(57)【要約】  【課題】ネイキッド（naked）DNA法を用いて可溶型インターフェロンγ受容体遺伝子導入法およびその遺伝子導入法による動脈硬化症または血管形成術後再狭窄を予防・治療法を提供すること。  【解決手段】可溶型インターフェロンγ受容体（sINFgR）遺伝子は、ブピバカインで前処置した骨格筋へ、ネイキッド（naked）DNA法を用いて導入される。この遺伝子導入により、動脈硬化症または血管形成術後再狭窄を予防ならびに治療することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネイキッド（naked）DNA法を用いて可溶型インターフェロンγ遺伝子を導入することを特徴とする遺伝子導入法。
【請求項２】
請求項１に記載の遺伝子導入法において、骨格筋へ可溶型インターフェロンγ遺伝子を導入することを特徴とする遺伝子導入法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の遺伝子導入法において、該骨格筋にsINFgR cDNAを組み替えたプラスミドを直接注入することを特徴とする遺伝子導入法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の遺伝子導入法によって可溶型インターフェロンγ遺伝子を骨格筋に導入することにより動脈硬化症または血管形成術後の再狭窄の予防もしくは治療することを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法において、前記骨格筋がブピバカインにより前処置していることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、前記骨格筋にsINFgR cDNAを組み替えたプラスミドを直接注入することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、可溶型インターフェロンγ受容体遺伝子導入法およびその遺伝子導入法による動脈硬化症または血管形成術後再狭窄を予防・治療法に関する。更に詳細は、この発明は、ネイキッド（naked）DNA法を用いて可溶型インターフェロンγ受容体（以下、「sINFgR」ともいう）遺伝子を骨格筋へ導入する遺伝子導入法およびその遺伝子導入法による動脈硬化症または血管形成術後再狭窄を予防法ならびに治療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化は、血管壁への脂質の蓄積や血管内膜におけるマクロファージ蓄積・平滑筋細胞増殖、それに引き続く泡沫化、さらにはコラーゲンの沈着などの進展により進展し、粥状硬化巣の破綻あるいは血管壁の肥厚により血管内腔狭窄あるいは閉塞をきたす。このような状態を放置しておくと、狭心症、心筋梗塞や脳梗塞などの重篤な事態を招く結果となる。
【０００３】
近年、高脂血症に伴う粥状硬化に対しては、スタチン系薬剤などの抗コレステロール剤が予防・治療に用いられている。スタチンは、コレステロール低下作用に加えて、動脈硬化病変の進展抑制作用があることが臨床的に知られている。しかし、スタチンには、破綻あるいは破綻が切迫した不安定粥腫を安定化させるような急性効果は認められない。したがって、不安定粥腫を速やかに安定化させ、破綻を予防する予防・治療法の開発は循環器内科領域における大きな課題となっている。
【０００４】
また、狭心症や心筋梗塞などの虚血性心疾患に対して経皮的冠動脈形成術（percutaneous transluminal coronary angioplasty、以下「PTCA」という）、四肢・腎・頸部動脈硬化性狭窄に対して経皮的動脈形成術（percutaneous transluminal angioplasty、以下「PTA」という）、さらには虚血性心疾患・その他の動脈硬化性狭窄に対して狭窄部の病変組織を選択的に切除する(directional coronary atherectomy、以下「DCA」という)、ステントの血管内留置などによる血管再建術が普及し、臨床的に実施されている。ところが、上述のような狭窄病変組織の物理的除去・排除は、血管の内膜を損傷することになり、血管平滑筋細胞の内膜下への遊走や内膜での増殖が惹起される恐れがあり、その結果として、当該処置部が肥厚することがある。特に、PTCAやPTAでは、バルーンカテーテルの挿入・拡張により血管が損傷を受け、約30〜40％の症例において、術後数ヶ月以内にその損傷部位に再狭窄が発生し、上記血管再建術において血管の再狭窄は最大の問題となっている。加えて、心臓・肝臓・腎臓・血管などの臓器移植後においても、血管内膜肥厚にともなう血管狭窄が知られており、慢性期拒絶の大きな原因である。これらの血管傷害にともなう血管狭窄に対する有効な予防・治療法は現在のところ見出されておらず、その開発は循環器内科における急務である。
