(57)【要約】【課題】ＤＮＡマイクロアレイを用いたＤＮＡ鎖伸長反応による遺伝子の検出方法において高感度の検出方法を提供すること。【解決手段】リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する担体に、（ａ）担体表面にＤＮＡ伸長用のプライマーを固定化させてプライマー固定化担体を作製する工程、（ｂ）検出する着目遺伝子のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片、ヌクレオチドモノマー、及びＤＮＡ伸長用酵素を含む試料溶液を担体表面に接触させる工程、（ｃ）試料溶液中のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を鋳型にして、担体表面に固定化されているＤＮＡ伸長用プライマー鎖を伸長させる工程、（ｄ）工程（ｃ）で、二本鎖をヘリカーゼ調製物と接触させる工程、を含む遺伝子の検出方法。【選択図】 なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する担体に、
（ａ）前記担体表面にＤＮＡ伸長用のプライマーを固定化させてプライマー固定化担体を作製する工程、
（ｂ）検出する着目遺伝子のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片、ヌクレオチドモノマー、及
びＤＮＡ伸長用酵素を含む試料溶液を担体表面に接触させる工程、
（ｃ）前記試料溶液中のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を鋳型にして、担体表面に固定
化されている前記ＤＮＡ伸長用プライマー鎖を伸長させる工程、
（ｄ）工程（ｃ）で、伸長によって得られるＤＮＡ鎖と着目遺伝子のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片との二本鎖をヘリカーゼ調製物と接触させる工程、
を含むことを特徴とする遺伝子の検出方法。
【請求項２】
請求項１記載の遺伝子の検出方法において、工程（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）を同一試料溶液中で行うことを特徴とする遺伝子の検出方法
【請求項３】
請求項１又は２に記載の遺伝子の検出方法において、
ヘリカーゼ調製物が少なくとも1種類以上のヘリカーゼを含むことを特徴とする遺伝子の検出方法。
【請求項４】
請求項１〜３いずれかに記載の遺伝子の検出方法において、
前記高分子物質の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルグリセロール基、ホスファチジルホスホリルグリセロール基のいずれかであることを特徴とする遺伝子の検出方法。
【請求項５】
工程(ｂ)において前記ヌクレオチドモノマーの何れかに標識がなされていていることを特徴とする請求項１〜４いずれか記載の遺伝子の検出方法。
【請求項６】
請求項１〜５いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
前記ＤＮＡ鎖伸長用酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡリガーゼであることを特徴とする遺伝子の検出方法。
【請求項７】
請求項１〜６いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
前記ＤＮＡ伸長用プライマー鎖が、前記電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位の部位で共有結合していることを特徴とする遺伝子の検出方法。
【請求項８】
請求項１〜７いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することを特徴とする遺伝子の検出方法。
【請求項９】
請求項１〜８いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
前記担体は、前記高分子物質に加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含むことを特徴とする遺伝子の検出方法。
【請求項１０】
請求項１〜９いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
前記担体が、プラスチック材料からなることを特徴とする遺伝子の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プライマーＤＮＡ鎖を所定の担体表面に固定化し、ＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片を鋳型としてＤＮＡ鎖を伸長させて遺伝子を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の発現状況や、菌やウィルスの同定等遺伝子を用いた検出や診断が生化学の分野では、日常に行なわれている。従来、遺伝子の検出には、電気泳動による方法が行なわれてきたが、近年になってＤＮＡマイクロアレイにより複数の遺伝子を同時にみる方法が行なわれている。
従来からの電気泳動による方法では、検出までに時間を要し、また操作に煩わしさがあった。
