(57)【要約】【課題】社会環境に存在する人体に有害とされるアスベストを、簡便な方法で迅速に検知するアスベスト定量法及び定量キットを提供する。【解決手段】クロシドライト等のアスベストを含む液体に大腸菌および抗生物質耐性遺伝子をコードしたプラスミドを混合し、寒天等の培地に滴下し、ストリークバー等を押し当て、所定の条件下にて大腸菌を形質転換させ、その形質転換数からアスベストを定量するアスベスト定量法から構成される。また、このアスベスト定量法に使用する定量キットによってアスベストを含む粉塵や砂礫中からアスベストの定量を可能とする。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスベストを含む液体に菌を混合することにより、菌を形質転換させ、その形質転換数からアスベストを定量するアスベスト定量法。
【請求項２】
菌が大腸菌である、請求項１記載のアスベスト定量法。
【請求項３】
アスベストがクロシドライトである、請求項１及び２記載のアスベスト定量法。
【請求項４】
アスベストを含む液体に菌を混合することにより、菌を形質転換させ、その形質転換数からアスベストを定量するアスベスト定量キット。
【請求項５】
菌が大腸菌である、請求項４記載のアスベスト定量キット。
【請求項６】
アスベストがクロシドライトである、請求項４及び５記載のアスベストキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、社会環境に存在する人体に有害とされるアスベストを、簡便な方法で迅速に検知するアスベスト定量法及び定量キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アスベストは、天然に産する鉱物繊維であり、耐熱性、耐薬品性、絶縁性等の諸特性に優れ、各種建設資材、電気製品、自動車、家庭用品等に大量に使用されていた。ところが、近年アスベストによる人の健康に対する危険性が指摘され、一部の例外を除きその製造、使用等が禁止されている。しかし、建築物の天井や鉄筋に吹き付けて断熱材として使用されたものや、屋根や外壁材に混入して使用されたものも多くあり、空気中に浮遊するアスベストを人が吸引する危険性も指摘されている。
【０００３】
従来、これらアスベストを検知し定量する方法としては、電子顕微鏡や光学顕微鏡によりアスベストの繊維数を計測する方法（繊維数測定法）かＸ線回折法等による重量測定法が有るが、測定に手間がかかり、またアスベスト以外の繊維を計測する虞もあった。しかもアスベスト以外の粘土鉱物が共存している場合、アスベストの定量不可能となる欠点を有していた。
【０００４】
そこで、無機質粉体などに不純物として混入する角閃石もしくは蛇紋石の重量濃度を粉末Ｘ線回折法により測定すると共に、レーザー顕微鏡で前記角閃石もしくは蛇紋石の横幅と高さの関係を求め、偏光顕微鏡もしくは電子顕微鏡によりアスペクト比と体積を算出し、形状を加味した上でアスベストの重量濃度を算出するアスベスト定量法が提案されている（特許文献１参照。）
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−１３４１２８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記特許文献１に提案されているアスベスト定量法の場合、天然鉱物を原料とした無機粉体に不純物として混入するアスベストの重量濃度の計測を可能とするものであるが、予めアスベストの形状を考慮するため、レーザー顕微鏡や電子顕微鏡等によって角閃石や蛇紋石の横幅と高さとの関係や、アスペクト比と体積を算出する必要があり非常に手間を要するという問題点がある。
【０００７】
また、電子顕微鏡を使用する方法は、民間の測定機関では経済的に困難であり、公共の試験機関に依頼しても迅速な対応ができないという問題点もある。
【０００８】
