(57)【要約】【課題】短時間で、試料から目標物質を拡散透析させる。【解決手段】化学分析前処理装置１００は、前処理デバイス２０２と流体制御システム２０１とを有する。前処理デバイスは、透析膜３０４ｃを挟んで透析試料流路３０１ｃと透析液流路３０２ｃとを密着して配置した透析部３０５を有する。流体制御システムは、前処理デバイス中を流通する透析試料と透析液の移動を制御する制御手段（ＰＣ）２０５を有する。制御手段は、透析液が透析液流路を一方向に移動し、透析試料が透析試料流路を往復動するように制御する。【選択図】図２
2007183141.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
透析膜を挟んで透析試料流路と透析液流路とを密着して配置した透析部を有する前処理デバイスと、この前処理デバイス中を流通する透析試料と透析液の移動を制御する制御手段を有する流体制御システムとを備える化学分析前処理装置において、前記制御手段は、透析液が前記透析液流路を一方向に移動し、透析試料が前記透析試料流路を往復動するように制御することを特徴とする化学分析前処理装置。
【請求項２】
前記前処理デバイスは、透析前の透析試料と透析液をそれぞれ収容する容器と、透析後の透析試料と透析液をそれぞれ収容する容器とを有し、前記制御手段は、透析試料濃度または透析液濃度の変化が所定値よりも低くなったら、前記透析液流路内の透析液を前記透析後の透析液収容容器に移動させて前記透析液流路内に新たな透析液を導くとともに、前記透析試料流路内の透析試料を前記透析後の透析試料収容容器に移動させた後に前記透析前の透析試料収容容器に移動させることを特徴とする請求項１に記載の化学分析前処理装置。
【請求項３】
さらに透析試料濃度または透析液濃度の変化が所定値よりも低くなったら、前記制御手段は前記透析液流路内の透析液を前記透析後の透析液収容容器に移動させて前記透析液流路内に新たな透析液を導くとともに、前記透析試料流路内の透析試料を前記透析後の透析試料収容容器に移動させた後に前記透析前の透析試料収容容器に移動させることを繰り返すことを特徴とする請求項２に記載の化学分析前処理装置。
【請求項４】
前記透析試料流路に前記透析膜を溶着または接着して透析試料の外部への漏洩を防止したことを特徴とする請求項１に記載の化学分析前処理装置。
【請求項５】
前記透析試料流路および前記透析液流路には、それぞれ複数回蛇行した蛇行流路部が形成されており、この蛇行流路部間の部分に谷形または山形を形成し、この谷形と山形部間に前記透析膜を挟持したことを特徴とする請求項１に記載の化学分析前処理装置。
【請求項６】
前記透析試料流路および前記透析液流路には、それぞれ複数回蛇行した蛇行流路部が形成されており、この蛇行流路部のエッジ部分で前記透析膜を挟持したことを特徴とする請求項１に記載の化学分析前処理装置。
【請求項７】
前記前処理デバイスは一体形成されていることを特徴とする請求項２に記載の化学分析前処理装置。
【請求項８】
試料を保持する試料保持容器と、試料と反応させる試薬を保持する複数の試薬保持容器と、反応した試料を透析する透析流路と、透析流路から流出する試料を回収する試料回収容器と、透析流路から流出する試薬を回収する試薬回収容器とを備えた化学分析前処理装置において、前記透析流路では透析液が一方向へ、透析試料が往復方向へ送液されるよう制御する制御手段を設けたことを特徴とする化学分析前処理装置。
【請求項９】
試料を保持する試料保持容器と、試料と反応させる試薬を保持する複数の試薬保持容器と、反応した試料を透析する透析流路と、透析流路から流出する試料を回収する試料回収容器と、透析流路から流出する試薬を回収する試薬回収容器とを備えた化学分析前処理装置において、微圧制御手段を設け、この微圧制御手段は前記各容器の少なくともいずれかに圧力を付与することを特徴とする化学分析前処理装置。
【請求項１０】
透析試料が前記透析流路から漏れ出すのを防止する漏洩防止手段を前記透析流路に設けたことを特徴とする請求項８または９に記載の化学分析前処理装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学分析に用いる前処理装置に係り、特に透析に好適な化学分析前処理装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
