(57)【要約】【課題】  本発明は、従来知られている高分子の糖―タンパク複合体に比較して低分子で、高度に免疫賦活化作用や抗腫瘍作用を有するマイタケ由来の糖−タンパク複合体を開発することを課題とする。【解決手段】  以下の工程により課題とする糖―タンパク複合体が得られた。１）マイタケの菌糸体もしくは子実体を水で熱水抽出する工程と、２）得られた抽出水溶性画分にアルコールを２０〜７０％の最終容量濃度になる様添加し、１〜２５℃の温度で放置し、液面もしくは液中に浮遊または容器の壁面に付着する物質を回収する工程と、３）その後回収した物質を水に溶解し、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより非吸着画分を回収する工程と、４）該溶液にアルコールを２０〜５０％の最終容量濃度になるまで添加し、１〜２５℃に放置して析出する沈殿物を除去する工程と、５）該溶液にさらに４０〜９９％の最終容量濃度になるまでアルコールを添加し、１〜２５℃の温度で放置して析出する沈殿物を採取する工程【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）マイタケの菌糸体もしくは子実体を水で熱水抽出する工程と、
（２）得られた抽出水溶性画分にアルコールを２０〜７０％の最終容量濃度になる様添加し、１〜２５℃の温度で放置し、液面もしくは液中に浮遊または容器の壁面に付着する物質を回収する工程と、
（３）その後回収した物質を水に溶解し、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより非吸着画分を回収する工程と、
（４）該溶液にアルコールを２０〜５０％の最終容量濃度になるまで添加し、１〜２５℃の温度で放置して析出する沈殿物を除去する工程と、
（５）該溶液にさらに４０〜９９％の最終容量濃度になるまでアルコールを添加し、１〜２５℃の温度で放置して析出する沈殿物を採取する工程と、
によって製造された糖―タンパク複合体。 
【請求項２】
糖とタンパク質の比率が７０：３０〜９９：１ の割合である請求項１記載の糖―タンパク複合体。
【請求項３】
マイタケがマイタケ（Grifola frondosa）、白マイタケ（Grifola albicans lmaz.）、チョレイマイタケ（Dendropolyporus umbellatus）である請求項１又は２に記載の糖―タンパク複合体。
【請求項４】
請求項１、２又は３記載の糖―タンパク複合体を有効成分として含有する免疫賦活剤。
【請求項５】
請求項１、２又は３記載の糖―タンパク複合体を有効成分として含有する抗腫瘍剤。  
【請求項６】
請求項１、２又は３記載の糖―タンパク複合体を含有することを特徴とする飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイタケの菌糸体あるいは子実体から抽出、分画した高度に免疫賦活化作用や抗腫瘍作用を有する糖―タンパク複合体に関する。更に本発明は該糖―タンパク複合体を有効成分として含有する免疫賦活剤、抗腫瘍剤又は飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイタケの菌糸体もしくは子実体から抽出したβ―１，６結合を主鎖とし、１，３の分岐鎖を持つ多糖体又はβ―１，３結合を主鎖とし１，６の分岐鎖を持つ多糖体が免疫賦活化作用を有することが知られている（特開昭５９−２１０９０１号公報(特許文献１)、特開平９−２３８６９７号公報(特許文献２)参照）。
【０００３】
また、マイタケ、チョレイマイタケ、トンビマイまたはマスタケのいずれかを熱水にて抽出し、これを減圧にて濃縮した後、有機溶媒による沈殿工程、透析工程による低分子物質の除去及び脂溶性有機溶媒による不純物の抽出除去工程を組み合わせて行うことを特徴とする制癌物質の製造法も公知である（特公昭４３−１６０４７号公報(特許文献３)参照）。
【０００４】
しかしながら、上記従来技術の各特許文献に記載のものは、分子量１００万前後の高分子糖―タンパク複合体である。これらの免疫賦活化作用における細胞レベルでの詳細なメカニズムを調べるためには、分子量が大きく、活性中心となる構造が特定できない。また、高分子であるがゆえに血中への投与も不可能である。
【０００５】
【特許文献１】特開昭５９−２１０９０１号公報
【特許文献２】特開平９−２３８６９７号公報
【特許文献３】特公昭４３−１６０４７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、従来知られている高分子の糖―タンパク複合体に比較して低分子で、高度に免疫賦活化作用や抗腫瘍作用を有するマイタケ由来の糖−タンパク複合体を開発することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者はマイタケ熱水抽出物から新たに分子量１〜１５万の糖―タンパク複合体を分画し、この物質が構造中にβ―１，６結合及１，３結合を有することを見出した。よって上記各特許文献に記載のものと類似の多糖構造をもつが、明らかに分子量及びタンパク含量の異なる免疫賦活剤或いは抗腫瘍剤として有用な低分子の糖―タンパク複合体を得ることができた。
