(57)【要約】【課題】魚類において、対象とする抗原に特異的な抗体を検出する方法及びＩｇ重鎖抗体の提供。【解決手段】魚類において、対象とする抗原に特異的な抗体を、該抗体のＩｇ重鎖にさらに特異的な抗体と結合させることで検出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚類において、対象とする抗原に特異的な抗体を検出する方法。
【請求項２】
次の１）〜３）の工程を含む、請求項１に記載の方法。
１）魚類に対象とする抗原を曝露する工程
２）魚類において該抗原に対する特異的な抗体を産生させる工程
３）該抗原に特異的な抗体を検出する工程
【請求項３】
該抗原に特異的な抗体を検出する工程が、Ｉｇ重鎖抗体を用いることによって検出するものである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該抗原に特異的な抗体がＩｇＭである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該抗原に特異的な抗体を検出する工程が、次の４）及び５）の工程を含むものである請求項４に記載の方法。
４）対象とする抗原を結合した不溶性担体と該抗原に特異的な抗体（１次抗体）とを反応させる工程
５）該抗原に特異的な抗体（１次抗体）とＩｇ重鎖抗体（２次抗体）とを反応させる工程
【請求項６】
さらに、Ｉｇ重鎖抗体に特異的な標識抗体（３次抗体）を反応させる工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該抗原に特異的な抗体がモノクローナル抗体である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法を用い、抗原に特異的な抗体を定量的に検出する方法。
【請求項９】
１つ以上の任意の抗原を結合させた不溶性担体、Ｉｇ重鎖抗体、Ｉｇ重鎖抗体に特異的な標識抗体を含む、抗原に特異的な抗体の検出キット。
【請求項１０】
１つ以上の任意の抗原を結合させた不溶性担体をアレイ上に並べた、抗原に特異的な抗体の検出器具。
【請求項１１】
魚類ＩｇＭの定常領域に結合するＩｇ重鎖抗体。
【請求項１２】
魚類ＩｇＭの定常領域またはその一部を含むタンパク質を哺乳動物に投与することによるＩｇ重鎖抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚類において、対象とする抗原に特異的な抗体を検出する方法及びその方法に用い得るＩｇ重鎖抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
魚類の種苗生産や養殖において、細菌やウィルス等の感染の問題が知られている。このうち、細菌感染に対しては抗菌剤によって積極的に予防されているが、ウィルス感染に対しては有効なワクチンや抗ウィルス剤が得られておらず、魚のウィルス感染の有無を調べ、感染している魚を除く方法等（例えば、特許文献１参照）が予防法として行われている。また、ワクチンを使用した場合であっても、そのワクチンの効果は、ウィルスの直接的な感染による攻撃試験の結果、生死を基準として判断するのが主であり、魚類体内への直接的な効果として、例えばワクチン投与による魚類の特異的抗体の産生等を基準とする判断方法等は確立されていなかった。
【特許文献１】特開平５−２３２１１５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、魚類において、対象とする抗原に特異的な抗体を検出する方法及びその方法に用い得るＩｇ重鎖抗体の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、抗原投与によって魚類が産生する該抗原に特異的な抗体を、Ｉｇ重鎖に特異的な抗体と結合させることで検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、次の（１）〜（１２）に関する。
（１）魚類において、対象とする抗原に特異的な抗体を検出する方法。
（２）次の１）〜３）の工程を含む、上記（１）に記載の方法。
１）魚類に対象とする抗原を曝露する工程
２）魚類において該抗原に対する特異的な抗体を産生させる工程
３）該抗原に特異的な抗体を検出する工程
（３）該抗原に特異的な抗体を検出する工程が、Ｉｇ重鎖抗体を用いることによって検出するものである上記（２）に記載の方法。
（４）該抗原に特異的な抗体がＩｇＭである上記（３）に記載の方法。
（５）該抗原に特異的な抗体を検出する工程が、次の４）及び５）の工程を含むものである上記（４）に記載の方法。
４）対象とする抗原を結合した不溶性担体と該抗原に特異的な抗体（１次抗体）とを反応させる工程
５）該抗原に特異的な抗体（１次抗体）とＩｇ重鎖抗体（２次抗体）とを反応させる工程
（６）さらに、Ｉｇ重鎖抗体に特異的な標識抗体（３次抗体）を反応させる工程を含む、上記（５）に記載の方法。
（７）該抗原に特異的な抗体がモノクローナル抗体である上記（６）に記載の方法。
（８）上記（１）〜（７）のいずれかに記載の方法を用い、抗原に特異的な抗体を定量的に検出する方法。
（９）１つ以上の任意の抗原を結合させた不溶性担体、Ｉｇ重鎖抗体、Ｉｇ重鎖抗体に特異的な標識抗体を含む、抗原に特異的な抗体の検出キット。
（１０）１つ以上の任意の抗原を結合させた不溶性担体をアレイ上に並べた、抗原に特異的な抗体の検出器具。
（１１）魚類ＩｇＭの定常領域に結合するＩｇ重鎖抗体。
（１２）魚類ＩｇＭの定常領域またはその一部を含むタンパク質を哺乳動物に投与することによるＩｇ重鎖抗体の製造方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の方法及びＩｇ重鎖抗体を用いることにより、魚類において、対象とする抗原に特異的な抗体を検出することができる。この方法において、例えば対象とする抗原をワクチンとする場合には、産生される抗体を定量的に検出することで、ワクチンの効果を判断することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の「検出する方法」とは、魚類において、対象とする抗原に特異的な抗体を検出する方法であればいずれの方法も用いることができるが、例えば、本発明の対象とする抗原を魚類に曝露することにより、魚類において産生される、該抗原に特異的な抗体を検出する方法等が挙げられる。
この検出方法には、例えば、魚類に抗原を曝露し、抗原に特異的な抗体を産生させた後、該抗体を回収し、抗原を結合させたメンブレンや不溶性担体に１次抗体として反応させる、いわゆるウェスタンブロッティング法や、ＥＬＩＳＡ法等を用いることができる。この場合、この１次抗体に反応し得る「Ｉｇ重鎖抗体」を２次抗体として用いることが好ましい。また、さらにこの２次抗体に反応し得る「Ｉｇ重鎖抗体に特異的な標識抗体」を３次抗体として用いることが好ましい。
【０００８】
本発明の「対象とする抗原」とは、曝露することによって、魚類に抗体を産生させることを目的とする、任意のペプチド、タンパク質等の物質のことをいう。さらに「対象とする抗原」にはワクチンも含まれ、ワクチン付与によって、魚類において産生される特異的な抗体を検出することで、ワクチンの効果を判断できる。
また、本発明の方法は、抗体の産生の有無を調べることにより、物質の抗原性のスクリーニングに利用できることから、この目的に用いる場合等において、本発明の抗原には抗体を産生しない、即ち抗原性を有しない物質も対象として含まれる。
なお、対象とする抗原の曝露には、魚類が存在する水中に投与する方法、魚類に直接投与する方法等のいずれの方法も用いることができる。
【０００９】
本発明の「対象とする抗原に特異的な抗体」（１次抗体）とは、対象とする抗原を魚類に曝露することにより、魚類において産生される該抗原に特異的な抗体のことをいう。この抗体には、魚類が産生し得る全ての免疫グロブリンが含まれるが、特にＩｇＭであることが好ましい。なお、曝露に用いた抗原が、十分な抗原性を有しない場合には、この抗体は産生されないか、あるいは産生されても微量である。
この「対象とする抗原に特異的な抗体」は、対象とする抗原を曝露された魚類のいずれの組織からも回収することができるが、特に血液中の血清等として回収することが好ましい。
【００１０】
本発明の「Ｉｇ重鎖抗体」（２次抗体）とは、免疫グロブリンのＩｇ重鎖に結合し得る抗体のことをいう。免疫グロブリンのＩｇ重鎖に結合できることから、任意の抗原に対して魚類体内で産生された「対象とする抗原に特異的な抗体」のいずれにも結合し得る。
例えば、魚類の「対象とする抗原に特異的な抗体」が免疫グロブリンのうちのＩｇＭである場合には、ＩｇＭのＩｇ重鎖またはその一部に特異的に結合し得る抗体であることが好ましく、特にＩｇ重鎖の定常領域に結合する抗体であることが好ましい。さらにＩｇ重鎖のうち、特に保存された領域に特異的に結合し得る抗体であることが好ましい。例えば本実施例において得たゼブラフィッシュｓＩｇ重鎖中のＤｏｍａｉｎIVに特異的に結合し得る抗体は、ゼブラフィッシュのみならず、少なくとも同じコイ科の魚のＩｇＭが検出できる可能性がある。また、マダイなどの他の魚種においても、上記と同様の原理で特異的抗体を検出できる。
なお、このＩｇ重鎖抗体は、蛍光物質等で標識したものも用いることができ、この標識により、「対象とする抗原に特異的な抗体」の産生の有無や、産生量を定量的に検出することができる。
【００１１】
本発明の「Ｉｇ重鎖抗体に特異的な標識抗体」（３次抗体）とは、蛍光物質、放射性物質、酵素等の物質で標識された、Ｉｇ重鎖抗体に結合し得る抗体のことをいう。標識されていない「Ｉｇ重鎖抗体」（２次抗体）を用いる場合には、「対象とする抗原に特異的な抗体」の産生の有無や、産生量を定量的に検出するために、この抗体を用いることが好ましい。Ｉｇ重鎖抗体に結合し得る抗体であればいずれの抗体も用いることができ、市販の抗体を用いることもできる。
本実施例では、標識物質として発色基質ＤＡＢ（３，３'−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を結合した抗ウサギーヤギ抗体（Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ Ｒａｂｂｉｔ Ｉｇ'ｓ，ＨＲＰ；ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ）を用いたが、その他の標識物質を結合した抗体を用いることができる。また、「Ｉｇ重鎖抗体」（２次抗体）の作成においてウサギ以外の動物を用いた場合には、その動物に対して抗原性を有する抗体を用いることもできる。
【００１２】
本発明の「抗原に特異的な抗体を定量的に検出する方法」とは、産生された抗原に特異的な抗体を定量的に検出できる方法であればいずれの方法も用いることができる。例えばＢｒａｄｆｏｒｄ法等によって定量する方法や、実施例のように、例えば３次抗体として蛍光標識をされている抗体を用いる場合には、その蛍光強度等から定量することができる。
