(57)【要約】【課題】高い抗酸化作用などの機能性を持つカバノアナタケは近年注目を集めている。しかしながら、従来のカバノアナタケの利用方法ではその有効成分を十分に利用できているとは言えず、その効果が不十分であった。【解決手段】従来の利用方法が、カバノアナタケ菌体を砕いて熱水抽出するという方法であることに注目し、この菌体からの抽出の難しさを解決するために、本発明者らはカバノアナタケを液体培養して、その培養上清を用いることにより、従来の問題を解決した。さらに、カバノアナタケ液体培養上清に米麹、米糠を加え、そしてこれを乳酸菌発酵させるといった操作を行うことにより、より高い抗酸化活性などの機能性を持つ組成物を得ることができた。また、米糠、米麹だけを乳酸菌発酵させた組成物にも抗酸化活性などがあることが分かった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
米糠または米糠抽出物および、米麹または米麹抽出物および、カバノアナタケ液体培養液または抽出物を含む混合物を乳酸菌発酵することを特徴とする健康機能組成物。
【請求項２】
米糠が赤糠である請求項１に記載の健康機能組成物。
【請求項３】
乳酸菌がLactobacillus brevisである請求項１から２の健康機能組成物。
【請求項４】
請求項１から３に記載の健康機能組成物を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、健康機能性組成物に関し、特に米麹、米糠、カバノアナタケ、乳酸菌よりなる健康機能性組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、カバノアナタケ（チャーガ）の保健機能効果が注目されおり、機能性成分とその効果については以下のようなことが知られている。
【０００３】
β−Ｄ−グルカン：免疫活性に貢献する主成分と言われ、ナチュラルキラー細胞を主とした全ての免疫細胞を活性化し、抗ガン作用などを示すと言われている。カバノアナタケのβ−Ｄ−グルカン含有量は、アガリクスの約３倍であることが知られており、抗ガン効果が非常に高いと考えられる。
【０００４】
ＳＯＤ（スーパーオキシドディスムターゼ）：抗酸化酵素とも呼ばれ、生体内では肝臓・副腎などに存在し免疫抵抗力増加・抗ガン作用をしめす非常に重要な酵素である。抗酸化作用により、生活習慣病の原因と言われる活性酸素を減らす効果があることに加え、活性酸素によって引き起こされる肌荒れやしみ・しわも防ぐことができる。カバノアナタケのＳＯＤ含有量はアガリクスの２０倍以上、青汁の６０倍、ホウレンソウの２４０倍に当たる３５，０００単位/ｇであると言われている。
【０００５】
リグニン画分：リグニン画分は免疫機構に作用する、ポリフェノールの一種である。また、ポリフェノール類の中でも比較的効果の高い有効成分といわれている。リグニン画分にはエイズウイルス増殖時に必要な酵素を阻害する効果があることが明らかとなっており、ＭＴ−４細胞におけるＨＩＶ−１の増殖を抑制し、マクロファージ好性ＨＩＶであるＪＲ−ＦＬ株に対しても有効であることなどが分かっている。
【０００６】
通常、カバノアナタケ菌体からこれらの有効成分を摂取する際には菌体を水又は熱水で抽出し、お茶などの形態として飲用している。
【０００７】
【非特許文献１】「幻のキノコカバノアナタケ、チャーガとも白樺茸ともいう抗ガンキノコ」甲田光雄著、健全社
【非特許文献２】「怪物カバノアナタケ」佐久間和夫著、上野芳夫監修、美登利出版
【非特許文献３】「カバノアナタケ（チャーガ）」星崎東明著、健全社
【非特許文献４】「ガンを消す幻の茸チャーガ」米山誠著、青萌堂
