(57)【要約】【課題】MAPKKK遺伝子の発現増強剤を提供する。【解決手段】ヒアルロナンを有効成分として含有する薬剤である。ヒアルロナンとしては-Ｄ-グルクロン酸-β-１,３-D-Ｎ-アセチルグルコサミン-β-１,４-を１単位とし、これを２個含む４糖（HA4）であることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロナンを有効成分とする、MAPキナーゼキナーゼキナーゼ遺伝子の発現増強剤。
【請求項２】
上記ヒアルロナンは、-Ｄ-グルクロン酸-β-１,３-D-Ｎ-アセチルグルコサミン-β-１,４-を１単位とし、これを２個含む４糖であることを特徴とする請求項１記載のMAPキナーゼキナーゼキナーゼ遺伝子の発現増強剤。
【請求項３】
上記MAPキナーゼキナーゼキナーゼ遺伝子は、MAPキナーゼキナーゼキナーゼ１３遺伝子であることを特徴とする請求項１記載のMAPキナーゼキナーゼキナーゼ遺伝子の発現増強剤。
【請求項４】
Stress responsive MAP kinase （SAPK）経路に関与しており、leucine zipper-bearing kinase （LZK）とも呼ばれるキナーゼであることを特徴とする請求項１記載のMAPキナーゼキナーゼキナーゼ遺伝子の発現増強剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロナンを有効成分とするMAPキナーゼキナーゼキナーゼ遺伝子の発現増強剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロナンは、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとの２糖繰り返し単位から構成されている長鎖の多糖であり、一方、オリゴ糖も知られている。ヒアルロナンは鶏冠、さい体、皮膚、関節液などの生体組織からの抽出液、またはストレプトコッカス属の細菌を用いる発酵法などにより製造され、毒性学的および免疫学的作用が存在しないため、薬剤や化粧品として利用されており、例えばヒアルロナンの関節内注射による関節炎の治療がよく知られている。以下の説明において、４糖のヒアルロナンをHA4と記載する。
【０００３】
HA4には、臓器保存、肝障害および胃潰瘍に対する治療・抑制効果があることが報告されている（特許文献１参照）。また、HA4には、ストレス蛋白発現増強作用および細胞死
抑制作用があることが知られている（非特許文献１参照）。さらに、ヒアルロン酸オリゴ糖には、さまざまな生理活性があることも報告されている（非特許文献２参照）。
【０００４】
一方、MAPキナーゼキナーゼキナーゼ（以下、MAPKKKと称する）は、MAPキナーゼシグナル伝達において、MAPキナーゼキナーゼ（以下、MAPKKと称する）をリン酸化する活性を有する。MAPKKKの中でもMAPKKK13は、Stress responsive MAP kinase （以下、SAPKと称する）経路に関与しており、leucine zipper-bearing kinase （以下、LZKと称する）とも呼ばれるキナーゼである。SAPKシグナル伝達経路は細胞外からの刺激を核に伝達し、遺伝子発現を調節することでストレス適応、アポトーシス、細胞増殖、癌化、分化、免疫応答などを制御することが知られている（非特許文献３〜５参照）。
【０００５】
LZKは、Mixed-lineage kinase（MLK）ファミリー（セリン/スレオニンキナーゼとチロシンキナーゼのハイブリッド型の触媒領域と、２つの隣接したロイシンジッパー構造によって特徴づけられる）に属するプロテインキナーゼである。LZKはセリン/スレオニンキナーゼ活性を有し、MAPKKであるMKK7を活性化するMAPKKKであり JNK/SPAK経路を特異的に活性化する。この経路においてスカフォールドタンパク質JIP-1と結合する（非特許文献３〜５参照）。LZKは膵臓ランゲルハンス島および脳に強く発現している（非特許文献３〜５参照）。
【０００６】
ところが、HA4がMAPキナーゼシグナル伝達に関与する、或いは何らかの影響を与えるといった知見は知られていなかった。
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００２／００４４７１
【非特許文献１】Xu H, Ito T, Tawada A, Maeda H, Yamanokuchi H, Isahara K, Yoshida K, Uchiyama Y, Asari A. Effect of hyaluronan oligosaccharides on the expression of heat shock protein 72. J Biol Chem. 2002 10;277(19):17308-14.
【非特許文献２】Asari A. Novel Functions of Hyaluronan Oligosaccharides. In Science of Hyaluronan Today. Editors: Vincent C. Hascall. Masaki Yanagishita. Glycoforum, (http://www.glycoforum.gr.jp/science/hyaluronan/HA12/HA12J.html). 2005.
【非特許文献３】Masaki M, Ikeda A, Shiraki E, Oka S, Kawasaki T.  Mixed lineage kinase LZK and antioxidant protein-1 activate NF-kappaB synergistically. Eur J Biochem. 2003 Jan;270(1):76-83.