また、マイクロアレイによる遺伝子検出においては、検出に高価な蛍光試薬を使用しなければならず、また検出にマイクロアレイ専用の高価な検出機を必要とし、臨床の検査分野や、食品検査等の分野ではなかなか使用されるまでに至っていない。
【０００３】
現在、ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子配列検出法として表面にプローブＤＮＡ鎖を所定の担体表面に固定化し、標識化したＤＮＡ鎖をハイブリダイズさせて検出させる方法が用いられている。また、近年ＤＮＡ断片を鋳型として担体表面に固定化された伸長用プライマーを伸長させて遺伝子を検出する方法が考案されている。その一つとして非特許文献１には、所定のアミノ−シラン試薬を用いて修飾されたガラス基板の表面に、プライマーとなるＤＮＡ鎖を共有結合させ、基板上でＰＣＲ反応を行わせＤＮＡ増幅を行う技術が開示されている。また、非特許文献２には、ガラス基板の代わりにポリ（メチルメタクリレート）表面にＤＮＡ断片を固定化させたＤＮＡマイクロアレイを用いて、所定のＤＮＡ鎖とのハイブリッド特性およびＰＣＲ反応条件下における熱安定性が評価されており、新規のＰＣＲ技術に適用できるデバイスの可能性を示唆する記載がなされている。しかしながら、これらの検出方法では十分な検出感度が得られず、微量なＤＮＡ断片を検出することができていない。
【０００４】
核酸の増幅は、研究、法科学、医学および農業において広く用いられている。その一つとして最もよく知られた増幅方法である、標的の増幅方法であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）がある（特許文献１〜３参照。）。ＰＣＲ反応は典型的には、標的配列の５’および３’端部にハイブリダイズさせる２種のオリゴヌクレオチドプライマーと、各デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）を加えることにより、アニールしたプライマーを伸長して、二本鎖産物を産生することのできるＤＮＡポリメラーゼとを用いる。反応混合物の温度を昇降することにより、ＤＮＡ産物の２本の鎖が分離し、次の回のアニーリングおよび伸長のための鋳型として機能できるようになり、このプロセスが繰り返される。
【０００５】
ＰＣＲは研究者によって広く用いられているが、２本のＤＮＡ鎖を分離するために、サーモサイクリングが必要である。近年、いくつかの等温標的増幅方法が開発されてきた。その一つとして、特許文献４にはサーモサイクリングによる２本鎖の分離を必要とせず、二本鎖核酸を酵素的に巻き戻すことのできる酵素であるヘリカーゼの添加をすることで等温条件下で標的ＤＮＡを指数的かつ、選択的に増幅できることが記載されている。
【非特許文献１】Adessi，Celine et al． “Solid Phase DNA amplification：Characterisation of primer attachment and amplification mechanisms” ，Nucleic Acids Research，2000，Vol．20，No.20，e87
【非特許文献２】Fixe ， F. et al ． “Functionalization of poly （ methyl- 5 -methacrylate ）（ PMMA） as a substrate for DNA microarrays” ， NucleicAcids Research，2004，January 12，Vol.32 No.１ ，ｅ9
【特許文献１】米国特許第４，６８３，１９５号明細書
【特許文献２】米国特許第４，６８３，２０２号明細書
【特許文献３】米国特許第４，８００，１５９号明細書
【特許文献４】特表２００６−５０００２８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者等は、非特許文献１および２に代表されているＤＮＡマイクロアレイを用いてＤＮＡ鎖伸長反応を行ったところ、検出感度に問題があることとサーモサイクリングが必要であり操作性に問題があることを見出し、表面に所定の高分子物質を配した担体を用いることと、反応溶液中にヘリカーゼ調製物を添加することでこの問題を解決して本発明の完成に至った。
【０００７】
即ち本発明は、（１）リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する担体に、
（ａ）前記担体表面にＤＮＡ伸長用のプライマーを固定化させてプライマー固定化担体を作製する工程、
（ｂ） 検出する着目遺伝子のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片、ヌクレオチドモノマー、及
びＤＮＡ伸長用酵素を含む試料溶液を担体表面に接触させる工程、
（ｃ） 前記試料溶液中のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を鋳型にして、担体表面に固定
化されている前記ＤＮＡ伸長用プライマー鎖を伸長させる工程、
（ｄ）工程（ｃ）で、伸長によって得られるＤＮＡ鎖と着目遺伝子のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片との二本鎖をヘリカーゼ調製物と接触させる工程、
を含むことを特徴とする遺伝子の検出方法、
（２）（１）記載の遺伝子の検出方法において、工程（ｂ）〜（ｄ）を同一試料溶液中で行うことを特徴とする遺伝子検出方法、（３）（１）又は（２）に記載の遺伝子の検出方法において、
