(57)【要約】【解決手段】納豆菌を人工突然変異又は自然突然変異することにより、Ｄｅｈｙｄｒｏｐｒｏｌｉｎｅ耐性株、Ｃａｎａｖａｎｉｎｅ耐性株、芳香族アミノ酸アナログ耐性株、８−Ａｚａｇｕａｎｉｎｅ耐性株を各々誘導・選択し、各々Ｌ−プロリン、Ｌ−アルギニン、芳香族アミノ酸、又はイノシン／イノシン酸の生産性を向上させ、これらのアミノ酸生産菌や核酸生産菌を用いて健康機能性を有する新規納豆を製造する。【効果】本発明によれば、健康、栄養、美容に効果があると期待できるＬ−プロリン、肝臓での解毒作用や皮膚再生の効果があるＬ−アルギニン、又、うつ病、不眠症、痴呆症、パーキンソン氏病に間接的に効果が期待できる各種芳香族アミノ酸、更には、疲労回復と納豆のうま味を増強できるイノシン、イノシン酸などを高濃度に含む納豆など各種機能性に富む新規納豆を安価に製造し、提供することが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−プロリンのアナログに対する耐性を有し、且つＬ−プロリンを分泌する性質を有する納豆菌を使用することを特徴とするＬ−プロリン高含有納豆の製造法。
【請求項２】
Ｌ−アルギニンのアナログに耐性を有し、且つＬ−アルギニンを分泌する性質を有する納豆菌を使用することを特徴とするＬ−アルギニン高含有納豆の製造法。
【請求項３】
芳香族アミノ酸（Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン）のアナログに対する耐性を有し、且つ芳香族アミノ酸（Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン）を分泌する性質を有する納豆菌を使用することを特徴とする芳香族アミノ酸高含有納豆の製造法。
【請求項４】
アデニン要求性とプリンアナログ耐性を有し、且つイノシン、イノシン酸を分泌する性質を有する納豆菌を使用することを特徴とするイノシン、イノシン酸高含有納豆の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、微生物の育種およびその利用に係り、更に詳細には、本発明は、機能性と付加価値を向上せしめた納豆、具体的にはＬ−プロリン、Ｌ−アルギニン、芳香族アミノ酸（Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン）またはイノシンおよびイノシン酸の生産性を向上させた納豆菌の育種、その育種納豆菌、その育種納豆菌を用いたこれらのアミノ酸や核酸を多く含む納豆の製造法、及びその育種納豆菌を使用して製造した納豆に関する。
【背景技術】
【０００２】Ｌ−プロリン、Ｌ−アルギニン、芳香族アミノ酸（Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン）は、いずれも蛋白質構成のアミノ酸として重要なアミノ酸であることが知られている。これらのアミノ酸の工業的製造法としては、ブレビバクテリウム  ラクトファーメンタム、コリネバクテリウム  グルタミクム、エシェリヒア  コリーなどの変異株または組換え体を使用して糖を主原料とする直接発酵法が主流となっている。他方、イノシンおよびイノシン酸は、バチルス  サチルスの変異株を使用して糖からイノシンを生産し、次にイノシンを化学的または菌体酵素反応によりイノシン酸を生産する方法が主流となっている。このようなアミノ酸、核酸の従来の製造法はいずれも液体培養法または液体反応法による製造方法であった。【０００３】Ｌ−プロリンは蛋白質中に含まれ、遊離した状態で存在することはまれである。皮膚の保湿性の保持に関与するアミノ酸として重要であり、腱の構成アミノ酸としても重要な役割を持っている。【０００４】Ｌ−アルギニンは塩基性アミノ酸であり、カキ、ハマグリ、アサリ、シジミなどの貝類や多くの発芽植物中に少量含まれている。動物に於いては、肝臓での解毒作用や、Ｌ−アルギニンの投与が皮膚および真皮のコラーゲン生成促進するなど重要な働きを行っている。【０００５】Ｌ−チロシンはタケノコに含まれている。Ｌ−チロシンは脳内神経伝達物質等の重要な前駆体であり、うつ病、痴呆症、パーキンソン氏病に有効なアミノ酸である。