(57)【要約】      （修正有）【課題】バージニアマイシンＭ生合成に関連する遺伝子ならびに遺伝子クラスターの提供。【解決手段】特定の配列のいずれかで表されるＤＮＡからなるバージニアマイシンＭ生合成遺伝子であり、また、上記配列ＤＮＡからなるバージニアマイシンＭ生合成遺伝子クラスターである。これらのバージニアマイシンＭ生合成遺伝子のいずれかを不活性化したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｇｉｎｉａｅ変異株を培養することによって、バージニアマイシンＭとＳのうちバージニアマイシンＳを特異的に生産することができる。【選択図】図１
2007061045.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）〜（Ｍ）のいずれかのＤＮＡからなるバージニアマイシンＭ生合成遺伝子。
（Ａ）  配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ（ｂｋｄＡ遺伝子）
（Ｂ）  配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ（ｂｋｄＢ遺伝子）
（Ｃ）  配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡ（ｖｉｒＡ遺伝子）
（Ｄ）  配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡ（ｖｉｒＢ遺伝子）
（Ｅ）  配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡ（ｖｉｒＣ遺伝子）
（Ｆ）  配列番号６の塩基配列からなるＤＮＡ（ｖｉｒＤ遺伝子）
（Ｇ）  配列番号７の塩基配列からなるＤＮＡ（ｖｉｒＥ遺伝子）
（Ｈ）  配列番号８の塩基配列からなるＤＮＡ（ｖｉｒＦ遺伝子）
（Ｉ）  配列番号９の塩基配列からなるＤＮＡ（ｖｉｒＧ遺伝子）
（Ｊ）  配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡ（ｖｉｒＨ遺伝子）
（Ｋ）  前記（Ａ）〜（Ｊ）のいずれかの塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、前記（Ａ）〜（Ｊ）のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
（Ｌ）  前記（Ａ）〜（Ｊ）のいずれかの塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、前記（Ａ）〜（Ｊ）のいずれかＤＮＡとの相同性が９０％以上であるＤＮＡ
（Ｍ）  前記（Ａ）〜（Ｊ）のいずれかのＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ
【請求項２】
下記（Ｎ）〜（Ｐ）のＤＮＡからなるバージニアマイシンＭ生合成遺伝子クラスター。
（Ｎ）  配列番号１１の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｏ）  前記（Ｎ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、前記（Ｎ）のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
（Ｐ）  前記（Ｎ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、前記（Ｎ）のＤＮＡとの相同性が９０％以上であるＤＮＡ
【請求項３】
Streptomyces virginiae変異株であって、請求項１記載のバージニアマイシンＭ生合成遺伝子が不活性化されており、バージニアマイシンのうちバージニアマイシンＳを特異的に生産する、Streptomyces virginiae変異株。
【請求項４】
請求項１記載のバージニアマイシンＭ生合成遺伝子が、全部もしくは部分的に欠失もしくは置換され、または、１個以上の塩基が付加されることにより、不活性化されている、請求項３記載のStreptomyces virginiae変異株。
【請求項５】
Streptomycesの培養によってバージニアマイシンＳを製造する方法であって、Streptomycesが請求項３または４記載のStreptomyces virginiae変異株である、バージニアマイシンＳの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バージニアマイシンＭ生合成遺伝子、それらの遺伝子からなる遺伝子クラスターおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
放線菌Streptomyces virginiaeが生産するバージニアマイシン（Virginiamycin）は、バージニアマイシンＭ（以下、「ＶＭ」という）とバージニアマイシンＳ（以下、「ＶＳ」という）とからなるStreptogramin系抗生物質（非特許文献１）であり、両者の共存によって顕著な相乗効果を示し、特にグラム陽性細菌に対して優れた抗菌活性を示すことが知られている。このようなバージニアマイシンは、水溶性に欠くためヒトへ適用が困難であったが、近年、バージニアマイシンからの水溶性誘導体の開発に成功したことにより、ヒトへの適用が有望視されている。特に、バージニアマイシンは、耐性菌がほとんど確認されていないという優れた抗菌性を示すことからも、医療分野等において非常に有用と考えられる。
【０００３】
しかしながら、バージニアマイシンのうちＶＭは、ＶＳ（非特許文献２）と比較して、その生合成機構が遺伝学的に解明されていない。
