(57)【要約】【課題】頭頸部癌の腫瘍マーカーの提供を目的とする。【解決手段】前記目的を達成するために、本発明の頭頸部癌の第１の腫瘍マーカーは、全身のいずれかの部位における頭頸部癌の存在を示す腫瘍マーカーであり、第２の腫瘍マーカーは、頭頸部癌のリンパ節転移を示す腫瘍マーカーであり、第３の腫瘍マーカーは、頭頸部癌のセンチネルリンパ節への転移を示す腫瘍マーカーであり、第４の腫瘍マーカーは、頭頸部癌の放射線化学療法の耐性を示す腫瘍マーカーである。本発明の腫瘍マーカーは、特定の遺伝子の転写産物及びその翻訳産物をマーカー物質とする。したがって、本発明の腫瘍マーカーを用いれば、例えば、頭頸部癌の遺伝子診断が可能となる。また、本発明の腫瘍マーカーと従来の診断法と併用することで、診断精度が向上し、無駄のない適切な治療が促進され、治療成績及び患者の治療後のＱＯＬの飛躍的な向上が期待できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１〜１７の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（２００５年５月１６日付）が、ＡＢ０１８３４２、ＡＦ１８６０８１、ＡＦ２６３４６６、ＡＦ４０５７０５、ＡＦ４４３２７８、ＡＦ４５８０８４、ＡＪ２３７６７３、ＡＫ０２３５７７、ＡＫ０５５５８８、ＡＬ８３２４６５、ＢＣ００２５９１、ＢＣ００２７１０、ＢＣ００３５６３、ＢＣ００３６３５、ＢＣ００７８５８、ＢＣ０１１０２９、ＢＣ０１３１４２、ＢＣ０１４６６８、ＢＣ０１８１３６、ＢＣ０２３５０４、ＢＣ０２６３２６、ＢＣ０３５４１９、ＢＣ０４１８４６、ＢＣ０５３５５５、ＢＸ６４１１５６、Ｍ１９４８１、Ｍ３６８０９、Ｘ７５０１５、Ｚ３４９７４であるポリヌクレオチドの塩基配列、その部分配列、及びそれらの相補配列からなる群から選択される塩基配列を含む遺伝子転写産物並びにその翻訳産物の少なくとも一方を含む頭頸部癌の腫瘍マーカーであって、被検者の体液試料における前記腫瘍マーカーの陽性が、前記被検者における頭頸部癌の存在を示す頭頸部癌の腫瘍マーカー。
【請求項２】
配列表の配列番号１８〜２０の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（２００５年５月１６日付）が、ＡＢ０１９４３８、ＡＢ０２７４４０、ＡＢ０６３９５５、ＡＦ０１７４６４、ＡＦ２９６３１４、ＡＦ４１０６３７、ＡＪ００４９５６、ＡＪ４０８２６８、ＡＪ４１５１４２、ＡＪ４２６４１５、ＡＪ５７８３３９、ＡＫ０９７３６３、ＡＫ０９７９５０、ＡＫ１２８５６８、ＡＫ１２８６４９、ＡＸ８１０７０５、ＡＹ１７２９６１、ＡＹ３２０６１６、Ｌ１５４６７、Ｍ１３２３２、Ｕ０３８７０、Ｘ５１７５５、Ｘ５７８０９、Ｘ６３０８１、Ｘ７０２０８、Ｘ７２８１８、Ｚ００００８、Ｚ２７５０１であるポリヌクレオチドの塩基配列、それらの部分配列、及びそれらの相補配列からなる群から選択される塩基配列を含む遺伝子転写産物並びにその翻訳産物の少なくとも一方を含む頭頸部癌の腫瘍マーカーであって、頭頸部癌の原発腫瘍組織試料における前記腫瘍マーカーの陽性が、前記頭頸部癌のリンパ節転移を示す頭頸部癌の腫瘍マーカー。
【請求項３】
配列表の配列番号１１、１５、２１、２２の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（２００５年５月１６日付）が、ＡＦ１８６０８１、ＡＦ４０５７０５、ＢＣ００１２２６、ＢＣ００２５９１、ＢＣ００２７１０、ＢＣ０１３１４２、ＢＣ０２３５０４、Ｍ１９４８１、Ｚ３４９７４であるポリヌクレオチドの塩基配列、それらの部分配列、及びそれらの相補配列からなる群から選択される塩基配列を含む遺伝子転写産物並びにその翻訳産物の少なくとも一方を含む頭頸部癌の腫瘍マーカーであって、リンパ節試料における前記腫瘍マーカーの陽性が、前記頭頸部癌のセンチネルリンパ節微小転移を示す頭頸部癌の腫瘍マーカー。
【請求項４】
配列表の配列番号２２〜２６の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（２００５年５月１６日付）が、ＡＦ０１７９８７、ＡＦ０７８７４９、ＡＫ０２４３５９、ＡＫ０２７６９４、ＡＫ０７５４２７、ＡＬ１３７５１７、ＢＣ００１５０１、ＢＣ００８０４２、ＢＣ００９７９９、ＢＣ０５２２６９、ＢＣ０６１９０５、ＢＣ０６７７６４であるポリヌクレオチドの塩基配列、それらの部分配列、及びそれらの相補配列からなる群から選択される塩基配列を含む遺伝子転写産物並びにその翻訳産物の少なくとも一方を含む頭頸部癌の腫瘍マーカーであって、頭頸部癌の腫瘍組織試料における前記腫瘍マーカーの陽性が、前記頭頸部癌の放射線化学療法への耐性を示す頭頸部癌の腫瘍マーカー。
【請求項５】
頭頸部癌の腫瘍マーカーの使用方法であって、被検試料を準備する準備工程と、前記被検試料中に請求項１から４のいずれか１項に記載の頭頸部癌の腫瘍マーカーを検出する検出工程と、前記腫瘍マーカーが陽性か否かを判定する判定工程とを含む頭頸部癌の腫瘍マーカーの使用方法。
【請求項６】
請求項１から４のいずれか１項に記載の頭頸部癌の腫瘍マーカーの検出にプローブ及びプライマーの少なくとも一方として使用するポリヌクレオチドであって、配列表の配列番号１〜２６の塩基配列、請求項１から４に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号の塩基配列、それらの部分配列、及びそれらの相補配列からなる群から選択される塩基配列からなるポリヌクレオチド、並びに、前記ポリヌクレオチドにおいて１個から数個の塩基が、欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチドであって前記ポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１から４のいずれか１項に記載の頭頸部癌の腫瘍マーカーの検出に使用できるマイクロアレイであって、請求項６に記載のポリヌクレオチドのスポットが配置されたマイクロアレイ。
【請求項８】
請求項１から４のいずれか１項に記載の頭頸部癌の腫瘍マーカーの検出に使用できるキットであって、請求項６に記載のポリヌクレオチド及び請求項７に記載のマイクロアレイの少なくとも一方を含むキット。
【請求項９】
下記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（１）配列表の配列番号１〜２６の塩基配列及びその部分配列からなる群から選択される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（２）前記（１）ポリヌクレオチドの塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（１）のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（３）前記（１）ポリヌクレオチドの塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（１）のポリヌクレオチドとの相同性が９０％以上であるポリヌクレオチド。
（４）前記（１）から（３）のポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項１０】
下記（１）又は（２）に記載のポリペプチド。
（１）配列表の配列番号２７〜４８のアミノ酸配列及びその部分配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）前記（１）ポリペプチドのアミノ配列の１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、前記（１）のポリペプチドとの相同性が９０％以上であるポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、頭頸部癌の腫瘍マーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
