(57)【要約】【課題】  培養中に膜が剥離しない、導電性膜を有する細胞培養基板を提供する。【解決手段】  細胞培養基板表面の平均粗さが１０ｎｍ以上３０ｎｍ以下であり、基板表面に略棒状の構造体を有する。蒸着法、スパッタ法、ＲＦイオンプレーティング法により基板上に導電性の膜を形成する。膜材料は、酸化インジウム、酸化亜鉛、酸化スズのいずれかである。基板表面に棒状の構造体を有するため、棒状構造体に細胞を絡めることができ、安定的に細胞を接着固定することが可能となる。表面粗さが均一であるため、光学的な観察に適する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、前記基板表面上の略棒状の構造体とを有することを特徴とする細胞培養基板。
【請求項２】
前記構造体の平均粗さが１０〜３０ｎｍであることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養基板。
【請求項３】
前記略棒状の構造体の長さが、５０〜６００ｎｍである請求項１又は２項に記載の細胞培養基板。
【請求項４】
前記略棒状の構造体が、導電性を有する膜で構成されている請求項１〜３項のいずれか1項に記載の細胞培養基板。
【請求項５】
前記膜が、細胞観察用の光を透過する透過性を有する請求項４記載の細胞培養基板。
【請求項６】
前記膜が、酸化インジウム、酸化亜鉛、又は酸化スズからなることを特徴とする請求項４又は５項に記載の細胞培養基板。
【請求項７】
前記基板が、ガラス、セラミック、又はプラスチックからなる群から選択される少なくとも１種である請求項１〜６項のいずれか１項に記載の細胞培養基板。
【請求項８】
前記ガラスが、ソーダライムガラス、石英ガラス、アルミノシリケートガラス、又はボロシリケートガラスからなる群から選択される少なくとも１種である請求項７項記載の細胞培養基板。
【請求項９】
請求項１〜８項のいずれか１項に記載の細胞培養基板の製造方法であって、前記構造体を、蒸着法、スパッタ法、又は膜材料を蒸発させてイオン化させ、イオン化した前記膜材料を前記基板上に堆積させる方法のいずれか１つの方法により形成することを特徴とする細胞培養基板の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜８項のいずれか１項に記載の細胞培養基板と、電流注入機構とを備えることを特徴とする細胞培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養基板、当該細胞培養基板の製造方法、及び当該細胞培養基板を用いた細胞培養装置に関し、特に、略棒状の構造体を有する細胞培養基板、当該細胞培養基板の製造方法、及び当該細胞培養基板を用いた細胞培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、動植物の細胞を種々の条件下において培養する研究においては、細胞をポリスチレンなどの高分子物質などからなる培養基板に細胞を接種し、これを培地中またはインキュベーター中に保持して培養する方法などが用いられている。培養基板として、培養細胞の試験方法に応じた特性を有する培養基板が開発されている。例えば、電位刺激を与える試験を行う場合は、導電性を有する培養基板が用いられる。
【０００３】
培養基板上に接着した細胞に様々な刺激が与えられると、電気的な応答がなされるため、例えば、形態変化や物質の分泌、受容体などの発現、細胞分化、細胞増殖などの現象を電気的性質の変化として捉えることができる。電解重合可能な高分子である導電性高分子は、細胞の出した情報伝達物質や、情報伝達物質の受容などに伴う電気的活動の検出に適しているため、このような導電性高分子が基板上の表面膜として良く用いられる。
【０００４】
培養基板を用いた培養においては、細胞の接着性や増殖性は、培養基板の特性、特に培養基板表面の特性の影響を受けるため、培養基板の特性を安定化させて細胞の接着性や増殖性のばらつきを抑えるために、ポリスチレンなどの表面を酸素プラズマ等で親水化処理するなどの方法が用いられている。
【０００５】
しかし、前記処理では経時的に親水性が劣化し、しかも劣化は不均一に起こるため、安定した品質を得ることができない。このような劣化を防ぐために、特開平６−３３５３８１号公報には、透明導電膜、金属、または金属化合物などの導電性の薄膜を、電解重合法で基板表面にコーティングし、更に前記薄膜を電極として、電解重合法によって薄膜上にポリマーを成膜して培養基板とする方法が開示されている。前記方法によれば、細胞が安定的に基板上に接着し、長期にわたっての細胞の成育・増殖を安定的に行うことができる。
【０００６】
【特許文献１】特開平６−３３５３８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特開平６−３３５３８１号に記載されているように、培養基板表面に高分子材料を用いる場合、培養基板表面は軟らかいため、実験中の取扱いによって剥がれたり損傷しやすいという問題がある。例えば、培養基板の洗浄や培地交換などを行う際に、高分子膜が容易に剥離してしまい、同じ基板を用いて繰り返し培養することが困難である。また、ドライプロセスにて導電性の無機膜を成膜した後に、ウェットプロセスにて高分子膜を成膜する必要があるため、工程が複雑となり、条件の制御が困難となるため、導電性膜の性能にばらつきが生じるという問題があった。
