(57)【要約】【課題】本発明は、保護物質で被覆した酵素触媒を用いる糖鎖物質の製造方法を提供する。【解決手段】保護物質で被覆した酵素触媒を、糖鎖物質の良溶媒である含水有機溶媒中あるいは非水系溶媒中で用いることで、単糖またはオリゴ糖からの糖鎖物質の合成や、糖鎖物質を用いる糖類基材の修飾が可能となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
保護物質で被覆した酵素触媒を用いて、含水有機溶媒中あるいは非水系溶媒中で、単糖またはオリゴ糖を重合させてなる糖鎖重合物質。
【請求項２】
保護物質で被覆した酵素触媒を用いて、含水有機溶媒中あるいは非水系溶媒中で、糖鎖物質を用いて糖類基材を修飾させてなる糖鎖修飾物質。
【請求項３】
保護物質が界面活性剤であることを特徴とする請求項１および２のいずれかに記載の糖鎖物質の製造方法。
【請求項４】
酵素触媒が糖鎖物質の加水分解酵素であること特徴とする請求項１および２のいずれかに記載の糖鎖物質の製造方法。
【請求項５】
反応溶媒が糖鎖物質の良溶媒であることを特徴とする請求項１および２のいずれかに記載の糖鎖物質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、保護物質で被覆した酵素触媒を用いて、糖鎖物質の良溶媒である含水有機溶媒中あるいは非水系溶媒中で、単糖またはオリゴ糖を重合させてなる糖鎖重合物質、糖鎖物質を用いて糖類基材を修飾させてなる糖鎖修飾物質、および該糖鎖物質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】糖鎖物質は、ＤＮＡやタンパク質に続く第３の鎖として生体内に存在しており、生命情報伝達を司る機能分子として、細胞の認識、受精、免疫、ガンの転移、ウィルスの感染等の諸現象で、極めて重要な役割を果たしている。近年、これらの生体内糖鎖の機能を、工学的に生医学材料や生体機能材料等に利用するグライコエンジニアリングが注目を集めており、種々の糖鎖物質あるいは糖鎖含有材料が開発されている。【０００３】上記の糖鎖物質あるいは糖鎖含有材料は、生体内で機能している糖鎖物質を合成あるいは他の材料に導入したものである。しかし、一般に糖類は反応性類似の官能基を多数持つことから、規則的な結合様式を持つ特定の糖鎖物質のみを選択的に製造することは困難である。【０００４】また、生体内の糖鎖物質はタンパク質等との弱い相互作用を補うため、集合化（クラスター化）してその機能を高めているが、人工糖鎖材料では十分なクラスター効果が発現しない。加えて、合成高分子材料等への導入では、生体適合性の低下や副作用等の懸念もあり、実用的には問題が多い。【０００５】一方、植物細胞壁の構成糖類であるセルロース等の構造性糖鎖物質についても、同様に合成の試みがなされているが、強すぎる分子内・分子間相互作用により、合成は著しく困難である。これまでに、有機合成法（Ｆ．Ｎａｋａｔｓｕｂｏ  ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８，１６７７−１６８１（１９９６））や酵素重合法（Ｓ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１３，３０７９−３０８４（１９９１））が提案されているが、前述の方法では完全な分子構造が、後述の方法では十分な分子量を持つ糖鎖物質が得られない。【０００６】ところで、構造性糖鎖物質の持つ分子集合力は、糖鎖物質のクラスター化機能として期待できる上、合成高分子材料と異なり、糖鎖物質自体の安全性も高い。しかし、上述のように高すぎる分子内・分子間相互作用が障壁となり、合成には至っていない。【０００７】この様に、生医学材料や生体機能材料等としての糖鎖物質は、既存技術で製造可能な簡単な糖鎖構造を持つものに限定されており、その利用も合成高分子材料に導入する等に留まっていることから、実用機能としては不十分なものである。また、その製造方法についてもさらなる技術革新が求められている。【０００８】特に、生体内で重要な機能を司る糖鎖物質を効率的に合成する方法や、糖鎖物質を用いる糖類基材の簡便な修飾法、および生体内で安全かつ効率的に糖鎖物質をクラスター化させる機能を持つ糖鎖物質とその製造方法の確立が希求されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】以上説明したように、合成が困難で現状では機能が不十分な糖鎖物質を、効率的に製造して機能化するためには、単糖およびオリゴ糖を規則的かつ位置選択的に重合、あるいは糖類基材に特異的に修飾させる製造方法が求められる。