(57)【要約】【課題】検出サイトの自由度が高く、誤認識の危険性が著しく少なく、かつ簡便な操作によって遺伝子多型を検出する方法を提供する。【解決手段】特定の配列（第1領域、第2領域及び第3領域からなり、第1領域は第2領域の下流に位置し、第2領域は検出すべき多型の塩基から構成され第3領域の下流に位置する配列）を有する、試料中の特定の核酸に、第1オリゴヌクレオチド（第3領域に相補的な配列、第2領域に相補的な配列、及び特定の配列と相補性のないフラップ配列を有するオリゴヌクレオチド）と、第2オリゴヌクレオチド（第1領域に相補的な配列、及び任意の配列を有するオリゴヌクレオチド）とを、ハイブリダイズさせることによって、3本鎖構造体を形成させ、フラップエンドヌクレアーゼによりフラップ配列を含む核酸断片を遊離させ、核酸断片を、質量分析計を用いて検出することによって、多型を確認する、遺伝子多型検出方法。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の配列として、第１領域、第２領域及び第３領域からなる配列であって、前記第１領域は前記第２領域に隣接した下流に位置し、前記第２領域は検出すべき多型の塩基から構成され且つ前記第３領域に隣接した下流に位置する特定の配列を有する、試料中の特定の核酸に、
第１オリゴヌクレオチドとして、前記第３領域に相補的な配列、前記第２領域に相補的な配列、及び前記特定の配列と相補性のないフラップ配列を有するオリゴヌクレオチドであって、前記第３領域に相補的な配列は前記第２領域に相補的な配列に隣接した下流に位置し、前記第２領域に相補的な配列は前記フラップ配列に隣接した下流に位置するオリゴヌクレオチドと、
第２オリゴヌクレオチドとして、前記第１領域に相補的な配列、及び任意の配列を有するオリゴヌクレオチドであって、前記任意の配列は前記第１領域に相補的な配列に隣接した下流に位置するオリゴヌクレオチドとを、ハイブリダイズさせることによって、３本鎖構造体を形成させ、
前記３本鎖構造体の３重鎖部分をフラップエンドヌクレアーゼに認識させることにより前記フラップ配列を含む核酸断片を遊離させ、
前記遊離した核酸断片を、質量分析装置を用いて検出することによって、前記多型を確認する、遺伝子多型検出方法。
【請求項２】
前記質量分析装置がマトリックス介助レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）/飛行時間型（ＴＯＦ）マススペクトロメトリーである、請求項１に記載の遺伝子多型検出方法。
【請求項３】
前記第１オリゴヌクレオチドとして、前記多型のアレルのそれぞれに応じて異なる前記フラップ配列を有するように設計されたオリゴヌクレオチドを用いる、請求項１又は２に記載の遺伝子多型検出方法。
【請求項４】
前記試料中に検出すべき多型部位が複数箇所存在し、前記第１オリゴヌクレオチドとして、前記複数の検出すべき多型部位のそれぞれに応じて異なる前記フラップ配列を有するように設計されたオリゴヌクレオチドを用いる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子多型検出方法。
【請求項５】
前記異なるフラップ配列はそれぞれ互いに長さにおいて異なる、請求項３又は４に記載の遺伝子多型検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＮＰなどの検出を簡便に行うことができる標的核酸の検出方法、及び、その方法により得られた結果を用いて薬剤投与や病気罹患率などの診断を行う方法に関する。
この遺伝子多型検出方法は、遺伝子解析の研究や臨床分野において利用することができる。
【背景技術】
【０００２】
フラップエンドヌクレアーゼ（FEN-1）が、ダブルフラップ（Double FLAP）構造と呼ばれる３塩基の立体構造を認識して、フラップ（FLAP）と呼ばれるオリゴヌクレオチドが遊離することが知られている（例えば、Harrington JJ and Lieber MR, Journal of Biological Chemistry, 1995 Mar 3; 270 (9): 4503-4508. Fig. 5.B参照）。
【０００３】
一方、ＳＮＰ部位の塩基を判別する、いわゆるタイピングについては多くの手法が報告されている。そのうちの代表的なものとして、インベーダー法、タックマンＰＣＲ法、モレキュラービーコン法、プライマーエクステンション法などが挙げられる（例えば、Kirk BW, Feinsod M, Favis R, Kliman RM and Barany F, Nucleic Acids Research, 2002 Aug 1; 30 (15): 3295-3311参照）。
【０００４】
インベーダー法は、２段階の酵素反応により、フラップ（FLAP）プローブから遊離した蛍光物質を測定する手法である。
具体的には、インベーダー法は、フラッププローブとインベーダープローブとが鋳型ＤＮＡにハイブリダイズしたダブルフラップ構造を形成し、酵素クリベース（Cleavase）がこの構造を認識しフラッププローブを切断することによってフラップ部分を遊離する工程を第１段階として；遊離したフラップをフレットと結合させ、再度クリベースで切断することで、フレットにおける消光物質と蛍光物質とを遊離させる工程を第２段階として含む。その結果、発生した蛍光を検出することで、ＳＮＰのアレル判定を行う。
