(57)【要約】  【課題】  本発明は、合成が容易で、様々な類縁構造も容易に調整でき、種々のリポ多糖の吸着に使用し得る、新しいリポ多糖吸着剤（細菌内毒素吸着剤）とそのスクリーニング方法を提供することを目的とする。  【解決手段】  本発明は、生合成前駆体型リピドＡ又は大腸菌型リピドＡのホスホノオキシエチル誘導体に放射性元素を導入したリピドＡ放射性標識体を用いて、ペプチドライブラリーとのバインディングアッセイ（結合実験）を行うことを特徴とする細菌内毒素吸着剤のスクリーニング方法、及び該スクリーニング方法により見出された特定のペプチドライブラリーから成る細菌内毒素吸着剤に関する。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
官能基を有する固相担体に、該官能基と結合し得る官能基を有し、且つ他の官能基を２以上有する化合物を結合させ、更にこれにオリゴペプチドを結合させてなるペプチドライブラリー。
【請求項２】
下記一般式［１］
【化１】
2007031448.tif 000015
（式中、球状の部分は固相担体を表し、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３及びＡＡ４はそれぞれ独立してアミノ酸残基を表す。）で示される請求項１に記載のペプチドライブラリー。
【請求項３】
一般式［１］において、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３及びＡＡ４が下記に記載の何れかの組み合わせからなるものである請求項２に記載のペプチドライブラリー。
2007031448.tif 000016
【請求項４】
下記一般式［２］
【化２】
2007031448.tif 000017
（式中、球状の部分は固相担体を表し、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３及びＡＡ４はそれぞれ独立してアミノ酸残基を表す。）で示される請求項１に記載のペプチドライブラリー。
【請求項５】
一般式［２］において、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３及びＡＡ４が下記に記載の何れかの組み合わせからなるものである請求項４に記載のペプチドライブラリー。
2007031448.tif 000018
【請求項６】
官能基を有する固相担体に、該官能基と結合し得る官能基を有し、且つ他の官能基を２以上有する化合物を結合させ、更にこれに、該他の官能基と結合し得る官能基を有し、且つこれ以外の官能基を２以上有する化合物を結合させ、然る後、更にこれにオリゴペプチドを結合させてなるペプチドライブラリー。
【請求項７】
下記一般式［３］
【化３】
2007031448.tif 000019
（式中、球状の部分は固相担体を表し、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３及びＡＡ４はそれぞれ独立してアミノ酸残基を表す。）で示される請求項６に記載のペプチドライブラリー。
【請求項８】
一般式［３］において、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３及びＡＡ４が下記に記載の何れかの組み合わせからなるものである請求項７に記載のペプチドライブラリー。
2007031448.tif 000020
【請求項９】
ＡＡ４がリジン残基である請求項２、４又は７の何れかに記載のペプチドライブラリー。
【請求項１０】
請求項３に記載のペプチドライブラリーを含んでなる細菌内毒素吸着剤。
【請求項１１】
請求項５に記載のペプチドライブラリーを含んでなる細菌内毒素吸着剤。
【請求項１２】
請求項８に記載のペプチドライブラリーを含んでなる細菌内毒素吸着剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドドキシン（細菌内毒素）吸着剤のスクリーニング・作製方法及びその方法により見出された特定構造の吸着剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
高等動物はバクテリアが体内に侵入すると自らの免疫系を活性化するシステムを有しており、このシステムは自然免疫(innate immunity)として注目を集めている。リポ多糖(Lipopolysaccharide：ＬＰＳ、内毒素、エンドトキシン)は大腸菌やサルモネラ菌などのグラム陰性菌の細胞表層の主成分であり、バクテリア侵入のシグナルとして働いてサイトカイン、プロスタグランジンやＰＡＦなどの脂質、ＮＯなど様々なメディエーターを生産させることで免疫系を活性化する。適量のリポ多糖が作用した場合は有益な免疫応答が起こるが、感染症などによりリポ多糖が過剰に作用すると免疫系が暴走し、高熱や全身的な血液凝固などが起こり致死的なショックが引き起こされる。一方で人工透析液中のリポ多糖の混入も透析中に体内にリポ多糖が入ることにより、サイトカインを誘導して種々の合併症を引き起こす可能性がある。また生物学的製剤へのリポ多糖の混入も大きな問題である。そこでリポ多糖を除去するためのリポ多糖吸着剤の開発が望まれてきた。しかしながら、現在までのところ、リポ多糖の吸着剤として開発され実用化されているのは、エンドトキシン吸着療法に用いられている、抗生物質ポリミキシンＢをファイバーに固定したトレミキシン（東レ（株）商品名）ぐらいしかない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は上記した如き現状に鑑みなされたもので、合成が容易で、様々な類縁構造も容易に調整でき、種々のリポ多糖の吸着に使用し得る、新しいリポ多糖吸着剤（細菌内毒素吸着剤）とそのスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、生合成前駆体型リピドＡ又は大腸菌型リピドＡのホスホノオキシエチル誘導体に放射性元素を導入したリピドＡ放射性標識体を用いて、ペプチドライブラリーとのバインディングアッセイ（結合実験）を行うことを特徴とする細菌内毒素吸着剤のスクリーニング方法、及び該スクリーニング方法により見出された細菌内毒素吸着剤に関する。
【０００５】
また、本発明は、官能基を有する固相担体に、該官能基と結合し得る官能基を有し、且つ他の官能基を２以上有する化合物を結合させ、更にこれにオリゴペプチドを結合させてなるペプチドライブラリーに関する。
【０００６】
更に、本発明は、官能基を有する固相担体に、該官能基と結合し得る官能基を有し、且つ他の官能基を２以上有する化合物を結合させ、更にこれに、該他の官能基と結合し得る官能基を有し、且つこれ以外の官能基を２以上有する化合物を結合させ、然る後、更にこれにオリゴペプチドを結合させてなるペプチドライブラリーに関する。
【０００７】
更にまた、本発明は、合成前駆体型リピドＡ又は大腸菌型リピドＡのホスホノオキシエチル誘導体に放射性元素を導入したリピドＡ放射性標識体に関する。
【０００８】
即ち、天然型リピドＡの１位グリコシルリン酸基は化学的に不安定であるが、これをホスホノオキシエチル（ＰＥ）基に置き換えたＰＥ類縁体は化学的に安定であり、天然型のものと同等の活性を示すことが明らかにされている。本発明者らは、先にＰＥ類縁体の効率的な合成法を開発し報告している（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，７２，１３７７（１９９９））が、今回、更にＰＥ類縁体合成においてアルデヒド中間体の還元にNaＢ３Ｈ４を用いることによって、大腸菌リピドＡトリチウム標識ＰＥ類縁体の合成に成功し、これらの放射性標識体を用いて特定のペプチドライブラリーとのバインディングアッセイ（結合実験）を行うことにより効果的な細菌内毒素吸着剤のスクリーニングが実施できることを見出し本発明を完成するに到った。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、エンドドキシン（細菌内毒素）吸着剤のスクリーニング・作製方法及びその方法により見出された特定構造の吸着剤に関するものであり、合成が容易で、様々な類縁構造も容易に調整でき、種々の細菌内毒素の吸着に使用し得る、新しい細菌内毒素吸着剤（エンドドキシン吸着剤）を提供するものである点に効果を有する。また、本発明の吸着剤は、既存の吸着剤と比べて、天然物（天然アミノ酸）を使用している点に大きな利点を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明で用いられる、生合成前駆体型リピドＡ又は大腸菌型リピドＡのホスホノオキシエチル誘導体に放射性元素を導入した放射線標識リピドＡ類縁体における放射性元素としては、例えば、トリチウム（３Ｈ）が挙げられる。
