(57)【要約】      （修正有）【課題】顕微鏡形式において複数工程かつ複合した反応を能動的に行うことができる自己アドレス可能な自己組立て超小型電子システムの設計、製造および使用。【解決手段】自己アドレス可能で、自己アセンブリング超小型電子方式デバイスを設計し製造して、複数工程かつ複合した分子生物学的反応を顕微鏡形式で有効に行い制御する。これらの反応には、核酸ハイブリダイゼーション、抗体/抗原反応、診断および生体高分子の合成が含まれる。アドレスされた特異的微細-位置への特異的結合体の輸送および付着を電子工学的に制御し、分析物および反応物を濃縮し、非特異的結合分子を除去し、ＤＮＡハイブリダイゼーション反応に厳格な制御を供し、かつ分析物の検出を改善することができる。該デバイスは、電子工学的に複製することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
電極を含む電子工学的にアドレス可能な位置を供し；
基質を該位置と接触させ；
該位置を基質に対して反対の電荷に置き、それにより、該基質を該位置に濃縮し；
該基質を該位置に付着させ；
該酵素を該位置と接触させ；
該位置を該酵素と反対の電荷に置き、それにより該酵素を該位置に濃縮し；
該酵素を該位置の該基質と反応させる工程を含むことを特徴とするアドレス可能な位置において電子工学的に制御された酵素反応を行う方法。
【請求項２】
該基質が核酸を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
該酵素が制限酵素、リガーゼ、プロテイナーゼ、グリコシダーゼまたはホスホリラーゼを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
該酵素がＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
該酵素がＲＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
該酵素反応が核酸の酵素消化を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
該酵素反応が核酸の合成を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
該酵素反応がポリペプチドの合成を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
（１）電極を含む電子工学的にアドレス可能な位置を供し；
（２）該位置に付着したオリゴヌクレオチドプライマーＹを供し；
（３）一本鎖核酸Ｘを、該プライマーＹが該核酸Ｘに特異的にハイブリダイズする該位置と接触させ；
（４）該位置を該核酸Ｘに対して反対の電荷に置き、それにより、該位置に該核酸Ｘを濃縮し、該核酸Ｘを該プライマーＹにハイブリダイズさせ；
（５）核酸ポリメラーゼを該位置と接触させ；
（６）該位置を該ポリメラーゼに対して反対の電荷に置き、それにより、該ポリメラーゼを該位置に濃縮し、該ポリメラーゼが該位置で該プライマーＹから核酸Ｙを合成するのを可能とし；
（７）該位置を十分な時間、負の電位に置いて、該核酸Ｘを該位置から除去し;
（８）オリゴヌクレオチドプライマーＸを、該プライマーＸは該核酸Ｙに特異的にハイブリダイズする該位置と接触させ；
（９）該位置を該プライマーＸに対して反対の電荷に置き、それにより、該プライマーＸを該位置に濃縮し、該プライマーＸを該核酸Ｙにハイブリダイズさせ;
（１０）該位置を該ポリメラーゼと反対の電荷に置き、それにより、該ポリメラーゼを該位置に濃縮し、それにより、該ポリメラーゼが該位置の該プライマーＸから核酸を合成するのを可能とする工程を含むことを特徴とする核酸の電子工学的に制御された増幅を行う方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡形式において複数工程かつ複合した反応を能動的に行うことができる自己アドレス可能な自己組立て超小型電子システムの設計、製造および使用に関する。特に、これらの反応には、核酸ハイブリダイゼーション、核酸増幅、試料調製、抗体／抗原反応、臨床的診断、および生体高分子合成のごとき分子生物学的反応が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学は核酸および蛋白質の分析のための広範囲の技術よりなり、そのうちの多くは、臨床的診断アッセイの基礎を形成する。これらの技術には、核酸ハイブリダイゼーション分析、制限酵素分析、遺伝子配列分析、ならびに核酸および蛋白質の分離および精製が含まれる（例えば、ジェイ・サムブルック(Ｊ.Ｓambrook)、イー・エフ・フリッシュ(Ｅ.Ｆ.Ｆritsch)およびティー・マニアティス(Ｔ.Ｍaniatis)、「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル(Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual)」第２版、ニューヨーク州、コールド・スプリング・ハーバー(Ｃold Ｓpring Ｈarbor,Ｎew Ｙork)のコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐress)社、１９８９年)。
【０００３】
多くの分子生物学的技術には、非常に多くの試料につき膨大な数の操作を行うことが含まれている。それらは、しばしば、複雑で時間がかかり、一般に高い精度が要求される。多くの技術は、感度、特異性または再現性の欠如によってその適用が制限されている。例えば、感度および特異性に伴う問題は、これまで、核酸ハイブリダイゼーションの実際的な適用を制限したきた。
【０００４】
核酸ハイブリダイゼーション分析には、一般的に、大量の非標的核酸の中から非常に少数の特異的標的核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）をプローブで検出することが含まれる。高い特異性を維持するためには、通常は、温度、塩、洗剤、溶媒、カオトロピック剤および変性剤の種々の組合せにより達成される最も厳格な条件下でハイブリダイゼーションを行う。
【０００５】
複数試料の核酸ハイブリダイゼーション分析は、種々のフィルターおよび固体支持体の形式で行われてきた（ジイ・エイ・ベルツ(Ｇ.Ａ.Ｂeltz)ら、メソッズ・イン・エンザイモロジー(Ｍethods in Ｅnzymology)第１００巻  Ｂ部、アール・ウー(Ｒ.Ｗu)、エル・グロスマン(Ｌ.Ｇrossman)、ケイ・モルダブ(Ｋ.Ｍoldave)編、ニューヨーク(Ｎew Ｙork)、アカデミック・プレス(Ａcademic Ｐress)社、第１９章、２６６-３０８頁、１９８５年)。１つの形式、いわゆる「ドットブロット」ハイブリダイゼーションには、フィルターへ標的ＤＮＡを非共有結合させ、引き続いてこれをラジオアイソトープで標識したプローブ(群)とハイブリダイズさせることが含まれる。「ドットブロット」ハイブリダイゼーションは広範囲の用途を獲得しており、多くのバージョンが開発された（エム・エル・エム・アンダーソン(Ｍ.Ｌ.Ｍ.Ａnderson)およびビイ・ディー・ヤング(Ｂ.Ｄ.Ｙoung)、「核酸ハイブリダイゼーション-実践的アプローチ(Ｎucleic Ａcid Ｈybridization-Ａ Ｐractical Ａpproach)」ビイ・ディー・ハーメス(Ｂ.Ｄ.Ｈames)およびエス・ジェイ・ヒギンズ(Ｓ.Ｊ.Ｈiggins)編、ワシントンＤＣ(Ｗashington Ｄ.Ｃ.)、アイアールエル・プレス(ＩＲＬ Ｐress)社、第４章、７３-１１１頁、１９８５年参照)。「ドットブロット」ハイブリダイゼーションは、さらに、ゲノム突然変異の多重分析用(ディー・ナニブシャン(Ｄ.Ｎanibhushan)およびディー・ラビン(Ｄ.Ｒabin)、１９８７年７月８日、欧州特許出願第０２２８０７５号)ならびに重複クローンの検出用およびゲノム地図作製用(ジイ・エイ・エバンス(Ｇ.Ａ.Ｅvans)、１９９３年６月１５日、米国特許第５,２１９,７２６号)にも開発されている。
【０００６】
もう１つの形式、いわゆる「サンドイッチ」ハイブリダイゼーションには、固体支持体にオリゴヌクレオチド・プローブを共有結合させ、次いでそれを用いて複数の核酸標的を捕捉し検出することが含まれる(エム・ランキ(Ｍ.Ｒanki)ら、ジーン(Ｇene)第２１巻、７７-８５頁、１９８３年；エイ・エム・パルバ(Ａ.Ｍ.Ｐalva)、ティー・エム・ランキ(Ｔ.Ｍ.Ｒanki)およびエイチ・イー・ソーダールンド(Ｈ.Ｅ.Ｓoderlund)、１９８５年１０月２日、英国特許出願ＧＢ２１５６０７４Ａ号；ティー・エム・ランキ(Ｔ.Ｍ.Ｒanki)およびエイチ・イー・ソーダールンド(Ｈ.Ｅ.Ｓoderlund)、１９８６年１月７日、米国特許第４,５６３,４１９号；エイ・ディー・ビイ・マルコム(Ａ.Ｄ.Ｂ.Ｍalcolm)およびジェイ・エイ・ランデール(Ｊ.Ａ.Ｌangdale)、１９８６年７月３日、ＰＣＴ ＷＯ ８６/０３７８２；ワイ・スタビンスキー(Ｙ.Ｓtabinsky)、１９８８年１月１４日、米国特許第４,７５１,１７７号；ティー・エイチ・アダムス(Ｔ.Ｈ.Ａdams)ら、１９９０年２月２２日、ＰＣＴ ＷＯ９０/０１５６４；アール・ビイ・ワラス(Ｒ.Ｂ.Ｗallace)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Ｎucleic Ａcids Ｒes.)第１１巻、３５４３頁、１９７９年；およびビイ・ジェイ・コナー(Ｂ.Ｊ.Ｃonnor)ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユウエスエイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)第８０巻、２７８-２８２頁、１９８３年)。これらの形式の複合バージョンは「リバース・ドット・ブロット(reverse dot blot)」と呼称されている。
【０００７】
最近の核酸ハイブリダイゼーション形式および厳格な制御方法を用い、最も高感度のレポーター基(酵素、蛍光発色団、ラジオアイソトープ等)および結合検出系(フルオロメーター、ルミノメーター、フォトン・カウンター、シンチレーション・カウンター等)を用いる場合でさえ、低コピー数(すなわち、１-１００,０００個)の核酸標的を検出することは依然困難である。
【０００８】
この困難さは、直接的プローブ・ハイブリダイゼーションに関連して生じる幾つかの問題によって引き起こされる。１つの問題は、ハイブリダイゼーション反応の厳格な制御に関連している。ハイブリダイゼーション反応は、ハイブリダイゼーションの特異性を達成するために、通常、厳格な条件下で行われる。厳格な制御の方法には、第一義的には、ハイブリダイゼーションにおける温度、イオン強度および変性剤の最適化、および続く洗浄法が含まれる。残念なことには、これらの厳格な条件を適用すると、検出するためのハイブリダイズ・プローブ/標的複合体の数の顕著な減少が起こる。
【０００９】
もう１つの問題は、大部分の試料、特にヒトゲノムＤＮＡ試料中のＤＮＡが非常に複雑なことに関連する。試料が、特異的標的配列に酷似した膨大な数の配列よりなる場合には、最もユニークなプローブ配列でさえ、非-標的配列と多数の部分的ハイブリダイゼーションを起こす。
【００１０】
第３の問題は、プローブとその特異的標的との間の好ましくないハイブリダイゼーション動力学に関連する。最良の条件下でさえ、大部分のハイブリダイゼーション反応は、相対的に低濃度のプローブおよび標的分子で行われる。加えて、プローブはしばしば標的核酸に対する相補鎖と競合する。
【００１１】
現在の大部分のハイブリダイゼーション形式に関する第４の問題は、高レベルの非-特異的バックグラウンド・シグナルである。これは、ほとんどいずれの物質にもＤＮＡプローブが親和性を有することによって引き起こされる。
【００１２】
これらの問題が個々に、または組み合わさって、前記形式の核酸ハイブリダイゼーションの感度および/または特異性を喪失させる。大部分の核酸を基礎とする臨床的診断アッセイには低コピー数の核酸標的を検出することが必要であるため、このことは残念である。
【００１３】
低コピー数の核酸標的を検出することが困難なために、研究コミュニティーは標的核酸配列を増幅させるためのポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)に大きく依存している(エム・エイ・イニス(Ｍ.Ａ.Ｉnnis)ら、「ＰＣＲ Ｐrotocols：Ａ Ｇuide to Ｍethods and Ａpplications」、アカデミック・プレス(Ａcademic Ｐress)社、１９９０年)。たとえ、どんなに長期を要し厄介な工程であっても、ＰＣＲ反応によって作製した膨大な数の標的核酸配列によって、続いての直接的核酸プローブ技術が改善される。
【００１４】
直接的プローブで低コピー数の標的核酸を検出することの一般的な困難さに対する特徴的な例外は、イン・サイチュ・ハイブリダイゼーション技術である。この技術によって、低コピー数のユニークな核酸配列を個々の細胞で検出することができる。イン・サイチュ形式においては、比較的高い局所濃度で細胞(〜２０-５０μｍ２)または核(〜１０μｍ２)の領域に標的配列が自然に制限される。さらに、プローブ/標的ハイブリダイゼーション・シグナルは、顕微鏡的および形態学的に異なった領域に制限され；このことによって、固体支持体上におけるハイブリダイゼーションよりも、人工的または非特異的シグナルから陽性シグナルを容易に区別することができる。
【００１５】
ある種の態様でイン・サイチュ・ハイブリダイゼーションを模倣することによって、超微細形式化した複合装置またはマトリックス装置(例えば、ＤＮＡチップ)にて多重試料核酸ハイブリダイゼーション分析を行う新しい技術が開発されている(エム・バリナガ(Ｍ.Ｂarinaga)、サイエンス(Ｓcience)第２５３巻、１４８９頁、１９９１年；ダブリュ・ベインズ(Ｗ.Ｂains)、バイオ／テクノロジー(Ｂio/Ｔechnology)第１０巻、７５７-７５８頁、１９９２年参照)。これらの方法は、通常、ＤＮＡチップの超微細ウェルのごとき固体支持体の非常に小さな特異的領域に特異的ＤＮＡ配列を結合させる。これらのハイブリダイゼーション形式は、従来の「リバース・ドット・ブロット」および「サンドイッチ」ハイブリダイゼーション系の超微細スケールのバージョンである。
【００１６】
超微細形式化ハイブリダイゼーションを用いれば、「ハイブリダイゼーションによる配列決定」(ＳＢＨ)(エム・バリナガ(Ｍ.Ｂarinaga)、サイエンス(Ｓcience)第２５３巻、１４８９頁、１９９１年；ダブリュ・ベインズ(Ｗ.Ｂains)、バイオ／テクノロジー(Ｂio/Ｔechnology)第１０巻、７５７-７５８頁、１９９２年参照)を行うことができる。ＳＨＢは、全ての可能なｎ-ヌクレオチド・オリゴマー(ｎ重体)を使用して、未知のＤＮＡ試料中のｎ重体を同定することができ、続いてそれをアルゴリズム分析によって並べて、ＤＮＡ配列を作製する(アール・ドーマナック(Ｒ.Ｄrmanac)およびアール・クルクベンジャコフ(Ｒ.Ｃrkvenjakov)、ユーゴスラビア国特許出願＃５７０/８７、１９８７年；アール・ドーマナック(Ｒ.Ｄrmanac)ら、ゲノミクス(Ｇenomics)第４巻、１１４頁、１９８９年；ステレゾスカ(Ｓtrezoska)ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユウエスエイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)第８８巻、１００８９頁、１９９１年；およびアール・ドーマナック(Ｒ.Ｄrmanac)およびアール・ビイ・クルクベンジャコフ(Ｒ.Ｂ.Ｃrkvenjakov)米国特許第５,２０２,２３１号、１９９３年４月１３日)。
【００１７】
ＳＢＨを行うには２つの様式がある。１つの形式には、支持体上に全ての可能なｎ重体アレイを作製し、次いで、これを標的配列とハイブリダイズさせることが含まれる。これは、リバース・ドット・ブロットのバージョンである。もう１つの形式には、標的配列を支持体に結合させ、これを全ての可能なｎ重体で順次釣り上げることが含まれる。両形式とも、直接的プローブ・ハイブリダイゼーションの基本問題および複合ハイブリダイゼーションに関するさらなる困難性を有している。
【００１８】
サザン(Ｓouthern)、英国特許出願ＧＢ８８１０４００号、１９８８年；イー・エム・サザン(Ｅ.Ｍ.Ｓouthern)ら、ゲノミクス(Ｇenomics)第１３巻、１００８頁、１９９２年では、ＤＮＡを分析しまたはＤＮＡを配列決定するのに「リバーズ・ドット・ブロット」形式を使用することが提案されている。サザン(Ｓouthern)は、ＰＣＲ増幅させたゲノムＤＮＡを用いて既知の単一点突然変異を同定した。また、サザンは、ＳＨＢ用の固体支持体上にオリゴヌクレオチドのアレイを合成する方法も記載している。しかしながら、サザンは、アレイ上の各オリゴヌクレオチドに対して、最適な厳格な条件をどのようにして達成するかについては触れていない。
【００１９】
フォドール(Ｆodor)ら、ネイチャー(Ｎature)第３６４巻、５５５-５５６頁、１９９３年では、固体支持体上の１,０２４の８重体のオリゴヌクレオチドのアレイを用いてＤＮＡ配列を決定している。この場合において、標的ＤＮＡは、ＡおよびＣ塩基のみを含有する蛍光標識した一本鎖の１２重体オリゴヌクレオチドであった。アレイ上の８重体オリゴマーとのハイブリダイゼーションには、１ｐｍｏｌ濃度(〜６×１０１１分子)の１２重体標的配列が必要であった。この結果は多くの誤対合を示した。サザンと同様に、フォドール(Ｆordor)らも、複合ハイブリダイゼーションについての厳格な制御のごとき、直接的プローブ・ハイブリダイゼーションの基本的な問題には触れていなかった。これらの問題は、大量の単純１２重体標的の必要性と合わさって、このＳＨＢ形式がかなり制限されることを示している。
【００２０】
最近、ドーマナック(Ｄrmanac)ら、サイエンス(Ｓcience)第２６０巻、１６４９-１６５２頁、１９９３年は、前記した第２形式を用いて幾つかの短かい(１１６ｂｐ)ＤＮＡ配列を配列決定した。標的ＤＮＡは膜支持体に結合させた(「ドット・ブロット」形式)。各フィルターを２７２の標識した１０重体および１１重体オリゴヌクレオチドと順次ハイブリダイズさせた。広範な厳格条件を用いて、各ｎ重体プローブの特異的ハイブリダイゼーションが達成された；洗浄時間は５分間〜一晩、温度は０℃〜１６℃で変化させた。大部分のプローブは、１６℃にて３時間洗浄することが必要であった。ハイブリダイゼーション・シグナルを検出するため、フィルターは２〜１８時間感光させる必要があった。標的配列が単純であり、オリゴマーの設定を減少させ、かつ利用できる最も厳格な条件を用いたにも拘わらず、総じての偽陽性ハイブリダイゼーション率は５％であった。
【００２１】
フォードール(Ｆodor)ら、サイエンス(Ｓcience)第２５１巻、７６７-７７３頁、１９９１年は、写真平板技術を用いてマトリックス上にオリゴヌクレオチドを合成した。ピルング(Ｐirrung)ら、米国特許第５,１４３,８５４号、１９９２年９月１日は、シリコン基板上のアレイ様式にてのポリペプチドの大規模写真平板固相合成法を教示している。
【００２２】
マトリックス・ハイブリダイゼーションのもう１つのアプローチにおいて、ビーティエ(Ｂeattie)ら、「１９９２年サンジエゴ会議：遺伝子認識(Ｔhe １９９２ Ｓan Ｄiego Ｃonference：Ｇenetic Ｒecognition)」１９９２年１１月では、超微細ロボット工学システムを用いて、特異的ＤＮＡ配列を含有する微小液滴をガラス基体上の個々の超微細加工試料ウェルに滴下させた。各試料ウェルにおけるハイブリダイゼーションは、交流(ＡＣ)電場で各個別超微小ウェルを取り囲んだ、ミニチュア電極試験固定体を応答指令信号を送ることによって検出する。
【００２３】
形式に拘わらず、全ての現行の超微細スケールのＤＮＡハイブリダイゼーションおよびＳＨＢのアプローチは、核酸ハイブリダイゼーション反応に関連する基本的な問題を克服していない。それらは、非常に高レベルの比較的短い一本鎖標的配列またはＰＣＲ増幅ＤＮＡを必要とし、最も厳格な条件下でさえ高レベルの偽陽性ハイブリダイゼーション・シグナルを生じる。短かいオリゴヌクレオチド配列のアレイを用いた複合形式の場合においては、いずれの従来アプローチを用いても各個別の配列につき厳格な条件を最適化することはできない。何故ならば、これらの形式に用いるアレイまたはデバイスでは、他の位置に比して個別の位置で温度、イオン強度または変性剤を変化させまたは調整できないからである。従って、共通の厳格な条件をデバイス上の全ての配列に用いなければならない。このことによって、多数の非-特異的および部分的ハイブリダイゼーションが生じ、デバイスの適用が非常に限定される。アレイ上の異なる配列の数が増加し、配列長が１０重体以下まで減少するか、２０重体以上まで増加するに従い、問題はより複雑となる。このことは、多数の短鎖オリゴヌクレオチド・プローブを必要とするＳＢＨについては特に厄介である。
【００２４】
異なったサイズ、電荷または立体構造の核酸は、電場におけるそれらの異なった移動度によりハイブリダイゼーション種を区別できる電気泳動技術によって、日常業務的に分離される。パルスフィールド電気泳動は、媒質(例えば、ゲル)の周りの複数の電極配列を用いて、従来のゲル電気泳動系によっては分離できない非常に大きなＤＮＡ断片を分離する(アール・アナンド(Ｒ.Ａnand)およびイー・エム・サザン(Ｅ.Ｍ.Ｓouthern)、「核酸のゲル電気泳動-実践的アプローチ(Ｇel Ｅlectrophoresis of Ｎucleic Ａcids-Ａ Ｐractical Ａpproach)」第２版、ディー・リックウッド(Ｄ.Ｒickwood)およびビイ・ディー・ハーメス(Ｂ.Ｄ.Ｈames)編、ニューヨーク(Ｎew Ｙork)のアイアールエル・プレス(ＩＲＬ Ｐress)社、１０１-１２２頁、１９９０年参照)。
【００２５】
ペース(Ｐace)、米国特許第４,９０８,１１２号、１９９０年３月１３日は、超微細加工技術を用いてシリコン基板上にキャピラリー・ゲル電気泳動系を作製することを記載している。複数電極は、該系に組み込まれていて、該デバイス内の分離媒質を通して分子を移動させる。
【００２６】
ソアネ(Ｓoane)およびソアネ(Ｓoane)、米国特許第５,１２６,０２２号、１９９２年６月３０日は、多数の電極を用いれば、管中に含まれるゲル分離媒質を通して混合物中の荷電分子の線形移動を制御することができることを記載している。分離媒質中の分子の移動および位置を制御するには、電極を管内に設置しなければならない。
【００２７】
ワシズ,エム(Ｗashizu,Ｍ.)およびクロサワ,オウ(Ｋurosawa,Ｏ.)アイイーイーイー・トランザクションズ・オン・インダストリー・アプリケーションズ(ＩＥＥＥ Ｔransactions on Ｉndustry Ａpplications)第６巻、１１６５-１１７２頁、１９９０年は、高周波数交流(ＡＣ)電場を用いて、超微細加工電極間に生じる電場列(line)の方向にＤＮＡを向けた。しかしながら、直流(ＤＣ)電界をそれらの研究に使用することはできない。ワシズ(Ｗashizu)、ジャーナル・オブ・エレクトロスタティクス(Ｊ.Ｅlectrostatics)第２５巻、１０９-１２３頁、１９９０年)には、二重電気泳動(dielectrophoresis)を用いた細胞および生物分子の操作が記載されている。細胞を融合でき、超微細-電極構造間のＡＣ電圧によって生じた電場列に沿って生物分子を方向付けることができる。しかしながら、二電気泳動工程には、非常に高周波数のＡＣ(１ＭＨｚ)電圧と低導電率の媒質とが必要である。これらの技術は、ＡＣ電場列に沿って異なったサイズのＤＮＡ分子を方向付けることができるが、それは同じサイズのハイブリダイゼーション複合体同志を区別することができない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
前記より明らかなごとく、複数工程かつ複合の分子生物学的反応を行う有効な技術を提供するために、膨大な試行がなされてきた。しかしながら、前記の理由によって、これらの技術は不十分であることが証明された。有効な技術に対する要望が長い間認識されてきたにも拘わらず、今まで満足のいく解法は提唱されていない。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明は、顕微鏡形式において制御された複数工程かつ複合の反応を能動的に行うことができる、プログラム可能で、自己アドレス可能な自己組立て超微細電子システムおよびデバイスの設計、製造および使用に関する。これらの反応には、限定するものではないが、核酸ハイブリダイゼーション、抗体／抗原反応、および関連する臨床的診断のごとき大部分の分子生物学的反応が含まれる。加えて、特許請求するデバイスは、多工程の組み合わせ生体高分子合成も行うことができ、それらには、限定するものではないが、特異的超微小位置での異なったオリゴヌクレオチドまたはペプチドの合成が含まれる。
