(57)【要約】【課題】従来の多孔質ガラス粉末を用いた反応検出チップでの定量精度、再現性、Ｓ/Ｎ比に問題があった。加えて、発現解析のためには、より長いプローブを基板に固定する必要があるが、in situ合成法を用いた場合、プローブ純度をこれ以上向上する事は技術的に困難であった。【解決手段】  検出対象と結合可能な反応性物質を担持した多孔質粒子担体に一定量の標識化合物を担持した多孔質粒子担体を存在させることで、検出対象の定量性及びＳ/Ｎ比を向上させることを可能とした。さらに、より大孔径の多孔質粒子を担体として利用する事によって、選択的縮合率を上げることができ、これにより長いプローブを高密度で基板に集積することを可能とした。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質粒子細孔内部表面に検出対象と結合可能な反応性物質を担持した多孔質粒子担体を基板に設けた複数区分の１つ以上の区分に配列・固定させた反応検出チップにおいて、
前記検出対象の濃度を定量可能とするために、前記多孔質粒子担体に一定量の"標準物質としての標識化合物を担持した多孔質粒子担体"が存在していることを特徴とする検出対象定量用反応検出チップ。
【請求項２】
前記多孔質粒子細孔内部表面に検出対象と結合可能な反応性物質を担持した多孔質粒子担体の細孔径の平均が100nm以上であることを特徴とする請求項１の検出対象定量用反応検出チップ。
【請求項３】
各区分に配列・固定させた多孔質粒子担体において、各区分において異なる反応性物質を担持していることを特徴とする請求項１又は２の検出対象定量用反応検出チップ。
【請求項４】
標準物質としての標識化合物が、以下のいずれか１から選ばれる請求項１〜３のいずれか１の検出対象定量用反応検出チップ。
（１）蛍光物質、（２）放射性物質、（３）発光物質、（４）間接的標識物質、（５）磁性物質
【請求項５】
以下の工程を含む検出対象定量用反応検出チップの作成方法。
（１）多孔質粒子細孔内部表面に検出対象と結合可能な反応性物質を担持した多孔質粒子担体の作成工程、
（２）標準物質としての標識化合物を担持した多孔質粒子担体の作成工程、
（３）（１）の反応性物質を担持した多孔質粒子担体に、（２）の標識化合物を担持した多孔質粒子担体を一定量混入させる工程、
（４）（３）の標識化合物を担持した多孔質粒子担体を含む反応性物質を担持した多孔質粒子担体を基板に設けた複数区分の１つ以上の区分に配列・固定させる工程
【請求項６】
多孔質粒子細孔内部表面に検出対象と結合可能な反応性物質としての長鎖オリゴヌクレオチドを担持した多孔質粒子担体を基板に設けた複数区分の１つ以上の区分に配列・固定させた反応検出チップにおいて、
前記長鎖オリゴヌクレオチドを該担体に固定化可能とするために、前記多孔質粒子の細孔径の平均が100nm以上であることを特徴とする検出対象定量用反応検出チップ。
【請求項７】
反応性物質としての長鎖オリゴヌクレオチド固定化反応検出チップにおける35塩基以上の長鎖オリゴヌクレオチドを固定化するための担体としての細孔径の平均が100nm以上の多孔質ガラスの用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子診断及び生理機能診断等に使用される多数の機能分子の認識を可能にする多孔質粒子を用いた反応検出チップ特に検出対象定量用反応チップ及び該チップの作成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の変異、特に一塩基の変異を含む多型の検出は、突然変異等に起因する疾患、例えばガンの診断等に有効なだけでなく、薬剤への応答性や副作用の指針に必要であり、多因子疾患の病因関連遺伝子の解析や予測医療にも貢献する。この検出にいわゆるDNAチップの使用が有効であることが知られている。従来利用されてきた、短いDNA鎖を固定化したDNAチップ、Affymetrix社のいわゆるGeneChipは、通常約１cm角のシリコンもしくはガラス基板上にフォトリソグラフィー技術を用いて１万以上のオリゴDNA断片（DNAプローブ）を作り込んだものである。このDNAチップ上に、例えば蛍光標識したDNA試料を流すと、上記DNAチップ上のプローブと相補的な配列を有するDNA断片はプローブと結合し、その部分だけが蛍光により識別でき、DNA試料中のDNA断片の特定配列を認識・定量することができる。この方法により、既に、ガン遺伝子の突然変異の検出や、遺伝子多型の検出が可能であることが示されている。
