(57)【要約】      （修正有）【課題】安定同位体元素でラベル化されたポリペプチド混合物を利用したタンパク質のＮＭＲ測定で得られるシグナルの帰属法を提供する。【解決手段】１）ｎ個のアミノ酸残基からなるポリペプチドＰｎのアミノ酸配列Ｘ１−・・・−Ｘｎを決定し、２）決定したアミノ酸配列Ｘ１−・・・−Ｘｎからなる安定同位体元素によりラベル化されたポリペプチドＰｎの混合物を合成する。３）更に、アミノ酸Ｘ１、Ｘ２、・・・Ｘｎにそれぞれ対応する合成用アミノ酸カクテルｘ１’、ｘ２’、・・・ｘｎ’を用いて、１）で決定したアミノ酸配列Ｘ１−・・・−Ｘｎからなる安定同位体元素によりラベル化されたポリペプチドＰｎ’の混合物を合成する。２）で合成したポリペプチドＰｎの混合物と３）で合成したポリペプチドＰｎ’の混合物についてそれぞれＮＭＲ測定を行い、対応するシグナル間のシグナル強度比を計算して各シグナルの帰属を決定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程を含む、ポリペプチドを対象としたＮＭＲ測定法により得られたシグナルの帰属方法：
１）ｎ個のアミノ酸残基からなるポリペプチドＰｎのアミノ酸配列Ｘ１−・・・−Ｘｎを決定する工程、ここでＸは任意のアミノ酸を、ｎは２以上の任意の整数を示す、
２）アミノ酸Ｘ１、Ｘ２、・・・Ｘｎにそれぞれ対応する合成用アミノ酸カクテルｘ１、ｘ２、・・・ｘｎを用いて、１）で決定したアミノ酸配列Ｘ１−・・・−Ｘｎからなる安定同位体元素によりラベル化されたポリペプチドＰｎの混合物を合成する工程、ここで該カクテルは安定同位体元素でラベル化されたアミノ酸と当該安定同位体元素でラベル化されていないアミノ酸との混合物であり、かつ前記ポリペプチドＰｎを対象としたＮＭＲ測定で得られるシグナルの帰属を行おうとするアミノ酸残基に対応するアミノ酸カクテルにおけるラベル化されたアミノ酸の含有比率が、他の全てのアミノ酸残基に対応するアミノ酸カクテルにおけるラベル化されたアミノ酸の含有比率とは異なる、
３）アミノ酸Ｘ１、Ｘ２、・・・Ｘｎにそれぞれ対応する合成用アミノ酸カクテルｘ１’、ｘ２’、・・・ｘｎ’を用いて、１）で決定したアミノ酸配列Ｘ１−・・・−Ｘｎからなる安定同位体元素によりラベル化されたポリペプチドＰｎ’の混合物を合成する工程、ここで該カクテルは安定同位体元素でラベル化されたアミノ酸と当該安定同位体元素でラベルされていないアミノ酸との混合物であり、かつ前記ポリペプチドＰｎを対象としたＮＭＲ測定で得られるシグナルの帰属を行おうとするアミノ酸残基に対応するアミノ酸カクテルにおけるラベル化されたアミノ酸の含有比率が全て同一である、
４）２）で合成したポリペプチドＰｎの混合物と３）で合成したポリペプチドＰｎ’の混合物についてそれぞれＮＭＲ測定を行う工程、及び
５）４）で得られたそれぞれ対応するシグナル間のシグナル強度比を計算して、各シグナルの帰属を決定する工程。
【請求項２】
安定同位体元素が１５Ｎ、１３Ｃ及び２Ｈよりなる群から選ばれる一以上の安定同位体元素である、請求項１に記載のシグナルの帰属方法。
【請求項３】
アミノ酸を構成する全ての窒素原子、炭素原子もしくは非交換性の水素原子が、それぞれ１５Ｎ、１３Ｃもしくは２Ｈによってラベル化されたアミノ酸を使用する、請求項２に記載のシグナルの帰属方法。
【請求項４】
ペプチド結合を形成する窒素原子、炭素原子もしくは水素原子が選択的にそれぞれ１５Ｎ、１３Ｃもしくは２Ｈによってラベル化されたアミノ酸を使用する、請求項２に記載のシグナルの帰属方法。
【請求項５】
化学合成用の保護基によって修飾されたアミノ酸のカクテルを使用してポリペプチドＰｎの混合物及びポリペプチドＰｎ’の混合物を合成する、請求項１に記載のシグナルの帰属方法。
【請求項６】
ＮＭＲ測定法が１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ測定法である、請求項２〜４のいずれかに記載のシグナルの帰属方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質（ポリペプチド）の立体構造に関する情報をＮＭＲを用いて獲得するための、ＮＭＲシグナルの帰属方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の立体構造に関する情報、例えばタンパク質の立体構造、酵素タンパク質の反応触媒機構、あるいはタンパク質とそれに結合するリガンドとの構造活性相関などを解析する手法として広く用いられている方法に、溶液中のタンパク質を対象とするＮＭＲ法がある。
【０００３】
多くの場合、タンパク質を対象にしたＮＭＲによる解析は、タンパク質中の窒素原子や炭素原子をＮＭＲでの観測が容易な安定同位体元素である１５Ｎや１３Ｃとし、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ（heteronuclear single quantum coherence）スペクトルや１Ｈ−１３ＣＨＳＱＣスペクトル等の観測をすることで行われる。さらに測定されたシグナルについて、タンパク質を構成するアミノ酸の構成原子に対応させるいわゆるシグナルの帰属を行い、タンパク質の立体構造情報が得られる。
【０００４】