本発明で用いられる、大腸菌型リピドＡのホスホノオキシエチル誘導体に放射性元素を導入した放射線標識リピドＡ類縁体としては、例えば、下記構造式［４］で示されるものが挙げられる。
【化４】
2007031448.tif 000002
【００１１】
また、本発明で用いられる、生合成前駆体型リピドＡのホスホノオキシエチル誘導体に放射性元素を導入した放射線標識リピドＡ類縁体としては、例えば、下記構造式［５］で示されるものが挙げられる。
【化５】
2007031448.tif 000003
【００１２】
上記放射線標識リピドＡ類縁体の製造方法は、後記実施例の項で詳細に述べるとおりである。
【００１３】
本発明で用いられるペプチドライブラリーとしては、例えば、官能基を有する固相担体に、該官能基と結合し得る官能基を有し、且つ他の官能基を２以上有する化合物を結合させ、更にこれにオリゴペプチドを結合させて作製したペプチドライブラリーが挙げられる。
また、官能基を有する固相担体に、該官能基と結合し得る官能基を有し、且つ他の官能基を２以上有する化合物を結合させ、更にこれに、該他の官能基と結合し得る官能基を有し、且つこれ以外の官能基を２以上有する化合物を結合させ、然る後、更にこれにオリゴペプチドを結合させて作製したペプチドライブラリーも好ましいものとして挙げられる。
【００１４】
官能基を有する固相担体としては、例えば、アミノ基を有する固相担体が挙げられる。
官能基を有する固相担体がアミノ基を有する固相担体である場合、該アミノ基と結合し得る官能基を有し、且つ他の官能基を２以上有する化合物としては、例えば、式：ＨＯＯＣ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ２（式中、ｎは１〜４の整数を表す。）で示される塩基性アミノ酸や、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸等の水酸基を２以上有するカルボン酸等が挙げられる。
上記アミノ酸の具体例としては、例えば、リジン、オルニチン等が好ましいものとして挙げられる。
【００１５】
官能基を有する固相担体がアミノ基を有する固相担体であり、該アミノ基と結合し得る官能基を有し、且つ他の官能基を２以上有する化合物が、式：ＨＯＯＣ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ２（式中、ｎは１〜４の整数を表す。）で示されるアミノ酸である場合、該他の官能基と結合し得る官能基を有し、且つこれ以外の官能基を２以上有する化合物としては、例えば、式：ＨＯＯＣ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ２（式中、ｎは１〜４の整数を表す。）で示される塩基性アミノ酸が挙げられる。
上記アミノ酸の具体例としては、例えば、リジン、オルニチン等が好ましいものとして挙げられる。
【００１６】
本発明で用いられるペプチドライブラリーにおいて、官能基を有する固相担体に、該官能基と結合し得る官能基を有し、且つ他の官能基を２以上有する化合物を介して、或いは、官能基を有する固相担体に、該官能基と結合し得る官能基を有し、且つ他の官能基を２以上有する化合物を結合させ、更にこれに、該他の官能基と結合し得る官能基を有し、且つこれ以外の官能基を２以上有する化合物を結合させたもの介して、結合させるオリゴペプチドとしては、例えば、アミノ酸残基が２から２０、好ましくは３から１０、より好ましくは４から８のオリゴペプチドが挙げられる。
アミノ酸残基の種類に特に制約はないが、例えば、Ｇｌｙ、Ｄ,Ｌ−Ｖａｌ、Ｄ,Ｌ−Ｐｈｅ、Ｄ,Ｌ−Ｐｒｏ、Ｄ,Ｌ−Ｓｅｒ、Ｄ,Ｌ−Ｇｌｎ、Ｄ,Ｌ−Ｇｌｕ、Ｄ,Ｌ−Ｌｙｓ等が好ましいものとして挙げられる。
【００１７】
本発明に係るペプチドライブラリーの具体例としては、例えば、下記一般式［１］、［２］又は［３］で示される化合物が挙げられる。
【化６】
2007031448.tif 000004
（式中、球状の部分は固相担体を表し、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３及びＡＡ４はそれぞれ独立してアミノ酸残基を表す。）
【化７】
2007031448.tif 000005
（式中、球状の部分は固相担体を表し、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３及びＡＡ４はそれぞれ独立してアミノ酸残基を表す。）
【化８】
2007031448.tif 000006
（式中、球状の部分は固相担体を表し、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３及びＡＡ４はそれぞれ独立してアミノ酸残基を表す。）
【００１８】
上記一般式［１］、［２］又は［３］で示されるペプチドライブラリーにおいて、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３及びＡＡ４で表されるアミノ酸残基の種類に特に制約はなく、何れのアミノ酸残基でも良いが、好ましいものとしては、例えば、Ｇｌｙ、Ｄ,Ｌ−Ｖａｌ、Ｄ,Ｌ−Ｐｈｅ、Ｄ,Ｌ−Ｐｒｏ、Ｄ,Ｌ−Ｓｅｒ、Ｄ,Ｌ−Ｇｌｎ、Ｄ,Ｌ−Ｇｌｕ、Ｄ,Ｌ−Ｌｙｓ等が挙げられる。
【００１９】
本発明の細菌内毒素吸着剤は、前記リピドＡ放射性標識体を用いて、上記ペプチドライブラリーとのバインディングアッセイを行うことにより検索、抽出されるが、そのようにして得られた本発明の細菌内毒素吸着剤の具体例としては、例えば、上記一般式［１］において、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３及びＡＡ４が下記表１に記載の何れかの組み合わせからなるもの、
【００２０】
【表１】
2007031448.tif 000007
【００２１】
上記一般式［２］において、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３及びＡＡ４が下記表２に記載の何れかの組み合わせからなるもの、
【００２２】
【表２】
2007031448.tif 000008
【００２３】
及び、上記一般式［３］において、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３及びＡＡ４が下記表３に記載の何れかの組み合わせからなるもの、
【００２４】
【表３】
2007031448.tif 000009
【００２５】
等が挙げられる。
オリゴペプチド構造と細菌内毒素吸着剤としての有効性との相関関係は、未だ十分には解明されていないが、ＡＡ４にリジンがあるのがより有効のようである。
【００２６】
本発明で用いられる官能基を有する固相担体としては、例えば、アミノ基、カルボキシル基、水酸基等の官能基を有する樹脂、好ましくはビーズ状樹脂が挙げられる。そのような樹脂の具体例としては、例えば、上記した如き官能基を有するポリエチレングリコール−ポリスチレン樹脂［具体的な商品名としては、例えば、ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ−ＮＨ２（Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ社）、Ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ ＮｏｖａＧｅｌ ＨＬ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社）等が挙げられる。］や、親水性ビニルポリマー［具体的な商品名としては、例えば、ＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ＡｍｉｎｏＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｓ（東ソー（株））等が挙げられる。］等が挙げられる。