【非特許文献１】Takuya Nihira, Microbial Secondary Metabolites:Genetics and Regulation, Research signpost (2002) 99-119
【非特許文献２】Namwat et. al. Gene (2002) 286, 283-290
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このため、Streptomyces virginiaeについて、例えば、ランダムな変異ではなく、特定の部位、すなわち、ＶＭの生合成に関与する遺伝子のみを選択的に破壊して、ＶＳのみを生産する変異株を作製することができなかった。また、ＶＭ生合成に関与する遺伝子が未知であることから、ＶＭ生合成の機構を遺伝学的に解明できず、このため、遺伝学的手法によるＶＭの合成方法を確立することも出来ない状況にある。
【０００５】
そこで、本発明は、ＶＭ生合成に関連する遺伝子ならびに遺伝子クラスターの提供を目的とし、さらに、ＶＭ生合成遺伝子が不活性化されたStreptomyces virginiae変異株ならびにこれを用いたＶＳの製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するため、本発明のＶＭ生合成遺伝子は、下記（Ａ）〜（Ｍ）のいずれかのＤＮＡからなることを特徴とする。
（Ａ）  配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ（ｂｋｄＡ遺伝子）
（Ｂ）  配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ（ｂｋｄＢ遺伝子）
（Ｃ）  配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡ（ｖｉｒＡ遺伝子）
（Ｄ）  配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡ（ｖｉｒＢ遺伝子）
（Ｅ）  配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡ（ｖｉｒＣ遺伝子）
（Ｆ）  配列番号６の塩基配列からなるＤＮＡ（ｖｉｒＤ遺伝子）
（Ｇ）  配列番号７の塩基配列からなるＤＮＡ（ｖｉｒＥ遺伝子）
（Ｈ）  配列番号８の塩基配列からなるＤＮＡ（ｖｉｒＦ遺伝子）
（Ｉ）  配列番号９の塩基配列からなるＤＮＡ（ｖｉｒＧ遺伝子）
（Ｊ）  配列番号１０の塩基配列からなるＤＮＡ（ｖｉｒＨ遺伝子）
（Ｋ）  前記（Ａ）〜（Ｊ）のいずれかの塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、前記（Ａ）〜（Ｊ）のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
（Ｌ）  前記（Ａ）〜（Ｊ）のいずれかの塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、前記（Ａ）〜（Ｊ）のいずれかＤＮＡとの相同性が９０％以上であるＤＮＡ
（Ｍ）  前記（Ａ）〜（Ｊ）のいずれかのＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ
また、本発明のＶＭ生合成遺伝子クラスターは、下記（Ｎ）〜（Ｐ）のＤＮＡからなることを特徴とする。
（Ｎ）  配列番号１１の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｏ）  前記（Ｎ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、前記（Ｎ）のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
（Ｐ）  前記（Ｎ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、前記（Ｎ）のＤＮＡとの相同性が９０％以上であるＤＮＡ
【０００７】
本発明のStreptomyces virginiae変異株は、前記本発明のＶＭ生合成遺伝子が不活性化されており、バージニアマイシンのうちＶＳを特異的に生産する変異株であることを特徴とする。また、本発明のＶＳの製造方法は、本発明のStreptomyces virginiae変異株の培養によってＶＳを製造することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明者らは、放線菌の二次代謝産物生合成遺伝子はその調節制御因子周辺に位置するという点に着目し、S. virginiae MAFF 10-06014株のゲノムＤＮＡについて、ＶＭ制御因子（ＢａｒＡ、ＢａｒＢ、ＢａｒＸ、ＢａｒＺ、ＶｍｓＲ等：下記文献参照）の周辺領域約３６．７ｋｂの塩基配列の解析を行った。そして、この塩基配列に基づくアミノ酸配列の情報から、コードされるタンパク質の機能を推定し、ＶＭ生合成に関与する複数の遺伝子、すなわち、分枝鎖α-ケト酸デヒドロゲナーゼ（branched-chain α-keto acid dehydrogenase:以下、「ＢＣＤＨ」という）を構成するＥ１ component(α／β融合タンパク質)およびＥ２componentの各コード遺伝子（ｂｋｄＡ、ｂｋｄＢ）、ならびに、ハイブリッドポリケチド／非リボソーマルペプチドシンターゼ（hybrid polyketide / non-ribosomal peptide synthase：以下、「ＰＫＳ／ＮＲＰＳ」という）群をコードする複数の遺伝子（ｖｉｒＡ〜ｖｉｒＨ）を同定するに至った。なお、これらの遺伝子が、それぞれＶＭ生合成に関与する遺伝子であることは、表現型がＶＭ生産型であるS. virginiae野生株から、前記各遺伝子の破壊株（disruptant）を作製し、その表現型がＶＭ非生産型に変化したことによって確認済みである。
