(57)【要約】【課題】  物質導入装置及び物質導入方法に関し、吐出量の定量化を容易にし、また、吐出物の垂れ流しを抑制するとともに、オンラインで目詰まりによる流量の低下を修正する。【解決手段】  微少物質吐出部材１を用いて蛍光試薬を含んだ第１の溶液２を、第１の溶液２と界面を生じない第２の溶液４中へ吐出して蛍光強度を検出する蛍光強度検出手段６、予め計測した吐出量と蛍光強度との相関より吐出量を求める吐出量算出段、算出した吐出量から、微少物質吐出部材１の吐出量と圧力及び加圧時間との相関を求める演算手段、及び、演算した吐出量と圧力及び加圧時間との相関に基づいて圧力及び加圧時間を制御して吐出量を調整する調整手段とを少なくとも備える。【選択図】          図１
2007289081.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中空尖頭部を有する微少物質吐出部材に充填した液体を圧力によって小胞体内へ吐出させて反応を観測する小胞体への物質導入装置であって、前記微少物質吐出部材を用いて蛍光試薬を含んだ第１の溶液を前記第１の溶液と界面を生じない第２の溶液中へ吐出して蛍光強度を検出する蛍光強度検出手段、予め計測した吐出量と蛍光強度との相関より吐出量を求める吐出量算出段、前記算出した吐出量から前記微少物質吐出部材の吐出量と圧力及び加圧時間との相関を求める演算手段、及び、前記演算した吐出量と圧力及び加圧時間との相関に基づいて圧力及び加圧時間を制御して吐出量を調整する調整手段とを少なくとも備えたことを特徴とする物質導入装置。
【請求項２】
請求項１記載の物質導入装置による物質導入方法であって、中空尖頭部を有する微少物質吐出部材に充填した蛍光試薬を含んだ第１の溶液を前記第１の溶液と界面を生じない第２の溶液中へ吐出して蛍光強度を検出し、予め計測した吐出量と蛍光強度との相関より吐出量を求めたのち、前記算出した吐出量から前記微少物質吐出部材の吐出量と圧力及び加圧時間との相関を求め、前記求めた吐出量と圧力及び加圧時間との相関に基づいて圧力及び加圧時間を制御して上記小胞体内への第１の溶液の吐出量を調整することを特徴とする物質導入方法。
【請求項３】
上記吐出量と蛍光強度との相関を、上記微少物質吐出部材に充填した蛍光試薬を含んだ第１の溶液を前記第１の溶液と界面を生じる液体へ吐出して液滴を形成し、前記液滴を撮像して取得した画像から前記液滴の直径を計測するとともに、前記液滴の蛍光強度を検出し、前記計測した液滴の直径と前記検出した蛍光強度とから吐出量と蛍光強度との相関を求めることを特徴とする請求項２記載の物質導入方法。
【請求項４】
上記小胞体内への第１の溶液の吐出量を調整するための吐出量の計測を、前記小胞体内への第１の溶液の吐出工程においてオンラインで行うことを特徴とする請求項２または３に記載の物質導入方法。
【請求項５】
上記小胞体を保持する容器に、小胞体保持部と、前記小胞体保持部と溶液が混じらないように隔離した位置に計測部とを設け、前記計測部において上記吐出量と圧力及び加圧時間との相関を求めることを特徴とする請求項２乃至４のいずれか１項に記載の物質導入方法。
【請求項６】
上記小胞体内への第１の溶液の吐出量を調整するための吐出量の計測を、前記小胞体内への第１の溶液の吐出工程の前に、オフラインで行うことを特徴とする請求項２または３に記載の物質導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は物質導入装置及び物質導入方法に関するものであり、ライフサイエンス分野、特に、再生医療分野や新薬開発分野における微少な細胞の溶液の注入を精度良く行うために吐出量を調整するための構成に特徴のある物質導入装置及び物質導入方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオや医療などの分野では、新薬開発等のために反応液や培養液中での反応・細胞の培養、或いは、細胞中への薬液の注入が重要になっており、その際、培養液や細胞等に薬液等の微量の溶液を精度良く滴下或いは注入するためにマイクロインジェクション法が用いられている（例えば、特許文献１、非特許文献１、或いは、非特許文献２参照）。