【００２７】
以下に、放射線標識リピドＡ類縁体と分子ピンセットライブラリー（ペプチドライブラリー）との結合実験の概略について述べる。
分子ピンセットライブラリーの調製
先ず、スプリット合成によってエンコード分子ピンセットライブラリー（ペプチドライブラリー）を調製した。
即ち、ケノデオキシコール酸をテンプレートとし、その２つの水酸基にＧｌｙ残基を介してテトラペプチドライブラリーを結合したもの（diarm Ｌ１）、Ｌ−Ｌｙｓの２つのアミノ基にそれぞれテトラペプチドライブラリーを結合したもの（diarm Ｌ２）、及びＬ−Ｌｙｓのそれぞれのアミノ基にＬ−Ｌｙｓを結合させ、計４つのアミノ基にテトラペプチドライブラリーを結合したもの（tetraarm Ｌ３）である。固相担体としては水中でアッセイを行うことを考慮して、水に膨潤性のポリエチレングリコール-ポリスチレン樹脂であるＴｅｎｔａＧｅｌを用いた。    Ｌ１をコア構造として用いる場合はまずデオキシコール酸を固相担体に導入した後、２つの水酸基に対してＦｍｏｃ−Ｇｌｙを結合させた。リジン（Ｌ２）とトリリジン（Ｌ３）コアは通常のペプチド固相合成法により調製した。ライブラリー調製には１５種類（ＧｌｙとＤ及びＬ−Ｖａｌ，Ｐｈｅ，Ｓｅｒ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｌｙｓ及びＰｒｏ）のアミノ酸を用いた。４段階のスプリットカップリングサイクルを行って、３×１５４＝１５１,８７５種類のペプチドを含むライブラリーを構築した。
【００２８】
放射線標識リピドＡ類縁体と分子ピンセットライブラリーの結合実験
上記構造式［４］で示される放射線標識リピドＡ類縁体（以下、［３Ｈ］ＰＥ５０６と略記する。）、又は上記構造式［５］で示される放射線標識リピドＡ類縁体（以下、［３Ｈ］ＰＥ４０６と略記する。）を用いて、分子ピンセットライブラリーとの結合実験（バインディングアッセイ）を行った。  なお放射線化合物を用いた分子ピンセットライブラリーとの結合実験についてはＮｅｓｔｌｅｒがすでに確立しており、その手法に従った（Nestler H.P.;Wennemers H.;Sherlock R.;Dong D.L.-Y.Bioorg.Med.Chem Lett.,6,1327(1996).）。
［３Ｈ］ＰＥ５０６を用いた結合実験についてはライブラリー（１５.７ｍｇ，約１９０００個のビーズ状樹脂を含む。）を［３Ｈ］ＰＥ５０６の存在下で４℃で４１時間振盪した。この操作により［３Ｈ］ＰＥ５０６を認識する分子ピンセットが結合した樹脂は［３Ｈ］ＰＥ５０６を吸着するので放射能を帯びる。これにKodak autoradiographic emulsionを作用させると、放射能を帯びた樹脂の回りが感光される。定着した後、余分なエマルジョンを除去すると放射能を帯びた樹脂は黒く染まる。これを取り出し、後に述べるエンコード法で樹脂上のペプチド配列を決定した。その結果、［３Ｈ］ＰＥ５０６と結合する１９種類の分子ピンセットが見出された（表４）。
【００２９】
【表４】
2007031448.tif 000010
【００３０】
表４から明らかなように、１９種類の分子ピンセットのうち１７種類までもがＬ３の構造を有していた。また各armのＣ−未端にＬ−リジン（Ｋ）残基を有するもの（Ｋ−Ｌ３構造）が９種類、Ｄ−リジン（ｋ）を有するもの（ｋ−Ｌ３構造）が３種類見出された。ライブラリー全体には１５１,８７５個の分子ピンセットが含まれているのに、実際のアッセイに用いたビーズ状樹脂の数は約１９，０００個であり、アッセイで調べた分子ピンセットの数は２０％に満たない。従って今回見つかったペプチド配列以外にも［３Ｈ］ＰＥ５０６と結合するものは数多く存在するものと予測される。
【００３１】
［３Ｈ］ＰＥ４０６を用いた結合実験についてはライブラリー（２４.２ｍｇ，約２９０００個のビーズ状樹脂を含む。）を用いて同様の結合実験を行った。その結果３２種類の分子ピンセットが見出された（表５）。
【００３２】
【表５】
2007031448.tif 000011
【００３３】
表５から明らかなように、３２種類中２０種類がＬ３構造を有しており、そのうち５種類のみにテトラペプチドのＣ未端にＬ−リジン残基が存在していた。この部分がコンセンサス配列であることに変わりないが、［３Ｈ］ＰＥ４０６では配座の運動性が増加したため、様々な分子ピンセットが結合できるものと考えられる。
【００３４】
リピドＡ類縁体認識分子ピンセットの再合成
上記のようにして見出された分子ピンセットが天然型リピドＡやリポ多糖に結合するかどうかを確かめるために、上記の分子ピンセットから適当に選んで分子ピンセットの結合した樹脂６〜１７を調製した。
［３Ｈ］ＰＥ５０６との結合実験で見出された分子ピンセット
（ｋ-s-k-S)４Ｌ３-TentaGel(６-TentaGel)，(s-S-K-k)４Ｌ３-TentaGel (７-TentaGel)，(K-K-k-k)４Ｌ３-TentaGel(８-TentaGel)，(Q-E-K-k)４Ｌ３-Tenta-gel(９-TentaGel)，(K-S-K-E)４Ｌ３-TentaGel(１０-TentaGel)，(E-q-f-K)４Ｌ３-TentaGel(１１-TentaGel)
［３Ｈ］ＰＥ４０６との結合実験で見出された分子ピンセット
（Ｓ-s-F-v)４Ｌ３-TentaGel(１２-TentaGel)，(F-V-E-s)４Ｌ３-TentaGel(１３-TentaGel)，(k-K-e-E)４Ｌ３-TentaGel(１４-TentaGel)，(K-v-E-e)４Ｌ３-TentaGel(１５-TentaGel)，(P-E-S-K)４Ｌ３-TentaGel(１６-TentaGel)，(P-P-S-k)４Ｌ３-TentaGel(１７-TentaGel)
【００３５】
再合成した分子ピンセットを用いた結合実験
次に再合成した分子ピンセットを用いて、大腸菌型リピドＡのホスホノオキシエチル誘導体（以下、ＰＥ５０６と略記する。）、大腸菌型リピドＡ（以下、５０６と略記する。）、生合成前駆体型リピドＡのホスホノオキシエチル誘導体（以下、ＰＥ４０６と略記する。）、生合成前駆体型リピドＡ（以下、４０６と略記する。）、大腸菌Ｒｅ変異株のリポ多糖（ＲｅＬＰＳ）、及び大腸菌リポ多糖（Ｅ.ｃｏｌｉ Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ社））との結合実験を行った。ＲｅＬＰＳはリピドＡ部にＫｄｏと呼ばれる糖が２残基結合した構造を有しており、コア多糖部の殆どの部分とＯ−特異多糖部を欠いている。
参考までにＲｅＬＰＳの構造式を以下に示す。
【化９】
2007031448.tif 000012
まず分子ピンセット樹脂６〜１７-TentaGelのトリフルオロ酢酸塩を用いてＰＥ５０６及び５０６との結合実験を行った。樹脂への結合はアッセイ後の溶液ＴＬＣ分析を行って確認した。結果を表６に示す。
【００３６】
【表６】
2007031448.tif 000013
【００３７】
次に樹脂６-TentaGel、１１-TentaGel、１２-TentaGel、１６-TentaGel、１７-TentaGelの吸着能をアッセイ後の溶液のリムルス活性を測定することによって確認した。リムルス活性試験とは、リポ多糖がカブトガニ（Limulus polyphemusなど）の血球抽出成分ＬＡＬ(Limulus Amebocyte Lysate)凝固酵素を活性化する反応を利用し、内毒素活性を比色定量する方法である。