頭頸部癌とは、耳、鼻、咽喉頭、口腔、頸部、顔面等にできる癌である。現在、頭頸部癌に対する治療法は、主に病理組織学的所見及び進行病期により決定されている。しかしながら、その治療効果及び予後は、必ずしも一様ではない。これは、がん細胞内の遺伝子の変異及び発現量の異常に起因していると考えられている。したがって、遺伝子レベルでの頭頸部癌の分類や解析が求められている。
【０００３】
また、顎口腔領域に発生する悪性腫瘍の治療において、大きな問題の一つに頸部リンパ節転移の抑制が挙げられる。現時点での口腔悪性腫瘍の根治的治療法は、手術療法のみであるが、頸部リンパ節転移の有無はその術式、さらには患者の予後をも大きく左右する。したがって、頸部リンパ節転移の正確な診断は、治療上必要不可欠である。しかしながら、触診や画像診断（ＣＴ，ＭＲＩ，Ｅｃｈｏ，ＰＥＴ）等の診断方法では、潜在的なリンパ節転移の検出には限界がある。そこで、より正確なリンパ節転移診断として、センチネルリンパ節生検が行われている（非特許文献１〜３参照）。センチネルリンパ節生検は、１９９２年にＭｏｒｔｏｎらが悪性黒色腫に対してその有用性を報告して以来（非特許文献４参照）、様々な悪性腫瘍に対しても臨床応用がなされており、頭頸部領域の悪性腫瘍に対してもその有用性が報告されている（非特許文献２及び３参照）。
【０００４】
本発明者の研究グループは、これまでに、センチネルリンパ節微小転移診断に関する研究を重ね、例えば、直径が２０μｍ以上の転移巣が存在すれば、ヘマトキシリンエオジン染色により検出可能であること、サイトケラチン免疫染色を併用することにより少数細胞でも確認できること、ＲＴ−ＰＣＲ法等を用いたリアルタイム定量化による遺伝子診断では、１〜数個の腫瘍細胞が検出可能であること、その検出標的遺伝子として、ＳｑｕａｍｏｕｓＣｅｌｌＣａｒｃｉｎｏｍａＡｎｔｉｇｅｎ（ＳＣＣＡ）遺伝子が有用であること等を明らかにしている（非特許文献５〜８参照）。
【非特許文献１】佐藤一彦、平山星夫  他：『腋窩郭清指標としての錫コロイドを用いた  ｓｅｎｔｉｎｅｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｂｉｏｐｓｙ』：医学のあゆみ  １９２（２）：１４７−１５０，２０００．
【非特許文献２】松塚  崇、鹿野真人  他：『センチネルリンパ節生検による頸部リンパ節転移予測』：頭頸部腫瘍  ２７（１）：１９２−１９７，２００１．
【非特許文献３】木原圭一、甲能直幸  他：『口腔癌Ｎ０症例におけるセンチネルリンパ節の検討』：頭頸部腫瘍  ２８（１）：１０８−１１３，２００２．
【非特許文献４】Ｍｏｒｔｏｎ  Ｄ．  Ｗｅｎ  ＤＲ．  ｅｔ  ａｌ：『Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｄｅｔａｉｌｓ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｆｏｒ  ｅａｒｌｙ  ｓｔａｇｅ  ｍｅｌａｎｏｍａ』：Ａｒｃｈ  Ｓｕｒｇ  １２７（４）：３９２−３９９，１９９２．
【非特許文献５】Ｈａｍａｋａｗａ  Ｈ．  Ｆｕｋｕｚｕｍｉ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ：『Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｓｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ＳＣＣ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅｓ  ｏｆ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ』：Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  １７：５９３−５９９，１９９９．
【非特許文献６】Ｈａｍａｋａｗａ  Ｈ．  Ｔａｋｅｍｕｒａ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ：『Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ｐＮ  ｕｐｇｒａｄｉｎｇ  ｏｆ  ｏｒａｌ  ｃａｎｃｅｒ』：Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ  ４３７：  １１６−１２１，  ２０００．
【非特許文献７】大西詔子：リアルタイム定量化ＰＣＲ法を用いた口腔癌頸部リンパ節微小転移の遺伝子診断：愛媛医学  ２１（２）：１８３−１９１，２００２．
【非特許文献８】中城公一、新谷  悟、大西詔子、寺門永顕、浜川裕之：口腔悪性腫瘍におけるセンチネルリンパ節微小転移の術中迅速診断：頭頸部腫瘍  ２９（２）：６４−６９，２００３．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、頭頸部癌において、遺伝子発現に基づく診断のための適切な腫瘍マーカーが、さらに必要とされている。そこで、本発明は、頭頸部癌の腫瘍マーカーであって、以下の４つの腫瘍マーカーの提供を目的とする。すなわち、第１の目的は、一次治療の後、癌が本当に消失したのか、又は、追加治療が必要なのかについて、患者に過度の負担を与えることなく検査できる腫瘍マーカーを提供することであり、第２の目的は、頭頸部癌の原発腫瘍組織から、この頭頸部癌が、リンパ節に転移し得るものであるのかどうかを検査できる腫瘍マーカーを提供することであり、第３の目的は、センチネルリンパ節において、頭頸部癌のセンチネルリンパ節微小転移があるのかどうかを高精度に検査できる腫瘍マーカーを提供することであり、第４の目的は、頭頸部癌の腫瘍組織において、前記癌が、放射線療法や化学療法に対して耐性を示すかどうかを検査できる腫瘍マーカーを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記第１の目的を達成するために、本発明の第１の頭頸部癌の腫瘍マーカー（以下、本発明の第１の腫瘍マーカーともいう）は、配列表の配列番号１〜１７の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（２００５年５月１６日付）が、ＡＢ０１８３４２、ＡＦ１８６０８１、ＡＦ２６３４６６、ＡＦ４０５７０５、ＡＦ４４３２７８、ＡＦ４５８０８４、ＡＪ２３７６７３、ＡＫ０２３５７７、ＡＫ０５５５８８、ＡＬ８３２４６５、ＢＣ００２５９１、ＢＣ００２７１０、ＢＣ００３５６３、ＢＣ００３６３５、ＢＣ００７８５８、ＢＣ０１１０２９、ＢＣ０１３１４２、ＢＣ０１４６６８、ＢＣ０１８１３６、ＢＣ０２３５０４、ＢＣ０２６３２６、ＢＣ０３５４１９、ＢＣ０４１８４６、ＢＣ０５３５５５、ＢＸ６４１１５６、Ｍ１９４８１、Ｍ３６８０９、Ｘ７５０１５、Ｚ３４９７４であるポリヌクレオチドの塩基配列、その部分配列、及びそれらの相補配列からなる群から選択される塩基配列を含む遺伝子転写産物並びにその翻訳産物の少なくとも一方を含む頭頸部癌の腫瘍マーカーであって、被検者の体液試料における前記腫瘍マーカーの陽性が、前記被検者における頭頸部癌の存在を示す頭頸部癌の腫瘍マーカーである。
【０００７】
