(57)【要約】【課題】有機溶媒に対し耐性のない微生物に対し、有機溶媒耐性遺伝子を解明或いは遺伝子導入する事なく、あるいは、突然変異を導入し有機溶媒耐性微生物を作製する。【解決手段】所望の形質を生物に迅速に付与する方法およびシステムを用いて変異を導入し、所望の有機溶媒存在下で培養することによって有機溶媒耐性微生物を作製する。有機溶媒耐性を有する生物であって、該生物は、該生物の天然型が有する耐性よりも高い耐性を有する、生物が、本発明によって提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機溶媒耐性を有する生物であって、該生物は、該生物の天然型が有する耐性よりも高い耐性を有する、生物。
【請求項２】
前記有機溶媒は、ベンゼン、イソオクタン、シクロヘキサン、ヘキサンおよびトルエンからなる群より選択される、請求項１に記載の生物。
【請求項３】
前記耐性は、ヘキサンに対して少なくとも１％の濃度での耐性である、請求項１に記載の生物。
【請求項４】
前記耐性は、ヘキサンに対して少なくとも２％の濃度での耐性である、請求項１に記載の生物。
【請求項５】
前記耐性は、ヘキサンに対して少なくとも６％の濃度での耐性である、請求項１に記載の生物。
【請求項６】
前記耐性は、ヘキサンに対して少なくとも１０％の濃度での耐性である、請求項１に記載の生物。
【請求項７】
前記耐性は、ヘキサンに対して少なくとも２０％の濃度での耐性である、請求項１に記載の生物。
【請求項８】
前記耐性は、ヘキサンに対する耐性とイソオクタンに対する耐性とを含む、請求項１に記載の生物。
【請求項９】
前記耐性は、ヘキサンに対して少なくとも１％の濃度での耐性である、請求項８に記載の生物。
【請求項１０】
前記耐性は、ヘキサンに対して少なくとも２％の濃度での耐性である、請求項８に記載の生物。
【請求項１１】
前記耐性は、ヘキサンに対して少なくとも６％の濃度での耐性である、請求項８に記載の生物。
【請求項１２】
前記耐性は、ヘキサンに対して少なくとも１０％の濃度での耐性である、請求項８に記載の生物。
【請求項１３】
前記耐性は、ヘキサンに対して少なくとも２０％の濃度での耐性である、請求項８に記載の生物。
【請求項１４】
前記耐性は、イソオクタンに対して少なくとも２％の濃度での耐性であり、請求項８に記載の生物。
【請求項１５】
前記耐性は、イソオクタンに対して少なくとも２％の濃度での耐性である、前記生物はＳａｃｃｈａｒｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｖｉｓｉａｅである、請求項８に記載の生物。
【請求項１６】
前記耐性は、イソオクタンに対して少なくとも６％の濃度での耐性である、請求項８に記載の生物。
【請求項１７】
前記耐性は、イソオクタンに対して少なくとも１０％の濃度での耐性である、請求項８に記載の生物。
【請求項１８】
前記耐性は、イソオクタンに対して少なくとも１０％の濃度での耐性であり、前記生物はＳａｃｃｈａｒｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｖｉｓｉａｅである、請求項８に記載の生物。
【請求項１９】
前記耐性は、ヘキサンとイソオクタンとを含む溶媒に対する耐性とを含む、請求項１に記載の生物。
【請求項２０】
前記ヘキサンとイソオクタンとは、それぞれ、１０％および５％で含まれる、請求項１９に記載の生物。
【請求項２１】
前記耐性は、有機溶媒環境において少なくとも２日以上生存することを包含する、請求項１に記載の生物。
【請求項２２】
前記耐性は、有機溶媒環境において少なくとも６日以上生存することを包含する、請求項１に記載の生物。
【請求項２３】
前記生物は、酵母である、請求項１に記載の生物。
【請求項２４】
前記生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の生物である、請求項１に記載の生物。
【請求項２５】
前記生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項１に記載の生物。
【請求項２６】
有機溶媒に対する耐性が改善された生物を作製するための方法であって、該方法は：
Ａ）目的の生物を、該有機溶媒について、正常状態での最大許容濃度〜該最大許容濃度の約１／２の濃度で培養する工程；
Ｂ）該目的の生物を、該有機溶媒について、改善について所望の濃度で培養する工程；および
Ｃ）生存する生物を選択し再生産する工程、
を包含する、方法。
【請求項２７】
前記最大許容濃度の約１／２の濃度は、ヘキサン０．５％である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記培養は、少なくとも２００ｍｌでの培養である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記培養工程Ａ）は、少なくとも１０８細胞／ｍｌの細胞密度で行われる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記培養工程Ｂ）は、前記最大許容濃度よりもわずかに増やした濃度で培養し、培養後、必要に応じて、さらに濃度を増加させ、これを前記改善について所望の濃度に増加するまで繰り返すことを包含する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
Ｄ）前記生物の遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を調節する工程をさらに包含する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記エラープローン頻度を調節する工程は、前記生物のＤＮＡポリメラーゼのエラープローン頻度を調節することを包含する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、真核細胞におけるＤＮＡポリメラーゼα、ＤＮＡポリメラーゼβ、ＤＮＡポリメラーゼγ、ＤＮＡポリメラーゼδおよびＤＮＡポリメラーゼεならびにそれらに対応するＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される少なくとも１つのポリメラーゼを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、真核細胞におけるＤＮＡポリメラーゼδおよびＤＮＡポリメラーゼεならびにそれに対応するＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される少なくとも１つのポリメラーゼを包含する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記生物は、真核生物である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
前記生物は、分離した細胞の状態で存在する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
前記生物は、動物、植物、真菌または酵母の細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３８】
前記生物は、酵母である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３９】
前記生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の生物である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４０】
前記生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの生物である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４１】
前記生物は、所望の形質の変換後も、野生型と実質的に同じ成長を示す、請求項２６に記載の方法。
【請求項４２】
前記所望の濃度は、前記最大許容濃度よりも高い濃度である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４３】
請求項２６〜４２のいずれか１項に記載の方法によって生産された生物。
【請求項４４】
菌学的性質は、所望の有機溶媒耐性以外は野生型と同じである生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機溶媒耐性に優れた生物および有機溶媒耐性に優れた生物の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケミカルプロセスでは、高温・高圧条件下で行われることが多いため、常温・常圧の生物反応の利用が求められている。しかし、生物由来の酵素反応が工業レベルで用いられている例としては、精製酵素の場合が１００例以上あるが、微生物そのままのバイオプロセスへの利用は多くない。その理由は、バイオプロセスの対象物質が、有機溶媒にしか溶けないことと工業化の容易な実験微生物が有機溶媒耐性能を有していないことにある。
その問題の解決の一手段として、有機溶媒耐性の酵素の探索や極限環境からの有機溶媒耐性の新規微生物の探索と応用研究が進められている。新規な有機溶媒耐性微生物の作製には、（１）自然環境から分離した微生物の有機溶媒耐性機構を調べ、耐性に関与する遺伝子を特定し、実験微生物に導入し利用する方法と、（２）紫外線照射や１−メチルー３−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）のような化学物質による突然変異を導入し、有機溶媒耐性微生物を作製する方法（古典的変異導入法）が用いられている。
【０００３】
（１）の例として、井上らは、開発した有機溶媒微生物の分離培養方法（特開昭６３−２４０７７８）を用いて、トルエン耐性微生物としてシュードモナス・プチダ、シュードモナス・エスピーを分離した（特許文献１＝特開昭６３−２１６４７３、特許文献２＝特開昭６３−２１６４７４）。
【０００４】
シュードモナス・プチダＤＯＴ−Ｔ１Ｅ株を材料として、３つのメカニズムからトルエンに対する耐性が構成されていると考えられている。第一のメカニズムは、細胞内に浸入してきたトルエンを細胞外へ積極的に排出する多剤排出ポンプの存在である。その例としてＪ．Ａ．Ｒａｍｏｓら（非特許文献１＝Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， Ｊｕｌｙ  １９９８， ｐ３３２３−３３２９）は、トルエン排出ポンプｍｅｘＢホモログを報告し、Ａ．Ｒｏｊａｓら（非特許文献２＝Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， Ｊｕｌｙ  ２００１， ｐ３９６７−３９７３）は、多剤排出ポンプファミリーの芳香族炭素によって発現が誘導されるＴｔｇＤＥＦと構成的に発現するＴｔｇＡＢＣを報告した。第二のメカニズムは、細胞外膜の構成成分を変化させることによってトルエンの細胞膜透過性を低くする機構である。Ｈ． Ｋｏｂａｙａｓｈｉら（非特許文献３＝Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｌｙ  １９９９， ｐ４４９３−４４９８）は、ＬＰＳの脂肪酸の種類と外膜タンパク質の量の変化がトルエン耐性と関連があると報告している。第三のメカニズムは、細胞内に入ってきたトルエンを酵素で代謝して微生物の生育に利用する機構である。Ｊ．Ａ．Ｒａｍｏｓら（非特許文献４＝Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｅｐｔ  ２００３， ｐ５１２０−５１２７）は、シュードモナス・プチダＤＯＴ−Ｔ１Ｅ株が、トルエンジオキシゲナーゼの触媒作用によってトルエンを３−メチルカテコールに変換していることを見出している。
【０００５】
有機溶媒耐性遺伝子を用いて大腸菌を代表とする実験微生物に導入し、有機溶媒耐性を付与した例として、Ｂ．Ｂｕｈｌｅｒら（非特許文献５＝Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２０００． Ｖｏｌ． ２７５， Ｎｏ．１４， １００８５−１００９２）は、シュードモナス・プチダｍｔ−２株由来のキシレンモノオキシゲナーゼ遺伝子を大腸菌ＪＭ１０１に導入し、キシレン耐性を付与するとともにキシレンやトルエンを代謝する微生物を作製した。
【０００６】
一方、（２）の例としてＡｏｎｏら（非特許文献６＝Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９１． ５５（７）： １９３５−１９３８）は大腸菌Ｋ−１２株をＮＴＧ処理してヘキサンを含む６種有機溶媒に対する耐性能を獲得させた。また、Ｂｅｎｎｅｔｔら（非特許文献７＝Ｎａｔｕｒｅ， １９９０，Ｖｏｌ．３４６，７９−８１）はＮＴＧ処理で高温耐性の大腸菌を作製した。
【０００７】
特許文献３（特開２００４−０３３０４５）では、有機溶媒として脂肪族炭化水素類および脂肪族アルコール類に耐性を有し、環状脂肪族炭化水素類を炭素源として分解資化し得ることを記載する。
【０００８】
特許文献４（特開平１１−２２１０８）は、有機溶媒耐性を有するまたはその有機溶媒  耐性  が増強された大腸菌が記載されている。
【０００９】
特許文献５（特開平０７−２５５４６２）は、親株微生物に変異処理を施し、有機溶媒  を加えて選択培養することを特徴とする有機溶媒耐性微生物の取得方法および該方法によって得られ得る有機溶媒耐性微生物を記載している。しかし、この特開平０７−２５５４６２は、親株微生物の変異処理としては、γ線およびＸ線等の放射線を含めた紫外線の照射処理、並びにニトロソグアニジンおよびＥＭＳ（エチルメタンスルフォネート）等の各種変異誘発物質による変異処理等が記載されている。
【００１０】
特許文献６（特許第２９６７２０２号）は、溶媒耐性微生物の取得方法に関し、詳しくは微生物による非水溶性物質の生産乃至分解を行うために、特定の有機溶媒に耐性を有する微生物を取得する方法を記載しており、分配係数Ｐｌの有機溶媒Ｓｌ中では生育するが、ｌｏｇ  Ｐｌ＋ｍ≧ｌｏｇ  Ｐｌ−０．６の条件を満たし、Ｐｌより小さい分配係数Ｐｌ＋ｍの有機溶媒Ｓｌ＋ｍ中では生育しない微生物を前記分配係数Ｐｌ＋ｍの有機溶媒Ｓｌ＋ｍと接触せしめて該溶媒に耐性を有する微生物を選抜することを特徴とする溶媒耐性生物の取得方法、を提供する。