ＮＭＲ法は、溶液状態のタンパク質を測定対象とするため、より自然な（あるいは天然の）状態にあるタンパク質の構造やその動きを測定することができること、また一般に難しい作業として理解されているタンパク質の結晶の調製が不要であることなどが、同じくタンパク質の立体構造に関する情報を解析する有効な手段であるＸ線回折法と比較したときの利点として考えられている。
【０００５】
一方、ＮＭＲ法には、タンパク質というヘテロな高分子を測定対象とすることに伴う幾つかの問題があることもまた事実である。例えば、測定対象とするタンパク質の高濃度溶液が必要となること、現状の解析技術並びに装置では、Ｘ線回折法による解析に比べて小さな（低分子量の）タンパク質に測定対象が限られてしまうこと、等がある。
【０００６】
また、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ測定法は、非常に感度の高いＮＭＲ測定法ではあるが、この１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ測定法で得られるシグナルのアミノ酸残基への帰属を行うためには、通常、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ測定法とは別に感度の低い複数種類の３次元ＮＭＲスペクトル等の測定を行い、さらに熟練者がこれらのスペクトルを組み合わせた複雑な解析を行わねばならない。この場合における３次元ＮＭＲスペクトルの測定は長時間を要するものであり、その間のタンパク質の失活、変性も重大な問題であった。
【０００７】
係る問題に対して、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ測定法のみを用いてＮＭＲ測定を行い、得られるシグナルをアミノ酸残基に帰属する方法も提案されている（特許文献１、非特許文献１など）。しかしながら、この方法は、一つのアミノ酸残基のみを安定同位体元素でラベル化したタンパク質を、シグナル帰属を行おうとするアミノ酸残基の個数に相当する数だけ調製し、それぞれについて１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ測定法等を行って測定しなければならないことから、実際的な方法であるとは言い難いものであった。
【０００８】
より簡便なＮＭＲ法による蛋白質の測定方法として、１５Ｎ／１３Ｃ標識アミノ酸と１５Ｎ標識アミノ酸等を組み合わせて合成した蛋白質を用いてＮＭＲ測定を行なう方法が報告されている（特許文献２）。しかし、かかる方法もラベル化されたポリペプチドを何種類も調製する必要がある他、測定しようとするアミノ酸残基を含んだ前後のアミノ酸配列の種類によっても制限を受けているのが現状である。
【非特許文献１】Yabuki, T. et al., J. Biomol. NMR,、１９９８年、第１１巻、第２９５−３０６頁
【特許文献１】ＷＯ２００２／０３３４０６
【特許文献２】ＷＯ２００５／０７３７４７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＮＭＲ法によるポリペプチドの解析において、上記のような煩わしさを解消することの出来る、新しいシグナルの帰属方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、測定対象となるポリペプチドを構成するアミノ酸残基への安定同位体元素による従来のラベリング方法を改め、ポリペプチドを構成するアミノ酸残基のラベル化比率（以下、ラベリング比率とする）を互いに異なる比率となるように安定同位体元素でラベル化することによって、もしくはシグナル帰属を行おうとするアミノ酸残基を他のアミノ酸残基とは異なるラベリング比率となるように安定同位体元素でラベル化することによって、原理的にわずか２種類のポリペプチド混合物を合成し、ＮＭＲ測定を行うだけで、ＮＭＲシグナルのアミノ酸残基への帰属を可能にする、下記の各発明を完成した。
【００１１】
（１）下記の工程を含む、ポリペプチドのＮＭＲ測定法により得られたシグナルの帰属方法
１）ｎ個のアミノ酸残基からなるポリペプチドＰｎのアミノ酸配列Ｘ１−・・・−Ｘｎを決定する工程、ここでＸは任意のアミノ酸を、ｎは２以上の任意の整数を示す、
２）アミノ酸Ｘ１、Ｘ２、・・・Ｘｎにそれぞれ対応する合成用アミノ酸カクテルｘ１、ｘ２、・・・ｘｎを用いて、１）で決定したアミノ酸配列Ｘ１−・・・−Ｘｎからなる安定同位体元素によりラベル化されたポリペプチドＰｎの混合物を合成する工程、ここで該カクテルは安定同位体元素でラベル化されたアミノ酸と当該安定同位体元素でラベル化されていないアミノ酸との混合物であり、かつ前記ポリペプチドＰｎを対象としたＮＭＲ測定で得られるシグナルの帰属を行おうとするアミノ酸残基に対応するアミノ酸カクテルにおけるラベル化されたアミノ酸の含有比率が、他の全てのアミノ酸残基に対応するアミノ酸カクテルにおけるラベル化されたアミノ酸の含有比率とは異なる、
３）アミノ酸Ｘ１、Ｘ２、・・・Ｘｎにそれぞれ対応する合成用アミノ酸カクテルｘ１’、ｘ２’、・・・ｘｎ’を用いて、１）で決定したアミノ酸配列Ｘ１−・・・−Ｘｎからなる安定同位体元素によりラベル化されたポリペプチドＰｎ’の混合物を合成する工程、ここで該カクテルは安定同位体元素でラベル化されたアミノ酸と当該安定同位体元素でラベルされていないアミノ酸との混合物であり、かつ前記ポリペプチドＰｎを対象としたＮＭＲ測定で得られるシグナルの帰属を行おうとするアミノ酸残基に対応するアミノ酸カクテルにおけるラベル化されたアミノ酸の含有比率が全て同一である、
