(57)【要約】      （修正有）【課題】抗原特異的なＣＴＬ誘導剤のスクリーニング方法等を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列をコードする、複数のヌクレオチド配列、前記のいずれかのヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ当該ＤＮＡの発現産物がHLA−A24拘束性抗原ペプチドと結合してＣＴＬ誘導能を有する、当該ＤＮＡのヌクレオチド配列を含有する遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスに被験物質を投与し、当該被験物質に特異的なＣＴＬが誘導されたか否かを測定・評価することを特徴とする、抗原特異的なＣＴＬ誘導剤のスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのヌクレオチド配列を含有する遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスに被験物質を投与し、当該被験物質に特異的なＣＴＬが誘導されたか否かを測定・評価することを特徴とする、抗原特異的なＣＴＬ誘導剤のスクリーニング方法：
（ａ）  配列番号：３に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｂ）  配列番号：２に記載のヌクレオチド配列、
（ｃ）  配列番号：１に記載のヌクレオチド配列、
（ｄ）  前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ当該ＤＮＡの発現産物がHLA−A24拘束性抗原ペプチドと結合してＣＴＬ誘導能を有する、当該ＤＮＡのヌクレオチド配列。
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのヌクレオチド配列を含有する遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスに被験物質を投与し、当該被験物質に特異的なＣＴＬが誘導されたか否かを測定・評価することを特徴とする、腫瘍もしくはウイルス感染症の治療又は予防剤のスクリーニング方法：
（ａ）  配列番号：３に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｂ）  配列番号：２に記載のヌクレオチド配列、
（ｃ）  配列番号：１に記載のヌクレオチド配列、
（ｄ）  前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ当該ＤＮＡの発現産物がHLA−A24拘束性抗原ペプチドと結合してＣＴＬ誘導能を有する、当該ＤＮＡのヌクレオチド配列。
【請求項３】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのヌクレオチド配列を含有する遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスから単離された細胞に被験物質を添加し、当該被験物質に特異的なＣＴＬが誘導されたか否かを測定・評価することを特徴とする、抗原特異的なＣＴＬ誘導剤のスクリーニング方法：
（ａ）  配列番号：３に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｂ）  配列番号：２に記載のヌクレオチド配列、
（ｃ）  配列番号：１に記載のヌクレオチド配列、
（ｄ）  前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ当該ＤＮＡの発現産物がHLA−A24拘束性抗原ペプチドと結合してＣＴＬ誘導能を有する、当該ＤＮＡのヌクレオチド配列。
【請求項４】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのヌクレオチド配列を含有する遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスから単離された細胞に被験物質を添加し、当該被験物質に特異的なＣＴＬが誘導されたか否かを測定・評価することを特徴とする、腫瘍もしくはウイルス感染症の治療又は予防剤のスクリーニング方法：
（ａ）  配列番号：３に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｂ）  配列番号：２に記載のヌクレオチド配列、
（ｃ）  配列番号：１に記載のヌクレオチド配列、
（ｄ）  前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ当該ＤＮＡの発現産物がHLA−A24拘束性抗原ペプチドと結合してＣＴＬ誘導能を有する、当該ＤＮＡのヌクレオチド配列。
【請求項５】
マウスがＣ５７ＢＬ／６系統のマウスである、請求項１〜４のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
配列番号：１に記載のヌクレオチド配列を含有する、単離されたＤＮＡ。
【請求項７】
配列番号：２に記載のヌクレオチド配列を含有する、単離されたＤＮＡ。
【請求項８】
配列番号：３に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有する、単離されたＤＮＡ。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれかに記載のＤＮＡの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ当該ＤＮＡの発現産物がHLA−A24拘束性抗原ペプチドと結合してＣＴＬ誘導能を有する、単離されたＤＮＡ。
【請求項１０】
配列番号：３に記載のアミノ酸配列の第２５位〜第１１４位をコードするヌクレオチド配列、第１１５位〜第２０６位をコードするヌクレオチド配列、及び第２０７位〜第２９８位をコードするヌクレオチド配列を含有する、請求項９に記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項１１】
配列番号：２に記載のヌクレオチド配列の第７２位〜第３３９位、第３４２位〜第６１５位、及び第６１８位〜第８９１位で示される配列を有するポリヌクレオチドを含有する、請求項９に記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項６〜１１のいずれかに記載のＤＮＡを含有する発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載の発現ベクターで形質転換された形質転換細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、抗原特異的なＣＴＬ誘導剤のスクリーニング方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、腫瘍もしくはウイルス感染症の治療又は予防剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はHLA−A24発現トランスジェニック動物及びその利用に関する。さらに詳しくは、本発明は、HLA−A24拘束性の抗原刺激により細胞傷害性Ｔ細胞（以下、ＣＴＬ）が誘導されることを特徴とするHLA−A24遺伝子導入トランスジェニック動物、当該トランスジェニック動物を用いた腫瘍やウイルス感染症の治療又は予防剤のスクリーニング方法、当該スクリーニング方法により選択されたＰＳＡ由来のHLA−A24拘束性腫瘍抗原ペプチド、あるいは、当該トランスジェニックマウスの製造に有用な組換えＤＮＡ構築物およびその利用などに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体による癌細胞やウイルス感染細胞等の排除には細胞性免疫、とりわけ細胞傷害性T細胞（以下ＣＴＬと呼ぶ）が重要な働きをしている。ＣＴＬは、癌やウイルス等に由来する抗原タンパク質のペプチド断片と細胞表面のMHCクラスI分子（ヒトの場合はHLAと呼ばれる）により形成された複合体をT細胞レセプターを介して認識して、癌細胞やウイルス感染細胞等を特異的に傷害したり、各種サイトカインを産生して免疫系を活性化する。MHCクラスI分子と複合体を形成するペプチド断片は抗原ペプチドと呼ばれ、通常８から１1アミノ酸程度の長さである。MHCクラスI分子の細胞外ドメインは、α１、α２、およびα３領域より構成され、このうちα１およびα２領域は抗原ペプチドの収容溝の形成に関与し、α３領域はＣＴＬ表面に発現する補助レセプターCD8分子との結合に関与する。
【０００３】
ＣＴＬが認識する腫瘍抗原タンパク質としては、非特許文献１のtable 1に記載のものが代表例として挙げられる。具体的にはメラノサイト組織特異的タンパク質であるgp100（非特許文献２）、MART-1（非特許文献３）、およびチロシナーゼ（非特許文献４）などのメラノソーム抗原が挙げられ、またメラノーマ以外の腫瘍抗原タンパク質としては、HER-2/neu（非特許文献５）、CEA（非特許文献６）、およびＰＳＡ（非特許文献７）などの腫瘍マーカー、あるいは扁平上皮癌由来のSART-1（非特許文献８）やサイクロフィリンＢ（非特許文献９）などが挙げられる。
【０００４】
これらの腫瘍抗原タンパク質、腫瘍抗原ペプチド及びこれらをコードするＤＮＡ、さらにはウイルス由来の抗原タンパク質や抗原ペプチドを投与して、生体内の特異的なT細胞を増強させる、いわゆるワクチン療法は、癌やウイルス感染症等の治療や予防において有用であると考えられている。実際、メラノーマ、肺癌、頭頚部癌などで過剰に発現する腫瘍抗原タンパク質MAGE-3由来の抗原ペプチドを用いた臨床結果からも、腫瘍排除におけるワクチン療法の重要性が示唆されている（非特許文献１０）。
【０００５】
前記ワクチン療法剤の開発においてイン・ビボにおける有用性を評価するためには、実験動物として一般に使用される純系マウスは使用できず、HLAを発現するトランスジェニック動物（以下、ヒトモデル動物と称する場合もある）を用いる必要がある。すなわち、当該ワクチン療法剤に由来するヒト抗原ペプチドは、HLAに提示されることにより特異的免疫応答を誘導することが可能となるものであるが、当該HLAはヒトに特異的なMHCクラスI分子であるため、HLAを有さない非ヒト実験動物をヒト治療用ワクチン療法剤のイン・ビボ評価に使用することは出来ない。従って、前記のようにワクチン療法剤の有用性の評価には、HLAを発現するトランスジェニック動物（ヒトモデル動物）が必須である。
【０００６】
ところでトランスジェニック動物の作製に関しては、種々の基本書により技術的には理解されているものの、所望の機能を有するトランスジェニック動物（ヒトモデル動物）を得ることは容易ではない。すなわち、導入遺伝子の発現が弱い、若しくは全く発現しない、あるいは発現していてもモデル動物としての所望の機能を有していない等、目的のモデル動物が得られないケースも多く、そのためヒトモデル動物の作製および／または樹立は未だ予測不能の技術であると考えられている。
【０００７】
HLAのヒトモデル動物に関しては、HLAと抗原ペプチドとの複合体をヒトモデル動物のＣＴＬが有効に認識できるように、モデル動物がマウスの場合には、HLAのα３領域をマウスMHCクラスI分子の同領域に置換したキメラHLA分子の遺伝子を導入したヒトモデルマウスが好ましいとされている。しかしながら、当該キメラHLA遺伝子導入ヒトモデル動物の成功例は極めて少なく、HLA-A2.1に関するヒトモデル動物（非特許文献１１；HLA-A2.1／Kbトランスジェニックマウスと呼ばれる, 非特許文献１２）、およびHLA-A11に関するヒトモデル動物（非特許文献１３；HLA-A11／Kbトランスジェニックマウスと呼ばれる）の２例が報告されているにすぎない。そこではトランスジェニックマウスのワクチン療法剤投与によるＣＴＬ誘導の有無が、ヒトの場合と高く相関していることが明らかにされており、トランスジェニックマウスのヒトモデル動物としての有用性が示されている。
【０００８】
前記HLA-A2.1及びHLA-A11は欧米人に多いHLAハプロタイプであるが、これらのHLAと異なりアジア人に多いHLAハプロタイプ、すなわち約60%の日本人を含む多数のアジア人に共通のHLAハプロタイプとしては、HLA−A24が良く知られている。当該HLA−A24に関して、前述のようなキメラHLA遺伝子導入ヒトモデル動物が樹立されれば、アジア人に広く適用可能なHLA−A24拘束性ワクチン療法剤のイン・ビボ評価が可能となるため、当該領域の医薬品開発に多大な貢献をもたらすものと考えられる。しかしながら、当該HLA−A24に関するヒトモデル動物は未だ報告されておらず、そのため当該モデル動物の樹立が望まれている状況にあった。そのようなモデル動物は、ワクチン療法剤の評価のみならず、スクリーニングにも有用である。
【０００９】
ところで腫瘍抗原タンパク質ＰＳＡは、正常な前立腺上皮細胞においても特異的に発現する糖タンパク質で、血中半減期は2〜3日である。癌化に伴い発現量が増強して腫瘍抗原タンパク質となることから、癌の診断マーカーとして利用されている（患者血清中のＰＳＡ値を測定）。前立腺癌は欧米諸国では発生率、死亡率ともに男性悪性腫瘍の第１〜３位を占め、また近年、我が国においても増加傾向が認められている。前立腺癌はアンドロゲン感受性癌であることより、アンドロゲン除去を目的とした治療法（内分泌療法）が施行されている。しかし、前立腺癌は治療開始時には内分泌療法に反応して制癌されていても、5年後には半数以上の症例が再燃癌、すなわちアンドロゲン不応性癌へと移行する。このアンドロゲン依存性喪失は前立腺癌の内分泌治療における大きな障害になっている。このため、ＰＳＡ由来の抗原ペプチドを用いたワクチン療法の開発が望まれている。
【００１０】
ＰＳＡに関して、最近、HLA-A2タイプの抗原ペプチド領域が同定された（非特許文献１４）。しかしながら HLA−A24（HLA−A2402）タイプに拘束性の抗原ペプチド領域の存在に関しては、これまで何ら報告されていない。ちなみにMHCクラスI分子には多くのサブタイプが存在し、結合できるペプチドのアミノ酸配列にはそれぞれのサブタイプについて規則性（結合モチーフ）が存在することが知られている。前記HLA−A24タイプの結合モチーフは、２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニン又はトリプトファンであり、C末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンである。しかしながら、当該結合モチーフより同定したペプチドが免疫原性を有するとは限らない。即ち、抗原ペプチドは腫瘍抗原タンパク質が細胞内でプロセシングされることにより生成されるため、in vivoでプロセシングにより生成されないペプチド領域は抗原ペプチドになり得ない。更に、結合モチーフに基づいて同定した腫瘍抗原タンパク質上のアミノ酸領域がペプチドとして細胞内で生成されても、そのような腫瘍抗原タンパク質は本来生体に存在する物質であるため、アナジーとなっている場合がある。以上のように、抗原ペプチドの同定は目的のHLAタイプに対する結合モチーフによる予測のみでは不十分であり、この観点からも、前記HLA−A24拘束性の抗原ペプチドを評価できるヒトモデル動物の樹立が望まれている状況にあった。