【００３０】
特許請求するデバイスは、超微細リソグラフィーおよび超微細加工技術の両方を用いて製造する。該デバイスはアドレス可能な顕微鏡位置のマトリックスをその表面に有しおり；各個別の超微細位置は、特異的に結合する物質(例えば、核酸、抗体)のそれ自体への輸送および結合を電子工学的に制御し指定できる。全ての超微細位置は、それらの特異的結合物質に関してアドレス可能である。これらのデバイスを用いれば、該システムは最小限の外部介入にて自己組立て可能である。
【００３１】
該アドレス・デバイスは、種々のアッセイおよび反応を制御することができ、かつ能動的に行うことができる。分析物または反応物は、自由フィールド電気泳動によっていずれかの特異的超微細-位置まで輸送でき、そこでその分析物または反応物は効率的に濃縮され、特異的結合物質と反応する。特異的な分析物または反応物を検出する感度は、濃縮効果のために改善される。いずれの非-結合分析物または反応物も、超微細-位置の極性を逆転させることによって除去することができる。かくして、当該デバイスはアッセイおよび反応の特異性も改善する。
【００３２】
該デバイスの能動的な特性によって、各特異的超微細-位置で生じるハイブリダイゼーション反応(またはいずれかの他の親和性反応)の全ての態様にわたる独立した電子工学的制御が供される。これらのデバイスによって、電子工学的厳格制御(ＥＳＣ)と呼称されるハイブリダイゼーション反応に影響する新たな機構が提供される。異なった厳格条件を要するＤＮＡハイブリダイゼーション反応については、ＥＳＣによって従来のアレイ技術の本来有する限界が克服される。本発明の能動的デバイスは、各超微細-位置で「異なった厳格条件」を電子工学的に作り出すことができる。かくして、全てのハイブリダイゼーションは、同一のバルク溶液中で最適に行うことができる。これらの能動的デバイスは、従来の複合ハイブリダイゼーション・アレイおよびＤＮＡチップとは基本的に異なる。従来のアレイは、各部位に位置する異なったプローブまたは標的ＤＮＡを有するにも拘わらず；アレイ上の全部位は温度、緩衝液、塩濃度およびｐＨの共通した反応もしくは厳格条件を有している。反応もしくは厳格条件におけるいずれの変化も、該アレイ上の全部位に影響する。複雑化した写真平板技術を用いてアレイを作製し、あるいは超小型電子検知素子を検出用に組み込むことができるが、従来のデバイスは受動的であり、かつ現実のハイブリダイゼーション工程を制御しまたは影響を与えない。本発明の能動的なデバイスは、各超微細-位置を完全に独立した試験もしくは分析部位として機能させる（すなわち、それらは各位置において同等の「試験管」を形成する）。複合的ハイブリダイゼーション反応が、最少の外部物理学的操作で行うことができる。加えて、緩衝液を交換するために温度を変化させる必要がなく、複数回洗浄する工程の必要性がなくなる。
【００３３】
かくして、特許請求するデバイスでは、多工程かつ複合した反応を完全かつ正確な電子工学的制御で、好ましくは全体マイクロプロセッサー制御で行う(すなわち、コンピューターによって行う)ことができる。多工程かつ複合した反応の速度、特異性および感度は、特許請求するデバイス上の各特異的超微細-位置で顕著に改善されている。
【００３４】
また、デバイスは、組み合わせた光学的(蛍光、化学ルミネッセンス、または分光光度測定)なイメージング検出系を用いることによって、各超微細-位置でハイブリダイズした複合体を容易に検出できる。直接的にＤＮＡを検出する集積オプトエレクトロニクスまたは電子工学的センシング素子も、そのデバイス本体に組み込むことができる。
【００３５】
所望により、特異的結合性物質でアドレスされたマスターデバイスは、もう１つの基盤デバイスに電子工学的に複製またはコピーできる。
【００３６】
本発明は、本発明の目的と一致するいずれのサイズまたは形態の超微細-位置にも利用することができる。本発明の好ましい具体例において、サブ-ミリメートル範囲の超微細-位置を用いる。
【００３７】
「特異的結合物質」とは、一般的に、共有結合または非共有結合を介して他の分子、高分子または細胞に対して特異的な親和性を有する生物学的分子または合成分子を意味する。好ましくは、特異的結合物質には、それを超微細-位置表面の共通官能基に共有結合または非共有結合させ得る(自然にまたは修飾による)官能化学基(第一級アミン、スルヒドリル、アルデヒド等)、共通配列(核酸)、エピトープ(抗体)、ハプテンまたはリガンドが含まれる。特異的結合物質には、限定するものではないが：デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)、リボ核酸(ＲＮＡ)、合成オリゴヌクレオチド、抗体、蛋白質、ペプチド、レクチン、修飾多糖、細胞、合成複合高分子、機能性ナノ構造物、合成ポリマー、修飾/ブロックしたヌクレオチド/ヌクレオシド、修飾/ブロックしたアミノ酸、蛍光発色団、発色団、リガンド、キレートおよびハプテンが含まれる。
【００３８】
「厳格な制御」とは、幾つかの物理学的パラメーターを変化させることによって、特異的および非特異的な結合相互作用を区別できる能力を意味する。核酸ハイブリダイゼーションの場合、温度制御を厳格性にしばしば用いる。反応は、特定の二本鎖ハイブリッド対の融点(Ｔｍ)またはその付近で行う。
【００３９】
かくして、本発明の第一かつ最も重要な態様は、電子工学的にプログラム可能で自己アドレス指定可能な顕微鏡位置のアレイを有するデバイスである。各顕微鏡位置には、基板によって支持される下部作動性直流(ＤＣ)超微細-電極が含まれる。各超微細-位置の表面は、小さな対イオンが自由に輸送される浸透層、および特異的結合物質が共有カップリングする付着層を有する。これらのユニークな設計特徴は、該デバイスに以下の重要な特性を提供する：(１)制御可能な機能性ＤＣ電極を超微細位置の下側に維持できること；(２)電気泳動的輸送を維持できること；および(３)電極(金属)インターフェースで起こる電気化学反応および逆電解反応から親和性反応または結合反応を分離すること。これらのデバイスに用いられる超微細-電極の主機能が、結合物質および反応物質を特異的位置に向ける電気泳動的推進力を供することである。
【００４０】
「アレイ」または「マトリックス」とは、デバイス上のアドレス指定可能な位置の配列を意味する。該位置は、二次元アレイ、三次元アレイ、または他のマトリックス形式で配置することができる。位置の数は、数個から少なくとも数十万までの範囲とすることができる。各位置は、全体的に独立した反応部位を表している。
【００４１】
第２の態様において、本発明は、結合物質をデバイス上のいずれかの特異的超微細-位置に輸送する方法をその要旨とする。活性化されれば、超微細-位置は、いずれの荷電した機能性特異的結合物体のそれ自体までの自由フィールド電気泳動的輸送にも影響を及ぼすことができる。特異的超微細-位置と接触すると、機能化された特異的結合物質が直ちにその特異的超微細-位置の付着層表面に共有結合する。他の超微細-位置も、荷電分子に対して反対の電位にそれらを維持することによって、同時に保護することができる。該工程は、全超微細-位置がそれらの特異的結合性物質でアドレスされるまで、迅速に繰り返すことができる。
【００４２】
「荷電機能化特異的結合物質」とは、化学反応性(すなわち、位置に共有結合できる)であって、正味荷電(＋または−のいずれか)に帯電していることを意味する。
【００４３】
第３の態様において、本発明はデバイス上のいずれかの特異的超微細-位置で分析物または反応物を濃縮させ、反応させる方法をその要旨とする。特異的結合物質が付着した後も、各超微細-位置の下部超微細電極は直流(ＤＣ)モードで機能し続ける。このユニークな特徴によって、溶液中に遊離した比較的希薄な荷電分析物または反応物分子を、該分析物または該反応分子に対して反対の電荷に維持されているいずれの特異的超微細-位置でも順次または平行様式で、迅速に輸送し、濃縮し、反応させることができる。特異的超微細-位置は、分析物または反応物分子と同じ電荷でそれを維持することによって保護または遮断することができる。選択した超微細-位置で希薄な分析物または反応分子を濃縮するこの能力によって、これら超微細-位置における反応速度を顕著に加速することができる。
【００４４】
所望の反応が完了したら、超微細-電極の電位を逆転させて、該超微細-位置から非特異的分析物または未反応分子を除去することができる。
【００４５】
特異的分析物または反応生成物は、いずれの超微細-位置からも放出し、さらなる分析のために他の位置に輸送することができ；あるいは、他のアドレス可能な位置に保存でき；あるいは、該システムから完全に除去することができる。
特異的超微細-位置における分析物の続く分析も、これらの位置から非特異的物質を反発させる能力によって、顕著に改善される。
【００４６】
第４の態様において、本発明は：
-ハイブリダイゼーションが起こる特異的超微細-位置(群)で、希薄標的ＤＮＡおよび/またはプローブＤＮＡ配列を迅速に濃縮し；
-ハイブリダイゼーションが起こった特異的超微細-位置(群)から、非-特異的に結合した標的ＤＮＡ配列を迅速に除去し；
-ハイブリダイゼーションが起こった特異的超微細-位置(群)から、競合性の相補的標的ＤＮＡを迅速に除去し；
-電子的厳格制御(ＥＳＣ)を調整して、部分的にハイブリダイズしたＤＮＡ配列(１塩基を超える誤対合)を除去し；
-ＥＳＣを調整して、８重体〜２１重体の範囲のプローブを用いた単一誤対合ハイブリダイゼーションの解析能を改善し(例えば、それにより点突然変異を同定する)；
-ＥＳＣを用いて、従来の方法で用いていた範囲外のオリゴヌクレオチド点突然変異プローブ(例えば、２１重体より長いプローブおよび８重体より短いプローブ)を効率的にハイブリダイズさせ；
-同一バルク溶液中、同一温度で起こる個々のハイブリダイゼーション事象に独立したＥＳＣを適用し；次いで
-ＥＳＣを用いて、捕捉オリゴヌクレオチド・プローブのアレイに非増幅標的ＤＮＡ配列がハイブリダイズするのを改善する
工程よりなる、核酸ハイブリダイゼーション反応の厳格制御を改善する方法をその要旨とする。
【００４７】
第５の態様において、本発明は、超微細-位置において生体高分子を組合せ合成する方法をその要旨とする。
【００４８】
第６の態様において、本発明は、マスターデバイスを複製する方法をその要旨とする。
【００４９】
第７の態様において、本発明は、試料の調製およびそのデバイスの分析構成要素までの輸送を電子工学的に行うデバイスをその要旨とする。
【００５０】
第８の態様において、本発明は、最小限の流体工学しか用いずに試薬および反応物を電子工学的にデリバリーするデバイスをその要旨とする。
【００５１】
第９の態様において、本発明は、分子生物学的反応およびＤＮＡ増幅反応(例えば、制限切断反応；およびＤＮＡ/ＲＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡリガーゼ標的増幅反応)を行うデバイスをその要旨とする。
【００５２】
第１０の態様において、本発明は、制限断片を電子工学的にサイズ決定し、同定できる(例えば、電子工学的な制限断片長多型分析およびＤＮＡ指紋分析)デバイスをその要旨とする。
【００５３】
第１１の態様において、本発明は、抗体-抗原および免疫診断反応を行うデバイスをその要旨とする。
【００５４】
第１２の態様において、本発明は、オリゴヌクレオチドおよびペプチドの組合せ合成を行うことができるデバイスをその要旨とする。
【００５５】
第１３の態様において、本発明は、選択的に細胞に結合し、細胞をハイブリダイゼーション用に加工し、細胞からＤＮＡを取り出し、または細胞内でイン-サイチュ・ハイブリダイゼーションを行うデバイスをその要旨とする。
【００５６】
第１４の態様において、本発明は、関連する光学的、オプトエレクトロニクス的または電子工学的な検出システムを有する自己-アドレス指定された超小型電子技術デバイス、または統合された光学的、オプトエレクトロニクス的または電子工学的な検出システムを有する自己-アドレス指定された超小型電子技術デバイスを用いて、アドレス指定された超微細-位置で起こる反応を検出し分析する方法をその要旨とする。
【００５７】
本発明のデバイスは能動的にプログラム可能な電子工学的マトリックス(active programmable electronic matrices)であるため、頭字語「ＡＰＥＸ」を用いてこれらのデバイスのユニークな性質を記載または示す。ＡＰＥＸ頭字語は、マイクロリソグラフィーにより作製した「チップ」および超微細加工デバイスの双方に用いる。
【００５８】
ＡＰＥＸ超小型電子技術デバイスおよびチップの能動的な性質によって、広範な種々の分子生物学的反応を行う新たな機構を創出することができる。これらには、標的ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子の線形および指数関数的な増加または増幅の両方を達成する新規な方法が含まれている。
【００５９】
該デバイスは：(１)室温(例えば、そのＴｍよりかなり下)の共通緩衝液中でＤＮＡハイブリッドを選択的に変性し；(２)２またはそれを超える超微細-位置の間でＤＮＡを迅速に往ったり来たりして輸送または移動させ；および(３)所望の超微細-位置で特異的反応物、試薬および酵素を選択的に濃縮させることができる電子工学的メカニズムを提供する。これら全てには、分子生物学的および標的増幅型反応を行う新たな物理学的指標が含まれている。
【００６０】
多数の電子工学的に制御された分子生物学的反応の例が開発され、これらには：(１)特異的ｄｓ-ＤＮＡ配列の電子工学的指向制限酵素切断；(２)電子工学的制限断片分析；(３)ＤＮＡポリメラーゼによる標的ＤＮＡの電子工学的増加；(４)ＤＮＡおよびＲＮＡリガーゼによる標的ＤＮＡ配列の電子工学的連結および増加；および(５)ＲＮＡポリメラーゼによる標的ＤＮＡの電子工学的増加が含まれる。これらの例は、ＡＰＥＸデバイス上で行うことができる分子生物学的反応および方法の代表的な型である。
本発明の他の要旨および利点は以下の発明の詳細な説明および請求の範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
本発明のデバイスおよび関連する方法論によって、分子生物学的反応および診断反応を「完全な電子制御」下に行うことができる。本発明にいう「電子工学的制御」の意味は、該語の従来の本来的な意味を越えている。ほとんどの慣用的な超微細電子工学的デバイス、機器および検出システムは、電子工学的制御下で常にあるレベルである。本発明の超小型電子技術デバイスは、慣用的な電子工学的制御のみならず、さらに重要なことには、それらが分子生物学的反応および診断反応を行う物理学的態様の直接的電子工学的制御をさらに提供する。本発明の基本的概念は、プログラム可能であってアドレス指定可能な顕微鏡位置を有する超小型電子技術デバイスである。各超微細-位置は、特異的結合物質が共有結合する誘導化された上面(すなわち、付着層)、中間浸透層、および下部直流(ＤＣ)超微細電極を有している。基本超小型電子技術構造を最初に作製した後、該デバイスは特異的結合性物質で各特異的超微細-位置のアドレッシングを自己指定することができる。この意味において、該デバイスはそれ自体を自己組立てする。自己アドレスされたデバイスは、続いていずれかのその超微細-位置で個々の複数工程で組合せ反応を能動的に行うことができる。デバイスは、複合の反応を行うことができるが、重要な利点は各反応が真に独立した試験部位で同等に起こることである。デバイスは、そのいずれの超微細-位置への、またはそこからの分析物および反応物の迅速な移動および濃縮を、電子工学的に指定し制御することができる。種々の反応の動的態様を電子工学的に制御するデバイスの能力によって、多数の新しい機構ならびに重要な利点および改善点が提供される。
【００６２】
本発明の概念および具体例を３つのセクションで記載する。第１のセクション「基本デバイスの設計および加工」は、基本的な下部超小型電子技術デバイスの設計、およびマイクロリソグラフィーおよびマイクロ-マシーン加工技術の双方を用いた該デバイスの加工を記載している。第２のセクション「デバイスの自己指定されたアドレッシング」は、デバイスの自己アドレッシングおよび自己組立て、特に各超微細-位置への特異的結合物質の迅速な輸送および付着を記載している。第３のセクション「デバイスの適用」は、デバイスが種々の複数工程の、組合わされた、複合の反応をいかに電子制御するかを記載している。また、このセクションは、デバイスの種々の用途および適用を記載している。
【００６３】
Ｉ．基本デバイスの設計および加工
デバイスに複数工程かつ複雑な反応を行わせるために、その電子部品は水溶液中で能動的な作動を維持できなければならない。この要件を満たすために、各超微細-位置は下部の制御可能かつ機能性のＤＣモードの超微細-電極を有していなければならない。しかしながら、活性なＤＣ電極表面上で起こる電解反応によって結合反応および親和性反応が影響されないということは、デバイス性能、特に感度(ノイズに対するシグナルの比)に重要である。デバイスの設計および加工に関する他の考慮には、限定するものではないが、物質適合性、特異的結合物質および続く反応物および分析物の性質、および超微細-位置の数が含まれる。
【００６４】
「制御可能かつ機能性のＤＣモード超微細電極」とは、制御可能な様式で荷電した特異的結結合物質、反応物、または分析物を該デバイスのいずれかの位置に、またはそこから、あるいは試料溶液からの自由フィールド電気泳動輸送に影響するか、またはそれを引き起こすことができる、直流モード(連続またはパルスのいずれか)で操作される、正または負のいずれかに偏倚した超微細電極を意味する。
【００６５】
本発明の範囲内で、分子の自由フィールド電気泳動輸送は、絶縁材によって結合されるか、または制限されて作り出される電場に実際には依存していない。従来の電気泳動分離技術には、絶縁(非-導電性)材によって電界列が制限されているか、または閉じ込められていることが必要であった。自由フィールド電気泳動輸送の場合には、荷電分子が１つの超微細位置から他のいずれかの超微細位置へ移動するか、またはバルク溶液から特異的超微細位置に移動する。従って、絶縁材による特殊な配置または制限は、本発明のこの態様には必要でない。
【００６６】
デバイスは、２つくらいの少ないアドレス可能な超微細位置、または数十万ほど多くの超微細位置を有するように設計することができる。一般的には、多数の超微細位置を有する複合デバイスは、マイクロリソグラフィー技術を用いて加工される。加工は、ケイ素、またはガラス、二酸化ケイ素、プラスティックもしくはセラミック材のごとき他の適当な基板材料上で行う。これらの超小型電子技術「チップ」の設計は、考慮された大規模のアレイまたは複合分析デバイスであろう。少数の超微細位置またはマクロ位置を有するデバイスは、マイクロマシーン加工技術を用いて加工されよう。
【００６７】
アドレス可能な超微細位置は、いずれの形状とすることもでき、好ましくは、円形、正方形または長方形とすることができる。アドレス可能な超微細位置のサイズは、いずれのサイズとすることもでき、好ましくは、サブミクロン(〜０.５μｍ)〜数センチメートル(ｃｍ)で、マイクロリソグラフィー技術を用いて作製するデバイスには５μｍ〜１００μｍが最も好ましい範囲で、マイクロマシーン加工技術を用いて作製するデバイスには１００μｍ〜１０ｍｍが最も好ましいサイズである。マイクロリソグラフィー法の分解能よりも小さな超微細位置を作製するためには、電子ビーム・リソグラフィー、イオンビーム・リソグラフィーまたは分子ビーム・エピタクシーのごとき技術が必要であろう。顕微鏡位置は分析および診断型の適用には望ましいが、限定するものではないが、分取スケールの生体高分子合成、試料調製、試薬の電子工学的調剤のごとき適用には、より大きなアドレス可能な位置またはマクロ-位置(例えば、５ｍｍより大きい)が望ましい。
【００６８】
マイクロリソグラフィーおよび/またはマイクロマシーン加工技術を用いることによって超微細位置を作製した後に、化学修飾、重合反応、またはなおさらにマイクロリソグラフィー加工技術を用いて、特別の付着層および浸透層を作る。これらの重要な層は、電極の金属表面から結合物質を隔離する。これらの重要な構造によって、各超微細位置表面下のＤＣモードの超微細電極が：(１)特異的(荷電)結合物質が１の超微細位置表面から他の超微細位置表面への、あるいはバルク溶液から特異的超微細位置への自由フィールド電気泳動輸送に影響するか、またはそれを引き起こすことができ；(２)特異的結合物質を特異的超微細位置の特別に修飾された表面へ濃縮し共有結合させることができ；(３)他の反応物および分析物が制御された様式にて超微細位置へ、またはそこから輸送されるように、特異的結合物質を付着させた後にＤＣモードで能動的に機能させ続けることができ；かつ、(４)電気化学反応および生成物との結合反応または親和性反応に悪影響しないようにすることができる。
【００６９】
Ｉ(ａ)  設計パラメーター(マイクロリソグラフィー)
図１はマイクロリソグラフィー技術を用いて加工した自己アドレス可能な超微細位置の基本設計を示す。３つの超微細位置(１０)(ＭＬ-１、ＭＬ-２、ＭＬ-３)が、絶縁材層/基板材上に沈着させてある金属部位(１２)上の表面に形成されている。金属部位(１２)は下部超微細電極構造(１０)として作用する。絶縁材は、金属部位(１２)を相互に隔離する。絶縁材には、限定するものではないが、二酸化ケイ素、窒化ケイ素、ガラス、レジスト、ポリイミド、ゴム、プラスチックまたはセラミック材が包含される。
【００７０】
図２はマイクロリソグラフィーにより作製した金属部位(１２)上に形成させた個々の超微細位置(１０)の基本的特徴を示している。アドレス可能な超微細位置が金属部位(１２)上に形成され、酸化層(２０)、浸透層(２２)、付着層(２４)および結合物質層(２６)を組み込んでいる。浸透層の共有結合カップリングのために、金属酸化物層は、ベースを供する。表面コーティング化学の当業者に知られている金属酸化物およびヒドロキシル基(単独または組み合わせ)、ならびに他の材は、そこから浸透層が構築または支持される共有結合部位を供することができる。浸透層が実際に金属電極表面に共有結合していることは絶対に必須ではない。浸透材の物理的重複は、本発明の範囲内にある別法を表している。
【００７１】
浸透層によって、金属表面および付着および/結合物質層の間に間隔が供され、これは、溶媒分子、小さな対イオン、および電解反応ガスが金属表面へ、またはそこからから自由に通過できるようにする。電解反応の物理学的および化学的に不利な効果を減少させることができる浸透層材には、限定するものではないが、Ｈ２に対するパラジウムのごとき酸化還元反応捕捉物質、ならびにＯ２および過酸化物に対する鉄錯体を含ませることができる。マイクロリソグラフィーにより作製したデバイスの浸透層の厚さは、約１ナノメートル(ｎｍ)〜１００マイクロメートル(μｍ)、最も好ましくは２ｎｍ〜１０μｍの範囲とすることができる。
【００７２】
付着層によって、結合物質の共有結合用の基板が提供される。マイクロリソグラフィーにより作製したデバイスの付着層の厚さは、０.５ｎｍ〜５μｍ、最も好ましくは１ｎｍ〜５００ｎｍとすることができる。ある種の場合においては、該浸透層および付着層は、同一の材から形成させることができる。結合物質のカップリングのためにさらに活性化できるある種の浸透層材も本発明の範囲内に包含される。
【００７３】
特異的結合物質は、付着層に共有結合し、特異的結合物質層を形成する。理想的には、該特異的結合物質層は、通常、単層の特異的結合分子である。しかしながら、ある場合においては、該結合物質層は数層または多層の結合分子を有することができる。
【００７４】
浸透層および付着層のある種の設計および機能態様は、物理的(例えば、サイズおよび形)および特異的結合性物質分子の特性によって指示される。また、それらは、続いて超微細位置まで輸送され、それに結合するであろう反応物および分析物分子の物理学的および化学的特性によってある程度指示される。例えば、オリゴヌクレオチド結合物質は、ＤＣモード機能の損失を引き起こすことなしに、１つの型の超微細位置表面に付着することができ、すなわち、該下部超微細電極は、下部電気泳動輸送は、オリゴヌクレオチド結合性物質が付着する表面に、またはそこから他の分子の迅速な自由フィールド電気泳動輸送をまだ引き起こすことができる。しかしながら、大きな球状蛋白質結合物質(例えば、抗体)が同じ型の表面に付着する場合、それらは、表面を絶縁し、ＤＣ様式機能の低下または完全な喪失を引き起こし得る。大きな結合物質(例えば、大きな球状蛋白質)の数が減少するか、または表面上の結合物質間をとるよう、付着層の適当な修飾は行わなければならないであろう。
【００７５】
