった。
【０００７】
加えて、従来の核酸分離方法は、手順中に、有機溶媒やカオトロピック塩など、有害物質を用いる場合が多いため、それらの方法を医療現場などで用いることには、安全性の観点から問題があった。
【０００８】
そこで、本発明は、簡易かつ安全に行うことができ、自動化が容易であり、比較的小型の装置などにも適用できる核酸分離手段を提供すること、を主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明では、生物試料を陽イオン性界面活性剤で処理した後、電気泳動を行うことにより、生物試料から核酸を分離する核酸分離方法を提供する。
【００１０】
生物試料を陽イオン性界面活性剤で処理することにより、生物試料中に存在する核酸のマイナス電荷を中和することができ、同じく生物試料中に存在するタンパク質をプラス電荷に帯電させることができる。また、生物試料中に存在する脂質を、乳化させ、プラス電荷を持ったミセルを形成させることができる。
【００１１】
従って、生物試料を陽イオン性界面活性剤で処理した後、電気泳動を行うことにより、電気泳動を行った際、核酸を所定の領域に留まらせ、タンパク質及び脂質を陰極側に移動させることができる。即ち、タンパク質及び／又は脂質を含有する生物試料から、核酸を分離することができる。
【００１２】
本発明に係る核酸分離方法は、手順・操作が比較的簡易であり、また、陽イオン性界面活性剤を用いるため、安全性も高い。加えて、この方法は、電気泳動手段を備えていれば核酸分離を行うことができるため、装置を小型化できる。その他、この核酸分離方法は、例えば、ＤＮＡチップなどを用いた核酸検出方法にも適用可能である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、簡易かつ比較的安全に、生物試料などから核酸を分離できる。また、本発明に係る核酸分離方法は、自動化が容易であり、比較的小型の装置などにも適用できるという利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
＜本発明に係る核酸分離方法について＞
この核酸分離方法では、生物試料を陽イオン性界面活性剤で処理した後、電気泳動を行い、生物試料から核酸を分離する。
即ち、この方法は、（１）生物試料を採取・調製する手順、（２）生物試料を陽イオン性界面活性剤で処理する手順、（３）電気泳動を行う手順、の三つの手順を少なくとも含む。
以下、順に説明する。
【００１５】
（１）生物試料を採取・調製する手順：
まず、目的に応じて、人体などから生物試料を採取し、場合によっては、採取した生物試料を調製する。
【００１６】
生物試料は、核酸を含有するものであればよい。例えば、血液・体液・組織・細胞などを人体などから生物試料を採取してもよいし、目的に応じて、培養細胞などを生物試料として用いてもよい。
【００１７】
なお、本発明では、次の工程において、生物試料を陽イオン性界面活性剤で処理する際に細胞を溶解させることができるため、特に、前処理として、細胞を溶解させ、細胞溶解液を調製などする必要はない。即ち、本発明には、複雑な生物試料の調製操作を行わないでよいという利点がある。
但し、本発明に係る核酸分離方法は、調製を行った生物試料にも適用可能である。即ち、例えば、細胞溶解液、凍結細胞などから核酸を分離する場合も、本発明に係る核酸分離方法を適用できる。
【００１８】
（２）生物試料を陽イオン性界面活性剤で処理する手順：
次に、採取・調製した生物試料を陽イオン性界面活性剤で処理する。
【００１９】
陽イオン性界面活性剤は、タンパク質への吸着力を有するものであればよく、その種類は、特に限定されない。
例えば、ＤＴＡＢ（Ｄｏｄｅｃｙｌ  Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ）、Ｃｅｔｙｌ  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ、Ｌａｕｒｙｌ  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｓｔｅａｒｙｌ  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ、などが好適である。
