(57)【要約】【課題】  ヒト由来のテネシンＣ（GenBank Accession No. NP_002151）の1231〜1236番目のアミノ酸配列を有するペプチドの新たな用途を提供すること。【解決手段】  ヒト由来のテネシンＣ（GenBank Accession No. NP_002151）の1231〜1236番目のアミノ酸配列からなるペプチドはシンデカン-4やPKCαを活性化する作用を有する。従って、ヒト由来のテネシンＣ（GenBank Accession No. NP_002151）の1231〜1236番目のアミノ酸配列からなるペプチドはシンデカン-4及びPKCαの活性化剤として有用である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有するシンデカン-4活性化剤。
【請求項２】
前記ペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする請求項１に記載のシンデカン-4活性化剤。
【請求項３】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有するPKCα活性化剤。
【請求項４】
前記ペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする請求項３に記載のPKCα活性化剤。
【請求項５】
シンデカン-4を介して前記PKCαを活性化することを特徴とする請求項３又は４に記載のPKCα活性化剤。
【請求項６】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを細胞に作用させることを特徴とするシンデカン-4活性化方法。
【請求項７】
前記ペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする請求項６に記載のシンデカン-4活性化方法。
【請求項８】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを細胞に作用させることを特徴とするPKCα活性化方法。
【請求項９】
前記ペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする請求項８に記載のPKCα活性化方法。
【請求項１０】
前記細胞の膜上に発現するシンデカン-4に作用させることを特徴とする請求項８又は９に記載のPKCα活性化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト由来のテネシンＣ（GenBank Accession No. NP_002151）の1231〜1236番目のアミノ酸配列からなるペプチドの新たな用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞接着および脱着、細胞増殖刺激および抑制、細胞移動促進および阻害、形態形成能、赤血球凝集活性、組織境界形成等の作用を有するタンパク質として、従来、細胞外マトリックスタンパク質であるテネシンＣが知られている（非特許文献１参照）。
【０００３】
ヒト由来のテネシンＣ（GenBank Accession No. NP_002151）の1231〜1236番目のアミノ酸配列を有するペプチドは、β１インテグリンを活性化する作用を有し、これにより細胞外マトリックスに対する細胞接着を増強させたり、細胞伸展を促進させたりする（例えば、特許文献１及び非特許文献２など参照）が、そのメカニズムは明らかにされていない。
【非特許文献１】Sakakura T. and Kusakabe M., 炎症 15, 5, 377, 1995
【非特許文献２】Biochemistry 2002, 41, 3270-3277
【特許文献１】特開２００１−２１３８９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ヒト由来のテネシンＣの1231〜1236番目のアミノ酸配列を有するペプチドの細胞接着増強作用や細胞伸展促進作用のメカニズムを明らかにすることにより、そのペプチドの新たな用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、ヒト由来のテネシンＣの1231〜1236番目のアミノ酸配列を有するペプチドのＣ末端にCysを付加したTNIII（配列番号２：RSTDLPGLKAATHYTITIRGVC）の細胞接着増強作用や細胞伸展促進作用のメカニズムを明らかにすべく鋭意研究した結果、PKCの阻害剤及び膜貫通型ヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）の阻害剤が、TNIIIによる上記作用を阻害することを見出し、これによりTNIIIがシンデカン-4及びPKCαを活性化することを明らかにし、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明に係るシンデカン-4は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する。  
また、本発明に係るPKCα活性化剤は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する。本発明に係るPKCα活性化剤は、例えば、シンデカン-4を介してPKCαを活性化するものである。
【０００７】
本発明に係るシンデカン-4活性化方法は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを細胞に作用させる工程を含む。  
また、本発明に係るPKCα活性化方法は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを細胞に作用させる工程を含む。本発明に係るPKCα活性化方法は、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを細胞膜上に発現するシンデカン-4に作用させることを特徴とする。
【０００８】
なお、上述のペプチドは、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを挙げることができる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ヒト由来のテネシンＣ（GenBank Accession No. NP_002151）の1231〜1236番目のアミノ酸配列を有するペプチドの新たな用途を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１１】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１２】