【０００８】
即ち本発明は、
(１)
１）マイタケの菌糸体もしくは子実体を水で熱水抽出する工程と、
２）得られた抽出水溶性画分にアルコールを２０〜７０％の最終容量濃度になる様添加し、１〜２５℃の温度で放置し、液面もしくは液中に浮遊または容器の壁面に付着する物質を回収する工程と、
３）その後回収した物質を水に溶解し、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより非吸着画分を回収する工程と、
４）該溶液にアルコールを２０〜５０％の最終容量濃度になるまで添加し、１〜２５℃の温度で放置して析出する沈殿物を除去する工程と、
５）該溶液にさらに４０〜９９％の最終容量濃度になるまでアルコールを添加し、１〜２５℃の温度で放置して析出する沈殿物を採取する工程によって製造された糖―タンパク複合体、
(２)  糖とタンパク質の比率が７０：３０〜９９：１ の割合である(１)記載の糖―タンパク複合体、
(３)  マイタケがマイタケ（Grifola frondosa）、白マイタケ（Grifola albicans lmaz.）、チョレイマイタケ（Dendropolyporus umbellatus）である(１)又は(２)に記載の糖―タンパク複合体、
(４)  (１)、(２)又は(３)記載の糖―タンパク複合体を有効成分として含有する免疫賦活剤、
(５)  (１)、(２)又は(３)記載の糖―タンパク複合体を有効成分として含有する抗腫瘍剤、
(６)  (１)、(２)又は(３)記載の糖―タンパク複合体を含有することを特徴とする飲食品
に関する。
【０００９】
本発明者等は、先に上記特許文献２に記載のように、マイタケから抽出した抗腫瘍物質を開発している。その発明のポイントは、(１)マイタケの菌糸体もしくは子実体を水で熱抽出処理する工程と、(２)得られた抽出水溶性画分にアルコールを２０〜７０％の最終容量濃度になる様添加し、１〜２５℃の温度で放置し、液面もしくは液中に浮遊または容器の壁面に付着する物質を除去する工程と、(３)その後該溶液に最終容量濃度８０〜９９％迄アルコールを添加し、１〜２５℃の温度で放置して析出する沈殿物を採取する工程と、によって製造された糖−タンパク複合体に関するものである。
【００１０】
本発明は、上記の特許文献２に記載のものと大きく異なっている点は、「液面もしくは液中に浮遊または容器の壁面に付着する物質を除去」するのではなく、「液面もしくは液中に浮遊または容器の壁面に付着する物質を回収」し、そのものを処理して糖―タンパク複合体を取得する点にあるとともに、得られた糖―タンパク複合体が、TNF−α産生を促進することによる免疫賦活化作用や腫瘍細胞増殖抑制作用のあることを見出した点にある。
【００１１】
本発明において、マイタケはマイタケ（Grifola frondosa）、白マイタケ（Grifola albicans lmaz.）、チョレイマイタケ（Dendropolyporus umbellatus）等いずれも用いることができ、使用形態としては生のものはそのままもしくは適宜カットした状態で、乾燥したものも同様にそのまま、適宜カットした状態、もしくは粉末で使用することができる。
【００１２】
熱水抽出の方法としては、５０〜１３５℃で１５分から３時間行う。短時間で行うには、圧力下１００℃以上、例えば圧力釜を用いて１〜２気圧下１２０℃前後で３０分〜１時間前後抽出を行う。
【００１３】
水としては、蒸留水、精製水、イオン交換水、水道水等を使用する。乾燥マイタケ１重量に対して４〜２０倍容量程度を使用する。生マイタケを使用する場合は、１重量に対して２〜１０倍容量程度使用する。
【００１４】
前記(１)の２）及び４）の工程で使用するアルコールとしてはメタノール、エタノール、プロピルアルコール等使用しうる。(１)の２）の工程でアルコールは抽出液に対して最終容量濃度で２０〜７０％になるように添加する。水分含量０〜５０％アルコールが使用できる。添加後は１〜２５℃の温度で１〜２０時間放置すると液面もしくは液中に浮遊又は容器の壁面に付着する物質が現れるのでろ過、ピペット或いは網状のもので掬うこと等により採取する。
【００１５】
前記(１)の２）の工程で回収した物質を水に溶解し、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより非吸着画分を回収する。
【００１６】
前記(１)の３）の工程で得られた溶液にアルコールを２０〜５０％の最終容量濃度になるまで添加し、１〜２５℃の温度で放置して析出する沈殿物を除去し、さらに４０〜９９％の最終容量濃度になるまでアルコールを添加し、１〜２５℃の温度で放置して析出する沈殿物を採取する。高濃度アルコールを添加した時に析出する沈殿物を採取する。
【００１７】
以上得られた本発明の目的物の性質について記載する。
外観：無色〜褐色系色調の液状もしくは固形状
呈色反応：アンスロン反応及びニンヒドリン反応が陽性
水溶液の液性：中性〜弱酸性
分子量：１〜１５万
【００１８】