上記の問題点に鑑み本発明者らは、遺伝子工学において大腸菌等腸内細菌群のプラスミドによる形質転換数はクロシドライト等アスベスト濃度に非常に鋭敏であり、相関関係を有することを見出し、鋭意研究の結果、クロシドライト等アスベストを含む液体に大腸菌を混合し、大腸菌を形質転換させ、その形質転換数からアスベストを定量しうるアスベスト定量方法及びアスベスト定量キットを提供するにいたった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
このため本発明は、アスベストを含む液体に菌を混合することにより、菌を形質転換させ、その形質転換数からアスベストを定量することを第１の特徴とする。
【００１０】
また、前記菌が大腸菌であることを第２の特徴とする。
【００１１】
また、前記アスベストがクロシドライトであることを第３の特徴とする。
【００１２】
そして、アスベストを含む液体に菌を混合することにより、菌を形質転換させ、その形質転換数からアスベストを定量するアスベスト定量キットであることを第４の特徴とする。
【００１３】
しかも、前記アスベスト定量キットに使用される菌が大腸菌であることを第５の特徴とする。
【００１４】
さらに、前記アスベスト定量キットで定量されるアスベストがクロシドライトであることを第６の特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係るアスベスト定量法及び定量キットによれば、簡便で正確なアスベストの定量が可能となるという優れた効果を有する。
【００１６】
また、定量を行なうアスベスト中に多量の粘土鉱物が混在していても、アスベストの定量ができるため、建築物解体に伴う粉塵や、砂礫中のアスベストの定量も可能であるという効果を有する。
【００１７】
さらに、定量キットを用いて同時に多数の検査が可能であるため、検査に係る時間が短くしかも安価であるという優れた効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明が本実施例に限定されないことは言うまでもない。本発明において、アスベストの一種であるクロシドライトを１０ｍｇ／ｍｌになるように滅菌蒸留水に懸濁洗浄後、１０μｍのフィルターで濾過して粒度を揃えた。ＬＢ（Ｌuria-Ｂertani）培地にて固体培養された大腸菌及び抗生物質耐性遺伝子をコードしたｐＵＣ１８等のプラスミドの混合液を、２％寒天やジェランガム等の弾性体を含む培地に滴下し、ストリークバーを弾性体表面に押しあて、弾性体に対する垂直抗力を一定に保ちながら、一定時間９０ｒｐｍの回転運動を与えたところ（弾性体曝露という）、大腸菌はプラスミドを取り込んで、抗生物質耐性に形質転換した。この弾性体曝露の過程において、弾性体表面に滴下された液体は１５秒以内に弾性体中に浸透し、弾性体とストリークバーとの界面に生じる滑り摩擦力は急激に増大した。この滑り摩擦力の増大によって大腸菌及びクロシドライトに物理的変化が与えられ、プラスミドによる大腸菌の形質転換が導かれた。
【００１９】
すなわち、クロシドライトにｐＵＣ１８等の抗生物質耐性遺伝子をコードしたプラスミドを付着させ、大腸菌を弾性体曝露させると、大腸菌はプラスミドを取り込んで、抗生物質耐性に形質転換することが確認され、しかも大腸菌の形質転換がクロシドライト等アスベストに対して非常に鋭敏であり、５０ｎｇ／ｍｌの低濃度においても形質転換が得られた。上記の結果により、クロシドライト濃度と大腸菌の形質転換数との相関を見出し、後述する定量キットを使用することによって、環境中とくに砂礫中から微細粒子を調製し、大腸菌とプラスミドを混合して弾性体曝露を行い、得られた形質転換数を計測し、砂礫中に含まれるアスベスト濃度を定量することができた。尚、クロシドライトを含む物質としては砂礫に限定されずカオリナイト、ベントナイト、ロックウール等の粘土鉱物やプラスチック等或いは水等の溶液であってもかまわない。
【実施例】
【００２０】
環境中からアスベスト濃度を算出するモデルとして、海砂や砂が多量に含まれるコンクリート廃材を想定し、海砂中に混在するアスベストを用い、鉱物コロイド溶液の調製を行い弾性体曝露によって得られる形質転換数を調べ、環境中のアスベスト繊維定量を行なった。
【００２１】
