(57)【要約】【課題】小型、高感度のセンサにおいて、局在化表面プラズモン及び光第２高調波発生を用いてさらに高感度のセンサを提供する。【解決手段】本発明による局在化表面プラズモンセンサＰＳ１は、金属層２上に微小膜厚の光透過性絶縁性薄膜３を介して、局在化表面プラズモンが励起される寸法の金属微粒子４を固定化し、金属微粒子４の表面に検出対象分子に相補的な分子の分子層７を形成し、金属微粒子４内の局在化表面プラズモンと金属微粒子４に入射された光６との相互作用に起因して生じる第２高調波８の変化を検出して、相補的な分子層７に吸着又は結合した検出対象分子９を検出する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属層上に光透過性絶縁性薄膜を介して、局在化表面プラズモンが励起される寸法の金属微粒子を固定化し、前記金属微粒子の表面に検出対象分子に相補的な分子の分子層を形成し、前記金属微粒子内の局在化表面プラズモンと前記金属微粒子に入射された光との相互作用に起因して生じる第２高調波の変化を検出して、前記相補的な分子に吸着又は結合した検出対象分子を検出する；
局在化表面プラズモンセンサ。
【請求項２】
金属層上に光透過性絶縁性薄膜を介して、局在化表面プラズモンが励起される寸法の、検出対象分子に相補的な分子の機能を有する金属微粒子を固定化し、前記金属微粒子内の局在化表面プラズモンと前記金属微粒子に入射された光との相互作用に起因して生じる第２高調波の変化を検出して、前記金属微粒子に吸着又は結合した検出対象分子を検出する；
局在化表面プラズモンセンサ。
【請求項３】
前記第２高調波の変化は、前記金属微粒子から反射又は散乱された前記第２高調波の強度、位相又は波長の変化である；
請求項１又は請求項２に記載の局在化表面プラズモンセンサ。
【請求項４】
前記金属微粒子が金を主成分とする直径１０〜１５０ｎｍの球状微粒子であり、前記光透過性絶縁性薄膜の膜厚が０．３〜５ｎｍである；
請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の局在化表面プラズモンセンサ。
【請求項５】
前記光透過性絶縁性薄膜としてメロシアニン単分子膜又はヘミシアニン単分子膜等の非線形光学材料を用いる；
請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の局在化表面プラズモンセンサ。
【請求項６】
前記金属微粒子がドットアレイ状に配置され、前記相補的な分子の種類がドット単位に定められている；
請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の局在化表面プラズモンセンサ。
【請求項７】
請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載の局在化表面プラズモンセンサと、前記表面プラズモンを励起する光を発光する光源と、前記第２高調波を検出する光検出器と、前記第２高調波の変化から前記相補的な分子に吸着又は結合した検出対象分子の屈折率、吸着量、結合量又は膜厚を算定する演算装置とを備える；
局在化表面プラズモンセンシング装置。
【請求項８】
請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載の局在化表面プラズモンセンサを準備する工程と、
前記局在化表面プラズモンセンサの前記金属微粒子内に局在化表面プラズモンを励起し、前記金属微粒子内の局在化表面プラズモンと前記金属微粒子に入射された光との相互作用に起因して生じる第２高調波を検出する工程と、
前記局在化表面プラズモンセンサに前記検出対象分子を吸着又は結合させる工程と、
前記局在化表面プラズモンセンサの前記金属微粒子内に局在化した表面プラズモン共鳴を励起し、前記金属微粒子内の局在化表面プラズモンと前記金属微粒子に入射された光との相互作用に起因して生じる第２高調波の変化を検出する工程と、
前記第２高調波の変化から前記検出対象分子を検出する工程とを備える；
局在化表面プラズモンを用いるセンシング方法。
【請求項９】
金属層上に検出対象分子に相補的な分子の分子層を形成する工程と、前記相補的な分子の分子層に検出対象分子を吸着又は結合させて検出対象分子層を形成する工程と、前記検出対象分子層に局在化表面プラズモンが励起される寸法の金属微粒子を吸着または結合させて、金属層の表面に薄膜を介して金属微粒子を固定化した金属微粒子固定化構造を形成する工程と、前記金属微粒子固定化構造に光を入射して、前記金属微粒子と前記金属層との間に生じる相互作用により生じる反射光の吸収や散乱の変化を検出することにより、前記吸着又は結合した検出対象分子を検出する工程とを備える；
局在化表面プラズモンを用いる分子検出方法。
【請求項１０】
金属層上に検出対象分子に相補的な分子の分子層を形成する工程と、前記相補的な分子の分子層に検出対象分子を吸着又は結合させて検出対象分子層を形成する工程と、前記検出対象分子層に局在化表面プラズモンが励起される寸法の金属微粒子を吸着または結合させて、金属層の表面に薄膜を介して金属微粒子を固定化した金属微粒子固定化構造を形成する工程と、前記金属微粒子固定化構造に光を入射して、前記金属微粒子と前記金属層との間に生じる相互作用に起因して生じる第２高調波を検出することにより、前記吸着又は結合した検出対象分子を検出する工程とを備える；
