(57)【要約】【課題】ＭＫ遺伝子プロモーター領域におけるＭＫ発現量の調節部位の変異とその変異部位の遺伝子型から両親間での子の出生および／または成人化の可能性を予測する方法を提供する。【解決手段】両親間での子の出生および／または成人化の可能性を予測する方法であって（１）前記両親に由来するポリヌクレオチドサンプルを得ることと、（２）前記（１）で得たポリヌクレオチドサンプルについてミッドカイン遺伝子の多型の遺伝子型を決定することと、（３）前記（２）で決定された遺伝子型から前記両親間での子の出生および／または成人化の可能性を予測することと、を具備する両親間での子の出生および／または成人化の可能性を予測する方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
両親間での子の出生および／または成人化の可能性を予測する方法であって、
（１）前記両親に由来するポリヌクレオチドサンプルを得ることと、
（２）前記（１）で得たポリヌクレオチドサンプルについてミッドカイン遺伝子の多型の遺伝子型を決定することと、
（３）前記（２）で決定された遺伝子型から前記両親間での子の出生および／または成人化の可能性を予測することと、
を具備する両親間での子の出生および／または成人化の可能性を予測する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、個体の発生に関連する遺伝子と、その遺伝子型から両親間での子の出生および／または成人化の可能性を予測する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ミッドカイン（midkine;以下、MKと記す）は、塩基性アミノ酸とシステインを多量に含むヘパリン結合性のタンパク質である。その機能は、胎児期での細胞分化、細胞造成作用および神経細胞の成長などであり、生命活動で重要な役割を担っている。
【０００３】
更に、成人でのＭＫ遺伝子の発現は腎臓において行われていることも報告されている。プロモーター領域は、その遺伝子の発現量を調節している領域である。
【０００４】
近年、ＭＫ遺伝子と発生との関連が明らかになってきた。例えば、ゼノパスでは、それぞれの発生ステージで神経に関連した組織で発現していることが示された（J.Biochem., 118(1), 94-100, 1995）。更に、癌発症との関連も明らかになってきた。例えば、Ｗｉｌｍ’ｓ腫瘍、大腸癌、胃癌、肺癌および食道癌などの癌組織におけるＭＫ遺伝子の発現は、正常な組織での発現に比較して十数倍もの高発現率になることが示された（Cancer Res, 53, 1281-1285, 1993）。また、短縮型ＭＫメッセンジャーＲＮＡ（truncated MK mRNA、tMK mRNA）が癌組織において発現することも報告されている（Biochem. Biophys. Res. Commun., 219, 256-260, 1996., Br. J. Cancer, 78, 472-477, 1998）。更に、ＭＫ遺伝子の発現頻度解析から癌を診断する方法（特開平６−１１３８９８）およびＭＫ遺伝子イントロン領域の多型解析から癌発症を予測する方法（特願２００１−３５９５０３）も提案されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＭＫ遺伝子プロモーター領域におけるＭＫ発現量の調節部位の変異とその変異部位の遺伝子型から両親間での子の出生および／または成人化の可能性を予測する方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、発明者がミッドカイン遺伝子のプロモーター領域−１７４１位（プロモーター領域４以内）に存在する多型の遺伝子が子の出生および／または出生成人化の可能性と関連のあることを見出したことに基づく。
【０００７】
前記の知見を基に、本発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意研究をおこない、以下のような手段を見出した。即ち、
両親間での子の出生および／または成人化の可能性を予測する方法であって、
（１）前記両親に由来するサンプルを得ることと、
（２）前記（１）で得たサンプルについてミッドカイン遺伝子の多型の遺伝子型を決定することと、
（３）前記（２）で決定された遺伝子型から前記両親間での子の出生および／または成人化の可能性を予測することと、
を具備する両親間での子の出生および／または成人化の可能性を予測する方法である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
１．出生および／または成人化予測関連遺伝子
