(57)【要約】【課題】染色された組織標本における陽性細胞数を定量解析する方法の提供。【解決手段】染色された組織標本を撮像し、得られた画像をコンピュータにより処理して染色陽性細胞を可視化して解析する方法であって、（１）一定の閾値以上に染色された領域を検出する工程、（２）検出された領域のうち、一定の大きさの細胞が染色された部分のみを陽性細胞像として選択する工程、（３）画像を碁盤目状のピクセルに区切り、各ピクセル内の陽性細胞密度を測定する工程、（４）陽性細胞密度に応じた擬似カラーを付し、組織標本全体の着色像を得る工程、（５）組織標本全体の形状を既知の組織標本形状に合わせて標準化を行う工程、及び（６）複数の個体由来の組織標本について前記（１）〜（５）の操作を行い、複数の組織標本についての着色像の平均値マップを得る工程を含むことを特徴とする染色された組織標本の陽性細胞の可視化解析方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色された組織標本を撮像し、得られた画像をコンピュータにより処理して染色陽性細胞を可視化して解析する方法であって、（１）一定の閾値以上に染色された領域を検出する工程、（２）検出された領域のうち、一定の大きさの細胞が染色された部分のみを陽性細胞像として選択する工程、（３）画像を碁盤目状のピクセルに区切り、各ピクセル内の陽性細胞密度を測定する工程、（４）陽性細胞密度に応じた擬似カラーを付し、組織標本全体の着色像を得る工程、（５）組織標本全体の形状を既知の組織標本形状に合わせて標準化を行う工程、及び（６）複数の個体由来の組織標本について前記（１）〜（５）の操作を行い、複数の組織標本についての着色像の平均値マップを得る工程を含むことを特徴とする染色された組織標本の陽性細胞の可視化解析方法。
【請求項２】
さらに、（７）複数の条件の個体群について前記（１）〜（６）の操作を行い、群間の比較を行うことを特徴とする請求項１記載の染色された組織標本の陽性細胞の可視化解析方法。
【請求項３】
さらに、群間比較の結果を、統計的パラメータとして数値化し、各ピクセルに擬似カラーを付すことを特徴とする請求項２記載の染色された組織標本の陽性細胞の可視化解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織学、病理学の分野における染色された組織標本における陽性細胞を客観的に定量するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織学、病理学の分野において、組織標本を免疫学的手段やハイブリダイゼーション等により染色し、その陽性細胞を定量解析することは、これらの分野における研究手段として、また病理学的診断の手段として極めて重要であり、広く実施されている。陽性細胞数の定量については、画像から実験者自ら設定した領域について、計数するという方法が用いられている（非特許文献１、２）。
【非特許文献１】Ｐｅｒｒｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２４（４７）:１０５９４−１０６０２（２００５）
【非特許文献２】Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２５（４９）:１１２３９−１１２４７（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、従来の定量方法では、実験者自らが設定した領域のみを定量するので、実験者が注目していない場所のデータを得ることができない、得られるデータは計数データのみであり設定した領域内の空間の情報が失われてしまうという問題があった。
従って、本発明の目的は、染色された組織標本における陽性細胞数を定量解析する新たな方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
そこで本発明者は、組織標本を撮像した画像のコンピュータによる処理手段について種々検討したところ、画像処理工程において染色細胞からノイズを排除するため染色領域の検出に加えて細胞の大きさによる検出を組み合せ、さらに陽性細胞像を擬似カラー化して陽性細胞密度として検出し、さらにその着色像を標準化するとともに、複数の標本を用いて平均値によるマップを作成することにより、領域設定が客観的になるとともに標準化と平均値マップの作成により空間情報を維持した上での定量データが可視化できることを見出した。
【０００５】
すなわち、本発明は、染色された組織標本を撮像し、得られた画像をコンピュータにより処理して染色陽性細胞を可視化して解析する方法であって、（１）一定の閾値以上に染色された領域を検出する工程、（２）検出された領域のうち、一定の大きさの細胞が染色された部分のみを陽性細胞像として選択する工程、（３）画像を碁盤目状のピクセルに区切り、各ピクセル内の陽性細胞密度を測定する工程、（４）陽性細胞密度に応じた擬似カラーを付し、組織標本全体の着色像を得る工程、（５）組織標本全体の形状を既知の組織標本形状に合わせて標準化を行う工程、及び（６）複数の個体由来の組織標本について前記（１）〜（５）の操作を行い、複数の組織標本についての着色像の平均値マップを得る工程を含むことを特徴とする染色された組織標本の陽性細胞の可視化解析方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、標本の領域設定及び定量がコンピュータにより自動的にでき、かつ複数の標本のデータが同時に解析できるため一点だけのデータでなく空間情報を加味したデータの可視化が可能となった。