４）２）で合成したポリペプチドＰｎの混合物と３）で合成したポリペプチドＰｎ’の混合物についてそれぞれＮＭＲ測定を行う工程、及び
５）４）で得られたそれぞれ対応するシグナル間のシグナル強度比を計算して、各シグナルの帰属を決定する工程。
【００１２】
（２）安定同位体元素が１５Ｎ、１３Ｃ及び２Ｈよりなる群から選ばれる一以上の安定同位体元素である、（１）に記載のシグナルの帰属方法。
【００１３】
（３）アミノ酸を構成する全ての窒素原子、炭素原子もしくは非交換性の水素原子が、それぞれ１５Ｎ、１３Ｃもしくは２Ｈによってラベル化されたアミノ酸を使用する、（２）に記載のシグナルの帰属方法。
【００１４】
（４）ペプチド結合を形成する窒素原子、炭素原子もしくは水素原子が選択的にそれぞれ１５Ｎ、１３Ｃもしくは２Ｈによってラベル化されたアミノ酸を使用する、（２）に記載のシグナルの帰属方法。
【００１５】
（５）化学合成用の保護基によって修飾されたアミノ酸のカクテルを使用してポリペプチドＰｎの混合物及びポリペプチドＰｎ’の混合物を合成する、（１）に記載のシグナルの帰属方法。
【００１６】
（６）ＮＭＲ測定法が１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ測定法である、（２）〜（４）のいずれかに記載のシグナルの帰属方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のシグナル帰属法は、ＮＭＲ測定に必要なポリペプチド混合物は２種類で足り、ＨＳＱＣ測定法のみでシグナル帰属を行うことを目的とする従来の方法のように、アミノ酸残基の個数分のポリペプチドをラベル化するアミノ酸残基を変えながら用意する必要がない点で、タンパク質のＮＭＲによる測定作業を著しく簡便化する方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、Ｘ１−Ｘ２−・・・・−Ｘ９−Ｘ１０（Ｘ１〜Ｘ１０はそれぞれ任意のアミノ酸を示す）というアミノ酸配列からなる１０残基のポリペプチドＰ１０を対象として、Ａ）１０アミノ酸残基の全てについてシグナル帰属を行う場合と、Ｂ）幾つかの、ここでは例として４つのアミノ酸残基、Ｘ２、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ８についてのシグナル帰属を行う場合とに分けて、本発明の詳細を説明する。
【００１９】
Ａ）１０アミノ酸残基の全てについてシグナル帰属を行う場合
１）アミノ酸配列の決定
まず、ポリペプチドＰ１０のアミノ酸配列を、Ｘ１−Ｘ２−・・・・−Ｘ９−Ｘ１０の様に決定する。アミノ酸配列は、ＮＭＲによって測定しようとするポリペプチドを構成するアミノ酸配列をそのまま再現すればよい。
【００２０】
なお、Ｘ１〜Ｘ１０は互いに同じアミノ酸であってもよい。この場合のポリペプチドは、一種類のアミノ酸からなる１０残基のポリペプチドとなる。またＸ１〜Ｘ１０が全て互いに異なるアミノ酸であってもよい。この場合のポリペプチドは１０種類のアミノ酸からなる１０残基のポリペプチドである。また、同じアミノ酸が２残基以上存在し、かつその様なアミノ酸が１種以上存在するポリペプチドであっても良い。この場合のポリペプチドは、２〜９種類のアミノ酸からなる１０残基のポリペプチドである。
【００２１】
この様に、本発明においてポリペプチドを構成するアミノ酸残基の種類には制限がなく、またアミノ酸配列にも制限がない。従って、どの様なアミノ酸配列からなるポリペプチドであっても、本発明の方法により製造することができる。このことは、ＮＭＲによって測定しようとするポリペプチドのアミノ酸配列にも一切の制限はなく、いかなるアミノ酸配列からなるポリペプチドでも、本発明あるＮＭＲシグナルの帰属方法の測定対象物となり得ることを意味する。
【００２２】
２）ポリペプチドＰ１０の混合物の調製
次に、このアミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−・・・・−Ｘ９−Ｘ１０の各アミノ酸残基について、安定同位体元素によるラベリング比率を、例えば１０％、２０％、・・・９０％及び１００％と、互いに異なるように設定したラベル化されたポリペプチドＰ１０の混合物を合成する。
【００２３】
本発明にいうポリペプチドの混合物とは、アミノ酸配列が異なるポリペプチドの混合物ではなく、同一のアミノ酸配列からなるが安定同位体元素の含有量が異なるポリペプチドの混合物、換言すれば安定同位体元素によるラベル化の程度という点で異なるポリペプチドの混合物を意味する。
【００２４】
また本発明にいうアミノ酸残基についての安定同位体元素によるラベリング比率とは、次項で説明する方法で製造されるポリペプチド混合物中の、安定同位体元素でラベリングされている特定のアミノ酸残基を有するポリペプチドの存在比率（％）を意味する。例えば、アミノ酸残基Ｘ１のラベリング比率を１０％に設定することは、ポリペプチドＰ１０の混合物中に、安定性同位体元素でラベリングされたアミノ酸残基Ｘ１を有しているポリペプチドを１０％存在させることを意味する。同様にアミノ酸残基Ｘ１０のラベリング比率を１００％に設定することは、安定性同位体元素でラベリングされたアミノ酸残基Ｘ１０を有しているポリペプチドを１００％存在させること、換言すれば混合物中のポリペプチドは全て安定性同位体元素でラベリングされたアミノ酸残基Ｘ１０を有しているポリペプチドとすることを意味する。
