(57)【要約】【課題】検出機器の汎用性が高く、開放系での検出が可能な、蛍光近接法を用いた遺伝子多型を検出する方法及びキットを提供する。【解決手段】特定の配列（下流から順に連続する第1領域、第2領域及び第3領域からなり、第2領域は検出すべき多型の塩基から構成される）を有する、試料中の特定の核酸に、第1オリゴヌクレオチド（第3領域の相補配列、第2領域の相補配列、非相補的フラップ配列、及びフラップ配列に蛍光エネルギー供与体又は受容体を有する）と、第2オリゴヌクレオチド（第1領域の相補配列、及び任意の配列を有する）とを、ハイブリダイズさせて3本鎖構造体を形成させ、ＦＥＮによりフラップ配列を含む核酸断片を遊離させ、核酸断片を、第３オリゴヌクレオチド（フラップ配列の相補配列及び蛍光エネルギー受容体又は供与体を有する）を用いて蛍光検出することによって多型を確認する、遺伝子多型検出方法。【選択図】図１３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）特定の配列として、第１領域、第２領域及び第３領域からなる配列であって、前記第１領域は前記第２領域に隣接した下流に位置し、前記第２領域は検出すべき多型の塩基から構成され且つ前記第３領域に隣接した下流に位置する特定の配列を有する、試料中の特定の核酸に、
第１オリゴヌクレオチドとして、前記第３領域に相補的な配列、前記第２領域に相補的な配列、前記特定の配列と相補性のないフラップ配列、及び前記フラップ配列において蛍光エネルギー供与体又は蛍光エネルギー受容体を有するオリゴヌクレオチドであって、前記第３領域に相補的な配列は前記第２領域に相補的な配列に隣接した下流に位置し、前記第２領域に相補的な配列は前記フラップ配列に隣接した下流に位置するオリゴヌクレオチドと、
第２オリゴヌクレオチドとして、前記第１領域に相補的な配列、及び任意の配列を有するオリゴヌクレオチドであって、前記任意の配列は前記第１領域に相補的な配列に隣接した下流に位置するオリゴヌクレオチドとを、ハイブリダイズさせることによって、３本鎖構造体を形成させ、
（ii）前記３本鎖構造体の３重鎖部分をフラップエンドヌクレアーゼに認識させることにより前記フラップ配列を含む核酸断片を遊離させ、
（iii）前記第１オリゴヌクレオチドにおける前記フラップ配列が蛍光エネルギー供与体を有する場合、第３オリゴヌクレオチドとして、前記フラップ配列と相補的な配列を有し且つ蛍光エネルギー受容体を有するオリゴヌクレオチドと、前記遊離した核酸断片とをハイブリダイズさせることによって２本鎖構造を形成させるか、又は、
前記第１オリゴヌクレオチドにおける前記フラップ配列が蛍光エネルギー受容体を有する場合、第３オリゴヌクレオチドとして、前記フラップ配列と相補的な配列を有し且つ蛍光エネルギー供与体を有するオリゴヌクレオチドと、前記遊離した核酸断片とをハイブリダイズさせることによって２本鎖構造を形成させ、
（iv）前記２本鎖構造において、前記蛍光エネルギー供与体と前記蛍光エネルギー受容体とが近接することにより起こる蛍光強度の変化に基づいて、前記多型を検出する、遺伝子多型検出方法。
【請求項２】
前記第１オリゴヌクレオチドにおける前記フラップ配列が蛍光エネルギー供与体を有する場合、前記蛍光エネルギー供与体は前記フラップ配列の５´末端に位置し、前記蛍光エネルギー受容体は前記第３オリゴヌクレオチドの３´末端に位置し、
前記第１オリゴヌクレオチドにおける前記フラップ配列が蛍光エネルギー受容体を有する場合、前記蛍光エネルギー受容体は前記フラップ配列の５´末端に位置し、前記蛍光エネルギー供与体は前記第３オリゴヌクレオチドの３´末端に位置する、請求項１に記載の遺伝子多型検出方法。
【請求項３】
前記蛍光エネルギー供与体又は前記蛍光エネルギー受容体の蛍光の経時変化を測定することによって、前記多型を検出する、請求項１又は２に記載の遺伝子多型検出方法。
【請求項４】
前記第１オリゴヌクレオチド及び前記第３オリゴヌクレオチドが、前記蛍光エネルギー供与体と前記蛍光エネルギー受容体との組み合わせが前記多型のアレルのそれぞれに応じて異なるように設計されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子多型検出方法。
【請求項５】
前記第３オリゴヌクレオチドは、固体支持体に固定化されており、前記遊離した核酸断片は前記固体支持体上で捕捉される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子多型検出方法。
【請求項６】
前記第３オリゴヌクレオチドの前記固体支持体上の固定位置が、前記多型のアレルのそれぞれに応じて異なるように設計されている、請求項５に記載の遺伝子多型検出方法。
【請求項７】
特定の配列として、第１領域、第２領域及び第３領域からなる配列であって、前記第１領域は前記第２領域に隣接した下流に位置し、前記第２領域は検出すべき多型の塩基から構成され且つ前記第３領域に隣接した下流に位置する特定の配列を有する、試料中の特定の核酸の塩基多型を検出するための、遺伝子多型検出キットであり、
（I）第１オリゴヌクレオチドとして、前記第３領域に相補的な配列、前記第２領域に相補的な配列、前記特定の配列と相補性のないフラップ配列、及び前記フラップ配列において蛍光エネルギー供与体又は蛍光エネルギー受容体を有するオリゴヌクレオチドであって、前記第３領域に相補的な配列は前記第２領域に相補的な配列に隣接した下流に位置し、前記第２領域に相補的な配列は前記フラップ配列に隣接した下流に位置するオリゴヌクレオチドと、
（II）第２オリゴヌクレオチドとして、前記第１領域に相補的な配列、及び任意の配列を有するオリゴヌクレオチドであって、前記任意の配列は前記第１領域に相補的な配列に隣接した下流に位置するオリゴヌクレオチドと、
（III）前記第１オリゴヌクレオチドにおける前記フラップ配列が蛍光エネルギー供与体を有する場合、第３オリゴヌクレオチドとして、前記フラップ配列と相補的な配列を有し且つ蛍光エネルギー受容体を有するオリゴヌクレオチドか、又は、
前記第１オリゴヌクレオチドにおける前記フラップ配列が蛍光エネルギー受容体を有する場合、第３オリゴヌクレオチドとして、前記フラップ配列と相補的な配列を有し且つ蛍光エネルギー供与体を有するオリゴヌクレオチドと、
（IV）フラップエンドヌクレアーゼとを含む、遺伝子多型検出キット。
【請求項８】
前記第１オリゴヌクレオチドにおける前記フラップ配列が蛍光エネルギー供与体を有する場合、前記蛍光エネルギー供与体は前記フラップ配列の５´末端に位置し、前記蛍光エネルギー受容体は前記第３オリゴヌクレオチドの３´末端に位置し、
前記第１オリゴヌクレオチドにおける前記フラップ配列が蛍光エネルギー受容体を有する場合、前記蛍光エネルギー受容体は前記フラップ配列の５´末端に位置し、前記蛍光エネルギー供与体は前記第３オリゴヌクレオチドの３´末端に位置する、請求項７に記載の遺伝子多型検出キット。
【請求項９】
前記蛍光エネルギー供与体がＳＹＢＲ(登録商標)ゴールド、ＳＹＢＲ(登録商標)グリーンＩ、ＦＡＭ、及びフルオレセイン発色団から選ばれ、前記蛍光エネルギー受容体がＣｙ５、ローダミン、ＴＡＭＲＡ、Ｒｅｄ６４０、Ｒｅｄ７０５、及びＲＯＸから選ばれる、請求項７又は８に記載の遺伝子多型検出キット。
【請求項１０】
前記第１オリゴヌクレオチド及び前記第３オリゴヌクレオチドが、前記蛍光エネルギー供与体と前記蛍光エネルギー受容体との組み合わせが前記多型のアレルのそれぞれに応じて異なるように設計されている、請求項７〜９のいずれか１項に記載の遺伝子多型検出キット。