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら従来のカバノアナタケ飲料では、菌糸体破砕物を水又は熱水で抽出しているためカバノアナタケの有効成分が十分に抽出できず、本来の効果が十分に発揮できないという欠点を持っていた。本発明ではこの欠点を解消し、カバノアナタケが有する有効成分を十分に利用することを目的とした。さらに、カバノアナタケは希少な天然資源であるため、今後安定して供給される保証が無く、有効成分を含有するカバノアナタケを安定して供給することも目的とした。また、カバノアナタケのみの効果にとどまらず、カバノアナタケと組み合わせることにより相乗効果を示す組成物を見出すことも目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、カバノアナタケの菌核粉砕物においては、その細胞壁強度の高さにより、十分な有効成分の抽出が難しいことを見出した。そこで本発明者らは上記課題を解決するために、カバノアナタケ細胞を液体培養し、その培養上清を用いることに考え至った。さらに、このようにカバノアナタケを液体培養すれば、希少で入手ににくいカバノアナタケを大量に、かつ安定して提供することができると考えた。
そこで、カバノアナタケ液体培養上清である「フジワラのカバノアナタケ」（株式会社フジワラテクノアート製）と、カバノアナタケ菌核粉砕物の生理活性を比較したところ、カバノアナタケ液体培養上清の方が種々の生理活性が高いことが明らかとなった。
さらに驚くべきことに、カバノアナタケ液体培養上清に米糠または米糠抽出物（以下、単に糠と言うこともある）、米麹または米麹抽出物（以下、単に麹ということもある）、乳酸菌を加えて醗酵させることによりさらに生理活性が上がることを確認し、本発明を完成させた。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、カバノアナタケ液体培養上清は、カバノアナタケの水又は熱水抽出物よ  
【００１１】
りも高い活性を持つことが示された。そして、カバノアナタケ液体培養上清は、希少な菌類であるカバノアナタケの有効成分を安定して大量に得るために最適であると言える。
さらに、カバノアナタケ液体培養上清に米糠または米糠抽出物、米麹を添加し、乳酸菌で発酵させたものはさらに強い活性を持つことが分かった。この混合液を用いることにより、抗酸化、炎症防止などの高い効果が得られることが分かった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明者らは、カバノアナタケの水又は熱水抽出物では十分な有効成分の抽出ができないこと、さらにカバノアナタケがロシア、中国、モンゴル、北海道の一部の地域などでしか生育せず、さらにその発見、入手もやや困難であることを考え併せ、カバノアナタケを液体培養し、その培養液を用いることを思い至った。そこで、それに相当する物質である「フジワラのカバノアナタケ」（株式会社フジワラテクノアート製。以下カバノアナタケ液体培養上清）を用いて鋭意検討したところ、ホスホリパーゼＡ２阻害活性、ＳＯＤ活性の点で、カバノアナタケ熱水抽出物よりも優れた活性を示すことが分かった。
そこで、カバノアナタケ液体培養上清単独よりも、より抗酸化などの活性の高い混合組成物を得ることを次の目的とした。本発明者らは、カバノアナタケ液体培養上清に、さらに米糠または米糠抽出物（より好ましくは赤糠または赤糠抽出物）、米麹を加え、これに乳酸菌を加えて発酵させた混合物を用いて様々な実験を行った。ここで言う赤糠とは、玄米を外側から削り、表面から１０％程度を精米する時にできる糠のことを指す。その結果、これらを組み合わせたものは、抗酸化などの様々な活性について高い活性が見られた。
