(57)【要約】 【課題】  網膜色素変性、錐体ジストロフィー、加齢黄斑変性、加齢黄斑症、黄斑浮腫、網膜剥離などの視細胞障害を惹起する難治性疾患に対して有効な治療剤を探索すること、および視細胞若しくはその機能を再生させるために有用な材料を提供すること。【解決手段】  レチノイドと乳酸−グリコール酸共重合体などの生体適合性高分子からなるレチノイド徐放性組成物と、脂肪由来間質細胞などの視細胞またはその機能を再生若しくは補完する役割を有する細胞を組み合わせて投与すれば、視細胞またはその機能が再生し、視細胞変性抑制効果が増強・持続する。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レチノイドと生体適合性高分子からなるレチノイド徐放性組成物と、視細胞またはその機能を再生若しくは補完する役割を有する細胞を有効成分として含有する視細胞障害を惹起する疾患の治療剤。
【請求項２】
レチノイドが、レチノイン酸である請求項１記載の治療剤。
【請求項３】
生体適合性高分子が、乳酸−グリコール酸共重合体である請求項１記載の治療剤。
【請求項４】
レチノイド徐放性組成物の形状が、微粒子状またはシート状である請求項１記載の治療剤。
【請求項５】
視細胞またはその機能を再生若しくは補完する役割を有する細胞が、間質細胞である請求項１記載の治療剤。
【請求項６】
間質細胞が、脂肪由来間質細胞である請求項５記載の治療剤。
【請求項７】
視細胞障害を惹起する疾患が、網膜変性疾患である請求項１記載の治療剤。
【請求項８】
網膜変性疾患が、網膜色素変性、錐体ジストロフィー、加齢黄斑変性、加齢黄斑症、黄斑浮腫、網膜剥離、癌関連網膜症、網膜静脈閉塞症または網膜色素上皮剥離である請求項７記載の治療剤。
【請求項９】
レチノイドと生体適合性高分子からなるレチノイド徐放性組成物と、視細胞またはその機能を再生若しくは補完する役割を有する細胞を含有する視細胞またはその機能を再生させるための材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レチノイドと生体適合性高分子からなるレチノイド徐放性組成物と、視細胞またはその機能を再生若しくは補完する役割を有する細胞を有効成分として含有する視細胞障害を惹起する疾患の治療剤に関する。また、本発明は、レチノイドと生体適合性高分子からなるレチノイド徐放性組成物と、視細胞またはその機能を再生若しくは補完する役割を有する細胞を含有する視細胞またはその機能を再生させるための材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
視細胞は、網膜への光刺激を電気信号に変換する細胞であり、光覚、視覚に関わる重要な機能を司るので、視細胞に障害が生ずれば、視力や視野などに対して深刻な影響を及ぼす。視細胞障害を惹起する疾患としては、例えば網膜色素変性、錐体ジストロフィー、加齢黄斑変性、加齢黄斑症、黄斑浮腫、網膜剥離、癌関連網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜色素上皮剥離などが挙げられる。これらの疾患は、難治性で既存の薬物を投与しても容易には治癒されず、一旦変性・脱落した視細胞の機能を取り戻すことはできないので、視細胞の変性を抑制・遅延させること、さらには視細胞の機能を再生させることが望まれている。新しい治療方法として、自家及び他家の細胞や組織を移植し、機能不全に陥った細胞、組織や臓器を置換、再生させる再生医療が試みられている。
【０００３】
ところで、レチノイドは、分子内に４個のイソプレノイド単位をもつ化合物である。レチノイドとしては、例えばレチノイン酸、レチノール、レチナールなどが知られている。
【０００４】
他方、非特許文献１は、脂肪由来間質細胞の分化に関する論文であり、脂肪組織から付着細胞を分離して、その性質を検討している。そして、脂肪組織から脂肪由来間質細胞を得ることの利点として、例えば脂肪細胞の採取は容易であり、また患者の苦痛も比較的少ないことを指摘している。
