(57)【要約】【課題】  プロテオグリカンの新規医薬用途を提供すること。【解決手段】  本発明によれば、プロテオグリカンの新規医薬用途としてＴＮＦ−α産生抑制剤、ＩＦＮ−γ産生抑制剤、ＩＬ−１０産生促進剤、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４発現抑制剤、ｉＮＯＳ発現抑制剤、ＳＴＡＴ−３発現促進剤が提供される。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテオグリカンを有効成分とすることを特徴とするＴＮＦ−α産生抑制剤。
【請求項２】
プロテオグリカンを有効成分とすることを特徴とするＩＦＮ−γ産生抑制剤。
【請求項３】
プロテオグリカンを有効成分とすることを特徴とするＩＬ−１０産生促進剤。
【請求項４】
プロテオグリカンを有効成分とすることを特徴とするＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４遺伝子発現抑制剤。
【請求項５】
プロテオグリカンを有効成分とすることを特徴とするｉＮＯＳ遺伝子発現抑制剤。
【請求項６】
プロテオグリカンを有効成分とすることを特徴とするＳＴＡＴ−３遺伝子発現促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテオグリカンの新規医薬用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテオグリカンは複合糖質のひとつで、コアタンパクとそれに結合するグリコサミノグリカン（酸性ムコ多糖）から成る。プロテオグリカンは細胞外マトリックスの主な構成要素であり、皮膚、軟骨、骨、血管壁などに存在する。最近、プロテオグリカンは、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなどと共に細胞増殖や接着に関わっていることが報告されている（例えば非特許文献１や非特許文献２を参照）。しかしながら、プロテオグリカンが有する作用の全容はいまだ明らかでない。
【非特許文献１】de Aguiar CBNM, Lobao-Soares B, Alvarez-Silva M, Trentin AG. Glycosaminoglycans mediate C6 glioma cell adhesion to extracellular matrix components and alter cell proliferation and cell migration. BMC Cell Biol 6:31, 2005.
【非特許文献２】Munakata H, Takagaki K, Majima M, Endo M. Interaction between collagens and glycosaminoglycans investigated using a surface plasmon resonance biosensor. Glycobiology 9:1023-1027, 1999.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで本発明は、プロテオグリカンの新規医薬用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは上記の点に鑑みて鋭意研究を進めた結果、プロテオグリカンにこれまでに報告されていない免疫系に対する新規な薬理作用を見出した。
【０００５】
本発明は、上記の知見に基づいてなされたものであり、本発明のＴＮＦ−α産生抑制剤は、請求項１記載の通り、プロテオグリカンを有効成分とすることを特徴とする。
また、本発明のＩＦＮ−γ産生抑制剤は、請求項２記載の通り、プロテオグリカンを有効成分とすることを特徴とする。
また、本発明のＩＬ−１０産生促進剤は、請求項３記載の通り、プロテオグリカンを有効成分とすることを特徴とする。
また、本発明のＴＬＲ２および／またはＴＬＲ４遺伝子発現抑制剤は、請求項４記載の通り、プロテオグリカンを有効成分とすることを特徴とする。
また、本発明のｉＮＯＳ遺伝子発現抑制剤は、請求項５記載の通り、プロテオグリカンを有効成分とすることを特徴とする。
また、本発明のＳＴＡＴ−３遺伝子発現促進剤は、請求項６記載の通り、プロテオグリカンを有効成分とすることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、プロテオグリカンの新規医薬用途が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明において有効成分とするプロテオグリカンは、サケ、サメ、ウシ、クジラなどの軟骨を原材料にして自体公知の方法により精製されてなるものであってよい。プロテオグリカンの精製方法としては、例えば、特開２００２−６９０９７号公報記載の酢酸を用いた方法を好適に採用することができる。