透析膜を使って目標物を抽出する例が、特許文献１に記載されている。この公報に記載の透析方法では、スケールの発生を防止しながら連続して拡散透析するために、アルミン酸イオンを含有する水溶液とアルミン酸イオンを含有しない水酸化アルカリ水溶液とを、それぞれ一定時間ずつ拡散透析槽に供給している。これにより、水酸化アルカリを回収している。すなわち、陽イオン交換膜からなる拡散透析膜を挟んで、一方の隔室に拡散透析の対象となるアルミン酸イオンを含有する水酸化アルカリ水溶液を供給し、他方の隔室には通常水を供給する。水酸化アルカリの回収効率を向上させるために、両隔室に供給する液の流れ方向を向流にする。
【０００３】
【特許文献１】特開平６−２４６１３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記特許文献１に記載の透析方法では、拡散透析膜を挟んで両隔室に供給する液を向流で供給している。この透析方法では、以下の理由により透析が完了するまでに要する時間が長時間になる恐れがある。つまり、透析液と透析試料を対向して送液しているので、濃度の高い透析試料が新鮮な透析液に接触する状態を長期にわたり維持しなければならず、透析液の下流側の濃度を低く、透析試料の下流側の濃度を高く保持する必要がある。また、試料の液量が微量であれば、液漏れを発生しない流路が必要になる。
【０００５】
本発明は上記従来技術の不具合に鑑みなされたものであり、その目的は、試料から短時間で目標物質を拡散透析することにある。また、本発明は拡散透析を小型で簡素な装置で実現することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するための本発明の特徴は、透析膜を挟んで透析試料流路と透析液流路とを密着して配置した透析部を有する前処理デバイスと、この前処理デバイス中を流通する透析試料と透析液の移動を制御する制御手段を有する流体制御システムとを備える化学分析前処理装置において、前記制御手段は、透析液が前記透析液流路を一方向に移動し、透析試料が前記透析試料流路を往復動するように制御することである。
【０００７】
そしてこの特徴において、前記前処理デバイスは、透析前の透析試料と透析液をそれぞれ収容する容器と、透析後の透析試料と透析液をそれぞれ収容する容器とを有し、前記制御手段は、透析試料濃度または透析液濃度の変化が所定値よりも低くなったら、前記透析液流路内の透析液を前記透析後の透析液収容容器に移動させて前記透析液流路内に新たな透析液を導くとともに、前記透析試料流路内の透析試料を前記透析後の透析試料収容容器に移動させた後に前記透析前の透析試料収容容器に移動させることが望ましい。
【０００８】
さらに、透析試料濃度または透析液濃度の変化が所定値よりも低くなったら、前記制御手段は前記透析液流路内の透析液を前記透析後の透析液収容容器に移動させて前記透析液流路内に新たな透析液を導くとともに、前記透析試料流路内の透析試料を前記透析後の透析試料収容容器に移動させた後に前記透析前の透析試料収容容器に移動させることを繰り返すのがよい。
【０００９】
上記特徴において、透析試料流路に前記透析膜を溶着または接着して透析試料の外部への漏洩を防止してもよく、透析試料流路および前記透析液流路には、それぞれ複数回蛇行した蛇行流路部が形成されており、この蛇行流路部間の部分に谷形または山形を形成し、この谷形と山形部間に前記透析膜を挟持してもよい。また、透析試料流路および前記透析液流路には、それぞれ複数回蛇行した蛇行流路部が形成されており、この蛇行流路部のエッジ部分で前記透析膜を挟持してもよい。さらに、前処理デバイスは一体形成されているのが望ましい。
【００１０】
上記目的を達成する本発明の他の特徴は、試料を保持する試料保持容器と、試料と反応させる試薬を保持する複数の試薬保持容器と、反応した試料を透析する透析流路と、透析流路から流出する試料を回収する試料回収容器と、透析流路から流出する試薬を回収する試薬回収容器とを備えた化学分析前処理装置において、前記透析流路では透析液が一方向へ、透析試料が往復方向へ送液されるよう制御する制御手段を設けたことにある。
【００１１】
