(57)【要約】【課題】  Ｌ−アラボノ−γ−ラクトン結晶の簡便な製法の提供。【解決手段】  Ｌ−アラボン酸を有機溶媒に溶解し、当該溶液から結晶化することを特徴とするＬ−アラボノ−γ−ラクトン結晶の製造法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アラボン酸を有機溶媒に溶解し、当該溶液から結晶化することを特徴とするＬ−アラボノ−γ−ラクトン結晶の製造法。
【請求項２】
Ｌ−アラボン酸をアセトン、メタノール、エタノール、アセトニトリルまたはこれらの混合溶媒から結晶化することを特徴とするＬ−アラボノ−γ−ラクトン結晶の製造法。
【請求項３】
Ｌ−アラボン酸をアセトン、メタノール、エタノール、アセトニトリルまたはこれらの混合溶媒に溶解し、次いで酢酸エチルまたはプロパノールを添加することを特徴とするＬ−アラボノ−γ−ラクトン結晶の製造法。
【請求項４】
Ｌ−アラボン酸が、Ｌ−アラビノースにアルドース酸化能を有する微生物または酵素を作用させることにより得られるものである請求項１〜３のいずれか１項記載のＬ−アラボノ−γ−ラクトン結晶の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬や食品添加物として有用なＬ−アラボノ−γ−ラクトン結晶の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アラボン酸は、アルドース酸化能を有する微生物あるいは酵素をＬ−アラビノースに作用させる方法や化学的酸化反応による方法など公知の方法（特許文献１、特許文献２）で製造されるＬ型アルドン酸の一種である。
【０００３】
しかし、Ｌ−アラボン酸に関しては、その生理機能についてほとんど研究がなされておらず、その性質もほとんど知られていない。従って、Ｌ−アラボン酸を脱水させればＬ−アラボノラクトンが得られることは予想できるが、その製法については知られておらず、Ｌ−アラボノラクトンの物性についてもほとんど知られていない。
【特許文献１】特開２００１−３２７２９８号公報
【特許文献２】特開平１１−３２７８８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
かかる実情において本発明者が、Ｌ−アラボン酸に着目してその生理機能を検討してきたところ、Ｌ−アラボン酸、その塩、およびそのラクトンが優れたカルシウム吸収促進作用を有し、骨粗鬆症の予防用の食品や医薬として有用であることが判明した。ところが、Ｌ−アラボン酸は水溶性で、濃縮しても結晶化はしにくく、シロップ状の液状物になる物質である。液状物であるためＬ−アラボン酸を正確に秤量することは困難であり、さらには保管する上で液状物は扱いにくいという欠点があった。従って、本発明の目的は、医薬や食品として有用で、かつ取扱い性の良好なＬ−アラボノラクトン結晶の簡便な製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、簡便にＬ−アラボノ−γ−ラクトンを結晶化する方法がないか鋭意研究を重ねてきた。その結果、Ｌ−アラボン酸を有機溶媒に溶解し、当該溶液から結晶化すれば、脱水反応と結晶化が同時に進行し、Ｌ−アラボノ−γ−ラクトンが結晶として得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、Ｌ−アラボン酸を有機溶媒に溶解し、当該溶液から結晶化することを特徴とするＬ−アラボノ−γ−ラクトン結晶の製造法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、Ｌ−アラボノ−γ−ラクトン結晶が簡便に出来るようになり、正確な秤量や固体での使用用途が拡大するとともに、水に溶かせばＬ−アラボン酸として使用できることから、その保管・管理においても利便性が格段に向上した。