(57)【要約】【課題】マイクロアレイにおける効率的なデータ解析手法を提供すること。【解決手段】  多数のプローブを含むブロックを複数配置したプローブ担体を試料と反応させて得られる反応データの処理法を、前記試料と反応した前記プローブ担体からシグナルを検出する工程；前記検出したシグナルに基づいてデータ列を作成する工程；前記データ列を周波数変換する工程；前記周波数変換されたデータから前記ブロックの繰り返しに対応する周波数成分をフィルタリングする工程；及び前記フィルタリング後の周波数成分を逆周波数変換することで反応データを得る工程を含む反応データの処理方法とする。【選択図】図１
2007183257.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多数のプローブを含むブロックを複数配置したプローブ担体を試料と反応させて得られる反応データの処理法において、以下の工程：
前記試料と反応した前記プローブ担体からシグナルを検出する工程；
前記検出したシグナルに基づいてデータ列を作成する工程；
前記データ列を周波数変換する工程；
前記周波数変換されたデータから前記ブロックの繰り返しに対応する周波数成分をフィルタリングする工程；及び
前記フィルタリング後の周波数成分を逆周波数変換することで反応データを得る工程；
を含むことを特徴とする反応データの処理法。
【請求項２】
前記周波数変換はフーリエ変換である請求項１に記載の処理法。
【請求項３】
前記フィルタリングは、ハイパスフィルタ特性を持つものであり、カットオフ周波数は前記ブロックの繰り返しに対応する周波数である請求項１に記載の処理法。
【請求項４】
前記データ列は、前記検出されたシグナルに基づいてブロック毎に一次元のデータ列を作成し、更に、各ブロックの前記一次元データ列を結合したデータ列を作成する請求項１に記載の処理法。
【請求項５】
前記フィルタリングとして、前記複数の１つのブロックに含まれるプローブの全数を一周期とした周波数成分より低周波の成分をカットするフィルタリングを行なう請求項１に記載の処理法。
【請求項６】
前記ブロックには、前記試料中の標的物質と反応可能なプローブとマーカープローブとが含まれる請求項１に記載の処理法。
【請求項７】
前記データ列の作成において、前記検出されたシグナルに基づいて前記マーカープローブに対応したデータ列を作成する請求項６に記載の処理法。
【請求項８】
前記フィルタリングは、ハイパスフィルタ特性を持つものであり、カットオフ周波数は前記ブロックに含まれる前記マーカープローブ数を一周期としたものである請求項７に記載の処理法。
【請求項９】
前記フィルタリングは、前記複数１つのブロックに含まれるマーカープローブの全数を一周期とした周波数成分よりも低周波の成分をカットするフィルタリングを行なう請求項７に記載の処理法。
【請求項１０】
前記フィルタリングした周波数成分を逆周波数変換することで得られた反応データに基づいて、前記マーカープローブ以外のプローブに対応するシグナルの補正を行う請求項７に記載の処理法。
【請求項１１】
前記プローブは核酸である請求項１に記載の処理法。
【請求項１２】
前記プローブはペプチド核酸である請求項１に記載の処理法。
【請求項１３】
前記ブロックは所定の間隔で２次元に配置されている請求項１に記載の処理法。
【請求項１４】
前記マーカープローブは、各ブロック内で対角線上に配置されている請求項７に記載の処理法。
【請求項１５】
前記マーカープローブは、各ブロックを囲むように配置されている請求項７に記載の処理法。
【請求項１６】
前記フィルタリングは、列配置されたマーカープローブと行配置されたマーカープローブに分けて行なわれる請求項１５に記載の処理法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の生体物質検出用の核酸やペプチド断片などの試料検査用プローブの多数を固相担体に固定したプローブ固定担体、あるいは試料中の標的物質を固定した担体でのこれらの反応結果から反応データを取得する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
検出対象物質に特異的に結合し得る多数のプローブを固相担体に所定の配置で固定したプローブ固定担体の代表例としてマイクロアレイが知られている。このマイクロアレイは、プローブの多数の微小スポットを高密度に固相担体の２次元平面上に固定したものである。このマイクロアレイに試料を反応させて、反応があったプローブと無かったプローブをこれらプローブの固定された位置によって見分け、反応があったプローブの種類に基づいて試料中に含まれる物質の検出やその構造の特定を行うことができる。つまり、マイクロアレイを用いることで、同時に複数の反応を少ない試料に対して並列に行い、各反応の結果をプローブ固定位置のアドレス情報を基に知ることができるようになっている。
