(57)【要約】【課題】  生理活性物質を魚類に簡便に投与することができ、かつその投与効果が長期間持続することが可能な製剤を提供すること。【解決手段】  本発明の油性製剤は、２０℃で固体の天然油脂に、生理活性物質の水性溶液または水性懸濁液を分散させることによって得られる。あるいは２０℃で固体の天然油脂と２０℃で液状の天然油脂との混合油脂に、生理活性物質の溶液または懸濁液を分散させることによって得られる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２０℃で固体の天然油脂に、生理活性物質の水性溶液または水性懸濁液を分散させることによって得られる、油性製剤。
【請求項２】
前記天然油脂が、カカオバターである、請求項１に記載の油性製剤。
【請求項３】
前記天然油脂と前記生理活性物質の水性溶液または水性懸濁液との質量比が９５：５〜７０：３０である、請求項１または２に記載の油性製剤。
【請求項４】
２０℃で固体の天然油脂と２０℃で液状の天然油脂との混合油脂に、生理活性物質の溶液または懸濁液を分散させることによって得られる、油性製剤。
【請求項５】
前記混合油脂中の２０℃で固体の天然油脂と２０℃で液状の天然油脂との質量比が９：１〜１：９である、請求項４に記載の油性製剤。
【請求項６】
前記２０℃で固体の天然油脂がカカオバターであり、前記２０℃で液状の天然油脂がピーナッツオイルである、請求項４または５に記載の油性製剤。
【請求項７】
前記混合油脂と前記生理活性物質の水性溶液または水性懸濁液との質量比が９５：５〜７０：３０である、請求項４から６のいずれかの項に記載の油性製剤。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかの項に記載の油性製剤からなる、魚類用注射剤。
【請求項９】
請求項１から７のいずれかの項に記載の油性製剤を魚類に注射する工程を含む、生理活性物質の魚類への投与方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性物質を含む油性製剤に関する。より詳細には、魚類に生理活性物質を投与するための油性製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、魚類の種苗生産において、良質な受精卵を安定的に得るために、飼育環境の調節、ホルモンの投与による人為的産卵誘導などが試みられている。特に、人工飼育環境下においては、例えば、卵黄形成が完了しても卵の最終成熟が起こらない魚種（非特許文献１）、水槽内で自然産卵するものの産卵期が長期に渡る魚種、あるいは日によって採卵数が大きく変動するため安定的に受精卵の獲得ができない魚種（非特許文献２および３）を対象に、人為的排卵誘導が試みられている。
【０００３】
このような魚種の人為的排卵誘導手段としては、生殖腺発達を統御する生殖腺刺激ホルモン放出ホルモンアナログ（lutenizing hormone releasing hormone analog；LHRHa）およびヒト胎盤性性腺刺激ホルモン（human chorionic gonadotropin；HCG）などの生理活性物質の投与が有効であることが知られている（非特許文献４〜８）。例えば、クエ・マハタ（非特許文献９）、トラフグ（非特許文献１０）、マツカワ（非特許文献１１）、ブリ（非特許文献１２）などでは上記投与の技術開発が進められ、一部で実用化されている。
【０００４】
生理活性物質、特にホルモンの魚類への投与方法としては、一般的に「埋め込み法」、「注射法」などが知られている。
【０００５】
「埋め込み法」は、親魚の表皮をメスで切開し、ホルモンを含んだペレットや結晶状のホルモンをチューブに詰めたものを埋め込むことにより行われる。この埋め込み法は、投与したホルモンの溶出が長期間続き、その効果を継続することができる。例えば、コレステロールペレットを用いた場合は、１〜２ヶ月（非特許文献１３および１４）、サイラスティックチューブを用いた場合は、半年〜１年（非特許文献１５）、エチレン酢酸ビニル共重合体（ＥＶＡｃ）を用いた場合は、１ヶ月（非特許文献１６）、そしてマイクロスフィア（ナノあるいはマイクロサイズのポリマー球の中に薬剤を閉じ込めたもの；microsphere）を用いた場合は６０日間（非特許文献１７）、ホルモンの効果が持続することが報告されている。しかし、投与時にメスで表皮を切開し、ペレットを筋肉中に無理に挿入するため、親魚へかかるストレスが大きい。また、ペレットの作成には、専用の道具や冷凍設備が必要なため、初期投資の費用が高額であることや、投与の前日から準備を行う必要があること等から、民間業者への普及が難しいといった問題がある。
【０００６】
一方、「注射法」は、生理食塩水やプロピレングリコール等にホルモンを溶解または縣濁して注射することにより行われる。注射法は、数時間もあれば投与溶液を調製でき、特別な道具や設備を必要としないことから、民間業者でも容易に扱うことができる。また、注射での投与のため、魚体を傷つけることが少なく、さらに処理が簡便で親魚へかかるストレスを軽減できる。しかし、投与したホルモン濃度を長期間維持できないといった問題点がある。例えば、生理食塩水（非特許文献１３）あるいはプロピレングリコール
（非特許文献１８）を投与助剤として用いた場合、投与直後にホルモンの血中濃度が増加するが、２日程度で急減することが報告されている。
【０００７】
そこで、生理活性物質を魚類に簡便に投与することができ、かつその投与効果が長期間持続することが可能な製剤が望まれている。
【非特許文献１】松山倫也ら、1997、水産増殖、45、67-73
【非特許文献２】長浜達章ら、1985、兵庫水誌研報、23、39-42
【非特許文献３】杉野博之および高見純一、2000、岡山水試報、15、25-29
【非特許文献４】山野目健ら、1997、岩手水技セ研報、1、13-19
【非特許文献５】Pankhurst,N. W.およびThomas, P. M.、1998、Aquaculture、166、163-177.
