(57)【要約】【課題】ラムノリピド類を治療薬の活性成分として使用してアルツハイマー病を治療する方法に関する。【解決手段】式（Ｉ）：2007308514.tif 000026［式中、Ｒ1はＨまたはα−Ｌ−ラムノピラノシル；        Ｒ2はＨまたは−ＣＨ（Ｒ4）−ＣＨ2−ＣＯＯＨ；        Ｒ3は（Ｃ5−Ｃ20）−飽和、モノまたはポリ不飽和ヒドロカルビル；そして  Ｒ4は（Ｃ5−Ｃ20）−飽和、モノまたはポリ不飽和ヒドロカルビルである］で表されるラムノリピド類の一以上を活性成分として含有するアルツハイマー病の治療用医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2007308514.tif 000024
［式中、Ｒ1はＨまたはα−Ｌ−ラムノピラノシル；
Ｒ2はＨまたは−ＣＨ（Ｒ4）−ＣＨ2−ＣＯＯＨ；
Ｒ3は（Ｃ5−Ｃ20）−飽和、モノまたはポリ不飽和ヒドロカルビル；
そして  Ｒ4は（Ｃ5−Ｃ20）−飽和、モノまたはポリ不飽和ヒドロカルビルである］で表されるラムノリピド類の一以上を活性成分として含有するアルツハイマー病の治療用医薬組成物。
【請求項２】
医薬組成物の形態が、クリーム、ローション、注射液、錠剤、カプセル剤、及び経口摂取可能な溶液および懸濁液からなる群から選択される形態のものである請求項１記載の組成物。
【請求項３】
ラムノリピドが、式（II）：
【化２】
2007308514.tif 000025
で表されるラムノリピドである請求項１記載の組成物。
【請求項４】
式（Ｉ）で表わされる一以上のラムノリピドにおいてＲ1が、α−Ｌ−ラムノピラノシルである請求項１記載の組成物。
【請求項５】
式（Ｉ）で表わされる一以上のラムノリピドにおいて、Ｒ3が−（ＣＨ2）x−ＣＨ3（ここで、ｘは４〜２０）である請求項１記載の組成物。
【請求項６】
式（Ｉ）で表わされる一以上のラムノリピドにおいて、Ｒ4が−（ＣＨ2）x−ＣＨ3（ここで、ｘは４〜２０）である請求項１記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラムノリピド類を治療薬の活性成分として使用して、臓器特異性および臓器非特異性の自己免疫疾患、エイズ、パーキンソン病、アルツハイマー病ならびに筋萎縮性側索硬化症等の自己免疫疾患を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本願は米国特許願第０７／８６６，６９１号（１９９２年４月１０日出願、係属中）の一部継続出願であり、その内容をここに本明細書の一部として援用する。
【０００３】
背景の説明
免疫応答
免疫応答においては、究極の標的は抗原（バクテリアまたはその他の侵入物）である。マクロファージ等の抗原細胞は抗原を摂取し、抗原ペプチドへと断片化する。これらのペプチドの一部分は互いに結合して主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子を形成し、それらが細胞表面上に発現する。Ｔ−リンパ球は、ＭＨＣ分子と結合した非天然ペプチドを認識することができるレセプターを有する。Ｔ−細胞は活性化されてリンフォカインまたは化学信号を分泌し、それらが免疫系の他の成分を起動させる。そうして起動される細胞の殆どはＢ−リンパ球である。Ｂ−リンパ球は、さまざまな体液中の抗原の一部分を認識するが、これらの抗原はＭＨＣ分子とは結合していない。Ｔ−細胞は抗原全体を認識することはできない。Ｔ−細胞上のレセプターは抗原の蛋白質フラグメント、即ち通常は８から１５のアミノ酸で構成されたペプチド類を認識する。
【０００４】
したがって、免疫応答には次の２種類がある：即ち、（１）Ｂ−細胞の反応を通して起る体液性免疫、及び（２）Ｔ−細胞を通して起る細胞性免疫である。
ウイルス感染においては、ウイルスは突然変異によってその外層膜を急速に変化させることができるようで、それによって抗体による中和を防ぐ。しかしウイルスがその核の中にウイルス自体の生存プロセスに不可欠な蛋白質類を含む場合は、そうした突然変異が起る余地はない。ウイルスが細胞中で複製されると、ウイルスの蛋白質から短いペプチド鎖が離れ落ち、細胞表面に移動する。それらはＴ−細胞の成熟標的となるので、Ｔ−細胞は感染細胞を攻撃できることとなり、ウイルスの広がりを防止するか、あるいは自己免疫疾患の場合に起きるように体の細胞を攻撃する。
【０００５】
Ｔ−細胞自体は、ＣＤ４（ヘルパー）細胞とＣＤ８（キラー）細胞の２種類の亜集団を有する。Ｔ−細胞のそれぞれの型は、ペプチドを認識できるようにそれぞれ独自のＭＨＣ型を作る。ＣＤ４細胞が適切な化学信号を受け取ると、それらは大量のリンフォカインを産生し、他のＴ−細胞の分裂を加速する。活性化されたＣＤ８細胞は非常に少量のリンフォカインしか産生しないが、これは標的の中に穴をあけて、感染された細胞またはなんらかの形で変化した細胞を殺す化学物質を分泌する能力を有する。
【０００６】
自己免疫疾患
自己免疫疾患は、Ｔ−リンパ球がＭＨＣの自己クラスII分子に結合した自己抗体を認識して活性化された場合に起きる。自己免疫疾患の基本的な特徴の１つは、免疫系が身体の自己成分と他の外部侵入物の成分とを区別することができず、したがって体の免疫系が自分自身に向かうことにある。一卵性双生児の研究で認められるように、これには遺伝的要素が明らかに関与する。多発性硬化症のケースでは、双子の一方が多発性硬化症を発症した場合、もう一方が発症するチャンスは約３０％であることが示されている。
また同一人に一以上の自己免疫症が起きる傾向もある。こうした場合、この関連性は自己免疫スペクトルの同一領域中の疾患同士であることが多い。例えば、自己免疫性甲状腺炎を発症している患者の悪性貧血発症例は、相当する年令および性別のランダム集団の検査における発症例よりもかなり多い。
自己免疫現象はまた、家系に集中する傾向もある。橋本病や悪性貧血の患者は、彼らの一親等の親族内に甲状腺および胃炎の自己抗体を有する例が多い。自己免疫疾患を純然たる臓器特異性のものから臓器特異性の低いものへと順にならべると、次に示すような自己免疫疾患スペクトルが得られる。
【０００７】
臓器特異性自己免疫疾患スペクトル
臓器特異性から臓器非特異性へと降順にならべた場合、次のような自己免疫疾患が含まれる：橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、自己免疫萎縮性胃炎、アジソン病、未熟閉経、男性不妊症、若年型糖尿病、グッドパスチュア症候群（Goodpasture's Syndrome）、交感性眼炎、水晶体性ぶどう膜炎、多発性硬化症、乾癬、自己免疫溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、特発性白血球減少症、原発性胆汁性肝硬変、活性慢性肝炎ＨＢｓ−ｖｅ、特発性肝硬変、尋常性天疱瘡、腫瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、連鎖球菌感染後の糸球体腎炎、リューマチ性関節炎、硬皮症、ワグナー肉芽腫症、多発性／皮膚筋炎。
【０００８】
技術水準におけるこれらの疾患の治療法の殆どは免疫応答の操作を含んだものである。しかしながら多くの臓器特異性疾患においては、代謝コントロールは通常十分にある。即ち、原発性粘液水腫におけるチロキシン置換、若年型糖尿病におけるインスリン、悪性貧血におけるビタミンＢ１２、甲状腺機能亢進症における抗甲状腺薬剤、重症筋無力症や胸腺摘出術におけるアセチルコリンエステラーゼ、全身性ループス・エリテマトーデスや免疫複合腎炎におけるステロイド類、リューマチ性関節炎におけるステロイド類とペニシラミン・サリチル酸塩や金塩等の抗炎症剤との組合わせなどの代謝のコントロールは通常十分である。シクロスポリンＡの有用性は、ぶどう膜炎、早発性Ｉ型糖尿病、ネフローゼ症候群および乾癬、特発性血小板減少性紫斑病、全身性ループス・エリテマトーデス、多発性筋炎、クローン病、原発性胆汁性肝硬変、重症筋無力症、および不応性リューマチ性関節炎などの疾患で証明されている。
【０００９】
ある研究では、特異性抗体を使用して得られる抗原／ＭＨＣ／Ｔ−細胞受容体の複合体を自己免疫疾患の治療のための標的とすることができることを示唆している。アレルギー性脳脊髄炎は、自己免疫疾病の典型的モデルと一般にみなされている急性の神経的自己免疫疾患であり、自己Ｉ−ａと会合したミエリン塩基性蛋白質（ＢＰ）またはそのペプチドを認識するＣＤ４＋Ｔ−細胞に介在されるものである。アレルギー性脳脊髄炎の治療にモノクローナル抗体を使用した研究が報告されている。これらのモノクローナル抗体類はＢＰとＩ−ａｓの複合体のみに結合する。インビトロでは、これらの抗体は遺伝学的に同系のマクロファージに発現するツベルクリンの非関連性抗原精製蛋白質誘導体の応答性には影響を与えずに、ＢＰの脳炎誘発性悪性物質に対する増殖応答性を遮断し、完全なＢＰ(intact BP) に対する応答性を減少させた。これらの抗体はまた、Ｈ−２ｓマウスにおいても実験的なアレルギー性脳脊髄炎を抑制した（非特許文献１）。
【００１０】
エイズ
ＨＩＶのライフサイクルには次のステップが含まれる：
付着、脱外皮、逆転写、ＲＮＡ−アーゼＨの分解、第２の鎖のＤＮＡ合成、核への移行、組込み、潜伏、ウイルス転写、ＲＮＡの核輸送、蛋白質合成、ＲＮＡ安定化、蛋白質のグリコシル化、ＲＮＡの折畳みとビリオンの組立て、ウイルス放出、および成熟。
これら全過程において最も厄介な部分は、ＨＩＶは現在までヒトで試験されたあらゆる抗レトロウイルス剤をすり抜けることができる形に突然変異できることである。その結果、多くの研究者はＨＩＶを打ち負かすためには、ＨＩＶといえども複数の薬剤の組合わせに対しては突然変異で十分素早く耐性を有するに至ることはできないであろうという理論のもとに、ＨＩＶに対して同時にいくつかの薬剤をぶつけなければならないと結論づけている。さらに良い方法はＨＩＶに対して複数の標的を有する単一の薬剤を使用することであろう。
【００１１】
現在ヒトに使用する抗レトロウイルス性ヌクレオシドには、３’−アジドチミジン、２’，３’−ジデオキシイノシンおよび２’，３’−ジデオキシシチジンの３種がある。これらのヌクレオシド類の耐性についてはこれまでに説明がなされている。また臨床ではその他の逆転写酵素（ＲＴ）抑制剤も使用されている。それらのあるものはヌクレオシド類であり、またいくつかは非ヌクレオシド類である。