超微細位置間の間隔は、作製の容易さ、超微細位置間の検出分解能の要件、および装置上の望ましい超微細位置数によって決定される。しかしながら、超微細位置(すなわち、下部超微細電極)のいずれの組合せでも完全なデバイス領域上で操作できる点において、超微細位置間の特定の間隔、または超微細位置の空間配置もしくは構造は、デバイス機能に必要でない。あるいは、誘電体または絶縁遮断材でデバイスを封じ込める、または超微細位置を完全に隔離することも実際必要ではない。このことは、複合電子フィールドのパターンまたは誘電体境界が、いずれかの電極間の空間または媒質中で特異的的分子を選択的に移動し、分離し、固定し、または方向付ける必要がないためである。特異的結合分子ならびに続く分析物および反応物がアドレス可能な超微細位置の表面に付着することによってデバイスはこのことを達成する。自由フィールド電気泳動の推進力によって、デバイス上のいずれかの位置および全位置の間のいずれの荷電分子の迅速かつ直接的な；またはバルク溶液から超微細位置への輸送が供される。しかしながら、流体容器およびバイオハザード目的のためにデバイスを取り囲むであろうことは指摘しなければならない。
【００７６】
数百個を超えて超微細位置の数が増加するにしたがって、該超微細位置の下部回路の複雑性も増大する。この場合においては、超微細位置のグルーピングパ
ターンを変化させ、空間距離も比例的に増加させなければならず、あるいは複層回路を基礎デバイスに作製することができる。
【００７７】
特異的結合物質でアドレスした超微細位置に加えて、他の機能を供する非-分析超微細位置およびマクロ位置が該デバイスには含まれているであろう。これらの超微細位置またはマクロ位置を用いて試薬を保存し、反応物、分析物もしくは細胞を一時的に保存することができ；かつ、過剰量の反応物、分析物または試料中の他の阻害成分のための一回使用ユニット(すなわち、試薬調剤系および試料調製系)として用いることができる。他の非アドレス超微細位置をアドレスされた超微細位置と組み合わせて使用して、これらの特異的超微細位置で生じる反応に作用または影響することができる。これらの超微細位置は、デバイス間およびデバイス内の活性および制御の双方に付加される。かくして、２つの離れたデバイスの間で相互作用し輸送することも超微細位置には可能である。このことによって、保存デバイスからの結合物質または反応物で作動デバイスをロードする機構、試料調製の機構、およびデバイスをコピーまた複製する機構が提供される。
【００７８】
図３は、６４個のアドレス可能な超微細位置(３０)を含有するマトリックス型のデバイスを示している。６４個の超微細位置デバイスは簡便な設計である。それは、標準的な超小型電子技術チップ・パッケージング構成要素と嵌合する。かかるデバイスは、６４個の超微細位置を含有する７５０μｍ×７５０μｍの中枢領域で、約１.５ｃｍ×１.５ｃｍのケイ素チップ基板上に作製する。各超微細位置(３２)は、近隣の超微細位置と５０μｍ離れている約５０μｍ２である。各個々の下部超微細電極用の接続回路は、金属接触パッド(３００μｍ２)(３４)の外側周辺部(１０ｍｍ×１０ｍｍ)を走っている。せり上がった内側周辺部は、超微細位置を有する領域および接触パッドの間に形成でき、約２〜１０μlの試料溶液を保持できるキャビティーを形成する。「チップ」は標準クアドパッケージ中にマウントすることができ、チップ接触パッド(３４)は該クアドパッケージのピンに配線する。１を超えるチップおよびさらなるパッケージングおよび周辺構成要素を含有するシステムは、臨床診断、すなわち試料物質の添加、流体の移動およびバイオハザード物質の封じ込めに関連する問題を扱うように設計することができる。次いで、パッケージングしたチップは、該デバイスを制御し操作できるマイクロプロセッサー制御ＤＣ電力供給源およびマルチメーター器具に接続することができる。互いに実質的に挟まれるであろう３種の基本構成要素の取り込みがデバイス製造(アドレッシング前)に最終的に含まれるであろうということが本発明によって意図される。それに結合物質が付着する基本チップデバイスは中間位置にあるであろう；試料または流体容器構成要素は基本チップデバイスの頂点上でアニーリングされるであろう；超小型電子技術検出器および外部コントローラー構成要素は基本チップデバイスの底部にアニーリングされるであろう。この戦略により、作製技術および物質和合性に関連する多数の問題が解決される。
【００７９】
Ｉ(ｂ)  マイクロリソグラフィー作製法
Ｉ(ｂ)(１)作製工程
一般的なマイクロリソグラフィー技術または写真平板技術を、膨大な数の小さな超微細位置を有する複合「チップ」型デバイスの作製に用いることができる。デバイスの作製には複雑写真平板技術は必要でないが、材の選択、および水溶液中で電子工学的デバイスを有効に機能させるという要件には特別な配慮がまさに必要である。
【００８０】
図３に示す６４個の超微細位置デバイス(３０)は、相対的に単純なマスク設計および標準的なマイクロリソグラフィー技術を用いて作製することができる。一般的に、基板材は１〜２ｃｍ２のシリコン・ウェハーまたは厚さ０.５μｍのチップであろう。シリコンチップは、プラズマ加熱化学蒸気沈着(ＰＥＣＶＤ)によって適用する、厚さ２μｍの二酸化ケイ素(ＳｉＯ２)絶縁コートで最初に保護膜形成する。
【００８１】
次工程において、真空蒸発によって０.２〜０.５μｍの金属層(例えば、アルミニウム)を沈着させる。また、スパッタリング技術によって金属を沈着させることもできる。アルミニウムに加えて、回路に適当な金属および材料には、金、銀、スズ、チタン、銅、白金、パラジウム、ポリケイ素、炭素および種々の金属の組合せが含まれる。絶縁基板材(ＳｉＯ２)に適当に粘着させる特別な技術は異なる金属で用いる。例えば、周辺接触パッド用にアルミニウム、相互連結回路用にポリケイ素、超微細電極用に貴金属(金または白金)を用いるように、異なる金属および他の材をデバイスの異なる導電性構成要素に用いることができる。
【００８２】
次いで、チップを正荷電のフォトレジスト(シプレー(Ｓhipley)、マイクロポジットＡＺ１３５０Ｊ)で保護膜形成し、回路パターンでマスク(明場(light field))し、露光し現像する。該フォト溶解したレジストを除去し、露光アルミニウムをエッチングする。今度は、アルミニウム回路パターンをチップ上に残しつつ、レジストのアイランドを除去する。これには、金属接触パッドの外側周辺部、接続回路(配線)、およびアドレス可能な超微細位置の下部基板として供される超微細電極の中枢アレイが含まれる。
【００８３】
ＰＥＣＶＤを用いると、該チップを最初に０.２〜０.４μｍのＳｉＯ２層で、次いで０.１〜０.２μｍの窒化ケイ素(Ｓｉ３Ｎ４)層で保護膜形成する。次いで、チップを正のフォトレジストで被覆し、接触パッドおよび超微細電極位置用にマスクし、露光し現像する。フォト溶解したレジストを除去し、ＳｉＯ２およびＳｉ３Ｎ４層をエッティングしてアルミニウム接触パッドおよび超微細電極を露光する。次いで、周囲のアイランド・レジストを除去すると、接触パッドおよび超微細電極の間の接続配線がＳｉＯ２およびＳｉ３Ｎ４層によって絶縁されたまま残る。
【００８４】
ＳｉＯ２およびＳｉ３Ｎ４層は該デバイスの機能性に重要な特性を供する。第二のＳｉＯ２層はアルミニウム回路とのより良好な接触および改善された密閉性を供する。また、レジスト材を用いて絶縁し密閉することもできる。このことによって、超微細電極が作動開している際の電解効作用による回路の掘削が防がれる。Ｓｉ３Ｎ４を、被覆する最終表層として用いる。なぜなら、特異的結合物質に付着する超微細電極表面を修飾するのに使用する続く試薬とそれが顕著に反応性が低いためである。
【００８５】
Ｉ(ｂ)(２)  浸透層および付着層形成工程
この時点で、デバイス上の超微細電極位置は、特殊化した浸透層および付着層で修飾する準備ができている。このことは本発明の重要な態様である。目的は、選択的な拡散特性を有する中間浸透層および最適な結合特性を有する付着表面層を超微細電極上に作製することである。
【００８６】
最適には、該付着層は特異的結合物質が付着するために、μｍ２当たり１０５〜１０７個の官能基化位置を有する。特異的結合物質の付着は、官能化から下部超微細電極が保護されるよう、表面を保護膜形成または絶縁してはならない。官能化デバイスには、ある画分(〜５％ないし２５％)の能動的金属超微細電極表面が溶媒(Ｈ２Ｏ)分子に依然として接近でき、かつ対イオン(例えば、Ｎａ＋およびＣl−)および電解ガス(例えば、Ｏ２およびＨ２)の拡散が生じ得ることが必要である。
【００８７】
また、中間浸透層も拡散が生じるように設計されている。加えて、該浸透層は、超微細電極表面との物理学的接触から大きな結合物質、反応物および分析物を阻害または妨害するポア限界特性を有していなければならない。浸透層は、超微細位置の結合物質とは物理学的に異なる能動的超微細電極表面を維持している。
【００８８】
この設計によって、電気泳動輸送に要する電解反応を超微細電極表面上で生じさせることができるが、結合物質、反応物および分析物に対する不利な電気化学効果が回避される。
【００８９】
また、浸透層は、電解反応で生成する有害な物質(Ｈ２、Ｏ２、フリーラジカル等)をスキャベンジする物質を含むよう設計することもできる。この目的のために、浸透層の亜層を設計することができる。
【００９０】
種々の設計および技術を用いて浸透層を作製することができる。一般的な設計には：(１)「ローン(Ｌawn)」、(２)「メッシュ(Ｍesh)」および(３)「ポーラス(Ｐorous)」構造が包含される。
【００９１】
ローン型浸透層には、繁茂した芝草に類似した方法で、金属表面から垂直方向に線状分子またはポリマーを配列させることが含まれる。これらの構造は、垂直構造の間に最小限の架橋を有しつつ、線状またはポリマー性の疎水性分子を金属表面に直接付着させることによって形成できる。理想的には、これらの疎水性線状分子は、金属パッドへ共有結合するのに適した１個の末端、および結合物質の共有結合に適したもう１個の末端を有する二官能基分子である。
【００９２】
メッシュ型浸透層には、架橋の程度によって決定される平均ポアサイズを有するメッシュ様構造を形成するポリマー性分子の不規則な配列が含まれる。これらの構造は、限定するものではないが、ポリアクリルアミド、アガロース、および重合し架橋できる他の生物学的材および非生物学的材のごときハイドロゲル型材によって形成できる。
【００９３】
ポアー型浸透層には、限定するものではないが、ポリカーボネート、ポリスルホンまたはガラス材を含む、層表面の頂点から金属パッドまで直接的にチャンネルまたは孔を形成できる材の使用が含まれる。全ての場合において、該浸透層は、物理学的または化学的に金属表面に固定されていなければならず、官能基を含んでいるか、結合物質がその表面へ付着することができるよう官能化できなければならない。
【００９４】
ローン型構造を作製する１つの好ましい方法には、アミノプロピルトリエトキシシラン(ＡＰＳ)を使用する金属超微細電極表面の誘導化が含まれる。ＡＰＳは、金属およびシリコン表面上で酸化物および/またはヒドロキシル基と容易に反応する。ＡＰＳは、結合物質の続く共有カップリングのための第一級アミン基で、浸透層および付着層を結合させる。表面結合部位によって、ＡＰＳは、わずかに酸化されたアルミニウム表面上に相対的に高いレベルの官能化(すなわち、多数の第一級アミン)、ＳｉＯ２表面上に中間レベルの官能化、およびＳｉ３Ｎ４表面の非常に制限された官能化を作製する。
【００９５】
ＡＰＳ反応は、全デバイス(例えば、チップ)表面をトルエン中の１０％ＡＰＳ溶液で５０℃にて３０分間処理することによって行う。次いで、該チップをトルエン、エタノール中で洗浄し、次いで５０℃にて１時間乾燥する。該超微細電極金属表面は、多数の第一級アミン基(１０５〜１０６/μｍ２)で官能化する。今度は、結合物質を、誘導化した超微細電極表面に共有結合することができる。この「ローン型」浸透層の深さは、ポリオキシエチレン=ビス(アミン)、ビス(ポリオキシエチレン=ビス(アミン))、および他のポリエチレングリコールまたは同様の化合物を用いることによって増加することができる。
【００９６】
ＡＰＳ法はオリゴヌクレオチド結合物質の付着によく作用する。図４は、３'-末端アルデヒド誘導化オリゴヌクレオチド(４０)をＡＰＳ官能化表面(４２)へ付着させる機構を示している。これは１つのアプローチを表しているが、浸透層および付着層を形成する種々の他のアプローチも可能である。これらには、塩基電極自体が：(１)塩基超微細電極に電気メッキすることにより二次金属層を形成する；(２)超微細電極位置への電気重合により浸透層を形成する、または(３)自由フィールド電気泳動工程によって活性化ポリマーおよび試薬を超微細電極表面に輸送し、続く浸透層および付着層を形成することによる自己-指定アドレッシングの使用が包含される。
【００９７】
Ｉ(ｃ)．マイクロマシーン加工デバイスの設計および作製
このセクションでは、マイクロマシーン加工技術(例えば、穿孔、粉砕等)または非リソグラフィー技術をいかに用いてデバイスを作製するかを記載する。一般的に、これらのデバイスは、マイクロリソグラフィーによって作製されるものよりも相対的に大きな超微細位置(＞１００μｍ)を有する。これらのデバイスは、分析適用、ならびに生体高分子合成、試料調製、試薬調剤機、保存容器および廃棄処分のごとき、分取型の適用に用いることができる。大きなアドレス可能な位置は、多量の結合物質を運搬するために三次元形式(例えば、管またはシリンダー)で作製することができる。かかるデバイスは、限定するものではないが、プラスチック、ゴム、シリコン、ガラス(例えば、超微細チャンネル、マイクロキャピラリー等)またはセラミックスを包含する種々の材を用いて作製することができる。低い蛍光性材が分析適用により理想的である。マイクロマシーン加工デバイスの場合、接続回路および大きな電極構造は、当業者に知られている標準的な回路ボード・プリンティング技術を用いて材上にプリントすることができる。
【００９８】
アドレス可能な超微細位置デバイスは、マイクロマシーン加工技術を用いて比較的容易に作製することができる。図５は、９６個の超微細位置デバイスの模式図である。この超微細位置デバイスは、材を通して均整をとって間隔を空けた９６個の孔(直径１ｍｍ)を穿孔することによって、適当な材料台材(２ｃｍ×４ｃｍ×１ｃｍ)から作製する。電極回路ボード(５２)は、超微細位置構成要素(５４)の上面に正確に嵌合する薄シートのプラスチック材台材上に形成する。回路ボードの下面には、各超微細位置(５５)への個々の配線(プリント回路)が含まれる。短い白金電極構造(〜３-４ｍｍ)(６２)は、個々の超微細位置チャンバー(５７)まで延びるよう設計されている。該プリント回路配線は、適当な防水性絶縁材で被覆されている。プリント回路配線はソケットに収束し、これにより複合スイッチ・コントローラー(５６)およびＤＣ電力供給源(５８)に接続される。デバイスは共通緩衝液貯蔵器(５９)中に部分的に浸漬しており、その中で作動する。マイクイロマシーン加工技術およびマイクロリソグラフィー技術によって作製したデバイス中の超微細位置の主機能は同一であるが、それらの設計は異なっている。マイクロリソグラフィーによって作製したデバイスにおいては、浸透層および付着層を下部金属超微細電極上に直接的に形成する。マイクロマシーン加工技術によって作製したデバイスにおいては、浸透層および付着層は、個々のチャンバーまたは容器(５７)中の緩衝溶液によって、それらの個々の金属電極構造(６２)から物理的に離されている(図６参照)。マイクロマシーン加工デバイスにおいては、該浸透層および付着層は、官能化親水性のゲル、膜、または他の適当な多孔性材を用いて形成できる。
【００９９】
一般的に、結合した浸透層および付着層の厚さは、１０μｍ〜３０ｍｍの範囲である。例えば、２０％〜３５％の(０.１％ポリリジンを有する)ポリアクリルアミド修飾親水性ゲルを用いて、デバイス中の各個々の超微細位置チャンバーを部分的に充填する(〜０.５ｍｍ)ことができる。これらのゲル濃度は、ポア限界２ｎｍ〜１０ｎｍを有する理想的な浸透層を形成する。ゲル中に取り込まれたポリリジンによって、特異的結合物質の続く付着のための第一級アミン官能基が供される。この型のゲル浸透層によって、ＤＣ様式で電極を能動的に機能させることができる。電極が活性化された場合には、ゲル浸透層は、それを通して小さな対イオンは通すが、大きな特異的結合物質分子は外側表面上に濃縮される。ここに、それらが第一級アミンの外側層に共有結合し、これが効率的に付着層となる。  浸透層および付着層の形成のための別の技術は、各超微細位置チャンバーの塩基に多孔性の膜材料に組み込むことである。次いで、膜の外側表面を化学官能基で誘導化し付着層を形成させる。このアプローチを行うのに適当な技術および材は、当業者に知られている。
【０１００】
マイクロリソグラフィーおよびマイクロマシーン加工デバイスの両方の設計および作製についての上記記載は、基本デバイスの他の変形または形態を限定することを意味するものでは決してない。より多数または少数のアドレス可能な超微細位置を有するデバイスの多くの変形、またはデバイスの組み合わせ、異なった分析および分取の適用とすることができる。より大きなアドレス可能な位置を有するデバイスの変形は、分取用生体高分子合成への適用、試料分取、セル・ソーティング系、イン・サイチュ・ハイブリダイゼーション、試薬調剤、保存系および廃棄処理系用に設計することができる。
【０１０１】
ＩＩ．  デバイスの自己指定アドレッシング
本発明のデバイスは、特異的結合物質で各超微細位置を電子工学的に自己アドレスすることができる。デバイス自体が、荷電特異的結合物質の特異的超微細位置への運搬に直接影響するか、またはそれを引き起こす。結合物質は、それが付着層に容易に反応し共有結合するように、一般的に官能化されている。デバイスは、ある程度まで外部工程、機構または器具を必要としないで、特異的超微細位置で特異的結合物質を物理的に方向付け、位置決定し、または設置する。この自己-アドレッシング工程は、迅速かつ特異的であり、連続様式または平行様式で行うことができる。
【０１０２】
デバイスは、ＤＣモードかつ特異的結合物質のものの反対の電荷(電位)に選択した超微細位置を維持することによって、特異的結合物質で連続してアドレスすることができる。結合物質が正味負の電荷を有する場合には、結合物質が運搬されるべき超微細位置が正に偏倚されよう。反対に、負電荷の超微細位置を用いて正に荷電した結合物質が運搬されるであろう。連続アドレッシング工程中の残りの超微細位置を偏倚させる選択には：反対の電荷(アドレスする超微細位置に対して反対)に全ての他の超微細位置を偏倚させること；反対の電荷に制限された群の超微細位置を偏倚させること；または、反対の電荷で超微細位置(または他の電極)を１個のみ偏倚させることが包含される。ある場合においては、反対の電荷で１またはそれを超える超微細位置を強く偏倚させることが望ましいが、他の群の超微細位置は弱く偏倚させることが望ましいであろう。この工程によって、残りの超微細位置をアドレスする間に、保護すべき超微細位置をあらかじめアドレスすることができる。結合物質が結合位置上の付着部位に過剰にない場合には、１個の他の超微細位置のみに影響して特異的超微細位置まで自由フィールド電気泳動運搬させる必要があり得る。特異的結合物質は、バルク溶液を通して迅速に運搬でき、それが付着層の特殊表面に迅速に共有結合する特異的超微細位置(群)で直接濃縮することができる。運搬速度は、結合物質のサイズおよび電荷、ならびに超微細位置間に用いる電圧および電流のレベルに依存する。一般的に、運搬速度は数秒から数分の範囲とすることができる。特異的超微細位置(７２)上に結合物質、反応物、または分析物（７２）を電子工学的に濃縮する能力を図７に示す。全ての他の超微細位置は、特異的結合物質アドレッシング工程の間、保護し、未作用のまま残すことができる。いずれの未反応物質も、特異的超微細位置の極性を反対にし、それを廃棄位置まで電気泳動することによって除去される。全ての所望の超微細位置がそれらの特異的結合物質でアドレスされるまで該サイクルを繰り返す。図８は、特異的オリゴヌクレオチド結合物質(８２、８４、８６)で特異的超微細位置(８１、８３、８５)をアドレスするための連続工程を示している。
【０１０３】
超微細位置をアドレスする平行工程には、同一の特異的結合物質を輸送し、濃縮し、１を超える特異的超微細位置と反応するよう、１個の超微細位置(特定基)を同時に活性化することが含まれる。続く平行加工も連続工程と同様である。
【０１０４】
ＩＩＩ．  デバイスの適用
デバイスが特異的結合物質で自己アドレスされれば、種々の分子生物学型の複数工程かつ複合の反応および分析をデバイス上で行うことができる。本発明のデバイスは、多数の重要な反応指標上の能動的かつ動的な制御を電子工学的に供する。この電子工学的制御によって、制御している反応に新たな物理学的機構が誘導され、反応速度、特異性および感度が顕著に改善される。デバイス能力から発生するこれらのパラメーターにおける改善点は：(１)付着した特異的結合物質を含有する超微細位置への反応物または分析物の迅速な輸送；(２)反応物または分析物の濃縮による、特異的超微細位置表面上での特異的結合物質との反応速度の上昇；(３)超微細位置からの未反応および非特異的結合成分の迅速かつ選択的な除去；および(４)最適結合条件の厳格性の電子工学的な制御および直接的作用である。
【０１０５】
本発明の自己アドレスされたデバイスは、種々の超微細形式化した複数工程および/または複合の反応および方法；限定するものではないが：
-従来形式のＤＮＡおよびＲＮＡハイブリダイゼーション工程および分析；
例えば、付着標的ＤＮＡ/プローブＤＮＡ、付着プローブＤＮＡ/標的ＤＮＡ、付着捕捉ＤＮＡ/標的ＤＮＡ/プローブＤＮＡ；
-連続および平行の両様式の複数または複合ハイブリダイゼーション反応；
-制限断片および一般的ＤＮＡ/ＲＮＡ断片サイズ分析；
-分子生物学的反応、例えば、制限酵素反応および分析、リガーゼ反応、キナーゼ反応、およびＤＮＡ/ＲＮＡ増幅；
-大きいまたは小さい抗原およびハプテンを含有する抗原/抗体反応；
-診断アッセイ、例えば、ハイブリダイゼーション分析(イン-サイチュー・ハイブリダイゼーションを含む)、遺伝子解析、指紋印刷および免疫診断；
-試料調製、細胞のソーティング、選抜、および分析；
-生物分子結合法(すなわち、蛍光、化学ルミネッセント、比色基(colorimetric)およびラジオアイソトープを包含するレポーター基での核酸、酵素、蛋白質または抗体の共有結合および非共有結合標識)；
-生体高分子合成、例えば、オリゴヌクレオチドまたはペプチドの組合せ合成;
-水溶性合成ポリマーの合成、例えば、炭化水素または線状ポリアクリル酸；ならびに
-高分子分子およびナノ構造(ナノメーター・サイズの粒子および構造)合成および作製
を迅速に行うことができる。
【０１０６】
ＩＩＩ(ａ)  核酸ハイブリダイゼーション
核酸ハイブリダイゼーションを本発明の主な例として用いた。なぜならば、それらの診断における重要性、およびそれが１を超える困難な型の結合(親和性)反応の特性を表すためである。このことは、各個々のハイブリダイゼーション反応が異なる厳格条件を要する複合様式でそれを行う場合には特に正しい。
特許請求するデバイスおよび方法によって、従来および新たな種々の様式で核酸ハイブリダイゼーションを行うことができる。反応パラメーターを電子工学的に制御するデバイスの能力は、核酸ハイブリダイゼーション分析、特に電子工学的な厳格制御(ＥＳＣ)をアレイ上の各個々の超微細位置に供する。
【０１０７】
「核酸ハイブリダイゼーション」なる語は、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)、リボ核酸(ＲＮＡ)、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを包含する全ての天然および合成形態の核酸ならびに核酸誘導体の間の全てのハイブリダイゼーション反応を包含することを意味する。
【０１０８】
「ドット・ブロット」ハイブリダイゼーションおよび「サンドイッチ」ハイブリダイゼーションのごとき従来のハイブリゼーション形式は、特許請求するデバイスならびに大スケールのアレイまたはマトリックス形式で行うことができる。例としては、ＤＮＡハイブリダイゼーション分析用のアペックスデバイスを設計し、作製し、以下の様式で用いる。超微細位置のアレイは、マイクロリソグラフィー(またはマイクロマシーン加工)技術を用いて最初に製作される。アレイ上のアドレス可能な超微細位置の数は、最終的な用途に依存する。該デバイスは、特異的オリゴヌクレオチド群と連続様式で迅速に自己アドレスする。この場合、特異的オリゴヌクレオチドは、６重体〜１００重体の範囲の３'-末端アルデヒド官能化オリゴヌクレオチドであるが、所望により、さらに長いポリヌクレオチドを付着することができる。アルデヒド官能基は、特異的超微細位置付着表面に共有結合させることができる(図４参照)。この群の特異的オリゴヌクレオチドは、従来技術を用いた従来のＤＮＡシンセサイザー上で容易に合成することができる。各特異的オリゴヌクレオチドの合成は、リボヌクレオチド制御された孔ガラス(ＣＰＧ)支持体から開始する。かくして、３'-末端位置にはリボヌクレオチドが含有され、次いでこれは末端ジアルデヒド誘導体へ合成され、精製された後に過ヨウ素酸酸化によって容易に転化される。オリゴヌクレオチド(４０)を含有するアルデヒドは、シフ(Ｓchiff)塩基反応工程によって、超微細位置表面上の第一級アミン官能基と容易に反応するであろう。