【０００３】
各反応の結果は、少量の反応産物でも観察できるように、ラジオ・アイソトープ(RI)や蛍光標識などで検出される。近年は取扱いに制限があるなどの理由からRIの使われる頻度は減っている。
【０００４】
蛍光によって標識した場合には、その結果をスキャナ等で読み取ることができ、位置情報も含めた画像データが結果として得られる。この画像データを解析することによって判定結果を得ることになる。
【０００５】
マイクロアレイに固定された各プローブの位置をアドレス情報により特定する場合には、結果として得られた上記画像データには規則的パターンが現れる。それは例えばAffymetrix社のGeneChipにみられるようなタイル状のパターンや、スポッティングによって作成されたマイクロアレイのようにスポットが格子状に並んだものなどが知られている。
【０００６】
マイクロアレイに固定された各プローブあるいは各スポットに識別用のタグをつけ、この識別用のタグにより各プローブを特定する場合は、多数のプローブの固定位置は規則的である必要はなくランダムであっても構わない。しかし実際にはある程度の規則性をもって固定される例が多い。そのようなタグを利用する方法の例としては、Illumina社のGoldenGate Assay法(米国特許第6355431号)などが知られている。
【０００７】
画像データ内の規則性を利用して画像データを解析し、補正等を加えて画像データを処理する方法としては様々なものがある。画像データを解析技術を応用して画像の欠陥検査などに用いる方法としては、半導体ウェハの規則的パターン中の欠陥をみつける表面検査法（特開平8-45999号）がある。また、画像データ解析のマイクロアレイへの応用としては、Media Cybernetics社のArrayPro（米国特許第6498863号）が知られている。
【０００８】
ArrayProは、マイクロアレイから得られる蛍光画像が、輝度の高いスポット部分や正方形タイルが規則的に格子状に並んでいることを利用して、画像内での生体試料が存在する領域の情報を自動抽出するソフトウェアである。それまでのスポット抽出ソフトウェアの多くは、あらかじめ作成された格子パターンを目視で画像の上に重ねる作業があったが、ArrayProによって自動的にスポット抽出することが可能となり、マイクロアレイ解析のHighThroughPut化に大きく貢献した。
【０００９】
このように画像データの規則性を利用することによるスポット抽出は可能となったが、そこからさらに、得られたデータから有意な判定をする必要がある。
【００１０】
マイクロアレイの用途は様々であるが、例えば核酸を固定したDNA（もしくはRNA）マイクロアレイにおいては、反応の過程でハイブリダイゼーションもしくは伸長反応等を行う場合がある。また、タンパク質をプローブとして使用する例としては、抗原・抗体反応により検出対象物質を特定する方法がある。このような生化学的反応を、固相上で、かつ少ない試料量で行う場合には、反応ムラを生じる可能性やプローブ固定部分の欠陥が結果に影響を与える可能性がある。
【００１１】
特に温度制御などを行う場合、温度が上昇した際に発泡することがあり、これは反応ムラとして結果にはっきりと現れる。このような例としては、ハイブリダイゼーション反応時にターゲットのディネーチャーのために90℃以上に温度を上昇させる場合などがあげられる。
【特許文献１】米国特許第6355431号明細書
【特許文献２】特開平8-45999号公報
【特許文献３】米国特許第6498863号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
そのようなデータのばらつきをいかに補正し、正しい判断が導かれるようにデータ処理を行うかは、マイクロアレイを実際に使用していく上で大変重要な技術となってくる。
【００１３】
マイクロアレイを用いた試料の検査にはDNAやRNAにおける２つの相補鎖間の特異的な結合や、抗原抗体反応などの生体反応が利用される。そのため、検査結果に「ばらつき」が生じる場合が多い。このような「ばらつき」を低減するための最も単純な手法として、同一条件での検査結果を２以上の適当数求め、それらの平均値をその代表値とする方法がある。この平均値を得るための方法としては、同一プローブを複数マイクロアレイ上に固定し、各プローブから得られた結果から平均値を得る方法が利用されてきた。
【００１４】