【００１１】
しかし、自然界から単離した有機溶媒耐性微生物の有機溶媒耐性メカニズムを遺伝子レベルで解明するには多大なコストと労力を要する。また、特許文献５のように実験微生物に有機溶媒耐性に対して古典的変異導入法を用いて、優れた微生物を作製することも、多大な労力を必要として現実的には困難であり、所望の生物が得られないことが多い。
【特許文献１】特開昭６３−２１６４７３号
【特許文献２】特開昭６３−２１６４７４号
【特許文献３】特開２００４−０３３０４５号
【特許文献４】特開平１１−２２１０８号
【特許文献５】特開平０７−２５５４６２号
【特許文献６】特許第第２９６７２０２号
【非特許文献１】Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， Ｊｕｌｙ  １９９８， ｐ３３２３−３３２９
【非特許文献２】Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， Ｊｕｌｙ  ２００１， ｐ３９６７−３９７３
【非特許文献３】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｌｙ  １９９９， ｐ４４９３−４４９８
【非特許文献４】Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｅｐｔ  ２００３， ｐ５１２０−５１２７
【非特許文献５】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２０００． Ｖｏｌ． ２７５， Ｎｏ．１４， １００８５−１００９２
【非特許文献６】Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９１． ５５（７）： １９３５−１９３８
【非特許文献７】Ｎａｔｕｒｅ， １９９０，Ｖｏｌ．３４６，７９−８１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、有機溶媒耐性能のない実験微生物に対して、低コスト、短時間で、効率よく、さらに各種有機溶媒に対して有機溶媒耐性に優れた形質を付与する方法を提供することである。
【００１３】
また、本発明の別の目的は、有機溶媒耐性に優れた形質を付与した微生物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の上記目的は、鋭意検討の結果、遺伝子の複製において正確さにかける生物を用いて、通常では生育しない有機溶媒存在下で培養し、生育する生物を単離することを特徴とする有機溶媒耐性微生物の作製方法によって達成された。
【００１５】
本発明の生物を得るために、工夫した点としては、例えば、（１）培養スケールを最低でもどれ位にすべきかの検討し、200ｍｌ培養で実施すれば、安定して耐性株が作製できることを発見したこと、（２）有機溶媒（例えば、ヘキサン）の濃度をいきなり所望の濃度（例えば、10％）ではなく、はじめに最大許容濃度よりも低い濃度（例えば、0.5％）で処理したことにある。
【００１６】
このほかに培養については、例えば、（３）４ｍｌの培養スケールでは耐性株を得ることはできず、２００ｍｌの培養ではできたこと；（４）培養を始める最初の投入する細胞数を通常よりは非常に多くする（１０８cells/ml)（５）一気に有機溶媒濃度を上げるのではなく、前処理として細胞の増殖を抑制しない程度のわずかな量の有機溶媒を加えて培養してから、最終濃度の有機溶媒にさらすと耐性が取れやすいことを見出した。
【００１７】
従って、本発明は、以下を提供する。
（１）有機溶媒耐性を有する生物であって、上記生物は、上記生物の天然型が有する耐性よりも高い耐性を有する、生物。
（２）上記有機溶媒は、ベンゼン、イソオクタン、シクロヘキサン、ヘキサンおよびトルエンからなる群より選択される、項１に記載の生物。
（３）上記耐性は、ヘキサンに対して少なくとも１％の濃度での耐性である、項１に記載の生物。
（４）上記耐性は、ヘキサンに対して少なくとも２％の濃度での耐性である、項１に記載の生物。
（５）上記耐性は、ヘキサンに対して少なくとも６％の濃度での耐性である、項１に記載の生物。
（６）上記耐性は、ヘキサンに対して少なくとも１０％の濃度での耐性である、項１に記載の生物。
（７）上記耐性は、ヘキサンに対して少なくとも２０％の濃度での耐性である、項１に記載の生物。
（８）上記耐性は、ヘキサンに対する耐性とイソオクタンに対する耐性とを含む、項１に記載の生物。
（９）上記耐性は、ヘキサンに対して少なくとも１％の濃度での耐性である、項８に記載の生物。
（１０）上記耐性は、ヘキサンに対して少なくとも２％の濃度での耐性である、項８に記載の生物。
（１１）上記耐性は、ヘキサンに対して少なくとも６％の濃度での耐性である、項８に記載の生物。
（１２）上記耐性は、ヘキサンに対して少なくとも１０％の濃度での耐性である、項８に記載の生物。
（１３）上記耐性は、ヘキサンに対して少なくとも２０％の濃度での耐性である、項８に記載の生物。
（１４）上記耐性は、イソオクタンに対して少なくとも２％の濃度での耐性であり、項８に記載の生物。
（１５）上記耐性は、イソオクタンに対して少なくとも２％の濃度での耐性である、上記生物はＳａｃｃｈａｒｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｖｉｓｉａｅである、項８に記載の生物。
（１６）上記耐性は、イソオクタンに対して少なくとも６％の濃度での耐性である、項８に記載の生物。
（１７）上記耐性は、イソオクタンに対して少なくとも１０％の濃度での耐性である、項８に記載の生物。
（１８）上記耐性は、イソオクタンに対して少なくとも１０％の濃度での耐性であり、上記生物はＳａｃｃｈａｒｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｖｉｓｉａｅである、項８に記載の生物。
（１９）上記耐性は、ヘキサンとイソオクタンとを含む溶媒に対する耐性とを含む、項１に記載の生物。
（２０）上記ヘキサンとイソオクタンとは、それぞれ、１０％および５％で含まれる、項１９に記載の生物。
（２１）上記耐性は、有機溶媒環境において少なくとも２日以上生存することを包含する、項１に記載の生物。
（２２）上記耐性は、有機溶媒環境において少なくとも６日以上生存することを包含する、項１に記載の生物。
（２３）上記生物は、酵母である、項１に記載の生物。
（２４）上記生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の生物である、項１に記載の生物。
（２５）上記生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、項１に記載の生物。
（２６）有機溶媒に対する耐性が改善された生物を作製するための方法であって、上記方法は：
Ａ）目的の生物を、上記有機溶媒について、正常状態での最大許容濃度〜上記最大許容濃度の約１／２の濃度で培養する工程；
Ｂ）上記目的の生物を、上記有機溶媒について、改善について所望の濃度で培養する工程；および
Ｃ）生存する生物を選択し再生産する工程、
を包含する、方法。
（２７）上記最大許容濃度の約１／２の濃度は、ヘキサン０．５％である、項２６に記載の方法。
（２８）上記培養は、少なくとも２００ｍｌでの培養である、項２６に記載の方法。
（２９）上記培養工程Ａ）は、少なくとも１０８細胞／ｍｌの細胞密度で行われる、項２６に記載の方法。
（３０）上記培養工程Ｂ）は、上記最大許容濃度よりもわずかに増やした濃度で培養し、培養後、必要に応じて、さらに濃度を増加させ、これを上記改善について所望の濃度に増加するまで繰り返すことを包含する、項２６に記載の方法。
（３１）  Ｄ）上記生物の遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を調節する工程をさらに包含する、項２６に記載の方法。
（３２）  上記エラープローン頻度を調節する工程は、上記生物のＤＮＡポリメラーゼのエラープローン頻度を調節することを包含する、項２６に記載の方法。
（３３）  上記ＤＮＡポリメラーゼは、真核細胞におけるＤＮＡポリメラーゼα、ＤＮＡポリメラーゼβ、ＤＮＡポリメラーゼγ、ＤＮＡポリメラーゼδおよびＤＮＡポリメラーゼεならびにそれらに対応するＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される少なくとも１つのポリメラーゼを含む、項３２に記載の方法。
（３４）  上記ＤＮＡポリメラーゼは、真核細胞におけるＤＮＡポリメラーゼδおよびＤＮＡポリメラーゼεならびにそれに対応するＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される少なくとも１つのポリメラーゼを包含する、項３２に記載の方法。
（３５）上記生物は、真核生物である、項２６に記載の方法。
（３６）上記生物は、分離した細胞の状態で存在する、項２６に記載の方法。
（３７）上記生物は、動物、植物、真菌または酵母の細胞である、項２６に記載の方法。
（３８）上記生物は、酵母である、項２６に記載の方法。
（３９）上記生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の生物である、項２６に記載の方法。
（４０）上記生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの生物である、項２６に記載の方法。
（４１）上記生物は、所望の形質の変換後も、野生型と実質的に同じ成長を示す、項２６に記載の方法。
（４２）上記所望の濃度は、上記最大許容濃度よりも高い濃度である、項２６に記載の方法。
（４３）項２６〜４２のいずれか１項に記載の方法によって生産された生物。
（４４）菌学的性質は、所望の有機溶媒耐性以外は野生型と同じである生物。
（４５）生物の有機溶媒耐性能を評価する方法であって、
Ａ）該生物を、該生物が通常生育する条件下で生育させる工程；
Ｂ）該有機溶媒存在下または不存在下で該生物を生育させる工程；および
Ｃ）該生物が死滅する該有機溶媒の濃度を決定する工程、
を包含する、方法。
（４６）
前記生物が死滅しているか否かの決定は、その細胞が形を維持している細胞かどうかを判定基準として用いることを特徴とする、項４５に記載の方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、各種の有機溶媒に対して、耐性に優れた微生物作製が可能となる。また、本発明は、有機溶媒耐性機構を解明するためのコストが不要で、これまでに解明された実験微生物のゲノム情報や開発されたベクター系が有効活用されることになる。本発明により得られる生物は、有機溶媒耐性以外の点については、正常な生物と同様の正常な機能を有している。有機溶媒耐性のみの機能が変更されていることから、他の特性が保持された所望の生物を提供することが可能である。
【００１９】
古典的な変異導入方法では、変異導入の処理をした後、培養をするが、培養期間中は基本的に変異導入の処理をしない。一方、本発明の方法は、培養期間中も変異は継続的に導入され、より優れた形質の生物を迅速に作製することが可能である。
【００２０】
さらには、バイオプロセスで本発明が利用された場合、触媒酵素が有機溶媒に対し優れた耐性を有していなくても、触媒活性を発揮可能となり、生物の特徴である自己複製（増殖）によって低コスト化が期待される。その他には、高温・高圧のケミカルプロセスを常温・常圧のバイオプロセスに変換することによって、製造設備の規模縮小やエネルギー消費の軽減が図られ環境への負荷が削減される。
【００２１】
本発明を用いることにより、石油化学分野のファインケミカルや医薬、農薬品原料・中間体など製造のケミカルプロセスから、微生物を利用したバイオプロセス（いわゆる微生物変換）に代替するための宿主微生物として利用に関する。現在、有機溶媒中での精製酵素を用いた触媒反応で実施されている反応系を、例えば、ヘキサン存在下での酵素を用いた触媒反応として、リパーゼを用いた長鎖脂肪酸のエタノールによるエステル化反応（Ａ．Ｚａｉｄｉら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２  Ｆｅｂ  ２８；９３（３）：２０９−２１６）、ヘキサン存在下で固定化リパーゼを触媒としたオレオイルオレエート（Ｏｌｅｙｌ  ｏｌｅａｔｅ）の合成（Ｊ．Ｚｈａｎｇら、Ｃｈｉｎ  Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９５；１１（４）：２４３−５１）、シクロヘキサン存在下で固定化リパーゼを触媒としてラセミ体イブプロフェン（ｒａｃｅｍｉｃ  ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ）からプロドラッグである２−Ｎ−モルホリノエチル（Ｓ）−イブプロフェンエステル（２−Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈｙｌ（Ｓ）−ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ  ｅｓｔｅｒ）の合成（Ｊ．Ｃ．Ｃｈｅｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． ２０００  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；１６（６）：９８６−９９２）が、本発明において、有機溶媒耐性に優れた微生物を用いたバイオプロセスに利用される。
【００２２】
本発明は、さらに、ヘキサンなどの特定の有機溶媒について耐性を付与させると、それによって得られた株（例えば、１０％ヘキサン耐性株）は、他の有機溶媒（２％イソオクタン、５％イソオクタン）に対する耐性（その存在下で増殖できる）という予想外の効果を見出すことができた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００２４】
（用語）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００２５】
