(57)【要約】【課題】  自己免疫疾患、例えば糖尿病、関節炎疾患、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症および重症性筋無力症を含む炎症性疾患、または腫瘍もしくは移植拒絶による炎症性応答の予防または治療のために有用であるペプチドが、提供される。【解決手段】  保存された哺乳動物のストレスタンパク質相同体をもつ微生物タンパク質のアミノ酸配列の一部分を含有しており、そのペプチドでは、微生物と哺乳動物の相同体間の全アミノ酸配列の同一性が少なくとも２５％であり、そして、少なくとも７５個の連続するアミノ酸の領域の微生物と哺乳動物の相同体間の配列の同一性が少なくとも３０％であり、該部分が、該ストレスタンパク質のＴ細胞エピトープにおける同じアミノ酸として同じ相対的位置に存在する少なくとも５個のアミノ酸を含み、そのエピトープが、対応する哺乳動物のストレスタンパク質アミノ酸と同一である少なくとも４個の連続するアミノ酸を含むペプチドが提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性疾患の予防もしくは治療に適するペプチドの生産方法であって、
ａ）微生物の相同体と哺乳動物の相同体間の全アミノ酸配列の同一性が、少なくとも２５％であり、そして少なくとも７５個の連続するアミノ酸の領域の微生物と哺乳動物の相同体間の配列同一性が、少なくとも３０％である、保存された哺乳動物ストレスタンパク質相同体をもつ微生物タンパク質を選択すること；
ｂ）少なくとも５個のアミノ酸が、該ストレスタンパク質における同じ相対的位置の対応するアミノ酸と同一である少なくとも５〜３０個のアミノ酸を含み、該ストレスタンパク質の少なくとも４個の連続するアミノ酸のある列が、選択された微生物タンパク質のアミノ酸のある列および哺乳動物ストレスタンパク質のアミノ酸の対応する列の両方と同一である、ペプチドを調製すること；
ｃ）調製されたペプチドを、Ｔ細胞エピトープの存在についてスクリーニングすること、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物および哺乳動物において保存された相同体を有するストレスタンパク質のアミノ酸配列の一部分を含有するペプチドであって、関節炎および他の炎症性疾患に対して免疫化することができ、そして／またはそのような疾患を治癒することができるペプチド、ならびにそのようなペプチドをコードしているヌクレオチド配列、そのようなペプチドを発現する細胞および微生物、そしてそのようなペプチドを含有する医薬および診断組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ストレスタンパク質は、非ウイルス性感染に対して免疫を与えたり、または免疫寛容を誘導することに有用であると記述されている。自己免疫疾患、特に、類リウマチ関節炎に対する免疫予防のための微生物ストレスタンパク質を含むワクチンが開示している(特許文献１参照)。アジュバント関節炎（ＡＡ）は、ヒトのリウマチ様関節炎（ＲＡ）または反応性関節炎の広く研究されたモデルである。ＲＡを起こす病原性機構がまだ不明であるので、広範な使用は、実験的な齧歯類の関節炎モデルについて行われている。Ｌｅｗｉｓラットは、ＩＦＡ中に懸濁された熱殺菌Ｍ．ツベルクロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（Ｍｔ）(アジュバント関節炎またはＡＡ）（１）、連鎖球菌細胞壁（ＳＣＷ−関節炎）、コラーゲンＩＩ型およびリポイド系アミンＣＰ２０９６１を含む種々の関節炎原性調製物の投与による関節炎にかかりやすい。ＡＡ誘導の細胞的基礎は、関節炎ラットからの脾細胞を用いて、未感作（ｎａｉｖｅ）ラットにその病気を受動的に伝達することによって例証された（２）。Ｍｔ−反応性Ｔ細胞クローンＡ２ｂの投与による照射ナイーブラットにおける病気の誘導が報告された（例えば、非特許文献３および４）。Ａ２ｂのＡｇ特異性は、ミコバクテリアの６５ｋＤａ熱ショックタンパク質（ｈｓｐ６５）の残基１８０〜１８８として同定された（５）。
【０００３】
アミノ酸配列１７１〜２４０またはミコバクテリアｈｓｐ６５のそれらの部分に対応するペプチドを含む、自己免疫疾患に対するワクチンが知られている(特許文献２参照)ている。また、ｈｓｐ６５の配列１８０−１８８に基づく類似のワクチンも知られている(特許文献３参照)。ｈｓｐ６５のアミノ酸配列１８０〜１８６に対応する変異ペプチドおよびそのような変異ペプチドに反応性のＴ細胞も知られている(特許文献４参照)。また、特許文献５によれば、ヒトｈｓｐ６５の配列４５８〜４７４および４３７〜４４８、ならびにミコバクテリアの類似体４３０〜４４６から得られる合成ペプチドは、弱い免疫原性抗原の免疫原性を増強する。
【０００４】
ｈｓｐ６５だけを用いる免疫化によってＡＡを誘導する試みは、成功しなかったことが証明された（５および６）。その代わりに、このアプローチは、続いて試みられた全Ｍｔを用いるＡＡの誘導に対する耐性が確認された。この防御効果は、ｈｓｐ６５に特異的なＴ細胞によって仲介されると信じられる（７）。ミコバクテリアｈｓｐ６５を用いる予備免疫化は、続いて、連鎖球菌細胞壁（例えば、非特許文献８参照）、コラーゲンＩＩ型（６および９）、またはＣＰ２０９６１（６）およびプリスタン（ｐｒｉｓｔａｎｅ）（１０）のような合成アジュバントを用いて誘導された別の型の実験的関節炎に対して防御を確実にすると報告されている。
【０００５】
ミコバクテリアのｈｓｐ６５は、進化を通じて高度に保存されている熱ショックタンパク質のｈｓｐ６０ファミリーに属し、そして哺乳動物の相同体、Ｐ１もしくはｈｓｐ６０と４８％の同一アミノ酸を共有する（１１）。哺乳動物ｈｓｐ６０の発現は、種々のスト
レス刺激に対する生理的応答として上方制御されることが知られており、そしてＲＡ（１２）または若年性慢性関節炎（１３）をもつ患者の炎症を起こした滑液中で高められることが分かった。
【特許文献１】国際公開第８９／１２４５５号パンフレット
【特許文献２】欧州特許出願公開第２６２７１０号明細書
【特許文献３】欧州特許出願公開第３２２９９０号明細書
【特許文献４】国際公開第９２／０４０４９パンフレット
【特許文献５】国際公開第９４／０３２０８号パンフレット
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、炎症性疾患の予防および治療のための防御性エピトープは、領域が微生物と哺乳動物の間で高度に保存されているストレスタンパク質の比較的短い領域（アミノ酸約５〜１５個）に位置するという発見に基づいている。防御性エピトープにおける高度の同一性に加えて、そのタンパク質は、より一般的に、微生物と哺乳動物の間で高度に保存されている。
【０００７】
用語「ストレスタンパク質」は、そのような炎症またはストレス状態の部位に生存する細胞中で、炎症または他のストレス刺激の間に合成レベルの上昇を示す酵素またはタンパク質を表すために、ここでは使用される。通常は、ストレスタンパク質は、例えば、細胞中で調節および代謝機能を発揮するために、構成的に発現される。この記述で、「微生物ストレスタンパク質」は、哺乳動物ストレスタンパク質の微生物相同体として理解されるべきである。炎症は、感染、自己免疫疾患、腫瘍成長、移植拒絶または組織損傷に起因するであろう。他のストレス刺激は、上昇した温度（４５℃まで）、薬物、重金属、外因性有機物質、オキシダント、細菌毒素、ＬＰＳ、ストレス誘導リポタンパク質、分裂促進因子（ＰＨＡ，ＣｏｎＡ）およびサイトカイン、例えばＩＬ１、ＩＬ２、ＴＮＦα，ＩＮＦαとβ、ＩＬ６およびＩＬ１２を含む。
【０００８】
合成の上昇は、細胞によるそのようなタンパク質の分泌または放出レベルの上昇、あるいは免疫系への提示レベルの上昇をみちびくことができる。合成の上昇は、例えば、ｍＲＮＡレベルの上昇を測定するためのノザンブロッティングによるか、あるいは細胞タンパク質を定量するための標準的アッセイを用いるか、タンパク質に特異的な抗体によるウエスタンブロッティングを用いることによりタンパク質の増加量を測定することによって検出できる。
【０００９】
ストレスタンパク質の保存は、微生物と哺乳動物のタンパク質の間で、全アミノ酸配列の同一性が、アミノ酸の少なくとも２５％、好ましくは少なくとも４０％を示すものとして定義される。さらに、例えば１００までの少なくとも７５個の連続するアミノ酸の領域が、微生物と哺乳動物の相同体の間で、アミノ酸の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、そしてより好ましくは少なくとも５０％の配列同一性をもたねばならない。適用されてもよいさらなる基準は、微生物と哺乳動物の相同体が、アミノ酸の少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、そしてより好ましくは少なくとも６０％の配列同一性をもつ、約１５までの少なくとも１０個の連続するアミノ酸の少なくとも５つの領域を示すことである。
【００１０】
防御性ペプチドは、微生物のストレスタンパク質のＴ細胞エピトープにおける同じアミノ酸として同じ相対的位置にある少なくとも５個のアミノ酸を含む配列から得られるが、そのエピトープは、対応する哺乳動物のストレスタンパク質アミノ酸と同一である少なくとも４個の連続するアミノ酸を含む。
【００１１】
かくして、本発明によるペプチドは、少なくとも、ストレスタンパク質のＴ細胞エピト
ープに対応するアミノ酸５個を含む。さらに、本ペプチドは、微生物のストレスタンパク質から得られても得られなくても、他の配列を含んでもよい。好ましくは、本ペプチドは、ストレスタンパク質の完全なアミノ酸配列を含まないで、不十分な相同性をもつ少なくとも１種のエピトープを欠如している。かくして、本ペプチドは、好ましくは、このエピトープが、対応する哺乳動物のストレスタンパク質アミノ酸と同一である少なくとも３個未満、特に４個未満の連続するアミノ酸を含む場合には、該ストレスタンパク質のＴ細胞エピトープに対応する少なくとも５個のアミノ酸、特に少なくとも８個のアミノ酸の切片を含まない。切り取られた切片は、例えば３０または５０個のアミノ酸までを含んでもよい。また、そのような相同性の低いエピトープの２つ以上が、好ましくは、本発明によるペプチドには存在しなくてもよい。
【００１２】
微生物および微生物体（ｍｉｃｒｏｂｅ）は、細菌のみならず原生動物および真核生物寄生体を含む。哺乳動物は、ヒト、マウスおよびラットを含む。ストレスタンパク質の例は、ストレスに誘導される酵素および非酵素タンパク質を含む。ストレスに誘導される酵素の特定の例は、アルドラーゼ、ヒト・アルドラーゼと６０％相同性をもつＰ．ファルシパルム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の４１ｋＤａタンパク質、ヒト・Ｇ−３−ＰＤと７０％相同性をもつグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ−３−ＰＤ）、住血吸虫抗原カテプシンＢおよびミオシン、ヒトの対応物と７１％相同性をもつエチノコッカス（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）のシクロフィリン、スーパーオキシドジスムターゼ（ミコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）とヒトのものの間で５０％以上の相同性）、およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼである。さらに、ストレスに誘導される酵素は、例えば、Ｌｙｓ−ｔＲＮＡシンテターゼ、スーパーオキシドジスムターゼ（Ｚｎ−，Ｃｕ−およびＭｎ−依存性）、ｌｏｎ−プロテアーゼ、エノラーゼ、ユビキチン複合酵素（ＵＢＣ４およびＵＢＣ５）、金属プロテイナーゼ：コラゲナーゼおよびストロメリシン（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ）ヒト軟骨ｇｐ−３９（Hakala et al., J. Biological Chem. 268: 25803-25810; 1993）およびオルニチンデカルボキシラーゼを含む。
【００１３】
スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）では、関節炎における防御力が、Kakimotoら（Clin.Exp. Imm. 94: 241-246, 1993）によって発見された。ゼラチン複合ＳＯＤは、関節炎を抑制したが、一方、ピラン重合体に複合したＳＯＤは、抑制しなかった。タンパク質としてのゼラチンは、Ｔ細胞エピトープを担持し、ピラン重合体は担持しないので、保存ＳＯＤ分子への免疫応答は、発見された関節炎抑制効果を説明できる。
【００１４】
非酵素タンパク質は、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）、例えば、ミコバクテリアｈｓｐ６５、ｈｓｐ６０（ＧｒｏＥＬ）、ＤｎａＪ、ｈｓｐ７０ファミリー（ＤｎａＫ）、ユビキチン、ｈｓｐ１０（ＧｒｏＥＳ）、低分子量ＨＳＰ（２０〜３０ｋＤａ）、ｈｓｐ４７、ｈｓｐ５６、ＴＣＰ−１（Ｔ複合体ペプチド）、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ１０４／１１０を含む。
【００１５】
非酵素ストレスタンパク質のさらなる例として、ヒストンＨ３（J. Immun. 142:1512, 1989），ヒストンＨ２Ａ、キネシン関連タンパク質、酸性リボソームタンパク質、クリスタリン、カルレチクリン（Kichalak et al., Biochem.J. 285: 681-692）およびクラミジア（Ｃｈｌａｍｉｄｉａ）の１８ｋＤａヒストン様タンパク質が、挙げられてもよい。１８ｋＤａクラミジア・ヒストン様タンパク質、ストレスに誘導される微生物抗原は、反応性関節炎をもつ患者において、Ｔ細胞によって認識されることが示された。自己免疫疾患の実験モデルで、細菌抗原への曝露が、防御的免疫応答に導くことが発見された。ボルデテラ・ペルツッシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）もしくはミコバクテリウム・ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）は、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）に対する防御を誘導できる（Lehman,Ben-Nun, J. Autoimm. 5: 675, 1992）。Ｍ．ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）は、ラットにおける糖尿病を防
御するであろう（M.W.J.Sadelain et al., J. Autoimmun. 3: 671-680; 1990）。
【００１６】
かくして、本発明は、炎症性疾患に対して防御を与えるペプチドに関しており、そのペプチドは、保存された哺乳動物ストレスタンパク質の対応物をもつ微生物タンパク質に対するＴ細胞エピトープの少なくとも一部分に対応する。
【００１７】
哺乳動物タンパク質それ自体の配列に基づくペプチドは、適切ではなく、その理由は、そのようなエピトープの免疫原性の場合には、これらは、哺乳動物自己タンパク質全部を認識する防御応答を引き出さない潜在性エピトープを構成するからであろう。この理由は、天然にプロセッシングされた自己タンパク質のエピトープへの応答は、胸腺のネガティブ選択または抹梢（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ）寛容にかけられるであろうという事実にあると信じられる。炎症における防御効果は、実際に、哺乳動物の自己タンパク質に対する比較的低い親和力の交差反応性応答を誘導する、微生物（相同性）エピトープを提示するペプチドに限定されるであろう。そのような低親和力応答では、ネガティブ選択または抹梢寛容は、存在しないであろう。
【００１８】
また、本発明は、前記定義のペプチドを生産する方法を提供するが、それは、次の段階：
ａ）微生物と哺乳動物の相同体の間の全体のアミノ酸配列の同一性が、少なくとも２５％、好ましくは少なくとも４０％あり、少なくとも７５個の連続するアミノ酸の領域の、微生物と哺乳動物の相同体の間の配列同一性が、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％またはちょうど５０％あり、そして少なくとも１０個の連続するアミノ酸の少なくとも５つの領域の、微生物と哺乳動物の相同体の間の配列同一性が、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％またはちょうど６０％ある、保存された哺乳動物ストレスタンパク質相同体をもつ微生物タンパク質を選択すること；
ｂ）該ストレスタンパク質の一連の少なくとも４個の連続するアミノ酸が、選択された微生物タンパク質の一連のアミノ酸および哺乳動物ストレスタンパク質の対応する一連のアミノ酸両方と同一である、該ストレスタンパク質の同じアミノ酸として同じ相対的位置に存在する少なくとも５個のアミノ酸を含むペプチドを調製すること；
ｃ）研究下の集団の各個体すべてによる必要はないが、１個以上の各個体によるＴ細胞応答によって立証されるように、調製されたペプチドをＴ細胞エピトープの存在についてスクリーニングすること；
を含む方法である。
【００１９】
本ペプチドを開発するためのこの方法は、高度に保存された酵素グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３−ＰＤ）に関して例示できる：
１）タンパク質配列の整列。
使用される微生物タンパク質のアミノ酸配列が、まず、配列番号：２および３および図１４のＧ３−ＰＤタンパク質について示されるように、哺乳動物（例えばラット）相同体の配列とともに整列させられる。
２）相同性基準にしたがうエピトープの選択。
細菌の配列が、哺乳動物のタンパク質配列内の同じ相対的位置における対応する残基と同一である少なくとも４個の連続するアミノ酸を含む領域が検索される（例えば、領域２−５，７−１４，７６−７９，９２−９７，１１６−１２１，１３０−１３４，１４７−１５８など、３２１−３２５まで、配列番号：２および３および図１４、参照）。次いで、合成ペプチドが、微生物の配列（アミノ酸５〜３０個）と同一になるように調製されるが、各ペプチドは、これらの同一領域の少なくとも４個のアミノ酸と重複している（例えば、ペプチド５０−７９、９２−１２１，１３０−１３４，１６７−１７８，３２１−３３３）。
３）選択された配列のＴ細胞エピトープ特性の決定。
このように選ばれた合成ペプチドは、例えば次のような操作によって、細菌Ｇ３−ＰＤタンパク質分子中の個々のエピトープを同定するために使用される。
ａ）細菌Ｇ３−ＰＤタンパク質全体による免疫化の後、ペプチドに対するＴ細胞応答が追跡され、個々のＴ細胞エピトープが、選ばれたペプチド内に含有されているか否かを決定される。
さらに、保存細菌タンパク質への免疫は、細菌抗原による初期感作によって既に存在していると思われるので、エピトープは、予備免疫化なしに、ペプチドに対する二次のＴ細胞応答を直接イン・ビトロでスクリーニングすることによって検出できる。
ｂ）あるいはまた、これらのペプチドによる免疫化によって、微生物Ｇ３−ＰＤタンパク質に対する配列に特異的なＴ細胞応答を誘導するそれらの能力は、それらのＴ細胞エピトープの特性を明らかにするであろう。可能性のあるエピトープの事前予測は、既知のＭＨＣ（ＨＬＡ）結合特性を基になされる。
あらゆる場合におけるイン・ビトロのスクリーニング法は、標準のリンパ球増殖アッセイの使用によって遂行できる。あるいは、Ｔ細胞活性化の他の兆候は、サイトカインの生産、Ｃａ２＋フラックス、細胞体拡大、および細胞表面マーカーの増加または変化として測定できる。
Ｔ細胞エピトープの特定は、患者、健康な個人および／または予防接種され／特異的に免疫された個体においてすることができる。
４）相同な自己タンパク質と交差反応するＴ細胞を誘導する選ばれたエピトープの能力を決定する。
確定した微生物エピトープを用いてイン・ビトロで活性化されたＴ細胞は、次に、相同な自己タンパク質（ラット・モデルにおいては、ストレスを受けた細胞または組織からの組み換えタンパク質または精製タンパク質としてか、あるいはストレスを受けた抗原提示細胞上の高レベルのＭＨＣ−ペプチド複合体としてかのいずれかの、ラットＧ３−ＰＤ）または相同ペプチドを用いて再刺激することができる。活性化（３の記述参照）のいずれの兆候も、自己タンパク質と微生物エピトープの交差反応性の指標として受け取ることができる。初発試験は、自己タンパク質の相同配列に基づく合成ペプチドを用いて実施できるが、単離された形でも細胞上に発現された形でもいずれにおいても、タンパク質自体との交差反応性の最終的証明が、潜在性エピトープを排除するために得られねばならない。
【００２０】
本発明によるペプチドは、例えば、ミコバクテリウム・ツベルクロシスの熱ショックタンパク質ｈｓｐ６５のＴ細胞エピトープの少なくとも一部分に対応することができる。例えばＬｅｗｉｓラットでは、ｈｓｐ６５のＴ細胞エピトープは、配列番号：１に示されるミコバクテリアのｈｓｐ６５配列の、アミノ酸残基それぞれ９１−１００，１７６−１９０，２１６−２２５，２２６−２３５，２５６−２６５，３８６−４００，３９６−４０５，４４６−４５５および５１１−５２０によってほぼ特定される領域に位置する。上記以外のＴ細胞エピトープの存在も排除されない。
【００２１】
配列番号：１の配列２５６−２７０に対応するペプチドによるラットの免疫化は、アジュバント関節炎（ＡＡ）の７日後の誘導に対して強い防御を誘導することが分かった。配列番号：１の配列８６−１００に対応するペプチドによる免疫化は、穏やかな防御を誘導したが、一方、他のエピトープに対応するペプチドによる免疫化は、アジュバント関節炎に対して防御をほとんどもしくは全く誘導することがなかった。
【００２２】
また、ｈｓｐ６５免疫ラットから最初に生成され、エピトープ２５６−２６５に特異的なＴ細胞株Ｈ．５２は、ミコバクテリウム・ツベルクロシスの投与時にｉ．ｖ．注射された場合、ＡＡ発症に対して防御効果を示した。
【００２３】
このことから次のことが結論される。すなわち、微生物ｈｓｐ６５中の防御ペプチドは、対応する哺乳動物ｈｓｐ６０のアミノ酸と同一である少なくとも４個の連続するアミノ
酸を含有している微生物ｈｓｐ６５のＴ細胞エピトープにおいて、少なくとも５個のアミノ酸が、同じアミノ酸として同じ相対的位置に存在する位置に置かれているということである。ヒト、ラット、マウスおよびミコバクテリアのｈｓｐ６０／ｈｓｐ６５アミノ酸配列は、図１３の一文字コードにおいて示される。「対応する哺乳動物ｈｓｐ６０アミノ酸と同一」は、問題のアミノ酸が、ヒト、ラットまたはマウスいずれかのｈｓｐ６０において同じ位置に存在するアミノ酸と同一であることを意味すると理解される。
【００２４】
ペプチドは、具体的には、配列番号：１の配列８１−１００および２４１−２７０の１つにおいて同じアミノ酸として同じ相対的位置に存在する５個のアミノ酸をもち、より具体的には、配列番号：１の配列８４−９５および２５６−２６５の１つにおいて同じアミノ酸として同じ相対的位置に存在する少なくとも５個のアミノ酸をもつものである。好適には、ペプチドは、ｈｓｐ６５Ｔ細胞エピトープのアミノ酸と同じ相対的位置をもつ少なくとも６個か、ちょうど７個のアミノ酸を含む。これらのエピトープは、特に、対応する哺乳動物ｈｓｐ６０のアミノ酸と同一である少なくとも４個の連続するアミノ酸をもつものである。適切なペプチドの例は、配列［Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｌａ］、［Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ］および［Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ
Ｖａｌ］を含む。特に、ペプチドは、ｈｓｐ６５のアミノ酸配列の５〜３０個のアミノ酸を含む。ｈｓｐ６５アミノ酸は、スペーサー配列または融合ペプチド配列のような他の配列に結合されていてもよい。
【００２５】
ペプチドは、糖尿病、関節炎疾患、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症および重症性筋無力症のような自己免疫疾患を含む炎症性疾患の治療および予防のために適切である。また、移植拒絶を起こす炎症過程も、ペプチドによって抑制されるであろう。