【００１１】
【非特許文献１】Immunity, vol.10:281, 1999
【非特許文献２】J.Exp.Med., 179:1005, 1994
【非特許文献３】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:3515, 1994
【非特許文献４】J. Exp. Med., 178: 489, 1993
【非特許文献５】J.Exp.Med., 181:2109, 1995
【非特許文献６】J. Natl. Cancer. Inst., 87:982, 1995
【非特許文献７】J. Natl. Cancer. Inst., 89:293, 1997
【非特許文献８】）J. Exp. Med., 187: 277, 1998
【非特許文献９】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 1903, 1991
【非特許文献１０】Int. J. Cancer, 80: 219,1999
【非特許文献１１】Eur.J.Immunol., 26:97, 1996
【非特許文献１２】J.Exp. Med., 185: 2034, 1997
【非特許文献１３】J. Immunol., 159:4753, 1997
【非特許文献１４】J. Natl. Cancer. Inst., 89:293, 1997
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、抗原タンパク質や抗原ペプチドのイン・ビボ評価を可能とする、HLA−A24のヒトモデル動物を初めて提供すること、及び当該ヒトモデル動物を用いて新規なHLA−A24拘束性抗原ペプチドを同定することなどを目的とする。具体的には、本発明は、HLA−A24拘束性の抗原刺激によりＣＴＬが誘導されることを特徴とするHLA−A24遺伝子導入トランスジェニック動物、当該トランスジェニック動物を用いた腫瘍やウイルス感染症の治療又は予防剤のスクリーニング方法、あるいは当該スクリーニング方法により選択されたＰＳＡ由来のHLA−A24拘束性腫瘍抗原ペプチドなどを提供することなどを目的とする。
【００１３】
本発明者らは、HLA−A24拘束性の抗原タンパクや抗原ペプチドのイン・ビボ評価を可能とするために、HLA−A24を発現するトランスジェニック動物（ヒトモデル動物）の作製につき鋭意検討した。
【００１４】
本発明者らの意図するトランスジェニックマウスの作製において参考となり得たのは、前述の２例の報告のうちHLA-A2.1のケース（Eur. J. Immunol., 26 :97 (1996)）の1例のみであった。しかしながら、この文献に記載の方法は、本発明の目的を達成するには不適切であった。即ち、前述のごとく、HLAのヒトモデル動物の作製にあたり、HLAのα３領域をマウスMHCクラスI分子（H-2Kbなど）の同領域に置換したキメラHLA分子の遺伝子を導入する方法が知られているが、適切なキメラ遺伝子を得るには、HLA分子上にH-2Kb分子との連結に適した制限酵素部位が必要である。しかし、HLA−A24遺伝子の場合、HLA-A2.1遺伝子と異なり、HLA−A24遺伝子のα1及びα2領域とマウスMHC（H-2Kb）のα3領域とをゲノム上で連結するための適当な制限酵素部位が存在しないので、人工的に適切な制限酵素部位を構築する必要があった。さらに、このような人工配列を含むキメラHLA−A24のゲノムＤＮＡを個体へ導入した際に、正常にスプライシングされて目的のキメラHLA−A24分子を発現するか否かは全く予測できない状況にあった。また、作製されたトランスジェニック動物が正常にキメラHLA−A24分子を発現し、所望のＣＴＬ誘導能を有するヒトモデル動物となり得るか否かについても不明であった。加えて、マウスH-2Kbのイントロン3領域（HLA−A24遺伝子との連結領域）の大半は遺伝子配列が明らかにされておらず、入手が容易でないという状況にあった。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
このような状況の中、本発明者らは、HLA−A24（HLA−A2402）遺伝子およびマウスH-2Kb遺伝子の、キメラ分子作製に必要な領域をクローニングし、人工的に作製した制限酵素部位を介して両配列を連結し、キメラHLA遺伝子（HLA−A2402/Kb遺伝子）を作製することに成功した。そして、当該キメラ遺伝子をC57BL／6マウス系統由来の受精卵へマイクロインジェクトすることにより、HLA−A2402／Kbトランスジェニックマウスの作製を試みた。800個以上の受精卵を対象にマイクロインジェクションを施行した結果、8ラインのトランスジェニックマウスが作出され、そのうち、わずかに１つのライン（04-1ライン）のみが、ホモ型で本発明のHLA−A24遺伝子（キメラ遺伝子）を有するトランスジェニックマウスとして発生した。当該04-1ライン系統のマウスに対して、既知のHLA−A24拘束性抗原ペプチドによる刺激を行った結果、良好なＣＴＬ誘導活性が認められ、本発明の目的にかなうHLA−A24トランスジェニックマウスであることが明らかとなった。
【００１６】
さらに本発明者は、この樹立されたトランスジェニックマウスを用いることにより、イン・ビボで抗原性を有するＰＳＡ由来のHLA−A24拘束性腫瘍抗原ペプチドを同定することにも成功した。
本発明は、以上のような知見に基づき完成するに至ったものである。
【００１７】
即ち本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）HLA−A24拘束性の抗原刺激により、ＣＴＬが誘導されることを特徴とする、HLA−A24遺伝子導入トランスジェニック非ヒト哺乳動物、
（２）HLA−A24遺伝子をホモで有することを特徴とする、前記（１）に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
（３）HLA−A24遺伝子が、HLA−A24遺伝子のα１及びα２領域とマウスMHCクラスＩ遺伝子のα３領域を含有するキメラ遺伝子である、前記（１）又は（２）に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
（４）HLA−A24遺伝子がHLA−A24０２遺伝子である、前記（１）〜（３）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
（５）HLA−A24遺伝子が配列番号：３に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有するものである、前記（１）〜（４）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
（６）HLA−A24遺伝子が配列番号：２に記載のヌクレオチド配列を含有するものである、前記（１）〜（４）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
（７）HLA−A24遺伝子が配列番号：１に記載のヌクレオチド配列を含有するものである、前記（１）〜（４）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
（８）HLA−A24遺伝子が、前記（５）〜（７）のいずれかに記載のヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ当該ＤＮＡの発現産物がHLA−A24拘束性抗原ペプチドと結合してＣＴＬ誘導能を有するものである、前記（１）〜（４）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
（９）非ヒト哺乳動物がマウスである、前記（１）〜（８）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
（１０）マウスがＣ５７ＢＬ／６系統のマウスである、前記（９）記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
（１１）前記（１）〜（１０）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、当該被験物質に特異的なＣＴＬが誘導されたか否かを測定・評価することを特徴とする、抗原特異的なＣＴＬ誘導剤のスクリーニング方法、
（１２）前記（１）〜（１０）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、当該被験物質に特異的なＣＴＬが誘導されたか否かを測定・評価することを特徴とする、腫瘍もしくはウイルス感染症の治療又は予防剤のスクリーニング方法、
（１３）被験物質に特異的なＣＴＬが誘導されたか否かを測定・評価するための標的細胞として、前記（１）〜（１０）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物が保有しているHLA−A24遺伝子が導入され、発現している形質転換細胞を用いることを特徴とする、前記（１１）又は（１２）記載のスクリーニング方法、
（１４）前記（３）〜（１０）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物が保有しているHLA−A24遺伝子が導入され、発現している形質転換細胞、
（１５）前記（１４）記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、抗原特異的なＣＴＬ誘導剤のスクリーニング方法、
（１６）前記（１４）記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、腫瘍もしくはウイルス感染症の治療又は予防剤のスクリーニング方法、
（１７）配列番号：１に記載のヌクレオチド配列を含有する、単離されたＤＮＡ、
（１８）配列番号：２に記載のヌクレオチド配列を含有する、単離されたＤＮＡ、
（１９）配列番号：３に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有する、単離されたＤＮＡ、
（２０）前記（１７）〜（１９）のいずれかに記載のＤＮＡの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ当該ＤＮＡの発現産物がHLA−A24拘束性抗原ペプチドと結合してＣＴＬ誘導能を有する、単離されたＤＮＡ、
（２１）配列番号：３に記載のアミノ酸配列の第25位〜第114位をコードするヌクレオチド配列、第115位〜第206位をコードするヌクレオチド配列、及び第207位〜第298位をコードするヌクレオチド配列を含有する、前記（２０）に記載の単離されたＤＮＡ、
（２２）配列番号：２に記載のヌクレオチド配列の第72位〜第339位、第342位〜第615位、及び第618位〜第891位で示される配列を有するポリヌクレオチドを含有する、前記（２０）に記載の単離されたＤＮＡ、
（２３）前記（１７）〜（２２）のいずれかに記載のＤＮＡを含有する発現ベクター、
（２４）前記（２３）に記載の発現ベクターで形質転換された形質転換細胞、
（２５）前記（２４）に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、抗原特異的なＣＴＬ誘導剤のスクリーニング方法、
（２６）前記（２４）に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、腫瘍もしくはウイルス感染症の治療又は予防剤のスクリーニング方法、
（２７）前記（１１）〜（１３）のいずれかに記載のスクリーニング方法により得られる、ＰＳＡ由来のHLA−A24拘束性腫瘍抗原ペプチド、または機能的に同等の特性を有するその誘導体、
（２８）配列番号：１５に記載のアミノ酸配列よりなる、前記（２７）に記載の腫瘍抗原ペプチド、または機能的に同等の特性を有するその誘導体、
（２９）配列番号：１７に記載のアミノ酸配列よりなる、前記（２８）に記載の腫瘍抗原ペプチド誘導体、
（３０）前記（２７）〜（２９）のいずれかに記載の腫瘍抗原ペプチド又はその誘導体を有効成分として含有する、ＣＴＬの誘導剤、
（３１）前記（２７）〜（２９）のいずれかに記載の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体をコードするＤＮＡ、
（３２）前記（３１）に記載のＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ、
（３３）前記（３２）に記載の組換えＤＮＡを発現させて得られるポリペプチド、
（３４）前記（３２）に記載の組換えＤＮＡまたは前記（３３）記載のポリペプチドを有効成分として含有してなる、ＣＴＬの誘導剤、
（３５）HLA−A24抗原と前記（２７）〜（２９）のいずれかに記載の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体が提示された抗原提示細胞、
（３６）前記（３５）に記載の抗原提示細胞を有効成分として含有してなるＣＴＬの誘導剤、
（３７）HLA−A24抗原と前記（２７）〜（２９）のいずれかに記載の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体を認識するＣＴＬ、
（３８）前記（２７）〜（２９）のいずれかに記載の腫瘍抗原ペプチド又はその誘導体、前記（３２）に記載の組換えＤＮＡ、前記（３３）に記載のポリペプチド、前記（３５）に記載の抗原提示細胞、あるいは前記（３７）に記載のＣＴＬを有効成分として含有してなる腫瘍の治療剤又は予防剤、並びに
（３９）前記（２７）〜（２９）のいずれかに記載の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を含有してなる腫瘍の診断薬。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、HLA−A24拘束性の抗原刺激によりＣＴＬが誘導されることを特徴とするHLA−A24遺伝子導入トランスジェニック動物、当該トランスジェニック動物を用いた腫瘍やウイルス感染症の治療又は予防剤のスクリーニング方法、及び当該スクリーニング方法により選択されたＰＳＡ由来のHLA−A24拘束性腫瘍抗原ペプチドが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、HLA−A24発現トランスジェニック動物を初めて提供するものである。具体的には本発明は、HLA−A24拘束性の抗原刺激によりＣＴＬが誘導されることを特徴とする、HLA−A24遺伝子導入トランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供するものである。