上記目的を達成する本発明のさらに他の特徴は、試料を保持する試料保持容器と、試料と反応させる試薬を保持する複数の試薬保持容器と、反応した試料を透析する透析流路と、透析流路から流出する試料を回収する試料回収容器と、透析流路から流出する試薬を回収する試薬回収容器とを備えた化学分析前処理装置において、微圧制御手段を設け、この微圧制御手段は前記各容器の少なくともいずれかに圧力を付与することにある。
【００１２】
そして上記いずれかの特徴において、透析試料が前記透析流路から漏れ出すのを防止する漏洩防止手段を前記透析流路に設けることが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、透析流路の両端にそれぞれ液の保持容器と回収容器を設け、透析液を保持容器から回収容器へ一方向で送液しているので、試料が保持容器と回収容器の間を往復送液され、透析に要する時間を短縮できる。また、複雑な構造を用いることなく小型の装置で効率よく透析できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明に係る化学分析前処理装置のいくつかの実施例を、図面を用いて説明する。図１は、化学分析の前処理のフローの一例であり、たんぱく質を質量分析する際のフロー図である。前処理工程は、変性・還元化工程およびアルキル化工程，脱塩工程，酵素消化工程の４つの工程を有している。変性・還元化行程では、前処理部に分析対象であるたんぱく質を含む試料を分注した後、第１の試薬Ａを混合させて第１の中間生成物Ｂを生成させる。アルキル化行程では、この第１の中間生成物Ｂに第２の試薬Ｃを混合して、透析試料を生成する。脱塩行程では、生成された透析試料に透析液を透析膜を介して接触させ、脱塩する。この透析により、第２の中間生成物Ｃが生成される。酵素消化行程では、第２の中間生成物Ｃに第３の試薬Ｅを加えて、最終生成物を生成する。前処理工程が完了して生成された最終生成物は、質量分析計に送られ質量分析される。
【００１５】
この図１で示した前処理工程で用いる化学分析前処理装置の模式図を、図２に示す。化学分析前処理装置１００は、試料などを送液する流体制御システム２０１と前処理工程を実行する前処理デバイス２０２とを有する。流体制御システム２０１には、従来用いられている装置を使用可能である。すなわち、試料などの送液に必要な圧力を保持する圧力チャンバ２０３に、圧力チャンバ２０３に圧力を付与する真空ポンプ２０４が接続されている。圧力チャンバ２０３内の圧力を検出する図示しない圧力計が、圧力チャンバ２０３に取り付けられている。検出された圧力チャンバ２０３内の圧力は、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）２０５に入力される。ＰＣ２０５は、入力された圧力に基づいて真空ポンプ
２０４をフィードバック制御する。圧力チャンバ２０３内の圧力が所定圧力を超えたときにチャンバ内のガスを放風する放風用電磁弁２００が、圧力チャンバ２０３に取り付けられている。
【００１６】
圧力チャンバ２０３と前処理デバイス２０２とは、圧力チャンバ２０３に接続された流路２３０から分岐した複数の流路２３２〜２４６により接続されている。この複数の流路２３２〜２４６のそれぞれには、電磁弁２０６〜２１３が取り付けられている。分岐流路２３２〜２４４は、前処理デバイス２０２の周辺部に配置した試薬収納容器２２５〜229にそれぞれ接続されている。各試薬収納容器２２５〜２２９には、大気と連通させるための大気開放用電磁弁２１４〜２２１が取り付けられている。電磁弁２０６〜２１３および大気開放用電磁弁２１４〜２２１は、ＰＣ２０５によりオン／オフ制御される。
【００１７】
前処理デバイス２０２は、周囲部に配置した６個の試薬収納容器２２４〜２２９と、中央部に配置した詳細を後述する透析部３０５と、この透析部３０５に配管接続され、透析部３０５を挟んで互いに対向して配置された透析液収納容器５１２および透析液回収容器５１３とを有している。透析液収納容器５１２および透析液回収容器５１３には、大気に開放する流路２５２,２５４が接続されており、この流路２５２,２５４には電磁弁２１７，２２１が取り付けられている。透析液収納容器５１２および透析液回収容器５１３には、圧力チャンバ２０３に接続された流路２３０から分岐した流路２４６，２３８が接続されており、この流路２４６，２３８には、それぞれ電磁弁２１３，２０９が取り付けられている。これらの電磁弁２１７，２２１，２０９，２１３もＰＣ２０５によりオン／オフ制御される。
