(57)【要約】【課題】  非植物由来の小胞体に局在するポリペプチドをコードする遺伝子を植物に導入し、発現させたときに、当該ポリペプチドが植物の小胞体に局在させることができるようなポリペプチドを提供することを課題とする。【解決手段】  CYP51ファミリー遺伝子のN末側のコード領域に融合させのキメラ遺伝子を構築することにより、小胞体に局在する非植物由来の酵素を、小胞体に輸送し、高効率で機能させることに成功した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号61で示される植物の小胞体又はミクロソームへの局在化シグナルペプチド、又は、
（２）配列番号61で示されるアミノ酸配列において数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、植物の小胞体又はミクロソームへの局在化シグナルペプチド活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
下記(a)又は（b）で表される植物の小胞体又はミクロソームへの局在化シグナルペプチドをコードする遺伝子。  
(a)配列番6１で示されるアミノ酸配列、又は配列番号61で示されるアミノ酸配列において数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、小胞体又はミクロソームへの局在化シグナルペプチド活性を有するポリペプチドポリペプチドをコードする塩基配列、
(b)配列番号62に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイスする塩基配列を有し、小胞体又はミクロソームへの局在化シグナルペプチド活性有するタンパク質をコードする塩基配列
【請求項３】
請求項２記載の小胞体又はミクロソームへの局在化シグナルペプチドをコードする遺伝子を用いることを特徴とする、非植物由来の小胞体又はミクロソームに局在化するポリペプチドをコードする遺伝子を植物で遺伝子組み替えにより発現する方法。
【請求項４】
植物がシロイヌナズナである請求項３記載の方法。
【請求項５】
非植物由来の小胞体又はミクロソームに局在化するポリペプチドが脂肪酸不飽和化酵素である請求項３又は４記載の方法。  
【請求項６】
請求項２記載の小胞体局在化シグナルペプチドをコードする遺伝子を用いることを特徴とする、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、ステロール類又はステロイド類の生合成及び／又は代謝に関わる非植物由来の酵素コードする遺伝子を植物に導入し、発現する方法。
【請求項７】
飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、ステロール類又はステロイド類の生合成及び／又は代謝に関わる非植物由来の酵素が非植物由来の脂肪酸不飽和化酵素である請求項６記載の方法。
【請求項８】
植物がシロイヌナズナである請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
（１）飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、ステロール類又はステロイド類の生合成及び／又は代謝に関わる非植物由来の酵素の活性を植物体内で上昇させる配列番号61で示されるシグナルペプチド、又は
（２）配列番号61で示されるアミノ酸配列において数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、非植物由来の飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、ステロール類又はステロイド類の生合成及び／又は代謝に関わる非植物由来の酵素の活性を植物体内で上昇させる活性を有するポリペプチド。
【請求項１０】
下記(a)又は（b）で表される、非植物由来の飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、ステロール類又はステロイド類の生合成及び／又は代謝に関わる非植物由来の酵素の活性を植物体内で上昇させる活性を有するポリペプチド。  
(a)配列番61で示されるアミノ酸配列、又は配列番号61で示されるアミノ酸配列において数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、非植物由来の飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、ステロール類又はステロイド類の生合成及び／又は代謝に関わる非植物由来の酵素の活性を植物体内で上昇させる活性を有するポリペプチド、並びに
(b)配列番号62に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイスする塩基配列を有し、非植物由来の飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、ステロール類又はステロイド類の生合成及び／又は代謝に関わる非植物由来の酵素の活性を植物体内で上昇させる活性を有するポリペプチド
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、植物の遺伝子組み換えの技術分野に関する。具体的には、本願発明は、植物において、遺伝子組み換え法で蛋白質を生産し、小胞体（ER、endoplasmic reticulum）又はミクロソームに局在化する方法に、及びそのための小胞体又はミクロソームヘの局在化シグナルに関する。
【背景技術】
【０００２】