まず、海砂を水で十分に洗浄後、３０ｍｅｓｈ篩（ａｐｅｒｔｕｒｅ５００μｍ）にて分別を行い、５００μｍ以下の径の海砂を回収した。回収した海砂は６０℃にて１８時間保温し滅菌した。つぎにクロシドライト（関東化学製）を５０ｍｇ／ｍｌとなるように蒸留水に懸濁させ、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌した。滅菌された海砂１ｇをチューブに取り、０．１５〜１５ｍｇ／ｍｌのクロシドライト溶液を３ｍｌ加え、この懸濁液をクロシドライト（アスベスト）を含む砂礫とし、ボルテックスマシーン（ＥＹＬＡ社製 ＣＭ−１０００）で１５００ｒｐｍ、１０分間震盪攪拌後、２０００ｒｐｍで２秒間遠心して得られた上層を粘土鉱物コロイド溶液とした。
【００２２】
次にＬＢ液体培地にて３０℃、２２時間培養された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９)培養液５００μｌをチューブに取り、９０００ｇ、３分間遠心後、上澄みを廃棄し細胞沈殿物を得た。そして細胞沈殿物に粘土鉱物コロイド溶液４７５μｌ、プラスミドＤＮＡ（ｐＵＣ１８）０．０２μｇ、２００ｍＭ  ＮaＣl solution ２５μｌを順に加えた後、細胞沈殿物を懸濁させ、細胞・粘土鉱物懸濁液とした。
【００２３】
そして、細胞・粘土鉱物懸濁液５０μｌを、２％寒天（ナカライ製）と、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ平板培地上に滴下し、６０秒間弾性体曝露を行い、当該ＬＢ寒天培地を３７℃の恒温槽にて１６〜２０時間インキュベートし、アンピシリン耐性に形質転換した大腸菌を得た。表１にアンピシリン耐性に形質転換した大腸菌のプレート当たりのコロニー数を示す。また、図１はアンピシリン耐性に形質転換した大腸菌のプレート当たりのコロニー数を示すグラフである。
【００２４】
【表１】
2007061056.tif 000003
【００２５】
表１及び図１に示すように、クロシドライト濃度と、弾性体曝露によって得られた大腸菌の形質転換数には相関があり、この相関から後述する数式を導き出すことによって海砂中のクロシドライト濃度の定量は可能となる。また、環境中の砂礫についても上記の方法を準拠することによってアスベストの濃度を定量することが可能となる。尚、クロシドライト以外の例えばクリソタイルが混入した場合であっても全アスベスト含有量としてアスベスト濃度の定量が可能となる。数１は表１のデータの相関を表す数式を示す。
【００２６】
【数１】
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【００２７】
数式１を用いることにより、例えば環境中の砂礫を上述のアスベスト定量方法に従って処理し、プレート中に形質転換したコロニーが１５０個得られた場合、４．０が導き出され、砂礫１ｇ中には４．０ｍｇのアスベストが含まれることが定量される。尚、本方法では砂礫１ｇ中１００μｇ以上のアスベストが含まれている場合に有効とされる。
【００２８】
次に、本発明に使用されるアスベスト定量キットについて図面に基づき説明する。図２は定量キットの正面説明図であり、図２ａは定量キットの分割説明図、図２ｂは定量キット使用状態の説明図である。
【００２９】
アスベスト定量キットは、検量線用キットと環境定量キットとから成っている。まず検量線キットは図２ａに示すように、Ａ部１、Ｂ部２、Ｃ部３の３部から構成されている。Ａ部は内径２ｃｍ、長さ４ｃｍの平底ポリプロピレン製円筒チューブからなり、頭部外側にはネジ部を有しスクリューキャップ４にて密封されている。またＢ部２は内径２ｃｍ、長さ４ｃｍの平底ポリプロピレン製円筒チューブで底部の所定位置には約０．１ｍｍ厚のガラス若しくはポリエチレンフィルムからなるシール５が形成され、底部の内側にはＡ部１のネジ部と螺合するネジ部６が形成されており、Ｂ部２の頭部外側には後述するＣ部３のネジ部９に螺合するネジ部７が形成され、Ａ部１と同様にスクリューキャップ４１にて密封されている。そしてＣ部３は内径２ｃｍの胴長釣鐘状ポリプロピレン製キャップであり、頭部には目薬滴下口形状の穴部８が形成されており、穴部８は一滴が１０〜２０μｌとなるように直径が調整されている。また底部内側には前述したＢ部２の頭部外側のネジ部７と螺合するネジ部９が形成され、Ｃ部３の内側所定位置にはナイロンフィルター１０（ポアサイズ３０μｍ）が装着されている。