H. Kinoshita, et. al. 1997. J. Bacteriol. 179:6986-6993.
R. Kawachi, et. al. 2000. Mol. Microbiol. 36:302-313.
R. Kawachi, et. al. 2000. J. Bacteriol. 182:6259-6263.
K. Matsuno, et. al. 2004. Arch. Microbiol. 181:52-59.
【０００９】
このような本発明のＶＭ生合成遺伝子やＶＭ生合成遺伝子クラスターを用いれば、さらにこれらの隣接領域の解析を行い、完全なＶＭ生合成遺伝子クラスターを同定することが可能であり、また、ＶＭ生合成系についての完全な生合成機構を明らかにすることができる。バージニアマイシンは、前述のように優れた抗菌活性を有し、ヒトへの適用が有望視されていることからも、ＶＭ生合成系の遺伝学的解明に寄与する本発明の遺伝子ならびに遺伝子クラスターは極めて有用であると言える。また、ＶＭ生合成遺伝子が明らかとなったことから、これらの遺伝子のいずれかを欠失させた本発明のStreptomyces virginiae変異株によれば、ＶＳのみを特異的に合成することができる。前述のようにバージニアマイシンは水溶性誘導体への変換によってヒトへの適用が可能となるため、誘導体の原料としてＶＳのみを合成することによって、ＶＳの誘導体への変換を効率良く行うこともできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のＶＭ生合成遺伝子は、前述のように、前記（Ａ）〜（Ｍ）のいずれかのＤＮＡからなることを特徴とする。
【００１１】
前述のように、配列番号１で表される遺伝子は、ＢＣＤＨを構成するＥ１ componentをコードするｂｋｄＡ遺伝子であり、配列番号２で表される遺伝子は、ＢＣＤＨを構成するＥ２ componentをコードするｂｋｄＢ遺伝子である。また、配列番号３〜１０で表される遺伝子は、前述のように多機能酵素であるＰＫＳ／ＮＲＰＳ群の遺伝子であり、以下、それぞれｖｉｒＡ〜ｖｉｒＨ遺伝子という。
配列番号１：ｂｋｄＡ遺伝子
配列番号２：ｂｋｄＢ遺伝子
配列番号３：ｖｉｒＡ遺伝子
配列番号４：ｖｉｒＢ遺伝子
配列番号５：ｖｉｒＣ遺伝子
配列番号６：ｖｉｒＤ遺伝子
配列番号７：ｖｉｒＥ遺伝子
配列番号８：ｖｉｒＦ遺伝子
配列番号９：ｖｉｒＧ遺伝子
配列番号１０：ｖｉｒＨ遺伝子
【００１２】
前記（Ｋ）および（Ｌ）において、欠失、置換または付加が可能な塩基数は、例えば、各遺伝子がコードするタンパク質の機能を喪失しない範囲であれば特に制限されない。例えば、５０塩基に対して、１〜６個が好ましく、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜３個である。特に、欠失・付加の場合には、例えば、３の倍数個（例えば、３）であることが好ましい。
【００１３】
前記（Ｋ）において、ハイブリダイズのストリンジェントな条件とは、例えば、当該技術分野における標準の条件があげられるが、例えば、温度条件は、各配列番号で示された塩基配列のＴｍ値の±５℃、好ましくは±２℃、より好ましくは±１℃である。条件の具体例として、５×ＳＳＣ溶液、１０×Denhardt溶液、１００μｇ/ｍｌサケ精子ＤＮＡおよび１％ＳＤＳ中、６５℃でのハイブリダイゼーション、０．２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、６５℃、１０分の洗浄（２回）があげられる。
【００１４】
前記（Ｌ）における相同性は、例えば、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７．５％以上である。
【００１５】
