(57)【要約】  【課題】  各種のアミノ酸を含有する試料を、水溶性の溶離液中で分離して、少量でも簡単、正確に判定のできるアミノ酸定量フロー装置、およびアミノ酸定量方法を提供する。  【解決手段】  種々のアミノ酸を含有した試料を第１の系を流れる溶離液中に注入し、上記溶離液中から酸分離カラムで各々のアミノ酸に分離し、一方、溶媒中に電解質とトロロックスなどのハイドロキノンを入れた共存電解液を一定流量で流している第２の系に作用極と対極と参照極を設け、参照極に対して作用極が一定の電位を示すように作用極と対極の間に電圧を印加しておき、この状態で、前記第１の系の分離カラムで分類されたアミノ酸を含む測定試料を、第２の系の溶液に液混合部にて混合させ、前記作用極と対極と参照極を有する第２の系に流させると、前記測定試料中のアミノ酸濃度に比例した電流値を、アミノ酸濃度測定部にて連続的に測定することができる。  【選択図】    図１
2007205874.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水成分を含有する溶離液を貯めたタンクと、
前記溶離液が流れる流路に、少なくとも１つのポンプと、アミノ酸を含有する試料を前記溶離液中に注入するための試料注入部と、該試料注入部でアミノ酸を含有する試料が注入された前記溶離液中からアミノ酸を分離するための水溶性アミノ酸分離カラムとを有する第１の系と、
３ｍＭ以下のクロマノール骨格を有する水溶性化合物及び電解質が含有された溶液を貯めたタンクと、
前記溶液が流れる流路に、少なくとも１つのポンプを有する第２の系と、
前記第１の系と前記第２の系とを交差させた部分にて、前記第１の系において前記水溶性アミノ酸分離カラムで分離された複数のアミノ酸と、前記第２の系における前記クロマノール骨格を有する水溶性化合物及び電解質を含有する溶液とを混合させる液混合部と、
前記液混合部からの液中に含まれる複数のアミノ酸のアミノ基の濃度を測定するアミノ酸濃度測定部と、を備え、
前記液混合部で混合させた溶液の水性分は、３０％以上６０％以下であり、
前記試料中の複数種類のアミノ酸の濃度を、連続的に測定可能である、
ことを特徴とするアミノ酸定量フロー装置。
【請求項２】
請求項１に記載のアミノ酸定量フロー装置において、
前記水溶性化合物が、トロロックス、
2H-1-Benzopyran-2-carboxylicacid,3,4-dihydro-6-hydroxy-7,8-dimethyl、
2H-1-Benzopyran-2-carboxylic acid,3,4-dihydro-6-hydroxy-5-methyl、
2H-1-Benzopyran-2-acetic acid,3,4-dihydro-6-hydroxy-2-methyl、
のいずれかである、
ことを特徴とするアミノ酸定量フロー装置。
【請求項３】
請求項１または２に記載のアミノ酸定量フロー装置において、
前記液混合部は、主管と、側管とよりなり、前記側管の先端断面積が、前記主管の内部断面積に対して１／３以下である、
ことを特徴とするアミノ酸定量フロー装置。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれかに記載のアミノ酸定量フロー装置において、
前記アミノ酸濃度測定部は、作用極と、対極と、参照極とで構成され、
前記参照極に対して前記作用極が一定の電位となるように前記作用極と前記対極間に電圧を印加したときに、前記作用極に流れる前記水溶性化合物の酸化電流を測定する、
ことを特徴とするアミノ酸定量フロー装置。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれかに記載のアミノ酸定量フロー装置において、
前記アミノ酸分離カラムが、イオン交換カラムである、
ことを特徴とするアミノ酸定量フロー装置。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれかに記載のアミノ酸定量フロー装置において、
前記第１の系および第２の系の、前記溶離液タンクおよび溶液タンクのそれぞれの後に、該各系の各流路の空気抜きを行うデガッサーを備えた、
ことを特徴とするアミノ酸定量フロー装置。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれかに記載のアミノ酸定量フロー装置において、
