(57)【要約】【課題】平滑筋細胞分化増殖抑制剤の提供。【解決手段】SELF蛋白質又はSELF遺伝子を含む発現ベクターを有効成分として含有する平滑筋細胞分化増殖抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
SELF蛋白質を有効成分として含有する平滑筋細胞分化増殖抑制剤であって、該SELF蛋白質が以下の(a)〜(c)から選択される少なくとも１つの蛋白質である、平滑筋細胞分化増殖抑制剤。
(a) 配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b) 配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ平滑筋細胞分化増殖抑制作用を有する蛋白質、及び
(c) 配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ平滑筋細胞分化増殖抑制作用を有する蛋白質
【請求項２】
SELF遺伝子を含む発現ベクターを有効成分として含有する平滑筋細胞分化増殖抑制剤であって、該SELF遺伝子が以下の(d)〜(j)から選択される少なくとも１つの遺伝子である、平滑筋細胞分化増殖抑制剤。
(d) 配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子
(e) 配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ平滑筋細胞分化増殖抑制作用を有する蛋白質をコードする遺伝子
(f) 配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ平滑筋細胞分化増殖抑制作用を有する蛋白質をコードする遺伝子
(g) 配列番号１で表される塩基配列上の塩基番号１５７番〜４３６５番を含む塩基配列からなる遺伝子
(h) 配列番号３で表される塩基配列からなる遺伝子
(i) 前記(g)又は(h)に記載の遺伝子の塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ平滑筋細胞分化増殖抑制作用を有する蛋白質をコードする核酸からなる遺伝子、及び
(j) 前記(g)又は(h)に記載の遺伝子の塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列からなり、かつ平滑筋細胞分化増殖抑制作用を有する蛋白質をコードする遺伝子
【請求項３】
請求項１又は２に記載の平滑筋細胞分化増殖抑制剤を含有する、血管形成阻害のための医薬組成物。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の平滑筋細胞分化増殖抑制剤を含有する、腫瘍形成抑制のための医薬組成物。
【請求項５】
血管内皮細胞増殖因子阻害剤をさらに含む、請求項３又は４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の平滑筋細胞分化増殖抑制剤と、血管内皮細胞増殖因子阻害剤とを含む、血管形成阻害又は腫瘍形成抑制のための医薬品キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、平滑筋細胞の分化増殖を抑制する薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の分化増殖制御における異常と関連した様々な疾患が知られている。そのような疾患の例として、血液細胞の増殖異常を伴う疾患（例えば、再生不良性貧血）や、異常な血管新生を伴う疾患（例えば、悪性新生物、糖尿病性網膜症）等がある。これらの疾患は、重篤な症状をもたらし、かつ治療が困難なものが多い。そのため、細胞の分化増殖制御異常と関連した疾患に対する有効な治療薬の開発が強く望まれている。
【０００３】
細胞の分化増殖制御の異常の１つに、平滑筋細胞の分化増殖亢進がある。例えば、血管平滑筋細胞の過剰な増殖は、血管壁の肥厚や血管内腔の狭窄又は閉塞の原因となり、アテローム性（粥状）動脈硬化、糖尿病性血管傷害、脳虚血発作、狭心症、心筋梗塞などの動脈硬化性疾患を引き起こす（非特許文献１）。血管平滑筋細胞の増殖抑制はそのような動脈硬化性疾患の予防および治療につながると考えられており、血管平滑筋細胞増殖抑制作用を有する薬剤を用いた動脈硬化性疾患等に対する様々な治療剤の開発が試みられているが（非特許文献２及び特許文献１〜３）、さらに高い有効性を示す治療剤の開発はなおも求められている。
【０００４】
一方、細胞の異常な増殖によって生じる腫瘍は、酸素や栄養分の補給のために腫瘍形成部位への血管新生を誘導することが知られている。この知見に基づき、各種の血管新生阻害剤が新たな作用機序の抗腫瘍剤として開発が進められている。そのような血管新生阻害剤としては、インターフェロン、血管内皮細胞増殖因子阻害剤（血管内皮細胞増殖因子に対する中和抗体など）、NK4、アンギオスタチン、エンドスタチン、プロラクチンなどがあるが、単独では抗腫瘍効果が弱いものもあり、さらなる開発が求められている。
【０００５】
in vivoでの細胞分化増殖制御には様々な因子が関与している。例えば、受容体であるNotch（ノッチ）蛋白質とそのリガンド蛋白質であるDelta、Serrate、Juggedも細胞の分化増殖制御因子として知られている。Notch、Delta、Jaggedのアミノ酸配列構造には共通してEGF（Epidermal growth factor）様モチーフの繰り返しが見出される（非特許文献３）。このEGF様モチーフのコンセンサス配列は、CXCXXXXXGXXC、又はCXCXX[G若しくはP][F若しくはY若しくはW][XXXX若しくはXXXXXXXX]Cである。EGF様モチーフの繰り返しは「EGF様繰り返し配列」と呼ばれている。EGF様モチーフの繰り返し構造は、EGFの他、多くの細胞外蛋白質に存在しており、EGF様モチーフが蛋白質同士の相互作用や細胞同士の相互作用に関わっていることが知られている（非特許文献４及び５）。
【０００６】
近年、骨髄中のストローマ細胞の機能とストローマ細胞が産生する分子との関連が注目されており、ストローマ細胞の造血支持能とサイトカインの関係が特によく調べられている。ストローマ細胞は、樹立された細胞株により異なるが、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、IL-6、IL-7、IL-11、LIF、TGF-β、SCF(stem cell factor)などのサイトカインを産生することが示されている（非特許文献６〜１０）。さらにLIF（白血病阻害因子）やTGF-β（腫瘍細胞増殖因子）は、幹細胞の分化を抑制するサイトカインとして知られている。LIFはマウス胚性幹細胞を分化させずに増殖させることが報告されているが（非特許文献１１）、造血幹細胞に対してはそのような効果はない。TGF-βについては、種々の細胞に対する増殖抑制効果は多数報告されているが（非特許文献１２及び１３）、幹細胞に対する効果については、一定の見解が得られていない。さらに、ストローマ細胞はマウス杯性幹細胞（ES細胞）等の未分化な細胞から分化誘導を支持することも知られているがその分子基盤は明らかにされていない（非特許文献１４）。
【０００７】
このように細胞の分化増殖制御に関わる分子は多数知られているが、その機能の解明はまだ十分には進んでいない。各種分化増殖因子の機能がさらに解明されれば、細胞分化増殖制御における異常と関連した様々な疾患の治療に有用な薬剤の開発が格段に進むと思われる。
【０００８】
【特許文献１】特開平７−１１２９３０号公報
【特許文献２】特開２００１−１７１８８号公報
【特許文献３】特表２００５−５２０４８０号公報
【非特許文献１】Ross, R. et al., N. Engl. J. Med., 314, p.488-500, 1986
【非特許文献２】Gordon, A et al., Science, 253, p.1129, 1991
【非特許文献３】Lindsell et al., Cell 80：909-917, 1995
【非特許文献４】Campbell ＆ Bork, Curr. Opin. Struct. Biol 3：385-392, 1993
【非特許文献５】Rao et al., Cell 82:131-141, 1995
【非特許文献６】Rennick et al., Blood 69:682-691, 1987
【非特許文献７】Young et al., J. Cell. Physiol. 134:292-296, 1988
【非特許文献８】Sudo et al., J. Exp. Med. 170:333-338 1989
【非特許文献９】Paul et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7512-7516, 1990
【非特許文献１０】Zsebo et al., Cell 63:213-224, 1990
【非特許文献１１】Smith et al., Nature 336:688-690, 1988
【非特許文献１２】Massague, Annu. Rev. Cell. Biol. 6:597-641, 1990
【非特許文献１３】Fan et al., Blood 79:1679-1685, 1992
【非特許文献１４】Yamashita et al., Nature 408:92-96, 2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、平滑筋細胞分化増殖抑制剤、及びそれを用いた血管形成阻害及び／又は腫瘍形成抑制のための医薬組成物の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、本発明者らによって以前に同定された細胞分化増殖制御に関わるSELF蛋白質（特願2004-351903号明細書）が、平滑筋細胞分化増殖抑制作用を有しており、血管形成阻害効果及び腫瘍形成抑制効果を発揮することを新たに見出し、本発明を完成させた。すなわち本発明は以下を包含する。
【００１１】
[1] SELF蛋白質を有効成分として含有する平滑筋細胞分化増殖抑制剤であって、該SELF蛋白質が以下の(a)〜(c)から選択される少なくとも１つの蛋白質である、平滑筋細胞分化増殖抑制剤。
(a) 配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b) 配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ平滑筋細胞分化増殖抑制作用を有する蛋白質、及び
(c) 配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ平滑筋細胞分化増殖抑制作用を有する蛋白質
[2] SELF遺伝子を含む発現ベクターを有効成分として含有する平滑筋細胞分化増殖抑制剤であって、該SELF遺伝子が以下の(d)〜(j)から選択される少なくとも１つの遺伝子である、平滑筋細胞分化増殖抑制剤。
(d) 配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子
(e) 配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ平滑筋細胞分化増殖抑制作用を有する蛋白質をコードする遺伝子
(f) 配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ平滑筋細胞分化増殖抑制作用を有する蛋白質をコードする遺伝子
(g) 配列番号１で表される塩基配列上の塩基番号１５７番〜４３６５番を含む塩基配列からなる遺伝子
(h) 配列番号３で表される塩基配列からなる遺伝子
(i) 前記(g)又は(h)に記載の遺伝子の塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ平滑筋細胞分化増殖抑制作用を有する蛋白質をコードする核酸からなる遺伝子、及び
(j) 前記(g)又は(h)に記載の遺伝子の塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列からなり、かつ平滑筋細胞分化増殖抑制作用を有する蛋白質をコードする遺伝子
[3] 上記[1]又は[2]の平滑筋細胞分化増殖抑制剤を含有する、血管形成阻害のための医薬組成物。
[4] 上記[1]又は[2]の平滑筋細胞分化増殖抑制剤を含有する、腫瘍形成抑制のための医薬組成物。
[5] 血管内皮細胞増殖因子阻害剤をさらに含む、上記[3]又は[4]の医薬組成物。
[6] 上記[1]又は[2]に記載の平滑筋細胞分化増殖抑制剤と、血管内皮細胞増殖因子阻害剤とを含む、血管形成阻害又は腫瘍形成抑制のための医薬品キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の平滑筋細胞分化増殖抑制剤は、平滑筋細胞の分化増殖を抑制することができ、さらに血管形成を阻害し、腫瘍形成も抑制することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
なお、本発明の実施に必要なmRNAの調製、cDNAの作製、RT-PCR法、RACE法、DNAの塩基配列の決定、ノーザンブロットによる発現の検討などの実験は通常の実験書に記載の方法によって行うことができる。そのような実験書としては、例えば、Sambrookらの編集したMolecular Cloning, A laboratory manual, 2001, Eds., Sambrook, J. & Russell, DW. Cold Spring Harbor Laboratory Pressを挙げることができる。また、抗体の作製等の実験は例えば、Harlowらの著書であるAntibodies A Laboratory Manual, 1998, Harlow,E.&Lane, D. Cold Spring Harbor Laboratory Pressの説明に従って行うことができる。
【００１５】
本明細書で用いる「核酸」は、DNAであってもRNAであってもよく、RNAである場合には塩基配列中の「Ｔ（チミン）」は「Ｕ（ウラシル）」に読み換えるものとする。本明細書では「核酸」と「ポリヌクレオチド」との用語は同じ意味で用いる。
【００１６】
本明細書では、未分化細胞は、幹細胞又は前駆細胞を指す。幹細胞とは、増殖可能であり、かつ他種類の細胞系統に分化可能な細胞と定義される。幹細胞としては、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、皮膚幹細胞、神経幹細胞、筋肉幹細胞、血液幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、網膜幹細胞、毛包幹細胞、生殖幹細胞、骨格筋幹細胞、消化管上皮幹細胞などが含まれる。また前駆細胞とは、各幹細胞からその細胞系統にコミットした細胞で、最終分化に至っていない細胞を言う。
【００１７】
１．血管形成機構に基づく医薬の開発
近年、血管新生阻害剤が、癌細胞の増殖に必要な宿主システムを阻害する抗癌剤として注目されている。1968年、腫瘍が自分自身の成長を促進させる物質を産生しているという仮説が提唱され、実際に、腫瘍細胞が未知の物質を産生し、血管を腫瘍内に引き込むこと（血管新生）により成長していることが報告された（Greenblatt, M & Shubik , JNCI 41:111-124, 1968）。1971年、Folkmanは、血管新生促進因子の作用を抑制し、腫瘍への血液供給を妨害すれば、腫瘍を小さくできるという考えを提案した(Folkman J. New England Journal of Medicine 285: 1182-1186, 1971)。実際、血液が供給されない場合、腫瘍は数ミリ以上の大きさに成長（発育）することはできず、新生血管を通じた癌転移も引き起こすことができない。血管新生を阻害する方法としては、血管新生促進因子の産生または作用を阻害する方法と、血管新生抑制因子の生産促進またはこれを外から投与する方法が考えられる。
【００１８】
血管形成（発生）過程は、一般に、胎生期に未熟な血管叢が新規に形成される脈管形成と既存血管から新しい血管が形成される血管新生の２つの側面から研究されている（Risauet et al.,Ann. Rev. Cell. Dev. Biol. 11: 73-91, 1995）。胎生期には、原腸形成によって外胚様と内胚様の間の中胚葉が形成され、その中胚葉細胞から分化した血管芽細胞が小さな細胞集塊内で管腔形成した後、お互いに融合し原始血管叢を形成する。このように、胎生期に未熟な血管叢が新規に形成される過程は脈管形成と呼ばれている。一方、既存の血管の内皮細胞は、血管新生刺激に反応して基底膜や細胞外マトリックスの融解、増殖、遊走、及び管腔形成を行い、その後に、壁細胞が追随して新生血管が完成される。このように、既存血管から新しい血管が出芽し新しい血管を形成する過程は血管新生と呼ばれている。胎生期では初めに血管内皮細胞だけで血管が構築され、ついで壁細胞が周囲を取り囲むという順序であるのに対して、成熟個体では、血管内皮細胞と壁細胞によって構築された既存血管から血管新生が起こる。なお、ここでいう壁細胞とは、血管内皮細胞の周囲を取り巻き、血管構造の支持や血管の弛緩収縮などを司る細胞である。壁細胞は、動静脈においては平滑筋細胞、毛細血管においては周皮細胞（ペリサイト）であり、いずれも平滑筋系の細胞である。
【００１９】
成熟個体における血管新生は抑制因子と促進因子のバランスによって制御されており、促進因子が抑制因子よりも優勢となったときに初めて血管新生が開始する。このとき、促進因子や抑制因子は、それぞれ単独の因子としてではなく、作用機序の異なる複数の因子が協同して作用すると考えられている。
【００２０】