さらに、本発明によれば、グループ間の統計比較も容易にできる。さらに、薬物投与や行動訓練といった実験操作を行った実験動物の組織標本について、実験者の意図しない領域の組織変化を明瞭にかつ客観的に可視化することが可能となった。病理診断の現場においてもこの方法を適用することで、客観的な診断が可能になる。また、本発明は、細胞以外の粒子状像等の定量にも適用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明においては、まず、染色された組織標本を撮像し、得られた画像をコンピュータに入力する。ここで、組織標本としては、ヒトを含む動物、植物等の生体組織から採取した組織標本が用いられる。例えば、臓器全体像の凍結切片、手術により摘出した組織の切片等が挙げられる。また、染色手段としては、細胞核や細胞体のみが濃染する対象に対する免疫染色、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎあるいは、核染色等が挙げられる。撮像には、顕微鏡と撮像装置を用いるのが好ましい。撮像装置としては、例えばカラーＣＣＤカメラ等のディジタル画像撮影が行えるカメラが用いられる。撮像装置により得られた画像は、ディジタル信号の画像データに変換されたコンピュータに送られる。
【０００８】
コンピュータによる画像処理は、入力装置、表示装置及びコンピュータにより行われる。
【０００９】
入力装置は、本発明方法の実施に関する指示入力の受付、各種文字及び記号を含むデータの入力等を行うための装置である。具体的には、前述した指示、データ等の入力に用いることができる、キーボード、マウス、タッチパネル、音声入力機器等の機器の組合せにより構成される。
【００１０】
表示装置は、メニュー画面、操作画面、指示画面等の他、取得した画像、計測結果、着色像等の表示を行うためのものである。具体的には、液晶、プラズマ等のフラットパネルディスプレイ、ＣＲＴ等の表示管により画像の表示が行える装置が用いられる。この他に、拡大投影表示するための、スライドプロジェクタ等を接続することもできる。
【００１１】
コンピュータは、中央処理ユニット（ＣＰＵ）と、メモリと、補助記憶装置とを有する。補助記憶装置には、ＣＰＵが実行するプログラム群、各種データ等が格納される。
【００１２】
以下の画像処理は、すべてコンピュータ上で行われる。
【００１３】
まず、染色された組織標本を撮像して得られた画像（図１）は、公知の画像処理ソフトウェア（ＮＩＨ−ｉｍａｇｅ）等で、バックグラウンドのノイズを取り除くことが好ましい（図２）。この画像から、（１）一定の閾値以上に染色された領域を検出する。この操作は、図３のように擬似カラー化して行うのが望ましい。ここで、一定の閾値は、実験者の経験から通常判断される閾値でもよい。この操作は、例えばＭＡＴＬＡＢソフトウェア上で行列データとして表現された画像から一定の数値以上のデータを選び出してくる操作を行うことで実現可能である。閾値については陽性像の存在しないバックグラウンドの値を基準にその２倍程度の濃度の領域を陽性像と捉えることが適していると考えられる。
【００１４】
この際、標本中のゴミや切片の傷などのノイズのデータへの混入を防ぐために、陽性細胞としてふさわしい（２）サイズの一定の大きさの細胞が染色された部分のみを陽性細胞として選択する。この部分のみを陽性像とする。ここで、一定の大きさの細胞の選択は、細胞サイズの大きさ、又は細胞核の大きさで判定することができる。この操作は、例えばＭＡＴＬＡＢソフトウェアに付加することができるｉｍａｇｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｔｏｏｌｂｏｘに含まれる選択領域の面積を計算するライブラリ関数を利用することで実現できる。このようにして計算した各領域の面積のうち一定の範囲内のもののみを陽性細胞像として選び出すことが可能である。
【００１５】
次に、（３）画像を碁盤目状のピクセルに区切り、各ピクセル内の陽性細胞密度を測定する（図４）。この陽性細胞密度の計数は、計数ソフトウェアにより自動的に行われる。各ピクセルの大きさは、例えば示した例の場合、２００μｍブロックによって９等分とすることができる。この操作は、例えば、ＭＡＴＬＡＢソフトウェアに付加することができるｉｍａｇｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｔｏｏｌｂｏｘに含まれるライブラリ関数群によって実現できる。選択領域の重心を計算する関数によって各領域を１点で表すように変換し、この変換データに対してブロックごとに任意の数値演算を行うことが可能な関数によってブロック内の平均値を求めることで陽性細胞密度を計算することができる。
【００１６】
（４）各ピクセルを、陽性細胞密度に応じた擬似カラーを付し（図５）、組織標本全体の着色像を得る（図６）。これにより、組織標本全体で陽性細胞密度の高い領域がスクリーニングでき、それを着色で可視化した画像が得られる。この操作は、例えば、ＭＡＴＬＡＢソフトウェアに含まれる画像データを任意のカラーマップによって表示する機能によって実現できる。
【００１７】