局在化表面プラズモンを用いる分子検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は局在化表面プラズモンセンサに関する。詳しくは、バイオセンシング等を行なう超小型、高感度のセンサにおいて、局在化表面プラズモン及び光第２高調波発生を用いて改良した、局在化表面プラズモンセンサに関する。また、局在化表面プラズモンを用いた新規な分子検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子解析などの進歩に伴い、タンパクやＤＮＡなど生体分子の検出方法の開発が重要となっている。これらの分子を検出する方法の一つにアフィニティーバイオセンシングがある。これは、分子間の相互作用を利用して検出対象分子を選択的に検出するものである。小型で高性能なバイオセンシング装置ができれば、生化学や遺伝子工学の分野をはじめ、製薬や医療、そして情報工学の分野で重要なツールとなる。
現在実用化されているアフィニティーバイオセンシングの手法に全反射減衰法（ＡＴＲ法：Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｔｏｔａｌ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ法）を利用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）がある。
【０００３】
図１２は全反射減衰（ＡＴＲ）法による表面プラズモンセンサを説明するための図である。図１２（ａ）にその構成を概略的に示す。プリズム２１の底面に金（Ａｕ）などの金属薄膜２２を形成する。膜厚は例えば４６．５ｎｍである。全反射条件で単色光２３を入射（入射角θ）するとある共鳴角θＲで金属薄膜２２中の電子波の一種である表面プラズモンが励起される。図１２（ｂ）は表面プラズモンの反射光の検出例を示す。横軸に入射角θ（ｄｅｇ）を、縦軸に反射率を示す。共鳴角θＲでＡＴＲ配置により生じる減衰波（エヴァネッセント光）２４の波数が表面プラズモン波の波数と一致するため、共鳴吸収が生じ、反射光にディップが生じる。図１２（ａ）にはエヴァネッセント光２４が放射され、その電場Ｅが金属薄膜２２からの距離ｚが遠ざかるにつれて減衰していく様子が示されている。共鳴角θＲは金属薄膜２２上に結合している分子の数や屈折率、厚さなどに敏感である。そのため、分子間の相互作用を利用して検出対象分子を選択的に検出し、また、共鳴角θＲの変化やそれに伴って生じる反射率や偏光状態の変化を観測することにより、検出対象分子のアフィニティー（親和性）を知ることができる。
【０００４】
ＳＰＲを利用して多くの試料を一度に検出するマルチチャンネルバイオセンシングを行うためには、金属表面上に様々な分子をドット状に塗布して各々のドットにおける反射率変化を測定することになる。プラズマ波は金属薄膜中を伝搬するため、ドットを小さくした場合には、ドットの界面等でプラズマ波の干渉等が起きるためその測定は易しいものではない。波長や金薄膜の表面状態によっても異なるが、プラズモンの伝搬長は金の場合５μｍ〜１０μｍ程度であり、実際には１００μｍを切るドットにおいては、干渉の効果により信頼性の高いセンシングは難しい。
【０００５】
これを解決するために、ナノ微粒子やナノ構造中で生じる局在化表面プラズモン（ＬＳＰ：Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ）共鳴を利用したバイオセンシング手法がある。ＡＴＲ条件を用いて表面プラズモン（ＳＰ：Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ）を励起する代わりに、ナノ構造による光の散乱時に生じるエヴァネッセント波によって表面プラズモンを励起する方法である。共鳴条件は金属薄膜上に結合している分子の数や屈折率、厚さなどに敏感であるため、これを利用したバイオセンシングも可能である。一般にＬＳＰを励起するためにはどのような入射角で光を入射してもよく、共鳴条件の変化は散乱光や透過光の強度変化を検出することになる。ＬＳＰを用いたバイオセンシングの大きな特徴として、センシングプローブを小さくできる利点がある。たとえば、ナノ微粒子１つからの散乱光が観測可能であれば、原理的にはナノ微粒子１つでもセンシングプローブを作成することが可能である。（特許文献１参照）
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−１８１２９６号公報（段落００３８〜００６６、図１〜６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これまでバイオセンシング等の分野で、超小型、高感度のセンサを得る工夫が求められている。ところで、ＬＳＰを用いたバイオセンサは小型化が可能でありそれをアレイ化したマルチチャンネルバイオセンシングにおいて、単位面積あたりのドット数を飛躍的に大きくすることができる。
【０００８】