【０００５】
一方、インターフェロンγは、動脈硬化病変に浸潤したＴリンパ球から産生放出され、マクロファージを活性化し、種々の炎症性サイトカイン産生を促して、粥腫形成、特に粥腫破綻の分子機序の中心的役割を果たすことが知られている。また、インターフェロンγが血管傷害後再狭窄の際の平滑筋細胞増殖に関与することが報告されている。したがって、インターフェロンγの機能阻害が動脈硬化症や血管形成術後再狭窄などの有効な治療法となりうることが示唆される。しかしながら、現在臨床応用可能なインターフェロンγ特異的拮抗薬は報告されていない。他方、sINFgRは、血中・組織間質などの細胞外で産生されたインターフェロンγと結合することによって、インターフェロンγが標的細胞上のインターフェロンγ受容体と結合することを阻害することにより、あたかもインターフェロンγの拮抗剤のような作用を示すことが知られている（非特許文献１）。
【０００６】
更に、動脈硬化巣あるいは血管形成術施行部位などの局所に目的遺伝子を強制発現させるためには、ダブルバルーンカテーテル、遺伝子コーティングステント留置など観血的な手技を用いることが必要である。また、現在、遺伝子導入効率・発現効率の最も高いウイルスベクターを用いても、その発現は一過性であることが知られている。そこで、動脈硬化症や血管形成術後再狭窄などの慢性的に進展する疾患に対しては、繰り返し遺伝子導入を行う必要がある。したがって、カテーテルなどを用いた観血的方法による遺伝子導入は臨床応用に際して現実的ではない。
【０００７】
また、ウイルスベクターを用いた遺伝子導入は繰り返し行うことで免疫作用などにより発現効率が著しく低下する。そして、ウイルスベクターを用いた遺伝子導入の安全性は未だに確立されていない。
これに対して、naked DNA法による遺伝子導入は、ウイルスベクターやリポソームなどを用いずに、プラスミドを直接投与するため、安全性が高く、かつ免疫原性がないため、繰り返し導入が可能であるという利点があるが、導入効率が低いという短所もある。
【０００８】
更に、近年、骨格筋に遺伝子を導入・発現させることで、骨格筋を分泌タンパクのバイオ工場（biofactory）として利用する試みがなされている（非特許文献２）。
【非特許文献１】Lawson et al. J Clin Invest 106:207, 2000
【非特許文献２】Egashira et al. FASEB J 14:1974, 2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明者は、naked DNA法による遺伝子導入効率が骨格筋細胞において他の臓器・組織よりも高いことに着目し、上記背景技術の短所を改善すべく鋭意検討を重ねた結果、ブピバカインで前処置した骨格筋にsINFgR cDNAをnaked DNA法により導入し、sINFgRタンパクを高発現させ血中に分泌させることを見出した。更に、本発明者は、naked DNA法によるsINFgR遺伝子導入により、高コレステロール負荷食アポEノックアウトマウスにおける粥腫形成およびラット頸動脈バルーン傷害後新生内膜形成を予防し、抑制することができることを見出した。したがって、この発明は、これらの知見に基づいて完成された。
【００１０】
したがって、この発明は、naked DNA法によりsINFgR遺伝子を用いた遺伝子導入法ならびにかかる遺伝子導入による遺伝子治療によって、動脈硬化症および血管形成術後再狭窄の予防ならびに治療法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するために、この発明は、naked DNA法によりsINFgR遺伝子を用いた臨床応用可能な遺伝子導入法を提供する。また、この発明は、上記sINFgR遺伝子治療により粥腫形成あるいは血管傷害後狭窄を予防ならびに治療法を提供する。
