(57)【要約】【課題】本発明の目的は、動物細胞に核酸を導入する際、遺伝子導入を妨げることなく、細胞障害を低減する方法を提供することにある。【解決手段】核酸導入（トランスフェクション）用試薬を用いて動物細胞に核酸を導入する際の細胞障害を低減するための方法であって、核酸導入後に培地に酸性多糖成分を添加することを特徴とする細胞障害の低減方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸導入（トランスフェクション）用試薬を用いて動物細胞に核酸を導入する際の細胞障害を低減するための方法であって、核酸導入後に培地に酸性多糖成分を添加することを特徴とする細胞障害の低減方法。
【請求項２】
酸性多糖が硫酸基を有することを特徴とする、請求項１に記載の細胞障害の低減方法。
【請求項３】
酸性多糖が２糖以上の繰り返し構造を有することを特徴とする、請求項２に記載の細胞障害の低減方法。
【請求項４】
酸性多糖がヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、フコイダン、デキストラン硫酸、ケラタン硫酸からなる群より選択される１つ以上である、請求項３に記載の細胞障害の低減方法。
【請求項５】
酸性多糖が、低分子量化されていることを特徴とする請求項４に記載の細胞障害の低減方法。
【請求項６】
酸性多糖を、核酸導入後２時間以降（２時間は含まない）に培地に添加することを特徴とする請求項１に記載の細胞障害の低減方法。
【請求項７】
酸性多糖成分の添加時に培地交換を行う請求項１に記載の細胞障害の低減方法。
【請求項８】
細胞への核酸の導入に、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、脂質、リポソーム、ポリマーからなる群より選択される物質を用いる、請求項１に記載の細胞障害の低減方法。
【請求項９】
請求項１〜８に記載の方法で使用する酸性多糖を成分として含む、細胞障害を低減させる試薬またはキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を導入する際、細胞への導入を妨げることなく、細胞障害を低減する方法に関する。更に詳しくは、核酸導入後の適切な時間に、酸性多糖を添加することにより、効率的な核酸の導入と細胞障害の低減の両方を成し遂げるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞に核酸を導入する技術は、遺伝子産物の機能解析、タンパク質発現、遺伝子発現の抑制、転写制御領域の解析などの基礎的な分野から、遺伝子治療等の応用分野まで、幅広く用いられる基本的な技術となっている。
【０００３】
細胞に核酸を導入する方法として、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法などの物理的方法、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、脂質、リポソーム、ポリマー等の物質を用いる化学的方法、アデノウイルス、レトロウイルス等を用いる生物学的方法が知られている。化学的方法は、簡便であるため、現在、様々な核酸導入用試薬が市販され、広く使用されている。また、これらの方法は、安全性が高い、大スケールでの製造が容易、簡便に使用可能等の理由により、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用にも適していると考えられている。
【０００４】
しかしながら、これらの手法の欠点として、細胞障害が生じやすい、核酸の導入が困難な細胞が存在する、実験の再現性が低い、等が挙げられるが、その中でも、最も深刻なのは細胞障害である。細胞障害は、核酸導入用試薬の種類および使用量、ＤＮＡと核酸導入用試薬の混合比、細胞の種類、核酸導入時の細胞数、細胞の状態等の諸要因に影響を受ける。細胞への核酸の導入率もまた、これらの要素の影響を受け、細胞へのダメージを低減するために上記条件を調節すると、導入率の低下が見られることが多い。
【０００５】
細胞障害を低減させる方法として、核酸を導入した後に、培地交換を行う方法が提唱されているが、それほどの効果が認められないことが多く、また、煩雑な手間がかかるとの問題がある。更に、培地交換を行うタイミングによっては、細胞への核酸の導入率が低下してしまうこともある。
【０００６】