【００１３】
本発明の「Ｉｇ重鎖抗体の製造方法」とは、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を製造するために、一般に知られているいずれの方法も用いることができる。
抗体の作製にあたり、Ｉｇ重鎖の定常領域の全体またはその一部のいずれも用いることができるが、高い相同性を有する部位を用いることが特に好ましい。抗体の作製には、ＰＣＲ、ウェスタンブロッティング等、抗体を作製するに当り必要ないずれの方法も用いることができる。例えば抗原とするタンパク質を得るためのＤＮＡの精製にあたり、ＱＩＡＧＥＮ Ｍｉｎ−Ｅｌｕｔｅ（ＱＩＡＧＥＮ）やＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）等の市販のキット等も用いることができる。
本発明の製造方法は、魚類のみならず、魚類以上のあらゆる動物において利用できる。したがって、本発明の方法を用いることにより、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ等の従来知られているＩｇＭ以外のいずれの免疫グロブリンについても、それぞれの免疫グロブリンのＩｇ重鎖に特異的な抗体を製造し得る。
【００１４】
本発明の「抗原に特異的な抗体の検出キット」とは、任意の抗原を結合させた不溶性担体、Ｉｇ重鎖抗体およびＩｇ重鎖抗体に特異的な標識抗体の組み合わせのことをいい、抗原に特異的な抗体を検出するのに用い得るその他のものを含んでもよい。
また、本発明の「不溶性担体」とは、抗原または抗体を安定に結合し得る不溶性の担体であればいずれのものも用いることができ、例えばビーズ、メンブレンフィルター、シャーレ等が挙げられる。ビーズは磁性を有するもの、ポリスチレン、ラテックス等の素材を用いることができる。ここで磁性ビーズは磁石を用いて回収することができるため便利である。
【００１５】
本発明の「抗原に特異的な抗体の検出器具」とは、１つ以上の任意の抗原を結合させた不溶性担体をアレイ上に並べたもののことをいう。１つ以上の任意の抗原の並べ方は特に問わないが、ある症状に特異的に抗原性を有する抗原を組み合わせて並べる等、目的に応じて並べることができる。
以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれらによって制限されない。
【実施例１】
【００１６】
Ｉｇ重鎖抗体の製造
１．ゼブラフィッシュＩｇＭ重鎖における定常領域の塩基配列のクローニング
１）ゼブラフィッシュＩｇＭ重鎖塩基配列の同定
ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用いて、既報の遺伝子配列およびアミノ酸配列が報告されているゼブラフィッシュ由来の２種類のＩｇＭ重鎖遺伝子（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ １．ＩｇＭ前駆体（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）ＧｅｎＢａｎｋＴＭ ａｃｃｅｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＡＫ９６４４２．１、２．分泌型ＩｇＭ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｍ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｆｏｒｍ）ＧｅｎＢａｎｋＴＭ ａｃｃｅｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＡＫ６９１６７．１）を検索して比較した。図１はこれらの比較を示した図であり、同一のアミノ酸配列はハイライトで示した。
【００１７】
また、ｓＩｇ重鎖のアミノ酸配列からＮＣＢＩ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎ Ｓｅａｒｃｈ機能でドメイン検索を行った結果、図２に示したようにｓＩｇ重鎖には５種類のＩＧドメインが存在することが認められた。これら５種類のドメインが重なる４箇所の領域をＮ末端側からＤｏｍａｉｎI、ＤｏｍａｉｎII、ＤｏｍａｉｎIII、ＤｏｍａｉｎIVとした。
Ｉｇμ重鎖およびｓＩｇ重鎖のそれぞれＣ末端側のアミノ酸配列において、高い相同性が見られた共通ドメイン（ＤｏｍａｉｎIV）が存在することがわかった。そこで、ＺＦＩＮ（Ｚｅｂｒａ Ｆｉｓｈ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｎｅｔｗｏｒｋ）のＢＬＡＴ Ｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｏｍｅ機能を用いて、ゼブラフィッシュｓＩｇ重鎖の遺伝子配列におけるエキソンとイントロンの配置からゼブラフィッシュｓＩｇのＤｏｍａｉｎIVは１つのエキソン上に存在することを確認した。図３は、ゼブラフィッシュｓＩｇ重鎖遺伝子のゲノム上の構成として、上部にエキソンおよびイントロンの配置を簡略的に示し、下部にスプライシングにより選択的に転写されたｍＲＮＡを示した図である。またＤｏｍａｉｎI、ＤｏｍａｉｎII、ＤｏｍａｉｎIII、ＤｏｍａｉｎIVの領域を示した。
【００１８】
２）ｚＩｇＭ３００の塩基配列の相同検索
本発明者らが単離したゼブラフィッシュゲノムＤＮＡを用いて、ゼブラフィッシュｓＩｇ重鎖中のＤｏｍａｉｎIVに相当する遺伝子配列３００ｂｐのクローニングを試みた。すなわち、ゼブラフィッシュゲノムＤＮＡからクローニングされたＰＣＲ増幅断片をＤＮＡシーケンスして全塩基配列を決定し、さらにアミノ酸配列に翻訳してｓＩｇ重鎖アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋＴＭ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＡＫ６９１６７．１）との間で比較した。図４はこれらの比較を示した図であり、同一のアミノ酸配列はハイライトで示し、ＤｏｍａｉｎIVを実線の矢印で示した。
その結果、クローニングされた遺伝子断片は目的のＤｏｍａｉｎIVであることが判明し、ＤｏｍａｉｎIVとの間で１００％の相同性が見られた。この塩基配列３００ｂｐの領域を以下、ｚＩｇＭ３００（Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ＩｇＭ重鎖定常領域相当領域３００ｂｐ）とした。ｚＩｇＭ３００の遺伝子配列は配列表配列番号１に示した。
【００１９】
３）ｚＩｇＭ３００のクローニング
上記１．２）で用いたゼブラフィッシュゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてＰＣＲによる増幅を行った。ＰＣＲ反応液の組成および反応手順を表１および２に示した。また、反応に用いたプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ ＦおよびＰｒｉｍｅｒ Ｒ）の配列を配列表配列番号２および３に示した。
得られた増幅断片を１．５％アガロースＴＡＥゲル中で５０Ｖ、１時間電気泳動し、目的断片をゲルから切り出してＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製した。
【００２０】
【表１】
2007255892.tif 000002
【００２１】
【表２】
2007255892.tif 000003
【００２２】
２．大腸菌を用いたｚＩｇＭ３００のタンパク質の作製
１）ｚＩｇＭ３００のタンパク質発現用プラスミドベクターの構築
上記１．３）で増幅、精製を行ったＤＮＡ増幅断片６μｌとＢａｍＨＩ１μｌ、ＸｈｏＩ１μｌ、１０×Ｈ ｂｕｆｆｅｒ２μｌ（ＴａＫａＲａ）、滅菌ｍｉｌｉＱ水１０μｌとを混合し、３７℃で２時間インキュベートして制限酵素処理を行い、同様に制限酵素処理したｐＥＴ２８（ｂ）プラスミドベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）とともに、１．５％アガロースＴＡＥゲルで５０Ｖ、１時間電気泳動を行った。目的のＤＮＡ断片をゲルから切り出し、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製した。精製した上記ＤＮＡ増幅断片およびｐＥＴ２８（ｂ）プラスミドベクターの断片を用いて、ＴａＫａＲａ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）によるライゲーション反応を行い、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５αに対して形質転換を行った。ｐＥＴ２８（ｂ）プラスミドベクターはＮ末端側にＨｉｓタンパク質が組み込まれるようにデザインされた大腸菌発現用のベクターであるため、ｚＩｇＭ３００のタンパク質の確認において、Ｈｉｓタンパク質の発現をポジティブコントロールとして用いることが可能である。
大腸菌をＬＢ／カナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含む寒天平板培地に塗抹後、３７℃で１晩インキュベートし、得られた形質転換体を用いてコロニーＰＣＲを行った。コロニーＰＣＲは、ＥＸ ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いてダイレクトＰＣＲ法により行った。ＰＣＲ反応液の組成および反応手順を表３および４に示した。また、配列表配列番号２および３をプライマーとして用いた。コロニーＰＣＲによりインサート配列の確認されたクローンのみを５ｍｌＬＢ／カナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含む液体培地に接種して３７℃で１６時間振とう培養し、その大腸菌培養液からＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐを用いてプラスミド抽出を行った。
【００２３】
【表３】
2007255892.tif 000004
【００２４】
【表４】
2007255892.tif 000005
２）シーケンスによる遺伝子配列の確認
上記２、１）で抽出したプラスミドを用いて、ＰＣＲ増幅されたインサート断片の塩基配列を決定した。シーケンス反応はＤＴＳＱ Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いてジデオキシ法で行った。また、シーケンス反応には既存のＴ７プライマーを使用した。決定した塩基配列は、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴを用いてデータベースに照合し、既報遺伝子配列およびアミノ酸配列との相同性検索を行った。
