(57)【要約】      （修正有）【課題】新たなプローブを用いたヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ−６）ＤＮＡの検出する方法を提供する。【解決手段】ＨＨＶ−６のタイプＡ（特定の配列で示されるポリヌクレオチド配列を含まないタイプ）およびタイプＢ（特定の配列で示されるポリヌクレオチド配列をウイルスＤＮＡ中に含むタイプ）に共通する部分配列を特定し、当該配列をプローブとして、ドットブロット等のハイブリダイゼーションを実施する。これにより、容易にＨＨＶ−６を検出することができる。また、ＨＨＶ−６のタイプＡとタイプＢの配列の差異を利用し、タイプに特異的なプローブを用いるハイブリダイゼーションによって、ＨＨＶ−６のサブタイプを識別することもできる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のヌクレオチド配列の少なくとも１２塩基対の長さを有する部分配列または全配列：
(1)   ５’−ＴＧＡＴＧＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡＡＡＧＡＧＡＴＧＴＣＣＡＡＴＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＣＣＡ−３’
(2)   ５’−ＡＡＧＣＡＧＡＴＧＡＡＴＣＡＡＡＴＣＴＴ−３’
(3)   ５’−ＡＴＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＡＡＡＴＴＴＡＡＴＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴ−３’
(4)   ５’−ＴＧＡＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡ−３’
(5)   ５’−ＴＴＡＴＧＡＴＧＡＴＡＣＴＧＧＴＴＴ−３’
(6)   ５’−ＡＴＴＡＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＴ−３’
(7)   ５’−ＡＧＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＴＧＡＴ−３’
(8)   ５’−ＡＴＡＴＴＣＡＧＡＧＧＡＡＴＣＴＴＣＴＡＴＣＧＡＡＴＣＴＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＣ−３’
(9)   ５’−ＴＴＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＣ−３’
(10)  ５’−ＡＡＡＡＴＧＴＡＴＣＣＡ−３’
(11)  ５’−ＡＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡ−３’
(12)  ５’−ＧＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＣＡＡＡ−３’
(13)  ５’−ＣＣＣＴＡＡＣＴＧＴＧＴＡ−３’
(14)  ５’−ＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＣＡＧＡＴＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＣＴ−３’
(15)  ５’−ＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡ−３’
(16)  ５’−ＡＴＣＡＴＴＴＣＴＧＡＴＡＴＴＡＡＡＧ−３’
(17)  ５’−ＧＡＧＴＧＡＴＣＡＧＴＴＴＣＡＴＡＡＣＣＡＡＡ−３’
(18)  ５’−ＴＴＴＣＡＴＣＡＴＴＧＴＴＡＴＣＧＣＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＴＡ−３’
(19)  ５’−ＴＧＣＡＡＴＧＴＡＡＴＣＡ−３’
(20)  ５’−ＴＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＡＴＧＴＴＡＴＴＡＧＴＴＣＴ−３’
(21)  ５’−ＴＴＧＣＴＡＡＡＴＧＧＴＧＴＡＴＴＣＴＣＡＴ−３’
(22)  ５’−ＧＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡ−３’
若しくは該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる少なくとも１つのＤＮＡをプローブとして用いるＤＮＡハイブリダイゼーションによって、ヒトヘルペスウイルス６型ＤＮＡを検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ−６）ＤＮＡの検出、並びにＨＨＶ−６のサブタイプの識別を行う方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトヘルペスウイルス６型（以下、ＨＨＶ−６と称する）は、１９８６年にSaluhuddin等によって後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）患者、及びリンパ球系疾患患者のリンパ球より第６番目のヘルペスウイルスとして分離され（1986, Science, 234, 596-601 ）、１９８８年、山西等によって突発性発疹の原因ウイルスであることが明らかにされた（1988, Lancet, 1065-1067 ）。
【０００３】
ＨＨＶ−６は当初ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）陽性リンパ腫及びリンパ腺炎、又ＨＩＶ陰性のリンパ腫より分離されており、又Ｂリンパ腫にＨＨＶ−６  ＤＮＡが見いだされるなど、何らかの血液系疾患に関与している可能性が示唆されている。又、腎移植後、ＨＨＶ−６抗体価が著名に上昇し、拒絶反応の起こった患者リンパ球よりＨＨＶ−６が分離される等、臓器移植後の拒絶反応との関係も示唆されている（1990, Transplantation, 49, 519〜522 ）。
【０００４】
