(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｘ線解析用の試料として使用可能な品質と大きさのタンパク質結晶を、少量のタンパク質溶液を用いて、高い結晶化成功率と短い結晶成長時間で生成するマイクロ流体デバイスおよびタンパク質結晶化装置を提供する。【解決手段】過飽和タンパク質溶液３１と沈殿剤溶液３２を、マイクロ流路の周囲に電極１７を備えたマイクロ流体デバイスへ導入し、交流電界を、ある特定の周波数を単独で、あるいは異なる複数の周波数を重畳して印加しながらタンパク質を結晶化する。【選択図】図７
2007061672.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の過飽和溶液をマイクロ流路に導入してタンパク質の結晶化を行うマイクロ流体デバイスであって、前記マイクロ流路の断面を囲む複数の電極を備え、前記電極に交流電圧を印加することを特徴とするマイクロ流体デバイス
【請求項２】
請求項１における電極に印加する交流電圧は、１ＭＨｚ以下である第１の周波数と、１ＭＨｚより高く３０ＭＨｚ以下である第２の周波数と、３０ＭＨｚより高く１ＧＨｚ以下である第３の周波数の、３つの周波数の２つ以上を重畳して印加することを特徴とするタンパク質結晶化装置
【請求項３】
請求項１のマイクロ流体デバイスを用いたタンパク質結晶化装置であって、生成したタンパク質結晶を、前記交流電圧を印加した電極から作用する誘電泳動力により浮遊状態で保持し、流路内の流体と共に移動させることを特徴とするタンパク質結晶化装置
【請求項４】
請求項１のマイクロ流体デバイスを用いたタンパク質結晶化装置であって、生成したタンパク質結晶を、前記交流電圧を印加した電極から作用する誘電泳動力により浮遊状態で保持し、流路内の流体だけを入れ換えることを特徴とするタンパク質結晶化装置
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の技術分野は、タンパク質構造を解析するためのＸ線回折に適したタンパク質結晶生成と、タンパク質結晶化条件の網羅的探索（スクリーニング）を行う技術に係わり、特に、マイクロ流路内でタンパク質の過飽和溶液からタンパク質結晶を生成するマイクロ流体デバイスおよびこれを用いたタンパク質結晶化装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオ研究においてはヒトゲノムの完全解読が終了し、今後はゲノム情報から作られる様々なタンパク質の機能や構造を解明しなければならない段階に入った。タンパク質構造の解析には、結晶化したタンパク質のＸ線回折像から推定する手法が最も多く使われている。しかし従来のタンパク質の結晶化方法は結晶化の成功率が低く、タンパク質の違いに応じて結晶化を促進するための沈殿剤の種類や沈殿剤溶液濃度、タンパク質溶液濃度、環境条件などを数多く試験しなければならず、結晶化条件のスクリーニングに長い時間と手間がかかっていた。
【０００３】
従来から用いられている結晶化方法にはハンギングドロップ法、シッティングドロップ法などの気液界面で生じる濃度勾配を利用する蒸気拡散法が最も多く使われており、その他にも試料溶液と混ざらない液体内で結晶化させるバッチ法、ゲル内で結晶化させるゲル法などがある。しかし上記のいずれの方法も、結果を見るには２、３ヶ月の時間が掛かり、結晶化に成功する確率も非常に低い。それだけでなく容器壁への付着や沈降、対流などが、溶液供給の偏りや歪による雑晶化を招き、特に蒸気拡散法では気液界面にタンパク質の酸化物を生成するなど、品質の良い結晶の生成が難しいという問題がある。
【０００４】
結晶化速度が遅いという課題を改善するために、特許文献１に開示された方法が提案されている。この方法は、突堤部分を有する半導体で形成したチャンバー内にタンパク質溶液を満たし、直流電界を印加した突堤部分にタンパク質分子を静電気力で集積させて、結晶生成速度を向上させている。しかしこの方法は、接触している固体面で強い歪を生じるために生成結晶の品質が劣る欠点があり、付着面から結晶を剥がす際に損傷を受けやすいなどの課題がある。
