(57)【要約】【課題】エタノール＋水＋リン酸塩系またはメタノール＋水＋リン酸塩系の液液平衡関係を、バイオ関連物質ならびに医薬品中間化学物等の連続抽出による分離・精製に適用することを課題とする。【解決手段】エタノール＋水＋リン酸塩系またはメタノール＋水＋リン酸塩系を使用したミキサー・セトラー連続抽出装置または向流連続抽出装置。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
▲１▼エタノール＋水＋リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）溶液または、▲２▼エタノール＋水＋リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）溶液または、▲３▼エタノール＋水＋リン酸カリウム（Ｋ３ＰＯ４）溶液が二液相を形成するとことを、バイオ関連物質ならびに医薬品中間化合物等（注１）の分離・精製にもちいたことを特徴とする抽出法。
（注１）以降では、「バイオ関連物質ならびに医薬品中間化合物等」を「バイオ関連物質等」と云う。
【請求項２】
▲１▼メタノール＋水＋リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）溶液または、▲２▼メタノール＋水＋リン酸カリウム（Ｋ３ＰＯ４）溶液が二液相を形成することを、バイオ関連物質等の分離・精製にもちいたことを特徴とする抽出法。
【請求項３】
▲１▼エタノール＋水＋リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）＋リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）溶液または、▲２▼エタノール＋水＋リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）＋リン酸カリウム（Ｋ３ＰＯ４）溶液が液液平衡を形成することを、バイオ関連物質等の分離・精製にもちいたことを特徴とする抽出法。
【請求項４】
メタノール＋水＋リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）＋リン酸カリウム（Ｋ３ＰＯ４）溶液が液液平衡を形成することを、バイオ関連物質等の分離・精製にもちいたことを特徴とする抽出法。
【請求項５】
エタノールまたはメタノールと他の物質（１−、２−プロパノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、アセトン等）の混合物に、上記請求項中のリン酸塩（Ｋ３ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４）を加えた水溶液が液液平衡を形成することを、バイオ関連物質等の分離・精製にもちいたことを特徴とする抽出法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、主にバイオ関連物質（タンパク質、酵素、炭水化物等）をエタノール（またはメタノール）＋水＋リン酸塩系の液液相平衡を利用して、連続的に分離・精製する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】  メタノール、エタノール、２−プロパノール、１−プロパノールおよびｔｅｒｔ−ブタノール（２−メチル−２−プロパノール）は水と任意の割合で混合するが、ｔｅｒｔ−ブタノールを除いた、Ｃ４以上のアルコールは水と部分的にしか混合しない。さらに２−プロパノール、１−プロパノールおよびｔｅｒｔ−ブタノール水溶液は、普通の良く知られた塩、たとえば食塩や塩化カルシウム等、を加えることによって容易に二液相になる。【０００３】  ある種のタンパク質（この中に酵素を含む）を水以外の溶剤（物質）に溶解させると、その性質が変り、元に戻らなくなる。このことはタンパク質の変性として良く知られている。そしてこの変性の度合いは、溶剤との接触時間、溶剤の濃度および温度に比例する。即ちタンパク質は、溶剤との接触時間が長いほど、溶剤の濃度が高いほど、溶剤の温度が高いほど大きく変性される。さらに溶剤の種類にも依存する。スコープスの「各種アルコールによるグリセルアルデヒドリン酸脱水酵素の変性実験」によると、アルコールの炭素数が長いほど、酵素が変性され易かった。彼の実験によると、酵素の溶剤に耐える強さは、メタノール＞エタノール＞２−プロパノール、＞１−プロパノール＞１−ブタノール＞１−ペンタノールであった。即ち酵素はメタノール中で一番変性を受け難く、ついでエタノール中で２番目に受け難かった。酵素は１−ペンタノール中で一番大きく変性された。（非特許文献１）