核酸導入時に表れる細胞への障害を低減する方法として、唯一Ｄｒａｇｏｍｉｒ，  Ａ．らによって、低分子量化ヘパリンをトランスフェクション後２時間以内に添加する方法が報告されている（非特許文献１）。この報告では、ＣＦＢＥ（Ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）、ＣＦＳＭＥ（Ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｓｕｂｍｕｃｏｓａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）細胞を対象に、ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ２（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）あるいはポリエチレンイミン（２５ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）を用いトランスフェクションを実施し、トランスフェクションの２時間後に、新しい培地に交換、培地中に低分子量化ヘパリンを添加することで、細胞障害を低減可能であることが示されている。しかしながら、この方法では、顕著な遺伝子導入率の低下が見られている。すなわち、効率的な核酸の導入と細胞障害の低減の２つの課題を同時に達成できていない。また、この方法は、トランスフェクション後に培地を除去し、新しい培地に交換する過程を含んでおり、煩雑な手間がかかってしまう。
【非特許文献１】Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ７５，  ２２０３−２２１６  （２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来技術では、低分子量化ヘパリンの添加により、核酸導入時に表れる細胞障害を低減することが可能であるものの、細胞への核酸の導入が妨げられるとの問題がある。従って、本発明の目的は、動物細胞に核酸を導入する際、遺伝子導入を妨げることなく、細胞障害を低減する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、種々検討の結果、意外にも、トランスフェクションから低分子量化ヘパリンの添加までの時間（トランスフェクションにより障害を受けた細胞の回復に寄与する低分子化ヘパリンを添加するまでの時間）を、逆に２時間からさらに延長することにより、遺伝子導入率を低下させることなく、細胞障害の低減が可能であることを見出した。
本発明者らは、また、フコイダン、ヘパリン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸Ｃ、アルギン酸、コンドロイチン硫酸Ｂなどの、低分子量化ヘパリン以外の化合物を用いることで細胞障害が低減することも見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
項１． 
核酸導入（トランスフェクション）用試薬を用いて動物細胞に核酸を導入する際の細胞障害を低減するための方法であって、核酸導入後に培地に酸性多糖成分を添加することを特徴とする細胞障害の低減方法。
項２．
酸性多糖が硫酸基を有することを特徴とする、請求項１に記載の細胞障害の低減方法。
項３．
酸性多糖が２糖以上の繰り返し構造を有することを特徴とする、請求項２に記載の細胞障害の低減方法。
項４．
酸性多糖がヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、フコイダン、デキストラン硫酸、ケラタン硫酸からなる群より選択される１つ以上である、請求項３に記載の細胞障害の低減方法。
項５．
酸性多糖が、低分子量化されていることを特徴とする請求項４に記載の細胞障害の低減方法。
項６．
酸性多糖を、核酸導入後２時間以降（２時間は含まない）に培地に添加することを特徴とする請求項１に記載の細胞障害の低減方法。
項７．
酸性多糖成分の添加時に培地交換を行う請求項１に記載の細胞障害の低減方法。
項８．
細胞への核酸の導入に、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、脂質、リポソーム、ポリマーからなる群より選択される物質を用いる、請求項１に記載の細胞障害の低減方法。
項９．
請求項１〜８に記載の方法で使用する酸性多糖を成分として含む、細胞障害を低減させる試薬またはキット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、細胞への核酸の導入を妨げることなく、核酸導入時に表れる細胞障害を低減することができるようになった。そのため、動物細胞への核酸の導入を簡便、容易、かつ、再現性よく実施できるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明でいう、細胞障害とは、核酸導入用試薬の添加によって引き起こされる細胞死、あるいは、細胞の形態変化を意味する。この細胞障害は、核酸導入実施後、ＭＴＴ法、ＬＤＨ法などにより評価することができる。ＭＴＴ法では、ＭＴＴ、ＸＴＴ、ＭＴＳ、ＷＳＴ等のテトラゾリウム塩を用い、これらの物質が生細胞内ミトコンドリア脱水素酵素によって還元され、ホルマザンを生成する性質を利用している。本方法では、生じたホルマザンの吸光度を測定することにより、生細胞数を算出することができる。また、ＬＤＨ法では、細胞膜に障害を受けた死細胞から遊離した乳酸脱水素酵素を測定することにより、細胞障害を評価する。
【００１２】
本発明は、核酸導入後に酸性多糖成分を添加することを特徴とする細胞障害の低減方法である。
【００１３】