【０００３】
しかし、市販のインジェクション装置において、細胞への物質導入量の定量性を謳った製品は現時点で皆無である。この理由は、マイクロインジェクション以外の方法では原理的に導入量の調整が困難であること、細胞への吐出量がｐｌ（ピコリットル）〜ｆｌ（フェムトリットル）のオーダであり、流量も小さいため、濃度や電気伝導度といった一般的な計測手段が適用しにくいことなどによる。
【０００４】
例えば、ラジオアイソトープなどの手法を用いれば、微小吐出量の計測の可能性はあるが、安全性やコストなどの点でインジェクション装置への適用は困難である。
【０００５】
なお、他分野でｐｌの吐出量を実現した製品としてインクジェットプリンタがあるが、インクが空気との界面を形成している点でマイクロインジェクション装置とは決定的に異なっている。
即ち、細胞への物質導入では、細胞内の水溶液に導入物質の水溶液を注入するために、細胞内の水溶液と導入物質の水溶液との間に界面を生じない。
【０００６】
良く知られているように、μｍ以下の微小サイズでは表面力の影響が顕著になり、液滴の内部圧力は液滴の曲率に比例して大きくなる。
このため、体積が同等でもインクジェットプリンタでは扱う圧力のオーダが桁違いに大きくなっており、同じ機構をマイクロインジェクションに適用することは非常に難しい。
【０００７】
また、インクジェットプリンタではアクチュエータ性能により最大流量も桁違いに大きいため、総量の計測が容易で一回当たりの平均吐出量の計測も容易となる。
【特許文献１】特開２００４−０８１０８４号公報
【非特許文献１】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ．ｊｐ
【非特許文献２】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｒｉｓｈｉｇｅ．ｃｏ．ｊｐ／ｊａｐａｎ／ｍａｉｎ＿ｊ．ｈｔｍ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のように、従来のマイクロインジェクション法では、実用的な定量計測手法が無いために、細胞の膨れ具合等から熟練者の経験と感により吐出量を調整しており、定量性が無いという問題があった。
【０００９】
また、マイクロインジェクション法では先端直径が１μｍ以下の非常に細い中空針を使用しているため、先端が徐々に詰まり流量が低下するが、その場合に、流量を定量的に修正する手段が無いという問題があった。
【００１０】
さらに、中空針はガラス製であり、水溶液は毛管上昇で逆流するため、拮抗する圧力を常にかけておく必要があるが、この圧力の閾値が正確にわからないために過剰に圧力をかけざるを得ず、吐出物が垂れ流しになり、この垂れ流しになった吐出物が細胞に作用する可能性があるという問題があった。
【００１１】
したがって、本発明は、吐出量の定量化を容易にし、また、吐出物の垂れ流しを抑制するとともに、オンラインで目詰まりによる流量の低下を修正することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
図１は本発明の原理的構成図であり、ここで図１を参照して、本発明における課題を解決するための手段を説明する。
なお、図における符号３は、透明容器である。
図１参照
上記課題を解決するために、本発明は、中空尖頭部を有する微少物質吐出部材１に充填した液体を圧力によって小胞体内へ吐出させて反応を観測する小胞体への物質導入装置であって、微少物質吐出部材１を用いて蛍光試薬を含んだ第１の溶液２を、第１の溶液２と界面を生じない第２の溶液４中へ吐出して蛍光強度を検出する蛍光強度検出手段６、予め計測した吐出量と蛍光強度との相関より吐出量を求める吐出量算出段、算出した吐出量から、微少物質吐出部材１の吐出量と圧力及び加圧時間との相関を求める演算手段、及び、演算した吐出量と圧力及び加圧時間との相関に基づいて圧力及び加圧時間を制御して吐出量を調整する調整手段とを少なくとも備えたことを特徴とする。