【０１０９】
特異的オリゴヌクレオチドとデバイスとの電子工学的アドレッシングを図８に示す。第１の特異的超微細位置(ＭＬ-１)(８１)とその特異的配列オリゴヌクレオチド(ＳＳＯ-１)(８２)とのアドレッシングは、特異的微小電極(ＭＬ-１)を正のＤＣ電位に維持する一方で、全ての他の微小電極を負の電位に維持することにより達成する(図８(Ａ))。水性緩衝液中のアルデヒド官能基化特異的配列
(ＳＳＯ-１)は、ＭＬ-１アドレスまで自由フィールド電気泳動され、そこでそれを濃縮(＞１０６倍)すると直ちにＭＬ-１(８１)の表面に共有結合する。全ての他の超微細電極は負に維持されており、ＳＳＯ-１配列(８２)との反応から依然として保護または遮断されている。次いで、ＭＬ-１電位を負（−）に逆転させていずれの非処理ＳＳＯ-１も廃棄系まで電気泳動する。サイクルは、全ての所望の超微細位置がそれらの特異的ＤＮＡ配列でアドレスされるまで、ＳＳＯ-２(８４)--→ＭＬ-２(８３)、ＳＳＯ-３(８６)--→ＭＬ-３(８５)、ＳＳＯ-ｎ--→ＭＬ-ｎを繰り返す(図８(Ｄ))。
【０１１０】
デバイスをアドレスするもう１つの方法は、電子工学的試薬供給デバイスから特異的オリゴヌクレオチドのごとき特異的結合物質を輸送することである。この供給デバイスは大量の結合物質または試薬を保持し、分析的デバイスを負荷するのに用いられるであろう。結合物質は、２つのデバイス間で電子工学的に輸送されるであろう。この系により、マイクロビペット添加、およびデバイス内またはデバイス間の複雑な流体デリバリー系のごとき物理的操作の必要がなくなった。
デバイスをアドレスするさらにもう１つの方法は、特異的超微細位置で特異的オリゴヌクレオチドの組合せ合成を行うことである。組合せ合成は後のセクションで記載する。
【０１１１】
特異的ＤＮＡ配列でデバイスをアドレスした後も、アレイデバイス上の超微細位置の下側の超微細電極が独立作動性直流(ＤＣ)電極のままであることが重要である。下部超微細電極は化学的または物理学的に絶縁されないように電極表面へ付着させるため、このことは可能である。各超微細電極は、超微細位置表面へのおよびそこからの他の荷電ＤＮＡ分子の自由フィールド電気泳動輸送に必要な強い直流を各超微細電極は依然として作り出すことができる。かくして、ＤＮＡアレイ・デバイスは、ＤＮＡハイブリダイゼーションの全ての態様およびいずれの他の続く反応にわたり完全に電子制御する。
【０１１２】
電子工学的に制御されたハイブリダイゼーション工程の一例を図９に示す。この場合において、各アドレス可能な超微細位置は特異的捕捉配列(９０)を有する。標的ＤＮＡ(９２)を含有する試料溶液を該デバイスに付する。全ての超微細位置が活性化され、該超微細位置で試料ＤＮＡが濃縮される(図９(Ｂ))。希釈溶液からの標的ＤＮＡ分子が超微細位置に高濃度に濃縮されるようになったことにより、表面上の特異的相補ＤＮＡ配列に非常に迅速にハイブリダイゼーションさせることができる。超微細電極電位をが逆転させると、全ての非-ハイブリダイゼーションＤＮＡは超微細位置から反発するが、標的ＤＮＡはハイブリダイズしたままである(図９(Ｃ))。同様な様式において、続く工程でレポーター・プローブをハイブリダイズさせて、ハイブリダイズした複合体を検出する。
【０１１３】
ハイブリダイゼーション工程の電子工学的制御は、全体のハイブリダイゼーション効率を向上し、かつ微細位置領域から非-特異的ＤＮＡを除去することによって、標的ＤＮＡ分子の続く検出を改善する。非-増幅ゲノムＤＮＡにおいて１０,０００〜１００,０００コピーの標的配列が検出できると予想される。この型のハイブリダイゼーション反応は、プローブＴｍよりかなり低い等温条件下；最小限の外部操作(すなわち、従来の洗浄工程は完全に除去される)で数分またはそれ未満で行うことができる。
【０１１４】
もう１つのＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイの通常の形式には、表面上に固定化した標的ＤＮＡを有すること、および次いで特異的プローブをこれらの標的ＤＮＡにハイブリダイズさせることが含まれる。この形式には、複数位置の同一の標的ＤＮＡ、または特異的位置の異なる標的ＤＮＡのいずれかを含むことができる。図１０は、この連続ハイブリダイゼーション形式の改善バージョンを示している。この場合において、超微細位置(１０１-１０７)は異なる捕捉ＤＮＡでアドレスされる。これらは、オリゴヌクレオチドに特異的な異なる配列と連続様式でハイズリダイズする(１０８、１０９)。超微細位置は、順次、正に偏倚させて、分子をそれ自体に輸送し、次いで、負に偏倚させて該分子を次ぎの超微細位置に輸送する。適当な電極電位では、特異的にハイブリダイズしたＤＮＡプローブは超微細位置に残るが、非-ハイブリダイズプローブは次の超微細位置に輸送される。配列特異的オリゴヌクレオチド・プローブは、蛍光発色団のごとき適当なレポーター基で標識することができる。
【０１１５】
特許請求するデバイスは、電子工学的な厳格条件を供することができる。厳格制御は、ハイブリダイゼーション特異性に必要であり、点突然変異における一塩基誤対合の解読には特に重要である。図１１は、電子工学的厳格制御を一塩基誤対合分析にいかに用いることができるかを示している。電子工学的厳格制御は、複数-塩基-誤対合の分析にも適用することができる。図１１(Ａ)において、完全対合ＤＮＡハイブリッド(１１０)は、誤対合ＤＮＡハイブリッド(１１２)よりも僅かに安定である。超微細位置を負に偏倚させ(図１１(Ｂ))、所定量の電気泳動電力を記載された時間に流すことによって、この誤対合ＤＮＡハイブリッドを変性または除去しつつ、完全対合ＤＮＡハイブリッドを保持することが可能である(図１１(Ｃ))。図１５は、電子工学的厳格制御を利用した電子工学的ハイブリダイゼーション工程と従来のハイブリダイゼーション工程との結果を比較している。ハイブリダイゼーションには、Ｒａｓ１２オンコジーン突然変異に関する１５重体のＧおよびＡ点突然変異プローブが含まれる。電子工学的ハイブリダイゼーションの結果は、顕著に改善されたハイブリダイゼーション効率と、従来法を上回る一塩基誤対合に関する非常に大きな識別比とを示している。
【０１１６】
さらなる改善において、特許請求するデバイスは、該デバイス上で生じる各特異的ハイブリダイゼーション反応に個別の厳格制御を供する。効果において、各ハイブリダイゼーションは独立反応である。従来または受動アレイ形式では、同一ハイブリダイゼーション溶液中に生じる全てのハイブリダイゼーション事象について最適な厳格性を達成することは不可能である。しかしながら、本発明の能動的アレイ・デバイスは、それらが同一のバルクハイブリダイゼーション溶液中で生じる場合でさえ、異なる超微細位置におけるハイブリダイゼーションに異なる電子工学的厳格性を供することができる。このことは、従来のマトリックスまたはアレイ・ハイブリダイゼーション形式、ハイブリダイゼーション形式による配列決定(ＳＢＨ)、および他の複合分析の生来の限界を克服するのに貢献している。
【０１１７】
ハイブリダイゼーションの特異性(すなわち、識別比)および(単一の点突然変異の検出のごとき)感度を改善することに加えて、電子工学的厳格制御によって、通常の範囲外のオリゴヌクレオチドをこれらの適用に用いることができる。８重体〜２１重体の範囲のオリゴヌクレオチドは、従来のハイブリダイゼーション法で点突然変異検出が可能と考えられる。従来のハイブリダイゼーション法を用いた最近の実践においては、１０重体〜１９重体のオリゴヌクレオチドを、厳格制御の温度および塩濃度を利用するこれらの従来法で最も頻繁に用いている。１０重体よりも短いオリゴヌクレオチドは、複合ハイブリダイゼーションに許容できなく；８重体よりも短い配列は、ハイブリダイゼーション効率が不足しているため、使用さえ考えられないことが判明した。２１重体を超える長い配列も用られない。なぜなら、対合および誤対合のプローブ間の識別比をそれらが非常に少ししか有していないためである。配列長が２１重体を超えて長くなるにしたがい、対合および誤対合プローブ間のハイブリダイゼーション・シグナルの差を識別する能力は顕著に低下する。
【０１１８】
本発明者らは、電子工学的厳格制御を有するＡＰＥＸデバイス上でのハイブリダイゼーションを、非常に高い識別比で短い(７重体およびそれ未満のもの)および長い(２２重体およびそれを超えるもの)両方のオリゴヌクレオチドにも用いることができることを発見した。短いオリゴヌクレオチド配列(７重体またはそれ未満のもの)は、ハイブリダイゼーションによる配列決定(ＳＨＢ)に利点を有している。短い長さの配列は、このＳＢＨについて用いるべき少数のオリゴヌクレオチド(８重体＝６５,５３６、７重体＝１６,３８４、６重体＝４,０９６)と整列させることができる。長い配列(２２重体およびそれを超えるもの)を電子工学的厳格突然変異分析と共に用いると、より感度が高く、選択的な突然変異分析を行うことができる。より長いプローブを使用することにより、非常に複雑なＤＮＡ試料において高感度を提供することができ、また高い全体ハイブリダイゼーション効率を提供することもできる。
【０１１９】
電気ハイブリダイゼーション技術を用いてイン-サイチュ・ハイブリダイゼーションを行うことができる。イン-サイチュとは、細胞から標的ＤＮＡ(またはＲＮＡ)は除去されるが、その内側を直接検出するという基本的に異なったハイブリダイゼーション形式を表す。イン-サイチュ・ハイブリダイゼーション法は一般的には複雑で、時間がかかり、かつ短い標的配列(すなわち、単一の点突然変異)を検出することはほとんど不可能である。電子工学的に制御されたイン-サイチュ・ハイブリダイゼーションは、当該デバイスの活性表面上で直接細胞に付着し、加工するＡＰＥＸデバイス上で行うことができる(試料調製技術については実施例１４参照)。しかしながら、細胞からＤＮＡを抽出するよりもむしろ、該ＡＰＥＸデバイスはレポーター・プローブを細胞内のＤＮＡに直接的に電子工学的にハイブリダイズさせる。電子工学的厳格制御を用いれば、非-特異的結合を大部分除去し、全体のハイブリダイゼーション効率を改善することによって、選択性および感度の双方が向上する。また、電子工学的厳格制御がハイブリダイゼーションに供する能力は、レポーター基標識ＤＮＡプローブを用いることなくＤＮＡハイブリダイゼーションを検出する新たな機構も提供する。それは、ハイブリダイゼーション工程自体のさらに直接的に検出する方法を提供する。蛍光色素検出工程を図１２に示し、実施例４および６に記載する。ＤＮＡハイブリッドの直接検出は、臭化エチジウムのごときＤＮＡ結合色素を用いることによって達成できる。該色素は二本鎖および一本鎖ＤＮＡの双方に結合するが、前者により大きな親和性を有する。図１２(Ｂ)において、正に電荷した色素(１２２)は、負に偏倚した超微細位置に輸送される。該色素は、ハイブリダイズした(１２０)および非-ハイブリダイズ(１２１)のＤＮＡ配列の双方に結合する(図１２(Ｃ))。超微細位置を正に偏倚し、所定量の電力を所定時間流すことによって、該色素分子が非-ハイブリダイズ超微細位置に結合して選択的に除去される。ＤＮＡハイブリッドに有害に作用しない適当な電流量を供することができる。次いで、色素分子と結合したハイブリダイズＤＮＡを、結合または集積光学システムを用いて蛍光検出する。
【０１２０】
本発明のデバイスによって、以下の反復する重要な利点が核酸ハイブリダイゼーション反応および反応に供される：
(１)希釈された標的ＤＮＡおよび/またはプローブＤＮＡ配列の、ハイブリダイゼーションが起こる特異的超微細位置(群)への迅速な輸送。この工程は、５〜１２０秒の範囲で起こすことができる。
(２)希釈された標的ＤＮＡおよび/またはプローブＤＮＡ配列の、ハイブリダイゼーションが起こる特異的超微細位置(群)での濃縮。濃縮効果は、恐らくは百万倍(＞１０６)をはるかに超える。
(３)非-特異的結合標的ＤＮＡ配列の、ハイブリダイゼーションが起こる特異的超微細位置(群)からの迅速な除去。この工程は、５〜１２０秒の範囲で起こすことができる。
(４)競合する相補的標的ＤＮＡ配列の、ハイブリダイゼーションが起こる特異的超微細位置(群)からの迅速な除去。この工程は、５〜１２０秒の範囲で起こすことができる。
(６)多数の独立したハイブリダイゼーション反応を数分間で行うことができる能力。
(７)プローブのＴｍよりはるかに低い等温条件かつ、最小限の外部操作または洗浄工程でハイブリダイゼーション工程を行うことができる能力。
(８)部分ハイブリダイズＤＮＡ配列を除去するための電子工学的厳格制御(ＥＳＣ)の使用。
(９)１,０００〜１００,０００コピー範囲の非増幅ゲノム標的ＤＮＡ配列のハイブリダイゼーション分析を行うことができる能力。
(１０)単一塩基誤対合ハイブリダイゼーション(点突然変異)の識別比(すなわち、分解能)および感度を改善するためのＥＳＣの使用。
(１１)従来のハイブリダイゼーション法で用いられていたものよりも短い(７重体およびそれ未満のもの)または長い(２２重体またはそれを超えるもの)かのいずれかの単一点突然変異プローブを使用できる能力。
(１２)マトリックス・ハイブリダイゼーションに個々の厳格制御を供するためのＥＳＣの使用。
(１３)非-特異的バックグラウンド成分を除去することによるハイブリダイゼーション事象の検出を改善すること。
(１４)固定化細胞で電子工学的イン-サイチュ・ハイブリダイゼーションを行うことができる能力。
(１５)ハイブリダイゼーションを検出するために共有的に標識したレポータープローブまたは標的ＤＮＡを用いる必要性がない検出方法の開発。
【０１２１】
ＩＩＩ(ｂ)  デバイスの再現性
特異的結合物質で個々のデバイスを別々にアドレッシングすることに加えて、特異的結合物質を他のデバイスにコピーできるマスターデバイスを作製することも可能である。このことは、デバイスの作製または製造のもう１つの方法を表している。デバイス複製の工程を図１３に示す。特異的結合配列でアドレスされた超微細位置を含むマスターデバイスを、各々の相補的ＤＮＡ配列(１３０)とハイブリダイズさせる。これらの相補的配列は活性化され、それ故、超微細位置付着層に共有結合できる。
【０１２２】
付着層を含有する非アドレス姉妹デバイス(１３２)を、ハイブリダイズしたマスターデバイスと比較した(図１３(Ｂ))。マスターデバイスの超微細位置は負に偏倚しており、姉妹デバイスの超微細位置は正に偏倚している。ＤＮＡハイブリッドを電子工学的に変性し、活性化ＤＮＡ配列が超微細位置に共有結合する姉妹デバイスまで輸送する(図１３(Ｃ))。超微細位置間のクロストークが最小限化されるようなデバイス構造に依存して、該工程は平行または連続で行うことができる。ハイブリッドは、十分な負電位を適用することによって、または正に電荷したカオトロピック剤または変性剤を用いることによって変性することができる。
【０１２３】
ＩＩＩ(ｃ)  構成要素デバイスおよび集積ＡＰＥＸシステム
多くの別々のＡＰＥＸデバイスまたはチップを組み合わせて集積ＡＰＥＸシステムを構築することができる。ＡＰＥＸ型のデバイスは多くの異なる機能を実行することができ、かつ反応物を自由フィールド電気泳動によって移動させることができるため、集積システムを開発することができる。例えば：(１)選択的に結合し細胞を溶解し、(２)試薬を電子工学的に調剤し、(３)プレ-ハイブリダイゼーションを行い、(４)廃棄処理ユニットとして作用させ、(５)ＤＮＡ断片を保存し、および(５)ハイブリダイゼーション分析を行う別々のＡＰＥＸデバイスまたはチップを組み合わせて試料調製およびハイブリダイゼーション分析システムを構築することができる(実施例１４および図１９参照)。これらの集積ＡＰＥＸ超小型電子工学システムは、完全な臨床分析器またはプログラム可能な分子生物学研究室と同等である(すなわちチップ上の研究室)。しかしながら、それが試料、試薬および反応物の最小限の流体工学または物理的操作しか要しない点において、それは自動制御(ロボット工学)または他の微細分析デバイスを超えている。集積ＡＰＥＸシステムのさらなる型には、限定するものではないが、イン-サイチュ・ハイブリダイゼーションを行うことができるもの、セル・セレクターおよびプロセッサー・システム、ならびに免疫診断分析器が包含されよう。
【０１２４】
ＩＩＩ(ｄ)  検出システムおよびレポーター基
蛍光標識レポーター基を含む結合反応の場合、結合反応を分析するためにエピ蛍光型の顕微鏡検出システムをＡＰＥＸデバイス上で使用することができる。該システムの全体的な感度は、組み合わせた検出構成要素(冷却電荷結合デバイス(ＣＣＤ)、増強電荷結合デバイス(ＩＣＣＤ)、マイクロチャネル・プレート検出器、またはフォトン計数フォト乗算機(ＰＭＴ)システム)に依存する。別法として、高感度ＣＣＤチップ検出器またはアバランシェ・フォトダイオード(ＡＰＤ)検出器をＡＰＥＸデバイスとさらに直接的に組み合わせることもできる。これらのシステムは、複合光学の必要性を幾分減じるものであろう。さらに進歩したシステムには、ＡＰＥＸチップへオプト・エレクトロニクス的または電子工学的検出素子を組み込むことが含まれるであろう。ＤＮＡの光学的および直接的電子工学的検出の双方が、これらのシステムで可能である。最も進歩したバージョンには、究極的に超小型電子検出器と共にオン-ボード・コントローラー構成要素を基本ＡＰＥＸチップ構成要素にサンドイッチすることが含まれよう。電子工学的および光学的(導波管)な回路は、ＡＰＥＸ構成要素の底部を通して直接的に作製されるであろう。この戦略によって、ＡＰＥＸ構成要素を使い捨てとするための作製技術、材料和合性、およびコスト効率に関連する多数の問題が解決される。  ＤＮＡプローブ、標的ＤＮＡまたは抗体を標識するのに用いることができる種々の蛍光色素およびレポーター基に加えて；他の型の標識またはレポーター基も用いることができる。これらには、化学ルミネッセンス標識、非-線形光学(周波数ダブラー)材料、ビオチン/アビジン複合体および種々の酵素が包含される。
【０１２５】
ＩＩＩ(ｅ)  組合せ生体高分子合成
本発明のデバイスは、オリゴヌクレオチドおよびペプチドのごとき生体高分子の組合せ合成を行うこともできる。かかる工程によって、外部の検出、影響または機械運動を全く必要としないで自己指定の合成を行うことができる。組合せ合成の他の工程には、顕微鏡位置において実際の合成を行うために、物理的保護および複合フォトリソグラフィー法、試薬デリバリーのためのマイクロロボット・ピペッティング・システム、またはコンポーネントの複雑な物理運動が必要である。本発明に開示した組合せ合成によって、非常に多数の配列をデバイス上で合成することができる。組合せ合成の基本概念には、輸送してデリバリーし、濃縮し、モノマーを反応させ、デバイス上の特異的アドレス可能な微細-微細位置で試薬をカップリングし、または試薬を脱ブロッキングするための自由フィールド電気泳動を使用することが含まれる。該概念はデバイスの本来の能力を利用して、近隣の試薬および反応物の作用から他の超微細位置を電子工学的に保護する。１またはそれを超える反応物が正味正または負に荷電するか、またはこれらの工程に適したかかる試薬を作り出すかのいずれかであるこれらの化学合成工程における選択工程の同定も該概念に重要である。
【０１２６】
組合せオリゴヌクレオチド合成の１つの方法を図１４に示す。この方法は、１セットの選択的にアドレス可能な超微細位置(１４０)で開始し、該超微細位置の表面はブロックされた第一級アミン(Ｘ-ＮＨ-)基(１４２)で誘導化されている。該工程における最初の工程には、電荷脱ブロッキング試薬(１４４)を用いた超微細位置の選択的脱ブロッキングが含まれる。この場合において、該試薬は正(＋)電荷に帯電しているであろう。該工程は、脱-ブロックしたそれら超微細位置に負電位を適用し、正電位を保護されたままの超微細位置に適用することによって行う(図１４(Ｂ))。正および負電位を選択電極に適用することによって、他の超微細位置からの試薬を排除しつつ、荷電試薬を試薬デリバリー部位から移動させ、脱-ブロックすべき所望の超微細位置に濃縮する。
【０１２７】
第二工程において、システムをホスホルアミダイト試薬(ｘ-Ｃ)(１４６)に単に暴露することによって、最初の塩基、この場合にはシトシンの脱ブロック超微細位置への化学カップリングが行われる。(Ｃ)ヌクレオチドは脱-ブロックされた超微細位置表面にはカップリングするが、ブロックされた電極表面には全くカップリングしない(図１４(Ｃ)および(Ｄ))。この時点で通常のホスホルアミド化学が次の脱-ブロッキング工程まで行われる。
【０１２８】
第二脱ブロッキング工程で(図１４(Ｄ))、次の塩基でカップリングすべき電極位置を負とし、保護したままの位置を正とする。今度は、カップリングすべき次の塩基に該システムを暴露し、この場合(ｘ-Ａ)(１４８)では、脱-ブロッキングした超微細位置への選択的なカップリングが達成される(図１４(Ｅ)および(Ｆ))。カップリングおよび脱-ブロッキング法は、異なるＤＮＡ配列の全部が各アドレス可能な超微細位置表面上で合成されるまで繰り返される。
【０１２９】
前記の例は、核酸合成の１つの可能なアプローチを表している。もう１つのアプローチには、完全水溶性ＤＮＡ合成が含まれる。この場合において、１-エチル-３-(３-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(ＥＤＣＡ)のごとき荷電した水溶性カップリング剤を用いて、水溶性核酸誘導体と共にオリゴヌクレオチド合成を行う。このアプローチは、塩基の広範なブロッキングを要する現在の有機溶媒に基づく技術を上回る重要な利点を有するであろう。水溶性合成は、より安価で、かつ現在の有機溶媒に基づく工程で用いる多くの有害な物質の使用がなくなるであろう。第三のアプローチ、再水溶性合成には、荷電モノマーおよび酵素の使用が含まれる。
【０１３０】
ＩＩＩ(ｅ)(１)  ターミナル・トランスフェラーゼを用いたオリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチドの組合せ合成に関するこのアプローチには、核酸重合酵素を使用することが含まれる。このアプローチはターミナルトランスフェラーゼ、５'-デオキシリボヌクレオチド三リン酸の３'-モノリン酸エステル、およびホスファターゼを利用する。ターミナル・トランスフェラーゼを用いてヌクレオチドをカップリングする。該３'-リン酸エステルは、各カップリング工程において２個以上のヌクレオチドが付加するのを防ぐブロッキング基として作用する。次のカップリング工程のために、３'-ホスファターゼを用いて３'-リン酸エステルを除去する。
【０１３１】
全ての試薬は水溶性であり荷電しているため、この組合せ合成法の全ての工程に一般的なＡＰＥＸ技術を用いることができる。このアプローチにおいては、それらの５'-ヒドロキシル位を介してデバイス上の適当な数のアドレスされた超微細位置に連結しているＡ、Ｔ、ＧおよびＣヌクレオチドを有するＡＰＥＸマトリックスを用いる。第一のヌクレオチドは標準的ＡＰＥＸアドレス技術に連結する。  カップリング反応の第１ラウンドは、その第二位でＡヌクレオチドとカップリングされるべき全ての超微細位置を正に偏倚させ、次いでターミナル・トランスフェラーゼおよびデオキシアデノシン三リン酸の３'-リン酸エステルを含有する２つの電子工学的な試薬調剤器を負に偏倚させることによって開始する。該試薬は適当な超微細位置に自由フィールド電気泳動され、マトリックス上で、ターミナル・トランスフェラーゼによってＡヌクレオチドが最初のヌクレオチドにカップリングされる。ヌクレオチド三リン酸はその３'位でリン酸基でエステル化されるため、ターミナル・トランスフェラーゼは１個のみのヌクレオチドを同時に付加する。
【０１３２】
ヌクレオチド・カップリングが完了した後、該超微細位置を負に偏倚し、廃棄処理系を正に偏倚すると、酵素および消費された試薬が除去される。該工程を、全ての超微細位置がカップリングされるまで、Ｇ、ＣおよびＴヌクレオチドの第１ラウンドカップリングの間、繰り返す。
【０１３３】
カップリングの第１完全ラウンド(Ａ、Ｔ、ＧおよびＣ)が完了する時に、全ての超微細位置を正に偏倚し、３'-ホスファターゼ酵素を有する試薬調剤器を負に偏倚させる。３'-ホスファターゼ酵素は、超微細位置まで自由フィールド電気泳動され、そこでそれは３'-リン酸エステルを加水分解する。リン酸エステルを除去すると３'-リン酸エステルが残り、次のラウンドのカップリング反応の準備ができる。該カップリング反応は、所望のオリゴヌクレオチド配列がＡＰＥＸデバイス上で完了するまで行う。
ＤＮＡ合成に加えて、同様な工程をＲＮＡ合成、ペプチド合成、および他の複合ポリマーに発展させることができる。
【０１３４】
ＩＩＩ(ｆ)  電子工学的に制御された分子生物学反応および増幅反応
標的ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の線形および指数関数的な増加および増幅を包含する種々の分子生物学的反応を、ＡＰＥＸ超小型電子デバイスおよびチップで行うことができる。
【０１３５】