血管新生は、まず周皮細胞が内皮細胞から解離するステップから始まる。このプロセスはアンジオポエチンによって調節されている（Hanahan, Science 277:48-50, 1997）。アンジオポエチンには互いに相同性の高い２つの分子アンジオポエチン-1（angiopoietin-1；以下「Ang-1」と称する）とアンジオポエチン-2（angiopoietin-2；以下「Ang-2」と称する）があり、いずれも内皮細胞のTIE2受容体に結合する。Ang-1はTIE2受容体のリン酸化を誘導するが、Ang-2はTIE2受容体のリン酸化を誘導しないため、Ang-1のTEI2受容体を通じたシグナル伝達を競合的に阻害し、周皮細胞を内皮細胞から解離させると考えられている。
【００２１】
周皮細胞が解離した部位の内皮細胞は促進因子の刺激に反応しやすくなる。促進因子の中では血管内皮細胞増殖因子（vascular endothelial growth factor；以下「VEGF」と称する）が特に重要と考えられており、この促進因子の刺激に反応した内皮細胞は種々のプロテアーゼを生産して血管基底膜やその周囲の細胞外マトリックスを消化し、刺激の方向へと向かって遊走を開始する。このようにして血管基底膜を破って間質へと浸潤を開始した内皮細胞は、さらに遊走と増殖によってその細胞数を増し、芽を伸ばしていくが、このとき、内皮細胞に特異的なVE-カドヘリン（vasucular endothelial-cadherin）によって隣接する内皮細胞同士が接着し、管腔構造物を形成する（Vittet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:6273-6278, 1997）。
【００２２】
こうして周皮細胞は内皮細胞に続いて遊走・増殖し、内皮細胞の未熟な新生血管の周囲を取り囲むが、この過程はAng-1によって調節されていることが知られている（Hanahan, Science 277:48-50, 1997）。すなわちAng-1がTIE2受容体に結合して内皮細胞を刺激し、２次的に血小板由来増殖因子(platelet-derived growth factor；以下「PDGF」と称する)などの周皮細胞を刺激する因子の産生を促進すると考えられている。
【００２３】
周皮細胞が内皮細胞を取り囲むことによって、内皮細胞の遊走と増殖は停止し、新しい血管基底膜が形成され、成熟した血管が構築される。この過程はトランスフォーミング増殖因子（transforming growth factor-β；以下「TGF-β」と称する）によって調節されると考えられている（Beck et al., FASEB J.11:365-373, 1997）。
【００２４】
以上のように、血管発生では、血管内皮細胞の分化増殖だけでなく壁細胞の分化増殖およびこれらの相互作用が重要である。成熟個体の血管形成は、既存血管の内皮細胞の増殖・遊走によると考えられてきたが、近年、血管内皮前駆細胞が血中に存在し、虚血部位の血管形成に貢献することが見出され、胎児期のみに存在するとされた脈管形成が成熟個体でも起こることが示された（Asahara et al. Science 275:964-967, 1997）。これは、未分化な血管内皮前駆細胞が目的の場所に遊走し、そこで増殖・分化し血管を形成できることを示している。マウス個体で癌、創傷治癒、虚血あるいは子宮、卵巣の血管形成を誘発させると、血管内皮前駆細胞が、骨髄から血流中に移動し、血管形成を助ける仕組みのあることも判明している（Asahara et al. Circ. Res. 85:221-228, 1999）。これらの知見から、血管新生を伴う疾患の治療として、血管内皮前駆細胞を治療の標的細胞とすることの妥当性が想起された。
【００２５】
FolkmanとKlagsbrunは毛細血管の異常増殖状態にある疾患群を血管新生病（angiogenic diseases）と総称することを提案した（Folkman & Klagsbrun, Science 235:442-447, 1987）。血管新生病としては、（１）固形腫瘍の増殖、（２）眼科的疾患（増殖性糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、虹彩ルベオーシス、鎌状赤血球網膜症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症、網膜中心動脈閉塞症、加齢性黄斑変性症など）（３）慢性関節リウマチ、（４）血管腫、血管線維腫、（５）乾癬、（６）粥状動脈硬化外膜の異常毛細血管網などがある（井藤英喜、代謝, 27:1075-1081, 1990）。
【００２６】
血管新生には血管内皮細胞増殖因子（VEGF）が深く関与していることが報告されている（Risau, Nature 386:671-674, 1997）。例えば固形腫瘍では、これまでに、腎癌（Takahashi, A. et al., Cancer Research 54:4233-4237, 1994）、乳癌（Brown, L. et al., Human Pathology 26: 86-91, 1995）、脳腫瘍（Berkman et al., J. Clinical Investigation 91: 153-159, 1993）、消化器癌（Brown et al., Cancer Research 53, 4727-4735, 1993）、卵巣癌（Olson, et al., Cancer Research 54, 276-280, 1994）、肝癌（Mise et al., Hepatology 23:455-464, 1996）などの多くのヒト腫瘍組織においてVEGFが産生されていることが報告されている。乳癌についてVEGF発現と患者の予後との関係が検討された結果、VEGF高発現腫瘍は、低発現腫瘍に比べて腫瘍血管新生が盛んであり、VEGF高発現腫瘍を有する患者の生存率が低いことが明らかとなっている（Toi et al., Japanese J. Cancer Research 85, 1045-1049, 1994）。
【００２７】
以上の観点から、VEGFの作用を阻害することによる腫瘍増殖抑制効果が検討されてきた。例えば、ヌードマウスにヒト腫瘍を皮下移植したゼノグラフトモデル実験系において、抗VEGFモノクローナル抗体の投与による血管新生の阻害が腫瘍増殖抑制効果を示すことが報告されている(Kim et al., Nature 362, 841-844, 1993)。また、ヌードマウスにおけるヒト腫瘍の転移癌モデルにおいて、抗VEGFモノクローナル抗体の投与による血管新生の阻害は癌転移を抑制できることが報告されている（Melnyk et al., Cancer Research 56, 921-924, 1996）。さらに大腸癌において、米国Genentech社の抗VEGFモノクローナル抗体Bevacizumab（AvastinTM）を、抗癌剤（イリノテカン、５-フルオロウラシル、ロイコボリンの３剤）と併用すると、抗癌剤のみと比較して生存期間の延長効果が得られることが確認されている（Hurwitz et al., New Engl. J. Med. 350:2335-2342, 2004）。この成績を受けて、米国FDAはBevacizumabを医薬として認可している。また、VEGFをコードするDNAに対するアンチセンスDNAを用いて血管新生を阻害することにより、ヌードマウス移植腫瘍モデルにおける腫瘍増殖を抑制できることも報告されている（Saleh et al., Cancer Research 56, 393-401, 1996）。さらに、VEGFの発現を抑制することができる短い２本鎖RNA（small interfering RNA；以下「siRNA」と称する）を用いることで、ヌードマウス移植腫瘍モデルにおける腫瘍増殖を抑制できることも報告されている（Takei et al. Cancer Res. 64:3365-3370, 2004）。
【００２８】
可溶型のVEGF受容体はVEGFに結合しVEGFの作用を阻害する。このことに基づき、可溶型VEGF受容体発現ベクターをヒト卵巣癌細胞株RMG-1に導入し、可溶型VEGF受容体を安定的に発現する細胞株をヌードマウスに移植して、マウスの生存を観察すると、可溶型VEGF受容体を発現するRMG-1接種群では、可溶型VEGF受容体を発現していないコントロールのRMG-1接種群と比較して有意に生存期間が延長されることが示されている（Hasumi et al., Cancer Res. 62:2019-2031, 2002）。さらに、可溶型VEGF受容体とヒトIgG1の定常領域（Fc）とのキメラ蛋白質は上記可溶型VEGF受容体と同様にVEGFと結合し、VEGFの作用を阻害する。ヒト卵巣癌細胞OVCAR-3を移植したヌードマウスに可溶型VEGF受容体-Fcキメラ蛋白質を投与した群では、ヒトFcを投与したコントロール群と比較して、形成された腫瘍の重量が有意に少ないことが示されている（Byrne et al., Clin. Cancer Res. 9:5721-5728, 2003）。この２つの実験は、可溶型VEGF受容体を発現するベクターを癌細胞に導入する遺伝子治療的治療方法でも、可溶型VEGF受容体蛋白質を投与する治療方法でも同様の効果が得られることを示している。
【００２９】
VEGF受容体は受容体型チロシンキナーゼであるので、このキナーゼ活性を阻害することによってもVEGFの作用を阻害することができる。VEGF受容体のチロシンキナーゼ阻害剤である低分子化合物SU5416が肺癌、大腸癌、カポジ肉腫に対して投与され、それらに対する改善効果が認められている（Rosen et al., Proceeding of35th ASCO, No 618, 1999、Fong et al. Cancer Res. 59:99-106, 1999）。
【００３０】
以上のように、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）の機能を阻害することにより、腫瘍増殖に必須の腫瘍血管新生を阻害し、腫瘍形成を抑制できたという成果は複数報告されている。しかし一方で、血管内皮細胞の増殖を阻害するだけでは、腫瘍形成の抑制には不十分な場合があることも報告されている。
【００３１】
例えば、VEGF受容体のチロシンキナーゼ特異的阻害剤であるSU5416は初期腫瘍には効果があったが、SU5416を後期の血管が十分に成長した腫瘍に投与した場合は腫瘍の退縮は起こらなかったこと、またVEGF受容体だけでなくPDGF受容体のチロシンキナーゼも阻害する低分子化合物SU6668の方が後期の腫瘍の成長を高度に阻害したことが報告されている（Novak, Nat. Rev. Cancer, 3:391, 2003、Bergers et al., J. Clin. Onvest. 111:1287-1295, 2003）。これらの知見からは、腫瘍形成の抑制には、血管を支える周皮細胞等の機能を阻害することも重要であると考えられる。
【００３２】
また、癌細胞はさまざまな血管新生促進因子を放出するので、VEGFだけを阻害する薬物を投与しただけでは、癌腫瘍は別の血管新生促進因子の働きで血流を確保しようとするであろうから、高い腫瘍形成抑制効果を得るためには複数の血管新生阻害剤を組み合わせることが必要であると考えられる（ジェインとカルメリ、日経サイエンス  ２００２年３月号、22-29）。
【００３３】
以上のように、血管新生を伴う腫瘍の治療においては、VEGFの作用を阻害するのみでは治療効果をうまく上げることができない腫瘍が存在することから、壁細胞の機能を阻害することが必要になると考えられた。
【００３４】
壁細胞の発生と分化の機構については、まだよく分かっていない点が多いが、多くは中胚葉から生じる間葉細胞を起源とする。壁細胞は血管内皮細胞などとの相互作用によって最終分化し、血管の成熟に寄与する。この過程には、PDGF、TGF-β、アンジオポエチンなどの増殖因子が関わっている（Owens, GK et al. Physiol Rev. 84:767-801, 2003、Suri, C. et al. Cell 87:1171-1180, 1996）。
【００３５】
近年、壁細胞の起源に関連して、Yamashitaらはマウス杯性幹細胞（ES細胞）を用いた血管構成細胞の分化誘導モデルにおいて、ES細胞から生じたFlk1（２型VEGF受容体）陽性の血管前駆細胞から、VEGFの作用により血管内皮細胞が、PDGFの作用により平滑筋細胞が分化することを見出している（Yamashita et al. Nature 408:92-96, 2000）。
【００３６】
一方、各種血管病において平滑筋細胞が内腔側へ蓄積する説がRossによって唱えられ、広く受け入れられている（Ross, Nature 362:801-809, 1993）。動脈硬化病変では、平滑筋細胞は、もともと中膜にあった平滑筋細胞が炎症をきっかけとして形質転換し、内皮下に移動して増殖したものであると考えられてきた（Ross, N. Eng. J. Med. 340:115-126, 1999）。しかしSataらは、動脈硬化モデルを用いて、骨髄から動員された平滑筋細胞の前駆細胞が傷害血管に定着し、平滑筋に分化する現象を報告した（Sata et al., Nature Med. 8:403-409, 2002、Sata et al., Circ. J. 67:983-991, 2003）。また、性不一致骨髄移植後の動脈硬化病変を解析した報告では、血管細胞が移植した骨髄細胞によって置き換えられ、平滑筋細胞マーカーを発現したことが示されている（Caplice et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1000:4754-4759, 2003）。これらの知見から、血管内皮細胞前駆細胞ばかりでなく、平滑筋前駆細胞も、骨髄細胞中に存在し、血管新生に関与すると考えられた。
【００３７】
平滑筋前駆細胞から壁細胞への分化誘導過程の解明も進められている。in vitroでの壁細胞の誘導の試みとして、神経提細胞株を用いた系（Jain, MK. et al. J. Biol. Chem. 273:5993-5996, 1998）、マウス胎仔由来の未分化間葉系細胞を用いた系（Yang, Y., et al. Development 126:3027-3033, 1999）、ES細胞を用いた系（Yamashita, J. et al. Nature 408:92-96, 2000）、マウス胎児の傍大動脈臓側板中胚葉（para-aortic splanchnopleural mesoderm；以下「P-Sp」と称する）を用いた系（Takakura, N. et al. Immunity 9:677-686, 1998）が報告されている。
【００３８】
以上のことから、血管新生を伴う疾患に対して、平滑筋前駆細胞の骨髄からの動員を抑制したり、平滑筋前駆細胞を循環中から吸着したり血管への定着を抑制したりするような、平滑筋前駆細胞を標的とした方法は、血管新生病の治療方法として有効と思われる。
【００３９】
２．造血系に関わる分化増殖制御因子の同定
本発明者らは、上記を踏まえ、平滑筋前駆細胞を標的として作用する造血系の分化増殖因子の探索を試みた。
【００４０】
造血が起こる部位は、発生の過程で、卵黄嚢から、肝臓、そして骨髄へと移動する。このように、特定の時期に特定の臓器でしか造血が起こらないということが古くから形態学者の興味を引き、造血には造血の場が必要であると考えられるようになり、造血微細環境（hemopoietic microenviroment）という概念が生まれた。造血微細環境についてはin vivoの研究が主であり、解析的な研究が困難であったが、1977年にDexterらによって血液細胞と骨髄間質細胞（骨髄ストローマ細胞）の細胞間相互作用を再現したと考えられる培養系が開発され、in vitroの研究に道が開かれた（Dexter et al., J. Cell. Physiol. 91:335, 1977）。さらに1981年以降、数多くのマウス骨髄由来のストローマ細胞株が樹立され、そのうちいくつかは造血幹細胞の増殖を支持する能力を持っていることが示された（Kodama et al., J. Cell. Physiol. 112:89-95, 1982、Zipori et al., J. Cell. Physiol. 118:143-152, 1984）。Kodamaらが新生児マウスの頭蓋冠より樹立したストローマ細胞株PA6とマウス骨髄細胞との共培養では、造血が数ヶ月持続することが示された（Kodama et al., J. Cell. Physiol. 118:233-240, 1984）。
【００４１】
ストローマ細胞はES細胞を分化誘導する機能も持つ。マウスES細胞とストローマ細胞株OP9とを共培養すると血液細胞が誘導されることが知られている（Nakano et al., Science 265, 1098-1101, 1994）。またマウスES細胞を骨髄由来ストローマ細胞ST2と活性型ビタミンD3及びデキサメサゾン存在下で培養すると破骨細胞が形成されるという報告もある（Yamane et al.,Blood 90:3516-3523, 1997）。また、ES細胞をST2上でデキサメサゾン、bFGF（basic Fibroblast growth factor）、コレラトキシン存在下で培養すると色素細胞が誘導される（Yamane et al., Dev. Dyn. 216:450-458, 1999）。ES細胞をストローマ細胞株PA6と無血清培地で培養すると神経細胞が誘導されることも示されている（Kawasaki et al., Neuron 28:31-40, 2000）。また、マウスES細胞を、LIFを加えない条件下でIV型コラーゲンをコートした培養皿にて培養し、その培養細胞からFlk1陽性細胞をセルソーターにて選別し、これをストローマ細胞株OP9と共培養すると、血管内皮細胞が得られることが知られている（Hirashima et al., Blood 93:1253-1263, 1999）。
【００４２】
