(57)【要約】【課題】  ポリペプチドの製造方法を提供する。【解決手段】  ポリペプチドの製造方法であって、下記のステップを含む方法：  細菌を低温ショック応答を引き出す環境又は増殖条件にさらし；  ｃｓｐＡ、ｃｓｐＢ、及びｃｓｄＡからなる低温ショックタンパク質の群から選択されるｍＲＮＡの５’非翻訳領域、開始コドン、開始コドンと重複する下流ボックスヌクレオチド配列及び前記下流ボックスの３’側に異種遺伝子由来のポリペプチドをコードする配列を含むｍＲＮＡを前記の細菌中で過剰発現させ、ただし前記下流ボックスの配列は配列５′−ＡＣＵＵＵＧＵＧＡＵＵＣＡＵ−３′で表される細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡのアンチ下流ボックスに対して相補的であり；  前記ｍＲＮＡを前記アンチ下流ボックスにアニールさせ、それによって１６Ｓ  ｒＲＮＡに結合させて他の細菌ｍＲＮＡの翻訳を阻害し；および  前記ポリペプチドを細菌中に高レベルに蓄積させる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃｓｐＡ、ｃｓｐＢ、及びｃｓｄＡからなる低温ショックタンパク質の群から選択されるｍＲＮＡの５’非翻訳領域、開始コドン、開始コドンと重複する下流ボックスヌクレオチド配列及び前記下流ボックスの３’側に異種遺伝子由来のポリペプチドをコードする配列を含むＲＮＡ構築物であって、前記下流ボックスの配列は配列５′−ＡＣＵＵＵＧＵＧＡＵＵＣＡＵ−３′で表される細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡのアンチ下流ボックスに対して相補的であるＲＮＡ構築物。
【請求項２】
開始コドンがＡＵＧ，ＧＵＧ，及びＵＵＧからなる群から選択される請求項１のＲＮＡ構築物。
【請求項３】
下流ボックスが６〜２０ヌクレオチドの長さである請求項１のＲＮＡ構築物。
【請求項４】
下流ボックスが８〜１４ヌクレオチドの長さである請求項１のＲＮＡ構築物。
【請求項５】
下流ボックスがＡＵＧＡＣＵＧＧＵＡＵＣＧＵ，ＡＵＧＡＣＵＧＧＵＵＵＣＧＵ，ＡＵＧＡＣＵＧＧＵＵＵＡＧＵ，ＡＵＧＡＧＵＵＡＵＧＵＡＧＡ，及びＡＵＧＧＣＧＡＡＡＡＧＡＡＵからなる群から選択される請求項１のＲＮＡ構築物。
【請求項６】
下流ボックスが１６Ｓ  ｒＲＮＡのアンチ下流ボックスに対して１００％相補的である請求項１のＲＮＡ構築物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか記載のＲＮＡ構築物を転写しうる単離されたＤＮＡ構築物。
【請求項８】
ＲＮＡ構築物の転写を制御するのに用いるプロモーターを含む請求項７のＤＮＡ構築物。
【請求項９】
請求項７または８のＤＮＡ構築物を含む複製媒体。
【請求項１０】
請求項９の媒体で形質転換された細菌。
【請求項１１】
ポリペプチドの製造方法であって、下記のステップを含む方法：
請求項１０の細菌を低温ショック応答を引き出す環境又は増殖条件にさらし；
ｃｓｐＡ、ｃｓｐＢ、及びｃｓｄＡからなる低温ショックタンパク質の群から選択されるｍＲＮＡの５’非翻訳領域、開始コドン、開始コドンと重複する下流ボックスヌクレオチド配列及び前記下流ボックスの３’側に異種遺伝子由来のポリペプチドをコードする配列を含むｍＲＮＡを前記の細菌中で過剰発現させ、ただし前記下流ボックスの配列は配列５′−ＡＣＵＵＵＧＵＧＡＵＵＣＡＵ−３′で表される細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡのアンチ下流ボックスに対して相補的であり；
前記ｍＲＮＡを前記アンチ下流ボックスにアニールさせ、それによって１６Ｓ  ｒＲＮＡに結合させて他の細菌ｍＲＮＡの翻訳を阻害し；および
前記ポリペプチドを細菌中に高レベルに蓄積させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生化学の分野、とりわけｍＲＮＡの翻訳及びタンパク質の生産の調節の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌はヒトを含む動物及び植物における数多くの病気の原因である。ペニシリンの如き抗生物質の到来前は、細菌感染症は治療することができないと考えられていた。その後様々な抗生物質が開発され、細菌を制御及び殺すことができるようになり、細菌感染症を治療することができるようになった。
【０００３】
しかし不幸なことに抗生物質に対する細菌の抵抗性が高められるため、多くの抗生物質は時間がたつにつれ細菌集団を制御する効果がますます小さくなることが明らかになった。
【０００４】
科学は抵抗性細菌を殺すことができるより新しくより良い抗生物質を発見することによってこの問題に答えてきた。しかし、新しい抗生物質が作り出されるとすぐに抵抗性株の細菌が出現してしまう。従って有害な細菌を殺す新しい手段に対する明らかなかつ差し迫った要求がある。
【０００５】
本発明は細菌のタンパク質生産を阻害することによる、細菌を殺すための新規のメカニズムを提供する。本発明の方法及び化合物に対して細菌が抵抗性を発達させる危険性は従来の抗生物質が直面している危険性と比較すると最小化される。何故なら本発明は細菌の自然の過程を利用しているからである。
【０００６】
本発明は標的低温ショックタンパク質のｍＲＮＡの５′非翻訳領域を過剰発現させる方法を更に提供する。いくつかの他の新規の側面は以下に更に記述される。
【０００７】
本発明の具体例の概要
解読領域に隣接する細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡの一部分（この部分はアンチ下流ボックス（ａｎｔｉ−ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｂｏｘ）（ＡＤＢ）として知られている。）に実質的に相補的な配列を含むＲＮＡを細菌中で過剰発現させることによって細菌中でのタンパク質合成が阻害され得るか又は完全に停止され得ることが偶然に発見されている。ＡＤＢに実質的に相補的なＲＮＡ配列は下流ボックス（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｂｏｘ）（ＤＢ）と呼ばれている。何故なら天然に存在する細菌ｍＲＮＡ中ではＤＢはｍＲＮＡの開始コドンの下流に配置されているからである。１６Ｓ  ｒＲＮＡの３′領域の構造及び細菌中での翻訳開始シグナルとしてのＤＢボックスの機能はＳｐｒｅｎｇａｒｔ等、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１５（３）：６６５−６７４（１９９６）に記載されている。これは参考文献としてここに組入れる。
【０００８】
本発明はいくつかの具体例を含む。一つの具体例においては本発明は細菌タンパク質の生産を阻害する方法に関する。本発明の方法は開始コドン及び下流ボックスを含むｍＲＮＡを細菌細胞中で過剰発現させることを含む。下流ボックスは０〜３０ヌクレオチドの介在ヌクレオチド配列を伴って、開始コドンの３′側にあることが好ましい。代わりに下流ボックスは開始コドンと重複していてもよい。この後者の場合、開始コドンの三つのヌクレオチドのいずれか又はすべてが下流ボックスの５′端を構成していてもよい。過剰発現されたｍＲＮＡのＤＢはＡＤＢにアニールさせられ、それによって１６Ｓ  ｒＲＮＡに効果的に結合し、他のｍＲＮＡの翻訳を妨げ、最終的には細菌タンパク質の生産を妨げる。
【０００９】
他の具体例においては本発明は細菌中でのタンパク質合成を阻害するためのオリゴヌクレオチドｍＲＮＡ構築物に関する。ＲＮＡ構築物は開始コドン及び開始コドンの３′側に位置するか又は開始コドンと重複するＤＢ配列を含むヌクレオチド配列を持つ。ＲＮＡ構築物はＲＮＡエンドヌクレアーゼのための部位を持たないことが好ましい。
【００１０】
他の具体例においては本発明はオリゴヌクレオチドＤＮＡ構築物に関し、そのＤＮＡ構築物は開始コドン及び開始コドンの３′側に位置するか又は開始コドンと重複するＤＢ配列を含むｍＲＮＡをコードする。
【００１１】
更なる具体例においては本発明は細菌細胞を形質転換するための媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）に関し、その媒体は開始コドン及び開始コドンの３′側に位置するか又は開始コドンと重複するＤＢ配列を含むｍＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に操作可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結されたＤＮＡプロモーター配列を含む。
【００１２】
更なる具体例は開始コドン及び開始コドンの３′側に位置するか又は開始コドンと重複するＤＢ配列を含むｍＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に操作可能に連結されたＤＮＡプロモーター配列を含む媒体で形質転換された細菌細胞である。
【００１３】
よく保存された配列である１６Ｓ  ｒＲＮＡはすべての細菌中に存在するので、本発明はすべての細菌に対して適用可能であり、実際に適用することができる。かくして本発明の実施は本発明を説明するために用いられるイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の如き用いられる細菌の種に依存しない。Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ及びＯ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ及びＧｏｅｂｅｌ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，４４（４）：８４６−８４９（１９９４）；Ｄｕｒａｎｄ及びＧｒｏｓ，１ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１４０：１９３−１９８（１９９６）；及びＯｌｓｅｎ及びＷｏｅｓｅ，ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ，７：１１３−１２３（１９９３）を参照されたい。これらの文献それぞれは参考文献としてここに組入れる。１６Ｓ  ｒＲＮＡがイー・コリのそれに対して高度に相同である細菌がミコバクテリウム属の種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）及びレジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）の如き哺乳動物の病原のみならず、リンガ・ペンシルバニカ（Ｌｉｎｇａ  ｐｅｎｓｙｌｖａｎｉｃａ）及びバチモディオルス・テルモフィルス（Ｂａｔｈｙｍｏｄｉｏｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の如き海生動物の非病原性共生菌をも含むという事実は、高度に保存されているという１６Ｓ  ｒＲＮＡの特徴及び本発明の一般的な適用性を示している。保存されているという１６Ｓ  ｒＲＮＡの特徴は所望の細菌において、ＧｅｎＢａｎｋ  データベースにおいて細菌について見出すことができる１６Ｓ  ｒＲＮＡのヌクレオチド配列からＡＤＢを同定することを可能にする。１６Ｓ  ｒＲＮＡのヌクレオチド配列を決定する手段は知られている。例えばＬａｎｅ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８２：６９５５−６９５９（１９８５），及びＢｏｔｔｇｅｒ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，６５：１７１−１７６（１９８９）を参照されたい。これらは参考文献としてここに組入れる。細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡはその３′端にアンチＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ領域（ＳＤ）及び解読領域を含む。ＡＤＢは１６Ｓ  ｒＲＮＡの解読領域に隣接する１２〜１４ヌクレオチド長の領域である。一旦ＡＤＢが同定されてその配列が確定すれば、本発明の構築物はいかなる特定の細菌についても容易に構築することができる。本発明の媒体についても同様であり、本発明の方法も同様にいかなる細菌中でも実施することができる。