最近の非常に有望な方法の１つはプロテアーゼ抑制剤を使用するものである。プロテアーゼ抑制剤は、ＨＩＶ複製の後期組込みステップで作用するものであるため、治療的な介入物として魅力的な研究対象である。逆転写酵素抑制剤がＨＩＶ感染前の培養細胞に添加した場合のみＨＩＶ複製を阻止するのに有効であるのに対して、プロテアーゼ抑制剤は慢性感染細胞からのＨＩＶ産生を抑制することができる。
【００１２】
急性および慢性的なＨＩＶ感染細胞中でのＨＩＶ複製を阻止できる抗Ｔａｔ（培養細胞中でのＨＩＶ複製に必要とされる調節蛋白質）剤は、抗ＲＴ剤との組み合わせで有用なものとなる。
ウイルス侵入阻止：ＨＩＶの侵入はＨＩＶｇｐ１２０膜蛋白質が敏感な細胞表面上のＣＤ４分子と非常に特異的に結合することにより始まる。さらに、シンシチウムの形成およびＨＩＶの細胞から細胞への伝播では、未感染細胞表面上でｇｐ１２０とＣＤ４の結合が起きる。ＣＤ４レセプターの可溶性リコンビナント（ｓＣＤ４）またはｓＣＤ４の血清寿命半減時間を延ばすように設計されたキメラＣＤ４−免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、臨床的に得られるレベルで培養細胞中のＨＩＶ感染とシンシチウム形成を効果的に阻止することが示されている（非特許文献２−３）。
【００１３】
ＣＤ４とｇｐ１２０の相互作用を利用するように設計された別の薬剤はＣＤ４−ＰＥ４０であり、これはＣＤ４と緑膿菌細胞外毒素Ａの２つのドメインの融合蛋白質である（非特許文献４−５）。ＣＤ４−ＰＥ４０は、細胞表面に発現されたｇｐ１２０との相互作用を通して感染細胞に結合する。トキシンのドメインの１つが、致死的な第２のドメインが細胞に侵入することを容易にし、その結果、培養物中の感染細胞は死滅する。
核酸および免疫再構築など、異なる進展段階でＨＩＶ複製を阻止するその他の標的も多く存在する。
【００１４】
ＨＩＶ複製を阻止するための免疫再構築は、免疫系を操作することにより補完される。見込みのありそうなＨＩＶワクチンを使用して、ＨＩＶ感染者の既存の免疫応答を増加させたり、または新たな応答を刺激する方法は各所で報告されている（非特許文献６）。免疫操作をベースとした別の方法は、相似線維芽細胞中にｅｎｖ遺伝子をｅｘ  ｖｉｖｏでレトロウイルス介在的に導入するものであり（非特許文献７−８）、この細胞を患者に戻して抗−ｅｎｖ免疫応答を刺激するものである。ＨＩＶ（ＩＩＩＢ）被膜を発現する同系の細胞でマウスを免疫することにより創出される細胞障害性Ｔ−リンパ球（ＣＴＬ）の研究では、これらのＣＴＬが、いくつかの臨床的単離物も含め、多様なＨＩＶ菌株に共通する決定基を認識することが示されている（非特許文献９）ＨＩＶワクチンはまた、既存の免疫応答も増進させることができる（非特許文献１０）。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）等のある種のサイトカイン類も、ＨＩＶ合成に何らかの作用を有することがある。インターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−α）はインビトロでＨＩＶ複製を阻止する。ＣＤ８＋（ＭＨＣ）クラス−制限細胞障害性Ｔ−リンパ球は組織培養中のＨＩＶ感染細胞を殺し、溶解因子の放出によりＨＩＶ複製を阻止することができる。免疫能力の再構築は、ＣＤ４細胞の数を非永久的に大量に増加させるＩＬ−２を導入することにより行われている。文献にはＩＬ−２とグリコールまたはＡＺＴ（３−アジドチミジン）との別の組合わせもいくつか見られる。
【００１５】
アルツハイマー病、パーキンソン病ならびに筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）
アルツハイマー病、パーキンソン病ならびに筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の神経変性障害の原因はわかっていない。これらの障害はそれぞれ主として、ペプチド性神経伝達物質（可能性としてはサブスタンスＰ）が失われることにより引き起こされるものであるとされている。この喪失が今度はこれら疾患のそれぞれで見られる古典的な神経変性を創出する。この神経変性は、幼少期におけるＣＮＳのウイルス感染に続く自然の老化と長期にわたる自己免疫崩壊が組み合わされた結果起こるものである。したがって上記の喪失は徐々に起こり、臨床症状が見られる時迄には抗原刺激が取り除かれるに伴って炎症プロセスは消失してしまう（非特許文献１１）。
【００１６】
その他臨床研究および動物モデルによる研究の両方における所見で、加齢による痴呆に神経免疫的な成分の存在が示唆されている。臨床研究では、アルツハイマー病患者の亜集団において痴呆と脳反応性自己抗体の間の関連性が示唆されている。マウスにおける研究では、ａ）正常な遺伝型と比べて自己免疫性を強化した突然変異マウスの場合は、暦年令の早い段階で学習および記憶障害が認められ；ｂ）自己免疫型および正常マウスの学習および記憶は定性的には似ており；またｃ）正常加齢マウスと自己免疫型マウスの行動欠陥は加齢痴呆のための同様の薬理学的治療で効果がある、ことが示唆されている（非特許文献１２）。
【００１７】
Ｌ−ドーパを使用した何ヵ月もの治療でよくならなかったパーキンソン症状でも、コルチコステロイドの３週間投与で改善されたという臨床的証明もある。したがってナガオ[Nagao] らは、薬剤耐性パーキンソン症状（振せん麻痺）の根源的な原因の１つが自己免疫疾患であると提唱している（非特許文献１３）。
特発性振せん麻痺（パーキンソン病）の病因に関するフリーラジカル仮説は自己免疫メカニズムに立脚した議論と多くの類似点がある。両者とも、神経破壊に関与すると思われる細胞性および分子性のからくりを提示している。最近では、フリーラジカル仮説が特に優勢になっている。何人かの研究者が、フリーラジカルによる損傷が疾患のプロセスにひそむ大きな要因であるとする説を支持する観察結果を報告している。（非特許文献１４）。
【００１８】
筋萎縮性側索硬化症は、特発性のヒト脊髄および脳運動神経の変性疾患である。多くの文献（非特許文献１５−１７）で、それらはすべての点において自己免疫性疾患であるとされている。
【００１９】
ラムノリピド
ラムノリピドはバイオ界面活性を有するグリコリピドの一群である。炭水化物と脂質の異なる組合わせ、異なる結合および異なるイオン状態によって、親水性／親油性バランスの大きく異なる多くの糖脂質（グリコリピド）がある。シュードモナス属（Psedomonas）の種々の菌株は、溶解性または不溶性の炭素源を用いて培養した場合に、ラムノリピドを細胞外に分泌する能力があることが知られている。
ラムノリピド類は全体として、また特定の種々のラムノリピド化合物としても、ある種の生物学的活性を有することは知られているが、今日まで誰もラムノリピド類を自己免疫疾患の治療に使用することは示唆しておらず、とりわけ臓器特異性（または非特異性）自己免疫疾患、エイズ、アルツハイマー病、パーキンソン病、あるいは筋萎縮性側索硬化症に対するラムノリピド類の有効性については全く示唆されていない。
【００２０】
イシガミ[Ishigami]Ｙ．らは、特許文献１において、ラムノリピドＡおよびＢまたはそれらの塩を含むリポソーム類は、薬剤、蛋白質、核酸、色素およびその他の化合物を供給するためのマイクロカプセルとして有用であることを開示している。そのような小胞に入れたラムノリピドの使用法として唯一考えられているのは明らかに補助的な性格のもの、つまりさまざまな研究のためのツールとして、ならびに治療目的のための薬剤キャリヤーとして役立てるというものである。
【００２１】
ワグナー[Wagner]らは、特許文献２において、緑膿菌およびその他いくつかのバクテリアが有する能力である、不溶性炭素源（ｎ−ヘキサデカン）を資化する能力に関するラムノリピド（Ｉ）の増殖促進効果を開示している。この効果はラムノリピドの界面活性特性に関係するものである。ラムノリピドが増殖培地中に存在（分泌されて、または添加された結果として）すれば、増殖するバクテリアが不溶性炭化水素をエマルション化して取り込みやすくする。このケースでのラムノリピドの役割はマイクロエマルションの形成であり、それによって微生物細胞中に炭化水素栄養素を拡散できるようにするものである。
【００２２】
イトウ[Itoh]らは、非特許文献１８において、ラムノリピド類はインビトロにおいて異なる生物学的活性を示すことがあると報告している。彼らはまた異なった緑膿菌株からのラムノリピド類の殺マイコプラズマ、抗ウイルスおよび抗生物活性についても開示している。いくつかのグラム（＋）バクテリアおよび尋常性プロテウス属に対する抗生物質活性は、モノラムノシル化合物がジラムノシル化合物よりかなり大きかったと開示されている。
【００２３】
ラング[Lang]らは、非特許文献１９において、インビトロでテストしたラムノリピド類の抗生物質活性について報告している。グラム（＋）バクテリアは異なる細胞壁構造および浸透性のためにグラム（−）バクテリアより強く抑制された。
【００２４】
シュリオック[Shryock] らは、非特許文献２０において、シュードモナスのラムノリピドは白血球のケモタキシス（走化性：特定方向への集団移動）およびケモキネシス（無定位運動：強化されたランダム集団移動）の両方を刺激することを開示している。白血球の濃度が高い場合には溶血されるが、これはラムノリピドの溶血特性を表わしている。テストは緑膿菌株により引き起こされた嚢胞性線維症について行われているが、宿主−寄生虫の相互作用の重要性が推測されている。
【００２５】
特許文献３は、経口または非経口的に適用される抗炎症組成物の活性成分としてのラムノピラノシルデカン酸を開示している。その効果はホスホリパーゼＡ２の抑制効果によるものである。
非特許文献２１は、化粧品、医薬品および食品に有用なグリコリピドなどを含む乳化組成物について述べている。但しそのような組成物中でラムノリピドが薬理学的活性を持つとは何ら説明されていない。
ヒラヤマ[Hirayama]らは、非特許文献２２において、緑膿菌株から単離された新規なメチル−ラムノリピド類は、抗菌、殺マイコプラズマ、および抗ウイルス活性を有する生物学的活性物質であることを開示している。
特許文献４は、例えばポテト−Ｘ−ウイルス、またはタバコモザイク病ウイルスに対する抗植物性ウイルス治療法の可能性に関するものである。
