(57)【要約】      （修正有）【課題】不凍活性を有する安全な抽出物を安定かつ安価に製造する方法を提供する。【解決手段】カイワレ大根を２０℃以下に低温保存することで、不凍活性を有する抽出物を得る。この方法は、カイワレ大根を原料とするので、季節を問わず、しかも簡単に抽出物を製造することができる。また、該抽出物は溶液、濃縮液、懸濁液、パスタ、ゲル、凍結乾燥物、粉末、顆粒、等いろいろ形状で、食品、化粧品、生体材料の保存、機器の可動部分の凍結防止、等の用途に用いることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
（ａ）カイワレ大根を２０℃以下で保存し、次に
（ｂ）カイワレ大根から抽出物を得る
を含む、不凍活性を有する抽出物を製造する方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法により得られる、不凍活性を有する抽出物。
【請求項３】
分子量が１００００以上の画分である、請求項２記載の抽出物。
【請求項４】
１００℃で３０分間維持した場合に、９０％以上の不凍活性を保持している、請求項２または３記載の抽出物。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれか１項記載の抽出物を含む食品。
【請求項６】
請求項２〜４のいずれか１項記載の抽出物を含む化粧品。
【請求項７】
請求項２〜４のいずれか１項記載の抽出物を含む生体材料用保存剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カイワレ大根由来の不凍活性を有する抽出物、その製造方法、ならびにその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
低温下で棲息する生物は、氷結晶制御物質である不凍タンパク質を生産することが知られている。例えば、魚由来のもの（特許文献１）、担子菌由来のもの（特許文献２）、冬野菜由来のもの（特許文献３）、冬ライ麦由来のもの（特許文献４）、ニンジン由来のもの（特許文献５）、細菌由来のもの（特許文献６）、または地衣類由来のもの（特許文献７）が単離されている。かかる不凍タンパク質を用いて、食品の冷凍保存中に生じる再結晶化による品質低下を阻害する試みがなされ、そのために魚または野菜由来の不凍タンパク質を大量に確保する必要がある。しかしながら、これらの不凍タンパク質は低温下でのみ産生されるため、１年中安定的に確保することは難しい。
【０００３】
また、遺伝子組換え技術を用いて、例えば、大腸菌などのパイロットプラントにおいて不凍タンパク質を大量生産する系が確立されている。しかしながら、安全の観点から消費者に受け入れられ難いという問題があった。
【特許文献１】特開２００４−０８３５４６号公報
【特許文献２】特開２００４−２７５００８号公報
【特許文献３】特開２００１−２４５６５９号公報
【特許文献４】国際公開第９２／２２５８１号公報
【特許文献５】欧州特許第８４３０１０号
【特許文献６】特開２００４−１６１７６１号公報
【特許文献７】特公２００２−５０８３０３号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の解決課題は、生体にとって安全な、不凍活性を有する抽出物を、一年中安定かつ安価に提供すること、さらにかかる抽出物の用途を見出すことである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意研究を重ねた結果、カイワレ大根を低温保存することで、不凍活性を有する抽出物が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、
（１）下記工程：
（ａ）カイワレ大根を２０℃以下で保存し、次に
（ｂ）カイワレ大根から抽出物を得る
を含む、不凍活性を有する抽出物を製造する方法；
（２）（１）記載の方法により得られる、不凍活性を有する抽出物；
（３）分子量が１００００以上の画分である、（２）記載の抽出物；
（４）１００℃で３０分間維持した場合に、９０％以上の不凍活性を保持している、（２）または（３）記載の抽出物；
（５）（２）〜（４）のいずれかに記載の抽出物を含む食品；
（６）（２）〜（４）のいずれかに記載の抽出物を含む化粧品；
（７）（２）〜（４）のいずれかに記載の抽出物を含む生体材料用保存剤
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、生体にとり安全な、不凍活性を有する抽出物が得られる。しかも、カイワレ大根を原料とするので、季節を問わず、しかも簡単な方法で安価に抽出物を製造することができる。また、単位面積あたりの抽出物生産量も多い。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、第１の態様において、
（ａ）カイワレ大根を２０℃以下で保存し、次に
（ｂ）カイワレ大根から抽出物を得る
を含む、不凍活性を有する抽出物を製造する方法
に関するものである。
【０００９】