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の方法において原料として用いられるＬ−アラボン酸は、市販試薬のＬ−アラボン酸カルシウムを陽イオン交換樹脂に供してＬ−アラボン酸溶液を調製するか、あるいはＬ−アラビノースにアルドース酸化能を有する微生物または酵素を作用させることによりＬ−アラボン酸に変換させた培養液からイオン交換樹脂等を用いて精製したＬ−アラボン酸溶液を用いることができる。このうち、Ｌ−アラビノースにアルドース酸化能を有する微生物または酵素を作用させることにより得られるＬ−アラボン酸を用いるのが好ましい。
【０００９】
好ましいＬ−アラボン酸の製造方法としては、たとえば、Ｌ−アラビノースを含む液体培地にアルドース酸化能を有する微生物Acinetobacter baumanniiを植菌して通気撹拌培養を行う。培養経過とともに培養液中のＬ−アラビノースが減少し、Ｌ−アラボン酸が生成してくる。また、あらかじめ、炭酸カルシウム等の塩類を培地中に添加しておくことで、培養液のpHが生成するＬ−アラボン酸により低下しすぎることがなくなり、安定したＬ−アラボン酸への変換が実現する。この場合は、生成したＬ−アラボン酸がカルシウム塩として得られる。培地中のＬ−アラビノースがすべて消費されたのち、培養液をろ過して菌体等の不溶成分を除き、得られたろ液をイオン交換樹脂カラム処理などの公知の方法で精製することにより、高純度のＬ−アラボン酸さらには、Ｌ−アラボン酸の塩を得ることができる。
【００１０】
本発明においては、Ｌ−アラボン酸を有機溶媒に溶解する。使用する有機溶媒としては、アセトン、メタノール、エタノール、アセトニトリルおよびこれらの混合溶媒が好ましい。これらの有機溶媒にＬ−アラボン酸を溶解するには、２０〜６０℃で行うのが好ましい。
【００１１】
得られた溶液を濃縮すれば、Ｌ−アラボン酸の脱水反応が進行し、Ｌ−アラボノ−γ−ラクトンが結晶化してくる。なお、Ｌ−アラボン酸として、Ｌ−アラボン酸水溶液を用いる場合には、有機溶媒を加え、濃縮を繰り返すことにより、水分を留去して有機溶媒に溶解させることができる。これら濃縮液を低温下で結晶化させるか、種結晶を加えることにより結晶化を促すことで、Ｌ−アラボノ−γ−ラクトンの結晶が得られる。ここで、濃縮は減圧下で行うのが好ましい。
【００１２】
また、得られた溶液に、酢酸エチル、プロパノール等の貧溶媒を添加して、結晶化させることによってもＬ−アラボノ−γ−ラクトン結晶が得られる。貧溶媒として加えられる溶媒は上記酢酸エチルやプロパノールに限定されるものではない。
【００１３】
得られたＬ−アラボノ−γ−ラクトン結晶は、ろ過等の固液分離手段により、容易に単離できる。また、常温常圧で安定であり、取扱い性が良好である。
【実施例】
【００１４】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１５】
実施例１
市販のＬ−アラボン酸カルシウム（Sequoia Research Products Ltd.社製）5ｇを水500mLに溶解し、Ｌ−アラボン酸含有溶液とする。内径2.0cm×長さ12cmの硝子カラムに陽イオン交換樹脂（三菱化学社製ダイヤイオンSK-1B）20mLを充填し、１規定塩酸にてＨ型にする。水洗した後にＬ−アラボン酸含有溶液を通液し、50mLずつ分画する。分画した溶液をＨＰＬＣにて分析し、Ｌ−アラボン酸を含む画分約850mLをエバポレーターにて濃縮する。シロップ状になったところにアセトンを加えて良く攪拌し、均一にする。さらに、濃縮とアセトン添加を繰り返し行い、低温下（約10℃）にて濃縮液からの結晶化を行った。その結果、約2.7ｇの結晶が得られた。