【００２０】
採取・調製した生物試料に、陽イオン性界面活性剤を添加し、所定時間静置することにより、細胞が溶解するとともに、生物試料中に存在する核酸は中和し、タンパク質・脂質はプラス電荷を持つ。
なお、この手順では、適宜、陽イオン性界面活性剤と生物試料との混合液を撹拌してもよいし、この混合液に所定時間加熱処理を行ってもよい。
【００２１】
（３）電気泳動を行う手順：
次に、陽イオン性界面活性剤と生物試料との混合液に直流電界を印加し、電気泳動を行う。
【００２２】
生物試料を陽イオン性界面活性剤で処理することにより、生物試料中に存在する核酸は中和され、タンパク質・脂質はプラス電荷を持つ。従って、核酸は、電気泳動によってもほとんど移動せず、所定の領域に留まり、一方、タンパク質及び脂質は、電気泳動により、陰極側に移動する。そのため、タンパク質及び／又は脂質を含有する生物試料から、核酸を分離することができる。
【００２３】
なお、本発明に係る核酸分離方法は、生物試料供給手段、陽イオン界面活性剤供給手段、電気泳動手段、及び所定の反応領域を有する装置において、自動化できる。
即ち、例えば、所定の反応領域に生物試料を供給するステップ、所定の反応領域に陽イオン界面活性剤を供給するステップ、直流電界を印加し電気泳動を行うステップ、以上三つのステップを、予めプログラムで記述しておくことにより、装置内において、自動化できる。
【００２４】
＜ＤＮＡチップなどを用いた遺伝子検出方法について＞
この遺伝子検出方法では、少なくとも下記（１）〜（３）の手順を行う。
（１）各ウエルに生物試料と陽イオン性界面活性剤を供給する手順、
（２）各ウエルにおいて電気泳動を行い、生物試料から核酸を分離する手順、
（３）ウエル内に保持又は固定された検出用核酸と、生物試料中に存在する核酸とのハイブリダイゼーションを検出する手順。
以下、図１を用いて、説明する。
【００２５】
図１の各図は、ＤＮＡチップの基板表面に複数設けられたウエルのうちの一つの断面模式図である。ウエル１は、ハイブリダイゼーションの場となる反応領域２と、該反応領域に固定された検出用核酸３と、電気泳動を行うことができるように設けられた電極４（プラス電極４１及びマイナス電極４２）とを備える。
【００２６】
図１（Ａ）は、ウエル１に生物試料Ｓと陽イオン性界面活性剤Ｉを供給する手順を示す。
【００２７】
図１（Ａ）では、それぞれ、生物試料供給手段５及び陽イオン界面活性剤供給手段６から、ウエル１に、生物試料Ｓと陽イオン性界面活性剤Ｉが供給され（矢印Ｘ１、Ｘ２）、反応領域２内は、生物試料Ｓと陽イオン性界面活性剤Ｉの混合液Ｆで満たされている。混合液Ｆは、核酸７、タンパク質８、脂質９などを含有する。
なお、この操作では、生物試料Ｓと陽イオン性界面活性剤Ｉを混合後（又は、混合・調製後）、ウエル１に供給するようにしてもよい。その場合、供給手段を、一つにすることができる。
【００２８】
図１（Ｂ）は、ウエル１において電気泳動を行い、生物試料Ｓから核酸７を分離する手順を示す。
【００２９】
プラス電極４１とマイナス電極４２との間に直流電界を印加することにより、電気泳動を行う。電気泳動を行うことにより、核酸７は、検出用核酸３の近傍に留まるが、タンパク質８及び脂質９は、陽イオン界面活性剤の吸着によりプラス電荷を持つため、マイナス電極４２の方へ移動する（矢印Ｘ３、Ｘ４）。これにより、核酸７とタンパク質８、脂質９などを分離できる。
【００３０】
図１（Ｃ）は、ウエル１内に保持又は固定された検出用核酸３と、生物試料Ｓ中に存在する核酸７とのハイブリダイゼーションを検出する手順を示す。
【００３１】
電気泳動により、タンパク質８、脂質９などの不純物を検出用核酸３の近傍から除去できるため、ノイズを低減でき、ハイブリダイゼーションを高精度で検出できる。
【００３２】
なお、本発明に係る遺伝子検出方法は、生物試料供給手段、陽イオン界面活性剤供給手段、ＤＮＡチップの電極間に直流電界を印加する電解印加手段、ハイブリダイゼーション検出手段、を有するＤＮＡチップ用ハイブリダイゼーション検出装置などにおいて、自動処理させることができる。
