(57)【要約】【課題】ニトロレダクターゼの作用により、少なくとも一つのＮＯ２基をＮＨＯＨまたはＮＨ２に還元する。【解決手段】ニトロレダクターゼの作用により、少なくとも一つのＮＯ２基をＮＨＯＨまたはＮＨ２に還元することを特徴とする、少なくとも一つのＮＯ２基を含むシアニン色素分子の蛍光を増大するための方法である。少なくとも一つのＮＯ２基を含むシアニン色素分子は、組成物中におけるニトロレダクターゼ酵素活性の検出用の基質として使用でき、検体、結合反応または遺伝子発現の検出用の酵素レポーターシステムにおけるニトロレダクターゼ酵素の使用を可能にする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つのＮＯ２基をＮＨＯＨまたはＮＨ２に還元することを特徴とする、少なくとも一つのＮＯ２基を含む色素分子の蛍光を増大するための方法。
【請求項２】
少なくとも一つのＮＯ２基を含む色素分子がシアニン色素である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
少なくとも一つのＮＯ２基を含む色素分子が、式Ｉ：
【化１】
2007183284.tif 000023
〔式中、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はＸおよびＹを含む環に結合し、または、所望により、Ｚ１およびＺ２環構造の原子に結合し、ｎは１−３の整数である；
Ｚ１およびＺ２は各々１個または２個の縮合芳香族環を達成するのに必要な結合または原子を示し、各環は炭素原子、および所望により、２個を超えない酸素、窒素および硫黄原子から選択される５個または６個の原子を有する；
ＸおよびＹは同一または異なり、ビス−Ｃ１−Ｃ４アルキル−およびＣ４−Ｃ５スピロアルキル−置換炭素、酸素、硫黄、セレン、−ＣＨ＝ＣＨ−およびＮ−Ｗ(ここで、Ｎは窒素およびＷは水素、基−(ＣＨ２)ｍＲ８から選択され、ｍは１から２６の整数およびＲ８は水素、アミノ、アルデヒド、アセタール、ケタール、ハロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、スルホネート、スルフェート、カルボキシレート、ホスホネート、ポリエチレングリコール、置換アミノ、４級アンモニウム、ニトロ、１級アミド、置換アミド、ならびにアミノ、ヒドロキシル、カルボニル、カルボキシル、ホスホリルおよびスルフヒドリル基と反応性の基から選択される)から選択される；
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、独立して水素、置換または非置換Ｃ１−Ｃ４アルキル、ＯＲ９、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、４級アンモニウム、ホスフェート、スルホネートおよびスルフェートからなる群から選択され、ここでＲ９は置換または非置換であり、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アミノ、アルデヒド、アセタール、ケタール、ハロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、スルホネート、スルフェート、カルボキシレート、置換アミノ、４級アンモニウム、ニトロ、１級アミド、置換アミド、ならびにアミノ、ヒドロキシル、カルボニル、カルボキシル、ホスホリルおよびスルフヒドリル基と反応性の基から選択される；
基Ｒ１およびＲ２は非置換または置換され得るＣ１−Ｃ１０アルキルから選択される；
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７の少なくとも一つが、本質的に非蛍光であるように該色素の蛍光放出を減少させる、少なくとも一つのニトロ基を含むを特徴とする〕
を有する修飾シアニン色素である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
少なくとも一つのＮＯ２基を含むシアニン色素分子が、式IIまたは式III
【化２】
2007183284.tif 000024
の化合物、またはそれらの塩である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも一つの該ＮＯ２基の還元が酵素により触媒される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
少なくとも一つの該ＮＯ２基の還元がニトロレダクターゼ、および好ましくは細菌ニトロレダクターゼにより触媒される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
組成物中のニトロレダクターゼ酵素活性の検出法であり、
ａ)該組成物と、少なくとも一つのＮＯ２基を含むシアニン色素分子を、ニトロレダクターゼ活性を促進する条件下で混合する；そして
ｂ)ニトロレダクターゼ活性の量の尺度である蛍光の増大を測定する：
ことを含む方法。
【請求項８】
組成物が細胞または細胞抽出物を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ａ)アッセイ試薬に結合したニトロレダクターゼ酵素を、酵素の活性の量がアッセイにおける検体の量と比例する条件下で提供する；
ｂ)少なくとも一つのＮＯ２基を含むシアニン色素分子を提供する；そして
ｃ)ニトロレダクターゼ活性の量の尺度として蛍光の増大を測定する
ことを含む、検体の検出法。
【請求項１０】
ａ)特異的結合対の第１成分を表面に結合させる；
ｂ)ニトロレダクターゼ酵素で標識されている特異的結合対の第２成分を、成分の間の結合を促進する条件下で添加する；
ｃ)少なくとも一つのＮＯ２基を含むシアニン色素分子を、ニトロレダクターゼ活性に適した条件下で添加する；そして
ｄ)第２成分の第１成分への結合を、結合ニトロレダクターゼ活性の尺度としての蛍光の増大の測定により検出する：
ことを含む、アッセイ法。
【請求項１１】
該特異的結合対が、抗体／抗原、レクチン／糖タンパク質、ビオチン／ストレプトアビジン、ホルモン／レセプター、酵素／基質、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡおよびＤＮＡ／結合タンパク質からなる群から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ａ)ニトロレダクターゼをコードする配列に作動可能に連結した発現制御配列を含む核酸分子でトランスフェクトされている宿主細胞と、少なくとも一つのＮＯ２基を含むシアニン色素分子を接触させる；そして
ｂ)ニトロレダクターゼ遺伝子発現の尺度としての蛍光の増大を測定する
ことを含む、アッセイ法。
【請求項１３】
シアニン色素分子が細胞に透過性である、請求項１２記載のアッセイ法。
【請求項１４】
シアニン色素分子が式Ｉの化合物である、請求項１２または１３に記載のアッセイ法。
【請求項１５】
式Ｉのシアニン色素分子の基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７の少なくとも一つが、細胞膜透過性化(permeabilising)基を含む、請求項１４に記載のアッセイ法。
【請求項１６】
細胞透過性であることを特徴とする、少なくとも一つのＮＯ２基を含む式Ｉのシアニン色素分子。
【請求項１７】
該シアニン色素分子が式IIIａまたは式IIIｂ
【化３】
2007183284.tif 000025
の化合物、またはそれらの塩から選択される、請求項１６記載のシアニン色素分子。
【請求項１８】
ａ)ニトロレダクターゼをコードする配列に作動可能に連結した発現制御配列を含む核酸分子でトランスフェクトされている宿主細胞の抽出物と、少なくとも一つのＮＯ２基を含むシアニン色素分子を接触させる；そして
ｂ)ニトロレダクターゼ遺伝子発現の尺度としての蛍光の増大を測定する
ことを含む、アッセイ法。
【請求項１９】
シアニン色素分子の増大した蛍光を、５００−９００nmの範囲の蛍光放出の分析により測定する、請求項１から１５のいずれかまたは１８に記載の方法。
【請求項２０】
シアニン色素分子の増大した蛍光を、６６５nm−７２５nmの範囲の蛍光放出の分析により測定する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ニトロレダクターゼ酵素を発現するための手段および少なくとも一つのＮＯ２基を含むシアニン色素分子を含む、レポーターシステムのためのキット。
【請求項２２】
特異的結合対の成分の一方の存在を検出するためのキットであり、結合対の他方の成分に結合したニトロレダクターゼ酵素と、少なくとも一つのＮＯ２基を含むシアニン色素分子を含むキット。
【請求項２３】
式IV：
【化４】
2007183284.tif 000026
〔式中、
Ｄ１は検出可能フルオロフォアである：
Ｄ２は式(Ｉ)を有するシアニン色素分子である：そして
Ｌはリンカー基である〕
の対になったフルオロフォアレシオメトリックレポーター。
【請求項２４】
該レポーターが膜透過性である、請求項２３記載の対になったフルオロフォアレシオメトリックレポーター。
【請求項２５】