ヘリカーゼ調製物が少なくとも1種類以上のヘリカーゼを含むことを特徴とする遺伝子検出方法、
（４）（１）〜（３）いずれかに記載の遺伝子の検出方法において、
前記高分子物質の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルグリセロール基、ホスファチジルホスホリルグリセロール基のいずれかであることを特徴とする遺伝子の検出方法、
（５）工程(ｂ)において前記ヌクレオチドモノマーの何れかに標識がなされていていることを特徴とする、（１）〜（４）いずれか記載の遺伝子の検出方法、
（６）（１）〜（５）いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
前記ＤＮＡ鎖伸長用酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡリガーゼであることを特徴とする遺伝子の検出方法、
（７）（１）〜（６）いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
前記ＤＮＡ伸長用プライマー鎖が、前記電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位の部位で共有結合していることを特徴とする遺伝子の検出方法、
（８）（１）〜（７）いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することを特徴とする遺伝子の検出方法、
（９）（１）〜（８）いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
前記担体は、前記高分子物質に加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含むことを特徴とする遺伝子の検出方法、
（１０）（１）〜（９）いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
前記担体が、プラスチック材料からなることを特徴とする遺伝子の検出方法、
である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ＤＮＡマイクロアレイ等において高感度な検出が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。  
ここで使用される担体の表面には、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質が存在するようになっている。
【００１０】
このリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを有する高分子物質は、ＤＮＡ鎖の非特異的吸着を抑制する性質とＤＮＡ鎖を固定化する性質とを併せ持つポリマーである。特に、第一単位に含まれるリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基は鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第二単位に含まれるカルボン酸誘導基はプライマーを化学的に固定化する役割を果たす。すなわち、プライマーは、この高分子物質からなるコーティング層のカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、当該担体の表面に固定化される。
【００１１】
第一の単位は、たとえば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルキルホスホリルコリン基；
２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン基および１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルコキシアルキルホスホリルコリン基；
アリルホスホリルコリン基、ブテニルホスホリルコリン基、ヘキセニルホスホリルコリン基、オクテニルホスホリルコリン基、およびデセニルホスホリルコリン基等のアルケニルホスホリルコリン基；
等の基を有し、ホスホリルコリン基がこれらの基中に含まれている構成とすることができる。
【００１２】
また、これらの基のうち、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを有する構成とすることにより、担体表面における鋳型ＲＮＡ断片の非特異的吸着をより一層確実に抑制することができる。
【００１３】
カルボン酸誘導体は、カルボン酸のカルボキシル基が活性化されたものであり、Ｃ＝Ｏを介して脱離基を有するカルボン酸である。カルボン酸誘導体は、具体的には、アルコキシル基よりも電子求引性の高い基がカルボニル基に結合して求核反応が活性化された化合物である。カルボン酸誘導基は、アミノ基、チオール基、水酸基等に対する反応性を有する化合物である。
【００１４】
活性化されたカルボン酸誘導体として、さらに具体的には、カルボン酸であるアクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸などのカルボキシル基が、酸無水物、酸ハロゲン化物、活性エステル、活性化アミドに変換された化合物が挙げられる。カルボン酸誘導基は、こうした化合物に由来する活性化された基であり、たとえば、ｐ−ニトロフェニル基やＮ−ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基；
