(57)【要約】【課題】本発明の課題は、被験者のヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子に肺胞微石症の発症原因となる既知の改変が存在するかを判定する方法の提供である。また、本発明の他の課題は肺胞微石症を発症していない被験者に対して発症可能性を判定し、また肺胞微石症の疑いのある被験者に対してその原因を確定する方法の提供である。本発明の更なる課題は、肺胞微石症患者に対して有効な治療を提供することである。【解決手段】被験者より核酸、若しくはタンパク質を抽出し、それぞれに含まれ得るヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子、及びヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質が既知の改変を有するか、あるいは野生型の塩基配列からの改変や野生型のアミノ酸配列からのアミノ酸改変を有するかを検出する方法と、それに使用する変異プライマーとクランププライマーを提供する。また、ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子を基礎とする矯正遺伝子を用いた肺胞微石症の治療法を提供する。【選択図】  図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来の核酸を抽出する核酸抽出工程と、
前記抽出された核酸に含まれ得るヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列が、配列番号１で表される野生型の塩基配列からの改変に由来する既知の改変を有するかを検出する遺伝子改変検出工程と、
からなる肺胞微石症の発症可能性を判定する肺胞微石症発症判定方法。
【請求項２】
ヒト由来の核酸を抽出する核酸抽出工程と、
前記抽出された核酸に含まれ得るヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列が、配列番号１で表される野生型の塩基配列から改変されたかを検出する遺伝子改変検出工程と、
前記抽出された核酸に含まれ得るヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の遺伝型が、野生型ホモ、改変型ホモ、野生型及び改変型のへテロ、又は改変型へテロのいずれであるかを判定する遺伝型判定工程と、
からなる肺胞微石症発症判定方法。
【請求項３】
前記核酸抽出工程において抽出する核酸は、ゲノムＤＮＡ、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又はそれらに基づく核酸である請求項1又は２に記載の肺胞微石症発症判定方法。
【請求項４】
前記トータルＲＮＡ、又はｍＲＮＡは、肺組織、喀痰、又は胸水から抽出されるものである請求項３に記載の肺胞微石症発症判定方法。
【請求項５】
前記遺伝子改変検出工程における検出すべき改変の様態は、
塩基の欠失、置換、又は付加である請求項1から４のいずれか一に記載の肺胞微石症発症判定方法。
【請求項６】
前記遺伝子改変検出工程における検出すべき既知の改変は、
配列番号１で表される第１３２９０位のＴから第１３３０４位のＧまでの塩基配列が配列番号３で表される塩基配列で置換された改変である請求項１から４のいずれか一に記載の肺胞微石症発症判定方法。
【請求項７】
前記遺伝子改変検出工程における検出すべき既知の改変は、
配列番号１で表される塩基配列において第8イントロンのスプライシングドナー部位のＧがＡに置換された改変に基づくものである請求項１から４のいずれか一に記載の肺胞微石症発症判定方法。
【請求項８】
前記遺伝子改変検出工程における改変の検出方法は、
配列番号１で表される野生型ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列からの改変に由来する既知の改変の塩基配列の全部、又は連続する少なくとも１４塩基以上からなる一部を有するポリヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションにより検出する方法である請求項１から７のいずれか一に記載の肺胞微石症発症判定方法。
【請求項９】
前記遺伝子改変検出工程における改変の検出方法は、
配列番号１で表される野生型ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列からの改変に由来する既知の改変の塩基配列が存在し得る領域の全部又は一部の塩基配列の決定により検出する方法である請求項１から７のいずれか一に記載の肺胞微石症発症判定方法。
【請求項１０】
前記遺伝子改変検出工程における改変の検出方法は、
配列番号１で表される野生型ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列の全部又は連続する少なくとも１４塩基以上からなる一部を有するポリヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションにより検出する方法である請求項２に記載の肺胞微石症発症判定方法、又は請求項３若しくは４に記載の肺胞微石症発症判定方法のうち請求項２に従属する肺胞微石症発症判定方法のいずれか一に記載の肺胞微石症発症判定方法。
【請求項１１】
前記遺伝子改変検出工程における改変の検出方法は、
前記核酸抽出工程で抽出された核酸においてヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子が存在し得る領域の全部、又は一部の塩基配列を決定し、当該塩基配列と配列番号１で表される野生型遺伝子の塩基配列との比較により検出する方法である請求項２に記載の肺胞微石症発症判定方法、又は請求項３若しくは４に記載の肺胞微石症発症判定方法のうち請求項２に従属する肺胞微石症発症判定方法のいずれか一に記載の肺胞微石症発症判定方法。
【請求項１２】
前記遺伝子改変検出工程における改変の検出方法は、
核酸増幅法によって目的とする核酸増幅産物が増加したかによって検出する方法である請求項１から７のいずれか一に記載の肺胞微石症発症判定方法。
【請求項１３】
前記遺伝子改変検出工程における改変の検出方法は、
核酸増幅法によって増幅される野生型の核酸増幅産物と、改変型の核酸増幅産物の塩基数の比較によって検出するする方法である請求項２に記載の肺胞微石症発症判定方法、又は請求項３若しくは４に記載の肺胞微石症発症判定方法のうち請求項２に従属する肺胞微石症発症判定方法のいずれか一に記載の肺胞微石症発症判定方法。
【請求項１４】
前記遺伝子改変検出工程における改変の検出は、
ＲＦＬＰを利用した制限酵素のよる野生型と改変型での切断パターンよって検出する方法である請求項２に記載の肺胞微石症発症判定方法、又は請求項３若しくは４に記載の肺胞微石症発症判定方法のうち請求項２に従属する肺胞微石症発症判定方法のいずれか一に記載の肺胞微石症発症判定方法。
【請求項１５】
ヒト由来のタンパク質を抽出するタンパク質抽出工程と、
前記抽出されたタンパク質に含まれ得るヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２で表される野生型のアミノ酸配列からの既知のアミノ酸改変を有するかを検出するアミノ酸改変検出工程と、
からなる肺胞微石症の発症可能性を判定する肺胞微石症発症判定方法。
【請求項１６】
ヒト由来のタンパク質を抽出するタンパク質抽出工程と、
前記抽出されたタンパク質に含まれ得るヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２で表される野生型のアミノ酸配列からアミノ酸改変されたかを検出するアミノ酸改変検出工程と、
前記抽出されたタンパク質に含まれ得るヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質をコードするヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の遺伝型が野生型ホモ、改変型ホモ、野生型及び改変型のへテロ、又は改変型へテロのいずれであるかを判定する第二遺伝型判定工程と、
からなる肺胞微石症発症判定方法。
【請求項１７】
前記タンパク質抽出工程におけるタンパク質は、
肺組織から抽出する請求項１５又は１６に記載の肺胞微石症発症判定方法。
【請求項１８】
前記アミノ酸改変検出工程における検出すべきアミノ酸改変の様態は、
アミノ酸の欠失、置換、又は付加である請求項１５から１７のいずれか一に記載の肺胞微石症発症判定方法。
【請求項１９】
前記アミノ酸改変検出工程における検出すべきアミノ酸改変は、
配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸改変である請求項１５から１７のいずれか一に記載の肺胞微石症発症判定方法。
【請求項２０】
前記アミノ酸改変検出工程における検出すべきアミノ酸改変は、
配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸改変である請求項１５から１７のいずれか一に記載の肺胞微石症発症判定方法。
【請求項２１】
前記アミノ酸改変検出工程におけるアミノ酸改変の検出方法は、
既知のアミノ酸改変型ヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列において、該アミノ酸配列のアミノ酸改変された全部又は連続する少なくとも5アミノ酸以上の一部を有するポリペプチドを抗原とした抗体を用いる抗原抗体反応法により検出する方法である請求項１５から２０のいずれか一に記載の肺胞微石症の発症可能性を判定する方法。
【請求項２２】
前記アミノ酸改変検出工程におけるアミノ酸改変の検出方法は
配列番号２で表される野生型ヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列の全部又は連続する少なくとも５アミノ酸以上の一部を有するポリヌクレオチドを抗原とした抗体を用いる抗原抗体反応法により検出する方法である請求項１６に記載の肺胞微石症発症判定方法、又は請求項１７若しくは１８に記載の肺胞微石症発症判定方法のうち請求項１６に従属する肺胞微石症発症判定方法のいずれか一に記載の肺胞微石症発症判定方法。
【請求項２３】
配列番号１で表される野生型の塩基配列からの改変に由来する既知の改変型ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列において、改変された領域の塩基配列の全部又は連続する少なくとも１４塩基以上を一部として有する塩基配列からなり、かつ請求項８に記載の肺胞微石症発症判定方法で使用するプローブとして用いられるポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記改変された領域の塩基配列が配列番号３で表される塩基配列である請求項２３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
前記改変された領域の塩基配列が配列番号４で表される塩基配列である請求項２３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
配列番号１で表される野生型ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列において全部、又は連続する少なくとも１４塩基以上を一部として有する塩基配列からなり、かつ請求項１０に記載の肺胞微石症発症判定方法で使用するプローブとして用いられるポリヌクレオチド。
【請求項２７】
配列番号１で表される野生型の塩基配列からの改変に由来する既知の改変型ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列において、改変された領域の塩基配列が１８塩基以上の場合、当該改変された領域の塩基配列の連続する１８から６０塩基を一部として有し、かつ請求項９、若しくは１２に記載の肺胞微石症発症判定方法で使用するプライマーとして用いられるポリヌクレオチド。
【請求項２８】
前記改変された領域の塩基配列が配列番号３で表される塩基配列である請求項２７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２９】
前記改変された領域の塩基配列が配列番号４で表される塩基配列である請求項２７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３０】
配列番号１で表される野生型ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列において連続する１８から６０塩基を一部として有し、かつ請求項１１、若しくは１３に記載の肺胞微石症発症判定方法で使用するプライマーとして用いられるポリヌクレオチド。
【請求項３１】
請求項２３から３０のいずれか一以上のポリヌクレオチドを用いて肺胞微石症の発症可能性を判定する肺胞微石症発症判定用キット。
【請求項３２】
配列番号２で表される野生型のアミノ酸配列からの既知のアミノ酸改変型ヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列において、アミノ酸改変された領域のアミノ酸配列の全部又は連続する少なくとも５アミノ酸以上を一部として有するアミノ酸配列からなり、かつ請求項１５に記載の肺胞微石症発症判定方法においてアミノ酸改変を検出する抗体を作成するための抗原としてのポリペプチド。
【請求項３３】
前記アミノ酸改変された領域のアミノ酸配列が配列番号５で表されるアミノ酸配列である請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
前記アミノ酸改変された領域のアミノ酸配列が配列番号６で表されるアミノ酸配列である請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
配列番号２で表される野生型ヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列の全部又は連続する少なくとも５アミノ酸以上を一部として有するアミノ酸配列からなり、かつ請求項１６に記載の肺胞微石症発症判定方法の改変を検出する抗体を作成するための抗原としてのポリペプチド。
【請求項３６】
ヒト由来の核酸を抽出する核酸抽出工程と、
前記抽出された核酸に含まれ得るヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の発現制御領域の塩基配列が、配列番号７で表される野生型の塩基配列から改変されたかを検出する発現制御領域改変検出工程と、
からなる肺胞微石症の発症可能性を判定する肺胞微石症発症判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺胞微石症の発症可能性を判定する方法と、該方法において使用するプローブ若しくはプライマーとしてのポリヌクレオチド、及び抗体作成のための抗原として使用するポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
肺胞微石症は、肺胞内に層状、年輪状のリン酸カルシウムよりなる無数の微結石が形成される原因不明の稀な疾患である（非特許文献１）。本疾患は小児から成人に至るまで見られるが発症における性差はなく、その症状は年齢により異なる。通常、小児期から若年期の症例では胸部Ｘ線像に顕著なびまん性肺陰影が見られるにもかかわらず、概して自覚症状に乏しい。そのため、この年齢の多くの症例は、健康診断や家族検診等で偶然の機会により発見されることが多い。これに対して４０歳以上の症例では運動時の呼吸困難、咳等自覚症状を訴える。本疾患の長期予後は発見時の年齢により異なるものの、必ずしも良好ではない。特に４０歳以上の中高年期では症状の進行に伴い咳、呼吸困難等の呼吸器症状を生じ、呼吸不全に陥って死亡する例も多い。本疾患罹患患者の平均死亡年齢は５０歳代であり、４０歳以上の発見では半数が５年以内に死亡している。