大多数の人においては、ＨＨＶ−６の感染は、生後１年以内に成立することが抗体保有率に関する調査より明らかとなっているが（1989 J. Clin. Microbiol.27, 651-653 ）、ウイルスの感染経路はいまだ明らかではない。唾液からＨＨＶ−６が分離された、という報告も見受けられる。
【０００５】
最近、ＨＨＶ−６はＤＮＡの多型性から２つのサブタイプに分けられており（1991 J. Clin. Microbiol 29, 367-372 ）、タイプ間での病原性の違い、細胞親和性の違い、及び増殖性の違いといった生物学的性状にどの様な差異があるか注目されている。これまでに、ＡＩＤＳ患者や、リンパ球系疾患患者からはタイプＡのＨＨＶ−６が主に分離されているが、Pruksannonda等はＨＨＶ−６の初感染によって発熱したと思われる患児から分離されたＨＨＶ−６は全てタイプＢであったと報告している（1992, The New England Journal of Medicine, 326, 1445-1550 ）。
【０００６】
このように、ＨＨＶ−６のタイピング、即ち型の決定は種々の疾患との関連で興味深いものと考えられる。ところが、従来ＨＨＶ−６のタイピングに利用されていた方法は、分離したウイルスからＤＮＡを抽出精製し、制限酵素によってウイルスＤＮＡを消化後、電気泳動にかけ、その電気泳動パターンによって多型性を調べるか、タイプＡ及びタイプＢそれぞれに特異的なモノクローナル抗体を利用してウイルス感染細胞を蛍光抗体法で染色することによって同定されてきた。しかしこれらの方法は、何れもウイルスの分離、培養等の操作を伴うものであり、非常に時間と労力を必要とするばかりか、ウイルスの分離ができなければ同定することは不可能であった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述した様に、ＨＨＶ−６のタイピングは、種々の疾患との関連で興味深いものと考えられるが、従来の技術は何れも細胞培養によるウイルス分離を伴うものであり、非常に煩雑であった。
【０００８】
本発明は、上記問題を解決する為のＨＨＶ−６タイプ特異的ＤＮＡを提供すること、及びＨＨＶ−６タイピングの簡便な方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は上記課題を解決するために、ＨＨＶ−６タイプＢに属するＨＳＴ株（K. Takahashiら、 J. Virol., 3161〜3163, 1989）の前初期遺伝子の一つについてその塩基配列を決定し、既報のＨＨＶ−６タイプＡに属するＵ１１０２株の同領域の塩基配列（1991, J. Virol 65, 5381-5390）と比較した。その結果、ＨＳＴ株とＵ１１０２株の塩基配列の間に特徴的な差異を見いだし、本発明を完成するに至った。即ち、本発明者等がその塩基配列解析を行ったＨＳＴ株と、既報のＵ１１０２株の前初期遺伝子内において、ＨＳＴ株にはＵ１１０２株には見られない新規の２ヵ所のポリヌクレオチドの挿入が認められた（図１参照）。１ヵ所は１０８ bp であり、もう１カ所は２２８ bp であった。それぞれの塩基配列を配列番号１及び２としてそれぞれ後記配列表中に示した。
【００１０】
新規の１０８ bp 及び２２８ bp ポリヌクレオチド配列は、図２に示すＨＨＶ−６のタイピングの結果からも明らかなように、タイプＢに属するＨＨＶ−６株に特徴的な配列であると考えられる。
【００１１】
従って、本発明は、配列番号１に示されるヒトヘルペスウイルス６型由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、又はその部分配列を提供する。本発明はまた、配列番号２に示されるヒトヘルペスウイルス６型由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、又はその部分配列を提供する。
【００１２】
本明細書中、「ＨＨＶ−６（サブ）タイプＢ」なる用語は、配列番号１及び２にそれぞれ示されるポリヌクレオチド配列をウイルスＤＮＡ中に含むタイプのＨＨＶ−６に言及して使用する。また、「ＨＨＶ−６（サブ）タイプＡ」なる用語は、そのようなポリヌクレオチド配列を共に含まないタイプのＨＨＶ−６に言及して使用する。
【００１３】
それ故、ＨＨＶ−６のタイプＡとタイプＢの上記差異を利用することによって、例えば、タイプＢに特徴的なＤＮＡ配列をプローブとして用いるＤＮＡハイブリダイゼーションによって、ＨＨＶ−６のサブタイプ（Ａ及びＢ）を識別することができる。
【００１４】
このように、本発明は、配列番号１に示されるＨＨＶ−６由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその部分配列をプローブとして使用するＤＮＡハイブリダイゼーションによってヒトヘルペスウイルス６型のサブタイプＡ及びＢを識別する方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、配列番号２に示されるＨＨＶ−６由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその部分配列をプローブとして使用するＤＮＡハイブリダイゼーションによってヒトヘルペスウイルス６型のサブタイプＡ及びＢを識別する方法を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、配列番号１及び２に示されるＨＨＶ−６由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその部分配列の両方をプローブとして使用するＤＮＡハイブリダイゼーションによってヒトヘルペスウイルス６型のサブタイプＡ及びＢを識別する方法を提供する。
【００１７】
ＤＮＡハイブリダイゼーションについては、Molecular Cloning, 1989 等に記載の技術が適用される。このとき、標識ＤＮＡの標識物質としては、酵素（例えばアルカリホスファターゼ）、ラジオアイソトープ（例えば32Ｐ）等が使用される。
【００１８】
