(57)【要約】【課題】非特異吸着が少なく、かつターゲット分子の捕捉効率が高い担体ポリマー粒子の製造方法を提供する。【解決手段】担体ポリマー粒子の製造方法は、粒径が０．１〜１５μｍで、かつ、カルボキシル基と反応性を有する官能基を有する有機ポリマー粒子と、カルボキシル基を有する糖類とを化学結合させることにより、前記有機ポリマー粒子の表面を前記糖類で被覆する工程と、前記表面が前記糖類で被覆された前記有機ポリマー粒子を塩基性溶液で処理する工程と、を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒径が０．１〜１５μｍで、かつ、カルボキシル基と反応性を有する官能基を有する有機ポリマー粒子と、カルボキシル基を有する糖類とを化学結合させることにより、前記有機ポリマー粒子の表面を前記糖類で被覆する工程と、
前記表面が前記糖類で被覆された前記有機ポリマー粒子を塩基性溶液で処理する工程と、
を含む、担体ポリマー粒子の製造方法。
【請求項２】
請求項１において、
前記糖類が多糖類である、担体ポリマー粒子の製造方法。
【請求項３】
請求項１または２において、
前記化学結合は、アミド結合およびエステル結合の少なくとも一方を含む結合基による、担体ポリマー粒子の製造方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれかにおいて、
前記カルボキシル基と反応性を有する官能基がアミノ基、水酸基およびエポキシ基から選ばれる少なくとも１種の官能基である、担体ポリマー粒子の製造方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれかにおいて、
ターゲット分子を特異的に捕捉するためのプローブを前記糖類に化学結合させる工程をさらに含む、担体ポリマー粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機ポリマー粒子の表面が糖類で被覆されている担体ポリマー粒子の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、創薬などの分野で、分子間相互作用を利用して、ある特定の分子に特異的な相互作用を有する分子を探索する試みが盛んに行われている。具体的には、相互作用を有する片方の分子（プローブ分子）を担体に固定し、特異的相互作用を利用してもう片方の分子(ターゲット分子)を捕捉、精製することが広く行われている。
【０００３】
例えば、アフィニティー樹脂を用いた免疫抑制剤ＦＫ５０６の細胞内結合タンパク質ＦＫＢＰ１２の発見（非特許文献１）などが知られている。このようなアフィニティー樹脂としては、アガロースなどの多孔質ゲルが一般的に用いられている。しかしながら、多孔質ゲルを用いる場合、ターゲット分子以外の分子がアフィニティー樹脂に吸着する、いわゆる、非特異吸着と呼ばれる現象が生じ、ターゲット分子の分離、精製が困難であるという問題が生じる。また、プローブ分子のうちある割合は多孔質ゲル内部に結合し、このようなプローブ分子はターゲット分子との相互作用が不十分になる結果、ターゲット分子の捕捉効率が低くなるという問題も生じる。
【０００４】
かかる非特異吸着の解決策として、表面がグリシジルメタクリレートで覆われたスチレン−グリシジルメタクリレート重合体にスペーサを介して生理活性物質を結合したミクロスフィア（特許文献―１，２）、粒子表面に親水性のスペーサを導入した粒子（特許文献―３，４）などが提案されている。しかしながら、これらはいずれも非特異吸着の低減効果が充分ではなく、さらに非特異吸着の少ない担体用粒子が求められている。また、これらの粒子においてもターゲット分子の捕捉効率は十分と言えない。
【０００５】
一方、化学結合法で感作させる生理活性物質担体ポリマー粒子として、主にカルボキシル基変性ポリスチレン粒子が広く使用されている。しかしながら、このポリスチレン系の粒子は一般に、試験検体中に存在する目的としない他の生理活性物質等の吸着（非特異吸着）が大きく、これにより感作粒子の性能が阻害されるため、粒子を使用する上での大きな障害になっている。これに対して、粒子表面に目的の生理活性物質を感作させた後、残りの粒子表面をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の害の少ないタンパクを先に吸着させるブロッキングの手法が用いられているが、非特異吸着を充分に防止することは困難である。また、ポリスチレン粒子にスチレンスルホン酸塩もしくは一般式（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎまたは（ＣＨ２ＣＨＣＨ３Ｏ）ｍで表されるポリアルキレンオキシド側鎖を有するアクリルエステルを共重合させたり、あるいは粒子の乳化重合後にアルカリ性水溶液中で加熱処理して粒子に結合した過硫酸塩系開始剤の断片を加水分解させたりすることにより、生理活性物質担体粒子としての性能を向上させることが知られているが、非特異吸着を充分に防止するには至っていない。また、これらの粒子においても、ターゲット分子の捕捉効率は十分と言えない。
【特許文献１】特許第３０８６４２７号公報
【特許文献２】特許第３２９２７２１号公報
【特許文献３】ＷＯ  ２００４／０２５２９７  Ａ１号公報
【特許文献４】ＷＯ  ２００４／０４０３０５  Ａ１号公報
【非特許文献１】Nature, 341, 758, 1989
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、タンパク質などの生理活性物質の非特異吸着が極めて少なく、かつ、ターゲット分子の捕捉効率が高い担体ポリマー粒子の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の担体ポリマー粒子の製造方法は、
粒径が０．１〜１５μｍで、かつ、カルボキシル基と反応性を有する官能基を有する有機ポリマー粒子と、カルボキシル基を有する糖類とを化学結合させることにより、前記有機ポリマー粒子の表面を前記糖類で被覆する工程と、
前記表面が前記糖類で被覆された前記有機ポリマー粒子を塩基性溶液で処理する工程と、を含む。
【０００８】
ここで、上記本発明の担体ポリマー粒子の製造方法において、前記糖類が多糖類であることができる。
【０００９】
ここで、上記本発明の担体ポリマー粒子の製造方法において、前記化学結合は、アミド結合およびエステル結合の少なくとも一方を含む結合基によることができる。
【００１０】
ここで、上記本発明の担体ポリマー粒子の製造方法において、カルボキシル基と反応性を有する官能基がアミノ基、水酸基およびエポキシ基から選ばれる少なくとも１種以上の官能基であることができる。