本明細書において「生物」とは、当該分野における最も広義に用いられ、生命現象を営むものをいい、代表的には、細胞構造、増殖（自己再生産）、成長、調節性、物質代謝、修復能力など種々の特性を有し、通常、核酸のつかさどる遺伝と、タンパク質のつかさどる代謝の関与する増殖を基本的な属性として有する。生物には、ウイルス、原核生物、真核生物（酵母のような単細胞生物、植物、動物のような多細胞生物など）などが包含される。本発明の方法は、グラム陽性細菌、および真核生物などの高等生物を含む、どのような生物であっても適用され得ることが理解される。本明細書では、サイズの小さな生物を「微生物」とも呼ぶが、有機溶媒耐性という点では同一であるので、本明細書では、生物と微生物とは交換可能に使用され得ることが理解される。
【００２６】
本明細書において「真核生物」とは、当該分野において通常用いられる意味と同様に用いられ、核膜のある、明確な核構造を持つ細胞からなる生物をいう。真核生物としては、例えば、酵母のような単細胞生物、イネ、コムギ、トウモロコシ、ダイズのような植物、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、サルのような動物、ハエ、カイコなどの昆虫が挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、酵母、線虫、ショウジョウバエ、カイコ、イネ、コムギ、ダイズ、トウモロコシ、シロイヌナズナ、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、カエル、魚類（例えば、ゼブラフィッシュ）などがモデルとして使用され得るがそれらに限定されない。
【００２７】
本明細書において「原核生物」とは、当該分野において通常用いられる意味と同様に用いられ、明確な核構造を持たない細胞からなる生物をいう。原核生物としては、例えば、大腸菌、サルモネラ菌のようなグラム陰性細菌、枯草菌、放線菌、ブドウ球菌のようなグラム陽性細菌、藍藻類、水素細菌などが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、代表的に、大腸菌以外に、グラム陽性細菌、として使用され得るがそれに限定されない。
【００２８】
本明細書において「動物」は、当該分野において最も広義で用いられ、脊椎動物および無脊椎動物（例えば、節足動物）を含む。動物としては、哺乳綱、鳥綱、爬虫綱、両生綱、魚綱、昆虫綱、蠕虫綱などが挙げられるがそれらに限定されない。動物は、好ましくは、脊椎動物（例えば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）であり得るが、それらに限定されない。ある一つの実施形態では、動物は、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）であり得るがそれらに限定されない。さらに好ましくは、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）または他のモデル動物となり得る種（例えば、奇蹄類、偶蹄類、マウスなどの齧歯類、ウサギ目など）であり得るがそれらに限定されない。本発明の方法は、生物であればどのようなものであっても適用できることが本発明において初めて解明されたことから、どのような生物であっても、対象とされ得ることが理解されるべきである。
【００２９】
本明細書において用いられる「植物」とは、植物界に属する生物の総称であり、クロロフィル、かたい細胞壁、豊富な永続性の胚的組織の存在，および運動する能力がない生物により特徴付けられる。代表的には、植物は、細胞壁の形成・クロロフィルによる同化作用をもつ顕花植物をいう。「植物」は、単子葉植物および双子葉植物のいずれも含む。好ましい植物としては、有用植物、例えば、コムギ、トウモロコシ、イネ、オオムギ、ソルガムなどのイネ科に属する単子葉植物が挙げられるがそれらに限定されない。好ましい植物のほかの例としては、タバコ、ピーマン、ナス、メロン、トマト、サツマイモ、キャベツ、ネギ、ブロッコリー、ニンジン、キウリ、柑橘類、白菜、レタス、モモ、ジャガイモおよびリンゴが挙げられる。好ましい植物は作物に限られず、花、樹木、芝生、雑草なども含まれる。特に他で示さない限り、植物は、植物体、植物器官、植物組織、植物細胞、および種子のいずれをも意味する。植物器官の例としては、根、葉、茎、および花などが挙げられる。植物細胞の例としては、カルスおよび懸濁培養細胞が挙げられる。本発明の方法は、生物であればどのようなものであっても適用できることが本発明において初めて解明されたことから、どのような生物であっても、対象とされ得ることが理解されるべきである。
【００３０】
本明細書において、「遺伝子」とは、細胞中に存在する核酸の一定の長さの配列をいう。本発明において遺伝子は、遺伝形質を規定するものであっても規定しないものであってもよい。本明細書において、遺伝子は、通常ゲノムに存在するものをさすが、それに限定されず、染色体外の配列、ミトコンドリアの配列なども包含することが理解される。多くの遺伝子は、通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子（たとえば、プロモーター）という。本明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含する。したがって、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子というときは、通常、ＤＮＡポリメラーゼの構造遺伝子ならびにＤＮＡポリメラーゼのプロモーターなどの転写および／または翻訳の調節配列の両方を包含する。本発明では、構造遺伝子のほか、転写および／または翻訳などの調節配列もまた、本発明が対象とする遺伝子として有用であることが理解される。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」ならびに／または「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を指すことがある。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現された「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」ならびに／または「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を包含する。当業者であれば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて理解することができる。
【００３１】
本明細書において「遺伝子の複製」とは、遺伝物質であるＤＮＡまたはＲＮＡにおいて，親の核酸鎖を鋳型として，親核酸と同一の構造と機能を有する新しい核酸分子（ＤＮＡであればＤＮＡ、ＲＮＡであればＲＮＡ）を生成することをいう。真核細胞では，二本鎖ＤＮＡ分子上にある多数の複製開始点に複製酵素（ＤＮＡポリメラーゼα）を含む複製開始複合体が形成されることによって複製が開始され、複製反応が複製開始点から両方向へ進行する。複製開始は、細胞周期によって制御される。酵母における自立複製配列（ＡＲＳ＝ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は複製開始点とされる。大腸菌などの原核細胞では、ゲノムの二本鎖環状ＤＮＡ分子に１個の複製開始点（ｏｒｉ）が存在し、ｏｒｉに複製開始複合体が形成され、反応はｏｒｉから両方向に進行する。複製開始複合体は複製酵素（ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ）を含む１０種類以上のタンパク質因子を含む複雑な構造を有する。複製反応は、二本鎖ＤＮＡのらせん構造の部分的巻戻しに始まり、その後短いＤＮＡプライマーが合成され、３’−ＯＨ基から新たなＤＮＡ鎖が伸長され、相補鎖鋳型において岡崎フラグメントが合成され、岡崎フラグメントの連結、鋳型と照らし合わせる校正（プルーフリーティング）などの多段階の反応によって複製反応が進行する。
【００３２】
生物の遺伝情報であるゲノムＤＮＡの複製機構は、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  Ａ．ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ  Ｔ．，“ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｆｒｅｅｍａｎ，１９９２に詳述されている。代表的には、１つの１本鎖ＤＮＡを鋳型として相補的な鎖を合成し、その結果、１つの２本鎖ＤＮＡを生じる酵素（ＤＮＡ複製を行う酵素）を、ＤＮＡポリメラーゼという。ＤＮＡ複製には、少なくとも２つのＤＮＡポリメラーゼが必要である。通常、リーディング鎖およびラギング鎖の合成を同時に行わなければならないからである。ＤＮＡ複製は、ＤＮＡ上の決まった位置から開始されるが、その位置を複製開始点（ｏｒｉ）という。例えば、細菌では、通常、環状ゲノムＤＮＡに少なくとも１つの両方向性の複製開始点を有する。これらを総合すると、通常は、１つのゲノムＤＮＡ複製には、４つのＤＮＡポリメラーゼが同時に作用する必要があることになる。本発明では、好ましくは、リーディング鎖およびラギング鎖の一方のみの複製誤りが調節されることが有利であり得、あるいは、二本の鎖のあいだの複製誤りの頻度が異なることが有利であり得る。
【００３３】
本明細書において「複製誤り」とは、遺伝子（ＤＮＡなど）の複製の過程で生じるヌクレオチド取り込みの誤りをいう。複製誤りは、通常、生体では、その頻度は１０８〜１０１２回に１回程度できわめて低い。複製誤りの頻度が低い理由としては、ヌクレオチドの取り込みが鋳型ＤＮＡと取り込まれるヌクレオチドとが相補的な塩基対を形成することによって複製が起こること、ＤＮＡポリメラーゼδ、εなどの酵素の校正機能すなわち３’→５’エキソヌクレアーゼが，鋳型に相補性を示さないヌクレオチドが誤って取り込まれたときそれを察知し直ちに切り出す機能が存在することなどが挙げられる。従って、本発明において複製におけるエラープローン頻度の調節は、特異的塩基対形成の障害、校正機能の障害などによって行うことができる。
【００３４】
本明細書において「エラーフリー」とは、遺伝子（ＤＮＡなど）の複製にいて誤りがほとんどない、好ましくは実質的に全くない性質をいう。エラーフリーは、主に、校正機能を有する酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼδ、εなど）の校正機能の精度によって影響を受ける。
【００３５】
本明細書において「エラープローン」とは、遺伝子（ＤＮＡなど）の複製における誤り易い（すなわち、複製誤りの）性質をいう。エラープローンは、主に、校正機能を有する酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼδ、εなど）の校正機能の精度によって影響を受ける。
【００３６】
本明細書においてエラープローンとエラーフリーとは、絶対的に（すなわち、エラープローン頻度のレベルなどで決定する）分類することができ、あるいは相対的（２種類以上の遺伝子の複製を担う因子（例えば、ＤＮＡポリメラーゼなど）におけるエラープローン頻度について多いほうをエラープローンとし、少ないほうをエラーフリーとする）に分類することができる。
【００３７】
本明細書において「エラープローン頻度」とは、エラープローンの性質のレベルをいう。エラープローン頻度は、例えば、遺伝子配列における変異の絶対数（変異の数そのもの）または相対数（全長における変異の数の比率）で表現することができる。あるいは、ある生物または酵素について言及するとき、エラープローン頻度は、ある生物の生殖または分裂１回あたりの遺伝子配列における変異の絶対数または相対数で表現してもよい。特に言及しない場合、遺伝子配列における複製過程１回あたりの誤差の数で表される。エラープローン頻度は、逆の尺度として本明細書において「精度」ということがある。エラープローン頻度が均一であるとは、複数の遺伝子の複製を担う因子（ポリメラーゼなど）に言及するとき、互いのエラープローン頻度が実質的に等しいことをいう。他方、エラープローン頻度が不均一であるとは、有意な差異が複数の遺伝子の複製を担う因子（ポリメラーゼなど）に存在する場合をいう。
【００３８】
本明細書において「エラープローン頻度の調節」とは、エラープローン頻度を変化させることをいう。そのようなエラープローン頻度の調節には、エラープローン頻度の上昇および低減が含まれる。エラープローン頻度の調節のための手法としては、例えば、校正機能を有するＤＮＡポリメラーゼの改変、複製中に重合反応または伸長反応を阻害または抑制するような因子の挿入これらの反応を促進するような因子の阻害、抑制、単数または複数の塩基の欠損、ＤＮＡ修復酵素の欠損、異常塩基の除去修復因子機能を有する酵素の改変、ミスマッチ塩基対修復因子の改変、複製自体の精度の低減などが挙げられるがそれらに限定されない。エラープローン頻度の調節は、ＤＮＡの二本鎖の両方に対して行われてもよいし、片方のみに対して行われてもよい。好ましくは、片方のみに対して行われることが有利であり得る。有害な変異誘発が低減されるからである。
【００３９】
本明細書において「ＤＮＡポリメラーゼ」またはＰｏｌとは、４種類のデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸からピロリン酸を遊離してＤＮＡを重合する働きを有する酵素をいう。ＤＮＡポリメラーゼ反応には、鋳型となるＤＮＡ、プライマー分子、Ｍｇ２＋などが必要とされる。プライマーの３’−ＯＨ末端に鋳型に相補的なヌクレオチドを順次付加し分子鎖を伸長する。
【００４０】
大腸菌にはＤＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩの少なくとも３種類の酵素が知られている。ＤＮＡポリメラーゼＩはＤＮＡ傷害の修復，遺伝的組換えおよびＤＮＡ複製に関与する。ＤＮＡポリメラーゼＩＩおよびＩＩＩは補助的機能を有するといわれる。この酵素は数種のタンパク質からなるサブユニット構造をとり，その構成からコア酵素およびホロ酵素の２つに分けられる。コア酵素は，α、εおよびθから構成され、ホロ酵素には、α、εおよびθサブユニットのほかに、τ、γ、δおよびβの成分がある。真核生物細胞も複数のＤＮＡポリメラーゼをもつことが知られており、高等生物ではＤＮＡポリメラーゼα、β、γ、δおよびεなど多種類存在する。動物では、ＤＮＡポリメラーゼα（核ＤＮＡの複製に関与、細胞増殖期のＤＮＡ複製に作用）、ＤＮＡポリメラーゼβ（核でのＤＮＡの修復に関与、増殖期、停止期のＤＮＡ傷害の修復などの作用を有する）、ＤＮＡポリメラーゼγ（ミトコンドリアＤＮＡの複製と修復に関与。エキソヌクレアーゼ活性をもつ）、ＤＮＡポリメラーゼδ（ＤＮＡの伸長に関与。エキソヌクレアーゼ活性をもつ）、ＤＮＡポリメラーゼε（ラギング鎖のすき間の複製に関与。エキソヌクレアーゼをもつ）などが知られている。