【０００３】
上記DNAチップと同様に多種類のDNAプローブを基板上に固定したデバイスとしてDNAマイクロアレイがある。一般に、マイクロアレイは固定化されたプローブが長いために、遺伝子変異の検出には適さないが、遺伝子発現解析に有用であることが示されている。
【０００４】
一方、分相法多孔質ガラスは、（１）母材ホウケイ酸ガラスの熔解、（２）成型、（３）分相、（４）化学的エッチングにより作成される（非特許文献１）。このような方法で作成された分相法多孔質ガラスは、例えばHPLC用充填剤等として使用されてきた（非特許文献２）。本発明者らは、この多孔質ガラスを微粉末として新しいタイプのDNAチップを開発した（非特許文献３）。
また、プローブ分子を内面に固定したキャピラリーを用いたアフィニティー検出分析チップ（特許文献１）、多孔質ガラスビーズ又はシリコン結晶上にガラス層を形成したものを担体としたアフィニティー反応プローブビーズ（特許文献２）もある。
さらに、多孔質ガラス粉末を担体とした反応検出チップがある（特許文献３−５）。しかし、該多孔質ガラス粉末を用いた反応検出チップは、スポット間に多孔質ガラス粉末量のムラがあった。よって、多孔質ガラス粉末量のムラにより、各スポット中に含まれるプローブ量にムラができ、チップで得られるデータはスポット毎に変動が大きく定量分析には利用しにくかった（参照図３）。さらに、S/N比などの点でなお改良する必要があり、遺伝子変異の検出は可能であるが、発現解析は不可能であることが現状である。
【非特許文献１】H.Tanaka, T.Yazawa, K.Eguchi, H.Nagasawa, N.Matuda and T.Einishi,: Precipitation of colloidal silica and pore size distribution in high silica porous glass. Journal of Non-Crystalline Solids 65, 301-309,(1984)
【非特許文献２】Hiroshi Nagasawa, Yonezo Matumoto, Naobumi Oi, Sigeru Yokoyama, Tetsuo Yazawa, Hiroshi Tanaka and Kiyoshi Eguchi : Effects of pore size on the retention time of octadescyl silanaized porous glass in high performance liquid chromatography. Analytical Science 7 Supplement, 181-182(1991)
【非特許文献３】Toshifumi Tsukahara, Hiroshi Nagasawa : Probe-on-carriers for oligonucleotide microarrays (DNA chips). Science and Technology of Advanced Materials 5, 359-362 (2004)
【特許文献１】特開2002-202305
【特許文献２】特開2003-139773
【特許文献３】特開2001-281251
【特許文献４】特開2002-218974
【特許文献５】特開2004-93330
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記多孔質ガラス粉末を担体とした反応検出チップの作成では、微細多孔質ガラス粉末をスラリー状にして接着剤の上に滴下し、各スポットに固着する。このため、各スポットに含まれる多孔質ガラス粉量（即ち、プローブ量）にバラツキがでる。従って、各スポット間の検出強度を比較する事が困難であった。これにより、従来の反応検出チップでの定量精度、再現性、Ｓ/Ｎ比に問題があった。