以前、本発明者らは、ＭＫ遺伝子における変異遺伝子の存在およびその遺伝子型を明らかにしており、既に報告している（Ahmed, K, M., Shitara, Y., Kuwano H., Takenoshita, S., Uchimuro, K. and Shinozawa T., ; Genetic variations of the midkine(MK) gene in human sporadic colorectal and gastric cancers, International Journal of Molecular Medicine 6: 281-287, 2000）。
【０００９】
今回、本発明者らは、更なるヒトにおける当該変異部位の遺伝子型を解析し、その多型変異の分布を明らかにした。即ち、両親のＭＫ遺伝子のプロモーター領域の−１７４１位に存在する遺伝子が、その両親の間で子が出生および／または成人化することに関連があることを見出した。
【００１０】
図１にＭＫ遺伝子プロモーター領域を模式的に示した。確認されている全ての推定上の機能モチーフおよびプロモーター領域の４箇所、即ち、領域１から領域４、およびＳＳＣＰ分析におけるＰＣＲ産物から得た塩基長とを示した。ブロック０からブロック３は、マウスＭＫ遺伝子と高度に類似した領域を示す。図中白丸はエンハンサーのコアエレメント、黒丸はレチノイン酸受容体結合部位、白三角はＩｇＧエンハンサーモチーフ、黒三角はＡＰ−１結合部位、白四角はウィルムス腫瘍遺伝子（Wilms' tumor gene）産物結合部位、黒四角はＮｆ−ｋＢ結合部位、白菱形はＧＣボックス、黒菱形はステロイド／サイロイドホルモン受容体結合部位、および白杵形はＡ／Ｔボックスを示す。
【００１１】
このようなプロモーター領域は、ＭＫタンパク質の発現を制御している。本発明に従う両親の間での子供の出生および／または成人化する可能性に関連する変異遺伝子の存在する部位は、プロモーター領域の領域４に存在する。この変異部位は、プロモーターの最下流部位から数えて、その上流の１７４１番目、即ち、−１７４１位である。本明細書では、この変異遺伝子を「ＭＫＰマイナス１７４１（即ち、ＭＫＰ−１７４１）」と記す。
【００１２】
従来では、ＭＫＰ−１７４１の部位の塩基は、アデニン（以下Ａまたはａと記す）しか報告されていない（DDBJ/EMBL/GenBank データベース、tissue type-placenta, accession No.D10604, D90540）。今回、発明者篠沢らは、当該対立遺伝子の遺伝子型が何れもＡ、即ち、Ａ／Ａホモ接合体（以下、Ａ／ＡまたはＡ／Ａ型とも記す）である場合と、何れかの対立遺伝子の遺伝子型がグアニン（以下、Ｇまたはｇと記す）、即ち、Ａ／Ｇヘテロ接合体（以下、Ａ／ＧまたはＡ／Ｇ型とも記す）である場合と、何れの対立遺伝子の遺伝子型もＧ、即ち、Ｇ／Ｇホモ接合体（以下、Ｇ／ＧまたはＧ／Ｇ型とも記す）である場合とを発見した。
【００１３】
両親のＭＫＰ−１７４１の遺伝子型が、父母共に、Ａ／ＡまたはＧ／Ｇの場合、Ａ／Ｇの場合に比較して、子の出生および／または成人化が生じにくいと考えられる。
【００１４】
このような変異は、子の出生および／または成人化の可能性を予測するための遺伝子マーカーとして使用することが可能である。そのような遺伝子マーカーも本発明の範囲内である。
【００１５】
２．用語
ここで使用される「出生および／または成人化予測関連遺伝子」とは、両親間での子の出生および／または成人化の可能性を左右する遺伝子である。即ち、当該遺伝子の遺伝子型によって、両親間に子が出生される可能性および／またはその出生された子が成人まで成長する可能性が左右される遺伝子である。ここで使用する「遺伝子型」の語は注目している遺伝子座の対立遺伝子の存在状態を示す。本発明においては、上述の通り、ＭＫＰ−１７４１が本発明に従う出生および／または成人化予測関連遺伝子である変異、即ち、多型である。
【００１６】
ここで使用される「多型」および「多型遺伝子」の語は、１つの遺伝子座を占める複数種の対立遺伝子群、またはこのような対立遺伝子群に属する個々の対立遺伝子を指称するものとする。ＭＫＰ−１７４１は一塩基置換であるので、一般的にはＳＮＰ（Single Nucleotide Polymorphism）とも称される変異である。
【００１７】
ここで使用される「出生および成人化の可能性を予測する」の語は、対象である両親間に子が出生される可能性および／またはその出生された子が成人まで成長する可能性の程度を示す。従って、出生および／または成人化の可能性が高い場合は、対象となる両親の間に子が出生し易く、および／またはその出生された子が成人まで成長し易い。
【００１８】
３．出生および／または成人化の可能性を予測する方法
本発明に従えば、上述の知見を利用することによって出生および／または成人化の可能性を予測することが可能である。そのような出生および／または成人化を予測する方法は、本発明の範囲内である。
【００１９】
本発明において使用され得る当該多型の遺伝子型を決定する手段は、それ自身公知の何れの手段を用いておこなってよい。例えば、対象となる個体より得たサンプルから目的のポリヌクレオチドを含む核酸を調製して、遺伝子型を決定すればよい。