Ｌが開裂可能リンカー基である、請求項２３または２４に記載の対になったフルオロフォアレシオメトリックレポーター。
【請求項２６】
請求項２３から２５のいずれかに記載の対になったフルオロフォアレシオメトリックレポーターを含む、請求項９から１５のいずれかに記載のアッセイ法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低いまたは無視できる蛍光の分子から高い蛍光アウトプットであり、酵素作用により触媒され得る分子を製造する方法に関する。特に、本発明は蛍光レポーター分子を製造するための酵素的手段を利用した検体の蛍光検出を達成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的アッセイにおける検出モダリティーとしての蛍光の使用は広範囲であり、別の種々の方法が、広範囲の技術により検出するためのアッセイ条件において蛍光を発生させるために利用可能である。これらの技術は、蛍光顕微鏡、蛍光免疫アッセイおよびフローサイトメトリーを含む。
【０００３】
蛍光シグナルを発生させるために使用される方法の中で、酵素を非蛍光基質から蛍光生成物に変換させるために使用するものがある。
【０００４】
酵素は、アッセイ成分、例えば、免疫アッセイにおける抗体または核酸ハイブリダイゼーションにおける核酸分子に結合し、典型的に非蛍光基質から蛍光シグナルを発生させるために使用され得る。このような方法において、生成物の蛍光強度は、アッセイシグナルを提供し、アッセイにおける検体(例えば、免疫アッセイにおける抗原または核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおける相補的核酸配列)の量と相関する。このような酵素をベースにした蛍光法アッセイの例は、“Applications of Fluorescence in Immunoassays”, Chapter 9, pages 223-232, I.A. Hemmila, John Wiley & Sons, New York, 1991 (免疫アッセイ)および“Nonisotopic DNA Probe Techniques”, Chapter 1, pages 3-23, L.J. Kricka, Academic Press Inc., New York, 1992 (核酸ハイブリダイゼーションアッセイ)に記載され、このようなアッセイに使用される酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)およびアルカリホスファターゼを含む。
【０００５】
あるいは、酵素はアッセイの過程においてタンパク質合成により製造し得る。例えば、インビボ遺伝子発現アッセイにおいて、酵素を、自然には存在しないか、低レベルでしか見られない細胞または生物に、レポーター遺伝子の発現が、目的の細胞性遺伝子の発現とリンクするように挿入された挿入された遺伝子、通常、レポーター遺伝子と呼ばれるが、から製造する。酵素の非蛍光基質の、蛍光生成物への続く加工は、レポーター遺伝子の発現と相関し、したがって、目的の細胞性遺伝子の発現の間接的尺度を提供する。
【０００６】
レポーター遺伝子から合成され、そして現在インビボ遺伝子発現の測定のための蛍光アッセイに使用されている酵素は、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびβ−ラクタマーゼを含む。
【０００７】
β−ガラクトシダーゼは細菌酵素であり、このような酵素−レポーターアッセイに、酵素活性により蛍光を付与できる基質と組み合わせた使用が十分特徴付けされている。β−ガラクトシダーゼ発現の検出は、“Fluorescence Microscopy and Fluorescent Probes”, pages 211-215, J. Slavik, Plenum Press, London, 1996に記載されている。ここで、非蛍光基質、ＣＭＦＤＧを、酵素を発現する細胞に微小注入し、そこで酵素活性の尺度を提供する蛍光形に加水分解する。しかし、哺乳類細胞が幾分かの内因性β−ガラクトシダーゼ活性を示し、変換基質のあるバックグラウンド蛍光が、レポーター遺伝子からのβ−ガラクトシダーゼの発現を導くシグナルの非存在下でさえ、遺伝子発現のインビボアッセイにおいて観察される。
【０００８】
哺乳類細胞はまた、アルカリホスファターゼ発現をベースにしたインビボアッセイにおいて、バックグラウンドの非蛍光基質のその蛍光形への活性化をまた導く、幾分かの内在性アルカリホスファターゼ活性を有し得る。この場合、蛍光基質は、典型的にフルオレッセイン二リン酸である。加えて、最適アルカリホスファターゼ活性は、この酵素のインシテュアッセイでの使用を制限するｐＨ９.８を必要とする。
【０００９】
より最近、β−ラクタマーゼのための蛍光基質が発表されている(米国特許第５,９５５,６０４号, Tsien et al.参照)。その中に記載されている基質ＣＣＦ２は、蛍光基質におけるドナーおよびアクセプター分子が、β−ラクタマーゼの酵素活性により分離され、ドナー分子から蛍光シグナルを発生させる、ＦＲＥＴベースのアッセイ(下記)における使用に適している。
【００１０】
しかし、これらの技術で使用される蛍光色素は、典型的にフルオレッセインおよびその誘導体である(Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, 6th Edition, 1996またはwww.probes.com参照)。フルオレッセインベースの蛍光色素は、典型的にスペクトルのＵＶから青色領域における励起波長およびスペクトルの青色から緑色領域における放出波長を有する(すなわち、約４８８nmでの励起および約５１０nmでの放出)。これらの特徴は、これらの蛍光色素の生物学的物質との使用に、これらの波長が、多くの生物学的分子の励起および放出範囲と一致するため、ある種の制限を与える。これは、生物学的アッセイにおける高いバックグラウンド蛍光を与え得、その結果検出感度が低下する。
【００１１】
更に、全てのこれらの既知の技術は、スペクトルの同じ領域内にシグナルを発生させるため、同時に用いるおよび読む複数のシグナル伝達システムの範囲に制限がある。
【００１２】
フルオレッセインをベースにした色素は、強い励起源により照射された時の光退色の傾向を含む、多くの他の欠点を有する。更に、これらの蛍光色素をベースにした酵素基質からのある製品はｐＨ感受性であり、異なる環境における蛍光の変化を導き得る。短い波長で高いエネルギー励起を必要とするＵＶ領域における励起が、細胞損傷を発生し得、それがついで誤解させる結果を導き得るため、これらの蛍光色素の細胞内アッセイにおける使用に問題が発生し得る。
【００１３】
酵素蛍光基質の励起のこれらの短所を克服するため、非遍在性酵素のための基質であり、最初の形では０または低い蛍光を有し、酵素の反応により、広い範囲のスペクトルにわたり光を放出できる環境的に安定な蛍光生成物を産生する、一つの分子(または複数の分子)の必要性がある。放出の範囲は、例えば、スペクトルの５００−９００nm範囲である。
【００１４】
例えば、米国特許第５,２６８,４８６号に記載のシアニン色素(ある場合“Cy dye(登録商標)”とも呼ばれる)は、高い蛍光放出、環境安定性およびフルオロフォアの内部分子骨格を変えることにより選択できる、近赤外線まで伸びる範囲の放出波長により特徴付けられる、生物学的に適合性のあるフルオロフォアのシリーズである。
【００１５】
近年、シアニン色素は、蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)アッセイにおける使用に関して開発されている。ＦＲＥＴの原理は、米国第４,９９６,１４３号におよびより最近、ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１７４６(公開番号ＷＯ９９／６４５１９)に記載された。簡単に、ＦＲＥＴアッセイは、二つのフルオロフォア、ドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォアの間の相互作用に依存する。ドナーとアクセプター分子が、十分に近いとき、ドナー分子の蛍光がアクセプター分子に移動し、ドナー種の寿命の減少および蛍光の消失、および付随するアクセプター種の蛍光強度の増大をもたらす。生物学的システムにおけるＦＲＥＴラベルの使用は既知である。原則は、ＦＲＥＴを使用するアッセイにおける結合事象または開裂反応の検出に使用されている。ペプチド開裂反応の場合、蛍光ドナー分子および蛍光アクセプター分子が開裂するペプチドのいずれかの側に、エネルギー伝達が起こるような距離で、ペプチド基質に結合する。ペプチド開裂反応は、ドナー分子とアクセプター分子を離し、したがって、ドナー分子の蛍光が貯蔵される。
【００１６】
この原則の一つの形において、蛍光部分は、励起ドナーフルオロフォアからのエネルギーがクエンチャーに移動し、蛍光エネルギーよりも熱として散乱させるような、“クエンチャー”分子と密接にさせる。この場合、残りの蛍光は、ドナー−クエンチャーペアの二つの成分が密接になったときに最少になり、シグナルの大きな変化が、それらが分離したとき得ることができる。
