(57)【要約】      （修正有）【課題】植物由来デンプン合成酵素の酵素活性を解析する系を構築し、デンプン合成酵素の機能解析を行う形質転換体とその利用法を提供する。【解決手段】イネ科植物由来のデンプン合成酵素をコードするポリヌクレオチドが導入されている、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ７９４２株由来のシアノバクテリア形質転換体の提供。更に、内在性のグリコーゲン合成酵素をコードするポリヌクレオチドを欠失している、上記シアノバクテリア形質転換体の提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
デンプン合成酵素をコードするポリヌクレオチドが導入されていることを特徴とするシアノバクテリア形質転換体。
【請求項２】
前記デンプン合成酵素がイネ科植物由来であることを特徴とする請求項１に記載のシアノバクテリア形質転換体。
【請求項３】
前記デンプン合成酵素がＳＳＩ型であることを特徴とする請求項１に記載のシアノバクテリア形質転換体。
【請求項４】
前記デンプン合成酵素が前駆体型デンプン合成酵素であることを特徴としている請求項１に記載のシアノバクテリア形質転換体。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが配列番号１に示される塩基配列からなることを特徴とする請求項１に記載のシアノバクテリア形質転換体。
【請求項６】
前記デンプン合成酵素が成熟型デンプン合成酵素であることを特徴としている請求項１に記載のシアノバクテリア形質転換体。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが配列番号３に示される塩基配列からなることを特徴とする請求項１に記載のシアノバクテリア形質転換体。
【請求項８】
Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属由来であることを特徴とする請求項１に記載のシアノバクテリア形質転換体。
【請求項９】
Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ７９４２株由来であることを特徴とする請求項１に記載のシアノバクテリア形質転換体。
【請求項１０】
内在性のグリコーゲン合成酵素（ＧＳ）をコードするポリヌクレオチドを欠失していることを特徴とする請求項１に記載のシアノバクテリア形質転換体。
【請求項１１】
デンプン合成能を有することを特徴とする請求項１に記載のシアノバクテリア形質転換体。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のシアノバクテリア形質転換体から抽出されたことを特徴とする多糖。
【請求項１３】
デンプン合成酵素をコードするポリヌクレオチドが導入されているシアノバクテリア形質転換体から抽出した多糖を解析する工程を包含することを特徴とするデンプン合成酵素の機能を解析する方法。
【請求項１４】
前駆体型デンプン合成酵素をコードするポリヌクレオチドが導入されているシアノバクテリア形質転換体から抽出した多糖と、成熟型デンプン合成酵素をコードするポリヌクレオチドが導入されているシアノバクテリア形質転換体から抽出した多糖とを比較する工程を包含することを特徴とするデンプン合成酵素の機能を解析する方法。
【請求項１５】
シアノバクテリア形質転換体から抽出した多糖を枝切り処理してグルカン鎖を得る工程および当該グルカン鎖を鎖長分布解析に供する工程をさらに包含することを特徴とする請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記鎖長分布解析がキャピラリー電気泳動であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デンプン合成酵素をコードするポリヌクレオチドが導入されることによって当該酵素が発現されたシアノバクテリア形質転換体、および当該シアノバクテリア形質転換体を用いたデンプン合成酵素の機能解析法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
α−ポリグルコースからなる多糖類であるデンプン（Ｓｔａｒｃｈ）およびグリコーゲン（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ）は、それぞれ植物および動物において合成され、エネルギー貯蔵物質として利用されている。高等植物の貯蔵器官に蓄積されているデンプンはデンプン粒を形成し、貯蔵組織中で「アミロプラスト」と呼ばれるプラスチド中に含まれている。
【０００３】
デンプンは、食品および飼料として利用されるだけでなく、デキストリン、オリゴ糖、異性化糖などの加工食品、ならびに糊もしくは添加剤などの工業製品またはその原材料として利用されている。
【０００４】
デンプンの性質（例えば、形状、味、糊化した際の物性など）は由来する植物（例えば、イネ、ジャガイモ、小麦、トウモロコシなど）によって微妙に異なるので、各種の植物由来のデンプンが、用途に応じて使い分けられている。この性質の差異は、デンプンを構成するアミロペクチンに起因することが示されている。
【０００５】
デンプンは、２種類のグルコースホモポリマー（アミロペクチン（Ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ）およびアミロース（Ａｍｙｌｏｓｅ））の混合物である。
【０００６】
アミロースは、貯蔵デンプン中の２０〜３０％を占めているが、デンプン粒の形成に必要ではない。アミロースは、グルコースユニットがα−１，４グルコシド結合で連結されており、少量のα−１，６グルコシド結合の枝を含む線状／らせん状の分子である。
【０００７】
アミロペクチンはデンプン粒中の７０〜８０％を占めており、グルコースユニットがα−１，４グルコシド結合で繋がっているとともに、α−１，６グルコシド結合の枝が主鎖と平行に連結された構造を有する。このようなアミロペクチンの特徴的な構造は「クラスター」構造と呼ばれており、デンプン粒の形成に重要である。
【０００８】
動物およびバクテリアの貯蔵物質であるグリコーゲンもまた、アミロペクチン同様のグルコースホモポリマーから構成されている。しかしグリコーゲンはクラスター構造を有しておらず、「ｔｒｅｅ  ｌｉｋｅ」構造または「ｂｕｓｈ  ｌｉｋｅ」構造を有すると報告されている。
【０００９】
アミロペクチン、アミロース、およびグリコーゲンの構造を図１に示す。図１において、α−グルコースの連鎖を実線で示す。アミロペクチンは、α−１，４グルコースの連鎖およびα−１，６グルコースの分枝構造（クラスター）を規則的に一定の間隔で有しているが、アミロースは、分枝がほとんどないα−１，４グルコースの１本鎖構造からなり、グリコーゲンは、不規則な分枝構造からなる（図１（ａ）、（ｂ）および（ｃ））。
【００１０】
アミロペクチンは、枝が長く、かつグルコースが高密度で充填されているために、一般に水不溶性の物質である。一方、グリコーゲンは、その多くが水溶性の物質であり、アミロペクチンと比較して分子サイズが小さく、枝も短い。
【００１１】
アミロペクチンのクラスター構造は、約９ｎｍの規則的な繰り返し構造であり、この９ｎｍのサイズはどのような植物種においても保持されている。このようなアミロペクチンのクラスター構造により、デンプン粒としての結晶構造が形成される。
【００１２】
詳細なアミロペクチンの構造を図２に示す。アミロペクチンは、Ａ〜Ｃ鎖の３タイプのα−１，４グルコシド鎖を有する。Ａ鎖は最も外側の鎖であり、鎖中に分枝を有していない。Ｂ鎖は、一鎖あたり１つ以上の鎖が分岐している。Ｂ鎖としては、１つのクラスターにとどまるＢ１鎖、２つのクラスターに及ぶＢ２鎖、３つのクラスターに及ぶＢ３鎖などがある。Ｃ鎖は還元末端を有しており、アミロペクチン１分子中に１つ存在する。
【００１３】
アミロペクチンは、以下の４種類の酵素による連続反応にて合成されると考えられている：
（１）ＡＤＰグルコースピロホスホリラ−ゼ（ＡＤＰ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ（ＡＧＰａｓｅ））；
（２）水溶性デンプン合成酵素（Ｓｔａｒｃｈ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＳＳ））；
（３）デンプン枝作り酵素（Ｓｔａｒｃｈ  ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ（ＢＥ））；および
（４）デンプン枝切り酵素（Ｓｔａｒｃｈ  ｄｅｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ（ＤＢＥ））。
【００１４】
ＡＧＰａｓｅは、デンプンポリマーの原材料であるＡＤＰグルコースを合成する酵素である。
【００１５】
ＳＳは、アミロペクチンの非還元末端にＡＤＰグルコースをα−１，４グルコシド結合にて連結し、鎖を伸長させる酵素である。デンプン合成酵素（ＳＳ）には、Ｉ型（ＳＳＩ）、ＩＩ型（ＳＳＩＩ）、ＩＩＩ型（ＳＳＩＩＩ）、ＩＶ型（ＳＳＩＶ）の少なくとも４タイプが存在し、ＳＳＩＩ、ＳＳＩＩＩ、ＳＳＩＶには、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩｃ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶａ、ＩＶｂなどのサブタイプが存在することが知られている。
