(57)【要約】【課題】  簡便な技術で実施することができ、経済的にも有利に、培養胚または卵子に対して安全で、且つ個体毎の胚群の識別が容易な培養方法を提供すること。【解決手段】  複数個体の哺乳動物由来の卵子及び／又は胚を同一培養液中で培養する方法において、卵子及び／又は胚をアルギン酸カルシウムに由来個体別に包埋し、さらに必要に応じて識別体を当該アルギン酸カルシウムに導入することを特徴とする哺乳動物の卵子及び／又は胚の個体識別培養方法、卵子及び／又は胚並びに必要に応じて導入する識別体がアルギン酸カルシウムに包埋されてなるアルギン酸カルシウム包埋体、並びに、卵子及び／又は胚並びに必要に応じて導入する識別体を、アルギン酸ナトリウム溶液と共に、塩化カルシウム溶液に加えることを特徴とする上記アルギン酸カルシウム包埋体の調製方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数個体の哺乳動物由来の卵子及び／又は胚を同一培養液中で培養する方法において、卵子及び／又は胚をアルギン酸カルシウムに由来個体別に包埋し、さらに必要に応じて識別体を当該アルギン酸カルシウムに導入することを特徴とする哺乳動物の卵子及び／又は胚の個体識別培養方法。
【請求項２】
培養５日目以降は卵子及び／又は胚、さらに必要に応じて識別体を導入したアルギン酸カルシウム包埋体を個体別の培養液中で培養する請求項１記載の方法。
【請求項３】
識別体が、ガラスビーズである請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
卵子及び／又は胚並びに必要に応じて導入する識別体がアルギン酸カルシウムに包埋されてなるアルギン酸カルシウム包埋体。
【請求項５】
識別体が、ガラスビーズである請求項４記載のアルギン酸カルシウム包埋体。
【請求項６】
卵子及び／又は胚並びに必要に応じて導入する識別体を、アルギン酸ナトリウム溶液と共に、塩化カルシウム溶液に加えることを特徴とする請求項４又は５記載のアルギン酸カルシウム包埋体の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物の卵子及び／又は胚の培養方法に関し、詳しくは複数個体の哺乳動物由来の卵子及び／又は胚を同一培養液中で培養する方法において、卵子及び／又は胚をアルギン酸カルシウムに由来個体別に包埋し、さらに必要に応じて識別体を当該アルギン酸カルシウムに導入することを特徴とする哺乳動物の卵子及び／又は胚の個体識別培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の卵子及び／又は胚を培養する方法において、例えばウシ生体卵子吸引（OPU）のように、個体別に卵子採取、体外培養する場合、採取卵子数によって培養成績が左右され、少数の場合は胚発生率が低くなる。そのため、胚移植に供する胚盤胞期胚の確保数が少なくなる傾向がある。
そこで、個々の胚をプールすることにより胚盤胞の発生率は改善されるが、この方法は個体毎の胚識別の問題があった。そのため、胚の簡易な個体識別培養方法の開発が望まれていた。
【０００３】
胚の多数培養と少数培養の成績の違いは、胚から分泌する培養液中の胚発育促進因子濃度の影響が大きいと言われている。そのため、少数の場合は培養に用いる培養液量を少なくすることで、胚１個あたりの胚発育促進因子濃度を多数培養時と同等となるように培養する方法（非特許文献１参照）が採られていた（図１参照）。
また、近年では培養するシャーレ底面に裁縫針等で複数の極小の窪みを作製し、複数の個体の胚をその中に入れ、前者と同様に胚１個あたりの胚発育促進因子濃度を相対的に高めて、多数培養時と同等となるような培養方法（非特許文献２参照）が研究されている（図２参照）。
【０００４】
【非特許文献１】ウシ体外受精における培養液量と培養卵数が胚盤胞発生率に及ぼす影響、平成８年３月  第91回日本畜産学会大会講演要旨p222、小林修司ら
【非特許文献２】Vajta G et al., Molecular Reproduction and Development  Volume 55, Issue 3 , Pages 256  264  Published Online: 2 Feb 2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、前者の方法では、10個程度の培養胚数であれば適用可能であるが、1-5個程度の少数の場合は、胚発育促進因子を有効利用出来ず、培養成績の改善には至らない。