本発明のカイワレ大根からの不凍活性を有する抽出物の製造方法の第１工程（ａ）はカイワレ大根を低温馴化させる工程である。この工程によりカイワレ大根植物体内に不凍活性が生じる。原料はカイワレ大根であり、市販されているものを用いてもよい。低温馴化の温度は通常２０℃以下であり、２０℃以上の温度の場合、低温馴化の効果が薄れるだけでなく、雑菌の繁殖や自己消化により原料が腐敗あるいは劣化してしまうおそれがある。低温馴化温度の下限温度は特に限定されず、原料が凍結しない温度であればよい。したがって本発明の方法における低温馴化温度は、通常には０℃ないし２０℃、好ましくは２℃ないし１５℃、より好ましくは４℃ないし１０℃である。
【００１０】
低温馴化工程の期間は通常には７日〜１４日、好ましくは７日〜１０日である。低温馴化期間が短すぎると生じた不凍活性が不十分であり、低温馴化期間が長すぎると腐敗や自己消化の影響が懸念される。
【００１１】
低温馴化の際、光は必須ではないので、暗所であっても明所であってもよい。また、低温馴化期間において、カイワレ大根が枯れないように水分を与えてもよい。さらに、ミネラル分や他の栄養素を低温馴化期間中に添加してもよい。
【００１２】
本発明のカイワレ大根からの不凍活性を有する抽出物の製造方法の第２工程（ｂ）は、上記のようにして得られた低温馴化カイワレ大根を抽出処理する工程である。第１工程で得られたカイワレ大根の植物体全体を抽出に用いてもよく、部分を用いてもよい。抽出媒体はいずれもものであってもよいが、水性媒体を用いることが好ましい。水性媒体としては、水、酢酸ナトリウム緩衝液等の種々の緩衝液、水混和性アルコールと水との混合物等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい抽出媒体の例としては、水、またはｐＨ５付近の５〜１００ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液などが挙げられる。抽出媒体の種類や量はカイワレ大根の状態や量などに応じて適宜選択することができる。
【００１３】
抽出は当業者に知られた種々の方法により行うことができる。抽出の前、あるいは抽出中に粉砕などの処理を加えて、抽出効率を高めることが好ましい。カイワレ大根の粉砕手段は各種のものが使用可能である。例えば、加圧型破壊、機械的磨砕、超音波処理、ホモジナイザー等の物理的破砕方法を用いることができる。粉砕手段の典型例としては、ポッター−エルベージェムホモジナイザーなどのホモジナイザー、ワーリングブレンダーなどのブレンダー、ダイノーミルなどの粉砕器、フレンチプレス、乳鉢および乳棒、らいかい機、液体窒素による凍結および破砕、超音波処理などの手段が挙げられる。カイワレ大根またはその粉砕物を水、食塩水または適当な緩衝液（例えば、酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液）などの抽出媒体に懸濁し、内容物の抽出を行う。所望により、抽出時に撹拌してもよい。抽出は、減圧抽出、ミキサーによる粉砕抽出などの公知手段を用いて行うことができる。抽出媒体は、目的抽出物の変性が少ないもの、毒性が低いものが好ましい。好ましい抽出媒体としては、水、食塩水、酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などが挙げられる。抽出媒体の組成、ｐＨ、温度、抽出時間はカイワレ大根の状態や量などに応じて適宜選択することができる。一般的には、抽出媒体のｐＨは中性付近（約５〜約９）である。抽出温度は常温であってもよい。
【００１４】
本発明の第２の態様は、上記方法により得られる、不凍活性を有する抽出物に関するものである。本明細書において「不凍活性」とは、液体の凍結温度を低下させる活性をいう。不凍活性により、例えば、凍結時の氷晶形成による細胞や組織の物理的損傷を抑制することができ、あるいは低温にさらされた細胞膜、またはリポソームのような脂質を安定化させることができる。したがって、不凍活性を用いることにより、例えば、食品を冷凍保存する際の氷結晶の再結晶化による組織破壊、あるいは融解時のドリッップを防止でき、おいしさ、食感を保持することができる。さらに、不凍活性を用いて食品の凍結濃縮、精子や臓器などの凍結保存、機器の可動部の凍結防止、除霜、道路や地盤の凍結防止を行うこともできる。不凍活性は、例えば、熱ヒステレシスの測定、氷結晶構造の観察、氷再結晶化抑制の測定などの公知の方法にて行うことができる。
【００１５】
得られた抽出物はそのまま用いることができるが、必要に応じ、さらに精製を行ってもよい。例えば、デカンテーション、濾過、遠心分離等の処理を行って夾雑物を除去してもよい。また例えば、硫酸アンモニウム等による塩析やエタノール等の有機溶剤による沈澱、等電点沈殿法による分画、イオン交換、吸着、ゲル濾過、疎水もしくはアフイニティー等のクロマトグラフィーを用いて精製してもよく、透析や濃縮過程を施してもよい。さらに得られた抽出物を凍結乾燥などの乾燥処理に付して粉末化してもよい。これらの操作は当業者に公知のものであり、用途や純度などに応じて適宜選択して用いることができる。
【００１６】