この方法は、フレット（FRET）配列を共通化することにより、２段階目の反応を共通に行うことができるように工夫されているのが特徴である（例えば、特表２００２−５１５７３７号公報参照）。
【０００５】
インベーダー法の利点を挙げると以下の通りである。１）ゲノム上の広い範囲でプローブを設計することが可能であり、その自由度は比較的高い；２）遺伝子変異部を含む領域を予めＰＣＲで増幅しておくことを必ずしも必要としない；及び、３）合成にコストがかかるＦＲＥＴを共通配列とすることで、ＳＮＰごとのプローブ設定費用が安価で済む。
【０００６】
タックマンＰＣＲ法、モレキュラービーコン法、プライマーエクステンション法、アレル特異的競合ＰＣＲ法などは、ＰＣＲを基本とした手法である。ＰＣＲを用いた多型検出法としては、この他にもシーケノムによって報告されたマスアレイ（ＭＡＳＳＡＲＡＹ）システム（特表２００２−５０７８８３号公報参照）などが挙げられる。
【０００７】
マトリックス介助レーザー脱離イオン化−飛行時間型マススペクトロメトリー（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）は、一般的にタンパク質を対象に用いられることが多く、ＤＮＡへの適用は少ないが、マスアレイシステムは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳも利用するＳＮＰ解析法である。マスアレイシステムにおいては、ダイデオキシヌクレオチドとデオキシヌクレオチドとの混合反応を用いた一塩基伸長により、質量数の異なるオリゴヌクレオチドを生成し、生成したオリゴヌクレオチドをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで検出することでＳＮＰの判別を行う。
【０００８】
【非特許文献１】カーク・ＢＷ（Kirk BW）、ファインソード・Ｍ（Feinsod M）、ファビス・Ｒ（Favis R）、クリーマン・ＲＭ（Kliman RM）、及びバーラーニ・Ｆ（Barany F）、複雑な疾患との長期関連性を探求する一塩基多型（Single nucleotide polymorphism seeking long term association with complex disease）、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）」、第３０巻、第１５号、ｐ．３２９５−３３１１、２００２年８月１日
【非特許文献２】ハリントン・ＪＪ（Harrington JJ）及びリーバー・ＭＲ（Lieber MR）、ＦＥＮ−１結合に必要なＤＮＡ構造要素（DNA structural elements required for FEN-1 binding）、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）」、第２７０巻、第９号、ｐ．４５０３−４５０８、第５．Ｂ図、１９９５年３月３日
【特許文献１】特表２００２−５１５７３７号公報
【特許文献２】特表２００２−５０７８８３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従来の方法では、例えば以下のような問題点がある。
インベーダー法では、クリベースを含む専用のキットと蛍光検出用のプレートリーダーとが必要になる。そして、インベーダー法に用いられるような蛍光標識は、一般的に高価である。
【００１０】
ＰＣＲ反応を基本とした手法の一般的な問題点としては、以下が挙げられる。例えばプライマーエクステンションや競合ＰＣＲなどにおいて、ＰＣＲで遺伝子変異部位を含む領域を増幅した後、別のプライマーで反応を行う場合、最初の増幅に用いたプライマーやｄＮＴＰを予め除く必要がある。プライマーエクステンションの場合は、特に、ダイデオキシで伸長を止めるため、完全にｄＮＴＰを除く必要がある。そして、必ずＰＣＲ産物の精製工程を要する。例えば、マスアレイシステムにおいては最初に核酸増幅が行われるが、最初の増幅に用いたプライマーやｄＮＴＰは予め除く必要がある。このため、作業が煩雑で、コストもかかる。
【００１１】
マスアレイシステムをはじめ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いた手法の一般的な問題点としては、以下が挙げられる。例えば、プローブの配列により、イオン化の際に分解が起こり、ピークの検出が難しい場合がある。また、一塩基の差（約３００−４００Ｄａ）を比較するため、質量分析装置について精度の高い調整が必要であり、未反応のオリゴヌクレオチドプローブとの区別がつけにくい場合がある。
【００１２】
そこで本発明の目的は、簡便な操作によって感度良く遺伝子多型を検出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、以下の発明を含む。
下記（１）においては、特定の核酸、第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドがダブルフラップ構造を形成し、フラップエンドヌクレアーゼが当該構造を認識するとともに核酸断片（本明細書ではフラップ断片と記載することがある）を遊離させ、遊離した核酸断片を質量分析法により検出することを記載する。
【００１４】
（１）特定の配列として、第１領域、第２領域及び第３領域からなる配列であって、前記第１領域は前記第２領域に隣接した下流に位置し、前記第２領域は検出すべき多型の塩基から構成され且つ前記第３領域に隣接した下流に位置する特定の配列を有する、試料中の特定の核酸に、
