(57)【要約】      （修正有）【課題】高感度でバラツキもなく、安定した測定が可能で、かつ操作性の優れた標識、及びそれを用いた標識化方法、並びに分析方法を提供する。【解決手段】化学物質に結合したオリゴヌクレオチドを標識として使用し、当該オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼを使用して核酸を切断する、より詳細にはフラップエンドヌクレアーゼを使用して核酸を切断する、詳細にはインベーダー法により検出、同定又は定量する。標識としてのオリゴヌクレオチドが結合した化学物質（以下、標識化化学物質という）を標的分子を含有するか、又は含有している可能性のある試料に接触させ、当該標識化化学物質と試料中の標的分子との複合体を形成させ、当該複合体におけるオリゴヌクレオチドをインベーダー法により測定することからなる、試料中の標的分子を検出、同定又は定量する方法、標識化学物質、及び標識用オリゴヌクレオチド、並びにそのための測定用キット。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学物質に結合したオリゴヌクレオチドを標識として使用し、当該オリゴヌクレオチドを利用してヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法により、試料中の標的分子を検出、同定又は定量する方法。
【請求項２】
標識としてのオリゴヌクレオチドが結合した化学物質（以下、標識化化学物質という。）を、試料中に標的分子を含有するか、又は含有している可能性のある試料に接触させ、当該標識化化学物質と試料中の標的分子との複合体を形成させ、当該複合体におけるオリゴヌクレオチドをヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法により測定することからなる、請求項１に記載の試料中の標的分子を検出、同定又は定量する方法。
【請求項３】
試料中の標的分子を検出、同定又は定量する方法において、標識としてオリゴヌクレオチドを使用し、当該オリゴヌクレオチドの存在をヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法により測定するからなる、請求項１又は２に記載の試料中の標的分子を検出、同定又は定量する方法。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドが、１本鎖のＤＮＡである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドが、１０〜１０００ｍｅｒのＤＮＡである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドが、１０〜１００ｍｅｒのＤＮＡである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドが、１０〜６０ｍｅｒのＤＮＡである請求項５に記載の方法。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドが、１０〜４０ｍｅｒのＤＮＡである請求項５に記載の方法。
【請求項９】
化学物質が、タンパク質、ビオチン、アビジン、又は核酸である請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
化学物質が、ビオチンである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
標識のオリゴヌクレオチドが、化学物質に直接結合している請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ヌクレアーゼにより切断される核酸が、標識のオリゴヌクレオチドである請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ヌクレアーゼにより切断される核酸が、標識のオリゴヌクレオチドに基づいて生成された核酸である請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ヌクレアーゼにより切断される核酸が、発光物質及び消光物質が結合した核酸である請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
発光物質が、希土類蛍光錯体ラベル剤を有するものである請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
希土類蛍光錯体ラベル剤が、Ｅｕ錯体、Ｔｂ錯体、Ｓｍ錯体、又はＤｙ錯体からなるラベル剤である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ヌクレアーゼが、フラップエンドヌクレアーゼである請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法が、インベーダー法である請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
標識のオリゴヌクレオチドが、インベーダー法におけるターゲットＤＮＡである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ターゲットＤＮＡが、シグナルプローブがハイブリダイズし得る塩基配列を１カ所又は２カ所以上有するものである請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
シグナルプローブが、２個のフラップを生成し得る塩基配列を有するものである請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
シグナルプローブが、隣接するシグナルプローブのインベーダーオリゴとして機能し得る塩基配列を有するものである請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２３】
試料中の標的分子を検出、同定又は定量する方法が、イムノアッセイである請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
イムノアッセイが、サンドイッチアッセイである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
試料中の標的分子を検出、同定又は定量する方法が、結合アッセイである請求項１〜２２に記載の方法。
【請求項２６】
標識としてのオリゴヌクレオチドが結合した化学物質が、ビオチン化ＤＮＡである請求項２３〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
１０〜１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドからなる化学物質の標識剤。
【請求項２８】
オリゴヌクレオチドが、１０〜６０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである請求項２７に記載の標識剤。
【請求項２９】
オリゴヌクレオチドが、１０〜４０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである請求項２７に記載の標識剤。
【請求項３０】
オリゴヌクレオチドが、１本鎖のＤＮＡである請求項２７〜２９のいずれかに記載の標識剤。
【請求項３１】
請求項２７〜２９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの塩基配列を２回以上繰り返して有していることを特徴とするオリゴヌクレオチドからなる化学物質の標識剤。
【請求項３２】
塩基配列の繰り返しが２回から１０回である請求項３１に記載の標識剤。
【請求項３３】
１０〜１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの標識としての使用。
【請求項３４】
オリゴヌクレオチドが、１０〜６０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
オリゴヌクレオチドが、１０〜４０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである請求項３３に記載の使用。
【請求項３６】
オリゴヌクレオチドが、１本鎖のＤＮＡである請求項３３〜３５のいずれかに記載の使用。
【請求項３７】
請求項３３〜３５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの塩基配列を２回以上繰り返して有していることを特徴とするオリゴヌクレオチドの標識としての使用。
【請求項３８】
塩基配列の繰り返しが２回から１０回である請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
１０〜１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが標識として化学物質に結合している標識化された化学物質。
【請求項４０】
オリゴヌクレオチドが、１０〜６０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである請求項３９に記載の標識化された化学物質。
【請求項４１】
オリゴヌクレオチドが、１０〜４０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである請求項３９に記載の標識化された化学物質。
【請求項４２】
オリゴヌクレオチドが、１本鎖のＤＮＡである請求項３９〜４１のいずれかに記載の標識化された化学物質。
【請求項４３】
請求項３９〜４１のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの塩基配列を２回以上繰り返して有していることを特徴とするオリゴヌクレオチドが標識として化学物質に結合している標識化された化学物質。
【請求項４４】
塩基配列の繰り返しが２回から１０回である請求項４３に記載の標識化された化学物質。
【請求項４５】
化学物質が、ビオチンである請求項３９〜４４のいずれかに記載の標識化された化学物質。
【請求項４６】
１０〜１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが標識として化学物質に結合している標識化された化学物質を少なくとも１種含有してなる、オリゴヌクレオチドを標識として使用するヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法による測定用キット。
【請求項４７】
オリゴヌクレオチドが、１０〜６０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである請求項４６に記載の測定用キット。
【請求項４８】
オリゴヌクレオチドが、１０〜４０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである請求項４６に記載の測定用キット。
【請求項４９】
オリゴヌクレオチドが、１本鎖のＤＮＡである請求項４６〜４８のいずれかに記載の測定用キット。
【請求項５０】
１０〜１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの塩基配列を２回以上繰り返して有していることを特徴とするオリゴヌクレオチドが標識として化学物質に結合している標識化された化学物質を少なくとも１種含有してなる、オリゴヌクレオチドを標識として使用するヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法による測定用キット。
【請求項５１】
塩基配列の繰り返しが２回から１０回である請求項５０に記載の測定用キット。
【請求項５２】
オリゴヌクレオチドを標識として使用するヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法が、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法である請求項４６〜５１のいずれかに記載の測定用キット。
【請求項５３】
標識化された化学物質が、ビオチンである請求項４６〜５２のいずれかに記載の測定用キット。
【請求項５４】
インベーダー法におけるシグナルプローブ（primary probe）、インベーダーオリゴ（secondary probe）、ターゲットＤＮＡ、及びフレットプローブからなる群から選ばれるオリゴヌクレオチドの少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを含有してなる、オリゴヌクレオチドを標識として使用するインベーダー法による測定用キット。
【請求項５５】
標識化された化学物質が、ビオチンである請求項５４に記載の測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な標識としてのオリゴヌクレオチドを用いた測定方法、標識化学物質、及び標識用オリゴヌクレオチド、並びにそのための測定用キットに関する。より詳細には、本発明は、化学物質に結合したオリゴヌクレオチドを標識として使用し、当該オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法、より詳細にはフラップエンドヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法、さらに詳細にはインベーダー法により検出、同定又は定量する方法に関する。さらに詳細には、本発明は、標識としてのオリゴヌクレオチドが結合した化学物質（以下、標識化化学物質という。）を標的分子を含有するか、又は含有している可能性のある試料に接触させ、当該標識化化学物質と試料中の標的分子との複合体を形成させ、当該複合体におけるオリゴヌクレオチドをインベーダー法により測定することからなる、試料中の標的分子を検出、同定又は定量する方法、標識化学物質、及び標識用オリゴヌクレオチド、並びにそのための測定用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの化学物質が個体の活動や維持に関わっており、特に生物体においてはタンパク質を多くの化学物質が生命の成長や維持や活動に関わっている。これらの化学物質の物理的又は化学的な挙動が少しづつではあるが解明されてきている。とりわけ、抗原と抗体や、リガンドと受容体のような特異的な相互関連性の解明が行われてきており、健康の維持だけでなく、病気の診断や治療のためにこれらの特異的な相互関連性が注目されてきている。
とりわけ、抗原抗体反応は、対応する抗原と抗体のみが選択的に反応する極めて特異性の高い反応であるだけでなく、生体内で生ずる抗原抗体反応をそのまま試験管内で再現することができることから、病気の診断や治療に広く利用されてきている。
しかしながら、化学物質の挙動、特に生命体内における化学物質の挙動を直接検出することは不可能であり、これらの化学物質の挙動を観察するための標識化が行われてきた。
【０００３】
標識化は、標的となる化学物質を検出、同定又は定量化するなどの各種の当該化学物質に関する情報を得るために、当該化学物質の一部を改変して測定可能な目印をつけることである。標識化した化学物質の生化学分野における最初の例は、１９０４年のノープ（F.Knoop）の実験であると言われている。これは、脂肪酸の末端のメチル基をフェニル基に代えた脂肪酸をウサギに投与し、尿中のフェニル酢酸などを分析して、脂肪酸の生体内におけるβ酸化説を提唱したものである。
現在では、標識として重水素、１３Ｃや１４Ｃ、３２Ｐなどの同位元素、特に放射性同位元素が使用されている。放射性同位体は化学物質の化学的な特性を大きく変えることなく、化学物質を追跡することが可能であり、また検出も容易であるが、放射性であることが大きな問題となっている。
同位体の標識のほかに、官能基を導入する標識化も行われている。官能基としては、紫外や可視部に吸収を有する基や、蛍光性の基などが使用されている。しかし、これらの官能基は化学物質の物理的又は化学的特性を変化させたり、また非生物系のものが多く、生体内への適用には問題が生じている。
このように標識は化学物質の各種の挙動を測定するために極めて重要であり、多種多様な標識が開発されてきている。例えば、抗原抗体反応を利用したイムノアッセイでは、放射性同位元素を用いたラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素を用いたエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、蛍光物質を用いた蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）などの標識化イムノアッセイが一般化してきている。
【０００４】