本発明は、小型、高感度のセンサにおいて、局在化表面プラズモン及び光第２高調波発生を用いてさらに高感度のセンサを提供することを目的とする。また、局在化表面プラズモンを用いる新規な分子検出方法を提供することを別の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、請求項１に記載の局在化表面プラズモンセンサＰＳ１は、例えば図１及び図４に示すように、金属層２上に光透過性絶縁性薄膜３を介して、局在化表面プラズモンが励起される寸法の金属微粒子４を固定化し、金属微粒子４の表面に検出対象分子９に相補的な分子の分子層７を形成し、金属微粒子４内の局在化表面プラズモンと金属微粒子４に入射された光６との相互作用に起因して生じる第２高調波８の変化を検出して、相補的な分子に吸着又は結合した検出対象分子９を検出する。
【００１０】
ここにおいて、金属層には、金属基板、金属膜等が含まれる。また、必ずしも純金属である必要はなく。不純物や結晶欠陥があっても良い。また、金属層には合金層が含まれるものとする。また、光透過性絶縁性薄膜３は金属層２と金属微粒子４とを微小距離離すためのものであり、光透過性かつ絶縁性であれば良く、例えば高分子ポリマー、透明な誘電体等を使用できる。また、局在化表面プラズモンが励起される金属微粒子４の寸法は１０〜１５０ｎｍ程度であり、金属微粒子４は、金、銀の球状微粒子が好ましいが、これに限定されず、任意の形状でも良い。また、金属層２上に固定化される金属微粒子４は単数でも複数でも良く、複数の金属微粒子４が例えばドット状に集められて固定化されても良い。また、局在化表面プラズモンと入射光との相互作用とは、入射光により局在化表面プラズモンが励起され、共鳴する相互作用をいう。その結果、金属微粒子４の表面近傍、特に金属層２と金属微粒子４の間に増強された光電場が発生し、光第２高調波発生（ＳＨＧ：Ｓｅｃｏｎｄ  ｈａｒｍｏｎｉｃ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）の増強がもたらされる。また、検出対象分子に相補的な分子とは、検出対象分子（アナライト）と良く結合し、それ以外の分子とは結合し難い分子（リガンド）をいう。このように構成すると、小型、高感度のセンサにおいて、局在化表面プラズモンの第２高調波を用いてさらに高感度のセンサを提供できる。
【００１１】
また、請求項２に記載の局在化表面プラズモンセンサは、金属層２上に光透過性絶縁性薄膜３を介して、局在化表面プラズモンが励起される寸法で、検出対象分子９に相補的な分子の機能を有する金属微粒子４を固定化し、金属微粒子層４内の局在化表面プラズモンと金属微粒子４に入射された光６との相互作用に起因して生じる第２高調波８の変化を検出して、金属微粒子４に吸着又は結合した検出対象分子９を検出する。このように構成すると、金属微粒子が検出対象分子と直接結合できる場合にも適用できる。
【００１２】
また、請求項３に記載の発明は、請求項１又は請求項２に記載の局在化表面プラズモンセンサにおいて、第２高調波８の変化は、金属微粒子４から反射又は散乱された第２高調波８の強度、位相又は波長の変化である。このように構成すると、第２高調波８の変化を確実に検出でき、好適である。
【００１３】
また、請求項４に記載の発明は、請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の局在化表面プラズモンセンサにおいて、金属微粒子４が金を主成分とする直径１０〜１５０ｎｍの球状微粒子であり、光透過性絶縁性薄膜３の膜厚が０．３〜５ｎｍである。このように構成すると、金属微粒子の鏡像ができやすく、第２高調波８の感度を向上するのに好適である。
【００１４】
また、請求項５に記載の発明は、請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の局在化表面プラズモンセンサにおいて、光透過性絶縁性薄膜３としてメロシアニン単分子膜又はヘミシアニン単分子膜等の非線形光学材料を用いる。このように構成すると、金属のみで発生するＳＨＧに、非線形光学材料からのＳＨＧが加わり信号強度が上がるため、Ｓ／Ｎ比や感度を向上でき好適である。非線型光学材料からのＳＨＧは、局在化表面プラズモンと入射光との相互作用による強い増強電場により励起されるため、著しく増強されている。特にメロシアニン単分子膜又はヘミシアニン単分子膜が好適である。
【００１５】
また、請求項６に記載の発明は、請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の局在化表面プラズモンセンサにおいて、金属微粒子４がドットアレイ状に配置され、相補的な分子の種類がドット単位に定められている。ここにおいて、ドット単位とはドット内では同種の分子を用いるが、異なるドットについては異なる分子を用いても良い意味であり、ドット毎に全て異種の分子としても良く、複数のドットに同種の分子を用いても良い。このように構成すると、局在化表面プラズモンセンサの高感度性を利用して、単位面積あたりのドット数を飛躍的に大きくできる。
【００１６】