第１オリゴヌクレオチドとして、前記第３領域に相補的な配列、前記第２領域に相補的な配列、及び前記特定の配列と相補性のないフラップ配列を有するオリゴヌクレオチドであって、前記第３領域に相補的な配列は前記第２領域に相補的な配列に隣接した下流に位置し、前記第２領域に相補的な配列は前記フラップ配列に隣接した下流に位置するオリゴヌクレオチドと、
第２オリゴヌクレオチドとして、前記第１領域に相補的な配列、及び任意の配列を有するオリゴヌクレオチドであって、前記任意の配列は前記第１領域に相補的な配列に隣接した下流に位置するオリゴヌクレオチドとを、ハイブリダイズさせることによって、３本鎖構造体を形成させ、
前記３本鎖構造体の３重鎖部分をフラップエンドヌクレアーゼに認識させることにより前記フラップ配列を含む核酸断片を遊離させ、
前記遊離した核酸断片を、質量分析装置を用いて検出することによって、前記多型を確認する、遺伝子多型検出方法。
【００１５】
下記（２）は、質量分析装置の具体例に関する。
（２）前記質量分析装置がマトリックス介助レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）/飛行時間型（ＴＯＦ）マススペクトロメトリーである、（１）に記載の遺伝子多型検出方法。
【００１６】
下記（３）〜（５）は、フラップ配列の設計に関する。
（３）前記第１オリゴヌクレオチドとして、前記多型のアレルのそれぞれに応じて異なる前記フラップ配列を有するように設計されたオリゴヌクレオチドを用いる、（１）又は（２）に記載の遺伝子多型検出方法。
【００１７】
（４）前記試料中に検出すべき多型部位が複数箇所存在し、前記第１オリゴヌクレオチドとして、前記複数の検出すべき多型部位のそれぞれに応じて異なる前記フラップ配列を有するように設計されたオリゴヌクレオチドを用いる、（１）〜（３）のいずれかに記載の遺伝子多型検出方法。
【００１８】
（５）前記互いに異なるフラップ配列は互いに長さにおいて異なる、（３）又は（４）に記載の遺伝子多型検出方法。
【００１９】
下記は、検出の対象に関する。
前記特定の核酸は、ｃＤＮＡ、生物のゲノミック遺伝子、及び微生物の遺伝子から選ばれる核酸の配列を有する、（１）〜（５）のいずれかに記載の遺伝子多型検出法。
微生物には、細菌及びウイルスが含まれる。
【００２０】
前記遺伝子は、ＤＮＡ又はＲＮＡの遺伝子である、上記の遺伝子多型検出法。
前記多型が、一塩基多型、挿入多型、及び欠失多型から選ばれる、（１）〜（５）のいずれかに記載の遺伝子多型検出方法。
【００２１】
下記は、特定の核酸を予め増幅させておく形態に関する。
前記特定の核酸の特定の配列を含む領域が、予め増幅されたものである、（１）〜（５）のいずれかに記載の遺伝子多型検出方法。
【００２２】
前記増幅はＰＣＲによって行われる、上記の遺伝子多型検出方法。
【００２３】
前記増幅は、２５℃におけるｐＨが８．５〜９．５である反応液中で行われる、上記の遺伝子多型検出方法。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によると、簡便且つ感度良く遺伝子多型を検出する方法を提供することができる。
【００２５】
すなわち、本発明は、オリゴヌクレオチドプローブのフラップ配列を、例えば長さにおいて任意に設定することができるため、検出されるフラップ断片と、未反応のオリゴヌクレオチドプローブとの区別を容易にすることができる。そして、各アレルに対応した２種類のオリゴヌクレオチドプローブ間においても、フラップ配列を、例えば長さにおいて任意に設定することができるため、検出される各アレルに対応したフラップ断片の判別を容易にすることができる。さらに、オリゴヌクレオチドプローブのフラップ配列を、例えばPoly-Tなどのように、イオン化の条件下においても分解を受けにくい配列とすることができるため、ピークの検出を常に容易にすることができる。従って、感度のよい検出を用意に行うことができる。しかも、質量分析装置に特別な精度を求めることなく、このような感度の良い検出を行うことができる。
また、本発明は、オリゴヌクレオチドプローブに対して高価な標識が必要なくなるため、例えば従来のインベーダー法を用いた遺伝子多型検出法に比べ、安価に遺伝子多型検出を行うことができる。
【００２６】
さらに、本発明は、予め検出すべき多型を含む領域をＰＣＲ増幅する場合、増幅後に再度伸長反応を行うことがないため、余剰のプライマーやｄＮＴＰを除去する必要がない。このため、例えば従来のＰＣＲ反応を基本とした遺伝子多型検出法に比べ、簡便に遺伝子多型検出を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明は、検出すべき多型を有する特定の核酸を鋳型核酸とし、鋳型核酸に対し、フラップ配列を有する第１オリゴヌクレオチドと、第２オリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせることにより、３本鎖構造体を形成し、フラップエンドヌクレアーゼによってフラップ配列を含む核酸断片を遊離し、遊離した核酸断片を質量分析装置によって確認することにより、多型を検出する方法である。
【００２８】
