(57)【要約】  【課題】  流路に充填された緩衝材中で生体サンプルを移動させて検出を行う際に、緩衝剤や生体サンプルの注入作業が容易で、そして短時間で正確な検出結果の得られる、生体サンプル分析用のプレートを提供する。  【解決手段】  流路１１，１２は、生体サンプルを一定量だけ取得するための予め定められた容積を有する定量分取部１０に一端が連結されており、流路１１の断面積は流路１２の断面積より大きくなる。流路１１の他端には、前記軸心に対して定量分取部１０と同心円上の位置において、流路１１，１２に充填される緩衝剤が保持される緩衝剤貯留部７を設けてあり、更に緩衝剤貯留部７には、緩衝剤貯留部分に保持できない余剰の緩衝剤が流入するオーバーフローチャンバー１７を連結する。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
緩衝剤が充填された流路中を生体サンプルが電気泳動により移動するときに生ずる輸送反応を検出して前記生体サンプルを判別する生体サンプル判別用プレートにおいて、前記生体サンプルを収容する空間を有し前記空間に前記生体サンプルを充填して収容する定量分取部と、前記定量分取部に前記緩衝剤を送出する第１流路と、前記第１流路から送出された前記緩衝剤が前記定量分取部に流入するときに前記定量分取部から流入する生体サンプルを電気泳動させる第２流路と、を備え、前記第１流路の流路断面積が前記第２流路の流路断面積より大きく形成されてなる、生体サンプル判別用プレート。
【請求項２】
前記第２流路に流入する前記緩衝剤のうち前記第２流路の容量を超える緩衝剤を収容するオーバーフローチャンバーを備えてなる、請求項１に記載の生体サンプル判別用プレート。
【請求項３】
前記第１流路の流路断面積が前記第２流路の流路断面積の１倍以上２倍以下に形成されてなる、請求項１に記載の生体サンプル判別用プレート。
【請求項４】
前記第１流路の長さが前記第２流路の長さより短く形成されてなる、請求項１に記載の生体サンプル判別用プレート。
【請求項５】
緩衝剤が充填された流路中を生体サンプルが電気泳動により移動するときに生ずる輸送反応を検出して前記生体サンプルを判別する生体サンプル判別用プレートにおいて、前記生体サンプル判別用プレートは、前記緩衝剤と前記生体サンプルが注入、充填される第３の流路と、前記緩衝剤が充填される第４の流路と、前記第３の流路と前記第４の流路が共通にする第２の定量分取部と、前記第３の流路の一部に設けられた、電極が挿入できる第１の電極挿入部と、第２の電極挿入部と、前記第４の流路の一部に設けられ、正電極が挿入される第３の電極挿入部と、負電極が挿入される第４の電極挿入部と、を備え、前記第４の流路において、正電極が挿入される前記第３の電極挿入部から前記第２の定量分取部までの流路の断面積が、負電極が挿入される前記第４の電極挿入部から前記第２の定量分取部までの流路の断面積より大きく形成されてなる、生体サンプル分析用プレート。
【請求項６】
前記第４の流路において、負電極が挿入される前記第４の電極挿入部から前記第２の定量分取部までの流路の断面積が、正電極が挿入される前記第３の電極挿入部から前記第２の定量分取部までの流路の断面積の１倍以上２倍以下でなる、請求項４に記載の生体サンプル分析用プレート。
【請求項７】
前記第４の流路において、負電極が挿入される前記第４の電極挿入部から前記第２の定量分取部までの流路の長さが、正電極が挿入される前記第３の電極挿入部から前記第２の定量分取部までの長さより短く形成されてなる、請求項４に記載の生体サンプル分析用プレート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡやタンパクその他の生体サンプルを緩衝剤中で移動させ、その輸送反応を検出して生体サンプルを分析するための生体サンプル判別用プレートに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的な生体サンプルを考えた場合、大きくはＤＮＡとタンパクが存在している。そして、近年、分子生物学の急速な進展によって、様々な疾患において遺伝子の関与がかなり正確に理解されるようになり、遺伝子をターゲットにした医療に注目が集まるようになってきている。