Ｌ−フェニルアラニンはＬ−チロシン生成に有効なアミノ酸であり、且つ必須アミノ酸として重要なアミノ酸である。Ｌ−トリプトファンは、脳内神経伝達物質の前駆体として重要なアミノ酸である。【０００６】イノシンは疲労回復に有効な核酸ヌクレオシドであり、イノシン酸はグアニル酸の前駆体であり、食品中のグルタミン酸と共存することにより、うま味の相乗効果を有することが知られている。【０００７】大豆を納豆菌で発酵した大豆発酵食品である納豆は、伝統的な日本発の栄養食品であり、最近は欧米にも愛好者が増えてきた。また、アフリカ、東南アジアのほか世界各地には、大豆以外にも各種の豆類が食用として多用されていて、これらの豆類が納豆菌やＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓなどの各種Ｂａｃｉｌｌｕｓ属微生物やカビ、酵母、乳酸菌などの微生物により発酵されて、豆類の発酵食品として利用されている。【０００８】納豆菌で大豆を発酵させると、納豆菌の持つプロテアーゼにより大豆蛋白質が分解されてペプチドやアミノ酸が生成し、蛋白質の消化・吸収を向上させる。【０００９】大豆を納豆菌で発酵させた納豆は、アミノ酸や核酸の供給源として極めて好ましい食品といえる。【００１０】しかし、納豆菌の育種改良研究は今後の進展を待つ状況であり、特にＬ−プロリン、Ｌ−アルギニン、芳香族アミノ酸、またはイノシン及びイノシン酸などの納豆中での含有量を納豆菌の育種開発により高めた報告は見当たらない。【００１１】納豆にＬ−プロリン、Ｌ−アルギニン、芳香族アミノ酸、またはイノシンおよびイノシン酸を別途に添加することが考えられるが、安価な納豆のコスト増につながるので、好ましい方法ではない。従って、納豆菌の能力を��為的に向上させることにより、自然な形でＬ−プロリン、Ｌ−アルギニン、芳香族アミノ酸、またはイノシンおよびイノシン酸の含有量を高めることが求められる。このような納豆菌が開発できて、納豆中にこれらのアミノ酸、核酸を蓄積できれば、従来の液体培養法や液体反応法に変わって、大豆という個体表面上における発酵的製造法、即ち固体培養法によるこれらアミノ酸、核酸の製造法を創生するものである。
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】本発明は、皮膚の保湿作用や腱の構成アミノ酸として重要なＬ−プロリン、肝臓での毒物解毒作用や皮膚と真皮のコラーゲン生成に有効なＬ−アルギニン、脳内神経伝達物質の前駆体でありうつ病、不眠症、痴呆症、パーキンソン氏病などに有効な芳香族アミノ酸、グリシンなどを市販の納豆よりも高濃度に含有する納豆を提供することを目的とし、さらに、本発明は、同様に納豆のうま味機能性や疲労回復性などを向上させるために、イノシンまたはイノシン酸含有量を高めた新規な納豆をも提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】本発明者等は、納豆のＬ−プロリン、Ｌ−アルギニン、芳香族アミノ酸などの遊離アミノ酸の含有量を向上させる手段や、イノシンおよびイノシン酸など核酸の納豆中での含有量を向上させる手段を各種検討し、納豆菌自体にこれらのアミノ酸や核酸の生成能力を人為的に改良することが出来ると考えて本発明を推進した。
【００１４】納豆菌は、稲ワラなどに付着して自然界には広く存在している。分類学的にはバチルス・サチルスに分類されているが、納豆特有の粘質物を生成し且つビオチンを要求することからバチルス・ナットウとして分類したり、バチルス・サチルスの変種として分類する文献もある。
【００１５】納豆菌のＬ−プロリン、Ｌ−アルギニン、芳香族アミノ酸、イノシンおよびイノシン酸の生合成調節機構は完全に解明されておらず、更にこれらのアミノ酸や核酸の生合成能を向上させる試みも全く行われていないのが現状であった。
【００１６】そこで、本発明者らは、多様な検討を重ねた結果として、人工的に変異処理して得た変異納豆菌をＬ−プロリンのアナログの１つである３，４−Ｄｅｈｙｄｒｏｐｒｏｒｉｎｅ含有培地で培養して得られた耐性株について、Ｌ−プロリン分泌能を検討したところ、この耐性株がＬ−プロリンを納豆中に分泌している新知見を得た。