一方、後者の方法では、1-5個の少数でも多数の胚と共に培養することで培養成績は改善される。しかし、窪みから胚が移動して、他の個体の胚と区別がつかなくなることが生じる場合があるため、普及には至っていない。また、窪みではなくプラスチックシャーレ底面の形状を利用して、仕切を設けて培養する方法が研究されたが、この方法も、胚の移動の問題やシャーレのコスト面などから普及には至ってはいない。
【０００６】
本発明の目的は、簡便な技術で実施することができ、経済的にも有利に、培養胚または卵子に対して安全で、且つ個体毎の胚群の識別が容易な培養方法を提供することである。
そこで、本発明者らは、この目的を達成すべく検討を重ね、その過程で個体毎の胚群を高い物質透過性を有する透明なゲル状のアルギン酸カルシウムで包埋し、さらにガラスビーズ等の識別体を、それぞれの包埋体に異数導入することで個体の識別を図った（図３参照）ところ、哺乳動物の卵子及び／又は胚の個体を識別できる培養が可能であることを見出し、本発明に至った。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
請求項１記載の本発明は、複数個体の哺乳動物由来の卵子及び／又は胚を同一培養液中で培養する方法において、卵子及び／又は胚をアルギン酸カルシウムに由来個体別に包埋し、さらに必要に応じて識別体を当該アルギン酸カルシウムに導入することを特徴とする哺乳動物の卵子及び／又は胚の個体識別培養方法である。
請求項２記載の本発明は、培養５日目以降は卵子及び／又は胚、さらに必要に応じて識別体を導入したアルギン酸カルシウム包埋体を個体別の培養液中で培養する請求項１記載の方法である。
請求項３記載の本発明は、識別体が、ガラスビーズである請求項１又は２記載の方法である。
請求項４記載の本発明は、卵子及び／又は胚並びに必要に応じて導入する識別体がアルギン酸カルシウムに包埋されてなるアルギン酸カルシウム包埋体である。
請求項５記載の本発明は、識別体が、ガラスビーズである請求項４記載のアルギン酸カルシウム包埋体である。
請求項６記載の本発明は、卵子及び／又は胚並びに必要に応じて導入する識別体を、アルギン酸ナトリウム溶液と共に、塩化カルシウム溶液に加えることを特徴とする請求項４又は５記載のアルギン酸カルシウム包埋体の調製方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の個体識別培養方法によれば、１個体の採取卵子数が少なくても、複数個体の哺乳動物由来の胚（体外受精後の卵子）を同一培養液中に培養することにより、多数培養と同等の培養成績が得られる。また、目印としてガラスビーズ等の識別体を併用することにより、個体の識別も容易である。
【０００９】
前述のOPU等では家畜のコンディションや術者の技術により、採取卵子数にバラツキが見られ、少数の場合が多い。その際、本発明の個体識別培養方法により、育種改良に有効である胚移植に供する胚盤胞期胚の確保が効率的に行われる。
【００１０】
体外受精技術およびOPU技術は日本において広く普及しており、少数培養の成績改善についてはその需要が多い。本発明の技術移転は、胚の取扱の経験者であれば半日の講習で習得可能であり、材料となるアルギン酸ナトリウムも安値でコストパフォーマンスに優れている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明について詳しく説明する。
本発明の方法において培養する卵子及び／又は胚は、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ラット、ハムスター、マウスなどの哺乳動物のものであればよく、特にウシ由来のものが好適である。また、これらの卵子及び／又は胚は、哺乳動物の生体あるいは死後数時間以内の死体から採取された受精卵、あるいは、これらの動物体から採取された未受精卵を定法により体外受精させたものを用いることができる。
【００１２】
本発明の方法では、同一個体から得た卵子及び／又は胚群並びに必要に応じて導入する識別体を同一のアルギン酸カルシウムに包埋することにより、個体識別を行いながら、複数個体由来の卵子及び／又は胚を同一培養液中で培養することを可能とした。
アルギン酸は、Ｄ−マンヌロン酸およびＬ−グルロン酸により構成される直鎖状の糖質高分子であり、極めて親水性が高く、人体に無害であることが知られている。また、アルギン酸は中性、酸性下では水に不溶であるが、アルカリ金属と塩を形成する条件下では粘性の高い水溶液となり、多価金属とキレート性の塩を形成することによりゲル化する性質を持つ。アルギン酸カルシウムゲルは透明で物質透過性が高く、固定化酵母、人工イクラ、人工種子などに利用されている。