―Ｃｌ、−Ｆ等のハロゲン；
等の基を有することができる。
【００１５】
また、カルボン酸誘導基は、下記式（１）に示される基とすることができる。
【００１６】
【化１】
2007289088.tif 000002
（ただし、上記式（１）において、Ａは水酸基を除く脱離基である。）
【００１７】
上記式（１）に示される一価の基は、たとえば下記式（ｐ）または式（ｑ）から選択されるいずれかの基とすることができる。
【００１８】
【化２】
2007289088.tif 000003
【００１９】
（ただし、上記式（ｐ）および式（ｑ）において、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式（ｐ）において、Ｒ1はＣとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式（ｑ）において、Ｒ2はＮとともに環を形成する二価の基であってもよい。）
【００２０】
上記式（ｐ）に示される基として、たとえば下記式（ｒ）、（ｓ）、および（ｗ）に示される基が挙げられる。また、上記式（ｑ）に示される基として、たとえば下記式（ｕ）に示される基が挙げられる。
【００２１】
上記式（１）に示される基は、たとえば下記式（ｒ）、式（ｓ）等に示される酸無水物由来の基；
下記式（ｔ）に示される酸ハロゲン化物由来の基；
下記式（ｕ）、式（ｗ）に示される活性エステル由来の基；または
下記式（ｖ）に示される活性化アミド由来の基とすることができる。
【化３】
2007289088.tif 000004
【００２２】
カルボン酸誘導基のうち、活性エステル基は、穏やかな条件における反応性に優れるため、好ましく用いられる。穏やかな条件としては、たとえば中性またはアルカリ性の条件、具体的にはｐＨ７．０以上１０．０以下、さらに具体的にはｐＨ７．６以上９．０以下、さらにまた具体的にはｐＨ８．０とすることができる。
【００２３】
また、本明細書において規定するところの「活性エステル基」は、その定義について厳密な規定はなされていないが、慣用の技術表現としては、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。なお、ペプチド合成の分野においては、泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇道典著、「ペプチド合成の基礎と実験」、１９８５年発行、丸善、に記載されているように、活性エステル法はアミノ酸またはペプチドのＣ末端を活性化する方法の一つとして用いられている。
【００２４】
実際的には、エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基、水酸基等の基に対する反応性を有する。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。
【００２５】
ここでは、高分子物質中の活性化カルボン酸誘導体基が活性エステル基である場合を例に、説明する。活性エステル基としては、たとえばｐ−ニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、5−ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド基等が挙げられるが、たとえばｐ−ニトロフェニル基が好ましく用いられる。
【００２６】
表面にプライマーが固定化される担体の場合、第一単位と第二単位のさらに具体的な構成の組み合わせとして、たとえば、ホスホリルコリン基を含む第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有し、活性エステル基がｐ−ニトロフェニル基である構成とすることができる。
【００２７】
また、本実施形態の担体のコーティング層に使用される高分子物質は、ホスホリルコリン基およびカルボン酸誘導基以外に他の基を含んでもよい。また、高分子物質は共重合体とすることができる。具体的には、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体であることが好ましい。こうすることにより、高分子物質を適度に疎水化し、この高分子物質の担体表面への吸着性をさらに好適に確保することができる。
【００２８】
具体的には、高分子物質を、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート（ＮＰＭＡ）基を有する第二単量体と、ブチルメタリレート（ＢＭＡ）基を有する第三単量体との共重合体とすることができる。これらの共重合体であるｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｃｏ−ＮＰＭＡ）（ＰＭＢＮ）は、模式的に下記一般式（２）で示される。
【００２９】
【化４】
2007289088.tif 000005
【００３０】
ただし、上記一般式（２）において、ａ、ｂ、およびｃは、それぞれ独立して、正の整数である。また、上記一般式（２）において、第一〜第三単量体がブロック共重合していてもよいし、これらの単量体がランダムに共重合していてもよい。
【００３１】