【０００５】
また特許文献２に開示されている自由界面拡散法は、使用する試料の量が少なく、対流（結晶品質低下の要因）が生じないというマイクロ流路の特徴を活かした方法である。この方法では、マイクロ流路を遮断するゲートが設けられたマイクロ流体デバイスが用いられ、ゲートを境にして一方からタンパク質溶液を、もう一方から沈殿剤溶液を導入した後に一斉にゲートを開放し、自由界面から２つの液体が拡散しながら混合する過程での結晶核生成を探索する。この方法により２、３日でスクリーニング結果が得られ、結晶化の成功率も２倍程度向上することが報告されている。しかしマイクロ流路内では、生成した結晶核の取り出しや移動が難しく、１００μｍ以下というマイクロ流路の断面サイズに制限されて大きな結晶が作れないという課題がある。
【特許文献１】ＷＯ  ２００１／８６０３７（ＰＣＴ／ＪＰ０１／０３７８２）
【特許文献２】ＷＯ  ２００４／０９４０２０（ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１２０７１）
【非特許文献１】Ｋ．  Ｖ．  Ｉ．  Ｓ．  Ｋａｌｅｒ  ａｎｄ  Ｔ．  Ｂ．  Ｊｏｎｅｓ：  “Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｓｐｅｃｔｒａ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ｆｅｅｄｂａｃｋ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｌｅｖｉｔａｔｉｏｎ”，  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ｖｏｌ．５７，  ｐｐ．１７３−１８２  （１９９０）．
【非特許文献２】Ｊ．  Ｂａｒｔｈｅｌ，  Ｋ．  Ｂａｃｈｈｕｂｅｒ，  Ｒ．  Ｂｕｃｈｎｅｒ，  ａｎｄ  Ｈ．  Ｈｅｔｚｅｎａｕｅｒ，  “Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｓｐｅｃｔｒａ  ｏｆ  Ｓｏｍｅ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｓｏｌｖｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ  Ｒｅｇｉｏｎ．  Ｗａｔｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｗｅｒ  Ａｌｃｏｈｏｌｓ”，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ｖｏｌ．１６５，  ｎｏ．４，  ｐｐ．３６９−３７３  （１９９０）．
【非特許文献３】Ｎ．  Ｍｉｕｒａ，  Ｎ．  Ａｓａｋａ，  Ｎ．  Ｓｈｉｎｙａｓｈｉｋｉ，  ａｎｄ  Ｓ．  Ｍａｓｈｉｍｏ：“Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ  Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  Ｂｏｕｎｄ  Ｗａｔｅｒ  ｏｆ  Ｇｌｏｂｕｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ”，  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，  ｖｏｌ．３４，  Ｉｓｓｕｅ  ３，  ｐｐ．３５７−３６４  （１９９４）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