スコープスの実験は、タンパク質（酵素を含む）は極性のより大きいアルコールに対して、より安定であることを示している。
【非特許文献１】ロバートＫ．スコープス著、塚田欣司訳、“新・タンパク質精製法−理論と実際”、シュプリンガー・フェアラーク東京（株）、ｐｐ．８９−９１および３１８、１９９５（東京）．
【０００４】  エタノール水溶液に、通常の塩（食塩、塩化カルシウム等）を加えても溶液は二液相にならない。しかしながら今回、本発明者は、リン酸塩のうち▲１▼リン酸カリウム（Ｋ３ＰＯ４）または、▲２▼リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）または、▲３▼リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）を加えると、この水溶液が二相を形成することを発見した。類似物質であるリン酸水素二カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）やリン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）を加えても、エタノール水溶液は二液相にならなかった。さらに、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムおよび酢酸ナトリウムを添加した時にも二液相は形成されなかった。現在のところ、エタノール水溶液を二液相にする塩として知られている物質は、硫酸セシウム（ＣｓＳＯ４）だけである。（非特許文献２）
【非特許文献２】Ｈｕ，Ｍ．；Ｚｈａｉ，Ｑ．；Ｌｉｕ．Ｚ．ａｎｄ  Ｘｉａ，Ｓ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｄａｔａ，４８，ｐｐ．１５６１−１５６４（２００３）．
【０００５】  さらにメタノール水溶液に、上記の▲１▼または▲２▼の物質を加えると、この溶液も二相になった。▲３▼の物質を加えたときには、二液相の形成は見られなかった。今日まで、メタノール水溶液を二相にする塩は、知られていない。【０００６】  本発明者は、（ａ）エタノール＋水＋Ｋ２ＨＰＯ４系と、（ｂ）エタノール＋水＋ＮａＨ２ＰＯ４系ならびに（ｃ）メタノール＋水＋Ｋ２ＨＰＯ４系の液液平衡を２８８，１５、２９８．１５および３０８．１５Ｋで測定して、その相平衡特性をしらべた。（図１、２及び３を参照。）その結果、（ａ）および（ｂ）の系の方が、硫酸セシウムの系よりも二相領域が広いことが分かった。（図４参照。）
（ａ）および（ｂ）の系では、水の濃度が６０〜６５ｗｔ％でも二液相を形成するが、硫酸セシウムの系では、水の濃度が４８ｗｔ％以下でないと二液相を形成しない。
すなわち、前者の系では、塩またはアルコール濃度が後者の系の濃度より小さい所まで二液相形成が可能である。このことは、アルコールによって変性を受け易いタンパク質や酵素を含む混合物の分離精製には重要なことである。【０００７】  またＫ２ＨＰＯ４は水溶液中では弱アルカリ性で、ＮａＨ２ＰＯ４は弱酸性であり、この混合液は緩衝溶液として生化学実験では良く用いられている物質である。したがってこれらのリン酸塩混合物を用いると、その混合割合を変えることにより、水溶液のＰＨの調整（ＰＨ＝６〜８）が可能である。Ｋ３ＰＯ４水溶液は強アルカリ性を示す。したがってＫ３ＰＯ４とＫ２ＨＰＯ４の混合物を用いると、さらにアルカリ性が強い領域の水溶液も調整できる。両性イオンであるアミノ酸は、ＰＨ値によっても分配係数（二つの相中でのアミノ酸の存在比率）が異なるので、混合リン酸塩によりＰＨ値が可変になるのは、エタノール＋水溶液＋リン酸塩系の液液平衡に関する一つの特性になる。