【００１６】
ＢＥは、アミロペクチンにてα−１，６グルコシド結合を形成させて、クラスター構造の分枝部分を形成させる酵素である。
【００１７】
従来、ＳＳおよびＢＥは、アミロペクチンの枝の頻度を決定することによりクラスター構造を形成するという重要な役割を果たしていると考えられてきた。しかし、α−１，６グルコシド結合の枝を分解するＤＢＥが欠損した植物では、アミロペクチンのクラスター構造が形成されないことが明らかにされ、ＤＢＥがクラスター構造の形成に不可欠であることが示された（下記の非特許文献１〜３参照）。
【００１８】
このように、アミロペクチンにおけるクラスター構造は、ＳＳおよびＢＥによる新たな結合形成だけでなく、ＢＥにより余分に形成された分枝をＤＢＥが分解することにより、規則的に構成されかつ維持される。
【００１９】
ＤＢＥとしては、イソアミラーゼ（Ｉｓｏａｍｙｌａｓｅ）およびプルラナーゼ（Ｐｕｌｌｕｌａｎａｓｅ（また、Ｒ−ｅｎｚｙｍｅまたはｌｉｍｉｔ  ｄｅｘｔｒｉｎａｓｅとも称される））が知られている。イソアミラーゼは、グリコーゲンまたはグリコーゲンよりもやや規則性を有するフィトグリコーゲン（ｐｈｙｔｏｇｌｙｃｏｇｅｎ）のα−１，６グルコシド結合の枝を分解し得るが、マルトトリオースが規則的にα−１，６結合した天然多糖類プルラン（ｐｕｌｌｕｌａｎ）には作用し得ない。プルラナーゼは、プルランには作用し得るが、グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンには作用し得ない。
【００２０】
近年、デンプンに関する研究は、デンプン合成に関連する酵素についての形質転換体を作製して行われているが、その大多数がジャガイモを用いて試みられたものである。例えば、非特許文献５には、ジャガイモＢＥ（イネＢＥＩに対応）のアンチセンスに導入することにより糊化特性の異なるデンプンを蓄積するジャガイモを作出したことが記載されており、非特許文献６には、ＢＥＡ（イネのＢＥＩＩに対応）のアンチセンス形質転換体ジャガイモを作製し、この形質転換体において、側鎖長の長くなったアミロペクチンが蓄積することを明らかにしたことが記載されており、非特許文献７には、ＳＳＩＩ、ＳＳＩＩＩ、ＳＳＩＩとＳＳＩＩＩのキメラアンチセンスＲＮＡを導入し、デンプン合成活性の低下した形質転換体ジャガイモを作製し、この形質転換体において、デンプン粒のサイズが小さくなり、側鎖長分布に大きな変化が見られることを明らかにしたことが記載されている。
【００２１】
このように、高等植物においては、ＡＧＰａｓｅ、ＳＳ、ＢＥ、ＤＢＥ（デンプン合成関連酵素）により植物の種類に応じたアミロペクチンが産生される。アミロペクチンの構造は植物種間において若干相違するが、これは、ＡＧＰａｓｅ、ＳＳ、ＢＥ、ＤＢＥの種類の違いに起因すると考えられており、これらの酵素の関わりにより、植物ごとに味および／または物性が異なるデンプンが産生されていると考えられている。
【００２２】
これまでに、イネデンプン合成酵素（ＳＳ）として、ＳＳＩ、ＳＳＩＩａ、ＳＳＩＩｂ、ＳＳＩＩｃ、ＳＳＩＩＩａ、ＳＳＩＩＩｂ、ＳＳＩＶａ、ＳＳＩＶｂ、ＧＢＳＳＩ、ＧＢＳＳＩｂの１０種類のアイソザイムが同定されている。しかし、各植物においてこれらの個々の酵素がどのように相違しており、またこれらの個々の酵素がデンプンの微細構造にどのように関与しているのかということは未だ解決されていない。
【００２３】
また、デンプン合成酵素ＳＳＩ型は、イネＳＳアイソザイムの中で特に発現レベルが高く、胚乳をはじめ各組織において主要なＳＳ活性を占めると考えられている。しかし、その機能解析は未だ十分には行われていない。なぜなら、植物の酵素、特にイネ由来デンプン合成酵素の酵素活性を解析する系が確立されていないからである。
【００２４】
デンプン合成に関与する上記各酵素の酵素活性を解析し、それぞれの機能を解明することができれば、必要に応じて各酵素を使い分けて、所望の味や物性を有するデンプンを自由に産生し得る。よって、デンプンの産生におけるデンプン合成に関与する上記各酵素の機能の解明が望まれている。
【非特許文献１】Ｍ．Ｇ．Ｊａｍｅｓら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，７：４１７〜４２９（１９９５）
【非特許文献２】Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１２：１４３〜１５３（１９９７）
【非特許文献３】Ａ．Ｋｕｂｏら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１２１：３９９〜４０９（１９９９）
【非特許文献４】Ｔ．Ｂａｂａら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０３：５６５〜５７３（１９９３）
【非特許文献５】Ｒ．Ｓａｆｆｏｒｄら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｐｏｌｙｍ．，３５：１５５〜１６８（１９９８）
【非特許文献６】Ｓ．Ａ．Ｊｏｂｌｉｎｇら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１８：１６３〜１７１（１９９９）
【非特許文献７】Ａ．Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１７：２５１〜２６１（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
デンプンの合成は高等植物における植物細胞内の色素体（葉では葉緑体、貯蔵組織ではアミロプラスト）において合成されるために、高等植物での実験が必要とされていた。しかしながら、高等植物におけるデンプン合成の過程は極めて複雑である。さらに、高等植物を用いた実験では、植物の生育に時間がかかるので個々の酵素の機能を解明することは極めて困難であった。
【００２６】
より容易な実験系を構築する手段の１つとして、動物細胞を用いることが考えられる。確かに、動物細胞を用いることができれば、植物細胞を用いる場合より容易に形質転換体を作製し得る。しかし、植物の酵素（およびその遺伝子（ポリヌクレオチド））を研究するために動物細胞を用いることは好ましくない。
【００２７】
アミロース、アミロペクチンおよびグリコーゲンの合成過程を図３に示す。図中のＳＳＳは水溶性ＳＳ、ＳＢＥは  デンプン（ｓｔａｒｃｈ）枝作り酵素、ＧＢＳＳは粒結合デンプン合成酵素（ｇｒａｎｕｌｅ−ｂｏｕｎｄ  ｓｔａｒｃｈ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＵＧＰａｓｅはグリコーゲンの材料となるリン酸化グルコースの合成酵素であり、ＧＳはグリコーゲン合成酵素であり、ＧＢＥはグリコーゲン枝作り酵素である。
【００２８】
このように、アミロペクチンおよびグリコーゲンは、その構成成分がいずれもグルコースであり、これがα−１，４結合およびα−１，６結合によって重合した高分子である点においては共通している。しかし、合成の前駆体が同じリン酸化グルコースとはいえ、前者はＡＤＰ−グルコース、後者はＵＤＰ−グルコースであり、これらの代謝系は植物と動物との間で大きく異なるので、アミロペクチン合成に必要なＡＤＰ−グルコースが動物細胞内で十分に供給されるということは考えられない。
【００２９】
また、植物細胞と動物細胞とでは翻訳後修飾（例えば、リン酸化）が異なるので、基質特異性が非常に高い植物の酵素が、動物細胞内で正常に機能することは考えられない。
【００３０】
したがって、植物の酵素（およびその遺伝子）を研究するために動物細胞を用いるためには、植物細胞と同様の細胞内環境を構築する必要がある。このような環境の構築には非常に煩雑な作業が必要であり、植物細胞と同様の細胞内環境を備えた動物細胞はこれまでに知られていない。
【００３１】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、植物由来デンプン合成酵素の酵素活性を解析する系を構築することにある。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
本発明者らは、イネデンプン合成酵素の機能を解析する上で、シアノバクテリアを宿主とした遺伝子発現系を用いればデンプン合成系を再構築し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。具体的には、シアノバクテリアのグリコーゲン合成酵素欠損株に前駆体型または成熟型のイネデンプン合成酵素ＳＳＩを導入すると、形質転換体において多糖合成がされることを見出し、そして、形質転換株から抽出した貯蔵多糖の構造を解析したところ、前駆体型ＳＳＩおよび成熟型ＳＳＩのいずれを発現させた場合にも、形質転換株においてグルカン糖鎖が検出されることなどを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００３３】
すなわち、本発明に係るシアノバクテリア形質転換体は、上記課題を解決するために、デンプン合成酵素をコードするポリヌクレオチドが導入されていることを特徴としている。