【００３０】
ここで、Ｂ部２には例えばＪＭ１０９株等の大腸菌細胞６×１０８個と、ｐＵＣ１８等のプラスミド様核酸物質１００〜２００ｎｇを含む滅菌生理食塩水３ｍｌが投入されて使用される。また、Ａ部１には例えば５００μｍのメッシュで篩い分けられた海砂または川砂１ｇと、０．１５〜１５ｍｇの範囲内のクロシドライトとが投入され、スクリューキャップ４にて密封し１分間激しく振盪させて攪拌後、１２０℃で２時間滅菌されて使用される。
【００３１】
環境定量キットの形状は上記検量線キットと同じであり省略するが、上記図２ａに示す検量線キットのうちＡ部１には定量を目的とする粉体等を投入するため空とされ、Ｂ部２には予め上記の大腸菌細胞と、プラスミドを含む滅菌生理食塩水が投入されてスクリューキャップ４にて密封されており、またＣ部３は上記検量線キットと同じである。
【００３２】
（検量線キットの使用方法）
次に検量線キットの使用方法について、図に従い説明する。図２ｂに示すように、まずＡ部１のスクリューキャップ４を外しＢ部２のネジ部６にＡ部のネジ部を螺合させて連結させる。ここでＡ部１は上記したクロシドライトが０．１５〜１５ｍｇの範囲内で投入されたものが複数用意されている。Ａ部１とＢ部２とをさらに強く螺合させ、シール５を破損させて前記クロシドライトと大腸菌細胞と、プラスミドを含む滅菌生理食塩水とを混ぜあわせ、さらにＡ部１とＢ部２を連結したまま上下に攪拌する。次にＢ部２のスクリューキャップ４１を外し、ネジ部７をＣ部３のネジ部９と螺合させてＡ部１、Ｂ部２、Ｃ部３を連結させる。この工程を複数用意したＡ部１に対して全て行い、準備する。尚、Ｂ部２は４℃で保管し５日以内に使用することが望ましい。
【００３３】
（弾性体の調製）
２パーセント寒天を含むＬＢ培地（トリプトン１％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ１％）を加圧滅菌（１２１℃、１ｋｇｆ／ｃｍ２、１５分）し、５０℃付近にまで冷まし、アンピリシンを５０μｇ／ｍｌとなるように加え、直径８ｃｍのシャーレに投入し固化させる。
【００３４】
（弾性体曝露及び検量線の作成）
前記準備されたＡ、Ｂ、Ｃ部を連結したポリプロピレン製チューブのＣ部３の頭部に設けられた穴部８から、前記固化されたＬＢ培地表面に前記クロシドライトと大腸菌細胞と、プラスミドを含む滅菌生理食塩水の混合液を５滴（５０μｌ）滴下し、ポリスチレン製のコーンラージバー（ストリークバー）を用いてＬＢ培地表面を６０秒間まんべんなくこすり、物理的刺激を与え、さらに、シャーレを３７℃で１４〜１８時間恒温槽内に放置する。その後アンピシリン耐性に形質転換した大腸菌をプレート当たりのコロニー数ｃｕｆ（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）として計測し、クロシドライト（アスベスト）濃度とコロニー数の関係をグラフ化して検量線とし、この検量線から関数を導き出す。
【００３５】
（環境定量キットの使用方法）
環境定量キットの使用方法を説明すると、アスベストが含まれていると思われる建築廃材を回収し、５００μｍのメッシュで篩分けし、篩分けられた粉状物１ｇを空のＡ部１に投入する。次いでＢ部２、Ｃ部３を連結して上述した検量線キットと同様に準備する。弾性体の調製及び弾性体曝露に関しては、上記検量線キットの場合と同等であり省略するが、計測されたプレート当たりのコロニー数と、前記検量線から得られた関数によって、クロシドライト（アスベスト）濃度が算出される。
【００３６】
以上の構成の定量キットを使用することによって、短時間で多くのアスベストの定量が可能となるため安価にできる、しかも簡便で正確なアスベストの定量が可能となり、さらに後述する他の粘土鉱物が混在してもアスベストの定量が可能である。