【０００３】
ＤＮＡに関しては、現在ＳＮＰｓ（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍの略で「１塩基多型」と一般に訳されており、遺伝子における１暗号（１塩基）の違いの総称である。）が注目されている。その理由としては、ＳＮＰｓの分類により、多くの疾患に対する罹患率や各個人の薬剤に対する効果や感受性を予測でき、さらには、地球上に親子兄弟といえども全く同じＳＮＰｓを持つ人間は絶対に存在しないことから個人の完全な特定ができると考えられているからである。
【０００４】
現在、ＳＮＰｓを調べる方法としては、ＤＮＡの塩基配列を端から直接読んでいくシーケンシング（塩基配列の決定）が最も一般的に用いられている。そして、前記シーケンシングを行う方法としては、いくつかの報告があるが、もっとも一般的に行われているのは、ジデオキシシーケリング（Ｓａｎｇｅｒ法）である。なお、シーケンシングは、このＳａｎｇｅｒ法を含め何れの方法においても、分離能の高い変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動か、キャピラリー電気泳動によって１塩基の長さの違いを分離・識別する技術が基になって成り立っている。
【０００５】
また、他の方法として、アフィニティリガンドキャピラリー電気泳動法がある。アフィニティリガンドキャピラリー電気泳動は、分子間親和力、とくに生態系における特異的親和力（酵素と基質、抗原と抗体の親和力等）を利用して分離に特異性を持たせるものであり、具体的には、キャピラリー管中の泳動溶液に、塩基配列を特異的に認識するアフィニティリガンドを添加しておき、試料を電気泳動させると、試料混合物中で相互作用する分子種だけが移動速度に変化を生じることに着目して分析を行うものである（例えば、特許文献１参照）。
【０００６】
一方、タンパク質は、細胞、組織、生体液中に存在し、生体活動の調節、細胞へのエネルギー供給、重要な物質の合成、生物構造体の維持、さらには細胞間でのコミュニケーションや細胞内情報伝達に関与している。現在では、タンパク質が様々な環境や、相互作用する他のタンパク質の存在、タンパク質が受けた修飾の程度や種類に応じて、複数の機能を有することが明らかになってきている。
【０００７】
タンパク質は、２０種類のアミノ酸が遺伝子の指示（配列情報）により順番につながることでつくられており、その種類は数千万種と言われるが、その遺伝子の配列がわかれば、どのアミノ酸がどういう順番でつながってできているかの情報を得ることができる。生物の遺伝子（ゲノム）から作られるタンパク質の一そろいのセットは、プロテオームと呼ばれるが、ヒトゲノムの塩基配列解読が終わった今、プロテオームの解析が盛んに進められている。
【０００８】
そして、このようなタンパク質の機能解析研究としては、同定やキャラクタリゼーションのみならず、生化学アッセイやタンパク質間相互作用研究、タンパク質ネットワーク、または細胞内外のシグナリング解明なども行っていく必要がある。このタンパク質機能の研究には、多方面の技術が使用され、酵素アッセイ、酵母  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  アッセイ、クロマトグラフィーによる精製、情報ツールとデータベース等があるが、特に、電気泳動によるたんぱく質の判別は重要な手法である。そして、電気泳動のように、キャピラリー管中のサンプル、分析物、緩衝剤、及び試薬等の液体を移動させた際に得られる輸送反応を検出して、該サンプルの分析、判別、判定等を行う場合の前記液体の輸送及び方向付けに関しては、さまざまな報告がある（例えば、特許文献２、特許文献３）。
【特許文献１】特開平７−３１１１９８号公報
【特許文献２】特表２０００−５１３８１３号公報
【特許文献３】特表２００１−５２３３４１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように生体サンプルの分析においては、キャピラリー電気泳動装置を利用した方法が広く使われている。
【００１０】