【非特許文献６】Mugnier,C.ら、2000、Aquaculture、181、241-255
【非特許文献７】Lee,W.-K.およびYang, S.-W.、2002、Aquaculture、207、169-183
【非特許文献８】宮内正幸ら、2003、福岡水海研報、13、1-5
【非特許文献９】高屋雅生および荒川敏久、1987、長崎水試報、13、39-41
【非特許文献１０】中田久ら、1997、水産増殖、45、67-73
【非特許文献１１】萱場隆昭ら、2000、北水試研報、58、9-16
【非特許文献１２】中田久ら、2001、九大農学芸誌、55、169-177
【非特許文献１３】Crim,L. W.ら、1988、Aquaculture、74、87-95
【非特許文献１４】Matsuyama,M.ら、1995、Fish. Sci.、61、3、472-477
【非特許文献１５】Pavlick,R. J. Jr.およびMoberg, G. P.、1997、Gen. Comp. Endocrinol.、105、218-227
【非特許文献１６】Greenwood,L. N.ら、2001、Gen. Comp.Endocrinol.、123、1-12
【非特許文献１７】Holland,H. C. M.ら、1998、Biol. Reprod.、59、1153-1162
【非特許文献１８】Yamada,H.ら、1997、Gen. Comp. Endocrinol.、106、181-188
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、生理活性物質を魚類に簡便に投与することができ、かつその投与効果が長期間持続することが可能な製剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の油性製剤は、２０℃で固体の天然油脂に、生理活性物質の水性溶液または水性懸濁液を分散させることによって得られる。
【００１０】
好ましい実施態様においては、上記天然油脂は、カカオバターである。
【００１１】
好ましい実施態様においては、上記天然油脂と上記生理活性物質の水性溶液または水性懸濁液との質量比が９５：５〜７０：３０である。
【００１２】
本発明の油性製剤はまた、２０℃で固体の天然油脂と２０℃で液状の天然油脂との混合油脂に、生理活性物質の溶液または懸濁液を分散させることによって得られる。
【００１３】
好ましい実施態様においては、上記混合油脂中の２０℃で固体の天然油脂と２０℃で液状の天然油脂との質量比が９：１〜１：９である。
【００１４】
好ましい実施態様においては、上記２０℃で固体の天然油脂がカカオバターであり、上記２０℃で液状の天然油脂がピーナッツオイルである。
【００１５】
好ましい実施態様においては、上記混合油脂と上記生理活性物質の水性溶液または水性懸濁液との質量比が９５：５〜７０：３０である。
【００１６】
本発明の魚類用注射剤は、上記油性製剤からなる。
【００１７】
本発明の生理活性物質の魚類への投与方法は、上記油性製剤を魚類に注射する工程を含む。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の、生理活性物質、特に魚類に適した生理活性物質の水性溶液または水性懸濁液を油脂に分散させて得られる油性製剤は、２０℃で固体の天然油脂、あるいは２０℃で固体の天然油脂と２０℃で液状の天然油脂とを混合した油脂を用いて調製されているため、油性製剤が固形状でも、加温により融解して注射可能となる。そのため、注射に適した油性製剤である。さらに、油性製剤の融点を自由に調整できるため、魚類の生育環境に適した条件（温度）で所望の生理活性物質を魚類に吸収させることができるようになる。例えば、融点２５℃の混合油脂を調製した場合、２５℃以上の温度で溶解した油性製剤を魚類に注射すると、水温が２４℃以下では注射後、体内で固化する。そのため、生理活性物質の急激な溶出が抑制できる。また、水温が上昇し、２５℃以上となったときに油性製剤が融解するので、生理活性物質が放出され、魚類に吸収される。また、生理活性物質の水性溶液または水性懸濁液を用いることにより、脂溶性の生理活性物質の油脂への溶解が防止できる。そのため、分散している水相中の生理活性物質が適切な速度で吸収される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の油性製剤は、２０℃で固体の天然油脂（以下、単に固体油脂という場合がある）、あるいは該固体油脂と２０℃で液状の天然油脂（以下、単に液状油脂という場合がある）との混合油脂に、生理活性物質の水性溶液または水性懸濁液を分散させることによって得られる。以下、本発明に用いられる天然油脂、生理活性物質、およびこれらを含む油性製剤について順次説明する。