酸性多糖成分は、バッファーに溶解し、水溶液として添加することが好ましい。酸性多糖成分を溶解するバッファーとしては、特に限定されないが、例えばＨＥＰＥＳバッファー、リン酸バッファーなどがあげられる。
【００１４】
本発明において、トランスフェクション後に添加する多糖は、酸性残基を有している、いわゆる酸性多糖と呼ばれるものを用いる。好ましくは、硫酸基を有するもので、例えばヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、フコイダン、デキストラン硫酸、ケラタン硫酸があげられる。より好ましくは、糖２分子当たり、硫酸基を複数含むものであり、特に限定されないが、ヘパリン、ヘパラン硫酸、フコイダン、デキストラン硫酸があげられる。更に好ましくは、酸性多糖が生体由来であるものであり、例えば、ヘパリン、ヘパラン硫酸があげられる。
【００１５】
また、酸性多糖は、低分子量化されていてもよく、例えば、低分子量化ヘパリン、低分子量化フコイダンを用いてもよい。ここでいう低分子量化とは、酸性多糖を化学的または酵素的に分解することを意味する。用いる低分子量化ヘパリン、低分子量化フコイダンは、好ましくは分子量２，０００〜８，０００Ｄａ、更に好ましくは分子量４，０００〜６，０００Ｄａのものである。
【００１６】
また、本発明における酸性多糖は、種々の塩の化合物として供給されると考えられるが、種類は限定されない。例えば、ナトリウム塩、アンモニウム塩、リチウム塩、カルシウム塩を用いることができる。
【００１７】
本発明においては、トランスフェクションから酸性多糖の添加までの時間（トランスフェクションにより障害を受けた細胞の回復に寄与する酸性多糖を添加するまでの時間）は、２時間を超える長さとすることが好ましく、より好ましい下限は３時間、更に好ましくは４時間、より好ましい上限は１２時間、更に好ましくは１０時間である。これにより、遺伝子導入率を低下させることなく、細胞障害の低減が可能になる。
【００１８】
また本発明においては、核酸の導入後、培地交換を行い、核酸導入用試薬を除去した後に、酸性多糖成分の添加を行ってもよい。培地交換のタイミングは、酸性多糖成分の添加の直前が好ましい。この場合、単に酸性多糖成分を添加したときと比較し、更なる細胞障害の低減効果が得られることがある。
【００１９】
本発明において、細胞への核酸の導入方法には特に限定されない。核酸の導入方法として、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポフェクション法などが挙げられる。
今回の検討では核酸導入用試薬として、ポリマーの1種のポリエチレンイミン、および、脂質を主成分とするＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いたが、本発明の範囲は、これらに限定されるものではなく、核酸を導入するために、他の脂質、あるいは、他のポリマーを主成分とする試薬、あるいは、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランを主成分とするいずれの試薬を用いても差し支えない。
【００２０】
また本発明においては、導入する核酸の種類にも限定されない。非特許文献１では、プラスミドＤＮＡを導入した場合に、細胞障害の低減が可能であるとの結果が開示されているのみである。一方、本発明では、プラスミドＤＮＡだけでなく、ＲＮＡ、および、ｓｉＲＮＡを導入した場合でも、酸性多糖の添加により、細胞障害の低減が可能であった。
【００２１】
当然、使用する細胞の種類も限定されるものではない。今回、ＣＯＳ−７細胞（アフリカミドリザル腎由来）、および、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頚部癌由来）を用い検討を行ったが、他の動物細胞を対象に核酸の導入を行った後に、酸性多糖を添加してもよい。
【００２２】
本発明は、更に、本発明の方法で使用する酸性多糖を成分とする細胞障害を低減させる試薬、キットにも及ぶ。本発明の方法を含む試薬を供給することで、多くのユーザーが核酸導入実験を容易にかつ再現性よく実施することができるようになると予想されるからである。
【００２３】
本発明の一態様としては、核酸導入時の細胞障害を低減する試薬、キットを考えることができる。
具体的には、例えば、０．１〜１０ｍｇ／ｍＬのヘパリン溶液あるいは低分子量化ヘパリン溶液を供給する形態が考えられる。それを、市販あるいは別途調製したトランスフェクション試薬と組み合わせて使用する。例えば、トランスフェクション試薬を用いて核酸を導入し、その２時間後以降（２時間は含まない）に、ヘパリン溶液あるいは低分子量化ヘパリン溶液を培地に添加することにより、細胞の障害性を防止することができる。
あるいは、例えば、上記低分子量化ヘパリン溶液とトランスフェクション試薬とをセットにしたものも、本願発明の試薬またはキットに含まれる。更に、例えば、上記低分子量化ヘパリン溶液、トランスフェクション試薬に加えて、細胞に導入する核酸をセットにしたものもまた、本願発明の試薬またはキットに含まれる。
【実施例】
【００２４】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２５】