なお、配列番号１〜１０で表される遺伝子は、それぞれ以下のような方法によって同定した。まず、S. virginiae MAFF 10-06014株のゲノムＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ断片（約３０〜４０ｋｂ）をコスミドベクター（商品名Supercos1；Stratagene社製）に連結し、公知の方法（商品名Gigapack III plus packaging extract；Stratagene社製）によってin vitro packagingを行い、この連結したＤＮＡによりE. coli XL-1 Blue MRを形質転換した。そして、前述の既知ＶＭ制御因子の周辺配列についてシークエンスを行い、Genetyx version 7で解析し、さらにタンパク質コード領域をFrame Plot 2.3.2で推定した。タンパク質領域の機能は、ＢＬＡＳＴＰや HYPERLINK "http://www.nii.res.in/nrs-pks.html" によって推定し、機能ドメインは、GenBankデータベースにおけるコアモチーフから推定した。そして、これらの遺伝子が、ＶＭ生合成遺伝子であることは、表現系がＶＭ生産型である野生株について、これらの各遺伝子を不活性化させた破壊株を作製し、この破壊株の表現型がＶＭ非生産型となったことにより証明されている。
【００１６】
つぎに、本発明のＶＭ生合成遺伝子クラスターは、前述のように、前記（Ｎ）〜（Ｐ）のＤＮＡからなることを特徴とする。なお、前記（Ｏ）および（Ｐ）における欠失、置換または付加が可能な塩基数、ならびに、ストリンジェントな条件は、前述と同様である。
【００１７】
本発明のＶＭ生合成遺伝子からなるクラスターの一例を、図１および図２に示す。図１は、S. virginiae野生株の染色体上におけるＶＭ生合成遺伝子クラスターの位置（遺伝子座）を示す地図であり、図において、ｖｉｓＡ遺伝子はＶＳ生合成に関与する遺伝子、ｖｉｓＡ遺伝子の下流に隣接する領域は、６種類の制御因子を含むＶＭ生合成系の制御領域（１０ｋｂ）をそれぞれ示し、前記制御領域の下流に、ＢＣＤＨをコードするｂｋｄＡ遺伝子ならびにｂｋｄＢ遺伝子、およびＰＫＳ／ＮＲＰＳ遺伝子群がこの順で位置している。なお、同図におけるｐＤＬ１およびｐＤＬ５は、後述する実施例において述べる。
【００１８】
図２は、S. virginiae野生株の染色体上におけるＢＣＤＨ遺伝子（ｖｉｒＡ遺伝子、ｖｉｒＢ遺伝子）およびｖｉｒＡ〜ｖｉｒＨ遺伝子の遺伝子座、各遺伝子がコードするドメインの種類、ならびに各ドメインにより生成されるＶＭ中間体の構造を示す図である。なお、図２に模式的に示した各ドメインの構成成分の説明を図３に示す。
【００１９】
図２に示すように、まず、ＢＣＤＨを構成するＥ１α／βとＥ２とからなるＢＣＤＨによって、例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン等が変換され、ＶＭ生合成の開始ユニットであるイソブチリルユニット（例えば、イソブチリル-ＣｏＡ）が供給される。さらに、ｖｉｒＡ〜ｖｉｒＨ遺伝子がコードするタンパク質の多段階反応によって、前述の開始ユニットに修飾が施され、ＶＭの中間体が生じる。そして、さらなる数個の生合成遺伝子の関与によって、最終的に図４に示すＶＭが生合成される。なお、図４のＶＭ構造式において点線で囲んだ部位（Ｃ１２）は、図２の中間体構造式における点線で囲んだ部位に相当し、Ｃ１２へのメチル基導入にはＨＭＧ-ＣｏＡシンターゼが利用されている。
【００２０】
つぎに、本発明のS. virginiae変異株は、本発明のＶＭ生合成遺伝子が不活性化されており、バージニアマイシンのうちＶＳを特異的に生産する変異株であることを特徴とする。前述のようにＶＭ生合成遺伝子が明らかになったことから、いずれかの遺伝子を不活性化することによって、ＶＭ生合成系を破壊することが可能になった。このため、ＶＭ生合成遺伝子のいずれかを不活性化させた本発明の変異株を用いれば、ＶＭが生成することなく、ＶＳのみを生成させることができる。このようにＶＳのみの生成が可能になれば、水溶性誘導体に変換するために、ＶＳとＶＭとを分離する必要もなく、また、効率良くＶＳの水溶性誘導体を提供することが可能である。
【００２１】
