(57)【要約】【課題】  生理活性物質を簡便に投与することができ、かつその投与効果が長期に渡って持続することが可能な製剤を提供すること。【解決手段】  本発明の乳化製剤は、２０℃で固体の天然油脂と、生理活性物質の水性溶液または水性懸濁液と、乳化剤との乳化物を含む。好ましくは乳化物が、カカオバターに分散されている。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２０℃で固体の天然油脂と、生理活性物質の水性溶液または水性懸濁液と、乳化剤との乳化物を含む、乳化製剤。
【請求項２】
前記２０℃で固体の天然油脂が、ココナッツオイルである、請求項１に記載の乳化製剤。
【請求項３】
前記乳化剤が、レシチンである、請求項１または２に記載の乳化製剤。
【請求項４】
前記乳化物が、カカオバターに分散されている、請求項１から３のいずれかの項に記載の乳化製剤。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかの項に記載の乳化製剤からなる、魚類用注射剤。
【請求項６】
請求項１から４のいずれかの項に記載の乳化製剤を魚類に注射する工程を含む、生理活性物質の魚類への投与方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性物質を含む乳化製剤に関する。より詳細には、生物、特に魚類に生理活性物質を投与するための乳化製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、魚類の種苗生産において、良質な受精卵を安定的に得るために、飼育環境の調節、ホルモンの投与による人為的産卵誘導などが試みられている。特に、人工飼育環境下においては、例えば、卵黄形成が完了しても卵の最終成熟が起こらない魚種（非特許文献１）、水槽内で自然産卵するものの産卵期が長期に渡る魚種、あるいは日によって採卵数が大きく変動するため安定的に受精卵の獲得ができない魚種（非特許文献２および３）を対象に、人為的排卵誘導が試みられている。
【０００３】
このような魚種の人為的排卵誘導手段としては、生殖腺発達を統御する生殖腺刺激ホルモン放出ホルモンアナログ（lutenizing hormone releasing hormone analog；LHRHa）およびヒト胎盤性性腺刺激ホルモン（human chorionic gonadotropin；ＨＣＧ）などの生理活性物質の投与が有効であることが知られている（非特許文献４〜８）。例えば、クエ・マハタ（非特許文献９）、トラフグ（非特許文献１０）、マツカワ（非特許文献１１）、ブリ（非特許文献１２）などでは上記投与の技術開発が進められ、一部で実用化されている。
【０００４】
生理活性物質、特にホルモンの投与方法としては、一般的に「埋め込み法」、「注射法」などが知られている。
【０００５】
「埋め込み法」は、親魚の表皮をメスで切開し、ホルモンを含んだペレットや結晶状のホルモンをチューブに詰めたものを埋め込むことにより行われる。この埋め込み法は、投与したホルモンの溶出が長期間続き、その効果を継続することができる。例えば、コレステロールペレットを用いた場合は、１〜２ヶ月（非特許文献１３および１４）、サイラスティックチューブを用いた場合は、半年〜１年（非特許文献１５）、エチレン酢酸ビニル共重合体（ＥＶＡｃ）を用いた場合は、１ヶ月（非特許文献１６）、そしてマイクロスフィア（ナノあるいはマイクロサイズのポリマー球の中に薬剤を閉じ込めたもの；microsphere）を用いた場合は６０日間（非特許文献１７）、ホルモンの効果が持続することが報告されている。しかし、投与時にメスで表皮を切開し、ペレットを筋肉中に無理に挿入するため、親魚へかかるストレスが大きい。また、ペレットの作成には、専用の道具や冷凍設備が必要なため、初期投資に高額な費用がかかることや、投与の前日から準備を行う必要があること等から、民間業者への普及が難しいといった問題を抱えている。
【０００６】
一方、「注射法」は、生理食塩水やプロピレングリコール等にホルモンを溶解または縣濁して注射することにより行われる。注射法は、数時間もあれば投与溶液の作製ができ、特別な道具や設備を必要としないことから、民間業者でも容易に扱うことができる。また、注射での投与のため、魚体を傷つけることがなく、さらに処理が簡便で親魚へかかるストレスを軽減できる。しかし、投与したホルモン濃度を長期間維持できないといった問題点を抱えている。例えば、生理食塩水（非特許文献１３）あるいはプロピレングリコール
（非特許文献１８）を投与助剤として用いた場合、投与直後にホルモンの血中濃度が増加するが、２日程度で急減することが報告されている。
【０００７】
そこで、季節を問わず簡便に投与することができ、かつその投与効果が長期に渡って持続させることができる投与助剤が求められている。
【非特許文献１】松山倫也ら、1997、水産増殖、45、67-73
【非特許文献２】長浜達章ら、1985、兵庫水誌研報、23、39-42
【非特許文献３】杉野博之および高見純一、2000、岡山水試報、15、25-29
【非特許文献４】山野目健ら、1997、岩手水技セ研報、1、13-19
【非特許文献５】Pankhurst,N. W.およびThomas, P. M.、1998、Aquaculture、166、163-177.
