(57)【要約】【課題】ＰＰＡＲ活性を調節することによって脂質及び糖代謝を制御する効果的な薬剤を開発する。【解決手段】治療を必要とする被検者に、有効量の１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−還元酵素のモジュレーターを投与することによってペルオキシソーム増殖活性化受容体の関連疾患を治療する方法。還元酵素の活性を阻害する化合物を同定する方法、及び被検者に有効量の還元酵素阻害剤を投与することによって血糖値を低下させる方法も開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１若しくは配列番号３の配列又はその機能的な等価物を含む単離ポリペプチドであって、前記ポリペプチドは１５−ケトプロスタグランジンを還元する単離ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の単離ポリペプチドにおいて、配列番号１又は配列番号３と少なくとも８０％同一である配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項３】
請求項２に記載の単離ポリペプチドにおいて、配列番号１又は配列番号３と少なくとも９０％同一である配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載の単離ポリペプチドにおいて、前記ポリペプチドは配列番号１又は配列番号３である単離ポリペプチド。
【請求項５】
請求項４に記載の単離ポリペプチドにおいて、前記１５−ケトプロスタグランジンは、１５−ケトＰＧＥ２、１５−ケトＰＧＥ１、１５−ケトＰＧＥ２α、又は１５−ケトＰＧＥ１αである単離ポリペプチド。
【請求項６】
請求項５に記載の単離ポリペプチドにおいて、前記１５−ケトプロスタグランジンは、１５−ケトＰＧＥ２である単離ポリペプチド。
【請求項７】
抗体であって、請求項１に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項８】
請求項７に記載の抗体において、前記抗体は、モノクローナル抗体である抗体。
【請求項９】
請求項７に記載の抗体において、前記ポリペプチドは、配列番号１である抗体。
【請求項１０】
ペルオキシソーム増殖活性化受容体の関連疾患を治療する方法であって、該治療を必要とする被検者に、有効量のＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２のモジュレーターを投与することを含む方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法において、前記モジュレーターは、１５−ケトプロスタグランジンである方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において、前記１５−ケトプロスタグランジンは、１５−ケトＰＧＥ２、１５−ケトＰＧＥ１、１５−ケトＰＧＥ２α、又は１５−ケトＰＧＥ１αである方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、前記１５−ケトプロスタグランジンは、１５−ケトＰＧＥ２である方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載の方法において、前記モジュレーターは、ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２阻害剤である方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法において、前記阻害剤は二本鎖リボ核酸であり、該二本鎖リボ核酸はポリリボヌクレオチドの第１鎖及びポリリボヌクレオチドの第２鎖を含み、該第１鎖は、ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２をコードする核酸の１９〜４９個の連続したヌクレオチドと同一な配列であり、該第２鎖は該第１鎖と相補的である方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法において、前記阻害剤は、テトラヒドロキシフラボン、トリヒドロキシフラボン、２−ヒドロキシ−トリメトキシカルコン、若しくは２−ヒドロキシ−ケイ皮酸ベンジル、又はこれらの誘導体である方法。
【請求項１７】
前記阻害剤は、以下の化合物１〜４９のいずれかである請求項１４に記載の方法。
【化１】
2007061093.tif 000014
2007061093.tif 000015
2007061093.tif 000016
【請求項１８】
請求項１４に記載の方法において、前記阻害剤は抗体である方法。
【請求項１９】
請求項１０に記載の方法において、前記ペルオキシソーム増殖活性化受容体の関連疾患は、ＩＩ型糖尿病、肥満、異脂肪血症、冠状動脈性心臓病、炎症性疾患、又は癌である方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法において、前記ペルオキシソーム増殖活性化受容体の関連疾患は、ＩＩ型糖尿病、肥満、異脂肪血症、又は冠状動脈性心臓病である方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法において、前記ペルオキシソーム増殖活性化受容体の関連疾患は、ＩＩ型糖尿病である方法。
【請求項２２】
被検者において血糖値を低下させる方法であって、前記被検者に有効量のＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２の阻害剤を投与することを含む方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法において、前記阻害剤は、テトラヒドロキシフラボン、トリヒドロキシフラボン、２−ヒドロキシ−トリメトキシカルコン、又は２−ヒドロキシ−ケイ皮酸ベンジルである方法。
【請求項２４】
請求項２２に記載の方法において、前記阻害剤は、二本鎖リボ核酸、又は前記化合物１〜４９であり、該二本鎖リボ核酸はポリリボヌクレオチドの第１鎖及びポリリボヌクレオチドの第２鎖を含み、該第１鎖はＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２をコードする核酸の１９〜４９個の連続したヌクレオチドと同一な配列であり、該第２鎖は該第１鎖と相補的である方法。
【請求項２５】
ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２の活性を阻害する化合物を同定する方法であって、
ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２を含む系を用意し、
化合物を前記系と接触させ、
ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２の活性を決定し、
前記活性を、前記化合物が存在しないことを除き同じ手順で得られる活性と比較することを含む方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法において、前記系は、ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２を発現する遺伝子を含む細胞であり、前記活性は、前記遺伝子の発現活性を測定することによって決定される方法。
【請求項２７】
請求項２５に記載の方法において、前記系は、ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２を含む無細胞溶液であり、前記活性は、ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２の酵素活性を測定することによって決定される方法。
【請求項２８】
ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２の発現を阻害する二本鎖リボ核酸であって、
ポリリボヌクレオチドの第１鎖及びポリリボヌクレオチドの第２鎖を含み、
前記第１鎖は、ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２をコードする核酸の１９〜４９個の連続したヌクレオチドと同一な配列であり、
前記第２鎖は、前記第１鎖と相補的である二本鎖リボ核酸。
【請求項２９】
請求項２８に記載の二本鎖リボ核酸において、前記第１鎖は、配列番号９若しくは配列番号１０、又はこれらの断片を含む二本鎖リボ核酸。
【請求項３０】
ペルオキシソーム増殖活性化受容体の関連疾患を治療する方法であって、該治療を必要とする被検者に、有効量の式（Ｉ）の化合物を投与することを含む方法。
【化２】
2007061093.tif 000017
［式中、Ｒ１及びＲ２の各々は、独立して、水素、ハロ、ＯＲａ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールであり、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、及びＲ１２の各々は、独立して、水素、ハロ、ＯＲｂ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールであり、又は、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールであり、又は、Ｒ１０及びＲ１１は、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールであり、
