(57)【要約】【課題】細胞膜透過性を有する非ウイルス性ベクターを提供する。【解決手段】正電荷をもつ膜透過性物質が結合された多糖−コレステロールまたは多糖−脂質誘導体からなることを特徴とする非ウイルス性ベクター、その製法、該ベクターと有用物質からなる複合体、ならびに該複合体を含む疾患の治療用組成物。【選択図】図３
2007145761.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
正電荷をもつ膜透過性物質が結合された多糖−コレステロールまたは多糖−脂質誘導体からなることを特徴とする非ウイルス性ベクター。
【請求項２】
前記膜透過性物質が、ペプチド、塩基性アミノ酸またはカチオン性高分子化合物であることを特徴とする、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記膜透過性物質が、細胞移行性、核移行性、または核移行シグナルとしての作用をもつ物質であることを特徴とする、請求項１または２に記載のベクター。
【請求項４】
前記膜透過性物質が、前記多糖の少なくとも１つの糖残基に結合されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項５】
前記膜透過性物質が、システイン残基を含むペプチドであることを特徴とする、請求項２〜４のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項６】
前記ペプチドが、そのC末端に、-Cys-Gly-NH2を含むことを特徴とする、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
前記ペプチドが、前記多糖−コレステロールまたは多糖−脂質誘導体とジスルフィド結合によって結合していることを特徴とする、請求項５または６に記載のベクター。
【請求項８】
水の存在下でナノサイズのミセルを形成することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のベクターと有用物質との複合体。
【請求項１０】
前記有用物質が、疾患の治療用であることを特徴とする、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
前記有用物質が、核酸、タンパク質、ペプチドまたは小分子であることを特徴とする、請求項９または10に記載の複合体。
【請求項１２】
前記核酸が、発現可能な遺伝子を含む核酸であることを特徴とする、請求項11に記載の複合体。
【請求項１３】
前記核酸が、プラスミドであることを特徴とする、請求項12に記載の複合体。
【請求項１４】
前記核酸が、一本鎖あるいは二本鎖構造をもち、約15〜30塩基の範囲の長さであり、および標的細胞において特定遺伝子の発現を抑制する機能をもつDNAまたはRNAであることを特徴とする、請求項11に記載の複合体。
【請求項１５】
前記核酸が、dsRNA、siRNAまたはリボザイムであることを特徴とする、請求項13に記載の複合体。
【請求項１６】
前記核酸が、アプタマーであることを特徴とする、請求項11に記載の複合体。
【請求項１７】
ヒトを含む哺乳動物の細胞、組織または器官の疾患もしくは非疾患部位に投与可能であることを特徴とする、請求項９〜16のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１８】
前記組織が粘膜であることを特徴とする、請求項17に記載の複合体。
【請求項１９】
請求項９〜18のいずれか１項に記載の複合体と薬学的に許容可能な担体とを含む、疾患の治療用組成物。
【請求項２０】
核移行性シグナルの作用をもつペプチドをさらに含むことを特徴とする、請求項19に記載の組成物。
【請求項２１】
正電荷をもつ膜透過性ペプチドが結合された多糖−コレステロールまたは多糖−脂質誘導体からなる請求項１〜８のいずれか１項に記載の非ウイルス性ベクターの製造方法であって、(i)多糖−コレステロールまたは多糖−脂質誘導体の糖残基の少なくとも１つのOH基に、メルカプト（SH）基を有するリンカーを結合する工程、および(ii)工程(i)で得られた生成物のリンカーのSH基と、C末端に-Cys-Gly-NH2を含む膜透過性ペプチドのシステイン（Cys）残基との間でジスルフィド結合を形成する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
保護および脱保護の工程をさらに含むことを特徴とする、請求項21に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、正電荷をもつ細胞膜透過性物質が化学的に結合された多糖−コレステロールもしくは多糖−脂質誘導体からなる非ウイルス性ベクター、その用途、およびその製造方法に関する。
【０００２】
本発明のベクターは、特定の遺伝子の発現を促進するかまたは抑制する核酸を、効率的に標的となる細胞内に導入することを可能にする。
【背景技術】
【０００３】
近年、先天性疾患や、癌、エイズ、多発性硬化症、重症筋無力症、パーキンソン病、慢性関節リウマチなどの難治性疾患の治療や再生医療に向けて、核酸、遺伝子、合成ペプチドやタンパク質などを細胞内に導入し細胞機能を制御する技術の開発が期待されており、なかでも遺伝子や核酸を標的細胞に送達させる遺伝子デリバリーシステムの開発が強く求められている。
【０００４】
遺伝子デリバリーシステムを達成するには、有効な遺伝子導入ベクターが必須であり、これには、細胞毒性がなく生体に安全で優れた遺伝子導入効率を示すのはもちろんのこと、患者の生活の質の向上（Quality of Life、QOL）を考慮すると、必要に応じて遺伝子発現を制御する時間的、空間的パターンの制御ができる遺伝子デリバリーシステムが望まれる。
【０００５】
遺伝子導入ベクターとしては、レトロウイルスやアデノウイルスなどを用いるウイルスベクターと、合成脂質であるカチオニックリポソームやカチオニックポリマーなどを用いる非ウイルスベクターがあげられる。ウイルスベクターはウイルスを不活化あるいは弱毒化してその感染能力を利用するため遺伝子導入効率が高く非分裂細胞にも遺伝子を導入できる利点をもつが、病原性の回復や免疫原性が高いなどの危険性も有する。これに対し、非ウイルスベクターはウイルスベクターに比べ遺伝子導入効率は低いが安全性が高い利点をもつことが知られている。しかし、この非ウイルスベクターは、カチオニックリポソームやカチオニックポリマーなどの正電荷をもつ物質と負電荷を帯びた細胞との間での静電気的相互作用を利用して遺伝子導入させる特徴をもつことが多いことから、時にはこの正電荷によって細胞毒性を示すことが知られている。
【０００６】
特許文献１には、標的細胞に対して特異性を有し、遺伝子発現性に優れた核酸の導入用キャリアーが記載されている。また、特許文献２には、遺伝子導入ベクターとして機能するサイクロデキストリン・デンドリマー結合体について記載されている。
【０００７】
遺伝子導入ベクターの素材には、生体に安全なものを使用する必要がある。砂本らは、特許文献３の中で、多糖類の単糖単位100個あたり0.1〜10個の割合で多糖類の側鎖コレステロールが結合している多糖−コレステロール誘導体とα−リノレン酸と水とを含有する脂肪乳剤を有効成分とする制癌剤について記載している。また、砂本らは特許文献４の中で、多糖−コレステロール誘導体、α−リノレン酸および中鎖脂肪酸トリグリセリドを含む油層によって構成される制癌活性をもつo/w型脂肪乳剤について記載している。特許文献５には、アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体を用いた製剤に多糖−コレステロールを併用した皮膚外用剤が記載されている。しかし、これらの特許文献３〜５には、多糖−コレステロール誘導体を遺伝子導入ベクターとして使用することに関する記載はない。
【０００８】
遺伝子を効率よく標的細胞内で発現させるためには、遺伝子の細胞内への導入、細胞内に取り込まれた後のエンドソーム（またはマクロピノソーム）やエンドソーム/ライソソームからの回避、核膜の透過、核内での転写などが効率よく行われる必要がある。遺伝子やベクターの細胞内への取り込みメカニズムや細胞内での挙動について明らかにされつつあり、細胞膜透過性ペプチド（cell penetrating peptide、CPP）やタンパク質透過ドメイン（protein transduction domain、PTD）と称される約10〜20個の膜透過に必要なアミノ酸を有する細胞内移行性ペプチド、さらには、核への移行や核での局在、転写促進の機能を有する核移行シグナル（nuclear localization signals、transcription factor）が注目されている（非特許文献１）。また、特許文献６には、特別な配列のポリペプチドを含む細胞透過性キャリアーペプチドについて記載されている。