ＨＬ６０(ヒト骨髄性白血病)細胞を用いたＯ２−の産生抑制効果を調べた。ＨＬ６０細胞にＤＭＳＯ刺激を与えることにより、好中球とし、これにホルボール１２-ミリスタート１３-アセタート（以下ＴＰＡと記す）刺激を加えることによってＯ２−を産生させた。このときＴＰＡ刺激を与えるに先立ち、各検体サンプルを添加することによって、Ｏ２−の産生抑制の度合いを調べた。Ｏ２−は、活性酸素（スーパーオキサイドアニオンラジカル）であり、それが多く産生されることは、酸化活性が高いことを示し、その産生を抑えることは、抗酸化活性があることを示す。その結果、カバノアナタケ液体培養抽出物だけではＯ２−産生抑制効果が見られなかったが、カバノアナタケ液体培養抽出物に米糠、米麹を加え、これを乳酸菌発酵させたものを添加したものでは強いＯ２−産生抑制効果が見られた。さらに、カバノアナタケを加えていない、米糠、米麹だけを乳酸菌発酵させた混合物でも高いＯ２−産生抑制効果のあることが分かった。
次にＲＡＷ（マウス由来マクロファージ）細胞を用いたＮＯラジカル産生抑制試験を行った。ＮＯラジカルも活性酸素の一種であるが、この試験では、ＲＡＷ細胞にそれぞれのサンプルを添加しておき、ポリサッカライド（大腸菌由来、以下ＬＰＳと記す）で刺激をし、そこで産生されたＮＯラジカルを測定して、その産生量の多少を評価した。ＬＰＳは起炎症剤であるため、このＮＯラジカルの産生の抑制が見られるということは抗炎症効果があると言える。その結果、米糠にはある程度のＮＯラジカル産生抑制効果が見られたが、カバノアナタケ液体培養抽出物では、これよりかなり強い抑制効果を示した。またカバノアナタケ培養抽出物を米糠、米麹に配合し、乳酸菌を加えて発酵させたものでは、さらに効果が向上した。
【００１３】
次に様々な物質で、炎症に関係する酵素ホスホリパーゼＡ２の阻害活性を調べた。反応基質Ｕｍｂｅｌｉｆｅｒｙｌ  ａｒａｃｈｉｄｏｎａｔｅに、サンプル溶液を加え、これにホスホリパーゼＡ２を添加した。バッファーは０．１Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）を用いた。これを反応させ、Ｕｍｂｅｌｉｆｅｒｙｌ  ａｒａｃｈｉｄｏｎａｔｅから遊離してくる７−ｈｙｄｒｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎの蛍光強度を検出して酵素活性の指標とした。その結果、食品素材として種々の活性を持つと期待されるいくつかの食品由来のペプチドよりも、カバノアナタケ液体培養液と米糠と米麹を乳酸菌で発酵させたものの方がホスホリパーゼＡ２の阻害活性が強かった。
市販の抗炎症食品素材として知られているグルコサミンと、カバノアナタケと赤糠と米麹を乳酸菌で発酵させたものの、ホスホリパーゼＡ２阻害活性、ＳＯＤ活性、リポキシゲナーゼ阻害活性を比較したところ、ホスホリパーゼＡ２阻害活性はほとんど同じであったが、ＳＯＤ活性及びリポキシゲナーゼ阻害活性はグルコサミンには見られず、カバノアナタケと赤糠と米麹を乳酸菌で発酵させたものだけに活性が見られた。
米糠のＳＯＤ活性を調べたところ、赤糠、中白糠、上白糠の順で糠が米の中心に近い部分のものほどＳＯＤ活性が低くなり、最も表層に近い赤糠が最もＳＯＤ活性が高いことが分かった。
糠の中で最も活性の強かった赤糠をさらにエタノール抽出した抽出物、及びこれをさらにカラムで分画して疎水成分を分取したカラム分画物でＮＯラジカルの発生抑制を調べたところ、赤糠そのものよりも、赤糠エタノール抽出物の方が抑制効果が高く、カラム分画物はさらに抑制効果が高かった。
【００１４】
以下、実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１５】