【００２０】
（天然油脂）
本発明の油性製剤は、２０℃で固体の天然油脂（固体油脂）を含み、必要に応じて、２０℃で液状の天然油脂（液状油脂）を含む。本発明に用いられる油脂は、投与対象の魚類が食品として流通する点から、天然物由来の油脂が用いられる。
【００２１】
上記固体油脂は、投与対象である魚類の体内で固化するため、生理活性物質の急な溶出を抑制することができる。固体油脂としては、カカオバター、ココナッツオイル、パームオイル、マンゴーオイルなどが挙げられる。これらの中でも、カカオバターは、融点が３２〜３８℃であるため、湯煎により容易に液状に調製でき、さらに上記融点が一般的な魚類の飼育水温より高いため、体内で容易に固化する点から好適に用いられる。固体油脂は、単独で用いてもよいし、２以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２２】
本発明においては、上記のとおり、固体油脂に加えて、さらに液状油脂を混合して用いることが好ましい。この混合油脂は、組み合わせによって、融点を調節することができるため、例えば、融点が低い混合油脂を調製することによって、低温下での注射法による投与も可能となる。上記液状油脂としては、ピーナッツオイル、セサミオイル、オリーブオイルなどが挙げられる。ピーナッツオイルは、融点が３℃前後と低く、融点を下げるのに適している点で好適である。液状油脂は、単独で用いてもよいし、２以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２３】
上記混合油脂中の固体油脂と液状油脂との組み合わせは、特に制限されない。各油脂の融点などに応じて適宜設定される。魚類の生育温度を考慮すると、カカオバターとピーナッツオイルとを組み合わせることが好ましい。
【００２４】
上記混合油脂中の固体油脂と上記液状油脂との割合は、注射時の温度、魚類の飼育温度などを参考に所望の融点となるように適宜設定すればよい。好ましくは質量比で９：１〜１：９、より好ましくは９：１〜１：２である。
【００２５】
（生理活性物質）
本発明に用いられる生理活性物質は、特に制限されない。魚類に対して長期間投与を要する生理活性物質を対象とすることが好ましい。生理活性物質としては、例えば、生殖腺刺激ホルモン、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、β―カロチン、カテキンなどが挙げられる。
【００２６】
生殖腺刺激ホルモンとしては、例えば、ヒト胎盤性性腺刺激ホルモン（human chorionic gonadotropin、ＨＣＧ）、テストステロン（testosterone）、エストラジオール（estradiol）、生殖腺刺激ホルモン放出ホルモンアナログ（lutenizing hormone releasing hormone analog、ＬＨＲＨａ）などが挙げられる。好ましくはヒト胎盤性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）およびテストステロン（testosterone）である。
【００２７】
本発明においては、上記生理活性物質を予め水性溶媒中に溶解させる、あるいは懸濁させて用いる。水性溶媒とは、水を含む溶媒のことをいい、水単独、あるいは水と有機溶媒（例えば、エタノールなどのアルコール）との混合溶媒が用いられる。このように、生理活性物質を水性溶液または水性懸濁液として用いることによって、得られる油性製剤が固化する際に、油相に分散している水相内に生理活性物質がトラップされているため、生理活性物質が油脂に溶解あるいは直接分散することがなく、固化した油性製剤が融解されたときに、水相に分散している生理活性物質が適切な速度で魚類に吸収される。上記水性溶液または水性懸濁液の調製は、特に制限されず、攪拌などの当業者が通常用いる調製方法によって行われる。
【００２８】
上記水性溶液または水性懸濁液中の生理活性物質の含有量は特に制限されないが、通常、０．０１質量％〜２０質量％、好ましくは０．１質量％〜１０質量％である。
【００２９】
（油性製剤）
本発明の油性製剤は、上記固体油脂または固体油脂と液状油脂との混合油脂に、上記生理活性物質の水性溶液または水性懸濁液を分散させることによって得られる。分散は、例えば、攪拌装置（ミキサーなど）を用いるなどの当業者が通常用いる方法によって行われる。
【００３０】
