(57)【要約】【課題】標的核酸分子に標識分子を結合させる煩雑な反応をせずに、従来の分析機器を用いて標的核酸分子を簡便に検出し、また、非特異的吸着反応が起こっても精度良く標的核酸分子を検出する方法を提供することを目的とする。【解決手段】予め標識分子３を結合している１本鎖核酸プローブ１が固定化されている生体分子検知チップ２上に標的核酸分子４をハイブリダイゼーション反応させ、２本鎖核酸５を形成させた後２本鎖核酸特異的分解酵素７を反応させることで標的核酸分子４と２本鎖核酸５を形成した１本鎖核酸プローブ１を分解し、生体分子検知チップ２上から失われた標識分子３を検出することによって簡便に標的核酸分子４の存在を検出する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸分子と相補的な塩基配列を有し、ハイブリダイゼーション反応によって前記標的核酸分子と２本鎖核酸を形成することのできる１本鎖核酸プローブを用いて前記核酸分子の存在を検出する核酸分子検出法方法において、それぞれ異なる塩基配列を含んだ１種類以上の前記１本鎖核酸プローブが一つの生体分子検知チップ上のそれぞれ独立した領域に固定化されており、前記１本鎖核酸プローブには予め標識分子が結合されており、前記生体分子検知チップ上で前記１本鎖核酸プローブと前記標的核酸分子のハイブリダイゼーション反応をさせた後、１本鎖の核酸を特異的に分解する１本鎖核酸特異的分解酵素を反応させ、前記標的核酸分子と２本鎖核酸を形成していない前記１本鎖核酸プローブを切断し、前記生体分子検知チップ上から前記標識分子が失われることを検出し、前記標的核酸分子の存在を検出することを特徴とする核酸分子検出方法。
【請求項２】
標的核酸分子と相補的な塩基配列を有し、ハイブリダイゼーション反応によって前記標的核酸分子と２本鎖核酸を形成することのできる１本鎖核酸プローブを用いて前記核酸分子の存在を検出する核酸分子検出法方法において、それぞれ異なる塩基配列を含んだ１種類以上の前記１本鎖核酸プローブが一つの生体分子検知チップ上のそれぞれ独立した領域に固定化されており、前記１本鎖核酸プローブには予め標識分子が結合されており、前記生体分子検知チップ上で前記１本鎖核酸プローブと前記標的核酸分子のハイブリダイゼーション反応をさせた後、２本鎖の核酸を特異的に分解する２本鎖核酸特異的分解酵素を反応させ、前記標的核酸分子と２本鎖核酸を形成した前記１本鎖核酸プローブを切断し、前記生体分子検知チップ上から前記標識分子が失われることを検出し、前記標的核酸分子の存在を検出することを特徴とする核酸分子検出方法。
【請求項３】
１本鎖核酸プローブが標的核酸分子と相補的な標的塩基配列と、制限酵素に分解される制限酵素分解配列から構成されており、１本鎖核酸プローブと標的核酸分子をハイブリダイゼーション反応させた後、ポリメラーゼ反応を行い前記制限酵素分解配列を２本鎖核酸に変換し、さらに前記制限酵素分解配列を分解する制限酵素を反応させることで、前記標的核酸分子と２本鎖核酸を形成した前記１本鎖核酸プローブのみ切断することを特徴とした請求項２に記載の核酸分子検出方法。
【請求項４】
１本鎖核酸プローブが標的核酸分子と相補的な標的塩基配列と制限酵素に分解される同一の制限酵素分解配列を２つ以上含有しており、前記標的塩基配列が少なくとも２つの前記制限酵素分解配列にはさまれて配置されており、２つの前記制限酵素分解配列が２本鎖核酸を形成することによって前記１本鎖核酸プローブが投げ縄構造をとることを特徴とする請求項２に記載の核酸分子検出方法。
【請求項５】
標識分子が蛍光色素であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の核酸分子検出方法。
【請求項６】
標識分子が金属粒子であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の核酸分子検出方法。
【請求項７】
標識分子が磁性材料であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の核酸分子検出方法。
【請求項８】
標的核酸分子と相補的な塩基配列を有し、ハイブリダイゼーション反応によって前記標的核酸分子と２本鎖核酸を形成することのできる１本鎖核酸プローブを用いて前記核酸分子の存在を検出する核酸分子検出方法において、それぞれ異なる塩基配列を含んだ１種類以上の前記１本鎖核酸プローブが一つの生体分子検知チップ上のそれぞれ独立した領域に固定化されており、前記標的核酸分子に標識分子を標識した後、前記生体分子検知チップ上で前記１本鎖核酸プローブと前記標的核酸分子をハイブリダイゼーション反応させ、前記生体分子検知チップ上に結合した前記標的核酸分子に結合させておいた標識分子を検出し、さらにハイブリダイゼーション反応によって形成された前記１本鎖核酸プローブと前記標的核酸分子の２本鎖核酸を解離させる解離反応を行い、前記標識分子で標識された前記標的核酸分子を前記生体分子検知チップから解離させた後、生体分子検知チップ上に残っている前記標識分子を検出し、前記生体分子検知チップ上に残った標識分子の検出量を前記解離反応の前後間で比較することによって、前記１本鎖核酸プローブに特異的に結合した前記標的核酸分子を検出することを特徴とした核酸分子検出方法。
【請求項９】
解離反応をアルカリ溶液で処理する反応としたことを特徴とする請求項８に記載の核酸分子検出方法。
【請求項１０】
解離反応を変性剤溶液で処理する反応としたことを特徴とする請求項８に記載の核酸分子検出方法。
【請求項１１】
解離反応を高温処理する反応としたことを特徴とする請求項８に記載の核酸分子検出方法。
【請求項１２】
生体分子検知チップ上にアルカリ溶液、あるいは変性剤を含んだ溶液あるいは高温にした高温溶液を流入させることを特徴とする請求項９乃至１１のいずれかに記載の核酸分子検出方法。
【請求項１３】
生体分子検知チップ自体を加熱することを特徴とする請求項１１に記載の核酸分子検出方法。
【請求項１４】
金属層を備えた生体分子検知チップを用いる事を特徴とする請求項１１乃至１３のいずれかに記載の核酸分子検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡマイクロアレイなどを用いて生体試料中に含まれる標的核酸分子の存在を検出し、標的核酸分子の塩基配列を決定し、標的核酸分子の存在量を計測する核酸分子の検出技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料中の分子マーカーとして特定の酵素の活性や抗原のエピトープや抗体以外にＤＮＡやＲＮＡなどの核酸分子が広く利用されるようになってきている。
【０００３】
遺伝子解析技術と情報システムの発展により膨大な量の塩基配列情報に関して誰もが利用することが可能になり、ウェブ上に公開されている膨大な量の塩基配列情報に基づき特定塩基配列の変異を調査する事や、多種類の遺伝子発現を網羅的に解析する事が可能となり、研究用途・診断用途で強力な方法として確立してきており、今後もテーラーメイド医療などへの応用が期待されている。
【０００４】
核酸分子を検出する方法として、標的核酸分子と相補的塩基対を形成するプローブ核酸を基板表面に固定化し、予め蛍光分子やＲＩなどの標識分子でラベルした標的核酸分子を反応させ、基板表面に標識分子が結合したかどうかを蛍光検出器等で検出する方法が利用される。
【０００５】
特に標的核酸分子とハイブリダイゼーションする多種類のプローブ核酸がマトリックス状に形成されたＤＮＡマイクロアレイの利用が活発になってきている。
【０００６】
ＤＮＡマイクロアレイ上には数千から数万種のプローブがマトリックス状に固定化されており、それぞれのプローブ分子に結合する核酸を検出することで同時に多種類の核酸分子を検出する事ができる。
【０００７】
生体試料からＤＮＡやＲＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡ分子に酵素反応などを利用して直接蛍光分子を標識する方法や、抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成しＰＣＲで増幅する際に蛍光分子を取り込ませる方法で標的核酸分子を蛍光分子で標識化し、マイクロアレイと反応させる方法がとられている。
【０００８】
また、標的核酸分子を蛍光分子等で標識しないでＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーション後に２本鎖ＤＮＡに特異的に結合するインターカレータなどの２本鎖認識体を添加し、２本鎖ＤＮＡに結合した２本鎖認識体を電極を介した電気化学的な測定により検出する方法も知られている（特許文献１参照）。
【０００９】
以下、そのような標的核酸分子に蛍光標識しない方法の遺伝子検出方法について図１５を参照しながら説明する。
【００１０】
図１５のように検出しようとする標的核酸分子を含むサンプルを遺伝子サンプル精製装置１０１に入れ、１本鎖に変性された標的核酸分子を含有する試料溶液を調整する。調整した試料溶液を反応槽１０２に送り、その後反応槽１０２を移動レール１０３上を所定の位置まで移動させた後、遺伝子センサ１０４を試料溶液中に浸漬する。遺伝子センサ１０４は核酸プローブ固定化電極が用いられており、反応槽１０２内の１本鎖に変性された標的核酸分子は遺伝子センサ１０４上の核酸プローブとハイブリダイゼーション反応する。ハイブリダイゼーション反応終了後、遺伝子センサ１０４を試料液体から引き上げ、洗浄タンク１０５から送られる洗浄液により洗浄して未反応の標的核酸分子を除いた後、検出槽１０６内に移動させる。検出槽１０６内には２本鎖認識体を含有する溶液が貯蔵されており、この２本鎖認識体が溶液中に浸漬した遺伝子センサ１０４の表面に形成された２本鎖核酸を認識して結合する。結合した２本鎖認識体が発する電気化学信号は、遺伝子センサ１０４により検出され、電気信号検出制御装置１０７により制御された後計算機１０８に入力されて解析される。
【特許文献１】特開平５−１９９８９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