本発明はまた、上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物の利用に関する。
さらに本発明は、上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作成に有用なＤＮＡ構築物（例、キメラ遺伝子）、該キメラ遺伝子で形質転換された宿主細胞およびそれらの利用等に関する。
【００２０】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製するために導入されるHLA−A24遺伝子としては、HLA−A2402遺伝子やHLA−A2403遺伝子などの亜種（J. Immunother., 23:282, 2000）を挙げることができる。しかし、HLA−A24保有者の大半がHLA−A2402遺伝子を保有しているため、多くの患者に適応可能なワクチン療法剤をイン・ビボ評価できるトランスジェニック動物を作製するという観点から、HLA−A2402遺伝子を用いることが好ましい。ここでHLA−A2402遺伝子はGenBank Acc. No. M64740として登録されており、またHLA−A2403遺伝子は Acc. No. M64741として登録されている。これらの配列に基き適当なPCRプライマーを作製し、ヒト腫瘍細胞等の種々の細胞株由来のゲノムＤＮＡやmRNAを鋳型として前記プライマーを用いたPCR反応を行うことにより、所望のHLA−A24遺伝子をクローニングすることができる。
【００２１】
また導入するHLA−A24遺伝子としては、天然のHLA−A24遺伝子（ゲノム及びcＤＮＡ）であってもよいが、当該HLA−A24遺伝子のα3領域が、導入対象動物の対応α3領域に置換されているキメラHLA−A24遺伝子を用いることが好ましい。
【００２２】
HLA分子の細胞外ドメインは、α1、α2、及びα3領域より構成されており、α1及びα2領域は抗原ペプチドの収容溝の形成に関与し、α3領域はＣＴＬ表面に発現する補助レセプター：CD8分子との結合に関与している。そして、HLAモデル動物のＣＴＬがHLAと抗原ペプチドとの複合体を有効に認識するためには、該動物が、HLAのα3領域を導入対象動物のMHCの同領域に置換したキメラHLA分子を発現していることが好ましいと考えられている（Eur. J. Immunol., 26: 97, 1996、J. Immunol., 159:4753,1997）。従って前述のように、HLA−A24遺伝子のα3領域が導入対象動物の対応α3領域に置換されていることが好ましい。このようなキメラHLA−A24遺伝子も、発現してHLA−A24としての機能を保持する限り、本発明における「HLA−A24遺伝子」の範疇に含まれる。
【００２３】
なお、本発明の目的から、当該キメラHLA−A24遺伝子において、抗原ペプチドの収容溝の形成に関与しているα1及びα2領域は、少なくともHLA−A24遺伝子由来である必要がある。一方、α3領域は前述のように導入対象動物のMHCの同領域に置換されていることが好ましく、さらにα3領域のみならず、α3領域以降の領域が導入対象動物のMHCの同領域に置換されているキメラHLA−A24遺伝子が、より好ましい。
【００２４】
例えば、導入対象動物がマウスの場合、ヒトHLAに対応するマウスMHCは、ＭＨＣクラスＩであるＨ−２（H−2Kbなど）に相当する（Immunogenetics., 41:178, 1995）。従って、マウスに導入するHLA−A24遺伝子の好適な例として、HLA−A2402遺伝子のα1及びα2領域とマウスH−2Kb遺伝子のα3領域とを含有する、キメラHLA−A2402遺伝子が挙げられる。
【００２５】
このように、本明細書中、本発明に関して「HLA−A24遺伝子」という語句は、HLA−A24遺伝子に属する種々の亜種を包含し、さらに、そのようなHLA−A24遺伝子を構成するα１、α２およびα３領域（ドメイン）の全てを含む天然のHLA−A24遺伝子のみならず、これら３つの領域のうち少なくともα１およびα２領域を含むＤＮＡ構築物をも包含する意味で用いる。ここに、ＤＮＡ構築物としては、HLA−A24由来のα１、α２領域と、マウス等の任意の哺乳動物由来のα３領域からなるキメラ遺伝子が挙げられる。
【００２６】
本発明に有用なキメラHLA−A2402遺伝子の具体例として、以下のものが列挙される。
(1)配列番号：3に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ。
(2)配列番号：2に記載のcＤＮＡのヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ。
(3)配列番号：1に記載のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ。
(4)上記(1)〜(3）のいずれかに記載のＤＮＡの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ当該ＤＮＡの発現産物がHLA−A24拘束性抗原ペプチドと結合してＣＴＬ誘導能（即ち、ＣＴＬ誘導活性）を有するようなＤＮＡ。
【００２７】
ここで(4)のＤＮＡは、前記(1)〜(3)のＤＮＡと類似の構造を有するＤＮＡ（例えば1〜数個のアミノ酸の改変等を含むＤＮＡ）を指すものである。具体的には、例えば、ホルムアミド濃度：45%(v/v)、塩濃度：5×SSPE、温度：42℃程度の条件下でハイブリダイズさせ、塩濃度：2×SSPE、温度：42℃程度の条件下で洗浄するといったストリンジェントな条件下で、前記(1)〜(3）のいずれかに記載のＤＮＡの相補鎖とハイブリダイズし、かつ前記活性を有するＤＮＡが挙げられる（活性測定法については後述する）。また、前記(1)〜(3)のＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において1〜複数個（好ましくは、１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡであって、かつ前記活性を有するＤＮＡが挙げられる。さらには、前記(1)〜(3)のＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列のいずれかと約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する配列をコードするＤＮＡであって、かつ前記活性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００２８】
より具体的には、配列番号：3に記載のアミノ酸配列の第25位〜第114位（α1領域）をコードするヌクレオチド配列、第115位〜第206位（α2領域）をコードするヌクレオチド配列、及び第207位〜第298位（α3領域）をコードするヌクレオチド配列を含有し、かつ前記活性を有するＤＮＡが挙げられる。さらに、配列番号：２に記載のヌクレオチド配列の第72位〜第339位（α1領域）、第342位〜第615位（α2領域）、及び第618位〜第891位（α3領域）を含有し、かつ前記活性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００２９】
以下、本発明のHLA−A24遺伝子作製法の具体例として、当該キメラHLA−A2402遺伝子作製法の一例を記述するが、これらは本発明を制限するものではない。
【００３０】
まず、キメラHLA−A2402遺伝子を作製するために、ヒトHLA−A2402のゲノムＤＮＡ（GenBank Acc.No.L47206）の配列情報を基に、α1及びα2領域を含む必要領域（プロモーター、エキソン1〜3、及びイントロン1〜3）をクローニングする。その際、マウスH−2Kb遺伝子との連結を可能とするために、イントロン3中に適当な制限酵素認識部位を構築することが望ましい。そのような制限部位としては制限酵素Bgl II部位が好ましい。当該Bgl II部位は、クローニングに用いる下流プライマー中にBgl II部位が生じるような改変を施しておき、この下流プライマーを用いてPCR反応を行うことにより、構築することができる。具体的には配列番号：5に記載のプライマーを用いることにより、当該改変を施すことができる。
【００３１】
なお前記クローニングは、例えばヒト腫瘍細胞株由来のゲノムＤＮＡを鋳型とし、前述のような適当なPCRプライマーを用いてPCR反応を行うことなどにより実施することができる。当該PCRは、例えば Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)などの基本書に従い容易に行うことができ、また現在ではPCRキット等も多数市販されている。
【００３２】
他方、マウスH−2KbのゲノムＤＮＡの配列情報（GenBank Acc. No. v00746, v00747）を基に、例えばマウス腫瘍細胞株由来のゲノムＤＮＡを鋳型として、前記と同じくPCR反応により、α3以降の領域（エキソン4〜8、及びイントロン3〜7）をクローニングする。なお、前記 GenBank登録配列は不完全であり、HLA−A2402遺伝子との連結に必要なイントロン3領域の大半が登録されていないので、まず当該未登録領域をクローニングして配列決定する必要がある。ここで、H−2Kb遺伝子には相同な偽遺伝子や相同性の高い遺伝子が存在しているため、正しいH−2Kb遺伝子をクローニングするには適切なプライマーを用いてクローニングする必要がある。好ましいプライマーとして、例えば、実施例２記載の各種プライマー（配列番号：6〜配列番号：9）を挙げることができる。
【００３３】
以上のようにして得られたHLA−A2402ゲノム断片及びマウスH−2Kbゲノム断片を連結して、所望のキメラ遺伝子（HLA−A2402/Kb遺伝子）を構築する。その際、前記のようにHLA−A2402遺伝子のイントロン3中にBgl II部位を構築した場合は、当該Bgl II部位とマウスH−2Kb遺伝子のイントロン3中のBam HI部位とで両遺伝子を連結することが好ましい。このようにして、本発明のキメラHLA−A2402遺伝子（HLA−A2402/Kb遺伝子）を作製することができる。
【００３４】
なお、作製されたキメラHLA−A2402遺伝子に対して1〜複数個のアミノ酸の改変を施す手法も当業者に周知であり、例えば Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)等の基本書に従い行うことができる。
次に、前記で作製されたHLA−A24遺伝子の受精卵への導入及びトランスジェニック動物の作製につき記述する。
【００３５】
まず、前記で作製されたHLA−A24遺伝子を含有するプラスミドからHLA−A24遺伝子部分を切り出し、この断片を常法により受精卵に導入できる程度に精製する。なお、HLA−A2402/Kb遺伝子が前述のように HLA−A2402遺伝子の本来のプロモーター領域を保有している場合は、切り出したHLA−A24遺伝子断片をそのまま用いて受精卵に導入することが可能であるが、このような本来のプロモーターを有していない場合は、発現に必要な外来性プロモーターを付加する必要がある。当該プロモーターとしては、βアクチンプロモーター、メタロチオネインプロモーター等が挙げられる。さらに、より発現量を上げるためにエンハンサーを付加することも可能であり、当該エンハンサーとしてはCMVエンハンサー、SV40エンハンサー、免疫グロブリンエンハンサー等が挙げられる。
【００３６】
次に、精製されたHLA−A24遺伝子を対象動物の受精卵へ導入する。ここで対象動物としてはマウス、ラット、ウサギ等を具体的に例示することができるが、創製、育成、使用の簡便さなどからしてマウス、ラット等のげっ歯目動物が好ましく、特にマウスが好ましい。中でもC57BL/6系統のマウスを用いることがより好ましい。すなわちC57BL/6系統マウスはクラスI分子としてH−2Kbを発現しており、HLA−A24と同様な結合モチーフを有するH−2Kdを発現していないため、当該トランスジェニックマウスにHLA−A24拘束性の抗原ペプチドを投与しても、内因性のマウスクラスIにより細胞表面に提示されることがなく、交差反応が起こらないという利点を有する。
【００３７】
以下、マウスを例にとりトランスジェニックマウスの作製につき説明する。
マウス受精卵への遺伝子の導入方法は特に限定されるものではなく、マイクロインジェクション法やエレクトロポレーション法等により導入することができる。導入後、得られた卵細胞を培養し、仮親マウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから本発明のHLA−A24遺伝子を含有する仔マウスを選択することにより、トランスジェニックマウスを創製することができる。当該トランスジェニックマウスの選択は、例えばマウスの尾ＤＮＡ調製物を鋳型として、導入したHLA−A24遺伝子特異的なプライマーを用いたPCR法等により、行うことができる。
【００３８】
作出されたトランスジェニックマウスのラインが、導入されたHLA−A24遺伝子を細胞表面に発現しているか否かは、例えばトランスジェニックマウスより摘出した脾臓より脾細胞を回収し、当該脾細胞をフローサイトメトリー法により解析することにより、調べることができる。このようにして得られた本発明のトランスジェニックマウスは、導入HLA−A24遺伝子をホモで有していることが望ましい。
【００３９】
なお、以上のようなトランスジェニック動物は、例えば新遺伝子工学ハンドブック,269−276,羊土社(1996)や、マウス胚の操作マニュアル,近代出版（1989）などの基本書を参考にして創製することができる。例えば、マウスゲノムのH−2Kb遺伝子座にキメラHLA−A24遺伝子としてのＤＮＡ構築物を組み込むことを目的として、マウス胚性幹細胞中に導入し、そのようにして製造された組み換え幹細胞を選択し、次いで、マウス胚盤胞中に導入してキメラ胚を得る。これを偽妊娠マウス中に移植し子孫を得、その子孫をスクリーニングして、導入キメラ遺伝子の対立遺伝子を含むヘテロ接合マウスを同定する。次いで、これらのマウスを交雑させて、HLA−A24拘束性抗原刺激により、ＣＴＬが誘導されることにより特徴付けられる表現型を有するホモ接合トランスジェニックマウスを得ることができる。
【００４０】
本発明のトランスジェニック動物がヒトモデル動物として使用できるか否か、すなわちHLA−A24拘束性の抗原刺激により特異的ＣＴＬが誘導されるか否かは、当業者に周知のあらゆる手法を用いて調べることが可能であるが、以下に代表的な一例を記載する。
