(57)【要約】【課題】  水に対する溶解性を改善し、かつ、腫瘍特異的に作用することにより副作用を軽減したタキソイド誘導体及びその製造方法を提供すること。【解決手段】  がん細胞に対して特異的に反応する抗体を、タキソイド誘導体に結合させてなる抗がん剤並びにタキソイド誘導体に過ヨウ素酸又は過ヨウ素酸塩を作用させて得た反応生成物に、がん細胞に対して特異的に反応する抗体を還元剤存在下で反応させることを特徴とする該抗がん剤の製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん細胞に対して特異的に反応する抗体を、タキソイド誘導体に共有結合させてなる抗がん剤。
【請求項２】
抗体が、卵巣がん、乳がん、肺がん、すい臓がん及び胃がんの細胞に特異的に反応するものである請求項１記載の抗がん剤。
【請求項３】
タキソイド誘導体が、タキサン骨格及び糖を有する化合物である請求項１又は２記載の抗がん剤。
【請求項４】
タキソイド誘導体が、7-グルコシルアセチルオキシパクリタクセル、2’-グルコシルアセチルオキシパクリタクセル、7-マルトオリゴシルアセチルオキシパクリタクセル、10-グルコシルアセチルオキシパクリタクセル、10-グルコシルアセチルオキシドセタクセル、10-ガラクトシルアセチルオキシドセタクセル及び10-マンノシルアセチルオキシドセタクセルから選ばれたものである請求項１〜３のいずれかに記載の抗がん剤。
【請求項５】
タキソイド誘導体に過ヨウ素酸又は過ヨウ素酸塩を作用させて得た反応生成物に、がん細胞に対して特異的に反応する抗体を還元剤存在下で反応させることを特徴とする請求項１記載の抗がん剤の製造方法。
【請求項６】
タキソイド誘導体が、7-グルコシルアセチルオキシパクリタクセル、2’-グルコシルアセチルオキシパクリタクセル、7-マルトオリゴシルアセチルオキシパクリタクセル、10-グルコシルアセチルオキシパクリタクセル、10-グルコシルアセチルオキシドセタクセル、10-ガラクトシルアセチルオキシドセタクセル及び10-マンノシルアセチルオキシドセタクセルから選ばれたものである請求項５に記載の抗がん剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん細胞に特異的に作用する、副作用の少ない抗がん剤並びにその製造方法に関する。詳しくは、がん細胞に特異的な抗体をタキソイド誘導体に結合させてなる抗がん剤、及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
パクリタクセル(paclitaxel）（商品名：タキソール)は、イチイの一種（Taxus brevifolia）の樹皮から単離されたジテルペン化合物（非特許文献１参照）で、従来の化学療法では治癒しないがんに対しても改善効果を持つ強力な抗がん剤として知られている。パクリタクセルの抗がん作用のメカニズムは特異的であり、微小管の過剰形成を引き起こして有糸分裂を抑制するものである。
【０００３】
しかし、パクリタクセルは水への溶解性が低いため、がん治療薬としての利用が限られるという課題がある。かかる溶解性を改善するために、パクリタクセル製剤に可溶化剤が使用されるが、該可溶化剤によって引き起こされる副作用が問題となっている。
そのため、溶解性を高めたパクリタクセル誘導体やその製剤が開発されている（特許文献１参照）が、これらの誘導体等もがん細胞に特異的に作用するものではなく、副作用が生じることは避けられず、その軽減が課題となっている。
【０００４】
【非特許文献１】M. C. Wani et al.: J. Am. Chem. Soc., 93. 2325 (1971)
【特許文献１】特開平９−２８６７９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、上記の事情を鑑み、高い水溶解性を有し、かつ、がん細胞に特異的に作用するタキソイド誘導体を開発し、効果的な抗がん剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、がん細胞に特異的に作用し、しかも水に対する溶解性が高いがん治療薬を開発すべく鋭意検討した結果、がん細胞に特異的に作用する抗体と、糖を有するタキソイド誘導体を結合させることに成功した。
このがん治療薬は、水への溶解性が高く、また、がん細胞に特異的に作用することによって抗がん剤のバイオアベラビリティを高めることができるため、副作用が少なく、高い治療効果が得られることが期待される。本発明者らは、これらの知見に基づいて本発明を完成させるに到った。
【０００７】
すなわち、請求項１に係る本発明は、がん細胞に対して特異的に反応する抗体を、タキソイド誘導体に共有結合させてなる抗がん剤である。
請求項２に係る本発明は、抗体が、卵巣がん、乳がん、肺がん、すい臓がん及び胃がんの細胞に特異的に反応するものである請求項１記載の抗がん剤である。