【０００９】
【特許文献１】特開2005-176830号公報
【特許文献２】特開2001-103969号公報
【特許文献３】特開平5-139967号公報
【特許文献４】特開平5-262645号公報
【特許文献５】特開2003-73281号公報
【特許文献６】特開2001-199997号公報
【非特許文献１】二木史郎、化学と生物43(10):649-653 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
生体適合性の素材を用いて、細胞内または核内への遺伝子移行機能を有し、かつ高い遺伝子導入および遺伝子発現を促す非ウイルス性ベクターの構築は、遺伝子デリバリーシステムの確立に極めて重要であると考えられている。
【００１１】
本発明の目的は、特定のタンパク質の発現を促進または抑制できるプラスミド、短鎖リボ核酸またはデオキシリボ核酸などの核酸、治療用タンパク質、ペプチドまたは小分子などの有用物質を効率的に標的細胞あるいは組織に導入することができる、生体適合性が高くかつ細胞毒性が少ない、正電荷をもつ細胞透過性物質が結合された多糖−コレステロールもしくは多糖−脂質非ウイルス性ベクターを提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、上記ベクターを製造する方法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、上記ベクターと有用物質との複合体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、膜透過性物質によって多糖−コレステロールもしくは多糖−脂質誘導体を化学的に修飾した結合体が、有用な核酸を標的細胞または組織に効率的に導入することを見出し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は、要約すると、以下の特徴を有する。
【００１５】
本発明は、その第１の態様において、正電荷をもつ膜透過性物質が結合された多糖−コレステロールまたは多糖−脂質誘導体からなることを特徴とする非ウイルス性ベクターを提供する。
その一の実施形態において、前記膜透過性物質が、ペプチド、塩基性アミノ酸またはカチオン性高分子化合物である。
その別の実施形態において、前記膜透過性物質が、細胞移行性、核移行性、または核移行シグナルとしての作用をもつ物質である。
その別の実施形態において、前記膜透過性物質が、前記多糖の少なくとも１つの糖残基に結合されている。
その別の実施形態において、前記膜透過性物質が、システイン残基を含むペプチドである。
その別の実施形態において、前記ペプチドが、そのC末端に、-Cys-Gly-NH2を含むものである。
その別の実施形態において、前記ペプチドが、前記多糖−コレステロールまたは多糖−脂質誘導体とジスルフィド結合によって結合している。
その別の実施形態において、本発明のベクターは水の存在下でナノサイズのミセルを形成することを特徴とする。
【００１６】
本発明はまた、第２の態様において、上記の本発明のベクターと有用物質との複合体を提供する。
その一の実施形態において、前記有用物質が疾患の治療用である。
その別の実施形態において、前記有用物質が、核酸、タンパク質、ペプチドまたは小分子である。
その別の実施形態において、前記核酸が発現可能な遺伝子を含む核酸である。
その別の実施形態において、前記核酸が発現可能な遺伝子を含む核酸がプラスミドである。
その別の実施形態において、前記核酸が、一本鎖あるいは二本鎖構造をもち、約15〜30塩基の範囲の長さであり、および標的細胞において特定遺伝子の発現を抑制する機能をもつDNAまたはRNAである。
その別の実施形態において、前記核酸がdsRNA、siRNAまたはリボザイムである。
その別の実施形態において、前記核酸がアプタマーである。
その別の実施形態において、上記の複合体がヒトを含む哺乳動物の細胞、組織または器官の疾患または非疾患部位に投与可能である。
その別の実施形態において、前記組織が粘膜である。
【００１７】
本発明はさらに、第３の態様において、上記の本発明の複合体と薬学的に許容可能な担体とを含む、疾患の治療用組成物を提供する。
その実施形態において、前記組成物が核移行性シグナルの作用をもつペプチドをさらに含む。
【００１８】
本発明はさらに、第４の態様において、正電荷をもつ膜透過性ペプチドが結合された多糖−コレステロールまたは多糖−脂質誘導体からなる非ウイルス性ベクターの製造方法であって、(i)多糖−コレステロールまたは多糖−脂質誘導体の糖残基の少なくとも１つのOH基に、メルカプト（SH）基を有するリンカーを結合する工程、および(ii)工程(i)で得られた生成物のリンカーのSH基と、C末端に-Cys-Gly-NH2を含む膜透過性ペプチドのシステイン（Cys）残基との間でジスルフィド結合を形成する工程を含むことを特徴とする方法を提供する。
その実施形態において、上記方法は保護および脱保護の工程をさらに含むことができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のベクターは、核酸、タンパク質などの有用物質を血液あるいは細胞中の酵素で分解されることなく安定にかつ速やかに細胞内に導入することが可能であるし、また短鎖デオキシリボ核酸およびリボ核酸などの有用物質を細胞内に導入して効率的に遺伝子の発現を阻害することができるし、さらにまた本発明のベクターを用いることによって核酸を細胞質内から核内へ速やかに移行し効率的に目的遺伝子の発現を促進することができる。
【００２０】
本発明のベクターはまた、核酸、タンパク質などの有用物質と容易に複合体を形成することができるし、さらに本発明のベクターは、細胞毒性がなく、標的細胞あるいは組織に障害を与える危険性がなく安全であるともいえる。さらに、本発明のベクターは、鼻、膣、肺などの粘膜に投与することができ、必要に応じてエレクトロポレーション法あるいはソノポレーション法を併用することで、より高い遺伝子導入および発現効果を示すことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
１．定義
本明細書中で使用する用語は、以下の定義を含む。
「ベクター」とは、核酸、タンパク質、小分子などの有用物質を細胞内に運搬する作用をもつ多糖−コレステロールまたは多糖−脂質誘導体を意味し、キャリアーと称することもできる。特に核酸を運搬する場合のベクターは、「遺伝子導入ベクター」、「遺伝子キャリアー」などと称することもできる。
【００２２】
「膜透過性」とは、本発明の非ウイルス性ベクターが動物細胞、例えばヒト細胞を含む哺乳動物細胞、の細胞膜または核膜を透過して細胞質内または核内に移送される特性を指す。したがって、「膜透過性物質」とは、このような特性をもち該ベクターを細胞内に移送することができる任意の低分子または高分子物質をいう。本発明で好ましい膜透過性物質はペプチドであるが、これは「キャリアーペプチド」と称する場合もある。
【００２３】
「正電荷をもつ」とは、分子が電気的に陽性であることを意味する。そのような正電荷を付与する基は、例えばアミノ基、グアニジノ基などの基であり、これらの基は正電荷の四級アンモニウムイオン、グアニジウムイオンを形成する。本明細書中で使用する「カチオン性」なる用語も、同様の意味を有する。
【００２４】
「ナノサイズ」とは、ナノ粒子の直径が約１μｍ未満のナノメートルの大きさをいう。
【００２５】
「複合体」とは、有用物質が、本発明のベクターに非共有的に結合された、または該ベクター内に取り込まれた状態の物質をいう。「非共有的」とは、イオン的相互作用、疎水的相互作用、物理的相互作用（すなわち、ファンデル・ワールス力）などの比較的弱い結合、あるいは包埋、包括などの取り込みを意味する。
【００２６】
「疾患部位」とは、実際に病気に侵された、あるいは遺伝子治療の対象となる組織や器官の部位を指す。
【００２７】
２．多糖−コレステロールまたは多糖−脂質誘導体