【００４１】
校正機能を担うＤＮＡポリメラーゼ（グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、真核生物など）では、ＥｘｏＩ用のアミノ酸配列が３’→５’エキソヌクレアーゼ活性中心を担うとされており、この部位が校正機能の精度に影響すると考えられている。
【００４２】
配列番号１：Ｐｏｌ  ＩＩＩ：３１７−ＩＭＳＦＤＩＥＣＡＧＲＩ−３２８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；
配列番号２：Ｐｏｌ  ＩＩ：２８６−ＶＭＡＦＤＩＥＴＴＫＰＰ−２９７（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；
変異型ｐｏｌ−３遺伝子発現株（ＡＭＹ１２８−１、以下ｐｏｌ−３変異株と略す）は、この配列を有しているものと推定される。ＡＭＹ１２８−１の代表例は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３０（変異型ｐｏｌ−３遺伝子発現株（１倍体株）（ＡＭＹ１２８−１））（寄託日平成１７年８月１９日）として寄託済みである。また、変異型ｐｏｌ−３遺伝子発現株（２倍体株）（ＢＹＤ５）は、受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１３１（寄託日平成１７年８月１９日）として寄託済みである。野生型ｐｏｌ−３遺伝子発現株（１倍体株）（ＡＭＹ５２−３Ｄ）は、受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９（寄託日平成１７年８月１９日）として寄託済みである。
【００４３】
ここで明らかなように、校正機能を有するＤＮＡポリメラーゼは、アスパラギン酸およびグルタミン酸がよく保存されている。本明細書において、このようなアスパラギン酸およびグルタミン酸を含む領域は、本明細書において校正機能活性部位ということがある。
【００４４】
１つの好ましい実施形態では、このような３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が破壊されるような変異を、ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子（ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子）に導入することにより、校正機能が低下した（すなわち、エラープローン頻度が増加した）ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸分子およびポリペプチドを産生することができる。なお、校正機能の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性は、単一のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（ＰｏｌＣ，ＰＯＬ２，ＣＤＣ２等）において、ＤＮＡ重合活性を担う分子中に含まれる場合（例えば、真核生物、グラム陽性細菌等）と、ＤＮＡ重合活性をコードする遺伝子（例えば、ｄｎａＥ）とは異なる遺伝子（例えば、ｄｎａＱ）にコードされる場合（例えば、グラム陰性細菌等）があることが知られており（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  Ａ．ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ  Ｔ．，“ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ”，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｆｒｅｅｍａｎ，１９９２）、当業者は、それらの特性を理解したうえで、本発明におけるエラープローン頻度の調節を適宜行うことができる。例えば、真核生物などでは、校正機能は変化するが、ＤＮＡ重合活性はほとんど変化させない変異をＤＮＡポリメラーゼに導入することが好ましい。この場合、上述のような校正機能に関与する２つの酸性アミノ酸（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ  ｅｔ．ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０，ｐｐ．１７−２４，Ｊａｎ．１９９１；  Ｆｉｊａｌｋｏｗｓｋａ  ａｎｄ  Ｓｃｈａａｐｅｒ，“Ｍｕｔａｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｘｏ  Ｉ  ｍｏｔｉｆ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｄｎａＱ：Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｅｒｒｏｒ  ｃａｔａｓｔｒｏｐｈｅ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｖｏｌ．９３，ｐｐ．２８５６−２８６１，Ａｐｒ．１９９６）を改変すること（好ましくは、保存されない置換（例えば、アラニン、バリンなどへの置換））が挙げられるがそれらに限定されない。
【００４５】
本明細書において「校正機能」とは、細胞が受けたＤＮＡ損傷および／または誤りを検知し補修する機能をいう。そのような機能は、脱プリン、脱ピリミジンがある場合はそのまま塩基が挿入されることによるか、あるいは、Ａ−Ｐエンドヌクレアーゼ（ａｐｕｒｉｎｉｃ−ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）で一本鎖切断が入れられたのち５’→３’エキソヌクレアーゼで除去されることによって達成され得る。除去部分は、ＤＮＡポリメラーゼでＤＮＡ合成され補充され、正常ＤＮＡとの連結はＤＮＡリガーゼが行う。このような反応は、除去修復といわれる。アルキル化剤による化学修飾，異常塩基，放射線，紫外線などによるＤＮＡ塩基傷害などは傷害部分をＤＮＡグリコシダーゼで取り除かれた上で上記の反応で修復される（不定期ＤＮＡ合成）。そのような校正機能を有するＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、真核生物におけるＤＮＡポリメラーゼδ、ＤＮＡポリメラーゼεなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、校正機能の程度を表すために、忠実度という用語もまた用いられ得る。この忠実度との用語は、ＤＮＡ複製の正確さを意味する。正常なＤＮＡポリメラーゼは、通常、忠実度が高いＤＮＡポリメラーゼであり、改変により校正機能が低下したＤＮＡポリメラーゼは、忠実度が低いＤＮＡポリメラーゼであり得る。
【００４６】
このようなＤＮＡポリメラーゼの校正機能については、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．：Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，１２８６６−１２８７４（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｓａｂｏｔｉｎｏ，Ｒ．Ｄ．＆  Ｂａｍｂａｒａ，Ｒ．Ａ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，４８６５−４８６９（１９８７）；Ｗｕ，Ｃ．Ｉ．＆  Ｍａｅｄａ，Ｎ．：Ｎａｔｕｒｅ，３２７，１６７−１７０（１９８７）；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．Ｄ．＆  Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａｌ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，７０６４−７０６８（１９８８）；Ｔｈｏｍａｓ，Ｄ．Ｃ．，Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｍ．Ｐ．＆  Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．：Ｂａｓｉｃ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，５２，２８７−２９７（１９９０）；Ｔｒｉｎｈ，Ｔ．Ｑ．＆  Ｓｉｄｅｎ，Ｒ．Ｒ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，５４４−５４７（１９９１）；Ｗｅｓｔｏｎ−Ｈａｆｅｒ，Ｋ．，＆  Ｂｅｒｇ，Ｄ．Ｅ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２７，６４９−６５５（１９９１）；Ｖｅａｕｔｅ，Ｘ．＆  Ｆｕｃｈｓ，Ｒ．ｐ．ｐ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１，５９８−６００（１９９３）；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｉｚｕｔａ，Ｓ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｄ．Ｃ．＆  Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．：Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２６９，１７１１−１７１７（１９９４）；Ｒｏｃｈｅ，Ｗ．Ａ．，Ｔｒｉｎｈ，Ｔ．Ｑ．＆  Ｓｉｄｅｎ，Ｒ．Ｒ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７，４３８５−４３９１（１９９５）；Ｋａｎｇ，Ｓ．，Ｊａｗｏｒｓｋｉ，Ａ．，Ｏｈｓｈｉｒｎａ，Ｋ．＆  Ｗｅｌｌｓ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１０，２１３−２１８（１９９５）；Ｆｉｊａｌｋｏｗｓｋａ，Ｉ．Ｊ．，Ｊｏｎｃｚｙｋ，Ｐ．，Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋａ−Ｔｋａｃｚｙｋ，Ｍ．，Ｂｉａｌｏｓｋｏｒｓｋａ，Ｍ．＆  Ｓｃｈａａｐｅｒ，Ｒ．Ｍ．Ｐｒｏｃ．ＮａｔＪ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９５，１００２０−１００２５（１９９８）；Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋａ−Ｔｋａｃｚｙｋ，Ｍ．，Ｊｏｎｅｚｙｋ，Ｐ．，Ｂｉａｌｏｓｋｏｒｓｋａ，Ｍ．，Ｓｃｈａａｐｅｒ，Ｍ．＆  Ｆｉｊａｌｋｏｗｓｋａ，Ｉ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，１２６７８−  １２６８３（２０００）；Ｇｗｅｌ，Ｄ．，Ｊｏｎｅｚｙｋ，Ｐ．，Ｂｉａｌｏｓｋｏｒｓｋａ，Ｍ．，Ｓｃｈａａｐｅｒ，Ｒ．Ｍ．＆  Ｆｉｊａｌｋｏｗｓｋａ，Ｉ．Ｊ．：Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５０１，１２９−１３６（２００２）．Ｎｅｇａｔｉｖｅ；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｄ．Ｃ．＆  Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．：Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ］．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，３４６５−３４６９（１９９１）；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｄ．＆  Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；３２，４０８３−４０８９（１９９３）；Ｆｒａｎｃｉｎｏ，Ｍ．Ｐ．，Ｃｈａｃ，Ｌ．，Ｒｉｌｅｙ，Ｍ．Ａ．＆  Ｏｃｈｍａｎ，Ｈ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２，１０７−１０９（１９９６）；Ａ  Ｂｏｕｌｅｔ，Ｍ．Ｓｉｍｏｎ，Ｇ．Ｆａｙｅ，ＧＡ  Ｂａｕｅｒ  ＆  ＰＭ  Ｂｕｒｇｅｒｓ．ＥＭＢＯ  Ｊ，８，１８４９−１８５４，（１９８９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  Ａ，Ａｒａ��ｉ  Ｈ，Ｃｌａｒｋ  ＡＢ，Ｈａｍａｔａｋｅ  ＲＫ，＆  Ｓｕｇｉｎｏ  Ａ．Ｃｅｌｌ，６２（６），１１４３−１１５１，（１９９０）などを参照のこと。
【００４７】
本明細書において「ＤＮＡポリメラーゼδ」とは、真核生物のものをさす場合、ＤＮＡの伸長に関与する酵素であって、エキソヌクレアーゼ活性をもち、これに起因して校正機能を有するといわれる。このＤＮＡポリメラーゼδの校正機能の調節は、上記の校正機能に関連するアミノ酸配列に改変を導入することによって達成することができる。代表的なＤＮＡポリメラーゼδは、核酸配列およびアミノ酸配列として、ｐｏｌδ：Ｘ６１９２０  ｇｉ／１７１４１１／ｇｂ／Ｍ６１７１０．１／ＹＳＣＤＰＢ２［１７１４１１］に記載されている配列を有する。ＤＮＡポリメラーゼδは、Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０，２１６３−２１７０，１９９１に記載されており、その内容は本明細書において参考として援用される。
【００４８】