前記アミノ酸分離カラムの溶離液の流量が、０．４ｍｌ／分〜１.３ｍｌ／分である、
ことを特徴とするアミノ酸定量フロー装置。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれかに記載のアミノ酸定量フロー装置において、
前記溶液の流量が、０．７ｍｌ／分〜１．３ｍｌ／分である、
ことを特徴とするアミノ酸定量フロー装置。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれかに記載のアミノ酸定量フロー装置において、
前記溶離液が、０．１ｍＭ〜１０ｍＭのリン酸またはクエン酸を含有した水溶液である、
ことを特徴とするアミノ酸定量フロー装置。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれかに記載のアミノ酸定量フロー装置において、
前記溶液が、３ｍＭ〜６ｍＭのクロマノール骨格を有する水溶性化合物と、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの過塩素酸リチウム、塩化リチウム、硝酸ナトリウムのいずれかとを含有した溶液である、
ことを特徴とするアミノ酸定量フロー装置。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれかに記載のアミノ酸定量フロー装置において、
前記アミノ酸濃度測定部のアミノ酸濃度測定感度が、２ｍＭ以下まで測定できるものである、
ことを特徴とするアミノ酸定量フロー装置。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれかに記載のアミノ酸定量フロー装置において、
前記液混合部と、前記アミノ酸濃度測定部との間隔が、２０ｍｍ〜８０ｍｍである、
ことを特徴とするアミノ酸定量フロー装置。
【請求項１３】
一定の流量に保たれた溶離液をアミノ酸分離カラムへ流す第１の系に、アミノ酸を含む測定試料を試料注入部より注入し、前記測定試料中のアミノ酸を前記アミノ酸分離カラムにより分離せしめるステップと、
一定流量に保たれたクロマノール骨格を有する水溶性化合物と電解質を含有した溶液を、第２の系において流すステップと、
前記第１の系と前記第２の系が交差する部分の液混合部にて、前記溶離液と、前記溶液とを混合させて、その水性分が３０％以上６０％以下である溶液を得るステップと、
前記液混合部で混合させた液中に含まれる、前記アミノ酸分離カラムで分離されたアミノ酸のアミノ酸濃度を、作用極と対極と参照極を有する測定部で測定するステップとを含む、
ことを特徴とするアミノ酸定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、両性イオン物質であるアミノ酸の濃度を測定できるアミノ酸定量フロー装置、およびアミノ酸定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品製剤原料としてのアミノ酸の品質を管理して、薬の有効性と安全性を確保するためには、薬局方の規格に従って試験が行なわれるが、なかでも定量は重要な項目である。
【０００３】
その医薬品の定量法では、多くの場合、酢酸あるいはその混合溶媒中にて、過塩素酸標準液を用いて行なわれる非水滴定が採用されている。中でも氷酢酸中で最も強い酸性を示す過塩素酸溶液を標準液として滴定することが広く行われている。
【０００４】
例として、日本薬局方の中からＬ−ロイシンの中和滴定方法を説明する。
Ｌ−ロイシンの中和滴定方法は、Ｌ−ロイシンを乾燥し、その約０．２５ｇを精密に量り、蟻酸３ｍＬに溶かし、氷酢酸５０ｍＬを加え、０．１ｍｏｌ／Ｌ過塩素酸で滴定する（指示薬：α−ナフトールベンゼイン試液０．５ｍＬ）。但し、滴定の終点は、液の橙が黄緑色を経て、緑色に変わるときとする。また、同様の方法で空試験を行い、補正する。この方法では、氷酢酸の異臭によりドラフト内での測定が余儀なくされること、溶液や試料を多量に必要とすること、廃液は多量の水で希釈して廃棄しなければならないことなど、多くの点で不都合であるとともに、手間と時間を費やすこととなる。また、測定対象物の吸光特性を利用した吸光検出ＨＰＬＣ、あるいは蛍光検出ＨＰＬＣを用いて測定を行うことが可能であるが、吸光特性や蛍光特性を持たないアミノ酸濃度を測定するためには、検出のために誘導体化などを行うことが必要となるため、測定精度の劣化や操作の煩雑性を生じる、等の問題があった。