【００１１】
ここで、上記本発明の担体ポリマー粒子の製造方法において、ターゲット分子を特異的に捕捉するためのプローブを前記糖類に化学結合させる工程をさらに含むことができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の担体ポリマー粒子の製造方法によれば、粒径が０．１〜１５μｍで、かつ、カルボキシル基と反応性を有する官能基を有する有機ポリマー粒子と、カルボキシル基を有する糖類とを化学結合させることにより、前記有機ポリマー粒子の表面を前記糖類で被覆する工程と、前記表面が前記糖類で被覆された前記有機ポリマー粒子を塩基性溶液で処理する工程と、を含むことにより、非特異吸着が少なく、かつターゲット分子の捕捉効率が高い担体ポリマー粒子を得ることができる。これにより、目的とする分子（ターゲット分子）の分離および精製を容易に行なうことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の担体ポリマー粒子の製造方法について、詳細に説明する。
【００１４】
１．担体ポリマー粒子の製造方法
本発明の担体ポリマー粒子の製造方法は、粒径が０．１〜１５μｍで、かつ、カルボキシル基と反応性を有する官能基を有する有機ポリマー粒子と、カルボキシル基を有する糖類とを化学結合させることにより、前記有機ポリマー粒子の表面を前記糖類で被覆する工程（第１の工程）と、前記表面が前記糖類で被覆された前記有機ポリマー粒子を塩基性溶液で処理する工程（第２の工程）と、を含む。
【００１５】
本発明の担体ポリマー粒子の製造方法の第１および第２の工程について、順次、詳細に説明する。
【００１６】
１．１．第１の工程
本発明の第１の工程において、有機ポリマー粒子に存在するカルボキシル基と反応性を有する官能基は、アミノ基、水酸基およびエポキシ基から選ばれる少なくとも１種の官能基であり、好ましくはアミノ基および水酸基から選ばれる少なくとも１種の官能基であり、さらに好ましくはアミノ基である。
【００１７】
本発明の第１の工程において、有機ポリマー粒子と糖類とを化学結合させるための手法としては特に制限がなく、公知の化学反応を用いることができる。ここで、化学結合は、アミド結合およびエステル結合の少なくとも一方を含む結合基によることができる。
【００１８】
図１は、本発明の担体ポリマー粒子の製造方法の第１の工程を説明する図であり、図２は、第１の工程により得られた担体ポリマー粒子の一態様を模式的に示す図である。
【００１９】
例えば、図１に示されるように、本発明の担体ポリマー粒子の製造に使用される有機ポリマー粒子１１は、カルボキシル基と反応性を有する官能基１３をその表面に有する。ここで、カルボキシル基と反応性を有する官能基１３は、有機ポリマー１１の粒子形状を形成する際に導入されてもよいし、あるいは、粒子形状を形成した後に所定の官能基を変換することによって得てもよい。その際、官能基の変換は、必要に応じて複数回行なってもよい。例えば、有機ポリマー１１の粒子形状を形成した際に導入された官能基がエポキシ基である場合、そのエポキシ基に大過剰のアンモニアあるいは適当なジアミン化合物を作用させて生じるアミノ基を、カルボキシル基と反応性を有する官能基１３とすることができるし、あるいは、例えば有機ポリマー１１の粒子形状を形成した際に導入された官能基が水酸基である場合、その水酸基をトシル基に変換した後、そのトシル基に大過剰の適当なジアミン化合物を作用させて生じるアミノ基を、カルボキシル基と反応性を有する官能基１３とすることができる。例えば後述する実施例１〜５でそれぞれ得られる有機ポリマー粒子Ａｍ−１〜５においては、カルボキシル基と反応性を有する官能基１３がアミノ基である。
【００２０】
また、本発明の担体ポリマー粒子を製造する際に使用される糖類１２は、その１分子中に１個または複数個のカルボキシル基１４を有していてもよく、そのカルボキシル基１４は、糖類１２中の所定の官能基を変換することにより得られたものであってもよい。
【００２１】
カルボキシル基と反応性を有する官能基１３として使用可能な官能基としては、例えば、アミノ基が挙げられる。このアミノ基は上述したように、有機ポリマー１１の粒子形状を形成した際に導入された官能基（例えば、水酸基、エポキシ基）から変換されたものであってもよい。この場合、カルボキシル基と反応性を有する官能基１３と、カルボキシル基１４とは、互いに対して反応性を有する。限定されないが、例えば、カルボキシル基と反応性を有する官能基１３がアミノ基、水酸基およびエポキシ基から選ばれる少なくとも１種である場合、この官能基１３はカルボキシル基１４と反応性を有する。
【００２２】
図１において、カルボキシル基と反応性を有する官能基１３とカルボキシル基１４とが反応することにより、有機ポリマー粒子１１と糖類１２とが化学的に結合することができる。
【００２３】
化学結合させるための手法は特に制限がなく、公知の化学反応を用いることができるが、例えば、カルボキシル基と反応性を有する基がエポキシ基である場合は、直接に反応させることによりエステル結合を形成させることができる。また、カルボキシル基と反応性を有する基が水酸基である場合は、例えば、種々の縮合剤を用いてエステル化する手法（第４版実験化学講座22, p45〜47, 1992）などを挙げることができる。また、カルボキシル基と反応性を有する基がアミノ基である場合は、有機合成において種々の縮合剤を用いてアミド化する手法（第４版実験化学講座22, p139〜144, 1992）や、ペプチド合成においてペプチド結合形成に用いられる種々の手法（第４版実験化学講座22, p259〜271, 1992）などを挙げることが出来る。
【００２４】
このように、有機ポリマー粒子１１と糖類１２とが化学的に結合して、有機ポリマー粒子１１の表面が糖類１２で被覆された後（図２参照）、反応系中に過剰に存在する糖類（図示せず）が、有機ポリマー粒子１１と化学的に結合した糖類１２に対して、カルボキシル基−カルボキシル基、および／またはカルボキシル基−水酸基、および／または水酸基−水酸基間の水素結合等により物理的に吸着することがある。有機ポリマー粒子１１の表面が化学結合した糖類１２で十分に被覆されるためには、過剰の糖類を反応に用いる必要があるため、糖類１２の物理的吸着が多少なりとも起こることは避けられない。このように、糖類が物理的に吸着したままの有機ポリマー粒子１１を用いて、ターゲット分子の分離および精製を行なうと、カルボキシル基１４の利用効率が低下したり、粒子１０の表面が部分的に多孔質化することにより非特異吸着が増加したり、いったん捕捉したターゲット分子が分離・精製の操作中に、物理的に吸着した糖類とともに脱離したりする等の問題が生じることがある。