【００１３】
このように、第２の溶液４中へ吐出した蛍光試薬を含んだ第１の溶液２の吐出量を、蛍光強度から算出する手段と吐出量と圧力及び加圧時間との相関を求める演算手段を設けることによって、ｐｌ（ピコリットル）〜ｆｌ（フェムトリットル）オーダの微少吐出量の定量化が可能になる。
【００１４】
また、演算した吐出量と圧力及び加圧時間との相関に基づいて圧力及び加圧時間を制御して吐出量を調整する調整手段を設けることによって、オンラインで目詰まりによる流量の低下を修正することが可能になる。
なお、本発明における小胞体とは細胞、微生物、マイクロカプセル等の総称であり、また、中空尖頭部を有する微少物質吐出部材とは、マイクロピペット、シリンジ、或いは、キャピラリ等の総称である。
【００１５】
また、上述の各手段に加えて、装置内部に蛍光７を発生させるための励起光を照射する励起光照射手段５を設けることが望ましく、それによって、蛍光強度を測定する際の装置構成を簡素化することができる。
【００１６】
また、上述の物質導入装置を用いて物質を導入する場合には、中空尖頭部を有する微少物質吐出部材１に充填した蛍光試薬を含んだ第１の溶液２を、第１の溶液２と界面を生じない第２の溶液４中へ吐出して蛍光強度を検出し、予め計測した吐出量と蛍光強度との相関より吐出量を求めたのち、算出した吐出量から、微少物質吐出部材１の吐出量と圧力及び加圧時間との相関を求め、求めた吐出量と圧力及び加圧時間との相関に基づいて圧力及び加圧時間を制御して、小胞体内への第１の溶液２の吐出量を調整すれば良い。
【００１７】
この場合、吐出量と蛍光強度との相関を、微少物質吐出部材１に充填した蛍光試薬を含んだ第１の溶液２を、第１の溶液２と界面を生じる液体８へ吐出して液滴を形成し、液滴を撮像して取得した画像から、液滴の直径を計測するとともに、液滴の蛍光強度を検出し、計測した液滴の直径と、検出した蛍光強度とから吐出量と蛍光強度との相関を求めること、特に、オフラインで求めることが望ましい。
【００１８】
また、微少物質吐出部材１としては、小胞体内への第１の溶液２を吐出する工程に用いる微少物質吐出部材１と別個の微少物質吐出部材１を用いても良いものである。
【００１９】
また、上述の小胞体内への第１の溶液２の吐出量を調整するための吐出量の計測を、小胞体内への第１の溶液２の吐出工程においてオンラインで行っても良く、常に精度の高い微少吐出量を実現することができる。
【００２０】
この場合、蛍光試薬を含んだ第１の溶液２が、小胞体にインジェクションしなくても接触するだけで作用が起こる場合には、小胞体を保持する容器に、小胞体保持部と、小胞体保持部と溶液が混じらないように隔離した位置に計測部とを設け、計測部において吐出量と圧力及び加圧時間との相関を求めるようにすれば良く、それによって、蛍光試薬を含んだ第１の溶液２がどのような性質であっても、オンラインキャリブレーションが可能になる。
【００２１】
或いは、小胞体内への第１の溶液２の吐出量を調整するための吐出量の計測を、小胞体内への第１の溶液２の吐出工程の前に、オフラインで行っても良く、この場合には、物質導入作業効率が向上する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、導入溶液として蛍光物質を含んだ溶液を用いて吐出量と蛍光強度との相関関係から微少な吐出量を精度良く測定して圧力／加圧時間を制御しているので、吐出量の定量化が容易になる。
【００２３】
また、上述の構成をマイクロインジェクション装置内に組み込むことによって、オンラインで工程途中の詰まり等による蛍光強度の変動を検知することができるため、その都度キャリブレーションを行うことにより、吐出量の安定化が可能になる。
【００２４】