上記固体油脂または混合油脂と、生理活性物質の水性溶液または水性懸濁液との割合は、特に制限されない。好ましくは質量比で９５：５〜７０：３０、より好ましくは９５：５〜８０：２０である。上記の質量比の範囲から外れる場合は、生体内において油性製剤が固化しにくくなるため、生理活性物質の溶出が速く、長期的な投与効果が得られない場合がある。
【００３１】
本発明の油性製剤は、魚類用注射剤として用いられる。本発明の油性製剤は、通常、常温下で液状であるか、固体であっても加温することにより容易に液状となる。そのため、この油性製剤を魚類に注射することによって、簡便に投与することができる。投与時において、一部または全部が固化している場合は、湯煎などにより加温して液状化すればよい。加熱温度は、使用する生理活性物質の熱安定性を考慮して適宜設定される。好ましくは４０℃以下、より好ましくは３５℃以下、さらに好ましくは３０℃以下である。
【００３２】
本発明の油性製剤は、注射法による投与が可能であるため、埋め込み法に比べて、魚類に対してストレスが少なく、簡便に生理活性物質を投与することができる。さらに、生理活性物質を生理食塩水またはプロピレングリコールに溶解し、注射する従来の方法に比べて、生理活性物質の除放性に優れている。すなわち生理活性物質の溶出量を抑制し、低濃度で長期間放出することができるため、生理活性物質の投与効果を長期間保持することができる。さらに、所定の温度で溶解できるように油性製剤を調製できるので、排卵と温度の関係が明らかな場合には、排卵を起こす温度で性ホルモンなどの水懸濁液を含有する油性製剤が融解するように調整すればよい。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【００３４】
（供試魚）
本実施例においては、養殖業者（草野緑化グリーンサービス、長崎）より購入したコイ（Cyprinus Carpio）を用いた。これらは、長崎大学水産学部附属海洋資源教育研究センターの屋内水槽（２００〜３５０Ｌ）に試験群に分けて収容した。試験開始時の収容密度は、５Ｌ／匹であった。試験環境に十分に馴致させた後、試験に供した。試験期間中、１日１回飽食量を給餌した。供試魚の飼育は止水で行った。ただし、１日１回、飼育水槽の半量の水を脱塩素水と置換した。試験開始時の供試魚の標準体長は４８．４±０．６２ｍｍ、体重は１２０±０．５６ｇであった（ｎ＝６６７）。
【００３５】
（血中ホルモン濃度の測定方法）
本実施例および比較例で調製されたホルモン油性製剤を、供試魚に投与した場合の血中ホルモン濃度の測定方法は、次のとおりである。
【００３６】
（１）血中ＨＣＧ濃度の測定
血中ＨＣＧ濃度の測定は、時間分解蛍光測定法（ＤＥＬＦＩＡ）法によって行った。測定には、DELFIA hCG Reagents R007-101（PerkinElmer, Inc. U.S.A.）を用いた。冷凍保存していた血清を４℃で冷蔵解凍し、これを第二抗体（Solid phase anti-βhCG IgG）をあらかじめ固層化しておいたプレート１穴中に２５μｌずつ分注した。これに、トリス塩酸バッファー（ウシ血清アルブミン、ウシグロブリン、ネズミIgG、Tween40、０．１％アジ化ナトリウム、ｐＨ７．８）を２００μｌずつ分注し、攪拌しながら室温で１時間反応させた。
【００３７】
この反応液を除去し、洗浄液（トリス塩酸バッファー、Tween 20  ｐＨ７．８を蒸留水で２０倍希釈）により７回洗浄し、最後に蒸留水で洗浄した。洗浄後、よく蒸留水を除き、抗ＨＣＧ−Ｅｕ標識抗体（トリス塩酸バッファー、ウシ血清アルブミン、０．１％アジ化ナトリウム  ｐＨ７．８）を２００μｌずつ分注し、攪拌しながら室温にて３０分間反応させた。この反応液を除去し、洗浄液により７回洗浄した。洗浄後、エンハンスメント溶液（Enhancement solution；Triton X-1002、酢酸）を２００μｌずつ分注し、攪拌しながら室温にて５分間反応させた。反応終了後、DELFIA Research 1234蛍光光度計（Wallac）のプログラム７を用いて、血中ＨＣＧ濃度を自動測定し、濃度を算出した。
【００３８】
（２）血中テストステロンおよび１１−ケトテストステロン濃度の測定
血中テストステロンおよび１１−ケトテストステロンの濃度の測定（ステロイド濃度測定）は、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法によって行った。冷凍保存していた血清を４℃で冷蔵解凍し、シリコンコーティング済みのガラス試験管に分取した。これに約１０倍量のジエチルエーテルを加え、２０秒間攪拌した後、試料層とエーテル層とに分離するまで静置した。その後、この試験管を、冷却機を用いて−３０℃に冷却したメタノールに浸して急冷し、試料層を凍結させ、ステロイドを含むエーテル層のみを別の試験管に回収した。この抽出操作を３回繰り返した後、約４０℃の温水に浸してエーテル層を蒸発させた。さらに、窒素ガスを用いて残留している微量のエーテルを完全に除去した。次に、この試験管に分取した血清と同量のワーキングバッファー（０．０５Ｍホウ酸バッファー、０．１％ＢＳＡ、０．０５％Thimerosal）を加え、抽出したステロイドを再溶解した。これを第二抗体（抗ウサギIgGヤギIgG、＃00779、CAPPEL、U.S.A.）をあらかじめ固層化しておいたＥＬＩＳＡプレート（SUMILON、MS-8496F、SUMITOMO BAKELITE）１穴中に５０μｌずつ分注した。