実際に輸送反応を行なう部分であるキャピラリーは、外形３００ミクロン、内径１００ミクロン程度のガラス管が使用される例が多く、折れにくくするために表面はポリイミド等でコーティングされている。しかしながら、内部試料を検出するために検出窓として焼いたり薬品で溶かすなどしてコーティングを一部剥ぎ取る。この時、コーティングを剥いだ部分は折れやすくなり取り扱いに十分注意する必要がある。折れた場合はなお危険である。
【００１１】
また、サンプルの注入においても、加圧や吸引で行なうのが一般的な方法であるが、一定量注入する必要があり、時間で調整するもののキャピラリー内の緩衝剤の粘度や温度変化により注入量が実験のたびに異なるという問題がある。サンプルの量は測定結果に及ぼす影響は大きく、大変重要な項目である。
【００１２】
また、このようなキャピラリーを使用した装置の場合、構成上短い流路での電気泳動を行なうことは困難であり、必要以上の泳動距離と時間をかけて測定することになる。
【００１３】
上記の煩雑な作業を簡便にする方法として、キャピラリーの代わりに、微細な流路を形成したプレートを使って、電気泳動させる方法がある。
【００１４】
しかし、このプレート上の流路を利用した場合でも試料の分離を行うのに、例えば特許文献２，特許文献３に記載の方法では、試料をトラップする緩衝剤が充填された、複数のキャピラリーチャンネルを交差させ、且つ少なくとも３つ電極を設けて、該少なくとも３つ設けられた電極のうちの２つの電極に印加して、前記交差部を通して前記試料を移動させているが、この方法でも、電気泳動させるための電圧印加に損失があるため、電気泳動速度が遅く、即ち、生体サンプルの輸送が遅いため、生体サンプルの判別検出に時間がかかる。
【００１５】
本発明は、流路に充填された緩衝剤中で生体サンプルを移動させて検出を行う際に、煩雑な準備作業が不要で、かつ、電気泳動中の電圧印加の効率を向上させたことで、短時間で正確な検出結果の得られる、生体サンプル判別用のプレートを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
前記課題を解決するために、本発明の生体サンプル判別用プレートは、緩衝剤が充填された流路中を生体サンプルが電気泳動により移動するときに生ずる輸送反応を検出して前記生体サンプルを判別する生体サンプル判別用プレートにおいて、前記生体サンプルを収容する空間を有し前記空間に前記生体サンプルを充填して収容する定量分取部と、前記定量分取部に前記緩衝剤を送出する第１流路と、前記第１流路から送出された前記緩衝剤が前記定量分取部に流入するときに前記定量分取部から流入する生体サンプルを電気泳動させる第２流路と、を備え、前記第１流路の流路断面積が前記第２流路の流路断面積より大きく形成されてなる。
【００１７】
さらに、前記第２流路に流入する前記緩衝剤のうち前記第２流路の容量を超える緩衝剤を収容するオーバーフローチャンバーを備えてなる。
【００１８】
さらに、前記第１流路の流路断面積が前記第２流路の流路断面積の１倍以上２倍以下に形成されてなる。
【００１９】
さらに、前記第１流路の長さが前記第２流路の長さより短く形成されてなる。
【００２０】
さらに、緩衝剤が充填された流路中を生体サンプルが電気泳動により移動するときに生ずる輸送反応を検出して前記生体サンプルを判別する生体サンプル判別用プレートにおいて、前記生体サンプル判別用プレートは、前記緩衝剤と前記生体サンプルが注入、充填される第３の流路と、前記緩衝剤が充填される第４の流路と、前記第３の流路と前記第４の流路が共通にする第２の定量分取部と、前記第３の流路の一部に設けられた、電極が挿入できる第１の電極挿入部と、第２の電極挿入部と、前記第４の流路の一部に設けられ、正電極が挿入される第３の電極挿入部と、負電極が挿入される第４の電極挿入部と、を備え、前記第４の流路において、正電極が挿入される前記第３の電極挿入部から前記第２の定量分取部までの流路の断面積が、負電極が挿入される前記第４の電極挿入部から前記第２の定量分取部までの流路の断面積より大きく形成されてなる。
【００２１】
さらに、前記第４の流路において、負電極が挿入される前記第４の電極挿入部から前記第２の定量分取部までの流路の断面積が、正電極が挿入される前記第３の電極挿入部から前記第２の定量分取部までの流路の断面積の１倍以上２倍以下でなる。