本発明において、前記ＶＭ生合成遺伝子の不活性化は、例えば、前記遺伝子を全部もしくは部分的に欠失もしくは置換し、または、１個以上の塩基を付加することにより、行うことができる。これらの不活性化の手段としては特に制限されず、一般的な方法が採用できる。具体例としては、S. virginiaeのゲノムＤＮＡと相補的な配列を有する組換えプラスミドを用いて、前記組換えプラスミドＤＮＡとゲノムＤＮＡ（表現型：ＶＭおよびＶＳ生産型）との交叉（crossover）により相同組換えする方法があげられる。例えば、１回の交叉（single crossover）を行えば、プラスミドＤＮＡ全体が染色体中に取り込まれるため（組み込み型形質転換）、例えば、目的の生合成遺伝子内部へのプラスミドＤＮＡの付加によって、前記の生合成遺伝子を分裂させ、不活性化することができる。また、例えば、ゲノムＤＮＡと相補的な配列を有し、且つ、目的遺伝子を全部または部分的に欠失もしくは置換した組換えプラスミドを用いて２回の交叉（second crossover）を行えば、プラスミドＤＮＡの目的遺伝子を全部または部分的に欠失もしくは置換した領域が、染色体中の領域と置き換わるため（置換型形質転換）、欠失や置換による不活性化を行うことができる。
【００２２】
なお、ＶＭ生合成遺伝子の不活性化のため、欠失させる塩基数、置換する塩基数、付加する塩基数は、遺伝子がコードするタンパク質の機能を喪失すればよく、それぞれ特に制限されないが、例えば、１００〜５００ｂｐ以上を欠失、置換したり、例えば、１０００〜２０００ｂｐを付加することによって不活性化を実現できる。
【００２３】
つぎに、本発明のＶＳ製造方法は、本発明のS. virginiae変異株を培養することを特徴し、前記変異株を使用する以外は特に制限されず、従来と同様の方法をとることができる。
【００２４】
S. virginiae変異株の培養条件としては、特に制限されないが、例えば、培養温度２５〜２８℃、培養時間２４〜７２時間である。使用する培地としては、例えば、ｆ-ｍｅｄｉｕｍ（Bacto Casitone 7.5 g、Yeast extract 7.5 g、 Glycerol 15 g、NaCl 2.5 g / リットル、pH6.5に調整 )等があげられる。
【００２５】
前記変異株によって生成されたＶＳは、通常、培地に含まれるため、遠心分離等によって菌体を除去し、上清を回収すればよい。ＶＳの水溶性誘導体への変換には、この上清をそのまま使用してもよいし、例えば、逆相カラム(商品名Cosmosil 5C18：ナカライテスク社製)等のカラムで精製したＶＳを使用することもできる。ＶＳの水溶性誘導体への変換方法は、特に制限されず、例えば、文献（J. C. Barriere, et. al., 1998. Current Pharmaceutical Design, 4:155-180.）に報告された方法が採用できる。
【００２６】
以下に、本発明の実施例について説明するが、本発明は、これらに制限されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
ＢＣＤＨのＥ１ componentをコードするｂｋｄＡ遺伝子とＥ２ componentをコードするｂｋｄＢ遺伝子とのクラスター（ｂｋｄＡＢクラスター）のＶＭ生合成への関与を確認した。
【００２８】
ｂｋｄＡ遺伝子破壊株の作製
まず、野生株S. virginiae MAFF 10-06014株（National Food Research Institute, Ministry of Agriculture, Frestry, and Fisheries, Tsukuba, Japan）のゲノムＤＮＡから、ｂｋｄＡ遺伝子の一部４８０ｂｐを欠失させた遺伝子破壊株（disruptant）を、以下に示す方法によって作製した。
【００２９】
ＶＭ制御因子の一つであるＢａｒＺの一部塩基配列を含むＰｓｔＩ断片（５．８ｋｂ：配列番号１２）を、ＰｓｔＩで処理したｐＵＣ１９に挿入し、組み換えプラスミドｐＤＬ１を作製した。このプラスミドに挿入された断片は、図１の矢印ｐＤＬ１に相当する断片であり、完全なｂｋｄＡＢクラスターを含んでいる。
【００３０】
前記ｐＤＬ１のＰｖｕII-ＳａｌＩ断片（２．３ｋｂ）を、ｐＵＣ１９のＳｍａＩ-ＳａｌＩサイトに連結した後、このプラスミドのＨｉｎｃIIサイトに、さらにｐＤＬ１のＡｌｕＩ断片（１．９ｋｂ）を挿入した。得られた組換えプラスミドにおける全挿入断片（４．２ｋｂ）を、E. coliからStreptomycesへの伝達を行う接合性プラスミドｐＫＣ１１３２のＥｃｏＲＩ-ＨｉｎｄIIIサイトに連結させて、ｂｋｄＡを部分的に欠失したプラスミドｐＫＣΔｂｋｄＡを作成した