【請求項１１】
前記第３オリゴヌクレオチドが、５´末端において固体支持体に固定化されている、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子多型検出キット。
【請求項１２】
前記第３オリゴヌクレオチドの前記固体支持体上の固定位置が、前記多型のアレルのそれぞれに応じて異なるように設計されている、請求項１１に記載の遺伝子多型検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＮＰなどの検出を簡便に行うことができる標的核酸の検出方法、及び、その方法により得られた結果を用いて薬剤投与や病気罹患率などの診断を行う方法に関する。
この遺伝子多型検出方法は、遺伝子解析の研究や臨床分野において利用することができる。
【背景技術】
【０００２】
フラップエンドヌクレアーゼ（FEN-1）が、ダブルフラップ（Double FLAP）構造と呼ばれる３塩基の立体構造を認識して、フラップ（FLAP）と呼ばれるオリゴヌクレオチドが遊離することが知られている（例えば、Harrington JJ and Lieber MR, Journal of Biological Chemistry, 1995 Mar 3; 270 (9): 4503-4508. Fig. 5.B参照）。
【０００３】
一方、ＳＮＰ部位の塩基を判別する、いわゆるタイピングについては多くの手法が報告されている。そのうちの代表的なものとして、インベーダー法、タックマンＰＣＲ法、モレキュラービーコン法、プライマーエクステンション法などが挙げられる（例えば、Kirk BW, Feinsod M, Favis R, Kliman RM and Barany F, Nucleic Acids Research, 2002 Aug 1; 30 (15): 3295-3311参照）。
【０００４】
インベーダー法は、２段階の酵素反応により、フラップ（FLAP）プローブから遊離した蛍光物質を測定する手法である。
具体的には、インベーダー法は、フラッププローブとインベーダープローブとが鋳型ＤＮＡにハイブリダイズしたダブルフラップ構造を形成し、酵素クリベース（Cleavase）がこの構造を認識しフラッププローブを切断することによってフラップ部分を遊離する工程を第１段階として；遊離したフラップをフレットと結合させ、再度クリベースで切断することで、フレットにおける消光物質と蛍光物質とを遊離させる工程を第２段階として含む。その結果、発生した蛍光を検出することで、ＳＮＰのアレル判定を行う。
この方法は、フレット（FRET）配列を共通化することにより、２段階目の反応を共通に行うことができるように工夫されているのが特徴である（例えば、特表２００２−５１５７３７号公報参照）。
【０００５】
インベーダー法の利点を挙げると以下の通りである。１）ゲノム上の広い範囲でプローブを設計することが可能であり、その自由度は比較的高い；２）遺伝子変異部を含む領域を予めＰＣＲで増幅しておくことを必ずしも必要としない；及び、３）合成にコストがかかるフレットを共通配列とすることで、ＳＮＰごとのプローブ設定費用が安価で済む。
【０００６】
タックマンＰＣＲ法、モレキュラービーコン法、プライマーエクステンション法、アレル特異的競合ＰＣＲ法などは、ＰＣＲを基本とした手法である。
【０００７】
さらに一方で、特開２００２−１７１９９２号公報においては、ダブルフラップ構造を形成するフラップ含有プローブの５´末端を担体に固定化し、ダブルフラップ構造形成に関与しない別のプローブと前記フラップとを、前記担体上でアニールさせ、前記別のプローブを鋳型としてポリメラーゼ反応により多型を検出する方法が記載されている。
【０００８】
またさらに一方で、特開２００１−１０３９９９号公報においては、検出すべき特定の核酸配列に対するプローブを、そのプローブが有する標識やフラッグ配列が検出すべき特定の核酸ごとに異なるように設計し、特定の核酸配列を検出する方法が記載されている。
【０００９】
【非特許文献１】カーク・ＢＷ（Kirk BW）、ファインソード・Ｍ（Feinsod M）、ファビス・Ｒ（Favis R）、クリーマン・ＲＭ（Kliman RM）、及びバーラーニ・Ｆ（Barany F）、複雑な疾患との長期関連性を探求する一塩基多型（Single nucleotide polymorphism seeking long term association with complex disease）、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）」、第３０巻、第１５号、ｐ．３２９５−３３１１、２００２年８月１日
【非特許文献２】ハリントン・ＪＪ（Harrington JJ）及びリーバー・ＭＲ（Lieber MR）、ＦＥＮ−１結合に必要なＤＮＡ構造要素（DNA structural elements required for FEN-1 binding）、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）」、第２７０巻、第９号、ｐ．４５０３−４５０８、第５．Ｂ図、１９９５年３月３日
【特許文献１】特表２００２−５１５７３７号公報
【特許文献２】特開２００２−１７１９９２号公報
【特許文献３】特開２００１−１０３９９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来の方法では、例えば以下のような問題点がある。
インベーダー法では、クリベースを含む専用のキットと蛍光検出用のプレートリーダーが必要になる。そして、遊離した蛍光物質を測定するため、蛍光の拡散が起こり、クローズドなウェル内でしか測定が出来ない。
【００１１】
また、検出器の汎用性に関する問題もある。通常、励起と蛍光との適正なスペクトルは、それぞれの物質にあわせて決まっており、蛍光共鳴エネルギー移動などのように、励起と蛍光との組み合わせが変わる場合、リアルタイムサイクラーや蛍光検出器では対応できない場合も多い。特に安価な機器では、予めこの組み合わせが決まっており、変更も出来ない。
【００１２】
ＰＣＲ反応を基本とした手法の一般的な問題点としては、以下が挙げられる。例えばプライマーエクステンションや競合ＰＣＲなどにおいて、ＰＣＲで遺伝子変異部位を含む領域を増幅した後、別のプライマーで反応を行う場合、最初の増幅に用いたプライマーやｄＮＴＰを予め除く必要がある。プライマーエクステンションの場合は、特に、ダイデオキシで伸長を止めるため、完全にｄＮＴＰを除く必要がある。そして、必ずＰＣＲ産物の精製工程を要する。このため、操作が煩雑であり、反応のコストも高かった。
【００１３】
そこで本発明の目的は、検出機器の汎用性が高く、開放系での検出が可能な、蛍光共鳴エネルギー移動法を用いた遺伝子多型を検出する方法及びキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、以下の発明を含む。
下記（１）〜（６）は遺伝子多型検出法に関する。
【００１５】