このような従来の遺伝子検出方法では、標的核酸分子に蛍光分子を標識する反応を行わなくても検出することができるが、２本鎖認識体による２本鎖核酸の認識量に反応条件による変動があり、電気化学反応が不安定で反応雰囲気の影響を受けやすいため得られる検出値の精度を上げるために測定環境の制御に十分な注意を払わなければならないという課題があり、また、標的核酸分子に蛍光分子を標識する反応を行う場合は、標識反応が煩雑で大変であり測定誤差の原因になるという課題があり、一般的な蛍光色素などの標識分子を検知できる広く汎用されている分析機器を用いて、標的核酸分子に標識分子を標識しなくても検出することのできる遺伝子検知方法が要求されている。
【００１２】
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、標的核酸分子に対して標識分子を標識しなくても汎用型の検出機器をもちいて標的核酸分子を検出することのできる核酸分子検出方法を提供することを目的としている。
【００１３】
また、２本鎖認識体をはじめ蛍光色素などの標識分子は核酸プローブ以外の期待されていない場所にも非特異的に結合してしまうため、その結果非特異的な吸着をした標識分子まで検知してしまい検知精度が悪くなるという課題があり、非特異的吸着によって検知精度が悪化することのない核酸分子検出方法が要求されている。
【００１４】
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、非特異的吸着反応があっても検知精度に影響を受けず、精度良く標的核酸分子を検出できる検知精度の高い核酸分子検出方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の核酸分子検出方法は上記目的を達成するために、標的核酸分子と相補的な塩基配列を有し、ハイブリダイゼーション反応によって前記標的核酸分子と２本鎖核酸を形成することのできる１本鎖核酸プローブを用いて前記核酸分子の存在を検出する核酸分子検出法方法において、それぞれ異なる塩基配列を含んだ１種類以上の前記１本鎖核酸プローブが一つの生体分子検知チップ上のそれぞれ独立した領域に固定化されており、前記１本鎖核酸プローブには予め標識分子が結合されており、前記生体分子検知チップ上で前記１本鎖核酸プローブと前記標的核酸分子のハイブリダイゼーション反応をさせた後、１本鎖の核酸を特異的に分解する１本鎖核酸特異的分解酵素を反応させ、前記標的核酸分子と２本鎖核酸を形成していない前記１本鎖核酸プローブを切断し、前記生体分子検知チップ上から前記標識分子が失われることを検出し、前記標的核酸分子の存在を検出することを特徴とする核酸分子検出方法としたものである。
【００１６】
これにより、標的核酸分子に対して標識分子を標識しなくても簡単に標的核酸分子を検出することのできる核酸分子検出方法が得られる。
【００１７】
本発明の核酸分子検出方法は上記目的を達成するために、標的核酸分子と相補的な塩基配列を有し、ハイブリダイゼーション反応によって前記標的核酸分子と２本鎖核酸を形成することのできる１本鎖核酸プローブを用いて前記核酸分子の存在を検出する核酸分子検出法方法において、それぞれ異なる塩基配列を含んだ１種類以上の前記１本鎖核酸プローブが一つの生体分子検知チップ上のそれぞれ独立した領域に固定化されており、前記１本鎖核酸プローブには予め標識分子が結合されており、前記生体分子検知チップ上で前記１本鎖核酸プローブと前記標的核酸分子のハイブリダイゼーション反応をさせた後、２本鎖の核酸を特異的に分解する２本鎖核酸特異的分解酵素を反応させ、前記標的核酸分子と２本鎖核酸を形成した前記１本鎖核酸プローブを切断し、前記生体分子検知チップ上から前記標識分子が失われることを検出し、前記標的核酸分子の存在を検出することを特徴とする核酸分子検出方法としたものである。
【００１８】
これにより、標的核酸分子に対して標識分子を標識しなくても簡単に標的核酸分子を検出することのできる核酸分子検出方法が得られる。
【００１９】
本発明の核酸分子検出方法は上記目的を達成するために、１本鎖核酸プローブが標的核酸分子と相補的な標的塩基配列と、制限酵素に分解される制限酵素分解配列から構成されており、１本鎖核酸プローブと標的核酸分子をハイブリダイゼーション反応させた後、ポリメラーゼ反応を行い前記制限酵素分解配列を２本鎖核酸に変換し、さらに前記制限酵素分解配列を分解する制限酵素を反応させることで、前記標的核酸分子と２本鎖核酸を形成した前記１本鎖核酸プローブのみ切断することを特徴とした請求項２に記載の核酸分子検出方法としたものである。
【００２０】
これにより、標的核酸分子に対して標識分子を標識しなくても簡単に検知することができる核酸分子検出方法が得られる。
【００２１】
本発明の核酸分子検出方法は上記目的を達成するために、１本鎖核酸プローブが標的核酸分子と相補的な標的塩基配列と制限酵素に分解される同一の制限酵素分解配列を２つ以上含有しており、前記標的塩基配列が少なくとも２つの前記制限酵素分解配列にはさまれて配置されており、２つの前記制限酵素分解配列が２本鎖核酸を形成することによって前記１本鎖核酸プローブが投げ縄構造をとることを特徴とする請求項２に記載の核酸分子検出方法としたものである。
【００２２】
これにより、標的核酸分子に対して標識分子を標識しなくても簡単に検知することができる核酸分子検出方法が得られる。
【００２３】
本発明の核酸分子検出方法は上記目的を達成するために、標識分子が蛍光色素であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の核酸分子検出方法としたものである。
【００２４】
これにより、標的核酸分子に対して標識分子を標識しなくても簡単に汎用型の光学機器で検知することができる核酸分子検出方法が得られる。
【００２５】
本発明の核酸分子検出方法は上記目的を達成するために、標識分子が金属粒子であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の核酸分子検出方法としたものである。
【００２６】
これにより、標的核酸分子に対して標識分子を標識しなくても簡単に汎用型の光学機器あるいは質量分析機器で検知することができる核酸分子検出方法が得られる。
【００２７】
本発明の核酸分子検出方法は上記目的を達成するために、標識分子が磁性材料であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の核酸分子検出方法としたものである。
【００２８】
これにより、標的核酸分子に対して標識分子を標識しなくても簡単に磁気センサで検知することができる核酸分子検出方法が得られる。
【００２９】
本発明の核酸分子検出方法は上記目的を達成するために、標的核酸分子と相補的な塩基配列を有し、ハイブリダイゼーション反応によって前記標的核酸分子と２本鎖核酸を形成することのできる１本鎖核酸プローブを用いて前記核酸分子の存在を検出する核酸分子検出法方法において、それぞれ異なる塩基配列を含んだ１種類以上の前記１本鎖核酸プローブが一つの生体分子検知チップ上のそれぞれ独立した領域に固定化されており、前記標的核酸分子に標識分子を標識した後、前記生体分子検知チップ上で前記１本鎖核酸プローブと前記標的核酸をハイブリダイゼーション反応させ、前記生体分子検知チップ上に結合した前記標的核酸分子に結合させておいた標識分子を検出し、さらにハイブリダイゼーション反応によって形成された前記１本鎖核酸プローブと前記標的核酸分子の２本鎖核酸を解離させる解離反応を行い、前記標識分子で標識された前記標的核酸分子を前記生体分子検知チップから解離させた後、生体分子検知チップ上に残っている前記標識分子を検出し、前記生体分子検知チップ上に残った標識分子の検出量を前記解離反応の前後間で比較することによって、前記１本鎖核酸プローブに特異的に結合した前記標的核酸分子を検出することを特徴とした核酸分子検出方法としたものである。
【００３０】
これにより非特異的吸着反応があっても検知精度に影響を受けず、精度良く標的核酸分子を検出できる検知精度の高い核酸分子検出方法が得られる。
【００３１】
本発明の核酸分子検出方法は上記目的を達成するために、解離反応をアルカリ溶液で処理する反応としたことを特徴とする請求項８に記載の核酸分子検出方法としたものである。
【００３２】
これにより非特異的吸着反応があっても検知精度に影響を受けず、精度良く標的核酸分子を検出できる検知精度の高い核酸分子検出方法が得られる。
【００３３】
本発明の核酸分子検出方法は上記目的を達成するために、解離反応を変性剤溶液で処理する反応としたことを特徴とする請求項８に記載の核酸分子検出方法としたものである。
【００３４】
これにより非特異的吸着反応があっても検知精度に影響を受けず、精度良く標的核酸分子を検出できる検知精度の高い核酸分子検出方法が得られる。
【００３５】
本発明の核酸分子検出方法は上記目的を達成するために、解離反応を高温処理する反応としたことを特徴とする請求項８に記載の核酸分子検出方法としたものである。
【００３６】
これにより非特異的吸着反応があっても検知精度に影響を受けず、精度良く標的核酸分子を検出できる検知精度の高い核酸分子検出方法が得られる。
【００３７】
本発明の核酸分子検出方法は上記目的を達成するために、生体分子検知チップ上にアルカリ溶液、あるいは変性剤を含んだ溶液あるいは高温にした高温溶液を流入させることを特徴とする請求項９乃至１１のいずれかに記載の核酸分子検出方法としたものである。
【００３８】
これにより非特異的吸着反応があっても検知精度に影響を受けず、精度良く標的核酸分子を検出できる検知精度の高い核酸分子検出方法が得られる。
【００３９】
本発明の核酸分子検出方法は上記目的を達成するために、生体分子検知チップ自体を加熱することを特徴とする請求項１１に記載の核酸分子検出方法としたものである。
【００４０】
これにより非特異的吸着反応があっても検知精度に影響を受けず、精度良く標的核酸分子を検出できる簡便かつ検知精度の高い核酸分子検出方法が得られる。
【００４１】