以上の背景技術で述べたように、従来からのタンパク質の結晶生成方法では、網羅的なパラメータ探索を行っても結晶化に成功する確率が低く、結晶が得られてもＸ線回折で構造解析が可能な品質ではないことも多く、これらの結果を知るまでに長い時間がかかるという課題がある。特に、マイクロ流路内で結晶化させる自由界面拡散法では、生成した結晶核の移動や取り出しが難しく、マイクロ流路幅以上の大きな結晶は造れないという課題がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、流路の周囲に電極を備えたマイクロ流体デバイスを用い、流路内へ過飽和タンパク質溶液を導入し、流路の周囲に備えた電極から交流電界を印加しながらタンパク質を結晶化する。そのときに印加する交流電界として、ある特定の周波数を単独で、あるいは異なる複数の周波数を重畳して印加することにより、上記、課題を解決あるいは改善するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によるマイクロ流体デバイスとタンパク質結晶化装置では、流路の周囲の電極から作用する誘電泳動力により、生成した結晶核を液体中に浮遊させた状態で捕獲、保持ができるため、流路壁への結晶の沈降や付着を防止するだけでなく、流れを利用して周囲の溶液だけを入れ換えることや破損させずに結晶を運搬すること、さらには取り出すことが可能になる。
【０００９】
また本発明による交流電界の印加は、結晶核やタンパク質分子の誘電配向（電界配向）、タンパク質分子の回転、タンパク質分子を囲む水和水の解離、振動励起による発熱などの作用を、周波数帯を分けて個別に、あるいは組み合わせて利用できる。これにより、結晶化成功率や生成結晶品質の向上と結晶成長時間の短縮化が実現する。
【００１０】
また本発明は、従来のタンパク質結晶化パラメータであるタンパク質溶液濃度、沈殿剤溶液濃度、沈殿剤の種類などに、印加交流電界の強度と周波数という、設定や変更が容易で自動化にも適した新規のパラメータを追加する。したがって、今まで結晶化が困難だった試料に対して、新たなパラメータを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に述べるように本発明により、使用するタンパク質溶液の少量化だけでなく、Ｘ線解析用の試料として使うことが可能な品質と大きさのタンパク質結晶を、高い結晶化成功率と短い結晶成長時間で生成するマイクロ流体デバイスおよびタンパク質結晶化装置を実現する。
【実施例１】
【００１２】
まず、本発明の原理の理解に必要な、誘電泳動力について説明する。非特許文献１によれば、誘電泳動力（Ｆ）は、粒子（複素誘電率ε２）が分散された流体中（複素誘電率ε１）に電界勾配が存在する場合に発生し、電界の極性（電気力線の向き）には関係なく粒子に作用する引力（あるいは斥力）であり
Ｆ＝２πｒ３ε0εＲ・Ｒｅ［ＣＭ（ω）］・ｇｒａｄ｜Ｅ｜２      …  式１
ε０：真空の誘電率、ｒ：粒子の半径、εＲ：流体の比誘電率、Ｅ：電界ベクトル
と表される。式１から、誘電泳動力（Ｆ）は粒子半径ｒの３乗（または体積）と、クラジウス−モソッティ係数ＣＭ（ω）＝｛（ε２−ε１）／（ε２＋２ε１）｝の実数部であるＲｅ［ＣＭ（ω）］と、電界の２乗の勾配である∇｜Ｅ｜２  の３つの項の積に比例することが分かる。
【００１３】
一般には、誘電泳動力を発生するために電極へ印加する電圧として、周波数が約５０Ｈｚから５０ＭＨｚの間の交流が使用される。この周波数範囲の交流電圧を用いると、粒子が帯電している場合に作用する電気泳動力を時間平均の効果によりキャンセルすることができる。また、電極が直に流体に接触している場合に生じる（電気分解などの）電極反応を抑制することができる。
【００１４】
流体を２０°Ｃの水とすれば比誘電率は約７８であり、通常の生体物質では多くても比誘電率は１０以下であるから、水中ではほとんどの物質に、電極から反発する力（斥力）である負の誘電泳動力（ＣＭ（ω）＜０）が働く。したがって、流路の周囲に設置した複数の電極から誘電泳動力を作用させると、水をベースとする流体内の粒子は電極からの反発力に押されて流路の中心付近へ移動し、電界の形状によっては一定位置にトラップされる。