植物分野での遺伝子組み換え技術の利用により、新規植物が育種、植物を用いた物質生産などもなされている。例えば、バチラス属に属する微生物が産生する殺昆虫製蛋白質を植物で産生させる耐昆虫性植物（特許文献1:特許第３２４３２３３号）、除草剤耐性を植物に与える遺伝子を導入した除草剤耐性植物（特許文献２：特許第２６１５０１３号）などが知られている。
【０００３】
また、翻訳されたポリペプチドの植物内の細胞小器官内への輸送についても研究されてきた。たとえば、クロロプラストへの輸送には、トランジットペプチドが必要とされ、Rubisco（ribulose-bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco) small subunit）を融合させることにクロロプラストへの輸送過程の解析がなされている。（非特許文献１：JBC  Vol.268  pp.4037-4042）
【０００４】
ミトコンドリアについても、ミトコンドリアゲノム上にコードされているタンパク質はごくわずかであり、その大部分は核ゲノムにコードされている。ほとんどの核ゲノムコードのミトコンドリアタンパク質のN末端には、ミトコンドリアでのタンパク質の機能には必要がなく、ミトコンドリアヘの輸送のみを決定づけているターゲッティング配列がある（非特許文献2:Schatz and Dobberstein (1996) Science 271:1519-1526）。
【０００５】
また、小胞体に局在する膜タンパク質には、小胞体局在化のジリジンシグナルがC末端側に存在することが知られている（非特許文献3：JBC  Vol.274,No.21,pp.15080-15084）。更に、P4501A1については、ミトコンドリア及び小胞体両者に移送されるところ、N末側の３３アミノ酸が小胞体へのターゲティングに必要で、引き続く12アミノ酸がミトコンドリアターゲティングに関与していると考えられている（非特許文献:JBC  Vol.274,no.34,pp24014-24022）。
【０００６】
【特許文献１】特許第３２４３２３３号
【特許文献２】特許第２６１５０１３号
【非特許文献１】非特許文献１：JBC  Vol. 268  pp.4037-4042
【非特許文献２】非特許文献2:Schatz and Dobberstein (1996) Science 271:1519-1526
【非特許文献３】非特許文献3：JBC  Vol.274,No.21,pp.15080-15084
【非特許文献４】非特許文献:JBC  Vol.274,no.34,pp24014-24022
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
植物は、微生物培養に比較し、大量の生物材料を産生することができるため植物を用いた遺伝子組み換え法による物質生産の重要性が今後ますます増加するものと予想されている。
【０００８】
植物には、微生物では存在しない細胞内小器官が存在し、遺伝子組み換えで発現されたポリペプチドは、所定の細胞内小器官に輸送され初めて、当該ポリペプチドの機能・活性を示すものも多いと考えられている。
【０００９】
また、不飽和脂肪酸など植物での産生が望まれている物質生産にかかわる脂肪酸又は脂肪酸誘導体を基質とする酵素は、小胞体に局在しているものが多い。これらの酵素を遺伝子組み換え法により植物内で発現させる場合には、小胞体に局在化させることが望まれる。ところが、非植物遺伝子を植物小胞体へ局在化するのに好適なシグナルはまだ見出されていない。
【００１０】
そこで、非植物由来の小胞体又はミクロソームに局在するポリペプチドをコードする遺伝子を植物に導入し、発現させたときに、当該ポリペプチドを植物の小胞体に局在させることができるようなポリペプチドを提供することを第1の課題とする。
【００１１】
さらに、本発明は、非植物において小胞体又はミクロソームに局在しているポリペプチドを、形質転換植物内で効果的に機能させる方法を提供することを第２の課題とする。
【００１２】
また、脂肪酸又は脂肪酸誘導体を基質とする非植物由来の酵素を、該酵素遺伝子を導入した形質転換植物で、該酵素遺伝子を効果的に機能させる方法を提供することを第３の課題とする。
【００１３】
更に、小胞体又はミクロソームに局在化されたときに機能及び/又は活性を増大させる非植物由来の酵素を、該酵素遺伝子を導入した形質転換植物で、該酵素遺伝子を効果的に機能させる方法を提供することを第４の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者等は、非植物由来の酵素を種々の植物由来のシグナルペプチドと組み合わせた融合蛋白質（キメラペプチド）を調製し、検討した結果、偶然にも、CYP51ファミリー遺伝子のN末側をシグナルペプチドとして利用することで、非植物由来の外来遺伝子を小胞体に局在化すること、そして、非植物において小胞体に局在するポリペプチドをコードする遺伝子を前記CYP51ファミリー遺伝子のN末側のコード領域に融合させたキメラ遺伝子を構築することにより、小胞体に局在する非植物由来の酵素を、小胞体に輸送し、高効率で機能させることに成功した。
【００１５】
さらに、CYP51ファミリー遺伝子のN末側をシグナルペプチドとして利用することで、非植物由来の脂肪酸不飽和化酵素など脂肪酸合成/代謝酵素を植物細胞内で効率的に機能させることができることを見出した。
【発明の効果】
【００１６】