本発明の核酸分子検出方法は上記目的を達成するために、金属層を備えた生体分子検知チップを用いる事を特徴とする請求項１１〜１３のいずれかに記載の核酸分子検出方法としたものである。
【００４２】
これにより非特異的吸着反応があっても検知精度に影響を受けず、精度良く標的核酸分子を検出できる検知精度の高い核酸分子検出方法が得られる。
【発明の効果】
【００４３】
本発明によれば、標的核酸分子を標識分子で標識しなくても汎用的な分析機器を用いて簡便に検知することのできる核酸分子検出方法を提供することができる。
【００４４】
また、非特異的吸着反応があっても検知精度が影響を受ける事がなく、精度良く標的核酸分子を検出できる検知精度の高い核酸分子検出方法が提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
本発明の請求項１記載の発明は、標的核酸分子と相補的な塩基配列を有し、ハイブリダイゼーション反応によって前記標的核酸分子と２本鎖核酸を形成することのできる１本鎖核酸プローブを用いて前記核酸分子の存在を検出する核酸分子検出法方法において、それぞれ異なる塩基配列を含んだ１種類以上の前記１本鎖核酸プローブが一つの生体分子検知チップ上のそれぞれ独立した領域に固定化されており、前記１本鎖核酸プローブには予め標識分子が結合されており、前記生体分子検知チップ上で前記１本鎖核酸プローブと前記標的核酸分子のハイブリダイゼーション反応をさせた後、１本鎖の核酸を特異的に分解する１本鎖核酸特異的分解酵素を反応させ、前記標的核酸分子と２本鎖核酸を形成していない前記１本鎖核酸プローブを切断し、前記生体分子検知チップ上から前記標識分子が失われることを検出し、前記標的核酸分子の存在を検出することを特徴とする核酸分子検出方法としたものであり、標的核酸分子と２本鎖核酸を形成した１本鎖核酸プローブのみを検出する際、１本鎖核酸プローブに予め結合されている標識分子を検出することにより、標的核酸分子に標識分子を結合させる反応を行うことなく標的核酸分子を検出することができるという作用を有する、また、標的核酸分子を含んだ溶液中に含まれる侠雑物の影響を受けることなく標識分子を１本鎖核酸プローブに結合させる反応を行う事ができるので再現性良く安定して標識分子を結合させることができるという作用を有する。
【００４６】
本発明の請求項２記載の発明は、標的核酸分子と相補的な塩基配列を有し、ハイブリダイゼーション反応によって前記標的核酸分子と２本鎖核酸を形成することのできる１本鎖核酸プローブを用いて前記核酸分子の存在を検出する核酸分子検出法方法において、それぞれ異なる塩基配列を含んだ１種類以上の前記１本鎖核酸プローブが一つの生体分子検知チップ上のそれぞれ独立した領域に固定化されており、前記１本鎖核酸プローブには予め標識分子が結合されており、前記生体分子検知チップ上で前記１本鎖核酸プローブと前記標的核酸分子のハイブリダイゼーション反応をさせた後、２本鎖の核酸を特異的に分解する２本鎖核酸特異的分解酵素を反応させ、前記標的核酸分子と２本鎖核酸を形成した前記１本鎖核酸プローブを切断し、前記生体分子検知チップ上から前記標識分子が失われることを検出し、前記標的核酸分子の存在を検出することを特徴とする核酸分子検出方法としたものであり、標的核酸分子と２本鎖核酸を形成していない１本鎖核酸プローブのみを検出する際、１本鎖核酸プローブに予め結合されている標識分子を検出することにより、標的核酸分子に標識分子を結合させる反応を行うことなく標的核酸分子を検出することができるという作用を有する。また、標的核酸分子を含んだ溶液中に含まれる侠雑物の影響を受けることなく標識分子を１本鎖核酸プローブに結合させる反応を行う事ができるので再現性良く安定して標識分子を結合させることができるという作用を有する。
【００４７】
本発明の請求項３記載の発明は、１本鎖核酸プローブが標的核酸分子と相補的な標的塩基配列と、制限酵素に分解される制限酵素分解配列から構成されており、１本鎖核酸プローブと標的核酸分子をハイブリダイゼーション反応させた後、ポリメラーゼ反応を行い前記制限酵素分解配列を２本鎖核酸に変換し、さらに前記制限酵素分解配列を分解する制限酵素を反応させることで、前記標的核酸分子と２本鎖核酸を形成した前記１本鎖核酸プローブのみ切断することを特徴とした請求項２に記載の核酸分子検出方法としたものであり、標的核酸分子と２本鎖核酸を形成した１本鎖核酸プローブの制限酵素分解配列をポリメラーゼ利用により２本鎖核酸に変換し制限酵素で切断できる２本鎖核酸とすることで、切断活性が高く安価な制限酵素を利用し、標的核酸分子と２本鎖核酸を形成している１本鎖核酸プローブのみを検出する際１本鎖核酸プローブに予め結合されている標識分子を検出することができるようになり、標的核酸分子に標識分子を結合させる反応を行うことなく標的核酸分子を検出する際に切断活性の高い安価な制限酵素を利用することができるという作用を有する。
【００４８】
本発明の請求項４記載の発明は、１本鎖核酸プローブが標的核酸分子と相補的な標的塩基配列と制限酵素に分解される同一の制限酵素分解配列を２つ以上含有しており、前記標的塩基配列が少なくとも２つの前記制限酵素分解配列にはさまれて配置されており、２つの前記制限酵素分解配列が２本鎖核酸を形成することによって前記１本鎖核酸プローブが投げ縄構造をとることを特徴とする請求項２に記載の核酸分子検出方法としたものであり、標的核酸分子と２本鎖核酸を形成した１本鎖核酸プローブは制限酵素分解配列が１本鎖核酸構造になる事によって、標的核酸分子と２本鎖核酸を形成していない１本鎖核酸プローブのみを制限酵素で切断することができるようになり、標的核酸分子と２本鎖核酸を形成している１本鎖核酸プローブのみを検出する際１本鎖核酸プローブに予め結合されている標識分子を検出することができるようになり、標的核酸分子に標識分子を結合させる反応を行うことなく標的核酸分子を検出する際に安価で分解活性の高い制限酵素を簡便に利用することができるという作用を有する。
【００４９】
本発明の請求項５記載の発明は、標識分子が蛍光色素であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の核酸分子検出方法としたものであり、標的核酸分子と２本鎖核酸を形成している１本鎖核酸プローブを検知する際、１本鎖核酸プローブに予め結合されている蛍光分子を蛍光検知可能な装置を用いて簡便に検知できるようになり、蛍光分子を標識分子として標的核酸分子に結合させるための結合反応をすることなく簡便な蛍光検知システムを利用して標的核酸分子を検知できるという作用を有する。
【００５０】
本発明の請求項６記載の発明は、標識分子が金属粒子であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の核酸分子検出方法としたものであり、標的核酸分子と２本鎖核酸を形成している１本鎖核酸プローブを検知する際、１本鎖核酸プローブに予め結合されている金属粒子を簡便な光学機器を用いて簡便に検知できるようになり、金属粒子を標識分子として標的核酸分子に結合させるための結合反応をすることなく簡便な光学機器を利用して標的核酸分子を検知できるという作用を有する。
【００５１】
本発明の請求項７記載の発明は、標識分子が磁性材料であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の核酸分子検出方法としたものであり、標的核酸分子と２本鎖核酸を形成している１本鎖核酸プローブを検知する際、１本鎖核酸プローブに予め結合されている磁性材料を磁気センサを用いて高感度に検知できるようになり、磁性材料を標識分子として標的核酸分子に結合させるための結合反応をすることなく磁気センサを利用して標的核酸分子を高感度に検知できるという作用を有する。
【００５２】
本発明の請求項８記載の発明は、標的核酸分子と相補的な塩基配列を有し、ハイブリダイゼーション反応によって前記標的核酸分子と２本鎖核酸を形成することのできる１本鎖核酸プローブを用いて前記核酸分子の存在を検出する核酸分子検出法方法において、それぞれ異なる塩基配列を含んだ１種類以上の前記１本鎖核酸プローブが一つの生体分子検知チップ上のそれぞれ独立した領域に固定化されており、前記標的核酸分子に標識分子を標識した後、前記生体分子検知チップ上で前記１本鎖核酸プローブと前記標的核酸をハイブリダイゼーション反応させ、前記生体分子検知チップ上に結合した前記標的核酸分子に結合させておいた標識分子を検出し、さらにハイブリダイゼーション反応によって形成された前記１本鎖核酸プローブと前記標的核酸分子の２本鎖核酸を解離させる解離反応を行い、前記標識分子で標識された前記標的核酸分子を前記生体分子検知チップから解離させた後、生体分子検知チップ上に残っている前記標識分子を検出し、前記生体分子検知チップ上に残った標識分子の検出量を前記解離反応の前後間で比較することによって、前記１本鎖核酸プローブに特異的に結合した前記標的核酸分子を検出することを特徴とした核酸分子検出方法としたものであり、標識分子を結合した標的核酸分子が１本鎖核酸プローブ以外に非特異的に結合してしまった場合でも、特異的に１本鎖核酸プローブに結合し２本鎖核酸を形成した標的核酸分子を１本鎖核酸プローブから解離させ、解離前後の標識分子の変化量を検知することによって１本鎖核酸プローブに特異的に結合した標的核酸分子のみ検知することができるようになるという作用を有する。
【００５３】
本発明の請求項９記載の発明は、解離反応をアルカリ溶液で処理する反応としたことを特徴とする請求項８に記載の核酸分子検出方法としたものであり、アルカリ溶液による簡便な処理で特異的に１本鎖核酸プローブに結合し２本鎖核酸を形成した標的核酸分子を１本鎖核酸プローブから解離させることができるようになり、簡便な操作で１本鎖核酸プローブに特異的に結合した標的核酸分子のみ検知することができるようになるという作用を有する。
【００５４】
本発明の請求項１０記載の発明は、解離反応を変性剤溶液で処理する反応としたことを特徴とする請求項８に記載の核酸分子検出方法としたものであり、変性剤溶液による簡単な処理で特異的に１本鎖核酸プローブに結合し２本鎖核酸を形成した標的核酸分子を１本鎖核酸プローブから解離させることができるようになり、簡単な操作で１本鎖核酸プローブに特異的に結合した標的核酸分子のみ検知することができるようになるという作用を有する。