また、請求項７に記載の局在化表面プラズモンセンシング装置は、請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載の局在化表面プラズモンセンサと、表面プラズモンを励起する光６を発光する光源と、第２高調波８を検出する光検出器と、第２高調波８の変化から相補的な分子に吸着又は結合した検出対象分子９の屈折率、吸着量、結合量又は膜厚を算定する演算装置とを備える。このように構成すると、高感度の局在化表面プラズモンを用いる高感度センシング装置を提供できる。
【００１７】
また、請求項８に記載の局在化表面プラズモンを用いるセンシング方法は、例えば図５に記載のように、請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載の局在化表面プラズモンセンサＰＳ１を準備する（Ｓ００１）工程と、局在化表面プラズモンセンサＰＳ１の金属微粒子４内に局在化表面プラズモンを励起し（Ｓ００２）、金属微粒子４内の局在化表面プラズモンと金属微粒子４に入射された光６との相互作用に起因して生じる第２高調波８を検出する（Ｓ００３）工程と、局在化表面プラズモンセンサＰＳ１に検出対象分子９を吸着又は結合させる（Ｓ００４）工程と、局在化表面プラズモンセンサＰＳ１の金属微粒子４内に局在化した表面プラズモン共鳴を励起し（Ｓ００５）、金属微粒子４内の局在化表面プラズモンと金属微粒子４に入射された光６との相互作用に起因して生じる第２高調波８の変化を検出する（Ｓ００６）工程と、第２高調波８の変化から吸着又は結合した検出対象分子９を検出する（Ｓ００７）工程とを備える。
【００１８】
ここにおいて、工程Ｓ００２における、局在化表面プラズモンの励起を工程Ｓ００５まで持続したまま、工程Ｓ００４で検出対象分子９を吸着又は結合させても良い。このように構成すると、小型、高感度のセンサの分野において、局在化表面プラズモンの第２高調波を用いてさらに高感度のセンシング方法を提供できる。
【００１９】
また、請求項９に記載の局在化表面プラズモンを用いる分子検出方法は、例えば図１１に記載のように、金属層１２上に検出対象分子１４に相補的な分子１３の分子層を形成する工程（Ｓ０１１）と、相補的な分子１３の分子層に検出対象分子１４を吸着又は結合させて検出対象分子層を形成する工程（Ｓ０１２）と、検出対象分子層に局在化表面プラズモンが励起される寸法の金属微粒子１５を吸着または結合させて、金属層１２の表面に薄膜１４を介して金属微粒子１５を固定化した金属微粒子固定化構造を形成する工程（Ｓ０１３）と、金属微粒子固定化構造に光を入射して、金属微粒子１５と金属層１２との間に生じる相互作用により生じる反射光の吸収や散乱の変化を検出することにより、吸着又は結合した検出対象分子１４を検出する工程（Ｓ０１４）とを備える。このように構成すると、検出対象分子層の膜厚を高感度で測定できる新規な分子検出方法を提供できる。
【００２０】
また、請求項１０に記載の局在化表面プラズモンを用いる分子検出方法は、金属層１２上に検出対象分子１４に相補的な分子１３の分子層を形成する工程（Ｓ０１１）と、相補的な分子１３の分子層に検出対象分子１４を吸着又は結合させて検出対象分子層を形成する工程（Ｓ０１２）と、検出対象分子層に局在化表面プラズモンが励起される寸法の金属微粒子１５を吸着または結合させて、金属層１２の表面に薄膜１４を介して金属微粒子１５を固定化した金属微粒子固定化構造を形成する工程（Ｓ０１３）と、金属微粒子固定化構造に光を入射して、金属微粒子１５と金属層１２との間に生じる相互作用に起因して生じる第２高調波を検出することにより、吸着又は結合した検出対象分子１４を検出する工程（Ｓ０１５）とを備える。このように構成すると、超小型、高感度のセンサにおいて、局在化表面プラズモンの第２高調波を用いてさらに高感度の分子検出方法を提供できる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のセンサによれば、小型、高感度のセンサにおいて、局在化表面プラズモン及び光第２高調波発生を用いてさらに高感度のセンサを提供できる。また、本発明の分子検出方法によれば、局在化表面プラズモンセンサを用いた新規な分子検出方法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
〔発明の要点〕
まず、本発明の原理的側面を説明する。ＬＳＰバイオセンシング材料として金属基板表面に固定化された金ナノ微粒子を用いる。ナノ微粒子の形状はどのようなものでも良いが、球状のナノ微粒子はよく規定された材料が入手できるので、球状とするのは現実的な選択である。また、微粒子の固定化には、数ナノメートル以下で、かつ、微粒子と結合するような材料を用いる。結合は、共有結合、静電的結合等どのようなものでも良い。ここでは、末端をアミノ基やチオール基などの含窒素化合物、電荷を有する基などで修飾された自己組織化単分子膜を用いる。自己組織化単分子膜（ＳＡＭ：Ｓｅｌｆ  ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）は、基板を試料溶液に浸積するだけで形成できるため簡単なプロセスで作製が可能である。
【００２３】