カバノアナタケ液体培養上清の製造、及び、赤糠、米麹、カバノアナタケの乳酸菌発酵物の製造
カバノアナタケ液体培養上清は次のようにして得た。培地（５ｇのグルコース、５ｇの麦芽エキス（日本バイオコン株式会社製）、１０ｇのポリペプトン（日本製薬株式会社製）、５ｇのＹＥＡＳＴ  ＥＸＴＲＡＣＴ（Ｄｉｆｃｏ社製；ｐＨ＝６．０）５００ｍｌを２ｌ容の坂口フラスコに入れ、これを１２１℃、１５分オートクレーブ滅菌した後、これにカバノアナタケ菌糸を植菌して、３０℃で振盪培養を行った。培養は２５日行った。培養後の内容物をろ過し、カバノアナタケ液体培養上清を得た。
次に、赤糠４０ｇに、米麹を１０ｇ、水を１３５ｍｌ加え、前述のカバノアナタケ液体培養上清を１５ｍｌ加えた。これを懸濁、ホモジネートした後に乳酸菌Lactobacillus brevisを１.０×１０１０個／ｍｌとなるように加え、３７℃で１０日間乳酸菌発酵させた。これを遠心分離してその上清を取り、赤糠・米麹・カバノアナタケの乳酸発酵物とした。
場合によっては、この工程のうち、米麹又はカバノアナタケの一方又はその両方を加えないで行うこともできる。この場合はそれぞれ加えなかったものを含まない乳酸発酵物となる。
【実施例２】
【００１６】
カバノアナタケの熱水抽出物とカバノアナタケ液体培養上清のホスホリパーゼＡ２阻害活性及びＳＯＤ活性の比較
カバノアナタケの従来の通常の用法である熱水抽出物と、本発明の方法であるカバノアナタケの液体培養上清の効果を、ホスホリパーゼＡ２阻害活性と、ＳＯＤ活性により比較した。
ホスホリパーゼＡ２阻害活性の測定法を以下に示す。反応基質Ｕｍｂｅｌｉｆｅｒｙｌ  ａｒａｃｈｉｄｏｎａｔｅを５ｐｐｍ／バッファーとしたものを１８０μｌに、固形分濃度を０．３％にそろえたサンプル水溶液１０μｌを加え、これに牛膵臓ホスホリパーゼＡ２（シグマ社製）を０．２％／バッファーとしたものを１０μｌ添加した。バッファーは０．１Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）を用いた。これを３７℃で６０分間反応させ、Ｕｍｂｅｌｉｆｅｒｙｌ  ａｒａｃｈｉｄｏｎａｔｅから遊離してくる７−ｈｙｄｒｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎの蛍光強度を、励起波長３６０ｎｍ、測定波長４６０ｎｍで検出して酵素活性の指標とした。阻害活性はコントロール（サンプルなし）の反応速度とサンプルを入れたものの反応速度の相対評価によって算出した。
次にＳＯＤ活性の測定法を以下に示す。サンプル水溶液（ブランクには水のみ）１０μｌに、酵素溶液（バターミルク由来キサンチンオキシダーゼ０．０４９単位／ｍｌを含む０．１Ｍリン酸バッファーｐＨ８．０）４５μｌと、発色試薬（キサンチン０．４ｍＭとニトロブルーテトラゾリウム０．２４ｍＭを含む０．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ８．０）４５μｌを加え、混和した後にマイクロプレートリーダーのインキュベーター中で３７℃で３０分間反応させた後、５６０ｎｍでの吸光度の増加をマイクロプレートリーダーにて測定した。１分当たりの吸光度の平均増加量を反応速度Ｖとして、コントロールのＶ（Ｖcont）を基準に被験区のＶ（Ｖtest）を比較した。次の式で計算した値をＳＯＤ活性（キサンチンオキシダーゼ阻害活性）とした。ＳＯＤ活性（阻害率％）＝１００×（Ｖcont―Ｖtest）／Ｖcont。
【００１７】