【００２５】
３）大腸菌によるｚＩｇＭ３００タンパク質の発現
上記２、２）で遺伝子配列を確認したｚＩｇＭ３００の遺伝子配列を含むプラスミドベクター５μｌを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、ＬＢ／カナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含む平板プレートにコンラージ棒を用いて塗抹し、３７℃で１晩インキュベートした。得られた大腸菌のコロニーをピックアップし、５ｍｌ ＬＢ／カナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）液体培地に接種して３７℃で１２時間振とう培養して、これを前培養液とした。この前培養液の５０μｌを５ｍｌのＬＢ／カナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含む液体培地４０本に加え、ＯＤ600＝０．５になるまで３７℃で振とう培養し、その後５ｍｌ液体培地に対して１Ｍ  ＩＰＴＧを１０μｌずつ加えて、さらに３７℃で９時間振とう培養した。こうして培養した４０本全ての大腸菌培養液を６，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。集菌した大腸菌ペレットを２０ｍｌのリン酸バッファー（ｐＨ７．４）で懸濁し、ＴＯＭＹ ＵＤ−２０１のソニケイターを使ってＯＵＴ ＰＵＴ４ ＤＵＴＹ６０の条件で３分間超音波による菌体破砕を行い、得られた破砕液を粗タンパク質として以後の操作に用いた。
【００２６】
４）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるｚＩｇＭ３００タンパク質の発現の確認
上記２、３）で得られた大腸菌破砕粗タンパク質と、表５に組成を示した２×ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）サンプルバッファーとを１対１の割合で懸濁して３分間煮沸後、本サンプルを１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用アクリルアミドゲルを用いて２５ｍＡで２時間電気泳動し、ＣＢＢ（クーマシーブリリアントブルー）染色によるタンパク質の検出を行った。
【００２７】
【表５】
2007255892.tif 000006
【００２８】
５）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるｚＩｇＭ３００タンパク質の発現の確認
上記２、４）で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、図６のレーンａに示したように、大腸菌タンパク質の中で２０ｋＤａ付近に過剰に発現しているタンパク質が確認された。目的タンパク質の推定分子量が１１ｋＤａ（３００ｂｐ；１００ａａ）であることから、２０ｋＤａ付近で過剰に発現しているタンパク質が目的のｚＩｇＭ３００タンパク質であるとはこの時点では断定できなかった。したがって、さらに電気泳動したゲルからタンパク質をＣＥＬＬＵＬＯＳＥ  ＮＩＴＲＡＴＥ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）に転写して抗Ｈｉｓ ｔａｇ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によるウェスタンブロッティングを行った。
ウェスタンブロッティングは、次の手順で行った。
（１）ＰＡＧＥゲル、ろ紙６枚、リンスしたＣＥＬＬＵＬＯＳＥ  ＮＩＴＲＡＴＥをブロッキングｂｕｆｆｅｒ（１０×ＳＤＳ泳動ｂｕｆｆｅｒ １０ｍｌ、メタノール ２０ｍｌ、ｄＨ2Ｏ ７０ｍｌ）に浸し３０ｍｉｎ室温に置いた。
（２）セミドライブロッターを６０ｍｉｎ、２〜３ｍＡ／ｃｍ2（２．５ｍＡ／ｃｍ2）にセットした。
（３）上記（２）でタンパク質を転写したＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＮＩＴＲＡＴＥを０．５％スキムミルク−ＰＢＳで３０ｍｉｎ〜２ｈｏｕｒ（４℃ ｏ／ｎ）ブロッキングした。
（４）上記（３）のＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＮＩＴＲＡＴＥを０．１〜０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳでゆっくり振倒した（５ｍｉｎ×２回）。
（５）上記（４）に１次抗体（抗体液／ＰＢＳ）を加え、６０〜９０ｍｉｎ室温静置した。
（６）上記（５）を０．１〜０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳでゆっくり振倒した（５ｍｉｎ×２回）。
（７）上記（６）に２次抗体（ＨＲＰ抗体液／ＰＢＳ）を加え、６０ｍｉｎ室温静置した。
（８）上記（７）を０．１〜０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳでゆっくり振倒した（５ｍｉｎ×３回）。
（９）上記（８）を発色基質（５ｍｌＰＢＳ，５μｌＨ2Ｏ2，５ｍｇＤＡＢ）で発色した。
（１０）上記（９）の頃合をみてＨ2Ｏで反応停止した。
（１１）上記（１０）を風乾した。
【００２９】
その結果、図６のレーンｂに示したように、２０ｋＤａ付近に過剰に発現しているタンパク質にのみ抗原抗体反応が検出されたことから、大腸菌中で過剰発現したタンパク質は目的のｚＩｇＭ３００タンパク質であることが確認された。なお、図６のＭはマーカーを示し、これ以降の図面においても同様である。
【００３０】
６）ｚＩｇＭ３００タンパク質の画分化
上記２、３）で調整したｚＩｇＭ３００タンパク質発現大腸菌サンプルをソニケイションで破砕し、得られた破砕液を１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、ｚＩｇＭ３００タンパク質の発現している上澄み液を可溶性画分および不溶性のペレットに分画した。なお、ペレットを１０ｍｌリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で再び懸濁したものを不溶性画分とした。リン酸バッファーの組成は表６に示した。
【００３１】
両画分それぞれの１０μｌに２×ＳＤＳサンプルバッファーを１対１の割合で混合して３分間煮沸した後、１２．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用アクリルアミドゲルで２５ｍＡ、２時間電気泳動して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。レーンａにはｚＩｇＭ３００タンパク質発現大腸菌液、レーンｂには可溶性画分タンパク質溶液、レーンｃには不溶性画分タンパク質溶液、レーンｄにはＢバッファー処理による可溶化したタンパク質溶液をスポットした。その結果、図７のレーンｃには矢印で示した目的タンパク質のバンドが見られるが、レーンｂには見られないことから、大腸菌で高発現されたｚＩｇＭ３００タンパク質はペレット中に存在する不溶性タンパク質であることが判明した。
【００３２】
【表６】
2007255892.tif 000007
【００３３】
７）不溶性タンパク質の可溶化
上記２、６）で得られた大腸菌体破砕液の不溶性画分であるペレットを１０ｍｌのＢバッファーで懸濁し、室温で２時間振とうし、ｚＩｇＭ３００タンパク質溶出溶液を作成した。Ｂバッファーの組成は表７に示した。その後、１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、遠心した溶液の上澄み液のみを回収し、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用アクリルアミドゲルで２５ｍＡ、２時間電気泳動した後、ＣＢＢ染色を行った。その結果、図７のレーンｄに見られるように２０ｋＤａ付近に見られる不溶性であったｚＩｇＭ３００タンパク質の可溶化が認められた。
【００３４】
【表７】
2007255892.tif 000008
【００３５】
８）Ｈｉｓ ｔａｇ合成タンパク質の精製
上記２、７）のｚＩｇＭ３００タンパク質溶出溶液１０ｍｌにＮｉ−ＮＴＡ（ＱＩＡＧＥＮ）溶液を１００μｌ加えて４℃で３時間振とうした。次に、シリンジの滴定を利用し、Ｈｉｓ ｔａｇを合成付加してある目的の発現タンパク質のみを回収した。Ｎｉ−ＮＴＡを用いたＨｉｓ ｔａｇを付加した目的タンパク質の精製プロトコルを図８に示した。
【００３６】
９）ｚＩｇＭ３００タンパク質精製の確認
上記２、７）で溶出したサンプルを１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用アクリルアミドゲルで２５ｍＡ、２時間電気泳動してＣＢＢ染色を行った。レーンａにはｚＩｇＭ３００タンパク質発現大腸菌液、レーンｂにはサンプル添加後の素通り画分、レーンｃにはリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）による洗浄画分、レーンｄには２０ｍＭから１００ｍＭイミダゾール・リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）による洗浄画分、レーンｅには５００ｍＭイミダゾール・リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）画分をスポットした。その結果、図９のレーンｅには矢印で示した目的タンパク質のバンドが見られることから、５００ｍＭイミダゾール・リン酸バッファーで溶出した画分中に、精製したｚＩｇＭ３００タンパク質があることが確認された。
【００３７】
３．抗ｚＩｇＭ３００タンパク質ウサギ血清抗体の作製
１）ｚＩｇＭ３００タンパク質溶液中のイミダゾール除去
上記２、３）から２、６）の作業を６回繰り返した後、回収されたｚＩｇＭ３００タンパク質溶出溶液を、両端をたこ紐で縛った透析チューブ内にいれ、２Ｌの透析用バッファー（リン酸バッファー、ｐＨ７．４）に対して４℃で１晩透析した。透析した透析用バッファーを捨て、再び２Ｌの同バッファー中で透析を行った。この操作を２回行った。さらに、５ｋＤａ限外ろ過フィルターＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を用いて３０００ｒｐｍで２時間遠心濃縮を行った。
【００３８】
２）ｚＩｇＭ３００タンパク質溶液のタンパク質量の測定
上記３、１）で得られた透析後の溶液中に含まれるタンパク質量をＢｒａｄｆｏｒｄ法にて測定した。また、測定にはＢｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いた。