【００１２】
具体的には、この発明の１つの形態は、上記naked DNA法を用いてsINFgRを導入することからなる遺伝子導入法を提供することである。また、この発明は、その好ましい態様として、ブピバカインにて前処置した骨格筋へsINFgRを導入することならびにsINFgR cDNAを組み替えたプラスミドを直接注入することからなる遺伝子導入法を提供する。
【００１３】
この発明の別の形態は、上記遺伝子導入法によってsINFgRを骨格筋に導入することにより動脈硬化症または血管形成術後の再狭窄の予防もしくは治療することからなる方法を提供することである。更に、この発明形態の好ましい態様は、骨格筋へsINFgRを導入することならびにsINFgR cDNAを組み替えたプラスミドを直接注入することからなる方法を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に、この発明を詳細に説明するが、この発明は下記説明に何ら限定されるものではない。
この発明に係る遺伝子導入法は、naked DNA法により、ブピバカインで前処置して細胞浸透性を高くした骨格筋にsINFgR遺伝子を導入し、骨格筋でsINFgRを発現させ、血中にsINFgRを分泌させることからなっている。
つまり、この発明によれば、naked DNA法による遺伝子導入により、ウイルスベクターやリポソームなどを用いずに、sINFgR cDNAを組み替えたプラスミドを、大腿骨格筋などの骨格筋に直接投与することができる。更に、かかるプラスミドを投与する骨格筋は、ブピバカインを用いてその細胞透過性を高めている。したがって、naked DNA法により直接注入されたプラスミドにより導入されたsINFgR cDNAは、sINFgRタンパクを骨格筋中に高発現することができ、かつ、血中に高濃度で分泌させることができる。
【００１５】
この発明に係る遺伝子導入法においては、まず、sINFgRを含む遺伝子を、たとえば、ヒト臍帯静脈内皮細胞のmRNAからRT-PCR法を用いてクローニングすることによって得ることができる。このクローニングは、当該技術分野の当業者によって常用されている方法であればいずれも用いて行うことができる。
【００１６】
上記のようにして得られたsINFgR遺伝子は、例えば、pcDNA3.1などのプラスミドに組み込まれて遺伝子導入することができる。なお、使用できるプラスミドとしては、上記のプラスミドに限定されるものではなく、使用目的に適うものであればいずれも使用することができる。また、プラスミドに組み込む方法にしても、当該技術分野に属する当業者が常用している方法であればいずれも使用することができる。
【００１７】
次に、上記のようにして、sINFgR遺伝子を組み替えたプラスミドは、大腿骨格筋などの骨格筋に導入されるが、その遺伝子導入は、その骨格筋に、細胞膜透過性亢進作用を持つブピバカインを筋肉内注射することによって行うのがよい。
このようにして骨格筋に導入されたsINFgRが有意に発現および分泌されていることは、それぞれ免疫組織法およびウエスタンブロット法によって確認することができる。
【００１８】
更に、この発明の遺伝子導入法によって骨格筋に導入されたsINFgRが、生体内においてインターフェロンγを抑制していることは、次のようにして確認することができる。
つまり、ブピバカイン前処置を施した骨格筋にsINFgR遺伝子を導入した後、リコンビナントヒトインターフェロンγを筋注して、骨格筋に組織学的検討を加えることによって、生体内におけるインターフェロンγの抑制作用を確認することができる。この組織学的検討は、コントロールとしてのPBS投与群ではマクロファージを主体とする著しい炎症細胞浸潤が認められるかを調べるのに対し、sINFgR遺伝子導入群では用量依存性に細胞浸潤が抑制することを調べることによって行なうのがよい。この組織学検討によって、生体内におけるインターフェロンγの抑制作用を確認することができる。
【００１９】