血液等のヒト検体中のＨＨＶ−６含有量が少ない場合、例えば感染初期の場合には、前記１０８ bp 及び２２８ bp 挿入領域をはさみ、タイプＡ及びＢに共通な配列を持つプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行ってＤＮＡ増幅するならば、ＰＣＲ産物の長さの違いから両タイプを識別することが可能となる。
【００１９】
上記目的で使用し得るプライマーセットの好適例を下記に列挙する。これらのプライマーセットは、ＨＨＶ−６タイプＢのＤＮＡ上に存在する新規の１０８bp及び２２８bpヌクレオチド配列近傍のＨＨＶ−６タイプＡ及びタイプＢ  ＤＮＡの共通配列の中から特定的に選択したものである。実際にプライマーとして利用される配列はプライマーセットの配列に示されたヌクレオチド配列の部分配列又は全配列である。また、下記に列挙するヌクレオチド配列以外にも、決定された配列に基づいて種々の可能な配列を選択し本発明の識別方法に適用することも可能であろう。
【００２０】
プライマーセット−１
プライマーＩ：
５’−ＴＧＡＴＧＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡＡＡＧＡＧＡＴＧＴＣＣＡＡＴＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＣＣＡ−３’
５’−ＡＡＧＣＡＧＡＴＧＡＡＴＣＡＡＡＴＣＴＴ−３’
５’−ＡＴＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＡＡＡＴＴＴＡＡＴＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴ−３’
５’−ＴＧＡＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡ−３’
５’−ＴＴＡＴＧＡＴＧＡＴＡＣＴＧＧＴＴＴ−３’
５’−ＡＴＴＡＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＴ−３’
５’−ＡＧＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＴＧＡＴ−３’
５’−ＡＴＡＴＴＣＡＧＡＧＧＡＡＴＣＴＴＣＴＡＴＣＧＡＡＴＣＴＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＣ−３’
プライマーII：
５’−ＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＡＴＣＴＧＧＡＧＡＡ−３’
５’−ＴＧＧＡＴＡＣＡＴＴＴＴ−３’
５’−ＴＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＴ−３’
５’−ＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣ−３’
５’−ＣＴＧＴＣＴＧＣＴ−３’
５’−ＴＡＣＡＣＡＧＴＴＡＧＧＧ−３’
５’−ＡＧＧＧＣＣＧＣＣＣＡＧＡＴＣＴＧＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＴＧＴＡＣ−３’
５’−ＴＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＡＴＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧ−３’
プライマーセット−２
プライマーＩ：
５’−ＴＴＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＣ−３’
５’−ＡＡＡＡＴＧＴＡＴＣＣＡ−３’
５’−ＡＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡ−３’
５’−ＧＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＣＡＡＡ−３’
５’−ＡＧＣＡＧＡＣＡＧ−３’
５’−ＣＣＣＴＡＡＣＴＧＴＧＴＡ−３’
５’−ＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＣＡＧＡＴＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＣＴ−３’
５’−ＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡ−３’
プライマーII：
５’−ＡＴＣＡＴＴＴＣＴＧＡＴＡＴＴＡＡＡＧ−３’
５’−ＧＡＧＴＧＡＴＣＡＧＴＴＴＣＡＴＡＡＣＣＡＡＡ−３’
５’−ＴＴＴＣＡＴＣＡＴＴＧＴＴＡＴＣＧＣＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＴＡ−３’
５’−ＴＧＣＡＡＴＧＴＡＡＴＣＡ−３’
５’−ＴＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＡＴＧＴＴＡＴＴＡＧＴＴＣＴ−３’
５’−ＴＴＧＣＴＡＡＡＴＧＧＴＧＴＡＴＴＣＴＣＡＴ−３’
５’−ＧＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡ−３’
プライマーセット−３
プライマーＩ：
５’−ＴＧＡＴＧＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡＡＡＧＡＧＡＴＧＴＣＣＡＡＴＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＣＣＡ−３’
５’−ＡＡＧＣＡＧＡＴＧＡＡＴＣＡＡＡＴＣＴＴ−３’
５’−ＡＴＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＡＡＡＴＴＴＡＡＴＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴ−３’
５’−ＴＧＡＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡ−３’
５’−ＴＴＡＴＧＡＴＧＡＴＡＣＴＧＧＴＴＴ−３’
５’−ＡＴＴＡＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＴ−３’