本発明の抽出物の分子量１００００以上の画分は不凍活性が豊富である。かかる画分を得るには、透析法、限外ろ過法、上記のようなクロマトグラフィー法などを用いてもよい。さらに純度の高い不凍活性画分を得るためにに、この分子量１００００以上の画分を、上記のごとき手段を用いてさらに精製してもよい。
【００１７】
本発明の抽出物は熱安定性が極めて高いという特徴を有する。本発明の抽出物は１００℃で３０分間維持した後であっても、９０％以上の不凍活性を保持する。本発明の抽出物は熱安定性が極めて高く、加熱工程を含むプロセスにも十分に耐えうるので、従来の不凍タンパク質あるいは抽出物と比較して、はるかに広い用途がある。
【００１８】
本発明の抽出物の形状は、使用目的に応じて様々であり、溶液、濃縮液、懸濁液、パスタ、ゲル、凍結乾燥物、粉末、顆粒、錠剤などであってもよい。本発明の抽出物の用途は様々である。本発明の抽出物はカイワレ大根由来であるため、ヒトや動物が食べても安全性に問題がない。それゆえ、本発明は、第３の態様において、本発明の抽出物を含む食品、特に冷凍食品に関するものである。本発明の不凍活性を有する抽出物を食品に用いることにより、例えば、凍結時の氷晶形成による組織破壊を防止して、あるいは融解時のドリップを防止して、冷凍食品の品質・食感を向上させることができる。さらに、本発明の抽出物をアイスクリームなどの氷菓子に用いることにより、その食感を向上させることもできる。本発明の抽出物の食品への添加割合は、食品の水分含有量などの条件により様々であり、適宜選択・決定し用いられる。
【００１９】
本発明は、第４の態様において、本発明の不凍活性を有する抽出物を含む化粧品に関するものである。本発明の抽出物を、例えば、リポソームなどの脂質を含む、乳液、クリームなどの化粧品に用いることにより、脂質を安定化させて、化粧品の品質を保持することができる。また、低温環境下での化粧品の凍結も防止できる。本発明の抽出物の化粧品への添加割合は、化粧品の他の構成成分などの条件により様々であり、適宜選択・決定し用いることができる。
【００２０】
さらに、本発明は第５の態様において、本発明の不凍活性を有する抽出物を含む生体材料用保存剤を提供するものである。生体材料とは、例えば、細胞、組織、器官、臓器、および血液、唾液、精液、リンパ液、尿などの生理液などの生体由来のものをいう。本発明の抽出物を用いることで、凍結による破壊を阻止、あるいは低減した状態で、生体材料を保存することができる。生体材料へ適用する際の本発明の抽出物の割合は、適用される生体材料の種類、その後の用途などの条件により適宜選択・決定することができる。
【００２１】
本発明の抽出物は、上記の他、機器の可動部分の凍結防止、除霜、道路や地盤の凍結防止などにも用いることができる。
【００２２】
以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００２３】
カイワレ大根抽出物の不凍活性
市販のカイワレ大根を４℃にて保存し、０、１、２、３、４、５、６、および７日目のカイワレ大根を、２ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）を用いて、室温にて３０分間減圧抽出した。得られた抽出物の不凍活性を決定するため、熱ヒステレシスの測定および氷結晶の構造観察を以下のようにして行った。低温度制御が可能な位相査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｌ６００Ａ）を使用し、ガラスシャーレを−２０℃に保持し、その上に１ｍｌの試料を置き、１００℃／分の速度で−４０℃まで温度を低下させて氷結晶を形成させ、その構造を観察した。形成させた氷結晶を、１００℃／分の速度で−５℃まで加温し、そこから５℃／分の速度で氷結晶を溶解させ、単結晶にした。次に、１℃／分の速度で温度を低下させ、単結晶にした氷結晶が成長し始める時間を測定した。式：熱ヒステレシス（℃）＝６０−１（℃／秒）×測定時間（秒）を用いて熱ヒステレシスを算出した。結果を図１に示す。カイワレ大根の熱ヒステレシスは、低温馴化後７日目に上昇することが分かった。また、７日目の抽出物溶液の氷結晶構造は、０日目の抽出物の氷結晶構造と比較して、不凍活性が高いことが確認できた。
【００２４】
カイワレ大根抽出物の不凍活性の熱安定性
上記の通り、４℃にて７日間保存したカイワレ大根から得た抽出物の７ｍｇ／ｍｌ溶液を、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、および１００℃にて３０分間インキュベーションし、それぞれの熱ヒステレシスを測定した。インキュベーション前の熱ヒステレシスを１００（％）として、熱安定性を評価した。同時に、氷結晶の構造観察も行った。結果を図２に示す。３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、および１００℃にてインキュベーションした抽出物溶液の全てが、９０％以上の熱ヒステレシスを保持しており、カイワレ大根抽出物の不凍活性は熱安定性であり、１００℃、３０分間のインキュベーションでも９０％以上の活性が保持されることが示された。