しかし、前記工程（４）で得られた画像は１個体１切片の結果である。全体の傾向をするには複数の切片、複数の個体から得られたデータを平均化する必要がある。しかし組織標本は、個体、条件によって形状が微妙に異なるので、そのままの形では複数の標本の画像と重ねあわせることができない。そこで、（５）組織標本全体の形状を既知の組織標本形状に合わせて標準化を行う工程が必要となる。この標準化は、既知の組織標本形状のデータ、例えば既知の脳地図のデータ（非特許文献２）をもとに、前記（４）の着色像を回転、拡大、縮小等を行って、データの標準化を行う（図７）。この標準化により、（４）で得られた着色画像を他の標本の画像と重ねあわせて平均値マップを作成可能なもととなる。この操作は、例えばＭＡＴＬＡＢソフトウェアに付加することができるｉｍａｇｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｔｏｏｌｂｏｘに含まれるライブラリ関数群によって実現できる。任意の領域を選択する関数により切片全体像を選び出し、これを楕円に近似して特徴抽出する関数により長軸と短軸、回転角度を算出する。この値に基づき画像操作を行う関数により変換することで標準化データを得ることができる。ＭＡＴＬＡＢソフトウェア上でこの情報は行列データとして表現されており、行列演算という形で各々のマップから平均値マップを計算することが可能である。
【００１８】
（６）複数の個体由来の組織標本について、前記（１）〜（５）の操作を行い、得られた複数の組織標本についての着色像の平均値マップを得る。これは、複数の個体由来の組織標本についての着色像を重ねあわせて、各ポイントごとの平均値を求め、それをマップ化すればよい（図８及び９）。
【００１９】
さらに、（７）複数の条件の個体群について、前記（１）〜（６）の操作を行い、群間の比較を行えば、群間の比較が可能である。図８と図９は、異なる実験操作を行った群についての着色像である。図８と図９では、陽性細胞密度が大きく異なる領域が腹側に存在することが判る。また、陽性細胞密度は、擬似カラー化されているが、定量化されており、定量解析もできる。ここで、組織標本の数は、統計学的有意差検定できる数、例えば５以上が好ましい。
【００２０】
さらに、群間比較の結果を、統計的パラメータとして数値化し、各ピクセルに擬似カラーを付せば、有意差検定で有意差があった部分のみを可視化することもできる。例えば、図９のデータをもとに有意差がある部分（ｔ検定）を擬似カラー化した図が図１０である。図１０によれば、右下の部分のみが、有意に陽性細胞が存在する部分であることがわかる。この操作は、例えばＭＡＴＬＡＢソフトウェアに含まれるｔ検定を行うための関数により実現できる。計算した統計量を対数値に変換する関数を利用し、前記工程（４）に記した方法で計算結果を可視的に表示することが可能である。
【実施例】
【００２１】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
【００２２】
実施例１
画像解析をプログラミング上で表現する手段としてはＭＡＴＬＡＢソフトウェアを用いた。
１）マイクログリア特異的な標識蛋白ｉｂａ−１に対する免疫染色を行った組織標本（ラット脳）に対して本発明を適用した。その結果、薬物を実験的に投与した群で見られる特定の組織の炎症によって生じたマイクログリア細胞の増加を明らかに検出することができた。
２）電気的な活動に応じて発現が増える標識蛋白ｃ−Ｆｏｓに対する免疫染色を行った組織標本（マウス脳）に対して、課題実行後にｃ−Ｆｏｓ発現細胞核が増える特定の領域を明らかに検出することができた。
図１１は、ｃ−Ｆｏｓ陽性細胞密度について擬似カラー化した画像を平均値マップ化した（工程（５））画像である。図１２は、工程（７）を行い、Ｐ＜０．０５の部分を擬似カラー表示した図である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】抗ｉｂａ−１抗体により染色された組織標本を撮像して得られた画像の一例を示す図である。
【図２】組織標本画像からバックグラウンドのノイズを取り除いた画像の一例を示す図である。
【図３】図２の画像の拡大図（右）及び閾値以上の領域を検出した結果（左）を示す画像の一例である。
【図４】画像をピクセルに区切り、ピクセル内の陽性細胞密度を計測した結果の一例を示す図である。
【図５】ｉｂａ−１陽性細胞密度に応じた擬似カラーを付した状態の一例を示す図である。
【図６】切片全体についてｉｂａ−１陽性細胞密度の高い領域が可視化された状態の一例を示す図である。
【図７】データの標準化を行った画像の一例を示す図である。
【図８】複数の個体由来の組織標本の着色像の平均値マップの一例を示す図である（統制群）。
【図９】複数の個体由来の組織標本の着色像の平均値マップの一例を示す図である（薬物投与群）。
【図１０】ｔ−検定によりＰ値に基づいて擬似カラー化した画像の一例を示す図である（Ｐ＜０．０１）。
【図１１】ｃ−Ｆｏｓ陽性細胞密度について擬似カラー化した画像を平均値マップ化した画像である。
【図１２】ｃ−Ｆｏｓ陽性細胞密度についてＰ＜０．０５の部分を擬似カラー表示した画像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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