【００３９】
これに西洋ワサビペルオキシターゼ（ＨＲＰ）標識抗原および第一抗体をワーキングバッファーで適当な濃度に希釈したものを、それぞれ５０μｌずつ加え、４℃にて１８〜２４時間反応させた。尚、ＨＲＰ−標識抗原（テストステロン：Testosterone-3-CMO-HRP、１１−ケトテストステロン：11-Oxo-Testosterone-3-CMO-HRP）及び第一抗体（テストステロン：anti Testosterone-3(E)-CMO-BSA、１１−ケトテストステロン：anti 11-Oxo-Testosterone-3-CMO-BSA）は、Cosmo BIO CO., LTD (Tokyo) より購入した。また、標識抗原の希釈倍率は、テストステロン：１００００倍、１−ケトテストステロン：１０００００倍とし、第一抗体の希釈倍率は、テストステロン：１０００００倍、１−ケトテストステロン：１０００００倍とした。
【００４０】
反応終了後、液を捨て０．８５％ＮａＣｌ水溶液にて７回洗浄し、未反応のＨＲＰ標識抗原を十分に除去した。洗浄後、よく水切りをし、連続分注器を用いて、発色液（０．２Ｍクエン酸バッファー  ｐＨ４．５、０．０１％Ｈ２Ｏ２、０．０５％o-Phenylenediamine）を１５０μｌずつ加え、２０℃にて４０分間反応させた。十分な発色を確認した後、６Ｎ硫酸を５０μｌずつ加えて発色反応を停止させた。マイクロプレートリーダー（MTP-120、CORONA electric Tokyo）を用い、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。試料中のホルモン濃度の算出は、総合分析ソフトウェアＡＳＳＡＹ  ＺＡＰ（BIOSOFT、U.K.）により既知の濃度のステロイドホルモン濃度測定結果から標準曲線を作製し、これを用いて行った。なお、測定に用いた各抗体は、目的とするホルモンとほぼ特異的に結合し、それ以外のステロイドとの非特異的結合は無視できるほど低いレベルであった。
【００４１】
（３）血中エストラジオール−１７β濃度の測定
血漿中のエストラジオール−１７βの濃度は、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法によって行った。測定にはエストラジオール−１７βＥＩＡキット（Cayman Chemical Company、U.S.A.）を用いた。冷凍保存していた血清を４℃で冷蔵解凍し、シリコンコーティング済みのガラス試験管に分取した。これに約１０倍量のジエチルエーテルを加え、２０秒間攪拌した後、試料層とエーテル層とに分離するまで静置した。その後、この試験管を、冷却機を用いて−３０℃に冷却したメタノールに浸して急冷し、試料層を凍結させてエストラジオール−１７βを含むエーテル層のみを別の試験管に回収した。この抽出操作を３回繰り返した後、約４０℃の温水に浸してエーテル層を蒸発させた。さらに、窒素ガスを用い残留している微量のエーテルを完全に除去した。次にこの試験管に分取した血清と同量のEIAバッファーを加え、抽出したエストラジオール−１７βを再溶解した。これをあらかじめ二次抗体が固層化してあるＥＩＡプレート１穴あたり５０μｌずつ分注した。また、プレート中には、エストラジオール（Estradiol）−１７β抗体を加えない穴（Ｂ０）を設けた。これらにアセチルコリンエステラーゼトレーサーおよび坑血清を１穴に５０μｌずつ加え、室温で振盪しながら１時間インキュベートした。
【００４２】
反応終了後、プレートの液を捨て、０．０５％Tween20を含む洗浄バッファーにより５回洗浄し、未反応のアセチルコリンエステラーゼトレーサーを十分に除去した。洗浄後よく水を切り、連続分注器を用いて、発色液（Ｅｌｌｍａｎ'ｓ試薬）を１穴に２００μｌずつ加え、室温で６０〜９０分間インキュベートし、十分な発色を確認した後、マイクロプレートリーダーを用いて４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。エストラジオール（Estradiol）−１７β抗原と競合せず全発色したＢ０の吸光値に対するサンプル及びスタンダードの吸光値（％Ｂ／Ｂ０）を求めた。総合分析ソフトウェアＡＳＳＡＹ  ＺＡＰ（BIOSOFT、U.K.）により既知の濃度のエストラジオール−１７βの％Ｂ／Ｂ０測定結果から標準曲線を作製し、それを基に試料中のエストラジオール−１７β濃度を測定した。