【０００８】
更に、高分子膜の形成は、一定時間の間、対向電極間に電界を発生させることによって行うが、下地である無機導電膜の内部抵抗により、電圧印加部から離れるに従って電圧が降下し、高分子膜の成膜レートが下がり、面内での膜厚が不均一になるという問題があった。この問題は、特に大面積の成膜を行う場合に顕著に発生するため、例えば、大面積の基板に成膜を行い、後で成膜基板を切断して大量生産を行うという方法を用いることができず、量産が困難であるという問題があった。
【０００９】
電圧降下を防ぐ方法としては、下地である無機導電膜の厚みを大きくして、シート抵抗を下げる方法があるが、膜厚を厚くすると成膜時間とコストがかかるため、量産に向かないという問題があった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、本発明者等は、基板上に種々の膜形成を行ったところ、本発明の細胞培養基板、当該細胞培養基板の製造方法、及び当該細胞培養基板を用いた細胞培養装置を発明するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明の細胞培養基板は、基板と、前記基板表面上の略棒状の構造体とを有することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明の細胞培養基板の好ましい実施態様において、前記構造体の平均粗さが１０〜３０ｎｍであることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明の細胞培養基板の好ましい実施態様において、前記略棒状の構造体の長さが、５０〜６００ｎｍであることを特徴とする。
【００１４】
また、本発明の細胞培養基板の好ましい実施態様において、前記略棒状の構造体が、導電性を有する膜で構成されていることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明の細胞培養基板の好ましい実施態様において、前記膜が、細胞観察用の光を透過する透過性を有することを特徴とする。
【００１６】
また、本発明の細胞培養基板の好ましい実施態様において、前記膜が、酸化インジウム、酸化亜鉛、又は酸化スズからなることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明の細胞培養基板の好ましい実施態様において、前記基板が、ガラス、セラミック、又はプラスチックからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明の細胞培養基板の好ましい実施態様において、前記ガラスが、ソーダライムガラス、石英ガラス、アルミノシリケートガラス、又はボロシリケートガラスからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。
【００１９】
次に、本発明の細胞培養基板の製造方法は、前記構造体を、蒸着法、スパッタ法、又は膜材料を蒸発させてイオン化させ、イオン化した前記膜材料を前記基板上に堆積させる方法のいずれか１つの方法により形成することを特徴とする。
【００２０】
また、本発明の細胞培養装置は、上述の本発明の細胞培養基板と、電流注入機構とを備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、培養基板表面に略棒状構造を有するため、棒状構造体に細胞を絡めて、安定的に細胞を接着固定することが可能である。そのため、高分子材料の化学的な粘着効果を利用した従来の方法に比べて、適用できる細胞種が増えるという利点を有する。従来は、培地に血清を加えないと十分な接着力が得られなかったが、本発明によれば、無血清で十分な接着力を得ることができる。本発明によれば、安定して細胞を基板上に接着することができるため、長期間にわたる細胞の培養、例えば神経細胞の長期培養が可能である。
【００２２】
また、本発明の培養基板は、有機材料を用いずに無機材料のみによって構成することが可能であるため、従来の培養基板に比べて製造工程を簡略化することができ、コストも低減することができる。また、無機材料は、有機材料に比べて耐久性が高いため、長期間の使用による品質の低下が起こりにくく、培地を取り替える際や洗浄の際に表面が損傷して品質が低下するということが起こりにくい。高分子材料の場合は成膜時に膜厚ばらつきが生じるが、本発明によれば、大面積の基板に成膜を行う場合でも均一な膜厚を得ることができ、量産が可能である。有機材料を使用した場合には、電解重合法(メッキ)での成膜であり均一性を得ることができないが、真空成膜法（スパッタ、蒸着）によれば、均一成膜、特に大面積での均一成膜が可能となる。
【００２３】