【００１３】
本発明の方法では、受精後０〜７２時間の哺乳動物の同一個体由来の卵子及び／又は胚（並びに識別体）を、アルギン酸ナトリウム溶液と共に塩化カルシウム溶液に加えることによって、アルギン酸カルシウム包埋体を調製する。
このとき、アルギン酸ナトリウム溶液と胚（卵子）（および識別体）を塩化カルシウム溶液に加えるための操作は特に限定されないが、たとえばパスツールピペットやキャピラリーピペットなどにより静かに吹き出すことにより行うことができる（図４参照）。また、このとき吹き出すアルギン酸ナトリウム溶液の量は、包埋する胚（卵子）や用いる識別体の数などによって適宜調整することができる。なお、この操作は、加温盤などを用いて液温を３７〜３８℃程度に保ちながら行う。
【００１４】
本発明において用いるアルギン酸としては、特に制限なく用いることができるが、たとえばナカライテスク株式会社製、No.31130-95  500g入り（形状：粉末、粘度：300cps（1％水溶液）、重合度：約450）などが挙げられる。
ここで、アルギン酸ナトリウムの溶液中における濃度は１〜２％（ｗ／ｖ）、好ましくは１％（ｗ／ｖ）、塩化カルシウムの溶液中における濃度は0.1〜0.2％（ｗ／ｖ）、好ましくは0.1％（ｗ／ｖ）とすることができる。
また、アルギン酸ナトリウム溶液に用いる溶媒は、アルギン酸ナトリウムの溶解を妨げないものであればよく、たとえばリンゲル液、修正ダルベッコリン酸緩衝液（カルシウムイオン不含のものが望ましい）、生理食塩水などを用いることが出来る。
塩化カルシウム溶液に用いる溶媒は、アルギン酸カルシウムゲルの形成並びに卵子及び／又は胚の培養を妨げないものであればよく、たとえばリンゲル液、生理食塩水、TCM-199培地（Morgan, J.F., Morton, H.J. and Parker, R.C. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1950; 73, 1）、CR1aa培地（Rosenkrans CFJ, Zeng GQ, MCNamara GT, Schoff PK, First NL. Biol Reprod 1993; 49: 459-462）等を用いることが出来る。中でも、リンゲル液、特に乳酸リンゲル液が好適であり、三鷹製薬（株）（商品名：ミタカ）などから市販されている。
【００１５】
上記の如く調製された本発明のアルギン酸カルシウム包埋体は、卵子及び／又は胚の発生を妨げない程度に軟らかく、また、パスツールピペット等による取扱いが可能であり、胚（卵子）および識別体の包埋を維持しうる程度の硬度と安定性を備えている。
【００１６】
本発明の方法において、１つのアルギン酸カルシウム包埋体に包埋できる卵子及び／又は胚の数は１〜20個であり、好ましくは１〜10個である。１包埋体中の卵子及び／又は胚の数が上限を超えると、ピペットによる包埋体の操作が困難（やり難い）になるため好ましくない。
また、本発明の方法により同一培養液中で培養できる卵子及び／又は胚の数は10〜50個であり、好ましくは10〜20個、さらに好ましくは20個である。培養液中の卵子及び／又は胚の数が上限を超えると、培養液としての許容量を超え、発育が低下する恐れがあるため好ましくない。また、下限値に満たないと、胚発育因子の濃度が低くなるため培養成績が十分に改善されない。
なお、同一培養液中の包埋体の数は胚の培養成績に影響を与えないことから、特に制限はない。
【００１７】
本発明の方法では、卵子及び／又は胚の個体識別のため、必要に応じて識別体をアルギン酸カルシウムに導入する。
この識別体は、胚の培養成績に悪影響を及ぼすものでなければ、その素材および形状は特に限定されないが、パスツールピペット等により胚と同様に扱うことができる程度の密度や大きさのものが好ましい。具体的には、ガラスビーズ、プラスチックビーズなどが挙げられ、中でも、ガラスビーズ（たとえばTOSHINRIKO製  No.0.10、直径0.105〜0.125ｍｍ）が好適であり、卵子及び／又は胚との識別は極めて容易である。識別体の大きさは、通常は卵子及び／又は胚の大きさと同等もしくは近似する大きさのものが好適に用いられ、具体的には直径50〜150μｍ程度のものが適当である。なお、これらの識別体は、高圧蒸気滅菌法などの定法により滅菌してから用いるのが好ましい。
本発明においては、アルギン酸カルシウムに導入する識別体の数や大きさ、形状、色等を個体毎に変えることにより、胚（卵子）群の個体識別を行う。たとえば、識別体の数により個体識別を行う方法としては、４個体から得られた卵子及び／又は胚を同一培養液中で培養する場合は、各包埋体に０〜３個の識別体を導入すればよい。
