(57)【要約】【課題】  水酸基選択的な反応等の複雑な反応を必要としない簡素な方法により、塩基部無保護ホスホロアミダイト化合物を製造する方法を得る。【解決手段】  塩基部保護ホスホロアミダイト化合物の塩基部を、アンモニア／メタノール溶液またはメチルアミン／ＴＨＦ溶液を用いて脱保護する。塩基部保護ホスホロアミダイト化合物としては、ヌクレオシドの塩基部を保護した後に５’−ＯＨ基を保護し、さらに３’−ＯＨ基をホスホロアミダイト化したものが好ましい。本発明によれば、水酸基選択的な反応等の複雑な反応を必要としない簡素な方法により、塩基部無保護ホスホロアミダイト化合物を製造する方法を得ることができ、塩基部無保護ホスホロアミダイト化合物を大量に生産できる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基部保護ホスホロアミダイト化合物の塩基部を、アンモニアおよび／またはアミンを含む溶液を用いて脱保護することを特徴とする、塩基部無保護ホスホロアミダイト化合物の製造方法。
【請求項２】
アンモニアおよび／またはアミンを含む溶液の溶媒が、低級アルコールおよび／またはＴＨＦを含むことを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
アミンが、アルキルアミン、ジアルキルアミン、またはトリアルキルアミンであることを特徴とする、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
アルキルアミンが、メチルアミンであることを特徴とする、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
低級アルコールが、メタノール、エタノール、プロパノール、またはイソプロパノールであることを特徴とする、請求項２に記載の製造方法。
【請求項６】
アンモニアおよび／またはアミンを含む溶液が、アンモニア／メタノール溶液またはメチルアミン／ＴＨＦ溶液である、請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
塩基部保護ホスホロアミダイト化合物が、ヌクレオシドの塩基部を保護した後に５’−ＯＨ基を保護し、さらに３’−ＯＨ基をホスホロアミダイト化することにより得られることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法により製造された塩基部無保護ホスホロアミダイト化合物を用いることを特徴とする、核酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ等の核酸の合成に用いられるホスホロアミダイト化合物の製造方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、塩基部を保護しないホスホロアミダイト化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ等の核酸の合成法としては、現在ホスホロアミダイト法が多く用いられている。このホスホロアミダイト法は、ヌクレオチドの亜リン酸アミドを用いて、順次ヌクレオチドを付加していく反応を行うものである。ここで、伸長反応が起きて欲しくない反応性に高い基については、適当な保護基を用いて保護しておく必要がある。例えば、各ヌクレオチドの塩基部は、アシル基やベンゾイル基などの保護基を用いて保護する必要があり、５’−ＯＨ基は、ジメトキシトリチル基などの保護基を用いて保護する必要がある。
【０００３】
そして、反応後に塩基部の保護基を脱保護するために、アンモニア等による長時間の処理を行う必要がある。しかし、この塩基部の脱保護の際に、合成した核酸が分解して、収率の低下をもたらす場合がある。
【０００４】
このため、塩基部の脱保護工程を要しない方法として、塩基部無保護のホスホロアミダイト法がいくつか提案されている（特許文献１参照）。
【０００５】
ここで、塩基部無保護のホスホロアミダイト化合物を製造する方法としては、ヌクレオシドの５’−ＯＨ基に水酸基選択的なトリチル化反応を行い、さらに３’−ＯＨ基に水酸基選択的なホスホロアミダイト化反応を行う必要がある（特許文献２参照）。
【０００６】
しかし、これらの水酸基選択的な反応は煩雑であり、塩基部無保護のホスホロアミダイト化合物を大量に生産するのには、適していない。
【特許文献１】特開２００４−９９５３２