＝＝配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドの薬理作用＝＝
配列番号１に示されるアミノ酸配列（RSTDLPGLKAATHYTITIRGV）からなるペプチドの作用を増強させるため、２つのペプチド鎖がジスルフィド結合で結合できるように、ペプチドのＣ末端にCysを付加して作製したペプチドTNIII（配列番号２：RSTDLPGLKAATHYTITIRGVC）は、以下の実施例のように、シンデカン-4及びPKCαを活性化する作用を有する。従って、配列番号１及び２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドは、シンデカン-4やPKCα（特にシンデカン-4を介したPKCα）を活性化する活性化剤として有用である。
【００１３】
なお、シンデカン-4やPKCα（特にシンデカン-4を介したPKCα）を活性化する活性化剤として用いられるペプチドは、上述の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでいればよく、他の部分の配列はなんでもよい。例えば、このようなペプチドとして、TNIII、タグ（例えば、Hisタグ、GSTタグなど）が結合した、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチド又はTNIIIなどを挙げることができる。
【００１４】
以上より、配列番号１及び２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを細胞に作用させることにより、シンデカン-4やPKCα（特にシンデカン-4を介したPKCα）を活性化することができる。ここで、ペプチドを細胞に作用させるというのは、ペプチドを細胞に投与して、細胞に対する作用（例えば、細胞内タンパク質の活性化など）を発揮させることをいい、対象となる細胞は、培養細胞であっても、個体内の細胞であってもよい。なお、前記個体としては、例えば、ヒトであってもよいし、ヒト以外のマウス、ラット、ブタなどの脊椎動物であってもよい。
【００１５】
＝＝配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチド等の製造方法＝＝
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドは、その配列情報に基づいて有機化学的に合成することができる。また、適切なエンハンサー／プロモーターをもつ発現ベクターに、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入し、この組換えベクターを大腸菌、サルモネラ菌等の菌や、イースト、動物細胞などに導入し、発現させ、生成したペプチドを、常法を用いて精製してもよい。また、この組換えベクターをin vitroで転写させて得られたmRNAを、ウサギ網状赤血球抽出液、大腸菌Ｓ３０抽出液、麦芽抽出液、小麦胚抽出液などを用いたインビトロ翻訳システムにより翻訳させて、合成されたペプチドを精製してもよい。
【００１６】
ここで、発現ベクターを作製する際、Hisタグ、GSTタグなどのタグをコードするポリヌクレオチドと、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドとを融合した融合ポリヌクレオチドをベクターに挿入し、融合タンパク質として発現させるのがより好ましい。タグを利用して、目的のペプチドを容易に精製することが可能になるからである。なお、タグは、最終段階で除去し、HPLC（high-performance(-speed) liquid chromatography）などで配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドだけを精製することもできる。
【００１７】
なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを細胞外に分泌させるため、シグナルペプチドを付加してもよく、そのような融合ペプチドを発現することのできる組換えベクターは、上述のように、適切なエンハンサー／プロモーターをもつ発現ベクターに、融合ペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入することで作製することができる。
【００１８】
また、前記組換えベクターを含有する細胞（組換え細胞）は、例えば、動物細胞に、前記組換えベクターをエレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、アデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターなどを用いたウイルス感染法、又はカルシウムを用いたトランスフェクション法等によって導入することにより作製できる。
【実施例】
【００１９】
以下に本発明を実施例によって具体的に説明する。
【００２０】
［実施例１］
発明者らは、TNIIIの細胞接着増強作用や細胞伸展促進作用のメカニズムを明らかにする過程で、PKCの阻害剤及び膜貫通型ヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）の阻害剤が、TNIIIの上記作用を阻害することを見出した。以下に、その詳細を記述する。
【００２１】
まず、96ウェルプレートの各ウェルを、5μg/ml ヒト由来血漿性フィブロネクチン溶液（FNのPBS(-)溶液）で37℃，1時間インキュベートすることによりコーティングした。その後、溶液を除去してPBS(-)溶液で1回洗浄し、0.2% BSAのPBS(-)溶液を添加して37℃でインキュベーションすることによりブロッキングを行った。
【００２２】
次に、フィブロネクチンをコートした各ウェルに、血清を含まない培養液（0.15% NaHCO3、2mM L-グルタミン、60μg/mL 硫酸カナマイシン、及び250ng/mL アンホテリシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM培地））に懸濁したWI38VA13（1.0×105 cells/ウェル；理研セルバンク）を添加し、さらに、PKC阻害剤としてGF109203X（1μM；BIOMOL社製）を、あるいはHSPG阻害剤として細胞外に存在するHSPGのHS（Heparam sulfate）鎖を消化するHSase（ヘパリチナーゼ；0.1 U/mL；Sigma社）を添加し、37℃、5%CO2インキュベーター中で30分間培養した。なお、ネガティブコントロールとして、阻害剤を添加しない培地を用いた。