制限酵素切断反応およびＤＮＡ断片分析は、完全な電子工学的制御下で行うことができる。ＡＰＥＸデバイスを用いた核酸の増加および増幅反応は、従来の増幅方法（ＰＣＲ、ＬＣＲ等）用の基本的には受動的な微細-マトリックス支持体である他の「ＤＮＡチップ」デバイスとは異なる。増幅の新規な機構は、ＡＰＥＸデバイスの能動的な性質から直接的に生じる。能動的なデバイスによって:(１)等温反応条条件かつそのＴｍ点よりもはるかに低い温度(熱溶解温度)下でＤＮＡハイブリッドを選択的に変性させ；(２)２またはそれを超える超微細位置間にＤＮＡを前後に迅速に輸送または移動させ；および(３)限定するものではないが、制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ、ならびにリガーゼのごときＤＮＡ修飾酵素を、デバイス上のいずれかの所望の超微細位置で選択的に濃縮するユニークな電子工学的機構が提供される。ＡＰＥＸデバイス上で行うことができる電子工学的に制御された分子生物学的反応および増幅反応をの例には：(１)ｄｓ-ＤＮＡ配列の電子工学的に指向された制限酵素切断；(２)ＤＮＡポリメラーゼによる標的ＤＮＡの電子工学的増幅；(３)ＤＮＡおよびＲＮＡリガーゼによる標的ＤＮＡ配列の電子工学的な連結および増幅；および(４)ＲＮＡポリメラーゼによる標的ＤＮＡの電子工学的な増加が包含される。
【０１３６】
ＩＩＩ(ｇ)  電子工学的な制限断片分析
ｄｓ-ＤＮＡの制限酵素切断を行うことに加えて、ＡＰＥＸデバイスおよび電子工学的技術は、ＤＮＡ断片の相対的サイズを分析し測定するのに用いることができる。このことは、異なる長さのＤＮＡ断片が個々の超微細位置上の共通捕捉配列にハイブリダイズできる場合に可能である。あるいは、異なる長さのＤＮＡ断片が異なる捕捉配列にハイブリダイズできる場合、その全てが同一のハイブリダイゼーションまたは結合エネルギーを有する。これらの場合には、電子工学的厳格条件を用いて、それらの非-ハイブリダイズ配列または重複配列の長さにより、異なるＤＮＡ断片を選択的に脱-ハイブリダイズさせることができる。長い重複配列を有する断片上の電気泳動力は、短い重複配列を有する断片の前にそれらを脱-ハイブリダイズさせる。かくして、断片が検出用に標識され、特異的超微細位置にアドレスされている場合には、それらを超微細位置から脱-ハイブリダイズさせるのに要する電気泳動電位または電力レベルによって、それらのサイズを測定することができる。同等の電子工学的な制限断片長の多形分析を行うことも可能であろう。
【０１３７】
ＡＰＥＸデバイスの製造および適用に関する以下の無制限の実施例に参照することによって、ここに本発明をさらに詳細に記載する。
【０１３８】
以下の実施例中の緩衝液、溶液および培地の処方は、ジェイ・サムブルック(Ｊ.Ｓambrook)、イー・エフ・フリッシュ(Ｅ.Ｆ.Ｆritsch)、およびティー・マニアティス(Ｔ.Ｍaniatis)「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル(Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual)」第２版、ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー(Ｃold Ｓpring Ｈarbor)のコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)社、１９８９年に記載されている。
【実施例】
【０１３９】
ＩＶ．実施例
実施例１：  オリゴヌクレオチドの合成および修飾
合成ＤＮＡプローブは、アプライド・バイオスステムズ(Ａpplied Ｂiosystems)自動ＤＮＡシンセサイザー上で、慣用的なホスホルアミダイト化学を用いて作製した。オイゴマーは、５'-アミノまたは３'-リボヌクレオシドのいずれかを含有するように設計した。５'-官能基はＡＢＩアミノリンク(Ａminolink)２試薬を用いることによって導入し、３'官能基はＲＮＡ ＣＰＧ支援からの合成を開始することによって導入した。３'-リボヌクレオチド末端は、第一級アミンと反応してシフ塩基を形成できる過ヨウ素酸酸化法によって末端ジアルデヒドに転化できる。  反応条件は以下の通りである：２０-３０Ｃ.Ｄ.オリゴマーを水中に最終濃度１ＯＤ/μlまで溶解する。１容量の０.１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５.２および１容量の０.４５Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム(水に新たに調製する)を添加する。その反応物を暗所下、室温にて少なくとも２時間撹拌しインキュベートする。反応混合物を、０.１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７.４で平衡化したセファデックスＧ-１０カラム(パスツール・ピペット、０.６×５.５ｃｍ)上に負荷する。２００μ立l画分を採取し、２μlのアリコートを薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)上にスポットし、紫外線(ＵＶ)吸収画分を保存する。
【０１４０】
以下のオリゴマーが３'-リボヌクレオシド末端(Ｕ)を含有している：
【０１４１】
【表１】
2007020568.tif 000002
【０１４２】
５'アミン基を含有するオリゴマーは、一般的にテキサス・レッド(ＴＲ、５９０ｎｍ励起、６１０ｎｍ蛍光)のごとき蛍光団と反応する。塩化スルホニルは第一級アミンに対して非常に反応性が高く、安定なスルホンアミド結合を形成する。
【０１４３】
テキサス・レッド-ＤＮＡコンジュゲートは以下のごとく作製する：テキサス・レッド塩化スルホニル(モレキュラー・プローブス(Ｍolecular Ｐrobes)社)をジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)に溶解し、最終濃度５０ｍｇ/ｍl(８０ｍＭ)とした。オリゴマーを０.４Ｍ重炭酸ナトリウム、ｐＨ９.０-９.１に溶解して最終濃度１Ｏ.Ｄ./μl(２１重体では５.４ｍＭ)とした。微小試験管中で、オリゴマー１０μlおよびテキサス・レッド２０μlを合わせた。暗所下にて１時間反応させた。アンモニアまたはヒドロキシルアミンで反応をクエンチし、試料を凍結乾燥し、ＰＡＧＥによって精製した(サムブルック(Ｓambrook)ら、１９８９年、前掲)。
【０１４４】
以下のオリゴマーには５'-アミノ末端が含まれている：
【０１４５】
【表２】
2007020568.tif 000003
【０１４６】
実施例２：  微細加工した試験デバイス上の電子工学的にアドレス可能な超微細位置-ポリリジン法
超微細位置は微小毛細管(０.２ｍｍ×５ｍｍ)から加工した。０.１-１.０％ポリリジンを含有する１８-２６％ポリアクリルアミドで毛細管を満たし、重合させた。過剰な毛細管を刻みを付け、空気泡を該管内にトラップされないように除去し、管の長さを標準化した。毛細管が共通の上部緩衝液容器を分かち、個々の下部緩衝液容器を有するように毛細管をマウントした。各下部緩衝液貯蔵器には、白金配線電極が含まれていた。
【０１４７】
上部貯蔵器中の微細毛細管の上部表面をアドレス可能な超微細位置であると考えた。上部および下部貯蔵器を０.１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７.４で満たし、バイオラド(ＢioＲad)５００/１０００電力供給機を用いて、０.０５ｍＡ一定で１０分間プレ-作動させた。過ヨウ素酸酸化ＥＴ-１２Ｒ捕捉配列約２μl(０.１Ｏ.Ｄ.)を電源を入れた上部貯蔵器にピペットで添加し、一定電流で２-５分間電気泳動した。該ＥＴ-１２Ｒ捕捉配列が濃縮され、超微細位置表面の第一級アミンに直ちに共有結合する。次いで、今度は試験毛細管が負に偏倚されるように極性を反対にし、さらに２-５分間電気泳動した。共有結合したＤＮＡは超微細位置に残るが、残存している非-結合ＤＮＡ配列はいずれも弾かれた。
【０１４８】
上部緩衝液貯蔵器を吸引し緩衝液で濯いだ。器具は分解して、新たな関係試験デバイスをマウントした。該貯蔵器を再充填し、蛍光標識した相補的ＤＮＡ配列、すなわちＥＴ-１０ＡＬ-ＴＲを添加した。正に偏倚した試験超微細位置において、０.０５ｍＡ定電流で２-５分間オリゴマーを電気泳動的に濃縮した。極性を反対にし、非結合相補鎖を除去した。該試験デバイスを除去し、エピ蛍光顕微鏡によって検鏡した。非-特異的結合についての負の対照は、ＥＴ-１０ＡＬ-ＴＲを非-相補的ＤＮＡ配列ＥＴ-２１Ａ-ＴＲに代えて、前記のごとく行った。
【０１４９】
毛細管超微細位置表面の断面は、ハママツＩＣＣＤカメライメージング・システム(Ｈamamatsu ＩＣＣＤ camera imaging system)を備えたジェナ(Ｊena)エピ蛍光顕微鏡下にて検査した。蛍光分析の結果は、相補的ＥＴ-１０ＡＬ-ＴＲ配列が結合物体にハイブリダイズし/配列を捕捉し、電位を負に偏倚させた場合でさえハイブリダイズしたままであることを示した。ＥＴ-２１Ａ-ＴＲ非-相補的配列は、電位を反対にした場合には試験デバイス表面に保持されなかった。
【０１５０】
実施例３： 微細加工試験デバイス上の電子工学的にアドレス可能な超微細位置-スクシンイミジルアクリル酸法
【０１５１】
この実施例では、オリゴヌクレオチドの５'-末端に共有結合する別の付着化学を記載する。ポリリジンを１％アクリル酸スクシンイミジル(モレキュラー・プオーブス(Ｍolecular Ｐrobes)社)に代える以外は前記のごとく、毛細管を加工した。第一級アミンを反応させるのに用いるスクシンイミジルエステルは相対的に、特にｐＨ８.０を超える領域にて不安定であるため、該毛細管は新鮮に仕上げた。該毛細管を前記のごとくマウントし、貯蔵器を０.１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７.４で満たした。該毛細管を０.０５ｍＡにてプレ-作動させた。５'-アミノ末端を含有するＥＴ-１０ＡＬ(０.１Ｏ.Ｄ.)約２μlを電源を点けながら上部貯蔵器にピペットで添加し、２-５分間電気泳動輸送を行った。試験デバイスが負に偏倚するように極性を反対にし、さらに２-５分間電気泳動を行った。非-結合ＤＮＡは反発したが、共有結合したＤＮＡは超微細位置に残留した。
【０１５２】
上部緩衝液貯蔵器を吸引し、緩衝液で濯いだ。参照試験デバイスを外し、新たな参照デバイスをマウントした。貯蔵器を再度満たして、蛍光標識相補的オリゴマーＥＴ-１１ＡＬ-ＴＲを添加し、前記のごとく電気泳動を行った。非-特異的結合の負の対照は、ＥＴ-１１ＡＬ-ＴＲを非-相補的ＤＮＡ配列ＥＴ-２１Ａ-ＴＲに代えて前記のごとく行った。
【０１５３】
各試験デバイスの蛍光分析は、相補的ＥＴ-１１ＡＬ-ＴＲが捕捉配列(ＥＴ-１０ＡＬ)にハイブリダイズし、極性を負に変化させた場合でさえハイブリダイズしたままであることを示した。非-相補的配列ＥＴ-２１Ａ-ＴＲは、極性を反対にした場合には超微細位置に残存していなかった。
【０１５４】
実施例４：  電子工学的に制御された蛍光ＤＮＡ/色素検出工程
エチジウムブロミド(ＥＢ)のごとき特定の色素は、二本鎖ＤＮＡに結合した(インターカレーション)場合に非常に蛍光性になる。二本鎖ＤＮＡに結合した場合に蛍光性および結合親和性は大きいが；該色素は一本鎖ＤＮＡにも幾分親和性を有し、結合した場合に低レベル蛍光を出す。以下の例では、電子工学的に制御されたＤＮＡ/色素検出工程をいかにして開発できるかを示している。
【０１５５】
実施例２および３に記載のごとく毛細管試験デバイスを調製し、ハイブリダイズさせた。エチジウムブロミド(ＥＢ)を緩衝溶液(〜０.０５ｍＭ ＥＢ最終濃度)に添加し、試験デバイスを負に偏倚させて、ハイブリダイズおよび非ハイブリダイズした超微細位置の双方でＥＢ(正に荷電)を濃縮した。試験デバイスは、５５０ｎｍ励起および６００ｎｍ蛍光にてエピ蛍光顕微鏡によって観察した。ハイブリダイズおよび非-ハイブリダイズした双方の超微細位置は、濃縮されたＥＢから強い赤蛍光を示した。
【０１５６】
試験デバイスを再度マウントし、０.０５ｍＡ、０.０３ボルト-時間の正の定電位に偏倚してＥＢを選択的に除去した。ハイブリダイズしなかった超微細位置の蛍光は減じられたが、ハイブリダイズした超微細位置は非常に高レベルのＥＢ蛍光を保持していた。以下のごとき結果が得られた：
捕捉                標的                標準化シグナル
ＥＴ-１０ＡＬ       ＥＴ-１１ＡＬ(正)   ２００＞
ＥＴ-１０ＡＬ       ＥＴ-２１Ａ(負)     １
【０１５７】
蛍光シグナルは、ＩＣＣＤイメージング・カンラシステムを用いて測定し、ピークの蛍光強度を表した。ノイズに対するシグナルの比は、全体の蛍光シグナル面積を積算した場合には１０００倍を超えるであろう。このことは、ノイズに対するシグナルの比を上昇させ、インターカレーティング色素を用いたＤＮＡアッセイの動的範囲について方法を証明している。
【０１５８】
実施例５：  金属基板上の電子工学的にアドレス可能な位置
アルミニウム(Ａl)および金(Ａｕ)配線(０.２５ｍｍ、アルドリッチ(Ａldrich)社)をトルエン中の１０％ ３-アミノプロピルトリエトキシシラン(ＡＰＳ)と反応させた。ＡＰＳ試薬は金属表面上のオキシドおよび/ヒドロキシル基と容易に反応して、オキシドおよび/またはヒドロキシル基と第一級アミンとの間に結合を形成した。アルミニウムは予め処理する必要はない。金配線を５×ＳＳＣ溶液中の電解に付して酸化層を形成させた。別法として、金属配線は過塩素酸浴によって酸化することができる。
【０１５９】
ＡＰＳ反応は以下のごとく行った：配線を３インチに切断し、ガラス板に置いた。トルエンを添加して該配線を完全に覆い、加熱プレート上で温度を５０-６０℃とした。ＡＰＳを添加して最終濃度１０％とした。溶液を混合し、反応を２０分間続けた。豊富な容量のトルエンで３回濯ぎ、次いで豊富な容量のアルコールで３回濯いで、５０℃オーブン中で乾燥した。
【０１６０】
次いで、ＡＰＳ処理配線は、アルデヒドを反応させてシフ塩基を形成させることができる。結合物体ＥＴ-１２Ｒは、明細書の他の場所に記載したごとく過ヨウ素酸酸化した。電極は脱気した水の貯蔵器中に設置した。電力は、.０５ｍＡ一定で約３０秒供給した。活性化ＥＴ-１２Ｒは直ちに添加した。電力を供給し、液体を吸引して新鮮な水を添加し、再度吸引した。試験(正に偏倚)および対照の電極は、蛍光標識成分ＤＮＡ、ＥＴ-１０-ＴＲを含有するハイブリダイゼーション緩衝液(ＨＢ、５×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ)中に設置した。２分後に電極を各１分間洗浄緩衝液(１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ)で３回洗浄し、蛍光によって観察した(励起５９０ｎｍ、蛍光６１０ｎｍ)。
【０１６１】
結果は、ＥＴ-１２Ｒが特異的に試験金属の表面に特異的にカップリングしたことを示している。試験電極は蛍光性であったが、対照電極はそうではなかった。金属に対するＤＮＡの非特異的吸着はハイブリダイゼーション緩衝液中のＳＤＳが存在することによって阻害された。電解による金基板への付着および続くＡＰＳ処理が有効であった。得られたシグナルは、非-酸化金で観察したものよりも顕著に強かった。さらに重要なことには、この実施例では、金属表面を結合物体で化学的に官能基付加し、かつ誘導化することができ、溶液から絶縁されることないことが示された。ＡＰＳ法は、ＤＮＡ-金属コンジュゲートを形成させる多くの利用可能な化学のうちの１種を表している。
【０１６２】
実施例６：  電子工学的に制御された蛍光色素検出工程-金属配線
ＤＮＡ-アルミニウム電極基板を調製し実施例５に記載のごとくハイブリダイズさせた。対照として、ハイブリダイズしたおよびハイブリダイズしなかったＤＮＡ-Ａl電極を非誘導化Ａl配線で処理した。エチジウムブロマイド(ＥＢ)を添加し、その溶液および試験ＤＮＡ電極を負に偏倚させて色素を誘引した。その溶液を吸引し、新たな緩衝液を添加した。金属表面を顕微鏡下で検鏡した。
【０１６３】
デバイスを再マウントし、所定の電圧-時間、正の電位を供給する。緩衝液を吸引し、エピ蛍光によって電極を観察した。このことは、ハイブリダイズしたおよびハイブリダイズしなかった金属表面の間の蛍光に有意な差が生じるまで繰り返した。
捕捉                標的                標準化シグナル
ＥＴ-１２Ｒ         ＥＴ-１０ＡＬ(正)   ＞１４０
ＥＴ-１２Ｒ         なし(負)            １
【０１６４】
ハイブリダイズしなかった金属表面の蛍光性は減じたが、ハイブリダイズした金属表面は蛍光性を保持していた。蛍光シグナルは、ＩＣＣＤカメラ・イメージングシステムを用いて測定し、ピークの蛍光強度を表した。全体の蛍光シグナル面積を積算した場合には、ノイズに対するシグナルの比は＞＞１０００倍となるであろう。この実施例では、この方法が、ノイズに対するシグナル比を上昇すること、それ故にアッセイの範囲が動的であることを示している。同様な結果が毛細管ゲル立体構造を用いても得られるということは、電気化学効果がアッセイの性能に顕著に影響しないことを示している。
【０１６５】
実施例７：  能動的プログラム可能な電子工学的マトリックス(ＡＰＥＸ)-マイクロマシーン加工
６個のアドレス可能な２５０μｍ毛細管位置の放射状配列は、プラスティック基板材から微細-加工した。該デバイスは、共通の上部貯蔵器と、各超微細位置を個々にアドレス可能なように分離した下部貯蔵器を有している。ユニークなオリゴマー配列結合物体は、前記した方法によって高度に架橋したポリアクリルアミドから製作した特異的超微細位置に位置させ、結合している。試験超微細位置は正の電荷を有しているが、他の位置は非-特異的相互作用を防ぐために負の電位を有している。
【０１６６】
該配列は洗浄し、次いで相補的な蛍光標識したＤＮＡプローブとハイブリダイズさせる。該配列を洗浄して過剰なプローブを除去し、次いでエピ蛍光顕微鏡下で観察した。特異的にアドレスした超微細位置のみが蛍光性であった。この工程は、他の１箇所にて他の結合物体で繰り返し、他の蛍光基で標識したプローブとのハイブリダイゼーションによって確認する。
【０１６７】
ＤＮＡ配列は、他の位置との無視してよい架橋で所定の位置に特異的に設置された。このことによって、数個〜数百個のユニークな配列を有するマイクロマトリックスを所定の位置に加工することができる。
【０１６８】
低バックグラウンドの適当なプラスチック基板を選択するために、それらの６００ｎｍにおける蛍光特性について、異なる基板を試験した。プラスチックは、エピ蛍光顕微鏡イメージングシステムおよびフルオロメーターによって試験した。基板のリストおよびＬＳ５０Ｂフルオロメーターから得た蛍光判読値を以下の表に記載する：
【０１６９】
【表３】
2007020568.tif 000004
【０１７０】
本実験は、黒色アクリル、ＡＢＳおよびポリカーボネートが最も低いバックグラウンドレベルを有することを示している。
【０１７１】
実施例８：  能動的でプログラム可能な電子工学的マトリックス(ＡＰＥＸ)-マイクロリソグラフィー加工
シリコン・ウエハー上の８×８のマトリックス(６４部位)の５０μｍ四方微細位置(図３参照)を設計し、加工し、スイッチ・ボックスと共にパッケージングした(詳細についてはデバイス加工セクション参照)。いかに記載する数種の材料および工程の改良を行って、ＡＰＥＸＤＮＡチップデバイスの感度および能動性を向上させた。
【０１７２】
８ａ）  最上層コートの選択
ＡＰＳ(３-アミノプロピルトリエトキシシラン)工程には、チップの全表面を反応させることが含まれる。この初期機能化工程の感度は、チップ表面上の種々の物質の相対反応性に依存する。超微細位置を囲む領域への官能基化および二次ＤＮＡ付着を減少させるためにＳｉＯ２または金属酸化物よりも反応性の低い材料が必要である。フォトレジストおよび窒化ケイ素を試験した。異なった最上層コートを窒化ケイ素チップに付した。該チップは、エピ蛍光によって検査し、次いでＡＰＳで処理した後、過ヨウ素酸酸化ポリ-Ａ ＲＮＡ配列(シグマ(Ｓigma)社、分子量１００,０００)を共有結合させた。該チップは、ハイブリダイゼーション緩衝液中のテキサスレッド標識２０重体(Ｔ２-ＴＲ)の２００ｎＭ溶液と３７℃にて５分間反応させた。そのチップは洗浄緩衝液中で３回、１×ＳＳＣ中で１回洗浄した。そのチップを５９０ｎｍ励起および６１０ｎｍ蛍光の蛍光性によって検査した。
【０１７３】
二酸化ケイ素に比してＡＰＳに対し非常に低い反応性、およびフォトレジスト材料のように本来は蛍光性でないため、窒化ケイ素を選択した。また、バックグラウンド面積のＵＶ焼損のごとき他の方法を可能である。
【０１７４】
８ｂ）  ＡＰＥＸの物理学的特性
仕上げたマトリックスチップは、ビイ・アンド・エル顕微鏡およびＣＣＤカメラを付けたプローブ・テスト・ステーション(Ｐrobe Ｔest Ｓtation)(マイクロマニュピュレーター・モデル６０００)を用いて目視検査した。試験パッドおよび外部接触パッドの間の連続性につき、チップを試験した。これは、パッドと、マルチメーターに連結したマニュピュレーター・プローブ・チップとを接触させることにより行った。連続性によって、該パッドが金属表面にエッチングされていることが確認された。次いで、電子工学的環境下での安定性についてパッドをチェックした。金属配線は、通常の乾燥条件下では１ｍＡまで扱えると評価された。
【０１７５】
１滴(１-５μl)の緩衝化溶液(１×ＳＳＣ)を８×８マトリックスにピペットで添加した。表面張力によって液体は、外部接触パッド領域を乾燥させつつ同じ場所に維持される。１個のプローブ・チップを接触パッドに接触させ、もう１個のプローブ・パッドを液体と接触させた。ＨＰ６６２５Ａ電力供給機およびＨＰ３４５８Ａデジタルマルチメーターを用いて最大電圧５０Ｖにて、電流を５０ｎＡまで段階的に上昇させた。
【０１７６】
第一の加工は、ケイ素基板、二酸化ケイ素絶縁層、アルミニウム沈着およびパターニング、ならびに窒化ケイ素最上層よりなる。
【０１７７】
第二の加工工程には、アルミニウム金属および窒化ケイ素の層の間の二酸化ケイ素層が含まれる。二酸化ケイ素およびＡlは、より和合性の物理特性を有し、より良好な化学インターフェースを形成して、第一の加工工程によって製作したものよりも、より安定かつ丈夫なチップを提供する。
【０１７８】
８(ｃ)  ＤＮＡ付着
８×８のマトリックス・チップを、実施例５記載のＡＰＳ試薬で機能化した。次いで、そのチップを過ヨウ素酸酸化ポリ-Ａ ＲＮＡ(シグマ(Ｓigma)社、平均分子量１００,０００)で処理した。チップを洗浄緩衝液(ＷＢ)中で洗浄して過剰なおよび結合しなかったＲＮＡを除去した。この工程によって、捕捉配列によりチップ全体がコートされるが、窒化物でカバーした領域よりも暴露した金属表面に非常に高い密度が存在した。そのチップを、ハイブリダイゼーション緩衝液(ＨＢ)中のＴ２-ＴＲの２００ｎＭ溶液と３７℃にて５分間ハイブリダイズさせた。次いで、ＷＢ中にて３回、１×ＳＳＣ中にて１回、各々常温で１分間洗浄した。チップは、５９０ｎｍ励起および６１０ｎｍ蛍光の蛍光性によって検査した。  広げられた金属領域は蛍光に光り、５０μｍ四方のパッド(超微細位置)の形状を有していた。低い蛍光強度および/または不定形の境界は、幾つかのパッドが完全に広がっていなかったことを示した。このような場合には、プラズマエッチングをさらに数回行うことが推奨されるであろう。
【０１７９】
８(ｄ)  電子工学的に制御されたハイブリダイゼーション
能動的ハイブリダイゼーションは、実施例８ｃからのチップを用い、１個の特異的超微細位置を正に偏倚させることによって行った。これは、残存した超微細位置を負に自動的に偏倚もするスイッチ・ボックスを用いるか、外部溶液有の電極を用いることによって行う。３μlの緩衝液をマトリックス・パッド(超微細位置)上のみに置いた。〜１-５ｎＡの電流を数秒間流し、０.１ピコモルのＴ２-ＴＲを該溶液に添加した。液体を除去し、チップを乾燥して、５９０ｎｍ励起および６１０ｎｍ蛍光のテキサス・レッド蛍光性について検査した。正に偏倚した特異的超微細位置のみが蛍光性であった。ＡＰＥＸチップ上の他の特異的超微細位置を用いて、この実験を数回繰り返した。加えて、１個の超微細位置の蛍光性ＤＮＡを電子工学的に脱-ハイブリダイズさせ、次いで、最初の位置を負に、かつ目的の超微細位置を正に偏倚させることによって、もう１個の超微細位置に移動させた。
【０１８０】
８ｅ）  電子工学的に制御するアドレッシングおよびデバイスの加工
８×８ＡＰＥＸマトリックスを、前記のごとくＡＰＳで機能化した。オリゴヌクレオチド結合物体ＣＰ-１は、過ヨウ素酸酸化法によって活性化した。４つの超微細位置をマトリックス内で正に偏倚させ、残存するものを負に偏倚させた。緩衝液２μlをマトリックスに置き、電流を流した。結合物体ＣＰ-１を添加し、示した位置に電子工学的に濃縮した。液体を除去し、該チップを緩衝液で簡単に洗浄し、緩衝液２μlを該チップ上に置いた。再度、電流を数秒間流し、Ｔ２-ＴＲ２ピコモルを添加した。短時間の後に、液体を除去して該チップ全体をＷＢで３回洗浄した。チップを乾燥し蛍光性について検査した。