【００２５】
本発明では、ポリペプチドを構成するアミノ酸残基が互いに異なるラベリング比率（％）を有するように、すなわち同一のラベリング比率を有するアミノ酸残基が２以上存在しないように設定する必要がある。
【００２６】
ただし、この条件を維持する他には格別の制限はない。例えば、上記ポリペプチドＰ１０の例ではアミノ酸残基間のラベリング比率の差を１０％づつ異なる値に設定したが、その差を１０％と一定にすることも、アミノ酸配列に沿って漸次的に増加あるいは減少させることも必ずしも必要ではなく、ラベリング比率はその値ならびに変動パターンにおいて全く任意に設定することができる。
【００２７】
また、ポリペプチド中の１アミノ酸残基だけ安定同位体元素を含まないように、すなわちラベリング比率を０％と設定してもよい。ただし、正確に言えば、ラベリング比率０％とは、用いる安定同位体元素の天然存在比（例えば１５Ｎでは０．４％）と同じ値のラベリング比率を意味するが、本発明では、便宜上、用いる安定同位体元素の各天然存在比をラベリング比率０％として表すことにする。
【００２８】
またポリペプチド中の１アミノ酸残基だけラベリング比率１００％と設定してもよい（１アミノ酸残基だけをラベル化するという意味ではない）。すなわち、本発明の方法によって全てのアミノ酸残基のシグナル帰属を行おうとするときのラベリング比率は、用いる安定同位体元素の天然比率（０％）〜１００％の範囲内の、任意の値として設定することができる。
【００２９】
次に、Ｘ１〜Ｘ１０それぞれについて、安定同位体元素を有するアミノ酸Ｘ’と当該安定同位体元素を有しない同じアミノ酸Ｘとを混合して、上記で設定したラベリング比率と同じ重量％の安定同位体元素を有するアミノ酸Ｘ’を含むアミノ酸混合物ｘ１〜ｘ２（以下、アミノ酸カクテルｘ１〜ｘ２と表す）を調製する。ただし、本発明においては、「安定同位体元素を有しない」とは「当該安定同位体元素を天然存在比で有する」ことを意味するものとする。
【００３０】
ポリペプチドＰ１０の混合物に即して具体的に言えば、ラベリング比率が１０％であるＸ１に対するアミノ酸カクテルｘ１としては、安定同位体元素を有するＸ１’の１重量部と当該安定同位体元素を含まないＸ１の９重量部とを混合して、安定同位体元素を有するＸ１’の含有率が１０％であるアミノ酸カクテルｘ１を調製することである。Ｘ２〜Ｘ１０についても同様に、それぞれのラベリング比率と同じ値の含有率でそれぞれ安定同位体元素を有するアミノ酸を含むアミノ酸カクテルｘ２〜ｘ１０を用意する。
【００３１】
このアミノ酸カクテルｘ１〜ｘ１０を原料として用いて、既に決定したアミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−・・・・−Ｘ９−Ｘ１０からなるポリペプチドＰ１０を、当業者に公知の方法を用いて合成する。
【００３２】
以上の操作によって、先に決定されたアミノ酸配列ならびに設定されたラベリング比率を各アミノ酸残基について有するポリペプチドＰ１０の混合物を製造する。このポリペプチドＰ１０の混合物を一本のポリペプチドＰ１０として眺めれば、そのポリペプチドＰ１０は、Ｘ１−Ｘ２−・・・−Ｘ９−Ｘ１０というアミノ酸配列からなり、アミノ酸残基Ｘ１、Ｘ２・・・Ｘ９、Ｘ１０はそれぞれ１０％、２０％・・・９０％、１００％というラベリング比率に比例した強度のＮＭＲシグナルを与えるポリペプチドということができる。
【００３３】
３）ポリペプチドＰ１０’の合成
ポリペプチドＰ１０の混合物とは別に、アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−・・・・−Ｘ９−Ｘ１０からなり、各アミノ酸残基の安定同位体元素によるラベリング比率が同一、例えば１０％である、ラベル化されたポリペプチドＰ１０’の混合物を合成する。
【００３４】
すなわち、ポリペプチドＰ１０’の混合物は、ポリペプチドＰ１０と同じアミノ酸配列からなるが、１０残基全てが同一のラベリング比率を有する点で、ポリペプチドＰ１０の混合物とは異なるポリペプチドの混合物である。
【００３５】
このポリペプチドＰ１０’の合成は、Ｘ１〜Ｘ１０それぞれについて、安定同位体元素を有するアミノ酸Ｘ’と当該安定同位体元素を有しない同じアミノ酸Ｘとを混合して、上記で設定したラベリング比率と同じ重量％の安定同位体元素を有するアミノ酸Ｘ’を含むアミノ酸混合物ｘ１’〜ｘ１０’（以下、アミノ酸カクテルｘ１’〜ｘ１０’と表す）を用いて行えばよい。
【００３６】
例えばラベリング比率を１０％とするには、安定同位体元素を有するアミノ酸１重量部と当該安定同位体元素を含まないアミノ酸９重量部とを混合して、安定同位体元素を有するアミノ酸の含有率が１０％であるアミノ酸カクテルを調製することである。これをＸ１〜Ｘ１０それぞれについて行えばよい。
【００３７】
このアミノ酸カクテルｘ１’〜ｘ１０’を原料として用いて、既に決定したアミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−・・・・−Ｘ９−Ｘ１０からなるポリペプチドＰ１０’を、当業者に公知の方法を用いて合成する。
【００３８】
なお、上記の例ではラベリング比率を１０％としたが、この値は任意に設定することができる。また、当該安定同位体元素を有しないアミノ酸Ｘ１〜Ｘ１０を用いてポリペプチドＰ１０’を合成してもよい。この場合には、全アミノ酸残基のラベリング比率を０とする、すなわち、ポリペプチドＰ１０の混合物の合成で用いた安定同位体元素の天然存在比をラベリング比率とすることを意味する。