【００５５】
本発明の請求項１１記載の発明は、解離反応を高温処理する反応としたことを特徴とする請求項８に記載の核酸分子検出方法としたものであり、高温処理で特異的に１本鎖核酸プローブに結合し２本鎖核酸を形成した標的核酸分子を１本鎖核酸プローブから解離させることができるようになり、薬剤を利用することなく簡便な高温処理装置で１本鎖核酸プローブに特異的に結合した標的核酸分子のみ検知することができるようになるという作用を有する。
【００５６】
本発明の請求項１２記載の発明は、生体分子検知チップ上にアルカリ溶液、あるいは変性剤を含んだ溶液あるいは高温にした高温溶液を流入させることを特徴とする請求項９、１０、１１のいずれかに記載の核酸分子検出方法としたものであり、処理溶液を生体分子検知チップ上に流入させることによって１本鎖核酸プローブに結合し２本鎖核酸を形成した標的核酸分子を１本鎖核酸プローブから効率良く解離させることができるようになり、処理溶液の流入によって解離された標的核酸分子を生体分子検知チップ上から洗い流すことができるようになり、１本鎖核酸プローブに特異的に結合した標的核酸分子のみ効率良く検知することができるようになるという作用を有する。
【００５７】
本発明の請求項１２記載の発明は、生体分子検知チップ自体を加熱することを特徴とする請求項１１に記載の核酸分子検出方法としたものであり、簡単な加熱手段によって簡単に１本鎖核酸プローブに結合し２本鎖核酸を形成した標的核酸分子を１本鎖核酸プローブから解離させることができるようになり、１本鎖核酸プローブに特異的に結合した標的核酸分子のみ簡単に検知することができるようになるという作用を有する。
【００５８】
本発明の請求項１４記載の発明は、金属層を備えた生体分子検知チップを用いる事を特徴とする請求項１１〜１３のいずれかに記載の核酸分子検出方法としたものであり、高温処理によって標的核酸分子を解離させる場合、生体分子検知チップの温度を迅速に変化させることができるようになり、迅速に標的核酸分子を解離させることで、迅速に１本鎖核酸プローブに特異的に結合した標的核酸分子のみ簡単に検知することができるようになるという作用を有する。
【００５９】
以下本発明の実施の形態について図面を参照しながら説明する。
【００６０】
（実施の形態１）
図１は本発明の請求項１に記載の核酸分子検出方法を示しており、図１（Ａ）は本発明の核酸分子検出方法に用いられる１本鎖核酸プローブ１が固定化された生体分子検知チップ２の構成を示しており、図１（Ｂ）〜図１（Ｄ）は本発明の核酸分子検出方法の手順を示しており、図１（Ｂ）はハイブリダイゼーション前の生体分子検知チップ２を示しており、図１（Ｃ）はハイブリダイゼーション後の生体分子検知チップ２を示しており、図１（Ｄ）は核酸分解酵素反応後の生体分子検知チップ２を示している。
【００６１】
図１（Ａ）に示すように本発明の核酸分子検出方法は、それぞれ異なる塩基配列を含んだ１種類以上の１本鎖核酸プローブ１が一つの生体分子検知チップ２上のそれぞれ独立した領域に固定されたものを利用して検知する方法を示している。１本鎖核酸プローブ１は、例えば合成されたＤＮＡ分子が用いられ、特定の生物由来の遺伝物質を検知するために、生物由来のＤＮＡやＲＮＡに対して相補的な塩基配列を有しており、結合の特異性を高めるために２０〜数百塩基の長さのＤＮＡ分子が利用される。例えば特定の細菌を検出するために、細菌のゲノム情報を元に細菌ゲノムに対する相補的な塩基配列を１本鎖核酸プローブ１に含ませることで検知可能となる。例えばＶＯＣ分解菌であるＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ  １９５Ｒを検出するためにＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ  １９５Ｒのゲノム上のＩＴＳを含む数十〜数百の塩基配列を１本鎖核酸プローブ１として利用される。また、同一サンプル中に含まれる複数種類の標的核酸分子４を同時に検出するために、複数種類の標的核酸分子４に対して相補的な塩基配列を有した複数種類の１本鎖核酸プローブ１が生体分子検知チップ２上にそれぞれ独立した領域に固定化されている。独立した領域とは円形や四角形など規定された一つの領域を指し、互いに結合していない２次元平面状に分布した領域を指し、例えば円形スポットが数十〜数百個並んだＤＮＡマイクロアレイやマイクロウェルプレートが利用されている。ＤＮＡマイクロアレイの場合数十μｍ〜数百μｍの直径を有する円形スポットが数十μｍ〜数百μｍの間隙をあけて２次元平面上に配設される。生体分子検知チップ２としては平面を有したガラス、樹脂、金属などが利用されており、ＤＮＡマイクロアレイの場合はスライドガラスが良く利用されている。１本鎖核酸プローブ１を生体分子検知チップ２に固定化する方法は、１本鎖核酸プローブ１を含んだ溶液を生体分子検知チップ２上に滴下し乾燥させる方法や、生体分子検知チップ２上にシランやチオールなどの分子種を利用して官能基を導入し、１本鎖核酸プローブ１とカップリング反応させる方法や、光重合反応を利用して生体分子検知チップ２上で１本鎖核酸プローブを合成する方法が利用される。
【００６２】
図１（Ｂ）に示すように予め標識分子３が結合された１本鎖核酸プローブ１が生体分子検知チップ２上に固定化されており、そこに変性させて１本鎖にした標的核酸分子４を滴下し、ハイブリダイゼーション反応を行う。標識分子３は例えば蛍光色素や発光タンパク質などの光強度を検知することによって検出が可能な分子が利用されるが、標識分子３の物理的特性を利用して検知できる物質であればこれらに限定されることなく利用することができ、蛍光分子の他には例えば金属粒子などの重量を持った顆粒をＱＣＭなどの手法を利用して検出することもできる。例えば、Ｃｙ３やＣｙ５などの蛍光色素が用いられ、発光タンパク質としてはルシフェラーゼやＧＦＰなどが用いられる。標識分子３の検知手段としては、例えば蛍光色素を標識分子３として利用する場合は蛍光顕微鏡や、蛍光スキャナなどの蛍光分子の輝度を検出し蛍光分子の存在量を検出するシステムが利用される。標的核酸分子４を１本鎖に変性させる方法としては、例えば生物試料からＤＮＡ分子をラウリル硫酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、リン酸ラウリル、カプリレート塩、コレート塩、スルフォンなどのアニオン性界面活性剤処理で抽出させた後、抽出されたＤＮＡをハイドロキシアパタイトカラムを利用して精製し、あるいはアルコール沈殿方法を利用して精製し、精製されたＤＮＡ分子を水の沸点近くの９４℃で１分間処理して熱変性させる方法がある。ハイブリダイゼーション反応の方法としては例えば、ＤＮＡマイクロアレイなどの生体分子検知チップ２上の１本鎖核酸プローブ１が固定されている領域に熱変性された標的核酸分子４を含んだ水溶液１０μｌ〜数百μｌを滴下し、水溶液が蒸発して乾燥してしまわないようにカバーガラスなどでシーリングし、４０〜６０℃の温度下に１時間から２４時間静置反応させる方法がある。ハイブリダイゼーション反応時に標的核酸分子４は相補的な塩基配列を有した１本鎖核酸プローブ１と相補的塩基対を形成して結合し安定した２本鎖核酸を形成する。
【００６３】
図１（Ｃ）に示すようにハイブリダイゼーション反応によって１本鎖核酸プローブ１と相補的な塩基配列を有する標的核酸分子４が存在する場合は、１本鎖核酸プローブ１と標的核酸分子４が相補的塩基対によって２本鎖核酸５を形成する。一方、１本鎖核酸プローブ１と相補的な塩基配列を有する標的核酸分子４が存在しない場合は、１本鎖核酸プローブは１本鎖のままである。この２本鎖核酸５に１本鎖の核酸を選択的に分解する１本鎖核酸特異的分解酵素６を反応させる。１本鎖核酸特異的分解酵素６としては、例えばＳ１ヌクレアーゼを用いることができ、３７℃でＳ１ヌクレアーゼを生体分子検知チップ２上で反応させることによって標的核酸分子４と２本鎖核酸５を形成していない１本鎖核酸プローブ１を選択的に分解することができる。ハイブリダイゼーション反応後、例えばＳ１ヌクレアーゼを０．１％〜１．０％になるように溶解させた水溶液をピペットなどを用いて生体分子検知チップ２上に滴下し、３７℃のインキュベーター内に３０分〜２４時間整置させることで反応させることができる。また、１本鎖核酸特異的分解酵素６としてはＳ１ヌクレアーゼに限定されるものでなく、蛇毒ヌクレアーゼやスタフィロコッカスヌクレアーゼなど他の酵素や配列特異性をもつリボザイムなども同様に利用することができる。
【００６４】
図１（Ｄ）に示すように１本鎖核酸特異的分解酵素６は、標的核酸分子４と結合せずに２本鎖核酸５を形成していない１本鎖核酸プローブ１のみを分解切断する。
【００６５】
２本鎖核酸５を形成していない１本鎖核酸プローブのみを分解切断することによって、２本鎖核酸分子５のみを生体分子検知チップ２上に残すことができる。また、標的核酸分子４と相補的塩基配列を有していながら標的核酸分子４とは異なる塩基配列を持つ１本鎖核酸プローブ１を用いれば、例えば、塩基配列を１塩基ずつ変化もしくは延長させた１本鎖核酸プローブ１を多数用いることによって標的核酸分子４の塩基配列を調べることもできる。
【００６６】
１本鎖核酸プローブ１は予め標識分子３が結合しているので、生体分子検知チップ２上から標識分子３が失われた場所を検知することによって、生体分子検知チップ２上に標識分子３を保持している１本鎖核酸プローブ１を検出することができる。
【００６７】
したがって、標的核酸分子４の存在量に依存して生体分子検知チップ２上から失われる標識分子３の量が減少することになり、標識分子３を定量することによって標的核酸分子４の存在量を定量することが可能となる。
【００６８】