【００２５】
１．２．第２の工程
本発明の第２の工程において、第１の工程で得られた、表面が糖類１２で被覆された有機ポリマー粒子１１を塩基性溶液で処理することにより、第１の工程で有機ポリマー粒子１１の表面に物理的に吸着した糖類を塩等の形態で溶液中に抽出することができる。第２の工程において、十分な量の塩基性溶液を用いて有機ポリマー粒子１１を処理することにより、最終的には、有機ポリマー粒子１１の表面に化学結合した糖類１２（図２参照）のみが残り、上述したような物理的に吸着した糖類に起因して生じる問題を解消することができる。以上の工程により、物理的に吸着した糖類が除去された、有機ポリマー粒子１１と、有機ポリマー粒子１１の表面を被覆する糖類１２とを含む担体ポリマー粒子１０が得られる。
【００２６】
ここで使用される塩基性溶液は、物理的に吸着した糖類を抽出できるものであれば特に限定されないが、例えば水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化リチウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸水素カリウム水溶液、炭酸リチウム水溶液、アンモニア水、水酸化テトラメチルアンモニウム水溶液等のアルカリ性水溶液、水溶性有機アミン類の水溶液等を挙げることができる。
【００２７】
ここで使用される塩基性溶液の濃度は、通常０．００１Ｍ以上である。また処理温度は、通常０〜５０℃、好ましくは０〜３０℃である。
【００２８】
また、塩基性溶液には効率の点で劣るが、適当な電解質溶液で処理することによっても物理的に吸着した糖類を抽出することができる。
【００２９】
１．３．第３の工程
本発明の担体ポリマー粒子の製造方法は、ターゲット分子を特異的に捕捉するためのプローブを前記糖類に化学結合させる工程（第３の工程）をさらに含むことができる。この第３の工程により得られる粒子（以下、「プローブ結合粒子」とする。）には、ターゲット分子を特異的に捕捉するためのプローブが糖類に化学結合している。ここで、特に限定されないが、糖類とプローブとは、例えば、−Ｏ−結合、−Ｓ−結合、−ＳＯ−結合、−ＳＯ２−結合、−ＣＯ−結合、−ＣＯ２−結合、−ＮＲ１Ｒ２−結合（ここで、Ｒ１，Ｒ２は独立して、アルキル基またはＨ）、−ＮＨＣＯ−結合、−ＰＯ２−結合などの化学結合を介して結合していることができる。例えば、糖類に含まれる官能基とプローブに含まれる官能基とを公知の方法により化学反応させることにより、糖類とプローブとを化学結合させることができる。
【００３０】
ここで、糖類に含まれる官能基およびプローブに含まれる官能基は特に限定されないが、例えば、水酸基、アシル基、メルカプト基、アミノ基、アミノアシル基、カルボニル基、ホルミル基、カルボキシル基、アミド基、スルホン酸基、リン酸基、エポキシ基、トシル基、アジド基、ビニル基、アリル基などの基が挙げられる。
【００３１】
また、本発明において、「ターゲット分子」とは、本発明のプローブ結合粒子を用いた捕捉の対象となる物質をいう。ターゲット分子としては、例えば生体関連物質が挙げられる。本発明において「生体関連物質」とは、生体に関わるすべての物質をいう。生体関連物質としては、例えば、生体に含まれる物質、生体に含まれる物質から誘導された物質、生体内で利用可能な物質が挙げられる。
【００３２】
より具体的には、生体関連物質は特に限定されないが、例えば、タンパク質（例えば、酵素、抗体、受容体等）、ペプチド（例えばグルタチオン、ＲＧＤペプチド等）、核酸（例えば、ＤＮＡやＲＮＡ等）、糖質、脂質、およびその他の細胞または物質（例えば、血小板、赤血球、白血球等の各種血球細胞を含む各種血液由来物質、各種浮遊細胞等）が挙げられる。
【００３３】
例えば、プローブがタンパク質である場合、タンパク質中の官能基（例えば、アミノ基、カルボキシル基）と、糖類中の官能基（例えばカルボニル基、水酸基、アミノ基）とを反応させることにより、プローブと糖類とを化学結合させることができる。この場合、プローブと糖類とをアミド結合またはエステル結合を介して結合させることができる。
【００３４】
また、例えば、プローブが核酸である場合、核酸中の官能基（例えば、リン酸基）と、糖類中の官能基（例えば水酸基）とを反応させることにより、プローブと糖類とを化学結合させることができる。この場合、プローブと糖類とをホスホジエステル結合を介して結合させることができる。
【００３５】
本発明の特異捕捉用粒子で使用可能なプローブは、特に限定されないが、例えば、タンパク質（例えば、抗体、抗原、酵素、受容体、ホルモンなど）、ペプチド、核酸（例えば、ＤＮＡ，ＲＮＡなど）、糖鎖化合物、および化学物質（例えば、薬物候補物質）であることができる。
【００３６】
例えば、プローブが抗体（または抗原）である場合、ターゲット分子は前記抗体（または前記抗原）と特異的に結合する抗原（または抗体）であることができる。
【００３７】
また、例えば、プローブが核酸である場合、ターゲット分子は前記核酸と特異的に結合する核酸であることができる。あるいは、例えば、プローブが酵素、受容体、またはホルモンの場合、ターゲット分子は前記酵素、前記受容体、または前記ホルモンと特異的に結合する化合物であることができる。
【００３８】
１．４．本発明の担体ポリマー粒子の製造で使用される物質
次に、本発明の担体ポリマー粒子の製造で使用される各物質について詳細に説明する。
【００３９】
１．４．１．有機ポリマー粒子
本発明の担体ポリマー粒子の製造で使用される有機ポリマー粒子の平均粒子径は好ましくは０．１〜１５μｍ、さらに好ましくは０．３〜１０μｍ、もっとも好ましくは１〜１０μｍである。また、本発明で使用する有機ポリマー粒子の変動係数は、通常３０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下である。
【００４０】
本発明において、有機ポリマー粒子は、本発明により製造される担体ポリマー粒子のベース粒子として使用することができる。有機ポリマー粒子は、化学結合によって結合された糖類で表面を被覆することが容易であるため、ベース粒子として適している。また、有機ポリマー粒子として、磁性体含有有機ポリマー粒子を用いることができる。
【００４１】
上述したように、本発明により製造される担体ポリマー粒子を溶媒に分散させる場合、分散媒に有機ポリマー粒子が溶解したり、あるいは溶媒によって有機ポリマー粒子が膨潤したりすると、タンパク質などの生理活性物質の非特異吸着が増加する。このため、有機ポリマー粒子は、分散媒に溶解しないことが望ましい。ここで、分散媒としては、例えば、水系媒体を用いることができる。ここで水系媒体とは、水、または水と水に溶解する溶剤（例えば、アルコール類、アルキレングリコール誘導体など）との混合物をいう。