【０００５】
特許文献１は、脂肪由来間質細胞を角膜障害の治療に適用するものであり、脂肪由来間質細胞とレチノイン酸を含む種々の因子を組合せて移植することが示唆されている。また、特許文献２は、核ホルモンレセプターを活性化して、網膜色素上皮細胞およびブルッフ膜から脂質含量を低下させることを特徴とする加齢黄斑変性の治療に関する発明である。そして、核ホルモンレセプターの１つとしてレチノイドＸレセプターが挙げられ、そのリガンドとしてレチノイン酸が記載されている。
【０００６】
しかしながら、レチノイドと生体適合性高分子からなるレチノイド徐放性組成物と、脂肪由来間質細胞を組合せて視細胞障害に対する薬理作用を検討する報告はない。
【特許文献１】特表２００５−５０８１７４号公報
【特許文献２】特表２００５−５１１７１３号公報
【非特許文献１】Mol Biol Cell 13;4279-4295,2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
網膜色素変性、錐体ジストロフィー、加齢黄斑変性、加齢黄斑症、黄斑浮腫、網膜剥離などの視細胞障害を惹起する難治性疾患に対して有効な治療剤を見出すことは重要な課題である。また、視細胞またはその機能を再生させるために有用な材料を提供できれば、視細胞障害を惹起する難治性網膜疾患の根本的な治療に貢献できるところが大きい。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、レチノイドと乳酸−グリコール酸共重合体からなるレチノイド徐放性組成物、および脂肪由来間質細胞を用いて薬理試験を実施したところ、レチノイド徐放性組成物と脂肪由来間質細胞を組合せると、視細胞またはその機能が再生し、視細胞変性抑制効果が顕著に増強・持続することを見出し、本発明に至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、
（１）レチノイドと生体適合性高分子からなるレチノイド徐放性組成物と、視細胞またはその機能を再生若しくは補完する役割を有する細胞を有効成分として含有する視細胞障害を惹起する疾患の治療剤、
（２）レチノイドが、レチノイン酸である前（１）記載の治療剤、
（３）生体適合性高分子が、乳酸−グリコール酸共重合体である前（１）記載の治療剤、
（４）レチノイド徐放性組成物の形状が、微粒子状またはシート状である前（１）記載の治療剤、
（５）視細胞またはその機能を再生若しくは補完する役割を有する細胞が、間質細胞である前（１）記載の治療剤、
（６）間質細胞が、脂肪由来間質細胞である前（５）記載の治療剤、
（７）視細胞障害を惹起する疾患が、網膜変性疾患である前（１）記載の治療剤、
（８）網膜変性疾患が、網膜色素変性、錐体ジストロフィー、加齢黄斑変性、加齢黄斑症、黄斑浮腫、網膜剥離、癌関連網膜症、網膜静脈閉塞症または網膜色素上皮剥離である前（７）記載の治療剤、および
（９）レチノイドと生体適合性高分子からなるレチノイド徐放性組成物と、視細胞またはその機能を再生若しくは補完する役割を有する細胞を含有する視細胞またはその機能を再生させるための材料、に関する。
【００１０】
本発明は、レチノイドと生体適合性高分子からなるレチノイド徐放性組成物と、視細胞またはその機能を再生若しくは補完する役割を有する細胞を含有する視細胞障害を惹起する疾患の治療剤並びに視細胞またはその機能を再生させるための材料である。
【００１１】
後述する薬理試験の結果より、レチノイドと乳酸−グリコール酸共重合体からなるレチノイド徐放性組成物と、視細胞またはその機能を再生若しくは補完する役割を有する細胞を組み合わせて、これらを視細胞障害部位またはその周辺組織（網膜下、網膜内、硝子体内など）に注入すれば、視細胞またはその機能が再生し、網膜変性抑制効果を増強・持続する。
【００１２】