【００１４】
更に１６Ｓ  ｒＲＮＡの３′端領域の配列は高度に保存されているという特徴があるので、いかなる第一の特定の細菌の種の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＡＤＢに実質的に相補的なＤＢは第二の細菌の種の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＡＤＢに十分相補的であるだろう。従って、本発明の方法は同一又は類似配列のＤＢを用いて異なる細菌の種において実施することができる。
【００１５】
図面の簡単な説明
図１は本発明のｍＲＮＡを過剰発現するＤＮＡ配列の構築を図式的に示す。
図２は本発明のｍＲＮＡの過剰発現による細胞タンパク質合成の阻害を示す。
図３は本発明のｍＲＮＡの低温ショック誘導発現による低温での細胞増殖の阻害を示す。
図４は細菌コロニー形成についての本発明のｍＲＮＡの過剰発現の阻害効果を示す。
図５は本発明のｍＲＮＡの発現による細菌タンパク質生産の抑制を示す。
図６は本発明の外因性ｍＲＮＡを過剰発現する細胞からの内因性ｍＲＮＡの翻訳を示す。
図７はＣｓｐＡの翻訳開始領域の分析を示す。
図８はｍＲＮＡ翻訳効率についてのｃｓｐＡコード領域中の下流配列の効果を示す。
図９は染色体ｃｓｐＡ発現及び他の細胞タンパク質の合成に対するｃｓｐＡ上流領域の効果を示す。
図１０はｐＪＪＧ７８及びｐＵＣ１９−６００による低温ショック適応の阻害及びＣｓｐＡの延長された発現を示す。
図１１は低温ショック適応の阻害及びｃｓｐＡの抑制解除機能についてのｃｓｐＡ上流領域の欠失分析を示す。
図１２は染色体及びプラスミドｃｓｐＡからの転写のレベルを示す。
図１３は低温ショック適応の阻害及びｃｓｐＡの延長された発現についてのｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの５′非翻訳領域の転写についての必要条件を示す。
図１４は他の低温ショックタンパク質及び非低温ショックタンパク質の生産についてのｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの５′非翻訳領域の過剰生産の効果を示す。
図１５は低温ショック応答についてのｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの５′非翻訳領域と共同してのｃｓｐＡの共過剰生産（co-overproduction ）の効果を示す。
図１６はｃｓｐＡ，ｃｓｐＢ，及びｃｓｄＡについてのｍＲＮＡの５′非翻訳領域における配列類似性を示す。
図１７はｃｓｐＡのヌクレオチド配列及びそこから引き出されるＣｓｐＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
図１８はｃｓｐＢのヌクレオチド配列及びそこから引き出されるＣｓｐＢタンパク質のアミノ酸配列を示す。
図１９はｃｓｄＡのヌクレオチド配列及びそこから引き出されるＣｓｄＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００１６】
本発明の具体例の詳細な記述
Ｓｐｒｅｎｇａｒｔ  等が報告しているように、細菌の下流ボックス（ＤＢ）はタンパク質を生産するｍＲＮＡの翻訳において重要な役割を果たす。ＤＢは３′端に近い細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡの一部分に結合し、翻訳が起こるのに好適な相対位置にｍＲＮＡとｒＲＮＡを配置するのを助けると考えられている。
【００１７】
本発明によれば、ＡＤＢが過剰発現されたｍＲＮＡのＤＢにアニールしている時間の間、１６Ｓ  ｒＲＮＡはアニールした過剰発現されたｍＲＮＡ以外の細胞ｍＲＮＡの翻訳に関与することができないということが発見されている。細菌のタンパク質生産機構全体は、１６Ｓ  ｒＲＮＡのＡＤＢに実質的に相補的でありかつすべての又は実質的にすべての細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡにアニールするＤＢをコードするｍＲＮＡを細菌に与えることによって阻害することができることが更に発見されている。
【００１８】
ここで用いる「相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」という用語は「実質的に相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」を含むことを意図される。従って「相補的」という用語は完璧な相補性を要求するわけではない。二つの配列が「相補的」であるためにはＫａｈｌ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．（１９９５）（この文献は参考文献としてここに組入れる。）において規定されているようなものであれば十分である。つまり、二つのヌクレオチド配列はワトソン−クリック型塩基対合の規則に従って相互に水素結合二本鎖を形成することができるのなら相補的である。二つの相補的ＲＮＡ配列、又はＲＮＡ及びＤＮＡ配列はＡ−Ｕ，Ｇ−Ｃ，又はＧ−Ｕの対合を形成するであろう。「完璧な相補性（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）」は要求されない。
【００１９】
ＡＤＢは１６Ｓ  ｒＲＮＡの解読領域の近くの１６Ｓ  ｒＲＮＡの３′端に位置する約１４塩基のヌクレオチド配列である。既知の細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡヌクレオチド配列は知られており、ＧｅｎＢａｎｋ  データベースにおいて見出すことができる。従って、選択された細菌について、ＡＤＢはＡＤＢ配列が知られている細菌（例えばイー・コリ）のＡＤＢ配列との比較によって容易に同定することができる。一旦ＡＤＢが同定されると、以下に示すようにＡＤＢに相補的なＤＢを構築して好適なｍＲＮＡ中に組入れることができる。
【００２０】
本発明のｍＲＮＡは単離されたｍＲＮＡ又は単離されたＤＮＡから転写されたｍＲＮＡである。ｍＲＮＡは開始コドンを含み、そのコドンはＡＵＧであることが好ましい。ｍＲＮＡについての他の好適な開始コドンはＧＵＧ及びＵＵＧを含む。
【００２１】
本発明のｍＲＮＡは下流ボックス配列を更に含み、それは通常は開始コドンの３′側にある。ＤＢのコドンは開始コドンと同期して（ｉｎ  ｐｈａｓｅ）いてもよいし、同期していなくてもよい。ＤＢ配列は開始コドンに直接隣接して、従って介在配列がないようにしてもよい。一般的にはＤＢは１−３０ヌクレオチド長の介在ヌクレオチド配列によって開始コドンから隔てられる。介在配列の塩基配列は重要ではなく、従っていかなるヌクレオチド配列から成っていてもよい。好ましくは介在ヌクレオチド配列は９〜１５ヌクレオチド長であり、最も好ましくは１２ヌクレオチド長である。代わりにＤＢは開始コドンと重複してもよい。つまり、本発明のｍＲＮＡの開始コドンの三つのヌクレオチドのいずれか一つはＤＢの５′端を形成していてもよい。
【００２２】
本発明のｍＲＮＡのＤＢ配列は細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＡＤＢに相補的なヌクレオチド配列である。ＤＢは２０塩基より長くすることができるが、一般的にＤＢは６〜２０塩基長、好ましくは８〜１４塩基長である。例えばＤＢはＡＤＢの３′側，５′側又は両方の側のヌクレオチドと相補的であるヌクレオチドを含んでいてもよい。ＤＢの長さに無関係に、ＤＢとＡＤＢの間の相補性が高いほどアニーリングがより効果的になる。このことは本発明の方法によれば細菌のタンパク質合成のより効果的な阻害をもたらす。
【００２３】
開始コドンに加えてＤＢ、及びいかなる介在配列、本発明のｍＲＮＡ構築物は開始コドンの５′側又はＤＢの３′側にヌクレオチド配列を含んでいてもよい。例えばｍＲＮＡ構築物はポリペプチドをコードする配列をＤＢの３′側に含んでいてもよく、又は終止コドンを含んでいてもよい。同様に、ｍＲＮＡは非翻訳配列及び／又はＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を開始コドンの５′側に含んでいてもよい。
【００２４】
開始コドン、いかなる介在配列、及びＤＢを含みかつ５′又は３′側のいかなる付加的なヌクレオチドを除くｍＲＮＡ構築物の長さは８ヌクレオチドから約４５ヌクレオチドの間のいかなる長さであることもできる。もちろんｍＲＮＡが上述の本質的成分に加えてＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列の如き５′又は３′配列を含む場合、ｍＲＮＡはより長く、数百ヌクレオチドの長さにまでなってもよい。
【００２５】
必須ではないが好ましくはｍＲＮＡ構築物はＲＮＡエンドヌクレアーゼについての部位を含まない。構築物の本質的部分（つまり開始コドン及びＤＢ）を含むｍＲＮＡ構築物の部分がＲＮＡエンドヌクレアーゼについての部位を含まないことが特に好ましい。さもないとＲＮＡエンドヌクレアーゼがｍＲＮＡ構築物を分解してしまい、細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡが細菌ｍＲＮＡに自由に結合するようになるだろう。
【００２６】
本発明のｍＲＮＡ構築物は細菌中で天然に発見されるｍＲＮＡ配列に類似の又はかかるｍＲＮＡ配列と同一の配列を持つことができる。例えばイー・コリのタンパク質ＣｓｐＡ，ＣｓｐＢ，ＣｓｐＧ，ＣｓｄＡ，及びＲｂｆＡについてのｍＲＮＡの如きいくつかの低温ショックタンパク質についてのｍＲＮＡはＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列、開始コドン、及びイー・コリ１６Ｓ  ｒＲＮＡのアンチ下流ボックスに実質的に相補的な下流ボックスを含む。Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列、開始コドン、及びイー・コリのＡＤＢに相補的な下流ボックスを含む他のイー・コリｍＲＮＡはＲｅｃＡ，Ｈｎｓ，ＮｕｓＡ，ＩｎｆＢ，及びＣｓｐＤを含む。
【００２７】
ｍＲＮＡ構築物についての好適なＤＢのいくつかの非限定的な例を以下に示す。以下のＤＢはそれぞれイー・コリ１６Ｓ  ｒＲＮＡのＡＤＢに実質的に相補的であり、そのＡＤＢは以下の配列を持つ：
2007061106.tif 000002
【００２８】
本発明による好適なｍＲＮＡ構築物は上述のＤＢのいずれか一つ、又は例えば以下のような他の好適なＤＢを用いて構築することができる：
2007061106.tif 000003
【００２９】
ただしｎは０〜３０の全数であり、ＸはＧ，Ｃ，Ｕ，又はＡである。それぞれのＸはいかなる他のＸと同一の塩基を持っていてもよく、異なる塩基を持っていてもよい。代わりにＤＢの５′端は開始コドンと重複していてもよい。
【００３０】
本発明のＤＮＡは上述の通り本発明のｍＲＮＡ構築物に好適なｍＲＮＡをコードする単離されたＤＮＡである。ＤＮＡは付加的なヌクレオチド配列を開始コドンの５′側に更に含んでいてもよく、その配列はプロモーター配列を含んでいてもよい。かかるプロモーター配列はｍＲＮＡ構築物の転写を制御するのに用いることができる。ＤＮＡはＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列の如きプロモーターとしての機能以外の機能を持つ配列、及び／又は未知の機能を持つ配列を開始コドンの５′側に含んでいてもよい。ＤＮＡはｍＲＮＡ構築物のＤＢをコードする部分の３′側に位置する配列を含んでいてもよく、その配列は例えば終止コドンを含んでいてもよいし、又はポリペプチド及び転写終止に必要な配列をコードしていてもよい。
【００３１】
本発明のｍＲＮＡ構築物をコードする好適なＤＮＡの列は以下のものである：
2007061106.tif 000004
【００３２】
ただしｎは０〜３０の全数であり、ＹはＧ，Ｃ，Ｔ，又はＡである。それぞれのＹはいかなる他のＹと同一の塩基を持っていてもよく、異なる塩基を持っていてもよい。代わりにＤＢの５′端は開始コドンＡＴＧと重複していてもよい。ＤＮＡは上述の通り付加的な配列をＤＮＡの５′及び／又は３′端に含んでいてもよい。
【００３３】