本発明のベクターの構成成分である多糖−コレステロールまたは多糖−脂質誘導体は、コレステロールまたは脂質に多糖を共有的に結合して得られたものである。
【００２８】
多糖としては、天然由来または化学合成品、例えば、プルラン、アミロペクチン、アミロース、グリコーゲン、シクロデキストリン、デキストラン、ヒドロキシエチルデキストラン、マンナン、セルロース、デンプン、アルギン酸、キチン、キトサン、ヒアルロン酸およびそれらの誘導体などを用いることができるが、これらに限定されない。
【００２９】
コレステロールおよび脂質としては、コレステロールに加えて、天然由来または化学合成からなる脂質、例えば、糖脂肪酸エステルを形成することが可能である、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、マーガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸などの脂肪酸、糖脂質を形成することが可能である、セラミド（N-アシルスフィンゴシン）、アシルグリセロール、アルキルグリセロール、ステロイドなどの脂質を用いることができるが、これらに限定されない。
【００３０】
多糖とコレステロールまたは脂質は、直接的に結合してもよいし、あるいはリンカー（またはスペーサー）を介して間接的に結合してもよいが、好ましくはリンカーを介して結合する。
【００３１】
多糖−コレステロール誘導体の合成は、例えば、コレステロールのC3位のOH基に、リンカーとしての例えばHOOC-NH(CH2)nNH-COOH（ここでn=1〜18）、HOOC-(CH2)n-COOH（ここでn=1〜18）などのアルキレンジイソシアネートやアルキレンジカルボン酸をエステル化し、他方のカルボキシル基を、多糖の一級OH基にエステル化することによって得ることができる。
【００３２】
具体的には、多糖−コレステロール誘導体は、特開平5-139967号公報（特許文献３）に記載されるような方法によって、以下のように合成することができる。
【００３３】
トルエン（100ml)にコレステロール(10mmol)を溶かし、これにピリジン（４ml)とアルキレンジイソシアネート(148mmol)を加え、80℃で24時間反応させたのち、トルエンおよび未反応のアルキレンジイソシアネートを減圧除去する。これに石油エーテル(500ml)を加え、生成物を抽出する（収率45％）。次に、多糖（糖単位当り7.44mmol)を無水ジメチルスルホキシド(100ml)に溶かし、ピリジン（８ml)を加えた液に、合成したＮ−（イソシアナトアルキル）コレステリルカルバメイト（0.19mmol)を加え、100℃で８時間反応させる。反応終了後、ジメチルスルホキシドを減圧除去し、これにエタノール(500ml)を加えて生成物を析出させる（収率約75％）。
【００３４】
多糖−脂質誘導体の合成は、脂質が脂肪酸の場合には、そのカルボキシル基を多糖の一級OH基にエステル化することによって行われるし、脂質がセラミド、アシルグリセロール、アルキルグリセロール、ステロイドの場合には、そのOH基に上記のようなリンカーを結合したのち、他方のカルボキシル基を、多糖の一級OH基にエステル化することによって得ることができる。多糖−コレステロール誘導体の合成の場合と同様の方法で、多糖−脂質誘導体を合成することができる。
【００３５】
本発明の多糖−コレステロールまたは多糖−脂質誘導体は、多糖類の単糖単位100個あたり0.1〜10個の割合で多糖類の側鎖にコレステロールまたは脂質が結合している結合体である。多糖が例えばプルランの場合、単糖単位100個あたり１〜２個の割合で多糖の側鎖にコレステロールが結合する（特許文献３）。
【００３６】
本発明の多糖−コレステロールまたは多糖−脂質誘導体は、疎水基と親水基をもつ構造のために、水中で自己会合し単分散なナノ微粒子を形成する特性を有している。電荷は中性であり、本発明のベクターの素材として用いるためには、これに正電荷をもつ膜透過性物質を結合する。
【００３７】
３．正電荷をもつ膜透過性物質
本発明によれば、多糖−コレステロールまたは多糖−脂質誘導体に、正電荷をもつ膜透過性物質を共有的に結合することによって、目的のベクターが得られる。
【００３８】
正電荷をもつ膜透過性物質は、正電荷をもち動物細胞の細胞内に膜透過可能な性質をもつものであればいかなる物質でもよい。好ましくは低分子または高分子の有機分子である。本発明の実施形態によれば、そのような好ましくは低分子または高分子の有機分子である。本発明の実施形態によれば、そのような膜透過性物質は、ペプチド、塩基性アミノ酸またはカチオン性高分子化合物である。他の可能な膜透過性物質には、カチオン性脂質が含まれる。
【００３９】
塩基性アミノ酸としては、（DL-、D-またはL-）アルギニン、リジン、ヒスチジンなどが例示されるが、これらに限定されない。
【００４０】
カチオン性高分子化合物としては、ポリエチレンイミン、ポリアルギニン、ポリリジンなどが例示されるが、これらに限定されない。
【００４１】
カチオン性脂質としては、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDAB）、トリメチル-2,3-ジオレイルオキシプロピルアンモニウムクロライド（DOTMA）、N-1-2,3-ジオレイルオキシプロピル-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド（DOTAP）、コレステリル3β-N-ジメチルアミノエチルカルバメートハイドロクロライド（DC-Chol）、1,2-ジミリスチルオキシプロピル-3-ジメチル-ハイドロキシルアンモニウムブロミド（DMRIE）などが例示されるが、これらに限定されない。
【００４２】
膜透過性ペプチドは、遺伝子やタンパク質など有用物質の細胞内への導入を速やかにする作用をもち、cell penetrating peptide（CPP）あるいはprotein transduction domain（PTD）と称され、膜透過に必要な約10〜45アミノ酸を有する塩基性ペプチドである。
【００４３】
膜透過性ペプチドとしては、例えば、細胞膜透過性を示すhuman immunodeficiency virus-1（HIV-1）Tatタンパク質の48〜57位のアルギニンに富むアミノ酸配列を含むペプチドあるいはその誘導体（JS Wadia and SF Dowdy, Adv. Drug Deliv. Rev. 57:579 (2005)）、６〜８個のアルギニンから構成されるR６〜R８ペプチドおよびその誘導体(LR Wright et al., Curr. Protein Pept. Sci. 4:105 (2003); S Futaki et al., J. Mol. Recobnit. 16:260 (2003))、およびHIV-1 Rev(34〜50位)、FHV coat(35〜49位)、BMG Gag(7〜25位)、HTLV-II Rex(4〜16位)、P22 N(14〜30位)、IN(1〜22位)、Yeast PRP6(129〜144位)、Human U2AF(142〜153位)、Human cFos(139〜164位)、Human cJun(252〜279位)、Yeast GCN4(231〜252位)などのDNAあるいはRNAと結合性をもつペプチドあるいはその誘導体（田畑泰彦編集、ドラッグデリバリーシステムDDS技術の新たな展開とその活用法、p25、メディカルドゥ、大阪、2003）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
本発明のベクターの構成成分である膜透過性物質は、細胞移行性、核移行性、または核移行シグナルとしての作用をもつ。
【００４５】
特に膜透過性物質が細胞膜を透過する機構として、マクロピノサイトーシスと呼ばれる特殊なエンドサイトーシスが提案されている（非特許文献１; JS Wadia et al., Nature Med., 10:310 (2004); I Nakase et al., Mol. Ther., 10:1011 (2004)）。マクロピノサイトーシスは、細胞膜周辺のアクチンフィラメントが重合することにより細胞外へ膜が突き出し、細胞外液を細胞内に取り込む機序である(SD Conner and SL Schmid, Nature 422:37 (2003)。マクロピノサイトーシスの場合、しばしば１μｍを超すエンドソーム（マクロピノソーム）が形成されるため、直径200nm以上の物質を細胞内に取り込むことができるといわれている。しかし、一方では、これらの膜透過性物質の細胞膜透過機構としては、温度依存性であるとしたり、カベオラを介したエンドサイトーシスとするもの（P.Jarver and U. Langel, Drug Discovery Today, 9(9), 395 (2004), A. Fittipaldi, M. Giacca, Ad. Drug Del. Rev., 57, 597-608 (2005)）などがあり、未だに完全には明らかにされていないのが現状である。