本発明において、「レチノイド」とは、分子内に４個のイソプレノイド単位をもつ化合物であれば特に制限されない。レチノイドとしては、例えばレチノイン酸、レチノール、レチナール、レチンアミド、レチノニトリル、レチノイルクロリドなどが挙げられ、より好ましくはレチノイン酸、レチノール、レチナールである。また、レチノイドに幾何異性体または光学異性体が存在する場合は、それらの異性体も本発明の範囲に含まれる。
【００１３】
本発明において、「徐放性組成物」を形成する材料としては生体分解性や生体吸収性を有する生体適合性高分子が好ましく、具体例としては、ポリ乳酸、ポリ（乳酸−グリコール酸）、ポリ乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体、ポリ乳酸−ポリエチレングリコール−ポリ乳酸ブロック共重合体、ポリ（乳酸−グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体、ポリ（乳酸−グリコール酸）−ポリエチレングリコール−ポリ（乳酸−グリコール酸）ブロック共重合体、乳酸−カプロラクトン共重合体、ポリアンハイドライド、ポリオルソエステル、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリアクリルシアノアクリレート、ポリハイドロキシアルカノエート、ポリフォスフォエステル、ポリα-ヒドロキシ酸等の生分解性高分子；ゼラチン、デキストラン、アルブミン、キトサン等の天然高分子；メタクリル酸コポリマー、ポリＮ-アルキルアクリルアミド等の合成高分子が挙げられ、より好ましくはポリ乳酸、ポリ（乳酸−グリコール酸）、ポリ乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体、ポリ乳酸−ポリエチレングリコール−ポリ乳酸ブロック共重合体、ポリ（乳酸−グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体、ポリ（乳酸−グリコール酸）−ポリエチレングリコール−ポリ（乳酸−グリコール酸）ブロック共重合体である。
【００１４】
これらの高分子物質の分子量については、特に制限は無く、徐放性組成物に含有させるレチノイドの種類、有効治療濃度、放出期間などにより適宜選択できる。
【００１５】
本発明におけるレチノイド徐放性組成物の形状は特に制限されないが、例えば微粒子状、シート状、ディスク状、円柱状、角柱状のものが挙げられる。本発明のレチノイド徐放性組成物を変性部位に注射剤として投与する場合には微粒子状のものが好ましく、また、これを広範な変性部位に移植・埋植する場合にはシート状のものが好ましい。
【００１６】
本発明のレチノイド徐放性微粒子を得るための方法は、特に制限されないが、例えば微粒子とレチノイドをジクロロメタンなどの溶媒に溶解し、これをポリビニルアルコール水溶液中に滴下し、乳化させ、この乳化液を室温下光を遮断した状態で攪拌し、油相を固化させてレチノイドを含有するレチノイド徐放性微粒子の粗生成物を得る。ついで、この粗生成物を冷却下で遠心分離し、上清を除き、残渣を精製水で再分散させ、再度、遠心分離を行い、この操作を数回繰り返して精製する。得られたレチノイド徐放性微粒子を洗浄した後、遮光した状態で凍結乾燥し、篩い分けすると粒子径がほぼ均一なレチノイド徐放性微粒子が得られる。さらに、得られたレチノイド徐放性微粒子に生理食塩水を加えて、レチノイド徐放性微粒子懸濁液を調製することもできる。微粒子の粒子径は、使用目的により適宜選択できるが、５００μｍ以下であることが好ましく、より好ましくは２００μｍ以下である。レチノイドを含有させたμｍオーダーの微粒子の例としてはマイクロスフェアーが、ｎｍオーダーの微粒子の例としてはナノスフェアーが挙げられる。
【００１７】
シート状、ディスク状、円柱状、角柱状のレチノイド徐放性組成物を調製する方法としては、例えば適切な形状を有する金型を用いて射出成型することによりシート状、ディスク状、円柱状、角柱状のものが得られる。