上記一般式（２）で示される共重合体は、高分子物質の適度な疎水化と、鋳型ＲＮＡ断片の非特異吸着を抑制する性質と、プライマーを固定化する性質とのバランスとに、より一層優れた構成である。このため、このような共重合体を用いることにより、担体表面をより一層確実に高分子物質で被覆するとともに、高分子物質がコーティングされた担体上への鋳型ＲＮＡ断片の非特異的吸着を抑制しつつ、プライマーをさらに確実に共有結合により固定化して担体上に導入することができる。
【００３２】
なお、上記一般式（２）で示される共重合体は、ＭＰＣ、ＢＭＡ、およびＮＰＭＡの各単量体を混合し、ラジカル重合等の公知の重合方法により得ることができる。上記一般式（２）で示される共重合体をラジカル重合により作製する場合、たとえば、Ａｒ等の不活性ガス雰囲気にて、３０℃以上９０℃以下の温度条件で溶液重合を行うことができる。
【００３３】
溶液重合に使用される溶媒は適宜選択されるが、たとえば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコールや、ジエチルエーテル等のエーテル、クロロホルム等の有機溶媒を単独でまたは複数混合して用いることができる。具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒とすることができる。
【００３４】
また、ラジカル重合反応に使用されるラジカル重合開始剤としては、通常使用されるものを用いることができる。たとえば、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、アゾビスバレロニトリル等のアゾ系開始剤；
過酸化ラウロイル、過酸化ベンゾイル、ｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート等の油溶性の有機過酸化物；
などが用いられる。
【００３５】
さらに具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒およびＡＩＢＮを用い、Ａｒ中、６０℃にて２〜６時間程度重合を行うことができる。
【００３６】
なお、本実施形態では、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有する例を説明したが、ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質を第一の高分子物質とし、これに加えて、ホスホリルコリン基を含む第一単位とブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含んでいてもよい。
【００３７】
なお、上記第一の高分子物質の第一単位と上記第二の高分子物質の第一単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。また、上記第一の高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を含むとき、この第一の高分子物質の第三単位と上記第二の高分子物質の第三単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。
【００３８】
このような第二の高分子物質は、鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制するポリマーとして用いられる。このようなポリマーとしては、たとえばホスホリルコリン基が３０モル％、ブチルメタクリレート基が７０モル％の割合で含まれているものであるＭＰＣポリマー（日本油脂社製）を用いることができる。
【００３９】
なお、高分子物質が上記第一の高分子物質、第二の高分子物質からなる場合、これらの高分子物質が混合されている構成とすることができる。各々の高分子物質のポリマーは、たとえばエタノール溶液に溶解できるため、それぞれのポリマー溶液を混合することにより容易に混合ポリマーを得ることができる。
【００４０】
以上のような高分子物質からなるコーティング層を表面に含む担体は、所定の形状に加工された担体の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に担体を浸漬し、乾燥してもよい。
【００４１】
また、担体として、プラスチック材料を用いた場合には、形状やサイズの変更に対する柔軟性が確保される上に、ガラス基板のものに比べて安価で提供することができるという観点から好ましい。このようなプラスチック材料としては、表面処理の容易性および量産性の観点から、熱可塑性樹脂を用いることができる。
【００４２】
熱可塑性樹脂としては、ある程度耐熱性があれば特に制限はない、耐熱性のある樹脂としてたとえば、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン；環状ポリオレフィン；含フッ素樹脂；
等を用いることができる。上記樹脂の中でも、飽和環状ポリオレフィンは、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、透明性および成形性に特に優れるため、光学的な分析に好適であり、担体の材料として好ましく用いられる。
【００４３】
次に、担体の表面へのプライマーの固定化方法について説明する。
例えば、（ｉ）担体上の高分子物質に含まれる複数の活性エステル基のうち、少なくとも一部の活性エステル基とプライマーとを反応させて共有結合を形成させることにより、担体表面でプライマーを固定化し、続いて（ｉｉ）プライマーを固定化した以外の担体表面の活性エステル基を不活性化する、すなわち残りの活性エステル基を不活性化することにより、プライマーを担体の表面に固定することができる。以下、それぞれの工程について説明する。