実施例１：低分子量化ヘパリン添加のタイミングの細胞生存率、遺伝子導入率に及ぼす影響
トランスフェクション前日に、１２ウェルプレートに１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでＣＯＳ−７細胞を播種した。トランスフェクションは、ポリエチレンイミン（２５ｋＤａ、Ａｌｄｒｉｃｈ製）あるいはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて行った。
ポリエチレンイミンを用いた場合は、以下の手順に従いトランスフェクションを実施した。ｐＱＢＩ２５（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）３．０μｇとポリエチレンイミン３．０μｇを無血清Ｄ−ＭＥＭ中で混合し、室温で２０分間静置した。予め、培地を無血清Ｄ−ＭＥＭに交換しておいた各ウェルに、作成したプラスミドＤＮＡとポリエチレンイミンの複合体溶液を添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内でインキュベートした。インキュベート２、４、６、８、１０時間後に、ＰＢＳに溶解した１．２５ｍｇ／ｍＬ低分子量化ヘパリン（４，０００−６，０００Ｄａ、Ｓｉｇｍａ製）溶液１０μＬを添加した。低分子量化ヘパリン添加の１日後、血清含有Ｄ−ＭＥＭ  １ｍＬ  を添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で更に１日間インキュベートした。
また、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いた場合は、以下の手順に従いトランスフェクションを実施した。ｐＱＢＩ２５  １．０μｇとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００  ２．５μＬをＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）中で混合し、室温で２０分間静置した（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００の取扱説明書参照）。各ウェルに、作成したプラスミドＤＮＡとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００の複合体溶液を添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内でインキュベートした。インキュベート２、４、６、８、１０時間後に、ＰＢＳに溶解した１．２５ｍｇ／ｍＬ低分子量化ヘパリン溶液１０μＬを添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で更に２日間インキュベートした。
トランスフェクション後の細胞障害は、テトラゾリウム塩ＷＳＴ−８を含む市販のキットを用い、評価した。具体的には、生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク社製）を各ウェルに１００μＬ添加、３７℃にて２０分間インキュベート後、マイクロプレートリーダーを用い、６５０ｎｍの吸光度を参照に、４５０ｎｍの吸光度を測定した。得られた吸光度を基に、トランスフェクションしていない細胞の生存率を１００％とし、トランスフェクション後の細胞生存率を算出した。次に、遺伝子導入率について、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）解析により測定した。すなわち、トランスフェクション２日後の細胞をトリプシンで処理後、ＰＢＳ中に浮遊させ、サンプルとし、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン社製）を用い、ＧＦＰの発現の有無により遺伝子導入率を算出した。
その結果、図１、２に示す結果を得ることができた。図１、２は、それぞれポリエチレンイミン、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用い、トランスフェクションを実施し、低分子量化ヘパリン添加のタイミングを検討した際の細胞生存率、遺伝子導入率を示す図である。どちらの核酸導入用試薬を用いた場合でも、トランスフェクションの２時間後に低分子量化ヘパリンを添加した場合、十分な細胞障害の低減効果が見られているものの、遺伝子導入率の低下も見られていた。一方、トランスフェクションの４時間後以降に低分子量化ヘパリンを添加した場合には、遺伝子導入率の低下はあまり見られておらず、本条件により細胞障害の低減と効率的な核酸の導入の両方を実現可能であることがわかった。
【００２６】
図１は、低分子量化ヘパリンの添加タイミングに着目し、その細胞生存率、遺伝子導入率に及ぼす影響について、非特許文献１で使用されているポリエチレンイミン（２５ｋＤａ、Ａｌｄｒｉｃｈ製）を核酸導入用試薬として用い、ＣＯＳ−７細胞を対象に検討した結果を示す。