【０１８１】
結果は、４個の正に偏倚した超微細位置は全て蛍光性であることを示している。この実施例は、特異的結合物体での超微細位置の選択的なアドレッシング、付着配列の微細位置への位置付けおよび共有結合、ならびに相補的標的配列の誘導化超微細位置への特異的ハイブリダイゼーションを示す。
【０１８２】
８ｆ）  ＡＰＥＸチップの遺伝的タイピング
多形性のＨＬＡ遺伝子ｄＱａに特異的な３'-リボヌクレオシド末端を有するＤＮＡ結合物体を合成した。該結合物体は、前記のごとき過ヨウ素酸酸化によって活性化した。反対の相補性物は、前記のごとく、５'-アミノ末端で合成し、テキサス・レッド、ローダミンまたがボジピー色素のごとき蛍光団とコンジュゲートさせた。超微細位置は、前記のごとく、ＡＰＳで処理することによって第一級アミンで機能化する。
【０１８３】
数μlの溶液を８×８マトリックス上に置いた。特異的超微細位置は、超微細位置を正に偏倚させることによってアドレスし、〜０.１ピコモルの過ヨウ素酸酸化ＤＮＡオリゴマーを添加し、その位置に移動させ共有結合させた。極性を反転させ、結合しなかった結合物体分子を除去した。これは、全てのユニーク付着結合物体がチップに結合するまで、他のアドレスされた超微細位置の他の結合物体について繰り返す。次いで、チップを個々の蛍光標識相補的配列にハイブリダイズさせて、カップリング反応の特異性を決定すると同時に、全てのアドレスされた超微細位置を視覚化した。電子工学的に変性させて相補的オリゴマーを除去した(０.０５％ＳＤＳ中、９０℃にて１０分間)同一のチップ上にて、アドレスした超微細位置が非標識標的ＤＮＡまたはゲノムＤＮＡと共にハイブリダイズする。検出は、明細書に前記したごとく、蛍光色素検出アッセイを介した。
【０１８４】
超微細位置がユニークな結合物体と共に特異的にアドレスされたことを結果は示すであろう。負に偏倚させた超微細位置への非特異的結合は、無視できるであろう。該デバイスおよび連結した結合物体化学は、変性条件下でも安定であり、それ故にアドレスされ加工されたデバイスは再利用することができる。ハイブリッドを変性させる電子工学的方法は、電流を上昇させおよび/またはそれを流す時間を増加させるであろう。
【０１８５】
実施例９：  電子工学的厳格制御
９Ａ）  １５重体 Ｒａｓ-１２プローブでの単一点突然変異
高レベルの電子工学的厳格制御に影響するデバイスの能力は、１５重体プローブを用いたＲａｓ-１２オンコジーン・モデル系で証明した。ＤＮＡ二本鎖における単一の塩基対の誤対合は、対合した二本鎖に比して僅かな不安定性しかハイブリッド対に生じない。この僅かな不安定性が、誤対合二本鎖を引き起こして、対合した二本鎖よりも僅かに低いＴｍで変性させる。該対(対合および誤対合)が両方とも対合した対に対して最適な厳格でハイブリダイズする場合、誤対合した対はより低い効率でしかハイブリダイズしないであろう。誤対合からのハイブリダイゼーション・シグナルは、対合した対からのシグナルよりも幾分低いであろう。従来のハイブリダイゼーション法では、単一の点突然変異分析は、８重体〜２１重体範囲のプローブで行う。１０重体〜２０重体範囲のプローブが最も頻繁に用いられる。突然変異プローブが８重体よりも短いか、２０重体よりも長い場合、いずれの信頼できる方法を用いても、誤対合から対合したものを識別することは極めて困難となる。これは、対合および誤対合した対の間のハイブリダイゼーション・シグナルにほとんど差異がないためである。点突然変異分析で使用するハイブリダイゼーション・厳格制御の典型的な方法は、温度および塩濃度をあてにしている。本発明者らは、厳格制御が電気泳動電位によっても影響されるということを見い出した。
【０１８６】
Ｒａｓ-１２の例において、１５重体点突然変異特異的プローブを試験デバイス上の超微細位置に付着した３０重体標的配列に電子工学的にハイブリダイズさせた。超微細位置の極性を負に偏倚させ、完全に対合したものには影響せずに誤対合したものを変性させる所定の電力レベルを供する一定電流に所定の時間該ハイブリッドを付した。
【０１８７】
以下の配列を、各々２５０μｍ表面超微細位置を有する３セットの試験構造上で合成し試験した。
付着配列は：
【０１８８】
【表４】
2007020568.tif 000005
【０１８９】
である。
レポーター・プローブ配列（テキサス・レッドで標識）は：
【０１９０】
【表５】
2007020568.tif 000006
【０１９１】
である。
デバイスは、明細書に前記したごとく、毛細管から加工した。付着配列Ｒａｓ-ＧおよびＲａｓ-Ｔを過ヨウ素酸酸化し、アドレスされた超微細位置に共有結合させた。
【０１９２】
次いで、Ｒａｓ-Ｇ超微細位置をＲａｓ-１、Ｒａｓ-２またはＲａｓ-３とハイブリダイズさせた。Ｒａｓ-１はＲａｓ-Ｇに完全に対合した。Ｒａｓ-２は１塩基対が誤対合である(Ｇ-Ａ)。Ｒａｓ-３は２塩基対誤対合である(Ｇ-ＡおよびＧ-Ｔ)。Ｇ-Ａ誤対合はＤＮＡ二本鎖に対して最も低い不安定性しか生じず、それ故、完全な対合から識別することが最も困難である。
【０１９３】
慣用的なハイブリダイゼーションを最初に行って超微細位置を蛍光的に検査し、どのくらいの範囲の相補的配列がハイブリダイズしているのかを測定した。試験デバイス(微細毛細管)を再マウントし、次いで電子工学的ハイブリダイゼーションを行った。完全に対合したハイブリッドに大きな影響を及ぼすことなく誤対合したハイブリッドが完全に除去されるまで、負の電位(一定電流)でそれらを偏倚させることによって同一の電子工学的厳格に試験デバイスを全て付した。方法および結果を以下に示す：
【０１９４】
従来のハイブリダイゼーション法：
-４０℃にて１５分間５×ＳＳＣ中でハイブリダイズさせ、
-各々２０℃にて５分間、１×ＳＳＣ中で３回洗浄し、
-蛍光分析を行い、
-１ｂｐ誤対合(Ｒａｓ-Ｇ/Ｒａｓ-２)に対する完全対合(Ｒａｓ-Ｇ/Ｒａｓ-１)のシグナル比を観察する：約１０対１。
【０１９５】
電子工学的厳格制御(ＥＳＣ)法：
-２０℃にて５分間、５×ＳＳＣ中でハイブリダイズさせ、
-「洗浄工程なし」
-１５０ボルト(Ｖ)にて０.１５ミリアンペア(ｍＡ)の電子工学的厳格を４分間(２０℃)適用し、
-蛍光分析を行い、
-１ｂｐ誤対合(Ｒａｓ-Ｇ/Ｒａｓ-２)に対する完全対合(Ｒａｓ-Ｇ/Ｒａｓ-１)のシグナル比を観察する：＞１００対１
【０１９６】
全実験についての完全な結果を図(１５)にグラフ的に示す。これらの結果は、ＤＮＡハイブリダイゼーション反応における厳格制御には電気泳動電位のみしか使用できないことを示している；しかし、ＥＳＣによって、従来のハイブリダイゼーション法よりも高いハイブリダイゼーション効率および高い識別比が供されることも示している。加えて、ＥＳＣは各個々の超微細位置に適用することができ、同一のバルク溶液中で独立した厳格制御が供される。
【０１９７】
(９Ｂ)  ７重体および２２重体プローブを用いた単一点突然変異分析
点突然変異分析で通常用いる正常なサイズ範囲とはかけ離れた７重体および２２重体の両方のプローブを調製し、さらに電子工学的ハイブリダイゼーションおよびＥＳＣの利点を証明した。以下に掲載する点突然変異特異的オリゴマー・プローブは、得られるハイブリッドが０、１または２塩基の誤対合を有するように対形成させることができる。前記のごとく、相補的オリゴマー配列を超微細位置にカップリングさせ、ハイブリダイズさせた。超微細位置で極性を反転させ(負に偏倚)、そのハイブリッドを、完全対合を除去することなく誤対合を変性させる所定の電力レベルを供する一定電流に所定の時間付した。
Ｒａｓ-ＧまたはＲａｓ-ＧＡオリゴマー(以下に示す)が超微細位置の付着し、これらを標的配列として用いた。以下に示す２２重体および７重体のＲａｓ特異的オリゴマーのシリーズを、本明細書のいずこかに記載したごとく、テキサス・レッド発蛍光団で標識した。「下線を引いた塩基および太字の塩基」は、誤-対合および/または誤-対合する可能性のある位置を示している：
【０１９８】
【表６】
2007020568.tif 000007
【０１９９】
試験デバイスは、本明細書中にて前記したごとく、毛細管から加工した。オリゴマー標的Ｒａｓ-ＧまたはＲａｓ-ＧＡは、超微細位置に共有結合した。次いで、１個の超微細位置を、テキサス・レッドで標識した完全な２２重体の相補的Ｒas-２２Ｃ-ＴＲとハイブリダイズさせた。第二の超微細位置は、１塩基対が誤対合している(Ｇ-Ａ)２２重体であるＲａｓ-２２Ａ-ＴＲ；または、２塩基が誤対合している(Ｇ-ＡおよびＧ-Ｔ)２２重体であるＲａｓ-２２-ＴＡとハイブリダイズした。
【０２００】
本明細書において前記した試験デバイスは、両方の超微細位置が同一の電流または電力レベルを同時に経験する二重チャンネル様式で同時に作動させた。試験デバイスを最初に従来法によってハイブリダイズさせ、超微細位置を蛍光的に検査してハイブリダイズした相補的配列の量を測定した。対で、試験デバイスを用いて電子工学的ハイブリダイゼーションを行い、完全対合ハイブリッドには大きく影響を及ぼさずに誤対合ハイブリッドが除去されるまで、一定電流で時間を制御した。バイオ-ラド(Ｂio-Ｒad)１０００/５００電力供給機は、典型的には、０.０２〜０.１ｍＡに設定し、０.０２〜０.０４ボルト-時間で一定電流で実験を行った。デバイスを分離し、ケイ素強化ＣＡＤカメラ(ハママツ(Ｈamamatsu)社)を付けたジェナ(Ｊena)顕微鏡上でエピ蛍光によって試験デバイスを観察した。そのイメージをハママツ・アーガス１０イメージ・プロセッサー(Ｈamamatsu 10 image processor)によって加工し、ソニー・ビデオプリンター(Ｓony Ｖideo Ｐrinter)によって記録した。さらなる電子工学的厳格を要する場合には、該毛細管を再作動させた。
【０２０１】
単一の塩基対誤対合の識別は、前記のごとく７重体で行った。しかしながら、その低Ｔｍにより、室温よりもむしろ４-６℃の冷却ボックス中でデバイスを作動させた。
【０２０２】
電子工学的ハイブリダイゼーションおよび厳格制御が、７重体および２２重体の両方を用いた単一の塩基対誤対合を識別できることを結果は示した。対合：誤対合比は１００：１またはそれよりも大きかった。このシグナル：ノイズ比は、温度およびイオン濃度を用いて厳格条件を制御するいずれかのハイブリダイゼーション法によって報告されたものよりも一般的に良好であった。
【０２０３】
たとえ、二本鎖を安定化できるＡとの水素結合にＧのイミノのプロトンが参加することができるためにＧ-Ａ誤対合が最も安定な誤対合であっても、電子工学的厳格制御は、完全対合から１塩基Ｇ-Ａの誤対合を識別することができた。
【０２０４】
電力の消費計算値および測定値は、温度においては無視できる変化しか示さず、厳格は超微細位置での温度変化によって引き起こされないことが証明された。前記のごとき受動的にハイブリダイズする超微細位置が対合および誤対合の間の識別を示さなかったことは、拡散性が識別を引き起こさないことを証明している。  また、これらの例は、各微細位置が個々の厳格制御を有することができ、従って単一の普通の厳格レベルに限定される大スケールの複合ハイブリダイゼーション技術に対する主要な障害を克服できる。また、電子工学的な厳格電力レベルを熱的融点(Ｔｍ)データと関連付けて、予想電気融点(Ｅｍ)曲線および等式を作成することもできる。
【０２０５】
(９Ｃ)  高いゲノム・バックグラウンドにおける電子工学的ハイブリダイゼーション
実施例の標的ＤＮＡ配列は、通常はゲノムＤＮＡ試料中の非常に小さい比率の総ＤＮＡのみからなる。ＡＰＥＸ・デバイス上の非常に小さな位置で総ＤＮＡを濃縮することによって、本発明は、過剰なヘテロＤＮＡの存在下にて標的ハイブリダイゼーションの効率を向上させる。
【０２０６】
この例において、５'-アミン基を載せている付着配列を、２２％ＰＡＧＥ、１％アクリル酸スクシンイミジルを含有する試験デバイスに付着させた。毛細管は、ＥＴ-２３ＡＬまたはＥＴ-１１ＡＬ捕捉配列のいずれかで誘導化した。標的プローブＥＴ-１２Ｒはテキサス・レッドで標識した。ＥＴ-１２Ｒ-ＴＲは、各々試験および対照の配列である、ＥＴ-２３ＡＬにはハイブリダイズするであろうが、ＥＴ-１１ＡＬ捕捉配列にはハイブリダイズしないであろう。
【０２０７】
ヘテロゲノムＤＮＡ、子ウシ胸腺ＤＮＡ(ＣＴ ＤＮＡ、シグマ(Ｓigma)社)を溶解して最終濃度１ｍｇ/ｍlの水とし、超音波処理し加熱して該ＤＮＡを変性させた。試料は、０、０.１μｇまたは１.０μｇの変性ＣＴ ＤＮＡと共に１０１０コピーのＥＴ-１２Ｒ-ＴＲ標的を含有する最終容量１００μlの０.５×ＴＢＥ中に調製した。これは、標的ＤＮＡに比して０、１,０００または１０,０００倍の過剰なＣＴ ＤＮＡを表していた。
【０２０８】
試験デバイスは、バイオ-ラド(Ｂio-Ｒad)１０００/５００電力供給機を用いて０.５×ＴＢＥ中、０.０３ｍＡにて５分間プレ-作動させた。試験および対照の毛細管が厳密に同一条件下で同時に作動できるよう試験デバイスを設定した。試料を付し(１００μl)、毛細管を０.０３ｍＡにて５分間、正の電位に偏倚させてＤＮＡを誘引した。極性を反転させ、同一の電力を流してハイブリダイズしなかった全てのＥＴ-１２Ｒ-ＴＲ標的を試験デバイス表面から除去した。緩衝液を吸引し、ケイ素強化ＣＡＤカメラを付けたジェナ顕微鏡(ハママツ(Ｈamamatsu)社)上で蛍光性によって試験デバイスを観察した。イメージは、ハママツ・アーガス１０イメージ・プロセッサーを用いて加工し、ソニー・ビデオ・プリンターによって記録した。
【０２０９】
１００μl当たり０.１μｇ ＣＴ ＤＮＡの存在または不存在における絶対ハイブリダイゼーションシグナルおよびシグナル/ノイズ比の間には差異がなかった。シグナル強度は同等であり、シグナルは有効領域にわたって均等に分布していた。１００μl当たり１μｇのＣＴ ＤＮＡのレベルで、シグナルが毛細管の周辺に優先して分布しているということは、捕捉配列がブロッキングまたは飽和していることを示している。この人工物は、ハイブリダイゼーション工程の間に極性を振動させることによって容易に切り抜けられた。このことによって、総ＤＮＡが有効領域に向けて、またはそこからパルスされ、より効率的かつ均等に標的をハイブリダイズさせることができるであろう。
【０２１０】
(９Ｄ)  受動ハイブリダイゼーション-対-電子工学的制御ハイブリダイゼーション
電子工学的制御ハイブリダイゼーションは、受動ハイブリダイゼーションよりもより効率が良く迅速である。なぜならば、電子工学的制御ハイブリダイゼーションにおける電気効果のためである。
【０２１１】
毛細管試験デバイスは、各々試験および対照デバイスとして、ＥＴ-２３ＡＬおよびＥＴ-１１ＡＬ付着配列で仕上げた。ＣＴ ＤＮＡ１μｇと共に１×１０１０コピーのＥＴ-１２Ｒ-ＴＲを含有する総容量１００μlのハイブリダイゼーション溶液を作製した。
【０２１２】
受動ハイブリダイゼーション：
【０２１３】
１セットの試験および対照デバイスを、５０℃のハイブリダイゼーション溶液１００μlを入れた小さな試験管に置き、１５分間ハイブリダイズさせた。次いで、試料を１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで３回、各４５℃にて５分間洗浄した。
【０２１４】
電子工学的制御ハイブリダイゼーション：
試験デバイスをマウントし、０.０６ｍＡにて５分間プレ-作動させた。次いで、緩衝液を吸引し、ハイブリダイゼーション溶液１００μlを添加した。試験デバイスは、０.０６ｍＡにて３分間正に偏倚させ、次いで３０秒間極性を反転させ、当該デバイスが再度正になるよう３分間再度反転させた。試験デバイスは３分間負に偏倚させて電子工学的に洗浄した。
【０２１５】
ハイブリダイゼーションの効率および程度は、受動形式よりも能動形式での方が非常に良好であった。能動(電気)形式における絶対シグナルは、受動形式におけるシグナルよりも１００倍を超えて高かった。能動形式におけるシグナル/ノイズ比は、受動形式におけるシグナルよりも１０倍上昇した。能動的ハイブリダイゼーション・アッセイは、最小限の操作で１０分以下で完了する。受動形式は、〜３０分間管および緩衝液の数種の操作を要する。
【０２１６】
典型的なハイブリダイゼーション法では、９０％の反応完了には、３回のＣ０ｔで２.５ｎＭのプローブを１５分間用いる。本発明者らの０.１７ｎＭのプローブの実験濃度は、受動ハイブリダイゼーション反応動力学では普通〜４時間を要するであろう。
【０２１７】
能動的ハイブリダイゼーションによって、低バックグラウンドとなる低プローブ濃度で使用することができる。典型的な方法は、拡散性に依存しており、従ってより高濃度を用いて反応動力学を動かさなければならない。能動的な方法によって、試料を非常に少量に濃縮することができ、このことは非常に局所的なプローブ濃度となり、続いて非常に迅速なハイブリダイゼーション反応動力学とすることができる。
【０２１８】
実施例１０：  蛍光ＤＮＡナノ-構造でのハイブリダイゼーション
通常、非-増幅型のハイブリダイゼーション・アッセイの全体の感度は、非特異的結合からのバックグラウンドによって制限される。このことは、複数のレポーター基または複数のレポーター基との二次複合体を用いてＤＮＡプローブを標識する場合には、しばしば主要な問題である。従って、しばしば、レポーター標識(群)の実際または固有の検出限界が到達するよりもかなり低い所までしかアッセイ検出限界が到達しない。
【０２１９】
電子工学的制御ハイブリダイゼーション法を用いることによって、本発明者らは、非常に蛍光性の強いサブ-ミクロンまたはナノ-スケールのビーズを、付着ＤＮＡプローブと共に超高感度アッセイに用いることを見い出した。本発明者らは、自由フィールド電気泳動を用いて、ＤＮＡプローブ-蛍光性ナノ構造物の運動を制御することができた。電子工学的厳格制御によってハイブリダイズしなかった構造からハイブリダイズしたものを高いレベルで識別できるため、ＤＮＡ プローブ-蛍光性ナノ構造物は顕著にハイブリダイゼーション感度を上昇することができる。電子工学的厳格制御によって、本発明者らは、増幅する必要なしに、これらの高い蛍光性のナノ構造物または他の複数の標識モデルを低コピー数(５０〜１０００標的)で検出できる。現在に至るまで、このことは、従来のハイブリダイゼーション法および工程では不可能であった。
【０２２０】
蛍光性のナノ粒子、フルオロフォアは、モレキュラー・プローブズ・インコーポレイテッド(Ｍolecular Ｐrobes,Ｉnc.)社から購入した。該粒子は、テキサス・レッドまたはフルオレセインのごとき蛍光性色素を載せたカルボキシメチル・ラテックススフェアおりなる。該ラテックス・スフェアは、アミンまたはアルデヒドのごときその表面の異なる官能基で得ることができる。該粒子は、直径０.０１〜５μｍのサイズで利用できる。
【０２２１】
１）蛍光性ナノ粒子の特徴付け
非修飾、アミン修飾またはアルデヒド修飾されたナノ粒子は、正味正の電荷を有している。電界においては、これらの粒子は負に偏倚させた超微細位置に向けて移動する。
【０２２２】
２）フルオロスフェアへのＤＮＡ付着化学
アミン修飾中止は、末端アルデヒド基を有する核酸にカップリングすることができる。次いで本明細書中において前記した過ヨウ素酸法によって酸化される３'-末端リボシドでＤＮＡプローブを合成することによって生成させることができる。
【０２２３】
粒子は、蒸留水中の２％懸濁液として保存した。０.０２-１.０μｍのアミン修飾赤色蛍光性のフルオロフォアのアリコットを、０.１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７.４中にピペット添加し、再懸濁した。過剰量の過ヨウ素酸酸化ポリリボ-Ａをその懸濁液に添加した。室温にて反応させて、９０分間インキュベートした。１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ(０.１５ｍＭ、塩化ナトリウム、０.０１５ｍＭクエン酸ナトリウム、０.１％(ｗ/ｖ)ドデシル硫酸ナトリウム、ｐＨ７.０)中で該粒子を洗浄しピペット添加して、結合しなかったおよび非特異的に結合したポリリボ-Ａを除去した。
【０２２４】
緩衝溶液中のＤＮＡ-フルオロスフェアを直流電界に置いた。該ＤＮＡ-フルオロスフェアが正電極に向かって移動することが観察され、これは今やその正味の電荷が負に変化していることを示している。これは、ＤＮＡカップリング反応が成功したかを決定するのに単純かつ簡便な方法である。粒子からの強烈な蛍光性がいずれかのハイブリダイゼーションシグナルによって妨害されるであろうため、伝統的なハイブリダイゼーション法では、放射性同位体標識レポーター・プローブを用いることが必要であろう。
【０２２５】
３）  試験デバイスへのＤＮＡ付着
試験デバイスは、続いて５'-アミン末端化ＤＮＡプローブと反応させることができる、１％アクリル酸スクシンイミジルを含有する高度に架橋したポリアクリルアミドで重合させた。捕捉配列、オリゴ-Ｔの付着性は、蛍光標識した相補的プローブ、ＣＰ-１-ＴＲとのハイブリダイゼーションによって証明した。試験デバイス表面は非常に蛍光性であり、このことは該表面が捕捉配列で誘導体化されたことを示している。
【０２２６】
４）  ＤＮＡ-フルオロスフェアの電子工学的ハイブリダイゼーションおよび検出ハイブリダイゼーション反応は、共通の上部貯蔵器および独立の下部貯蔵器を分かち合って有する２つの毛細管試験デバイスを支持する構造中で行った。反応性の表面を共通の上部貯蔵器に暴露した。
【０２２７】
試験デバイスを該構造にマウントし、０.０５ｍＡの０.５×ＴＢＥ中で１５分間プレ-作動させた。１つの試験デバイスはＴ２相補的付着配列を有しており、もう１つはＥＴ-１０ＡＬ非-相補的付着配列を有している。ＤＮＡ-フルオロフェア１μlを上部貯蔵器に添加した。試験デバイスを.０２ｍＡで正に５分間偏倚させ、ＤＮＡ-フルオロスフェア(蛍光性のナノ粒子)を誘引させた。該粒子が表面上に存在することを確認するために該試験デバイスを精査した。試験デバイスが今度は負に偏倚され、ハイブリダイズしなかったＤＮＡ-フルオロスフェアが弾かれるように極性を反転させた。
試験および対照デバイスの間に差異はなかった。該粒子は、流した電力量にも拘わらず、繰り返し試みた後でも除去することができなかった。
【０２２８】
５）  ＤＮＡ-フルオロスフェアの受動ハイブリダイゼーションおよび検出
いずれの理論および仮定にもとらわれずに、本発明者らは、粒子の電子工学的ハイブリダイゼーションが、試験デバイスの表面ゲルマトリックス中の粒子を固定または捕捉すると考えた。かくして、ゲル表面上の付着性配列に受動的にハイブリダイズするＤＮＡ-フルオロスフェアは、電子工学的な脱-ハイブリダイゼーションによってより容易に除去されなければならない。
【０２２９】
新しい試験デバイスを前記のごとくマウントした。ＤＮＡ-フルオロスフェアの０.０５％懸濁液を上部貯蔵器にピペット添加し、５分間受動的にハイブリダイズさせた。その緩衝液を吸引し、新たな１×ＴＢＥ緩衝液を添加した。今度は試験デバイスを負に偏倚させて粒子を弾いた。試験デバイスは、０.０２ｍＡにて５分間操作し、次いで蛍光によって検査した。
【０２３０】
今度は、室温にて合計１０分間ＥＣＳを行った後の試験および対照のデバイスの間に顕著な識別性があった。シグナルは試験表面にわたって均一に分布していなかったが、単一のポケットに濃縮された。このことは、表面付着性配列の有効性が制限されることを示しているのかもしれない。疎水性、親水性または混合された特性を有するより長いスペーサー・アームを用いて改善できる。かかるスペーサーは、例えば、ジアミノヘキサン、無水ケイ皮酸、ならびに当該分野でよく知られている種々の他のスペーサー基を用いて作製することができる。
【０２３１】
実施例１１：  特異的ｄｓ-ＤＮＡ配列の電子工学的な指向性制限酵素切断
２つの例を用いて、ＡＰＥＸデバイスがｄｓ-ＤＮＡ配列の制限エンドヌクレアーゼ切断を選択的に行うことができる能力を証明する。Ｍ１３ｍｐ１８(ＸbaＩ制限部位を有する)およびＭ１３ｍｐ８(ＸｂａＩ制限部位を有していない)ベクターをこれらの実施例に用いた。これらのベクターは多くのクローニングおよびＤＮＡ配列決定工程に普通に用いられている。
【０２３２】
第１の例では：(１)試験デバイス上の特異的微細位置に対するＭ１３ｍｐ配列の電子工学的ハイブリダイゼーション、(２)微細位置へのＸｂａＩ制限酵素の自由フィールド電気泳動輸送、および(３)他の微細位置における切断断片の二次捕捉を証明する。該例では、特異的結合物体(オリゴヌクレオチド捕捉配列、他)で自己アセンブル可能な該デバイスの能力も証明する。
【０２３３】
方法における基本工程を図(１６)に示す。オリゴヌクレオチド捕捉配列に共有結合する４つの特異的超微細位置(ＭＬ-１、ＭＬ-２、ＭＬ-３およびＭＬ-４)を用いた。試薬(オリゴヌクレオチド、制限酵素、他)をデリバリーするため、および反応物を処理するためには、電子工学的デリバリーシステムを用いる。
【０２３４】
第一の工程には、Ｍ１３-１オリゴヌクレオチド捕捉配列のＭＬ-１およびＭＬ-２微細位置までの輸送およびそこへの共有結合、ならびにＭ１３-２オリゴヌクレオチド捕捉配列のＭＬ-３およびＭＬ-４微細位置への輸送および付着が含まれる。核酸はｐＨ＞４で負に荷電しているため、ｐＨ５-９の範囲の緩衝溶液中で電気泳動した場合、それらは常に正に荷電した電極に向かって動く。