【０００８】
プロテオグリカンは、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）およびＩＦＮ−γ（インターフェロンγ）の産生を抑制する一方で、抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０（インターロイキン１０）の産生を促進させる作用を有する。また、細菌を認識するレセプターであるマクロファージ上のＴＬＲ（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）２やＴＬＲ４の転写レベルの発現を抑制する作用を有する。さらに、殺菌に関わる窒素酸化物生成を媒介するマクロファージのｉＮＯＳ（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｓｔｈａｓｅ）の転写レベルの発現を抑制する作用やＩＬ−１０により活性化される転写因子であるマクロファージのＳＴＡＴ（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）−３の転写レベルの発現を促進させる作用を有する。従って、プロテオグリカンを有効成分とする本発明は、炎症性疾患や自己免疫疾患の予防治療に有用である他、臓器移植時の拒絶反応の抑制、アレルギーの処置、糖尿病などにも有用である。
【０００９】
プロテオグリカンは、経口投与または非経口投与（例えば、静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与など）することができる。投与に際してはそれぞれの投与方法に適した剤型に製剤化すればよい。製剤形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、丸剤、トローチ剤、舌下錠、坐剤、軟膏、注射剤、乳剤、懸濁剤、シロップなどが挙げられ、これら製剤の調製は、無毒性の賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、防腐剤、等張化剤、安定化剤、分散剤、酸化防止剤、着色剤、矯味剤、緩衝剤などの添加剤を使用して自体公知の方法にて行うことができる。無毒性の添加剤としては、例えば、でんぷん、ゼラチン、ブドウ糖、乳糖、果糖、マルトース、炭酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ペトロラタム、グリセリン、エタノール、シロップ、塩化ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、クエン酸、ポリビニルピロリドン、水などが挙げられる。なお、製剤中には、本発明の有用性を補強したり増強したりするために、他の薬剤を含有させてもよい。
【００１０】
製剤中における有効成分の含有量は、その剤型に応じて異なるが、一般に０．１〜１００重量％の濃度であることが望ましい。製剤の投与量は、投与対象者の性別や年齢や体重の他、症状の軽重、医師の診断などにより広範に調整することができるが、一般に１日当り０．０１〜３００ｍｇ／Ｋｇとすることができる。上記の投与量は、１日１回または数回に分けて投与すればよい。
【００１１】
また、プロテオグリカンは、種々の形態の食品（サプリメントを含む）に、所望する薬理作用を発揮するに足る有効量を添加することで、機能性食品として食してもよい。
【実施例】
【００１２】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は、以下の記載に何ら限定して解釈されるものではない。
【００１３】
実験１：
（実験方法）
２４穴培養プレートを用い、マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７を１０％牛胎児血清添加ＤＭＥＭ中で２×１０6／ｗｅｌｌにて培養を行った。その際に特開２００２−６９０９７号公報記載の方法によりサケ軟骨から抽出したプロテオグリカン（以下ＰＧと略す）を所定の濃度で添加した。また、比較対照として、グリコサミノグリカンのひとつである硫酸化ムコ多糖のコンドロイチン４硫酸（以下Ｃ４Ｓと略す）とコンドロイチン６硫酸（以下Ｃ６Ｓと略す）のいずれかも所定の濃度で添加した。同時にマクロファージを刺激するために、グラム陽性細菌であるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（ＬＭ）またはグラム陰性細菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＥＣ）の加熱死菌（以下それぞれＨＫＬＭ、ＨＫＥＣと略す）を２×１０7／ｗｅｌｌ添加した。４８時間培養を行った後、培養上清に含まれるＴＮＦ−αとＩＬ−１０の量をＥＬＩＳＡ法にて測定した。また、回収した培養細胞からｍＲＮＡを抽出し、抽出したｍＲＮＡにおけるＴＬＲ−２、ＴＬＲ−４、ｉＮＯＳ、ＳＴＡＴ−３の発現を定量的ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲにて測定した。