【００３９】
３）ｚＩｇＭ３００タンパク質抗体の作製
上記３、２）で濃縮したＩｇＭ重鎖タンパク質溶液（１．１４ｍｇ／ｍｌ）を用いて、ウサギに対する抗ｚＩｇＭ３００タンパク質抗体（以下、Ｉｇ重鎖抗体とする）を作製した。
即ち、抗原となるタンパク質溶液（１．１４ｍｇ／ｍｌ）の４００μｌに対して、等量のアジュバンドを混合してウサギの耳静脈に注射した。追加免疫として、２週間後に３００μｌのタンパク質のみを再度ウサギ耳静脈に注射した。さらに、追加免疫として、２週間後に３００μｌのタンパク質のみを再度ウサギ耳静脈に注射した。最終的に、ウサギの全血液を採血し、軽く攪拌後、室温に放置して血小板成分を凝固させた。その後、３，５００ｒｐｍで５分間室温にて遠心分離して、血清成分のみを採取した。
【００４０】
４）Ｉｇ重鎖抗体の有効性の確認
上記２、４）で使用したサンプルを２×ＳＤＳサンプルバッファーと１対１の割合で懸濁して３分間煮沸後、本サンプルを１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用アクリルアミドゲルを用いて２５ｍＡで２時間電気泳動し、ＣＢＢ染色によるタンパク質の検出を行った。図１０のレーンａに示したように、大腸菌タンパク質の中で２０ｋＤａ付近に過剰に発現しているタンパク質が確認された。
また、上記３、３）で作製したＩｇ重鎖抗体を用いて、ｚＩｇＭ３００タンパク質発現大腸菌液に対するウェスタンブロッティングを行った。ウェスタンブロッティングは上記２．５）と同様の手順によって行った。その結果、抗Ｈｉｓ ｔａｇ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて同タンパク質溶液を検出した結果と同様に、図１０のレーンｂに示したように、２０ｋＤａ付近に抗原抗体反応を示すｚＩｇＭ３００タンパク質が検出された。
【実施例２】
【００４１】
Ｉｇ重鎖抗体のＩｇＭ検出能の確認
１．ゼブラフィッシュ生体内で産生されるＩｇＭの精製
１）ゼブラフィッシュ血液中からの血清サンプルの回収
ゼブラフィッシュは水温２７．５℃、明期１４時間、暗期１０時間で飼育したものを使用した。５０尾の成魚ゼブラフィッシュ尾部を切断し、大動脈から流れ出る血液を回収した。これを５ｍｌの２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に懸濁し、ＴＯＭＹ  ＵＤ−２０１のソニケイターを使ってＯＵＴ ＰＵＴ４ ＤＵＴＹ６０の条件で１０秒超音波による血液の破砕を行った後、４℃で７０００ｒｐｍの１０分間遠心分離をして上澄み液を回収した。
【００４２】
２）ゼブラフィッシュ血清サンプル中のＩｇＭの精製
上記１、１）で回収したゼブラフィッシュ血清サンプルをＨｉ Ｔｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、ゼブラフィッシュＩｇＭのみを回収をした。カラムから回収したゼブラフィッシュＩｇＭ溶出液をｐＨごとに５ｋＤａ限外ろ過フィルターＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａを用いて３０００ｒｐｍで２時間遠心濃縮した。図１１にゼブラフィッシュ血清からのＩｇＭの精製プロトコルを示した。
【００４３】
３）ゼブラフィッシュ生体内で産生されるＩｇＭの精製およびその検出
上記１、２）で精製、濃縮したゼブラフィッシュＩｇＭ溶出液のタンパク質量をＢｒａｄｆｏｒｄ法にて測定した。測定にはＢｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いた。その結果、ｐＨ２．５区では０．２３μｇ／ｍｌ、ｐＨ３．５区では０．６２μｇ／ｍｌ、ｐＨ４．５区では０μｇ／ｍｌであった。また、ＩｇＭ溶出液を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析したところ、図１２のレーンａの矢印で示したように、およそ８５ｋＤａ付近にＩｇＭ重鎖のバンドが検出され、２０ｋＤａ付近にＩｇＭ軽鎖のバンドがそれぞれ検出された。
【００４４】
４）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＩｇ重鎖抗体の確認
また、実施例１で作製したＩｇ重鎖抗体を用いて、ゼブラフィッシュＩｇＭタンパク質がどのように検出されるかについて、ウェスタンブロッティングによる解析を行った。その結果、図１３のレーンｂに示したように、ゼブラフィッシュＩｇＭ重鎖にのみ抗原抗体反応が検出され、ＩｇＭ軽鎖には反応が見られなかった（図１３のレーンａにはＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した）。以上の結果から、作製したＩｇ重鎖抗体はゼブラフィッシュＩｇＭ重鎖に特異的なＩｇ重鎖抗体であることが判明した。
【００４５】
５）ゼブラフィッシュ臓器別におけるＩｇＭの検出
１０尾の成魚ゼブラフィッシュを解剖し、脳、心臓、肝臓、腎臓脾臓、腸、筋肉、精巣、および卵巣を５尾ずつから摘出し、臓器の重量を測定して１ｍｇに対して３０μｌのリン酸バッファー（ｐＨ７．４）を加えて、針（１８Ｇ×１１／２"、テルモ）とシリンジ（テルモ）を用いて固体物が目で見て確認できなくなるまでホモジナイズして各臓器からのタンパク質を抽出した。これらのサンプルを１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、アクリルアミドゲルを用いて２０ｍＡで２時間電気泳動し、実施例１で作製したＩｇ重鎖抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。ウェスタンブロッティングは上記実施例１、２．５）と同様の手順によって行った。その結果、ゼブラフィッシュ臓器別タンパク質サンプルにおいて、図１４に示したように腸においてのみ抗原抗体反応が検出された。
【実施例３】
【００４６】
抗３８０Ｒタンパク質ウサギ血清抗体の製造
ポジティブコントロールとして用いるために、抗３８０Ｒタンパク質ウサギ血清抗体を作製した。
１．イリドウィルス感染防御抗原タンパク質３８０Ｒ部位の遺伝子配列クローニング
１）マダイイリドウィルスワクチンからのゲノムＤＮＡ抽出
マダイイリドウィルスワクチン（財団法人 阪大微生物病研究会）１０ｍｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ２０μｌ、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）１００μｌ、１０％ＳＤＳ ２ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ １２０μｌを混合し、５８℃で３０分間インキュベートして等量のフェノールを加え、４℃で２晩緩やかに混合した。その後、３０００ｒｐｍで３０分間遠心して上澄みを回収後、得られた上澄み溶液に０．５Ｍ酢酸ナトリウム２００μｌ、９９．５％エタノール２５ｍｌを加えて混合し、室温で１０分インキュベートした。その後、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心してエタノールを除去し、ペレットを７０％エタノール１０ｍｌで洗浄後、１２，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。この操作を２度行った後、エタノール溶液を除去してペレットを乾燥させた。乾いたペレットにＴＥバッファー１ｍｌを加え、４℃で３日間緩やかに振とう・混合した。
【００４７】
２）３８０Ｒ部位の遺伝子配列クローニング
上記１．１）で抽出したイリドウィルスゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてＰＣＲによる増幅を行った。表１と同様のＰＣＲ反応液を調製し、反応手順を表８に示した。また、反応に用いたプライマーの配列を図１５に示し、配列表配列番号４および５に示した。
得られた増幅断片を１．５％アガロースＴＡＥゲル中で５０Ｖ、１時間電気泳動し、目的断片をゲルから切り出してＱＩＡＧＥＮ Ｍｉｎ−Ｅｌｕｔｅ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。
【００４８】
【表８】
2007255892.tif 000009
【００４９】
３）３８０Ｒ遺伝子配列増幅用プラスミドベクターの構築
上記１、２）で増幅・精製を行った３８０Ｒ遺伝子配列をＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてライゲーション反応を行い、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） ＤＨ５αに対して形質転換を行った。大腸菌を２０ｍｇ／ｍｌ Ｘ−ｇｅｌ ４０μｌ、１００ｍＭ ＩＰＴＧ ５０μｌを塗抹したＬＢ／カナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）の２０ｍｌ平板培地で培養した。３７℃で１晩インキュベートした後、ブルーホワイトセレクションにより白いコロニーを形成した大腸菌をピックアップし、５ｍｌのＬＢ／カナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含む液体培地で３７℃１６時間振とう培養し、その大腸菌培養液からＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミド抽出を行った。
【００５０】
４）３８０Ｒ遺伝子の塩基配列決定
上記１、３）で抽出したプラスミドベクターを用いて、ＰＣＲ増幅されたインサート断片の塩基配列を決定した。シーケンス反応はＤＴＳＱ Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いてジデオキシ法で行った。また、シーケンス反応には既存のＴ７プライマーと合成した配列番号６および７に記載の３８０Ｒシーケンス用プライマーを使用した。決定した塩基配列は、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴを用いてデータベースに照合し、既報遺伝子配列およびアミノ酸配列との相同性検索を行った。３８０Ｒ遺伝子の塩基配列は配列表配列番号８に示した。
【００５１】
２．大腸菌による３８０Ｒタンパク質の作製
１）３８０Ｒのタンパク質発現用プラスミドベクターの構築