前記第２の目的を達成するために、本発明の第２の頭頸部癌の腫瘍マーカー（以下、本発明の第２の腫瘍マーカーともいう）は、配列表の配列番号１８〜２０の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（２００５年５月１６日付）が、ＡＢ０１９４３８、ＡＢ０２７４４０、ＡＢ０６３９５５、ＡＦ０１７４６４、ＡＦ２９６３１４、ＡＦ４１０６３７、ＡＪ００４９５６、ＡＪ４０８２６８、ＡＪ４１５１４２、ＡＪ４２６４１５、ＡＪ５７８３３９、ＡＫ０９７３６３、ＡＫ０９７９５０、ＡＫ１２８５６８、ＡＫ１２８６４９、ＡＸ８１０７０５、ＡＹ１７２９６１、ＡＹ３２０６１６、Ｌ１５４６７、Ｍ１３２３２、Ｕ０３８７０、Ｘ５１７５５、Ｘ５７８０９、Ｘ６３０８１、Ｘ７０２０８、Ｘ７２８１８、Ｚ００００８、Ｚ２７５０１であるポリヌクレオチドの塩基配列、それらの部分配列、及びそれらの相補配列からなる群から選択される塩基配列を含む遺伝子転写産物並びにその翻訳産物の少なくとも一方を含む頭頸部癌の腫瘍マーカーであって、頭頸部癌の原発腫瘍組織試料における前記腫瘍マーカーの陽性が、前記頭頸部癌のリンパ節転移を示す頭頸部癌の腫瘍マーカーである。
【０００８】
前記第３の目的を達成するために、本発明の第３の頭頸部癌の腫瘍マーカー（以下、本発明の第３の腫瘍マーカーともいう）は、配列表の配列番号１１、１５、２１、２２の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（２００５年５月１６日付）が、ＡＦ１８６０８１、ＡＦ４０５７０５、ＢＣ００１２２６、ＢＣ００２５９１、ＢＣ００２７１０、ＢＣ０１３１４２、ＢＣ０２３５０４、Ｍ１９４８１、Ｚ３４９７４であるポリヌクレオチドの塩基配列、それらの部分配列、及びそれらの相補配列からなる群から選択される塩基配列を含む遺伝子転写産物並びにその翻訳産物の少なくとも一方を含む頭頸部癌の腫瘍マーカーであって、リンパ節試料における前記腫瘍マーカーの陽性が、前記頭頸部癌のセンチネルリンパ節微小転移を示す頭頸部癌の腫瘍マーカーである。
【０００９】
前記第４の目的を達成するために、本発明の第４の頭頸部癌の腫瘍マーカー（以下、本発明の第４の腫瘍マーカーともいう）は、配列表の配列番号２２〜２６の塩基配列、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（２００５年５月１６日付）が、ＡＦ０１７９８７、ＡＦ０７８７４９、ＡＫ０２４３５９、ＡＫ０２７６９４、ＡＫ０７５４２７、ＡＬ１３７５１７、ＢＣ００１５０１、ＢＣ００８０４２、ＢＣ００９７９９、ＢＣ０５２２６９、ＢＣ０６１９０５、ＢＣ０６７７６４であるポリヌクレオチドの塩基配列、それらの部分配列、及びそれらの相補配列からなる群から選択される塩基配列を含む遺伝子転写産物並びにその翻訳産物の少なくとも一方を含む頭頸部癌の腫瘍マーカーであって、頭頸部癌の腫瘍組織試料における前記腫瘍マーカーの陽性が、前記頭頸部癌の放射線化学療法への耐性を示す頭頸部癌の腫瘍マーカーである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の第１の腫瘍マーカーのため、本発明者は、まず、正常組織又は他の組織型の悪性腫瘍組織と比較して、頭頸部癌である扁平上皮癌組織においてのみ共通して３倍以上の発現亢進を認める遺伝子転写産物を３１０種類同定した。そして、次に、これらのうち、健常者及び良性腫瘍患者の血液中には発現が認められず、頭頸部癌患者の血液中にのみ発現が認められる遺伝子を同定して本発明の第１の腫瘍マーカーに到達した。
【００１１】
本発明の第１の腫瘍マーカーは、例えば、血液や唾液等の体液試料を検査試料として使用できるから、患者に過度の負担を与えることなく前記腫瘍マーカーを用いた検査をすることができる。また、本発明の第１の腫瘍マーカーは、全身のいずれかの部位における頭頸部癌の存在を示すから、例えば、一次治療後の追加治療の妥当性の検討や、手術後の癌の取り残しの検査、癌の発見等を目的とした検査に使用できる。
【００１２】
本発明の第２の腫瘍マーカーのため、本発明者は、頭頸部扁平上皮癌の原発腫瘍組織部において、リンパ節への転移陽性症例と転移陰性症例とで遺伝子発現量を比較し、転移陽性症例においてのみ共通して３倍以上の発現亢進を認める遺伝子転写産物を３１種類同定して本発明の第２の腫瘍マーカーに到達した。
【００１３】
本発明の第２の腫瘍マーカーによれば、頭頸部癌の原発腫瘍組織部から、リンパ節転移の可能性を知ることができるから、例えば、頭頸部癌の治療や診断における重要な判断基準を提供できる。また、本発明の第２の腫瘍マーカーによれば、例えば、生検試料のみを用いてリンパ節転移の可能性を知ることができるから、頸部への外科的侵襲を避けることが可能となる。さらに、本発明の第２の腫瘍マーカーは、悪性黒色腫症例においても、同様に、リンパ節転移のマーカーとなりうる。
【００１４】
本発明の第３の腫瘍マーカーのため、本発明者は、まず、正常組織又は他の組織型の悪性腫瘍組織と比較して、頭頸部癌である扁平上皮癌組織においてのみ共通して３倍以上の発現亢進を認める遺伝子転写産物を３１０種類同定した。そして、次に、これらのうち、病理組織学的に微小転移陰性リンパ節にその発現が認められず、転移陽性リンパ節においてのみ発現が認められる遺伝子転写産物を同定して本発明の第３の腫瘍マーカーに到達した。
【００１５】
本発明の第３の腫瘍マーカーによれば、頭頸部癌のセンチネルリンパ節への転移をより高い精度で判定でき、複数種類の本発明の第３の腫瘍マーカーを用いれば、さらに精度が向上し、偽陰性症例の排除を確実とすることができる。
【００１６】
本発明の第４の腫瘍マーカーのため、本発明者は、放射線化学療法施行後、局所再発あるいは肺転移を認めた症例と、放射線化学療法により完全寛緩が得られた症例とを比較して、再発腫瘍組織にのみ共通して３倍以上の発現亢進を認めた遺伝子転写産物を同定して本発明の第４の腫瘍マーカーに到達した。
【００１７】
本発明の第４の腫瘍マーカーによれば、例えば、頭頸部癌に対する放射線化学療法の治療効果を予見でき、より適切な治療法が選択、無駄な治療の回避が可能となる。
【００１８】
以上のように、本発明の第１〜第４の頭頸部癌の腫瘍マーカーを用いれば、頭頸部癌の遺伝子診断が可能であり、本発明のそれぞれの頭頸部癌の腫瘍マーカー及び従来の診断法を併用することで、診断精度が向上し、無駄のない適切な治療が促進され、治療成績及び患者の治療後のＱＯＬの飛躍的な向上が期待できる。さらに、本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカーの遺伝子は、頭頸部癌の新規治療ターゲットとしても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカーの使用方法は、被検試料を準備する準備工程と、前記被検試料中に本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカーを検出する検出工程と、前記腫瘍マーカーが陽性か否かを判定する判定工程とを含む方法である。
【００２０】
本発明のプローブ及びプライマー用ポリヌクレオチドは、本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカーの検出にプローブ及びプライマーの少なくとも一方として使用するポリヌクレオチドであって、配列表の配列番号１〜２６の塩基配列、前記ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号の塩基配列、それらの部分配列、及びそれらの相補配列からなる群から選択される塩基配列からなるポリヌクレオチド、並びに、前記ポリヌクレオチドにおいて１個から数個の塩基が、欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチドであって前記ポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドである。
【００２１】
本発明のマイクロアレイは、本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカーの検出に使用できるマイクロアレイであって、本発明のプローブ用ポリヌクレオチドのスポットが配置されたマイクロアレイである。