【００２２】
さらに、前記第４の流路において、負電極が挿入される前記第４の電極挿入部から前記第２の定量分取部までの流路の長さが、正電極が挿入される前記第３の電極挿入部から前記第２の定量分取部までの長さより短く形成されてなる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、電気泳動中の電圧印加の効率を向上させることができるため、電気泳動速度が速くなり、短時間で検出することが可能となる。さらに、遠心力によるサンプル輸送できるプレートについては、遠心力によって、短時間で一定量の生体サンプルを緩衝剤中に添加することができ、その後の電気泳動によって、正確かつ短時間で検出を行うことができる。さらに本発明によれば、緩衝剤や生体サンプルをプレートに供給する際に、緩衝剤注入部あるいは生体サンプル注入部の全体を満たすように注入するだけで、分析に必要な量の緩衝剤や生体サンプルを、過不足なく供給することができる。このため、従来のように、ピペットなどからプレートに供給する際に、一定量だけ吐出させるような、熟練した操作は必要とならず、簡単な操作で緩衝剤や生体サンプルを注入することができる。このように煩雑な準備作業が不要で、短時間で正確な検出結果の得られる、生体サンプル分析用のプレートを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
（実施の形態１）
まず、図１〜図８を用いて、本実施の形態１における生体サンプル分析プレートの構成について説明する。図１は、本実施の形態１における生体サンプル分析プレートの流路形成面からみた図である。
【００２５】
本実施の形態１におけるプレート１には図２に示すパターン２が４個放射線状に形成されており、同時に４検体のＤＮＡ判別が可能である。
【００２６】
図１に示すように本実施の形態１におけるプレート１の外形は８センチ四方の正方形で４角は面取りされており、そのうちの１角は更に大きく面取りされている。
【００２７】
更に穴４を設けているが、これは外形を非対称にしてパターンの場所を特定できるようにされている。プレート１をこのような外形形状にしている訳は、図示しない光学読取装置にプレートを取り付けて、上記の蛍光度や、吸光度を検出する際の位置決めを容易にするためである。材料はアクリル系の樹脂を使用し厚みは２ｍｍである。流路形成面には溝が形成されさらに厚さ５０μｍのアクリル製フィルムを接着することで密閉流路が形成されている。
【００２８】
また、５は本プレートの軸心であり、軸心５を中心に本プレートを上記の光学読取装置の回転部に固定するための孔３を設けている。
【００２９】
図２に示す６は緩衝剤であるＤＮＡコンジュゲートを注入する、空気孔を兼ねた緩衝剤注入口、７は注入された緩衝剤を一旦保持するための緩衝剤注入部、８はＤＮＡサンプルを注入する、空気孔を兼ねたサンプル注入口、９は注入されたＤＮＡサンプルを一旦保持するためのサンプル注入部である。緩衝剤注入部７とサンプル注入部９の形状は相似しており、周辺断面を図３に示す。
【００３０】
図３は緩衝剤注入部やサンプル注入部近傍の断面を表した図であり、斜線でハッチングした部分がプレート１である。１９が緩衝剤注入口６およびサンプル注入口８にあたり、２０が緩衝剤注入部７およびサンプル注入部９である。２１が前述したフィルムであり溝にフタをするように貼り付けることで密閉流路が形成される。ちなみに流路形成面は下部である。
【００３１】
再び図２に戻り、サンプル注入部９はサンプル定量分取部１０と接続しており、緩衝剤注入部７も流路１１によって、定量分取部１０と接続している。また、定量分取部１０には空気抜きをするための空気孔１３と、注入されたＤＮＡサンプルを遠心力により、定量化するためのオーバーフローチャンバー１４と、電気泳動時に前記した光学読取装置にて走査するための流路１２が接続されており、流路１２の端部には、空気孔１５が接続されており、更に、１７は緩衝剤貯留部分に保持できない余剰の緩衝剤が流入するためのオーバーフローチャンバーが設置されている。本実施の形態では、流路１１の幅は３００μｍ、深さは５０μｍ、流路１２の幅は２００μｍ、深さは５０μｍである。