【非特許文献６】Mugnier,C.ら、2000、Aquaculture、181、241-255
【非特許文献７】Lee,W.-K.およびYang, S.-W.、2002、Aquaculture、207、169-183
【非特許文献８】宮内正幸ら、2003、福岡水海研報、13、1-5
【非特許文献９】高屋雅生および荒川敏久、1987、長崎水試報、13、39-41
【非特許文献１０】中田久ら、1997、水産増殖、45、67-73
【非特許文献１１】萱場隆昭ら、2000、北水試研報、58、9-16
【非特許文献１２】中田久ら、2001、九大農学芸誌、55、169-177
【非特許文献１３】Crim,L. W.ら、1988、Aquaculture、74、87-95
【非特許文献１４】Matsuyama,M.ら、1995、Fish. Sci.、61、3、472-477
【非特許文献１５】Pavlick,R. J. Jr.およびMoberg, G. P.、1997、Gen. Comp. Endocrinol.、105、218-227
【非特許文献１６】Greenwood,L. N.ら、2001、Gen. Comp.Endocrinol.、123、1-12
【非特許文献１７】Holland,H. C. M.ら、1998、Biol. Reprod.、59、1153-1162
【非特許文献１８】Yamada,H.ら、1997、Gen. Comp. Endocrinol.、106、181-188
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、生理活性物質を簡便に投与することができ、かつその投与効果が長期に渡って持続することが可能な製剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討したところ、生理活性物質を投与するに際して、２０℃で固体の天然油脂と、生理活性物質の水性溶液または水性懸濁液と、乳化剤とから得られる乳化物を用いることによって、注射法により投与することが可能であり、かつ生体内への生理活性物質の溶出を抑制し、投与効果を長期に渡り持続させることができることを見出して、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明の乳化製剤は、２０℃で固体の天然油脂と、生理活性物質の水性溶液または水性懸濁液と、乳化剤との乳化物を含む。
【００１１】
好ましい実施態様においては、上記２０℃で固体の天然油脂は、ココナッツオイルである。
【００１２】
好ましい実施態様においては、上記乳化剤は、レシチンである。
【００１３】
好ましい実施態様においては、上記乳化物は、カカオバターに分散されている。
【００１４】
本発明の魚類用注射剤は、上記乳化製剤からなる。
【００１５】
本発明の生理活性物質の魚類への投与方法は、上記油性製剤を魚類に注射する工程を含む。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の生理活性物質を含有する乳化製剤は、常温で液状であるか、あるいは常温で固体もしくはゲル状である場合には、加温して容易に液状とすることができる。そのため、生理活性物質を生物、特に魚類に注射法により簡便に投与することができる。投与された乳化製剤は、体内において、生理活性物質を徐々に放出することができるため、投与効果を長期に渡り持続させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の乳化製剤は、２０℃で固体の天然油脂と、生理活性物質の水性溶液または水性懸濁液と、乳化剤との乳化物を含む。以下、本発明の乳化製剤に用いられる材料、それを用いた乳化物からなる乳化製剤、および該乳化物を含む乳化製剤について、順次説明する。
【００１８】
（Ｉ）乳化製剤に用いられる材料
（Ｉ−１）２０℃で固体の天然油脂
上記乳化物の原料である油脂は、投与対象の生物、特に魚類が食品として流通する点から、天然物由来のものが用いられる。このような油脂を用いることによって、生体内で固化し得るため、さらに生理活性物質の溶出を抑制する。