【００１５】
しかし、式１に示したように体積に相当するｒ３に比例する項があるために、試料のサイズが小さくなるにつれて誘電泳動力は急激に小さくなる。２００ｎｍ以下のサイズになると、熱運動（ブラウン運動）に負けて集束の効果が小さくなり、１５ｎｍ以下（ほとんどのタンパク質が含まれる）となると、ほとんど誘電泳動力の効果が見られなくなる。
【００１６】
次に、これも本発明の原理説明に必要な、水の誘電損失について述べる。図１に示したグラフは非特許文献２に掲載された水の誘電損失（実線）と比誘電率（点線）のスペクトルであり、誘電損失は周波数２０ＧＨｚにピークを持ち、バンド幅の広い吸収特性を持つことが示されている。この特性はγ分散と呼ばれ、γ分散周波数を境に水の比誘電率が低周波側における７８程度から高周波側における４．５程度にまで低下する。また、交流電界内でγ分散により水が発熱する性質は、電子レンジなどの調理器として利用されている。
【００１７】
非特許文献３には、タンパク質水溶液の誘電損失が報告されている。その中の一例として、タンパク質ミオグロビン（分子量１７．８ＫＤａ）の５％（重量％）水溶液に対する誘電損失（実線）のスペクトル測定値を、図２に示す。この測定結果によれば、６ＭＨｚ付近に大きな吸収ピーク（図２の矢印Ａ）が観測されるが、このピークの周波数はタンパク質分子の大きさに依存して移動することからタンパク質自身の回転であると推定されている。また同じデータの解析として、水和水分子のγ分散周波数は１００ＭＨｚ（点線）となることと、水和する水分子の数はタンパク質分子の表面積に相関があることが示されている。
【００１８】
従来からのタンパク質の結晶生成技術や結晶化研究においては、結晶化プロセス内に交流電界を作用させる考えは無かった。我々は、以下に指摘するとおり、これらの交流電界の作用が、タンパク質水溶液からタンパク質結晶を生成する際に重要な役割を果たすことを発見した。
【００１９】
まず第１に、誘電泳動力であるが、この作用は粒子の径の３乗に比例する力であり、タンパク質分子に対しては力が余りに小さすぎる。しかし、タンパク質水溶液から結晶核が生成され、その大きさが２００ｎｍ程度となると、充分に大きな力となる。つまり結晶核生成プロセスに続く結晶成長プロセスにおいては、結晶を浮遊状態のまま特定の位置に集中、あるいは捕捉することが可能になる。
【００２０】
第２に、タンパク質分子どうしが近づく、あるいはタンパク質分子が結晶表面に吸着する過程において、タンパク質に水和した水分子は障壁となるため、水和水を解離するエネルギーが必要である。したがって水和水の振動だけを励起する周波数（図２の矢印Ｂ）の交流印加は、結晶核生成プロセス、結晶成長プロセスのいずれの段階に対しても結晶化の推進力として作用する。
【００２１】
第３に、溶液中に浮遊するタンパク質分子の移動は拡散現象であり、その推進力は濃度勾配であるため、タンパク質分子が活発に動くほど結晶表面に到達する時間は早くなる。また、結晶表面に吸着したタンパク質分子は、表面拡散のランダムウォークで活発に動くほど結晶成長の最前線であるキンク位置へ到達する可能性が高くなる。したがってタンパク質分子の回転を誘起する周波数（図２の矢印Ａ）の交流印加は、結晶成長プロセスに対して推進力として作用する。
【００２２】
第４に、タンパク質分子は水溶液内で熱エネルギーにより活発に動き回る状態（ブラウン運動）ではあるが、それでも回転周波数よりも充分に低い周波数の交流電界を印加されると、誘電分極により電気力線に沿って整列（電界配向）する機会や時間が確率的に増加する。多数の結晶核が局所的に集中した状態でも同様に、交流電界を印加されると結晶核が整列する確率が増大し、雑晶化、アモルファス化には至らずに一体化し、単結晶として成長する。つまり充分に低い周波数の交流電界の印加は、タンパク質分子および結晶核のエントロピーを減少する方向に作用し、結晶化を推進する効果がある。