【００１７】さらに、本発明者らは、多様な検討を重ねた結果として、人工的に変異処理して得た変異納豆菌の中から、Ｌ−アルギニンのアナログの一つであるＣａｎａｖａｎｉｎｅ含有培地で培養して得られた耐性株について、Ｌ−アルギニン分泌能を検討したところ、この耐性株がＬ−アルギニンを納豆中に分泌している新知見を得た。
【００１８】また、本発明者らは、様々なテストを行い、人工的に変異処理して得た変異納豆菌からＬ−フェニルアラニンおよびＬ−チロシンのアナログの１種であるｐ−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ含有培地で培養して得られた耐性株について、Ｌ−フェニルアラニンとＬ−チロシン分泌能を検討したところ、この耐性株が納豆中にＬ−フェニルアラニンとＬ−チロシンを分泌することを新規に見出した。さらに、Ｌ−トリプトファンのアナログである５−メチルトリプトファン耐性株を変異誘導したところ、納豆中にＬ−トリプトファンを分泌することを新規に見出した。
【００１９】更に、本発明者らは、各種の検討を行い、人工的に変異処理して得た変異納豆菌からアデニン要求性変異株を誘導し、つぎにこの変異株をさらに変異処理した重複変異納豆菌からプリン系アナログの１つである８−Ａｚａｇｕａｎｉｎｅ含有培地で培養して得られた耐性株について、核酸分泌能を検討したところ、納豆中にイノシンとイノシン酸が分泌される現象を始めて見出した。
【００２０】すなわち本発明者らは、選択培地としてＬ−プロリン、Ｌ−アルギニン、各種芳香族アミノ酸などのアミノ酸アナログ含有培地やプリン系アナログ含有培地などを使用してこれらのアミノ酸高分泌性の納豆菌およびイノシン及びイノシン酸高分泌性の納豆菌の新規育種に成功し、次にこのような育種納豆菌を使用して通常の納豆製造法により納豆を製造することにより、Ｌ−プロリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、イノシン及びイノシン酸などを多く含む各種の納豆の製造が可能であることを確認して本発明を完成するに至った。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】本発明で使用する納豆菌の親株としては、自然界からの分離株、工業的に使用されている菌株、或いは栄養要求性や薬剤耐性を付与した菌株などを用いることが出来る。【００２２】本発明で用いられる納豆菌の変異方法はいかなる変異方法でもよい。即ち、自然突然変異、紫外線照射やエックス線照射などの物理的変異、エチルメチルスルホン酸やＮ−メチルーＮ−ニトローＮ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの化学的変異、さらには組換ＤＮＡ法などを用いることができる。【００２３】本発明では、目的とする育種納豆菌の選択培地に特徴を有するものである。Ｌ−プロリンを分泌する納豆菌を取得するには、選択培地にＬ−プロリンのアナログを添加することが望ましい。Ｌ−プロリンのアナログとしては、３，４−Ｄｅｈｙｄｒｏｐｒｏｌｉｎｅ，Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｒｉｎｅ，Ａｚｅｔｉｄｉｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄなどを用いることができる。Ｌ−プロリンのアナログの添加濃度は変異操作を行う納豆菌のアナログ耐性度を調べて実施する必要があるが、５０〜５０００μｇ／ｍｌ程度の濃度で選択培地に添加するとよい。【００２４】また、Ｌ−アルギニンを分泌する納豆菌を取得するには、選択培地にＬ−アルギニンのアナログを添加することが望ましい。Ｌ−アルギニンの分解能を有する納豆菌のときは、予めＬ−アルギニン分解能を変異により欠失するとよい。Ｌ−アルギニンのアナログとしては、Ｃａｎａｖａｎｉｎｅ，Ｈｏｍｏａｒｇｉｎｉｎｅ，などを用いることができる。Ｌ−アルギニンのアナログの添加濃度は、使用する納豆菌のアナログ耐性度を検討して決める必要があるが、１００〜８０００μｇ／ｍｌ程度の濃度で選択培地に添加するとよい。【００２５】また、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファンなどを分泌する納豆菌を取得するには、選択培地に芳香族アミノ酸のアナログを添加することが望ましい。