【００１６】
得られた結晶の一部をＸ線結晶回析による構造解析を行ったところ、Ｌ−アラボノ-γ-ラクトンであることを確認した。Ｘ線結晶回析により得られた構造は図１に示す通りである。
【００１７】
ＨＰＬＣ分析における条件は以下の通りである。カラム：ICSepICE-ION-300（Transgenomic社製）内径0.78cm×長さ30cm、カラム温度：70℃、溶出溶媒：0.0085N硫酸水溶液、検出器：示差屈折検出器（Shodex社製 RI SE-61）、流速：0.4mL／min、溶出されるＬ−アラボン酸の保持時間はおよそ17.5分であった。
【００１８】
実施例２
エタノール3.0％、尿素0.15％、硫酸アンモニウム0.15％、硝酸アンモニウム0.15％、酵母エキス0.03％、KH2PO4 0.15％、Na2HPO4・12H2O 0.15％、MgSO4・7H2O 0.03％、CaCl2・2H2O 0.001％、ZnSO4・7H2O 0.001％、FeSO4・7H2O 0.001％、MnSO4・7H2O 0.0001％を含む培地（pH 7.0） 100mLを入れた500mL三角フラスコにAcinetobacter baumanniiを一白金耳接種し、30℃、210rpmで２日間振盪培養する。１％の植菌量で同様の培地に植菌し、同条件で３日間培養する。そこに、滅菌済みのＬ−アラビノース溶液（2ｇ/10mL）を最終濃度２％になるように加え、乾熱滅菌した炭酸カルシウム0.5％(0.5ｇ)を加えて培養を続ける。約24〜48時間でＬ−アラビノースはＬ−アラボン酸に変換される。
【００１９】
上記の三角フラスコ培養液60本分（６Ｌ）を遠心分離することにより、培養上清約5.5Ｌを調製する。この培養上清に30ｇの活性炭を加え室温で20分攪拌し、遠心分離により得られた上澄みをメンブランフィルター（φ0.45μｍ）でろ過する。得られたろ過液約5.3Ｌをエバポレーターで濃縮し、不溶化物が出てきたところで濃縮を止めて４℃以下で一昼夜放置した。得られた不溶化物をろ別回収し、乾燥物として約70ｇが得られた。
内径4.5cm×20cmの硝子カラムに陽イオン交換樹脂DOWEX 50WＸ８（ダウケミカル社製）270mLを充填し、１規定塩酸にてＨ型にした後水洗する。得られた乾固物約70ｇを約５Ｌの蒸留水に溶解し、カラムに通液する。通液した液を約100mLずつ分画し、実施例１と同様にＨＰＬＣ分析し、Ｌ−アラボン酸を含む画分約8Ｌを得た。得られたＬ−アラボン酸溶液約８Ｌをエバポレーターにて濃縮し、シロップ状になったところにアセトンを加えて良く攪拌し、均一にした。さらに、濃縮とアセトン添加を繰り返し行い、低温下（約10℃）にて濃縮液からの結晶化を行った。その結果、約41.65ｇの結晶が得られた。得られた結晶はＬ−アラボノ−γ−ラクトンであることを確認した。
【００２０】
実施例３
実施例１と同様にして得られたＬ−アラボン酸溶液約850mLをエバポレーターにて濃縮し、シロップ状になったところにエタノールを加えて良く攪拌し、均一にする。さらに、濃縮とエタノール添加を繰り返し行い、低温下（約10℃）にて濃縮液からの結晶化を行った。その結果、約2.3ｇの結晶が得られた。得られた結晶はＬ−アラボノ−γ−ラクトンであることを確認した。
【００２１】
実施例４