【００２３】
そして第５に、タンパク質水溶液にタンパク質分子が回転する周波数、あるいはタンパク質分子に束縛された水和水を振動させる周波数の、強い交流電界を印加すると、誘電損失に相当する発熱が生じる。しかしマイクロ流体では、流体内の温度はほとんど周囲温度に一致するという特徴があるので、マイクロ流路内の強い交流電界は局所的に僅かな温度勾配あるいは短時間の小さな昇温ストレスなどの作用を与える。したがって強い交流電界の印加は、従来の結晶化方法では観測できなかった未知の効果を発現する可能性もある。
【００２４】
以上の原理に基づき考案された本発明によるタンパク質結晶化装置の全体図を図３に、その中心となる本発明によるマイクロ流体デバイス１０の平面図を図４に示して、その構成と動作について説明する。
【００２５】
本発明のマイクロ流体デバイス１０における流入口の１つである沈殿剤溶液流入ウェル１３には、チューブを介して沈殿剤溶液供給ポンプ２５が接続され、沈殿剤溶液供給ポンプ２５から沈殿剤溶液３２が供給される。マイクロ流体デバイス１０の流出ウェル１９にはチューブを介して混合液回収ポンプ２６が接続されている。
【００２６】
マイクロ流体デバイス１０の内部は、ピペットによる点滴で試料を注入するタンパク質過飽和溶液注入ウェル１２と、前述の沈殿剤溶液流入ウェル１３の２つの流入口がある。プロセス制御装置２４からの指令によりプロセスがスタートすると、流入したタンパク質過飽和溶液と沈殿剤溶液の２つの液体は、途中から合流、混合されてマイクロ流路１１の終端である流出ウェル１９の方向へ流れる。このときのタンパク質過飽和溶液と沈殿剤溶液の混合比は、おおよそ沈殿剤溶液供給ポンプ２５からの圧力（正圧）と、混合液回収ポンプ２６からの吸引力（負圧）の差で決まり、また流れの速度は２つのポンプの圧力差とマイクロ流路の粘性抗力で決まる。
【００２７】
２つの液体は合流し、上流側電極群１７に囲まれた試料液混合流路１４を流れる間に混合し、もし結晶化に適した条件であれば結晶核３４が生成される。生成した結晶核３４は下流側電極群１８との境界に存在する結晶核トラップ領域１５でトラップ、あるいは観察状況やプログラムされたプロセスタイミングに応じてリリースされ、下流側電極群１８に囲まれた結晶核運搬流路１６を流れ、流出ウェル１９へと向かう。
【００２８】
試料液混合流路１４と結晶核トラップ領域１５の状況は、顕微鏡２１を通してイメージセンサーで電気信号に変換され、画像解析装置２３にて結晶核の有無や大きさの画像認識、さらには位置、時間などの各種条件とともにデータとして蓄積される。プロセス制御装置２４は、画像解析装置２３からの情報による状況判断も加えながら、プログラミングされたプロセスを運行し、沈殿剤溶液供給ポンプ２５や混合液回収ポンプ２６、交流電源２０を制御する。
【００２９】
交流電源２０は、本発明の重要な働きを担う部分である上流側電極群１７や下流側電極群１８へ交流電圧を供給するもので、各種の交流周波数の発生、発生した交流の合成、そして電極へ電圧を供給するための電力増幅の機能を有し、そのシークエンスはプロセス制御装置２４により制御される。
【００３０】
交流電源２０から出力される交流の周波数は、図２で示したタンパク質ミオグロビンの誘電損失特性を例にして、水和水の励起周波数を１００ＭＨｚ、タンパク質分子の回転周波数を８ＭＨｚとし、さらに本実施例では誘電泳動用として水和水励起やタンパク質分子回転への影響が無い５００ＫＨｚを使用する。これら３つの周波数のうち、誘電泳動用の周波数については、位相が１８０°異なる２相の交流出力が必要となる。本実施例の中ではこれを、図６（ａ）に示したようにゼロ相とπ相として区別する。さらに図６（ｂ）には、５００ＫＨｚの誘電泳動用周波数のゼロ相にタンパク質分子回転用周波数である８ＭＨｚを重畳した場合の、交流電源出力波形を示す。
【００３１】