【００１８】
本発明で使用される「視細胞またはその機能を再生若しくは補完する役割を有する細胞」は、特に限定されないが、例えば脂肪由来間質細胞、骨髄間質細胞などの間質細胞、未分化間葉系細胞、網膜幹（前駆）細胞、網膜色素上皮細胞、虹彩色素上皮細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、皮膚幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、さらに胚性幹細胞、胚性生殖幹細胞などから分化誘導された上記各細胞などが挙げられ、好ましくは間質細胞であり、より好ましくは脂肪由来間質細胞である。なお、視細胞またはその機能を再生若しくは補完する役割を有する細胞は、視細胞に障害をもつ患者自身の組織から採取してもよく、また、患者以外の組織から採取したものを用いてもよい。
【００１９】
例えば、ヒトの皮下脂肪から採取した脂肪組織塊を鋏で細かくし、得られた細片をコラゲナーゼ溶液で振とう処理後、フィルターで濾別し、遠心分離することにより回収する。つぎに、回収した細胞群から付着性細胞だけを回収しインキュベーターで培養して増殖させることにより、脂肪由来間質細胞が得られる。
【００２０】
本発明の「脂肪由来間質細胞」には、視細胞特異的ホメオボックス遺伝子や神経保護作用あるいは変性抑制作用を示す因子をコードする遺伝子を導入したものも含まれる。
【００２１】
視細胞特異的ホメオボックス遺伝子としては、視細胞の発生過程において、視細胞の領域特異的な発現様式を有し、かつ領域特異的な形態形成を制御する遺伝子や分化形質の発現に関与する遺伝子などがあり、具体的には、Ｃｒｘ、Ｏｔｘ２、Ｎｒｌ、Ｃｈｘ１０等が挙げられる。
【００２２】
また、神経保護作用あるいは変性抑制効果を示す因子をコードする遺伝子としては、具体的には、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、網膜色素上皮由来の神経栄養因子（ＰＥＤＦ）、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）等の因子をコードする遺伝子が挙げられる。
【００２３】
脂肪由来間質細胞への視細胞特異的ホメオボックス遺伝子や神経保護作用あるいは変性抑制作用を示す因子をコードする遺伝子の導入方法は、特に制限されず、例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、遺伝子銃を用いる方法などの物理化学的な導入法をはじめ、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、センダイウイルスベクター、センダイウイルスエンベロープベクターなどを用いる方法が挙げられる。
【００２４】
上記の方法によって得られるレチノイド徐放性組成物と視細胞またはその機能を再生若しくは補完する役割を有する細胞を混合することにより、視細胞障害を惹起する疾患の治療剤、および視細胞またはその機能を再生させるための材料が得られる。
【００２５】
本発明において、「視細胞障害」とは、種々の要因により視細胞が損傷を受けた状態にあるものをいい、「視細胞障害を惹起する疾患」としては、例えば網膜色素変性、錐体ジストロフィー、加齢黄斑変性、加齢黄斑症、黄斑浮腫、網膜剥離、癌関連網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜色素上皮剥離などの網膜変性疾患が挙げられる。
【００２６】
本発明のレチノイド徐放性組成物と視細胞またはその機能を再生若しくは補完する役割を有する細胞の混合物には、必要に応じて製剤上許容される安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤、懸濁化剤、緩衝剤、等張化剤、防腐剤、無痛化剤、抗酸化剤などの添加剤を含有してもよく、これらの添加剤は公知のものを使用できる。また、レチノイド徐放性微粒子の徐放期間等を調節するために、アミノ酸、アミノ基、リン酸基、硫酸基、ＳＨ基、カルボキシル基などを有する糖や脂質などを添加することができる。