【００２６】
また、本発明は、前記ペプチドの免疫学的性質を示すが、１つ以上の化学的改変を含むペプチド類似体に関する。そのようなペプチド類似体は、また、ペプチド疑似体とも言われ、例えば、本質的に同じ側鎖基が存在するが、骨格が、ＣＨ＝ＣＨ，ＣＯ−Ｏ，ＣＯ−ＣＨ２もしくはＣＨ２−ＣＨ２のようなその他の基によるアミド基（ＣＯ−ＮＨ）の置換のような改変を含む、前記ペプチドのアミノ酸残基に対応する単位からなることができる。他の改変、例えば、類似の天然もしくは非天然アミノ酸によるアミノ酸の置換も考えられる。これに関して、「類似の」は、ほぼ同じサイズ、電荷および極性もつことを意味し；したがって、脂肪族アミノ酸アラニン、バリン、ノルバリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシンおよびメチオニンが、類似と考えることができ；同様に、リジン、アルギニン、オルニチン、シトルリン、アスパラギンおよびグルタミンのような塩基性ないし中性の極性アミノ酸が、本目的のために類似であり；同じことが、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、セリン、ホモセリンおよびスレオニンのような酸性ないし中性の極性アミノ酸に適用される。
【００２７】
前記ペプチドは、そのままで使用されても、またはそれらの抗原性もしくは免疫原性を増強する配列に結合されてもよい。そのような配列は、トキソイドもしくは免疫グロブリンの一部を含んでもよい。また、ペプチドは、ＭＨＣ分子との複合体として使用されても、そして／またはリポソーム中に組み込まれてもよい。また、ペプチドは、免疫刺激のためのベクターとしての他の分子または全細胞に共有結合されてもよい。ペプチドは、単量体、二量体もしくは多量体の形で存在してもよい。
【００２８】
また、本発明は、前記ペプチドをコードしているヌクレオチド配列にも関する。そのようなヌクレオチド配列は、ストレスタンパク質のＴ細胞エピトープに対応する領域をコードしている１５個以上のヌクレオチドを含有してもよい。ストレスタンパク質のヌクレオチド配列は、既知であるか、または慣用の手段で決定できる。例として、ｈｓｐ６５をコードしているミコバクテリウム・ツベルクロシス遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号
：１に示される。適切なヌクレオチド配列の例は、配列番号：１の配列２７１−２８５，７６６−７８０および７６９−７８３、および縮重配列そしてこれらの配列とハイブリダイズする配列を含む。本発明によるヌクレオチド配列は、そのままで使用されても、またはイン・ビボで免疫するペプチドを産生するためのワクチン材料として、ベクター配列に組み込まれてもよい（「裸のＤＮＡアプローチ」）。また、本発明により提供されるものは、プロモーター配列および他の調節配列の作動制御下で、ストレスタンパク質をコードしている配列の一部分に対応するヌクレオチド配列を含む前記ペプチドを発現できる発現系である。その発現系は、ベクター有機体、または細胞、特に真核細胞中に存在することができ、そして大規模に本発明によるペプチドを生産するために使用できる。
【００２９】
また、本発明は、前記ペプチドを用いる免疫刺激によって活性化されるオートロガスＴ細胞またはＴ細胞レセプターを発現している他の細胞、またはそのようなＴ細胞由来のそれらの部分を提供する。
【００３０】
また、本発明は、前記ペプチドに向けられる抗体、特にモノクローナル抗体に関する。抗体は、既知の方法を用いて、例えばハイブリドーマ技術によって生産できる。抗体は、受動ワクチンとしても、診断道具としても使用される。
【００３１】
さらにまた、本発明は、前記ペプチド、またはそのようなペプチドに対応し、そして／またはそのようなペプチドをコードしているヌクレオチド配列、発現系、細胞（真核）もしくは微生物を含有する、自己免疫疾患、糖尿病、関節炎疾患、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症および重症性筋無力症を含む炎症性疾患の予防または治療のために適切な医薬組成物に関する。その組成物は、ワクチンの剤形であってもよく；次にまた、それは、常用アジュバント、例えばＡｌｕアジュバント、Ｉｓｃｏｍ，フロイントの完全もしくは不完全アジュバントまたは他のアジュバント、そして／またはキャリアー材および他の添加物を含有できる。
【００３２】
組成物は、特に、発症しつつあるか発症した炎症性疾患を治癒するために適切な医薬品の剤形で存在してもよく；それは、常用の添加物および添加剤を含有する。治療用組成物として、それは、また、前記ペプチドに対する抗体を含有してもよい。本発明によるワクチンおよび薬物は、例えば、非経口、経口または経鼻投与に適切な剤形であってもよい。
【００３３】
また、本発明は、前記ペプチドに基づく診断手段および方法、あるいはそれらが、炎症部位におけるペプチド（エピトープ）配列の特異的発現を測定するために使用できるような対応する抗体またはヌクレオチド配列（プローブ）に関する。また、ペプチドが、診断目的のために、Ｔ細胞増殖またはＴ細胞のサイトカイン産生を測定するアッセイに使用される方法も、考えられる。
【００３４】
この記述において使用される略語：
ＡＡ：        アジュバント関節炎
Ａｇ：        抗原
ＡＰＣ：      抗原提示細胞
ＤＤＡ：      臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム
Ｄｈｂｔ：    ３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾト
リアジン
ＦＡＣＳ：    蛍光標示式細胞分取器
ＦＣＳ：      ウシ胎児血清
ＦＩＴＣ：    フルオレセインイソチオシアネ−ト
Ｆｍｏｃ：    ９−フルオレニルメトキシカルボニル
Ｈｏｂｔ：    Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ｈｓｐ６０：  哺乳動物の６０ｋＤａ熱ショックタンパク質
ｈｓｐ６５：  ミコバクテリアの６５ｋＤａ熱ショックタンパク質
ＩＦＡ：      不完全フロイントアジュバント
ＪＣＡ：      若年性慢性関節炎
２−ＭＥ：    ２−メルカプトエタノール
ＭＨＣ：      主要組織適合遺伝子複合体
Ｍｔ：        熱殺菌ミコバクテリウム・ツベルクロシス
ＰＡＬ：      ペプチドアミドリンカー（商標）
ＰＢＳ：      リン酸塩緩衝化生理食塩水
Ｐｆｐ：      ペンタフルオロフェニル
ＰＰＤ：      Ｍ．ツベルクロシスの精製タンパク質誘導体
ＰＬＮＣ：    感作リンパ節細胞
ＲＡ：        リウマチ性関節炎
ＴＣＧＦ：    Ｔ細胞成長因子
ＴｄＲ：      ［３Ｈ］チミジン
【００３５】
材料および方法
動物：  雄の近交系Ｌｅｗｉｓラット（ＲＴ１  Ｂ１  ＭＨＣハプロタイプ）は、The University of Limburg, Maastricht, The Netherlandsから得られた。ラットは、各実験の開始時には５〜８週令であった。  抗原およびアジュバント：  熱殺菌ミコバクテリウム・ツベルクロシス菌株Ｈ３７Ｒａ（Ｍｔ）は、Difcoから得られた。Ｍ．ツベルクロシスの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）およびＭ．ボビスの精製組み換えｈｓｐ６５（Ｍ．ツベルクロシスｈｓｐ６５と同一である）は、親切にもDr.J.D.A. van Embden, National
Institute of Public Health and EnvironmentalProtection, Bilthoven, The Netherlandsによって提供された。不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ，Difco）および 臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ，EastmanKodak, Rochester, NY, 引用文献１８）が、アジュバントとして使用された。ＤＤＡは、ＰＢＳ中２０ｍｇ／ｍｌの懸濁液として調製され、そして音波処理して、免疫化の前にＡｇ溶液と１：１に混合されるゲルを作成した。  合成ペプチド：  ペプチドは、自動同時多ペプチド合成（ＳＭＰＳ）によって調製された。ＳＭＰＳの開始は、既述の標準オートサンプラー（Ｇｉｂｓｏｎ  ２２１）を用いて起こされた（１９）。簡単に言えば、ペプチドの同時合成のために、６倍モル過剰のＰｆｐ−活性化アミノ酸（セリンおよびスレオニンではＤｈｂｔ）および触媒としてのＨｏｂｔを用いる標準Ｆｍｏｃ化学作用が使われた。ペプチドは、６ｍｇ樹脂／ペプチド（０．３３ｍｅｑ／ｇＰＡＬ樹脂、Millipore）からＣ−末端アミドとして得られた。Ｍｔ・ｈｓｐ６５（２０）およびラットｈｓｐ６０（２１）の配列を基に、２つのペプチドパネルが合成された。ペプチドは、各々隣接するペプチドと１０個のアミノ酸が重複した１５量体（すなわち、１−１５，６−２０，１１−２５など）であった。かくして、各タンパク質の各々可能性のある１１量体の配列が、１個のペプチド内に含まれた。
【００３６】
免疫化および感作リンパ節細胞集団：  ラットは、Ｍｔまたはｈｓｐ６５のいずれかで免疫された。Ｍｔは、ＩＦＡもしくはＤＤＡ中５ｍｇ／ｍｌに懸濁され、１００μｌが、各後足しょに注射された（すなわち、５００μｇ／足しょ、１ｍｇ／ラット）。ｈｓｐ６５（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ）は、ＤＤＡと１：１に混合され、１００μｌが注射された（すなわち、５０μｇ／足しょ、１００μｇ／ラット）。１０〜２１日後、分泌している（ｄｒａｉｎｉｎｇ）膝窩筋のリンパ節が、採取され、砕かれ、３回洗浄され、そして感作リンパ節細胞（ＰＬＮＣ）源として使用された。対照実験では、非免疫ラットからの脾細胞およびリンパ節、そしてＩＦＡまたはＤＤＡ／ＰＢＳのみで免疫されたラットからのＰＬＮＣが使用された。
【００３７】
合成ペプチドを用いる免疫化および感作リンパ節細胞：  ラットは、ＰＢＳ／ＤＤＡ中
合成ペプチド５０μｇを用いて、各後足しょにおいて免疫された（すなわち、５０μｇ／足しょ、１００μｇ／ラット）。１０日後、分泌している膝窩筋のリンパ節が、採取され、砕かれ、３回洗浄され、そして感作リンパ節細胞（ＰＬＮＣ）源として使用された。ある実験では、ＰＬＮＣは、Ｍｔ免疫化後３５〜４２日のＡＡラットからプールされる鼠径部および膝窩筋のリンパ節として得られた。
【００３８】
組織培養試薬：  ５％ＦＣＳ、２ｍＭＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（すべてGibco製）および５ｘ１０−５Ｍ２−ＭＥを補足したＩｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ，Gibco）が、培養基として使用された。細胞集団は、補足物なしのＩＭＤＭ中で洗浄された。
【００３９】
Ｔ細胞増殖アッセイ：  ＰＬＮＣは、２００μｌ平底ミクロタイターウェル（Costar）中、抗原添加または無添加で、１ウェル当たり２ｘ１０５細胞において、３並列で培養された。最初の実験では、ＰＬＮＣは、濃度５および２０μｇ／ｍｌの各ペプチド、および一定濃度範囲にわたるＭｔ、ｈｓｐ６５およびＰＰＤに対する応答性に関して試験された。コンカナバリンＡ（２μｇ／ｍｌ）は、Ｔ細胞増殖に対するポジティブ対照として使用された。培養物は、加湿された５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃９６時間、培養された。培養物は、最後の１６時間［３Ｈ］ＴｄＲ（Amersham,U.K.,  １μＣｉ／ウェル）を用いてパルスラベルされ、そしてＴｄＲ取り込みが、液体シンチレーションβカウンターを用いて測定された。Ｔ細胞株を用いるアッセイは、照射（３０Ｇｙ）された同系の補助細胞（３ｘ１０５脾細胞／ウェルまたは１０６胸腺細胞／ウェルのいずれか）とともに２ｘ１０４系統細胞／ウェルを用いて行われた。結果は、３並列培養の１分間当たりの平均カウント（ｃｐｍ）として表された。Ａｇに対する応答が低い場合の実験では、刺激指数（Ｓ．Ｉ．＝Ａｇ添加の平均ｃｐｍ−Ａｇ無添加の平均ｃｐｍ）が、２を超え、そしてＳｔｕｄｅｎｔのｔ試験が、ｐ＜０．０１を与えたならば、応答は、有意と考えられた。