【００１８】
図３に、透析部３０５を示す。図３（ａ）は、透析部３０５の分解斜視図であり、同図（ｂ）は、透析部３０５を組み立てた状態である。透析部３０５は、透析膜３０４とこの透析膜３０４の上下両面に配置した透析試料流路３０１，３０２とを有する。透析試料流路３０１，３０２は、流路を複数に折り曲げた蛇行流路である。透析膜３０４を左右から挟みこんで縦型の透析部３０５を形成してもよい。
【００１９】
図４に、透析部３０５ｂの他の例を上面図で示す。透析試料が流通する透析試料流路
３０１は、図３の実施例と同様に蛇行流路に形成する。一方、透析液が流通する透析液流路４０１は、蛇行流路として形成された透析試料流路３０１をカバーする大きさであり、透析液が流路入口から出口へ送液される際にガイドとなる整流板４０２を斜めに配置している。この透析部３０５ｂの場合、透析液流路の入口４０３と出口４０４を対角状に配置するのが望ましい。
【００２０】
透析液収納容器５１２および透析液回収容器５１３は、透析試料流路３０１，３０２に接続されている。試薬保持容器２２６は、試料を保持する試料保持容器として使用される。また、試薬保持容器２２７は、試薬を回収する試薬回収容器として使用される。その他の容器２２４，２２５，２２８，２２９は試薬を保持する。また、透析液回収容器２２７は、前処理工程の途中で生成された生成物や透析処理された中間生成物を収納するのにも用いられる。
【００２１】
上記構成の化学分析前処理装置１００の動作を、以下に説明する。試料収納容器２２４から第１の試薬を収納する試薬収納容器２２５へ試料を送液する場合を、例にとる。圧力チャンバ２０３内を、試料の送液が可能な負圧に制御する。試料収納容器２２４に接続された大気開放用電磁弁２１４を開ける。それとともに、試薬収納容器２２５と圧力チャンバ２０３間に介在させた電磁弁２０７を開ける。試料収納容器２２４よりも試薬収納容器２２５が低圧になる。試料の送液が開始される。試料と第１の試薬とが反応し、第１の中間生成物を生成する。
【００２２】
このように、前処理工程を実行する作業者は、ＰＣ２０５を用いて圧力チャンバ２０３内の圧力を制御する。それとともに、動作させる流路に応じて電磁弁および大気開放電磁弁を選択する。その際、電磁弁および大気開放電磁弁の駆動時間も設定する。なお、圧力チャンバ２０３の内圧を常時モニタして、圧力を一定に維持している。また、各電磁弁は、選択されない限り常時閉である。
【００２３】
図５から図９を用いて、透析部３０５ｃの作用を説明する。透析試料５０１が含む塩
５０２を透析する場合を例にとる。理解を容易にするために、各流路を１次元的に表示しているが、実際は図３または図４に示すような蛇行流路を用いる。透析膜３０４ｃを挟んで図３または図４に示したような透析液流路３０２ｃと透析試料流路３０１ｃとが、対向配置されている。透析液流路３０２ｃの左右両端部には、入口５０３および出口５０７が形成されている。同様に、透析試料流路３０１ｃの両端部には、入口５０５および出口
５０６が形成されている。
【００２４】
透析液５０４は、透析液流路入口５０３から図中右方向に移動する。透析試料５０１も、透析試料流路入口５０５から図中右方向に移動する。透析液流路３０２ｃおよび透析試料流路３０１ｃを、透析液５０４および透析試料５０１が満たす。時間が経過するにつれ、透析が進行する。そして、透析試料流路３０１ｃから透析液流路３０２ｃに、透析膜
３０４ｃの間から透析試料５０１が移動する。
【００２５】
図９は、透析の進行状態を示すグラフである。この図９において、横軸は経過時間であり、縦軸は透析試料５０１の濃度６０１および透析液５０４の塩濃度である。透析が進行するにつれて、透析試料５０１と透析液５０４の境界で塩濃度が平均化５０９される。その結果、透析試料５０１の移動速度が低下し、透析効率が低下する。図９では、各濃度を示す線が、ｘ軸に平行な線になっている。
【００２６】