本発明で得られた物質の分析の結果、主に糖質とタンパク質からなる。カラムクロマト法で精製したところ本発明によって得られる免疫賦活作用を有する抗腫瘍性物質の主たる成分は糖―タンパク複合体であると認められ、糖とタンパク質の比率は主に７０：３０〜９９：１の範囲で、原料マイタケの品質、抽出精製の条件により適宜変動する。
【００１９】
本発明の糖―タンパク複合体は、以下の実施例からも分かるように免疫賦活化効果や抗腫瘍効果を有する物質であるから、ヒト又は動物に直接投与してもよいし、またこの物質を飲食品や餌に添加して免疫賦活作用や抗腫瘍作用を奏せしめてもよい。
【００２０】
本発明の糖―タンパク複合体を免疫賦活剤や抗腫瘍剤として用いる場合、医薬製剤に一般的に使用される担体、賦形剤、その他の添加剤を配合してもよい。本発明の免疫賦活剤や抗腫瘍剤は、経口的又は非経口的に投与できるが、特に経口的に投与することが好ましい。経口投与するために錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、カプセル剤、液剤もしくはシロップ等の剤形であり得る。
【００２１】
本発明の免疫賦活剤や抗腫瘍剤の投与量は、年齢及び体重、投与経路、投与回数、状態により異なり、一概には決めがたいが、当業者ならば個々のケースに対応して用量を適宜決定することができる。
【００２２】
本発明の免疫賦活剤や抗腫瘍剤は、単回投与でも良いが、食用キノコから抽出した、安全性の高い物質であるから、ヒト又は動物に長期にわたって反復的に投与することができる。
【００２３】
次に本発明の糖―タンパク複合体を飲食品に添加する量は、年齢及び体重、摂取頻度、腫瘍の状態等により異なるが、当業者であればその具体的な量を適宜決定することができる。
【００２４】
本発明における飲食品とは、牛乳、ドリンク等の飲料及び日常食している食品に限定されるものではなく、いわゆる健康食品をも含めた一般飲食品と称するものから、栄養機能食品や特定保健食品等を含めた保健機能食品、更には病者用食品や高齢者用食品等を含めた特別用途食品等全て含まれる。  
【発明の効果】
【００２５】
本発明により、マイタケ熱水抽出物から新たに分画された分子量１〜１５万の糖―タンパク複合体が、免疫賦活化作用や腫瘍増殖抑制作用の増強効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明する。
【実施例１】
【００２７】
抽出方法
乾燥マイタケ子実体５００ｇを蒸留水５ｌで１２０℃、６０分間熱抽出処理を行い、得られた可溶性画分９５０ｍｌにエタノールを最終容量濃度５０％になるよう添加する。該溶液を４℃で１２時間静置すると液面もしくは液中に浮遊または容器の壁面に付着する飴状、茶褐色の物質が生成した。この物質をピペットなどにより回収した後水に溶解し、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．２）緩衝液等を溶出液として陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより非吸着画分を回収した。
【００２８】
該溶液にアルコールを２０〜５０％の最終容量濃度になるまで添加し、１〜２５℃に放置して析出する沈殿物を除去し、さらに４０〜９９％迄アルコールを添加し、１〜２５℃に放置して析出する沈殿物を得た。該物質はアンスロン反応及びニンヒドリン反応ともに陽性であり、カラムクロマト法で精製したところ、糖―タンパク複合体であることが認められ糖とタンパク質の比率は９１：９であった。
【００２９】
分子量分布を高速液体クロマトグラフィーにより検討した結果、１〜１５万の間に分布していることが分かった。
【００３０】
糖質を酸分解し、薄層クロマトグラフィーにより中性単糖類の定性試験を行った結果、グルコースのみが検出された。また、β―１，６及びβ―１，３ｇｌｕｃａｎａｓｅを作用させた結果、共に分解物としてグルコースが検出された。
【実施例２】
【００３１】
抗腫瘍試験
実施例１で得た物質と対照として生理食塩水をＭＭ−４６カルシノマを移植したＣ３Ｈマウスに体重あたり４ｍｇ／ｋｇを１０回腹腔内投与し、腫瘍の増殖に及ぼす作用を検討し表１の結果を得た。
【００３２】
【表１】
2007031665.tif 000002
【００３３】
腫瘍増殖抑制率は下記の式により求めた。
腫瘍増殖抑制率＝｛１−（処置群の平均腫瘍重量（ｇ）／対照群の平均腫瘍重量（ｇ））｝×１００
【００３４】
表１から分かるように、実施例１で得た物質投与群が対照群に比べ強い腫瘍増殖抑制効果を示した。また免疫担当細胞の活性化を調べるため、マウス末梢血由来マクロファージ様セルラインであるＪ７７４．１細胞をこの物質で１８時間３７℃、５％ＣＯ２条件下で刺激した結果、ＴＮＦ−α産生量を表２に示す。なお、TNF−α産生量は免疫担当細胞の活性化を示す代表的な指標である。
【００３５】
【表２】
2007031665.tif 000003
【００３６】
以上の結果により実施例１で得た物質投与群が対照群に比べ強い腫瘍増殖抑制効果及び免疫賦活化作用を示すことが認められた。