【００４０】
Ｔ細胞株：  ミコバクテリアのｈｓｐ６５またはペプチドに特異性をもつＴ細胞株は、ｈｓｐ６５−ＰＬＮＣまたはＭｔ−ＰＬＮＣのいずれかのバルク刺激によって生成された。ＰＬＮＣは、Ａｇ１０μｇ／ｍｌ存在下で２％正常ラット血清(ＮＲＳ)を補足した培養基中、５ｘ１０６／ｍｌで培養された。３日後、生存細胞が、ｆｉｃｏｌｌ−ｉｓｏｐａｑｕｅ勾配を用いて収穫され、そしてさらに４日間、培養基＋５％ＦＣＳおよび５％ＴＣＧＦ（ＣｏｎＡ−活性化ラット脾臓上澄液）において培養された。最初の刺激後７日に、細胞株は、培養基＋ＮＲＳ中の照射脾臓補助細胞およびＡｇにより再刺激された。細胞株は、この７日の再刺激サイクルにおいて維持された。
短期のエピトープ特異的Ｔ細胞株は、また、合成ペプチドで免疫されたラットから生成された。ペプチド−ＰＬＮＣは、ペプチド１０μｇ／mlの存在下で上記のように培養された。
【００４１】
モノクローナル抗体：  抗−ＭＨＣモノクローナル抗体は、ｈｓｐ６５およびペプチドに対する応答のＭＨＣ−限定を決定するために増殖アッセイに添加された。ＯＸ６（抗−ＲＴ１．Ｂ，クラスＩＩ）、ＯＸ１７（抗−ＲＴ１．Ｄ，クラスＩＩ）、ＯＸ１８（抗−ＲＴ１．Ａ，クラスＩ）およびＵＤ１５（抗−クロラムフェニコール対照抗体）が、使用された。すべての抗体は、マウスＩｇＧ１であった。
【００４２】
ＦＡＣＳ分析：  ＦＡＣＳ分析は、表現型Ｔ細胞株に対して使用された。細胞は、Ｒ７３（抗−αβＴＣＲ）、Ｗ３／２５（抗−ＣＤ４）またはＯＸ８（抗−ＣＤ８）、すべてのマウスＩｇＧ１抗体とともに培養された。第２段階の染色は、ＦＩＴＣ−複合ヒツジ抗−マウスＩｇ（Becton, Dickinson）を用いて行った。細胞は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎ分析器を用いて分析された。
【００４３】
実験的関節炎の誘導および臨床評価：  関節炎は、尾の基部に単回皮内注射によって誘導された。ＡＡは、ＩＦＡ１００μｌ中に懸濁されたＭｔ０．５ｍｇを用いて誘導された。ＣＰ２０９６１関節炎は、軽鉱油（Sigma）１００μｌ中ＣＰ２０９６１  ２ｍｇを用いて誘導された。ラットは、関節炎の臨床徴候について毎日検査された。関節炎の重篤度は、関節の腫脹、紅斑および変形の程度に基づき各足に０〜４をスコアすることによって評価された。かくして、最大可能な関節炎スコアは、１６であった。
【００４４】
ｈｓｐ６５ペプチドおよびエピトープに特異的Ｔ細胞株による関節炎の変調：  ミコバクテリアのｈｓｐ６５に存在する８種のＴ細胞エピトープに対応する合成ペプチドが、関節炎の発症における防御効果について試験された。ラットは、関節炎誘導前７日に、各々のペプチド１００μｇを用いて免疫された。ペプチドは、１０ｍｇ／ｍｌＤＤＡ（５０μｌ／足しょ）で各後足しょに免疫された。対照のラットは、ＰＢＳ／ＤＤＡのみを受けた。また、エピトープ特異的Ｔ細胞株は、関節炎誘導時点で、細胞株の静脈内投与によって防御活性を試験された。Ｔ細胞株は、イン・ビトロで照射脾臓ＡＰＣおよび特異的ペプチドによって再刺激された。４日後、Ｔ細胞芽球が、ｆｉｃｏｌｌ勾配によって収穫され、洗浄され、そして第２回のｆｉｃｏｌｌ勾配にかけられて、すべての混入しているＡＰＣを除かれた。Ｔ細胞は、洗浄培地で２回そしてＰＢＳで２回洗浄され、最後にＰＢＳ中に２．５ｘ１０７／ｍｌで懸濁された。Ｍｔ２００μｌ（すなわち、５ｘ１０６）の注射直前に、Ｔ細胞は、尾静脈にｉ．ｖ．注射された。
【００４５】
結果
Ｍｔ、ＰＰＤおよびｈｓｐ６５に対する初期感作リンパ節細胞の応答。
ｈｓｐ６５による免疫化は、ｈｓｐ６５に対する応答性を感作した。また、ＰＰＤ（生来のｈｓｐ６５を含有する）は、組み換えｈｓｐ６５による免疫化が、生来のミコバクテリアｈｓｐ６５を認識するＴ細胞を活性化したことを示すＴ細胞増殖を誘導した。ｈｓｐ６５−ＰＬＮＣは、ＤＤＡ／ＰＢＳ−ＰＬＮＣに比較してＭｔに対する応答性の増大を示した。ｈｓｐ６５に対するｈｓｐ６５−ＰＬＮＣ増殖応答は、培養物へのＯＸ６モノクローナル抗体の添加によって効果的に阻害されたので、このことは、応答が、ＲＴ１．Ｂ１  ＭＨＣクラスＩＩ分子に顕著に（全体的ではなくても）限定されることを指している（図２）。有意な阻害は、抗−ＲＴ１．Ｄ、抗−ＲＴ１．Ａまたは抗−クロラムフェニコール・イソタイプ対照ｍＡｂｓを用いては見られなかった。
【００４６】
ｈｓｐ６５による免疫化に続くｈｓｐ６５Ｔ細胞エピトープの同定。
ｈｓｐ６５−ＰＬＮＣが、ｈｓｐ６５の完全配列をカバーしているペプチドのパネルに対する応答性に関して分析された（図３）。数種のペプチドは、有意な増殖を誘導したので、これは、７種のエピトープの存在を示唆する。応答の大きさの項において、分子の３領域（残基１７６−１９０，２１１−２３０および２２１−２４０）が、「強力な（ｄｏｍｉｎａｎｔ）」Ｔ細胞エピトープを含むとみられたが、一方、領域８６−１００，２５１−２７０，３９６−４１０および５０６−５２５は、「準強力な（ｓｕｂｄｏｍｉｎａｎｔ）」または弱い（ｍｉｎｏｒ）エピトープを含んでいた。これらのエピトープの４種（２１１−２３０，２２１−２４０，２５１−２７０および５０６−５２５）については、隣接して重複するペプチドに対する応答が見られ、コアエピトープが、それぞれ２１６−２２５，２２６−２３５，２５６−２６５および５１１−５２０内にあることを示唆した。
【００４７】
ペプチド１７６−１９０は、ＡＡ−関連エピトープ１８０−１８８を含有した。また、合成ペプチド１８０−１８８が、試験された。それは、応答を誘導するが、比較的長い１７６−１９０ペプチドよりも低いレベルにおいてであることが分かり、これは、最小のエピトープが、ＰＬＮＣレベルではほとんど有効な刺激を与えないことを示した。
【００４８】
ＰＬＮＣ応答は、免疫後１０，１４および２１日に試験された。応答は、１０日目に最強であり、時間とともに下降した。強さのパターンは、一定して残り、そして別のペプチドに対する「新しい」応答は、２１日目には観察されなかった。最初の実験は、数匹の免疫ラットからのプールされたＰＬＮＣを使用した。個々のラットの応答性を試験する実験は、応答性のパターンにおいて、ラット間の差異を示さなかった。また、ｈｓｐ６５−ＰＬＮＣを刺激したペプチドは、未感作の脾細胞およびＤＤＡ／ＰＢＳ−ＰＬＮＣにおいて試験され、そして刺激活性をもたないことが分かったが、このことは、ｈｓｐ６５による免疫化が、ペプチドに誘導される応答には初期感作を必要とすることを示唆した。
【００４９】
また、ｈｓｐ６５−ＰＬＮＣが、ラットｈｓｐ６０の完全配列をカバーしているペプチドのパネルに対する応答を試験された。ラットｈｓｐ６０のいずれも、免疫後１０または１２日に試験されたｈｓｐ６５−ＰＬＮＣにおいて有意な応答を誘導しなかった。
【００５０】
ＰＬＮＣレベルで同定されたｈｓｐ６５Ｔ細胞エピトープの存在を確認するために、短期Ｔ細胞株が、ｈｓｐ６５によるバルク刺激によって１０日目のｈｓｐ６５−ＰＬＮＣから確立された。最初の再刺激後７日に、これらの細胞株は、ｈｓｐ６５ペプチドの完全パネルに対して試験された（図４）。得られた応答パターンは、最初のＰＬＮＣ集団のパターンに類似していた。３種の強力なエピトープ、１７６−１９０，２１６−２２５および２２６−２３５は、すべて強い応答を誘導し、そしてエピトープ２５６−２６５，３９６−４１０および５１１−５２０も、また認識された。ｈｓｐ６５−ＰＬＮＣを刺激できなかった２種のエピトープ（３８６−４００および４４６−４６０）は、ｈｓｐ６５−特異的な細胞株を刺激した。
【００５１】
全Ｍ．ツベルクロシスによる免疫化に続くｈｓｐ６５エピトープに対するＴ細胞応答。
Ｍｔ−ＰＬＮＣが、ｈｓｐ６５ペプチドに対する応答について試験され、全Ｍｔによる免疫化が、前記ｈｓｐ６５エピトープに対する応答性を初期感作できたかどうか決定した。Ｍｔ／ＩＦＡによる免疫化（すなわちＡＡ−誘導法）は、ｈｓｐ６５ペプチドに対する有意な応答を、常には誘導できなかった。Ｍｔ／ＩＦＡ免疫化は、ｈｓｐ６５に対する低レベルの反応性を誘導しただけであり（図１）、ＤＤＡと混合されたＭｔにより免疫されたラットからのＰＬＮＣが試験された。この方法（１ラット当たりＭｔ５００μｇまたは１ｍｇを用いる）は、ｈｓｐ６５に対する反応性の増大、およびｈｓｐ６５ペプチドに対する有意な応答を示すＰＬＮＣを生産した（図１および４５）。その応答パターンは、ｈｓｐ６５−ＰＬＮＣを用いて得られたパターンとは相異した。エピトープ１７６−１９０は、強力であるように見え、エピトープ２１６−２２５，２２６−２３５，２５６−２６５および５１１−５２０は、弱く、そしてエピトープ８６−１０５および３９６−４１０に対する応答は欠如した（図４）。
【００５２】
確定したｈｓｐ６５エピトープに特異的なＴ細胞株の解析。
Ｔ細胞株は、個々の合成ペプチドによるｈｓｐ６５−ＰＬＮＣの再刺激によって生成された。応答が、２種の重複しているペプチドに対して検出されたエピトープでは、細胞株は、ｈｓｐ６５−ＰＬＮＣの最も強い増殖を誘導したペプチド（例えば、エピトープ２１６−２２５では、ペプチド２１１−２２５が使用された）を用いて生成された。これは、８種のＴ細胞株をもたらした。表Ｉは、各エピトープに対する応答パターンを総括し、そして各ペプチドに特異的なＴ細胞株を命名する。ペプチド３８６−４００に特異的な細胞株は、確立されなかった。少なくとも４回のイン・ビトロの再刺激の後、各細胞株が、特異的なペプチド、ｈｓｐ６５、ＭｔおよびＰＰＤに対する応答性を試験された。自己ｈｓｐ６０との交差反応性を試験するために、各細胞株は、また対応するラットｈｓｐ６０ペプチドに対して試験された（図７〜１０）。
【００５３】
すべての細胞株は、ｈｓｐ６５およびそれらの特異的ペプチド、そして１つの例を除いてすべてにおいて、重複しているペプチドに応答した。残基２１１と２３５の間の４種の重複するペプチドが、刺激性であった。かくして、４種の別々なエピトープが、この領域に存在すること可能性があった。しかしながら、ペプチド２１６−２３０および２２１−２３５に対して生成されたＴ細胞株は、それぞれペプチド２１１−２２５および２２６−２４０に、より強く応答したので、これは、２種のエピトープ：前記２１６−２２５および２２６−２３５のみの存在を示唆した。また、ペプチド１７６−１９０に特異的な細胞株Ｈ．３６は、関節炎を起こすＴ細胞クローンＡ２ｂによって認識されると先に述べられた残基１８０−１８８を含むペプチドに応答したが、これは、これらの２種の細胞株が、同じコアエピトープを認識することを示唆する。
【００５４】
残基２５６−２６５に特異的な細胞株Ｈ．５２は、ラットｈｓｐ６０の相同ペプチドに明瞭な応答を示した。したがって、ラットｈｓｐ６０ペプチドに対する応答は、ｈｓｐ６５−ＰＬＮＣまたはｈｓｐ６５に特異的な細胞株を用いて検出できなかったにも拘わらず、交差反応性Ｔ細胞認識は、このエピトープ特異的細胞株用いて例証できた。ミコバクテリアのペプチドは、ラットのペプチドよりも５〜１０倍高レベルの増殖を誘導した。このことは、何故、ラットのペプチドが、ミコバクテリアのペプチドに対する応答が弱かったようなＰＬＮＣレベルでは認識されず、そして刺激活性においていかに減退しても、検出レベル以下の応答をもたらすことができたかという理由を説明するであろう。Ｈ．５２によって認識されるコアエピトープは、そのエピトープのＣ−末端に置かれるラットｈｓｐ６０配列とは異る唯一の残基３個を含む（表Ｉ参照）。すべて他のＴ細胞株は、ラットｈｓｐ６０ペプチドに対して応答できなかった。かくして、この研究によって同定されたミコバクテリアｈｓｐ６５における９種のＴ細胞エピトープについて、ただ１種のみが、ラットｈｓｐ６０と交差反応性を示した。
【００５５】
ペプチドに特異的か、またはｈｓｐ６５に特異的なすべてのＴ細胞株が、Ｔ細胞表現型およびＭＨＣ−限定に関して解析された。ＦＡＣＳ解析は、全Ｔ細胞株が、αβ  ＴＣＲ＋  ＣＤ４＋  ＣＤ８−であることを明らかにした。ＭＨＣ−限定は、増殖アッセイにおいてｈｓｐ６５もしくはペプチド（１μｇ／ｍｌ）に誘導される応答を阻害する、抗ＭＨＣ−モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）の能力を評価することによって決定された。抗ＲＴ１．Ｂの添加は、すべての細胞株の増殖を７０％超低下したが、一方、抗ＲＴ１．Ｄもしくは抗ＲＴ１．Ａは、有意な効果をもたなかった（図１１）。かくして、すべての細胞株は、ＲＴ１  Ｂ１−限定であった。