本発明のＤＮＡ配列はプラスミド又はファージベクターの如き媒体又はクローニングベクター内に含まれていてもよい。ベクター内のＤＮＡ配列は開始コドンの５′側に配置されたプロモーター配列の制御下にあってもよい。本発明のＤＮＡを含むこれらのベクターはホスト細菌を形質転換するのに用いることができ、それは本発明のｍＲＮＡを過剰発現させるために、つまり類似の非形質転換細菌で生産されるレベルよりも高いレベルで細菌中でｍＲＮＡを生産させるために用いることができる。クローニングベクターによって形質転換することができるいかなる細菌も本発明のＤＮＡ配列のための好適なホストである。クローニングベクターの製造方法及び細菌の形質転換方法は当該技術分野では知られており、例えばＡｕｓｕｂｅｌ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９５）から学ぶことができる。この文献は参考文献としてここに組入れる。
【００３４】
本発明のｍＲＮＡ配列の過剰発現は細菌中で通常見出されるものよりも高い量でｍＲＮＡを生産させる。いかなる程度でｍＲＮＡが過剰発現されようとも細菌タンパク質の生産は阻害される。もしｍＲＮＡが十分に高いレベルで発現されるならば、細菌タンパク質の生産は完全に停止され、それは細菌の死に究極的に通ずる。
【００３５】
それ故、ｍＲＮＡを生産する構築物は細菌を殺すか又は細菌の増殖を停止させるための抗生物質として有用である。ｍＲＮＡを生産する構築物はバクテリオファージ中にパッケージングされることができ、それはｍＲＮＡを消毒剤として又は局所的抗生物質調製品として用いることを可能にするだろう。送達のための方策はヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、及び家畜等の哺乳動物の如き動物又は植物の感染症を引き起こす細菌の形質転換を可能にするように工夫されるであろうということが考えられる。かかる抗生物質は真核生物において安全に用いることができる。何故なら真核生物は細菌には存在する１６Ｓ  ｒＲＮＡを欠くからである。
【００３６】
本発明の方法によれば開始コドン及び細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＡＤＢに相補的なＤＢを含むｍＲＮＡは細菌中で過剰発現され、次に細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡのＡＤＢにアニールさせられ、それによって細菌中で他のｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の生産を阻害する。
【００３７】
本発明のｍＲＮＡの過剰発現を引き起こすいかなる送達手段も本発明の方法にとって好適である。例えば、細菌は本発明のｍＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む媒体によって形質転換させることができる。
【００３８】
もし所望ならば、本発明のｍＲＮＡ配列の発現はＤＮＡ配列を誘導可能プロモーターの制御下に置くことによって制御される。例えばもし有害な細菌を殺すか又はその増殖を阻害しつつも有益な細菌には危害を加えないでおきたいのなら、ＤＮＡ配列は第一の細菌中のみに存在する生成物を制御するプロモーターの制御下に置いてもよい。このようにして本発明のｍＲＮＡの致死的な抗生作用効果は望ましくない有害な細菌のみに影響を与えるであろう。
【００３９】
タンパク質生産を阻害するｍＲＮＡ配列の発現を制御する他の手段は特定の条件下では不安定なｍＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を用いることである。
【００４０】
例えば、イー・コリの低温ショックタンパク質ＣｓｐＡのｍＲＮＡの５′非翻訳領域（５′ＵＴＲ）は約３７℃の生理的増殖温度で分解（たぶんＲＮａｓｅ  Ｅによって行われる。）に対して感受性であるＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ領域のすぐ５′側の領域を含む。それ故、５′ＵＴＲを含むｃｓｐＡ  ｍＲＮＡは通常の増殖条件下では不安定であり、約１２秒と推定される半減期を持つ。イー・コリのＣｓｐＢ及びＣｓｄＡの如き他の低温ショックタンパク質はそれらのｍＲＮＡが不安定であるため、生理的増殖温度では同様に不安定である。温度が１５℃に低下された場合のように低温ショックが与えられると、ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの半減期は劇的に増大し、約１５分にもなる。この安定性の増大は通常の生理的増殖温度でのｍＲＮＡについての値の約７５倍である。
【００４１】
ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの５′ＵＴＲを含むｍＲＮＡは３７℃で不安定であるため、この領域又はｃｓｐＢ若しくはｃｓｄＡ  ｍＲＮＡの５′ＵＴＲは本発明のｍＲＮＡ配列の発現を制御してその抗生作用効果が低温ショック条件下の如き生理的増殖温度より下でのみ起こるようにするために用いることができる。本発明の方法の抗生作用効果は低温ショック条件で増大する。何故なら低温ショックを受けた細菌は新しいリボゾーム因子を要求するが、その合成はＤＢ配列を含むｍＲＮＡの過剰生産によって阻害されるからである。
【００４２】
本発明のｍＲＮＡが細菌中で過剰発現させられる本発明の方法の抗生作用効果は発現されるべきｍＲＮＡのコピー数の増大に伴って増大する。つまり、本発明のｍＲＮＡの最小限の過剰発現は細菌によるタンパク質の生産を阻害するであろうが、かかる阻害は細菌の更なる増殖を防止したり細菌を殺したりするのには十分ではないかもしれない。ｍＲＮＡの高レベルの発現はタンパク質生産の阻害の増大と正の相関がある。コピー数が細菌中で十分に高ければ、タンパク質生産は完全に阻害されるだろう。
【００４３】
過剰発現されるｍＲＮＡのＤＢと１６Ｓ  ｒＲＮＡのＡＤＢとの相補性に関しても同様の効果が見出されている。１００％の相補性を持つＤＢを含むｍＲＮＡの過剰発現は、より少ない、例えば７５％の相補性を持つＤＢを含むｍＲＮＡよりもＡＤＢに対する結合においてより効果的であるだろう。かくして高い相補性を持つＤＢを持つｍＲＮＡのタンパク質阻害効果は、相補性が低いＤＢを持つｍＲＮＡの効果と比較するとずっと明らかであると断言される。それ故、相補性の低いＤＢを持つｍＲＮＡを用いる場合、相補性の高いＤＢを持つｍＲＮＡと同一又は同様の抗生作用結果を達成するためには、ｍＲＮＡを高いコピー数で発現させる必要があるかもしれない。
【００４４】
下流ボックスの翻訳阻害特性は低温ショック後、形質転換された細菌中で、異質遺伝子を過剰発現させるのにも有利である。内因性細菌タンパク質の翻訳阻害は異質遺伝子生成物が形質転換された生物体中で極めて高レベルに蓄積することを可能にするだろう。更に、低温でのｍＲＮＡ転写を安定化させる機能を持つ低温ショック誘導可能遺伝子の５′非翻訳領域及び強いプロモーターに結合された下流ボックスを含む構築物は低温での異質遺伝子の高レベル発現に直接効果を与えるだろう。
【００４５】
本発明の更なる具体例の概要
本発明の更なる重要な具体例は、低温ショック適応における、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の主要な低温ショックタンパク質であるｃｓｐＡのｍＲＮＡの５′端非翻訳領域の役割に関する。
【００４６】
発明の背景
本発明の他の重要な具体例は、低温ショック適応における、エシェリキア・コリの主要な低温ショックタンパク質であるｃｓｐＡのｍＲＮＡの５′端非翻訳領域の役割に関する。しかし、本発明の範囲は低温ショックに対する細菌の適応のみに限定されるものではなく、細菌の低温ショック応答（例えば低温ショック遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現）を引き出す生理的ストレスを生ずるいかなる環境又は増殖条件にも及ぶ。例えば、細菌をその生物体についての通常の生理的条件以外の環境又は増殖条件にさらすと、かかる応答が引き起こされる。
【００４７】
指数関数的に増殖しているエシェリキア・コリ細胞の培養温度が３７℃から１０℃に下げられた場合、細胞増殖の再開前に増殖遅滞期がある（Ｊｏｎｅｓ等、１９８７）。熱ショック応答と同様に、イー・コリは低温ショック応答と呼ばれる遺伝子発現の特異的パターンを誘導することによって温度低下に対して応答する。これは低温ショックタンパク質と定義される一連のタンパク質の誘導を含む（Ｊｏｎｅｓ等、１９９２；Ｊｏｎｅｓ及びＩｎｏｕｙｅ  １９９４を参照されたい。）。低温ショック応答は細菌増殖の遅滞期中に生じ、低温への細胞の適応に必要であると考えられている。
【００４８】
イー・コリの主要な低温ショックタンパク質であるＣｓｐＡは温度低下によって劇的に誘導され、その生産は総タンパク質合成量の１３％にも達する（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ等、１９９０）。しかし興味深いことに低温ショック応答中のＣｓｐＡ生産は一過性であり、低温での細胞増殖が再開するときには基礎レベルに激減する。ＣｓｐＡは７０アミノ酸残基からなり、遺伝子調節及びｍＲＮＡマスキングと関連していることが知られている真核生物のＹ−ボックスタンパク質族の「低温ショックドメイン（ｃｏｌｄ−ｓｈｏｃｋ  ｄｏｍａｉｎ）」と４３％の同一性を示す（Ｗｏｌｆｆｅ等、１９９２；Ｗｏｌｆｆｅ  １９９３を参照されたい。）。ＣｓｐＡの三次元構造は決定されており、β−バレル構造を形成する五つの逆平行β−シートからなる（Ｎｅｗｋｉｒｋ等、１９９４；Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ等、１９９４）。二つのＲＮＡ結合モチーフ、ＲＮＰ１及びＲＮＰ２がそれぞれＢ２及びＢ３シートに同定されている。その構造においては、八つの芳香族残基のうち七つは同一表面に位置しており、一本鎖ＤＮＡがこれらの表面芳香族残基と相互作用することが示されている（Ｎｅｗｋｉｒｋ等、１９９４）。ＣｓｐＡは低温での翻訳効率を高めるＲＮＡシャペロンとして機能するということが提案されている（Ｊｏｎｅｓ及びＩｎｏｕｙｅ  １９９４を参照されたい。）。
【００４９】
イー・コリはＣｓｐＢ，ＣｓｐＣ，ＣｓｐＤ及びＣｓｐＥを含む大きなＣｓｐＡ族を含む（Ｌｅｅ等、１９９４；Ｄｏｎｇｉｅｒ等、１９９２；Ｙａｍａｎａｋａ等、１９９４）。それらのうち、ＣｓｐＡ及びＣｓｐＢのみが低温ショック誘導可能であることが示されている（Ｌｅｅ等、１９９４）。最近、リボゾームともっぱら協同しかつ二本鎖ＤＮＡを巻き戻す能力がある他の低温ショックタンパク質ＣｓｄＡが同定されている（Ｊｏｎｅｓ等、１９９５）。
【００５０】
発明のこの具体例の概要
低温への細胞の適応中、エシェリキア・コリは主要な低温ショックタンパク質ＣｓｐＡを一過的に合成する。本発明によれば低温ショックへの適応過程はｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの５′非翻訳領域の１４３塩基配列が過剰生産されると阻害されることがわかった。１５℃でこの非翻訳領域を過剰生産させると、ＣｓｐＡのみならずＣｓｐＢ及びＣｓｄＡの如き他の低温ショックタンパク質の合成がもはや一過性ではなく、むしろ発現が延長された。更に低温ショックタンパク質以外の細胞タンパク質の合成及び細胞増殖の両方ともの阻害が観察された。興味深いことにＣｓｐＡが５′非翻訳領域と共に過剰生産される場合は通常の低温ショック適応応答が再開され、細胞増殖の遅滞期の延長はみられなかった。このことはｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの５′非翻訳領域はその遺伝子生成物であるＣｓｐＡと同様に低温ショック遺伝子の発現の調節及び低温ショック適応において決定的な役割を果たしているということを示す。ｃｓｐＡ，ｃｓｐＢ，及びｃｓｄＡ  ｍＲＮＡの５′非翻訳領域において配列類似性が見出されている。本発明によれば仮想的なリプレッサーが適応過程中に低温ショックｍＲＮＡの共通配列（低温ボックス）に結合し、それが次に低温ショック遺伝子の転写を阻害するのではないかということが提案されている。ＣｓｐＡは直接的又は間接的にリプレッサー機能を促進するようである。
【００５１】