５’−ＡＧＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＴＧＡＴ−３’
５’−ＡＴＡＴＴＣＡＧＡＧＧＡＡＴＣＴＴＣＴＡＴＣＧＡＡＴＣＴＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＣ−３’
プライマーII：
５’−ＡＴＣＡＴＴＴＣＴＧＡＴＡＴＴＡＡＡＧ−３’
５’−ＧＡＧＴＧＡＴＣＡＧＴＴＴＣＡＴＡＡＣＣＡＡＡ−３’
５’−ＴＴＴＣＡＴＣＡＴＴＧＴＴＡＴＣＧＣＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＴＡ−３’
５’−ＴＧＣＡＡＴＧＴＡＡＴＣＡ−３’
５’−ＴＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＡＴＧＴＴＡＴＴＡＧＴＴＣＴ−３’
５’−ＴＴＧＣＴＡＡＡＴＧＧＴＧＴＡＴＴＣＴＣＡＴ−３’
５’−ＧＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡ−３’。
【００２１】
たとえば、上記プライマーセット−１を用いた場合、そのＰＣＲ増幅産物の長さは、ＨＨＶ−６タイプＢ株ではタイプＡ株より１０８ bp 長くなる。また、プライマーセット−２を用いた場合、タイプＢ株ではタイプＡ株より２２８ bp 長くなる。またプライマーセット−３を用いた場合、タイプＢ株ではタイプＡ株より３３６ bp 長くなる。何れのプライマーセットを用いた場合でもＨＨＶ−６タイプＢ株とタイプＡ株でのＰＣＲ産物の長さには大きな違いが生じるため、通常のアガロースゲル電気泳動等のサイズ分析によって容易に両株を識別することが可能である。
【００２２】
従って、本発明は、上記プライマーセット−１の中から各々一種ずつ選択されたプライマーＩ及びIIの組合わせを用いて、検体中のヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ−６）ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応を行って該ＨＨＶ−６ＤＮＡを増幅した後、その増幅産物をサイズ分析に掛けて、配列番号１に示されるＨＨＶ−６由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその部分配列を含有するＨＨＶ−６ＤＮＡと該配列を含有しないＨＨＶ−６ＤＮＡとに分離して、ＨＨＶ−６のサブタイプＡ及びＢを識別する方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、上記プライマーセット−２の中から各々一種ずつ選択されたプライマーＩ及びIIの組合わせを用いて、検体中のヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ−６）ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応を行って該ＨＨＶ−６ＤＮＡを増幅した後、その増幅産物をサイズ分析に掛けて、配列番号２に示されるＨＨＶ−６由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその部分配列を含有するＨＨＶ−６ＤＮＡと該配列を含有しないＨＨＶ−６ＤＮＡとに分離して、ＨＨＶ−６のサブタイプＡ及びＢを識別する方法を提供する。
【００２４】
本発明はさらに、上記プライマーセット−３の中から各々一種ずつ選択されたプライマーＩ及びIIの組合わせを用いて、検体中のヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ−６）ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応を行って該ＨＨＶ−６ＤＮＡを増幅した後、その増幅産物をサイズ分析に掛けて、配列番号１及び２に示されるＨＨＶ−６由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその部分配列を含有するＨＨＶ−６ＤＮＡと該配列を含有しないＨＨＶ−６ＤＮＡとに分離して、ＨＨＶ−６のサブタイプＡ及びＢを識別する方法を提供する。
【００２５】
ここで、ポリメラーゼ連鎖反応については、公知の技術が適用され、また、サイズ分析においては、アガロースゲル電気泳動等の技術が使用され、これらの方法は特定のものに限定されない。
【００２６】
既にＨＨＶ−６のタイプが明らかにされている１３株を用いて、上記プライマーセット−２を用いてＰＣＲを行ったところ、各タイプに特徴的な長さのバンドがそれぞれ確認され、本発明によってＨＨＶ−６のタイピングが可能であることが明らかとなった（図２参照）。
【００２７】
ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ量が十分な場合、アガロースゲル電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、ＤＮＡを確認できるが、臨床検体等でＨＨＶ−６  ＤＮＡ量が少ない検体においては、ＰＣＲ後でもエチジウムブロマイド染色では特異的なバンドを確認できない場合がある。その様な場合、サザンブロッティングの後、上記プライマーセット中のポリヌクレオチドをプローブとして、ハイブリダイゼーション法によってＨＨＶ−６  ＤＮＡの存在を同定することができる。これらプライマーセット中のポリヌクレオチド配列は、タイプＡ及びＢの双方に共通な配列であるため、どちらのタイプのＨＨＶ−６  ＤＮＡでも検出することができる。一方、配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列若しくはその相補的配列の一部又は全部をプローブとして用いた場合、このポリヌクレオチド配列はタイプＡのＨＨＶ−６  ＤＮＡには存在しない配列であるため、タイプＢのＨＨＶ−６  ＤＮＡとのみハイブリダイズする。ここで、プライマーセット−１または−３を用いてＰＣＲを行った場合、タイプＢ特異的なプローブは配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列若しくはその相補的配列の一部又は全部が利用される。又、プライマーセット−２又は−３を用いた場合、タイプＢ特異的なプローブは配列番号２に示されるポリヌクレオチド配列若しくはその相補的配列の一部又は全部が利用される。
