(57)【要約】【課題】シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを単離すること、および有用な量の哺乳類、特にヒトのシアリルトランスフェラーゼを組換え体ＤＮＡ技術を用いて製造すること。【解決手段】保存相同領域を含むシアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ単離物、およびそのようなＤＮＡを得る方法が、種々のシアリルトランスフェラーゼの組換え体生産のための発現系とともに提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に規定されたブタＳＴ３Ｏシアリルトランスフェラーゼ、またはそのアミノ酸配列変異型をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ単離物。
【請求項２】
前記ＤＮＡ配列が水溶性のブタＳＴ３Ｏシアリルトランスフェラーゼをコードする、請求項１のＤＮＡ単離物。
【請求項３】
前記ＤＮＡ配列が、アミノ末端膜通過が欠失しているブタＳＴ３Ｏシアリルトランスフェラーゼをコードする、請求項１のＤＮＡ単離物。
【請求項４】
前記ＤＮＡ配列が、アミノ末端細胞質ドメインが欠失しているブタＳＴ３Ｏシアリルトランスフェラーゼをコードする、請求項１のＤＮＡ単離物。
【請求項５】
前記ＤＮＡ配列が、アミノ末端細胞質ドメイン、膜通過ドメイン、および幹領域ドメインが欠失しているブタＳＴ３Ｏシアリルトランスフェラーゼをコードする、請求項１のＤＮＡ単離物。
【請求項６】
配列番号２で規定されたブタＳＴ３Ｏシアリルトランスフェラーゼをコードする第二のＤＮＡ配列と実質的な類似性を有する第一のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ単離物。
【請求項７】
配列番号２で説明されたアミノ酸配列またはそのアミノ酸配列変異型を含む実質的に純粋なブタＳＴ３Ｏシアリルトランスフェラーゼ。
【請求項８】
水溶性である、請求項７の実質的に純粋なブタＳＴ３Ｏシアリルトランスフェラーゼ。
【請求項９】
アミノ末端膜通過が欠失している、請求項７の実質的に純粋なブタＳＴ３Ｏシアリルトランスフェラーゼ。
【請求項１０】
アミノ末端細胞質ドメインが欠失している、請求項７の実質的に純粋なブタＳＴ３Ｏシアリルトランスフェラーゼ。
【請求項１１】
アミノ末端細胞質ドメイン、膜通過ドメイン、および幹領域ドメインが欠失している、請求項７の実質的に純粋なブタＳＴ３Ｏシアリルトランスフェラーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、１９９２年３月９日出願の出願番号０７／８５０３５７号の一部継続出願である１９９２年８月４日出願の出願番号０７／９２５３６９号の一部継続出願である１９９３年８月４日出願の出願番号０８／１０２３８５号の一部継続出願である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本発明はシアリルトランスフェラーゼ遺伝子ファミリーに関する。当該遺伝子ファミリーは、触媒ドメイン内に相同性をもつ保存領域を含む糖蛋白、糖脂質およびオリゴ糖の炭水化物基の末端にシアル酸付加（ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ）を引き起こす一群のグリコシルトランスフェラーゼである。シアリルトランスフェラーゼ遺伝子ファミリーに属するメンバーは、Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα２，３シアリルトランスフェラーゼおよびＧａｌ１，３（４）ＧｌｃＮＡｃα２，３シアリルトランスフェラーゼを含む。本発明はさらに、その新規な形および組成物に関し、具体的には、シアリルトランスフェラーゼ遺伝子ファミリーに属するメンバーの同定および極めて有用な量で均質であるそれらの産生の手段および方法に関する。本発明はまた、シアリルトランスフェラーゼの産生をコードする単離デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の調製、シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ分子獲得方法、そのようなＤＮＡを用いたヒトおよび哺乳類シアリルトランスフェラーゼの発現に関し、それ以外にも、シアリルトランスフェラーゼまたはそのフラグメントをコードする新規な核酸を含む新規な化合物にも関する。本発明はまた、シアリルトランスフェラーゼ誘導体、特に当該蛋白の細胞質部分および／または膜通過部分を欠く誘導体、および組換え体ＤＮＡ技術によるそれらの製造も目的とする。
【０００３】
シアリルトランスフェラーゼは、以下の一般的反応で糖脂質およびオリゴ糖の炭水化物基の末端部分にシアル酸（ＳＡ）の伝達を触媒する酵素ファミリーである：
シチジジン５モノホスフェート−シアル酸（ＣＭＰ−ＳＡ）＋
ＨＯ−受容体→ＣＭＰ＋ＳＡ−Ｏ−受容体
（Ｔ．Ａ．  Ｂｅｙｅｒら、Ａｄｖ．  Ｅｎｚｙｎｏｌ．，  ５２：２３−１７５（１９８１））
シアリルトランスフェラーゼは主として細胞のゴルジ装置で見出され、そこで、シアリルトランスフェラーゼは翻訳後糖付加経路に加わる（Ｂ．Ｊ．  Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒ，  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ８９：２４６−２５５（１９８１））。それらはまた体液、例えば乳汁、初乳および血液にも見出される。少なくとも１０−１２種の異なるシアリルトランスフェラーゼが、全ての既知のシアリルオリゴ糖配列を合成するために必要である。４種のシアリルトランスフェラーゼが精製された（Ｊ．  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２５７：１３８３５−１３８４４（１９８２）；  Ｔ．  Ｍｉａｇｉ  ＆  Ｓ．  Ｔｓｕｉｋｉ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １２５：２５３−２６１（１９８２）；  およびＤ．Ｈ．  Ｊｏｚｉａｓｓｅら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６０：４９４１−４９５１（１９８５））。より具体的には、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃα２−６シアリルトランスフェラーゼおよびＧａｌβ１，３（４）ＧｌｃＮＡｃα２−３シアリルトランスフェラーゼが、ラット肝臓膜から精製された（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、同書）。
【０００４】
他のグリコシルトランスフェラーゼが、血清、乳汁または初乳中の可溶性酵素として分離されたが、これらにはシアリル−、フコシル−、ガラクトシル−、Ｎ−アセチルグルコサミニル−およびＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼを含む（Ｂｅｙｅｒら、同書）。ウシおよびヒトβ−Ｎ−アセチルグルコサミドβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼが分離された（Ｈ．  Ｎａｔｉｍａｔｓｕら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８３：４７２０−４７２４（１９８６）；  Ｎ．Ｌ．  Ｓｈａｐｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８３：１５７３−１５７７（１９８６）；  Ｈ．Ｅ．  Ａｐｐｅｒｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｏｎ，  １３９：１６３−１６８（１９８６）；  Ｍ．Ｇ．  Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ−Ｂｅｙｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８３：８９１８−８９２２（１９８６））。これら精製グリコシルトランスフェラーゼは大きさが異なるが、これは、活性に必須でない膜スパンニングドメインのような蛋白部分の除去によるものであろう。
【０００５】
グリコシルトランスフェラーゼ（ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼおよびＮ−アセチルガラクトサミニル−トランスフェラーゼを含む）をコードするｃＤＮＡクローンの推定アミノ酸配列の比較によって、これらの酵素は実質的に配列相同性を持たないことが明らかになった。この種類のグリコシルトランスフェラーゼは構造的に関係があるかもしれないという考えは、クローニングされたシアリルトランスフェラーゼの一次構造の最近の分析から出てきた（Ｊ．  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、同書）。しかしながら、それらは全て、短いＮＨ2−末端の細胞質尾部、１６−２０個のアミノ酸のシグナルアンカードメインおよび長いＣＯＯＨ−末端触媒ドメインを伴う伸長幹領域を有する（Ｊ．  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６２：１７７３５−１７７４３（１９８７）；  Ｊ．Ｃ．Ｐａｕｌｓｏｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６４：１７６１５−１７６１８（１９８９））。シグナルアンカードメインは、切断不能シグナルペプチドと膜スパンニング領域の両方として働き、ゴルジ装置の管腔内のこれらグリコシルトランスフェラーゼの触媒ドメインの方向を定める。同様な受容体またはドナー基質を共有するグリコシルトランスフェラーゼ間では、共通のアミノ酸配列が期待されるであろう；しかしながら、驚くべきことには、グリコシルトランスフェラーゼの触媒ドメイン内には相同性をもつ領域は殆ど見出されず、さらにＧｅｎＢａｎｋの他のいずれの蛋白についても顕著な配列相同性は認められていない（Ｎ．Ｌ．  Ｓｈａｐｅｒら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２１６：１０４２０−１０４２８（１９８８）；  Ｇ．  Ｄ’Ａｇｏｓｔａｓｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １８３：２１１−２１７（１９８９）  ；Ｊ．  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６３：１７７３５−１７７４３（１９８７））。このことは、特にＧａｌα１，３−ＧＴおよびＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧＴ、２種のガラクトシルトランスフェラーゼについては驚くべきことである。しかしながら、これらのガラクトシルトランスフェラーゼは全体的な相同性を全く示さないが一方、Ｇａｌα１，３−ＧＴ（ウシ、３０４−３０９）についてはＫＤＫＫＮＤ、さらにＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧＴ（ウシ、ヒト、ネズミ、アミノ酸３４６−３５１）についてはＲＤＫＫＮＥという共通のヘキサペプチドが存在する（Ｊｏｚｉａｓｓｅら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６４：１４２９０−１４２９７（１９８９））。
【０００６】
シアル酸は糖蛋白および糖脂質上に存在する炭水化物基の末端の糖であり、動物組織に広く分布する（Ｔ．  Ｍｏｍｏｌら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６１：１６２７０−１６２７３（１９８６））。シアル酸は、その末端位置のゆえに炭水化物構造物の生物学的機能において重要な役割を果たす。例えば、シアル酸は、インフルエンザウイルスの宿主細胞への結合のためのリガンドとして機能する（Ｊ．Ｃ．  Ｐａｕｌｓｏｎ，  レセプター（Ｔｈｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、２巻、Ｐ．Ｍ，  Ｃｏｎｎ編、１３１−２１９ページ、アカデミックプレス（１９８５））。シアル酸結合における変化でも宿主特異性を変えるために十分である（Ｇ．Ｎ．  Ｒｏｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，  ３０４：７６−７８（１９８３））。神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）は、神経系の発生中にＮＣＡｍ仲介細胞粘着を調節すると考えられている、発生によって調節されるシアル酸多付加反応を受ける（Ｕ．  Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４０：５３−３７（１９８８）；Ｕ．  Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ，  Ａｄｖ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．，  ２６５：１７９−１８（１９９０））。最近、炭水化物構造物、シアリルルイスＸ（ｓｉａｌｙｌ  ｌｅｗｉｓ  Ｘ（ＳＬｅx）は、活性化内皮細胞に好中球結合を仲介する内皮性白血球粘着分子（“  Ｅ−セレクチン”）のためのリガンドとして機能することが分かった（Ｌｏｗｅら、（１９９０）；  Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、（１９９０）；Ｇｏｅｌｚ  ら、（１９９０）；  Ｗａｌｚら、（１９９０）；Ｂｒａｎｄｌｅｙら、（１９９０））  。Ｐ−セレクチン（外部膜蛋白に対する血小板活性化依存顆粒；ＣＤ６２）、セレクチンファミリーに属する別のメンバー（Ｌ．Ｍ．  Ｓｔｏｏｌｍａｎ，  Ｃｅｌｌ，  ５６：９０７−９１０（１９８９））は、単球およびＰＭＮｓ上に存在するＳＬｅxを認識することが示された（Ｌａｒｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｃｓｉ．  ＵＳＡ，  ８７：６６７４−６６７８（１９９０）；  Ｍｏｍｏｌら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２６１：１６２７０−１６２７３（１９８６）；  Ｐｏｌｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８：６２２４−６２２８（１９９１）；  Ｋ．Ｆ．Ｊ．  Ｃｈａｎ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６３：５６８−５７４（１９８８）；  Ｔ．Ａ．  Ｂｅｙｅｒら、Ａｄｖ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，５２：２３−１７５（１９８１））。両方の例で、シアル酸は、炭水化物構造物がリガンドとして機能するためのキー成分である。細胞粘着において役割を果たすことに加えて、炭水化物構造を含むシアル酸は、分化において直接的役割を果たすと考えられてきた。造血系細胞株ＨＬ−６０は、糖脂質ＧM3による処置で分化を誘発できる。ガングリオシドはまた、増殖因子−プロテインキナーゼ活性の調節および細胞サイクルの制御に役割を果たすと考えられている。
【０００７】
ある程度の精製シアリルトランスフェラーゼは入手できたが、一つには、それが小胞体およびゴルジ装置の膜結合蛋白であるがゆえに、その量は極めて少ない。これらのシアリルトランスフェラーゼを精製するための大きな犠牲（経済的および労力の両方で）のために、それらは稀少物質となっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを単離すること、および有用な量の哺乳類、特にヒトのシアリルトランスフェラーゼを組換え体ＤＮＡ技術を用いて製造することである。別の目的は、種々の組織同様他の種からもこのシアリルトランスフェラーゼ遺伝子ファミリーに属するその他のメンバーをコードするＤＮＡを得る手段を提供することである。本発明のさらに別の目的は、新規な形のシアリルトランスフェラーゼを調製することである。本発明のさらにまた別の目的は、ある炭水化物基上の末端位にシアル酸の転移を触媒する改良方法を提供することである。本発明のこのような目的およびその他も目的は、全体的な明細書から明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の要旨
本発明の目的は、以下の工程を含む方法によって達成された：哺乳類シアリルトランスフェラーゼ（以下で規定される）をコードする遺伝子を同定しクローニングすること、ここで、このトランスフェラーゼには、ブタＧａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα２，３シアリルトランスフェラーゼ、およびラットＧａｌβ１，３（４）ＧｌｃＮＡｃα２，３シアリルトランスフェラーゼ（ラットＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃα２，６シアリルトランスフェラーゼ以外のもの）が含まれるが、これらに限定されるものではない；組換え体ＤＮＡベクターに当該遺伝子を組み込むこと；この遺伝子を含むベクターで宿主を形質転換させること；そのような宿主で哺乳類シアリルトランスフェラーゼ遺伝子を発現させること；産生された哺乳類シアリルトランスフェラーゼを回収すること。また別に、その他の種々の組換え体技術を用いて、シアリルトランスフェラーゼを発現させてもよい。同様に、本発明は、哺乳類シアリルトランスフェラーゼおよび／またはその誘導体を組換え体技術を用いて製造することを可能にし、同様にそのようなシアリルトランスフェラーゼを製造する手段も提供する。シアリルトランスフェラーゼは、豊富な蛋白ではなく精製が困難である。シアリルトランスフェラーゼ遺伝子の単離および同定は極めて困難である。そのｍＲＮＡは稀少であり、大量のｍＲＮＡのための細胞株またはその他の起源材料は入手できない。本発明ではまず、この酵素の触媒ドメインにおける保存相同領域によって規定されるシアリルトランスフェラーゼ遺伝子ファミリーを設定した。
【００１０】
本発明は、組換え体ＤＮＡ技術によって哺乳類シアリルトランスフェラーゼを製造する組成物および方法に対するものである。これには以下が含まれる：１）酵素の完全なＤＮＡ配列およびその５’−隣接領域の発見と同定；２）当該ＤＮＡ配列を含むクローニングと発現用担体（ビヒクル）の構築、これは哺乳類シアリルトランスフェラーゼ蛋白の他、その融合共役物またはシグナルＮ−末端共役物の発現を可能にする；３）そのような担体を含むことによって遺伝的に変化し、哺乳類のシアリルトランスフェラーゼを産生することができる活動（ｖｉａｂｌｅ）細胞培養物および他の発現系。本発明はさらに、哺乳類シアリルトランスフェラーゼの細胞性産生をコードするＤＮＡを製造する組成物および方法に対するものである。本発明のまた別の態様は新規な化合物であり、これには、シアリルトランスフェラーゼを発現することができるクローンを得るために用いられるデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドが含まれる。本発明のさらにまた別の態様は、血液および／または組織でシアリルトランスフェラーゼとともに見出される天然に生じる一切の物質を実質的に含まないシアリルトランスフェラーゼである。すなわち、組換え体の手段によって製造されるシアリルトランスフェラーゼは、インビボの生理学的環境で典型的に見出される夾雑物を含まないであろう。さらに、製造方法に依存して、本明細書のシアリルトランスフェラーゼは、そのインビボ環境（すなわち血液および／または組織）から得られる物質と比較して多かれ少なかれ付随する糖付加を含むかもしれない。本発明はさらに、新規なシアリルトランスフェラーゼ誘導体、特にシアリルトランスフェラーゼアミノ末端残基を欠く誘導体、例えば短いＮＨ2細胞質ドメインまたは疎水性Ｎ−末端シグナルアンカー配列（これはシアリルトランスフェラーゼの膜通過ドメインおよび幹領域を構成する）を欠く誘導体に対するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の哺乳類シアリルトランスフェラーゼおよびその誘導体は、糖蛋白および糖脂質に存在する炭水化物基にシアル酸を付加するために有用である。さらに、シアリルトランスフェラーゼおよびその誘導体は、シアル酸を糖鎖に付加して生物学的認識のための決定基として機能する炭水化物を製造するうえで酵素的に有用である。そのようなシアリルトランスフェラーゼ酵素は、多酵素系でオリゴ糖および誘導体を合成するために用いることができる（Ｉｃｈｉｋａｗａら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，  １１３：４６９８（１９９１）；  Ｉｃｈｉｋａｗａら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １１３：６３００（１９９１））。最後に、本発明のシアリルトランスフェラーゼ遺伝子ファミリーをコードするＤＮＡ、特にその触媒ドメインにおける保存相同領域は、当該シアリルトランスフェラーゼ遺伝子ファミリーの中の他の酵素をコードする遺伝子をクローニングする手段を提供するうえで有用である。このシアリルトランスフェラーゼおよびこれをコードするＤＮＡの他の用途は当業者には明瞭であろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
詳細な説明
本発明は用いられている通り、シアリルトランスフェラーゼまたはシアリルトランスフェラーゼ誘導体は、ラットＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃα２，６シアリルトランスフェラーゼ以外のシアリルトランスフェラーゼ酵素を指し、これは、触媒ドメインに保存相同領域を含み、糖蛋白、糖脂質、オリゴ糖等の糖鎖末端部位にシアル酸を移転させる酵素活性を有する。酵素的に機能を有するシアリルトランスフェラーゼの例は、ＣＭＰ−シアル酸から受容体オリゴ糖へシアル酸を移転させることができる酵素であり、この場合、オリゴ糖受容体は、個々のシアリルトランスフェラーゼにしたがって異なる。
【００１３】
“保存相同領域”とは、２つのシアリルトランスフェラーゼを整列比較すれば他のシアリルトランスフェラーゼ内の同じ一続きのアミノ酸と実質的に同一となる、あるシアリルトランスフェラーゼ内の一続きのアミノ酸を指す。本発明のシアリルトランスフェラーゼ遺伝子ファミリーにおいて、保存相同領域は触媒ドメイン内に存在し、少なくとも約７個、好ましくは少なくとも約２０個、最も好ましくは図２の残基１５６−２１０または図１の残基１４２−１９６のアミノ酸配列を有する少なくとも約５５個を越える連続アミノ酸として広がっている。保存相同領域が一旦確認されると、この保存領域のアミノ酸配列の変異型（ｖａｒｉａｎｔ）を作製し、次の３クラスのうちの１つまたは２つ以上のクラスに分類することができる。すなわち、置換変異型、挿入変異型または欠失変異型である。通常、これらの変異型は、シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ内の部位特異的変異誘発ヌクレオチドによって調製され、これによって保存相同領域変異型を含むシアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡが作製される。
【００１４】
本発明のシアリルトランスフェラーゼは以下を含む：ラットＧａｌβ１，３（４）ＧｌｃＮＡｃα２，３シアリルトランスフェラーゼ（本明細書では  “α２，３−Ｎ”または  “ラットＳＴ３Ｎ”と呼び、配列番号４として区別される）で、これはＮｅｕＮＡｃα２，３Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ配列を形成し、これらはしばしば複雑なＮ−連結オリゴ糖で終結する；ブタＧａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα２，３シアリルトランスフェラーゼ（本明細書では  “α２，３−Ｏ”またはブタＳＴ３Ｏ”と呼び、配列番号２として区別される）で、これはＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃを形成し、これは、ある種のガングリオシド上の末端配列と同様にスレオニンまたはセリンにＯ−連結された糖鎖で見出される；ヒトＧａｌβ１，３（４）ＧｌｃＮＡｃ∝２，３シアリルトランスフェラーゼ（本明細書では  “ヒトＳＴ３Ｎ”と呼び、配列番号１０として区別される）；ＳＴ３（また別には  “ヒトＳＴＺ”と呼ばれる）として区別され、配列番号１７で説明されるシアリルトランスフェラーゼ；ラットＳＴＸとして区別される蛋白で配列番号８で説明される；配列番号１４のヒトＳＴＸ；ヒトＧａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα２，３シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３０とも呼ばれ、配列番号１６で説明される）。その触媒ドメインにおいてこれら４種のシアリルトランスフェラーゼのいずれかと少なくとも９０％相同なシアリルトランスフェラーゼは、本発明の範囲内に入ると考えられる。そのような相同な酵素は、本明細書では触媒ドメイン相同体（ホモログ）と呼ばれる。
【００１５】
当該用語が本明細書で用いられる場合にシアリルトランスフェラーゼの範囲に含まれるものは、ラットおよびブタのシアリルトランスフェラーゼ（図１または２で説明）の天然の糖付加およびアミノ配列を有するシアリルトランスフェラーゼ、他の動物種（例えばウシ、ヒトなど）もしくは他の組織由来の類似（アナログ）シアリルトランスフェラーゼ、そのようなシアリルトランスフェラーゼの糖除去もしくは糖未付加誘導体、シアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列変異型およびトランスフェラーゼのインビトロ精製共有結合誘導体である。シアリルトランスフェラーゼのこれら形態の全ては、保存相同領域を含み酵素的に活性を有するが、また酵素活性を持たないときは、酵素活性を有するシアリルトランスフェラーゼと共通な少なくとも１つの免疫エピトープを含む。
【００１６】
シアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列変異型は、以下の３種類のうち１つまたは２つ以上のクラスに分類される。すなわち置換、挿入または欠失変異型である。通常、これらの変異型は、シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ内のヌクレオチドの部位特異的変異誘発によって変異型をコードするＤＮＡを作製し、その後組換え体細胞培養でこのＤＮＡを発現させることによって調製される。しかしながら、約１００−１５０残基までの残基を有する変異型シアリルトランスフェラーゼフラグメントは、インビトロ合成を用いて都合よく調製することができる。アミノ酸配列変異型は、その変異型の予め分かっている性質、そのシアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列の天然に存在する対立形質または種間変更（バリエーション）からそれらを区別する特性によって特徴付けられる。保存相同領域における変異型は、その天然に存在する類似体と質的に同じ生物活性を示す。
【００１７】
アミノ酸配列変更を導入する部位は予め決まっているとしても、変異それ自体は予め決められている必要はない。例えば、ある部位で最適な変異を得るためには、標的コドンまたは領域に不規則変異誘発を実施し、発現シアリルトランスフェラーゼ変異型を所望活性の最適組み合わせについてスクリーニングすることができる。既知の配列を有するＤＮＡの予め決められた部位に置換変異を起こす技術は周知で、例えばＭ１３プライマー変異誘発またはＰＣＲ基本変異誘発がある。
【００１８】
アミノ酸置換は典型的にはただ１つの残基に関するものであり、挿入は通常、約１から１０個のアミノ酸残基の規模で、欠失は約１から３０残基の範囲であろう。欠失または挿入は好ましくは隣接ペアーで実施される。すなわち２残基の欠失または２残基の挿入である。置換、欠失、挿入またはそのいずれの組み合わせでも連合させて最終的構築物に到達できる。明らかに、変異型シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡで惹起できる変異は、配列をリーディングフレームの外に配置するものであってはいけない。さらにまた、二次的なｍＲＮＡ構造を生じるような相補的領域を創り出すものであってもいけない（ＥＰ７５、４４４Ａ）。
【００１９】
置換変異型は、図１、２、１４、１６または１７の少なくとも１個の残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入されているものである。そのような置換は、シアリルトランスフェラーゼの特性を微妙に調節することを所望する場合、以下の表１にしたがって実施できる。
【００２０】
【表１】
2007020587.tif 000002
【００２１】
機能または免疫学的同一性における実質的な変化は、表１のものより保存性が少ない置換を選択することによって、すなわち（ａ）置換領域内のポリペプチドの骨格構造（例えばシート構造または螺旋構造）、（ｂ）標的部位の分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩の維持に対するそれらの作用がより顕著に異なる残基を選択することによって行われる。一般に、シアリルトランスフェラーゼ特性において最大の変化を生じると期待される置換は、（ａ）親水性残基（例えばセリルもしくはスレオニル）が疎水性残基（例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルもしくはアラニル）のために（もしくは疎水性残基によって）置き換えられる置換、（ｂ）システインもしくはプロリンが他のいずれかの残基のために（もしくは残基によって）置き換えられている置換、（ｃ）陽性側鎖（例えばリジル、アルギニルもしくはヒスチジル）が陰性残基（例えばグルタミルもしくはアスパチル）のために（もしくは陰性残基によって）置き換えられている置換、（ｄ）大きい側鎖を有する残基（例えばフェニルアラニン）が側鎖を持たないもの（例えばグリシン）のために（もしくは側鎖を持たないものによって）置き換えられている置換であろう。
【００２２】
主要な置換変異型または欠失変異型の種類は、シアリルトランスフェラーゼの膜通過および／または細胞質領域を含むものである。シアリルトランスフェラーゼの細胞質ドメインは、図１および２に示した開始コドンに始まり、さらに約１１の付加残基に続くアミノ酸残基配列である。ラットおよびブタのそれぞれ残基１０−２８および１２−２７は、転移停止配列として機能すると考えられている。Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ＡｓｎおよびＰｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−残基によってそれぞれラットまたはブタに導入された構造的湾曲およびこれらの残基の陽性電荷の性質は、下記の膜通過領域と一緒になって、細胞膜を通過してシアリルトランスフェラーゼが移転するのを停止させる。
【００２３】
シアリルトランスフェラーゼの膜通過領域は、ブタの配列では約残基１２−２７に（ここでは図２に示すようにＡｌａは＋１である）、ラット配列では類似の場所に位置する。この領域は、細胞膜の脂質二重層を跨ぐために適した大きさの高度に疎水性のドメインである。ゴルジまたは小胞体にシアリルトランスフェラーゼを固着させるために、これは、細胞質ドメインと協力して機能すると考えられている。
【００２４】
細胞質ドメインおよび膜通過ドメインのいずれかまたは両方の欠失または置換は、水溶液中にシアリルトランスフェラーゼを維持するために洗剤（デタージェント）を必要としないようにその細胞または膜の脂質親和性を減少させ、さらにその水溶性を改善することによって組換え体シアリルトランスフェラーゼの回収を促進させるであろう（例えば、参照により本明細書に含まれる、可溶性β−ガラクトシドα２，６−シアリルトランスフェラーゼの製造を開示する米国特許第５０３２５１９号を参照のこと）。一方、膜通過配列を保持しながら細胞質ドメインだけの欠失は、洗剤で可溶化されるシアリルトランスフェラーゼをもたらすであろう。細胞質ドメイン欠失シアリルトランスフェラーゼはより膜に入り込み易く、それによって、その酵素活性を達成することが可能となるであろう。好ましくは、細胞質ドメインまたは膜通過ドメインは、置換よりむしろ欠失させられる（例えば、可溶性シアリルトランスフェラーゼを産生するために、ラットα２，３−Ｎシアリルトランスフェラーゼでは転移停止配列のためのアミノ酸１−３３）。
【００２５】
細胞質および／または膜通過（Ｃ−Ｔ）欠失または置換シアリルトランスフェラーゼは、組換え体細胞培養で直接、またはシグナル配列（好ましくは宿主相同シグナル）との融合として合成できる。例えば、原核細胞発現ベクターを構築する場合は、Ｃ−Ｔドメインは、細菌のアルカリホスファターゼ、ｌｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーに有利なように欠失させられ、さらに酵母では、これらのドメインは酵母のインベルターゼ、アルファ因子または酸性ホスファターゼリーダーによって置換される。哺乳類細胞の発現では、Ｃ−Ｔドメインは、哺乳類細胞ウイルスの分泌リーダー、例えば単純疱疹ｇＤシグナルによって置換される。分泌リーダーが宿主によって  “認識”されると、宿主のシグナルペプチダーゼは、Ｃ−Ｔ欠失シアリルトランスフェラーゼにそのＣ−末端で融合させたリーダーポリペプチドの融合を切断することができる。Ｃ−Ｔ欠失シアリルトランスフェラーゼの利点は、培養液中に分泌させることができるということである。この変異型は水溶性で細胞膜脂質に対して相応の親和性を持たず、したがって組換え体細胞培養からの回収は極めて簡単である。
【００２６】
洗剤（例えば非イオン性洗剤）の添加は、膜固着配列を含む蛋白の可溶化、安定化および／またはその生物学的活性の強化のために実施できる。例えば、デオキシコール酸は好ましい洗剤であり、トゥイーン、ＮＰ−４０およびトリトンＸ−１００は他の洗剤同様用いることができる。洗剤の選択は、特定の環境条件および含まれるポリペプチドの性質に基づいて実施者の判断で決定できる。
【００２７】
置換または欠失変異誘発は、Ｎ−またはＯ−連結糖付加部位を排除するために用いられる。また別に、糖未付加シアリルトランスフェラーゼは組換え体細胞培養で産生される。システインまたは他の不安定な残基の除去もまた、例えばシアリルトランスフェラーゼの酸化耐性の増強のために望ましい。潜在的な蛋白分解部位（例えばＡｒｇＡｒｇのような二塩基残基）の欠失または置換は、その塩基性残基の１つを欠失させるか、またはそのうちの１つをグルタミルもしくはヒスチジル残基によって置換することによって達成される。
【００２８】
シアリルトランスフェラーゼの挿入アミノ酸配列変異型は、１つまたは２つ以上のアミノ酸が標的シアリルトランスフェラーゼの予め決められた部位に導入されたものである。最も普通には、挿入変異型は、異種蛋白またはポリペプチドのシアリルトランスフェラーゼのアミノ末端もしくはカルボキシ末端への融合である。
【００２９】
シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡは、ラットまたはブタ以外の他の起源から、（ａ）特定動物の例えば肝臓または下顎腺のような種々の組織からのｃＤＮＡライブラリーを得、（ｂ）ｃＤＮＡライブラリー中の相同配列を含むクローンを検出するために、シアリルトランスフェラーゼまたはそのフラグメント（通常３０ｂｐ以上）の保存相同領域をコードする標識ＤＮＡとのハイブリダイゼーション解析を実施し、さらに（ｃ）制限酵素解析および核酸配列決定によってクローンを分析して完全な長さのクローンを同定することによって得られる。完全な長さのクローンがライブラリーに存在しない場合は、種々のクローンから適切なフラグメントを回収し、クローンに共通の制限部位をつなぎ合わせて、完全な長さのクローンを組み立てる。
【００３０】
本発明によって産生されるシアリルトランスフェラーゼの状態を説明する場合の  “実質的遊離形”または  “実質的に純粋”とは、例えば血液および／または組織から抽出および精製によってシアリルトランスフェラーゼが得られる場合のように、その天然に存在するインビボの生理学的環境でシアリルトランスフェラーゼに通常付随する蛋白または他の物質を含まないことを意味する。本発明の方法によって製造されるシアリルトランスフェラーゼは、全蛋白の９５重量％以上又はこれに等しいシアリルトランスフェラーゼであり；ポリアクリルアミドゲル電気泳動でただ１本の濃いバンドを構成し（クーマシーブルー染色）；少なくとも約５００ｎｍｏｌｅ／ｍｇ蛋白／分の比活性度を有した。
【００３１】
本明細書で用いられている  “実質的な類似性”または  “実質的な同一性”という用語はポリペプチド配列または核酸配列の特性を表し、この場合、このポリペプチド配列は対象配列と比較して少なくとも７０％配列同一性を有し、この核酸配列は対象配列と比較して少なくとも８０％の配列同一性を有する。配列同一性の％は、その合計が対象配列の３５％未満である小さな欠失または付加を排除して計算される。対象配列は大きな配列のサブセット、例えば図１および２に示したようなものであってもよい。しかしながら対象配列はポリヌクレオチドの場合は少なくとも長さが１８ヌクレオチドで、ポリペプチドの場合は少なくとも６アミノ酸残基の長さである。
【００３２】
一般に、原核細胞が、本発明で有用なベクターを構築するＤＮＡ配列のクローニングに用いられる。例えば、大腸菌Ｋ１２の株２９４（ＡＴＣＣ  ３１４４６号）は特に有用である。使用可能な他の微生物株には、大腸菌Ｂおよび大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１５３７号）が含まれる。但しこれらは例示であり、これらに限られるものではない。
【００３３】
原核細胞はまた発現にも用いられる。前述の株の他、大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ-λ-、原栄養株、ＡＴＣＣ  ２７３２５号）、桿菌（例えば枯草菌）および他の腸内細菌科（例えばネズミチフス菌または霊菌）並びに種々のシュードモナス種を用いることができる。
【００３４】
一般に、宿主細胞に適合する種に由来するプロモーターおよび制御配列を含むプラスミドベクターが、これらの宿主とともに用いられる。通常、ベクターはマーカー配列と同様に複製部位を含み、マーカー配列は形質転換細胞において表現型選別を提供することができる。例えば、大腸菌は，典型的にはｐＢＲ３２２（大腸菌種に由来；Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ，２：９５（１９７７））を用いて形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、したがって形質転換細胞を区別する容易な手段を提供する。ｐＢＲ３２２プラスミド（または他の微生物プラスミド）は、組換え体ＤＮＡ構築物で通常用いられるプロモーターおよび他の制御成分を含むか、または含むように改造されねばならない。
【００３５】
原核細胞宿主とともに使用するために適したプロモーターは、例えばβ−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，  ２７５：６１５（１９７６）；Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ，  ２８１：５４４（１９７９））、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｄ．  Ｇｏｅｄｄｅｌ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ８：４０５７（１９８０））およびｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーター（Ｈ．  ｄｅ  Ｂｏｅｒ，  ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）  ８０：２１−２５（１９８３））を含む。しかしながら、機能的な他の細菌プロモーターも適切である。それらのヌクレオチド配列は一般に既知で、したがって当業者には、シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ，  Ｃｅｌｌ，  ２（１９８０））にリンカーまたはアダプターを用いてそれらを作動できるように連結し、必要ないずれの制限部位をも提供することが可能である。細菌系で使用するプロモーターはまた、シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡに作動できるように連結したシャイン−ダルガーノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（Ｓ．Ｄ．））配列を含むであろう。
【００３６】
原核細胞に加え、真核微生物（例えば酵母培養物）もまた用いることができる。ビール酵母または通常のパン酵母が最も普通に用いられる真核微生物であるが、他の多くの株も普通に入手できる。酵母菌属での発現には、例えばプラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ，  ２８２：３９（１９７９）；  Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ，  ７：１４１（１９７）；  Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、Ｇｅｎｅ，  １０：１５７（１９８０））が通常用いられる。このプラスミドは既にｔｒｐｌ遺伝子を含むが、これはトリプトファンの中で増殖する能力を欠く酵母の変異株（例えばＡＴＣＣ  ４４０７６号またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ８５：１２（１９７７））のための選別マーカーを提供する。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐｌ損傷部の存在は、したがってトリプトファンの非存在下での増殖によって形質転換を検出する効果的な環境を提供する。
【００３７】
酵母宿主とともに用いる適切なプロモーター配列には、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５５：２０７３（１９８０））または他の解糖酵素（ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ）  （Ｈｅｓｓら、Ｊ．  Ａｄｖ．  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．，  ７：１４９（１９６８）；  Ｈｏｌｌａｎｄ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １７：４９００（１９７８））、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオセホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼが含まれる。
【００３８】
他の酵母プロモーター（これらは、発育条件によって制御される転写に関するまた別の利点をもつ誘発可能プロモーターである）は、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に付随する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ並びにマルトースおよびガラクトース利用に必要な酵素のためのプロモーター領域である。酵母の発現で使用する適切なベクターおよびプロモーターは、さらに欧州特許出願公告第７３６５７Ａ号（Ｒ．  Ｈｉｔｚｅｍａｎら）に開示されている。酵母エンハンサーはまた、酵母プロモーターとともに有利に用いられる。
【００３９】
“制御領域”は真核細胞遺伝子の５’および３’末端の特異的な配列を指し、これは、転写または翻訳のいずれかの制御に深く関わっているであろう。実質的に全ての真核細胞遺伝子がＡＴ富裕領域を有し、これは、転写開始部位から約２５−３０塩基上流に位置する。多くの遺伝子の転写開始から７０−８０塩基上流に認められるまた別の配列はＣＸＣＡＡＴ領域である（ここでＸはいずれのヌクレオチドでもよい）。殆どの真核細胞遺伝子の３’末端にＡＡＴＡＡＡ配列が存在し、これはポリＡ尾部（テール）を転写されたｍＲＮＡに付加するためのシグナルであろう。
【００４０】
哺乳類宿主細胞でベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、種々の起源、例えばウイルス（例えばポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましいサイトメガロウイルス）から、または異種哺乳類プロモーター（例えばベータアクチンプロモーター）から得られるであろう。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターはＳＶ４０制限フラグメントとして都合よく得られるが、これはまたＳＶ４０ウイルスの複製起点を含んでいる（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ，  ２７３：１１３（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの即時初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）  プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限フラグメントとして都合よく得られる（Ｐ．Ｊ．  Ｇｒｅｅｎａｗａｙら、Ｇｅｎｅ，  １８：３５５−３６０（１９８２））。もちろん、宿主細胞または関連種からのプロモーターもまた本明細書で有用である。
【００４１】
エンケファリナーゼをコードするＤＮＡのより高等な真核細胞での転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増強される。エンハンサーは、通常約１０−３０００ｂｐでシス−作動性ＤＮＡ成分であり、プロモーターに作用しその転写を増強する。エンハンサーは比較的方向性と存在場所に左右されず、イントロン内（Ｊ．Ｌ．  Ｂａｎｅｒｊｉら、Ｃｅｌｌ，  ３３：７２９（１９８３））だけでなくコード配列自体（Ｔ．Ｆ．  Ｏｓｂｏｒｎｅら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，  ４：１２９３（１９８４））の中の転写ユニットの５’（Ｌ．  Ｌａｉｍｉｎｓら、ＰＮＡＳ，  ７８：９９３（１９８１））および３’（Ｍ．Ｌ．  Ｌｕｓｋｙら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，  ３：１１０８（１９８３））に見出された。多くのエンハンサー配列が哺乳類で分かってきた（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン）。しかしながら、典型的には真核細胞ウイルスのエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（塩基１００−２７０）、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスのエンハンサーが含まれる。
【００４２】
真核宿主細胞で用いられる発現ベクター（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物からの核導入細胞）はまた、ｍＲＮＡ発現に影響を与える可能性がある転写の終了に必要な配列を含む。これらの領域は、シアリルトランスフェラーゼをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分においてポリアデニル化セグメントとして転写される。この３’非翻訳領域はまた転写終了部位を含む。
【００４３】
発現ベクターは選別遺伝子（また選別可能マーカーとも呼ぶ）を含むことができる。哺乳類細胞用の適切な選別可能マーカーの例は、ジヒドロホレート還元酵素（ＤＨＦＲ）、オルニチンデカルボキシラーゼ、多剤耐性生化学マーカー、アデノシンデアミナーゼ、アスパラギン合成酵素、グルタミン合成酵素、チミジンキナーゼまたはネオマイシンである。そのような選択可能マーカーは、哺乳類宿主細胞に首尾よく移すことができ、形質転換された宿主細胞は、選択的強制下に置かれたときに生存することができる。選択方法には広範囲に用いられる２つの異なる種類がある。第一の種類は細胞の代謝に基づくもので、補充培地に依存しないで増殖する能力を欠く変異細胞を使用する。ＣＨＯＤＨＦＲ−細胞とマウスＬＴＫ−細胞が２つの例である。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンのような栄養物の添加がなければ増殖することができない。これらの細胞は完全なヌクレオチド合成経路に必要なある種の遺伝子を欠くので、補充培地でこの失われたヌクレオチド合成経路が提供されなければ生存することができない。培地を補充するまた別の方法は、完全なＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子をそれぞれの遺伝子を欠く細胞に導入し、それによってその増殖要件を変更させることである。ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子で形質転換されなかった個々の細胞は、非補充培地で生存することができない。
【００４４】
第二の種類は優性遺伝子選別で、いずれの細胞タイプにおいても用いられる選別計画と呼ばれ、変異細胞株の使用を必要としない。この方法は典型的には宿主細胞の増殖を停止させる薬剤を使用する。新規な遺伝子を有する細胞は、薬剤耐性を伝える蛋白を発現し、その選別に生き残るであろう。そのような優性遺伝子選別の例は、ネオマイシン（Ｐ．  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ＆  Ｐ．  Ｂｅｒｇ，  Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．，１：３２７（１９８２））  、ミコフェノール酸（Ｒ．Ｃ．  Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｐ．  Ｂｅｒｇ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２０９：１４２２（１９８０））、ヒグロマイシン（Ｂ．  Ｓｕｇｄｅｎら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ５：４１０−４１３（１９８５））を用いる。上記の３つの例は、真核細胞性制御下で細菌の遺伝子を用い、それぞれ適切な薬剤Ｇ４１８もしくはネオマイシン（ゲンチシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）もしくはヒグロマイシンに対する耐性を伝える。
【００４５】
“増幅”とは細胞のクロモゾームＤＮＡ内の独立領域の増加または複製を指す。増幅は、選別薬剤、例えばＤＨＦＲ遺伝子を不活性化させるメトトレキセート（ＭＴＸ）を用いて達成される。ＤＨＦＲ遺伝子の多数のコピーの増幅または蓄積は、より大量のＭＴＸの存在にもかかわらず産生されるより大量のＤＨＦＲをもたらす。増幅強制は、内在性ＤＨＦＲの存在にもかかわらず、これまでにないような大量のＭＴＸを培養液に添加することによって実施される。所望の遺伝子の増幅は、所望の蛋白をコードするＤＮＡを含むプラスミドを哺乳類宿主細胞に同時トランスフェクトすることによって達成できる。同時に組み込まれたＤＨＦＲまたは増幅遺伝子については共同増幅と呼ぶ。細胞はより多くのＤＨＦＲを必要とし、この要請は、かつてなく大量のＭＴＸ濃度の中で増殖することができる細胞のみを選別することによって選別遺伝子の複製に応じることができるということである。所望の異種蛋白をコードする遺伝子が選別遺伝子とともに組み込まれているかぎり、この遺伝子の複製は所望の遺伝子の複製をしばしばもたらす。その結果、所望の異種蛋白をコードする増やされた遺伝子コピー（すなわち増幅遺伝子）はより多くの所望異種蛋白を発現する。
【００４６】