図２にマイクロアレイの一例を示す。図２に示すマイクロアレイは、16×16個のスポットをもつ同一ブロック（拡大部分参照）が９個、基板上に固定されている。ここで９つのブロックで同一位置にあるスポットには同一プローブが固定されている。基板上のプローブに試料中の物質、例えば検出対象物質（標的物質）が結合した状態は、発光、例えば蛍光の発生を利用して検出する。図２の構成のマイクロアレイをデザインした場合、最も単純に考えると、各ブロックに配置された９つの同一プローブからの輝度の平均や分散をとることによって、その試料からの値をより正確に知ることができる。また、試料からの値にどの程度のばらつきがあるのかを知ることもできる。この分散（もしくは標準偏差）の値を他の試料スポットからの輝度値と比較することによって、それらを比較する可能性、つまりどの試料とどの試料の輝度値は有意な差であるかなどを議論することもできる。
【００１５】
しかし、基板に固定されたプローブと、液体試料中に含まれる標的物質の反応は、液相系での反応のように均一に起るとはかぎらず、反応ムラや固定位置の欠陥等の問題が、基板上に得られる輝度に影響を与えることがある。そのような一つの例として、プローブ核酸によって標的核酸を捕捉する際の反応ムラの発生がある。すなわち、標的核酸とプローブ核酸のハイブリダイゼーションのために、温度を上昇及び降下させるステップが行われ、その際にマイクロアレイ上の液体試料中に発泡が生じ易くなる。そして、基板上の発泡が生じた部分では反応ムラが生じ易くなる。なかでも、長鎖の標的核酸（ターゲット）が自己（二本鎖）構造を持つことを防ぐために、ディネーチャーと呼ばれるプロセスで90℃度程度に温度を上昇させる際などに、このような影響がより顕著にみられることがある。試料が少量である場合には、基板上の発泡による全体の分析結果に対する影響がより顕著となる。
【００１６】
このような反応の不均一が起った際には、上記のように単純に９つのデータの平均を取ると、その値は一つの反応ムラに引きずられて他の８つとは大きくずれた値となってしまうことがある。このような結果を防ぐために、真の値の推定値としては平均値ではなく、中間値を用いる場合もある。
【００１７】
従って、上述した方法は、９つのブロックの周期性、つまり異なるブロック内の対応するスポットは同一試料からの反応を示しているという事実を有効に使用しているとは言えない。要するに、複数プローブが規則的に配置されていることを特徴とするマイクロアレイにおける効率的なデータ解析手法とはいえなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明によれば、以下の反応データの取得方法が提供される。多数のプローブを含むブロックを複数配置したプローブ担体を試料と反応させて得られる反応データの処理法において、以下の工程：
前記試料と反応した前記プローブ担体からシグナルを検出する工程；
前記検出したシグナルに基づいてデータ列を作成する工程；
前記データ列を周波数変換する工程；
前記周波数変換されたデータから前記ブロックの繰り返しに対応する周波数成分をフィルタリングする工程；及び
前記フィルタリング後の周波数成分を逆周波数変換することで反応データを得る工程；
を含むことを特徴とする反応データの処理法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、マイクロアレイにおける効率的なデータ解析手法を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の反応データ取得方法は、同一構造（プローブの配列パターンが同じであるという意味。）をもつ複数個の領域（ブロック）が繰り返し固定されているようなマイクロアレイなどの検査デバイス（プローブ固定担体）に対して好適に適用可能である。また、試料中の標的物質を所定のパターンで配列した領域が繰り返し固定されている標的物質固定担体に対しても好適に適用可能である。
【００２１】
本発明の反応データ取得方法においては、複数個のブロックが繰り返し固定されている検査デバイスから得られる各プローブ固定領域（例えばスポット）や標的物質固定領域でのシグナルをデータ列として配置した時に見られる周期性を利用して反応ムラのような無効な結果を除去する。
【００２２】
図１は、本発明の反応データ取得方法の一例における各工程のフローの一例を示す図である。この処理例では、まず、プローブ固定担体である検査デバイス上の各プローブスポットで得られたシグナルがアレイデータ解析ソフトによりコンピュータに取り込まれ、必要に応じて適当な格納場所に格納される。このシグナルとしては、プローブと試料からの物質（例えば標的物質）との反応による結合体の形成に応じて取り込まれた蛍光標識からの蛍光の輝度が利用できる。シグナルとしは、蛍光に限定されず、データとして取り込み可能なものであればよい。図１の例では、蛍光輝度をシグナルとして利用している。