さらにストローマ細胞は、マウス胎児の傍大動脈臓側板中胚葉（P-Sp）を分化誘導する能力を持っている。ストローマ細胞上でP-Sp組織片（外植体）を培養すると血管形成が観察されることが報告されている（Takakura et al., Immunity,9,677-689,1998、Takakura et al. Cell,102,199-209, 2000）。
【００４３】
in vivoでは、骨髄ストローマ由来の間葉系細胞中に幹細胞が存在し、その幹細胞が骨、脂肪、骨格筋、軟骨、心筋、神経になる能力を持つことも知られている（Pittenger etal., Science 284:143-147,1999）。
【００４４】
ストローマ細胞が持つ、造血支持能を含むこのような幹細胞に対する分化増殖制御機能については、ストローマ細胞が産生する分子の解析に基づいて多くの研究が進められている。ストローマ細胞の造血支持能とサイトカインの関係が特に調べられており、ストローマ細胞が、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、IL-6、IL-7、IL-11、LIF、TGF-β、SCF(stem cell factor)などの造血因子として知られるサイトカインを産生することが示されている。しかし、これらのサイトカインを用いて造血幹細胞を培養すると、造血幹細胞は多分化能を失い、造血幹細胞としての性質を喪失する。このことから、これらのサイトカインを用いて、造血幹細胞の分化を抑制して未分化な状態のまま造血幹細胞株を維持することが可能ではないかと考えられている。
【００４５】
また、マウスのウイルス性乳癌のプロトオンコジーンとして発見されたWnt（Nusse et al., Cell, 31:99-109, 1982）は器官発生に重要な分子であることが知られているが（McMahon et al., Cell 62:1073-1085, 1990）、このWntが、ストローマ細胞が産生する造血因子の一つであることが最近になって示された（Murdoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:3422-3427, 2003）。
【００４６】
一方、ストローマ細胞が産生する、ES細胞から神経、血管内皮細胞、平滑筋細胞への分化を誘導する作用を有する分子の詳細は明らかにされていない。
【００４７】
ストローマ細胞が産生する分子としては、分泌型蛋白質のみならず膜型蛋白質も注目を浴びている。ストローマ細胞株OP9より見出された膜型蛋白質であるkirreにも造血支持作用があることが知られている（Ueno et al., Nat. Immunol. 4:457-463, 2003）。同様に注目を浴びている膜型蛋白質としては、ショウジョウバエで神経細胞の分化制御に関わる分子として発見されたNotch（ノッチ）と呼ばれる受容体蛋白質がある。Notch分子の相同体（ホモログ）は無脊椎動物、脊椎動物の分類を超えた広範囲な生物で見出されている（Artavanis-Tsakonas et al., Science 268:225-232, 1995）。NotchのリガンドであるDelta、Serrate、Jaggedも細胞の分化増殖制御分子として注目されている。Notch、Delta、Juggedのアミノ酸配列構造を比較すると共通してEGF（Epidermal growth factor: EGF）様モチーフ（EGF様ドメイン）の繰り返しが見つかる（Lindsell et al., Cell 80: 909-917, 1995）。EGF様モチーフのコンセンサス配列はC-X-C-X(5)-G-X(2)-C又はC-X-C-X(2)-[GP]-[FYW]-X(4,8)-Cとして表すことができる。
【００４８】
しかしながら、ストローマ細胞が持つ幹細胞に対する分化増殖制御機能は、上記のような既知のストローマ細胞産生分子についての知見では十分な説明ができない。そのため本発明者らは、ストローマ細胞が産生する分化増殖制御機能を担う分化増殖制御分子として、Notch、Delta、及びJuggedと同じ蛋白質ファミリーに属する未同定の蛋白質が存在すると考え、新規の分化増殖制御分子の同定を試みた結果、造血促進作用を有するSELF蛋白質及びそれをコードする遺伝子（SELF遺伝子）の単離にすでに成功している。そのSELF蛋白質及びSELF遺伝子の単離については、特願2004-351903号明細書に記載している。
【００４９】
本発明では、こうして得られたSELF蛋白質のもつ機能をさらに調べた結果、後述の実施例に示される通り、平滑筋細胞分化増殖抑制作用、並びに血管形成阻害作用及び腫瘍形成抑制作用を有することを見出したことから、SELF蛋白質又はSELF遺伝子の平滑筋細胞分化増殖抑制剤、血管形成阻害剤、及び抗腫瘍剤としての用途を提供するに至った。
【００５０】
３．SELF蛋白質
本発明で用いるSELF蛋白質は、EGF様繰り返し配列を持つ、細胞の分化増殖制御機能を有する蛋白質である。このSELF蛋白質は、平滑筋細胞分化増殖抑制作用（特に、血管平滑筋細胞分化増殖抑制作用）をも有する。
【００５１】
本発明のSELF蛋白質の１つの好適な態様は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質である。本発明のSELF蛋白質の別の好適な態様は、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質である。
【００５２】
配列番号２のアミノ酸配列からなるSELF蛋白質は、次のような配列構造を有する。配列番号２のアミノ酸番号１番から21番は、SOSUI（http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html）による検索で予測されるように、シグナルペプチドである。また配列番号２のアミノ酸番号38番から40番までは細胞接着配列RGDである。アミノ酸番号1081番から1084番まではグリコサミノグリカン接着配列である。アミノ酸番号408番、484番、536番、712番，886番、977番、1015番、1109番、1139番、1298番の10個のアミノ酸残基は、アスパラギン結合型糖鎖の付加部位である。EGF様モチーフは15ヶ所存在する。第1 EGF様モチーフは278番システインから308番システインまでに相当する。第2 EGF様モチーフは315番システインから346番システインまでに相当する。第3 EGF様モチーフは353番システインから384番システインまでに相当する。第4 EGF様モチーフは387番アスパラギン酸から422番システインまでに相当する。第5 EGF様モチーフは433番システインから464番システインまでに相当する。第6 EGF様モチーフは472番システインから499番システインまでに相当する。第7 EGF様モチーフは545番システインから576番システインまでに相当する。第8 EGF様モチーフは584番システインから615番システインまでに相当する。第9 EGF様モチーフは623番システインから654番システインまでに相当する。第10 EGF様モチーフは661番システインから692番システインまでに相当する。第11 EGF様モチーフは753番グルタミン酸から788番システインまでに相当する。第12 EGF様モチーフは791番グルタミン酸から826番システインまでに相当する。第13 EGF様モチーフは833番システインから864番システインまでに相当する。第14 EGF様モチーフは871番システインから902番システインまでに相当する。第15 EGF様モチーフは1310番システインから1341番システインまでに相当する。
【００５３】
また、第4 EGF様モチーフ、第11 EGF様モチーフ及び第12 EGF様モチーフはカルシウム結合型のEGF様モチーフであり、蛋白間相互作用に関与している。
【００５４】
また、第6 EGF様モチーフと第7 EGF様モチーフの間にEGF様モチーフに類似した配列が１ヶ所存在する。
【００５５】
配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるSELF蛋白質は、次のような配列構造を有する。配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸番号１番から29番は、SOSUI（http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html）による検索で予測されるように、シグナルペプチドである。配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸番号38番から40番までは細胞接着配列RGDであるアミノ酸番号145番，204番、368番、408番、484番、536番、712番、886番、977番、1015番，1109番、1139番、1310番の10個のアミノ酸残基は、アスパラギン結合型糖鎖付加部位である。EGF様モチーフは15ヶ所存在し、第1 EGF様モチーフは278番システインから308番システインまでに相当する。第2 EGF様モチーフは315番システインから346番システインまでに相当する。第3 EGF様モチーフは353番システインから384番システインまでに相当する。第4 EGF様モチーフは387番アスパラギン酸から422番システインまでに相当する。第5 EGF様モチーフは433番システインから464番システインまでに相当する。第6 EGF様モチーフは472番システインから499番システインまでに相当する。第7 EGF様モチーフは545番システインから576番システインまでに相当する。第8 EGF様モチーフは584番システインから615番システインまでに相当する。第9 EGF様モチーフは623番システインから654番システインまでに相当する。第10 EGF様モチーフは661番システインから692番システインまでに相当する。第11 EGF様モチーフは753番グルタミン酸から788番システインまでに相当する。第12 EGF様モチーフは791番グルタミン酸から826番システインまでに相当する。第13 EGF様モチーフは833番システインから864番システインまでに相当する。第14 EGF様モチーフは871番システインから902番システインまでに相当する。第15EGF様モチーフは1311番システインから1342番システインまでに相当する。
【００５６】
本発明で用いるSELF蛋白質は、配列番号２又は４に表されるアミノ酸配列中において、限定はされないが、好ましくは１〜数個（２〜９個）、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸配列を含み、かつ平滑筋細胞分化増殖抑制作用を有する蛋白質であってもよい。
【００５７】
また配列番号２又は４に表されるアミノ酸配列と、BLAST等を用いて計算したときに（例えば、BLASTのデフォルトすなわち初期条件のパラメーターを用いた場合に）、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは97％、98％若しくは99％以上の相同性を有しており、かつ平滑筋細胞分化増殖抑制作用を有するSELF蛋白質も、本発明においてSELF蛋白質として用いることができる。
【００５８】
本発明で用いるSELF蛋白質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列上のアミノ酸番号21番〜1403番のアミノ酸配列からなる、シグナル配列を含まない蛋白質であってもよい。本発明で用いるSELF蛋白質は、配列番号４で表されるアミノ酸配列上のアミノ酸番号29番〜1413番のアミノ酸配列からなる、シグナル配列を含まない蛋白質であってもよい。
【００５９】
本発明で用いるSELF蛋白質は、平滑筋細胞分化増殖抑制作用を有し、さらに、平滑筋細胞の分化増殖抑制の結果として血管形成を阻害することができる。本発明において「平滑筋細胞分化増殖抑制作用を有する」とは、当該蛋白質の存在下での未分化細胞からの平滑筋細胞の生成が、当該蛋白質の非存在下と比較して減少することを意味する。本発明では、Takakuraらの方法（Takakura, N. et al. Immunity 9:677-686, 1998）に従い、SELF蛋白質の存在下、ストローマ細胞株OP9上でマウス胎児の傍大動脈臓側板中胚葉（P-Sp）を37℃で10日間共培養した後に、血管内皮細胞によるシート様構造（血管床）の形成は認められるが血管網の形成は起こらない場合、そのSELF蛋白質によって平滑筋細胞の分化増殖が抑制されたことを確認することができる。
【００６０】
本発明で用いるSELF蛋白質は、当業者に公知の技術によって製造することができる。例えば、SELF蛋白質は、遺伝子工学的手法により宿主細胞に導入したSELF遺伝子から発現させ、適宜単離精製することにより調製することができる。あるいはSELF蛋白質は、天然にSELF蛋白質を有する生物（好ましくは哺乳類）の組織から抽出してもよい。
【００６１】
４．SELF遺伝子
本発明におけるSELF遺伝子とは、上述のSELF蛋白質をコードする遺伝子を言う。本発明で用いるSELF遺伝子の１つの好適な態様は、EGF様繰り返し配列を有するマウス由来SELF蛋白質をコードする、配列番号１で表される塩基配列からなる核酸である。本発明で用いるSELF遺伝子のさらに好適な態様は、配列番号１で表される塩基配列上の塩基番号157番〜4365番（SELF蛋白質コード領域）を含む塩基配列からなる核酸である。なお、配列番号１の塩基番号157番〜4365番の塩基配列と終止コドンからなるオープンリーディングフレーム配列は配列番号２のアミノ酸配列をコードしている。本発明で用いるSELF遺伝子は、配列番号１の塩基配列の一部であってSELF蛋白質をコードするオープンリーディングフレームよりも外側までを含む4212〜5000bp、好ましくは4212〜4988bpの塩基配列からなる核酸、例えば、配列番号１の塩基番号13番〜5000番までの塩基配列からなる核酸であってもよい。なお配列番号１の塩基番号１番から12番までの配列は、cDNAをクローニングする際に使用した合成核酸由来の配列にも対応している。
【００６２】
本発明のSELF遺伝子の別の好適な態様は、上記マウスSELF遺伝子の塩基配列に基づいて単離されたヒト相同遺伝子（配列番号３）である。この配列番号３の塩基配列は、配列番号４のアミノ酸配列をコードする。
【００６３】
一般に天然の遺伝子では、遺伝コードの縮重により、アミノ酸レベルの変異を生ずることなく塩基配列が変異した例がしばしば認められる。また、5’非翻訳領域及び3’非翻訳領域は蛋白質のアミノ酸配列をコードしないので、塩基配列に変異が生じやすい。本発明では、そのような変異が天然に生じたSELF遺伝子も好適に用いることができる。さらに、人工的に変異導入したSELF遺伝子も、平滑筋細胞分化増殖抑制作用を保持するSELF蛋白質をコードする限り、本発明において好適に用いることができる。SELF遺伝子への人工的な変異導入は、当業者に周知の突然変異誘発法（例えばKunkel法や Gapped duplex法等又はこれに準ずる方法）により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K（TAKARA社製）やMutant-G（TAKARA社製））などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて行うことができる。
【００６４】
本発明で用いるSELF遺伝子としては、配列番号１で表される塩基配列上の塩基番号157番〜4365番を含む塩基配列（マウス由来核酸）、又は配列番号３で表される塩基配列（ヒト由来核酸）と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ平滑筋細胞分化増殖抑制作用を有する蛋白質をコードする核酸からなる遺伝子も好適である。ここでストリンジェントな条件とは、例えばMolecular Cloning, A laboratory manual, 2001, Eds., Sambrook, J. & Russell, DW. Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されているハイブリダイゼーション条件を指す。本発明における典型的なストリンジェントな条件とは、核酸を固定したフィルターを用いて、0.7〜1.0MのNaCl存在下、68℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のSSC溶液（1倍濃度のSSCとは150mM NaCl、15mMクエン酸ナトリウムからなる）を用い、68℃で洗浄する条件を言うが、実質的に同等の条件ならば良い。
【００６５】
本発明で用いるSELF遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列上の塩基番号157番〜4365番を含む塩基配列、又は配列番号３で表される塩基配列との相同性が、BLAST等を用いて計算したときに（例えば、BLASTのデフォルトすなわち初期条件のパラメーターを用いた場合に）、70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上、96％以上、97％以上、98％以上若しくは99％以上である塩基配列からなり、かつ平滑筋細胞分化増殖抑制作用を有するSELF蛋白質をコードする遺伝子であってもよい。
【００６６】
本発明で用いるSELF遺伝子は、例えば、Notch及びDelta蛋白質に認められるEGF様モチーフのアミノ酸配列を検索し、これらの蛋白質のEGF様モチーフ配列に比較的高い頻度で出現するアミノ酸配列を指標としてクローニングすることができる。既知コンセンサス配列の情報から目的の遺伝子をクローニングする方法としては、そのコンセンサス配列を含む核酸をプローブとしてハイブリダイゼーション法にて相同性の高い遺伝子をクローニングする方法（Shibuya et al., Oncogene 5:519-524,1990）、コンセンサス配列の特徴に基づいて、縮重プライマーを設計しPCR増幅法にてDNA断片をクローニングする方法などがある（Iwama et al., Blood 83:3160-3169, 1994）。なおNotch、Delta、JuggedのファミリーのEGF様ドメインコンセンサス配列をもとに作製した縮重プライマーを用いてPCRを行うことによる、Deltaの相同遺伝子の単離法が報告されている（Yoneya et al., J. Biochem. 129:27-34,2001）。