【００１０】近年、酵素触媒の反応特異性を有機合成に機能利用するために、該反応を有機溶媒中で行う試みがなされている。特に、各種保護物質による酵素触媒の被覆に関する発明がいくつか報告されている（特開昭６４−８０２８２、特開平７−２５５４７８）。【００１１】さらに、セルロースをはじめとする構造性糖鎖物質であっても、特殊な含水有機溶媒あるいは非水系溶媒には溶解することが分かっており、該溶媒中においては、その分子内・分子間相互作用を弱めることが可能である。【００１２】そこで、上記の従来の課題を解決するため本発明は、セルロース等の構造性糖鎖物質の良溶媒を用いることで、生成糖鎖物質および糖類基材の分子内・分子間相互作用を弱め、かつ保護物質で被覆された酵素触媒を用いた特異的な触媒反応を介して、特定の糖類を重合あるいは修飾した糖鎖物質を提供することを目的とする。また本発明は、前記糖鎖物質の製造方法を提供することを他の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、通常の酵素触媒が即座に失活する含水有機溶媒中あるいは非水系溶媒中においても、高活性を発現することが可能な保護物質で被覆した酵素触媒を用いることで、単糖またはオリゴ糖を重合させてなる糖鎖重合物質、糖鎖物質を用いて糖類基材を修飾させてなる糖鎖修飾物質、および該糖鎖物質の製造方法を発明するに至った。【００１４】すなわち本発明の糖鎖重合物質は、多糖類分解酵素、糖転移酵素、または糖リン酸化酵素等が基質として認識する単糖またはオリゴ糖を原料物質として、含水有機溶媒中あるいは非水系溶媒中において、保護物質で被覆した酵素触媒により重合させて製造することを特徴とする。【００１５】これにより、例えば、セルロースの加水分解酵素であるセルラーゼを、特開昭６４−８０２８２に示される保護物質を用いて被覆し、グルコースまたはセロビオースを原料物質として、セルロースの良溶媒である塩化リチウム含有Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド溶液中で反応させることで、高分子量のセルロースを合成することが可能となる。【００１６】また、本発明の糖鎖修飾物質は、多糖類分解酵素、糖転移酵素、または糖リン酸化酵素等が基質として認識する単糖またはオリゴ糖を修飾物質として、含水有機溶媒中あるいは非水系溶媒中において、保護物質で被覆した酵素触媒により糖類基材に修飾させて製造することを特徴とする。【００１７】これにより、例えば、ラクトースの加水分解酵素のβ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２３）や、セルロースのエキソ型分解酵素のセロビオヒドラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９１）を、特開昭６４−８０２８２に示される保護物質を用いて被覆し、ラクトースあるいはラクトース関連糖鎖を修飾物質として、塩化リチウム含有Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド溶液中に分散させたセルロース基材と反応させることで、通常不活性なセルロース基材表面に特定の糖鎖物質を導入することが可能となる。【００１８】さらに、本発明の糖鎖物質の製造方法は、原料物質の糖鎖物質と生成糖鎖物質の良溶媒を反応媒体とし、規則的かつ位置選択的な酵素触媒の反応特異性を活かして重合あるいは修飾を行うことから、非常に多彩な糖鎖物質を製造することが可能である。【００１９】これにより、既存技術では限定された種類しか合成できなかった糖鎖物質、特に構造性糖鎖物質を含む糖鎖物質の製造および糖類基材への修飾が可能となる。
【発明の効果】
【００２０】以上説明したように、本発明の糖鎖物質とその製造方法は、生体内で重要な機能を司る糖鎖物質を効率的に合成する方法、糖鎖物質を用いる糖類基材の簡便な修飾法、および生体内で安全かつ効率的に糖鎖物質をクラスター化させる機能を持つ糖鎖物質を提供するものであり、生医学材料や生体機能材料等として、幅広い分野での利用が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】以下に、本発明の糖鎖物質に係わる構成要素、次いでその製造方法について詳細に説明する。【００２２】本発明に用いる糖鎖物質としては、生成糖鎖物質の良溶媒である含水有機溶媒あるいは非水系溶媒に溶解すれば良く、例えばグルコース、ガラクトース、マンノース等の単糖や、セロビオース、マルトース、ゲンチオビオース、ラクトース等の二糖類およびオリゴ糖等が挙げられるが、純度が高く、入手が容易で、酵素触媒の基質認識性に優れた二糖類が有利に用いられる。