【００３２】
それでは、以下前述した該ＤＮＡサンプルのＳＮＰｓ（一塩基多型）の有無を判別するまでの具体的操作および動作の一例を、外周側パターン２の詳細形状を示す図２を利用して説明する。
【００３３】
まず、検体となるＤＮＡサンプルを準備する。本来ＤＮＡは２本鎖の螺旋構造をしたものであるが、本実施の形態１においては、判別したいＳＮＰｓ部位を含む約６０塩基長の１本鎖ＤＮＡを準備する。抽出方法や１本鎖化については本発明とは直接関係がないので詳細説明は省略する。
【００３４】
次に、緩衝剤としてＤＮＡコンジュゲートを準備する。ＤＮＡコンジュゲートとは、６〜１２塩基長１本鎖ＤＮＡの５’末端に高分子のリニアポリマーが共有結合したものである。さらにＤＮＡは、正常型に対しては相補であるが変異型に対しては相補ではない配列であり、正常型ＤＮＡに対しての結合力が強く、変異型ＤＮＡに対しての結合力が弱い特性がある。また、電気泳動した場合、５’末端に結合したリニアポリマーがおもりとなり泳動速度がかなり遅いという特性もある。  以後記述する「ＤＮＡコンジュゲート」とは、電解質の役目もするｐＨ緩衝剤およびＭｇＣｌ2などのＤＮＡ結合力制御剤を含んだ物性とする。
【００３５】
試料の準備が終わったところで、ＤＮＡコンジュゲートおよびＤＮＡサンプルをプレート内へ注入する。まず、ＤＮＡコンジュゲートをピペッター等により緩衝剤注入口６から緩衝剤注入部７を充填するように分注する。分注量としては、パターンのスケールにより異なるが本実施の形態１においては、緩衝剤注入部７と流路１１と定量分取部１０と流路１２を満たすには、ＤＮＡコンジュゲートが３マイクロリットル必要である。緩衝剤注入部７の容積は、３マイクロリットルより若干多くなるように予め形成してある。
【００３６】
次に光学読取装置の回転部にプレート１を固定し、軸心５を軸に回転させる。この時分注されたＤＮＡコンジュゲートは、遠心力により外周方向へと移動する。緩衝剤注入部７内のＤＮＡコンジュゲートは流路１１を通り定量分取部１０へと移動した後、さらに流路１２まで移動する。回転数４０００ｒｐｍで回転開始から２分後、ＤＮＡコンジュゲートの移動が停止した状態が図４である。また、定量分取部１０周辺を拡大した図が、図５である。
【００３７】
ＤＮＡコンジュゲートの移動が終了した後、緩衝剤注入部７と流路１２内に存在するＤＮＡコンジュゲートの液面高さと定量分取部の液面高さは、軸心５を中心とする同一円周上となる。但し、緩衝剤注入部７内に注入するＤＮＡコンジュゲートの量が３マイクロリットルより少ない場合、図６ａに示すように、定量分取部１０や流路１２内にＤＮＡコンジュゲートが充填されない。充填していなければ、電気泳動ができなくなる。
【００３８】
一方、３マイクロリットルより多い場合においては、緩衝剤貯留部分に保持できない余剰の緩衝剤が流入するためのオーバーフローチャンバー１７を設置している。このため、ＤＮＡコンジュゲートの液面高さと定量分取部の液面高さは、常に軸心５を中心とする同一円周上となる。なお、オーバーフローチャンバー１７は、図６ｂに示すように、オーバーフローチャンバー１７を除くハッチング部分、すなわち、緩衝剤注入部７と流路１１と定量分取部１０と流路１２のハッチングした容積が３マイクロリットルになった時の、重心５を中心とする同一円周上の流路１２に配置されている。
【００３９】
次にＤＮＡコンジュゲートが流路内に輸送された後、ＤＮＡサンプルをプレート内へ注入する。ＤＮＡサンプルはピペッター等によりをサンプル注入口８よりサンプル注入部９へ分注する。本実施の形態１においては、ＤＮＡサンプルは１マイクロリットル必要とするので、サンプル注入部９の容積は、それより若干大きく形成しておく。
【００４０】
次に回転部にプレート１を固定し、軸心５を軸に回転させる。この時分注されたＤＮＡサンプルは、遠心力により外周方向へと移動する。
【００４１】
サンプル注入部９内のＤＮＡサンプルは空気孔１３により気泡が発生することなく、定量分取部１０へと移動する。このとき、定量分取部１０に移動したＤＮＡサンプルはオーバーフローチャンバー１４により、定量化することができ、不必要なＤＮＡサンプルはオーバーフローチャンバー１４内へと移動する。そして、４０００ｒｐｍでの回転開始から２分後、ＤＮＡサンプルの移動が停止した状態が図７である。また、定量分取部１０周辺を拡大した図が図８である。