即ち、生物試料及び／又は陽イオン界面活性剤供給手段から所定の反応領域に生物試料を供給するステップ、電気泳動を行うためにＤＮＡチップに直流電界を印加するステップ、所定の反応領域におけるハイブリダイゼーションを蛍光強度などにより検出するステップ、以上三つのステップは、予めプログラムで記述しておくことにより、ＤＮＡチップ用ハイブリダイゼーション検出装置内などにおいて、自動化できる。
【００３３】
その他、本発明に係る遺伝子検出方法には、次のような利点がある。
まず、ウエル１に生物試料Ｓなどの供給する手順（図１（Ａ）の手順）から、ハイブリダイゼーションなどを検出する手順（図１（Ｃ）の手順）までを、一つのウエルの中で行うことができるため、それらの各手順で行う動作を、一つの装置で連続的に行うことができ、簡易に自動化できる。
また、ＤＮＡチップなどを用いることにより、一連の工程を、連続的に、自動処理で行うことができるため、多種・多数の遺伝子検査を、比較的簡易に、一回のアッセイでまとめて行うことができる。
【実施例１】
【００３４】
実施例１では、核酸とタンパク質との混合溶液に陽イオン性界面活性剤を添加することにより、核酸とタンパク質を分離できるかどうか、検討した。
【００３５】
本実験では、タンパク質のサンプルとしてＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｍｉｎ、以下同じ）を、核酸サンプルとして制限酵素処理を行ったプラスミドＤＮＡを、陽イオン性界面活性剤としてＤＴＡＢ（ＤｏｄｅｃｙｌＴｒｉｍｅｔｈｙｌＡｍｍｏｎｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ、以下同じ）を、用いた。
また、対照として、陰イオン性界面活性剤であるＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｏｄｅｃｙｌ  Ｓｕｌｆａｔｅ、以下同じ）を用いた。
【００３６】
実験手順の概要は次の通りである。
まず、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）に、プラスミドＤＮＡ及びＢＳＡを適量溶解した。次に、ＤＴＡＢを終濃度２％になるように添加し、１００℃で３分間、熱変性処理を行った。次に、グリセロールを終濃度１０％になるように添加した。
次に、１％アガロースゲルの各ウエルにサンプルを入れ、５０Ｖで４５分間、電気泳動を行った。電気泳動バッファーには、ＴＡＥ（Ｔｒｉｓ  Ａｃｅｔａｔｅ  ＥＤＴＡ）を用いた。
次に、アガロースゲルを回収し、エチジウムブロマイド染色を行った後、ＵＶトランスイルミネーターで撮影し、核酸の挙動を観察した。また、同じアガロースゲルについて、ＣＢＢ染色を行った後、可視光観察により、タンパク質の挙動を観察した。
【００３７】
結果を図２に示す。
図中、右側の写真は、エチジウムブロマイド染色を行った場合の写真であり、左側の写真は、ＣＢＢ染色を行った場合の写真である。両写真において、右側が陽極であり、左側が陰極である。
両写真において、一番上側及び上から二番目のレーンはコントロールであり、一番上側のレーンは核酸用マーカーを電気泳動したもの、二番目のレーンは、タンパク質マーカーを電気泳動したものである。
両写真において、上から三番目から五番目のレーンは、タンパク質（ＢＳＡ）を電気泳動したものであり、上から三番目のレーンは、ＢＳＡ単独を電気泳動したもの、四番目のレーンは、ＢＳＡにＳＤＳを添加して電気泳動したもの、五番目のレーンは、ＢＳＡにＤＴＡＢを添加して電気泳動したものである。
両写真において、上から六番目から八番目のレーンは、核酸（プラスミドＤＮＡ）を電気泳動したものであり、上から六番目のレーンは、プラスミドＤＮＡ単独を電気泳動したもの、七番目のレーンは、プラスミドＤＮＡにＳＤＳを添加して電気泳動したもの、八番目のレーンは、プラスミドＤＮＡにＤＴＡＢを添加して電気泳動したものである。