【００２０】
本発明の方法の対象となる「個体」は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、及びサルを含む任意の哺乳動物であり得るが、ヒト、特に日本人が最も好適な個体である。
【００２１】
ここで使用される「サンプル」とは、生物個体から採取した血液、血清、リンパ液、組織、毛髪、爪および耳垢などの生物試料をいう。また、「サンプル」は必要に応じて、生物試料をホモジネートおよび抽出などの必要な任意の前処理を行って得た試料であってもよい。このような前処理は、対象となる生物試料に応じて当業者によって選択され得るであろう。また、ここで使用される「ポリヌクレオチドサンプル」とは、サンプルより調製されたポリヌクレオチドであればよい。ここで、本明細書において使用する「ポリヌクレオチド」の語は、便宜的にポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドなどを総括した意味で用いる。
【００２２】
例えば、サンプルから調製されるポリヌクレオチドは、サンプルに含まれるＤＮＡから調製すればよい。例えば、対象からのゲノムＤＮＡをポリヌクレオチドサンプルとして用いる場合には、対象から得た末梢血中の白血球、単球、リンパ球および顆粒球などの血球細胞から、フェノールクロロホルム法、塩析法または市販のキットなどを用いてポリヌクレオチドを抽出すればよく、それ以外の手段であっても、一般的にポリヌクレオチドを抽出するために使用される何れの手段も用いることが可能である。
【００２３】
得られたポリヌクレオチドの量が少ないときには、必要に応じてポリヌクレオチドを増幅する操作を行ってもよい。増幅操作は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ等の酵素を用いたポリメラーゼ連鎖反応（以下PCRと略記する）によって行ってもよい。
【００２４】
必要に応じて、抽出操作及び／又は増幅操作を行った後に、ポリヌクレオチドサンプルについてＭＫＰ−１７４１の遺伝子型を決定する。
【００２５】
遺伝子型を決定する手段は、クローニングを行った後にシーケンシングを行ってもよく、直接シークエンス法、ＳＳＣＰ法、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法および特異的プライマー法などの一般的に使用される何れの手段を使用してもよい。更なる遺伝子型を決定する方法としては、制限酵素を使用して行うＰＣＲ−ＲＦＬＰ法（制限酵素断片長多型法）、ＰＣＲ−ＳＳＰ(PCR-specific sequence primers)法、ドットプロット法とＰＣＲを組み合わせたPCR-SSO（PCR-sequence specific oligonucleotide）法、及びＰＣＲ−ＳＳＣＰ法など、その他周知の方法を使用することができる。しかしながらこれらに限定されるものではない。
【００２６】
上記のような方法によって、ＭＫＰ−１７４１の遺伝子型を決定し、その結果を基に出生および／または成人化の可能性を予測することができる。
【００２７】
また当該ＭＫＰ−１７４１の遺伝子型を決定すると共に、他のそれ自身公知の他の出生および／または成人化予測関連遺伝子の遺伝子型を決定し、その結果から総合的に出生および／または成人化の可能性を予測する方法も本発明の範囲内である。その場合、決定されたそれらの遺伝子型を基に、例えば、それらの遺伝子型と出生および／または成人化の可能性の程度を対応付けた情報を示すテーブルを検索し、対応する出生および／または成人化の可能性の程度を抽出し、それによって出生および／または成人化の可能性を予測すればよい。
【００２８】
上述したように、ＭＫＰ−１７４１の遺伝子型によって出生および／または成人化の可能性の大きさは左右される。即ち、ＭＫＰ−１７４１の遺伝子型を用いれば、出生および／または成人化の可能性を高い確率で予測することが可能である。しかしながら、出生および／または成人化の可能性は、ＭＫＰ−１７４１の遺伝子型に唯一関連するものではなく、他の遺伝的要因や種々の環境的要因との複合的要因によってその発症が左右されることも考えられる。従って、本発明に従う当該出生および／または成人化予測関連遺伝子であるＭＫＰ−１７４１に関する情報の他に、他の遺伝的要因、例えば、他の出生および／または成人化予測関連遺伝子に関する情報や、環境的要因、例えば、加齢、食物の摂取傾向および嗜好品などの情報を加味して予測を行ってもよい。その場合も同様にそれらの因子と出生および／または出生成人化の可能性の程度を対応付けた情報を示すテーブルを使用すればよい。そのような予測方法も本発明の範囲内に含まれる。
【００２９】
更に、上述した本発明に従う方法は、所望に応じて本願発明の範囲を逸脱しない範囲において変更することが可能である。
【００３０】
【実施例】