【００４１】
まず、既知のHLA−A24拘束性の抗原ペプチドを、常法により不完全フロイントアジュバントと混合し、water-in-oilエマルションを作製する。当該エマルションでトランスジェニックマウスを免疫する。免疫部位としてはマウス尾部や背の皮下、腹腔内および足蹠などが好ましい。数日後に脾臓を摘出し、常法により脾細胞を回収・調製する。ここで脾細胞を用いる理由は、樹状細胞などの抗原提示細胞は脾細胞に含まれているためであるが、脾細胞に限定されるものではない。
【００４２】
次に当該脾細胞を溶血処理し、Ｘ線照射した後、前記抗原ペプチドをパルスする。その際、非照射・非ペプチドパルスの脾細胞を同時に加えて37℃で再刺激を行う。数日間刺激し、これを評価用の被験試料とする。
【００４３】
他方、前記被験試料をアッセイするための標的細胞を作製する。当該標的細胞としては、細胞表面にHLA−A24が発現している細胞であれば、如何なる細胞であっても用いることが可能であり、天然にHLA−A24を発現している細胞、及びHLA−A24遺伝子を導入して作製された形質転換細胞のいずれをも用いることができる。
【００４４】
ここで天然にHLA−A24を発現している細胞としては、本発明のトランスジェニック動物から単離・精製されたリンパ球や、天然にHLA−A24を発現しているRERF-LC-AI細胞（理研細胞バンク RCB0444）などが挙げられる。
【００４５】
また、HLA−A24遺伝子を導入して作製された形質転換細胞としては、以下のものが挙げられる。
【００４６】
まず、細胞へ導入するHLA−A24遺伝子としては、天然型のHLA−A24遺伝子であっても、また前述のようなキメラHLA−A24遺伝子であっても良いが、評価対象であるトランスジェニック動物のＣＴＬが認識し易いように、当該トランスジェニック動物が保有しているHLA−A24遺伝子と同じ遺伝子を細胞に導入することが好ましい。すなわち、トランスジェニック動物がキメラHLA−A2402遺伝子（HLA−A2402/Kb遺伝子）を保有している場合、当該トランスジェニック動物の評価に用いる標的細胞においても、HLA−A2402/Kb遺伝子を導入することが好ましい。
【００４７】
当該導入用のHLA−A24遺伝子は、cＤＮＡの形態であってもゲノムＤＮＡの形態であっても良い。またトランスジェニック動物自身から当該HLA−A24遺伝子を単離しても、それ以外の細胞等から単離しても良い。
【００４８】
例えば導入用遺伝子としてHLA−A24のcＤＮＡを用いる場合、トランスジェニック動物から単離されたmRNAを鋳型として、HLA−A24遺伝子特異的なプライマーを用いたPCR反応を行うことにより、目的のcＤＮＡを得ることができる。また、導入用遺伝子としてHLA−A24のゲノムＤＮＡを用いる場合は、天然にHLA−A24を発現しているRERF-LC-AI細胞（理研細胞バンク RCB0444）より単離されたゲノムＤＮＡを鋳型として、HLA−A24遺伝子特異的なプライマーを用いたPCR反応を行うことにより、目的のゲノムＤＮＡを得ることができる。さらに、前記でトランスジェニック動物への導入用に作製されたHLA−A24遺伝子（キメラHLA−A24遺伝子等）も使用することができる。
【００４９】
当該導入されるcＤＮＡやゲノムＤＮＡの具体例としては、前述の(1)〜(4)のＤＮＡ、すなわち、配列番号：3に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有するcＤＮＡや、配列番号：２に記載のヌクレオチド配列を含有するcＤＮＡ、あるいは配列番号：1に記載のヌクレオチド配列を含有するゲノムＤＮＡなどが挙げられる。
【００５０】
得られたcＤＮＡやゲノムＤＮＡは、pcＤＮＡ3.1、pcＤＮＡ3.1誘導体、pRc/RSV、pRc/CMV、pEF誘導体、pREP9誘導体(インビトロジェン)、pIRESneo（クロンテック）等の市販の発現ベクターに組み込むことにより、所望のHLA−A24を発現する組換え発現ベクターを作製することができる。
【００５１】
宿主細胞としては、ヒトリンパ球細胞であるJurkat細胞（ATCC T1B-152）、T2細胞（ATCC CRL-1992）や、マウスリンパ球細胞であるEL4細胞（ATCC T1B-39）、RMA-S細胞（Nature.,346,476-80(1990)）、K562細胞（ATCC CCL-243）、C1R細胞（ATCC CRL-2369）などが挙げられる。当該宿主細胞へのHLA−A24遺伝子含有発現ベクターの導入法としては、例えば遺伝子導入装置を用いる方法、リン酸カルシウム法（J.Virol.,52,456-467(1973)）、LT−1（Panvera社）を用いる方法、遺伝子導入用リピッド(Lipofectamine, Lipofectin; Gibco-BRL社）を用いる方法等が挙げられる。その後、選択培地にて生存する細胞を培養することにより、導入遺伝子が安定に発現する宿主細胞を樹立することができる。
【００５２】
以上のようにして樹立された標的細胞は、当業者に周知の手法により前記トランスジェニック動物の評価（トランスジェニック動物由来の被験試料の評価）に用いられる。具体的には、例えば抗原刺激により誘導されたＣＴＬが標的細胞に反応して産生する種々のサイトカイン（例えばIFN−γ）の量を、例えばELISA法などによって測定する手法や、標的細胞の傷害活性を測定する５１Crリリースアッセイ（Int.J.Cancer,58:317(1994)）などが挙げられる。
【００５３】
ここで５１Crリリースアッセイとは、前記標的細胞を５１Crラベルし、対象となる抗原ペプチドをパルスして、前記トランスジェニック動物由来の被験試料（脾細胞）を添加し、標的細胞がＣＴＬにより傷害を受けて遊離された５１Crの量を測定する手法である。このようなアッセイによって抗原特異的なＣＴＬの誘導が認められれば、当該トランスジェニック動物はHLA−A24拘束性の腫瘍抗原タンパクや腫瘍抗原ペプチドを評価することのできるヒトモデル動物であることが明らかとなる。
【００５４】
以上のようにして作製された本発明のトランスジェニック動物は、HLA−A24拘束性の抗原刺激によりＣＴＬが誘導されるものである。従って、被験物質がイン・ビボで抗原特異的ＣＴＬ誘導能（誘導活性）を有するか否かの評価に使用することができる。すなわち、本発明は、本発明のトランスジェニック動物に被験物質を投与し、当該被験物質に特異的なＣＴＬが誘導されたか否かを測定・評価することを特徴とする、抗原特異的なＣＴＬ誘導剤のスクリーニング方法を提供する。
【００５５】
当該スクリーニング方法に供される被験物質としては、イン・ビトロ試験で特異的ＣＴＬ誘導能を有することが明らかにされている抗原タンパクやそれに由来する抗原ペプチド、あるいはそれらをコードするプラスミドＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、活性未知のタンパク質やペプチドあるいはそれらをコードするプラスミドＤＮＡなども含まれる。
【００５６】
具体的には、例えばMAGE（Science ，254:1643，1991）、gp100（J.Exp.Med.，179:1005，1994）、MART−1（Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91:3515 ，1994）、チロシナーゼ（J.Exp.Med.，178:489 ，1993）、HER2/neu（J.Exp.Med.，181:2109，1995）、CEA（J.Natl.Cancer.Inst. ，87:982，1995）、ＰＳＡ（J. Natl. Cancer. Inst. ，89:293，1997）、SART−1（J. Exp. Med., vol. 187, p277−288, 1998 、国際公開第97/46676号パンフレット） 、サイクロフィリンＢ（Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 88: 1903, 1991）、SART−3（国際公開第00/12701号パンフレット）、ART−1（国際公開第00/32770号パンフレット）等の腫瘍抗原タンパク質及びその部分ペプチド、あるいはそれらをコードするプラスミドＤＮＡが挙げられる。さらに、HIV、HCV、HBV、インフルエンザウイルス、HPV、HTLV、EBV等のウイルス本体、ウイルス由来の抗原タンパク質及びその抗原ペプチドや、結核菌等の細菌由来の抗原タンパク質及びその抗原ペプチドが挙げられる。
【００５７】
このような被験物質のトランスジェニック動物への投与により、被験物質特異的なHLA−A24拘束性のＣＴＬが誘導されたか否かの測定・評価は、前記トランスジェニック動物の評価方法と同様にして行うことができる。
【００５８】
すなわち一例を以下に記載すると、まず、本発明のトランスジェニック動物を被験物質で免疫し、脾臓を摘出して脾細胞を回収する。当該脾細胞を溶血処理し、Ｘ線照射した後、被験物質をパルスする。その際、非照射・非パルスの脾細胞を同時に加えて37℃で再刺激を行う。数日間刺激し、これを評価用の被験試料とする。
【００５９】
他方、前述のようなアッセイ用の標的細胞を５１Crでラベルし、被験物質の抗原ペプチドをパルスした後、前記被験試料（脾細胞）を添加する。被験試料の添加によって、抗原特異的なＣＴＬの誘導が認められた場合は、当該被験物質はイン・ビボで抗原特異的ＣＴＬ誘導能を有する物質であることが明らかとなる。このようにして選択されたＣＴＬの誘導剤は、腫瘍やウイルス感染症の治療剤及び／又は予防剤として用いることができる。
【００６０】
なお、前述の標的細胞は、トランスジェニック動物の評価や、トランスジェニック動物に投与した被験物質の評価に用いられるのみならず、HLA−A24抗原特異的なＣＴＬが誘導されるか否かを評価する必要のある如何なる被験物質の評価においても、使用することができる。
【００６１】
本発明はまた、本発明のトランスジェニック動物を用いた前記スクリーニングにより得られた、ＰＳＡ由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性腫瘍抗原ペプチド、及び機能的に同等の特性を有するその誘導体を包含するものである。ここでＰＳＡとは、Biochem. Biophys. Res. Commun. 160(2), 903−910(1989)及び GenBank Acc No. M26663において開示されたアミノ酸配列を有する腫瘍抗原タンパク質である。
【００６２】
HLA抗原に結合して提示される抗原ペプチドの配列には規則性（モチーフ）があり、ＨＬＡ−Ａ２４抗原の場合、８〜１１アミノ酸よりなるペプチドのうちのＮ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンであり、Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンであることが知られている(Immunogenetics, 41: 178, 1995、J. Immunol., 152: p3913,1994、J. Immunol., 155: 4307,1994）。ＰＳＡのアミノ酸配列からこのような結合モチーフ構造を有するペプチド部分を選択し、選択されたペプチドを本発明のトランスジェニック動物に供することにより、イン・ビボで効果を有するＨＬＡ−Ａ２４拘束性腫瘍抗原ペプチドを同定し、得ることができる。
【００６３】
当該腫瘍抗原ペプチドとしては、具体的には配列番号：15に記載のアミノ酸配列よりなる腫瘍抗原ペプチドが挙げられる。
【００６４】
本発明の腫瘍抗原ペプチドは、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて合成することができる。合成方法としては、文献（ペプタイド・シンセシス（Peptide Synthesis ），Interscience，New York，1966；ザ・プロテインズ（The Proteins），Vol 2 ，Academic Press Inc. ，New York，1976；ペプチド合成，丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発  続  第１４巻・ペプチド合成，広川書店，1991）などに記載されている方法が挙げられる。
【００６５】
前記において「腫瘍抗原ペプチドと機能的に同等の特性を有する誘導体」（以下、腫瘍抗原ペプチド誘導体と略す場合がある）とは、本発明の腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸残基を改変した改変体であって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるという腫瘍抗原ペプチドとしての特性を有するものをいう。
【００６６】
ここで、アミノ酸残基の「改変」とは、アミノ酸残基の置換、欠失、及び／又は付加（ペプチドのＮ末端、Ｃ末端へのアミノ酸の付加も含む）を意味し、好ましくはアミノ酸残基の置換が挙げられる。アミノ酸残基の置換に係る改変の場合、置換されるアミノ酸残基の数および位置は、腫瘍抗原ペプチドとしての活性が維持される限り任意である。
前述の如く、HLA抗原に結合して提示される抗原ペプチドの配列には規則性（モチーフ）があり、ＨＬＡ−Ａ２４抗原の場合、８〜１１アミノ酸よりなるペプチドのうちのＮ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンであり、Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンであることが知られている（Immunogenetics, 41: 178,1995、J. Immunol., 152: p3913, 1994、J. Immunol., 155:4307,1994）。より好ましくは、当該モチーフは、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンであり、Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシンまたはトリプトファンである。また、該モチーフ上とり得るアミノ酸に類似の性質を持つアミノ酸残基も許容される可能性がある。
【００６７】
従って、本発明の腫瘍抗原ペプチド誘導体の具体例としては、第２位および／またはＣ末端のアミノ酸を前記モチーフ上置換が可能なアミノ酸に置換し、かつ腫瘍抗原ペプチドとしての活性を有する腫瘍抗原ペプチド誘導体が挙げられる。ペプチドの長さは、ＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合して提示されるという観点から、８〜１１アミノ酸程度が好ましい。