従来植物細胞内での機能発現が容易でなかった非植物由来の小胞体局在化シグナルポリペプチドを効率よく、機能させることができるようになり、今後植物を用いた物質生産に大いに役立つものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本願発明は、非植物由来の小胞体に局在するポリペプチドをコードする遺伝子を植物に導入し、発現させたときに、当該ポリペプチドを植物の小胞体又はミクロソームに局在させることができる、言いかえれば、小胞体又はミクロソームへ輸送し局在させることができる、小胞体又はミクロソーム局在化シグナルポリペプチド（小胞体又はミクロソームへのシグナルペプチドとも呼ぶ）を提供する。本発明でいう非植物とは、哺乳類、及び昆虫を含めた動物、並びに酵母などを含む微生物のことを意味している。
【００１８】
さらに、本発明は、非植物において小胞体に局在しているポリペプチドを、植物内で効果的に機能させる方法を提供する。また、脂肪酸又は脂肪酸誘導体を基質とする非植物由来の酵素を、植物で、効果的に機能発現させる方法を提供する。
【００１９】
１．植物小胞体局在化シグナルペプチド又は植物ミクロソーム局在化シグナルペプチド（植物における小胞体又はミクロソームへのシグナルペプチドとも呼ぶ。）
１−１．本願発明は、シロイヌナズナのcyp51（配列番号63）のN末側のポリペプチドであって、配列番号63のアミノ酸位置番号でＮ末が1でＣ末が30から50のいずれかの位置である小胞体又はミクロソーム局在化シグナルペプチド並びに当該シグナルペプチドをコードする塩基配列からなる植物小胞体局在化シグナルペプチド遺伝子を包含する。更に、本願発明は、配列番号63のアミノ酸位置番号でＮ末が1でＣ末が30から50のいずれかの位置で表されるアミノ酸配列において数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、小胞体又はミクロソームへの局在化シグナルペプチド活性を有するポリペプチド、並びに当該ポリペプチドをコードする遺伝子を包含する。
【００２０】
本願発明は、シロイヌナズナのcyp51のN末側40アミノ酸からなる配列番号61で示される小胞体又はミクロソーム局在化シグナルペプチド並びに当該シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるシグナルペプチド遺伝子、又は、配列番号61で示されるアミノ酸配列において数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、小胞体又はミクロソームへの局在化シグナルペプチド活性を有するポリペプチドを包含する。
【００２１】
更に、本願発明は、配列番号61で示されるアミノ酸配列、又は配列番号61で示されるアミノ酸配列において数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、小胞体又はミクロソームへの局在化シグナルペプチド活性を有するポリペプチド並びに当該ポリペプチドをコードする塩基配列を包含する。
【００２２】
また、配列表の配列番号62に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイスする塩基配列を有し、小胞体又はミクロソーム局在化シグナルペプチド活性有するポリペプチドをコードする塩基配列、並びに当該塩基配列によりコードされる小胞体又はミクロソーム局在化シグナルペプチド活性有するポリペプチド包含する。
【００２３】
更に、配列表の配列番号61に記載のアミノ酸配列と80％、好ましくは、90％、更に好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上の同一性を有する、小胞体又はミクロソーム局在化シグナルペプチド活性有するポリペプチド、並びに当該ポリペプチドをコードする塩基配列からなる遺伝子を包含する。なお、ここで、1〜数個のとは、1から９個以内、好適には、1から5個、更に好適には、1から3個の塩基又はアミノ酸を意味する。
【００２４】
更に、本願発明の植物における小胞体又はミクロソーム局在化シグナルペプチド（植物における小胞体又はミクロソームへの輸送シグナルペプチド）には、小麦（Biochem J.(1991) 277, 483-492）、ソルガム（J.Biol. Chem. (1996) 271, 32944-32950）でCYP51の相同性遺伝子によりコードされるポリペプチドのN末端約５０アミノ酸までの領域を含む小胞体又はミクロソーム局在化シグナルペプチドも包含される。
【００２５】
なお、本願発明で、小胞体局在化又はミクロソーム局在化とは、細胞内で発現している目的酵素の総タンパク質の内、１０%以上の量が小胞体又はミクロソームへ局在することを意味している。
【００２６】
２．本願発明の植物小胞体局在化シグナルペプチドを結合して植物体内で発現される遺伝子
本願発明のシグナルペプチドを結合して植物体内で発現される遺伝子としては、植物内で小胞体に局在するポリペプチドの非植物ホモログをコードする遺伝子であれば、例えば、昆虫ホモログの遺伝子、ヒトホモログの遺伝子など、いずれの遺伝子でも良い。
【００２７】
更に、本願発明のシグナルペプチドを結合して植物体内で発現される遺伝子には、非植物由来であって、小胞体又はミクロソームに輸送し小胞体又はミクロソームに局在化させることにより活性を増大させるポリペプチドをコードする遺伝子、更には、小胞体又はミクロソームに局在することが予想されるポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。
【００２８】
例えば、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、ステロール（コレステロールなど）、ステロイド（ブラシノステロイド、女性ホルモンのプロゲステロン、男性ホルモンのエストロン、）等の生合成及び／又は代謝に関わる非植物由来の酵素をコードする遺伝子が挙げられる。
