(57)【要約】      （修正有）【課題】単離オリゴヌクレオチドおよび核酸−タンパク質複合体由来の少なくとも２つのポリヌクレオチドを検出および／または同定するための単離オリゴヌクレオチドの使用方法を提供する。【解決手段】ＤＮＡ／蛋白質／ＤＮＡ複合体の結合されているＤＮＡフラグメントをリンカー配列によって連結する。リンカー配列は制限酵素切断部位を含む。蛋白質複合体を架橋により固定後制限酵素でリンカーを切断する。そして遊離した末端をタグとして塩基配列の解析を行なう。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの第１のタグおよび少なくとも１つの第２のタグを含む単離オリゴヌクレオチドであって、前記第１のタグおよび前記第２のタグが核酸−タンパク質複合体のタグである、単離オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記第１のタグが第１のポリヌクレオチドのタグであり、前記第２のタグが第２のポリヌクレオチドのタグであり、ここで、前記第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体のポリヌクレオチドである、請求項１に記載の単離オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの制限酵素の認識部位をさらに含む、請求項１または２に記載の単離オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのリンカーをさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の単離オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記リンカーが、少なくとも１つの制限酵素の認識部位を含む、請求項４に記載の単離オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記少なくとも１つのリンカーが、タグの間に挿入されているか、第１のタグの上流または第２のタグの下流に配置されている、請求項４または５に記載の単離オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記少なくとも１つの制限酵素の認識部位が、ＩＩｓ型制限酵素の認識部位である、請求項３、５または６のいずれかに記載の単離オリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記少なくとも１つの制限酵素の認識部位が、ホーミング制限酵素の認識部位である、請求項３、５、または６に記載の単離オリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記少なくとも１つの第１のタグが第１のポリヌクレオチドの５’末端および３’末端を含み、前記少なくとも１つの第２のタグが第２のポリヌクレオチドの５’末端および３’末端を含み、前記第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体のポリヌクレオチドである、請求項１〜８のいずれかに記載の単離オリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記リンカーが、第１のポリヌクレオチドを切断して第１のタグを得ることができる制限酵素によって認識される第１の制限認識部位、および第２のポリヌクレオチドを切断して第２のタグを得ることができる制限酵素によって認識される第２の制限認識部位を含み、前記第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体のポリヌクレオチドである、請求項５または６に記載の単離オリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記リンカーが、第１のポリヌクレオチドを切断して第１のポリヌクレオチドの３’末端を得ることができる第１の制限酵素によって認識される第１の制限認識部位、および第２のポリヌクレオチドを切断して第２のポリヌクレオチドの５’末端を得ることができる第２の制限酵素によって認識される第２の制限認識部位を含み、前記第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体のポリヌクレオチドである、請求項５または６に記載の単離オリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記リンカーが、第１のポリヌクレオチドを切断して第１のポリヌクレオチドの５’末端を得ることができる第１の制限酵素によって認識される第１の制限認識部位、および第２のポリヌクレオチドを切断して第２のポリヌクレオチドの３’末端を得ることができる第２の制限酵素によって認識される第２の制限認識部位を含み、前記第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体のポリヌクレオチドである、請求項５または６に記載の単離オリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記リンカーが、第１のポリヌクレオチドを切断して第１のポリヌクレオチドの３’末端を得ることができる第１の制限酵素によって認識される第１の制限認識部位、および第２のポリヌクレオチドを切断して第２のポリヌクレオチドの５’末端を得ることができる第２の制限酵素によって認識される第２の制限認識部位を含み、前記第１のポリヌクレオチドが、第１のポリヌクレオチドを切断して第１のポリヌクレオチドの５’末端を得ることができる第３の制限酵素によって認識される第３の制限認識部位をさらに含み、前記第２のポリヌクレオチドが、第２のポリヌクレオチドを切断して第２のポリヌクレオチドの３’末端を得ることができる第４の制限酵素によって認識される第４の制限認識部位を含み、前記第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体のポリヌクレオチドであり、前記少なくとも１つの第１のタグが前記第１のポリヌクレオチドの５’末端および３’末端のライゲーションから得られ、前記少なくとも１つの第２のタグが前記第２のポリヌクレオチドの５’末端および３’末端のライゲーションから得られる、請求項５、６、または１１のいずれかに記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記核酸−タンパク質複合体がクロマチン構造の一部である、請求項１〜１３のいずれかに記載の単離オリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１〜１４のいずれかに記載の単離オリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１７】
少なくとも２つの単離オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのコンカテマーであって、各単離オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの第１のタグおよび少なくとも１つの第２のタグを含み、前記第１のタグおよび第２のタグが核酸−タンパク質複合体のタグである、コンカテマー。
【請求項１８】
前記第１のタグが第１のポリヌクレオチドのタグであり、前記第２のタグが第２のポリヌクレオチドのタグであり、前記第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体に由来し、各単離オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの制限酵素の認識部位を含む、請求項１７に記載のオリゴヌクレオチドのコンカテマー。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの制限部位が少なくとも１つのリンカーに含まれる、請求項１８に記載のオリゴヌクレオチドのコンカテマー。
【請求項２０】
前記少なくとも１つのリンカーが、タグの間に挿入されているか、または第１のタグの上流および／または第２のタグの下流に配置されている、請求項１９に記載のオリゴヌクレオチドのコンカテマー。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの制限酵素の認識部位が、ＩＩｓ型制限酵素の認識部位である、請求項１８〜２０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドのコンカテマー。
【請求項２２】
前記第１のタグが第１のポリヌクレオチド由来の５’末端および３’末端を含み、前記第２のタグが第２のポリヌクレオチド由来の５’末端および３’末端をさらに含む、請求項１７〜２１のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドのコンカテマー。
【請求項２３】
請求項１〜１５のいずれかに記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドライブラリー。
【請求項２４】
少なくとも１つの単離オリゴヌクレオチドを調製する方法であって、
（ｄ）核酸−タンパク質複合体を供するステップと、
（ｅ）少なくとも１つの第１のタグおよび少なくとも１つの第２のタグを含むオリゴヌクレオチドを調製するステップであって、前記第１のタグおよび第２のタグが前記核酸−タンパク質複合体から得られる、ステップと、
（ｆ）前記オリゴヌクレオチドを単離するステップと、
を含む、方法。
【請求項２５】
前記第１のタグが第１のポリヌクレオチドから得られ、前記第２のタグが第２のポリヌクレオチドから得られ、前記第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体から得られる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ステップ（ｂ）が、
（ｉ）少なくとも１つの制限酵素の認識部位を含む少なくとも１つのリンカーを挿入するステップと、
（ｉｉ）前記第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを、リンカー中の少なくとも１つの制限部位を認識する少なくとも１つの制限酵素で切断して、第１のポリヌクレオチドから得た第１のタグ、第２のポリヌクレオチドから得た第２のタグ、およびリンカーを含むオリゴヌクレオチドを形成するステップと
を含む、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ステップ（ｂ）が、
（ｉ）少なくとも１つの制限酵素の認識部位を含む少なくとも１つのリンカーを、複合体の第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間に挿入するステップと、
（ｉｉ）少なくとも１つの制限酵素の制限部位を前記第１のポリヌクレオチドの５’末端および前記第２のポリヌクレオチドの３’末端の各々に付加するステップと、
（ｉｉｉ）前記第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを、少なくとも１つの認識部位を認識する少なくとも１つの制限酵素で切断して切断フラグメントを得るステップと、
（ｉｖ）前記切断フラグメントをライゲーションして、前記第１のポリヌクレオチドから得た第１のタグ、前記第２のポリヌクレオチドから得た第２のタグ、各ポリヌクレオチドの５’末端および３’末端を含むタグ、および前記タグの間に挿入されたリンカーを含むオリゴヌクレオチドを形成するステップと
を含む、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ステップ（ｉｉ）の少なくとも１つの制限酵素の認識部位が、アダプターまたはベクターの一部である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記核酸−タンパク質複合体が、クロマチン免疫沈降によって得られたものである、請求項２４〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
核酸−タンパク質複合体由来の少なくとも２つのポリヌクレオチドを検出および／または同定する方法であって、
（ｇ）核酸−タンパク質複合体を供するステップと、
（ｈ）少なくとも１つの第１のタグおよび少なくとも１つの第２のタグを含むオリゴヌクレオチドを調製するステップであって、前記第１のタグが第１のポリヌクレオチドから得られ、前記第２のタグが第２のポリヌクレオチドから得られ、前記第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体から得られるステップと、
（ｉ）前記オリゴヌクレオチドを配列決定するステップと、
（ｊ）第１のタグおよび第２のタグのヌクレオチド配列に基づいて少なくとも２つのポリヌクレオチドをマッピングし、それにより、前記少なくとも２つのポリヌクレオチドを検出および／または同定するステップと
を含む、方法。
【請求項３１】
前記ステップ（ｂ）が、
（ｉ）少なくとも１つの制限認識部位を含む少なくとも１つのリンカーを挿入するステップと、
（ｉｉ）前記第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを、リンカー中の少なくとも１つの制限部位を認識する少なくとも１つの制限酵素で切断して、第１のポリヌクレオチドから得た第１のタグ、第２のポリヌクレオチドから得た第２のタグ、および前記タグの間にリンカーを含むオリゴヌクレオチドを形成するステップと
を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ステップ（ｂ）が、
（ｉ）少なくとも１つの制限酵素の認識部位を含む少なくとも１つのリンカーを、複合体の第１のヌクレオチドと第２のヌクレオチドとの間に挿入するステップと、
（ｉｉ）少なくとも１つの制限酵素の制限部位を前記第１のポリヌクレオチドの５’末端および前記第２のポリヌクレオチドの３’末端の各々に付加するステップと、
（ｉｉｉ）前記第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを、少なくとも１つの認識部位を認識する少なくとも１つの制限酵素で切断して切断フラグメントを得るステップと、
（ｉｖ）前記切断フラグメントをライゲーションして、前記第１のポリヌクレオチドから得た第１のタグ、前記第２のポリヌクレオチドから得た第２のタグ、各ポリヌクレオチドの５’末端および３’末端を含むタグ、および前記タグの間に挿入されたリンカーを含むオリゴヌクレオチドを形成するステップと
を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記ステップ（ｉｉ）の少なくとも１つの制限酵素の認識部位が、アダプターまたはベクターの一部である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸−タンパク質複合体が、クロマチン免疫沈降によって得られたものである、請求項３０〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記オリゴヌクレオチドが、配列決定前にステップ（ａ）〜（ｂ）によって得られた少なくとも１つのさらなるオリゴヌクレオチドと鎖状体形成される(concatenate)、請求項３０〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記ポリヌクレオチドが同一染色体上に存在するか、前記ポリヌクレオチドが異なる染色体上に存在する、請求項３０〜３５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、遺伝子発現分野に関する。特に、本発明は、核酸相互作用に関する。特に、本発明は、核酸−タンパク質相互作用事象および成分の分析、検出および同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロマチン相互作用は、遺伝子調節において重要である。最近完了したヒトゲノム配列により、遺伝情報の枠組みが得られる。しかし、ヒトゲノム構造および情報は、しばしば、一次元の直線として示され、細胞系の複雑さおよび連携を説明するには不十分である。どのようにしてゲノムが実際に生きた細胞中の三次元の核内で組織化された系として機能するのかを理解するために完全に異なる観点が必要である。ゲノムＤＮＡ（全長２ｍと推定されている）は、核内の染色体中にわずか数ミクロンに凝縮されている。染色体はユークロマチンおよびヘテロクロマチンに不規則に組織化され、クロマチンタンパク質に包まれ、転写および複製のための転写因子とやり取りしていることが公知である。
【０００３】
これらの活動は、順序付けられているようである。巨大な染色体ループが活性遺伝子を含むことが認められている。さらに、遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）、エンハンサー、およびインスレーターなどの遠位調節エレメントが特定の遺伝子座を活性またはサイレントな転写を行う領域に再配置することによって作用することが示唆されている。最近の研究により、β−グロビン、ごく最近では、サイトカイン遺伝子（ＩＦＮ−γ）で、ＬＣＲが同一染色体上の離れたプロモーターと直接相互作用することができ、異なる染色体上のプロモーターでさえも相互作用することができることが証明されている。染色体内相互作用および染色体間相互作用が、重要な経路の遺伝子調節を調整する複数の遺伝子座で起こる一般的な現象である可能性がある。染色体間相互作用は、疾患にも関与している。例えば、第１５染色体上のｃ−ｍｙｃ／ｐｖｔ−１遺伝子座が第１２染色体上の免疫グロブリン遺伝子座の１つと並列する染色体の転位置によってｍｙｃ転写物の調節不全が起こる。全相互作用を同定し、細胞における高次遺伝子調節を解明するために全ゲノムレベルでの染色体間相互作用のさらなる分析が必要である。
【０００４】
クロマチン相互作用の研究のために使用されるテクノロジー−三次元構造およびクロマチン相互作用を研究するために多数のアプローチが使用されているが、これらは全て非常に限定されている。この問題に適用することができるテクノロジーを、視覚化ツール（顕微鏡法、蛍光インサイチューハイブリッド形成法（ＦＩＳＨ）、およびＲＮＡ−ＴＲＡＰ（ＲＮＡタグ化および関連タンパク質の回収）など）および分子的方法（染色体高次構造捕捉法(Chromosome Conformation Capture)（３Ｃ）および３Ｃ後のクロマチン免疫沈降（３Ｃ−ＣｈＩＰ）など）に大きく分類することができる。
【０００５】
多数の初期の研究で核内のクロマチンの空間的構成を調査するために顕微鏡法を使用していた。しかし、このような細胞遺伝学的アプローチでは、染色体中のクロマチンの大まかなセグメント情報しか得ることができない。ＦＩＳＨは、この傾向を有意に改良しており、特定の遺伝子座をゲノムＤＮＡとハイブリッド形成する蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮＡプローブを介して染色体上の特定の物理的位置に局在化させる。しかし、分解能は依然として非常に限られている。ＦＩＳＨを修正したＲＮＡ−ＴＲＡＰは、遺伝子プロモーターと物理的に極めて近接した遠位エンハンサーを示すことができる方法である。
【０００６】
染色体高次構造捕捉法（３Ｃ）は、本来、酵母の染色体高次構造を調査するためにデザインされ(Dekker et al,2002)、長距離および／または異なる染色体に分離した遺伝因子の相互作用を研究するために使用されている。３Ｃでは、ＤＮＡ−タンパク質（クロマチン）構造は、インビボでホルムアルデヒド架橋しており、クロマチンは、制限酵素消化によって断片化される。次いで、ＤＮＡ結合タンパク質によって繋留されたＤＮＡフラグメントを、ライゲーションによって互いに連結し、２つの疑いのある公知のエレメントの連結点(junction)を、ＰＣＲによって検出する。３Ｃ手順で得られたタンパク質と架橋したキメラＤＮＡフラグメントを抗体プルダウンによって富化させるクロマチン免疫沈降（３Ｃ−ＣｈＩＰ）によって、特定のＤＮＡ結合タンパク質または転写因子によって媒介されたクロマチン相互作用の検出をさらに増強することができる。
【０００７】