【００６７】
本発明では、本発明者らが同定したEGF様モチーフ中に高頻度に出現する配列CPPGF（配列番号１８）及びNGGTC（配列番号１９）に基づいて縮重（degenerate）プライマーを設計し、それをDNA合成機で合成し、精製して用いて、任意の生物試料から調製したmRNA調製物からRT-PCRによりSELF cDNA断片を増幅することができる。次いでそのSELF cDNA断片を各種ベクター中にクローニングして、SELF cDNA断片の塩基配列を決定する。こうしてクローニングされたcDNA断片は、通常は完全長cDNAの部分断片であるため、決定された配列の塩基配列に基づいて該断片に特異的なプライマーを作製し、さらにRACE法を行うことにより、さらに３'及び５'側の配列を決定することができる。このRACE法によればSELF遺伝子の全長配列を得ることができる。あるいは、SELF遺伝子の完全長cDNAのクローニングは、配列が決定された完全長cDNAの部分断片をラジオアイソトープ等で標識してプローブとして用いて、mRNAから作製したcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、行うこともできる。
【００６８】
上記のRT-PCRによりSELF cDNAを作製するためには、任意の生物由来の細胞から調製されたmRNAを鋳型として用いることができる。しかしながら、哺乳類（例えばげっ歯類又は霊長類）由来の細胞から調製されたmRNAを用いることが好ましい。また、このmRNAは、任意の臓器又は組織由来の細胞から調製されたものであってもよいが、ストローマ細胞由来のmRNAを用いることが好ましい。ストローマ細胞は、幹細胞あるいは前駆細胞の増殖・分化を支持する細胞株を意味し、例えばPA6、OP9、又はST2、好ましくはPA6が挙げられる。
【００６９】
SELF遺伝子の完全長cDNAの塩基配列が一旦決定されれば、その後は化学合成によって、又はcDNAを鋳型としたPCRによって、あるいは該塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、当業者であれば容易にSELF遺伝子を取得することができる。例えば、SELF遺伝子の完全長cDNAを含む塩基配列（例えば配列番号１又は３）に基づき、好ましくはオープンリーディングフレームの全体が含まれる増幅産物をPCR増幅できるようなプライマーを設計し、それを化学合成して、mRNAを鋳型としたPT-PCRを行うことにより、SELF遺伝子を含むDNA断片を得ることができる。この場合に鋳型として用いるmRNAとしても、任意の生物由来の細胞から常法によって調製されたmRNAを用いることができる。例えば、ヒトSELF遺伝子を含むDNA断片を取得したい場合には、ヒト由来の細胞から調製したmRNAを用いればよい。
【００７０】
５．SELF遺伝子を含む発現ベクターの作製とそれを用いたSELF蛋白質の製造
上記SELF蛋白質、及び上記SELF遺伝子を含む発現ベクターは、本発明における平滑筋細胞分化増殖抑制剤の有効成分としてそれぞれ好適に用いることができる。
【００７１】
SELF遺伝子を含む発現ベクターは、当業者に周知の遺伝子工学的手法を用いて作製することができる。SELF遺伝子を挿入する発現ベクターは、宿主細胞中で挿入遺伝子の転写を誘導できるものであれば特に限定されないが、典型的には、遺伝子挿入部の5'上流にプロモーター配列を組み込んだベクターであることが好ましい。SELF遺伝子を挿入する発現ベクターは、構成性発現ベクターであってもよいし、温度や薬剤などをインデューサーとする誘導性発現ベクターであってもよい。SELF遺伝子を挿入する発現ベクターは、大腸菌や枯草菌などの細菌、酵母などの真菌、昆虫細胞や哺乳類細胞などの動物細胞、又はイネ細胞などの植物細胞を宿主とした発現ベクターでありうる。そのような発現ベクターは、限定するものではないが、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、ファージミドベクターなどであってよい。例えばプラスミドとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばpBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等）、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13、YEp24、YCp50等）などから作製された発現ベクターが挙げられる。ファージとしてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等）などから作製された発現ベクターが挙げられる。さらに、無毒化又は弱毒化した、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、SV40、免疫不全症ウイルス（HIV）等のDNAウイルス又はRNAウイルス、pCI-neo、pcDNA3、pZeoSV等の動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスなどから作製した発現ベクターを用いることもできる。プロモーター配列は、宿主細胞中で発現誘導できるものであればいずれを用いてもよい。細菌宿主を用いる場合は、限定するものではないが、例えばtrpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。tacプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。酵母宿主を用いる場合は、限定するものではないが、例えばgal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等を用いることができる。動物細胞を宿主とする場合は、限定するものではないが、例えば、プロモーターとしてSRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMVプロモーター、アクチンプロモーター、EF-1α（elongation factor-1α）プロモーター、ユビキチンプロモーター、PGK（ホスフォグリセリン酸キナーゼ）プロモーター等が用いられる。
【００７２】
SELF遺伝子の発現ベクターへの挿入には、SELF遺伝子を含む精製DNA断片を適当な制限酵素で切断し、それを発現ベクターの対応する制限酵素部位（例えばマルチクローニングサイト）に連結する方法などが採用される。
【００７３】
SELF遺伝子は、宿主細胞内で適切に発現されるように発現ベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明で用いる発現ベクターは、プロモーター配列、SELF遺伝子のほか、宿主に応じてエンハンサーなどのシスエレメント、ポリA付加シグナル、リボソーム結合配列（SD配列）、及び転写終結配列などを含んでもよい。
【００７４】
本発明で用いる発現ベクターは、さらに選択マーカー遺伝子、レポーター遺伝子、タグペプチド配列、動物型糖鎖合成系遺伝子などを含んでもよく、さらにプロモーターを制御する遺伝子を含んでもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチル転移酵素遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子、β-ガラクトシダーゼ遺伝子などが挙げられる。
【００７５】
上記のようなSELF遺伝子を含む発現ベクターを、該ベクターが適合する宿主細胞中に導入して形質転換体を作製し、発現誘導することによりSELF蛋白質を産生させることができる。形質転換する宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞、植物細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）K12株DH1(Low, B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60:160-167, 1968）、JM103（Messing, J et al. Nucleic Acids Res.9:309-321, 1981）、JM109、JA221（Clarke L et al. J. Mol. Biol. 120:517-532, 1978）、HB101(Boyer, HW et al. J. Mol. Biol. 41:459-472, 1969)、C600（Appleyard, RK Genetics 39:440-452, 1954）などが用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Bacillus subtilis）MI114（Kawashima, S. et al. J. Biochem., 95: 87-93, 1984）などが用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）AH22、AH22R、NA87-11A、DKD-5D、20B-12、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）NCYC1913、NCYC2036、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などが用いられる。昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがAcNPVの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Sf細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のMG1細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM 細胞、Mamestrabrassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがBmNPVの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞（ATCC CRL1711）、Sf21細胞（In Vivo, 13: 213-217, 1977）などが用いられる。昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる（Nature, 315:529, 1985）。動物細胞としては、例えば、サル細胞COS-1、COS-7、Vero、CV-1、チャイニーズハムスター細胞CHO（以下、CHO細胞と略記），dhfr遺伝子欠損CHO、ハムスター細胞BHK、ラットGH3、ラット褐色腫由来細胞PC12、マウスＬ細胞、マウスAtT-20、マウスミエローマ細胞、マウスリンパ腫細胞EL4、マウス線維芽細胞NIH3T3、10T1/2、マウス筋芽細胞C2C12、マウスストローマ細胞PA6、ST2、 OP9、Tst-4、ヒト巨核芽球細胞CMK、ヒトT細胞Jurkat、ヒト腎上皮細胞293、ヒト肝臓ガン細胞HepG2、ヒト骨肉腫細胞MG-63、ヒトFL細胞、白色脂肪細胞、卵細胞、ES細胞、また適当な分化条件により分化誘導された細胞などが用いられる。また動物個体へのDNA移入への一過程としての卵細胞、あるいはES細胞（Evans, MJ & Kaufman, MH  Nature 292:154-156, 1981）も使用される。
【００７６】
これらの細胞を形質転換する方法としては、リポフェクション法（Focus, 21:54, 1999）、リン酸カルシウム法（Graham FL & Eb AJ van der Virology 52:456-467, 1973）、エレクトロポレーション法（Molecular Cloning, 3rd. Ed. 16.33-16.36, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2001）、マイクロインジェクション法などが用いられる。より具体的には、エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 89:2110-2144, 1972）やGene（17:107, 1982）などに記載の方法に従って行なうことができる。バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Mol. Gen. Genet（168:111-155, 1979）などに記載の方法に従って行なうことができる。酵母を形質転換するには、例えば、Methods in Enzymology（194:182-187, 1991）やProc. Natl. Acad. Sci. USA（75:1929-1933, 1978）などに記載の方法に従って行なうことができる。昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Bio/Technology（6, 47-55, 1988）などに記載の方法に従って行なうことができる。動物細胞を形質転換するには、例えば、Molecular Cloning, 3rd. Ed.（ 16.1-16.62, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2001）、Virology（ 52:456-467, 1973）に記載の方法に従って行なうことができる。
【００７７】
該形質転換体の培養はそれ自体公知の方法で行なう。宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のpHは約5〜8が望ましい。エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地（Experiments in Molecular Genetics，431-433，Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972）が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、3β-インドリル アクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約15〜43℃で約3〜24時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約30〜40℃で約6〜24時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地（Bostian, KL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4505, 1980）や0.5％カザミノ酸を含有するSD培地（Bitter, GA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330-5334, 1984）が挙げられる。培地のpHは約5〜8に調整するのが好ましい。培養は通常約20℃〜35℃で約24〜72時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Nature, 195:788, 1962）に非動化した10％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のpHは約6.2〜6.4に調整するのが好ましい。培養は通常約27℃で約3〜5日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約5〜20％の胎児牛血清を含むMEM培地(Seience,122:501, 1952)、DMEM培地（Dulbecco, R. & Freeman, G. Virology 8:396-397, 1959）、RPMI 1640培地（The Journal of the American Medical Association,199:519, 1967）、199培地（Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73:１, 1950）などが用いられる。pHは約6〜8であるのが好ましい。培養は通常約30℃〜40℃で約15〜60時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。このようなSELF遺伝子を導入した形質転換体の培養は、SELF遺伝子の発現が誘導される条件下で行う。例えば、温度や薬剤によって転写誘導を引き起こすプロモーターを組み込んだ誘導性発現ベクターを用いた場合には、培養温度を当該温度に設定したり当該薬剤を培地に添加したりすればよい。
【００７８】
培養終了後、その培養液から遠心分離等により菌体又は細胞を除去し、得られた培養上清を当業者に公知の蛋白質分離精製法（例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等）にかけることにより、SELF蛋白質を単離精製することができる。
【００７９】
６．SELF蛋白質又はSELF遺伝子を含む発現ベクターを含有する製剤
本発明では、SELF蛋白質又はSELF遺伝子を含む発現ベクターを有効成分として含有する組成物を、平滑筋細胞の分化増殖を抑制するための製剤、すなわち平滑筋細胞分化増殖抑制剤として用いることができる。本発明の平滑筋細胞分化増殖抑制剤において用いるSELF蛋白質又はSELF遺伝子は、限定するものではないが、投与対象と同一又は近縁な生物種に由来するものが好ましい。