下記（１）においては、特定の核酸、第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドがダブルフラップ構造を形成し、フラップエンドヌクレアーゼが当該構造を認識するとともに核酸断片（本明細書ではフラップ断片と記載することがある）を遊離させ、遊離した核酸断片を第３オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることによって蛍光共鳴エネルギー移動法により検出することを記載する。前記ハイブリダイズの際に核酸断片と第３オリゴヌクレオチドとの間で蛍光共鳴エネルギー移動が可能となるように、第１オリゴヌクレオチド及び第３オリゴヌクレオチドには、予め蛍光エネルギー供与体や蛍光エネルギー受容体が設けられている。
【００１６】
（１）（i）特定の配列として、第１領域、第２領域及び第３領域からなる配列であって、前記第１領域は前記第２領域に隣接した下流に位置し、前記第２領域は検出すべき多型の塩基から構成され且つ前記第３領域に隣接した下流に位置する特定の配列を有する、試料中の特定の核酸に、
第１オリゴヌクレオチドとして、前記第３領域に相補的な配列、前記第２領域に相補的な配列、前記特定の配列と相補性のないフラップ配列、及び前記フラップ配列において蛍光エネルギー供与体又は蛍光エネルギー受容体を有するオリゴヌクレオチドであって、前記第３領域に相補的な配列は前記第２領域に相補的な配列に隣接した下流に位置し、前記第２領域に相補的な配列は前記フラップ配列に隣接した下流に位置するオリゴヌクレオチドと、
第２オリゴヌクレオチドとして、前記第１領域に相補的な配列、及び任意の配列を有するオリゴヌクレオチドであって、前記任意の配列は前記第１領域に相補的な配列に隣接した下流に位置するオリゴヌクレオチドとを、ハイブリダイズさせることによって、３本鎖構造体を形成させ、
（ii）前記３本鎖構造体の３重鎖部分をフラップエンドヌクレアーゼに認識させることにより前記フラップ配列を含む核酸断片を遊離させ、
（iii）前記第１オリゴヌクレオチドにおける前記フラップ配列が蛍光エネルギー供与体を有する場合、第３オリゴヌクレオチドとして、前記フラップ配列と相補的な配列を有し且つ蛍光エネルギー受容体を有するオリゴヌクレオチドと、前記遊離した核酸断片とをハイブリダイズさせることによって２本鎖構造を形成させるか、又は、
前記第１オリゴヌクレオチドにおける前記フラップ配列が蛍光エネルギー受容体を有する場合、第３オリゴヌクレオチドとして、前記フラップ配列と相補的な配列を有し且つ蛍光エネルギー供与体を有するオリゴヌクレオチドと、前記遊離した核酸断片とをハイブリダイズさせることによって２本鎖構造を形成させ、
（iv）前記２本鎖構造において、前記蛍光エネルギー供与体と前記蛍光エネルギー受容体とが近接することにより起こる蛍光強度の変化に基づいて、前記多型を検出する、遺伝子多型検出方法。
【００１７】
下記（２）は、蛍光エネルギー供与体及び蛍光エネルギー受容体の、オリゴヌクレオチドにおける位置に関する。
（２）  前記第１オリゴヌクレオチドにおける前記フラップ配列が蛍光エネルギー供与体を有する場合、前記蛍光エネルギー供与体は前記フラップ配列の５´末端に位置し、前記蛍光エネルギー受容体は前記第３オリゴヌクレオチドの３´末端に位置し、
前記第１オリゴヌクレオチドにおける前記フラップ配列が蛍光エネルギー受容体を有する場合、前記蛍光エネルギー受容体は前記フラップ配列の５´末端に位置し、前記蛍光エネルギー供与体は前記第３オリゴヌクレオチドの３´末端に位置する、（１）に記載の遺伝子多型検出方法。
【００１８】
下記（３）は、蛍光の検出方法に関する。
（３）  前記蛍光エネルギー供与体又は前記蛍光エネルギー受容体の蛍光の経時変化を測定することによって、前記多型を検出する、（１）又は（２）に記載の遺伝子多型検出方法。
特に、上記（３）において蛍光エネルギー供与体側の蛍光の経時変化を測定する場合は、蛍光強度が下降していくことを確認することで、容易に検出することができる。
【００１９】
下記は、蛍光共鳴エネルギー移動に関わる蛍光エネルギー供与体及び蛍光エネルギー受容体の具体例に関する。
前記蛍光エネルギー供与体がＳＹＢＲ(登録商標)ゴールド、ＳＹＢＲ(登録商標)グリーンＩ、ＦＡＭ、及びフルオレセイン発色団から選ばれ、前記蛍光エネルギー受容体がＣｙ５、ローダミン、ＴＡＭＲＡ、Ｒｅｄ６４０、Ｒｅｄ７０５、及びＲＯＸから選ばれる、（１）〜（３）のいずれかに記載の遺伝子多型検出方法。
【００２０】
下記（４）〜（６）は、アレル及び/又は多型部位に対応したオリゴヌクレオチドの設計に関する。
（４）  前記第１オリゴヌクレオチド及び前記第３オリゴヌクレオチドが、前記蛍光エネルギー供与体と前記蛍光エネルギー受容体との組み合わせが前記多型のアレルのそれぞれに応じて異なるように設計されている、（１）〜（３）のいずれかに記載の遺伝子多型検出方法。
【００２１】
前記試料中に検出すべき多型部位が複数箇所存在し、前記第１オリゴヌクレオチド及び前記第３オリゴヌクレオチドが、前記蛍光エネルギー供与体と前記蛍光エネルギー受容体との組み合わせが前記複数の検出すべき多型部位のそれぞれに応じて異なるように設計されている、（１）〜（４）のいずれかに記載の遺伝子多型検出方法。
【００２２】
（５）  前記第３オリゴヌクレオチドは、固体支持体に固定化されており、前記遊離した核酸断片は前記固体支持体上で捕捉される、（１）〜（４）のいずれかに記載の遺伝子多型検出方法。
【００２３】
（６）  前記第３オリゴヌクレオチドの前記固体支持体上の固定位置が、前記多型のアレルのそれぞれに応じて異なるように設計されている、（５）に記載の遺伝子多型検出方法。
【００２４】
前記第３オリゴヌクレオチドの前記固体支持体上の固定位置が、前記複数の検出すべき多型部位のそれぞれに応じて異なるように設計されている、（５）又は（６）に記載の遺伝子多型検出方法。
【００２５】
下記は、検出の対象に関する。
前記特定の核酸は、ｃＤＮＡ、生物のゲノミック遺伝子、及び微生物の遺伝子から選ばれる核酸の配列を有する、（１）〜（６）のいずれかに記載の遺伝子多型検出法。
微生物には、細菌及びウイルスが含まれる。
前記遺伝子は、ＤＮＡ又はＲＮＡの遺伝子である、上記の遺伝子多型検出法。
前記多型が、一塩基多型、挿入多型、及び欠失多型から選ばれる、（１）〜（６）のいずれかに記載の遺伝子多型検出方法。
【００２６】
下記は、特定の核酸を予め増幅させておく形態に関する。
前記特定の核酸の特定の配列を含む領域が、予め増幅されたものである、（１）〜（６）のいずれかに記載の遺伝子多型検出方法。
前記増幅はＰＣＲによって行われる、上記の遺伝子多型検出方法。
前記増幅は、２５℃におけるｐＨが８．５〜９．５である反応液中で行われる、上記の遺伝子多型検出方法。
【００２７】
下記の（７）〜（１２）は、上記（１）〜（６）に記載の遺伝子多型検出方法に好適に用いることができる遺伝子多型検出キットに関する。
下記（７）は、（I）第１オリゴヌクレオチド、（II）第２オリゴヌクレオチド、（III）第３オリゴヌクレオチド、及び（IV）フラップエンドヌクレアーゼを含む、遺伝子多型検出キットに向けられる。第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドは、検出すべき多型を有する特定の核酸にハイブリダイズすることによりフラップエンドヌクレアーゼによって特異的に認識されるダブルフラップ構造を形成することができるものである。また、下記（７）においては、第１オリゴヌクレオチドは蛍光エネルギー供与体を、第３オリゴヌクレオチドは蛍光エネルギー受容体を有するか、又は、第１オリゴヌクレオチドは蛍光エネルギー受容体を、第３オリゴヌクレオチドは蛍光エネルギー供与体を有するように設計されている。  
【００２８】