高等真核細胞でシアリルトランスフェラーゼをコードする本発明のベクターを発現させる適切な好ましい宿主細胞には以下が含まれる：ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）形質転換サル腎ＣＶ１株；ヒト胎児腎株（２９３）（Ｆ．Ｌ．  Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ３６：５９（１９７７））；ベービーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ＆  Ｃｈａｓｉｎ，  ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），  ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトーリ細胞腫（ＴＭ４、Ｊ．Ｐ．  Ｍａｔｈｅｒ，  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．，  ２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；およびＴＲＩ細胞（Ｊ．Ｐ．  Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．  Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ３８３：４４−４６（１９８２））；  バキュロウイルス細胞。
【００４７】
“形質転換”とは、ＤＮＡを生物に導入し、その結果、クロモゾーム外成分として、またはクロモゾームに組み込まれることによってそのＤＮＡが複製できることを意味する。特に指定しないかぎり、宿主細胞の形質転換のために本明細書で用いられる方法は、グラハムとファンデルエブの方法である（Ｆ．  Ｇｒａｈａｍ  ＆  Ａ．Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ５２：４５６−４５７（１９７３））。しかしながら、細胞にＤＮＡを導入するその他の方法、例えば核取り込み（ｎｕｃｌｅａｒ  ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ）  またはプロトプラスト融合もまた用いることができる。原核細胞または、実質的な細胞壁構成物を含む細胞を用いる場合、トランスフェクションの好ましい方法は、コーエンらが記載したように塩化カルシウムを用いるカルシウム処理である（Ｆ．Ｎ．  Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ６９：２１１０（１９７２））  。
【００４８】
構築したプラスミド内の正確な配列を確認する分析では、連結混合物（ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅ）を用いて大腸菌Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）を形質転換させ、形質転換できたものを適宜アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性によって選別する。形質転換体からプラスミドを調製し、メッシングら（Ｍｅｓｓｉｎｇら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，  ９：３０９（１９８１））の方法によって制限酵素処理およびまたは配列決定によって、またはマキサムら（Ｍａｘａｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ６５：４４９（１９８０））の方法によって解析する。
【００４９】
宿主細胞は本発明の発現ベクターで形質転換させることができる。さらに、プロモーターを誘発し、形質転換細胞を選別しまたは遺伝子を増幅するために適切なように修飾した通常の栄養培地で培養できる。温度やｐＨなどの培養条件は、発現について選別した宿主細胞に以前に用いたようなもので、当業者には明瞭であろう。
【００５０】
“トランスフェクション”とは、いずれのコード配列が実際発現されるかどうかにかかわらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを指す。トランスフェクションの多くの方法が当業者には既知で、例えばリン酸カルシウム法や電気的穿孔がある。トランスフェクションの成功は、一般にこのベクターの作動を示唆するものが宿主内で発生するとき認識される。
【００５１】
以下の実施例の理解を深めるために、頻繁に出現するある種の方法および／または用語を説明する。
【００５２】
“プラスミド”は先頭の小文字ｐで示され、および／または大文字および／または数字がそれに続く。本明細書で出発原料のプラスミドは市販されているか、または制約なく公的に入手可能であるか、または入手可能なプラスミドから文献記載の方法にしたがって構築できる。さらに、記載されたものに匹敵するプラスミドは当該技術分野で既知であり、当業者には明白であろう。
【００５３】
ＤＮＡの  “消化”とは、ＤＮＡ中の一定の配列でのみ作用する制限酵素によるＤＮＡの触媒的切断を指す。本明細書で用いられる種々の制限酵素は市販されており、その反応条件、補助因子および他の要件は当業者に既知のものを用いた。分析目的には、典型的には１μｇのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを、約２０μｌの緩衝溶液中の約２単位の酵素とともに用いる。プラスミド構築のためにＤＮＡを単離するには、典型的には５から５０μｇのＤＮＡをより大容量中で２０から２５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は製造元によって特定されている。３７℃で約１時間のインキュベーション時間を通常用いるが、供給元の指示にしたがい変動させることができる。消化後、反応物を直接ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、所望のフラグメントを単離する。
【００５４】
切断フラグメントのサイズによる分離は、ゲーデルら（Ｇｏｅｄｄｅｌら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ８：４０５７（１９８０））の記載にしたがって８％のポリアクリルアミドゲルを用いて実施する。
【００５５】
“脱リン酸”とは、細菌のアルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）で処理することによって５’末端のリン酸塩を除去することを言う。この処理は、制限切断部位に別のＤＮＡフラグメントが挿入されるのを妨害する、ＤＮＡフラグメントの２つの制限切断末端の  “環状化”または閉鎖ループ形成を防止する。脱リン酸の手順および試薬は慣用的である（マニアーティスら、分子クローニング、１３３−１３４ページ、（１９８２））。ＢＡＰを用いる反応は５０ｍＭトリス中で６８℃で実施し、酵素調製物中に存在する可能性がある一切のエクソヌクレアーゼ活性を抑制する。反応は１時間行う。反応の後、ＤＮＡフラグメントはゲル精製される。
【００５６】
“オリゴヌクレオチド”とは、一本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２本の相補的なポリデオキシヌクレオチドのいずれかを意味し、これらは化学的に合成が可能である。そのような合成オリゴヌクレオチドは、５’リン酸塩を持たず、したがってＡＴＰとともにキナーゼの存在下でリン酸塩を付加しなければ別のオリゴヌクレオチドに連結できない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸されていないフラグメントには連結される。
【００５７】
“連結”とは、２本の二重鎖核酸フラグメント間にホスホジエステル結合を形成する工程を指す（マニアーティスら、上掲書、１４６ページ）。また別に指示しないかぎり、連結は、連結されるべきＤＮＡフラグメントの約等モル量の０．５μｇにつきＴ４ＤＮＡリガーゼ（  “リガーゼ”）１０単位を用いて既知の緩衝液と条件で達成できる。所望のコード配列と制御配列を含む適切なベクターの構築は標準的な連結技術を用いる。単離プラスミドまたはＤＮＡフラグメントは、切断され、目的に適合させ、所望の形態に再連結して必要なプラスミドが形成される。
【００５８】
“充填”または  “平滑末端化”とは、制限酵素切断核酸の粘着末端における一本鎖端が二重鎖に変換される工程を指す。この工程は粘着末端を除去し、平滑端を形成する。この処理は、ただ１つかまたは他のわずかの制限酵素によって創出される末端に対して粘着性を有する制限酵素切断端を、平滑切断制限エンドヌクレアーゼまたは他の充填された粘着端に適合できる末端に変換する有用な手段である。典型的には、平滑端形成は、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント８単位および各々２５０μＭの４種のデオキシヌクレオシドトリホスフェートの存在下で、２−１５μｇの標的ＤＮＡを１０ｍＭのＭｇＣｌ2 、１ｍＭのジチオスレイトール、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）緩衝液中で訳３７℃でインキュベートすることによって達成される。一般にこのインキュベーションは、フェノールとクロロホルム抽出およびエタノール沈澱によって３０分後に停止させる。
【００５９】
開示配列の部分に一致するポリヌクレオチドまたは相補的なポリヌクレオチドは、それぞれの生殖系（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）  遺伝子を同定および／または単離するためにハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。そのようなポリヌクレオチドはまた、ｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーをスクリーニングして、ｃＤＮＡおよび、本発明のシアリルトランスフェラーゼ配列と構造的におよび／または進化的に関連するポリヌクレオチドをコードする遺伝子を単離するために、ハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。また別に、そのようなポリヌクレオチドは、生殖系遺伝子配列または関連配列をポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させるプライマーとして役立つであろう。
【００６０】
さらに別のシアリルトランスフェラーゼｃＤＮＡを同定し、単離するために用いられるハイブリダイゼーションプローブは、このヌクレオチドをベースにデザインされ、その推定アミノ酸配列は図１および２に示す。ハイブリダイゼーションプローブ（これは典型的には放射性同位元素の取り込みによって標識されている）は、ブタα２，３−Ｏシアリルトランスフェラーゼのアミノ酸残基１３４からアミノ酸残基１８９に広がる５５残基セグメントに対応する保存領域の全てまたは一部分をコードする縮退オリゴヌクレオチドの１つまたは２つ以上のプールから成る（図１）。特に、そのヘプタペプチドモチーフ、−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−は高度に保存的で、このハイブリダイゼーションプローブは、このモチーフ（またはこのモチーフの変形（この場合１つまたは２つ以上のアミノ酸が修飾され、その結果このヘプタペプチドの少なくとも約４個または５個のアミノ酸が残存する））をコードする縮退オリゴヌクレオチドを含む。このヘプタペプチドモチーフの一本鎖または二本鎖アミノ酸置換変異型をコードする縮退オリゴヌクレオチドプローブはまた、関連シアリルトランスフェラーゼｃＤＮＡ種をスクリーニングするために有用である。縮退オリゴヌクレオチドの他に、クローン化ポリヌクレオチドフラグメント（例えば図１および２に示されるようなもの）は、プローブとして用いることができる；望ましくは、そのようなプローブは、ヘプタペプチドモチーフと、さらに所望の場合は上記の保存５５アミノ酸残基セグメントに亙る。
【００６１】
シアリルトランスフェラーゼをコードするゲノムクローンまたはｃＤＮＡクローンは、図１および２で示したようなシアリルトランスフェラーゼヌクレオチドを基にデザインしたハイブリダイゼーションプローブを用いてクローンライブラリーから分離することができる。ｃＤＮＡクローンを所望する場合は、シアリルトランスフェラーゼを発現している細胞に由来するｃＤＮＡを含むクローンライブラリーが好ましい。また別に、図１および２に示した配列の全部または一部分に対応する合成ポリヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチドの化学的合成によって構築してもよい。さらに、図１および２に開示した配列データに基づくプライマーを用いてポリメラーゼ鎖伸長反応（ＰＣＲ）を使って、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡプールまたはｃＤＮＡクローンライブラリーからのＤＮＡフラグメントを増幅してもよい。米国特許第４６８３１９５号および４６８３２０２号はＰＣＲ法を開示する。さらに、図１および２に開示した配列データに基づく１つのプライマーと、当該配列データに基づかない第二のプライマーを用いたＰＣＲ法もまた利用することができる。例えば、ポリアデニル化反応セグメントと相同なまたは相補的な第二のプライマーを用いることができる。
【００６２】
ヌクレオチド置換物、欠失物および付加物が本発明のポリヌクレオチドに取り込まれ得ることは、当業者には明白であろう。しかしながら、そのようなヌクレオチド置換物、欠失物および付加物は、図１および２に示したポリヌクレオチド配列の１つと、特異的ハイブリダイゼーションを生じるに足る厳格なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするというこのヌクレオチドの能力を損なうものであってはならない。
【００６３】
図に示したヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、コードされるポリペプチド配列の全部または一部に対応するポリペプチドを当業者が製造することを可能にする。そのようなポリペプチドは、完全な長さのシアリルトランスフェラーゼまたはそのフラグメントおよびその類似体をコードするポリヌクレオチドの発現させることによって原核細胞または真核細胞で製造することができる。また別に、そのようなポリペプチドは化学的な方法によって合成でき、またはポリヌクレオチドの鋳型を用いて翻訳させるインビトロ翻訳系で産生することもできる。組み換えたい宿主で異種蛋白を発現させる方法、ポリペプチドの化学的合成の方法およびインビトロ翻訳の方法は当該技術分野で周知であるが、さらに、マニアーティスらの文献（Ｍａｎｉａｔｉｓら、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８９））およびバーガーとキンメルの文献（Ｂｅｒｇｅｒ  ＆  Ｋｉｍｍｅｌ、酵素学の手法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）  １５２巻、分子クローニング技術ガイド（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、アカデミックプレス刊、サンディエゴ、カリフォルニア（１９８７））に記載されている。
【００６４】
シアリルトランスフェラーゼのフラグメントは当業者には調製することができる。フラグメントまたは類似体の好ましいアミノ末端およびカルボキシ末端は、構造ドメインおよび／または機能ドメインの境界の近く、例えば酵素活性部位の近くに生じる。実質的に１つまたは２つ以上の機能ドメインを含むフラグメントは異種ポリペプチド配列に融合させることができる。この場合、得られた融合蛋白は、機能的特性、例えばフラグメントによって付与された酵素活性を示す。また別に、１つまたは２つ以上の機能ドメインが欠失している欠失ポリペプチドは、この失われたフラグメントによって通常付与されていた特性の消失を示す。
【００６５】
バキュロウイルスの真核細胞遺伝子発現は、クローニングされた遺伝子から機能的に活性な蛋白を大量に製造する最も有効な手段の１つである（Ｍ．  Ｓｕｍｍｅｒｓ  ＆Ｖ．  Ｌｕｃｋｏｗ  （１９８８）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ６：４７、この文献は参照により本明細書に含まれる）。本発明のシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、クローニングされたポリヌクレオチドからバキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、サンディエゴ、カリフォルニア）による発現で製造できる。
【００６６】
代表的なシアリルトランスフェラーゼおよびその組換え体発現産物は、以下のプロトコルにしたがって得られる：
１．  ブタの肝シアリルトランスフェラーゼを外見的に均質となるまで精製した。
２．  ブタシアリルトランスフェラーゼのＮ−末端アミノ酸配列を決定した。
３．  ＮＨ2−末端配列近くの１８アミノ酸に対応するオリゴヌクレオチドプローブを化学的に合成した。
４．  ａ）ブタ下顎腺から得たランダムにプライム（つり上げ）したポリＡ＋富裕ｍＲＮＡ、ｂ）ラット肝から得たオリゴｄＴでプライムしたポリＡ＋富裕ｍＲＮＡ、およびｃ）ラット脳から得たオリゴｄＴでプライムしたポリＡ＋富裕ｍＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡライブラリーをλｇｔ１０で構築した。
５．  例えば以下のようなシアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列のためのコドンに相補的な放射能標識合成デオキシオリゴヌクレオチドのプールを用いた：
ａ）５’ＡＣＣ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＣＴＧ  ＣＧＣ  ＡＣＣ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＴＣＣ  ＴＴＣ  ＴＴ３’
ｂ）５’ＧＡＣ  ＧＴＣ  ＧＧＧ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＡＣＣ  ＡＣＣ３’
６．  ランダムにプライムしたブタ下顎腺ライブラリーを、化学的に合成し、さらにポリヌクレオチドキナーゼと32Ｐ−ＡＴＰで標識した長いオリゴヌクレオチドプローブおよび短いオリゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングした。共に陽性を示したプラークを精製し、挿入物の配列を決定した。
７．  オリゴｄＴでプライムしたブタ下顎腺ライブラリーを再スクリーニングするために、１個の32Ｐ標識挿入物を用いた。
８．  ブタシアリルトランスフェラーゼの完全なリーディングフレームは、２個の重複クローンから得られた。ラットの肝および脳から得たｃＤＮＡは、得られたクローンのＤＮＡ配列分析によって決定したとき保存相同領域を含んでいた。
９．  ブタシアリルトランスフェラーゼをコードする完全な長さのｃＤＮＡは、１つのプラスミドの２個の重複クローンから構築され、配列が決定された。図１および２のＤＮＡ配列の開示によって、シアリルトランスフェラーゼｃＤＮＡの保存相同領域からプローブを調製することができ、それによってこれらの種または他の種から、或いはこれらの種
もしくは他の種の他の組織から得られるｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーをプローブで調べることが極めて簡単になり、さらにプローブ検査の効率も高められ、シアリルトランスフェラーゼの精製、配列決定、さらにはプローブプールの調製の手間が不要になるということは評価されるべきところであろう。
１０．  ブタおよびラットのシアリルトランスフェラーゼをコードする完全な長さのｃＤＮＡは、続いて発現ベクターに適合させ、このベクターを用いて適切な宿主細胞を形質転換し、さらにこの宿主細胞を培養して所望のシアリルトランスフェラーゼを製造する。
１１．  前述の手順によって製造された生物学的に活性な完全なシアリルトランスフェラーゼは、図４および５に示したようにまた別の形であってもよい。これらは、４５ｋＤａおよび４８ｋＤａの２つの分子量をもたらす。
【００６７】
本発明のポリヌクレオチド並びに組換え体によって製造されたシアリルトランスフェラーゼポリペプチドおよびフラグメントまたはそのアミノ酸置換変異型は、図１、２、３、５、７および８で提供した配列データを基に、または本発明の方法によって単離された新規なシアリルトランスフェラーゼｃＤＮＡから得られる配列データを基に調製できる。ポリヌクレオチドおよび組換え体によって製造されたシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの製造は、当該技術分野で既知の方法およびマニアーティスらおよびバーガーとキンメルの記載にしたがって実施できる（Ｍａｎｉａｔｉｓら、分子クローニング：実験室マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８９）；Ｂｅｒｇｅｒ  ＆  Ｋｉｍｍｅｌ、酵素学の手法  １５２巻、分子クローニング技術ガイド、アカデミックプレス刊、サンディエゴ、カリフォルニア（１９８７）、これらの文献は参照により本明細書に含まれる）。ポリヌクレオチド配列は、転写のために適切な条件の下でポリヌクレオチド配列の転写が起こるように、当該配列を発現制御配列に  “機能的に連結”し（すなわち、発現制御配列の機能を保証できるように配置し）た後、宿主で発現させることができる。
【００６８】
“特異的ハイブリダイゼーション”とは、本明細書ではプローブヌクレオチド（例えば、本発明のポリヌクレオチドで、置換、欠失および／または付加を含むことがある）と特異的標的ポリヌクレオチド（例えば相補的な配列を有するポリヌクレオチド）との間のハイブリッド形成と定義されるが、ここでは、このプローブは専ら特異的標的とハイブリダイズし、その結果例えば、ただ１つのバンドが、真核細胞から調製された標的ＲＮＡを含むＲＮＡのノザンブロット上で同定でき、および／またはプローブヌクレオチドがＰＣＲプライマーとして用いられるとき、ただ１つの主要なＰＣＲ生成物が得られる。いくつかの事例では、標的配列は、１つ以上の標的ポリヌクレオチド種として存在する（例えば、特定の標的配列はシアリルトランスフェラーゼ遺伝子ファミリーに含まれる多数のメンバーとして、または、同じ遺伝子から転写され、別な態様でスプライスされたＲＮＡとして生じる可能性がある。最適ハイブリダイゼーション条件は、プローブおよび標的の配列組成並びに長さ、並びに実施者によって選択された実験方法にしたがって変動するであろう。種々のガイドラインが適切なハイブリダイゼーション条件を選択するために用いられる（Ｍａｎｉａｔｉｓら、分子クローニング：実験室マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８９）；Ｂｅｒｇｅｒ＆  Ｋｉｍｍｅｌ、酵素学の手法  １５２巻、分子クローニング技術ガイド、アカデミックプレス刊、サンディエゴ、カリフォルニア（１９８７）参照、この文献は参照により本明細書に含まれる）。
【００６９】
“アンチセンスポリヌクレオチド”は、（１）図１および２に示された配列の全部または一部分、および／または本発明の方法によって単離された新規なシアリルトランスフェラーゼｃＤＮＡから得られた配列と相補的なポリヌクレオチド、および（２）相補的な標的配列と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。そのような相補的アンチセンスポリヌクレオチドは、ヌクレオチド置換、付加、欠失または転位を含むことができるが、ただし、関連標的配列（例えば図１または２と一致する）との特異的ハイブリダイゼーションがこのポリヌクレオチドの機能的特性として保持されている場合に限られる。相補的なアンチセンスポリヌクレオチドは、可溶性アンチセンスＲＮＡ、またはＤＮＡオリゴヌクレオチド（これは個々のシアリルトランスフェラーゼｍＲＮＡ種またはシアリルトランスフェラーゼｍＲＮＡファミリーの多数のメンバーと特異的にハイブリダイズすることができる）を含み、ｍＲＮＡ種の転写および／またはコードポリペプチドへの翻訳を阻害する（Ｃｈｉｎｇら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８６：１００６−１００１０（１９８９）；  Ｂｒｏｄｅｒら、Ａｎｎ．  Ｉｎｔ．  Ｍｅｄ．，  １１３：６０４−６１８（１９９０）；  Ｌｏｒｅａｕら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ２７４：５３−５６（１９９０）；  Ｈｏｌｃｅｎｂｅｒｇら、ＷＯ９１／０９８６５；  ＷＯ９１／０４７５３；  ＷＯ９０／１３６４１；ＥＰ３８６５６３、この文献は各々参照により本明細書に含まれる）。アンチセンスポリヌクレオチドはしたがって、コードされるポリペプチドの産生を抑制する。この点で、１つまたは２つ以上のシアリルトランスフェラーゼの転写および／または翻訳を抑制するアンチセンスポリヌクレオチドは、ポリペプチドに糖付加する細胞の能力および／または特性を変更することができる。
【００７０】
アンチセンスポリヌクレオチドは、トランスフェクト細胞または遺伝子導入細胞（例えば、個々人の造血幹細胞の全部または一部を再構成するために用いられる遺伝子導入多能性造血幹細胞）で、異種発現カセットから製造してもよい。また別に、アンチセンスポリヌクレオチドは、外部環境（インビトロ培養液またはインビボ循環系もしくは間隙体液のいずれか）に投与される可溶性オリゴヌクレオチドを含むことができる。外部環境に存在する可溶性アンチセンスポリヌクレオチドは、細胞質に到達して、特異的ｍＲＮＡ種の翻訳抑制することが示された。いくつかの実施例では、アンチセンスポリヌクレオチドはメチルホスホネート部分を含み、また別にはホスホロチオレートもしくはｏ−メチルリボヌクレオチドも用いることができ、さらにキメラオリゴヌクレオチドもまた用いることができる（Ｄａｇｌｅら、（１９９０）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １８：４７５１）。幾つかの応用例では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ポリアミド核酸を含むことができる（Ｎｉｅｌｓｅｎら、（１９９１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５４：１４９７）。アンチセンスポリヌクレオチドに関する一般的な方法については、  “アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ”（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ＤＮＡ  （１９８８）、Ｄ．Ａ．  Ｍｅｌｔｏｎ編、コールドスプリングハーバー研究所、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク）を参照のこと。
【００７１】