【００２２】
本発明のキットは、本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカーの検出に使用できるキットであって、本発明のプローブ及びプライマー用ポリヌクレオチド並びに本発明のマイクロアレイの少なくとも一方を含むキットである。
【００２３】
本発明のポリヌクレオチドは、下記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチドである。
（１）配列表の配列番号１〜２６の塩基配列及びその部分配列からなる群から選択される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（２）前記（１）ポリヌクレオチドの塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（１）のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（３）前記（１）ポリヌクレオチドの塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（１）のポリヌクレオチドとの相同性が９０％以上であるポリヌクレオチド。
（４）前記（１）から（３）のポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００２４】
本発明のポリペプチドは、下記（１）又は（２）に記載のポリペプチドである。
（１）配列表の配列番号２７〜４８のアミノ酸配列及びその部分配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）前記（１）ポリペプチドのアミノ酸配列の１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ配列からなるポリペプチドであって、前記（１）のポリペプチドとの相同性が９０％以上であるポリペプチド。
【００２５】
本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカーについて説明する。
【００２６】
本発明において、前記「腫瘍マーカー」とは、癌細胞の目印（マーカー）になる物質であって、癌の診断や治療の判断基準として役立つ物質の総称をいう。本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカーにおいて、マーカーとなる物質は、遺伝子の転写産物であるＲＮＡ鎖、及び前記転写産物の翻訳産物であるポリペプチドの少なくとも一方である。
【００２７】
本発明において、「遺伝子転写産物」とは、遺伝子のＤＮＡを鋳型として転写されるＲＮＡ鎖、すなわち、ＲＮＡポリメラーゼにより合成されるＲＮＡ鎖、及び、転写後細胞内で修飾されたＲＮＡ鎖をいう。前記転写産物に含まれるＲＮＡ鎖は、特に制限されず、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、運搬ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、及びその他のタンパク質を指令しないＲＮＡ等が挙げられる。これらのＲＮＡ鎖は、転写後、細胞内でプロセッシングされたものも含む。本発明において、「遺伝子転写産物の翻訳産物」とは、前記転写産物がｍＲＮＡである場合に、前記ｍＲＮＡから翻訳されるポリペプチドをいう。前記ポリペプチドには、オリゴペプチド及びタンパク質も含まれ、翻訳後、細胞内又は体内で種々のプロセッシングをされたものを含む。また、本発明において、「遺伝子」とは、生体機能と関連するＤＮＡの任意の断片をいう。なお、配列表のポリヌクレオチドが転写産物であるｍＲＮＡ等のＲＮＡを表す場合、ｔ（チミン）塩基は、ｕ（ウラシル）塩基に読み替えるものとする。
【００２８】
次に、本発明の第１の腫瘍マーカーについて説明する。本発明の第１の腫瘍マーカーは、被検者の体液試料で使用するマーカーであって、前記被検者の身体のいずれかに頭頸部癌が存在すること示すマーカーである。この第１の腫瘍マーカーにおいて、マーカーとなる分子は、配列表の配列番号１〜１７の塩基配列、下記表１に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセション番号の塩基配列、それらの部分配列、及びそれらの相補配列からなる群から選択される塩基配列を含む遺伝子転写産物及び/又はその翻訳産物である。前記遺伝子転写産物及び前記翻訳産物を、以下、本発明の第１の腫瘍マーカーのマーカー転写産物及びマーカー翻訳産物ともいい、また、前記マーカー転写産物及びマーカー翻訳産物をコードする遺伝子を、本発明の第１の腫瘍マーカーのマーカー遺伝子という。前記「体液試料」とは、特に制限されず、例えば、血液、唾液等が含まれる。
【００２９】
本発明の第１の腫瘍マーカーのマーカー遺伝子の中で、配列表の配列番号１〜１７のマーカー転写産物をコードするマーカー遺伝子は、本発明者が見出した新規遺伝子である。これらの中で、配列表の配列番号５〜７、及び、配列表の配列番号１６と１７のマーカー転写産物は、それぞれ、スプライシングバリアントであって、同一遺伝子由来のｍＲＮＡの配列である。また、下記表１に、本発明の第１腫瘍マーカーのマーカー転写産物の中で、公知の配列のものについて、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号及び一般的な遺伝子名を示す。
【００３０】
【表１】
2007000052.tif 000002
【００３１】
本発明の第１の腫瘍マーカーにおいて、腫瘍マーカーが陽性であるとは、腫瘍マーカーの測定値が、所定のしきい値より大きい場合のことをいう。前記しきい値は、当該技術分野の当業者であれば、例えば、健常者や良性の腫瘍患者における前記腫瘍マーカーの数値を統計学的に処理した値に基づいて定めることができる。前記しきい値としては、例えば、健常者や良性の腫瘍患者等の平均の値の３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、及びそれ以上の値が挙げられる。
【００３２】
次に、本発明の第２の腫瘍マーカーについて説明する。本発明の第２の腫瘍マーカーは、頭頸部癌の原発腫瘍組織試料で使用するマーカーであって、前記頭頸部癌がリンパ節転移をしたこと、又はするおそれがあることを示すマーカーである。この第２の腫瘍マーカーにおいて、マーカーとなる分子は、配列表の配列番号１８〜２０の塩基配列、下記表２に記載のＧｅｎＢａｎｋのアクセション番号の塩基配列、その部分配列、及びそれらの相補配列からなる群から選択される塩基配列を含む遺伝子転写産物及び/又はその翻訳産物である。前記遺伝子転写産物及び前記翻訳産物を、以下、本発明の第２の腫瘍マーカーのマーカー転写産物及びマーカー翻訳産物ともいい、また、前記マーカー転写産物及びマーカー翻訳産物をコードする遺伝子を、本発明の第２の腫瘍マーカーのマーカー遺伝子という。
【００３３】
本発明の第２の腫瘍マーカーのマーカー遺伝子の中で、配列表の配列番号１８〜２０のマーカー転写産物をコードするマーカー遺伝子は、本発明者が見出した新規遺伝子である。また、下記表２に、本発明の第２腫瘍マーカーのマーカー転写産物の中で、公知の配列のものについて、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号及び一般的な遺伝子名を示す。
【００３４】
【表２】
2007000052.tif 000003
【００３５】