この透析効率の低下を抑制するために、透析の進行が低下した透析試料５０１を、透析試料収納容器５１０から透析試料回収容器５１１へ送液する。透析試料回収容器５１１で透析試料５０１を攪拌して濃度の均一化を図った後、透析試料回収容器５１１から透析試料収納容器５１０へ透析試料５０１を戻す。この動作と平行して、透析液５０４を透析液収納容器５１２から透析液回収容器５１３側へ送液する。そして、新鮮な透析液５０４と透析試料５０１を、透析膜３０４ｃの介在の下に接触させる。この状態で、再度、塩を透析する（図９の線図６０２（ｂ）参照）。
【００２７】
時間が経過するにつれ、透析が進行する。透析試料と透析液の境界で塩濃度が再び平均化する。透析試料５０１を透析試料回収容器５１１から透析試料収納容器５１０へ戻し、透析試料５０１を攪拌する。そして、透析試料収納容器５１０から透析試料回収容器511へ、透析試料５０１を送液する。それと平行して透析液５０４を透析液収納容器５１２から透析液回収容器５１３側へ送液する(図９の線図６０２(ｃ)参照)。透析液流路３０２ｃには新たな透析液５０４が導かれる。これにより、新鮮な透析液５０４と透析試料５０１が、透析膜３０４ｃの介在の下に再度接触する。透析試料５０１中の塩５０２を透析する。この手順を繰り返すことにより、透析時間を短縮する。本実施例では、透析部３０５ｃにおいて、透析液は透析液収納容器５１２から透析液回収容器５１３に一方向にだけ送液される。一方、透析試料５０１は、透析試料収納容器５１０と透析試料回収容器５１１の間を往復送液される。その結果、透析試料５０１を攪拌して透析試料５０１の均一濃度化が可能になるとともに、新鮮な透析液５０４が均一濃度化した透析試料に接触するので、透析時間が短縮される。
【００２８】
図１０ないし図１３に、本発明に係る透析部３０５のいくつかの変形例を、断面図で示す。図１０に示す変形例では、透析液５０４と透析試料５０１を対向流としている。透析液流路３０２ｃでは、透析液５０４は上記実施例と同様に透析液流路３０２ｃの入口側
７０１から出口側７０２へ図中右方向に移動する。一方、透析試料５０１は、透析試料流路３０１ｃを、透析試料流路３０１ｃの入口７０３から出口７０４へ、図中左方向に移動する。この場合の送液の流速を、塩５０２の拡散速度程度かそれよりも低速にする。そして、圧力チャンバ２０３内の圧力を微圧にする。圧力チャンバ２０３は、大気開放用絞り機構付き開放弁２００を有しているので、真空ポンプ２０４で負圧を発生しながら圧力チャンバ２０３を大気開放して微圧を制御する。
【００２９】
図１１に、透析部のさらに他の変形例を断面図で示す。本変形例では、透析中に透析試料５０１が流路の外に漏れるのを防止する手段を講じている。透析試料５０１の漏れを防止するために、透析試料流路３０１ｄの流路部８０１に、透析膜３０４ｃを溶着或いは接着している。透析試料流路３０１ｄの流路部８０１がシールされ、透析試料５０１が透析部外に流出するのが防止される。したがって、透析試料５０１が微量になっても回収率を低下させること無く透析できる。
【００３０】
図１２および図１３に透析部のさらに他の変形例を、断面図で示す。本変形例では、試料のいかんに関わらず、試料の漏れを防止する手段を講じている。図１１に示したシールの場合、取り扱う試料によっては、接着材や溶着に用いた材料の残りが、試料を汚染する恐れがある。そこで、本変形例では、接着材や溶着などを使用せずに、物理的にシールしている。透析試料流路３０１ｆおよび透析液流路３０２ｆが透析膜３０４ｄを挟む部分をそれぞれ山形９０１および谷形９０２にして、透析膜３０４ｄを透析試料流路３０１ｆに押さえつけている。また、図１３に示すように透析試料流路３０１ｆおよび透析液流路
３０１ｇの流路部以外を双方とも谷形に形成し、透析膜３０４ｃを各流路３０１ｆ，302gのエッジ部９１１で挟んでいる。上記各変形例によれば、透析試料の外部への漏洩を防止でき、透析の進行により透析試料が微量になっても、透析効率を低下させることがない。
【００３１】
図１４を用いて、上記実施例に示した前処理デバイスを用いた色素透析実験について説明する。色素透析実験に用いた試薬類は、以下の通りである。被透析サンプルとして、色素メチルグリーンを含んだ１００ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液をｐＨ４に調整して用いる。メチルグリーンの濃度を、１mg／１ｍＬに調整する。透析液として、１００ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液をｐＨ４に調整して用いる。被透析サンプルおよび透析液のｐＨを７以上にすると、色素が透析膜に非特異吸着しやすくなり、透析効率が低下するので、これらの液のｐＨを７以下にしている。