【００４６】
さらにまた、膜透過性物質が核膜を透過する機構として、核膜上に存在する核膜孔複合体（nuclear pore complex、NPC）を介して核と細胞質間の物質交換が行われると考えられており、直径9 nm以下の分子（分子量40〜90 kDa相当）については自由にNPCを通過できるといわれている。核移行シグナルは、NPCを自由に通過することができない直径約9〜40 nm（分子量90 kDa以上）の大きな分子を選択的に核に移行させる作用をもち、また、遺伝子などの物質の核への移行や核での局在、転写促進の機能を有する。
【００４７】
核移行シグナルとしては、例えば転写因子のNF-κB(p50)やNF-κB(p60)、Mitosin、Myc、DNAへリカーゼQ1、hNRNPなどのペプチドあるいはその誘導体が挙げられる（田畑泰彦編集、ドラッグデリバリーシステムDDS技術の新たな展開とその活用法、p25、メディカルドゥ、大阪(2003））が、これらに限定されるものではない。
【００４８】
また、本発明における膜透過性ペプチドとしては、細胞移行性および核移行性をもつペプチドだけでなく、膜融合能をもつpH感受性もしくはpH非感受性のペプチドなどを用いることができる。
【００４９】
pH非感受性ペプチドとしては、例えば、
HIV-1 gp41(N-terminus)（AVGVLGALFLGFLGAAGSTMGAASLTLT；配列番号４）、
SIV gp32(N-terminus)（GVFVLGFLGFLATAG；配列番号５）、
Sendai virus F1(N-terminus)（FFGAVIGTIALGVATSAQITAGIALAER；配列番号６）
などのウイルス由来ペプチド、
pH感受性ペプチドとしては、例えば、
influenza(X31) HA2(N-terminus)（GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG；配列番号７）、
influenza(X31)HA2(N-terminus)（IFGIDDLIIGLLFVAIVEAGIG；配列番号８）、
Polio1 vp1(N-terminus)（GLGQMLESMIDNTVREVGGA；配列番号９）、
Polio3 vp1(N-terminus)（GIEDLISEVAQGALTLVP；配列番号10）、
Vaccinia virus 14kD(N-terminus)（MDGTLFPGDDDLAIPATEFFSTKA；配列番号11）、
Semliki Forest virus E1(internal)（DYQCKVYTGVYPFMWGGAYCFCD；配列番号12）
などのウイルス由来ペプチド、
INF1 (GLFGAIAGFIENGWEGMIDGGGC；配列番号13)、
INF2 (GLFEAIAGFIENGWEGMIDGGGC；配列番号14)、
INF3 (GLFEAIEGFIENGWEGMIDGGGC；配列番号15)、
INF4 (GLFEAIEGFIENGWEGnIDGCA；配列番号16)、
INF5 (GLFEAIEGFIENGWEGnIDGC-s-s-CGDINGEWGNEIFGEIAEFLG；配列番号17)、
INF6 (GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG；配列番号18)、
INF7(GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYG；配列番号19)、
diINF7 (GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGC-s-s-CGYWGDIMGEWGNEIFGEIAEFLG；配列番号20)、
NF8 (GLFEAIEGFIENGFEGMIDGGGC-s-sCGGGDIMGEFGNEIFGEIAEFLG；配列番号21)、
INF9 (GLFELAEGLAELGAEGLAEGWYGC；配列番号22)、
INF10 (GLFELAEGLAELGWEGLAEGWYGC；配列番号23)、
D4 (GLFGAIADFIEGGWEGLIEG；配列番号24)、
E5 (GLFEAIAEFIEGGWEGLIEG；配列番号25)、
E5L (GLLEALAELLEGGWEGLLEG；配列番号26)、
K5 (GLFKAIAKFIKGGWKGLIKG；配列番号27)、
GALA (WEAALAEALAEALAEHLAEALAEALAEALAAGGSC；配列番号28)、
GALA-GLF (GLFGALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAAGGSC；配列番号29)、
GALA-INF1 (GLFGAIAGFIENGWEGLAEALAEALEALAAGGSC；配列番号30)、
GALA-INF3 (GLFEAIEGFIENGWEGLAEALAEALEALAAGGSC；配列番号31)、
KALA (WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA；配列番号32)、
ppTG1 (GLFLALLKLLKSLWKLLLKA；配列番号33)、
ppTG20 (GLFRALLRLLRSLWRLLLRA；配列番号34)、
JTS-1 (GLFEALLELLESLWELLLEA；配列番号35)、
JST-1-K13 (GLFEALLELLESLWELLLEAC；配列番号36、SEKKKKWKKKKKKKKAKYC；配列番号37)
などの合成ペプチド、が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
４．ベクターの製造
膜透過性物質と多糖−コレステロールまたは多糖−脂質誘導体とを結合する方法は、膜透過性物質を多糖の少なくとも１つの糖残基の水酸基(OH)に化学的に結合することを含む。
【００５１】
結合は、直接的または間接的に行うことができる。膜透過性物質が例えば塩基性アミノ酸の場合、アミノ基やグアニジノ基を適当な保護基で保護したのち、遊離のカルボキシル基をエステル化反応によって糖の一級OH基と直接結合させることができる。必要ならば
リンカー（またはスペーサー）を介してそれらを結合させてもよい。
【００５２】
膜透過性物質が上に例示したようなペプチドである場合、システイン(Cys)残基を含むように改変することが望ましい。本発明の実施形態によれば、膜透過性ペプチドは、そのC末端に、-Cys-Gly-NH2を含むように改変される。ペプチドがCys残基を含むことによって、そのCys基と、多糖のOH基に予め結合されたリンカーの末端メルカプト(SH)基との間でジスルフィド(-S-S-)結合を形成させることができる。ジスルフィド結合は血液などの体循環系では安定で細胞内に取り込まれた後、酵素によって切断され、Tatなどの塩基性ペプチドと細胞質内を拡散し、核内へ移行して遺伝子発現を効率よく進めることが予想される。
【００５３】
リンカーの例は、例えばω−メルカプトアルカン酸、例えば２−メルカプト酢酸、３−メルカプトプロピオン酸、４−メルカプト酪酸、５−メルカプト吉草酸などであるが、これらに限定されない。多糖にω−メルカプトアルカン酸を結合する際には、メルカプト基を適当な保護基、例えばトリフェニルメチル基で保護したのち、多糖のOH基（好ましくは一級OH基）との間でエステル結合を形成する。
【００５４】
したがって、上記の方法は、正電荷をもつ膜透過性ペプチドが結合された多糖−コレステロールまたは多糖−脂質誘導体からなる本発明のウイルス性ベクターの製造方法を提供し、この方法は、(i)多糖−コレステロールまたは多糖−脂質誘導体の糖残基の少なくとも１つのOH基に、メルカプト（SH）基を有するリンカーを結合する工程、および(ii)工程(i)で得られた生成物のリンカーのSH基と、C末端に-Cys-Gly-NH2を含む膜透過性ペプチドのシステイン（Cys）残基との間でジスルフィド結合を形成する工程を含む。