【００２９】
本願発明のシグナルペプチドを結合して植物体内で発現される遺伝子としては、具体的には、ステロールを生合成及び／又は代謝に関わる非植物由来の酵素をコードする遺伝子としては、コレステロール、デスモステロール、ラトステロール、メステノール、チモステロール、ラノステロール、エルゴステロール、スクアレン、コール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸、（植物）シクロアルテノール、シクロオイカノール、オブツシホリオール、カンペステロール、シトステロール、（酵母）ラノステロール、又はエルゴステロールを生合成及び／又は代謝する酸化酵素（オキシダーゼ）、水酸化酵素（ヒドロキシゲナーゼ）、脱水素酵素（デヒドロゲナーゼ）、脱水酸化酵素、不飽和化酵素、飽和化酵素、環化酵素（サイクラーゼ）、脱メチル化酵素（デメチラーゼ）、メチル化酵素（メチラーゼ）、及び脂肪酸不飽和化酵素などをコードする遺伝子が含まれる。
【００３０】
また、具体的には、ステロイドを生合成及び／又は代謝に関わる非植物由来の酵素をコードする遺伝子としては、プロゲステロン、プログネノロン、コルチゾール、コルチゾン、コルチコステロン、アルドステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオン、テストステロン、エキリン、エキレニン、エストリオール、エストラジオール、エストロン、ジヒドロテストステロン、エクジソン、ブラシノステロイド、ブラシノライド、カスタステロン、ティステロン、又はカンペステロイドを生合成及び／又は代謝する酸化酵素（オキシダーゼ）、水酸化酵素（ヒドロキシゲナーゼ）、脱水素酵素（デヒドロゲナーゼ）、脱水酸化酵素、不飽和化酵素、飽和化酵素、環化酵素（サイクラーゼ）、脱メチル化酵素（デメチラーゼ）、メチル化酵素（メチラーゼ）、及び脂肪酸不飽和化酵素などをコードする遺伝子が含まれる。
【００３１】
不飽和化酵素遺伝子については、具体的にはカイコ由来のdesat1、desat4及びdesat5が含まれる。なお、語頭が大文字であるDesat1、Desat4およびDesat5はそれぞれ酵素を表し、語頭が小文字のdesat1 、desat4、及び desat5はそれぞれの遺伝子を表し、Desat1遺伝子、Desat4遺伝子およびDesat5遺伝子と表記されることもある。
【００３２】
desat1、desat4及びdesat5のそれぞれについて：
（１）配列番号3,4、又は5で表される塩基配列からなる不飽和化酵素遺伝子、
（２）配列番号57,58、又は59で表されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる不飽和化酵素変異体遺伝子； 
（３）配列番号3,4、又は5で表される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイスする塩基配列を有し、不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる不飽和化酵素変異体遺伝子；又は
（４）配列番号3,4、又は5で表される塩基配列に対して、同一性が90％以上、好適には95％以上、更に好適には98％以上である塩基配列を有し、不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる不飽和化酵素変異体遺伝子
が含まれる。
【００３３】
なおここで、「数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から４０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００３４】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９（以下、モレキュラークローニング第２版と略す）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ， Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３５】
３．小胞体又はマイクロソームへの局在化シグナルと連接された非植物由来のポリペプチドをコードする遺伝子を発現する発現ベクターの構築  
上記２．に挙げた、植物体内で発現させる非植物由来ポリペプチドをコードする遺伝子のN末には、前記1.に記載された小胞体局在化シグナルペプチドをコードする遺伝子を融合される。融合されたキメラ遺伝子は対象植物で機能する発現ベクターに組み込まれる。
【００３６】
例えば、（１）非植物由来であって、小胞体又はミクロソームに輸送し、小胞体又はミクロソームに局在化させることにより活性を増大させるポリペプチドをコードする遺伝子、更には、（２）小胞体又はミクロソームに局在することが予想されるポリペプチドをコードする遺伝子、又は（３）飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、ステロール類（コレステロールなど）、ステロイド類（ブラシノステロイド、女性ホルモンのプロゲステロン、男性ホルモンのエストロン、）等の生合成／代謝に関わる非植物由来の酵素をコードする遺伝子のN末には、前記1.に記載された小胞体局在化シグナルペプチドをコードする遺伝子を融合される。融合されたキメラ遺伝子は対象植物で機能する発現ベクターに組み込まれる。
【００３７】
ベクターとしては、植物で遺伝子を発現させることができるベクターであれば、いずれも使用可能であるが、具体的には、例えば、Tiベクター、例えば、ｐBI101（Clonetch）、バイナリーベクター、例えば、pCAMBIAなど、種々のベクターが使用可能である。