【００１４】
（実験結果）
Ａ：ＰＧは加熱死菌刺激によるマクロファージからのＴＮＦ−αの産生を抑制し、逆にＩＬ−１０の産生を促進した。
マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７を加熱死菌存在下で４８時間培養し、培養上清中のＴＮＦ−αとＩＬ−１０の量を測定したところ、ＰＧを添加することにより、ＨＫＬＭまたはＨＫＥＣを用いた刺激によるＴＮＦ−αの産生は用量依存的に抑制されたが、Ｃ４ＳおよびＣ６Ｓを添加してもＴＮＦ−αの産生抑制は認められなかった。逆にＰＧを添加することにより、ＩＬ−１０の産生は用量依存的に促進された（図１参照）。
【００１５】
Ｂ：ＰＧおよびＣＳは加熱死菌刺激によるＴＬＲの遺伝子発現を抑制した。
ＴＬＲ２は細菌のペプチドグリカンやリポタンパク質の認識に関与しており、ＴＬＲ４はグラム陰性細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）認識に関与していることが明らかとなっている。ＨＫＬＭを用いた刺激により増加するＴＬＲ２の遺伝子発現はＰＧ、Ｃ４Ｓ、Ｃ６Ｓの添加により用量依存的に抑制された。同様に、ＨＫＥＣにより増加するＴＬＲ４の遺伝子発現はＰＧ、Ｃ４Ｓ、Ｃ６Ｓの添加により用量依存的に抑制された（図２参照）。
【００１６】
Ｃ：ＰＧおよびＣＳはｉＮＯＳの遺伝子発現を抑制した。
ＴＮＦ−αはマクロファージを活性化し、細胞内に侵入した細菌の殺菌に重要なＮＯ産生に関わるｉＮＯＳを誘導する。ＨＫＬＭまたはＨＫＥＣを用いた刺激は培養細胞にｉＮＯＳの遺伝子発現の増加を誘導したが、ＰＧ、Ｃ４Ｓ、Ｃ６Ｓの添加によりその誘導は用量依存的に抑制された。この抑制効果はＨＫＬＭとＨＫＥＣのいずれを用いた刺激の場合でもＰＧを添加した場合が最も強かった（図３参照）。
【００１７】
Ｄ：ＰＧはＳＴＡＴ−３の遺伝子発現を促進した。
ＩＬ−１０はＳＴＡＴ−３の誘導に関与している。Ｃ４ＳまたはＣ６Ｓを培養上清中に添加した場合にはＳＴＡＴ−３の遺伝子発現に変化は認められなかった。一方、ＰＧを添加した場合、ＨＫＬＭとＨＫＥＣのいずれを用いた刺激の場合でも用量依存的にＳＴＡＴ−３の遺伝子発現の促進が認められた（図４参照）。
【００１８】
（考察）
生体内で炎症が起こる際、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−８などの様々なサイトカインが誘導される。近年、グルコサミノグリカンまたはその分解産物が炎症の際のこれらのサイトカインの発現調節に関与することが報告されている。例えば、ヘパリンはマウスマクロファージからのＴＮＦ−αの産生を抑制することが報告されている。また、ヘパラン硫酸は腸管上皮細胞からのＩＬ−１βおよびＩＬ−８の産生を抑制することが報告されている。逆に、低分子ヒアルロン酸がＮＦ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ）−κＢの活性化を誘導することも明らかとなっており、分子量によってグルコサミノグリカンの作用に差異があると考えられている。
細菌が生体内に侵入すると、ＴＮＦ−αやＩＦＮ−γなどのサイトカインが誘導され、感染防御に働く。ＮＫ（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ）細胞から産生されるＩＦＮ−γがマクロファージを活性化し、活性化されたマクロファージはＴＮＦ−αを産生し、さらにＴＮＦ−αがマクロファージに取り込まれた細菌の殺菌を促進する。ＩＬ−１０は抗炎症性サイトカインとして知られており、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６などの産生を抑制する。また、ＩＬ−１０はＬＭなどの細胞内寄生菌が増殖するために必要とされているとも考えられている。今回我々が得た結果から、ＰＧが加熱死菌により誘導されたＴＮＦ−αの産生を抑制し、逆にＩＬ−１０の産生を促進することが示された（図１参照）。また、ＴＮＦ−αによって誘導されるｉＮＯＳの遺伝子発現はＰＧ、Ｃ４Ｓ、Ｃ６Ｓの添加によって抑制され（図３参照）、ＩＬ−１０によって誘導されるＳＴＡＴ−３の遺伝子発現はＰＧの添加によって促進された（図４参照）。このことから、ＰＧにはＩＬ−１０の産生を促進させる効果が存在することにより、細菌感染防御に対する抑制作用があることが示唆された。