本発明における検出の対象としては、特に限定されないが、例えば、ｃＤＮＡ、ヒトを含む様々な生物のゲノミック遺伝子、ウイルス及び細菌を含む様々な微生物の遺伝子などが挙げられる。従って、これら核酸の配列を有するものを鋳型核酸とすることができる。また、これら検出対象となる遺伝子としては、ＤＮＡの遺伝子及びＲＮＡの遺伝子を問わない。
【００２９】
鋳型核酸を含む試料としては特に限定されない。すなわち、生体試料、生体由来試料、抽出核酸試料などに対して多型検出を行うことができる。ここで、生体試料や生体由来試料は、核酸の抽出操作を行わず、核酸包含体（例えば細胞、真菌、細菌、ウイルスなど、核酸を内部に含有する膜構造体）を維持した形態の試料である。生体試料の例としては、臓器、組織、体液、排泄物などが挙げられる。体液には、血液試料、髄液、唾液、乳等が含まれる。血液試料には、全血、血漿、血清等が含まれる。排泄物には、尿、便などが含まれる。生体由来試料は、生体試料から核酸包含体を回収した試料をいう。核酸包含体の回収方法としては特に限定されないが、遠心・超遠心操作、ポリエチレングリコールなどの共沈剤、吸着担体などを用いた方法が挙げられる。抽出核酸試料は、核酸の抽出操作を行った試料であり、抽出後さらに核酸を精製した試料であっても良い。抽出方法としては、酵素、界面活性剤、カオトロピック剤などを用いた方法が挙げられ、精製方法としては、フェノール/クロロホルム、イオン交換樹脂、ガラスフィルター、ガラスビーズ、磁気ビーズ、タンパク凝集作用を有する試薬などを用いた方法が挙げられる。
【００３０】
本発明で検出できる多型は特に限定されず、いわゆる単一ヌクレオチド多型（１塩基多型：single nucleotide polymorphism：ＳＮＰ）及び複数ヌクレオチドからなる配列にわたる多型の両方を含む。本発明においては、多型にはさらに変異も含むものとする。具体的には、本発明で検出できる多型の例としては、一塩基多型、挿入多型、欠失多型などが挙げられる。
【００３１】
本発明の３本鎖構造体の一例を、図１に示す。  
本発明において、特定の核酸である鋳型核酸は、第１領域、第２領域及び第３領域から構成される特定の配列を含む。第１領域は第２領域に隣接した下流に位置し、第２領域は第３領域に隣接した下流に位置する。このうち第２領域が、検出すべき多型の塩基から構成される領域である。
【００３２】
第１オリゴヌクレオチドは、フラップ配列を有し、第２領域から第３領域に特異的なオリゴヌクレオチドである。フラップ配列は、特定の配列と相補性のない配列（具体的には、第１領域に相補性のない配列）である。すなわち第１オリゴヌクレオチドは、第３領域に相補的な配列、第２領域に相補的な配列、及び特定の配列と相補性のないフラップ配列を有する。そして、第３領域に相補的な配列は第２領域に相補的な配列に隣接した下流に位置し、第２領域に相補的な配列はフラップ配列に隣接した下流に位置する。さらに、第１オリゴヌクレオチドは、第３領域に相補的な配列に隣接する上流に、鋳型核酸と相補性のない配列（具体的には、鋳型核酸における、特定の配列に隣接する下流の配列と相補性のない配列）を有していても良い。
【００３３】
第２オリゴヌクレオチドは、第１領域に特異的なオリゴヌクレオチドである。第２オリゴヌクレオチドは、第１領域に相補的な配列、及び、任意の配列を有する。そして、任意の配列は、第１領域に相補的な配列に隣接した下流に位置する。さらに、第２オリゴヌクレオチドは、第１領域に相補的な配列に隣接する下流に、鋳型核酸と相補性のない配列（具体的には、鋳型核酸における、特定の配列に隣接する上流の配列と相補性のない配列）を有していても良い。
【００３４】
フラップエンドヌクレアーゼは、核酸の特殊な構造、すなわち３本鎖構造（ダブルフラップ構造）を認識し、第１オリゴヌクレオチドを切断することによってフラップ配列を含む核酸断片を遊離することができるものであれば特に限定されない。具体的には、鋳型核酸、第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドが３本鎖構造体を形成したとき、３重鎖部分を認識し、第１オリゴヌクレオチドを切断する酵素であれば良い。例えば、クリベース（cleavase）や、特開平１１−７５８４９号公報に記載されている熱耐性フラップエンドヌクレアーゼが挙げられる。例えば多型がＳＮＰでクリベースを用いる場合、図２に示すように、３本鎖構造体のＳＮＰの部位の構造がクリベースによって認識され（図２（ａ））、ＳＮＰ部位に対応する塩基の３´側で第１オリゴヌクレオチドが切断され、フラップ配列及びＳＮＰ部位に対応する塩基を有する核酸断片（以下、フラップ断片と記載する。）が遊離する（図２（ｂ））。  
【００３５】
第１オリゴヌクレオチドは、通常、試料中の多型部位一箇所つき、多型のアレルそれぞれに応じて設計されている。例えば、第１オリゴヌクレオチドとしては、アレル特異的な２種のオリゴヌクレオチドを用いることができる。そして、これらアレル特異的な第１オリゴヌクレオチドの一方及び/又は他方から生じるフラップ断片がマススペクトルにおいて識別可能となるように、第１オリゴヌクレオチドそれぞれのフラップ部分を設定することができる。フラップ配列は、質量分析におけるイオン化の条件下において分解を受けにくい配列とすることが好ましい。このような配列としては、例えばＴのみからなる配列（poly-T）などが挙げられる。
マススペクトルにおいていずれのアレルが検出されたかの区別が可能となるように、第１オリゴヌクレオチドのそれぞれは、フラップ部分の配列において、アレルに応じて異なるように設計することができる。
【００３６】