上記１、４）で遺伝子配列を確認したプラスミドベクターに、制限酵素処理（ＢａｍＨＩ １μｌ、ＸｈｏＩ １μｌ、１０×Ｈ ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ（ＴａＫａＲａ）、上記１、４）に示したプラスミドＤＮＡ ６μｌ、滅菌ミリＱ水 １０μｌを混合し、３７℃で２時間インキュベートをして制限酵素処理を行い、同様に制限酵素処理を行ったｐＥＴ２８（ｂ）プラスミドベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）とともに１．５％アガロースＴＡＥゲルで５０Ｖ、１時間電気泳動を行った。目的のＤＮＡ断片をゲルから切り出し、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製した。精製したＤＮＡ増幅断片およびプラスミドベクターの断片を用いてＴａＫａＲａ Ｌｉｇｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）によるライゲーション反応を行い、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５αに対して形質転換を行った。
大腸菌をＬＢ／カナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含む寒天平板培地に塗抹後、３７℃で１晩インキュベートし、得られた形質転換体を用いてコロニーＰＣＲを行った。なお、プライマーは配列番号６および７に記載の３８０Ｒシーケンス用プライマーを使用した。目的の挿入断片が確認されたクローンのみを５ｍｌＬＢ／カナマイシン（最終濃度（５０μｇ／ｍｌ）を含む液体培地に摂取して３７℃１６時間振とう培養し、その大腸菌培養液からＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉ ｐｒｅｐを用いてプラスミド抽出を行った。また、抽出したプラスミドベクターを上記１、４）の方法でＤＮＡシーケンスを行い、挿入断片は塩基配列を決定して配列を確認した。
【００５２】
２）大腸菌による３８０Ｒタンパク質の発現
上記２、１）で構築した３８０Ｒタンパク質発現用プラスミドベクター５μｌを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、ＬＢ／カナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含む平板プレートにコンラージ棒を用いて塗抹し、３７℃で１晩インキュベートした。得られた大腸菌のシングルコロニーをピックアップし、５ｍｌＬＢ／カナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）液体培地により３７℃１６時間振とう培養して、これを前培養液とした。この前培養液の２００μｌを５００ｍｌ容三角フラスコに調整した２００ｍｌのＬＢ／カナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含む液体培地に加え、ＯＤ600＝０．５になるまで３７℃で振とう培養後、１Ｍ ＩＰＴＧ １００μｌを添加して、さらに３７℃で９時間振とう培養したこうして培養した大腸菌培養液を６，０００ｒｐｍで１５分遠心分離した。集菌した大腸菌ペレットを２０ｍｌのリン酸バッファー（ｐＨ７．４）で懸濁し、ＴＯＭＹ ＵＤ−２０１ソニケイター（ＴＯＭＹ）を用いて、ＯＵＴ ＰＵＴ４ ＤＵＴＹ６０の条件で３分間超音波による菌体破砕を行い、得られた破砕液を粗タンパク質として以後の操作に用いた。
【００５３】
３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる３８０Ｒタンパク質の発現の確認
上記２、２）で得られた大腸菌破砕粗タンパク質を２×ＳＤＳサンプルバッファーと１対１の割合で懸濁して３分間煮沸後、本サンプルを１２．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用アクリルアミドゲルを用いて２５ｍＡで２時間電気泳動し、ＣＢＢ染色によるタンパク質の検出を行った。また、泳動したゲルからタンパク質をＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＮＩＴＲＡＴＥ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）に転写して抗Ｈｉｓ ｔａｇ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いたウェスタンブロッティングを行った。ウェスタンブロッティングは上記実施例１、２．５）と同様の手順によって行った。
【００５４】
４）３８０Ｒタンパク質の画分化
上記２）、３）で調整した３８０Ｒ発現大腸菌サンプルを１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上澄み液を可溶性画分および不溶性のペレットに分画した。なお、ペレットを１０ｍｌリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で再び懸濁したものを不溶性画分とした。両画分それぞれと１０μｌの２×ＳＤＳサンプルバッファーと１対１の割合で混合して３分間煮沸した後、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用アクリルアミドゲルで２５ｍＡ、２時間電気泳動し、ＣＢＢ染色を行った。
【００５５】
５）不溶性タンパク質の可溶化
上記２、４）で得られた不溶性画分であるペレットを２０ｍｌの０．１％Ｔｗｅｅｎ２０リン酸バッファー（ｐＨ７．４）で懸濁し、室温で１時間インキュベートして１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離してペレットの洗浄を行った。この操作を２回繰り返した後、洗浄したペレットを８Ｍ尿素溶液（８Ｍ Ｕｒｅａ、１ｍＭ ＤＤＴ ５ｍｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）１０ｍｌで懸濁した。室温で１時間インキュベートし、１３，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して得られたペレットのみをリン酸バッファー（ｐＨ７．４）５ｍｌで懸濁後、２×ＳＤＳサンプルバッファーと１対１の割合で混合して３分間煮沸し、電気泳動に用いた。
【００５６】
６）３８０Ｒタンパク質の精製
最終的に調製した不溶性画分に含まれる３８０Ｒタンパク質を用いて、濃縮ゲルのウェル部分を平坦にした１２．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用アクリルアミドゲルで電気泳動を行った。目的の３８０Ｒタンパク質の予定分子量の辺りのゲルを切り出し、５ｍｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動バッファーとともに、両端をたこ紐で縛ったＤｉａｌｙｓｉｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｉｚｅ２０（Ｗａｋｏ）内にゲルを投入して、５００ｍｌ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動バッファーを入れたＭｕｐｉｄ電気泳動装置に浸し、５０Ｖで２時間電流を流した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動バッファーの組成は表９に示した。その後、透析チューブ内のＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動バッファーを回収して２×ＳＤＳサンプルバッファーと１対１の割合で混合し、これを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用アクリルアミドゲルを用いて電気泳動後、上述のように目的タンパク質のみをゲルから切り出して精製し、透析チューブを用いて同様に目的タンパク質をゲルから溶出した。不溶性画分タンパク質の精製の手順は図１６に示した。
【００５７】
【表９】
2007255892.tif 000010
【００５８】
３．抗３８０Ｒタンパク質ウサギ血清抗体の作製
１）３８０Ｒタンパク質溶出溶液からＳＤＳの除去
上記２、６）で得られた３８０Ｒタンパク質溶液を、両端をたこ紐で縛った透析チューブにいれ、２Ｌの透析用バッファー（Ｔｒｉｓ ３．０３ｇ、グリシン １４．４１ｇ）対して４℃で１晩透析した。透析した透析用バッファーを捨て、再び２Ｌの同バッファー中で透析を行った。この操作を２回行った。さらに、１０ｋＤａ限外ろ過フィルターＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を用いて、２，５００ｒｐｍで２時間遠心濃縮を行った。
【００５９】
２）３８０Ｒタンパク質溶出溶液のタンパク質量の測定
上記３、１）で得られた透析後の溶液中に含まれるタンパク質量をＢｒａｄｆｏｒｄ法にて測定した。また、測定にはＢｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓｅｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いた。
【００６０】
３）抗３８０Ｒタンパク質ウサギ血清抗体の作製
上記２、６）で濃縮した３８０Ｒタンパク質溶液（０．８ｍｇ／ｍｌ）を用いて、ウサギに対する抗３８０Ｒタンパク質抗体を作製した。抗体の作製は上記実施例１、３．３）と同様の手順によって行った。
【００６１】
４）抗３８０Ｒタンパク質ウサギ血清抗体の有効性の確認
３８０Ｒタンパク質発現大腸菌を１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用アクリルアミドゲルで２０ｍＡ２時間泳動し、泳動したゲルからタンパク質をＣＥＬＬＵＬＯＳＥ  ＮＩＴＲＡＴＥ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）に転写して上記２、３）で作製した抗３８０Ｒタンパク質ウサギ血清抗体を用いてウェスタンブロッティングを行い、抗３８０Ｒタンパク質ウサギ血清抗体の有用性を確認した。ウェスタンブロッティングは上記実施例１、２．５）と同様の手順によって行った。
【実施例４】
【００６２】
対象とする抗原に特異的な抗体を検出する方法
１．試料の調製
（１）抗原（トランスジェニック酵母）の作製
１）酵母の作製と培養
曝露試験には京都大学農学研究科応用生命科学専攻生体高分子化学研究室の植田充美教授に作製いただいた３８０Ｒ表層発現酵母と３８０Ｒ内部発現酵母、未発現酵母を使用した（参考文献参照）。すなわち、酵母は前培養として５ｍｌＳＤ＋Ｗ０．５％カザミノ酸培地にシングルコロニーの酵母を植菌し、２４時間３０℃で振倒培養した。次に本培養として５００ｍｌ容の坂口フラスコに１５０ｍｌのＳＤ＋Ｗ０．５％カザミノ酸培地を調製し、その中に前培養液１ｍｌを加えて３０℃で３０時間振倒培養を行った後、６，０００ｒｐｍ２０分間遠心して得られた酵母のペレット重量を測定した。