【００２６】
特許文献５においては、枯草菌に対する抗生物質活性が述べられており、またマイコプラズマに対する生物学的活性に関しても説明されている。
ハフェルブルグ[Haferburg] らは、非特許文献２３において、緑膿菌株１９６Ａからのラムノリピドが過敏な宿主Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｇｌｕｔｉｎｏｓａ  Ｌの葉の上のタバコモザイクウイルスの局所病変の数を最大９０％減少させることを示している。ムラサキツメクサ斑点ウイルスも同じ程度にラムノリピドによる影響を受けている。
特許文献６において、ピリャック[Piljac]，Ｇ．らは乾癬および関連する皮膚疾患の治療におけるラムノリピド類の局所適用について開示している。
特許文献７において、ピリャック[Piljac]，Ｇ．らはラムノリピド類の表面張力および界面張力特性をベースとして、異なる産業への応用の可能性を開示している。
【特許文献１】米国特許第４，９０２，５１２号明細書
【特許文献２】米国特許第４，８１４，２７２号明細書
【特許文献３】ドイツ特許ＤＤ−Ａ−２４８２７９号明細書
【特許文献４】ドイツ特許ＤＥ−Ａ−２１５０３７５号明細書
【特許文献５】ベルギー特許第１，００５，７０４号明細書
【特許文献６】ベルギー特許第１，００５，８２５号明細書
【非特許文献１】アハローニ（Aharoni), Ｒ；Ｎａｔｕｒｅ  １９９１，３５１（６３２２）
【非特許文献２】Ｊ．Ｏ．カーン[Kahn]ら、Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１１２，２５４（１９９０）
【非特許文献３】Ｄ．Ｊ．カポン[Capon] ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３７，５２５（１９８９）
【非特許文献４】Ｐ．アショーン[Ashorn]ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７，８８９（１９９２）
【非特許文献５】Ｖ．Ｋ．ショーダリー[Shaudhary] ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３５，３６９（１９８８）
【非特許文献６】Ｂ．Ｆ．ヘインズ[Haynes]、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０，１２８９；１９９３
【非特許文献７】Ｊ．Ｆ．ワーナー[Warner]ら，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ７，６４４５（１９９１）
【非特許文献８】Ｄ．Ｊ．ジョリー[Jolly] およびＪ．Ｆ．ワーナー，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．＃２，３２９（１９９０）
【非特許文献９】Ｓ．チャダ[Chada] ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７
【非特許文献１０】（Ｂ．Ｆ．ヘインズ[Haynes]，Ｓｃｉｎｅｃｅ  ２６０，１２８９；１９９３
【非特許文献１１】バーカー[Barker]，Ｒ．，Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ，１９９１年１０月，２０（２）
【非特許文献１２】フォースター[Forster] ，Ｍ．Ｊ．ら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，１９９０年９月，２５（３）
【非特許文献１３】ナガオ[Nagao] ，Ｔ．ら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１９９１年１１月，３１（１１）
【非特許文献１４】カルネ[Calne] ，ＤＢ，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆＮｅｕｒｏｌｏｇｙ，１９９２年１２月，３２（６）
【非特許文献１５】キムラ[Kimura]，Ｆ．ら，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１９９４年２月
【非特許文献１６】アペル[Appel] ，ＳＨら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９３年９月
【非特許文献１７】ハンセン[Hansen]，ＰＲら，Ｕｇｅｒｓｋｒｉｆｔ  ｆｏｒ  Ｌａｅｇｅｒ，１９９１年２月
【非特許文献１８】イトウ[Itoh]ら，Ｊ．ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  １９７１，２４，（１２）：８５５
【非特許文献１９】ラング[Lang]ら，Ｆａｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９８９年９月：３６３
【非特許文献２０】シュリオック[Shryock]，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８４年１０月：３２３
【非特許文献２１】ダーウェントアブストラクト  ８５−２７２３３８
【非特許文献２２】ヒラヤマ[Hirayama]ら，Ｆｅｂｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９８２，１３９、１：８１
【非特許文献２３】ハフェルブルグ[Haferburg]，Ａｃｔａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａ  ７，No. ４，１９８７，ｐ３５３
【発明の開示】
【００２７】
発明の要旨
したがって本発明の目的は、一以上のラムノリピド類を活性成分として含む組成物を投与することにより、自己免疫疾患を治療する方法を提供することにある。
本発明のさらに別の目的は、一以上のラムノリピド類を活性成分として含む組成物を、免疫回復を必要とする患者に投与することによって免疫を回復させる方法を提供することにある。
【００２８】
本発明の別の目的は、一以上のラムノリピド類を活性成分として含む組成物を使用して、免疫調節を必要とする患者の免疫系の免疫調節を行う方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、一以上のラムノリピド類を活性成分として含む組成物を使用して、臓器特異性および臓器非特異性自己免疫疾患を治療する方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、一以上のラムノリピド類をそれらを必要とする患者に投与することによって、エイズを治療する方法を提供することにある。
【００２９】
本発明の別の目的は、一以上のラムノリピド類を活性成分として含む組成物で処置することにより、アルツハイマー病、パーキンソン病、ならびに筋萎縮性側索硬化症を治療する方法を提供することにある。
【００３０】
本発明の上記のおよびその他の目的は、式（Ｉ）のラムノリピド類：
【００３１】
【化１】
2007308514.tif 000002
【００３２】
［式中、Ｒ1はＨまたはα−Ｌ−ラムノピラノシル；
Ｒ2はＨまたは−ＣＨ（Ｒ4）−ＣＨ2−ＣＯＯＨ；
Ｒ3は（Ｃ5−Ｃ20）−飽和、モノまたはポリ不飽和ヒドロカルビル；
そして  Ｒ4は（Ｃ5−Ｃ20）−飽和、モノまたはポリ不飽和ヒドロカルビルである］が免疫活性を与え、また免疫回復および免疫調節に有効なものであり、したがって臓器特異性および臓器非特異性自己免疫疾患、エイズ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ならびに筋萎縮性側索硬化症に有効な治療を与えるとの発見によって達成された。
【００３３】
本発明は、以下に係る発明を提供するものである。
（１）  式（Ｉ）：
【００３４】
【化２】
2007308514.tif 000003
【００３５】
［式中、Ｒ1はＨまたはα−Ｌ−ラムノピラノシル；
Ｒ2はＨまたは−ＣＨ（Ｒ4）−ＣＨ2−ＣＯＯＨ；
Ｒ3は（Ｃ5−Ｃ20）−飽和、モノまたはポリ不飽和ヒドロカルビル；
そして  Ｒ4は（Ｃ5−Ｃ20）−飽和、モノまたはポリ不飽和ヒドロカルビルである］で表されるラムノリピド類の一以上を活性成分として含有する医薬組成物を、それらを必要とする患者に有効量投与することを特徴とする自己免疫疾患用医薬組成物。
【００３６】
（２）  自己免疫疾患が、臓器特異性自己免疫疾患及び臓器非特異性自己免疫疾患からなる群から選択される疾患である前記（１）記載の組成物。
【００３７】
（３）  自己免疫疾患が、乾癬、魚鱗癬、尋常性天疱瘡、全身性エリテマトーデス、及び偏平紅色苔癬からなる群から選択される疾患である前記（１）記載の組成物。
【００３８】
（４）  自己免疫疾患が、エイズ、パーキンソン病、アルツハイマー病及び筋萎縮性側索硬化症からなる群から選択される疾患である前記（１）記載の組成物。
【００３９】
（５）  医薬組成物の形態が、クリーム、ローション、注射液、錠剤、カプセル剤、及び経口摂取可能な溶液および懸濁液からなる群から選択される形態のものである前記（１）記載の組成物。
【００４０】
（６）  ラムノリピドが、式（ＩＩ）：
【００４１】
【化３】
2007308514.tif 000004
【００４２】
で表されるラムノリピドである前記（１）記載の組成物。
【００４３】
（７）  式（Ｉ）で表わされる一以上のラムノリピドにおいてＲ1が、α−Ｌ−ラムノピラノシルである前記（１）記載の組成物。
（８）  式（Ｉ）で表わされる一以上のラムノリピドにおいて、Ｒ3が−（ＣＨ2）x−ＣＨ3（ここで、ｘは４〜２０）である前記（１）記載の組成物。
（９）  式（Ｉ）で表わされる一以上のラムノリピドにおいて、Ｒ4が−（ＣＨ2）x−ＣＨ3（ここで、ｘは４〜２０）である前記（１）記載の組成物。
【００４４】
（１０）  式（Ｉ）：
【００４５】
【化４】
2007308514.tif 000005
【００４６】
［式中、Ｒ1はＨまたはα−Ｌ−ラムノピラノシル；
Ｒ2はＨまたは−ＣＨ（Ｒ4）−ＣＨ2−ＣＯＯＨ；
Ｒ3は（Ｃ5−Ｃ20）−飽和、モノまたはポリ不飽和ヒドロカルビル；
