(57)【要約】【課題】炎症性疾患、自己免疫疾患又は骨吸収異常を治療する方法を提供すること。【解決手段】プレキシン-A1-DAP12相互作用を阻害する組成物の治療的有効量を患者に投与する工程を含む、炎症性疾患、自己免疫疾患又は骨吸収異常を治療する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プレキシン-A1-DAP12相互作用を阻害する組成物の治療的有効量を患者に投与する工程を含む、炎症性疾患、自己免疫疾患又は骨吸収異常を治療する方法。
【請求項２】
（1）プレキシン-A1タンパク質及びDAP12タンパク質を含む細胞を、仮定的調節化合物と接触させる工程、及び（2）プレキシン-A1とDAP12との相互作用を阻害する前記仮定的調節化合物の能力を判定する工程を含む、プレキシン-A1とDAP12活性との細胞内相互作用を阻害する化合物を同定する方法。
【請求項３】
（1）プレキシン-A1タンパク質及びTrem-2タンパク質を含む細胞を、仮定的調節化合物と接触させる工程、及び（2）プレキシン-A1とTrem-2との相互作用を阻害する前記仮定的調節化合物の能力を判定する工程を含む、プレキシン-A1とTrem-2活性との細胞内相互作用を阻害する化合物を同定する方法。
【請求項４】
（1）DAP12タンパク質及びTrem-2タンパク質を含む細胞を、仮定的調節化合物と接触させる工程、及び（2）DAP12とTrem-2との相互作用を阻害する前記仮定的調節化合物の能力を判定する工程を含む、DAP12とTrem-2活性との細胞内相互作用を阻害する化合物を同定する方法。
【請求項５】
プレキシン-A1、Trem-2若しくは DAP12又はそれらのフラグメントと効果的に結合する抗体又は抗体結合部位であって、前記プレキシン-A1、Trem-2若しくは DAP12と結合する抗体又は抗体結合部位が、プレキシン-A1とDAP12との結合、プレキシン-A1とTrem-2との結合、又はTrem-2とDAP12との結合を阻害する、前記抗体又は抗体結合部位。
【請求項６】
治療的に有効な量のプレキシン-A1タンパク質、Trem-2タンパク質若しくはDAP12タンパク質又はそれらのフラグメントを含む、炎症性疾患、自己免疫疾患又は骨吸収異常を治療するバイオ薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プレキシン-A1-DAP12相互作用、プレキシン-A1-Trem-2相互作用又はDAP12-Trem-2相互作用を阻害することによって、炎症性疾患、自己免疫疾患又は骨吸収異常を治療する組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セマフォリン（semaphorin）及びそれらのレセプターは、軸索誘導、器官発生、脈管形成/血管形成、腫瘍形成、及び免疫応答の調節において多用な役割を果たす1-11。セマフォリンの主要なレセプターはプレキシンファミリーのメンバーである2,12-14。特に、プレキシン-A1は、リガンド結合ニューロピリンとともに、可溶性クラスIIIセマフォリンのために反発性軸索誘導シグナルをトランスデュースし15、一方、プレキシン-A1はニューロピリン非依存性トランスメンブレンセマフォリンSema6Dのためのレセプターとしてニワトリの心臓の発生で多数の役割を演じる16。さらにまた、プレキシン-A1は免疫系の樹状細胞（DC）機能に関係が有る17。しかしながら、プレキシン-A1のin vivoでの役割並びに免疫応答及び骨のホメオスタシスにおけるその重要な役割は本発明以前には明らかではなかった。
【発明の開示】
【０００３】
発明の要旨
したがって、本発明の目的は、炎症性疾患、自己免疫疾患又は骨吸収異常を、プレキシン-A1-DAP12相互作用を阻害する組成物を患者に投与することによって治療する方法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、炎症性疾患、自己免疫疾患又は骨吸収異常を、プレキシン-A1-Trem-2相互作用を阻害する組成物を患者に投与することによって治療する方法を提供することである。
本発明のまた別の目的は、炎症性疾患、自己免疫疾患又は骨吸収異常を、DAP12-Trem-2相互作用を阻害する組成物を患者に投与することによって治療する方法を提供することである。
本発明のまた別の目的は、プレキシン-A1とDAP12活性との細胞内相互作用を制御する化合物を同定する方法を提供することである。前記方法は以下の工程を含む：（1）プレキシン-A1タンパク質及びDAP12タンパク質を含む細胞を、仮定的調節(putative regulatory)化合物と接触させる工程；及びプレキシン-A1とDAP12との相互作用を阻害する前記仮定的調節化合物の能力を判定する工程。
さらにまた別の本発明の目的は、プレキシン-A1とDAP12活性との細胞内相互作用を制御する組成物を提供することであり、ここで前記組成物は、炎症性疾患、自己免疫疾患又は骨吸収異常の処置で治療的に有用である。
【０００４】
発明の詳細な説明
第一の一般的な実施態様では、炎症性疾患、自己免疫疾患、又は骨吸収異常を、プレキシン-A1-DAP12相互作用を阻害する組成物を患者に投与することによって治療する方法が提供される。
本発明者らは、プレキシン-A1欠損（プレキシン-A1-/-）マウスを作製し、免疫応答だけでなく骨のホメオスタシスにおいても重要なその役割を特定した。さらにまた、我々は、プレキシン-A1は、ミエロイド細胞-2（Trem-2）で発現されるトリガーレセプターと結合して、セマフォリン-シグナリングをイムノレセプターチロシン系活性化モチーフ(ITAM)保持-アダプタータンパク質、DAP12に連結させることを示した。したがって、これらの発見は、プレキシン-A1の予期せぬ役割を明らかにし、セマフォリンの多面発現性機能を発揮させる新規なシグナリングメカニズムを提示する。
プレキシン-A1のin vivoにおける役割の理解を容易にするために、本発明者らは、遺伝子ターゲッティングによる相同組換えによってプレキシン-A1遺伝子に欠損を有するマウスを作製し（図1参照）、ノザンブロット法及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）の両技術によってプレキシン-A1欠損の成功を確認した（図1参照）。マウスは、ヘテロ接合変異体の交雑から予想されるメンデルの法則の比率で出生し、得られたプレキシン-A1-/-マウスは生殖能力を有していた。外見上の異常は、胚（E11.5）並びに4週齢マウスの脳、腎、肺、心、肝及び脾（プレキシン-A1転写物が発現されている全ての組織）の巨視的全体検査又は組織学的検査では観察されなかった（図2及び3参照）。これらの観察は、上記組織でプレキシンファミリーメンバー間には胚発生時に機能的重複性が存在することを強く示唆している。しかしながら、変異マウスは、免疫系における機能不全とともに骨格組織における形態学的異常を有していた。したがって、我々は、下記に記載するように免疫及び骨格組織に焦点を当てながら、プレキシン-A1の生物学的機能をさらに究明した。
【０００５】
リンパ球の発達はプレキシン-A1-/-マウスで正常であるように見えた。野生型とプレキシン-A1-/-マウスとの間で、脾臓及び胸腺の細胞表面表現型マーカーの発現では、T細胞、B細胞、マクロファージ及び樹状細胞（DC）の数並びに比率における相違は全く認められなかった。プレキシン-A1はDCで強く発現され17、我々は、DC機能におけるプレキシン-A1欠損の影響を調べた。プレキシン-A1-/-マウスでFITCを皮膚に塗布した後のDCによるFITC-デキストラン取り込み及びリンパ節ドレーン中の蛍光DCの出現は、野生型同腹子で認められたものと類似していた（図16a及び16b）。さらにまた、野生型とプレキシン-A1-/-DCとの間で、共働刺激分子（CD40、CD80、CD86及びMHCクラスIIを含む）の発現レベルに顕著な相違は認められなかった（図16c）。しかしながら、プレキシン-A1-/-DCは、野生型DCと比較してアロジェニックT細胞をほとんど刺激しなかった（図17a）。対照的に、プレキシン-A1-/-マウス又は野生型同腹子から得たCD4+ T細胞をアロジェニックな野生型DCとともに培養したとき、細胞分裂における相違は観察されず（図17b）、アロジェニックT細胞におけるDC-発現プレキシン-A1の重要な役割が示唆された。さらにまた、プレキシン-A1-/-DCのin vivoにおける抗原特異的T細胞刺激の能力もまた障害された（図17c）。これらの観察は、RNAi-ターゲッティングプレキシン-A1を用いたWongらの実験17と一致している。彼らは、DCにおけるプレキシン-A1のRNAi仲介ノックダウンは、T細胞刺激の実質的な低下を生じることを示した。したがって、DCによるプレキシン-A1の発現は正常なT細胞刺激に必須であるように思われる。我々は、次に免疫したプレキシン-A1-/-マウスにおける抗原特異的T細胞の生成を調べた。CD4+ T細胞は、免疫した野生型又はプレキシン-A1-/-マウスのリンパ節ドレーンから調製し、抗原特異的T細胞応答をin vitroで調べた。
【０００６】
CD4+ T細胞による分裂応答及びサイトカイン産生はプレキシン-A1-/-マウスで顕著に低下し（図17d）、抗原特異的T細胞の生成におけるプレキシン-A1の重要な役割を示した。対照的に、有糸分裂誘発刺激に対するB細胞及びT細胞のin vitro応答で野生型とプレキシン-A1-/-マウスとの間で相違はなく（図5及び6参照）、B細胞及びT細胞における低レベルのプレキシン-A1発現と一致する17（Takegahara et al., 未発表データ）
プレキシン-A1-/-マウスから骨髄細胞を単離する過程で、我々は、野生型の同腹子と比較してプレキシン-A1-/-動物では長骨の細胞充実性の低下（25±5%）を認めた。対照的に、類リンパ器官の細胞数及びリンパ球集団は、記載したように変異マウスとコントロールマウスとで類似していた（図4参照）。したがって、このプレキシン-A1の役割並びに骨のホメオスタシス及び骨吸収異常におけるその機能について調べた。