本発明によれば、低温ショックによるｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの５′非翻訳領域の過剰発現は細胞タンパク質合成の阻害の延長及び細胞増殖の遅滞期の延長をまねく。付随的にＣｓｐＡ，ＣｓｐＢ，及びＣｓｄＡの如き低温ショックタンパク質の合成はもはや一過性ではなく、むしろ長時間持続し、それは細胞増殖の延長された遅滞期に相当する。ｃｓｐＡ，ｃｓｐＢ，及びｃｓｄＡのｍＲＮＡの５′端非翻訳領域内で配列類似性が見出されている。興味深いことにｃｓｐＡがそのｍＲＮＡの５′非翻訳領域と共に過剰生産された場合、通常の低温ショック応答が延長された遅滞期なしに再開された。これらの結果は低温ショック遺伝子が低温ショック応答中、新規のメカニズムによって調節されることを示している。仮想的なリプレッサーは低温ショックｍＲＮＡの領域内の共通配列（低温ボックス）に結合し、それは次にこれらの遺伝子の転写を阻害すると考えられている。かくしてＣｓｐＡが直接的又は間接的にリプレッサー機能を促進すると更に考えられる。
【００５２】
本発明は以下の非限定的実施例によって説明される。
【００５３】
実施例１
イー・コリ株及び培養培地
イー・コリ  ＣＬ８３［ｒｅｃＡ  ａｒａ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）ｒｐｓＬ（＝ｓｔｒＡ）φ８０  ｌａｃＺ  Ｍ１５］（Ｌｅｒｎｅｒ及びＩｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：４６３１（１９９０））は全ての実験に用いられ、Ｍ９カザミノ酸培地（Ｍｉｌｌｅｒ，ＪＨ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９７２））で増殖された。パルスラベル実験のために、メチオニン以外のすべてのアミノ酸の混合物が用いられた。各アミノ酸の最終濃度は５０μｇ／ｍｌであった。パルスラベル実験及びＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）はＪｉａｎｇ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５：５８２４−５８２８（１９９３）に記載の通り行われた。この文献は参考文献としてここに組入れる。
【００５４】
実施例２
プラスミド構築物
以下のプラスミド構築物は図１において図式的に示されている。
プラスミドｐＦ１は以下のようにして構築された：野生型ｃｓｐＡを含むｐＪＪＧ０２（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ等、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，８７：２８３−２８７（１９９０））はＰｖｕＩＩによって消化された。放出された８９８ｂｐの断片はｃｓｐＡプロモーター全体、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ領域を含む５′非翻訳領域、及びＮ末端の６３アミノ酸残基のｃｓｐＡ配列を含む、ｃｓｐＡ遺伝子の−４５８から＋３４８ｂｐまで（転写開始部位を＋１と規定する）を含む。次にこの断片はＰｖｕＩＩで消化されたｐＵＣ１９に再クローニングされた。その結果、ＣｓｐＡのＮ末端の６３残基配列はｐＵＣ１９配列の塩基３０８でｌａｃＺについての＋１フレームシフトによって生じたｌａｃＺ配列の１９残基配列と融合された（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等、Ｇｅｎｅ，３３：１０３（１９８５））。
【００５５】
ｐＦ２は８９８ｂｐの断片がＰｖｕＩＩではなくｐＵＣ１９のＳｍａＩの部位に再クローニングされたことを除いてはｐＦ１と同様の方法で構築された。その結果、ＣｓｐＡのＮ末端の６３残基配列はｐＵＣ１９の塩基４１１から１４９までの同一の読み枠におけるｌａｃＺからの８９残基配列と融合された。
ｐＦ３は以下のようにして構築された：短くされたｃｓｐＡ断片（−２８０〜＋２４３）は以下のようなｃｓｐＡのＳＤ配列においてＸｂａＩ部位を作り出すことによってｐＪＪＧ０２から構築されたｐＪＪＧ２１からＰＣＲ増幅された：
2007061106.tif 000005
【００５６】
（かっこ内の元のヌクレオチドは下線を引いたヌクレオチドによって置換された）。ＰＣＲ用の二つのプライマーはプライマー３５５２
2007061106.tif 000006
及び３５５１
2007061106.tif 000007
であった。断片はｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位にクローニングされた。その結果、ＣｓｐＡのＮ末端２８残基配列はｐＵＣ１９の塩基４１４での＋１フレームシフトによって生ずるｌａｃＺからの５４残基配列と融合された。
【００５７】
ｐＦ５は２ステップのＰＣＲによるフレームシフト突然変異として構築された。第一ステップにおいてはＰＣＲはプライマー３５５２及びプライマー６８７９
2007061106.tif 000008
を用いて行われた。第二ステップにおいてはＰＣＲはＰＣＲ１生成物及び４８６０
2007061106.tif 000009
をプライマーとして行われた。ｐＪＪＧ０２は両方のＰＣＲ反応についての鋳型として用いられた。ｃｓｐＡの第５コドンの第２位置に挿入されたＣ残基を持つ、生じたＰＣＲ生成物は次にｐＵＣ９のＳｍａＩ部位にクローニングされた。上述のすべての融合構築物は配列決定によって確認された（Ｓａｎｇｅｒ等，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，７４：５４６３−５４６７（１９７７））。
【００５８】
ｐＦ２Ａは以下のようにして構築された：ｃｓｐＡ遺伝子全体を含むＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩ断片はｐＪＪＧ０２から得られ、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＨｉｎｃＩＩで消化されたｐＦ２へクローニングされた。従って、ｃｓｐＡの配向は融合遺伝子の配向と反対であった。
【００５９】
ｐＦ２Ｂは以下のようにして構築された：ｃｓｐＢ遺伝子全体を含む２．１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ  断片はｐＳＪ７から得られ（Ｌｅｅ等，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１：８３３−８３９（１９９４））、ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＦ２へクローニングされた。ｃｓｐＢの配向は融合遺伝子の配向に対して反対であった。
【００６０】
実施例３
本発明のｍＲＮＡの低温ショック誘導による細胞タンパク質合成の阻害
実施例２において記述したとおりの様々なＤＮＡ構築物で形質転換されたイー・コリ細胞ＣＬ８３は既に記載されているように１５℃への温度低下から０，０．５，１，３及び１８時間後に［３５Ｓ］メチオニンで１５分間パルスラベルされた（ｐｕｌｓｅ−ｌａｂｅｌｅｄ）（Ｊｉａｎｇ等（１９９３））。ＤＮＡ構築物及びラベリングの時点は各レーンの上部に示されている。タンパク質の合成パターンは図２に示される通り、１７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。０．２５ｍｌの細胞培養物からの細胞抽出物が添加された。Ａ：レーン１〜５、ｐＪＪＧ０２を持つ細胞；レーン６〜１０、ｐＦ１を持つ細胞；レーン１１〜１５、ｐＦ２を持つ細胞；レーン１６〜２０、ｐＦ３を持つ細胞。ＣｓｐＡ及び融合タンパク質Ｆ１，Ｆ２及びＦ３の位置は矢印で示されている。分子量マーカー（ｋＤａ）の位置は右側に示されている。Ｂ：レーン１〜４、ｐＵＣ１９を持つ細胞；レーン９〜１２、ｐＦ５を持つ細胞。
【００６１】
イー・コリＣＬ８３はＣｓｐＡ融合タンパク質についてのプラスミドで形質転換され、細胞タンパク質の生産は３７℃から１５℃への温度低下後、［３５Ｓ］メチオニンを用いて調べられた。次に総細胞タンパク質が図２に示すようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。無傷のｃｓｐＡ遺伝子を持つｐＪＪＧ０２を持つ細胞は３７℃ではほとんどＣｓｐＡを生産しないが（レーン１）、低温ショックを与えられるとＣｓｐＡの生産は劇的に誘導される（レーン２及び３）。細胞タンパク質の全体の生産はＣｓｐＡ発現の高レベルと対照的に３０分で有意に減少したことに注意すべきである（レーン２）。これは低温ショック適応中の通常の細胞応答である。細胞は数時間で増殖阻害から回復し、細胞タンパク質合成は３時間で最高の活性に戻る（レーン４及び５）。ｐＪＪＧ０２は無傷のｃｓｐＡ遺伝子を持つマルチコピープラスミドであるので、ＣｓｐＡ生産は低温ショックの１８時間後でさえも低い基礎レベルには減少しない（このことは通常の細胞においては普通に起こることであるが）。
【００６２】
三つの異なるｃｓｐＡ融合構築物を持つ細胞について、３７℃での細胞タンパク質の合成はｐＪＪＧ０２のそれと同様であった（図２のレーン６，１１，及び１６をレーン１と比較されたい）。温度が低下すると三つの融合タンパク質（Ｆ１，Ｆ２及びＦ３）はすべて、矢印で示されるように低温誘導された。驚くべきことに、ほとんどすべての細胞タンパク質は１５℃で調べられたすべての時点において激しく阻害された（Ｆ１，Ｆ２及びＦ３についてそれぞれレーン７〜１０、レーン１２〜１５、及びレーン１７〜２０）。このことは細胞はもはや低温ショック適応することができないことを示す。ＣｓｐＡ融合タンパク質以外にもゲルの中央に主要なバンドがあり、それはβ−ラクタマーゼ、つまり用いられたプラスミド中のアンピシリン抵抗性遺伝子（ｂｌａ）の生成物であると同定された。これらの結果はＣｓｐＡ融合タンパク質及びプラスミド上でＣｓｐＡ融合タンパク質遺伝子の下流にコードされているタンパク質が細胞タンパク質の合成（これは激しく阻害された）と比較して十分に合成されたということを示す。
【００６３】
実施例４
低温での細胞増殖の阻害
図３に示すとおり、ｐＪＪＧ０２又はｐＦ２で形質転換されたＣＬ８３細胞はＭ９−カザミノ酸培地で３７℃で増殖された。中間対数相（ｍｉｄ−ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ）（ＯＤ６００＝０．６）で細胞培養物は二つに分けられた。一方は３７℃で、他方は１５℃で保持された。細胞密度はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用いてＯＤ６００で測定された。ｐＪＪＧ０２：ｏ−−−−ｏ，３７℃；・−−−−・，１５℃。ｐＦ２：△−−−−△，３７℃；▲−−−−▲，１５℃。ｐＦ１又はｐＦ３で形質転換された細胞はｐＦ２で形質転換された細胞と同様の挙動を示した。
【００６４】
実施例５
細菌コロニー形成に対しての本発明のｍＲＮＡの過剰発現の効果
様々なプラスミドを含むＣＬ８３細胞はアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を添加されたＬ−ブロス培地で３７℃で増殖された。中間対数相で細胞はアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含む二つのＬ−ブロス寒天プレートに塗布された。一方のプレートは３７℃で１２時間、他方のプレートは２０℃で３６時間インキュベートされた。図４はプラスミドｐＦ２又はｐＦ５を持つ細菌の低温ショック温度でのコロニー増殖の阻害を示す。プラスミドｐＦ１又はｐＦ３を持つ細菌の増殖も同様に阻害された。
【００６５】
実施例６
本発明のｍＲＮＡの低温での発現は細菌のタンパク質生産を抑制する