近年になって、標識としてＤＮＡなどの核酸を用いる方法も開発され、当該ＤＮＡをＰＣＲ法により増幅して感度を上げることを試みたものである。この方法は、元々はＤＮＡの５’末端側に抗体を結合させてＤＮＡを検出するために使用されていた抗体結合型ＤＮＡ（特許文献１参照）を、イムノアッセイに適用したものであり、抗体にＤＮＡを結合させこれをＰＣＲ法により増幅させて、当該抗体の検出感度の上昇試みたものである（特許文献２、及び非特許文献１参照）。この方法は、現在ではイムノ−ＰＣＲ法としてイムノアッセイの分野で使用されてきている（特許文献３及び４参照）。
イムノ−ＰＣＲ法は原理的には無限に増幅可能であり、感度的には有利な方法ではあるが、操作が煩雑であり、また定量化が困難であり、測定値のバラツキが大きく、従来からのＥＬＩＳＡ法に比べても実用性が十分なものではない。
【０００５】
一方、ヒトゲノムの解析に伴い、遺伝子多型が注目され、ＲＦＬＰ（制限酵素切断断片長多型）法、ダイレクトシークエンス法、ＡＳＯ（Allele Specific Oligonucleotide）ハイブリダイゼーション法、ＲＮａｓｅＡ切断法、ＤＯＬ（Dye-labeled Oligonucleotide Ligation）法、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法（Matrix Assisted Laser Desorption-time of Flight/Mass Spectrometry）法、ＤＮＡチップ法、インベーダー法などの各種の方法が開発されてきたが、これらの方法の多くはＰＣＲ法による増幅を必要とするものであった。この中で、インベーダー法は、被検体ＤＮＡは勿論のこと、シグナルプローブもインベーダーオリゴにも標識化は必要でなく、標識化を必要とするものはフレットプローブのみである。そして、当該フレットプローブは、フラップ部分の塩基配列だけと関わり、とりわけフラップ部分の塩基とも無関係であり、被検体ＤＮＡの塩基配列に全く影響されず、被検体と関係無く任意に決定できるフラップ部分の塩基に基づくものであることから、大量生産ができ、プローブ作製コストを大幅に減少することができるという利点があった。
【０００６】
【特許文献１】特開平３−２３１１５１号公報
【特許文献２】米国特許第５，６６５，５３９号明細書
【特許文献３】特表平８−５０２４１３号公報
【特許文献４】特開２００３−５０４０７３号公報
【非特許文献１】Lab. Clin. Pract.，20: 110-114; 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、より高感度で、測定のバラツキもなく、安定した測定が可能で、かつ操作性の優れた標識、及びそれを用いた標識化方法、並びに、分析方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、遺伝子多型の検出法であるインベーダー法の高感度化の開発を行ってきたが、このインベーダー法を応用することにより各種の物質の標識化ができることを見出した。インベーダー法は、ゲノム中の１塩基多型を検出するために開発された方法であり、もっぱら被検体ＤＮＡ中の１塩基の多型をインベーダーオリゴにより検出するものであり、その概要を説明しておく。インベーダー法は、ＳＮＰタイピング法の１種として広く知られている方法であり、例えば、中村祐輔編集「ＳＮＰ遺伝子多型の戦略」（株式会社中山書店、２０００年）にも、その方法の詳細が記載されている。図１にインベーダー法による核酸１塩基多型解析法の概略を模式図として示す。
この方法は、被検体ＤＮＡ（target DNA）の中に図１に示されるように「Ｎ」の位置でＳＮＰになっている塩基が存在していることを判定する方法である。このためにシグナルプローブ（primary probe）とインベーダープローブ（secondary probe）、及び検出用のフレットプローブ（FRET probe）（蛍光共鳴エネルギー移動プローブ（ＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）プローブ））を用いる。シグナルプローブは被検体ＤＮＡのＳＮＰの位置から５’側において相補的な塩基配列を有し、さらに「フラップ（flap）」と呼ばれる塩基配列部分を有している。このフラップの部分の塩基配列は、フレットプローブの３’側の塩基配列と相補的な塩基配列となっている。また、インベーダーオリゴは被検体ＤＮＡの３’側において相補的な塩基配列を有するものである。ＳＮＰの位置（図１中の「Ｎ」で示されている位置。）における被検体ＤＮＡの塩基「Ｎ」は１塩基多型部位の塩基、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのひとつであり、シグナルプローブの塩基「Ｎ１」はＮと正常な塩基対を形成できる塩基であり、そして、インベーダ ープローブの塩基「Ｎ２」は任意な塩基である。フレットプローブは、３’側にフラップ部分が結合するための１本鎖部分を有するプローブであり、フレットプローブの５’側はその全部又は一部が２本鎖を形成するようになっている。図１では５’側の全部が２本鎖を形成するように示されているが必ずしも全部が２本鎖になる必要はないが、ここでは説明のために図１に従って説明する。そして、フレットプローブの５’側の末端部分には発光色素「Ｌｎ」及び消光物質「Ｑ」が結合されている。消光物質「Ｑ」が発光色素「Ｌｎ」の一定の距離内に存在しているときは、発光色素の発光が消光され、発光を観察することはできない。
【０００９】
インベーダー法では、まず、被検体ＤＮＡにシグナルプローブ及びインベーダーオリゴが結合するが、この際にシグナルプローブの塩基「Ｎ１」と被検体ＤＮＡの塩基「Ｎ」との塩基対の間にインベーダーオリゴの塩基「Ｎ２」がインベーダー（侵入者）のように割り込んでくるようになる。このような状態を示しているのが図１の最上段に示している状態である。このような３塩基がからんでいる状態に特異的に作用する解裂酵素（structure-specific 5' nuclease）を作用させると、この解裂酵素はシグナルプローブを塩基「Ｎ１」の位置で切断して、フラップ部分のみの断片を形成させる。そして、このフラップ部分はフレットプローブの３’側に結合する。この状態を示しているのが、図１の中段である。このとき、フラップ部分の塩基「Ｎ１」を含む先端部分が、フレットプローブの２本鎖の部分に割り込むような状態になる。この状態は先程のインベーダーの状態と同様であり、解裂酵素による特異的な切断位置になる。そして、当該解裂酵素によりフレットプローブの５’末端側がフラップ部分に割り込まれた部分から切断される。切断されたフレットプローブの５’側には、発光色素「Ｌｎ」が結合されており、この切断により発光色素「Ｌｎ」は消光物質「Ｑ」から離れることになり、その結果発光色素「Ｌｎ」の発光を観察することができるようになる。このような状態を示しているのが図１の最下段に示している状態である。発光色素「Ｌｎ」は消光物質「Ｑ」から開放され、本来の発光を示すことになる。シグナルプローブの塩基「Ｎ１」が被検体ＤＮＡの塩基「Ｎ」と正常な塩基対を形成することができない場合には、インベーダーのような状態にならないので、解裂酵素による切断は起こらない。したがって、被検体ＤＮＡの塩基「Ｎ」がシグナルプローブの塩基「Ｎ１」と正常な塩基対を形成することができる塩基であるか否かを発光により判定することができることになる。
本発明におけるインベーダー法は、従来のインベーダー法とは異なり、被検体ＤＮＡの１塩基多型（ＳＮＰ）を検出することを目的とするものではないので、以下の説明では、ここで使用した「被検体ＤＮＡ」の代わりに「ターゲットＤＮＡ」という用語を使用する。
【００１０】
このように、従来のインベーダー法は、被検体としてゲノムＤＮＡを使用するものであり、当該ゲノムＤＮＡ中の１塩基多型を検出するものであったが、当該被検体として抗体や抗原などの化学物質に結合させたＤＮＡなどの核酸（オリゴヌクレオチド）を用いることにより、煩雑なＰＣＲ法を行うことなく高感度で当該核酸を検出・同定することができ、化学物質の標識化合物として利用することができることを見出した。
【００１１】
即ち、本発明は、オリゴヌクレオチドを化学物質の標識として使用することを第一の特徴とし、さらに当該オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法、好ましくはインベーダー法により検出、同定又は定量することを第二の特徴とするものである。
本発明の第一の特徴点は、ＰＣＲ法を適用することができない程度の短いオリゴヌクレオチドを標識として使用することである。イムノ−ＰＣＲに関する米国特許第５６６５５３９号では、２．６７ｋｂのＤＮＡを標識として、約３０ｍｅｒのプライマーを使用して２６１ｂｐのフラグメントを増幅しているが、本発明のオリゴヌクレオチドは、インベーダー法におけるシグナルプローブ（primary probe）として使用する場合には、約１０〜１００ｍｅｒ、好ましくは約２０〜６０ｍｅｒ程度で十分であり、従来のイムノ−ＰＣＲ法における標識としてのオリゴヌクレオチドとは、その長さにおいて明確に区別できるものである。当該オリゴヌクレオチドは、前記の説明におけるインベーダー法のシグナルプローブ（primary probe）、インベーダーオリゴ（secondary probe）、又はターゲットＤＮＡのいずれのものとしてもよいが、好ましくは当該オリゴヌクレオチドは前記したインベーダー法におけるターゲットＤＮＡ又はシグナルプローブ（primary probe）として使用されるものである。
また、本発明の第二の特徴点は、当該オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法、好ましくはフラップエンドヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法、より好ましくはインベーダー法により検出、同定又は定量することである。本発明の方法におけるヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法をインベーダー法を例として説明すれば、方法としては従来のインベーダー法と方法としては同様であるが、従来のインベーダー法のように被検体ＤＮＡ（target DNA）における１塩基の相補性を検出するためのものではなく、標識としてのオリゴヌクレオチドの存在又は非存在、さらにその存在量を検定する方法である点において相違するものである。
本発明のこれらの２つの特徴点のいずれか又は両方を備えたものであれば、その手段の如何を問わず本発明の範囲に包含されるものである。
【００１２】
本発明をより具体的に説明する。
本発明は、化学物質に結合したオリゴヌクレオチドを標識として使用し、当該オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法により、より詳細にはフラップエンドヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法により、さらに詳細には当該オリゴヌクレオチド中の１塩基の存在をインベーダー法により検出、同定又は定量する方法に関する。より詳細には、本発明は、標識としてのオリゴヌクレオチドが結合した化学物質（以下、標識化化学物質という。）を標的分子を含有するか、又は含有している可能性のある試料に接触させ、当該標識化化学物質と試料中の標的分子との複合体を形成させ、当該複合体におけるオリゴヌクレオチドをヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法により、より詳細にはフラップエンドヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法により、さらに詳細には、当該オリゴヌクレオチド中の１塩基の存在をインベーダー法により測定することからなる、試料中の標的分子を検出、同定又は定量する方法に関する。
また、本発明は、イムノアッセイにおいて、標識としてオリゴヌクレオチドを使用し、当該オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法により、より詳細にはフラップエンドヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法により、さらに詳細には、当該オリゴヌクレオチド中の１塩基の存在をインベーダー法により検出、同定又は定量する方法に関する。即ち、本発明は、イムノアッセイにおける新規な標識の使用、及びその解析方法を提供するものである。
さらに、本発明は、結合アッセイや競合アッセイなどの各種の標的分子をアッセイ（分析）する方法において、標識としてオリゴヌクレオチドを使用し、当該オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法により、より詳細にはフラップエンドヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法により、さらに詳細には、当該オリゴヌクレオチド中の１塩基の存在をインベーダー法により検出、同定又は定量することからなる標的分子をアッセイ（分析）する方法に関する。即ち、本発明は、各種のアッセイにおける新規な標識の使用、及びその解析方法を提供するものである。
【００１３】
また、本発明は、１０〜１００ｍｅｒ、好ましくは１０〜６０ｍｅｒ、１０〜４０ｍｅｒ、より好ましくは２０〜６０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドからなる化学物質の標識剤に関する、及び１０〜１００ｍｅｒ、好ましくは１０〜６０ｍｅｒ、１０〜４０ｍｅｒ、より好ましくは２０〜６０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの標識としての使用（use）に関する。さらに、オリゴヌクレオチドをインベーダー法におけるターゲットＤＮＡとして使用する場合には、この整数倍の長さを有するものを使用することができる。
さらに、本発明は、１０〜１００ｍｅｒ、好ましくは１０〜６０ｍｅｒ、１０〜４０ｍｅｒ、より好ましくは２０〜６０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが標識として化学物質に結合している標識化された化学物質に関する。
また、本発明は、１０〜１００ｍｅｒ、好ましくは１０〜６０ｍｅｒ、１０〜４０ｍｅｒ、より好ましくは２０〜６０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが標識として化学物質に結合している標識化された化学物質を少なくとも１種含有してなる、オリゴヌクレオチドを標識として使用するヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法、好ましくはフラップエンドヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法、より好ましくはインベーダー法による測定用キットに関する。
さらに、本発明は、インベーダー法におけるシグナルプローブ（primary probe）、インベーダーオリゴ（secondary probe）、ターゲットＤＮＡ、及びフレットプローブからなる群から選ばれるオリゴヌクレオチドの少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを含有してなる、オリゴヌクレオチドを標識として使用するインベーダー法による測定用キットに関する。
【００１４】
本発明の態様をより詳細に説明すれば、以下のとおりとなる。
（１）
化学物質に結合したオリゴヌクレオチドを標識として使用し、当該オリゴヌクレオチドを利用してヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法により、試料中の標的分子を検出、同定又は定量する方法。
（２）
標識としてのオリゴヌクレオチドが結合した化学物質（以下、標識化化学物質という。）を、試料中に標的分子を含有するか、又は含有している可能性のある試料に接触させ、当該標識化化学物質と試料中の標的分子との複合体を形成させ、当該複合体におけるオリゴヌクレオチドをヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法により測定することからなる、前記（１）に記載の試料中の標的分子を検出、同定又は定量する方法。
（３）
試料中の標的分子を検出、同定又は定量する方法において、標識としてオリゴヌクレオチドを使用し、当該オリゴヌクレオチドの存在をヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法により測定するからなる、前記（１）又は（２）に記載の試料中の標的分子を検出、同定又は定量する方法。
（４）
オリゴヌクレオチドが、１本鎖のＤＮＡである前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）
オリゴヌクレオチドが、１０〜１０００ｍｅｒのＤＮＡである前記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）
オリゴヌクレオチドが、１０〜１００ｍｅｒのＤＮＡである前記（５）に記載の方法。