【００６８】
具体的には、配列番号：15に記載のアミノ酸配列の第２位のアミノ酸をフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンのいずれかに置換し、および／またはＣ末端のアミノ酸をフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンのいずれかに置換したアミノ酸配列（配列番号：17）からなり、かつ腫瘍抗原ペプチドとしての活性を有するものが挙げられる。
【００６９】
本発明の腫瘍抗原ペプチド誘導体は、本発明の腫瘍抗原ペプチドと同様に、候補となるペプチドを前記ペプチド合成法に基づき合成し、これを本発明のトランスジェニック動物に供して前記のＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬ誘導活性に関して試験することにより、腫瘍抗原ペプチドと機能的に同等の特性を有するか否かを同定することができる。
【００７０】
本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体は、後述の実施例にも記載のようにＣＴＬの誘導能を有するものであり、誘導されたＣＴＬは、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗腫瘍効果を発揮することができる。従って本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体は、腫瘍の治療剤または予防剤の有効成分とすることができる。本発明は、腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を有効成分として含有する腫瘍の治療剤または予防剤を提供する。本発明の腫瘍の治療剤または予防剤をＨＬＡ−Ａ２４陽性かつＰＳＡ陽性の患者に投与すると、抗原提示細胞のＨＬＡ−Ａ２４抗原に腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体が効果的に提示され、提示されたHLA−A24抗原複合体特異的ＣＴＬが増殖して腫瘍細胞を破壊することができ、従って、腫瘍の治療または予防が可能となる。ＰＳＡは前立腺癌において高頻度に発現しているので、本発明の腫瘍の治療剤または予防剤は、特に前立腺癌に対して有効に使用される。
【００７１】
本発明の腫瘍の治療剤または予防剤は、細胞性免疫が効果的に成立するようにアジュバントとともに投与したり、粒子状の剤型にして投与することができる。アジュバントとしては、文献（Clin. Microbiol.Rev., 7:277−289, 1994)に記載のものなどが応用可能である。また、リポソーム製剤、直径数μm のビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤なども考えられる。投与方法としては、皮内投与、皮下投与、静脈注射などが考えられる。製剤中の本発明の腫瘍抗原ペプチドあるいはその誘導体の投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常0.0001mg〜1000mg、好ましくは 0.001mg〜1000mg、より好ましくは0.1mg 〜10mgであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
【００７２】
本発明はまた、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体をコードするＤＮＡをも提供するものである。本発明のＤＮＡは、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体のアミノ酸配列に基き、当業者であれば容易に合成することができる。本発明のＤＮＡの好適な例としては、配列番号：１５に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００７３】
このような本発明のＤＮＡは、本発明の腫瘍抗原ペプチド又はその誘導体を製造する際に有効に用いられる。さらに以下に述べるように、本発明のＤＮＡはＣＴＬの誘導（腫瘍の治療又は予防）においても有効に用いることができる。
【００７４】
すなわち近年、複数のＣＴＬエピトープを連結させた、いわゆる"ポリトープ"をコードするＤＮＡを、ＤＮＡワクチンに利用する手法が用いられている（例えば Journal of Immunology, 160,p1717,1998などを参照のこと）。従って、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体をコードするＤＮＡを少なくとも１種または２種以上連結させることにより、また場合によっては他の腫瘍抗原ペプチドをコードするＤＮＡも連結させることにより作製されたＤＮＡ（以下、当該連結されたＤＮＡを「組換えＤＮＡ」と称する）を、適当な発現ベクターに組み込むことにより、ＣＴＬの誘導剤（腫瘍の治療剤または予防剤）の有効成分とすることができる。また、前記の組換えＤＮＡを治療剤または予防剤として用いるのみならず、当該組換えＤＮＡを宿主細胞内で発現させて得られたポリペプチドも、腫瘍の治療剤または予防剤の有効成分とすることができる。
【００７５】
ここで「組換えＤＮＡ」は、ＤＮＡ合成および通常の遺伝子工学的手法に基づき、例えば Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に従い容易に作製することができる。また、この組換えＤＮＡの発現ベクターへの組み込みも、前記基本書等に従い行うことができる。
【００７６】
作製された本発明の組換えＤＮＡが、HLA−A24抗原と結合してＣＴＬにより認識され得る腫瘍抗原ペプチドを生じるか否かも、本発明のトランスジェニック動物を用いて評価することができる。
【００７７】
本発明の組換えＤＮＡを腫瘍の治療剤または予防剤として適用する際には、以下の方法が使用され得る。
【００７８】
すなわち、本発明の組換えＤＮＡを細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターによる方法およびその他の方法（日経サイエンス, 1994年4月号, 20−45頁、月刊薬事, 36(1), 23-48(1994)、実験医学増刊, 12(15), (1994)、およびこれらの引用文献等）のいずれの方法も適用することができる。
【００７９】
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスに本発明のＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
【００８０】
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【００８１】
本発明の組換えＤＮＡを実際に医薬として作用させるには、当該ＤＮＡを直接体内に導入する in vivo法、およびヒトからある種の細胞を採集し体外でＤＮＡを該細胞に導入しその細胞を体内に戻す ex vivo法がある（日経サイエンス, 1994年4月号, 20-45頁、月刊薬事, 36(1), 23-48(1994)、実験医学増刊, 12(15), (1994)、およびこれらの引用文献等）。in vivo法がより好ましい。
【００８２】
in vivo法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に投与することができる。 in vivo法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には有効成分である本発明の組換えＤＮＡを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、本発明の組換えＤＮＡを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
【００８３】
製剤中の本発明の組換えＤＮＡの含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常、0.0001mg〜100mg、好ましくは0.001mg〜10mgの本発明の組換えＤＮＡを、数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
【００８４】
以上のような本発明の組換えＤＮＡの腫瘍患者への投与により、抗原提示細胞内で当該組換えＤＮＡに対応するポリペプチドが高発現する。その後、細胞内分解を受けて生じた個々の腫瘍抗原ペプチドがHLA抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体特異的なＣＴＬが体内で効率的に増殖し、腫瘍細胞を破壊する。以上のようにして、腫瘍の治療又は予防が達成される。本発明の組換えＤＮＡは、特に前立腺癌の治療又は予防に有効である。
【００８５】
また、前記組換えＤＮＡを発現させることにより得られる「ポリペプチド」は、前記組換えＤＮＡを適当な発現ベクター（例えばｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ１など）に組み込みこんで作製された発現プラスミドを宿主細胞に導入して形質転換体を得、この形質転換体を適当な培地で培養することにより、発現・生産することができる。ここで宿主細胞としては、大腸菌などの原核生物、酵母のような単細胞真核生物、昆虫、動物などの多細胞真核生物の細胞などが挙げられる。また、宿主細胞への遺伝子導入法としては、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、電気パルス法などがある。以上のようにして得られたポリペプチドは、一般的な生化学的方法によって単離精製することができる。また、当該ポリペプチドがHLA−A24抗原と結合してＣＴＬにより認識され得る腫瘍抗原ペプチドを生じるか否かも、本発明のトランスジェニック動物を用いて評価することができる。
【００８６】
本発明のポリペプチドを腫瘍の治療剤または予防剤として適用する際には、前記本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体と同様の投与形態、投与方法および投与量により、投与することができる。本発明のポリペプチドを腫瘍患者に投与すると、抗原提示細胞内に取り込まれ、その後、細胞内分解を受けて生じた個々の腫瘍抗原ペプチドがHLA抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体に特異的なＣＴＬが体内で効率的に増殖し、腫瘍細胞を破壊する。以上のようにして、腫瘍の治療又は予防が達成される。本発明のポリペプチドは、特に前立腺癌の治療又は予防に有効である。
【００８７】
本発明はまた、HLA−A24抗原と本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体の提示された抗原提示細胞をも提供する。
【００８８】
後述の実施例において、本発明のペプチド刺激により強い細胞傷害活性が認められたが、これは、トランスジェニック動物のリンパ節に本発明のペプチドとHLA−A24抗原との複合体の提示された抗原提示細胞が存在し、そして、この抗原提示細胞を特異的に認識するＣＴＬが誘導された結果に他ならない。このような、HLA−A24抗原と本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体の提示された抗原提示細胞は、以下に述べるような細胞療法（ＤＣ療法）において有効に用いられる。
【００８９】
細胞療法において用いられる抗原提示細胞は、腫瘍患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、この細胞に本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を体外でパルスして、HLA−A24抗原と本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体を細胞表面に提示させることにより作製される。ここで「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を提示可能なHLA−A24抗原を細胞表面に発現している細胞であれば特に限定されないが、抗原提示能が高いとされている樹状細胞が好ましい。
【００９０】
また、前記抗原提示能を有する細胞にパルスされるものとしては、前記のようなペプチドの形態のみならず、本発明の組換えＤＮＡまたはそのＲＮＡの形態であっても、本発明のポリペプチドの形態であっても良い。
【００９１】
本発明の抗原提示細胞は、例えば腫瘍患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、該細胞に本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体、あるいは本発明のポリペプチドを体外でパルスしてHLA−A24抗原と前記ペプチドまたはその誘導体との複合体を作製することにより得られる(Cancer Immunol. Immunother., 46:82, 1998、J. Immunol.,158: p1796,1997、Cancer Res.,59:p1184,1999）。樹状細胞を用いる場合は、例えば、腫瘍患者の末梢血からフィコール法によりリンパ球を分離し、その後非付着細胞を除き、付着細胞をGM-CSFおよびIL-4存在下で培養して樹状細胞を誘導し、当該樹状細胞を本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはポリペプチドと共に培養してパルスすることなどにより、本発明の抗原提示細胞を調製することができる。
【００９２】
また、前記抗原提示能を有する細胞に本発明の組換えＤＮＡを導入することにより本発明の抗原提示細胞を調製する場合は、 Cancer Res.,56:p5672,1996や J. Immunol., 161: p5607,1998などを参考にして行うことができる。また、ＤＮＡのみならずＲＮＡの形態でも同様に抗原提示細胞を調製することができるが、この場合は、J. Exp. Med., 184: p465,1996などを参考にして行うことができる。
【００９３】
本発明は、前記抗原提示細胞を有効成分として含有するＣＴＬの誘導剤（腫瘍の治療剤）をも提供するものである。該治療剤は、抗原提示細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。また投与量は、前記文献記載の投与量が例示される。
【００９４】
前記治療剤を患者の体内に戻すことにより、HLA−A24陽性かつＰＳＡ陽性の患者の体内で効率良く特異的なＣＴＬが誘導され、腫瘍を治療することができる。本発明の抗原提示細胞は、特に前立腺癌の治療に有効である。