本発明の第２の腫瘍マーカーにおいて、腫瘍マーカーが陽性であるとは、腫瘍マーカーの測定値が、所定のしきい値より大きい場合のことをいう。前記しきい値は、当該技術分野の当業者であれば、例えば、健常者や転移陰性症例の原発腫瘍組織部等における前記腫瘍マーカーの数値を統計学的に処理した値に基づいて定めることができる。前記しきい値としては、例えば、健常者や転移陰性症例の原発腫瘍組織部等の平均の値の３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、及びそれ以上の値が挙げられる。
【００３６】
次に、本発明の第３の腫瘍マーカーについて説明する。本発明の第３の腫瘍マーカーは、リンパ節試料で使用するマーカーであって、前記頭頸部癌のセンチネルリンパ節微小転移を示すマーカーである。この第３の腫瘍マーカーにおいて、マーカーとなる分子は、配列表の配列番号１１、１５、２１、２２の塩基配列、下記表３に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセション番号の塩基配列、その部分配列、及びそれらの相補配列からなる群から選択される塩基配列を含む遺伝子転写産物及び/又はその翻訳産物である。前記遺伝子転写産物及び前記翻訳産物を、以下、本発明の第３の腫瘍マーカーのマーカー転写産物及びマーカー翻訳産物ともいい、また、前記マーカー転写産物及びマーカー翻訳産物をコードする遺伝子を、本発明の第３の腫瘍マーカーのマーカー遺伝子という。
【００３７】
本発明の第３の腫瘍マーカーのマーカー遺伝子の中で、配列表の配列番号１１、１５、２１、２２のマーカー転写産物をコードする遺伝子は、本発明者が見出した新規遺伝子である。また、下記表３に、本発明の第３腫瘍マーカーのマーカー転写産物の中で、公知の配列のものについて、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号及び一般的な遺伝子名を示す。
【００３８】
【表３】
2007000052.tif 000004
【００３９】
本発明の第３の腫瘍マーカーにおいて、腫瘍マーカーが陽性であるとは、腫瘍マーカーの測定値が、所定のしきい値より大きい場合のことをいう。前記しきい値は、当該技術分野の当業者であれば、例えば、健常者や微小転移陰性リンパ節等における前記腫瘍マーカーの数値を統計学的に処理した値に基づいて定めることができる。前記しきい値としては、例えば、健常者や転移陰性リンパ節等の平均の値の３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、及びそれ以上の値が挙げられる。
【００４０】
次に、本発明の第４の腫瘍マーカーについて説明する。本発明の第４の腫瘍マーカーは、頭頸部癌の腫瘍組織試料で使用するマーカーであって、前記頭頸部癌が放射線化学療法に対して耐性を有することを示すマーカーである。この第４の腫瘍マーカーにおいて、マーカーとなる分子は、配列表の配列番号２３〜２６の塩基配列、下記表４に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセション番号の塩基配列、その部分配列、及びそれらの相補配列からなる群から選択される塩基配列を含む遺伝子転写産物及び/又はその翻訳産物である。前記遺伝子、転写産物及び翻訳産物を、以下、本発明の第４の腫瘍マーカーのマーカー遺伝子、マーカー転写産物及びマーカー翻訳産物という。なお、放射線化学療法とは、特に制限されず、例えば、既存の放射線療法及び化学療法の少なくとも一方を含む治療方法である。前記化学療法としては、例えば、抗癌剤治療を含む。
【００４１】
本発明の第４の腫瘍マーカーのマーカー遺伝子の中で、配列表の配列番号２３〜２６のマーカー転写産物をコードする遺伝子は、本発明者が見出した新規遺伝子である。また、下記表４に、本発明の第４腫瘍マーカーのマーカー転写産物の中で、公知の配列のものについて、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号及び一般的な遺伝子名を示す。
【００４２】
【表４】
2007000052.tif 000005
【００４３】
本発明の第４の腫瘍マーカーにおいて、腫瘍マーカーが陽性であるとは、腫瘍マーカーの測定値が、所定のしきい値より大きい場合のことをいう。前記しきい値は、当該技術分野の当業者であれば、例えば、健常者や放射線化学療法感受性症例等における前記腫瘍マーカーの数値を統計学的に処理した値に基づいて定めることができる。前記しきい値としては、例えば、健常者や放射線化学療法感受性症例等の平均の値の３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、及びそれ以上の値が挙げられる。
【００４４】
次に、本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカーの使用方法について説明する。本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカーの使用方法としては、特に制限されず、従来公知の腫瘍マーカーと同様の使用方法にて使用できるが、例えば、被検者の被検試料を準備する準備工程と、前記被検試料中に本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカーを検出する検出工程と、前記腫瘍マーカーが陽性か否かを判定する判定工程とを含む使用方法が挙げられる。まず、前記準備工程において、被検者由来の本発明の各腫瘍マーカーに適した試料を準備する。本発明の第１の腫瘍マーカーであれば、例えば、血液や唾液等の体液試料を準備し、本発明の第２の腫瘍マーカーであれば、例えば、手術又は生検等による原発腫瘍組織試料を準備し、本発明の第３の腫瘍マーカーであれば、例えば、手術又は生検等によるリンパ節試料又はセンチネルリンパ節生検試料を準備し、本発明の第４の腫瘍マーカーであれば、例えば、手術又は生検等による腫瘍組織を準備する。次に、前記検出工程において、本発明の各腫瘍マーカーのマーカー転写産物及び／又はマーカー翻訳産物を、後述するように、それぞれ、例えば、従来公知の方法等を用いて検出し、最後に、前記判定工程において、前記腫瘍マーカーが陽性か否かを判定する。
【００４５】
前記判定工程における本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカーが陽性か陰性かの判定は、前述のとおり、例えば、健常者等の値を基準として設定するしきい値と比較して判定することができる。また、前記判定は、本発明の各腫瘍マーカーにおいて、いずれか１種類のマーカー転写産物やマーカー翻訳産物に基づいて行ってもよいが、より多くの種類に基づくことが好ましい。偽陰性や偽陽性を排除できるからである。
【００４６】
本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカーにおける前記マーカー転写産物を検出する方法としては、特に制限されないが、前記ＲＮＡ鎖を定量できる従来公知の方法が挙げられ、その方法にも特に制限はないが、例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、ドットプロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ等のほか、マイクロアレイを用いる方法、リアルタイムＰＣＲ法等のＰＣＲを利用する方法、前記ＲＮＡ鎖を直接測定する方法等の迅速な測定が可能な方法があげられる。前記定量は、前記判定工程において前記しきい値との比較ができる相対的な定量であってもよく、例えば、適当な内部標準や外部標準を利用することができる。
【００４７】