遺伝子多型検出法においては、試料中の複数の多型部位を検出ターゲットにする場合が多い。この場合、第１オリゴヌクレオチドは、検出すべき複数の多型部位の箇所それぞれに応じて設計されている。例えば、第１オリゴヌクレオチドとしては、アレル特異的な２種の第１オリゴヌクレオチドのセットを、多型部位の種類の数だけ用いることができる。そして、これら多型部位に応じて設計された第１オリゴヌクレオチドから生じるフラップ断片のそれぞれがマススペクトルにおいて識別可能となるように、第１オリゴヌクレオチドそれぞれのフラップ部分を設定することができる。マススペクトルにおいていずれの部位の多型が検出されたかの区別が可能となるように、第１オリゴヌクレオチドのそれぞれは、フラップ部分の配列において、多型の部位に応じて異なるように設計することができる。
【００３７】
フラップ配列が互いに異なる第１オリゴヌクレオチドにおいては、フラップ配列の長さが互いに異なるものが好ましい。例えば、フラップ配列が、単一の塩基から構成され長さにおいてのみ互いに異なるものとすることができる。
【００３８】
第１オリゴヌクレオチド及びフラップ配列の長さとしては特に限定されず、本発明で用いる質量分析装置の分離能を考慮して、当業者が適宜設定することができる。未反応の第１オリゴヌクレオチド、一方のアレルに対応するフラップ断片、及び他方のアレルに対応するフラップ断片がマススペクトルにおいて判別がつくように、それぞれの長さを設定すると良い。例えば、第１オリゴヌクレオチドを、例えば２５〜１４０merの長さに設定することができる。この設定された長さのうち、フラップ配列を例えば１０〜５０merの長さに設定することができる。さらに、異なる第１オリゴヌクレオチド間においては、フラップ配列は、互いに１〜２０merの長さの差をもって設定すると良い。また、上の設定された長さのうち、第２及び第３領域に相補的な配列は例えば１５〜８０merの長さに設定することができる。
【００３９】
第２オリゴヌクレオチドの長さとしては特に限定されないが、例えば１５〜６０merの長さに設定することができる。この設定された長さのうち、第２オリゴヌクレオチドにおける任意の配列は、例えば多型を構成する配列と同じ長さにすることができる。例えば、ＳＮＰを検出する場合、任意の配列は１merとすると良い。上の設定された長さのうち、第１領域に相補的な配列は例えば９〜５９merの長さに設定することができる。
【００４０】
３本鎖構造体の形成及びフラップ断片の遊離における反応は、例えば以下の条件で行うことができる。用いるフラップエンドヌクレアーゼにもよるが等温で５５〜７５℃、５分〜１８時間の条件下で反応行うことができる。クリベースを用いる場合は、５５〜６８℃、５分〜１８時間で反応を行うことができ、例えば６３℃で３０分程度の条件で反応を行うと良い。この反応に先立って核酸増幅を行った場合（核酸増幅については後述する）、用いたプライマーなどの試薬類は除去する必要はない。
【００４１】
また、この反応の直前に、一本鎖にするための条件に供することが好ましい。このために、反応液を例えば９０℃以上で５分以上保持することができる。
【００４２】
反応後は、反応液を脱塩処理し、マトリックスと混合し、測定用プレートにアプライすると良い。脱塩処理には、脱塩カラムを用いると良い。脱塩カラムとしては、ＺｉｐＴｉｐ（ミリポア社製）などが挙げられる。脱塩カラムは、フィルター付きチップの形状のものなどを用いることができる。
【００４３】
マトリックスとしては、２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン(2,4,6-trihydroxyacetophenone)、２，３，４−トリヒドロキシアセトフェノン(2,3,4-trihydroxyacetophenone)、３−ヒドロキシピコリン酸 (3-hydroxypicolinic acid；3-HPA)、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸メチルエステル(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid methyl ester)などから選ぶことができる。これらマトリックスは、例えば適当な溶媒に溶解することにより調製された溶液として用いられる。このような溶媒としては、例えばアセトニトリル−トリフルオロ酢酸水溶液などが挙げられる。マトリックス溶液の組成は、当業者が適宜決定することができる。
【００４４】
測定プレートを、質量分析装置に導入し、通常の方法に従って測定を行う。本発明では、第１オリゴヌクレオチドにおけるフラップ配列を任意に設定することができるため、用いる質量分析装置としては特に限定されることなく、既存の質量分析装置を用いることができる。質量分析装置としては、マトリックス介助レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）イオン源を有するものが好ましい。そして、ＭＡＬＤＩイオン源は、飛行時間（ＴＯＦ）型質量分析計と組み合わせて用いられることがさらに好ましい。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳとしては、例えば、ＡＸＩＭＡ（島津製作所製）やＡＢＩ Voyager（パセプティブ・バイオシステムズ社製）などが挙げられる。
【００４５】