図７は、上で述べた交流電源２０の電圧出力を上流側電極群１７に印加しながら、試料液混合流路１４で結晶核を生成する過程を示した図である。図７には示されていない上流側で２つの流路から流入したタンパク質過飽和溶液３１と沈殿剤溶液３２は、合流した後、界面を形成する２相流になって流れる。流れの速度は非常に遅く設定されていて、２相流はゆっくりと流れながら、界面から徐々にお互いの領域内へ拡散し、混合が進行する。
【００３２】
２つの溶液の混合比は、前述したとおり、沈殿剤溶液供給ポンプ２５と混合液回収ポンプ２６の２つのポンプで制御できる。この機能を利用して、結晶化条件スクリーニング用に、時間と共に徐々に混合比が変化するプロセスがプログラミングされている。したがって流れの方向の相対位置あるいは一定の場所を通過する時間は、混合液３３の混合比に対応する。もし結晶化に適した条件が設定されていた場合には、適切な混合比となる流れ内の位置で結晶核が生成される。
【００３３】
結晶化条件のスクリーニングは、印加する交流に重畳された３つの周波数のうち、水和水励起周波数（１００ＭＨｚ）とタンパク質分子回転周波数（８ＭＨｚ）の２つの周波数の振幅値をパラメータにして行う。これらのパラメータは時間的にも変更が自由にできるので、数多くの流路をアレイ状に並べたデバイスを用いなくても、時間的にパラメータをシフトさせるスクリーニングを行うことが可能である。また、誘電泳動用も含めた全周波数をパラメータとして、さらには振幅値と周波数を共にパラメータとしてスクリーニングを行うことも可能である。
【００３４】
結晶核運搬流路１６で、運良く結晶核が生成されると、印加交流電圧に重畳された３つの周波数のうち、誘電泳動用の周波数（５００ＫＨｚ）成分による誘電泳動力が、上流側電極群１７から結晶核に作用する。結晶核は、流路周囲の４方向からの反発力に押され、力がバランスする流路断面の中央位置まで移動して保持され、ゆっくりした流れと共に進み、結晶核トラップ領域１５へ運ばれる。
【００３５】
結晶核トラップ領域１５では、図８（ａ）と図８（ｂ）に示すように上流側電極群１７と下流側電極群１８で生ずる８方向からの反発力を受け、中央位置にトラップされる。この状態で、次の３つプロセスを選択することができる。（１）そのままトラップを解き、結晶核運搬流路１６へ移動させる。（２）トラップしたまま流れを止め、同じ液体内で（マイクロサイズの大きさになるまで）成長させる。（３）トラップしたまま周囲の液体だけを入れ換える。周囲の液体の入れ換えは、例えば、結晶成長に適した低めの過飽和濃度の溶液に、あるいは逆に、短時間成長を目指して高めの過飽和濃度の溶液に、さらには骸晶などの低品質結晶が生成したときには周囲部分を削ぎ落とすために低濃度溶液に入れ換えることも可能である。
【００３６】
結晶核トラップ領域１５から結晶核をリリースするには、一定時間の間、周囲を囲む８つの電極に印加する電圧を低下させ、流れから受ける粘性抗力よりも誘電泳動力が弱くなる電圧値にすれば良い。図９（ａ）は、トラップから抜け、結晶核運搬流路１６を流れとともに移動する結晶核を示す。結晶核運搬流路１６では、試料液混合流路１４と同様、流路を囲む４電極で構成される下流側電極群１８からの誘電泳動力（反発力）が作用し、結晶核３４は図９（ｂ）に示したように、流路断面のほぼ中央の位置を維持しながら流れる。ただし、結晶核運搬流路１６を流れる間だけ流れを速くする場合には、結晶核の沈降や壁への接近は起こらないので、下流側電極群１８への電圧印加をしなくても構わない。
【００３７】
流出ウェルは、１００μｍ程度の流路幅に比べて、一般にはかなり大きく作られているので、流出ウェル１９まで運び出すことができた結晶核は、スポイトなどにより容易に取り出すことができる。一旦、結晶核ができれば、それを種にした結晶成長は比較的易しいプロセスとなる。したがって、別に用意した容器へ結晶核を移動して、Ｘ線回折像による構造解析に必要とされる２００μｍから２ｍｍの大きさまで、結晶成長させることができる。あるいは、流出ウェル１９の中で結晶成長を行うことも可能である。後者の方法であれば、Ｘ線装置へ設置する凍結試料を作るプロセスまで含めた、オールインワンのタンパク質結晶化装置も実現できる。