加えて、発現解析のためには、より長いプローブ特に長鎖オリゴヌクレオチドを基板（担体）に固定する必要があるが、in situ合成法を用いた場合、プローブ純度をこれ以上向上する事は技術的に困難であった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで、本発明者らは、鋭意研究したところ、検出対象と結合可能な反応性物質を担持した多孔質粒子担体に一定量の標識化合物を担持した多孔質粒子担体を存在させることで、スポット中に含まれる多孔質粒子担体量（即ち、反応性物質（プローブ）量）を標準化・定量化し、各スポットの相対比較が可能になり、これにより検出対象の定量性及びＳ/Ｎ比を向上させることを可能とした。
さらに、より大孔径の多孔質粒子を担体として利用する事によって、選択的縮合率を上げることができ、これにより長いプローブ特に長鎖オリゴヌクレオチドを高密度で基板に集積することを可能とした。
以上により、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち本発明は以下からなる。
「１．多孔質粒子細孔内部表面に検出対象と結合可能な反応性物質を担持した多孔質粒子担体を基板に設けた複数区分の１つ以上の区分に配列・固定させた反応検出チップにおいて、
前記検出対象の濃度を定量可能とするために、前記多孔質粒子担体に一定量の"標準物質としての標識化合物を担持した多孔質粒子担体"が存在していることを特徴とする検出対象定量用反応検出チップ。
２．前記多孔質粒子細孔内部表面に検出対象と結合可能な反応性物質を担持した多孔質粒子担体の細孔径の平均が100nm以上であることを特徴とする前項１の検出対象定量用反応検出チップ。
３．各区分に配列・固定させた多孔質粒子担体において、各区分において異なる反応性物質を担持していることを特徴とする前項１又は２の検出対象定量用反応検出チップ。
４．標準物質としての標識化合物が、以下のいずれか１から選ばれる前項１〜３のいずれか１の検出対象定量用反応検出チップ。
（１）蛍光物質、（２）放射性物質、（３）発光物質、（４）間接的標識物質、（５）磁性物質
５．以下の工程を含む検出対象定量用反応検出チップの作成方法。
（１）多孔質粒子細孔内部表面に検出対象と結合可能な反応性物質を担持した多孔質粒子担体の作成工程、
（２）標準物質としての標識化合物を担持した多孔質粒子担体の作成工程、
（３）（１）の反応性物質を担持した多孔質粒子担体に、（２）の標識化合物を担持した多孔質粒子担体を一定量混入させる工程、
（４）（３）の標識化合物を担持した多孔質粒子担体を含む反応性物質を担持した多孔質
粒子担体を基板に設けた複数区分の１つ以上の区分に配列・固定させる工程
６．多孔質粒子細孔内部表面に検出対象と結合可能な反応性物質としての長鎖オリゴヌクレオチドを担持した多孔質粒子担体を基板に設けた複数区分の１つ以上の区分に配列・固定させた反応検出チップにおいて、
前記長鎖オリゴヌクレオチドを該担体に固定化可能とするために、前記多孔質粒子の細孔径の平均が100nm以上であることを特徴とする検出対象定量用反応検出チップ。
７．反応性物質としての長鎖オリゴヌクレオチド固定化反応検出チップにおける35塩基以上の長鎖オリゴヌクレオチドを固定化するための担体としての細孔径の平均が100nm以上の多孔質ガラスの用途。」
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、フォトリソグラフィー設備等の特別な設備を要することなく、遺伝子解析に必要な長鎖オリゴヌクレオチドなどの検出対象を定量性・再現性を高く測定できる検出チップを容易に提供することができる。
また、既存のGeneChipより、高い集積度を有する検出チップを提供すること及びチップを再利用することも可能である。また、標識化合物を担持した多孔質粒子担体を含む反応性物質を固定した多孔質粒子担体を準備しておけば、必要な時に必要な組み合わせの反応性物質を固定した検出チップを簡単に作成できる。本発明はさらに、低コストかつ安定性の高い反応性検出チップを提供することができる。従って、各個人の必要に対応したDNAなどの反応性検出チップの作成が可能となり、オーダーメイドの医療に貢献できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の「多孔質粒子」は、反応性物質である任意の塩基配列を持つオリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、核酸、タンパク質、抗体、リガンドなどを担持する材料であり、多孔質ガラス、シリカゲル、イオン交換樹脂のような結合能力のある多孔質材料が好ましく、細孔径の表面特性からは多孔質ガラスが最も好ましい。