【００４３】
（４）統計学的解析
算出した血中ＨＣＧ、テストステロン、１１−ケトテストステロン、およびエストラジオール−１７β濃度の有意差検定を統計解析ソフトStatview、Var. 5.0（Abacus Concepts Inc., U.S.A.）を用いて行った（Student’s t-test、One-factor ANOVA）。
【００４４】
（参考例：油性助剤の融点の確認）
カカオバター（キシダ化学株式会社）と、ピーナッツオイル（SIGMA-ALDRICH CO.）またはココナッツオイルとを表１に示す割合で混合して助剤を調製した。これらの助剤を、３０℃に設定したインキュベーター（三洋電機株式会社）中にて３０分間静置した。その後、作製した助剤の状態が固体か液体を目視により判断した。静置温度を２５℃、２０℃、１５℃、および１０℃に設定して、上記と同様に助剤の状態を判断した。固体化した温度をその助剤の融点とした。結果を表１に示す。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
表１の結果から、カカオバターとピーナッツオイルとを１：３の質量比で混合した油性助剤の融点は１５℃であり、１：２の質量比で混合した油性助剤の融点は２０℃であり、７：３の質量比で混合した油性助剤の融点は２５℃であることがわかる。
【００４７】
（実施例１：油性製剤の調製）
カカオバターとピーナッツオイルとを１：３の質量比で混合して融点が１５℃の油性助剤を調製した。これとは別に、生理食塩水にＨＣＧ（日本薬局方  注射用胎盤性性腺刺激ホルモン、三共株式会社）を１％となるように溶解し、ＨＣＧ溶液を調製した。上記油性助剤とＨＣＧ溶液とを９：１の質量比で混合してＨＣＧ含有油性製剤（ホルモン油性製剤１）を調製した。
【００４８】
（実施例２）
カカオバターとピーナッツオイルとを１：２の質量比で混合して融点が２０℃の油性助剤を調製したこと以外は、実施例１と同様にして、ＨＣＧ含有油性製剤（ホルモン油性製剤２）を調製した。
【００４９】
（実施例３）
カカオバターとピーナッツオイルとを７：３の質量比で混合して融点が２５℃の油性助剤を調製したこと以外は、実施例１と同様にして、ＨＣＧ含有油性製剤（ホルモン油性製剤３）を調製した。
【００５０】
（実施例４〜６）
５０％エタノール水溶液にテストステロン(生化学用Testosterone、和光純薬工業株式会社)を１％となるように溶解させたテストステロン溶液を、ＨＣＧ溶液の代わりに用いたこと以外は、実施例１〜３と同様にして、テストステロン含有油性製剤（ホルモン油性製剤４〜６）を調製した。
【００５１】
（実施例７：高温期飼育における血中ＨＣＧ濃度の経時変化）
１群の供試魚に、上記融点が１５℃のホルモン油性製剤１を、ＨＣＧ投与濃度が５００ＩＵ／ｋｇ体重となるように背部筋肉中に注射した。ホルモン油性製剤１は、室温において、液状であった。その後、自然水温が２０〜２５℃（高温期）の水槽に戻して飼育した。注射してから１２、２４、３６、４８、９６、１６８（１週間）、３３６（２週間）、および５０４時間後（３週間）に供試魚をそれぞれ取り上げ２−フェノキシエタノールで麻酔を施した後、体長及び体重を測定した。２３Ｇの注射針をつけた１ｍｌのシリンジを用いて尾柄部より採血した。採取した血液から、遠心分離（１８００×Ｇ、２０分間）により血清を分離した。この血清を用いて、血中のＨＣＧ濃度を測定した。ＨＣＧは魚類にはないヒト特有のタンパク質ホルモンである。結果を図１に示す。なお、上記遠心分離により得られた血清は、測定に供するまで−４０℃で冷凍保存した。
【００５２】
ホルモン油性製剤１の代わりに、融点が２０℃のホルモン油性製剤２または３を用いたこと以外は、上記と同様にして、１群の供試魚に注射した。投与時、ホルモン油性製剤２または３は、室温において液状であった。投与した供試魚を自然水温が２０〜２５℃（高温期）の水槽に戻して飼育した後、上記と同様に操作して、血清を得、血中のＨＣＧ濃度を測定した。結果を図１に示す。なお、遠心分離により得られた血清は、測定に供するまで−４０℃で冷凍保存した。
【００５３】