また、毛管上昇防止のための圧力も定量化することができるため、導入量の変動や待機時の吐出による不要な垂れ流しや逆流の変動を抑制するが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明は、キャピラリ等の中空尖頭部を有する微少物質吐出部材に充填した蛍光試薬を含んだ第１の溶液を、透明容器内に収容した第１の溶液と界面を生じないシリコーンオイル等の第２の溶液中へ吐出して蛍光強度を検出し、予め、微少物質吐出部材に充填した蛍光試薬を含んだ第１の溶液を、第１の溶液と界面を生じる液体へ吐出して液滴を形成し、液滴を撮像して取得した画像から、液滴の直径を計測するとともに、液滴の蛍光強度を検出し、計測した液滴の直径と、検出した蛍光強度とから求めた吐出量と蛍光強度との相関より吐出量を求めたのち、算出した吐出量から、微少物質吐出部材の吐出量と圧力及び加圧時間との相関を求め、求めた吐出量と圧力及び加圧時間との相関に基づいて圧力及び加圧時間を制御して、小胞体内への第１の溶液の吐出量を調整するものである。
【実施例１】
【００２６】
ここで、図２乃至図６を参照して、本発明の実施例１のマイクロインジェクション方法を説明する。
図２参照  
図２は、本発明の実施例１に用いるマイクロインジェクション装置の概念的構成図であり、内部に対物レンズ１３を上下移動させるフォーカス手段を持つ同軸照明付きの倒立型高倍率顕微鏡１２を収容した基台１１上にコントローラ付きのＸＹステージ３０を支持・固定し、このＸＹステージ３０によってキャリブレーション用シャーレや細胞を収容する細胞反応チップ等の透明容器２１を観察位置まで移動する。
【００２７】
この倒立型高倍率顕微鏡１２の内部には励起光源１４、フィルタ１５、コリメートレンズ１６及びハーフミラー１７のセットと、冷却ＣＣＤカメラ１８、蛍光フィルタ１９及び反射ミラー２０のセットが設けられている。
【００２８】
なお、この場合の励起光源１４の励起光２２はフィルタ１５により例えば、４６５ｎｍ〜４９５ｎｍの波長に絞られ、コリメートレンズ１６で平行化されたのち、ハーフミラー１７によって透明容器２１側に反射され、対物レンズ１３によって収束された状態で透明容器２１を照射する。
【００２９】
また、透明容器２１内に収容した溶液中に蛍光試薬が含まれている場合には、励起光２２によって蛍光試薬が励起されて蛍光２３は発生し、発生した蛍光２３は対物レンズ１３、ハーフミラー１７、反射ミラー２０を介して蛍光フィルタ１９に入射し、この蛍光フィルタ１９によって蛍光波長以外の波長の光がカットされて、蛍光２３のみが、例えば、−７０℃に冷却された冷却ＣＣＤカメラ１８によって強度検出される。
【００３０】
また、ＸＹステージ３０の上方には対物レンズをＺ軸方向に上下移動させるフォーカス手段を持つ同軸照明付きの正立型高倍率顕微鏡２４と正立型高倍率顕微鏡２４の顕微鏡像を撮像するＣＣＤカメラ２５が設けられており、倒立型高倍率顕微鏡１２により透明容器２１の下面から透過して上面を観察するとともに、正立型高倍率顕微鏡２４により透明容器２１の上面を直接観察する。
【００３１】
なお、この場合の同軸照明付きの正立型高倍率顕微鏡２４においては、明視野照明用光源２６、明視野照明シャッター２７、コリメートレンズ２８が設けられており、透明容器２１の上面を照射して観察を容易にする。
【００３２】
また、ＸＹステージ３０にはキャピラリ３１及びキャピラリホルダ３２を位置決めするコントローラ付きの移動ステージ３３が設けられており、また、キャピラリホルダ３２はチューブ３４を介して吐出機構３５に接続されている。
【００３３】
次に、図３を参照して、本発明の実施例１のマイクロインジェクション方法におけるオフラインキャリブレーション法を説明する。
図３参照  
まず、
ａ．後述する蛍光試薬を含んだ蛍光試薬水溶液からなる液滴を球状にするため、予め、透明容器２１として用いるシャーレ４１に疎水化処理を施すか、或いは、透過率を下げないために、ナノスケールの微細凹凸を形成する被膜などを設ける。
【００３４】
次いで、
ｂ．シャーレ４１にシリコーンオイル等の液体４２を満たす。
この場合の液体４２は高透過率で、低自家蛍光であり、屈折率が蛍光試薬水溶液と近いとともに、蛍光試薬水溶液と界面を形成するという条件を満たせば任意である。