ホスホリパーゼＡ２阻害活性の測定結果を図１に示す。サンプル溶液はいずれも固体分濃度０．３％にそろえたため、反応系における固体分濃度はいずれも１５０ｐｐｍである。カバノアナタケ菌体の熱水抽出物のホスホリパーゼＡ２阻害率は６５％であったのに対し、カバノアナタケ液体培養上清のホスホリパーゼＡ２阻害率は８９％と、液体培養上清の方がホスホリパーゼＡ２阻害活性において上回った。
【００１８】
ＳＯＤ活性の測定結果を図２に示す。カバノアナタケの熱水抽出物のＳＯＤ活性は５８％であったのに対し、カバノアナタケ液体培養上清では８１％と、カバノアナタケ液体培養上清の方がＳＯＤ活性が高かった。
【実施例３】
【００１９】
ＨＬ６０細胞を用いたスーパーオキシドアニオンＯ２−抑制試験
ヒト骨髄性白血病細胞であるＨＬ６０細胞を用い、Ｏ２−発生抑制試験を行った。まずＨＬ６０細胞を、細胞密度３.０×１０５個／ｍｌに調製してから、これにＤＭＳＯを培地に対して１．２５％（Ｖ／Ｖ）になるように添加した。培地交換はせずそのまま５日間培養を続け、好中球に分化させた。このとき培地は１０％ＦＢＳ/ＲＰＭＩ１６４０（大日本住友製薬株式会社製）を用いて、５％ＣＯ２気流下、３７℃で培養を行った。
【００２０】
この分化したＨＬ６０細胞培養液を遠心して培地上清を除去し、ＰＢＳ（０．１Ｍリン酸緩衝液；ｐＨ＝７．０）に懸濁して密度５×１０５個／ｍｌに調製して細胞懸濁液を得た。これをエッペンドルフチューブに０．１ｍｌずつ分注し、検体のＰＢＳ溶液（コントロールはＰＢＳのみ）を１０μｌ添加し、１５分間３７℃でインキュベートした後、遠心してＰＢＳ上清を除去した。この細胞沈殿ペレットを１．０％ハンクス液（日水製薬株式会社製）０．１ｍｌに再度懸濁して細胞懸濁液を得た。この細胞懸濁液に、ＰＢＳで２.０μＭに調整したＴＰＡ（和光純薬工業株式会社製）溶液を５μｌ添加した（ブランクはＰＢＳ）。その９０秒後に、ＰＢＳで２．０％に調製したチトクロームＣ（株式会社シグマ製）溶液を１０μｌ添加した。３７℃で１５分間インキュベートし、その後１５分間氷冷した後に遠心した。遠心上清０．１ｍｌをとり、マイクロプレートリーダーにてＯＤ５５０を測定することによって、スーパーオキシドアニオンＯ２−の生成量を測定して、Ｏ２−の産生抑制効果を調べた。このときコントロールでは最も多くのＯ２−が生成するため、チトクローム反応によるＯＤ５５０の呈色が顕著であった。これに対し被験物がＯ２−の生成を抑制した場合は、ＯＤ５５０の呈色が抑制された。その結果を表１に示す。
【００２１】
【表１】
2007153813.tif 000002
この結果、αトコフェロール、βカロチンなど、抗酸化物質と呼ばれている物質にはＯ２−の産生抑制効果は全く見られなかった。また、カバノアナタケ液体培養上清単独ではＯ２−の産生抑制効果は見られなかった。しかし、これに赤糠と麹を加えたものではいくらか抑制効果が見られた。また、赤糠と麹を乳酸菌発酵させたものでは大きなＯ２−産生抑制効果が見られた。また、これにカバノアナタケ液体培養上清を加えた場合でも同じ程度のＯ２−産生抑制効果が見られた。このことからＯ２−産生抑制効果については、赤糠と麹を加え、これを乳酸菌発酵させた組成物が非常に効果的であることが分かった。Ｏ２−産生抑制効果があるということは、抗酸化性があるということを示す。
【実施例４】
【００２２】
ＲＡＷ細胞を用いたＮＯラジカル産生抑制試験