１つまたは２つ以上の配列に対して相補的なアンチセンスポリヌクレオチドは、同族のｍＲＮＡ種の翻訳を抑制し、したがってそれぞれによってコードされるポリペプチド量を減少させるために用いられる。そのようなアンチセンスポリヌクレオチドは、１つまたは２つ以上のシアリルトランスフェラーゼのインビボでの生成を抑制することによって治療的機能を提供することができる。
【００７２】
シアリルトランスフェラーゼ導入遺伝子の１つまたは２つ以上の組み込まれたコピーを有する遺伝子導入動物を作ることができる。シアリルトランスフェラーゼ導入遺伝子は、機能的プロモーターに作動できるように連結され、さらに選択可能マーカー配列（例えばＧ−４１８耐性遺伝子）に連結されたシアリルトランスフェラーゼ蛋白をコードするポリヌクレオチド配列またはフラグメントを含むポリヌクレオチドである。
【００７３】
例えば薬剤スクリーニングおよび薬剤効果の評価のためのモデル系として使用するために、シアリルトランスフェラーゼ導入遺伝子を含む遺伝子導入モデル系および／または完全細胞系を、遺伝子操作を用いて開発することは可能である。さらに、そのようなモデル系は、シアリルトランスフェラーゼ代謝の基礎的生化学の解明のための手段を提供し、したがって、合理的薬剤デザインおよび実験的検査のための基礎を提供する。
【００７４】
遺伝子導入動物を作出する１つの方法は、胚幹（ＥＳ）細胞株でインビトロ相同組み換えを行うことによって所望の遺伝子に対する変異を起こし、続いてこの改変ＥＳ細胞株を宿主未分化胚芽細胞に極微注入（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）し、さらに養育母の体内で培養することである（Ｆｒｏｈｍａｎ  ＆  Ｍａｒｔｉｎ  （１９８９）  Ｃｅｌｌ，  ５６：１４５参照）。また別には、変異遺伝子またはその部分を一細胞胚に極微注入し、続いて養育母の体内で培養する技術も用いることができる。遺伝子導入動物、特に天然のシアリルトランスフェラーゼ蛋白またはそのフラグメントを発現する遺伝子導入動物には、種々の用途がある。また別に、変異によって変化（例えば変異誘発）した、酵素活性を有しまたは有しないシアリルトランスフェラーゼ蛋白をコードする導入遺伝子を宿す遺伝子導入動物は、所望にしたがって構築できる。遺伝子導入動物を作出する別の方法も当該技術分野で既知である。
【００７５】
また別に、部位誘導変異誘発および／または遺伝子変換は、シアリルトランスフェラーゼ対立遺伝子（内在性にしろトランスフェクションによるものにしろ）をインビボで変異させるために用いることができ、その結果、変異対立遺伝子が変異型のシアリルトランスフェラーゼをコードする。
【００７６】
また別に、相同組み換えは、シアリルトランスフェラーゼ配列を宿主ゲノムの特異的部位、例えば対応する宿主シアリルトランスフェラーゼ座位に挿入するために用いてもよい。相同組み換えの１つのタイプでは、１つまたは２つ以上の宿主配列が置換される、例えば宿主シアリルトランスフェラーゼ対立遺伝子（またはその部分）は変異シアリルトランスフェラーゼ配列（またはその部分）と置換される。そのような遺伝子置換法の他に、相同組み換えでは、シアリルトランスフェラーゼ（またはそのフラグメント）をコードするポリヌクレオチドを宿主シアリルトランスフェラーゼ座位以外の特定の部位に置くことを目的として用いることができる。相同組み換えは、変異シアリルトランスフェラーゼ対立遺伝子を取り込んだ、ヒト以外の遺伝子導入動物および／または細胞を作出するために用いることができる。ジーンターゲティングは、１つまたは２つ以上の内在性シアリルトランスフェラーゼ遺伝子を破壊し、さらに不活性化するために用いることができる。これらいわゆる  “ノックアウト”遺伝子導入体は、他の遺伝子に関して当該技術分野で開示されている（ＷＯ９１／１０７４１；  Ｋｕｈｎら、（１９９１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ７０８：７０７））。
【００７７】
以下の実施例は、本明細書発明に関して最良と思われる態様を詳述するもので、本発明を制限するものと解してはならない。本明細書の全ての引用文献は、参照により本明細書に含まれている。
【実施例１】
【００７８】
実施例１
ブタシアリルトランスフェラーゼの精製
α２，３−Ｏシアリルトランスフェラーゼの２つの形態の精製
先に記載された２つの方法（Ｊ．Ｅ．  Ｓａｄｌｅｒ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５４：４４３４−４４４３（１９７９）；  Ｈ．Ｓ．  Ｃｏｎｒａｄｔら、日独シアル酸シンポジウム詳録（Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  １９８８  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｊａｐａｎｅｓｅ−Ｇｅｒｍａｎ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ（Ｓｃｈａｕｅｒ  ＆  Ｙａｍａｋａｗａ編）、１０４−１０５ページ、Ｖｅｒｌａｇ  Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ  ＆  Ｂｉｌｄｕｎｇ刊、キール（１９８８））を組み合わせて、α２，３−Ｏシアリルトランスフェラーゼを精製した。この酵素は、ブタ肝臓のトリトンＸ−１００抽出物をＣＤＰ−ヘキサノルアミンアガロースカラムで３回連続アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。第一および第三精製工程の溶出曲線は、図３と４にそれぞれ示した。図３は、シアリルトランスフェラーゼ活性の２つのピークが最初のアフィニティーカラムの溶出曲線で認められることを示している。これら２つのピークを、表示した分画をプールＡ、プールＢにまとめることによって分け、後にこれら２つのプールは、異なる２種の分子量形のα２，３−Ｏシアリルトランスフェラーゼに富むことが分かった。
【００７９】
各プールについての第二回目のアフィニティー精製によって、ブタ肝にまた存在している（Ｊ．Ｅ．  Ｓａｄｌｅｒ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５４：４４３４−４４４３（１９７９））夾雑α２，６シアリルトランスフェラーゼの大半が除去された。第三回目のアフィニティークロマトグラフィーの後、カラム分画を分析したが、個々の分画は４８ｋＤａ（図４Ａ、分画４−６）または４５ｋＤａ（図４Ｂ、分画２−６）分子量形のα２，３シアリルトランスフェラーゼに富むことが分かった。これら２種の蛋白は、それぞれＡ型およびＢ型と呼ぶ。両方のカラムの分画の比活性度は、８−１０単位／ｍｇ蛋白であった。図４カラムＡの分画６の強く見えるバンド（〜４４ｋＤａ）はα２，３シアリルトランスフェラーゼではない。なぜならば、最後のアフィニティークロマトグラフィー工程で酵素活性がなく、その前のカラムの後のプールＡおよびプールＢの両方に主要な夾雑物質の１つであるからである。
【００８０】
シアリルトランスフェラーゼ活性を、基質としてラクトースおよび／または低分子量凍結防止糖蛋白を用いて調べた（Ｊ．Ｅ．  Ｓａｄｌｅｒ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５４：４４３４−４４４３（１９７９））。この酵素は文献に記載された方法（Ｊ．Ｅ．  Ｓａｄｌｅｒ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５４：４４３４−４４４３（１９７９）；  Ｈ．Ｓ．  Ｃｏｎｒａｄｔら、日独シアル酸シンポジウム詳録（Ｓｃｈａｕｅｒ  ＆  Ｙａｍａｋａｗａ編）、１０４−１０５ページ、Ｖｅｒｌａｇ  Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ  ＆  Ｂｉｌｄｕｎｇ刊、キール（１９８８））を幾分改変してブタ肝から精製した。簡単に記せば、２ｋｇの肝臓を緩衝液中で均質にし、文献（Ｊ．Ｅ．  Ｓａｄｌｅｒ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５４：４４３４−４４４３（１９７９））のように膜を調製した。膜を緩衝液で３回抽出し（Ｈ．Ｓ．  Ｃｏｎｒａｄｔら、日独シアル酸シンポジウム詳録（Ｓｃｈａｕｅｒ  ＆  Ｙａｍａｋａｗａ編）、１０４−１０５ページ、Ｖｅｒｌａｇ  Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ  ＆  Ｂｉｌｄｕｎｇ刊、キール（１９８８））、抽出物を１．５ｌのＣＤＰ−ヘキサノルアミンアガロースカラム（カラムＩ）（１６ｕｍｏｌ／ｍｌ）に通した。このカラムを３Ｌの緩衝液Ｂで洗浄した後、緩衝液Ｂ中の０．０５から１．０ＭのＫＣＬ（２．５ｌ×２．５ｌ）の直線勾配でカラムを溶出した。α２，３シアリルトランスフェラーゼを含む分画を、２つのプールＡおよびＢにまとめた。これはそれぞれピークの主要部分とその後続端を含む（図３参照）。このプールを緩衝液Ｂに対して透析し、もう一度ＣＤＰ−ヘキサノルアミンアガロースでアフィニティークロマトグラフィーを施した（カラムＩＩＡおよびＩＩＢ）。１５０ｍｌのカラムをプールＡに、３０ｍｌのカラムをプールＢに用いた；カラムＩからの２種の調製物（総量４ｋｇの肝臓から）は、工程ＩＩで同じカラムに添加された。α２，３シアリルトランスフェラーゼは、緩衝液Ｂ中の０−２．０ｍＭのＣＴＰの勾配で溶出させた（７５０ｍｌ、プールＡ；１５０ｍｌ、プールＢ）。α２，３シアリルトランスフェラーゼ活性をもつ分画をＧ５０セファデックスで脱塩し、緩衝液で平衡させ、さらに活性分画を１．０ｍｌのＣＤＰ−ヘキサノルアミンアガロースカラムに添加し（パートＩＩＩ）、これを緩衝液Ｂ中の０．１から１．０ｍＭのＣＴＰの段階勾配（２０工程、各々１．０ｍｌ）で溶出させた（図２）。活性分画をプールし、両方のカラムからまとめた収量は、比活性度が８−１０単位／ｍｇ蛋白の２．５単位であった。
【００８１】
４８ｋＤａおよび４５ｋＤａのシアリルトランスフェラーゼペプチド（図４参照）をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでＰＶＤＦ膜（ＩｍｍｏｂｉｌｏｎＴｒａｎｓｆｅｒ、ミリポァー）に電気的に溶出して分離し、（Ｕ．Ｋ．  Ｌｅａｍｍｌｉ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２２７：６８０−６８５（１９７０））クマシーブリリアントブルー（シグマ）で染色した。シアリルトランスフェラーゼバンドを切り出し、アプライドバイオシステムズ社の４７５Ａ蛋白配列決定装置を用いて、結合ペプチドをエドマン分解によるＮＨ2−末端アミノ酸配列分析に付した。
【００８２】
シアリルトランスフェラーゼの４８ｋＤａ（Ａ型）および４５ｋＤａ（Ｂ型）に富む分画をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）に付し、ＰＤＶＦ膜にブロットを移し、ＮＨ2−末端配列決定によって調べた。２２個のアミノ酸残基をもつ配列が各ペプチドから得られた（図５）。Ａ型のＮＨ2−末端配列は、小型は疎水性ペプチドの蛋白分解切断によって大型から得られるというサドラーらおよびウェスコットら（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５４：４４３４−４４４３（１９７９）；  Ｗｅｓｃｏｔｔら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６０：１３１０９−１３１２１）の予想通り、アミノ酸の疎水性部分を含んでいた。この領域はおそらくＡ型に固有である、洗剤および膜に結合する特性の説明となると思われた。
【実施例２】
【００８３】
実施例２
ブタシアリルトランスフェラーゼｃＤＮＡ
ポリＡ＋ＲＮＡは、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が供給するキットを用いて一本鎖ｃＤＮＡを構築する鋳型として用いた。ｃＤＮＡは、パーキンエルマーシータス（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）が供給する試薬とプロトコルを用いてポリメラーゼ鎖伸長反応（ＰＣＲ）を行うときの鋳型としての機能を有する。用いた特定条件は、変性、ＤＮＡアニーリングおよび重合反応について、それぞれ９２°１分；５０°２分；７２°２分であった。ＰＣＲ反応はＳＴ１の３’末端の１２０ｂｐ欠失に隣接する配列に一致するオリゴヌクレオチドである３０ｂｐをプライマーとした。増幅反応の生成物を２％アガロースゲルで分離した。ＳＴ１およびＳＴ２クローンに対応する１２０ｂｐの違いがある２本の特異的なバンドが、臭化エチジウム染色で区別された。これらのバンドをゲル（Ｑｉａｅｘキット、Ｑｉａｇｅｎ）から溶出させ、ＴＡベクター（インビトロゲン）に再度クローニングし、明瞭に区別するために上記のように配列決定した。
ＲＮＡ単離とｃＤＮＡライブラリーの構築
新鮮なブタ下顎腺（死後３０分以内）を凍結し、ドライアイス−エタノール中で輸送した。全ＲＮＡを文献の方法にしたがって単離した（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  ＆  Ｓａｃｃｈｉ，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １６２：１５６−１５９（１９８７））。ポリＡ＋ＲＮＡはオリゴｄＴ−セルロースクロマトグラフィー（ファルマシア）で精製した。二重鎖ｃＤＮＡは、プライマーとしてランダムヘキサマーを用い、ファルマシアｃＤＮＡ合成キットと供給元の推奨方法にしたがってポリＡ＋ＲＮＡの逆転写によって合成した。ＥｃｏＲＩアダプターをＥｃｏＲＩ消化λｇｔ１０に連結し、インビトロパッケージングを行った（ＰｒｏＭｅｇａ）。ｃＤＮＡライブラリーは大腸菌Ｃ６００の感染によるスクリーニングのためにこのパッケージ混合物とともにプレートに播種した。
ｃＤＮＡクローンの単離と配列決定
特に明示しないかぎり、全ての工程はマニアーティスらの文献（分子クローニング：実験室マニュアル、コールドスプリングハーバー研究所、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８２））  にしたがって実施した。精製４８ｋＤａシアリルトランスフェラーゼペプチドのＮＨ2−末端配列近くの１８アミノ酸（図５参照）に対応する、５３ｂｐのオリゴヌクレオチドプローブ（５’ＡＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＣＧＣＡＣＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＴＧＡＣＣＴＣＣＴＴＣＴＴ３’）を、32Ｐで比活性１０7ｃｐｍ／ｐｍｏｌとなるよう末端標識した。５０００００プラークを、以下のプレハイブリダイゼーション／ハイブリダイゼーション溶液でヌクレオチドハイブリダイゼーションによってスクリーニングした：３７℃において、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ６．７）、２０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、０．１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ（Ｗ．  Ｗｏｏｄ，  分子クローニング技術ガイド、酵素学の手技、４４３ページ）。ニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ  ０．４５ｍ孔）を０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで４０分間、４２℃で洗浄した。強くハイブリダイズした１クローン（λＳＴ１）を得たが、これは、４８ｋＤａおよび４５ｋＤａの精製シアリルトランスフェラーゼペプチドに一致するアミノ酸配列をコードする１個のオープンリーディングフレームを含んでいた。第二のクローン（λＳＴ２）は、λＳＴ１の３’末端から得た制限フラグメントプローブを用いてヌクレオチドハイブリダイゼーションによって単離した。このプローブ（０．５ｋｂのＰｖｕＩＩ−ＥｃｏＲＩ制限フラグメント）を、ランダムプライミングキットおよび〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰ（アマーシャム）を用いて標識した。
【００８４】
ファージＤＮＡのｃＤＮＡ挿入物に対応するＥｃｏＲＩ制限フラグメントをｐＵＣベクター（ファルマシア）でサブクローニングした。このサブクローンをファルマシアのＴ７キットを用いて配列決定した。配列データはＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，  ウイスコンシン、米国）を用いてコンピューターで解析した。
【００８５】
図５に示したアミノ酸配列情報に基づきα２，３シアリルトランスフェラーゼのためのｃＤＮＡをクローンを得るために、幾つかのクローニング方法を試みた。最初の試みでは、４８ｋＤａおよび４５ｋＤａ蛋白のＮＨ2−末端配列に広がるプローブを（それらは完全な酵素では連続していると仮定して）作製する試みとして、ポリメラーゼ鎖反応プライマーを調製した。ふりかえれば、この方法は、４５ｋＤａ種のために得られたアミノ酸配列が不正確であったために成功しなかった（図５および６参照）。その他の失敗した陽性クローンを得る試みでは、ブタ下顎腺ｃＤＮＡをスクリーニングするために、プローブとして短い（１６−２０ｂｐ）縮退オリゴヌクレオチドを用いた。完全に成功であった方法は、Ａ型のＮＨ2−末端の１７個アミノ酸からデザインした非縮退５３ｂｐオリゴヌクレオチドプローブを使用することであった。この５３ｂｐプローブを、λｇｔ１０ブタ下顎唾液腺ｃＤＮＡライブラリーの５０００００個のプラークをスクリーニングするために用いた。ただ１つの１．６ｋｂのクローン（λＳＴ１）が得られたが、これは共通ＡＴＧ開始コドン（Ｍ．  Ｋｏｚａｋ，  Ｃｅｌｌ，  ４９：２８３−２９２（１９８６）；  Ｍ．  Ｋｏｚａｋ，  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １２：８５７−８７２（１９８４））、α２，３シアリルトランスフェラーゼのＡ型およびＢ型の両方のＮＨ2−末端アミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレームを含むが、インフレームの停止コドンは含まなかった。α２，３シアリルトランスフェラーゼの両方の形態のＮＨ2−末端アミノ酸配列はλＳＴ１の翻訳されるオープンリーディングフレームに存在するという事実は、λＳＴ１クローンはα２，３シアリルトランスフェラーゼの一部分をコードするということを示唆している。
【００８６】
λＳＴ１の３’制限フラグメントをプローブとして用い、第二の重複クローンλＳＴ２を同じライブラリーから得た（図６）。λＳＴ２は、λＳＴ１から発生し、オープンリーディングフレームを完全なものにしている。これら２つのｃＤＮＡはただ１つのオープンリーディングフレーム（９０９−１０２９、下記参照）、６００ｂｐの５’非翻訳領域および１０００ｂｐの３’非翻訳領域をコードする。このヌクレオチド配列は、その１０２９ｂｐのオープンリーディングフレームに対する翻訳されたアミノ酸配列とともに図７に示す。λＳＴ１の翻訳されるオープンリーディングフレームの推定アミノ酸配列と精製蛋白の直接分析によって得られたアミノ酸配列との間には良好な一致があった。
【００８７】
λＳＴ１およびλＳＴ２の重複領域の配列は、λＳＴ１のただ１つの１２０ｂｐのギャップを除いて、その全長に亙って同一であった。この固有のオープンリーディングフレームは、λＳＴ１のこの妨害物の両側に連続している（図６）。この２種のｃＤＮＡ形の１方または両方が真のｍＲＮＡを表しているか否かを決定するために、このギャップに隣接するプライマーを用いてＰＣＲ分析を、ブタ唾液腺のポリＡ＋ＲＮＡの逆転写によって得られたｃＤＮＡ鋳型で実施した。λＳＴ１およびλＳＴ２に対応する増幅ＰＣＲフラグメントをこの方法で検出した（データは示さず）。このＰＣＲ生成物をサブクローニングし、それらの同一性を確認するために配列決定した。両方ともλＳＴ１およびλＳＴ２の対応領域と同一であることが分かった。したがって、ｃＤＮＡ直接クローニングおよびＰＣＲ増幅の両方の結果は、ブタ下顎腺にはα２，３シアリルトランスフェラーゼについて２種のｍＲＮＡ種が存在し、それらの違いはそのオープンリーディングフレームに１２０ｂｐの挿入物が存在するか否かである。
【００８８】
シアリルトランスフェラーゼ蛋白（１０２９ｂｐオープンリーディングフレーム）の予想サイズは３９ｋＤａで、４個の潜在的Ｎ−連結糖付加部位をもつ（Ｅ．Ｂｏｕｓｅ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  ２０９：３３１−３３６（１９８３））（図７参照）。これらの部位のうち３か所を使用すれば、精製シアリルトランスフェラーゼＡ型について観察された約４８ｋＤａの予想サイズをもつ蛋白が得られるであろう。アミノ末端配列は極めて接近した状態で２つのＡＴＧコドンを含み、最初のもののみが、強力な共通翻訳開始部位内に存在する（Ｍ．  Ｋｏｚａｋ，  Ｃｅｌｌ，  ４９：２８３−２９２（１９８６）；  Ｍ．  Ｋｏｚａｋ，  Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １２：８５７−８７２（１９８４））。カイト−ドゥーリットル水分析（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １５７：１０５−１３２（１９８２））は、１６個の疎水性残基から成る１つの潜在的な膜スパンニング領域はアミノ末端から１１残基に位置することを明らかにした（図７）。この構造的特性は、α２，３シアリルトランスフェラーゼは、これまで調べられてきた他の糖転位酵素と同じように、ＩＩ型の膜方向性を有し、このただ１つの疏水領域は、切断不可のアミノ末端シグナル／アンカードメインとして作用するであろうということを提唱する（Ｊ．Ｃ．Ｐａｕｌｓｏｎ  ＆  Ｋ．Ｊ．  Ｃｏｌｌｅｙ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４：１７６１５−１７６１８（１９８９））  。
【００８９】
λＳＴ１およびλＳＴ２によってコードされるオープンリーディングフレームは、α２，３−ＯシアリルトランスフェラーゼのＡ型およびＢ型の両方から得られる完全なＮＨ2−末端アミノ酸配列を含む。図６に示したように、Ａ型のＮＨ2−末端配列は、オープンリーディングフレームの仮定翻訳開始部位から８アミノ酸で、Ｂ型の対応するＮＨ2−末端配列は、この蛋白のＣＯＯＨ−末端に向かって２７アミノ酸残基であることが分かった。α２，３シアリルトランスフェラーゼのＢ型は触媒的に完全な活性を有するので（Ｊ．Ｉ．  Ｒｅａｒｉｃｋら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２５４：４４４４−４４５１（１９７９））、完全な長さの酵素の仮定イニシエーターのメチオニンとＢ型のアミノ末端との間の蛋白配列は、おそらく酵素活性に必要ではないであろう。したがって、シグナルアンカードメインと触媒ドメインとの間に存在するα２，３−Ｏシアリルトランスフェラーゼの蛋白分解に感受性を有する領域は、以前に調べられたグリコシルトランスフェラーゼについて明らかにされたように幹領域のようである（Ｊ．  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６２：１７７３５−１７７４３（１９８７）；Ｊ．Ｃ．  Ｐａｕｌｓｏｎ  ＆  Ｋ．Ｊ．  Ｃｏｌｌｅｙ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６４：１７６１５−１７６１８（１９８９））  。
【００９０】
ブタまたはラット組織から全ＲＮＡの２０ｍｇを、記載の通り２．２Ｍのホルムアルデヒド（２６）を含む１．０％アガロースゲル上で電気泳動し、ニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）に移した。ニトロセルロースフィルターを32Ｐ標識ｃＤＮＡプローブでハイブリダイズし、先に述べたように洗浄した。
【実施例３】
【００９１】
実施例３
可溶性ブタシアリルトランスフェラーゼの発現
α２，３−Ｏシアリルトランスフェラーゼの触媒ドメインおよびインスリンシグナル配列との間で、クローンλＳＴ２のＣ−末端８９０ｂｐをベクターｐＧＩＲ−１９９のＮ−末端部分に対して、両ベクターのリーディングフレームに含まれるＳａｃＩ部位で融合させることによって、分泌可能キメラ蛋白を作製した。このキメラ、ｓｐ−ＳＴを制限酵素ＮｈｅＩおよびＳｍａＩで消化し、１．０ｋｂフラグメントを単離し、さらに、ポリリンカーに含まれる部位を切断するＸｂａＩおよびＳｍａＩで消化したｐＳＶＬ（ファルマシア）でサブクローニングした。生じた構築物をｐＳＶＬ−ｓｐＳＴと呼び、ＣＯＳ−１細胞でのα２，３−Ｏシアリルトランスフェラーゼの可溶形の一時的発現のベクターとして用いた。供給元の推奨方法にしたがってリポフェクチンを用いて、高次コイルＤＮＡ、ｐＳＶＬｓｐ−ＳＴをＣＯＳ細胞にトランスフェクトした（５０％密集細胞を含む６０ｍｍの培養皿に５μｇＤＮＡ、２０ｍｌリポフェクチン試薬でトランスフェクション）。トランスフェクション後４８時間して、ＣＯＳ−１細胞培養液を採取し、α２，３−Ｏシアリルトランスフェラーゼ活性のアッセーのためにセントリコン３０フィルター（Ａｍｉｃｏｎ）で１５×濃縮した。先に記載されたように（Ｓａｄｌｅｒ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５４：４４３４−４４４３（１９７９））、凍結防止糖蛋白受容体を用いてα２，３−Ｏシアリルトランスフェラーゼ活性を決定した。
【００９２】
ｐＳＶＬ−ｓｐＳＴでトランスフェクション後４８時間して、ＣＯＳ細胞（６０ｍｍ培養皿）をメチオニン非含有培養液（ＤＭＥＭ、５％ウシ胎児血清）（ギブコ製）で洗浄し、同じ培養液で１時間培養した。１５０ｍＣｉ／１５０ピコモルの35Ｓ−ｍｅｔエクスプレスラベル（ＮＥＮ）を用いて、１．５ｍｌのメチオニン非含有培養液中で細胞を２時間パルス標識した。続いてこれらの細胞をＰＳＡで洗浄し、35Ｓ−メチオニン標識を含まない培養液中で標識追い出し（チェース）培養を５時間実施した。その後、分泌された蛋白を含むこの培養液を採取し、１５倍濃縮してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、フルオログラフィーで解析した。
【００９３】