それに対して硫酸セシウムを水に溶解しても、ＰＨの値をほとんど変化しない。またリン酸塩は値段も安く、低濃度ならば人体に害はない。それに対して硫酸セシウムは高価であり、あまり一般的に広く使用されている物質ではない。【０００８】  リン酸塩は、水溶液中で多くの酵素を安定化する作用がある。（非特許文献１）【０００９】  エタノール＋水＋Ｋ３ＰＯ４系とメタノール＋水＋Ｋ３ＰＯ４系については、二液相を形成すること確認したが、現時点では、まだその液液平衡を測定していない。【００１０】  水にポレエチレングリコール（以下ではＰＥＧ）とデキストラン、またはリン酸塩、を加えると、水の相が二相になることが知られており、タンパク質の分離精製に使用されている。
この場合、上相はＰＥＧを含む水相（ＰＥＧは９〜１３ｗｔ％、水は８６．４〜８９．７ｗｔ％）で、下相はデキストランを含む水相（デキストランは１０〜２０ｗｔ％、水は７４．３〜８６．１ｗｔ％）になる。アミノ酸のような小さい分子では、両相でのアミノ酸の濃度が等しく、分配係数はほとんど１であるが、タンパク質のように大きな分子になってくると、溶解している高分子（ＰＥＧ，デキストラン）とタンパク質との相互作用によりどちらかに偏って存在するようになるので、目的とするタンパク質を、他のタンパク質や、細胞片や、きょう雑物から分離できるようになる。（非特許文献３）
しかしながらこの水＋ＰＥＧ＋デキストラン系および水＋ＰＥＧ＋リンサン塩系の問題点は、上相と下相の密度差が小さいことである。このために前者では相分離のために遠心分離器を用いており、後者では相分離のために数時間要している。
【非特許文献３】Ｒｙｄｂｅｒｇ，Ｊ．；Ｍｕｓｉｋａｓ，Ｃ．ａｎｄ  Ｃｈｏｐ−ｐｉｎ、Ｇ．Ｒ．（ｅｄｉｔｅｄ）；“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ  ｏｆ  Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ”，ｐｐ．３４０−３４３，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）．
【００１１】  （例１）今回本発明者が発見したエタノール＋水＋Ｋ２ＨＰＯ４系で、２９８．１５Ｋの１つの相平衡を挙げると、
上相（エタノール  ０．２６３、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．０８６、水  ０．６５１）
下相（エタノール  ０．０６２、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．２８５、水  ０．６５３）
が対応している。上記の単位は全て質量分率である。
例１で上相はエタノールｒｉｃｈ相であり、水の含有量は６５．１ｗｔ％ある。下相はＫ２ＨＰＯ４ｒｉｃｈ相であり、水のそれは６５．３ｗｔ％ある。両相ともほとんど同じ含水量である。大雑把に云うと上相はエタノール＋水で、下相はＫ２ＨＰＯ４＋水と云える。
この相にバイオ関連物質を溶解させると、分配係数（上相と下相でのバイオ関連物質の濃度比）は、上相でのエタノールとバイオ関連物質との相互作用、下相でのＫ２ＨＰＯ４とバイオ関連物質との相互作用によって決まってくる。【００１２】  水にエタノール（またはメタノール）を加えると、密度が１ｇ／ｃｍ３より小さくなり、逆に水にリン酸塩を加えると、密度が１ｇ／ｃｍ３より大きくなる。したがって、エタノール（又はメタノール）＋水＋リン酸塩系では、両相の密度差が大きいので、攪拌後、静置すると直ちに相分離が起きる。このことは、連続液液抽出には、重要な因子となる。【００１３】  現在、水＋ＰＥＧ＋デキストラン系や、水＋ＰＥＧ＋リン酸塩系の液液平衡を利用したタンパク質の二水相抽出法は良く知られている。しかしながら、この抽出法は、前に述べたように、アミノ酸のような低分子物質の分離・精製には、その分配系数はほとんど１に近いので適用できない。さらに水＋ＰＥＧ＋デキストラン系では、密度差が小さいので、上相と下相を混合した後、エマルションになった混合液を分離するのに遠心分離機を使っている。また水＋ＰＥＧ＋リン酸塩系でも、密度差が小さいので、遠心分離法を使用しないときには、十分な相分離のために、数時間から一昼夜静置することが必要である。この二水相抽出方法は、現在、ある種の酵素の分離・精製に、工業的に利用されているが、その利用は限られたものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】  本発明は、バイオ関連物質等を連続的に抽出分離・精製することを課題とする。そのとき以下の利点をも有する。