そして  Ｒ4は（Ｃ5−Ｃ20）−飽和、モノまたはポリ不飽和ヒドロカルビルである］で表されるラムノリピド類の一以上を活性成分として含有する、乾癬、魚鱗癬、尋常性天疱瘡、全身性エリテマトーデス、偏平紅色苔癬、エイズ、パーキンソン病、アルツハイマー病及び筋萎縮性側索硬化症からなる群から選択される疾患の治療に使用するための免疫回復用医薬組成物。
【００４７】
（１１）  医薬組成物の形態が、クリーム、ローション、注射液、錠剤、カプセル剤、及び経口摂取可能な溶液および懸濁液からなる群から選択される形態のものである前記（１０）記載の組成物。
【００４８】
（１２）  ラムノリピドが、式（ＩＩ）：
【００４９】
【化５】
2007308514.tif 000006
【００５０】
で表されるラムノリピドを含有するものである前記（１０）の組成物。
【００５１】
（１３）  式（Ｉ）で表わされる一以上のラムノリピドにおいて、Ｒ1がα−Ｌ−ラムノピラノシルである（１０）記載の組成物。
（１４）  式（Ｉ）で表わされる一以上のラムノリピドにおいて、Ｒ3が−（ＣＨ2）x−ＣＨ3（ここで、ｘは４〜２０）である前記（１０）記載の組成物。
（１５）  式（Ｉ）で表わされる一以上のラムノリピドにおいて、Ｒ4が−（ＣＨ2）x−ＣＨ3（ここで、ｘは４〜２０）である前記（１０）記載の組成物。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５２】
好ましい実施態様の説明
本発明は、式（Ｉ）のラムノリピド類の一以上を活性成分として含有する組成物を、それらを必要とする患者に治療有効量投与することにより、各種の自己免疫疾患を治療する方法に関する。
【００５３】
【化６】
2007308514.tif 000007
【００５４】
［式中、Ｒ1はＨまたはα−Ｌ−ラムノピラノシル；
Ｒ2はＨまたは−ＣＨ（Ｒ4）−ＣＨ2−ＣＯＯＨ；
Ｒ3は（Ｃ5−Ｃ20）−飽和、モノまたはポリ不飽和ヒドロカルビル；
そして  Ｒ4は（Ｃ5−Ｃ20）−飽和、モノまたはポリ不飽和ヒドロカルビルである］。
本発明の方法で使用される組成物において、好ましいラムノリピドはジラムノリピド（ｒ1＝α−Ｌ−ラムノピラノシル）である。
さらに、置換基Ｒ2がＨの場合、ラムノリピドはただ１つのリピドグループを含有するだけであり、一方Ｒ2が−ＣＨ（Ｒ4）−ＣＨ2−ＣＯＯＨの場合は、ラムノリピドは１つのエステル結合により結合された２つのリピドユニットを有するものである。
置換基Ｒ3およびＲ4は直鎖、または分岐鎖Ｃ5−Ｃ20炭化水素基であり、これらは飽和あるいは一以上の不飽和部位を含むものとすることができる。好ましいのは、式−（ＣＨ2）x−ＣＨ3の直鎖飽和アルキル基で、ｘ＝４−２０のものである。最も好ましいのは、直鎖飽和アルキル基でｘ＝４−６のものである。
最も好ましいラムノリピドの実施態様は下記の式（ＩＩ）の化合物である：
【００５５】
【化７】
2007308514.tif 000008
【００５６】
本発明のラムノリピド類を合成する能力のあるバクテリアは油井掘削泥から単離することができる。この泥には水溶性炭素栄養源（グルコース）または不溶性炭素栄養源（グリセリン、軽油）のいずれかでバクテリアを培養した時にラムノリピド類を産生するバクテリアが含まれていることが知られている。好適なバクテリアが単離され、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）であると特定された。
【００５７】
本発明の方法に基づいて自己免疫疾患を治療する場合には、活性成分として式（Ｉ）のラムノリピドを一以上含む製薬組成物をそれらを必要とする患者に投与する。各種の自己免疫疾患の中で、本法は臓器特異性および臓器非特異性自己免疫疾患の治療に好ましいが、特に乾癬、偏平紅色苔癬、全身性ループス・エリトマトーデス、魚鱗癬、エイズ、アルツハイマー病、パーキンソン病、および筋萎縮性側索硬化症の治療に最も好ましい。
【００５８】
この製薬組成物は、経口、経静脈、腹腔内および経皮投与に限らず、従来のどのような方法でも投与することができる。投与量は治療する患者の体重により異なるが、ＬＤ90、ＬＤ50、ＬＤ10および１用量致死量、ならびに１用量毒性（１日１用量）、５用量毒性（１日１用量で５日間５用量）および５用量毒性（１日５用量）から医学分野における当業者によって容易に決定することができる。本発明のラムノリピドの用量範囲は、４．０ｍｇ／ｋｇから１３．０ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは４．５ｍｇ／ｋｇから１２．５ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは６．５ｍｇ／ｋｇから１１．５ｍｇ／ｋｇである。成人に対する治療用量は約１００ｍｇ／日から１０００ｍｇ／日である。
【００５９】
この製薬組成物は、水性懸濁液、クリームまたはローションとしてもよく、また水性注射液あるいは薬剤分野で常用される錠剤またはカプセル用賦形剤を使用して錠剤またはカプセルに入れた固形状とすることもできる。組成物を液状（または懸濁液）あるいはカプセルまたは錠剤で経口投与する場合は、組成物中に薬剤分野で常用されている適当な緩衝剤を加え、治療する患者の消化管を保護し、また患者が腹痛を起こさないようにするのが望ましい。
【００６０】
以下の実施例の中で提示するデータは、本発明のラムノリピド、特にラムノリピド（ＩＩ）の一般的な薬理学的プロファイルと、自己免疫疾患の治療におけるラムノリピドの効果に関するデータの両方を示すものである。
インビトロの試験結果、特に自己免疫疾患の治療に関するデータは、リポキシゲナーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、カルボキシペプチダーゼＡおよびトリプシンから選択した酵素の抑制作用と、ＤＮＡ合成、細胞毒性、Ｔ−リンパ球増殖およびＣｏｎＡ共存でのＴ−リンパ球増殖に対するラムノリピドの作用に関するデータを含んでいる。
インビボの試験結果、特に自己免疫疾患の治療に関するデータは、細胞の免疫抑制に対するラムノリピドの効果（オキサゾロン誘発の遅延型過敏性）と、免疫回復（シクロホスファミドとカンジダ感染での免疫抑制）、ならびに免疫調節（カンジダ・アルビカンス感染）に関するデータを含んでいる。
同じく以下に含まれるものには、いくつかの皮膚自己免疫疾患の治療に関する臨床データがあるが、これらは自己免疫疾患であると認定されている乾癬および偏平紅色苔癬に対して、コルチコステロイド類を使用する従来の治療法と比較した場合に、本発明のラムノリピドが優れた治療効果を有することを示すものである。
【００６１】
α−Ｌ−ラムノピラノシル−（１，２）α−Ｌ−ラムノピラノシル）−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸（ラムノリピドＩＩ）の酵素抑制に関するインビトロテストでは、種々の濃度で下記の酵素が抑制されることが示された：
−リポキシゲナーゼ  １０μｇ／ｍＬ
−アセチルコリンエステラーゼ  １ｍｇ／ｍＬ
−α−アミラーゼ  １ｍｇ／ｍＬ
−β−ガラクトシダーゼ  １００μｇ／ｍＬ
−カルボキシペプチダーゼＡ  １ｍｇ／ｍＬ
−トリプシン  １ｍｇ／ｍＬ
【００６２】
本発明のラムノリピドは濃度１００μＭで、ｐ５６lck チロシンキナーゼに対して、またｐ５９fyn チロシンキナーゼに対しても同濃度で、非常に弱い抑制効果（それぞれ、１１％と１５％の抑制）を示す。以下の酵素に対しては活性は全く認められなかった：α−キモトリプシン、パパイン、エラスターゼ、α−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、およびアデノシンデアミナーゼ。
【００６３】
本発明のラムノリピドは０．１ｍｇ／ｍＬ濃度で、血清成長因子が存在しない状態において、Ａ４３１細胞でのＤＮＡ合成の抑制を示し、ラムノリピドIIでは完全な抑制を示す。本発明のラムノリピドは０．０５ｍｇ／ｍＬでも、ホルボールミリステート−アセテート（ＰＭＡ）、プロテインキナーゼＣアクチベーター（ＰＫＣ）の細胞“抑制”作用を悪化させる。本発明のラムノリピドのＡｍｅｓテストは陰性であった。濃度１０μＭおよび１μＭのラムノリピドを使用したＢ細胞増殖の機能分析においては、リポ多糖類が存在しない場合は何の刺激あるいは抑制効果を示さなかったが、リポ多糖類が存在する場合はＢ細胞増殖にかなりの抑制が見られた。Ｔ−細胞の増殖は、１０μＭのラムノリピドが存在する場合に、ＣｏｎＡが共存する場合もしない場合も抑制された。１００μＭのラムノリピドが存在する場合は、ドーパミンＤ1（ヒト・リコンビナント）[3Ｈ] ＳＣＨ２３３９０レセプターおよびドーパミンＤ2A（ヒト・リコンビナント）[3Ｈ] スピペロンレセプターはそれぞれ抑制され、ラムノリピドＩＩはドーパミンＤ1レセプターを１０１％抑制し、またドーパミンＤ2Aレセプターを５３％抑制した。
【００６４】
本発明のラムノリピド類は、濃度７．５ｍｇ／ｋｇでマウスのインビボ静脈内投与４日後に、好中球のかなりの増加とリンパ球の減少を示した。同じ結果がラムノリピド投与２９日後にも見られた。
免疫薬理学的テスト結果では本発明のラムノリピドは、オキサゾロン誘発遅延型過敏性でみる細胞の免疫刺激性は示さないが、オキサゾロン誘発遅延型過敏性の細胞免疫抑制テストではラムノリピドによる中程度の免疫抑制作用を示した。体液の免疫刺激および免疫抑制テストでは何ら顕著な作用は示さない。カンジダ・アルビカンス感染による本発明のラムノリピドの免疫調節テストでは、濃度１０ｍｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇの範囲のラムノリピド（ＩＩ）が中程度の作用を示した。シクロホスファミドによる免疫抑制とカンジダ・アルビカンスによる感染に基づく免疫薬理学的テストでは、本発明のラムノリピドは１０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の濃度であっても非常に強い免疫回復作用を示し、腹腔内投与では０．１ｍｇ／ｋｇの濃度でも中程度の免疫回復を示した。
【００６５】