【０００５】
このような問題を解決する方法、および装置として、本件発明者らは、電気化学的に塩基度濃度を測定する塩基物質定量装置（特開２００１−２４２１４３号公報）を提供している。
【０００６】
これは、ハイドロキノンまたはハイドロキノン誘導体と、有機溶媒と、電解質及び塩基を含有する被測定試料とを混合した共存電解液を収容する容器に、作用電極と対極と比較電極を浸漬し、比較電極と作用電極間の電圧差を所定の電位範囲内で一定に変化させてその際に得られる作用電極と対極に流れるハイドロキノンの酸化電流プレピーク値から塩基物質濃度を測定するというものである。
【０００７】
しかしながら、このときのハイドロキノンまたはハイドロキノン誘導体は、水に溶けづらく、５wt％以下の水溶液にしか溶解しない。よって、液混合部で混合する前の溶離液の水比率を更に少なくできない場合には、高精度の分離を行うことはできなくなる。
【０００８】
通常、アミノ酸の分離には、水溶性の溶離液を用いてイオン交換カラムによる分離を行うのが適している。しかしこの場合、分離した後のアミノ酸を検出することは困難であり、そこで誘導体化法などを用いてアミノ酸を前処理して、該アミノ酸を分離した後の検出を行う方法が用いられている。従って、各種のアミノ酸をＨＰＬＣで分離するときには、溶離液を水溶性にしてアミノ酸を分解し、その後各種のアミノ酸毎に分取し、その溶液を乾燥させる、などの前処理を行うことにより、前述した装置でのアミノ酸の濃度の測定を行うことができる。
【０００９】
また、アミノ酸分析の方法論と、その基本原理として、第十四改正日本薬局方の参考情報に記載されている中には、事前にアミノ酸を誘導体化しておくポストカラム蛍光検出法や、ＨＰＬＣでの分離後にオンラインで誘導体化するプレカラム誘導体化法が挙げられている。
【特許文献１】特開２００１−２４２１４３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以上説明したように、従来日本薬局方の非水系溶媒によるアミノ酸の中和滴定法の測定では、溶媒として氷酢酸あるいは氷酢酸に蟻酸を加えたもの、無水酢酸、ニトロベンゼン、ジオキサン、塩酸エタノール、加熱エタノール留去無水酢酸、あるいはこれらのいずれかを使用する場合があったが、これらの方法では強烈な酢酸等の臭気のために専用のドラフト、すなわち大規模な排気設備を設けることが必要であった。
【００１１】
また、滴定するための滴定装置が必要なことは当然として、同時に滴定装置以外の排気設備等の準備も十分に行っていないと排気を行ってもその能力が足りず、周囲に臭気で迷惑をかけてしまうことになる。以上のような理由から、日本の実験室の環境では非常に困りながら測定をしているという状況であった。
【００１２】
さらに、現在環境汚染防止のために法的にも規制があり、溶媒である氷酢酸は水で薄めて廃棄しなければならない。測定試料も１回の測定に付き１２０ｍＬと大量に必要であるから、食酢程度に薄める場合でも１回の測定の量で４Ｌの水が必要であり、臭気があることの外に水溶液の消費が多くなり、無駄を省く点からも新規な測定方法の開発が望まれていた。
【００１３】
さらに根本的な問題として測定のために本来測定試料が相当量必要であるから、少量の試料の場合には測定できないという問題もあった。また、前記第十四改正日本薬局方の参考情報に記載されたポストカラム蛍光検出法やプレカラム誘導体化法では、誘導体化する際に試料の拡散が生じピークがブロードになるため、ＨＰＬＣによる分離が良く行われていないと隣の分離物と重なるなどの問題もあった。
【００１４】
その上、前記問題を解決した塩基物定量装置は、複数のアミノ酸を含有する溶液からＨＰＬＣで各アミノ酸を分離した溶液が水溶性である場合には、電気化学的に測定する溶液が非水性であるため、乾燥させるなどの前処理が必要となり、手間がかかるものであった。
【００１５】