多孔質粒子の細孔は、検出対象が拡散により十分入り込める大きさである通常の約50nmで良いが、本発明では長鎖のオリゴヌクレオチドを担持することを考慮すれば、約70nm以上、好ましくは約100nm以上、より好ましくは200nm以上である。
さらに、本発明の多孔質ガラスの平均細孔径の測定方法は、水銀圧入法を主に、電子顕微鏡による観察を併せて行う。
また、多孔質ガラスの組成は、分相により多孔質を成形できる分相性基礎ガラスであれば限定されるものではない。例えば、ホウケイ酸ガラスから構成されるガラス、又は重量比（％）で、SiO2：60-80%、B2O3：15-25％、NaO：3-10％、Al2O3：1-5％であり、好適には、SiO2：70%、B2O3：21％、NaO：6％、Al2O3：3％のガラス等である。
【００１０】
本発明の「反応性物質（プローブ）」の「反応性」とは、化学反応により、水素結合、イオン結合や共有結合による化学構造等が変化する場合のみではなく、ファンデルワールス力、水素結合、配位結合、化学吸着、物理吸着等のその他の様式により、他の物質と結合した状況を作り得る性質を意味する。
そのような反応性物質としては、任意の構成を持つタンパク質又は任意の塩基配列を持つオリゴヌクレオチドなどを担持する材料であるが、当然のことながらこれらに限定されない。
なお、本発明の「反応性物質としての長鎖オリゴヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチド長が35塩基以上、好ましくは60塩基以上、最も好ましくは100塩基以上であるオリゴヌクレオチドである。
【００１１】
本発明の「検出対象」とは、上記の「反応性物質」に特異的に認識される物質である。例としては、「反応性物質」がオリゴヌクレオチドの場合には、各オリゴヌクレオチドと相補配列のオリゴヌクレオチドであり、「反応性物質」が抗体の場合には、抗原であるが、当然のことながらこれらに限定されない。
【００１２】
本発明の「基板」は、検出システムに対して変化しない安定な素材であれば特に限定されないが、多孔質粒子を固定するのに適した表面特性を持つことが必要であり、石英ガラス、ホウケイ酸ガラスなどのガラス基板、シリコンウェハーなどの無機基板が好ましいが、多孔質粒子との結合方法を工夫することによりポリエステルフィルム・ポリエチレンフィルムなどの有機基板を用いることもでき、場合によっては紙類を用いることができる。
さらに、基板上は、複数の区分（スポット）に仕切られており、ある反応性物質が基板上のどの位置に存在するかを識別することができる。
【００１３】
本発明の「標識化合物」とは、多孔質粒子を直接的又は間接的に標識することができる物質であり、かつ検出対象の検出を阻害しない物質であれば特に限定されない。例えば、（１）蛍光物質としては、FITC, ローダミン, Cy3, Cy5, Alexa, TAMRA, FAM, GFP, YFP等、（２）放射性物質としては、32P, 33P, 35S, 3H, 14C, 125I等、（３）発光物質としては、ルミノール, Cyalume, CLA, ルシフェラーゼ等、（４）間接的標識物質としては、DIG,Biotin,aminoallyl等（ここで間接的標識物質とは、多孔質粒子に固定され、直接的又は２次的に蛍光物質、発光物質あるいはタンパク質性標識（例、酵素、抗体等）と特異的に結合する物質を意味する）、（５）磁性物質等が挙げられる。
【００１４】
本発明の「一定量の"標準物質としての標識化合物を担持した多孔質粒子担体"が存在する」における「一定量」とは、ある反応性物質を担持した多孔質粒子担体群に含まれる、標識化合物を担持した多孔質粒子の割合が同じであることを意味する。
【００１５】
本発明の「プローブ純度」とは、目的の完全長プローブ（オリゴヌクレオチド）が、担体（基板）に固定化されている割合を意味する。一般に遺伝子発現解析に利用するような長い配列になればなるほど、目的の完全長プローブの部分配列である不完全長配列が担体（基板）に固定化されてプローブ純度は低下する。
【００１６】