ＰＥ５０６、５０６、ＰＥ４０６、４０６、ＲｅＬＰＳ、及び大腸菌リポ多糖（Ｅ.ｃｏｌｉ Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ社））を用いて、それぞれ上記と同様に６-TentaGel、１１-TentaGel、１２-TentaGel、１６-TentaGel、１７-TentaGelとの結合実験を行い、上清についてリムルス活性を測定した。これらの内毒素が樹脂に吸着されると観測される吸光度は低下する。なお、ここではアッセイを行う前に各々の樹脂を水で洗浄したため、樹脂上の大部分のアミノ基は遊離となっているものと考えられる。そのため酸性複合糖質であるリポ多糖やリピドＡに対する樹脂の吸着能は水で洗浄する前よりも向上している。実際、上記のトリフルオロ酢酸塩を用いた場合は１２-TentaGelはＰＥ５０６、５０６を吸着しないが、水で洗浄後の１２-TentaGelはどちらもよく吸着している。樹脂１１-TentaGelは４０６に対して吸着力が弱い。全ての樹脂が天然のＲｅＬＰＳに対しても強い吸着能を示したが、大腸菌リポ多糖（Ｅ.ｃｏｌｉ Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ社））に対しては殆ど吸着能を示さなかった（図１参照）。
【００３８】
TentaGelはポリエチレングリコール−ポリスチレングラフトポリマーであり、水には膨潤するものの疎水性の高い樹脂である。大腸菌リポ多糖（ＬＰＳ）は長い糖鎖を有しており、親水性の糖鎖部が樹脂への浸透を妨害しているものと考えられた。そこでより親水性の高い、ＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ＡｍｉｎｏＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｓ（東ソー（株））を担体として用いて、分子ピンセット６，１１，１２，１６及び１７を結合させた６-Toyopearl，１１-Toyopearl，１２-Toyopearl，１６-Toyopearl，及び１７-Toyopearlを合成し、５０６、ＲｅＬＰＳ、及び大腸菌リポ多糖（Ｅ.ｃｏｌｉ Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ社））との結合実験を行い、結合能をリムルス活性により評価した。その結果、期待したとおり、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌをベースにした樹脂はわずかな例外を除いてこれら全てを効率的に吸着した（図２参照）。
【００３９】
以上のことから、表４に記載の１９種類の分子ピンセット（ペプチドライブラリー）及び表５に記載の３２種類の分子ピンセット（ペプチドライブラリー）は、何れも細菌内毒素吸着剤としてより効果的に使用し得るものと大いに期待される。
本発明の吸着剤は、既存の吸着剤と比べて、天然物（天然アミノ酸）を使用している点が大きな利点である。
なお、本発明の特定の吸着体を得る為に、上記の如く、１５のアミノ酸から選んで１５４×３＝１５１８７５ケとし、更に、実際には、１９０００と２９０００からなるライブラリーを得て、これから有効な吸着体５１ケを得た。
このとき、１５のアミノ酸の選択、１５１８７５からの１９０００と２９０００への絞り込みは、疎水性、親水性、酸・塩基性などの点を考慮して行った。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００４１】
実施例１  放射性標識リピドＡ類縁体の合成
下記の合成スキームに従って、２種類の放射性標識リピドＡ類縁体を合成した。
【化１０】
2007031448.tif 000014
なお、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにはＫｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ社 ０.０４０−０．０６３ｍｍ）を用いた。また、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０はＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓｗｅｄｅｎから購入した。無水ＣＨ２Ｃｌ２とＣＨＣｌ３は水素化カルシウムを脱水剤に用いて蒸留して調製した。無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）と無水ベンゼンは関東化学（株）より購入した。ＮａＢ３Ｈ４（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ２２２ ＧＢｑ ｍｍｏｌ−１）はアマシャムライフサイエンスより購入した。オートラジオグラフィーにはイメージングプレートＢＡＳ−ＴＲ２０４０Ｓ（富士フィルム（株））を用い、検出にはバイオ・イメージングアナライザーＢＡＳ−１５００ ＭＡＣ（富士フィルム（株））を用いた。
【００４２】
（１） 2-(ホスホノオキシ)[2-３Ｈ１]エチル 2-デオキシ-6-O-[2-デオキシ-2-[(R)-3-(ドデカノイルオキシ)テトラデカノイルアミノ]-4-O-ホスホノ-3-O-[(R)-3-(テトラデカノイルオキシ)テトラデカノイル]-β-Ｄ-グルコピラノシル]-3-O-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイル]-2-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-α-Ｄ-グルコピラノシド（［３Ｈ］ＰＥ５０６：４＊）の合成
（１−１） ホルミルメチル4-O-ベンジル-6-O-[6-O-ベンジル-2-デオキシ-4-O-(1,5-ジヒドロ-3-オキソ-3λ５-3H-2,4,3-ベンゾジオキサホスフェピン-3-イル)-2-[(R)-3-(ドデカノイルオキシ)テトラデカノイルアミノ]-3-O-[(R)-3-(テトラデカノイルオキシ)テトラデカノイル]-β-Ｄ-グルコピラノシル]-3-O-[(R)-3-(ベンジルオキシ) テトラデカノイル]-2-[(R)-3-(ベンジルオキシ)テトラデカノイルアミノ]-2-デオキシ-α-Ｄ-グルコピラノシド（化合物２０）の合成
化合物１９（４５０ｍｇ，２０２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ／ｔ−ブタノール／水  （１０：１０：１，１２ｍＬ）溶液に激しく撹拌下、４−メチルモルフォリンＮ−オキシド（ＮＭＯ）（９４ｍｇ，０.８０ｍｍｏｌ）と四酸化オスミウム（ＯｓＯ４）の水溶液（２.５％，４００ｍＬ，４０ｍｍｏｌ）を加えた。６時間後飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液（５０ｍＬ）を加え、酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出した。有機層をＮａ２Ｓ２Ｏ３水溶液（５０ｍＬ×２）と飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した後、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮して粗生成物のジオールを得た（４５８ｍｇ）。ジオールを無水ベンゼン（１０ｍＬ）に溶かし、四酢酸鉛（Ｐｂ（ＯＡｃ）４）（純度９０％，１１９ｍｇ，２４２ｍｍｏｌ）を加え、３０分間撹拌した。反応混合物をシリカゲルカラム（３ｇ）にチャージし、酢酸エチルで溶出した。減圧濃縮後、残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（２０ｇ，トルエン／酢酸エチル＝５：１）で精製し化合物２０を無色シラップとして得た（３７７ｍｇ，収率：８４％）。
FAB-MS (positive) m/z 2244 [(M+Na)＋]; １H NMR (500MHz,CDCl３) δ=9.37(s,1H,CHO)。
なお、化合物１９の合成は、文献［Liu W-C, Oikawa M, Fukase K, Suda Y, Kusumoto S. Bull Chem Soc Jpn 1999; 72:1377-1385．； Fukase K, Oikawa M, Suda Y, Liu W-C, Fukase Y, Shintaku T, Sekljic H, Yoshizaki H, Kusumoto S. J Endotoxin Res 1999; 5: 46-51.]に記載の方法に準じて行った。
【００４３】
