(57)【要約】      （修正有）【課題】ワクチンとして使用するための表現型／組織化学的／遺伝子型β−ｇａｌ標識を含む弱毒化ｇＥ欠失ウシヘルペスウイルス１型ウイルス（ＢＨＶ−１）の提供。【解決手段】ＢＨＶ−１の固有糖タンパクＥ（ｇＥ）をコードする領域の一部を欠失し、続いて該ｇＥ座に外来の機能性β−ｇａｌを含むプラスミドを挿入することにより、安全な生菌組換えウイルスとともにワクチンが製造される。ｇＥ遺伝子の欠失は、ウイルスを安定的に弱毒化し、また感染動物からワクチン接種した動物を分別する免疫標識として働く。さらに、β−ｇａｌの産生は、ワクチン接種した動物におけるｇＥΔ3.1 ＩＢＲβウイルスの複製を容易に評価させ、感染した動物における野生型ウイルス複製と区別するための表現型標識として働く。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
その固有糖タンパクＥをコードする領域に、欠失され、かつ遺伝子挿入により置換された部位を有するウシヘルペスウイルス１型からなり、該挿入が外来β−ガラクトシダーゼ遺伝子のコード領域からなり、組換えウイルスは宿主細胞中でβ−ガラクトシダーゼを発現する、弱毒化された組換えウシヘルペスウイルス１型ウイルス。
【請求項２】
前記ウイルスが他の遺伝子欠失部位を持たない請求項１に記載のウイルス。
【請求項３】
前記挿入が、ヒトサイトメガロウイルスのごく初期のプロモーターおよび該ヒトサイトメガロウイルスのごく初期のプロモーターのエンハンサー配列からなる請求項１または２に記載のウイルス。
【請求項４】
前記欠失部位が、前記固有糖タンパクＥをコードする領域の約３分の２からなる請求項１〜３のいずれかに記載のウイルス。
【請求項５】
前記挿入がＳＶ40ポリアデニル酸部位に連結されている請求項１〜４のいずれかに記載のウイルス。
【請求項６】
前記外来β−ガラクトシダーゼ遺伝子が真正ウシヘルペスウイルス１型コード化遺伝子の発現と同様に発現される請求項１〜５のいずれかに記載のウイルス。
【請求項７】
前記欠失された固有コード領域が遺伝子型標識として働く請求項１〜６のいずれかに記載のウイルス。
【請求項８】
前記遺伝子挿入が表現型標識として働く請求項１〜７のいずれかに記載のウイルス。
【請求項９】
前記欠失された固有コード領域が免疫標識として働く請求項１〜８のいずれかに記載のウイルス。
【請求項１０】
前記β−ガラクトシダーゼをコードする配列が、前記宿主細胞において、感染早期および後期の両段階で発現される請求項１〜９のいずれかに記載のウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．本発明は、広くは組換えウシヘルペスウイルスワクチンおよびこれに対応する方法に関する。特に、本発明は、好ましくは、固有糖タンパクＥ（ｇＥ）をコードする領域に欠失された部位をもち、かつｇＥ遺伝子座のそこに機能性β−ガラクトシダーゼ遺伝子（β−ｇａｌ）が挿入された感染性組換えウシヘルペスウイルス１型（ＢＨＶ−１）の構築に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．従来技術
ウシヘルペスウイルス１型（ＢＨＶ−１）は、感染性鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲＶ）としても知られており、鼻気管炎、結膜炎、性器感染症、場合によっては流産、腸炎、脳炎および家畜（cattle、ウシ）の全身性感染症などのさまざまな臨床的疾患に関与している。ＢＨＶ−１のゲノムは約１４０ｋｂの線状ｄｓＤＮＡからなる。内部で隣接した長い非反復（ＵL ）領域および短い非反復（ＵS ）領域と、繰返し配列（それぞれＩR およびＴR ）を逆転する末端とから構成される。上記ＢＨＶ−１ゲノムは、ほぼ７０のタンパクをコード化する（Misra ら、ウシヘルペスウイルス１の特定するタンパク（感染性ウシ鼻気管炎、40、J. Virol. 367-378(1981) ）。
【０００３】