本発明においては、試料の脱塩、試料とマトリックスとの混合、及びＭＳ検出用プレート作製までの工程が自動で行われても良い。このように自動化された場合、多検体について効率よく遺伝子多型検出を行うことが可能である。
【００４６】
マススペクトルにおいては、設定したフラップ配列の質量数に基づき、フラップ断片の存在を確認することによって、多型を検出することができる。フラップエンドヌクレアーゼによる切断反応の前において検出される第１オリゴヌクレオチドのピークが、切断反応後に消失するとともに、フラップ断片のピークが検出されていることを確認することが好ましい。
【００４７】
第１オリゴヌクレオチドとして設計したオリゴヌクレオチドにおける、第２領域（すなわち多型塩基）に対応する塩基が、鋳型核酸において想定した多型部位とマッチする場合は、３本鎖構造を形成し（図２（ａ））、クリベースがこの構造を認識することによって第１オリゴヌクレオチドを切断し、フラップ断片が遊離する（図２（ｂ））。したがって、質量分析の結果は、第１オリゴヌクレオチドが検出されず、フラップ配列が検出される。
【００４８】
反対に、第１オリゴヌクレオチドとして設計したオリゴヌクレオチドにおける、多型塩基に対応する塩基が、鋳型核酸において想定した多型部位とマッチしない場合は、クリベースが認識することができる３本鎖構造が形成されないため、第１オリゴヌクレオチドは切断されず、フラップ断片は遊離しない（図３）。したがって、質量分析の結果は、第１オリゴヌクレオチドが検出され、フラップ断片は検出されない。
【００４９】
例えば、あるＳＮＰ部位がＴ又はＣを取りうる場合、第１オリゴヌクレオチドとして、Ｔ用のオリゴヌクレオチド及びＣ用のオリゴヌクレオチドを用意する。Ｔ用オリゴヌクレオチドとＣ用オリゴヌクレオチドとは、第２領域（すなわちＳＮＰ）に相補的な塩基としてそれぞれＡとＧとを有し、フラップ配列が互いに異なるように設計される。フラップ配列は、Ｔ用オリゴヌクレオチドとＣ用オリゴヌクレオチドとで互いに長さが異なるように設計されることが好ましい。
【００５０】
例えば、Ｔ用オリゴヌクレオチドのフラップ配列をPoly-T12（すなわち１２個のＴで構成される配列）とした場合、図４に模式的に示した反応が起これば、Poly-T12の長さのフラップ配列を有するフラップ断片を検出することによってＳＮＰを検出することができる。一方、Ｃ用オリゴヌクレオチドのフラップ配列をPoly-T15（すなわち１５個のＴで構成される配列）とした場合、図５に模式的に示した反応が起これば、Poly-T15の長さのフラップ配列を有するフラップ断片を検出することによってＳＮＰを検出することができる。そして、検出の結果、フラップ配列Poly-T12を有するフラップ断片が検出され、フラップ配列Poly-T15を有するフラップ断片が検出されない場合は、ＳＮＰがＴ/Ｔのホモ接合体であるとのタイピングを行うことができる。また、フラップ配列Poly-T12を有するフラップ断片とフラップ配列Poly-T15を有するフラップ断片との両方が検出される場合は、ＳＮＰがＴ/Ｃのヘテロ接合体であるとタイピングできる。さらに、フラップ配列Poly-T12を有するフラップ断片が検出されず、フラップ配列Poly-T15を有するフラップ断片が検出される場合は、ＳＮＰがＣ/Ｃのホモ接合体であるとのタイピングを行うことができる。
その他の多型についても同様にタイピングを行うことができる。
【００５１】
本発明においては、ゲノムから直接３本鎖構造形成及びフラップエンドヌクレアーゼによる切断反応を行ってもよいし、検出すべき多型を含む特定の配列を含む領域を予め増幅させておいても良い。特定の配列を含む領域を増幅させるための方法としては特に限定されないが、例えばＰＣＲを行うことができる。試料中の複数の多型を検出する場合は、相当する複数の特定の配列に対し、マルチプレックスＰＣＲを行うことができる。
【００５２】
核酸増幅においては、ホットスタート法を用いることが好ましい。ホットスタート法を用いることによって、プライマーのミスアニーリングやオリゴマー化を防止することができ、望ましくない核酸増幅を防止することができる。また、ホットスタート法を用いると、多くの領域を同時に増幅することができるため、効率よく多型検出を行うことを可能にする。
【００５３】
ゲノムの増幅において、１つの多型部位を増幅するためにはその多型部位をはさんで結合する１対のプライマーを用いる。対象となる試料中の検出すべき多型が複数である場合、検出すべき多型部位が互いに離れた位置に存在する場合には、多型部位の種類の数の２倍のプライマーを用いる。しかし、例えば複数の多型、たとえば２つの多型が接近している場合には、２つの多型部位それぞれを挟んでプライマーを結合させて増幅を行っても良い、２つの多型部位の間にプライマーを結合させず、２つの多型部位の両端に１対のプライマーを結合させて増幅を行っても良い。
【００５４】
ＰＣＲ反応液は、ｐＨ緩衝液、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌなどの塩類、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類、及び熱安定性合成酵素を含む。その他に、界面活性剤やタンパク質などの物質を必要に応じて添加することができる。
【００５５】
ｐＨ緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと、塩酸、硝酸、硫酸などの鉱酸とを組み合わせたもの、及び、その他種々のｐＨ緩衝液を用いることができる。ｐＨ調製された緩衝液は、ＰＣＲ反応液の中で１０ｍＭから１００ｍＭの間の濃度で使用することが好ましい。