（イ）高分子物質は元より、アミノ酸のような低分子物質の分離・精製にも適用可能である。
（ロ）しかも必要に応じて溶剤のＰＨが調節できる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】  以上の課題を解決するために、第１発明では、▲１▼エタノール＋水＋リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）系または、▲２▼エタノール＋水＋リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）系または、▲３▼エタノール＋水＋リン酸カリウム（Ｋ３ＰＯ４）系が二液相を形成するとことをもちいた。【００１６】  また第２発明は、▲１▼メタノール＋水＋リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）系または、▲２▼メタノール＋水＋リン酸カリウム（Ｋ３ＰＯ４）系が二液相を形成することをもちいた。【００１７】  さらに第３発明は、▲１▼エタノール＋水＋リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）＋リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）系または、▲２▼エタノール＋水＋リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）＋リン酸カリウム（Ｋ３ＰＯ４）系が液液平衡を形成することをもちいた。第３発明は、ＰＨの値を調整することが可能である。【００１８】  第４発明は、メタノール＋水＋リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）＋リン酸カリウム（Ｋ３ＰＯ４）系が液液平衡を形成することをもちいた。この発明もＰＨの調整が可能である。【００１９】  最後に第５発明は、エタノールまたはメタノールと他の物質（１−、２−プロパノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、アセトン等）の混合物に、上記請求項中のリン酸塩（Ｋ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｋ３ＰＯ４）を加えた水溶液が液液平衡を形成することをもちいた。これらの混合溶媒を使用することにより、第１〜４発明よりもより水性二相抽出に近づくことが期待される。すなわち両相での水の濃度が高くなる。
【発明の効果】
【００２０】  本発明（第１から第５発明）により、多数のバイオ関連物質等が連続的に分離・精製できるようになることが期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】  この発明の実施形態を、図５に示す。図５では、液液抽出で良く用いられるミキサー・セトラー型の抽出操作を考えた。この工程では、まず、▲１▼リン酸塩水溶液と、▲２▼エタノールと、▲３▼分離したいバイオ関連物質等を含む溶液を、ミキサーに入れて良く攪拌する。ついでこの混合液を静置槽に入れて相分離させる。そして上相と下相流出液を別々に取出す。この操作の後、バイオ関連物質等とその他の成分（細胞残さや、目的外のタンパク質等）は、互いに逆の相に多く溶解しているようになる。（注２）
（注２）現在はまだ、エタノール＋水＋リン酸塩（Ｋ２ＨＰＯ４またはＮａＨ２ＰＯ４）、メタノール＋水＋リン酸塩（Ｋ２ＨＰＯ４）系の液液平衡を測定しただけの段階なので、バイオ関連物質等の分配平衡特性は分かっていない。即ち、どのバイオ関連物質等が、上相または下相に、どれだけ多く分配されるかは分かっていない。
【実施形態の効果】