他のいくつかの動物ヘルペスウイルスと同様に、ＢＨＶ−１ゲノムは糖タンパク（ｇＥ）遺伝子をコード化する。このＢＨＶ−１ｇＥ遺伝子配列は、５７５アミノ酸（ａａ）残基をコードするが、２種の株が報告されている（Leung-Taek, P.ら、ウシヘルペスウイルス１型株（ＳＴ株）の短い非反復領域（ＵS ）の完全ＤＮＡ配列および遺伝機構、199 ウイルス学 409-421(1994)；Rebordosa,X.ら、ＨＳＶ−１由来ｇＥ遺伝子に相同のウシヘルペスウイルス１型糖タンパクをコードする遺伝子のマッピング、クローニングおよび配列決定、149 遺伝子203-209(1994)）。上記ｇＥアミノ酸は、Ｎ末端と、Ｃ末端（膜貫通配列）近辺とに、典型的な分類Ｉ内在性膜タンパク質である、伸長の疎水性アミノ酸（一般にシグナル配列と考えられている）を含む。
【０００４】
上記ＢＨＶ−１ｇＥ、あるいは他のヘルペスウイルス中の相同体は、in vitro複製には重要でないことが示されてきたが、仮狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ゲノムの完全ｇＥコード配列の欠失は、生ワクチン株NordenおよびBarthaの菌力低減（Petrovski,E.A.ら、仮狂犬病ウイルスのワクチン株における欠失およびその糖タンパクｇｐ63合成における効果、J, Viol. 1166-1169(1986 ）と、神経侵襲性の変質（Card,J.P. ら、ラット視覚系の感染における仮狂犬病ウイルスエンベロープ糖タンパクｇＩの神経指向性および菌力に与える影響）との両方を招く。すなわち、ｇＥ遺伝子が動物中で発現するには、ウイルスの完全な病原性ポテンシャルが要求されるが、組織培養での成育では必ずしも要求されない（Kritasら、鼻腔内接種したブタの三叉神経経路におけるオーエスキー病ウイルス（ＡＤＶ）の単糖タンパク欠失変異株の侵入および蔓延、50 Vet. Microbiol.323-334(1994) ）；Kritasら、ブタの鼻神経経路中、オーエスキー病ウイルスの侵入および蔓延におけるエンベロープ糖タンパクｇＩ、ｇｐ63およびｇIII の役割、75 J. General Virol.2319-2327(1994) ）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
最近、ＰＲＶおよびＩＢＲのｇＥ遺伝子を欠失した変異株は、分別標識ワクチンとしての有用性について興味がもたれてきている。現在、欧州では、ｇＥ遺伝子欠失標識ワクチン株がＩＢＲの撲滅に使用されている。しかしながら、欧州でのこのｇＥ遺伝子欠失ワクチン株は、β−ｇａｌ酵素活性を検出するためのin situ （元の位置）組織化学的検出法およびβ−ｇａｌタンパクを検出するためのin situ 組織化学的方法あるいは免疫ブロット法に使われるβ−ｇａｌを欠く。またβ−ｇａｌのコード領域は、組換えウイルスの遺伝子型標識としても機能する。ウイルスはサザンブロットハイブリダイゼイションにより容易に検出することができ、またＰＣＲ検査は、ワクチンウイルスの野生型からの遺伝的精製の決定を容易にすることができる。それ故、適切な表現型／組織化学的／遺伝子型β−ｇａｌ標識を含むアビルレニト（無毒性）ｇＥ欠失ＩＢＲＶ株は必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ｇＥオープンリードフレーム（ＯＲＦ's）が、ｇＥコード配列の一部が欠失され、かつその場所にキメラレポーター／標識遺伝子が挿入されたタンパクからなるＢＨＶ−１組換えウイルス（ｇＥΔ3.1 ＩＢＲβ）が構築された。
挿入されたβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）遺伝子は、ウイルスの複製において調節的な役割を何ら果さないが、ｇＥΔ3.1 ＩＢＲβウイルスのための表現型標識として機能する。
【０００７】
この組換えＢＨＶ−１ウイルスを構築するために、ＢＨＶ−１ｇＥ遺伝子コード領域および上流および下流に隣接する配列がクローンされた。ｇＥ遺伝子コード領域に欠失をもたらすために、その領域の３分の２のアミノ酸を放出するように上記クローンされたＤＮＡが好適な酵素で消化され、β−ｇａｌ遺伝子に連結された。得られたプラスミドＤＮＡは、全長のＤＮＡおよび野生型ＩＢＲウイルス株Cooperと、ＭＤＢＫ細胞中に共形質移入（cotransfected ）された。