【００８０】
本発明の平滑筋細胞分化増殖抑制剤は、限定するものではないが、例えば、医薬組成物、化粧料、機能性食品、飼料、又は研究用若しくは検査用試薬の有効成分として、好適に用いることができる。
【００８１】
本発明では、平滑筋細胞分化増殖抑制剤を用いて、未分化細胞から平滑筋細胞への分化及びその分化した平滑筋細胞の増殖を抑制することができる。本発明の平滑筋細胞分化増殖抑制剤によって分化増殖が抑制される平滑筋細胞は、血管平滑筋細胞、消化管平滑筋細胞、気管支平滑筋細胞、膀胱平滑筋細胞などの任意の平滑筋細胞であってよいが、好ましくは血管平滑筋細胞（動静脈における平滑筋細胞と、毛細血管における周皮細胞の両方を包含する）である。ここで未分化細胞は、任意の未分化細胞を包含するが、好ましくは造血幹細胞、造血前駆細胞、骨髄幹細胞、末梢血幹細胞、神経提細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、平滑筋前駆細胞などでありうる。本発明において平滑筋細胞の分化増殖を「抑制する」とは、平滑筋細胞の分化増殖が誘導されうる条件下において、平滑筋細胞を増加させないか又はその増加レベルを減少させることを意味する。例えば、血管新生部位に本発明の平滑筋細胞分化増殖抑制剤を投与することにより、血管平滑筋細胞の分化増殖が抑制され、さらなる新生血管を構成するだけの数の平滑筋細胞が生成されなくなる。
【００８２】
本発明の平滑筋細胞分化増殖抑制剤は、平滑筋細胞の分化増殖が誘導されうる条件下にある未分化細胞又は未分化細胞を含む組織に対してSELF蛋白質が作用しうる様式で、被験体又は被験試料に投与することが好ましい。本発明の平滑筋細胞分化増殖抑制剤は、ヒト又は動物の被験体中の、平滑筋細胞の異常な増殖が認められるか又は予測される部位、例えば血管新生が生じているか又は生じることが予測される部位（例えば、動脈硬化を生じた血管壁、血管新生緑内障などを生じた眼、悪性腫瘍を始めとする腫瘍など）に注射などで直接、局所投与してもよいし、全身投与してもよい。あるいは本発明の平滑筋細胞分化増殖抑制剤は、未分化細胞（例えば、ES細胞、神経堤細胞）を含む培養培地などの被験試料に直接添加してもよい。本発明のSELF蛋白質を含有する平滑筋細胞分化増殖抑制剤を、ストローマ細胞と未分化細胞（例えばES細胞）とのin vitro共培養系に添加して、その未分化細胞からのin vitroでの血管形成などを阻害してもよい。
【００８３】
本発明の平滑筋細胞分化増殖抑制剤は、医薬組成物として特に好適に用いることができる。例えば本発明の平滑筋細胞分化増殖抑制剤は、後述の実施例に記載されるように、血管平滑筋細胞の分化増殖を抑制することによって血管形成を効果的に阻害することができる。従って本発明は、平滑筋細胞分化増殖抑制剤を含有する、血管形成阻害のための医薬組成物（血管形成阻害剤）をも提供する。ここで本発明の平滑筋細胞分化増殖抑制剤による「血管形成阻害」とは、それを投与した細胞、組織又は臓器等において、新たな血管形成（脈管形成及び血管新生を含む）を停止させるか、又はその進行を遅延させることを言う。本発明の平滑筋細胞分化増殖抑制剤を投与することにより血管形成が抑制されることは、例えば、その投与部位に新たな血管網の形成が観察されないことに基づいて確認することができる。
【００８４】
本発明の平滑筋細胞分化増殖抑制剤はまた、後述の実施例に記載されるように、腫瘍血管形成を阻害することにより、腫瘍形成を効果的に抑制することができる。従って本発明は、平滑筋細胞分化増殖抑制剤を含有する、腫瘍形成抑制のための医薬組成物（抗腫瘍剤）も提供する。ここで本発明の平滑筋細胞分化増殖抑制剤による「腫瘍形成抑制」とは、腫瘍の発育（成長）を停止させるか、又は腫瘍の発育を遅延させることを言う。本発明の平滑筋細胞分化増殖抑制剤を投与することにより腫瘍形成が抑制されることは、例えば、腫瘍のサイズの経時的な増加量が、平滑筋細胞分化増殖抑制剤を投与しない場合と比較して減少することに基づいて確認することができる。
【００８５】
本発明の平滑筋細胞分化増殖抑制剤を含有する医薬組成物は、平滑筋細胞の異常な分化増殖を伴う疾患、例えば、動脈硬化性疾患、血管形成の異常な亢進を伴う疾患、腫瘍形成を伴う疾患などの治療用又は予防用に好適である。そのような疾患の具体例としては、限定するものではないが、虚血性疾患、例えばアテローム性動脈硬化、脳梗塞、脳出血、急性心筋梗塞、末梢動脈閉塞症、狭心症、虚血性発作など；糸球体腎炎；眼科的血管新生関連疾患、例えば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、虹彩ルベオーシス、鎌状赤血球網膜症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症、網膜中心動脈閉塞症、加齢性黄斑変性症、血管新生緑内障など；慢性炎症性疾患、例えば慢性関節リウマチ等の異常な血管新生に基づく関節炎など；皮膚科的血管新生関連疾患、例えば尋常性乾癬等の乾癬など；血管透過性の異常な亢進を伴う疾患、例えば腹水癌、胸水癌、Crow-Fukase症候群、卵巣過敏症症候群など；非癌性腫瘍、固形腫瘍及び転移腫瘍を含む悪性腫瘍等の腫瘍などが挙げられる。悪性腫瘍としては、例えば腎癌、乳癌、脳腫瘍、消化器癌、卵巣癌、肝癌、血管腫、血管線維腫、多発性骨髄腫などの原発癌および転移癌が挙げられる。
【００８６】
本発明の医薬組成物を投与する被験体は、ヒト、家畜、愛玩動物、実験（試験）動物等を含む哺乳動物であることが好ましい。特に、上記のような平滑筋細胞の異常な分化増殖を伴う疾患に罹患しているか又は罹患する可能性の高い哺乳動物が、本発明の医薬組成物を投与する被験体として好ましい。
【００８７】
本発明の医薬組成物は、種々の形態で投与することができる。このような投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与であってもよいが、注射剤、点眼剤、点滴剤、座薬などによる非経口投与がより好ましく、とりわけ患部への直接注入用の注射剤がさらに好ましい。かかる組成物は、公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含みうる。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射剤は、SELF蛋白質又はSELF遺伝子を含む発現ベクターを通常注射剤に用いられる無菌の水性若しくは油性液に溶解、懸濁又は乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用しても良い。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用しても良い。
【００８８】
本発明の医薬組成物の投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、通常経口投与では、SELF蛋白質又はSELF遺伝子を含む発現ベクターの量で、1日約0.001mg〜数百mgであり、１回又は数回に分けて投与する。また、非経口投与では、１回あたり、SELF蛋白質又はSELF遺伝子を含む発現ベクターの量で0.001mg〜数百mgを皮下注射、筋肉注射、又は静脈注射によって投与する。
【００８９】
ところで、SELF遺伝子を含む発現ベクターを有効成分として含む本発明の医薬組成物は、いわゆる遺伝子治療用の医薬に相当する。
【００９０】
1990年に米国NIHにおいて世界最初の遺伝子治療がアデノシンデアミナーゼ欠損症患者に対して開始され（Culliton, BJ Science,249:1372, 1990）、現在では、遺伝子治療は、難病治療の戦略の一つに考えられだしている。遺伝子治療では、核酸をin vivoおよびex vivoで患者に導入する工程を含む。核酸は、一般的には、治療に必要な標的蛋白質をコードするか、標的蛋白質の機能を阻害するアンチセンス核酸もしくはshRNAをコードしており、通常はその核酸配列を細胞内に移送し、発現をコントロールする機能を持つベクターに連結されている。
【００９１】
in vivo遺伝子治療では、標的蛋白質が必要とされている部位にその蛋白質をコードする核酸が直接導入される。例えば、全身投与によってそのような核酸を腫瘍に送達することが考えられる。これは、転移性癌またはすでに微視的な転移が起こっているかもしれない癌を攻撃する上で有用である。内視鏡等で腫瘍塊を同定できる場合には、直接、局所的に標的核酸含有ベクターを投与することができる。また、腫瘍を切除する前、切除中、切除後に治療することもできる。カテーテルによって標的核酸含有ベクターを送達することもできるし、腫瘍血管系を利用して標的核酸含有ベクターを腫瘍に送達することもできる。本発明のSELF遺伝子を含む発現ベクターを含有する医薬組成物を遺伝子治療に用いる場合にも、このような従来の遺伝子治療法で用いられている各種投与法を用いることができる。特に本発明のSELF遺伝子を含む発現ベクターを含有する医薬組成物については、全身投与して該発現ベクターが患部（例えば、腫瘍部位や動脈硬化部位など）に送達されるようにしてもよいし、患部の周辺に投与してもよいが、患部に直接投与することが最も好ましい。本発明のSELF遺伝子を含む発現ベクターを含有する医薬組成物は、好ましくは、数日又は数週間又は数ヶ月おきに１回あたり、0.001mg〜数百mgを皮下注射、筋肉注射、又は静脈注射によって投与される。
【００９２】
ex vivo遺伝子治療では、患者由来の細胞を採取し、少なくともいくらかの期間、体外に保持する。この期間に、採取した細胞に標的核酸含有ベクターを導入し、その後に細胞を患者に戻す。遺伝子治療において、核酸を細胞に導入する方法は、広く３つの方法に分類される。すなわち、物理的方法、化学的方法および生物学的方法である。物理的方法には、エレクトロポレーション法（Potter et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81:7161-7165, 1984）、マイクロインジェクション法（Harland and Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099, 1985）およびパーティクル銃を用いる方法（Johnston, SA.  Nature 346: 776-777, 1990）などが挙げられる。化学的方法には、リン酸カルシウム沈殿法(Graham and Van Der Eb, Virology 52:456-467, 1973)、DEAE-デキストラン法（Gopal, Mol. Cell Biol. 5:1188-1190, 1985）及びリポソーム法（Felgner, PL. et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84:7413, 1987）などが挙げられる。生物学的方法として、トランスフェリンなどの受容体を介した導入法（Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3410-3414, 1990）や不活化HVJウイルスと融合したリポソームを用いた膜融合リポソーム法（Kaneda et al., Science 243:375-378, 1989）およびウイルスベクターを用いた方法が挙げられる。本発明のSELF遺伝子を含む発現ベクターを含有する医薬組成物は、このような従来公知の方法に従って、ex vivo遺伝子治療に用いることもできる。
【００９３】
遺伝子治療に好適に用いられるウイルスベクターには、レトロウイルスベクター（Cavazzna-Calvo, M. et al., Science 288:669-672, 2000）、アデノウイルスベクター（Rosenfield, MA. Et al. Cell, 68:143-155, 1992）、アデノ随伴ウイルスベクター（Samulski, RJ. et al., J. Viol. 63:3822-3828, 1989）、レンチウイルスベクター（Miyoshi, H. et al. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 94:10319-10323）、ワクシニアウイルスベクター（Elroy-Stein, O., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130, 1989）、シンドビスウイルスベクター（Berglund, P et al., Biotechnology 11:916-920, 1993）などが挙げられる。本発明において遺伝子治療に用いるベクターは、投与対象とする宿主において発現可能なものを用いることが好ましい。例えば投与対象がヒトである場合には、哺乳類細胞を宿主とするプラスミドやウイルス等に基づくベクターを用いることが好ましい。
【００９４】
本発明は、上記のような医薬組成物の製造におけるSELF蛋白質又はSELF遺伝子を含む発現ベクターの使用にも関する。また本発明は、SELF蛋白質又はSELF遺伝子を含む発現ベクターを有効成分として含む医薬組成物を投与することによる、上記のような平滑筋細胞の異常な分化増殖を伴う疾患、特に、動脈硬化性疾患、血管形成の異常な亢進を伴う疾患、腫瘍形成を伴う疾患などの治療又は予防方法にも関する。
【００９５】
７．平滑筋細胞分化増殖抑制剤と血管内皮細胞増殖因子阻害剤との併用
本発明では、SELF蛋白質又はSELF遺伝子を含む発現ベクターを有効成分として含む平滑筋細胞分化増殖抑制剤と血管内皮細胞増殖因子（VEGF）阻害剤との併用により、血管形成（特に腫瘍血管新生）に対し、さらに高い抑制効果を得ることができ、その結果として腫瘍形成（特に悪性腫瘍の発育及び転移）を顕著に抑制することができる。
【００９６】
ここで血管内皮細胞増殖因子阻害剤としては、限定するものではなく、松本らにより（高倉伸幸編、「基礎から臨床応用までの血管研究がわかる」羊土社、2004年10月,p91-99）解説されているが、抗体として、血管内皮細胞増殖因子の中和抗体、FGFの中和抗体、アンジオポエチン-2の中和抗体、Tie-2抗体、VEGF受容体抗体などが挙げられ、VEGF受容体、Tie-2、エンドスタチン、アンジオスタチン、コンドロモジュリン（Hiraki et al. J. Biol. Chem., 272:32419-32426, 1997）、テノノジュリン（Shukunami et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 280:1323-1327, 2001）、アンジオポエチン-2、トロンボスポンジン、インターフェロン及びそれら蛋白質をコードする核酸などが挙げられる。さらに、VEGF、VEGF受容体、FGF、FGF受容体、アンジオポエチン-2、Tie-2などのアンチセンスオリゴマーまたはsiRNAも挙げることができる。好ましい血管内皮細胞増殖因子阻害剤の例としては、可溶型VEGF受容体とヒトIgG1の定常領域（Fc）とのキメラ蛋白質であるFlt1-Fc蛋白質を発現するベクター mFlt-1-hIgG1（Hirashima, M., et al., Blood 93:1253-1263, 1999）がある。なお血管内皮細胞増殖因子受容体をコードする遺伝子は、ヒト（GenBankアクセッション番号X51602）、マウス（GenBankアクセッション番号NM010228）ラット（GenBankアクセッション番号NM 019306）などで同定されている。
【００９７】
本発明の平滑筋細胞分化増殖抑制剤と血管内皮細胞増殖因子阻害剤は、混合状態で投与してもよいし、薬剤毎に別個にかつ同時に投与してもよいし、それら薬剤を連続的に投与してもよい。このような本発明の併用医薬は、腫瘍に直接投与することがより好ましい。
【００９８】
従って本発明は、本発明に係る平滑筋細胞分化増殖抑制剤と血管内皮細胞増殖因子阻害剤とを含有する、血管形成阻害又は腫瘍形成抑制のための医薬組成物に関する。平滑筋細胞分化増殖抑制剤と血管内皮細胞増殖因子阻害剤は、医薬組成物中に任意の用量比であってよいが、１：１の用量比で含有されていることがより好ましい。
【００９９】
さらに本発明は、本発明に係る平滑筋細胞分化増殖抑制剤と血管内皮細胞増殖因子阻害剤とを、併用するために組み合わせて含む、血管形成阻害又は腫瘍形成抑制のための医薬品キットにも関する。この医薬品キットに含まれる平滑筋細胞分化増殖抑制剤と血管内皮細胞増殖因子阻害剤は、それぞれ単回用量であってもよいし、複数回用量であってもよい。この医薬品キットには、注射器、投与説明書などが含まれていてもよい。
【実施例】
【０１００】
以下、実施例等を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はそれらより限定されるものではない。
【０１０１】
参考例１
EGF様繰り返し配列を持つ新規遺伝子のクローニング
本発明者らは、まず、Notch蛋白質及びDelta蛋白質に認められるEGF様モチーフのアミノ酸配列を検索し、これらの蛋白質のEGF様モチーフ配列に比較的高い頻度で配列CPPGF及びNGGTCが出現することを突き止めた。これらのアミノ酸配列に基づいて縮重プライマー、EGFLM-s、EGFLM-asを設計し、化学合成法により作製した。EGFLM-sの５'末端にはEcoR I部位を、EGFLM-asの５'末端にはBamH I部位を導入した。これらの縮重プライマーの配列を以下に示す。
【０１０２】
EGFLM-s ： GAA TTC TGY CCN CCN GGN TTY T（配列番号５）
EGFLM-as： GGA TCC RCA NGT NCC NCC RTT（配列番号６）
R = A又はG、Y = C又はT、N = G、A、T、又はC
【０１０３】
これらの縮重プライマーを用いて、下記のようにして、マウスストローマ細胞PA6（Kodama et al., J. Cell. Physiol. 112, 89-95, 1982）のmRNAを鋳型として用いるRT-PCR（reverse transcription PCR）を行った。