（７）  特定の配列として、第１領域、第２領域及び第３領域からなる配列であって、前記第１領域は前記第２領域に隣接した下流に位置し、前記第２領域は検出すべき多型の塩基から構成され且つ前記第３領域に隣接した下流に位置する特定の配列を有する、試料中の特定の核酸の塩基多型を検出するための、遺伝子多型検出キットであり、
（I）第１オリゴヌクレオチドとして、前記第３領域に相補的な配列、前記第２領域に相補的な配列、前記特定の配列と相補性のないフラップ配列、及び前記フラップ配列において蛍光エネルギー供与体又は蛍光エネルギー受容体を有するオリゴヌクレオチドであって、前記第３領域に相補的な配列は前記第２領域に相補的な配列に隣接した下流に位置し、前記第２領域に相補的な配列は前記フラップ配列に隣接した下流に位置するオリゴヌクレオチドと、
（II）第２オリゴヌクレオチドとして、前記第１領域に相補的な配列、及び任意の配列を有するオリゴヌクレオチドであって、前記任意の配列は前記第１領域に相補的な配列に隣接した下流に位置するオリゴヌクレオチドと、
（III）前記第１オリゴヌクレオチドにおける前記フラップ配列が蛍光エネルギー供与体を有する場合、第３オリゴヌクレオチドとして、前記フラップ配列と相補的な配列を有し且つ蛍光エネルギー受容体を有するオリゴヌクレオチドか、又は、
前記第１オリゴヌクレオチドにおける前記フラップ配列が蛍光エネルギー受容体を有する場合、第３オリゴヌクレオチドとして、前記フラップ配列と相補的な配列を有し且つ蛍光エネルギー供与体を有するオリゴヌクレオチドと、
（IV）フラップエンドヌクレアーゼとを含む、遺伝子多型検出キット。
【００２９】
下記（８）は、蛍光エネルギー供与体及び蛍光エネルギー受容体の、オリゴヌクレオチドにおける位置に関する。
（８）  前記第１オリゴヌクレオチドにおける前記フラップ配列が蛍光エネルギー供与体を有する場合、前記蛍光エネルギー供与体は前記フラップ配列の５´末端に位置し、前記蛍光エネルギー受容体は前記第３オリゴヌクレオチドの３´末端に位置し、
前記第１オリゴヌクレオチドにおける前記フラップ配列が蛍光エネルギー受容体を有する場合、前記蛍光エネルギー受容体は前記フラップ配列の５´末端に位置し、前記蛍光エネルギー供与体は前記第３オリゴヌクレオチドの３´末端に位置する、（７）に記載の遺伝子多型検出キット。
【００３０】
下記（９）は、蛍光エネルギー供与体及び蛍光エネルギー受容体の具体例に関する。蛍光エネルギー供与体及び蛍光エネルギー受容体は、互いに近接することによって蛍光共鳴エネルギー移動を起こすものである。
（９）  前記蛍光エネルギー供与体がＳＹＢＲ(登録商標)ゴールド、ＳＹＢＲ(登録商標)グリーンＩ、ＦＡＭ、及びフルオレセイン発色団から選ばれ、前記蛍光エネルギー受容体がＣｙ５、ローダミン、ＴＡＭＲＡ、Ｒｅｄ６４０、Ｒｅｄ７０５、及びＲＯＸから選ばれる、（７）又は（８）に記載の遺伝子多型検出キット。
【００３１】
下記（１０）〜（１２）は、アレル及び/又は多型部位に対応したオリゴヌクレオチドの設計に関する。
（１０）  前記第１オリゴヌクレオチド及び前記第３オリゴヌクレオチドが、前記蛍光エネルギー供与体と前記蛍光エネルギー受容体との組み合わせが前記多型のアレルのそれぞれに応じて異なるように設計されている、（７）〜（９）のいずれかに記載の遺伝子多型検出キット。
【００３２】
前記第１オリゴヌクレオチド及び前記第３オリゴヌクレオチドが、前記蛍光エネルギー供与体と前記蛍光エネルギー受容体との組み合わせが複数の検出すべき多型部位のそれぞれに応じて異なるように設計されている、（７）〜（９）のいずれかに記載の遺伝子多型検出キット。
【００３３】
（１１）  前記第３オリゴヌクレオチドが、５´末端において固体支持体に固定化されている、（７）〜（１０）のいずれかに記載の遺伝子多型検出キット。
【００３４】
（１２）  前記第３オリゴヌクレオチドの前記固体支持体上の固定位置が、前記多型のアレルのそれぞれに応じて異なるように設計されている、（１１）に記載の遺伝子多型検出キット。
【００３５】
前記第３オリゴヌクレオチドの前記固体支持体上の固定位置が、複数の検出すべき多型部位のそれぞれに応じて異なるように設計されている、（１１）又は（１２）に記載の遺伝子多型検出キット。
【００３６】
下記は、検出の対象に関する。
前記特定の核酸は、ｃＤＮＡ、生物のゲノミック遺伝子、及び微生物の遺伝子から選ばれる核酸の配列を有する、（７）〜（１２）のいずれかに記載の遺伝子多型検出キット。
前記遺伝子は、ＤＮＡ又はＲＮＡの遺伝子である、上記の遺伝子多型検出キット。
前記多型が、一塩基多型、挿入多型、及び欠失多型から選ばれる、（７）〜（１２）のいずれかに記載の遺伝子多型検出キット。
【００３７】
下記は、特定の核酸を予め増幅させておくためのアイテムをさらに含むキットに関する。
前記特定の配列を含む領域を増幅するためのプライマーと、増幅試薬とをさらに含む、（７）〜（１２）のいずれかに記載の遺伝子多型検出キット。
２５℃におけるｐＨが８．５〜９．５である核酸増幅反応液をさらに含む、（７）〜（１２）のいずれかに記載の遺伝子多型検出キット。    
【発明の効果】
【００３８】
本発明によると、検出機器の汎用性が高く、開放系での検出が可能な、蛍光共鳴エネルギー移動法を用いた遺伝子多型を検出する方法及びキットを提供することができる。
【００３９】
すなわち、本発明によると、励起波長と蛍光波長との双方を特に変えることなく、単一の蛍光物質（例えば蛍光供与体側）の蛍光に合わせた測定を行うだけで、検出が可能になる。
そして、本発明によると、蛍光物質が遊離することが無いので、第３オリゴヌクレオチド（例えば蛍光受容体が付与されたオリゴヌクレオチド）を固定化しておくことで、開放系での検出が可能になる。このため、例えば従来のインベーダー法に比べ、簡便且つ検出器の汎用性の高い遺伝子多型検出を行うことができる。
さらに、本発明は、予め検出すべき多型を含む領域をＰＣＲ増幅する場合、増幅後に再度伸長反応を行うことがないため、余剰のプライマーやｄＮＴＰを除去する必要がない。このため、例えば従来のＰＣＲ反応を基本とした遺伝子多型検出法に比べ、簡便に遺伝子多型検出を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動法を用いた遺伝子多型検出方法を提供する。本発明の遺伝子多型検出方法では、検出すべき多型を有する特定の核酸を鋳型核酸とし、鋳型核酸に対し、蛍光エネルギー供与体/受容体を有するフラップ配列を有する第１オリゴヌクレオチドと、第２オリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせることにより、３本鎖構造体を形成し、フラップエンドヌクレアーゼによってフラップ配列を含む核酸断片を遊離し、遊離した核酸断片を蛍光エネルギー受容体/供与体を有する第３オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせ、蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光強度の変化に基づいて多型を検出する。ここで、鋳型核酸は、予め増幅されても良い。また、第３オリゴヌクレオチドは、固体支持体上に固定されていても良い。
【００４１】
本発明における検出の対象としては、特に限定されないが、例えば、ｃＤＮＡ、ヒトを含む様々な生物のゲノミック遺伝子、ウイルス及び細菌を含む様々な微生物の遺伝子などが挙げられる。従って、これら核酸の配列を有するものを鋳型核酸とすることができる。また、これら検出対象となる遺伝子としては、ＤＮＡの遺伝子及びＲＮＡの遺伝子を問わない。