【０００３】
本疾患は同胞発生の頻度が高いことや兄弟間のような水平伝播の傾向が見られることから常染色体劣性遺伝による遺伝性肺疾患と考えられている（非特許文献2）。しかし、その原因遺伝子は同定されていない。稀な疾患ではあるが、単一民族からなる島国のように同胞性の高い国や、宗教的背景から近親婚率の高い国では潜在的な発症頻度は必ずしも低いとは言えず、無視できる疾患ではない。特に日本は本疾患の症例が世界的にも非常に多いことが知られている（非特許文献3）。
【０００４】
このような背景から、本疾患の原因究明や治療方法の開発が望まれているが、現在のところ酸素療法等の対処療法や肺移植以外には有効な治療方法は知られていない。また、本疾患は発見時が高齢なほど、あるいは加齢が進むほど症状が悪化する傾向にある。しかし、小児期から若年期が無症状であることや経過が極めて緩慢なこと等から、偶然的な機会がなければ早期発見は難しい。実際、自覚症状による発見時には既に症状が進行している例が多い。自覚症状のない時期に肺胞微石症を発症する可能性を迅速、かつ容易に判定できれば、医師による早期診断や近い将来開発されると予想される本疾患の治療方法による早期治療を受けることも可能と考えられる。
【特許文献１】特願２００５−２０３６５４
【特許文献２】ＵＳＰ５，４２４１８６
【特許文献３】特表平１０−５０３８４１
【特許文献４】特願２００５−１１７６９８
【非特許文献１】Ｍａｒｉｏｔｔａ  S．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ  Ｖａｓｃ．  Ｄｉｆｆｕｓｅ  Ｌｕｎｇ  Ｄｉｓ．  ２１，  １７３−８１  （２００４）．
【非特許文献２】Ｃａｓｔｅｌｌａｎａ  G．  &  Ｌａｍｏｒｇｅｓｅ  Ｖ．，  Ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ７０，  ５４９−５５ （２００３）．
【非特許文献３】Ｔａｃｈｉｂａｎａ  T．，  Ｈａｙａｓｈｉ  Ｓ．，  Ｊｏｋｏｈ  Ｔ．，  UEDA S．  & Ｔａｋａｈａｓｈｉ  H．，  Ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ  Ｖａｓｃ．  Ｄｉｆｆｕｓｅ  Ｌｕｎｇ  Ｄｉｓ．  １８（ｓｕｐｐｌ  1），  ５８  （２００１）．
【非特許文献４】Ｌａｎｄｅｒ  E．  &  Ｂｏｔｓｔｅｉｎ  D．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６，  １５６７−７０  （１９８７）．
【非特許文献５】Ｍｕｒｅｒ  Ｈ．，  Ｆｏｒｓｔｅｒ  Ｉ．  &  Ｂｉｂｅｒ  Ｊ．，Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ．−Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ４４７，  ７６３−６７（２００４）．
【非特許文献６】Ｘｕ  Ｈ．，  Ｂａｉ  Ｌ．，  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｊ．Ｆ．  &  Ｇｈｉｓｈａｎ  Ｆ．Ｋ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６２，  ２８１−４  （１９９９）．
【非特許文献７】ＮａｇａｉＹ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）．
【非特許文献８】Ｈｕｑｕｎ，  Ｉｚｕｍｉ  Ｓ．，  Ｍｉｙａｚａｗａ  Ｈ．，  Ｉｓｈｉｉ  Ｋ．，  Ｕｃｈｉｙａｍａ  Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、肺胞微石症の自覚症状前の被験者に対して肺胞微石症の発症可能性を判定する方法を提供することである。本発明の他の課題は、臨床症状で肺胞微石症の疑いがあると診断された被験者に対して、その原因を確定することである。本発明の更なる課題は、被験者に対して迅速、かつ容易に肺胞微石症の発症が可能な発症判定に使用するプローブ若しくはプライマーとしてのポリヌクレオチド、及び抗体作成のための抗原として使用するポリペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するためには、まず肺胞微石症の原因遺伝子を同定する必要があった。そこで、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、肺胞微石症の原因遺伝子がヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質をコードするヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子であることを発見した。本発明は、係る肺胞微石症原因遺伝子の発見に基づいて完成された以下の肺胞微石症の発症可能性を判定する方法、それに使用するポリヌクレオチド及びポリペプチドを提供する。該方法において使用するプローブ若しくはプライマーとしてのポリヌクレオチド、及び抗体作成のための抗原として使用するポリペプチドに関する。すなわち、以下の発明を提供する。
【０００７】
（１）本発明は、ヒト由来の核酸を抽出する核酸抽出工程と、前記抽出された核酸に含まれ得るヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列が、配列番号１で表される野生型の塩基配列からの改変に由来する既知の改変を有するかを検出する遺伝子改変検出工程とからなる肺胞微石症の発症可能性を判定する肺胞微石症発症判定方法を提供する。
【０００８】
（２）本発明は、ヒト由来の核酸を抽出する核酸抽出工程と、前記抽出された核酸に含まれ得るヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列が、配列番号１で表される野生型の塩基配列から改変されたかを検出する遺伝子改変検出工程と、前記抽出された核酸に含まれ得るヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の遺伝型が、野生型ホモ、改変型ホモ、野生型及び改変型のへテロ、又は改変型へテロのいずれであるかを判定する遺伝型判定工程とからなる肺胞微石症発症判定方法を提供する。
【０００９】
（３）本発明は、前記核酸抽出工程において抽出する核酸がゲノムＤＮＡ、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又はそれらに基づく核酸である肺胞微石症発症判定方法を提供する。
【００１０】
（４）本発明は、前記トータルＲＮＡ、又はｍＲＮＡが肺組織、喀痰、又は胸水から抽出されるものである肺胞微石症発症判定方法を提供する。
【００１１】
（５）本発明は、前記遺伝子改変検出工程における検出すべき改変の様態が塩基の欠失、置換、又は付加である肺胞微石症発症判定方法を提供する。
【００１２】
（６）本発明は、前記遺伝子改変検出工程における検出すべき既知の改変が配列番号１で表される第１３２９０位のＴから第１３３０４位Ｇまでの塩基配列が配列番号３で表される塩基配列で置換された改変である肺胞微石症発症判定方法を提供する。
【００１３】
（７）本発明は、前記遺伝子改変検出工程における検出すべき既知の改変が配列番号１で表される塩基配列において第8イントロンのスプライシングドナー部位のＧがＡに置換された改変に基づくものである肺胞微石症発症判定方法を提供する。
【００１４】
（８）本発明は、前記遺伝子改変検出工程における改変の検出方法が配列番号１で表される野生型ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列からの改変に由来する既知の改変の塩基配列の全部、又は連続する少なくとも１４塩基以上からなる一部を有するポリヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションにより検出する方法である肺胞微石症発症判定方法を提供する。
【００１５】
（９）本発明は、前記遺伝子改変検出工程における改変の検出方法が配列番号１で表される野生型ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列からの改変に由来する既知の改変の塩基配列が存在し得る領域の全部又は一部の塩基配列の決定により検出する方法である肺胞微石症発症判定方法を提供する。
【００１６】
（１０）本発明は、前記遺伝子改変検出工程における改変の検出方法が配列番号１で表される野生型ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列の全部又は連続する少なくとも１４塩基以上からなる一部を有するポリヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションにより検出する方法である肺胞微石症発症判定方法を提供する。
【００１７】
（１１）本発明は、前記遺伝子改変検出工程における改変の検出方法が前記核酸抽出工程で抽出された核酸においてヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子が存在し得る領域の全部、又は一部の塩基配列を決定し、当該塩基配列と配列番号１で表される野生型遺伝子の塩基配列との比較により検出する方法である肺胞微石症発症判定方法を提供する。
【００１８】
（１２）本発明は、前記遺伝子改変検出工程における改変の検出方法が核酸増幅法によって目的とする核酸増幅産物が増加したかによって検出する方法である肺胞微石症発症判定方法を提供する。
【００１９】
（１３）本発明は、前記遺伝子改変検出工程における改変の検出方法が核酸増幅法によって増幅される野生型の核酸増幅産物と、改変型の核酸増幅産物の塩基数の比較によって検出するする方法である肺胞微石症発症判定方法を提供する。
【００２０】
（１４）本発明は、前記遺伝子改変検出工程における改変の検出がＲＦＬＰを利用した制限酵素のよる野生型と改変型での切断パターンよって行われる肺胞微石症発症判定方法を提供する。
【００２１】
（１５）本発明は、ヒト由来のタンパク質を抽出するタンパク質抽出工程と、前記抽出されたタンパク質に含まれ得るヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２で表される野生型のアミノ酸配列からの既知のアミノ酸改変を有するかを検出するアミノ酸改変検出工程と、からなる肺胞微石症の発症可能性を判定する肺胞微石症発症判定方法を提供する。
【００２２】
（１６）本発明は、ヒト由来のタンパク質を抽出するタンパク質抽出工程と、前記抽出されたタンパク質に含まれ得るヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２で表される野生型のアミノ酸配列からアミノ酸改変されたかを検出するアミノ酸改変検出工程と、前記抽出されたタンパク質に含まれ得るヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質をコードするヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の遺伝型が野生型ホモ、改変型ホモ、野生型及び改変型のへテロ、又は改変型へテロのいずれであるかを判定する第二遺伝型判定工程とからなる肺胞微石症発症判定方法を提供する。
【００２３】
（１７）本発明は、前記タンパク質抽出工程におけるタンパク質が肺組織から抽出する肺胞微石症発症判定方法を提供する。
【００２４】
（１８）本発明は、前記アミノ酸改変検出工程における検出すべきアミノ酸改変の様態がアミノ酸の欠失、置換、又は付加である肺胞微石症発症判定方法を提供する。
【００２５】
（１９）本発明は、前記アミノ酸改変検出工程における検出すべきアミノ酸改変が配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸改変である肺胞微石症発症判定方法を提供する。
【００２６】
（２０）本発明は、前記アミノ酸改変検出工程における検出すべきアミノ酸改変が配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸改変である肺胞微石症発症判定方法を提供する。
【００２７】
（２１）本発明は、前記アミノ酸改変検出工程におけるアミノ酸改変の検出方法が既知のアミノ酸改変型ヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列において、該アミノ酸配列のアミノ酸改変された全部又は連続する少なくとも5アミノ酸以上の一部を有するポリペプチドを抗原とした抗体を用いる抗原抗体反応法により検出する方法である肺胞微石症発症判定方法を提供する。
【００２８】
（２２）本発明は、前記アミノ酸改変検出工程におけるアミノ酸改変の検出方法が配列番号２で表される野生型ヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列の全部又は連続する少なくとも５アミノ酸以上の一部を有するポリヌクレオチドを抗原とした抗体を用いる抗原抗体反応法により検出する方法である肺胞微石症発症判定方法を提供する。
【００２９】
（２３）本発明は、配列番号１で表される野生型の塩基配列からの改変に由来する既知の改変型ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列において、改変された領域の塩基配列の全部又は連続する少なくとも１４塩基以上を一部として有する塩基配列からなり、かつ前記（８）に記載の肺胞微石症発症判定方法で使用するプローブとして用いられるポリヌクレオチドを提供する。
【００３０】
（２４）本発明は、前記改変された領域の塩基配列が配列番号３で表される塩基配列であるポリヌクレオチドを提供する。
【００３１】
（２５）本発明は、前記改変された領域の塩基配列が配列番号４で表される塩基配列であるポリヌクレオチドを提供する。
【００３２】
（２６）本発明は、配列番号１で表される野生型ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列において全部、又は連続する少なくとも１４塩基以上を一部として有する塩基配列からなり、かつ前記（１０）に記載の肺胞微石症発症判定方法で使用するプローブとして用いられるポリヌクレオチドを提供する。
【００３３】
（２７）本発明は、配列番号１で表される野生型の塩基配列からの改変に由来する既知の改変型ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列において、改変された領域の塩基配列が１８塩基以上の場合、当該改変された領域の塩基配列の連続する１８から６０塩基を一部として有し、かつ前記（９）、若しくは（１２）に記載の肺胞微石症発症判定方法で使用するプライマーとして用いられるポリヌクレオチドを提供する。
【００３４】
（２８）本発明は、前記改変された領域の塩基配列が配列番号３で表される塩基配列であるポリヌクレオチドを提供する。
【００３５】
（２９）本発明は、前記改変された領域の塩基配列が配列番号４で表される塩基配列であるポリヌクレオチドを提供する。
【００３６】
（３０）本発明は、配列番号１で表される野生型ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列において連続する１８から６０塩基を一部として有し、かつ前記（１１）、若しくは（１３）に記載の肺胞微石症発症判定方法で使用するプライマーとして用いられるポリヌクレオチドを提供する。
【００３７】
（３１）本発明は、前記（２３）から（３０）のいずれか一以上のポリヌクレオチドを用いて肺胞微石症の発症可能性を判定する肺胞微石症発症判定用キットを提供する。
【００３８】