様々な菌体成分がＴＬＲによって認識されることが明らかになっている。ＴＬＲリガンドの刺激に対し、ＭｙＤ８８（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ８８）、ＴＩＲ（Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＴＲＩＦ（ｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｄａｐｔｏｒ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  β）などのアダプター分子を介してシグナルが伝達されることで、ＮＦ−κＢやＡＰ−１（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−１）などの炎症性サイトカインの遺伝子発現を制御する転写因子が活性化される。今回我々が得た結果では、ＨＫＬＭを用いた刺激によりマクロファージにおけるＴＬＲ２の遺伝子発現が促進され、また、ＨＫＥＣを用いた刺激によりＴＬＲ４の遺伝子発現が促進された（図２参照）。これらの遺伝子の発現促進は、それぞれＬＭの菌体成分がＴＬＲ２に認識され、また、ＥＣのＬＰＳがＴＬＲ４に認識された結果である可能性が考えられる。しかしながら、これらの遺伝子の発現は、ＰＧ、Ｃ４Ｓ、Ｃ６Ｓを培養細胞に添加することによって抑制された（図２参照）。このことから、ＰＧには細菌感染によるＴＬＲの遺伝子発現を抑制する効果があることが示唆された。
以上の結果より、ＰＧは菌体成分による刺激に対するＴＮＦ−αの産生を抑制し、ＩＬ−１０の産生を促進する効果があることが示された。この効果はＣ４ＳやＣ６Ｓに比較して強く、菌体刺激によるＴＬＲの遺伝子発現の抑制が関与していることが示唆された。これらの結果はＰＧが炎症性疾患の予防治療に有用であることを示すものである。
【００１９】
実験２：
（実験方法）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスより無菌的に脾細胞を調製し、１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地で２×１０6／ｍｌとし、大腸菌由来リポ多糖を１０ｍｇ／ｍｌになるように添加し、同時に種々の濃度のＰＧを共存させ、４８時間培養を行った後、培養上清に含まれるＩＦＮ−γの量をＥＬＩＳＡ法にて測定した。
【００２０】
（実験結果）
結果を図５に示す。図５から明らかなように、ＰＧはＩＦＮ−γの産生を用量依存的に抑制した。この結果もＰＧが炎症性疾患の予防治療に有用であることを示すものである。なお、データは示さないが、Ｃ４ＳとＣ６Ｓについて同様の実験を行ったところ、Ｃ４ＳとＣ６ＳにはＩＦＮ−γの産生を抑制する作用は認められなかった。
【００２１】
製剤例１：錠剤
１錠当たり５ｍｇのプロテオグリカンを含む以下の成分組成からなる２００ｍｇ錠剤を、各成分をよく混合してから打錠することで製造した。
プロテオグリカン                      ５ｍｇ
乳糖                              １３７〃
でんぷん                            ４５〃
カルボキシメチルセルロース          １０〃
タルク                                ２〃
ステアリン酸マグネシウム              １〃
合計２００ｍｇ／錠
【００２２】
製剤例２：カプセル剤
１カプセル当たり２０ｍｇのプロテオグリカンを含む以下の成分組成からなる１００ｍｇカプセル剤を、各成分をよく混合してからカプセルに充填することで製造した。
プロテオグリカン                    ２０ｍｇ
乳糖                                ５３〃
でんぷん                            ２５〃
ステアリン酸マグネシウム              ２〃
合計１００ｍｇ／カプセル
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明は、プロテオグリカンの新規医薬用途を提供することができる点において、産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】プロテオグリカンが加熱死菌刺激によるマクロファージからのＴＮＦ−αの産生を抑制し、逆にＩＬ−１０の産生を促進することを示すグラフである。
【図２】プロテオグリカンおよびコンドロイチン硫酸が加熱死菌刺激によるＴＬＲの遺伝子発現を抑制することを示すグラフである。
【図３】プロテオグリカンおよびコンドロイチン硫酸がｉＮＯＳの遺伝子発現を抑制することを示すグラフである。
【図４】プロテオグリカンがＳＴＡＴ−３の遺伝子発現を促進することを示すグラフである。
【図５】プロテオグリカンがＩＦＮ−γの産生を抑制することを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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