ホルモン油性製剤１の代わりに、融点が２０℃のホルモン油性製剤２または３を用いたこと以外は、上記と同様にして、１群の供試魚に注射した。投与時、ホルモン油性製剤２または３は、室温において液状であった。投与した供試魚を自然水温が２０〜２５℃（高温期）の水槽に戻して飼育した後、上記と同様に操作して、血清を得、血中のＨＣＧ濃度を測定した。結果を図１に示す。なお、遠心分離により得られた血清は、測定に供するまで−４０℃で冷凍保存した。
【００５４】
図１から明らかなように、ホルモン油性製剤１〜３を用いた場合はいずれも、投与１２時間後に血中ＨＣＧ濃度が最も上昇した。しかし、その上昇程度は、ホルモン油性製剤１で最も顕著であった。ホルモン油性製剤２および３では、ホルモン油性製剤１の１／２〜１／３程度であった。従来の生理食塩水またはプロピレングリコールの溶液あるいは懸濁液を投与した場合の血中ＨＣＧ濃度が直ちにピークに達することを考慮すると、本発明の油性製剤は、血中濃度のピークに達する時間が遅く、生理活性物質の溶出量が抑制されていることがわかる。以上のことから、本発明の油性製剤は、常温において、液状であり、注射法による簡便に投与することができること、油性製剤を投与することにより生理活性物質の溶出量が従来の注射法に用いられる製剤に比べて抑制され、長期間の放出が可能であることが示唆される。
【００５５】
（実施例８：低温期飼育における血中ＨＣＧ濃度の経時変化）
ホルモン油性製剤１〜３をそれぞれ投与した供試魚を自然水温が１５〜２０℃（低温期）の水槽で飼育したこと以外は、上記と同様にして、経過時間毎に血液を採取し、血清を得た。なお、投与時、ホルモン油性製剤１は、室温において、液状であった。ホルモン油性製剤２または３は、室温において、一部固化していたが、約３０℃前後で湯煎することによって、液化し、注射による投与が可能な状態となった。得られた血清を用いて、血中のＨＣＧ濃度を測定した。結果を図２に示す。
【００５６】
図２から明らかなように、ホルモン油性製剤１を用いた場合、投与２４時間後に血中ＨＣＧ濃度が最も上昇し、徐々に低下した。ホルモン油性製剤２も投与２４時間後にピークに達したが、その程度はホルモン油性製剤１の１／３程度であった。ホルモン油性製剤３を用いた場合は、明りょうな血中ＨＣＧ濃度のピークが見られず、低値で推移した。このことは、飼育温度が１５〜２０℃の低温期においては、融点が２５℃のホルモン油性製剤３は体内で固化しており、そのため、ホルモンの溶出速度が比較的安定であることを示す。このように、本発明の油性製剤を用いることによって、低温期においても湯煎などにより簡便に注射法により投与することができ、かつホルモンの除放効果を得ることができることがわかる。
【００５７】
図１および図２の結果から明らかなように、ホルモン油性製剤１〜３を投与した群は、いずれも低温側で飼育した場合に血中濃度のピークに達する時間は遅れた。このことは、ホルモン油性製剤が体内で固体化するため、ホルモンの溶出が抑制されていることを示唆する。
【００５８】
（実施例９：血中テストステロン濃度の経時変化）
ホルモン油性製剤１〜３（ＨＣＧ含有）を投与して低温飼育（自然水温１５℃〜２０℃）した場合の血中のテストステロン濃度を、実施例８で得られた血清を用いて測定した。結果を図３に示す。
【００５９】
図３の結果から明らかなように、ホルモン油性製剤１〜３（ＨＣＧ含有）を投与した群は、ばらつきはあるものの、いずれも３週間経過後においても血中のテストステロン濃度が上昇した。このように、本発明の油性製剤は、注射法により簡便に投与でき、かつ生理活性物質の急激な溶出が抑制され、長期間徐々に放出されていることが示唆される。
【００６０】
（実施例１０：水温上昇環境における血中テストステロンおよび血中ステロイドの濃度変化）
１群の供試魚に、実施例５で得られた融点が２０℃のテストステロン含有油性製剤（ホルモン油性製剤５）を、テストステロン投与濃度が１．０ｍｇ／ｋｇ体重となるように筋肉中に投与した（投与群）。他方、カカオバターとピーナッツオイルとを１：２の質量比で混合した助剤のみを投与した対照群を設けた。投与群および対照群を実験開始時の水温を１５℃に設定した水槽に戻した。この水槽の水温を１日１℃の割合で加温するように設定した。投与開始から１２、２４、３６、４８、９６、１６８時間（７日）、および２４０時間（１０日）後に供試魚をそれぞれ取り上げ、２−フェノキシエタノールで麻酔を施した後、体長及び体重を測定した。その後、ヘパリン処理を施した２３Ｇの注射針をつけた１ｍｌのシリンジを用いて尾柄部より採血した。採取した血液から、遠心分離（１８００×Ｇ、２０分間）により血清を分離した。この血清を用いて、血中のテストステロン、１１−ケトテストステロン、およびエストラジオール−１７β濃度を測定した。結果を図４、５、および６にそれぞれ示す。なお、上記遠心分離により得られた血清は、測定に供するまで−４０℃で冷凍保存した。
【００６１】