ｐＦ２を持つＣＬ８３細胞が３７℃から１５℃へ移された場合、Ｆ２生産は劇的に誘導され、細胞タンパク質合成はほぼ完全に阻害された（図５、レーン２及び３）。細胞が１５℃で３時間ラベルされ、続いてラベルされた生成物を３７℃でもう１時間追跡された場合、Ｆ２バンドはなおも検出可能であり（レーン４）、Ｆ２が３７℃で極めて安定であることが示された。別の実験においては細胞が１５℃で３時間まず低温ショック処理された後、培養物は３７℃に戻され、３７℃で１時間インキュベート後、細胞はパルスラベルされた。レーン５に示されるように細胞タンパク質の合成はほとんど回復しており、Ｆ２は比較的高いレベルでなおも生産された。この結果は本発明のｍＲＮＡをコードするＤＮＡの３７℃での発現（この温度においてはｍＲＮＡは不安定である）が細胞タンパク質合成について阻害効果を与えないということを示す。３７℃に戻した３時間後にパルスラベルされると、Ｆ２はもはや合成されず、細胞タンパク質合成は完全に回復された（レーン６）。細胞がｐＦ２プラスミドをまだ持っていることを確認するため、細胞は再び１５℃に戻された。するとＦ２生産は再び誘導され、細胞タンパク質合成は阻害された（レーン７）。これらの結果はｍＲＮＡをコードするＤＮＡの発現による阻害効果は用いられた条件下で低温でのみ発揮されるということを示す。
【００６６】
実施例７
本発明のｍＲＮＡを過剰発現する細胞からの内因性ｍＲＮＡの翻訳
ｐＦ２を持つ細胞は１５℃で３時間まず低温ショック処理された。次にリファンピシン（２００μｇ／ｍｌ）が培養物に添加され、１０分インキュベートした後、培養物は３７℃に戻された。次に細胞は温度低下させた０分（レーン７、図６）、２分（レーン８）、５分（レーン９）、及び１０分（レーン１０）後に５分間［３５Ｓ］メチオニンでパルスラベルされた。ｐＪＪＧ０２を持つ細胞を用いてコントロールとして同様のラベル実験が行われた（レーン１〜５、図６）。レーン１に示すように、コントロール細胞は３時間のインキュベート後、１５℃によく適応し、すべての細胞タンパク質を生産したが、ｐＦ２を持つ細胞は細菌タンパク質の生産が強く阻害され、Ｆ２融合タンパク質及びβ−ラクタマーゼを主に生産した（レーン６）。リファンピシンの添加後、１５℃でのタンパク質合成のパターンと極めてよく似たパターン（レーン２〜５をレーン１と比較されたい。）がｐＪＪＧ０２を持つ細胞について得られた。このことはリファンピシンの添加の前後で同一のｍＲＮＡが用いられたことを示す。ｐＦ２を持つ細胞の場合、リファンピシンの添加後３７℃で生産される主要なタンパク質（レーン７〜１０）は翻訳阻害された細胞によって生産されるもの（レーン６）と同一であった。このことは翻訳阻害された細胞において翻訳に用いられたｍＲＮＡ以外には他の細胞ｍＲＮＡは細胞中には存在していないということを示す。これらの結果は細菌ｍＲＮＡの翻訳が本発明の方法によって阻害された細胞中のほぼすべてのポリソームが本発明のｍＲＮＡで占領されたことを示す。
【００６７】
実施例８
下流ボックスをコードする遺伝子で形質転換された細菌でのタンパク質生産
ｃｓｐＡ及びｌｐｐの翻訳開始領域の翻訳効率を直接比較するため、二つのβ−ガラクトシダーゼ発現系ｐＭＭ０２７及びｐＭＭ０２８は各々の翻訳開始領域が同一のプロモーター下に配置されてｌａｃＺに融合されるようなやり方で構築された（図７ａ）。ｐＭＭ０２７はｌｐｐプロモーター（このプロモーターはイー・コリ中で３７℃での最も強いプロモーターの一つである）の下流にｐＫＭ００５からのプロモーターを持たないｌａｃＺ及びｐＩＮＩＩＩプラスミドからのｌａｃプロモーター−オペレーター領域を挿入することによって構築された（Ｉｎｏｕｙｅ，１９８３）。ｐＭＭ０２８においてはｐＭＭ０２７の翻訳開始領域はｃｐｓＡの＋１４４〜＋１９８からの断片によって置換された。この断片を挿入するため、ＸｂａＩ部位はｃｓｐＡの仮想的ＳＤ配列のすぐ上流に導入され、ＳＤ配列の回りの配列は（＋１４３）ＴＡＴＴＡＡＧＧ（＋１５０）からＴＣＴＡＧＡＧＧへ変えられた（ＳＤ配列は下線をひかれている。）。両方の構築物におけるｌａｃＺ遺伝子は同一であり、それらはＢａｍＨＩ部位で上流領域に翻訳的に（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）融合された。ｐＭＭ０２７においては開始コドン及び第二残基Ｌｙｓはｌｐｐから由来しており、もう八つの残基（ＧＧＩＰＳＬＤＰ）が添加されて８番目のアミノ酸残基でｌａｃＺに融合された。一方ｐＭＭ０２８においては開始コドンから１３番目の残基までの領域はＣｓｐＡから由来し、それに加えてＢａｍＨＩ部位を作り出すことによって生じた三つの残基（ＬＤＰ）が８番目のアミノ酸残基でｌａｃＺに翻訳的に融合された。
【００６８】
ｐＭＭ０２７とｐＭＭ０２８は両方とも同一のプロモーターを含んでいた。これらの構築物からの転写生成物もｌａｃＺの前に位置する、ＳＤ配列から翻訳的融合部位までの短い領域（これはｐＭＭ０２７についてはＭＫＧＧＩＰＳであり、ｐＭＭ０２８についてはＭＳＧＫＭＴＧＩＶＫＷＦＮである）を除いては同一であった。これらのプラスミドを持つ細胞は３７℃でＭ９−カザミノ酸培地で増殖され、そして中間対数相にイソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ）が１ｍＭの最終濃度で添加された。ＩＰＴＧを添加して３０分後、培養物は二つに分けられた；一方は３７℃で、そして他方は１５℃で保持された。両方の培養物についての３７℃でのβ−ガラクトシダーゼ活性は図７ｂに示すとおり確実に誘導された。しかし、温度低下後、ｐＭＭ０２７を持つ細胞についてはβ−ガラクトシダーゼ活性の増加は起こらなかったが、ｐＭＭ０２８を持つ細胞についてはβ−ガラクトシダーゼ活性は１５℃で確実に増加した。
【００６９】
実施例９
低温ショック誘導についての下流ボックスの必要性
ｌａｃＺ遺伝子の低温ショック誘導を引き起こす正確な領域を明らかにするため、我々は次にｐＭＭ０２７とｐＭＭ０２８との間のコード配列のみを交換することによってｐＬＦ０２７及びｐＬＦ０２８を構築した。ｐＬＦ０２７はｐＭＭ０２７のｌａｃＺ融合部位と開始コドンとの間の配列に対応するＮ末端の７残基配列（ＭＫＧＧＩＰＳ）がｐＭＭ０２８のｌａｃＺ融合部位と開始コドンとの間の配列に対応するＮ末端の１３残基配列（ＭＳＧＫＭＴＧＩＶＫＷＦＮ）で置換されたことを除いてはｐＭＭ０２７と同一であった（図８ａを参照されたい。）。同様に、ｐＬＦ０２８はｐＭＭ０２８のＮ末端の１３残基配列がｐＭＭ０２７のＮ末端の７残基配列で置換されたことを除いてはｐＭＭ０２８と同一であった（図８ａを参照されたい。）。ｐＬＦ０２７は以下のようにして構築された：ＰＣＲはｐＭＭ０２８を鋳型として用いてプライマー＃７４８５
2007061106.tif 000010
及びプライマーＭ１３−４７
2007061106.tif 000011
で行われた。ＰＣＲ生成物はＢａｍＨＩ及びＸｂａＩでまず消化され、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化されたｐＭＭ０２７へクローニングされた。
【００７０】
ＰＣＲ反応においてプライマー＃７４８６
2007061106.tif 000012
がプライマー＃７４８５の代わりに用いられたことを除いて、ｐＬＦ０２８はｐＬＦ０２７と同じようなやり方で構築された。
【００７１】
ｐＬＦ０２９は以下のように構築された：オリゴヌクレオチド＃７４９３
2007061106.tif 000013
及びオリゴヌクレオチド＃７４９４
2007061106.tif 000014
はまずアニールされ、次にＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化されたｐＭＭ０２７へクローニングされた。すべての構築物のＤＮＡ配列は鎖終結法（ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）（Ｓａｎｇｅｒ等，１９７７）を用いるＤＮＡ配列決定によって確認された。
【００７２】
イー・コリＡＲ１３７はｐＬＦ０２７及びｐＬＦ０２８で形質転換され、β−ガラクトシダーゼ活性は１ｍＭのＩＰＴＧの存在下で測定された。図８ｂに示すとおり、３７℃でβ−ガラクトシダーゼはｐＬＦ０２７及びｐＬＦ０２８を持つ細胞においてほぼ同様に誘導された。しかし、β−ガラクトシダーゼ活性はｐＬＦ０２８を持つ細胞においては１５℃ではほとんど増加しなかった。対照的にβ−ガラクトシダーゼ活性はｐＬＦ０２７を持つ細胞においては１５℃で確実に増加した（図８ｂ）。これらの結果はｐＭＭ０２７及びｐＭＭ０２８と共に、ＳＤ配列を含む開始コドンの上流にある領域ではなく、Ｎ末端領域にある短いコード配列が１５℃でのｌａｃＺ融合ｍＲＮＡの翻訳効率に関与していることを示す。ｐＬＦ０２７からのｍＲＮＡは高い翻訳効率を持つが、ｐＬＦ０２８からのｍＲＮＡは持たない。
【００７３】
下流ボックス配列が１５℃でのｐＬＦ０２７からの転写生成物の翻訳効率に関与しているかどうかを調べるため、ｌａｃＺ遺伝子はｃｓｐＡの４番目のコドンで融合され、下流ボックス配列が除去され、ｐＬＦ０２９が作り出された（構造については図８ａを、ＤＮＡ配列については図８ｃを参照されたい。）。ｐＬＦ０２９で形質転換されたイー・コリＡＲ１３７はｐＬＦ０２７及びｐＬＦ０２８について記述されたのと同じように３７℃及び１５℃でのβ−ガラクトシダーゼ活性の誘導について調べられた。図８ｂに示されるように３７℃でのβ−ガラクトシダーゼ活性はｐＬＦ０２７のそれの約５０％であった。このことは３７℃でのｐＬＦ０２７  ｍＲＮＡの翻訳効率がＳＤ配列及び下流配列の両方によって調節されることを示す。しかし、ｐＬＦ０２７  ｍＲＮＡと対照的に低温ショックによってβ−ガラクトシダーゼ活性は増加しなかった。この結果は下流ボックス配列がｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの効果的な翻訳において主要な役割を果たすことを明確に示している。
【００７４】
実施例１０
低温ショック適応についてのｃｓｐＡ上流領域のマルチコピー効果
ｃｓｐＡ遺伝子は３７℃から１５℃又は１０℃への温度低下直後に誘導されること、及びＣｓｐＡ生産速度は温度低下後１５℃では１時間後に、及び１０℃では２時間後にピークに達することが示されている（３）。この時点以降、ＣｓｐＡ生産は新しい基礎レベルに急落する。ＣｓｐＡのこの一過性生産の時期は、低温ショック後に観察される、遅滞期として知られる増殖阻害の継続に相当する（７）。従って、ＣｓｐＡのかかる一過性発現は低温への細胞適応に必要であるとみなされる。
【００７５】
ｃｓｐＡのこの一過性発現の特性決定をするため、我々は適応期間中のｃｓｐＡ発現の調節に必要とされる領域を同定しようと試みた。この目的のため、６００−ｂｐ  ｃｓｐＡ上流領域がｌａｃＺ遺伝子に転写的に（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ）融合されているｐＪＪＧ７８がまず構築された（図９ａ）。ｃｓｐＡのこの６００ｂｐの上流領域はｃｓｐＡの転写開始部位を＋１と規定して、ｃｓｐＡのＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列の直前にある−４５７〜＋１４３からの領域を含む（３）。イー・コリ株ＣＬ８３はｐＪＪＧ７８で形質転換され、β−ガラクトシダーゼの生産は３７℃から１５℃への温度低下から０，０．５，及び３時間後に［３５Ｓ］メチオニンで細胞をパルスラベルすることによって調べられた。コントロールとしてＣＬ８３細胞、及びベクターｐＫＭ００５で形質転換されたＣＬ８３細胞（４）が用いられた。図９ｂに示されるとおり、ＣＬ８３及びＣＬ８３／ｐＫＭ００５の両方について、ｃｓｐＡの発現は温度低下後０．５時間で高度に誘導された（図９ｂ、それぞれレーン２及び５）。しかし参考文献（３）に既に示されているように、この高い発現は一過性であり、３時間で新しい基礎レベルに減少した（図９ｂ、それぞれレーン３及び６）。０時点ではｃｓｐＡ発現が検出されなかったこと（図９ｂ、それぞれレーン１及び４）、及びβ−ガラクトシダーゼは両方の株についていかなる時点でも生産されなかったこと（図９ｂ、レーン１〜６）に注意されたい。
【００７６】
ＣＬ８３及びＣＬ８３／ｐＫＭ００５とは対照的に、ｐＪＪＧ７８を持つ細胞においてはβ−ガラクトシダーゼは温度低下を受けると明らかに誘導された（図９ｂ、レーン７〜９）。このことはｃｓｐＡの６００ｂｐの上流領域が低温ショック誘導に関与していることを示す。驚くべきことに、ｐＪＪＧ７８を持つ細胞においてはｃｓｐＡの生産はもはや一過性ではなく、低温ショックの３時間後でさえも高レベルに保持されていた（図９ｂ、レーン９をレーン３及び６と比較されたい。）。ｐＪＪＧ７８はｃｓｐＡコード配列を含まないので、温度低下の３時間後のｃｓｐＡの高生産は染色体ｃｓｐＡ遺伝子に起因する。用いられた条件下では染色体ｃｓｐＡ遺伝子は抑制されず、つまり抑制解除されるようになったようである。興味深いことに図９ｂにおいてはＸで示される他のバンドがあり、その発現パターンはｃｓｐＡのそれとほぼ同一であった。それは低温ショックタンパク質であり、その生産もｐＪＪＧ７８の存在下で抑制解除された。この低温ショックタンパク質ＸはＣｓｄＡであると最近同定された。それはリボソームと協同する（１０）。