【００３４】
本発明に係るシアノバクテリア形質転換体において、上記デンプン合成酵素はイネ科植物由来であることが好ましい。
【００３５】
本発明に係るシアノバクテリア形質転換体において、上記デンプン合成酵素はＳＳＩ型であることが好ましい。
【００３６】
本発明に係るシアノバクテリア形質転換体において、上記デンプン合成酵素は前駆体型デンプン合成酵素であることが好ましい。
【００３７】
本発明に係るシアノバクテリア形質転換体において、上記ポリヌクレオチドは配列番号１に示される塩基配列からなることが好ましい。
【００３８】
本発明に係るシアノバクテリア形質転換体において、上記デンプン合成酵素は成熟型デンプン合成酵素であることが好ましい。
【００３９】
本発明に係るシアノバクテリア形質転換体において、上記ポリヌクレオチドは配列番号３に示される塩基配列からなることが好ましい。
【００４０】
本発明に係るシアノバクテリア形質転換体は、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属由来であることが好ましい。
【００４１】
本発明に係るシアノバクテリア形質転換体は、シネココッカス・エロンガータスＰＣＣ７９４２（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２）株）由来であることが好ましい。
【００４２】
本発明に係るシアノバクテリア形質転換体は、内在性のグリコーゲン合成酵素（ＧＳ）をコードするポリヌクレオチドを欠失していることが好ましい。
【００４３】
本発明に係るシアノバクテリア形質転換体は、デンプン合成能を有することが好ましい。
【００４４】
本発明に係る多糖は、上記のシアノバクテリア形質転換体から抽出されたことを特徴としている。
【００４５】
本発明に係るデンプン合成酵素の機能を解析する方法は、デンプン合成酵素をコードするポリヌクレオチドが導入されているシアノバクテリア形質転換体から抽出した多糖を解析する工程を包含することを特徴としている。
【００４６】
本発明に係るデンプン合成酵素の機能を解析する方法は、前駆体型デンプン合成酵素をコードするポリヌクレオチドが導入されているシアノバクテリア形質転換体から抽出した多糖と、成熟型デンプン合成酵素をコードするポリヌクレオチドが導入されているシアノバクテリア形質転換体から抽出した多糖とを比較する工程を包含することを特徴としている。
【００４７】
本発明に係るデンプン合成酵素の機能を解析する方法は、シアノバクテリア形質転換体から抽出した多糖を枝切り処理してグルカン鎖を得る工程および当該グルカン鎖を鎖長分布解析に供する工程をさらに包含することが好ましい。
【００４８】
本発明に係るデンプン合成酵素の機能を解析する方法は、上記鎖長分布解析がキャピラリー電気泳動であることが好ましい。
【発明の効果】
【００４９】
本発明を用いれば、デンプン合成酵素の機能を容易に解析することができる。また、本発明を用いれば、多様なデンプンを人工的に作り分けることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
上述したように、植物の酵素（およびその遺伝子）を研究するために動物細胞を用いることは好ましくない。特に多糖合成に関与する酵素については、以下のような観点から、植物の酵素が動物細胞内で機能することは期待し得ない：
（１）最終生成物（アミロペクチンとグリコーゲン）は全く性状が異なる；
（２）出発物質（ＡＤＰ−グルコースとＵＤＰ−グルコース）が全く異なる；
（３）動物細胞では、ＡＤＰ−グルコースが植物細胞ほど供給され得ない；
（４）合成系に関与する酵素はいずれも基質特異性が非常に高い；および
（５）植物細胞内と動物細胞内とでは細胞内環境が異なり、翻訳後修飾などにも違いがある。
【００５１】
したがって、本発明者らは、多糖合成に関与する植物の酵素（およびその遺伝子）を研究するために、少なくとも多糖合成については植物細胞と同様の細胞内環境を有する動物細胞を構築することを目的とし、その必要条件を検討することにした。
【００５２】
シアノバクテリアは、動物と同様の貯蔵多糖（グリコーゲン）合成系を有するが、この系は、動物におけるグリコーゲン合成系と比較して単純である。また、数種のシアノバクテリアにおいて形質転換技術がすでに確立している。そこで、本発明者らは、インビボでのデンプン合成系の再構築にシアノバクテリアを用いることを試みた。
【００５３】
本発明者らは、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２株の内在性のグリコーゲン合成酵素（ＧＳ）を欠失した株（ＧＳ遺伝子ノックアウト株）を作製し、同株におけるポリグルカン合成およびＧＳ酵素活性を調べた。同株ではポリグルカン合成およびＧＳ酵素活性がほとんど検出されなかった。このことは、グリコーゲン合成酵素（ＧＳ）が細胞内活性の大部分を占めることを示す。
【００５４】
本発明者らはさらに、上記ＧＳ遺伝子ノックアウト株（ΔＧＳ）に植物由来のデンプン合成酵素（ＳＳ）を導入することを試みた。その結果、本発明者らは、シアノバクテリアΔＧＳ株にデンプン合成酵素をコードするポリヌクレオチドを首尾よく導入することができた。
【００５５】
得られた形質転換体においてポリグルカン合成を調べたところ、上述したような予想に反して、従来の技術水準からは予想し得なかった導入遺伝子依存的多糖合成がこの形質転換体内で行われることを見出した。
【００５６】
（１）形質転換体
本発明は、ＳＳ活性を有するポリペプチドが発現されている形質転換体、すなわち、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されている形質転換体を提供する。本明細書中で使用される場合、「ＳＳ活性」は、植物由来のデンプン合成酵素活性が意図される。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、用語「形質転換体」は、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体をも含むことが意図される。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、各種微生物、植物または動物が挙げられる。
【００５８】
好ましくは、本発明に係る形質転換体は、シアノバクテリアであり得る。一実施形態において、本発明に係るシアノバクテリア形質転換体は、ＳＳ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを、ＳＳ活性を有するポリペプチドが発現され得るようにシアノバクテリア中に導入することによって取得される。好ましくは、本発明に係るシアノバクテリア形質転換体は、ＳＳ活性を有するポリペプチドを安定して発現し得る。
【００５９】
本発明に係る形質転換体は、ＳＳ活性を有するポリペプチドが発現されていることを特徴とする。本発明に係る形質転換体は、ＳＳ活性を有するポリペプチドが安定的に発現されていることが好ましい。本発明に係る形質転換体では、ＳＳ活性を有するポリペプチドが発現されていることにより従来予想し得なかった多糖合成が行われる。
【００６０】
本発明に係るシアノバクテリア形質転換体において、上記デンプン合成酵素はいずれの植物に由来してもよいが、イネ科植物由来であることが好ましく、植物中の含有量が一番多いＳＳＩ型であることがより好ましい。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、「デンプン合成酵素（ＳＳ）Ｉ型」または「ＳＳＩ」は、デンプン合成酵素（スターチシンターゼ）に属するアイソザイムの１つが意図される。配列番号１には、日本晴品種ＥＳＴ由来ＳＳＩのヌクレオチド配列を含む塩基配列が示され、配列番号２には同ヌクレオチド配列によってコードされる前駆体型ＳＳＩのアミノ酸配列が示される。なお、配列番号１に示される塩基配列の第１３塩基〜１９３８塩基が前駆体型ＳＳＩをコードする領域に相当する。
【００６２】
イネなどの高等植物においては、ＳＳＩは細胞質での翻訳により前駆体型が合成され、次いで、合成された前駆体型は色素体内に輸送される。その際、前駆体型のＮ末端のシグナルペプチド領域が切断され、成熟型に変換される。このように、高等植物の細胞を宿主に用いて、ＳＳＩの機能解析を行うためには前駆体型ＳＳＩをコードするポリヌクレオチドが導入される必要がある。
【００６３】
しかし、本発明に係るシアノバクテリア形質転換体においては、原核生物ゆえにオルガネラへの輸送過程が存在せず、よってＳＳＩはシグナルペプチドがない成熟型であってもよい。
【００６４】
したがって、本発明に係るシアノバクテリア形質転換体においては、デンプン合成酵素をコードするポリヌクレオチドは、前駆体型ＳＳＩをコードするポリヌクレオチドであっても成熟型ＳＳＩをコードするポリヌクレオチドであってもよい。すなわち、本発明に係るシアノバクテリア形質転換体において発現されるＳＳ活性を有するポリペプチドは、前駆体型であっても成熟型であってもよい。
【００６５】
なお、イネＳＳＩの前駆体型は６４１アミノ酸からなり、成熟型は第１１４位のＳｅｒからの５２９アミノ酸からなる。前駆体型デンプン合成酵素はシグナルペプチドを含み、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる（対応するｃＤＮＡ配列は配列番号１に示される塩基配列からなる）。