【００３９】
４）ＮＭＲスペクトルの測定
上記の２）で合成したポリペプチドＰ１０の混合物、ならびに上記の３）で合成したポリペプチドＰ１０’の混合物それぞれの等量物について、共通する測定条件下でＮＭＲスペクトル、典型的には１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを測定し、シグナルを得る。
【００４０】
共通する測定条件下でポリペプチドＰ１０の混合物から得られるＮＭＲシグナルとポリペプチドＰ１０’の混合物から得られるＮＭＲシグナルは、いずれも同一アミノ酸配列からなるポリペプチドであるために、同一のパターンからなる合計１０個のＨＳＱＣスペクトルが観察されることになる。一方、ポリペプチドＰ１０の混合物から得られるＮＭＲシグナルとポリペプチドＰ１０’の混合物から得られるＮＭＲシグナルとの間でそれぞれ対応するシグナル間のシグナル強度は、ポリペプチドＰ１０の混合物におけるラベリング比率に比例して異なる。具体的には、ポリペプチドＰ１０の混合物から得られるＮＭＲシグナルとポリペプチドＰ１０’の混合物から得られるＮＭＲシグナルとの間の１０個の対応スペクトル間のシグナル強度の比は、１：１〜１０：１になる。
【００４１】
この対応スペクトル間のシグナル強度の比率は、ポリペプチドＰ１０の混合物とポリペプチドＰ１０’の混合物における各対応アミノ酸残基のラベリング比率の相違と同じものである。従って、シグナル強度の比が１：１であるシグナルはアミノ酸残基Ｘ１由来のシグナルであると帰属することができ、シグナル強度の比が２：１であるシグナルはアミノ酸残基Ｘ２由来のシグナルであると帰属することができる。同様の計算を繰り返せば、測定されたＮＭＲスペクトルのＸ１〜Ｘ１０のアミノ酸残基への帰属を、シグナル強度の比をもって一義的に帰属させることができる。この方法において、ポリペプチドＰ１０’の混合物について得られるＮＭＲシグナルは、アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−・・・−Ｘ９−Ｘ１０からなるタンパク質の、前記の共通する測定条件下で得られるシグナル強度に関するコントロール値の役割を果たすものとなる。
【００４２】
Ｂ）４アミノ酸残基（Ｘ２、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ８）についてのシグナル帰属を行う場合
１）アミノ酸配列の決定
上記Ａと同じである。なお、シグナル帰属を行おうとするアミノ酸残基の種類、配列上の位置には特に制限はない。
【００４３】
２）ポリペプチドＰ１０の合成
ポリペプチドＰ１０を構成する全てのアミノ酸残基ではなく、幾つかの特定のアミノ酸残基に関してのみシグナル帰属を行おうとするときは、その対象とするアミノ酸残基が他の全てのアミノ酸残基とは異なるラベリング比率を有するようにラベリング比率を設定し、ポリペプチドＰ１０の混合物を合成すればよい。例えば、シグナル帰属を行おうとする４つのアミノ酸残基、Ｘ２、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ８について、安定同位体元素によるラベリング比率をＸ２：２０％、Ｘ４：４０％、Ｘ６：６０％、Ｘ８：８０％等のように設定し、合成すればよい。ここで、ラベリング比率は前記Ａ）と同義である。
【００４４】
この様に、ポリペプチドを構成するアミノ酸残基の幾つかのみを対象とする場合、安定同位体元素によるラベル化は、対象とするアミノ酸残基だけについて行えばよく、対象ではないアミノ酸残基をラベル化することは特に必要ではない。ただし、対象とするアミノ酸残基に対して設定したラベリング比率とは異なるラベリング比率であれば、対象外のアミノ酸残基をラベル化するのは差し支えない。例えば、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ９全部についてラベリング比率１０％としてもよく、２０％、４０％、６０％、８０％以外のラベリング比率をそれぞれ違えて設定してもよい。
【００４５】
また、上記の例では残基間のラベリング比率の差を２０％づつ異なる様に設定したが、その様に設定することも、アミノ酸配列に沿って漸次的に増加あるいは減少させることも必ずしも必要ではなく、ラベリング比率はその値ならびに変動パターンにおいて全く任意に設定することができる。
【００４６】
Ｘ２、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ８それぞれについて、安定同位体元素を有するアミノ酸Ｘ’と当該安定同位体元素を有しない同じアミノ酸Ｘとを混合して、先に設定したラベリング比率と同じ重量％の安定同位体元素を有するアミノ酸Ｘ’を含むアミノ酸混合物ｘ２、ｘ４、ｘ６、ｘ８を調製する。この調製は上記Ａ）と同様に行えばよい。
【００４７】
Ｘ１、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ９ならびにＸ１０についてラベリング比率０％（用いる安定同位体元素の天然存在比）と設定したときは、当該安定同位体元素を有しないアミノ酸のみからなるアミノ酸カクテルを用いてポリペプチドＰ１０の混合物を合成する。なお、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ９ならびにＸ１０についてもラベリング比率を設定したときは、その設定に基づいて上記と同様にアミノ酸カクテルｘ１、ｘ３、ｘ５、ｘ７、ｘ９、ｘ１０を用意すればよい。なお、「当該安定同位体元素を有しない」の意味は、前記Ａ）と同じである。