【００５６】
ｈｓｐ６５ペプチドによる免疫化は、エピトープに特異的なＴ細胞応答を初期感作する。
合成ペプチドによるラットの免疫化が、ｈｓｐ６５エピトープに対するＴ細胞反応性を初期感作することに効果的であるか否かを決定するために、個々のＴ細胞エピトープを含む各ペプチド１００μｇによる免疫化に続いて、イン・ビトロの増殖応答が試験された。免疫後１０日目に単離されたＰＬＮＣが、免疫ペプチド、重複するペプチド、およびｈｓｐ６５に対する応答について試験された（表ＩＩ）。ＰＬＮＣ応答は、９種のペプチドの７種による免疫後に観察された。応答は、ペプチド３８６−４００および５１１−５２５による免疫後には見られなかった。バルク刺激は、試験された９種のペプチドの８種に対するＴ細胞株を生成した。これらの８種の細胞株は、４回のイン・ビトロの再刺激の後、特異性が試験された（表ＩＩ）。すべてが、免疫ペプチドに対して、そしてある程度ｈｓｐ６５に対して応答した。また、細胞株は、重複するペプチドに対する応答性を試験され、そして１つの場合以外はすべてにおいて、ｈｓｐ６５全体による免疫後同じエピトープに対して前以て生成されたＴ細胞株に対して、同一の応答パターンを示した。これらの知見は、ｈｓｐ６５または合成ペプチドによる免疫化によってイン・ビボで活性化されたＴ
細胞が、同じコアエピトープを認識することを示唆する。
【００５７】
ｈｓｐ６５により免疫されたラットから生成された８６−１００ペプチドに特異的なＴ細胞株は、ペプチド８６−１００および９１−１０５に応答した（すなわち、それは、９１−１００のコアエピトープを認識した）。また、８６−１００ペプチドによる免疫後生成されたＴ細胞株は、ペプチド８１−９５および９１−１０５に応答した。このことは、１つは残基８６−９５を認識し、他の１つは残基９１−１００を認識する２種のＴ細胞集団の存在を示唆した。興味あることには、残基８６−９５をカバーするミコバクテリアｈｓｐ６５およびラットｈｓｐ６０の配列は、同一である。したがって、その細胞株は、ラットｈｓｐ６０の８１−９５および８６−１００に対応するペプチドに対する応答して増殖した。かくして、ｈｓｐ６５の８６−１００ペプチドによる免疫化は、自己ｈｓｐ６０中のエピトープに対する応答性を初期感作できた。
【００５８】
また、細胞株Ｈ．５２（ｈｓｐ６５による免疫ラットから生成され、エピトープ２５６−２６５を認識する）も、高度に相同なラットｈｓｐ６０の２５６−２７０ペプチド（前記、参照）に応答した。したがって、ペプチドで免疫されたラットから得られた２５６−２７０特異的Ｔ細胞株も、またラット２５６−２７０に応答した（表ＩＩ）。また、この細胞株は、３７℃で培養された比較対照ＡＰＣにおいて、熱ショック（照射前に４２℃で１時間）を受けた同系のＡＰＣに対する「自己反応性」応答の増大を示した（表ＩＩＩ）。このことは、ＡＰＣによる内因性ｈｓｐ６０の発現増加が、Ｔ細胞認識のためにＭＨＣと共同してこの交差反応性エピトープの提示をもたらすことを示唆した。
【００５９】
本発明に記載のペプチドのヒトにおける最初の試験は、両ペプチド２５６−２７０および８６−１００が、ある種の自己免疫病患者においてＴ細胞増殖応答を誘導できることを示した。かくして、今や、ラットの確定したＴ細胞エピトープ自体が、ある種の個体（ある種のＨＬＡタイプ）における治療的介入に使用できた。
【００６０】
関節炎に対するｈｓｐ６５ペプチドの予防接種能の解析。
ＡＡの発症に及ぼす各エピトープを含む合成ペプチドによる前免疫化の影響が、解析された（図１２〜１５）。エピトープに特異的なＴ細胞を初期感作した８種のペプチドが、試験された。ラットは、ＭｔによるＡＡ誘導７日前に、ペプチド１００μｇを用いて免疫された。
【００６１】
ペプチド２５６−２７０による前免疫化は、ＡＡ発症に対して明らかな防御効果をもたらした。２５６−２７０での前免疫化の後、平均最大関節炎スコアは、ＰＢＳで前免疫された対照ラットの平均最大スコア１１．５に比べて１．７（５回の別実験における２４匹のラット）であった。２５６−２７０により前免疫されたラット２４匹について、１２匹は、関節炎の臨床徴候を生じたが、それは対照ラットで生じたものよりも軽度であった。また、最初の関節炎後に、持続する永久関節変形を蒙った対照ラットは、生き続けたけれども、ＡＡを発症した２５６−２７０で前免疫されたラットは、永久変形を全く生じなかった。ｈｓｐ６５Ｔ細胞エピトープを含む他のペプチドによる前免疫化は、ペプチド８６−１００の弱い効果を除いては、ＡＡの発症に有意な効果をもたなかった。前免疫ラットからのＰＬＮＣが、Ｍｔ投与後４２日に、ｈｓｐ６５エピトープに対する応答性を試験された（図１６）。ＰＢＳ／ＤＤＡのみで前免疫されたラットからのＰＬＮＣは、ペプチド１７６−１９０（ＡＡに関連する１８０−１８８エピトープを含有している）に対して有意な応答を示したが、確定したｈｓｐ６５エピトープの他のいずれにも応答しなかった。個々のｈｓｐ６５ペプチドで前免疫されたラットからのＰＬＮＣは、すべて、増殖の程度には差があるけれども免疫ペプチドに対する応答を示した。かくして、ペプチド２１１−２２５および４４６−４６０による前免疫化は、強い応答を誘導したけれども、ペプチド２５６−２７０（ＡＡに対して防御した）による前免疫化は、限界的なＰＬＮＣ応答を誘
導したに過ぎなかった。ＡＡに関連するエピトープを含むペプチド１７６−１９０に対する応答は、１つの例外はあったがすべてのＰＬＮＣ集団（そして１７６−１９０による前免疫化後、増加した）において見出だされた。ペプチド２５６−２７０による前免疫化によってＡＡを防御されたラットからのＰＬＮＣは、１７６−１９０に対する応答の完全欠如を示した。
【００６２】
交差反応性２５６−２６５エピトープに特異的なＴ細胞株の投与は、ＡＡに対する防御を与える。
ＡＡに及ぼすエピトープに特異的なＴ細胞株の影響が、試験された(図１７）。Ｔ細胞株は、ＡＡ誘導のためのＭｔと同時にラットに投与された（１ラット当たり５ｘ１０６Ｔ細胞を尾静脈にｉ．ｖ．注射）。２回の実験において、２５６−２６５エピトープを認識する細胞株Ｈ．５２の投与は、明らかに、ＰＢＳを注射されている対照動物に比較してＡＡの重篤度を低下した。Ｔ細胞株Ｈ．３６，Ｈ．４３およびＨ．４６（それぞれエピトープ１８０−１８８、２１６−２２５および２２６−２３５に特異的）もまた試験されたが、ＡＡ発症に有意な効果をもたなかった。細胞株Ｈ．５２の防御効果が、細胞株のイン・ビトロ再刺激から持ち込まれた残存している２５６−２７０ペプチドの投与の結果ではないことを確認するために、細胞株Ｈ．４６が、ペプチド２５６−２７０  １０μｇ／ｍｌの存在下で特異的ペプチド（２２６−２４０）を用いて再刺激された。得られる２２６−２３５に特異的なＴ細胞芽球の投与は、ＡＡを防御できなかった。
【００６３】
ペプチド２５６−２７０による前免疫化は、また、ＣＰ２０９６１に誘導される関節炎に対して予防接種する。
ＡＡを強く防御する唯一のｈｓｐ６５ペプチドは、ラットｈｓｐ６０の対応する配列に対するＴ細胞反応性を誘導した２５６−２７０であることが発見された。この発見は、自己反応性Ｔ細胞が、関節炎に対するｈｓｐ６５で誘導される防御を説明することを示唆した。次に、この機構が、他の化合物によって誘導され、ミコバクテリアの使用によらない関節炎を防御するよう期待されるであろう。それ故、ペプチド２５６−２７０の、ＣＰ２０９６１に誘導されるモデルにおける防御の誘導能が試験された。ＣＰ２０９６１は、リポイド系アミンであるので、この関節炎原性調製物が、ｈｓｐ６５の２５６−２７０との潜在的交差反応性をもつ抗原成分を含む可能性はない。ｈｓｐ６５の２５６−２７０による前免疫化は、ＣＰ２０９６１に誘導される関節炎に対して強力にラットを防御したが、対照ペプチド（ｈｓｐ６５の２１１−２２５）は防御しなかった（図１８）。かくして、ｈｓｐ６５・２５６−２７０による前免疫化は、ＡＡおよびＣＰ２０９６１に誘導される関節炎（多分、関節炎原性接種物の成分としてのミコバクテリアの投与によらない機構をへる）を防御できる。
【００６４】
ラットｈｓｐ６０（２５６−２７０）は、関節炎に対して予防接種できない。
ＡＡに対する防御を与えるｈｓｐ６５・２５６−２７０およびこのペプチドに特異的なＴ細胞による前免疫化は、また、ラットのｈｓｐ６０・２５６−２７０配列に基づく高度に相同なペプチドに応答したので、ラットのペプチドが、同様の防御効果について試験された（図１９）。防御は、ミコバクテリアｈｓｐ６５・２５６−２７０による前免疫化後に観察されたが、ラットｈｓｐ６０・２５６−２７０によっては観察されなかった。この差異に関する説明は、ラットｈｓｐ６０・２５６−２７０による前免疫化が、適当なＴ細胞応答を初期感作しないからであろう。このことを探究するために、本発明者らは、ラット２５６−２７０（Ｒ．２５６−２７０）で免疫されたＰＬＮＣからペプチドに特異的なＴ細胞株を生成し、そしてこの細胞株の応答と、ミコバクテリア２５６−２７０（Ｍ．２５６−２７０）で免疫されたＰＬＮＣからの細胞株の応答とを比較した（図２０）。Ｍ．２５６−２７０に対して生成された細胞株は、Ｍ．２５６−２７０、Ｍ．２５１−２６５およびより短い「コア」ペプチドＭ．２５６−２６５を表すペプチドに応答し、そしてＲ．２５６−２７０および（弱く）Ｒ．２５６−２６５と交差反応した。これに対して、Ｒ
．２５６−２７０に対して生成された細胞株は、Ｒ．２５６−２７０には応答したが、Ｍ．２５６−２７０またはＲ．２５６−２６５およびＭ．２５６−２６５には応答しなかった。また、この細胞株が、ＡＰＣのみに高い「自己反応性」応答を示したことは、ＡＰＣが、既に自己ｈｓｐ６０エピトープを発現していたことを示唆する。
【００６５】
かくして、Ｍ．２５６−２７０による免疫化は、Ｒ．２５６−２７０と交差反応するＴ細胞応答を初期感作したが、Ｒ．２５６−２７０による免疫化は、Ｍ．２５６−２７０と交差反応しないラットに特異的なＴ細胞応答を初期感作した。Ｒ．２５６−２７０に特異的な細胞株が、Ｒ．２５１−２６５またはＲ．２５６−２６５に応答しなかったという事実は、Ｒ．２５６−２７０の５個のＣ−末端残基の１個以上が、この細胞株の刺激に重要であることを示唆する。これらの５個の残基のどれも、ミコバクテリアの配列と同一性を持ち合わせておらず、これが、多分、Ｍ．２５６−２７０に対する応答性の欠如を説明するであろう。
【００６６】
さらにまた、抗ＭＨＣｍＡｂを用いて、Ｍ．２５６−２７０およびＲ．２５６−２７０に対して生成されたＴ細胞株は、異なるＭＨＣ−限定をもつことが分かった。Ｍ．２５６−２７０に特異的な細胞株のペプチド誘導増殖は、ＯＸ６抗ＲＴ１．ＢｍＡｂによって阻害されたが、一方、Ｒ．２５６−２７０に特異的な細胞株は、ＯＸ１７抗ＲＴ１．ＤｍＡｂによって阻害された。
【００６７】
【表１】
2007000147.tif 000002
脚注
１．  各細胞株を生成するために使用されたｈｓｐ６５ペプチドの配列が示めされる：
それらは、配列番号：１の指摘部分に対応する。重複するペプチドに対する応答によって決定されたコアエピトープは、下線の残基によって表される。ラットｈｓｐ６０の対応する配列と同一性を共有する残基は、太字で示される。
種々の免疫化および再刺激操作によるエピトープの異なる認識が総括される。
−      無応答
＋      弱い応答
＋＋＋  強力な応答
２．  この欄の＋および−は、ペプチドに特異的なＴ細胞株が、ｈｓｐ６５−ＰＬＮＣから生成されたか否かを指す。
【００６８】
表ＩＩ
ｈｓｐ６５ペプチドを用いる免疫化によるＴ細胞応答
ラットは、各ｈｓｐ６５エピトープを含む合成ペプチドを用いて免疫された（１ラット当たり１００μｇペプチド／ＤＤＡ）。１０日後、ＰＬＮＣが、単離され、重複しているペプチド（２０μｇ／ｍｌ）に対する応答について試験された。ペプチドに特異的なＴ細胞株は、免疫ペプチドによるＰＬＮＣのイン・ビトロでのバルク刺激によって生成された。すべてのＰＬＮＣおよびＴ細胞株が、２０μｇ／ｍｌのｈｓｐ６５に対して有意な応答を示した。結果は、３並列培養の平均ｃｐｍとして表される。全ＳＥＭが、２０％未満であった。
【００６９】
【表２】
2007000147.tif 000003
表ＩＩＩ
熱ショックＡＰＣによるｈｓｐ６５（２５６−２７０）に特異的なＴ細胞の刺激