そこで、本発明はこのような従来の問題点を解決するためになされたもので、中和滴定法を用いることなく、少量の試料にてコンパクトかつ簡単に操作でき、精度の高い、複数のアミノ酸の濃度の測定を行うことができ、更に測定後の後処理も簡単に行うことができるアミノ酸定量フロー装置、及びアミノ酸定量方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記課題を解決するために、本発明の請求項１にかかるアミノ酸定量フロー装置は、水成分を含有する溶離液を貯めたタンクと、前記溶離液が流れる流路に、少なくとも１つのポンプと、アミノ酸を含有する試料を前記溶離液中に注入するための試料注入部と、該試料注入部でアミノ酸を含有する試料が注入された前記溶離液中からアミノ酸を分離するための水溶性アミノ酸分離カラムとを有する第１の系と、３ｍＭ以下のクロマノール骨格を有する水溶性化合物、及び電解質が含有された溶液を貯めたタンクと、前記溶液が流れる流路に、少なくとも１つのポンプを有する第２の系と、前記第１の系と前記第２の系とを交差させた部分にて、前記第１の系において前記水溶性アミノ酸分離カラムで分離された複数のアミノ酸と、前記第２の系における前記クロマノール骨格を有する水溶性化合物及び電解質を含有する溶液とを混合させる液混合部と、前記液混合部からの液中に含まれる複数のアミノ酸のアミノ基の濃度を測定するアミノ酸濃度測定部と、を備え、前記液混合部で混合させた溶液の水性分は、３０％以上６０％以下であり、前記試料中の複数種類のアミノ酸の濃度を、連続的に測定可能である、ことを特徴とする。
【００１７】
本発明の請求項２にかかるアミノ酸定量フロー装置は、請求項１に記載のアミノ酸定量フロー装置において、前記水溶性化合物が、トロロックス、2H-1-Benzopyran-2-carboxylicacid,3,4-dihydro-6-hydroxy-7,8-dimethyl、2H-1-Benzopyran-2-carboxylic acid,3,4-dihydro-6-hydroxy-5-methyl、2H-1-Benzopyran-2-acetic acid,3,4-dihydro-6-hydroxy-2-methyl、のいずれかである、ことを特徴とする。
【００１８】
本発明の請求項３にかかるアミノ酸定量フロー装置は、請求項１または２に記載のアミノ酸定量フロー装置において、前記液混合部は、主管と、側管とよりなり、前記側管の先端断面積が、前記主管の内部断面積に対して１／３以下である、ことを特徴とする。
【００１９】
本発明の請求項４にかかるアミノ酸定量フロー装置は、請求項１ないし３のいずれかに記載のアミノ酸定量フロー装置において、前記アミノ酸濃度測定部は、作用極と、対極と、参照極とで構成され、前記参照極に対して前記作用極が一定の電位となるように前記作用極と前記対極間に電圧を印加したときに、前記作用極に流れる前記水溶性化合物の酸化電流を測定する、ことを特徴とする。
【００２０】
本発明の請求項５にかかるアミノ酸定量フロー装置は、請求項１ないし４のいずれかに記載のアミノ酸定量フロー装置において、前記アミノ酸分離カラムが、イオン交換カラムである、ことを特徴とする。
【００２１】
本発明の請求項６にかかるアミノ酸定量フロー装置は、請求項１ないし５のいずれかに記載のアミノ酸定量フロー装置において、前記第１の系および第２の系の、前記溶離液タンクおよび溶液タンクのそれぞれの後に、該各系の各流路の空気抜きを行うデガッサーを備えた、ことを特徴とする。
【００２２】
本発明の請求項７にかかるアミノ酸定量フロー装置は、請求項１ないし６のいずれかに記載のアミノ酸定量フロー装置において、前記アミノ酸分離カラムの溶離液の流量が、０．４ｍｌ／分〜１.３ｍｌ／分である、ことを特徴とする。
【００２３】
本発明の請求項８にかかるアミノ酸定量フロー装置は、請求項１ないし７のいずれかに記載のアミノ酸定量フロー装置において、前記溶液の流量が、０．７ｍｌ／分〜１．３ｍｌ／分である、ことを特徴とする。
【００２４】
本発明の請求項９にかかるアミノ酸定量フロー装置は、請求項１ないし８のいずれかに記載のアミノ酸定量フロー装置において、前記溶離液が、０．１ｍＭ〜１０ｍＭのリン酸またはクエン酸を含有した水溶液である、ことを特徴とする。
【００２５】
本発明の請求項１０にかかるアミノ酸定量フロー装置は、請求項１ないし９のいずれかに記載のアミノ酸定量フロー装置において、前記溶液が、３ｍＭ〜６ｍＭのクロマノール骨格を有する水溶性化合物と、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの過塩素酸リチウム、塩化リチウム、硝酸ナトリウムのいずれかとを含有した溶液である、ことを特徴とする。