高解析マイクロコンピュータ支援断層撮影技術を用いる三次元ミクロ構造分析は、予期せぬことながら、プレキシン-A1欠損性は骨質量の増加をもたらすことを明らかにし（図18a及び18b）、このことは、骨の形態計測分析を用いて確認された（図18c）。プレキシン-A1-/-長骨の切片では野生型の骨と比較して小柱質量が増加し（図18）、プレキシン-A1-/-マウスにおける大理石骨病の発生を示していた。プレキシン-A1-/-マウスの骨質量の増加は、骨芽細胞機能の増加、破骨細胞機能の低下又はその両方の帰結でありえる。プレキシン-A1-/-マウスで観察された大理石骨病の細胞メカニズムを説明するために、我々は、骨芽細胞及び破骨細胞の発達及び機能を調べた。プレキシン-A1-/-骨芽細胞は、野生型骨芽細胞と同程度に野生型破骨細胞の形成を促進し（図18e）、頭蓋冠から単離したプレキシン-A1-/-骨芽細胞は、破骨細胞誘発因子（M-CSF及びNF-κΒリガンドの可溶性レセプターアクチベータ（RANKL）を含む）の分泌及びin vitroカルシウム沈着で明瞭な機能的相違を示さなかった（データは示されていない）。野生型とプレキシン-A1-/-マウスとの間で骨芽細胞マーカーレベルに相違はなかった（図7参照）。さらにまた、骨の形態計測分析によって、骨芽細胞表面対骨表面比は正常であることが示された（図18f）。カルセイン標識もまたin vivoにおける正常な骨芽細胞活性を示した（図7参照）。
【０００７】
総合すれば、プレキシン-A1の低下は骨芽細胞の発達及び機能に明瞭な影響をもたなかった。対照的に、TRAP染色を用いる骨の組織形態計測分析によって、プレキシン-A1-/-マウスでは破骨細胞数が顕著に低下し、破骨細胞表面対骨表面比が低下することが示された（図19a）。さらにまた、プレキシン-A1-/-マウスは、デオキシピリジノリン（Dpyd）及びI型コラーゲンフラグメントの減少を示した（図19b）。前記は両者とも破骨細胞活性及び骨吸収のマーカーであり、破骨細胞によるin vivoでの骨の代謝回転の低下を示している。このことと一致して、骨芽細胞のin vivo誘発18,19がプレキシン-A1の非存在下で低下した（図19c）。TRAP陽性細胞の数は個々の変異マウスで変動したが、いくつかの変異マウス（〜40%）はin vitroで正常な数のTRAP陽性細胞数を示した。全てのプレキシン-A1メンバーの発現がin vitroで誘発された破骨細胞で認められたが、プレキシン-A1は新鮮な単離破骨細胞では顕著に発現されていた（図19d）。この変動性は、他のプレキシン-A1ファミリーメンバーを巻き込む代償性メカニズムのためであるかもしれない。
【０００８】
プレキシン-A1は、免疫応答の発生及び骨格のホメオスタシスに明らかに必要とされるが、これらの作用に必要なリガンドは不明であった。神経系では、プレキシン-A1はニューロピリンと結合し、クラスIIIセマフォリン（例えばSema3A）のレセプター成分のトランスダクションのためのシグナルとして機能する2,15,20。しかしながら、組換えSema3Aは、IL-12の産生又はDCでの共働刺激分子の発現を促進せず、破骨細胞形成をin vitroで増強させもしなかった（データは示されていない）。逆に、我々は、以前にニワトリの心臓発生時のSema6Dのレセプターとしてプレキシン-A1を同定した16。免疫系ではSema6DはT細胞で強く発現され（図8参照）、T細胞-DC細胞の細胞接触におけるSema6D-プレキシン-A1相互作用の役割が示唆される。したがって我々は、DC機能に対する可溶性組換えSema6Dの作用を調べた。DCと可溶性組換えSema6DとのインキュベーションはIL-12産生及びMHCクラスII発現のアップレギュレーションを誘発したが（図20a−20c）、そのような作用はコントロールの組換えSema4Aタンパク質では観察されなかった（図9参照）。さらにまた、Sema6Dは破骨細胞で発現され（図8参照）、さらに可溶性組換えSema6Dはin vitroで破骨細胞の実質的な分化を促進した（図20d）。総合すれば、これらの結果は、プレキシン-A1は、ニワトリの心臓発生時と同様に、免疫組織及び骨格組織の両方でSema6Dの機能的レセプターであることを強く示唆している。この仮説に一致して、プレキシン-A1-/-DCをSema6Dとインキュベートしたとき、Sema6D結合、IL-12産生及びMHCクラスIIアップレギュレーションは全て顕著に低下した（図20a−20c）。しかしながら、残留するSema6D結合がin vitroで誘発されたプレキシン-A1-/-の破骨細胞の前駆細胞で観察され（図10参照）、それによってSema6Dは、プレキシン-A1の非存在下でなお破骨細胞のin vitro誘発を促進した（データは示されていない）。以前に記載されたように16、Sema6Dは他のプレキシン-Aサブファミリーメンバー（例えばプレキシン-A4）と弱く結合することができる。プレキシン-A1-/-マウスのDCと破骨細胞との間のSema6Dに対する応答性の相違は、in vitroで誘発された破骨細胞における他のプレキシン-Aサブファミリーメンバーの発現のためである可能性は高い（図19d、さらに図11参照）。
【０００９】
共通のメカニズムが、免疫系及び骨格組織におけるプレキシン-A1機能の根底に存在するかもしれない。また別には、これらの機能は無関係であるかもしれない。プレキシンは種々の補助レセプターを利用して、多様な生物学的作用を示すことは注目に値する2,16,21。実際、プレキシン-A1は、ニワトリの心臓の形態発生時に、レセプター型チロシンキナーゼ（例えば血管内皮増殖因子レセプター2（VEGFR2）又はオフ-トラック）と領域特異的態様でレセプター複合体を形成する。しかしながら、VEGFR2及びオフ-トラック発現はDCでは検出されなかった（データは示されていない）。したがって、プレキシン-A1はさらに別の新規な補助レセプターと結合して、ここに記載したような機能を示す可能性がある。
プレキシン-A1が免疫系及び骨のホメオスタシスの両方に影響を与えるメカニズムをより理解しやすくするために、我々は、DC及び破骨細胞の両方でプレキシン-A1との結合について仮定的機能を持ついくつかの候補分子をスクリーニングした。そのようなアプローチを用いて、我々は、Trem-2がプレキシン-A1と結合することを見出した（図21a及び図12）。
したがって第二の一般的な実施態様では、本発明はまた、プレキシン-A1-Trem-2相互作用を阻害する組成物を患者に投与することによって炎症性疾患、自己免疫疾患又は骨吸収異常を治療する方法を提供する。
【００１０】
Trem-2は、DAP12（ITAMを保持する活性化アダプタータンパク質）とそのトランスメンブレンドメイン内の陽性荷電アミノ酸を介してレセプター複合体を形成する22,23。興味深いことに、Trem-2及びDAP12は、破骨細胞の発達を調節することによって免疫応答の発達だけでなく骨のホメオスタシスにおいても重要な役割を果たす24,25。プレキシン-A1、Trem-2及びDAP12をトランスフェクトされたCOS7細胞で、我々は、Trem-2の存在下でプレキシン-A1とDAP12との結合を観察し（図21b及び21c）、前記はまたこれらのタンパク質を安定的に発現する細胞及びDCで確認された（図21d及び21e）。プレキシン-A1及びTrem-2の結合のための構造的要件を決定するために、我々は、Trem-2コード構築物をプレキシン-A1の一連のN-末端切端変異体とともに同時トランスフェクトした。図4fに示したように、プレキシン-A1とTrem-2との結合はなお、プレキシン-A1のSema及びプレキシン/セマフォリン/インテグリン（PSI）ドメインの非存在下でさえ検出されたが、ただし前記結合は顕著に低下した。しかしながら、前記結合はプレキシン-A1のTIGドメインの欠失によって完全に失われた。したがって、プレキシン-A1-TIGドメインはプレキシン-A1とTrem-2の相互作用のために最小限要求されるように思われる。
【００１１】
本発明のさらに別の実施態様では、DAP12-Trem-2相互作用を阻害する組成物を患者に投与することによって炎症性疾患、自己免疫疾患又は骨吸収異常を治療する方法が提供される。
セマフォリン-仲介シグナルにおけるTrem-2及びDAP12の役割を決定するために、我々は“機能低下”実験を実施した。Trem-2に対抗するRNAiはDCに対するSema6Dの刺激性活性を低下させた（図22b）。同様に、DAP12-/-DCはSema6Dに対して顕著に低下した応答を示した（図22c）。RAW264.7細胞がプレキシン-A1を発現しているとき、Trem-2及びDAP12は可溶性組換えSema6Dタンパク質で刺激され、DAP12のチロシンリン酸化が観察された（図22d）。総合すれば、これらの結果は、DAP12及びTrem-2はSema6Dのための機能的レセプター成分であることを強く示唆している。
プレキシン-A1は、胚から成人の広範囲の組織で発現され（図3参照）、軸索誘導及び発生時の心臓形成におけるプレキシン-A1の役割が提唱されてきた15,16。しかしながら、我々の実験で、プレキシン-A1-/-マウスの発生的又は機能的欠損は、主として免疫組織及び骨格組織に限定されることが明らかになった。我々が神経系及び心脈管系における欠損を検出できなかったのは、他のプレキシンメンバーによる代償メカニズムのためかもしれない。さらにまた、変異マウスは、我々が実施した全体的な巨視的又は組織学的分析で見落とされた微妙な欠陥をもっていた可能性もある。変異マウスについてのさらに詳細な実験がこれらの疑問に答えるために必要である。プレキシン-A1-/-DCに対する共働刺激分子の抗原取り込み又は発現レベルは野生型DCに対するものと類似しており（図16a−16c）、プレキシン-A1はDCの発達に必要とされないことが示された。しかしながら、DCのアロジェニック及び抗原特異的T細胞の刺激活性はプレキシン-A1-/-マウスでは障害されており（図17a及び17c）、DCにおけるプレキシン-A1の欠乏は、T細胞を刺激するDCの活性の障害に起因することが示唆される。このような状況では、プレキシン-A1-/-DCの刺激活性の低下は、プレキシン-A1-/-マウスにおける不完全なT細胞プライミングによると説明できるかもしれない。重要なことには、Sema6DはT細胞で大量に発現されるが、Tヘルパー細胞（Th）分化時にはダウンレギュレートされ（図8参照）、T細胞-DC接触を介する比較的初期の免疫応答でのSema6D-プレキシン-A1相互作用の必要性が示唆される。しかしながら、現時点では、我々は、免疫応答のエフェクター相におけるSema6D-プレキシン-A1相互作用の中心的関与の可能性を排除することができない。