トランスフェクションの２時間後に低分子量化ヘパリンを添加した場合、十分な細胞障害の低減が見られたものの、低分子量化ヘパリン未添加と比較し遺伝子導入率の低下が見られていた。一方、トランスフェクションから低分子量化ヘパリンの添加までの時間を延長することにより、遺伝子導入率を低下させることなく、細胞障害の低減が可能であった。
【００２７】
図２は、代表的な核酸導入用試薬のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用い、ＣＯＳ−７細胞を対象にトランスフェクションを実施、低分子量化ヘパリンの添加タイミングの細胞生存率、遺伝子導入率に及ぼす影響について検討した結果を示す。
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いた場合でも、トランスフェクションの２時間後に低分子量化ヘパリンを添加した場合は、十分な細胞障害の低減が見られたものの、低分子量化ヘパリン未添加と比較し遺伝子導入率の低下が見られていた。一方、トランスフェクションから低分子量化ヘパリンの添加までの時間を延長することにより、遺伝子導入率を低下させることなく、細胞障害の低減が可能であった。
【００２８】
以上をまとめると、低分子量化ヘパリン添加のタイミングの細胞生存率、遺伝子導入率に及ぼす影響について検討した結果、核酸の導入から低分子量化ヘパリンの添加までの時間を延長することにより、細胞障害の低減効果を維持しつつ、かつ、効率的に核酸を導入することが可能であった。また、用いる核酸導入用試薬はポリエチレンイミンに限定されず、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いた場合でも、低分子量化ヘパリンの添加により、細胞障害の低減が可能であった。
【００２９】
実施例２：各種酸性多糖の添加による細胞生存率、遺伝子導入率に及ぼす影響
トランスフェクション前日に、１２ウェルプレートにＣＯＳ−７細胞の場合１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、ＨｅＬａ細胞の場合１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。トランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用い、以下の手順で行った。ｐＱＢＩ２５（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）１．０μｇとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００  ２．５μＬをＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）中で混合し、室温で２０分間静置した（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００の取扱説明書参照）。各ウェルに、作成したプラスミドＤＮＡとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００の複合体溶液を添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内でインキュベートした。インキュベート６時間後、ＰＢＳに溶解した１．２５ｍｇ／ｍＬ各種酸性多糖溶液１０μＬを添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で更に２日間インキュベートした。酸性多糖は、低分子量化ヘパリン、フコイダン、ヘパリン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸Ｃ、アルギン酸、コンドロイチン硫酸Ｂ、ヒアルロン酸の計８種類を用いた。
トランスフェクション後の細胞障害は、テトラゾリウム塩ＷＳＴ−８を含む市販のキットを用い、評価した。具体的には、生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク社製）を各ウェルに１００μＬ添加、３７℃にて２０分間インキュベート後、マイクロプレートリーダーを用い、６５０ｎｍの吸光度を参照に、４５０ｎｍの吸光度を測定した。得られた吸光度を基に、トランスフェクションしていない細胞の生存率を１００％とし、トランスフェクション後の細胞生存率を算出した。次に、遺伝子導入率について、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）解析により測定した。すなわち、トランスフェクション２日後の細胞をトリプシンで処理後、ＰＢＳ中に浮遊させ、サンプルとし、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトンディッキンソン社製）を用い、ＧＦＰの発現の有無により遺伝子導入率を算出した。