マウス由来マクロファージであるＲＡＷ２６４．７細胞を、1ウェルあたり１.０×１０５個／０．５ｍｌになるようにプレートに分注して前培養を行った。増殖用培地としては１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地（大日本住友製薬株式会社製）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２気流下で培養を行った。２４時間後に培地を除去して、同量の試験用培地と交換した。試験用培地としては、ＦＢＳおよびフェノールレッドを含まないＤＭＥＭ培地（大日本住友製薬株式会社製）に、２００ｍＭグルタミン水溶液を１％添加して用いた。これに被験物１０μｌを添加して、３０分間放置した後、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳ（株式会社シグマＬ４５１６）溶液１０μｌと１０ｍｇ／ｍｌのアルギニン溶液１０μｌを加えた。さらに２４時間培養を続けた後に、培地上清より１００μｌを取り、ＯＤ５４３を測定してＥ１とした。これにＧｒｉｓｓ試薬（１．０％ｓｕｌｆａｎｉｌａｍｉｄｅ５％リン酸水溶液と、１．０％ｎａｐｈｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ水溶液を調製し、使用直前に１：１で混合したもの）を１００μｌ加え、その反応液のＯＤ５４３を測定してＥ２とした。Ｅ２−Ｅ１を算出し、これより発生したＮＯラジカル量の指標とした。ＮＯラジカルの発生は炎症の発症と結びつくため、ＮＯラジカルの産生抑制は抗酸化作用と共に、抗炎症作用があることを表す。その結果を表２に示す。
【００２３】
【表２】
2007153813.tif 000003
この結果から、コラーゲン、カルノシン、ＧＡＢＡにはＮＯラジカル産生抑制効果はないことが分かった。赤糠についてはやや抑制効果が見られた。また、カバノアナタケ液体培養上清は、単独でも強いＮＯラジカル産生抑制効果が見られ、これにさらに赤糠と米麹を加え、これらを乳酸菌で発酵させたものも、カバノアナタケ液体培養上清と同等のＮＯラジカル産生抑制効果が見られた。
【実施例５】
【００２４】
赤糠と米麹に対する、カバノアナタケ液体培養上清添加と乳酸菌発酵によるＯ２−とＮＯの産生抑制効果
実施例３及び実施例４の結果から、赤糠と米麹を加えたものには抗酸化活性があることが分かった。これにカバノアナタケ液体培養上清を添加する、又は乳酸菌発酵を行う、という操作を加えることにより、抗酸化、抗炎症の指標であるＯ２−とＮＯの産生抑制効果を調べた。赤糠４０ｇに麹１０ｇを加え、これに水１３５ｍｌを添加し、これにカバノアナタケ液体培養上清１５ｍｌを添加して懸濁ホモジネートしたもの、又はカバノアナタケ液体培養上清を添加する代わりに乳酸菌を添加して懸濁ホモジネートした後に１０日発酵させたもの、又はカバノアナタケ液体培養上清を添加した上に乳酸菌を添加して１０日発酵させたものをサンプルとして用意し、Ｏ２−とＮＯの産生抑制効果を調べた。ブランクは赤糠と米麹と水だけを加え、カバノアナタケ液体培養上清も加えず、乳酸菌発酵もさせなかったものとした。その結果を表３に示す。
【００２５】
【表３】
2007153813.tif 000004
この結果から、赤糠と米麹を乳酸菌発酵をすることによりＯ２−産生抑制効果が高まり、赤糠と米麹にカバノアナタケ液体培養上清を加えることによりＮＯラジカル産生抑制効果が高まり、赤糠と米麹にカバノアナタケ液体培養上清を加えてさらに乳酸菌発酵をさせたものでは、その両方の産生抑制効果が見られることが分かった。このことから、抗酸化、抗炎症の効果をより高めるには、赤糠と米麹を混ぜたものにさらにカバノアナタケ液体培養抽出物を加えて、これに乳酸菌を添加して乳酸発酵させるのが最も良いということが分かった。
【実施例６】
【００２６】
主な機能性食品素材とのホスホリパーゼＡ２阻害活性の比較
いくつかの食品由来ペプチド、ＧＡＢＡ，カルニチン、緑茶粉末、カバノアナタケ液体培養上清を赤糠と米麹を加えて乳酸菌発酵させたもののホスホリパーゼＡ２阻害活性を測定して比較した。ホスホリパーゼＡ２阻害活性は実施例２に記載したのと同じ方法で行った。