【００３８】
植物で機能するプロモーターとしては、当該対象植物由来のプロモーターであっても、異種由来のものであっても、当該対象植物において機能する限り使用することができる。また、必要に応じ、外部誘導性のプロモーター、組織特異的プロモーターを用いることもできる。プロモーターとしては、例えば、NapA  promoter（ Brassica napus napin gene, promoter and 5' UTR、Josefssonら（1987）J. Biol. Chem. 262, 12196-12201）。組織非特異性ながら強い発現誘導性を示すプロモーターとしては、CaMV35、NOS promoter、およびオクトピンシンターゼプロモーター（Ｆｒｏｍｍら（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １： ９７７）を用いることが出来る。また、緑葉での強い発現を誘導するrbcS promoterやcab promoterを用いることが出来る(Choryら(1991)、Plant Cell,3, 445-459)。 また、estradiol inducible promoter（Plant Cell 2000;12:65-80）、pUAS-Gal4 glucocorticoid-inducible promoter（Plant J. 11, 605-612））等を使用することができる。
【００３９】
選抜用マーカーとしては、カナマイシン耐性遺伝子（nptII）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（hptI）、ブレオマイシン耐性遺伝子等を挙げることができる。植物体での発現位置を確認するためのレポーター遺伝子としてルシフェラーゼ、GUS（βグルクロニダーゼ）遺伝子などを挙げることができる。
【００４０】
更に、アデノウイルスE19タンパク質のC末端部分で見つかった小胞体残留シグナルKKXXモチーフ（Teasdale, R. D. & Jackson, M. R. :Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 12: 27-54, 1996）を不飽和化酵素のC末側に融合させることもできる。
【００４１】
また、３‘末端側にはターミネーター配列、例えば、nos (nopaline synthase) 3'UTR (polyA signal)"を用いることができる。
【００４２】
４．発現ベクターの植物体への導入
４−１．発現ベクターを導入する植物。
形質転換対象となる植物としては任意の形質転換する植物が対象となりうる。好適には、遺伝子導入をする対象植物は、小胞体局在化シグナルペプチドが由来する植物と同じ俗に属する植物、さらに好適には同じ種に属する植物であることが望ましい。
【００４３】
具体的には、配列番号61又は配列番号61で示されるアミノ酸配列において数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、小胞体局在化シグナルペプチド活性を有するポリペプチドを小胞体局在化シグナルペプチドとして用いる場合には、シロイヌナズナに前記3．で調製した発現ベクターを導入することが望ましい。
【００４４】
４−２．標的遺伝子組み換えベクターは、周知の手段、例えば、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法等により、カルス又は胚に導入される。
【００４５】
4-2-1．パーティクルガン法を利用する場合は、次のように行う。
まず、金粒子（好適には直径１−２μｍ）に調製された標的遺伝子組み換えベクターでコーティングし、マイクロキャリアーに接着させる。カルス又は胚をプレートに並べ、パーティクルガン装置で、２回打ち込む。
【００４６】
4-2-2．アグロバクテリウム法では次のように行う。
標的遺伝子を導入されたTiプラスミド又は標的遺伝子バイナリーベクターを、アグロバクテリウムツメファシエンスに導入する。形質転換されたアグロバクテリウムを、標的遺伝子をカルスに導入することができる。場合によっては、形質転換されたアグロバクテリウムを植物体又は種子に感染させ、得られた植物体で生産される種子集団から回収できる。
【００４７】
4-2-3．エレクトロポレーション法
カルスを処理することにより、プロトプラストを調製する。調製したプロトプラストを標的遺伝子組み換えベクターの共存下、キュベット中のマニトール／MES溶液中で、500V/cm程度の高圧電場を掛け、発現ベクターをプロトプラストに導入する。
【００４８】
4-2-4．減圧浸潤法
花を付け始めた植物固体に、形質転換アグロバクテリウムの懸濁液に、植物体を浸潤し、減圧する。懸濁液が花内部に浸透し、花で感染し、種子中に形質転換植物種子が得られる。
【００４９】
５．植物体の再生
カルスを用いて植物を形質転換させた場合は、遺伝子導入されたカルス又はプロトプラストは、培地中で増殖させ、増殖させたカルスから、再分化培地及び発根誘導培地を用いて、光を照射し植物を再生させる。  
【００５０】
［実施例］
以下の実施例では、植物の小胞体又はマイクロソームに局在する遺伝子としては、配列番号3で表されるdesat1（Z11−不飽和化活性及びΔ10,12−不飽和化活性の両者を有するDesat1をコードするカイコ由来の遺伝子）を用いた。植物体には、さらにカイコ由来の脂肪族アシル還元酵素ｐｇFAR（pheromone gland fatty-acyl reductase）遺伝子を発現ベクターに組み替えて導入されている。このシグナルペプチドにより、カイコ由来の酵素を植物の小胞体又はマイクロソームへ導くことが可能となる。その結果、植物体が小胞体において自ら合成したパルミチン酸に、カイコガ由来の配列番号57で示されるDesat1を作用させてパルミチン酸の10,12位に二重結合を導入し、次に配列番号60であらわされるpgFARを作用させてアシル基を還元することでボンビコール（ (E,Z)-10,12-hexadecadien-1-ol、なお、E10Z12-16:OHとも略記される。）を産生するように遺伝子導入することで形質転換植物を育種することができる。(図1参照)