組換えウイルスを発現するβ−ｇａｌ（青色プラーク）は、プラーク精製され、さらに、遺伝的性質がブロットハイブリダイゼイションにより検定され、免疫ブロット法によりＢＨＶ−１ｇＥペプチド特異的ウサギポリクロナール抗体に対する反応性が検定された。組換えウイルスの１つであるｇＥΔ3.1 ＩＢＲβは、そのin vitro成育性、コウシ（calves）におけるin vivo の発病性について調べられた。組換えウイルスの、感染したコウシにおけるＢＨＶ−１中和抗体を誘発する能力は、プラーク減少試験により検討された。
【０００８】
キメラβ−ｇａｌ遺伝子の調節および発現は、この組換えＢＨＶ−１ウイルスに特有の２つの特徴がある。この組換えウイルス第一の特徴は、β−ｇａｌ遺伝子が強いヒトサイトメガロウイルスごく初期の（ＨＣＭＶ−ＩＥ）プロモーターにより調節される（ＢＨＶ−１で誘導された調節配列によってではない）ことである。第二の特徴は、該遺伝子が早期および後期両方の感染段階で、ＢＨＶ−１コード化された遺伝子として発現されることである。このｇＥ欠失組換えウイルスのin vitro およびin vivo での性質を、その親ＩＢＲＶ株Cooperと比較することにより分析した。
【０００９】
組織培養実験において、ｇＥΔ3.1 ＩＢＲβウイルスは、感染早期の成育は野生型（親株Cooper）よりも力価が低いが、感染後後期には組換えウイルスは野生型株とほぼ同等の力価（滴定量）に成育する。組換えウイルスは、通常、親の野生型株Cooperに比して著しく小さいプラークを発生する。これは、ウイルスの細胞−細胞間展着の欠如によるものであろうし、他のヘルペスウイルスでの結果とも一致する。
【００１０】
動物実験では、ｇＥΔ3.1 ＩＢＲβに感染させたコウシは、親株Cooperに感染させたコウシよりも、ウイルス放出期間内のウイルスの放出量は約１００倍少なかった。またこのウイルス放出期間は、ｇＥΔ3.1 ＩＢＲβウイルスに感染したコウシの方が２日短かった。ｇＥΔ3.1 ＩＢＲβウイルスに感染したコウシは健康を保持したのに対し、親株Cooperに感染したコウシは典型的なＩＢＲウイルスの徴候と症状を示した。血清中和の結果、野生型およびｇＥ欠失ＩＢＲＶ感染したコウシは、いずれも共通のＢＨＶ−１中和抗体を誘発することを示した。
【００１１】
先に、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子欠失ＩＢＲＶは、in vitro およびin vivo のどちらも著しく低い力価の成育であったことが報告されている（Chowdhury,S.I.、弱毒性ウシヘルペスウイルス１型（ＢＨＶ−１）組換えウイルスの構築と特徴、52 Vet. Microbiol.13-23(1996))。これらから、組換えｇＥΔ3.1 ＩＢＲβウイルスは、ＴＫ欠失ＩＢＲに比して比較的よく成育するが、ｇＥΔ3.1 ＩＢＲβウイルスはコウシに実質的に無毒性であったという結果が示される。
【００１２】
組換えｇＥΔ3.1 ＩＢＲβウイルスの示す弱毒性は、下記に並行して示されている：１）Chowdhury,S.I.による、弱毒性ウシヘルペスウイルス１型（ＢＨＶ−１）組換えウイルスの構築と特徴（52 Vet. Microbiol.13-23(1996))中で示されるような弱毒化ウシヘルペスウイルス１型（ＢＨＶ−１）におけるＴＫの欠失；
２）Kritasらによる鼻腔内接種したブタの三叉神経経路におけるオーエスキー病ウイルス（ＡＤＶ）の単糖タンパク欠失変異株の侵入および蔓延、50 Vet. Microbiol.323-334(1994) 、あるいはKritasらによるブタの鼻神経経路中、オーエスキー病ウイルスの侵入および蔓延におけるエンベロープ糖タンパクｇＩ、ｇｐ63およびｇIII の役割、75 J. General Virol.2319-2327(1994) ）中で示されるようなＰＲＶにおけるｇＥの欠失；および３）Kaashoekらによる糖タンパクＥ−ネガティヴ株ウシヘルペスウイルス１型に基づく不活性化ワクチンは有望な免疫性を誘発し、血清学的分化を起す（13 ワクチン342- 346(1995)）、およびVan Englenburgらによるウシヘルペスウイルス１型の糖タンパクＥ欠失変異株は、コウシにおいて野生型ウイルスと特定同数の組織に感染するがその期間は短い（76 J.Gen.Virol.2387-2392(1994)）中で示されるような欧州型ｇＥ欠失ＩＢＲＶワクチン分離株。
【００１３】