【００１７】
ＦＲＥＴアッセイにおけるアクセプターまたは“クエンチャー”としての使用に適したシアニン色素は、シアニン色素に、分子の蛍光を減少させるまたは無くす効果を有する化学基の導入を介してシアニン色素にある修飾を成すことにより開発されている(ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１７４６参照)。このような化学修飾の一つの例は、−ＮＯ２基の導入である。このような消光されたＣｙ色素は、−Ｃｙ−Ｑ色素または“暗色素”と呼ぶ。
【００１８】
ニトロレダクターゼと呼ばれる細菌酵素は、下記反応スキーム１に示す一般的な反応を触媒することが示されている：
【化１】
2007183284.tif 000002
ここで、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下で、有機分子上の１個以上の−ＮＯ２基がヒドロキシルアミン基に還元させ、それは続いてアミン基に変換され得る。
【００１９】
細菌ニトロレダクターゼは、抗腫瘍治療において、プロドラッグ分子をその対応する細胞毒性形(Anlezark et al 1995, Biochem-Pharmacol 50(5), 609-18)に、プロドラッグ基質上の１個以上の−ＮＯ２基を除去または還元することにより変換するために使用されている。そのような基質は、細胞毒性化合物のｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル誘導体を含む。腫瘍細胞の選択的致死は、ニトロレダクターゼ遺伝子の腫瘍細胞へのターゲティング発現および感染細胞へのプロドラッグの投与により達成できる(例えば、米国特許第５,７８０,５８５号に記載のように)。プロドラッグ基質は、ニトロレダクターゼを発現する腫瘍細胞においてその細胞毒性形に変換されるが、回りの細胞(ニトロレダクターゼを含まない)は、影響されないままである。
【００２０】
ニトロレダクターゼはまた環境または健康危険物を作り得るニトロ芳香族化合物のクリーニングの工程におけるバイオリメディエーションに使用されている。米国特許第５,７７７,１９０号は、酸素の添加により反応が完了まで進むのを防止するために制御し得るニトロ芳香族化合物の還元のための、酸素感受性ニトロレダクターゼが関与する触媒法を記載する。示唆される基質は、ニトロベンゼン、トリニトロトルエンおよびオルトクロロニトロベンゼンを含み、好ましい酸素感受性ニトロレダクターゼ酵素はフェレドキシンＮＡＤＰ、キサンチンオキシダーゼおよびグルタチオンレダクターゼを含む。
【００２１】
今日まで、―ＮＯ２含有修飾シアニン色素分子が、蛍光分子を産生するためにニトロレダクターゼの基質として作用するという報告はないようである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明は、少なくとも一つのＮＯ２(ニトロ)基を含む修飾シアニン色素、例えば、Ｃｙ−Ｑ色素の蛍光を増大させる方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
これは、このようなＣｙ−Ｑ色素におけるＮＯ２基のＮＨＯＨまたはＮＨ２への、ニトロレダクターゼ(ＮＴＲ)の作用による酵素的変換により達成できる。Ｃｙ−Ｑ色素の構造に依存して、Ｃｙ−Ｑ／ＮＴＲ反応の産物からの蛍光放出は、スペクトルの青−緑領域においてのみ放出する既存のレポーターと対照的に、広範囲の波長、典型的に５００−９００nmで起こり得る。より長い波長でのこの放出は、生物学的システムにおけるバックグラウンド蛍光を避け、感受性を増加するのに有利である。
【００２４】
更に、Ｃｙ−Ｑ／ＮＴＲ反応産物の蛍光放出特性は、ニトロレダクターゼとの反応に関与する分子の末端、例えばＮＯ２基を変えることなく、Ｃｙ−Ｑ分子の内部構造を変えることにより、適用に適するように変え得る。したがって、複合システムにおける他のfluorsとの使用に適合した蛍光レポーターが提供できる。
【００２５】
加えて、Ｃｙ−Ｑの構造定義放出特性により、対の一つのメンバーが蛍光色素であり、第２のメンバーがＣｙ−Ｑ色素である、対になったフルオロフォアレシオメトリックレポーター分子への包含に適する。Ｃｙ−Ｑ上のニトロレダクターゼ作用は、二つの異なる波長で励起およびモニターした時の、二つのfluorsからの蛍光放出の比率の変化を導く。このようなレシオメトリックレポーター分子は、レポーター分子の濃度と独立した、酵素活性の測定を可能にする。
【００２６】
したがって、本発明は、第１の態様において、少なくとも一つのＮＯ２基を含む色素分子の、少なくとも一つの該ＮＯ２基をＮＨＯＨまたはＮＨ２に還元することを特徴とする、蛍光を増大するための方法を提供する。
【００２７】
適当なＮＯ２−含有色素は、シアニン誘導体、Ｃｙ−Ｑ(ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１７４６０に記載)、ＮＯ２−ランタニドキレート(例えば、Latra, M.J., Lumin. 1997, 75, 149-169およびBlasse, G., J. Phys. Chem. 1998; 92; 2419-2422に記載)およびＮＯ２−含有フルオレッセイン、ピレン、ローダミン、クマリンまたはBODIPY(登録商標)色素のような蛍光色素を含む。
【００２８】
第１の態様の一つの実施態様において、本発明で使用するための少なくとも一つのＮＯ２基を含む色素分子は、式Ｉ：
【化２】
2007183284.tif 000003
〔式中、基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はＸおよびＹを含む環に結合し、または、所望により、Ｚ１およびＺ２環構造の原子に結合し、ｎは１−３の整数である；
Ｚ１およびＺ２は各々１個または２個の縮合芳香族環を達成するのに必要な結合または原子を示し、各環は炭素原子、および所望により、２個を超えない酸素、窒素および硫黄原子から選択される５個または６個の原子を有する；
ＸおよびＹは同一または異なり、ビス−Ｃ１−Ｃ４アルキル−およびＣ４−Ｃ５スピロアルキル−置換炭素、酸素、硫黄、セレン、−ＣＨ＝ＣＨ−およびＮ−Ｗ(ここで、Ｎは窒素およびＷは水素、基−(ＣＨ２)ｍＲ８から選択され、ｍは１から２６の整数およびＲ８は水素、アミノ、アルデヒド、アセタール、ケタール、ハロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、スルホネート、スルフェート、カルボキシレート、ホスホネート、ポリエチレングリコール、置換アミノ、４級アンモニウム、ニトロ、１級アミド、置換アミド、ならびにアミノ、ヒドロキシル、カルボニル、カルボキシル、ホスホリルおよびスルフヒドリル基と反応性の基から選択される)から選択される；
基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、独立して水素、置換または非置換Ｃ１−Ｃ４アルキル、ＯＲ９、ＣＯＯＲ９、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、４級アンモニウム、ホスフェート、スルホネートおよびスルフェートからなる群から選択され、ここでＲ９は置換または非置換であり、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アミノ、アルデヒド、アセタール、ケタール、ハロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、スルホネート、スルフェート、カルボキシレート、置換アミノ、４級アンモニウム、ニトロ、１級アミド、置換アミド、ならびにアミノ、ヒドロキシル、カルボニル、カルボキシル、ホスホリルおよびスルフヒドリル基と反応性の基から選択される；
基Ｒ１およびＲ２は非置換または置換され得るＣ１−Ｃ１０アルキルから選択される；
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７の少なくとも一つが、本質的に非蛍光であるように該色素の蛍光放出を減少させる、少なくとも一つのニトロ基を含むを特徴とする〕
を有する修飾シアニン色素である。
【００２９】
適当には、式Ｉの色素に含まれる少なくとも一つのニトロ基が、ＸおよびＹを含む環に直接結合し得る。別法として、単または二ニトロ置換ベンジル基が、ＸおよびＹを含む環に結合し得、それは所望により更に芳香族環に直接結合する１個以上のニトロ基で置換され得る。
【００３０】
一つの実施態様において、Ｒ１およびＲ２は、ＮＨ２、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ４Ｈ、ＳＨ、ポリエチレングリコールおよびフェニルからなる群から選択される置換基で置換し得るＣ１−Ｃ１０アルキルから選択し得る。フェニル基が置換されている場合、所望により、カルボキシル、スルホネートおよびニトロ基から選択される２個までの置換基で置換し得る。
【００３１】
本発明での使用に適した非蛍光シアニン色素分子は、式IIおよびIIIのいずれかを有する：
【化３】
2007183284.tif 000004