但しＲａ及びＲｂの各々は、独立して、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールである］
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法において、Ｒ１及びＲ２の各々は、独立して、水素、シクロペンチルに融合されたフェニル、又はヘテロアリールで置換されたフェニルである方法。
【請求項３２】
請求項３０に記載の方法において、Ｒ３及びＲ１２の各々は、ＯＨである方法。
【請求項３３】
ペルオキシソーム増殖活性化受容体の関連疾患を治療する方法であって、該治療を必要とする被検者に、有効量の式（ＩＩ）の化合物を投与することを含む方法。
【化３】
2007061093.tif 000018
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の各々は、独立して、水素、ハロ、ＯＲ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールであり、
但しＲは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールである］
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０の各々は、独立して、水素又はＯＨである方法。
【請求項３５】
ペルオキシソーム増殖活性化受容体の関連疾患を治療する方法であって、該治療を必要とする被検者に、有効量の式（ＩＩＩ）の化合物を投与することを含む方法。
【化４】
2007061093.tif 000019
［式中、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ＯＲａ、ＮＲａＲｂ、又はＳＲａであり、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６の各々は、独立して、水素、ハロ、ＯＲｃ、ＮＲｃＲｄ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、アリール又はヘテロアリールであり、
但しＲａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄの各々は、独立して、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールである］
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法において、Ｒ１は、ハロ、ＯＲ、ＮＯ２、又はＣ１−Ｃ１０アルキルで置換されたフェニルであり、Ｒは、水素又はＣ１−Ｃ１０アルキルである方法。
【請求項３７】
請求項３５に記載の方法において、Ｒ１は、ＯＲａ、ＮＲａＲｂ又はＳＲａであり、Ｒａは、フェニルで置換されたＣ１−Ｃ１０アルキルであり、該フェニルは、ＣＦ３、Ｆ又はＯＨで任意に置換され、ＲｂはＨである方法。
【請求項３８】
請求項３５に記載の方法において、Ｒ１は、ヘテロアリール又はＣ（Ｏ）Ｒで置換されたＣ１−Ｃ１０アルキルであり、Ｒは、水素又はＣ１−Ｃ１０アルキルである方法。
【請求項３９】
ペルオキシソーム増殖活性化受容体の関連疾患を治療する方法であって、該治療を必要とする被検者に
【化５】
2007061093.tif 000020
からなる群から選択される有効量の化合物を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００５年８月１２日に出願された米国仮特許出願第６０／７０７，８９７号に優先権を主張し、その内容は、本明細書に参考として組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
ペルオキシソーム増殖活性化受容体（ＰＰＡＲ）は、脂質及び糖代謝を調整する核内受容体のファミリーに属する。３種の哺乳動物のＰＰＡＲ、即ちＰＰＡＲ−α、ＰＰＡＲ−γ及びＰＰＡＲ−δが同定されている。食事性脂肪酸又はそれらの代謝誘導体のいずれかによる活性化で、ＰＰＡＲは、脂質及び糖代謝の変化につながる転写事象のカスケードを引き起こす。例えば、活性化で、脂肪組織において高度に発現されるＰＰＡＲ−γは、ブドウ糖摂取を促進し、かつ血糖値を低下させる。
【０００３】
ＰＰＡＲは、脂質及び糖代謝でのその役割を考えると、疾患、例えばＩＩ型糖尿病、肥満、異脂肪血症、冠状動脈性心臓病、炎症性疾患、及び癌の有望な治療標的である。合成ＰＰＡＲ−γアゴニスト、即ちＡＶＡＮＤＩＡ及びＡＣＴＯＳは、ＩＩ型糖尿病を治療するために使用され、他の合成ＰＰＡＲ−αアゴニスト（即ちＦｉｂｒａｔｅ）は、異脂肪血症を治療するために使用されてきた（非特許文献１及び２を参照）。しかしながら、大部分のＰＰＡＲ療法において有効性は限られており、かつ重大な副作用がある。
【非特許文献１】Ｌｅｈｍａｎｎ他，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，（１９９５）２７０：１２９５３−１２９５６
【非特許文献２】Ｆｒｕｃｈａｒｔ他，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｄｏｌ．（１９９９）１０：２４５−２５７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＰＰＡＲ活性を調節することによって脂質及び糖代謝を制御する効果的な薬剤を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ＰＰＡＲ活性を調節することによって、被検者におけるＰＰＡＲの関連疾患を治療する方法に関する。
【０００６】
一態様では、本発明は、１５−ケトプロスタグランジンを還元するが、ロイコトリエンＢ４は還元しない単離ポリペプチドであるＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２を特徴とする。プロスタグランジン（ＰＧ）は、種々の不飽和度の中心環及び側鎖によって特徴づけられる生理的媒体の種類である。１５−ケトプロスタグランジンには１５−ケトＰＧＥ２、１５−ケトＰＧＥ１、１５−ケトＰＧＥ２α、及び１５−ケトＰＧＥ１αが含まれるが、それらに限定されない。
【０００７】
別の態様において、本発明は、上記ポリペプチドに特異的に結合する抗体を特徴とする。この抗体は、ポリクローナルであれモノクローナルであれ、ポリペプチド断片に結合することができる。
【０００８】
更に別の態様において、本発明は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、並びにこのリボ核酸をコードするＤＮＡベクターを特徴とし、１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−還元酵素活性を有するポリペプチドの発現を阻害する。１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−還元酵素は、プロスタグランジンのΔ１３二重結合を還元することによって１３，１４−ジヒドロ−１５−ケトプロスタグランジンへの１５−ケトプロスタグランジンの転換に触媒作用を及ぼす酵素を指す。１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−還元酵素の例には、１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−還元酵素／ロイコトリエンＢ４  １２−ヒドロキシデヒドロゲナーゼ（ＰＧＲ／ＬＴＢ４ＤＨ）、亜鉛結合アルコールデヒドロゲナーゼ１（ＰＧＲ２／ＺＡＤＨ１）、及び亜鉛結合アルコールデヒドロゲナーゼ２（ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２）が含まれる。ｄｓＲＮＡは、ポリリボヌクレオチドの２本鎖を含む。第１鎖は、１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−還元酵素をコードする核酸の１９〜４９個の連続したヌクレオチドと同一である配列を含む。第２鎖は、第１鎖と相補的である。好ましくは、ｄｓＲＮＡの少なくとも一端は、１〜４のヌクレオチドの突出を有する。一実施例において、第１鎖は、配列番号９若しくは配列番号１０、又はその断片を含む。１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−還元酵素は、ＰＧＲ／ＬＴＢ４ＤＨ、ＰＧＲ２／ＺＡＤＨ１又はＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２であってもよい。
【０００９】
更に別の態様において、本発明は、ＩＩ型糖尿病、肥満、異脂肪血症、冠状動脈性心臓病、炎症性疾患、及び癌のようなＰＰＡＲの関連疾患の治療方法を特徴とする。この方法は、被検者に有効量のＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２モジュレーターを投与することを含む。ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２モジュレーターは、ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２の活性又は発現に影響を及ぼす分子又は分子の複合体を指す。モジュレーターは、１５−ケトプロスタグランジンであってもよいし、大分子の阻害剤（例えば上記のｄｓＲＮＡ）又は小分子の阻害剤（例えばテトラヒドロキシフラボン、トリヒドロキシフラボン、２−ヒドロキシ−トリメトキシカルコン、２−ヒドロキシ−ケイ皮酸ベンジル、又はケイ皮酸ベンジルヒドロキシル）のようなＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２の活性又は発現を抑制する阻害剤であってもよい。小分子阻害剤の例には、下記の化合物１〜４９が含まれる。