なお、ボンビコールは、カイコガやクワの害虫であるクワコの性フェロモンである。
【実施例１】
【００５１】
シロイヌナズナで、desat1及びpgFAR遺伝子を発現させるための発現ベクターの調製  (なお、本実施例で使用するオリゴヌクレオチドの一覧表を表１として下に掲げる。)
（１）シロイヌナズナ発現用コドン改変desat1 DNA断片(以後、Ds1At)の作製
Ds1Atの部分断片（napA/14DMN/Ds1KKAA/NOSter の1284-1632に相当する部分、以後Ds1At-1）を得るために、４本のオリゴヌクレオチド（Ds1F1、Ds1R1、Ds1F2、Ds1R2）を鋳型とし、1対のプライマー（PstI-Ds1(At)f1、Ds1-347r2）を用いてPCRを行った。PCRはKOD-Plus(Toyobo, Osaka)を使用して行い、その条件はまず94℃にて2分間インキュベート後、さらに３ステップからなる反応（94℃15秒間、45℃で30秒間、68℃1分間）を30サイクル行った。得られたPCR産物をアガロース電気泳動で分離し、目的とする355bpのDNA断片をQuantum prep freeze 'N squeeze DNA gel extraction spin columns(BIO RAD)によりアガロースゲルから精製した。
【００５２】
Ds1Atの部分断片（napA/14DMN/Ds1KKAA/NOSter の1614-1956に相当する部分、以後Ds1At-2）を得るために、４本のオリゴヌクレオチド（Ds1F3、Ds1R3、Ds1F4、Ds1R4）を鋳型とし、1対のプライマー（Ds1-318f2、Ds1-676r2）を用いてPCRを行った。PCR、および目的とする343bpのPCR産物の精製はDs1At-1と同様に行った。
【００５３】
Ds1Atの部分断片（napA/14DMN/Ds1KKAA/NOSter の1937-2297に相当する部分、以後Ds1At-3）を得るために、４本のオリゴヌクレオチド（Ds1F5、Ds1R5、Ds1F6、Ds1R6）を鋳型とし、1対のプライマー（Ds1-647f2、SpeI-Ds1(At)KKAAr1）を用いてPCRを行った。PCR、および目的とする363bpのPCR産物の精製はDs1At-1と同様に行った。
【００５４】
DNA断片Ds1Atを得るために、上記３種類のPCR産物（Ds1At-1、Ds1At-2、Ds1At-3）を鋳型とし、1対のプライマー（PstI-Ds1(At)f1、SpeI-Ds1(At)KKAAr1）を用いてPCRを行った。PCRはサイクル数を20とした以外はDs1At-1と同様に行った。PCR産物はUltra clean PCR purification kit (Mobio)により精製後、Zero blunt(R) TOPO(R) cloning kit for sequencing manual（Invitrogen）に従い、pCR(R)4Blunt-TOPO(R)にクローニングした。Ds1Atの塩基配列に間違いがないことを確認した後、制限酵素PstIおよびSpeIで二重消化し、さらにアガロース電気泳動で分離後、Wizard(R)  SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）によりアガロースゲルから Ds1At DNA断片を精製した。
【００５５】
（２）シロイヌナズナ発現用コドン改変pgFAR 遺伝子DNA断片(以後、pgFARAt)の作製
pgFARAtの部分断片（napA-pgFAR-NOSter の1200-1557に相当する部分、以後pgFARAt-1）を得るために、４本のオリゴヌクレオチド（pgFAR-F1、pgFAR-R1、pgFAR-F2、pgFAR-R2）を鋳型とし、1対のプライマー（PstI-pgFAR(At)f2、pgFAR348r2）を用いてPCRを行った。PCR、および目的とする360bpのPCR産物の精製はDs1At-1と同様に行った。
【００５６】
pgFARAtの部分断片（napA-pgFAR-NOSter の1526-1881に相当する部分、以後pgFARAt-2）を得るために、４本のオリゴヌクレオチド（pgFAR-F3、pgFAR-R3、pgFAR-F4、pgFAR-R4）を鋳型とし、1対のプライマー（pgFAR314f2、pgFAR670r2）を用いてPCRを行った。PCR、および目的とする357bpのPCR産物の精製はDs1At-1と同様に行った。
【００５７】
pgFARAtの部分断片（napA-pgFAR-NOSter の1842-2277に相当する部分、以後pgFARAt-3）を得るために、5本のオリゴヌクレオチド（pgFAR-F5、pgFAR-R5、pgFAR-F6、pgFAR-R6、pgFAR-F7）を鋳型とし、1対のプライマー（pgFAR632f2、pgFAR1069r2）を用いてPCRを行った。PCR、および目的とする436bpのPCR産物の精製はDs1At-1と同様に行った。
【００５８】