各技術およびいくつかの技術の組み合わせがいくつかの特定の染色体内相互作用および染色体間相互作用の同定に有用であることが証明されているが、これらのアプローチは、どのような可能な遠位クロマチン相互作用が存在することができるかについての既存の知識または推測と、ＰＣＲによって１回に１つの領域のこのような連結点を検出するためにデザインしたプライマーとに依存する。したがって、クロマチン相互作用を研究するための現在のテクノロジーでは、新規のクロマチン相互作用の同定および全ゲノムレベルでの大規模の同定が非常に制限される。
【０００８】
染色体が核内で空間的に組織化される方法およびどのようにして染色体が遠位遺伝子の転写を一斉に調節することができるのかについて非常に興味が持たれているにもかかわらず、現在、バラバラの間接的な情報しか利用できない。この態様の情報の欠如は、主に、染色体相互作用の三次元の問題に有効に取り組むことができる確固たるテクノロジーの欠如に起因する。
【０００９】
染色体相互作用の三次元の問題に有効に取り組むことができ、既存の技術の欠点および制限を克服することができるより有効な方法および確固たるテクノロジーが当分野で必要である。
【発明の開示】
【００１０】
本発明は、核酸複合体、特に核酸−タンパク質複合体由来の少なくとも１つの核酸配列またはフラグメントを検出、同定および／または調製する新規の方法を提供することによって上記問題を解決する。特に、本発明の方法は、核酸−タンパク質複合体由来の少なくとも２つの核酸配列またはフラグメントを検出、同定および／または調製する方法を提供する。本発明はまた、本発明の任意の実施形態にかかる方法を使用して調製したオリゴヌクレオチドに関する。特定のＤＮＡ結合タンパク質によって媒介される長い距離および異なる染色体間のクロマチン相互作用事象を同定する方法も提供する。
【００１１】
別の態様では、本発明は、少なくとも１つの第１のタグおよび少なくとも１つの第２のタグを含む単離オリゴヌクレオチドであって、第１のタグおよび第２のタグが核酸−タンパク質複合体のタグである、単離オリゴヌクレオチドの提供によって上記問題を解決する。特に、少なくとも１つの第１のタグおよび少なくとも１つの第２のタグを含む単離オリゴヌクレオチドであって、第１のタグが第１のポリヌクレオチドから得られ、第２のタグが第２のポリヌクレオチドから得られ、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体から得られる、単離オリゴヌクレオチドを提供する。第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、同一の核酸領域の一部であり得、また、核酸−タンパク質複合体の異なる核酸領域に由来し得る。
【００１２】
単離オリゴヌクレオチドは、さらに、少なくとも１つの制限酵素の認識部位、少なくとも１つのリンカーを含み得る。特に、少なくとも１つの制限酵素の認識部位を、リンカー中に含めることができる。リンカーをタグの間(between the tags)に挿入することができ、また、リンカーを少なくとも１つのタグに隣接させる（すなわち、少なくとも１つのタグの上流および／または下流に配置する）ことができる。少なくとも１つの制限酵素の認識部位は、非対称であり得る。少なくとも１つの制限酵素の認識部位は、例えば、ＩＩｓ型制限酵素またはホーミング制限酵素の認識部位であり得る。
【００１３】
少なくとも１つの第１のタグは、第１のポリヌクレオチド由来の５’末端および３’末端を含むことができ、少なくとも１つの第２のタグは、第２のポリヌクレオチド由来の５’末端および３’末端を含むことができる。単離ポリヌクレオチドは、さらに、少なくとも１つのリンカーを含むことができる。リンカーをタグの間に挿入することができ、また、リンカーを少なくとも１つのタグの上流および／または下流に配置することができる。リンカーは、少なくとも１つの制限酵素の認識部位を含む。少なくとも１つの制限酵素の認識部位は、非対称であり得る。少なくとも１つの制限酵素の認識部位は、例えば、ＩＩｓ型制限酵素またはホーミング制限酵素の認識部位であり得る。
【００１４】
リンカーは、第１のポリヌクレオチドを切断して第１のタグを得ることができる制限酵素によって認識される第１の制限認識部位、および第２のポリヌクレオチドを切断して第２のタグを得ることができる制限酵素によって認識される第２の制限認識部位を含むことができる。特に、リンカーは、第１のポリヌクレオチドを切断して第１のポリヌクレオチドの３’末端を得ることができる制限酵素によって認識される第１の制限認識部位、および第２のポリヌクレオチドを切断して第２のポリヌクレオチドの５’末端を得ることができる第２の制限酵素によって認識される第２の制限認識部位を含むことができる。第１の制限認識部位および第２の制限認識部位を、同一または異なる制限酵素によって認識することができる。
【００１５】
別の態様によれば、第１のポリヌクレオチドを、第３の認識部位を認識する第３の制限酵素によってさらに切断して第１のポリヌクレオチドの５’末端を得ることができ、第２のポリヌクレオチドを、第４の認識部位を認識する第４の制限酵素によって切断して第２のポリヌクレオチドの３’末端が得られる。この実施形態によれば、少なくとも１つの第１のタグは、第１のポリヌクレオチドの５’末端および３’末端のライゲーションによって得られ、少なくとも１つの第２のタグは、第２のポリヌクレオチドの５’末端および３’末端のライゲーションによって得られる。第３の認識部位および第４の認識部位を、同一または異なる制限酵素によって認識することができる。さらなる認識部位を、第１のポリヌクレオチドの５’末端および第２のポリヌクレオチドの３’末端にライゲーションしたアダプター中にそれぞれ含めることができる。あるいは、第３の制限部位および第４の制限部位は、第１のポリヌクレオチド−リンカー−第２のポリヌクレオチド構造が挿入されたベクター中に存在し得る。この場合、第３の制限部位は第１のポリヌクレオチドの５’末端に隣接し、第４の制限部位は第２のポリヌクレオチドの３’末端に隣接する。
【００１６】
単離オリゴヌクレオチドの核酸−タンパク質複合体は、クロマチン構造の一部であり得る。目的のタンパク質が結合する核酸フラグメントは、目的のタンパク質が結合する領域（例えば、ヒストン結合部位）を含む任意の核酸フラグメントであり得る。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
【００１７】
別の態様では、本発明は、少なくとも２つの単離オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのコンカテマーであって、各単離オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの第１のタグおよび少なくとも１つの第２のタグを含み、第１のタグおよび第２のタグが核酸−タンパク質複合体のタグである、コンカテマーを提供する。特に、少なくとも２つの単離オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのコンカテマーであって、各単離オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの第１のタグおよび少なくとも１つの第２のタグを含み、第１のタグが第１のポリヌクレオチドのタグであり、第２のタグが第２のポリヌクレオチドのタグであり、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体に由来する、コンカテマーを提供する。コンカテマーは、少なくとも１つのリンカーをさらに含むことができる。リンカーは、少なくとも１つの制限酵素の認識部位を含むことができる。さらに、コンカテマーの各単離オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの制限酵素の認識部位を含み得る。少なくとも１つの制限酵素の認識部位は、少なくとも１つのリンカーおよび／または少なくとも１つのアダプター中に含まれてもよい。
【００１８】
リンカーをタグの間に挿入することができ、また、リンカーを少なくとも１つのタグの上流および／または下流に配置することができる。リンカーは、少なくとも１つの制限酵素の認識部位を含むことができる。少なくとも１つの制限酵素の認識部位は、ＩＩｓ型制限酵素またはホーミング制限酵素の認識部位であり得る。コンカテマーの各オリゴヌクレオチドの第１のタグは第１のポリヌクレオチド由来の５’末端および３’末端を含むことができ、第２のタグは第２のポリヌクレオチド由来の５’末端および３’末端を含むことができる。
【００１９】
本発明のオリゴヌクレオチドまたはコンカテマーを、ベクターおよび／または細胞に挿入することができる。細胞は、細菌細胞であり得る。
【００２０】
ポリヌクレオチド核酸−タンパク質複合体は、クロマチン構造の一部であり得る。ポリヌクレオチドは同一染色体上に存在することができ、また、異なる染色体上に存在することができる。
【００２１】
別の態様では、本発明は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのライブラリーまたはオリゴヌクレオチドのコンカテマーであって、オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの第１のタグおよび少なくとも１つの第２のタグを含み、第１のタグが第１のポリヌクレオチドから得られ、第２のタグが第２のポリヌクレオチドから得られ、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体から得られる、オリゴヌクレオチドのライブラリーまたはオリゴヌクレオチドのコンカテマーを提供する。
【００２２】
ライブラリーの少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのリンカーを含むことができる。リンカーをタグの間に挿入することができ、また、リンカーを少なくとも１つのタグの上流および／または下流に配置することができる。第１のタグは第１のポリヌクレオチド由来の５’末端および３’末端を含むことができ、第２のタグは第２のポリヌクレオチド由来の５’末端および３’末端を含むことができる。
【００２３】
別の態様では、本発明は、少なくとも１つの単離オリゴヌクレオチドの調製方法であって、
（ａ）核酸−タンパク質複合体を供する工程と、
（ｂ）少なくとも１つの第１のタグおよび少なくとも１つの第２のタグを含むオリゴヌクレオチドを調製する工程であって、第１のタグおよび第２のタグが核酸−タンパク質複合体から得られる、工程と、
（ｃ）オリゴヌクレオチドを単離する工程と、
を含む、方法を提供する。
【００２４】
特に、本発明は、少なくとも１つの単離オリゴヌクレオチドの調製方法であって、
（ａ）核酸−タンパク質複合体を供する工程と、
（ｂ）少なくとも１つの第１のタグおよび少なくとも１つの第２のタグを含むオリゴヌクレオチドを調製する工程であって、第１のタグが第１のポリヌクレオチドから得られ、第２のタグが第２のポリヌクレオチドから得られ、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体から得られる、工程と、
（ｃ）オリゴヌクレオチドを単離する工程と、
を含む、方法を提供する。
【００２５】
１つの実施形態では、本発明のこの態様の工程（ｂ）が、
（ｉ）少なくとも１つの制限酵素の認識部位を含む少なくとも１つのリンカーを挿入する工程と、
（ｉｉ）第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを、リンカー中の少なくとも１つの制限部位を認識する少なくとも１つの制限酵素で切断して、第１のポリヌクレオチドから得た第１のタグ、第２のポリヌクレオチドから得た第２のタグ、およびタグの間にリンカーを含むオリゴヌクレオチドを形成する工程と
を含む。
【００２６】
別の実施形態では、本発明のこの態様の工程（ｂ）が、
（ｉ）少なくとも１つの制限酵素の認識部位を含む少なくとも１つのリンカーを、複合体の第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間に挿入する工程と、
（ｉｉ）少なくとも１つの制限酵素の各制限部位を第１のポリヌクレオチドの５’末端および第２のポリヌクレオチドの３’末端に付加する工程と、
（ｉｉｉ）第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを少なくとも１つの認識部位を認識する少なくとも１つの制限酵素で切断して切断フラグメントを得る工程と、
（ｉｖ）切断フラグメントをライゲーションして、第１のポリヌクレオチドから得た第１のタグ、第２のポリヌクレオチドから得た第２のタグ、各ポリヌクレオチドの５’末端および３’末端を含むタグ、およびタグの間に挿入されたリンカーを含むオリゴヌクレオチドを形成する工程であって、工程（ｉｉ）の少なくとも１つの制限酵素の認識部位がアダプターの一部またはベクターの一部である、工程と
を含む。
【００２７】
核酸（例えば、ＤＮＡ）および／または目的のタンパク質への光活性化可能な部分の組み込み、ならび抗体媒介沈降または親和性媒介技術による核酸／タンパク質複合体の単離によって、核酸−タンパク質複合体からポリヌクレオチドを単離することができる。このような親和性ベースの技術の例には、ストレプトアビジン／ビオチン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオンマトリクス、マルトース結合タンパク質／アミロースマトリクスの相互作用が含まれる。
【００２８】
別の態様では、本発明は、核酸−タンパク質複合体由来の少なくとも２つのポリヌクレオチドを検出および／または同定する方法であって、
（ａ）核酸−タンパク質複合体を供する工程と、
（ｂ）少なくとも１つの第１のタグおよび少なくとも１つの第２のタグを含むオリゴヌクレオチドを調製する工程であって、第１のタグが第１のポリヌクレオチドから得られ、第２のタグが第２のポリヌクレオチドから得られ、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体から得られる、工程と、
（ｃ）オリゴヌクレオチドを配列決定する工程と、
（ｄ）第１のタグおよび第２のタグのヌクレオチド配列に基づいて少なくとも２つのポリヌクレオチドをマッピングし、それにより、少なくとも２つのポリヌクレオチドを検出および／または同定する工程と
を含む方法を提供する。
【００２９】
工程（ｂ）で得たオリゴヌクレオチドを、工程（ｃ）で配列決定する前に増幅することができる。ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができる。増幅したオリゴヌクレオチドを、増幅後、工程（ｃ）で配列決定する前に少なくとも１つの精製工程に供することができる。少なくとも１つの精製工程は、ゲル電気泳動であり得る。
【００３０】
本発明のオリゴヌクレオチドを、配列決定前に工程（ａ）〜（ｂ）によって得た少なくとも１つのさらなるオリゴヌクレオチドと鎖状体形成する(concatenate)ことができる。
【００３１】
Sanger法またはピロシーケンスなどの多重配列決定によって配列決定することができる。
【００３２】
ポリヌクレオチドのトランスフュージョン(transfusion)または転座について検出および／または同定することができる。したがって、この方法を使用して、核酸−タンパク質複合体（クロマチン中の核酸−タンパク質複合体）中で互いに近接したポリヌクレオチドおよび／または遺伝子を検出および／または同定することができる。さらに、目的のタンパク質が結合する核酸フラグメントは、目的のタンパク質が結合する領域（例えば、ヒストン結合部位）を含む任意の核酸フラグメントであり得る。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
【００３３】
オリゴヌクレオチドを、少なくとも１つの細胞にトランスフェクトすることができる。エレクトロポレーションによってトランスフェクションを行うことができる。細胞は、細菌細胞であり得る。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
【００３４】
別の態様では、本発明は、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドのコンカテマー、またはオリゴヌクレオチドまたはコンカテマーのライブラリーを含むベクターを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
［定義］
制限酵素−制限酵素（または制限エンドヌクレアーゼ）は、二本鎖ＤＮＡを切断する酵素である。この酵素は、２つの切り込み（塩基を損傷することなく二重らせんの各リン酸骨格に１つ）を作製する。酵素に切断された化学結合は、その末端が相補的であれば、リガーゼとして知られる他の酵素によって再形成することができ、これにより異なる染色体または遺伝子から得た制限フラグメントを互いにつなぎ合わせることができる。ＩＩ型酵素は、特定の核酸配列を認識し、その認識配列部位の近くまたは内部の定義された位置でＤＮＡを切断する。これらにより、個別の制限フラグメントおよび異なるゲルバンドパターンが得られる。ＩＩｓ型酵素は、その認識配列の外側の一方を切断する。ＭｍｅＩにより、ほとんどのＩＩｓ型制限酵素と同様に、長さが異なる末端が得られる。Dunn etal,2002は、ＭｍｅＩがおよそ１：１の比で１８／２０または１９／２１塩基を切断することができることを示した。全図中に示した配列は、それぞれＭｍｅＩを使用した１つの共通の変異形(variant)を示す。
【００３６】
ＰＥＴ中間体はまた、ポリヌクレオチドが異なる長さのポリヌクレオチドであり得るので、種々の長さを有する（すなわち、ｐＧＩＳ８プラスミドおよびＭＰＥＴ中間体へのクローニング後のＭおよびＧアダプターＤＮＡ配列）。ＩＩＩ型酵素はまたは、巨大な制限酵素と修飾酵素との組み合わせである。これらは、その認識配列の外側を切断し、切断するために同一ＤＮＡ分子内に反対方向に２つのこのような配列を必要とする。ホーミングエンドヌクレアーゼは、巨大な非対称の認識部位（１２〜４０塩基対）およびイントロン（ＤＮＡ）またはインテイン（タンパク質）のいずれかに通常は包埋されたコード配列を有する稀な二本鎖ＤＮアーゼである。制限酵素は、平滑末端またはオーバーハングを有する粘着末端のいずれかが残存する切断物を作製することができる。粘着末端フラグメントを、最初に切断されたフラグメントだけでなく、適合可能な付着末端または粘着末端を有する任意の他のフラグメントとライゲーションすることができる。このようなものとして、異なる酵素によって産生された末端も適合可能である。したがって、粘着末端を、ライゲーションすることができる末端ともいうことができる。多数のＩＩ型制限酵素は、回文ＤＮＡ配列を切断する。制限酵素が非縮重回文切断部位を有する場合、産生される全末端は適合可能である。「回文」配列は、一方の鎖上の配列が相補鎖上の配列を反対方向に読む配列である。そのようなものとして、その末端が結合し（ｍａｔｅ）、核酸鎖が自己環状化するような回文付着末端が得られるように核酸鎖を処理することが可能である。本文脈中での「回文」の意味は、その言葉遣いとは異なる。例えば、配列GTAATGは回文ＤＮＡ配列ではなく、配列GTATACは回文ＤＮＡ配列である。付着末端または粘着末端を遊離する制限酵素の例には、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩが含まれる。平滑末端、非付着末端、または非粘着末端を遊離する制限酵素の例には、ＢｓｅＲ１およびＡｌｕＩが含まれる。
【００３７】
ヌクレオチド−ヌクレオシドのリン酸エステル；核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の基本構造単位。ヌクレオチドは塩基対を形成する−２つの鎖を有するＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子の相補鎖を連結する水素結合によって結合した化学塩基対の１つ；塩基対は、ＤＮＡでは、アデニンとチミンとの対およびグアニンとシトシンとの対、ＲＮＡではアデニンとウラシルの対およびグアニンとシトシンとの対である。ヌクレオチドの短い鎖を、オリゴヌクレオチドといい、より長い鎖をポリヌクレオチドという。ヌクレオチドを、他のヌクレオチドと結合するか鎖状体形成することができる。用語「ヌクレオチド」を、用語「核酸」と交換可能に使用することができる。核酸ストレッチは、５’末端および３’末端を有する。核酸ストレッチの末端領域を、それぞれ５’末端および３’末端ということができる。ポリヌクレオチドの５’末端または３’末端を使用して、ポリヌクレオチドの実際の５’末端または３’末端を含むポリヌクレオチドの任意の領域、フラグメント、または全片が含まれることが理解される。
【００３８】