【００４２】
以上の動作で定量分取部１０に残存したＤＮＡサンプルがＳＮＰｓの判別を行なう最終試料となる。
【００４３】
次に、電気泳動を行う。流路が形成されたプレート前面にはフィルム２１が貼られており、そこへ針状の電極を突き刺し内部へ挿入することで電圧印加が可能となる。電極を突き刺す場所は、正電極の場合、流路１２の端部に、負電極の場合は、緩衝剤注入部７に突き刺す。電気泳動は、電極間に数百Ｖの電圧を印加すると、流路１２さらには定量分取部１０において電界が発生し、定量分取部１０に一定量残存したＤＮＡサンプルは、流路１２中を正電極側（図７中Ａ方向）へ泳動する。
【００４４】
流路１２中にはＤＮＡコンジュゲートが充填されており、ＤＮＡサンプルはＤＮＡコンジュゲートとの結合を繰り返しながら電気泳動する。この時、上述したようにＤＮＡサンプル中の正常型ＤＮＡはＤＮＡコンジュゲートとの結合力が強いため泳動速度が遅くなり、変異型ＤＮＡは結合力が弱いため正常型に比べ泳動速度は速くなる。つまりＤＮＡサンプル中に正常型、変異型両方が存在した場合は、正常型のＤＮＡと変異型のＤＮＡが分離していくこととなり、ＳＮＰｓの判別が行なえるのである。
【００４５】
続いて、グラフ１に流路断面積を変化させた時の、電圧降下の関係を示す。グラフの縦軸は電圧、横軸が電圧印加した時の流路の位置を示し、０ｍｍが正の電極位置、４２ｍｍが負の電極位置を表す。
【００４６】
電圧が印加される流路１１と流路１２の流路幅、深さをともに２００μｍ、深さ５０μｍにした場合、電圧降下はグラフ上の点線を示す。次に流路１１の流路幅のみを１５０μｍに減らした場合、電圧降下のグラフは大きめの点線をし、流路１１の流路幅のみを上３００μｍに増やした場合は、電圧降下はグラフ上の実線となった。
【００４７】
流路１１の断面積を大きくすることで、電圧印加時の流路１１の電気抵抗が下がり、電圧降下が低下する。その結果、電気泳動が行われる流路１２の電圧効率があがるため、泳動速度が速くなり、検出時間が短縮できる。ちなみに、泳動時間は流路１１の流路幅を２００μｍとした時に、検出時間は約５分、流路幅３００μｍだと、約４分と１分程度短縮することができた。更に、流路１１の断面積を増やして、電気泳動試験を行った結果、ＤＮＡコンジュゲートの充填時に流路内に気泡が入り込むという問題が発生し、また、ＤＮＡサンプルの定量化も安定しなくなるという問題が発生した。逆に、流路幅を１倍以下の１５０μｍにした場合だと、検出時間は約５分半かかった。グラフ２に流路断面積を変化させた時の、検出時間の関係を示す。このグラフからわかるように、断面積の最適化は、流路１２の断面積に対し、流路１１の断面積を１．５倍程度にするのが最良であることがわかった。
【００４８】
今回の実験では、流路幅を増加させる方法で、断面積を増やしたが、流路の深さや、流路の長さを変更してもよい。
【００４９】
以上のように、本実施の形態によれば、電気泳動中の電圧印加の効率を向上させることができるため、電気泳動速度が速くなり、短時間で検出することが可能となる。さらに、遠心力によるサンプル輸送できるプレートについては、遠心力によって、短時間で一定量の生体サンプルを緩衝剤中に添加することができ、その後の電気泳動によって、正確かつ短時間で検出を行うことができる。
【００５０】
（実施の形態２）
以下、図９を用いて、本実施の形態２について説明する。
実施の形態２における生体サンプル分析プレートは、イオン、有機酸、アミノ酸等の低分子や、タンパク質、核酸、糖等の高分子からなる荷電性分子、ウイルス、細胞等の荷電性粒子、などの荷電性物質を分離して、対象物質を分析することが実現するものである。
【００５１】
具体的には、本発明の電気泳動用チップの溝の中に分離用緩衝液、分離用高分子ゲル、分離用等電性フォーカッシング緩衝液等の分離用媒体を充填させて、分析対象物質を含む試料を注入し、溝の両端に電圧を印加することによって、分離用媒体中で分析対象物質を電位差で移動させて分離することができる。
【００５２】