【００４２】
鋳型核酸を含む試料としても特に限定されない。すなわち、生体試料、生体由来試料、抽出核酸試料などに対して多型検出を行うことができる。ここで、生体試料や生体由来試料は、核酸の抽出操作を行わず、核酸包含体（例えば細胞、真菌、細菌、ウイルスなど、核酸を内部に含有する膜構造体）を維持した形態の試料である。生体試料の例としては、臓器、組織、体液、排泄物などが挙げられる。体液には、血液試料、髄液、唾液、乳等が含まれる。血液試料には、全血、血漿、血清等が含まれる。排泄物には、尿、便などが含まれる。生体由来試料は、生体試料から核酸包含体を回収した試料をいう。核酸包含体の回収方法としては特に限定されないが、遠心・超遠心操作、ポリエチレングリコールなどの共沈剤、吸着担体などを用いた方法が挙げられる。抽出核酸試料は、核酸の抽出操作を行った試料であり、抽出後さらに核酸を精製した試料であっても良い。抽出方法としては、酵素、界面活性剤、カオトロピック剤などを用いた方法が挙げられ、精製方法としては、フェノール/クロロホルム、イオン交換樹脂、ガラスフィルター、ガラスビーズ、磁気ビーズ、タンパク凝集作用を有する試薬などを用いた方法が挙げられる。
【００４３】
本発明で検出できる多型は特に限定されず、いわゆる単一ヌクレオチド多型（１塩基多型：single nucleotide polymorphism：ＳＮＰ）及び複数ヌクレオチドからなる配列にわたる多型の両方を含む。本発明においては、多型にはさらに変異も含むものとする。具体的には、本発明で検出できる多型の例としては、一塩基多型、挿入多型、欠失多型などが挙げられる。
【００４４】
本発明の３本鎖構造体の一例を、図１に示す。  
本発明において、特定の核酸である鋳型核酸は、第１領域、第２領域及び第３領域から構成される特定の配列を含む。第１領域は第２領域に隣接した下流に位置し、第２領域は第３領域に隣接した下流に位置する。このうち第２領域が、検出すべき多型の塩基から構成される領域である。
【００４５】
第１オリゴヌクレオチドは、フラップ配列を有し、第２領域から第３領域に特異的なオリゴヌクレオチドである。フラップ配列は、特定の配列と相補性のない配列（具体的には、第１領域に相補性のない配列）である。すなわち第１オリゴヌクレオチドは、第３領域に相補的な配列、第２領域に相補的な配列、及び特定の配列と相補性のないフラップ配列を有する。そして、第３領域に相補的な配列は第２領域に相補的な配列に隣接した下流に位置し、第２領域に相補的な配列はフラップ配列に隣接した下流に位置する。さらに、第１オリゴヌクレオチドは、第３領域に相補的な配列に隣接する上流に、鋳型核酸と相補性のない配列（具体的には、鋳型核酸における、特定の配列に隣接する下流の配列と相補性のない配列）を有していても良い。
【００４６】
そして、第１オリゴヌクレオチドのフラップ配列は、蛍光エネルギー供与体又は蛍光エネルギー受容体を有する。蛍光エネルギー供与体又は蛍光エネルギー受容体は、フラップ配列の５´末端に設けることができる。（図１においては、蛍光エネルギー供与体“ｄ”が第１オリゴヌクレオチドの５´末端に位置する例を模式的に示す。）
【００４７】
第２オリゴヌクレオチドは、第１領域に特異的なオリゴヌクレオチドである。第２オリゴヌクレオチドは、第１領域に相補的な配列、及び、任意の配列を有する。そして、任意の配列は、第１領域に相補的な配列に隣接した下流に位置する。さらに、第２オリゴヌクレオチドは、第１領域に相補的な配列に隣接する下流に、鋳型核酸と相補性のない配列（具体的には、鋳型核酸における、特定の配列に隣接する上流の配列と相補性のない配列）を有していても良い。
【００４８】
フラップエンドヌクレアーゼは、核酸の特殊な構造、すなわち３本鎖構造（ダブルフラップ構造）を認識し、第１オリゴヌクレオチドを切断することによってフラップ配列を含む核酸断片を遊離することができるものであれば特に限定されない。具体的には、鋳型核酸、第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドが３本鎖構造体を形成したとき、３重鎖部分を認識し、第１オリゴヌクレオチドを切断する酵素であれば良い。例えば、クリベース（cleavase）や、熱耐性フラップエンドヌクレアーゼなどが挙げられる。耐熱性フラップエンドヌクレアーゼとしては、例えば特開平１１−７５８４９号公報に記載されているものが挙げられる。例えば多型がＳＮＰでクリベースを用いる場合、図２に示すように、３本鎖構造体のＳＮＰの部位の構造がクリベースによって認識され（図２（ａ））、ＳＮＰ部位に対応する塩基の３´側で第１オリゴヌクレオチドが切断され、フラップ配列及びＳＮＰ部位に対応する塩基を有する核酸断片（以下、フラップ断片と記載する。）が遊離する（図２（ｂ））。  
【００４９】
遊離したフラップ断片は、第３オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする（図２（ｃ））。第３オリゴヌクレオチドは、フラップ配列に相補的な配列と、蛍光エネルギー受容体又は蛍光エネルギー供与体とを有するオリゴヌクレオチドである。第１オリゴヌクレオチドが蛍光エネルギー供与体を有している場合は、第３オリゴヌクレオチドは蛍光エネルギー受容体を有し、第１オリゴヌクレオチドが蛍光エネルギー受容体を有している場合は、第３オリゴヌクレオチドは蛍光エネルギー供与体を有する。フラップ断片と第３オリゴヌクレオチドとがハイブリダイズすることにより、蛍光エネルギー供与体と蛍光エネルギー受容体とが近接し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴと記載することがある）によって蛍光が発せられる。フラップ断片と第３オリゴヌクレオチドとの間における蛍光エネルギー供与体と蛍光エネルギー受容体との距離は、ＦＲＥＴが起こる距離（例えば１〜１０ｎｍ）であればよい。例えば、第１オリゴヌクレオチドにおける蛍光エネルギー供与体又は蛍光エネルギー受容体が第１オリゴヌクレオチドの５´末端に設けられた場合は、第３オリゴヌクレオチドにおける蛍光エネルギー受容体又は蛍光エネルギー供与体は、第３オリゴヌクレオチドの３´末端に設けることができる。図２（ｃ）は、蛍光エネルギー供与体を５´末端に有するフラップ断片と蛍光エネルギー受容体を３´末端に有する第３オリゴヌクレオチドとがハイブリダイズし、ＦＲＥＴが起こり蛍光エネルギー受容体の蛍光強度が増強することにより、蛍光が発せられたことを例示する模式図である。
【００５０】
蛍光エネルギー供与体は、ＳＹＢＲ(登録商標)ゴールド、ＳＹＢＲ(登録商標)グリーンＩ、ＦＡＭ、フルオレセイン(ＦＩＴＣ)系発色団などから選ぶことができる。また、蛍光エネルギー受容体は、Ｃｙ５、ローダミン、ＴＡＭＲＡ、Ｒｅｄ６４０、Ｒｅｄ７０５、及びＲＯＸなどから選ぶことができる。
【００５１】
蛍光エネルギー供与体と蛍光エネルギー受容体との組み合わせは、蛍光エネルギー供与体の蛍光スペクトルが、蛍光エネルギー受容体の励起光スペクトルと重なるような組み合わせであれば、どのような組み合わせを採用しても良い。
【００５２】
第３オリゴヌクレオチドは、固体支持体に固定されていても良い。例えば、第３オリゴヌクレオチドは、その５´末端において、リンカーを介して固体支持体上の特定の位置に固定されていても良い。
【００５３】