コンカテマー−末端と末端が連結した少なくとも２つのヌクレオチドモノマー配列から構成され、任意選択的に、リンカーまたはスペーサーによって分離している。本発明の目的のために、コンカテマーは、本発明の方法にしたがって調製された少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む。
【００３９】
クローン、クローニング−一方の生物由来のヌクレオチド（遺伝子など）を他方の生物に導入することおよび／または遺伝子操作技術による複製ヌクレオチド。
【００４０】
ライブラリー−通常、１つまたは複数のプラスミド中に含まれる、クローン化した核酸配列、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの集団。
【００４１】
ベクター−バクテリオファージ、プラスミド、または一方の細胞から他方の細胞に遺伝物質を導入する他の因子(agent)。
【００４２】
得る、由来する−材料に一定の所望の特徴を付与するために核酸およびタンパク質などの生体材料に対して分子生物学および遺伝子工学ならびに操作技術を使用すること。用語「得る」および「由来する」を、本発明で交換可能に使用することができる。
【００４３】
増幅−核酸コピー数の増加。一般的に使用されている１つの方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。当業者に公知の他の増幅方法も使用することができる。
【００４４】
トランスフェクションまたは形質転換−外来分子を細胞に移入するための任意の方法。リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、レトロウイルス送達、エレクトロポレーション、および遺伝子銃形質転換は、使用することができる技術のほんの一例である。
【００４５】
クロマチン−細胞核において、塩基性色素で容易に染色され、凝縮されて細胞分裂中に染色体を形成する核酸とタンパク質（主に、ヒストン）との複合体。クロマチンは、核酸−タンパク質複合体の例である。染色体領域は、同一または異なる染色体上のいずれかの他の領域と相互作用することができる。したがって、相互作用事象は、染色体間事象または染色体内事象であってよく、関連領域での遺伝物質の再整列を含み得る。
【００４６】
トランスフュージョン−新規のキメラ転写物を形成するＲＮＡプロセシングレベルでの遺伝情報の再整列。
【００４７】
転座−ゲノムＤＮＡレベルでの遺伝情報の再整列。
【００４８】
核酸−タンパク質複合体−遺伝物質とタンパク質（クロマチン中または転写因子が核酸ストレッチに結合した場合に見出されるタンパク質など）との相互作用。ＤＮＡ−タンパク質−ＤＮＡ（ＤＰＤ）複合体は、タンパク質が目的の核酸（ＤＮＡ）の２つのストレッチ間に結合するより特異的な構造である。ＤＮＡなどの核酸のストレッチを、タグまたは同定可能なＤＮＡ配列となるように操作することができる。
【００４９】
タグ、タグ−リンカー構造−タグまたはサイン(signature)は、同定可能な核酸配列であり、任意の連続ＤＮＡ領域由来の５’または３’の最も末端の核酸配列（末端；通常、１８〜２０ｂｐ）のいずれかをいうか、タグは、５’または３’の最も末端の核酸配列または任意の連続ＤＮＡ領域の末端を含むことができる。リンカーは、人工核酸配列である。したがって、タグ−リンカー−タグ構造は、リンカーが２つのタグの間にリンカーが挿入された核酸の整列である。別の可能な整列は、リンカーがタグに隣接した（すなわち、少なくとも１つのタグの上流および／または下流に配置した）リンカー−タグ−タグ−リンカーである。用語「タグ」および「サイン」を、本発明で交換可能に使用することができる。
【００５０】
ジタグ（ｄｉｔａｇ）−ポリヌクレオチドの短い（通常、１２〜６０ｂｐ）核酸フラグメント由来の末端タグまたはサイン。ジタグを、米国特許出願番号20050255501および／または同第20050059022号（その内容が本明細書中で参照することにより組み込まれる）にしたがって調製することができる。
【００５１】
配列決定−生体高分子（この場合、核酸）の構成要素の順序を決定するために使用される方法。使用される配列決定技術には、Sanger法およびその修正形態ならびにピロシーケンスまたは配列決定の「４５４法」が含まれる。
【００５２】
以下の説明では、本発明の実施形態を説明するために、詳細、特定の量、およびパラメーターを示す。しかし、このような詳細を用いることなく本発明を実施することができることが当業者に明らかなはずである。詳細のうちのいくつかは、本発明を曖昧にしないために、長々とは説明していない。
【００５３】
特定の実施形態のための本発明の方法の実施のために、本発明の他の実施形態を実施する目的のために開示した任意の説明も使用することができ、これは、本明細書中で参照することにより組み込まれる。特に、技術、試薬、実験条件、制限部位、酵素、ベクター、およびプライマーなど。特に、どのようにして他の実施形態のために開示された技術および材料を本発明の実施形態に適用するのかについては、当業者に明らかである。
【００５４】
当業者は、本明細書中で詳細に教示していない技術を、Molecular Cloning:A Laboratory Manual by Sambrook and Russell,Third Edition,2001,published by Cold Spring Harbor Laboratory Pressなどの標準的な分子生物学の参考図書で見出すことができることを認識している。
【００５５】
［説明］
本発明は、核酸複合体、特に、核酸−タンパク質複合体由来の少なくとも１つの核酸配列またはフラグメントを検出、同定、および／または調製する新規の方法に関する。特に、本発明の方法は、核酸−タンパク質複合体由来の少なくとも２つの核酸配列またはフラグメントを検出、同定、および／または調製する方法を提供する。本発明はまた、オリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドのコンカテマーを提供する。
【００５６】
１つの態様によれば、本発明は、クロマチン相互作用分析（ＣＩＡ）法を提供する。ＣＩＡは、ｄｅ  ｎｏｖｏでの遠位調節領域および染色体間相互作用に関する新規の情報を捕捉するためにデザインされている。本方法は、特定のＤＮＡ結合タンパク質（ヒストンなど）によって媒介される長距離および異なる染色体間のクロマチン相互作用事象を同定するようにデザインされている。
【００５７】
このようなＤＮＡ連結点を検出するためのＣＩＡ法の２つの実施形態（すなわち、２つのライゲーションした各ＤＮＡフラグメントから１つのタグサイン（約２０ｂｐ）を抽出して「タグ１−リンカー−タグ２」（「第１のタグ−リンカー−第２のタグ」とも呼ばれる）対合末端ジタグ（ＰＥＴ）構造を形成するＣＩＡ−ＰＥＴ法（図１）および「ＰＥＴ１−リンカー−ＰＥＴ２」構造（いわゆる、ｄｉＰＥＴ）中の２つの関連ＤＮＡフラグメントを示すために２つの対合末端ジタグ（ＰＥＴ）を得るＣＩＡ−ｄｉＰＥＴ法（図２））を本発明で提供する。ＣＩＡ−ＰＥＴおよびＣＩＡ−ｄｉＰＥＴのタグを、「４５４」ピロシーケンス法などの多重配列決定技術を使用して直接配列決定することができるか、従来の配列決定法を使用したクローニングおよび配列決定のために鎖状体形成することができる。
【００５８】
したがって、本発明は、少なくとも１つの単離オリゴヌクレオチドの調製方法であって、
（ａ）核酸−タンパク質複合体を供する工程と、
（ｂ）少なくとも１つの第１のタグおよび少なくとも１つの第２のタグを含むオリゴヌクレオチドを調製する工程であって、第１のタグおよび第２のタグが核酸−タンパク質複合体から得られる工程と、
（ｃ）オリゴヌクレオチドを単離する工程と、
を含む、方法を提供する。
【００５９】
第１のタグを第１のポリヌクレオチドから得ることができ、第２のタグを第２のポリヌクレオチドから得ることができ、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、核酸−タンパク質複合体から得られる。
【００６０】
工程（ｂ）が、
（ｉ）少なくとも１つの制限酵素の認識部位を含む少なくとも１つのリンカーを挿入する工程と、
（ｉｉ）第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを、リンカー中の少なくとも１つの制限部位を認識する少なくとも１つの制限酵素で切断して、第１のポリヌクレオチドから得た第１のタグ、第２のポリヌクレオチドから得た第２のタグ、およびリンカーを含むオリゴヌクレオチドを形成する工程と
を含むことができる。
【００６１】
特に、工程（ｂ）が、
（ｉ）少なくとも１つの制限酵素の認識部位を含む少なくとも１つのリンカーを、複合体の第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間に挿入する工程と、
（ｉｉ）少なくとも１つの制限酵素の各制限部位を第１のポリヌクレオチドの５’末端および第２のポリヌクレオチドの３’末端に付加する工程と、
（ｉｉｉ）第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを少なくとも１つの認識部位を認識する少なくとも１つの制限酵素で切断して切断フラグメントを得る工程と、
（ｉｖ）切断フラグメントをライゲーションして、第１のポリヌクレオチドから得た第１のタグ、第２のポリヌクレオチドから得た第２のタグ、各ポリヌクレオチドの５’末端および３’末端を含むタグ、およびタグの間に挿入されたリンカーを含むオリゴヌクレオチドを形成する工程
とを含むことができる。
【００６２】
本発明はまた、核酸−タンパク質複合体由来の少なくとも２つのポリヌクレオチドを検出および／または同定する方法であって、
（ａ）核酸−タンパク質複合体を供する工程と、
（ｂ）少なくとも１つの第１のタグおよび少なくとも１つの第２のタグを含むオリゴヌクレオチドを調製する工程であって、第１のタグが第１のポリヌクレオチドから得られ、第２のタグが第２のポリヌクレオチドから得られ、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体から得られる工程と、
（ｃ）オリゴヌクレオチドを配列決定する工程と、
（ｄ）配列に基づいて少なくとも２つのポリヌクレオチドをマッピングし、それにより、少なくとも２つのポリヌクレオチドを検出および／または同定する工程と
を含む方法を提供する。
【００６３】
リンカー配列は、各末端に２つのＩＩ型制限酵素の認識部位を保有する（図２および４）。それにより、ＩＩ型制限消化後に、各タグ配列サインの各々（約２０ｂｐ）を、２つの連結ＤＮＡフラグメントから切り出してタグ−リンカー−タグ構造（この構造は、一方のタグは染色体の１つのＤＮＡ領域を示す一方で、他のタグは同一染色体上の離れた領域の遺伝子座または異なる染色体中の遺伝子座を示す。）を形成することができる。この対合末端ジタグ構造を、「ＣＩＡ−ＰＥＴ」といい、より長いＤＮＡストレッチへの鎖状体形成(concatenation)によって有効に配列決定することができるか、配列決定によって直接分析することができる。
【００６４】
あるいは、リンカー配列を２つのタグに隣接させて、リンカー−タグ−タグ−リンカー構造を得ることができる。
【００６５】
この方法では、核酸−タンパク質複合体（未変性のＤＮＡ−タンパク質−ＤＮＡ（ＤＰＤ）複合体など）を、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはメタノールなどの適切な固定液によって架橋する。次いで、架橋ＤＰＤ複合体を、超音波処理、ハイドロシャーリング(hydroshearing)(Hydroshear,Gene Machines)、皮下注射針による引き抜きの反復(repeated drawing)、または制限酵素消化によって断片化することができる。異なる染色体に由来するか、距離の長いＤＮＡフラグメントを、ＤＰＤ複合体中のＤＮＡ結合タンパク質によって繋留する。これらのＤＮＡフラグメントのうちのどのＤＮＡフラグメントがＰＣＲプライマーを生成するのかについての既存の知識または推移を必要とする３Ｃ技術と異なり、ＤＰＤ複合体中に結合した遠位関係のＤＮＡフラグメントの末端を、ライゲーションによって特定のリンカーで連結する。
【００６６】
リンカー（約２０ｂｐ）は、各ＤＰＤ複合体中のタンパク質によって繋留された異なるＤＮＡフラグメントの末端を連結するための２つのＩＩ型制限酵素の認識部位を含む。次いで、２つの関連するＤＮＡフラグメントのＤＮＡ連結点を、対合末端ジタグ化（ＰＥＴ）ストラテジー（米国特許出願番号20050255501号）によってタグ化することができる。ＩＩｓ型制限酵素の認識部位が好ましい。ＩＩ型制限酵素に加えて、任意の他の適切な制限酵素（ＩＩＩ型またはホーミング制限酵素が含まれる）を使用することができる。
【００６７】
したがって、本発明は、１つの態様では、特定のＤＮＡ結合タンパク質（ヒストンなど）によって媒介される長距離および異なる染色体間のクロマチン相互作用事象を同定する方法を提供する。別の態様では、本発明は、少なくとも１つの第１のタグおよび少なくとも１つの第２のタグを含む単離オリゴヌクレオチドであって、第１のタグが第１のポリヌクレオチドから得られ、第２のタグが第２のポリヌクレオチドから得られ、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体から得られる、単離オリゴヌクレオチドを提供する。タグは、核酸−タンパク質複合体中のクロマチン領域に対応する。これらのタグを、クロマチン相互作用事象の分析、同定、および／または検出のために配列決定することができる（図３および５）。
【００６８】
単離オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのリンカーをさらに含むことができる。リンカーをタグの間に挿入することができ、また、リンカーを少なくとも１つのタグの上流および／または下流に配置することができる。リンカーは、少なくとも１つの制限酵素の認識部位を含むことができ、少なくとも１つの制限酵素の認識部位は非対称であってよく、少なくとも１つの制限酵素の認識部位はＩＩｓ型制限酵素またはホーミング制限酵素の認識部位であり得る。
【００６９】
あるいは、少なくとも１つの第１のタグは第１のポリヌクレオチド由来の５’末端および３’末端を含むことができ、少なくとも１つの第２のタグは第２のポリヌクレオチド由来の５’末端および３’末端を含むことができる。単離オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのリンカーをさらに含むことができる。リンカーをタグの間に挿入することができ、また、リンカーを少なくとも１つのタグの上流および／または下流に配置することができる。リンカーは、少なくとも１つの制限酵素の認識部位を含むことができ、少なくとも１つの制限酵素の認識部位は非対称であってよく、少なくとも１つの制限酵素の認識部位はＩＩｓ型制限酵素またはホーミング制限酵素の認識部位であり得る。
【００７０】
リンカーは、第１のポリヌクレオチドを切断して第１のタグを得ることができる制限酵素によって認識される第１の制限認識部位、および第２のポリヌクレオチドを切断して第２のタグを得ることができる制限酵素によって認識される第２の制限認識部位を含むことができる（図１および４）。
【００７１】
リンカーは、第１のポリヌクレオチドを切断して第１のポリヌクレオチドの３’末端を得ることができる制限酵素によって認識される第１の制限認識部位、および第２のポリヌクレオチドを切断して第２のポリヌクレオチドの５’末端を得ることができる第２の制限酵素によって認識される第２の制限認識部位を含むことができる。あるいは、リンカーは、第１のポリヌクレオチドを切断して第１のポリヌクレオチドの５’末端を得ることができる制限酵素によって認識される第１の制限認識部位、および第２のポリヌクレオチドを切断して第２のポリヌクレオチドの３’末端を得ることができる第２の制限酵素によって認識される第２の制限認識部位を含むことができる。
【００７２】
第１のポリヌクレオチドを、第３の認識部位を認識する第３の制限酵素によってさらに切断して第１のポリヌクレオチドの３’末端を得ることができ、第２のポリヌクレオチドを、第４の認識部位を認識する第４の制限酵素によってさらに切断して第２のポリヌクレオチドの５’末端を得ることができ、少なくとも１つの第１のタグは、第１のポリヌクレオチドの５’末端および３’末端のライゲーションによって得られ、少なくとも１つの第２のタグは、第２のポリヌクレオチドの５’末端および３’末端のライゲーションによって得られる（図２および６）。第１の認識部位および第３の認識部位は同一の配列を有することができ、第２の認識部位および第４の認識部位は同一の配列を有することができる。
【００７３】
単離オリゴヌクレオチドの核酸−タンパク質複合体は、クロマチン構造の一部であり得る。目的のタンパク質が結合する核酸フラグメントは、目的のタンパク質が、例えば、ヒストン結合部位に結合する領域を含む任意の核酸フラグメントであり得る。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
【００７４】
得られたＣＩＡ−ＰＥＴ配列を、クロマチン相互作用連結点を局在化するために基準ゲノム配列にマッピングすることができ、連結点は、長距離の染色体内（同一染色体上）または染色体間（異なる染色体上）のいずれかであり得る。この情報を、核内の染色体三次元組織化構造、転写因子によって媒介される長距離および異なる染色体における遺伝子調節の調和、および他の後成的遺伝学に関する問題の研究のために使用することができる（図３および５）。
【００７５】
完全なゲノム配列を利用可能であるので、全てのクロマチン相互作用の可能性を同定するための全ゲノムアプローチを開発することが可能である。全ゲノムタイリング(tiling)アレイは、ゲノム調査のための魅力的なアプローチであり、これは、マイクロアレイ中の全ゲノムを対象とするために２０〜６０量体のオリゴヌクレオチドをタイリングし、生体内容物を含むＤＮＡプローブをアレイとハイブリッド形成し、全アレイエレメントのハイブリッド形成シグナル強度のプロフィールが遺伝因子調査のための読み出し情報である。タイリングアレイは、エクソンの同定およびＣｈＩＰ（ＣｈＩＰ−ｃｈｉｐ）と組み合わせた場合の転写因子結合部位の局在化に有用であることが証明されている。アレイベースのアプローチは、その高度な複雑さおよび並列性(parallel nature)によって有効であるけれど、ハイブリッド形成ベースの検出がクロマチン相互作用における２つのＤＮＡフラグメントの非直線関係を検出することができるとは考えられない。
【００７６】
［１つの実施形態のオリゴヌクレオチドの調製］
核酸−タンパク質複合体を、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）によって得ることができる。
【００７７】
［クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）］
ＣｈＩＰを使用して富化し、それにより、ヒストンおよび核酸−タンパク質複合体中の核酸に結合することができる他のタンパク質などの特定のタンパク質と会合するゲノム領域を同定可能である（Tavermer et al.,Genome Biol.2004.5(3):p.210に概説）。タンパク質をその相互作用部位でＤＮＡと架橋することを目的とする。培養物中の生きた細胞へのホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはメタノールなどの適切な固定液の直接添加によってこれを迅速且つ有効に行う。
【００７８】
次いで、これらの固定細胞の粗抽出物を調製し、超音波処理、ハイドロシャーリング、皮下注射針による引き抜きの反復、または制限酵素消化によって、クロマチンを、通常、約１ｋｂの平均サイズに剪断し、次いで、目的のＤＮＡ会合タンパク質（例えば、転写因子またはヒストン）に対して惹起する抗体での免疫沈降反応で使用する。次いで、各免疫沈降で富化したＤＮＡフラグメントを脱連結し、精製し、種々の方法によって同定することが可能である。ＣｈＩＰ使用の利点は、このアプローチがクロマチンおよび他のヒストンタンパク質の迅速な架橋によってインビボ遺伝子調節ネットワークを「フリーズ」し、それにより、例えば、異種発現によって課される人工産物を含まない、調節系の「真の」姿(picture)をいつでも示す理論を得ることができることである。
【００７９】