Ｔ細胞株（２ｘ１０４／ウェル）が、照射前に３７℃か４２℃のいずれかで１時間インキュベートされたＡＰＣ（２ｘ１０５／ウェル）とともに培養された。細胞は、Ａｇ（１０μｇ／ｍｌ）としての特異的ペプチドの存在または不在下で培養された。非交差反応性
ミコバクテリアｈｓｐ６５の独特エピトープ２１１−２２５に特異的な細胞株Ｈ．４６が、対照として使用された。結果は、３並列培養の平均ｃｐｍとして表される。全ＳＥＭが、２０％未満であった。
【００７０】
【表３】
2007000147.tif 000004
考察
ＩＦＡ中の熱殺菌ＭｔによるＬｅｗｉｓラットの免疫化が、ＡＡを誘導する（１）ことが、ミコバクテリアｈｓｐ６５の残基１８０−１８８に対するＴ細胞応答に関連することが報告された（５）。反対に、ｈｓｐ６５による免疫化は、まだ未解明のＴ細胞仲介機構によって、続いてのＡＡを誘導する試みに対して防御する（５，６）。ＬｅｗｉｓラットＴ細胞によって認識されるｈｓｐ６５内のエピトープは、この明細書において同定された。Ｍｔかｈｓｐ６５のいずれかによる免疫化に続く、Ｔ細胞集団中のこれらのエピトープに対する応答性が比較された。
【００７１】
組み換えミコバクテリアｈｓｐ６５によるラットの免疫化は、ｈｓｐ６５のＭＨＣクラスＩＩ（ＲＴ１．Ｂ１）−限定認識を初期感作した。完全なｈｓｐ６５配列をカバーしている重複ペプチドに対するｈｓｐ６５−ＰＬＮＣ応答の解析は、７種のＴ細胞エピトープを同定した。ｈｓｐ６５による単回のイン・ビトロ再刺激に続いて、２種のさらなるエピトープが同定された。かくして、ＬｅｗｉｓラットＴ細胞は、ミコバクテリアｈｓｐ６５中の９種のエピトープを認識する。
【００７２】
ＩＦＡ中に懸濁されたＭｔによる免疫化（ＡＡ誘導操作に使用されたように）は、ｈｓｐ６５ペプチドに対するＰＬＮＣ応答を初期感作しなかった。しかしながら、Ｍｔ／ＤＤＡ免疫化は、ｈｓｐ６５ペプチドに対する有意な応答を誘導した。重要なことは、ＡＡが、Ｍｔ／ＩＦＡ免疫化に続いてのみ発症し、そしてＭｔ／ＤＤＡ免疫化後には発症しないことである（Ｓ．Ｍ．Ａ，未発表観察）。かくして、ＤＤＡがアジュバントとして使用される場合の、ｈｓｐ６５に特異的なＴ細胞の活性化増進が、この違いを説明するかもしれない。Ｍｔ／ＩＦＡおよびＭｔ／ＤＤＡで免疫されたラットからのＴ細胞は、ｈｓｐ６５によるイン・ビトロの再刺激後は、同一の応答パターンを示したので、これは、Ｍｔ／ＩＦＡが、比較的低レベルではあるがｈｓｐ６５のＴ細胞認識を初期感作することを示唆している。
【００７３】
ｈｓｐ６５エピトープの強さのパターンは、ｈｓｐ６５またはＭｔ全体による免疫化により異なった。ｈｓｐ６５免疫化は、３種の共に強力なエピトープ：１７６−１９０、２１６−２２５および２２６−２３５をもたらした。Ｍｔ免疫化の後は、エピトープ１７６−１９０が、エピトープ２１６−２２５とともに強力であるように現れ、そして２２６−２３５は、２５６−２６５および５１１−５２０とともに弱かった。１７６−１９０エピトープの強さは、Ｍｔ−ＰＬＮＣが、Ｍｔ  Ｈｓｐ６５により再刺激された時に、より一
層顕著であったが、Ｍｔ免疫化は、エピトープ８６−１００および３９６−４１０に対する応答を初期感作しなかった。
【００７４】
本発明者らは、同定された９種のエピトープの８種について特異的なαβＴＣＲ＋ＣＤ４＋，ＲＴ１．Ｂ１−限定Ｔ細胞株を生成した。これらの８種のＴ細胞株の２種、Ｈ．３６およびＨ．４６（それぞれ１７６−１９０および２２６−２３５を認識する）は、Ｍｔに対して強く応答したが、一方その他は、比較的弱く応答した。このことは、Ｍｔによる免疫化の後の強力な１７６−１９０と両立する。Ｍｔ調製物中に存在する比較的少量のｈｓｐ６５が、ＭＨＣクラスＩＩ分子に高い親和力をもつｈｓｐ６５エピトープへのＴ細胞応答の集中をもたらすのであろう。他のＡｇ特異性をもつＴ細胞株の増殖を阻害すべき、ｈｓｐ６５エピトープを含むペプチドの能力を試験する予備実験は、ペプチド１７６−１９０が、ペプチド２１１−２２５または２２６−２４０よりもＲＴ１．Ｂ１分子に対して高い親和力をもつかもしれないことを示唆する（データ未掲載）。かくして、Ａｇ濃度が、限定される場合（すなわち、Ｍｔ免疫化の後）には、Ｔ細胞エピトープの強さは、それらの相対的ＭＨＣ結合親和力に、より一層依存するであろうが、実際は、大量の特異抗原（１ラット当たり５０〜１００μｇｈｓｐ６５）による免疫化の後は、相対的な強さは、簡単に、ＭＨＣに対する親和力の作用とは言えないであろう。明らかに、無傷のｈｓｐ６５分子の抗原プロセッシングは、イン・ビボでの初期感作の間に生成されるペプチド断片を決定するであろうし、そして天然にプロセッシングされた断片は、本研究で使用された合成１５量体と同一ではないであろう。また、ｈｓｐ６５の分子的背景（すなわち、組み換え単量体ｈｓｐ６５か、またはＭｔ調製物中の多量体の生来のタンパク質か）は、抗原プロセッシングに影響するし、またエピトープ認識のパターンに影響するであろう。
【００７５】
重要なことは、Ｍｔ免疫化に続く強力なｈｓｐ６５エピトープ、１７６−１９０は、関節炎原性のＴ細胞クローンＡ２ｂによって認識されると既に報告された１８０−１８８を含有している。したがって、ＡＡ誘導操作は、ＡＡに関連するエピトープに対してゆがめられたＴ細胞応答をもたらす。ＰＬＮＣ応答では、より長い１７６−１９０ペプチドは、最小の１８０−１８８ペプチドより強い増殖応答を誘導した。これは、以前の研究が、１８０−１８８に対するポリクローナル応答を解析していた（７，２２）ので、意味のある発見である。ＭＨＣクラスＩＩ分子の結合グルーブに見いだされる天然にプロセッシングされたペプチドの長さは、１３〜２５個のアミノ酸として記載されている（２３，２４）。かくして、９量体１８０−１８８と比較して、ＲＴ１．Ｂ１分子と１５量体１７６−１９０とのより安定な相互作用は、刺激活性の増強を説明できるであろう。
【００７６】
本研究で定義された９種のｈｓｐ６５Ｔ細胞エピトープのうち、１種は、ラットｈｓｐ６０と交差反応性であった。いかなるラットｈｓｐ６０ペプチドに対する有意な応答も、ｈｓｐ６５かＭｔのいずれかによる免疫化後のＰＬＮＣレベルにおいて観察されなかったけれども、２５６−２６５エピトープに特異的なＴ細胞株Ｈ．５２は、対応するラットｈｓｐ６０ペプチドに応答した。したがって、この領域は、７個の同一残基および他の３つの位置における保存置換によって高度に保存される(ミコバクテリア：ＡＬＳＴＬＶＶＮＫＩ、ラット:ＡＬＳＴＬＶＬＮＲＬ)。領域２４３−２６５は、１８／２３同一残基および５つの保存置換をもつミコバクテリアと哺乳動物のｈｓｐ６０の間で高度な同一性を示す(１１）。
【００７７】
本発見は、関節炎の実験モデルにおいて、ｈｓｐ６５による前免疫化のＴ細胞に仲介される防御効果への重要な洞察を提供するが、それには３つの可能性あるメカニズムが提案された。第１には、以前のデータは、ｈｓｐ６５による前免疫化が、ＡＡに関連する１８０−１８８エピトープに対する応答を下方制御するであろうことを示唆した（２２）。１７６−１９０は、ｈｓｐ６５免疫化の後では共に強力なエピトープであるので、本研究の結果は、このことを指示しない。
【００７８】
第２には、前免疫化後のＴ細胞（１種以上のｈｓｐ６５エピトープを認識する）の活性化の増大は、続いてのチャレンジにおいてＡＡが発症する前に、Ｍｔのより有効な認識とクリアランスをもたらすであろう。ｈｓｐ６５による免疫化が、Ｍｔによる免疫化に比べて（認識されるエピトープ数および応答の大きさという両観点で）、ｈｓｐ６５エピトープ認識の改良をもたらすことが分かった。これらの相異は、そのような防御機構のための基礎を形成するであろう。
【００７９】
ミコバクテリアｈｓｐ６５と哺乳動物ｈｓｐ６０の間で観察されるエピトープのＴ細胞認識の報告（１４−１７）は、ｈｓｐ６５による前免疫化が、交差反応性エピトープを認識するＴ細胞を活性化するという第３の仮説に導いた（１６）。関節内の炎症の間に上方制御された後の自己ｈｓｐ６０の認識が、次に、炎症過程を制御し、慢性的関節炎の発症を防ぐのであろう。もし、この仮説が正しければ、関連するＴ細胞エピトープ（Ｌｅｗｉｓラットを用いるモデルでは）は、残基２５６−２６５でなければならない。何故ならば、これは、ｈｓｐ６５免疫化後に認識される唯一の交差反応性エピトープであるからである。興味あることには、エピトープ２５６−２６５は、Ｍｔ／ＩＦＡ免疫化によっては、わずかに認識されるだけであった。また、細胞株Ｈ．５２は、Ｍｔには弱く応答した。それ故、ＡＡ誘導操作は、このエピトープに特異的なＴ細胞を活性化することにあまり働かない。
【００８０】
ｈｓｐ６５による前免疫化は、ＡＡのみならず、ミコバクテリアなしで誘導される関節炎（６−１０）、そしていかなる外因性タンパク質の添加なしに、プリスタン（１０）およびＣＰ２０９６１（６）に誘導される関節炎においても防御をする。それ故、これらのモデルにおける病原性メカニズムは多分異なるであろうが、すべてが、ｈｓｐ６５による前免疫化によって防ぐことができる。このことを考えると、Ｍｔ全体の認識を必要としないが、ミコバクテリアｈｓｐ６５とラットｈｓｐ６０の交差反応性Ｔ細胞認識を必要とする仮説は、使用される関節炎原性薬剤とは無関係な単一メカニズムによって説明できる防御として、もっとも魅力的であるように見える。自己ｈｓｐ６０のＴ細胞認識もまた、ヒト関節炎症状への抵抗性に関連するであろう。自己ｈｓｐ６０に対するＴ細胞反応性は、ＲＡ（２５）およびＪＣＡ（２６）をもつ患者において報告されてきた。この興味ある進展は、本研究のＨ．５２Ｔ細胞株によって認識される高度に保存された領域（２４３−２６５）中の交差反応性エピトープを認識した、ＪＣＡ患者からの２種のＣＤ４＋Ｔ細胞クローンについての報告であり、そしてその供与患者が、病気からの回復をもったという報告であった（１７）。また、自己ｈｓｐ６０のこの領域中のエピトープも、健康なヒト供与体からのＣＤ４＋ＣＴＬによって認識された（１４）。
【００８１】
ｈｓｐ６５に対するＴ細胞反応性が、防御機構に関与していると信じられる。ラットは、ＭｔによるＡＡ誘導の前７日に、各エピトープを含む合成ペプチドを用いて前免疫された。このアプローチは、ペプチド２５６−２７０によって前免疫されたラットにおける衝撃的防御効果に導いた。試験された他のペプチドのいずれも、ＡＡ発症には何の影響も示さなかった。初めてｈｓｐ６５による免疫ラットから生成され、そしてエピトープ２５６−２６５に特異的なＴ細胞株Ｈ．５２もまた、Ｍｔ投与時にｉ．ｖ．注射された場合、ＡＡ発症に防御効果を示した。細胞株Ｈ．５２の接種は、ＡＡに対する完全な防御を誘導しなかったが、関節炎の重篤度を明らかに低下させた。Ｈ．５２によって示される低速度の成長に応じて実施された本研究において移植された少数の細胞（他の研究における５ｘ１０７〜１０８と比較して５ｘ１０６）は、完全な防御効果を誘導するには不十分だったであろう。
【００８２】
ペプチド１７６−１９０（ＡＡに関連する１８０−１８８エピトープを含む）による前免疫化が、ＡＡ発症に何の効果ももたなかったという発見は、ペプチド１８０−１８８に
よる前免疫化が、ＡＡに対する効果的防御を誘導するというこれまでの報告とは逆である。この違いの可能な説明は、採用された異なる前免疫化の方法にある。本発明者らは、アジュバントとしてＤＤＡを用いて、Ｍｔ免疫化７日前に足しょにペプチドで免疫したが、一方、以前の研究は、３５、２０および５日前のＩＦＡ中ペプチドによりｉ．ｐ．で免疫した。ＩＦＡ中のペプチドによるｉ．ｐ．免疫化は、エピトープに特異的なＴ細胞寛容を誘導するために使用されたけれども、このアプローチは、ナイーブ（ｎａｉｖｅ）ラットに防御を伝達できる１８０−１８８に特異的なＴ細胞を誘導すると報告された。これらの知見は、再現できなかった。
【００８３】
Ｍｔ免疫化の時点で１８０−１８８に特異的なＴ細胞株Ｈ．３６を投与することによる防御効果は見いだされなかった。これは、１８０−１８８による免疫ラットからの脾臓Ｔ細胞または１８０−１８８に特異的なＴ細胞株Ａ２およびＡ２ｃを移植することによる、これまでに報告された防御効果とは異なる。それ故、Ｈ．３６の移植は、ＡＡの重篤度を増進しないし、そして本発明者らは、照射ラットにおける細胞株のＡＡ誘導能を試験しなかったけれども、Ｈ．３６は、防御活性よりもむしろＡＡ誘導活性をもつ「Ａ２ｃ様」細胞株であろう。あるいはまた、本研究において移植された低い細胞数は、再び、防御効果を誘導するには十分ではなかったのであろう。