また、請求項３に係る本発明は、タキソイド誘導体が、タキサン骨格及び糖を有する化合物である請求項１又は２記載の抗がん剤である。
請求項４に係る本発明は、タキソイド誘導体が、7-グルコシルアセチルオキシパクリタクセル、2’-グルコシルアセチルオキシパクリタクセル、7-マルトオリゴシルアセチルオキシパクリタクセル、10-グルコシルアセチルオキシパクリタクセル、10-グルコシルアセチルオキシドセタクセル、10-ガラクトシルアセチルオキシドセタクセル及び10-マンノシルアセチルオキシドセタクセルから選ばれたものである請求項１〜３のいずれかに記載の抗がん剤である。
【０００８】
さらに、請求項５に係る本発明は、タキソイド誘導体に過ヨウ素酸又は過ヨウ素酸塩を作用させて得た反応生成物に、がん細胞に対して特異的に反応する抗体を還元剤存在下で反応させることを特徴とする請求項１記載の抗がん剤の製造方法である。
請求項６に係る本発明は、タキソイド誘導体が、7-グルコシルアセチルオキシパクリタクセル、2’-グルコシルアセチルオキシパクリタクセル、7-マルトオリゴシルアセチルオキシパクリタクセル、10-グルコシルアセチルオキシパクリタクセル、10-グルコシルアセチルオキシドセタクセル、10-ガラクトシルアセチルオキシドセタクセル及び10-マンノシルアセチルオキシドセタクセルから選ばれたものである請求項５に記載の抗がん剤の製造方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、がん細胞に対して特異的に反応する抗体をタキソイド誘導体に結合させた抗がん剤と、その製造方法が提供される。この抗がん剤は、高い水溶性と、がん細胞に特異的に作用する性質を兼ね備えている。そのため、本発明によれば、極めて効果的で、かつ副作用による患者の負担が少ないがん治療の実現が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に本発明を詳しく説明する。
本発明の抗がん剤は、タキソイド誘導体に腫瘍に対して特異的に反応する抗体を結合させてなるものである
本発明に使用するタキソイド誘導体は、パクリタクセルにスペーサーを介して糖を結合させたものである。パクリタクセルとしては、Kingston, D.G.I.: Pharmacol. Ther., 52, 1 (1992)に記載された方法により、イチイ（Taxus brevifolia）の樹皮、枝、葉等から単離することにより得られるものの他、化学合成されたもの（R. A. Holton: Europian Patent-A 400971, 1990）なども用いられる。また、糖としてはグルコースの他に、マンノース、ガラクトースなどが用いられる。
【００１１】
タキソイド誘導体は、特開平９−２８６７９４号公報に記載された方法で製造することができる。すなわち、グルコースを出発物質として常法により得られるテトラベンジルグルコースに、スペーサー（エチレングリコレートなどのグリコレート）を結合させてエステル化合物とした後、脱エチル化してテトラベンジル酢酸オキシグルコシドを得、このものをパクリタクセルと反応させることにより製造できる。なお、グルコースの代わりに他の糖類を用いた場合も同様の反応で目的物を得ることができる。
タキソイド誘導体としては、例えば7-グルコシルアセチルオキシパクリタクセル（以下、7-GLG-PTと称することがある。）、2’-グルコシルアセチルオキシパクリタクセル、（以下、2’-GLG-PTと称することがある。）、7-マルトオリゴシルアセチルオキシパクリタクセル、10-グルコシルアセチルオキシパクリタクセル、（以下、10-GLG-PTと称することがある。）、10-グルコシルアセチルオキシドセタクセル、10-ガラクトシルアセチルオキシドセタクセル及び10-マンノシルアセチルオキシドセタクセルなどを挙げることができ、これらの中では特に7-GLG-PTが好ましい。
【００１２】
次に、本発明において用いられるがん細胞に対して特異的に反応する抗体としては、例えばヒトの卵巣がん、乳がん、肺がん、すい臓がん、又は胃がんの細胞に対するモノクローナル抗体が好適なものとして挙げられる。これらのがん細胞に特異的に反応する抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウサギなどの適当な宿主に上記がん細胞を接種し、その体液から採取することにより得ることができる。また、市販品を用いることもできる。
【００１３】
本発明において、タキソイド誘導体とがん細胞に特異的に反応する抗体を結合させる反応について説明する。はじめに、タキソイド誘導体を過ヨウ素酸又は過ヨウ素酸塩、例えば過ヨウ素酸ナトリウム溶液と反応させ、選択的な酸化反応により反応生成物を得る。この反応は、タキソイド誘導体の糖部分を、そのアルデヒド体に変換する工程を含み、該アルデヒド体は、抗体のアミノ基と結合する。過ヨウ素酸塩として、過ヨウ素酸ナトリウム以外に過ヨウ素酸カリウム、メタ過ヨウ素酸ナトリウム、メタ過ヨウ素酸カリウムが使用できる。