前記マイクロアレイを用いる方法としては、前記マーカー転写産物に対応するプローブが配置されたマイクロアレイを準備し、このマイクロアレイに、前記体液試料中の前記ＲＮＡ鎖を鋳型として調製した標識化ターゲットをハイブリダイズさせ、前記プローブに結合した前記ターゲットの標識シグナルを測定して前記ＲＮＡ鎖を定量する方法が挙げられる。測定値の標準化のため、例えば、頭頸部癌の患者と健常者等との間で転写産物量が変化しない遺伝子の転写産物に対応するプローブを内部標準プローブとして利用してもよい。また、例えば、被検者由来のターゲットと健常者等の対照試料由来のターゲットとを用いた競合ハイブリダイゼーションをしてもよい。前記マイクロアレイ及び前記マイクロアレイに配置するプローブは、後述する本発明のマイクロアレイ及び本発明のポリヌクレオチドをそれぞれ使用できる。前記標識化ターゲットの調製方法としては、例えば、トータルＲＮＡを鋳型としたランダムプライミング法、ＰＣＲ法、その他の遺伝子増幅法等が挙げられる。前記標識化ターゲットは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。前記ターゲットの標識化方法としては、特に制限されず、例えば、プライマーを予め標識化しておく方法や、標識化ヌクレオチドを用いる方法等が挙げられるが、標識化ヌクレオチドの場合、取り込み時に偏りがあることから、標識化プライマーを用いる方法が好ましい。標識とする化合物は、特に制限されず、例えば、蛍光物質やＤＩＧ（ジゴキシゲニン）等が挙げられる。ハイブリダイゼーションの方法及び条件は、特に制限されず、従来公知の方法で行うことができ、当業者であれば、プローブ、ターゲット、ポリヌクレオチドの種類などによって、適宜調節できる。一般的なハイブリダイゼーション方法及び条件としては、例えば、５×ＳＳＣ＋０．３％ＳＤＳ中でターゲット及びリファレンスを熱変性した後、マイクロアレイに添加し、６５℃で４〜１６時間のハイブリダイゼーションし、常温の２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ、及び、２×ＳＳＣでそれぞれ５分間洗浄し、０．０５×ＳＳＣでリンスすること等が挙げられる。前記プローブとハイブリダイゼーションした前記ターゲットの標識シグナルをそれぞれ検出し測定する方法は、特に制限されず、標識の種類に応じて、従来公知の方法又は装置により測定できる。
【００４８】
前記リアルタイムＰＣＲ法としては、例えば、被検試料のトータルＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型に前記マーカー転写産物領域をＰＣＲで増幅し、リアルタイムモニタリング用試薬を用いて増幅産物の生成過程をリアルタイムでモニタリングし、解析する方法があげられる。前記リアルタイムモニタリング試薬としては、例えば、ＳＹＢＲ（登録商標：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）ＧｒｅｅｎＩや、ＴａｑＭａｎ（登録商標：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）プローブ等が挙げられる。さらに、定量性に優れるＬＡＴＥ−ＰＣＲ法（Ｌｉｎｅａｒ−Ａｆｔｅｒ−Ｔｈｅ−Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ−ＰＣＲ；  Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  ＰＮＡＳ，  １０１（７）；  １９３３−１９３８）を利用してもよい。また、前記ｍＲＮＡを直接測定する方法としては、例えば、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標：Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）ＲＮＡアッセイ等があげられる。ただし、マーカー転写産物を検出する方法としては、これらの方法に限られず、種々の定量方法を適用できる。
【００４９】
本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカーにおけるマーカー翻訳産物を検出する方法としては、特に制限されないが、例えば、前記マーカー翻訳産物に特異的な抗体を用いた免疫学的測定方法が挙げられる。前記免疫学的測定方法としては、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、サンドウィッチＥＬＩＳＡ等が挙げられる。前記抗体は、前記マーカー翻訳産物を用いた従来公知の方法で作製でき、ポリクローナルであっても、モノクローナルであってもよい。前記マーカー翻訳産物の調製方法は、特に制限されないが、例えば、前記マーカー翻訳産物をコードするポリヌクレオチドを、適当な発現ベクターに組み込み、大腸菌等の原核生物、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞等の真核生物細胞、又は、インビトロで前記ポリペプチドを発現させ、単離する方法が挙げられる。これらの方法は、当業者であれば、適宜選択して実施できる。
【００５０】
次に、本発明のプローブ及びプライマー用ポリヌクレオチドについて説明する。本発明のプローブ及びプライマー用ポリヌクレオチドは、頭頸部癌の腫瘍マーカーの検出にプローブ及びプライマーの少なくとも一方として使用するポリヌクレオチドであって、配列表の配列番号１〜２６の塩基配列、前記ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号で規定されるポリヌクレオチドの塩基配列、それらの部分配列、及びそれらの相補配列からなる群から選択される塩基配列からなるポリヌクレオチド、並びに、前記ポリヌクレオチドにおいて１個から数個の塩基が、欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチドであって前記ポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドである（以下、本発明のプローブ又は本発明のプライマーともいう）。前記ポリヌクレオチドとしては、特に限定されず、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は、従来公知のこれらの誘導体や類縁体等を使用できる。また、欠失、置換もしくは付加が可能な塩基数としては、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上であって、好ましくは、１〜３個、より好ましくは、１又は２個である。前記ストリンジェントな条件は、例えば、５×ＳＳＣ＋０．３％ＳＤＳ中で熱変性した後、６５℃で４〜１６時間のハイブリダイゼーションし、常温の２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ、及び、２×ＳＳＣでそれぞれ５分間洗浄し、０．０５×ＳＳＣでリンスすること等が挙げられる。本発明のプローブ及びプライマー用ポリヌクレオチドの製造方法としては、特に制限されず、例えば、従来公知の方法により化学合成により製造してもよく、酵素的にインビボ又はインビトロで製造してもよい。
【００５１】
本発明のプローブの使用方法は、例えば、上述したとおり、マイクロアレイのプローブに使用したり、リアルタイムＰＣＲ法のプローブに使用すること等が挙げられる。マイクロアレイのプローブとして使用する場合、その長さとしては、特に制限されないが、例えば、１０〜２００ヌクレオチドであって、２０〜１００ヌクレオチドが好ましく、より好ましくは４０〜８０ヌクレオチドである。通常、プローブは、その長さが短くなるほど配列特異性が増し、信頼度が向上する。マイクロアレイのプローブとして使用する場合、本発明のプローブには、マイクロアレイの基板に固定するための修飾がされていてもよい。前記修飾は、使用するマイクロアレイ基板の種類に応じて従来公知のものを選択できるが、例えば、プローブのポリヌクレオチドの５’又は３’側のＣ（３〜７）アミノ化等が挙げられる。また、リアルタイムＰＣＲ法のプローブとして使用する場合、本発明のプローブには、例えば、蛍光物質及びクエンチャーが結合されていてもよい。