【００３２】
特に好ましいのは、以下のＣｙ色素のいずれでも、ＮＯ２−含有“暗色素”形である。非修飾色素の励起(Ａｂｓ)および放出(Ｅｍ)特性を示す：
【表１】
2007183284.tif 000005
【００３３】
第１の態様の他の実施態様において、ＮＯ２基の還元は、ニトロレダクターゼ、そして好ましくは細菌レダクターゼであり得る酵素により触媒される。
【００３４】
重要なことに、これは、シアニンベースの色素が、このような酵素基質反応において、スペクトルの青色／緑色領域の蛍光読み出しを与える任意の慣用の酵素基質反応と同時に使用できることを意味する。測定は、同時に二つの異なる波長を使用して行なうことができる：例えば、フルオレッセインベースの分子は、Ａｂｓ４８８／Ｅｍ５１０で検出され、一方Ｃ５をベースにしたもののような還元シアニンベース分子は、Ａｂｓ６４９／Ｅｍ６７０で検出される。これは、複合化を可能にし、すなわち、多くの異なるインビトロまたはインビボの測定を同時に果たす。
【００３５】
ＮＯ２−含有シアニン分子は、“非蛍光色素”、すなわち、吸収された入射光を蛍光に変換するのに内因性の低い効率を有する色素と記載できる。非蛍光色素のニトロレダクターゼ基質としての有効性は、入射光を蛍光に還元反応後に変える程度である。
【００３６】
蛍光の増大は、ニトロレダクターゼ非存在下で、ＮＯ２含有シアニン色素分子基質を含むコントロールサンプルに関連して測定できる。
【００３７】
本発明の第２の態様において、組成物中のニトロレダクターゼ酵素活性の検出法であり、
ａ)該組成物と少なくとも一つのＮＯ２基を含む色素化合物を、ニトロレダクターゼ活性を促進する条件下で混合する；そして
ｂ)ニトロレダクターゼ活性の量の尺度である蛍光の増大を測定する：
ことを含む方法を提供する。
【００３８】
特に好ましい実施態様において、色素化合物は少なくとも一つのＮＯ２基を含むシアニン色素化合物である。
適当には、シアニン色素化合物は、前記の式Ｉの化合物である。
【００３９】
第２の態様の一つの実施態様において、組成物は細胞または細胞抽出物を含む。原則として、任意のタイプの細胞、すなわち、原核または真核(細菌、哺乳類および植物細胞を含む)を使用できる。適当な場合、細胞抽出物を、細胞から、当業者に既知の標準法(Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989)を使用して、蛍光測定前に調製できる。
【００４０】
ニトロレダクターゼ活性の典型的条件は、組成物と、少なくとも一つのＮＯ２基を含むシアニン色素分子の、ＮＡＤＨおよびＦＭＮの存在下での約３７℃でのインキュベーションを含む。
【００４１】
本発明の第３の態様において、
ａ)アッセイ試薬に結合したニトロレダクターゼ酵素を、酵素の活性の量がアッセイにおける検体の量と比例する条件下で提供する；
ｂ)少なくとも一つのＮＯ２基を含む色素化合物を提供する；そして
ｃ)ニトロレダクターゼの量の尺度として蛍光の増大を測定する
ことを含む、検体の検出法を提供する。
【００４２】
本発明の第４の態様において、
ａ)特異的結合対の第１成分を表面に結合させる；
ｂ)ニトロレダクターゼで標識されている特異的結合対の第２成分を、成分の間の結合を促進する条件下で添加する；
ｃ)少なくとも一つのＮＯ２基を含む色素化合物を、ニトロレダクターゼ活性に適した条件下で添加する；そして
ｄ)第２成分の第１成分への結合を、結合ニトロレダクターゼ活性の尺度としての蛍光の増大の測定により検出する：
ことを含む、アッセイ法を提供する。
【００４３】
本発明の第３または第４の態様の特に好ましい実施態様において、色素化合物は、少なくとも一つのＮＯ２基を含むシアニン色素である。
適当には、第３または第４の態様で用いる色素化合物は、前記の式Ｉの化合物である。
【００４４】
第４の態様の一つの実施態様において、該結合対は、抗体／抗原、レクチン／糖タンパク質、ビオチン／ストレプトアビジン、ホルモン／レセプター、酵素／基質、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ＤＮＡ／結合タンパク質または操作した結合対からなる群から選択される。
【００４５】
簡単に、抗体結合の検出のためのインビトロアッセイ法は、下記のように形成される。目的の抗原に特異的な抗体は、それを酵素的に活性ナニトロレダクターゼに共有結合的に結合させることにより標識し得る。該標識抗体を、次いで、抗原を含む試験サンプルに結合条件下で挿入し得る。非結合抗体を除去するための洗浄の後、抗体結合の量を、サンプルと非蛍光シアニン色素基質を、ニトロレダクターゼ活性の条件下でインキュベートし、蛍光の増大を測定することにより検出する。検出された蛍光の量は、検体に結合しているニトロレダクターゼ標識抗体の量と比例する。
【００４６】
核酸の結合のハイブリダイゼーションによる検出のためのインビトロアッセイにおいて、標的とプローブ核酸の対のいずれかが膜または表面に結合する。非結合パートナーをニトロレダクターゼで標識し、ハイブリダイズ条件下で結合核酸とインキュベートする。非結合、標識核酸を洗い出し、結合、標識核酸の量を、膜または表面と非蛍光シアニン色素を、ニトロレダクターゼ活性に適した条件下でインキュベートすることにより測定する。蛍光の増大の量は、結合標識ＤＮＡの量の尺度を与える。
【００４７】
酵素を他の生体分子、例えば、タンパク質および核酸に結合させる方法は、既知である(Bioconjugate Techniques, Academic Press 1996)。結合は、例えば、適当な２官能性架橋剤(例えば、Ｎ−[β−マレイミドプロピオン酸]ヒドラジン酵素と結合パートナーを共有結合的に結合するために、Pierce)を使用することにより、直接的手段により達成し得る。あるいは、結合は、例えば、酵素と結合パートナーを、化学的反応性ビオチン誘導体(例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−ビオチン、Pierce)を使用してビオチニル化し、続いて分子をストレプトアビジン架橋分子を介して結合させることによる、間接的手段により達成し得る。
【００４８】
細胞ベースのアッセイは、ハイスループットスクリーニング(ＨＴＳ)に使用するためのインビトロ生化学アッセイの魅力を増加させる。これは、細胞ベースのアッセイが最小操作を必要とし、読み出しが通常の生理学的条件をより忠実に模倣する生物学的状況において試験できるからである。このようなインビボアッセイは、細胞性過程を測定する能力およびその読み出しを測定する手段を必要とする。例えば、多くの遺伝子の転写のパターンの変化は、例えば、アゴニストとその細胞表面のレセプターの相互作用により、またはＤＮＡ損傷のような内部細胞性事象により引き金を引かれた細胞性シグナルにより誘導できる。この転写における誘導された変化は、レポーター遺伝子を、特異的活性化シグナルを担うことが知られているプロモーター領域にレポーター遺伝子を融合することにより動的できる。
【００４９】
蛍光ベースの酵素基質システムにおいて、蛍光の増大は、レポーター遺伝子の発現の活性化の尺度を与える。
【００５０】
したがって、本発明の第５の態様において、
ａ)ニトロレダクターゼをコードする配列に作動可能に連結した発現制御配列を含む核酸分子でトランスフェクトされている宿主細胞と、少なくとも一つのＮＯ２基を含む色素化合物を接触させる；そして
ｂ)ニトロレダクターゼ遺伝子発現の尺度としての蛍光の増大を測定する
ことを含む、アッセイ法を提供する。
【００５１】
特に好ましい実施態様において、色素化合物は少なくとも一つのＮＯ２基を含むシアニン色素化合物である。適当には、シアニン色素は前記の式Ｉの化合物である。
【００５２】
哺乳類細胞におけるレポーター遺伝子として種々の酵素遺伝子を使用する方法は既知である(レビューのために、Naylor L. H. (1999) Biochemical Pharmacology 58, 749-757参照)。レポーター遺伝子は、遺伝子の産物が他の細胞性タンパク質の存在下で測定可能であり、細胞に宿主細胞内における遺伝子発現の変化を担う選択制御配列の制御下に挿入されるように選択する。典型的な制御配列は、ホルモン、第２メッセンジャーおよび他の細胞性制御を担うものおよびシグナル伝達因子を含む。例えば、７つの膜貫通レセプターに結合するアゴニストが、ｃＡＭＰ応答要素、ＮＦＡＴ、ＳＥＲおよびＡＰ１を含むプロモーター要素を調節することが知られている；ＭＡＰキナーゼ活性化は、ＳＲＥの調節を導き、ＦＯＳおよびＪｕｎ転写を導く；ＤＮＡ損傷はＤＮＡ修復酵素および腫瘍抑制因子ｐ５３の転写の活性化を導く。適当な制御配列の選択により、レポーター遺伝子は添加試薬の効果のアッセイまたは研究下に選択した制御配列が関与する細胞性過程のアッセイに使用できる。
【００５３】