【００５５】
多糖−コレステロールまたは多糖−脂質誘導体の多糖にリンカーを結合するときには、メルカプト基を保護する必要がある。その後、多糖のリンカー基に膜透過性ペプチドを結合するときには、メルカプト基の保護基を脱保護する必要がある。それゆえ、本発明の上記方法には、保護および脱保護工程をさらに含むことができる。
後述の実施例には、Tat修飾コレステロールプルラン誘導体の製造例が具体的に記載されている。
【００５６】
いずれにしても、多糖−コレステロールまたは多糖−脂質誘導体と膜透過性物質との結合のための方法としては、上記のジスルフィド結合を形成する方法に限定されることなく、エステル結合、エーテル結合、アミド結合などアミノ酸や糖の化学で一般的に使用される手法が含まれる（C. Fernadez, O. Nieto, and A. Fernadez-Mayoralas and et al., Org. Biomol. Chem., 1, 767-771 (2003)、水野卓、西沢一俊 共著、図解糖質化学便覧、p187-286（1971））。
【００５７】
５．ベクターと有用物質との複合体
本発明のベクターは、コレステロールまたは脂質部を疎水性基とし、一方多糖部を親水性基とすることにより、水の存在下でナノサイズのミセルを形成する。その平均粒径は、約50nm〜3μm、好ましくは約50nm〜1,000nm、さらに好ましくは約50nm〜800nm、もっと好ましくは300nm未満、例えば約50nm〜200nmである。本発明のベクターの重要な特性の１つが、ナノ微粒子形成能である。これによって細胞内や核内への導入効率が向上する。
【００５８】
本発明のベクターはまた、細胞毒性試験により100％の細胞が生存することから、細胞毒性が極めて低く、高い安全性を有している。この特性は、ヒト生体に適用するときには非常に重要である。
【００５９】
本発明のベクターはさらに、有用物質を、その内部にまたは表面に取り込むまたは吸着（もしくは付着）することができるし、また細胞内または核内に取り込まれた有用物質は細胞内または核内でその機能を果たすことができる。
【００６０】
有用物質には、核酸、タンパク質、ペプチド、小分子などが含まれるが、これらに限定されない。好ましい有用物質は疾患の治療用のものである。
疾患には、例えば癌、欠陥遺伝子に起因する遺伝性疾患などが含まれる。
【００６１】
核酸には、例えば(i)外来遺伝子を含むプラスミド、例えば(a)外来遺伝子を発現可能に含むプラスミド、(b)欠陥遺伝子（欠陥酵素遺伝子、欠陥腫瘍抑制遺伝子など）に替わる正常遺伝子を細胞ゲノムに相同組換えにより導入するための遺伝子治療用プラスミド、(c)dsRNA、siRNA、リボザイムなどの核酸をコードするDNAを含むプラスミド、など、(ii)一本鎖あるいは二本鎖構造をもち、約15〜30塩基の範囲の長さであり、および標的細胞において特定遺伝子の発現を抑制する機能をもつDNAまたはRNA（短鎖デオキシリボ核酸およびリボ核酸）、例えばdsRNA、siRNA、リボザイムなど、(iii)アプタマーなどが含まれる。
【００６２】
特にdsRNA、siRNAまたはリボザイムは、血管新生因子癌形成関連遺伝子、癌転移関連遺伝子などの腫瘍において特異的に発現される遺伝子の機能を阻害または阻止するために有用である。これらのRNAおよびリボザイムは、腫瘍関連遺伝子の転写産物(mRNA)に結合するか、あるいはそれを切断することによって、タンパク翻訳を阻止することができる。このような疾患関連遺伝子の配列は、GenBankなどに登録されており容易に入手可能である。登録された標的遺伝子の配列情報に基づいて、dsRNA、siRNAまたはリボザイムの配列を設計することができる。
【００６３】
dsRNAおよびsiRNAはともに、RNA干渉に関わる核酸であり、二本鎖RNA(dsRNA)がダイサー(dicer)によってプロセシングされてsiRNA(small interfering RNA)が形成される。siRNAは標的mRNAを特異的に切断する。ターゲットサイトの選択基準も知られている(DM Dykxhoorn et al., Nature Rev. Mol. Cell Biol. 77:7174-7181 (2003); A Khvorova et al., Cell 115:209-216 (2003))ので、この基準に基づいて標的遺伝子のターゲットサイトを推定し、siRNA配列を決めることができる。
【００６４】
リボザイムは、触媒活性をもつRNAであり、標的mRNAを切断し、これによって標的遺伝子の発現が阻害または阻止される。その標的配列は、一般にNUX（ここで、N=A,G,C,U; X=A,C,U）、例えばGUCトリプレットを含む配列であることが知られている。また、リボザイムにはハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピン型リボザイムなどが含まれる。
【００６５】
アプタマーは、タンパク質と結合する比較的鎖長の短い核酸であり、RNAアプタマーおよびDNAアプタマーからなる。アプタマーは、その分子標的はタンパク質に限らず、金属イオン、アミノ酸、抗生物質などの低分子物質から蛋白質、ウイルス、細胞まで幅広い物質をターゲットにしてインビトロ・セレクションという進化工学の手法により人為的に作ることができる。特に、酵素に結合するアプタマーは、その酵素活性を阻害する作用をもつ。
【００６６】
タンパク質、ペプチドまたは小分子は、好ましくは疾患の治療用のものであり、疾患部位で直接作用可能な物質であり、例えば細胞内酵素、抗体、シグナル伝達物質、阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト、遺伝子発現制御タンパク質あるいはペプチド（P. Jarver and U. Lougel, Drug Discovery Today, 9(9), 395 (2004)）、APC、p53やp73などの癌抑制遺伝子産生タンパク質、その他低分子医薬などが含まれる。
【００６７】
本発明の複合体は、本発明のベクターと有用物質を、生理食塩水、緩衝液などの生理的に許容可能な水溶液中で混合することによって形成される。有用物質対ベクターの比は、１：２〜１：15、好ましくは１：５〜１：10（質量比）である。
【００６８】
６．治療用組成物
本発明の複合体は、薬学的に許容しうる希釈剤などの担体、および適宜使用される添加物と組み合わせて治療用組成物としうる。
希釈剤の例には、生理食塩水、緩衝液などが含まれる。
【００６９】
添加物には、例えばポリエチレングリコール、カチオン性脂質、グルコース、マンノースやガラクトースなどの糖類、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）やポロキサマーやツイーン80などの界面活性作用をもつ物質、疾病に関与する組織や細胞およびその受容体あるいは関連因子に特異的な物質、例えば、トランスフェリン（TF）、内皮細胞増殖因子（EGF）、低比重リポタンパク質（LDL）、インスリン、葉酸、ガラクトース、マンノースなどを含むことができるが、これらに限定されない。
【００７０】
本発明の組成物には、上に記載したような核移行性シグナルの作用をもつペプチド、例えば転写因子のNF-κB(p50)やNF-κB(p60)、Mitosin、Myc、DNAへリカーゼQ1、hNRNPなどのペプチドを含有させることができる。これによって、核内への移行効率が高まる。
【００７１】
本発明の組成物によって治療可能な疾患は、特に限定されないが、例えば癌、遺伝性疾患、HIV、HCVやHPVなどに起因するウイルス性疾患、重症筋無力症、パーキンソン病、慢性関節リウマチ、アルツハイマー病、閉塞性動脈硬化症、狭心症、心筋梗塞、加齢性黄斑症などを含む。
【００７２】
以下、実施例および実験例に基づき、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７３】
（実施例１）
本実施例は、細胞移行性および核移行性をもつTat誘導体、および核移行シグナルであるNF-κB誘導体ならびにMA（HIV-1）誘導体を合成することを目的としている。
【００７４】
（合成例１）