本研究は、ｇＥ  ＯＲＦ配列の欠失およびウイルスのｇＥ座での機能性β−ｇａｌ遺伝子の挿入は、安定的にウイルスを弱毒化することも示した。このウイルスの実際的適用は、ＩＢＲに対して用いる安全な生菌ワクチンとしてそれを使用することである。ｇＥ遺伝子の欠失は、ワクチン接種した動物を感染動物と分別するための免疫学的標識としても機能するであろう。さらに、現在の欧州でのβ−ｇａｌ表現型標識が欠落したｇＥ遺伝子欠失ワクチン株に対し、β−ｇａｌの産生は、ワクチン接種した動物の鼻粘膜上皮でのｇＥΔ3.1 ＩＢＲβウイルスの複製の評価を容易にするとともに、野生型ＩＢＲウイルスにより起される感染との分別も容易にするであろう。
【００１４】
固有ｇＥをコードする領域の欠失は、ウイルスを弱毒化させ、野生型ウイルス感染からｇＥ−欠失組換えウイルスを分別する遺伝子型あるいは免疫学的標識として働く。さらに、β−ｇａｌ遺伝子の挿入は、宿主細胞におけるβ−ｇａｌ活性の発現により、ｇＥ−欠失組換えウイルス感染の有無を検定するための表現型方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下の実施例は、欠失されたネガティブのｇＥコード領域をもち、それによりウイルスが弱毒化され、かつ該ｇＥ座に機能性β−ｇａｌ遺伝子が挿入された感染性組換えＢＨＶ−１、この組換えＢＨＶ−１をワクチンとして用い、ＢＨＶ−１により引起される疾患に対する免疫性を動物に付与する方法、およびこの組換えウイルスおよび野生型ウイルスによる動物での感染を、遺伝子型および表現型の両方で検出し分別する方法の構築を記載する。これら実施例は、説明のためになされるのであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００１６】
［実施例１］
材料および方法
この実験は、ｇＥ遺伝子が欠失され、かつβ−ガラクトシダーゼを発現する組換えＩＢＲＶの作成と特徴づけを行なう。構築された組換えウイルスは、ＢＨＶ−１のｇＥコード領域を置換したキメラ遺伝子（４．５Ｋｂ長）を含む。キメラ遺伝子は、ＨＣＭＶ−ＩＥプロモーター、およびＳＶ40ポリアデニル酸部位に結合した、β−ｇａｌ遺伝子をコードする領域に結合したその促進（enhancer）配列から構成されることが好ましい。好ましくは、該β−ｇａｌ遺伝子コード領域は細菌性であるが、どのβ−ｇａｌ遺伝子コード領域を用いてもよいと考えられる。
【００１７】
組換えＢＨＶ−１の構築と特徴づけを行なうために、ＩＢＲＶのCooper（Colorado-1）株をＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）より入手した。ウイルスは、Chowdhury S.I.らの方法（呼吸性ヘルペスウイルス１（ＢＨＶ−１）および神経毒性のＢＨＶ−５の糖タンパクＣ（ｇＣ）間での抗原変異の分子主成分、213 Virol.273-288(1986) ）を用いて、Madin-Darby ウシ腎臓細胞中、増殖され、滴定された。そこに記載の該方法を参照して本明細書に記載されたものとする。ウイルスＤＮＡは、Chowdhury S.I.ら（リピツァナの種ウマにおけるウマヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）が誘発した流産および麻痺：ウマヘルペスウイルスの分類への寄与、90 ARCH. Virol.273-288(1986)）に記載された方法に準じ、ドデシル硫酸ナトリウムおよびタンパクＫ溶解（リーシス）、フェノール／クロロホルム抽出、およびエタノール沈殿により分離した。そこに記載の該方法を参照して本明細書に記載されたものとする。
【００１８】
ＢＨＶ−１ｇＥ−特異的抗ペプチドウサギポリクロナール血清を、公知の加水分解（hydropathicity）および抗原性技術に基づいて合成した。Leung-Teak,P. ら（ウシヘルペスウイルス１型株（ＳＴ株）の短い非反復領域（Ｕ）の完全ＤＮＡ配列および遺伝的構築、199 Virology 409-421(1994)）により記載された残基３７８−３９８を含むこのｇＥペプチドを合成した。そこに記載の該配列および遺伝的構築を参照して本明細書に記載されたものとする。
【００１９】