【００１０】
【化１】
2007061093.tif 000002
2007061093.tif 000003
2007061093.tif 000004
【００１１】
更に別の態様において、本発明は、ＰＰＡＲの関連疾患を治療する方法を特徴とする。その方法は、その治療を必要とする被検者に有効量の式（Ｉ）の化合物を投与することを含む。
【化２】
2007061093.tif 000005
［式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ２の各々は、独立して、水素、ハロ、ＯＲａ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、アリール又はヘテロアリールであり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２の各々は、独立して、水素、ハロ、ＯＲｂ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、アリール又はヘテロアリールであり、又は、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールであり、又は、Ｒ１０及びＲ１１は、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、アリール又はヘテロアリールであり、但しＲａ及びＲｂの各々は、独立して、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、アリール又はヘテロアリールである。］
【００１２】
式（Ｉ）の化合物のサブセットにおいて、Ｒ１及びＲ２の各々は、独立して、水素、シクロペンチルに融合されたフェニル、又はヘテロアリールによって置換されたフェニルである。式（Ｉ）の化合物の他のサブセットにおいて、Ｒ３及びＲ１２はＯＨである。
【００１３】
用語「アルキル」は、飽和又は不飽和の線形又は分岐炭化水素部分、例えば、−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、又は分岐−Ｃ３Ｈ７を指す。用語「シクロアルキル」は、飽和又は不飽和の非芳香族環状炭化水素部分、例えばシクロヘキシル又はシクロヘキセン−３−イルを指す。用語「ヘテロシクロアルキル」は、少なくとも１個の環式ヘテロ原子（例えばＮ、Ｏ又はＳ）を有する飽和又は不飽和の非芳香族環状部分、例えば４−テトラヒドロピラニル又は４−ピラニルを指す。用語「アリール」は、１個以上の芳香環を有する炭化水素部分を指す。アリール部分の例には、フェニル（Ｐｈ）、フェニレン、ナフチル、ナフチレン、ピレニル、アントリル及びフェナントリルが含まれる。用語「ヘテロアリール」は、少なくとも１個のヘテロ原子（例えばＮ、Ｏ又はＳ）を含む１個以上の芳香環を有する部分を指す。ヘテロアリール部分の例には、フリル、フリレン、フルオレニル、ピロリル、チエニル、オキサゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、キナゾリニル、キノリル、イソキノリル及びインドリルが含まれる。
【００１４】
本明細書において言及されるアルキル、アルキレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール及びヘテロアリールは、他に特定されない限り、置換及び非置換部分の両方を含む。シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール及びヘテロアリール上の置換基には、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ５−Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ１０アルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、アミノ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルアミノ、Ｃ１−Ｃ２０ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヒドロキシル、ハロゲン、チオ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルチオ、アリールチオ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アシルアミノ、アミノアシル、アミノチオアシル、アミジノ、グアニジン、ウレイド、シアノ、ニトロ、アシル、チオアシル、アシルオキシ、カルボキシル及びカルボン酸エステルが含まれるが、それらに限定されない。また、アルキル、アルキレン又はヘテロアルキレン上の置換基には、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル及びＣ２−Ｃ１０アルキニルを除き、前述の置換基の全てが含まれる。また、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、及びヘテロアリールは、互いに融合することができる。
【００１５】
更に別の態様において、本発明は、ＰＰＡＲの関連疾患の治療を必要とする被検者に有効量の式（ＩＩ）の化合物を投与することによって、その関連疾患を治療する方法を特徴とする。
【化３】
2007061093.tif 000006
［式（ＩＩ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０の各々は、独立して、水素、ハロ、ＯＲ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールであり、但しＲは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールである。］
式（ＩＩ）の化合物のサブセットにおいて、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０の各々は、独立して、水素又はＯＨである。
【００１６】
更に別の態様において、本発明は、ＰＰＡＲの関連疾患の治療を必要とする被検者に有効量の式（ＩＩＩ）の化合物を投与することによって、その関連疾患を治療する方法を特徴とする。
【化４】
2007061093.tif 000007
［式（ＩＩＩ）中、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ＯＲａ、ＮＲａＲｂ、又はＳＲａであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６の各々は、独立して、水素、ハロ、ＯＲｃ、ＮＲｃＲｄ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、アリール又はヘテロアリールであり、但しＲａ、Ｒｂ、Ｒｃ、及びＲｄの各々は、独立して、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールである］
式（ＩＩＩ）の化合物のサブセットにおいて、Ｒ１は、ハロ、ＯＲ（Ｒは、水素又はＣ１−Ｃ１０アルキルである）、ＮＯ２、又はＣ１−Ｃ１０アルキルによって置換されたフェニルであってもよい。式（ＩＩＩ）の化合物の他のサブセットにおいて、Ｒ１は、ＯＲａ、ＮＲａＲｂ、又はＳＲａ（Ｒａは、フェニルによって置換されたＣ１−Ｃ１０アルキルであり、フェニルは、ＣＦ３、Ｆ又はＯＨによって任意に置換され、Ｒｂは水素である）であってもよい。式（ＩＩＩ）の化合物の更に他のサブセットにおいて、Ｒ１は、ヘテロアリール、又はＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒは水素又はＣ１−Ｃ１０アルキルである）によって置換されたＣ１−Ｃ１０アルキルである。
【００１７】
被検者において血糖値を低下させる方法も、本発明の範囲内である。この方法は、被検者に、有効量の上記ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２阻害剤の１種類を投与することを含む。この阻害剤は、ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２の活性又は発現を抑制することができる。
【００１８】