まず、図９を用いて、本実施の形態２における生体サンプル分析プレートの構成について説明する。図９は、本実施の形態２における生体サンプル分析プレートの流路形成面からみた図である。
【００５３】
図９に示すように本実施の形態２におけるプレート４０の外形は２０ｍｍ×７５ｍｍであり、厚さ１ｍｍのアクリル系樹脂を使用した。
【００５４】
プレート４０上には穴４１、４２を設けている。これはプレート２を図示しない光学読取装置にプレートを取り付けて、上記の蛍光度や、吸光度を検出する際の位置決めを容易にするためである。流路形成面には溝が形成されさらに厚さ５０μｍのアクリル製フィルムを接着することで密閉流路が形成されている。
【００５５】
４３、４４、４５は分離用媒体を注入するための分離用媒体注入部、４６は分析対象物質を含むサンプルを注入ためのサンプル注入部である。分離用媒体注入部４３、４４、４５とサンプル注入部４６の形状は同じであり、内径１ｍｍ、深さ０．９ｍｍである。
【００５６】
４７はサンプルを分離させるための分離流路であり、その両端部には分離用媒体注入部４３、４４が接続されている。４８はサンプルや分離用媒体を導入するための導入流路であり、その両端部には分離用媒体注入部４５とサンプル注入部４６が接続されている。また、分離流路４７と導入流路４８は直角に交差し、交差した部分４９を定量分取部とよぶ。流路の寸法は分離用媒体注入部４４から定量分取部４９までの分離流路４７の流路幅が１５０μｍ、それ以外の全ての流路幅は１００μｍである。
【００５７】
流路の深さは分離流路４７も導入流路４８も全て５０μｍである。流路の長さは分離用媒体注入部４３から定量分取部４９までの分離流路４７の長さが２５ｍｍ、分離用媒体注入部４４から定量分取部４９までの分離流路４７の長さが３ｍｍ、分離用媒体注入部４５から定量分取部４９までの分離流路４８の長さが３ｍｍ、分離用媒体注入部４６から定量分取部４９までの分離流路４８の長さが３ｍｍである。
【００５８】
それでは、以下にΦＸ１７４ＨａｅＩＩＩ分解断片ＤＮＡが分離するまでの具体的操作および動作の一例を説明する。
【００５９】
まず、５ｇ／Ｌハイドロキシプロピルメチルセルロース（Ａｌｄｒｉｃｈ社製、平均分子量９０，０００）、５ｍｇ／Ｌエチジウムブロマイド、４４．７５ｍＭ  ＴＲＩＳ（２−アミノー２−ヒドロキシメチルー１，３−プロパンジオール）、４４．７５ｍＭホウ酸（ｐＨ８．２）を含む分離用ゲル緩衝液を、泳動液導入用液溜まり４３に５μｌ、４４と４５に各３μｌをピペッター等により滴下する。注入方法としては特に制限はないが、例えば、毛細管現象を利用する方法、注射筒等を用いる加圧注入法、一方の液溜まり部に滴下した媒体をもう一方の液溜まり部から水流ポンプ、真空ポンプ等を用いて減圧することによって注入する減圧注入法などが挙げられる。
【００６０】
本発明では、流路表面をプラズマ処理により、親水性処理を行い、毛細管現象を利用して分離流路４７及び試料導入流路４８に緩衝液を充填した。次に、ＤＮＡ鎖長で７２ｂｐから１３５３ｂｐの１１個の断片から構成される、ΦＸ１７４のＨａｅＩＩＩ分解断片を上記分離用ゲル緩衝液に４０μｇ／ｍｌ濃度に溶解した試料液３μＬを、ピペッター等を使って、サンプル注入部４６に滴下する。次に、分離用媒体注入部４５とサンプル注入部４６に電極を挿入し、１０００Ｖ／ｃｍの電圧を印加して、サンプルを定量分取部４９まで移動させる。続いて分離用媒体注入部４３、４４にも電極を挿入し、４００Ｖ／ｃｍの電圧を印加して電気泳動を実施し、ＤＮＡ断片を分離できることが確認できた。
【００６１】
続いて、グラフ３に流路断面積を変化させた時の、電圧降下の関係を示す。グラフの縦軸は電圧、横軸が電圧印加した時の流路の位置を示し、０ｍｍが正の電極が挿入される分離用媒体注入部４３、２５ｍｍが負の電極が挿入される分離用媒体注入部４４の位置を表す。
【００６２】
電圧が印加される分離流路４７の流路幅、深さを１００μｍ、深さ５０μｍにした場合、電圧降下はグラフ上の点線となった。次に分離用媒体注入部４４から定量分取部４９までの分離流路４７の流路幅のみを５０μｍに減らした場合、電圧降下のグラフは大きめの点線をし、分離用媒体注入部４４から定量分取部４９までの分離流路４７の流路幅のみを１５０ｍに増やした場合は、電圧降下はグラフ上の実線となった。