以前に述べたように、α２，３−ＯシアリルトランスフェラーゼのＢ型は酵素的に活性を有する、完全な長さの膜結合酵素の蛋白分解によって切断された生成物である。したがって、可溶性のキメラ蛋白は、Ｂ型の完全配列を含むかぎり、α２，３−Ｏシアリルトランスフェラーゼ活性を保持するであろうと期待される。そのような可溶性蛋白を作製するために、Ｂ−ペプチド配列のＮＨ2−末端の上流の制限部位が、λＳＴ２ｃＤＮＡとインスリンシグナル配列をコードするベクター、ｐＧＩＲ−１９９との融合部位として選ばれた。図８に示したように、この構築物はシグナルペプチド−ＳＴ（ｓｐ−ＳＴ）と呼ぶ融合蛋白をコードするが、これは、ｐＧＩＲリンカーによってコードされる９アミノ酸がその後に続くインスリンシグナル配列と、α２、３−Ｏシアリルトランスフェラーゼの完全な仮定触媒ドメインから成る。このｓｐ−ＳＴ構築物は、宿主哺乳類細胞にトランスフェクトした場合、３８ｋＤａの分泌蛋白合成を指令すると期待された。グリコシルトランスフェラーゼの可溶形の産生について同様な方法が用いられ成功した（Ｊ．Ｃ．  Ｐａｕｌｓｏｎ  ＆  Ｋ．Ｊ  Ｃｏｌｌｅｙ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６４：１７６１５−１７６１８（１９８９）；  Ｋ．Ｊ．  Ｃｏｌｌｅｙら、ｊ＞  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６４：１７６１９−１７６２２（１９８９）；  Ｒ．Ｄ．  Ｌａｒｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８７：６６７４−６６７８（１９９０））。
【００９４】
ｓｐ−ＳＴ構築物をｐＳＶＬ発現ベクターに配置し、一時的にＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトした。４８時間後に、このトランスフェクトした細胞をトランス35Ｓ−標識を含む培養液で２時間インキュベーションし、その後標識を含まない培養液で標識追跡培養を５時間行った。この培養液を採取し、１５倍に濃縮してＳＤＳ−ＰＡＧＥ／フルオログラフィーで調べた。図９Ｂは、この培養液は専ら３８ｋＤａの、ｓｐ−ＳＴ蛋白として予想された大きさの蛋白種を含んでいることを示す。平行して実施したトランスフェクト培養物において、トランスフェクション後４８時間して培養液を採取し、濃縮してα２，３−Ｏシアリルトランスフェラーゼ活性について調べた。図９Ｃに示したように、ｓｐ−ＳＴを用いてトランスフェクションした細胞から得た培養液は、ミリ単位／ｍｌのシアリルトランスフェラーゼを含んでいたが、一方、擬似トランスフェクト細胞は顕著な活性を示さなかった。
【実施例４】
【００９５】
実施例４
ラット肝シアリルトランスフェラーゼの精製と配列決定
小胞体およびゴルジ装置に存在する膜蛋白である他のグリコシルトランスフェラーゼと同様に、シアリルトランスフェラーゼは少ししか存在しない蛋白であり精製が困難で、それがこの種類ではわずか２種のみしかクローニングされていない理由である。Ｇａｌβ１，３（４）ＧｌｃＮＡｃα２，３シアリルトランスフェラーゼ（  “α２，３−Ｎ”）は、バインシュタインら（Ｊ．  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５７：１３８３５−１３８４４（１９８２）；  Ｊ．  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １３８４５−１３８５３（１９８２））によって初めて１９８２年にラット肝から８０００００倍精製され、約１０μｇ／ｎｇ組織が得られた。アミノ酸配列情報を得るため、または通常の方法を用いてこの酵素に対する抗体を作製する試みがいくつか為されたが、得られたのが少量の希薄蛋白であったので、これらの試みは成功しなかった。代替方法として、質量分析法が、生物学的に重要な巨大分子の構造解析に大きな役割を果たしてきた。新しいイオン化法および装置の開発は、解析可能な質量範囲を広げ、さらに検出感度を高めた。高速連続質量分析法は、翻訳後修飾および化学的修飾の決定同様（Ｔ．Ｅ．  Ｄｅｖｅｒら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６４：２０５１８−２０５２５（１９８９）；Ｃ．Ａ．  Ｓｅｔｔｉｎｅｒｉら、Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，１９：６６５−６７６（１９９０）；  Ｗ．Ｅ．  ＤｅＷｏｌｆ  Ｊｒ．，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２７：９０９９３−９１０１（１９８８））、蛋白の配列決定のため（Ｗ．Ｒ．  Ｍａｔｈｅｗｓら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６２：７５３７−７５４５（１９８７））の強力な技術として、今日確立されている。したがって、シアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を提供するために質量分析法を用いた。
【００９６】
還元とカルボキシメチル化−約１３μｇのＧａｌβ１，３（４）ＧｌｃＮＡｃα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（α２，３Ｎ）を、３０ｍＭのカコジル酸ナトリウム（ｐＨ＝６．５）、１００ｍＭＮａＣｌ、０．１％トリトンＣＦ−５４および５０％グリセロールを含む３５０ｍｌに保存した。トリスＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）、グアニジンＨＣｌおよびジチオスレイトールを、それぞれ最終濃度０．２Ｍ、６Ｍおよび７ｍＭで加えた。還元はアルゴン下で１．５時間６０℃で実施した。０．２ＭトリスＨＣｌ緩衝液２．５ｍｌ中のヨード酢酸ナトリウム（１．３２ｍｇ）をこの混合物に加えた。アルキル化はアルゴン下の暗室で１．５時間室温で実施した。
【００９７】
透析−ベセスダリサーチラブ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ，  ”ＢＲＬ”）のＢＲＬ調製透析膜（カットオフ分子量１２−１４ｋＤａ）
付きマイクロダイアリシスシステムを用いて、４リットルの５０ｍＭＮ−エチルモルホリンアセテート緩衝液（ｐＨ＝８．１）に対して、還元しカルボキシメチル化したα２，３Ｎを透析した。透析が完了したとき、１０％ＳＤＳを透析ウェルに添加し、最終ＳＤＳ濃度を約０．１％とした。ウェルの内容物を集め、スピードバック（ＳｐｅｅｄＶａｃ）濃縮装置（Ｓａｖａｎｔ）を用いて乾燥させた。ＳＤＳを除去するのために、コーニッグズバーグ（Ｋｏｒｎｉｇｓｂｅｒｇ）沈澱を実施した（Ｗ．Ｈ．  Ｋｏｒｎｉｇｓｂｅｒｇ  ＆  Ｌ．  Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ９１：２５４−２５９（１９９３））  。
【００９８】
トリプシン消化−沈澱α２，３Ｎを消化緩衝液（１００ｍＭのトリスＨＣｌ、２Ｍ尿素、１ｍＭのＣａＣｌ2、ｐＨ＝８．０）に溶解させ、約２ｍｇ／ｍｌの蛋白濃度を得た。α２，３Ｎを１０％トリプシン（ｗ／ｗ）（ベーリンガーマンハイム、配列決定グレード、１ｍＭのＨＣｌに溶解）で消化した。７時間消化した後、さらに適量のトリプシン液を混合物に加え、最終トリプシン濃度を約１３％にした。１８時間後に消化を停止させた。得られたトリプシン消化物を逆相ＨＰＬＣ（ＡＢＩ  Ｃ１８カラム、１．０Ｘ１００ｍｍ）でＡＢＩ１４０Ａ溶媒分配系を用いて分離した。溶媒Ａは、０．１％ＴＦＡ水溶液であった。溶媒Ｂは７０％アセトニトリル／３０％水中の０．０８％ＴＦＡであった。この系は５０ｍｌ／分の流速で実施した。注入後１０分して、溶媒Ｂの％を０％から５０％まで９０分かけて増加させ、続いて３０分で１００％まで増加させた。ＡＢＩ７８３Ａ吸収検出装置を用いて２１５ｎｍでペプチドを検出した。分画の幾つかをＨＣｌ／ｎ−ヘキサノール混合物を用いてエステル化した。
【００９９】
質量分析法−液体二次イオン質量分析（ＬＳＩＭＳ）発生源および高磁場を装備したクラトス（Ｋｒａｔｏｓ）ＭＳ５０Ｓ二重フォーカシング質量分析装置を用いて、ＬＳＩＭＳ実験を実施した。採取分画の各々の約１／５をＬＳＩＭＳ分析に使用した。１％ＴＦＡで酸性にしたグリセロール−チオグリセロール１：１の混合物１μｌを液体マトリックスとして用いた。サンプルをプローブチップから再度集めた。最も豊富な分子イオンを、衝突誘発解離（ＣＩＤ）分析のために選んだ。これらの実験は、電気光学マルチチャンネルアレー検出装置を搭載したクラトスコンセプトＩＩＨＨで４セクター質量分析装置で実施した。この装置は、質量範囲の連続した４％セグメントを同時に記録することができる。衝突エネルギーは４ｋｅＶに設定し、衝突ガスはヘリウムで、その圧は、選択前駆体イオンの充満度を最初の体積の３０％に減少させるように調節した。各サンプルの残りを添加し、上記マトリックス１ｍｌを加えた。高エネルギーＣＩＤデータはコンピューターの支援なしに解析した。
【０１００】
テンダム質量分析法は、強力な蛋白配列決定方法で、通常のエドマン法を凌ぐ利点を示す。等モル混合物でさえ、この方法によれば配列決定が可能である。質量分析法による解析のために、ＨＰＬＣから得られた僅かのペプチド分画は先ずエステル化で疎水性が高められ、したがってその蒸着効果が改善される（Ａ．Ｍ．  Ｆａｌｉｃｋ  ＆  Ｄ．Ａ．  Ｍａｌｔｂｙ，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １８２：１６５−１６９（１９８９））  。各分画のＬＳＩＭＳ分析は多数の分子イオンを示し、各々において１ペプチドより多いペプチドの存在を示唆した。最も豊富な３０分子イオンをＣＩＤ分析のために選んだ。これらの実験では、対象となっているイオンの１２Ｃ同位元素のピークが最初の質量分析装置で選択された。衝突セル（２つの質量分析装置に配置）中でのヘリウムとの衝突によって誘発される解離から生じるこの種のフラグメントのみが、第二の質量分析装置の末端で検出される。高エネルギー衝突誘発解離（ＣＩＤ）分析では、フラグメント化は主にペプチドのバックボーンにそって生じる。多数切断、すなわちアミノ酸側鎖におけるフラグメント化もまた観察される。ペプチド鎖にそったフラグメント化は、アミノ酸残基重量によって異なるイオンシリーズを生じ、したがって、対応するアミノ酸配列が推定できる。高エネルギーモードのフラグメント化によってアミノ酸同一性についての新たな情報が提供され、したがって得られた配列が確認でき同重核Ｌｅｕ／Ｉｌｅ間の区別が可能になる（Ｒ．Ｓ．  Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ５９：２６２１−２６２５（１９８７））。側鎖のフラグメント化は、塩基性アミノ酸、すなわちＡｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓが配列内に存在するときに主に観察される（Ｒ．Ｓ．  Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．  Ｉｏｎ  Ｐｒｏｃ．，  ８６：１３７−１５４（１９８８））  。一般的には、Ｎ−末端に存在するか、またはその近くの塩基性アミノ酸残基の優先的プロトン化は、分子のこの末端に好ましい電荷保持をもたらす。Ｃ−末端またはその近くに塩基性アミノ酸を含むペプチドは、殆どＣ−末端フラグメントを示すであろう。したがって、トリプシンは初期消化について利点を有する。高エネルギーＣＩＤデータの解析によって、結局１４配列が得られた（表２および図９参照）。
【０１０１】
ＣＩＤスペクトル分析によって、トリプシン消化の間に幾つかの副反応が生じることが明らかになった。２つのトリプシン自己消化産物がｍ／ｚ６５９．３および１１５３．６で識別された（図９）。長時間のインキュベーションと適切なスカベンジャーの欠如のために、幾つかのトリプシン消化ペプチドがそのＮ−末端でカルバミル化された。そのような副反応がエドマン分解を阻害する一方で、質量分析による配列決定では、Ｎ−末端修飾は有用ですらあるだろう。実際、これらの修飾ペプチドのＣＩＤ分析は、上記の配列の幾つかを確認する上で有用で、１例では、Ｎ−末端ロイシンまたはイソロイシンとの間の違いを識別する手段を提供した（図１０）。
【実施例５】
【０１０２】
実施例５
ラット肝シアリルトランスフェラーゼ
特異的ｃＤＮＡプローブの増幅−α２，３Ｎ由来の１４個のペプチドのうち１１個のアミノ酸配列に基づき、センス鎖とアンチセンス鎖の両方の２２個の縮退オリゴヌクレオチドプールを合成した（Ｇｅｎｏｓｙｓ）。最初のＰＣＲ実験は、ペプチド１１とペプチド１は以前にクローニングされたシアリルトランスフェラーゼ、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃα２，６−シアリルトランスフェラーゼ（Ｊ．  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５７：１３８３５−１３８４４（１９８２））および上記に述べたα２，３−Ｏ（図１１）の中心近くに位置する領域と相同であるという観察に基づいてデザインした。２群のＰＣＲ実験は、ペプチド１１に対するセンスプライマーまたはペプチド１に対するアンチセンスプライマーを他方のオリゴヌクレオチドプライマーと対にしたもの、およびラット肝の全ＲＮＡを鋳型として合成した最初の鎖のｃＤＮＡを用いて実施した。鋳型の溶融工程（９４℃で５分）から開始して、増幅は、ジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）ＴＭＤＮＡ増幅試薬キットを用いて、アンプリタック（ＡｍｐｌｉＴａｑ）ＴＭＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー・シータス製）とともに、９４℃で１分、３７℃で１分、７２℃で２分のサイクルを３５回行い最後に延長工程（７２℃で１５分）で終了した。幾つかのｃＤＮＡフラグメントをこれらのＰＣＲ反応で作製した。ペプチド１１とペプチド１はアミノ酸の連続した一続きを示していると仮定して、また別のＰＣＲ実験セットを、特異的ｃＤＮＡフラグメントを同定するためにネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）プライマー法（Ｋ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓ  ＆  Ｆ．  Ｆａｌｏｏｎａ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５５：３３５−３５０（１９８７））を用いて実施した。この方法を用いて、特異的なｃＤＮＡフラグメント、１１センス−１４アンチセンス（１１ｓ−１４ａｓ）が識別された。この１１ｓ−１４ａｓｃＤＮＡフラグメントをブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）  プラスミド（  ストラテジーン製）でサブクローニングし、ユニバーサルプライマー（ストラテジンーン製）およびシークェナーゼバージョン（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ）２．０キット（ＵＳＢ）を用いて配列決定した。
【０１０３】
シアリルトランスフェラーゼのクローニング−ファルマシア製のｃＤＮＡ合成キットを用いて、ラット肝ポリ（Ａ）＋ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを構築した（Ｕ．  Ｇｕｂｌｅｒ  ＆  Ｂ．Ｊ．  Ｈｏｆｆｍａｎ，  Ｇｅｎｅ  ２５：２６３−２６９（１９８３））。オリゴ（ｄＴ）をプライマーとしてｃＤＮＡを合成し、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩリンカーに連結した。続いてｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ切断λｇｔ１０ＤＮＡ（プロメガ製）に連結した。ＤＮＡパッケージング抽出物（ストラテジーン）を用いてインビトロパッケージングを実施した後、ファージを宿主株、大腸菌Ｃ６００ｈｆｌ−（プロメガ）上に播種した。約１００万個のプラークを１１ｓ−１４ａｓｃＤＮＡプローブでスクリーニングした（Ｕ．  Ｇｕｂｌｅｒ  ＆  Ｂ．Ｊ．  Ｈｏｆｆｍａｎ，  Ｇｅｎｅ  ２５：２６３−２６９（１９８３））。２個の陽性ファージをプラーク精製し、配列決定のためにブルースクリプトプラスミドベクター（ストラテジーン）でサブクローニングした。
【０１０４】
ｃＤＮＡクローンの単離−デイホッフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）の蛋白データベースを用いて、既知の蛋白との相同性についてペプチド配列をスクリーニングした。この調査はα２，３−Ｎおよび他のクローン化シアリルトランスフェラーゼとの間の相同性の最初の証拠を提供した。この分析から、ペプチド１１（表２）は、ラットおよびヒトβ−ガラクトシドａ−２，６−シアリルトランスフェラーゼの両方（これら２つの酵素は８８％保存されている：  Ｔ．Ｊ．  Ｇｕら、ＦＥＢＳ  ２７５：８３−８６（１９９０）；  Ｐ．Ｌａｎｃｅ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １６４：２２５−２３２（１９８９））に存在する配列と相同であることが分かった。この分析をブタα２，３−Ｏ（別の新たなペプチド）にまで広げたとき、ペプチド１（表２）は両方のクローン化シアリルトランスフェラーゼの配列と相同であることが分かった。先にクローン化シアリルトランスフェラーゼに存在する配列とこれらのペプチドとの整列比較によって、これら２つのペプチドは、トリプシン消化の間に切断される連続した一続きのアミノ酸を表していることが提唱された（図１１）。
【０１０５】
【表２】
2007020587.tif 000003
【０１０６】
ペプチド１１とペプチド１は、他の２つのクローン化シアリルトランスフェラ
ーゼの中心の保存相同領域として以前に識別された配列と相同性を示すということを認識することによって、本発明者らのクローニングによる攻略方法の基礎が得られた（図１１）。ペプチド１１とペプチド１はこの蛋白の中心部近くに存在するかもしれないと、本発明者らは仮定し、そこで長いｃＤＮＡプローブを作製するべくＰＣＲ実験をデザインした。１４シアリルトランスフェラーゼペプチドのアミノ酸配列に基づき、センスおよびアンチセンスの両方の縮退オリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲ実験に使用するために合成した。これらの実験ではプライマー１１センスおよび１アンチセンスは他のプライマーと対にし、α２，３−Ｎの長いｃＤＮＡフラグメントを増幅させることを試みた。これらの実験ではいくつかのｃＤＮＡフラグメントが増幅された。ペプチド１１とペプチド１は連続した一続きのアミノ酸を表していると仮定して、プライマー１１およびプライマー１を続いてネスティッドプライマー法（Ｋ．Ｂ．  Ｍｕｌｌｉｓ  ＆  Ｆ．  Ｆａｌｏｏｎａ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５５：３３５−３５０（１９８７））に用いて、特異的ｃＤＮＡフラグメントを同定した。プライマー１１センスおよび１４アンチセンスを用いて増幅させたフラグメントは、１センスおよび１４アンチセンスプライマーを用いて増幅させたフラグメントと殆ど同じ大きさで、このことは、生成されたフラグメントはプライマーによるアニーリングの結果で、人工産物ではないことを示唆している。
【０１０７】
１１センス−１４アンチセンスフラグメントのクローニングおよび性状決定によって、ペプチド１１と１は実際連続していることが分かった。このｃＤＮＡフラグメントの配列と２つのクローン化シアリルトランスフェラーゼとの比較によって、この相同性はペプチド１から伸長し、１８アミノ酸まで広がることが分かった。その相同性の故に、本発明者らは、１１ｓ−１４ａｓｃＤＮＡフラグメントはシアリルトランスフェラーゼｍＲＮＡから増幅されたと確信した。この配列はまた、このｃＤＮＡフラグメントは、ラット肝に豊富なＧａｌｂ１，４ＧｌｃＮＡｃα２、６−シアリルトランスフェラーゼのフラグメントではないことを示した（Ｊ．  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５７：１３８３５−１３８４４（１９８２））。
【０１０８】
１１センス−１４アンチセンスフラグメントを用いて、オリゴｄＴをプライマーとしてラット肝ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、スクリーニングした１００万個の中から２つの陽性クローンが得られた。陽性クローンの特性を明らかにすることによって、クローンＳＴ３Ｎ−１は２．１ｋｂの挿入物を含み、一方、クローンＳＴ３Ｎ−２は極めて短く、長さはわずか１．５ｋｂであることが分かった。ノザン分析によって、Ｇａｌα２，３−ＳＴｍＲＮＡは２．５ｋｂ（下記参照）であることを示唆されたが、このことは、ＳＴ３Ｎ−１はＧａｌα２，３−ＳＴの完全なコード配列を含むかもしれない可能性を示している。
【０１０９】
α２、３−Ｎシアリルトランスフェラーゼの一次構造−配列分析によって、クローンＳＴ３Ｎ−１はシアリルトランスフェラーゼの完全なオープンリーディングフレームを含んでいることが明らかにされた（図２）。それは、８２ｂｐの５’非翻訳領域、長さが１１２２ｂｐのオープンリーディングフレーム、約１ｋｂの３’非翻訳領域およびポリ（Ａ）尾部から成る。クローンＳＴ３Ｎ−１のオープンリーディングフレームは、予想分子量４２０３３の３７４アミノ酸蛋白をコードする。ただ１つのアミノ酸の違いを除けば、このオープンリーディングフレームは、精製シアリルトランスフェラーゼの質量分析から得られた１４ペプチド配列の全てをコードする。このことは、クローンＳＴ３Ｎ−１のｃＤＮＡは確かにシアリルトランスフェラーゼのそれであるということを立証する。他のクローン化グリコシルトランスフェラーゼで観察されたように（Ｊ．Ｃ．  Ｐａｕｌｓｏｎ  ＆  Ｋ．Ｊ．  Ｃｏｌｌｅｙ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４：１７６１５−１７６１８（１９８９））、α２，３−Ｎは、短いＮ−末端細胞質尾部、約２０残基のシグナルアンカー配列、および酵素の触媒ドメインを含む大型のＣ−末端領域を有することが予想される。
【実施例６】
【０１１０】
実施例６
可溶性ラットシアリルトランスフェラーゼの発現
酵素的性状を明らかにするためにシアリルトランスフェラーゼの可溶形を製造する目的で、この酵素の触媒ドメインおよびインスリンの切断可能シグナル配列を含む融合蛋白を、哺乳類発現ベクターｐＳＶＬ（ファルマシア）で構築した。特に、シアリルトランスフェラーゼの触媒ドメインを、膜通過ドメインの下流、＋１８２位（図１１）の５’プライマー、およびポリＡ付加部位の上流３’ＵＴＲに位置する３’プライマーを用いてＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ反応は、５５℃のアニーリング温度で上記に述べたように実施した。ＰＣＲ生成物をｐＧＩＲ−１９９（Ｋ．  Ｄｒｉｃｋａｍｅｒより分与）のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位でサブクローニングし、ｐＧＩＲベクターに存在するインスリンシグナル配列とインフレームのシアリルトランスフェラーゼとの融合が得られた（Ｅ．Ｃ．  Ｈｕｓｅｈら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６１：４９４０−４９４７（１９８６））。得られた融合蛋白を発現ベクターｐＳＶＬのＸｂａＩ−ＳｍａＩ部位に挿入し、プラスミドｐＢＤ１２２を生じた。
【０１１１】
ＣＯＳ−１細胞での一時的発現のために、この発現プラスミドｐＢＤ１２２（２０ｍｇ）を、１００ｍｍプレートのＣＯＳ−１細胞に製造元（ＢＲＬ）の推奨にしたがってリポフェクチンを用いてトランスフェクトした。４８時間後、細胞培養液を採取し、セントリコン１０微量濃縮装置を用いて濃縮した。濃縮培養液を、受容体基質としてオリゴ糖を用いてシアリルトランスフェラーゼ活性を測定した。オリゴ糖へのシアル酸の転移は、イオン交換クロマトグラフィーを用いてモニターした（Ｊ．Ｅ．  Ｓａｄｌｅｒら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５４：５９３４−５９４１（１９７９）；  Ｊ．Ｃ．  Ｐａｕｌｓｏｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４：１０９３１−１０９３４（１９８９））。
【０１１２】
クローンＳＴ３Ｎ−１はα２，３−Ｎシアリルトランスフェラーゼをコードしないことを示すために、このクローンをＣＯＳ−１細胞で発現させてみた。クローンＳＴ３Ｎ−１のアミノ酸配列は、この蛋白が、細胞内のゴルジ装置に酵素を付着させると推定されているＮＨ2−末端シグナル−アンカー配列を含むことを示した（Ｊ．Ｃ．  Ｐａｕｌｓｏｎ  ＆  Ｋ．Ｊ．  Ｃｏｌｌｅｙ，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６４：１７６１５−１７６１８（１９８９））。この酵素の機能分析を容易にするために、発現時に細胞から分泌される可溶形酵素を産生させることが望まれた。シアリルトランスフェラーゼのＮＨ2−末端のシグナル−アンカー配列を置換するために、切断可能インスリンシグナル配列を用いて融合蛋白を構築した。発現プラスミドｐＢＤ１２２をＣＯＳ−１細胞で発現させたとき、この酵素は細胞から分泌され、シアリルトランスフェラーゼ活性を示した。
【０１１３】
α２，３−Ｎシアリルトランスフェラーゼの酵素特性は、最初に精製蛋白で決定された（Ｊ．  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５７：１３８４５−１３８５３（１９８２））  。シアリルトランスフェラーゼは、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃのいずれかの配列を含むβ−ガラクトシド受容体を利用することが分かったが、これらの配列はＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃを形成し、これらはしばしば複合型Ｎ−連結オリゴ糖を集結させるために見出される。発現プラスミドｐＢＤ１２２をトランスフェクトした細胞から分泌されるこの酵素は、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃのいずれかの配列を含むβガラクトシド受容体を利用することができた（表２）。親ベクターをトランスフェクトした細胞はそのようなシアリルトランスフェラーゼ活性を分泌しなかった。分泌酵素はまた、アシアロ−α１酸性糖蛋白（ａｓｉａｌｏ−α１  ａｃｉｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）をシアリル付加することができる。このデータは精製α２，３−Ｎの酵素特性と一致する。