最近、ＣｈＩＰは、全ゲノム(Lieb et al.,Nat Genet,2001,28(4):p.327-34)、全染色体(Euskirchen et al.,MolCell Biol.2004.24(9):p.3804-14)、およびＣｐＧ島(Weinmann et al.,Genes Dev,2002.16(2):p.235-44)、または転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）などのタンパク質結合部位のゲノムレベルで局在化することができる見込みがある「ＣｈＩＰ−ｃｈｉｐ」または「ＣｈＩＰ−ｏｎ−ｃｈｉｐ」アプローチ（Buck and Lieb,2004に概説）におけるマイクロアレイと組み合わされている。このアプローチの実用性は酵母などの小さなゲノムで証明されている一方で(Lieb et al.,Nat Genet,2001,28(4):p.327-34)、より複雑な生物の全ゲノムマイクロアレイの産生の費用および複雑さが依然として制限要因である。
【００８０】
ＣｐＧ島マイクロアレイは、ＣｐＧ含有量が高いヒトゲノムフラグメントを含む。ＣｐＧ島はしばしばプロモーター領域に対応するので(Antequera and Bird,Proc Natl Acad Sci USA,1993.90(24):p.11995-9)、このようなマイクロアレイは妥協案となりえる。しかし、推定タンパク質結合部位の位置は、依然として、アレイ上にスポットされたＣｐＧリッチプローブのゲノムＤＮＡの上流および下流（これが超音波処理されたＣｈＩＰフラグメントのおおよそのサイズであるので、通常、１〜２ｋｂ）の試験によって間接的に推測しなければならない。
【００８１】
代替法として、ＣｈＩＰ富化ＤＮＡフラグメントのクローニングおよび配列決定が以前に試みられてきたが、少しの成功しかおさめられていない。全ゲノムの高バックグラウンドに対してＣｈＩＰ富化の標的が得られることが問題である。特異的標的が１００倍富化されている場合でさえも、依然としてＣｈＩＰライブラリー中に小フラクションのクローンしか認められず、このことが標準的なＤＮＡ配列決定を非常に高額な解決法にしている。したがって、これらの環境下でのＣｈＩＰクローンの配列決定は、富化標的の同定のための良好なアプローチではない。遺伝子発の連続分析(Serial Analysis of Gene Expression)(SAGE)および大量並行サイン配列決定(Massively Parallel Signature Sequencing(MPSS))(Brenner et al.,Nat Biotechnol,2000.18(6):p.630-4)により、ＣｈＩＰ富化の検出のための有用な定量ツールとしても示唆されており、基本原理は、ＣｈＩＰ富化ＤＮＡフラグメントから生成されたタグが非特異的バックグラウンドと比較して多数存在することである。
【００８２】
次いで、これらのタグを、目的の一般的領域の同定のために、ゲノム配列にマッピングすることができる（すなわち、１〜２ｋｂ（超音波処理フラグメントを示す））。２０ｂｐのＳＡＧＥタグおよびＭＰＳＳタグは、ほとんどの場合、特定のゲノムの位置を定義するのに十分に特異的なはずであるにもかかわらず、ゲノムにマッピングする場合、タグの約１〜２ｋｂ上流および下流の全配列を依然として試験しなければならない。これは、ＣｐＧ島マイクロアレイアプローチが直面する問題と同一である。さらに、これらの方法を使用して完全に対象とするためには、必須の制限酵素の認識部位（マッピング−酵素部位）の利用可能性に依存し、認識部位が一定のゲノムの位置に存在しない場合、特定のタグが対応するＣｈＩＰフラグメントから喪失しているので、この位置は、ゲノム内の「盲点」である。
【００８３】
上記の問題から、ゲノムレベルの転写調節分析を容易にするために必要なのは、全ゲノムアレイの代替法として、タンパク質結合領域に隣接する核酸配列を正確且つ迅速に特定する方法であることが明らかである。これに関して、本発明によって提供された新規のアプローチは、以下のいくつかの利点を有する。（ｉ）各タグが５’および３’サインに含まれる連続ＤＮＡセグメントに由来することが既に公知であるので、本発明の１つの方法によって生成されたタグ配列がより高いマッピング特異性を示す。この情報によって目的のゲノム領域の正確な局在化が容易になり、標準的なＳＡＧＥタグまたはＭＰＳＳタグの上流および下流の配列をおよそ１〜２ｋｂ毎に繰り返し試験する必要性が回避される。（ｉｉ）したがって、本発明の方法は、マッピング−酵素部位の存在のためのいかなる要件とも無関係である。（ｉｉｉ）配列決定前のタグの鎖状体形成は、１回の配列決定の読み取りで数個のタグを同定することができることを意味する。（ｉｖ）したがって、このクラスター中のマッピングされた全タグに共通の（すなわち、重複した）領域により、問題の核酸−タンパク質複合体に関与するＤＮＡ領域が定義される。
【００８４】
［タグおよびジタグ］
本出願の目的のために、タグは、核酸分子から得られたヌクレオチド配列またはサインであり、タグが得られるか由来するポリヌクレオチドに相当する。収縮するか相当することが意図されるポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、全長ｃＤＮＡ、またはｃＤＮＡであり得る。
【００８５】
本発明では、本発明のオリゴヌクレオチド中に存在する２つのタグを、それぞれ、ジタグと呼ぶこともできる。タグと同様に、ジタグは、由来するか相当する元の核酸分子よりも短い。好ましくは、ジタグは、元の核酸分子よりも短くなければならない。「収縮」の結果として、ジタグは、本質的に、元の核酸分子の５’末端領域（５’タグとしても示される）および３’末端領域（３’タグとしても示される）のいずれかまたは両方を含むことができる。したがって、最初は５’タグおよび３’タグの間または内側に存在する元の核酸分子の一部は、ジタグ中に含まれない。本発明のジタグは、元の核酸分子のほとんどの有益な特徴（すなわち、核酸の出発サインおよび終結サイン）を保持している。
【００８６】
ジタグを形成する５’タグおよび３’タグは、同一または異なるサイズを有することができる。好ましくは、これらは、同数のヌクレオチドを有する。ジタグは、任意のサイズであってよいが、由来する親配列のサイズより有意義且つ有利である必要がある。タグまたはジタグの好ましいサイズは、ゲノムの複雑さによって決定される。細菌ゲノムについては、約８ｂｐ〜約１６ｂｐのタグが十分であり得るのに対して、ヒトゲノムのような複雑なゲノムについては、１６〜２０ｂｐのタグ（言い換えれば、３２〜４０ｂｐのジタグ）と見なすことができる。一般に、ジタグのサイズは、約１２〜６０ｂｐである。
【００８７】
本出願の目的のために、用語「５’末端(terminus)」、「５’末端(end)」、および「５’タグ」は、互いに等価であり、交換可能に使用することができる。同様に、用語「３’末端(terminus)」、「３’末端(end)」、および「３’タグ」は、互いに等価であり、交換可能に使用することができる。減少または相当することを意図する核酸分子内の元の核酸分子または一部では、５’末端および３’末端は、それぞれ、先端に最も近い領域または部分および分子の中央領域から最も遠い領域または部分に相当する。
【００８８】
本発明の１つの態様によれば、ジタグ中に含まれる５’タグおよび３’タグは、それぞれ、減少するか相当することが意図される核酸分子またはその一部の５’末端および３’末端に最も近い制限酵素によって切断された分子領域である。したがって、ジタグのサイズを、使用する制限酵素によって決定することができる。
【００８９】
したがって、本発明は、少なくとも１つの第１のタグおよび少なくとも１つの第２のタグを含む単離オリゴヌクレオチドを含む単離オリゴヌクレオチドであって、第１のタグが第１のポリヌクレオチドから得られ、第２のタグが第２のポリヌクレオチドから得られ、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体から得られる、単離オリゴヌクレオチドを提供する。オリゴヌクレオチドは、タグの間に挿入された少なくとも１つのリンカーをさらに含むことができる。オリゴヌクレオチドはまた、タグに隣接させるために挿入された少なくとも１つのリンカーをさらに含むことができる（すなわち、少なくとも１つのリンカーを、少なくとも１つのタグの上流および／または下流に配置することができる）。
【００９０】
［リンカー］
特に、各リンカーは、少なくとも１つの第１の制限部位および少なくとも１つの第２の隣接制限部位を少なくとも含むことができる。したがって、各リンカー中に存在する制限部位数は、１つまたは複数、好ましくは、２つであり得る。制限部位は、非対称の制限部位であり得る。非対称の制限部位の例は、ホーミングエンドヌクレアーゼ非対称認識部位およびいくつかのＩＩ型（またはクラスＩＩ）認識部位である。その認識部位の片側を切断するＩＩｓ型制限酵素が好ましい。
【００９１】
しかし、当分野で公知の任意の認識部位を使用することができる。核酸分子内の少なくとも１つの認識部位を認識し、且つ使用することができる制限酵素は、当業者に明らかである（例えば、Current Protocols in Molecular Biology,Vol.2,1995,Ed.Ausubel,et al.Greene Publish.Assoc.& Wiley Interscience,Unit 3.1.15;New England Biolabs Catalog,2005を参照のこと）。可能な制限部位およびこれらを認識する対応制限酵素のリストを以下に報告する。
【００９２】
例として、制限部位を認識する制限酵素を、本発明のジタグの調製のために使用することができる。特に、ＩＩｓ型酵素（例えば、ＭｍｅＩ）。ＭｍｅＩを使用する場合、この酵素は、減少することが意図される核酸分子に隣接する２つのアダプターのそれぞれの内側の配列を認識するが、核酸分子の内側を切断して１７〜２１ヌクレオチドを含むタグを形成する（図１および４中に示すＭｍｅＩ切断物を参照のこと）。２つのこのようなタグを、平滑末端形成およびライゲーションによってさらに処理して、３４〜３８ヌクレオチドを含むジタグを形成することができる。したがって、互いにスプライシングするか同一の核酸分子の５’末端および３’末端をライゲーションすることによってジタグが得られる。
【００９３】
例として、非対称部位を移入することができる。本発明の目的に有用な非対称部位配列は、以下である。ｉ）２つのホーミングエンドヌクレアーゼ非対称認識部位の配列、またはｉｉ）ＩＩ型制限酵素によって認識される制限エンドヌクレアーゼ非対称切断部位の配列。
【００９４】
ホーミングエンドヌクレアーゼは、市販されており、New England Biolabs,Inc.によって説明されており、非対称部位配列の説明を、New England Biolabs Catalogから利用することもできる。これらのホーミングエンドヌクレアーゼ非対称認識部位の配列は、１８〜３９ｂｐである。しかし、本発明では、認識部位配列は、これらの配列やこれらのサイズに限定されない。好ましくは、非対称部位配列を切断することができる制限ホーミングエンドヌクレアーゼは、以下からなる群から選択される。Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、およびＩ−ＳｃｅＩ。しかし、上記リストは、完全ではない。当分野で公知である他のホーミングエンドヌクレアーゼおよびその後に発見することができる他のホーミングエンドヌクレアーゼは、本発明の範囲に含まれる。
【００９５】
ＩＩ型制限酵素の例には、以下が含まれる。ＡａｒＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＡｌｏＩ、ＢａｅＩ、Ｂｂｒ７Ｉ、ＢｂｖＩ、ＢｂｖＩＩ、ＢｃｃＩ、Ｂｃｅ８３Ｉ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｅｆＩ、ＢｃｇＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｉＩ、ＢｉｎＩ、ＢｐＩＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｃＡＩ、ＢｓｅＭＩＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、Ｂｓｐ２４Ｉ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｔＦ５Ｉ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＣｊｅＩ、ＣｊｅＰＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｃｏ５７Ｉ、Ｅｃｏ５７ＭＩ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａＩＩ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＧｓｕＩ、ＨａｅＩＶ、ＨｇａＩ、Ｈｉｎ４Ｉ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｋｓｐ６３２Ｉ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎＩＩ、ＰｌｅＩ、ＰｐｉＩ、ＰｓｒＩ、ＲｌｅＡＩ、ＳａｐＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｓｐＤ５Ｉ、Ｓｔｈ１３２Ｉ、ＳｔｓＩ、ＴａｑＩＩ、ＴｓｐＤＴＩ、ＴｓｐＧＷＩ、ＴｓｐＲＩ、およびＴｔｈ１１１ＩＩ（Rebase Enzymes(登録商標)のウェブサイト中のリスト：http://rebase.neb.com/cgi-bin/outsidelist;Szybalski,W.,1985,Gene,40:169も参照のこと）。しかし、上記リストは、完全ではない。当分野で公知である他のＩＩ型酵素およびその後に発見することができる他のＩＩ型酵素は、本発明の範囲に含まれる。
【００９６】
いくつかのクラスＩＩ制限酵素の認識部位および切断部位の例は、ＢｂｖＩ（GCAGC  ８／１２）、ＨｇａＩ（GACGC  ５／１０）、ＢｓｍＦＩ（GGGAC  １０／１４）、ＳｆａＮＩ（GCATC  ５／９）、およびＢｓｐＩ（ACCTGC  ４／８）である（括弧内は認識部位および切断部位である）。
【００９７】
人工制限エンドヌクレアーゼも使用することができる。これらのエンドヌクレアーゼを、タンパク質工学によって調製することができる。例えば、エンドヌクレアーゼＦｏｋＩは、挿入によってＤＮＡ基質の両鎖上の認識部位からさらに離れた１つのヌクレオチドを切断するように操作されている。Li and Chandrasegaran.Proc.Nat.Acad.Sciences USA 90:2764-8,1993を参照のこと。このような技術を適用して、所望の認識配列および認識部位から切断部位までの所望の距離を有する制限エンドヌクレアーゼを調製することができる。
【００９８】
本発明では、本発明の単離オリゴヌクレオチドを、他の単離オリゴヌクレオチドと連結または鎖状体形成して、オリゴヌクレオチドのコンカテマーを形成することができる。配列決定または適切なプラスミドまたはベクターへのクローニングのためにかなり多数のオリゴヌクレオチドを互いに連結することができる。
【００９９】
したがって、別の態様では、本発明は、少なくとも２つの単離オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのコンカテマーであって、各単離オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの第１のタグおよび少なくとも１つの第２のタグを含み、ここで、第１のタグが第１のポリヌクレオチドから得られ、第２のタグが第２のポリヌクレオチドから得られ、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体から得られる、コンカテマーである。
【０１００】
オリゴヌクレオチドのコンカテマーの単離オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのリンカーをさらに含むことができる。リンカーを、タグの間に挿入することができる。あるいは、リンカーをタグに隣接させることができる。リンカーは、少なくとも１つの制限酵素の認識部位を含むことができ、少なくとも１つの制限酵素の認識部位は、ＩＩｓ型制限酵素の認識部位であり得る。
【０１０１】
１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドのコンカテマーの第１のタグは、第１のポリヌクレオチド由来の３’末端を含むことができ、第２のタグは、第２のポリヌクレオチド由来の５’末端をさらに含む。鎖状体形成したポリヌクレオチドの単離オリゴヌクレオチドは、それぞれ、タグの間に挿入された少なくとも１つのリンカーをさらに含むことができる。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドのコンカテマーの第１のタグは、第１のポリヌクレオチド由来の５’末端を含むことができ、第２のタグは、第２のポリヌクレオチド由来の３’末端をさらに含む。
【０１０２】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドのコンカテマーの第１のタグは、第１のポリヌクレオチド由来の５’末端および３’末端を含むことができ、第２のタグは、第２のポリヌクレオチド由来の５’末端および３’末端をさらに含む。オリゴヌクレオチドのコンカテマーの単離オリゴヌクレオチドは、それぞれ、タグの間に挿入された少なくとも１つのリンカーをさらに含むことができる。
【０１０３】
これらの実施形態のいずれかのリンカーは、少なくとも１つの制限酵素の認識部位を含むことができ、少なくとも１つの制限酵素の認識部位は、ＩＩｓ型制限酵素の認識部位であり得る。
【０１０４】
オリゴヌクレオチドのコンカテマーを、ベクターまたは細胞に挿入することができ、細胞は細菌細胞であり得る。
【０１０５】
オリゴヌクレオチドのコンカテマーは、クロマチン構造に由来し得る。ポリヌクレオチドは、同一染色体上に存在するか、ポリヌクレオチドは、異なる染色体上に存在する。
【０１０６】
これらは好ましいコンカテマーであるが、鎖状体形成することができる本発明のオリゴヌクレオチド数がオリゴヌクレオチドの長さに依存し、当業者が過度に実験することなく容易に決定することができることが明らかである。コンカテマーの形成後、配列決定のために複数のタグをベクターにクローン化することができるか、ジタグまたはコンカテマーを当業者に公知の方法によってクローニングすることなく直接配列決定することができる。したがって、ジタグの鎖状体形成により、１つのベクターまたはクローン内の複数のジタグの配列決定による連続的様式において全長ｃＤＮＡのような核酸分子を有効に分析可能である。
【０１０７】
用語「ベクター」または「組換えベクター」は、ジタグ遺伝子配列の挿入または組み込みによって操作されたプラスミド、ウイルス、または当分野で公知の他の送達体(vehicle)も使用することができることが意図される。このようなベクターは、有効な転写を容易にするプロモーター配列を含む。ベクターは、典型的には、複製起点、プロモーター、および形質転換細胞を表現型で選択することが可能な特定の遺伝子を含む。本発明での使用に適切なベクターには、例えば、pBlueScript(Stratagene,La Jolla,CA)、ｐＢＣ、ｐＺＥｒＯ−１(Invitrogen,Carlsbad,CA)、およびｐＧＥＭ３ｚ(Promega,Madison,WI)、またはこれらの修飾ベクター、ならびに当業者に公知の他の類似のベクターが含まれる。特定の用途（realization)として、ｐＧＥＭ３ｚベクターを修飾し、これを、ｐＧＩＳ８という（図７および１１）。ｐＧＥＭベクターは、米国特許第4,766,072号（本明細書中で参照することにより組み込まれる）にも開示されている。
【０１０８】
タグまたはジタグが由来する親ポリヌクレオチドまたは核酸分子の産生のために、全長ライブラリーとして、適切なベクターを使用することができる。したがって、本発明の範囲内である適切なベクターは、ベクター骨格がポリヌクレオチドの挿入後にポリヌクレオチドまたはジタグに隣接するアダプター中に含まれる同一の制限部位を含まないベクターである。好ましくは、本発明は、ベクター骨格（ポリヌクレオチドの挿入時に除去される多クローニング部位を含むスタッファー(stuffer)領域内以外）は、アダプターに含まれる第１の制限部位および第２またはさらなる制限部位を含まないベクターを提供する。特に、ベクターは、アダプター中に含まれる少なくともＩＩ制限部位（例えば、ＩＩｓ型制限部位）および少なくとも第２またはさらなる制限部位を含まない。より好ましくは、ベクター骨格（ポリヌクレオチドの挿入時に除去されるスタッファー領域内以外）は、ＭｍｅＩおよびＢａｍＨＩを含まない。