【００１２】
Sema6Dの発現は、in vitro誘発破骨細胞だけでなく、新鮮な単離破骨細胞でも検出された（図8参照）。しかしながら、Sema6Dはトランスメンブレン型セマフォリンであるが、可溶型のSema6Dが細胞表面から切り離されることが示された16。したがって、Sema6Dはオートクリン的態様で破骨細胞形成において機能するように思われる。これに関しては、Sema6Dは破骨細胞形成時にはオートクリン的及びパラクリン的両態様で機能することができる可能性がある。しかしながら、Sema6Dの作用がオートクリン的刺激とパラクリン刺激とに応じて異なるか否かは不明である。更なる実験が、トランスメンブレン型Sema6Dの生物学的活性が可溶性Sema6Dのそれと機能的に異なるか否かを知るために要求されるであろう。
本発明のある実施態様はプレキシン-A1とDAP12活性との細胞内での相互作用を制御する化合物を同定する方法に関する。前記方法は以下の工程を含む：（1）プレキシン-A1タンパク質及びDAP12タンパク質を含む細胞を、仮定的調節化合物と接触させる工程、及び（2）プレキシン-A1とDAP12との相互作用を阻害する前記仮定的調節化合物の能力を判定する工程。前記判定工程は好ましくは、i）この部分から下記に記載されているようにサイトカインの産生を決定するか、又はii）以前の記載24,25及び当業界で公知の方法にしたがって実施されるin vitro破骨細胞形成のどちらかを必要とする。
【００１３】
本発明のまた別の実施態様はプレキシン-A1とTrem-2活性との細胞内での相互作用を制御する化合物を同定する方法に関する。前記方法は以下の工程を含む：（1）プレキシン-A1タンパク質及びTrem-2タンパク質を含む細胞を、仮定的調節化合物と接触させる工程、及び（2）プレキシン-A1とTrem-2との相互作用を阻害する前記仮定的調節化合物の能力を判定する工程。前記判定工程は好ましくは、i）この部分から下記に記載されているようにサイトカインの産生を決定するか、又はii）以前の記載24,25及び当業界で公知の方法にしたがって実施されるin vitro破骨細胞形成のどちらかを必要とする。
本発明のさらに別の実施態様はDAP12とTrem-2活性との細胞内での相互作用を制御する化合物を同定する方法に関する。前記方法は以下の工程を含む：（1）DAP12タンパク質及びTrem-2タンパク質を含む細胞を、仮定的調節化合物と接触させる工程、及び（2）DAP12とTrem-2との相互作用を阻害する前記仮定的調節化合物の能力を判定する工程。前記判定工程は好ましくは、i）この部分から下記に記載されているようにサイトカインの産生を決定するか、又はii）以前の記載24,25及び当業界で公知の方法にしたがって実施されるin vitro破骨細胞形成のどちらかを必要とする。
【００１４】
“調節する”という用語は、分子の活性及び/又は生物学的機能を制御すること、例えばそのような活性若しくは機能を強化又は低下させることを指す。
“患者”という用語はヒト及び非ヒト哺乳動物を含む。
“治療する”又は“治療”という用語は患者の病的状態の処置を意味し、以下を含む：
（i）特にそのような患者が遺伝的に又は他の理由で前記病的状態への傾向を有するが、未だ前記病的状態であると診断されていない場合に、前記病的状態が患者で発生するのを予防する；
（ii）前記病的状態を患者で抑制するか又は緩和する、すなわちその進行を停止させるか又は遅らせる；又は
（iii）患者の前記病的状態を取り除く、すなわち前記病的状態の退行又は治癒をもたらす。
【００１５】
本発明のまた別の実施態様は、プレキシン-A1、Trem-2若しくはDAP12又はそれらのフラグメントと結合する抗体又は抗体の結合部位に関する。本発明の実施態様はさらにポリクローナル及びモノクローナル抗体を含む。本発明の好ましい実施態様はモノクローナル抗体、例えば抗プレキシン-A1モノクローナル抗体を含む。プレキシン-A1、Trem-2又はDAP12と結合する、上記の抗体又は抗体の結合部位は、プレキシン-A1とDAP12又はTrem-2との結合、又はTrem-2のDAP12との結合を阻害する。
本発明のさらに別の実施態様は、プレキシン-A1タンパク質、Trem-2タンパク質若しくはDAP12タンパク質又はそれらのフラグメントを含むバイオ薬剤に関する。前記バイオ薬剤は、炎症性疾患、自己免疫疾患又は骨吸収異常の治療に有用である。
本明細書で用いられる“組成物”という用語は、仮定的化合物、又はプレキシン-A1、Trem-2若しくはDAP12又はそれらのフラグメント、プレキシン-A1、Trem-2若しくはDAP12又はそれらのフラグメントと結合する抗体又は抗体の結合部位から選択される実質的に純粋なタンパク質、プレキシン-A1、Trem-2若しくはDAP12又はそれらのフラグメントをコードする発現ベクター、プレキシン-A1、Trem-2若しくはDAP12又はそれらのフラグメントを含む融合タンパク質を含む。抗体の結合部位に関する実施態様では、前記抗体の結合部位は以下のようでありえる：プレキシン-A1、Trem-2又はDAP12から成る群から選択される成熟タンパク質と特異的に免疫反応する；精製された、又は組換えにより製造されたヒト又はマウスのプレキシン-A1、Trem-2又はDAP12に対して作製される；モノクローナル抗体、Fab又はF(ab)2の状態である；変性抗原と免疫反応する；又は標識抗体の状態である。ある種の実施態様では、前記抗体結合部位は生物学的サンプルで以下の方法によって検出される：プレキシン-A1、Trem-2又はDAP12に対して親和性を有する結合物質を前記生物学的サンプルと接触させ；前記結合物質を前記生物学的サンプルとインキュベートして、結合物質：プレキシン-A1、Trem-2又はDAP12タンパク質複合体を形成し；さらに前記複合体を検出する。好ましい実施態様では、前記生物学的サンプルはヒトであり、前記結合物質は抗体である。
【００１６】
本明細書で用いられる仮定的化合物には、例えば理論的薬剤デザインによる生成物、天然の生成物及び部分的に特定されたシグナルトランスダクション調節特性を有する化合物が含まれる。仮定的化合物はタンパク質系化合物でも、炭水化合物系化合物でも、脂質系化合物でも、核酸系化合物でも、天然有機化合物でも、合成により誘導された有機化合物でも、抗イディオタイプ抗体でも、或いは触媒性抗体又はそれらのフラグメントでもよい。仮定的調節化合物は、例えば天然化合物又は合成化合物のライブラリー、特に化合物ライブラリー又は順列組合せライブラリー（すなわち配列又はサイズが異なるが同じ構築ブロックを有する化合物のライブラリー、例えば米国特許5,010,175号及び5,266,684号（Rutter and Santi）（前記文献は参照により本明細書に含まれる）を参照されたい）から入手するか、又は論理的薬剤デザインによって入手することができる。
論理的薬剤デザインの方法では、化合物、例えばシグナルトランスダクション分子の三次元構造を、例えば核磁気共鳴（NMR）又はX-線結晶学によって分析することができる。続いてこの三次元構造を用いて、潜在能力を有する化合物、例えば仮定的調節化合物の構造を、例えばコンピュータモデリングによって予測することができる。続いて前記予測した化合物の構造を、例えば化学的合成、組換えDNA技術又は天然の供給源（例えば植物、動物、細菌及び菌類）からミメトープを単離することによって製造することができる。潜在的調節化合物はまた、例えばPCT公告WO91/19813；WO92/02536及びWO93/03172（前記文献は参照により本明細書に含まれる）に開示されたSELEX技術を用いて同定することができる。
【００１７】
特に、天然に存在する細胞内シグナルトランスダクション分子は、その構造及び機能の分析を基にして改変し、適切な調節化合物を生成することができる。例えば、プレキシン-A1-TIGドメインを調節することができる化合物は、このドメインのアミノ酸残基と類似の構造を有する化合物を含むことができる。そのような化合物はペプチド、ポリペプチド又は小有機分子を含むことができる。
仮定的調節化合物はまた、プレキシン-A1と干渉するようにデザインした分子を含むことができる。例えば、プレキシン-A1の変異体を作製し、前記タンパク質とTrem-2或いはDAP12とのカップリングに干渉させることができる。仮定的調節化合物は、プレキシン-A1、Trem-2又はDAP12のアゴニスト又はアンタゴニストを含むことができる。そのようなアゴニスト及びアンタゴニストは、これらのタンパク質の天然に存在するリガンドの構造を基にして選択することができる。
モノクローナル抗体を製造する技術は周知である。一般的には、不朽化細胞株（典型的にはミエローマ細胞）を、与えられた抗原（例えばプレキシン-A1）を発現する完全細胞で免疫した哺乳動物から得たリンパ球（典型的には脾臓細胞）と融合させ、得られたハイブリドーマ細胞の培養上清を前記抗原に対する抗体についてスクリーニングする。例えば、一般的には以下の文献を参照されたい：Kohler et al., 1975, Nature 265:295-497, “Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity”。
【００１８】
免疫は標準的方法を用いて実施することができる。ユニットドース及び免疫スケジュールは、免疫される哺乳動物の種、その免疫状況、哺乳動物の体重などにより左右される。典型的には、免疫された哺乳動物を採血し、各血液サンプル由来の血清を適切なスクリーニングアッセイを用いて個々の抗体についてアッセイする。例えば、抗インテグリン抗体は、インテグリン発現細胞由来の125I-標識細胞溶解物の免疫沈澱によって同定することができる。
抗体（例えば抗プレキシン-A1抗体を含む）はまた、フローサイトメトリーによって、例えばプレキシン-A1分子を認識すると考えられる抗体とともにインキュベートして抗体発現細胞の蛍光染色を測定することによって同定することができる。ハイブリドーマ細胞の製造に用いられるリンパ球は、その血清が、前記のようなスクリーニングアッセイを用いて抗プレキシン-A1抗体の存在について陽性であることが既に検査された免疫哺乳動物から単離される。