ｇＥペプチドの合成には、Abdelmagidら（ＢＨＶ−５ｇＤと比較した型特異的モノクロナール抗体および配列によるウシヘルペスウイルス−１（ＢＨＶ−１）糖タンパクＤ（ｇＤ）を中和するエピトープの詳細地図、206 Viology 242-253(1995) ）に記載された9-フルオレニル−メトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）試薬を用いることができ、そこに記載の該方法を参照して本明細書に記載されたものとする。スカシガイのヘモシニアン（ＫＬＨ）への抱合を促進するため、付加の不適合システイン（Ｃ）（* で標識された）をペプチドのＣ末端に付加した。Kyte J. 、Doolittle,R.F.（簡便なタンパク質の加水分解性表現方法、157 J. Mol. Biol.105-132(1982)）の記載に準じて、１７部分（ｍｅｒ）のペプチド［Ｈ］−ＴＳＤＲＬＶＲＡＶＴＤＨＴＲＰＥＣ* −［ＯＨ］をＫＬＨに連結し、抗血清を調製した。そこに記載の該方法を参照して本明細書に記載されたものとする。
【００２０】
模擬ウイルス感染細胞タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを、Chowdhury S.I.（呼吸性ヘルペスウイルス１（ＢＨＶ−１）および神経毒性ＢＨＶ−５の糖タンパクＣ（ｇＣ）間での抗原変異の分子主成分、213 Virology.558-568(1995)）およびLaemli（バクテリアファージＴ４の頭部構築中おける構造タンパクの英国型分割、227 Nature(London) 680-685(1970)）の記載に準じて還元条件下で行なった。そこに記載の該方法を参照して本明細書に記載されたものとする。
【００２１】
組換えプラスミドの構築は、ｐＢＨＶ１ＨＫおよびｐＢＨＶ１ＨＦプラスミドを、Dr.W. Lawrence（米国、フィラデルフィア州、ペンシルバニア大学）より入手して行なった。それぞれのプラスミドは、ＢＨＶ−１ＤＮＡのＨindIII−ＫおよびＨindIII−Ｆ断片を含んでいた。
完全ｇＤ、ｇＩおよびｇＥコード領域のアミノ末端の一部、好ましくは３分の２を含むプラスミドｐＢＨＶ１ＨＫからの４．４ＫｂのＸhoＩ／ＨindIII小断片が、プラスミドｐＧＥＭ７Ｚ（ｐＢＨＶ１ｇＥ５’）のＸhoＩ／ＨindIII部位中でサブクローンされた。
次いでｇＥコード領域のカルボキシ末端の３分の１を含むｐＢＨＶ１ＨＦからの１．１５ＫｂのＨindIII／Ｂsu36Ｉ（Klenowによるブラントエンド）断片と、完全ＵＳ９ＯＲＦコード領域とが、プラスミドｐブルースクリプトＫＳ（ｐＢＨＶ１ｇＥ３’）のＨindIII／ＨincII 部位中でサブクローンされた。
最後に、完全ｇＥコード領域およびその隣接配列を構築するため、ＨindIII／ＸhoＩ小断片を含むｐＢＨＶ１ｇＥ５’の４．４ＫｂＨindIII／ＸbaＩベクター部位断片が、プラスミドｐＢＨＶ１ｇＥ３’のＨindIII／ＸbaＩ部位中でクローンされた。得られたクローンは、ｐＢＨＶ１ｇＥ５’３’として設計されたものである。
【００２２】
このｇＥコード領域を欠失させるため、上記ｐＢＨＶ１ｇＥ５’３’ＤＮＡをＡsuIIで部分消化させ、次いでＨindIIIで完全消化させた。大きな断片をゲル精製し、ＣＭＶ早期プロモーターが調節されたβ−ｇａｌ配列を含むｐＣＭＶβ（米国、カリフォルニア州、パロアルトクロンテック社より入手）の４．５Ｋｂ ＰstＩ断片（Ｔ４ポリメラーゼのブラントエンド）に連結した。得られたｇＥ欠失／β−ｇａｌ挿入プラスミド、ｐＢＨＶ１ｇＥΔβは、はじめの３７２アミノ酸をコードする遺伝子配列を含む１ＫｂのＢＨＶ−１ＤＮＡ配列が欠失され、β−ｇａｌ遺伝子がＣＭＶプロモーターの調節下に挿入されたものである。β−ｇａｌ遺伝子は、ウイルス特異性３．３２Ｋｂの上流配列（完全ｇＤおよびｇＩ遺伝子配列およびｇＥプロモーター配列）、およびウイルスＤＮＡを用いた組換えに必要な１．１５Ｋｂの下流配列（ｇＥコード領域のカルボキシ末端３分の１および完全ＵＳ９遺伝子を含む）に配置された。
【００２３】