【特許文献２】特開２００３−２８９５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、水酸基選択的な反応等の複雑な反応を必要としない簡素な方法により、塩基部無保護ホスホロアミダイト化合物を製造する方法を得ることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明らは、塩基部保護ホスホロアミダイト化合物を出発物質として、特定の溶液を用いて塩基部の脱保護を行うことにより、塩基部無保護ホスホロアミダイト化合物を簡素かつ効率的に製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、これまでは、ホスホロアミダイト化合物の化学的安定性が乏しいと考えられていたが、本発明者らは、特定の溶液中では安定であることを発見し、これらの溶液中で保護された塩基部を脱保護することにより、塩基部無保護のホスホロアミダイト化合物を容易に製造できることを見出した。
【０００９】
即ち、本発明は、塩基部保護ホスホロアミダイト化合物の塩基部を、アンモニアおよび／またはアミンを含む溶液を用いて脱保護することを特徴とする、塩基部無保護ホスホロアミダイト化合物の製造方法である。
【００１０】
また、本発明は、アンモニアおよび／またはアミンを含む溶液の溶媒が、低級アルコールおよび／またはＴＨＦを含むことを特徴とする、上記の製造方法である。
【００１１】
また、本発明は、アミンが、アルキルアミン、ジアルキルアミン、またはトリアルキルアミンであることを特徴とする、上記の製造方法である。
【００１２】
また、本発明は、アルキルアミンが、メチルアミンであることを特徴とする、上記の製造方法である。
【００１３】
また、本発明は、低級アルコールが、メタノール、エタノール、プロパノール、またはイソプロパノールであることを特徴とする、上記の製造方法である。
【００１４】
また、本発明は、アンモニアおよび／またはアミンを含む溶液が、アンモニア／メタノール溶液またはメチルアミン／ＴＨＦ溶液である、上記の製造方法である。
【００１５】
また、本発明は、塩基部保護ホスホロアミダイト化合物が、ヌクレオシドの塩基部を保護した後に５’−ＯＨ基を保護し、さらに３’−ＯＨ基をホスホロアミダイト化することにより得られることを特徴とする、上記の製造方法である。
【００１６】
また、本発明は、上記の方法により製造された塩基部無保護ホスホロアミダイト化合物を用いることを特徴とする、核酸の製造方法である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、水酸基選択的な反応等の複雑な反応を必要としない簡素な方法により、塩基部無保護ホスホロアミダイト化合物を製造する方法を得ることができ、塩基部無保護ホスホロアミダイト化合物を大量に生産できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の出発物質として用いる塩基部保護ホスホロアミダイト化合物としては、ＤＮＡ合成試薬として広く市販されているもの等、いずれのものであっても用いることができる。例えば、ヌクレオシドの塩基部がアシル基、ベンゾイル基、フェノキシアセチル基などの保護基により保護され、ヌクレオシドの５’−ＯＨ基がジメトキシトリチル基などの保護基により保護され、ヌクレオシドの３’−ＯＨ基がホスホロアミダイト化されているものを挙げることができる。なお、これらの保護基は、上記のものに限定されず、いずれのものも用いることができる。
【００１９】
より具体的には、５’−Ｏ−（ジメトキシ）トリチル−Ｎ−アセチル−２’−デオキシシチジン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）、５’−Ｏ−（ジメトキシ）トリチル−Ｎ−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）、５’−Ｏ−（ジメトキシ）トリチル−Ｎ−フェノキシアセチル−２’−デオキシアデノシン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）、５’−Ｏ−（ジメトキシ）トリチル−Ｎ−フェノキシアセチル−２’−デオキシグアノシン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）、５’−Ｏ−（ジメトキシ）トリチル−Ｎ−ベンゾイル−２’−デオキシグアノシン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）、等を塩基部保護ホスホロアミダイト化合物の例として挙げることができる。
【００２０】
なお、これらの塩基部保護ホスホロアミダイト化合物は、一般的に、以下の工程によって製造される。即ち、ヌクレオシドの塩基部をアシル基やベンゾイル基などの保護基を用いて保護する。次に、ヌクレオシドの５’−ＯＨ基を、ジメトキシトリチル基などの保護基を用いて保護する。そして、ヌクレオシドの３’−ＯＨ基を、ホスホロアミダイト化する。この方法によれば、まず塩基部を保護するため、その後の５’−ＯＨ基や３’−ＯＨ基における反応を、水酸基選択的な反応とする必要はなく、比較的簡素な方法により、塩基部保護ホスホロアミダイト化合物を製造することができる。
【００２１】