参考文献： Ａ．Ｋｏｎｄｏ．Ｍ．Ｕｅｄａ．Ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ−ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｓｐｌａｙ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００４） ６４：２８−４０．
【００６３】
２）酵母における３８０Ｒタンパク質の発現確認
３８０Ｒ表層発現酵母と３８０Ｒ未発現酵母は抗Ｈｉｓ ｔａｇ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と、本研究室で作製した３８０Ｒタンパク質ウサギ血清抗体を用いて、３８０Ｒ内部発現酵母は本研究室で作製した３８０Ｒタンパク質ウサギ血清抗体を用いて蛍光抗体染色法を行い、３８０Ｒタンパク質の発現の有無を確認した。３８０Ｒタンパク質ウサギ血清抗体は実施例３で製造したものを用いた。図１７に蛍光抗体染色法の手順を示した。
３８０Ｒ内部発現酵母と３８０Ｒ未発現酵母は、酵母培養液３ｍｌをそれぞれ１０．０００ｒｐｍ３分間の遠心分離で集菌し、５００μｌリン酸バッファー（ｐＨ７．４）で懸濁した後、ＴＯＭＹ ＵＤ−２０１のソニケイターを使い、ＯＵＴ ＰＵＴ４ ＤＵＴＹ６０で１５秒間超音波による酵母細胞の破砕を行った。破砕した酵母液２０μｌを２×ＳＤＳサンプルバッファーと１対１の割合で懸濁して３分間煮沸後、それぞれのサンプルを１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲルを用いて２０ｍＡ９０分間電気泳動し、泳動したゲルからタンパク質をＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＮＩＴＲＡＴＥ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）に転写して３８０Ｒタンパク質ウサギ血清抗体によるウェスタンブロッティングを行い、３８０Ｒタンパク質の発現の有無を確認した。ウェスタンブロッティングは上記実施例１、２．５）と同様の手順によって行った。
【００６４】
３）結果
蛍光抗体染色において暗視野をＦＩＴＣ系フィルターで観察した結果を図１８に示した。図１８のａに３８０Ｒ表層発現酵母の顕微鏡写真を示し、ｂに３８０Ｒ未発現酵母の、抗Ｈｉｓ ｔａｇ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて蛍光抗体染色をおこなった後の顕微鏡写真を示した。その結果蛍光抗体染色をおこなった酵母の中、３８０Ｒ表層発現酵母には表層にＨｉｓ ｔａｇタンパク質の発現が見られたが、３８０Ｒ未発現酵母ではＨｉｓ ｔａｇタンパク質の発現は見られなかった。
【００６５】
また、３８０Ｒタンパク質ウサギ血清抗体を用いた蛍光抗体染色の結果を図１９に示した。図１９のａは３８０Ｒ表層発現酵母、ｂは３８０Ｒ未発現酵母、ｃは３８０Ｒ内部発現酵母のそれぞれについての３８０Ｒタンパク質ウサギ血清抗体を用いて蛍光抗体染色をおこなった後の顕微鏡写真を示した。その結果蛍光抗体染色をおこなった酵母の中、３８０Ｒ表層発現酵母では発現が確認されたが、３８０Ｒ未発現酵母、３８０Ｒ内部発現酵母には発現が見られなかった。
【００６６】
さらに、内部発現における３８０Ｒ内部発現酵母および３８０Ｒ未発現酵母のウェスタンブロッティングの結果を図２０に示した。図２０のａは抗Ｈｉｓ ｔａｇ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いたウェスタンブロッティングの結果、ｂは３８０Ｒタンパク質ウサギ血清抗体をもちいておこなったウェスタンブロッティングの結果を示した。その結果、内部発現には３８０Ｒタンパク質の発現が見られたが、未発現酵母では３８０Ｒタンパク質の発現は見られなかった。これにより、３８０Ｒ表層発現では酵母表層に、３８０Ｒ内部発現では内部に３８０Ｒタンパク質を発現しており、３８０Ｒ未発現酵母は３８０Ｒタンパク質を発現していないことが確認できた。
【００６７】
（２）実験対象魚（ゼブラフィッシュ）の調製
ゼブラフィッシュは水温２７．５℃、明期１４時間、暗期１０時間で飼育したものを使用した。
１試験区に５０尾で６試験区、３００尾のゼブラフィッシュを供した。幅６０ｃｍ、奥行き３０ｃｍ、高さ３０ｃｍの水槽に２０Ｌの環境水をはり、その水槽を６個作成し、１水槽５０尾で飼育した。
【００６８】
（３）対象とする抗原に特異的な抗体（１次抗体）を検出するための抗体（２次抗体）の作製
Ｉｇ重鎖抗体（２次抗体）は、上記実施例１で製造したものを用いた。また、Ｉｇ重鎖抗体に特異的な標識抗体（３次抗体）はＧｏａｔ Ａｎｔｉ Ｒａｂｂｉｔ Ｉｇ'ｓ，ＨＲＰ（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ）を用いた。また、ポジティブコントロールとして抗Ｈｉｓ ｔａｇ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いた。この抗Ｈｉｓ ｔａｇ抗体にはＨＲＰが付いているので、ＤＡＢによる直接検出が可能であった。
【００６９】
２．対象とする抗原（３８０Ｒタンパク質）に特異的な抗体の産生
１）曝露試験
上記１、１）で作製した３種類の酵母（３８０Ｒ表層発現酵母、３８０Ｒ内部発現酵母、３８０Ｒ未発現酵母）を抗原として、それぞれ５００μｇ／ｍｌの濃度で環境水に懸濁したものを１０Ｌ作製し、そこに上記１、２）で調製したゼブラフィッシュを１００尾ごと３０分浸漬した後、５０尾ごとを２つに無作為に振り分けて飼育した。１回目の曝露試験をおこなった後、１５日後に２度目の曝露試験をおこなった。曝露試験の工程は図２１に示した。
【００７０】
２）ゼブラフィッシュ血液のサンプリング
２度目の曝露試験の５日後、１０日後に３８０Ｒ表層発現酵母、３８０Ｒ内部発現酵母および３８０Ｒ未発現酵母の３種類の抗原における３試験区で、それぞれ５０尾ごとに血液のサンプリングをおこなった。
サンプリングはゼブラフィッシュの尾部を切断し、大動脈から流れ出る血液を１．５ｍｌチューブに入れておいた５００μｌの結合バッファー（２０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4と２０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4を混合してｐＨ７．０に調整）内に流入した。１つのチューブに５尾ずつ血液を回収し、これを試験区ごとに統一することにより、１試験区５ｍｌのゼブラフィッシュ血液溶出バッファーを得た。
【００７１】
３）ゼブラフィッシュ血液中からの３８０Ｒに特異的な抗体の精製
Ｈｉ Ｔｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、回収したゼブラフィッシュ血液溶液から３８０Ｒに特異的な抗体（２次抗体、以下、ゼブラフィッシュＩｇとする）の精製をおこなった。ＰｒｏｔｅｉｎＡ（ＨＰ）カラムを用いたゼブラフィッシュ血液中からのＩｇの精製プロトコルを図２２に示した。精製ゼブラフィッシュＩｇ溶出液を５ｋＤａ限外ろ過フィルターＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を用いて１ｍｌ〜１．５ｍｌにまで濃縮し、１５ｍｌのリン酸バッファー（ｐＨ７．４）で懸濁した。再び５ｋＤａ限外ろ過フィルターＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａを用いて１ｍｌ〜１．５ｍｌにまで濃縮し、その後、タンパク質量をＢｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓｅｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてＢｒａｄ ｆｏｒｄ法にて測定した。
【００７２】
３．対象とする抗原に特異的な抗体の検出
（１）プルダウンアッセイによる３８０Ｒに特異的な抗体の検出
１）特異的抗体の吸着
大腸菌により作製し、Ｈｉｓ ｔａｇを合成して精製した３８０Ｒタンパク質を３μｌ（７８０ｍｇ／ｍｌ）とリン酸バッファー（ｐＨ７．４）５００μｌ、Ｎｉ−ＮＴＡ（ＱＩＡＧＥＮ）１５μｌを、各試験区ごとの１．５ｍｌチューブに加え、４℃で２時間振倒混合をおこなった。その後ゼブラフィッシュＩｇ精製液（３８０Ｒ表層発現酵母曝露試験区０．３６ｍｇ／ｍｌ、３８０Ｒ内部発現酵母曝露試験区０．３２ｍｇ／ｍｌ、３８０Ｒ未発現酵母曝露試験区０．２７ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれ１００μｌずつ加えて４℃で１２時間振倒混合をおこなった。
【００７３】
２）結合タンパク質の精製
上記３、（１）、１）で吸着させたサンプルを４℃で３，０００ｒｐｍ１０分間遠心分離し、ペレット状になったビーズ（以下、ビーズペレットとする）を吸わずに上澄みを除去し、そこにリン酸バッファー（ｐＨ７．４）を１０００μｌ加えてビーズペレットを懸濁し、４℃、４，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。次に再び出来たビーズペレットを２０ｍＭイミダゾール・リン酸バッファー（ｐＨ７．４）３００μｌを加えて懸濁し、４℃、４０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ遠心分離し、ビーズペレットを吸わずに上澄みを除去した。最後に出来上がったビーズペレットを５００ｍＭイミダゾール・リン酸バッファー（ｐＨ７．４）３０μｌで懸濁し、４℃、４０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ遠心分離して上澄みを回収し、これを３８０Ｒ−ゼブラフィッシュＩｇ結合プルダウン精製液とした。イミダゾール・リン酸バッファー（ｐＨ７．４）の組成は表１０に示した。
【００７４】
【表１０】
2007255892.tif 000011
【００７５】
３）３８０Ｒ合成タンパク質、ゼブラフィッシュＩｇの検出
３８０Ｒ−ゼブラフィッシュＩｇ結合プルダウン精製液をＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＮＩＴＲＡＴＥにスポットし、抗Ｈｉｓ ｔａｇ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてのウェスタンブロッティング、本研究室で作製したＩｇ重鎖抗体用いてのウェスタンブロッティングをおこなった。ウェスタンブロッティングは上記実施例１、２．５）と同様の手順によって行った。ここでは、抗原である３８０Ｒタンパク質に１次抗体となるゼブラフィッシュ血清中の特異的抗体が結合した状態のタンパク質複合体をＮｉ−ＮＴＡカラムで単離して溶出させた精製液をＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＮＩＴＲＡＴＥにスポットし、それを抗Ｈｉｓ ｔａｇ抗体を用いて検出した。