図１に、金属微粒子固定化構造を概略的に示す。基板１上に金（Ａｕ）などの金属層として金属膜２が形成され、その上に光透過性絶縁性薄膜として膜厚０．３〜５ｎｍの薄い自己組織化単分子膜３が形成されている。更にその上に、直径数１０〜１５０ｎｍ程度の金ナノ微粒子４が固定されている。金属膜２は約５０ｎｍ以上が好ましく、基板１と金属膜２の代わりに金属基板を用いても良い。ここにおいて、このような金属層２の表面に薄膜３を介して金属微粒子４を固定化した構造を金属微粒子固定化構造と称することとする。
【００２４】
図２は、金属微粒子固定化構造の作用を説明するための図である。図１と同じ部位については同一の符号を付して重複する説明を省略する（以下の図面について同じ）。なお、金属膜２の表面に対して金ナノ微粒子４の鏡像５が生じるため、２連球と同様の光学応答を示す。このため、孤立球に対してレッドシフトした強い共鳴吸収線が生じ、また、ギャップ中（ＳＡＭ３の部分）には増強磁場が生じる。これらの性質を積極的に利用することにより、孤立球を用いた場合より高感度の局在化表面プラズモン（ＬＳＰ）バイオセンシングを行うことができる。なお、１０はエヴァネッセント光、Ｒは金ナノ微粒子４の半径である。
【００２５】
ＬＳＰバイオセンシングの原理は、アナライトと呼ばれる検出対象分子に対してリガンドと呼ばれる相補的な分子を固体基板表面上に塗布し、それをアナライトを含む試料溶液に浸漬することによりそれらの間の相互作用を検出する。アナライトとリガンドの関係はちょうど鍵と鍵穴の関係になっており、適切なリガンドを用いるとアナライトとの強い相互作用を有するが、アナライト以外の分子との相互作用が弱いため吸着速度や吸着量は小さく、これにより分子の選択的な認識を行うことができる。リガンド層へのアナライトの吸着は、光学的には表面における誘電体層の膜厚の増加に対応する。そのため、それを高い感度でリアルタイムにセンシングできれば試料溶液の分析や分子間の相互作用についての議論を行うことができる。例えば、アナライトとしての塩基配列に相補的なＤＮＡをリガンドとして用いれば、そのＤＮＡは２量体化を起こして検出される。また、リガンドとして抗原を用いると対応する抗体を検出することになる。同様の原理で、ＤＮＡ、脂質、糖、タンパク間の相互作用を利用してこれらの分子を測定することが可能である。
【００２６】
しかしながら、相互作用を起こして吸着する分子の量は高々単分子層程度でありその計測には工夫が必要である。すなわち、一般に１０ｐｇ／ｍｍ２程度の吸着分子量が検出できる感度が必要である。高い感度を実現するひとつの方法としては、蛍光分子などによりアナライトを標識する方法があり、現在使われているＤＮＡチップの検出システムは、蛍光標識されたＤＮＡが相補的な塩基配列で修飾された基板表面へ吸着する様子を蛍光顕微鏡を使って検出するものである。しかしながら、検出対象を標識することなく高い感度で検出する手法が実現できれば汎用性やコストの点で有利である。他方、非標識のバイオセンシング手法として、上述の全反射減衰法を用いた表面プラズモン共鳴を利用した手法や水晶振動子を利用した手法が開発されている。これらは優れた手法でありすでに実用化もされている。しかし、光学配置や試料構造上の制限が厳しいため微小化することは容易ではない。もし、単純な光学配置でセンシング部分が構築できれば、微小なセンサの作成やそれを２次元的に配列した高密度センシングアレイの作製が可能となる。
【００２７】
また、共鳴状態の変化を検出する具体的な方法としては、反射吸収スペクトルや散乱スペクトルを測定してそのピーク位置を測定する方法や変化量の大きいある波長に注目してその波長における反射や吸収スペクトルの変化量を読み取る方法がある。しかしながら、ドットからの散乱を利用したＬＳＰバイオセンシングは感度の点で満足できないことが多く、これを改善する方法が望まれている。本発明では、２次の非線形光学効果の一種である光第２高調波発生（ＳＨＧ）を用いてＬＳＰの状態を検出することによりバイオセンシングができる手法を開発した。以下、この手法をＳＨ−ＬＳＰバイオセンシングと称することとする。線形光学を利用したセンシングでは、微粒子近傍の増強電場に比例した線形分極が生じ、検出の際に生じる増強電場の変化を反射光や散乱光で検出する。一方、非線形光学を利用したセンシングでは、増強電場の２乗に比例した非線形分極が生じるため、変化量が大きく、上述のＬＳＰセンサの問題点を解決できるという特徴がある。以下に光第２高調波発生（ＳＨＧ）を用いる局在化表面プラズモンセンサの実施の形態及び局在化表面プラズモンを用いる分子検出方法の実施の形態について説明する。
【００２８】
〔第１の実施の形態〕
以下に図面に基づき本発明の第１の実施の形態について説明する。センサとして図１に記載の金属微粒子固定化構造を用い、金ナノ微粒子４にリガンドとしてビオチンを修飾し、アナライトとしてアビジンを結合する例を説明する。
【００２９】
図３に金属微粒子固定化構造の反射吸収スペクトルの例を示す。金属微粒子固定化構造の金ナノ微粒子の表面にはリガンドとしてビオチンが修飾され、これにアナライトとして生体由来分子であるアビジン蛋白質を吸着させた。実線はビオチンにアビジン吸着前のスペクトルを、破線はビオチンにアビジン吸着後のスペクトルを示す。ｐ−偏光の反射吸収スペクトルでは孤立金微粒子球の共鳴バンドである５２０ｎｍ付近の吸収に対して、６００ｎｍ付近にレッドシフトした強い吸収バンドがあらわれる。このバンドは金微粒子４と金属層２の相互作用によるものと考えられている。ｓ−偏光や垂直入射光の場合にはこのバンドはあらわれず、このことから、基板表面法線方向の励起電場に対して共鳴するバンドであることがわかる。アビジン吸着後は、吸収強度が大きくなっていること、ピーク波長がレッドシフトしていることがわかる。これらの測定から、金微粒子表面における分子の量を知ることができるため、センサとして使用できることがわかる。