。続いて、ｐＫＣΔｂｋｄＡを、ｐＵＺ８００２を有するE. coli ET12567株に
導入し、さらに、接合伝達によってS. virginiae MAFF 10-06014株に導入した。そして、アプラマイシン添加または無添加のＩＳＰ２寒天培地で培養し、S. virginiaeの染色体上においてsingle crossoverさせ、後にsecond crossoverさせた。これによって、ｂｋｄＡ遺伝子のうち４８０ｂｐが欠失した遺伝子破壊株を得た。なお、図５の地図に、遺伝子破壊株におけるｂｋｄＡＢクラスター周辺域の遺伝子座を示す。同図において、Ｆ-ｐｒｉｍｅｒおよびＲ-ｐｒｉｍｅｒは、それぞれ後述するＰＣＲに使用するプライマーを示し、ｐｒｏｂｅは、後述するサザンハイブリダイゼーションのプローブを示す。
【００３１】
また、前述のsecond crossoverの際に、前記遺伝子破壊株と同時に生じる、遺伝子型が野生株と同等の復帰株(revertant)を取得した。
【００３２】
野生株、遺伝子破壊株、復帰株およびsingle cross over株からそれぞれＤＮＡを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとして、以下の配列番号で表されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物についてのアガロースゲル電気泳動写真を図６（Ａ）に示す。図示のように、野生株のＰＣＲ産物が約１．４ｋｂであるのに対して、遺伝子破壊株（１〜３）、single cross over株のＰＣＲ産物は約０．９ｋｂであることから、ｂｋｄＡ遺伝子の一部が欠失していることを確認できた。また、復帰株のＰＣＲ産物が野生株と同様に約１．４ｋｂであることから、完全なｂｋｄＡＢクラスターが復帰していることを確認できた。
Forward primer（配列番号１３）
5’- CATCTCGTAGAGCAGTTCGTC -3'
Reverse primer（配列番号１４）
5’- GTCTTCCTCGTCTCCGACAAC -3'
【００３３】
また、抽出した各ＤＮＡをＢａｍＨＩで処理し、この切断物について、プローブとして配列番号１５で表されるｐＤＬ１のＨｉｎｃII断片（１．２ｋｂ）を用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。この結果を図６（Ｂ）に示す。図示のように、野生株のＢａｍＨＩ断片は４．８ｋｂであるのに対して、遺伝子破壊株およびsingle cross over株のＢａｍＨＩ断片は４．３ｋｂであることから、ｂｋｄＡ遺伝子の一部が欠失していることを確認できた。また、復帰株のＢａｍＨＩ断片が野生株と同様に約４．８ｋｂであることから、完全なｂｋｄＡＢクラスターが復帰していることが確認できた。
【００３４】
ＶＭ生成の確認
次に、野生株、遺伝子破壊株および復帰株を培養し、ＶＳおよびＶＭの生成の有無を確認した。
【００３５】
まず、前培養として、前述の各株（胞子１×１０8）を７０ｍｌのｆ-ｍｅｄｉｕｍ（５００ｍｌ容量バッフル付きフラスコ）で振とう培養した。培養条件は、２４時間、１４０ｓｐｍとした。前培養後、回収した菌体をｆ-ｍｅｄｉｕｍで２回洗浄し、等量の新たなｆ-ｍｅｄｉｕｍに懸濁して、使用時まで−８０℃で保存した。凍結させた前培養の菌体を室温に放置した後、ｆｉｎａｌ ＯＤ600が０.０７５になるように７０ｍｌのｆ-ｍｅｄｉｕｍに前記菌体を添加した。そして、これを前述の前培養と同様の条件でインキュベートし本培養を行った。培養２４時間後、培養液から菌体を除去し、得られた上清を０.４μｍのフィルターに通し、ろ液を以下の条件でＨＰＬＣに供してＶＭおよびＶＳの生成を確認した。これらのＨＰＬＣのクロマトグラムを図７に示す。
【００３６】
（ＨＰＬＣ条件）
カラム    ：逆相カラム
（商品名Cosmosil 5C18 カラム：ナカライテスク社製）
サイズ    ：直径４.６ｍｍ×１５０ｍｍ