【００８４】
細胞株Ｈ．５２は、ラットｈｓｐ６０の２５６−２７０配列を認識することが示された。同様に、ペプチド２５６−２７０（ペプチド免疫化１０日後のラット、およびＭｔ投与４２日後の防御されたラットの両方から生成された）により免疫されたラットから得られた短期Ｔ細胞株は、対応するラットｈｓｐ６０ペプチドに応答した。また、これらの細胞株は、熱ショックＡＰＣに対する小さいが有意な応答を示したことは、内因性の自己ｈｓｐ６０エピトープが、ｈｓｐ６０レベルが上方制御された場合に、Ｔ細胞認識のためにＭＨＣクラスＩＩと共同して提示されることを示している。
【００８５】
かくして，ミコバクテリアｈｓｐ６５の２５６−２７０による免疫化は、ＡＡ発症を防御し、そしてラットｈｓｐ６０中に共有されるエピトープに応答できるＴ細胞を活性化した。この知見は、ｈｓｐ６５による前免疫化がＬｅｗｉｓラットを関節炎から防御するメカニズムが、ラットｈｓｐ６０と共有されるエピトープを認識するＴ細胞の活性化に基づいているという仮説に対する支持を与える。次いで、炎症部位（関節）において、ＭＨＣクラスＩＩを発現している細胞によって提示される高いレベルの自己エピトープを、これらのＴ細胞が認識することは、炎症過程の制御に関する抗原に特異的なメカニズムを提供するであろう。このメカニズムは、ミコバクテリア成分を認識すべき「防御性」Ｔ細胞を必要とせず、それ故、細菌由来の関節炎原を用いないモデルに対する、ｈｓｐ６５に誘導される抵抗性を説明するための魅力的な単一メカニズムを提供する。Ｌｅｗｉｓラットにおけるもっとも注目されるこれらのモデルは、ＣＰ２０９６１により誘導されるモデルであって、ＣＰ２０９６１は、リポイド系アミンであり、そのためにｈｓｐ６５との可能性ある抗原交差反応性をもたない。事実、ペプチド２５６−２７０は、ＣＰ２０９６１に誘導されるモデルに対して防御を与えることが発見された。
【００８６】
ラット２５６−２７０による前免疫化は、ＡＡを防御することができなかった。Ｍ．２５６−２７０およびＲ．２５６−２７０によって免疫されたラットから得られたＴ細胞株は、２種の別個のエピトープを認識した。Ｍ．２５６−２７０による免疫化は、交差反応性のコアエピトープ２５６−２６５に特異的なＲＴ１．Ｂ１−限定Ｔ細胞を誘導した。Ｒ．２５６−２７０による免疫化は、ラットに独特なコアエピトープ２６１−２７０に特異的なＲＴ１．Ｄ１−限定Ｔ細胞を誘導した。かくして、ここで観察された防御効果は、ＲＴ１．Ｂ１と共同して２５６−２６５エピトープのＴ細胞認識を必要とした。Ｍ．２５６−２７０免疫化後のＲ．２５６−２７０に対する相対的に弱い応答は、Ｒ．２５６−２７０、ＲＴ１．Ｂ１およびＴＣＲの３分子相互作用が、相対的に低い親和力をもっていたこ
とを示唆する。Ｒ．２５６−２７０に特異的なＴ細胞株の強い増殖応答は、Ｒ．２５６−２７０、ＲＴ１．Ｄ１、ＴＣＲ相互作用が、高い親和力をもっているであろうことを示唆する。ラットに独特なＲ．２６１−２７０エピトープは、潜在性であろう（すなわち、ＡＰＣによる内因性ｈｓｐ６０のプロセッシングの後、ＭＨＣクラスＩＩとともに発現されず、それ故、潜在的防御性のＴ細胞による認識には利用されない）。もしそうであれば、このエピトープに高い親和力をもつＴ細胞は、胸腺においてネガティブには選択されないし、そしてＲ．２５６−２７０による免疫化後のＴ細胞応答を増強して、防御性の２５６−２６５エピトープに対する効果的応答の発生を防ぐであろう。もし、２つの相互作用の異なる親和力が、Ｒ．２５６−２７０に対するＲＴ１．Ｂ１よりも高い結合親和力をもつＲＴ１．Ｄ１から得られるならば、「決定基捕捉（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｃａｐｔｕｒｅ）」（Deng et al., J. Exp. Med. 178: 1675-1680）の形式が、この効果を説明できるであろう。Ｒ．２５６−２７０とＭ．２５６−２７０に対する両方のＭＨＣクラスＩＩ分子の結合親和力の解析が、これを明らかにするであろう。かくして、治療上の応用は、内因的にプロセッシングされた自己ｈｓｐ６０に対する相対的に低い親和力の交差反応性応答を誘導する、細菌のｈｓｐ６０エピトープの使用を要求するかもしれない。天然にプロセッシングされた内因性ｈｓｐ６０のエピトープに対する応答は、胸腺選択および末梢寛容という正常なメカニズムによって調節されるであろうから、合成ペプチドとして投与された場合強く免疫原性となる自己ｈｓｐ６０エピトープはいずれも、十分に潜在性であるかもしれない。
【００８７】
本発明の主要な態様は、次のとおりである。
１：保存された哺乳動物のストレスタンパク質相同体をもつ微生物タンパク質のアミノ酸配列の一部分に対応するペプチドであって、微生物と哺乳動物の相同体間の全アミノ酸配列の同一性が少なくとも２５％であり、少なくとも７５個の連続するアミノ酸の領域の微生物と哺乳動物の相同体間の配列の同一性が少なくとも４０％であり、該部分が、少なくとも５個のアミノ酸が、該ストレスタンパク質のＴ細胞エピトープにおける同じ相対的位置の対応するアミノ酸と同一である、５〜３０個のアミノ酸を含み、該エピトープおよび該部分が、対応する哺乳動物のストレスタンパク質アミノ酸と同一である少なくとも４個の連続するアミノ酸を含む、ペプチド。
２：微生物と哺乳動物の相同体間の全アミノ酸配列の同一性が少なくとも４０％であり、そして少なくとも７５個の連続するアミノ酸の領域の微生物と哺乳動物の相同体間の配列の同一性が少なくとも５０％である、上記１記載のペプチド。
３：該ストレスタンパク質が、熱ショックタンパク質およびストレスに誘導される酵素から選ばれる、上記１または２記載のペプチド。
４：該熱ショックタンパク質が、配列番号：１に示されるミコバクテリウム・ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の熱ショックタンパク質ｈｓｐ６５（Ｍ．ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧの熱ショックタンパク質と同一）である、上記３記載のペプチド。
５：ペプチドが、配列番号：１の配列８１−１００および２４１−２７０の１つにおいて、同じ相対的位置の対応するアミノ酸と同一である少なくとも５個のアミノ酸を含む、上記４記載のペプチド。
６：ペプチドが、配列番号：１の配列８４−９５および２５６−２６５の１つにおいて、同じ相対的位置の対応するアミノ酸と同一である少なくとも５個のアミノ酸を含む、上記５記載のペプチド。
７：該部分が、エピトープが、対応する哺乳動物のストレスタンパク質アミノ酸と同一である少なくとも３個未満、特に４個未満の連続するアミノ酸を含む、該ストレスタンパク質のＴ細胞エピトープに対応する５〜５０個のアミノ酸の１つ以上の切片を含まない、上記１〜６のいずれか１つに記載のペプチド。
８：アミノ酸残基の１個以上が、類似のサイズ、電荷および極性をもつアミノ酸の残基によるか、または１つ以上の骨格の改変において得られるアミノ酸疑似体により置換されている、上記１〜７のいずれか１つに記載のペプチド。
９：上記１〜８のいずれか１つに記載のペプチドを生産する方法であって、次の段階：
ａ）微生物と哺乳動物の相同体間の全アミノ酸配列の同一性が、少なくとも２５％であり、そして少なくとも７５個の連続するアミノ酸の領域の微生物と哺乳動物の相同体間の配列同一性が、少なくとも３０％である、保存された哺乳動物ストレスタンパク質相同体をもつ微生物タンパク質を選択すること；
ｂ）少なくとも５個のアミノ酸が、該ストレスタンパク質における同じ相対的位置の対応するアミノ酸と同一である少なくとも５〜３０個のアミノ酸を含み、該ストレスタンパク質の少なくとも４個の連続するアミノ酸のある列が、選択された微生物タンパク質のアミノ酸のある列および哺乳動物ストレスタンパク質のアミノ酸の対応する列の両方と同一である、ペプチドを調製すること；
ｃ）調製されたペプチドを、Ｔ細胞エピトープの存在についてスクリーニングすること、を含む方法。
１０：上記１〜７のいずれか１つに記載のペプチドをコードしているヌクレオチド。
１１：上記１〜７のいずれか１つに記載のペプチドを発現することができる発現系。
１２：上記１１記載の発現系を含む微生物または真核細胞。
１３：上記１〜８のいずれか１つに記載のペプチドを用いる免疫刺激によって活性化された、Ｔ細胞またはそれからＴ細胞レセプターを発現している細胞。
１４：上記１〜９のいずれか１つに記載のペプチドに対して産生された抗体。
１５：上記１〜８のいずれか１つに記載のペプチド、上記１０記載のヌクレオチド配列、上記１１記載の発現系、上記１２または１３記載の細胞、または上記１４記載の抗体を含有する、自己免疫疾患、例えば糖尿病、関節炎疾患、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症および重症性筋無力症を含む炎症性疾患の治療または予防のために適切な医薬組成物。
１６：上記１〜８のいずれか１つに記載のペプチドまたは上記１４記載の抗体を含有する、自己免疫病を含む炎症性疾患を検出するために適切な診断組成物。
【００８８】
【表４】
2007000147.tif 000005
【００８９】
【表５】
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【００９０】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】Ｍｔもしくはｈｓｐ６５による免疫化は、ｈｓｐ６５のＴ細胞認識を初期感作する。ｈｓｐ６５、Ｍｔ／ＩＦＡもしくはＭｔ／ＤＤＡにより免疫されたラットからの１０日目のＰＬＮＣが、ｈｓｐ６５、ＰＰＤおよびＭｔに対して広い濃度範囲（２０μｇ／ｍｌ、ここに示されるように最大応答を与えた）にわたって試験された。非免疫脾細胞およびＰＢＳ／ＤＤＡにより免疫されたラットからのＰＬＮＣが、ネガティブ対照として使用された（ＩＦＡによる免疫ラットからのＰＬＮＣは、ＰＢＳ／ＤＤＡ−ＰＬＮＣと同じ応答パターンを示した）。すべてのＳ．Ｅ．Ｍ．は、２０％未満であった。
【図２】抗ｈｓｐ６５ＰＬＮＣ応答の抗ＭＨＣｍＡｂ阻害。１０日目のｈｓｐ６５−ＰＬＮＣが、ＲＴ１．Ｂ（ＯＸ６）、ＲＴ１．Ｄ（ＯＸ１７）およびＲＴ１．Ａ（ＯＸ１８）に特異的なｍＡｂ１０μｇ／ｍｌの存在下で、一定範囲のｈｓｐ６５用量とともに培養された。抗ｃｍｐ＝ＵＤ１５抗クロラムフェニコール、イソタイプの対照抗体。すべてのＳ．Ｅ．Ｍ．は、２０％未満であった。
【図３】ｈｓｐ６５による免疫化に続くミコバクテリアｈｓｐ６５ペプチドに対する応答。ｈｓｐ６５ペプチドの完全パネルに対する応答が、１０日目のｈｓｐ６５−ＰＬＮＣ。ｈｓｐ６５、ＰＰＤおよびＭｔ（２０μｇ／ｍｌ）に対する応答は、６０，０００ｃｐｍを超えていた。重複しているペプチドが、刺激性である場合には、より強い応答を与えるペプチドが同定された。この実験の結果は、３回のさらなる実験において再現された。すべてのＳ．Ｅ．Ｍ．は、２０％未満であった。
【図４】ｈｓｐ６５による免疫化に続くミコバクテリアｈｓｐ６５ペプチドに対する応答。図３と、同じｈｓｐ６５−ＰＬＮＣ集団から生成されたｈｓｐ６５に特異的なＴ細胞株を用いて解析された。ペプチドは、５および２０μｇ／ｍｌにおいて試験された（２０μｇ／ｍｌがここで示される）。ｈｓｐ６５、ＰＰＤおよびＭｔ（２０μｇ／ｍｌ）に対する応答は、すべて、１５０，０００ｃｐｍを超えていた。有意な応答を誘導するペプチドが、同定された。重複しているペプチドが、刺激性である場合には、より強い応答を与えるペプチドが同定された。この実験の結果は、３回のさらなる実験において再現された。すべてのＳ．Ｅ．Ｍ．は、２０％未満であった。
【図５】Ｍｔ全体による免疫化に続くミコバクテリアｈｓｐ６５ペプチドに対する応答。ｈｓｐ６５ペプチドの完全パネルに対する応答が、Ｍｔ／ＤＤＡによる免疫ラットからの１０日目のＰＬＮＣを用いて解析された。ペプチドは、５および２０μｇ／ｍｌにおいて試験された（２０μｇ／ｍｌがより強い応答を与え、ここで示される）。ｈｓｐ６５、ＰＰＤおよびＭｔ（２０μｇ／ｍｌ）に対する応答は、すべて、４０，０００ｃｐｍを超えていた。