（３２）本発明は、配列番号２で表される野生型のアミノ酸配列からの既知のアミノ酸改変型ヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列において、アミノ酸改変された領域のアミノ酸配列の全部又は連続する少なくとも５アミノ酸以上を一部として有するアミノ酸配列からなり、かつ前記（１５）に記載の肺胞微石症発症判定方法においてアミノ酸改変を検出する抗体を作成するための抗原としてのポリペプチドを提供する。
【００３９】
（３３）本発明は、前記アミノ酸改変された領域のアミノ酸配列が配列番号５で表されるアミノ酸配列であるポリペプチドを提供する。
【００４０】
（３４）本発明は、前記アミノ酸改変された領域のアミノ酸配列が配列番号６で表されるアミノ酸配列であるポリペプチドを提供する。
【００４１】
（３５）本発明は、配列番号２で表される野生型ヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列の全部又は連続する少なくとも５アミノ酸以上を一部として有するアミノ酸配列からなり、かつ前記（１６）に記載の肺胞微石症発症判定方法の改変を検出する抗体を作成するための抗原としてのポリペプチドを提供する。
【００４２】
（３６）本発明は、ヒト由来の核酸を抽出する核酸抽出工程と、前記抽出された核酸に含まれ得るヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の発現制御領域の塩基配列が、配列番号７で表される野生型の塩基配列から改変されたかを検出する発現制御領域改変検出工程と、からなる肺胞微石症の発症可能性を判定する肺胞微石症発症判定方法を提供する。
【発明の効果】
【００４３】
本発明の「発症判定方法」によれば、ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子が肺胞微石症の発症原因となる既知の改変を有するかを迅速、かつ容易に検出することができる。肺胞微石症の自覚症状発症前の被験者であれば、当該検出により今後肺胞微石症を自覚症状として発症する可能性を判定することができる。判定結果が「発症する可能性がある。」というものであれば、当該被験者のヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の遺伝型を確認し、医師による早期診断、早期治療を受診することが可能となる。また臨床症状から既に肺胞微石症と診断されている被験者であれば、この検出により当該被験者のヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子が既知の改変を有するかを判定できる。既知の改変を有していれば、当該被験者は遺伝子レベルでも肺胞微石症である可能性があると判定できる。
【００４４】
本発明の「発症判定方法」によれば、肺胞微石症の自覚症状前に被験者のヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子に関する遺伝型を迅速、かつ容易に判定することが出来る。当該判定結果により当該疾患の将来的な発症可能性を判定することができる。また、当該方法は、被験者が胎児であっても実施が可能である。さらに、当該方法で被験者の当該疾患の発症可能性が高いと判定された場合も、医師による早期診断、早期治療を受診することが可能となる。
【００４５】
本発明の「発症判定方法」によれば、臨床症状から肺胞微石症の疑いのある疾患を発症している被験者に対して実施することで、ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の改変を検出することにより当該被験者が肺胞微石症であると確定することができる。また、当該遺伝子の改変によることが判明すれば、それに応じた適切な治療を施すことが可能となる。
【００４６】
本発明の「発症判定方法」によれば、夫婦のヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の遺伝型を明らかにすることで、当該夫婦間に生まれる子供の肺胞微石症の発症可能性を予測できる。さらに、その結果に応じて妊娠判明後、早期に胎児の発症可能性を判定することで、胎児における肺胞微石症の早期診断、早期治療が可能となる。
【００４７】
本発明の「発症判定方法に用いるポリペプチドを含むキット等」によれば、ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の改変による肺胞微石症の発症の可能性を迅速かつ簡便に判定することができる。
【００４８】
本発明の前記判定方法、又は前記キット等によれば、一定の操作技術を習得した者であれば医師のような専門知識や熟練性を要すること無くヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の改変による肺胞微石症の発症可能性を判定することができる。また、当該方法のうちいくつかは、特段の専用機器等を必要とせず、ほとんどの研究施設等に常備されている機器等で実施できる。また、当該方法のうち特別な専用機器を必要とするものに関しては、専門業者に容易に解析を委託することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
以下に、各発明を実施するための最良の実施形態を説明する。なお、本発明はこれらの実施の形態に何ら限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において、種々なる様態で実施しうる。
【００５０】
本発明において、核酸、塩基、塩基配列、遺伝子、遺伝型、野生型、ホモ、へテロ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ、イントロン、スプライシングドナー部位、ハイブリダイゼーション、プローブ、プライマー、タンパク質、アミノ酸、アミノ酸配列、コードの用語の定義は、現在、分子生物学、遺伝学、遺伝子工学等の分野で当業者が広く一般的に使用している意味と同じであることから、本明細書ではこれらの定義の説明を省略する。
【００５１】
実施形態１は、請求項１、３から９、１２、２３から３０等に関するものである。
実施形態２は、請求項２から１４、２３から３０等に関するものである。実施形態３は、請求項１５、１７から２１、３２から３５等に関するものである。実施形態４は、請求項１６から２２、３２から３５等に関するものである。実施形態５は、請求項３１等に関するものである。実施形態６は、請求項３６等に関するものである。
【００５２】
本実施形態の説明に入る前に、肺胞微石症の原因遺伝子の発見に関して説明しておく。本疾患は単純劣性遺伝子疾患であることが過去の研究結果から示唆されている（非特許文献３）。劣性疾患遺伝子を同定する方法としては、従来技術としてホモ接合体マッピング（Ｈｏｍｏｚｙｇｏｓｉｔｙ  ｍａｐｐｉｎｇ）法が知られている（非特許文献4）。しかし、家系解析を主体とするこの方法では、肺胞微石症のような稀少遺伝子疾患の原因遺伝子を同定することは困難であった。そこで、本発明者らはホモ接合体マッピング法の概念を拡張して新たにホモ接合体指紋法（Ｈｏｍｏｚｙｇｏｓｉｔｙ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ法）を開発した。ホモ接合体指紋法の原理等に関しては、本発明者らが発明した特許出願中の「ホモ接合指紋法による同祖領域判定方法、同祖領域判定装置、及び遺伝子スクリーニング方法（特許文献１）」を参照されたい。
【００５３】
前記ホモ接合体指紋法により３人の肺胞微石症患者から得られた試料を用いてその原因遺伝子のスクリーニングを行った結果、本疾患の原因遺伝子は１１．５Ｍｂ（Ｍｂ＝１００万塩基）の候補領域に存在することが判明した。当該候補領域には３５個の遺伝子が含まれており、このうち２５個は既知遺伝子、若しくはその機能が予測された遺伝子であった。本疾患と関連性が高いと考えられるカルシウムやリン酸の代謝に直接関与する遺伝子は、前記候補領域中ではヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子のみであった。ヒトＳＬＣ３４Ａ２（Ｕｎｉｇｅｎｅ  Ｈｓ．４７９３７２）遺伝子は、ソリュート・キャリアー・ファミリー３４（ＳＬＣ３４）メンバーの一つであり、ヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質をコードしている。このタンパク質は主に細胞膜上でナトリウム依存的方法によりリン酸イオンの輸送に機能している膜タンパク質である（非特許文献５）。そこで、当該遺伝子を肺胞微石症の原因遺伝子の候補として着目して、前記肺胞微石症患者３人、及び健常人１０人の当該遺伝子のゲノム塩基配列をそれぞれ決定した。その結果、健常人ではいずれも野生型の塩基配列と同じであったが、肺胞微石症患者では３人全員が当該遺伝子にホモ接合で改変を有していた。肺胞微石症患者から検出された改変の種類は、図１、及び図２に示す二種類であった。また、当該二種類の遺伝子の改変に基づくアミノ酸改変型タンパク質は、いずれもヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体としての活性を有さないことが判明した。以上の結果から、ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子が肺胞微石症の原因遺伝子であり、ヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体の機能の失活が肺胞微石症の発症原因と関連することが明らかとなった（非特許文献８）。以下、本発明者らが発見した二種類の改変について詳細に説明する。
【００５４】
第一の改変は図１のＡに示すような置換による改変であった。具体的には野生型の塩基配列（０１０１）において配列番号１の第１３２９０位のＴから第１３３０４位のＧまでの１５塩基に相当する配列が、改変型（０１０２）では配列番号３で表される１９塩基からなる配列（０１０３）に置き換わっていた。当該改変によりアミノ酸のフレームシフトが生じるため、野生型ＣＤＳの途中に停止コドンが現れる。その結果、配列番号２の第２８６位のイソロイシン以降が配列番号５で表される２８アミノ酸に置換され、図１のＢに示すように３１3アミノ酸からなるアミノ酸改変型ヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質（０１０５）が生じる。当該改変型タンパク質は、野生型タンパク質（０１０４）のアミノ酸配列から予想される８つの膜貫通ドメイン（ＴＭ：ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ）のうちＣ末側に存在する５つを欠失している。本明細書では、以下、当該塩基配列の改変を改変Ａ、改変Ａにより生じるアミノ酸配列をアミノ酸改変Ａとする。
【００５５】
第二の改変も図２のＡに示すような置換による改変であった。具体的には野生型の塩基配列（０２０１）において第８イントロンのスプライシングドナー部位（二重下線部）として表されるＧＴが、改変型（０２０２）ではＡＴに置き換わる点突然変異を生じていた。この改変により、当該遺伝子の転写後、第８イントロンがｍＲＮＡスプライシングによって除去されなくなることから、図２のＢに示すように、成熟ｍＲＮＡは改変を有した第８イントロンが残された塩基配列（０２０３）となる。すなわち、これは配列番号１内で説明する当該遺伝子の野生型ＣＤＳ（Ｃｏｒｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ：アミノ酸コード配列）において、第１４３０４位のＴと第１５６７０位のＧ間に配列番号４で表される塩基配列が挿入された状態と同様の配列となる。当該改変によりアミノ酸のフレームシフトが生じるため、配列番号４の塩基配列内に停止コドンが現れる。その結果、配列番号２の第３５０位のシステイン以降が配列番号６で表される１０アミノ酸に置換され、図２のＣで示すように３５９アミノ酸からなるアミノ酸改変型ヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質が生じる。当該改変型タンパク質（０２０５）は野生型タンパク質（０２０４）のアミノ酸配列から予想される８つの膜貫通ドメインのうちＣ末側に存在する５つを欠失している。本明細書では、当該塩基配列の改変を改変Ｂ、改変Bにより生じるアミノ酸配列をアミノ酸改変Bとする。
【００５６】
ここで、配列番号１は、野生型ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子のゲノム上の全塩基配列（５'非翻訳領域、及び３'非翻訳領域を含む。）とそのコード領域に対応するアミノ酸配列を表している。前記エクソン及びイントロンの番号等の位置情報は配列表内に説明している。配列番号２は、野生型のヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質の全アミノ酸配列を表している。配列番号３は、前記改変Ａにおいて置き換わる１９塩基からなる配列を表している。配列番号４は、前記改変Ｂにおいてスプライシングドナー部位に点突然変異を有する第８イントロンの塩基配列を表している。配列番号５は、前記アミノ酸改変Ａでアミノ酸改変をしたアミノ酸配列を表している。配列番号６は、前記アミノ酸改変Ｂでアミノ酸改変をしたアミノ酸配列を表している。
【００５７】
以下の実施形態は、上記の発見に基づいて発明されたものである。
【００５８】
<<実施形態１>>
【００５９】
<実施形態１：概要>  実施形態１は、ヒト由来の核酸を抽出し、抽出した核酸に含まれ得る肺胞微石症の原因遺伝子ヒであるトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子が既知の改変を有するかを検出することで肺胞微石症の発症可能性を判定する方法を基本とするものである。
【００６０】
<実施形態１：処理の流れ>  図３に実施形態１の処理の流れを例示する。まず、「核酸抽出工程」（Ｓ０３０１）で試料から適当な方法によってヒト由来の核酸を抽出する。次に、「遺伝子改変検出工程」（Ｓ０３０２）で前記核酸抽出工程で得られたヒト由来の核酸に含まれ得るヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列が、配列番号１で表される野生型の塩基配列からの改変に由来する既知の改変を有するかを検出する。以上の工程により得られた結果から肺胞微石症の発症可能性を判定するものである。以下、各工程について詳細に説明する。
【００６１】
「核酸抽出工程」（Ｓ０３０１）は、試料からヒト由来の核酸を抽出する工程である。試料は通常人体から得られるものであるが、ヒト以外の生物種で、かつヒト由来の核酸を含む形質転換体から得られるものであってもよい。試料はヒト一個体由来のものを使用する。ただし、本発明の方法を用いて二人以上の複数単位でヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の改変の有無を調べる場合にはこの限りではない。試料が人体から得られるものの場合、当該試料は採取した個体の核酸を抽出できればその種類や状態は問わない。例えば、血液、粘膜、皮膚、毛髪、爪のような人体を構成する組織の一部や、唾液、精液、膿、大便等のような人体より分泌、排泄されたものや、胎児を判定の対象とする場合には絨毛、又は羊水が該当する。また、試料の状態は採取直後一定期間培養されたもの（生きている細胞に限る）を用いてもよいし、採取後冷凍保存されたもの、若しくはホルマリン固定後にパラフィン包理切片標本として保存されたもの等を用いてもよい。核酸抽出工程で抽出される核酸の種類は、目的とするヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列情報を含み得るゲノムＤＮＡ、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又はそれらに基づく核酸であることが好ましい。
【００６２】