【００１９】
上記２０℃で固体の天然油脂（以下、単に油脂という）としては、カカオバター、ココナッツオイル、パームオイル、マンゴーオイルなどが挙げられる。油脂は、単独で用いてもよいし、２以上を組み合わせて用いてもよい。これらの中でも、少量の乳化物、特に少量のレシチンで乳化可能な点から、ココナッツオイルが特に好適に用いられる。
【００２０】
ココナッツオイルは、ココやしの核から得られる融点が２４℃〜２７℃の油脂であり、脂肪酸組成でラウリン酸が約５０％の割合で含有される代表的なラウリン酸油脂である。そのため、融点以上に加温することにより容易に液状に調製できる。特に、得られる製剤を魚類に投与する場合、一般的に魚類の飼育水温が２４℃以下であることが多いことから、液状で注射しても魚類体内で容易に固化する。
【００２１】
（Ｉ−２）生理活性物質
上記乳化物の原料である生理活性物質は、親水性および脂溶性のいずれであってもよく、特に制限されない。長期間投与を要する生理活性物質を用いることが好ましい。生理活性物質としては、例えば、生殖腺刺激ホルモン、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、β―カロチン、カテキンなどが挙げられる。
【００２２】
生殖腺刺激ホルモンとしては、例えば、ヒト胎盤性性腺刺激ホルモン（human chorionic gonadotropin、ＨＣＧ）、テストステロン（testosterone）、エストラジオール（estradiol）、生殖腺刺激ホルモン放出ホルモンアナログ（lutenizing hormone releasing hormone analog、ＬＨＲＨａ）などが挙げられる。好ましくはヒト胎盤性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）およびテストステロン（testosterone）である。
【００２３】
本発明においては、上記生理活性物質を予め水性溶媒中に溶解させる、あるいは懸濁させて用いる。水性溶媒とは、水を含む溶媒のことをいい、水単独、あるいは水と有機溶媒（例えば、エタノールなどのアルコール）との混合溶媒が用いられる。この生理活性物質の水性溶液または水性懸濁液を、油脂および乳化剤と混合することによって、Ｗ／Ｏエマルジョンを形成する。そのため、生理活性物質は水相にトラップされる。上記水性溶液または水性懸濁液の調製は、特に制限されず、攪拌などの当業者が通常用いる調製方法によって行われる。
【００２４】
上記水性溶液または水性懸濁液中の生理活性物質の含有量は特に制限されないが、通常、０．０１質量％〜２０質量％、好ましくは０．１質量％〜１０質量％である。
【００２５】
（Ｉ−３）乳化剤
上記乳化物の原料である乳化剤は、主にＷ／Ｏエマルジョンを形成するものであればよく、特に制限されない。乳化剤としては、例えば、レシチン、ショ糖脂肪酸エステルなどが挙げられる。天然に存在するレシチンが好ましく用いられる。
【００２６】
レシチンは、リン脂質混合物の総称であり、その主成分は、ホスファチジルコリンである。これ以外にもホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトールなどを含む。本発明に用いられるレシチンは、魚や人に害がなければよく、特に制限されない。レシチンは、主に大豆および卵黄に由来する。好ましくは卵黄由来のレシチンである。卵黄由来のレシチンは、ホスファチジルコリン含量が高く、特に強い乳化力を有する。
【００２７】
（ＩＩ）乳化物およびそれを含む乳化製剤
（ＩＩ−１）乳化物
本発明に用いられる乳化物は、油脂と、生理活性物質の水性溶液または水性懸濁液と、乳化剤とを混合し、乳化することによって得られる。本発明の乳化製剤は、例えば、上記油脂と乳化剤とを混合して助剤を得、この助剤と、生理活性物質の水性溶液または水性懸濁液とを混合し、乳化することによって得られる。
【００２８】
上記油脂と乳化剤との割合は、特に制限されない。乳化剤としてレシチンを用いる場合、油脂３質量部に対してレシチンが１質量部以上の割合とすることが好ましい。レシチンが１質量部未満の場合、乳化が十分に行われない場合がある。