本発明において、塩基部の脱保護に用いられる溶液としては、溶質としてアンモニアおよび／またはアミンを含むものである。ここで、アミンとしては、塩基部の脱保護ができるものであれば特に制限はないが、例えば、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン等のアルキルアミン；ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、ジブチルアミン等のジアルキルアミン；トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン等のトリアルキルアミン等を挙げることができる。これらの中で、特にメチルアミンが好ましいアミンとして挙げられる。
【００２２】
また、本発明において、塩基部の脱保護に用いられる溶液の溶媒としては、低級アルコールおよび／またはＴＨＦを含むことが好ましい。低級アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等を挙げることができ、特にメタノールを好ましい例として挙げることができる。
【００２３】
これらの溶質と溶媒の組み合わせは、塩基と脱保護する保護基の性質に応じて適宜決定される。例えば、アデニン塩基をフェノキシアセチル基で保護した場合は、脱保護するための溶液としてアンモニア／メタノールの組み合わせが好ましく、また、シトシン塩基やアデニン塩基をベンゾイル基で保護した場合は、メチルアミン／ＴＨＦの組み合わせが好ましい。
【００２４】
本発明で用いられるアンモニアおよび／またはアミンを含む溶液の濃度としては、特に制限はないが、通常０．１〜５０Ｍ、好ましくは０．５〜１０Ｍ、より好ましくは１〜５Ｍのものが挙げられる。
【００２５】
塩基部の脱保護の反応時間としては、特に制限はないが、例えば、１分〜１００時間、好ましくは１０分〜６０時間、より好ましくは３０分〜１０時間、さらに好ましくは１時間〜５時間を挙げることができる。
【００２６】
塩基部の脱保護の反応温度としては、特に制限はないが、例えば、０〜１００℃、好ましくは５〜８０℃、より好ましくは１０〜５０℃、さらに好ましくは１５〜３５℃を挙げることができ、通常は室温付近で反応を行うことができる。
【００２７】
本発明の塩基部無保護ホスホロアミダイト化合物の製造方法の手順としては、例えば、塩基部保護ホスホロアミダイト化合物を、アンモニアおよび／またはアミンを含む溶液に溶解または分散させて所定時間攪拌し、その後、溶媒を留去して、カラムクロマトグラフィー等で精製することにより、目的物を得ることができる。
【００２８】
本発明の製造方法により得られた塩基部無保護ホスホロアミダイト化合物を用いて核酸を製造する方法としては、特に制限はなく、通常の塩基部無保護ホスホロアミダイト化合物を用いた核酸の合成方法を用いることができる。
【００２９】
例えば、固相合成により核酸を合成する場合においては、市販のＤＮＡ合成装置を用いて、３’位をＯ−固相担体に結合したヌクレオシドに対して、本発明により得られた塩基部無保護ホスホロアミダイト化合物を伸長剤として添加し、１−ヒドロキシ−６−ニトロベンゾロリアゾール、イミダゾリニウムトリフレート等の反応促進剤を用いてカップリング反応を行う。アセトニトリル等で洗浄を行った後、酸化してリン酸トリエステルとした後、トリクロロ酢酸等で５’−ＯＨの保護基をはずし、次の伸長反応を行う。これらの操作を繰り返すことにより、塩基部の脱保護を必要とすることなく、核酸を効率的に合成することができる。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３１】
＜実施例１＞
５’−Ｏ−（ジメトキシ）トリチル−２’−デオキシシチジン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の製造
５’−Ｏ−（ジメトキシ）トリチル−Ｎ−アセチル−２’−デオキシシチジン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（２１６ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）を２Ｍアンモニア−メタノール溶液（２．５ｍｌ）に溶解させた。２時間撹拌した後、溶媒を減圧留去させた。この粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（１％  トリエチルアミン）により精製し、ヘキサンに５０〜１００％クロロホルム、続いてクロロホルムに０〜３％メタノールのグラジエントをかけて溶出し、溶媒を留去し目的の白色個体を得た。（１９０ｍｇ，９４％）
31Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：１４８．７−１４８．３