例えば、１本鎖核酸特異的分解酵素６を反応させた後、７．５％塩化ナトリウムの生理食塩水やＰＢＳなどの洗浄液１０ｍｌで生体分子検知チップ２上の反応液をピペットなどで洗い流し、１本鎖核酸特異的分解酵素６及び分解された１本鎖核酸プローブ１を除去し、さらに純水で洗浄した後に乾燥室などを用いて３７℃で１０分間処理し生体分子検知チップ２を乾燥させる。標識分子３として蛍光分子を用いる場合は、生体分子検知チップ２を蛍光顕微鏡などの蛍光分子を検知する装置によって観察することによって、生体分子検知チップ２上に標識分子３を保持している１本鎖核酸プローブ１を検出することができる。また、蛍光スキャナなどを用いて、定量的に蛍光分子の量を計測する方法が用いられる。
【００６９】
上記構成において、標的核酸分子４に標識分子３を結合させる煩雑で再現性の悪い反応工程を経ることなく、簡便に標的核酸分子４を検知することができ、かつ標識分子３は予め生体分子検知チップ２に結合されているので、汎用型の分析機器をもちいて簡便に感度良く検出することができる核酸検出方法となる。
【００７０】
また、標識分子３を定量することによって、標的核酸分子４の存在量を定量することができ、生体分子検知チップ２上に固定化されている１本鎖核酸プローブ１の種類数に応じて多種類の標的核酸分子４を同時に定量することが可能となり、簡便に感度良く多種類の核酸を検出することができる核酸分子検出方法となる。
【００７１】
（実施の形態２）
図２は本発明の請求項２に記載の核酸分子検出方法を示しており、図２（Ａ）〜図２（Ｃ）は本発明の核酸分子検出方法の手順を示しており、図２（Ａ）はハイブリダイゼーション前の生体分子検知チップ２を示しており、図２（Ｂ）はハイブリダイゼーション後の生体分子検知チップ２を示しており、図２（Ｃ）は核酸分解酵素反応後の生体分子検知チップ２を示している。
【００７２】
図２において実施の形態１と異なるところは、ハイブリダイゼーション反応後に反応させる分解酵素を２本鎖核酸特異的分解酵素７とした点である。図２において、実施の形態１と同じ構成要素については同じ符号を用いその説明を省略する。
【００７３】
図２（Ａ）に示すように本発明の核酸分子検出方法は、標的核酸分子４と１本鎖核酸プローブ１とのハイブリダイゼーション反応を基本としている。
【００７４】
図２（Ｂ）に示すようにハイブリダイゼーション反応を行うと、標的核酸分子４は相補的塩基配列を含んだ１本鎖核酸プローブ１に結合し２本鎖核酸５を形成する。
【００７５】
図２（Ｃ）に示すように、ハイブリダイゼーション後に、２本鎖核酸特異的分解酵素７を生体分子検知チップ２上に反応させることによって標的核酸分子４と結合し２本鎖核酸５を形成している１本鎖核酸プローブ１が分解され、標的核酸分子４と結合していない１本鎖核酸プローブ１は生体分子検知チップ２上に残る。２本鎖核酸特異的分解酵素７としては、例えばＲＮａｓｅＨなどを利用することができ、この場合１本鎖核酸プローブ１としてはＲＮＡで構成されたものを利用しＤＮＡで構成された標的核酸分子４を検知することができる。ＲＮａｓｅＨこれ以外であっても１本鎖核酸は分解せずに２本鎖核酸のみを分解するヌクレアーゼであれば何れの場合も同じように利用できる。ハイブリダイゼーション反応後、例えば２０Ｕ／ｍｌのＲＮａｓｅＨ溶液をピペットなどを用いて生体分子検知チップ２上に滴下し、３７℃のインキュベーター内に整置させ３０分間反応させることで標的核酸分子４であるＤＮＡに結合した１本鎖核酸プローブ１であるＲＮＡ分子を特異的に分解することができる。
【００７６】
標的核酸分子４の存在量に依存して生体分子検知チップ２上から失われる標識分子３の量が増加することになり、標識分子３を定量することによって標的核酸分子４の存在量を定量することが可能となる。
【００７７】
上記構成において、標的核酸分子４に標識分子３を結合させる煩雑で再現性の悪い反応工程を経ることなく、簡便に標的核酸分子４を検知することができ、かつ標識分子３は予め生体分子検知チップ２に結合されているので、汎用型の分析機器をもちいて簡便に感度良く検出することができる核酸分子検出方法となる。
【００７８】
（実施の形態３）
図３は本発明の請求項３に記載の核酸分子検出方法を示しており、図３（Ａ）〜図３（Ｃ）は本発明の核酸分子検出方法の手順を示しており、図３（Ａ）はハイブリダイゼーション前の生体分子検知チップ２を示しており、図３（Ｂ）はハイブリダイゼーション後の生体分子検知チップ２を示しており、図３（Ｃ）は核酸伸長反応後の生体分子検知チップ２を示しており、図３（Ｄ）は核酸分解酵素反応後の生体分子検知チップ２を示している。
【００７９】
図３において実施の形態１、２と異なるところは、１本鎖核酸プローブ１が標的核酸分子４と相補的な標的塩基配列８と制限酵素９に分解される制限酵素分解配列１０から構成されており、ハイブリダイゼーション反応後にポリメラーゼ１１を用いてポリメラーゼ反応をさせ、その後、制限酵素９を反応させる点である。図３において、実施の形態１と同じ構成要素については同じ符号を用いその説明を省略する。
【００８０】
図３（Ａ）に示すように、同一分子内に標的核酸分子４と相補的な標的塩基配列８と制限酵素９に分解される制限酵素分解配列１０から構成された１本鎖核酸プローブ１が固定化された生体分子検知チップ２上に、標的核酸分子４を反応させる。
【００８１】
図３（Ｂ）に示すように、ハイブリダイゼーション反応によって標的核酸分子４は標的塩基配列８と相補的塩基対を形成し２本鎖核酸５を形成する。一方で、標的核酸分子４と相補的な標的塩基配列８を持たない１本鎖核酸プローブ１は２本鎖核酸を形成しない。次に、ポリメラーゼ１１を反応させポリメラーゼ反応させる。ポリメラーゼ１１としては例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼが利用され、２〜５Ｕ／μｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼと２〜２００μｍｏｌ／ｌのｄＮＴＰを溶解した水溶液を生体分子検知チップ２上にピペットなどを用いて載せ、ブロックインキュベーターなどを用いて７２℃で１０分間インキュベートさせる方法が取られる。
【００８２】
図３（Ｃ）に示すように、ポリメラーゼ反応により核酸が伸長され、１本鎖の状態であった制限酵素分解配列１０も２本鎖核酸５になり、制限酵素９によって分解され得る構造に変化する。次に、制限酵素９が溶解した水溶液を生体分子検知チップ２上に添加し、制限酵素９を反応させる。制限酵素９としては例えばＥｃｏＲＩなどが利用され、この場合制限酵素分解配列１０としては５’−ＧＡＡＴＴＣ―３‘の塩基配列が用いられる。またＥｃｏＲＩ以外の制限酵素９を用いても、２本鎖核酸５の形態をとった制限酵素分解配列１０を分解し、１本鎖状態の制限酵素分解配列１０は分解しない分解酵素であれば、制限酵素９が特異的に分解する塩基配列を持った制限酵素分解配列１０を用いることができる。ポリメラーゼ反応後、例えばＥｃｏＲＩを１０Ｕ／μｌになるように溶解した水溶液をピペットなどを用いて生体分子検知チップ２上に滴下し、３７℃のインキュベーター内に３０分〜２４時間整置させることで反応させることができる。
【００８３】
図３（Ｄ）に示すように、制限酵素９が反応することによって２本鎖核酸５を形成した制限酵素分解配列１０で分解させ、予め標識分子３が結合されていた１本鎖核酸プローブ１が生体分子検知チップ２上から失われる。
【００８４】
したがって、標的核酸分子４の存在量に依存して生体分子検知チップ２上から失われる標識分子３の量が増加することになり、標識分子３を定量することによって標的核酸分子４の存在量を定量することが可能となる。
【００８５】
上記構成において、標的核酸分子４に標識分子３を結合させる煩雑で再現性の悪い反応工程を経ることなく、簡便に標的核酸分子４を検知することができ、かつ標識分子３は予め生体分子検知チップ２に結合されているので、汎用型の分析機器をもちいて簡便に感度良く検出することができる核酸分子検出方法となる。
【００８６】
（実施の形態４）
図４は本発明の請求項４に記載の核酸分子検出方法を示しており、図４（Ａ）〜図４（Ｃ）は本発明の核酸分子検出方法の手順を示しており、図４（Ａ）はハイブリダイゼーション前の生体分子検知チップ２を示しており、図４（Ｂ）はハイブリダイゼーション後の生体分子検知チップ２を示しており、図４（Ｃ）は核酸分解酵素反応後の生体分子検知チップ２を示している。
【００８７】
図４において実施の形態２と異なるところは、１本鎖核酸プローブ１が標的核酸分子４と相補的な標的塩基配列８と制限酵素に分解される制限酵素分解配列１０を２つ以上含有しており、生体分子検知チップ２上において２つの前記制限酵素分解配列が２本鎖核酸を形成することによって投げ縄構造１２を形成している点であり、ハイブリダイゼーション反応後に反応させる分解酵素を制限酵素９とした点である。投げ縄構造１２とは図４（Ａ）のように２つの制限酵素分解配列１０が相補的塩基対を形成し、２つの制限酵素分解配列１０に挟まれた標的塩基配列８が１本鎖の状態で輪を形成している状態のことをさす。図４において、実施の形態２と同じ構成要素については同じ符号を用いその説明を省略する。
【００８８】
図４（Ａ）に示すように、１本鎖核酸プローブ１上の制限酵素分解配列１０は互いに相補的塩基対を形成し投げ縄構造１２を形成している。投げ縄構造１２としては２本鎖核酸構造５を形成する二つの制限酵素分解配列１０が相補的塩基対を形成することによって、制限酵素分解配列１０に挟まれた標的塩基配列８がループ状の１本鎖核酸を維持している状態を指す。制限酵素分解配列１０として、例えばＥｃｏＲＩが特異的に分解する配列として５’−ＧＡＡＴＴＣ―３‘を用いることができ、この場合ＧとＣ、ＡとＴ、ＡとＴ、ＴとＡ、ＴとＡ、ＣとＧがそれぞれ相補的塩基対を形成することで投げ縄構造１２を形成することができる。生体分子検知チップ２上に標的核酸分子４をハイブリダイゼーション反応させる。
【００８９】