典型的には、不朽化細胞株（例えばミエローマ細胞株）は前記リンパ球と同じ哺乳動物種に由来する。好ましくは、不朽化細胞株はマウスミエローマ細胞株で、前記は、ヒポキサンチン、アルニノプテリン及びチミジン含有培養液（“HAT培地”）に感受性を有する。典型的には、分子量1500のポリエチレングリコール（“PEG1500”）を用いて、HAT-感受性マウスミエローマ細胞をマウス脾臓細胞と融合させる。融合から得られたハイブリドーマ細胞を続いてHAT培地を用いて選別する。HAT培地は非融合ミエローマ細胞及び融合非産生ミエローマ細胞を殺す（脾臓細胞は形質転換されていないので、非融合脾臓細胞は数日後に死ぬ）。所望の抗体を製造するハイブリドーマは、ハイブリドーマの培養上清をスクリーニングすることによって検出される。例えば、抗プレキシン-A1抗体を産生するように調製したハイブリドーマは、組換えプレキシン-A1発現細胞株と結合する能力を有する分泌抗体について、ハイブリドーマ培養上清を検査することによってスクリーニングすることができる。
【００１９】
本発明の範囲内に包含される、完全な免疫グロブリンである抗体ホモローグ（抗プレキシン-A1抗体ホモローグを含む）を製造するために、前記のようなスクリーニングアッセイで陽性と判定されたハイブリドーマ細胞を、前記細胞がモノクローナル抗体を培養液中に分泌することができるような条件下及び十分な時間、栄養培養液中で培養した。組織培養技術及びハイブリドーマ細胞に適した培養液は周知である。条件付けされたハイブリドーマ培養上清を採集し、抗プレキシン-A1抗体を周知の方法によって場合によってさらに精製することができる。
また別には、所望の抗体は非免疫マウスの腹腔にハイブリドーマ細胞を注射することによって製造することができる。前記ハイブリドーマ細胞は腹腔で分裂し、抗体を分泌し、前記抗体は腹水として蓄積される。腹腔から腹水を注射筒で抜き取ることによって抗体を採集することができる。
完全にヒトのモノクローナル抗体ホモローグ（例えば抗プレキシン-A1）は、本発明の方法で抗原を遮断することができるまた別の好ましい結合物質である。前記は、Boernerら（J. Immunol. 1991, 147:86-95 “Production of Antigen-specific Human Monoclonal Antibodies from In Vitro-Primed Human Splenocytes”）が記載したように、in vitroプライミングによってヒトの脾臓細胞によりその完全な形態で製造することができる。
【００２０】
また別に前記は、Perssonら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, 88:2432-2436, “Generation of diverse high-affinity human monoclonal anibodies by repertoire cloning”）及びHuang and Stollar（J. Immunol. Methods 1991, 141:227-236, “Construction of representative immunoglobulin variable region CDNA libraries from human peripheral blood lymphocytes without in vitro stimulation”）が記載したように、レパートリークローニングによって製造することもできる。米国特許5,798,230号（”Process for the preparation of human monoclonal antibodies and their use”, 1998年8月25日出願）は、ヒトB細胞からヒトモノクローナル抗体の製造を開示している。このプロセスに従えば、ヒト抗体製造B細胞は、エプスタインーバーウイルス、又はエプスタイン-バーウイルス核内抗原2（EBNA2）を発現するその誘導体による感染によって不朽化される。続いてEBNA2機能（前記は不朽化のために必要である）は停止され、その結果、抗体産生が増加する。
【００２１】
完全にヒトの抗体を製造するさらに別の方法として、米国特許5,789,650号（“Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies”, 1998年8月4日出願）は、異種抗体を産生することができる非ヒトトランスジェニック動物及び内因性免疫グロブリン遺伝子を不活化した非ヒトトランスジェニック動物を開示している。内因性免疫グロブリン遺伝子は、アンチセンスポリヌクレオチドによって及び/又は内因性免疫グロブリンに対して誘導された抗血清によって抑制される。異種抗体は、前記非ヒト動物種のゲノムには通常見出されない免疫グロブリンによってコードされる。再編成されていない異種のヒト免疫グロブリン重鎖の配列を含む1つ又は2つ以上のトランスジーンが非ヒト動物に導入され、それによってトランスジェニック免疫グロブリン配列を機能的に再編成することができるトランスジェニック動物を形成し、ヒト免疫グロブリン遺伝子によってコードされる種々のアイソタイプ抗体レパートリーを製造することができる。そのような異種ヒト抗体はB細胞で生成される。前記B細胞は、その後不朽化細胞株（例えばミエローマ）との融合によって不朽化されるか、又はモノクローナルで異種の完全にヒトの抗体ホモローグを産生することができる細胞株を永続化させるための他の技術によって前記のB細胞を操作することによって不朽化される。
本発明の細胞を仮定的調節化合物と（例えば混合することによって）接触させる条件は、プレキシン-A1、Trem-2又はDAP12活性と干渉するような他の調節化合物が本質的に存在しないならば、細胞がプレキシン-A1、Trem-2又はDAP12活性を示すことができる条件である。そのような条件を達成することは当業者には周知であり、前記には有効な培養液が含まれ、細胞がプレキシン-A1、Trem-2又はDAP12活性を示すことができるように前記培養液で培養することができる。例えば、哺乳類細胞のためには、有効な培養液は典型的には、10%ウシ胎児血清を含むRPMI1640培養液を含む水性媒体である。
【００２２】
本発明の細胞は、多様な容器（組織培養フラスコ、試験管、マイクロタイタープレート、ペトリ皿が含まれるが、ただしこれらに限定されない）で培養することができる。培養は、細胞にとって適切な温度、pH及び二酸化炭素濃度で実施される。そのような培養条件はまた当業者の技術範囲内である。例えば、ラモス（Ramos）細胞の場合、培養は37℃、5%CO2の環境で実施することができる。
細胞を仮定的調節化合物と有効な態様で接触させるための認容できるプロトコルには、容器当たりの接触細胞数、細胞に投与される仮定的調節化合物の濃度、仮定的化合物と細胞とのインキュベーション時間、細胞に投与されるリガンド及び/又は細胞内イニシエーター分子の濃度、及びリガンド及び/又は細胞内イニシエーター分子と細胞とのインキュベーション時間が含まれる。そのようなプロトコルの決定は、変数（例えば容器のサイズ、容器内の液体の体積、被検細胞タイプ及び試験される仮定的調製化合物の化学的組成（すなわちサイズ、電荷など）を基に当業者が実施することができる。
本発明の方法のある実施態様では、適切な数の細胞が、96ウェルの組織培養皿の培養液に添加される。好ましい細胞数には、プレキシン-A1、Trem-2又はDAP12活性における変化を、本発明の検出方法（下記で詳細に説明）を用いて検出することを可能にする細胞数が含まれる。より好ましい細胞数には、96ウェルの組織培養皿の各ウェル当たり1から1ｘ106細胞が含まれる。細胞を組織培養皿に添加した後、細胞を37℃、5%CO2で約0から約24時間プレインキュベートすることができる。
【００２３】
本発明の検出方法を用いてプレキシン-A1、Trem-2又はDAP12タンパク質の活性の調節を検出することができるように、前記活性の細胞内調節に十分な量の、培養液に懸濁した適切な仮定的調節化合物を細胞に添加する。仮定的調節化合物の好ましい量は、96ウェルプレートの各ウェル当たり約1nMから約10mMの仮定的調節化合物を含む。細胞を適切な時間インキュベートして、前記仮定的調節化合物を細胞に侵入させ、さらにプレキシン-A1、Trem-2又はDAP12タンパク質と相互作用させる。好ましいインキュベーション時間は約1分から約48時間である。
本発明の方法のまた別の実施態様では、本発明の使用に適した細胞が、本発明のプレキシン-A1、Trem-2又はDAP12タンパク質と結合することができる刺激分子で刺激されて、シグナルトランスダクション経路を開始し、細胞応答を生じる。好ましくは、細胞は、仮定的調節化合物と細胞との接触に続いて刺激分子で刺激される。適切な刺激分子には、例えばプレキシン-A1、Trem-2又はDAP12タンパク質と特異的に結合する抗体が含まれえる。細胞に添加すべき刺激分子の適切な量は、例えば使用されるリガンドのタイプ（例えばモノマーであるかマルチマーであるか、透過性であるかなど）及びプレキシン-A1、Trem-2又はDAP12タンパク質の豊富さなどに左右される。好ましくは、約1.0nMから約1mMのリガンドが細胞に添加される。
本発明の方法は、組成物がプレキシン-A1、Trem-2又はDAP12タンパク質の活性化を調節することができるか否かを決定することを含む。そのような方法には、実施例の節で詳細に記載されるアッセイが含まれる。本発明の方法はさらに組成物の毒性を決定するための毒性試験を実施する工程を含むことができる。
本発明のまた別の特徴は、プレキシン-A1、Trem-2又はDAP12タンパク質活性を細胞内で調節することができる組成物を同定するキットを含む。そのようなキットは以下を含む：（1）プレキシン-A1、Trem-2又はDAP12タンパク質を含む細胞；及び（2）プレキシン-A1、Trem-2又はDAP12タンパク質のいずれかの調節を検出する手段。プレキシン-A1、Trem-2又はDAP12タンパク質の調節を検出するための手段には、当業者に公知の方法及び試薬が含まれる。例えば、プレキシン-A1タンパク質活性は、例えば下記に記載する活性化アッセイを用いて検出することができる。プレキシン-A1、Trem-2又はDAP12タンパク質の調節を検出する手段でもまた当業者に公知の方法及び試薬が含まれる。本発明のキットとともに使用される適切な細胞には本明細書に詳細に記載した細胞が含まれる。キットとともに使用される好ましい細胞にはヒト細胞が含まれる。