pgFARAtの部分断片（napA-pgFAR-NOSter の2244-2598に相当する部分、以後pgFARAt-4）を得るために、4本のオリゴヌクレオチド（pgFAR-R7、pgFAR-F8、pgFAR-R8、pgFAR-F9）を鋳型とし、1対のプライマー（pgFAR1034f2、SpeI-pgFAR(At)r2）を用いてPCRを行った。PCR、および目的とする357bpのPCR産物の精製はDs1At-1と同様に行った。
【００５９】
DNA断片pgFARAtを得るために、上記４種類のPCR産物（pgFARAt-1、pgFARAt-2、pgFARAt-3、pgFARAt-4）を鋳型とし、1対のプライマー（PstI-pgFAR(At)f2、SpeI-pgFAR(At)r2）を用いてPCRを行った。PCRはKOD-Plusを使用して行い、その条件はまず94℃にて2分間インキュベート後、さらに３ステップからなる反応（94℃15秒間、45℃で30秒間、68℃84秒間）を20サイクル行った。PCR産物はUltra clean PCR purification kit により精製後、Zero blunt(R) TOPO(R) cloning kit for sequencing manualに従い、pCR(R)4Blunt-TOPO(R)にクローニングした。pgFARAtの塩基配列に間違いがないことを確認した後、制限酵素PstIおよびSpeIで二重消化し、さらにアガロース電気泳動で分離後、Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up SystemによりアガロースゲルからpgFARAt DNA断片を精製した。
【００６０】
（３）napA プロモーターを有する発現ベクター（pnapA-NOSter）の作製
NOS terminatorを含む植物形質転換遺伝子ベクターpBI121（Clontech）を鋳型とし、1対（NotI-NOSf1、SacI-NOSr1）のプライマーを用いてPCRを行った。PCRはKOD-Plusを使用して行い、その条件はまず94℃にて2分間インキュベート後、さらに３ステップからなる反応（94℃15秒間、45℃で30秒間、68℃１分間）を20サイクル行った。PCR産物をUltra clean PCR purification kit により精製後、制限酵素NotIおよびSpeIにより二重消化し、さらにアガロース電気泳動で分離後、Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up Systemによりアガロースゲルから精製した。これを前もってNotIおよびSpeIにより二重消化したpBluescriptIISK(+)（Stratagene）にクローニングした。これを以後、pNOSterとする。
【００６１】
Brassicanapus（セイヨウアブラナ）のnapA プロモーターを有するベクター（Iwabuchi et al., JBC(2000)Vol.278,No.7, 4603-4610）を鋳型とし、1対（KpnI-napAf1、ApaI-napAr1）のプライマーを用いてPCRを行った。PCRはKOD-Plusを使用して行い、その条件はまず94℃にて2分間インキュベート後、さらに３ステップからなる反応（94℃15秒間、45℃で30秒間、68℃１分間）を20サイクル行った。PCR産物をUltra clean PCR purification kit により精製後、制限酵素KpnIおよびApaIにより二重消化し、さらにアガロース電気泳動で分離後、Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up System によりアガロースゲルから精製した。これを前もってKpnIおよびApaIにより二重消化したpNOSterにクローニングした。これを以後、pnapA-NOSterとする。
【００６２】
（４）pnapA-DM14N-Ds1KKAA-NOSterの作製
Arabidopsisthaliana（シロイヌナズナ）種子から調製したcDNAを鋳型とし、1対（ApaI-14DMf1、PstI-14DMr1）のプライマーを用いてPCRを行った。PCRはKOD-Plusを使用して行い、その条件はまず94℃にて2分間インキュベート後、さらに３ステップからなる反応（94℃15秒間、45℃で30秒間、68℃１分間）を20サイクル行った。PCR産物をUltra clean PCR purification kitにより精製後、制限酵素ApaIおよびPstIにより二重消化し、さらにアガロース電気泳動で分離後、Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up Systemによりアガロースゲルから精製した。これを前もってApaIおよびPstIにより二重消化したpnapA-NOSterにクローニングした。さらにこのプラスミドDNAをPstIおよびSpeIで二重消化し、前もってPstIおよびSpeIで二重消化したDs1At DNA断片を挿入した。
【００６３】
（５）pnapA-pgFAR-NOSterの作製
PstIおよびSpeIで二重消化したpgFARAt DNA断片を、前もってPstIおよびSpeIで二重消化したpnapA-NOSterにクローニングした。
【００６４】
（６）GATEWAY用バイナリーベクター 「pGWB1-napA-14DM-Ds1KKAA-NOSter」および「pGWB1-napA-pgFAR-NOSter」の作製      