表１の配列番号１で表されるように、細胞膜透過性および核移行性を持つといわれているhuman immunodeficiency virus 1 (HIV-1) Tatの48-57位のアミノ酸配列を持つポリペプチドのC末端に、システイン-グリシン-アミド（-Cys-Gly-NH2）が付加されたポリペプチドを、Applied Biosystems製ABI433A型ペプチド合成機を用い、NH2-SAL-Trt(2-Cl)樹脂を出発原料にしてFmoc固相合成法で合成した。
【００７５】
得られたペプチドは、トリフルオロ酢酸1050 μL／チオアニソール62.5 μL／水62.5 μL／トリイソプロピルシラン31.5 μL／結晶フェノール100 mgの混合液1 mLを加えて室温で3時間処理し、脱保護と樹脂からの切り出しを行い、イオン交換樹脂（TOYOPEARL CM-650、TOSOH製）およびゲルろ過剤（Sephadex G-25、Amersham Biosciences社製）を用いて精製した後、凍結乾燥した。飛行時間型質量分析計（MALDI-TOFMS、Voyager DE、PerSeptive Biosystems製）を用いて質量分析を、また、得られたペプチドに6N塩酸を適量加え、110℃で24時間密封加熱処理を行った後、高速アミノ酸分析計（L-8500、HITACHI製）によりアミノ酸分析を行った。
【００７６】
（結果）
得られたポリペプチドの質量は、各アミノ酸の分子量から算出した計算値と極めて近似し、さらにアミノ酸分析の結果からも配列番号１で表されたアミノ酸配列を持つペプチドであることが確認された。なお、システインとグリシンの付加によりHIV-1 Tatのアミノ酸配列を一部改変したので本実施例においてはTat誘導体と称する。
【００７７】
（合成例２、３）
表１の配列番号２、３で表されるように、核移行シグナル（nuclear localization signal: NLS）である転写因子（nuclear factor-κB、NF-κB）およびHIV-1のマトリックスタンパク質由来MAペプチドのアミノ酸配列を持つポリペプチドのN末端にGly、C末端に-Cys-Gly-NH2がそれぞれ付加されたポリペプチドを、合成例１と同じ方法で合成および精製し、凍結乾燥品として回収した。得られたポリペプチドについて、合成例１と同様に質量分析およびアミノ酸分析を行った。
【００７８】
（結果）
質量分析の結果、得られたポリペプチドの質量は、各アミノ酸の分子量から算出した計算値と極めて近似し、さらにアミノ酸分析の結果からも配列番号2、3で表されたアミノ酸配列を持つペプチドであることが確認された。なお、システインとグリシンの付加によりNF-eBおよびMAペプチドのアミノ酸配列を一部改変したので本実施例においてはNF-eB誘導体およびMA誘導体と称する。
【００７９】
【表１】
2007145761.tif 000003
【００８０】
（実施例２）
本実施例は、非ウイルス性の遺伝子導入ベクターとして、細胞透過性および核移行性ペプチドTat誘導体をジスルフィド結合を介してコレステロールプルランと化学的に結合したTat修飾コレステロールプルラン誘導体を合成することを目的としている。
【００８１】
（合成例４）
架橋剤である56.6 mmolの3-メルカプトプロピオン酸をジクロロメタン50 mLに溶解し、この溶液に、3−メルカプトプロピオン酸の1.1当量に相当する62.3 mmolのトリフェニルクロロメタンをジクロロメタン30 mLに溶解した溶液を加え、室温で16時間撹拌した後、溶媒を留去した。次に、アセトニトリルを加えて加熱溶解した後、再結晶させ、吸引ろ過によって8.7189 gの白色粉末3-トリチルメルカプトプロピオン酸（収率72.61%）を得た。
この生成物は、NMRスペクトル解析および熱分析により目的物であることが確認された。
【００８２】
融点208.3℃、H1-NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ7.23-7.36（m, 15H, C6H5-）、δ2.14-2.30（d, 4H, -CH2S-, -CH2CO-）；13C NMR（100 MHz, DMSO-d6）δ172.57（-CO-）、δ126.63-128.98、144.25（C6H5-）、δ66.07（C6H5-CS-）、δ32.79（-CH2S-）、δ26.58（-CH2CO-）；m/z=243.12（C6H5）3C+）。
【００８３】
下記の構造：
【化１】
2007145761.tif 000004
を有するコレステロールプルラン(MW 108,000; 0.9コレステロール単位/100グルコース単位) 150 mg（約1 mmol）と、上記生成物の3-トリチルメルカプトプロピオン酸365 mg（約1.05 mmol）とをジメチルホルムアミド4 mLに溶解し、さらに、水溶性カルボジイミド0.266 mL（1.5 mmol）と4-ジメチルアミノピリジン12.2 mg（0.1 mmol）を加えて室温で24時間撹拌し、3-トリチルメルカプトプロピオン酸をコレステロールプルランにエステル結合を介して導入した。反応終了後、生成されたコレステロールプルランと3-トリチルメルカプトプロピオン酸の結合体を、水を加えて沈殿させたのち吸引ろ過によって固体を回収した。これをアセトニトリルもしくは水/酢酸エチル混液で洗浄後、減圧乾燥を行い、精製された白色固体のコレステロールプルランと3-トリチルメルカプトプロピオン酸の結合体（保護基付）を得た。この生成物50 mgに対して、トリフルオロ酢酸／ジクロロメタン／トリイソプロピルシラン／結晶フェノール／水（50/47/1/1/1）の混合液2-5 mLを加え、15分間撹拌することによってトリチル基を脱保護し、さらに、この反応液を濃縮後、残渣にジエチルエーテルを加えて生成物を析出させ、洗浄後、減圧乾燥によりチオール基を有するコレステロールプルラン−リンカー（収率49%）を得た。
【００８４】
合成例１におけるTat誘導体保護ペプチド樹脂50 mgに、酢酸／2,2,2-トリフルオロエタノール／ジクロロメタン（20：20：60）1 mLを加え、室温で30分間反応させ保護ペプチドを樹脂から遊離させた後、溶液をろ過し樹脂を除去した。このろ液を完全に留去したのち残渣（Tat誘導体保護ペプチド）をジクロロメタン1.5 mｌに溶かし、Tat誘導体保護ペプチドに対して4〜5倍量（モル比）のchlorocarbonylsulfenyl chlorideを加え、室温で15分間反応させた。次に、冷却しながらchlorocarbonylsulfenyl chlorideに対して10倍量（モル比）のメチルアニリンを加え、室温で15分間反応させた後、窒素ガスを用いて溶媒を留去し、酢酸エチル／蒸留水で抽出した。酢酸エチル層を濃縮した後、少量のジエチルエーテルを加えてTat誘導体を析出させ、デカンテーションにて3回洗浄し、溶媒を留去後、乾燥した（回収率53%）。上記の操作によって、Tat誘導体のシステイン基の保護基がアセトアミドメチル基（Acm）からN-methyl-N-phenylcarbamoyl)sulfenyl基（Snm）に置換される。
【００８５】
前記コレステロールプルラン−リンカー10 mgをジメチルホルムアミド／N-メチルモルホリン（99：1）に溶解した。これに前記のシステインの保護基をAcmからSnmに置換したTat誘導体40 mgを加えて一晩撹拌し、コレステロールプルラン−リンカーのチオール基（-SH）とシステインのSH基をジスルフィド結合させた。反応終了後、反応液を濃縮し、残渣にジエチルエーテルを加えて固体を析出させ、洗浄後、窒素ガスを用いて溶媒を留去し、減圧乾燥して白色固体であるTat修飾コレステロールプルラン（保護基付）を得た。このTat修飾コレステロールプルラン（保護基付）をトリフルオロ酢酸1050 μL／チオアニソール62.5 μL／水62.5 μL／トリイソプロピルシラン31.5 μL／結晶フェノール100 mgの混合液1 mLに溶解し、3時間脱保護処理を行い、保護基を切断した。反応溶液を濃縮し、残渣にジエチルエーテルを加え、析出物を洗浄後、減圧乾燥し、白色固体であるTat修飾コレステロールプルランを得た。生成物は、透析膜（スペクトラ/ポアCE透析用チューブ、Spectrum Laboratories製）を用いて、蒸留水中で透析処理によって精製し、凍結乾燥によって精製されたTat修飾コレステロールプルラン(CP-Tat)を回収した（回収率25%）。
【００８６】