その結果を図３に示す。炎症関連酵素であるホスホリパーゼＡ２の阻害活性は、調べた中では、カバノアナタケの液体培養上清を赤糠と米麹に加え、これを乳酸菌で発酵させたものが一番強かった。また、いくつかの食品由来ペプチドは抗炎症作用が期待されており、ホスホリパーゼＡ２の阻害が見込まれたため、それらの食品由来ペプチドについて調べたが、海苔ペプチド、コラーゲンペプチド、シルクペプチド、はこの順にホスホリパーゼＡ２阻害活性が低くなり、最も阻害活性の強かった海苔ペプチドでも、カバノアナタケの液体培養上清を赤糠と米麹に加え、これを乳酸菌発酵させたものに活性が遠く及ばなかった。また、ＧＡＢＡ，カルニチン、緑茶粉末では、これらのペプチドよりもさらに阻害活性が低かった。
また、カバノアナタケを赤糠と米麹に加えて乳酸菌で発酵させたものに対し、試薬として既知のホスホリパーゼＡ２の阻害物質であるアリストロキア酸（aristolochic acid）を比較した。まず前者のＩＣ５０値が２６９３ｐｐｍであるのに対し、後者は２５９ｐｐｍと活性の強さではアリストロキア酸の１／１０程度であった。ただしアリストロキア酸では同時に毒性も強く、ラット試験でのＬＤ５０値が１０６ｍｇ／ｋｇであるのに対し、カバノアナタケを赤糠と米麹に加えて乳酸菌で発酵させたものでは、１２０００ｍｇ／ｋｇの投与でもラットの死亡例が全く見られなかったことから、毒性ではアリストロキア酸の１／１００以下であることが判明した。このことからも、アリストロキア酸は実際に生体に投与するには毒性が高いため不適であるのに対し、本発明のカバノアナタケを赤糠と米麹に加えて乳酸菌で発酵させたものは安全で好適であると言える。
【実施例７】
【００２７】
カバノアナタケ液体培養上清に赤糠、米麹を加えたものを乳酸菌発酵させたものと、グルコサミンの抗炎症効果の比較
カバノアナタケ液体培養上清を赤糠、米麹に加えたものを乳酸菌発酵させたものと、グルコサミンの抗炎症効果を比較するために、ホスホリパーゼＡ２阻害活性、ＳＯＤ活性、リポキシゲナーゼ阻害活性の３つの活性を調べて比較した。グルコサミンは市販の抗炎症食品素材として知られている。本実験では甲陽ケミカル株式会社製のグルコサミンを用いた。
ホスホリパーゼＡ２活性と、ＳＯＤ活性の測定は実施例２に記載した通りに行った。リポキシゲナーゼ阻害活性測定は以下のようにして行った。０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０；０．４Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２）にリノール酸を１００μＭとなるように溶解して基質溶液とした。この酵素溶液１ｍｌを石英セルに取り、検体の水溶液（コントロール群は水）を１０μｌ加えた。これに大豆由来１２−リポキシゲナーゼ溶液（株式会社シグマ製；１００万ユニット／０．３５ｍｌ；この懸濁液原液を同緩衝液で１００倍希釈して調製）を４０μｌ添加して、直後に吸光度２３４ｎｍを測定して初期値とした。そのまま３７℃で１０分間反応させて、初期値からの吸光度２３４ｎｍの増加をもって、生成したリノール酸過酸化物の指標とした。阻害活性は、コントロール群を基準とした吸光度の増加抑制の割合（％）で表した。
その結果を表４に示す。ホスホリパーゼＡ２阻害活性は、カバノアナタケ液体培養上清に赤糠と米麹を加えて乳酸菌発酵させたものと、グルコサミンでは前者の方がやや高かったが、ほとんど変わらなかった。前者のＩＣ５０は２６９３ｐｐｍであった。ＳＯＤ活性は、グルコサミンは系への添加限度量の４０００ｐｐｍ添加しても全く不活性であったのに対し、カバノアナタケの液体培養上清を赤糠と米麹に加えて乳酸菌発酵させたものはＩＣ５０値１６５０ｐｐｍの活性を示した。また、赤糠の水抽出物のＳＯＤ活性を調べたところ、ＩＣ５０値２４６０ｐｐｍの活性を示した。リポキシゲナーゼ阻害活性は、グルコサミンは１０００ｐｐｍでも全く不活性だったのに対し、カバノアナタケの液体培養上清を赤糠と米麹に加えて乳酸菌発酵させたものはＩＣ５０値３３１ｐｐｍの強い活性を示した。