【００２９】
上記油脂と、生理活性物質の水性溶液または水性懸濁液との混合割合についても特に制限されない。好ましくは油脂と、生理活性物質の水性溶液または水性懸濁液との質量比が９５：５〜６０：４０、より好ましくは９０：１０〜６５：３５となるように混合される。上記の質量比の範囲から外れる場合は、乳化が十分でないため、生理活性物質の溶出が速く、長期的な投与効果が得られない場合がある。
【００３０】
乳化は、当業者が用いる通常の乳化方法によって行われる。例えば、ホモジナイザー、ミキサー、コロイドミルなどによる機械的攪拌、圧力による噴射などにより行われる。乳化温度についても特に制限はなく、通常、室温（約１５〜２５℃）で行われる。乳化物（エマルジョン）の形成は、例えば、水に滴下した場合に拡散せずに水面に留まることにより確認される。このようにして乳化物が得られる。
【００３１】
（ＩＩ−２）乳化製剤
本発明の乳化製剤は、上記乳化物を含む。すなわち本発明の乳化製剤は、上記乳化物のみで構成されていてもよく、さらにその他の成分を含有してもよい。例えば、本発明の乳化製剤は、乳化物をカカオバターに分散したもの（以下、乳化物分散体という）で構成され得る。
【００３２】
本発明の乳化製剤が乳化物分散体で構成される場合、生体内での生理活性物質の溶出がさらに抑制される。そのため、得られる製剤を注射法により投与した場合に、生理活性物質が投与直後に一時に溶出されることがなく、低濃度で安定に溶出し、埋め込み法による投与に近い溶出パターンを得ることができる。
【００３３】
上記乳化物分散体において、乳化物とカカオバターとの割合は、特に制限されない。好ましくは乳化物１質量部に対して、カカオバターが０．５〜１０質量部、より好ましくは３〜１０質量部である。カカオバターの含有量が０．５質量部未満の場合、分散が十分に行われない場合がある。さらに分散体が得られたとしても体内で固化しない場合がある。１０質量部を超える場合、分散した乳化物からの生理活性物質の放出が阻害され、十分な投与効果が得られない場合がある。
【００３４】
上記カカオバターを含有する場合の乳化製剤の調製方法は、具体的には、上記乳化物を、液状のカカオバター中に分散させることによって行われる。カカオバターは、融点が３２〜３８℃であるため、必要に応じて加温して液化する。得られた乳化製剤は、必要に応じて、冷却し、成形される。
【００３５】
本発明の乳化製剤は、注射剤として利用される。対象となる生物は、特に制限されず、例えば、魚類、両生類、爬虫類、タコ、イカなどの軟体動物、鳥類、ヒト以外の哺乳類などが挙げられる。好ましくは魚類である。本発明の乳化製剤は、通常、常温下で液状であるか、固体状である。固体状の場合、加温することにより容易に液状となる。投与時において、一部または全部が固化している場合は、湯煎などにより液状化すればよく、そのため、この乳化製剤は、注射によって、簡便に生物、特に魚類に投与することができる。加熱温度は、使用する生理活性物質の熱安定性を考慮して適宜設定される。好ましくは４０℃以下、より好ましくは３５℃以下、さらに好ましくは３０℃以下である。
【００３６】
本発明の乳化製剤は、注射法による投与が可能であるため、埋め込み法に比べて、魚類に対してストレスが少なく、簡便に生理活性物質を投与することができる。さらに、体内においては、従来の注射法に用いられている生理食塩水またはプロピレングリコール溶液あるいは懸濁液に比べて、生理活性物質の溶出量を抑制し、低濃度での長期間放出することができる（徐放性がある）ため、生理活性物質の投与効果を長期間保持することができる。特に、乳化物がカカオバターに分散された乳化物分散体を用いる場合は、生理活性物質の溶出量をさらに抑制することができる。本発明の乳化製剤は、生理活性物質の低濃度長期間処理に特に有用である。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【００３８】
（供試魚）