（７）
オリゴヌクレオチドが、１０〜６０ｍｅｒのＤＮＡである前記（５）に記載の方法。
（８）
オリゴヌクレオチドが、１０〜４０ｍｅｒのＤＮＡである前記（５）に記載の方法。
（９）
化学物質が、タンパク質、ビオチン、アビジン、又は核酸である前記（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）
化学物質が、ビオチンである前記（９）に記載の方法。
（１１）
標識のオリゴヌクレオチドが、化学物質に直接結合している前記（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
【００１５】
（１２）
ヌクレアーゼにより切断される核酸が、標識のオリゴヌクレオチドである前記（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）
ヌクレアーゼにより切断される核酸が、標識のオリゴヌクレオチドに基づいて生成された核酸である前記（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１４）
ヌクレアーゼにより切断される核酸が、発光物質及び消光物質が結合した核酸である前記（１）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）
発光物質が、希土類蛍光錯体ラベル剤を有するものである前記（１４）に記載の方法。
（１６）
希土類蛍光錯体ラベル剤が、Ｅｕ錯体、Ｔｂ錯体、Ｓｍ錯体、又はＤｙ錯体からなるラベル剤である前記（１５）に記載の方法。
（１７）
ヌクレアーゼが、フラップエンドヌクレアーゼである前記（１）〜（１６）のいずれかに記載の方法。
（１８）
ヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法が、インベーダー法である前記（１）〜（１７）のいずれかに記載の方法。
（１９）
標識のオリゴヌクレオチドが、インベーダー法におけるターゲットＤＮＡである前記（１８）に記載の方法。
（２０）
ターゲットＤＮＡが、シグナルプローブがハイブリダイズし得る塩基配列を１カ所又は２カ所以上有するものである前記（１９）に記載の方法。
（２１）
シグナルプローブが、２個のフラップを生成し得る塩基配列を有するものである前記（１９）又は（２０）に記載の方法。
（２２）
シグナルプローブが、隣接するシグナルプローブのインベーダーオリゴとして機能し得る塩基配列を有するものである前記（１９）又は（２０）に記載の方法。
（２３）
試料中の標的分子を検出、同定又は定量する方法が、イムノアッセイである前記（１）〜（２２）のいずれかに記載の方法。
（２４）
イムノアッセイが、サンドイッチアッセイである前記（２３）に記載の方法。
（２５）
試料中の標的分子を検出、同定又は定量する方法が、結合アッセイである前記（１）〜（２２）に記載の方法。
（２６）
標識としてのオリゴヌクレオチドが結合した化学物質が、ビオチン化ＤＮＡである前記（２３）〜（２５）のいずれかに記載の方法。
【００１６】
（２７）
１０〜１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドからなる化学物質の標識剤。
（２８）
オリゴヌクレオチドが、１０〜６０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである前記（２７）に記載の標識剤。
（２９）
オリゴヌクレオチドが、１０〜４０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである前記（２７）に記載の標識剤。
（３０）
オリゴヌクレオチドが、１本鎖のＤＮＡである前記（２７）〜（２９）のいずれかに記載の標識剤。
（３１）
前記（２７）〜（２９）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの塩基配列を２回以上繰り返して有していることを特徴とするオリゴヌクレオチドからなる化学物質の標識剤。
（３２）
塩基配列の繰り返しが２回から１０回である前記（３１）に記載の標識剤。
（３３）
１０〜１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの標識としての使用。
（３４）
オリゴヌクレオチドが、１０〜６０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである前記（３３）に記載の使用。
（３５）
オリゴヌクレオチドが、１０〜４０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである前記（３３）に記載の使用。
（３６）
オリゴヌクレオチドが、１本鎖のＤＮＡである前記（３３）〜（３５）のいずれかに記載の使用。
（３７）
前記（３３）〜（３５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの塩基配列を２回以上繰り返して有していることを特徴とするオリゴヌクレオチドの標識としての使用。
（３８）
塩基配列の繰り返しが２回から１０回である前記（３７）に記載の使用。
（３９）
１０〜１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが標識として化学物質に結合している標識化された化学物質。
（４０）
オリゴヌクレオチドが、１０〜６０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである前記（３９）に記載の標識化された化学物質。
（４１）
オリゴヌクレオチドが、１０〜４０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである前記（３９）に記載の標識化された化学物質。
（４２）
オリゴヌクレオチドが、１本鎖のＤＮＡである前記（３９）〜（４１）のいずれかに記載の標識化された化学物質。
（４３）
前記（３９）〜（４１）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの塩基配列を２回以上繰り返して有していることを特徴とするオリゴヌクレオチドが標識として化学物質に結合している標識化された化学物質。
（４４）
塩基配列の繰り返しが２回から１０回である前記（４３）に記載の標識化された化学物質。
（４５）
化学物質が、ビオチンである前記（３９）〜（４４）のいずれかに記載の標識化された化学物質。
【００１７】
（４６）
１０〜１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが標識として化学物質に結合している標識化された化学物質を少なくとも１種含有してなる、オリゴヌクレオチドを標識として使用するヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法による測定用キット。
（４７）
オリゴヌクレオチドが、１０〜６０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである前記（４６）に記載の測定用キット。
（４８）
オリゴヌクレオチドが、１０〜４０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである前記（４６）に記載の測定用キット。
（４９）
オリゴヌクレオチドが、１本鎖のＤＮＡである前記（４６）〜（４８）のいずれかに記載の測定用キット。
（５０）
１０〜１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの塩基配列を２回以上繰り返して有していることを特徴とするオリゴヌクレオチドが標識として化学物質に結合している標識化された化学物質を少なくとも１種含有してなる、オリゴヌクレオチドを標識として使用するヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法による測定用キット。
（５１）
塩基配列の繰り返しが２回から１０回である前記（５０）に記載の測定用キット。
（５２）
オリゴヌクレオチドを標識として使用するヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法が、前記（１）〜（２６）のいずれかに記載の方法である前記（４６）〜（５１）のいずれかに記載の測定用キット。
（５３）
標識化された化学物質が、ビオチンである前記（４６）〜（５２）のいずれかに記載の測定用キット。
（５４）
インベーダー法におけるシグナルプローブ（primary probe）、インベーダーオリゴ（secondary probe）、ターゲットＤＮＡ、及びフレットプローブからなる群から選ばれるオリゴヌクレオチドの少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを含有してなる、オリゴヌクレオチドを標識として使用するインベーダー法による測定用キット。
（５５）
標識化された化学物質が、ビオチンである前記（５４）に記載の測定用キット。
【００１８】
本発明における「ヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法」（以下では、本発明の「核酸切断法」と言うこともある。）としては、ヌクレアーゼによる核酸、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどを特定の位置で切断することができる方法であればよく、より詳細には、ヌクレアーゼによる核酸の切断により、当該核酸中に結合されている蛍光物質などの発光物質と、当該発光物質による発光を消光する消光物質（クエンチャー）とを分離することができ、当該分離の結果として発光物質による発光を外部から観察又は測定することが可能な方法である。ヌクレアーゼによる核酸の切断により蛍光物質などの発光物質による発光を外部から観察又は測定することが可能な方法における、核酸としては、例えば、インベーダー法によるフレットプローブや、タックマンＰＣＲ法におけるタックマンプローブなどが知られており、このようなプローブを本発明の方法に使用することができるが、本発明の方法はこのようなプローブの使用に限定されるものではない。
本発明のこの方法におけるヌクレアーゼとしては、核酸を切断することができるものであれば特に制限はないが、エンドヌクレアーゼやエキソヌクレアーゼのいずれであってもよく、二本鎖の核酸に作用する酵素であっても、三本鎖に作用する酵素であっても、一本鎖の核酸に作用する酵素であってもよい。また、核酸の高次構造を認識する酵素であってもよい。本発明のこの方法におけるヌクレアーゼは、核酸を切断することができ、その結果として前記した発光物質と消光物質を分離（距離的な隔たりを設けられるようして、発光物質による発光が消光物質により消光されない状態にすること。）することができるものであればよいが、好ましくは本発明の標識として使用されるオリゴヌクレオチドを切断することなく、発光物質と消光物質が結合している核酸を選択的に切断することができるヌクレアーゼが挙げられる。
本発明のこの方法におけるヌクレアーゼとしては、例えば各種の制限酵素を使用することもできる。例えば、タックマンプローブのように両末端の発光物質と消光物質とがそれぞれ結合しているプローブを用いて、その中間部位を制限酵素などで切断することにより、タックマンプローブ中の発光物質と消光物質を分離し、その結果、測定系からの発光を観測することもできる。しかしながら、このような単純な方法では、ひとつの標識としてのオリゴヌクレオチドから、一つの発光物質が放出されるだけであり、十分な感度が得られない場合がある。高速度で高感度な測定を行うためには、本発明の標識として使用されるオリゴヌクレオチドを切断することなく、発光物質と消光物質が結合している核酸を選択的に切断することができる方法が好ましいことになる。このような方法では、一つの標識としてのオリゴヌクレオチドから多数の発光物質の放出が可能となり、高感度な測定が可能となる。
したがって、本発明の「ヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法」の特に好ましい態様としては、インベーダー法のように、一つのターゲットＤＮＡから多数のフラップを生じさせることができる方法が挙げられることになる。このような方法により、高速度で、高感度で、定量的な測定が可能となる。しかも、ＰＣＲ法のような煩雑な操作も必要とせず、ＰＣＲ法のような長い核酸を必要とすることもない。例えば、１０〜１００ｍｅｒ、好ましくは１０〜４０ｍｅｒ、１０〜３０ｍｅｒ程度の比較的短い核酸を標識として使用したとしても、本発明のこの方法によれば、十分な感度を得ることが可能となる。
以下の説明においては、本発明の「ヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法」として、インベーダー法による方法を例として説明するが、本発明の方法は、このような方法に限定されるものではない。
【００１９】
本発明におけるオリゴヌクレオチドとしては、インベーダー法における場合には、シグナルプローブ（primary probe）、インベーダーオリゴ（secondary probe）、又はターゲットＤＮＡのいずれかに使用可能なものであれば、その長さ、塩基配列において特に制限はなく、相補配列においてハイブリダイズが可能であれば、ＤＮＡでもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡが好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドは、インベーダー法におけるターゲットＤＮＡ又はシグナルプローブ（primary probe）が好ましく、ターゲットＤＮＡが特に好ましく、その長さは特に制限はないが、従来のイムノ−ＰＣＲ法に使用される核酸類との区別のためには、１０〜１００ｍｅｒ、好ましくは１０〜６０ｍｅｒ、１０〜４０ｍｅｒ、より好ましくは２０〜４０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが好ましい。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドをインベーダー法におけるターゲットＤＮＡを例にして説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明オリゴヌクレオチドの塩基配列は特に制限はないが、本発明のオリゴヌクレオチドをシグナルプローブとして使用する場合には、フラップ部分が５〜５０ｍｅｒ、好ましくは１０〜４０ｍｅｒ、より好ましくは１０〜２０ｍｅｒ程度となるように設計され、残りの部分がターゲットＤＮＡと相補的な配列となるように設計される。この場合にはインベーダーオリゴ（secondary probe）は、ターゲットＤＮＡの残りの部分と相補的な配列であり、さらにインベーダーとしての１塩基を有するものである。
本発明におけるこのようなシグナルプローブ（primary probe）、インベーダーオリゴ（secondary probe）、ターゲットＤＮＡ、及びフレットプローブの関連性をより具体的な塩基配列をもとにして図２として説明する。この例では、本発明の標識としてのオリゴヌクレオチドは、シグナルプローブ（primary probe）として、ターゲットＤＮＡの５’末端側にハイブリダイズし、フラップ部分がハイブリダイズせずに残される。そして、インベーダーオリゴ（secondary probe）がターゲットＤＮＡの３’側にハイブリダイズし、解裂箇所（Cleavage site）に１塩基が浸入し、解裂され、フラップが生じる。このフラップがフレットプローブにハイブリダイズして、同様に１塩基が浸入して、フレットプローブの標識サイト（この例では、ＢＰＴＡ−Ｔｂ３＋結合サイト）が解裂し、蛍光が観察されることになる。
また、本発明のオリゴヌクレオチドをインベーダー法におけるターゲットＤＮＡとして使用する場合を例にして説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。この場合も本発明オリゴヌクレオチドの塩基配列は特に制限はないが、本発明のオリゴヌクレオチドとしては、１０〜２００ｍｅｒ、好ましくは１０〜６０ｍｅｒ、より好ましくは２０〜６０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、又はこれを同じ配列を有する整数倍、例えば２倍、３倍、さらにそれ以上の長さのオリゴヌクレオチドを使用することもできる。このような場合には、本発明のオリゴヌクレオチドとしては、１０〜１０００ｍｅｒ、好ましくは１０〜５００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを使用することもできる。このような長さのオリゴヌクレオチドは、従来のイムノ−ＰＣＲ法で使用されているオリゴヌクレオチドと同程度の長さになるが、本発明のオリゴヌクレオチドは明確な繰り返しの塩基配列、又はその相補的な配列を有する点において相違するものである。また、さらに長いオリゴヌクレオチド、例えば生体由来の１ｋｂ以上のような長いヌクレオチドを使用することもできる。