「pnapA-DM14N-Ds1KKAA-NOSter」および「pnapA-pgFAR-NOSter」をそれぞれ鋳型とし、1対（ENTRCCACBskf2、SacI-NOSr1）のプライマーを用いてPCRを行った。PCRはKOD-Plusを使用して行い、その条件はまず94℃にて2分間インキュベート後、さらに３ステップからなる反応（94℃15秒間、45℃で30秒間、68℃150秒間）を15サイクル行った。PCR産物をUltra clean PCR purification kitにより精製後、pENTR Directional TOPO(R) Cloning Kits Manual(Invitrogen)に従い、Gateway用エントリーベクターpENTR/D-TOPO(R)にクローニングした。得られたエントリーベクターはGateway(R)Technology Manual(Invitrogen)に従い、試験管内においてGateway用植物形質転換遺伝子ベクターpGWB1（島根大学遺伝子実験施設・中川強先生から譲渡して頂いたもの）とLR反応を起こさせた後、大腸菌DH5にトランスフォーメーションした。得られた形質転換大腸菌をカナマイシン（最終濃度50μg/ml）およびハイグロマイシン（最終濃度50μg/ml）を含む50mlのLB液体培地で培養後、プラスミドDNAをDNA自動分離装置（PI50、Kurabo）により精製し、200μlのMilliQ水に溶解した。
【００６５】
（７）「pGWB1-napA-pgFAR-NOSter」及び「pnapA-DM14N-Ds1KKAA-NOSter」のアグロバクテリウムへの導入
pGWB1-napA-pgFAR-NOSter溶液 2μlについて、Agrobacterium  tumefacience C58 strain コンピテントセル 200μlと混合し、氷上で30min静置した。この混合液の入ったチューブを液体窒素中で1min凍結し、その後、37℃で融解した。続いて、YEP液体培地を1ml添加し、28℃で2時間静置した。これらについて、50μg/mlカナマイシン、50μg/mlハイグロマイシン、100μg/mlリファンピシンを含むYEP寒天プレートに展開塗布し、28℃で３日間静置培養した。出現するコロニーがpGWB1-napA-pgFAR-NOSterが形質転換されたアグロバクテリウムである。
同様にして「pnapA-DM14N-Ds1KKAA-NOSter」もアグロバクテリウムに導入した。
【００６６】
（８）「pGWB1-napA-pgFAR-NOSter」を持つアグロバクテリウムの植物への感染による形質転換植物の作成
pGWB1-napA-pgFAR-NOSterを形質転換したAgrobacterium  tumefacienceについて、シングルコロニーから50μg/mlカナマイシン、50μg/mlハイグロマイシン、100μg/mlリファンピシンを含む2ml YEP液体培地中で、28℃で１昼夜培養した後、この培地を50μg/mlカナマイシン、50μg/mlハイグロマイシン、100μg/mlリファンピシンを含む500ml YEP液体培地中で、28℃で１昼夜大量培養した。得られたpGWB1-napA-pgFAR-NOSterを形質転換したAgrobacterium  tumefacienceについて、1/2MS植物培養培地、5% Sucrose、0.044μM ベンジルアミノプリンを含む500ml溶液に懸濁する。このアグロバクテリウム液に対して、アラビドプシスコロンビア種の開花初期のつぼみを天地逆にして、浸透させる。15min静置する。この後、登熟する種子にアグロバクテリウムが感染している。
【００６７】
（９）「pnapA-DM14N-Ds1KKAA-NOSter」を持つアグロバクテリウムの植物への感染による形質転換植物の作成
上記（８）と同様にして、「pnapA-DM14N-Ds1KKAA-NOSter」を持つアグロバクテリウムを植物に感染させ、形質転換植物を調製した。
【００６８】
（１０）「pGWB1-napA-pgFAR-NOSter」を持つアグロバクテリウムにより形質転換された植物の選抜
pGWB1-napA-pgFAR-NOSterを持つアグロバクテリウムを感染されたアラビドプシス種子について、エタノール滅菌後、50μg/mlカナマイシン、50μg/mlハイグロマイシンを含む1/2MS植物培養用培地（1/2MS、1%アガロース、1.5%シュークロース）に播種する。この種子を22℃で2週間光条件下（100μE）で育種する。白化枯死せず、薬剤耐性を示す個体がpGWB1-napA-pgFAR-NOSter形質転換アラビドプシスであり、土への移植後、オスカイコガへの影響試験に用いる。
【００６９】
（１１）「pnapA-DM14N-Ds1KKAA-NOSter」を持つアグロバクテリウムにより形質転換された植物の選抜
上記（１０）と同様にして、「pnapA-DM14N-Ds1KKAA-NOSter」を持つアグロバクテリウムにより形質転換された植物を選抜した。
【００７０】
【表１】
2007000120.tif 000002
2007000120.tif 000003
2007000120.tif 000004
2007000120.tif 000005
2007000120.tif 000006
2007000120.tif 000007
【実施例２】
【００７１】
形質転換植物を用いたオスカイコガへの影響確認試験
pGWB1-napA-14DM-Ds1KKAA-NOSter形質転換アラビドプシスおよびpGWB1-napA-pgFAR-NOSter形質転換アラビドプシスを掛け合わせることにより、14DM-Ds1KKAAおよびpgFARを共発現する形質転換アラビドプシスを得た。この形質転換アラビドプシスの鞘に対し、オスカイコガが独特の配偶行動を解発することを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】ボンビコールの生成経路
【図１】
2007000120.tif 000008
【配列表】
2007000120000001.app