【００２８】
従って、プライマーセット−１，−２又は−３を用いてＰＣＲを行った後、これらプライマーセット中のポリヌクレオチド配列の何れか一種の一部又は全部をプローブとしてＨＨＶ−６  ＤＮＡの存在を確認した後、配列番号１又は２に示したポリヌクレオチド配列若しくはその相補的配列の何れか一種の一部又は全部をプローブとしてＨＨＶ−６タイプＢを同定することにより、ＨＨＶ−６のタイピングを行うことができる。もちろん、多量のＨＨＶ−６  ＤＮＡが利用できる場合には、ＰＣＲの過程を省略して直接上記ポリヌクレオチド配列をプローブとして組み合わせることにより、ＨＨＶ−６のタイピングが可能である。
【００２９】
あるいは、ＨＨＶ−６タイプＡとＢのＤＮＡ塩基配列の違いを利用して、タイプＡ特異的プローブ及びタイプＢ特異的プローブを設定し、これらのプローブの認識部位を含むＨＨＶ−６ＤＮＡのＰＣＲ産物に対してハイブリダイゼーションを行えば、タイプの判別が可能である。このための有効なプローブの例として、次のものが挙げられる。
タイプＡ特異的プローブ：
(1)   ５’−ＧＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＣＣＴＣＣＡＧ−３’、
タイプＢ特異的プローブ：
(2)   ５’−ＴＡＡＡＴＣＣＡＴＴＡＣＴＧＧＣＣＴＴＧＡＡ−３’。
【００３０】
従って、本発明は、上記ヌクレオチド配列(1) 及び(2) 若しくはこれらの配列に相補的なヌクレオチド配列、又はその部分配列からなる、それぞれタイプＡ及びタイプＢに特異的な各ヌクレオチド配列を独立に少なくとも１つずつプローブとして用いて、検体中のヒトヘルペスウイルス６型ＤＮＡとハイブリダイゼーションすることによって、ヒトヘルペスウイルス６型のサブタイプＡ及びＢを識別する方法をも提供する。
【００３１】
本発明によれば、下記のヌクレオチド配列：
(1)   ５’−ＴＧＡＴＧＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡＡＡＧＡＧＡＴＧＴＣＣＡＡＴＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＣＣＡ−３’
(2)   ５’−ＡＡＧＣＡＧＡＴＧＡＡＴＣＡＡＡＴＣＴＴ−３’
(3)   ５’−ＡＴＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＡＡＡＴＴＴＡＡＴＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴ−３’
(4)   ５’−ＴＧＡＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡ−３’
(5)   ５’−ＴＴＡＴＧＡＴＧＡＴＡＣＴＧＧＴＴＴ−３’
(6)   ５’−ＡＴＴＡＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＴ−３’
(7)   ５’−ＡＧＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＴＧＡＴ−３’
(8)   ５’−ＡＴＡＴＴＣＡＧＡＧＧＡＡＴＣＴＴＣＴＡＴＣＧＡＡＴＣＴＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＣ−３’
(9)   ５’−ＴＴＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＣ−３’
(10)  ５’−ＡＡＡＡＴＧＴＡＴＣＣＡ−３’
(11)  ５’−ＡＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡ−３’
(12)  ５’−ＧＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＣＡＡＡ−３’
(13)  ５’−ＡＧＣＡＧＡＣＡＧ−３’
(14)  ５’−ＣＣＣＴＡＡＣＴＧＴＧＴＡ−３’
(15)  ５’−ＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＣＡＧＡＴＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＣＴ−３’
(16)  ５’−ＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡ−３’
(17)  ５’−ＡＴＣＡＴＴＴＣＴＧＡＴＡＴＴＡＡＡＧ−３’
(18)  ５’−ＧＡＧＴＧＡＴＣＡＧＴＴＴＣＡＴＡＡＣＣＡＡＡ−３’
(19)  ５’−ＴＴＴＣＡＴＣＡＴＴＧＴＴＡＴＣＧＣＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＴＡ−３’
(20)  ５’−ＴＧＣＡＡＴＧＴＡＡＴＣＡ−３’
(21)  ５’−ＴＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＡＴＧＴＴＡＴＴＡＧＴＴＣＴ−３’
(22)  ５’−ＴＴＧＣＴＡＡＡＴＧＧＴＧＴＡＴＴＣＴＣＡＴ−３’
(23)  ５’−ＧＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡ−３’
若しくは該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、並びに配列番号１及び２に示されるヌクレオチド配列若しくはその相補的配列又はその部分配列からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列をプローブとして用いるＤＮＡハイブリダイゼーションによって、ＨＨＶ−６  ＤＮＡを検出することも可能であり、従って、本発明はＨＨＶ−６  ＤＮＡの検出方法も提供する。
【実施例】