【００３８】
以上のようにして、運良く生成された結晶核を、マイクロ流路壁への付着や接触による損傷なしに取り出せるマイクロ流体デバイスが実現し、これを用いたタンパク質結晶化装置により、タンパク質結晶核生成の成功率向上と結晶成長時間の短縮、生成結晶品質の向上を実現することができる。
【００３９】
（変形例）
本発明の実施例では、送液を２つのポンプと大気圧に通じる開放ウェルで行ったが、送液は落差で行っても良い。落差を使う場合にはポンプで注意しなければならない振動などの問題を回避することができる。
【００４０】
本発明の実施例では、流入ウェルの数をタンパク質過飽和溶液注入ウェル１２と沈殿剤溶液流入ウェル１３の２つとしたが、３つあるいはそれ以上であっても構わない。例えば３つ目の流入ウェルとして、バッファ液の流入口を新たに設置すれば、結晶化条件スクリーニングのパラメータとしての濃度調整の自由度が増大する。
【００４１】
また本発明の実施例では、上流側電極群１７と下流側電極群１８の２つの電極群としたが、本発明の意図によれば、電極群の数や配置について制限を設けるものでは無い。例えば、生成結晶核を流れに逆らって静止させる必要がなければ、１つの電極群だけでも壁への付着や接触の回避は可能であり、また、２種類以上の周波数の重畳も可能である。
【００４２】
また本発明の実施例では、イメージセンサー２２や画像解析装置２３、プロセス制御装置２４などを用いて自動化が可能な構成としたが、人手による観測、判断、制御を行うシステムであっても構わない。結晶化が非常に難しいタンパク質の場合には、その方が微妙な設定や確実な実験ができる場合もある。
【００４３】
また本発明の実施例では、１チップ上に１ラインの結晶化流路しか設けていない例を示したが、もちろん複数の流路が並列アレイ状に並ぶチップであっても良い。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
以上述べたように、本発明によるマイクロ流体デバイスおよびこれを用いたタンパク質結晶化装置は、タンパク質の過飽和溶液試料から最適な結晶化条件を網羅的に探索する用途、さらにはＸ線回折像からタンパク質の構造を解析するために使用するタンパク質結晶を生成する用途に適している。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の原理に関わる水の誘電損失スペクトル図
【図２】本発明の原理に関わるタンパク質水溶液の誘電損失スペクトル図
【図３】本発明によるタンパク質結晶化装置の全体図
【図４】本発明によるマイクロ流体デバイスの平面図
【図５】マイクロ流路と電極の配置を示す立体図
【図６】電極に印加する交流電圧の波形図
【図７】上流側流路での結晶核生成を説明する図
【図８】タンパク質結晶核のトラップ状態を説明する図
【図９】下流側流路での結晶核運搬を説明する図
【符号の説明】
【００４６】
１０  マイクロ流体デバイス
１１  マイクロ流路
１２  タンパク質過飽和溶液注入ウェル
１３  沈殿剤溶液流入ウェル
１４  試料液混合流路
１５  結晶核トラップ領域
１６  結晶核運搬流路
１７  上流側電極群
１８  下流側電極群
１９  流出ウェル
２０  交流電源
２１  顕微鏡
２２  イメージセンサー
２３  画像解析装置
２４  プロセス制御装置
２５  沈殿剤溶液供給ポンプ
２６  混合液回収ポンプ
３１  タンパク質過飽和溶液
３２  沈殿剤溶液
３３  混合液
３４  結晶核
３５  回収混合液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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