レポーター遺伝子として使用するために、ニトロレダクターゼ遺伝子は、慣用法で、例えば、ｃＤＮＡライブラリーからポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)の使用により増幅することにより、単離し得る(Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989 pp. 14.5-14.20)。単離されたら、ニトロレダクターゼ遺伝子を、試験下で遺伝子制御配列と関連しておよびその制御下に、哺乳類プロモーターと使用するのに適したベクター(Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989 pp 16.56-16.57)に挿入し得る。ベクターはニトロレダクターゼレポーターを含み、関連制御配列を次いで宿主細胞に、既知の技術を使用したトランスフェクション、例えば、ＤＥＡＥ−デキストランまたはリン酸カルシウムの使用により挿入し得る(Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989 pp 16.30-16.46)。他の適当な技術は、当業者に既知である。
【００５４】
ニトロレダクターゼは、この方法で発現されたとき、細胞内に保持されることが示されている(Bridgewater et al. Eur. J. Cancer 31a, 2362-70)。
【００５５】
本発明の第５の態様の好ましい実施態様において、少なくとも一つのＮＯ２基を含むシアニン色素分子は、細胞に透過性である。好ましくは、式Ｉのシアニン色素分子の基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７の少なくとも一つが、細胞膜透過性化(permeabilising)基を含む。膜浸透化合物は、親水性基をマスキングし、より疎水性の化合物とすることにより産生できる。マスキング基は、細胞内の蛍光基質から開裂し、細胞内で誘導された基質を産生するように設計できる。基質が膜浸透誘導体よりも親水性であるため、次いでそれは細胞にトラップされる。適当な細胞膜透過性化基は、内因性哺乳類細胞内エステラーゼにより容易に開裂されるアセトキシメチルエステル(Jansen, A.B.A. and Russell, T.J., J. Chem Soc. 2127-2132 (1965)およびDaehne W. et al. J. Med-.Chem. 13, 697-612(1970))およびピバロイルエステル(Madhu et al., J. Ocul. Pharmacol. Ther. 1998, 14, 5, pp 389-399)から選択されるが、デリバリー分子(デリバリーペプチドのような)を含む他の適当な基が、当業者に認識されよう。
【００５６】
本発明の第６の態様において、細胞に挿入できるように修飾されている、式Ｉに従ったＮＯ２含有化合物を提供する。したがって、特に好ましい実施態様において、式IIIａまたは式IIIｂの化合物から選択されるＮＯ２含有化合物が提供される。
【化４】
2007183284.tif 000006
【００５７】
典型的に、細胞性応答を、試験下の制御配列を介して活性化する試薬の活性をアッセイするために、ニトロレダクターゼレポーターでトランスフェクトした細胞を試験薬とインキュベートし、続いて少なくとも一つのＮＯ２基を含むシアニン色素分子のような細胞浸透シアニン色素基質を添加する。シアニン色素基質がより高い蛍光を示す形に変換するのに必要な適当な時間の後、細胞からの蛍光放出を選択シアニン色素に適当な波長で測定する。例えば、化合物Ｃｙ−ＱＦ(図１ａに示す)に関して、蛍光放射は６５０nmでの励起で、６９０nmで追跡される。蛍光の測定は、蛍光顕微鏡(例えば、LSM 410, Zeiss)、マイクロプレートリーダー(例えば、CytoFlour 4000, Perkin Elmer)、ＣＣＤイメージングシステム(例えば、LEADseeker(登録商標), Amersham Pharmacia Biotech)およびFlow Cytometers(例えば、FACScalibur, Becton Dickinson)を含む、さまざまな検出装置の使用により容易に達成し得る。
【００５８】
測定した蛍光を、試験薬に曝していないコントロール細胞からの蛍光と比較し、もしあれば、調節配列を介して調節した遺伝子発現への試験薬の効果を、コントロール細胞における蛍光に対する試験細胞における蛍光から決定する。
適当な場合、細胞抽出物を慣用法を使用して調製できる。
【００５９】
したがって、本発明の第７の態様において、
ａ)ニトロレダクターゼをコードする配列に作動可能に連結した発現制御配列を含む核酸分子でトランスフェクトされている宿主細胞の抽出物と、少なくとも一つのＮＯ２基を含む色素化合物を接触させる；そして
ｂ)ニトロレダクターゼ遺伝子発現の尺度としての蛍光の増大を測定する
ことを含む、アッセイ法を提供する。
【００６０】
特に好ましい実施態様において、色素化合物は少なくとも一つのＮＯ２基を含むシアニン色素化合物である。適当には、シアニン色素は前記の式Ｉの化合物である。
【００６１】
本発明の任意の先の態様の一つの実施態様において、シアニン色素分子の増大した蛍光は、５００から９００nm、好ましくは５５０−７８０nm、および最も好ましくは６６５−７２５nmの範囲の蛍光放射の分析により同定される。
【００６２】
本発明の第８の態様において、ニトロレダクターゼ酵素と、少なくとも一つのＮＯ２基を含む色素分子を発現する手段を含む、レポーターシステムのためのキットを提供する。
【００６３】
ニトロレダクターゼ酵素を発現させるのに適当な手段は、発現プラスミドまたは他の発現構築物を含む。このような発現構築物を製造する方法は、当業者に既知である。
【００６４】
本発明の第９の実施態様において、特異的結合対の成分の一方の存在を検出するためのキットであり、結合対の他方の成分に結合したニトロレダクターゼ酵素と、少なくとも一つのＮＯ２基を含む色素分子を含むキットを提供する。
【００６５】
第８または第９の態様における好ましい実施態様において、色素分子は少なくとも一つのＮＯ２基を含むシアニン色素分子である。適当には、シアニン色素は前記の式Ｉの化合物である。
【００６６】
少なくとも一つのＮＯ２を含む色素分子、および特にＣｙ−Ｑ色素におけるニトロレダクターゼに起因する蛍光の変化は、その一つがＣｙ−Ｑ色素のような分子である結合フルオロフォアに基づくレシオメトリック蛍光レポーターの構築物または“カセット”内に利用できる。
【００６７】
したがって、本発明の第１０の態様において、式IV：
【化５】
2007183284.tif 000007
〔式中、
Ｄ１は検出可能フルオロフォアである：
Ｄ２は式(Ｉ)を有するシアニン色素分子である：そして
Ｌはリンカー基である〕
の対になったフルオロフォアレシオメトリックレポーターを提供する。
【００６８】
適当には、Ｄ１およびＤ２は、カセットの励起が、二つの異なる波長、λ１およびλ２であるように選択し、ここで波長は、フルオロフォアＤ１(波長λ３で)およびＤ２に対応するフルオロフォア(波長λ４で)からの蛍光放出を誘導するのに適するように選択し、そこからＤ２が誘導され、まだ少なくとも一つのＮＯ２基を欠く。特に好ましい実施態様において、Ｄ２はＣｙ３ＱおよびＣｙ５Ｑから選択される。
【００６９】
好ましい実施態様において、Ｌは開裂可能リンカー、例えば、化学的開裂可能、光開裂可能(例えば、ニトロベンジルアルコール)またはプロテアーゼのような酵素により酵素的開裂可能(例えば、エステル、アミド、ホスホジエステル、アゾ)である。このようなリンカーを開裂するための適当な方法は既知であり、例えば、Gerard Marriott et al., Preparation and photoactivation of caged proteins using new cross-linking reagent, Bioconjugate Chemistry; (1998) 9(2); 143-151およびＷＯ０１０／７５３５８に記載されている。
【００７０】
一つの実施態様において、Ｄ１およびＤ２はＦＲＥＴアレンジメントであり得る。
好ましくは、式IVの化合物は細胞または膜透過性を付与される。
【００７１】
第１０の態様の特に好ましい実施態様において、式Ｖの化合物が提供される。
【化６】
2007183284.tif 000008
【００７２】
この実施態様において、Ｄ１は８−ヒドロキシ−ピレン−１,３,６−トリスルホン酸(Casade Blue(登録商標))、Ｄ２はＣｙ５ＱおよびＬはエステル結合である。
【００７３】
この実施態様において、Ｄ１およびＤ２は、Ｄ１の蛍光がＤ２により消光されるような、ＦＲＥＴアレンジメントに配置される。式Ｖのカセットを細胞内酵素の存在下でインキュベートするとき(例えば、カセットが細胞内に十分輸送されるとき)、リンカーＬは開裂され、従って、エネルギー移動配置からＤ１が放出され、波長λ１で励起されたとき、波長λ３の放出が検出できる。これらの条件下で、λ３での蛍光放射の測定および非反応カセットとの比較は、リンカー部分Ｌの開裂の尺度(そして、したがって、例えば、細胞内へのカセットの取り込みの尺度)を提供する。ニトロレダクターゼの非存在下で、波長λ４でＤ２から低いまたは０の放出しか検出されない。ニトロレダクターゼ存在下で、ＣｙＱ部分は還元され、波長λ２での励起が、波長λ４での放出を与えるように、Ｃｙの蛍光形を形成する。これらの条件下で、λ４での蛍光放出の測定および非反応カセットのλ４での蛍光放出との比較は、Ｄ２のその還元形への変換の程度の尺度、したがって、ニトロレダクターゼ活性の尺度を提供する。