第１オリゴヌクレオチド及びフラップ配列としては特に限定されず、当業者が適宜設定することができる。例えば、第１オリゴヌクレオチドを、例えば２５〜１４０merの長さに設定し、このうちフラップ配列を、例えば１０〜５０merの長さに設定することができる。また、上の設定された長さのうち、第２及び第３領域に相補的な配列は例えば１５〜８０merの長さに設定することができる。さらに、異なる第１オリゴヌクレオチド間においては、フラップ配列は、Ｔｍ値をできるだけそろえることが好ましい。
【００５４】
第２オリゴヌクレオチドの長さとしては特に限定されないが、例えば１５〜６０merの長さに設定することができる。このうち、第２オリゴヌクレオチドにおける相補的でない配列は、例えばＳＮＰを検出する場合、１merとすると良い。また、上の設定された長さのうち、第１領域に相補的な配列は例えば９〜５９merの長さに設定することができる。
【００５５】
第３オリゴヌクレオチドの長さとしては特に限定されないが、第１オリゴヌクレオチドのフラップ配列との兼ね合いを考慮し、例えば１５〜５０merの長さに設定することができる。例えば固体支持体上に固定する場合、このうち５´末端の７〜３５merを、リンカーとしての配列とすることができる。
【００５６】
３本鎖構造体の形成及びフラップ断片の遊離における反応は、例えば以下の条件で行うことができる。用いるフラップエンドヌクレアーゼにもよるが等温で５５〜７５℃、５分〜１８時間の条件下で反応行うことができる。クリベースを用いる場合は、５５〜６８℃、５分〜１８時間で反応を行うことができ、例えば６３℃で３０分程度の条件で反応を行うと良い。この反応に先立って核酸増幅を行った場合（核酸増幅については後述する）、用いたプライマーなどの試薬類は除去する必要はない。
【００５７】
また、この反応の直前に、一本鎖にするための条件に供することが好ましい。このために、反応液を例えば９０℃以上で５分以上保持することができる。
【００５８】
第１オリゴヌクレオチドとして設計したオリゴヌクレオチドにおける、第２領域（すなわち多型塩基）に対応する塩基が、鋳型核酸において想定した多型部位とマッチする場合は、３本鎖構造体を形成し（図２（ａ））、クリベースがこの構造を認識することによって第１オリゴヌクレオチドを切断し、フラップ断片が遊離する（図２（ｂ））。そして、第３オリゴヌクレオチドが速やかに、遊離したフラップ断片のフラップ配列とハイブリダイズし、２本鎖構造体を形成する（図２（ｃ））。このとき、近接した蛍光エネルギー供与体と蛍光エネルギー受容体との間でエネルギー転移が起こる。そして、エネルギー転移による蛍光強度の変化を認識することによって、フラップ断片を検出する。このようにして、多型が検出される。なお、この場合、蛍光エネルギー受容体の蛍光は可能な強度（すなわちフラップ断片と第３オリゴヌクレオチドとの２本鎖構造体が、全てのフラップ断片について形成され、全ての２本鎖構造体で蛍光エネルギー受容体の蛍光が発せられたときの蛍光強度）まで速やかに達する。（本明細書では、蛍光エネルギー受容体の蛍光が可能な強度まで速やかに達することを、単に蛍光が発せられると記載する場合がある。）
【００５９】
反対に、第１オリゴヌクレオチドとして設計したオリゴヌクレオチドにおける、多型塩基に対応する塩基が、鋳型核酸において想定した多型部位とマッチしない場合は、クリベースが認識することができる３本鎖構造体が形成されないため、第１オリゴヌクレオチドは切断されず、フラップ断片は遊離しない（図３）。そして、第３オリゴヌクレオチドは、鋳型核酸にハイブリダイズした状態における第１オリゴヌクレオチドの一部分としてのフラップ配列とハイブリダイズすることも可能ではあるが、ハイブリダイズの速度は、上記図２のような遊離したフラップ断片とのハイブリダイズの場合に比べて非常に遅い。従って、蛍光エネルギー受容体の蛍光が可能な強度に達するためには非常に時間がかかる。
【００６０】
多型が検出されたか否かの判断は、蛍光強度の変化に基づくが、そのためには、従来からの蛍光検出法を特に限定することなく用いることができる。例えば、蛍光強度の経時変化を調べることによって判断してもよいし、一定時間経過後の蛍光強度を調べることによって判断してもよい。具体的には、以下のように検出を行うことができる。
【００６１】
例えば、蛍光スペクトルに基づいて判断する場合は、適当な励起波長のもと、蛍光波長を変化させて、蛍光強度を波長ごとにプロットし、最大蛍光強度や最大蛍光波長の経時変化、又は一定時間経過後の最大蛍光強度や最大蛍光波長の値から判断することができる。この場合、例えば図１０に示すような曲線が得られる。図１０の詳細については、後述の実験例１に記載する。
【００６２】
また、蛍光強度の経時変化によって判断する別の方法として、時間に対する蛍光強度を調べ、蛍光強度が頭打ちになるのに要する時間に基づいて判断することもできる。そのような時間としては、試料などによるため特に限定されない。目安としては、多型が検出される場合、だいたい１０分以内の速さで蛍光強度が頭打ちになる。
一定時間経過後の蛍光強度によって判断する場合は、一定時間経過後、好ましくは蛍光強度が頭打ちになる時間前後に、比較的強い蛍光が出ているか否かで判断することができる。
【００６３】
蛍光の検出は、具体的には、リアルタイムＰＣＲ装置やプレートリーダなどを用い、適当な励起波長及び蛍光波長を固定して行うことができる。リアルタイムＰＣＲ装置としては、例えばストラタジーン社製MX3000pなどが挙げられる。プレートリーダとしては、例えば大塚電子社製FluoDia T70などが挙げられる。このような場合、通常、蛍光物質ごとにフィルターセットを用意する必要がある。
【００６４】
本発明では、上記の方法以外にも、蛍光エネルギー供与体及び蛍光エネルギー受容体のいずれかの蛍光強度の変化を測定する方法が可能である。すなわち、エネルギー供与体に対して励起を行い、エネルギー供与体側の蛍光強度の経時変化を調べるか、或いは、エネルギー供与体に対して励起を行い、エネルギー受容体側の蛍光強度の経時変化を調べることができる。好ましくは、エネルギー供与体に対して励起を行い、エネルギー供与体側の蛍光強度の経時変化を調べる。エネルギー供与体側の蛍光強度が経時により減衰すると、多型が検出できたことになる。例えば、図１１、１２及び１３のような曲線が得られる。なおこれらの図の詳細については、後述の実験例１及び実験例２で詳述する。このように、本発明では、単一の蛍光物質のシグナルのみで検出が可能である。このように単一の蛍光物質のシグナルのみによって多型検出する例では、蛍光物質ごとにフィルターセットを用意する必要がない。この方法においては、検出器としては特に限定されることなく、さまざまな機種を用いることができる。
【００６５】
ここで、蛍光物質ごとにフィルターセットを用意する場合は、異なる励起/蛍光のセットによる検出系を用意することが必要である。しかしながら、特に廉価版の装置では、フィルターの組み合わせを変えることができない場合がある。例えば上述のMX3000pなどでは、設定した蛍光以外のフィルターの変更は困難で、また、組み合わせの変更もできない。異なる励起/蛍光の組み合わせを実現するには、高額な機械や専用機を用意する必要がある。上述のような、単一の蛍光物質のシグナルのみによる検出は、例えばこのように異なる励起/蛍光のセットによる検出系を用意することが困難な場合に行うことが好ましい。
【００６６】