図４（Ｂ）に示すように、標的核酸分子４をハイブリダイゼーション反応させると投げ縄構造１２の中で１本鎖核酸であった標的塩基配列８と標的核酸分子４が相補的塩基対を形成し２本鎖核酸５を形成する際に、制限酵素分解配列１０同士の相補的塩基対が解離し１本鎖になる。例えばＥｃｏＲＩ分解配列を使用する場合制限酵素分解配列１０は６塩基の長さになり、他の制限酵素９に対する分解配列もおおむね６塩基程度の長さである。ハイブリダイゼーション反応の際、１本鎖核酸プローブ１及び標的核酸分子４を反応させる溶液を例えば９４℃に処理し熱変性させる。熱変性後、反応させる溶液の温度を例えば６０℃程度に低下させることによって相補的な塩基配列を持つ核酸同士は２本鎖核酸５を形成するが、標的核酸分子４及び標的塩基配列８は２０塩基以上の長さであるので６塩基の長さの制限酵素分解配列よりも安定に２本鎖核酸５を形成する。標的核酸分子４と標的塩基配列８が２本鎖核酸５を安定に形成することによって、標的塩基配列と２本鎖核酸５を形成していない標的核酸４上の余剰の塩基配列が、制限酵素分解配列１０同士の結合を立体的に傷害する。従って、標的核酸分子４と相補的塩基対を形成する１本鎖核酸プローブ１は、制限酵素分解配列１０同士が結合できなくなり、制限酵素分解配列１０は２本鎖核酸５を形成できない状態となる。一方、標的核酸分子４と相補的塩基対を形成しなかった１本鎖核酸プローブ１は制限酵素分解配列１０同士が立体障害受けずに２本鎖核酸５を形成し再び投げ縄構造１２を形成する。
【００９０】
図４（Ｃ）に示すように、ハイブリダイゼーション反応後に制限酵素９を生体分子検知チップ２に反応させると、投げ縄構造１２が開裂して１本鎖の状態の制限酵素分解配列は分解されずに生体分子検知チップ２上に保持される。一方、標的核酸分子４と結合せずに投げ縄構造１２を形成している１本鎖核酸プローブ１は制限酵素分解配列同士が２本鎖核酸５を形成しているので、制限酵素９によって分解を受け生体分子検知チップ２上から解離する。
【００９１】
上記構成において、標的核酸分子４に標識分子３を結合させる煩雑で再現性の悪い反応工程を経ることなく、簡便に標的核酸分子４を検知することができ、かつ標識分子３は予め生体分子検知チップ２に結合されているので、汎用型の分析機器をもちいて簡便に感度良く検出することができる核酸検出方法となる。また、安価で分解活性の高い制限酵素を簡便に利用することができるため、安価に感度良く標的核酸分子４を検知できる核酸分子検出方法となる。
【００９２】
（実施の形態５）
図５は本発明の請求項５に記載の核酸分子検出方法を示しており、図５（Ａ）は蛍光分子１３を利用した標識分子３の検出方法を示しており、図５（Ｂ）は検出された生体分子検知チップ２上の標識分子の観察像を示している。
【００９３】
図５は、本発明の核酸分子検出方法において、標識分子３として蛍光分子１３を使用する方法を示している。図５において、実施の形態２と同じ構成要素については同じ符号を用いその説明を省略する。
【００９４】
図５（Ａ）に示すように、１本鎖核酸プローブ１には予め蛍光分子１３が結合されている。生体分子検知チップ２上の蛍光分子１３の量を計測するために、ハイブリダイゼーション反応と分解反応の後に、生体分子検知チップ２を７．５％〜９％の生理食塩水あるいはＰＢＳなどの洗浄液で洗浄した後、励起光源１４から励起光１５を生体分子検知チップ２上に照射し、その反射光１６を受光手段１７によって受光し、蛍光分子１３を検出する。蛍光分子としては、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５などが利用され、特定波長の励起光を分子に照射することによって励起光とは異なる波長の反射光を発する性質を持っている。蛍光分子１３は例えばグルタールアルデヒドなどを用いて１本鎖核酸プローブ１に結合される。Ｃｙ３を用いる場合は例えば５５０ｎｍの波長の光を出すＬＥＤを励起光源として用いることで、Ｃｙ３は反射光１６として５７０ｎｍの波長の光を反射する。反射された反射光１６を例えばバンドパスフィルターを通過させた後にＣＣＤなどの受光手段１７を用いて光電変換することによって、蛍光分子１３の量を計測することができる。
【００９５】
図５（Ｂ）に示すように、蛍光分子１３が除去されたスポットは暗点１８として観察され、蛍光分子１３が残っているスポットは明点１９として観察される。このように生体分子検知チップ２上のスポットの蛍光の強さを測定することによって、生体分子検知チップ２上に残っている蛍光分子１３の量を計測することができる。
【００９６】
上記構成において、標的核酸分子４と２本鎖核酸５を形成している１本鎖核酸プローブ１を検知する際、１本鎖核酸プローブ１に予め結合されている蛍光分子１３を蛍光検知可能な装置を用いて簡便に検知できるようになり、蛍光分子１３を標識分子３として標的核酸分子４に結合させるための結合反応をすることなく簡便な蛍光検知システムを利用して標的核酸分子を検知できる核酸分子検出方法となる。
【００９７】
（実施の形態６）
図６は本発明の請求項６に記載の核酸分子検出方法を示しており、図６（Ａ）は金属粒子２０を利用した標識分子３の検出方法を示しており、図６（Ｂ）は金属粒子２０を利用した標識分子３の別の検出方法を示している。
【００９８】
図６は、本発明の核酸分子検出方法において、標識分子３として金属粒子２０を使用する方法を示している。図６において、実施の形態５と同じ構成要素については同じ符号を用いその説明を省略する。
【００９９】
図６（Ａ）に示すように、１本鎖核酸プローブ１には予め金属粒子２０が結合されている。ハイブリダイゼーション反応と分解反応の後に、生体分子検知チップ２を７．５％〜９％の生理食塩水あるいはＰＢＳなどの洗浄液１０ｍｌで洗浄した後、生体分子検知チップ２上の金属粒子２０の量を計測するために、励起光源１４から励起光１５を生体分子検知チップ２上に照射し、その反射光１６を受光手段１７によって受光し、蛍光分子１３を検出する。金属粒子２０としては、例えば金、銀、白金、カドミウムセレナイドなどの金属が用いられ、粒子径としては例えば１ｎｍ〜１００ｎｍの粒径が用いられる。例えば金粒子を用いる場合はチオール基を介して１本鎖核酸プローブ１が結合される。励起光源１４から励起光１５を照射されることによって金粒子はプラズモン共鳴のため赤紫を呈し、赤紫色の反射光１６を受光手段１７で受光することによって、金粒子を検出することができる。
【０１００】
図６（Ｂ）は金属粒子２０を標識分子３として利用する場合のＳＰＲの原理を用いた検知方法を示している。図６（Ｂ）に示すように、１本鎖核酸プローブ１は金属薄膜２１で構成された生体分子検知チップ２上に固定化されている。金属粒子２０としては例えば金、銀、白金、カドミウムセレナイドなどの金属が用いられ、粒子径としては例えば１ｎｍ〜１００ｎｍの粒径が用いられるが、質量を有するものであればいずれのものを用いてもかまわない。金属薄膜２１としては金、銀、白金などが用いられる。生体分子検知チップ２の１本鎖核酸プローブ１が固定化されていない裏面から励起光源１４によって励起光１５を照射し、その反射光１６を受光手段１７によって受光する。表面プラズモン共鳴によって、生体分子検知チップ２上に残っている１本鎖核酸プローブ１の質量に応じて反射光１６の反射角度が変化し、反射光１６の反射角度の変化を受光手段１７が検出することによって、生体分子検知チップ２上の１本鎖核酸プローブ１の量が検出される。１本鎖核酸プローブ１には質量のある金属粒子２０があらかじめ結合されているので、わずかな量の変化でも感度良く検出することができるようになる。なお、質量の大きな分子を１本鎖核酸プローブ１に結合させることによって表面プラズモン共鳴による感度が大きくなるため、質量の大きな分子であれば金属以外の粒子を用いることができる。
【０１０１】
上記構成において、標的核酸分子４と２本鎖核酸５を形成している１本鎖核酸プローブ１を検知する際、１本鎖核酸プローブ１に予め結合されている金属粒子２０を簡便な光学機器を用いて簡便に検知できるようになり、金属粒子２０を標識分子３として標的核酸分子４に結合させるための結合反応をすることなく簡便な光学機器を利用して標的核酸分子４を検知できる核酸分子検出方法となる。
【０１０２】
（実施の形態７）
図７は、本発明の請求項７に記載の核酸分子検出方法において、標識分子３として磁性材料２２を使用する方法を示している。図７において、実施の形態５と同じ構成要素については同じ符号を用いその説明を省略する。
【０１０３】
図７に示すように、１本鎖核酸プローブ１には予め磁性材料２２が結合されている。生体分子検知チップ２上の磁性材料２２の量を計測するために、ハイブリダイゼーション反応と分解反応の後に、生体分子検知チップ２を７．５％〜９％の生理食塩水あるいはＰＢＳなどの洗浄液１０ｍｌで洗浄した後、磁気センサ２３を生体分子検知チップ２上に走査することによって、磁性材料２２を結合した１本鎖核酸プローブ１の量が定量される。磁性材料２２としては、例えば、希土類などの硬質磁性材料で形成された粒子が用いられ、磁気センサ２３としては、例えば磁電変換作用を利用したホール素子や、磁気抵抗効果素子が用いられる。
【０１０４】
上記構成において、標的核酸分子と２本鎖核酸を形成している１本鎖核酸プローブ１を検知する際、１本鎖核酸プローブ１に予め結合されている磁性材料２２を磁気センサ２３で高感度に検知できるようになり、磁性材料２２を標識分子３として標的核酸分子４に結合させるための結合反応をすることなく磁気センサ２３を利用して標的核酸分子４を高感度に検知できる核酸検出方法となる。
【０１０５】
（実施の形態８）
図８は本発明の請求項８に記載の核酸分子検出方法を示しており、図８（Ａ）はハイブリダイゼーション前の生体分子検知チップ２を示しており、図８（Ｂ）はハイブリダイゼーション後の生体分子検知チップを示しており、図８（Ｃ）は解離反応後の生体分子検知チップ２を示しており、図８（Ｄ）はハイブリダイゼーション反応のみの信号を検出する方法を示している。
【０１０６】