「それらに基づく核酸」とは、ヒト由来のゲノムＤＮＡ、トータルＲＮＡ、又はｍＲＮＡに基づいて加工された核酸を意味する。例えば、ｍＲＮＡの逆転写反応によって得られるｃＤＮＡや、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、若しくはＥＳＴの全部又は一部をプラスミドやウイルス等のベクター内に組み込んだクローンＤＮＡ等である。
【００６３】
「それらに基づく核酸」とは、ヒト由来のゲノムＤＮＡ、トータルＲＮＡ、又はｍＲＮＡに基づいて加工された核酸を意味する。例えば、ｍＲＮＡの逆転写反応によって得られるｃＤＮＡや、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、若しくはＥＳＴの全部又は一部をプラスミドやウイルス等のベクター内に組み込んだクローンＤＮＡ等が該当する。
【００６４】
核酸抽出工程でトータルＲＮＡ、又はｍＲＮＡを抽出する場合には、試料は被験者の肺組織、喀痰、又は胸水であることが好ましい。これは、肺胞微石症の原因遺伝子であるヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子が肺で最も多く発現していることに基づく（非特許文献６）。
【００６５】
細胞から核酸を抽出する方法は、目的とする核酸を試料から抽出できる方法であれば特に限定しない。しかし、通常は図４に示すように（Ａ）細胞を破砕するステップ（Ｓ０４０１）、（Ｂ）タンパク質を除去するステップ（Ｓ０４０２）、（Ｃ）目的以外の核酸を除去するステップ（Ｓ０４０３）を経る方法が一般的である。以下、細胞から核酸を抽出する方法の一例として、この方法の各ステップについて説明する。
【００６６】
（Ａ）細胞を破砕するステップ（Ｓ０４０１）は、採取した細胞の膜構造を破壊して細胞質等の細胞内容物を流出させるステップである。細胞の膜構造の破壊は、例えば界面活性剤による細胞膜脂質構造の化学的破壊、又はプロテイナーゼＫ等のタンパク質分解酵素と界面活性剤との併用による酵素化学的破壊によって達成することができる。
【００６７】
（Ｂ）タンパク質を除去するステップ（Ｓ０４０２）は、細胞内容物が溶解した細胞溶解液中に含まれるタンパク質を変性処理して除去するステップである。タンパク質の変性処理方法は、例えば、フェノール処理によって達成することができる。
【００６８】
（Ｃ）目的以外の核酸を除去するステップ（Ｓ０４０３）は、前記タンパク質を除去するステップで得られたサンプル中に含まれる核酸から目的以外の核酸を除去し、目的の核酸を精製するステップである。ここで除去する核酸は、ＤＮＡ、又はＲＮＡのいずれか一方である。目的以外の核酸を除去する方法は、ＲＮＡ分解酵素、又はＤＮＡ分解酵素のような一方の核酸のみを特異的に分解する核酸分解酵素を用いた酵素処理等によって達成することができる。
【００６９】
試料から核酸を抽出する場合には、前記方法以外にも市販のキットを使用すると便利である。キットを使用する際は試料の種類に適したタイプのキットを使用する。また、キットを使用する際の手順は当該キットに添付されているプロトコル等に従えばよい。
【００７０】
ところで、核酸抽出工程で抽出された核酸の量が、以降の工程で必要とされる量に足りない場合がしばしばある。このような場合には以降の工程を行う前に必要に応じて核酸を増幅しておくとよい。増幅する方法は、目的とする核酸の領域が増幅できれば特に限定はされない。例えば、遺伝子クローニング法であってもよいが、核酸増幅法が迅速、かつ簡易な点から便利である。核酸増幅法とは、増幅用プライマーを用いて特定の核酸の領域を酵素反応により増幅する方法である。例えば、ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、又はＮＡＳＢＡ法が該当する。このうちＰＣＲ法は、医学、分子生物学の分野において現在世界中で最も広く浸透している方法であり、様々な応用技術も知られていることから便利である。
【００７１】
「遺伝子改変検出工程」（Ｓ０３０２）は、前記核酸抽出工程で抽出された核酸に含まれ得るヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子（以下、改変検出遺伝子とする）の塩基配列が、配列番号１で表される野生型の塩基配列からの改変に由来する既知の改変を有するかを検出する工程である。
【００７２】
本実施形態において「改変」とは、改変検出遺伝子の塩基配列が野生型ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列と一致しない状態を意味する。野生型ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列とは、配列番号１で表されるゲノム上の塩基配列に基づくものである。「ゲノム上の塩基配列に基づく」とは、配列番号１で表されるゲノム上の塩基配列が転写されて、スプライシングされた成熟ｍＲＮＡの野生型塩基配列、及びヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体のアミノ酸をコードする野生型ＣＤＳも含むことを意味する。また、本実施形態の改変は、特にホモ接合により肺胞微石症を発症する実質的な改変を意味する。即ち、ホモ接合により野生型ヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体としての機能を有しないタンパク質のみが産生される場合、又は当該共輸送体として機能をする上で必要なだけの野生型のタンパク質量が産生されない場合等が該当する。
【００７３】
本実施形態において検出すべき改変の様態には、例えば、塩基の欠失、置換、又は付加がある。「欠失」とは、改変検出遺伝子の塩基配列を野生型ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列と比較した時に、野生型遺伝子の塩基配列から一以上の塩基が失われている改変を言う。また、本実施形態において「置換」とは、改変検出遺伝子の塩基配列を野生型ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列と比較した時に、野生型遺伝子の塩基配列から全部でない一以上の連続した塩基が他の異なる塩基と置き換えられた改変を言う。例えば、点突然変異、逆位、又は欠失を伴う重複、挿入、若しくは転座が該当する。さらに、本実施形態において「付加」とは、改変検出遺伝子の塩基配列をその野生型遺伝子の塩基配列と比較した時に、野生型ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列では見られない位置に一以上の連続した塩基が新たに付加されている改変を言う。例えば、欠失を伴わない挿入、重複、又は転座が該当する。
【００７４】
本実施形態において「既知の改変」とは、肺胞微石症の患者より得られるヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列上に生じた改変であって、かつ日本国内又は外国において頒布された刊行物に記載された改変、あるいは電気通信回線を通じて公知となった肺胞微石症を発症し得る改変を意味する。当該既知の改変の具体的な例としては前述の改変Ａ、又はＢが該当する。
【００７５】
本実施形態において「検出すべき既知の改変」は、配列番号１で表される野生型の塩基配列からの改変に由来する既知の改変のものを含む。「改変に由来するもの」とは、ゲノム塩基配列上の改変部位だけでなく、その改変に起因して発生する改変の全領域を言う。例えば、改変Ｂで検出すべき既知の改変は、検出の対象となる核酸がｍＲＮＡの場合には図２のＢに示す第８イントロンのスプライシングドナー部位の１塩基だけでなく、成熟ｍＲＮＡに残されている当該改変された塩基を有する第８イントロンの全領域が該当する。
【００７６】
当該工程で既知の改変を検出する方法は、例えば、（１）プローブを用いたハイブリダイゼーションによる検出方法であってもよいし、（２）塩基配列の決定による検出方法であってもよいし、（３）核酸増幅法を利用した増幅産物の比較による検出方法であってもよいし、又は（４）多型マーカーを用いた方法であってもよい。これら４つの検出方法に関して、以下で説明する。
【００７７】
（１）プローブを用いたハイブリダイゼーションによる検出方法について説明する。当該方法は、既知の改変の塩基配列を有するポリヌクレオチドをプローブとして、ハイブリダイゼーションにより既知の改変の有無を検出する方法である。例えば、ゲル・ブロッティング法を用いる方法であってもよいし、核酸が固定された基板を用いる方法であってもよい。ゲル・ブロッティング法を用いる方法の具体例としてはサザンブロット・ハイブリダイゼーション法、ノザンブロット・ハイブリダイゼーション法等が該当する。核酸が固定された基板を用いる方法の具体例としてはマイクロアレイ、又はＤＮＡチップを用いた解析方法等が該当する。
【００７８】
本発明で用いる「ポリヌクレオチド」は、通常の定義の範囲内だけではなく、数塩基〜２０塩基で構成されるオリゴヌクレオチドも含むものとする。また、当該ポリヌクレオチドの構成は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ等やそれらの組み合わせから構成されていてもよい。
【００７９】
プローブとして用いられるポリヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１で表される野生型ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列からの改変に由来する塩基配列の全部、又は連続する少なくとも１４塩基以上を一部として有する配列である。例えば、改変Ａの場合には配列番号３で表される１９塩基配列の全部か、又は当該１９塩基のうち連続する１４塩基以上の１８塩基以下の配列を有していればよい。また、改変Ｂの場合には配列番号４で表される塩基配列の全部か、又は当該塩基配列のうち連続する１４塩基以上の１３６４塩基以下の配列を有していればよい。当該プローブとして用いられるポリヌクレオチドの塩基配列は、検出の対象となる核酸がＤＮＡである場合にはセンス鎖側、アンチセンス鎖側を問わないが、検出する核酸がＲＮＡである場合には、アンチセンス鎖側の配列を使用する。
【００８０】
プローブとして用いられるポリヌクレオチドは修飾されていてもよい。例えば、放射性核種、発色性物質、若しくは蛍光物質等による標識や、消光物質、化学基、若しくは糖鎖の付加等が該当する。一のプローブは、同種、又は異なる種類の修飾を複数受けていても構わない。修飾箇所は問わない。例えば、５'末端部であってもよいし、それ以外であってもよい。また、当該ポリヌクレオチドの末端若しくは内部には制限酵素部位、又はタグ配列等の修飾的な配列が含まれていてもよい。
【００８１】
プローブとして用いられるポリヌクレオチドは、支持体に固定されていてもよい。支持体は核酸が直接結合できる素材、又は核酸が結合する素材でコーティングされた素材であれば、形状、サイズは問わない。例えばシリカで構成された微粒子であってもよいし、ガラスで構成された基板であってもよいし、有機高分子ポリマー鎖で構成された繊維であってもよい。ポリヌクレオチドの固定方法は、例えば前記素材上でポリヌクレオチドを直接合成する方法（特許文献２）や、予め調製されたポリヌクレオチドを後から素材に担持させる方法（特許文献３）等が利用できる。
【００８２】
当該方法により、ハイブリダイゼーションの結果がポジティブであった場合には、試料に含まれるヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列は、既知の改変に基づく塩基配列を有していると判定される。
【００８３】
（２）塩基配列の決定による検出方法について説明する。当該方法は、前記核酸抽出工程で抽出された核酸に含まれ得るヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子において既知の改変に由来する塩基配列が存在し得る領域の全部又は一部の塩基配列を決定することにより改変の有無を検出する方法である。塩基配列の決定方法に関しては特に限定しない。現在世界で最も広く使用されている核酸増幅法に基づく方法とダイデオキシ法を組み合わせた方法が便利である。各社からこの原理に基づいた専用の試薬や自動塩基配列読取機（シーケンサー）等が市販されており、迅速性、簡便性の点からも非常に便利である。
【００８４】
当該検出方法では、鋳型となる核酸、プライマーとしてのポリヌクレオチド、及び合成ＤＮＡ鎖の原料となるｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ）等の核酸が必要である。
【００８５】
鋳型となる核酸は前記核酸抽出工程で得られたゲノムＤＮＡ、若しくはｃＤＮＡを使用することが好ましい。当該鋳型となる核酸がＲＮＡの場合には、一旦逆転写反応によってｃＤＮＡに変換したものを用いる。鋳型となる核酸は必要に応じて増幅してもよい。ダイデオキシ法を用いた配列決定法の場合には、ｄＮＴＰと共にｄｄＮＴＰ（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ）を加えておく。ｄｄＮＴＰは、放射性核種、蛍光物質等で修飾されていてもよい。
【００８６】
プライマーとしてのポリヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１で表される野生型ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列からの改変に由来する塩基配列の全部、又は一部の塩基配列を決定でき、かつ当該改変に対応する野生型遺伝子の塩基配列が検出できない領域であればいずれの塩基配列であってもよい。例えば、改変Ａの場合、プライマーとして用いられるポリヌクレオチドの塩基配列は、配列番号３で表される１９塩基配列の全部とすることができる。
【００８７】
プライマーとしてのポリヌクレオチドの塩基配列の向きは、鋳型となる核酸のセンス鎖側、アンチセンス鎖側、又は両鎖を問わない。結果の正確性を期する点においては両鎖にデザインし、両方の鎖の塩基配列を決定することが好ましい。
【００８８】
プライマーとしてのポリヌクレオチドの塩基の長さは、１８から１００塩基の範囲内であればよいが、そのうち１８から８０塩基はヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列の全部、又は連続する一部であることが好ましい。
【００８９】
プライマーとして用いられるポリヌクレオチドは修飾されていてもよい。例えば、放射性核種、発色性物質、若しくは蛍光物質等による標識や、消光物質、化学基、若しくは糖鎖の付加等が該当する。一のプライマーは、同種、又は異なる種類の修飾を複数受けていても構わない。修飾箇所は問わない。例えば、５'末端部であってもよいし、それ以外であってもよい。
【００９０】
当該方法によって決定された塩基配列中に改変が検出された場合には、試料に含まれるヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列は、既知の改変に基づく塩基配列を有していると判定される。
【００９１】
（３）核酸増幅法を利用した増幅産物による検出方法について説明する。当該方法は、改変型ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列を有する核酸増幅産物の増幅の有無として検出する方法である。当該方法は、増幅用プライマーをデザインする際に目的とする改変型ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子のみが増幅されるような塩基配列を選択する。例えば、一組の増幅用プライマーのうち、一方の増幅用プライマーの塩基配列の全てが改変型遺伝子特異的な塩基配列になるようにデザインすれば、当該一組の増幅用プライマーは当該改変型が存在する場合のみ増幅産物が得られる。また、本発明者らが開発したＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲ  ｃｌａｍｐ法（特許文献４、非特許文献７）を使用すれば改変型遺伝子の改変箇所を特異的に検出することができるので便利である。