精製されたCP-Tatを蒸留水に溶解し、その溶液をシリカゲル薄層クロマトグラフィー用プレートにスポットし、ニンヒドリン反応（ニンヒドリン噴霧後、110℃で10分間加熱処理）を行った結果、ニンヒドリンとアミノ基が反応して青紫色を呈したことからCP-Tatに含まれるTatの存在を確認した。また、5%フェノール噴霧後、濃硫酸を噴霧しフェノール硫酸反応を行った結果、CP-Tat中の多糖の糖鎖の存在を確認し、目的とするCP-Tatが合成されていることが確認された。
【００８７】
（実験例１）
合成例４で合成されたCP-Tat、ならびにTat誘導体を結合していないコレステロールプルラン（CP）を、それぞれ蒸留水に分散させ、プローブ型超音波破砕機（TAITEC ULTRASONIC PROCESSOR VP-5）を用いて、氷上で5分間超音波処理を行い、ゼータ電位・粒度分布測定器（NICOMP380ZLS、Particle Sizing Systems製）を用いてCP-Tatのゼータ電位ならびに粒度分布を測定し、個数基準分布における平均粒子径を求めた。
【００８８】
（結果）
DLS装置によって測定された平均粒子径は、CPでは約11 nm、CP-Tatでは約82 nmであり、また、ゼータ電位は、CPでは約1.1 mV、CP-Tatでは約21.1 mVであり、合成例４で合成されたCP-Tatは極めて小さな粒子径と高い正電荷を持ち、有用な遺伝子導入キャリアーとなる可能性が示された。
【００８９】
（実験例２）
本実験例では、合成例4で合成されたCP-Tatを用いた場合の遺伝子発現効果を測定し、遺伝子導入ベクターとしての有用性を評価することを目的として、CP-Tatとルシフェラーゼタンパク質を発現する環状プラスミド（pCMV-LucあるいはpDNAと表記）との複合体を用いて実験を行った。
【００９０】
アフリカミドリザル腎由来株化細胞であるCOS7細胞を、10%ウシ胎児血清（FBS）を含むDulbecco’s Modified Eagle’s Medium（DMEM）に懸濁し、1×105個/mLの密度で2ｍLずつ6穴培養フラスコに播種し、37℃、5%CO2条件下で24時間前培養した。前培養したCOS7細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄したのち、無血清培地Opti-MEMを1.9 mL添加した。次に、pCMV-Luc1 μgを100 μL無血清培地Opti-MEMIに溶解したnaked pDNA溶液、もしくは合成例４で合成されたCP-Tat（1〜20 μg）を100 μL無血清培地Opti-MEMIに溶解した後CMV-Luc 1 μgを添加し、4℃で30分間回転撹拌して調製したCP-TatとpCMV-Lucの複合体溶液を加え、37℃、5%CO2条件下で4時間トランスフェクション（遺伝子導入）した。その後、細胞をPBSで洗浄し、10%FBS 含有DMEM培地に培地交換し、37℃、5%CO2条件下で20時間培養した。その後、細胞をPBSで洗浄し、滅菌水で5倍に希釈した培養細胞溶解液100 μLを加え、室温で15分間放置した後、この懸濁液を回収して15,000 rpmで3分間遠心分離し、上清を細胞抽出液として回収した。得られた細胞抽出液15 μLにルシフェリン、コエンザイムA、ATPなどを含む基質液30 μLを添加し、ルミノメーター（MICROLUMAT PLUS LB96V、ベルトールド社製）を用いて1分間あたりの発光量を測定した。また、上記細胞抽出液5 μLを超純水で160倍希釈し、タンパク質染色試薬40 μLを加えて撹拌した後、室温で1時間反応させた。反応終了後、反応液について595 nmの波長における吸光度をマイクロプレートリーダー（Safire Microplate Reader、TECAN製）を用いて測定した。標準液に2 mg/mLウシ血清アルブミン溶液を用いて検量線を作成し、細胞抽出液中のタンパク質の濃度を算出した。上記試料溶液の1分間の発光量をタンパク質1 mgあたりに換算した相対発光量（Relative Light Unit, RLU）をルシフェラーゼ活性とし、遺伝子発現量の指標とした。
【００９１】
（結果）
CP-TatとpCMV-Lucの複合体をトランスフェクションした場合、pCMV-Luc単独に比べ、ルシフェラーゼ活性は高く、特に、pCMV-Lucに対するCP-Tatの質量比が1：10のときに極めて高いルシフェラーゼ活性となることが示された。
【００９２】
（実験例３）
本実験例では、合成例4で合成されたCP-Tatを遺伝子導入ベクターとして用いた場合の遺伝子発現効果を他の遺伝子導入ベクターと比較検討することを目的としている。
【００９３】
実験例2と同じ方法で前培養して無血清培地Opti-MEM1.9 mLに培地交換したCOS7細胞に、実験例2で用いたnaked pDNA溶液、および合成例4で合成されたCP-Tat 10 μgもしくは分岐型ポリエチレンイミン（PEI、Mw 25kDa、Sigma製）を100 μLの無血清培地Opti-MEMIにそれぞれ溶解させた後、実験例2で用いたpCMV-Luc 1 μgを添加し4℃で30分間回転撹拌して調製したCP-Tat/pDNA複合体およびPEI/pDNA複合体、ならびに市販導入試薬Lipofectamine（商標）16 μgを100 μL無血清培地Opti-MEMIに溶解し室温で30分間放置することによって調製したLipofectamine（商標）/pCMV-Luc複合体を添加し、37℃、5%CO2条件下で4時間トランスフェクションした。その後、細胞をPBSで洗浄し、10%FBS 含有DMEM培地に培地交換し、37℃、5%CO2条件下で20時間培養し、実験例2と同様の方法でルシフェラーゼ活性を測定した。
【００９４】
（結果）
図１に示すように、CP-TatとpCMV-Lucの複合体をCOS7細胞にトランスフェクションした場合、PEIやLipofectamine(商標)の場合には及ばないものの、pCMV-Luc単独に比べ、極めて高いルシフェラーゼ活性を示した。このことから、実施例2、合成例4で合成されたCP-Tatは、環状プラスミドなどの核酸の遺伝子導入ベクターとなることが示された。
【００９５】
（実験例４）
本実験例では、合成例4で合成されたCP-Tatの遺伝子導入ベクターとしての安全性を評価することを目的として実験を行った。
【００９６】
実験例2と同じ方法で前培養したCOS7細胞を10%FBS含有DMEM培地に懸濁し、5×103個/100 μLずつ96穴培養プレートに播種した。実験例3で用いたnaked pDNA溶液、CP-Tat/pDNA複合体溶液、PEI/pDNA複合体溶液、Lipofectamine（商標）/pDNA複合体溶液、および合成例１で合成されたTat誘導体10 μgを100 μL無血清培地Opti-MEMIに溶解した後pCMV-Luc 1 μgを添加し、4℃で30分間回転撹拌して調製したTat/pDNA複合体溶液を、培養プレートの各穴にそれぞれ添加し、37℃、5%CO2条件下で4時間トランスフェクションした。その後、細胞をPBSで洗浄し培地交換した後、37℃、5%CO2条件下で20時間培養し、次に記す細胞賦活評価試験（MTT試験）を行った。
【００９７】
MTT試験：上記COS7細胞にMTT試薬（3-[4,5-dimethylthyazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide）を加えて4時間放置後、可溶化液100 μLを加えて室温で24時間放置した。生存細胞では、細胞内のミトコンドリアの脱水素酵素がMTTのテトラゾリウム環を切断し、水溶液に不溶の紫色のホルマザン結晶が生成されることから、上記MTT試薬で処理した96穴培養プレート中の試料についてマイクロプレートリーダーを用いて波長550 nmで吸光度を測定した。プラスミドや複合体を添加していない細胞単独の場合の吸光度をコントロール（100％）とし、これに対する各試料の吸光度の割合を細胞の生存率として算出し、この生存率を指標として細胞毒性を評価した。
【００９８】
（結果）
PEIやLipofectamine（商標）を用いてトランスフェクションした場合、細胞生存率はそれぞれ95%、77%であり細胞毒性が見られた。これに対し、合成例１で合成されたTat誘導体および合成例４で合成されたCP-TatをキャリアーとしたpCMV-Luc複合体をトランスフェクションした場合、100%の細胞生存率を示し、細胞毒性が極めて低い遺伝子導入ベクターであることが示された。
【００９９】
（実験例５）
本実験例では、合成例4で合成されたCP-Tatに、合成例2、3で合成された核移行シグナル（NLS）であるNF-κB誘導体およびMA誘導体を共にしたpCMV-Luc複合体を用いて、遺伝子発現効果が向上できる可能性を検討することを目的として実験を行った。