【００１８】
次に、本発明の方法においては、複数の上記アルギン酸カルシウム包埋体中に包埋されている卵子及び／又は胚を、同一培養液中で同時に培養する。培養方法としては、一般的な卵子及び／又は胚の培養方法を採用することができ、たとえばペトリ皿上に培養液小滴（例えば50〜200μl）を作製し、ミネラルオイルまたは流動パラフィンで覆い被せるマイクロドロップレット法（図５参照）などが挙げられる。
【００１９】
培養液としては、通常用いられる発生培養液を用いることができ、培養する卵子及び／又は胚の種類などに応じて適宜選択すればよい。
たとえばウシ体外受精胚の場合は、５％子牛血清添加CR1aa培地（Rosenkrans CFJ, Zeng GQ, MCNamara GT, Schoff PK, First NL. Biol Reprod 1993; 49: 459-462）、修正合成卵管液（m-SOF  Takahashi Y, First NL. Theriogenology. 1992; 37: 963-978）、TCM-199培地（Morgan, J.F., Morton, H.J., Parker, R.C. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1950; 73, 1）などが挙げられる。
また、ブタ体外受精胚の場合は、NCSU-23培地（Reed, M. L., Illera, M, and Petters, R. M. Theriogenology 1992; 37:95-109）、PZM培地(Yoshioka K, Suzuki C, Tanaka A, Anas IM, Iwamura S. Biol Reprod 2002; 66(1):112-9)などが挙げられる。
ヒツジ体外受精胚の場合は、Eagle’s MEM培地（Wright, R. N., Jr., Anderson, G. B., Cupps, P. T., Drost, M., Bradford, G. E.  J. Anim. Sci 1976; 42, 912）などが挙げられる。
【００２０】
ウサギ体外受精胚の場合は、Ham’s F10培地（Ham, R. G. Exp. Cell Res. 1963; 29, 515-526）、Eagle’s MEM培地（Wright, R. N., Jr., Anderson, G. B., Cupps, P. T., Drost, M., Bradford, G. E. J. Anim. Sci 1976; 42, 912.）、RPMI1640培地（Moore, J. J., Gerner, R.E., Franklin, H.A. J.Am. Med. Assoc 1967; 199, 519）などが挙げられる。
ラット体外受精胚の場合は、m-KRB培地（Toyoda, Y., Chang, M.C. J.Reprod. Fert 1974; 36:9-22）、HECM-1培地（Schini, S.A. and Bavister, B.D. Biol. Reprod 1998; 39:1183-1192）、TMM培地（Horiuchi, T. et al. 日本不妊学会誌  1983, 28:319）などが挙げられる。
ハムスター体外受精胚の場合は、Eagle’s MEM培地（Wright, R. N., Jr., Anderson, G. B., Cupps, P. T., Drost, M., Bradford, G. E. J. Anim. Sci 1976; 42, 912）などが挙げられる。
マウス体外受精胚の場合は、YH培地（Toyoda, Y., Yokoyama, M. and Hoshi, T. Jpn. J. Anim. Reprod 1971; 16:147-157）、HTF培地（Tervit, H. R., Whittingham, D. G. and Rowson, L. E. A.  J. Reprod. Fertil 1972; 30:493-497）、CZB培地（Chatot, C.L., Ziomek, C. A. and Barister, B. D. J. Reprod Fertil 1989; 86:679-688）などが挙げられる。
【００２１】
また、培養条件は、胚（卵子）の培養において通常採用されている条件でよく、胚（卵子）や培養液の種類に応じて適宜設定することができる。たとえば、ウシ体外受精胚を５％子牛血清添加CR1aa培地で培養する場合は、３８℃、５％CO2、湿度飽和条件下で培養すればよい。また、培養液の交換は２日ごとに行うのが望ましい。