次に、本発明の検出対象定量用反応検出チップの作成方法を説明する。しかしながら、反応性物質を担持した多孔質粒子担体に一定量の標識化合物を担持した多孔質粒子が存在する反応検出チップを構成する限り、特に作成方法は限定されない。
【００１７】
（１）反応性物質を担持した多孔質粒子担体の作成工程
表面処理した多孔質ガラスに、定法により各種の反応性物質であるオリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、核酸、タンパク質、抗体またはリガンドを合成または固定する。
【００１８】
（２）標準物質としての標識化合物を担持した多孔質粒子担体の作成工程
表面処理した多孔質ガラスに、定法により標識化合物を固定する。
【００１９】
（３）反応性物質を担持した多孔質粒子担体に、標識化合物を担持した多孔質粒子担体を一定量存在させる工程
（１）の反応性物質を担持した多孔質粒子担体に、一定量の標識化合物を担持した多孔質粒子担体を混入させ、均一にする。混入割合は、反応性物質を担持した多孔質粒子担体を１とすると、標識化合物を担持した多孔質粒子担体は0.2以下である。
【００２０】
（４）標識化合物を担持した多孔質粒子担体を含む反応性物質を担持した多孔質粒子担体を基板に設けた複数区分の１つ以上の区分に配列・固定させる工程
まず、検出チップのスライドガラスやプラスチック板等の基板上の多孔質粒子を設置する領域に適当な接着剤を塗布する。次いで、（３）で作成しておいた"標識化合物を担持した多孔質粒子担体を含む反応性物質を担持した多孔質粒子担体"を基板上に移動させ、所定位置に固定する。続いて、同一又は別種の"標識化合物を担持した多孔質粒子担体を含む反応性物質を担持した多孔質粒子担体"を所定位置に固定し、この作業を順次繰り返すことにより、同一又は異なった種類の"標識化合物を担持した多孔質粒子担体を含む反応性物質を担持した多孔質粒子担体"を配列していく。これにより、基板上の所定位置に同一又は異なった種類の"標識化合物を担持した多孔質粒子担体を含む反応性物質を担持した多孔質粒子担体"が配列された検出チップを得ることができる。
【００２１】
測定方法
まず、検出チップ上の各スポットの標準物質としての標識化合物の検出強度を比較する。各スポットの標識化合物の検出強度差から、各スポットに含まれるプローブの量を算出する。
次に、反応検出チップを反応セルにいれ、標準物質とは別の方法で標識した検出対象をセルに流し込み、反応させる。反応・洗浄の後、検出チップ上の各スポットの位置及び標識の強度を検出器により解析する。この時、標準物質としての標識化合物と検出対象の標識化合物に例えばCy5とCy3の様な検出波長の異なる蛍光化合物を用いれば、先のステップを省略できる。
スポットに含まれるプローブ量及び検出対象の蛍光値を基にして、検出対象を正確に定量化する。詳しくは、検出対象の検出強度量を標準化合物の検出強度量で割った数値が相対的な検出対象の検出強度量とすることができる。
【００２２】
より正確に検出対象を定量するためには、予め複数の既知濃度の蛍光標識した内部標準となる検出対象の蛍光強度を測定する。既知濃度の蛍光標識した検出対象の蛍光強度及びプローブ量を基にして検量線を作成し、この検量線を用いて検出対象の定量化を行う事もできる。
【００２３】
次に、本発明の長鎖オリゴヌクレオチド固定化反応検出チップに用いる長鎖オリゴヌクレオチドの固定化担体としての多孔質ガラス担体の作成方法及び長鎖オリゴヌクレオチド固定化反応検出チップを説明する。しかしながら、望みの細孔径の平均を持つ多孔質ガラスを作成できる限り、特に以下の作成方法は限定されない。
【００２４】
長鎖オリゴヌクレオチドの固定化担体としての多孔質ガラス担体の作成方法
上記述べた母材ホウケイ酸ガラスに熱処理（約600℃〜800℃で数十時間以上）を行う。これにより、母材ホウケイ酸ガラスは分相といわれる現象を起こす。分相後のガラスを、粉砕して粒状にする。この状態では、まだ多孔質にはなっていない。続いて、各粒子状の分相ガラスを、酸溶液中（塩酸、硝酸等）に浸け込み、酸処理を行う。得られた酸処理後の各粒子状の分相ガラスを回収し、アルカリ処理（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等）により、細孔中の堆積シリカゲルを除去する。
以上により、粒子状の多孔質ガラスを作成することができる。
【００２５】
長鎖オリゴヌクレオチド固定化反応検出チップの作成方法