【００７７】
大部分の細胞タンパク質の合成は低温ではＣＬ８３細胞及びＣＬ８３／ｐＫＭ００５におけるよりもｐＪＪＧ７８を持つ細胞においてより大きく阻害されたことにも注意すべきである（図９ｂ、レーン８及び９をレーン２，３，５及び６と比較されたい。）。これらの結果は低温への細胞適応は細胞がｃｓｐＡ遺伝子の一部分を持つマルチコピープラスミドを持つ場合、より厳しい低温ショック応答によってそこなわれるということを示す。
【００７８】
低温ショック後のＣｓｐＡの延長された合成がｐＪＪＧ７８によって引き起こされるので、ｐＪＪＧ７８にクローニングされた６００ｂｐのｃｓｐＡ上流領域が低温ショック後ＣｓｐＡ生産の阻害に関与する因子を隔離し、ｃｓｐＡの抑制解除又は延長された発現を生ずるのかもしれないと考えられる。この仮説を確かめるため、ｃｓｐＡの６００ｂｐの上流領域がｐＵＣ１９に再クローニングされた。そのプラスミドはｐＵＣ１９−６００と呼ばれる。ｐＵＣ１９のコピー数（３００コピー／細胞）はｐＢＲ３２２由来のｐＪＪＧ７８（３０コピー／細胞）よりも約１０倍高いということに注意されたい。パルスラベル実験は参考文献（６）に既に記述されているように行われた。図１０に示されるとおり、ＣＬ８３細胞においてはＣｓｐＡ生産は１５℃では１．５時間まで増大し、３時間後には基礎レベルに減少した（図１０、レーン１〜６）。ｐＪＪＧ７８を持つＣＬ８３細胞においては１５℃で２４時間後でも一定レベルのｃｓｐＡ発現が観察された（図１０、レーン７〜１２）。ｐＵＣ１９−６００を持つＣＬ８３細胞のＣｓｐＡ生産のパターンはｐＪＪＧ７８を持つもののそれに類似している（図１０、レーン１３〜１８）。しかし、３時間及び５時間でのＣｓｐＡ生産から判断すると、ｃｓｐＡ抑制解除のレベルはｐＪＪＧ７８を持つものよりもｐＵＣ１９−６００を持つものの方がずっと高かった。このように、ｃｓｐＡ上流領域のコピー数が高いほど、ＣｓｐＡ発現の抑制解除は強い。又、ＣｓｄＡ（Ｘで示される）は図１０に示されるすべてのレーンにおいてＣｓｐＡと正確に同じ発現パターンを示した。
【００７９】
図９ｂに示されるように、ｐＪＪＧ７８を持つ細胞は低温で一般的タンパク質合成の一定の阻害を示した（図１０のレーン８〜１１をレーン２〜５と比較されたい。）。注意すべきことに、ｐＵＣ１９−６００を持つ細胞におけるこの阻害はタンパク質合成速度及び阻害時間の両方の意味でｐＪＪＧ７８を持つ細胞よりもずっと明らかであった（図１０のレーン１４〜１７をレ〜ン８〜１１と比較されたい。）。６００ｂｐのｃｓｐＡ上流領域のコピー数が高くなると他の細胞タンパク質の合成の阻害が強くなる。このことは低温ショック適応が阻害されたことを示す。
【００８０】
実施例１１
ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの５′非翻訳領域の過剰生産
６００ｂｐ配列の内でも低温での低温ショック適応の阻害及びｃｓｐＡの抑制解除に必要な正確な領域を決定するため、図１１に示されるようないくつかの内部断片がＰＣＲによって作られ、ｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位にクローニングされた。それらの配列はＤＮＡ配列決定によって確認された。各構築物について１５℃で低温ショック適応を阻害する能力及びｃｓｐＡの発現を抑制解除する能力がパルスラベル実験によって調べられた。まず、６００ｂｐ断片の５′末端から欠失突然変異体が作られた。図１１に示すとおり、断片３（１８６塩基の欠失）、断片２（３１２塩基の欠失）、断片２Ｅ（３６６塩基の欠失）、及び断片２Ｇ（３９０塩基の欠失）すべてが抑制解除機能を保持していた。次に断片２は図１１に示すように２３ｂｐで重複する断片２Ａ及び２Ｂに更に分けられた。驚くべきことに、２Ａ及び２Ｂの両方ともが機能を失っていた。断片２Ｂよりも５′末端で３３ｂｐだけ長い断片２Ｆも構築されたが、これも機能することができなかった。ｃｓｐＡの抑制解除ができる構築物は低温ショック適応の阻害をも引き起こすこと、そして逆もまた同じであることがここにおいて見出された。
【００８１】
断片２はｃｓｐＡ抑制解除及び低温ショック適応の阻害の両方について機能的であるのに断片２Ａはそうでないという事実はｃｓｐＡプロモーター領域のみでは６００ｂｐ断片が機能するのには十分ではないということを示す。更に、機能的断片２Ｇは非機能的断片２Ｆよりも３１ｂｐだけ５′末端で長いという事実は両方の機能がｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの５′ＵＴＲの転写についてｃｓｐＡプロモーター全体を必要としている可能性を示唆する。ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡが５′末端に１５９塩基の非翻訳配列を持つことに注意されたい（３）。この可能性を確かめるため、クローニングされた断片（断片２，２Ａ，２Ｂ，２Ｅ，及び２Ｆ）から生産されたｃｓｐＡ転写生成物はプライマー伸長によって調べられた。１５℃で１時間インキュベートされた、様々なプラスミドを持つ細胞から単離されたＲＮＡ画分全体を用いて、二つの独立したプライマーを用いてプライマー伸長が行われた；５′ＵＴＲの＋１２４〜＋１４３の配列に相当するプライマー３５５０及び＋２２４〜＋２４３のｃｓｐＡコード配列の一部分に相当するプライマー３５５１。前者のプロモーターはプラスミド及び染色体の両方から転写されるｃｓｐＡ  ｍＲＮＡを検出し、一方、後者は染色体ｃｓｐＡ遺伝子からのｍＲＮＡのみを検出する。何故ならいずれのプラスミドもｃｓｐＡコード領域を含んでいないからである。
【００８２】
図１２に示されるとおり、プライマー３５５１によって示される染色体ｃｓｐＡ遺伝子からの転写産物の量はすべての構築物の間でほぼ同じであった（図１２、レーン１〜６）。対照的に、プライマー３５５０によって示される、５′ＵＴＲを含むｃｓｐＡ転写生成物の量は二つの異なるレベルを示した。非機能的な構築物（ｐＵＣ１９−２Ａ，ｐＵＣ１９−２Ｂ，及びｐＵＣ−２Ｆ）についてはプライマー３５５０によって検出される転写生成物の量（それぞれ図１２のレーン３，４，及び６）はｐＵＣ１９を持つもののそれ（図１２のレーン１）とほぼ同様であった。このことはこれらのプラスミドにクローニングされたｃｓｐＡ領域は転写されなかったことを示す。他方、機能的構築物（ｐＵＣ１９−２及びｐＵＣ１９−２Ｅ）についてはプライマー３５５０によって検出されるｃｓｐＡ転写生成物のレベル（それぞれ図１２のレーン２及び５）はｐＵＣ１９を持つもののレベル（図１２のレーン１）と比較するとずっと高かった。これらの結果はｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの５′ＵＴＲは断片２及び２Ｅでは転写されるが断片２Ａ、２Ｂ及び２Ｆでは転写されないことを示す。このように低温での低温ショック適応を阻害する能力及びｃｓｐＡ発現を延長させる能力はｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの５′ＵＴＲの転写と関連している。
【００８３】
ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの５′ＵＴＲの転写がｃｓｐＡ抑制解除及び低温ショック適応の阻害の両方に必要であることを確実に示すため、プロモーター断片全体（−４５７〜−１）及びｃｓｐＡからの６塩基領域（＋１〜＋６）がｐＵＣ１９へクローニングされた。この断片は断片１と命名された（図１１を参照されたい。）。このように断片１においてはｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの５′ＵＴＲの大部分が除去されていた。図１３ｂに示されるようなパルスラベル実験によって、断片１はｃｓｐＡプロモーターからの転写生成物がプライマー伸長によってはっきりと検出可能であるにもかかわらず、ｃｓｐＡを抑制解除することができないことが示された（図１３ａ）。これらの結果から、ｃｓｐＡ発現及び低温ショック適応について効果を発揮するためには、＋１〜＋１４３のｃｓｐＡ非翻訳領域の少なくとも一部分が転写される必要があると結論付けることができる。
【００８４】
実施例１２
ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの５′ＵＴＲの過剰生産によって影響を受ける低温ショック遺伝子
次に、ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡが他の低温ショック遺伝子の発現に影響を及ぼすかどうか決定するため、ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの５′ＵＴＲの過剰生産が調べられた。ｃｓｐＡ  ５′ＵＴＲを過剰生産している低温ショックを受けた細胞のタンパク質発現パターンが二次元電気泳動によって分析された。プラスミドｐＪＪＧ２１／Ｘ，ＳはｃｓｐＡプロモーター全体及びｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの５′ＵＴＲの大部分（＋１〜＋１４３）を含むが、ｐＪＪＧ８１／Ｘ，ＳはｃｓｐＡプロモーター全体とｃｓｐＡ非翻訳ｍＲＮＡの最初の６塩基領域のみを含む。これらのプラスミドを持つ細胞は参考文献（６）に記載されているようにパルスラベルされた。３７℃ではタンパク質合成速度及びタンパク質パターンは両方の株について極めて類似していた（図１４，Ａ及びＢ）；低温ショックタンパク質は検出されていないことに注意されたい。これらの細胞が１時間１５℃におかれると（図１４，Ｃ及びＤ）、低温ショックタンパク質（１．ＣｓｐＡ；２．ＣｓｐＢ′；３．ＣｓｐＢ；及び４．ＣｓｄＡ）の合成が極めて顕著になってくる。ＣｓｐＢ′はＣｓｐＢと共誘導され、ＣｓｐＢの修飾された形態か又は未同定の低温ショックタンパク質であろうと考えられている（２）ことに注意されたい。両方の構築物についての低温ショックタンパク質の合成速度はスポットの濃さから判断すると同じくらいである。大部分の他の細胞タンパク質の合成は両方の株について３７℃でのものと比較すると有意に減少するが、ｐＪＪＧ２１／Ｘ，Ｓで形質転換された細胞においてはずっと強い阻害効果が観察された。細胞が１５℃で３時間インキュベートされると、大部分の細胞タンパク質の合成はｐＪＪＧ８１／Ｘ，Ｓを持つ細胞におけるすべての低温ショックタンパク質の減少に付随して通常レベルに回復した（図１４ｆ）。対照的にｐＪＪＧ２１／Ｘ，Ｓを持つ細胞についてはすべての低温ショックタンパク質（１〜４でマークされている）の生産は他の細胞タンパク質の生産の減少に付随して極めて高レベルになおも維持されていた（図１４ｅ）。これらの結果はｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの５′ＵＴＲの過剰生産はｃｓｐＡのみならず他の低温ショック遺伝子の抑制解除をも引き起こすことを明らかに示し、低温ショックタンパク質遺伝子が共通のメカニズムによって調節されていることを示唆する。低温ショック適応の阻害はｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの５′ＵＴＲが過剰生産されて他の細胞タンパク質の合成を阻害することによって起こることも更に確認される。上述の結果に基づいてｃｓｐＡ  ｍＲＮＡのＵＴＲの過剰生産は他の細胞タンパク質の付随的阻害を引き起こすことが示唆される。これは低温ショック後の細胞増殖は野生型細胞よりもｃｓｐＡ  ｍＲＮＡのＵＴＲを過剰生産する細胞でより厳しく阻害されるであろうということを意味する。ｐＵＣ１９−６００又はｐＵＣ１９−２Ｇを持つ細胞の増殖（図１１を参照されたい。）は実際、ひどく阻害される。これは長い遅滞期によって特性付けられる（データーは示さず。）。
【００８５】
実施例１３
ｃｓｐＡの過剰生産の効果
ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの５′ＵＴＲの過剰生産はＣｓｐＡの過剰生産の延長を引き起こす（図１０を参照されたい）。それ故、上で観察された効果はｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの５′ＵＴＲよりもむしろＣｓｐＡタンパク質の過剰生産によるのであろう。この可能性はｃｓｐＡ遺伝子全体を含むｐＪＪＧ０２を持つＣＬ８３細胞を用いて調べられた。パルスラベル実験は上述のように行われた。ｐＵＣ１９を持つＣＬ８３株を用いて図１５に示されるように、ｃｓｐＡ及びｃｓｄＡ（タンパク質Ｘの遺伝子）の発現は１５℃への温度低下後１時間で誘導され（レーン１及び２）、温度低下後３時間で基礎レベルに戻った（レーン３）。一方細胞がｐＪＪＧ０２で形質転換された場合、ｃｓｐＡの発現は１５℃で誘導されるのみならず、二次元ゲル電気泳動によって判断されるようにｐＵＣ１９を持つ細胞よりも有意に高かった（データーは示さず。）。高いＣｓｐＡ生産は１５℃で３時間後でも観察されることに注意されたい（レーン６）。低温ショック後３時間でのＣｓｐＡのこの過剰生産は上述のｃｓｐＡの５′ＵＴＲの過剰生産（図１０）の場合に極めて類似していたが、同じ時点では細胞増殖の遅滞期の延長及びＣｓｐＢ及びＣｓｄＡの如き他の低温ショックタンパク質の生産の延長は観察されなかったことに気付くことは重要である。これらの結果はｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの５′ＵＴＲを持つＣｓｐＡの共生産は５′ＵＴＲのみの過剰生産の効果を抑制すること、及び低温ショックの３時間後のＣｓｐＡ生産の高レベルはこの効果の原因ではないことを示す。
【００８６】
結果の検討
タンパク質合成という意味での低温ショック応答は低温ショック遺伝子の一過性発現によって特徴付けられる。温度が下げられると、ｃｓｐＡ，ｃｓｐＢ，及びｃｓｄＡの如きいくつかの低温ショック遺伝子が劇的に誘導される（３，９，１０）。しかし、発現はすぐに新しい基礎レベルに減少する。低温ショック遺伝子のかかる一過性発現は低温への細胞適応にとって必須であると考えられる。何故なら低温ショック後の細胞増殖の遅滞期は低温ショック遺伝子の一過性発現の期間に相当するからである（７，８）。本発明においてはｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの５′ＵＴＲが低温ショック後に過剰生産されると、細胞は以下にまとめる通りストレスに対して適切に応答することができないことが示された：（ａ）低温ショック遺伝子の発現はもはや一過性ではない。（ｂ）低温ショックタンパク質と対照的に、他の細胞タンパク質の合成は長時間ひどく損なわれる；低温ショックタンパク質の生産と他の細胞タンパク質の生産の間には相互関係がある。（ｃ）低温ショック後に通常観察される細胞増殖の一時的停止も延長される。
【００８７】
これらの結果に基づいて、低温ショック遺伝子生成物は低温への細胞適応にとって必須である、つまり、より効果的な翻訳、転写、及び／又はＤＮＡ複製のために必要であると推測することができる。これらの適応過程は他の非低温ショックタンパク質の合成の一時的阻害を引き起こし、それは細胞増殖の遅滞期又は一時的停止をもたらす。低温ショックタンパク質の誘導された生産は新しい基礎レベルにまで減少又は抑制される必要があり、次にそれは他の細胞タンパク質の合成を可能にし、それによって通常の細胞増殖が再開される。現在では低温ショックタンパク質の合成と他の細胞タンパク質の間の相互関係のメカニズムは知られていない。しかし、現在までの結果はｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの異常に長い５′ＵＴＲ（１５９塩基）（３）がそれ自体の遺伝子ｃｓｐＡのみならず、ｃｓｐＢ及びｃｓｄＡの如き他の低温ショック遺伝子の高度に誘導される発現の抑制において重要な役割を果たすことをはっきりと示す。
【００８８】
ｃｓｐＡ，ｃｓｐＢ（２）及びｃｓｄＡ（１０）はすべて異常に長い５′ＵＴＲ（それぞれ１５９，１６１，及び２２６塩基）を持つｍＲＮＡを生産することに気付くことは興味深いことである。これらのＵＴＲ中、「低温ボックス（ｃｏｌｄ  ｂｏｘ）」と命名された、１１塩基からなる高度に相同の配列が各々のｍＲＮＡ中に見出されている（図１６Ａ）。低温ボックスにおいては、ｃｓｐＡとｃｓｐＢの間、及びｃｓｐＡとｃｓｄＡの間にはそれぞれ２及び１のミスマッチしかない。低温ボックスの共通配列は図１６Ａに示すとおりＵＧＡＣＧＵＡＣＡＧＡである。低温ボックスがリプレッサー結合部位であると推測するのは魅力的である。ｃｓｐＡ生産が低温ショック適応中減少するにつれ、ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの量はほぼ平行して減少することに気付くことは重要である（１７）。この結果は低温ショック適応中のｃｓｐＡの抑制はｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの量に比例していること、及びそれは翻訳レベルでは調節されていないことを示す。我々は仮想的な低温ショック誘導可能リプレッサーが低温ショックｍＲＮＡに共通の低温ボックス配列に結合し、それが次にこれらの遺伝子の転写を阻害する（仮説Ｉ）か又はそれらのｍＲＮＡを不安定にさせる（仮説ＩＩ）ということを提案する。この提案を実際に支持する結果が得られており、そこではｃｓｐＡ抑制解除に関与する領域はｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの最初の２５塩基配列中に存在する（データーは示さず）。更にｃｓｄＡ  ５′ＵＴＲはｃｓｐＡプロモーター下で発現されると低温でのｃｓｐＡ発現を抑制解除することができた（データーは示さず）。
【００８９】
本発明によれば、低温ボックスに結合するリプレッサーは遺伝子の更なる転写に干渉することが提案される。ｍＲＮＡに結合するリプレッサーがどのようにしてＲＮＡポリメラーゼの機能をシスで（ｉｎ  ｃｉｓ）阻害して更なるＲＮＡ伸長を阻害するかは現在ではまだ知られていない。仮想的なリプレッサーは低温ショック誘導可能であり、その細胞レベルが一定のしきい値よりも高くなるとそれは低温ショック誘導可能なｍＲＮＡの低温ボックスに結合すると考えられている。それ故、低温ボックスを含むｍＲＮＡの一部分の過剰生産はリプレッサーを隔離し、低温ショック遺伝子の発現抑制解除を引き起こす。仮説ＩＩにおいては、低温誘導可能な因子又はリプレッサーは低温ボックス配列に結合し、それは低温ショックｍＲＮＡを不安定化し、それらの細胞濃度を減少させる。これは次に低温ショックタンパク質の生産の減少を引き起こす。
【００９０】
５′ＵＴＲとのＣｓｐＡの共過剰生産は通常の低温ショック応答を再開させるので、ＣｓｐＡはそれ自体がリプレッサーの機能に直接的又は間接的に関与しているようである。ＣｓｐＡ（これはＲＮＡシャペロンとして機能することが推定されている（９）。）は低温ボックス又は低温ボックス関連構造に結合するのかもしれない。もしそうなら、ｍＲＮＡ上に結合するＣｓｐＡがどのようにして転写の減弱又はｍＲＮＡの不安定化を引き起こすのかということは興味深い問題である。
【００９１】
材料及び方法
イー・コリ株及び培養培地。イー・コリＣＬ８３［ｒｅｃＡ  ａｒａ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）ｒｐｓＬ（＝ｓｔｒＡ）ｆ８０  ｌａｃＺ  Ｍ１５］（１２）はすべての実験に用いられ、既述（１３）されたようにＭ９−カザミノ酸培地で増殖された。パルスラベル実験には、メチオニンを欠くアミノ酸混合物が用いられた。各アミノ酸の最終濃度は５０ｍｇ／ｍｌであった。
【００９２】
プラスミドの構築
ｐＪＪＧ０２は以下のようにしてｐＪＪＧ０１（３）から構築された：ｃｓｐＡ遺伝子全体を含む９９８塩基の断片はＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｍｎＩ消化によってｐＪＪＧ０１から得られた。この断片は次にＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理され、ｐＵＣ９のＳｍａＩ部位に挿入された。
【００９３】
ｐＪＪＧ２１は以下のようにｃｓｐＡのＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列のすぐ上流にＸｂａＩ部位を作り出すことによってｐＪＪＧ０２から構築された：
2007061106.tif 000015
（かっこ内の元のヌクレオチドは下線を引いたヌクレオチドによって置換された；参考文献１）。ｐＪＪＧ８１は以下のようにｃｓｐＡの転写開始部位のすぐ下流にｘｂａＩ部位を作り出すことによってｐＪＪＧ０２から構築された：
2007061106.tif 000016
（下線を引かれたヌクレオチドは挿入された塩基を表す）。
【００９４】
ｐＪＪＧ７８は以下のようなｌａｃＺと０．６ｋｂのｃｓｐＡ上流領域の転写的融合物である：ｐＪＪＧ２１からのｃｓｐＡを含む１ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片はＫｌｅｎｏｗ酵素で充填され、ｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位に結合された。次にｃｓｐＡ調節領域（−４５７〜＋１４３）を含む０．６ｋｂのＸｂａＩ断片が切り出され、正しい配向でｐＫＭ００５のＸｂａＩ部位に結合された（４）。
【００９５】
ｐＵＣ１９−６００はｐＪＪＧ２１からの０．６ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片をｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ部位に挿入することによって構築された。断片１を含むｐＪＪＧ８１／Ｘ，Ｓ（図３）はｐＪＪＧ８１から０．７４ｋｂのＸｂａＩ／ＳａｌＩ断片を除去することによって構築された。両端はＫｌｅｎｏｗ断片で処理され、次に自己結合された。図３に示す他のすべての構築物はＰＣＲによって作られた（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  のプロトコル）。ＰＣＲ増幅された断片はｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位に挿入された。すべてのＰＣＲ生成物はＤＮＡ配列決定によって確認された（１５）。
【００９６】
ｐ２ＪＴＥＫは以下のようにして構築された：プライマー３５４９
2007061106.tif 000017
及びプライマー４４２８
2007061106.tif 000018
によるＰＣＲ生成物はｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位にクローニングされた。このＰＣＲ生成物はｃｓｐＡの転写開始部位を＋１と規定して−１４６から＋２５までのｃｓｐＡを含む。次にｃｓｐＡの転写ターミネーターがプライマー６２９０
2007061106.tif 000019
及び４８６０
2007061106.tif 000020
を用いてＰＣＲによって増幅された。次にＰＣＲ生成物はＥｃｏＲＩで消化され、ＥｃｏＲＩ及びＳｓｐＩで消化された上述のプラスミドへクローニングされた。次にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫからの５２ｂｐのＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ断片はＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩ部位へクローニングされた。すべてのＰＣＲ生成物はＤＮＡ配列決定によって確認された（１５）。
【００９７】
ｐ６ｍＴＥＫは最初のＰＣＲが異なるプライマー：プライマー３５５２
2007061106.tif 000021
及び６１９５
2007061106.tif 000022
を用いて行われたことを除いてはｐ２ＪＴＥＫと同じようにして構築された。このＰＣＲ生成物はｃｓｐＡの転写開始部位を＋１と規定してｃｓｐＡの−２７８から＋６までを含む。すべてのＰＣＲ生成物はＤＮＡ配列決定によって確認された（１５）。
【００９８】
パルスラベル実験は既に記載されている通りに行われた（６）。タンパク質はポリアクリルアミドＳＤＳゲル電気泳動（５）によって又は既に記載されている通り２次元電気泳動（７）によって分析された。