なお、シリコーンオイルを用いる場合には、吸湿性があるため測定時間に注意を要する。
【００３５】
次いで、
ｃ．キャピラリ３１に蛍光試薬水溶液３６を充填し、マイクロインジェクション装置にセットする。
【００３６】
次いで、
ｄ．この段階で、シャーレ４１に収容した液体４２に励起光源１４から励起光２２を照射して液体４２の自家蛍光を含めた背景画像を冷却ＣＣＤカメラ１８によって撮影する。
【００３７】
次いで、
ｅ．キャピラリ３１を吐出機構３５によって加圧して、シャーレ４１内に蛍光試薬水溶液３６を微少量滴下して、シャーレ４１の底部に蛍光試薬水溶液３６の微少な液滴３７を形成する。
【００３８】
次いで、
ｆ．正立型高倍率顕微鏡２４を用いて明視野画像をＣＣＤカメラ２５で撮像するとともに、励起光源１４から励起光２２を照射して液滴３７からの蛍光２３を含めた蛍光画像を冷却ＣＣＤカメラ１８で撮像する。
【００３９】
次いで、
ｇ．撮像した明視野画像より、液滴３７の直径Ｄから液滴３７の体積Ｖを求める。
なお、画像と実寸のスケールはあらかじめ計測しておく。
【００４０】
一方、
ｈ．撮像した蛍光画像の各ピクセルにおける蛍光強度Ｉs から背景画像の各ピクセルにおける背景強度Ｉb を引き、全画面、もしくは一定輝度の範囲を総計して蛍光強度の総和Ｉ（＝Σ（Ｉs −Ｉb ））を求める。
【００４１】
次いで、
ｉ．このような計測を吐出機構３５による加圧する圧力を変えることにより、液滴３７の直径Ｄを変えて順次行うことによって蛍光強度の総和Ｉと液滴３７の体積Ｖの比例曲線を得る。
この場合の液滴３７の体積Ｖとしては、必要に応じて１０ｆｌ〜１００ｐｌの範囲内で計測を行う。
【００４２】
なお、蛍光は全方位に放射されるが、液滴３７が微少であるため、全光量の内、対物レンズ１３に入る光の割合は液滴３７のサイズによらずほぼ一定と見なせる。
また、励起光２２は液滴３７中の蛍光分子が飽和するのに充分な強度とする。
【００４３】
なお、ここでは、蛍光試薬水溶液３６として、例えば、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．社製商品名）を用い、励起光２２の波長を４６５ｎｍ〜４９５ｎｍとすることによって、、例えば、５５０ｎｍ程度の波長の蛍光２３が発せられる。
【００４４】
図４参照  
図４は、蛍光強度の総和Ｉと液滴の体積Ｖの相関を表す比例曲線であり、ほぼ、
Ｖ＝１２．５〔ｐｌ／ｃｏｕｎｔ〕×Ｉ〔ｃｏｕｎｔ〕
の比例関係にあることが確認された。
但し、球状の液滴３７であるため、吐出液体とシャーレ４１に満たした液体４２の屈折率が大きく異なる場合には得られた直線の傾きに補正を加える。
【００４５】
なお、便宜上、光強度の単位を〔ｃｏｕｎｔ〕としているが、これは冷却ＣＣＤ１８の輝度のカウント値である。
このため、光の絶対強度を知りたい場合には、別途キャリブレーション作業を必要とするが、本発明の実施例においては、同じ冷却ＣＣＤカメラ１８を用いているので絶対強度は不要である。
また、異なる冷却ＣＣＤカメラを使用する場合も、基準となる冷却ＣＣＤカメラとの感度の相対比率さえキャリブレーションすれば、絶対強度は不要である。
【００４６】
次に、図５を参照して、本発明の実施例１のマイクロインジェクション方法におけるオンラインキャリブレーション法を説明する。
図５参照  
まず、上述のオフラインキャリブレーションによって、吐出量と蛍光強度との相関関係を取得したのち、キャピラリ３１の形状の公差などの誤差要因を取り除くため、細胞に導入する所定の薬液と蛍光試薬を混合した蛍光試薬水溶液を用いて、まず、
Ａ．シャーレ４１に収容した水溶液４３、例えば、細胞液の組成に近い水溶液に対し、上述のオフラインでキャリブレーションした蛍光試薬水溶液３６を吐出する。
【００４７】
図６参照  
この時、
Ｂ．吐出量が微少であるため、数秒のオーダでは観測画面内に残滓が留まり、図６に示すように蛍光強度の総和Ｉは吐出が完全に終了したのち、拡散が進行しているにも拘わらず一定の値を保つため、一定になった蛍光強度総和Ｉを冷却ＣＣＤカメラ１７で測定し、測定結果を図４に示した蛍光強度の総和Ｉと液滴の体積Ｖの相関関係と対比させて吐出量に換算する。