【００９５】
本発明はさらに、HLA−A24抗原と本発明の腫瘍抗原ペプチド又はその誘導体との複合体を認識するＣＴＬをも提供する。本発明のＣＴＬは、以下の養子免疫療法において有効に用いられる。
【００９６】
すなわちメラノーマにおいては、患者本人の腫瘍内浸潤Ｔ細胞を体外で大量に培養して、これを患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている（J. Natl. Cancer. Inst., 86: 1159、1994）。またマウスのメラノーマにおいては、脾細胞をイン・ビトロで腫瘍抗原ペプチドＴＲＰ−２で刺激し、腫瘍抗原ペプチドに特異的なＣＴＬを増殖させ、該ＣＴＬをメラノーマ移植マウスに投与することにより、転移抑制が認められている（J. Exp. Med.,185: 453, 1997）。これは、抗原提示細胞のHLA抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識するＣＴＬをイン・ビトロで増殖させた結果に基づくものである。従って、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体、あるいは本発明の組換えＤＮＡやポリペプチドを用いて、イン・ビトロで患者末梢血リンパ球を刺激して腫瘍特異的ＣＴＬを増やした後、このＣＴＬを患者に戻す治療法は有用であると考えられる。
【００９７】
さらに本発明は、本発明のＣＴＬを有効成分として含有する腫瘍の治療剤も提供する。該治療剤は、ＣＴＬを安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。また投与量としては、前記文献記載の投与量が例示される。
【００９８】
前記治療剤を患者の体内に戻すことにより、HLA−A24陽性かつＰＳＡ陽性の患者の体内でＣＴＬによる腫瘍細胞の傷害作用が効率的に促進され、腫瘍細胞を破壊することにより、腫瘍を治療することができる。本発明のＣＴＬは、特に前立腺癌の治療に有効である。
【００９９】
本発明の腫瘍抗原ペプチドおよびその誘導体はまた、腫瘍を診断するための診断薬の有効成分とすることができる。すなわち、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体そのものを診断薬として用い、腫瘍が疑われる患者から得た試料（例えば血液、腫瘍組織など）中の抗体の存在を検出することにより、腫瘍の早期発見、再発、転移を診断することが可能である。また本発明の腫瘍抗原ペプチド等を有効成分とする医薬の適応可能な腫瘍患者の選択にも利用できる。具体的には、イムノブロット法、RIA、ELISA、蛍光または発光測定法などを用いることにより、当該診断を行うことができる。本発明の診断薬は、特に前立腺癌の診断において有効に用いられる。
【０１００】
さらに近年、抗原ペプチドとHLA抗原との複合体を用いて抗原特異的ＣＴＬを検出する新しい検出方法が確立された（Science,274:p94,1996）。本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体とHLA抗原との複合体を前記検出方法に供し、腫瘍抗原特異的ＣＴＬを検出することにより、腫瘍の早期発見、再発、転移を診断することができる。また本発明の腫瘍抗原ペプチド等を有効成分とする医薬の適応可能な腫瘍患者の選択や、当該医薬による治療効果の判定などにも利用できる。すなわち本発明においては、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体を有効成分の一部として含有する、腫瘍の診断薬をも提供するものである。
【０１０１】
具体的には、文献（Science,274:p94,1996）に記載の方法に従って蛍光標識したHLA抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体の４量体を作製し、これを用いて腫瘍が疑われる患者の末梢血リンパ球中の抗原ペプチド特異的ＣＴＬをフローサイトメーターにより定量することにより、前記診断を行うことができる。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【実施例１】
【０１０２】
HLA−A2402ゲノムＤＮＡ断片のクローニング
（１）HLA−A2402ゲノムＤＮＡ断片のクローニング
ヒトHLA−A2402ゲノムＤＮＡをPCRクローニングするため、ヒト腫瘍細胞株RERF-LC-AI細胞（理研細胞バンク RCB0444）を培養し、Genomic Prep Cells and Tissue ＤＮＡ Isolation Kit（Amersham社製）を用い、添付のプロトコールに従い、ヒトゲノムＤＮＡを精製した。次に、キメラHLA遺伝子の構築に必要なHLA−A2402ゲノムＤＮＡ配列についてGenBankデータベースにより調べたところ、Accession番号．Z72422が該当するものであったが、プロモーター領域（270bp）が登録されていないことが判明した。当該トランスジェニックマウスの作製には、プロモーター、エキソン１〜３、およびイントロン１〜３を必要とする。そこで、プロモーターを含むHLA−A2402ゲノムＤＮＡのPCRクローニングにあたり、日本人に多いHLA−A2601のプロモーターのヌクレオチド配列（Accession番号．AB005048）を参考にHLA26−1F（5'-CCC AAG CTT ACT CTC TGG CAC CAA ACT CCA TGG GAT-3’, 36mer、配列番号：4）を上流プライマーとし、またイントロン３に含まれるヌクレオチド配列の一部を改変したもの、すなわちAccession番号．Z72422の5’末より1282番目をGからAに改変したA24−Bgl II 30（5’-CGG GAG ATC TAC AGG CGA TCA GGT AGG CGC-3’, 30mer、配列番号：5）を下流プライマーとして用いた。
【０１０３】
ここで、当該ヌクレオチド改変の理由は以下の通りである。すなわち、トランスジェニックマウスにおいて発現するキメラHLAが、エキソン１から３までをHLA−A2402、エキソン４から８までをH−2Kbによって構成されることを目的としており、このようなキメラHLAを作製するために、HLA−A2402ゲノムＤＮＡ上流よりイントロン３にコードされる制限酵素Bam HI部位までとH−2KbゲノムＤＮＡのイントロン３より下流とを連結するため、HLA−A2402のイントロン３に人為的に制限酵素Bgl II部位を構築する必要があったからである。
【０１０４】
次に、3’→5’のエキソヌクレアーゼ活性の高いNative Pfu ＤＮＡ Polymerase（Stratagene社製）を用い、添付のプロトコールに従い、上記プライマーペアを用いてHLA−A2402ゲノムＤＮＡ断片のPCRクローニングを行った。PCRは95℃45秒で熱処理した後、95℃45秒、66℃１分、および72℃４分を35サイクル繰り返したのち、72℃で10分反応させ、その後４℃に冷却した。増幅遺伝子断片をファージミドベクターpBluescriptの制限酵素Hind IIIおよびBam HI切断部位にライゲーションにより連結して組み換えプラスミドを得た。この組み換えプラスミドを42℃のヒートショック法により大腸菌JM109（東洋紡社製）に導入し、X−GalおよびIPTGを塗布したアンピシリン（50μg/ml）含有LB寒天培地（1%バクトトリプトン、0.5%イーストエキストラクト、1%NaCl、2%寒天）で組み換えプラスミドが導入されている白色の大腸菌コロニーを判別し、形質転換体を選択した。
【０１０５】
（２）HLA−A2402プロモーター領域のヌクレオチド配列の決定
上記で得られた形質転換体の４個について、3mlのアンピシリン含有LB培地にて一晩培養したのち、各形質転換体が包含するプラスミドクローンをアルカリ溶解法（F.M.Ausubelら編、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc.）により精製した。次に、ABI PRISMTM 377ＤＮＡシークエンシングシステム（PEバイオチステムズ社製）によりヌクレオチド配列を解析した。シーケンス解析用サンプルは、ABI PRISMTM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactionキット（PEバイオシステムズ社製）を用いて、添付プロトコールに従い、各クローンのシーケンスを解析した。その結果、すべてのクローンについてプロモーター領域を比較すると完全に一致していたことより、GenBankデータベースに登録されていないHLA−A2402のプロモーター領域のヌクレオチド配列が決定された。また、Accession番号．Z72422のヌクレオチド配列と各クローンを比較したところ、PCR変異はみられない正常な１個のクローンが存在していた。
【実施例２】
【０１０６】
H−2KbゲノムＤＮＡ断片のクローニング
（１）H−2KbゲノムＤＮＡ断片のクローニング
マウス腫瘍細胞株EL4細胞（ATCC T1B−39）を培養してマウスゲノムＤＮＡを精製し、PCRクローニングに用いた。ＤＮＡの精製方法は、長鎖ＤＮＡの増幅に適するTaKaRa LA Taq TM（宝酒造社株式会社製）を用い、添付のプロトコールに従い実施した。次に、キメラHLA遺伝子の構築に必要なH−2Kb遺伝子配列についてGenBankデータベースにより調べたところ、２つに分断されて登録されていた。すなわち、Accession番号．v00746およびv00747である。v00746ではイントロン３の一部迄のH−2Kb上流をコードする1594bp領域が、一方、v00747ではイントロン７の一部迄のH−2Kb下流をコードする1837bp領域が登録されていた。v00746およびv00747により２つに分断されて登録されているイントロン３には制限酵素Bam HI部位が存在していなかったことにより、データベースに登録されているH−2Kb遺伝子は不完全長と推測された。
【０１０７】
H−2Kb遺伝子には相同な偽遺伝子や相同性の高い遺伝子が存在している（Cell., 25:683, 1981）。そこで、当該相同遺伝子と相同性が低く且つv00746のエキソン３にコードされるH−2KB F3（5’-CGC AGG CTC TCA CAC TAT TCA GGT GAT CTC-3’, 30mer、配列番号：6）を上流プライマーとし、また v00747の末端に制限酵素Eco RI部位を付加したH−2KB 3R（5’-CGG AAT TCC GAG TCT CTG ATC TTT AGC CCT GGG GGC TC-3’, 38mer、配列番号：7）を下流プライマーとして、TaKaRa LA Taq TM（宝酒造社株式会社製）を用いて添付のプロトコールに従い、上記精製マウスゲノムＤＮＡを鋳型にPCR反応を実施した。当該PCRは、98℃10秒および66℃4分25サイクル繰り返したのち、68℃で10分反応させ、その後４℃に冷却した。
【０１０８】
増幅遺伝子断片をファージミドベクターpBluescriptの制限酵素Kpn IおよびEco RI切断部位にライゲーションにより連結して組み換えプラスミドを得た。この組み換えプラスミドを42℃のヒートショック法により大腸菌JM109（東洋紡社製）に導入し、X−GalおよびIPTGを塗布したアンピシリン含有LB寒天培地で組み換えプラスミドが導入されている白色の大腸菌コロニーを判別し、形質転換体を選択した。この形質転換体３個を3mlのアンピシリン含有LB培地にて一晩培養したのち、各形質転換体が包含する組み換えプラスミドクローンを精製し、シーケンスを解析した。方法は上記と同様にして行った。３つの当該クローンのヌクレオチド配列とv00747のヌクレオチド配列を比較したところ、２クローンでそれぞれ別々に１ヶ所のPCR変異が、他方１クローンで３ヶ所のPCR変異がみられた。また、３クローン間では共通しているがv00747と異なるヌクレオチドが5ヶ所みられた。これらヌクレオチドはイントロン６と３’非翻訳領域に相当する領域にあった。更に、未登録のイントロン３領域においては、３クローン間で異なるPCR変異したヌクレオチドが1ヶ所みられた。これより、未登録領域のヌクレオチド配列部分を決定することができなかったため、3’→5’のエキソヌクレアーゼ活性の高いポリメラーゼを用いて未登録のイントロン３領域について再度クローニングを行い、ヌクレオチド配列の決定を行った。
【０１０９】
（２）H−2Kbイントロン３のヌクレオチド配列の決定
未登録領域のヌクレオチド配列を決定するため、Native Pfu ＤＮＡ Polymerase（Stratagene社製）を用い、添付のプロトコールに従い、上記精製マウスゲノムＤＮＡを鋳型に未登録のイントロン３を含む領域についてPCRクローニングした。ここでは、v00746に登録されているH−2kb F5（5’-AGG ACT TGG ACT CTG AGA GGC AGG GTC TT-3’, 29mer、配列番号：8）を上流プライマーとして用い、またv00747に登録されているH-2kb 5R（5’-CAT AGT CCC CTC CTT TTC CAC CTG TGA GAA-3’, 30mer、配列番号：9）を下流プライマーとして用いた。PCRは95℃45秒で熱処理した後、95℃45秒、68℃１分、および72℃４分を25サイクル繰り返したのち、72℃で10分反応させ、その後４℃に冷却した。増幅遺伝子断片をファージミドベクターpBluescriptの制限酵素Bam HIおよびBgl II切断部位にライゲーションにより連結して組み換えプラスミドを得た。この組み換えプラスミドを42℃のヒートショック法により大腸菌JM109（東洋紡社製）に導入し、X−GalおよびIPTGを塗布したアンピシリン含有LB寒天培地で組み換えプラスミドが導入されている白色の大腸菌コロニーを判別し、形質転換体を選択した。この形質転換体の５個について3mlのアンピシリン含有LB培地にて一晩培養したのち、各形質転換体が包含するプラスミドクローンを精製し、ヌクレオチド配列を解析した。方法は上記と同様にして行った。その結果、解析したクローン間のイントロン３領域について比較すると、すべてのクローンで完全に一致していた。これよりイントロン３領域のヌクレオチド配列を決定することができた。未登録領域の制限酵素Bam HI部位よりv00747までは、463bpであることも判明した。
【０１１０】
（３）H−2KbゲノムＤＮＡの構築