本実施例においては、養殖業者（草野緑化グリーンサービス、長崎）より購入したコイ（Cyprinus Carpio）を用いた。これらは、長崎大学水産学部附属海洋資源教育研究センターの屋内水槽（２００〜３５０Ｌ）に試験群に分けて収容した。試験開始時の収容密度は、５Ｌ／匹であった。試験環境に十分に馴致させた後、試験に供した。試験期間中、１日１回飽食量を給餌した。供試魚の飼育は止水で行った。ただし、１日１回、飼育水槽の半量の水を脱塩素水と置換した。試験開始時の供試魚の標準体長は４８．４±０．６２ｍｍ、体重は１２０±０．５６ｇであった（ｎ＝６６７）。
【００３９】
（血中ホルモン濃度の測定方法）
本実施例および比較例で調製された乳化製剤を、供試魚に投与した場合の血中ホルモン濃度の測定方法は、次のとおりである。
【００４０】
（１）血中ＨＣＧ濃度の測定
血中ＨＣＧ濃度の測定は、時間分解蛍光測定法（ＤＥＬＦＩＡ）法によって行った。測定には、DELFIA hCG Reagents R007-101（PerkinElmer, Inc. U.S.A.）を用いた。冷凍保存していた血清を４℃で冷蔵解凍し、これを第二抗体（Solid phase anti-βhCG IgG）をあらかじめ固層化しておいたプレート１穴中に２５μｌずつ分注した。これに、トリス塩酸バッファー（ウシ血清アルブミン、ウシグロブリン、ネズミIgG、Tween40、０．１％アジ化ナトリウム、ｐＨ７．８）を２００μｌずつ分注し、攪拌しながら室温で１時間反応させた。
【００４１】
この反応液を除去し、洗浄液（トリス塩酸バッファー、Tween 20  ｐＨ７．８を蒸留水で２０倍希釈）により７回洗浄し、最後に蒸留水で洗浄した。洗浄後、よく蒸留水を除き、抗ＨＣＧ−Ｅｕ標識抗体（トリス塩酸バッファー、ウシ血清アルブミン、０．１％アジ化ナトリウム  ｐＨ７．８）を２００μｌずつ分注し、攪拌しながら室温にて３０分間反応させた。この反応液を除去し、洗浄液により７回洗浄した。洗浄後、エンハンスメント溶液（Enhancement solution；Triton X-1002、酢酸）を２００μｌずつ分注し、攪拌しながら室温にて５分間反応させた。反応終了後、DELFIA Research 1234蛍光光度計（Wallac）のプログラム７を用いて、血中ＨＣＧ濃度を自動測定し、濃度を算出した。
【００４２】
（２）血中テストステロン濃度の測定
血中テストステロンの濃度の測定は、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法によって行った。冷凍保存していた血清を４℃で冷蔵解凍し、シリコンコーティング済みのガラス試験管に分取した。これに約１０倍量のジエチルエーテルを加え、２０秒間攪拌した後、試料層とエーテル層とに分離するまで静置した。その後、この試験管を、冷却機を用いて−３０℃に冷却したメタノールに浸して急冷し、試料層を凍結させ、テストステロンを含むエーテル層のみを別の試験管に回収した。この抽出操作を３回繰り返した後、約４０℃の温水に浸してエーテル層を蒸発させた。さらに、窒素ガスを用いて残留している微量のエーテルを完全に除去した。次に、この試験管に分取した血清と同量のワーキングバッファー（０．０５Ｍホウ酸バッファー、０．１％ＢＳＡ、０．０５％Thimerosal）を加え、抽出したテストステロンを再溶解した。これを第二抗体（抗ウサギIgGヤギIgG、＃00779、CAPPEL、U.S.A.）をあらかじめ固層化しておいたＥＬＩＳＡプレート（SUMILON、MS-8496F、SUMITOMO BAKELITE）１穴中に５０μｌずつ分注した。
【００４３】
これに西洋ワサビペルオキシターゼ（ＨＲＰ）標識抗原および第一抗体をそれぞれワーキングバッファーで１００００倍に希釈し、これらの希釈液をそれぞれ５０μｌずつ加え、４℃にて１８〜２４時間反応させた。なお、ＨＲＰ−標識抗原（Testosterone-3-CMO-HRP）及び第一抗体（anti Testosterone-3(E)-CMO-BSA）は、Cosmo BIO CO., LTD (Tokyo) より購入した。
【００４４】