【００２３】
培養後、TNIII（50μg/ml）又は、ポジティブコントロールとしてインテグリン活性化剤であるMg2+（5 mM）を加えて37℃、5%CO2インキュベーター中で30分間培養し、4% ホルマリン及び5% スクロースを含むPBS(-)溶液で細胞を固定した後、非接着細胞をPBS(-)溶液で洗浄除去した。プレートに接着した細胞をトリパンブルー染色液で染色し、４つの視野における接着細胞を100倍顕微鏡下で計測し、その平均を求めた。その結果を図１に示す。
【００２４】
図１に示すように、HSaseで処理してもMg2+の細胞接着活性はほとんど変化しないのに対して、TNIIIにおいてはHSaseで処理することにより、その活性が減少することが明らかになった。このことから、HSPGがTNIIIによる細胞接着作用に関与することが示された。また、図１に示すように、PKCα阻害剤で処理することによりTNIIIの細胞接着活性が、PKCα阻害剤でのみ処理した場合と同程度まで減少することが明らかになった。このことから、PKCαがTNIIIによる細胞接着作用に関与することが示された。
【００２５】
［実施例２］
次に、実施例１の結果を踏まえ、TNIIIによる細胞接着作用に関与するβ１インテグリンの活性化がHSase やPKCαの阻害剤により阻害されるかどうか調べた。
【００２６】
上述の血清を含まない培養液に懸濁したWI38VA13（5.0×105 cells/mL）をエッペンチューブに添加し、さらにGF109203X（1μM）あるいはHSase（0.1 U/mL）を添加した後、ローテーターを用いて37℃で30分間インキュベートした。その後、50μg/ml TNIIIを添加し、さらに37℃で30分間インキュベートした。なお、ネガティブコントロールとして、培養液に阻害剤を添加しないでインキュベートしたものを準備した。
【００２７】
次に、活性型β１インテグリン特異的エピトープを認識するAG89抗体（MBL社製）を添加して4℃で30分間インキュベートし、さらにFITC標識抗マウスIgG（Jackson Immuno Laboratries）を添加して4℃で30分間インキュベートした後、細胞をPBS(-)溶液で洗浄し、FACScanにて蛍光強度を測定した。その結果を図２に示す。
【００２８】
図２Ａに示すように、TNIIIを添加することによりβ１インテグリンが活性化するが、HSaseで処理するとTNIIIによるβ１インテグリンの活性化は観察されず、コントロール又はHSaseのみで処理したものと同程度の発現しかみられなかった。また、図２Ｂに示すように、PKC阻害剤で処理してもTNIIIによるβ１インテグリンの活性化が観察されないことが明らかになった。以上のことから、HSPGとPKCαがTNIIIによるβ１インテグリンの活性化に関与することが示された。
【００２９】
［実施例３］
次に、HSPGのうちどの種のタンパク質がTNIIIに関与するのかを調べた。
【００３０】
エッペンチューブに、0.1 U/mL ヘパリチナーゼ、0.5 U/mL コンドロイチナーゼABC（生化学工業(株)）を含有するPBS(-)溶液を添加した後、WI38VA13（3.5×105 cells/tube）を懸濁して37℃で30分間インキュベートした。その後、PBS(-)で2回洗浄し、Laemmli Bufferで細胞を溶解した後、SDS-PAGEを行い、PVDF膜（polyvinilidene difluoride membrane）を用いてウェスタンブロットを行った。一次抗体として、HSase切断残存糖鎖を認識する抗体であるΔヘパラン硫酸抗体（3G10；生化学工業(株)）を、二次抗体として、POD標識抗マウスIgG抗体（Jackson Immuno Laboratries）をそれぞれ用いた。検出はECL（Enhanced Chemiluminescence；アマシャムバイオサイエンス社製）により行った。その結果を図３に示す。
【００３１】
図３に示すように、ヘパリチナーゼによって処理することにより38kDaのタンパク質が出現することが明らかになった。この分子量はシンデカンファミリーであるシンデカン-4（44kDa）のコアタンパクの分子量（Trend in Glycoscience and Glycotechnology (1998) 10, 211-221、J. Biol. Chem (2000) 275, 9410-9417）とほぼ一致したことから、TNIIIに関与するタンパク質が少なくともシンデカン-4であることが示された。
【００３２】
従来、シンデカン-4は、PIP2と共に４量体を形成してPKCαを活性化させる報告（J. Biol. Chem (2002) 277, 20367-20371、Matrix Biol. (2003) 22, 25-33、Reprod Biol Endocrinol. (2004) 2, 3-14 Review）や、PKCαの活性化により、細胞内から細胞表面にβ１インテグリンのエキソサイトーシスのアップレギュレーションが誘導される報告（J Cell Phusiol. (1997), 173(3), 361-370）は、本発明者らによる上記発見を支持する。
【００３３】
以上より、TNIIIはシンデカン-4を活性化し、これを介してPKCαを活性化してβ１インテグリンを活性化し、細胞接着作用を増強することが明らかになった。このことから、TNIIIは、シンデカン-4及びPKCの活性化剤として、有効に機能することが示された。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明の一実施例において、HSPGとPKCαがTNIIIによる細胞接着作用に関与するかどうかを調べた結果を示す図である。
【図２】本発明の一実施例において、ヘパリチナーゼ及びGF109203Xが、TNIIIによるβ１インテグリンの活性化に与える影響を調べた結果を示す図である。
【図３】本発明の一実施例において、TNIIIによる細胞接着作用に関与するHSPGがシンデカン-4であることを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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