【００９９】
プライマー伸長実験に用いられたプライマー
プライマー３５５０
2007061106.tif 000023
はｃｓｐＡの転写開始部位を＋１と規定して＋１４３から＋１２４ｎｔの配列に相当する（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ等，１９９０）。プライマー３５５１
2007061106.tif 000024
は＋２４３から＋２２４ｎｔまでである。逆プライマー
2007061106.tif 000025
は４６８から４８７ｎｔまでのｐＵＣ９の配列に相当する（１９）。プライマーは既に記載されている通り（６）、Ｔ４キナーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて［ｇ−３２Ｐ］ＡＴＰによって５′末端でラベルされた。ＲＮＡは既に記載されている方法（６）に従って抽出された。
【０１００】
図の説明
図１〜８は上述されている。
図９。  （Ａ）６００ｂｐのｃｓｐＡ上流領域及びｌａｃＺ遺伝子の転写的融合物を含むｐＪＪＧ７８の地図。ｐＪＪＧ７８の構造は「材料及び方法」に記載されている。６００ｂｐのｃｓｐＡ上流領域はｃｓｐＡの−４５７から＋１４３塩基の配列に相当する（３）。
（Ｂ）ｃｓｐＡの６００ｂｐ上流領域の効果。パルスラベル実験は「材料及び方法」において記述されている通りに行われた。細胞培養物は中間対数相（８０Ｋｌｅｔｔ  単位）で３７℃から１５℃へ温度低下された。パルスラベルの時点は上の各レーンに示されている。同一の培養物容量（０．２５ｍｌ）が各時点について用いられ、３７℃及び１５℃でのパルスラベル時間はそれぞれ５分及び１５分であった。ＣｓｐＡ、β−ガラクトシダーゼ、及びＣｓｄＡ（タンパク質Ｘ）の位置は矢印で示されている。レーン１〜３、ホスト細胞ＣＬ８３；レーン４〜６、ｐＫＭ００５を持つＣＬ８３細胞；及びレーン７〜９、ｐＪＪＧ７８を持つＣＬ８３細胞。ＣｓｐＡのすぐ下に見えるバンドは主要な外膜リポタンパク質であると同定されている（レーン１，３，４，６，及び７）。
図１０。  ｐＪＪＧ７８又はｐＵＣ１９−６００を持つＣＬ８３及びＣＬ８３株を用いたパルスラベル実験は「材料及び方法」で記述した通りに行われた。調べられた構築物及びパルスラベルの時点はレーンの上部に示されている。ＣｓｐＡ及びタンパク質Ｘ（ＣｓｄＡ）は矢印で示されている。レーン１〜６、ＣＬ８３細胞；レーン７〜１２、ｐＪＪＧ７８を持つＣＬ８３細胞；及びレーン１３〜１８、ｐＵＣ１９−６００を持つＣＬ８３細胞。
図１１。  全長６００ｂｐのｃｓｐＡ上流領域は上部に示されている。各断片の名称、５′及び３′末端位置は各バーの上に示されている。低温ショック適応過程中ｃｓｐＡ発現を抑制解除する能力は温度低下の３時間後でのＣｓｐＡ生産によって判断され、＋又は−で示されている。塗りつぶされたバーは染色体ｃｓｐＡ遺伝子を抑制解除することができるクローンを示し；塗りつぶされていないバーはｃｓｐＡを抑制解除することができない。
図１２。  各構築物の名称は各レーンの上部に示されている。二つの異なるプライマー（プライマー３５５０及び３５５１）は同量の総細胞ＲＮＡを用いたプライマー伸長に別々に用いられた。各レーンにおいて等量の二つの反応生成物が混合され、７Ｍ尿素−６％ポリアクリルアミドゲルに添加された。予測される伸長生成物はプライマー番号で示されている。
図１３。  （Ａ）ｐＪＪＧ８１／Ｘ，Ｓを用いた断片１（図３）におけるｃｓｐＡプロモーターからの転写生成物の検出。プライマー伸長実験は「材料及び方法」において記述された通りに行われた。ｐＵＣ１９からの逆プライマーは断片１においてｃｓｐＡプロモーターからの転写生成物を検出するのに用いられた。低温ショック後の時点はレーンの上部に示されている。（Ｂ）低温ショック処理（３７℃から１５℃へ）後の、ｐＪＪＧ８１／Ｘ，Ｓを持つＣＬ８３細胞のタンパク質合成のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。パルスラベル実験は「材料及び方法」に記述されている通りに行われた。パルスラベルの時点はレーンの上部に示されている。ＣｓｐＡ及びタンパク質Ｘ（ＣｓｄＡ）は矢印で示されている。
図１４。  パルスラベル実験及び二次元電気泳動は「材料及び方法」に記述されている通りに行われた。Ａ，Ｃ，及びＥはそれぞれ３７℃で、１５℃で１時間、及び１５℃で３時間の、ｐＪＪＧ２１／Ｘ，Ｓを持つＣＬ８３細胞のタンパク質発現パターンを示す。Ｂ，Ｄ，及びＦはそれぞれ３７℃で、１５℃で１時間、及び１５℃で３時間の、ｐＪＪＧ８１／Ｘ，Ｓを持つＣＬ８３細胞のタンパク質発現パターンを示す。低温ショックタンパク質は矢印で示されている。矢印１、ＣｓｐＡ；矢印２、ＣｓｐＢ′；矢印３、ＣｓｐＢ；及び矢印４、ＣｓｄＡ。
図１５。  ｐＵＣ１９及びｐＪＪＧ０２を持つＣＬ８３細胞は３７℃で（それぞれレーン１及び４）、１５℃で１時間（それぞれレーン２及び５）、及び３時間（それぞれレーン３及び６）パルスラベルされ、「材料及び方法」に記述されている通りにＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析された。ＣｓｐＡ及びタンパク質Ｘ（ＣｓｐＡ）は矢印で示されている。
図１６Ａ。  高度に相同な１１塩基配列は線で囲まれており、「低温ボックス」と名付けられている。共通の低温ボックス配列は下部に示されている。同一の塩基は垂直線によって連結されている。
【０１０１】
ここで参照されるすべての参考文献は参考文献として組入れる。
上述の記載に鑑みて、本発明の実施においては本発明の範囲からはずれることなしに多くの修正、変更、及び置換が可能である。かかる修正、変更、及び置換は請求の範囲の範囲に含まれることを意図される。
関連出願
この特許出願は「細菌中でのタンパク質発現を阻害する方法及び構築物」というタイトルで１９９６年１２月１９日に出願された係属中の特許（シリアルＮｏ．０８／７６９９４５）の部分係属出願である。この文献は参考文献としてその全体をここに組入れる。この出願は１９９６年３月２２日に出願された出願（シリアルＮｏ．６０／０１３９２２）の部分係属出願である。この文献はシリアルＮｏ．０８／７６９９４５の出願において参考文献としてその全体を組入れられている。
2007061106.tif 000026
2007061106.tif 000027
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】本発明のｍＲＮＡを過剰発現するＤＮＡ配列の構築を図式的に示す。
【図２】本発明のｍＲＮＡの過剰発現による細胞タンパク質合成の阻害を示す。
【図３】本発明のｍＲＮＡの低温ショック誘導発現による低温での細胞増殖の阻害を示す。
【図４】細菌コロニー形成についての本発明のｍＲＮＡの過剰発現の阻害効果を示す。
【図５】本発明のｍＲＮＡの発現による細菌タンパク質生産の抑制を示す。
【図６】本発明の外因性ｍＲＮＡを過剰発現する細胞からの内因性ｍＲＮＡの翻訳を示す。
【図７】ＣｓｐＡの翻訳開始領域の分析を示す。
【図８】ｍＲＮＡ翻訳効率についてのｃｓｐＡコード領域中の下流配列の効果を示す。  図１は本発明のｍＲＮＡを過剰発現するＤＮＡ配列の構築を図式的に示す。  図２は本発明のｍＲＮＡの過剰発現による細胞タンパク質合成の阻害を示す。  図３は本発明のｍＲＮＡの低温ショック誘導発現による低温での細胞増殖の阻害を示す。  図４は細菌コロニー形成についての本発明のｍＲＮＡの過剰発現の阻害効果を示す。  図５は本発明のｍＲＮＡの発現による細菌タンパク質生産の抑制を示す。  図６は本発明の外因性ｍＲＮＡを過剰発現する細胞からの内因性ｍＲＮＡの翻訳を示す。  図７はＣｓｐＡの翻訳開始領域の分析を示す。  図８はｍＲＮＡ翻訳効率についてのｃｓｐＡコード領域中の下流配列の効果を示す。
【図９】染色体ｃｓｐＡ発現及び他の細胞タンパク質の合成に対するｃｓｐＡ上流領域の効果を示す。
【図１０】ｐＪＪＧ７８及びｐＵＣ１９−６００による低温ショック適応の阻害及びＣｓｐＡの延長された発現を示す。
【図１１】低温ショック適応の阻害及びｃｓｐＡの抑制解除機能についてのｃｓｐＡ上流領域の欠失分析を示す。
【図１２】染色体及びプラスミドｃｓｐＡからの転写のレベルを示す。
【図１３】低温ショック適応の阻害及びｃｓｐＡの延長された発現についてのｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの５′非翻訳領域の転写についての必要条件を示す。
【図１４】他の低温ショックタンパク質及び非低温ショックタンパク質の生産についてのｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの５′非翻訳領域の過剰生産の効果を示す。
【図１５】低温ショック応答についてのｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの５′非翻訳領域と共同してのｃｓｐＡの共過剰生産（ｃｏ−ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）の効果を示す。
【図１６】ｃｓｐＡ，ｃｓｐＢ，及びｃｓｄＡについてのｍＲＮＡの５′非翻訳領域における配列類似性を示す。
【図１７Ａ】ｃｓｐＡのヌクレオチド配列及びそこから引き出されるＣｓｐＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１７Ｂ】ｃｓｐＡのヌクレオチド配列及びそこから引き出されるＣｓｐＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１７Ｃ】ｃｓｐＡのヌクレオチド配列及びそこから引き出されるＣｓｐＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１８Ａ】ｃｓｐＢのヌクレオチド配列及びそこから引き出されるＣｓｐＢタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１８Ｂ】ｃｓｐＢのヌクレオチド配列及びそこから引き出されるＣｓｐＢタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１９Ａ】ｃｓｄＡのヌクレオチド配列及びそこから引き出されるＣｓｄＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１９Ｂ】ｃｓｄＡのヌクレオチド配列及びそこから引き出されるＣｓｄＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１０３】
配列番号１３は共通配列である。
配列番号２３は人工配列（ｍＲＮＡ構造物）の記載である。ここで、ｎはｇ，ｃ，ｕまたはａであり、この配列は“ｎ”領域が０〜３０である構造物を包含する。
配列番号２４は人工配列（ｍＲＮＡ構造物をコードするＤＮＡ）の記載である。ここで、ｎはｇ，ｃ，ｔまたはａであり、この配列は“ｎ”領域が０〜３０である構造物を包含する。
配列番号２５は人工配列（ＤＮＡ構造物）の記載であり、ａはｔにより置換され、ｔはｃにより置換され、ａはｃにより置換される。  
配列番号２６〜２９，３３〜３７及び３９〜４７は人工配列（プライマー）の記載である。
配列番号３０〜３２は人工配列（構成されたペプチド）の記載である。
配列番号３８は転写開始位置の配列である。
配列番号４８はＣｓｐＡ  ５’ＵＴＲの配列である。
配列番号４９はＣｓｐＡ（−４５７から＋１４３）の配列である。
配列番号５０はＣｓｐＡ（−２７１から＋１４３）の配列である。
配列番号５１はＣｓｐＡ（−１４５から＋１４３）の配列である。
配列番号５２はＣｓｐＡ（−９１から＋１４３）の配列である。
配列番号５３はＣｓｐＡ（−６７から＋１４３）の配列である。
配列番号５４はＣｓｐＢ  ５’  ＵＴＲの配列である。
配列番号５５はＣｓｄＡ  ５’  ＵＴＲの配列である。
配列番号５６はＣｓｐＡプロモーターの配列である。
配列番号５７はＣｓｐＢプロモーターの配列である。
配列番号５８はＣｓｄＡプロモーターの配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【配列表】
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