実施例２と同様にして得られた乾燥物約72ｇのうち、10ｇを蒸留水500mLに溶解し、Ｌ−アラボン酸含有溶液とした。内径3.0cm×長さ15cmの硝子カラムに陽イオン交換樹脂DOWEX 50WＸ８（ダウケミカル社製）40mLを充填し、１規定塩酸にてＨ型にした後、水洗する。Ｌ−アラボン酸溶液500mLをカラムに通液する。通液した液を約50mLずつ分画し、実施例１と同様にＨＰＬＣ分析にて分析し、得られたＬ−アラボン酸溶液約950mLをエバポレーターにて濃縮し、シロップ状になったところにアセトニトリルを加えて良く攪拌し、均一にする。さらに、濃縮とアセトニトリル添加を繰り返し行い、実施例２で得られた結晶を種晶として少量加え、低温下（約10℃）にて濃縮液からの結晶化を行った。その結果、約4.9ｇの結晶が得られた。得られた結晶はＬ−アラボノ−γ−ラクトンであることを確認した。
【００２２】
実施例５
実施例２で得られた結晶41.65ｇのうち、約10ｇをアセトンとエタノールの混合溶媒（１：１）に溶解し、エバボレーターで濃縮後、低温化（約10℃）にて濃縮液からの結晶化を行った。その結果、約6.1ｇの結晶が得られた。得られた結晶はＬ−アラボノ−γ−ラクトンであることを確認した。
【００２３】
実施例６
実施例２で得られた結晶41.65ｇのうち約10ｇをアセトンに溶解し、エバボレーターで濃縮後、酢酸エチルを少しずつ加え、低温下（約10℃）にて結晶化を行った。その結果、約6.3ｇの結晶が得られた。得られた結晶はＬ−アラボノ−γ−ラクトンであることを確認した。
【００２４】
実施例７
実施例２で得られた結晶41.65ｇのうち、約10ｇをアセトンとメタノールの混合溶媒（４：１）に溶解し、エバボレーターで濃縮後、酢酸エチルを少しずつ加え、実施例２で得られた結晶を種晶として少量加え、低温下（約10℃）にて濃縮液からの結晶化を行った。その結果、約6.4ｇの結晶が得られた。得られた結晶はＬ−アラボノ−γ−ラクトンであることを確認した。
【００２５】
参考例１
Ｌ−アラボン酸の食餌性カルシウム吸収促進作用
実験には11週齢のICR系雄性マウスを終夜絶食して使用した。試験期間中は脱イオン水のみを与えた。マウスを８群（Ｉ〜VIII群、各群の例数は５）に分け、すべての実験群に炭酸カルシウム５mmol/kgを経口投与した。カルシウムとしては200mg/kgの投与量に相当する。Ｉ群には炭酸カルシウムのみを投与し、II〜Ｖ群には炭酸カルシウムとＬ−アラボン酸、VI〜VIII群には炭酸カルシウムとＤ−グルコン酸を同時に経口投与した。併用投与したＬ−アラボン酸の投与量は1.25mmol/kg（II群）、2.5mmol/kg（III群）、5.0mmol/kg（IV群）、10.0mmol/kg（Ｖ群）、Ｄ−グルコン酸の投与量は、2.5mmol/kg（VI群）、5.0mmol/kg（VII群）、10.0mmol/kg（VIII群）とした。
【００２６】
カルシウム吸収促進作用の指標として、血中カルシウム濃度変化を調べるために、被験物質投与前および投与後15分、30分、60分、90分、２時間および４時間に眼窩静脈より毛細管を用いて各10μLを採血した。血中カルシウム濃度はキレート発色法（オルトクレゾールフタレインコンプレキソン (OCPC)法）で定量した。得られたデータは、対応のあるｔ検定で解析し、危険率5%以下を有意差ありとした。
【００２７】
その結果、炭酸カルシウムのみを投与したＩ群では、投与後４時間まで血中カルシウム濃度は上昇しなかったが、炭酸カルシウムとＬ−アラボン酸を併用投与したII〜Ｖ群では用量依存的かつ有意な血中カルシウム濃度上昇が認められた。一方、炭酸カルシウムとＤ−グルコン酸を併用投与したVI〜VIII群では有意な血中カルシウム濃度上昇は認められなかった。
【００２８】