【００６６】
本発明に係るシアノバクテリア形質転換体は、ＳＳ活性を有する酵素の酵素活性を反映させるためには、内在性のグリコーゲン合成酵素（ＧＳ）をコードするポリヌクレオチドを欠失していることが好ましく、デンプン合成能を有していることがより好ましい。
【００６７】
本発明に係る形質転換体を作製するためのシアノバクテリアとしては、デンプン様のグリコーゲンを産生し得るものであればよく、好ましいシアノバクテリアとしては、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属のシアノバクテリアが挙げられる。このようなシアノバクテリアとしては、例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２株が挙げられる。本発明に係る形質転換体を作製するための宿主として使用されるシアノバクテリアは野生型を使用してもよいが、外来遺伝子の導入による機能相補の効果を検討するためには、内在性のグリコーゲン合成酵素（ＧＳ）をコードする遺伝子の欠損株など、デンプン合成関連酵素をコードする遺伝子を欠損した株を使用することが好ましい。このような遺伝子の欠損株を得る方法としては、ジーンターゲッティング法などの公知の手法を用いればよい。
【００６８】
遺伝子の発現用のプロモーターとしては、シアノバクテリアにおいて発現可能なものであれば特に制限されず、シアノバクテリアのプロモーター領域を使用してもよく、シアノバクテリアにて発現可能であれば外来遺伝子のプロモーター領域を使用しても、ｌａｃプロモーターなどのプロモーター領域を使用してもよい。
【００６９】
宿主のシアノバクテリアへの遺伝子導入方法としては、プラスミドベクターを使用する方法、ウイルスを使用する方法、遺伝子銃による方法などの公知の手法が使用され得る。
【００７０】
このようにして外来遺伝子が導入されたシアノバクテリアは、抗生物質による培地を用いた公知の手法により選択され得る。次いで、外来遺伝子が導入されていること、目的の遺伝子産物がシアノバクテリアにおいて発現されていることが、ネイティブＰＡＧＥや各種のブロッティング法などの公知の手法により確認され得る。
【００７１】
本発明に係るシアノバクテリア形質転換体において、上記デンプン合成酵素がイネ前駆体型デンプン合成酵素である場合は、上記遺伝子は配列番号１に示される塩基配列からなることが好ましい。また、本発明に係るシアノバクテリア形質転換体において、上記デンプン合成酵素がイネ成熟型デンプン合成酵素である場合は、上記遺伝子は配列番号３に示される塩基配列からなることが好ましい。なお、配列番号３に示される塩基配列には、成熟型デンプン合成酵素が首尾よく組換え発現されるように開始コドンが導入されており、配列番号４に示されるアミノ酸配列は成熟型デンプン合成酵素のＮ末端にメチオニンを有する。
【００７２】
なお、宿主シアノバクテリアに導入される遺伝子（ポリヌクレオチド）は、上記配列からなるイネＳＳＩ遺伝子に限定されない。また、同じＳＳＩ遺伝子を導入する場合であっても、ＳＮＰなどにより上記配列と一部配列が異なる天然のイネＳＳＩ遺伝子を宿主に導入しても、遺伝子工学的手法により人為的に遺伝子配列を一部改変したイネＳＳＩ遺伝子を宿主に導入してもよい。また、インディカ品種由来のＳＳＩ遺伝子またはその改変遺伝子を宿主に導入してもよい。
【００７３】
宿主における遺伝子発現を確保するため、ＳＳＩ遺伝子は、リボソーム結合配列などの他の配列と共に導入されることが好ましい。また、ＳＳＩ遺伝子は、デンプン合成酵素ＳＳＩをコードするものであって、当該酵素の機能を損なわない範囲であれば必ずしも全長をコードする遺伝子でなくてもよいし、適当な部分長の遺伝子を用いて、当該酵素の活性の有無を検討することにより、活性発現に必須の部分を本発明により解析することも可能である。
【００７４】
なお、イネＳＳＩの遺伝子配列は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ  ｄａｔａｂａｓｅｓにおいてアクセッション番号Ｄ１６２０２として提供されており、Ｔ．Ｂａｂａら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０３：５６５〜５７３（１９９３）において同遺伝子に関する説明が記載されている。
【００７５】
本発明に係る形質転換体を使用すれば、植物由来の遺伝子産物により生成した多糖がどのような構造的特徴を有しているかを調べることができる。
【００７６】
（２）ＳＳ活性を有するポリペプチド
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用され、「デンプン合成酵素活性を有するポリペプチド」は、「ＳＳ活性を有する酵素（ポリペプチド）」または「デンプン合成酵素（ポリペプチド）」と交換可能に使用される。
【００７７】
一実施形態において、本発明に係るシアノバクテリア形質転換体において、デンプン合成酵素は配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが好ましい。
【００７８】
別の実施形態において、本発明に係るシアノバクテリア形質転換体におけるデンプン合成酵素は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体でありかつＳＳ活性を有するポリペプチドであることが好ましい。
【００７９】
本明細書中で使用される場合、「配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」は、配列番号１に示される塩基配列の１３〜１９３８位からなるポリヌクレオチドによってコードされ、シグナル配列（配列番号１に示される塩基配列の１３〜３５１位からなるポリヌクレオチドによってコードされる配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１〜１１３位）が意図される。ＳＳ活性を有する成熟型のポリペプチドは、当該シグナル配列が切断された形態であるが、本明細書中で使用される場合、「配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」に包含される。
【００８０】
このような変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性の残基から別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が挙げられる。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しない。
【００８１】
ポリペプチドのアミノ酸配列中でのいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００８２】
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るシアノバクテリア形質転換体におけるデンプン合成酵素のＳＳ活性を変化させない。
【００８３】
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【００８４】
上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントでありそうか（すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか）に関するさらなるガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｓｓａｇｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）（本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。
【００８５】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法（変異誘発法）に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望のＳＳ活性を有するか否かを容易に決定し得る。
【００８６】
一実施形態において、本発明に係るシアノバクテリア形質転換体におけるデンプン合成酵素は、ＳＳ活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列
からなるポリペプチドであることが好ましい。このような変異ポリペプチドは、上述したように、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するポリペプチドを単離精製したものであってもよい。
【００８７】
他の局面において、本発明に係るシアノバクテリア形質転換体におけるデンプン合成酵素は、ＳＳ活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号１に示される塩基配列の１３〜１９３８位からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列の１３〜１９３８位において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