（１−２） 2-ヒドロキシ-[2-３H１]エチル4-O-ベンジル-6-O-[6-O-ベンジル-2-デオキシ-4-O-(1,5-ジヒドロ-3-オキソ-3λ５-3H-2,4,3-ベンゾジオキサホスフェピン-3-イル)-2-[(R)-3-(ドデカノイルオキシ)テトラデカノイルアミノ]-3-O-[(R)-3-(テトラデカノイルオキシ)テトラデカノイル]-β-Ｄ-グルコピラノシル]-3-O-[(R)-3-(ベンジルオキシ) テトラデカノイル]-2-[(R)-3-(ベンジルオキシ) テトラデカノイルアミノ]-2-デオキシ-α-Ｄ-グルコピラノシド （化合物２１＊）の合成
化合物２０（１５０ｍｇ，６２.４ｍｍｏｌ）の２−プロパノール／メタノール／ＣＨ２Ｃｌ２（５：１：１，３.５ｍＬ）溶液に０℃でＮａＢ３Ｈ４（５９０ｍＬ，２６.４ｍｍｏｌ／ｍＬ，２４０ＧＢｑ ｍｍｏｌ−１）を加え、３０分間撹拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を止めた後、酢酸エチルで抽出した。抽出液をＮａ２ＳＯ４で乾燥した後、減圧濃縮し、化合物２１＊の無色シラップを得た（１４４ｍｇ，定量的）。生成物は精製することなく次の反応に用いた。
【００４４】
（１−３） 2-(1,5-ジヒドロ-3-オキソ-3λ５-3H-2,4,3-ベンゾジオキサホスフェピン-3-イルオキシ)-[2-３H１] エチル4-O-ベンジル-6-O-[6-O-ベンジル-2-デオキシ-4-O-(1,5-ジヒドロ-3-オキソ-3λ５-3H-2,4,3-ベンゾジオキサホスフェピン-3-イル)-2-[(R)-3-(ドデカノイルオキシ)テトラデカノイルアミノ]-3-O-[(R)-3-(テトラデカノイルオキシ)テトラデカノイル]-β-Ｄ-グルコピラノシル]-3-O-[(R)-3-(ベンジルオキシ) テトラデカノイル]-2-[(R)-3-(ベンジルオキシ)テトラデカノイルアミノ]-2-デオキシ-α-Ｄ-グルコピラノシド（化合物２２＊）の合成
化合物２１＊（１４４ｍｇ，５９.９ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１４ｍＬ）溶液に０℃でＮ,Ｎ−ジエチル−１，５−ジヒドロ−３Ｈ−２，４，３−ベンゾジオキサフォスフェピン−３−アミン（８９ｍｇ，０.３７ｍｍｏｌ）とテトラゾール  （２５ｍｇ，０.３２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で３０分間撹拌した後、−７８℃に冷却した。ｍＣＰＢＡ（７０％，８１ｍｇ，０.３７ｍｍｏｌ）を加えた後、４５分間撹拌した。飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３を加えて反応を終了させた後、ＣＨＣｌ３で抽出した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液と飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。減圧濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［３.０ｇ，トルエン／酢酸エチル／ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）＝１００：５０：１］で精製し化合物２２＊の無色シラップを得た（１３４ｍｇ，収率：８７％）。得られた化合物はＴＬＣ上で標品の非標識体２２と一致した。
[α]Ｄ２５ = +17.8 (c 1.00, CHCl３); FAB-MS (positive) m/z 2428 [(M+Na)＋]。  Found: C, 69.96; H, 9.21; N, 1.14%.  Calcd for C１４０H２１８N２O２６P２: C, 69.85; H, 9.13; N, 1.16%。
【００４５】
（１−４） 2-(ホスホノキシ)[2-３H１]エチル 2-デオキシ-6-O-[2-デオキシ-2-[(R)-3-(ドデカノイルオキシ)テトラデカノイルアミノ]-4-O-ホスホノ-3-O-[(R)-3-(テトラデカノイルオキシ)テトラデカノイル]-β-Ｄ-グルコピラノシル]-3-O-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイル]-2-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-α-Ｄ-グルコピラノシド（［３Ｈ］ＰＥ５０６：４＊）の合成
化合物２２＊（５７ｍｇ，２２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（８ｍＬ）溶液にＰｄ−ｂｌａｃｋ（１３０ｍｇ）を加え、加圧下（７ｋｇｃｍ−２）室温で２時間接触還元を行った。トリエチルアミンを加えて中和した後、Ｐｄ−ｂｌａｃｋを濾過で除いた。減圧濃縮して得た残渣を液液分配クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０：２０ｇ，ＣＨＣｌ３／メタノール／水／２−プロパノール＝９：９：９：１）（有機層を固定相として水層を移動相として使用）で精製し、［３Ｈ］ＰＥ５０６（４＊）を白色粉末として得た（２５ｍｇ，８４１ＭＢｑ，６２ＧＢｑ ｍｍｏｌ−１，収率：６３％）。得られた化合物はクロマトグラフィー上で標品の非標識体４と一致した。
FAB-MS (negative) m/z 1840 [(M-H)−]; １H NMR (600MHz,CD３OD/CDCl３=1:1)δ=5.23 (m,1H), 5.19 (t,J =8.2 Hz,1H), 5.17 (m,1H), 5.14 (t,J =8.2 Hz,1H), 4.82 (d,J =3.0 Hz,1H), 4.56 (d,J =7.4 Hz,1H), 4.23 (q,J =8.0Hz,1H), 4.18 (dd,J =8.9, 3.0Hz,1H), 4.08-3.93 (m,5H), 3.92-3.82 (m,4H), 3.80 (dd,J =10.3, 4.5Hz,1H), 3.74 (d,J =10.６Hz,1H), 3.63 (m,1H), 3.56 (t,J =8.1Hz,1H),3.37 (m,1H), 2.72 (dd,J =14.0, 6.6Hz,1H), 2.64 (dd,J =14.0, 4.5Hz,1H), 2.52-2.46 (m,2H), 2.44-2.36 (m,2H), 2.36-2.27 (m,6H), 1.66-1.39 (m,12H),1.38-1.20 (m,108H), 0.89 (t,J =5.6Hz,18H)。
【００４６】
（２） 2-(ホスホノキシ)[2-３H１]エチル 2-デオキシ-6-O-[2-デオキシ-2-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-4-O-ホスホノ-3-O-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイル]-β-Ｄ-グルコピラノシル]-3-O-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイル]-2-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-α-Ｄ-グルコピラノシド（［３Ｈ］ＰＥ４０６：５＊）の合成
（２−１） ホルミルメチル4-O-ベンジル-6-O-[6-O-ベンジル-2-デオキシ-4-O-(1,5-ジヒドロ-3-オキソ-3λ５-3H-2,4,3-ベンゾジオキサホスフェピン-3-イル)-2-[(R)-3-(ベンジルオキシ)テトラデカノイルアミノ]-3-O-[(R)-3-(ベンジルオキシ)テトラデカノイル]-β-Ｄ-グルコピラノシル]-3-O-[(R)-3-(ベンジルオキシ) テトラデカノイル]-2-[(R)-3-(ベンジルオキシ)テトラデカノイルアミノ]-2-デオキシ-α-Ｄ-グルコピラノシド（化合物２４）の合成