その結果、表１に示す結果を得ることができた。表１は、検討した酸性多糖の特徴と細胞障害の低減効果の強弱の関係を示す表である。表１には、ＣＯＳ−７細胞、ＨｅＬａ細胞を対象に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いトランスフェクションを実施し、その６時間後、各種化合物を添加して検討した結果を示す。
ＣＯＳ−７細胞、ＨｅＬａ細胞のどちらを対象とした場合も、低分子量化ヘパリン、フコイダン、ヘパリン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸Ｃ、アルギン酸、コンドロイチン硫酸Ｂなどの酸性多糖で細胞障害の低減が確認できた。しかし、同じ酸性多糖でもヒアルロン酸では細胞障害の低減が確認できなかった。また、糖２分子当たりに硫酸基を複数（好ましくは１．５〜４分子）含む、低分子量化ヘパリン、フコイダン、ヘパリン、デキストラン硫酸の４種類では、大幅な細胞障害の低減が可能であった。更に、フコイダン、ヘパリン、デキストラン硫酸を用いた場合では、低分子量化ヘパリンを上回る細胞障害の低減効果を確認できた。このとき、どの酸性多糖を用いた場合も、遺伝子導入率の低下はほとんど認められなかった。
なお、低分子量化ヘパリンを遺伝子導入直後に添加した場合はほとんど遺伝子導入されなかった。また、遺伝子導入２時間後に添加した場合でも、遺伝子導入率は２５−２６％にとどまった。（比較例）
このように、本発明者らは、フコイダン、ヘパリン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸Ｃ、アルギン酸、コンドロイチン硫酸Ｂなどの、低分子量化ヘパリン以外の化合物を用いることで細胞障害が低減することを見出した。
【００３０】
【表１】
2007289162.tif 000002
【００３１】
実施例３  ｓｉＲＮＡ導入系での低分子量化ヘパリンの細胞障害低減効果の確認
実施例１で、プラスミドＤＮＡのかわりに、ｓｉＲＮＡを用い、低分子量化ヘパリンの効果を検討した。
Ｎｅｕｒｏ  ２ａ細胞、あるいは、ＨｅＬａ細胞を対象に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いてトランスフェクションを行う系で検討した。具体的には、Ｎｅｇ．  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ，  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（Ｑｉａｇｅｎ製）６０ｐｍｏｌとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００  ３．０μＬをＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ中で混合し、室温で２０分間静置した（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００の取扱説明書参照）。各ウェルに、作成したｓｉＲＮＡとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００の複合体溶液を添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内でインキュベートした。インキュベート６時間後に、ＰＢＳに溶解した１．２５ｍｇ／ｍＬ低分子量化ヘパリン溶液１０μＬを添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で更に２日間インキュベートした。その後、実施例１での方法を用いて、トランスフェクション後の細胞生存率を算出した。その結果、プラスミドＤＮＡのかわりに、ｓｉＲＮＡを用いた場合でも、低分子量化ヘパリンによる細胞障害の低減が確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明の核酸導入時の細胞障害を低減する方法により、効率的な核酸の導入を妨げることなく、細胞への障害を低減することが可能である。遺伝子産物の機能解析、タンパク質発現、遺伝子発現の抑制、転写制御領域の解析などの基礎的な分野から、遺伝子治療等の応用分野にまで利用することができ、産業界に大きく寄与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＣＯＳ−７細胞を対象にポリエチレンイミンでトランスフェクションを実施後、低分子量化ヘパリン添加のタイミングを検討した際の、細胞生存率と遺伝子導入率を示す図。図の見方は、例えば、細胞生存率６０％で導入率４０％のとき、当初１００個の細胞があったとすると、１００×０．６×０．４＝２４個の細胞に導入されることを示す。トランスフェクション実施直後の細胞生存率は１００％で導入率は０％である。
【図２】ＣＯＳ−７細胞を対象にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００でトランスフェクションを実施後、低分子量化ヘパリン添加のタイミングを検討した際の、細胞生存率と遺伝子導入率を示す図。図の見方は、図１と同じ。
【図１】
2007289162.tif 000003
【図２】
2007289162.tif 000004