【００２７】
本発明の視細胞障害を惹起する疾患の治療剤、および視細胞若しくはその機能を再生させるための材料の投与量は、疾患部位や疾患の程度、患者の年齢や体重などを考慮して適宜調整できるが、「レチノイド」については０．００１〜１０００μｇの範囲が好ましく、より好ましくは０．０１〜５００μｇの範囲であり、また、「視細胞またはその機能を再生若しくは補完する役割を有する細胞」については１×１０2〜１×１０14個/μｌ、より好ましくは１×１０3〜１×１０12個/μｌの範囲であり、投与形態としては、例えば視細胞障害部位またはその周辺組織（網膜下、網膜内、硝子体内など）に注射剤として注入してもよく、また、視細胞障害部位またはその周辺組織（網膜下、網膜内、硝子体内など）に移植・埋植することもできる。
【発明の効果】
【００２８】
後述する自然発症網膜変性モデルラット（ＲＣＳラット）を用いた網膜変性抑制試験の結果から明らかなように、レチノイン酸徐放性微粒子（レチノイン酸含有乳酸−グリコール酸共重合体マイクロスフェアー）と脂肪由来間質細胞の混合物を網膜下投与すれば、視細胞またはその機能が再生し、レチノイド徐放性微粒子、脂肪由来間質細胞をそれぞれ単独で網膜下投与する場合よりも網膜変性抑制効果が増強・持続する。
【００２９】
したがって、本発明のレチノイドと乳酸−グリコール酸共重合体などの生体適合性高分子からなるレチノイド徐放性組成物と、視細胞またはその機能を再生若しくは補完する役割を有する細胞を併用すれば、網膜色素変性、錐体ジストロフィー、加齢黄斑変性、加齢黄斑症、黄斑浮腫、網膜剥離、癌関連網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜色素上皮剥離などの視細胞障害を惹起する疾患の治療剤として有用であり、また、視細胞またはその機能を再生させるための優れた材料となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下に、薬理試験の結果および製剤例を示すが、これらの例は本発明をよりよく理解するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３１】
１．薬理試験
（１）レチノイン酸含有乳酸−グリコール酸共重合体マイクロスフェアーの調製
乳酸−グリコール酸共重合体（共重合比；５０／５０、平均分子量；２００００、和光純薬工業社製）とオールトランス型レチノイン酸（Ｓｉｇｍａ社製）をジクロロメタンに同時に溶解した。これをポリビニルアルコール水溶液中に滴下し、乳化した。この乳化液を室温下光を遮断した状態で４時間攪拌し、油相を固化させレチノイン酸含有乳酸−グリコール酸共重合体マイクロスフェアーの粗生成物を得た。この粗生成物を冷却下で遠心分離し、上清を除き、残渣を精製水で再分散させ、再度、遠心分離を行った。この操作を５回行い、得られたレチノイン酸含有乳酸−グリコール酸共重合体マイクロスフェアーを洗浄した後、遮光した状態で２４時間凍結乾燥した。このレチノイン酸含有乳酸−グリコール酸共重合体マイクロスフェアーを篩い分けし、平均粒子径が１０μｍ、レチノイン酸含有率２．０％のレチノイン酸含有乳酸−グリコール酸共重合体マイクロスフェアーを得た。さらに、得られたレチノイン酸含有乳酸−グリコール酸共重合体マイクロスフェアー２．５ｍｇにリン酸緩衝生理食塩水１００μｌを加え、レチノイン酸含有乳酸−グリコール酸共重合体マイクロスフェアー懸濁液（マイクロスフェアー濃度２．５ｗ／ｖ％）を調製した。
【００３２】
（２）ラット脂肪由来間質細胞の単離・培養