【００３２】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００３３】
実施例１
ａ）ＤＮＡの抽出
ヒト末梢血単核球培養細胞にＨＨＶ−６を感染させ、培養後、感染細胞を遠心により収集する。感染細胞沈渣に細胞溶解用緩衝液（10mM Tris-HCl (pH8.0), 150mM NaCl, 0.4% SDS, 10mM EDTA, 1mg/ml Proteinase K ）を０．４ml加え、６５℃で一夜（又は５６℃で３時間）インキュベートする。インキュベーション後、フェノール／クロロホルム（１：１）混合液を２００μｌ加え、激しく振盪し、遠心処理によって液を２層に分離し、上部の水層を回収する。同操作を更に２回繰り返し行った後、３００μｌのクロロホルムを加え激しく振盪し、更に遠心処理を行った後上部の水層を回収する。同操作を更にもう一度繰り返す。最終的に回収した水層に１０μｇの酵母ｔＲＮＡと３倍量のエタノールを加え、−７０℃、１時間以上静置する。遠心処理によってＤＮＡを沈殿させた後、沈渣を８０％エタノールで洗浄、風乾し、０．５×ＴＥ（5mM Tris-HCl (pH8.0), 0.5mM EDTA）に溶解し、ＰＣＲ用サンプルとした。
【００３４】
ｂ）ＰＣＲによるＨＨＶ−６  ＤＮＡ
上記サンプルを用いてＰＣＲを行った（ＰＣＲに関しては、例えば、R. K. Saiki ら、Science, 230, 1350(1985)参照）。ＨＨＶ−６としてはＨＳＴ株とＵ１１０２株を用いて行った。また、プライマーとしては以下のオリゴヌクレオチドを使用した。
【００３５】
プライマーＡ：５’−ＴＴＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＣ−３’
プライマーＢ：５’−ＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＣＡＧＡＴＣＴＧＧＧＣ−３’
プライマーＣ：５’−ＣＡＴＣＡＴＴＧＴＴＡＴＣＧＣＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣ−３’
プライマーＤ：５’−ＴＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＡＴＧＴＴＡＴＴＡＧＴＴＣＴ−３’
ＰＣＲを行うに当っては、上記プライマーの組み合わせとしてＡとＣ、ＡとＤ、ＢとＣ及びＢとＤの組み合わせでそれぞれ行った。
【００３６】
ＰＣＲの反応条件は、サンプル１〜１０μｌを用い、終濃度が10mM Tris-HCl (pH8.3), 1.5mM  MgCl2 , 0.01％ゼラチン，dNTP 200μＭ，各プライマー５０ｐＭ，Ｔａｑポリメラーゼ 2.5単位となるように各組成を加え、最終５０μｌとして９０℃  １分、６０℃  ２分、７２℃  ３分のサイクルを２５サイクル繰り返しＰＣＲを行った（図３）。増幅産物をアガロースゲル電気泳動に掛けてサイズにより分析した。
【００３７】
図３に示すように、４組のプライマー何れの組み合わせにおいてもＵ１１０２株のＰＣＲ産物はＨＳＴ株のＰＣＲ産物に比較してその長さが明らかに短く、両株を容易に判別することができた。
【００３８】
実施例２
ａ）ＤＮＡの抽出
ＨＨＶ−６としてタイプＡであることが知られているＵ１１０２株及びＧＳ株（1986, Science, 234, 596-601 ）、タイプＢであることが知られているＨＳＴ株（K. Takahashiら、 J. Virol., 3161〜3163, 1989）、Ｚ２９株（1988, J. Infect. Dis, 157, 1271-1273）及びＥｎｄｅｒｓ株とタイプＡに特異的なモノクローナル抗体とタイプＢに特異的なモノクローナル抗体の両方に反応することからタイプＡとタイプＢの中間型と考えられているＤＡ株を用いてＰＣＲによって各タイプを識別できるかどうか検討を行った。又その他、臨床検体として国内の突発性発疹急性期患者の末梢血から分離されたＯＫＣ株、ＮＫＴ株、１０３株、１０１株、Ｉｎｏｕｅ株及びＫｉｔａｈａｒａ株とＨＨＶ−６と一部相同性があるといわれているＨＨＶ−７（1990, Proc. Natl. Acad. Sci, 87, 748-752）についても検討した。ＤＮＡの抽出は、実施例１に述べた方法に準拠して行った。
【００３９】
ｂ）ＰＣＲによるＨＨＶ−６のタイピング
上記各ＨＨＶ−６より抽出したＤＮＡをサンプルとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは実施例１で示した方法に従って行い、またプライマーとしては実施例１で示したプライマーのＡとＣの組合わせを用いて行った。結果を図２に示した。
【００４０】
プライマーＡとＣの組み合わせでは、タイプＢのＨＳＴ株は５５４ bp のＰＣＲ産物を生じ、タイプＡのＵ１１０２株では３２６ bp のＰＣＲ産物を生じる。図２から明らかなようにタイプＢに属するＺ２９株、及びＥｎｄｅｒｓ株は何れも同じタイプＢのＨＳＴ株と同じ泳動位置にバンドが検出され、一方タイプＡに属するＧＳ株は同じタイプＡのＵ１１０２株と同じ泳動位置にバンドが検出され、本発明の方法を用いることによってＨＨＶ−６のタイピングが可能であることが検証された。又両タイプの中間型と考えられていたＤＡ株では３２６ bp のバンド以外に５５４ bp 付近に弱いバンドが検出され、このことから、ＤＡ株は中間型ではなく両タイプのウイルスが混在している可能性が考えられた。
【００４１】
また、国内の突発性発疹患者からの分離株は全てＨＳＴ株と同じタイプＢであった。ＨＨＶ−７は本法では検出されなかった。
【００４２】
実施例３
ａ）ＤＮＡの抽出
ＨＨＶ−６としてタイプＡであることが知られているＵ１１０２株とタイプＢであることが知られているＨＳＴ株を用い、それぞれ実施例１で述べた方法に準拠してＤＮＡの抽出を行った。
【００４３】
ｂ）プローブの調製
配列番号１に示される配列を利用したプローブは、その配列内に、５’−ＧＴＡＧＡＡＴＡＴＴＴＡＡＡＡＴＡＣＡＴＧＧＡＡＧ−３’及び５’−ＧＴＴＴＧＴＡＡＧＴＴＴＴＴＧＴＣＴＴＧＴＴＧＧＧ−３’の一組のプライマーを設定し、実施例１で示したＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅し、その増幅産物をランダムプライマーＤＮＡラベリングキット（宝酒造）を用いて32Ｐ標識することによって調製した。