【非特許文献４】Ikeda A, Sakuma H, Masaki M, Kozutsumi Y, Oka S, Inazawa J, Kawasaki T.  Genomic organization and fine-mapping of the human leucine zipper-bearing kinase (LZK) gene.  J Biochem Mol Biol Biophys. 2002 Apr;6(2):113-7.
【非特許文献５】Ikeda A, Hasegawa K, Masaki M, Moriguchi T, Nishida E, Kozutsumi Y, Oka S,Kawasaki T.  Mixed lineage kinase LZK forms a functional signaling complex with JIP-1, a scaffold protein of the c-Jun NH(2)-terminal kinase pathway.  J Biochem (Tokyo). 2001 Dec;130(6):773-81.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明は、新規なMAPKKK遺伝子の発現増強剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述した目的を達成した本発明に係る、MAPKKK遺伝子の発現増強剤は、ヒアルロナンを有効成分として含有する。すなわち、ヒアルロナンにはMAPKKK遺伝子の発現を増強する新規な機能があることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明に係るMAPKKK遺伝子の発現増強剤は、ヒアルロナンを有効成分とする。ここでヒアルロナンとしては、-Ｄ-グルクロン酸-β-１,３-D-Ｎ-アセチルグルコサミン-β-１,４-を１単位とし、これを２個含む４糖であることが望ましい。また、上記MAPKKK遺伝子として、特にSAPKシグナル伝達経路に関与するMAPKKK13遺伝子の発現を増強することができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係るMAPKKK遺伝子の発現増強剤は、ヒアルロナンを有効成分とするものであるから、比較的安価にかつ容易に大量生産できる利点がある。また、ヒアルロナンは毒性や抗原性がほとんどないこと、生体が元来有している治療作用や疾患の防止作用を増強することから副作用の極めて少ない抑制剤として期待される。したがって、本発明によれば、MAPKKK遺伝子の発現抑制に起因する疾患の治療に有効な新規な薬剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明に係るMAPKKK遺伝子の発現増強剤は、種々のMAPKKK遺伝子の発現を増強する機能を有する剤である。MAPKKK遺伝子の発現を増強するとは、未処理の動物細胞における当該遺伝子の発現量と、本剤で処理した動物細胞における当該遺伝子の発現量とを比較したときに、後者の発現量が有意に大であることを意味する。遺伝子の発現量は、多数のプローブDNAが基板に固定化されてなるDNAチップを使用して測定することができる。
【００１３】
以下の説明において、本発明に係るMAPKKK遺伝子の発現増強剤を単に薬剤と称する。すなわち、本発明に係る薬剤は、MAPKKK遺伝子の発現抑制に起因する疾患の治療に使用することができる。本発明に係る薬剤に含まれるヒアルロナンとしては、基本的にはβ−Ｄ−グルクロン酸の１位とβ−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンの３位とが結合した２糖単位を少なくとも１個含む２糖以上のものでかつβ−Ｄ−グルクロン酸とβ−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンとから構成されるものであれば、２糖単位が１個または複数個結合したものにそれらの要素が結合した糖であってもよく、またこれらの誘導体、例えば、アシル基等の加水分解性保護基を有したもの等も使用し得る。該糖は不飽和糖であってもよく、不飽和糖としては、非還元末端糖、通常、グルクロン酸の４，５位炭素間が不飽和のもの等が挙げられる。本発明で使用するヒアルロナンとしては、具体的には動物等の天然物から抽出されたもの、微生物を培養して得られたもの、化学的もしくは酵素的に合成されたものなどいずれも使用することができる。例えば鶏冠、さい体、皮膚、関節液などの生体組織から公知の抽出法と精製法によって得ることができる。またストレプトコッカス属の細菌等を用いた発酵法によっても製造できる。
【００１４】
本発明においては、ヒアルロナンオリゴ糖もヒアルロナンに包含され、上記２糖単位１個からなる２糖およびその誘導体のような低分子量のヒアルロナンから、重量平均分子量４００万程度の高分子量のヒアルロナンまで使用することができる。好ましくは組織における浸透性などの点で優れる重量平均分子量３８０程度〜９００，０００程度のヒアルロナンが挙げられ、より好ましくは２〜２０糖程度のヒアルロナンを挙げることができる。
【００１５】