【００２４】
治療的使用方法
プレキシン-A1は正常な免疫応答及び骨ホメオスタシスの両発達においてDAP12と密接に連携することができるということが、本発明によって初めて見出された。
DAP12を介するITAM仲介シグナリングは、適切な免疫応答の発達のためだけではなく、破骨細胞分化のためにも重要な共働刺激シグナルであることが以前に示された24-26。DAP12-/-マウスで報告されたように26、プレキシン-A1-/-マウスは抗原特異的T細胞生成の障害を示し、その場合、抗原特異的T細胞は実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）の発症に耐性を示した（図13参照）。さらに骨格組織では、DAP12遺伝子における欠損は、Trem-2遺伝子の場合と同様に、破骨細胞分化の障害をもたらすことが知られている24,25,27,28。したがって、プレキシン-A1とDAP12との結合は、おそらくDC及び破骨細胞の両者に対し共働刺激シグナルを提供する。このことを支持するものとして、カルシウムシグナリングは、DAP12-/-細胞の場合にそうであるように25、プレキシン-A1-/-細胞で影響を受けた（図12、14参照）。したがって、本発明は、プレキシン-A1-DAP12相互作用を阻害する組成物を患者に投与することによって、炎症性疾患、自己免疫疾患又は骨吸収異常を治療する方法を提供する。
本発明はまた、Trem-2はプレキシン-A1-DAP12結合のために架橋として機能することを示した。本発明はしたがって、プレキシン-A1-Trem-2相互作用を阻害する組成物を患者に投与することによって、炎症性疾患、自己免疫疾患又は骨吸収異常を治療する方法を提供する。
【００２５】
本発明はまた、DAP12及びTrem-2はSema6Dのための機能的レセプター成分であることを示した。本発明はしたがって、DAP12-Trem-2相互作用を阻害する組成物を患者に投与することによって、炎症性疾患、自己免疫疾患又は骨吸収異常を治療する方法を提供する。
プレキシン-A1とDAP12との相互作用、プレキシン-A1-Trem-2又はDAP12-Trem-2を遮断する組成物は、炎症性サイトカインの細胞からの産生を遮断するであろう。サイトカイン産生の阻害は、過剰なサイトカイン産生に付随する、多様なサイトカイン仲介疾患又は症状、例えば炎症、自己免疫応答又は骨吸収における異常及び病変の予防及び治療に魅力的な手段である。したがって、前記組成物は以下を含む疾患及び症状の治療に有用である：変形性関節症、アテローム性硬化症、接触皮膚炎、骨吸収異常（骨粗しょう症を含む）、再灌流障害、喘息、多発性硬化症、ギヤン-バレー症候群、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、対宿主性移植片病、全身性紅斑性狼瘡及びインスリン依存性真性糖尿病、慢性関節リウマチ、毒素ショック症候群、アルツハイマー病、糖尿病、炎症性腸疾患、炎症及び心脈管系疾患の症状とともに急性及び慢性痛、卒中、心筋梗塞、血栓溶解治療により又は前記に続く症状、熱傷、成人呼吸促迫症候群（ARDS）、外傷後の二次性多器官障害、急性糸球体腎炎、急性炎症成分を有する皮膚病、急性化膿性髄膜炎又は他の中枢神経系疾患、血液透析、白血球搬出法に付随する症状、顆粒球輸液に付随する症状、壊死性腸炎、経皮経管冠状動脈形成術後の再狭窄を含む合併症、外傷性関節炎、敗血症、慢性閉塞性肺疾患及びうっ血性心不全。前記組成物はまた抗凝固治療又は線維溶解治療（及びそのような治療に関連する疾患又は症状）にも有用でありえる。
【００２６】
抗サイトカイン活性は、当業界で公知の方法を用いることによって示すことができる。例えばBrangerら（J. Immunol. 168:4070-4077, 2002）の論文及びその中に引用された46の文献を参照されたい（前記文献は参照により本明細書に含まれる）。
本発明の組成物はまた腫瘍学的疾患の治療にも有用であろう。前記疾患には、固形腫瘍、例えば乳房、呼吸器系管、脳、生殖器官、消化管、尿路、眼、肝、皮膚、頭部及び頸部、甲状腺、傍甲状腺の癌及びそれらの遠位性転移が含まれるが、ただしこれらに限定されない。上記疾患にはまたリンパ腫、肉腫及び白血病が含まれる。
乳癌の例には、侵襲性腺管癌、侵襲性小葉癌、上皮内小葉癌、上皮内腺管癌が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
呼吸器系管の癌の例には小細胞及び非小細胞肺癌の他に気管支腺癌並びに胸膜肺の芽細胞腫及び中皮腫が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
脳の癌の例には、脳幹、視神経及び下眼神経グリオーマ、及び大脳星状細胞腫、髄芽細胞腫、脳室上衣細胞腫の他に下垂体、神経外皮及び松果体腫瘍が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
末梢神経系の腫瘍の例には、神経芽腫、神経節神経芽腫及び末梢神経鞘腫瘍が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
内分泌系及び外分泌系腫瘍の例には、甲状腺癌、副腎皮質癌、褐色細胞腫、類癌腫が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００２７】
男性生殖器腫瘍には前立腺癌及び精巣癌が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
女性生殖器腫瘍には子宮内膜、子宮頸部、卵巣、膣、外陰部の癌の他に子宮体の肉腫が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
消化管の腫瘍には肛門、結腸、結腸直腸、食道、胆嚢、胃、膵臓、直腸、小腸及び唾液腺の癌が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
尿路の腫瘍には膀胱、陰茎、腎臓、腎盂、尿管及び尿道の癌が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
眼の癌には眼球内メラノーマ及び網膜芽細胞腫が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
肝臓癌の例には、肝細胞癌（線維層板をもつ、又はもたない肝細胞の癌腫）、肝芽細胞腫、胆管癌（肝臓内胆管の癌腫）及び混合型肝細胞胆管癌が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
皮膚の癌には扁平上皮癌、カポジ肉腫、悪性メラノーマ、メルケル細胞皮膚癌、及び非メラノーマ性皮膚癌が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
頭頸部癌には咽頭/下咽頭/食道/口腔咽頭癌並びに舌及び口腔内の癌が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
リンパ腫にはエイズ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫及び中枢神経系のリンパ腫が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
肉腫には軟組織の肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、線維性組織球腫、リンパ肉腫、血管肉腫及び横紋筋肉腫が含まれるが、ただしこれらに限定されない。白血病には急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病及び毛様細胞性白血病が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
プラズマ細胞異混和症には多発性ミエローマ及びヴァルデンストレームマクログロブリン血症が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
これらの疾患はヒトで性状がよく調べられているが、他の哺乳動物でも類似の病因論をもつものが存在し、本発明の医薬組成物で治療することができる。
【００２８】
治療的な使用のために、本組成物は、通常的な任意の態様で通常的な任意の投与形態で投与することができる。投与ルートには静脈内、筋肉内、滑液嚢内、輸液、舌下、経皮、経口、局所又は吸入によるルートが含まれるが、ただしこれらに限定されない。好ましい投与態様は経口及び静脈内である。
前記組成物は単独で投与しても、他の活性成分を含むアジュバントと組み合わせて投与してもよい。前記アジュバントは、阻害物質の安定性を高め、ある種の実施態様では前記阻害物質を含む医薬組成物の投与を容易にし、溶解又は分散を増強し、阻害活性を高め、補助治療を提供するというような作用を有する。有利には、そのような併用治療は、より低用量の通常的治療薬を利用でき、したがって単独治療として前記薬剤が用いられたときに生じる可能性がある毒性及び副作用を回避できる。上述の組成物は、通常的な治療薬又は他のアジュバントと物理的に結合させて単一の医薬組成物にすることができる。有利には、前記組成物は、続いて単一投与形で一緒に投与することができる。いくつかの態様では、そのような組成物の組合せを含む医薬組成物は、少なくとも約5%、より好ましくは少なくとも約20%（w/w）の組成物又はその組合せを含む。本発明の組成物の最適百分率（w/w）は変動可能で、当業者が決定できる。また別には、前記組成物は（連続的に又は平行して）別々に投与してもよい。別々に投与することによって、投与スケジュールのより大きな融通性が許容される。
【００２９】