【００４２】
有機ポリマー粒子を構成するポリマーとしては、特に、ビニル系ポリマーが好ましい。ビニル系モノマーとしては、スチレン、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレン、ジビニルベンゼンなどの芳香族ビニル単量体、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニルなどのビニルエステル類、アクリロニトリルなどの不飽和ニトリル、メチルアクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、ブチルアクリレート、ブチルメタクリレート、２−エチルヘキシルアクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ラウリルアクリレート、ラウリルメタクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレートなどのエチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステル、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレートなどの多官能性（メタ）アクリレート、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレートなどの官能基を有する（メタ）アクリレートなどを例示することができる。このビニル系ポリマーは単独重合体であっても、あるいは上記ビニル系モノマーから選ばれた２種以上のモノマーからなる共重合体であってもよい。また、上記ビニル系モノマーとブタジエン、イソプレンなどの共役ジオレフィン、アクリル酸、メタクリル酸、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−メチロールメタクリルアミド、ジアリルフタレート、アリルアクリレート、アリルメタクリレートなどの共重合可能なモノマーとの共重合体も使用することができる。
【００４３】
磁性体含有有機ポリマー粒子は、磁石で集めることが可能な公知の粒子状物質であり、磁性体微粒子を含有する。本発明において使用される有機ポリマー粒子が磁性体含有有機ポリマー粒子である場合、本発明により製造される担体ポリマー粒子は、例えば後述する用途に使用可能な磁性粒子として使用することができる。
【００４４】
磁性体含有有機ポリマー粒子の粒径が０．１μｍ未満であると、磁力による分離精製に長時間を要することがあり、１０μｍを超えると表面積が小さくなり、ターゲットとするタンパク質などの生理活性物質の捕捉量が少ない場合がある。
【００４５】
磁性体含有有機ポリマー粒子の内部組成は均質であってもよいが、上記の好ましい粒径範囲にある均質な磁性体含有有機ポリマー粒子は、常磁性である物質が多く、磁力による分離精製を繰り返すと媒質への再分散が困難になる場合がある。このため、磁性体含有有機ポリマー粒子は、残留磁化の少ない磁性体微粒子を含む、不均質な内部組成を有することがより好ましい。このような不均質な内部組成を有する磁性体含有有機ポリマー粒子の内部構造としては、磁性体微粒子をポリマーなどの非磁性体の連続相中に分散した構造、磁性体微粒子の２次凝集体をコアとしてポリマーなどの非磁性体をシェルとする構造、ポリマーなどの非磁性体（非磁性核粒子）をコアとして磁性体微粒子の２次凝集体をシェルとする構造などが挙げられる。ここで、磁性体含有有機ポリマー粒子に含まれるポリマーとしては、例えば、有機ポリマー粒子を構成するものとして列記された上記ポリマーであってもよい。ポリマーなどの非磁性体（非磁性核粒子）をコアとして磁性体微粒子の２次凝集体をシェルとする内部構造の場合、最外層にさらにポリマー層を形成することが好ましい。最外層のポリマーとしては、例えば、有機ポリマー粒子を構成するものとして列記された上記ポリマーであってもよい。
【００４６】
本発明において、有機ポリマー粒子は、例えば、乳化重合、ソープフリー重合、懸濁重合などの定法を用いて製造が可能である。また、有機ポリマー粒子が磁性体含有有機ポリマー粒子の場合、例えば、非磁性核粒子と磁性体微粒子とを混合し、非磁性核粒子の表面に磁性体微粒子を物理的に吸着させることにより製造が可能である。なお、本発明において、「物理的吸着」とは、化学反応を伴わない吸着を意味する。「物理的吸着」の原理としては、例えば、疎水／疎水吸着、溶融結合または吸着、融着結合または吸着、水素結合、ファンデルワールス結合などが挙げられる。
【００４７】
より具体的には、有機ポリマー粒子は、例えば、上記ビニル系モノマーの懸濁重合、あるいはポリマーバルクの粉砕によって得ることができる。例えば、有機ポリマー粒子は、特公昭５７−２４３６９号公報記載のシード粒子を用いる二段膨潤重合法、ジャーナル・オブ・ポリマーサイエンス・ポリマーレター・エディション，９３７頁，第２１巻，１９６３年（J. Polym. Sci., Polymer Letter Ed. ２１，９３７（１９６３））記載の重合方法、特開昭６１−２１５６０２号公報、特開昭６１−２１５６０３号公報、および特開昭６１−２１５６０４号公報記載の方法によって作製することができる。
【００４８】
また、磁性体含有有機ポリマー粒子は、上述したように、疎水／疎水吸着を利用する方法によって作製することができる。例えば、非磁性核粒子の表面および磁性体微粒子の表面が疎水性のものあるいは疎水化処理されたものを選択し、これらの非磁性核粒子および磁性体微粒子をドライブレンドするか、あるいは、非磁性核粒子および磁性体微粒子の双方を侵すことなく良分散性の溶剤（例えばトルエン、ヘキサン）中で充分分散させた後、混合条件下で溶剤を揮発させる方法が挙げられる。
【００４９】
あるいは、磁性体含有有機ポリマー粒子を、物理的に強い力を外部から加えることにより、非磁性核粒子および磁性体微粒子の複合化を実現させる方法により作製することもできる。物理的に強い力を付加する方法としては、例えば、乳鉢、自動乳鉢、ボールミル、ブレード加圧式粉体圧縮法、メカノフュージョン法のようなメカノケミカル効果を利用するもの、あるいはジェットミル、ハイブリダイザーなど高速気流中衝撃法を利用するものが挙げられる。効率よくかつ強固に複合化を実施するには、物理的吸着力が強いことが望ましい。その方法としては、攪拌翼付き容器中で攪拌翼の周速度が好ましくは１５ｍ／秒以上、より好ましくは３０ｍ／秒以上、さらに好ましくは４０〜１５０ｍ／秒で実施することが挙げられる。撹拌翼の周速度が１５ｍ／秒より低いと、非磁性核粒子の表面に磁性体微粒子を吸着させるのに十分なエネルギーを得ることができないことがある。なお、撹拌翼の周速度の上限については、特に制限はないが、使用する装置、エネルギー効率などの点から自ずと決定される。