【０１００】
実験例2と同じ方法で前培養して無血清培地Opti-MEM 1.9 mLに培地交換したCOS7細胞に、実験例2で用いたnaked pDNA溶液、実験例4で用いたTat/pDNA複合体溶液、および合成例4で合成されたCP-Tat 10 μgを無血清培地Opti-MEM 100 μLに溶解し、実験例2で用いたpCMV-Luc 1 μgを加えて室温で15分間放置した後、合成例2で合成されたNF-κB誘導体10 μgあるいはMA誘導体 10 μgを加えて室温で15分間放置して調製したCP-Tat/pDNA/NLS複合体、およびNF-κB誘導体 10 μgあるいはMA誘導体 10 μgをOpti-MEM培地100 μLに溶解してpCMV-Luc 1 μgを加えて室温で15分間放置した後、CP-Tat 10 μgを加え室温で15分間放置して調製したNLS/pDNA/CP-Tat複合体、CP-Tat 10 μgとNF-κB 10 μgあるいはMA誘導体 10 μgをOpti-MEM培地100 μLに溶解して室温で15分間放置した後pCMV-Luc 1 μgを加えて室温で15分間放置して調製したCP-Tat/NLS/pDNA複合体をそれぞれ添加し、37℃、5%CO2条件下で4時間トランスフェクションした。その後、細胞をPBSで洗浄し、10%FBS 含有DMEM培地に培地交換し、37℃、5%CO2条件下で20時間培養し、実験例2と同様の方法でルシフェラーゼ活性を測定した。
【０１０１】
（結果）
CP-Tatと核移行シグナルであるNF-κB誘導体あるいはMA誘導体を添加して調製したpDNA複合体では、Tat/pDNA複合体に比べ、著しく高いルシフェラーゼ活性を示し、Tat誘導体だけでなく、核移行性を持つNF-κB誘導体やMA誘導体などの核移行シグナルを共に複合体とすることで、pDNAの遺伝子発現効率が向上することが示された。
【０１０２】
（実験例６）
本実験例では、実験例2〜5に記載された核酸（pDNA）のみならず遺伝子発現抑制作用を持つ短鎖デオキシリボ核酸およびリボ核酸などへの合成例4で合成されたCP-Tatの遺伝子導入ベクターとしての応用の可能性を評価することを目的として実験を行った。
【０１０３】
マウス由来癌細胞Sarcoma180（S180細胞）を無血清培地RPMI1640に懸濁し、1×105個/mLの密度で24穴培養プレートに1 mLずつ播種し24時間前培養した。トランスフェクションの1時間前に培地交換を行った。その後、合成例4で合成されたCP-Tatとマウス血管内皮増殖因子（VEGF）の産生抑制作用を持つ21塩基対の短鎖リボ核酸（small interference RNA、siRNA）を、siRNAに対するCP-Tat質量比が1、2、5、10、15となるように無血清培地RPMI1640に添加し、4℃で30分間放置して調製した異なる質量比のCP-Tat/siRNA複合体、もしくはsiRNA単独溶液を細胞に添加して12時間トランスフェクションした。次に、培地の上清を適量採取し、培地中のVEGF量を酵素免疫測定法（ELISA法）で測定した。細胞のみが入った培地中の単位細胞あたりのVEGF量を100%とし、これに対する各試料培地中の単位細胞あたりのVEGF量の割合をVEGF産生抑制率（％）として算出した。このVEGF産生抑制率を指標として、短鎖リボ核酸あるいはデオキシリボ核酸に対するCP-Tatの遺伝子導入ベクターとしての効果を評価した。
【０１０４】
（結果）
図2に示すように、siRNAを単独でトランスフェクションした場合は31%の極めて低いVEGF産生抑制率であるのに対し、CP-TatとsiRNAの複合体においては、siRNAに対するCP-Tatの質量比の増大に伴いVEGF産生抑制率は顕著に増大し、特に、CP-Tat/siRNA質量比が10のとき、85%もの極めて高いVEGF産生抑制率を示した。
【０１０５】
（実験例７）
実験例6と同じ方法で前培養したS180細胞に、実験例6で用いた抗マウスVEGF siRNA（0.13 μg）と、合成例１で合成されたTat誘導体（1.3 μg）、合成例４で合成されたCP-Tat（1.3 μg）もしくはLipofectamine（商標）（2 μg）を無血清培地RPMI1640に添加し4℃で30分間放置して調製したsiRNA/Tat複合体、siRNA/CP-Tat複合体、siRNA/Lipofectamine複合体、およびsiRNA単独溶液を添加して12時間トランスフェクションした。その後、培地の上清を適量採取し、実験例6と同様の方法でVEGF産生抑制率（％）を測定した。
【０１０６】
（結果）
図3に示すように、CP-TatとsiRNAの複合体において、Tat誘導体およびLipofectamineを用いた場合に比べ、顕著にVEGF産生が抑制されることが認められた。このことから実施例2、合成例４において合成されたCP-Tatは核酸だけでなく、siRNAなどの短鎖リボ核酸およびデオキシリボ核酸にも有用な遺伝子キャリアーであることが示された。
【０１０７】
（実験例８）
本実験例では、担癌マウスと実験例6で用いたsiRNAを用いて、合成例4で合成されたCP-Tatの生体内での遺伝子導入効果を評価することを目的として実験を行った。
【０１０８】
担癌マウスの作製：無血清培地RPMI1640に懸濁した実験例6で用いたS180細胞（5×106個／300 μL）を8週令ICR雌性マウスの背部皮下に注射し、移植した。移植後6日後、形成される腫瘍の体積が50 mm3以上に到達した時点で担癌マウスが作製されたと判断し、以下の実験に用いた。
【０１０９】
前記方法によってS180細胞移植6日後の担癌マウスの腫瘍内に、CP-Tat単独溶液、siRNA単独溶液、CP-TatとsiRNAを混合して調製したCP-Tat/siRNA複合体、およびPEIとsiRNAを混合して調製したPEI/siRNA複合体を投与し、2日ごとに18日間腫瘍の長径と短径を測定し、次式を用いて腫瘍の体積を算出した。何も投与していない担癌マウスの腫瘍体積をコントロールとして用いた。
【０１１０】
腫瘍体積 (mm3)＝(腫瘍の短径)2×腫瘍の長径／２
【０１１１】
（結果）
図4に示すように、コントロールおよびCP-Tat単独投与群においては、経日的に急速な腫瘍体積の増大が確認された。これに対し、CP-TatとsiRNAの複合体を投与した群においては、siRNA単独投与に比べ、腫瘍体積はより小さく、腫瘍成長が抑制されることが示された。PEIとsiRNAの複合体ではCP-Tat/siRNA複合体に比べ腫瘍の成長が抑制されたが、これは実験例4で示されたようにPEIは細胞毒性が高いことに起因すると考えられる。以上のことから、細胞毒性が低いCP-Tatは生体内においても十分に効果を発揮できる遺伝子導入ベクターであることが示された。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】ルシフェラーゼタンパク質を発現する環状プラスミド（pDNA）と合成例4で合成されたTat修飾コレステロールプルラン（CP-Tat）との複合体、および他の遺伝子導入試薬とのpDNA複合体をCOS7細胞にトランスフェクションした場合のルシフェラーゼ活性を示した図である（平均値±S.D., n=3）。
【図２】異なる質量比で調製した、抗マウス血管内皮増殖因子（VEGF）の産生を抑制する短鎖リボ核酸（siRNA）とCP-Tatとの複合体を、マウス由来癌細胞（S180細胞）に導入した場合の細胞からのVEGF産生抑制率を示す図である（平均値±S.D., n=3）。
【図３】CP-Tat、Tat誘導体、およびLipofectamineを用いてsiRNAをS180細胞に導入した場合の細胞からのVEGF産生抑制効率を示す図である（平均値±S.D., n=3）。
【図４】CP-TatとsiRNAの複合体を担癌マウスの腫瘍内に投与した後の経時的な腫瘍体積変化を示す図である。白三角はsiRNA無投与のコントロール群、白丸はCP-Tat単独投与群、白抜き四角はsiRNA単独投与群、黒丸はCP-Tat/siRNA複合体投与群、黒四角はPEI/siRNA複合体投与群を示す（平均値±S.E., n=5）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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