【００９２】
当該方法により、ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列を有する核酸増幅産物が増幅された場合には、試料に含まれるヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列は、既知の改変に基づく塩基配列を有していると判定される。
【００９３】
（４）最後に、多型マーカーを用いた方法について説明する。当該方法は、改変型のヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列上に特異的に存在し得るＤＮＡの多型マーカーを利用して、当該多型マーカーの有無から改変を検出する方法である。
【００９４】
「多型」とはＤＮＡ上の塩基の違いを言い、ある塩基の変化が人口中１％以上の頻度で存在しているものと定義されているが、本発明においては、野生型と改変型との塩基配列の間で塩基の違いのあるものをすべて多型とする。例えば、ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｉｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、マイクロサテライト、ＶＮＴＲ（Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｒｅｐｅａｔ）、又はＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）等が該当する。
【００９５】
多型マーカーとは、特定の多型をマーカー（標識）として用いたものである。多型マーカーを用いた方法は、予め改変の検出に用いる改変型ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子に特異的な多型マーカーを選定しておく必要がある。選定した多型マーカーがＳＮＰ、マイクロサテライト、ＶＮＴＲである場合には、検出する対象が改変に由来する塩基配列か、若しくは改変型遺伝子に特異的な多型マーカーの違いかであって検出方法は前記（１）のハイブリダイゼーションによる検出方法、又は前記（２）の塩基配列の決定による検出方法と同様の方法でよい。したがって、当該多型マーカーを用いた検出方法は、前記二つの方法のいずれかで検出された改変検出遺伝子の改変を確認するための方法として併用されてもよい。
【００９６】
ＲＦＬＰを用いた検出方法は、改変型ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子に特異的な制限酵素部位が多型マーカーとして存在する場合に使用できる方法である。当該制限酵素部位を含む塩基領域を前記（３）の核酸増幅法に準じた方法によって増幅する。得られた増幅産物を当該制限酵素で切断処理し、切断の有無によって改変の有無を検出できる。
【００９７】
当該方法により、改変型遺伝子に特異的な多型マーカーが検出された場合には、試料に含まれるヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列は、既知の改変に基づく塩基配列を有していると判定される。
【００９８】
当該遺伝子改変検出工程は、業者に委託して行ってもよい。特に前記マイクロアレイ、又はＤＮＡチップを用いた解析方法は、本発明用の基板作成のための技術、労力、コストを考慮するとマイクロアレイやＤＮＡチップの受託解析サービスを行っている専門業者を利用する方が便利である。また、塩基配列受託サービスを行っている業者も多数存在するのでこちらも利用できる。
【００９９】
本実施形態では、既知の複数の改変型について検証することが望ましい。最も望ましくは既知の全ての改変型について検出することである。例えば、改変Ａのみを検出するのではなく、改変Ａと改変Ｂを検出することである。
【０１００】
本発明において「肺胞微石症の発症」とは、肺胞微石症の自覚症状である咳、呼吸困難等の呼吸器症状、あるいは呼吸不全等の症状が現れることを意味する。したがって、肺胞内の微石形成やその蓄積等が生じていても無自覚で進行する症状については、本発明では肺胞微石症の発症として考慮しない。
【０１０１】
<実施形態１の効果>  本実施形態によれば、被験者のヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子に肺胞微石症を発症し得る既知の改変が存在するかを容易に判定できる。当該遺伝子に既知の改変が検出された場合には、当該被験者は肺胞微石症が未発症であっても「今後少なくとも５０％の確率で発症する可能性を有する。」と判定できる。また、被験者の臨床症状から肺胞微石症であると診断された場合、ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の既知の改変を確認することで当該疾患であることを遺伝子レベルで確定できる。
【０１０２】
<<実施形態２>>
【０１０３】
<実施形態２：概要>  実施形態２はヒト由来の核酸を抽出し、抽出した核酸に含まれ得る肺胞微石症の原因遺伝子ＳＬＣ３４Ａ２の塩基配列が、配列番号１で表される野生型の塩基配列から改変されたかを検出することで、抽出された核酸に含まれ得るヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の遺伝型が、野生型ホモ、改変型ホモ、野生型及び改変型のへテロ、又は改変型へテロのいずれであるかを判定する方法を基本とするものである。
【０１０４】
<実施形態２：処理の流れ>  図５に実施形態２の処理の流れを例示する。まず、「核酸抽出工程」（Ｓ０５０１）で試料から適当な方法によってヒト由来の核酸を抽出する。次に、「遺伝子改変検出工程」（Ｓ０５０２）で前記核酸抽出工程にて得られた改変検出遺伝子に関して、その塩基配列が配列番号１で表される野生型の塩基配列から改変されたかを検出する。最後に、「遺伝型判定工程」（Ｓ０５０３）で、前記遺伝子改変検出工程にて得られた結果から試料を提供した被験者のヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の遺伝型を判定する。
【０１０５】
本実施形態のうち「核酸抽出工程」（Ｓ０５０１）は実施形態１の「核酸抽出工程」（Ｓ０３０１）と同様であることからその説明は省略する。また、「遺伝子改変検出工程」（Ｓ０５０２）も実施形態１の「遺伝子改変検出工程」（Ｓ０５０１）を基本としていることから、ここでは本実施形態に特徴的な点についてのみ説明をする。さらに、「遺伝型判定工程」（Ｓ０５０３）は本実施形態に特徴的な工程であることから、以下で詳細に説明する。
【０１０６】
本実施形態の「遺伝子改変検出工程」（Ｓ０５０２）で特徴的な点は、実施形態１が改変検出遺伝子の塩基配列が既知の改変を有するかを検出することであったのに対して、本実施形態は改変検出遺伝子の塩基配列が配列番号１で表される野生型の塩基配列から改変されたかを検出する点である。即ち、既知の改変を有するかを検出するだけでなく、改変を有しないことも検出する点にある。
【０１０７】
本実施形態における「改変」、改変の様態、「既知の改変」、「改変に由来するもの」、そして「ポリヌクレオチド」等の定義については実施形態１と同様である。
【０１０８】
当該工程で既知の改変を検出する方法も、実施形態１の遺伝子改変検出工程を基本とする。即ち、（１）プローブを用いたハイブリダイゼーションによる検出方法であってもよいし、（２）塩基配列の決定による検出方法であってもよいし、（３）核酸増幅法を利用した増幅産物の比較による検出方法であってもよいし、又は（４）多型マーカーを用いた方法であってもよい。以下、各方法において本実施形態に特徴的な点について説明する。その他の点に関しては、実施形態１と同様であるのでその説明は省略する。
【０１０９】
（１）プローブを用いたハイブリダイゼーションによる検出方法で本実施形態に特徴的な点はプローブとして改変型検出用ポリヌクレオチドと野生型検出用ポリヌクレオチドの２種を使用する点にある。「改変型検出用ポリヌクレオチド」は実施形態１と同様に配列番号１で表される野生型ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列からの改変に由来する塩基配列の全部、又は連続する少なくとも１４塩基以上を一部とした塩基配列を有する。「野生型検出用ポリヌクレオチド」は、配列番号１で表される野生型ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列の全部、又は連続する少なくとも１４塩基以上を一部とした塩基配列を有し、かつ改変型検出用ポリヌクレオチドの存在位置に対応する野生型の塩基配列を検出可能なポリヌクレオチドである。例えば、改変Ａの場合、「改変型検出用ポリヌクレオチド」の塩基配列は、配列番号３で表される１９塩基配列の全部か、当該１９塩基のうち連続する１４塩基以上１８塩基以下を有していればよい。これに対して「野生型検出用ポリヌクレオチド」の塩基配列は、配列番号３で表される１９塩基配列に置換される前の１５塩基（配列番号１の第１３２９０位のＴから第１３３０４位のＧまでに相当）のうち全部、又は１４塩基を有していればよい。また、改変Ｂの場合、「改変型検出用ポリヌクレオチド」の塩基配列は、配列番号４で表される塩基配列の全部か、又は当該塩基配列のうち連続する１４塩基以上の１３６４塩基以下の配列を有していればよい。これに対して「野生型検出用ポリヌクレオチド」の塩基配列は、第８、及び第９エクソンにおけるスプライシング連結後の配列で当該連結部位を含み、かつ連続する１４塩基以上有していればよい。
【０１１０】
改変型検出用ポリヌクレオチドと野生型検出用ポリヌクレオチドはそれぞれ一つずつ選択していれば、一度の検出で２種以上使用してもよい。例えば、一の改変型検出用のポリヌクレオチドに対して、一以上の野生型検出用のポリヌクレオチド使用してもよい。
【０１１１】
当該検出方法によって改変を有しない場合も検出可能となる。したがって、前記実施形態１では改変型を有するとしか検出できなかった野生型と改変型のヘテロの場合であっても当該改変型に関しては正確にその遺伝型を検出できる。
【０１１２】
（２）塩基配列の決定による検出方法で本実施形態に特徴的な点は、前記核酸抽出工程で抽出された核酸に含まれ得るヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の望ましくは全塩基配列、少なくとも既知の改変に由来する塩基配列が存在し得る領域の全部又は一部の塩基配列を決定することにより当該ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子が野生型のみか、改変型のみか、あるいは野生型と改変型の双方を有するかを決定する点にある。
【０１１３】
プライマーとしてのポリヌクレオチドの塩基配列は、ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の全塩基配列を決定する場合、鋳型がゲノムＤＮＡ由来であれば配列番号１、ｍＲＮＡ由来（例えばｃＤＮＡ）であれば配列番号１で説明する野生型ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子のＣＤＳの任意の領域を選択してよい。一度の検出で使用するプライマーの種類数は、ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の全塩基配列を決定できるようにデザインされていれば１種以上であってもよい。
【０１１４】
プライマーとしてのポリヌクレオチドの塩基配列は、既知の改変に由来する塩基配列の存在し得る領域の塩基配列を決定する場合、その領域が野生型のみを有するか、改変型のみを有するか、あるいは野生型と改変型の双方を有するかを検出できればいずれの領域の塩基配列であってもよい。例えば、改変Ａの場合、プライマーとして用いられるポリヌクレオチドの塩基配列は、配列番号３で表される１９配列の全部が検出できるように配列番号１の改変箇所である第８５６位から上流（５'側）約１００塩基の位置の塩基配列をプライマーとしてデザインすればよい。これにより、既知の改変に由来する塩基配列が存在し得る領域が野生型のみであれば、野生型の塩基配列のバンドのみが、また改変Ａのみであれば改変Ａのみの塩基配列のバンドのみが検出される。さらに改変Ａがヘテロの場合には第８５６位以降は野生型と改変Ａの２種のバンドが検出される。
【０１１５】
本実施形態において望ましくは改変検出遺伝子における既知の全改変型の有無を検出することであり、最も望ましくは既知の全改変型の有無を検出するとともに、全塩基配列を決定して他の改変がないことを確認することである。
【０１１６】
（３）核酸増幅法を利用した核酸増幅産物で本実施形態に特徴的な点は、（３−１）核酸増幅産物の有無を検出する場合には、野生型、及び改変型のそれぞれについて検出する点と、（３−２）核酸増幅産物の塩基数の違いとして野生型、及び改変型を検出する点である。
【０１１７】
（３−１）核酸増幅産物の増幅の有無として検出する方法は、ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の一の改変に関して、改変を有する核酸増幅産物のみが増幅されるか、当該改変に対応する野生型の塩基配列を有する核酸増幅産物のみが増幅されるか、あるいはその両方が増幅されるかを検出するものである。増幅用プライマーの塩基配列は、改変を含む領域、若しくはそれに対応する野生型の領域いずれか一方のみが増幅されるように領域を選択する。増幅プライマーは、改変型検出用、及び野生型検出用として、それぞれ少なくとも１組ずつ選択する。望ましくは既知の全改変に対して、野生型検出用、及び改変型検出用の各組を少なくとも一つずつ選択することである。他は実施形態１の方法に準ずる。当該方法により、一の改変に関して改変を有する核酸増幅産物のみが増幅された場合は当該改変に関して改変型ホモとして、また当該改変に対応する野生型の塩基配列を有する核酸増幅産物のみが増幅された場合には当該改変に関して野生型ホモとして、そして両方が増幅された場合には当該改変に関して野生型と改変型のヘテロとして検出することができる。
【０１１８】
（３−２）核酸増幅産物の塩基数の違いとして検出する方法は、一の改変に関して野生型と改変型との間で塩基数の違いが生じている場合にのみ使用できる方法である。塩基数の違いが生じている場合とは、例えば欠失、付加、又は塩基数の違いを伴う置換が該当する。このような場合には、塩基数の違いが生じている塩基配列上の領域を挟み込むようにして少なくとも一組の増幅用プライマーをデザインして、遺伝子増幅法を行う。検出は、核酸増幅産物の塩基数の違いをゲル電気泳動等で確認してもよいし、核酸増幅産物を蛍光物質で染色してその蛍光強度をリアルタイムＰＣＲ等で測定してもよい。当該一組の増幅用プライマー間の距離は、予想される核酸増幅産物の塩基数が少なくとも５０塩基以上あることが好ましい。当該方法により、一の改変に関して改変を有する場合の塩基数に相当する核酸増幅産物のみが増幅された場合は当該改変に関して改変型ホモとして、また当該改変に対応する野生型の塩基配列を有する場合の塩基数に相当する核酸増幅産物のみが増幅された場合には当該改変に関して野生型ホモとして、そして両方が増幅された場合には当該改変に関して野生型と改変型のヘテロとして検出することができる。
【０１１９】
（４）最後に、多型マーカーを用いた方法で本実施形態に特徴的な点は、野生型と改変型のヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子間で異なるＤＮＡの多型マーカーを利用して当該多型マーカーの有無から野生型、及び改変型を検出する点である。
【０１２０】