【０１０４】
マウスストローマ細胞PA6からのmRNAの調製は、ファルマシア社製のmRNA分離キットを用いて、添付の説明書に従って行った。cDNAの合成はGIBCO-ライフテック-BRL社製のスーパースクリプトIIを用いて添付の説明書に従って行った。合成したcDNA（0.5μｇ）を鋳型とし、それに10×緩衝液（500mM KCl、100mM Tris-HCl(pH8.3)、15mM MgCl2、0.01％ゼラチン）を５μl、2.5mM dNTP混合液（ファルマシア社製）を４μl、40μMの前記プライマーEGFLM-s及びEGFLM-asをそれぞれ１μl加え、最終的に脱イオン水を加えて全量を49μlとした。次にTaq DNAポリメラーゼ（東洋紡社製 ５U/μl）を１μl加えた後、PCR反応を、94℃で１分間、48℃で２分間、72℃で３分からなる工程を１サイクルとして35サイクル行い、最後に４℃にて終了するように行った。得られたPCR産物の一部についてアガロースゲルにて電気泳動を行ったところ、約0.2kb、約0.35kb、約0.6kbの複数の増幅産物が確認された。そこで、このPCR産物２μlを使用して、T4 DNAリガーゼにより増幅産物をベクターpCR II（インビトロジェン社製）中に連結させるライゲーション反応を行った。このライゲーション反応物を用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドDNAを調製した。
【０１０５】
次にこのプラスミドDNAを制限酵素EcoR Iで消化し、アガロースゲルにて電気泳動を行って、増幅産物が組み込まれているプラスミドクローンを選択した。
【０１０６】
選択された200クローン中のインサートDNAの塩基配列を決定したところ、50クローンがEGF様モチーフを含むアミノ酸配列をコードするインサートDNAを有していた。その50クローンの内訳は、dlk cDNA断片を含むものが30クローン、Delta-1 cDNA断片を含むものが11クローン、Jagged-2 cDNA断片を含むものが８クローン、新規遺伝子のものと思われるcDNA断片を含むものが１クローン（プラスミドクローン pCR2-E13）であった。この新規遺伝子をE13と名付けた。E13のcDNA断片は３つのEGF様モチーフをコードしていることが判明した。なお、このE13のcDNA断片の塩基配列は、配列番号１の塩基番号1624番から2172番までの塩基配列に相当し、E13の塩基配列から推定されるアミノ酸配列は配列番号２のアミノ酸番号490番から672番までのアミノ酸配列に相当する。
【０１０７】
参考例２
完全長E13 cDNAのクローニング
参考例１でクローニングしたE13遺伝子の完全長cDNAをクローン化するために、Marathon cDNA Amplificationキット（クローンテック社製）を原則として本キットのマニュアルに従って使用して、RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）法を実施した。E13遺伝子の５'末端及び３'末端をクローニングするために、E13特異的プライマー、E13-GSP-1as及びE13-GSP-2sを、参考例１でクローニングしたE13 cDNA断片の配列に基づいて設計し、化学合成法により作製した。それらのプライマーの配列を以下に示す。
【０１０８】
E13-GSP-1as： AGTGCCGTCCAGAGAATCCTGG（配列番号７）
E13-GSP-2s： GGAGGCACATGCAAGGAAATGGGCGACG（配列番号８）
【０１０９】
次いで、上記キットのマニュアルに従って、マウスPA6由来のmRNAから参考例１に記載のようにして合成されたcDNAに、キット添付のMarathon cDNAアダプターを連結した。次に、５'末端側についてはE13遺伝子特異的プライマーE13-GSP-1asとキットに添付されているアダプタープライマーAP1とを用いてPCRを行い（5'RACE）、３'末端側についてはE13遺伝子特異的プライマーE13-GSP-2sと前記AP1とを用いてPCRを行った（3' RACE）。得られたそれぞれのPCR産物を使用して、T4 DNAリガーゼにより、増幅産物をベクターpT-Adv（クローンテック社製）中に連結するライゲーション反応を行った。このライゲーション反応物を用いて大腸菌を形質転換した。これらの形質転換体のレプリカを作製し、それらをワットマン541に写し取った。この転写物に対し、常法に従い、32Pでラベル化したE13遺伝子断片（参考例１で得られたcDNA断片）をプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーションを行った。陽性のクローンからプラスミドDNAを調製した。調製したプラスミドDNAをEcoR I消化し、アガロースゲルにて電気泳動することにより、目的のDNA断片が挿入されていることを確認した。次いでそのプラスミドDNA中のインサートDNAの塩基配列を、アプライドバイオシステムズ社のシークエンサーPRIZM 377XLにより、BigDye Terminator Cycle Sequencingキットを用いて決定した。配列決定を行ったプラスミドクローン5C中に挿入されていた3' RACEにて得られた約3.4kbのDNA断片の塩基配列の解析結果から、配列番号１の塩基番号1930番から5245番までの塩基配列が明らかになった。また、配列決定を行ったプラスミドクローン8N中に挿入されていた5' RACEにて得られた約1.4kbのDNA断片の塩基配列の解析結果から、配列番号１の塩基番号703番から2127番までの塩基配列が明らかになった。
【０１１０】
以上にて決定された配列よりもさらに５' 上流のE13 cDNA配列をクローニングするために、E13 mRNAに相補的なプライマーDNA E13-R1718を設計し、それを化学合成した。E13-R1718の塩基配列は以下の通りである。
【０１１１】
E13-R1718： GACATACTTTGTTGTCACACGAAGATTGGCCCGATTCACAGG（配列番号９）
【０１１２】
このプライマーE13-R1718を用いて、PA6由来のmRNA１μgからライフテック社のキットを用いてcDNAを合成した。まず、１μgのPA6由来mRNAを４μlの蒸留水に溶解し、２μMのE-13-R1718プライマーを１μl添加した。次に70℃にて２分間加熱した後、氷上で２分間冷却した。５×ファーストストランド反応液２μl、0.1M DTT溶液１μl、10mM dNTP混合液１μl、逆転写酵素スーパースクリプトII １μlを添加し、45℃にて１時間、55℃にて30分間保温した。
【０１１３】
続いてその反応液に、蒸留水48.4μl、５×セカンドストランド反応液16μl、10mM dNTP混合液1.6μl、20×セカンドストランド酵素混合液４μlを加え、16℃にて1.5時間反応させた。次に５U/μlのT4 DNAポリメラーゼを２μl加え、引き続き16℃にて45分間反応させた。EDTA／グリコーゲン混合液を４μl加えて反応を停止させ、フェノール・クロロホルム(1:1)を100μl加えて、激しく攪拌した後、14,000回転にて10分間遠心し、水層を集めた。水層に再度フェノール・クロロホルム(1:1)を100μl加え、14,000回転にて10分間遠心し、水層を集めた。これに1/2容量の４M酢酸アンモニウム溶液、2.5倍容量のエタノールを加えて攪拌した後、14,000回転にて20分間遠心した。得られた沈殿物を、80％エタノール溶液で洗浄した後、風乾し、さらに10μlの蒸留水に溶解して、cDNA溶液を得た。以上のようにして得たcDNA溶液は使用するまで-20℃にて保存した。
【０１１４】
次に、このcDNAについて、Clontech社製のMarathon cDNA Amplificationキットを使用して、5' RACEを行った。まず、該キット添付のMarathon cDNAアダプターをcDNAに連結するために、上記cDNA溶液 ５μlに、10μM Marathon cDNAアダプター１μl、５×ライゲーション反応液２μl、400U/μlのT4 DNAリガーゼ１μl、蒸留水１μlを加え、16℃にて18時間反応させ、さらに70℃にて５分間加熱した。
【０１１５】
また、E13特異的プライマーE13-1718asを設計し、それを化学合成した。このプライマーの配列は以下の通りである。
【０１１６】
E13-1718as： CACACGAAGATTGGCCCGATTCACAGG（配列番号１０）
【０１１７】
続いて、トリシンEDTA緩衝液で50倍に希釈した、Marathon cDNAアダプターを連結したcDNA ５μl、10μMのE13特異的プライマーE13-1718as １μl、10μM AP-1プライマー１μl、５×GC2 PCR反応液 10μl、GC-Melt ５μl、２μM dNTP混合液 ５μl、蒸留水 22μl、50×Advantage G2 ポリメラーゼ １μlを混合し、全量で50μlとして5'RACEを行った。PCR反応は、94℃で５秒加温後、94℃で５秒、72℃で10分からなる工程を１サイクルとして５サイクル行い、次に94℃で５秒、70℃で10分からなる工程を１サイクルとして５サイクル行い、さらに94℃で５秒、68℃で10分からなる工程を１サイクルとし25サイクル行い、最後に４℃にて終了するように行った。このPCR産物 ５μlについてアガロースゲルにて電気泳動を行ったところ、約3.5kb〜約0.6kbのスメアーな複数のバンドとして増幅産物が確認された。スメアーなバンドが見られるのは、非特異的な増幅が起こっているためと考えられるので、この増幅産物を鋳型にしてさらにNested PCRを行った。
【０１１８】
まず、Nested PCR用プライマーE13-GSP-3asを設計し、化学合成した。このプライマーの配列は以下の通りである。
【０１１９】
E13-GSP-3as： GCACTTGCCACCATTGAGGCATGGACG（配列番号１１）
【０１２０】
次に、トリシンEDTA緩衝液で250倍に希釈した上記増幅産物５μl、10μMのNested PCR用プライマーE13-GSP-3as １μl、10μM AP-2プライマー（クローンテック社製）１μl、５×GC2 PCR反応液 10μl、GC-Melt 10μl、２μM dNTP混合液 ５μl、蒸留水 17μl、50×Advantage G2 ポリメラーゼ １μl（クローンテック社製）を混合し全量で50μlとして、PCR反応に供した。PCR反応は、94℃で５秒加温後、94℃で５秒、72℃で10分からなる工程を１サイクルとして５サイクル行い、次に94℃で５秒、70℃で10分からなる工程を１サイクルとして５サイクル行い、さらに94℃で５秒、68℃で10分からなる工程を１サイクルとして25サイクル行い、最後に４℃にて終了するように行った。このPCR産物 ５μlについてアガロースゲルにて電気泳動を行ったところ、約0.9kbのバンドとして増幅産物が確認された。得られたPCR産物を使用して、T4 DNAリガーゼを用いて、増幅産物をベクターpT-Adv（クローンテック社製）中に連結するようにライゲーション反応を行った。このライゲーション反応物を用いて大腸菌を形質転換した。得られた形質転換体からプラスミドDNAを調製し、プラスミドDNAを制限酵素EcoR Iで消化し、アガロースゲル電気泳動にかけて、約0.9kbのcDNAが組み込まれているプラスミドクローンを選択した。選択されたプラスミドクローンの一つであるクローンES14に挿入された約0.9kbのDNA断片について、アプライドバイオシステムズ社のシークエンサーPRIZM 377XLにより、BigDye Terminator Cycle Sequencingキットを用いて塩基配列を決定した。この塩基配列の解析結果から、配列番号１の塩基番号１番から951番までの塩基配列が明らかになった。
【０１２１】
以上のそれぞれの実験から得られた塩基配列を遺伝子情報処理ソフトウエアGENETXY-WIN（Version 5、株式会社ゼネティックス製）により解析し、E13遺伝子の完全長cDNAの塩基配列を、配列番号１に示す配列として決定した。また配列番号１の塩基配列に基づいて、本cDNAのオープンリーディングフレームを推定した。その結果、このE13遺伝子の翻訳開始コドンは配列番号１の塩基番号157番〜159番に相当し、終止コドンは塩基番号4366番〜4368番に相当するものと考えられた。配列番号１の塩基配列から推定されたオープンリーディングフレームにコードされるアミノ酸配列を、配列番号２に示す。さらに、遺伝子解析ソフトウエアによる解析により、配列番号２のアミノ酸番号１番〜21番の配列はシグナル配列であることが推定された。これにより、この構造遺伝子から発現され、産生される蛋白質の推定アミノ酸残基数は1382、その推定分子量は149,499.1と算出された。本発明者らは、以上のようにして同定された遺伝子及びそれにコードされる蛋白質に、改めて、SELF（stromal cell-derived EGF-like rpeat containing factor）と名付けた。
【０１２２】
さらに、上記で決定した塩基配列をクエリー配列として、NCBI-BLASTにて相同性のある遺伝子を探索した結果、国際公開第WO01/32873号パンフレットの図４及び図６に記載の塩基配列、並びにGenBankアクセッション番号NM172463及びXM 059482の塩基配列との間で相同性を有していた。国際公開第WO01/32873号パンフレットの図４Ａにはラット由来の塩基配列が記載されており、本願の配列番号１記載の塩基番号1342番から4368番までの配列との間に相同性が認められた。マウスSELF遺伝子（配列番号１）との間で相同性が示されたNM172463の塩基配列については、マウス腎臓ストローマ細胞にて発現される遺伝子の配列であることが示されていたが、その遺伝子にコードされる蛋白質の生理学的機能は示されていなかった（Leimeister, C., et al. Dev. Dyn. 230：371-377, 2004）。国際公開第WO01/32873号パンフレットの図６Ａおよび図６Ｂにはヒト由来の塩基配列が記載されており、本願の配列番号１の塩基番号1252番から4368番までの配列との間で相同性が認められた。XM059482の塩基配列は、ヒトゲノム配列からコンピューターにより予測したmRNA配列であった。XM 059482の塩基配列には、細胞で転写されたmRNAから取得した本発明に係るヒトSELF遺伝子配列中に192塩基が挿入されており、その塩基配列にコードされる蛋白質の生理学的機能も明らかにされていなかった。なお、国際公開第WO01/32873号パンフレットに開示された遺伝子がコードする蛋白質は、細胞内の転写因子であり、インスリンのシグナル伝達を調節するものであった。
【０１２３】
参考例３
マウスストローマ細胞PA6由来のmRNAを用いたSELF cDNA断片のクローニング
参考例２によって得られた配列番号１の配列に基づいて、SELF cDNAのオープンリーディングフレーム全体を増幅できるプライマーE13F-S1及びE13F-AS1を設計し、それらを化学合成した。それらのプライマーの配列を下記に示す。
【０１２４】
E13F-S1 ： CAGATCCCGGCGATGCGCCTC（配列番号１２）
E13F-AS1： AGGGAATTCTGGAACCTTCCT（配列番号１３）
【０１２５】
参考例１で調製したPA6由来のmRNAから合成した一本鎖cDNAを鋳型に用い、プライマーE13F-S1及びE13F-AS1とGC2ポリメラーゼ（クローンテック社製）とを使用してPCRを行った。
【０１２６】
得られたPCR増幅断片をT4DNAポリメラーゼで処理して平滑化し、さらにEcoR Iで消化した。これをアガロースゲル電気泳動に供し、当該バンドを切り出して精製した後、pCRIIベクターのEcoR I部位とEcoR V部位の間にクローン化して、プラスミドクローンpCR-mSELFを得た。このクローン中のインサートDNAの塩基配列を、アプライドバイオシステムズ社のシークエンサーPRIZM 377XLにより、BigDye Terminator Cycle Sequencingキットを用いて決定した。その結果、このインサートDNAの配列は配列番号１の塩基番号145番から4543番までの配列と一致した。すなわち、マウスストローマ細胞PA6由来のmRNAを鋳型とし、上記プライマーE13F-S1及びE13F-AS1を用いてPCRを行うことにより、SELF cDNAのオープンリーディングフレーム全体を含む4399塩基対(bp)のDNA断片を増幅できることが確認された。
【０１２７】
さらに、このpCR-mSELFをXba Iで消化してインサートDNAを切り出した後、T4DNAポリメラーゼで処理して該インサートDNA断片を平滑化した。このインサートDNA断片をEcoR Iで消化したDNA断片を、ほ乳類細胞系の発現ベクターpCl-neo（プロメガ社製）中の、Nhe I部位（平滑化処理済）とEcoR I部位との間に導入した。このようにして得られた発現ベクターをpCl-neo-mSELFと名付けた。
【０１２８】
参考例４
ヒトSELF cDNAのクローニング
配列番号１の塩基配列情報を基にNCBIのゲノムデータベースを検索すると、マウスSELFcDNAに相同性の高い領域がヒト第２染色体上に存在することが判明した。このヒトゲノム塩基配列と配列番号のマウスSELF cDNAとの詳細な比較から、配列番号３に示す塩基配列をヒトSELF cDNAの塩基配列として推定した。さらに配列番号３の塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号４に示した。推定された配列（配列番号３）からなるヒトSELF cDNAに対応するmRNAが実際にヒト細胞で発現されていることを、下記に示すようにして確認した。
【０１２９】