によってコードされることが好ましい。
【００８８】
別の局面において、本発明に係るシアノバクテリア形質転換体におけるデンプン合成酵素は、ＳＳ活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号１に示される塩基配列の１３〜１９３８位からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列の１３〜１９３８位と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
によってコードされることが好ましい。
【００８９】
ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。
【００９０】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０ｎｔより長いポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。このようなポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）は、本明細書中においてより詳細に考察されるような検出用プローブとしても有用である。
【００９１】
さらに別の局面において、本発明に係るシアノバクテリア形質転換体におけるデンプン合成酵素は、ＳＳ活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号１に示される塩基配列の１３〜１９３８位からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列の１３〜１９３８位と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド
によってコードされることが好ましい。
【００９２】
例えば、「本発明に係るシアノバクテリア形質転換体におけるデンプン合成酵素をコードするポリヌクレオチドの参照（ＱＵＥＲＹ）塩基配列に少なくとも９５％同一の塩基配列からなるポリヌクレオチド」によって、対象塩基配列が、本発明に係るシアノバクテリア形質転換体におけるデンプン合成酵素をコードするポリヌクレオチドの参照塩基配列の１００ヌクレオチチド（塩基）あたり５つまでの不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を含み得ることを除いて、参照配列に同一である、ということが意図される。換言すれば、参照塩基配列に少なくとも９５％同一の塩基配列からなるポリヌクレオチドを得るために、参照配列における塩基の５％までが、欠失され得るかまたは別の塩基で置換され得るか、あるいは参照配列における全塩基の５％までの多くの塩基が、参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの不一致は、参照塩基配列の５’または３’末端位置または参照配列における塩基中で個々にかまたは参照配列内の１以上の隣接した群においてのいずれかで分散されて、これらの末端部分の間のどこでも起こり得る。この参照配列は、本明細書中で記載されるように、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、改変体、誘導体またはアナログであり得る。
【００９３】
任意の特定の核酸分子が、例えば、配列番号１に示される塩基配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラム（例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）を使用して決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の最も良好な相同性セグメントを見出す（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２〜４８９（１９８１））。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列プログラムを用いて、特定の配列が、本発明に従う参照配列に対して、例えば、９５％同一であるか否かを決定する場合は、同一性のパーセントが参照塩基配列の全長にわたって計算され、そして参照配列におけるヌクレオチド数全体の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように、パラメーターが設定される。
【００９４】
特定の実施形態では、参照（ＱＵＥＲＹ）配列（本発明に係る配列）と対象配列との間の同一性（全体的な配列整列ともいわれる）は、Ｂｒｕｔｌａｇらのアルゴリズム（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７〜２４５（１９９０））に基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定される。％同一性を計算するために、ＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝５００または対象塩基配列の長さ（どちらかより短い方）である。この実施形態に従って、対象配列が、５’または３’欠失に起因して（内部の欠失が理由ではなく）ＱＵＥＲＹ配列よりも短い場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、同一性パーセントを算定する場合に、対象配列の５’短縮化および３’短縮化を考慮しないという事実を考慮して、手動の補正が結果に対してなされる。ＱＵＥＲＹ配列と比較して５’末端または３’末端が短縮化された対象配列については、同一性パーセントは、一致／整列していない、対象配列の５’および３’であるＱＵＥＲＹ配列の塩基数を、ＱＵＥＲＹ配列の総塩基のパーセントとして計算することにより補正される。ヌクレオチドが一致／整列しているか否かの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセントが、指定されたパラメーターを使用する上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された同一性パーセントから差し引かれ、最終的な同一性パーセントスコアに到達する。この補正されたスコアが、本実施形態の目的で使用されるものである。ＱＵＥＲＹ配列と一致／整列していない対象配列の５’塩基および３’塩基の外側の塩基のみが、ＦＡＳＴＤＢ整列に示されるように、同一性パーセントスコアを手動で調整する目的で計算される。例えば、９０塩基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために１００塩基のＱＵＥＲＹ配列と整列される。その欠失は、対象配列の５’末端で生じ、従ってＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基の一致／整列を示さない。１０個の不対合塩基は、配列の１０％（整合していない５’末端および３’末端での塩基の数／ＱＵＥＲＹ配列中の塩基の総数）を表し、そのため１０％が、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。残りの９０残基が完全に整合する場合、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００塩基のＱＵＥＲＹ配列と比較される。この場合、その欠失は内部欠失であり、そのためＱＵＥＲＹ配列と整合／整列しない対象配列の５’末端または３’末端の塩基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正されない。再度、ＱＵＥＲＹ配列と整合／整列しない対象配列の５’末端および３’末端の塩基のみが手動で補正される。他の手動の補正は、本実施形態の目的のためにはなされない。
【００９５】
上述したように、本発明に係るシアノバクテリア形質転換体におけるデンプン合成酵素は、成熟型ポリペプチドであってもよい。
【００９６】
一実施形態において、本発明に係るシアノバクテリア形質転換体におけるデンプン合成酵素は、ＳＳ活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１４〜６４１位；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１４〜６４１位において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列
からなるポリペプチドであることが好ましい。このような変異ポリペプチドは、上述したように、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するポリペプチドを単離精製したものであってもよい。
【００９７】