当該多型マーカーを用いた方法は、ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子における多型マーカーを検出前に予め特定しておく必要がある。この時特定される多型マーカーは、野生型と改変型の間で異なる分布パターン、又は異なる塩基配列を示す必要がある。当該多型マーカーのうちＳＮＰ、マイクロサテライト、ＶＮＴＲの検出は、検出対象が異なるだけで、本実施形態の前記（１）のハイブリダイゼーションによる検出方法、又は前記（２）の塩基配列の決定による検出方法と同様の方法で達成され得る。したがって、当該多型マーカーを用いた検出方法は、前記二つの方法のいずれかで検出された改変検出遺伝子の結果を確認する方法として併用されてもよい。
【０１２１】
ＲＦＬＰを用いた検出方法は、ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子において野生型と改変型の間で異なる制限酵素部位が存在する場合、あるいはいずれか一方にのみ制限酵素部位が存在する場合に使用できる方法である。当該制限酵素部位を含む塩基領域を前記（３）の核酸増幅法に準じた方法によって増幅する。得られた核酸増幅産物を当該制限酵素で切断処理し、切断の有無によって改変の有無を検出できる。
【０１２２】
当該方法により一の改変に関して、改変型遺伝子に特異的な多型マーカーのみが検出された場合には当該改変に関して改変型ホモとして、また野生型遺伝子に特異的な多型マーカーのみが検出された場合には当該改変に関して野生型ホモとして、そして両方の多型マーカーが検出された場合には当該改変に関して野生型と改変型のヘテロとして検出することができる。
【０１２３】
本実施形態における遺伝子改変検出工程も、業者に委託して行ってもよい。
【０１２４】
「遺伝型判定工程」（Ｓ０５０３）は、改変検出遺伝子の遺伝型が、野生型ホモ、改変型ホモ、野生型及び改変型のへテロ、又は改変型へテロのいずれであるかを判定する工程である。当該判定工程は前記遺伝子改変検出工程において確認した各既知の改変の検出結果に基づいて行われる。
【０１２５】
図６は当該判定工程における遺伝型の判定の概念を示した図である。ａ、ｂ、ｃはヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の既知の改変を、数字は各既知の改変の検出結果の組み合わせ（ケース）を表している。
【０１２６】
「野生型ホモ」と判定されるのは、改変検出遺伝子の全塩基配列を決定して改変が全く検出されなかった場合、又は確認した範囲の改変が全て野生型のみ検出された場合である。図６のケース１から３が該当する。確認した改変の結果からのみ判定し、未確認の改変は判定に加えない。例えば、２では改変ｃに関して未確認であるが、仮に実際はｃが改変を有しており、野生型と改変型のヘテロ、若しくは改変型ホモであったとしても、未確認である限りは判定の考慮には入れない。
【０１２７】
「野生型と改変型のヘテロ」と判定されるのは、改変検出遺伝子において確認した改変のうち一の改変で野生型と改変型の両方が検出された場合であり、他の改変は未確認か全て野生型が検出された場合である。図６のケース４から６が該当する。当該判定も確認した改変の結果からのみ判定し、未確認の改変については判定に加えない。
【０１２８】
「改変型ヘテロ」と判定されるのは、改変検出遺伝子において確認した改変のうち二以上の改変で野生型と改変型の両方が検出された場合であり、他の改変は未確認か野生型が検出された場合である場合である。図６のケース７から９が該当する。当該判定も確認した改変の結果からのみ判定し、未確認の改変については判定に加えない。
【０１２９】
「改変型ホモ」と判定されるのは、改変検出遺伝子において確認した改変のうち少なくとも一以上の改変で改変型のみが検出された場合である。即ち、他の改変が「野生型のみ」、「野生型と改変型の両方」、又は「二以上の改変で野生型と改変型の両方」のいずれであっても「改変型のみ」が一つでも検出されれば必ず「改変型ホモ」と判定される。図６のケース１０から１９が該当する。
【０１３０】
上記のように当該工程で判定される遺伝型は、前記遺伝子改変検出工程で確認した改変に対して総合判定されるものである。遺伝型の正確さは、前記遺伝子改変検出工程で確認した改変に対してのみ適用される。したがって、検出された改変の一つ以上が「改変型ホモ」である場合と、改変検出遺伝子の全塩基配列を決定する場合を除けば、必ずしも改変検出遺伝子全体に対して遺伝子型が判定されるのではない。
【０１３１】
例えば、前記遺伝子改変検出工程で図６のケース１のように改変aについてのみ確認を行い、野生型のみが検出された場合、当該遺伝型判定工程では野生型ホモと判定される。しかし、これは改変aに対してのみ改変検出遺伝子が野生型ホモであると判定されたのであり、改変検出遺伝子全体が野生型ホモと判定されたわけではない。とは言うものの、改変aに対してのみの遺伝子型判定であっても、従来皆無であった肺胞微石症の発症判定が、当該工程によって少なくとも一つの既知の改変について野生型ホモであると判定できることの意義は大きい。同様に、図６のケース５のように改変aとｂの二つの既知の改変について確認を行い、改変aは野生型と改変型の両方が検出され、改変ｂが野生型のみ検出されたという結果であれば、野生型と改変型のヘテロと判定される。この判定も改変aと改変ｂに対する結果から総合判定されたのであって、遺伝子全体が野生型ホモと判定されたわけではない。しかし、確認する既知の改変数が１つのときよりも複数になればなるほど、判定の正確さが高まり、誤判定のリスク度が減少することから、判定の意義はより大きくなる。
【０１３２】
本実施形態で判定されたヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の遺伝型から、被験者の肺胞微石症を発する可能性を以下で説明する。
【０１３３】
遺伝型が改変型ホモの場合には、当該被験者は肺胞微石症が未発症であっても今後発症する可能性が極めて高いと判定できる。
【０１３４】
遺伝型が野生型ホモの場合には、当該被験者は確認した改変に関しては肺胞微石症を発症する可能性はないと判定できる。ただし、確認外の改変に関してはその限りではない。改変検出遺伝子に関して肺胞微石症の発症可能性を完全に除去するためには、改変検出遺伝子の全塩基配列を決定する等の方法により当該遺伝子の全領域を確認し、肺胞微石症の原因となる実質的な改変を有さないことを確認する必要がある。しかしながら、この方法は時間や、コストを要する上に、非効率的である。肺胞微石症は稀な疾患であることから、現在全世界に存在する肺胞微石症の発症原因となるヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の実質的な改変数は非常に限定されると予想できる。したがって、当該方法による遺伝型の判定は、例えヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子全体ではなく部分的な改変であったとしても、実質的な既知の改変のみをピンポイントで検出することから、その判定精度は低くはない。さらに、全塩基配列を決定する場合と比較し、改変検出の効率性、迅速性、コスト面においては優れている。
【０１３５】
遺伝型が野生型と改変型のヘテロの場合には、当該被験者は確認した改変に関しては肺胞微石症を発症する可能性はないと判定できる。ただし、確認外の改変に関してはその限りではない。
【０１３６】
遺伝型が改変型へテロの場合には、その改変型の組み合わせにより肺胞微石症の発症可能性は異なる。例えば、改変Ａと改変Ｂのヘテロであれば肺胞微石症の発症可能性は極めて高いと判定できるが、改変Ａと改変ｃ（Ｎ末側の３つのＴＭドメインを欠く改変と仮定する。）のヘテロであれば改変Ａと改変ｃの遺伝子産物がお互い補償し合い野生型のヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質と同等の機能を持ちえる可能性もある。この場合は、当該被験者は確認した改変に関しては肺胞微石症を発症する可能性はないと判定できる。したがって、改変型へテロの場合には臨床データ、若しくは実験データから得られる結果からのみ発症可能性を判定できる。
【０１３７】
<実施形態２の効果>  本実施形態によれば、被験者が肺胞微石症を発する可能性を遺伝型で判定できる。また、被験者が既に肺胞微石症を発症している場合、被験者のヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の遺伝型が実質的な改変による改変型ホモ、若しくは改変型へテロであれば少なくとも当該遺伝子の改変が当該疾患の原因であると判定できる。
【０１３８】
<<実施形態３>>
【０１３９】
<実施形態３：概要>実施形態３は、ヒト由来のタンパク質を抽出し、抽出したタンパク質に含まれ得るヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質がアミノ酸改変を有するかを検出することで肺胞微石症の発症可能性を判定する方法を基本とするものである。
【０１４０】
<実施形態３：処理の流れ>  図７に実施形態３の処理の流れを例示する。まず、「タンパク質抽出工程」（Ｓ０７０１）で試料から適当な方法によってヒト由来のタンパク質を抽出する。次に、「アミノ酸改変検出工程」（Ｓ０７０２）で前記タンパク質抽出工程にて得られたヒト由来のタンパク質に含まれ得るヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列が、既知のアミノ酸改変を有するかを検出する。以上の工程により得られた結果から肺胞微石症の発症可能性を判定するものである。以下、各工程について詳細に説明する。
【０１４１】
「タンパク質抽出工程」（Ｓ０７０１）は、試料からヒト由来のタンパク質を抽出する工程である。試料は人体から得られるものが該当するが、ヒト以外の生物種で、かつヒト由来のタンパク質を産生する形質転換体であってもよい。試料は一個体由来のものを使用する。ただし、本発明の方法を用いて二人以上の複数単位でヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸改変の有無を調べる場合にはこの限りではない。試料が人体から得られるものの場合、当該試料は採取した個体のタンパク質を抽出できればその種類は問わないが、抽出されたタンパク質にヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質が含まれていなければならない。したがって、試料の種類は被験者の肺組織が好ましい。これは、当該タンパク質が肺や小腸に局在すると言う実験データに基づく（非特許文献８）。肺組織は、気管支鏡による肺生検等で採取すればよい。
【０１４２】
タンパク質の抽出は、（Ａ）細胞破砕ステップ、（Ｂ）可溶性画分採取ステップ、（Ｃ）目的とするタンパク質の精製ステップを経る方法が一般的である。以下各ステップについて説明するが、目的とするタンパク質を試料から抽出できる方法であれば特定の方法に限定はされない。
【０１４３】
（Ａ）細胞破砕ステップは試料に含まれる細胞を破砕して細胞質を外部に流出させるステップである。細胞を破砕は、例えばホモジェナイザーやソニケーター（超音波破砕装置）等を用いた機械的な破砕方法や、界面活性剤による細胞膜脂質構造の化学的破壊方法によって達成できる。いずれの方法も、低温下で行う等のようにタンパク質の分解を最小限に抑制した状態で細胞から抽出しなければならない。当該ステップで得られる破砕された細胞を含む溶液を細胞破砕液とする。
【０１４４】
（Ｂ）可溶性画分採取ステップは、前記細胞破砕ステップで得られる細胞破砕液を可溶性画分と不溶性画分に分離し、可溶性画分を採取するステップである。可溶性画分の採取は、遠心操作によって達成できる。細胞破砕液を低温下で適当な重力加速度で遠心した後、上清を可溶性画分とする。注意すべきはアミノ酸改変を検出するヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質が、膜タンパク質であるという点である。膜タンパク質は疎水性の膜貫通ドメインを有することから基本的には可溶化しない。そこで、前記（Ａ）のステップにおいて界面活性剤による化学的破壊方法以外の方法を用いた場合には、（Ｂ）ステップを実行する前に細胞破砕液に適当な界面活性剤を加えておく。これにより細胞膜脂質構造が破壊され、膜タンパク質も可溶化することができる。
【０１４５】
（Ｃ）目的とするタンパク質の精製ステップは、アフィニティー精製やＨＰＬＣ精製等により目的とするタンパク質を得るステップであるが、本実施形態におけるタンパク質の抽出においては、前記（Ｂ）可溶性画分採取ステップまでで十分であり、当該ステップは必ずしも必要ではない。
【０１４６】
「アミノ酸改変検出工程」（Ｓ０７０２）は、前記タンパク質抽出工程で抽出されたタンパク質に含まれ得るヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質（以下、アミノ酸改変検出タンパク質とする）の塩基配列が、配列番号２で表される野生型のアミノ酸配列からの既知のアミノ酸改変を有するかを検出する工程である。
【０１４７】
本実施形態において「アミノ酸改変」とは、アミノ酸改変検出タンパク質のアミノ酸配列が配列番号２で表される野生型ヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列と一致しない状態を意味する。本実施形態のアミノ酸改変は、特に野生型のヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体としての機能を失う実質的なアミノ酸改変を意味する。
【０１４８】
本実施形態において検出すべきアミノ酸改変の様態には、例えば、アミノ酸の欠失、置換、又は付加がある。「欠失」とは、アミノ酸改変検出タンパク質のアミノ酸配列を野生型ヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列と比較した時に、野生型タンパク質のアミノ酸配列から一以上のアミノ酸が失われているアミノ酸改変を言う。また、本実施形態において「置換」とは、アミノ酸改変検出タンパク質のアミノ酸配列を野生型ヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列と比較した時に、野生型タンパク質のアミノ酸配列から全部でない一以上の連続したアミノ酸が他の異なるアミノ酸と置き換えられたアミノ酸改変を言う。さらに、本実施形態において「付加」とは、アミノ酸改変検出タンパク質のアミノ酸配列をその野生型タンパク質のアミノ酸配列と比較した時に、野生型ヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列には見られない位置に一以上の連続したアミノ酸が新たに付加されているアミノ酸改変を言う。
【０１４９】
本実施形態において「既知のアミノ酸改変」とは、配列番号２で表される野生型ヒトＩＩｂ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列上に生じたアミノ酸改変であって、かつそれによって当該タンパク質としての活性を失うことが日本国内又は外国において頒布された刊行物に記載されたアミノ酸改変、あるいは電気通信回線を通じて公知となったアミノ酸改変を意味する。当該既知のアミノ酸改変の具体的な例としては前述のアミノ酸改変Ａ、又はＢが該当する。
【０１５０】
当該工程で既知のアミノ酸改変を検出する方法は、抗原抗体反応法等を用いればよい。本実施形態における抗原抗体反応法は、既知のアミノ酸改変されたアミノ酸配列の全部又は一部を有するポリペプチドを抗原として作成された抗体を用いて、アミノ酸改変検出タンパク質に対して抗原抗体反応を行い、既知のアミノ酸改変の有無を検出する方法である。例えば、ノザン・ブロッティング法のようなイムノ・ブロッティング法であってもよいし、ＥＬＩＳＡ法であってもよい。
【０１５１】
本発明において「ポリペプチド」は、数アミノ酸〜１０アミノ酸で構成されるオリゴペプチドの意味も含むものとする。
【０１５２】