化合物２３（２３０ｍｇ，０.１５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ／ｔ−ブタノール／水  （１０：１０：１，９ｍＬ）溶液に激しく撹拌下、４−メチルモルフォリンＮ−オキシド（ＮＭＯ）（４０ｍｇ，０.４５ｍｍｏｌ）と四酸化オスミウム（ＯｓＯ４）の水溶液（２.５％，２３０ｍＬ，２０ｍｍｏｌ）を加えた。６時間後飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液（５０ｍＬ）を加え、酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出した。有機層をＮａ２Ｓ２Ｏ３水溶液（５０ｍＬ×２）と飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した後、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮して粗生成物のジオールを得た（４５８ｍｇ）。ジオールを無水ベンゼン（１０ｍＬ）に溶かし、四酢酸鉛（Ｐｂ(ＯＡｃ)４）  （純度９０％，６８ｍｇ，１４０ｍｍｏｌ）を加え、３０分間撹拌した。反応混合物をシリカゲルカラム（３ｇ）にチャージし、酢酸エチルで溶出した。減圧濃縮後、残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（６ｇ，トルエン／酢酸エチル＝４：１）で精製し化合物２４を無色シラップとして得た（１９０ｍｇ，収率：８３％）。
FAB-MS (positive) m/z 2032 [(M+Na)＋];  １H NMR (500MHz,CDCl３)δ=9.30 (s, 1H, CHO)。
【００４７】
（２−２） 2-ヒドロキシ-[2-３H１]エチル4-O-ベンジル-6-O-[6-O-ベンジル-2-デオキシ-4-O-(1,5-ジヒドロ-3-オキソ-3λ５-3H-2,4,3-ベンゾジオキサホスフェピン-3-イル)-2-[(R)-3-(ベンジルオキシ)テトラデカノイルアミノ]-3-O-[(R)-3-(ベンジルオキシ)テトラデカノイル]-β-Ｄ-グルコピラノシル]-3-O-[(R)-3-(ベンジルオキシ) テトラデカノイル]-2-[(R)-3-(ベンジルオキシ) テトラデカノイルアミノ]-2-デオキシ-α-Ｄ-グルコピラノシド（化合物２５＊）の合成
化合物２４（１００ｍｇ，４９.８ｍｍｏｌ）の２−プロパノール／メタノール（５：１，１.５ｍＬ）溶液に０℃でＮａＢ３Ｈ４（４７４ｍＬ，２６.３ｍｍｏｌ／ｍＬ，２４０ＧＢｑ ｍｍｏｌ−１）を加え、３０分間撹拌した。２Ｍ ＨＣｌ水溶液と飽和食塩水を加えて反応を止めた後、酢酸エチルで抽出した。抽出液をＮａ２ＳＯ４で乾燥した後、減圧濃縮し、化合物２５＊の無色シラップを得た（１００ｍｇ，定量的）。生成物は精製することなく次の反応に用いた。
【００４８】
（２−３） 2-(1,5-ジヒドロ-3-オキソ-3λ５-3H-2,4,3-ベンゾジオキサホスフェピン-3-イルオキシ)-[2-３H１] エチル4-O-ベンジル-6-O-[6-O-ベンジル-2-デオキシ-4-O-(1,5-ジヒドロ-3-オキソ-3λ５-3H-2,4,3-ベンゾジオキサホスフェピン-3-イル)-2-[(R)-3-(ベンジルオキシ)テトラデカノイルアミノ]-3-O-[(R)-3-(ベンジルオキシ)テトラデカノイル]-β-Ｄ-グルコピラノシル]-3-O-[(R)-3-(ベンジルオキシ) テトラデカノイル]-2-[(R)-3-(ベンジルオキシ) テトラデカノイルアミノ]-2-デオキシ-α-Ｄ-グルコピラノシド（化合物２６＊）の合成
化合物２５＊（１００ｍｇ，４９.８ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１４ｍＬ）溶液に０℃でＮ,Ｎ−ジエチル−１，５−ジヒドロ−３Ｈ−２，４，３−ベンゾジオキサフォスフェピン−３−アミン（７０ｍｇ，０.２９ｍｍｏｌ）とテトラゾール  （２０ｍｇ，０.２５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で３０分間撹拌した後、−２０℃に冷却した。ｍＣＰＢＡ（７０％，６５ｍｇ，０.２９ｍｍｏｌ）を加えた後、４５分間撹拌した。飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３を加えて反応を終了させた後、ＣＨＣｌ３で抽出した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液と飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。減圧濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［２.３ｇ，トルエン／酢酸エチル／ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）＝１００：５０：１］で精製し化合物２６＊の無色シラップを得た（６３．９ｍｇ，収率：５９％）。得られた化合物はクロマトグラフィー上で標品の非標識体２６と一致した。
[α]Ｄ２５ = +16.9 (c 1.00, CHCl３); FAB-MS (positive) m/z 2428 [(M+Na)＋]。
Found: C, 69.98; H, 8.40; N, 1.33%.  Calcd for C１２８H１８２N２O２４P２: C, 70.05; H, 8.36; N, 1.28%。
【００４９】
（２−４） 2-(ホスホノキシ)[2-３H１]エチル 2-デオキシ-6-O-[2-デオキシ-2[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-4-O-ホスホノ-3-O-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイル]-β-Ｄ-グルコピラノシル]-3-O-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイル]-2-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-α-Ｄ-グルコピラノシド （［３Ｈ］ＰＥ４０６：５＊）の合成
化合物２６＊（１７ｍｇ，７.８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（６ｍＬ）溶液にＰｄ−ｂｌａｃｋ（１２０ｍｇ）を加え、加圧下（７ｋｇｃｍ−２）室温で２時間接触還元を行った。トリエチルアミンを加えて中和した後、Ｐｄ−ｂｌａｃｋを濾過で除いた。減圧濃縮して得た残渣を液液分配クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０：２０ｇ，ＣＨＣｌ３／メタノール／水／２−プロパノール＝８：８：９：１）（有機層を固定相として水層を移動相として使用）で精製し、［３Ｈ］ＰＥ４０６（５＊）の白色粉末を得た（７.５ｍｇ，３３１ＭＢｑ，６４ＧＢｑ ｍｍｏｌ−１，収率：６６％）。得られた化合物はクロマトグラフィー上で標品の非標識体５  と一致した。
FAB-MS (negative) m/z 1448 [(M-H)−]; １H NMR (500MHz, SDS-d２５-D２O) d = 5.18(dd,J =9.4, 7.5Hz,1H), 5.17 (dd,J =9.8, 9.6Hz,1H), 4.87 (d,J = 3.8 Hz,1H), 4.67 (d,J =7.0Hz,1H), 4.12 (dd,J =9.8, 3.8 Hz,1H), 4.11 (dd,J =15.5,1.6Hz,1H), 4.11 (q,J =7.5,1H), 4.02 (dd,J =9.4, 7.0Hz,1H), 3.99 (m,1H), 3.96 (m,1H), 3.91 (m,3H), 3.87 (ddd,J =9.6, 1.6, 2.9Hz,1H), 3.82 (dd,J =9.8, 8.6Hz,1H), 3.82 (dd,J =15.5, 2.9Hz,1H), 3.82 (m,1H), 3.81 (m,3H), 3.71 (m,1H), 3.59 (m,1H), 2.56-2.23 (m,8H), 1.54-1.11 (m,80H), 0.86 (m,12H)。
【００５０】
実施例２  分子ピンセットライブラリー（ペプチドライブラリー）の調製