本明細書において「ＤＮＡポリメラーゼε」とは、真核生物のものをさす場合、ラギング鎖のすき間の複製に関与する酵素であって、エキソヌクレアーゼ活性をもち、これに起因して校正機能を有するといわれる。代表的なＤＮＡポリメラーゼεは、核酸配列およびアミノ酸配列として、ｐｏｌε：Ｍ６０４１６  ｇｉ／１７１４０８／ｇｂ／Ｍ６０４１６．１／ＹＳＣＤＮＡＰＯＬ［１７１４０８］に記載されている配列を有する。
【００４９】
ＤＮＡポリメラーゼδおよびεの分類は、ＨＵＧＯ分類によると別名はデルタがＰＯＬＤ１／ＰＯＬ３，イプシロンがＰＯＬＥ／ＰＯＬ２となっており、本明細書では、どの命名法をも用い得る。
【００５０】
その他ＤＮＡポリメラーゼの説明については、例えば、Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｃ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２２，１−２１，１９７８、Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｃ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ９２，３９７−４０８、Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｃ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．ＭＧＧ，１９５，４８７−４９０，１９８４、Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｃ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．ＭＧＧ．２００，８６−９１，１９８５（ＤＮＡポリメラーゼβおよびＤＮＡポリメラーゼζ）；Ｍａｈｅｒ  Ｖ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２６１，５９３−５９５，１９７６、ＭｃＧｒｅｇｏｒ，Ｗ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９，１４７−１５４、１９９９（ＤＮＡポリメラーゼη）；Ｓｔｒａｎｄ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６５，２７５−２７６，１９９３、Ｐｒｏｌｌａ  Ｔ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５，４０７−４１５，１９９４、Ｋａｔ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，６４２４−６４２８、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ  Ｎ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，６３１９−６３２３，１９９４、Ｆａｂｅｒ  Ｆ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．３，２５３−２５６，１９９４、Ｅｓｈｌｅｍａｎ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １０，３３−３７，１９９５、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，９４７３−９４７７，１９９１、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２，１４６７−１４７３，１９９３、Ｆｏｕｒｙ  Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１１，２７１７−２７２６，１９９２（ＤＮＡポリメラーゼλ、ＤＮＡポリメラーゼμなど）などに記載されており、その内容は本明細書において参考として援用される。
【００５１】
本明細書においてＤＮＡポリメラーゼなどの遺伝子および酵母などの生物の「野生型」は、もっとも広汎な定義では、天然に存在するＤＮＡポリメラーゼなどの遺伝子および酵母などの生物を含み、通常、天然に存在するＤＮＡポリメラーゼなどの遺伝子および酵母などの生物のうち、由来となる生物種においてもっとも広汎に存在するものをいう。従って、通常、ある種において最初に同定されるＤＮＡポリメラーゼなどの遺伝子および酵母などの生物の種は野生型といえる。野生型はまた、「天然標準型」ともいう。生物であれば、野生型は、酵素活性が正常であり得、形質が正常であり得、行動が正常であり得、生理が正常であり得、繁殖が正常であり得、ゲノムが正常であり得る。
【００５２】
本明細書において校正機能が「野生型のものよりも低い」とは、ある校正機能を有する酵素などについて言及するとき、その酵素の野生型よりも校正機能が低いこと（すなわち、その酵素での校正処理の後に残留する変異の数が野生型による校正処理の後に残留する変異の数よりも多いこと）をいう。そのような野生型との比較は、相対的または絶対的な表示によって行うことができる。そのような比較はまた、エラープローン頻度などによって行うことができる。
【００５３】
本明細書において「変異」とは、遺伝子について言及するとき、その遺伝子の配列の変化を生じることまたはその変化によって生じた遺伝子の（核酸またはアミノ酸）配列の状態をいう。本明細書では、例えば、変異は、校正機能について生じる遺伝子配列の変化について用いられる。本明細書では、特に言及しない場合は、変異は、改変と同義で用いられる。
【００５４】
有用な変異体を作製するためには、生物において変異誘発を行うことがもっとも一般的である。変異とは、通常、遺伝子をコードする塩基配列の変化をいい、ＤＮＡ配列の変化が包含される。変異は、それが発生した個体に与える影響により、大きく次の３種類に分けられる：Ａ）中立変異（ｎｅｕｔｒａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）：この変異は、ほとんどの変異が該当し、生物の成育および代謝にほとんど影響がない。Ｂ）有害変異（ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）：この変異は、中立変異よりは頻度は少ない。生物の成長または代謝を阻害する。有害変異には、生育に必須な遺伝子を破壊するような致死変異（ｌｅｔｈａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）も含まれる。微生物の場合、種によっても異なるが、通常全変異に占める有害変異の割合は、約１／１０〜１／１００とされている。Ｃ）有益変異（ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）：この変異は、生物の育種に有益な変異である。その発生頻度は中立変異と比較して極めて低い。したがって、有益変異が導入された生物個体を得るためには、大きな生物集団と、長い時間が必要となる。また、生物の育種の十分な効果は、単一の変異だけで現れることはまれであり、複数の有益変異の蓄積が必要であることが多い。従って、本発明は、有機溶媒耐性のみを付与する技術としては初めて提供されたことになる。
【００５５】
本明細書において「成長（または生長）」とは、ある生物について言及するとき、その生物の個体としての量的増大をいう。成長は、具体的には体長（身長）、体重などの計測値の増加で個体の量的増大を認識することができる。個体の量的増大は細胞の増大および細胞数の増加に依存する。
【００５６】
本明細書において「実質的に同じ成長（または生長）」とは、生物について言及するとき、その生物が、比較対象となる生物（例えば、遺伝形質の変換前の生物）と比較して、成長速度がほとんど変化しないことをいう。そのような成長速度がほとんど変化しない範囲には、例えば、通常の成長の統計分布における１偏差分以内に入ることなどが挙げられるがそれに限定されない。また、本発明の生物では、例えば、（１）子供の数が変わらない；（２）形態は変化するが、通常の人為的突然変異と違って、障害的ではなく、変異率が極めて高いにも拘わらず、見た目が“美しい”と予想される。（成長とは直接関係しないが、本発明の方法により創出された変異体の特徴だと考えられる）；（３）一度獲得した形質あるいは遺伝型あるいは表現型は後もどりしないなどの効果が得られる。
【００５７】
本明細書において生物の「生産」とは、ある生物について言及するとき、その生物の個体を作り出すことをいう。
【００５８】
本明細書において生物の「再生産」とは、ある生物について言及するとき、親個体から次の世代の新たな個体を作り出すことをいう。再生産には、生殖、繁殖など天然現象によるもの、クローン（核移植）技術などの人工技術などによるものが包含されるがそれらに限定されない。再生産に用いられる技術としては、例えば、植物の場合、１培養細胞から個体ができる；接木、挿し木などが挙げられるがそれらに限定されない。再生産によって生産された生物は、通常、親に由来する遺伝形質を有する。有性生殖によって再生産される生物では、再生産された生物は、通常２つの性にそれぞれ由来する遺伝形質を有する。通常、そのような由来遺伝形質は、２つの性に由来するものをほぼ等しい割合で有する。無性生殖によって再生される生物では、通常再生産された生物は、親に由来する遺伝形質を有する。
【００５９】
本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞）であってもよい。細胞の供給源としては、例えば、単一の細胞培養物であり得、あるいは、正常に成長したトランスジェニック動物の胚、血液、または体組織、または正常に成長した細胞株由来の細胞のような細胞混合物が挙げられるがそれらに限定されない。
【００６０】
本発明において使用される細胞は、どの生物由来の細胞（たとえば、任意の種類の単細胞生物（例えば、細菌、酵母）または多細胞生物（例えば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物）、植物（たとえば、単子葉植物、双子葉植物など）など））でもよい。例えば、脊椎動物（たとえば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）由来の細胞が用いられ、より詳細には、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）由来の細胞が用いられる。１つの実施形態では、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞、特にヒト由来の細胞が用いられるがそれに限定されない。本発明において用いられる細胞は、上記細胞は、幹細胞であってもよく体細胞であってもよい。そのような細胞は、移植目的に使用されるものであってもよい。あるいは、植物細胞としては、好ましくは、顕花植物（単子葉または双子葉）由来の細胞が用いられ、より好ましくは双子葉植物細胞が用いられ、より好ましくはイネ科、ナス科、ウリ科、アブラナ科、セリ科、バラ科、マメ科、ムラサキ科の植物由来の細胞が用いられる。さらに好ましくは、コムギ、トウモロコシ、イネ、オオムギ、ソルガム、タバコ、ピーマン、ナス、メロン、トマト、イチゴ、サツマイモ、アブラナ、キャベツ、ネギ、ブロッコリー、ダイズ、アルファルファ、アマ、ニンジン、キウリ、柑橘類、ハクサイ、レタス、モモ、ジャガイモ、ムラサキ、オウレン、ポプラおよびリンゴ由来の細胞が用いられる。植物細胞は、植物体の一部、器官、組織、培養細胞などであり得る。細胞、組織、器官または個体の形質転換法は、当該分野で周知である。そのような技術は、本発明において引用した文献などに十分記載されている。核酸分子の生物細胞への導入は、一過的であっても恒常的であってもよい。一過性または恒常性の遺伝子導入の技術はそれぞれ当該分野において周知である。本発明において用いられる細胞を分化させて形質転換植物を作出する技術もまた当該分野において周知であり、そのような技術は、本発明において引用した文献などに十分記載されていることが理解される。形質転換植物から種子を得る技術もまた、当該分野において周知であり、そのような技術は、本発明において引用した文献などに記載されている。
【００６１】
本明細書において「単離された」とは、通常の環境において天然に付随する物質が少なくとも低減されていること、好ましくは実質的に含まないことをいう。従って、単離された細胞とは、天然の環境において付随する他の物質（たとえば、他の細胞、タンパク質、核酸など）を実質的に含まない細胞をいう。核酸またはポリペプチドについていう場合、「単離された」とは、たとえば、組換えＤＮＡ技術により作製された場合には細胞物質または培養培地を実質的に含まず、化学合成された場合には前駆体化学物質またはその他の化学物質を実質的に含まない、核酸またはポリペプチドを指す。単離された核酸は、好ましくは、その核酸が由来する生物において天然に該核酸に隣接している（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列（即ち、該核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。
【００６２】
本明細書において、「樹立された」または「確立された」細胞とは、特定の性質（例えば、多分化能）を維持し、かつ、細胞が培養条件下で安定に増殖し続けるようになった状態をいう。
【００６３】
本明細書において細胞、生物などの「状態」とは、細胞の種々のパラメータ（例えば、細胞周期、外来因子に対する応答、シグナル伝達、遺伝子発現、遺伝子の転写など）に関する状況をさす。そのような状態としては、例えば、分化状態、未分化状態、外来因子に対する細胞応答、細胞周期、増殖状態などが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、特に、対象となる生物の環境、例えば、温度、湿度（例えば、絶対湿度、相対湿度など）、ｐＨ、塩濃度（例えば、塩全体の濃度または特定の塩の濃度）、栄養（例えば、炭水化物量など）、金属（例えば、金属全体の量または特定の金属（例えば、重金属）の濃度など）、ガス（例えば、ガス全体の量または特定のガスの量）、有機溶媒（例えば、有機溶媒全体の量または特定の有機溶媒（例えば、エタノールなど）の量）、圧力（例えば、局所圧または全体の圧など）、気圧、粘性、流速（例えば、培地中に生物が存在する場合のその培地の流速など）、光度（ある特定波長の光量など）、光波長（例えば、可視光のほか紫外線、赤外線なども含み得る）、電磁波、放射線、重力、張力、音波、対象となる生物とは異なる他の生物（例えば、寄生虫、病原菌など）、化学薬品（例えば、医薬品など）、抗生物質、天然物、精神的ストレス、物理的ストレスなどのようなパラメータに対する反応性または耐性を、そのような状態に関する指標として使用することができる。