【０２３５】
第二の工程には、ＭＬ-１超微細位置におけるＭ１３ｍｐ１８配列のＭ１３-１捕捉配列への、ならびにＭＬ-２微細位置におけるＭ１３ｍｐ８配列の該Ｍ１３-１配列への自由フィールド電気泳動輸送およびハイブリダイゼーションが含まれる。
【０２３６】
第三の工程には、ＸｂａＩ制限酵素もＭＬ-Ｉ(Ｍ１３ｍｐ１８)超微細位置およびＭＬ-２(Ｍ１３ｍｐ８)超微細位置への輸送が含まれる。ＸｂａＩはＭＬ-１のＭ１３ｍｐ１８を切断するが、ＭＬ-２のＭ１３ｍｐ８は切断しない。ＭＬ-１からの切断断片は、ＭＬ-３のＭ１３-２配列に輸送され、それにハイブリダイズする。実験の制御としては、ＭＬ-２およびＭＬ-４の間で自由フィールド電気泳動を行った。ＭＬ-２のＭ１３ｍｐ８配列は切断されていないため、ＭＬ-４では断片が全く検出されない。
【０２３７】
本実施例で用いた種々のＭ１３付着配列およびプローブ配列は、本明細書中において前記したごとく調製する。これらの配列を以下に示す：
【０２３８】
【表７】
2007020568.tif 000008
【０２３９】
工程-１-Ｍ１３捕捉配列の付着
この工程には、アミン活性化高架橋(２６％)ポリアクリルアミド表面またはポリカーボネート(５-１０ｎｍ)多孔性膜表面の２００μｍ超微細位置を有するＡＰＥＸ試験装置を用いる。
【０２４０】
Ｍ１３-Ｃ１捕捉配列は、３'-リボヌクレオチドを含有する３１重体のＤＮＡオリゴヌクレオチドである。Ｍ１３-Ｃ１配列は、Ｍ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ８一本鎖(＋)ベクターの３'-末端に相補的である。Ｍ１３-Ｃ１捕捉配列は、全ての非切断Ｍ１３ベクターにハイブリダイズし、強く結合するように設計されている。
【０２４１】
Ｍ１３-Ｃ２配列は、３'-リボヌクレオチドを含有する３１重体 オリゴヌクレオチドである。Ｍ１３-Ｃ２は、ＸｂａＩ制限部位を含有するクローニング部位から上流のＭ１３配列の部位に相補的である。Ｍ１３-Ｃ２捕捉配列は、ＸｂａＩ切断Ｍ１３断片にハイブリダイズし、強く結合するように設計されている。Ｍ１３-Ｃ１およびＭ１３-Ｃ２捕捉配列は、ＡＰＥＸ超微細位置上のアミン誘導体にカップリングさせるために、行列酸化によって活性化する。３'リボヌクレオチド末端は、第一級アミンと反応してシフ塩基を形成できる行列酸化によって末端アルデヒドに転化される。
【０２４２】
反応条件は以下の通り：
１０-２０Ｏ.Ｄ.のＭ１３-Ｃ１またはＭ１３-Ｃ２オリゴマーを水中に溶解して最終濃度１ＯＤ/μlとする。０.１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５.２を１容量、および０.４５Ｍ行列ナトリウム塩(水中に新たに作製)を１容量添加する。暗所下、常温にて少なくとも２時間、撹拌しインキュベート反応する。０.１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７.４で平衡化したセファデックスＧ-１０カラム(パスツール・ピペット、０.６×５.５ｃｍ)に反応混合物を負荷する。２００μl画分を採取し、アリコット２μlを薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)上にスポットし、紫外線(ＵＶ)吸収画分を保存する。
【０２４３】
ＡＰＥＸ試験デバイスの４上面は、アドレス可能な超微細位置ＭＬ-１、ＭＬ-２、ＭＬ-３およびＭＬ-４と示される。
【０２４４】
Ｍ１３-Ｃ１は、以下の工程によってＭＬ-１およびＭＬ-２超微細位置に共有結合する：
上部および下部貯蔵器を０.１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７.４で満たし、バイオラド(ＢioＲad)５００/１０００電力供給機を用いて０.０５ｍＡ定電流で５分間プレ作動される。〜０.１Ｏ.Ｄ.単位の行列酸化Ｍ１３-Ｃ１オリゴヌクレオチドを含有する電子工学的デリバリーシステムのチップを下部貯蔵器に設置する。電子工学的デリバリーシステムは、白金電極内側において特異的に修飾したプラスティック・ピペットチップである。０.１ｍＡにて、電子工学的デリバリーシステムは負(−)に偏倚されており、超微細位置ＭＬ-１およびＭＬ-２は正(＋)に偏倚されている。Ｍ１３Ｃ-１は、定電流にて２分間ＭＬ-１およびＭＬ-２に電気泳動し、そこで表面と共有結合する。反応しなかったＭ１３-Ｃ１をＭＬ-１およびＭＬ-２超微細位置から除去されるように、４分間極性を反転させる。
Ｍ１３Ｃ-２配列は、前記と同一の工程で、ＭＬ-３およびＭＬ-４超微細位置に結合する。
【０２４５】
工程 ２-Ｍ１３ベクター、相補的配列、および蛍光性レポーター・プローブのハイブリダイゼーション
制限エンドヌクレアーゼは切断するために二本鎖ＤＮＡを必要とするため、一本鎖Ｍ１３ｍｐ１８のクローニング/制限部位セグメント(６２４０〜６２８０)およびＭ１３ｍｐ８(６２３０〜６２７０)は相補的ＤＮＡ配列とハイブリダイズしなければならない。電子工学的ハイブリダイゼーションを用いて、各々、４０重体相補的断片(ＭＰ１８-４０Ｃ配列)をＭＬ-１/Ｍ１３Ｃ-１超微細位置上のＭ１３ｍｐ１８ベクターにハイブリダイズさせ；４０重体相補的断片(ＭＰ８-４０Ｃ配列)をＭＬ-２/Ｍ１３Ｃ-１超微細位置上のＭ１３ｍｐ８ベクターにハイブリダイズさせた。
【０２４６】
電子工学的ハイブリダイゼーションは、０.１ｍＡにて２分間、０.０５Ｏ.Ｄ.単位のＭ１３ｍｐ１８を含有する電子工学デリバリーシステムを負(−)に偏倚させ、かつＭＬ-１/ＭＰ１３Ｃ-１超微細位置を正(＋)に偏倚させることによって行う。極性を４分間反転させ、ハイブリダイズしなかったＭ１３ｍｐ１８を超微細位置から除去する。同一の工程を用いて、Ｍ１３ｍｐ８ベクターをＭＬ-１/Ｍ１３Ｃ-１超微細位置に電子工学的にハイブリダイズさせる。
【０２４７】
次いで、Ｍ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ８配列を、２種の異なる蛍光レポーター・プローブと電子工学的にハイブリダイズさせる。ＭＬ-１/Ｍ１３Ｃ-１超微細位置上のＭ１３ｍｐ１８ベクターは、２４重体テキサス・レッド標識レポーター・プローブ(ＭＰ１８-Ｒ１配列)と電子工学的にハイブリダイズさせ、これはクローニング/制限部位の５'-末端にハイブリダイズする。Ｍ１３ｍｐ８ベクターは、２４重体フルオレセイン標識レポーター・プローブ(ＭＰ８-Ｒ２配列)と電子工学的にハイブリダイズさせ、これはクローニング/制限部位の５'-末端にハイブリダイズする。
【０２４８】
工程-３-ＸｂａＩ制限酵素を用いたＭ１３ｍｐ１８ベクターの制限切断
それらの等電点(ｐＩ)に依存して、ｐＨ５-９の範囲で、多くの蛋白質および酵素を負(ｐＨ＞ｐＩ)に、中性(ｐＨ＝ｐＩ)に、または正(ｐＨ＜ｐＩ)に荷電させることができる。数多くの制限エンドヌクレアーゼは、６-７の範囲内にｐＩを有する。ｐＩより高いｐＨでは、これらの酵素は負の電荷を運んでいるであろう。従って、ｐＨ＞７の緩衝溶液中で自由フィールド電気泳動を行う場合、これらの酵素は正に荷電した超微細位置に移動するであろう。
【０２４９】
制限エンドヌクレアーゼのような多くのＤＮＡ修飾酵素の場合、迅速な電気泳動移動度と最適酵素活性とが釣り合うｐＨを供する緩衝溶液を選択するのが常に望ましい。ある場合においては、ｐＩより上およびそれより以下の両方の合理的酵素活性を有することが可能である。これらの酵素は、選択したｐＨに応じて、正または負のいずれかに偏倚した超微細位置に向かって移動することがきる。
【０２５０】
ＭＬ-１におけるＭ１３ｍｐ１８ベクターのＸｂａＩ切断は以下のように行う。電子工学デリバリー・システムを用いて、最初にＸｂａＩエンドヌクレアーゼをＭＬ-１/Ｍ１３ｍｐ１８超微細位置まで自由フィールド電気泳動させる。０.１ｍＡにて２分間、ｐＨ７.６の緩衝液中に１００ユニットのＸｂａＩを含有する電子工学デリバリー・システムを負に偏倚させ、ＭＬ-１/Ｍ１３ｍｐ１８超微細位置を正に偏倚させる。次いで、電流を０.０２ｍＡに３分間低下させる。電子工学デリバリー・システムは切るが、０.１ｍＡにて５分間、ＭＬ-１/Ｍ１３ｍｐ１８超微細位置は負に偏倚させ、ＭＬ-３/Ｍ１３Ｃ-２超微細位置は正に偏倚させる。今度は、Ｘｂａ１およびハイブリダイズしなかった断片をＭＬ-３/Ｍ１３Ｃ-２超微細位置から除去するために、ＭＬ-３/Ｍ１３Ｃ-２超微細位置を負に偏倚させ、電子工学デリバリー・システムを切り、０.１ｍＡにて２分間正に偏倚させる。
【０２５１】
エピ蛍光顕微鏡による観察は、ＭＬ-１/Ｍ１３ｍｐ１８超微細位置における赤色蛍光シグナルの消失、およびＭＬ-３/Ｍ１３Ｃ-２超微細位置における赤色蛍光シグナルが存在することを示し、Ｍ１３ｍｐ１８ベクターがＸｂａＩ切断されたことを証明している。同一の基本ＸｂａＩ切断法を今度は、負対照として供する、ＭＬ-２/Ｍ１３ｍｐ８超微細位置について繰り返す。Ｍ１３ｍｐ８ベクターはＸｂａＩ部位を有していないため、断片の切断および生成は不可能である。かくして、ＭＬ-２/Ｍ１３ｍｐ１８超微細位置はその緑色蛍光シグナルを維持するが、ＭＬ-４/Ｍ１３Ｃ-２超微細位置では蛍光シグナルは全く認められない。
【０２５２】
第二の実施例には、デバイス上のアドレス可能な超微細位置に共有結合する制限酵素で行う制限切断反応が含まれる。この場合において、制限エンドヌクレアーゼは誘導化され、ＡＰＥＸデバイス上のアドレス可能な超微細位置まで自由フィールド電気泳動され、そこでそれらは共有結合するであろう。制限酵素を固形指示体に誘導化させ、共有結合させる方法は当業者に知られている。種々の異なる制限酵素をＡＰＥＸデバイスにアドレスすることができた。特異的切断反応は、自由フィールド電気泳動を用いて、所望の制限エンドヌクレアーゼを含有する超微細位置にｄｓ-ＤＮＡベクターまたはＤＮＡ試料を濃縮することによって行われるであろう。ｄｓ-ＤＮＡを切断し、次いでデバイス上の他の超微細位置まで断片を移動させる。その際に、所望の、または有用な他のＤＮＡ修飾酵素をＡＰＥＸ・デバイス上のアドレス可能な超微細位置にカップリングすることができる。また、この実施例はＤＮＡ修飾酵素に限定するものではなく、大部分の他の酵素をＡＰＥＸ・デバイス上のアドレス可能な超微細位置に付着させることができる。
【０２５３】
実施例１２：  電子工学増幅法
標的配列のコピー数が非常に少ない場合(例えば、ＨＩＶ、敗血症感染、他)には、精製標的ＤＮＡおよび/またはＲＮＡを直接的にＡＰＥＸ・デバイス上で増幅させることによって、標的ＤＮＡ配列の複製または増幅により感度を改善することができるであろう。また、増幅によって、ハイブリダイゼーション分析を行う前に非常に高収率の分取工程を行う必要性も減じられるであろう。
【０２５４】
ＡＰＥＸ増幅プロトコールによって、ＤＮＡ運動、変性および合成反応の完全な電子工学的制御が提供される。最も重要なことは、高温の使用または高熱耐性ポリメラーゼまたは他の熱安定性酵素を使用することなく、ＤＮＡハイブリッドを電子工学的に変性させることである。
【０２５５】
第一の実施例として、ＤＮＡポリメラーゼ(大きな方のクレノー断片)を用い、かつ熱サイクルの必要性なしに、ＤＮＡ合成を非常に忠実に行うことができる。この実施例においては、超微細位置に共有結合させたままの方法で１本のＤＮＡ鎖が複製される。この工程は、以下の様式で行う：１）アドレスされた超微細位置上の公知の配列の捕捉プローブに公知の標的配列を電子工学的にハイブリダイズさせ、２）捕捉プローブにより鋳型化されたＤＮＡポリメラーゼ鋳型化によって発生しようとする相補的ＤＮＡ鎖(−)を合成を行い、３）新たに合成したＤＮＡハイブリッドを電子工学的に変性させ、４）標的ＤＮＡを非-伸長捕捉プローブにアニーリングさせ、−鎖相補的プローブを発生しようとしている−鎖ＤＮＡにアニーリングさせ、５）発生しようとしている標的ＤＮＡ(＋)鎖をＤＮＡポリメラーゼによって合成し、２と同様に−鎖ＤＮＡを同時に合成し、それによって＋および−鎖の数を倍加させ、各回にこの工程を繰り返し、次いで６）特異的に設計した相補的プローブにハイブリダイズさせることによって増幅標的をサイズ選択する。図１７に示す完全な工程を以下にさらに詳細に記載する：
【０２５６】
工程１）捕捉プローブへの標的配列の付着
標的配列を(１)共有結合した捕捉プローブを含有する超微細位置に光電子工学的に輸送する。標的配列は、非-標的(ゲノム)配列中に存在するかもしれないが、アニーリングっせてプローブを捕捉する前に変性させなければならない。最初に捕捉されるであろう標的配列は種々の長さであろう。
【０２５７】
工程２）標的に相補的なＤＮＡの合成
ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰを超微細位置１に光電子工学的に輸送する。捕捉プローブはＤＮＡポリメラーゼに３'末端を、捕捉標的配列は鋳型を提供する。合成に影響を受けやすい試薬の濃度を維持するのに十分な電流を流す。電流は定電流または変調電流とすることができる。これらの指標を操作すれば、異なった範囲の長さの発生しようとする相補的(−)鎖を得ることができる。
【０２５８】
工程３）新たに合成した鎖の電子工学的変性
超微細位置１の極性を反転させ、電位をかけて２本鎖を分離させる。電位およびかけた時間の量は、ハイブリッドＤＮＡ複合体の長さおよび塩基組成に依存するであろう。これらの指標は、経験的、または電子工学変性曲線から計算して決定することができる。
【０２５９】
工程４）プライマー(捕捉および相補的プローブ)のＤＮＡ鎖へのアニーリング＋および−ＤＮＡ鎖の両方にアニーリングさせてＤＮＡポリメラーゼ用のプライマーを得るにはオリゴが必要である。標的または＋鎖については、このことを非-伸長捕捉プローブまでの＋鎖の電子工学的輸送によって達成される。このことにより、過剰に伸長し、共有結合した−鎖ＤＮＡと同じくらいの長さの非-伸長捕捉プローブを発生させるであろう。相補的プローブを超微細位置まで電気泳動して−鎖ＤＮＡに共有結合させる。今度は、＋および−の両方の鎖がそれらに結合するプライマーを有し、合成を触媒する鋳型ＤＮＡポリメラーゼである(図参照)。
【０２６０】
相補的プローブの結合性は非共有結合−鎖ＤＮＡで発生させることもできるが、これらのハイブリッドは電子工学的に変性され、それ故全体的な増幅にはほとんど影響を有してはならない。
【０２６１】
工程５）２本の新しいＤＮＡ鎖の合成
工程２を繰り返し、＋および−鎖が鋳型形成を開始した時から、配列特異的ＤＮＡの量は倍加する。ＤＮＡ量におけるこの幾何学的増加は、繰り返したこれらの工程の各回で起こるであろう。
【０２６２】
工程６）増幅標的配列のサイズ選抜
相補的プローブのヌクレオチド配列は、増幅標的ＤＮＡのサイズおよび配列を決定するであろう。従って、増幅ＤＮＡは慣例設計して、二次分析および/または操作の効率の向上させることができる。
【０２６３】
他の酵素を本発明の増幅法用いることができ、それらには、限定するものではないが、他のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＤＮＡリガーゼおよびポリヌクレオチド・ホスホリラーゼ、ならびに他の核酸修飾酵素(エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、他)との組合せが含まれる。
【０２６４】
実施例１３：電子工学コントローラーおよびデータ・システム
ＡＰＥＸ・チップまたはマイクロマシーン加工デバイスのいずれであろうと、全てのデバイスは、超微細位置(またはマクロ-位置)のアドレス可能なアレイの性質であろう。コンピューター・コントロール/データ収集システムは、電子工学電位をアレイ中のいずれのパッドにも独立して流せるよう、微細位置-電極システムを結果として流れた電流が測定されるように設計されている。コンピューター制御/データ収集インターフェースによって：
ａ）超微細位置のアレイの表示
高いレベルおよび低いレベルの表示によって、最も高いレベルにおける遮断を解決するために、および低いレベルにおける超微細位置の遮断を十分に解決するために、全超微細位置の図が提供される。
ｂ）超微細位置上をクリックすると超微細位置の特性を説明する超微細位置のウインド図が立ち上がり、種々の形態、電位の大きさおよび様子の信号の時間配列他、他の超微細位置のものに重複する制御配列の表示、他で超微細位置の制御が設定できるであろう。また、該システムは、他の超微細位置を形成するデータとの統計学および比較で超微細位置につき収集したデータおよび信号も表示する。一覧表によって、制御設計、認められた実際の制御信号および収集したデータについての解析、分類システムおよび保管文書機能が提供される。
【０２６５】
ｃ）ソフトウェアによって、ｂ）に記載したアレイ制御ソフトウェアからのインプットによって制御されるハードウェア・インターフェイスを通して全てのスイッチングおよびデータ収集が提供される。
ｄ）別々のハードウェアおよびソフトウェアシステムによって、イメージ収集および処理能力が提供される。このシステムは、超微細位置のアレイを映し、活性超微細位置におけるＤＮＡ結合相互作用からの蛍光信号を記録して、ＤＮＡ結合実験の結果を読み出す。イメージ処理ソフトウェアによって、これらのイメージを定量的に処理し、定量的なアッセイ結果を抽出することができる能力が提供される。このソフトウェアは、アレイ制御/データ収集ソフトウェアと完全にインターフェースで接続されており、ＡＰＥＸデバイス制御/電極の電流データおよびイメージング・データからのアッセイ結果を全て記録する集中システムを提供し、該データを解析してこれらの結果の整合性および信頼性に関する補助的な情報と一緒にアッセイに関する結果を減少させて、全てのデータおよび解析を保管する。
ｅ）ＡＰＥＸコントローラーには、このソフトウェア、および「アッセイ中」および「結果」の表示のみを提供する上層と、要すればａ）ないしｃ）の機能にアクセスするボタンが組み込まれるであろうが、ａ）ないしｃ）は全ての場合において収集され、保管されるであろう。
【０２６６】
ｆ）開発対象に用いるべき初期バージョンのコントローラーはホスト・コンピュータとしてマッキントッシュ・クアドラ(Ｍacintosh Ｑuadra)９５０を用い、該クアドラ９５０と接続したナショナル・インスツルメンツ(Ｎational Ｉnstruments)ボードを用いて前記のハードウェア・インターフェースを提供する。これらのボードは種々の電流をＡＰＥＸ超微細位置に流し、結果として電極システムを流れる電位を測定する。このコントローラーで用いるナショナル・インスツルメンツ(Ｎational Ｉnstruments)ボードは、ハイ・レソルーション・マルチファンクション(Ｈigh Ｒesolution Ｍultifunction)Ｉ/Ｏボード、ＮＢ-ＭＩＯ-１６ＸＬ-１８、アナログ・アウトプット(Ａnalog Ｏutput)・ボード、ＮＢ-ＡＯ-６、タイミング・インプット/アウトプット(Ｔiming Ｉnput/Ｏutput)・ボード、ＮＢ-ＴＩＯ-１０、ブロック・モード(Ｂlock Ｍode)ＤＭＡ・アンド・ＧＰＩＢインターフェイス(Ｉnterface)・ボード、ＮＢ-ＤＭＡ２８００、ならびにアナログ・シグナル・コンディショニング・モジュール(Ａnalog Ｓignal Ｃonditioning Ｍodules)・ボードおよび熱電対用のモジュール、ならびに他の環境センサー５ｂシリーズである。クアドラ中のＮuＢusボードおよびＡＰＥＸデバイス間の接続は、ＳＣＸＩ-１００１フレームに収められたＳＣＸＩ １６-チャンネルＳＰＤＴリレイ・モジュール・ボードを通されるであろう。
【０２６７】
実施例１４：  電子工学制御試料の調製およびハイブリダイゼーション分析-集中ＡＰＥＸシステム
試料調製には、通常細胞の選抜；細胞性物質の破砕(例えば、消化)、ならびに一連の分離工程および親和性反応が含まれる。試料調製は、分子生物学的反応にとって重要である。例えば、試料調製工程における非効率により実際の標的ＤＮＡ配列量が多量に失われるため、ハイブリダイゼーション・アッセイはしばしば制限される。
【０２６８】
電子工学制御の基本的なＡＰＥＸ概念は、ＤＮＡハイブリダイゼーション・アッセイにおける試料調製に用いることができる。電子工学的な方法によって、ＡＰＥＸ部品の活性な電子工学システム上で行うべき試料調製、細胞選抜および分析が可能であろう。試料調製は、細胞の選抜および消化、ならびに試料中の細胞性および異質の物質からのＤＮＡの粗分離で開始するであろう。電子工学的デバイスは、該試料ＤＮＡを電子工学的に処理して、他の物質を除去しつつ、デバイスの分析部品に向けて効率的に移動させる。該システムは、標的ＤＮＡの効率的加工用の適当なスケーリング因子を提供する。ヒトゲノム解析について、電子工学的試料調製には、大部分の非-特異的ＤＮＡが標的ＤＮＡから分離されるであろう高効率プレ-ハイブリダイゼーション工程が含まれるであろう。
【０２６９】
試料調製については、集中デバイスまたは完全ＡＰＥＸシステムは、相対的に粗試料(血液、痰、尿他)を採取し、最小限の機械的操作および流体工学でそれを処理し、次いで標的ＤＮＡを該デバイスの分析部品に電子工学的にデリバリーする。この「活性電子工学加工」は、一般的には手動の工程および技術の機械的バージョンである自動制御またはロボティクス加工とは異なる。
【０２７０】
ＤＮＡ試料調製および分析のための集中ＡＰＥＸ・システムは、全て一般ＡＰＥＸ概念に基づく多数の部品を用いて加工することができる。システムの構成要素には(１)電子工学細胞セレクター・ユニット；(２)電子工学試薬調剤ユニット；(３)電子工学不要の一回使用ユニット；(４)粗ＤＮＡセレクター・ユニット;(５)第二ＤＮＡまたは制限断片セレクター・ユニット；(６)ＤＮＡ断片保存ユニット；および(７)ＡＰＥＸ分析ユニット(チップ)が含まれる。集中ＡＰＥＸシステムを図１８に示す。
【０２７１】
かかるシステムは、大きなケイ素ウェハー上に加工することができる。別法として、個々の構成要素は、微細リソグラフィーまたはマイクロマシーン加工技術によって加工でき、特別に設計したプラットフォームユニットを配置する(例えば、接続する)ことができる。完全なシステムの構成要素は、それらの有効領域が相対的な試料のサイズおよび(細胞のごとき)該試料中の物質の量に対して一定の比率で拡大(縮小)されるように設計されている。例えば、セル・ソーター有効領域は、一般的に粗ＤＮＡセレクター有効領域よりも大きいであろうし、次ぎにそれは制限断片ＡＰＥＸ分析チップ有効領域よりも大きいであろうし、ＡＰＥＸチップ有効領域よりも大きいであろう。
【０２７２】
実施例として、該セル・ソーター「有効面積」は数ｃｍ２のオーダーとすることができるが、６４超微細位置ＡＰＥＸ分析構成要素についての合計「有効面積」は１ｍｍ２未満であろう。プラットフォーム・ユニットは、密閉共通緩衝液貯蔵器中の全ての構成要素ユニットを支持するように設計されている。数百μlにのぼる適当な試料は、セルセレクター構成要素付近の試料添加口を通して該システムに添加する。セル・セレクター構成要素は、異なる細胞型につき１またはそれを超える選択親和性を有することができる大きなスケールのＡＰＥＸデバイスである。これらの親和性の選択は、細胞表面電荷、ハプテンおよび抗原に基づいて行うことができる。
【０２７３】
実施例として、全血液試料の親和性選択は、白血球細胞(リンパ球、他)を赤血球細胞から選択することができる。高い選択工程を用いて、肉体的血液試料から胎児細胞を選択することができる。また、感染性微生物(公募、カビ、最近およびウイルス)について親和性選択をすることもできる。選択された細胞がセル・セレクター構成要素付着して残るのに対して；全ての他の細胞および蛋白質物質は消費一回使用ユニットに輸送される。この時点で、荷電した洗浄剤、および/またはカオトロピック剤、および/または適当な消化酵素および蛋白質分解酵素(リゾチーム、プロテインキナーゼＫ、ペプシン、他)の電子工学試薬調剤ユニットからセル・セレクター・ユニット上の細胞までの自由フィールド電気泳動輸送によって細胞を消化することができる。電子工学消費一回使用システムを適当に偏倚させることによって、ある種の消化消費物質を除去することができる。粗ＤＮＡセレクター・ユニットを正に偏倚させることによって、今度はこの構成要素まで粗核酸(ＤＮＡ/ＲＮＡ)物質を輸送することができる。
【０２７４】
粗ＤＮＡセレクターは、ＤＮＡに対して一般的な親和性を有するＡＰＥＸデバイスである。この親和性は、正に荷電した表面、または共通または反復性のＤＮＡ配列を含有する表面である。例えば、Ａｌｕ繰り返し捕捉配列は、ヒト細胞から抽出した大部分の粗ＤＮＡを効率的に捕捉するであろう。感染症分析が対象である場合には、共通または属に共通の細菌またはウイルス配列を用いることができる。ＤＮＡから外来物質を除去することに加えて；該ＡＰＥＸ・システムは、試料ＤＮＡの複合性を減少させるようにも設計されている。このことは、制限酵素を用いて、粗ＤＮＡセレクター・ユニットでＤＮＡを選択的に切断することによって達成することができる。該制限酵素は、試薬調剤ユニットから輸送される。切断制限断片は、今度は、それを正に偏倚することによって、第二ＤＮＡまたは制限断片セレクター・ユニットから輸送される。このユニットは、その表面上の適当な捕捉配列を用いて、大きな断片のＤＮＡに選択的に結合するように設計されている。