【００４４】
配列番号２に示される配列を利用したプローブは、その配列内に、５’−ＡＣＡＡＣＡＡＧＡＣＡＴＴＴＴＧＣＴＴＡＣＡＧＣＣ−３’及び５’−ＧＡＴＴＣＡＣＴＡＧＡＣＴＴＴＣＴＡＣＡＧＣＴＣＣ−３’の一組のプライマーを設定し、実施例１で示したＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅し、その増幅産物をランダムプライマーＤＮＡラベリングキット（宝酒造）を用いて32Ｐ標識することによって調製した。
【００４５】
ｃ）ＰＣＲ及びサザンブロットハイブリダイゼーション
上記各ＨＨＶ−６より抽出したＤＮＡをサンプルとしてＰＣＲを行った。プライマーとしては配列番号１に示される配列を含む領域の増幅には５’−ＧＡＧＧＡＡＴＣＴＴＣＴＡＴＣＧＡＡＴＣＴＡＴＣＣ−３’及び５’−ＴＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＡＴＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧ−３’の組み合わせを用いた。又配列番号２に示される配列を含む領域の増幅には、実施例１で示したプライマーのＡとＣの組み合わせを用いて行った。ＰＣＲは実施例１で示した方法に従って行った。
【００４６】
ＰＣＲによって増幅した産物は、１％アガロースゲル内で電気泳動した後、ＤＮＡをナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋；Ａｍｅｒｓｈａｍ製）に転写した。転写した膜を２％ＳＤＳ、３％スキムミルクを含む６×ＳＳＰＥ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ，６ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．０６Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４））中６５℃、６時間行った後、同液中に32Ｐ標識したプローブを加えた液と交換し、更に６５℃、１６時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション終了後、膜を２×ＳＳＰＥで室温２０分洗浄し、更に２×ＳＳＰＥで６５℃、２０分洗浄を２回、０．２×ＳＳＰＥで６５℃、２０分洗浄を２回行った。洗浄後の膜をＸ線フィルムとコンタクトし、フィルムを感光させることによってプローブのハイブリダイゼーションの有無を確認した。
【００４７】
図４には、配列番号１に示される配列を含む領域のＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動後のエチジウムブロマイド染色図（Ａ）及び該配列をもとに作製したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションの結果（Ｂ）を示した。
【００４８】
図５には、配列番号２に示される配列を含む領域のＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動後のエチジウムブロマイド染色図（Ａ）及び該配列をもとに作製したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションの結果（Ｂ）を示した。
【００４９】
何れの場合においても、配列番号１及び２に示される各配列をもとに作製したプローブは共に、タイプＢに属するＨＳＴ株のＤＮＡとのみハイブリダイズし、タイプＡであるＵ１１０２株のＤＮＡとはハイブリダイズしなかった。従って、これら配列番号１及び２に示されるＤＮＡ配列をプローブとして利用することにより、ＨＨＶ−６のタイピングが可能である。
【００５０】
実施例４
ａ）ＤＮＡの抽出
ＨＨＶ−６としてタイプＡであることが知られているＵ１１０２株およびタイプＢであることが知られているＨＳＴ株、またタイプ不明の臨床分離株１及び２の感染ヒト末梢血単核球培養細胞よりＤＮＡを抽出した。ＤＮＡの抽出は実施例１に述べた方法に準拠して行った。
【００５１】
ｂ）ＰＣＲによるＤＮＡの増幅及びドットブロット
上記各ＨＨＶ−６より抽出したＤＮＡをサンプルとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは実施例１で示した方法に従って行い、またプライマーとしては実施例１で示したプライマーのＡとＣの組み合わせを用いて行った。これらのＰＣＲ産物をナイロンメンブレンフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋）に０．５μｌずつ載せ、０．４Ｎ  ＮａＣｌで２０分間処理した後、６×ＳＳＰＥで中和した。
【００５２】
ｃ）アルカリフォスファターゼ標識ＤＮＡプローブの調製
ＨＨＶ−６タイプ特異的酵素標識プローブとしては、５’−ＧＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＣＣＴＣＣＡＧ−３’を有するオリゴヌクレオチドをタイプＡに特異的なプローブ、５’−ＴＡＡＡＴＣＣＡＴＴＡＣＴＧＧＣＣＴＴＧＡＡ−３’を有するオリゴヌクレオチドをタイプＢに特異的なプローブとして用いるため、これらをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（３８１Ａ）を用いて合成し、アミノリンクIIを用いてその５’末端にアミノ基を付加した。アミノ基を付加したＤＮＡをＥＭＣＳ［Ｎ−（ε−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ］を用いてマレイミド化し、一方アルカリフォスファターゼは２−Ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅを用いてＳＨ基を付加した。両者を混合反応させることによりアルカリフォスファターゼ標識ＤＮＡプローブを作製した。
【００５３】