溶出条件  ：（５分間）
２０％*1アセトニトリル-０.１％ ＴＦＡ*2
（３０分間）
２０-８０％アセトニトリルリニアグラジェント
（洗浄）
１００％アセトニトリル
流速      ：０.７５ｍｌ／分
検出波長  ：ＵＶ３０５ｎｍ
＊１：％＝体積％
＊２：ＴＦＡ＝トリフルフルオロ酢酸
【００３７】
同図において、（Ａ）は野生株、（Ｂ）は遺伝子破壊株、（Ｃ）は復帰株の結果である。図示のようにｂｋｄＡＢクラスターを部分的に欠失させることによって、破壊株ではＶＭを生成できなくなり、また、ＢＣＤＨ遺伝子を復帰させることによって、復帰株では再度ＶＭの生成が確認できた。なお、ＶＳの生成は何ら影響を受けなかった。以上の結果から、ｂｋｄＡＢクラスターがＶＭの生成に関与していること、ならびに、ＶＳのみの生成が可能であることが証明された。
【実施例２】
【００３８】
ＰＫＳ／ＮＲＰＳ遺伝子群（ｖｉｒＡ〜ｖｉｒＨ）の一部を欠失させ、ＰＫＳ／ＮＲＰＳ遺伝子群のＶＭ生合成への関与を確認した。
【００３９】
ＰＫＳ／ＮＲＰＳ遺伝子群破壊株の作製
まず、野生株S. virginiae MAFF 10-06014のｖｉｒＡ遺伝子の内部に３．５ｋｂのＤＮＡ断片を挿入して、ＰＫＳ／ＮＲＰＳ遺伝子群を分裂させた遺伝子破壊株を、以下に示す方法によって作製した。
【００４０】
ｖｉｒＡ遺伝子（配列番号３）のＳｐｈＩ断片（５．８ｋｂ、配列番号１６）を、ＳｐｈＩ処理したｐＵＣ１９に挿入し、組換えプラスミドｐＤＬ５を作製した。この組換えプラスミドの挿入断片は、図１の矢印ｐＤＬ５に相当する断片である。なお、前記ＳｐｈＩ断片は、ｖｉｒＡ遺伝子（配列番号３）の５６８番目〜６３３４番目に相当する。
【００４１】
前記ｐＤＬ５のＳａｃＩ断片（module１に相当するｖｉｒＡ遺伝子の部分断片：３.２ｋｂ）をｐＵＣ１９のＳａｃＩサイトに挿入した。この挿入断片を、さらに、接合性プラスミドｐＫＣ１１３２のＥｃｏＲＩ-ＨｉｎｄIIIサイトに連結させて、接合プラスミドｐＫＣ-ΔＰＫＳを作製した。これを、ｐＵＺ８００２を有するE. coli ET12567株に導入し、さらに、接合伝達によってS. virginiae MAFF 10-06014株に導入した。そして、前記実施例１と同様にして培養を行い、single crossoverさせることによって、前記ｐＫＣ-ΔＰＫＳプラスミドのＤＮＡを染色体ＤＮＡ中に取り込ませた。これにより、ＰＫＳ／ＮＲＰＳ遺伝子群のｖｉｒＡ遺伝子内部に、３．５ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたＰＫＳ／ＮＲＰＳ遺伝子群欠失株を得た。
【００４２】
なお、図８に、野生株（ＷＴ）、接合プラスミドおよび遺伝子破壊株におけるＰＫＳ／ＮＲＰＳ遺伝子群の１つであるｖｉｒＡ遺伝子のmodule１周辺の地図を示す。同図において、（Ａ）は、プラスミドｐＫＣ-ΔＰＫＳおよび野生株におけるｖｉｒＡ遺伝子のmodule１周辺の遺伝子座を示す地図であり、（Ｂ）は、前記遺伝子破壊株における遺伝子座を示す地図である。同図において、野生株（ＷＴ）におけるＳｃ（ＳａｃＩ）断片は、配列番号３に示すｖｉｒＡ遺伝子の１０７８〜４３０９番目の塩基配列（３．２ｋｂ）に相当する。また、図中のａｃｃプローブおよびＣｐｏＩプローブは、それぞれ後述するサザンハイブリダイゼーションのプローブを示す。
【００４３】
また、前記遺伝子破壊株を、アプラマイシンを含まない培地で培養することにより、さらにsecond crossoverさせ、内部で分裂していない完全なＰＫＳ／ＮＲＰＳ遺伝子群を有する復帰株（revertant）を作製した。
【００４４】
野生株および遺伝子破壊株からそれぞれ抽出したＤＮＡをＢａｍＨＩで処理し、この切断物について、ａｃｃ遺伝子およびＣｐｏＩ断片をそれぞれプローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行った。ａｃｃ遺伝子のプローブとは、ｐＫＣ１１３２のＳａｃＩ断片（０．９ｋｂ）であり、ＣｐｏＩ遺伝子のプローブとは、ｐＤＬ５のＣｐｏＩ断片（１.０ｋｂ）である。
【００４５】