【０２７５】
この時点で、選択されたＤＮＡ断片は、ハイブリダイゼーション分析のためにＡＰＥＸ分析チップまで輸送される。また、ＤＮＡ断片は貯蔵ユニット、あるいはシステムの外部にさえ輸送することができる。前記の実施例は、試料調製および複数ハイブリダイゼーション分析に可能なシナリオのほんの幾つかを示している。構成要素の結合親和性がプログラム可能なこと、および結合した異なる構成要素および機能の融通性によって、広範な種々の工程を行うことができる。
【０２７６】
ＤＮＡを第一の例として用いたが、前記のデバイスおよび方法は、標的ＲＮＡ分子、蛋白質、多糖、脂質および他の巨大分子の加工および分析にも用いることができる。
【０２７７】
各刊行物に掲載されている核酸配列およびアミノ酸配列を含む、参照した全ての刊行物は出典明示して本明細書の一部とみなす。
他の具体例も以下の請求の範囲の範囲内である。
【０２７８】
配  列  表
(１)一般情報：
(ｉ)出願人：      マイケル・ジェイ・ヘラー(Ｍichael Ｊ.Ｈeller)
ユージン・チュー(Ｅugene Ｔu)
グレン・エイ・エバンス(Ｇlen Ａ.Ｅvans)
ロナルド・ジイ・ソスノウスキー(Ｒonald Ｇ.Ｓosnoeski)
(ｉｉ)発明の名称：分子生物学的分析および診断用の自己アドレス指定可能な超小型電子システムおよびデバイス
(ｉｉｉ)配列の数：４５
(ｉｖ)通信住所：
(Ａ)受信人：              ライオン・アンド・ライオン(Ｌyon & Ｌyon)
(Ｂ)通り：                ウエスト・シックスス・ストリート６１１番
(Ｃ)都市：                ロスアンゼルス
(Ｄ)州：                  カリフォルニア州
(Ｅ)国籍：                合衆国
(Ｆ)郵便番号：            ９００１７
(ｖ)コンピューター判読形式：
(Ａ)媒体の型：              ３.５'ディスケット、１.４４Ｍｂ保存
(Ｂ)コンピューター：        ＩＢＭコンパチブル
(Ｃ)オペレーティング・システム：ＩＢＭ Ｐ.Ｃ.ＤＯＳ(バージョン５.０)
(Ｄ)ソフトウェア：          ワードパーフェクト(バージョン５.１)
(ｖｉ)最新出願データ：
(Ａ)出願番号：            ０８/２７１,８８２
(Ｂ)出願日：              １９９４年７月７日
(Ｃ)分類：
(ｖｉｉ)先の出願データ：
(Ａ)出願番号：            ０８/１４６,５０４
(Ｂ)出願日：              １９９３年１１月１日
(ｖｉｉｉ)代理人/代理事務所情報：
(Ａ)氏名：                マーフィー,デイビッド・ビイ
(Ｍurphy,Ｄavid Ｂ.)
(Ｂ)登録番号：            ３１,１２５
(Ｃ)参照/ファイル番号     ２０７/２６３
(ｉｘ)電信電話通信情報：
(Ａ)電話番号：            (２１３)４８９-１６００
(Ｂ)ファックス番号：      (２１３)９５５-０４４０
(Ｃ)テレックス番号：      ６７-３５１０
【０２７９】
(２)配列番号：１に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              ２４
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：１：
【０２８０】
【表８】
2007020568.tif 000009
【０２８１】
(２)配列番号：２に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              ２１
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：２：
【０２８２】
【表９】
2007020568.tif 000010
【０２８３】
(２)配列番号：３に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              ３４
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：３：
【０２８４】
【表１０】
2007020568.tif 000011
【０２８５】
(２)配列番号：４に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              ２０
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：４：
【０２８６】
【表１１】
2007020568.tif 000012
【０２８７】
(２)配列番号：５に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              ２０
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：５：
【０２８８】
【表１２】
2007020568.tif 000013
【０２８９】
(２)配列番号：６に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              １８
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：６：
【０２９０】
【表１３】
2007020568.tif 000014
【０２９１】
(２)配列番号：７に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              ２０
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：７：
【０２９２】
【表１４】
2007020568.tif 000015
【０２９３】
(２)配列番号：８に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              １８
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：８：
【０２９４】
【表１５】
2007020568.tif 000016
【０２９５】
(２)配列番号：９に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              ２２
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：９：
【０２９６】
【表１６】
2007020568.tif 000017
【０２９７】
(２)配列番号：１０に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              ２０
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：１０：
【０２９８】
【表１７】
2007020568.tif 000018
【０２９９】
(２)配列番号：１１に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              ２０
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：１１：
【０３００】
【表１８】
2007020568.tif 000019
【０３０１】
(２)配列番号：１２に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              ２０
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：１２：
【０３０２】
【表１９】
2007020568.tif 000020
【０３０３】
(２)配列番号：１３に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              ２０
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：１３：
【０３０４】
【表２０】
2007020568.tif 000021
【０３０５】
(２)配列番号：１４に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              １８
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：１４：
【０３０６】
【表２１】
2007020568.tif 000022
【０３０７】
(２)配列番号：１５に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              １８
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：１５：
【０３０８】
【表２２】
2007020568.tif 000023
【０３０９】
(２)配列番号：１６に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              １９
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：１６：
【０３１０】
【表２３】
2007020568.tif 000024
【０３１１】
(２)配列番号：１７に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              ３３
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：１７：
【０３１２】
【表２４】
2007020568.tif 000025
【０３１３】
(２)配列番号：１８に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              １９
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：１８：
【０３１４】
【表２５】
2007020568.tif 000026
【０３１５】
(２)配列番号：２０に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              １９
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：２０：
【０３１６】
【表２６】
2007020568.tif 000027
【０３１７】
(２)配列番号：２１に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              １７
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：２１：
【０３１８】
【表２７】
2007020568.tif 000028
【０３１９】
(２)配列番号：２２に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              １９
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：２２：
【０３２０】
【表２８】
2007020568.tif 000029
【０３２１】
(２)配列番号：２３に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              １７
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：２３：
【０３２２】
【表２９】
2007020568.tif 000030
【０３２３】
(２)配列番号：２４に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              ２１
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：２４：
【０３２４】
【表３０】
2007020568.tif 000031
【０３２５】
(２)配列番号：２５に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              １９
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：２５：
【０３２６】
【表３１】
2007020568.tif 000032
【０３２７】
(２)配列番号：２６に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              １９
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：２６：
【０３２８】
【表３２】
2007020568.tif 000033
【０３２９】
(２)配列番号：２７に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              １９
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：２７：
【０３３０】
【表３３】
2007020568.tif 000034
【０３３１】
(２)配列番号：２８に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              ３０
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：２８：
【０３３２】
【表３４】
2007020568.tif 000035
【０３３３】
(２)配列番号：２９に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              ３０
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：２９：
【０３３４】
【表３５】
2007020568.tif 000036
【０３３５】
(２)配列番号：３０に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              １５
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：３０：
【０３３６】
【表３６】
2007020568.tif 000037
【０３３７】
(２)配列番号：３１に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              １５
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：３１：
【０３３８】
【表３７】
2007020568.tif 000038
【０３３９】
(２)配列番号：３２に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              １５
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：３２：
【０３４０】
【表３８】
2007020568.tif 000039
【０３４１】
(２)配列番号：３３に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              ３０
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：３３：
【０３４２】
【表３９】
2007020568.tif 000040
【０３４３】
(２)配列番号：３４に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              ２９
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：３４：
【０３４４】
【表４０】
2007020568.tif 000041
【０３４５】
(２)配列番号：３５に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              ２２
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：３５：
【０３４６】
【表４１】
2007020568.tif 000042
【０３４７】
(２)配列番号：３６に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              ２２
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：３６：
【０３４８】
【表４２】
2007020568.tif 000043
【０３４９】
(２)配列番号：３７に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              ？
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：３７：
【０３５０】
【表４３】
2007020568.tif 000044
【０３５１】
(２)配列番号：３８に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              ７
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：３８：
【０３５２】
【表４４】
2007020568.tif 000045
【０３５３】
(２)配列番号：３９に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              ７
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：３９：
【０３５４】
【表４５】
2007020568.tif 000046
【０３５５】
(２)配列番号：４０に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              ３１
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：４０：
【０３５６】
【表４６】
2007020568.tif 000047
【０３５７】
(２)配列番号：４１に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              ３１
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：４１：
【０３５８】
【表４７】
2007020568.tif 000048
【０３５９】
(２)配列番号：４２に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              ４０
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：４２：
【０３６０】
【表４８】
2007020568.tif 000049
【０３６１】
(２)配列番号：４３に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              ４０
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：４３：
【０３６２】
【表４９】
2007020568.tif 000050
【０３６３】
(２)配列番号：４４に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              ２４
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：４４：
【０３６４】
【表５０】
2007020568.tif 000051
【０３６５】
(２)配列番号：４５に関する情報：
(ｉ)配列の特性：
(Ａ)配列の長さ：                              ２４
(Ｂ)配列の型：                                核酸
(Ｃ)鎖の数：                                  一本鎖
(Ｄ)トポロジー                                直鎖状
(ｉｉ)配列：配列番号：４５：
【０３６６】
【表５１】
2007020568.tif 000052
【図面の簡単な説明】
【０３６７】
【図１】図１はマイクロリソグラフィー技術を用いて作製した３つの自己アドレス指定可能な超微細-位置の断面図である。
【図２】図２はマイクロリソグラフ的に作製した超微細-位置の断面図である。
【図３】図３は実際に作製し、オリゴヌクレオチドでアドレス指定し、試験した自己アドレス指定可能な６４の超微細-位置チップの模式図である。
【図４】図４は特異的なオリゴヌクレオチドを超微細-位置の付着表面に迅速に共有結合させる特定の付着化学過程を示している。
【図５】図５は超微細-機械加工した９６の超微細-位置デバイスの引き延ばしたダイアグラムである。
【図６】図６は超微細-機械加工したデバイスの断面図である。
【図７】図７は特定の超微細-位置で分析物または反応分子を電子工学的に濃縮するのに使用するデバイスの機構を示している。
【図８】図８は３つの特異的オリゴヌクレオチド結合物質(ＳＳＯ-Ａ、ＳＳＯ-ＢおよびＳＳＯ-Ｃ)を有するデバイスの自己指定された組立てを示している。
【図９】図９は特異的ＤＮＡ捕捉配列を含有する超微細-位置で濃縮される試料/標的ＤＮＡの電子工学的に制御されたハイブリダイゼーション工程を示している。
【図１０】図１０は電子工学的に指定された逐次ハイブリダイゼーション工程を示している。
【図１１】図１１は単一の点突然変異を決定するハイブリダイゼーション工程の電子工学的な厳格制御(ＥＳＣ)を示している。
【図１２】図１２は標識ＤＮＡプローブを用いることなく、すなわち電子工学的に制御された蛍光染料検出プロセスによって、ハイブリダイズしたＤＮＡを検出するスキームを示している。
【図１３】図１３はデバイスの電子工学的に制御された複製のスキームを示している。
【図１４】図１４はオリゴヌクレオチドの電子工学的に指向された組合せ合成のスキームを示している。
【図１５】図１５は電子工学的な厳格制御および従来技術を用いて行った１５重体Ｒａｓ１２点突然変異ハイブリダイゼーションの結果を比較するグラフを示す。
【図１６】図１６はＤＮＡの電子工学的に制御制限断片切断のスキームを示している。
【図１７】図１７はＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡの電子工学的に制御された増幅のスキームを示している。
【図１８】図１８は試料調製およびＤＮＡ分析を行うよう設計したＡＰＥＸデバイスのダイアグラムを示している。
【図１】
2007020568.tif 000053
【図２】
2007020568.tif 000054
【図３】
2007020568.tif 000055
【図４】
2007020568.tif 000056
【図５】
2007020568.tif 000057
【図６】
2007020568.tif 000058
【図７】
2007020568.tif 000059
【図８】
2007020568.tif 000060
【図９】
2007020568.tif 000061
【図１０】
2007020568.tif 000062
【図１１】
2007020568.tif 000063
【図１２】
2007020568.tif 000064
【図１３】
2007020568.tif 000065
【図１４】
2007020568.tif 000066
【図１５】
2007020568.tif 000067
【図１６】
2007020568.tif 000068
【図１７】
2007020568.tif 000069
【図１８】
2007020568.tif 000070
【配列表】
2007020568000001.app