【００７６】
（２）結果
１）３８０Ｒ特異的ゼブラフィッシュＩｇの精製
上記１．（３）に記載の本研究室で作製したＩｇ重鎖抗体を用いてゼブラフィッシュ血液溶出バッファーでウェスタンブロッティングをおこなった結果、血液中ではタンパク質の共存物が多く、ゼブラフィッシュＩｇを検出することが出来なかった。そのためＨｉ Ｔｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎｓを用いてゼブラフィッシュＩｇを精製した後、精製したゼブラフィッシュＩｇを１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用アクリルアミドゲルで２０ｍＡ９０分間電気泳動し、ゲルをＣＢＢ染色した。図２３のａ．に示したように、レーンＳではゼブラフィッシュＩｇの重鎖と軽鎖が確認された。図２３のレーンＳはゼブラフィッシュＩｇ精製溶液、レーンＰはゼブラフィッシュＩｇ重鎖抗体を作製する時に用いた大腸菌由来によるゼブラフィッシュＩｇ重鎖の一部分をスポットしたことを示している。
さらに電気泳動したゲルからＣＥＬＬＵＬＯＳＥ  ＮＩＴＲＡＴＥにタンパク質を転写し、ウェスタンブロッティングを行ったところ、図２３のｂ．の矢印で示したように、レーンＳではゼブラフィッシュＩｇ重鎖抗体によりゼブラフィッシュＩｇの重鎖が検出された。濃縮をおこなった結果、タンパク質濃度は３８０Ｒ表層発現酵母曝露試験区０．３６ｍｇ／ｍｌ、３８０Ｒ内部発現酵母曝露試験区０．３２ｍｇ／ｍｌ、３８０Ｒ未発現酵母曝露試験区０．２７ｍｇ／ｍｌであった。これにより、ゼブラフィッシュ血液中に存在するゼブラフィッシュＩｇの検出が可能であることを証明した。なお、ウェスタンブロッティングは上記実施例１、２．５）と同様の手順によって行った。
【００７７】
２）プルダウンアッセイによる３８０Ｒ特異的抗体の検出
３８０Ｒ−ゼブラフィッシュＩｇ結合プルダウン精製液について、抗Ｈｉｓ ｔａｇ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いたウェスタンブロッティングと、本研究室で作製したＩｇ重鎖抗体用いたウェスタンブロッティングをおこなった。ウェスタンブロッティングは上記実施例１、２．５）と同様の手順によって行った。その結果、図２４のａ．に示したように、３試験区ともＨｉｓ ｔａｇ融合３８０Ｒタンパク質を検出することが出来たが、ｂ．に示したように、ゼブラフィッシュＩｇは３８０Ｒ表層発現酵母曝露区、３８０Ｒ内部発現酵母曝露区では検出できたものの、３８０Ｒ未発現酵母曝露区では検出されなかった。
これにより、両３８０Ｒ発現酵母区ではゼブラフィッシュ血液中で３８０Ｒに特異的に結合する抗体（ゼブラフィッシュＩｇ）が産生されていることが認められた。
【実施例５】
【００７８】
１．マダイＩｇ重鎖ウサギ血清抗体の作製
１）マダイ血液中からの血清サンプルの回収
マダイは和歌山県田辺湾内の網生簀で飼育した７歳魚（平均体重約５．５ｋｇ）を使用した。１０尾の成魚マダイの尾静脈あるいは尾動脈から１８Ｇの針を付けた５０ｍｌのディスポシリンジを用いて血液を採取した。これを５ｍｌの２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に懸濁し、ＴＯＭＹ  ＵＤ−２０１のソニケイターを使ってＯＵＴ  ＰＵＴ４  ＤＵＴＹ６０の条件で１０秒超音波による血液の破砕を行った後、４℃で７０００ｒｐｍの１０分間遠心分離をして上澄み液を回収した。
【００７９】
２）マダイ血清サンプル中のＩｇＭの精製
上記１、１）で回収したマダイ血清サンプルをＨｉ  Ｔｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＨＰ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、マダイＩｇＭのみを回収した。カラムから回収したマダイＩｇＭ溶出液をｐＨごとに５ｋＤａ限外ろ過フィルターＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａを用いて３０００ｒｐｍで２時間遠心濃縮した。
【００８０】
３）マダイ生体内で産生されるＩｇＭの精製およびその検出
上記１、２）で精製、濃縮したマダイＩｇＭ溶出液のタンパク質量をＢｒａｄｆｏｒｄ法にて測定した。測定にはＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いた。その結果、ｐＨ２．５〜３．５区では０．０２５μｇ／ｍｌ、ｐＨ４．５〜５．５区では０．００３μｇ／ｍｌであった。また、ＩｇＭ溶出液を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析したところ、図２５のａ．に示すように、およそ８５ｋＤａ付近にＩｇＭ重鎖のバンドが検出され、２０〜２５ｋＤａ付近にＩｇＭ軽鎖のバンドがそれぞれ検出された。電気泳動後のゲルからＩｇＭ重鎖のバンドのみを切り出し、実施例３、２．６）と同様の手法でマダイＩｇＭ重鎖タンパク質をゲルから溶出した。
【００８１】
４）マダイＩｇＭ重鎖タンパク質溶出溶液からＳＤＳの除去
上記１．３）で得られたマダイＩｇＭ重鎖タンパク質溶液を、両端をたこ紐で縛った透析チューブにいれ、２Ｌの透析用バッファー（Ｔｒｉｓ  ３．０３ｇ、グリシン  １４．４１ｇ）対して４℃で１晩透析した。透析した透析用バッファーを捨て、再び２Ｌの同バッファー中で透析を行った。この操作を２回行った。さらに、１０ｋＤａ限外ろ過フィルターＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を用いて、２，５００ｒｐｍで２時間遠心濃縮を行った。
【００８２】
５）マダイＩｇＭ重鎖タンパク質溶出溶液のタンパク質量の測定
上記１．４）で得られた透析後の溶液中に含まれるタンパク質量をＢｒａｄｆｏｒｄ法にて測定した。測定にはＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓｅｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いた。また、精製したＩｇ重鎖を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析したところ、図２５のｂ．に示すように、およそ８５ｋＤａ付近にＩｇ重鎖のバンドが検出された。
【００８３】
６）マダイＩｇＭ重鎖タンパク質ウサギ血清抗体の作製
上記１．５）で濃縮したマダイＩｇＭ重鎖タンパク質溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて、ウサギに対する抗マダイＩｇ重鎖タンパク質抗体を作製した。
即ち、抗原となるタンパク質溶液（１ｍｇ／ｍｌ）の４００μｌに対して、等量のアジュバンドを混合してウサギの耳静脈に注射した。追加免疫として、２週間後に２００μｌのタンパク質のみを再度ウサギ耳静脈に注射した。さらに、追加免疫として、２週間後に２００μｌのタンパク質のみを再度ウサギ耳静脈に注射した。最終的に、ウサギの全血液を採血し、軽く攪拌後、室温に放置して血小板成分を凝固させた。その後、３，５００ｒｐｍで５分間室温にて遠心分離して、血清成分のみを採取した。
【００８４】
７）抗マダイＩｇ重鎖タンパク質ウサギ血清抗体の有効性の確認
マダイ血清、ゼブラフィッシュ初期胚、ゼブラフィッシュ血清を１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用アクリルアミドゲルで２０ｍＡ２時間泳動し、泳動したゲルからタンパク質をＣＥＬＬＵＬＯＳＥ  ＮＩＴＲＡＴＥ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）に転写して上記２、３）で作製した抗マダイＩｇ重鎖タンパク質ウサギ血清抗体を用いてウェスタンブロッティングを行い、抗マダイＩｇ重鎖タンパク質ウサギ血清抗体の有用性を確認した。ウェスタンブロッティングは上記実施例１、２．５）と同様の手順によって行った。その結果、図２６に示すように、マダイＩｇＭ重鎖にのみ抗原抗体反応が検出され、ゼブラフィッシュ初期胚、ゼブラフィッシュ血清には反応が見られなかった。以上の結果から、作製したＩｇ重鎖抗体はマダイＩｇＭ重鎖に特異的なＩｇ重鎖抗体であることが判明した。
【実施例６】
【００８５】
対象とする抗原に特異的な抗体を検出する方法
１．試料の調製
（１）抗原（トランスジェニック酵母）
上記実施例４、１．（１）で作製した３８０Ｒ内部発現酵母と未発現酵母を抗原として使用した。
【００８６】
（２）実験対象魚（マダイ）の調製
マダイは５４日齢の稚魚を使用した。
１試験区に１５尾で３試験区、４５尾のマダイを供した。幅６０ｃｍ、奥行き３０ｃｍ、高さ３０ｃｍの水槽に２０Ｌの環境水をはり、その水槽を３個作成した。
【００８７】
（３）対象とする抗原に特異的な抗体（１次抗体）を検出するための抗体（２次抗体）の作製
Ｉｇ重鎖抗体（２次抗体）は、上記実施例５で作製したものを用いた。また、Ｉｇ重鎖抗体に特異的な標識抗体（３次抗体）はＧｏａｔ  Ａｎｔｉ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｉｇ’ｓ，ＨＲＰ（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ）を用いた。
【００８８】
２．対象とする抗原（３８０Ｒタンパク質）に特異的な抗体の産生
１）曝露試験
上記１．（１）の２種類の酵母（３８０Ｒ内部発現酵母、３８０Ｒ未発現酵母）を抗原として、それぞれ市販の配合飼料（日清丸紅飼料社製アルテックＫ−４）の５％の容量の水に酵母を湿重で０．５％（乾重で０．１％）添加し，給餌まで−２０℃で凍結保存した。未処理対照として，酵母を添加しない飼料区も設定した。給餌は１日３回，午前８時，午後１時および午後５時に行い，いずれの時間にも飽食量を与えた。給餌は１０日間行った。
【００８９】
２）マダイ血液のサンプリング
曝露試験の１４日後に各区より１０尾ずつの血液のサンプリングをおこなった。
サンプリングはマダイの尾静脈あるいは尾動脈から２４Ｇの針を付けた１ｍｌのディスポシリンジを用いて血液を採取した。
【００９０】
３）マダイ血液中からの３８０Ｒに特異的な抗体の精製
Ｈｉ  Ｔｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨＰ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、回収したマダイ血液溶液から３８０Ｒに特異的な抗体（２次抗体、以下、マダイＩｇとする）の精製をおこなった。図２２に示したＰｒｏｔｅｉｎＡ（ＨＰ）カラムを用いたマダイ血液中からのＩｇの精製プロトコルを用いた。精製の結果を図２７に示した。