【００２３】本発明に用いる保護物質としては、酵素触媒を被覆可能な界面活性成分で反応溶媒に溶解すれば良く、例えばリン脂質、ＴＷＥＥＮ２０、二シオレール（特開昭６４−８０２８２）等が挙げられるが、高い酵素活性が得られる二シオレールが有利に用いられる。【００２４】本発明に用いる酵素触媒としては、原料糖鎖物質および糖類基材の種類によって異なるが、例えばα−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼやセルラーゼのようなオリゴサッカラーゼ、ポリサッカラーゼ、トランスグルコシダーゼ等の転移酵素や、その他、糖リン酸化酵素、酸化還元酵素、脱水素酵素等が挙げられる。【００２５】本発明に用いる反応溶媒としては、原料糖鎖物質、生成糖鎖物質および保護物質が溶解すれば良く、例えば塩化リチウム含有Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド溶液や塩化リチウム含有Ｎ，Ｎ−ジメチルイミダゾリジノン溶液等が挙げられるが、中性糖を広く溶解可能な塩化リチウム含有Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド溶液が有利に用いられる。【００２６】本発明の糖鎖物質の製造において、原料糖鎖と酵素触媒の比率に特に制限はないが、一般的に重量％で糖鎖物質１００に対して酵素触媒１〜１００が望ましい。【００２７】本発明の糖鎖物質の製造温度は、一般的な触媒反応温度であれば良く、好ましくは２０〜６０℃の温度が望ましい。【００２８】本発明の糖鎖物質の製造時間は、原料糖鎖物質の仕込み比率、酵素触媒の種類と量、製造温度により異なるため、特に限定されないが、一般的に１〜７２時間が望ましい。
【実施例】
【００２９】以下、本発明の糖鎖物質について、セルロース合成を対象に具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。なお、以下の実施例中の部および％は重量基準の割合を示す。【００３０】酢酸緩衝液（ｐＨ  ５．０）に溶解したセルラーゼ２０部と、トルエンに溶斛した二シオレール１０部を、酢酸緩衝液とトルエンの液比が１０部対２０部になるように混合し、ホモジナイザーを用いて１５，０００ｒｐｍで３分間攪拌し、Ｗ／Ｏエマルションを調製した。液体窒素で急冷後、凍結乾燥により溶媒を除去し、界面活性剤被覆酵素を得た。【００３１】８％塩化リチウム含有Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド溶液１００部に、セロビオース５部と被覆酵素１部を加え、３７℃で２４時間インキュベートした。生成物を精製後、凍結乾燥により得た白色粉末を実施例１とした。【００３２】実施例１において、被覆酵素を２部にする以外は、すべて実施例１と全く同一の処理を行い、実施例２とした。【００３３】実施例１において、セロビオースを１０部にする以外は、すべて実施例１と全く同一の処理を行い、実施例３とした。【００３４】実施例１において、セロビオースを１０部、被覆酵素を２部にする以外は、すべて実施例１と全く同一の処理を行い、実施例４とした。【００３５】実施例１において、被覆酵素を０部にする以外は、すべて実施例１と全く同一の処理を行い、比較例１とした。【００３６】実施例１において、保護物質を０部にする以外は、すべて実施例１と全く同一の処理を行い、比較例２とした。【００３７】以上、実施例で得られた糖鎖物質と比較例の試料を、転化率測定および粘度平均重合度分析に供した。その結果を（表１）に示す。【００３８】
【表１】
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（表１）によれば、比較例１および２では原料糖鎖以外の糖鎖物質は全く得られなかったが、実施例１〜４においては、重合度約２０〜９０の長鎖のセルロースが得られた。転化率は５％以下で非常に低いものであったが、重合度はこれまでの報告（Ｓ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１３，３０７９−３０８４（１９９１））の約２３をはるかに上回るものが得られた。生成物は精密糖鎖分析により、セルロースの結合様式のみからなる糖鎖物質であった。【００３９】得られた長鎖セルロースは、天然セルロースと同様に水中で分子集合することで、容易に不溶化した。また、セルロース基材への修飾も同様に可能であった。【００４０】以上説明したように、本発明の糖鎖物質の製造方法においては、原料糖鎖物質のセロビオースと界面活性剤被覆セルラーゼの配合比率が５：２となる実施例２が、セルロースの伸長反応に効果的であった。