また、この発明は、かかる遺伝子導入法によって、動脈硬化症により生じる粥状硬化巣形成および血管壁の障害により誘導される血管狭窄（例えば、経皮的冠動脈形成術の施行後に起こる再狭窄、経皮的血管形成術の施行後に起こる血管再狭窄、DCA  (directional coronary atherectomy) や、ステント血管内留置等の血管再建術後に起こる血管狭窄、臓器移植後に起こる血管狭窄）の予防法ならびに治療することからなっている。
【００２０】
この発明に係る遺伝子導入法の動脈硬化病変形成に対する効果は、例えば、アポEノックアウトマウスの大腿骨格筋にブピバカイン前処置後、pcDNA3sINFgRを遺伝子導入した後、高コレステロール食を負荷して、オイルレッドO法によりプラーク面積を、アザン染色によりコラーゲンを、MOMA-2免疫染色法により単球・マクロファージ浸潤を、α平滑筋アクチン免疫染色法により平滑筋細胞を調べることによって行うことができる。これに対して、対照群では、プラスミドを含有しない生理的緩衝液を投与して行なうのがよい。
【００２１】
また、この発明の遺伝子導入法による頸動脈傷害後新生内膜形成に対する効果は、例えば、ウイスターラットの大腿骨格筋にブピバカイン前処置後、pcDNA3sINFgR を遺伝子導入し、左総頚動脈内で拡張し全長にわたり内膜を剥離して、その組織をヘマトキシリン＝エオジン染色し、新生内膜厚/中膜厚（I/M）比を計測することによって行なうことができる。対照群においてはプラスミドを含有しない生理的緩衝液を投与して行なうのがよい。
【実施例１】
【００２２】
（ヒトsINFgR組換えプラスミドpcDNA3sINFgRの作成）
まず、ヒト臍帯静脈内皮細胞のmRNAからRT-PCR法を用いてsINFgRを含む遺伝子をクローニングした。この際にプライマーとして、「CAG CAT GGC TCT CCT CTT TC」（SEQ.No.1）および「TTT TTC CTT CAA TGG ATT AAT TTT C」（SEQ.No.2）を用いた。
次に、TOPO TAクローニングキット（Invitrogen）を用いて、pCR2.1-TOPOベクターに組み込んだ。シークエンスによりsINFgRの塩基配列にミスマッチがないことを確認した後、T7ポリメラーゼとプライマー（「CGC GGA TCC TCA AGA ACC TTT TAT ACT GCT」（SEQ.No.3））を用いて５’側に停止コドンとBamHIの制限酵素サイトを持つsINFgRのPCRを行い増幅した。
PCR産物のジーン・クリーニングを施行した後、NotIとBamHIでこの遺伝子とpcDNA3.1（Invitrogen）の消化を行い、ライゲーションしてsINFgR cDNA組換えpcDNA3.1を作成した。シークエンスにてsINFgRの塩基配列にミスマッチがないことを確認した。
【００２３】
（大腿骨格筋へのsINFgR遺伝子導入法の確立）
細胞膜透過性亢進作用を持つブピバカイン（12.5μg/g 体重）を3日前にマウス筋肉内注射し、同部位に生理的緩衝溶液（PBS）に溶解したLacZ遺伝子組換えpcDNA3.1を注入すると、LacZ遺伝子導入効率が著しく向上した（LacZ陽性細胞、ブピバカイン前処置群34％  vs.  非前処置群 7％）。
そこで、ブピバカイン前処置３日後にPBSに溶解したpcDNA3sINFgR（200μg）を筋肉内注射し導入すると、骨格筋組織および血中にsINFgRが、導入後3日をピークに第14日後まで有意に発現あるいは分泌されることをそれぞれ免疫組織法およびウエスタンブロット法にて確認した。
【００２４】
（生体内におけるsINFgRのインターフェロンγ抑制作用の確認）
上記ブピバカイン前処置を施したマウス大腿骨格筋にpcDNA3sINFgRを注入した。sINFgR遺伝子導入3日後にリコンビナントヒトインターフェロンγ10μgまたはPBS（vehicle）を筋注した。翌日、大腿筋に組織学的検討を加えると、PBS投与群ではマクロファージを主体とする著しい炎症細胞浸潤がみられたが、sINFgR遺伝子導入は用量依存性に細胞浸潤を抑制した。200μg投与で最大抑制反応が認められ、細胞浸潤は約90％減少した。
【００２５】
以下に、この発明をpcDNA3.1sINFgR調製方法および効果を挙げて具体的に説明するが、この発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【実施例２】