【００２２】
なお、上記の培養方法で培養した胚（卵子）は、５日齢以降に１個培養に移行させても、多数培養と同等の培養成績が得られることが明らかとなった。
したがって、上記アルギン酸カルシウム包埋体は、培養５日目以降は個体別の培養液中で培養することができる。このように個体別培養に移行させることによって、胚（卵子）が拡張に伴って包埋体から脱出し、胚（卵子）群の個体識別ができなくなるのを防ぐことができる。
このようにして卵子及び／又は胚の培養を継続することにより、受精後７〜９日程度で胚盤胞が高い発生率で形成される。
【００２３】
上記の本発明の方法と通常の培養方法（包埋なし）とで同数の胚（卵子）を培養した際には、包埋の有無によって培養成績に差は認められず、胚に対する包埋の毒性は無いと考えられた。
さらに、図３のように、胚（卵子）を５個ずつ包埋させた４個体の包埋体を同一培養液で培養した場合と、包埋なしで20個の胚（卵子）を培養した場合では、胚盤胞の発生率に差が認められず、採取卵子数が少数（この場合は５個）でも、多数培養（20個）と同等の培養成績が得られた。
【実施例】
【００２４】
以下に実施例等を挙げて本発明を具体的に説明する。
【００２５】
（試験例１）アルギン酸カルシウム包埋がウシ胚の培養成績に及ぼす影響
アルギン酸カルシウムに包埋することによる胚の体外培養成績への影響の有無を検証するため、以下のように試験を行った。
【００２６】
まず、屠畜された雌牛（黒毛和種およびホルスタイン種）から卵子を採取し、同品種の雄牛の精子を用いて体外受精を行った。ここで、体外受精は、カフェイン-ヘパリン法により行った。また、卵子を採取後、精子と受精させる前に用いる成熟培地TCM199は、Medium 199 Earle's（Gibco社）を用い、体外受精時に用いる培養液は、BO液（Brackett, B. G. & Oliphant, G., Biology and Reproduction 1975; 12: 260-274）を用いた。
【００２７】
次に、下記の組成の乳酸リンゲル液（商品名：ミタカ、三鷹製薬（株）製）に、アルギン酸ナトリウム（ナカライテスク株式会社、No.31130-95、500g入り、形状：粉末、粘度：300cps（1％水溶液）、重合度：約450）を添加して１％アルギン酸ナトリウム加リンゲル溶液を調製した。次いで、上記で得られた受精後のウシ胚を、内径２００〜３００マイクロメートルに加工したパスツールピペットを用いて吸引し、１％アルギン酸ナトリウム加リンゲル溶液に導入することにより胚を洗浄した。
【００２８】
リンゲル液の組成（100ml中）
塩化ナトリウム  600mg
塩化カリウム     30mg
塩化カルシウム   20mg
乳酸ナトリウム  310mg
【００２９】
その後、洗浄した胚20個を１％アルギン酸ナトリウム加リンゲル溶液と共にパスツールピペットで吸引し、リンゲル溶液に塩化カルシウムを添加した０．１％塩化カルシウム加リンゲル溶液中に静かに吹き出した。胚と共に吹き出した１％アルギン酸ナトリウム加リンゲル溶液は、０．１％塩化カルシウム加リンゲル溶液中でアルギン酸カルシウムゲルに変化し、20個の胚を包み込むアルギン酸カルシウム包埋体を得た。
【００３０】
得られたアルギン酸カルシウム包埋体を、パスツールピペット（内径を包埋体に合わせて加工したもの）を用いて50μlの５％子牛血清添加CR1aa培地（Rosenkrans CFJ, Zeng GQ, MCNamara GT, Schoff PK, First NL. Biol Reprod 1993; 49: 459-462）中に移動させ、マイクロドロップレット法により培養を継続した。
なお、上記の各工程における培養は、全てCO2制御インキュベータ−を用いて３８℃、５％CO2、湿度飽和条件下で行った。また、上記のいずれの操作も、加温盤を用いて培養液を３７〜３８℃に保温しながら行った。
一方、対照として、上記のようにして得た20個のウシ体外受精胚を、アルギン酸カルシウムに包埋せずに５％子牛血清添加CR1aa培地中で上記と同様に培養した。
【００３１】
各試験区について、培養２日目に卵割数、７〜９日目に胚盤胞数を観察した。結果を表１に示す。
その結果、アルギン酸カルシウム包埋体区および対照区における卵割率および胚盤胞発生率の間に有意差は見られなかった。このことから、胚に対するアルギン酸カルシウム包埋体の毒性はないと考えられる。
【００３２】
【表１】
2007075053.tif 000002
【００３３】
（実施例１）ウシ胚の個体識別培養