【０１０９】
スタッファーの外側の任意の領域中にＭｍｅＩを含まないこのようなベクターの例は、図７および１１に示すベクターｐＧＩＳ８である。ｐＧＩＳ８では、ＭｍｅＩ認識部位を、変異誘発によって欠失した。
【０１１０】
したがって、本発明は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのライブラリーであって、オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの第１のタグおよび少なくとも１つの第２のタグを含み、第１のタグが第１のポリヌクレオチドから得られ、第２のタグが第２のポリヌクレオチドから得られ、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体から得られる、ライブラリーを提供する。本発明のオリゴヌクレオチドのコンカテマーのライブラリーも提供する。
【０１１１】
オリゴヌクレオチドライブラリーの少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、タグの間に挿入された少なくとも１つのリンカーを含むことができる。あるいは、リンカーは、その代わりにタグに隣接することができる。第１のタグは、第１のポリヌクレオチド由来の５’末端および３’末端を含むことができ、第２のタグは、第２のポリヌクレオチド由来の５’末端および３’末端をさらに含む。
【０１１２】
ポリヌクレオチド核酸−タンパク質複合体は、クロマチン構造の一部であり得る。ポリヌクレオチドは、同一染色体上に存在することができるか、ポリヌクレオチドは、異なる染色体上に存在することができる。
【０１１３】
１つの態様によれば、オリゴヌクレオチドを増幅する。例えば、ＰＣＲまたは任意の他の公知の増幅法の使用による。ＰＣＲプライマーおよびプローブ配列を、ジタグの配列情報に基づいて調製することができる。したがって、ベクター内の特定の領域に対応する適切なＰＣＲプライマーを使用する。このような領域は、ジタグおよびアダプターを含むオリゴヌクレオチドに隣接する。ＰＣＲを、ライゲーション（自己環状化）反応によって直接行い、短い（例えば、２００ｂｐ）ＰＣＲ産物を得ることができる。
【０１１４】
次いで、必要なジタグを含むこれらのＰＣＲ産物を、少なくとも第２の制限部位（アダプター内）を認識する酵素で切断して、必要な短い付着ジタグを生成することができる。第２の制限部位またはさらなる制限部位を認識する制限酵素として、例えば、ＢａｍＨＩを使用することができ、５０ｂｐの付着ジタグが生成される。この増幅工程の利点は、生成されたジタグがジタグライブラリー増幅を必要とせず、自己環状化タグ化プラスミドを形質転換しないことによって回避することができることである。次に、増幅オリゴヌクレオチドを、ベクターから切り出し（この例では、ＢａｍＨＩでの消化による）、次のクローニングおよび配列決定分析のために長いＤＮＡまたはＲＮＡストレッチ中に鎖状体形成することができる（図１および２）。
【０１１５】
特定の態様として、本発明は、オリゴヌクレオチドが少なくとも１つのジタグを含み、ジタグが約３４〜３８ヌクレオチドを含み、且つ全長ｃＤＮＡまたはそのフラグメントの５’末端由来のヌクレオチドおよび３’末端由来のヌクレオチドのスプライシングによって得られる、ｃＤＮＡライブラリーを開示する。
【０１１６】
本発明のジタグライブラリーは、元の核酸分子を含むライブラリーの代表である。例えば、核酸分子を含むライブラリーが全長ポリヌクレオチドライブラリーである場合、ジタグライブラリーは、全長ジタグライブラリーの代表である。各ジタグクローンは、特定の全長クローンを特徴づける十分な情報を含む。本発明のより重要なジタグは、核酸−タンパク質複合体由来の元の全長ポリヌクレオチドの５’末端および３’末端を含む。したがって、ジタグは、ポリヌクレオチド構造の代表である。
【０１１７】
したがって、ジタグライブラリーのジタグクローンを配列決定および分析することで十分である。目的のジタグが見出された場合、対応する全長ポリヌクレオチドを選択し、例えば、ＰＣＲによって全長ポリヌクレオチドライブラリーから調製するか、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって標的ＲＮＡサンプルから直接調製することができる。
【０１１８】
本発明のオリゴヌクレオチドを、「４５４」配列決定（ピロシーケンス）法(Margulies et al,2005)によって配列決定するか、クローニングのためにより長いＤＮＡストレッチに鎖状体形成してＣＩＡ−ＰＥＴライブラリーを作製し、その後に、Sangerキャピラリー法を使用して配列決定することができる。
【０１１９】
したがって、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドを調製し、核酸−タンパク質複合体由来の少なくとも２つのポリヌクレオチドを検出および／または同定し、本発明のオリゴヌクレオチドおよび鎖状体形成したオリゴヌクレオチドを含むベクターを調製する方法を提供する。
【０１２０】
したがって、別の態様では、本発明は、少なくとも１つの単離オリゴヌクレオチドの調製方法であって、
（ａ）核酸−タンパク質複合体を供する工程と、
（ｂ）少なくとも１つの第１のタグおよび少なくとも１つの第２のタグを含むオリゴヌクレオチドを調製する工程であって、第１のタグおよび第２のタグが核酸−タンパク質複合体から得られる工程と、
（ｃ）オリゴヌクレオチドを単離する工程と、
を含む、方法を提供する。
【０１２１】
特に、少なくとも１つの単離オリゴヌクレオチドの調製方法であって、
（ａ）核酸−タンパク質複合体を供する工程と、
（ｂ）少なくとも１つの第１のタグおよび少なくとも１つの第２のタグを含むオリゴヌクレオチドを調製する工程であって、第１のタグが第１のポリヌクレオチドから得られ、第２のタグが第２のポリヌクレオチドから得られ、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体から得られる工程と、
（ｃ）オリゴヌクレオチドを単離する工程と、
を含む、方法を提供する。
【０１２２】
１つの実施形態では、本発明のこの態様の工程（ｂ）が、
（ｉ）少なくとも１つの制限酵素の認識部位を含む少なくとも１つのリンカーを挿入する工程と、
（ｉｉ）第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを、リンカー中の少なくとも１つの制限部位を認識する少なくとも１つの制限酵素で切断して、第１のポリヌクレオチドから得た第１のタグ、第２のポリヌクレオチドから得た第２のタグ、およびタグの間にリンカーを含むオリゴヌクレオチドを形成する工程と
を含む。
【０１２３】
別の実施形態では、本発明のこの態様の工程（ｂ）が、
（ｉ）少なくとも１つの制限酵素の認識部位を含む少なくとも１つのリンカーを、複合体の第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間に挿入する工程と、
（ｉｉ）少なくとも１つの制限酵素の各制限部位を第１のポリヌクレオチドの５’末端および第２のポリヌクレオチドの３’末端に付加する工程と、
（ｉｉｉ）第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを少なくとも１つの認識部位を認識する少なくとも１つの制限酵素で切断して切断フラグメントを得る工程と、
（ｉｖ）切断フラグメントをライゲーションして、第１のポリヌクレオチドから得た第１のタグ、第２のポリヌクレオチドから得た第２のタグ、各ポリヌクレオチドの５’末端および３’末端を含むタグ、およびタグの間に挿入されたリンカーを含むオリゴヌクレオチドを形成する工程であって、工程（ｉｉ）の少なくとも１つの制限酵素の認識部位がベクターの一部である工程と
を含む。
【０１２４】
核酸−タンパク質複合体を、クロマチン免疫沈降によって得ることができる。
【０１２５】
別の態様では、本発明は、核酸−タンパク質複合体由来の少なくとも２つのポリヌクレオチドを検出および／または同定する方法であって、
（ａ）核酸−タンパク質複合体を供する工程と、
（ｂ）少なくとも１つの第１のタグおよび少なくとも１つの第２のタグを含むオリゴヌクレオチドを調製する工程であって、第１のタグが第１のポリヌクレオチドから得られ、第２のタグが第２のポリヌクレオチドから得られ、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドが核酸−タンパク質複合体から得られる工程と、
（ｃ）オリゴヌクレオチドを配列決定する工程と、
（ｄ）第１のタグおよび第２のタグのヌクレオチド配列に基づいて少なくとも２つのポリヌクレオチドをマッピングし、それにより、少なくとも２つのポリヌクレオチドを検出および／または同定する工程と
を含む方法を提供する。
【０１２６】
１つの実施形態では、本発明のこの態様の工程（ｂ）が、
（ｉ）少なくとも１つの制限酵素の認識部位を含む少なくとも１つのリンカーを挿入する工程と、
（ｉｉ）第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを、リンカー中の少なくとも１つの制限部位を認識する少なくとも１つの制限酵素で切断して、第１のポリヌクレオチドから得た第１のタグ、第２のポリヌクレオチドから得た第２のタグ、およびタグの間にリンカーを含むオリゴヌクレオチドを形成する工程と
を含む。
【０１２７】
別の実施形態では、本発明のこの態様の工程（ｂ）が、
（ｉ）少なくとも１つの制限酵素の認識部位を含む少なくとも１つのリンカーを、複合体の第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間に挿入する工程と、
（ｉｉ）少なくとも１つの制限酵素の各制限部位を第１のポリヌクレオチドの５’末端および第２のポリヌクレオチドの３’末端に付加する工程と、
（ｉｉｉ）第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを少なくとも１つの認識部位を認識する少なくとも１つの制限酵素で切断して切断フラグメントを得る工程と、
（ｉｖ）切断フラグメントをライゲーションして、第１のポリヌクレオチドから得た第１のタグ、第２のポリヌクレオチドから得た第２のタグ、各ポリヌクレオチドの５’末端および３’末端を含むタグ、およびタグの間に挿入されたリンカーを含むオリゴヌクレオチドを形成する工程であって、工程（ｉｉ）の少なくとも１つの制限酵素の認識部位がアダプターの一部またはベクターの一部である工程と
を含む。
【０１２８】
本発明において、核酸−タンパク質複合体を、クロマチン免疫沈降によって得ることができる。核酸−タンパク質複合体を、目的のＤＮＡおよび／またはタンパク質への光活性化可能な部分の組み込み、ならび抗体媒介沈降または親和性媒介技術によるＤＮＡ／タンパク質複合体の単離によって得ることができる。このような親和性ベースの技術の例には、ストレプトアビジン／ビオチン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオンマトリクス、マルトース結合タンパク質／アミロースマトリクスの相互作用が含まれる。
【０１２９】
工程（ｂ）で得られたオリゴヌクレオチドを、工程（ｃ）での配列決定する前に増幅することができ、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができる。増幅したオリゴヌクレオチドを、増幅後であるが工程（ｃ）で配列決定する前に少なくとも１つの精製工程に供することができる。少なくとも１つの精製工程は、ゲル電気泳動であり得る。
【０１３０】
本発明のオリゴヌクレオチドを、配列決定前に工程（ａ）〜（ｂ）によって得た少なくとも１つの他のオリゴヌクレオチドと鎖状体形成し、その後にオリゴヌクレオチドのコンカテマーを作製するために配列決定することができる。
【０１３１】
Sanger法または多重配列決定によって配列決定することができる。多重配列決定は、ピロシーケンスであり得る。Bonetta(2006)によって記載された方法などの任意の適切な配列決定方法を使用することができる。目的のタンパク質が結合する核酸フラグメントは、目的のタンパク質が結合する領域（例えば、ヒストン結合部位）を含む任意の核酸フラグメントであり得る。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
【０１３２】
ポリヌクレオチドは、同一染色体上に存在することができ、また、ポリヌクレオチドは、異なる染色体上に存在することができる。
【０１３３】
ポリヌクレオチドのトランスフュージョンまたは転座について検出および／または同定することができる。
【０１３４】
オリゴヌクレオチドを、細胞にトランスフェクトすることができる。エレクトロポレーションによってトランスフェクションを行うことができる。細胞は、細菌細胞であり得る。
【０１３５】
本発明のこの態様の実施形態を、以下のＣＩＡ−ＰＥＴおよびＣＩＡ−ｄｉＰＥＴ技術として以下により詳細に記載する。
【０１３６】
別の態様では、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドのコンカテマー、またはオリゴヌクレオチドのライブラリーを含むベクターを提供する。
【０１３７】
［ＣＩＡ−ＰＥＴ］
ＣＩＡ−ＰＥＴ法（図１および４）では、ＤＰＤ複合体中のタンパク質によって繋留されたＤＮＡフラグメントを、ライゲーションを介してリンカー配列によって連結する。リンカー配列は、２つのＭｍｅＩ部位を含む。逆(reversal)架橋後、ライゲーションしたＤＮＡをＭｍｅＩで消化して、対合末端ジタグを放出させる（ＣＩＡ−ＰＥＴ）。各ＣＩＡ−ＰＥＴは、２つの隣接タグ（それぞれ約２０ｂｐ）を有するリンカーを含む（図１の工程２）。したがって、ＣＩＡ−ＰＥＴ中に含まれる２つのタグは、線状ゲノム配列中で互いに離れているが、互いに相互作用し、ヒストンタンパク質などの特定のタンパク質によって媒介される２つの遠位遺伝子領域を示す。
【０１３８】
ＣＩＡ−ＰＥＴのゲル精製後、配列特異的アダプターを、ＣＩＡ−ＰＥＴの各部位に添加し、次いで、ＰＣＲによって増幅する（図１の工程３）。増幅ＣＩＡ−ＰＥＴを、「４５４」ピロシーケンス法などの多重配列決定法または任意の他の適切な配列決定法によって直接配列決定するか、クローニングのためにより長いＤＮＡストレッチに鎖状体形成してＣＩＡ−ＰＥＴライブラリーを作製し、その後に、Sangerキャピラリー法を使用して配列決定することができる。ＣＩＡ−ＰＥＴ配列を、基準ゲノム配列にマッピングする。真のクロマチン相互作用部位を、特定の遺伝子座中のＣＩＡ−ＰＥＴクラスターの頻発に基づいて同定することができ、シングルトンとして無作為に散乱したバックグラウンドノイズと区別する（図３）。
【０１３９】
［ＣＩＡ−ｄｉＰＥＴ］
ＣＩＡ−ｄｉＰＥＴ法（図２および６）では、２つの各関連ＤＮＡフラグメントを示す対合末端ジタグ配列を抽出および配列決定し、配列あたりたった１つのタグと比較する。そのようなものとして、得られたＣＩＡ−ｄｉＰＥＴは、ＣＩＡ−ＰＥＴ法のタグよりも長いタグ配列を含む。当業者は、したがって、本発明のＣＩＡ検出法が当分野の他の方法よりもクロマチン相互作用のマッピングでより特異的であることを認識する。ＤＰＤ複合体中のＤＮＡフラグメントを、ＭｍｅＩ部位およびＧｓｕ１部位を含むリンカー配列によって連結する。逆架橋後、ライゲーションしたＤＮＡを、超音波処理によって無作為に破壊する。
【０１４０】
次いで、ＤＮＡをサイズ分画し、そのクローニング部位（図７）に即時型(immediate)ＭｍｅＩ部位およびＧｓｕ部位を含むｐＧＩＳ８ベクターにクローン化する（図２の工程２）。細菌細胞中での形質転換および増殖後、ライブラリークローンを、消化、自己ライゲーション、および形質転換の連続操作に供して１つのｄｉＰＥＴライブラリーを作製する。１つのｄｉＰＥＴライブラリーのプラスミドＤＮＡをＢａｍＨ１によって消化して、ｄｉＰＥＴ構造を遊離し（図２の工程４）、ＭＳ−ＰＥＴ配列決定法を使用して直接配列決定するか、クローニングおよび配列決定のためにさらに鎖状体形成することができる。ＣＩＡ−ｄｉＰＥＴ配列を、基準ゲノム配列にマッピングする。真のクロマチン相互作用部位を、特定の遺伝子座中のＣＩＡ−ｄｉＰＥＴクラスターの頻発に基づいて同定することができ、シングルトンとして無作為に散乱したバックグラウンドノイズと区別する（図５）。
【０１４１】
ここに本発明を一般的に説明してきたが、例示の目的で提供され、本発明を制限することを意図しない以下の実施例を参照して、本発明がより深く理解される。
【０１４２】
品質管理およびリンカーまたはアダプターを確実に正確に挿入するために、ゲル電気泳動を実施して、過程中の望ましくないフラグメントを除去する（図８〜１０）。
〔実施例〕
【０１４３】
［ＣＩＡの方法］
マウスＥＳ細胞（Ｅ１４）中のＮａｎｏｇ転写因子、ＮａｎｏｇについてのＣｈＩＰ−ＰＥＴデータ、および他の重要なＥＳ細胞転写因子（Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２など）を、本発明を実施するための生体系として使用した。ＣｈＩＰ−ＰＥＴデータにより、これらの転写因子が結合する場所を示す線状マップが得られ、これを、クロマチン相互作用データを立証するための基準として使用する。クロマチン間の相互作用を、２つの方法（ＣＩＡ−ＰＥＴおよびＣＩＡ−ｄｉＰＥＴ）によって検出した。
【０１４４】
実施例で使用した配列を、以下および配列表に示す。２つの鎖を示す場合、上の鎖はセンス鎖であり、下の鎖はアンチセンス鎖である。全配列を、５’→３’方向で示す。ヌクレオチドを、Ｎまたはｎ（図中ではＸまたは数字）で示す場合、その位置を任意のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）を示すことができることを意味する。
【０１４５】
Ｍ＆Ｍリンカー
5’ GTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGTCCAACT 3’(31 nt)(配列番号1)
5’ GTTGGACGTACGGCCGCCTTGGCCTCCGAC 3’(31 nt)(配列番号2)
５’末端をリン酸化する。
Ｍ＆Ｇリンカー
5’ GTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGCTGGAGT 3’(31 nt)(配列番号3)
5’ CTCCAGCGTACGGCCGCCTTGGCCTCCGACT 3’(31 nt)(配列番号4)
５’末端をリン酸化する。
Ｐ１鎖状体形成アダプター（ＰＭＲ０１１）
5’ GGATCCCTTAATCGCCTTGCAGCACATC 3’(28 nt)(配列番号5)
5’ GATGTGCTGCAAGGCGATTAAGGGATCCNN 3’(30 nt)(配列番号6)
上のアダプターの５’末端をリン酸化する。
下のアダプターの５’末端をリン酸化しない。
Ｐ２鎖状体形成アダプター（ＰＭＲ０１２）
5’ GGATCCCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCT 3’(29 nt)(配列番号7)
5’ AGCGGATAACAATTTCACACAGGGGATCCNN 3’(31 nt)(配列番号8)
上のアダプターの５’末端をリン酸化する。
下のアダプターの５’末端をリン酸化しない。
Ｄ１  ｄｉＰＥＴｉｎｇアダプター（ＰＭＲ０１１）
5’ GGATCCCTTAATCGCCTTGCAGCACATC 3’(28 nt)(配列番号9)
5’ GATGTGCTGCAAGGCGATTAAGGGATCCNN 3’(30 nt)(配列番号10)
上のアダプターの５’末端をリン酸化する。
下のアダプターの５’末端をリン酸化しない。
Ｄ２  ｄｉＰＥＴｉｎｇアダプター（ＰＭＲ０１２）
5’ GGATCCAATGCTCCTCCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCT 3’(39 nt)(配列番号11)
5’ AGCGGATAACAATTTCACACAGGGAGGAGCATTGGATCCNN 3’(41 nt)(配列番号12)
上のアダプターの５’末端をリン酸化する。
下のアダプターの５’末端をリン酸化しない。
ＰＭＲ０１１プライマー
5’ GATGTGCTGCAAGGCGATTAAG 3’(22 nt)(配列番号13)
５’末端をリン酸化する。
ＰＭＲ０１２プライマー
5’ AGCGGATAACAATTTCACACAGG 3’(23 nt)(配列番号14)