【００５６】
プライマーはＰＣＲ反応による核酸合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは合成したものであっても良く、生物界から単離したものであっても良い。
熱安定性合成酵素はプライマー付加による核酸合成のための酵素であり、化学合成系も含む。適切な合成酵素としては、E.coliのＤＮＡポリメラーゼ、E.coliのＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメント、T4ＤＮＡポリメラーゼ、TaqＤＮＡポリメラーゼ、T.litoralisＤＮＡポリメラーゼ、TthＤＮＡポリメラーゼ、PfuＤＮＡポリメラーゼ、Hot Start Taqポリメラーゼ、KODＤＮＡポリメラーゼ、EX TaqＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などがあるが、これらに限定されるものではない。なお、熱安定性とは、高温下、好ましくは６５〜９５℃でもその活性を保持する化合物の性質を意味する。
【００５７】
増幅反応におけるその他の条件としては特に限定されず、公知の方法における条件に基づいて反応を行うことができる。試料に生体試料や生体由来試料を用いる場合は、増幅反応を、２５℃におけるｐＨが８．５〜９．５となる反応液中で行うことが好ましい。そうすることにより、生体試料や生体由来試料に、直接核酸増幅反応液を作用させ、反応を行うことも可能である。
【００５８】
本発明の方法を実施するために好適なキットとして、次のものが挙げられる。
特定の配列として、第１領域、第２領域及び第３領域からなる配列であって、前記第１領域は前記第２領域に隣接した下流に位置し、前記第２領域は検出すべき多型の塩基から構成され且つ前記第３領域に隣接した下流に位置する特定の配列を有する、試料中の特定の核酸の塩基多型を検出するための、遺伝子多型検出キットであり、
<1> 第１オリゴヌクレオチドとして、前記第３領域に相補的な配列、前記第２領域に相補的な配列、及び前記特定の配列と相補性のないフラップ配列を有するオリゴヌクレオチドであって、前記第３領域に相補的な配列は前記第２領域に相補的な配列に隣接した下流に位置し、前記第２領域に相補的な配列は前記フラップ配列に隣接した下流に位置し、且つ、前記フラップ配列が前記多型のアレルのそれぞれに応じて異なるように設計されたオリゴヌクレオチドと、
<2> 第２オリゴヌクレオチドとして、前記第１領域に相補的な配列、及び任意の配列を有するオリゴヌクレオチドであって、前記任意の配列は前記第１領域に相補的な配列に隣接した下流に位置するオリゴヌクレオチドと、
<3>フラップエンドヌクレアーゼと、
<4> マトリックス、及び/又は脱塩カラムとを含む、遺伝子多型検出キット。
【実施例】
【００５９】
以下に、本実施例及び比較例で用いたオリゴヌクレオチドの配列を挙げる。右肩に＊印を付している塩基は、多型部位として想定した塩基、又は、その塩基に対応する相補塩基又は非相補塩基である。
Inv_A：AGTCTGTACTAATTGCACATG*TATTGTTGGGGATTTTCCAT（配列番号1）
Inv_A40merA：AGTCTGTACTAATTGCACATG*TATTGTTGGGGAT（配列番号2）
Inv_Cw1：TTTTTTTTTTTTC*ATGTGCAATTAGTACAGACT（配列番号3）
Inv_Cm：TTTTTTTTTTTTTTTA*ATGTGCAATTAGTACAGACT（配列番号4）
Inv_B1：ATGGAAAATCCCCAACAATAG*（配列番号5）
【００６０】
＜実施例１＞
１．オリゴヌクレオチドの調製
鋳型核酸として、配列番号１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドInv_Aと、第１オリゴヌクレオチドとして、配列番号３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドInv_Cw1と、第２オリゴヌクレオチドとして、配列番号５に示される配列を有するオリゴヌクレオチドInv_B1とについて、プロリゴ・ジャパン株式会社に合成を委託し、合成されたそれぞれのオリゴヌクレオチドを、ＤＷ（蒸留水）で100pmol/mlになるよう調製した。
【００６１】
ここで、鋳型核酸Inv_Aの21番目の塩基をＳＮＰとして想定する。第１オリゴヌクレオチドInv_Cw１が有する塩基配列（配列番号３）は、鋳型核酸が有する塩基配列（配列番号１）の1〜21番目の塩基配列に相補的な塩基配列と、フラップ配列（Poly-T12）とを有する。第２オリゴヌクレオチドInv_B1の塩基配列（配列番号５）は、鋳型核酸が有する塩基配列（配列番号１）の22〜32番目の塩基配列に相補的な塩基配列と、鋳型核酸と無関係な配列とを有する。
【００６２】
２．ダブルフラップ構造の形成及びフラップの切断
以下の成分をＤＷ中に含む反応溶液7μlを調製した。  
Inv_A（鋳型核酸）水溶液                    0.5μl
Inv_Cw1（第１オリゴヌクレオチド）水溶液    1μl
Inv_B1（第２オリゴヌクレオチド）水溶液      1μl
Enzyme Mix（フラップエンドヌクレアーゼ）    0.3μl