【００５２】
本発明のプライマーの使用方法は、例えば、前記リアルタイムＰＣＲ法におけるプライマーとして使用したり、マイクロアレイ法のおけるターゲットの調製のためのＰＣＲ法のプライマーとして使用できる。プライマーの設計は、特に制限されず、従来公知の方法、例えば、プライマー設計用アルゴリズムやソフトウエアを利用して行うことができる。本発明のプライマーは、例えば、蛍光物質やＤＩＧ等が修飾されたプライマーを含む。
【００５３】
次に、本発明のマイクロアレイについて説明する。本発明のマイクロアレイは、本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカーの検出に使用するマイクロアレイであって、基板上に本発明のプローブのスポットが配置されたマイクロアレイである。前記マイクロアレイの製造方法は、特に制限されず、例えば、基板表面で直接プローブのポリヌクレオチドを合成する方法（オンチップ法）や、予め調製した本発明のプローブを基板表面に固定する方法等の従来公知の方法が挙げられる。前記オンチップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術及び固相合成技術とを組合せて、微小なマトリックスの所定の領域で選択的合成を行う方法が挙げられる。また、前記予め調製したプローブを用いる方法としては、プローブ溶解液をインクジェット法により基材に微小滴下して、化学的又は物理的に固定する方法が挙げられる。前記基材としては、特に制限されず、例えば、ガラス、金属、プラスチック等が挙げられる。
【００５４】
次に、本発明のキットについて説明する。本発明のキットは、本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカーの検出に使用するキットである。本発明のキットは、第１の態様として、本発明のマイクロアレイを含むキットが挙げられる。前記キットには、さらに、被検試料からトータルＲＮＡを調製するプライマーや試薬、ターゲットを調製するための標識化された本発明のプライマーや試薬等を含んでもよい。前記試薬としては、従来公知の試薬が利用でき、例えば、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、標識化合物、バッファー等があげられる。また、本発明のキットは、第２の態様として、本発明のプローブを含むキットが挙げられる。前記キットは、例えば、前記キットに含まれるプローブの中から選択的に使用してマイクロアレイを製造する場合や、リアルタイムＰＣＲ法により検出する場合に使用できる。さらに、本発明のキットは、第３の態様として、前記マーカー翻訳産物に対する抗体を含むキットが挙げられ、例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ等の前記ポリペプチドの免疫学的測定に使用できる。
【００５５】
次に、本発明のポリヌクレオチドについて説明する。本発明のポリヌクレオチドは、下記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチドであって、例えば、本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカーとして使用でき、また、本発明のプローブ又は本発明のプライマーとして使用できる。また、本発明のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、新規なポリペプチドであって、例えば、本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカーのマーカー物質として使用でき、また、前記抗体の製造に使用できる。
（１）配列表の配列番号１〜２６の塩基配列及びその部分配列からなる群から選択される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（２）前記（１）ポリヌクレオチドの塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（１）のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（３）前記（１）ポリヌクレオチドの塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（１）のポリヌクレオチドとの相同性が９０％以上であるポリヌクレオチド。
（４）前記（１）から（３）のポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００５６】
本発明のポリヌクレオチドとしては、特に限定されず、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は、従来公知のこれらの誘導体や類縁体等を使用できる。また、欠失、置換もしくは付加が可能な塩基数としては、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上であって、好ましくは、１〜３個、より好ましくは、１又は２個である。前記ストリンジェントな条件は、例えば、５×ＳＳＣ＋０．３％ＳＤＳ中で熱変性した後、６５℃で４〜１６時間のハイブリダイゼーションし、常温の２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ、及び、２×ＳＳＣでそれぞれ５分間洗浄し、０．０５×ＳＳＣでリンスすること等が挙げられる。前記相同性としては、例えば、９０％以上であり、好ましくは９５％以上であり、より好ましくは、９７．５％以上である。本発明のプローブ及びプライマー用ポリヌクレオチドの製造方法としては、特に制限されず、例えば、従来公知の方法により化学合成により製造してもよく、酵素的にインビボ又はインビトロで製造してもよい。
【００５７】
本発明のポリヌクレオチドのなかでも、配列表の配列番号１〜１７に対応する本発明のポリヌクレオチドは、健常者及び良性腫瘍の患者では発現がないか又は発現が抑制され、頭頸部癌が全身のいずれかの部位に残存する患者の体液中に発現される配列表の配列番号１〜１７に記載の新規配列の転写産物に由来するという共通の性質を有し、かつ、頭頸部癌患者の体液にのみ存在する転写産物ＲＮＡを検出できるという前記共通の性質に不可欠な重要な構造要素を有する。また、配列表の配列番号１８〜２０に対応する本発明のポリヌクレオチドは、リンパ節転移陰性の原発腫瘍組織では発現が抑制され、リンパ節転移陽性の頭頸部癌の原発腫瘍組織に発現される配列表の配列番号１８〜２０の新規配列の転写産物に由来するという共通の性質を有し、かつ、リンパ節転移陽性の原発腫瘍組織にのみ存在する転写産物ＲＮＡを検出できるという前記共通の性質に不可欠な重要な構造要素を有する。また、配列表の配列番号１１、１５、２１、２２に対応する本発明のポリヌクレオチドは、健常者及び頭頸部癌のリンパ節微小転移陰性症例の患者では発現されず、センチネルリンパ節微小転移があった患者のセンチネルリンパ節にのみ発現される配列表の配列番号１１、１５、２１、２２に記載の新規配列の転写産物に由来するという共通の性質を有し、かつ、センチネルリンパ節微小転移が認められるリンパ節にのみ発現される転写産物ＲＮＡを検出できるという前記共通の性質に不可欠な重要な構造要素を有する。また、配列表の配列番号２３〜２６に対応する本発明のポリヌクレオチドは、放射線化学療法感受性症例では発現が抑制され、放射線化学療法に耐性を有する頸部癌の腫瘍組織において発現が亢進する配列表の配列番号２３〜２６の新規配列の転写産物に由来するという共通の性質を有し、かつ、放射線化学療法に耐性を有する頸部癌の腫瘍組織においてのみ発現が亢進する転写産物ＲＮＡを検出できるという前記共通の性質に不可欠な重要な構造要素を有する。