エンコード分子ピンセットライブラリーはスプリット（split-mix)合成法で調製した。固相担体としては１５ｇのＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ−ＮＨ２（Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ社，粒径９０μｍ，０.２９ｍｍｏｌ／ｇ ｏｆ ＮＨ２）を用いた。標準的なＦｍｏｃ／Ｂｏｃ（Fluorenylmethoxycarbonyl/Butyloxycarbonyl）ペプチド固相合成法を用いてペプチド鎖を伸長させた。ペプチド縮合法としてはＨＯＢｔ／ＤＩＣ（Hydroxybenzotriazole / Diisopropylcarbodiimide)を用いた。ペプチド縮合反応の終点はブロモフェノールブルーテストで青色の発色がなくなることで確認した。カテコールＴａｇはカルボキシル基を介してＨＯＢｔ／ＤＩＣ法でアミノ基の約１％にアミド結合形成反応により導入した。ケノデオキシコール酸（Ｌ１）をコア構造として用いる場合はまずデオキシコール酸を固相担体に導入した後、２つの水酸基に対しＤＭＦ中で６当量のＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｆと６当量のトリエチエルアミン、０.０６当量のジメチルアミノピリジンを作用させて、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙを結合させた。リジン（Ｌ２）とトリリジン（Ｌ３）コアは通常のペプチド固相合成法により調製した。ライブラリー調製には１５種類（ＧｌｙとＤ及びＬ−Ｖａｌ，Ｐｈｅ，Ｓｅｒ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｌｙｓ及びＰｒｏ）のアミノ酸を用いた。４段階のスプリットカップリングサイクルを行って、３×１５４＝１５１,８７５種類のペプチドを含むライブラリーを構築した。ライブラリー上の保護基は２０％ピペリジン／ＤＭＦと９５％ＴＦＡ／２．５％水／２．５％チオアニソールを用いて除去した後４℃で保管した。
【００５１】
実施例３  分子ピンセットライブラリー（ペプチドライブラリー）と放射性標識リピドＡ類縁体との結合実験
（１）［３Ｈ］ＰＥ５０６との結合実験
［３Ｈ］ＰＥ５０６（６２ＧＢｑ／ｍｍｏｌ，１.４ｍｇ，４７ＭＢｑ）を水（２ｍｌ）に溶かした。分子ピンセットライブラリー（１５.７ｍｇ，約１９０００ビーズ）を水（２００μｌ）に懸濁し、［３Ｈ］ＰＥ５０６溶液（１００μｌ，２.４ＭＢｑ）を加えた。この［３Ｈ］ＰＥ５０６（１３０μＭ）と樹脂の懸濁液を４℃で４１時間ゆっくりと振盪した。遠心して樹脂を沈殿させ、上清を除く操作を３回繰り返した。 ガラスプレートをＮａＣＩＯ溶液で処理した後、十分に水洗し、０.５ゼラチン溶液に浸してから取り出し、風乾してゼラチンがコートされたガラスプレートを調製した。これに上記の樹脂をのせ、風乾させた。これを温めて溶融させた Ｋｏｄａｋ ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ ｅｍｕｌｓｉｏｎで覆い、十分に固まったことを確認後、遮光下−７８℃で１２日間放置した。ガラスプレートを展開液に１０分間つけた後、水で洗浄した。固定液に１５分間つけた後に水で洗浄した。放射能を帯びた樹脂の回りはゼラチンに銀が付着して黒くなる。これを指標に放射能を帯びた樹脂を取り出し、樹脂に結合したＴａｇを樹脂から切り離し、電子補足ガスクロマトグラフィー（ＥＣＧＣ）でＴａｇを検出、デコードすることにより１９種類の［３Ｈ］ＰＥ５０６を結合する分子ピンセットを見出した
（２）［３Ｈ］ＰＥ４０６との結合実験
［３Ｈ］ＰＥ４０６（６４ＧＢｑ／ｍｍｏｌ，０.６ｍｇ，２６ＭＢｑ）を水（１ｍｌ）に溶かした。分子ピンセットライブラリー（２４.２ｍｇ，約２９０００ビーズ）を水（２００μｌ）に懸濁し、［３Ｈ］ＰＥ４０６の溶液（１００μｌ，２．６ＭＢｑ）を加えた。この［３Ｈ］ＰＥ４０６（１３０μＭ）と樹脂の懸濁液を４℃で４８時間ゆっくりと振盪した。遠心して樹脂を沈殿させ、上清を除いた。水１μｌを加え振盪し、遠心して樹脂を沈殿させ、上清を除く操作を３回繰り返した。
ゼラチンがコートされたガラスプレートに樹脂をのせ、風乾させた。これを温めて溶融したＫｏｄａｋ ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ ｅｍｕｌｓｉｏｎで覆い十分に固まったことを確認後、遮光下−７８℃で７日間放置した。放射線を帯びた樹脂を取り出し、ＥＣＧＣ解析した。３２種類の［３Ｈ］ＰＥ４０６を結合する分子ピンセットを見出した。
【００５２】
実施例４  分子ピンセットの再合成
固相担体としてはＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ−ＮＨ２（Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ社，粒径９０μｍ，０.２９ｍｍｏｌ／ｇ ｏｆ ＮＨ２）又はＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ＡｍｉｎｏＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｓ（東ソー（株），０.１ｍｍｏｌ／ｍｌ）を用いた。標準的なＦｍｏｃ／Ｂｏｃ（Fluorenylmethoxycarbonyl/Butyoxycarbonyl）ペプチド固相合成法を用いてペプチド鎖を伸長させた。ペプチド縮合法としてはＨＯＢｔ／ＤＩＣ(Hydroxybenzotriazole / Diisopropylcarbodiimide)を用いた。ペプチド縮合反応の終点はブロモフェノールブルーテストで青色の発色がなくなることで確認した。
代表的な例として分子ピンセット６−Toyopearl［(ｋ-ｓ-ｋ-Ｓ)４Ｌ３−Toyopearl］の合成例を示す。
（１） Ｎα，Ｎε−ジ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジン（Ｂｏｃ-Ｌ-Ｌｙｓ(Ｂｏｃ)-ＯＨ）の導入
ＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ＡｍｉｎｏＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｓ（０.１ｍｍｏｌ／ｍｌ）（１ｍｌ，０.１ｍｍｏｌ）に１０％ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）／ＤＭＦ（４.０ｍｌ）を加え３０秒間振盪した後、濾渦した。ＤＭＦ（４．０ｍｌ）で樹脂を２回洗浄後、Ｂｏｃ-Ｌ-Ｌｙｓ(Ｂｏｃ)-ＯＨ（１０４ｍｇ，０.３００ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（３ｍｌ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（４７.０μｌ，０.３００ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１ｍｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（４０.５ｍｇ，０.３００ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１ｍｌ）を加え、室温で２時間振盪した。濾渦後、樹脂をＤＭＦ（４.０ｍｌ）で４回洗浄した。Ｂｏｃ-Ｌ-Ｌｙｓ(Ｂｏｃ)-ＯＨを用いたペプチド縮合反応をもう一度繰り返した。無水酢酸−ＤＭＦ（１：１）溶液（２ｍｌ）とトリエチルアミン−ＤＭＦ（１：１）溶液（２ｍｌ）を加え、室温で１５分間振盪し、わずかに残る未反応のアミノ基を完全にブロックした。濾渦後、樹脂をＤＭＦ（４ｍｌ）で４回洗浄した。
（２） Ｂｏｃ基の除去
２５％ＴＦＡ／ＤＭＦ（４.０ｍｌ）を加え、室温で３０分間振盪した。濾渦後 、樹脂をＤＭＦ（４．０ｍｌ）で４回洗浄した。
（３） Ｎα−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｎε−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジン（Ｆｍｏｃ-Ｌ-Ｌｙｓ(Ｂｏｃ)-ＯＨ）の縮合