ヒアルロナンのうち分子量の低いものは、具体的には、酵素分解法、アルカリ分解法、加熱処理法、超音波処理法(Biochem., 33(1994)p6503-6507)等の公知の方法によってヒアルロナンを低分子化する方法、化学的もしくは酵素的に合成する方法(Glycoconjugate J., (1993)p435-439、WO93/20827) などで製造することが好ましい。例えば酵素分解法としては、ヒアルロナン分解酵素（ヒアルロニダーゼ（睾丸由来）、ヒアルロニダーゼ（Streptomyces由来）、ヒアルロニダーゼＳＤなど）、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＡＣII、コンドロイチナーゼＡＣIII 、コンドロイチナーゼＡＢＣなどのヒアルロナンを分解する酵素をヒアルロナンに作用させてヒアルロナンオリゴ糖を生成する方法（新生化学実験講座「糖質II−プロテオグリカンとグリコサミノグリカン−」p244-248、1991年発行、東京化学同人 参照）などが挙げられる。
【００１６】
また、アルカリ分解法としては、例えばヒアルロナンの溶液に１Ｎ程度の水酸化ナトリウム等の塩基を加え、数時間加温して、低分子化させた後、塩酸等の酸を加えて中和して、低分子量のヒアルロナンを得る方法などが挙げられる。本発明で用いるヒアルロナンは、塩の形態を包含し、製剤上の必要に応じて、その薬学上許容できる塩を用いることができる。例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、トリ（ｎ−ブチル）アミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、アミノ酸塩等のアミン塩などであることができる。
【００１７】
本発明の薬剤は、ある分子量のヒアルロナン単独又は種々の分子量のヒアルロナンを組み合わせたものなど特に限定することなく使用できる。本発明の薬剤は、ヒアルロナンを有効成分とするものであり、その有効量をヒトを含む哺乳動物に投与することによって生体に悪影響を与えることなく、MAPKKK遺伝子の発現を増強することができる。すなわち、本発明の薬剤は、生体に対する悪影響がない、MAPKKK遺伝子の発現抑制に起因する疾患の治療に使用することができる。特に、本発明の薬剤は、MAPKKK遺伝子の中でもMAPKKK13遺伝子の発現を増強することができる。
【００１８】
MAPKKK13遺伝子は、SAPKシグナル伝達経路に関与するLZKである。SAPKシグナル伝達経路は、細胞外からの刺激を核に伝達することによってストレス適応、アポトーシス、細胞増殖、癌化、分化、免疫応答などを制御する。したがって、本発明の薬剤によりMAPKKK13遺伝子の発現を増強することができれば、特に、神経障害（多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ギランバレー症候群、脳卒中、脊髄損傷、ぶどう膜炎、緑内障など）、各種外傷（脳挫傷、脊髄損傷、じょく創）、心筋梗塞、狭心症、心筋炎、自己免疫疾患（リウマチ、SLE、炎症性腸炎、多発性硬化症など）、がん、各種アレルギー疾患、肝炎、肝硬変、膵炎、肺炎、肺繊維症、喘息、各種潰瘍、腎炎、腎賞、糖尿病、等の症状を改善することが期待される。
【００１９】
本発明の薬剤は、上述したような疾患の治療又は症状の改善を目的として、ヒアルロナン又はその塩を、そのまままたは必要に応じて担体、賦形剤、その他の添加物と共に、経口的あるいは非経口的に投与（関節内投与、静脈内、筋肉内、皮下などの組織内投与（注射）、経腸投与、経皮投与など）するための医薬品として、任意の剤形に製剤化することが可能であり、任意の投与方法で患者に投与される。特に、本発明に係る薬剤は、注射剤及び経口製剤とすることが好ましい。
【００２０】
経口製剤としては、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤等の固形製剤；シロップ剤、エリキシル剤、乳剤等の液状製剤を挙げることができる。散剤は、例えば、乳糖、デンプン、結晶セルロース、乳酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、無水ケイ酸等の賦形剤と混合して得ることができる。顆粒剤は、上記賦形剤のほか、必要に応じ、例えば白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤や、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の結合剤や、カルボキシメチルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤をさらに加え、湿式又は乾式で造粒して得ることができる。錠剤は、上記散剤又は顆粒剤をそのまま、或いはステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤を加えて打錠して得ることができる。また、上記錠剤又は顆粒剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタアクリル酸メチルコポリマー等の腸溶性基剤で被覆し、或いはエチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油等で被覆し、これらを腸溶性或いは持続性製剤にすることができる。硬カプセル剤は、上記散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填して得ることができる。また軟カプセル剤は、ヒアルロナン又はその塩を、グリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油等に混合し、これをゼラチン膜で被覆して得ることができる。シロップ剤は、白糖、ソルビトール、グルセリン等の甘味剤とヒアルロナン又はその塩とを、水に溶解して得ることができる。また、甘味剤及び水のほかに、精油、エタノール等を加えてエリキシル剤とするか、或いはアラビアゴム、トラガカント、ポリソルベート８０、カルボキシメチルセルロースナトリウム等を加えて乳剤又は懸濁剤にすることができる。またこれらの液状製剤には必要に応じ、矯味剤、着色剤、保存剤等を加えることができる。