そのアナログとしては、Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅｓ，Ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅｓ，Ｆｌｕｏｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅｓ，５−Ｍｅｔｈｙｌｔｒｙｐｔｏｐｈａｎなどを用いることが出来る。これら芳香族アミノ酸のアナログの添加濃度は、使用する納豆菌のアナログ耐性度を検討して決める必要があるが、２００〜１００００μｇ／ｍｌ程度の濃度で選択培地に添加するとよい。【００２６】更に、イノシンとイノシン酸を分泌する納豆菌を取得するには、選択培地にプリンアナログを添加することが望ましい。プリンアナログとしては、８−Ａｚａｇｕａｎｉｎｅ，８−Ａｚａｘａｎｔｈｉｎｅなどを用いることができる。プリンアナログの添加濃度は、変異操作を行う納豆菌の耐性度にもよるが、１００〜８０００μｇ／ｍｌ程度の濃度で選択培地に添加するとよい。【００２７】改良をしたい納豆菌を変異処理し、次に３，４−Ｄｅｈｙｄｒｏｐｒｏｌｉｎｅ，Ｃａｎａｖａｎｉｎｅ，Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ，８−Ａｚａｇｕａｎｉｎｅなどのアナログを添加した固体の選択培地に播菌し、３７℃、５日間培養し、形成したコロニーを純化する。この純化した納豆菌を使用して納豆をつくり、各々、Ｌ−プロリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−チロシン及び／又はＬ−フェニ��アラニン、イノシン及びイノシン酸を多く含有するようになった納豆菌が取得選択できる。【００２８】以上のように納豆菌を育種開発した、各々、Ｌ−プロリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、イノシンおよびイノシン酸の高分泌株を使用して実際の納豆生産に利用するには、従来よりの納豆製造設備の使用がそのまま可能であり、新たな設備投資の必要はない。このようにして、育種開発した納豆菌を用いることにより、各々、Ｌ−プロリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、イノシンおよびイノシン酸が高濃度で含有された栄養豊富な新規納豆の生産が可能である。【００２９】本特許の記載技術を用いれば、大豆や各種穀物類を原料として、バチルス属各種微生物の同様な育種株を使用することにより、Ｌ−プロリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、イノシンおよびイノシン酸の含有量が向上した発酵食品、飼料などの製造が可能であり、本特許の範囲に含まれる。【００３０】以下に本発明の実施例について記述する。
【実施例１】
【００３１】本実施例において使用した培地は、ＬＢ培地、改変Ｓｐｉｚｉｚｅｎ最小培地である。【００３２】ＬＢ培地組成は、トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、食塩５ｇ、水１Ｌ、ｐＨ６．８である。固体培地には寒天２％を添加した。【００３３】改変Ｓｐｉｚｉｚｅｎ最小培地組成は、グルコース５ｇ、クエン酸Ｎａ１ｇ、硫安２ｇ、燐酸１カリウム６ｇ、燐酸２カリウム１４ｇ、硫酸マグネシウム７水塩０．２ｇ、ビオチン０．１ｍｇ、水１Ｌ、ｐＨ６．８である。固体培地には寒天２％を添加した。【００３４】市販納豆から分離した納豆菌ＮＡ−１株をＬＢ培地で１晩培養し、滅菌生理食塩水で洗浄後、同生理食塩水中で通常の方法によりＮＴＧ変異処理を行った。ＮＴＧ変異処理後の洗浄菌液を３，４−Ｄｅｈｙｄｒｏｐｒｏｌｉｎｅ１０００μｇ／ｍｌ含有の改変Ｓｐｉｚｉｚｅｎ最小培地に播いた。３７℃で１週間培養し、出現したコロニーをＬＢ培地で純化し、次に３，４−Ｄｅｈｙｄｒｏｐｒｏｌｉｎｅ１０００μｇ／ｍｌ含有の改変Ｓｐｉｚｉｚｅｎ最小培地にてアナログ耐性を確認した。【００３５】アナログ耐性を確認した３，４−Ｄｅｈｙｄｒｏｐｒｏｌｉｎｅ耐性株であるＮｏ．