他の局面において、本発明に係るシアノバクテリア形質転換体におけるデンプン合成酵素は、ＳＳ活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号１に示される塩基配列の３５２〜１９３８位からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列の３５２〜１９３８位において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
によってコードされることが好ましい。
【００９８】
別の局面において、本発明に係るシアノバクテリア形質転換体におけるデンプン合成酵素は、ＳＳ活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号１に示される塩基配列の３５２〜１９３８位からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列の３５２〜１９３８位と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
によってコードされることが好ましい。
【００９９】
さらに別の局面において、本発明に係るシアノバクテリア形質転換体におけるデンプン合成酵素は、ＳＳ活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号１に示される塩基配列の３５２〜１９３８位からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列の３５２〜１９３８位と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド
によってコードされることが好ましい。
【０１００】
なお、成熟型ポリペプチド（配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１４〜６４１位）を組換え発現させるためには、Ｎ末端にメチオニンを付加する必要があり、この場合の成熟型ポリペプチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる。また、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる成熟型ポリペプチドは、配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされる。
【０１０１】
本発明に係るシアノバクテリア形質転換体におけるデンプン合成酵素は、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖およびイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されない。
【０１０２】
また、本発明に係るシアノバクテリア形質転換体におけるデンプン合成酵素は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。
【０１０３】
また、本発明に係るシアノバクテリア形質転換体におけるデンプン合成酵素は、当該デンプン合成酵素をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入して、そのポリペプチドを細胞内発現させた状態であってもよいし、細胞、組織などから単離精製されてもよい。
【０１０４】
他の実施形態において、本発明に係るシアノバクテリア形質転換体におけるデンプン合成酵素は、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明に係るシアノバクテリア形質転換体におけるデンプン合成酵素の付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間または引き続く操作および保存の間の安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加され得る。
【０１０５】
本実施形態に係るポリペプチドは、例えば、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列であるタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）にＮ末端またはＣ末端へ付加され得る。このような配列は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、タグアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）において提供されるタグ）であり、他の中では、それらの多くは公的および／または商業的に入手可能である。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４（１９８９）（本明細書中に参考として援用される）において記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質由来のエピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドであり、それは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４）（本明細書中に参考として援用される）によって記載されている。他のそのような融合タンパク質は、ＮまたはＣ末端にてＦｃに融合される本実施形態に係るポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。
【０１０６】
（３）ＳＳ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、「配列番号１に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。
【０１０７】
本発明に係るシアノバクテリア形質転換体におけるデンプン合成酵素をコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【０１０８】
また本発明に係るシアノバクテリア形質転換体におけるデンプン合成酵素をコードするポリヌクレオチドは、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに融合され得る。
【０１０９】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個（または数百個以上）結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、合成されてもよい。
【０１１０】
本発明に係るシアノバクテリア形質転換体におけるデンプン合成酵素をコードするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった１本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。本発明に係るシアノバクテリア形質転換体におけるデンプン合成酵素をコードするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡメカニズムによる遺伝子発現操作のためのツールとして使用することができる。アンチセンスＲＮＡ技術によって、内因性遺伝子に由来する遺伝子産物の減少が観察される。本発明に係るシアノバクテリア形質転換体におけるデンプン合成酵素をコードするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【０１１１】
本発明に係るシアノバクテリア形質転換体におけるデンプン合成酵素をコードするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得する方法としては、本発明に係るシアノバクテリア形質転換体におけるデンプン合成酵素をコードするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離する種々の公知の方法が挙げられる。例えば、本発明に係るシアノバクテリア形質転換体におけるデンプン合成酵素をコードするポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製して、ゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすれば、本発明に係るシアノバクテリア形質転換体におけるデンプン合成酵素をコードするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得することができる。このようなプローブとしては、本発明に係るシアノバクテリア形質転換体におけるデンプン合成酵素をコードするポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）であればよい。このようなハイブリダイゼーションによって選択されるポリヌクレオチドとしては、天然のポリヌクレオチドが挙げられるが、これに限定されない。
【０１１２】