本発明は更に、ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２活性を阻害する化合物を同定する方法を特徴とする。阻害とは、ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２の活性又は発現の抑制を指す。その方法は、ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２を含む系を準備し、その系に化合物を接触させ、ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２活性を決定し、得られた活性を化合物が存在しない場合に得られる活性と比較することを含む。実施態様において、系はＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２を発現する遺伝子を含む細胞であり、活性は遺伝子の発現活性を測定することによって決定される。別の実施態様において、系はＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２を含む細胞のない溶液であり、活性は無細胞溶液のＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２の酵素活性を測定することによって決定される。
【００１９】
本発明の実施態様の詳細は、下記の説明に記載される。本発明の他の特徴、目的、及び効果は、説明及び特許請求の範囲から明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−還元酵素ファミリーのメンバーである、１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−還元酵素３（ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２）の発見に基づく。ＰＰＡＲ活性の基質及び阻害剤によってその活性を制御することができることが思いがけなくも分かった。これらの基質及び阻害剤は、ＰＰＡＲの関連疾患、例えばＩＩ型糖尿病、肥満、異脂肪血症、冠状動脈性心臓病、炎症性疾患、及び癌を治療するために有用である。
【００２１】
配列番号１の単離ヒトポリペプチド又は１５−ケトプロスタグランジンを還元する機能的な等価物は、本発明の範囲内で考察される。アミノ酸配列（配列番号１）並びにコードしたヌクレオチド配列（配列番号２）を以下に示す。
【００２２】
【化５】
2007061093.tif 000008
【００２３】
また、１５−ケトプロスタグランジンを還元する単離マウスポリペプチド又は機能的な等価物も本発明の範囲内である。マウスポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号３）並びにコードしたヌクレオチド配列（配列番号４）を以下に示す。
【００２４】
配列番号３
【００２５】
【化６】
2007061093.tif 000009
【００２６】
配列番号４
【化７】
2007061093.tif 000010
【００２７】
単離ポリペプチドは、天然に結合した分子が実質的にないポリペプチドを指し、即ち、乾燥重量で少なくとも７５％（即ち、７５％から１００％の間のいずれかの数）純度を有する。純度は、いかなる適切な標準的方法、例えばカラムクロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、又はＨＰＬＣ分析によって測定される。本発明の単離ポリペプチドは、天然の原料から精製でき、又は組み換えＤＮＡ技術若しくは化学的方法によって生成できる。用語「機能的な等価物」は、１５−ケトプロスタグランジンを還元する能力を備える配列番号１又は配列番号３のポリペプチドの変異体、例えば、１つ以上の点突発変異、挿入、欠失、切断、又はそれらの組合せを有するタンパク質を指す。一態様において、本発明の単離ポリペプチド又はその機能的な等価物は、配列番号１又は配列番号３と少なくとも８０％（例えば、８５％、９５％、又は１００％、或いは８０％〜１００％）同一である配列を含む。融合タンパク質であってもよい。
【００２８】
１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−還元酵素活性は、１３，１４−ジヒドロ−１５−ケトプロスタグランジンへの１５−ケトプロスタグランジンの酵素転換を指す。比活性度は以下の通りに決定される。
０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．５ｍＭのＮＡＤＰＨ、及び０．５７ｍＭの１５−ケトＰＧＥ２を含む反応緩衝液において、３７℃で、検定される１０μｇのタンパク質調合剤をインキュベートする。３７℃で１０分間、暗所で反応させ、５０ｍＭのフタル酸カリウム水素（ｐＨ３．０）、及び１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む７００μｌの緩衝液を添加して終了する。７９０μＭの塩化インドニトロテトラゾリウム、６０μＭのメト硫酸フェナゼン（ｐｈｅｎａｚｅｎｅ）、及び１％のＴｗｅｅｎ２０を含む２００μｌの発色試薬を使用して、未反応ＮＡＤＰＨを酸化する。ＥＬＩＳＡプレート読み取り装置を使用して、４９０ｎｍにおける吸収度を測定する。連続的に希釈した量のＮＡＤＰＨを含む反応緩衝液を使用して、標準曲線を作成する。比活性度が少なくとも９０ｎｍｏｌ／分ｍｇのタンパク質は、そのポリペプチドが１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−還元酵素活性を有することを示す。
【００２９】
上記のヌクレオチド配列、即ち配列番号２又は配列番号４は、本発明のポリペプチドを発現するために使用できる。ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）又はＤＮＡ類似体若しくはＲＮＡ類似体を指す。ＤＮＡ類似体又はＲＮＡ類似体は、ヌクレオチド類似体から合成できる。核酸分子は、一本鎖、又は二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖である。タンパク質発現のために、核酸を適切な制御配列に操作可能に連結し、発現ベクターを生成することができる。ベクターとは、連結された他の核酸を輸送することができる核酸分子を指し、自律増殖が可能であるか、又は宿主ＤＮＡに統合することが可能である。ベクターの例には、プラスミド、コスミド、又はウィルスベクターが含まれる。ベクターは、宿主細胞中の核酸の発現に適した形のヌクレオチド配列を含んでもよい。好ましくは、ベクターは、発現する核酸配列に操作可能に連結した１個以上の制御配列を含む。「制御配列」には、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御要素（例えばポリアデニル化シグナル）が含まれ、ヌクレオチド配列の構成的発現を導く配列、並びに組織特異制御配列及び／又は誘導性配列を含む。発現ベクターの設計は、形質転換する宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベルなどのような因子によって決められる。発現ベクターは、本発明のポリペプチドを生成するために、宿主細胞に導入できる。上記の核酸を含む宿主細胞も、本発明の範囲内であり、例えば、大腸菌細胞、Ｓｆ９昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現ベクターの使用）、酵母細胞又は哺乳動物細胞が含まれる。例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，（１９９０）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡを参照。本発明のポリペプチドを生成するために、本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを発現する条件下において、培地中で宿主細胞を培養し、培養した細胞又は細胞の媒体からポリペプチドを精製することができる。或いは、ヌクレオチド配列は、例えばＴ７プロモーター制御配列及びＴ７ポリメラーゼを使用して、インビトロで転写及び翻訳できる。
【００３０】
上記ポリペプチドは、動物において抗体を発生させるために使用できる。抗体がポリペプチド断片からも発生することが理解される。動物においてモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体及びその断片を作る方法は、当該技術分野において公知である。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照。用語「抗体」には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖抗体）、及びｄＡｂ（ドメイン抗体；Ｗａｒｄ，ｅｔ．ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ，３４１，５４４）のような完全分子並びにその断片が含まれる。
【００３１】
一般に、本発明のポリペプチドは、ＫＬＨのような担体タンパク質に結合でき、アジュバントと混合でき、かつ宿主動物に注入できる。その動物において生成される抗体は、次にペプチドアフィニティクロマトグラフィによって精製できる。一般に用いられる宿主動物には、ウサギ、マウス、モルモット及びラットが含まれる。免疫応答を増加させるために使用可能な種々のアジュバントは、宿主種によって決まり、フロイントアジュバント（完全及び不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、及びジニトロフェノール表面活性物質が含まれる。有用なヒトアジュバントには、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）及びコリネバクテリウムパルブムが含まれる。
【００３２】