Buffer（0.8g/ml PEG800、0.2mmol/ml MOPS）  0.3μl
なお、Enzyme Mixは、Invader DNA Assay (THIRD WAVE TECHNOLOGIES)のKitに含まれているものを使用した。
反応溶液7μlを、0.5mlマイクロチューブに入れ、さらに、蒸発を防ぐため、ミネラルオイルを反応液に重層した。サーマルサイクラーにマイクロチューブをセットし、95℃3分、60℃60分の反応を行なった。
【００６３】
３．質量分析装置によるフラップ断片の確認
反応終了後、マイクロチューブ内の反応溶液から2μlを取り出し、ZipTipC18で脱塩処理を行い、測定用サンプルとした。測定用サンプルは、ＭＳプレート上に50v/v%アセトニトリル水溶液0.5μlで溶出した。さらに、マトリックス液として、3-HPA（３−ヒドロキシピコリン酸）溶液
（0.3M 3-HPA−0.07Mアンモニウムリン酸塩水溶液とアセトニトリルとの50v/v%溶液）を0.5μl重層した。測定は、AXIMA-CFR（島津製作所製）を用いて、Linear-Negativeモードで行った。
【００６４】
得られたマススペクトルを図６（ａ）に示す。図６において、横軸は質量/電荷、縦軸は相対強度(%Int.)を示す。図６（ａ）が示すように、13merのピーク及び20merのピークが検出された。これは、第１オリゴヌクレオチドInv_Cw1が切断されることにより、第１オリゴヌクレオチドInv_Cw1から、（Poly-T12）＋（１塩基：Ｇ）の13merのフラップ断片と、残りの20merのオリゴヌクレオチド断片とが生成したためと考えられる。また、図６（ａ）に示したスペクトルにおいては、第１オリゴヌクレオチドInv_Cw1に相当する33mer付近の質量/電荷の範囲は示されていないが、33merのピークは消失している。このことからも、ダブルフラップ構造が認識されてフラップが切断されたと考えられる。
【００６５】
＜比較例１＞
鋳型核酸として、配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドInv_A40merAと、第１オリゴヌクレオチドとして、配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドInv_Cm（いずれもプロリゴ・ジャパン株式会社に合成を委託）を用いたこと以外は、実施例１の方法と同じ操作を行った。ここで、第１オリゴヌクレオチドInv_Cmが有する塩基配列（配列番号４）は、鋳型核酸が有する塩基配列（配列番号２）の1〜20番目の塩基配列に相補的な塩基配列と、21番目の塩基に相補的でない塩基と、フラップ配列（Poly-T15）とを有する。
【００６６】
得られたマススペクトルを図６（ｂ）に示す。図６（ｂ）が示すように、フラップ断片に相当する16merのピークと、第１オリゴヌクレオチドからフラップ断片が遊離した場合の残りのオリゴヌクレオチド断片に相当する20merのピークとは検出されなかった。また、図６（ｂ）に示したスペクトルにおいては、第１オリゴヌクレオチドInv_Cmに相当する36mer付近の質量/電荷の範囲は示されていないが、36merのピークが検出されている。このことから、Inv_A40merAの21番目の塩基がInv_Cmと相補的でないために、ダブルフラップ構造を形成することができず、認識サイトが存在しなかったため、酵素が働かなかったと考えられる。
【００６７】
以上のように、実施例１において、ＳＮＰがプローブと相補的であればフラップエンドヌクレアーゼによる反応が起こりＳＮＰが検出され、一方、比較例１において、ＳＮＰがプローブと相補的でなければフラップエンドヌクレアーゼによる反応が起こらないことが確認できた。これにより、ＳＮＰを判別することができたといえる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】本発明の鋳型核酸、第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドが３本鎖構造体を形成したときの一例を示した模式図である。
【図２】第１オリゴヌクレオチドとして設計したオリゴヌクレオチドが多型部位において鋳型核酸とマッチすることにより形成した本発明の３本鎖構造体の模式図（ａ）、及び３本鎖構造体がフラップエンドヌクレアーゼによって切断反応を受け、フラップ断片が遊離した様子を示す模式図（ｂ）である。
【図３】第１オリゴヌクレオチドとして設計したオリゴヌクレオチドが多型部位において鋳型核酸とマッチしない場合を表した模式図である。
【図４】ＳＮＰとしてＣが検出される場合を表した模式図である。
【図５】ＳＮＰとしてＴが検出される場合を表した模式図である。
【図６】実施例１において得られたマススペクトル（ａ）及び比較例１において得られたマススペクトル（ｂ）である。
【配列表フリーテキスト】
【００６９】
配列番号１は、合成オリゴヌクレオチドである。
配列番号２は、合成オリゴヌクレオチドである。
配列番号３は、合成オリゴヌクレオチドである。
配列番号４は、合成オリゴヌクレオチドである。
配列番号５は、合成オリゴヌクレオチドである。
【図１】
2007075021.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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