ｄ）ハイブリダイゼーション
ｂ）で作製したメンブレンフィルターを２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで室温で５分間洗浄、更に２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを用いて４０℃、５分間の洗浄を３回行った。ハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．５％ＳＤＳ、１％Ｃａｓｅｉｎ）を用いて５０℃、３０分間ブロッキングを行い、次にｃ）で調製した酵素標識プローブ２種のうち１種を加え（アルカリフォスファターゼの最終濃度０．１μｇ／ｍｌ）、５０℃で１時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション終了後１×ＳＳＣ、１％ＳＤＳを用いて４０℃で５分間の洗浄を２回、１×ＳＳＣ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて４０℃で５分間の洗浄を２回、１×ＳＳＣを用いて室温で５分間の洗浄を２回行った。アルカリフォスファターゼ基質反応液（0.3M  Tris−HCl 、0.1M  NaCl、50mM  MgCl2 （pH 9.8））を加え、室温で５分間インキュベートした後、ＮＴＢ溶液［７０％  Ｎ’Ｎ−ＤｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅにＮＴＢ（Ｎｉｔｒｏ  Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  Ｂｌｕｅ）を７５ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解したもの］を３３μｌ／７．５ｍｌ、ＢＣＩＰ溶液［100 ％  Ｎ’Ｎ−ＤｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅにＢＣＩＰ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−Ｉｎｄｏｒｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅを５０ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解したもの］を２５μｌ／７．５ｍｌ加え、３７℃で２時間反応させた。
【００５４】
結果を図６に示した。図６のＡではタイプＡに特異的なプローブをＢではタイプＢに特異的なプローブを用いた。またＰＣＲ産物の１はＵ１１０２株、２はＨＳＴ株、３は臨床分離株１、４は臨床分離株２を示している。図に示す通り、タイプＡ特異的プローブはＵ１１０２株のＰＣＲ産物とハイブリダイズするが、ＨＳＴ株とはハイブリダイズせず、またタイプＢ特異的プローブはＨＳＴ株とハイブリダイズするがＵ１１０２株とはハイブリダイズしなかった。これらのプローブを用いることにより、ＰＣＲ産物をサザンブロットすることなく、ドットブロットを行うことによって簡便かつ迅速にタイプを識別することが可能である。また、この方法により、臨床分離株１はタイプＡ、臨床分離株２はタイプＢであることが判明した。
【００５５】
ＨＨＶ−６のタイピングは、種々の疾患との関連で興味深いものと考えられるが、これまでそのタイピングには数週間以上の時間を必要としていた。本発明によって臨床検体からＨＨＶ−６  ＤＮＡの存在の有無を判定することができるばかりか、そのタイピングを簡便且つ迅速に行うことが可能となり、臨床医学、基礎医学等の分野で極めて有効な研究手段が提供されたものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ＨＨＶ−６  Ｕ１１０２株と比較される、ＨＳＴ株ゲノム上の新規１０８ bp 及び２２８ bp ヌクレオチド配列部位を示す。
【図２】タイプＡ及びＢのいずれかに属する１３種類のＨＨＶ−６株と２種類のＨＨＶ−７株について、各ウイルスＤＮＡのＰＣＲ増幅後、アガロースゲル電気泳動に掛けて得られた、サイズによりサブタイプの識別が可能であることを示す泳動写真である。
【図３】４種類のプライマーセットを用いてＨＳＴ株とＵ１１０２株のＤＮＡの各ＰＣＲを実施した後、アガロースゲル電気泳動に掛けて得られた、サイズによりサブタイプの識別が可能であることを示す泳動写真である。
【図４】配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む領域のＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動後のエチジウムブロマイド染色図（Ａ）、及び、該配列をもとにして作製したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションの結果（Ｂ）を示す写真である。
【図５】配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含む領域のＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動後のエチジウムブロマイド染色図（Ａ）、及び、該配列をもとにして作製したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションの結果（Ｂ）を示す写真である。
【図６】タイプＡに特異的なプローブ（Ａ）又はタイプＢに特異的なプローブ（Ｂ）を用いるハイブリダイゼーションによってサブタイプ識別を実施した結果を示すドットブロット写真である。
【符号の説明】
【００５７】
１  Ｕ１１０２株、
２  ＨＳＴ株、
３  臨床分離株
４  臨床分離株
【図１】
2007061084.tif 000002
【図２】
2007061084.tif 000003
【図３】
2007061084.tif 000004
【図４】
2007061084.tif 000005
【図５】
2007061084.tif 000006
【図６】
2007061084.tif 000007
【配列表】
2007061084000001.app