【００２１】
非経口製剤としては、注射剤、直腸投与剤、ペッサリー、皮膚外用剤、吸入剤、エアゾール剤、点眼剤等を挙げることができる。注射剤は、ヒアルロナン又はその塩に塩酸、水酸化ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等のｐＨ調節剤；塩化ナトリウムウム、ブドウ糖等の等張化剤；及び注射用蒸留水を加え、滅菌濾過した後、アンプルに充填して得ることができる。また、更にマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチン等を加えて真空凍結乾燥し、用時溶解型の注射剤とすることができる。またヒアルロナン又はその塩にレシチン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の乳化剤を加えた後、水中で乳化された注射用乳剤とすることもできる。
【００２２】
直腸投与剤は、ヒアルロナン又はその塩にカカオ脂肪酸のモノ、ジ又はトリグリセリド、ポリエチレングリコール等の坐剤用基剤を加えた後、加温して溶解し、これを型に流し込んで冷却するか、或いはヒアルロナン又はその塩をポリエチレングリコール、大豆油等に混合した後、ゼラチン膜で被覆して得ることができる。皮膚外用剤は、ヒアルロナン又はその塩に、白色ワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、ポリエチレングリコール等を加え、必要に応じて加温し、混練して得ることができる。テープ剤は、ヒアルロナン又はその塩を、ロジン、アクリル酸アルキルエステル重合体等の粘着剤と混練し、これを不織布等に展延して得ることができる。吸入剤は、例えば薬学的に許容される不活性ガス等の噴射剤に、ヒアルロナン又はその塩を溶解又は分散し、これを耐圧容器に充填して得ることができる。
【００２３】
（投与方法）本発明のヒアルロナンを有効成分とする薬剤の投与方法は、特に限定されないが、静脈内投与、経口投与および関節内投与を挙げることができる。
（投与量）投与量は、対象とする疾患、患者の年令、健康状態、体重等に応じ適宜決定するが、一般には０．０５〜５０mg/kg を１日１回あるはそれ以上に分けて投与する。
（毒性）本発明で使用するヒアルロナンは、医薬としての生物活性を示す投与量において細胞毒性はほとんどもしくは全く認められなかった。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明に係る薬剤を、実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２５】
〔実施例１〕
本実施例では、本発明に係る薬剤によるMAPKKK遺伝子の発現増強剤を、遺伝子の発現増強・発現抑制をモニターすることができるDNAチップを用いて評価した。
【００２６】
実験方法
先ず、１、２群に分けてK562をRPMI培地で培養した。両群は、42℃で20分、次いで37℃で30分インキュベートする培養条件とした。なお、２群の培地には、HA4（10ng/ml）を添加した。
【００２７】
次に、培養の後、1000rpmで遠心分離して培地を除去した。得られた細胞を-60℃ディープフリーザーにて保存した。保存した細胞から、次に、定法に従ってRNAを抽出した。抽出したRNAを用いて、MAPKKK13遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが固定化されたDNAチップにて遺伝子発現を解析した。DNAチップによる遺伝子発現解析はDNAチップ研究所に外注した。詳細には、DNAチップ研究所製、商品名：AceGene Human Oligo Chip 30K 1 Chip Versionを使用した。
結果
DNAチップを用いたMAPKKK13遺伝子の発現解析の結果として、１群における発現強度と２群における発現強度との比（〔２群の発現強度〕/〔１群の発現強度〕）を算出した。結果を表１に示す。MAPKKK13遺伝子について発現強度比は11.43であった。
【００２８】
【表１】
2007153766.tif 000002
【００２９】
また、本実施例で使用したDNAチップの画像を図１に示す。
【００３０】
考察
本実施例において、HA4の処理により、MAPKKK遺伝子の発現増強が認められた。本実施例では、K562以外の細胞が入っていないので、他の種類の細胞による影響を排除している。また、本実施例では、20分の42℃の熱ショック終了後、37℃30分のインキュベートの時点では、新規mRNA発現はあるものの、新規の蛋白発現はほとんど起きていないと考えられる。例えば、Hsp72についてはmRNA発現増強はあっても、蛋白レベルでは変化がないと言える。したがって、本実施例で示したMAPKKK遺伝子のmRNA発現増強は、HA4による直接的な影響であり、他の因子を介した2次的現象ではないと言える。以上の結果からHA4はMAPKKK遺伝子の発現増強剤として機能することが実証された。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】実施例で使用したDNAチップを撮像した写真である。
【図１】
2007153766.tif 000003