これらの結果を、図９に示す。同図において（Ａ）がａｃｃ遺伝子、（Ｂ）がＣｐｏＩ断片をそれぞれプローブとして使用した際の結果である。図（Ａ）に示すように、ａｃｃ遺伝子をプローブとした場合、野生株ではバンドが確認されず、遺伝子破壊株ではバンドが確認できたことから、crossoverにより染色体ＤＮＡ中にｐＫＣ１１３２のＤＮＡが挿入されたことが確認できた。また、同図（Ｂ）に示すように、ＣｐｏＩ断片をプローブとして使用した場合、野生株のＢａｍＨＩ断片は３．１ｋｂであった。これに対して、遺伝子破壊株のＢａｍＨＩ断片は５．２ｋｂおよび３．１ｋｂであることから、ＰＫＳ／ＮＲＰＳ遺伝子群のｖｉｒＡ遺伝子内部がプラスミドの挿入によって分裂されたことが確認できた。
【００４６】
ＶＭ生成の確認
次に、野生株、遺伝子破壊株および復帰株を培養し、ＶＳおよびＶＭの生成の有無を確認した。培養およびＶＭ等の生成の確認は、前記実施例１と同様にして行った。これらのＨＰＬＣのクロマトグラムを図１０に示す。同図において、（Ａ）は野生株、（Ｂ）は遺伝子破壊株、（Ｃ）は復帰株の結果である。
【００４７】
図示のようにｖｉｒＡ遺伝子内部にＤＮＡ断片を挿入することによってＶＭを生成できなくなり、また、ＰＫＳ遺伝子を復帰させることによって、再度ＶＭの生成が確認できた。なお、ＶＳの生成は何ら影響を受けなかった。以上の結果から、ＰＫＳ遺伝子がＶＭの生成に関与していること、ならびに、ＶＳのみの生成が可能であることが証明された。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
以上のように、本発明によれば、さらにこれらの隣接領域の解析を行い、完全なＶＭ生合成系クラスターを同定することが可能であり、また、ＶＭ生合成系についての完全な生合成機構を明らかにすることができる。また、バージニアマイシンは、優れた抗菌活性からヒトへの適用が有望視されているため、ＶＭ生合成系の遺伝学的解明に寄与する本発明の遺伝子ならびに遺伝子クラスターは極めて有用であると言える。さらに、ＶＭ生合成遺伝子が明らかとなったことから、これらの遺伝子のいずれかを欠失させた本発明のStreptomyces virginiae変異株によれば、ＶＳのみを特異的に合成することができるため、効率良くＶＳ誘導体の原料として供給することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明の一実施形態におけるＶＭ生合成遺伝子からなるクラスターの遺伝子座を示す地図である。
【図２】本発明の一実施形態における、染色体上のＢＣＤＨ遺伝子およびｖｉｒＡ〜ｖｉｒＨ遺伝子の遺伝子座、各遺伝子がコードするドメインの種類、ならびに各ドメインにより生成されるＶＭ中間体の構造を示す図である。
【図３】前記図２において模式的に示した各ドメインの構成成分の説明を示す図である。
【図４】ＶＭの構造を示す図である。
【図５】本発明の遺伝子破壊株の一実施例における、一部欠失したＢＣＤＨ遺伝子の周辺域の遺伝子座を示す地図である。
【図６】（Ａ）は、本発明の一実施例におけるＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の写真であり、（Ｂ）は、サザンハイブルダイゼーションのラジオグラムである。
【図７】本発明の一実施例における培養液上清のＨＰＬＣクロマトグラムであり、（Ａ）は野生株、（Ｂ）は遺伝子破壊株、（Ｃ）は復帰株の結果を示す。
【図８】（Ａ）は、本発明の他の実施例の野生株およびプラスミドにおける、ｖｉｒＡ遺伝子周辺の遺伝子座を示す地図であり、（Ｂ）は、前記実施例の遺伝子破壊株における、ｖｉｒ遺伝子周辺の遺伝子座を示す地図である。
【図９】本発明の他の実施例におけるサザンハイブルダイゼーションのラジオグラムであり、（Ａ）は、ａｃｃ遺伝子、（Ｂ）はＣｐｏＩ遺伝子をそれぞれプローブとした際の結果を示す。
【図１０】本発明の他の実施例における培養液上清のＨＰＬＣクロマトグラムであり、（Ａ）は野生株、（Ｂ）は遺伝子破壊株、（Ｃ）は復帰株の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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