ポリクローナル抗体、抗体分子の異種集団が、免疫化した被検者の血清に存在する。モノクローナル抗体、本発明のポリペプチドに対する抗体の同種集団は、標準ハイブリドーマ技術を使用して調製することができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ他（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５、Ｋｏｈｌｅｒ他（１９７６）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６，５１１、Ｋｏｈｌｅｒ他（１９７６）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６，２９２、及びＨａｍｍｅｒｌｉｎｇ他（１９８１）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．を参照）。特に、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ他（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５及び米国特許第４３７６１１０号明細書に記載の技術、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒ他（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４，７２；Ｃｏｌｅ他（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０，２０２６）、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ他（１９８３）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）などの、培養中の連続継代細胞系によって抗体分子を生成するいかなる技術によって得られる。かかる抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びそのいずれかのサブクラスを含む、あらゆる免疫グロブリンクラスでもよい。本発明のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマは、インビトロ又はインビボで培養してよい。インビボにおける高い滴定濃度のモノクローナル抗体の生成は、特に有用な製造方法である。
【００３３】
加えて、「キメラ抗体」の生成のために開発された技術を使用することができる。例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ他（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１，６８５１；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ他（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２，６０４；及びＴａｋｅｄａ他（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２を参照。キメラ抗体は、様々な部分が、異なる動物の種に由来する分子であり、例えばマウスモノクローナル抗体及びヒト免疫グロブリン定常領域に由来する可変領域を有する分子である。或いは、単鎖抗体の生成のために記載された技術（米国特許第４９４６７７８号明細書及び米国特許第４７０４６９２号明細書）は、単鎖Ｆｖ抗体のファージライブラリを生成するのに適している。単鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖断片及び軽鎖断片を連結することによって形成される。更に、抗体断片は、公知の技術によって生成できる。例えばかかる断片には、抗体分子のペプシン消化によって生成するＦ（ａｂ’）２断片及びＦ（ａｂ’）２のジスルフィド架橋を還元することによって生成するＦａｂ断片が含まれるが、それらに限定されない。抗体は、当該技術分野において公知の方法によってヒト化することができる。例えば、所望の結合特性を有するモノクローナル抗体は、商業的にヒト化できる（Ｓｃｏｔｇｅｎｅ，  Ｓｃｏｔｌａｎｄ；及びＯｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）。また、遺伝子移入動物において発現するような完全なヒト抗体も本発明の特徴である（例えばＧｒｅｅｎ他（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７，１３；及び米国特許第５５４５８０６号明細書及び米国特許第５５６９８２５号明細書参照）。
【００３４】
また、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）も本発明の範囲内である。このｄｓＲＮＡは、ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２の発現を阻害するために使用できる。このように、被検者にｄｓＲＮＡを投与することによって、ＰＰＡＲの関連疾患を治療することができる。用語「ｄｓＲＮＡ」は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている方法である、標的ＲＮＡ配列の分解によって遺伝子発現を封じる二本鎖リボ核酸を指す。ＲＮＡｉは、（線虫、ゼブラフィッシュ及びマウス胚を含む）多種多様な動物モデル、及び（外植されたニワトリ神経細胞及び哺乳動物の細胞培養を含む）他の生物系において、遺伝子発現を封じるために使用されている。国際公開第９９／３２６１９号パンフレット、国際公開第００／４４９１４号パンフレット、国際公開第００／４４９１４号パンフレット、国際公開第００／４４８９５号パンフレット、国際公開第００／６３３６４号パンフレット、及び国際公開第０１／３６６４６Ａ１号パンフレット参照。
【００３５】
本発明のＲＮＡは、当該技術分野において周知の技術によって合成できる。例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ他，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１１，３−１９，Ｗｉｎｃｏｔｔ他，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４，Ｗｉｎｃｏｔｔ他，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．７４，５９，Ｂｒｅｎｎａｎ他，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．，６１，３３−４５，及びＢｒｅｎｎａｎ，米国特許第６００１３１１号明細書参照。ＲＮＡは、発現ベクターから転写され、かつ標準技術を使用して単離できる。本発明のＲＮＡ又はベクターは、当該技術分野において同様に周知の方法を使用し、標的細胞に送達され（例えば、Ａｋｈｔａｒ他，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．２，１３９参照）、リポソーム、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル又は生体接着性微小球体などを使用して、細胞に導入できる。或いは、ＲＮＡ又はベクターは、直接の注入によって、又は、注入ポンプを使用して局所的に送達される。他のアプローチには、様々な輸送及び担体系の使用、例えば接合体及び生分解性ポリマーを使用することが含まれる。
【００３６】
本発明は、ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２活性又は発現を調節することによってＰＰＡＲの関連疾患を治療する方法も特徴とする。用語「治療する」は、ＰＰＡＲの関連疾患、かかる疾患の症状、又はかかる疾患の素因を有する被検者に、ＰＰＡＲの関連疾患、その症状又はその素因を治療する、軽減する、変える、影響を及ぼす、改善する、又は予防するなどの治療効果を与える目的で、１個以上の上記のＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２モジュレーター、即ちＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２基質及び阻害剤を投与することを指す。「有効量」とは、治療される被検者に治療効果を与えるために必要となる量を指す。「ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２の基質」には、１５−ケトＰＧＥ２、１５−ケトＰＧＥ１、１５−ケトＰＧＥ２α、及び１５−ケトＰＧＥ１α及びその構造類似体が含まれる。
【００３７】
ＰＰＡＲの関連疾患（又は障害又は状況）の例には、ＩＩ型糖尿病、高血糖、低い糖耐性、症候群Ｘ、インスリン耐性、肥満、脂質障害、異脂肪血症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、低ＨＤＬレベル、高ＬＤＬレベル、アテローム性動脈硬化症（及びアンギナ、跛行、心臓発作又は脳卒中のような、その後遺症）血管再狭窄、過敏性大腸症候群、炎症性疾患（例えば炎症性腸疾患、慢性関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、骨関節炎、多発性硬化症、喘息、血管炎、虚血／再灌流傷害、凍瘡又は成人呼吸窮迫症候群）、膵炎、神経変性疾患、網膜症、新生物形成状況、癌（例えば、前立腺癌、胃癌、乳癌、膀胱癌、肺癌若しくは大腸癌、又は脂肪肉腫のような脂肪細胞癌）、血管形成、アルツハイマー病、皮膚疾患（例えば、ざ瘡、乾癬、皮膚炎、湿疹又は角化症）高血圧、卵巣アンドロゲン過剰、骨粗鬆症及び骨減少症が含まれる、それらに限定されない。