反応終了後、この反応液を除き、０．８５％ＮａＣｌ水溶液にて７回洗浄し、未反応のＨＲＰ標識抗原を十分に除去した。洗浄後、よく水切りをし、連続分注器を用いて、発色液（０．２Ｍクエン酸バッファー  ｐＨ４．５、０．０１％Ｈ２Ｏ２、０．０５％o-Phenylenediamine）を１５０μｌずつ加え、２０℃にて４０分間反応させた。十分な発色を確認した後、６Ｎ硫酸を５０μｌずつ加えて発色反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（MTP-120、CORONA electric Tokyo）を用い、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。試料中のテストステロン濃度の算出は、総合分析ソフトウェアＡＳＳＡＹ  ＺＡＰ（BIOSOFT、U.K.）により既知の濃度のテストステロン濃度測定結果から標準曲線を作製し、これを用いて行った。なお、測定に用いた各抗体は、目的とするテストステロンとほぼ特異的に結合し、それ以外のステロイドとの非特異的結合は無視できるほど低いレベルであった。
【００４５】
（３）統計学的解析
算出した血中ＨＣＧおよびテストステロン濃度の有意差検定を統計解析ソフトStatview、Var. 5.0（Abacus Concepts Inc., U.S.A.）を用いて行った（Student’s t-test、One-factor ANOVA）。
【００４６】
（実施例１：乳化製剤の調製およびその投与効果）
ココナッツオイル（SIGMA-ALDRICH CO.）と、ＨＣＧ（日本薬局方  注射用胎盤性性腺刺激ホルモン、三共株式会社）を４％含む生理食塩水とを、質量比が２：１となるようにして２５℃で混合した。さらに、この混合液とレシチン（和光純薬工業株式会社）とを質量比が３：１となるようにして２５℃で混合した（レシチン混合液とする）。このレシチン混合液を三方活栓に接続した２つの注射筒の間で何回も往復させて混和させてエマルジョンを得た（乳化製剤１とする）。エマルジョンが得られたかどうかは、水を張ったビーカーの上に、混和物を滴下し、水面に拡散せず、球体のままの状態を保つことを確認することによって行った（大室、１９９４）。混和物が水面に拡散した場合は、乳化が不十分として、引き続き混和作業を行った。
【００４７】
得られた乳化製剤１を用いて、以下のように投与試験を行い、投与効果を評価した。まず１群の供試魚に、乳化製剤１をＨＣＧ投与濃度が５００ＩＵ／ｋｇ体重となるように背部筋肉中に注射した。その後、自然水温が２０℃の水槽に戻して飼育した。注射してから２、６、１２、２４、４８、９６、および１６８時間後（１週間後）に供試魚を取り上げ、２−フェノキシエタノールで麻酔を施した後、体長及び体重を測定した。その後、ヘパリン処理を施した注射針２３Ｇをつけた１ｍｌのシリンジを用いて尾柄部より採血した。採取した血液から、遠心分離（１８００×Ｇ、２０分間）により血清を分離した。この血清を用いて、血中のＨＣＧ濃度を測定し、統計処理により解析した。ＨＣＧは魚類にはないヒト特有のタンパク質ホルモンである。結果を図１に示す。なお、上記遠心分離により得られた血清は、測定に供するまで−４０℃で冷凍保存した。
【００４８】
（比較例１）
ココナッツオイルと、ＨＣＧ（日本薬局方  注射用胎盤性性腺刺激ホルモン、三共株式会社）を４％含む生理食塩水とを、質量比が２：１となるように混合して混合物を得た（混合物１とする）。得られた混合物１を用いて、実施例１と同様にして投与試験を行い、血中のＨＣＧ濃度を測定した。結果を図１に示す。
【００４９】
図１の結果から明らかなように、実施例１の乳化製剤１は、比較例１の混合物１に比べて、ＨＣＧの溶出ピークが遅かった。このことは、生理活性物質含有水溶液と、ココナッツオイルとをレシチンの存在下で乳化することによって、生理活性物質の溶出速度が抑制されることを示す。このように、本発明の乳化製剤は、注射による投与が可能で、長期間、投与された生理活性物質を安定的に放出することができる徐放性製剤であることがわかる。
【００５０】
（実施例２：乳化製剤の調製およびその投与効果）