反応は０〜４０℃の室温で３０分〜５時間、好ましくは１〜２時間行い、反応終了後、遠心分離などの固−液分離手段により不溶物を除去する。さらに、脱塩カラム（例えばD-Salt Polyacrylamide 1800 Desalting Column、PIERCE製）に反応液を通液して過剰の過ヨウ素酸ナトリウムを除く。なお、脱塩する代わりに、エチレングリコールを添加して反応を停止させ、次の反応に進むことが可能である。
【００１４】
次いで、還元剤の存在下で、上記の反応生成物と抗体を反応させることにより、両者を結合させて本発明の抗がん剤（抗腫瘍剤）を得る。還元剤としてシアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウムなどが用いることができる。
この反応は、上記反応生成物（脱塩液）に、リン酸緩衝液に溶解した抗体及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加え、０〜４０℃の室温で１〜３０時間、好ましくは１０〜２０時間反応させる。反応終了後、低分子化合物を除去するため、遠心濃縮膜を用いて遠心分離を行い、目的とする抗がん作用を有する物質を得る。
【００１５】
このようにして得られた本発明の抗がん（抗腫瘍）作用を有する物質は、澄んだ透明な液体である。この物質は、そのまま抗がん剤の調製のために用いることができるが、必要に応じて凍結乾燥法やスプレードライ法などにより粉末として用いたり、あるいは錠剤、マイクロカプセルなどの形態で用いることもできる。
なお、この物質を用いて製剤化する場合、その剤形については特に制限はなく、例えば液剤、粉剤、錠剤、マイクロカプセルなどとすることができる。その際、所望により常用の成分、例えば担体、賦形材、増量材、甘味料、香料、乳化剤、及び医薬分野において通常用いられる他の添加物などを適宜加えることができる。
【００１６】
本発明の抗がん剤であるタキソイド誘導体（例えば7-GLG-PT）と抗体との結合物は、水に対する溶解性が改善されており、パクリタクセルの溶解度が0.4 μg/mLであるのに対して、例えば後記実施例１で用いた7-GLG-PTの抗がん剤の溶解度は22.6 μg/mLである。
【００１７】
本発明の抗がん剤は、パクリタクセル又はドセタクセルの構造を有しており、そのためパクリタクセル又はドセタクセルと同様の方法でチュブリンの過剰生産を誘発することにより、その抗がん作用を発揮するものと推測される。しかし、この化合物は、ビンブラスチン（vinblastine)と同様の方法でチュブリンの重合を阻止する。なお、チュブリンの重合活性は、試験例１のように、340ｎｍにおける吸光度を測定し、次いでチュブリン重合活性を測定することにより行う。
また、試験例２のin vitroで評価する方法は、がん細胞を培養し、色を測定することにより細胞数を測定する方法である。
【実施例】
【００１８】
以下に、本発明を実施例等によって詳しく説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
【００１９】
実施例１
150μgの7-GLG-PTを、6.25mLの0.3M 過ヨウ素酸ナトリウム溶液に溶解し、室温で２時間反応させた。反応終了後、反応液から不溶物を除去するために15000rpmで10分間遠心分離を行った。
次いで、過剰の過ヨウ素酸ナトリウムを除去するために、該反応液を脱塩カラム（商品名：D-Salt Polyacrylamide 1800 Desalting Column、PIERCE製）に通液した。
【００２０】
得られた脱塩反応液に2mLの1M リン酸緩衝液(pH 7.0)、1mLの抗体溶液（商品名：Monoclonal Mouse Anti-Human Antibody CA125,Clone OC125[抗ヒトCA125、クローンOC125マウスモノクローナル抗体]、タンパク質濃度5.6mg/mL、卵巣がん抗体、DAKO製）及び160mgのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加え、室温で16時間反応させた。
反応終了後、低分子化合物を除去するために、反応液を遠心濃縮膜装置（分画分子量30000 Da、Amicon製）を用いて5000rpmで15分間遠心分離した。
このようにして、最終的に3mLの反応液（本発明品、CA125DV）を得た。
【００２１】
試験例１
実施例１で得られた本発明の反応液及び対照としてのパクリタクセルの水溶液（3.7mg/mL）について、HTS-Tubulin Polymerization Assay Kit（Cytoskeleton製）を用いて、チュブリン重合活性を測定した。