【００５０】
１．４．２．糖類
本発明の担体ポリマー粒子の製造で使用される、カルボキシル基を有する糖類としては、例えば、フルクトース，アラビノース，キシロース，リボース，デオキシリボースなどのフラノース類、グルコ−ス，マンノース，ガラクトースなどのピラノース類、セプタノース類などの単糖類、トレハロース，ラクトース，コージオース，ニゲロース，マルトース，イソマルトース，ソホロース，ラミナリオース，セロビオース，ゲンチビオースなどの二糖類、デンプン，アミロース，アミロペクチン，デキストリン，グリコーゲン，シクロデキストリン，セルロース，アガロース，イヌリン，グルコマンナン，キチン，キトサンなどの多糖類、などの糖類の分子内の官能基（例えば、水酸基，アミノ基など）の少なくとも一部を化学修飾してカルボキシル基を導入したもの（例えば、カルボキシメチルセルロース，カルボキシメチルデキストランや、カルボキシル基を元来有する多糖類（例えば、アルギン酸、ヒアルロン酸など）などを挙げることができる。
【００５１】
ここで、糖類を化学修飾してカルボキシル基を導入するための手法としては特に制限がなく、公知の化学反応を用いることができ、その化学修飾は必要に応じて多段階施されたものであってもよい。また、有機ポリマー粒子と糖類とを化学結合させて、有機ポリマー粒子の表面を覆うためには、被覆効率の点で高分子量の多糖類が好ましい。カルボキシル基を含有する糖類として、特に好ましいのは、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシメチルデキストランである。
【００５２】
１．５．担体ポリマー粒子
本発明により製造される担体ポリマー粒子の粒径は、好ましくは０．１〜１７μｍであり、より好ましくは１〜１０μｍである。ここで、粒径が０．１μｍ未満の場合、遠心分離などを用いた分離に長時間を要し、水などの洗浄溶媒と粒子との分離が不十分になるため、目的外の分子（例えば、タンパク質などの生理活性物質）の除去が不十分になり、充分な精製ができない場合がある。一方、粒径が１７μｍを超えると、表面積が小さくなり、ターゲットとするタンパク質などの生理活性物質の捕捉量が少ない場合がある。
【００５３】
本発明により製造される担体ポリマー粒子は、上述の製造方法によって作製された後、必要に応じて、ｐＨ調整を行ない、次いで、透析・限外ろ過・遠心分離等の精製処理によって表面を洗浄してから、担体粒子として使用できる。
【００５４】
本発明により製造される担体ポリマー粒子は、そのままで使用することも可能であるが、化合物との反応を効率的に行なうために、分散媒に分散させた分散液として使用することも可能である。かかる分散媒としては、水、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、イソブチルアルコール、ｓｅｃ-ブタノール、ｔ−ブタノールなどのアルコール類、エチレングリコール、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノプロピルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテルアセテート、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテル、ジエチレングリコールジエチルエーテルなどのエチレングリコール誘導体、プロピレングリコール、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコールモノプロピルエーテル、プロピレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテートなどのプロピレングリコール誘導体、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、メチルアミルケトン、ジイソブチルケトン、シクロヘキサノンなどのケトン類、酢酸エチル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、乳酸エチル、γ―ブチロラクトンなどのエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどのアミド類、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素、ジメチルスルホキシドなどが挙げられる。
【００５５】
また、本発明の担体ポリマー粒子には、上述のターゲット分子を特異的に捕捉するためのプローブが糖類に化学結合されたプローブ結合粒子であってもよい。このプローブは上述の第３の工程によって糖類に化学結合させることができる。プローブ結合粒子の粒径は好ましくは０．１〜２０μｍであり、より好ましくは０．３〜１７μｍであり、さらに好ましくは０．５〜１０μｍである。
【００５６】
２．用途
本発明により製造される担体ポリマー粒子は、創薬分野での化合物担体用粒子および診断薬用の化学結合担体用粒子として利用できる。
【００５７】
より詳しくは、本発明により製造される担体ポリマー粒子を用いて、解析対象の化学物質（被解析化学物質）を化学結合で固定化し、被解析化学物質と特異的な相互作用を有するターゲット分子（タンパク物質など）を選別し、精製することが可能である。
【００５８】
また、本発明により製造される担体ポリマー粒子は、抗体・抗原・酵素・ホルモン等のタンパク質、ＤＮＡ・ＲＮＡ等の核酸物質、あるいは生理活性糖鎖化合物（以下、これらを「生理活性物質」という）を粒子表面に化学結合法で感作させる生理活性物質担体ポリマー粒子として利用できる。
【００５９】
なお、本発明により製造される担体ポリマー粒子の用途は、上述した創薬分野での化合物担体用粒子および診断薬用の化学結合担体用粒子に限定されるわけではなく、例えば、生化学分野、塗料、紙、電子写真、化粧品、医薬品、農薬、食品、触媒など広い分野で利用できる。
【００６０】
３．実施例
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。なお、本実施例において、「％」および「部」は重量基準である。
【００６１】
３．１．評価方法
３．１．１．非特異吸着性の評価１（タンパク質の非特異吸着性評価）
３．１．１Ａ．前洗浄工程