実施例１で得られたエマルジョン（乳化製剤１）と、カカオバターとを質量比が１：９となるようにして２５℃で混合して乳化製剤を得た（乳化製剤２とする）。得られた乳化製剤２を加温して融解し、実施例１と同様にして投与試験を行った。結果を図２に示す。
【００５１】
（比較例２）
ＨＣＧ（日本薬局方  注射用胎盤性性腺刺激ホルモン、三共株式会社）を４％含む生理食塩水と、カカオバターとを、質量比が９：１となるように混合して混合物を得た（混合物２とする）。得られた混合物２を用いて、実施例１と同様にして投与試験を行った。結果を図２に示す。
【００５２】
図２の結果から明らかなように、実施例２の乳化物を用いてカカオバターに分散させた乳化製剤２は、比較例２のＨＣＧ含有水溶液をカカオバターに混合させた混合物２に比べて、ＨＣＧの溶出速度が遅かった。さらに、実施例２の乳化製剤２を投与した群の血中のＨＣＧ濃度は、４８時間後までは比較例２よりも有意に低い値を示した。このように乳化製剤２を投与した群は、注射法による投与でありながら、投与直後から低濃度のＨＣＧを安定して溶出し、埋め込み法での投与を行った時に近い溶出パターンを示した。これは上記の乳化物（エマルジョン）をカカオバターが外側から取り囲み、固化することにより、ホルモンの溶出をさらに抑制したためと考えられる。さらに、実験期間中（注射投与後１週間）のＨＣＧの溶出総量を算出したところ、実施例２は、比較例２の半分以下の量であった。このように、乳化製剤２は、投与後の一過性溶出量および総溶出量が少ないことから、ホルモンの低濃度長期間処理に特に有用であることがわかる。
【００５３】
図１および図２の結果において、乳化製剤２が最も生理活性物質の溶出を抑制していた。このことは、乳化物をカカオバターに分散させることによって、さらに生理活性物質の溶出を抑制することができることを示す。
（実施例３：投与効果２）
実施例１の乳化製剤１投与群の血清について、血中テストステロン濃度を測定した。実施例２の乳化製剤２投与群の血清についても、同様に血中テストステロン濃度を測定した。結果を図３に併せて示す。
【００５４】
図３の結果から明らかなように、乳化製剤１および２を投与した群は、いずれも実験期間（１週間）を通して血中テストステロン濃度が低濃度で推移した。なお、実験開始時の血中テストステロン濃度は、全個体共に検出限界以下であった。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の乳化製剤は、２０℃で固体の天然油脂と、生理活性物質の水性溶液または水性懸濁液と、乳化剤との乳化物を含む。この乳化物は、常温で液状であるか、あるいは必要に応じて、加温して容易に液状とすることができる。そのため、生理活性物質を生体内、特に魚体内に注射法により簡便に投与することができる。さらに、この乳化製剤は、生体内において、生理活性物質を徐々に放出するため、投与効果が長期間持続する。特に、乳化物がカカオバターに分散された乳化物分散体を用いる場合は、さらに生理活性物質の溶出が抑制される。この乳化製剤は、注射剤、特に魚類用注射剤として利用され、特に生理活性物質の低濃度長期間処理に有用である。例えば、ヒラメや、メキシコ原産のbullseye puffer fishのように１週間以上に渡る投与効果の継続を必要とする魚種に投与する場合、非産卵期に成熟誘導を行う場合、性転換の誘導を行うなどの１ヶ月を超える長期的効果を要する場合、あるいはホルモンの過剰溶出を嫌う種苗生産の現場において成熟誘導を行う場合に特に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明の乳化製剤または乳化していない混合物を投与した場合の魚類の血中ＨＣＧ濃度の経時変化を示すグラフである。
【図２】本発明の乳化製剤または乳化していない混合物を投与した場合の魚類の血中ＨＣＧ濃度の経時変化を示すグラフである。
【図３】本発明の乳化製剤を投与した場合の魚類の血中テストステロン濃度の経時変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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