【００６３】
分離用媒体注入部４４から定量分取部４９までの分離流路４７の断面積を大きくすることで、電圧印加時の分離用媒体注入部４４から定量分取部４９までの分離流路４７の電気抵抗が下がり、電圧降下が低下する。その結果、電気泳動が行われる分離用媒体注入部４３から定量分取部４９までの分離流路４７の電圧効率があがるため、泳動速度が速くなり、検出時間が短縮できる。
【００６４】
ちなみに、泳動時間は分離用媒体注入部４４から定量分取部４９までの分離流路４７の流路幅を１００μｍとした時に、検出時間は約１４０秒、流路幅１５０μｍだと、約１２０秒と２０秒程度短縮することができた。
【００６５】
更に、分離用媒体注入部４４から定量分取部４９までの分離流路４７の断面積を増やして、電気泳動試験を行った結果、ＤＮＡ断片の分離が不安定になるという問題が発生した。逆に、分離用媒体注入部４４から定量分取部４９までの分離流路４７の流路幅を１倍以下の７５μｍにした場合だと、検出時間は約１５０秒かかった。グラフ４に流路断面積を変化させた時の、検出時間の関係を示す。このグラフからわかるように、断面積の最適化は、分離用媒体注入部４３から定量分取部４９までの分離流路４７の断面積に対し、分離用媒体注入部４４から定量分取部４９までの分離流路４７の断面積を１．５倍程度にするのが最良であることがわかった。
【００６６】
今回の実験では、流路幅を増加させる方法で、断面積を増やしたが、流路の深さや、流路の長さを変更してもよい。
以上のように、本実施の形態によれば、電気泳動中の電圧印加の効率を向上させることができるため、電気泳動速度が速くなり、短時間で検出することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の生体サンプル分析プレートは、ＤＮＡサンプル等の生体サンプルの判別を、短時間で正確に、且つ簡便に行えるようにするものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】本発明の実施の形態１にかかる生体サンプル判別用プレートの平面図
【図２】同生体サンプル判別用プレートのバターンを拡大して示す平面図
【図３】同生体サンプル判別用プレートのサンプル注入部、および緩衝剤注入部の断面図
【図４】同生体サンプル判別用プレートのパターンを示す平面図
【図５】同生体サンプル判別用プレートの定量分取部を拡大して示す平面図
【図６ａ】同生体サンプル判別用プレートのパターンを示す平面図
【図６ｂ】同生体サンプル判別用プレートのパターン部分を示す平面図
【図７】同生体サンプル判別用プレートのパターンを示す平面図
【図８】同生体サンプル判別用プレートの定量分取部を拡大して示す平面図
【図９】本発明の実施の形態２にかかる生体サンプル判別用プレートの平面図
【図１０】本発明の実施の形態１にかかる流路断面積を変化させた時の電圧降下の関係を示すグラフ
【図１１】本発明の実施の形態２にかかる流路断面積を変化させた時の検出時間の関係を示すグラフ
【図１２】本発明の実施の形態１にかかる流路断面積を変化させた時の電圧降下の関係を示すグラフ
【図１３】本発明の実施の形態２にかかる流路断面積を変化させた時の検出時間の関係を示すグラフ
【符号の説明】
【００６９】
１    プレート
２    流路パターン
３    回転部固定用穴
４    位置決め穴
５    プレート重心
６    緩衝剤注入口
７，７ａ，７ｂ  緩衝剤注入部
８    サンプル注入口
９    サンプル注入部
１０  定量分取部
１１，１２  流路
１３  空気孔
１４，１７  オーバーフローチャンバー
１５  空気孔
１６  流路
３０  ＤＮＡコンジュゲート
３１  ＤＮＡサンプル
４０  プレート
４１，４２  穴
４３，４４，４５  分離用媒体注入部
４６  サンプル注入部
４７  分離流路
４８  導入流路
４９  定量分取部
Ａ    泳動方向
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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