１．ＭＫ遺伝子の多型の解析
（１）対象
対象は、健常者６０例と癌患者１８３例である。健常者群は、群馬大学職員および大学生から構成される２０歳以上の男女各３０人からなる。また、癌患者群は、群馬大学付属病院で治療を受けた、または受けている癌患者（大腸癌７７例、胃癌３７例、肺癌３２例および乳癌３７例）からなる。これらの対象は全て日本人であり、両親より子として出生され、且つ２０歳以上の成人化が達成された個体として採用した。
【００３１】
（２）ゲノムＤＮＡの抽出
先ず、夫々の群の個体から採取したサンプルからゲノムＤＮＡを抽出した。
【００３２】
健常者からはサンプルとして血液を採取して使用した。ゲノムＤＮＡは、採取した末梢血から、ＱＩＡａｍｐ・ブラッド・キット(登録商標、QIAamp Blood kit, Qiagen,Hilden,Germany)を使用し、使用マニュアルに従って精製した。
【００３３】
癌患者の場合、群馬大学付属病院において実施された外科的手術により、前記癌患者から切除された腫瘍組織をサンプルとして使用した。また、腫瘍組織は、腫瘍全体から見て中心部分に相当する部分であり、且つ明らかに腫瘍と判定された部分および腫瘍周辺で明らかに腫瘍でないと判定された部分を使用した。採取した組織サンプルは、切除後直ちに液体窒素中で凍結し、−８０℃で保存した。凍結保存しておいた組織を、ドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳと記す）、プロテナーゼＫ（和光純薬社製）で処理した後、フェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行うことによってＤＮＡを抽出した。
【００３４】
（３）ＭＫ遺伝子のＰＣＲ増幅
前記（２）で抽出したゲノムＤＮＡのそれぞれを、配列番号１および２に示すポリヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲによる増幅は、以下の方法で行った。前記（２）で得た５００ｎｇの精製ゲノムＤＮＡを、５０ｐモルの上流下流それぞれのＰＣＲプライマー、０．２ｍＭそれぞれのｄＮＴＰ、１０％ジメチルスルホキシド（DMSO、和光純薬社製）、１．０ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（サワデイ社製）を含む最終容量１００μｌ反応液（10mM Tris-HCl、50mM KCl、1.5mM MgCl2、pH8.8、25℃）の中で行った。ＰＣＲ反応はＤＮＡサーマルサイクラー（Progene、Techne社製、英国）において、９６℃３分のＤＮＡ変性後、９６℃１分、６０℃５０秒、７２℃１分、伸長反応７２℃５分の５０サイクルで行った。
【００３５】
（４）ＤＮＡ塩基配列解析
得られたＰＣＲ産物は、３３３塩基対断片（以下、ｂｐと記す）であることをアガロースゲル電気泳動で確認した。次にこの産物をＱｉａｇｅｎＰＣＲ精製キット（Qiagen、ドイツ）で精製した。ＤＮＡ塩基配列の決定は２００ｎｇの精製ＰＣＲ産物を２．４ｐモルの蛍光プライマー（TGGAGAACCGGCAGCACTAC）を用いて島津製作所製のＤＮＡシーケンサー(DSQ1000型)により行った。
【００３６】
２．結果
前記１の（４）のシーケンシングの結果を表１に示す。
【００３７】
【表１】
2007000001.tif 000002
【００３８】
対象におけるＭＫＰ−１７４１の遺伝子型、即ち、Ａ／Ａ、Ａ／ＧおよびＧ／Ｇの分布とその割合（％）を示した。括弧内は、各群の総数を１００としたときの各遺伝子型の割合（％）である。
【００３９】
何れの群においてもＭＫＰ−１７４１の遺伝子型がＡ／Ｇである場合が最も多かった。また、メンデルの法則に従って考えると遺伝子型の分布は、Ａ／Ａ：Ａ／Ｇ：Ｇ／Ｇは１：２：１となることが妥当であると考えられる。しかしながら、上述のような試験により明らかになった通り、当該多型の遺伝子型の分布は極端に偏っている。従って、両親のＭＫＰ−１７４１の遺伝子型が、父母共に、Ａ／ＡまたはＧ／Ｇの場合には、Ａ／Ｇの場合に比較して子の出生および／または成人化が生じにくいことが示唆された。更に、Ａ／Ｇの人が大多数であることを考えると、両親共にＡ／Ｇの場合の確率が高い。このような、両親ともにＡ／Ｇの場合でも、Ａ／ＡまたはＧ／Ｇとしての子の出生および／または成人化が生じにくいことが示唆された。
【００４０】
【発明の効果】
上述のような本発明により、ＭＫ遺伝子プロモーター領域におけるＭＫ発現量の調節部位の変異とその変異部位の遺伝子型から両親間での子の出生および／または成人化の可能性を予測する方法が提供された。
【００４１】
【配列表】
2007000001.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトミッドカイン遺伝子プロモーター領域を模式的に示す図。
【図１】
2007000001.tif 000004