【００２０】
本発明におけるターゲットＤＮＡの塩基配列の特徴を挙げれば、次の（１）〜（５）のようになる。
（１）自分自身が構造の一部で二本鎖を形成しない。またターゲットＤＮＡ同士がダイマーを形成しない。ターゲットＤＮＡの内部やターゲットＤＮＡ間に相補的な配列がない。
（２）１０〜１００塩基、好ましくは１０〜４０塩基からなる配列が、０〜５０塩基の適当なスペースを置いて反復した配列を有する。この反復配列の繰り返し数は１〜１０が好ましい。
（３）１ユニットが隣接した２つのブロックの配列からなり、各々の配列が１０〜１００塩基、好ましくは１０〜４０塩基であり、このユニットが０〜５０塩基の適当なスペースを置いて反復した配列を有する。この反復配列の繰り返し数は１〜１０が好ましい。
（４）上記２つのブロックがインベーダーオリゴおよびシグナルプローブとのハイブリダイゼーションし、各領域のＴｍ値がそれぞれ５０〜６５℃程度となるような塩基配列が好ましいが、この範囲に限定されるものではなく、使用する酵素の至適温度にＴｍを合わせることができる。
（５）インベーダーオリゴまたはシグナルプローブが正しくオーバーラップし、三重鎖が形成できる。インベーダーオリゴまたはシグナルプローブがターゲットＤＮＡ上にミスアニーリングしないことが好ましい。
このような特徴を備えていれば、任意の塩基配列を設定することができ、本発明のオリゴヌクレオチドは特定の塩基配列であるものに限定されるものではない。
本発明のオリゴヌクレオチドの塩基配列の例を次ぎに示しておくが、これに限定されるものではない。
ターゲット領域が１カ所の場合では、
（１）5'-AATCAAATCCAGTACCTGTGAATCAGGCT CCGGATTTGCTGAAGTGCAG-3'
インベーダーオリゴ相補領域    シグナルプローブ相補領域
（Ｔｍ：６０℃）              （Ｔｍ：５８℃）
（２）5'-CAAGCAATGGATGATTTGATGCTGTCCC CCGGACGATATTGAACAATGGTTCACTGAA-3'
インベーダーオリゴ相補領域    シグナルプローブ相補領域
（Ｔｍ：６１℃）              （Ｔｍ：６１℃）
（３）5'-GAATCGCACTATTGCCCATGATGACAATCG GTCCAGTAAGCGACTTGCAGGC-3'
インベーダーオリゴ相補領域      シグナルプローブ相補領域
（Ｔｍ：６３℃）              （Ｔｍ：６２℃）
【００２１】
ターゲット領域が２カ所以上ある場合では、
（４）ターゲット単位間のスペースが０ｍｅｒのものの例としては、
5'-GTGTCTGCGGGAGTCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTGGTGTCTGCGGGAGTCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTG-3'   （８６ｍｅｒ）
（５）ターゲット単位間のスペースが５ｍｅｒのものの例としては、
5'-GTGTCTGCGGGAGTCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTGATCGTGTGTCTGCGGGAGTCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTG-3' （９１ｍｅｒ）
（６）ターゲット単位間のスペースが１０ｍｅｒのものの例としては、
5'-GTGTCTGCGGGAGTCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTGATCGTACGATGTGTCTGCGGGAGTCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTG-3' （９６ｍｅｒ）
（７）ターゲット単位間のスペースが３４ｍｅｒのものの例としては、
5'-GTGTCTGCGGGAGTCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTGAATCAAATCCAGTACCTGTGAATCAGGCTCCGGAGTGTCTGCGGGAGTCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTG-3'  (120mer)
などが挙げられる。また、シグナルプローブがインベーダーオリゴの機能を備えているシグナルプローブを使用する場合の例としては、
（８）ターゲット配列に５回の繰り返しを有する例として、
5'-GTGTCTGCGGGAGTGTGTCTGCGGGAGTGTGTCTGCGGGAGTGTGTCTGCGGGAGTGTGTCTGCGGGAGTCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTG-3'  （９９ｍｅｒ）
のものが挙げられる。
【００２２】
エクソヌクレアーゼ（Exonuclease）用のフレットプローブ（FRET probe）の例としては、
5’-（FAM）-ACTCCCGCAGACAC-(Dabcyl)-3’
が挙げられ、これに対応するターゲットＤＮＡの配列の例としては、
5'-GTGTCTGCGGGAGTCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTG-3'
（下線部は、前記のフレットプローブとの相補領域を示している。）
が挙げられる。また、上記の相補配列を２〜５回繰り返したものも使用することができる。
【００２３】
本発明の方法では、ターゲット領域を２カ所以上繰り返して有するオリゴヌクレオチドを使用することができ、このような繰り返しを有するオリゴヌクレオチドを使用することにより、標識としての一つのオリゴヌクレオチドから複数のフラップを短時間で得ることができ、高速度で高感度な測定が可能となる。このような繰り返しを有するオリゴヌクレオチドは、公知の各種の方法により製造することができる。
例えば、６〜１０個の繰り返し配列をもつマルチターゲットＤＮＡの製造方法を具体的に例に基づいて説明する。
まず、以下の（１）〜（３）の３種類のオリゴヌクレオチドを自動合成機により製造する。
（１）５’末端に制限酵素ＮｄｅＩ認識配列、３’末端にＢａｍＨＩ認識配列をもつ。
5'-GGAATTCCATATGGTGTCTGCGGGAGTCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTGATCGTATGCAGTGTCTGCGGGAGTCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTGGGATCCCG-3' （１１７ｍｅｒ）
下線部はインベーダーオリゴおよびシグナルプローブとの相補領域であり、２個の繰り返しを有し、ターゲット間のスペースは１０ｍｅｒである。
（２）５’末端に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列、３’末端にＸｈｏＩ認識配列をもつ。
5'-CGGGATCCGTGTCTGCGGGAGTCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTGATCGTATGCAGTGTCTGCGGGAGTCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTGCTCGAGCGG-3' （１１３ｍｅｒ）
下線部はインベーダーオリゴおよびシグナルプローブとの相補領域であり、２個の繰り返しを有し、ターゲット間のスペースは１０ｍｅｒである。
（３）両’末端にＢａｍＨＩ認識配列をもつ。
5'-CGGGATCCGTGTCTGCGGGAGTCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTGATCGTATGCAGTGTCTGCGGGAGTCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTGGGATCCCG-3' （１１２ｍｅｒ）
下線部はインベーダーオリゴおよびシグナルプローブとの相補領域であり、２個の繰り返しを有し、ターゲット間のスペースは１０ｍｅｒである。
【００２４】
次に前記（１）の合成オリゴヌクレオチド、及び発現ベクターｐＥＴ  ２２ｂ(Merck）を、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ベクター中に合成オリゴヌクレオチド（１）をライゲーションして、合成オリゴヌクレオチド（１）をベクター中に組み込む。合成オリゴヌクレオチド（１）が組み込まれたベクターと合成オリゴヌクレオチド（２）を、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断し、合成オリゴヌクレオチド（２）をライゲーションして、合成オリゴヌクレオチド（２）をベクター中に組み込む。さらに、これを、ＢａｍＨＩで切断し、切断箇所に合成オリゴヌクレオチド（３）をライゲーションして、合成オリゴヌクレオチド（３）をベクター中に組み込む。この操作により、６カ所のターゲット領域を有するオリゴヌクレオチドを製造することができることになるが、合成オリゴヌクレオチド（３）は、両末端の制限酵素サイトが同一のため、複数個が同時に入る可能性があり、ターゲット領域が６カ所以上のオリゴヌクレオチドをこの方法により同時に製造することできる。ダイレクトＰＣＲによる長さから、ベクター内に入ったターゲット配列の繰り返し回数を推定できるので、いくつかのクローンから目的の長さのオリゴヌクレオチドを取得することができる。
そして、ベクター上の配列にプライマーを設計して、ターゲット領域のＰＣＲを行い、続いて、片側のプライマーのみを用いたＰＣＲを行い、１本鎖ＤＮＡとする。このとき、ビオチン標識プライマーを用いれば、ビオチン標識ターゲットができる。
【００２５】
本発明のインベーダー法におけるフレットプローブの発光物質としては、蛍光物質が好ましく、このような蛍光物質としては、例えば、ＦＡＭ（モノ−５（又は６）−カルボキシフルオレセン）のような蛍光染料であってもよいが、検出感度を向上させるためには、フレットプローブにおける発光色素として希土類蛍光錯体ラベル剤、例えば、配位子として次の一般式（１）〜（６）
【００２６】
【化１】
2007020526.tif 000003
【００２７】
【化２】
2007020526.tif 000004
【００２８】
【化３】
2007020526.tif 000005
【００２９】
【化４】
2007020526.tif 000006
【００３０】
【化５】
2007020526.tif 000007
【００３１】
【化６】
2007020526.tif 000008
【００３２】
（式（１）〜（６）中、ｎは１〜４の整数を示し、Ｒは置換基を有するアリール基を示し、Ｒ’はアミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、又はイソチオシアネート基を示す。）で表される配位子のいずれか１種を含有する、サマリウム（Ｓｍ）、ユウロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）、又はジスプロシウム（Ｄｙ）などからなる希土類元素の希土類蛍光錯体ラベル剤が好ましい（特開２００３−３２５２００号及び特願２００５−１０６８６０号参照）。また、フレットプローブにおける消光物質としては、蛍光クエンチャーラベル剤が好ましく、例えば、次の一般式（７）〜（９）
【００３３】
【化７】
2007020526.tif 000009
【００３４】
【化８】
2007020526.tif 000010
【００３５】
【化９】
2007020526.tif 000011
【００３６】
（式（７）〜（９）中、ｍは１〜４の整数を表し、Ｒ１、Ｒ２のいずれか一方は担体又は核酸に固定するためのリンカー基を表し、他方は水素原子又はアルキル基を表し、Ｒ３は担体又は核酸に固定するためのリンカー基を表す。）で表される蛍光クエンチャーラベル剤の使用が好ましい（特開２００３−３２５２００号及び特願２００５−１０６８６０号参照）。ここに、特開２００３−３２５２００号及び特願２００５−１０６８６０号の記載を参照して本明細書に取り込む。
【００３７】
本発明における標識化される化学物質としては、特に制限はなく、標識化が可能な各種の化学物質が包含される。本発明の化学物質としては、例えば、抗原、抗体、ビオチン、アビジンなどのタンパク質、ビタミン、ホルモン、脂質、糖質、糖鎖、芳香族化合物、酵素、アプタマーなどの核酸、低分子リガンドまたはリガンドレセプター（抗体を除く）からなる群などが挙げられる。ここで言う低分子リガンドとは、糖鎖、芳香族化合物、ガングリオシド、オリゴサッカライド、アミノ酸数が２〜１０のペプチドなどの有機化合物等を指し、例えば、ｍｙｃペプチド、サイロキシン、トリヨードサイロニン、ガングリオシドＧＭ２、セロビオース、シアル酸を末端に有する糖鎖などがある。リガンドレセプターとは、細胞あるいは細胞中、または細胞間に存在する特定のリガンドと特異的に結合する物質を指し、例えば、セルロース結合蛋白質、シアル酸結合レクチン、アルブミンレセプターなどがある。低分子リガンドまたはレセプターの例をさらに挙げると、例えば、インシュリン、インシュリンレセプター、ＥＧＦ、ＥＧＦレセプター、ＨＧＦ、ＨＧＦレセプター、ＴＳＨ、ＴＳＨレセプターなどのホルモンまたはホルモンレセプター、ＩＬ−８などのサイトカインあるいはケモカインに対するレセプター、アセチルコリンレセプター、ヒスタミンリセプターなどの低分子リガンドに対するレセプターなどがある。
また、プロテインキナーゼＣ、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ、カルモジュリン依存性リン酸化酵素、チロシンリン酸化酵素などの酵素もリガンド−レセプター反応により測定でき、本発明の化学物質として使用できる。さらに、各種糖鎖、ガングリオシドに対する種々のレクチンも、本発明の化学物質として使用できる。レクチンの例としては、細胞上で種々の蛋白質と結合したＤ−マンノースに対するコンカナバリンＡ、ジ−Ｎ−アセチルキトビオースに対する小麦胚凝集素、シアル酸に対するカブトガニ由来シアル酸結合レクチンなどが挙げられる。
核酸としては、種々のデオキシリボ核酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＵＴＰ）が連続したＤＮＡ、また、種々のリボ核酸（ｒＡＴＰ、ｒＧＴＰ、ｒＴＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＵＴＰ）が連続したＲＮＡ、また、ＰＮＡやＬＮＡ、更にはこれらのキメラ体を本発明の化学物質として使用することができる。本発明の化学物質として核酸を使用する場合には、本発明の標識としてのオリゴヌクレオチドと連続した配列となることがあり、標識化化学物質の全体が核酸となる場合もある。
また、本発明の化学物質は、担体や微粒子などに固定化されているものであってもよい。
【００３８】
本発明における標識としてのオリゴヌクレオチドと化学物質との「結合」としては、化学物質と標識としてのオリゴヌクレオチドが直接的に結合したものであってもよいし、またリンカーのような両者を結合させるための基を介して間接的に結合したものであってもよい。このような「結合」としては、共有結合などの化学結合が好ましいが、これに限定されるものではなく、吸着などの物理的な結合であってもよく、両者が測定系において分離されないものであればよい。
本発明におけるインベーダー法としては、前記で例示してきた基本的な方法に限定されるものではなく、インベーダー塩基の存在によりフラップが生じて、このフラップにより測定可能となる状態を形成することができる方法であればよい。即ち、塩基配列中の１部、好ましくは１塩基部分に３重鎖部分を形成させ、この部分を特異的な解裂酵素（structure-specific 5' nuclease）（以下、具体的な酵素としてＦＥＮと言うこともある。）により解裂させることができ、当該解裂によりフレットプローブが認識できる（部分的にハイブリダイズ可能な）オリゴヌクレオチドを遊離することができる方法を包含している。この方法により、ターゲットＤＮＡなどの標識用のオリゴヌクレオチドと、観測系の対象となるフレットプローブとを全く分離して取り扱うことが可能となり、測定の感度やＳ／Ｎ比などを標識物とは分離して考慮することが可能となる。
本発明における複合体とは、標識としての本発明のオリゴヌクレオチドが結合した化学物質（標識化化学物質）と、化学的又は物理的に結合して一体となる物質であり、例えば、抗原と抗体の結合体、リガンドと受容体との結合体、酵素などのタンパク質の多量体などが例示される。
本発明におけるイムノアッセイとしては、標識を用いる抗原抗体反応に基づく分析方法であれば特に制限はなく、サンドイッチアッセイなどのいずれの方法であってもよい。また、ストレプトアビジン−ビオチン系を使用するものであっても、使用しないものであってもよいが、汎用性をもたせるためにはビオチンに結合したものが好ましい。