上記で述べたように、本明細書に開示した組成物の投与形は、当業者に公知の医薬的に許容できる担体及びアジュバントを含む。これらの担体及びアジュバントには、例えばイオン交換物質、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清蛋白質、緩衝物質、水、塩類又は電解質、及びセルロース系物質が含まれる。好ましい投与形態には、錠剤、カプセル、カプレット、リキッド、溶液、懸濁液、乳濁液、ロゼンジ、シロップ、再構成性散剤、顆粒、座薬及び経皮パッチが含まれる。前記のような投与形態を製造する方法は公知である（例えば以下を参照されたい：H.C. Ansel & N.G. Popovish, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th ed., Lea & Febiger (1990)）。投与レベル及び要件は当業界ではよく認識されており、個々の患者に適した利用可能な方法及び技術から当業者が選択することができる。いくつかの実施態様では、投与レベルは、70kgの患者に対し約1−1000mg/用量の範囲である。1日当たり1回投与で十分であるが、1日当たり5回まで投与することができる。経口投与の場合、2000mg/日までの量を要求することができる。当業者には理解されるところであるが、個々の要因に応じて前記より低い又は高い投与量も要求することができる。例えば、具体的な投与量及び治療スケジュールは、例えば患者の一般的な健康状態、患者の疾患の重篤度及び経過並びにそれに対する処置、及び担当医の判断に左右されるであろう。
【００３０】
実験方法
マウス：
プレキシン-A1ターゲティングベクターを構築するために、開始コドンをもつ第二のエクソン及びsema-ドメインのコード配列をもつ第三のエクソンを含む3kbフラグメントをneo耐性カセットで置き換え、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（HSV-tk）遺伝子をランダム組み込みの排除選別のために挿入した。直鎖化ターゲティングプラスミドDNAをエレクトロポレーションによりES細胞にトランスフェクトした。G418及びガンシクロヴィルによる二重選別の後で、以下で述べるように、96の耐性クローンをプレキシン-A1標的対立遺伝子座の相同組換えについてPCR及びサザンブロット分析でスクリーニングした。相同組換えをもつ2つのクローンを特定し、単離した。2つの別個のプレキシン-A1変異クローンに由来するES細胞をC57BL/6マウスの胚盤胞に別々に注入した。前記胚盤胞を偽妊娠ICR養育母に移し、続いてキメラの雄をC57BL/6又はBALB/cの雌に戻し交配した。ヘテロ接合マウスを交配してホモ接合体を得た。免疫学的分析については、ヘテロ接合雄マウスをC57BL/6又はBALB/cの雌に5世代にわたって戻し交配した。プレキシン-A1標的対立遺伝子座の生殖系列伝達及び遺伝子型をさらにサザンブロット及びPCR分析によって解析した。PCRは94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で60秒の35サイクルで実施した。以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、再編成プレキシン-A1遺伝子座を同定した。プライマー1（5'-AGCACCACACTCACACCCTCTTT-3'）は、3'-非翻訳領域に位置するゲノムDNAと相補的である。プライマー2（5'-TCCTTGATTTTCTCCTTGATGGCC-3'）は第二のエクソンの3'-末端の配列と相補的である。プライマー3（5'-TCCCTGTCAGAGAAAACCTGGTTT-3'）は、第三のエクソンの非翻訳領域に位置するゲノムDNAと相補的である。サザンブロット分析の場合、尾部由来のゲノムDNAをBAMHIで消化し、アガロースゲル電気泳動に付した。DNAをナイロンのブロッティングメンブレン（Hybond N; Amersham Pharmacia）に製造元のプロトコルに従って移した。フィルターを放射能標識プローブと一晩ハイブリダイズした。続いてオートラジオグラフィーの前に、前記フィルターを0.1xSSC、0.1%SDSで1時間65℃で洗浄した。RT-PCR分析では、RNAを脳、心臓及び脾臓からRNイージー（RNeasy）キット（Qiagen）を用いて単離し、DNアーゼI（Invitrogen）で処理して、ゲノムDNAを排除した。cDNAをスーパースクリプトII（SuperScript II）cDNA合成キット（Invitrogen）を用いて合成し、RT-PCRは94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で60秒の35サイクルで、以下のプライマーを用いて実施した：5'-ACATCTACTATGTGTACAGTTTCC-3'及び5'-AAAAACCACGGTGCGGCCTTGGGTA-3'。ノザンブロット分析の場合、脳から単離した全RNAをホルムアルデヒド含有ゲル電気泳動に付し、さらにブロッティングメンブレンに移して放射能標識プローブで一晩ハイブリダイズさせた。DAP12欠損マウスは以前に文献24に記載された。OT-2 TgマウスはDr. William R. Heathから寄贈された30。マウスは特定病原体排除環境で維持した。全ての実験方法は我々の研究所内ガイドラインに沿うものであった。
【００３１】
in vitroアッセイ：
脾DCはMACS（Miltenyi Biotech）を用いて脾臓から単離した。得られた純度は各実験で＞95%であった。骨髄由来DC（BMDC）はGM-CSFを用いて骨髄の先駆細胞から作製した。FITCデキストラン取り込みについては、BMDCをアロフィコシアニン(APC)-結合抗CD11cを用いて染色し、2mg/mLのFITCデキストランを含む予め加温した培養液とともに37℃で10分インキュベートした。冷却培養液で3回洗浄した後、内在化FITCデキストランをFACSで測定した。MLRについては、照射（3000rad）脾臓DCをアロジェニックCD4+ T細胞（5ｘ104細胞/ウェル）とともに48時間培養した。細胞分裂を測定するために、培養時間の最後の14時間の間、2マイクロCiの[3H]チミジンで細胞をパルスした。in vitro T細胞応答でのT細胞プライミングのために、CFA中の100μgのKLHを用いマウスをフットパッドで免疫した7,8。免疫後5日に、リンパ節ドレーンから単離したCD4+ T細胞を種々の濃度のKLHで72時間刺激した。分裂アッセイのために、最後の14時間の間、2マイクロCiの[3H]チミジンで細胞をパルスした。培養上清のサイトカインの産生はBio-Plex懸濁アレイ系で測定した。
【００３２】
破骨細胞及び骨芽細胞培養：
in vitro破骨細胞形成は以前に記載されたように実施した24,25。簡単に記せば、野生型又はプレキシン-A1-/-マウスの由来の骨髄先駆細胞を、10%FCS含有α-MEM中でM-CSF（10ng/mL）とともに5ｘ105細胞で培養した。2日目に、細胞を採集し、さらにM-CSH（10ng/mL）及びRANKL（10ng/mL）とともに平底の96ウェルプレートで3日間5ｘ104細胞で培養した。得られた細胞を固定し、TRAP-染色キット（Takara, Japan）を用いて酒石酸耐性酸性ホスファターゼで染色した。一次性破骨細胞は、新生児マウスの頭蓋冠から0.1%コラゲナーゼ及び0.2%ジスパーゼの連続消化後に単離した。同時培養実験では、頭蓋冠の破骨細胞及び間質細胞を非粘着性骨髄細胞とともに、10nMの1,25(OH)2-ビタミンD3及び1mMのプロスタグランジンE2を補充した培養液中で同時培養した。
骨表現型の分析：
組織学的実験、組織形態計測実験及びミクロラジオグラフィー実験は、以前に記載25されたものと本質的に同じ方法を用いて実施した。統計分析はスチューデントt-検定を用いて実施した（*ｐ＜0.05；**ｐ＜0.01；***ｐ＜0.001）。
安定なトランスフェクタントの樹立：
安定なプレキシン-A1、Trem-2及びDAP12発現293T細胞のトランスフェクタントは、リポフェクタミン（Invitrogen）を製造元のプロトコルに従って用い、Flag-付加プレキシン-A1、V5-付加Trem-2及びmyc-付加DAP12発現構築物をpMC1neoベクターにより導入することによって樹立した。Flag-付加プレキシン-A1、V5-付加Trem-2及びmyc-付加DAP12を発現しているトランスフェクタントをG418の存在下で選別し、抗Flag-ｍAb（M2, Signa）、抗V5-ｍAb（Invitrogen）及び抗myc-抗体（9B11、Cell Signaling Technology）によってスクリーニングし、クローン化した。
【００３３】
RNAi：
マウスのTrem-2に特異的な4つのsiRNA配列（5'-CCACGGTGCTGCAGGGCAT-3'；5'-TGACCAAGATGCTGGAGAT-3'；5'-CGGAATGGGAGCACAGTCA-3'；及び5'-GCACAGTCATCGCAGATGA-3'）を選別した（Dharmacon）。製造業者（Dharmacon）が全てのsiRNA配列を合成し、アニールした。トランスフェクションはRNAiFect（Qiagen）を製造元のプロトコルにしたがって用いて実施した。簡単に記せば、DCを洗浄し、24ウェルプレートの完全RPMI1640に播種した。siRNAをRNAiFect試薬とともに完全RPMI1640中で10分、室温でインキュベートし、続いてDC培養に添加した。48時間インキュベートした後で、得られた細胞を採集し、洗浄し、その後の実験に用いた。トランスフェクション効率は蛍光標識ノンサイレンシングRNAを用いて決定した（40から50%）。
免疫沈澱：
マウスプレキシン-A1に対するマウス抗血清を、CFA中の可溶性プレキシン-A1タンパク質でプレキシン-A1-/-マウスを免疫することによって入手し、イムノブロッティングに使用した。マウスプレキシン-A1に対するウサギ抗血清を免疫沈澱に使用した。野生型又はDAP12-/-BMDCを抗CD40 mAbで24時間刺激した。細胞を1%のディジトニン、10mMのトリス-Cl、150mMのNaCl、0.5mMのPMSF、5μg/mLのアプロチニン、5μg/mLのロイペプチン及びプロテアーゼインヒビターカクテル（Nakarai, Japan）を含む緩衝液中で可溶化した。細胞溶解物をプロテインA-セファロース＋抗プレキシン-A1とともに4℃で3時間インキュベートした。溶解緩衝液で5回洗浄した後、免疫沈澱物をSDS-PAGEで分離し、抗DAP12で免疫ブロットを実施した25。全細胞の溶解物を抗プレキシン-A1抗体で免疫ブロッティングした。