ラムノリピド（ＩＩ）の静脈内投与により、マウスの平均ＬＤ50は１０５．０ｍｇ／ｋｇと判明した。脊髄細胞の染色体構造異常に関するインビボの小核テストにおいて、上述のラムノリピドは３１．５ｍｇ／ｋｇ動物体重の濃度では、対照群と比較して染色体にも染色分体にも何ら悪作用は及ぼさなかった。
【００６６】
アルツハイマー病、パーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症は自己免疫疾患であるという証拠が科学文献には多いことから、そのような病気の治療は免疫的な機能障害を治療することを目標にすべきであるということになる。これは即ち適用される薬剤は、免疫抑制、免疫調節および免疫回復作用が証明されたものであるべきということになる。エイズもまた自己免疫不全疾患である。したがってエイズに対する多くの新しい治療法には、免疫再構築やＴ細胞へのウイルス侵入の阻止が含まれている。
【００６７】
本発明のラムノリピド（ＩＩ）は濃度１０μｍｏｌ／ｋｇで、ＣｏｎＡの刺激の有無にかかわらず、インビトロでＴ細胞の免疫抑制作用を示した。またこの物質は中程度のインビボ免疫調節作用と、非常に強いインビボ免疫回復作用を示した。乾癬などの皮膚の自己免疫疾患に対する臨床実験において、１％のラムノリピド（ＩＩ）はコルチコステロイド類と比較して長期にわたり治療効果が持続することが示された。それどころか、ある患者では治療した部分が３年経過後でもなお寛解状態にある。
このラムノリピドは自己免疫疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびエイズで特定の役割を果たす種々の酵素に対して抑制効果を示した。リポキシゲナーゼ抑制剤（チェン[Chen]，Ｆ．ら、Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９１）は、実験的な自己免疫性ぶどう膜の発達抑制に顕著な効果を示した。スパーニー[Spurney] ，Ｒ．Ｆ．ら（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、１９９１年１月）は、腎臓中のロイコトリエン産生の増加がループス腎炎の病原性に重要であろうということを示している。
【００６８】
アイゼンロール[Eisenlohr] ，ＬＣら（Ｃｅｌｌ、１９９２年１２月）は、膜カルボキシペプチダーゼＡの発現が、ＭＨＣクラスＩ−制限細胞障害性Ｔ−リンパ球に対するある種の内因性合成ペプチドの作用を強化するとしている。したがって、カルボキシペプチダーゼＡの抑制が、ＭＨＣクラスＩ−制限細胞障害性Ｔ−リンパ球に対するペプチドの発現を防止するのに重要である。
ウォール[Wall]，ＪＲら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１９９３年１２月）は、β−ガラクトシダーゼとの融合蛋白質を開示しており、これは甲状腺が関与する眼障害、バセドウ病の甲状腺機能亢進の患者の２９−４３％、ならびに未治療の橋本甲状腺障害の患者で検出されたものである。β−ガラクトシダーゼの阻害はこの融合蛋白の生成を防ぐことができる。
【００６９】
アセチルコリンエステラーゼの抑制は、アルツハイマー病に対する新薬を見つけるための周知の方法である。カカベロス[Cacabelos] ，Ｒら（Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９９３年９月）は、アルツハイマー病に見られるコリン作働性機能障害は、神経栄養のアンバランス、神経免疫の障害、および／またはアセチルコリンニューロン中のβ−アミロイドの堆積およびＮＦＴ（神経細繊維のもつれ）の形成による直接的な影響に関連するコリン作働性ニューロンの特異な脆弱性によるものであろうと提唱している。この仮説によれば、アルツハイマー病の多元的治療が、１）β−アミロイドとＮＦＴ形成の抑制と；２）ニューロン膜の完全性の回復；そして３）神経免疫の自己攻撃のコントロール、がもたらされることになる。
【００７０】
ガブダ[Gabuzda] ，Ｄら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９３年１２月）は、プロテインキナーゼＣの活性化（ＰＫＣ活性化）がβ−アミロイドの産生を抑制するとした。ヒトＡ４３１表皮細胞の組織培養において示されているように、本発明のラムノリピド（ＩＩ）は、フォルボール−ミリステート−アセテート（ＰＭＡ）、プロテインキナーゼＣアクチベーターの細胞“抑制”作用を、０．０５ｍｇ／ｍＬでも弱めた。したがって、本発明のラムノリピド類はまたＰＫＣアクチベーターでもある可能性がある。したがって、これらの物質はヒトにおけるβ−アミロイドの産生を抑制するであろう。
【００７１】
コザキ[Kozaki]，Ｙ．ら（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、１９９３年４月）は、トリプシン抑制剤がＨｅＬａ細胞のトリプターゼ活性も著しく抑制することを示している。膜結合のトリプターゼＴＬ２は、ＨＩＶ−１の外層膜蛋白質ｇｐ１２０の  Ｖ３ドメインと相互作用してｇｐ１２０に結合する。この結合はトリプターゼＴＬ２抑制剤によって選択的に阻止された（キド[Kido]，Ｈら；ＦｅｂｓＬｅｔｔｅｒｓ、１９９１年７月）。このトリプシン様プロテイナーゼは、ＨＩＶ被膜のリコンビナントｇｐ１２０によって抑制された。ＨＩＶが標的細胞に結合・侵入する場合にこれら外層膜の糖蛋白質が決定的な役割を果たすことから、ＣＤ４に対する補助的または代替レセプターとしての膜関連のプロテイナーゼの抑制は、ウイルスが宿主細胞に入るのを防止し、またＨＩＶ感染の広がりを防止することになる。したがって、本発明のラムノリピドのようなトリプシン抑制剤はトリプシン様プロテイナーゼがヒトＴ４−リンパ球へ結合するのを防止する。
【００７２】
ベルギー特許第１，００５，７０４号において、本発明者らは臨床データによって、乾癬および偏平紅色苔癬などの自己免疫疾患の治療に１％ラムノリピド軟膏を適用した場合に強力な作用を有することを示した。同じ特許の中で、尋常性天疱瘡、魚燐癬、および全身性ループス・エリテマトーデスなどのその他の自己免疫疾患についても当然同じような作用が考えられるとした。
ここに示した結果は、本発明のラムノリピドがある種の自己免疫疾患の進展に関与する種々の酵素に対して非常に顕著な抑制作用を有することを示しており、また非常に有望な免疫活性、特に免疫回復性を有し、同時に皮膚自己免疫疾患に対する臨床的な証明もしており、これらのことから活性成分として一以上のラムノリピドを含有する薬用組成物が、エイズ、パーキンソン病、アルツハイマー病および筋萎縮性側索硬化症などの臓器特異性および非特異性自己免疫疾患の治療に有効であることを示している。
【００７３】
本発明を全般的に説明してきたが、以下に示す特定の実施例を参照すればさらに理解を深めることができよう。ただし、これらの実施例は説明の目的で提示したものであって、特に断らない限り本発明を限定するものではない。
【００７４】
実施例
菌株の特性
選択培地を使用して油井泥から、ラムノリピドバイオ界面活性剤を分泌する能力のある桿状のグラム（−）バクテリアを単離した。ＢＢＬRＭｉｎｉｔｅｋTM番号同定システムの「非発酵およびその他のグラム（−）バクテリア用インストラクション」（ＢＢＬR微生物学システム；１９８７）を適用することにより、このバクテリア株はタイプ番号６４６０１１の緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）と同定された。上記の番号同定においてプロファイル番号を割り出した反応の他に、下記の増殖テストも行った：
【００７５】
試験                                    結果
オキシダーゼ                              ＋
嫌気性デキストロース                      −
好気性デキストロース                      ＋
マルトース                                −
サッカロース                              −
Ｄ−キシロース                            ＋
アルギニンジヒドロラーゼ                  ＋
リシンデカルボキシラーゼ                  −
オルニチンデカルボキシラーゼ              −
ウレアーゼ                                −
ＯＮＰＧ                                  −
インドール                                −
唯一の炭素源としてクエン酸塩              ＋
硝酸塩の亜硝酸塩への還元                  −
脱窒素（Ｎ２）                            ＋
でんぷんの加水分解                        −
フェニルアラニンの脱アミノ                −
ＭａｃＣｏｎｋｏｙプレート上での増殖      ＋
ＳＳプレート上での増殖                    ＋
【００７６】
増殖可能な最高温度は２４時間曝露で４５℃であった。増殖可能な最大ＮａＣｌ許容度は２４時間曝露で９％であった。
【００７７】
ラムノリピドの産生と単離
Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ産生株を好気的に１５Ｌ（ＬＫＢ）バイオリアクターで２８−３２℃の半連続条件（ＲＦＢＣ）で、または３０Ｌ発酵器（Ｅｌｅｃｔｒｏｌｕｘ）を用いてバッチ方式で培養した。ＲＦＢＣ法のエアレーションは２．０−３．０Ｌ／分、ボルテックス混合は４００−８，０００ｒｐｍで、バイオリアクターの作業容量は泡があるためにバイオリアクター全容量の２／３を超えないようにした（ＬＫＢ発酵器の場合は４．５−７．１Ｌとした）。バッチ法の場合は３０Ｌ発酵器でエアレーションを５．０−３０．０Ｌ／分、６００−１，０００ｒｐｍのボルテックス混合とし、Ｅｌｅｃｔｒｏｌｕｘ発酵器の作業容量は１２Ｌとした。
【００７８】
バッチ生産においてグルコースの最初の濃度は９．０ｇ／Ｌとしたが、１５−２０時間の培養後には２．０−２．５ｇ／Ｌに減少し、培養終期に近づくにつれ１．５−２．０ｇ／Ｌに低下した。バイオリアクターへの接種物は、ブラウン・ロータリー・シェーカー（２４０ｒｐｍ）上、５００ｍＬフラスコ（培地１００ｍＬ）中で４８時間増殖させ、調製した接種物を発酵器中の培地に５％添加した。