ｇＥ欠失ＩＢＲ組換えウイルスを発現するため、線状化したｐＢＨＶ１ｇＥΔβ（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−２６３７）および全長野生型ＩＢＲＶ（Cooper株）ＤＮＡを、Madin-Darby ウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞中でリポフェクション（lipofection ）によって共形質移入させた。全長ＩＢＲＶ中のｇＥ座でのβ−ｇａｌの適切な挿入、次いで野生型ＩＢＲＶｇＥコード領域の一部の欠失は、ウイルスＤＮＡの複製を用いたプラスミドにおけるＢＨＶ−１特異的フランキング配列の相同組換えによるものである。ウイルス特異的フランキング配列が、コード領域中の欠失と同領域での挿入とをもたらすように、新規に合成されたウイルスＤＮＡ中に組入れられる。β−ｇａｌを発現する組換えウイルスは、Chowdery, S.I.（弱毒性ウシヘルペス１型（ＢＨＶ−１）組換えウイルスの構築と分析、52 Vet. Microbiol 13-23(1996) ）（そこに記載の方法を参照して本明細書中に記載されたものとする。）に準じて、Bluo-Gal被覆下、青色プラークのスクリーニングにより３回プラーク精製された。
いくつかの組換え体分離培養物は、さらにブロットハイブリタイゼイション法および抗ＢＨＶ−１ｇＥ特異的抗ペプチドウサギポリクロナール血清を用いる免疫ブロット法により分析された。Chowdery, S.I.のブロットハイブリタイゼイション法（弱毒性ウシヘルペス１型（ＢＨＶ−１）組換えウイルスの構築と分析、52 Vet. Microbiol 13-23(1996) ）が用いられ、その方法を本明細書中に記載されたものとする。Chowdery, S.I.の免疫ブロット法（呼吸器系ウシヘルペスヘルペス１型（ＢＨＶ−１）および神経毒性ＢＨＶ−５間の抗原変異糖タンパクＣ（ｇＣ）の分子主成分、213 Viology 558-568(1995) ）が用いられ、その方法を本明細書中に記載されたものとする。
【００２４】
［結果］
意図されたｇＥ座での欠失およびβ−ｇａｌ配列の挿入のためのサザンブロットハイブリダイゼイションによる、２つの組換えウイルス由来のＤＮＡ、ｇＥΔ3.1 ＩＢＲβ（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ-2367 ）と、ｇＥΔ3.5 ＩＢＲβとの分析を図２に示す。
分離培養物ｇＥΔ3.1 ＩＢＲβおよびｇＥΔ3.5 ＩＢＲβにおける、ｇＥ遺伝子のアミノ末端のはじめの３７２アミノ酸をコードする１ＫｂのＡsuII- ＨindIII断片配列の欠落、およびβ−ｇａｌ配列の存在は、これら分離培養物中、意図した組換えが部位特異的な方法で行われたことを示した。この知見に一致して、92-95 ＫｄのＢＨＶ−１ｇＥタンパクが、ＢＨＶ−１ｇＥ特異的抗ペプチドウサギポリクロナール血清により野生型親Cooper株中でも見つけられたが、ｇＥ欠失組換えウイルスｇＥΔ3.1 ＩＢＲβ中には欠けていた。この結果は図３に示され、またその分離培養物はさらなる研究に使用された。
さらに、ｇＥΔ3.1 ＩＢＲβは、野生型ＩＢＲＶ由来のフランキング配列および起源ｇＥ配列を含むプラスミドと共に形質移入することにより再び野生型ＩＢＲに戻ることができる。これは本質的にｇＥΔ3.1 ＩＢＲβを産生するために使用される共形質移入の逆である。
【００２５】
ウイルス感染したＭＤＢＫ細胞中のβ−ｇａｌ発現速度は、感染して３、６、１２および２４時間後、組織化学的に測定された。β−ｇａｌ活性は感染後３時間の早期と、２４時間の後期に測定された。これにより、ＣＭＶ−ＩＥでプロモーター調節されたｇＥΔ3.1 ＩＢＲβウイルスのβ−ガラクトシターゼ遺伝子は、早期でも後期でも発現されることがわかる。さらに、キメラ遺伝子が外来ヒトヘルペスウイルスＨＣＭＶ−ＩＥプロモーターにより調節され、かつβ−ｇａｌおよびＢＨＶ−１のいずれに対しても外来であるエンハンサー同様の非ウイルス性β−ｇａｌ配列を含んでいても、真正ＢＨＶ−１遺伝子として調節され、発現される。したがって、β−ｇａｌは、ＢＨＶ−１（ＢＨＶ−１の天然状態では存在しない）およびＨＣＭＶ−ＩＥに対し外来であり、かつそのエンハンサー配列は、それが調節／促進するＢＨＶ−１およびβ−ｇａｌのいずれに対しても外来である。
【００２６】
ｇＥ遺伝子の欠失は、ワクチン化した動物を感染した動物と分別するための免疫学的標識を提供する。ワクチン株に誘起される抗体反応は、ｇＥ特異的抗体を欠くであろうから、ｇＥ特異性抗体を含む野生型ＢＨＶ−１感染により惹起される反応とは区別することができる。このためワクチン化群中の感染動物を特定して間引くことができる。この血清学的標識は、群れからＢＨＶ−１を排除するために重要である。