【００４８】
次いで、この様な計測を吐出機構３５による加圧する圧力Ｐi 及び加圧時間ｔi を変えることによって、
Ｃ．各圧力Ｐi 及び加圧時間ｔi における吐出量Ｖi を求める。
【００４９】
上記のＢ及びＣの工程により圧力Ｐi 及び加圧時間ｔi と吐出量Ｖi との関係が求まるため、
Ｄ．要求される吐出量を満たすための圧力と加圧時間の条件を内挿もしくは外挿する。
【００５０】
以上の手順でキャリブレーションを行なった上で、細胞へインジェクションを行なう。  例えば、図示は省略するが、透明基板に複数の細胞培養槽を設けた細胞反応チップをＸＹステージ３０に搭載し、各細胞培養槽に培養液とともに収容した細胞を、正立型高倍率顕微鏡２４の視野内に移動させ、正立型高倍率顕微鏡２４で位置確認しながら、圧力及び加圧時間を制御してキャピラリ３１により所望の吐出量の蛍光試薬水溶液３６を細胞内へ吐出してインジェクションを行うことになる。
【００５１】
このように、本発明の実施例１においては、２段階のキャリブレ─ション法によって吐出量と圧力及び加圧時間の相関関係を取得し、キャピラリに加える圧力と加圧時間の関係から先端の吐出量を調整しているため、吐出量を精度良く定量性をもって制御することができる。
【実施例２】
【００５２】
次に、図７及び図８を参照して、本発明の実施例２のマイクロインジェクション方法を説明する。
図７参照  
図７は、本発明の実施例２に用いる細胞保持容器の説明図であり、透明プラスチック基板５１上に２段構造の細胞収容槽部５２と１段構造の第１計測用槽５５及び第２計測用槽５６とを設ける。
なお、細胞収容槽部５２と第１計測用槽５５及び第２計測用槽５６との間隔は、各槽に収容する溶液が互いに混ざらない間隔とする。
【００５３】
この細胞収容槽部５２の下段部には、細胞５４を一個一個収容する複数の細胞収容部を設けたＳｉ製細胞チップ５３が貼り付けられている。
このＳｉ製細胞チップ５３の各細胞収容部の底部には吸引孔（図示は省略）が設けられており、細胞収容槽部５２の下段部に設けられた吸引口（図示は省略）を介して細胞５４を吸引固定している。
【００５４】
このような、細胞保持容器５０を用いてインジェクションを行う場合、まず、第１計測用槽５５に例えば、シリコンオイル５７を収容し、このシリコンオイル５７中にキャピラリ３１を用いて蛍光試薬水溶液３６を滴下することによって、吐出量と蛍光強度との相関関係を取得する。
【００５５】
次いで、第２計測用槽５６に、例えば、培養液５８を収容し、この培養液５８中にキャピラリ３１を用いて蛍光試薬水溶液３６を滴下して蛍光強度を測定し、第１計測用槽５５を用いて取得した蛍光強度の総和Ｉと液滴の体積Ｖの相関関係と対比させて吐出量に換算する。
【００５６】
次いで、この様な計測を吐出機構による加圧する圧力Ｐi 及び加圧時間ｔi を変えることによって、各圧力Ｐi 及び加圧時間ｔi における吐出量Ｖi を求める。
上記の結果を用いて、キャピラリ３１からの吐出量Ｖi が所望の値となるように圧力Ｐi 及び加圧時間ｔi を調整しながら細胞５４に蛍光試薬水溶液３６をインジェクションする。
【００５７】
このように、本発明の実施例２においては、細胞保持容器５０に第１計測用槽５５及び第２計測用槽５６を設けているので、２段階のキャリブレーションを全てオンラインで行うことが可能になり、常に精度の高いインジェクションが可能になる。
特に、蛍光試薬水溶液３６が細胞５４内にインジェクションしなくても、細胞５４と接触するだけで作用する場合に有効となる。
【００５８】
以上、本発明の各実施例を説明してきたが、本発明は各実施例に記載された構成・条件等に限られるものではなく各種の変更が可能であり、例えば、上記の実施例においては、シャーレを用いてオンラインキャリブレーションを一度行って、それ以降はマイクロインジェクションのみを行っているが、マイクロインジェクション工程中で適宜オンラインキャリブレーションを繰り返しても良いものである。