また、本発明のアッセイとしては、前記したイムノアッセイに限定されるものではなく、リガンドと受容体などの結合アッセイや競合アッセイなどの各種のアッセイを包含するものである。
したがって、本発明における試料としては、本発明の標識化化学物質と化学的又は物理的に結合して複合体を形成し得る物質が含有されている、又は含有されている可能性があるものは全て包含している。
さらに、本発明の標識は、アッセイに使用されるものに限定されるものではなく、トレーサーとして使用される場合も包含するものである。したがって、本発明の標識化化学物質は、複合体を形成しない場合も包含している。
【００３９】
本発明の方法は、従来の同位体や蛍光物質などの標識を使用する方法において、従来の標識に代えて本発明のオリゴヌクレオチドを使用することにより、従来の方法と同様に使用することができる。これらの具体的な例については、後述する実施例においてより詳細に説明する。
化学物質、例えばビオチンと本発明のオリゴヌクレオチド標識とを結合させる方法としては、従来のＤＮＡの標識化方法のような技術をそのまま使用することができる。特にビオチンと本発明のオリゴヌクレオチドの結合体は、汎用性のある標識試薬として有用であり、従来のアビジン−ビオチン系を使用するアッセイ系と同様に使用することができる。
後述する実施例においては、インベーダー法におけるターゲットＤＮＡを本発明のオリゴヌクレオチドとして使用例を示しているが、本発明の方法はこれに限定されるものではなく、シグナルプローブを本発明のオリゴヌクレオチドとして使用することも可能であり、またインベーダーオリゴを標識として使用することも可能である。
【００４０】
また、インベーダーオリゴによる３重鎖部分がＦＥＮにより切断され、フラップが生じることになるのであるが、このような３重鎖部分を１カ所だけでなく２カ所以上設けるように設計することもできる。例えば、基本的なインベーダー法では図３に示されるように、１カ所がＦＥＮにより切断され、１個のフラップが生じる。図３においては、ターゲットＤＮＡとシグナルプローブとの相補的な配列部分であるＮ１から３’末端までがターゲットＤＮＡとハイブリダイズし、さらに、インベーダーオリゴとターゲットＤＮＡとの相補的な配列部分である５’末端からＮ２の手前の塩基までが、ターゲットＤＮＡとハイブリダイズする。そして、インベーダーオリゴの末端の塩基Ｎ２が３重鎖部分を形成し、この結果、本発明の１個のオリゴヌクレオチドからＦＥＮにより１個のフラップが生じる（図３の下側を参照）。このような使用方法においては、原理的には、１つの標識オリゴヌクレオチドから１個のフラップが生じることになる。
より具体的には、例えば、ターゲットＤＮＡとして、
5'-GTGTCTGCGGGAG-T-CGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTG-3'
を用い、シグナルプローブとして、
5'-AACGAGGCGCAC-ACTCCCGCAGACAC-3'
を用い、インベーダーオリゴとして、
5'-CAAAGAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG-C-3'
を用いることにより、フラップ（下線部分）を生じさせることができる。
１つの標識オリゴヌクレオチドからさらに多数のフラップを生じさせることが可能である。例えば、標識オリゴヌクレオチドをＰＣＲ法などにより増幅することも不可能ではないが、操作として煩雑になるだけでなく、ＰＣＲ法による増幅に定量性が担保されない場合には、定量化が困難となる。さらに、ＰＣＲ法により増幅する場合には、最低１００ｂｐ程度の長さが必要であり、より長いオリゴヌクレオチドを標識として用いなければならないという問題が生じる。
【００４１】
１つの標識オリゴヌクレオチドから多数のフラップを生じさせるもっと簡便な方法としては、２つのフラップが生じるシグナルプローブを使用する方法が挙げられる。例えば、図４に示すように、１つのシグナルプローブとターゲットＤＮＡから、シグナルプローブの５’側フラップを切断するための解裂酵素としてＦＥＮを、３’フラップを切断するための解裂酵素としてＨｅｆ（Helicase-associated Endonuclease for Fork-structured DNA, Pyrococcus furiosus由来（Komori et al. (2002) Genes Genet. Syst. 77:227-241））を用いることにより、２つのフラップを生じさせることができる。このためには、ターゲットＤＮＡとして、例えば、
5'-GTTTCTTTTCGACGCACTACTACTT-TGAGGGCGTCTGTG-TTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTG-3'
を用い、シグナルプローブとして、
5'-AACGAGGCGCAC-ACTCCCGCAGACAC-AACGAGGCGCAC-3'
を用いることにより、２個のフラップ（下線部分）を生じさせることができる。即ち、１個の標識オリゴヌクレオチドから、２倍の標識化物を得ることができようになり、標識の感度が増加することになる。
【００４２】
前記した方法では、３’フラップを切断するための解裂酵素としてＨｅｆを用いた方法であるが、単純に２個以上のシグナルプローブが結合するようにすることもできる。例えば、図５に示されるように、ターゲットＤＮＡを複数のシグナルプローブが結合できるように、シグナルプローブの結合部位が複数個繰り返す様に設計することもできる。これは前記した１個のフラップを生じさせる従来にインベーダー法の単純な繰り返しである。この方法では、標識として使用されるオリゴヌクレオチドの長さは、その繰り返しの数だけ長くなるが、５’側フラップを切断するための解裂酵素としてＦＥＮだけを用いて１度に多数のフラップを得ることが可能となり、標識としての感度を飛躍的に高くすることも可能となる。
同様に、前記した５’側フラップを切断するための解裂酵素としてＦＥＮを、３’フラップを切断するための解裂酵素としてＨｅｆを用いて、２つのフラップを同時に生じさせる方法を、繰り返して使用できるように、本発明のオリゴヌクレオチドを設計することができる。例えば、前記した図４の方法を単純に繰り返して、図６に示すように設計することもできる。
【００４３】
さらに、図５に示される単純な繰り返し方法においては、繰り返しの数だけのインベーダーオリゴが必要になるが、当該インベーダーオリゴを、省略することも可能である。例えば、シグナルプローブと相補的な配列を繰り返して合成したオリゴヌクレオチドをターゲットＤＮＡとして用いており、そこにはシグナルプローブが結合する部位とインベーダーオリゴが結合する部位が設けられている（図５参照）が、このとき、シグナルプローブの３’末端側にさらに１塩基を付加し、この部分が隣り合う相補配列と３重鎖を形成するようにする。即ち、シグナルプローブの結合部位をそのままインベーダーオリゴの結合部位として使用する。このようすを概念的に図７に示す。この手法ではインベーダーオリゴを用いず、シグナルプローブのターゲットＤＮＡとの結合部分がインベーダーオリゴの役割も果たすことになる。例えば、ターゲットＤＮＡとして、
5'-(GTGTCTGCGGGAGT)×n-CGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTG-3'
（ｎは２以上の整数を示す。）
を用い、シグナルプローブとして、
5'-AACGAGGCGCAC-ACTCCCGCAGACAC-C-3'
を用いることにより、シグナルプローブを隣接するシグナルプローブのインベーダーオリゴとして使用する。この場合には最初のシグナルプローブにはインベーダーオリゴが存在していないので、フラップを生じさせることはできないが、それ以降のシグナルプローブからはフラップが生じることになる。
この方法において、さらにインベーダーオリゴを使用することもできることは当然である。このようなインベーダーオリゴを使用することにより、最初のシグナルプローブからもフラップを生じさせることができるようになる。
【００４４】
本発明の標識としてオリゴヌクレオチドの塩基配列については、インベーダーオリゴなどにより３重鎖の箇所を発生させることができる十分な長さがあればよく、その配列は任意に設計することができる。そして、当該オリゴヌクレオチドは合成により人為的に製造したものであってもよく、また天然のものであってもよい。天然の生体由来のオリゴヌクレオチドを本発明の標識オリゴヌクレオチドとして使用する場合には、シグナルプローブやインベーダーオリゴの塩基配列を、それに対応するように設計すればよい。生体由来の比較的長いオリゴヌクレオチドを本発明の標識として利用する場合には、対応するシグナルプローブやインベーダーオリゴを設計する部位が沢山有るので、これらの適当な部位の１カ所以上を任意に選択することができる。前記した応用例を適宜組み合わせて使用することもできる。
さらに、本発明の方法においては、化学物質に結合させたオリゴヌクレオチド自体を直接インベーダー法におけるオリゴヌクレオチドとして、例えば、シグナルプローブやターゲットＤＮＡとして使用する方法について説明してきたが、これに限定されるものではない。例えば、化学物質に結合した本発明の標識としてのオリゴヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイズさせて、標識としたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたＤＮＡだけを分離し、これをインベーダー法におけるシグナルプローブやターゲットＤＮＡやインベーダーオリゴとして使用することもできる。より具体的には、例えば１０〜１００ｍｅｒ、好ましく１０〜５０ｍｅｒ、より好ましくは１０〜２０ｍｅｒ程度のより短いＤＮＡを本発明の標識としてのオリゴヌクレオチドとし、当該オリゴヌクレオチドとハイブリダイズ可能な配列を含む第二のオリゴヌクレオチドであって、インベーダー法におけるシグナルプローブやターゲットＤＮＡやインベーダーオリゴとして使用するに十分な長さを有するＤＮＡとハイブリダイズさせ、測定系においてハイブリダイズしない第二のオリゴヌクレオチドを分離し、次いでハイブリダイズした第二のＤＮＡを乖離させて分離し、得られたハイブリダイズした第二のオリゴヌクレオチドをインベーダー法により解析することもできる。
これらの点以外に種々の点において改良を加えることも可能であるが、本発明の特徴はオリゴヌクレオチドを標識として使用すること、そして、それを「ヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法」、好ましくはフラップエンドヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法、より好ましくはインベーダー法により解析することである。その他の点において改良を加えられたとしても、これらの方法は全て本発明の実施の態様として、本発明に包含されるものであることは当業者であれば容易に理解されることである。
【００４５】
本発明の測定用キットは、第一の態様においては、１０〜１００ｍｅｒ、好ましくは１０〜６０ｍｅｒ、１０〜４０ｍｅｒ、より好ましくは２０〜４０ｍｅｒ、又はこれらの整数倍の長さを有するオリゴヌクレオチドが標識として化学物質に結合している標識化された化学物質を少なくとも１種含有してなる、オリゴヌクレオチドを標識として使用するインベーダー法による測定用キットに関するものである。このような本発明のオリゴヌクレオチドで標識化された化学物質としては、抗体や受容体などのタンパク質、各種の抗原、蛍光物質、放射性同位体を含有する化学物質、ビオチンやアビジンのような特異的な親和性を有する化学物質などが挙げられる。なかでも、ビオチンは現在のアッセイ系でよく使用されている物質であり、現在使用されているアッセイ系に容易に適用可能であることから、本発明のオリゴヌクレオチドが結合したビオチンが特に好ましいが、これに限定されるものではない。本発明の測定用キットは、このような本発明のオリゴヌクレオチドで標識化された化学物質の少なくとも１種を含有するものであり、そのほかに、測定に必要な物質、例えば、抗体、抗原、バッファー溶液、アビジンなどや、インベーダー法の解析に必要な各種のプローブを含有させることができる。
また、本発明の測定用キットの第二の態様は、少なくともインベーダー法におけるシグナルプローブ（primary probe）、インベーダーオリゴ（secondary probe）、及び／又はターゲットＤＮＡ、及び／又はフレットプローブを含有してなる、オリゴヌクレオチドを標識として使用するインベーダー法による測定用キット。このような測定用キットは、ターゲットＤＮＡを除けばゲノムのＳＮＰ解析用のキットをそのまま適用することもできるが、ＳＮＰ解析用のキットは非常に沢山の種類の標的ＤＮＡを短時間に解析するためのものであるが、本発明のキットは塩基配列の確定しているターゲットＤＮＡを検出、同定又は定量化するためのものであり、標的ＤＮＡが確定されているものであるという点において基本的に相違するものである。即ち、本発明のこの測定用キットは、既知の塩基配列を有するプローブの検出、同定又は定量化のためのキットであり、測定対象とするＤＮＡが特定されている測定用キットである。本発明のこの測定用キットは、インベーダー法におけるシグナルプローブ（primary probe）、インベーダーオリゴ（secondary probe）、及びターゲットＤＮＡの３種類のプローブを全て含有していてもよい。この場合には、それらのなかの１種、好ましくはターゲットＤＮＡを目的の化学物質に結合させて使用することになる。また、すでに本発明のオリゴヌクレオチドが結合した化学物質を使用する測定系においては、シグナルプローブ（primary probe）、インベーダーオリゴ（secondary probe）、及びターゲットＤＮＡの３種類のプローブのうちの１種が欠如したもの、例えば、シグナルプローブ（primary probe）、及びインベーダーオリゴ（secondary probe）の組み合わせ、インベーダーオリゴ（secondary probe）、及びターゲットＤＮＡの組み合わせであってもよい。さらに、前記応用例のように、インベーダーオリゴを使用する必要性の無い場合には、インベーダーオリゴの無い組み合わせであってもよい。本発明の測定用キットのなかには前記したオリゴヌクレオチドのほかに、３重鎖を特異的に解裂させるためのＦＥＮやＨｅｆのような解裂酵素、フレットプローブ、バッファー溶液などの他の必要なものが含有されていてもよい。
【００４６】
本発明のインベーダー法による解析に当たっては、フラップの発生を必要としているが、これを解析するためのフレットプローブは必ずしも必須のものではなく、発生したフラップを解析する他の手段があれば特にフレットプローブを使用する必要性は無い。しかしながら、フレットプローブを使用する解析法はＳＮＰの解析用のインベーダー法として広く使用されてきており、フレットプローブを使用する解析方法が経済的にも利点が多い。
一般にフレットプローブは、発光物質と消光物質を有しており、本発明のフレットプローブとしては、測定可能である限りにおいて任意の発光物質と任意の消光物質が使用可能である。本発明のオリゴヌクレオチドを標識として使用する方法においては、当該オリゴヌクレオチドをフレットプローブにより測定するものであることから、測定系全体の感度や測定レンジは、フレットプローブの性質によるところが大きく、フレットプローブの選択はある意味では重要である。感度や特異性の大きいフレットプローブの使用が特に好ましい。好ましいフレットプローブとしては、発光物質として、前記したサマリウム（Ｓｍ）、ユウロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）、又はジスプロシウム（Ｄｙ）などからなる希土類元素の希土類蛍光錯体ラベル剤を用いるものが好ましく、特にユウロピウム（Ｅｕ）錯体を用いるものが好ましい。
【発明の効果】
【００４７】
本発明は、オリゴヌクレオチドをアッセイなどの測定系における標識物質として使用するという新規な概念を提供するものである。イムノ−ＰＣＲ法のように長いＤＮＡを標識として使用することは知られていたが、ＰＣＲ法という煩雑で熟練を要する操作が必要であるばかりでなく、測定レンジがせまく、かつＰＣＲが可能な塩基の長さが必要であり、標識自体が非常に大きな分子種とならざるを得なかった。これに対して、本発明の標識は、より短いオリゴヌクレオチドを使用するものであり、標識としての大きさも小さく、対象となる化学物質の特性に与える影響も小さく、対象となる化学物質の特性を大きく変化させること無く測定が可能であり、測定レンジも広いものとなる。
さらに、本発明の方法では、「ヌクレアーゼを使用して核酸を切断する方法」、好ましくはインベーダー法を応用することにより、極めて高感度で測定することができ、かつ発生させるフラップの数を増加させることにより、さらに高感度の測定が可能となり、従来測定法における測定限界をさらに改善することもできる。