【００３０】
共鳴状態の変化は反射吸収スペクトルの変化としてあらわれたが、非線形感受率の変化として観測することにより高感度なセンシングを実現できる。金属微粒子固定化構造は反転中心を有さないためそれ自身が２次の非線形光学活性である。また、金属層表面と金ナノ微粒子間のギャップにおいて５０倍以上の増強電場が生じているため、強いＳＨＧが観測される。さらに、ＳＨ−ＬＳＰバイオセンシングでは、光透過性絶縁性薄膜としてメロシアニンチオールなどの非線形光学効果を示す材料を用いて、直径８０〜１５０ｎｍの球状金ナノ微粒子を金表面に固定化した金属微粒子固定化構造が最適であるとの結果を得た。メロシアニンチオールの膜厚は約１〜２ｎｍが好ましく、また、ＳＨＧ観測には波長約７００〜９００ｎｍの基本光で、波長約３５０〜４５０ｎｍの第２高調波を観測することが好ましい。
【００３１】
図４に、この系を用いて、ＳＨ−ＬＳＰセンシングを行った結果を示す。図４（ｂ）に本実施の形態における局在化表面プラズモンセンサ（センサ部を金属微粒子固定化構造とした）ＰＳ１の模式図を示す。上図では金ナノ微粒子４の表面にリガンド７が修飾されている。この局在化表面プラズモンセンサＰＳ１をアナライト９を含む試料溶液に浸漬し、角周波数ωの入射光６を照射すると、金属微粒子固定化構造において光第２高調波発生ＳＨＧが生じ、当該金属微粒子固定化構造から角周波数２ωの第２高調波８が反射方向に放射される。下図ではリガンド７にアナライト９が結合され、結合後の金属微粒子固定化構造から反射方向に放射される角周波数２ωの第２高調波８を検出する。図４（ａ）は第２高調波検出信号（以下、ＳＨＧ信号という）によるビオチン−アビジン反応の検出経過を示す。縦軸はＳＨＧ信号の相対的強度を、横軸は経過時間（ｓ）を示す。アビジンの注入（図中矢印で示す）と同時にビオチンへの結合が起こり、約３０分（１８００秒）後に反応が終了して一定値となる。このとき、水中で第２高調波光強度が１６％減少していることがわかる。これはアビジンの結合によるＬＳＰのわずかな共鳴波長変化により、基本光（λ＝８００ｎｍ）に対する共鳴効果が小さくなり、第２高調波光強度が大きく減少したと考えられる。この過程は、単純な反射スペクトルでも追跡できるが、その変化量はこの３分の１程度である。なお５０分後に水洗（図中矢印で示す）により、溶液中のアナライトが除去されている。
【００３２】
図５に本実施の形態における局在化表面プラズモンを用いるセンシングの処理フロー例を示す。まず、局在化表面プラズモンセンサＰＳ１を準備する（Ｓ００１）。次に、局在化表面プラズモンセンサＰＳ１の金属微粒子４内に局在化表面プラズモンを励起し（Ｓ００２）、金属微粒子４内の局在化表面プラズモンと金属微粒子４に入射された光６との相互作用に起因して生じる第２高調波８を検出する（Ｓ００３）。次に、局在化表面プラズモンセンサＰＳ１に検出対象分子９を吸着又は結合させる（Ｓ００４）。次に、局在化表面プラズモンセンサＰＳ１の金属微粒子４内に局在化した表面プラズモン共鳴を励起し（Ｓ００５）、金属微粒子４内の局在化表面プラズモンと金属微粒子４に入射された光６との相互作用に起因して生じる第２高調波８の変化を検出する（Ｓ００６）。次に、第２高調波８の変化から吸着又は結合した検出対象分子９を検出する（Ｓ００７）。ここにおいて、工程Ｓ００２における、局在化表面プラズモンの励起を工程Ｓ００５まで持続した状態で、工程Ｓ００４で検出対象分子９を吸着又は結合させても良い。
【００３３】
以上により、本実施の形態によれば、小型、高感度のセンサにおいて、局在化表面プラズモンの第２高調波を用いてさらに高感度のセンサを提供できる。
【００３４】
〔第２の実施の形態〕
第２の実施の形態は、ＳＨＧ顕微鏡を用いた光第２高調波発生（ＳＨＧ）バイオセンシングについて説明する。ドット状の複数の金属微粒子による金属微粒子固定化構造をアレイ状に配列し、多種のアナライトを含む試料溶液に対しチップ毎（ドット毎）に異なるリガンドを用いて、結合を生じさせ、顕微鏡で反射光の変化を観察する方法である。
前述のように、メロシアニンを使った金属微粒子固定化構造がＳＨ−ＬＳＰバイオセンシングに最適であることがわかったので、これを用いてチップ化を行った。
【００３５】
図６に金属微粒子固定化構造のアレイチップを用いたセンシングの例を示す。図６（ａ）はアレイチップの顕微鏡写真であり、１２０μｍの金属微粒子固定化構造のチップが４列×４行のドットアレイ状に配列されている。ドットＢ２にはあらかじめビオチンが結合されており、これに対して特異結合したアビジンが検出されていることがわかる。図６（ｂ）に各バイオチップにおける局在化表面プラズモンセンサ（センサ部を金属微粒子固定化構造とした）ＰＳ２の模式図を示す。図４（ｂ）と同様であり説明を省略する。金属微粒子固定化構造を構成する金属微粒子は数１０ｎｍ〜１５０ｎｍの球状の金ナノ微粒子であり、複数の金ナノ微粒子をドット状にグループ化したチップをアレイ状に配置した。また、相補的な分子の種類がドット単位に定められている。すなわち、同一ドット内では同種の分子が用いられ、ドット毎に全て異種の分子としても良く、複数のドットに同種の分子を用いても良い。ビオチン−アビジン反応が進むと、センサ表面からの反射光に変化が生じる。