【００２３】
なお、検査デバイスの構成例としては図２、４及び５に示す構成を挙げることができる。図２における９個のブロックはそれぞれ１６×１６個のプローブスポットの同一配列を有している。すなわち、１６×１６個のプローブスポットの配列が、９回繰り返されて基板上に配置されていることになる。各ブロックに配置されるプローブは、試料に含まれる物質の分析に必要なものが選択される。例えば、標的遺伝子の検出、微生物の種や属の特定、病気のマーカーとなる物質の検出などに必要なプローブが選択されて検出に効果的な所定の配列でブロック内に配置される。
【００２４】
本発明のデータ処理の第１の態様では、同じプローブ配列を有する領域（ブロック）の複数回の繰り返しにおける全てのプローブスポットからの蛍光輝度が取り込まれる。例えば、図２に示すマイクロアレイの全てのプローブスポットの蛍光輝度が取り込まれる。本発明のデータ処理の第２の態様では、各ブロック中にデータ処理用として配置したマーカープローブの各ブロックにわたる複数回の繰り返しにおける全マーカープローブスポットからの蛍光輝度が取り込まれる。例えば、図４及び５に示す全てのマーカープローブスポットからの蛍光輝度が取り込まれる。
【００２５】
マーカープローブとしては、試料中の物質と相互作用がないものが選択される。プローブ及び標的物質が核酸である場合は、相同性検索等により、マーカープローブの配列が試料となる検体中の配列とハイブリダイゼーションを起こさない配列であることを確認してこれを使用することが好ましい。更に、標識された標的核酸に対して、コントロールとなる蛍光標識プローブ相補鎖を加えていない場合には、マーカープローブからのシグナルが観察されないことを確認した上でマーカープローブとして選択することが更に好ましい。
【００２６】
コンピュータに取り込まれた蛍光輝度は一次元化され、更に、周波数変換される。この周波数変換にはフーリエ変換が好適に利用できる。次に、周波数変化されたデータをフィルタリングにかけ、周波数成分から所定のプローブまたはマーカープローブの配列を有するブロックの繰り返しに対応する周波数成分を残す。更に、この残された周波数成分を逆変換して一元化の復元を行い、各スポットの輝度を得る。
【００２７】
以上のフローに従う本発明の方法は、マイクロアレイのようにHigh-Throughputなデバイスから得られる大量データの解析に好適に適用可能である。
【００２８】
なお、図２、４及び５に示すマイクロアレイは、DNAからなるプローブをインクジェット方式（特開平11-187900号公報参照）で担体としての基板上に固定化したDNAマイクロアレイの一例である。プローブとそれにより検出される物質との組合せについは、DNAプローブと標的DNAとの組合せに限定されない。例えば、プローブとしては、検出対象物質に応じて、RNA、PNA等の核酸及び核酸変異体、あるいは、たんぱく質、糖鎖などから選択できる。
【００２９】
また前記した本発明の第１の態様においては、プローブを固定したプローブ固定担体を用いた例で説明したが、本発明はこれに限定されず、検出対象たる標的物質を固定した標的物質固定担体を用い、プローブと反応させて得られる反応データを取得する場合についても同様に行うことができる。
【００３０】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
（マイクロアレイの構成）
図２にマイクロアレイの基板上にプローブが固定されている様子を示す。プローブの固定は特開平11-187900号公報に詳細が示されているように、表面処理を行った基板にインクジェット法により、プローブとしての塩基配列を有し、かつ５'末端がチオール化されたオリゴDNAを吐出する方法を用いる。ここでプローブとなるDNAは25塩基程度の長さをもち、（株）ベックスから購入したものである。
【００３１】
（ブロッキング）
ハイブリダイゼーション反応を行う前に、ブロッキング反応を行う。マイクロアレイのブロッキングは、マイクロアレイのプローブ以外の部分に核酸分子が吸着するのを防ぐために行う。ハイブリダイゼーションの直前に行うのが一般的である。ブロッキングは、BSA（牛血清アルブミンFraction  V:Sigma社製）を１wt％となるように100ｍM NaCl/10mMりん酸バッファに溶解し、この溶液にDNAマイクロアレイを室温で2時間浸すことにより行なう。ブロッキング終了後、0.1wt%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を含む0.1xSSC溶液（くえん酸三ナトリウムとNaCl）と、SDSを含まないSSC溶液で洗浄し、超純水でリンスしてから、スピンドライで水切りを行った。