前記（２）で未登録領域のヌクレオチド配列が決定されたことにより、目的とするキメラHLA遺伝子の構築に必要なH−2KbゲノムＤＮＡの全ヌクレオチド配列が決定された。その結果、前記（１）で得られた2種類のクローン、すなわち5’末端側にPCR変異の無い１つのクローン（H−2Kb#26）、及び3’末端側にPCR変異の無い１つクローン（H−2Kb#20）を組み合わせることにより、目的とするH−2KbゲノムＤＮＡが構築できることが明らかとなった。そこで、これらクローンを制限酵素消化で切断したのち、PCR変異の無いそれぞれの領域を互いに組み合わせることにより、PCR変異の無いH−2KbゲノムＤＮＡを構築した。構築方法の模式図を図１に示す。
【０１１１】
両クローンを制限酵素Bgl II部位およびEco RI部位で切断し、ライゲーションにより連結して組み換えプラスミドを得た。この組み換えプラスミドを42℃のヒートショック法により大腸菌JM109（東洋紡社製）に導入し、X−GalおよびIPTGを塗布したアンピシリン含有LB寒天培地で組み換えプラスミドが導入されている白色の大腸菌コロニーを判別し、形質転換体を選択した。３個の形質転換体を3mlのアンピシリン含有LB培地にて一晩培養したのち、各形質転換体が包含するプラスミドクローンをアルカリ溶解法により精製し、シーケンスを解析した。方法は上記と同様にして行った。その結果、すべての形質転換体がPCR変異の無いH−2KbゲノムＤＮＡをコードするプラスミドを含有することが明らかとなった。
なお、ここで得られたH−2KbゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列は、後述する配列番号：１に記載のヌクレオチド配列の第1551位以降の配列に相当するものである。
【実施例３】
【０１１２】
キメラゲノムＤＮＡ（HLA−A2402/Kb ＤＮＡ）の構築
上記実施例１で得られたHLA−A2402ゲノムＤＮＡを含有するプラスミド（HLA−A2402#1）を制限酵素Bgl II部位で切断し、また上記実施例２で得られたH−2KbのゲノムＤＮＡを含有するプラスミド（H−2Kb#20/26）を制限酵素Bam HI部位で切断し、ライゲーションにより連結して組み換えプラスミドを得た。構築方法の模式図を図２に示す。この組み換えプラスミドを42℃のヒートショック法により大腸菌JM109（東洋紡社製）に導入し、X−GalおよびIPTGを塗布したアンピシリン含有LB寒天培地で組み換えプラスミドが導入されている白色の大腸菌コロニーを判別し、形質転換体を選択した。10個の形質転換体を3mlのアンピシリン含有LB培地にて一晩培養したのち、各形質転換体が包含するプラスミドクローンを精製してシーケンスを解析した。方法は上記と同様にして行った。その結果、３個の形質転換体が目的のキメラ遺伝子（HLA−A2402/Kb ＤＮＡ、単にA2402/Kb ＤＮＡと略することもある）を有するプラスミドを含有することが明らかとなった。構築されたHLA−A2402/Kbのゲノム配列を配列番号：１に記載する。
【実施例４】
【０１１３】
キメラゲノムＤＮＡのスプライシング解析
マウス腫瘍細胞株EL4細胞へ、遺伝子導入装置（島津製作所製）を用い、添付プロトコールに従い、構築したキメラHLA遺伝子（HLA−A2402/Kb遺伝子）をトランスフェクトした。２日後、トランスフェクトしたEL4細胞およびコントロールとして遺伝子導入していないEL4細胞より、ISOGEN（ニッポンジーン社製）を用いて添付のプロトコールに従って、トータルRNAを精製した。次に、スーパースクリプトチョイスシステム（GIBCO BRL社製）を用いて、添付プロトコールに従い、当該RNAの一部を鋳型にOligo(dT)12-18により逆転写反応を行いcＤＮＡを合成した。更に、当該cＤＮＡの一部を鋳型にNative Pfu ＤＮＡ Polymerase（Stratagene社製）を用い、添付のプロトコールに従い、キメラ遺伝子を特異的にPCR増幅した。
このとき、上流プライマーとしてHLA−A2402遺伝子のエキソン１にコードされ且つH−2Kb遺伝子と相同性の低いChimera−F2（5’-CGA ACC CTC GTC CTG CTA CTC TC-3’, 23mer、配列番号：10）を、一方の下流プライマーとしてH−2Kb遺伝子のエキソン８にコードされ且つHLA−A2402遺伝子と相同性が低いChimera-R2（5’-AGC ATA GTC CCC TCC TTT TCC AC-3’, 23mer、配列番号：11）を用い、PCRは95℃45秒を熱処理した後、95℃45秒、53℃１分、および72℃2分を40サイクル繰り返したのち、72℃で10分反応させ、その後４℃に冷却した。
その結果、トランスフェクトしたEL4細胞においてのみ特異的に約1.1kbp遺伝子断片が増幅したことより、導入したキメラゲノムＤＮＡはマウス細胞内で転写されたこと、すなわちHLAプロモーターが機能し、予想した部位でスプライシングされたmRNAが発現していることが予想された。次に、前記PCRの増幅断片をシークエンス解析した結果、予想通りのHLA−A2402/KbをコードするcＤＮＡのヌクレオチド配列が決定された。当該HLA−A2402/KbのcＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号：２に、またそのアミノ酸配列を配列番号：３に記載する。さらに、配列番号：１に記載のHLA−A2402/Kbのゲノム配列と配列番号：２に記載のcＤＮＡ配列とを並列に配して相互の位置関係を、図３Ａ〜図３Ｐに示す。図中、上段は配列番号：1に記載のHLA−A2402/Kb ゲノム配列、下段は配列番号：2に記載のHLA−A2402/Kb cＤＮＡ配列を表している。
図３における配列相互の関係は以下の通りである。
2007289191.tif 000002
【実施例５】
【０１１４】
マイクロインジェクション用ＤＮＡ溶液の製造
構築したキメラHLA遺伝子をコードするプラスミド11μgを制限酵素Hind IIIとEco RI、更にベクターのみを切断する制限酵素Dra Iで消化した。1% SeaKem GTG（ニッポンジーン社製）ゲルで電気泳動したのち、キメラゲノムＤＮＡを含有するゲル片を回収した。その後、Prep-A-Gene purificationキット（バイオ・ラッド社製）を用い、添付プロトコールに従い、導入遺伝子を精製し、1／10 TEバッファー（10mM Tris pH 8、0.1mM EDTA pH 8）に溶解することにより、マイクロインジェクション用ＤＮＡ溶液を製造した。
【実施例６】
【０１１５】
マウス受精卵への導入とトランスジェニックマウスの同定
C57BL／6系統マウス由来の受精卵を対象に構築したキメラ遺伝子のインジェクションを施行した。
C57BL／6系統マウス由来の受精卵を用いた理由は、C57BL／6系統マウスはクラスI分子としてH−2b系統を発現しており、HLA−A2402と同様な結合モチーフを有するH−2Kdを発現していないことによるものである。すなわち、当該C57BL／6系統のトランスジェニックマウスにHLA−A24拘束性の抗原ペプチドを投与しても、内因性のマウスクラスIによって当該ペプチドが細胞表面に提示されず、交差反応が起こらないという利点を有する。
【０１１６】
第１回目のインジェクションでは、81個の受精卵を対象に施行し、４匹のレシピエントマウスに移植したが産出されなかった。第２回目のインジェクションでは、50個の受精卵を対象に施行し、2匹のレシピエントマウスに移植することにより4匹が産出されたが離乳前にすべて死亡した。第３回目のインジェクションでは101個の受精卵を対象に施行し、４匹のレシピエントマウスに移植することにより11匹が産出されたが離乳前にすべて死亡した。
【０１１７】
第４回目のインジェクションでは、168個の受精卵を対象に施行し、6匹のレシピエントマウスに移植することにより22匹が産出され、19匹が離乳した。その中の４匹、すなわち01-4、04-2、05-1、および05-6がトランスジェニックマウスとして同定されたが、01-4は奇形のため交配不可能で、05-6は離乳後まもなく死亡した。第５回目のインジェクションでは、221個の受精卵を対象に施行し、8匹のレシピエントマウスに移植することにより14匹が産出され、6匹が離乳した。その中の3匹、すなわち04-1、04-5、および04-6がトランスジェニックマウスとして同定された。第６回目のインジェクションでは、225個の受精卵を対象に施行し、8匹のレシピエントマウスに移植することにより13匹が産出され、9匹が離乳した。その中の3匹、すなわち10-5、14-1、および15-2がトランスジェニックマウスとして同定された。
【０１１８】
ここでトランスジェニックマウスの同定は、HLA−A2402遺伝子のクローニングで使用したプライマー、すなわちHLA26-1F（配列番号：4）およびA24-Bgl II 30（配列番号：5）を用いて尾ＤＮＡ調整物を鋳型にTaKaRa LA Taq TM（宝酒造社株式会社製）を用い、添付のプロトコールに従ってPCRを行い、1%アガロースゲル電気泳動を行い、1.5kbpの大きさのＤＮＡバンドがみられるマウスを選別することにより行った。
【実施例７】
【０１１９】
トランスジェニックマウスにおける導入遺伝子産物の発現
実施例６で作出された８ライン、すなわち04-2、05-1、04-1、04-5、04-6、10-5、14-1、および15-2由来のトランスジェニックマウスより、J.E.Coliganlら編、CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, John Wiley & Sons, Inc.の記載に従い脾臓を摘出し、脾細胞を回収した。トランスジェニックマウス脾細胞における導入遺伝子由来のタンパク質であるHLA−A2402/Kbの細胞表面発現は、フローサイトメトリー法により解析した。このとき、C57BL／6系統マウスより調整した脾細胞をコントロールとして用いた。具体的には、5×106個の脾細胞をモノクローナルなFITC標識抗HLA抗体B9.12.1（Immunotech社製）で染色した。また、モノクローナルなFITC標識抗H-2Kb抗体AF6-88.5（Pharmingen社製）で内因性のマウスクラスIを染色した。
その結果、５ライン、すなわち04-1、04-5、10-5、14-1、および15-2でHLAクラスI特異的な発現がみられ、このうち04-1ラインのみが、繁殖能を有するラインであることが明らかとなった。一方、他の３ライン、すなわち04-6、04-2、および05-1ラインではHLAクラスI特異的な発現はみられなかった。以上により、８ラインのトランスジェニックマウスが作出されたが、クラスIの発現様式であり且つホモ化を達成したのは04-1ラインのみであった。
【実施例８】
【０１２０】
HLA−A2402を発現する形質転換細胞の樹立
前記で作製されたトランスジェニックマウスにおけるＣＴＬ誘導能の評価のために、HLA−A2402/Kbを安定に発現する形質転換細胞、Jurkat-A2402/Kb細胞を樹立した。
（１）発現ベクターの構築
Tgマウスより脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。ISOGEN（ニッポンジーン社製）を用い、添付のプロトコールに従って、トータルRNAを精製した。次に、スーパースクリプトチョイスシステム（GIBCO BRL社製）を用いて、添付プロトコールに従い、当該RNAの一部を鋳型にOligo(dT)12-18により逆転写反応を行いcＤＮＡを合成した。更に、当該cＤＮＡの一部を鋳型にLA-PCRキット（宝酒造社製）を用い、添付のプロトコールに従った。このとき、上流プライマーとしてchi.PF1（5’-CCC AAG CTT CGC CGA GGA TGG CCG TCA TGG CGC CCC GAA-3’、配列番号：12）を、一方の下流プライマーとしてchi.PR1（5’-CCG GAA TTC TGT CTT CAC GCT AGA GAA TGA GGG TCA TGA AC-3’、配列番号：13）を用いた。PCRは95℃45秒で熱処理した後、95℃45秒、60℃１分、および68℃2分を25サイクル繰り返したのち、72℃で10分反応させ、その後４℃に冷却した。PCR増幅遺伝子を発現ベクターpcＤＮＡ3.1(+)（Invitrogen社製）に導入することにより、HLA−A2402/Kbをコードする発現ベクターを構築した。
【０１２１】
（２）Jurkat細胞への導入
10ugの上記ベクターを制限酵素Pvu Iで消化することにより、直線化した。次に、Jurkat細胞（ATCC T1B-152）5×106個について、遺伝子導入装置（GIBCO BRL社製）を用い、添付プロトコールに従い、構築したキメラHLA遺伝子をトランスフェクトした。96穴プレートに0.5cell/wellで播種し、0.6mg/mlのGeneticin含有培地で培養した。その結果、6穴中（６クローン）にて細胞の増殖が確認された（A-2、A-4、A-6、A-9、A-10、A-11）。これらの中で、A-10において導入遺伝子の発現が最も高かったことより、当クローンをJurkat-A2402/Kb細胞として樹立した。
【実施例９】
【０１２２】
トランスジェニックマウスにおけるＣＴＬ誘導能試験
ヒト癌抗原HER-2/neuは乳癌、卵巣癌、および肺癌で過剰発現していることで知られ、当該抗原由来ペプチドによってHLA−A24陽性健常人末梢血から特異的ＣＴＬを誘導できることが、イン・ビトロ試験により明らかにされている（Int.J.Cancer., 87:553, 2000）。
【０１２３】
そこで、当該ヒト癌抗原由来のHLA−A24拘束性ペプチドHER-2/neu780-788（配列番号：14）を、破傷風毒素由来のマウスMHCクラスIIのI-Ab拘束性ヘルパーペプチド（FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE）と共に当該トランスジェニックマウスに免疫し、ヒトの場合と同様に特異的ＣＴＬを誘導し得るか調べた。すなわち、DMSOによりHER-2/neu780-788を40mg/mlに、またヘルパーペプチドを20mg/mlに調整し、生理食塩水で2mg/ml及び1mg/mlに希釈した。次に、ガラスシリンジを用いて、等量の不完全フロイントアジュバント（和光純薬株式会社製）と混合することによりwater-in-oilエマルションを作製した。200μlの当該薬剤をトランスジェニックマウス（04-1ライン）の尾の皮下に免疫した。実験開始7日後に脾臓を摘出し、スライドガラスのフロスト部分にて擦り破壊し、脾細胞を回収・調製した。ACKバッファー（0.15M NH4Cl,10mM KHCO3,0.1mM EDTA,pH7.2-7.4）にて溶血処理した脾細胞の一部をX線照射（2,000 rad）した後、前記ペプチドを100μg/mlで１時間パルスして0.7×106個／wellで24穴プレートに播種した。このとき、非照射・非ペプチドパルスの7×106個／wellの脾細胞を同時に加えて37℃下で再刺激を施行した（ペプチド終濃度1μg/ml）。培養液には、RPMI1640培地に10%FCS、10mM HEPES、20mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1mM MEM非必須アミノ酸、1%MEMビタミン、55μM 2-メルカプトエタノールを含む培養液（CTM培養液）を10ml用い、6日間イン・ビトロ刺激した。