【００４８】
このアミノ酸カクテルｘ１〜ｘ１０を原料として用いて、既に決定したアミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−・・・・−Ｘ９−Ｘ１０からなるポリペプチドＰ１０の混合物を、当業者に公知の方法を用いて合成する。
【００４９】
以上の操作によって、先に決定されたアミノ酸配列ならびに設定されたラベリング比率を各アミノ酸残基について有するポリペプチドＰ１０の混合物を製造する。このポリペプチドＰ１０の混合物を一本のポリペプチドとして眺めれば、そのポリペプチドは、Ｘ１−Ｘ２−・・・−Ｘ９−Ｘ１０というアミノ酸配列からなり、アミノ酸残基Ｘ２、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ８はそれぞれ２０％、４０％、６０％、８０％というラベリング比率に比例した強度のＮＭＲシグナルを与えるポリペプチドということができる。
【００５０】
３）ポリペプチドＰ１０’の合成
ポリペプチドＰ１０の混合物とは別に、アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−・・・・−Ｘ９−Ｘ１０からなり、アミノ酸残基Ｘ２、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ８の各アミノ酸残基の安定同位体元素によるラベリング比率が同一、例えば１０％であり、かつ他のアミノ酸残基のラベリング比率が対応するポリペプチドＰ１０のアミノ酸残基のラベリング比率と同じである、ラベル化されたポリペプチドＰ１０’の混合物を合成する。
【００５１】
すなわち、ポリペプチドＰ１０’の混合物は、ポリペプチドＰ１０と同じアミノ酸配列からなるが、アミノ酸残基Ｘ２、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ８全てが同一のラベリング比率を有する点のみで、ポリペプチドＰ１０の混合物とは異なるポリペプチドの混合物である。
【００５２】
このポリペプチドＰ１０’の混合物の合成は、Ｘ２、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ８それぞれについて、安定同位体元素を有するアミノ酸Ｘ’と当該安定同位体元素を有しない同じアミノ酸Ｘとを混合して、上記で設定したラベリング比率と同じ重量％の安定同位体元素を有するアミノ酸Ｘ’を含むアミノ酸混合物ｘ２’、ｘ４’、ｘ６’、ｘ８’（以下、アミノ酸カクテルｘ２’、ｘ４’、ｘ６’、ｘ８’と表す）と、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ９及びＸ１０については、ポリペプチドＰ１０の混合物の合成に使用したアミノ酸カクテルと同じラベリング比率としたものを用いて行えばよい。
【００５３】
アミノ酸カクテルの調製、ポリペプチドの合成は、前記Ａと同じである。
【００５４】
なお、上記の例ではラベリング比率を１０％としたが、この値は任意に設定することができる。また、当該安定同位体元素を有しないアミノ酸Ｘ１〜Ｘ１０を用いてポリペプチドＰ１０’の混合物を合成してもよい。この場合には、全アミノ酸残基のラベリング比率を０とする、すなわち安定同位体元素の天然存在比をラベリング比率とすることを意味する。
【００５５】
４）ＮＭＲスペクトルの測定
上記の２）で合成したポリペプチドＰ１０の混合物、ならびに上記の３）で合成したポリペプチドＰ１０’の混合物それぞれの等量物について、共通する測定条件下でＮＭＲスペクトル、典型的には１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを測定し、シグナルを得る。
【００５６】
共通する測定条件下でポリペプチドＰ１０の混合物から得られるＮＭＲシグナルとポリペプチドＰ１０’の混合物から得られるＮＭＲシグナルは、いずれも同一アミノ酸配列からなるポリペプチドであるために、同一のパターンからなる合計４〜１０個のＨＳＱＣスペクトルが観察されることになる。一方、ポリペプチドＰ１０の混合物から得られるＮＭＲシグナルとポリペプチドＰ１０’の混合物から得られるＮＭＲシグナルとの間には、対応するシグナル間でシグナル強度の異なる４つのシグナルが観察される。ポリペプチドＰ１０とポリペプチドＰ１０’との相違はＸ２、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ８の各ラベリング比率のみであるから、これら４つのシグナルはＸ２、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ８のシグナルを表していることになる。さらに対応シグナル間の強度は、ポリペプチドＰ１０の混合物におけるラベリング比率に比例して異なっているはずである。具体的には、ポリペプチドＰ１０の混合物から得られるＮＭＲシグナルとポリペプチドＰ１０’の混合物から得られるＮＭＲシグナルとの間の４つの対応スペクトル間のシグナル強度の比は、２：１〜８：１になる。
【００５７】