【００３２】
（ターゲットの準備）
検体由来の核酸の増幅(PCR)反応と標識反応の例を以下に示す。増幅＆標識反応液組成の例を以下に示す。
【００３３】
--PCR溶液組成--
・Premix PCR  試薬(TAKARA ExTaq)：25μl
・Template Genome DNA：〜5ng
・Forward/Reverse Primer：0.05μM each
（Total：50μl）
上記組成の反応液を図６に示す温度サイクルのプロトコルに従って、サーマルサイクラーを用い増幅反応を行う。ここでターゲットを標識するために、Cy3で標識されたプライマーを用いて反応を行う。反応終了後、精製用カラム(QIAGEN QIAquick PCR PurificationKit: QIAGEN社製)を用いてPrimerを除去した後、電気泳動(Bioanalyzer：Agilent社製)により、増幅産物の定量を行う。
【００３４】
（ハイブリダイゼーション）
水切りしたＤＮＡマイクロアレイをハイブリダイゼーション装置（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｔａｔｉｏｎ）にセットし、以下に示すハイブリダイゼーション溶液、条件でハイブリダイゼーション反応を行う。ハイブリダイゼーション装置を用いずに、スライドガラスとハイブリダイゼーション用のチャンバーを用いてマニュアルで反応を行ってもよい。
【００３５】
（ハイブリダイゼーション溶液）
以下にハイブリダイゼーション溶液の組成を示す。
【００３６】
６×ＳＳＰＥ  ／  １０％  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ  ／  ターゲット（未知検体由来の核酸）（ＰＣＲ産物  ５００ｎｇ）  ／  標識付きコントロールプローブ相補鎖（最終濃度１ｎＭ）
前述した増幅した未知検体由来の核酸５００ｎｇ相当をバッファー（ＳＳＰＥ）に溶かし、最終濃度が１０％になるように  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅを加え、最終濃度が1nMになるように標識付きプローブ相補鎖を加え、ハイブリダイゼーション溶液を作成する。なお、バッファー（ＳＳＰＥ）の濃度は、最終溶液の状態で６×ＳＳＰＥになるように予め計算しておく。
【００３７】
上記ハイブリダイゼーション溶液を、６５℃に加温し３分間保持したあと、さらに９２℃で２分間、続いて４５℃で３時間保持した。その後、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを用いて、２５℃で洗浄をした。さらに２×ＳＳＣを用いて２０℃で洗浄を行い、必要に応じて通常のマニュアルに従い純水でリンスして、プローブと未反応の未知検体由来のターゲット及び標識付きプローブ相補鎖を除去し、スピンドライ装置で水切りを行った。
【００３８】
（蛍光測定）
ハイブリダイゼーション反応終了後のＤＮＡマイクロアレイを、ＤＮＡマイクロアレイ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ）を用いて、蛍光測定を行う。蛍光測定波長をターゲットの標識及び標識付きプローブ相補鎖に含まれる蛍光物質の波長と合わせて、蛍光測定値が３００００以下になるように励起光の強さを調製して、測定する。
【００３９】
（スポット解析）
蛍光測定結果の画像を、マイクロアレイ用のデータ解析ソフトArrayPro(Media Cybernetics社製)で解析を行い、各スポットの座標(i,j,ｌ)、（但しここで、 i：ブロック内の行番号0〜15、 j：ブロック内の列番号0〜15、ｌ：ブロック番号0〜8）に対する輝度値のデータを得た。これをさらにデータ処理し、反応データを取得する方法として次に述べる。
【００４０】
（実施例１）
図２に示す１つのブロックが16×16のスポットで構成され、その同一ブロックが3×3の9ブロック配置された核酸マイクロアレイを用いる。それぞれのスポットには異なるオリゴDNAが固定されている。このマイクロアレイに対して500bp程度のCy3標識されたターゲットDNAをハイブリダイゼーション反応させる。その後蛍光輝度をスキャナによって測定し、蛍光輝度画像を得る。画像を市販のアレイ解析用ソフトウェアによって解析し、各スポット位置に対して輝度の値を得る。ターゲットの調整及びハイブリ反応、輝度の測定、画像解析にいたるまでの各工程は上述の例に従って行う。
【００４１】