本発明に係るシアノバクテリア形質転換体におけるデンプン合成酵素をコードするポリヌクレオチドを取得する別の方法として、ＰＣＲを用いる方法が挙げられる。このＰＣＲ増幅方法は、例えば、本発明に係るシアノバクテリア形質転換体におけるデンプン合成酵素をコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡの５’側および／または３’側の配列（またはその相補配列）を利用してプライマーを調製する工程、これらのプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等をテンプレートにしてＰＣＲ増幅する工程を包含することを特徴としており、本方法を使用すれば、本発明に係るシアノバクテリア形質転換体におけるデンプン合成酵素をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得することができる。
【０１１３】
（４）ＳＳ活性を有するポリペプチドの生産方法
本発明は、ＳＳ活性を有するポリペプチドを生産する方法を提供する。本発明に係るポリペプチドの生産方法を用いれば、ＳＳ活性を有するポリペプチドを低コストでありかつ環境に低負荷な条件下で提供することが可能となる。また、本発明に係るポリペプチドの生産方法を用いれば、ＳＳ活性を有するポリペプチドを容易に生産することが可能となる。
【０１１４】
本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係る形質転換体を用いることを特徴としている。本発明に係るポリペプチドの生産方法は、ＳＳ活性を有するポリペプチドを含む細胞（形質転換体）から当該ポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。ＳＳ活性を有するポリペプチドを精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。なお、デンプン合成酵素をコードするポリヌクレオチドを適当なタグと連結した後に導入することにより得られたシアノバクテリア形質転換体を用いれば、比較的容易に目的のポリペプチドを精製することが可能である。
【０１１５】
（５）デンプン合成酵素の機能を解析するための方法、組成物およびキット
本発明は、本発明に係る形質転換体を用いるデンプン合成酵素の機能を解析する方法を提供する。一実施形態において、本発明に係るデンプン合成酵素の機能を解析する方法は、本発明に係る形質転換体から多糖を抽出する工程を包含する。
【０１１６】
本発明に係るデンプン合成酵素の機能を解析する方法は、デンプン合成酵素をコードする遺伝子が導入されている形質転換体から抽出した多糖（貯蔵多糖）を解析する工程をさらに包含することがより好ましい。
【０１１７】
本発明に係るデンプン合成酵素の機能を解析する方法において使用される形質転換体は、上述した手順に従って作製された形質転換体であることが好ましい。好ましくは、上記形質転換体は、シアノバクテリアであり得る。一実施形態において、本発明に係るデンプン合成酵素の機能を解析する方法は、ＳＳ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを、ＳＳ活性を有するポリペプチドが発現され得るようにシアノバクテリア中に導入する工程を包含し得る。好ましくは、上記シアノバクテリア形質転換体は、ＳＳ活性を有するポリペプチドを安定して発現し得る。
【０１１８】
本発明に係るデンプン合成酵素の機能を解析する方法において、上記デンプン合成酵素はいずれの植物に由来してもよいが、イネ科植物由来であることが好ましく、植物中の含有量が一番多いＳＳＩ型であることがより好ましい。また、本発明に係るデンプン合成酵素の機能を解析する方法において、上記デンプン合成酵素は、前駆体型であっても成熟型であってもよい。
【０１１９】
シアノバクテリアが本発明に係るデンプン合成酵素の機能を解析する方法において使用される場合、好ましいシアノバクテリアとしては、デンプン様のグリコーゲンを産生し得るものであればよく、好ましいシアノバクテリアとしては、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属のシアノバクテリアが挙げられる。このようなシアノバクテリアとしては、例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２株が挙げられる。また本発明に係るデンプン合成酵素の機能を解析する方法において使用されるシアノバクテリアは、野生型であっても、デンプン合成関連酵素をコードする遺伝子を欠損した株（例えば、内在性のグリコーゲン合成酵素（ＧＳ）をコードする遺伝子の欠損株など）であってもよい。
【０１２０】
特定の実施形態において、本発明に係るデンプン合成酵素の機能を解析する方法は、イネ由来デンプン合成酵素をコードする遺伝子が導入されたシアノバクテリアを用いて、当該シアノバクテリアから抽出した貯蔵多糖を解析することを特徴としている。
【０１２１】
形質転換体から多糖を抽出する際に使用される溶媒は、特に制限されないが、例えば、熱水、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、プロパノールなど）、塩酸、有機酸（例えば、クエン酸、酢酸など）が好ましい。多糖が食品に使用される場合は、熱水またはアルコールが好ましい。また多糖抽出の際、必要に応じて、超音波、攪拌機などを用いて攪拌してもよい。
【０１２２】
本発明に係るデンプン合成酵素の機能を解析する方法は、前駆体型デンプン合成酵素をコードする遺伝子が導入されている形質転換体から抽出した多糖と、成熟型デンプン合成酵素をコードする遺伝子が導入されている形質転換体から抽出した多糖とを比較する工程を包含することを特徴としている。
【０１２３】
一実施形態において、前駆体型デンプン合成酵素をコードする遺伝子を導入したシアノバクテリア、および、成熟型デンプン合成酵素をコードする遺伝子を導入したシアノバクテリアを作製し、両者から抽出した貯蔵多糖を解析し比較することによりデンプン合成酵素の機能を解析し得る。
【０１２４】
また、本発明に係るデンプン合成酵素の機能を解析する方法における貯蔵多糖を解析する手法としては、特に制限されないが、例えば、貯蔵多糖を枝切り処理し、得られたグルカン鎖を鎖長分布解析に供する方法が挙げられる。鎖長分布解析は、例えば、シアノバクテリア形質転換株からアルコール抽出した多糖についてα−１，６結合切断後、キャピラリー電気泳動法により分画を行って、クラスター中の糖鎖の重合度（糖の数）を測定する方法が好ましい。測定された重合度は、同じ重合度の糖鎖を有するものをそれぞれ定量し、糖鎖の全量に対する各重合度の糖鎖の比率（％）を計算して糖鎖の重合度の分布を示すグラフにすることができる。これにより、当該デンプンを形成しているクラスター中の糖鎖の重合度の分布がわかり、デンプンの構造的な特徴を把握することができる。
【０１２５】
本発明はまた、本発明に係る形質転換体を含む組成物を提供する。本発明に係る組成物は、本発明に係る形質転換体が、培養培地中に含まれる形態であっても、必要に応じて培養培地に添加される形態であってもよい。本発明に係る組成物に含まれる形質転換体は、上述した手順に従って作製された形質転換体であることが好ましい。
【０１２６】
本発明はさらに、本発明に係る形質転換体を備えるキットを提供する。本発明に係るキットは、本発明に係る形質転換体を単独で備えても、必要に応じて他の試薬をさらに備えてもよい。本発明に係るキットに備えられる形質転換体は、上述した手順に従って作製された形質転換体であることが好ましい。
【０１２７】
本発明に係る形質転換体を用いる、デンプン合成酵素の機能を解析するための組成物およびキットは、上述したデンプン合成酵素の機能を解析する方法に用いるための組成物およびキットであり得ることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【０１２８】
以上のように、本発明は、イネデンプンの特異的な構造の形成に深く関与し、特に、ジャポニカ、インディカ品種におけるデンプン物性に差異が生じる主要な原因とされている、イネデンプン合成酵素の機能解明において非常に有効な研究材料を提供するものである。
【０１２９】
本発明は、デンプン合成酵素型の機能解析のみならず、広くデンプン合成機構の研究に有用であり、さらに、デンプン合成技術に利用可能である。例えば、イネＳＳＩの機能上の特徴を生かしたデンプンの構造を設計し、その設計したデンプンを宿主に産生させ得る。このことは、新規クラスター構造を有するデンプンの開発を可能にする。
【０１３０】
すなわち、本発明の目的は、植物由来デンプン合成酵素をコードする遺伝子をシアノバクテリアに導入することにより得られたシアノバクテリア形質転換体、およびその利用を提供することにある。
【０１３１】
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様および以下の実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、当業者は、本発明の精神および添付の特許請求の範囲内で変更して実施することができる。
【０１３２】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【０１３３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されない。
【実施例】
【０１３４】
〔実施例１：イネデンプン合成酵素（ＳＳＩ）発現のためのプラスミドの構築〕