【００７４】
適当には、式IVの化合物は本発明の第３、第４、第５、第６または第８の態様の任意の一つに従ったアッセイ法で使用し得る。
【００７５】
具体的な記載
明確にする目的で、本発明の一定の実施態様を、以下の図面を参照した実施例の方法で記載する：
図１ａはＣｙ−ＱＦと呼ばれる式IIの化合物の化学構造を示す。
図１ｂは種々の時間、E. coli Bニトロレダクターゼの存在下インキュベートしたＣｙ−ＱＦの蛍光放出スペクトルを示す。
図２ａはＣｙ−ＱＧと呼ばれる式IIIの化合物の化学構造を示す。
図２ｂは種々の時間、E. coli Bニトロレダクターゼの存在下インキュベートしたＣｙ−ＱＧの蛍光放出スペクトルを示す。
図３ａはＣｙＱＧのＨＰＬＣ分析を示す。
図３ｂはニトロレダクターゼ処理ＣｙＱＧのＨＰＬＣ分析を示す。
図４ａはＣｙＱＧのMALDI-TOFマススペクトル分析を示す。
図４ｂはニトロレダクターゼで処理したＣｙＱＧのMALDI-TOFマススペクトル分析を示す。
図５はＣｙＱＧおよびニトロレダクターゼで処理したＣｙＱＧの赤外線吸収スペクトル分析を示す。
図６はＣｙ５Ｑの化学構造を示す。
図７はニトロレダクターゼ存在下の異なる濃度のＣｙ５Ｑの蛍光放出を示す。
図８はニトロレダクターゼとのインビトロ結合アッセイの結果を示す。
図９はＣｙ５蛍光を検出することによる、トランスフェクトしたおよびコントロール細胞からの細胞融解物におけるニトロレダクターゼ活性の検出を示す。
図１０はニトロレダクターゼ発現細胞およびコントロール細胞におけるＣｙ３蛍光を示す。
図１１はニトロレダクターゼ発現細胞およびコントロール細胞におけるＣｙ５蛍光を示す。
図１２はフローサイトメトリーによる細胞性ニトロレダクターゼ活性恩測定を示す。
図１３はＣｙ５Ｑ−カスケードブルーカセット、水中、６４９nmでａ＝１、次いで１００μl＋３ml水に希釈、励起４５０nmの蛍光放出スペクトルを示す。
図１４は８−ヒドロキシ−ピレン−１,３,６−トリスルホン酸、水中、４５５nmでａ＝１、次いで１００μl＋３ml水に希釈、励起４５０nmの蛍光放出スペクトルを示す。
図１５はＮａＯＨ溶液で処理後の、水中、６５０nmでａ＝１、次いで１００μl＋３ml水に希釈、励起４５０nmＣｙ５Ｑ−カスケードブルーカセットを示す。
図１６は融解物／ＮＴＲの存在下または非存在下のＣｙ５Ｑ−カスケードブルーカセットの相対的蛍光を示す。
【実施例】
【００７６】
実施例１
氷浴上で、リン酸緩衝生理食塩水中に、０.８mg／mlのE.Coli B ニトロレダクターゼ、１mMのＮａＤＨ、０.４μｍのＦＭＮおよび０.０５mMのシアニン−Ｑ Ｆ(Ｃｙ−Ｑ Ｆ、図１ａ)を含む反応混合物を調製した。蛍光分光器による分析を行うためにサンプルを直ちに移し、さらに反応混合物を３７℃で１時間、２時間、５時間インキュベートした後分析を行うためにサンプルを移した。
【００７７】
６５０nmでの励起から生じる、６６５nmから７２５nmの範囲での蛍光の放出の分析は、ニトロレダクターゼと共にＣｙ−Ｑ Ｆをインキュベートした時間に伴って、最大放出光６９０nmでの蛍光の著しい増大を示した(図１ｂ)。
【００７８】
実施例２
氷浴上で、リン酸緩衝生理食塩水中に、０.８mg／mlのE.Coli B ニトロレダクターゼ、１mMのＮａＤＨ、０.４μｍのＦＭＮおよび０.０５mMのシアニン−Ｑ Ｆ(Ｃｙ−Ｑ Ｇ、図２ａ)を含む反応混合物を調整した。蛍光分光器による分析を行うためにサンプルを直ちに移し、さらに反応混合物を３７℃で１時間、２時間、５時間インキュベートした後分析を行うためにサンプルを移した。
【００７９】
６５０nmでの励起から生じる、６６０nmから７２０nmの範囲での蛍光の放出の分析は、ニトロレダクターゼと共にＣｙ−Ｑ Ｇをインキュベートした時間に伴い、最大放出光６７５nmでの蛍光の著しい増大を示した(図２ｂ)。
【００８０】
ニトロレダクターゼの存在下でＣｙ−Ｑ Ｇをインキュベートしたサンプルと、ニトロレダクターゼの非存在下でＣｙ−Ｑ Ｇをインキュベートしたサンプルを、ＨＰＬＣによって分析した。ＨＰＬＣの結果(図３ａおよび図３ｂ)は、Ｃｙ−Ｑをニトロレダクターゼで処理すると、Ｃｙ−Ｑ Ｇの転化が起こり、出発物質のＨＰＬＣの保持時間が４３.２分であるのに比べて、その生成物の保持時間は、３０.５分であることを示した。ＨＰＬＣ分析の主要なピークは、さらにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって分析した(図４ａおよび図４ｂ)。この分析は、出発物質のＣｙ−ＱＧの質量が６５０.１であるのに比べ、反応生成物の主要な質量が６２０.３であることを示し、この質量の変化は、−ＮＯ２基の−ＮＨ２基への転化と一致し、提案された反応メカニズムと一致する。このことは、さらに赤外吸収分光器を用いた分析(図５)によって、強いＮ＝Ｏ結合の吸収のバンドが、酵素処理で消失し、酵素のＣｙ−Ｑ Ｇ−ＮＯ２基のアミン基への還元と一致することから確かめられる。
【００８１】
実施例３
Ｃｙ５Ｑに対するニトロレダクターゼのＫｍ測定
E.Coli B ニトロレダクターゼ(５００ng)を、１mM ＮＡＤＨを含む１０mM Ｔｒｉｓ.ＨＣｌ(ｐＨ７.５)２００μｌ中の増やした濃度のＣｙ５Ｑ(図６)の存在下で、室温で３０分間インキュベートした。
【００８２】
各反応の蛍光は、CytoStarプレートリーダー(PerSeptive Biosystems)で、６１０／２０nmの励起光と、６７０／４０nmの放出光のフィルターを用いて測定した。結果は、ニトロレダクターゼ酵素非存在下での蛍光で補正し(図７)、カーブ・フィッティング・ソフトウェア(Prism)を用いて、Ｋｍ値は８.６±０.７μＭと計算した。
【００８３】
実施例４
ニトロレダクターゼのインビトロ結合アッセイ
氷浴上で、ニトロレダクターゼ(４００μｇ、１６.７nmｏｌ)を、ＰＢＳ(ｐＨ８.０)中の３３４nmｏｌのスルホ−ＮＨＳ−ビオチン(Pierce)で、二時間ラベルした。遊離ビオチンを４℃、ＰＢＳ(ｐＨ７.４)に対して一晩透析することによって除いた。
【００８４】
ビオチン(Sigma)の濃度を０−１００nmｏｌ／ウェルから増やした濃度を、ストレプトアビジンでコートしたマイクロタイタープレート(Pierce)のウェルに２個ずつ加え、次に０.５μＭのビオチン化したニトロレダクターゼを含む、１００μＭのＰＢＳを加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。
インキュベーション後、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、結合していない酵素を除き、１mMのＮＡＤＨを含む、１００μｌのＰＢＳ中の、５μＭのＣｙ５Ｑを全てのウェルに加えた。
【００８５】
室温で３５分間インキュベートし、結合したニトロレダクターゼと加えたＣｙ５Ｑを反応させた後、６１０／２０nmの励起フィルターと６７０／４０nmの放出フィルターを用いて、プレートをCytoflourプレートリーダーで分析した。図８では、結合したニトロレダクターゼの存在下で、Ｃｙ５が高い蛍光を示す。ニトロレダクターゼのプレートへの結合は、高濃度の遊離ビオチンで置換され、従ってＣｙ５Ｑは還元されず、低い蛍光を示す。
【００８６】
実施例５
ニトロレダクターゼのトランスフェクションおよび細胞融解物における活性測定
E. coli Bの遺伝子を、ＣＭＶプロモーターの制御下で、ｐ−標的哺乳類発現ベクター(Promega)にクローニングし、供給された器具に従い、Effectene transfection reagent(Quiagen)を用いてＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。
【００８７】
２４時間細胞を成長させた後、トランスフェクトした細胞と、トランスフェクトしていないコントロールの細胞を、リン酸緩衝生理食塩水中で超音波破砕することによって、細胞融解物を調製した。ニトロレダクターゼ活性は、２μＭのＣｙ５Ｑを添加し、室温で９０分間インキュベートした後、CytoStarプレートリーダー(PerSeptive Biosystems)で、６１０／２０nmの励起光と、６７０／４０nmの放出光のフィルターを用いて、蛍光を測定することによって決定した(図９)。ニトロレダクターゼ発現細胞由来の融解物サンプルにおいて、アッセイした細胞融解物の量は比例した蛍光の強い増大を示す結果であった。
【００８８】
実施例６
細胞透過性蛍光基質を用いる細胞性ニトロレダクターゼ活性の測定
ニトロ消光性シアニン色素Ｃｙ３Ｑｅｅ(式IIIa)およびＣｙ５Ｑｅｅ(式IIIb)の２つのエチルエステル誘導体を合成した。
【００８９】
ヨウ化 ５−(カルボキシメチル)−１,２,３,３−テトラメチル−３Ｈ−インドリウム(１)の製造
【化７】
2007183284.tif 000009
ヨウ化メチル(３ml、４８.１９mmol)を２,３,３−トリメチル−３Ｈ−インドール−５−イル−酢酸(２.５ｇ、１１.５２mmol)のスルホラン(１５ml)溶液に加えた。反応液を４８℃で１８時間加熱し、次いで室温まで冷却した。粗反応混合物を過剰量のジエチルエーテルに滴下し、沈澱をろ過により回収し、真空中で乾燥すると、ベージュ色の固体として生成物を得た(３.２７ｇ、収率７９％)。