この対応スペクトル間のシグナル強度の比率は、ポリペプチドＰ１０の混合物とポリペプチドＰ１０’の混合物における各対応アミノ酸残基のラベリング比率の相違と同じものである。従って、シグナル強度の比が２：１であるシグナルはアミノ酸残基Ｘ２由来のシグナルであると帰属することができ、シグナル強度の比が４：１であるシグナルはアミノ酸残基Ｘ４由来のシグナルであると帰属することができる。同様の計算を繰り返せば、測定されたＮＭＲスペクトルのＸ６、Ｘ８のアミノ酸残基への帰属を、シグナル強度の比をもって一義的に帰属させることができる。この方法において、ポリペプチドＰ１０’の混合物について得られるＮＭＲシグナルは、アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−・・・−Ｘ９−Ｘ１０からなるタンパク質の、前記の共通する測定条件下で得られるシグナル強度に関するコントロール値の役割を果たすものとなる。
【００５８】
上記Ａ）Ｂ）に説明した本発明のＮＭＲシグナルの帰属法において利用可能な安定同位体元素としては、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈなどを挙げることができる。タンパク質等の立体構造解析の基本として多用されることや、スペクトル上でのシグナルの単純さ、さらには安価であること等を勘案すれば、安定同位体元素としては１５Ｎの利用が好ましい。
【００５９】
また一アミノ酸（アミノ酸残基）における安定同位体元素によるラベル化のの位置にも特別の制限はなく、一つのアミノ酸を構成する全ての窒素原子、炭素原子もしくは非交換性の水素原子を、それぞれ１５Ｎ、１３Ｃもしくは２Ｈによってラベル化してもよいし、特定の位置にある窒素原子等だけをラベル化してもよい。例えば、ペプチド結合を構成する窒素原子、炭素原子あるいは水素原子を選択的にラベル化してもよい。
【００６０】
本発明では、ＮＭＲ測定によって得られるシグナルの帰属を行おうとするアミノ酸残基は、少なくとも全て同じ安定同位体元素を用いてラベル化する必要がある。上記Ａ）で言えば、Ｘ１、Ｘ２・・・Ｘ９、Ｘ１０は全て、例えばその窒素原子（窒素原子を側鎖に持たないアミノ酸ではペプチド結合を構成する窒素原子）を１５Ｎでラベル化する必要があり、また上記Ｂ）ではＸ２、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ８は全て、例えばそれらを構成する炭素原子を１３Ｃでラベル化する必要がある。言い換えれば、測定対象とするアミノ酸残基は必ず共通する少なくとも一種の安定同位体元素でラベル化されている必要がある。ただし、同時に別種の安定同位体元素が一つのアミノ酸残基中にあるいはポリペプチド中に共存（二重標識化）していてもよい。例えば、一部あるいは全てのアミノ酸が、１５Ｎによるラベル化に加えて、１３Ｃや２Ｈでラベル化されていてもよい。
【００６１】
１５Ｎや１３Ｃでラベル化されたアミノ酸は既に市販されており、本発明ではかかる市販のラベル化されたアミノ酸を利用することができる。また安定同位体元素を有する適当な化合物から、当業者に公知の方法に従って新たに所望のラベリングされたアミノ酸を合成し、これを用いても良い。また、１５Ｎや１３Ｃを唯一の窒素源あるいは炭素源とする培地で適当な微生物を培養して、ラベル化されたアミノ酸を製造させてもよい。
【００６２】
アミノ酸カクテルを用いたポリペプチド混合物の製造自体は、無細胞蛋白合成系や有機化学的手法などの当業者に公知の方法のいずれも利用することができるが、本発明では有機化学合成的手法、特にペプチドシンセサイザーを用いた合成が好ましい。
【００６３】
ペプチドシンセサイザーを用いたポリペプチドの合成では、原料となるアミノ酸はＦｍｏｃやｔＢｏｃなどの保護基によって修飾されたアミノ酸を用いることとなるが、かかる保護基を有する修飾アミノ酸においても、安定同位体元素でラベル化された修飾アミノ酸などは既に市販されており、当業者が容易に入手可能である。
【００６４】
本発明では、これまでに報告されている多数の測定方法を利用することが出来る。その一部の例としては、異種核多次元NMR測定法であれば、HSQC、HMQC等を、同種核多次元NMR測定法であれば、COSY等を挙げることができるが、これらには限られない。
【００６５】
分子量２万を越えるようなタンパク質を測定対象とするときは、ＴＲＯＳＹ効果（Pervushin,  K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., １９９７年、第９４巻、１２３６６−１２３７１頁）を用いた測定法を利用することにより、感度の減少を抑えることが可能である。
【００６６】
これらの情報を用いてChemical Shift Index法（Wishart、D.,Methods in enzymol. ２００１年、第３３８巻、３−３４頁）を用いることにより、目的蛋白質の２次構造が推定できる。
【００６７】
また、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣの全シグナルが帰属できることより、Residual Dipolar Coupling法(Bax  et a1.、Methods in Enzymol. 339  (2001)  127-174)の測定を行うことが可能であり、目的蛋白質の立体構造情報を得ることができる。
【００６８】