【００３２】
このように調整した被透析サンプルを試薬保持容器２２６に分注するとともに、透析液を透析液収納容器５１２に分注する。流体制御システム２０１を用いて、被透析サンプルを透析試料流路３０１に送液する。透析している間は、透析試料流路３０１に被透析サンプルを保持する。その後同様に、透析液収納容器５１２に分注した透析液を、透析液回収容器５１３に送液する。透析部３０５で、透析膜３０４を介して被透析サンプルと透析液が接触する。透析膜３０４近傍の色素濃度勾配により、色素が透析バッファ側に透析される。数時間透析を継続し、透析が完了したら被透析サンプルを流体制御システム２０１を用いて試薬保持容器２２７へ送液する。
【００３３】
透析が完了したら、被透析サンプルを採取し、分光光度計で吸光度を計測する。このようにして測定した結果の一例を、図１４に示す。この図１４では従来の色素透析実験結果と、本発明に係るデバイスを用いた色素実験法とを比較して示している。デバイスを用いた透析法１４０１の方が従来の透析法１４０２より、２５％程度透析時間を短縮できる。なお、透析時間は透析距離の２乗に比例するので、透析試料流路３０１の高さ寸法は、可能な限り小さくすることが望ましい。このようにすれば、透析時間を短縮できる
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明に係る化学分析前処理装置における処理手順の一例を示すフロー図である。
【図２】本発明に係る化学分析前処理装置の一実施例の模式図である。
【図３】図２に示した化学分析前処理装置に用いる透析部の斜視図である。
【図４】透析部の他の実施例の上面図である。
【図５】透析を説明する断面図である。
【図６】透析を説明する断面図である。
【図７】透析を説明する断面図である。
【図８】透析を説明する断面図である。
【図９】透析の進行を説明するグラフである。
【図１０】透析部の変形例の断面図である。
【図１１】透析部の変形例の断面図である。
【図１２】透析部の変形例の断面図である。
【図１３】透析部の変形例の断面図である。
【図１４】透析時間と吸光度の変化の関係を説明する図である。
【符号の説明】
【００３５】
１００…化学分析前処理装置、２００…開放弁、２０１…流体制御システム、２０２…前処理デバイス、２０３…圧力チャンバ、２０４…真空ポンプ、２０５…パーソナルコンピュータ（ＰＣ）、２０６〜２２１…電磁弁、２２４…試料収納容器、２２５…試薬収納容器、３０１…透析試料流路、３０２，４０１…透析液流路、３０４…透析膜、３０５…透析流路装置(透析部)、４０２…整流板、４０３…流路入口、４０４…流路出口、５０１…透析試料、５０２…塩、５０３…透析液流路入口、５０４…透析液、５０５…透析試料流路入口、５０７…出口流路、５０９…塩濃度の平均化、５１０…透析試料収納容器、
５１１…透析試料回収容器、５１２…透析液収納容器、５１３…透析液回収容器、６０１…透析試料塩濃度、６０２…透析液塩濃度、７０１…液流路入口、７０２…液流路出口、７０３…試料流路入口、７０４…試料流路出口、８０１…流路部以外の部分、９０１…山形、９０２…谷形、９１１…エッジ部。
【図１】
2007183141.tif 000003
【図２】
2007183141.tif 000004
【図３】
2007183141.tif 000005
【図４】
2007183141.tif 000006
【図５】
2007183141.tif 000007
【図６】
2007183141.tif 000008
【図７】
2007183141.tif 000009
【図８】
2007183141.tif 000010
【図９】
2007183141.tif 000011
【図１０】
2007183141.tif 000012
【図１１】
2007183141.tif 000013
【図１２】
2007183141.tif 000014
【図１３】
2007183141.tif 000015
【図１４】
2007183141.tif 000016