【実施例７】
【０１１４】
実施例７
バキュロウイルスでのα２，３−Ｎシアリルトランスフェラーゼの発現
末端四糖類シアリルルイス（ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓx）（Ｓｌｅx：ＳＡ２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ〔α１，３Ｆｕｃ〕）は、Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンのためのリガンドとして同定された。さらにＳＬｅx構造を含む合成オリゴ糖は、セレクチン−リガンド相互作用を阻害する候補物質である。ＳＬｅxの完全な化学合成は技術的、経済的に困難であるが、末端シアル酸およびフコース残基を化学的に合成したコアー糖類に特異的に付着させるグリコシルトランスフェラーゼの使用は、遊離ＳＬｅxの合成を可能にするであろう。α２，３−Ｎシアリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子をラット肝ｃＤＮＡライブラリーからクローニングしたところ、トランスフェクトＣＯＳ−１細胞で発現させたとき特異的α２，３（Ｇａｌβ１，３／４ＧｌｃＮＡｃ）シアリルトランスフェラーゼ活性を有することが示された（Ｗｅｎら、論文準備中）。このポリペプチドの酵素部分をコードする（しかし疎水性シグナル／膜アンカードメインは欠落している）ｃＤＮＡクローンの一部分を前−インスリンシグナル配列に融合させ、可溶性分泌性α２、３ＮＳＴ蛋白をコードするｃＤＮＡを形成した。このｃＤＮＡをバキュロウイルストランスファーベクターでクローニングし、野性型バキュロウイルスＤＮＡの存在下でＳｆ−９昆虫細胞にトランスフェクトするために用いた。α２，３−ＮシアリルトランスフェラーゼｃＤＮＡを含む組換え体ウイルスを単離して精製し、Ｓｆ−９昆虫細胞を感染させるために用いた。感染細胞は大量のα２，３ＮＳＴを培養液中に分泌し、この蛋白をイオン交換クロマトグラフィーで精製した。
【０１１５】
Ｓｆ−９細胞はＡＴＣＣから購入した。ＤＮＡベクターｐＧＩＲ１９９およびｐＢｌｕｅＢａｃは、ポールソン（Ｊ．Ｃ．  Ｐａｕｌｓｏｎ）  およびインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、サンディエゴ、カリフォルニア）からそれぞれ入手した。Ｓｆ−９細胞は、０．３および１．５×１０6細胞／ｍｌの細胞密度でグレース昆虫培養液（０．３３％ラクトアルブミン水解物および０．３３％イーストレートを補充（ギブコ（グランドアイランド、ニューヨーク）より入手））プラス１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、レネキサ、カンザス）中でスピンナー培養で増殖させた。この培養液をＧＣＭＳ＋１０％ＦＣＳと呼ぶ。
【０１１６】
α２，３−Ｎシアリルトランスフェラーゼの可溶形を以下のようにして作製した。完全なα２，３−ＮシアリルトランスフェラーゼｍＲＮＡを示すｃＤＮＡをＰＣＲのための鋳型として、さらにアンプリマーとして２種のオリゴヌクレオチドを用いた。これら２種のオリゴヌクレオチドは、この酵素のシグナル／アンカー連合領域の丁度Ｃ−末端位（５’）と、さらに３’非翻訳領域のポリ（Ａ）付加部位の上流（３’）とハイブリダイズする。両オリゴヌクレオチドはその５’末端にＢａｍＨＩ部位（この部位はＰＣＲ産物をｐＧＩＲ１９９のＢａｍＨＩ部位でクローニングすることを可能にする）をコードし、これを前−インスリンシグナル配列とインフレームで融合させた。隣接ＮｈｅＩ部位を遺伝子融合を解き放つために用い、バキュロウイルスポリヘドロンプロモーターの制御下で、バキュロウイルストランスファーベクターｐＢｌｕｅｂａｃでこのｃＤＮＡフラグメントをクローニングした。全ての組換え体ＤＮＡ操作は、酵素の製造元の指示書の推奨する条件下で実施した。ｐＢｌｕｅｂａｃベクターは異なるバキュロウイルスプロモーターの制御下にある大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含んでおり、組み換えを受けこのＤＮＡを取り込んだウイルスは、発色団Ｘ−ｇａｌを青い生成物に変換できる。
【０１１７】
組換え体バキュロウイルスの作製は、製造元の推奨するプロトコルに正確に従いながらＭａｘＢａｃ発現系（インビトロゲン）を用いて実施した。簡単に記せば、プラスミドおよび野性型ウイルスＤＮＡを混合し、リン酸カルシウム法によってＳｆ−９細胞をトランスフェクトするために用いた。ウイルスはトランスフェクト細胞から産生され、培養液中に放出された。組換え体ウイルスは、１５０μｇ／ｍｌの濃度でプラーク培地に含まれるＸ−ｇａｌに対するβ−ガラクトシダーゼの作用によって生じる青色によるプラークアッセーで同定され、さらに、希釈／プラーク形成を繰り返すことによって野性型ウイルスから精製した。精製されたウィルスは、５００ｍｌの新鮮なＳｆ−９細胞の感染により増やされた。α２，３−Ｎシアリルトランスフェラーゼの感染細胞培養液中への分泌をもたらす能力について、幾つかのクローンを、下記に述べるようにシアリルトランスフェラーゼ放射能アッセーで適量の培養液を直接検査することによって調べた。
【０１１８】
大量のウイルスを増殖させるために、５ｍｌのＧＣＭＳ＋１０％ＦＣＳの入った２５ｃｍ2の組織培養フラスコ中の３×１０6Ｓｆ−９細胞を、野性型を含まないただ１個の青色プラークで感染させ、さらに２７℃で５−７日間増殖させた。得られた５ｍｌのウイルスストックを遠心で清澄にし、さらに増殖させた。５ｍｌのストック中のウイルス力価は１×１０8プラーク形成単位（ｐｆｕ）であると仮定して、１×１０7細胞／ｍｌの細胞濃度に対して感染多重度（ｍｏｉ）１で増殖期のＳｆ−９細胞（０．５−１．５×１０6細胞／ｍｌ）を感染させた。細胞をＧＣＭＳ＋１０％ＦＣＳで１０倍希釈し、２７℃で５−７日間増殖させた。得られたウイルスを清澄にし、プラークアッセーでウイルス力価を求めた。通常は、１０9ｐｆｕ／ｍｌより高かった。α２，３−Ｎシアリルトランスフェラーゼを発現させるために、増殖期の２．５×１０9Ｓｆ−９細胞をテントレーセルファクター（ＣＦ−１０と呼ぶ）（Ｎｕｎｃ、ナッパビル、イリノイ）の各層に播種した。各ＣＦ−１０の全増殖面積は６０００ｃｍ2で、細胞は３００ｍｌの容量でｍｏｉ＝５の組換え体バキュロウイルスで感染させた。１時間のインキュベーション後、１リットルのエクセル−４００（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（血清非含有培養液）を加え２７℃で７２時間細胞をインキュベーションした。培養液を採取し、清澄にしてさらに０．２μｍのフィルターユニットで濾過した。新しい培養液（２％ウシ胎児血清補充エクセル４００）を加え、さらに４８時間２７℃で細胞をインキュベーションした。培養液を採取し、清澄にし濾過した。
【０１１９】
α２，３−Ｎシアリルトランスフェラーゼ活性を、改造した文献記載のアッセー（Ｓａｄｌｅｒら、（１９７９））を用いて調べた。３０μｌの容量で、１４μｌのサンプルに３．５μｌのラクト−Ｎ−テトロース（Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ）および下記のアッセーミックス１２．５μｌを混合した。サンプルを簡単に混合し、反応管の底を上にして１回転させ、３７℃で１０分インキュベーションした。続いて直ちに反応物を５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６）の１ｍｌで希釈し、０．５ｍｌのイオン交換カラムに添加した。カラムを通過させ、１ｍｌの洗浄液をシンチレーション管に採取し計測した。１単位は、１分間に１マイクロモルのシアル酸を受容体に転移させるために必要な酵素量と規定される。
【０１２０】
反応動態が直線範囲に保たれるよう（カラムからの排出は約１００００ｃｐｍ）、サンプルは清澄上清または希釈上清のいずれかから成る。アッセーミックスは、０．６５ｍｌ（５０μＣｉ）の〔14Ｃ〕−ＣＭＰ−シアル酸（ＮＥＮ、ボストン、マサチューセッツ）を乾燥させ、２．３ｍｇのＣＭＰ−シアル酸を含む水０．６５ｍｌに再懸濁させて調製した。これに、カコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）の１Ｍ溶液の０．９６、０．４８ｍｌの２０％トリトンＣＦ−５４、０．２９ｍｌのウシ血清アルブミン溶液（５０ｍｇ／ｍｌ）（以上全てシグマより、セントルイス、ミズーリー）、さらに水を加えて全量を８ｍｌとする。アッセーミックスの比活性を求め、適量ずつに分け−２０℃で保存した。使用したイオン交換樹脂は、ＡＧ１−Ｘ８、２００−４００メッシュ、リン酸型（バイオラッド、リッチモンド、カリフォルニア）である。
【０１２１】
α２，３−Ｎシアリルトランスフェラーゼの濃縮と精製−α２，３ＮＳＴを含む培養液（１−３リットル）を濾過し、Ｓ１Ｙ１０カートリッジを搭載したアミコンＣＨ２ＰＲＳ螺旋カートリッジシステムで約２５０ｍｌに濃縮した。続いてこのユニットをダイアフィルトレーションモードで作動させ、３倍量の１０ｍＭカコジル酸、２５ｍＭのＮａＣｌ、２５％グリセロール（ｐＨ５．３）（緩衝液Ａ）とともに濃縮上清を脱塩した。続いて、緩衝液Ａで平衡化したＳ−セファロースファーストフロー（ファルマシア）のカラム（２．５×１７ｃｍ）に、流速２ｍｌ／分でサンプルを加えた。全てのサンプルを添加し終えてから、カラム流出液のＯＤ280が基線に戻るまで、緩衝液Ａでカラムを洗浄した（１．６カラム容積）。続いて、５０ｍＭカコジル酸、１ＭのＮａＣｌ、２５５グリセロール（ｐＨ６．５）でα２，３ＮＳＴをカラムから溶出させた。α２，３ＮＳＴを含む分画を集め、１リットルの５０ｍＭカコジル酸、０．５モルのＮａＣｌ、５０％グリセロール（ｐＨ６．０）に対して一晩透析し、−８０℃で保存した。
【実施例８】
【０１２２】
実施例８
ラットα２，３−Ｎシアリルトランスフェラーゼの組織分布
クローン化ラットシアリルトランスフェラーゼの組織分布の状態を調べるために、全ＲＮＡを種々のラット組織から分離し、シアリルトランスフェラーゼの32Ｐ標識ｃＤＮＡで調べた。〜２．５ｋｂのｍＲＮＡに対するハイブリダイゼーションは調べた全ての組織で認められた。２つのシアリルトランスフェラーゼクローンで認められたように、α２，３−Ｎシアリルトランスフェラーゼは、ラットの組織で弁別的な発現を見せた。最高レベルのα２，３−ＮシアリルトランスフェラーゼｍＲＮＡは脳で観察された。肝、腎、結腸、心、卵巣および肺は中間レベルのメッセージを発現し、一方、下顎腺、脾、腸では低レベルのｍＲＮＡが認められた。対照的に、最高レベルのＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃα２，６−シアリルトランスフェラーゼｍＲＮＡ（４．７および４．３ｋｂ、４１、４６）はラット肝および下顎腺で認められ、一方、低レベルのｍＲＮＡは心、卵巣および脳で認められた。
【実施例９】
【０１２３】
実施例９
触媒ドメインの保存相同領域
シアリルトランスフェラーゼファミリーの保存領域−３つのクローン化シアリルトランスフェラーゼの一次構造の比較によって、広範囲の相同性をもつ領域が明らかになった（図１２）。この領域は、α２，３−Ｎシアリルトランスフェラーゼの残基１５６から残基２１０の５５アミノ酸から成り、３種全ての酵素の間で４２％のアミノ酸同一性と、５８％の保存アミノ酸を有する。この３種全てのシアリルトランスフェラーゼの配列はこの領域以外では顕著な相同性はもたない。この相同な領域は酵素の触媒ドメインの中心近くに位置するので、この領域は、これらシアリルトランスフェラーゼの酵素活性について必要な保存構造を表しているのかもしれない。
【０１２４】
グリコシルトランスフェラーゼのシアリルトランスフェラーゼファミリーのうち３種がクローニングされた。クローニングされた３種全てのシアリルトランスフェラーゼの配列で８５％が顕著な相同性をもたないが、各分子の中心の５５アミノ酸領域が高度に保存されており、これはシアリルトランスフェラーゼファミリーの蛋白モチーフを示唆している。蛋白モチーフは、特異的領域におけるよく保存された１群のアミノ酸である。この領域外の他のアミノ酸残基は通常あまり保存されていない。そこで同じモチーフを含む蛋白でも全体的な相同性は低い。この定義によれば、３種のクローン化シアリルトランスフェラーゼの一次構造によって限定される保存領域は、シアリルトランスフェラーゼファミリーのモチーフである。
【０１２５】
蛋白モチーフは、しばしば触媒反応およびリガンド結合に深く関与する（Ｔ．Ｃ．Ｈｏｄｇｍａｎ，  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ａｐｐｌｉｃ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  ５：１−１３（１９８９）；  Ａ．  Ｂａｉｒｏｃｈ，  プロサイト：蛋白の部位とパターンの字引（Ｐｒｏｓｉｔｅ：Ａ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｔｅｓ  ＆  Ｐａｔｔｅｒｎｓ）、第５版、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｖａ  （１９９０）；  Ｍ．Ｊ．Ｅ．  Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：１１１（１９９１））。３種のクローン化シアリルトランスフェラーゼの全てが、末端ガラクトースのα２，３または２，６結合においてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃからシアル酸の転移を触媒し、以下の配列を形成する：
ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，３（４）ＧｌｃＮＡｃ−  （ＳＴ３Ｎ）
ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−        （ＳＴ３Ｏ）
ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−        （ＳＴ６Ｎ）
この３種の酵素は全て共通の機能を有する。保存領域の残基の５０％以上が、電荷を有するアミノ酸または極性アミノ酸のいずれかであり、これら酵素の表面に存在することと矛盾しない。この３種全てのシアリルトランスフェラーゼ間で同一の保存領域に一続きの７個のアミノ酸、Ａｓｐ．Ｖａｌ．Ｇｌｙ．Ｓｅｒ．Ｌｙｓ．Ｔｈｒ．Ｔｈｒ（図１２）が存在することは驚くべきことである。
【実施例１０】
【０１２６】
実施例１０
保存相同領域を用いた新規なシアリルトランスフェラーゼのクローニング
シアリルトランスフェラーゼ遺伝子ファミリーの中の別の遺伝子をクローニングするために保存相同領域を用いた。
【０１２７】
縮退オリゴヌクレオチドによるＰＣＲクローニング−保存相同領域の５’および３’末端に対応する２つの縮退オリゴヌクレオチド（図１３）を合成したＧｅｎｏｓｙｓ）。５’および３’プライマーの配列は、それぞれ５’ＧＧＡＡＧＣＴＴＴＧＳＣＲＮＭＧＳＴＧＹＲＹＣＲＴＣＧＴおよび５’ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＲＧＴＹＴＴＮＳＮＳＣＣＡＣＲＴＣ（Ｎ＝Ａ＋Ｇ＋Ｔ＋Ｃ、Ｓ＝Ｇ＋Ｃ、Ｒ＝Ａ＋Ｇ、Ｍ＝Ａ＋Ｃ、Ｙ＝Ｃ＋Ｔ）である。ＰＣＲ実験は、各プライマー１００ピコモルと、鋳型として新生児ラットの脳から合成した最初の鎖のｃＤＮＡとを用いて実施した。増幅は、９４℃１分、３７℃１分および７２℃２分の３０サイクルで行った。ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ブルースクリプトＫＳ（ストラテジーン、１１０９９  Ｎｏｒｔｈ  Ｔｏｒｒｅｙ  Ｐｉｎｅｓ  Ｒｏａｄ、ラホイヤ、カリフォルニア）のこれらの部位でサブクローニングした。サブクローンはＴ３プライマーを用いた配列決定によって性状を調べた。これらのサブクローンの１つから得た増幅フラグメント、ＳＭ１を、シアリルトランスフェラーゼをコードするＳＭ１含有遺伝子のスクリーニングのために用いた。
【０１２８】
ＳＭ１含有遺伝子のクローニング−任意プライミングで作製した新生児ラット脳ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩリンカーで連結し、続いてその後、ＥｃｏＲＩ消化λｇｔ１０に連結した。生じたライブラリーをストラテジーンギガパックＩＩパッケージング抽出物を用いてパッケージングし、大腸菌Ｃ６００ｈｆｌ上に播種した。クローン化ＳＭ１ＰＣＲフラグメントを用いて、約１０6プラークをスクリーニングした。４個のクローン、ＳＴＸ１−４を精製し、さらに分析するためにブルースクリプト（ストラテジーン）のＮｏｔＩ部位にサブクローニングした。
【０１２９】
ノザン分析−先に記載された酸フェノール工程（Ｐ．  Ｃｈｏｍｏｚｎｓｙｉ，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １６２：１３６−１５９（１９８７））を用いて、ラット組織から全ＲＮＡを抽出した。新生児ＲＮＡサンプルを出生後４日以内の子ラットから単離した。ＲＮＡをホルムアルデヒド含有１％アガロースゲルで電気泳動し、ニトロセルロースに移し以下の標準的工程（Ｍ．  Ｋｒｉｅｇｅｒ，  遺伝子の移入と発現（Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＆  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、ストックトンプレス、ニューヨーク、ニューヨーク（１９９０））でハイブリダイズさせた。ＳＴＸ１から単離したゲル精製放射能標識９００ｂｐＥｃｏＲＩフラグメントを用いてノザンブロットで調べた。
【０１３０】
ＳＴＸの可溶形の構築−オープンリーディングフレームの最初の３１アミノ酸を欠くＳＴＸの短縮形（  “ラットＳＴＸ”とも呼ぶ）を、インフレームのＢａｎＨＩ部位を含む５’プライマーとｓｔｐコドンの５０ｂｐ下流に位置する３’プライマーとを用いてＰＣＲ増幅によって調製した。増幅は、９４℃１分、４５℃１分および７２℃２分の３０サイクルで実施した。融合ベクターｐＧＩＲ２０１ｐｒｏｔＡを、ｐＲＩＴ５（ファルマシアＬＫＢバイオテック社、１０２５  Ａｔｌａｍｔｉｃ  Ａｖｅｎｕｅ，  １０１号室、アラメダ、カリフォルニア  ９４５０１）から単離した、蛋白ＡＩｇＧ結合ドメインをコードするＢｃＩＩ／ＢａｍＨＩフラグメントをｐＧＩＲ２０１（Ｄｒ．  Ｋ．  Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）より分与）のＢａｍＨＩ部位に挿入することによって構築した。増幅フラグメントをｐＧＩＲ２０１ｐｒｏｔＡのＢａｍＨＩ部位でサブクローニングし、ベクターに存在するインスリンシグナル配列と蛋白Ａとに融合したＳＴＸを得た。この融合蛋白を含むＮｈｅフラグメントをプラスミドｐＳＶＬでサブクローニングし、発現プラスミドＡＸ７８を得た。
【０１３１】
ＳＴＸの可溶形の発現−発現プラスミドＡＸ７８（１０μｇ）を１０ｃｍプレートのＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後２日して、培養液を採取し、ＩｇＧセファロース（ファルマシア）とともに室温で１時間インキュベーションした。オリゴ糖、凍結防止糖蛋白、混合ガングリオシドおよび受容体基質としてノイラミニダーゼ処理新生児ラット脳膜を用いて、シアリルトランスフェラーゼ活性についてビーズを調べた。これら受容体へのシアル酸の転移は、イオン交換（Ｊ．  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５７：１３８３５−１３８４４（１９８２））、サイズ排除（ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ，  Ｉｄ）および下降型ペーパークロマトグラフィー（Ｒ．Ｄ．  ＭｃＣｏｙら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６０：１２６９５−１２６９９（１９８５））を用いて測定した。
【０１３２】
全く同じトランスフェクションをパルス−チェース標識実験のために実施した。３６時間の発現時間経過後、プレートを３７℃で２．５ｍｌのＤＭＥＭ−メチオニンとともにインキュベーションした。１時間後、２５０μＣｉの35Ｓ−トランスラベル（アマーシャム、２６３６  Ｓ．  Ｃｌａｉｒｅｂｒｏｏｋ、アーリントンハイツ、イリノイ  ６０００５）を培養液に添加し、プレートをさらに３時間培養した。終了時に、プレートを洗浄し、完全ＤＭＥＭとともに一晩インキュベーションした。標識融合蛋白をＩｇＧセファロース（ファルマシア）とともにインキュベーションすることによって単離した。結合させた後、ビーズを洗浄しレムリー（Ｌａｅｍａｌｌｉ）  サンプル緩衝液中で煮沸し、遊離蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥ／フルオログラフィーで解析した。
【０１３３】
性状決定シアリルトランスフェラーゼで認められた保存相同領域と関連する領域のＰＣＲ増幅−性状を調べたシアリルトランスフェラーゼの保存相同領域に存在するアミノ酸の約７０％が保存されているが、この保存相同領域の末端のアミノ酸配列に最大の連続保存領域が見出される（図１３）。保存相同領域のＣ−末端近くのアミノ酸配列は、連続した７個の不変残基をもつ一続きを含むことが分かっている。このアミノ酸配列の強い保存性は、コドン使用で観察される全てのバリエーションを含む２５６倍の縮退度を用いる比較的複雑性の低いオリゴヌクレオチドのデザインを許容するものであった。保存相同領域のＮ−末端に対応するオリゴヌクレオチドのデザインはより困難であった。この領域に存在するアミノ酸は、保存相同領域の反対側の末端部に見出される変動性よりさらに強い変動性を示す。オリゴヌクレオチドデザインは、アミノ酸の高コドン重複性によってさらに複雑になった。これらの要素を補償するために、保存相同領域の５’末端からのオリゴヌクレオチドは１０２６倍の縮退度で合成した。この程度の複雑度がＰＣＲＥ実験を許容する縮退度の限界に近いので、保存相同領域のこの領域をコードすることが分かったヌクレオチド配列の全てとなる。
【０１３４】
神経系の発生は、細胞表面の炭水化物発現で見出される劇的な変化から明らかなように、グリコシルトランスフェラーゼがダイナミックな調節を受ける複雑な過程である。この理由のために、新規なシアリルトランスフェラーゼを分離しようと起源として新生児ラット脳が選択された。新生児ラット脳ｃＤＮＡを鋳型として用い、縮退プライマーによるＰＣＲ実験の結果１５０ｂｐバンドの増幅が得られたが、これは保存相同領域の既知のサイズと一致する。サブクローニングと配列決定によって、このバンドは２つのＤＮＡフラグメントの混合物であることが明らかにされた。性状が明らかにされた３０個の単離物のうち、５６％は∝保存相同領域をコードし、残りのクローンは固有の保存相同領域、ＳＭ１をコードした。いくらか驚いたことには、ＳＭ１は、先にクローニングされた３つのシアリルトランスフェラーゼで不変であることが分かったアミノ酸で５つの変化を含んでいる。これらの変化が不変残基の総数を減少させる一方で、ＳＭ１の性状が明らかにされることによって提供される新規な配列情報は、共通配列の全体的な保存性を高める。
【０１３５】
ＳＭ１の予想アミノ酸配列は個々の保存相同領域のいずれに対する偏りも示さない。いくつかの位置（アミノ酸１、２、５３、５４）では、ＳＭ１は∝２，６保存相同領域と類似し、他の位置（アミノ酸８、９、５４、５５）では、ＳＭ１は∝２，３保存相同領域で認められる配列を示す。保存相同領域が８５％保存されている一方で、この類似性バランスによって、ＳＭ１はシアリルトランスフェラーゼ遺伝子ファミリーのその他の種類に対して約４５％相同性をもつこととなる。
【０１３６】
ＳＭ１含有遺伝子の一次構造−１．５ｋｂクローンＳＴＸ１の配列解析によって、以前のＰＣＲ実験によって特徴が明らかにされたＳＭ１保存相同領域をコードする、連続した３７５アミノ酸のオープンリーディングフレームが同定された（図１４）。ＳＴＸ１の推定アミノ酸配列によって、この蛋白は、他のクローン化グリコシルトランスフェラーゼの各々で認められたようにＩＩ型膜通過蛋白であることが示唆される。ＳＴＸ１の予想アミノ酸配列は、この蛋白のアミノ末端から８残基の疎水性領域の存在を示唆する。この領域はシグナルアンカードメインとして作用するかもしれない。保存相同領域はこの蛋白の中心近くに位置する。ＳＴＸ蛋白の全体的な大きさ並びに、疎水性領域および保存相同領域の相対位置は、クローン化シアリルトランスフェラーゼの一次配列特性に極めて類似する。ＳＴＸは、この保存相同領域以外では、他のクローン化シアリルトランスフェラーゼとは相同性を示さないが、これら遺伝子の著しい構造類似性は、ＳＴＸが、このシアリルトランスフェラーゼファミリーに属する種類であることを明確にする。
【０１３７】
ＳＴＸの酵素的特性−シアリルトランスフェラーゼの天然に存在する可溶形は、種々の分泌物および体液で見出される（Ｊ．Ｃ．  Ｐａｕｌｓｏｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５２：２３５６−２３６７（１９７７）；  Ｒ．Ｌ．  Ｈｕｄｇｉｎら、Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４９：８２９−８３７（１９７１））。これらの可溶形は、シアリルトランスフェラーゼの幹領域を切断する蛋白分解消化によって膜通過アンカーから触媒ドメインが遊離することにより生じる。可溶性シアリルトランスフェラーゼは、内在性シグナルアンカードメインを切断可能なシグナル配列で置換することにより、組み換えによって構築することができる（Ｋ．Ｊ．  Ｃｏｌｌｅｙら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４：１７６１９−１７６２２（１９８９））  。ＳＴＸの機能解析を容易にするために、最初の３１アミノ酸を切断可能なインスリンシグナル配列と蛋白ＡＩｇＧ結合ドメインとで置換することによって、この蛋白の可溶形を作製した。ＩｇＧ結合ドメインは、可溶性ＳＴＸ蛋白の検出を促進するために構築物に加えた。ＳＴ３Ｎとの同様な融合物が発現細胞から活発に分泌され、ＩｇＧセファロースに結合し、さらに酵素的に活性を有していた。蛋白Ａ／ＳＴＸ融合（ＡＸ７８）を含む発現プラスミドをＣＯＳ−１細胞で発現させたとき、８５ｋｄ蛋白が単離された。この融合蛋白の大きさは、ポリペプチドの予想分子量よりも１５ｋｄ大きく、このことは、多数のＳＴＸ潜在Ｎ−連結グリコシル付加部位が利用されていることを示唆している。
【０１３８】