図２に、炭酸カルシウムのみを投与したＩ群、炭酸カルシウムとＬ−アラボン酸５mmol/kgを同時に投与したIV群および炭酸カルシウムとＤ−グルコン酸５mmol/kgを同時に投与したVII群における血中カルシウム濃度変化を示した。Ｌ−アラボン酸によりカルシウムの吸収が促進されること、およびその作用が速効性かつ持続的であることが明らかとなった。
【００２９】
参考例２
Ｌ−アラボン酸ナトリウムの食餌性カルシウム吸収促進作用
８週齢のICR系雄性マウスを使用し、１週間カルシウム欠乏食と脱イオン水を与えた。マウスは試験前に終夜絶食させ、試験期間中は脱イオン水のみを与えた。マウスを２群に分け、Ｉ群には炭酸カルシウム５mmol/kgのみを投与し、II群には炭酸カルシウム５mmol/kgとＬ−アラボン酸ナトリウム５mmol/kgを同時に経口投与した。血中カルシウム濃度の測定は参考例１と同様にした。得られたデータは、対応のあるt検定で解析し、危険率５％以下を有意差ありとした。
【００３０】
その結果、表１に示すように、炭酸カルシウムのみを投与したＩ群では、投与後４時間まで血中カルシウム濃度は上昇しなかったが、炭酸カルシウムとＬ−アラボン酸ナトリウムを併用投与したII群では有意な血中カルシウム濃度上昇が認められた。
【００３１】
【表１】
2007039389.tif 000002
【００３２】
参考例３
ラットにおけるＬ−アラボン酸の消化管内動態
実験には7-11週齢のWistar系雄性ラットを終夜絶食して使用した。Ｌ−アラボン酸５mmol/kgを経口投与した後、動物を代謝ケージに入れ、２時間後、６時間後および24時間後に屠殺して消化管を摘出した。消化管部位ごとにその内容物を回収し、未変化のＬ−アラボン酸量をHPLC法で定量した。各時点までの尿および糞の全量を回収し、同様にＬ−アラボン酸量を定量した。試験期間中、動物には脱イオン水のみを与えた。
【００３３】
その結果を表２に示した。投与後２時間から６時間にかけて、Ｌ−アラボン酸の大部分は、小腸でほとんど吸収されることなく未変化のまま盲腸および結腸に移行していくことが明らかとなった。投与２４時間後の盲腸および結腸内に総投与量の約３０％が残存していたこと、および排泄された糞中からもＬ−アラボン酸が検出されたことから、Ｌ−アラボン酸は腸内細菌による資化を受けにくいことが示唆された。未変化のＬ−アラボン酸が少量ではあるが、尿中にも検出された。盲腸あるいは結腸に達したＬ−アラボン酸の一部が吸収され、体内で利用されることなく尿中へ排泄されたものと考えられる。試験期間を通して、血液中のＬ−アラボン酸濃度は検出限界以下であった。
【００３４】
【表２】
2007039389.tif 000003
【００３５】
Ｌ−アラボン酸の塩（カルシウム塩）についても投与後の消化管残存率を調べた結果、アラボン酸部分は小腸でほとんど吸収されることなく、未変化のまま盲腸および結腸に移行していくことが明らかとなった。
また、Ｌ−アラボノ−γ−ラクトンについても、参考例１と同様に食餌性カルシウム吸収促進組成物を測定した。その結果、Ｌ−アラボノ−γ−ラクトンを与えても、Ｌ−アラボン酸と同様の効果が得られた。
【００３６】
参考例４
Ｌ−アラボン酸の安全性試験
マウス経口単回試験の結果、Ｌ−アラボン酸のＬＤ50値は約１０g/kgであり、安全性の高い物質であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】Ｌ−アラボノ−γ−ラクトンのＸ線結晶回析により得られた構造を示す図である。
【図２】食餌性カルシウム吸収に及ぼすＬ−アラボン酸の作用を示す図である。
【図１】
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【図２】
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