１株およびその親株ＮＡ−１株を用いて、納豆を作製した。大豆を浸漬後、水切りし、次に蒸煮した。蒸煮大豆１ｇあたり３０００個の胞子を各々植菌し、４５ｇずつＰＳＰトレーに入れ、蓋をして発酵に入れ、４０℃、高湿度下で醗酵を行った。【００３６】作製した２つの納豆について、納豆中の遊離Ｌ−プロリン含有量を定量した。その結果、親株ＮＡ−１株を使用した場合はＬ−プロリン含有量２５ｍｇ／納豆１００ｇ、３，４−Ｄｅｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ耐性株Ｎｏ．１株を使用した場合はＬ−プロリン含有量２９０ｍｇ／納豆１００ｇであり、３，４−Ｄｅｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ耐性株使用の納豆において、Ｌ−プロリン含有量の増大が認められた。（図１）
【実施例２】
【００３７】親株ＮＡ−１株からＬ−アルギニン非分解性株を通常の方法で育種し、次に実施例１に記載した同様な方法により、Ｃａｎａｖａｎｉｎｅ５０００μｇ／ｍｌに耐性を示す変異株Ｎｏ．２株を取得した。ＮＡ−１株及びＮｏ．２株を使用して、上記の方法により納豆を作製した。次に、作製した納豆中のＬ−アルギニン含有量を定量した結果、親株ＮＡ−１株を使用した場合は、Ｌ−アルギニン含有量２ｍｇ／納豆１００ｇであり、Ｃａｎａｖａｎｉｎｅ耐性株Ｎｏ．２株を使用した場合は、Ｌ−アルギニン含有量１６５ｍｇ／納豆１００ｇであった。
【実施例３】
【００３８】親株ＮＡ−１株から実施例１に記載した同様な方法により、ｐ−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ２０００μｇ／ｍｌ、５−ｍｅｔｈｙｌｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ３０００μｇ／ｍｌに耐性を示す変異株Ｎｏ．３株を取得した。ＮＡ−１株及びＮｏ．３株を使用して、上記の方法により納豆を作製した。次に、作製した納豆中の芳香族アミノ酸含有量を測定した結果、親株ＮＡ−１株を使用した場合は、Ｌ−チロシン２５ｍｇ／納豆１００ｇ、Ｌ−フェニルアラニン３０ｍｇ／納豆１００ｇ、Ｌ−トリプトファン１０ｍｇ／納豆１００ｇであった。一方、ｐ−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ耐性株Ｎｏ．３株を使用した場合は、Ｌ−チロシン１８０ｍｇ／納豆１００ｇ、Ｌ−フェニルアラニン１５０ｍｇ／納豆１００ｇ、Ｌ−トリプトファン６５ｍｇ／納豆１００ｇであった。【００３９】親株ＮＡ−１株から常法によりアデニン要求性変異株ＮＡ−１Ａを取得した。次に、ＮＡ−１Ａ株から実施例１に示した方法により、８−Ａｚａｇｕａｎｉｎｅ１５００μｇ／ｍｌに耐性を有する変異株Ｎｏ．４株を取得した。ＮＡ−１株及びＮｏ．４株を使用して、納豆を作製した。次に、作製した納豆中のイノシン、イノシン酸含有量を測定した結果、親株ＮＡ−１を使用した場合は、イノシンとイノシン酸は認められなかったが、８−Ａｚａｇｕａｎｉｎｅ耐性株Ｎｏ．４株を使用した場合は、イノシン５５ｍｇ／納豆１００ｇ、イノシン酸５０ｍｇ／納豆１００ｇであった。【００４０】上記の各実施例で取得した変異株Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．Ｎｏ．１株，Ｎｏ．２株，Ｎｏ．３株，Ｎｏ．４株については、各々ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０５８２、ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０５８３、ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０５８４、及びＦＥＲＭ  ＡＰ−２０５８５として、産業技術総合研究所に寄託されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の１例を示す図である。図の縦軸はＬ−プロリン含有量（ｍｇ／納豆１００ｇ）、横軸は納豆製造時の親株ＮＡ−１株と育種株Ｎｏ．１株を示す。
【図１】
2007075081.tif 000002