また、本発明の方法は、放射性物質や毒性の高い物質を使用する必要が無く、安全な測定が可能である。
さらに、本発明の方法は、発生するフラップを測定するものであるから、煩雑な操作や熟練を必要とする操作は必要無く、簡便な手法で安全で確実な測定結果を安定して得ることができる。
また、本発明の方法は、従来のＳＮＰ解析方法としてのインベーダー法を応用することができ、プレート及びチップ上で大量の検体を処理することも可能である。
【００４８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４９】
ウサギＩｇＧ（Rabbit IgG）を抗原としたサンドイッチイムノアッセイ
抗ウサギＩｇＧ抗体を固相化した後、非特異反応を防ぐために、１％ＢＳＡ及び０．２％グリシンでブロッキングした。これに、ウサギＩｇＧを０．００５ｐｇ／ｍＬ〜５００００ｐｇ／ｍＬのそれぞれの濃度で反応させた後、ビオチン標識した抗ウサギＩｇＧ抗体でサンドイッチし、ビオチン化ＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）をアビジンを介して結合させた。これを１０回洗浄した後、５０ｍｌの後述するプローブミックスを入れ、６３℃で１時間反応させ、ＦＡＭの蛍光強度を測定した。
ここで使用した標識ＤＮＡはインベーダー法による解析ではターゲットＤＮＡとして用いられるものであり、その配列は、
5'-AAGGA GAAGG TGTCT GCGGG AGTCG ATTTC ATCAT CACGC AGCTT TTCTT TG-3'
であった。
また、プローブミックスにおけるシグナルプローブ（primary probe）、インベーダーオリゴ（secondary probe）、及びフレットプローブ（FRET probe）の配列は、
シグナルプローブ（primary probe）：
5'-AACGA GGCGC ACACT CCCGC AGACA C-3'
インベーダーオリゴ（secondary probe）：
5'-CAAAG AAAAG CTGCG TGATG ATGAA ATCGC-3'
フレットプローブ（FRET probe）：
5'-GCTTG TCTCG GTTTT TCCGA GACAA GCGTG CGCCT CGTT-3'
フレットプローブ（FRET probe）は、５’末端側にＦＡＭが結合し、５’末端から３番目の塩基に消光物質としてＤＡＢＣＹＬが結合している。
使用したプローブミックスは、
ＰＨ  ＦＥＮ                      １０ｎｇ／ｍＬ
ＦＡＭフレットプローブ          １２５ｎＭ
シグナルプローブ                １２５ｎＭ
インベーダーオリゴ                ５０ｎＭ
ＭｇＣｌ２                      ７．５ｍＭ
ｔＲＮＡ                            ５ｎｇ／ｍＬ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）      １０ｍＭ
ツウィーン２０                ０．０５％
からなるものであった。
結果を図８にグラフで示す。図８の縦軸はＦＡＭの蛍光強度を示し、横軸は添加したウサギＩｇＧの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。図８中の黒丸印が本発明の実施例１の結果を示し、黒四角印は後述するＥＬＩＳＡ法の結果を示す。この結果、図８に示すようにウサギＩｇＧの検出限界が５ｐｇ／ｍＬで、検出範囲は５００００ｐｇ／ｍＬから５ｐｇ／ｍＬまで、平均ＣＶ％は３であった。
なお、検出限界は、ネガティブコントロール（ＮＣ）の蛍光強度にその時の標準偏差（ｎ＝４）の３倍を加えた値が検量線と一致する時の濃度とした。
【００５０】
比較例１
実施例１に記載した方法において、標識としてオリゴヌクレオチドを使用するに代えて、従来の酵素標識法（ＥＬＩＳＡ法）で行った。
この結果を実施例１の本発明の方法と比較して図８に黒四角印で示す。この結果、酵素測定法（ＥＬＩＳＡ法）では検出限界が４４９ｐｇ／ｍＬで、検出範囲は５００００ｐｇ／ｍＬから５００ｐｇ／ｍＬまで、平均ＣＶ％は９であった。
本発明の方法が酵素測定法より検出感度は１桁上げ、傾きが大きくて低濃度にも測定できることが分かった。
【実施例２】
【００５１】
ウサギＩｇＧを抗原とした、直接アッセイ
０．０５ｐｇ／ｍＬ〜５０００００ｐｇ／ｍＬの各濃度のウサギＩｇＧを固相化した後、非特異反応を防ぐために、１％ＢＳＡ及び０．２％グリシンでブロッキングした。ビオチン標識抗ウサギＩｇＧ抗体を反応させた後，ビオチン化ＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）をアビジンを介して結合させた。その後、実施例１と同様に、１０回洗浄後、５０ｍｌのプローブミックスを入れ、６３℃で３０分時間を反応させ、ＦＡＭの蛍光強度を測定した。
結果を図９にグラフで示す。図９の縦軸はＦＡＭの蛍光強度を示し、横軸は添加したウサギＩｇＧの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。この結果、図９に示すようにウサギＩｇＧの検出限界が６ｐｇ／ｍＬで、検出範囲は５０００００ｐｇ／ｍＬから６ｐｇ／ｍＬまでで、平均ＣＶ％は１．７であった。
【実施例３】
【００５２】
ヒトＴＮＦ−αを抗原としたサンドイッチイムノアッセイ
ＴＮＦ−α抗体で固相化したマイクロプレートに希釈した各濃度のＴＮＦ−αおよびビオチン化ＴＮＦ−α抗体を室温で２時間インキュベートし、抗原−抗体複合体を形成させた。１００ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジンを加え、室温で１時間インキュベートした後、バッファーＡ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．８））で３回洗浄後、バッファーＢ（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．８））で１回洗浄した（以下、洗浄は同様に行った。）。実施例１と同様に、０．１ｎＭのビオチン化ＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）をアビジンを介して結合させた。洗浄した後、さらに水で３回洗浄し、プローブミックス５０ｍＬを入れ、６３℃で１時間反応させた。カメレオン（Chameleon）（ＨＩＤＥＸ製）により励起波長（Ｅｘ．）４８５ｎｍで、発光波長（Ｅｍ．）５３０ｎｍでＦＡＭの蛍光強度を測定した。
結果を図１０にグラフで示す。図１０の縦軸はＦＡＭの蛍光強度を示し、横軸は添加したＴＮＦ−αの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。実施例３の結果を図１０の黒丸印で示す。この結果、図１０に示すようにＴＮＦ−αの検出限界が０．６５ｐｇ／ｍＬ、検出範囲は１０００ｐｇ／ｍＬから０．６５ｐｇ／ｍＬまで、平均ＣＶ％は３．２であった。
【００５３】
比較例２
実施例３に記載した方法において、標識としてオリゴヌクレオチドを使用するに代えて、従来の酵素標識法（ＥＬＩＳＡ法）で行った。酵素測定では抗原―抗体複合体複合体にストレプトアビジン−ＨＲＰを加え室温で３０時間ンキュベートした後、ＴＭＢと室温で３０分反応した。停止溶液（Stop solution）を加えた後、カメレオン（Chameleon）でＯＤ４５０ｎｍを測定した。
この結果を実施例３の本発明の方法と比較して図１０に黒四角印で示す。この結果、酵素測定法（ＥＬＩＳＡ法）では検出限界が２６ｐｇ／ｍＬで、検出範囲は１０００ｐｇ／ｍＬから２６ｐｇ／ｍＬまで、平均ＣＶ％は４．５であった。
この結果、本発明の方法は従来の酵素測定法（ＥＬＩＳＡ法）に比較して、優れた感度を有するものであることが分かった。
【実施例４】
【００５４】
蛍光色素として希土類蛍光錯体を用いた実験
実施例１に記載のＦＡＭフレットプローブの代わりに、５‘末端に蛍光色素としてＤＴＢＴＡのユウロピム錯体(Ｅｕ−ＤＴＢＴＡ)を結合し、５’末端から４番目の塩基に消光物質としてＢＨＱ２（登録商標)を結合したフレットプローブを用いて時間分解蛍光測定した以外は、実施例３に記載の内容と同様の手順、条件でアッセイを実施した。時間分解蛍光測定は、カメレオン(Chameleon) (ＨＩＤＥＸ製)により励起波長（Ｅｘ．）３４０ｎｍで、発光波長（Ｅｍ．）６１６ｎｍ、遅延時間１００μｓ、ウィンドウ時間４００μｓでＥｕ−ＤＴＢＴＡの蛍光強度を測定した。
結果を図１１にグラフの黒丸印で示す。図１１の縦軸はＥｕ−ＤＴＢＴＡの蛍光強度を示し、横軸は添加したＴＮＦ−αの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。この結果、図１１に示すようにＴＮＦ−αの検出限界が検出限界が１．９ｐｇ／ｍＬであり、検出範囲は１０００ｐｇ／ｍＬから１．９ｐｇ／ｍＬまで、平均ＣＶ％は７であった。
【００５５】
比較例３
実施例４に記載した方法において、標識としてオリゴヌクレオチドを使用するに代えて、従来の酵素標識法（ＥＬＩＳＡ法）で行った。
この結果を実施例４の本発明の方法と比較して図１１に黒四角印で示す。この結果、酵素測定法（ＥＬＩＳＡ法）では検出限界が２０ｐｇ／ｍＬで、検出範囲は１０００ｐｇ／ｍＬから２０ｐｇ／ｍＬまで、平均ＣＶ％は４．５であった。
この結果、本発明の方法は、従来の酵素測定法（ＥＬＩＳＡ法）に比較して、優れた感度を有するものであることがわかった。
【実施例５】
【００５６】
糖タンパク質糖鎖とレクチンとの結合アッセイとその定量法
糖タンパク質のモデルとして、牛乳由来ラクトフェリンを用いた。ラクトフェリンは、次に示す糖鎖構造（Matsumotoら、Journal of Biochemistry, 91(1),143-155, 1982）を持ち、
【００５７】
【化１０】
2007020526.tif 000012
【００５８】
これはレンズマメレクチン（ＬＣＡ）が認識する次に示す、
【００５９】
【化１１】
2007020526.tif 000013
【００６０】
糖鎖構造（谷口ら、生物物理化学、35(3), 199-204, 1991）と一致することから、ＬＣＡを用いた本発明の方法によるラクトフェリンの結合アッセイを試みた。
９６穴フルオロヌンクモジュールマイクロプレート（Ｎｕｎｃ製）に０．０５Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．３）で希釈した各濃度のラクトフェリン（和光製）を１ウエル当たり１００μｌで４℃で一晩コーティングした。バッファーＡ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．８））で３回洗浄した後、バッファーＢ（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．８））で１回洗浄した（以下、洗浄は同様に行った。）。１％ＢＳＡ（ｓｉｇｍａ製）で室温で、１時間インキュベートしブロッキングを行い、洗浄した後、５μｇ／ｍｌのビオチン化ＬＣＡと室温で１時間インキュベートし、ビオチン化ＬＣＡ−ラクトフェリン複合体を形成させた。１００ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジンを加え、３７℃で１時間インキュベートした後、実施例１と同様にして、０．０１ｎＭのビオチン化ＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）と室温で３０分反応した。洗浄した後、さらに水で３回洗浄した。実施例１と同様に、プローブミックス５０ｍＬを入れ、６３℃で１時間反応させた。カメレオン（Chameleon）（ＨＩＤＥＸ製）により励起波長（Ｅｘ．）４８５ｎｍ、発光波長（Ｅｍ．）５３０ｎｍでＦＡＭの蛍光強度を測定した。
結果を図１２にグラフで示す。図１２の縦軸はＦＡＭの蛍光強度を示し、横軸は添加したラクトフェリンの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。黒丸印が本発明の実施例５の結果を示し、黒四角印は後述するＥＬＩＳＡ法の結果を示す。この結果、図１２に示すように検出限界が７．３ｐｇ／ｍＬ、検出範囲は１００００ｐｇ／ｍＬから７．３ｐｇ／ｍＬまで、平均ＣＶ％は３．３であった。
【００６１】
比較例４
実施例５に記載した方法において、標識としてオリゴヌクレオチドを使用するに代えて、従来の酵素標識法（ＥＬＩＳＡ法）で行った。酵素測定ではビオチン化ＬＣＡ−ラクトフェリン複合体にストレプトアビジン−ＨＲＰを加え３７℃で１時間インキュベートした後、ＴＭＢと室温で３０分反応した。停止溶液（Stop solution）を加えた後、カメレオン（Chameleon）でＯＤ４５０ｎｍを測定した。
この結果を実施例５の本発明の方法と比較して図１２に黒四角印で示す。この結果、酵素測定法では検出限界が６５ｐｇ／ｍＬで、検出範囲は１００００ｐｇ／ｍＬから１００ｐｇ／ｍＬまで、平均ＣＶ％は１３．２であった。
本発明の方法が、酵素測定法より検出感度は１桁上げ、ばらつきも少ないことが分かった。
【００６２】
実施例５に記載した方法の応用例としては、癌化した細胞や、種々の疾患時には糖タンパク質や糖脂質などの糖鎖構造が変化することが知られている。この糖鎖の変化をレクチンを用いて検出し、癌や肝疾患の診断に用いる報告がすでになされている。従来技術として、ウェスタンブロット法やレクチンカラムによる検出が一般的であるが、抗体-レクチン酵素免疫法（谷口ら、生物物理化学、35(3), 199-204）として、いわばELISAの変法のような形で迅速に特定の糖鎖をもつ糖たんぱく質を検出する方法も開発されている。今回、検出法としてレクチンとInvader法を組み合わせることにより、抗体-レクチン酵素免疫法よりも高感度に、ウェスタンブロット法よりも容易に（ウェスタンブロットではおおよそ6〜7時間の工程が必要であるが、本法では5時間程度である）多検体を同時に扱い、迅速に診断を行う事ができる。また、生化学実験などでも、迅速に従来よりも微量の糖鎖の検出を行う事ができる。
【実施例６】
【００６３】
本発明の方法による細胞タンパクの発現アッセイ
（１）ＨＴ−１０８０細胞によるアクチンタンパク質の発現の検出
０．５５×１０５個／ウェルのＨＴ−１０８０細胞（human fibrosarcoma）を、９６穴マイクロプレートに入れ、５％ホルマリン水溶液中、室温で１５分間インキュベートして、細胞コーティングした。次に細胞コーティングしたウェルをＰＢＳバッファーで洗浄した後、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳバッファーで５分間インキュベートした。再度ＰＢＳバッファーで洗浄した後、マウス抗ヒトアクチン平滑筋（mouse anti-human actin, smooth muscle）抗体（１：１０）（ＵＫ−Ｓｅｒｏｔｅｃ  Ｌｔｄ）及び抗体なし陰性コントロールを室温で２時間インキュベートした。
再度ＰＢＳバッファーで洗浄後、ビオチン化抗マウスＩｇＧ（１：１００）を加え、室温で１時間インキュベートして、ビオチン化抗原―抗体複合体を形成させた。
得られたビオチン化抗原―抗体複合体を本発明の方法により検出する為に、１０００ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジンを加え、室温で１時間インキュベートした後、バッファーＡ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．８））で３回洗浄後、バッファーＢ（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．８））で１回洗浄した（以下、洗浄は同様に行った。）。
次に、実施例１と同様にして、０．１ｎＭのビオチン化ＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）と室温で３０分反応させた。これを洗浄した後、さらに水で３回洗浄した。
実施例１と同様にして、プローブミックス５０ｍＬを入れ、６３℃で２５分反応させた後、カメレオン（Chameleoｎ）（フィンランド、ＨＩＤＥＸ製）により励起波長（Ｅｘ．）４８５ｎｍ、発光波長（Ｅｍ．）５３０ｎｍでＦＡＭの蛍光強度を測定した。
結果を図１３にグラフで示す。図１３の縦軸はＦＡＭの蛍光強度を示し、横軸は添加したビオチン化抗マウスＩｇＧを添加した場合（Positive）と、添加しない場合（Negative）を示す。この結果、本発明の方法による定量では、陰性コントロールに比べて、陽性コントロールのＨＴ  １０８０細胞質に発現したアクチンタンパク質が入っている細胞の蛍光強度が上昇していることが認められた。
【００６４】
（２）  ＨＴ−１０８０細胞によるアクチンタンパク質の定量法
細胞数０．５５×１０５個、０．２７５×１０５個、０．１３７５×１０５個、及び０．０３４×１０５個／ウェルの細胞（ＨＴ−１０８０）を９６穴マイクロプレートに入れ、それぞれを５％ホルマリン水溶液中で、室温で３０分間インキュベートして、細胞コーティングした後、前記（１）に記載したと同様に行ってタンパク質の定量化を試みた。