５’末端をリン酸化する。
ＲｅｃＡ選択オリゴ
5’ AGTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGCTGGAGT 3’(配列番号15)
（ビオチニル化）
【０１４６】
ｐＧＩＳ８ベクター
このベクターは、ｐＧＥＭベクター(Promega)に由来し、以下の制限酵素のための固有の多クローニング部位をこの順序で含む。
ＢａｍＨ１→Ｍｍｅ１；切断領域；Ｇｓｕ１→ＢａｍＨ１→ＢｓｅＲ１
以下のオリゴヌクレオチドを使用する。
5’ AATTGGATCCGACTCGAGGATGAATTCTCCAGGATCCCTCCTC 3’(43 nt)(配列番号16)
5’ TCGAGAGGAGGGATCCTGGAGAATTCATCCTCGAGTCGGATCC 3’(43 nt)(配列番号17)
５’末端をリン酸化する。
このベクターの残りは、ＢｓｅＲ１部位、ＢａｍＨ１部位、Ｍｍｅ１部位、またはＧｓｕ１部位のいずれも含まない。
【０１４７】
ｐＧＩＳ８プラスミドは、使用することができるベクターの一例である（図７）。センス鎖配列を配列番号１８に示し、アンチセンス鎖配列は配列番号１９である。制限酵素の認識部位を含む多クローニング部位（配列番号１６および１７に示す）を、ベクターに挿入する。種々の制限酵素の認識部位を示すｐＧＩＳ８についての配列表を、図１１に示す。要件を満たす任意の他のベクターを調製し、当業者が使用することができる。
【０１４８】
Ｍ＆ＭアダプターＰＥＴ
5’NNNNNNNNNNNNNNNNAGTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGTCCAACTNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3’(69 nt)(配列番号20)
5’NNNNNNNNNNNNNNNNNNAGTTGGACGTACGGCCGCCTTGGCCTCCGACTNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3’(69 nt)(配列番号21)
アダプター配列を有するＭ＆ＭアダプターＰＥＴ
5’GATGTGCTGCAAGGCGATTAAGGGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGTCCAACTNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGATCCCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCT 3’(128 nt)(配列番号22)
5’ AGCGGATAAC AATTTCACAC AGGGGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNA GTTGGACGTACGGCCGCCTTGGCCTCCGACTNNNNNNNNN NNNNNNNNNN GGATCCCTTA ATCGCCTTGCAGCACATC  3’(128 nt)(配列番号23)
Ｍ＆Ｍ最終ＰＥＴ（アダプター配列の切断後）
5’GATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGTCCAACTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNG (77 nt)(配列番号24)
5’ GATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGTTGGACGTACGGCCGCCTTGGCCTCCGACTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNG 3’(77 nt)(配列番号25)
超音波処理後のＭ＆ＧアダプターＤＮＡ配列
5’NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGCTGGAGTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3’(配列番号26)
5’ NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNACTCCAGCG TACGGCCG CCTTGGCCTCCGACTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3’(配列番号27)
（種々のｎｔ）
ｐＧＩＳ８プラスミドへのクローニング後のＭ＆ＧアダプターＤＮＡ配列
（注釈：残りのプラスミドは示さず）
5’GGATCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGCTGGAGTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCCAGGATCC 3’(140 nt)(配列番号28)
5’ GGATCCTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNACTCCAGCGTACGGCCGCCTTGGCCTCCGACTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NGTCGGATCC 3’(140 nt)(配列番号29)
Ｍ  ＰＥＴ中間体
5’ GGATCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGCTGGAGTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCCAGGATCC 3’(132 nt)(配列番号30)
5’ GGATCCTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNACTCCAGCGTACGGCCGCCTTGGCCTCCGACTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTCGGATCC 3’(132 nt)(配列番号31)
ＭおよびＧ  ｄｉＰＥＴ
5’ ATCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGCTGGAGTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCCAGGATCC 3’(116 nt)(配列番号32)
5’ GGATCCTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNACTCAGCGTACGGCCGCCTTGGCCTCCGACTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNGTCGGATC 3’(116 nt)(配列番号33)
ＢａｍＨ１粘着末端を有する放出ｄｉＰＥＴ
5’ GATCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGCTGGAGTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNCTCCAG 3’(111 nt)(配列番号34)
5’ GATCCTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNACTCCAGCGTA CGGCCGCCTTGGCCTCCGACTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTCG 3’(111 nt)(配列番号35)
ＭｍｅＩ消化前のＭ＆ＭアダプターＰＥＴ
5’ NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGTCCAACTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3’(91 nt)(配列番号 36)
5’ NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCAGCCTCCGGTTCCGCCGGCATGCAGGTTGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3’(91 nt)(配列番号37)
Ｍ＆Ｇリンカーの挿入前の図８のオリゴヌクレオチド
5’ NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3’(53 nt)(配列番号38)
5’ NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3’(53 nt)(配列番号39)
プラスミドに挿入した図８のオリゴヌクレオチド（残りのプラスミドは示さず）
5’ GGATCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCCAGGATCC 3’
(140 nt)(配列番号40)
5’ GGATCCTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTCGGATCC 3’(140 nt)(配列番号41)
プラスミドに挿入した図８のオリゴヌクレオチド（残りのプラスミドは示さず）
5’ GGATCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCCAGGATCC 3’(140 nt)(配列番号42)
5’ GGATCCTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTCGGATCC 3’(140 nt)(配列番号43)
電気泳動によって除去された挿入Ｍ＆Ｇリンカーを含まない図８のオリゴヌクレオチド
5’ GATCCGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCCAG 3’(112 nt)(配列番号44)
5’ GATCCTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCG 3’(112 nt)(配列番号45)
Ｍ＆Ｇリンカーの挿入前の図９のオリゴヌクレオチド
5’ NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3’(59 nt)(配列番号46)
5’ NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTCGGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3’(59 nt)(配列番号47)
Ｍ＆Ｇリンカーの一部の挿入後の図９のオリゴヌクレオチド
5’ GGATCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCCAGGATCC 3’(140 nt)(配列番号48)
5’ GGATCCTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTCGGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTCGGATCC 3’(140 nt)(配列番号49)
制限酵素消化後に挿入された部分的Ｍ＆Ｇリンカーを有する図９のオリゴヌクレオチド（残りのプラスミドは示さず）
5’ GGATCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCCAGGATCC 3’(126 nt)(配列番号50)
5’ GGATCCTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTCGGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTCGGATCC 3’(126 nt)(配列番号51)
プラスミドからの切り出し後の図９のオリゴヌクレオチド
5’ GATCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCCAG 3’(120 nt)(配列番号52)
5’ GATCCTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTCGGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTCG 3’(120 nt)(配列番号53)
逆方向に挿入されたＭ＆Ｇリンカーを有する図１０のオリゴヌクレオチド
5’ NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGCTGGAGTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3’(85 nt)(配列番号54)
5’ NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNACTCCAGCGTACGGCCGCCTTGGCCTCCGACTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3’(85 nt)(配列番号55)
プラスミドに挿入した図１０のオリゴヌクレオチド（残りのプラスミドは示さず）
5’ GGACTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGCTGGAGTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTCGGATCC 3’(148 nt)(配列番号56)
5’ GGATCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNACTCCAGCGTACGGCCGCCTTGGCCTCCGACTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCCAGTCC 3’(148 nt)(配列番号57)
図１０のオリゴヌクレオチド中間体１
5’ GGACTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTCGGATCC 3’(62 nt)(配列番号58)
5’ GGATCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCCAGTCC 3’(62 nt)(配列番号59)
図１０のオリゴヌクレオチド中間体２
5’ GGACTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3’(62 nt)(配列番号60)
5’ GGATCCGACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCCAGTCC 3’(62 nt)(配列番号61)
図１０のオリゴヌクレオチド産物
5’ GATCCGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCCAG 3’(114 nt)(配列番号62)
5’ GATCCTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCG 3’(114 nt)(配列番号63)
〔実施例１〕
【０１４９】
［マウス胚幹細胞を使用したＣＩＡ−ＰＥＴのプロトコール］
ＣＩＡ−ＰＥＴ法（図１および４）は、以下の５つの部を含む。（１）ＣｈＩＰ  ＤＮＡ−タンパク質−ＤＮＡ複合体の生成、（２）ＣＩＡ−ＰＥＴの調製、（３）ＣＩＡ−ＰＥＴの増幅、（４）ＣＩＡ−ＰＥＴの配列決定、および（５）ＣＩＡ−ＰＥＴ配列のマッピング（図３）。
【０１５０】
（１）ＣｈＩＰ  ＤＮＡ−タンパク質−ＤＮＡ複合体の生成
（ａ）マウス胚幹（ＥＳ）細胞を、白血病阻害因子(Chemicon)の存在下での無支持細胞(feeder-free)条件で培養する。
【０１５１】
（ｂ）約１〜２×１０8細胞を回収し、ホルムアルデヒド（最終濃度１％；Sigma）にて室温で１０分間架橋する。
【０１５２】
（ｃ）細胞溶解物およびクロマチンの調製
ｃ１．細胞を溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１％デオキシコール酸ナトリウム、全てAmbion）に溶解する。
ｃ２．クロマチンを、Branson450超音波細胞破壊機（２０％負荷出力、３０秒、５〜８回）を使用した超音波処理によって可溶化する。
ｃ３．クロマチンを１０倍希釈し、ＳＤＳを０．１％に低下させる。
ｃ４．次いで、抽出物を、１４，０００ｒｐｍにて４℃で１０分間の遠心分離によって明澄化する。
ｃ５．この抽出物を、使用するまで−８０℃で保存する。
【０１５３】
（ｄ）免疫沈降
ｄ１．２μｇのモノクローナル抗体（Ｆ７、Santa Cruz）を、プロテインＧセファロース(Pharmacia)に結合させる。
ｄ２．抗体被覆ビーズを、クロマチン抽出物と４℃で１６時間インキュベートする。
ｄ３．次いで、ビーズを、以下の緩衝液を使用して洗浄する（Sigma Chemical Companyの試薬）：
緩衝液１（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１％デオキシコール酸ナトリウム）で２回洗浄する。
緩衝液２（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１％デオキシコール酸ナトリウム）で１回洗浄する。
緩衝液３（２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５Ｍ  ＬｉＣｌ、０．５％  ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム）で１回洗浄する。
緩衝液４（２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で１回洗浄する。
ｄ４．次いで、タンパク質−ＤＮＡ複合体を、溶離緩衝液（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）にて６５℃で２０分間ビーズから溶離する。
ｄ５．次いで、溶離物を、ＰＢＳ（Ａｍｂｉｏｎ）中にて４℃で３時間透析して、ＳＤＳを除去する。
【０１５４】
（２）ＣＩＡ−ＰＥＴの調製
（ａ）末端修復
Epicentre End-Itキットおよび以下の化学物質を使用して末端修復を行う。
クロマチン（５μｇまで）        ２．５μｌ
１０×末端修復緩衝液            ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス    ５μｌ
１０ｍＭ  ＡＴＰ                ５μｌ
末端修復酵素ミックス            １μｌ
無ヌクレアーゼ水                ５０μｌにする
短時間ボルテックスして混合し、次いで、室温で４５分間インキュベートし、７０℃で１０分間の加熱によって反応を停止させる。２７μｌの無ヌクレアーゼ水の添加によって濃度を６５ｎｇ／μｌに調整する。
【０１５５】
（ｂ）Ａテーリング
ＤＮＡ                            ２０μｌ
１０ｍＭ  ｄＡＴＰ(Roche)         ０．５μｌ
１０×ＥｘＴａｑ緩衝液(Takara)    ２．５μｌ
ＥｘＴａｑポリメラーゼ(Takara)    ０．５μｌ
無ヌクレアーゼ水                  ２５μｌにする
ＰＣＲ装置中にて７２℃で３０分間インキュベートし、次いで、４℃にする。一旦７２℃でインキュベートすると、その直後にチューブを取り出してライゲーションを行うのに最良である。
【０１５６】
（ｃ）Ｍ＆ＭリンカーでのＤＮＡのライゲーション（配列番号１および２）
クロマチンＤＮＡ（２００μｇ）              ３．１μｌ
Ｍ＆Ｍアダプター−Ｔテール（３８ｎｇ）      ３．１μｌ
５×ＰＥＧ含有リガーゼ緩衝液(Invitrogen)    ６μｌ
Ｔ４リガーゼ（５Ｕ／μｌ）(Invitrogen)      １μｌ
無ヌクレアーゼ水                            １２．３μｌ
１６℃で一晩ライゲーションして、Ｍ＆Ｍリンカーを挿入したオリゴヌクレオチド（配列番号２０および２１）を得る。
【０１５７】
（ｄ）プロテイナーゼＫでの逆架橋(reverse cross-link)