配列番号１に示されるＳＳＩ遺伝子のコード領域１，９２６塩基、およびその上流９０塩基と下流４６９塩基（イネ・日本晴品種のＥＳＴ由来のＳＳＩ  ｃＤＮＡ配列）を含むプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、ＳＳＩ遺伝子の前半部分を増幅した。
【０１３５】
ＰＣＲのプライマーとしては、以下の配列のものを用いた：
フォワードプライマー１、５’−ＡＡＧＧＡＧＧＧＧＡＴＣＡＴＧＧＣＧＡＣＧＧＣＧＧＣＧＧＧＧ−３’（配列番号５）；
フォワードプライマー２、５’−ＡＡＧＧＡＧＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＧＴＧＡＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＡＧ-３’（配列番号６）；および
リバースプライマー、５’−ＧＧＴＣＣＴＣＧＧＡＧＡＡＡＴＴＣＧＣＴ−３’（配列番号７）。
【０１３６】
フォワードプライマー１を、前駆体タンパク質コード領域の上流にリボソーム結合配列（５’側に示される下線部分）が付加されるように設計した。フォワードプライマー２を、成熟タンパク質Ｎ末端の直前にＡＴＧが付加され、さらにその上流にリボソーム結合配列（５’側に示される下線部分）が付加されるように設計した。フォワードプライマー２の鋳型に対合する部位は、フォワードプライマー１と比較して３３６塩基下流である。
【０１３７】
イネにおいて、ＳＳＩ遺伝子は細胞核にて転写され、細胞質での翻訳により前駆体タンパク質が合成された。合成された前駆体は、色素体内に輸送され、ここで、Ｎ末端のシグナルペプチド領域が切断され、成熟型の酵素に変換される。しかしながら、シアノバクテリアは原核生物なので、オルガネラへの輸送過程を有しておらず、よってシグナルペプチドはなくてもよい。そこで、このシグナルペプチド部分を残した場合（前駆体型）と予め取り除いた場合（成熟型）との間で効果を比較するために、フォワードプライマー１および２の２種類を用いて前駆体型および成熟型の２種のポリヌクレオチドを作製した。
【０１３８】
さらに、シアノバクテリアでは翻訳開始のためにコード領域上流のリボソーム結合配列が必要となるため、これもフォワードプライマー中に組み入れた。
【０１３９】
リバースプライマーには、イネＳＳＩ遺伝子の３’末端、すなわち終止コドンの下流１８〜３７塩基に対応する相補配列を用いた。
【０１４０】
これらのプライマーを組み合わせてＰＣＲを行い、リボソーム結合配列の付加などの加工を施した後、増幅断片をプラスミドベクター  ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。クローニング後に増幅断片を組換えプラスミドから切り出し、シャトルプラスミド  ｐＥＣＡＮ８（Ｒ．Ｈ．Ｌａｕ  ａｎｄ  Ｎ．Ａ．Ｓｔｒａｕｓ、ＦＥＭＳ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２７：２５３〜２５６（１９８５）を参照のこと）へクローニングした。このシャトルプラスミドには、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓにおける複製開始に必要な配列が存在するので、このシャトルプラスミドを使用すればシアノバクテリア細胞中で遺伝子を自律増殖させることができる。増幅断片をプラスミドに連結する際に、ＳＳＩ遺伝子がｌａｃプロモーター依存的に転写されるように、プラスミド中のｌａｃプロモーターと増幅断片とが順方向に配列されたクローンを選抜した。
【０１４１】
挿入断片全長の配列を決定することにより、遺伝子組換え操作中に変異が生じていないことを確認した。なお、本実施例にて作製した２種のプラスミドを用いて宿主において発現させるＳＳＩタンパク質のうち、前駆体タンパク質を「ＳＳＩ＿ｐｒｅ」、成熟タンパク質を「ＳＳＩ＿ｍａｔ」と称する。
【０１４２】
〔実施例２：Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  形質転換株の作製〕
実施例１で作製したプラスミドを用いて、Ｓ．Ｓ．Ｇｏｌｄｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：２１５〜２３１（１９８７）の方法に準じてＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２株の形質転換を行い、イネＳＳＩ遺伝子をシアノバクテリア細胞内に導入した。この形質転換体を液体培地中で対数増殖期まで増殖させて得た培養液５０ｍｌを遠心分離して細胞を回収し、少量（５００μｌ）の液体培地中に懸濁した後、ＤＮＡ溶液１μｌを添加して、遮光下にて３０℃、２０時間振盪した。振盪処理後、細胞懸濁液をアンピシリン２μｇ／ｍｌを含む寒天培地上にひろげ、３０℃で連続光照射下にてコロニーが出現するまでインキュベートし、アンピシリン耐性を指標として、外来遺伝子を含む形質転換株を選抜した。なお、形質転換株の宿主として、内在性グリコーゲン合成酵素を欠損した株（ΔＧＳ）を用いた。この株では、多糖（グリコーゲン）の蓄積がほとんど起こらないので、ＳＳＩ導入依存的多糖形成を確認することが容易である。
〔実施例３：形質転換株における貯蔵多糖の構造解析〕
実施例２に従って外来遺伝子（イネＳＳＩ）を含む形質転換株を選抜した後、アンピシリン２０μｇ／ｍｌを含む５０ｍｌの液体培地中で形質転換株を培養し、回収した細胞からアルコール抽出により貯蔵多糖を調製した。調製した多糖に対して市販のイソアミラーゼによって枝切り処理を行って得たサンプルをキャピラリー電気泳動に供して、グルカン鎖の鎖長分布を調べた（図４）。
【０１４３】
図４（ａ）は、「ＳＳＩ＿ｐｒｅ」を発現させた形質転換株および比較としての野生株（ＷＴ）において検出された枝切り処理後の糖鎖のパターンを示すグラフであり、図４（ｂ）は、「ＳＳＩ＿ｍａｔ」を発現させた形質転換株および比較としての野生株（ＷＴ）において検出された枝切り処理後の糖鎖のパターンを示すグラフである。グラフの横軸は、キャピラリー電気泳動から得た各種糖鎖の重合度（ＤＰ：ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を示し、縦軸は、各糖鎖の相対量（Ａｒｅａ  ％）を示す。またグラフ中のピークに付された数字はグルコース重合度を示す。
【０１４４】
図４（ａ）および（ｂ）に示すように、野生株では本来この生物が蓄積するグリコーゲンに由来したオリゴ糖鎖が検出され、鎖長分布における重合度（ＤＰ）のピークは６に認められた。図には示さないが、遺伝子導入の親株として用いたグリコーゲン合成酵素欠損株（ΔＧＳ）においては、多糖合成を担う唯一の酵素を欠損しているため、グラフに示されるような貯蔵多糖由来のオリゴ糖鎖は全く検出されなかった。よって、グリコーゲン合成酵素欠損株（ΔＧＳ）は、多糖（グルコース）を合成する機能が失われていることが確認された。
【０１４５】
これに対し、２種の形質転換株においてはいずれも多糖由来のグルカン糖鎖が検出された。糖鎖の量比としてはいずれもグルコース重合度６をピークとしたものであった。親株においては糖鎖がほとんど認められなかったことから、形質転換株に見出された糖鎖は、導入遺伝子の産物に起因するものであると考えられた。
【０１４６】
野生株および形質転換株における鎖長分布をさらに詳細に比較すると、野生株では、ＤＰ６およびＤＰ８に鎖長分布のピークを有する（ＤＰ７＜ＤＰ８）のに対し、形質転換株ではいずれも鎖長分布のピークはＤＰ６にのみ認められた（ＤＰ７＞ＤＰ８）。また、形質転換株ではＤＰ１０以上の糖鎖の存在比が野生株に比べ著しく減少しており、ＤＰ２０以上の糖鎖はほとんど認められなかった。
【０１４７】
以上の結果より、シアノバクテリアに導入されたイネデンプン合成酵素ＳＳＩは、シアノバクテリア生体内において糖鎖合成の機能を発揮することが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１４８】
本発明を用いれば、所望の構造を有するデンプンを人工的に合成することができるので、デンプンが利用される食品工業、紙工業、生分解性プラスチック工業など各種の産業分野に広く利用できる。また、本発明を用いれば、新規なクラスター構造を有するデンプンを開発し得るので、既存の天然のデンプンでは用いることができなかった新規な適用を開発し得、新規産業の開拓に役立つ。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】図１は、アミロペクチン（ａ）、アミロース（ｂ）、およびグリコーゲン（ｃ）の構造を示す図である。
【図２】図２は、アミロペクチンのクラスター構造の詳細を示す図である。
【図３】図３は、植物および動物における貯蔵性ポリグルカンの合成過程を簡略的に示す図である。
【図４】図４は、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ野生株（ＷＴ）およびイネＳＳＩ遺伝子を導入した形質転換株から抽出した貯蔵多糖の枝切り処理後のキャピラリー電気泳動による鎖長分析結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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