【００２６】
本発明の請求項１１にかかるアミノ酸定量フロー装置は、請求項１ないし１０のいずれかに記載のアミノ酸定量フロー装置において、前記アミノ酸濃度測定部のアミノ酸濃度測定感度が、２ｍＭ以下まで測定できるものである、ことを特徴とする。
【００２７】
本発明の請求項１２にかかるアミノ酸定量フロー装置は、請求項１ないし１１のいずれかに記載のアミノ酸定量フロー装置において、前記液混合部と、前記アミノ酸濃度測定部との間隔が、２０ｍｍ〜８０ｍｍである、ことを特徴とする。
【００２８】
本発明の請求項１３にかかるアミノ酸定量方法は、一定の流量に保たれた溶離液をアミノ酸分離カラムへ流す第１の系に、アミノ酸を含む測定試料を試料注入部より注入し、前記測定試料中のアミノ酸を前記アミノ酸分離カラムにより分離せしめるステップと、一定流量に保たれたクロマノール骨格を有する水溶性化合物と電解質を含有した溶液を、第２の系において流すステップと、前記第１の系と前記第２の系が交差する部分の液混合部にて、前記溶離液と、前記溶液とを混合させて、その水性分が３０％以上６０％以下である溶液を得るステップと、前記液混合部で混合させた液中に含まれる、前記アミノ酸分離カラムで分離されたアミノ酸のアミノ酸濃度を、作用極と対極と参照極を有する測定部で測定するステップとを含む、ことを特徴とする。
【００２９】
これにより、水溶性の溶離液を使用してＨＰＬＣで分離したアミノ酸の濃度を、後処理なしで電気化学的に測定することが可能となる。
【発明の効果】
【００３０】
以上のような本発明によれば、以下のような効果が得られる。
請求項１にかかるアミノ酸定量フロー装置によれば、水溶性の溶離液で種々のアミノ酸濃度を測定することが可能である。
【００３１】
請求項２にかかるアミノ酸定量フロー装置によれば、水溶性化合物がトロロックスなどの水溶性の物質であり、アミノ酸の測定を電気化学的に測定可能となる。
【００３２】
請求項３にかかるアミノ酸定量フロー装置によれば、主管の溶液中に側管の試料がばらつき無く拡散することが可能となる。
【００３３】
請求項４にかかるアミノ酸定量フロー装置によれば、ボルタンメトリーで正確に測定することが可能となる。
【００３４】
請求項５にかかるアミノ酸定量フロー装置によれば、試料中の種々のアミノ酸濃度を分離することを容易に行うことができる。
【００３５】
請求項６にかかるアミノ酸定量フロー装置によれば、溶液中にノイズの原因となる溶存酸素や、気泡を除去することができる。
【００３６】
請求項７にかかるアミノ酸定量フロー装置によれば、種々のアミノ酸を効率よく分離することができる。
【００３７】
請求項８にかかるアミノ酸定量フロー装置によれば、試料中のアミノ酸濃度を正確に測定することができる。
【００３８】
請求項９にかかるアミノ酸定量フロー装置によれば、試料中の種々のアミノ酸を分離することができる。
【００３９】
請求項１０にかかるアミノ酸定量フロー装置によれば、試料中のアミノ酸濃度を正確に測定することができる。
【００４０】
請求項１１にかかるアミノ酸定量フロー装置によれば、幅広い範囲での測定が可能である。
【００４１】
請求項１２にかかるアミノ酸定量フロー装置によれば、ノイズが発生せず、ピークがブロードにならない測定が可能である。
【００４２】
請求項１３にかかるアミノ酸定量方法によれば、種々のアミノ酸濃度を前処理することなく測定することで、測定時間が短く、更に正確な測定を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
以下、本発明の実施の形態１によるアミノ酸定量フロー装置について、詳細に説明する。
（実施の形態１）