更に、本発明によれば、表面粗さが一定範囲であるため、細胞を安定して接着固定することが容易にできる上に、表面にヘイズが生じないため、光学的な観察手段を用いても、光の散乱などが起こらず、良好な観察が可能である。また、基板表面に導電性を有する膜が設けられているため、細胞に電位刺激を与えるなどの試験も可能となる。前記膜は、特定の光を透過することができるため、光学的な観察手段による観察が容易となる。更に膜材料を酸化インジウム、酸化亜鉛、または酸化スズのいずれかにすると、比抵抗値が低く、エッチング等の加工を容易に行うことができる。膜形成を蒸着法、スパッタ法、ＲＦイオンプレーティング法で行うことにより、大面積の成膜が可能となり、低シート抵抗を実現することができ、試験中の電圧降下を防止することができる。
【００２４】
本発明の細胞培養基板は、一の基板を繰り返し何度も使用することができる。また、長期間の培養が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明の実施形態の一例について説明する。
【００２６】
本発明による細胞培養基板の表面構造および断面構造の一例を図１〜４に示す。図１〜４に示すように基板表面にウィスカー構造のような棒状構造体が多数存在する。１つの棒状構造体の長さは、特に限定されないが、細胞の定着性という観点から、５０〜６００ｎｍとすることができる。
また、構造体の平均直径についても、特に限定されないが、細胞の定着性という観点から、１０〜３００ｎｍとすることができる。棒状構造体の最適な密度は培養する細胞の大きさによるが、細胞１個の面積内に棒状構造体が１本以上あれば、培養可能である。ここで、棒状構造体の長さとは、棒状構造体の一端から他端までの長さをいい、平均直径とは、１本の棒状構造体の円近似断面径の平均をいう。
【００２７】
また、構造体の表面粗さ（Ｒａ）についても特に限定されるものではないが、細胞の定着性という観点から、１０〜３０ｎｍとすることができる。当該構造体の表面粗さは、基板の可視域での透明性という観点から、より好ましくは、１０〜２０nmとする。Ｒａが大きくなると表面にヘイズができるため、光学的な観察手段を用いる場合には散乱などの問題が発生する。Ｒａが小さいと細胞を十分に接着固定することができず、良好な定着性が得られない。
【００２８】
膜の材料は、試験目的によって適宜選択すればよいが、培養液等によって腐食しないよう、耐酸性、耐アルカリ性のものを選択する。培養細胞に電位刺激を与える場合は導電性を有する材料を用い、培養細胞を光学的に観察する場合には、観察に用いる光を透過する材料を用いればよい。
例えば光学顕微鏡で観察を行う場合には、可視光を透過する材料を用いることができる。ＩＴＯ膜（インジウム錫酸化膜）は、導電性を有し、可視光に対して透明であるので膜として好ましい。ＩＴＯ膜には不純物として銀や酸化亜鉛などが含まれていてもよい。ＩＴＯ膜の他に酸化亜鉛膜やＡＴＯ膜（アンチモン錫酸化膜）を用いてもよい。
【００２９】
上記の棒状構造は、基板に直接成形してもよいし、成膜などにより成形してもよい。例えば、ゾルゲルプレス成型や樹脂プレス成型基板上への成膜なども可能である。
【００３０】
成膜は、膜材料を蒸発させた後、イオン化させ、基板上に堆積させることによって行うことができる。このような方法を用いることによって、基板の種類に依らず基板表面に棒状構造を形成することができる。膜材料を高周波（ＲＦ）によりイオン化させるＲＦイオンプレーティング蒸着法を用いると、成膜速度が大きく、また基板に対する膜の付着強度が大きくなるため好ましい。
【００３１】
成膜により棒状構造を成形する場合は、目的とする成膜材料を成膜することが可能な基板であればいかなる基板を用いてもよいが、例えば透明導電膜を成膜する場合は、基板として、ガラス、セラミック、プラスチックなどを用いることができる。耐熱性、対薬品性、耐久性、量産性という観点から、特にガラスを用いることが好ましく、例えば、ソーダライムガラス、石英ガラス、アルミノシリケートガラス、ボロシリケートガラスなどを用いることができる。
【００３２】
このようにして得られた細胞培養基板上に培養セルを作製する。培養セルの作製方法について一例を示せば、例えば、セル内にＮａＯＨ溶液などを注入して基板表面およびセル表面の親水化処理を行う。調製した培地をセル内に注入し（またはセル内で調製してもよい）、培地に細胞を接種して細胞培養系を構成する。培養セルは、例えば基板上にリングを樹脂製接着剤などを用いて接着することによって形成することができる。リングは、耐熱性、耐薬品性という観点から、好ましくはガラス製、テフロン（登録商標）製（テトラフロロエチレン樹脂製、パーフロロアルコキシ樹脂製、フッ化エチレンプロピレン樹脂製）、シリコン製とする。
【００３３】
セル内に隔壁を設けて培地の分画を行うこともできる。セルの形状は培養方法に応じて選択すればよく、例えばセルを流路のような形状に成形して灌流培養を行うこともできる。前記細胞培養系に、電極など電流注入機構を加えて、細胞培養装置とすることができる（図６）。電極の他に、例えば測定機構として顕微鏡、電流計、電圧計など、雰囲気制御機構としてインキュベーター、加湿器、ヒーター、クーラーなど、また、自動培地交換機構、分離機構、撹拌機構などを加えて細胞培養装置とすることができる。