【００５９】
特に、上記の実施例２の細胞収容容器を用いる場合には、予め定めた個数の細胞へのインジェクションが終了する毎に、第２計測用槽を用いてキャリブレーションしても良い。  この場合、キャピラリの目詰まりが進行して吐出量が減少しても、キャピラリからの吐出量をリアルタイムで計測することにより、キャピラリーに加える圧力及び加圧時間にフィードバックして少なくともその一方を変更することによって、キャピラリーからの吐出量をほぼ一定に保つことができる。
【００６０】
或いは、蛍光試薬水溶液が細胞と接触するだけでは作用しない場合には、細胞収納槽を二次元マトリクス状に設けた細胞反応チップに数列毎に一個の細胞収納槽をキャリブレーション用槽として用い、キャリブレーション用槽中に充填した培養液等の溶液中に蛍光試薬水溶液を滴下して蛍光強度を測定し、リアルタイムでキャピラリからの吐出量を測定するようにしても良いものである。
なお、この時、キャリブレーション用槽に細胞が存在しても問題はない。
【００６１】
また、上記の実施例１においては、オフラインキャリブレーションをマイクロインジェクションを行うマイクロインジェクション装置を用いて行っているが、オフラインキャリブレーションは吐出量、即ち、液滴の体積と蛍光強度の総和の関係を求めるだけであるので、別個の装置を用いて行っても良いものである。
【００６２】
また、上記の実施例１においては、蛍光試薬水溶液と界面を形成しない水溶液中での蛍光強度測定をオンラインで行っているが、予めオフラインで行っても良いものであり、さらには、マイクロインジェクション工程に使用するキャピラリーとは同じ仕様であるが別個のキャピラリーを用いて行っても良いものである。
【００６３】
また、上記の各実施例においては、蛍光試薬水溶液と界面を形成する液体としてシリコーンオイルを用いているが、シリコーンオイルに限られるものではなく、シリコーンオイルと同様に蛍光試薬水溶液と界面を形成する液体であれば良く、例えば、流動性パラフィンを用いても良いものである。
【００６４】
また、上記の実施例においては、細胞内に薬液を注入する工程として説明しているが、このような注入工程に限られるものではなく、例えば、細胞懸濁液中に蛍光試薬水溶液等を滴下して、細胞との反応を観察する場合にも適用されるものである。
【００６５】
ここで再び図１を参照して、本発明の詳細な特徴を改めて説明する。
再び、図１参照  
（付記１）  中空尖頭部を有する微少物質吐出部材１に充填した液体を圧力によって小胞体内へ吐出させて反応を観測する小胞体への物質導入装置であって、前記微少物質吐出部材１を用いて蛍光試薬を含んだ第１の溶液２を前記第１の溶液２と界面を生じない第２の溶液４中へ吐出して蛍光強度を検出する蛍光強度検出手段６、予め計測した吐出量と蛍光強度との相関より吐出量を求める吐出量算出段、前記算出した吐出量から前記微少物質吐出部材１の吐出量と圧力及び加圧時間との相関を求める演算手段、及び、前記演算した吐出量と圧力及び加圧時間との相関に基づいて圧力及び加圧時間を制御して吐出量を調整する調整手段とを少なくとも備えたことを特徴とする物質導入装置。
（付記２）  上記液滴からの蛍光７を放出するための励起光を照射する励起光照射手段５を備えたことを特徴とする付記１記載の物質導入装置。
（付記３）  付記１または２に記載の物質導入装置による物質導入方法であって、中空尖頭部を有する微少物質吐出部材１に充填した蛍光試薬を含んだ第１の溶液２を前記第１の溶液２と界面を生じない第２の溶液４中へ吐出して蛍光強度を検出し、予め計測した吐出量と蛍光強度との相関より吐出量を求めたのち、前記算出した吐出量から前記微少物質吐出部材１の吐出量と圧力及び加圧時間との相関を求め、前記求めた吐出量と圧力及び加圧時間との相関に基づいて圧力及び加圧時間を制御して上記小胞体内への第１の溶液２の吐出量を調整することを特徴とする物質導入方法。