本発明の実施の形態１によるアミノ酸定量フロー装置は、水成分を含有する溶離液を貯めたタンクと、前記溶離液が流れる流路に、少なくとも、１つのポンプと、アミノ酸を含有する試料を前記溶離液中に注入するための試料注入部と、該試料注入部でアミノ酸を含有する試料が注入された前記溶離液中からアミノ酸を分離するための水溶性アミノ酸分離カラムとを有する第１の系と、３ｍＭ以下のクロマノール骨格を有する水溶性化合物、及び電解質が含有された溶液を貯めたタンクと、前記溶液が流れる流路に、少なくとも、１つのポンプを有する第２の系と、前記第１の系と、前記第２の系とを交差させた部分にて、前記第１の系において前記水溶性アミノ酸分離カラムで分離された複数のアミノ酸と、前記第２の系における、前記クロマノール骨格を有する水溶性化合物及び電解質を含有する溶液とを混合させる液混合部と、前記液混合部からの液中に含まれる複数のアミノ酸のアミノ基の濃度を測定するアミノ酸濃度測定部と、を備え、前記液混合部で混合させた溶液の水性分は、３０％以上６０％以下とし、前記試料中の複数種類のアミノ酸の濃度を、連続的に測定可能である、ものとしたものである。
【００４４】
以下、本発明の実施の形態１について、図面を参照しながら説明する。
図１は本発明の実施の形態１によるアミノ酸定量フロー装置の外観図、図２は本実施の形態１のアミノ酸定量フロー装置の概略図、図３は本実施の形態１のアミノ酸定量フロー装置の液混合部の断面図、図４は本実施の形態１のアミノ酸定量フロー装置の電極詳細図である。
【００４５】
図１において、１は装置を内部に納めている筐体、２は分離カラムを交換するためのドア、３は測定過程および測定結果を表示するディスプレイ、４は測定試料を注入するための注入部、５は各種操作を行うための操作ボタン、６はトグルスイッチ、７は測定中に溜まった廃液を廃棄するための廃棄ドアである。
【００４６】
また、図２において、８は電気化学的にアミノ酸濃度測定を行うための、目的とする溶液の、溶液タンクである。溶媒は、メタノール、エタノール、プロパノールの単独または２〜３種混合系、アセトニトリルとメタノール、エタノール、プロパノールの２〜４種混合系のものであり、電解質としては、過塩素酸リチウム、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、過塩素酸テトラメチルアンモニウム、過塩素酸テトラエチルアンモニウム、であり、ハイドロキノンは、３ｍＭ以下のクロマノール骨格を有する水溶性化合物であるトロロックス、2H-1-Benzopyran-2-carboxylicacid,3,4-dihydro-6-hydroxy-7,8-dimethyl、2H-1-Benzopyran-2-carboxylic acid,3,4-dihydro-6-hydroxy-5-methyl、2H-1-Benzopyran-2-acetic acid,3,4-dihydro-6-hydroxy-2-methyl、を含有している。
【００４７】
例えば、前記溶液は、３ｍＭ〜６ｍＭのクロマノール骨格を有する水溶性化合物と、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの過塩素酸リチウム、塩化リチウム、硝酸ナトリウムのいずれかとを含有した溶液である。
【００４８】
また、９は酸分離を行うための溶離液を溜めておくための溶離液タンクであり、溶離液としては、イオン交換型の場合は、リン酸やクエン酸の水溶液が良く、逆相カラムの場合は、水とメタノール、エタノール、アセトニトリル、プロパノールの２〜４種混合系、イオン交換カラムの場合は、過塩素酸水溶液、リン酸、塩酸、ベンゼンスルホン酸が良い。
【００４９】
また、１０は溶液と溶離液中の気泡や溶存酸素を除去するためのデガッサー、１１は溶液を送液するポンプＡ、１２は溶離液を送液するポンプＢ、であり、上記ポンプＡ１１およびポンプＢ１２は、ＪＩＳ  Ｋ０１２４  高速液体クロマトグラフ分析通則４.２分離部（２）ポンプで規定されるポンプが望ましい。
【００５０】
また、１３は試料を溶離液中に注入するための試料注入部、１４は試料注入部１３で注入された試料中の各種アミノ酸を分離する分離カラムであり、アミノ酸分離カラムとしては、ＯＤＳなどの逆相カラムと、イオン交換カラムがあるが、精度を得るためには、イオン交換型カラムの方が望ましい。
【００５１】
また、１５は酸分離カラム１４より出てきた溶離液と、ポンプＢ１１で送液された溶液とを混合する液混合部であり、その詳細は図３に示す。液混合部１５は、主管２１と、側管２２とよりなり、前記側管２２の先端断面積が、前記主管２１の内部断面積に対して１／３以下である。
【００５２】
１６は分離されたアミノ酸の濃度を測定するアミノ酸濃度測定部であり、その詳細は図４に示す。
【００５３】