【００６４】
本明細書において、「対応する」アミノ酸または核酸とは、あるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチド分子またはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸または核酸と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸または核酸をいい、特に酵素分子にあっては、活性部位（例えば、ＤＮＡポリメラーゼの校正機能を担う範囲など）中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸またはそれをコードする核酸をいう。例えば、アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。このような対応するアミノ酸または核酸は、当該分野において公知のアラインメント技術を用いて同定することができる。そのようなアラインメント技術としては、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，  ＳＢ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  ＣＤ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３，１９７０に記載される技術が挙げられるがそれに限定されない。
【００６５】
本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子の対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、マウスＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物（ヒト、ラット、ブタ、ウシなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、マウスＤＮＡポリメラーゼなど）の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えばヒト、ラット）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
【００６６】
（遺伝子工学）
本発明において用いられるＤＮＡポリメラーゼならびにそのフラグメントおよび改変体のようなタンパク質は、遺伝子工学技術を用いて生産および細胞内導入することができる。
【００６７】
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。そのような制限酵素部位およびマルチプルクローニング部位は、当該分野において周知であり、当業者は、目的に合わせて適宜選択して使用することができる。そのような技術は、本明細書に記載される文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）に記載されている。そのようなベクターとしては、例えば、プラスミドが挙げられる。
【００６８】
本明細書において「プラスミド」とは、染色体とは別個に存在して自律的に増殖する遺伝因子をいう。本明細書において、プラスミドは、特に言及するとき、核細胞のミトコンドリア、葉緑体などに含まれるＤＮＡは一般にはオルガネラＤＮＡと区別して呼び、プラスミドに入らないことが理解される。
【００６９】
そのようなプラスミドとしては、例えば、
大腸菌：ｐＥＴ（ＴＡＫＡＲＡ）、ｐＵＣ（ＴＯＹＯＢＯ）、ｐＢＲ３２２（ＴＯＹ  ＯＢＯ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＴＯＹＯＢＯ）  
酵母：ｐＡＵＲ（ＴＡＫＡＲＡ）、ｐＥＳＰ（ＴＯＹＯＢＯ）、ｐＥＳＣ（ＴＯＹＯＢＯ）  
枯草菌：ｐＨＹ３００ＰＬＫ（ＴＡＫＡＲＡ）  
糸状菌：ｐＰＲＴＩ（ＴＡＫＡＲＡ）、ｐＡＵＲ３１６（ＴＡＫＡＲＡ）  
動物細胞：ｐＣＭＶ（ＴＯＹＯＢＯ）、ｐＢＫ−ＣＭＶ（ＴＯＹＯＢＯ）
が挙げられるがそれらに限定されない。
【００７０】
本明細書において「発現ベクター」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカー、サイレンサーおよび／またはエンハンサーを含み得る。生物（例えば、動物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。特定のプロモーターなどを含ませることによって、一定条件下でエラープローン頻度を調節するように細胞を操作することができる。
【００７１】
本発明において用いられ得る原核細胞に対する「組み換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡ３（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（＋／−）、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰ、ｐＨＡＴ、ｐＵＣ１８、ｐＦＴ−ＤＥＳＴＴＭ４２ＧＡＴＥＷＡＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが例示される。
【００７２】
本発明において用いられ得る動物細胞に対する「組み換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（いずれもフナコシより市販）、ｐＡＧＥ１０７（特開平３−２２９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、ｐＡＧＥ１０３（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７））、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３））、マウス幹細胞ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉｒｕｓ）（ＭＳＣＶ）に基づいたレトロウイルス型発現ベクター、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰなどが例示される。
【００７３】
植物細胞に対する「組換えベクター」としては、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクターカリフラワーモザイクウイルスベクター、ジェミニウイルスベクターなどが例示される。
【００７４】
昆虫細胞に対する「組換えベクター」としては、バキュロウイルスベクターなどが例示される。
【００７５】
本明細書において「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。
【００７６】
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、通常ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。したがって、本明細書においてある遺伝子のプロモーターの働きを有する部分を「プロモーター部分」という。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモータ領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在する。
【００７７】
本明細書において「エンハンサー」とは、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられる配列をいう。そのようなエンハンサーは当該分野において周知である。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。
【００７８】
本明細書において「サイレンサー」とは、遺伝子発現を抑制し静止する機能を有する配列をいう。本発明では、サイレンサーとしてはその機能を有する限り、どのようなものを用いてもよく、サイレンサーを用いなくてもよい。
【００７９】
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
【００８０】
本明細書において、校正機能を改変したＤＮＡポリメラーゼなどをコードする核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、あるいは、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．およびその第三版（２００１），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
【００８１】
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。
【００８２】
（有機溶媒耐性）
本明細書において「有機溶媒」とは、有機物であって、常温で液体である物質をいう。
【００８３】
本明細書において「有機溶媒耐性」とは、有機溶媒に対して、耐性を有することをいう。そのような耐性とは、微量の有機溶媒の存在に対して、死滅しないことを少なくとも意味するが、より好ましくは、有機溶媒の存在下で成長することを意味し得る。
【００８４】
本明細書において使用され得る、有機溶媒としては、例えば、ベンゼン、イソオクタン、シクロヘキサン、ヘキサン、トルエンなどの炭化水素、１−ヘプタノールなどのアルコールおよびケトン（炭素数１〜８の直鎖または分岐鎖を有する、脂肪族アルコールおよび脂肪族ケトンなどが含まれ得る）が挙げられ、これらはそれぞれ単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００８５】
有機溶媒耐性は以下のようにして決定する。この生物の有機溶媒耐性能を評価する方法は、Ａ）該生物を、該生物が通常生育する条件下で生育させる工程；Ｂ）該有機溶媒存在下または不存在下で該生物を生育させる工程；およびＣ）該生物が死滅する該有機溶媒の濃度を決定する工程、を包含する。ここでは、前記生物が死滅しているか否かの決定は、その細胞が形を維持している細胞かどうかを判定基準として用いる。
【００８６】
あるいは、毒性の強い有機溶媒とは、ｌｏｇ  Ｐが小さい有機溶媒、すなわち水に溶け易い有機溶媒である、それ故、生物がこの毒性の強い有機溶媒を排除するためには、疎水性となることが重要であると考えられる。遊離脂肪酸はグリセロールリン酸を含まない脂肪酸であるので、脂質に組み込まれた脂肪酸より疎水性が大きい。ここで重要な点は、遊離脂肪  酸の絶対量ではなく、その割合である。たとえ絶対量が多くても、これに比例して脂質に組込まれた脂肪酸が多ければ疎水性は打ち消されてしまう。さらに、リポ多糖の高分子量側は親水性の糖がたくさん結合したものである。これがはずれた、膜に埋め込まれた部分の親水性は非常に小さい。それ故、高分子量側がなくなれば、疎水性となると考えられる。
【００８７】
本発明の方法において、微生物に有機溶媒を加えて選択培養する工程は、寒天培地上に変異処理した有機溶媒感受性微生物を塗布した上に有機溶媒を目的の濃度比率で重層しても良く又は液体培養において変異処理した有機溶媒感受性菌及び目的有機溶媒を一緒に入れて培養しても良い。また、ｐＨ、温度及び通気の割合（通気する場合）等の条件も当業者によって容易に設定され得るが、好ましくは、その微生物が成育する条件が良いことは言うまでもない。
【００８８】
生物に対して極めて毒性（殺菌力）の高い有機溶媒としては、１−ヘプタノール及びベンゼンが挙げられる（Ａｋｉｒａ  Ｉｎｏｕｅ  ａｎｄ  Ｋｏｋｉ  Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ，“Ａ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｈｒｉｖｅｓ  ｉｎ  ｈｉｇｈ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｏｌｕｅｎｅ  ”，  Ｎａｔｕｒｅ  ｐ．２６４−２６８  Ｖｏｌ．３３８  １６  Ｍａｒｃｈ  １９８９）。この理由で、本発明の実施例では、ヘキサンのほか、ベンゼン、イソオクタン、シクロヘキサン、トルエン、１−ヘプタノール、１−ノナノール、１−デカノールなどを使用しても有機溶媒耐性微生物が得られ得る。他の有機溶媒に関しても本発明の方法により有機溶媒耐性微生物が得られることは当業者にとって自明のことであり、本発明でいう有機溶媒が、実施例により限定されるものではないと解釈されたい。
【００８９】
有機溶媒の微生物に対する毒性尺度として、現在一般的にｌｏｇ  Ｐｏｗ値が用いられている。ｌｏｇ  Ｐｏｗ値とは、水とｎ−オクタノールとの二相間における任意の物質の分配係数Ｐｏｗ値の常用対数であり、物質の極性を表す。任意の物質において、Ｐｏｗ値  は、（ｎ−オクタノール相における濃度）／（水相における濃度）として算出される。従って、ｌｏｇ  Ｐｏｗ値が低い物質は極性が高いことを示している。そして、一般的にｌｏｇ  Ｐｏｗ値が低い、すなわち極性の高い有機溶媒ほど微生物に対する毒性が強いことが明らかにされている（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３８８，２６４−２６６（１９８９））。そして、ある微生物が生育できる最も低いｌｏｇ  Ｐｏｗ値を、その微生物の有機溶媒耐性の程度の指標として利用することができる。本発明において、ｌｏｇ  Ｐｏｗ値を指標としてその有機溶媒耐性を評価することが出来る。なお、本明細書において用いるｌｏｇ  Ｐｏｗの数値は、各種有機溶媒の構造から算出されたものを使用する。算出の方法は、例えばＣｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  （Ｌｅｏ，  Ａ．  Ｊ．，  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｎｇ  ｌｏｇ  Ｐｏｃｔ  ｆｒｏｍ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．  ９３  ；  １２８１−１３０６．）  に記載の方法やｌｏｇ  Ｐｏｗ計算プログラムＣ  ｌｏｇ  Ｐ  ｖｅｒ．１．０．３  （Ｂｉｏ−Ｂｙｔｅ  ｃｏｒｐ．，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）  等を使用して行った。また、これら有機溶媒の存在量は、水に対する飽和濃度以上とする。