【表２】
2007183284.tif 000010
【００９０】
臭化 １−(３,５−ジニトロベンジル)−５−(カルボキシメチル)−３Ｈ−インドリウム(２)の製造
【化８】
2007183284.tif 000011
３,５−ジニトロベンジルクロライド(１２.４６ｇ、５７.５mmol)を２,３,３−トリメチル−３Ｈ−インドール−５−イル−酢酸(２.５ｇ、１１.５mmol)のスルホラン(１０ml)溶液中に、臭化ナトリウム(５.９２ｇ、５７.５mmol)とともに加えた。反応液を１００℃で２０時間加熱し、次いで室温まで冷却した。粗反応混合液を過剰量の酢酸エチルに滴下し、暗褐色の固体をろ取し、ジメチルスルホキシド中に溶解させ、その後逆相クロマトグラフィーで精製した。生成物をベージュ色の固体として単離した(収率５４％)。
【表３】
2007183284.tif 000012
【００９１】
５−(カルボキシメチル)−２−{(１Ｅ,３Ｅ)−５−[６−(カルボキシメチル)−１,１,３−トリメチル−１,３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン]−１,３―ペンタジエニル}−１−(３,５−ジニトロベンジル)−３,３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム塩(３)の製造
【化９】
2007183284.tif 000013
ヨウ化 １,２,３,３−テトラメチル−３Ｈ−インドリウム(１)(５０mg、０.１３９mmol)および臭化 １−(３,５−ジニトロベンジル)−５−(カルボキシメチル)−３Ｈ−インドリウム(２)(６６mg、０.１３９mmol)を、マロンアルデヒドビス(フェニルイミン)一塩酸塩(３５８mg、１.３９mmol)とともに酢酸(３.１５ml)、ピリジン(３.１５ml)および無水酢酸(０.７ml)中に溶解させた。反応液を７０℃で２時間加熱した。次いで、反応液を過剰量のジエチルエーテルに滴下し、青色の固体をろ取し、逆相クロマトグラフィー(溶出液として水／０.１％トリフルオロ酢酸およびアセトニトリル／０.１％トリフルオロ酢酸を用いるＨＰＬＣ)により精製した。生成物を暗青色粉末として単離した(３３.３mg、収率３１％)。UVmax(H2O) = 646 nm.
【表４】
2007183284.tif 000014
【００９２】
１−(３,５−ジニトロベンジル)−５−(２−エトキシ−２−オキソエチル)−２−{(１Ｅ,３Ｅ)−５−[６−(２−エトキシ−２−オキソエチル)−１,１,３−トリメチル−１,３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン]−１,３―ペンタジエニル}−３,３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム塩(４)(式IIIa)の製造
【化１０】
2007183284.tif 000015
５−(カルボキシメチル)−２−{(１Ｅ,３Ｅ)−５−[６−(カルボキシメチル)−１,１,３−トリメチル−１,３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン]−１,３―ペンタジエニル}−１−(３,５−ジニトロベンジル)−３,３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム(３)(４.５mg、０.００５８mmol)を、濃塩酸(２０μｌ)とともにエタノール(２ml)に溶解させ、室温で、窒素下で１６時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を逆相クロマトグラフィー(溶出液として水／０.１％トリフルオロ酢酸およびアセトニトリル／０.１％トリフルオロ酢酸を用いるＨＰＬＣ)により精製すると、青色の固体として生成物を単離した(４.１mg、収率８５％)。UVmax(H2O) = 647 nm.
【表５】
2007183284.tif 000016
【００９３】
５−{２−[(アセチルオキシ)メトキシ]−２−オキソエチル}−２−{(１Ｅ,３Ｅ)−５−[６−{２−[(アセチルオキシ)メトキシ]−２−オキソエチル}−１,１,３−トリメチル−１,３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン)−１,３―ペンタジエニル]−１−(３,５−ジニトロベンジル)−３,３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム塩(５)の製造
【化１１】
2007183284.tif 000017
Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン(４.７mg、０.０３７５mmol)の入った無水アセトニトリル(２ml)中の５−(カルボキシメチル)−２−{(１Ｅ,３Ｅ)−５−[６−(カルボキシメチル)−１,１,３−トリメチル−１,３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン]−１,３−ペンタジエニル}−１−(３,５−ジニトロベンジル)−３,３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム塩(３)(１０mg、０.０１５mmol)の溶液に、酢酸ブロモメチル(２３mg、０.１５０mmol)を加えた。反応液を室温で、窒素雰囲気下で２４時間撹拌した。次いで、溶媒を減圧下で蒸発させ、青色の残渣を逆相クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)で精製した。生成物を青色の粉末として単離した(１０.６mg、収率８３％)。UVmax(H2O) = 643 nm.
【表６】
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【００９４】
５−(カルボキシメチル)−２−{(１Ｅ)−３−[６−(カルボキシメチル)−１,１,３−トリメチル−１,３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン]−１―プロペニル}−１−(３,５−ジニトロベンジル)−３,３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム塩(６)の製造
【化１２】
2007183284.tif 000019
ヨウ化 １,２,３,３−テトラメチル−３Ｈ−インドリウム(１)(１００mg、０.２８mmol)および臭化 １−(３,５−ジニトロベンジル)−５−(カルボキシメチル)−３Ｈ−インドリウム(２)(１３３mg、０.２８mmol)を、Ｎ,Ｎ'−ジフェニルホルムアミジン(５５mg、０.２８mmol)とともに酢酸(２.２５ml)、ピリジン(２.２５ml)および無水酢酸(０.２５ml)中に溶解させた。反応液を７０℃で２時間加熱した。次いで、反応液を過剰量のジエチルエーテルに滴下し、赤色の固体をろ取し、次いで逆相クロマトグラフィー(溶出液として水／０.１％トリフルオロ酢酸およびアセトニトリル／０.１％トリフルオロ酢酸を用いるＨＰＬＣ)により精製した。生成物を暗桃色の粉末として単離した(１６.５mg、収率８％)。UVmax(H2O) = 553 nm。MALDI-TOF: m/z = 640 (Ｃ３５Ｈ３５Ｎ４Ｏ８ではＭ＋＝６３９)
【００９５】
１−(３,５−ジニトロベンジル)−５−(２−エトキシ−２−オキソエチル)−２−{(１Ｅ)−３−[６−(２−エトキシ−２−オキソエチル)−１,１,３−トリメチル−１,３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン]−１―プロペニル}−３,３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム塩(７)(式IIIb)の製造
【化１３】
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５−(カルボキシメチル)−２−{(１Ｅ)−３−[６−(カルボキシメチル)−１,１,３−トリメチル−１,３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン]−１―プロペニル}−１−(３,５−ジニトロベンジル)−３,３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム塩(６)(４mg、０.００５３１mmol)を、濃塩酸(５０μｌ)とともにエタノール(２ml)に溶解させ、室温で、窒素下で２０時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を逆相クロマトグラフィー(溶出液として水／０.１％トリフルオロ酢酸およびアセトニトリル／０.１％トリフルオロ酢酸を用いるＨＰＬＣ)により精製すると、ピンク色の固体として生成物を単離した(３.２mg、収率７４％)。UVmax(H2O) = 549 nm.