図４の結果から、テストステロンを含むホルモン油性製剤５を投与した群（投与群）は、血中テストステロン濃度が投与してから９６時間目まで有意に高い値を示すことがわかる。このことは、本願の油性製剤が、生理活性物質を水温上昇と共に徐々に溶出させることが可能であり、そのため、その効果を長期間持続させていることを示す。さらに図５および図６は、供試魚の血中のテストステロンの増加に伴い、１１−ケトテストステロンおよびエストラジオール−１７βの血中濃度が上昇することを示す。
【００６２】
図４〜６の結果から、本願の油性製剤は、低温期においても生理活性物質を簡便に投与でき、かつ体内において徐々に溶出されるため、長期間にわたって生理活性物質の効果を持続することができることがわかる。
【００６３】
（実施例１１）
生理食塩水に溶解したＨＣＧとカカオバターとを１：９の質量比で混合して分散させたＨＣＧ含有油性製剤（ホルモン油性製剤７）を調製した。１群の供試魚に、上記ホルモン油性製剤７を、ＨＣＧ投与濃度が５００ＩＵ／ｋｇ体重となるように背部筋肉中に注射した。その後、自然水温２０〜２５℃（高温期）の水槽に戻して飼育した。注射してから２、６、１２、２４、４８、９６、および１６８時間（７日）後に供試魚をそれぞれ取り上げ、２−フェノキシエタノールで麻酔を施した後、体長及び体重を測定した。２３Ｇの注射針をつけた１ｍｌのシリンジを用いて尾柄部より採血した。採取した血液から、遠心分離（１８００×Ｇ、２０分間）により血清を分離した。この血清を用いて、血中のＨＣＧ濃度およびテストステロン濃度を測定した。ＨＣＧ濃度の結果を図７に、テストステロン濃度の結果を図８に示す。なお、血清は、測定に供するまで−４０℃で冷凍保存した。
【００６４】
生理食塩水に溶解したＨＣＧとココナッツオイルとを１：９の質量比で混合して分散させたＨＣＧ含有油性製剤（ホルモン油性製剤８）を調製した。上記と同様にして、血中のＨＣＧ濃度およびテストステロン濃度を測定した。ＨＣＧ濃度の結果を図７に、テストステロン濃度の結果を図８に示す。
【００６５】
図７の結果から、ホルモン油性製剤７および８を投与した群は、いずれも血中ＨＣＧの濃度が１６８時間目（７日目）においても高いことがわかる。特にカカオバターを用いたホルモン油性製剤７を用いた群は、血中ＨＣＧ濃度が急激に高くならず、ほぼ継続的にホルモンが放出されることがわかる。
【００６６】
また、図８の結果から、ホルモン油性製剤７および８を投与した群は、いずれも血中テストステロン濃度が９６〜１６８時間に高くなることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の、生理活性物質、特に魚類に適した生理活性物質の水性溶液または水性懸濁液を油脂に分散させて得られる油性製剤は、２０℃で固体の天然油脂、あるいは２０℃で固体の天然油脂と２０℃で液状の天然油脂とを混合した油脂を用いて調製されているため、油性製剤が固形状でも、加温により融解して注射可能となる。この油性製剤は、魚類体内において、生理活性物質の吸収・放出量を時間的および量的に調整できる。本発明の油性製剤は、魚類の生育環境に応じた油性製剤の融解条件を設定できるので、マツカワ、メイタガレイ、カサゴなどの冬季産卵魚を始めとする、魚類の養殖において、利用される。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】本発明の油性製剤を投与した場合の高温期飼育（水温２０〜２５℃）における魚類の血中ＨＣＧ濃度の経時変化を示すグラフである。
【図２】本発明の油性製剤を投与した場合の低温期飼育（水温１５〜２０℃）における魚類の血中ＨＣＧ濃度の経時変化を示すグラフである。
【図３】本発明の油性製剤を投与した場合の低温期飼育（水温１５〜２０℃）における魚類の血中テストステロン濃度の経時変化を示すグラフである。
【図４】本発明の油性製剤を投与後、水温を上昇させた場合の魚類の血中テストステロン濃度の経時変化を示すグラフである。
【図５】本発明の油性製剤を投与後、水温を上昇させた場合の魚類の血中１１−ケトテストステロン濃度の経時変化を示すグラフである。
【図６】本発明の油性製剤を投与後、水温を上昇させた場合の魚類の血中エストラジオール−１７β濃度の経時変化を示すグラフである。
【図７】本発明の油性製剤を投与した場合の魚類の血中ＨＣＧ濃度の経時変化を示すグラフである。
【図８】本発明の油性製剤を投与した場合の魚類の血中テストステロン濃度の経時変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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