結果を図１４のグラフで示す。図１４の縦軸はアクチンタンパク質の発現強度（蛍光強度）を示し、横軸は細胞数（×１０５細胞／ウエル）を示す。この結果、図１４に示されるように、本発明のこの方法では、蛍光強度はアクチンタンパク質の濃度にほぼ比例して観測され、定量測定にも使えることが確認された。
【実施例７】
【００６５】
本発明の方法によるアポトーシスの検出
アポトーシスapoptosisは、apo（off、離れる）とptosis（falling、落ちる）を合成した術語で、"生"の象徴であるmitosis（有糸分裂）に対比させられている。アポトーシスは、生体の中で不要となった細胞を除去する生体制御機構であり、突然変異や傷害を受けて異常となった細胞を排除する生体防御の意義も兼ね備えている。すなわち、正常・異常細胞の自己消去機能による"生の更新"がアポトーシスの本質といえる。形態発生学の領域のみならず、医学の分野においても、病態の成立機序、診断や治療に関するアポトーシスの生物学的意義が論じられている。アポトーシスに関する研究を行うためには、アポトーシスを正確かつ鋭敏に検出する手技の確立が重要であり、これを簡便に検出する方法として本発明の方法を説明する。
（１）早期アポトーシスの検出
アポトーシスの初期段階では、細胞膜の完全性は保たれているが、膜のリン脂質の非対称性が失われる。それに伴い、細胞膜の内側に局在する陰性荷電リン脂質のホスファチジルセリンが細胞表面に露出する。Ｃａ２＋依存性のりん脂質結合タンパクであるアネキシンＶ（Annexin V）が、ホスファチジルセリンに選択的に結合することを利用してアポトーシスを検出する。本発明では、ビオチン化アネキシンＶを用いて，  ビオチン化合成ＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）をアビジンを介して結合させる。これを実施例１と同様にして、本発明の方法により早期アポトーシス細胞を検出する。
実施例６で用いたＨＴ−１０８０  細胞にマグノロール（Magnolol）を投与することでアポトーシスが誘導された報告（Biol Pharm Bull 2002;25, 1546-1549 Ikeda K et al）があることから、ＨＴ−１０８０細胞を用いて早期アポトーシスの検出を以下の手順で行った。
１ｘ１０５個／ウェルのＨＴ−１０８０細胞（human fibrosarcoma）を、９６穴マイクロプレートに入れ、炭酸ガス培養器にて３７℃で一晩インキュベートし、０μＭ及び７５μＭのマグノロール（Ｗａｋｏ製）を入れ、さらに、炭酸ガス培養器にて３７℃で一晩インキュベートした。次にマグノロールを含む培養液を捨て、２００μｌ  １×結合バッファー（BioVision製）を入れ、さらに５μｌのビオチン化アネキシンＶ（BioVision製）、５μｌのヨウ素化プロピジウム（propidium iodide）（BioVision製）を加え、暗室室温で５分インキュベートした。次に１×結合バッファーで一回洗浄した後、５％ホルマリンＰＢＳ溶液、室温で１５分インキュベートし、細胞コーティングした。次に細胞コーティングしたウェルをＰＢＳバッファーで洗浄した後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳバッファー中、室温で１時間インキュベートしブロッキングを行った。
固定化されたビオチン化アネキシンＶを本発明の方法により検出する為に、１０００ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジンを加え、室温で１時間インキュベートした後、バッファーＡ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．８））で３回洗浄後、バッファーＢ（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  バッファー（ｐＨ７．８））で１回洗浄した。
次に、実施例１と同様にして、０．１ｎＭのビオチン化ＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）と室温で３０分反応した。これを上記と同様にバッファーＡで３回洗浄後、バッファーＢで１回洗浄した後、さらに水で３回洗浄した。
実施例１と同様にして、プローブミックス５０ｍＬを入れ、６３℃で６０分反応させた後、蛍光プレートリーダー（カメレオン；フィンランド、ＨＩＤＥＸ社製）により励起波長（Ｅｘ．）４８５ｎｍ、発光波長（Ｅｍ．）５３０ｎｍでＦＡＭの蛍光強度を測定した。
その蛍光強度測定の結果、マグノロールを入れなかった陰性（０μＭ）と比べて、マグノロールを入れた陽性（７５μＭ）の蛍光強度が上昇していることを確認し、早期アポトーシス細胞を検出できることが確認された。
【００６６】
（２）後期アポトーシスの検出
アポトーシスは、ネクローシス（necrosis）と異なる細胞死としてアポトーシスが進行すると、原形質膜の完全性が失われ、核のクロマチンの凝縮（margination）に基づいて行われる。そして、エンドヌクレアーゼ活性によるヌクレオソーム（約１８０塩基対）単位のＤＮＡ断片化がアポトーシスを特徴づけている。
この方法では、ＤＮＡの二本鎖切断端（double-stranded break）に末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（terminal deoxynucleotidyl transferase）（ＴｄＴ）を用いてビオチン標識化デオキシウリジントリホスフェイト（deoxyuridine triphosphate）（ｄＵＴＰ）を付加させ、ビオチン化ＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）をアビジンを介して結合させた。これを実施例１と同様にして、本発明の方法によって後期アポトーシス細胞を検出する。  
６μｍラット胸腺（後期アポトーシスを含む陽性コントロール）スライド（Trevigen製）をキシレンに５分間、２回：１００％エタノール１分間、２回：９９％エタノールに１分間、３回：水で１分間、５回の順で脱パラフィン・親水化した。次にプロテインＫ（Protein K）に常温に２０分間浸した後、水で２分間、２回洗浄した。次にクエンチング溶液（Trevigen製）に５分間浸した後、ＰＢＳバッファーで１分間した後、ＴｄＴラベリングバッファー（Trevigen製）に常温で５分間浸漬した。次に５０μｌのＴｄＴ酵素（Trevigen製）とラベリングバッファー（陽性）、又はラベリングバッファーのみ（陰性、酵素なし）を入れ、湿潤箱中で３７℃１時間ハイブリダイゼーションした。次に、ＴｄＴ停止液（Trevigen製）中に５分間浸漬し、ＰＢＳバッファーで５分間、１回洗浄した。次に、５０μｌの抗ＢｒｄＵ（anti-BrdU）（Trevigen製）を入れ、湿潤箱中で３７℃で１時間ハイブリダイゼーションした。更に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳバッファーで５分間、３回洗浄した。その後、ダコペンで標本の周囲を囲み、次の反応を行った。
得られた断片化ＤＮＡとビオチン標識化デオキシウリジントリホスフェイト複合体を本発明のインベーダー法により検出する為に、１０００ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジンを加え、室温で１時間インキュベートした後、バッファーＡ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．８））で３回洗浄後、バッファーＢ（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  バッファー（ｐＨ７．８））で１回洗浄した。次に０．１ｎＭのビオチン化合成ＤＮＡと室温で３０分間反応した。上記バッファーＡで３回洗浄後、バッファーＢで１回洗浄した後、さらに水で３回洗浄した。次にプローブミックスを入れ、６３℃で９０分間反応させた。次に２０μｌの反応液を、３８４穴の黒色マイクロプレートに入れ、蛍光プレートリーダー（カメレオン；フィンランド、ＨＩＤＥＸ社製）により励起波長（Ｅｘ．）４８５ｎｍ、発光波長（Ｅｍ．）５３０ｎｍでＦＡＭの蛍光強度を測定した。
その蛍光強度測定の結果、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（terminal deoxynucleotidyl transferase）（ＴｄＴ）を入れなかった陰性と比べて、ＴｄＴを入れた陽性の蛍光強度が上昇していることを確認し、後期アポトーシス細胞を検出できることが確認された。
【実施例８】
【００６７】
レセプター−リガンド・バインディング・アッセイ
本発明の方法において、化学物質としてリガンド分子を用いて、本発明を行う。これにより、細胞のレセプター発現、その活性の測定、レセプター（例えばオーファンレセプター）のリガンド探索、または特定のリガンドに対するレセプター探索等への応用が可能となる。
例えば、ラミニンは、細胞接着因子の一つであり、細胞表面にあるレセプター（ラミニンレセプター）を介して作用を示すことが知られている。これまでの研究により、ラミニンのアミノ酸配列のうち、β鎖９２９−９３３番目に当たるＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（ＹＩＧＳＲ）配列が、ラミニンレセプターとの結合を与えることが報告されている。実際、この配列のみの５アミノ酸のペプチドでも、レセプターと結合しラミニンの作用を阻害することが報告されている。そこで、本配列を持つリガンドをプローブとして、レセプター−リガンド・バインディング・アッセイを行う。
【００６８】
１ｘ１０５個／ウェルのＨＴ−１０８０細胞（human fibrosarcoma）を、９６穴マイクロプレートに入れ、一晩培養し、それぞれ０、５μｇ／Ｗｅｌｌのビオチン化ＹＩＧＳＲペプチドを入れ、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳバッファー３回洗浄した後、５％ホルマリンＰＢＳ溶液中、室温で１５分インキュベートし、細胞コーティングした。次に細胞コーティングしたウェルをＰＢＳ  バッファー洗浄した後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳバッファー中で、室温１時間インキュベートしブロッキングを行った。
レセプター−リガンド複合体を本発明の方法で検出するために、１０００ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジンを加え、室温で１時間インキュベートした後、バッファーＡ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．８））で３回洗浄後、バッファーＢ（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．８））で１回洗浄した。次に０．１ｎＭのビオチン化合成ＤＮＡと室温で３０分反応した。上記バッファーＡ３回洗浄およびバッファーＢ洗浄後、さらに水で３回洗浄した。
実施例１と同様にして、プローブミックス５０ｍＬを入れ、６３℃で６０分反応させた後、蛍光プレートリーダー（カメレオン；フィンランド、ＨＩＤＥＸ社製）により励起波長（Ｅｘ．）４８５ｎｍ、発光波長（Ｅｍ．）５３０ｎｍでＦＡＭの蛍光強度を測定した。
その結果を図１５に示す。図１５の縦軸はＦＡＭの蛍光強度を示し、横軸は調製したビオチン化ＹＩＧＳＲペプチドの有無を示す。図１５に示すように、ネガティブコントロールのビオチン化ＹＩＧＳＲペプチドなしと比較して、５μｇのビオチン化ＹＩＧＳＲペプチドを入れたものの蛍光強度が増大することが観察され、レセプターの検出が可能であることが確認された。
【実施例９】
【００６９】
ｍＲＮＡアッセイ
本発明の方法において、化学物質としてｍＲＮＡの全部又は一部に相補的な配列を持つＤＮＡ（又はＲＮＡ）を配する。これにより、細胞での遺伝子発現パターンおよび発現量の測定を本発明の方法により行うことができる。
例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ（Matrix metalloproteinase）（ＭＭＰ）類はコラーゲンなどの細胞外マトリックスの分解を行う酵素である。本酵素類は、ガン細胞の浸潤・転移の関係しており、ガン細胞で高度に発現していることが知られている。特に、ＭＭＰ‐２（または、ゼラチナーゼＡ、７２‐ｋＤａゼラチナーゼ、または７２‐ｋＤａ  ｔｙｐｅ  ＩＶコラゲナーゼ）は、ＨＴ‐１０８０細胞等の繊維肉腫細胞で構成的に発現していることが報告されている。そこで、ＭＭＰ‐２のｍＲＮＡをターゲットとしてｍＲＮＡアッセイを行う。
９６穴プレートの各ウエルに細胞ＨＴ‐１０８０を１．１×１０５個を取り、５％ホルマリン水溶液中で１５分インキュベートして、細胞コーティングを行った。次いで、これをＰＢＳバッファーで洗浄した後、９５℃に温めたターゲットレトリーバルソルーション（Target Retrieval Solution）（Ｄａｋｏ社製）の４０分間浸し、次いで０．２Ｎ  ＨＣｌで２０分処理してターゲット遺伝子を賦活化した。これをＤＥＰＣ水で１分間、３回洗浄した後、９５％エタノールで１分間、１００％エタノールで１分間処理して脱水し、冷風で風乾した。
ビオチン化ＭＭＰ２、及び内因性コントロールＧＡＰＤＨ（Glyceraldehyde Phosphate Dehydrogenase）プローブ（センス及びアンチセンス、各々２μｇ／ｍＬ）を、ＲＮＡインサイチュウハイブリダイゼーション（RNA in-situ Hybridization）溶液で希釈して１０μＬとして添加し、ハイブリスリップハイブリダイゼーションカバー（Hybrislip Hybridization cover）でカバーして３７℃で１晩ハイブリダイゼーションさせた。次いで、４０℃に温めた５０倍に希釈したストリンジェント洗浄溶液（Stringent wash solution）中でカバーをはずした後、２０分間４０℃でインキュベートした。その後、再度、新鮮な洗浄溶液中で、２０分間４０℃でインキュベーションした。
次いで、室温でＴＢＳバッファー(50mM Tris-HCl, 159mM NaCl, PH 7.6)に５分間浸した。１０００ｎｇ／ｍＬのストレプトアビジンを加え、室温で１時間インキュベートした後、バッファーＡ（０．０５％のツウィーン−２０を含有する0.05M Tris-HCl バッファー(pH7.8)）で３回洗浄した後、バッファーＢ（0.05M Tris-HCl buffer (pH7.8)）で１回洗浄した（以下洗浄は同様に行った）。
次いで、０．１ｎＭのビオチン化ＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）と室温で３０分反応させた後、洗浄し、さらに水で３回洗浄した。
次いで、実施例１と同様にしてプローブミックス５０ｍＬを添加して、６３℃で６０分反応させた。次いで、カメレオン（Chameleon (HIDEX 製)）により励起波長（Ex.）485nm、発光波長（Em.） 530nmでFAMの蛍光強度を測定した。
ＭＭＰ２の結果を図１６に、ＧＡＰＤＨの結果を図１７にそれぞれ示す。図１６及び図１７の縦軸は蛍光強度を示し、それぞれの図の左側はセンス鎖の場合を、右側はアンチセンス鎖の場合を示す。この結果、図１６及び図１７に示すように、本発明の方法の定量では、センスと比べて、アンチセンス（ｍＲＮＡに相補的な）プローブを加えた細胞の蛍光強度が１．５倍または２倍上昇していることが示された。
【実施例１０】
【００７０】
本発明の方法による細胞内のＤＮＡを抽出することなく、細胞内の特異的ＤＮＡの検出
細胞のＤＮＡを抽出せず、本発明のビオチン化プローブを用いて、細胞内の特異的ＤＮＡの発現の検出、同定を試みた。以下の実験例では、特異的ＤＮＡとして、細胞内のシングルコピーのウイルスのＤＮＡの検出、同定を行った。
パピローマ１６ウイルスが、１〜２コピー感染したSiHa細胞を貼付したスライド（Dako 製）をキシレンに５分間、２回，１００％  エタノール１分間、２回，９９％エタノールに１分間、３回，水で１分間、５回の順で脱パラフィン・親水化した。
次いで、９５℃で、ターゲットリトリーバル溶液（Target Retrieval Solution）(Dako製)に４０分間浸した後、漬けたまま常温に２０分間、放置し、ターゲット遺伝子を賦活化した。水で１分間、５回洗浄した後、常温に風乾し、ダコペンで標本の周囲を囲った。
ビオチン標識ヒトＨＰＶ１６配列がある陽性プローブ（Dako製）、及びＨＰＶ１６配列を含まない陰性プローブ（Dako製）を入れ、カバーグラスをかけ、湿潤箱中で３７℃で一晩ハイブリダイゼーションさせた。
次いで、ＴＢＳＴ（Dako製）中に１０分間浸し、カバーガラスをはずした後、５５℃に温め、５０倍希釈ストリンギェント洗浄溶液（Stringent wash solution）（Dako 製）に３０分、５５℃でインキュベートした。