【００９０】
本発明の生物、および本発明の方法によって得られる生物は、３．３以上のｌｏｇ  Ｐｏｗ値の有機溶媒、例えばペンタン（３．３；ｌｏｇ  Ｐｏｗ値を表す。以下同様）、シクロヘキサン（３．３５）、ｏ−ジクロロベンゼン（３．６）、プロピルベンゼン（３．８）、ｎ−ヘキサン（３．９）、ジフェニルエーテル（４．２）、シクロオクタン（４．５）、イソオクタン（４．８）、ｎ−オクタン（４．９）、ヘキシルエーテル（５．１）、ｎ−ノナン（５．５）、ｎ−デカン（６．０）、ｎ−ドデカン（７．０）等の有機溶媒の、水に対する飽和濃度以上の濃度の存在下にあっても生存および生育が可能となる。
【００９１】
（一般生化学・分子生物学）
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔ  ＥＳ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【００９２】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【００９３】
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。
【００９４】
１つの局面において、本発明は、有機溶媒耐性を有する生物であって、該生物は、該生物の天然型が有する耐性よりも高い耐性を有する、生物を提供する。天然型の生物が有する有機溶媒に対する耐性は、以下の通りである：
酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）：
ベンゼン:  0.1%
イソオクタン:  0.1%
シクロヘキサン:  0.5%
ヘキサン:    1.0%
トルエン：    ０．１％
大腸菌もほぼ同様である。
【００９５】
１つの実施形態において、本発明は、ベンゼン、イソオクタン、シクロヘキサン、ヘキサンおよびトルエンなどの有機溶媒に対して耐性が改善された生物を提供する。
【００９６】
１つの実施形態において、本発明は、ヘキサンに対して少なくとも１％の濃度の耐性を有する生物を提供する。これまで、ヘキサンに対して多くとも１％未満の濃度までしか耐性がある生物が存在していなかった。従って、本発明は、従来存在しなかった生物を提供するという顕著な効果を奏する。好ましい実施形態では、本発明は、ヘキサンに対して少なくとも２％の、より好ましくは少なくとも４％の、さらに好ましくは少なくとも６％の、さらにより好ましくは少なくとも１０％の、最も好ましくは少なくとも２０％の濃度の耐性を有する生物を提供する。ここで、ヘキサンなどの有機溶媒に対する耐性は、その耐性とすべき環境中に少なくとも２日間、好ましくは４日間、さらに好ましくは６日間生存している（少なくとも生存率が２０％）ことを意味する。
【００９７】
１つの実施形態において、本発明は、イソオクタンに対して少なくとも１％の濃度の耐性を有する生物を提供する。これまで、イソオクタンに対して多くとも１％未満の濃度までしか耐性がある生物が存在していなかった。従って、本発明は、従来存在しなかった生物を提供するという顕著な効果を奏する。好ましい実施形態では、本発明は、イソオクタンに対して少なくとも２％の、より好ましくは少なくとも４％の、より好ましくは少なくとも５％の、さらに好ましくは少なくとも６％の、さらにより好ましくは少なくとも１０％の、最も好ましくは少なくとも２０％の濃度の耐性を有する生物を提供する。ここで、イソオクタンなどの有機溶媒に対する耐性は、その耐性とすべき環境中に少なくとも２日間、好ましくは４日間、さらに好ましくは６日間生存している（少なくとも生存率が２０％）ことを意味する。
【００９８】
別の実施形態において、本発明の生物は、任意の微生物であり、さらに好ましくは、真核生物であり、さらにより好ましくは酵母である。さらにより好ましくは、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ属の生物である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが好ましい。別の実施形態では、本発明の生物は、原核生物であり得る。酵母については、有機溶媒１％でも耐性が獲得できていなかった。
【００９９】
さらに好ましい実施形態では、本発明の代表的な生物の代表的な例は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１２０（へキサン耐性（ＡＭＹ１２８−１−Ｈ１０）；１０％ヘキサンを含むＹＰＤ培地中で増殖可能な株）として寄託済み（寄託日２００５年７月２９日；ＡＭＹ１２８−１Ｈ−１０）である。
【０１００】
別の局面では、本発明はまた、菌学的性質は、所望の有機溶媒耐性以外は野生型と同じである生物を提供する。このような生物は、古典的な変異方法では、入手不可能であった。
【０１０１】
別の局面において、本発明は、有機溶媒に対する耐性が改善された生物を作製するための方法を提供する。この方法は、Ａ）目的の生物を、該有機溶媒について、正常状態での最大許容濃度〜該最大許容濃度の、代表的には、約１／２の濃度（正確には、耐性を付与する前の増殖を阻害しない最大濃度以下（１／２でも１／１０でも可）であればよい。これは、糖異業者であれば、適宜決定することができる。）で培養する工程；Ｂ）該目的の生物を、該有機溶媒について、改善について所望の濃度で培養する工程；およびＣ）生存する生物を選択し再生産する工程、を包含する、方法。この方法を用いると、ある有機溶媒で耐性をえることができると、他の有機溶媒に対する耐性を付与することができるという顕著な効果を奏する。例えば、ヘキサンに対する耐性を付与させると、イソオクタンに対する耐性を付与させることができる。このような再生産の方法には、当該分野において公知の技術を応用できることが理解される。
【０１０２】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、Ｄ）生物の遺伝子の複製におけるエラープローン頻度を調節する工程をさらに包含する。
【０１０３】
別の実施形態において、本発明において使用されるエラープローン頻度を調節する工程は、生物のＤＮＡポリメラーゼのエラープローン頻度を調節することを包含することが好ましい。本発明において使用されるＤＮＡポリメラーゼは、真核細胞におけるＤＮＡポリメラーゼα、ＤＮＡポリメラーゼβ、ＤＮＡポリメラーゼγ、ＤＮＡポリメラーゼδおよびＤＮＡポリメラーゼεならびにそれらに対応するＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される少なくとも１つのポリメラーゼを含む。
【０１０４】
好ましい実施形態において、本発明において使用されるＤＮＡポリメラーゼは、真核細胞におけるＤＮＡポリメラーゼδおよびＤＮＡポリメラーゼεならびにそれに対応するＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される少なくとも１つのポリメラーゼを包含する。
【０１０５】
好ましい実施形態では、本発明において用いられる生物は、真核生物（例えば、動物、植物、真菌または酵母の細胞）であり、より好ましくは酵母である。
【０１０６】
別の実施形態では、本発明において用いられる生物は、分離した細胞の状態で存在する。
【０１０７】
好ましい実施形態では、本発明において得られる生物は、所望の形質の変換後も、野生型と実質的に同じ成長を示す。古典的な変異誘発方法では、野生型と実施的に同じ成長を示すものはほとんど取れなかった。従って、本発明は、有機溶媒に対する耐性を持ちながら、かつ、野生型と実施的に同じ成長を呈する（正常型とほぼ同じ）性質を有する生物を提供するという点で従来技術では提供し得なかった生物を提供するという効果を奏する。
【０１０８】
別の実施形態では、本発明の方法において用いられる所望の濃度は、最大許容濃度よりも高い濃度であることが好ましい。最大許容濃度は、本発明の方法を実施する直前に実際に測定してもよく、あるいは、文献などから既知の数値を入手して使用してもよい。
【０１０９】
別の局面では、本発明は、本発明の方法によって生産された生物に関する。このような生物は、有機溶媒に対する耐性が従来技術にも増して増大しており、従来技術では入手できなかった有機溶媒耐性を有する生物であり得る。
【０１１０】
別の局面において、本発明は、生物の有機溶媒耐性能を評価する方法を提供する。この方法は、Ａ）該生物を、該生物が通常生育する条件下で生育させる工程；Ｂ）該有機溶媒存在下または不存在下で該生物を生育させる工程；およびＣ）該生物が死滅する該有機溶媒の濃度を決定する工程、を包含する。
【０１１１】
１つの実施形態において、生物が死滅しているか否かの決定は、その細胞が形を維持している細胞かどうかを判定基準として用いることができる。形を維持しているだけの細胞は、生存しているかどうかが不明であることから、トリパンブルー染色などにより従来はさらなる測定をする必要があったが、本発明において、有機溶媒中では、形を維持すること自体が生存の重要な指標であることが明らかになった。従って、この形の維持を指標とする評価方法は、従来技術に比して顕著に簡便な判定方法を提供する。
【０１１２】
ここで、形を維持しているかどうかの判定は、）形を維持している（細胞が生存している）と判断する基準は、きれいな球形で細胞の輪郭が明-確であること、形を維持できていないと判断する基準は、きれいな球形でなく輪郭が薄くしわがよって、細胞内が薄く透けていることであり、これらを判定することによって決定することができる。
【０１１３】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１１４】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１１５】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。以下の実施例において用いられる試薬類、例外を除き、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ、和光純薬（大阪、日本）などから市販されるものを用いた。以下において使用した動物は、日本の大学において規定される飼育規準を遵守して飼育および実験した。以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
【０１１６】
（実施例１：酵母菌の有機溶媒感受性試験方法）
酵母株の有機溶媒５種に対する感受性を以下の方法で検討した。
【０１１７】
（酵母株および試薬）
大阪市立大学の下田らから供与された変異型ｐｏｌ−３遺伝子発現株（ＢＹＤ５、以下ｐｏｌ−３変異株と略す。ＢＹＤ５は、受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１３１（寄託日平成１７年８月１９日）として〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センターに寄託済みである）と野生型ｐｏｌ−３遺伝子発現株（ＡＭＹ５２−３Ｄ、以下、野生株と略す。ＡＭＹ５２−３Ｄは、受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１２９（寄託日平成１７年８月１９日）として〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センターに寄託済みである。）を用いた。ＡＭＹ１２８−１の遺伝子型は、〔ｐｏｌ３−０１，ＭＡＴα，ｕｒａ３−５２，ｌｅｕ２−１，ｌｙｓ１−１，ａｄｅ２−１，ｈｉｓ１−７，ｈｏｍ３−１０，ｔｒｐ１−２８９，ｃａｎＲ〕であり、ＡＭＹ５２−３Ｄの遺伝子型は、〔ＭＡＴα，ｕｒａ３−５２，ｌｅｕ２−１，ｌｙｓ１−１，ａｄｅ２−１，ｈｉｓ１−７，ｈｏｍ３−１０，ｔｒｐ１−２８９，ｃａｎＲ〕である。試験に用いた有機溶媒５品目は和光純薬から購入し、そのカタログ番号は、クロロホルム（ｃａｔ．＃０３８−０２６０６）、ヘキサン（ｃａｔ．＃０８５−００４１６）、イソオクタン（ｃａｔ．＃２０２−０２８８６）、シクロヘキサン（ｃａｔ．＃０３７−０５０９６）、トルエン（ｃａｔ．＃２０４−０１８６６）である。
【０１１８】
液体培地のＹＰＤ  ｍｅｄｉｕｍ（ｃａｔ．＃６３０４０９）と寒天培地のＹＰＤ  Ａｇａｒ  ｍｅｄｉｕｍ（ｃａｔ．＃６３０４１０）は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入し、オートクレーブ（１２０℃、２０分）して使用した。
【０１１９】
（方法）
ｐｏｌ−３変異株と野生株を寒天培地プレート上にコロニーを形成させ、コロニーを白金耳でＹＰＤ培地４ｍｌに植え、３０℃、一晩（１６時間以上）振とう培養した。
【０１２０】
４０μｌの一晩培養液（１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を新鮮ＹＰＤ培地４ｍｌに植え継いだ。
そして、最終濃度が０．０２５％、０．１％、０．５％、１．０％、２．０％になるよう有機溶媒を添加した。比較のために、有機溶媒０％の培養も実施した。５種の有機溶媒は揮発性なので、ネジ口栓付培養試験管を用い有機溶媒の漏出を防いだ。
【０１２１】
３０℃、一晩振とう培養し、菌の増殖を吸光度、菌数のカウント、培養試験管の写真撮影などで増殖の有無の評価をした。１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上に菌の増殖が認められた最大の有機溶媒濃度を耐性濃度と定義した。広義には、増殖しなくとも生存していれば耐性と考えられるが、評価を簡便にするため、本実験では有機溶媒中で菌が増殖する場合、耐性を有すると評価した。
【０１２２】
（結果）
（１）  酵母２株は、５種の有機溶媒に対して同濃度の耐性を示した（表１）。
（２）  ５種の有機溶媒の中で菌の増殖を阻害しない最大濃度が、最小だったのはベンゼン、イソオクタン、トルエンで、耐性濃度は０．１％であった。この３種有機溶媒は酵母に対し、低濃度で増殖を阻害することから毒性が高いと考えられた。