画像解析ソフトによる、輝度解析の結果は、ブロックｌの(i,j)スポットの輝度がh(i,j,l)のように出力される。ここでｎ=NCOL*i+j＋NSPOT*lとしてh(n)＝h(i,j,l)のようにおくことで、チップ上の輝度データを一次元のデータ列とすることができる。但し、ここでNCOL はブロック内の列の数（図２では16）を表し、NSPOTはブロック内の全スポット数（図２では16×16＝256）を表す。一つの基板上の全スポット数をNとする。（N＝NSPOT*NBLOCK）ここでNBLOCKは基板上のブロック数で図２では9となる。
【００４２】
ここでは最も単純に一次元のデータ列を得たが、この方法は複数ある。一つのブロックごとに縦や横のカウントの仕方を変える場合（図３）や、またブロックの周期性をそのまま利用はできなくなるが、3つ並んだブロックをまとめて一列づつカウントしていってもよい。このように一次元化には無数の方法が考えられ、目的（どのような無効な結果を除去したいか）に応じて使い分けることができる。
【００４３】
このh(n)に対して、以下のようなフーリエ変換を行った。
【００４４】
【数１】
2007183257.tif 000003
【００４５】
ここで、
【００４６】
【数２】
2007183257.tif 000004
【００４７】
（ｋ＝0〜N-1までの整数）である。
まず、図２のように基板上には、同一ブロックが複数構成されているので、
【００４８】
【数３】
2007183257.tif 000005
【００４９】
の周期をもつ。またブロック内のプローブの配置によっては、さらに高周波の成分fm（ｍ＞NBLOCK）をもつことも考えられる。例えば、ブロック内でプローブ種類毎に周期性をもって配置されている場合などがこれにあたる。
これに対して、
【００５０】
【数４】
2007183257.tif 000006
【００５１】
の周期を考える。これはハイブリ反応が理想的であった場合には現れることのない周波数成分であるが、
反応ムラや基板上の欠陥などが反映されている場合にはこの成分として現れる。このような周期成分は、正確な輝度値を計算する妨げとなっているものなので、このような成分をフィルタリングにより除去したい。
それは例えば、
【００５２】
【数５】
2007183257.tif 000007
【００５３】
をカットオフ周波数とするHighPassフィルタ特性をもつ関数
【００５４】
【数６】
2007183257.tif 000008
【００５５】
を考え
【００５６】
【数７】
2007183257.tif 000009
【００５７】
というフィルタリング関数HF(ｆk)を得た。これに対し、フーリエ逆変換
【００５８】
【数８】
2007183257.tif 000010
【００５９】
を行うことで、反応ムラ等の欠陥を効率的に排除できる。
【００６０】
ここでフィルタは様々な種類のものが考えられ、同じHighPassフィルタ特性でも異なる閾値のものを選ぶこともできれば、
【００６１】
【数９】
2007183257.tif 000011
【００６２】
の近辺のみを残すようなフィルタ(但し、プローブ配置を反映した高周波成分はカットしない)
でもよい。その際のウィンドウの形としては、一般にシグナルの切り出しに用いられる様々な形のウィンドウ関数を用いることが可能である。
【００６３】
（実施例２）
図４で示す実施例２は実施例１の場合と異なり、ブロックが25個基板上に存在する。各ブロック内のスポットでマーカープローブでない部分（図４で各ブロックの対角線上に配置されているのがマーカープローブ、それ以外のすべてが試料の検出に用いられるプローブ）は各ブロックで同一ではなく、図４の例では6000個の異なるプローブが固定されている。なお、図４の例ではマーカープローブ１〜４がこの順に対角線上に繰り返し配置されている。
【００６４】
図４の例では、マーカープローブは4種類存在し、各ブロック16×16プローブ中の対角線の部分に配置してあるが、異なるマーカープローブの数、配置の仕方は任意である。マーカープローブが多ければ多いほどフィルタリングには都合がいいが、その分配置できる検体検出用のプローブ数が減ってしまうので、どのレベルのフィルタリングが必要であるかを考察した上でプローブ種類、配置を考える必要がある。例えば、ブロックの端のみにマーカープローブを配置する場合には、ブロック内部のみに発生した反応ムラ等に対応できない場合がある。しかし、本実施例のようにマーカープローブを対角線配置すれば、マーカープローブがブロック内に生じた反応ムラや欠陥部分に重なる可能性が高くなり、フィルタリングには都合が良い。
【００６５】
図４の構成の基板を用いて、実施例１と同様にハイブリダイゼーション反応を行った。但し検体の準備から蛍光検出、スポット輝度解析までは実施例１と同様である。
【００６６】