【００４４】
上記工程（ｉ）において、担体形状が、基板状の場合は、鋳型ＲＮＡ断片とアニールするプライマーを基板上に固定化する際には、プライマーを溶解または分散した液体を点着する方法が好ましい。高分子物質に含まれる活性エステル基の一部がプライマーと反応して、プライマーの間で共有結合が形成される。
【００４５】
このプライマーを溶解または分散した液体は、例えば中性からアルカリ性、例えばｐＨが７．６以上とすることができる。
【００４６】
また、点着後、担体表面に固定化されなかったプライマーを除去するため、純水や緩衝液で洗浄してもよい。
【００４７】
また、上記工程（ｉｉ）に示したように、洗浄後はプライマーを固定化した以外のプラスチック担体表面の活性エステルの不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行う。
【００４８】
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを用いることができる。
【００４９】
一級アミノ基を有する化合物としては、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５-アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを用いることができる。これらのうち、アミノエタノール、グリシンを用いることが好ましい。
【００５０】
また、担体に固定化するプライマーには、活性エステル基との反応性を高めるため、アミノ基を導入しておくことが好ましい。アミノ基は活性エステル基との反応性に優れるため、アミノ基が導入されたプライマーを用いることにより、効率よくかつ強固に担体の表面上にプライマーを固定化することができる。アミノ基の導入位置はプライマーの分子鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端に導入されていることが、相補的な鋳型ＲＮＡ断片とのアニーリングをより一層効率よく行うことができるという観点からは、好ましい。
【００５１】
以上により、担体の表面上にプライマーが固定化されたアレイが得られる。
【００５２】
本発明に使用するヘリカーゼ調製物については、１つのヘリカーゼを含むものであってもよいし、複数のヘリカーゼを含むものであってもよい。調製物中の１つまたは複数のヘリカーゼは、３’→５’ヘリカーゼのクラスまたは５’→３’ヘリカーゼのクラスから選択することができる。
【００５３】
本明細書において「ヘリカーゼ」とは、二本鎖核酸を酵素的に巻き戻すことのできる任意の酵素のことをいう。たとえば、ヘリカーゼは、あらゆる有機体において、複製、組み換え、修復、転写、翻訳およびＲＮＡスプライシングなどの核酸が関与するすべてのプロセスにおいて見られる酵素である（ＫｏｒｎｂｅｒｇとＢａｋｅｒ、ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（第２版１９９２））、特に第１１章）。ＤＮＡまたはＲＮＡに沿って５’から３’の方向または逆に３’から５’の方向に移動する任意のヘリカーゼを、本発明の実施形態において用いることができる。これには、原核生物、ウィルス、古細菌、および真核生物または天然の酵素の組換え型から得られるヘリカーゼ、ならびに特定の活性を有するアナログまたは誘導体が含まれる。
【００５４】
さらに、ヘリカーゼ調製物は、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）またはデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、例えば、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）またはデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）を含んでいてもよい。エネルギー源のための適切な濃度は、約０．１〜５０ｍＭの範囲である。
【００５５】
より詳細には、ヘリカーゼ調製物は、ヘリカーゼと、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）またはデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）などのエネルギー源と、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）とを含む。１つ以上の追加の物質をヘリカーゼ調製物中に含めてもよいが、該物質は、１つ以上の追加のヘリカーゼ、アクセサリタンパク質、小分子、化学物質およびバッファのなかから選ばれる。
【００５６】
ヘリカーゼ調製物中に含まれる一本鎖結合タンパク質においては、例えば、Ｔ４遺伝子３２ＳＳＢ、大腸菌ＳＳＢ、Ｔ７遺伝子２．５ＳＳＢ、ファージφ２９ＳＳＢおよびそれらの誘導体、およびアクセサリタンパク質においては、例えばＭｕｔＬを含んでいてもよい。
【００５７】