【００３４】
以下、実施例によりさらに具体的に説明する。
【実施例１】
【００３５】
横１０ｃｍ、縦１０ｃｍのソーダライムシリカ基板上に、ＲＦイオンプレーティング蒸着法により、ＩＴＯ膜を成膜し、細胞培養基板を作製した。ソースとして錫を５質量％含有したインジウムを用いた。ＲＦパワーは１５００Ｗ、基板加熱温度は３００℃とし、プラズマガスは酸素を用い、酸素流量は８．４５×１０−３Ｐａ・ｍ３／ｓ（５ｓｃｃｍ）とした。作製した細胞培養基板を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した結果を図２に示す。図２に示すように表面にはヘイズが殆どなく、ウィスカー構造を有する粗い凹凸構造が形成された。この膜の表面をＡＦＭ（原子間力顕微鏡）で評価した結果、Ｒａ＝２５．２ｎｍであった。
【００３６】
得られた細胞培養基板を５ｃｍ角に切断し、図６に示すようにガラスリングを基板上に載置し、シリコーン接着剤で接着して、基板上にガラスセルを形成した。ガラスセル内に１ＮのＮａＯＨ溶液を注入し、２４時間放置して、ＩＴＯ膜表面およびガラスセル表面の親水化処理を行った。その後、ＮａＯＨ溶液を抜き取り、血清を加えたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）をセル内に投入し、５×１０６個のＴＧＷ−ｎｕ細胞を接種して培養を行った。細胞の基板への付着力を評価したところ、１０日間、細胞培養基板上に接着固定することができた。
【実施例２】
【００３７】
細胞接種から２日目に、培地を無血清のＤＭＥＭ培地に交換した以外は実施例１と同様にして細胞を培養した結果、８日間、細胞培養基板上に細胞を接着固定することができた。
【実施例３】
【００３８】
酸素流量を１．５２×１０−２Ｐａ・ｍ３／ｓｅｃ（９ｓｃｃｍ）とした以外は実施例１と同様にして得られた細胞培養基板の表面をＳＥＭで観察した結果を図３に示す。図３に示すように、表面にはヘイズが殆どなく、ウィスカー構造を有する粗い凹凸構造が形成された。ＡＦＭで評価した結果、Ｒａ＝１５．９ｎｍであった。
得られた細胞培養基板を用いて、実施例１と同様の方法で細胞の培養を行った結果、１０日間、細胞を接着固定することができた。
【実施例４】
【００３９】
実施例３で得られた細胞培養基板を用いて、細胞接種から２日目に、培地を無血清のＤＭＥＭ培地に交換した以外は実施例１と同様にして細胞の培養を行った結果、８日間、細胞を接着固定することができた。
【実施例５】
【００４０】
基板を石英基板とし、酸素流量を１．５２×１０−２Ｐａ・ｍ３／ｓｅｃ（９ｓｃｃｍ）とした以外は実施例１と同様にして得られた細胞培養基板の表面をＳＥＭで観察した結果を図４に示す。図４に示すように、表面にはヘイズが殆どなく、ウィスカー構造を有する粗い凹凸構造が形成された。得られた細胞培養基板を用いて、実施例１と同様の方法で細胞の培養を行った結果、１０日間、細胞を接着固定することができた。
【００４１】
（比較例）
スパッタ成膜法によって成膜をした以外は実施例１と同様にして得られた細胞培養基板の表面をＳＥＭで観察した結果を図５に示す。図５に示すように、凹凸が殆どない平坦な表面が得られた。ＡＦＭで評価した結果、Ｒａ＝５．３ｎｍであった。
得られた細胞培養基板を用いて、実施例１と同様の方法で細胞の培養を行った結果、２日しか接着固定を行うことができなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明に係る細胞培養基板は、細胞の培養に利用することができる。本発明に係る細胞培養基板および装置は、細胞の電位を測定しながら行う細胞培養に利用することができる。特に長期間培養することが必要な細胞の培養に好適に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明の一実施例に係る細胞培養基板の表面および断面の電子顕微鏡像である。
【図２】本発明の一実施例に係る細胞培養基板の表面および断面の電子顕微鏡像である。
【図３】本発明の一実施例に係る細胞培養基板の表面および断面の電子顕微鏡像である。
【図４】本発明の一実施例に係る細胞培養基板の表面および断面の電子顕微鏡像である。
【図５】スパッタ成膜により作製した細胞培養基板の表面および断面の電子顕微鏡像である。
【図６】細胞培養装置の一例を示す斜視図である。
【図７】細胞培養装置の一例を示す断面図である。
【符号の説明】
【００４４】
１  細胞培養基板
２  ガラス基板
３  ＩＴＯ膜
４  培養セル
５  培養液（培地）
６  電源
【図６】
2007075034.tif 000003
【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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