１μｇのヒト脾臓mRNA（クローンテック社製）からインビトロジェン社の逆転写酵素スーパースクリプトIIを用いてcDNAを合成した。まず、１μｇのヒト脾臓mRNAを10μlの蒸留水に溶解し、0.5μg/μlのオリゴ(dT)を1μl加え、70℃にて10分間加熱した。次にそれを氷上で２分間冷却し、前記逆転写酵素製品に添付されていた5xファーストストランド反応液4μl、0.1M DTT溶液2μl、10mM dNTP混合液2μl、逆転写酵素スーパースクリプトIIを200単位加え、最終容量を蒸留水で20μlとして、45℃にて１時間、55℃にて30分間保温してcDNAを合成した。合成したcDNA １μlを鋳型としてアドバンテージ２ポリメラーゼミックスに添付されていた10×緩衝液を5μl、2mM dNTP混合液（ファルマシア社製） 5μl、１0μMのプライマーヒトSELF-s2(CCAAGGACCGCTGCGTGGTG:配列番号２３)及びヒトSELF-as8(TTAAGATTTCACCAGTGTCAGACTC:配列番号２４)をそれぞれ１μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49μlとした。次にアドバンテージ２ポリメラーゼミックス（クローンテック社製）を１μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、最初に94℃で４分間処理し、次いで94℃で１分間、68℃で２分間、72℃で３分からなる工程を１サイクルとして35サイクル行い、最後に72℃で7分間処理し、４℃にて終了するように行った。このPCR産物の一部についてアガロースゲルにて電気泳動を行ったところ、約4.0kbの増幅産物が確認された。そこで、このPCR産物２μlを用いて、増幅産物をベクターpCR2.1-TOPO（インビトロジェン社製）中に連結するライゲーション反応を行った。このライゲーション反応物を用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドDNAを調製した。このプラスミドDNAをEcoR Iで消化し、アガロースゲル電気泳動に供して、そのプラスミドDNAに約４kbのDNA断片が挿入されていることを確認した。このDNA断片を保持するベクターをpCR2.1-TOPO-hSELF3'と名付けた。挿入されているDNA断片の塩基配列は常法により決定した。その結果得られた塩基配列は、配列番号３の塩基番号284番から4242番までの塩基配列と一致していた。
【０１３０】
次に、ヒト脾臓mRNA１μgを10μlの蒸留水に溶解し、2μMのヒトSELF遺伝子特異的プライマーであるヒトSELF-R1034(ACACTCTTTGGTGTCACAGGGGGATTGGGCTGTCTCACAGG:配列番号２５)を1μl加え、70℃にて２分間加熱した。次に氷上で２分間冷却し、5Xファーストストランド反応液4μl、0.1M DTT溶液2μl、10mM dNTP混合液2μl、逆転写酵素スーパースクリプトIIを200単位加え、最終容量を蒸留水で20μlとして、42℃にて１時間、55℃にて30分間保温しcDNAを合成した。合成したcDNA１μlを鋳型としてアドバンテージGC2ポリメラーゼミックスに添付された5×緩衝液を10μl、アドバンテージGC-メルトを10μl、2mM dNTP混合液を5μl、１0μMのプライマーヒトSELF-s1（ATGCGGCACGGCGTCGCCTG:配列番号２６）及びヒトSELF-as2（AAGGTCACTCGGTACCAGGTGG:配列番号２７）をそれぞれ１μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49μlとした。次にアドバンテージGC２ポリメラーゼミックス（クローンテック社製）を１μl加え、最初に94℃で４分間処理し、次いで94℃で１分間、66℃で２分間、72℃で３分からなる工程を１サイクルとして35サイクル行い、最後に72℃で７分間処理し、４℃にて終了するようにPCR反応を行った。このPCR産物の一部についてアガロースゲルにて電気泳動を行ったところ、約480bpの増幅産物が確認された。そこで、このPCR産物２μlを用いて、増幅産物をベクターpCR2.1-TOPO（インビトロジェン社製）中に連結するライゲーション反応を行った。このライゲーション反応物を用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドDNAを調製した。このプラスミドDNAをEcoR Iで消化し、アガロースゲル電気泳動に供することにより、該プラスミドに約480bpのDNA断片が挿入されていることを確認した。このDNA断片を保持するプラスミドベクターをpCR2.1-TOPO-hSELF5'と名付けた。挿入されたDNA断片の塩基配列は常法により決定した。その結果得られた塩基配列は、配列番号３の塩基番号１番から476番までの塩基配列と一致していた。
【０１３１】
ヒトSELF蛋白質をコードするcDNA断片を取得するために、まずpCR2.1-TOPO-hSELF5'をAat IIにて消化した。Aat IIで消化するとヒトSELF cDNAは配列番号３の塩基番号411番の位置で切断される。ベクターであるpCR2.1-TOPOにはAat II認識部位は存在しないので、pCR2.1-TOPO-hSELF5'はAat IIによって１箇所で切断される。次にこのDNA断片をXba Iで消化し、配列番号３の塩基番号１番から411番までの塩基配列からなる核酸とpCR2.1-TOPOベクターとからなる長鎖DNA断片を切り出した。一方、pCR2.1-TOPO-hSELF3'をAat IIとXba Iで消化し、配列番号３の塩基番号411番から4242番までの配列とpCR2.1-TOPOのクローニング部位とを含む約3.9kbのDNA断片を切り出した。この約3.9kbのDNA断片と、配列番号３の塩基番号１番から411番までの配列からなる核酸と、pCR2.1-TOPOベクターからなる長鎖DNA断片とを、T4リガーゼにより連結するライゲーション反応を行った。このライゲーション反応物を用いて大腸菌を形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミドDNAを調製して、それをSpe IとXba Iで消化し、アガロースゲル電気泳動に供して、約4.2kbの断片が挿入されているプラスミドクローンを選択した。このプラスミドクローンをpCR2.1TOPOhSELFと名付けた。
【０１３２】
動物細胞における発現ベクターであるpCl-neo（プロメガ社製）をXho Iで消化し、T4ポリメラーゼにて平滑化した。引き続きXba Iで消化し、得られる長鎖DNA断片を単離精製した。一方、pCR2.1TOPOhSELFをSpe Iで消化し、さらにT4ポリメラーゼにて平滑化した後、Xba Iで消化することにより、4242bpのヒトSELF cDNA断片を含むDNA断片を得た。この4242bpのDNA断片を、先に調製したpCl-neoのXho I部位（平滑化済み）とXba I部位との間に挿入した。このベクターをpCl-neo-hSELFと名付けた。
【０１３３】
また、pCR2.1-TOPO-hSELF5'をEcoRIで消化して得られる約480bpのDNA断片をプローブとして用いて、ヒトマルチプルティッシュノーザンブロット#636818（クローンテック社製）にてノーザンブロット解析を行った。その結果、マウスSELF cDNA断片を用いた場合と同じ結果が得られた。この結果は、本参考例で得られたヒトSELF cDNAはマウスSELFの相同物であることを強く示唆している。
【０１３４】
以上の通り、ゲノム配列から推定された配列番号３の塩基配列を含む遺伝子は、ヒト細胞において実際に発現されていることが証明された。すなわち配列番号３に示す塩基配列は、ヒトSELF cDNAであることが判明した。配列番号３に示す塩基配列を用いてNCBIの核酸データベースを検索したところ、相同性の高い遺伝子として、GenBankアクセッション番号AK074062とXM059482（FLJ00133蛋白質）で示される配列がヒットした。しかしながら、AK07406で示される塩基配列は、蛋白質をコードする全領域を含んでいなかった。一方、XM059482で示される塩基配列は、ヒトゲノム情報からコンピューターにより解析して得た情報であることが付記されており、また実際のmRNAの配列と一致するかどうかもその生物活性に付いても不明とされていた。配列番号３の塩基配列とXM059482の塩基配列とを比較したところ、XM 059482の配列には、配列番号２８に示す塩基配列が配列番号３の塩基番号213番と214番の間に挿入されていることが分かった。すなわちXM059482の配列は、実際のSELF mRNAの配列とは異なっていた。このことから、配列番号３の塩基配列からなる転写産物は天然には存在するが、その転写産物はXM059482で示された既知配列とは異なる配列をもつ核酸であることが示された。
【０１３５】
参考例５
SELF蛋白質を認識する抗体の作製
配列番号２のアミノ酸番号1390番から1403番までのアミノ酸配列のＮ末端にシステインを加えた配列、CQSTSLRKPKQETK（配列番号２０）からなるペプチドを合成した。そのペプチドに、Imject Maleimide Activated KLH Kit（ピアース社製）を用いて、添付説明書に従ってペプチドのシステインを介してKLHを結合させた。このペプチド-KLH複合体6mgを４回に分けてウサギに投与して免疫した。初回免疫はフロイントの完全アジュバントと混合しエマルジョンの状態にして背部皮下に投与した。２回目からは、２週間おきに３回、フロイントの不完全アジュバントと混合しエマルジョンの状態にして、背部皮下に投与した。最終投与の２週間後、全採血し、その血清を分離した。10mlの血清に等量のPBSを加えて希釈し、それを３mlのプロセップＡカラム（Bioprocessing社製）に通した。30mlのPBSで該カラム中の未吸着物質を洗浄した後、10mlの0.1Mグリシン緩衝液（pH3.0）による溶出を行った。溶出液に0.5mlの1MTris-HCl緩衝液（pH8.0）を加え中和し、SELF蛋白質を認識するウサギ精製抗体を得た。
【０１３６】
CDM8（インビトロジェン社製）からBamH I認識部位を欠損させたベクターDNAをHind IIIとXhoIで消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、最長のDNA断片をゲルから精製した。
【０１３７】
次に、それぞれAGCTTCCACCATGTCTGCACTTCTGATCCTAGCTCTTGTTGGAGCTGCAGTTGCTGACTACAAAGACGATGACGACAAGCAC（配列番号１４）及びTCGAGTGCTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCAGCAACTGCAGCTCCAACAAGAGCTAGGATCAGAAGTGCAGACATGGTGGT（配列番号１５）の配列を有する合成一本鎖DNAをアニールさせ二本鎖DNAを調製した。この二本鎖DNAは、末端にHind IIIとXho Iの接着末端を有する。この二本鎖DNA断片はマウスプレプロトリプシンのリーダー配列とFLAG配列（Hopp, HP, et al. Bio/Technology 6,1204-1210,1988）をコードしている。このDNA断片を上記のBamH I認識部位欠損CDM8ベクターのHind III-Xho I部位に導入して、CDM8 flagを作製した。このCDM8flagをXho IとXba Iで消化し最長の断片をアガロースゲル電気泳動で分離し、単離した。一方、CD4IgG（Zettlmessl et al., DNA Cell Biol. 9： 9125-9129, 1990）をBamH IとXba Iで消化し、IgGFcをコードする約1280bpの断片をアガロースゲル電気泳動にて分離し、それを単離した。上記のXho IとXba Iで消化して得たCDM8flag断片に、そのIgGFcをコードするDNA断片を連結し、CDMflagIgGを作製した。
【０１３８】
次に、参考例１で調製したPA6由来のcDNAを鋳型にして、プライマーE13-ATG-2s及びE13-Bam-2asを用いてPCRを行った。
E13-ATG-2sとE13-Bam-2asの配列は下記の通りである。
【０１３９】
E13-ATG-2s ： CCGCTCGAGAGACATGGCTGAGGTGGAGACC（配列番号１６）
E13-Bam-2as： CTGGGATCCGGTGAAGGCACCAGGTAG（配列番号１７）
【０１４０】
E13-ATG-2sにおいては、配列番号１６の塩基番号10番から31番の配列が配列番号１の塩基番号854番から882番の配列と一致しており、その配列に人工的にXho I認識部位（配列番号１６の塩基番号４番から９番）が付加されている。
【０１４１】
E13-Bam-2asにおいては、配列番号１７の塩基番号９番から27番の配列が配列番号１の塩基番号1434番から1451番の配列に相補的な配列と一致しており、その配列に人工的にBamH I認識部位（配列番号１７の塩基番号４番から９番）が付加されている。
【０１４２】
このPCR産物をXho IとBamH Iで消化し、DNA断片をアガロースゲル電気泳動で分離し、約580bpのDNA断片を単離して、Xho IとBamH Iで消化したCDMflagIgGに導入した。得られたベクターDNAをCDMflagE13IgGと名付けた。このベクターには、サイトメガロウイルスのプロモーターの下流にマウスプレプロインシュリンリーダー配列、Flag配列、SELF構造遺伝子の一部の配列（配列番号２のアミノ酸番号235(Asp)からアミノ酸番号432(Pro)までに対応する配列）及びヒトIgG Fc部分をそれぞれコードする配列がインフレーム（読み枠があった状態）で連結されている。このベクターを用いれば、動物細胞でFlagペプチド-SELF-IgGFcのキメラ蛋白を発現させることができる。
【０１４３】
このCDMflagE13IgGを、サルCOS-1細胞にDEAEデキストラン法に従って導入した。まず、20mM Tris-HCl(pH7.4)及び50μM ２メルカプトエタノールを含んだRPMI1640培地に、最終濃度がそれぞれ400μg/ml、100μMとなるようにDEAEデキストラン（ファルマシア社製）とクロロキン（シグマ社製）を加え、さらに13ml当たり50μgのCDMflagE13IgGを加えた。
【０１４４】
一方COS1細胞は、DNA導入前日に２倍のスプリットレシオで150平方培養フラスコ（コーニング・コースター社製）にて培養しておいた。DNA導入当日、このフラスコの培養液を除き、PBSで１回洗浄した後、上記で調製したCDMflagE13IgGを含むDNA混合液を13ml加え、培養を続けた。４時間後、DNA混合液を除き、Hybridoma SFM培地（GIBCO社製）を50ml加え、さらに培養を続けた。４日後に培養液を回収し（１回目）、フラスコには新たにHybridoma SFM培地を50ml加え、さらに４日間培養を続け、再度培養液を回収した（２回目）。１回目と２回目に回収した培養液を一緒にし、3,000回転で10分間遠心することにより細胞の破砕物を除去し、さらに0.2μmのフィルターにて濾過滅菌した。
【０１４５】
IgGFcがプロテインＡに特異的に結合する性質を持っていることを利用し、このキメラ蛋白質の精製には、プロテインＡを結合させたプロセップＡカラム（Bioprocessing社製）を用いた。上記の通り濾過滅菌した培養液500mlを１mlのプロセップＡカラム（Bioprocessing社製）に添加し、１日かけてそのカラムを通過させた。次に15mlのPBSでカラムの未吸着物質を洗浄後、0.1Mグリシン緩衝液(pH3.0)で溶出を行った。溶出液を１mlずつ集め、タンパク量のもっとも多かった２番目のフラクションの溶出液に0.1mlの１M Tris-HCl緩衝液(pH8.0)を加えて中和し、さらにPBSに対して透析した。この操作を合計２回行い、１Lの培養液から１mgの蛋白質を得た。この蛋白質２μgを８％SDSポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、キメラ蛋白質について予想された分子量を示すことを確認した。
【０１４６】
このようにして得られたキメラ蛋白質0.8mgを４回に分けてウサギに投与して免疫した。初回免疫は0.2mgのキメラ蛋白質とフロイントの完全アジュバントとを混合しエマルジョンの状態にして背部皮下に投与した。２回目からは、２週間おきに３回、0.2mgのキメラ蛋白とフロイントの不完全アジュバントとを混合しエマルジョンの状態にして、背部皮下に投与した。最終投与の２週間後、全採血して、血清を分離した。10mlの血清に等量のPBSを加え希釈し、３mlのプロセップＡカラム（ミリポア社製）に通した。30mlのPBSで該カラムの未吸着物質を洗浄後、10mlの0.1Mグリシン緩衝液(pH3.0)で溶出を行った。溶出液に0.5mlの１M Tris-HCl緩衝液(pH8.0)を加えて中和し、flag-SELF-IgGキメラ蛋白質を認識するウサギ精製抗体を得た。
【０１４７】
参考例６
SELF蛋白質の発現確認
参考例５で作製した２種類の抗体を用いて、SELF蛋白質が細胞で実際に蛋白質として合成されていることを確認する実験を行った。
【０１４８】
マウスストローマ細胞PA6を150平方の培養フラスコにてコンフルエントになるまで培養した。次にこの培養細胞をPBSで２回洗浄し、50mlのHybridoma-SFM（ギブコ社製）を加えさらに４日間培養した。この培養液に50％飽和硫安となるように飽和硫安を加え４℃にて一晩置き、蛋白質を沈殿させた。次に10,000回転にて20分間遠心し、沈殿を集め、それを１mlのPBSに溶解し、１LのPBSに対して２回透析した。本透析液を0.2μmのフィルターにて濾過滅菌した後、４℃にて保存した。
【０１４９】