本明細書において「アクセサリタンパク質」とは、ヘリカーゼ活性を刺激することのできる任意のタンパク質のことをいう。例えば、大腸菌ＭｕｔＬタンパク質は、ＵｖｒＤヘリカーゼ融解活性を強化するためのアクセサリタンパク質である（Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：９１９７〜９２０１（１９９８）；Ｍｅｃｈａｎｉｃら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３８３３７〜３８３４６（２０００））。代替の実施形態において、核酸の巻き戻しは、アクセサリタンパク質の非存在下でヘリカーゼによって行ってもよい。
【００５８】
ＤＮＡマイクロアレイ表面に、固定化されたプライマー鎖に検出する着目遺伝子の鋳型ＤＮＡ断片または鋳型ＲＮＡ断片、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系、ヘリカーゼ調整物及びヌクレオチドモノマーを含む試料が導入される。
【００５９】
この導入された試料からなる反応系としては、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系は、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼのいずれかを用い、ヌクレオチドモノマー（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰなど）を含有するバッファーを用いることができる。
【００６０】
また、ＤＮＡポリメラーゼの中でも、特に耐熱性細菌に由来するＤＮＡポリメラーゼで
あるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮ Ａポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼなどを用いることもできる。
【００６１】
また、これらヌクレオチドモノマーの少なくとも一種をラベルしておくことができる。例えば、ｄＴＴＰの塩基の３ 位を蛍光ラベルしたＣｙ３−ｄＵＴＰをヌクレオチドモノマーとして用いることで、鋳型ＤＮＡ 断片のアデニン（Ａ）に対応する伸長（ プライマー）側の位置にＣｙ３−ｄＵＴＰが挿入される。これにより、伸長反応が生じたプライマーから形成されるＤＮＡ断片がＣｙ３−ｄＵＴＰで蛍光染色されて、このＤＮＡ断片の検出を行うことができるようになる。
【００６２】
なお、他のヌクレオチドモノマーをラベルしてもよく、また複数の種類のヌクレオチドモノマーをラベルしてもよい。また、ラベル方法も蛍光体の導入の他に、光吸収体の導入の方法、放射線ラベルの方法（P32-ATP、P32-ｄATP）、酵素標識などの非放射性ラベルの方法などによってもＤＮＡ鎖を検出することができる。
【００６３】
この酵素標識の方法においては、ビオチン（biotin） 化またはジゴキシゲニン（ＤＩＧ： ステロイド系天然物）を結合した核酸（例えば、biotin-dUTP、DIG-dUTP）を使用してプライマーを伸張させた後、蛍光標識化させたり、アルカリフォスファターゼまたはアルカリフォスファターゼ処理しニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）液中で数時間反応させることによってＤＮＡを検出することができる。
ここでは、鋳型ＤＮＡ断片に対して耐熱性ＤＮＡ ポリメラーゼを用いた例を示したが、ＤＮＡ鎖を鋳型として新たなＤＮＡ鎖を合成する酵素であれば特に限定はされない。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ（大腸細菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ断片など）、α型ＤＮＡポリメラーゼ（ピロコッカス・フリオサス由来ＤＮＡポリメラーゼ、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥ ＥＰＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ）及び非α非ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ（ 国際公開第９７／２４４４４号パンフレット記載のＤＮＡポリメラーゼ）等が挙げられる。
【００６４】
ＤＮＡポリメラーゼの代わりに、ＤＮＡリガーゼを用いてもＤＮＡ鎖伸長反応を行うことができるため、ＤＮＡ鎖増幅を行うことが可能である。
【００６５】
このＤＮＡ鎖増幅のためには、担体上の一定の区画内に複数のスポットを設けておき、各スポットにプライマーＤＮＡ鎖を固定化しておき、マイクロアレイを形成しておくことが好ましい。
【００６６】
また、担体の表面に固定化させるＤＮＡ伸長用プライマーＤＮＡ鎖の長さを検出対象に応じて任意に決定することができ、例えば５〜５０塩基とすることができる。
【００６７】
ＤＮＡ伸長反応の後に、反応液を除去して、ＤＮＡマイクロアレイを、例えば０．１ｗｔ％ のＴＷＥＥＮ２０溶液を用いて洗浄して、終了する。
【００６８】
以下に、本実施形態となる遺伝子の検出方法の流れについて記載する。
【００６９】
担体表面へ固定化するプライマーの選択は、検出対象の遺伝子に特異的な配列をもとに設計する、プライマー鎖の長さは、２０〜３０塩基がＤＮＡの伸長反応のし易さから好適である。
【００７０】
設計されたプライマー鎖の５’末端にアミノ修飾がなされ、担体表面の活性エステル基と反応し担体上への強固に固定化される。
【００７１】
本発明を用いた、遺伝子の検出方法の一例を記載する。ただし本記載例に限定したものではない。