両写真において、上から九番目から十一番目のレーンは、核酸（プラスミドＤＮＡ）とタンパク質（ＢＳＡ）を電気泳動したものであり、上から九番目のレーンは、プラスミドＤＮＡとＢＳＡを電気泳動したもの、十番目のレーンは、プラスミドＤＮＡとＢＳＡにＳＤＳを添加して電気泳動したもの、十一番目のレーンは、プラスミドＤＮＡとＢＳＡにＤＴＡＢを添加して電気泳動したものである。
【００３８】
図２の左側の写真の上から三番目から五番目のレーンでは、電気泳動を行うことにより、ＢＳＡ単独の場合、ＢＳＡが右側（陽極側）に移動し（上から三番目のレーン）、ＢＳＡにＳＤＳを添加した場合、ＢＳＡがさらに右側（陽極側）に移動した（同じく四番目のレーン）のに対し、ＢＳＡにＤＴＡＢを添加した場合、ＢＳＡが左側（陰極側）に移動した（同じく五番目のレーン）。
これらの結果は、タンパク質を陽イオン性界面活性剤で処理することにより、電気泳動を行った場合、タンパク質を陰極側に移動させることができることを示す。
【００３９】
また、図２の右側の写真の上から六番目から八番目のレーンでは、電気泳動を行うことにより、プラスミドＤＮＡ単独、または、プラスミドＤＮＡにＳＤＳを添加した場合、ＤＮＡが右側に移動した（上から六番目及び七番目のレーン）のに対し、プラスミドＤＮＡにＤＴＡＢを添加した場合、ＤＮＡはウエル内に留まり、移動しなかった（同じく八番目のレーン）。
これらの結果は、核酸を陽イオン性界面活性剤で処理することにより、電気泳動を行った場合でも、核酸を移動させずに留まらせることができることを示す。
【００４０】
加えて、図２の右側の写真の上から九番目から十一番目のレーンでは、ＢＳＡとプラスミドＤＮＡの両者を混合した場合も、上記と同じ結果が得られた。
従って、以上の実験結果は、核酸とタンパク質の両者の混合液を陽イオン性界面活性剤で処理し、電気泳動を行うことにより、核酸とタンパク質とを分離できることを示す。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明により、生物試料から核酸を簡易かつ少ない操作で分離できるため、遺伝子検査などを、より簡易に行うことができる可能性がある。
例えば、人体などから所定の細胞（血液などを含む）を採取し、その細胞から核酸を分離することにより、遺伝性疾患及びその発症リスクを検出できる可能性がある。また、罹患動物から所定の細胞を採取し、その生物試料に含まれる病原微生物の核酸を検出することにより、その病原微生物の種類・由来などを高精度に検出できる可能性がある。同様に、がん細胞を採取し、がん細胞中に含まれる核酸を分離することにより、腫瘍の種類・悪性度などの検出や、適用可能な抗がん剤の判定などを高精度に行うことができる可能性がある。
【００４２】
加えて、本発明は、ＤＮＡチップなどを用いた遺伝子解析などにも適用可能である。
例えば、ＤＮＡチップなどの基板表面に形成した複数のウエルのそれぞれに電極を設け、電気泳動を行うことが可能な構成にする。そして、各ウエルに生物試料などを供給し、電気泳動を行い、核酸をウエル内の所定の領域に留まらせ、タンパク質を陰極側に移動させた後、ハイブリダイゼーションなどの反応を進行させることにより、遺伝子の検出精度を高くすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ＤＮＡチップの基板表面に複数設けられたウエルのうちの一つを示す断面模式図であって、本発明に係る遺伝子検出方法の操作手順を示す図。
【図２】核酸とタンパク質との混合溶液に陽イオン性界面活性剤を添加後、電気泳動を行った場合の泳動像を示す図面代用写真。
【符号の説明】
【００４４】
１    ＤＮＡチップの基板表面に形成されたウエル
２    反応領域
３    検出用核酸
４    電極
４１  プラス電極
４２  マイナス電極
５    生物試料供給手段
６    陽イオン界面活性剤供給手段
７    （生物試料中の）核酸
８    （生物試料中の）タンパク質
９    （生物試料中の）脂質
Ｆ    生物試料Ｓと陽イオン界面活性剤Ｉとの混合液
Ｉ    陽イオン界面活性剤
Ｓ    生物試料
【図１】
2007020440.tif 000003
【図２】
2007020440.tif 000004