この濾過滅菌後の透析液を還元条件でSDS-ポリアクリルアミド電気泳動（８％ゲル）にかけ、ニトロセルロースメンブランであるHybond-ECL（アマシャム社製）に蛋白質を転写した。このようにして、PA6細胞が生産する蛋白質がブロットされたフィルターを２枚作製した。これらのフィルターについてブロックエース（雪印社製）でブロッキングを行った後、１枚のフィルターは、１μg/mlのSELF蛋白質のＣ末端ペプチドに対する上記抗体を用いて、もう１枚のフィルターは、１μg/mlのflag-E13-IgGキメラ蛋白質に対する上記抗体を用いて処理した。１時間後、洗浄液で６回洗浄し、5,000倍に希釈したHRP標識化抗ウサギIgG抗体（アマシャムファルマシア社製）を加え、洗浄液で十分洗浄した後、アマシャム社製のECL検出キットにて、SELFc末端ペプチドに対する抗体及びflag-SELF-IgGキメラ蛋白質に対する抗体が結合した蛋白質の検出を行った。その結果、両抗体とも約200kDaの蛋白質を認識したことが示された。このことから、PA6においてSELF蛋白質が発現され分泌されていることが明らかとなった。この結果を図１に示す。ストローマ細胞PA6を無血清培地にて培養しその上清を50%飽和硫安にて50倍に濃縮したサンプル（レーン１）および、ストローマ細胞を10%FCSを含む培地で培養した上清（レーン２）についての結果から示される通り、レーン１において約200 kDaのSELF蛋白質が検出できた。
【０１５０】
さらに、SELF蛋白質の発現を参考例５で作製したSELFのＣ末端ペプチドに対する抗体を用いて、胎生９日目と11日目のマウス胎児についてホールマウントで解析した。９日目及び11日目のいずれのサンプルにおいても肢芽（limb bud）及び顔面の間葉系細胞全域でその発現が認められた。血管に関しては、胎生９日目の胎児では卵黄嚢動脈（臍腸間膜動脈）で強い発現が観察され、頭部の前主静脈（anterior cardinal vein）でも弱い発現が認められた。胎生９日目及び11日目の胎児では、共に、心臓でも弱い発現が観察された。胎生９日目の心臓では、心室のみで発現が認められたことから、SELF遺伝子は心筋細胞で発現されていると考えられた。胎生11日目の胎児では、腸管の内腔側の上皮層と、最も外側の被膜で発現が認められた。
【０１５１】
参考例７
組換え型SELFの発現
サルCOS-1細胞にDEAEデキストラン法に従い、参考例３で得られたpCl-neo-mSELFを導入した。まず、20mM Tris-HCl(pH7.4)、50μM ２メルカプトエタノールを含んだRPMI1640培地に最終濃度がそれぞれ400μg/ml、100μMとなるようにDEAEデキストラン（ファルマシア社製）とクロロキン（シグマ社製）を加え、さらに13ml当たり50μgのpCl-neo-mSELFを加えた。
【０１５２】
一方COS1細胞は、DNA導入前日に２倍のスプリットレシオで150平方培養フラスコ（コーニング・コースター社製）にて培養しておいた。DNA導入当日、フラスコの培養液を除き、PBSで１回洗浄後、上記のpCl-neo-mSELFを含むDNA混合液を13ml加え、培養を続けた。４時間後、上記DNA混合液を除き、Hybridoma SFM培地（ギブコ社製）を50ml加え、さらに培養を続けた。４日後に培養液を回収した（１回目）後、フラスコには新たにHybridoma SFM培地を50ml加え、さらに４日間培養を続け、培養液を回収した（２回目）。１回目と２回目に回収した培養液を一緒にして、3,000回転で10分間遠心することにより、細胞の破砕物を除去した培養上清を得て、それをさらに0.2μmのフィルターにて濾過滅菌した。濾過滅菌したこの培養上清について、セントリカット（クラボウ製）を用いて分子量５万以上の蛋白質を20倍に濃縮した。これを還元条件でSDS-ポリアクリルアミド電気泳動（８％ゲル）にかけ、ニトロセルロースメンブランとHybond-ECL（アマシャムファルマシア社製）に蛋白質を転写した。これらのフィルターについてブロックエース（雪印社製）でブロッキングを行い、さらに１μg/mlのSELF蛋白質のＣ末端ペプチドに対する上記抗体で処理した。１時間後、洗浄液で６回洗浄し、5,000倍に希釈したHRP標識化抗ウサギIgG抗体（アマシャムファルマシア社製）を加え、洗浄液で十分洗浄した後、アマシャムファルマシア社製のECL検出キットにて、SELF  C末端ペプチドに対する上記抗体が結合した蛋白質の検出を行った。その結果、SELF C末端ペプチドに対する上記抗体が約200kDaの蛋白質が認識したことが示された。このことから、COS-1細胞における組換えSELF蛋白質の産生が確認された。
【０１５３】
参考例８
SELF-frag融合蛋白質の作製
高純度に精製された組換え型SELF蛋白質を作製するには、目的の蛋白質のアミノ末端又はカルボキシル末端にタグとなるペプチドを付加し、そのペプチドに対する抗体を結合させた担体を用いて、該ペプチドを融合させた目的の蛋白質を精製する方法が好適である。そこで、FlagペプチドをタグとしてSELFのカルボキシル末端に持つ融合蛋白質を発現させることができるベクターを作製した。具体的には、p3xflag-CMV-14（シグマ社製）をHind IIIとBgl IIで消化し、アガロースゲル電気泳動に供して、CMVプロモーターを含む最長の断片を分離し、それをゲルから精製した。このDNA断片と、pCl-neo-mSELFをHind III及びAfe Iで消化することにより得られる約4,200kbpのSELF cDNA断片と、GCTGCCAGAGCACAAGCCTCAGGAAACCCAAACAGGAAACAAAGTCGATA（配列番号２１）及びGATCTATCGACTTTGTTTCCTGTTTGGGTTTCCTGAGGCTTGTGCTCTGGCAGC（配列番号２２）の配列からなる一本鎖DNAをアニールさせた二本鎖DNAとをリガーゼにより連結して、SELF-Flagペプチド融合蛋白質を発現するベクターp3XFLAGCMV14mSELFを作製した。このベクターを、上記の方法に従い、サルCOS-1細胞にDEAEデキストラン法にて導入した。導入後、上述のようにして４日間培養した後に回収した培養上清と、抗Flagペプチド抗体を結合させた担体（Ｍ２アガロース；シグマ社製）とを混合し、４℃にて２時間穏やかに撹拌した。次に、このＭ２アガロース担体をクロマトカラムに回収し、リン酸緩衝液にて十分に洗浄した。0.1Mグリシン（pH3.5）を添加し、Ｍ２アガロース担体に結合したSELF-Flagペプチド融合蛋白質を溶出した。溶出後直ちに1Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）を加え、溶出液を中性に調整した。このサンプルを還元条件でSDS-ポリアクリルアミド電気泳動（８％ゲル、テフコ社製）にかけ、ニトロセルロースメンブランとHybond-ECL（アマシャムファルマシア社製）に蛋白質を転写した。このフィルターについてブロックエース（大日本製薬社製）でブロッキングを行い、さらに10μg/mlの抗Flag抗体 M2（シグマ社製）及び１μg/mlのSELF蛋白質のＣ末端ペプチドに対する上記抗体で処理した。抗体処理の１時間後、フィルターを洗浄液で６回洗浄した。次いで両フィルターに、それぞれ5,000倍に希釈したHRP標識化抗マウスIgG抗体（アマシャムファルマシア社製）、5,000倍に希釈したHRP標識化抗ウサギIgG抗体（アマシャムファルマシア社製）を加え、洗浄液で十分洗浄した後、アマシャムファルマシア社製のECL検出キットにて、抗Flag抗体及びSELF C末端ペプチドに対する上記抗体が結合した蛋白質の検出を行った。その結果、両抗体は、同一の分子量の蛋白質を認識したことが示された。このことから、本方法により、SELF-flagペプチド融合蛋白質が作製されたことが確認された。
【０１５４】
実施例１
平滑筋細胞分化増殖に対するSELF蛋白質の作用
マウス胎児の傍大動脈臓側板中胚葉（Para-aortic splanchnopleural mesoderm; P-Sp）領域の組織片をストローマ細胞株OP9と共培養すると、平滑筋細胞の分化増殖及び血管形成が観察されることが報告されている（Takakura et al., Immunity 9:677-689, 1998、Takakura et al., Cell 102:199-209, 2000）。この実験系を、SELF蛋白質存在下及び非存在下で用いて、SELF蛋白質が平滑筋細胞の分化増殖と血管形成に及ぼす影響を調べた。
【０１５５】
まず、10％FCS（インビトロジェン社製）、10μMの2ME（シグマ社製）、IL-6（20ng/ml；R&D Systems社製）、IL-7（20ng/ml；R&D Systems社製）、SCF（50ng/ml；R&D Systems社製）、Epo（2U/ml；キリン社製）を添加したRPMI1640培地（インビトロジェン社製）に、参考例８で作製したSELF-Flagペプチド融合蛋白質をSELF蛋白質として100ng/mlで添加した。このように調製した培地で胎生期8.5日目〜9.5日目のC57BL6マウス（SCL社より入手）由来のP-Sp組織片をストローマ細胞株OP9（理研細胞銀行RCB1124）上で37℃で共培養した。対照実験としては、SELF蛋白質を培地に添加しないこと以外は同様にしてP-Sp組織片とストローマ細胞株OP9との共培養を行った。培養開始後10日目に血管新生の有無を観察したところ、SELF蛋白質の存在下では、血管内皮細胞によるシート様構造（血管床）の形成は認められたが、平滑筋細胞の動員が認められず、血管網の形成は観察されなかった（図２Ｂ）。一方、SELF蛋白質の非存在下では、チューブ状の血管網の形成が観察された（図２Ａ）。この結果は、SELF蛋白質が、P-Spに含まれる未分化な平滑筋細胞からの平滑筋細胞の分化増殖を抑制し、血管新生を阻害することを示している。
【０１５６】
実施例２
腫瘍形成に対するSELF遺伝子の効果
悪性腫瘍に対するSELF遺伝子の効果について検討を行った。マウス大腸癌細胞株colon26（Brattain, MG., et al., Cancer Res. 40:2142-2146, 1980）に、参考例８で作製したベクターp3XFLAGCMV14mSELF（SELF-Flagペプチド融合蛋白質を発現する）を導入し、SELF遺伝子を発現するcolon26細胞（以下、SELF/colon26と称する）を作製した。一方、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）を阻害することができるFlt1-Fc蛋白質（可溶型VEGF受容体とヒトIgG1の定常領域（Fc）とのキメラ蛋白質）を発現するベクター mFlt-1-hIgG1（Hirashima, M., et al., Blood 93:1253-1263, 1999）をcolon26細胞に導入して、Flt1-Fc遺伝子を発現するcolon26細胞（以下、Flt-Fc/colon26と称する）を作製した。細胞へのベクターの導入には、リポフェクトアミン2000（インビトロジェン社製）を、その製品マニュアルに従って使用した。
【０１５７】
次いで、Colon26細胞株、SELF/colon26細胞株及びFlt1-Fc/colon26細胞株の増殖性を検討した。それぞれの細胞株を、６穴プレートの４穴にて、2mlの10％FCSを含むRPMI1640培地で1×105個ずつ培養した。培養開始から４日後に、血球計算盤にて、細胞数を測定した。各細胞株における４穴の平均値は、Colon26細胞が2.18×106個、SELF/colon26細胞が2.22×106個、Flt1-Fc/colon26細胞が2.18×106個となり、これら３種類の細胞株の増殖性には有意な差が見られなかった（表１）。この結果により、SELF遺伝子及びFlt1-Fc遺伝子の発現は、colon26細胞自体の増殖には直接的な影響を与えないことが確認された。
【０１５８】
【表１】
2007308407.tif 000002
【０１５９】
そこで次に、2×106個のcolon26細胞、Flt1-Fc/colon26細胞、SELF/colon26細胞、及びSELF/colon26細胞とFlt1-Fc/colon26細胞を1×106個ずつ混合した細胞集団を、それぞれ10匹の８週齢のBalb/c雄マウスの皮下に移植した（colon26移植群、Flt1-Fc/colon26移植群、SELF/colon26移植群、SELF/colon26＋Flt1-Fc/colon26移植群；各群10匹ずつ）。移植後14日目に腫瘍の大きさを比較した。腫瘍の体積は下記の計算式にて求めた（Iwanuma, Y., et al., Cancer Immunol Immunother. 40:17-23, 1995）。
【０１６０】
Ｖ＝ab2π/6
［式中、a＝腫瘍の長径（mm）、b＝腫瘍の幅（mm）（腫瘍の長径と幅はノギスを用いて測定）］
【０１６１】
図３にその結果を示した。colon26移植群における腫瘍の体積を100％として比較した場合、Flt1-Fc/colon26移植群の腫瘍体積は49％、SELF/colon26移植群の腫瘍体積は67％となり、Flt1-Fc/colon26移植群及びSELF/colon26移植群では腫瘍形成が有意に抑制されていることが示された。さらに、SELF/colon26＋Flt1-Fc/colon26移植群では、colon26移植群と比較して腫瘍体積は33％となり、腫瘍形成が顕著に抑制されていることが示された。
【０１６２】
以上の結果から、SELF蛋白質は、Flt1-Fc蛋白質のような血管内皮細胞の増殖抑制作用をもつ分子と併用すると、強い腫瘍形成抑制効果を示すことが示された。従って、SELF蛋白質は腫瘍自体に作用するのではなく、宿主において腫瘍の増殖に必要な平滑筋細胞の分化増殖を抑制することにより血管新生を阻害し、その結果、腫瘍形成を抑制することが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１６３】
本発明に係るSELF蛋白質を含有する平滑筋細胞分化増殖抑制剤は、平滑筋細胞の分化増殖が亢進した組織に投与することにより、平滑筋細胞の分化増殖を抑制することができる。またSELF遺伝子を含む発現用核酸分子を含有する平滑筋細胞分化増殖抑制剤は、それを平滑筋細胞の分化増殖が亢進した組織に投与して遺伝子発現させることにより、組織内でSELF蛋白質を産生させ、その作用により平滑筋細胞の分化増殖を抑制することができる。そのような本発明の平滑筋細胞分化増殖抑制剤は、in vivoで腫瘍細胞により誘導される平滑筋細胞の分化増殖を抑制し、腫瘍血管形成を抑制する目的で使用することができる。従って本発明の平滑筋細胞分化増殖抑制剤は、医薬組成物として、平滑筋細胞の異常な分化増殖を伴う疾患の治療若しくは予防用、たとえば癌などの細胞の分化増殖制御における異常と関連した疾患の治療若しくは予防用などに、好適に使用することができる。また本発明の平滑筋細胞分化増殖抑制剤はそれらの疾患に対する遺伝子治療にも用いることができる。本発明の平滑筋細胞分化増殖抑制剤はまた、試験試薬として、平滑筋細胞の分化増殖をin vitroで抑制したり、血管形成モデルにおける血管新生を阻害したり、モデル動物における腫瘍形成を抑制したりする目的で、好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】図１は、ウエスタンブロッティング法によるPA6細胞培養上清に産生されるSELF蛋白質の解析の結果を示す写真である。レーン１：ストローマ細胞PA6を無血清培地にて培養しその上清を50%飽和硫安にて50倍に濃縮したサンプル。レーン２：ストローマ細胞を10%FCSを含む培地で培養した上清サンプル。
【図２】図２は、血管新生に対するSELF蛋白質の作用を示す写真である。図２Ａの写真はSELF蛋白質非存在下で、図２Ｂの写真はSELF蛋白質存在下（100ng/ml）で行った実験結果である。図２Ａでは血管網の形成が認められるが、図２Ｂでは血管内皮細胞のシート形成は認められるものの平滑筋細胞の動員はなく（矢印）、血管網の形成は認められなかった（血管網形成阻害）。
【図３】図３は、悪性腫瘍に対するSELF遺伝子の効果について示すグラフである。レーン１．colon26：colon26細胞、レーン２．SELF/colon26：colon26細胞にp3XFLAGCMV14mSELFを導入した細胞、レーン３．Flt1-Fc/colon26：colon26細胞にmFlt-1-hIgG1を導入した細胞、レーン４．SELF/colon26＋Flt1-Fc/colon26：SELF/colon26とFlt1-Fc/colon26を1:1で混合した細胞。アスタリスクは、１つがP<0.01、２つが0.05を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１６５】
配列番号１-マウスselfcDNAのDNA配列
配列番号２-マウスself蛋白質のアミノ酸配列
配列番号３-ヒトselfcDNAのDNA配列
配列番号４-ヒトself蛋白質のアミノ酸配列
配列番号５〜１７-人工配列の説明：合成DNA
配列番号１８及び１９-EGF様モチーフ
配列番号２０-人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号２１〜２７-人工配列の説明：合成DNA
配列番号２８-人工配列の説明：推定配列
配列番号２９〜３１-EGF様モチーフの既知のコンセンサス配列
配列番号２９の塩基番号2、4、5、6、7、8、10及び11は任意の天然アミノ酸である。
配列番号３０の塩基番号2、4、5、8、9、10及び11は任意の天然アミノ酸であり、塩基番号6はGly又はProであり、塩基番号7はPhe、Tyr又はTrpである。
配列番号３１の塩基番号2、4、5、8、9、10、11、12、13、14及び15は、任意の天然アミノ酸であり、塩基番号6はGly又はProであり、塩基番号7はPhe、Tyr又はTrpである。
【図１】
2007308407.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【配列表】
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