第１オリゴヌクレオチドは、通常、試料中の多型部位一箇所つき、多型のアレルそれぞれに応じて設計されている。例えば、第１オリゴヌクレオチドとしては、アレル特異的な２種のオリゴヌクレオチドを用いることができる（以下、第１オリゴヌクレオチドとしてアレル特異的な２種のオリゴヌクレオチドを用いる場合を挙げて説明を行う）。この場合、第３オリゴヌクレオチドとしては、アレル特異的な２種の第１オリゴヌクレオチドそれぞれに対応するように（すなわちアレル特異的な２種の第１オリゴヌクレオチドの、それぞれのフラップ配列に相補的な配列を有するように）設計された２種類のオリゴヌクレオチドが用いられる。そして、これらアレル特異的な第１オリゴヌクレオチドの一方及び/又は他方から生じるフラップ断片と第３オリゴヌクレオチドとから形成される２本鎖構造体において発せられる蛍光が識別可能となるように、第１オリゴヌクレオチド及び対応する第３オリゴヌクレオチドを設定することができる。蛍光からアレルの識別を可能にする（すなわちそれぞれのアレルをＩＤ化する）具体的な方法としては、アレルごとに異なる挙動を示す蛍光に基づく方法と、アレルごとに異なる固体支持体上の位置における蛍光に基づく方法とが挙げられる。各オリゴヌクレオチドの設計の仕方によっては、アレルごとに、蛍光及び固体支持体上における位置の両方が異なるようにすることも可能である。
【００６７】
以下に、蛍光からアレルの識別を可能にする具体的な方法について例を挙げて説明する。ここで、第１オリゴヌクレオチドとして、一方のアレル（アレル１とする）に特異的なものを第１オリゴヌクレオチドI１とし、他方のアレル（アレル２とする）に特異的なものを第１オリゴヌクレオチドI２とする。そして、第３オリゴヌクレオチドとして、第１オリゴヌクレオチドI１に対応するものを第３オリゴヌクレオチドIII１とし、第１オリゴヌクレオチドI２に対応するものを第３オリゴヌクレオチドIII２とする。
【００６８】
アレルごとに異なる挙動を示す蛍光に基づいてアレル識別を行うためには、以下に挙げる方法を行うことができる。
【００６９】
まず、第１オリゴヌクレオチドが蛍光エネルギー供与体を有する場合、一例としては、アレルごとに第１オリゴヌクレオチドの蛍光エネルギー供与体が異なるようにすることができる（より具体的な例を図４に挙げる）。この例では、蛍光エネルギー供与体の蛍光強度の減衰に基づいて各アレルを識別することができる。具体的には、第１オリゴヌクレオチドI１は、アレル１に応じた相補配列と、アレル１の識別のための蛍光エネルギー供与体ｄ１とを有する。第１オリゴヌクレオチドI２は、アレル２に応じた相補配列と、アレル２の識別のための蛍光エネルギー供与体ｄ２とを有する。第１オリゴヌクレオチドI１とI２とのフラップ配列は、互いに同じであっても良いし、互いに異なっていても良い。
【００７０】
第３オリゴヌクレオチドIII１は、第１オリゴヌクレオチドI１のフラップ配列に相補的な配列と、蛍光エネルギー受容体とを有する。第３オリゴヌクレオチドIII２は、第１オリゴヌクレオチドI２のフラップ配列に相補的な配列と、蛍光エネルギー受容体とを有する。第１オリゴヌクレオチドI１とI２とのフラップ配列が互いに同じである場合、用意する第３オリゴヌクレオチドとしては、当該フラップ配列に相補的な配列を有するもの１種類でよい。第３オリゴヌクレオチドIII１とIII２との蛍光エネルギー受容体は、第１オリゴヌクレオチドの蛍光エネルギー供与体ｄ１及びｄ２それぞれに対応したものとするため、互いに同じである場合と、互いに異なる場合とがあり得る。
【００７１】
このような第１オリゴヌクレオチド及び第３オリゴヌクレオチドを、あるＳＮＰ部位がＴ（アレル１）又はＣ（アレル２）を取りうる場合に用いた例が、図４に示される。この例では第１オリゴヌクレオチドI１とI２とのフラップ配列が互いに同じものとした（図４（ａ））。仮に鋳型核酸が有するＳＮＰがＴであった場合、第１オリゴヌクレオチドI１がハイブリダイズした鋳型核酸において、フラップエンドヌクレアーゼが認識可能な３本鎖構造体が形成され（図４（ｂ））、フラップ断片が遊離する。フラップ断片は第３オリゴヌクレオチドと２本鎖構造体を形成し、ＦＲＥＴによりａの蛍光強度が増強し、ｄ１の蛍光強度が減衰する（図４（ｃ））。ｄ１の蛍光強度の減衰に基づいて、ＳＮＰとしてＴを検出することができる。
【００７２】
アレルごとに蛍光エネルギー供与体が異なる上記の例は、すでに述べたように、単一の蛍光物質のシグナルのみに基づいて検出する方法を用いることができる点で好ましい。
【００７３】
第１オリゴヌクレオチドが蛍光エネルギー供与体を有する場合の他の一例としては、アレルごとに第３オリゴヌクレオチドの蛍光エネルギー受容体が異なるようにすることができる（より具体的な例を図５に挙げる）。この例では、蛍光エネルギー受容体の蛍光強度の増強に基づいて各アレルを識別することができる。この例では、アレルごとに第１オリゴヌクレオチドのフラップ配列が異なるようにする必要がある。具体的には、第１オリゴヌクレオチドI１は、アレル１に応じた相補配列と、アレル１の識別のためのフラップ配列ｆ１とを有する。第１オリゴヌクレオチドI２は、アレル２に応じた相補配列と、アレル２の識別のためのフラップ配列ｆ２とを有する。第１オリゴヌクレオチドI１とI２との蛍光エネルギー供与体は、第３オリゴヌクレオチドの蛍光エネルギー受容体ａ１及びａ２それぞれに対応したものとするため、互いに同じである場合と、互いに異なる場合とがあり得る。
【００７４】
第３オリゴヌクレオチドIII１は、第１オリゴヌクレオチドI１のフラップ配列ｆ１に相補的な配列と、アレル１の識別のための蛍光エネルギー受容体ａ１とを有する。第３オリゴヌクレオチドIII２は、第１オリゴヌクレオチドI２のフラップ配列ｆ２に相補的な配列と、アレル２の識別のための蛍光エネルギー受容体ａ２とを有する。
【００７５】
このような第１オリゴヌクレオチド及び第３オリゴヌクレオチドを、あるＳＮＰ部位がＴ（アレル１）又はＣ（アレル２）を取りうる場合に用いた例が、図５に示される。この例では、第１オリゴヌクレオチドI１及びI２は、図５（ａ）のように模式的に表される。仮に鋳型核酸が有するＳＮＰがＴであった場合、第１オリゴヌクレオチドI１がハイブリダイズした鋳型核酸において、フラップエンドヌクレアーゼが認識可能な３本鎖構造体が形成され（図５（ｂ））、フラップ断片が遊離する。フラップ断片は第３オリゴヌクレオチドIII１と２本鎖構造体を形成し、ＦＲＥＴによりａ１の蛍光強度が増強し、ｄの蛍光強度が減衰する（図５（ｃ））。ａ１の蛍光強度の増強に基づいて、ＳＮＰとしてＴを検出することができる。  
【００７６】
次に、第１オリゴヌクレオチドが蛍光エネルギー受容体を有する場合、一例としては、アレルごとに第３オリゴヌクレオチドの蛍光エネルギー供与体が異なるようにすることができる（より具体的な例を図６に挙げる）。この例では、蛍光エネルギー供与体の蛍光強度の減衰に基づいて各アレルを識別することができる。この例では、アレルごとに第１オリゴヌクレオチドのフラップ配列が異なるようにする必要がある。具体的には、第１オリゴヌクレオチドI１は、アレル１に応じた相補配列と、アレル１の識別のためのフラップ配列ｆ１とを有する。第１オリゴヌクレオチドI２は、アレル２に応じた相補配列と、アレル２の識別のためのフラップ配列ｆ２とを有する。第１オリゴヌクレオチドI１とI２との蛍光エネルギー受容体は、第３オリゴヌクレオチドの蛍光エネルギー供与体ｄ１及びｄ２それぞれに対応したものとするため、互いに同じである場合と、互いに異なる場合とがあり得る。
【００７７】