上記多孔質ガラス担体に表面処理をして、定法により長鎖オリゴヌクレオチドを合成する。
次に、検出チップのスライドガラスやプラスチック板等の基板上の多孔質粒子を設置する領域に適当な接着剤を塗布する。次いで、上記作成した長鎖オリゴヌクレオチドを担持（固定）した多孔質粒子担体を基板上に移動させ、所定位置に固定する。続いて、同一又は別種の長鎖オリゴヌクレオチドを担持した多孔質粒子担体を所定位置に固定し、この作業を順次繰り返すことにより、同一又は異なった種類の長鎖オリゴヌクレオチドを担持した多孔質粒子担体を配列していく。これにより、基板上の所定位置に同一又は異なった種類の長鎖オリゴヌクレオチドを担持（固定）した多孔質粒子担体が配列された検出チップを得ることができる。
【００２６】
以下に実施例を示し、本発明の特徴をより詳細に説明する。但し、本発明の範囲は、これら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
長鎖オリゴヌクレオチド固定化多孔質ガラスの作成方法
細孔径の平均100nm又は200nmを持つ多孔質ガラスに、120塩基のオリゴヌクレオチド配列（taaccgggga ttctgtacat gcattgagct ctctcattgt ctgtgtagag tgttatactt gggaatataa aggaggtgac caaatcagtg tgaggaggta gatttggctc ctctgcttct：配列番号１）を定法により合成した。
なお、コントロールとして、細孔径の平均100nm相当のCLPS（ABI社の市販品：Cross-Linked Polystyrene製）でも上記同様に長鎖オリゴヌクレオチドを合成した。
【実施例２】
【００２８】
長鎖オリゴヌクレオチド合成の確認
実施例２で得られた長鎖オリゴヌクレオチド固定化多孔質ガラスから、アンモニア水を用いて合成した長鎖オリゴヌクレオチドを切断した。
（１）電気泳動測定
上記切断した長鎖オリゴヌクレオチドを電気泳動にかけて、長鎖オリゴヌクレオチドの120塩基長を示すバンドの位置を確認した（図１：（１）細孔径の平均100nmを持つ多孔質ガラス、（２）細孔径の平均200nmを持つ多孔質ガラス、（３）細孔径の平均100nm相当のCLPS）。
（２）HPLC測定
上記切断した長鎖オリゴヌクレオチドをHPLCで測定し、120塩基長の長鎖オリゴヌクレオチドを検出した（図２：（１）細孔径の平均100nmを持つ多孔質ガラス、（２）細孔径の平均200nmを持つ多孔質ガラス、（３）細孔径の平均100nm相当のCLPS）。
【００２９】
上記（１）の測定結果より、本発明の細孔径平均100nm又は200nmを持つ多孔質ガラスでは、長鎖オリゴヌクレオチドが効率良く合成できていたことを示す120塩基付近の濃いバンドを検出できた。しかし、従来の担体であるCLIPSでは、120塩基付近の濃いバンドを検出することができなかった。
上記（２）の測定結果より、本発明の細孔径平均100nm又は200nmを持つ多孔質ガラスでは、120塩基長の長鎖オリゴヌクレオチドを高効率で回収することができた（それぞれ、回収率1.89％、3.17％）。しかし、従来の担体であるCLIPSでは、長鎖オリゴヌクレオチドをわずかしか回収することことができなかった（回収率0.19％）。
【００３０】
以上の結果より、本発明の多孔質ガラス担体は目的の長鎖オリゴヌクレオチドが効率良く合成することが確認できた。これにより、本発明の多孔質ガラス担体は高いプローブ純度を示す。さらに、200nmの細孔径平均は、100nmの細孔径平均より、高いプローブ純度を示すので、より大孔径の多孔質ガラスが担体として優れていることがわかった。
最後に、本発明の多孔質ガラスを集積した反応検出チップは、生体試料由来の標識DNAあるいはRNAを効率良く固定化できるので遺伝子発現解析に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】電気泳動の結果
【図２】HPLCの結果
【図３】従来の多孔質ガラス粉末を担体とした反応検出チップ
【図１】
2007192812.tif 000002
【図２】
2007192812.tif 000003
【図３】
2007192812.tif 000004
【配列表】
2007192812000001.app