【００２５】
カイワレ大根由来の抽出物に含まれるタンパク質の検出
上述の通り４℃にて７日間保存したカイワレ大根から得た抽出物を、セントリカット（分子量１００００）し、１３０００×ｇにて１０分間遠心分離し、得られた分子量１００００以上の抽出物を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。マーカーとして、Low-Rangeマーカー（ＢｉｏＲＡＤ）、およびポリペプチドマーカー（ＢｉｏＲＡＤ）を用いた。結果を図３に示す。分子量１００００以上のカイワレ大根由来抽出物には、例えば、分子量約５５０００、３８０００、３３０００、３００００、２１０００などのタンパク質が存在することが分かった。
【００２６】
カイワレ大根由来の抽出物のゲル濾過クロマトグラフィー
上述の通りにして得られた、分子量１００００以上のカイワレ大根由来の抽出物について、ゲル濾過クロマトグラフィー（Sephacryl S-300）を行った。結果を図４に示す。抽出物中に、分子量約１００万、約８．２万、約２．１万、１．１万、約０．１３万のタンパク質が存在することが確認できた。かかる画分のグルカナーゼ活性を、次の通りに測定した。１００μｇ／ｍｌ  画分試料５０μｌを、２５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液中の１％  ラミラリン溶液に添加し、３７℃で３０分間反応させた。ＤＮＳ溶液３００μｌを添加し、１００℃で５分間加熱し、次に、ＯＤ５００値を測定した。１分間に１μｍｏｌのグルコースを遊離する画分のグルカナーゼ活性を１Ｕｎｉｔ（Ｕ）とし、抽出物１ｍｇ当たりのその値を図４において括弧内に示す。分子量約８．２万、約２．１万、約１．１万の画分がグルカナーゼ活性を有することが分かった。さらに、画分Ｎｏ．３３〜３８、および５１〜５４の氷結晶構造を調べた。結果を図５に示す。かかる画分は、高い不凍活性を有することが分かった。
【００２７】
カイワレ大根由来の抽出物の氷再結晶化抑制能
上述の通りにして得られた、分子量１００００以上のカイワレ大根由来の抽出物の氷再結晶化抑制能を、次の通りに測定した。上述のごとく、単結晶にした氷結晶を、１℃／分の速度で温度を低下させることにより再結晶化させ、写真を取り込んだ。対照としてＭｉｌｌｉＱを使用した。結果を図６に示す。タンパク質濃度５ｍｇ／ｍｌの抽出物溶液を添加した場合の氷再結晶化が、対照と比較して抑制されることが示された。この結果からも、本発明のカイワレ大根由来の抽出物が高い不凍活性を有することが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明により、カイワレ大根由来の不凍活性を有する可食性抽出物、その製造方法、ならびにその用途が提供されるので、食品分野、医薬品分野、土木建築分野、農業分野、あるいは人工降雪などに利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、低温馴化後のカイワレ大根抽出物の熱ヒステレシス、およびかかる抽出物溶液の氷結晶構造を示す図である。
【図２】図２は、カイワレ大根抽出物の不凍活性の熱安定性を示す図である。
【図３】図３は、分子量１００００以上のカイワレ大根由来抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。
【図４】図４は、分子量１００００以上のカイワレ大根由来抽出物のゲル濾過クロマトグラフィーの結果、およびかかる画分におけるグルカナーゼ活性を示す図である。
【図５】図５は、ゲル濾過クロマトグラフィーによるカイワレ大根由来抽出物の画分の氷結晶構造を示す図である。
【図６】図６は、カイワレ大根由来の抽出物の氷再結晶化抑制能を示す図である。
【図１】
2007153834.tif 000002
【図２】
2007153834.tif 000003
【図３】
2007153834.tif 000004
【図４】
2007153834.tif 000005
【図５】
2007153834.tif 000006
【図６】
2007153834.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成19年4月17日(2007.4.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
（ａ）カイワレ大根を２０℃以下で保存し、次に
（ｂ）カイワレ大根から抽出物を得る
を含む、不凍活性を有する抽出物を製造する方法であって、該抽出物は１００℃で３０分間維持した場合に、９０％以上の不凍活性を保持しているものである、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法により得られる、不凍活性を有する抽出物。
【請求項３】
分子量が１００００以上の画分である、請求項２記載の抽出物。
【請求項４】
請求項２または３記載の抽出物を含む食品。
【請求項５】
請求項２または３記載の抽出物を含む化粧品。
【請求項６】
請求項２または３記載の抽出物を含む生体材料用保存剤。