【００３７】
次に、アスベスト以外の粘土鉱物による大腸菌への形質転換に対する影響について説明する。使用したアスベスト以外の粘土鉱物は、ベントナイト（和光純薬製）、カオリナイト（ナカライテクス製）、グラスウール（建築廃材物）、ロックウール（建築廃材物）、タルク（和光純薬製）、酸化マグネシウム（和光純薬製）であり、比較として、クロシドライト（関東化学製）、クリソタイル（和光純薬製）のアスベストを使用した。
【００３８】
（粘土鉱物コロイド溶液の調製）
夫々の粘土鉱物を０．４ｍｇ／ｍｌとなるように蒸留水に懸濁し、ボルテックスマシン（ＥＹＬＡ製  ＣＭ−１０００）を用い１５００ｒｐｍ、１０分間回転攪拌後さらに２０００ｒｐｍ、２分間遠心し上澄みを廃棄した。次に得られた粘土鉱物沈殿物に４０ｍｌの蒸留水を加えボルテックスマシンを用い１５００ｒｐｍにて１０分間回転攪拌後、さらに２０００ｒｐｍにて２分間遠心し、上澄みを別のチューブに取りオートクレーブ滅菌し粘土鉱物コロイド溶液とした。尚、この時の濁度はＯＤ５５０の値として０．０５〜０．１となり、粘土鉱物の濃度はいずれも略５０μｇ／ｍｌとなる。
【００３９】
（大腸菌・粘土鉱物混合液の調製）
ＬＢ液体培地にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を植え付け、１８〜２４時間、３０℃で震盪、培養液５００μｌをチューブに取り８０００ｘｇで２分間遠心し、上澄みを廃棄した。次に用意した大腸菌の沈殿に前記粘土鉱物コロイド溶液を各々４７５μｌ、ｐＵＣ１８ＤＮＡ０．５ｎｇ、２００ｍＭ  ＮａＣｌを２５μｌ加えた後、大腸菌を分散させて大腸菌・粘土鉱物混合液とした。
【００４０】
（弾性体の調製及び曝露）
弾性体の調製及び曝露に関しては、上述した方法と同等であり、省略する。アンピシリン耐性に形質転換した大腸菌をプレート当たりのコロニー数ｃｕｆ（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）として計測した。その結果を表２に示す。
【００４１】
【表２】
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【００４２】
表２に示すように、大腸菌の形質転換に影響するのはクロシドライト、クリソタイルのアスベストのみであった。アスベストの代替品として多用されるグラスウールやロックウールは物性においてアスベストと類似するものの形質転換は示さなかった。上記の結果により、弾性体曝露を介して大腸菌にプラスミドによる形質転換を引き起こすことができるのはアスベスト特有の現象であることが確認され、アスベスト以外のグラスウールやロックウール等、他の粘土鉱物が混在した状態であっても、大腸菌のプラスミドによる形質転換数はアスベストの量と相関することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明によるアスベスト定量法によれば、建物の解体に伴う粉塵や、砂礫中のアスベストの定量であり、作業環境ばかりでなく一般環境の測定として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明に係る細菌のアンピシリン耐性に形質転換した大腸菌のプレート当たりのコロニー数を示すグラフである。
【図２】本発明に係る定量キットの正面説明図である。
【符号の説明】
【００４５】
１                  Ａ部
２                  Ｂ部
３                  Ｃ部
４、４１            スクリューキャップ
５                  シール
６、７、９          ネジ部
８                  穴部
１０                  ナイロンフィルター
【図１】
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【図２】
2007061056.tif 000007