４頭のウシから５個ずつ得られたウシ胚（卵子）を、本発明の個体識別培養方法によって同一培養液中で培養し、その効果を以下のようにして検証した。
まず、試験例１と同様の方法でウシ体外受精胚を作製し、同一個体由来の胚５個をパスツールピペットを用いて１％アルギン酸ナトリウム加リンゲル溶液に導入し、洗浄した。また、個体識別用の目印として、高圧蒸気滅菌法（120℃、20分間）で滅菌したガラスビーズ（商品No.0.10、直径0.105〜0.125mm、TOSHINRIKO製）も、１％アルギン酸ナトリウム加リンゲル溶液に導入した。
次いで、５個の胚およびガラスビーズを、１％アルギン酸ナトリウム加リンゲル溶液と共にパスツールピペットを用いて吸引し、０．１％塩化カルシウム加リンゲル溶液中に静かに吹き出した。このとき、吹き出した１％アルギン酸ナトリウム加リンゲル溶液の量は５〜10μｌ程度であった。このようにして、同一個体由来の胚５個とガラスビーズを包み込んだアルギン酸カルシウム包埋体を調製した。なお、ガラスビーズの数は、同時に培養する各包埋体で異なる任意の数（０〜３個）とした。
【００３４】
同様の操作を繰り返し、４頭のウシ由来の４個のアルギン酸カルシウム包埋体を調製し、これらをパスツールピペット（内径を包埋体に合わせて加工したもの）を用いて50μlの５％子牛血清添加CR1aa培地中に移動させ、マイクロドロップレット法により同一培養液中で培養を継続した（アルギン酸カルシウム包埋体区）。
なお、上記の各工程における培養は、全てCO2制御インキュベータ−を用いて３８℃、５％CO2、湿度飽和条件下で行った。また、上記のいずれの操作も、加温盤を用いて培養液を３７〜３８℃に保温しながら行った。
一方、対照として、試験例１と同様にして得た１９〜２１個のウシ体外受精胚を、アルギン酸カルシウムに包埋せずに同一培養液（５％子牛血清添加CR1aa培地）中で上記と同様に培養した。
【００３５】
各試験区について、培養２日目に卵割数、７〜９日目に胚盤胞数を観察した。結果を表２に示す。
その結果、アルギン酸カルシウム包埋体区および対照区における卵割率および胚盤胞発生率の間に有意差は見られなかった（試験例１の結果と同様）。このことから、採取卵子数が少数（この場合は５個）でも、本発明の個体識別培養方法を適用することにより、多数培養法（約２０個）と同等の培養成績が得られることが明らかになった。
【００３６】
【表２】
2007075053.tif 000003
【００３７】
（試験例２）５日齢からの個別培養がその後の発生に及ぼす影響
多数培養を行った胚（卵子）を５日齢から１個培養に移行させた場合に、その後の胚発生に及ぼす影響を調べるため、以下のような試験を行った。
すなわち、試験例１と同様にして得られたウシ体外受精胚２０−２５個を、マイクロドロップレット法により100μｌの５％子牛血清添加CR1aa培地で５日間培養した。その後、各胚をパスツールピペットを用いて25μｌの５％子牛血清添加CR1aa培地に移し、１個培養を継続した。
なお、上記の培養は全てCO2制御インキュベータ−を用いて３８℃、５％CO2、湿度飽和条件下で行った。
一方、対照区においては、上記と同様の条件により継続して２０−２５個で培養した。
【００３８】
各試験区について、培養２日目に卵割数、7-9日目に胚盤胞数を観察した。結果を表３に示す。
その結果、１個培養区および対照区における卵割率および胚盤胞発生率の間に有意差は見られなかった。このことから、本発明の方法において、５日齢以降にアルギン酸カルシウム包埋体を個別培養に移行させても、胚発生成績には影響しないことが明らかになった。
【００３９】
【表３】
2007075053.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明によれば、簡便に実施することができ、経済的にも有利で、培養胚（卵子）に対し安全で、かつ、個体毎の胚群の識別が容易な培養方法が提供される。したがって、本発明は畜産業に貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】従来の胚の少数培養法を示す。
【図２】従来の複数個体由来の少数胚を同一培養液中で培養する方法を示す。
【図３】本発明の個体識別培養方法を示す。
【図４】本発明におけるアルギン酸カルシウム包埋体の調製方法を示す。
【図５】マイクロドロップレット法を示す。
【図１】
2007075053.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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