抗原として用いられるポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２で表される野生型ヒトＩＩＢ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列からのアミノ酸改変に由来するアミノ酸配列の全部、又は連続する少なくとも５アミノ酸以上を一部として有する配列である。例えば、アミノ酸改変Ａの場合には配列番号５で表される２８アミノ酸配列の全部か、又は当該２８アミノ酸のうち連続する５アミノ酸以上２７アミノ酸以下の配列を有していればよい。また、アミノ酸改変Ｂの場合には配列番号６で表されるアミノ酸配列の全部か、又は当該アミノ酸配列のうち連続する5アミノ酸以上9アミノ酸以下の配列を有していればよい。
【０１５３】
抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよいが、いずれの場合も当該抗原に特異的な免疫反応性を有する抗体であることが望ましい。抗体の作成は、ポリクローナル抗体の場合は通常行われるように、例えばウサギ等の実験用家畜に上記抗原を接種し免疫させることで作成すればよい。また、モノクローナル抗体の場合も一般に行われる方法でよい。例えば、マウス等に上記抗原を接種し免疫させた後、Ｂリンパ球とミエローマ細胞等との細胞融合を行い、スクリーニングによって目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を得ればよい。これらの抗体の作成は、時間と手間を要するため、ややコストはかかるが抗体作成の受託サービスを行っている各企業に委託すると便利である。
【０１５４】
抗体は標識されていてもよい。例えば、発色性物質、蛍光物質、酵素若しくはビオチン等による標識等が該当する。
【０１５５】
抗体は、支持体に固定されていてもよい。支持体は抗体が直接結合できる素材、又は抗体が直接結合できる素材でコーティングされた素材であれば、形状、サイズは問わない。例えばガラスで構成された微粒子であってもよいし、プラスチックで構成されたプレートであってもよい。支持体の素材は抗体が固定によって変性しないものが好ましい。
【０１５６】
当該方法により、抗原抗体反応の結果がポジティブであった場合には、試料に含まれるヒトＩＩＢ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列は、既知のアミノ酸改変に基づくアミノ酸配列を有していると判定される。
【０１５７】
<実施形態３：処理の効果>  本実施形態によれば、被験者のヒトＩＩＢ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質に既知のアミノ酸改変が存在するかを容易に判定できる。当該タンパク質に既知の実質的なアミノ酸改変が検出された場合には、当該被験者は肺胞微石症が未発症であっても「少なくとも５０％の確率で発症する可能性を有する。」と判定できる。また、被験者の症状から肺胞微石症の疑いがある場合には、ヒトＩＩＢ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質の既知のアミノ酸改変を確認することで当該疾患であることを確定できる。
【０１５８】
<<実施形態４>>
【０１５９】
<実施形態４：概要>  実施形態４はヒト由来のタンパク質を抽出し、抽出したタンパク質に含まれ得るヒトＩＩＢ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２で表される野生型のアミノ酸配列からアミノ酸改変されたかを検出することで、抽出されたタンパク質に含まれ得るヒトＩＩＢ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質をコードするヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の遺伝型が、野生型ホモ、改変型ホモ、野生型及び改変型のへテロ、又は改変型へテロのいずれであるかを判定する方法を基本とするものである。
【０１６０】
<実施形態４の流れ>  図８に実施形態４の処理の流れを例示する。まず、「タンパク質抽出工程」（Ｓ０８０１）で試料から適当な方法によってヒト由来のタンパク質を抽出する。次に、「アミノ酸改変検出工程」（Ｓ０８０２）で前記タンパク質抽出工程にて得られたアミノ酸改変検出タンパク質に関して、そのアミノ酸配列が配列番号２で表される野生型のアミノ酸配列からアミノ酸改変されたかを検出する。最後に、「第二遺伝型判定工程」（Ｓ０８０３）で、前記アミノ酸改変検出工程にて得られた結果から試料を提供した被験者のヒトＩＩＢ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質をコードするヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の遺伝型を判定する。
【０１６１】
本実施形態のうち「タンパク質抽出工程」（Ｓ０８０１）は実施形態３の「タンパク質抽出工程」（Ｓ０７０１）と同様であることからその説明は省略する。また、「アミノ酸改変検出工程」（Ｓ０８０２）も実施形態３の「アミノ酸改変検出工程」（Ｓ０８０１）を基本としていることから、ここでは本実施形態に特徴的な点についてのみ説明をする。さらに、「第二遺伝型判定工程」（Ｓ０８０３）は本実施形態に特徴的な工程であることから、以下で詳細に説明する。
【０１６２】
本実施形態の「アミノ酸改変検出工程」（Ｓ０８０２）で特徴的な点は、実施形態３がアミノ酸改変検出タンパク質のアミノ酸配列が既知のアミノ酸改変を有するかを検出することであったのに対して、本実施形態はアミノ酸改変検出タンパク質のアミノ酸配列が配列番号２で表される野生型のアミノ酸配列からアミノ酸改変されたかを検出する点である。即ち、既知のアミノ酸改変を有するかを検出するだけでなく、アミノ酸改変を有しないことも検出する点にある。
【０１６３】
本実施形態における「アミノ酸改変」、アミノ酸改変の様態、「既知のアミノ酸改変」、「アミノ酸改変に由来するもの」、そして「ポリペプチド」等の定義については実施形態３と同様である。
【０１６４】
当該工程でアミノ酸改変を検出する方法も、実施形態３のアミノ酸改変検出工程を基本とする。即ち、アミノ酸改変検出タンパク質に対して抗原抗体反応を行い、アミノ酸改変の有無を検出する方法を用いればよい。以下、抗原抗体反応法を用いたアミノ酸改変の検出方法で本実施形態に特徴的な点に関して説明する。その他の点に関しては、実施形態３と同様であるのでその説明は省略する。
【０１６５】
抗体を用いた抗原抗体反応による検出方法で本実施形態に特徴的な点は、検出に用いる抗体として改変型検出用抗体と野生型検出用抗体の２種を使用する点にある。
【０１６６】
「改変型検出用抗体」は、実施形態３と同様に配列番号２で表される野生ヒトＩＩＢ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列からのアミノ酸改変に由来するアミノ酸配列の全部、又は連続する少なくとも５アミノ酸以上を一部としたアミノ酸配列を有するポリペプチドを抗原として作成された抗体である。
【０１６７】
「改変型検出用抗体」の作成にあたり抗原として用いられるポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、アミノ酸改変Ａの場合であれば、配列番号５で表される２８アミノ酸配列の全部か、当該２８アミノ酸のうち連続する５アミノ酸以上を有していればよい。また、アミノ酸改変Ｂの場合であれば、配列番号６で表されるアミノ酸配列の全部か、又は当該アミノ酸配列のうち連続する５アミノ酸以上を有していればよい。
【０１６８】
「野生型検出用抗体」は、配列番号２で表される野生型ヒトＩＩＢ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質のアミノ酸配列の全部、又は連続する少なくとも５アミノ酸以上を一部としたアミノ酸配列を有するポリペプチドを抗原として作成された抗体であり、かつアミノ酸改変型検出用抗体の存在位置に対応する野生型のアミノ酸配列を検出可能な抗体である。
【０１６９】
「野生型検出用抗体」の作成にあたり抗原として用いられるポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、アミノ酸改変Ａの場合であれば、配列番号５で表される２８アミノ酸配列に置換される前の４０５アミノ酸配列（配列番号２で表される第２８６位のイソロイシン以降）のうち全部、又は５アミノ酸以上を有していればよい。また、アミノ酸改変Ｂの場合であれば、配列番号２で表される第３５０位のＣ以下のアミノ酸配列のうち全部、又は連続する５アミノ酸以上を有していればよい。
【０１７０】
改変型検出用抗体と野生型検出用抗体はそれぞれ少なくとも一つずつ選択していれば、一度の検出で２種以上使用してもよい。例えば、一の改変型検出用抗体に対して、一以上の野生型検出用の抗体使用してもよい。
【０１７１】
「第二遺伝型判定工程」（Ｓ０８０３）は、前記アミノ酸改変検出工程において検出されたアミノ酸改変検出タンパク質におけるアミノ酸改変の結果に基づいて、当該試料のヒトＩＩＢ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質をコードするヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の遺伝型が、野生型ホモ、改変型ホモ、野生型及び改変型のへテロ、又は改変型へテロのいずれであるかを判定する工程である。
【０１７２】
該工程での試料におけるヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の遺伝型の判定方法は、前記実施形態２の「遺伝型判定工程」（Ｓ０７０３）に準ずる。すなわち、「野生型ホモ」と判定されるのは、アミノ酸改変検出タンパク質において検証したアミノ酸改変に関して全て野生型のみが検出された場合である。検証したアミノ酸改変の結果からのみ判定し、未検証のアミノ酸改変については判定に加えない。また、「野生型と改変型のヘテロ」と判定されるのは、アミノ酸改変検出タンパク質において検証したアミノ酸改変のうち一のアミノ酸改変で野生型と改変型の両方が検出された場合であり、他のアミノ酸改変は未検証か全て野生型が検出された場合である。当該判定も検証したアミノ酸改変の結果からのみ判定し、未検証のアミノ酸改変については判定に加えない。さらに、「改変型ヘテロ」と判定されるのは、アミノ酸改変検出タンパク質において検証したアミノ酸改変のうち二以上のアミノ酸改変で野生型と改変型の両方が検出された場合であり、他のアミノ酸改変は未検証か野生型が検出された場合である。当該判定も検証したアミノ酸改変の結果からのみ判定し、未検証のアミノ酸改変については判定に加えない。最後に、「改変型ホモ」と判定されるのは、アミノ酸改変検出タンパク質において検証したアミノ酸改変のうち少なくとも一以上のアミノ酸改変で改変型のみが検出された場合である。即ち、他のアミノ酸改変が「野生型のみ」、「野生型と改変型の両方」、又は「二以上のアミノ酸改変で野生型と改変型の両方」のいずれであっても「改変型のみ」が一つでも検出されれば必ず「改変型ホモ」と判定される。その他に関しては、前記実施形態２の「遺伝型判定工程」（Ｓ０７０３）と同様であることからその説明は省略する。
【０１７３】
本実施形態で判定された遺伝型から被験者の肺胞微石症を発する可能性は、前記実施形態２の「遺伝型判定工程」（Ｓ０７０３）と同様であることからその説明は省略する。
【０１７４】
<実施形態４の効果>  本実施形態によれば、検出対象をタンパク質にすることが可能となり、かつ実施形態２とほぼ同様の効果を得ることができる。
【０１７５】
<<実施形態５>>
【０１７６】
<実施形態５：概要>  実施形態５は、前記実施形態１、若しくは２の方法等で使用する肺胞微石症の発症可能性を判定するためのプローブ、若しくはプライマーとしてのポリヌクレオチドを用いる肺胞微石症発症判定用キットである。
【０１７７】
<実施形態５：構成>
【０１７８】
実施形態５の構成を説明する。本実施形態の肺胞微石症発症判定用キットは、（１）プローブ、又はプライマーとしてのポリヌクレオチドを用いるキット。以下、（１）、（２）のそれぞれについて具体的に説明する。
【０１７９】
本実施形態の肺胞微石症発症判定用キットは、前記実施形態１、又は２の方法等で肺胞微石症の発症可能性を判定する際に必要となる抗原、又はプライマーとしてのポリヌクレオチドを包含する。当該ポリヌクレオチドはヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の実質的な改変を検出する上ですぐに利用可能なように予め調製されている。例えば、改変の検出のために適当な塩基配列や塩基の長さを有するポリヌクレオチドが事前に合成、若しくはクローン化されていること、当該ポリヌクレオチドが検出時に必要となる蛍光物質等で事前に修飾されていること、及び／又は基板等に予め固定されていること等が該当する。当該キットは野生型検出用、各改変型検出用の前記ポリヌクレオチドのいずれか一方、又は両方を包含してもよい。好ましくは両方を包含することである。更に好ましくは既知の改変型が全て検出できるようにそれぞれの改変型検出用のポリヌクレオチドを全て包含することである。当該キットに包含されるポリヌクレオチドは、抗原として使用されるもの、プライマーとして使用されるもののいずれか一方、又は両方であってもよい。キットは前記ポリヌクレオチドだけでなく、当該ポリヌクレオチドを使用する検出方法に必要なバッファーや酵素等の試薬を包含していてもよい。また、プロトコルを添付していてもよい。当該キットに包含されるポリヌクレオチドや試薬は、所定の条件下では一定期間安定して保存可能なものであることが好ましい。所定の条件とは、低温、遮光、乾燥等が該当する。一定期間は、試薬の性質等によって異なるが、１ヶ月以上であることが好ましい。
【０１８０】
<実施形態５：効果>  本実施形態によれば、肺胞微石症の発症判定等を行うためにヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の実質的な改変の検出を迅速、かつ容易に行う事ができる。また、添付のプロトコルに従うことで、一定の訓練を受けた者であれば特段の知識や技術を必要とせずに肺胞微石症の発症判定を実施することができる。
【０１８１】
<<実施形態６>>
【０１８２】
<実施形態６：概要>  実施形態６は、ヒト由来の核酸を抽出し、抽出した核酸に含まれ得る肺胞微石症の原因遺伝子ＳＬＣ３４Ａ２の発現制御領域が改変を有するかを検出することで肺胞微石症の発症可能性を判定する方法を基本とするものである。
【０１８３】
<実施形態６：処理の流れ>  実施形態６の処理の流れは、まず、「核酸抽出工程」で試料から適当な方法によってヒト由来の核酸を抽出する。次に、「発現制御領域改変検出工程」で前記核酸抽出工程にて得られたヒト由来の核酸に含まれ得るヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の発現制御領域の塩基配列が、配列番号７で表される野生型の塩基配列から改変されたかを検出する。以上の工程により得られた結果から肺胞微石症の発症可能性を判定するものである。「核酸抽出工程」は、実施形態１の「核酸抽出工程」（Ｓ０３０１）と、また「発現制御領域改変検出工程」は実施形態１の「遺伝子改変検出工程」（Ｓ０３０２）とその大部分が同様である。したがって、各工程において本実施形態に特徴的な点に関してのみ以下で説明する。
【０１８４】
本実施形態の「核酸抽出工程」に特徴的な点は、使用する核酸の種類がゲノムＤＮＡ、若しくはゲノムＤＮＡ由来の核酸である点にある。ゲノムＤＮＡ由来の核酸とは、ゲノムＤＮＡのポリペプチド鎖の一部をコスミド等のベクターやＹＡＣ等の人工染色体に組み込んだ核酸を言う。核酸の抽出方法等は、ゲノムＤＮＡであればゲノムＤＮＡの抽出方法に準ずればよい。また、ゲノムＤＮＡ由来の核酸であればその種類に応じた抽出方法に準ずればよい。例えば、コスミドであればコスミド抽出方法に従って抽出すればよい。
【０１８５】