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：０．９５−１．０９（ｍ，１２Ｈ），２．０３−２．１９（ｍ，１Ｈ），２．２５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ），２．４２−２．５５（ｍ，２Ｈ），３．２２−３．５６（ｍ，５Ｈ），３．５７−３．７２（ｍ，７Ｈ），４．０３−４．０９（ｍ，１Ｈ），４．４１−４．５５（ｍ，１Ｈ），５．４０−５．５５（ｍ，１Ｈ），６．１０−６．２７（ｍ，１Ｈ），６．７０−６．８１（ｍ，４Ｈ），７．０８−７．３６（ｍ，１１Ｈ），７６０−７．６９（ｍ，１Ｈ）、７．６７−７．７８（２ｓ，１Ｈ）
Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ39Ｈ48Ｎ5Ｏ7Ｐ：Ｃ６４．１８，Ｈ６．６３，Ｎ９．６０，Ｆｏｕｎｄ：Ｃ６３．９９，Ｈ６．６２，Ｎ９．８８，
【００３２】
【化１】
2007039385.tif 000002
【００３３】
＜実施例２＞
５’−Ｏ−（ジメトキシ）トリチル−２’−デオキシシチジン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の製造
５’−Ｏ−（ジメトキシ）トリチル−Ｎ−アセチル−２’−デオキシシチジン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（２１６ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）を２Ｍメチルアミン−ＴＨＦ溶液（２．５ｍｌ）に溶解させた。２時間撹拌した後、溶媒を減圧留去させた。この粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（１％  トリエチルアミン）により精製し、ヘキサンに５０〜１００％クロロホルム、続いてクロロホルムに０〜３％メタノールのグラジエントをかけて溶出し、溶媒を留去し目的の白色個体を得た。（１９８ｍｇ，９７％）
【００３４】
【化２】
2007039385.tif 000003
【００３５】
＜実施例３＞
５’−Ｏ−（ジメトキシ）トリチル−２’−デオキシシチジン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の製造
５’−Ｏ−（ジメトキシ）トリチル−Ｎ−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（２３３ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）を２Ｍメチルアミン−ＴＨＦ溶液（２．５ｍｌ）に溶解させた。１２時間撹拌した後、溶媒を減圧留去させた。この粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（１％  トリエチルアミン）により精製し、ヘキサンに５０〜１００％クロロホルム、続いてクロロホルムに０〜３％メタノールのグラジエントをかけて溶出し、溶媒を留去し目的の白色個体を得た。（１７４ｍｇ，８５％）
【００３６】
【化３】
2007039385.tif 000004
【００３７】
＜実施例４＞
５’−Ｏ−（ジメトキシ）トリチル−２’−デオキシアデノシン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の製造
５’−Ｏ−（ジメトキシ）トリチル−Ｎ−フェノキシアセチル−２’−デオキシアデノシン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（１９６ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）を２Ｍアンモニア−メタノール溶液（２．５ｍｌ）に溶解させた。１時間撹拌した後、溶媒を減圧留去させた。この粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（１％トリエチルアミン）により精製し、ヘキサンに５０〜１００％クロロホルム、続いてクロロホルムに０〜３％メタノールのグラジエントをかけて溶出し、溶媒を留去し目的の白色個体を得た。（１７７ｍｇ，９８％）
31Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：１４９．４−１４９．３
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：１．０５−１．３３（ｍ，１２Ｈ  ），２．４２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ），２．４３−２．７２（ｍ，２Ｈ），２．８１−２．９３（ｍ，１Ｈ），３．２２−３．７８（ｍ，１２Ｈ），４．２３−４．５５（ｍ，１Ｈ），４．７０−４．８３（ｍ，１Ｈ），６．０４−６．２０（ｂｒ，ｓ，２Ｈ），６．４２−６．４９（ｍ，１Ｈ），６．７２−６．７８（ｍ，４Ｈ），７．１３−７．４２（ｍ，９Ｈ），７．９６，８．０１（２ｓ，１Ｈ），８．２５（ｓ，１Ｈ）
Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ40Ｈ48Ｎ7Ｏ6Ｐ：Ｃ６３．７３，Ｈ６．４２，Ｎ１３．０１，Ｆｏｕｎｄ：Ｃ６３．７１，Ｈ６．４０，Ｎ１３．０５，
【００３８】
【化４】
2007039385.tif 000005
【００３９】
＜実施例５＞
５’−Ｏ−（ジメトキシ）トリチル−２’−デオキシアデノシン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の製造
５’−Ｏ−（ジメトキシ）トリチル−Ｎ−フェノキシアセチル−２’−デオキシアデノシン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（２１５ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）を２Ｍメチルアミン−ＴＨＦ溶液（２．５ｍｌ）に溶解させた。１時間撹拌した後、溶媒を減圧留去させた。この粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（１％  トリエチルアミン）により精製し、ヘキサンに５０〜１００％クロロホルム、続いてクロロホルムに０〜３％メタノールのグラジエントをかけて溶出し、溶媒を留去し目的の白色個体を得た。（１７５ｍｇ，９７％）
【００４０】
【化５】
2007039385.tif 000006
【００４１】
＜実施例６＞
５’−Ｏ−（ジメトキシ）トリチル−２’−デオキシアデノシン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の製造
５’−Ｏ−（ジメトキシ）トリチル−Ｎ−フェノキシアセチル−２’−デオキシアデノシン−３’−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（２１５ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）を２Ｍメチルアミン−ＴＨＦ溶液（２．５ｍｌ）に溶解させた。２時間撹拌した後、溶媒を減圧留去させた。この粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（１％  トリエチルアミン）により精製し、ヘキサンに５０〜１００％クロロホルム、続いてクロロホルムに０〜３％メタノールのグラジエントをかけて溶出し、溶媒を留去し目的の白色個体を得た。（１６１ｍｇ，８９％）
【００４２】
【化６】
2007039385.tif 000007
【００４３】
＜実施例７＞
５’−Ｏ−（ジメトキシ）トリチル−２’−デオキシグアノシン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の製造
５’−Ｏ−（ジメトキシ）トリチル−Ｎ−フェノキシアセチル−２’−デオキシグアノシン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（４２０ｍｇ，０．４４ｍｍｏｌ）を２Ｍアンモニア−メタノール溶液（４．５ｍｌ）に溶解させた。２時間撹拌した後、溶媒を減圧留去させた。この粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（１％トリエチルアミン）により精製し、ヘキサンに５０〜１００％クロロホルム、続いてクロロホルムに０〜３％メタノールのグラジエントをかけて溶出し、溶媒を留去し目的の白色個体を得た。（２９８ｍｇ，８８％）
31Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：１４９．４−１４９．２
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：１．０１−１．２５（ｍ，１２Ｈ  ），２．４１（ｔ，１Ｈ，  Ｊ＝１０．５Ｈｚ），２．４３−２．７７（ｍ，３Ｈ），３．３１−３．８０（ｍ，１２Ｈ），４．１１−４．１８（ｍ，１Ｈ），４．５５−４．６１（ｍ，１Ｈ），６．４３−６．４９（ｍ，１Ｈ），６．７４−６．８０（ｍ，４Ｈ），７．１０−７．３６（ｍ，１１Ｈ），７６０−７．６９（ｍ，１Ｈ）
Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ40Ｈ48Ｎ7Ｏ7Ｐ：Ｃ６２．４１，Ｈ６．２８，Ｎ１２．５５，Ｆｏｕｎｄ：Ｃ６２．３０，Ｈ６．３９，Ｎ１２．５５，
【００４４】
【化７】
2007039385.tif 000008
【００４５】
＜実施例８＞
５’−Ｏ−（ジメトキシ）トリチル−２’−デオキシグアノシン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の製造