ＤＮＡサンプルを２０μｌアリコートに分割し、１５μｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ(Ambion)の存在下での６５℃にて一晩のインキュベーションによって逆架橋する。翌日、１μｌの１０ｍｇ／ｍｌ  ＲＮＡアーゼＡ(Qiagen)を添加し、ＲＮＡを３７℃で４５分間分解し、その後、ＤＮＡのフェノール抽出およびエタノール沈殿を行う。２０μｌの溶離緩衝液中に再懸濁し、−２０℃で保存する。得られた濃度は、通常、５００ｎｇ／μｌである。
【０１５８】
ＤＮＡを定量し、Takara広範囲ラダーおよびInvitrogen低分子量ラダーならびに（ａ）由来の０．５μｌの材料を含む１％ゲルによる０．５μｌのＤＮＡの泳動によって品質管理を行う。（ｄ）由来の材料をゲル上により少なく塗布すべきであり、約５０〜１００ｂｐのマークでいかなる明るいバンドも示されないはずである。
【０１５９】
（ｅ）Ｍｍｅ１切断
１０μｇのＤＮＡ                                 ２０μｌ
１０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ４(New England Biolabs)    ２０μｌ
１０×ＳＡＭ(New England Biolabs)                ２０μｌ
Ｍｍｅ１（２Ｕ／μｌ）(New England Biolabs)      ２０μｌ
無ヌクレアーゼ水                                 １２０μｌ
２つのチューブに分割し、３７℃で一晩インキュベートする。ＳＡＭを新たに調製すべきである。グリコブルーを使用してフェノールクロロホルムおよびエタノール沈殿を行う。
【０１６０】
ＤＮＡを定量し、Takara広範囲ラダーおよびInvitrogen低分子量ラダーならびに工程（ｄ）由来の０．５μｌの材料を共に含む２％ゲルまたはＰＡＧＥゲルによる３μｌの泳動によって品質管理を行う。
【０１６１】
（ｆ）ゲル精製
得られたＤＮＡを、適切なラダー（例えば、２０μｌのTakara広範囲ラダー）と共に、Scie-Plas中型ユニット（６０μｌ／ウェル）中の２％アガロースゲルにロードする。８０Ｖで約１．５時間泳動し、３６５ｎｍのＵＶで視覚化する。不正確に挿入されたリンカーを有するオリゴヌクレオチドを、ゲル電気泳動によって除去する（不正確に挿入されたリンカーの例は、図８〜１０を参照のこと）。ジタグバンドを切り出し、製造者の説明書にしたがって使い捨てFermentas Eluta Tubesを使用して電気溶出する。９０Ｖで１〜１．５時間電気溶出し、採取したジタグを、エタノール沈殿する。２００μｌの溶出液毎に、以下を添加する。
３Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）(Amresco)    ２０μｌ
１Ｍ  ＭｇＣｌ２(Ambion)                   ４．５μｌ
グリコチューブ(Ambion)                     ２μｌ
１００％エタノール                         ８００μｌ
沈殿したジタグを、１２μｌ溶離緩衝液(Qiagen)中に再懸濁し、純度チェックおよび視覚的定量のための低分子量ラダー(Invitrogen)と共に、４〜２０％ＰＡＧＥミニゲルで２〜５μｌを泳動する。正確に得られたジタグは、配列番号２２および２３に示す配列を有する。
【０１６２】
（３）ＰＥＴの増幅
（ａ）アダプターライゲーション（配列番号５〜８のアダプターの鎖状体形成）
ＤＮＡ（１００ｎｇ）                              ６μｌ
アダプター（１０μｇ）                            ６μｌ
１０×リガーゼ緩衝液（スペルミジン含有）          １．５μｌ
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（５Ｕ／μｌ、Invitrogen）    １μｌ
無ヌクレアーゼ水                                  ０．５μｌ
総体積は１５μｌである。１６℃で１６時間インキュベートする。
１０×スペルミジン含有ライゲーション緩衝液を以下から作製する。
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）(Ambion)
６０ｍＭ  ＭｇＣｌ２(Ambion)
５０ｍＭ  ＮａＣｌ(Ambion)
１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ(New England Biolabs)
７０ｍＭ  β−メルカプトエタノール(Sigma)
１ｍＭ  ＡＴＰ(Invitrogen)
２０ｍＭ  ＤＴＴ(Invitrogen)
１０ｍＭスペルミジン(Sigma)
【０１６３】
（ｂ）ＰＣＲ増幅
以下のプライマー（ＰＭＲ１１および１２）（それぞれ、配列番号１３および１４）およびQiagenのHotstartaqキットを使用して増幅する。
ＤＮＡ                                            １μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液(Qiagen)                        １０μｌ
ｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ）(Invitrogen)        ２μｌ
ＰＭＲ１１                                        １μｌ（０．２μＭ）
ＰＭＲ１２                                        １μｌ（０．２μＭ）
ＨｏｔＳｔａｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(Qiagen)    ０．５μｌ
無ヌクレアーゼ水                                  １００μｌにする
【０１６４】
十分に混合し、以下のようにＰＣＲ装置中でインキュベートする。
１．９５℃で１５分間
２．９４℃で０．５分間
３．５５℃で０．５分間
４．７２℃で１分間
５．工程２を２５回繰り返す
６．７２℃で１０分間
ＰＣＲ精製キット(Qiagen)を使用して精製する。
【０１６５】
（４）ＣＩＡ−ＰＥＴの配列決定
ＣＩＡ−ＰＥＴを、４５４多重配列決定装置(454 life sciences)のプロトコールにしたがって直接配列決定することができる。この技術は、Margulies et al(2005)および米国特許出願番号20030068629号に教示されている。これらの引例は、その全体が本明細書中で参照することにより組み込まれる。
【０１６６】
（５）ＣＩＡ−ＰＥＴのマッピング
Compressed Suffix Arrayを使用して、マッピングを行うことができる。２つの異なるＤＮＡフラグメント（ｎ＞３）にわたる複数の連結を、実際の遠位調節領域を示すために利用するべきである（図３）。
〔実施例３〕
【０１６７】
［ＣＩＡ−ｄｉＰＥＴ法］
ＣＩＡ−ｄｉＰＥＴ法（図２および６）は、以下の部を含む。（１）ＣｈＩＰ  ＤＮＡ−タンパク質−ＤＮＡ複合体の生成、（２）ＣＩＡ−ライブラリーの調製、（３）ＣＩＡ−ＰＥＴライブラリーの調製、（４）配列決定、および（５）ＣＩＡ−ＰＥＴ配列のマッピング（図５）。
【０１６８】
（１）ＣｈＩＰ  ＤＮＡ−タンパク質−ＤＮＡ複合体の生成（上記）
（ａ）マウス胚幹（ＥＳ）細胞を、白血病阻害因子(Chemicon)の存在下での無支持細胞条件で培養する。
【０１６９】
（ｂ）約１〜２×１０8細胞を回収し、ホルムアルデヒド（最終濃度１％；Sigma）にて室温で１０分間架橋する。
【０１７０】
（ｃ）細胞溶解物およびクロマチンの調製
ｃ１．細胞を溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１％デオキシコール酸ナトリウム、全てAmbion）に溶解する。
ｃ２．クロマチンを、Branson 450超音波細胞破壊機（２０％負荷出力、３０秒、５〜８回）を使用した超音波処理によって可溶化する。
ｃ３．クロマチンを１０倍希釈し、ＳＤＳを０．１％に低下させる。
ｃ４．次いで、抽出物を、１４，０００ｒｐｍにて４℃で１０分間の遠心分離によって明澄化する。
ｃ５．この抽出物を、使用するまで−８０℃で保存する。
【０１７１】
（ｄ）免疫沈降
ｄ１．２μｇのモノクローナル抗体（Ｆ７、Santa Cruz）を、プロテインＧセファロース(Pharmacia)に結合させる。
ｄ２．抗体被覆ビーズを、クロマチン抽出物と４℃で１６時間インキュベートする。
ｄ３．次いで、ビーズを、以下の緩衝液を使用して洗浄する（Sigma Chemical Companyの試薬）：
緩衝液１（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１％デオキシコール酸ナトリウム）で２回洗浄する。
緩衝液２（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１％デオキシコール酸ナトリウム）で１回洗浄する。
緩衝液３（２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５Ｍ  ＬｉＣｌ、０．５％  ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム）で１回洗浄する。
緩衝液４（２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で１回洗浄する。
ｄ４．次いで、タンパク質−ＤＮＡ複合体を、溶離緩衝液（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）にて６５℃で２０分間ビーズから溶離する。
ｄ５．次いで、溶離物を、ＰＢＳ(Ambion)中にて４℃で３時間透析して、ＳＤＳを除去する。
【０１７２】
（２）ＣＩＡ−ｄｉＰＥＴライブラリーの調製
（ａ）末端修復（ＣＩＡ−ＰＥＴの調製に関する）、Epicentre End-Itキットを使用して末端修復を行う。
クロマチン（５μｇまで）                   ２．５μｌ
１０×末端修復緩衝液(Epicentre)            ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス(Epicentre)    ５μｌ
１０ｍＭ  ＡＴＰ(Epicentre)                ５μｌ
末端修復酵素ミックス(Epicentre)            １μｌ
無ヌクレアーゼ水                           ３１．５μｌ
短時間ボルテックスして混合し、次いで、室温で４５分間インキュベートし、７０℃で１０分間の加熱によって反応を停止させる。２７μｌの無ヌクレアーゼ水の添加によって濃度を６５ｎｇ／μｌに調整する。
【０１７３】
（ｂ）Ａテーリング（上記のＣＩＡ−ＰＥＴと同様）
ＤＮＡ                            ２０μｌ
１０ｍＭ  ｄＡＴＰ(Roche)         ０．５μｌ
１０×ＥｘＴａｑ緩衝液(Takara)    ２．５μｌ
ＥｘＴａｑポリメラーゼ(Takara)    ０．５μｌ
無ヌクレアーゼ水                  １．５μｌ
ＰＣＲ装置中にて７２℃で３０分間インキュベートし、次いで、４℃にする。一旦７２℃でインキュベートすると、その直後にチューブを取り出してライゲーションを行うのに最良である。
【０１７４】
（ｃ）Ｍ＆ＧリンカーでのＤＮＡのライゲーション（配列番号３および４）
クロマチンＤＮＡ（２００ｎｇ）              ３．１μｌ
Ｍ＆Ｇアダプター−Ｔテール（３８ｎｇ）      ７．６μｌ
５×ＰＥＧ含有リガーゼ緩衝液(Invitrogen)    ６μｌ
Ｔ４リガーゼ（５Ｕ／μｌ）(Invitrogen)      １μｌ
最終体積                                    １２．３μｌ
１６℃で一晩ライゲーションして、Ｍ＆Ｇリンカーを挿入したオリゴヌクレオチド（配列番号２６および２７）を得る。
【０１７５】
（ｄ）プロテイナーゼＫでの逆架橋（上記のＣＩＡ−ＰＥＴと同様）
ＤＮＡサンプルを２０μｌアリコートに分割し、１５μｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ(Ambion)の存在下での６５℃にて一晩のインキュベーションによって逆架橋する。翌日、１μｌの１０ｍｇ／ｍｌ  ＲＮＡアーゼＡ(Qiagen)を添加し、ＲＮＡを３７℃で４５分間分解し、その後、ＤＮＡのフェノール抽出およびエタノール沈殿を行う。２０μｌの溶離緩衝液中に再懸濁し、−２０℃で保存する。濃度は、通常、５００ｎｇ／μｌである。
【０１７６】
定量し、Takara広範囲ラダーおよびInvitrogen低分子量ラダーならびに（ａ）由来の０．５μｌの材料を含む１％ゲルによる０．５μｌの泳動によって品質管理を行う。（ｄ）由来の材料をゲル上により少なく塗布すべきであり、約５０〜１００ｂｐのマークでいかなる明るいバンドも示されない。
【０１７７】
（ｅ）Ｎｌａ  ＩＩＩでの消化
Ｎｌａ  ＩＩＩを、−８０℃（半減期は、−８０℃で６ヶ月）で保存する。使用直前に氷上に置く。
ＤＮＡ（約１μｇ）                               ２μｌ
１０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ４(New England Biolabs)    ５μｌ
ＮｌａＩＩＩ(New England Biolabs)                １μｌ
１００×ＢＳＡ(New England Biolabs)              ０．５μｌ
無ヌクレアーゼ水                                 ４１．５μｌ
５つの上記反応チューブを調製する。３７℃で１時間インキュベートする。グリコブルーを使用してフェノールクロロホルムおよびエタノール沈殿を行い、１０μｌの溶離緩衝液(Qiagen)に再懸濁する。
【０１７８】
（ｆ）Epicentre End-Itキットを使用した末端の研磨
ＤＮＡ（５μｇまで）                       ３４μｌ
１０×末端修復緩衝液(Epicentre)            ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス(Epicentre)    ５μｌ
１０ｍＭ  ＡＴＰ(Epicentre)                ５μｌ
末端修復酵素ミックス(Epicentre)            １μｌ
室温で４５分間インキュベートし、７０℃で１０分間の加熱によって反応を停止させる。
【０１７９】
（ｉ）Ｍｍｅ１およびＧｓｕ１隣接部位を有するｐＧＩＳ８ベクター（配列番号１８および１９、図７および１１）へのクローニング
１．７ｍｌ微量遠心管を使用して（複数のチューブを使用する）、氷上に準備する。
４０ｎｇ／μｌ  プレカットｐＧＩＳ                １μｌ
ＤＮＡ                                            ６μｌ
５×ＰＥＧ含有リガーゼ緩衝液(Invitrogen)          ２μｌ
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（５Ｕ／μｌ）(Invitrogen)    １μｌ
１６℃で一晩（１２〜１６時間）インキュベートして、配列番号２８および２９に示すオリゴヌクレオチドを得る。ベクター自己ライゲーションコントロールも準備する。
【０１８０】
エレクトロポレーションによって５０μｌのエレクトロコンピテントＴＯＰ１０細胞(Invitrogen)あたり１μｌのライゲーション反応物を形質転換する。１ｍｌ  ＬＢ培地中に各アリコートを３７℃で１時間回収し、次いで、品質管理および滴定のために一連の連続希釈物（ＬＢ寒天＋アンピシリン）にプレートする。
【０１８１】
次いで、残りの培養物の巨大な寒天プレート(Q-trays)へのプレーティングによってこの過程を拡大し、Qiagen HiSpeed Plasmid Maxiキットを使用してマキシプレップ(maxiprep)を行う。
【０１８２】
（３）ＣＩＡ−ｄｉＰＥＴライブラリー
（ａ）Ｍｍｅ１切断
１０μｇのＤＮＡ                                 １００μｌ
１０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ４(New England Biolabs)    ２０μｌ
１０×ＳＡＭ(New England Biolabs)                ２０μｌ
Ｍｍｅ１（２Ｕ／μｌ）(New England Biolabs)      １２μｌ
無ヌクレアーゼ水                                 ４８μｌ
３７℃で一晩インキュベートして、配列番号３０および３１に示すオリゴヌクレオチドを得る。ＳＡＭを、新たに調製すべきである。グリコブルーを使用してフェノールクロロホルムおよびエタノール沈殿を行い、１２μｌの溶離緩衝液に再懸濁する。
【０１８３】
ＤＮＡを定量し、Takara広範囲ラダーおよびInvitrogen低分子量ラダーならびに工程（ｅ）由来の１μｌの材料を共に含む２％ゲルまたはＰＡＧＥゲルによる１μｌの泳動によって品質管理を行う。
【０１８４】
（ｂ）環状化
以下(MJ Research)を含む各ウェルを有する９６ウェルプレートを準備する。
１００ｎｇのＤＮＡ                                ５０μｌ
ライゲーション溶液１(Takara Ligation Kit ver2)    ５０μｌ
プレートをしっかりと密封して蒸発を防ぐ。１６℃で一晩インキュベートする。３つのカラムを使用してＰＣＲ精製(Qiagen)を行い、４０μｌの各溶離緩衝液に再懸濁し、総量が１２０μｌになる。
【０１８５】
（ｃ）Ｇｓｕ１切断
９つのチューブを準備する
環状化ＤＮＡ                         １２μｌ
１０×ＴＡＮＧＯ緩衝液(Fermentas)    ８．６μｌ
１０×ＳＡＭ(New England Biolabs)    ８．６μｌ
ＧｓｕＩ（５Ｕ／μｌ）(Fermentas)    １μｌ
無ヌクレアーゼ水                     ５５．８μｌ
３０℃で少なくとも２時間消化させるが、一晩切断しない。配列番号３２および３３に示すオリゴヌクレオチドを得る。
【０１８６】
（ｄ）環状化
以下を含む９つのチューブを準備する。
約１００ｎｇのＤＮＡ                              ５０μｌ
ライゲーション溶液１(Takara Ligation Kit ver2)    ５０μｌ
１６℃で一晩インキュベートする。フェノールクロロホルムエタノール沈殿を行い、１２μｌの溶離緩衝液に再懸濁する。
【０１８７】
（ｅ）ローリングサークル増幅(Templiphi kit、Amersham)を使用した増幅
氷上で溶液を解凍する。以下を含む３〜４つのチューブを調製する。
２．５ｎｇのＤＮＡ                                  １μｌ
Ｔｅｍｐｌｉｐｈｉ  ｋｉｔの変性緩衝液(Amersham)    １０μｌ
９５℃で３分間加熱し、その後、氷上で短時間冷却する。
【０１８８】
反応緩衝液に、以下を添加する。
Ｔｅｍｐｌｉｐｈｉ  ｋｉｔプレミックス(Amersham)    １０μｌ
軽くたたくか穏やかにボルテックスして十分に混合する。震盪せずに３０℃で１６〜１８時間インキュベートする。材料を、例えば、１μｌのマイクロピペッティングによって試験する。材料は、粘性を示すはずである。ピコグリーン蛍光光度法（Quant-iT DNAアッセイキット、Molecular Probes）によって二本鎖ＤＮＡを定量する。
【０１８９】
（ｆ）ＢａｍＨ１切断
１００μｇのＤＮＡ                                           １μｌ
１０×固有のＢａｍＨ１緩衝液(New England Biolabs)            １０μｌ
１００×ウシ血清アルブミン(New England Biolabs)              １μｌ
ＢａｍＨ１（２０Ｕ／μｌ；２倍過剰）(New England Biolabs)    ２０μｌ
無ヌクレアーゼ水                                             ７８μｌ