「発現制御領域改変検出工程」は、前記核酸抽出工程で抽出された核酸に含まれ得るヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の発現制御領域（以下検出対象遺伝子発現制御領域とする）の塩基配列が、配列番号７で表される野生型の塩基配列から改変されたかを検出する工程である。
【０１８６】
「発現制御領域」とは、特定の遺伝子の発現を制御、又は調整するゲノム配列上の塩基配列としての領域である。例えば、エンハンサー領域やプロモーター領域等が該当する。当該発現制御領域は遺伝子によって位置や塩基配列に相違が見られることが多く、それらを特定するには困難を伴うが、少なくともプロモーターの場合には、通常制御する遺伝子の転写開始点から上流３Ｋｂ（Ｋｂ＝１０００塩基）の範囲内に含まれることが多い。したがって、本発明においては「発現制御領域」を配列番号７で示すようにヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の予想転写開始点（配列番号1の第1位）から上流２．７Ｋｂとした。
【０１８７】
発現制御領域の改変の様態、改変の検出方法等は実施形態１に準ずればよい。本実施形態で検出される改変には、その改変を有する発現制御領域の制御下にあるヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子に対して、（１）発現を抑制させる場合と、（２）発現を増強させる場合と、そして（３）特に影響しない場合があるが、好ましくは（１）、又は（２）の改変を検出することである。
<実施形態６：効果>  本実施形態によれば、被験者のヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の発現制御異常から肺胞微石症の発症可能性を判定できる。仮にヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の発現制御領域に発現を抑制させる改変が検出された場合には、当該被験者は肺胞微石症が未発症であっても「少なくとも５０％の確率で発症する可能性を有する。」と判定できる。
【実施例１】
【０１８８】
以下の実施例をもって本発明をより詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【０１８９】
なお、肺胞微石症は稀な疾患であるため本発明の発症判定方法を通常の被験者に対して行ったとしても、ほとんどの場合は既知の改変に対して陰性でとなり、またヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の遺伝型も野生型ホモとなる。つまり、被験者の中に本疾患発症前の肺胞微石症キャリアーが含まれていることは稀であるため、発症判定方法で改変型ホモ、ないしは野生型と改変型のヘテロ等のポジティブな結果を例示することは難しい。そこで、本実施例では臨床症状で肺胞微石症と診断された患者に対して本発症判定方法を行い、本発症判定方法が有効に働くことを示すポジティブ例とした。
【０１９０】
<<実施例１>>
【０１９１】
<肺胞微石症患者と健常人ボランティアとのヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子における既知の改変の存在の検証>
【０１９２】
本実施例では、臨床症状から肺胞微石症と診断された検体（患者）、ならびに１８８人の健常人ボランティア検体が、ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子に既知の改変である改変Ａ、又は改変Ｂを有するかを検証するために、実施形態１を基本とする本発明の肺胞微石症発症判定方法を行った。以下、本実施例について具体的に説明する。
【０１９３】
（核酸抽出工程）    ゲノムＤＮＡの抽出
まず、肺胞微石症と診断された検体、ならびに１８８人の健常人ボランティア検体から末梢血を得た。次に、各検体の末梢血５ｍｌに溶解バッファー（終濃度：１００μg／ｍｌプロテイナーゼＫ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ  ７．５、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１％ＳＤＳ）を加えて、５０℃で30分インキュベートして細胞を溶解した。続いて、前記細胞溶解液にＴＥバッファーで飽和させたフェノールを等量加えた後、容器を数回反転して混合した。次に、室温にて３０００ｘｇで１０分間遠心処理を行い、水層とフェノール層に分離させた。続いて、上層の水層のみを採取して新たな容器に移した。次に、当該水層にフェノール・クロロホルム混合液（１：１混合比）を等量加え、再び容器を数回反転して混合した。室温にて３０００ｘｇで１０分間再び遠心処理を行い、水層と中間層（変性タンパク質層）、そしてフェノール・クロロホルム層の３層に分離させた。中間層を構成する変性タンパク質を混入させないように水層のみを採取した後、中間層が確認できなくなるまで前記フェノール・クロロホルム混合液による処理を数回繰り返し行った。次に、最後に得られた水層サンプルに終濃度５０μｇ／ｍｌになるようＲＮａｓｅ  Ａを加えて５０℃で１時間ほどインキュベートしてＲＮＡを分解した。続いて、前述の溶解バッファーを加えて再びプロテイナーゼＫ処理して水層サンプル中のＲＮａｓｅ  Ａを失活させた。次に、前述のフェノール・クロロホルム混合液を等量加えて再びフェノール・クロロホルム処理を行った。処理後の水層の容量に対して３Ｍ  酢酸ナトリウムを1／１０容量、及びイソ・プロパノールを等量加えて静かに撹拌した。最後に、析出してくるゲノムＤＮＡをガラス棒で絡め取るか、室温にて３０００xｇで１０分間遠心処理を行い、それぞれの検体から目的のゲノムＤＮＡを得た。
【０１９４】
（遺伝子改変検出工程）
前記核酸抽出工程で得られた検体のゲノムＤＮＡを用いて既知の改変の検出を行った。改変Ａの検出には、ＬＮＡプローブを用いた５'→３'ヌクレアーゼアッセイ・リアルタイムＰＣＲ法を、また改変Ｂの検出には、ＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲ  ｃｌａｍｐ法を使用した。ＬＮＡプローブを用いた５'→３'ヌクレアーゼアッセイ・リアルタイムＰＣＲ法は、両末端が蛍光物質と消光物質とでそれぞれ修飾されたＬＮＡを含むプローブを用いてＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５'→３'ヌクレアーゼ活性を利用してリアルタイムＰＣＲを行うものであり、その原理はタカラ  バイオのＴａｑＭａｎプローブ法と同じである。ＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲ  ｃｌａｍｐ法は、非特許文献７に寄った。
【０１９５】
Ａ．リアルタイムＰＣＲ反応液の調製
【０１９６】
（１）ＰＣＲ用基本反応液の調製  「ＰＣＲ用基本反応液」として以下の試薬を混合して調製した。２５ｍＭ  ＴＡＰＳ（ｐＨ９．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、２００μＭ  各ｄＮＴＰ（＝ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ）、１．２５Ｕ  ＴＡＫＡＲＡ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＨＳ（タカラ  バイオ）。
【０１９７】
（２）改変Ａ検出用反応液の調製  上記「ＰＣＲ基本反応液」に、改変Ａ用増幅プライマーとしてフォワード側（Ｆ）プライマーとリバース側（Ｒ）プライマーをそれぞれ２００ｍＭずつ添加した。改変Ａ用増幅プライマーのＦプライマーの配列は、配列番号８で表される。改変Ａ用増幅プライマーのＲプライマーの配列は、配列番号９で表される。さらに、改変Ａ検出用ＬＮＡプローブを１００ｎＭ添加した。改変Ａ検出用ＬＮＡプローブの塩基配列は配列番号１２で表される。改変Ａ検出用ＬＮＡプローブの塩基配列のうち第４位のＴ、７位のＣ、１１位のＴ、１５位のＣ、１８位のＣはＬＮＡによって構成されている。また、当該ＬＮＡプローブの５'末端は蛍光色素６−ＦＡＭに、また３'末端は蛍光抑制物質ＢＨＱ１によって修飾されている。
【０１９８】
（３）改変Ｂ検出用反応液の調製  上記「ＰＣＲ基本反応液」に、改変Ｂ用増幅プライマーとしてＦプライマーとＲプライマーをそれぞれ２００ｍＭずつ添加した。改変Ｂ用増幅プライマーのＦプライマーの配列は、配列番号１０で表される。改変Ｂ用増幅プライマーのＲプライマーの配列は、配列番号１１で表される。さらに、改変Ｂ検出用ＬＮＡプローブを１００ｎＭとＰＮＡクランププライマーを５μＭ添加した。改変Ｂ検出用ＬＮＡプローブの塩基配列は配列番号１３で表される。改変Ｂ検出用ＬＮＡプローブの塩基配列のうち第１０位のＴがＬＮＡによって構成されている。また、当該ＬＮＡプローブの５'末端は蛍光色素６−ＦＡＭに、また３'末端は蛍光抑制物質ＢＨＱ１によって修飾されている。ＰＮＡクランププライマーの塩基配列は配列番号１４で表される。ＰＮＡクランププライマーは全塩基がＰＮＡで構成されている。
【０１９９】
前記ＬＮＡプローブはいずれもＩＤＴ社に、またＰＮＡクランププライマーはグライナージャパン社にそれぞれ合成委託した。
【０２００】
前記（２）、（３）のそれぞれの改変検出用反応液に、前記核酸抽出工程で得られた検体のゲノムＤＮＡ２５μｇを加えて最終総量が２５μｌになるように調節した。続いて、それぞれの反応液について次のリアルタイムＰＣＲを行った。
【０２０１】
Ｂ．リアルタイムＰＣＲ反応
Ｅｘ  Ｔａｑの５'→３'ヌクレアーゼ活性を利用したリアルタイムＰＣＲは、Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＩＩ（Ｃｅｐｈｅｉｄ  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ社）を用いてモニタリングした。ＰＣＲ反応のサイクルは、９５℃で３０秒保持した後、９５℃３秒と５６℃３０秒のステップを４５サイクルで行い、各サイクルにおける蛍光強度を測定した。リアルタイムＰＣＲ反応を各検体一人一人について行い、ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子における既知の改変について検出を行った。
【０２０２】
（結果）
図９にその結果を示す。各グラフの縦軸は蛍光強度であり、また横軸はＰＣＲのサイクル数を示す。まず、１８８人の健常人ボランティア検体に関しては全員が同じ蛍光パターンを示したことから、ここではＡにその一人の結果を代表図として提示する。改変検出用反応液は、改変Ａ、改変ＢのいずれもＰＣＲのサイクル数が増加しても蛍光強度に大きな変化は見られなかった。この結果は、当該１８８人の健常人ボランティア検体（３７６ゲノム中）のヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子には改変Ａ、Ｂとも存在しないことを意味している。
【０２０３】
一方、臨床症状から肺胞微石症と診断された検体では、Ｂに示す蛍光パターンを示した。改変Ａ検出用反応液ではＰＣＲのサイクル数が増加しても蛍光強度に大きな変化は見られなかった。この結果は、当該検体のヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子には改変Ａが存在しないことを意味している。これに対して、改変Ｂ検出用反応液ではＰＣＲのサイクル数が２５サイクル以上で急激な蛍光強度の増加が観察された。この結果は、当該検体のヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子には改変Ｂが存在することを意味している。
【０２０４】
（考察）
上記結果から、１８８人の健常人ボランティア検体（３７６ゲノム中）のヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子に既知の改変である改変Ａ，改変Ｂはいずれも存在しないことが判明した。これに対して、臨床症状から肺胞微石症と診断された当該検体のヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子には改変Ｂがヘテロ、ないしはホモで存在することが明らかとなった。したがって、この検体は改変ＢによるヒトＩＩＢ型ナトリウム−リン酸共輸送体タンパク質の機能の失活が肺胞微石症の発症原因である可能性が高いことが遺伝子レベルでも示唆された。
【０２０５】
<<実施例２>>
【０２０６】
<肺胞微石症患者のヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子における遺伝型の確認>
【０２０７】
前記実施例１の臨床症状から肺胞微石症と診断された検体は、既知の改変である改変Ｂを有することが判明した。そこで、改変Ｂ、及び改変Ｂに対応する野生型の塩基配列が決定可能な配列番号１０で表されるプライマーを用いて、当該検体に対してヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の塩基配列決定を行った。コントロールとして改変Ａ，改変Ｂのいずれも存在しないことが判明した健常人ボランティア検体一人についても同様に行った。
【０２０８】
（ＰＣＲ増幅産物の配列確認）
前記実施例１−ＢのリアルタイムＰＣＲ反応で得られた改変Ｂ検出用反応液のＰＣＲ増幅産物をＷｉｚａｒｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｅｐ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（プロメガ社）を用いて精製した後、クローニングで用いた前記配列番号１０で表されるＦプライマーをプライマーとして、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ社）を用いて添付のプロトコルに従って反応を行った。自動ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０：ＡＢＩ社）でこの反応産物の塩基配列を直接読んだ。
【０２０９】
（結果）
図１０にその結果を示す。まず、Ａで示すように臨床症状から肺胞微石症と診断された検体の増幅産物の塩基配列は、改変Ｂの配列を表す波形のみが得られ、野生型の配列を表す波形との混合波形は観察できなかった。この結果は、臨床症状から肺胞微石症と診断された検体が改変Ｂをホモで有しており、野生型と改変型のヘテロではないことを示している。一方、Ｂで示すように健常人ボランティア検体の増幅産物の塩基配列は、野生型の配列を表す波形のみが得られた。これにより当該検体のヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の遺伝型は改変型ホモであり、少なくとも改変Ｂをホモ接合で有することが、当該検体が肺胞微石症を発症した原因であることが確定された。
【図面の簡単な説明】
【０２１０】
【図１】ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子における改変Ａの様態、及び当該遺伝子産物であるアミノ酸改変Ａの構造を説明するための概念図。
【図２】ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子における改変Ｂの様態、及び当該遺伝子産物であるアミノ酸改変Ｂの構造を説明するための概念図。
【図３】実施形態1を説明するための流れ図。
【図４】細胞から核酸を抽出する一般的方法の流れ図。
【図５】実施形態２を説明するための流れ図。
【図６】実施形態２の遺伝型判定工程における遺伝型の判定の概念を示した図。
【図７】実施形態３を説明するための流れ図。
【図８】実施形態４を説明するための流れ図。
【図９】実施例１の結果。
【図１０】実施例２の結果。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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