【００２７】
組換えウイルスの作製に使用されたプラスミド（ｐＢＨＶ１ｇＥΔβ）および作製した組換えウイルス、ｇＥΔ3.1 ＩＢＲβは、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）に寄託された。該プラスミド（ｐＢＨＶ１ｇＥΔβ）は、ＡＴＣＣ受託番号２０３６０７として承認され、組換えウイルス（ｇＥΔ3.1 ＩＢＲβ）は、ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−２６３７として承認されている。
【００２８】
［実施例２］
材料および方法
家畜（コウシ）におけるｇＥΔ3.1 ＩＢＲβウイルスの病原性を試験測定し、その結果を親Cooper株ＩＢＲＶの病原性と比較した。ＩＢＲＶおよびウシウイルス性下痢ウイルスに感染していない１０頭の６ケ月齢ホルシュタインコウシを、ランダムに各５頭ずつ２つの群（ＡおよびＢ）に分けた。２つの群は、分離の保たれる牛舎で、同一条件下で飼育した。試験に先立ってすべてのコウシは健康であり、試験の開始まで血清陰性を保った。
【００２９】
Ａ群の各コウシには、組換えｇＥ欠失ＩＢＲＶを鼻腔内接種した。Ｂ群の各コウシには、親Cooper株ＩＢＲＶを鼻腔内接種した。接種材料は、各動物に対し、それぞれ１×１０7 ＴＣＩＤ50のウイルスを含む。接種は、Delvis社（ペンシルバニエ州サマセット）製DEVILBISモデル50噴霧剤を用い、鼻孔あたり２ｍｌの接種材料を３０秒以上ないし１分間噴霧することにより行った。
【００３０】
ウイルス曝露（接種）後、すべてのコウシを１４日間毎日集中的に臨床的観察した。直腸温度を毎日記録した。以下の状態には特別注意を払った：行動（低下）、食欲、咳、目および鼻からの排出物、充血または鼻および口粘膜（mucosae ）の病変、結膜炎、および異常呼吸。各条件は別々に記録し、各コウシの日毎の臨床スコアとともに各条件に対する全スコアを合計することにより、各群の臨床スコアの日平均を計算した。スコアパラメータは以下のとおり：
鼻水 正常＝０；少し漿液＝１；激しく漿液＝２；やや膿性＝２；少し膿性＝３；および激しく膿性＝４。
行動（低下） みられず＝０；やや＝１；少し＝２；激しく＝３
充血／鼻粘膜の赤味＝２
鼻粘膜の潰瘍＝２
咳＝２
呼吸困難＝２
日毎の直腸温度 39.7−39.99 ℃＝ 1；40.0−40.5℃＝２；40.6−41.0℃＝３；約41.0℃＝４
【００３１】
［結果］
ＩＢＲＶの親Cooper株（野生型ＩＢＲＶ）を感染させたＢ群のコウシは、感染の典型的な徴候を示した：低下、食欲低下、よだれおよび鼻水、鼻潰瘍／鼻プラーク、および咳。これら臨床的徴候は、図５に示すように、数日間以上、毎日高い臨床スコアを示す結果であった。しかしながら組換えｇＥΔ3.1 ＩＢＲβウイルスを感染させたコウシ群（群Ａ）は、臨床的に認められるどのような徴候も示さず（これも図５に示す）、それらの行動および食欲も正常に保持した。図６は、各群（ＡおよびＢ）のコウシの直腸温度の平均値を比較したものである。親株Cooperを感染させたコウシ群（Ｂ群）について、39.7℃−40.5℃の高い直腸温度が、終日間記録された。ｇＥΔ3.1 ＩＢＲβを感染させたコウシ群（Ａ群）について、38.9℃を超える直腸温度はまったく記録されなかった。
【００３２】
［実施例３］
材料および方法
ＭＤＢＫ細胞中のｇＥΔ3.1 ＩＢＲβウイルスと、ＭＤＢＫ細胞中の親ＩＢＲ株Cooperとの間で、成育速度を比較する実験を行なった。ＭＤＢＫ細胞の複製培養系列Ａには、組換えｇＥΔ3.1 ＩＢＲβまたは親株Cooperのいずれかの細胞当り、５プラーク形成単位（ＰＦＵ）を別々に感染させた。感染培養菌は、感染後継続期間をおいて回収し、ウイルス滴定検定に使用するウイルス系株を調製した。
【００３３】
［結果］
１段成長実験の結果を図４に示す。ウイルス成長曲線は、ｇＥΔ3.1 ＩＢＲβと親株Cooperとの後代ウイルスの時間曲線が同じものであることを示した。しかしながら、組換えウイルスは感染早期の収量が少なかった。
【００３４】
［実施例４］
材料および方法