【００３６】
図７に、金属微粒子固定化構造のアレイチップを用いた顕微鏡イメージングを示す。図７（ａ）に４×４配列の直径１２０μｍのＬＳＰドットアレイの顕微鏡イメージングを、図７（ｂ）に光第２高調波強度（ＳＨＧ強度）のドットＡ１からＡ４に対する位置依存性（（ａ）の破線に沿って測定）の結果を示す。図７（ａ）の４×４配列のうち、３ドット（Ａ１、Ｂ２、Ｃ３）にアビジンを吸着させ、これを第２高調波（ＳＨ）顕微鏡測定した。図７（ａ）によればＡ１、Ｂ２、Ｃ３の３ドットにおいて周囲のドットに比べて第２高調波光強度が低下しており、図７（ｂ）によれば、Ａ１について低下が約３０％であることが観測された。同様にしてＢ２、Ｃ３についても３０％の低下が観測された。これにより、この手法が誘電体の結合や吸着の検出に対して高感度であることが示された。
【００３７】
図８に金属微粒子固定化構造のアレイチップの他の例を示す。直径３０μｍの金属微粒子固定化構造のチップがアレイ状に高密度に配列されている。このように微小ドットのアレイも形成可能である。
【００３８】
〔第３の実施の形態〕
第３の実施の形態では、金属微粒子固定化構造を利用し、検出対象分子を検出する例を説明する。
【００３９】
図９は第３の実施の形態における局在化表面プラズモンセンサＰＳ３の構成を説明するための図である。金属層として金（Ａｕ）などの金属基板１２上にリガンド１３を塗布すると、これに特異結合するタンパク分子が結合する。一般にタンパク分子は金などの金属微粒子と相互作用を起こして結合するため、さらに金属微粒子１５を固定化することができる。その結果、タンパク分子を光透過性絶縁性薄膜３とする金属微粒子固定化構造が形成される。図９では、金基板１２上に、リガンドとしてビオチン１３を用いて検出対象分子としてアビジン１４を結合し、さらにその上に直径数１０〜１５０ｎｍの金ナノ微粒子１５を吸着し、金属微粒子固定化構造を形成している。この金属微粒子固定化構造をチップ毎にグループ化して、例えばその１２０μｍ大のチップをドットアレイ状に配列する。また、相補的な分子の種類がドット単位に形成され、これによりアナライトの種類もドット単位に形成される。また、金属微粒子固定化構造の共鳴条件は金ナノ微粒子１５の金属層１２表面からの距離に依存する。そのため、金属微粒子固定化構造からの反射スペクトルや第２高調波スペクトルを測定することによりたとえば、生物由来分子の結合構造、吸着構造に関する知見を得ることができる。
【００４０】
図１０に金属微粒子固定化構造を用いた分子検出の例を示す。図９のように金基板１２上に結合したアビジン１４にさらに金ナノ微粒子１５を吸着した金属微粒子固定化構造の反射スペクトルを図１０（ａ）に示す。金属微粒子固定化構造に由来する吸収バンドの位置（約６００ｎｍ）から金ナノ微粒子１５と基板１２表面のギャップの大きさｄを計算することができる。図１０（ａ）の例では、これをもとにアビジン層１４の厚さｄがおよそ２ｎｍであると見積もられた。実際の大きさより小さいので、吸着による構造変化がおこっていると考えられる。また、この系は金属微粒子固定化構造を形成しているため、強い第２高調波光を得ることができる。これを利用して、平坦な金属基板上に固定化されたリガンドアレイに結合したタンパク分子を金属微粒子固定化構造による電場増強を用いて高コントラストでイメージングしたものが図１０（ｂ）である。３ドット（Ａ３、Ｂ２、Ｃ１）以外のドットにタンパク分子が結合されている。金ナノ微粒子１５は多くのタンパク分子と相互作用して吸着し、タンパク分子を光透過性絶縁性薄膜３とする金属微粒子固定化構造が形成される。その結果、３ドット（Ａ３、Ｂ２、Ｃ１）以外のドットで光第２高調波が強くなっているのがわかる。多くのタンパクは金と相互作用することから、タンパクがある部分には金ナノ微粒子が結合する。これを利用するとＳＨ光のみでなくＳＥＲＳ（Ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒａｍａｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）等にも適用できるため、さらに多くの情報を得ることができると考えられる。
【００４１】
図１１に本実施の形態における分子検出方法の処理フロー例を示す。図１１（ａ）に反射スペクトル又は散乱スペクトルの変化により検出する例を示す。まず、金属層１２上に検出対象分子１４に相補的な分子の分子層１３を形成する（Ｓ０１１）。次に、相補的な分子１３の分子層に微小膜厚の検出対象分子層１４を吸着又は結合させて形成する（Ｓ０１２）。次に、検出対象分子層１４上に局在化した表面プラズモン共鳴が励起される寸法の金属微粒子１５を吸着または結合させて固定化する（Ｓ０１３）。これにより、金属層１２、相補的な分子１３の分子層、検出対象分子層１４及び金属微粒子１５からなる金属微粒子固定化構造が形成される。次に、金属微粒子固定化構造に光を入射して、金属微粒子１５内に局在化した表面プラズモンと金属微粒子１５に入射された光との相互作用における反射スペクトル又は散乱スペクトルの変化を検出する（Ｓ０１４）。これにより、検出対象分子を検出できる。