Ｆｍｏｃ-Ｌ-Ｌｙｓ(Ｂｏｃ)-ＯＨ（２８１ｍｇ，０.６００ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（３ｍｌ）、ＤＩＣ（９４.０μｌ，０.６００ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１ｍｌ）、ＨＯＢｔ（８１.１ｍｇ，０.６００ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液を加え、室温で２時間振盪した。濾渦後、樹脂をＤＭＦ（４.０ｍｌ）で４回洗浄した。Ｆｍｏｃ-Ｌ-Ｌｙｓ(Ｂｏｃ)-ＯＨを用いたペプチド縮合反応をもう一度繰り返した。未反応のアミノ基は無水酢酸を用いて、同様にブロックした。
（４） Ｆｍｏｃ基の除去
２０％ピペリジン／ＤＭＦ（４ｍｌ）を加え室温で３０分間振盪してＦｍｏｃ基を除去した。濾渦後、樹脂をＤＭＦ（４.０ｍｌ）で３回、メタノール（４.０ｍｌ）で２回洗浄した。Ｆｍｏｃ基を除去する操作を２回繰り返した。
（５） Ｂｏｃ基の除去
上記（２）と同様にしてＢｏｃ基を除去した。
（６） Ｎα−フルオレニルメトキシカルボニル−ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−セリン（Ｆｍｏｃ-Ｌ-Ｓｅｒ(ｔＢｕ)-ＯＨ）の縮合
Ｆｍｏｃ-Ｌ-Ｓｅｒ(ｔＢｕ)-ＯＨ（４６０ｍｇ，１.２０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（６ｍｌ）、ＤＩＣ（１８８μｌ，１.２０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２ｍｌ）、ＨＯＢｔ（１６２ｍｇ，１.２０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を加え、室温で２時間振盪した。濾渦後、樹脂をＤＭＦ（４．０ｍｌ）で４回洗浄した。
（７） Ｆｍｏｃ基の除去
上記（４）と同様にしてＦｍｏｃ基を除去した。
（８） Ｆｍｏｃ-Ｄ-Ｌｙｓ(Ｂｏｃ)-ＯＨの縮合
Ｆｍｏｃ-Ｄ-Ｌｙｓ(Ｂｏｃ)-ＯＨ（５６２ｍｇ，１.２０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（６ｍｌ）、ＤＩＣ（１８８μｌ，１.２０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２ｍｌ）、ＨＯＢｔ（１６２ｍｇ，１.２０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を加え、室温で２時間振盪した。濾渦後、樹脂をＤＭＦ（４.０ｍｌ）で洗浄した。
（９） Ｆｍｏｃ基の除去
上記（４）と同様にしてＦｍｏｃ基を除去した。
（１０） Ｆｍｏｃ-Ｄ-Ｌｙｓ(Ｂｏｃ)-ＯＨの縮合
Ｆｍｏｃ-Ｄ-Ｌｙｓ(Ｂｏｃ)-ＯＨ（５６２ｍｇ，１.２０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（６ｍｌ）、ＤＩＣ（１８８μｌ，１.２０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２ｍｌ）、ＨＯＢｔ（１６２ｍｇ、１.２０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を加え、室温で２時間振盪した。濾渦後、樹脂をＤＭＦ（４.０ｍｌ）で洗浄した。
（１１） Ｆｍｏｃ基の除去
上記（４）と同様にしてＦｍｏｃ基を除去した。
（１２） Ｂｏｃ基とｔＢｕ基の除去
上記（２）のＢｏｃ基の除去操作と同様にして側鎖保護基を除去した。
以上、（１）〜（１２）の操作を順次行うことにより、分子ピンセット［(ｋ-ｓ-ｋ-Ｓ)４Ｌ３−Toyopearl］が得られた。
他の分子ピンセット樹脂も上記と同様にして合成した。
【００５３】
実施例５  分子ピンセット６-TentaGel〜17-TentaGelと、ＰＥ５０６，５０６，ＰＥ４０６，４０６，ＲｅＬＰＳ及び大腸菌リポ多糖（ＬＰＳ)
との結合実験
ＰＥ５０６（０.０６ｍｇ）を水（０.８０ｍｌ）に溶かした。分子ピンセット６〜１７TentaGel（約２０ｍｇ）を水（１００μｌ）に懸濁し、ＰＥ５０６溶液（２５μｌ）を加えた。この懸濁液を室温で終夜ゆっくりと振盪した。遠心して樹脂を沈殿させ上清をＴＬＣ分析、リムルス活性測定に用いた。
５０６（０.５６ｍｇ）、ＰＥ４０６（０.７ｍｇ）、４０６（０.７ｍｇ），ＲｅＬＰＳ（０.８５ｍｇ）、ＬＰＳ（１ｍｇ）を用い同様に結合実験を行い、得られた上清をリムルス活性測定に用いた（５０６の場合は、ＴＬＣ分析にも使用した。）。なお、ＴＬＣ分析の結果は表６に示した通りである。
【００５４】
実施例６  分子ピンセット６-Toyopearl，１１-Toyopearl，１２-Toyopearl，１６-Toyopearl，及び１７-Toyopearlと、５０６，ＲｅＬＰＳ及び大腸菌リポ多糖（ＬＰＳ）との結合実験
５０６（０.５６ｍｇ）を水（０.８０ｍｌ）に溶かした溶液をさらに３倍に希釈した。分子ピンセットの各Toyopearl（約２０ｍｇ）を水（１００μｌ）に懸濁し、５０６溶液（２５μｌ）を加えた。この懸濁液を室温で終夜ゆっくりと振盪した。遠心して樹脂を沈殿させ上清をリムルス活性測定に用いた。
ＲｅＬＰＳ（０.８５ｍｇ）、大腸菌リポ多糖（ＬＰＳ）（１ｍｇ）も同様に上記溶液を３倍に希釈した後に、同様に結合実験を行い、得られた上清をリムルス活性測定に用いた。
【００５５】
実施例７  リムルス活性の測定
エンドスペーシーＲ（生化学工業（株）製）を用いてリムルス活性の測定を行った。
１．各試料（ＰＥ５０６，５０６，ＰＥ４０６，４０６，ＲｅＬＰＳ及び大腸菌リポ多糖（ＬＰＳ)）を水に溶かし１ｍｇ／ｍｌの溶液を調製した。
２．注射用蒸留水（大塚製薬株式会社製）を用いて９６穴のマイクロプレート上で試料を適当な濃度に希釈した。
３．試料溶液２０μｌずつをマイクロプレートに分注し、氷水浴中で冷却しながらエンドスペーシーＲ ＥＳ−５０ＭセットＬＡＬ試薬３０μｌを加え、３７℃で２０分間加温した。
４．下記のジアゾ化試薬Ａ，Ｂ，Ｃを順次７５ｍｌづつ加えた後、波長５４０ｎｍの吸光度を測定した。各試料濃度が１０−６ｍｇ／ｍｌのときの吸光度を標準に用いた。
（ジアゾ化試薬）
Ａ：亜硝酸ナトリウム４０ｍｇを濃塩酸４ｍｌと水９６ｍｌに溶かした溶液
Ｂ：スルファミン酸アンモニウム３００ｍｇを水１００ｍｌに溶かした溶液
Ｃ：Ｎ−ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩７０ｍｇを水１００ｍｌに溶かし      た溶液
結合実験で得られた各試料についても全く同様にして希釈し、それぞれについてリムルス活性試験を行い、吸光度を測定した。上記の各試料の標準の吸光度と比較して各樹脂の吸着能を見積もった。結果は、図１及び図２に示すとおりである。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、リピドＡ、リピドＡ類縁体、リポ多糖に対する本発明のペプチドライブラリー（固相担体としてポリエチレングリコール−ポリスチレン樹脂であるＴｅｎｔａＧｅｌを使用したもの）の結合能力を調べた結果を示す。  図１中、（ａ）は大腸菌型リピドＡのホスホノオキシエチル誘導体（ＰＥ５０６）との、（ｂ）は大腸菌型リピドＡ（５０６）との、（ｃ）は生合成前駆体型リピドＡのホスホノオキシエチル誘導体（ＰＥ４０６）との、（ｄ）は生合成前駆体型リピドＡ（４０６）との、（ｅ）は大腸菌Ｒｅ変異株のリポ多糖（ＲｅＬＰＳ）との、（ｆ）は大腸菌リポ多糖（ ＬＰＳ）との結合実験の結果をそれぞれ示す。
【図２】図２は、リピドＡ、リピドＡ類縁体、リポ多糖に対する本発明のペプチドライブラリー（固相担体として親水性ビニルポリマーのＴＯＹＯＰＥＡＲＬを使用したもの）の結合能力を調べた結果を示す。  図２中、（ａ）は大腸菌型リピドＡ（５０６）との、（ｂ）は大腸菌Ｒｅ変異株のリポ多糖（ＲｅＬＰＳ）との、（ｃ）は大腸菌リポ多糖（ ＬＰＳ）との結合実験の結果をそれぞれ示す。
【図１】
2007031448.tif 000021
【図２】
2007031448.tif 000022