１７は測定後の溶液と溶離液を貯蔵する廃液槽、１８はこの装置の電源を供給する電源ボックス、１９はこの装置を制御する制御基板、２０は種々のアミノ酸の濃度に対する酸化電流値を表示するディスプレイである。
【００５４】
液混合部の詳細を示す図３において、２１は溶液が流れる主管、２２は分離されたアミノ酸を含む溶離液が流れる側管、２３は側管２２の側管先端部、である。
【００５５】
アミノ酸濃度測定部の詳細を示す図４において、２４は溶液中のハイドロキノンを酸化するための作用極、２５は溶液の電位を参照する参照極、２６は作用極からの電流が流れ込み、作用極との間に電圧を印加するための対極、２７は溶液の通路を確保するためのスペーサ、２８は電極中を流れていく溶液である。
【００５６】
次に、本実施の形態１のアミノ酸定量フロー装置の測定動作について説明する。
図２において、まず、各種のアミノ酸を含有する試料を、試料注入部４より注入する。溶離液は、溶離液タンク９からデガッサー１０を通って、ポンプＡ１２によって、流量０．６ｍｌ／分で、アミノ酸分離カラム１４を通過し、液混合部１５まで到達する。従って、アミノ酸分離カラム１４の前で注入された試料は、溶離液に混入し、アミノ酸分離カラム１４で、種々のアミノ酸に分離される。溶離液としては０．１ｍＭのリン酸水溶液を使用し、アミノ酸分離カラムは、イオン交換型で、昭和電工株式会社製のイオン交換カラムShodex RSpak NN-814を使用する。なお、アミノ酸分離カラムの溶離液の流量が、０．４ｍｌ／分〜１.３ｍｌ／分であるものとする。
【００５７】
また、溶液は、溶液タンク８から、デガッサー１０を通って、ポンプＢ１１によって流量１ｍｌ／分で、液混合部１５まで供給される。液混合部１５で、溶離液は、溶液に混入される。なお、溶液の流量が、０．７ｍｌ／分〜１．３ｍｌ／分であるものとする。また、液混合部１５で混合させた溶液の水成分は、３０％以上６０％以下である。
【００５８】
このとき、本実施の形態１の装置では、ポストカラム誘導体化法で移動相３４と誘導体化試薬３５を混合した後ミキシングデバイス３７で十分な混合を行った後、反応コイルで移動相３４と誘導体化試薬３５を反応させる場合のように、溶離液を溶液に混入後、溶離液と溶液を反応させるものではないので、図５に示したような、反応のためのミキシングデバイス３７や、加熱恒温槽は必要ではないが、液混合部１５で混合された液は、次に、アミノ酸濃度測定部１６を通過する。
【００５９】
図４に、アミノ酸濃度測定部１６の電極部断面図を示す。
スペーサ２７によって形成された流路を、混合された溶液が、図４の矢印の方向に流れていく。作用極２４は、グラッシーカーボン、参照極２５は、飽和カロメロ電極（以降ＳＣＥと呼ぶ）よりなり、対極２６は流路を囲むように形成されており、材料はステンレスを用いる。アミノ酸濃度測定部１６では、参照極２５に対して作用極２４の電位が−０．５３Ｖになるように、作用極２４と対極２６の間に電圧を印加している。
【００６０】
よって、種々のアミノ酸を含む溶液が、アミノ酸濃度測定部１６を通過すると、アミノ酸の濃度に比例する酸化電流が得られる。
【００６１】
しかしながら、溶離液が溶液にうまく混合せずに乱流の状態になると、アミノ酸濃度測定部１６の作用極２４の表面に形成される電気二重層が乱れてしまうため、測定時にノイズが発生してしまう。
【００６２】
また、混合がうまくいっても、アミノ酸濃度の検出までに時間がたってしまうと、アミノ酸濃度測定時に得られるピークがブロードになる。
【００６３】
このため、ノイズが発生せず、かつ、ピークがブロードにならない条件として、液混合部１５と、アミノ酸濃度測定部１６との間の間隔は、２０ｍｍ〜８０ｍｍぐらいが適当であるが、５０ｍｍぐらいにするのが望ましい。なお、アミノ酸濃度測定部１６のアミノ酸濃度測定感度は、２ｍＭ以下まで測定できるものである。
【００６４】
更に、うまく溶離液を溶液に混入する方法を行うための液混合部１５における動作を説明する。
図３で示すように、溶液が流れる主管２１の一部に、溶離液が流れる側管２２を突き刺して、側管２２の側管先端部２３を、主管２１の中央の位置に位置するよう位置決めする。
【００６５】
側管先端部２３は、主管２１に流れる溶液の方向に対して、平行になるようにする。
主管内の溶液の流れで、側管先端部２３の出口部分の圧力は低圧になり、側管内を通過してきた溶離液は、側管の出口で圧力が開放されてしまうため、図３に示すように、溶離液は側管出口で霧状に拡散して溶液に混入していくこととなり、作用極２４の表面にできるだけ乱流を発生させずに、溶離液を溶液に混入することができるようになる。