【００３８】
ＰＰＡＲの関連疾患を治療するために、その治療を必要とする被検者に、ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２モジュレーター及び薬理学的に許容できる体を含む医薬組成物を投与することができる。医薬組成物は、経口で、又は静脈内点滴によって投与され、又は注射され、又は皮下、筋内、クモ膜下腔内、腹膜内、直腸内、膣内、鼻腔内、胃内、気管内、若しくは肺内に移植される。
【００３９】
医薬組成物は、例えば１，３−ブタンジオールの溶液のような、非毒性の許容できる希釈剤又は溶媒中の溶液又は懸濁液であってよい。使用される許容できるビヒクル及び溶媒には、マンニトール、水、リンガー溶液及び等張食塩液がある。更に、従来、不揮発性油が、溶媒又は懸濁媒体（例えば合成モノ又はジグリセリド）として使用されている。オレイン酸及びそのグリセリド誘導体などの脂肪酸、特にポリオキシエチル化形態のオリーブ油又はヒマシ油などの天然の薬理学的に許容できる油などは、注射剤の調製において有用である。これらの油剤又は懸濁液は、長鎖アルコールの希釈剤又は分散剤、カルボキシメチルセルロース又は類似の分散助剤を含むこともできる。薬理学的に許容できる固体、液体又は他の剤形の製造において一般に使用される、Ｔｗｅｅｎｓ又はＳｐａｎｓのような他の一般的に用いられる界面活性剤、又は他の類似の乳化剤、又は生物学的利用能エンハンサーも、製剤の目的で使用される。
【００４０】
必要な投与量は、投与経路の選択、製剤の性質、被検者の疾患の性質、被検者の大きさ、体重、表面積、年齢及び性別、投与されている他の薬剤、及び主治医の判断によって決まる。適切な投与量は、０．０１〜１００．０ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。必要とされる投与量の範囲は、利用可能な組成物の多様性及び様々な投与経路による効率から予想されるべきである。当該技術分野においてよく理解されているように、これらの投与量レベルの範囲は、最適化するための標準経験的ルーチンを使用して調整される。適切な送達ビヒクル（例えば、高分子微粒子又は移植可能装置）内での組成物のカプセル化によって、送達、特に経口送達の効率を上げることができる。
【００４１】
上記の医薬組成物は、従来の方法を利用して、異なる投与経路用の剤形、例えば、経口投与のためのカプセル、ゲルシール又は錠剤に調合できる。カプセルは、ゼラチン又はセルロースのような、いかなる標準的な薬理学的に許容できる材料も含んでもよい。錠剤は、固体担体及び潤滑剤を有する組成物の混合物を圧縮することによって、従来の手順に従って調合される。固体担体の例には、澱粉及び砂糖ベントナイトが含まれる。組成物は、結合剤、例えばラクトース又はマンニトール、従来の充填剤及び錠剤化剤を含む硬質なシェル錠剤（ｓｈｅｌｌ  ｔａｂｌｅｔ）、又はカプセルの形で投与されてもよい。医薬組成物は、非経口経路を介して投与される。非経口剤形の例には、活性剤又は他の周知の薬理学的に許容できる賦形剤の水溶液、等張性食塩水、又は５％のブドウ糖が含まれる。シクロデキストリン又は当業者にとって周知の他の可溶化剤は、治療薬の送達のための医薬賦形剤として利用できる。
【００４２】
上記の医薬組成物の有効性は、インビトロ及びインビボの両方で評価することができる。簡単に述べると、医薬組成物は、インビトロでＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２活性又は発現を阻害する能力に関して検査できる。インビボ研究において、医薬組成物を動物（例えばマウスモデル）に注射することができ、その治療的有効性が確認される。結果に基づき、用量の適切な範囲及び投与経路を決定することができる。
【００４３】
本発明は更に、ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２活性又は発現を阻害する化合物を同定する方法を特徴とする。化合物は、例えば、ポリペプチドの三次元配座に従って、コンピュータモデリングプログラムを使用して設計され、当該技術分野において公知の方法を使用して合成される。化合物は、ライブラリスクリーニングによっても同定され、又は従来公知の組合せライブラリ方法において多くのアプローチのいずれかを使用して得られる。好適なライブラリには、ペプチドライブラリ、ペプトイドライブラリ（ペプチドの機能性を有する分子のライブラリであるが、酵素分解に耐性を示す、新規の非ペプチド性バックボーンを有する）、空間的にアドレス指定可能な平行した固相又は溶液相ライブラリ、デコンボリューション又はアフィニティクロマトグラフィ選択によって得られる合成ライブラリ、「ビード対化合物」ライブラリ及び抗体ライブラリが含まれる。例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ他（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７，２６７８−８５、Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２，１４５、Ｌａｍ他（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４，８２、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ他（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４，８４、及びＳｏｎｇｙａｎｇ他（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２，７６７参照。分子ライブラリを合成する方法の例は、当該技術分野で、例えば、ＤｅＷｉｔｔ他（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，６９０９、Ｅｒｂ他（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，１１４２２、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ他（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７，２６７８、Ｃｈｏ他（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１，１３０３、Ｃａｒｒｅｌｌ他（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３，２０５９、Ｃａｒｅｌｌ他（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３，２０６１、及びＧａｌｌｏｐ他（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７，１２３３に見出される。化合物ライブラリは、溶液（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３，４１２−４２１）、ビード（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４，８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４，５５５−５５６）、細菌（米国特許第５２２３４０９号明細書）、胞子（米国特許第５２２３４０９号明細書）、プラスミド（Ｃｕｌｌ他（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，１８６５−１８６９）、又はファージ（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９，３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９，４０４−４０６、Ｃｗｉｒｌａ他（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，６３７８−６３８２、Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２，３０１−３１０、及び米国特許第５２２３４０９号明細書）において提示される。
【００４４】
下記の具体例は、単に例証として解釈されるべきであり、かついかなる形であれ開示の残りの部分に限定的であるとは解釈されない。当業者は、更に詳述することなく、本明細書の説明に基づき、本発明をその最も完全な範囲で利用することができる。本明細書において引用される全ての文献は、その全体が参考として組み込まれる。
【実施例１】
【００４５】
［新規の１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−還元酵素の同定］
ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ１４６０９０及びＢＣ０３３７８０の遺伝子のコード領域に対応する全長のｃＤＮＡ配列は、それぞれ、マウスＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２及びヒトＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２と呼ばれる。マウスＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２  ｃＤＮＡを、ＰＣＲによって３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞から抽出したｍＲＮＡを使用して調製し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によってｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にライゲートした。マウス及びヒトＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２を得るためのフォワード／リバースプライマの配列を下記に示す。
マウス：
フォワード５’−ＡＴＴＧＧＡＴＣＣＣＡＡＡＴＧＣＴＧＡＧＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣ−３’（配列番号５）
リバース５’−ＡＣＧＡＴＧＡＡＴＴＣＡＣＡＧＣＴＴＡＣＴＧＣＴＧＡＣＡＧ−３’（配列番号６）
ヒト：
フォワード５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＧＣＴＧＣＧＧＣＴＧＧＴＧＣＣＣＡＣ−３’（配列番号７）
リバース５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＧＣＴＴＡＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＡＧＴＧ−３’（配列番号８）
【００４６】
ヒトＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２（配列番号１）及びマウス配列番号３であると推定されたアミノ酸配列を上記に示す。マウスＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２は、ヒトＺＡＤＨ１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ１５２４４４）に相同であることが発見されたが、有意な類似性ではなかった。
【００４７】
３Ｔ３−Ｌ１細胞中での脂肪生成の間、ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２の発現は、増加し、脂肪生成の誘導後３日目に最も増加したことが観察された。この時点で、脂質滴が、脂肪細胞において広範囲に蓄積することが観察された。最大限のＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２タンパク質レベルは、完全に分化した脂肪細胞において検出された。ＰＰＡＲ−γが、脂肪生成の初期の段階で著しく誘導されることも発見された。
【００４８】
ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２の組織分布も解明され、ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２は脂肪組織において高度に発現していた。大網脂肪中のＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２  ｍＲＮＡの量は、同種接合体及び異種接合体の両方のｄＢ／ｄＢマウスにおいて、野生型マウスより著しく高かった。
【００４９】
ヒト及びマウス両方のＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２タンパク質は、標準的手順によるＧＳＴ融合タンパク質として、大腸菌において組み換えによって発現させた。このように得られた組換えＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２タンパク質を使用して、基質特異性及び酵素反応速度を測定した。
【００５０】
酵素活性は、以下の通りに測定した。
０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．５ｍＭのＮＡＤＰＨ及び０．５７ｍＭの１５−ケトＰＧＥ２を含む反応緩衝液において、３７℃で１０μｇの組換えマウス又はヒトＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２タンパク質をインキュベートした。３７℃で１０分間、暗所で反応させ、５０ｍＭのフタル酸カリウム水素（ｐＨ３．０）、及び１％のＴｗｅｅｎ  ２０を含む７００μｌの緩衝液を添加して終了した。７９０μＭの塩化インドニトロテトラゾリウム、６０μＭのメト硫酸フェナゼン（ｐｈｅｎａｚｅｎｅ）及び１％のＴｗｅｅｎ  ２０を含む、２００μｌの発色試薬を添加して、未反応ＮＡＤＰＨを酸化した。ＥＬＩＳＡプレート読み取り装置を使用して４９０ｎｍにおける吸収度を測定した。連続的に希釈した量のＮＡＤＰＨを含む反応緩衝液を使用して、標準曲線を作成した。
【００５１】
ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２の基質特異性は、１５−ケトＰＧＥ２を、６つのプロスタグランジンの基質の各々、３つの下流代謝物質の各々、又はロイコトリエンＢ４と置き換えたことを除き、この直前に記載した手順を使用して決定した。１５−ケトＰＧＥ１、１５−ケトＰＧＦ１α、及び１５−ケトＰＧＦ２αは、ＰＧＲ−３と特異的に反応した。対照的に、６−ケトＰＧＦ１α、ＰＧＦ２β、１１ｂ−ＰＧＦ２α、１３，１４−ジヒドロ−１５−ケトＰＧＦ２α、１３，１４−ジヒドロ−１５−ケトＰＧＤ２、１３，１４−ジヒドロ−１５−ケトＰＧＥ２又はロイコトリエンＢ４からは、比活性度が検出されなかった。
【００５２】
内在性ヒトＰＰＡＲ−α及びＰＰＡＲ−γを発現したヒトＨｅｐ３Ｂ細胞におけるＰＰＡＲ−γの転写の調整に与える、ＰＧＲ−３／ＺＡＤＨ２発現の影響も調査した。Ｈｅｐ３Ｂ細胞のＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２の過剰発現は、ＰＰＡＲを介した転写活性化を抑制することを発見した。ＰＰＡＲ−γアゴニスト、即ちＢＲＬ４９６５３によってＨｅｐ３Ｂ細胞が刺激された後でさえ、転写活性化を抑制した。同じような結果を３Ｔ３−Ｌ１細胞からも得た。
【実施例２】
【００５３】
［プロスタグランジン］
脂肪細胞中のＰＰＡＲ−γ活性に対するプロスタグランジンの影響を調査した。細胞分化を誘発する培地による処理後、１４μＭ  １５−ケトＰＧＥ２、１３，１４−ジヒドロ−１５−ケトＰＧＥ２、１５−ケトＰＧＦ２α、１３，１４−ジヒドロ−１５−ケトＰＧＦ２、又は４．５μＭのＢＲＬ４９６５３、ＰＰＡＲ−γアゴニストによって、脂肪生成中の２〜４日目に３Ｔ３−Ｌ１細胞を処理した。Ｆｏｒｍａｎ他，Ｃｅｌｌ（１９９５）８３：８０３−８１２を参照。６日目、脂質滴の凝集体を観察するためにオイルレッドＯによって着色した。１５−ケトＰＧＥ２は、ＢＲＬ４９６５３と類似のレベルで、効果的に脂肪生成を強化した。３Ｔ３−Ｌ１細胞を２日間誘発して分化した後に、レポーター遺伝子によってトランスフェクトした。１５−ケトＰＧＥ２及び１５−ケトＰＧＦ２αの両方は、内因性ＰＰＡＲ活性を著しく促進させた。対照的に、対応する下流の代謝物質、即ち１３，１４−ジヒドロ−１５−ケトＰＧＥ２及び１３，１４−ジヒドロ−１５−ケトＰＧＦ２αは、ＰＰＡＲ活性を増加させることができなかった。
【００５４】
ルシフェラーゼレポーター遺伝子を、酵母ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインに融合したＰＰＡＲ−α、ＰＰＡＲ−γ又はＰＰＡＲ−δのリガンド結合ドメインと共に、３Ｔ３−Ｌ１細胞にトランスフェクトした。１５−ケトＰＧＥ２及び１５−ケトＰＧＦ２αは、ＰＰＡＲ−γ、及び少量のＰＰＡＲ−αを活性化した。
【００５５】
脂肪生成特異的なＰＰＡＲ−γ標的遺伝子、即ちＩＲＳ−１及びＩＲＳ−２のタンパク質発現を誘導する１５−ケトＰＧＥ２の能力も検査した。３Ｔ３−Ｌ１細胞における実質的な量のＰＰＡＲ−γ１及びＰＰＡＲ−γ２タンパク質は、インスリン及びデキサメタゾンで処理したときには検出されたが、メチルイソブチルキサンチン（ＭＩＸ）で処理したときには検出されなかった。１５−ケトＰＧＥ２、並びにインスリン及びデキサメタゾンを有するＭＩＸの添加は、ＰＰＡＲ−γ１及びＰＰＡＲ−γ２発現を著しく促進した。１５−ケトＰＧＥ２及びＢＲＬ４９６５３は、ＭＩＸが存在しなくても、脂肪細胞の特異マーカー、ａＰ２の発現を強力に誘発した。インスリン及びデキサメタゾンの存在下では、ＩＲＳ−２発現はＢＲＬ４９６５３処理によって劇的に増加した。１５−ケトＰＧＥ２は、ＭＩＸと類似のレベルまで発現を促進させた。インスリン／デキサメタゾン、又はＭＩＸは、ＩＲＳ−１発現を誘発した。１５−ケトＰＧＥ２及びＢＲＬ４９６５３を含むＰＰＡＲ−γリガンドは、ＩＲＳ−１タンパク質の量を増加させなかった。
【実施例３】
【００５６】
［ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２小分子阻害剤］