後述する実施例または比較例で得られた担体ポリマー粒子の濃度が１ｗｔ％になるように純水に希釈分散し、分散液を調製した。次に、この分散液５００μｌを微量遠心用チューブ（エッペンドルフ社製、商品名：セーフ−ロックチューブ）に取り、遠心分離機（ＭＸ−１５０，トミー精機（株）製）にて遠心分離し（回転数１５,０００ｒｐｍ、１５℃、１０分間）、上澄みを除去した。次いで、沈降物を含むチューブにＰＢＳ（−）緩衝液５００μｌを注ぎ、タッチミキサーで振動を与えて前記粒子を分散させた。
【００６２】
３．１．１Ｂ．蛋白吸着反応工程
引き続きこのチューブに、１ｗｔ％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）のＰＢＳ（−）溶液５００μｌを注ぎ、さらにタッチミキサーで振動を与えて前記粒子を分散させた後、常温にて２時間回転倒混和させた。
【００６３】
３．１．１Ｃ．洗浄工程
引き続きこのチューブを遠心分離した後、上澄みを除去し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ１ｍｌを注いでタッチミキサーで振動を与えて前記粒子を分散させた。同様の処理をさらに２回繰り返した後、内容物を別の未使用の微量遠心用チューブに移し、遠心分離を行なった後、上澄みを除去した。
【００６４】
３．１．１Ｄ．剥離工程
引き続きこのチューブに０．５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）水溶液５０μｌを注いでタッチミキサーでごく軽く振動を与えて前記粒子を分散させた。１０分間放置した後、遠心分離を行ない、上澄みの２０μｌを採取した。
【００６５】
３．１．１Ｅ．サンプリング工程
バイオラッド社製プレミックスサンプルバッファー中での濃度が２ｗｔ％になるように２−メルカプトエタノールを溶解させ（以下、これを「サンプルバッファー」とする）、このうち２０μｌを微量遠心用チューブに採取した。これに上記剥離工程で採取した上澄み２０μｌを混ぜ、チューブヒーターにて１００℃で５分間加熱した。
【００６６】
一方、コントロールとして、１ｗｔ％のＢＳＡのＰＢＳ（−）溶液を２％ＳＤＳ溶液で５，０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍に希釈したものを２０μｌ取り、サンプルバッファー２０μｌと混ぜ、チューブヒーターにて１００℃で５分間加熱した。これらを参照用希釈ＢＳＡと呼ぶ。
【００６７】
３．１．１Ｆ．電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
バイオラッド社製縦型電気泳動システム「ミニプロティアン３」、バイオラッド社製プレキャストポリアクリルアミドゲル「レディーゲルＪ（１５％）」、およびバイオラッド社製プレミックス泳動バッファーを用いて、ゲル１レーンあたり２０μｌをアプライし、電気泳動を行った。染色はバイオラッド社製シルバーステインプラスキットを用いて標準的な手法で行った。染色されたゲルはバイオラッド社製デンシトメーター「ＧＳ−７００」でスキャンして画像化し、解析ソフトウェア「Ｍｕｌｔｉ−Ａｎａｌｙｓｔ」を用いて、ゲルにおけるＢＳＡのバンドの濃度と面積との積を定量した。
【００６８】
参照用希釈ＢＳＡにおいて、ゲル１レーンあたりに流れるＢＳＡの重量が既知であるため、バンド濃度と面積との積から検量線を引き、この検量線に基づいて、前記粒子から剥離したＢＳＡの重量を重量単位で換算した。なお、この重量は、粒子１ｍｇあたりに吸着していたＢＳＡの重量に相当する。
【００６９】
３．１．２．特異捕捉性評価
３．１．２Ａ．プローブ結合粒子の作製
後述する実施例または比較例で得られた担体ポリマー粒子を、濃度が１ｗｔ％になるように純水に希釈分散して、水分散液を調製した。次に、この水分散液５００μｌを微量遠心用チューブに取り、遠心分離し、上澄みを除去した。５０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ６（Ｂｕｆｆｅｒ−１）にて３回洗浄後、５００μｌのＢｕｆｆｅｒ−１に分散し、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）０．8ｍｇおよび1−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）０．８８ｍｇを加え撹拌した後、ターゲット分子（α−フェトプロテイン，以下「ＡＦＰ」ともいう）を特異的に捕捉するためのプローブとなるタンパク質（抗α−フェトプロテイン抗体）を０．０５ｍｇを添加し、室温下２時間撹拌を行った。反応終了後、遠心分離して上澄みを除去した。次いで、１％エタノールアミンを含むＰＢＳ（−）緩衝液５００μｌを加え、室温で２時間撹拌を行った。さらに、ＰＢＳ（−）緩衝液にて５回洗浄した後、ＰＢＳ（−）緩衝液５００μｌで粒子を分散させることにより、プローブ（抗体）結合粒子の分散液を得た。
【００７０】
３．１．２Ｂ．ターゲット分子（タンパク質）吸着反応工程
上記プローブ結合粒子の分散液１００μＬを別のチューブに取り遠心分離して上澄みを除去した。これに、ターゲット分子であるタンパク質（ヒトα−フェトプロテイン（ＡＦＰ））２００ｎｇ／ｍＬを含むヒト血清溶液５００μｌを注ぎ、さらにタッチミキサーで振動を与えて前記粒子を分散させた後、常温にて２時間回転倒混和させた。
【００７１】
３．１．２Ｃ．洗浄工程
引き続きこのチューブを遠心分離した後、上澄みを除去し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ１ｍｌを注いでタッチミキサーで前記粒子を分散させた。同様の処理をさらに２回繰り返した後、内容物を別の未使用の微量遠心用チューブに移し、遠心分離を行なった後、上澄みを除去した。
【００７２】
３．１．２Ｄ．剥離工程
引き続きこのチューブに０．５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）水溶液５０μｌを注いでタッチミキサーでごく軽く振動を与えて前記粒子を分散させた。１０分間放置した後、遠心分離を行ない、上澄みの２０μｌを採取した。
【００７３】
３．１．２Ｅ．サンプリング工程
バイオラッド社製プレミックスサンプルバッファー中での濃度が２ｗｔ％になるように２−メルカプトエタノールを溶解させ（以下、これを「サンプルバッファー」とする）、このうち２０μｌを微量遠心用チューブに採取した。これに上記剥離工程で採取した上澄み２０μｌを混ぜ、チューブヒーターにて１００℃で５分間加熱した。
【００７４】
一方、コントロールとして、１ｍｇ／ｍＬのＡＦＰ／ＰＢＳ（−）溶液をＳＤＳ溶液で１００倍、２００倍、５００倍に希釈したものを２０μｌ取り、サンプルバッファー２０μｌと混ぜ、ブロックヒーターにて１００℃で５分間加熱した。これらを参照用希釈ＡＦＰと呼ぶ。