ＴＢＳＴに室温で５分間浸した。１０００ｎｇ／ｍＬのストレプトアビジンを加え、室温で１時間インキュベートした後、バッファーＡ（０．０５％のツウイーン２０を含む０．０５Ｍ Tris-HCl バッファー(pH7.8)）で３回洗浄した後、バッファーＢ（０．０５Ｍ Tris-HCl バッファー(pH7.8)）で１回洗浄した（以下、洗浄は同様に行った。）。０．１ｎＭのビオチン化合成ＤＮＡと室温で３０分間反応させた。洗浄した後、さらに水で３回洗浄した。図１９に示したように、実施例１と同様にプローブミックス試薬を入れ、６３℃で９０分間反応させた。次に２０ｍＬの反応液を、３８４穴の黒色マイクロプレートに入れ、蛍光プレートリーダー（カメレオン；フィンランド、ＨＩＤＥＸ社製）により励起波長（Ｅｘ．）４８５ｎｍ、発光波長（Ｅｍ．）５３０ｎｍでＦＡＭの蛍光強度を測定した。
結果を図１８に示す。図１８の縦軸は蛍光強度を示し、図１８の左側はネガティブの場合を、右側はポジティブの場合を示す。この結果、図１８に示されるように、本発明の方法による定量化では、陰性（ネガティブ）に比べて、陽性（ポジティブ）の蛍光強度は約３倍以上に上昇することが示された。このことから、本発明の方法によれば、従来法より高感度な検出が可能となり、スライド塗抹標物に少ないコピーウイルスのＤＮＡを検出することができる。
【実施例１１】
【００７１】
アプタマーによる測定
アプタマーは、核酸（一本鎖DNAまたはRNA）で構成される抗体様分子で、立体構造によりターゲットとなる分子と特異的に結合する。15〜30mer程度の核酸であるため、一度配列が決定されれば人工的に、高い再現性で合成することができる。いわば「試験管内でできる人工抗体」といえる。
前記してきた本発明の方法において、化学物質をアプタマーに置き換えることにより、検出の迅速化、再現性の向上を図ることが可能となる。
この実験では、アプタマーのモデルとして、トロンビンアプタマーを用いた。トロンビンアプタマーは長さ１５ｍｅｒの１本鎖ＤＮＡアプタマーで、α−トロンビンと特異的に結合する。その配列は公知であり（Bock et al. (1992), Nature 355:564-566）、酵素標識によるＥＬＩＳＡによる測定のデータもすでに報告されている（Paborsky et al. (1993), J Biol Chem. 268:20808-20811）。これに、（１）５’末端にビオチン標識したもの、（２）３’末端側に本発明のインベーダー法のターゲット配列を結合したもの、の２種類のアプタマーを作製し、それぞれの親和性の測定を行った。
【００７２】
（１）ビオチンを結合したトロンビンアプタマー（5’-Biotin-GGTTGGTGTGGTTGG-3’）によるトロンビンの検出
９６穴マイクロプレートにセレクションバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−アセテート（ｐＨ７．４），１４０ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＣａＣｌ２，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中に溶解したα−トロンビンを、それぞれ０．２５、２．５、２５、２５０、及び２５００ｎＭの濃度でコーティングし、１％ＢＳＡによりブロッキングを行った後、５００ｎＭのビオチン標識アプタマーと３７℃で１時間インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むセレクションバッファで３回洗浄した後、３０μｇ／ｍｌのストレプトアビジンと室温で１時間インキュベートした。３回の洗浄の後、５０ｎＭのビオチン結合ターゲットＤＮＡと室温で３０分反応させた。さらに３回の洗浄を行い、ＰＨ  ＦＥＮを含む５０μｌのプローブミックスを注ぎ、６３℃、１時間インベーダー反応を行った後、ＦＡＭの蛍光を測定した。
結果を図１９にグラフで示す。この結果、α−トロンビン濃度が２．５ｎＭ以上で、濃度に比例してＦＡＭ蛍光強度の増加が見られ、抗体の代わりにアプタマーを用いた場合にも正しく標的物質を検出できることが示された。
【００７３】
(２)３’末端側に本発明のインベーダー法のターゲット配列を結合したアプタマーによるトロンビンの検出
5’-GGTTGGTGTGGTTGG GTGTCTGCGGGAGTCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTG-3’
Thrombin aptamer               target配列
（下線部は、本発明のインベーダー法におけるターゲット配列であることを示す。）
９６穴マイクロプレートにセレクションバッファ中に溶解したα−トロンビンを、それぞれ０．２５、２．５、２５、２５０、及び２５００ｎＭの濃度でコーティングし、１％ＢＳＡによりブロッキングを行った後、５００ｎＭのターゲット配列融合アプタマーと３７℃で１時間インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むセレクションバッファで３回洗浄した後、ＰＨ  ＦＥＮを含む５０μｌのプローブミックスを注ぎ、６３℃、１時間反応を行った後、ＦＡＭの蛍光を測定した。
結果を図２０にグラフで示す。その結果、αトロンビン濃度が２．５ｎＭ以上で、濃度に比例してＦＡＭ蛍光強度の増加が見られ、抗体の代わりにアプタマーを用いた場合にも正しく標的物質を検出できることが示された。本方法は、ターゲット配列に直接アプタマー配列を融合した一本鎖ＤＮＡを使用しているため、ビオチン−アビジンを用いた方法よりもより迅速簡便に測定を行う事ができる。また、アプタマー融合ターゲットの合成も、ビオチン結合抗体あるいはビオチン結合アプタマーに比べ容易である。
【実施例１２】
【００７４】
マルチターゲットＤＮＡによる感度試験
ターゲット領域を複数箇所有するターゲットＤＮＡ（マルチターゲットＤＮＡ）を用いて、検出感度を比較した。
（１）ターゲット領域が２カ所あるターゲットＤＮＡによる試験
ターゲット単位間のスペースが５ｍｅｒのものの例として、次の９１ｍｅｒの塩基配列を有するターゲットＤＮＡを使用した。
5'-GTGTCTGCGGGAGTCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTGATCGTGTGTCTGCGGGAGTCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTG-3' （９１ｍｅｒ）
シグナルプローブとして、
5'-AACGA GGCGC ACACT CCCGC AGACA C-3'
を使用し、インベーダーオリゴとしては、
5'-CAAAG AAAAG CTGCG TGATG ATGAA ATCGC-3'
を使用した。
比較として、ターゲット領域が１カ所である従来のターゲットＤＮＡを使用して、それぞれインベーダー法による蛍光感度を比較した。実験条件は次のとおりであった。
ターゲットＤＮＡの濃度    ：    １０ｐＭ
ｔＲＮＡ                  ：    ５０ｎｇ
フレットプローブ（ＦＡＭ）：  １２５ｎＭ
シグナルプローブ          ：  ２５０ｎＭ
インベーダーオリゴ        ：    ５０ｎＭ
ＦＥＮ（ＰＨＦＥＮ）      ：    ４０ｎｇ
反応条件                  ：    ６３℃、６０分
試行回数                  ：      ３回
結果を図２１に示す。図２１の縦軸は蛍光強度を示し、横軸は、左側から、コントロール（No Target）、ターゲット領域が１カ所である従来のターゲットＤＮＡの場合（Ｍｏｎｏ）、ターゲット領域を２カ所有するターゲットＤＮＡの場合（Ｍｕｌｔｉ）をそれぞれ示す。
この結果、ターゲット領域を２カ所にすることにより、インベーダーアッセイではＦＡＭの蛍光感度は、約１．５５倍に増加した。
【００７５】
（２）シグナルプローブが、インベーダーオリゴを兼ねるものであって、ターゲット領域が５回繰り返されるターゲットＤＮＡによる試験
ターゲット単位間のスペースは０ｍｅｒであり、これが５回繰り返される例として、次の９９ｍｅｒの塩基配列を有するターゲットＤＮＡを使用した。
5'-GTGTCTGCGGGAGTGTGTCTGCGGGAGTGTGTCTGCGGGAGTGTGTCTGCGGGAGTGTGTCTGCGGGAGTCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTG-3'  （９９ｍｅｒ）
シグナルプローブとして、
5'-AACGA GGCGC ACACT CCCGC AGACA CC-3'
を使用した。このシグナルプローブはインベーダーオリゴを兼ねているが、最初のフラップの作成のために、次のインベーダーオリゴ、
5'-CAAAG AAAAG CTGCG TGATG ATGAA ATCGC-3'
を使用した。
比較として、ターゲット領域が１カ所である従来のターゲットＤＮＡを使用して、それぞれインベーダー法による蛍光感度を比較した。実験条件は次のとおりであった。
ターゲットＤＮＡの濃度    ：    １０ｐＭ
ｔＲＮＡ                  ：    ５０ｎｇ
フレットプローブ（ＦＡＭ）：  １２５ｎＭ
シグナルプローブ          ：  ２５０ｎＭ
インベーダーオリゴ        ：    ５０ｎＭ
ＦＥＮ（ＰＨＦＥＮ）      ：    ４０ｎｇ
反応条件                  ：    ６３℃、６０分
試行回数                  ：      ３回
結果を図２２に示す。図２２の縦軸は蛍光強度を示し、横軸は、左側から、コントロール（Ｎｏ  Ｔａｒｇｅｔ）、ターゲット領域が１カ所である従来のターゲットＤＮＡの場合（Ｍｏｎｏ）、ターゲット領域を２カ所有するターゲットＤＮＡの場合（Ｍｕｌｔｉ）をそれぞれ示す。
この結果、ターゲット領域を２カ所にすることにより、インベーダーアッセイではＦＡＭの蛍光感度は、約１．５倍に増加した。
【実施例１３】
【００７６】
ビオチン化ＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）の製造
自動合成装置（ＡＢＩ３９４）を用いて、固相法により合成した。
まず、ＣＰＧ（controlled pore glass）の多孔質ガラスビーズの固相担体に、デオキシチミジンが結合したジメトキシトリチル体（ＤＭＴｒ−ｄＴ−ＣＰＧ）出発物質とした。３％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を６秒流し、５秒待つというサイクルを５回行うことでＤＭＴｒ基をはずした。ついでシトシンホスホロアミダイトを反応させ、つぎにＩ２で酸化してリン酸トリエステル（ＤＭＴｒ−ｄＴ−（Ｏ＝Ｐ−ＯＲ）−ｄＣ−ＣＰＧ）とした。  以上のサイクルを繰り返し、３’→５’の方向に１塩基ずつ延長し（５’）ＤＭＴｒ−ＡＧＡＡＧ  ＧＴＧＴＣ  ＴＧＣＧＧ  ＧＡＧＴＣ  ＧＡＴＴＴ  ＣＡＴＣＡ  ＴＣＡＣＧ  ＣＡＧＣＴ  ＴＴＴＣＴ  ＴＴＧＡＧ  ＧＣＴ−ＣＰＧ（３’）塩基配列を有するＤＮＡを得た。
さらに、ビオチンホスホロアミダイド（Biotin phosphoramidite（1-Dimethoxytrityloxy-2-(N-biotinyl-4-aminobutyl)-propyl-3-O-(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidite）を加え、２分間反応させ。その後、２８％アンモニア水で５５℃，５時間反応させ、ＣＰＧより脱離させた。得られたビオチン化ＤＮＡはＨＰＬＣで精製し、分光光度計で２６０ｎｍの値を測定することにより保持時間７．４１分でシングルピークであることを確認した。最後に、残ったＤＭＴｒを外し、カラムで脱塩して凍結乾燥して、本発明のビオチン化ＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）を製造した。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明は、安全で、簡便で、高感度で、確実で、かつ測定レンジの広い新規な標識を用いた方法を提供するものであり、生理活性物質などの挙動を測定するための新規な手法を提供するものである。本発明の方法により、例えば、各種の抗体や抗原などの生理活性物質の存在、定量化などを行うことができ、病気の診断や治療に有用なだけでなく、病気の発症原因の解明や、各種のスクリーニング方法における新規な標識として極めて有用なものであり、本発明は産業上の利用可能性を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、インベーダー法の概要を模式的に示したものである。
【図２】図２は、インベーダー法の概要をより具体的な塩基配列に基づいて例示したものである。
【図３】図３は、本発明の方法におけるフラップの生成を模式的に例示したものである。
【図４】図４は、本発明の方法における２個のフラップを生成させる方法を模式的に示したものである。
【図５】図５は、本発明の方法におけるインベーダーオリゴとシグナルプローブとの相補的配列を繰り返したターゲットによるインベーダー法の例を模式的に示したものである。
【図６】図６は、本発明の方法における両端にフラップを付加したシグナルプローブによるインベーダー法の例を模式的に示したものである。
【図７】図７は、本発明の方法におけるシグナルプローブ自身がインベーダーオリゴを兼ねた場合のシグナルプローブとの相補的配列を繰り返すようにしたインベーダー法の例を模式的に示したものである。
【図８】図８は、本発明の方法（図８中の黒丸印）及び従来のＥＬＩＳＡ法（図８中の黒四角印）による、ウサギＩｇＧの検量線を比較してグラフで示したものである。
【図９】図９は、本発明の方法によるウサギＩｇＧを抗原とした、直接アッセイ法における検量線をグラフで示したものである。
【図１０】図１０は、本発明の方法（図１０中の黒丸印）及び従来のＥＬＩＳＡ法（図１０中の黒四角印）による、ヒトＴＮＦ−αを抗原としたサンドイッチイムノアッセイ法における検量線をグラフで示したものである。
【図１１】図１１は、希土類蛍光錯体を用いた本発明の方法（図１１中の黒丸印）及び従来の酵素測定法（図１１中の黒四角印）による、ヒトＴＮＦ−αを抗原としたサンドイッチイムノアッセイ法における検量線をグラフで示したものである。
【図１２】図１２は、本発明の方法（図１２中の黒丸印）及び従来の酵素測定法（図１２中の黒四角印）による、ラクトフェリン糖類に対するレクチンの親和性の検量線を比較してグラフで示したものである。
【図１３】図１３は、本発明の方法による、ＨＴ１０８０細胞におけるアクチンタンパク質の発現量を解析した結果をグラフで示したものである。
【図１４】図１４は、本発明の方法による、ＨＴ１０８０細胞におけるアクチンタンパク質の発現量の検量線をグラフで示したものである。
【図１５】図１５は、本発明の方法により、ラミニンを用いたレセプター−リガンド・バインディング・アッセイを行った結果を示すグラフである。
【図１６】図１６は、本発明の方法により、細胞のマトリックスメタロプロテイナーゼ（Matrix metalloproteinase）２（ＭＭＰ２）の発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図１７】図１７は、本発明の方法により、細胞のＧＡＰＤＨ（Glyceraldehyde Phosphate Dehydrogenase）の発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図１８】図１８は、本発明の方法により、細胞中のパピローマウイルスの検出、同定を行った結果を示すグラフである。
【図１９】図１９は、ビオチンを結合したトロンビンアプタマーによるトロンビンの検出・定量を行った結果を示すグラフである。
【図２０】図２０は、３’末端側に本発明のターゲット配列を結合したアプタマーによるトロンビンの検出・定量を行った結果を示すグラフである。
【図２１】図２１は、本発明のターゲット領域が２カ所あるターゲットＤＮＡによる検出感度の試験を行った結果を示すグラフである。
【図２２】図２２は、本発明のシグナルプローブが、インベーダーオリゴを兼ねるものであって、ターゲット領域が５回繰り返されるターゲットＤＮＡによる検出感度の試験を行った結果を示すグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【００７９】
配列番号１：本発明の標識としてのオリゴヌクレオチドの例である。
配列番号２：本発明の方法におけるシグナルプローブの例である。
配列番号３：本発明の方法におけるインベーダーオリゴの例である。
配列番号４：本発明の方法におけるフレットプローブの例である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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