【００７９】
半連続培養方法においては、プロセスはバッチ方式で開始し、２４時間培養したが、その間にグルコース濃度は２．０ｇ／Ｌに低下しそうだったので、新しい培養培地を３．０Ｌ／８ｈの割合で添加しなければならなかった。８時間毎に３．０Ｌの使用後培養液を抜き取った（または４時間毎に１．５Ｌを抜き取った）。グルコース濃度は２．０ｇ／Ｌから４．５ｇ／Ｌの範囲で変動した。バイオリアクターには上述の接種物を５％植え込んだ。培養温度は両法とも３２℃とした。
【００８０】
ｐＨはｐＨ電極により自動的にモニタし、表面張力はホワイトのリング張力計により測定し、バイオマスの増加はホライゾンのデジタル比色計で６１０ｎｍで光電測定し、またグルコース摂取量は同じ計測器で４９０ｎｍで測定した。
培養培地は、グルコース９ｇ、ペプトン５ｇ、酵母抽出物２ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．５ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4 ２ｇ、Ｈ2Ｏ、ＫＮＯ3 ３ｇ、ゴットリーブ溶液１ｍＬおよび水１リットルからなるものである。炭素源としてのグルコースをグリセリンに置き換えれば、結果的に二相システムとなり収率をさらに良くすることができる。代替培地としては、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．５ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4 ０．２ｇ、ＫＮＯ3 ２ｇ、ＮａＣｌ １ｇ、ゴットリーブ溶液１ｍＬ、Ｈ2Ｏ １リットルおよび３％の不溶性炭素源（グリセリン、軽油）である。表面張力の減少（２８−３１ｍＮ／ｍ）を収率および発酵終了の指標として使用した。
【００８１】
ラムノリピドの精製および単離
濃縮
発酵後、バイオマスを連続流シャープレス遠心分離器により６０，０００Ｇで室温で分離した。次いで得られた上清を下記のように処理した。
最初の容積を蒸発により当初の１／１０に減らし、濃ＨＣｌによりｐＨ１．５−２．０で、＋４℃で酸沈降させた。水に溶けやすい細胞外グリコリピドは、酸沈降時にｐＨと温度を変えることにより簡単に濃縮することができた。次に、フィルターペレットを水に再溶解させ、０．１ｍｍフィルター、およびミリポア連続フローシステムにより１０6および１０5フィルター（ＰＴＨＫ０００Ｃ５）で限外ろ過した。ラムノリピドは臨界ミセル濃度以上ではミセルを形成するため、限外ろ過により濃縮することができ、それら凝集物が比較的高分子の分離膜上に保持される。こうして塩、遊離アミノ酸、ペプチドおよび小蛋白質などの低分子量の不純物は容易に分離された。この方法は、大量の培地を非常に低コストで迅速に処理できるため、ラムノリピドの精製に非常に重要なものである。
濃縮はまた溶剤抽出によっても良好に行うことができ、たとえばジクロロメタンで満足に行える。このプロセスの後半で、酸による沈降処理後にＣＨ2Ｃｌ2抽出を行う精製ステップをさらに加えることもできる。
【００８２】
クロマトグラフィ
カラムクロマトグラフィ
低圧の実験室規模の分離用（ファルマシア）吸着カラムで、アンバーライ  トＸＡＤ−７、ＸＡＤ−８樹脂（ローム＆ハース）上でカラムクロマトグラフィを行った。平衡と水洗は水で行い、ラムノリピドは最大５０％のＥｔＯＨまたはＭｅＯＨで溶離させた。その後有機溶媒を蒸発させ、ラムノリピド画分を酸で沈降させた。陰イオン交換カラムＩＲＡ−４００（Ｃｌサイクル）も使用できるが、１Ｍ  ＮａＣｌによる溶離を行うために、あまり適当ではない。
【００８３】
分離ＨＰＬＣをウォーターズの装置とシリカカラムを使用して行った。酸沈降し、凍結乾燥したラムノリピドをプロパノール中に溶解（１０ｇ／５０ｍＬ）させ、ヘキサンで平衡させたシリカカラム（５００ｍＬ）を通過させた。活性画分をプロパノール−２５％ＮＨ4ＯＨ（４：１）溶液で溶離させ、有機溶媒を留去し、純粋なラムノリピドを再度酸沈降させ、水に再溶解させ、０．１Ｎ  ＮａＯＨによりｐＨを７．２に調整し、安全に保存するために凍結乾燥させた。
【００８４】
試料の薄層クロマトグラフィ
培養液画分の上清、酸沈降物、ジクロロメタン抽出物、２回精製した沈降物および精製工程の種々の画分を、薄層クロマトグラフィ（シリカゲル６０Ｆ２５４[ メルク] ０．２−０．５ｍｍ、および同じ担体（ケミカ）で調製された２ｍｍ厚の分離用プレート）に付した。プレート（幅０．２１ｍｍ）を乾燥機中で１時間、９０℃で活性化させ、続く３０分間使用した。試料を、プロパノールと２５％ＮＨ4ＯＨが８０：１５との混合溶剤中で展開した。プレートに入れるサンプル量はサンプルのタイプと純度に応じて変えた。３時間処理後の平均Ｒｆ値は０．２６であった。
【００８５】
試料の目視および化学的検出のために、Ｍｅｒｃｋ  Ｄｙｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ＴｈｉｎＬａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｐａｐｅｒ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（１９８０），ＣＲＣ−Ｐｒｅｓｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，第２巻（１９７２）およびＭ．ケイツ[Kates] 、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  ｌｉｐｏｉｄｏｌｏｇｙ（１９７２）に基づいて調製したスプレー試薬を使用した。グリコリピド用試薬としては、α−ナフトールおよびジフェニルアミンが好ましいものであった。
【００８６】
スペクトル分析とラムノリピドの構造
スペクトル分析
薄層クロマトグラフィ後に調製物を1Ｈ  ＮＭＲ、13Ｃ  ＮＭＲおよび質量分光分析計を使用して同定した。いくつかのデータを下に示す。
【００８７】
2007308514.tif 000009
【００８８】
2007308514.tif 000010
マス・スペクトル
m/z: 673 [M+H+Na]+
m/z: 695 [M+H+2Na]+
m/z: 525 [M-C10H18O2＋2Na]+ マイナス末端脂質
m/z: 379 [m-C10H18O2−ラムノース＋2Na]+ マイナス末端脂質及びラムノース
【００８９】
ラムノリピドの構造
このラムノリピドはスペクトルデータから、下記構造式を有する（α−Ｌ−ラムノピラノシル−（１，２）α−Ｌ−ラムノピラノシル）−３−ヒドロキシデカノイル−３−ヒドロキシデカン酸であることが同定された：
【００９０】
【化８】
2007308514.tif 000011
【００９１】
精製された（ＩＩ）を使用して、インビトロおよびインビボテストを行った。
【００９２】
インビトロテスト
酵素阻害
ラムノリピド（ＩＩ）をインビトロで広範囲の各種酵素に対してテストした。
下記の酵素は下記の各種濃度のラムノリピドにより阻害された：
−リポキシゲナーゼ  １０μｇ／ｍＬ
−アセチルコリンエステラーゼ  １ｍｇ／ｍＬ
−α−アミラーゼ  １ｍｇ／ｍＬ
−β−ガラクトシダーゼ  １００μｇ／ｍＬ
−カルボキシペプチダーゼＡ  １ｍｇ／ｍＬ
−トリプシン  １ｍｇ／ｍＬ
すべての酵素検定は、コンピュータ接続の自動マイクロプレートリーダー（Labsystem Multiskan ）およびダイオードアレイ分光光度計（Perkin Elmer）により分光分析方式で行った。
【００９３】
【表１】
2007308514.tif 000012
【００９４】
ラムノリピド（ＩＩ）は下記の酵素に対しては効果を有さないことが判明した：
−α−キモトリプシン
−パパイン
−エラスターゼ
−α−グルコシダーゼ
−アルカリホスファターゼ
【００９５】
ウイルスに対する効果
テストは、Ｄ．Ａ．ヴァンデンバーグ[Vanden Berghe] ら、Ｉｎｓｔ．Ｐａｓｔｅｕｒ  ８４，１０１（１９８６）に基づいて行った。ラムノリピド（ＩＩ）はベロ（VERO）細胞については濃度≧２００μｇ／ｍＬで毒性があり、ＭＴ４細胞については濃度＞１６９．４０μｇ／ｍＬで細胞毒性があった。以下のものに対しては活性はなかった：
−単純ヘルペスウイルス
−コクサッキーＢ２ウイルス
−麻疹エドモンストンＡウイルス
−ポリオＩウイルス
−セムリキ森林熱ウイルス
−水疱性口内炎ウイルス、濃度≦１００μｇ／ｍＬ
ＨＩＶ  Ｉ、菌株IIIＢに対しては、ラムノリピド（ＩＩ）は最大保護９％にとどまった。
【００９６】
ラムノリピド（ＩＩ）の抗菌活性
カンジダ・アルビカンス、大腸菌、黄色ブドウ球菌および緑膿菌に対するラムノリピド（ＩＩ）の最小阻止濃度（ＭＩＣ）はテストした培地では＞０．５％であった。
【００９７】
細胞ＤＮＡ合成と細胞障害性に対する効果
ラムノリピド（ＩＩ）は、濃度０．１ｍｇ／ｍＬで、血清成長因子が存在しない場合に、Ａ４３１ヒト表皮細胞におけるＤＮＡ合成を完全に抑制した（表２）。濃度０．５ｍｇ／ｍＬで血清が存在する場合は、ラムノリピド（ＩＩ）は細胞毒性があることが判明した（表３）。このラムノリピド（ＩＩ）は、フォルボール−ミリステート−アセテート（ＰＭＡ）、プロテインキナーゼＣアクチベーター（ＰＫＣ）の細胞“抑制”作用を０．０５ｍｇ／ｍＬでも弱めた。このように、ラムノリピド（ＩＩ）はＡ４３１細胞の成長を、特にＰＭＡが存在する場合に抑制した。これは本発明のラムノリピドの調製における良好な“表皮ケラチン細胞”抑制作用を意味するものである。本発明のラムノリピドとＰＭＡの相乗作用で、ラムノリピド（ＩＩ）がＰＫＣ抑制剤となる可能性は少ない。
【００９８】
同時に、ラムノリピド（ＩＩ）は、ヒト臍帯静脈内皮細胞から放出される基底組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）に対して全く作用を示さなかった。ＰＭＡによって誘発されて放出されるｔ−ＰＡは、濃度０．１ｍｇ／ｍＬで僅かに抑制されたが、この濃度は内皮細胞に対しても毒性のあるレベルである。