【００７５】
３．１．２Ｆ．電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
ＡＦＰをＢＳＡの代わりに用いた以外は、４．１．１Ｆと同様の操作で電気泳動を行なった。
【００７６】
参照用希釈ＡＦＰにおいては、ゲル１レーンあたりに流れるＡＦＰの重量が既知であるため、参照用希釈ＡＦＰを用いた場合におけるバンド濃度と面積との積から検量線を作成し、この検量線に基づいて、前記粒子から剥離したＡＦＰの重量を重量単位で換算した。なお、この重量は、粒子０．２ｍｇあたりに吸着していたＡＦＰの重量に相当する。
【００７７】
３．１．３．粒径
直径１μｍ以上の粒子については、レーザ回折式粒度分布測定装置(（株）島津製作所製)ＳＡＬＤ−２００Ｖにより、直径１μｍ未満の粒子についてはレーザ散乱回折法粒度分布測定装置（型名：ＬＳ  １３  ３２０，（株）ベックマン・コールター製）により粒径を測定した。
【００７８】
３．１．４．赤外吸収スペクトル
フーリエ変換赤外分光光度計（日本電子株式会社製ＪＩＲ−５５００）を用い、ＫＢｒ法により赤外吸収スペクトルを測定した。
【００７９】
３．２．合成例
３．２．１．合成例１（有機ポリマー粒子Ａ−１の合成）
有機ポリマー粒子Ａ−１は、シード粒子を用いる二段膨潤重合法で作製した。
【００８０】
シード粒子として、ソープフリー重合で重合した粒子径０．９８μｍのポリスチレン粒子を用い、このポリスチレン粒子を水５００ｇに窒素雰囲気下で分散させて水分散体（固形分量５．０ｇ）を調製し、これに二段膨潤重合法（特公昭５７−２４３６９号公報記載の方法に準拠）でシード粒子に、一段目として有機溶剤（シェルゾールＴＫ０．１ｇ）、二段目としてモノマーＴＭＰ（トリメチロールプロパントリメタクリレート）１０ｇ、およびＧＭＡ（グリシジルメタクリレート）９０ｇ）を加えて吸収させた後、ＡＩＢＮ（アゾビスイソブチロニトリル）を２ｇ添加して７５℃で２４時間ゆっくり撹拌した。次に、この反応液を冷却した後、５００メッシュ金網でろ過したところ、９９％が通過し、良好な重合安定性であった。重合収率は９９％であった。得られた有機ポリマー粒子Ａ−１の粒子径は２．５８μｍであり、粒子径の変動係数は２．３％であり、単分散粒子であった。
【００８１】
３．２．２．合成例２（有機ポリマー粒子Ａ−２の合成）
モノマーとしてＭＭＡ３０ｇ、ＴＭＰ１０ｇ、およびＧＭＡ６０ｇを使用した以外は、上記合成例１と同様の方法を用いることにより、粒子径が２．６１μｍであり、変動係数が２.１％の有機ポリマー粒子Ａ−３を得た。
【００８２】
３．２．３．合成例３（糖類ＣＭＣ−１の合成）
日本製紙ケミカル株式会社製カルボキシメチルセルロースナトリウム塩ＡＰＰ−８４（平均分子量１７，０００でグルコース単位１個当たり平均０．７個のカルボキシル基を含有）の水溶液に液のｐＨが２以下になるまで希塩酸を加え、この液を透析した後、濃縮することによりカルボキシメチルセルロースＣＭＣ−１の１％水溶液を得た。
【００８３】
３．３．実施例１
３．３．１．担体ポリマー粒子Ｐ−１の作製
有機ポリマー粒子Ａ−１の分散液から遠心分離により単離した重合体粒子をアセトンに分散させ、遠心分離して洗浄する操作を３回繰り返した後、乾燥させた。
次に、この粒子０．５０ｇを２００ｍｌフラスコに入れ、アセトン５ｇおよび１％硫酸７５ｇを加えた後、間接超音波を２０分間照射して分散させてから、６０℃にて２時間加熱攪拌し、その後、遠心分離により前記粒子を単離した。次いで、この粒子を水で３回洗浄した後、乾燥させることにより、０．５１ｇの有機ポリマー粒子Ｈｙ−１を白色粉末として得た。
【００８４】
この有機ポリマー粒子Ｈｙ−１は、有機ポリマー粒子Ａ−１と比較して重量が増加した。さらに、硫酸処理前の赤外吸収スペクトル（有機ポリマー粒子Ａ−１の赤外吸収スペクトル）と比較して、この有機ポリマー粒子Ｈｙ−１（硫酸処理後）の赤外吸収スペクトルにおいては、有機ポリマー粒子Ａ−１の赤外吸収スペクトルにおいて９００ｃｍ−１付近に観測されたエポキシ基に由来するピークが弱くなり、かつ、水酸基に由来する３５００ｃｍ−１付近の幅広なピークが新たに観測された。以上の結果から、有機ポリマー粒子Ｈｙ−１は、有機ポリマー粒子Ａ−１のエポキシ基が部分的に加水分解され水酸基が導入されて得られたものであることが確認された。
【００８５】
次に、０．５０ｇの有機ポリマー粒子Ｈｙ−１を１００ｍｌフラスコに入れ、エチレンジアミン２５ｇを加えた後、間接超音波を１０分間照射して分散させてから、窒素雰囲気下で５０℃にて６時間加熱攪拌し、その後、遠心分離により前記粒子を単離した。次いで、この粒子をメタノールで４回洗浄した後、乾燥させることにより、０．６１ｇの有機ポリマー粒子Ａｍ−１を白色粉末として得た。
【００８６】
この有機ポリマー粒子Ａｍ−１は、有機ポリマー粒子Ｈｙ−１と比較して重量が増加した。さらに、エチレンジアミン処理前の赤外吸収スペクトル（有機ポリマー粒子Ｈｙ−１の赤外吸収スペクトル）と比較して、この有機ポリマー粒子Ａｍ−１（エチレンジアミン処理後）の赤外吸収スペクトルにおいては、有機ポリマー粒子Ｈｙ−１の赤外吸収スペクトルにおいて９００ｃｍ−１付近に観測されたエポキシ基に由来するピークが消失し、かつ、１級アミンに典型的なピークが３３００ｃｍ−１付近および３５００ｃｍ−１付近に新たに観測された。以上の結果から、有機ポリマー粒子Ａｍ−１は、有機ポリマー粒子Ｈｙ−１にアミノ基が導入されて得られたものであることが確認された。
【００８７】
次に、上記合成例３で得られたＣＭＣ−１の１％水溶液３ｇにＮ−ヒドロキシコハク酸イミドを６ｍｇ加えて室温で１０分間撹拌した。次いで、この溶液を氷冷し、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを２０ｍｇ加え、氷冷下で３０分間攪拌した。次いで、この溶液に上記有機ポリマー粒子Ａｍ−１を３０．１ｍｇ加え、間接超音波を２０分間照射して分散させた後、氷冷下で１２時間攪拌した。続いて、遠心分離により粒子を単離し、純水に分散させ遠心分離して洗浄する操作を１０回繰り返した後、乾燥させることにより、３５．０ｍｇの担体ポリマー粒子前駆体ｐｒｅ−Ｐ−１を得た。
【００８８】
担体ポリマー粒子前駆体ｐｒｅ−Ｐ−１の赤外吸収スペクトルにおいては、反応前の有機ポリマー粒子Ａｍ−１に由来するピークに加えて、新たにカルボキシメチルセルロースに由来する３４００ｃｍ−１付近および１６００ｃｍ−１付近のピークなどが観測された。以上の結果から、担体ポリマー粒子前駆体ｐｒｅ−Ｐ−１においては、有機ポリマー粒子Ａｍ−１に糖類（カルボキシメチルセルロース）が結合していることが確認された。