必要に応じて、ＤＮＡを消化するためのさらなるチューブを調製し、３７℃で一晩インキュベートして、配列番号３４および３５に示すオリゴヌクレオチドを得る。
【０１９０】
（ｇ）ゲル精製
適切なラダー（例えば、２０μｌのTakara広範囲ラダー）と共に、Scie-Plas中型ユニット（６０μｌ／ウェル）中の２％アガロースゲルにロードする。８０Ｖで約１．５時間泳動し、３６５ｎｍのＵＶで視覚化する。不正確に挿入されたリンカーを有するオリゴヌクレオチドを、ゲル電気泳動によって除去する（不正確に挿入されたリンカーの例は、図８〜１０を参照のこと）。ジタグバンドを切り出し、製造者の説明書にしたがって使い捨てFermentas Eluta Tubesを使用して電気溶出する。９０Ｖで１〜１．５時間電気溶出し、採取したジタグを、エタノール沈殿する。２００μｌの溶出液毎に、以下を添加する。
３Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）    ２０μｌ
１Ｍ  ＭｇＣｌ２                  ４．５μｌ
グリコチューブ                    ２μｌ
１００％エタノール                ８００μｌ
沈殿したｄｉＰＥＴを、１２μｌ溶離緩衝液中に再懸濁し、純度チェックおよび視覚的定量のための低分子量ラダー(Invitrogen)と共に、４〜２０％ＰＡＧＥミニゲルで２〜５μｌを泳動する。
【０１９１】
（４）ＣＩＡ−ｄｉＰＥＴの配列決定
（ａ）ゲル精製ＢａｍＨＩ付着ｄｉＰＥＴの鎖状体形成
ＣＩＡ−ｄｉＰＥＴ  ２００〜１０００ｎｇ          ６μｌ
１０×リガーゼ緩衝液（スペルミジン含有）          １μｌ
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（５Ｕ／μｌ、Invitrogen）    １μｌ
無ヌクレアーゼ水                                  ２μｌ
１６℃で２時間から一晩インキュベートする。次いで、６５℃で１０分間加熱不活化する。
【０１９２】
（ｂ）ＣＩＡ−ｄｉＰＥＴコンカテマーの部分的ＢａｍＨＩ再消化
Qiagen PCR精製QuickSpinキットを使用して、コンカテマーＤＮＡを精製する。次いで、Nanodrop(Nanodrop technologies)のための１μｌの使用によってＤＮＡを定量し、短いＢａｍＨＩの再消化物を定量する。
コンカテマー                                           ２０μｌ
１０×ＢａｍＨＩ緩衝液(New England Biolabs)            ３μｌ
ＢａｍＨＩ（１Ｕ／μｌに希釈）(New England Biolabs)    ０．２μｌ
１００×ＢＳＡ(New England Biolabs)                    ０．５μｌ
無ヌクレアーゼ水                                       ６．３μｌ
３７℃で３０分間インキュベートし、それ以上はインキュベートしない。６μｌのローディング色素を迅速に添加し、６５℃で１５分間加熱し、氷上で冷却し、その後にＰＡＧＥゲルにローディングする。
【０１９３】
（ｃ）鎖状体形成したＣＩＡ−ｄｉＰＥＴのＰＡＧＥ精製
好ましくは、サイズ測定のためのTakara広範囲ラダーおよびInvitrogen低分子量ラダーを隣接させた４〜２０％の勾配のＰＡＧＥミニゲルの１つの穴に全サンプルをローディングする。２００Ｖで約１時間電気泳動する。ＳＹＢＲグリーンＩで１５〜３０分間染色し、ゲル切り出し物についてDark Readerトランスイルミネーター(Clare Chemical)で視覚化する。
【０１９４】
（ｄ）コンカテマーの切り出し
鎖状体形成ＤＮＡを３つの個別の画分（低（４００〜１０００ｂｐ）、中（１０００〜２０００ｂｐ）、および高（＞２０００ｂｐ））に切り出す。切り出した各サイズ画分のゲルスライスを０．６ｍｌの微量遠心管に入れ、２１Ｇニードルで底を突き刺した。この突き刺したチューブを、１．７ｍｌ微量遠心管内に入れ、１６１１０ｇにて４℃で５分間遠心分離した。それにより、ゲル片が都合良くバラバラになり、１．７ｍｌの各チューブの底に回収される。２００μｌのＬｏＴＥ：ＮＨ４ＯＡｃ（１６７：３３）（ＬｏＴＥは以下の配合表に従い、ＮＨ４ＯＡｃはAmbionから入手）を、各チューブに添加し、６５℃で２時間の加熱によって溶離する。
【０１９５】
ＬｏＴＥ緩衝液：
３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）(Ambion)
０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ(Ambion)
【０１９６】
上記のマイクロスピンフィルターユニットを用いた１６１１０ｇでの４℃で１０分間のスピンによって上清（溶離した鎖状体形成ＤＮＡを含む）をゲル片から分離する。溶離した各サイズ画分に対してフェノール／クロロホルム抽出を行い、その後にエタノール沈殿を行う。
溶離ＤＮＡ画分                        ２００μｌ
３Ｍ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）    ２０μｌ
ＧｌｙｃｏＢｌｕｅ                    ２．２μｌ
１００％エタノール                    ８００μｌ
−８０℃で３０分間保持し、次いで、１６１１０ｇにて４℃で３０分間スピンし、７５％エタノールで１回洗浄する。６μｌのＬｏＴＥ緩衝液中にペレットを再懸濁した。
【０１９７】
（ｅ）ｐＺＥｒＯ−１ベクターへのライゲーション
使用前に、ｐＺＥｒＯ−１クローニングベクターを、３７℃で２時間の１０単位のＢａｍＨＩ(New England Biolabs)での２μｇのｐＺＥｒＯ−１プラスミドＤＮＡ(Invitrogen)の消化によって調製する。消化されたプラスミドＤＮＡを、フェノール・クロロホルム抽出し、エタノール沈殿を行い、３３ｎｇ／μｌの濃度の６０μｌのＬｏＴＥに再懸濁する。プラスミドを、コントロールとしてのベクターの自己ライゲーションの準備（わずかなコロニーが存在するはずである）およびアガロースゲルでの泳動によって立証することができる。
【０１９８】
以下のようにライゲーションを準備する。
コンカテマーＤＮＡ画分                            ６μｌ
ＢａｍＨＩ／ｐＺＥｒＯ−１                        １μｌ
５×リガーゼ緩衝液（ＰＥＧ含有）(Invitrogen)      ２μｌ
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（５Ｕ／μＬ）(Invitrogen)    １μｌ
１６℃で一晩インキュベートする。熱不活化させない。コントロールとして、並行して、ベクターの自己ライゲーションも準備する。自己ライゲーションのためのベクターを調製する場合、コンカテマーＤＮＡ画分を無ヌクレアーゼ水と置換する。
【０１９９】
エレクトロポレーション前に各ライゲーション反応物を精製して塩を除去する。無ヌクレアーゼ水で体積を２００μｌに調整し、フェノール／クロロホルム抽出（ｐＨ７．９）および−８０℃で３０分間のエタノール沈殿（GlycoBlueを使用）を行う。スピンし、ペレットを、７０％エタノールで少なくとも２回洗浄し、１２μｌのＬｏＴＥに再懸濁する。
【０２００】
１μｌの精製ライゲーション反応物を、予め冷却した１．７ｍｌ微量遠心管中の２５μｌのエレクトロコンピテント細胞（例えば、Lucigenの大腸菌、InvitrogenのTop10）に添加する。ピペットを上下させて混合しないこと。その代わりに、ピペットチップで穏やかに撹拌する。氷上に５分間静置し、次いで、予め冷却したBioradエレクトロポレーションキュベット（光路０．１ｃｍ）に移す。
【０２０１】
氷上でさらに５分間静置する。Biorad Micropulserユニット、単一パルス、プログラムＥＣ１を使用して、エレクトロポレーションを行う。時定数は、通常、４．５〜５ｍｓである。パルシングから１０秒以内に室温で１ｍｌを無添加のＬＢ培地に添加し、１５ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎチューブに移し、２００ｒｐｍにて３７℃で１時間震盪しながら回収する。
【０２０２】
２０〜５０μｌ（１ｍｌのうち）を、低塩ＬＢ寒天＋ゼオシン（Immedia Zeocin Agar，Invitrogen）を含む小寒天プレートにプレートし、３７℃で一晩インキュベートする。
【０２０３】
（ｆ）ライブラリーの品質管理
コロニー数を計数し、自己ライゲーションバックグラウンドの排除後に有効にライブラリーを測定する。プライマーＰＭＲ０１１およびＰＭＲ０１２を使用したＰＣＲスクリーニングのために２４〜４８コロニーを選別する。ｐＺＥｒＯ−１ベクター自体にコントロールＰＣＲを含める。ＰＣＲの結果に基づいて、一晩の培養物（低塩ＬＢ＋ゼオシン、Immedia、Invitrogen）について１〜４×９６ウェルプレートのコロニーを選別し、プラスミドを精製および配列決定して、インサートあたりのジタグの平均数を決定する。この段階で、ライブラリーを、精製ライゲーションミックスの形態にて、大量形質転換、プラスミド抽出、および配列決定の実施が望まれるまで−２０℃で保存することができる。
【０２０４】
（ｇ）ライブラリープレーティングおよびコロニー選別の配列決定
形質転換ＴＯＰ１０(Invitrogen)細菌細胞を、ロボット選別を容易にするための２，０００／プレート未満のコロニー密度で２２×２２ｃｍ寒天プレート（Q-trays，Genetix）にプレートした。各コロニーを選別し、ＬＢ＋ゼオシン（上記を参照のこと）を含む３８４ウェルプレートにて３７℃で一晩培養した。３８４ウェルプレートの複数のコロニーを複製し、１５％グリセロール(Sigma)の存在下にて−８０℃で保存する。
【０２０５】
（ｈ）テンプレートの調製
ｐＺＥｒＯ−１由来のクローン由来のプラスミドＤＮＡを、Sprintprep固相キット(Agencourt)を使用して調製する。
【０２０６】
（ｉ）ＤＮＡ配列決定
プラスミドを、両方の方向から配列決定するために、配列決定プライマーＰＭＲ０１１およびＰＭＲ０１２（それぞれ、配列番号１３および１４）を使用して配列決定する。
【０２０７】
（５）ＣＩＡ−ｄｉＰＥＴのマッピング
Compressed Suffix Arrayを使用して、マッピングを行うことができる。２つの異なるＤＮＡフラグメント（ｎ＞３）にわたる複数の連結を、実際の遠位調節領域を示すために利用するべきである（図５）。３つを超えるＰＥＴが、ＤＮＡの同一ストレッチの再整列を示さなければならない。すなわち、１０ｋＢを超える距離で分離しているか、異なる染色体上に存在するタグ１およびタグ２を、ゲノムの異なる位置にマッピングするタグからなる任意のキメラの前に、ゲノム再整列の代表として利用する。
〔実施例４〕
【０２０８】
使用のためのＭおよびＧベクターｐＧＩＳ８の調製
（ａ）ｐＧＩＳ８ベクターを得る。
【０２０９】
（ｂ）従来どおりローリングサークル増幅（Templiphi kit，Amersham）によって増幅する。氷上で溶液を解凍する。以下を含む３〜４つのチューブを調製する。
１ｎｇのＤＮＡ(Maxiprep)                １μｌ
Ｔｅｍｐｌｉｐｈｉ  ｋｉｔ変性緩衝液    １０μｌ
９５℃で３分間加熱し、次いで、氷上で短期間冷却する。
【０２１０】
反応緩衝液に以下を添加する。
Ｔｅｍｐｌｉｐｈｉ  ｋｉｔプレミックス    １０μｌ
軽くたたくか穏やかにボルテックスして十分に混合する。震盪せずに３０℃で１６〜１８時間インキュベートする。材料を試験する。材料は粘性を示すはずである。ピコグリーン蛍光光度法（Quant-It kit、Molecular Probes）によってＤＮＡを定量する。
【０２１１】
（ｃ）制限酵素消化の実施
ＤＮＡ                                             ２５μｌ
ＸｈｏＩ（２０Ｕ／μｌ）(New England Biolabs)      １μｌ
ＥｃｏＲ１（２０Ｕ／μｌ）(New England Biolabs)    １μｌ
１０×ＥｃｏＲ１緩衝液(New England Biolabs)        ５μｌ
１００×ＢＳＡ(New England Biolabs)                １μｌ
無ヌクレアーゼ水                                   １７μｌ
３７℃で１６時間インキュベートする。ＰＣＲ精製キット(Qiagen)を使用して精製する。１％アガロースゲルにて５μｌを試験する。
【０２１２】
（ｄ）平滑末端化
以下のように２つのチューブを準備する。
ＤＮＡ                                     ２２．５μｌ
１０×末端修復緩衝液(Epicentre)            ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス(Epicentre)    ５μｌ
１０ｍＭ  ＡＴＰ(Epicentre)                ５μｌ
末端修復酵素ミックス                       １μｌ
無ヌクレアーゼ水                           １１．５μｌ
室温で４５分間インキュベートし、７０℃で１０分間の加熱によって反応を停止させる。
【０２１３】
当業者は、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、種々の修正形態および改良を実施することができると認識される。
【０２１４】
例えば、本発明のＣＩＡ法を、哺乳動物細胞の代わりに、酵母細胞などの他の細胞種で使用することができる。または、ＣｈＩＰを使用する代わりに、本方法を、免疫沈降を必要としない適切な固定液での架橋によって実施することができる。この変形形態では、プロトコールは以下である。
１．細胞を採取する。
２．ホルムアルデヒドにて３６℃で１０分間架橋する。
３．ビーズビーターでの細胞溶解およびその後の遠心分離によって上清を得る。
４．超音波処理、ハイドロシャーリング、皮下注射針による引き抜きの反復、または制限酵素消化によってＤＮＡを剪断する。
５．ＳＤＳおよびＴｒｉｔｏｎ−Ｘ処理を用いて望ましくないタンパク質を除去する。
【０２１５】
その後、ＤＮＡを、上記のようにさらに処理することができる（平滑末端化、ライゲーション）。
【０２１６】
さらに、別の変形形態では、ローリングサークル増幅を、ＰＣＲの代わりに使用することができる。このような変形形態では、望ましくないタンパク質の除去後のプロトコールは以下である。
１．ＤＮＡを平滑末端化する。
２．ＤＮＡをＡ−テーリングする。
３．ライゲーションする。
４．ローリングサークル増幅を、Amersham BioscienceのTempliphi kitなどの適切な市販のキットを使用して行うことができる。
５．ＤＮＡの定量を、Invitrogen/Molecular ProbesのPicoGreenの蛍光定量キットを使用して行うことができる。
６．ＭｍｅＩ制限酵素を使用して消化し、単離オリゴヌクレオチドを得る。
【０２１７】
さらに、別の変形形態では、Ａ−テーリング工程を省略し、適切な平滑末端化アダプターを使用することができる。
【０２１８】
［参考文献］
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【図面の簡単な説明】
【０２１９】
【図１】末端対合(paired end)（ジ）タグ（ＣＩＡ−ＰＥＴ）配列決定によるクロマチン相互作用分析のための本発明の１つの方法の概観を示す図である。
【図２】ＣＩＡ−ｄｉＰｅｔ法のための本発明の別の方法の概観を示す図である。
【図３】ＣＩＡ−ＰＥＴのマッピングを示す図である。実際の相互作用領域を示すＣＩＡ−ＰＥＴにより、２つの異なるゲノム領域にわたると予想され、多重ＣＩＡ−ＰＥＴにより、クラスター化していると予想される。
【図４】ＣＩＡ−ＰＥＴの関連制限酵素の認識配列を示す図である。ＮまたはＸを使用して示した各塩基は、任意のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれか）であり得る。ＮおよびＸを含む領域は、異なるポリヌクレオチドから得た部分を示す。図中の上から下までに認められる配列は以下である。配列番号１、配列番号２、配列番号３６、配列番号３７、配列番号２０、配列番号２１、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１３、配列番号２２、配列番号２３、配列番号１４、配列番号２４、配列番号２５（配列番号２４および２５は、３回反復している）。
【図５】ＣＩＡ−ｄｉＰＥＴのマッピングを示す図である。相互作用領域を示すＣＩＡ−ｄｉＰＥＴにより、２つの異なるゲノム領域にわたると予想され、多重ＣＩＡ−ｄｉＰＥＴにより、クラスター化していると予想される。ＣＩＡ−ｄｉＰＥＴの２つのＰＥＴによって得られたさらなる情報は、ゲノムへのＣＩＡ−ｄｉＰＥＴのマッピングに有用である。
【図６】ＣＩＡ−ｄｉＰＥＴの関連制限酵素の認識配列を示す図である。塩基ＮおよびＸは、任意のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれか）を示し、これらは、異なるポリヌクレオチドから得られる。数字１および２は、２つの領域由来のヌクレオチドまたは１つのポリヌクレオチドから得た末端を示す一方で、数字３および４は、２つの領域由来のヌクレオチドまたは別のポリヌクレオチドから得た末端を示す。数字（１、２、３、および／または４）は、任意のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴのいずれか）を示し得る。図中の上から下までに認められる配列は以下である。配列番号３、配列番号４、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５（配列番号２４および２５は、３回反復している）。
【図７】本発明で使用することができるベクターの例である複数の固有のクローニング部位を含むベクターｐＧＩＳ８を示す図である。
【図８】どのようにしてリンカーが挿入されていないオリゴヌクレオチドが制限酵素によって切断されず、それにより、非常に長く、電気泳動によって除去されるのかを示す図である。図中の上から下までに認められる配列は以下である。配列番号３、配列番号４、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、および配列番号４５。
【図９】リンカーの一部のみがオリゴヌクレオチドに挿入された場合、どのようにして不正確に切断され、それにより、非常に長いので電気泳動によって除去されるオリゴヌクレオチドが得られるのかについて示す図である。図中の上から下までに認められる配列は以下である。配列番号３、配列番号４、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、および配列番号５３。
【図１０】どのようにして不正確に挿入されたリンカーが、非常に長く、且つ長さが変化し得るので、電気泳動によって除去することができるオリゴヌクレオチドを生じるのかを示す図である。図中の上から下までに認められる配列は以下である。配列番号３、配列番号４、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、および配列番号６３。
【図１１Ａ】示した種々の制限酵素の認識部位を含む実施例で使用したベクターｐＧＩＳ８の核酸配列を示す図である。この配列は、配列表中に配列番号１８および配列番号１９として認められる。
【図１１Ｂ】示した種々の制限酵素の認識部位を含む実施例で使用したベクターｐＧＩＳ８の核酸配列を示す図である。この配列は、配列表中に配列番号１８および配列番号１９として認められる。
【図１１Ｃ】示した種々の制限酵素の認識部位を含む実施例で使用したベクターｐＧＩＳ８の核酸配列を示す図である。この配列は、配列表中に配列番号１８および配列番号１９として認められる。
【図１１Ｄ】示した種々の制限酵素の認識部位を含む実施例で使用したベクターｐＧＩＳ８の核酸配列を示す図である。この配列は、配列表中に配列番号１８および配列番号１９として認められる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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