DAP12のリン酸化：
製造元のプロトコルにしたがいリポフェクタミン（Invitrogen）によって、RAW264.7細胞にFlag-付加プレキシン-A1、V5-付加Trem-2及びmyc-付加DAP12発現構築物を同時トランスフェクトし、24時間インキュベートした。細胞を6時間の血清枯渇後に5μg/mLのSema6D-Fcで刺激した。種々の時点で、細胞を、1%のNonidet-P40、10mMのトリス-Cl、150mMのNaCl、1mMのEDTA、10mMのNa3VO4、0.5mMのPMSF、5μg/mLのアプロチニン、5μg/mLのロイペプチン及びプロテアーゼインヒビターカクテル（Roche）を含む緩衝液中で可溶化した。細胞溶解物をプロテインG-アガロース＋抗myc mAbとともに4℃で3時間インキュベートした。溶解緩衝液で5回洗浄した後、免疫沈澱物をSDS-PAGEで分離し、抗ホスホチロシン抗体（4G10、Upstate Biotechnology）又は抗myc抗体で免疫ブロットを実施した。
【００３４】
文献
本明細書に記載の文献は、参照によりその内容が全て本明細書の記載に含まれるものとする。
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【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１ａ】プレキシン-A1-/-マウスの作製を示す。プレキシン-A1遺伝子の破壊。野生型プレキシン-A1遺伝子座（上）、プレキシン-A1ターゲティング構築物（中）及び作製したプレキシン-A1変異遺伝子座（下）の遺伝子構造が示されている。塗りつぶされた枠はエクソンを示す。開始コドン及びsemaドメインのコード配列を含む3.0kbフラグメントをNeoで置き換えた。HSV-tk遺伝子を付加して、ランダムな組み込みの排除選別を可能にした。B、BamHI。
【図１ｂ】サザンブロット分析。野生型（+/+）、ヘテロ接合体（+/-）及びホモ接合体（-/-）の変異マウスの遺伝型を判定するために、尾部DNAをBamHIで消化し、電気泳動し、放射能標識プローブ（（a）の灰色の枠で示されている）とハイブリダイズさせた。11.5kbフラグメントは野生型の対立遺伝子座を示し、2.5kbフラグメントは標的とされる遺伝子座を示す。
【図１ｃ】ノザンブロット分析。野性型（+/+）又はプレキシン-A1-/-（-/-）マウスの脳から調製したRNAを電気泳動し、放射能標識プローブとハイブリダイズさせた。
【図１ｄ】RT-PCR分析。野性型（+/+）又はプレキシン-A1-/-（-/-）マウスの脳、心臓及び脾臓から得られたcDNAをRT-PCRに用いて、プレキシン-A1の発現を測定した。
【図２】野生型（+/+）とプレキシン-A1-/-（-/-）の胚（E12）の間には外見的相違は存在しない。以前に記載（Giger et al., Neuron(2000), 25:29）された抗神経フィラメント抗体（2H3）を用いる、野生型（+/+）又はプレキシン-A1-/-（-/-）のE12胚の全マウント染色。IV、滑車神経；V、三叉神経；Vop、三叉神経の眼神経分枝；Vmax、三叉神経の上顎神経分枝；VII、顔面神経；VIII、内耳神経；X、迷走神経。
【図３】プレキシン-A1の発現プロフィル。プレキシン-A1転写物の発現は多数のマウス組織パネルcDNA（Clontech）を用いRT-PCRによって決定した。G3PDH-転写物をコントロールとして用いた。
【図４】プレキシン-A1-/-マウスの正常なリンパ球の発達。細胞は野生型（+/+）又はプレキシン-A1-/-（-/-）マウスから調製し、種々の抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。
【図５】プレキシン-A1-/-マウスの正常なB細胞増殖応答。野生型マウス（白丸）又はプレキシン-A1-/-マウス（黒丸）から調製した小型の休止B細胞を種々の濃度の表示因子とともに72時間培養した。[3H]-チミジンを最後の14時間の間添加した。データは平均±S.D.である。
【図６ａ】プレキシン-A1-/-マウスの正常なCD4+T細胞増殖応答。野生型マウス（白丸）又はプレキシン-A1-/-マウス（黒丸）から精製したCD4+T細胞を種々の濃度の固定抗CD3抗体とともに、抗CD28の存在下（10μg/mL）又は非存在下で48時間培養した。[3H]-チミジンを最後の14時間の間添加した。データは平均±S.D.である。
【図６ｂ】プレキシン-A1-/-マウスの正常なCD4+T細胞増殖応答。野生型マウス（白丸）又はプレキシン-A1-/-マウス（黒丸）から精製したCD4+T細胞を種々の濃度の固定抗CD3抗体とともに、抗CD28の存在下（10μg/mL）又は非存在下で48時間培養した。[3H]-チミジンを最後の14時間の間添加した。データは平均±S.D.である。
【図７ａ】プレキシン-A1-/-マウスの正常な骨芽細胞機能。（a,b）プレキシン-A1-/-の骨芽細胞におけるオステオカルシン（a）及びBSP（b）の比肩しえる発現。血清のオステオカルシンレベルはELISAにより決定した。野生型（+/+）又はプレキシン-A1-/-（-/-）の骨芽細胞における骨シアロプロテイン（BSP）の転写物の発現は、定量的PCRのリアルタイムモニター分析によって決定した。G3PDH-転写物を内部コントロールとして用いた。データは平均±S.D.である。
【図７ｂ】プレキシン-A1-/-マウスの正常な骨芽細胞機能。（a,b）プレキシン-A1-/-の骨芽細胞におけるオステオカルシン（a）及びBSP（b）の比肩しえる発現。血清のオステオカルシンレベルはELISAにより決定した。野生型（+/+）又はプレキシン-A1-/-（-/-）の骨芽細胞における骨シアロプロテイン（BSP）の転写物の発現は、定量的PCRのリアルタイムモニター分析によって決定した。G3PDH-転写物を内部コントロールとして用いた。データは平均±S.D.である。
【図７ｃ】典型的なカルセイン発現が示されている。野生型（+/+）及びプレキシン-A1-/-（-/-）マウスのミネラル付加速度（MAR）及び骨形成速度（BFR）が示されている。データは3匹のマウス±s.e.m.である。
【図８ａ】T細胞及び破骨細胞におけるSema6D転写物の発現プロフィル。cDNAは非刺激-又は抗CD3刺激-T細胞から調製した。Sema6Dの転写物の発現は、定量的PCRのリアルタイムモニター分析によって決定した。G3PDH-転写物を内部コントロールとして用いた。
【図８ｂ】cDNAは、休止T細胞（-）、Th1（IL-12＋抗IL-4）局在化細胞、及びTh2（IL-4＋抗IL-12）局在化細胞から調製した。これらの細胞におけるSema6D及びG3PDHの転写物の発現は、それらの特異的なプライマーを用いPCRによって決定した。cDNAはまた、M-CSF＋PANKLで誘発（in vitro）した破骨細胞、又は13日齢のマウスの大腿骨及び脛骨（一次性）から調製した。プレキシン-A1及びG3PDHの転写物の発現は、それらの特異的なプライマーを用いPCRによって決定した。
【図９ａ】コントロールの可溶性Sema4Aタンパク質はDC及び破骨細胞に対して影響を表さない。組換えSema4AはDCと結合しない。野生型BMDCを抗CD40mAbとともに24時間培養し、ビオチン化組換えSema４A（太線）又はビオチン化ヒトIgG1（点線）＋ストレプトアビジン-APCで染色した。
【図９ｂ】Sema4AはDCによるIL-12産生を誘発しない。野生型マウス由来のBMDCを組換えSema4A、Sema6D-Fc、抗ＣＤ40 mAb又はLPSとともに72時間培養し、IL-12p40の産生をELISAで測定した。データは平均±S.D.である。
【図９ｃ】Sema4Aは破骨細胞の発達に影響を与えない。野生型マウスの骨髄細胞をM-CSF（10ng/mL）及びSema4A-Fc（10μg/mL）とともに2日間培養し、さらにM-CSF（10ng/mL）及び至適量より少ない用量のRANKL（5ng/mL）で3日間培養した。TRAP陽性細胞数を数えた。
【図１０】プレキシン-A1-/-の前破骨細胞で観察された、減少しているが相当量のSema6Dの結合。野生型（+/+）又はプレキシン-A1-/-（-/-）の同腹子由来の破骨細胞の前駆細胞をビオチン化Sema6D-Fc（太線）又はビオチン化ヒトIgG1（点線）＋ストレプトアビジン-APCで染色した。
【図１１】DCにおけるプレキシン-Aサブファミリーメンバーの発現プロフィル。cDNAを抗CD40で刺激したBMDCから調製した。プレキシン-A1、-A2、-A3、-A4及びG3PDHの転写物の発現をそれらの特異的なプライマーを用いてPCRで決定した。コントロールとして、プレキシン-A1、-A2、-A3及び-A4のcDNAの10ngをそれらの特異的なプライマーによってPCRで増幅させた。