【００８９】
次にこの担体ポリマー粒子前駆体ｐｒｅ−Ｐ−１（２０．２ｍｇ）を０．０１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液２ｍｌに分散させ遠心分離により単離する操作を３回、続いて純水２ｍｌに分散させ遠心分離により単離する操作を３回繰り返した後、乾燥させることにより１８．６ｍｇの担体ポリマー粒子Ｐ−１を得た。
【００９０】
担体ポリマー粒子Ｐ−１の赤外吸収スペクトルにおいては、反応前の担体ポリマー粒子前駆体ｐｒｅ−Ｐ−１と比較すると弱くなったものの、依然としてカルボキシメチルセルロースに由来する３４００ｃｍ−１付近および１６００ｃｍ−１付近のピークなどが観測された。以上の結果から、担体ポリマー粒子Ｐ−１においては、有機ポリマー粒子Ａｍ−１に糖類（カルボキシメチルセルロース）が結合していることが確認された。また、この担体ポリマー粒子Ｐ−１を０．０１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でさらに処理しても重量減少は０．１ｍｇ未満であり無視できる程度であった。
【００９１】
３．３．２．タンパク質の非特異吸着性評価結果
担体ポリマー粒子Ｐ−１について、タンパク質の非特異吸着性を上記評価方法にしたがって測定した結果、検出限界以下（０．０１ｎｇ／ｍｇ）であった。
【００９２】
３．４．実施例２
３．４．１．担体ポリマー粒子Ｐ−２の作製
有機ポリマー粒子Ａ−２の分散液から遠心分離により単離した重合体粒子をアセトンに分散させ、遠心分離して洗浄する操作を３回繰り返した後、乾燥させた。次に、この粒子０．５０ｇを１００ｍｌフラスコに入れ、エチレンジアミン２５ｇを加えた後、間接超音波を１０分間照射して分散させてから、窒素雰囲気下で５０℃にて６時間加熱攪拌し、その後、遠心分離により前記粒子を単離した。次いで、この粒子をメタノールで４回洗浄した後、乾燥させることにより、有機ポリマー粒子Ａｍ−２を白色粉末として０．６１ｇ得た。次に、上記合成例３で得られたＣＭＣ−１の１％水溶液３ｇに上記有機ポリマー粒子Ａｍ−２を２９．９ｍｇ加え、間接超音波を２０分間照射して分散させた。次いで、この分散液を氷冷し、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの２０ｍｇを加え、氷冷下で１２時間攪拌した。続いて、上記実施例１と同様に単離、乾燥の操作を行なうことにより、３６．２ｍｇの担体ポリマー粒子前駆体ｐｒｅ−Ｐ−２を得た。
次いで、上記実施例１の担体ポリマー粒子前駆体ｐｒｅ−Ｐ−１の代わりに、担体ポリマー粒子前駆体ｐｒｅ−Ｐ−２（２０．３ｍｇ）を用いた以外は上記実施例１と同様の操作を行なうことにより、担体ポリマー粒子Ｐ−２を１７．９ｍｇ得た。
【００９３】
３．４．２．非特異吸着性評価結果
担体ポリマー粒子Ｐ−２について、タンパク質の非特異吸着性を上記評価方法にしたがって測定した結果、０．０２ｎｇ／ｍｇと非常に低い値であった。
【００９４】
３．５．比較例１
有機ポリマー粒子Ａ−１へのタンパク質の非特異吸着性を上記方法にしたがって測定した結果、１．１ｎｇ／ｍｇと高い値であった。
【００９５】
３．６．比較例２
市販の標準ポリスチレン粒子（ＳＴＡＤＥＸ  ＳＣ２００Ｓ、ＪＳＲ株式会社製）を純水で充分洗浄してから、非特異吸着性を上記方法にしたがって測定した結果、２０ｎｇ／ｍｇと極めて高い値であった。
【００９６】
３．７．比較例３
担体ポリマー粒子前駆体ｐｒｅ−Ｐ−１へのタンパク質の非特異吸着性を上記方法にしたがって測定した結果、０．０２ｎｇ／ｍｇと非常に低い値であったが検出限界以下となった担体ポリマー粒子Ｐ−１には及ばなかった。
【００９７】
３．８．特異捕捉性評価結果
図３は、実施例１，２それぞれにおいて得られた担体ポリマー粒子（Ｐ−１およびＰ−２）、および比較例３の担体ポリマー粒子前駆体ｐｒｅ−Ｐ−１の特異捕捉性評価を上記方法にしたがって測定した結果（プローブ結合粒子に吸着したタンパク質の電気泳動パターン）を示す写真である。
【００９８】
図３において、レーン１は実施例１の担体ポリマー粒子Ｐ−１を用いて形成されたプローブ結合粒子によって捕捉されたタンパク質を示し、レーン２は実施例２の担体ポリマー粒子Ｐ−２を用いて形成されたプローブ結合粒子によって捕捉されたタンパク質を示し、レーン３は比較例３の担体ポリマー粒子前駆体ｐｒｅ−Ｐ−１を用いて形成されたプローブ結合粒子によって捕捉されたタンパク質を示し、レーン４はコントロールであるターゲット分子（ＡＦＰ）２０ｎｇを示し、レーン５はコントロールであるターゲット分子（ＡＦＰ）５０ｎｇを示し、レーン６は分子量マーカを示す。
【００９９】
図３を参照すると、実施例１の担体ポリマー粒子Ｐ−１を用いて形成されたプローブ結合粒子からは、ターゲット分子であるＡＦＰのバンドのみが血清中から回収され、その回収量は粒子０．２ｍｇ当たり１６ｎｇであった。また、実施例２の担体ポリマー粒子Ｐ−２を用いて形成された抗体結合粒子からは、ターゲット分子であるＡＦＰのバンドのみが血清中から回収され、その回収量は粒子０．２ｍｇ当たり１２ｎｇであった。一方、比較例３の粒子からは、ターゲット分子であるＡＦＰのバンドを確認することは困難であった。
【０１００】
以上により、実施例１，２の担体ポリマー粒子を用いて形成されたプローブ結合粒子は、タンパク質の非特異吸着が少なく、かつ、ターゲット分子を特異的に捕捉できることが確認された。一方、比較例３の磁性粒子は、タンパク質の非特異吸着は少なかったものの、ターゲット分子を特異的に捕捉することはできなかった。このことから、比較例３の粒子のように、表面が糖類で被覆された上にさらに糖類が物理的に吸着していると、ターゲット分子の特異的捕捉を十分には行なうことができないことが理解できる。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】本発明の担体ポリマー粒子の製造方法の第１の工程を説明する図である。
【図２】第１の工程により得られた担体ポリマー粒子の一態様を模式的に示す図である。
【図３】図３は、実施例１，２および比較例３において得られたプローブ結合粒子の特異捕捉性評価結果（プローブ結合粒子に吸着したタンパク質の電気泳動パターン）を示す写真である。
【符号の説明】
【０１０２】
１０・・・担体ポリマー粒子
１１・・・有機ポリマー粒子
１２・・・糖類
１３・・・カルボキシル基と反応性を有する官能基
１４・・・カルボキシル基
【図１】
2007145985.tif 000002
【図２】
2007145985.tif 000003
【図３】
2007145985.tif 000004