【００２６】
（高コレステロール負荷食アポEノックアウトマウスにおける動脈硬化病変形成に対する効果）
（方法）
８週令のアポEノックアウトマウスの大腿骨格筋にブピバカイン （12.5 μg/g body weight） 前処置後3日目に pcDNA3sINFgR 200 μg （PBS 30μLに溶解）を遺伝子導入（day 0）。同日より高コレステロール食を負荷した。１４日目および２８日目に、同様の方法でsINFgR遺伝子導入を繰り返した。対照群においては、プラスミドを含有しない 生理緩衝液 30μLを投与した。４２日目にマウスを屠殺し、上行大動脈を摘出した。その組織標本を調製して、オイルレッドO法によりプラーク面積を、アザン染色によりコラーゲンを、MOMA-2免疫染色法により単球・マクロファージ浸潤を、α平滑筋アクチン免疫染色法により平滑筋細胞を検討し、遺伝子治療群と対照群を比較評価した。
【００２７】
（結果）
図１は、遺伝子治療群と対照群の上行大動脈のオイルレッドO染色標本を示す。表１に両群におけるオイルレッドO法、アザン染色、MOMA-2免疫染色、α平滑筋アクチン免疫染色による％陽性染色面積（対血管壁面積）を示す。
【００２８】
【表１】
2007020401.tif 000002
【００２９】
表１から明らかなように、遺伝子治療群において、有意にプラーク面積が対照群に比して減少していた。さらに、単球・マクロファージ浸潤も有意に抑制されていた。一方、コラーゲン産生と平滑筋細胞増生は遺伝子治療群において有意に増加していた。なお、両群間で、血中総コレステロール・HDLコレステロール・中性脂肪に差を認めなかった。この結果は、sINFgR遺伝子治療により、動脈硬化病変形成が抑制されたのみならず、病変の脆弱性が改善し安定化したことを示唆する。
【実施例３】
【００３０】
（頸動脈傷害後新生内膜形成に対する効果）
（方法）
ウイスターラットの大腿骨格筋にブピバカイン（12.5 μg/g 体重）前処置後3日目にpcDNA3sINFgR 700μg （PBS 700μLに溶解）を遺伝子導入した（２日目）。対照群においてはプラスミドを含有しないPBS 700μLを投与した。同日に左外頚動脈から２Ｆフォガティカテーテルを挿入し、左総頚動脈内で拡張し全長にわたり内膜を剥離した。遺伝子導入・PBS注入を行わず当該内膜剥離処置を行わないものをシャム群とした。１４日目に潅流固定後、左総頚動脈を摘出し、ヘマトキシリン＝エオジン染色し、新生内膜厚/中膜厚（I/M）比を計測した。
【００３１】
（結果）
図２は遺伝治療群と対照群の左総頚動脈の横断切片のヘマトキシリン＝エオジン染色を示す。対照群では平滑筋細胞増殖を主体とする新生内膜が増生し、I/M比が1.33±0.12とシャム群（I/M比：0.02±0.01）に比して著しく増加し、内腔狭窄を認めた。これに対して、遺伝子治療群ではI/M比は0.73±0.22と有意に減少し（P<0.05 vs, 対照群、n=4）、内膜増殖・内腔狭小化が抑制された。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
上記実験結果より、naked DNA法を用いた骨格筋への可溶型インターフェロンγ受容体遺伝子導入は、動脈硬化病変の形成抑制作用・安定化作用および血管傷害後の新生内膜形成抑制作用などの諸作用を有することから、動脈硬化症予防・治療薬あるいは血管傷害後の血管狭窄予防・治療薬、具体的には高血圧症・高脂血症にともなう動脈硬化症、PTCAの施行後に起こる再狭窄、PTAの施行後に起こる血管再狭窄、DCAやステント血管内留置等の血管再建術後に起こる血管狭窄臓器移植後に起こる血管狭窄の予防・治療薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】遺伝子治療群と対照群の上行大動脈のオイルレッドO染色標本を示す図。
【図２】遺伝治療群と対照群の左総頚動脈の横断切片のヘマトキシリン・エオジン染色結果を示す図。
【図１】
2007020401.tif 000003
【図２】
2007020401.tif 000004
【配列表】
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