実施例１の場合と同様ここでも一次元化には様々な手法が存在するが、大きな違いはここではマーカープローブの値のみを用いることである。図４のような配置のマーカープローブに対して、各位置(i,j,l)に存在するスポットの輝度をs(i,j,l)とすれば、ここでの一次元化はh(ｎ= i＋NCOL*l)＝s(i,i,j)のように行われる。それは、マーカーとしてとりうる(i,j,l)の組み合わせが、i= j＝0〜NCOL-1、l＝0〜NBLOCK-1であることによる。
【００６７】
但しここで、ブロックの行数と列数は同一（NCOL）の場合を考えている。そして周波数解析を行う準備として、実施例１と同様、一つの基板上の全マーカースポット数をN（N＝NBLOCK＊NCOL）として一次元配列をつくり、これをh(ｎ)とする。
【００６８】
このように一次元化したマーカープローブの輝度データ h(ｎ)に対し、実施例１と同様にフーリエ変換を行った。ここでも様々なフィルタリングの可能性があるが、基板上の欠陥や反応ムラの除去を第一の目的として考えて、周期
【００６９】
【数１０】
2007183257.tif 000012
【００７０】
より低周波の成分を取り除くようなフィルタをかける。
【００７１】
【数１１】
2007183257.tif 000013
【００７２】
その後実施例１と同様に、フーリエ逆変換を行いマーカープローブのｈF(ｎ)を求める。
【００７３】
ここで注意しなくてはいけないのは、実施例１の場合と異なり、ここでは単純にｈF(ｎ)を求めて終わりではない。マーカープローブのみをデータ処理しても意味がないからである。ここでは ｈF(ｎ)を利用して、同一ブロック内のプローブの輝度補正を行う。
【００７４】
補正の仕方にも様々な方法があるが、ここでは最も単純に各ブロックのマーカープローブの補正項A(i,i,.l)を
【００７５】
【数１２】
2007183257.tif 000014
【００７６】
とする。但しここで h(i,l)＝h(ｎ= i＋NCOL*l)である。そしてマーカープローブ以外のプローブに対する補正を
【００７７】
【数１３】
2007183257.tif 000015
【００７８】
のように行った。
【００７９】
このような補正は、図４のマーカープローブの配置図からもわかるように、ブロックの中心付近(マーカープローブ近傍)のスポットに特に効果的である。
【００８０】
（実施例３）
実施例２におけるブロックの中心付近(マーカープローブ近傍)のスポットでの補正に加えて、ブロック全体において効果的であるマーカープローブの配置として、図5に示すマーカープローブの配置をデザインした。一般的には各ブロックの最上列、最左列にマーカープローブを置く（マーカープローブ１〜４をこの順に繰り返し配置）が、最右列と最下列のブロックに対しては、通常のブロックの外側に一列マーカープローブを追加している。これで各ブロックはそれぞれ225個の異なるプローブを持ちかつ、上下左右をマーカープローブに囲まれていることになる。
【００８１】
ここでも実施例１及び２と同様、データの一次元化を行ったのちフーリエ変換を行う。ここでのフィルタリングは実施例１、２と同様、
【００８２】
【数１４】
2007183257.tif 000016
【００８３】
を用いた。
得られたhF(n)を用いて、各マーカープローブに対して、実施例と同様以下のような補正を行う。
【００８４】
【数１５】
2007183257.tif 000017
【００８５】
但しここで、(i,j,l)はマーカープローブの位置、nはそのマーカープローブに対応する、フーリエ変換時に一次元化した際、対応づけられた値を表す。そしてこれらを用いたマーカープローブ以外のプローブに対する補正としては、以下のように行った。
【００８６】
【数１６】
2007183257.tif 000018
【００８７】
但しここで、il、irは考えているスポットと同じ行で、一番近い左側のマーカーと一番近い右側のマーカーに対応し、同様にju、jdは同じ列で一番近い上部のマーカーを一番近い下部のマーカーに対応している。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】本発明のデータ処理の全体のフローを示す図である。
【図２】マイクロアレイ上へのDNAプローブの配置例を示す図である。
【図３】データの一次元化操作説明するための概略図である。
【図４】一次元化の方法例を説明するための概略図である。
【図５】マーカープローブの配置概略図である。
【図６】PCRの温度サイクル条件を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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