種々の受容体基質を用いて、結合した融合蛋白をシアリルトランスフェラーゼ活性について分析した。Ｇａｌβ１，３（４）ＧｌｃＮＡｃ配列を含むβ−ガラクトシド受容体を用いたとき活性は検出されず、同様に、凍結防止糖蛋白のＯ−連結オリゴ糖へのシアル酸転移も検出されなかった。脳組織におけるＳＴＸの発現は、この遺伝子は糖脂質の生合成に深く関与している可能性を示唆するが、しかしながら、成獣のウシの脳から分離した混合ガングリオシドは受容体基質として役立たなかった。ノイラミニダーゼ処理新生児脳の膜は、受容体として作用する僅かな能力を示すただ１つの基質であった。処理膜をＳＴＸ融合蛋白とともにインキュベーションしたとき、バックグラウンドに対して５０％の活性増加が得られた。
【０１３９】
ＳＴＸの発生における発現と組織特異的発現−ＳＴＸ遺伝子の発現パターンとメッセージサイズを知るために、ＳＴＸ１から単離した９００ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントをプローブとしてノザンブロットを調べた。調べた種々の組織のうち、５．５ｋｂメッセージのハイブリダイゼーションは新生児ラット脳のＲＮＡでのみ認められた。関連する保存相同領域に対する交差ハイブリダイゼーションは認められなかった。ＳＴＸの限定発現は、性状が明らかにされたシアリルトランスフェラーゼで認められた差別的な組織特異的発現から離脱している。これら遺伝子の各々が独立して調節され、その結果、組織特異的発現の種々のパターンが生じる一方で、各シアリルトランスフェラーゼは、一般的に種々の多くの組織で様々に発現される（Ｊ．Ｃ．Ｐａｕｌｓｏｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４：１０９３１−１０９３４（１９８９））。対照的に、ＳＴＸは新生児脳でのみ発現され、その発現は、当該メッセージが新生児腎で検出されなかったので、胎児の現象として一般化できないようである。
【実施例１１】
【０１４０】
実施例１１
ヒトＧａｌβ１，３（４）ＧｌｅＮＡｃ∝２，３−シアリルトランスフェラーゼのクローニングと発現
縮退オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲクローニング−先の実験で明らかになった配列の相同性に基づき、１５０ｂｐの増幅フラグメントが得られることが予想される２つの縮退オリゴヌクレオチドを合成した（Ｇｅｎｏｓｙｓ）。５’および３’プライマーの配列は、それぞれ、５’ＧＧＡＡＧＣＴＴＴＧＳＣＲＮＭＧＳＴＧＹＲＹＣＲＴＣＧＴおよび５’ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＲＧ  ＴＹＴＴＮＳＮＳＣＣＳＡＣＲＴＣ（Ｎ＝Ａ＋Ｇ＋Ｔ＋Ｃ、Ｓ＝Ｇ＋Ｃ、Ｒ＝Ａ＋Ｇ、Ｍ＝Ａ＋Ｃ、Ｙ＝Ｃ＋Ｔ）である。ＰＣＲ増幅のためには、ヒト胎盤全ＲＮＡから合成した最初の鎖のｃＤＮＡを、１００ピコモルの各プライマーと混合した。ｐｆｕポリメラーゼ（ストラテジーン）を用いて３０サイクル（９５℃１分、３７℃１分および７３℃２分）で実施し、生成物をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ブルースクリプトＳＫ（ストラテジーン）のこれらの部位でサブクローニングした。クローンはＴ７プライマーを用いて配列決定した。
【０１４１】
ヒトＳＴ３ＮｃＤＮＡの単離−ランダムにプライムされたヒト胎盤ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩリンカーに連結し、続いてその後ＥｃｏＲＩ消化λＺＡＰＩＩ（ストラテジーン）に連結した。得られたライブラリーをストラテジーンギガパックＩＩパッケージ抽出物を用いてパッケージを行い、大腸菌ＸＬ−１ブルー（ストラテジーン）上に播種した。上記のクローニングしたＰＣＲフラグメントを用いて約１００万個のプラークをスクリーニングした。２つの陽性クローンをプラーク精製し、続いてＲ４０８ヘルパーファージを用いてインビボ切り出しによってブルースクリプトベクター中に切り出した。
【０１４２】
ヒトＳＴ３Ｎの可溶形の構築−ヒトＳＴ３Ｎの短縮形（オープンリーディングフレームの最初の６１アミノ酸を欠く）を、インフレームのＢａｍＨＩ部位を含む５’プライマーと終止コドンの５０ｂｐ下流に位置する３’プライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ反応はｐｆｕポリメラーゼを用いて、９５℃４５秒、５５℃４５秒および７３℃９０秒の３０サイクルで実施した。融合ベクターｐＧＩＲ２０１ｐｒｏｔＡは、ｐＲＩＴ５（ファルマシア）から単離され蛋白ＡＩｇＧ結合ドメインをコードするＢｃＩＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＧＩＲ２０１（ドリッカマー博士より分与）のＢａｍＨＩ部位に挿入することによって構築した。続いて、各ＰＣＲフラグメントをｐＧＩＲ２０１ｐｒｏｔＡのＢａｍＨＩ部位にサブクローニングし、その結果ヒトＳＴ３Ｎをベクター内に存在するインスリンシグナル配列と蛋白Ａに融合させた。その後得られた各融合蛋白を発現ベクターｐＳＶＬに挿入し、発現プラスミドＡ３ＮＨＰを得た。
【０１４３】
シアリルトランスフェラーゼの可溶形の発現と酵素活性の分析−発現プラスミド（１０μｇ）を１００ｍｍプレートのＣＯＳ−１細胞にリポフェクチン（ＢＲＬ）を用いてトランスフェクトした。４８時間後、細胞培養液を採取し、ＩｇＧセファロース（ファルマシア）とともに１時間インキュベーションした。オリゴ糖および受容体基質として糖蛋白を用いてシアリルトランスフェラーゼについてビーズを分析した。基質へのシアル酸の転移は、イオン交換またはセファデックスＧ−５０クロマトグラフィーを用いてモニターした。
【０１４４】
ノザン解析−解析のために、多数の組織のポリ（Ａ）＋ＲＮＡのノザンブロットをクロンテックラボラトリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から購入した。クローンＳＴ３ＮＨＰ１のｃＤＮＡ挿入物をゲル精製し、放射能標識（＞１×１０9ｃｐｍ／ｍｇ）し、プローブとして使用した。
【０１４５】
結果−ヒト胎盤ｃＤＮＡを鋳型として用い、保存領域に対する縮退プライマーによるＰＣＲ実験の結果、１５０ｂｐバンドの増幅が得られ、これを個々のクローンの分析のためにサブクローニングした。５０個のクローンのうちで、配列決定された３個は、ラットＳＴ３Ｎのヒト相同体であることを証明した（実施例４−６参照）。完全なコード配列を得るために、ヒトＳＴ３Ｎ１５０ｂｐフラグメントを用いて、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。２個のハイブリダイズ陽性クローンを単離した。陽性クローンの性状を調べることによって、クローンＳＴ３ＮＨＰ−１は１．３ｋｂ挿入物を含み、一方、クローンＳＴ３ＮＨＰ−２は長さが１．１ｋｂのものを含むことが明らかになった。配列分析は、クローンＳＴ３ＮＨＰ−１はシアリルトランスフェラーゼの完全なオープンリーディングフレームを含むことを明らかにした。それは、１５５塩基対の５’非翻訳領域、長さが１１２５塩基対のオープンリーディングフレームおよび１３塩基対の３’非翻訳領域から成る。図１５は、ＳＴ３ＮＨＰ−１ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームとラットＳＴ３Ｎの対応する部分とのヌクレオチド配列の比較を示す。ＳＴ３ＮＨＰ−１とラットＳＴ３Ｎとの間にはヌクレオチド配列レベルで９１％相同性が、さらに９７％保存性がアミノ酸配列レベルで観察された（図１６）。この違いは、ヒト蛋白の幹領域のただ１つのアミノ酸挿入（Ｇｌｕ）を含む。この挿入は、ヒト∝２，６−シアリルトランスフェラーゼについての同様な発見に匹敵するが、この酵素は、ラットのそれと比較したとき幹領域に３個の新たな付加残基Ｅ−Ｋ−Ｋをコードする。
【０１４６】
発現プラスミド、Ａ３ＮＨＰ（ヒト）をＣＯＳ−１細胞で発現させたとき、シアリルトランスフェラーゼ活性を示す約８０ｋｄの蛋白が各形質転換細胞から分泌された。これら融合蛋白の基質特異性特性を明らかにするために、ＩｇＧセファロースで精製し、表の受容体基質に対するシアリルトランスフェラーゼ活性について分析した。表３に示したように、ヒトおよびラット融合蛋白間で顕著な違いは存在しない。これらの結果は、ヒトＳＴ３Ｎ酵素はラットの酵素と極めて類似していることを示唆している（実施例４−６）。ラットの酵素は専ら１型鎖（Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ）に作用することが分かっており、触媒効果は低いながらも２型鎖（Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）のシアル酸付加もまた触媒することができる。
【０１４７】
【表３】
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【０１４８】
＊活性は、それぞれＬＮＴで得られたものに対する比較である。１型および２型鎖（１４）の両方に対するラットＳＴ３Ｎ動力学的定数は、これらＫｍ値（それぞれ０．１−０．６および２−４ｍＭ）と本質的に異なり、さらに同様な相対的Ｖｍａｘ（それぞれ１．０−１．２および０．８−１．０）を有する。アシアロ−∝1酸性糖蛋白については、この濃度はガラクトース濃度に比較して０．２ｍＭに設定された。
【実施例１２】
【０１４９】
実施例１２
ＳＴ３シアリルトランスフェラーゼのクローニングと発現
縮退オリゴヌクレオチドによるＰＣＲクローニング−先きの実施例で示した配列の相同性に基づいて、先に述べたものと同じ態様で２つの縮退オリゴヌクレオチドを合成した。ＰＣＲ増幅のためには、ヒト胎盤全ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から合成した最初の鎖のｃＤＮＡを、各プライマー１００ピコモルと合わせた。ｐｆｕポリメラーゼ（ストラテジーン）を用い３０サイクル（９５℃１分、３７℃１分、７３℃２分）で実施し、生成物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ブルースクリプトＳＫ（ストラテジーン）のこれらの部位にサブクローニングした。Ｔ７プライマー（ストラテジーン）を用いてこのクローンの配列を決定した。
【０１５０】
ヒトシアリルトランスフェラーゼのクローニング−任意にプライムされたヒト胎盤ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩリンカーに連結し、続いてＥｃｏＲＩ消化λＺＡＰＩＩ（ストラテジーン）に連結した。得られたライブラリーを、ストラテジーンギガパックＩＩパッケージング抽出物を用いてパッケージし、大腸菌ＸＬ−１ブルー（ストラテジーン）上に播種した。約１００万個のプラークを上記のクローン化ＰＣＲフラグメントでスクリーニングした。６個の陽性クローンをプラーク精製し、続いてＲ４０８ヘルパーファージを用いてインビボ切り出しによってブルースクリプトベクター中に切り出した。
【０１５１】
ノザン分析−分析のために多数の組織のポリ（Ａ）＋ＲＮＡのノザンブロットをクロンテックラボラトリーズから購入した。ＳＴ３−１から単離したゲル精製放射能標識（＞１×１０9ｃｐｍ／μｇ）１．３ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントをプローブとして、ブロットを調べた。
【０１５２】
シアリルトランスフェラーゼの可溶形の構築−長型の最初の３９アミノ酸を欠くＳＴ３（またＳＴＺとも呼ばれる）短縮形を、インフレームのＢａｍＨＩ部位を含む５’プライマーおよび終止コドンの下流５０ｂｐに位置する３’プライマーを用いてＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ反応は、ｐｆｕポリメラーゼを用いて９５℃４５秒、５８℃４５秒、７３℃９０秒の３０サイクルで実施した。融合ベクターｐＧＩＲ２０１ｐｒｏｔＡを前述のように構築した（１３、１６）。このＰＣＲフラグメントをｐＧＩＲ２０１ｐｒｏｔＡのＢａｍＨＩ部位にサブクローニングし、ＳＴ３をベクター中に存在するインスリンシグナル配列と蛋白Ａに融合させた。得られた融合蛋白を発現ベクターｐＳＶＬに挿入し、発現プラスミドＡＺ３を得た。
【０１５３】
シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３）の可溶形の発現と酵素活性の分析−発現プラスミド（１０μｇ）を１００ｍｍプレートのＣＯＳ−１細胞に、製造元の推奨にしたがってリポフェクチン（ＢＲＬ）を用いてトランスフェクトした。４８時間して、細胞培養液を集め、セントリコン１０（アミコン製）を用いて超遠心によって濃縮した。オリゴ糖、糖蛋白および受容体基質として糖脂質を用いて、シアリルトランスフェラーゼ活性について濃縮培養液をアッセーした。基質へのシアル酸の転移はイオン交換またはセファデックスＧ−５０クロマトグラフィーを用いてモニターした。
【０１５４】
トランスフェクションＣＯＳ−１細胞のパルスチェース標識−この目的のために同一のトランスフェクションを実施した。４８時間の発現期間経過後に、プレートを５％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含む、Ｍｅｔ非含有ＤＭＥＭ培養液で洗浄し、同じ培養液で１時間培養した。２５０μＣｉ〔35Ｓ〕−Ｍｅｔイクスプレスラベル（Ｄｕ  Ｐｏｎｔ−Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ）を用いて、２．５ｍｌのＭｅｔ非含有培養液中で３時間細胞をパルス標識した。これらの細胞を続いてＰＢＳで洗浄し、さらに５％ウシ胎児血清を含む完全ＤＭＥＭで一晩標識追い出し培養を実施した。続いて、分泌蛋白を含むこの培養液を採取し、ＩｇＧセファロース（ファルマシア）とともにインキュベートした。結合後、ビーズを洗浄し、レマリー（Ｌａｅｍａｌｌｉ）サンプル緩衝液中で煮沸し、遊離蛋白にＳＤＳ−ＰＡＧＥを施しフルオログラフィーで解析した。
【０１５５】
シアリルトランスフェラーゼの連結特異性分析−ＣＯＳ−１細胞で発現させたＳＴ３酵素、ＳＴ３ＮまたはＳＴ６Ｎ酵素をそれぞれ含む濃縮培養液を用いて、ＣＭＰ〔14Ｃ〕ＮｅｕＡｃ（Ｄｕ  Ｐｏｎｔ−Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ）でアシアロ∝1酸性糖蛋白をシアル酸付加した。14Ｃ標識生成物をセファデックスＧ−５０カラムでゲル濾過によって分離し、続いて濃縮し水で洗浄して、セントリコン１０（アミコン）を用いて塩を除去した。このシアル酸付加糖蛋白をニューカッスル病ウイルスのシアリダーゼ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｇｌｙｃｏｓｙｓｔｅｍ製）による消化に付した。この酵素は、ガラクトースもしくはＮ−アセチルガラクトサミンに連結された非還元性末端シアル酸∝２，３、またはシアル酸に連結された∝２，８に対して強い特異性を有する。処理生成物をセファデックスＧ−５０カラムに添加し、溶出液の液体シンチレーション計測によって〔14Ｃ〕ＮｅｕＡｃの遊離をモニターした。
【０１５６】
ＳＴ３の２つの形態の一次構造−ＳＴ３シアリルトランスフェラーゼを含む遺伝子の完全なコード配列を単離するために、ＳＭ３の１５０ｂｐフラグメントを用いて、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。６個のハイブリダイゼーション陽性クローン（ＳＴ３−１〜６）を分離した。陽性クローンの性状を調べることによって、クローンＳＴ３−１は１．８ｋｂの挿入物を、クローンＳＴ３−２、３および４は１．３ｋｂを、クローンＳＴ３−５は１．２ｋｂを、さらにクローンＳＴ３−６は長さが１．１ｋｂの挿入物を含むことが明らかにされた。それらの配列分析によって、ｃＤＮＡは２種の形態、長型および短型として生じ、さらにクローンＳＴ３−１およびＳＴ３−２は、それらの完全なオープンリーディングフレームをそれぞれ含むことが明らかになった。長型（ＳＴ３−１）のアミノ末端配列は、近接した状態で３つのインフレームのＡＴＧコドンを含む。もし最初のＡＴＧコドンが翻訳の開始位置であるならば、たとえ当該ＡＴＧコドンが、そのコドンに対して−３位に存在するピリミジンによる翻訳開始については貧弱な配列状況であるにしても、長型、ＳＴ３−１は、１５９塩基対５’非翻訳領域、長さが９９６塩基対のオープンリーディングフレームおよび約０．６ｋｂの３’非翻訳領域から成る。このクローンのオープンリーディングフレームは、４つの潜在的Ｎ連結グリコシル付加部位をもつ３３２個のアミノ酸をコードする（図１７）。カイト−ドゥーリットル水分析によって、アミノ末端から７残基の位置にある１８個の疎水性残基から成る１個の潜在的膜スパンニング領域が明らかにされた。この構造特性は、この遺伝子は、これまで調べられてきた他のグリコシルトランスフェラーゼ同様、ＩＩ型の膜トポロジーを有し、さらにこのただ１つの疎水性領域は、切断不可のアミノ末端シグナルアンカードメインとして機能することを示唆している。
【０１５７】
他の典型的クローン化シアリルトランスフェラーゼに対する相同性−ＳＴ３と先の実施例の３つのクローン化シアリルトランスフェラーゼとの比較によって、限定的ではあるが明瞭な相同性が明らかにされた（図１８）。ＳＴ３のアミノ酸配列は、触媒ドメインにおいてＳＴ３Ｎのそれと３８％同一性を有する。広範囲な相同性領域は仮定触媒ドメインの中心近くに位置し、この領域の整列比較ではこの配列に幾つかのギャップの導入が必要とされるが、一方、触媒ドメイン全体の他の位置に幾つかの保存的置換が存在する。
【０１５８】
他のクローン化グリコシルトランスフェラーゼとのＳＴ３（ＳＴＺ）の整列比較を図１９に示す。ＳＴＺ蛋白および他の３つのクローン化シアリルトランスフェラーゼの一次構造の比較は、長さが３３２から４０３個のアミノ酸の範囲の４つの酵素の最も短いものを示す（図１９）。モチーフでの印の付いた列は、４つの残基のうち２つ以上で共通である残基を示している。大文字は３つまたは４つの配列で同一であることが分かった配列を示し、小文字は４つの配列のうち２つで見出された残基を示す。この３つのクローン化シアリルトランスフェラーゼはヒトＧａｌβ１，３（４）ＧｌｃＮＡｃα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３Ｎ）、、ブタＧａｌβ１，３（４）ＧｌｃＮＡｃα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３０）およびラットＧａｌβ１，３（４）ＧｌｃＮＡｃα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ６Ｎ）である。他の３つのシアリルトランスフェラーゼ配列の以前の比較によって、高い保存性を有する限定領域が見出され、その結果共通のシアリルモチーフが明らかとなった（Ｄ．Ｘ．  Ｗｅｎ，  Ｂ．Ｄ．  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｋ．Ｆ．  Ｍｅｄｚｉｈｒａｄｚｋｙ，  Ｓ．  Ｋｅｌｍ，  Ａ．Ｌ．  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ  ＆  Ｊ．Ｃ．  Ｐａｕｌｓｏｎ（１９９２）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７：２１０１１−２１０１９；  Ｋ．  Ｄｒｉｃｋａｍａｅｒ（１９９３）、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３：２−３；  Ｂ．Ｄ．  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ  ＆  Ｊ．Ｃ．  Ｐａｕｌｓｔｏｎ（１９９３）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８：１１５０４−１１５０７  ）。ドリッカマーの文献（Ｋ．  Ｄｒｉｃｋａｍａｅｒ（１９９３）、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３：２−３）に従いながら、さらに１２ギャップを導入してそれらの配列の整列比較をさらに最適化することによって、以前には認められなかった広範囲の配列相同性が明らかとなった（図１９）。実際、比較のために整列させた蛋白によって、７２個の位置で３つまたはそれ以上の配列において、さらに１８０個の位置で２つまたはそれ以上の配列において同一性が明らかとなった。他の３つの配列に対してＳＴＺの最高の相同性は、ＳＴ３Ｎの整列比較配列全体にわたって３５％同一性を有するＳＴ３Ｎの配列で認められた。
【０１５９】
これらの観察は、これらの遺伝子は、全体的な構造において以前に認識されたものよりももっと多く保存されていることを示唆している。
【０１６０】
ＳＴ３の可溶形の発現とその酵素的特性−ＳＴ３の機能分析を容易にするために、発現されたときに細胞から分泌される可溶形酵素を製造することが所望された。この蛋白の可溶形は、最初の３９アミノ酸を切断可能なインスリンシグナル配列とプロテインＡＩｇＧ結合ドメインとで置換することによって作製した。プロテインＡ／ＳＴ３融合（ＡＺ３）を含む発現プラスミドをＣＯＳ−１細胞で発現させたとき、約８０ｋｄ蛋白が分泌された。融合蛋白のサイズは、このペプチドの予想分子量より約１５ｋｄ大きく、このことは、多数のＳＴ３潜在Ｎ連結グリコシル付加部位が利用されていることを示唆している。
【０１６１】
この融合蛋白の基質特異性の特性を調べるために、表４に示したように種々の受容体基質を用いてＡＺ３をトランスフェクションさせた細胞から得た培養液を調べた。それを他の２つのクローン化∝２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３ＮおよびＳＴ３Ｏ）のそれと比較するために、先の実施例で述べたように各発現プラスミドを用いて同じ実験を実施した。
【０１６２】
【表４】
2007020587.tif 000005
【０１６３】
表４に示したように、シアル酸は、ＳＴ３酵素によって凍結防止糖蛋白、アシアロ−フェツインおよびアシアロ−∝1−酸性糖蛋白中に取り込まれたが、一方、ヒツジの下顎腺アシアロ−ムチンは受容体にはならなかった。さらに、調べた他のいずれの糖蛋白（完全なフェツインおよび∝1−糖蛋白（結果は示さず）を含む）でも顕著な量のシアル酸取り込みはなかった。これらのうちで、アシアロ−フェツインは最良の受容体で、これはＧａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃおよびＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ配列の両方を含んでいる。アシアロ−ムチン中に取り込まれる少量のシアル酸さえ、少量のＧａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ構造を含むそのオリゴ糖の微量異種成分によって生じたものと言える。対照的に、ＳＴ３Ｏ酵素は、糖蛋白のＧａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ配列に極めて特異的で、ＳＴ３Ｎ酵素は、低い効率とはいえＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ末端をもつ受容体に作用する。
【０１６４】
糖脂質を受容体基質として用いたとき、ＳＴ３酵素に対する好ましい糖脂質は、ＧM1をもつアシアロ−ＧM1および、その程度は低下するが基質としてまた作用するラクト−ネオテトラオシルセラミド（ｎＬｃ4）である（表４）。さらに、低いけれども明瞭な取り込みはラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）でもまた認められた。対照的に、ＳＴ３Ｏ酵素は、アシアロ−ＧM1およびＧM1に良好に作用し、一方、全ての糖脂質、ラクト−ネオテトラオシルセラミドでさえＳＴ３Ｎ酵素にとって極めて貧弱な受容体である。
【０１６５】
ＳＴ３酵素の連結特異性−ＳＴ３酵素はＧａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃおよびＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ配列を利用し、それらの２，３シアリル付加オリゴ糖は受容体基質として役立たないので、この酵素は∝２，３−シアリルトランスフェラーゼであると考えられる。ＳＴ３酵素によって形成される生成物の連結特異性を確認するために、ニューカッスル病ウイルスシアリダーゼを用いた。この酵素は、ＮｅｕＡｃ∝２，６ＧａｌおよびＮｅｕＡｃ∝２，６ＧａｌＮＡｃ連結を含むオリゴ糖が無傷のまま残る条件下で、アスパラギンにＮ−連結された糖蛋白オリゴ糖およびスレオニンまたはセリンにＯー連結された糖蛋白オリゴ糖の両方に含まれるＮｅｕＡｃ∝２，３Ｇａｌ連結の加水分解について厳密な特異性を示すことが知られている。各〔14Ｃ〕ＮｅｕＡｃ標識∝1−酸性糖蛋白を、それぞれＳＴ３、ＳＴ３ＮおよびＳＴ６Ｎ酵素を用いてアシアロ−誘導体から生成した。続いて、これらの標識生成物をニューカッスル病ウイルスのシアリダーゼで加水分解した。全〔14Ｃ〕ＮｅｕＡｃの８３％、８２％および０％が、ＳＴ３、ＳＴ３ＮおよびＳＴ６Ｎ生成物からそれぞれ遊離された。この結果は、ＳＴ３酵素によって形成されたシアリル付加生成物はＮｅｕＡｃ∝２，３Ｇａｌ連結を有し、したがってＳＴ３酵素はβ−ガラクトシド∝２、３−シアリルトランスフェラーゼであることを示している。
【実施例１３】
【０１６６】
実施例１３
ヒトＳＴ３Ｏシアリルトランスフェラーゼのクローニングと発現
ヒトＧａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα２，３−シアリルトランスフェラーゼヒトＳＴ３Ｏ遺伝子シアリルモチーフのＰＣＲクローニング−保存シアリルモチーフの配列情報に基づいて、２つの縮退オリゴヌクレオチドを合成した（Ｇｅｎｏｓｉｓ）。これは、１５０ｂｐ増幅フラグメントを生じるであろうと予想された。５’および３’配列は、それぞれ５’ＧＧＡＡＧＣＴＴＴＧＳＣＲＮＭＧＳＴＧＹＲＹＣＲＴＣＧＴおよび５’ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＲＧＴＹＴＴＮＳＮＳＣＣＳＡＣＲＴＣ（Ｎ＝Ａ＋Ｇ＋Ｔ＋Ｃ、Ｓ＝Ｇ＋Ｃ、Ｒ＝Ａ＋Ｇ、Ｍ＝Ａ＋Ｃ、Ｙ＝Ｃ＋Ｔ）であった。ＰＣＲ増幅では、ヒト胎盤またはヒト胎児脳の全ＲＮＡ（クロンテック）から合成された最初の鎖のｃＤＮＡを、１００ピコモルの各プライマーと合わせた。ｐｆｕポリメラーゼを用いて３０サイクル（９５℃１分、３７℃１分、７３℃２分）実施し、生成物をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して、ブルースクリプトＳＫ（ストラテジーン）のこれらの部位でサブクローニングした。ヒト胎盤から得られた５０個のクローンをＴ７プライマー（ストラテジーン）を用いて配列決定し、ブタの配列との相同性の判定によって、これらの８クローンはヒトＳＴ３Ｏシアリルモチーフを含んでいると判定した。