【００７２】
まず、採取したヒトの血液等からＤＮＡを抽出する。抽出する方法として、市販のＤＮＡ 抽出キットを使用することがあげられる。
【００７３】
次に、抽出されたＤＮＡを断片化する。抽出されたＤＮＡ鎖は長いため断片化の工程が必要になる。断片化すなわち切り出しの方法の一つにＰＣＲがあげられる。遺伝子特異配列を含む部分を増幅するように、プライマー設計を行い、ＰＣＲにより増幅することにより、ＤＮＡ鎖の一部の切り出しを行なう、切り出されるＤＮＡ鎖の長さが、１００〜１０００塩基程度になるように、プライマーの設計をおこなう。
【００７４】
ＤＮＡ鎖の断片化は、ＰＣＲの他に超音波による破砕も可能である。しかし、破砕条件については、ＤＮＡ鎖が細断片化されない注意を要する。また、制限酵素による断片化も可能である。
【００７５】
ＤＮＡ鎖断片化の後、プライマー鎖が固定された担体上で、ＤＮＡ伸長反応を行う。
【００７６】
断片化されたＤＮＡ鎖、ＤＮＡ伸長酵素、ヘリカーゼ調製物、ヌクレオチドモノマーを含む溶液を、プライマーＤＮＡ鎖が固定された担体上に供給し、必要に応じてカバーガラスをかけ、密閉容器中に納め、ＤＮＡ鎖の伸長反応を行う。
【００７７】
ヌクレオチドモノマーの何れかに、Ｃｙ３などの蛍光色素を標識しておけば、蛍光スキャナーによりスポットの確認が可能である。
【００７８】
あるいは、ヌクレオチドモノマーの何れかに、ビオチンを標識しておき、ＤＮＡ伸長反応の後、アルカリフォスファターゼを標識したアビジンを反応させることにより、伸長したＤＮＡにアルカリフォスファターゼを標識した後、ＢＣＩＰ/ＮＴＢなどの発色試薬を作用させることにより、ＤＮＡ が伸長したスポットの可視化が可能となる。可視化されたスポットは、目での認識が可能である他、デジカメやＯＡスキャナーで画像を認識し、画像処理ソフトなどを使って、スポットの強度の解析も可能となる。
【実施例】
【００７９】
以下、実施例を記載する。
【００８０】
以下の手法にて、プラスチック担体にオリゴＤＮＡプライマーを固定化して、鋳型となるオリゴＤＮＡ、ポリメラーゼ、蛍光標識化オリゴヌクレオチド、ヘリカーゼ調製物、ＭｇＣｌ２、ＡＴＰ、バッファを含む溶液を滴下し、一定時間反応後、プライマーのＤＮＡ鎖伸長反応を検出し、蛍光スキャナーを用いて評価を行った。
【００８１】
（ プラスチック基板の製造）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物
（ＭＦＲ（Melt flow rate）：２１ｇ/１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度１２３℃）を用い、射出成形によりスライドガラス形状の基板を得た。基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体（各基は、モル％で２５：７４：１）の０．５重量％ エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入して、プラスチック基板を得た。
【００８２】
（プライマーの固定）
５’末端がアミノ基で修飾された、オリゴＤＮＡを０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０） を用いて溶解し、１０μＭのオリゴＤＮＡ溶液を調製した。これら溶液をスポッタ（日立ソフトウェアーエンジニアリング製Marks-I）を用い、１００μｍ径クロスカットピンでプラスチック基板の表面上にスポットした。オリゴＤＮＡをスポットした基板を、８０℃で一時間加熱して、オリゴＤＮＡ（プライマー）を固定化させた。スポットおよび固定化させたオリゴＤＮＡプライマーの鎖配列を下記に示す。
オリゴＤＮＡプライマー：gcaagtcgcttcacctacat（配列番号１）
【００８３】
（基板上でのＤＮＡの伸長反応）
ＰＣＲバッファ（タカラバイオ株式会社製１０ＸＴａｑ Ｂｕｆｆｅｒ (Ｍｇ２+ ｆｒｅｅ)）８ μ Ｌ、１０ｎＭの鋳型オリゴＤＮＡを８μＬ、１００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、Ｃｙ３標識ｄＵＴＰを２μｌ、５ＵのＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製 Ｔａｑ）、３ｍＭのマグネシウムイオン（塩化マグネシウム）を８μＬ、２ｍｍｏｌのＡＴＰを８μＬを溶解させた。この試料溶液に１ＵＮＩＴ／μＬのヘリカーゼ（和光純薬  ＤＮＡＨｅｌｉｃａｓｅII）を０μＬ、１μＬ、５μＬと加える量を変化させた試料溶液を調整し、以下の実験に使用した。
鋳型オリゴＤＮＡ：gaaggcacgctgatatgtaggtgaagcgacttgctcgtggagctgaaatc（配列番号２）
【００８４】
試料溶液をオリゴＤＮＡプライマーを固定化した担体表面に滴下し、３７℃で３０分静置させてＤＮＡ鎖伸長反応を行った。
【００８５】
ＤＮＡ伸長反応の後、基板を０．１ｗｔ％のＳＤＳ溶液を用いて洗浄して、終了した。スライド用スキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙパーキンエルマー社製） によりスポットの蛍光強度を測定し、比較を行った。
【００８６】
スポットの蛍光強度の比較を表１に示す。
【００８７】
【表１】
2007289088.tif 000006
【配列表】
2007289088000001.app