【図６】Ｍｔ全体による免疫化に続くミコバクテリアｈｓｐ６５ペプチドに対する応答。ｈｓｐ６５かＭｔによる再刺激によってＭｔ／ＩＦＡ−ＰＬＮＣから生成されたＴ細胞株を用いて解析された。ペプチドは、５および２０μｇ／ｍｌにおいて試験された（２０μｇ／ｍｌがより強い応答を与え、ここで示される）。ｈｓｐ６５、ＰＰＤおよびＭｔ（２０μｇ／ｍｌ）に対する応答は、すべて、１５０，０００ｃｐｍを超えていた。有意な応答を誘導するペプチドが、強調された。すべてのＳ．Ｅ．Ｍ．は、２０％未満であった。
【図７】確定されたｈｓｐ６５エピトープに特異的なＴ細胞株の応答。Ｔ細胞株が、ラットｈｓｐ６０ペプチド、ｈｓｐ６５およびＭｔに対応する重複するｈｓｐ６５ペプチドに対する応答について、一定範囲のＡｇ濃度にわたって試験された（１０μｇ／ｍｌがここで示される）。すべての細胞株が、ＰＰＤに対して応答し、他のエピトープを含む対照ｈｓｐ６５ペプチドに対しては応答しなかった。すべてのＳ．Ｅ．Ｍ．は、２０％未満であった。
【図８】上記図７と同様。
【図９】上記図７と同様。
【図１０】上記図７と同様。
【図１１】Ｔ細胞株応答の抗ＭＨＣｍＡｂ阻害。エピトープ特異的およびｈｓｐ６５特異的なＴ細胞株が、ＲＴ１．Ｂ(ＯＸ６）、ＲＴ１．Ｄ（ＯＸ１７）およびＲＴ１．Ａ（ＯＸ１８）に特異的なｍＡｂ１０μｇ／ｍｌの存在下で、照射されたＡＰＣおよびＡｇ(エピトープに特異的な細胞株に対する特異的ペプチドまたはｈｓｐ６５に特異的な細胞株に対するｈｓｐ６５）１μｇ／ｍｌとともに培養された。抗ｃｍｐ＝ＵＤ１５抗クロラムフェニコール、イソタイプの対照抗体。すべてのＳ．Ｅ．Ｍ．は、２０％未満であった。
【図１２】ｈｓｐ６５ペプチドを用いる前免疫化によるＡＡ発症の変調。ラットは、尾の基部にｉ．ｄ．注射されるＩＦＡ  １００μｌ中Ｍｔ５ｍｇを用いるＡＡ誘導の７日前に、各合成ペプチド１００μｇまたはＤＤＡ中ＰＢＳを用いて、後足しょに免疫された。５匹のラットが、各々の前免疫化群において使用された。関節炎スコアは、Ｍｔ注射後８日から毎日評価された。
【図１３】上記図１２と同様。
【図１４】上記図１２と同様。
【図１５】上記図１２と同様。
【図１６】ペプチドで前免疫されたＡＡラットのＰＬＮＣ応答。ラットは、図１２〜１５において記載のように前免疫化そしてＭｔによる免疫化が行われた。ＰＬＮＣ（プールされた鼠径部および膝窩筋ＬＮ）は、Ｍｔ免疫後４２日に単離され、そして確定されたＴ細胞エピトープを含むｈｓｐ６５ペプチド（２０μｇ／ｍｌ）に対する応答を試験された。すべてのＰＬＮＣが、ｈｓｐ６５、Ｍｔに応答した（応答は、すべて５０，０００ｃｐｍを超えていた）。すべてのＳＥＭは、２０％未満であった。
【図１７】エピトープに特異的なＴ細胞株を用いるＡＡの変調。ラットは、尾の基部にｉ．ｄ．注射されるＩＦＡ  １００μｌ中Ｍｔ５ｍｇを用いるＡＡ誘導の時点に、ＰＢＳ中５ｘ１０６Ｔ細胞か、またはＰＢＳのみをｉ．ｖ．投与された。５匹のラットが、各群において使用された。関節炎スコアは、Ｍｔ注射後８日から毎日評価された。細胞株Ｈ．４６（２２６−２３５に特異的）およびＨ．５２（２５６−２６５に特異的）を用いる結果が示される。細胞株Ｈ．３６およびＨ．４３(それぞれ、エピトープ１８０−１８８および２１６−２２５に特異的）の注射は、ＡＡには有意な効果をもたなかった（データ未掲載）。
【図１８】ｈｓｐ６５ペプチドを用いる前免疫化によるＣＰ２０９６１誘導ＡＡの変調。ラットは、尾の基部にｉ．ｄ．注射される鉱油１００μｌ中ＣＰ２０９６１  ２ｍｇを用いるＡＡ誘導の７日前に、各合成ペプチド（２１１−２２５または２５６−２７０）１００μｇまたはＤＤＡ中ＰＢＳを用いて、後足しょに免疫された。５匹のラットが、各々の前免疫化群において使用された。関節炎スコアは、Ｍｔ注射後８日から毎日評価された。
【図１９】ラットｈｓｐ６０（２５６−２７０）による前免疫化は、ＡＡを防御しない。ラットは、尾の基部にｉ．ｄ．注射されるＩＦＡ１００μｌ中Ｍｔ５ｍｇを用いるＡＡ誘導の７日前に、各合成ペプチド１００μｇまたはＤＤＡ中ＰＢＳを用いて、後足しょに免疫された。５匹のラットが、各々の前免疫化群において使用された。関節炎スコアは、Ｍｔ注射後８日から毎日評価された。対照ペプチド（ｈｓｐ６５  ２１１−２２５）による前免疫化は、ＡＡ発症に何ら影響しなかった（データ未掲載）。
【図２０】ｈｓｐ６５（２５６−２７０）およびラットｈｓｐ６０(２５６−２７０）による免疫化は、別個のエピトープに対するＴ細胞株応答を初期感作する。ラットは、ＤＤＡ中Ｍ．２５６−２７０またはＲ．２５６−２７０のいずれかを用いて、後足しょに免疫された。７日後ＰＬＮＣが、単離され、そして免疫されたペプチドを用いてイン・ビトロで再刺激された。得られたＴ細胞株（Ｍ．２５６−２７０を認識する細胞株Ｐ．ｍ５２またはＲ．２５６−２７０を認識する細胞株Ｐ．ｒ５７）は、照射された同系の脾臓ＡＰＣの存在下で、ミコバクテリアおよびラットのペプチドに対する応答を試験された。すべてのＳＥＭは、２０％未満であった。
【図２１】単文字コードにおけるヒト、ラット、マウスおよびＭ．ボビス（Ｍ．Ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧ熱ショックタンパク質ｈｓｐ６５（ｈｓｐ６０）の多配列の整列。整列は、４種のタンパク質配列についてなされた。星印＊は、完全保存アミノ酸を示す。ドット・は、良好に保存された、すなわち同一ではないが類似のアミノ酸を示す。一致する長さ：  ５７３同一残基：      ２５４（４４．３％）類似残基：      ２１１（３６．８％）
【００９２】
整列のために使用された配列の説明
［１］Ｐ６０＄ＨＵＭＡＮ        サイズ：  ５７３残基
ＤＥ    ミトコンドリアマトリックス・タンパク質Ｐ１前駆体（Ｐ６０リンパ球タンパク質）（Ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ相同体）（ＨＵＣＨＡ６０）（熱ショックタンパク質６０）（ｈｓｐ６０）。
ＯＳ    ＨＵＭＡＮ(ホモ・サピエンス(Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ))。
［２］Ｐ６０＄ＲＡＴ            サイズ：  ５４７残基
ＤＥ    ミトコンドリアマトリックス・タンパク質Ｐ１（Ｐ６０リンパ球タンパク質）（Ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ相同体）（熱ショックタンパク質６０）（ｈｓｐ６０）。
ＯＳ    ＲＡＴ（ラタス・ノルベジクス（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））
［３］Ｐ６０＄ＭＯＵＳＥ        サイズ：  ５５５残基
ＤＥ    ミトコンドリアマトリックス・タンパク質Ｐ１前駆体（Ｐ６０リンパ球タンパク質）（Ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ相同体）（熱ショックタンパク質６０）（ｈｓｐ６０）（断片）。
ＯＳ    ＭＯＵＳＥ(マス・マスクルス(Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ))。［４］Ｐ６０＄Ｍ．ＴＵＢ        サイズ：  ５４０残基
ミコバクテリウム・ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）／ミコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧ  ｈｓｐ６０
【図２２】図２１に続く配列
【図２３】グリセルアルデヒド−３−デヒドロゲナーゼの核酸配列、それぞれBacillusstearothermophilus由来(上の配列)およびRattus norvegicus (Rat)由来(下の配列)を示す。図中、＋＋＋同一アミノ酸  ／Rat(182= 54.3%) ;+類似(同一でない)アミノ酸  ：Bcillus ／Ｒａｔ（１１５）
【図２４】図２３に続く配列
【図２５】図２４に続く配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年9月8日(2006.9.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
保存された哺乳動物のストレスタンパク質相同体をもつ微生物タンパク質のアミノ酸配列の一部分に対応するペプチドであって、微生物と哺乳動物の相同体間の全アミノ酸配列の同一性が少なくとも２５％であり、少なくとも７５個の連続するアミノ酸の領域の微生物と哺乳動物の相同体間の配列の同一性が少なくとも４０％であり、該部分が、少なくとも５個のアミノ酸が、該ストレスタンパク質のＴ細胞エピトープにおける同じ相対的位置の対応するアミノ酸と同一である、５〜３０個のアミノ酸を含み、該エピトープおよび該部分が、対応する哺乳動物のストレスタンパク質アミノ酸と同一である少なくとも４個の連続するアミノ酸を含む、ペプチド。
【請求項２】
請求項１記載のペプチドであって、微生物と哺乳動物の相同体間の全アミノ酸配列の同一性が少なくとも４０％であり、そして少なくとも７５個の連続するアミノ酸の領域の微生物と哺乳動物の相同体間の配列の同一性が少なくとも５０％である、上記ペプチド。
【請求項３】
請求項１または２記載のペプチドであって、該ストレスタンパク質が、熱ショックタンパク質およびストレスに誘導される酵素から選ばれる、上記ペプチド。
【請求項４】
請求項３記載のペプチドであって、該熱ショックタンパク質が、配列番号：１に示されるミコバクテリウム・ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の熱ショックタンパク質ｈｓｐ６５（Ｍ．ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧの熱ショックタンパク質と同一）である、上記ペプチド。
【請求項５】
請求項４記載のペプチドであって、配列番号：１の配列８１−１００および２４１−２７０の１つにおいて、同じ相対的位置の対応するアミノ酸と同一である少なくとも５個のアミノ酸を含む、上記ペプチド。
【請求項６】
請求項５記載のペプチドであって、配列番号：１の配列８４−９５および２５６−２６５の１つにおいて、同じ相対的位置の対応するアミノ酸と同一である少なくとも５個のアミノ酸を含む、上記ペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１つに記載のペプチドであって、該部分が該ストレスタンパク質のＴ細胞エピトープに対応する５〜５０個のアミノ酸の１つ以上の切片を含まず、かつ、該エピトープが、対応する哺乳動物のストレスタンパク質アミノ酸と同一である少なくとも３個未満、特に４個未満の連続するアミノ酸を含むものである、上記ペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１つに記載のペプチドであって、アミノ酸残基の１個以上が、類似のサイズ、電荷および極性をもつアミノ酸の残基によるか、または１つ以上の骨格の改変において得られるアミノ酸疑似体により置換されている、上記ペプチド。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１つに記載のペプチドをコードしているヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１つに記載のペプチドを発現することができる発現系。
【請求項１１】
請求項１０記載の発現系を含む微生物または真核細胞。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１つに記載のペプチドを用いる免疫刺激によって活性化された、Ｔ細胞またはそれからＴ細胞レセプターを発現している細胞。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか１つに記載のペプチドに対して産生された抗体。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１つに記載のペプチド、請求項９記載のヌクレオチド配列、請求項１０記載の発現系、請求項１１または１２記載の細胞、または請求項１３記載の抗体を含有する、自己免疫疾患の治療または予防用医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか１つに記載のペプチドまたは請求項１３記載の抗体を含有する、自己免疫病を含む炎症性疾患を検出するための診断組成物。