この精製マダイＩｇ溶出液を５ｋＤａ限外ろ過フィルターＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を用いて１ｍｌ〜１．５ｍｌにまで濃縮し、１５ｍｌのリン酸バッファー（ｐＨ７．４）で懸濁した。再び５ｋＤａ限外ろ過フィルターＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａを用いて１ｍｌ〜１．５ｍｌにまで濃縮し、その後、タンパク質量をＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓｅｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてＢｒａｄ  ｆｏｒｄ法にて測定した。
【００９１】
３．対象とする抗原に特異的な抗体の検出
（１）プルダウンアッセイによる３８０Ｒに特異的な抗体の検出
１）特異的抗体の吸着
大腸菌により作製し、Ｈｉｓ  ｔａｇを合成して精製した３８０Ｒタンパク質を３μｌ（７８０ｍｇ／ｍｌ）とリン酸バッファー（ｐＨ７．４）５００μｌ、Ｎｉ−ＮＴＡ（ＱＩＡＧＥＮ）１５μｌを、各試験区の１．５ｍｌチューブに加え、４℃で２時間振倒混合をおこなった。その後マダイＩｇ精製液（３８０Ｒ内部発現酵母曝露試験区０．０３８μｇ／ｍｌ、３８０Ｒ未発現酵母曝露試験区０．０４５μｇ／ｍｌ）をそれぞれ１００μｌずつ加えて４℃で１晩振倒混合をおこなった。
【００９２】
２）結合タンパク質の精製
上記３．（１）、１）で吸着させたサンプルを４℃で３，０００ｒｐｍ１０分間遠心分離し、ペレット状になったビーズ（以下、ビーズペレットとする）を吸わずに上澄みを除去し、そこにリン酸バッファー（ｐＨ７．４）を１０００μｌ加えてビーズペレットを懸濁し、４℃、４，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。次に再びできたビーズペレットを２０ｍＭイミダゾール・リン酸バッファー（ｐＨ７．４）５００μｌを加えてゆっくり混合、洗浄し、４℃、４０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ遠心分離し、ビーズペレットを吸わずに上澄みを除去した。最後に出来上がったビーズペレットを５００ｍＭイミダゾール・リン酸バッファー（ｐＨ７．４）３０μｌで懸濁し、４℃、４０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ遠心分離して上澄みを回収し、これを３８０Ｒ−マダイＩｇ結合プルダウン精製液とした。イミダゾール・リン酸バッファー（ｐＨ７．４）は表１０の組成のものを用いた。
【００９３】
３）プルダウンアッセイによる３８０Ｒ特異的抗体の検出
３８０Ｒ−マダイＩｇ結合プルダウン精製液をＣＥＬＬＵＬＯＳＥ  ＮＩＴＲＡＴＥにスポットし、抗マダイＩｇ重鎖抗体用いてウェスタンブロッティングをおこない、各サンプルにおける３８０Ｒ特異的抗体の発現量を調べた。
サンプルとして３８０Ｒ内部発現酵母曝露区および３８０Ｒ未発現酵母曝露区において、マダイ血清中から精製したマダイＩｇＭ（以下、マダイＩｇとする）、このうち抗原である３８０Ｒタンパク質に結合するマダイＩｇＭ（以下、吸着とする）と、結合しないマダイＩｇＭを遠心分離によってわけて、それぞれ吸着、非吸着として用いた。
ウェスタンブロッティングは次の手順で行った。
（１）ろ紙１枚、リンスしたＣＥＬＬＵＬＯＳＥ  ＮＩＴＲＡＴＥをブロッキングｂｕｆｆｅｒ（１０×ＳＤＳ泳動ｂｕｆｆｅｒ  １０ｍｌ、メタノール  ２０ｍｌ、ｄＨ2Ｏ  ７０ｍｌ）に浸し３０ｍｉｎ室温に置いた。
（２）ラップの上に、乾いたろ紙、ブロッキングｂｕｆｆｅｒに浸したろ紙、ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ  ＮＩＴＲＡＴＥの順にのせ、各サンプルを１サンプル２．５μｌずつアプライした後、５ｍｉｎ室温に置いた。
（３）上記（２）でサンプルをアプライしたＣＥＬＬＵＬＯＳＥ  ＮＩＴＲＡＴＥを０．５％スキムミルク−ＰＢＳで３０ｍｉｎ〜２ｈｏｕｒ（４℃  ｏ／ｎ）ブロッキングした。
（４）上記（３）のＣＥＬＬＵＬＯＳＥ  ＮＩＴＲＡＴＥを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳでゆっくり振倒した（５ｍｉｎ×２回）。
（５）上記（４）に１次抗体（抗体液／ＰＢＳ）を加え、９０ｍｉｎ室温静置した。
（６）上記（５）を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳでゆっくり振倒した（５ｍｉｎ×２回）。
（７）上記（６）に２次抗体（ＨＲＰ抗体液／ＰＢＳ）を加え、６０ｍｉｎ室温静置した。
（８）上記（７）を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳでゆっくり振倒した（５ｍｉｎ×３回）。
（９）上記（８）を発色基質（５ｍｌＰＢＳ，５μｌＨ2Ｏ2，５ｍｇＤＡＢ）で発色した。
（１０）上記（９）の頃合をみてＨ2Ｏで反応停止した。
（１１）上記（１０）を風乾した。
【００９４】
その結果、図２８、２９に示したように、マダイＩｇは３８０Ｒ内部発現酵母曝露区では他の試験区に比べて顕著に３８０Ｒ特異的Ｉｇが存在することが確認された。これにより、３８０Ｒ内部発現酵母曝露区ではマダイ血液中で３８０Ｒに特異的に結合する抗体（マダイＩｇ）が抗原タンパク質（３８０Ｒ）に依存的により多く産生されていることが認められた。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明の対象とする抗原に特異的な抗体を検出する方法を用いることにより、多種多様
な抗原タンパク質に対する抗体産生をチェックすることができ、免疫付括する機能性ペプ
チドのスクリーニングにも利用できる。また、免疫グロブリンＩｇＭの抑制や付括に関す
る医薬品のスクリーニングにも利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】ゼブラフィッシュにおける２種類のＩｇＭ重鎖アミノ酸配列を比較した図である（実施例１）。
【図２】ゼブラフィッシュｓＩｇアミノ酸配列のドメインを示した図である（実施例１）。
【図３】ゼブラフィッシュｓＩｇ重鎖遺伝子のゲノム上の構成を示した図である（実施例１）。
【図４】クローニング断片のアミノ酸翻訳配列およびｓＩｇ重鎖のアミノ酸配列との比較した図である（実施例１）。
【図５】ＰＣＲ反応に用いたプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ ＦおよびＰｒｉｍｅｒ Ｒ）の配列を示した図である（実施例１）。
【図６】ウェスタンブロッティングによる大腸菌由来ｚＩｇＭ３００タンパク質発現の検出を示した図である（実施例１）。
【図７】大腸菌発現系による不溶性ｚＩｇＭ３００タンパク質の可溶化を確認した図である（実施例１）。
【図８】Ｎｉ−ＮＴＡを用いたＨｉｓ ｔａｇを付加した目的タンパク質の精製プロトコルを示した図である（実施例１）。
【図９】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる大腸菌由来のｚＩｇＭ３００タンパク質の精製を確認した図である（実施例１）。
【図１０】抗ｚＩｇＭ３００タンパク質ウサギ血清抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果を示した図である（実施例１）。
【図１１】ゼブラフィッシュ血清からのＩｇＭの精製プロトコルを示した図である（実施例２）。
【図１２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるゼブラフィッシュ血清サンプル中のＩｇＭの検出を示した図である（実施例２）。
【図１３】抗ゼブラフィッシュＩｇＭ重鎖タンパク質ウサギ血清抗体を用いたゼブラフィッシュＩｇＭの検出を示した図である（実施例２）。
【図１４】ゼブラフィッシュにおける臓器別ウェスタンブロッティングの結果を示した図である（実施例２）。
【図１５】ＰＣＲ反応に用いたプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ ＦおよびＰｒｉｍｅｒ Ｒ）の配列を示した図である（実施例３）。
【図１６】不溶性画分タンパク質の精製の手順を示した図である（実施例３）。
【図１７】蛍光抗体染色法の手順を示した図である。（実施例３）
【図１８】抗Ｈｉｓ ｔａｇ抗体を用いた蛍光抗体染色の結果を示した図である（実施例４）。
【図１９】３８０Ｒタンパク質ウサギ血清抗体を用いた蛍光抗体染色の結果を示した図である（実施例４）。
【図２０】抗Ｈｉｓ ｔａｇ抗体及び３８０Ｒタンパク質ウサギ血清抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果を示した図である（実施例４）。
【図２１】曝露試験の工程を示した図である（実施例４）。
【図２２】ゼブラフィッシュ血液中からのＩｇの精製プロトコルを示した図である（実施例４）。
【図２３】精製ゼブラフィッシュＩｇＭのＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングの結果を示した図である（実施例４）。
【図２４】抗ＨＩＳ ｔａｇ抗体と抗ゼブラフィッシュＩｇＭ重鎖タンパク質ウサギ血清抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果を示した図である（実施例４）。
【図２５】マダイＩｇＭの及び単離したマダイＩｇ重鎖のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した図である（実施例５）。
【図２６】抗マダイＩｇ重鎖タンパク質ウサギ血清抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果を示した図である（実施例５）。
【図２７】マダイにおける３８０Ｒに特異的な抗体の精製を示した図である（実施例６）。
【図２８】マダイにおける３８０Ｒ特異的抗体の検出を示した図である（実施例６）。
【図２９】マダイにおける３８０Ｒ特異的抗体の発現量を示した図である（実施例６）。
【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図１５】
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【図２１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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