組換えヒトＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２タンパク質を発現させ、その酵素活性を検査した。マウスＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２と同様に、組換えヒトＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２は、１５−ケト−プロスタグランジン−Δ１３−還元酵素活性、及び１５−ケトプロスタグランジンの１３，１４−ジヒドロ−１５−ケトプロスタグランジンへの触媒転換を有していた。
【００５７】
化合物１〜４９を、ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２活性の阻害効果に関して検査した。これらの化合物は市販され（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから）、当該技術分野において公知の方法から調製してもよい。阻害アッセイを上記の手順に従って実行した。様々な濃度のＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２阻害剤を、反応混合物に添加し、３７℃で２時間インキュベートした。
【００５８】
より具体的には、５０μＭの化合物８、１２、１３、及び２７、及び２５μＭのトリフルオロベンジル−２−ケイ皮酸ヒドロキシ（化合物２２）を、ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２酵素反応系に添加し、１５−ケトＰＧＥ２を還元する酵素の能力を測定した。結果は、下記の表１及び表２に要約した。
【００５９】
【表１】
2007061093.tif 000011
【００６０】
【表２】
2007061093.tif 000012
【００６１】
表１及び表２に示すように、ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２の１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−還元酵素活性は、上記５種類の化合物によって阻害された。更に、化合物１〜７、９〜１１、１４〜２６及び２８−４９が、５０μＭの濃度で活性を２０％以上阻害することが判明した。
【実施例４】
【００６２】
［インスリン感受性に対するＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２阻害剤の影響］
インスリン感受性に対する上記２つのＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２阻害剤、即ち化合物１２及び化合物２８の影響を以下の通りに検査した。
上記と同様に３Ｔ３−Ｌ１細胞を誘発して分化した。Ｆｉｎｇａｒ他（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３４：７２８−７３５）に記載された方法に従って２−デオキシＤ−［３Ｈ］ブドウ糖摂取量を測定することにより、ブドウ糖輸送アッセイを行った。１．６７μＭの阻害剤又は４５ｎＭのＰＰＡＲ−γアゴニスト、即ちＡＶＡＮＤＩＡを細胞に添加した。
【００６３】
１０μＭ  サイトカラシン−Ｂを使用して、ブドウ糖摂取バックグラウンドレベルを測定した。１００ｎＭのインスリンを使用して、ブドウ糖摂取を刺激した。分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞中におけるインスリン処理のみにおいて、ブドウ糖摂取レベルが１０倍以上増加した。これら２つのＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２阻害剤のうちいずれかの存在下で、ブドウ糖摂取レベルは３０倍増加した。ブドウ糖摂取を促進するこれらの阻害剤の能力がＡＶＡＮＤＩＡの能力と同程度であることが判明した。
【００６４】
ｄＢ／ｄＢマウスにおける血糖の減少に対するＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２阻害剤の影響を検査した。雌のｄＢ／ｄＢマウス（生後１０〜１１週間のＣ５７ＢＬＫＳ／Ｊ−ｍ＋／＋Ｌｅｐｄｂ、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を４匹／ケージで収容した。１０匹のマウスに、５ｍｇ／ｋｇのトリフルオロベンジル２−ケイ皮酸ヒドロキシ（化合物２２）、ＰＧＲ３阻害剤（マウス＃１〜＃６）又はプラセボ（マウス＃７〜＃１０、体液に対する最終濃度：ＰＢＳ中で０．２％のＤＭＳＯ／０．７％のエタノール）を、１日２回、７日間に亘り、腹膜内注射した。マウスの眼窩後洞からの血液試料を、最初の注入前及び最後の注入１８時間後に得た。血液試料の血糖値を、電極タイプ血糖メーター（ＨＯＲＩＢＡ、ＡｎｔＳｅｎｓｅ  ＩＩ、Ｊａｐａｎ）で測定した。結果を下記の表３に要約した。最後の列は、（Ｂ．Ｇ．．ｂｅｆｏｒｅ−Ｂ．Ｇ．．ａｆｔｅｒ）／Ｂ．Ｇ．．ｂｅｆｏｒｅＸ１００％で表される阻害％を示す。結果は、ＰＧＲ−３阻害剤がマウスの血糖値を著しく低下させたことを示唆する。
【００６５】
【表３】
2007061093.tif 000013
【実施例５】
【００６６】
［干渉ＲＮＡ］
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）アプローチを使用して３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞（Ｐｒｅ−ａｐｏｃｙｔｅｓ）中のＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２発現を封じた。ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２を標的とする干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）をコードするベクターを生成するために、標準方法を使用して、５’−ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＴＧＣ  ＣＡＣ  ＧＴＴ  ＡＴＣ  ＧＧＡ  ＡＣＣ  ＴＴＣ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＧＧＴ  ＴＣＣ  ＧＡＴ  ＡＡＣ  ＧＴＧ  ＧＣＡ  ＣＴＴ  ＴＴＴ  ＴＧＧ  ＡＡＡ−３’（配列番号９；フォワードプライマー）及びＡＧＣ  ＴＴＴ  ＴＣＣ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＴＧ  ＣＣＡ  ＣＧＴ  ＴＡＴ  ＣＧＧ  ＡＡＣ  ＣＴＣ  ＴＣＴ  ＴＧＡ  ＡＧＧ  ＴＴＣ  ＣＧＡ  ＴＡＡ  ＣＧＴ  ＧＧＣ  ＡＣＧ−３’（配列番号１０；リバースプライマ）を含むオリゴヌクレオチドを合成した。次にそのオリゴヌクレオチドをアニールし、線状のｓｉＲＮＡ発現ベクター、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒＴＭ  ｎｅｏ（カタログ番号５７６４、Ａｍｂｉｏｎ）に組み込んだ。その後、このｓｉＲＮＡ発現ベクターを、エレクトロポーレーションによって３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞に導入した。安定してトランスフェクトされたクローンを、Ｇ４１８選択によって単離した。次に特許請求の範囲のＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２のｍＲＮＡレベルを標準ＲＴ−ＰＣＲによって検査した。ＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２のｍＲＮＡ転写レベルが抑制されることが判明した。
【００６７】
ＰＰＲＥ−レポーターに基づくアッセイは、Ｆｏｒｍａｎ他，  Ｃｅｌｌ  （１９９５）８３：８０３−８１２に記載されている方法に従って上記のクローンを使用して行った。ＰＰＡＲ−γの転写活性がこれらのクローンにおいて増加することが判明した。これらの結果は、ＲＮＡ干渉によってＰＧＲ３／ＺＡＤＨ２発現を封じて、ＰＰＡＲ−γ活性を調節することができ、かつこれによりＰＰＡＲの関連疾患を治療することができることを示す。
【００６８】
［他の実施態様］
本願明細書において開示される特徴の全ては、いかなるように組み合わせることができる。本願明細書において開示される各特徴は、同一、等価、類似の目的を果たすその他の特徴と置き換えられる。このように、明確な別段の記載がない限り、開示された各特徴は、包括的な一連の等価又は類似の特徴の例に過ぎない。
【００６９】
前記説明から、当業者は、本発明の本質的特徴を容易に確認することができ、かつその趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明を様々な用途及び条件に適応させるために、本発明の種々の変更及び修正を行なうことができる。このように、他の実施態様も、本願特許請求の範囲内にある。
【配列表】
2007061093000001.app
【外国語明細書】
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2007061093.tif 000022
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