【００２８】
【表４】
2007153813.tif 000005
【実施例８】
【００２９】
米糠の種類の違いによるＳＯＤ活性の差異
実施例１から７までの実験では米糠は赤糠を使って行ってきたが、赤糠以外の糠の効果も調べた。ここで用いた糠は、赤糠、中白糠、上白糠である。ここで言う赤糠、中白糠、上白糠とは、赤糠は玄米から外側１０％までを削った時に発生する糠を指し、中白糠は、外側１０％までを削ったところから外側２２％までを削った時に発生する糠のことを指す。また、上白糠は外側２２％以上を削った時に発生する糠のことを指す。これらの糠と米麹にさらにカバノアナタケの液体培養上清を加え、これを乳酸菌で発酵させたもののＳＯＤ活性を調べた。ＳＯＤ活性の測定は、実施例２と同じ方法で行った。実験区は、赤糠４：米麹１、中白糠４：米麹１、上白糠４：米麹１、全て米麹（糠無し）、の４区で行った。
【００３０】
その結果を図４に示す。ＳＯＤ活性は赤糠で一番高く、７６％であった。次に中白糠で３５％、上白糠で３０％であり、米麹のみでは１６％であった。このことから、米麹にもいくらかのＳＯＤ活性があるが、これに糠を添加することによりＳＯＤ活性が高くなることが分かり、さらに、糠の中でもより米の外側に近い部分の糠を用いた方がＳＯＤ活性が高いこと、即ちここでは赤糠を用いたものが一番ＳＯＤ活性が高いことが分かった。
【実施例９】
【００３１】
赤糠のＮＯラジカル産生抑制効果
実施例４の結果で見られたように、赤糠にはいくらかのＮＯラジカル産生抑制効果が見られたため、赤糠をエタノール抽出したもの、それをさらにカラム分画したもののＮＯラジカル産生抑制効果を調べた。
カラム分画は次のようにして行った。赤糠のエタノール抽出液を逆相系固相抽出カラム（Ｏａｓｉｓ  ＨＬＢ；日本ウォーターズ株式会社製）に吸着させた後、これにメタノールを流して洗浄し、さらにこれにアセトニトリルを流して溶出した。この溶出液を濃縮乾固して秤量し、濃度を調節して画分を得た。この画分は赤糠のうち最も疎水性の高い部分である。ＲＡＷ細胞を用いたＮＯラジカルの測定は実施例４と同様の方法で行った。
その結果を表５に示す。赤糠そのものではややＮＯラジカル産生抑制効果が見られ、これをエタノール抽出した抽出物ではさらに強いＮＯラジカル産生抑制効果が見られた。また、これをカラム分画したものでは、さらに強いＮＯラジカル産生抑制効果が見られた。すなわち、赤糠中にはＮＯラジカルの産生を強く抑制する物質が含まれており、それは赤糠のエタノール抽出物の中でも最も疎水性の高い部分であった。
【００３２】
【表５】
2007153813.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】カバノアナタケ熱水抽出物とカバノアナタケ液体培養上清のホスホリパーゼＡ２阻害活性の比較をした図である。
【図２】カバノアナタケ熱水抽出物とカバノアナタケ液体培養上清のＳＯＤ活性の比較をした図である。
【図３】種々の物質のホスホリパーゼＡ２阻害活性を比較した図である。
【図４】糠の種類によるＳＯＤ活性の比較をした図である。
【図１】
2007153813.tif 000007
【図２】
2007153813.tif 000008
【図３】
2007153813.tif 000009
【図４】
2007153813.tif 000010