図８に示すように本発明の核酸検出方法は、それぞれ異なる塩基配列を含んだ１種類以上の１本鎖核酸プローブ１が一つの生体分子検知チップ２上のそれぞれ独立した領域に固定されたものを利用して検知する方法において、それぞれ異なる塩基配列を含んだ１種類以上の前記１本鎖核酸プローブ１が一つの生体分子検知チップ２上のそれぞれ独立した領域に固定化されており、前記標的核酸分子４に標識分子３を標識した後、前記生体分子検知チップ２上で前記１本鎖核酸プローブ１と前記標的核酸分子４をハイブリダイゼーション反応させ、前記生体分子検知チップ２上に結合した前記標的核酸分子４に結合させておいた標識分子３を検出し、さらにハイブリダイゼーション反応によって形成された前記１本鎖核酸プローブ１と前記標的核酸分子４の２本鎖核酸５を解離させる解離反応を行い、前記標識分子３で標識された前記標的核酸分子４を前記生体分子検知チップ２から解離させた後、生体分子検知チップ２上に残っている前記標識分子３を検出し、前記生体分子検知チップ２上に残った標識分子３の検出量を前記解離反応の前後間で比較することによって、前記１本鎖核酸プローブ１に特異的に結合した前記標的核酸分子４を検出する方法を示している。図８において実施の形態１と異なるところは、標識分子３を１本鎖核酸プローブ１ではなく、標的核酸分子４に結合させる点である。図８において、図１と同じ構成要素については同じ符号を用いその説明を省略する。
【０１０７】
図８（Ａ）に示すように、複数種類の１本鎖核酸プローブ１がそれぞれ独立した領域に固定化されている生体分子検知チップ２上に、標識分子３を結合させた標的核酸分子４をハイブリダイゼーション反応させる。標的核酸分子４に標識分子３を結合させる方法としては、例えば、シスプラチン類似体のＵＬＳ試薬を用いて直接結合させる方法や、標的核酸分子４をＰＣＲで増幅する際に蛍光分子１３を結合したｄＮＴＰを取り込ませる方法が用いられる。
【０１０８】
図８（Ｂ）に示すように、標識分子３を結合させた標的核酸分子４をハイブリダイゼーション反応させ２本鎖核酸５を形成させた後、生体分子検知チップ２上に結合した標識分子３を検出すると、結合した標的核酸分子４の量が定量される。例えば標識分子３として蛍光分子１３を用いれば、標的核酸分子４を結合したスポットは明点１９として検出され、標的核酸分子４を結合していないスポットは暗点１８として検出される。この生体分子検知チップ２上の標識分子３の量を解離前の標識分子情報２４とする。
【０１０９】
図８（Ｃ）に示すように、生体分子検知チップ２上の標的核酸分子４を検出した後に、ハイブリダイゼーション反応によって形成された２本鎖核酸５を解離させる解離反応を行い、標的核酸分子４を１本鎖核酸プローブ１から解離させる。解離させる方法としては、例えば加熱する方法があり、生体分子検知チップ２上に水などの水溶液をピペットなどで滴下し、純水に浸漬した状態で生体分子検知チップ２をインキュベーターなどを用いて９４℃に１分間加熱することによって、相補的塩基対が解離し、標的核酸分子４は１本鎖核酸プローブ１から解離する。標的核酸分子４を解離させた後、生体分子検知チップ２上の標識分子３を検出すると、例えば標識分子３として蛍光分子１３を用いた場合は、標的核酸分子４と結合していた１本鎖核酸プローブ１のスポットも標的核酸分子４と結合していなかった１本鎖核酸プローブ１のスポットも暗点１８として検出される。この生体分子検知チップ２上の標識分子３の量を解離後の標識分子情報２５とする。
【０１１０】
図８（Ｄ）に示すように、図８（Ｂ）で得られた解離前の標識分子情報２４から、図８（Ｃ）で得られた解離後の標識分子情報２５を差し引くことによって、ハイブリダイゼーション反応によって１本鎖核酸プローブ１に結合した標的核酸分子４のみを検出することができ、これがハイブリダイゼーション反応のみの標識分子情報２６となる。標的核酸分子４は１本鎖核酸プローブ１に相補的塩基対によって結合するほかに、非特異的に生体分子検知チップ２上に結合することが知られている。これは相補的塩基対による結合ではなく疎水的に物理吸着するものであって、ひとたび非特異的に結合してしまうと７．５％〜９％の生理食塩水あるいはＰＢＳなどによる洗浄操作などでは解離させることが困難であり、ハイブリダイゼーション反応を基本とする核酸分子検出方法において計測誤差を生むノイズになる。しかし相補的塩基対によって１本鎖核酸プローブ１に結合した標的核酸分子４は加熱処理などの操作によって可逆的に解離させることができるため、２本鎖核酸５の解離前後の標識分子３量を測定しハイブリダイゼーション反応のみの標識分子情報２６を入手することによって、可逆的なハイブリダイゼーション反応による相補的塩基対による２本鎖核酸５の形成量を測定することができ、非特異的吸着が起こっても、精度良く標的核酸分子４を検出することができる。
【０１１１】
上記構成において、標識分子３を結合した標的核酸分子４が１本鎖核酸プローブ１以外に非特異的に結合してしまった場合でも、特異的に１本鎖核酸プローブ１に結合し２本鎖核酸５を形成した標的核酸分子４を１本鎖核酸プローブ１から解離させ、解離前後の標識分子３の変化量を検知することによって１本鎖核酸プローブ１に特異的に結合した標的核酸分子４のみ検知することができる核酸分子検出方法となる。
【０１１２】
（実施の形態９）
図９は、実施の形態８に示した核酸分子検出方法において、ハイブリダイゼーション反応によって形成した２本鎖核酸５を解離させる方法として、アルカリ溶液２７を用いる方法を示している。図９において、実施の形態８と同じ構成要素については同じ符号を用いその説明を省略する。
【０１１３】
図９（Ａ）に示すように、標的核酸分子４を１本鎖核酸プローブ１とハイブリダイゼーション反応させ、２本鎖核酸５を形成させた後、１本鎖核酸プローブ１に相補的塩基対によって２本鎖核酸５を形成した標的核酸分子４以外に非特異的に吸着した標的核酸分子２８が生体分子検知チップ２上に存在する。
【０１１４】
図９（Ｂ）に示すように、ハイブリダイゼーション後の生体分子検知チップ２を容器２９内に浸漬し、容器２９をアルカリ溶液２７で満たし解離反応させる。アルカリ溶液２７としては、例えば２０ｍｍＮａＯＨ溶液が利用され、例えばポリプロピレン製などの樹脂で形成された容器２９内にピペットなどを用いて滴下し３０分間反応させる方法が用いられる。なお、アルカリ溶液２７以外であっても、２本鎖核酸５を１本鎖に解離させ、ＤＮＡ鎖自体は分解させない反応をする反応液であればアルカリ溶液２７以外であっても同様に用いることができる。
【０１１５】
図９（Ｃ）に示したように、２０ｍｍＮａＯＨ溶液に生体分子検知チップ２を浸漬し、例えば３７℃にて１時間インキュベーターなどで反応させることによって、２本鎖核酸５を形成した標的核酸分子４のみ生体分子検知チップ２上から解離するが、非特異的に吸着した標的核酸分子２８は相補的塩基対による水素結合ではなく、疎水結合によって強固に生体分子検知チップ２上に吸着しているため解離しない。
【０１１６】
上記構成において、アルカリ溶液２７による簡便な処理で特異的に１本鎖核酸プローブ１に結合し２本鎖核酸５を形成した標的核酸分子４を１本鎖核酸プローブ１から解離させることができるようになり、簡便な操作で１本鎖核酸プローブ１に特異的に結合した標的核酸分子４のみ検知することができるようになる核酸分子検出方法となる。
【０１１７】
（実施の形態１０）
図１０は、実施の形態８に示した核酸分子検出方法において、ハイブリダイゼーション反応によって形成した２本鎖核酸５を解離させる方法として、変性剤溶液３０を用いる方法を示している。図１０において、実施の形態９と同じ構成要素については同じ符号を用いその説明を省略する。
【０１１８】
図１０（Ａ）に示すように、標的核酸分子４を１本鎖核酸プローブ１とハイブリダイゼーション反応させ、２本鎖核酸５を形成させた後、１本鎖核酸プローブ１に相補的塩基対によって２本鎖核酸５を形成した標的核酸分子４以外に非特異的に吸着した標的核酸分子２８が生体分子検知チップ２上に存在する。
【０１１９】
図１０（Ｂ）に示すように、ハイブリダイゼーション後の生体分子検知チップ２を容器２９内に浸漬し、容器２９を変性剤溶液３０で満たし解離反応させる。変性剤溶液３０としては、例えば１０％ウレア溶液が利用され、例えばポリプロピレン製などの樹脂で形成された容器２９内にピペットなどを用いて滴下する方法が用いられる。
【０１２０】
図１０（Ｃ）に示したように、１０％ウレア溶液に生体分子検知チップ２を浸漬し、例えば３７℃１時間インキュベーターなどで反応させると、２本鎖核酸５を形成した標的核酸分子４のみ生体分子検知チップ２上から解離するが、非特異的に吸着した標的核酸分子２８は相補的塩基対による水素結合ではなく、疎水結合によって強固に生体分子検知チップ２上に吸着しているため解離しない。
【０１２１】
上記構成において、変性剤溶液による簡便な処理で特異的に１本鎖核酸プローブ１に結合１し２本鎖核酸５を形成した標的核酸分子を１本鎖核酸プローブ１から解離させることができるようになり、簡便な操作で１本鎖核酸プローブ１に特異的に結合した標的核酸分子４のみ検知することができるようになる核酸分子検出方法となる。
【０１２２】
（実施の形態１１）
図１１は、実施の形態８に示した核酸分子検出方法において、ハイブリダイゼーション反応によって形成した２本鎖核酸５を解離させる方法として、加熱手段３１によって高温処理する方法を示している。図１１において、実施の形態９と同じ構成要素については同じ符号を用いその説明を省略する。
【０１２３】
図１１（Ａ）に示すように、標的核酸分子４を１本鎖核酸プローブ１とハイブリダイゼーション反応させ、２本鎖核酸５を形成させた後、１本鎖核酸プローブ１に相補的塩基対によって２本鎖核酸５を形成した標的核酸分子４以外に非特異的に吸着した標的核酸分子２８が生体分子検知チップ２上に存在する。
【０１２４】
図１１（Ｂ）に示すように、容器２９を７．５％〜９％の生理食塩水あるいはＰＢＳなどの水溶液３２で満たしハイブリダイゼーション後の生体分子検知チップ２を容器２９内に浸漬し、水溶液３２を加熱手段３１によって加熱し、解離反応させる。加熱手段３１としては、ペルチェなどの電熱素子が利用され、水溶液３２は例えばポリプロピレン製などの樹脂で形成された容器２９内にピペットなどを用いて滴下する方法が用いられる。
【０１２５】
図１１（Ｃ）に示したように、ペルチェなどの電熱素子によって水溶液３２を９４℃まで加熱し、水溶液３２の沸点以下で１分程度反応させると、２本鎖核酸５を形成した標的核酸分子４のみ生体分子検知チップ２上から解離するが、非特異的に吸着した標的核酸分子２８は相補的塩基対による水素結合ではなく、疎水結合によって強固に生体分子検知チップ２上に吸着しているため解離しない。