【図１２】プレキシン-A1とTrem-2との間の蛍光共鳴エネルギー移転（FRET）。プレキシンA1(その細胞質領域に欠失有り)-CFPとTrem-2-YFP又はYFP-pm（コントロール）との結合を分子間FRETによってCOS7細胞で分析した。COS7細胞に発現プラスミドをトランスフェクトし、YFP、FRET及びCEFで画像化した。これらはIMDモードでFRETCを表すために用いられた。八色（赤から青）がFRET効率を表し、それによって各色の強度がCFPの平均強度を示す。スケールバーは10μmを表す。pCAGGS-YFP-pmはK-RAS4Bタンパク質のカルボキシ末端（aa169−188）に融合されたYFPをコードした。  分子間FRET分析：蛍光プローブを発現するCOS7細胞を画像化し、以前に記載されたようにデータを加工した。（a）簡単に記せば、蛍光画像は、YFP（励起、510/23nm；放射、560/15nm）、CFP（励起、420/20nm；放射、480/20nm）、及びFTRT（励起、420/20nm；放射、535/35nm）フィルターチャネルを通して連続的に得た。FRETフィルターセットを通過する蛍光は、FRET-成分（“修正”FRET、FRETC）及び非FRET成分、スペクトルブリードスルー及びクロス励起から成っていた。非FRET成分は以前に記載されたように差し引いた（b）。我々の実験条件のために、以下の等式を使用した：FRETC＝FRET−（0.34ｘCFP）−（0.10ｘYFP）FRETCの算出後、マイクロソフトエクセルを用いて統計分析を実施した。a. K. Terai & M. Matsuda, “Ras binding opens c-Raf to expose the docking site for mitogen-activated protein kinase”. EMBO Rep. 6:251-255(2005),  b. A. Sorkin, M. McClure, F. Huang & R. Carter, “Interaction of EGF receptor and grb2 in living cells visualized by fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy”. Curr. Biol. 10:1395-1398(2000)。
【図１３ａ】プレキシン-A1-/-マウスはMOG-ペプチドによる免疫によって誘発されたEAEに耐性であった。6から8週齢の野生型（ｎ＝8）及びプレキシン-A1-/-（ｎ＝8）マウスをCFA中の100μgのMOG35-55により皮下免疫した。100ngの百日咳毒素を前記免疫日及び2日後に静脈注射した。マウスを毎日臨床的に採点した：0、症状無し；1、尾の脱力；2、後肢の虚弱；3、後肢の麻痺；4、後肢及び前肢の麻痺；5、瀕死状態。EAEを生じなかった動物を含む全マウスのスコアを平均することによって平均臨床スコアを算出した。
【図１３ｂ】プレキシン-A1-/-マウスの脊髄には炎症性単核細胞は浸潤しなかった。脊髄を取り出し、10%ホルマリンで固定した。光学顕微鏡法のために、パラフィン包埋切片をヘマトキシリン-エオシンで染色した。
【図１３ｃ】プレキシン-A1-/-マウスにおけるT細胞プライミングの障害。野生型（白丸）及びプレキシン-A1-/-（黒丸）マウスをCFA中の100μgのMOG35-55により後肢のフットパッドで免疫した。プライミングの7日後に、リンパ節ドレーンから調製した細胞を種々の濃度のMOG35-55で再刺激した。
【図１４】プレキシン-A1-/-細胞におけるカルシウム振動の障害。プレキシン-A1-/-破骨細胞の前駆細胞におけるカルシウムシグナリングはM-CSF及びRANKLによって刺激された。野生型（+/+）又はプレキシン-A1-/-（-/-）マウス由来の破骨細胞の前駆細胞をM-CSFの存在下でRANKLとともに24時間インキュベートし、以前に文献25に記載されたようにカルシウムの測定に付した。
【図１５】Sema6Dによって誘発されたRacの活性化は、DAP12が存在しないことによって影響を受けない。野生型（+/+）又はDAP12-/-（-/-）のBMDCをSema6D-Fc又はコントロールIgGで30分刺激した。細胞溶解物をPAK-1GST-アガロース又はタンパク質-Gセファロース＋抗Rac mABとともにインキュベートし、抗Rac mABでブロットした。
【図１６ａ】（a−b）野生型同腹子で観察されるFITCと比較したプレキシン-A1-/-マウスのFITC及び（c）野生型及びプレキシン-A1-/-のDCでの共働刺激因子（CD40、CD80、CD86及びMHCクラスIIを含む）の発現レベル。
【図１６ｂ】（a−b）野生型同腹子で観察されるFITCと比較したプレキシン-A1-/-マウスのFITC及び（c）野生型及びプレキシン-A1-/-のDCでの共働刺激因子（CD40、CD80、CD86及びMHCクラスIIを含む）の発現レベル。
【図１６ｃ】（a−b）野生型同腹子で観察されるFITCと比較したプレキシン-A1-/-マウスのFITC及び（c）野生型及びプレキシン-A1-/-のDCでの共働刺激因子（CD40、CD80、CD86及びMHCクラスIIを含む）の発現レベル。
【図１７ａ】プレキシン-A1-/-のDCは野生型DCと比較してアロジェニックT細胞を刺激した。
【図１７ｂ】アロジェニックの野生型DCとともに培養されたプレキシン-A1-/-（-/-）マウス又は野生型同腹子由来のCD4+T細胞の細胞増殖。
【図１７ｃ】in vitroで抗原特異的T細胞を刺激するプレキシン-A1-/-DCの能力。
【図１７ｄ】プレキシン-A1-/-マウスのCD4+T細胞による増殖応答及びサイトカイン産生。
【図１８ａ】マイクロコンピュータ支援高解析断層撮影技術を用いた三次元微小構造分析による骨質量。
【図１８ｂ】マイクロコンピュータ支援高解析断層撮影技術を用いた三次元微小構造分析による骨質量。
【図１８ｃ】骨の形態測定分析。
【図１８ｄ】野生型の骨と比較して小柱重量の増加を示すプレキシン-A1-/-長骨の切片。
【図１８ｅ】プレキシン-A1-/-の骨芽細胞は、野生型の骨芽細胞と同様な強さで野生型の破骨細胞の形成を促進した。
【図１８ｆ】骨の形態測定分析は、骨芽細胞表面対骨表面の正常な比率を示した。
【図１９ａ】TRAP染色を用いた骨の組織形態計測分析は、プレキシン-A1-/-マウスは骨芽細胞数の減少及び骨芽細胞表面対骨表面比の低下を示すことを提示した。
【図１９ｂ】プレキシン-A1-/-マウスは、デオキシピリジノリン（Dpyd）及びI型コラーゲンフラグメントの減少を示した。
【図１９ｃ】破骨細胞のin vitro誘発（18、19）はプレキシン-A1の非存在下で減少した。
【図１９ｄ】プレキシン-A1は新鮮な単離破骨細胞で顕著に発現された。
【図２０ａ】DCと可溶性組換えSema6DとのインキュベーションはIL-12の産生とMHCクラスII発現のアップレギュレーションを誘発した。
【図２０ｂ】DCと可溶性組換えSema6DとのインキュベーションはIL-12の産生とMHCクラスII発現のアップレギュレーションを誘発した。
【図２０ｃ】DCと可溶性組換えSema6DとのインキュベーションはIL-12の産生とMHCクラスII発現のアップレギュレーションを誘発した。
【図２０ｄ】可溶性組換えSema6Dはin vitroで実質的な破骨細胞の分化を促進した。
【図２１ａ】DC及び破骨細胞でプレキシン-A1との結合について仮定的機能をもついくつかの候補分子のスクリーニング。
【図２１ｂ】Trem-2の存在下でのプレキシン-A1とDAP12との結合。
【図２１ｃ】Trem-2の存在下でのプレキシン-A1とDAP12との結合。
【図２１ｄ】DAP12とともにこれらプレキシン-A1の細胞発現。
【図２１ｅ】DAP12とともにこれらプレキシン-A1の細胞発現。
【図２２ａ】Trem-2に対するRNAiがDCでのSema6Dの刺激性活性を低下させるか否か（図22b）を決定する “機能低下”実験。
【図２２ｂ】Trem-2に対するRNAiがDCでのSema6Dの刺激性活性を低下させるか否か（図22b）を決定する “機能低下”実験。
【図２２ｃ】DAP12-/-DCはSema6Dに対する顕著な応答低下を示した。
【図２２ｄ】プレキシン-A1、Trem-2及びDAP12を発現するRAW264.7細胞は可溶性組換えSema6Dタンパク質で刺激され、DAP12のチロシンリン酸化が観察された。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１６ｃ】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
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【図１７ｄ】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１８ｃ】
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【図１８ｄ】
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【図１８ｅ】
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【図１８ｆ】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図１９ｃ】
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【図１９ｄ】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２０ｃ】
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【図２０ｄ】
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【図２１ａ】
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【図２１ｂ】
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【図２１ｃ】
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【図２１ｄ】
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【図２１ｅ】
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【図２２ａ】
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【図２２ｂ】
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【図２２ｃ】
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【図２２ｄ】
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【外国語明細書】
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