【００２２】
その結果を図１に示した。図中の横軸は反応時間(分）を示し、縦軸はチュブリン重合活性値（OD340）を示す。図１から、パクリタクセルはチュブリンの重合を促進したのに対し、本発明品(CA125DV)はチュブリンの重合を阻害することが分かった。
このことから、本発明品は抗がん作用を有していることが明らかとなった。
【００２３】
試験例２
実施例１で得られた最終反応液を凍結乾燥し、本発明品の粉末を得た。この粉末を100mg/mLの濃度になるように室温で蒸留水に溶解したところ、該粉末は完全に溶解した。
一方、ヒト由来の卵巣がんの細胞であるSHIN-3、KOC-2sを、10％FCSを含むRPMI1640培地（日水製）で5％CO2下、37℃で培養した後、96well plate（米国、コーニング社製）に、それぞれ細胞104個/wellになるように接種した。
接種から１日後に、本発明の抗がん剤(CA125DV)水溶液を、最終濃度が10mg/mL又は5mg/mLになるように各ウェルに加えた。24時間後にMTT（3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を加え、さらに４時間後に上清を吸引し、DMSOを加えて570nmの吸光度を測定した。
【００２４】
結果を図２に示した。図中の縦軸は吸光度（570nm）を示し、横軸は抗がん剤濃度を示す。この結果から、本発明の抗がん剤は細胞系でも抗がん活性を有していることが明らかとなった。
【００２５】
実施例２
150μgの7-オリゴシル  アセチルオキシ-PTを、6.25mLの0.3M 過ヨウ素酸ナトリウム溶液に溶解し、室温で２時間反応させた。反応終了後、反応液から不溶物を除去するために15000rpmで10分間遠心分離を行った。
次いで、過剰の過ヨウ素酸ナトリウムを除去するために、該反応液を脱塩カラム（商品名：D-Salt Polyacrylamide 1800 Desalting Column、PIERCE製）に通液した。
【００２６】
得られた脱塩反応液に2mLの1M リン酸緩衝液(pH 7.0)、1mLの抗体溶液（商品名：Monoclonal Mouse Anti-Human Antibody CA125,Clone OC125[抗ヒトCA125、クローンOC125マウスモノクローナル抗体]、タンパク質濃度5.6mg/mL、卵巣がん抗体、DAKO製）及び160mgのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加え、室温で16時間反応させた。
反応終了後、低分子化合物を除去するために、反応液を遠心濃縮膜装置（分画分子量30000 Da、Amicon製）を用いて5000rpmで15分間遠心分離した。
このようにして、最終的に3mLの反応液（本発明品、CA125DV）を得た。
【００２７】
試験例３
実施例２で得られた最終反応液を凍結乾燥し、本発明品の粉末を得た。この粉末を100mg/mLの濃度になるように室温で蒸留水に溶解したところ、該粉末は完全に溶解した。
一方、ヒト由来の卵巣がんの細胞であるSHIN-3、KOC-2sを、10％FCSを含むRPMI1640培地（日水製）で5％CO2下、37℃で培養した後、96well plate（米国、コーニング社製）に、それぞれ細胞104個/wellになるように接種した。
接種から１日後に、本発明の抗がん剤(CA125DV)水溶液を、最終濃度が10mg/mL又は5mg/mLになるように各ウェルに加えた。24時間後にMTT（3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を加え、さらに４時間後に上清を吸引し、DMSOを加えて570nmの吸光度を測定した。
【００２８】
結果を図３に示した。図中の縦軸は吸光度（570nm）を示し、横軸は抗がん剤濃度を示す。この結果から、本発明の抗がん剤は細胞系でも抗がん活性を有していることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明によれば、副作用が少なく、しかも溶解性が高い抗がん剤とその製造方法が提供される。本発明の抗がん剤は、タキソイド誘導体に結合させる抗体を適切に選ぶことにより、様々ながんに対して効率よく、かつ選択的に作用することができる。
したがって、本発明は各種がんの化学療法の分野において貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】試験例１におけるチュブリン重合活性の測定結果を示す。
【図２】試験例２における抗がん作用の測定結果を示す。
【図３】試験例３における抗がん作用の測定結果を示す。
【図１】
2007039346.tif 000002
【図２】
2007039346.tif 000003
【図３】
2007039346.tif 000004