【０１２６】
上記構成において、加熱手段３１による簡便な加熱処理で特異的に１本鎖核酸プローブ１に結合し２本鎖核酸５を形成した標的核酸分子４を１本鎖核酸プローブ１から迅速に解離させることができるようになり、簡便な操作で迅速に１本鎖核酸プローブ１に特異的に結合した標的核酸分子４のみ検知することができるようになる核酸分子検出方法となる。
【０１２７】
（実施の形態１２）
図１２は、実施の形態９〜１１で示した解離反応を行う際、解離溶液３３を生体分子検知チップ２上に流入させる方法を示している。図１２において、実施の形態９と同じ構成要素については同じ符号を用いその説明を省略する。
【０１２８】
図１２の（Ａ）に示すように、生体分子検知チップ２を流路３４内に設置し、生体分子検知チップ２上にアルカリ溶液２７あるいは変性剤溶液３０あるいは予め高温に加熱した高温溶液である解離溶液３３を流入させる。流路３４としては例えば生体分子検知チップ２上にＳＵＳやシリコンなどで形成された溝であり、１０μｍ〜数百μｍ幅の流路が生体分子検知チップ２上の１本鎖核酸プローブ１が固定されているスポット上を解離溶液３３が流れるように配置されている。解離溶液３３を流路３４内に流入させる方法としては、ピペットなどを用いて手動で流入させる方法や、ポンプなどを用いて１００〜数千μｌ／分の流速で１分間送液する方法が用いられる。
【０１２９】
図１２の（Ｂ）に示すように、解離溶液３３によって解離された標的核酸分子４は解離溶液３３の流れに流されて生体分子検知チップ２上かから除去される。
【０１３０】
上記構成において、流路３４内を解離溶液３３が流れる事によって、解離溶液３３によって解離した標的核酸分子４が速やかに生体分子検知チップ２上から流されることによって除去され、１本鎖核酸プローブに結合し２本鎖核酸を形成した標的核酸分子４を１本鎖核酸プローブ１ら迅速に解離させることができるようになる。また、解離させた標的核酸分子４が生体分子検知チップ２に再度結合することが防止されるため、より精度良く１本鎖核酸プローブに特異的に結合した標的核酸分子４のみ検知することができるようになる核酸分子検出方法となる。
【０１３１】
（実施の形態１３）
図１３は、実施の形態１１で示した解離反応を行う際、生体分子検知チップ２自体を加熱手段３１によって加熱する方法を示している。図１３において、実施の形態１１と同じ構成要素については同じ符号を用いその説明を省略する。
【０１３２】
図１３（Ｂ）に示すように、容器２９を７．５％〜９％の生理食塩水あるいはＰＢＳなどの水溶液３２で満たしハイブリダイゼーション後の生体分子検知チップ２を容器２９内に浸漬し、生体分子検知チップ２を加熱手段３１によって加熱し、解離反応させる。加熱手段３１としては、ペルチェなどの電熱素子が利用され、水溶液３２は例えばポリプロピレン製などの樹脂で形成された容器２９内にピペットなどを用いて滴下する方法が用いられる。
【０１３３】
図１３（Ｃ）に示したように、ペルチェなどの電熱素子によって生体分子検知チップ２を加熱し、水溶液３２の沸点以下で１分程度反応させると、２本鎖核酸５を形成した標的核酸分子４のみ生体分子検知チップ２上から解離するが、非特異的に吸着した標的核酸分子２８は相補的塩基対による水素結合ではなく、疎水結合によって強固に生体分子検知チップ２上に吸着しているため解離しない。標的核酸分子４が結合している生体分子検知チップ２を直接加熱することによって、生体分子検知チップ２上に固定化されている１本鎖核酸プローブ１を効率良く加熱することができ、少ない加熱量で標的核酸分子４を解離させることができる。
【０１３４】
上記構成において、加熱手段３１による簡便な加熱処理で特異的に１本鎖核酸プローブ１に結合し２本鎖核酸を形成した標的核酸分子４を１本鎖核酸プローブ１から迅速に低消費エネルギーで解離させることができるようになり、簡便な操作で迅速に低消費エネルギーで１本鎖核酸プローブ１に特異的に結合した標的核酸分子４のみ検知することができるようになる核酸分子検出方法となる。
【０１３５】
（実施の形態１４）
図１４は、実施の形態１１あるいは実施の形態１３で示した高温処理による解離反応を行う際、金属層３５を有した生体分子検知チップ２自体を加熱手段３１によって加熱する方法を示している。図１４において、実施の形態１１と同じ構成要素については同じ符号を用いその説明を省略する。
【０１３６】
図１４（Ａ）に示すように生体分子検知チップ２は金属層３５を有している。金属層３５は１本鎖核酸プローブ１が固定化されている面とは反対の面に配置されているが、金属層３５のみで生体分子検知チップ２が構成されていてもかまわない。金属層３５は例えば金、銀、アルミニウム、銅などの金属で構成され、例えばアルミニウムの板を生体分子検知チップ２裏面に貼り付けることで形成される他、金などを電子ビーム加熱方式などで金属薄膜蒸着させる方法で作られる。生体分子検知チップ２が金属層３５のみで形成されている場合、例えば金で生体分子検知チップ２が構成されていると、金表面に硫黄基を介して１本鎖核酸プローブ１を固定化することが容易になり、生体分子検知チップが作り易くなるというメリットもある。
【０１３７】
図１４（Ｂ）に示すように、容器２９を７．５％〜９％の生理食塩水あるいはＰＢＳなどの水溶液３２で満たしハイブリダイゼーション後の生体分子検知チップ２を容器２９内に浸漬し、生体分子検知チップ２を加熱手段３１によって加熱し、解離反応させる。加熱手段３１が生体分子検知チップ２を直接加熱する際、加熱手段３１は金属層３５を加熱することによって生体分子検知チップ２が迅速に加熱される。
【０１３８】
図１４（Ｃ）に示したように、ペルチェなどの電熱素子によって生体分子検知チップ２を加熱し、水溶液３２の沸点以下で１分程度反応させると、２本鎖核酸５を形成した標的核酸分子４のみ生体分子検知チップ２上から解離するが、非特異的に吸着した標的核酸分子２８は相補的塩基対による水素結合ではなく、疎水結合によって強固に生体分子検知チップ２上に吸着しているため解離しない。標的核酸分子４が結合している生体分子検知チップ２を直接加熱することによって、生体分子検知チップ２上に固定化されている１本鎖核酸プローブ１を効率良く加熱することができ、少ない加熱量で標的核酸分子４を解離させることができる。
【０１３９】
上記構成において、加熱手段３１による加熱処理で熱が金属層３５を介して生体チップ検知チップ２を迅速に温める事ができるようになり、特異的に１本鎖核酸プローブ１に結合し２本鎖核酸５を形成した標的核酸分子を１本鎖核酸プローブ１から迅速に低消費エネルギーで解離させることができるようになり、簡便な操作で迅速に低消費エネルギーで１本鎖核酸プローブに特異的に結合した標的核酸分子４のみ検知することができる核酸分子検出方法となる。
【産業上の利用可能性】
【０１４０】
本発明の核酸分子検出方法を用いることによって、サンプルの核酸に標的分子を結合させる煩雑な操作をしなくても生体分子検知チップ上の標的分子を従来から使用している分析機器を利用して検出することができ、また、サンプル中の核酸が非特異的に吸着し検知精度を損なう状況にあったとしても精度良く標的核酸分子を検出できるようになる。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】本発明の実施の形態１の核酸分子検出方法を示す図
【図２】本発明の実施の形態２の核酸分子検出方法を示す図
【図３】本発明の実施の形態３の核酸分子検出方法を示す図
【図４】本発明の実施の形態４の核酸分子検出方法を示す図
【図５】本発明の実施の形態５の核酸分子検出方法を示す図
【図６】本発明の実施の形態６の核酸分子検出方法を示す図
【図７】本発明の実施の形態７の核酸分子検出方法を示す図
【図８】本発明の実施の形態８の核酸分子検出方法を示す図
【図９】本発明の実施の形態９の核酸分子検出方法を示す図
【図１０】本発明の実施の形態１０の核酸分子検出方法を示す図
【図１１】本発明の実施の形態１１の核酸分子検出方法を示す図
【図１２】本発明の実施の形態１２の核酸分子検出方法を示す図
【図１３】本発明の実施の形態１３の核酸分子検出方法を示す図
【図１４】本発明の実施の形態１４の核酸分子検出方法を示す図
【図１５】従来の核酸分子検出方法を示す図
【符号の説明】
【０１４２】
１    １本鎖核酸プローブ
２    生体分子検知チップ
３    標識分子
４    標的核酸分子
５    ２本鎖核酸
６    １本鎖核酸特異的分解酵素
７    ２本鎖核酸特異的分解酵素
８    標的塩基配列
９    制限酵素
１０  制限酵素分解配列
１１  ポリメラーゼ
１２  投げ縄構造
１３  蛍光分子
１４  励起光源
１５  励起光
１６  反射光
１７  受光手段
１８  暗点
１９  明点
２０  金属粒子
２１  金属薄膜
２２  磁性材料
２３  磁気センサ
２４  解離前の標識分子情報
２５  解離後の標識分子情報
２６  ハイブリダイゼーション反応のみの標識分子情報
２７  アルカリ溶液
２８  非特異的に吸着した標的核酸分子
２９  容器
３０  変性剤溶液
３１  加熱手段
３２  水溶液
３３  解離溶液
３４  流路
３５  金属層
【図１】
2007000009.tif 000003
【図２】
2007000009.tif 000004
【図３】
2007000009.tif 000005
【図４】
2007000009.tif 000006
【図５】
2007000009.tif 000007
【図６】
2007000009.tif 000008
【図７】
2007000009.tif 000009
【図８】
2007000009.tif 000010
【図９】
2007000009.tif 000011
【図１０】
2007000009.tif 000012
【図１１】
2007000009.tif 000013
【図１２】
2007000009.tif 000014
【図１３】
2007000009.tif 000015
【図１４】
2007000009.tif 000016
【図１５】
2007000009.tif 000017