【００２２】  「実施例１」図５の実施形態により、実験室規模での回分操作から、工業的分規模での連続抽出によるバイオ関連物質等の分離・精製技術の適用例が可能になる。
【００２３】  「実施例２」図５の実施形態では、ミキサー・セトラー型を使用したが、工業的に広く使用されている、図６のような多段向流抽出装置も使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】  この図は、本発明者が、２８８．１５、２９８．１５および３０８．１５Ｋで測定したエタノール＋水＋Ｋ２ＨＰＯ４系の液液平衡図である。横軸はエタノールの質量分率を表し、縦軸は水の質量分率を表している。三角形の各頂点は、それぞれの成分が１００％であることを示す。この図から温度が違っても溶解度曲線はほとんど違わないことが分かる。ただし対応線の勾配は、温度か高い時の方がより負の勾配が大きい。水濃度が増すに連れて、二相領域が小さくなり、それに対応して対応線の傾きは次第に水平になる。そして水の濃度６２〜６５ｗｔ％では、両相の水の濃度はほほ同じ大きさになる。二液相領域は、下相では水濃度は５０〜６６ｗｔ％の範囲で、上相では、水濃度は３２〜６６ｗｔ％である。両相の水濃度がほぼ等しい、水濃度６０〜６５ｗｔ％の領域が、バイオ関連物質等の抽出に便利な領域であると思われる。図中の◎印の組成（２点）は、図６で使用する。
【図２】  この図は、エタノール＋水＋ＮａＨ２ＰＯ４系の測定結果である。二相領域はエタノール＋水＋Ｋ２ＨＰＯ４系より少し小さい。水濃度５２〜５８ｗｔ％が、バイオ関連物質等の抽出に便利な領域であると思われる。
【図３】  この図は、メタノール＋水＋Ｋ２ＨＰＯ４系の測定結果である。メタノールはエタノールより極性が大きいので、二相領域はエタノールのときより遥かに小さい。しかしながら、メタノールの方が、エタノールよりタンパク質を変性しない。エタノール＋水＋Ｋ２ＨＰＯ４系にないバイオ関連物質等の分配特性が期待される。水の濃度４７〜５０ｗｔ％が、バイオ関連物質等の抽出に便利な領域であると思われる。
【図４】  この図は、２９８Ｋ付近での、エタノール＋水＋Ｋ２ＨＰＯ４系と、エタノール＋水＋ＮａＨ２ＰＯ４系と、エタノール＋水＋硫酸セシウム系の液液平衡の比較を行なったものである。この図から、硫酸セシウムの系は二相領域が一番小さいことが分かる。硫酸セシウムの系では、水濃度４０〜４７ｗｔ％が、バイオ関連物質等の抽出に便利な領域であると思われる。ただし水の濃度が低いので、下相の硫酸セシウム濃度（５０〜５７ｗｔ％）が高くなることが避けられない。その分、タンパク質が変性され易くなる。
【図５】  この図は、連続ミキサー・セトラー抽出装置で、（例１）の組成の相を用いた、バイオ関連物質等の分離を想定した。▲１▼６０ｗｔ％Ｋ２ＨＰＯ４水溶液と、▲２▼純エタノールと、▲３▼バイオ関連物質等を、攪拌槽に入れる。そのとき▲１▼、▲２▼および▲３▼の混合液の組成が、上相と下相の平均組成（Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１９、エタノール０．１６、水０．６５；質量比）になるように調整する。
【図６】  この図は、連続向流抽出装置で、密度の大きいＫ２ＨＰＯ４ｒｉｃｈ相を上から、密度が小さいエタノールｒｉｃｈ相を下から加えている。回転円盤をゆっくり回して、各段階で両相を攪拌して液液接触を良くして、両相間での物質移動を促進させている。上相では、▲１▼バイオ関連物質を含む水溶液と▲２▼６０ｗｔ％Ｋ２ＨＰＯ４水溶液を混合して平均組成（Ｋ２ＨＰＯ４  ０．３５，水０．６５；質量比：図１中の左の◎印の点）になるように流量を調整する。下から３５ｗｔ％エタノール水溶液（エタノール０．３５、水０．６５；質量比：図１中の右の◎印の点）を入れる。そして上の流量（▲１▼＋▲２▼）（ｇ／ｍｉｎ）と下の流量（ｇ／ｍｉｎ）をほぼ等しくする。図５および６では、バイオ関連物質がエタノールｒｉｃｈ相に、きょう雑物がＫ２ＨＰＯ４ｒｉｃｈ相に抽出されるとした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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