（付記４）  上記吐出量と蛍光強度との相関を、微少物質吐出部材１に充填した蛍光試薬を含んだ第１の溶液２を前記第１の溶液２と界面を生じる液体８中へ吐出して液滴を形成し、前記液滴を撮像して取得した画像から前記液滴の直径を計測するとともに、前記液滴の蛍光強度を検出し、前記計測した液滴の直径と前記検出した蛍光強度とから吐出量と蛍光強度との相関を求めることを特徴とする付記３記載の物質導入方法。
（付記５）  上記微少物質吐出部材１が、上記小胞体内への第１の溶液２を吐出する工程に用いる微少物質吐出部材１と別個の微少物質吐出部材１であることを特徴とする付記４記載の物質導入方法。
（付記６）  上記小胞体内への第１の溶液２の吐出量を調整するための吐出量の計測を、前記小胞体内への第１の溶液２の吐出工程においてオンラインで行うことを特徴とする付記３乃至５のいずれか１に記載の物質導入方法。
（付記７）  上記小胞体を保持する容器に、小胞体保持部と、前記小胞体保持部と溶液が混じらないように隔離した位置に計測部とを設け、前記計測部において上記吐出量と圧力及び加圧時間との相関を求めることを特徴とする付記３乃至６のいずれか１に記載の物質導入方法。
（付記８）  上記小胞体内への第１の溶液２の吐出量を調整するための吐出量の計測を、前記小胞体内への第１の溶液２の吐出工程の前に、オフラインで行うことを特徴とする付記３乃至５のいずれか１に記載の物質導入方法。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明の活用例としては、バイオや医療分野における細胞と薬液との反応現象の観察が典型的であるが、細胞に限られるものではなく、多細胞の微生物にも適用されるものであり、さらには、マイクロカプセル、例えば、バクテリアやウイルスを培養液とともに封入したマイクロカプセルにも適用されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本発明の原理的構成の説明図である。
【図２】本発明の実施例１に用いるマイクロインジェクション装置の概念的構成図である。
【図３】本発明の実施例１のマイクロインジェクション方法におけるオフラインキャリブレーション法の説明図である。
【図４】蛍光強度の総和Ｉと液滴の体積Ｖの相関を表す比例曲線である。
【図５】本発明の実施例１のマイクロインジェクション方法におけるオンラインキャリブレーション法の説明図である。
【図６】蛍光強度総和の時間変化の説明図である。
【図７】本発明の実施例２に用いる細胞保持容器の説明図である。
【図８】本発明の実施例２のマイクロインジェクション方法の説明図である。
【符号の説明】
【００６８】
１  微少物質吐出部材
２  第１の溶液
３  透明容器                                                                    ４  第２の溶液
５  励起光照射手段
６  蛍光強度検出手段
７  蛍光
８  液体
１１  基台
１２  倒立型高倍率顕微鏡
１３  対物レンズ
１４  励起光源
１５  フィルタ
１６  コリメートレンズ
１７  ハーフミラー
１８  冷却ＣＣＤカメラ
１９  蛍光フィルタ
２０  反射ミラー
２１  透明容器
２２  励起光
２３  蛍光
２４  正立型高倍率顕微鏡
２５  ＣＣＤカメラ
２６  明視野照明用光源
２７  明視野照明シャッター
２８  コリメートレンズ
３０  ＸＹステージ
３１  キャピラリ
３２  キャピラリホルダ
３３  移動ステージ
３４  チューブ
３５  吐出機構
３６  蛍光試薬水溶液
３７  液滴
４１  シャーレ
４２  液体
４３  水溶液
５０  細胞保持容器
５１  透明プラスチック基板
５２  細胞収容槽部
５３  Ｓｉ製細胞チップ
５４  細胞
５５  第１計測用槽
５６  第２計測用槽
５７  シリコンオイル
５８  培養液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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