ラット血小板が多い血漿におけるコラーゲン誘発の血小板凝集は０．１ｍｇ／ｍＬのラムノリピド（ＩＩ）には影響されなかった。したがって、ラット血小板（ＰＫＣを含む）で起きるような細胞活性化システムへの干渉は見られなかった。
【００９９】
【表２】
2007308514.tif 000013
【０１００】
Ａ４３１を２４時間マイクロ滴定プレート中で、ラムノリピドと無血清培地または血清を含む培地で培養した。次いで、［3Ｈ］チミジンを加え、４８時間後に細胞を採取し、ＤＮＡに組込まれた［3Ｈ］を測定した。
【０１０１】
【表３】
2007308514.tif 000014
【０１０２】
ラムノリピドの細胞毒性を測定するために、Ａ４３１をラムノリピドとともに血清存在下で２４時間または８４時間インキュベートし、その後ミトコンドリアＭＴＴ変換能力を測定した。ミトコンドリアＭＴＴ変換能力は細胞生存能力のための広く受け入れられているマーカーである。
【０１０３】
Ａｍｅｓテスト
エイムス  Ｎ．ブルース[Ames N.Bruce]らが記載する方法（ＭｕｔａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ，３１（１９７５），３４７−３６４））に基づいてテストを行った。ラムノリピド（ＩＩ）のテスト濃度は、１０、１００、２００、５００、１０００μｇ／プレートとした。
テストしたラムノリピドの濃度範囲では、１ペトリ皿当たりのバクテリア復帰変異体の数は、Ｓ９の混合がない場合に見られる自然発生の復帰変異体数の範囲内であった。したがって、ラムノリピド（ＩＩ）はテストした濃度範囲では変異原性はなかったと結論づけられる。
【０１０４】
組織培養における変異原性テスト
平板効率の測定と世代時間を測定した。テストはＣＨＯ細胞系で行った。世代時間（ＧＴ）平板効率（ＰＥ）は下記の通りであった：
ＧＴ＝１６時間
ＰＥ＝９０％
【０１０５】
ＣＨＯ細胞培養の集団増殖
非同時性細胞系（ＣＨＯ細胞）の集団増殖をフレッシュニーＲ．イアン[Freshney R.Ian]の“Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌｓ”，１９８３；（１２５−１２８）に基づいて行った。下記濃度のラムノリピドをＣＨＯ細胞の増殖培地に添加した：３１．２５μｇ／ｍＬ、６２．５０μｇ／ｍＬおよび１２５．０μｇ／ｍＬ。適用したラムノリピド濃度では、ＣＨＯ細胞の増殖能力は大きくは変化しなかった。
【０１０６】
コロニー形成能力
種々の濃度のラムノリピド（ＩＩ）で処理した後のＣＨＯ細胞のコロニー形成能力を、キルビーＢ．Ｊ．[Kilbey B.J.] らの“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｍｕｔａｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｔｅｓｔ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ”，１９７７；（６８および１７５）に基づいてテストした。下記濃度のラムノリピド（ＩＩ）をテストした：０、８、１６、３２、６２．５および１２５μｇ／ｍＬ。対照群と比べて上記濃度のラムノリピド（ＩＩ）ではコロニー形成能力の顕著な喪失は観察されなかった。
【０１０７】
構造的染色体異常分析
構造的染色体異常分析（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｏｓｉｍｅｔｒｙ  １９８６，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ；Ｒｅｐｏｒｔｓ  Ｓｅｒｉｅｓ，２０，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｔｏｍｉｃ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ａｇｅｎｃｙ，ウィーン，５９頁）。
異なる濃度のラムノリピド（ＩＩ）を２時間目および１６時間目に投与した（３１．２５、６２．５０、１２５および２５０μｇ／ｍＬ）。分裂中期（メタファーゼ）の４００が明らかに観察され、各標本ごとに２０の染色体（異数体）を分析した。３１．２５μｇ／ｍＬの濃度が、無処理の対照標本に比べて多くの構造的染色体異常を引き起こしたことが明らかであった。同じインキュベーション時間での６２．５μｇ／ｍＬ濃度のものは染色体異常の傾向が少なく、最も高濃度の２つについては対照群とほぼ同じ値であった。テストした物質では１６時間のインキュベーション後に顕著に異なった状態が観察された。全体的な構造的染色体の損傷が数倍になり、異常な細胞の数も２から４倍に増加した。しかしながら、この場合も濃度が増加すると異常の数が減少する点が注目される。
いわゆるスパイラル欠陥と呼ばれる現象は、ラムノリピド（ＩＩ）添加のＣＨＯ細胞の２時間インキュベーションでは認められなかった。
【０１０８】
小核テスト
小核テスト（フレンチＭ．[French M.] およびＡ．Ａ．モーリー[A.A.Morley]（１９８６），Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．，１６１：１９３の方法の応用）。ラムノリピド（ＩＩ）の濃度３１．２５μｇ／ｍＬ、６２．５０μｇ／ｍＬ、１２５μｇ／ｍＬおよび２５０μｇ／ｍＬでの小核テストの結果は、明らかにテスト化合物と細胞内物質の相互作用を示した。小核の数は平行対照標本に比べて増加した。ラムノリピド添加ＣＨＯ細胞の１６時間インキュベーション後には、二核細胞内の小核の数は４まで増加した。
【０１０９】
姉妹染色分体間の組換え分析
この方法は、カトウ[Kato]，Ｈ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７４）２５２：７０を応用したものである。ラムノリピド（ＩＩ）のテスト濃度は、３１．２５μｇ／ｍＬ、６２．５０μｇ／ｍＬ、１２５μｇ／ｍＬおよび２５０μｇ／ｍＬとした。本法による試験結果では対照群と処理培養細胞群の間には顕著な差はなかった。
【０１１０】
ラムノリピドへのＣＨＯ細胞の慢性曝露
本法は、キルビーＢ．Ｊ．[Kilbey B.J.] らの“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｍｕｔａｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｔｅｓｔ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ”，１９７７：２５０および２６７を応用したものである。濃度３１．２５μｇ／ｍＬ、６２．５０μｇ／ｍＬ、１２５μｇ／ｍＬのラムノリピド（ＩＩ）へのＣＨＯ細胞の２時間および１６時間曝露を３０回繰り返した後の染色体異常の全体的な発生頻度およびタイプは対照サンプル群と顕著な差はなかった。
【０１１１】
溶血活性
ラムノリピド（ＩＩ）の溶血活性は赤血球が沈降した後、ヘモグロビンが溶液を着色した場合に見られる。もし溶血活性がなければ、赤血球は溶液を着色せずに沈降する。テストの目的のために１ｍＬのクエン酸ウシ血液を４９ｍＬの等張液に添加した。
濃度１．０ｍｇ／ｍＬから０．０１ｍｇ／ｍＬの範囲の一連のテストサンプルを調製した。１ｍＬの希釈クエン酸ウシ血液を１ｍＬの希釈テストサンプルに添加した。試験管を静かに振とうして混合させ、それぞれ０．２５時間、１時間および２４時間放置した。１５分間で溶血を起こしたラムノリピド（ＩＩ）の最小濃度は０．３５ｍｇ／ｍＬであり、１時間では０．２５ｍｇ／ｍＬ、２４時間では０．１２５ｍｇ／ｍＬであった。
【０１１２】
【表４】
2007308514.tif 000015
【０１１３】
結論：希釈クエン酸ウシ血液の等張液２ｍＬに０．２５ｍｇのラムノリピド（ＩＩ）を希釈した場合、溶血活性を示す。これ以下の濃度では溶血活性はない。
【０１１４】
リンパ球増殖テスト
Ｂ−リンパ球増殖
方法：常法によりマウス脾臓からＢ細胞を単離し、ＤＭＥＭに懸濁させた。１０6個／ｍＬの細胞を３７℃で１晩インキュベートし、細胞増殖の刺激性（プラス評点、１μｇ／ｍＬリポ多糖に関して）または抑制性（マイナス評点、ブランクの対照と比較）を評価した。テスト物質はこれらの条件下で、濃度１０、１、０．１、０．０１、および０．００１μＭで評価した。１晩インキュベートした後、２ｕＣｉ［3Ｈ］チミジンの取込み量を液体シンチレーション計測器を用いて測定評価した。
【０１１５】
Ｂ−リンパ球増殖＋ＬＰＳ
方法：常法によりマウス脾臓からＢ細胞を単離し、ＤＭＥＭに懸濁させた。１０6個／ｍＬの細胞を１０μｇ／ｍＬのリポ多糖（ＬＰＳ）の存在下３７℃で１晩インキュベートし、細胞増殖の刺激性（プラス評点、１ｎｇ／ｍＬのラットインターロイキン−５に関して）または抑制性（マイナス評点、対照と比較）を評価した。テスト物質はこれらの条件下で、濃度１０、１、０．１、および０．０１μＭで評価した。１晩インキュベートした後、２ｕＣｉ［3Ｈ］チミジンを各ウェルに添加した。さらに４８時間インキュベーション後に細胞を採取し、チミジン取込み量を液体シンチレーション計測器を用いて測定評価した。
【０１１６】
Ｔ−リンパ球増殖
方法：常法によりマウス胸腺からＴ細胞を単離し、ＤＭＥＭに懸濁させた。５×１０6個／ｍＬの細胞を３７℃で１晩インキュベートし、細胞増殖の刺激性（プラス評点、３μｇ／ｍＬのコンカナバリン（ＣｏｎＡ）に関して）または抑制性（マイナス評点、ブランクの対照と比較）を評価した。テスト物質は濃度１０、１、０．１、０．０１、および０．００１μＭでこれらの条件下で評価した。１晩インキュベートした後、２ｕＣｉ［3Ｈ］チミジンを各ウェルに添加した。さらに４８時間インキュベート後に細胞を採取し、チミジン取込み量を液体シンチレーション計測器を用いて測定評価した。
【０１１７】
Ｔ−リンパ球増殖＋ＣｏｎＡ
方法：常法によりマウス胸腺からＴ細胞を単離し、ＤＭＥＭに懸濁させた。５×１０6個／ｍＬの細胞を、３μｇ／ｍＬのＣｏｎＡの存在下で３７℃で１晩インキュベートし、細胞増殖の刺激性（プラス評点、１０Ｕ／ｍＬのラットインターロイキン−２に関して）または抑制性（マイナス評点、対照と比較）を評価した。テスト物質は濃度１０、１、０．１および０．０１μＭでこれらの条件下で評価した。１晩インキュベートした後、２ｕＣｉ［3Ｈ］チミジンを各ウェルに添加した。さらに４８時間インキュベート後に細胞を採取し、チミジン取込み量を液体シンチレーション計測器を用いて測定評価した。