（３）  一方、シクロヘキサンとヘキサンに対する耐性濃度は、それぞれ０．５％と１．０％と高く、菌に対する毒性が低いという結果であった。
【０１２３】
（表１．野生株とｐｏｌ−３変異株の有機溶媒に対する耐性濃度）
【０１２４】
【表１】
2007061022.tif 000002
（実施例２：有機溶媒耐性微生物の作製方法（１））
（２０ｍｌ培養でヘキサン耐性能を獲得させる方法）
培地２０ｍｌの連続培養で有機溶媒耐性能を獲得させるには以下のように行った。
【０１２５】
（使用した酵母株）
実施例１に同じく、ｐｏｌ−３変異株と野生株を使用した。
【０１２６】
（方法）
Ｐｏｌ−３変異株と野生株のコロニーをかきとり、４ｍｌのＹＰＤ培地を入れた試験管（φ１８ｍｍ）で３０℃、１８０ｒｐｍで一晩前培養した。
【０１２７】
前培養液を２００ｍＬのＹＰＤ培地を含む５００ｍＬ容三角フラスコに移植し、３０℃、１８０ｒｐｍで約１８時間回転振とう培養した。
【０１２８】
培養液を５０ｍＬ容の遠心チューブに集め、スウィングローターで遠心（１５００ｒｐｍ、５分間）して各酵母株を集菌した。
【０１２９】
集菌した酵母株を新しいＹＰＤ培地に再懸濁し、血球計算盤を用いて１ｍＬあたりの菌数を算出した。この細胞数をもとに、それぞれ最終的に１ｍＬあたり約４．２×１０８  細胞となるよう調製した。
【０１３０】
細胞密度を調整した各懸濁液２ｍＬ（約８．４×１０８  細胞）をそれぞれ１８ｍＬのＹＰＤ培地を入れた５０ｍＬ容遠沈管に加えた後、ヘキサンを最終濃度が１．０％、２．０％、４．０％、６．０％、８．０％をそれぞれ含むように添加した。
【０１３１】
有機溶媒添加後、３０℃、１８０ｒｐｍで回転振とう培養し、毎日、培養液１ｍＬを回収し菌濃度をカウントし増殖曲線を作成した。培養は７日間実施した。
【０１３２】
（結果）
（１）  ｐｏｌ−３変異株と野生株について、有機溶媒を含まない培地で培養したときの細胞数の変化を調べた結果、両株とも６日目で細胞密度が最大となった。細胞密度最大時には、野生株は２．０×１０８  ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、ｐｏｌ−３変異株は４．０×１０８  ｃｅｌｌｓ／ｍｌであった。また、ｐｏｌ−３変異株の細胞密度は野生株のおよそ２倍であった。
【０１３３】
（２）  有機溶媒としてヘキサンを含む培地で培養した結果、野生株における細胞の増殖はほとんど認められなかった（図１）。また、顕微鏡観察を行ったところ、ほとんどの細胞が萎縮し、死滅していた。一方、ｐｏｌ−３変異株においても多数の死滅細胞が確認されたものの、低いヘキサン濃度（１．０％、２．０％、４．０％）において数％程度の生存細胞が観察された。さらに、ヘキサン１．０％および２．０％においては４日目以降、著しい細胞の増殖が認められた（図２）。高いヘキサン濃度（６．０％、８．０％）では両株ともに増殖することなく死滅した。
【０１３４】
（実施例３：有機溶媒耐性微生物の作製方法（２））
（２００ｍｌ培養でヘキサン耐性能を獲得させる方法）
（方法）
野生株とｐｏｌ−３変異株を４ｍｌＹＰＤで前々培養し、続けて２００ｍｌＹＰＤで３０℃、一日前培養した。
【０１３５】
更に、ヘキサンを終濃度０．５％になるよう添加し、１２時間培養した後、ヘキサンを加え最終濃度１０％とし２４時間培養した。
【０１３６】
その後、１，０００ｒｐｍ、５分遠心し、菌体を回収し、ヘキサンを含まないＹＰＤ寒天プレートにまいた。
【０１３７】
３０℃で２日間静置培養し、出現したコロニー数をカウントした。
【０１３８】
（結果）
２００ｍｌＹＰＤ培養液で０．５％ヘキサン１２時間処理の開始時と終了時の菌濃度を測定した。野生株は１．１０倍に、ｐｏｌ−３変異株は２．３７倍に増加した（表２）。
１０％ヘキサン２４時間処理終了前後での菌濃度の増加を調べた。野生株は０．７６倍に、ｐｏｌ−３変異株は１．２９倍に増加した（表２）。
【０１３９】
１０％ヘキサン２４時間処理終了後、野生株の培養液を遠心し菌体を回収したが、沈殿は極くわずかであった。回収された菌体全量をプレートにまいたが、コロニーは全く形成されなかった（表３）。
【０１４０】
１０％ヘキサン２４時間処理終了後、ｐｏｌ−３変異株の培養液を遠心し多量の菌体が沈殿として回収された。そこで、回収菌体を５ｍｌに懸濁し、更に１，０００倍希釈した菌液１ｍｌをプレート１０枚にまいた結果、２４個のコロニーが形成された。従って、菌液の希釈倍率から計算して、２００ｍｌ培養液中には１０％ヘキサン耐性菌が１．２×１０５  ｃｅｌｌｓ存在したと推定された（表３）。
【０１４１】
（表２  １０％ヘキサン耐性株作製時の菌濃度）
【０１４２】
【表２】
2007061022.tif 000003
（表３  １０％ヘキサン耐性付与処理後に出現したコロニー数表３：）
【０１４３】
【表３】
2007061022.tif 000004
（実施例４：有機溶媒耐性微生物の判定）
（方法および結果）
実施例２で得られたコロニーをヘキサンを含まないＹＰＤ４ｍｌで一晩培養し、一晩培養液０．４ｍｌを新鮮なＹＰＤ培地３．２ｍｌに植え継ぎ、ヘキサンを最終濃度１０％加え、３０℃、１２０ｒｐｍで５日間培養し、増殖能を検討した。
【０１４４】
ヘキサンを含まないＹＰＤ培地のみの培養では、調べた５コロニー全部が１日で増殖した。１０％ヘキサンを含むＹＰＤ培地の培養では、５コロニー中２コロニーが１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌレベルまで増殖した（表４）。
【０１４５】
その２コロニーを再度、１０％ヘキサンを含むＹＰＤ培地で培養して増殖した酵母菌の写真を図３に示す。
【０１４６】
表４の１０％ヘキサン培地で増殖しなかった３コロニーの培養液を顕微鏡観察すると、菌の活発な増殖は認められないものの、トリパンブルーで染色されない生存した菌が培地中に存在していた。
【０１４７】
（表４    １０％ヘキサン中で再度、増殖したｐｏｌ−３変異株コロニー数の割合）
【０１４８】
【表４】
2007061022.tif 000005
（実施例５：１０％ヘキサン耐性ｐｏｌ−３変異株の生存率の比較）
野生株（ＷＴ）、１０％ヘキサン耐性付与前のｐｏｌ−３変異株（ＡＭＹ）、１０％ヘキサン耐性付与後のｐｏｌ−３変異株（Ｈ１０Ａ）のヘキサン存在下における生存率を比較した。
【０１４９】
（方法）
基本的操作は、実施例１．と同じ方法を用いた。ただ、培養開始時の植菌濃度は２×１０７〜４×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌに設定した点が異なる。
【０１５０】
本実施例では、培養開始時の菌濃度をヘキサン耐性付与時より減らしているため、菌の増殖が認められないが、ヘキサン存在下で培養開始後の生存菌数でヘキサン耐性度を評価した。生存率の評価としては、以下の式で計算した。  
【０１５１】
生存率（％）＝（形を維持している細胞／全体の細胞）×１００
この方法で形を維持している細胞は、トリパンブルーで染色されることはなく、また、ヘキサンを含まない培地に戻すと活発に増殖することからヘキサン培地中の形を維持した細胞は生存していると考えられる。
【０１５２】
（結果）
（１）野生株（ＷＴ）と１０％ヘキサン耐性付与前のｐｏｌ−３変異株（ＡＭＹ）では、調べたヘキサン濃度範囲（２〜２０％）で培養直に急激（１割以下）に生存率が低下した。
【０１５３】
（２）ヘキサン耐性ｐｏｌ−３変異株（Ｈ１０Ａ）では、２〜６％ヘキサン存在下の培養２日目で生存率５０％と高い生存率だった。Ｈ１０Ａは、１０％ヘキサンで耐性を付与したが、図６に示すように２０％ヘキサンに対しても低濃度ヘキサンと同レベルの生存率を示した。
【０１５４】
得られた株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１２０（へキサン耐性（ＡＭＹ１２８−１−Ｈ１０）；１０％ヘキサンを含むＹＰＤ培地中で増殖可能な株；平成１７年７月２９日寄託）として寄託済みである。
【０１５５】
（実施例６：１０％ヘキサン耐性株の他の有機溶媒中での増殖）
10％ヘキサン耐性付与後のpol-3変異株（H10A）が、ヘキサン以外の有機溶媒に対して耐性を獲得しているか、４種の有機溶媒存在下における細胞増殖を比較した。比較対象として、野生株(WT)を使用した。
【０１５６】
（方法）
基本的操作は、実施例２．と同じ方法を用いた。ただ、添加した有機溶媒をヘキサンの代わりに、実施例１で使用したベンゼン、イソオクタン、シクロヘキサン、トルエンを用いた点が異なる。使用濃度は、ベンゼン（０.２％、１．０％）、イソオクタン（２％、５％）、シクロヘキサン（２％、５％）、トルエン（０.２％、１．０％）の各２濃度とした。細胞増殖の評価は実施例２と同じく、血球計算盤を用いて顕微鏡観察で測定した。
【０１５７】
（結果）
（１）  調べた４種の有機溶媒の中でイソオクタンに対してのみ、pol-3変異株（H10A）は増殖した。イソオクタン２％と５％濃度下で、培養開始後２日目で既に急速な増殖が認められた。培養開始日に比べ、細胞数は、２％イソオクタン下では１０．３倍(図７．)に、５％イソオクタン下では１６．３倍(図８.)に増加した。このイソオクタン下での細胞の増加速度は、ヘキサン存在下での細胞の増加速度に同等であった(実施例２．図２)。野生株（WT）は、イソオクタン存在下で、細胞は増殖しなかった。イソオクタン下増殖したpol-3変異株（H10A）は、顕微鏡観察の結果、野生株と同じく形態がきちんと維持され、細胞輪郭が明瞭で、トリパンブルーで染色されることもなかったので、イソオクタン耐性を獲得しているものと考えられた。
【０１５８】
（２）  イソオクタン以外の３種の有機溶媒については、調べた２濃度について１１日間では細胞増殖は認められなかったので、耐性を獲得していないものと考えられた。
【０１５９】
（実施例７：その他の有機溶媒耐性微生物の作製）
（200ｍｌ培養でのイソオクタン耐性株の作製）
（方法と結果）
ヘキサンの代わりにイソオクタンを使用して、pol-3変異株からイソオクタン耐性株を作製した。基本的実験操作は、実施例３．に同じだが、１２時間の前培養時のイソオクタン濃度は、０．１％とした点が異なる。
【０１６０】
２％イソオクタン存在下の２００ｍｌ培養の２４時間後に、遠心回収され細胞は、ヘキサン耐性株の場合と同じ程度の細胞量ペレットが回収された。野生株の場合、同じ条件で培養した場合、遠心回収される細胞ペレットは肉眼的に確認できないほどごくわずかなもので、念のためそれらをすべて寒天プレートに播種しても全くコロニーは形成されなかった。
【０１６１】
一方、２％イソオクタン耐性株として、寒天プレートに出現したコロニーを２％イソオクタン存在下のＹＰＤ培地で増殖した耐性株の細胞の写真を図９．に示した。細胞同士が凝集しやすい性質がある以外は、細胞形態の外観は野生株とほぼ同じであった。
【０１６２】
今回得られた１０％ヘキサン耐性株について、他の有機溶媒について耐性が増加しているか検討したところ、イソオクタンに対する耐性が、０．５％から５％にアップしていた。ベンゼン、トルエン、シクロヘキサンについて、耐性はアップしていなかった。
また、イソオクタンにのみ耐性を有する株も取れた。
【０１６３】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１６４】
本発明によって、従来の方法に比べて、有機溶媒耐性を生物に迅速にかつ生物に対して有害な影響をほとんど与えずに、付与することが達成された。また、本発明によれば、簡便な操作により、生物の遺伝形質を改変することができる。これにより、従来の方法では得ることができなかったような、有機溶媒耐性を有する生物を効率よく得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】図１は、野生株の増殖に対する培地中ヘキサン濃度の影響を示す。横軸は日数、種々の点は、各々のヘキサン濃度を示す。縦軸は生存率を示すための細胞数を示す。
【図２】図２は、ｐｏｌ−３変異株の増殖に対する培地中のヘキサン濃度の影響を示す。横軸は日数、種々の点は、各々のヘキサン濃度を示す。縦軸は生存率を示すための細胞数を示す。
【図３】図３は、１０％ヘキサン中で増殖したｐｏｌ−３変異株の顕微鏡写真である。
【図４】図４は、野生株のヘキサン中での生存率を示す。横軸は培養期間を示し、縦軸は生存率を示す。種々のヘキサン濃度は、数値（％）にて示されている。
【図５】図５は、１０％ヘキサン耐性付与前のｐｏｌ−３変異株のヘキサン中での生存率を示す。横軸は培養期間を示し、縦軸は生存率を示す。種々のヘキサン濃度は、数値（％）にて示されている。
【図６】図６は、１０％ヘキサン耐性付与後のｐｏｌ−３変異株のヘキサン中での生存率を示す。横軸は培養期間を示し、縦軸は生存率を示す。種々のヘキサン濃度は、数値（％）にて示されている。
【図７】図７は、１０％ヘキサン耐性株の２％イソオクタンを含む培地での増殖を示す。図中、H10A:１０％ヘキサン耐性株、WT:野生株を示す。
【図８】図８は、１０％ヘキサン耐性株の５％イソオクタンを含む培地での増殖である。図中、H10A:１０％ヘキサン耐性株、WT:野生株を示す。
【図９】図９は、２％イソオクタン中で増殖したpol-3変異株の顕微鏡写真である。
【配列表フリーテキスト】
【０１６６】
（配列表の説明）
配列番号１は、酵母のポリメラーゼＰｏｌ  ＩＩＩの：３１７−３２８位アミノ酸情報（ＩＭＳＦＤＩＥＣＡＧＲＩ）を示す。
【０１６７】
配列番号２は、酵母のポリメラーゼＰｏｌ  ＩＩ：２８６−２９７位アミノ酸情報（ＶＭＡＦＤＩＥＴＴＫＰＰ）を示す。
【図１】
2007061022.tif 000006
【図２】
2007061022.tif 000007
【図３】
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【図４】
2007061022.tif 000009
【図５】
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【図６】
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【図７】
2007061022.tif 000012
【図８】
2007061022.tif 000013
【図９】
2007061022.tif 000014
【配列表】
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