【表７】
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【００９６】
Ｃｙ３Ｑｅｅ(式IIIa)およびＣｙ５Ｑｅｅ(式IIIb)を生細胞中のニトロレダクターゼの測定のための細胞透過性蛍光基質として評価した。ニトロレダクターゼを発現している細胞およびコントロールの細胞を、１０％ウシ胎児血清を含む組織培養培地中、９６ウェルプレート中で、１０,０００細胞／ウェルで培養し、１０μＭ Ｃｙ３Ｑｅｅ(式IIIa)または３０μＭ Ｃｙ５Ｑｅｅ(式IIIb)の存在下で３７℃で培養した。蛍光の測定をCytoStar(PerSeptive Biosystems)プレートリーダーを用いて行った。Ｃｙ３Ｑｅｅでは５３０／２５nm励起および５８０／５０nm発光フィルターを用い、Ｃｙ５Ｑｅｅでは６１０／２０nm励起および６７０／４０nm発光フィルターを用いた。
【００９７】
蛍光の測定により、ニトロレダクターゼ発現細胞においては蛍光が時間依存的に顕著に増加し、コントロール細胞においては蛍光はわずかしか変化しないことが示され、このことは、Ｃｙ３Ｑｅｅ(図１０)およびＣｙ５Ｑｅｅ(図１１)の両方が生細胞中のニトロレダクターゼ活性の測定のための細胞透過性基質として有効であることを示唆している。
【００９８】
実施例７
フローサイトメトリーによる生細胞中の細胞性ニトロレダクターゼ活性の測定
ニトロレダクターゼ発現細胞およびコントロール細胞を３０μＭ Ｃｙ３Ｑｅｅを含む組織培養培地中で、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後の細胞をリン酸緩衝性生理食塩水で洗浄し、トリプシン処理してフローサイトメトリー用の細胞懸濁液を調製した。
【００９９】
細胞をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター(Becton Dickinson)を用いて、４８８nmレーザー励起および５８５／４２nm発光フィルターを用いて分析した。結果(図１２)は、コントロールの細胞(平均蛍光１８.２)と比較してニトロレダクターゼ発現細胞(平均蛍光１６９.９)内の蛍光の顕著な増加を示している。
【０１００】
実施例８
Ｃｙ５ＱＴＭ−Cascade Blue(登録商標)エステル結合カセット
【化１４】
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Ｃｙ５Ｑモノ遊離酸カリウム塩(Amersham Pharmacia Biotech Ltdから入手した)(５mg、０.００６mmol)、Cascade Blue(登録商標)(Molecular Probes)(８−ヒドロキシピレン−１,３,６−トリスルホン酸ナトリウム塩(８.８mg、０.０１８mmol)(Fluka))、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド(１０μｌ、０.０６５mmol)、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール(１mg、０.００７mmol)、４−(ジメチルアミノ)ピリジン(０．９mg、０.００７mmol)および活性化モレキュラーシーブス粉末(２５０mg)を、無水Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド(２ml)中で、室温で１２時間一緒に撹拌した。ＴＬＣ(ＲＰ Ｃ１８  １：１  ＭｅＯＨ：水)により、ｒｆ＝０.８(遊離のＣｙ５Ｑとの比較；ｒｆ＝０.７２)に新しい生成物のスポットが観察された。モレキュラーシーブスをろ取し、生成物をジエチルエーテル中に沈澱させた。沈澱をろ取し、酢酸エチルで洗浄し、乾燥した。生成物をＲＰ Ｃ１８フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。未反応の８−ヒドロキシピレン−１,３,６−トリスルホン酸ナトリウム塩を水でカラムから溶出させ、次いで、５％アセトニトリル／水で溶出させた。純粋な生成物を含むフラクションを回収し、溶媒の大部分を減圧下で除去した。残渣を凍結乾燥すると、藍色の粉末として生成物を得た(１mg、１１％)。
λmax(水) 648nm (Cy5Q) 354, 372nm (ピレン)
MALDI-TOF MS; 実測値１２４６(ＭＨ＋)；[理論値(Ｃ５４Ｈ４４Ｎ４Ｏ２１Ｓ５)１２４５]
【０１０１】
蛍光；Ｃｙ５Ｑ−Cascade Blueエステル結合カセットは、５１０nm(図１３)で、ごくわずかに発光する；水中の遊離８−ヒドロキシピレン−１,３,６−トリスルホン酸ナトリウム塩の蛍光は、５１０nmで最大である(図１４)。このことは、Cascade BlueからＣｙ５Ｑへ効率的にエネルギー伝達されること、およびカセット内のＣｙ５Ｑと結合した場合にCascade Blue部分の蛍光消光することを示唆している。水酸化ナトリウム溶液で処理した場合、５１０nmでの蛍光発光が観察され(図１５)、このことはエステル結合の化学的加水分解および蛍光性８−ヒドロキシピレン−１,３,６−トリスルホン酸部分の遊離を示唆している。
【０１０２】
インビトロでの評価
Ｃｙ５Ｑ−Cascade Blueカセット(酢酸緩衝液ｐＨ５.０中０.８mM)を１mM ＮＡＤＨを含むＰＢＳ(ｐＨ７.４)中で８μＭに希釈した。細胞融解物を２ｘ１０７個のＳＫＯＶ細胞から、４℃で５mlのＰＢＳ中の掻爬した細胞の再懸濁により調製し、２５ゲージのシリンジ針内を繰り返し通過させた。Ｃｙ５Ｑ−Cascade Blueのアリコート(１ml)を、５００μｌの細胞融解物またはＰＢＳとともに３７℃で２０分間インキュベートした。インキュベーション後、１００μｌのE.coli Bのニトロレダクターゼの１ng／μｌ溶液を１つのサンプルに加え、インキュベーションを５分間継続した。次いで、アリコート(１００ml)を、Ｃｙｔｏｆｌｏｕｒプレートリーダーでの蛍光の測定のために、各サンプルから９６ウェルプレートへと４づつ配分した。Cascade Blueでは４５０nm励起／５３０nm発光フィルターを用い、Ｃｙ５では６１０nm励起／６７０nm発光フィルターを用いた。
【０１０３】
図１６は、カセットを細胞融解物の存在下でインキュベートした場合に、５３０nm(すなわちCascade Blue)での蛍光発光が増加すること、および、ニトロレダクターゼ酵素が存在する場合に、６７０nm(すなわちＣｙ５)での蛍光放出が増加することを示している。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】図１ａはＣｙ−ＱＦと呼ばれる式IIの化合物の化学構造を示す。図１ｂは種々の時間、E. coli Bニトロレダクターゼの存在下インキュベートしたＣｙ−ＱＦの蛍光放出スペクトルを示す。
【図２】図２ａはＣｙ−ＱＧと呼ばれる式IIIの化合物の化学構造を示す。図２ｂは種々の時間、E. coli Bニトロレダクターゼの存在下インキュベートしたＣｙ−ＱＧの蛍光放出スペクトルを示す。
【図３】図３ａはＣｙＱＧのＨＰＬＣ分析を示す。図３ｂはニトロレダクターゼ処理ＣｙＱＧのＨＰＬＣ分析を示す。
【図４】図４ａはＣｙＱＧのMALDI-TOFマススペクトル分析を示す。図４ｂはニトロレダクターゼで処理したＣｙＱＧのMALDI-TOFマススペクトル分析を示す。
【図５】ＣｙＱＧおよびニトロレダクターゼで処理したＣｙＱＧの赤外線吸収スペクトル分析を示す。
【図６】Ｃｙ５Ｑの化学構造を示す。
【図７】ニトロレダクターゼ存在下の異なる濃度のＣｙ５Ｑの蛍光放出を示す。
【図８】ニトロレダクターゼとのインビトロ結合アッセイの結果を示す。
【図９】Ｃｙ５蛍光を検出することによる、トランスフェクトしたおよびコントロール細胞からの細胞融解物におけるニトロレダクターゼ活性の検出を示す。
【図１０】ニトロレダクターゼ発現細胞およびコントロール細胞におけるＣｙ３蛍光を示す。
【図１１】ニトロレダクターゼ発現細胞およびコントロール細胞におけるＣｙ５蛍光を示す。
【図１２】フローサイトメトリーによる細胞性ニトロレダクターゼ活性恩測定を示す。
【図１３】Ｃｙ５Ｑ−カスケードブルーカセット、水中、６４９nmでａ＝１、次いで１００μl＋３ml水に希釈、励起４５０nmの蛍光放出スペクトルを示す。
【図１４】８−ヒドロキシ−ピレン−１,３,６−トリスルホン酸、水中、４５５nmでａ＝１、次いで１００μl＋３ml水に希釈、励起４５０nmの蛍光放出スペクトルを示す。
【図１５】ＮａＯＨ溶液で処理後の、水中、６５０nmでａ＝１、次いで１００μl＋３ml水に希釈、励起４５０nmＣｙ５Ｑ−カスケードブルーカセットを示す。
【図１６】融解物／ＮＴＲの存在下または非存在下のＣｙ５Ｑ−カスケードブルーカセットの相対的蛍光を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2007183284.tif 000039
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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