【００６６】
このような状態で溶液中のアミノ酸濃度を測定すると、ブロードにならないピーク波形を得ることができる。
【００６７】
ここで、各種アミノ酸の濃度を相互に比較する場合には、ノイズ成分が上記のように一定になることにより、上記各種アミノ酸の濃度は、見かけ上、ノイズが影響無い状態になる。
【００６８】
図６に、アミノ酸濃度を測定したグラフを示す。図６において、横軸は試料を注入してからの保持時間、縦軸はアミノ酸濃度測定部で測定したトロロックスの酸化電流値を示す。Ｌ−ロイシンなどの各種アミノ酸を含有した標準液を予め作成しておいて、本実施の形態１の装置でアミノ酸濃度を測定して試料を注入してからの保持時間における各種アミノ酸のピーク発生位置を確認しておけば、試料を測定したときに、各種のアミノ酸の種類を限定することができる。
【００６９】
以上のように、本実施の形態１によるアミノ酸定量フロー装置によれば、水成分を含有する溶離液が流れる流路に、少なくとも１つのポンプと、試料注入部と、水溶性アミノ酸分離カラムとを有する第１の系と、３ｍＭ以下のクロマノール骨格を有する水溶性化合物、及び電解質が含有された溶液が流れる流路に、少なくとも１つのポンプを有する第２の系と、前記第１の系と前記第２の系とを交差させた部分にて、前記第１の系において前記水溶性アミノ酸分離カラムで分離された複数のアミノ酸と、前記第２の系における前記クロマノール骨格を有する水溶性化合物及び電解質を含有する溶液とを混合させ、前記液混合部からの液中に含まれる複数のアミノ酸のアミノ基の濃度を測定するアミノ酸濃度測定部を備えるようにしたので、水溶性の溶離液を使用してＨＰＬＣで分離したアミノ酸の濃度を後処理なしで電気化学的に測定することが可能となり、さらに、第２の系における液は、水溶性のハイドロキノンであるため、アミノ酸を分離する溶離液に水溶性の溶媒を使用でき、更に、各種アミノ酸を含有した試料を、注入部より注入することにより、簡単に種々のアミノ酸の濃度を測定することができるものが得られる。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明によるアミノ酸定量フロー装置は、第２の系の液に水溶性のハイドロキノンを用いているためアミノ酸を分離する溶離液に水溶性の溶媒を使用でき、更に各種アミノ酸を含有した試料を注入部より注入することにより、簡単に種々のアミノ酸の濃度を測定でき、アミノ酸の定量において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】本発明の実施の形態１によるアミノ酸定量フロー装置の外観図
【図２】本発明の実施の形態１によるアミノ酸定量フロー装置の概略図
【図３】本発明の実施の形態１によるアミノ酸定量フロー装置の液混合部の断面図
【図４】本発明の実施の形態１によるアミノ酸定量フロー装置の電極詳細図である。
【図５】従来の高速液体クロマトグラフにおけるポストカラム誘導体化法を示した図である。
【図６】本発明の実施の形態１によるアミノ酸定量フロー装置において、便中のアミノ酸濃度量を酸測定部で測定した場合の、試料を注入してからの保持時間と還元電流との相関を示す図である。
【符号の説明】
【００７２】
１    筐体
２    ドア
３    ディスプレイ
４    注入部
５    操作ボタン
６    トグルスイッチ
７    廃棄ドア
８    溶液タンク
９    溶離液タンク
１０  デガッサー
１１  ポンプＡ
１２  ポンプＢ
１３  試料注入部
１４  酸分離カラム
１５  液混合部
１６  アミノ酸濃度測定部
１７  廃液タンク
１８  電源ボックス
１９  制御基板
２０  ディスプレイ
２１  主管
２２  側管
２３  側管先端部
２４  作用極
２５  参照極
２６  対極
２７  スペーサ
２８  溶液
３４  移動相
３５  誘導体化試薬
３６  分離カラム
３７  ミキシングデバイス
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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