ＡおよびＢ群（上記実施例３より）の各動物由来のウイルスを分離培養し、定量する実験を行なった。平たい綿チップの綿棒をそれぞれの鼻孔中に挿入した。粘膜に対し、綿棒を３回回転させた。試料培地（１００μｇ／ｍｌゲンタマイシン、３％v/v ＦＢＳ、アンフォテリシンＢを２５μｇ／ｍｌで含有するＭＥＭ）３ｍｌ中、室温で１時間かけて、ウイルスを綿棒から溶出させた。試料１０００ｇを５分間遠心分離して清澄化し、−７０℃で保存した。ＭＤＢＫ細胞中のウイルス分離培養は、１：１０希釈された綿棒サウペンション１００μｌを用いて行なわれた。ウイルス陽性試料をミクロタイター皿上で滴定した。培養培地中で一連の１０倍希釈物を作成し、各希釈液の５０μｌを、各１．５×１０5 ＭＤＢＫ細胞を含む８ウエルに（９６ウエル皿中）に添加した。３７℃で５日後、細胞変性効果（ＣＰＥ）をみるため皿を顕微鏡で計測した。ウイルス滴定量は、Reed, L.J.およびMuench, H.の方法に準じてＴＣＩＤ50で計算した。この方法を参照して本明細書に含まれるものとする。
【００３５】
［結果］
鼻綿棒から分離培養されたウイルスの量は、鼻上皮細胞中、ｇＥΔ3.1 ＩＢＲβウイルスの成育が、その親株Cooperに比して、効果的に少ないことを示した。鼻分泌物中のウイルス放出を図７に示す。このウイルス放出は、ｇＥΔ3.1 ＩＢＲβウイルスの方が野生型ＢＨＶ−１（親株Cooper）よりも、約１５ないし５５倍少ない。ウイルス放出期間も、ｇＥΔ3.1 ＩＢＲβ感染コウシの方が、野生型ウイルスに感染したコウシに比べ２日短かった。
【００３６】
［実施例５］
材料および方法
この実験では、ＡおよびＢ群（上記実施例３および４より）のコウシから採取した血清中のＢＨＶ−１中和抗体の力価を測定した。ＡおよびＢ両群の各コウシから、感染後１３日目の血液試料を採集した。血清中のＢＨＶ−１中和抗体力価を、Chowdhury S.I.らの反芻宿主より単離されたウマヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）の分子生物学的分析（11、Virus Res.127-139(1988) ）の記載に準じて、１２皿を用いてプラーク減少法により測定した。この方法を参照して本明細書に含まれるものとする。
【００３７】
［結果］
野生型（親株Cooper）およびｇＥ欠失ＩＢＲＶウイルス（ｇＥΔ3.1 ＩＢＲβ）とも、コウシ中にＢＨＶ−１中和抗体を誘発した。しかしながら、野生型に感染したコウシの血清は、ｇＥ欠失中和抗体（１：１１−１：３０で平均滴定量１：１６）に比して、中和滴定量がわずかに高かった（１：２０−１：３５で平均滴定量１：３０）。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ｇＥ−欠失ＢＨＶ−１ウイルス（ｇＥΔ3.1 ＩＢＲβ）およびｇＥコード領域のアミノ末端３分の２を置換した機能性β−ｇａｌ遺伝子を含む挿入／欠失ベクタープラスミドの構築を概略的に示すフロー図である。
【図２】ｇＥコード領域の欠失およびｇＥ座でのβ−ｇａｌ配列の挿入を意図したサザンブロットハイブリダイゼイションの増殖を示す図である。
【図３】ＢＨＶ−１ｇＥタンパクが野生型親Cooper株で検出されるが、ｇＥ−欠失組換えウイルス（ｇＥΔ3.1 ＩＢＲβ）では検出されないことを示す図である。
【図４】ＭＤＢＫ細胞におけるｇＥ−欠失ＩＢＲの成長速度と、野生型ＩＢＲの成長速度とを比較する１段成長実験の結果を示す図である。各データの点は、それぞれのコウシ群で得られた結果の平均値を示す。
【図５】ｇＥ−欠失ＩＢＲを感染させたコウシの日別臨床的スコアと、野生型ＩＢＲを感染させたコウシの日別臨床的スコアとを比較する図である。各データの点は、それぞれのコウシ群で得られた結果の平均値を示す。
【図６】ｇＥ−欠失ＩＢＲを感染させたコウシの日別の直腸温度と、野生型ＩＢＲを感染させたコウシの日別の直腸温度スコアとを比較する図である。各データの点は、それぞれのコウシ群で得られた結果の平均値を示す。
【図７】ｇＥ−欠失ＩＢＲの鼻のウイルス分泌（排出）物と、野生型ＩＢＲの鼻のウイルス分泌物とを、それぞれのコウシ群で得られた結果の平均値を示すデータ点で比較する図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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