緑色蛍光タンパクトランスジェニックラット（３週齢）をジエチルエーテルの過麻酔により安楽死させ、皮下脂肪を採取した。採取した皮下脂肪をリン酸緩衝生理食塩水（５ｍｌ）中でハサミを用いて細断し、５ｍｌのコラゲナーゼ溶液（２ｍｇ／ｍｌ）を加え、３７℃で１５−２０分間振とうした。振とう後、１０ｍｌの１０％ウシ胎仔血清含有Medium199（１０ｍｌ、Invitrogen社製）を加え、懸濁液とした。この懸濁液を滅菌した２００μｍフィルターでろ過して細胞塊を除去した。ろ液を遠心分離（２０００ｒｐｍ、 ５分間）し、上清を除去後、１０％ウシ胎仔血清含有Medium199（１０ｍｌ）に懸濁させ、再度遠心分離（１０００ｒｐｍ、１０分間）した。上清を除去後、５ｍｌの１０％ウシ胎仔血清含有Medium199に懸濁させ、培養用フラスコに播種し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で培養した。播種後、１２−２４時間で、非付着性細胞を除去するために培地交換［ウシ胎仔血清（１０％）および塩基性線維芽細胞増殖因子（１００ｎｇ／ｍｌ）含有Medium199］をし、３７℃、５％ＣＯ2条件下でコンフルエントになるまで培養して、実験用脂肪由来間質細胞を得た。
【００３３】
（３）網膜変性抑制試験
Jiang LQらの方法［Invest. Ophthalmol. Vis. Sci 35(13):4300−4309 (1994)］に準じて、網膜変性抑制試験を実施した。網膜変性抑制試験では、自然発症網膜変性モデルラットとして、ＲＣＳラット（Royal College of Surgeons Rat）を用い、網膜電図におけるｂ波振幅（投与前および投与４週間後）を測定して、網膜変性抑制作用を評価した。
【００３４】
（実験方法）
前記のレチノイン酸含有乳酸−グリコール酸共重合体マイクロスフェアー懸濁液に実験用脂肪由来間質細胞を４×１０４個/μｌになるように分散させた。つぎに、この実験用脂肪由来間質細胞を分散させた懸濁液５μｌ（レチノイン酸；０．５μｇ、マイクロスフェアー；１２５μｇ、脂肪由来間質細胞；２×１０5 個）/眼を３週齢のＲＣＳラットの両眼の網膜下に注入した。また、コントロールとしてリン酸緩衝生理食塩水を、対照としてレチノイン酸含有乳酸−グリコール酸共重合体マイクロスフェアー、脂肪由来間質細胞を用いて比較検討した。
【００３５】
網膜下投与後４週目に網膜電図をとり、ｂ波の振幅を測定した。網膜下投与後４週目のｂ波の残存率は、投与前におけるｂ波振幅を基準（１００％）にして算出した。試験結果を図１に示す（網膜変性抑制効果は、ｂ波振幅残存率が高いほど大きい。）。なお、例数は各８眼である。
【００３６】
（結果）
図１から明らかなように、レチノイン酸含有乳酸−グリコール酸共重合体マイクロスフェアーと脂肪由来間質細胞を組み合わせて網膜下に注入すれば、視細胞またはその機能が再生し、レチノイン酸含有乳酸−グリコール酸共重合体マイクロスフェアー、脂肪由来間質細胞をそれぞれ単独で網膜下に注入する場合よりも網膜変性抑制効果が増強した。
【００３７】
２．製剤例
本発明の代表的な製剤例を以下に示す。
【００３８】
注射剤１（１ｍｌ）
レチノイン酸含有乳酸−グリコール酸共重合体マイクロスフェアー
（レチノイン酸；５μｇ）                              ２５ｍｇ
脂肪由来間質細胞                                   ４×１０７個
濃グリセリン                                          ２６ｍｇ
滅菌精製水                                             適量  
１ｍｌ
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、レチノイン酸含有乳酸−グリコール酸共重合体マイクロスフェアー、脂肪由来間質細胞、およびレチノイン酸含有乳酸−グリコール酸共重合体マイクロスフェアーと脂肪由来間質細胞の混合物を用いた網膜変性抑制試験における網膜下投与後４週目のｂ波振幅残存率（平均値）を示す。
【図１】
2007153808.tif 000002