５’−Ｏ−（ジメトキシ）トリチル−Ｎ−フェノキシアセチル−２’−デオキシグアノシン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（４２０ｍｇ，０．４４ｍｍｏｌ）を２Ｍアンモニア−メタノール溶液（４．５ｍｌ）に溶解させる。２時間撹拌した後、溶媒を減圧留去させた。この粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（１％トリエチルアミン）により精製し、ヘキサンに５０〜１００％クロロホルム、続いてクロロホルムに０〜３％メタノールのグラジエントをかけて溶出し、溶媒を留去し目的の白色個体を得た。（２９８ｍｇ，９０％）
【００４６】
【化８】
2007039385.tif 000009
【００４７】
＜実施例９＞
５’−Ｏ−（ジメトキシ）トリチル−２’−デオキシグアノシン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の製造
５’−Ｏ−（ジメトキシ）トリチル−Ｎ−ベンゾイル−２’−デオキシグアノシン−３’−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（２５２ｍｇ，０．３ｍｍｏｌ）を２Ｍアンモニア−メタノール溶液（４．５ｍｌ）に溶解させた。２時間撹拌した後、溶媒を減圧留去させた。この粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（１％トリエチルアミン）により精製し、ヘキサンに５０〜１００％クロロホルム、続いてクロロホルムに０〜３％メタノールのグラジエントをかけて溶出し、溶媒を留去し目的の白色個体を得た。（１７３ｍｇ，７５％）
【００４８】
【化９】
2007039385.tif 000010
【００４９】
＜実施例１０〜１７＞
上記の実施例と同様にして、表１に示す内容にて塩基部無保護のホスホロアミダイトを製造した。
【００５０】
【表１】
2007039385.tif 000011
実施例１〜１７に示す通り、本発明により塩基部無保護ホスホロアミダイトを容易に製造できることがわかる。
【００５１】
＜実施例１８＞
以下の手順で核酸を製造した。
【００５２】
１−ヒドロキシ−６−ニトロベンゾトリアゾールの合成
２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（１２．２ｇ，６１．８ｍｍｏｌ）を溶解したピリジン−水混合液（３００ｍｌ，（２：３，ｖ／ｖ））にヒドラジン一水和物（３ｍｌ，  ６１．８ｍｍｏｌ）、酢酸ナトリウム（１８．２ｇ，２２１ｍｍｏｌ）、酢酸（１４．９ｍｌ，２７２ｍｍｏｌ）をいれ、１４時間加熱還流した。この反応溶液を冷却した後、クロロホルム５００ｍｌで希釈し水３００ｍｌで３回抽出操作を行った。水層を回収し、溶媒を減圧留去させ粗精製物を得た。最後に、この粗精製物を２Ｍ塩酸水溶液で洗浄することで、目的の１−ヒドロキシ−６−ニトロベンゾトリアゾールを６３％の収率で得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ：８．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），８．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），８．６３（ｓ，１Ｈ）
【００５３】
ＤＮＡの固相合成サイクル（ＤＮＡ自動合成機）
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．（ＡＢＩ）のＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ３９２を使用した。ＤＮＡオリゴマーの自動合成機による合成は、末端にチミジンを導入したＨＣＰ固相担体（１μｍｏｌ，２８μｍｏｌ／ｇ，ｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ｌｉｎｋｅｒ）を用いて行った。合成各鎖伸長サイクルは、以下の表２に示すとおりである。塩基部無保護ホスホロアミダイトは、実施例１〜１７に従って製造したものを用いた。また、Ｎ−２−イソブチリル基によって塩基部を保護したグアニン（Ｇibu）のホスホロアミダイト化合物を参照として用いて核酸を合成した。
この反応により、ｄ［ＴＡＣＣＴＧＧibuＧＴＣＣＡＴ］を、３９％の収率で得た。
【００５４】
【表２】
2007039385.tif 000012
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明によれば、水酸基選択的な反応等の複雑な反応を必要としない簡素な方法により、塩基部無保護ホスホロアミダイト化合物を製造する方法を得ることができ、塩基部無保護ホスホロアミダイト化合物を大量に生産できる。