【０１１８】
【表５】
2007308514.tif 000016
【０１１９】
インビボテスト
免疫薬理学テスト
免疫刺激（細胞性）−オキサゾロン誘発遅延型過敏性
予め剃毛した５匹のマウス群の腹部表面にオキサゾロン（５％溶液０．１ｍＬ）を塗布（感作）する１時間前に、テスト物質を腹腔内投与した。７日後にオキサゾロン２％溶液２５μＬを右耳に塗布（誘発投与）し、賦形剤を左耳に塗布した。２４時間後にそれぞれのマウスを屠殺し、耳の厚さをＤｙｅｒ型マイクロメーターゲージで測定した。３０パーセント以上増加したものは免疫刺激活性があると考えられる。
【０１２０】
2007308514.tif 000017
免疫抑制（細胞性）−オキサゾロン誘発遅延型過敏性
５匹のマウス群の剃毛腹部表面に５％オキサゾロンを０．１ｍＬ塗布して感作
した。１時間後にテスト物質を腹腔内投与し、連続５日間（毎日１回）投与した。
さらに４日後に、各マウスの右耳に５％オキサゾロン２５μＬ塗布による誘発投与を行った。２４時間後に、耳の厚さをＤｙｅｒ型マイクロメーターゲージで測定した。
対照動物と薬剤処理動物の比較で、５０パーセントまたはそれ以上の減少があったものは、顕著な免疫抑制活性があると考えられる。
【０１２１】
2007308514.tif 000018
免疫刺激および免疫抑制（体液性）−ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）の血球凝集
６匹のマウス群に２％ＳＲＢＣ懸濁液を０．２ｍＬ静脈注射で投与して感作した。感作後９日目に血液を眼窩洞から抜き取り、また６匹のマウスから同量の補体不活性血清を抜き取り、単一の０．２５ｍＬサンプルを作るためにプールした。補体添加の連続２倍希釈液を１０回繰りかえし調製した。血清価は、完全な溶血を示す希釈率の逆数で表わした。血清価が１６以下または１２８以上のものは有意であると考えられ、それぞれ顕著な免疫抑制または免疫刺激活性を示す可能性がある。
免疫刺激活性を調べるために、テスト物質または賦形剤をマウス群に３日連続で腹腔内投与し、３回目（最終）注射の２時間後にＳＲＢＣに感作させた。
免疫抑制活性を調べるために、ＳＲＢＣへの感作２時間後から、テスト物質または賦形剤をマウス群に３日連続で腹腔内投与した。
【０１２２】
2007308514.tif 000019
【０１２３】
2007308514.tif 000020
免疫回復
シクロホスファミドによる免疫抑制とカンジダ・アルビカンスによる感染
テスト物質または賦形剤を１０匹のマウス群に、１、３、および５日目に腹腔内投与し、シクロホスファミド（２５ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．）を２、４、および６日目に投与した。最後の免疫抑制剤投与の１日後に、賦形剤処理対照群が１０日以内に９０から１００パーセント死亡率となるのに十分な量のカンジダ・アルビカンス懸濁液を、マウスに誘発投与した。薬剤処理群で生存率が３０パーセント以上大きいものはすべて有意であると考えられ、免疫回復活性を示す可能性がある。
【０１２４】
2007308514.tif 000021
免疫調節
カンジダ・アルビカンス感染
テスト化合物または賦形剤を１０匹のマウス群に、賦形剤処理対照群が１０日以内に９０から１００パーセント死亡率となるのに十分な量のカンジダ・アルビカンス懸濁液を誘発投与する１時間前に、腹腔内投与した。処理群の中で生存率が３０パーセント以上大きいものはすべて明らかに有意であり、免疫調節の結果と考えられる。一方２０％の増加は中程度の免疫調節と考えられる。
【０１２５】
2007308514.tif 000022
マウスにおける血算に対するジラムノリピドの活性
【０１２６】
2007308514.tif 000023
結論：ラムノリピド（投与後４日目から２９日目まで）は顕著に、好中球を増加させ、リンパ球を減少させた。
【０１２７】
構造的染色体異常分析（インビボテスト）
ラット骨髄細胞における構造的染色体異常分析の結果は、ラムノリピド（II）の濃度３１．５ｍｇ／ｋｇ（動物体重）では染色体の損傷を引き起こさないことを示した。対照および処理サンプル群において、分析した細胞中僅か１％だけが、染色体の個別の破壊および無動原体フラグメントを伴った染色分体が見られた。そのような結果は十分に有意であるとはいえず、テクニカル誤差であり、かつラムノリピド（II）と骨髄ＤＮＡの相互反応によるものではないと見なされる。
【０１２８】
全般的な毒性調査
この検討の目的は、ＬＤ90、ＬＤ50、ＬＤ10の決定、ならびに１回の静脈投与、５日間で５用量（１日１用量）の腹腔内投与、および１日５用量の腹腔内投与によるマウスの標的臓器毒性を決定することにあり、これによって薬剤の毒性を推定し、またげっ歯目の発癌性検討のための初期用量を決定できるようなデータをげっ歯動物で得ることにある。
テストはマウスＣ５７Ｂ１／６（動物出所：ＢａｎｔｉｎおよびＫｉｎｇｍａｎ）で実施した。このテストは、米国Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ省のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒａｍのテクニカル・レポート・シリーズに記載の方法に準拠した。
【０１２９】
範囲探索検討フェーズ（１用量）
下限用量（ＬＢＤ）は６７．５ｍｇ／ｋｇ、上限用量（ＵＢＤ）は１２７．５ｍｇ／ｋｇであった。
テストに供されたラムノリピドを静脈投与した結果、マウスの平均ＬＤ50は１０５．０ｍｇ／ｋｇということも示された。
範囲探索検討フェーズ（１用量）において、ラムノリピド（II）の静脈内投与における１用量毒性は７．５ｍｇ／ｋｇであった。ラムノリピド（II）の投与４日後に、好中球の顕著な増加とリンパ球の顕著な減少が観察された。観察期間中には処理マウスには行動および外観の変化は見られなかった。
【０１３０】
範囲探索検討フェーズ（５日間５用量、１日１用量）
下限用量（ＬＢＤ）は４５ｍｇ／ｋｇ、上限用量（ＵＢＤ）は１２５ｍｇ／ｋｇであった。
範囲探索検討（５日間５用量、１日１用量）において、ラムノリピド（II）の腹腔内投与における１用量毒性は５ｍｇ／ｋｇであった。ラムノリピド（II）の投与４日後に、好中球、好塩基球、好酸球の顕著な増加と、リンパ球の顕著な減少が観察された。観察期間中には処理マウスには行動および外観の変化は見られなかった。
【０１３１】
範囲探索検討フェーズ（１日５用量）
下限用量（ＬＢＤ）は４５ｍｇ／ｋｇ、上限用量（ＵＢＤ）は１２５ｍｇ／ｋｇであった。
範囲探索検討（１日５用量）において、ラムノリピド（II）の腹腔内投与における５用量毒性は５ｍｇ／ｋｇであった。ラムノリピド（II）の投与４日後において、ラムノリピド（II）と対照の間には統計的な差異は見られなかった。
【０１３２】
組織病理学的検討
すべての試験において、各マウスの死体解剖で得た下記組織を検査した：骨（大腿骨）、骨髄（大腿骨）−滑動部のみ、脳、結腸、十二指腸、心臓、腎臓、肝臓、肺（ホルマリン漬け）、膵臓、脾臓、筋肉、副腎結節、子宮、腸管。
【０１３３】
結論
結論として、すべての対照および実験動物のすべての器官に関する完全な組織病理学報告書において、実験グループには実験物質に起因すると考えられる退行性−進行性または炎症性の変化が全く認められなかったことが示された。
【０１３４】
乾癬治療の臨床的結果
男性１１名、女性６名の１７名の患者をラムノリピド（II）で治療した。これらのうち、１２名は乾癬、２名は神経皮膚炎、１名は偏平紅色苔癬、１名は脂漏性皮膚炎、そして１名は湿疹様の限局単房性皮膚炎を患っていた。
患者の年令は１９から８０才の範囲であった。
乾癬の患者は以前数回治療を受けており、この疾患を１．５年から２５年患っている。
乾癬の最初の患者６名の実験的治療は１９９１年５月から６月にかけて開始した。
すべての患者は、選択した乾癬箇所にラムノリピド（II）を含むクリームを１日２回、２１日間、塗布して治療した。
身体の残りの乾癬箇所はコルチコステロイドで局所治療した。
患者の治療および追跡は“二重盲検”で行った。
治療の有効性はＰＡＳＩインデックスでモニタした。
最初の６名の乾癬患者で改善方向の結果が得られたため、ラムノリピドを乾癬のより広い箇所（患者の身体の乾癬病変箇所の半分まで）に適用して年末まで治療し、観察を続けた。また、閉鎖包帯も使用（４８時間まで）し、その使用期間は３５日まで延長された。
このような方法により、患者が病院を離れるまでに良好な結果が観察され、病状再発も少なくなった。何人かの患者は治療後１０ヵ月でさえも再発は見られなかった。
研究室テストのための血液サンプルは、治療初日と最終日に１２名の患者すべてから採取された。多くの研究室テストが実施されたが、本発明のラムノリピド（II）による乾癬病変部の局所治療の結果、前記と異なる試験結果は見られなかった。
患者は治療後３、６および９ヵ月後に診察し、ラムノリピド（II）を適用した同じ箇所には他のいかなる局所剤も塗らないように指示した。
追跡後の結論は、ラムノリピド（II）を適用した乾癬病変部すべてにおいて良好な結果が得られたということである。この物質の治療効果は、殆どのケースにおいて、局所コルチコステロイドが効果を現わすより早いか、または同じ時期であった。再発はラムノリピド（II）治療１０ヵ月後というように極めて遅いのに対し、局所コルチコステロイド治療の患者はなお緩解期の状態にある。
再発は、乾癬局所に対するラムノリピド（II）治療の期間の長さに関係するものと思われる。
神経皮膚炎の２名の患者は１９９２年初めに治療した。ラムノリピド（II）を１日２回病変部に適用し、閉鎖包帯も使用（２４時間以内）した。
患者の治療および観察はこの場合も“二重盲検”で行った。コルチコステロイドを適用しているその他の部分を比較用とした。
改善は極めて迅速に見られ、コルチコステロイドを適用した箇所よりも早く、また再発は局所コルチコステロイド適用した部分より少し遅れて現れた。
脂漏性皮膚炎、偏平紅色苔癬、限局単房性皮膚炎を患っていたそれぞれ１名の患者は完全に治癒した。
当然のことながら、上記の教示に照らせば本発明の多くの修正や変形が可能である。したがって、本発明は本明細書に具体的に記述した以外にも添付の請求項の範囲において実施できることはいうまでもない。