【０１２４】
他方、実施例８で作製したJurkat-A2402/Kb細胞を 3.7MBq/106個で51Crラベル後、前記ペプチドを100μg/mlで１時間パルスした。（ラベル時間２時間、ラベル開始１時間後にペプチドを終濃度100μg/ml添加）。また、ペプチド非パルスの細胞をコントロール標的細胞として調製した。
【０１２５】
当該Jurkat-A2402/Kbを標的細胞とし、先に調製されたトランスジェニックマウス脾細胞調製物を添加して、ＣＴＬの誘導能を51Crリリースアッセイ(J. Immunol., 159: 4753, 1997）により測定した。結果を図４に示す。結果として、HER-2/neu780-788で刺激することにより、特異的なＣＴＬの誘導が認められた。
さらに、前記HER-2/neu780-788と同様にHLA−A24拘束性癌抗原ペプチドであることが知られているMAGE-3195-203(配列番号：18)、CEA652-660(配列番号：19)、及びCEA268-277（配列番号：20）を用いて、前記と同様のＣＴＬ誘導能試験を行った。結果を図５〜図７に示す。結果として、これら既知のHLA−A24拘束性癌抗原ペプチドで刺激することにより、特異的なＣＴＬの誘導が認められた。
以上の結果から、本発明のHLA−A24トランスジェニックマウスは、HLA−A24拘束性の腫瘍抗原タンパクや腫瘍抗原ペプチドを評価することのできるヒトモデル動物であることが明らかとなった。
【実施例１０】
【０１２６】
癌抗原ＰＳＡ由来ペプチドによるＣＴＬ誘導
本発明のHLA−A24トランスジェニックマウスを用いてHLA−A24拘束性の腫瘍抗原タンパクや腫瘍抗原ペプチドをin vivoで評価できることが明らかとなったため、当該マウスを用いて、腫瘍抗原ペプチドとして未同定のペプチドの評価を行った。実験にはヒト癌抗原ＰＳＡ由来のペプチドを用いた。なおＰＳＡ由来のHLA−A24拘束性腫瘍抗原ペプチド領域に関しては、これまで何ら報告されていない。
【０１２７】
まず、ＰＳＡタンパク質のアミノ酸配列中のヒトHLA−A24結合モチーフ（第２位のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニン又はトリプトファンであり、C末端のアミノ酸がフェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、イソロイシン又はメチオニン）に一致する配列を検索し、9アミノ酸あるいは10アミノ酸よりなる2種の配列（ＰＳＡ152-160:配列番号：15、ＰＳＡ248-257：配列番号：16）を同定した。なお、ＰＳＡ152-160はＰＳＡアミノ酸配列の上の第152-160位、ＰＳＡ248-257は第248-257位の部分に該当するものである。
【０１２８】
ＰＳＡ152-160またはＰＳＡ248-257の腫瘍抗原性について、実施例７で作製した04-1ライン由来HLA−A2402／Kbトランスジェニックマウスを利用することにより解析した。ＰＳＡ152-160またはＰＳＡ248-257を破傷風毒素由来のマウスMHCクラスIIのI-Ab拘束性ヘルパーペプチド（FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE）と共に当該トランスジェニックマウスに免疫し、実施例９と同様の手法によりＣＴＬの誘導能を測定した。図８にＰＳＡ152-160によるＣＴＬ誘導結果を、また図９にＰＳＡ248-257によるＣＴＬ誘導結果を示す。結果として、ＰＳＡ152-160において特異的なＣＴＬの誘導がみられたが、ＰＳＡ248-257では特異的なＣＴＬの誘導はみられなかった。これより、ＰＳＡ152-160はイン・ビボで腫瘍抗原性を有すること、すなわちHLA−A24拘束性の腫瘍抗原ペプチドであることが明らかになった。また、上記の結果は、HLA−A24タイプの結合モチーフを有するペプチドが必ずしもin vivoで免疫原性を有するとは限らず、本発明方法が、活性なペプチドの同定に有用であることを示している。
【０１２９】
配列表フリーテキスト
配列番号：1に記載のヌクレオチド配列の第1位から第1550位までの領域はヒト由来であり、第1551位から第3587位までの領域はマウス由来である。
配列番号：2に記載のヌクレオチド配列の第1位から第618位までの領域はヒト由来であり、第619位から第1119位までの領域はマウス由来である。
配列番号：3に記載のアミノ酸配列の第1位から第206位までの領域はヒト由来であり、第207位から第372位までの領域はマウス由来である。
配列番号：4に記載のヌクレオチド配列はPCRプライマーである。
配列番号：5に記載のヌクレオチド配列はPCRプライマーである。
配列番号：6に記載のヌクレオチド配列はPCRプライマーである。
配列番号：7に記載のヌクレオチド配列はPCRプライマーである。
配列番号：8に記載のヌクレオチド配列はPCRプライマーである。
配列番号：9に記載のヌクレオチド配列はPCRプライマーである。
配列番号：10に記載のヌクレオチド配列はPCRプライマーである。
配列番号：11に記載のヌクレオチド配列はPCRプライマーである。
配列番号：12に記載のヌクレオチド配列はPCRプライマーである。
配列番号：13に記載のヌクレオチド配列はPCRプライマーである。
配列番号：17に記載のアミノ酸配列の第2番目のアミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンであり、第9番目のアミノ酸は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンである。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】本発明のキメラ遺伝子（HLA−A2402/Kb遺伝子）の作製に用いたH-2KbゲノムＤＮＡの構築方法を示す模式図である。
【図２】本発明のキメラ遺伝子であるHLA−A2402/Kb遺伝子の構築方法を示す模式図である。HLA−A2402ゲノムＤＮＡを含有するプラスミド（HLA−A2402#1）を制限酵素Bgl II部位で切断し、これにH-2KbのゲノムＤＮＡを含有するプラスミド（H-2Kb#20/26）を制限酵素Bam HI部位で切断して切り出したBamHIフラグメントをライゲーションにより連結して組み換えプラスミドHLA−A2402/Kbを構築した。なお、non-A2402/Kbは、Bgl II切断プラスミドプラスミド（HLA−A2402#1）に、H-2Kb#20/26のBamHIフラグメントが逆向きに連結されて生じたプラスミドである。
【図３】図３Ａ〜図３Ｐは、配列番号：1に記載のHLA−A2402/Kb ゲノム配列と配列番号：2に記載のHLA−A2402/Kb cＤＮＡ配列の位置関係を示した図である。
【図４】HLA-24拘束性のヒト癌抗原HER−2/neu由来の抗原ペプチド(HER2/neu780-788)で本発明のHLA−A24発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は細胞傷害性活性（% Specific Lysis）を、また横軸は各トランスジェニックマウスの名称を示す。また図中、pep+はペプチドパルスした標的細胞を用いた結果を、pep-はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。実験には、抗原ペプチドHER2/neu780-788で免疫したHLA−A24発現トランスジェニックマウスの脾細胞を該ペプチドでパルスして得たマウス脾細胞調製物を試料として用いた。標的細胞として、本発明のキメラ遺伝子HLA−A2402/Kbによる形質転換細胞Jurkat−A2402/Kb細胞を５１Crで標識し、上記ペプチドでパルスしたもの（pep+）を用いた。また、コントロールとしてペプチド非パルス標的細胞（pep-）を用いた。
【図５】HLA−A24拘束性の癌抗原MAGE−3由来の抗原ペプチド（MAGE−3195-203）で本発明のHLA−A24発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は細胞傷害性活性（% Specific Lysis）を、また横軸は各トランスジェニックマウスの名称を示す。また図中、白棒はペプチドパルスした標的細胞を用いた結果を、黒棒はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。  試料及び標的細胞の調製法は図４に関して記載した方法と同様である。
【図６】HLA−A24拘束性の癌抗原CEA由来の抗原ペプチド（CEA652-660）で本発明のHLA−A24発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は細胞傷害性活性（% Specific Lysis）を、また横軸は各トランスジェニックマウスの名称を示す。また図中、白棒はペプチドパルスした標的細胞を用いた結果を、黒棒はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。  試料及び標的細胞の調製法は図４に関して記載した方法と同様である。
【図７】HLA−A24拘束性の癌抗原CEA由来の抗原ペプチド（CEA268-277）で本発明のHLA−A24発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は細胞傷害性活性（% Specific Lysis）を、また横軸は各トランスジェニックマウスの名称を示す。また図中、白棒はペプチドパルスした標的細胞を用いた結果を、黒棒はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。  試料及び標的細胞の調製法は図４に関して記載した方法と同様である。
【図８】ヒト癌抗原ＰＳＡタンパク質から、ヒトHLA−A24結合モチーフ情報に基づいて得たＰＳＡ由来の抗原ペプチド（ＰＳＡ152-160）で本発明のHLA−A24発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は細胞傷害性活性（% Specific Lysis）を、また横軸は各トランスジェニックマウスの名称を示す。また図中、pep+はペプチドパルスした標的細胞を用いた結果を、pep-はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。  試料及び標的細胞の調製法は図４に関して記載した方法と同様である。
【図９】ヒト癌抗原ＰＳＡタンパク質から、ヒトHLA−A24結合モチーフ情報に基づいて得たＰＳＡ由来の抗原ペプチド（ＰＳＡ248-257）で本発明のHLA−A24発現トランスジェニックマウスを免疫しても特異的ＣＴＬが誘導されなかったことを示したグラフである。図中、縦軸は細胞傷害性活性（% Specific Lysis）を、また横軸は各トランスジェニックマウスの名称を示す。また図中、pep+はペプチドパルスした標的細胞を用いた結果を、pep-はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。  試料及び標的細胞の調製法は図４に関して記載した方法と同様である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【図３Ｍ】
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【図３Ｎ】
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【図３Ｏ】
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【図３Ｐ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年9月18日(2007.9.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのヌクレオチド配列を含有する遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスに被験ペプチドを投与する工程、
（２）前記マウスから脾細胞を回収し、被験ペプチドのみで刺激を行う工程、および
（３）前記脾細胞と標的細胞とを接触させ、当該被験ペプチドに特異的なＣＴＬが誘導されたか否かを測定・評価する工程、
を有することを特徴とする、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の抗原ペプチド特異的なＣＴＬ誘導剤のスクリーニング方法：
（ａ）  配列番号：３に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｂ）  配列番号：２に記載のヌクレオチド配列、
（ｃ）  配列番号：１に記載のヌクレオチド配列、
（ｄ）  前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ当該ＤＮＡの発現産物がHLA−A24拘束性抗原ペプチドと結合してＣＴＬ誘導能を有する、当該ＤＮＡのヌクレオチド配列。
【請求項２】
（１）以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのヌクレオチド配列を含有する遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスに被験ペプチドを投与する工程、
（２）前記マウスから脾細胞を回収し、被験ペプチドのみで刺激を行う工程、および
（３）前記脾細胞と標的細胞とを接触させ、当該被験ペプチドに特異的なＣＴＬが誘導されたか否かを測定・評価する工程、
を有することを特徴とする、腫瘍もしくはウイルス感染症の治療又は予防剤のスクリーニング方法：
（ａ）  配列番号：３に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｂ）  配列番号：２に記載のヌクレオチド配列、
（ｃ）  配列番号：１に記載のヌクレオチド配列、
（ｄ）  前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ当該ＤＮＡの発現産物がHLA−A24拘束性抗原ペプチドと結合してＣＴＬ誘導能を有する、当該ＤＮＡのヌクレオチド配列。
【請求項３】
マウスがＣ５７ＢＬ／６系統のマウスである、請求項１または２に記載のスクリーニング方法。