【００４２】
また、図１１（ｂ）に第２高調波の変化により検出する例を示す。図１１（ａ）の検出方法において、反射スペクトル、散乱スペクトルの変化を検出する工程Ｓ０１４に代えて、第２高調波８の変化を検出する（Ｓ０１５）。その他の工程は図１１（ａ）と同様である。この方法はＳＨＧを利用しており、より高感度の検出が可能である。
【００４３】
この方法は、タンパクの検出や吸着構造の研究に有力な方法であり、単純なアフィニティーバイオセンシングと異なり様々な情報を得ることができる。
このように、本実施の形態によれば検出対象分子を高感度で検出できる。
【００４４】
以上、本発明の実施の形態について説明したが、本発明は以上の実施の形態に限定されるものではなく、実施の形態に種々変更を加えられることは明白である。
【００４５】
例えば、以上の実施の形態においては、金属層が金であり、金属微粒子が球状の金ナノ微粒子である例を説明したが、銀でも局在化プラズモンを励起できるので使用可能であり、形状も球状に限られず任意で良い。また、以上の実施の形態では、光透過性絶縁性薄膜としてメロシアニンを使用する例を説明したが、その他の微小膜厚の光透過性絶縁性薄膜を使用しても良い。また、以上の実施の形態ではリガンドを介して金属微粒子にアナライトを結合させる例を説明したが、金属微粒子に直接アナライトを結合させても良く、また、アナライトとリガンドの組み合わせも、アビジン−ビオチンの組み合わせに限られず、オクタデカンチオールと金、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ（リボ核酸）、ＤＮＡ−タンパク質、ＤＮＡ−糖、ＤＮＡ−有機化合物、タンパク質−タンパク質、脂質−タンパク質、糖−タンパク質、タンパク質−有機化合物、金、銀−チオールやジスルフィド基を持つ有機硫黄化合物、アミノ基を持つ１級アミン、２級アミン、３級アミン化合物等の組み合わせも可能である。また、以上の実施の形態に記載の局在化表面プラズモンセンサに、表面プラズモンを励起する光を発光する光源と、第２高調波を検出する光検出器と、第２高調波の変化から相補的な分子に吸着又は結合した検出対象分子の屈折率、吸着量、結合量又は膜厚を算定する演算装置と組み合わせることにより、局在化表面プラズモンセンシング装置を構成できる。また、入射光の波長、金属微粒子の寸法、ドットアレイの配列等は種々選択可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明は、高感度のバイオセンシング等に利用される。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】金属微粒子固定化構造を概略的に示す図である。
【図２】金属微粒子固定化構造の作用を説明するための図である。
【図３】金属微粒子固定化構造の反射吸収スペクトルの例を示す図である。
【図４】ＳＨ−ＬＳＰセンシングを行った結果を示す図である。
【図５】第１の実施の形態における局在化表面プラズモンを用いるセンシングの処理フロー例を示す図である。
【図６】金属微粒子固定化構造のアレイチップを用いたセンシングの例を示す図である。
【図７】第２の実施の形態における金属微粒子固定化構造のアレイチップを用いた顕微鏡イメージングを示す図である。
【図８】第２の実施の形態における金属微粒子固定化構造アレイチップの他の例を示す図である。
【図９】第３の実施の形態における局在化表面プラズモンセンサの構成を説明するための図である。
【図１０】金属微粒子固定化構造を用いた分子検出の例を示す図である。
【図１１】第３の実施の形態における分子検出方法の処理フロー例を示す図である。
【図１２】全反射減衰（ＡＴＲ）法による表面プラズモンセンサを説明するための図である。
【符号の説明】
【００４８】
１    基板
２    金属層（金属膜、金属基板）
３    光透過性絶縁性薄膜（自己組織化膜）
４    金属微粒子（金ナノ微粒子）
５    鏡像
６    入射光
７    リガンド
８    第２高調波
９    アナライト
１０  エヴァネッセント光
１２  金基板
１３  リガンド
１４  検出対象分子
１５  金ナノ微粒子
２１  プリズム
２２  金属薄膜
２３  入射光
２４  エヴァネッセント光
ｄ  膜厚
ＰＳ１〜ＰＳ３  局在化表面プラズモンセンサ
θ  入射角
θＲ  共鳴角
【図３】
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【図５】
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【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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