【０１６７】
ヒトＳＴ３ＯシアリルトランスフェラーゼｃＤＮＡのクローニング−ランダムにプライムされたヒト胎盤ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩリンカーに連結し、続いてＥｃｏＲＩ消化λＺＡＰＩＩ（ストラテジーン）に連結した。得られたライブラリーをストラテジーンギガパックＩＩパッケージング抽出物を用いてパッケージし、大腸菌ＸＬ−１ブルー（ストラテジーン）上に播種した。約１００万個のプラークを上記のクローン化ＰＣＲフラグメントでスクリーニングした。４個の陽性クローン（ｈＳＴ３Ｏ−１〜４）をプラーク精製し、続いて、Ｒ４０８ヘルパーファージを用いてインビボ切り出しによってブルースクリプトベクターに切り出した。陽性クローンの特性を明らかにすることによって、クローンｈＳＴ３Ｏ−１は３．０ｋｂ挿入物を、クローンｈＳＴ３Ｏ−２は２．７ｋｂ、クローンｈＳＴ３Ｏ−３は２．２ｋｂ、さらに、クローンｈＳＴ３Ｏ−４は長さが２．２ｋｂ挿入物を含むことが明らかにされた。配列分析によって、これらｃＤＮＡは、その５’末端が異なる２つの型をもつことが明らかになった。ｈＳＴ３ＯｃＤＮＡの２つの型の完全なコード配列は、ｈＳＴ３Ｏ−１（長い）およびｈＳＴ３Ｏ−２（短い）のｃＤＮＡ挿入物に含まれ、その各々は同一の蛋白配列をコードし、その５’非翻訳配列のみに違いが存在した。特に、短型のヌクレオチド配列はヌクレオチド−１５３からヌクレオチド−３７の欠失を有し（図２０）、おそらくこれは、それがコンセンサススプライス部位と境を接するためにまた別のスプライシングが生じたためであろう。もっとも大きなクローン、ｈＳＴ３Ｏ−１（３ｋｂ）は、約０．９ｋｂの５’非翻訳領域、長さが１０２３塩基対のオープンリーディングフレーム、約１．１ｋｂの３’非翻訳領域から成る。
【０１６８】
可溶形ヒトＳＴ３Ｏの構築−オープンリーディングフレームの最初の４４アミノ酸を欠くヒトＳＴ３Ｏの短縮形を、インフレームのＢａｍＨＩ部位を含む５’プライマー（５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＡＧＣＴＣＴＣＣＧＡＧＡＡＣＣＴＧＡＡ）およびＥｃｏＲＩ部位をもつ終止コドンの下流５０ｂｐに位置する３’プライマー（５’ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＧＡＡＡＴＧＣＡＧＡＧ）によって増幅させた。ＰＣＲ反応はｐｆｕポリメラーゼを用いて、３０サイクル（９５℃４５秒、５５℃４５秒、７３℃９０秒）で実施した。このＰＣＲ精製物をｐＧＩＲ１９９（Ｋ．ドリッカマー博士（コロンビア大学）より分与）のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位でサブクローニングし、ｐＧＩＲベクターに存在するインスリンシグナル配列とシアリルトランスフェラーゼのインフレーム融合物を得た。得られた融合蛋白を含むｃＤＮＡをｐＧＩＲ構築物から切り出し、発現ベクターｐＳＶＬのＸｂａｌ−ＳｍａＩ部位に挿入し、発現プラスミドＩ３ＯＨＰを得た。
【０１６９】
可溶形シアリルトランスフェラーゼの発現と酵素活性の分析−製造元の推奨にしたがってリポフェクチン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）を使用し、発現プラスミド（１０μｇ）を１００ｍｍプレートのＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトした。４８時間後、細胞培養液を集め、α２、３−シアリルトランスフェラーゼ活性測定のためにセントリコン１０（アミコン）を用いて超遠心によって約１０倍に濃縮した。活性は、受容体基質として二糖類（Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃおよびＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）、糖蛋白、凍結防止糖蛋白）（Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα−Ｏ−Ｔｈｒ）および糖脂質、アシアロ−ＧＭ１およびＧＭ１を用いて求めた。各基質へのシアル酸の転移は、先に記載されたように（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５：１３８３５−１３８４４（１９８２））イオン交換（二糖類）またはセファデックスＧ−５０クロマトグラフィーを用いてモニターした。
【０１７０】
結果：ヒトＧａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ｈＳＴ３Ｏ）ｃＤＮＡのクローニングと発現−上記で述べたように、ヒトＧａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ｈＳＴ３Ｏ）のｃＤＮＡをＰＣＲ法によってクローニングし、保存シアリルモチーフをコードするｃＤＮＡフラグメントを得た。続いてヒト胎盤由来の標準ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。図２０は、ｈＳＴ３Ｏのヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列を示す。ブタＳＴ３Ｏ配列との比較によって、予想コード領域にはヌクレオチド配列レベルで８４％相同性、アミノ酸配列レベルで８６％保存性が存在することが示された。ヒト蛋白における違いは、細胞質尾部のただ１つのアミノ酸の欠失および幹領域の２つのアミノ酸の欠失を含む。
【０１７１】
５’および３’非翻訳領域の比較は相対的に低い相同性（５０％未満）を明らかにした。その５’末端が異なる２つのｃＤＮＡをクローニングした（実験方法の項）。２つのｃＤＮＡの長い方は極めて長い（９３０ｂｐ）５’非翻訳領域を有し、これは多数の上流ＡＴＧコドンと上流オープンリーディングフレーム（  “ミニ−シストロン”）を含んでいる。仮定翻訳開始部位から上流に１６個のＡＴＧコドンが存在する。７個はインフレームの終止コドンが直ぐ後に続き、一方、８個は、終止コドンまで１３アミノ酸から４８アミノ酸の範囲の短いオープンリーディングフレームがその後に続く。２つのｃＤＮＡの短い方では１つまたは２つ以上のエクソンが欠落しており、３個の上流ＡＴＧを含む２０３ｂｐをコードする。上流ＡＴＧコドンは強く翻訳を抑制する（Ｋｏｚａｋ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６：１９８６７−１９８７０（１９９１））ので、５’非翻訳領域は、ｈＳＴ３Ｏ遺伝子発現の翻訳制御に重要な役割を果たすかもしれない。
【０１７２】
ｈＳＴ３ＯｃＤＮＡはＧａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα２，３−シアリルトランスフェラーゼをコードし、密接に関連する蛋白はコードしないことを証明するために、組換え体ヒトＳＴ３Ｏ融合蛋白可溶形を、シアリルトランスフェラーゼの最初の４４アミノ酸を切断可能インスリンシグナル配列（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）で置換することによって作製した。続いて、トランスフェクトＣＯＳ−１細胞で産生されたｈＳＴ３Ｏ蛋白を組換え体ブタＳＴ３Ｏ酵素のそれと比較した。ブタおよびヒトの蛋白の両方の発現プラスミドは、トランスフェクトＣＯＳ−１細胞の培養液中にシアリルトランスフェラーゼ活性を示す約３８０００ダルトンの蛋白を産生した（データは示さず）。それらの基質特異性の性状を明らかにするために、トランスフェクション後４８時間して培養液を採取し濃縮して、受容体基質一覧に対してシアリルトランスフェラーゼ活性についてアッセーした。表５に示したように、非受容体の二糖類（Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）、好ましい受容体配列（Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ）、およびＳＴ３Ｏシアリルトランスフェラーゼとリーらが報告した（１９９４）同様な特異性をもつ相同なネズミの酵素とを区別する２つの受容体基質を含む受容体基質間で認められる顕著な違いは存在しなかった。
【０１７３】
【表５】
2007020587.tif 000006
【実施例１４】
【０１７４】
実施例１４
ヒトＳＴＸのクローニング
ヒトＳＴＸ（ｈＳＴＸ）遺伝子シアリルモチーフのＰＣＲクローニング−保存シアリルモチーフの配列情報に基づいて、１５０ｂｐの増幅フラグメントが得られると予想される、２つの縮退オリゴヌクレオチドを合成した（Ｇｅｎｏｓｉｓ）。５’および３’プライマーは、それぞれ５’ＧＧＡＡＧＣＴＴＴＧＳＣＲＮＭＧＳＴＧＹＲＹＣＲＴＣＧＴおよび５’ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＲＧＴＹＴＴＮＳＮＳＣＣＳＡＣＲＴＣ（Ｎ＝Ａ＋Ｇ＋Ｔ＋Ｃ、Ｓ＝Ｇ＋Ｃ、Ｒ＝Ａ＋Ｇ、Ｍ＝Ａ＋Ｃ、Ｙ＝Ｃ＋Ｔ）であった。ＰＣＲ増幅のためには、ヒト胎盤またはヒト胎児脳の全ＲＮＡ（クロンテック）から合成した最初の鎖ｃＤＮＡを、１００ピコモルの各プライマーと合わせた。ｐｆｕポリラーゼ（ストラテジーン）を用いて３０サイクル（９５℃１分、３７℃１分、７３℃２分）で実施し、生成物をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ブルースクリプトＳＫ（ストラテジーン）のこれらの部位でサブクローニングした。ヒト胎児脳から得られた３０クローンをＴ７プライマーを用いて配列決定した。ラット配列との相同性で判定したとき、それらのうちの１２個がＳＴＸ遺伝子のシアリルモチーフを含んでいた。
【０１７５】
ヒトＳＴＸ（ｈＳＴＸ）ｃＤＮＡのクローニング−ヒトＳＴＸ（ｈＳＴＸ）ｃＤＮＡを、上記のようにして得た１５０ｂｐ増幅シアリルモチーフの配列情報から得られた５’プライマー（５’ＧＧＣＴＡＴＧＧＧＣＡＧＧＡＧＡＴＴＧＡＣ）、およびラットＳＴＸ配列に由来する３’プライマー（５’ＴＣＣＴＴＡＣＧＴＡＧＣＣＣＣＧＴＣＡＣＡＣＴＴＧＧ）を用い、鋳型としてヒト胎児脳全ＲＮＡ（クロンテック）から逆転写したｃＤＮＡを使ってＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ生成物（０．６２ｂｐ）、ｈＳＴＸをサブクローニングし配列決定した。
【０１７６】
結果：ヒトＳＴＸｃＤＮＡのクローニング−ヒトＳＴＸ（ｈＳＴＸ）遺伝子の部分ｃＤＮＡ（６２０ｂｐ）を実験方法で述べた通り単離した。図２１は、ｈＳＴＸｃＤＮＡのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。ラットＳＴＸ配列との比較によって、ヌクレオチドレベルでは９０％相同性が存在することが示唆された。アミノ酸レベルでは、保存度は９８％である。これは、２種の哺乳動物種間で比較されたシアリルトランスフェラーゼ遺伝子と他のグリコシルトランスフェラーゼとの間で今日までに認められた最高の保存度である。
【０１７７】
【表６】
2007020587.tif 000007
【０１７８】
本発明の代表的な実施例を記載してきたが、本明細書に開示したものは代表例のみであり、その他の種々なる変更、応用、改造が本発明の範囲内において実施可能であることは当業者には理解されよう。したがって、本発明は本明細書で詳述された実施例に限定されないで、むしろ以下の請求の範囲によってのみ制限される。
【０１７９】
（配列表）
2007020587.tif 000008
【０１８０】
2007020587.tif 000009
【０１８１】
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【０１８２】
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【０１８３】
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【０１８４】
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【０１８５】
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【０１８６】
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【０１８７】
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【０１８８】
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【０１８９】
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【０１９０】
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【０１９１】
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【０１９２】
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【０１９３】
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【０１９４】
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【０１９５】
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【０１９６】
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【０１９７】
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【０１９８】
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【０１９９】
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【０２００】
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【０２０１】
2007020587.tif 000030
【図面の簡単な説明】
【０２０２】
【図１】ブタのＧａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα２，３シアリルトランスフェラーゼ（  “α２，３−Ｏ”）。ブタα２，３−０ｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、２個の重複クローンλＳＴ１およびλＳＴ２のＤＮＡ配列分析から決定された。α２，３−０ポリペプチドの予想アミノ酸配列はそのＤＮＡ配列の上部に示し、類似精製蛋白のＮ−末端の最初の残基から番号付けした。仮説シグナルアンカー配列は白枠で表示した。Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒによる潜在的糖付加部位は星印（＊）で示した。この配列は、重複クローンλＳＴ１およびλＳＴ２によってコードされるα２，３シアリルトランスフェラーゼの長形型に一致する。配列番号１および２を参照。
【図２Ａ】ラットＧａｌβ１，３（４）ＧｌｃＮＡｃα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（  “α２，３−Ｎ”）。ラットα２，３−ＮｍＲＮＡのヌクレオチド配列はＤＮＡ配列分析から決定された。シアリルトランスフェラーゼポリペプチドの推定アミノ酸はそのＤＮＡ配列の上部に示し、Ｎ−末端蛋白配列決定にしたがい成熟蛋白の最初の残基から番号付けした。配列番号３および４参照。
【図２Ｂ】図２Ａの続きである。
【図３】ＣＤＰ−ヘキサノルアミンアガロース上でのα２，３−Ｏシアリルトランスフェラーゼの精製（ＫＣ１溶出）。２ｋｇのブタ肝臓由来ホモジネートをＣＤＰ−ヘキサノルアミンアガロースカラムに添加し、ＫＣ１の直線状勾配で溶出させた（実験方法参照）。蛋白濃度および受容体基質としてラクトースを用いるシアリルトランスフェラーゼ活性は、個々の分画について決定した。２つの酵素活性ピークを表示の通りプールＡおよびプールＢに分けた。
【図４Ａ】ＣＤＰ−ヘキサノルアミンアガロース上でのα２，３−Ｏシアリルトランスフェラーゼの精製（カラムＩＩＩ、ＣＤＰ溶出）。酵素活性は、特異的受容体基質凍結防止糖蛋白（ａｎｔｉｆｒｅｅｚｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｏｉｎ（ＡＦＧＰ））を用いて求めた。カラムＡおよびＢで、酵素活性の溶出は、それぞれ４８ｋＤａおよび４５ｋＤａの蛋白種と専ら相関性を示した。これら２つの種、α２，３シアリルトランスフェラーゼの形態Ａおよび形態Ｂは、比活性度が８−１０ユニット／ｍｇ蛋白であった。４８ｋＤａおよび４５ｋＤａ種をＰＶＤＦ膜に移し、ＮＨ2−末端配列決定によって分析した。
【図４Ｂ】ＣＤＰ−ヘキサノルアミンアガロース上でのα２，３−Ｏシアリルトランスフェラーゼの精製（カラムＩＩＩ、ＣＤＰ溶出）。酵素活性は、特異的受容体基質凍結防止糖蛋白（ａｎｔｉｆｒｅｅｚｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｏｉｎ（ＡＦＧＰ））を用いて求めた。カラムＡおよびＢで、酵素活性の溶出は、それぞれ４８ｋＤａおよび４５ｋＤａの蛋白種と専ら相関性を示した。これら２つの種、α２，３シアリルトランスフェラーゼの形態Ａおよび形態Ｂは、比活性度が８−１０ユニット／ｍｇ蛋白であった。４８ｋＤａおよび４５ｋＤａ種をＰＶＤＦ膜に移し、ＮＨ2−末端配列決定によって分析した。
【図５】４８ｋＤａおよび４５ｋＤａα２，３−ＯシアリルトランスフェラーゼペプチドのＮＨ2−末端アミノ酸配列。４８ｋＤａペプチドのＮＨ2−末端近くの推定シグナルアンカードメインを含む１６個の疎水性アミノ酸には下線が付されている。
【図６Ａ】２個のシアリルトランスフェラーゼのドメイン構造および相同領域の比較。Ａ：α２，６シアリルトランスフェラーゼおよびα２，３−Ｏシアリルトランスフェラーゼの一次配列の整列比較は、６４％の配列同一性および８４％の配列相同性をもつ４５個のアミノ酸領域を明らかにした。
【図６Ｂ】２個のシアリルトランスフェラーゼのドメイン構造および相同領域の比較。Ｂ：図６Ａの相同性ドメインはα２，６シアリルトランスフェラーゼのエクソン２および３の間の結合部に広がり、両酵素の触媒ドメイン内に存在する。
【図７】２つのα２，３−ＯシアリルトランスフェラーゼｃＤＮＡクローンの制限地図および配列決定の仕方。
【図８】触媒的に活性な可溶性α２，３−Ｏシアリルトランスフェラーゼ発現。Ａ：α２，３−Ｏシアリルトランスフェラーゼの可溶形の発現を指令するｃＤＮＡ、ｓｐ−ＳＴを野性型シアリルトランスフェラーゼの細胞質ドメインとシグナルアンカードメインをインスリンシグナルペプチドで置き換えることによって構築した。ｓｐ−ＳＴは３８ｋＤａ（宿主細胞にトランスフェクトしたとき分泌される蛋白種）をコードすると予想された。Ｂ：ｓｐ−ＳＴを発現ベクターｐＳＶＬに挿入し、ＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間して、細胞をＴｒａｎ３５Ｓ標識を含む培養液中で２時間パルス標識し、その後標識を含まない培養液で５時間追跡期間をおいた。この培養液を採取し、１５倍に濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／フルオログラフィーで解析した。ｓｐ−ＳＴおよび擬似トランスフェクト細胞の培養液サンプルをそれぞれ２つずつ調べた。Ｃ：ＣＯＳ−１細胞にリポフェクチン（＋ｓｐ−ＳＴ）またはリポフェクチン単独（擬似）を７Ｂと同じ態様でトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間して、培養液を採取し、１５倍に濃縮し、特異的受容体基質ＡＦＧＰとともにシアリルトランスフェラーゼ活性について調べた（Ｊ．Ｅ．  Ｓａｄｌｅｒら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５４：４４３４−４４４３（１９７９））。
【図９】Ｇａｌα２，３−Ｎシアリルトランスフェラーゼ酵素の配列決定された最長トリプシン消化ペプチドのＣＩＤスペクトル。このペプチド配列は、Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ* −Ａｒｇで、ＭＨ+＝１２８３．６である。Ｃｙｓ* はカルボキシメチルシステインを表す。Ｎ−末端で電荷を保持するイオンはａ、ｂ、ｃイオンと表示され、Ｃ−末端イオンはｘ、ｙ、ｚフラグメントと称される（Ｋ．  Ｂｉｅｍａｎｎ，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １９３：８８６−８８７（１９９０））。最初のイオン（ａ、ｘ）は、α炭素とカルボニル基との間の切断産物である。イオンｙおよびｂは、ペプチド結合が切断されたときに形成される。イオンｃおよびｚは、アミノ基とα炭素との間の切断によって存在する。これらのフラグメントの番号付けは、常に対応する末端から開始する。側鎖のフラグメント化はアミノ酸のβおよびγ炭素との間で発生し、いわゆるｄ（Ｎ−末端）およびｗ（Ｃ−末端）イオンが得られる。観察されたフラグメントイオンは表に示す。同じイオンシリーズに属するイオンは並べて表示した。
【図１０】Ｇａｌα２，３−Ｎシアリルトランスフェラーゼ酵素のカルバミル付加トリプシン消化ペプチドのＣＩＤスペクトル。ペプチド配列は、Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＬｙｓでＭＨ+＝７７１．４である。フラグメント化は、リジン残基のε−アミノ基ではなくＮ−末端での修飾を明瞭に示唆した。ｍ／ｚ６６９（ｗ７）における豊富なイオンによって、このペプチドにおけるＮ−末端ロイシンの存在が確信される。星印を付したイオンはマトリックス関連バックグラウンドイオンである（Ｆａｌｉｃｋら、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，  ４：３１８（１９９０））。観察されたフラグメントイオンは表に示す。同じイオンシリーズに属するイオンは並べて表示した。
【図１１】先にクローニングしたシアリルトランスフェラーゼを含むＧａｌβ１，３（４）ＧｌｃＮＡｃα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３Ｎ）由来ペプチド１および１１のアラインメント（整列比較）。Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃα２，６−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ６Ｎ）およびＧａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３Ｏ）は白棒で示した。黒棒はシグナルアンカー配列を示す。斜線棒は、２つのシアリルトランスフェラーゼ間で確認された相同領域を示す。
【図１２】クローニングされた３種のシアリルトランスフェラーゼ。この３種のクローン化シアリルトランスフェラーゼは、ラットＧａｌβ１，３（４）ＧＬｃＮＡｃα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３Ｎ）、ブタＧａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３Ｏ）およびラットＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃα２，６−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ６Ｎ）である。この領域はＧａｌβ１，３（４）ＧｌｃＮＡｃα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３Ｎ）の残基１５６から残基２１０までの５５アミノ酸から成る。アミノ酸同一性は枠で示した。
【図１３】増幅フラグメントＳＭ１の推定アミノ酸配列および先に性状決定された保存相同領域との比較。相同性を有する共通保存領域は、クローニングして性状を決定したシアリルトランスフェラーゼと増幅フラグメントＳＭ１との保存相同領域の比較から作製した。不変アミノ酸は大文字で示し、一方、５０％以上の保存相同領域に存在するアミノ酸は小文字で示した。ｒまたはｑが見出される部位はｂで示し、ｉまたはｖが見出される部位はｘで示した。下線部アミノ酸は、縮退プライマーのデザインに用いた領域を表す。増幅フラグメントで見出された先の不変アミノ酸には星印を付した。
【図１４Ａ】ＳＴＸ１のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列。最も長いオープンリーディングフレームの推定アミノ酸配列は、保存相同領域ＳＭ１（アミノ酸１５４−２０８））（波線枠で示す）をコードする。推定シグナルアンカー（アミノ酸８−２３）配列は枠で囲み、潜在的Ｎ連結糖付加部位は下線で示した。配列番号７および８参照。
【図１４Ｂ】図１４Ａの続きである。
【図１５】対応するラット酵素との比較を示す、ヒトＧａｌβ１，３（４）ＧｌｃＮＡｃ∝２，３−シアリルトランスフェラーゼのヌクレオチド配列。
【図１６】対応するラット酵素との比較を示す、ヒトＧａｌβ１，３（４）ＧｌｃＮＡｃ∝２，３−シアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列。
【図１７】ＳＴ３シアリルトランスフェラーゼのヌクレオチド／アミノ酸配列。
【図１８】相同なモチーフを示す本発明のシアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列の比較。
【図１９Ａ】相同なモチーフを示す本発明のシアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列のまた別の比較。
【図１９Ｂ】図１９Ａの続きである。
【図２０Ａ】ヒトＳＴ３０をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列。
【図２０Ｂ】図２０Ａの続きである。
【図２１】ヒトＳＴＸをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列（ＰＣＲプライマーの部位には下線を付し、潜在的なＮ−糖付加部位には星印を付した）。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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