また、本発明の帰属方法を行うために用いられる安定同位体元素でラベル化されたアミノ酸と当該安定同位体元素を含まないアミノ酸を組み合わせた試薬キットが、本発明に基づいて提供され得る。ペプチドシンセザイザーを用いたポリペプチドの合成様としては、ｔＢｏｃやＦｍｏｃ等の適当な保護基で修飾された上記アミノ酸が含まれる。
【００６９】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７０】
アワヨトウ由来の成長因子機能を有するポリペプチド（Growth-Blocking Peptide、ＧＢＰ、Tada M. et al., J. Biol.Chem., 2003年、第278巻、第10778−10783頁）を合成する目的で、そのアミノ酸配列を次の様に決定した。
【００７１】
ＥＮＦＳＧＧＣＶＡＧＹＭＲＴＰＤＧＲＣＫＰＴＦＹＱ（配列番号１）
次に、上記アミノ酸配列において４つのグリシン（Ｇ５、Ｇ６、Ｇ１０、Ｇ１７）の各アミノ酸残基のシグナル帰属を目的として、ラベリング比率をＧ５：２０％、Ｇ６：４０％、Ｇ１０：６０％、Ｇ１７：８０％とそれぞれ設定した。
【００７２】
グリシンのアミノ基のＮが１５Ｎでラベル化された化学合成用Ｆｍｏｃ修飾グリシン（Canbridge Isotope Laboratories社製）と、１５Ｎでラベル化されていない化学合成用Ｆｍｏｃ修飾グリシン（島津製作所製）を用意し、両者を混合して、ラベル化されたグリシンの含有量が２０％、４０％、６０％、８０％である４つのアミノ酸カクテルをそれぞれ調製した。また、上記アミノ酸配列における４つのグリシン残基以外のアミノ酸残基それぞれに対するアミノ酸カクテルは、いずれも１５Ｎでラベル化されていないＦｍｏｃ修飾各アミノ酸を用意した。
【００７３】
これらのアミノ酸カクテルをセットしたペプチドシンセサイザー（島津製作所製）を用いて、上記アミノ酸配列からなるポリペプチド混合物を調製し、定法に従って精製し、保護基を外して、４つのグリシン残基のみがそれぞれ異なるラベリング比率で１５Ｎでラベル化されたＧＢＰ混合物を得た。
【００７４】
配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるタンパク質ＧＢＰをコードする遺伝子をプラスミドベクターｐＥＴ３２のBglII/HindIIIサイトに組み込んだ発現ベクターを用いて、大腸菌BL21(DE3)を形質転換した。この発現ベクターは、BglII/HindIIIサイトに組み込まれたＧＢＰをコードする遺伝子をＴ７プロモーターの機能下において発現し、それにより組換え宿主にＧＢＰを生産させることができる。
【００７５】
上記の形質転換体を、１５Ｎを唯一の窒素源とするＭ９培地でＯＤ＝０．６となるまで培養した後に、１ｍＭのＩＰＴＧを培地に添加してＧＢＰを誘導、発現させた。Tadaら（前記）の方法に従って組み換え体ＧＢＰを宿主細胞から回収、精製した。組換え宿主を１５Ｎを唯一の窒素源とした培地で培養したことにより、該宿主が生産する組み換え体ＧＢＰの１５Ｎによるラベリング比率は、全てのアミノ酸残基で１００％となる。
【００７６】
実施例１で調製したＧＢＰ混合物と上記の組み換え体ＧＢＰを０．３ｍMとなるよう１０％重水水溶液にそれぞれ別に溶解して、ＮＭＲ測定用試料を用意し、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルをBruker社製ＮＭＲ測定装置（500Ｍｚ）を利用して測定した。ＧＢＰ混合物の１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを図１に、組み換え体ＧＢＰの１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを図２にそれぞれ示す。
【００７７】
図１では、１５Ｎでラベル化した４つのグリシン残基に由来するシグナルが４種類（Ａ〜Ｄ）観察されている。一方、図２は組み換え体ＧＢＰを構成するアミノ酸残基のうちプロリンを除く他のアミノ酸残基に由来するシグナルが観察されている。このうち、シグナルのイ〜ニが、図１のＡ〜Ｄにそれぞれ対応していることが分かる。
【００７８】
図２のイ〜ニのシグナル強度を計算した結果を図３に、図１のＡ〜Ｄのシグナル強度を計算した結果を図４に、Ａ〜Ｄとイ〜ニでそれぞれ対応するシグナル間の強度比を算出した結果を図５に示す。この結果から、図１のシグナル強度に対して約２０％の強度を示すシグナルＤがＧ５、約４０％の強度を示すシグナルＣがＧ６、約６０％の強度を示すシグナルＡがＧ１０、約８０％の強度を示すシグナルＤがＧ１７と決定された。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】ＧＢＰ混合物についての１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルである。
【図２】組み換え体ＧＢＰについての１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルである。
【図３】図２のシグナルイ〜ニそれぞれのシグナル強度を示す。
【図４】図１のシグナルＡ〜Ｄそれぞれのシグナル強度を示す。
【図５】シグナルイ〜ニとシグナルＡ〜Ｄのそれぞれのシグナル強度比を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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