【００５８】
次に、本発明のポリペプチドについて説明する。本発明のポリペプチドは、下記（１）又は（２）に記載の新規なポリペプチドであって、例えば、本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカーのマーカー翻訳産物として使用でき、また、前記マーカー翻訳産物の抗体の製造に使用できる。
（１）配列表の配列番号２７〜４８のアミノ酸配列及びその部分配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）前記（１）ポリペプチドのアミノ酸配列の１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、前記（１）のポリペプチドとの相同性が９０％以上であるポリペプチド。
【００５９】
欠失、置換もしくは付加が可能なアミノ酸残基数としては、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上であって、好ましくは、１〜３個、より好ましくは、１又は２個である。前記相同性としては、例えば、９０％以上であり、好ましくは９５％以上であり、より好ましくは、９７．５％以上である。
【００６０】
本発明のポリペプチドにおいて、配列表の配列番号２７及び２８のポリペプチドは、それぞれ、配列表の配列番号１及び２のポリヌクレオチドにコードされるものであり、配列表の配列番号２９〜３１のポリペプチドは、それぞれ、配列表の配列番号５〜７のポリヌクレオチドにコードされるものであり、配列表の配列番号３２〜３５のポリペプチドは、それぞれ、配列表の配列番号９〜１２のポリヌクレオチドにコードされるものであり、配列表の配列番号３６〜４８のポリペプチドは、配列表の配列番号１４〜２６のポリヌクレオチドにコードされるものである。本発明のポリペプチドの調製方法は、特に制限されないが、例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、適当な発現ベクターに組み込み、大腸菌等の原核生物、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞等の真核生物細胞、又は、インビトロで前記ポリペプチドを発現させ、単離する方法が挙げられる。これらの方法は、当業者であれば、適宜選択して実施できる。
【００６１】
以下、実施例を用いて本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【００６２】
試料の準備
再発症例２例を含む頭頸部悪性腫瘍１３症例を対象とした。対象症例の内訳は病理組織学的診断では８例が扁平上皮癌、２例が悪性黒色腫で、骨肉腫、唾液腺癌、基底細胞癌が各１例であった。頸部リンパ節あるいは遠隔転移については、陽性症例が６例、陰性症例が７例であった。また、比較対象として正常粘膜組織（３例）及び健常者（３例）、良性腫瘍症例（１例）血液を用いた。なお、検体の本研究への使用については、患者本人および家族へ十分な説明を行ったうえで、文書による同意を得た。
【００６３】
ハイブリダイゼーション
各症例の腫瘍及び正常部組織からは、機械的にホモジナイズした後Ｉｓｏｇｅｎ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ社製）を用い、血液からは、Ｔｅｍｐｕｓ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてトータルＲＮＡを抽出し、精製した。前記トータルＲＮＡ２μｇを、ケミルネッセントＲＴ−ＩＶＴラベリングキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて増幅し、ジゴキシゲニン（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）で標識されたｃＲＮＡを合成した。前記合成ｃＲＮＡを、ヒトゲノムサーベイマイクロアレイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にハイブリダイゼーションさせた後、ケミルミネッセントディテクションキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、洗浄、発色後、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ１７００マイクロアレイアナライザー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて２９０９８個のヒト全遺伝子の発現を定量した。各症例の遺伝子発現量の比較は、ソフトウエアＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製）を用いて解析した。
【００６４】
癌細胞存在腫瘍マーカーの同定
まず、正常組織若しくは他の組織型の悪性腫瘍組織と比較し、扁平上皮癌組織においてのみ共通して３倍以上の発現亢進を認める遺伝子転写産物を３１０種類同定した。次に、これらの中から、健常者及び良性腫瘍症例血液中にはその発現が認められない遺伝子転写産物を４３種類同定した。その４３種類の遺伝子転写産物の配列が、配列表の配列番号１〜１７及び上記表１のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号の塩基配列である。
【００６５】
リンパ節転移腫瘍マーカーの同定
リンパ節への転移陽性症例と転移陰性症例とで遺伝子発現量を比較し、転移陽性症例においてのみ共通して３倍以上の発現亢進を認める遺伝子転写産物を３１種類同定した。その３１種類の遺伝子転写産物の配列が、配列表の配列番号１８〜２０及び上記表２のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号の塩基配列である。なお、これら３１種類の遺伝子転写産物のうち、３０種類は、イムノグロブリンに関連する遺伝子の転写産物であった。
【００６６】
センチネルリンパ節微小転移腫瘍マーカーの同定
上述の扁平上皮癌組織においてのみ共通して３倍以上の発現亢進を認める３１０の遺伝子転写産物の中で、病理組織学的に微小転移陰性リンパ節にその発現が認められず、転移陽性リンパ節においてのみ発現が認められた遺伝子転写産物を１３種類同定した。その１３種類の遺伝子転写産物の配列が、配列表の配列番号１１、１５、２１、２２及び上記表３のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号の塩基配列である。
【００６７】
放射線化学療法耐性腫瘍マーカーの同定
放射線および化学療法施行後、局所再発あるいは肺転移を認めた２症例と放射線化学療法により完全寛緩を得られた４症例とを比較して、再発腫瘍組織にのみ共通して３倍以上の発現亢進を認めた遺伝子を１５種類同定した。その１５種類の遺伝子転写産物の配列が、配列表の配列番号２３〜２６及び上記表４のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号の塩基配列である。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
以上、説明したとおり、本発明の頭頸部癌の第１〜第４の腫瘍マーカーは、全身のいずれかの部位における頭頸部癌の存在を示す腫瘍マーカー、頭頸部癌のリンパ節転移を示す腫瘍マーカー、頭頸部癌のセンチネルリンパ節への転移を示す腫瘍マーカー、及び頭頸部癌の放射線化学療法の耐性を示す腫瘍マーカーを提供できるから、例えば、頭頸部癌の遺伝子診断を含む頭頸部癌の治療・診断の分野で有用である。
【配列表】
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