第３オリゴヌクレオチドIII１は、第１オリゴヌクレオチドI１のフラップ配列ｆ１に相補的な配列と、アレル１の識別のための蛍光エネルギー供与体ｄ１とを有する。第３オリゴヌクレオチドIII２は、第１オリゴヌクレオチドI２のフラップ配列ｆ２に相補的な配列と、アレル２の識別のための蛍光エネルギー供与体ｄ２とを有する。
【００７８】
このような第１オリゴヌクレオチド及び第３オリゴヌクレオチドを、あるＳＮＰ部位がＴ（アレル１）又はＣ（アレル２）を取りうる場合に用いた例が、図６に示される。この例では、第１オリゴヌクレオチドI１及びI２は、図６（ａ）のように模式的に表される。仮に鋳型核酸が有するＳＮＰがＴであった場合、第１オリゴヌクレオチドI１がハイブリダイズした鋳型核酸において、フラップエンドヌクレアーゼが認識可能な３本鎖構造体が形成され（図６（ｂ））、フラップ断片が遊離する。フラップ断片は第３オリゴヌクレオチドIII１と２本鎖構造体を形成し、ＦＲＥＴによりａの蛍光強度が増強し、ｄ１の蛍光強度が減衰する（図６（ｃ））。ｄ１の蛍光強度の減衰に基づいて、ＳＮＰとしてＴを検出することができる。
【００７９】
アレルごとに蛍光エネルギー供与体が異なる上記の例は、すでに述べたように、単一の蛍光物質のシグナルのみに基づいて検出する方法を用いることができる点で好ましい。
【００８０】
第１オリゴヌクレオチドが蛍光エネルギー受容体を有する場合の他の一例としては、アレルごとに第１オリゴヌクレオチドの蛍光エネルギー受容体が異なるようにすることができる（より具体的な例を図７に挙げる）。この例では、蛍光エネルギー受容体の蛍光強度の増強に基づいて各アレルを識別することができる。具体的には、第１オリゴヌクレオチドI１は、アレル１に応じた相補配列と、アレル１の識別のための蛍光エネルギー受容体ａ１とを有する。第１オリゴヌクレオチドI２は、アレル２に応じた相補配列と、アレル２の識別のための蛍光エネルギー受容体ａ２とを有する。第１オリゴヌクレオチドI１とI２とのフラップ配列は、互いに同じであっても良いし、互いに異なっていても良い。
【００８１】
第３オリゴヌクレオチドIII１は、第１オリゴヌクレオチドI１のフラップ配列に相補的な配列と、蛍光エネルギー受容体とを有する。第３オリゴヌクレオチドIII２は、第１オリゴヌクレオチドI２のフラップ配列に相補的な配列と、蛍光エネルギー受容体とを有する。第１オリゴヌクレオチドI１とI２とのフラップ配列が互いに同じである場合、用意する第３オリゴヌクレオチドとしては、当該フラップ配列に相補的な配列を有するもの１種類でよい。第３オリゴヌクレオチドIII１とIII２との蛍光エネルギー供与体は、第１オリゴヌクレオチドの蛍光エネルギー受容体ａ１及びａ２それぞれに対応したものとするため、互いに同じである場合と、互いに異なる場合とがあり得る。
【００８２】
このような第１オリゴヌクレオチド及び第３オリゴヌクレオチドを、あるＳＮＰ部位がＴ（アレル１）又はＣ（アレル２）を取りうる場合に用いた例が、図７に示される。この例では、第１オリゴヌクレオチドI１及びI２は、図７（ａ）のように模式的に表される。仮に鋳型核酸が有するＳＮＰがＴであった場合、第１オリゴヌクレオチドI１がハイブリダイズした鋳型核酸において、フラップエンドヌクレアーゼが認識可能な３本鎖構造体が形成され（図７（ｂ））、フラップ断片が遊離する。フラップ断片は第３オリゴヌクレオチドIII１と２本鎖構造体を形成し、ＦＲＥＴによりａ１の蛍光強度が増強し、ｄの蛍光強度が減衰する（図７（ｃ））。ａ１の蛍光強度の増強に基づいて、ＳＮＰとしてＴを検出することができる。
【００８３】
いずれの例においても、第３オリゴヌクレオチドは固体支持体上に固定されていなくとも良いし、固定されていても良い。いずれにしても、強度に変化があった蛍光に基づいてＳＮＰ検出やタイピングを行うことができる。例えば、ｄ１に由来する蛍光スペクトルの変化（すなわち、蛍光強度の減衰による変化。以下において同じ。）のみ検出され、ｄ２に由来する蛍光スペクトルの変化が検出されなければ、ＳＮＰがＴ/Ｔのホモ接合体であるとのタイピングを行うことができる。また、ｄ１とｄ２との両方に由来する蛍光スペクトルの変化が検出されれば、ＳＮＰがＴ/Ｃのヘテロ接合体であるとのタイピングを行うことができる。さらに、ｄ２に由来する蛍光スペクトルの変化のみ検出され、ｄ１に由来する蛍光スペクトルの変化が検出されなければ、ＳＮＰがＣ/Ｃのホモ接合体であるとのタイピングを行うことができる。
第３オリゴヌクレオチドが固体支持体上に固定されている場合は、蛍光だけでなく固体支持体上の位置によって、確実かつ容易にＳＮＰ検出やタイピングを行うことができる点で好ましい。
【００８４】
なお、オリゴヌクレオチドを固体支持体上に固定する方法としては特に限定されないが、例えばビオチンを用いる方法が挙げられる。固体支持体の種類としても、特に限定されず、例えば、通常ＤＮＡチップとして用いられる支持体などが挙げられる。
【００８５】
一方、アレルごとに異なる固体支持体上の位置における蛍光に基づいてアレル識別を行うためには、以下に挙げる方法を行うことができる。
【００８６】
まず、第１オリゴヌクレオチドが蛍光エネルギー供与体を有する場合、一例としては、フラップ配列がアレルごとに異なるようにすると良い（より具体的な例を図８に挙げる）。具体的には、第１オリゴヌクレオチドI１は、アレル１に応じた相補配列と、アレル１の識別のためのフラップ配列ｆ１とを有する。第１オリゴヌクレオチドI２は、アレル２に応じた相補配列と、アレル２の識別のためのフラップ配列ｆ２とを有する。第１オリゴヌクレオチドI１とI２との蛍光エネルギー供与体は、それぞれ、第３オリゴヌクレオチドIII１とIII２との蛍光エネルギー受容体に対応していれば良く、互いに同じであっても良いし、互いに異なっていても良い。
【００８７】
第３オリゴヌクレオチドIII１は、第１オリゴヌクレオチドI１のフラップ配列ｆ１に相補的な配列と、蛍光エネルギー受容体とを有し、アレル１の識別のための固体支持体上の特定の位置Ｐ１に固定化される。第３オリゴヌクレオチドIII２は、第１オリゴヌクレオチドI２のフラップ配列ｆ２に相補的な配列と、蛍光エネルギー受容体とを有し、アレル２の識別のための、固体支持体上のＰ１とは異なる位置Ｐ２に固定化される。第３オリゴヌクレオチドIII１とIII２との蛍光エネルギー受容体は、互いに同じであっても良いし、互いに異なっていても良い。
【００８８】
なお、この例に限らず第３オリゴヌクレオチドが固体支持体上に固定化される場合は、Ｐ１とＰ２との距離としては、例えばＰ１においてｆ１配列を有するフラップ断片と第３オリゴヌクレオチドIII１とがハイブリダイズしたときに、ｆ１配列を有するフラップ断片の蛍光エネルギー供与体と第３オリゴヌクレオチドIII２の蛍光エネルギー受容体との間で蛍光共鳴エネルギー移動が起こらない程度の距離を確保できるような距離を、第３オリゴヌクレオチドの長さなどを考慮して、当業者が適宜決定することができる。
【００８９】
このような第１オリゴヌクレオチド及び第３オリゴヌクレオチドを、あるＳＮＰ部位がＴ（アレル１）又はＣ（アレル２）を取りうる場合に用いた例が図８に示される。この例では第１オリゴヌクレオチドI１とI２との蛍光エネルギー供与体が互いに同じものとした（図８（ａ））。仮に鋳型核酸が有するＳＮＰがＴであった場合、第１オリゴヌクレオチドI１がハイブリダイズした鋳型核酸において、フラップエンドヌクレアーゼが認識可能な３本鎖構造体が形成され（図８（ｂ））、フラップ断片が遊離する。固体支持体上のＰ１の位置で、フラップ断片が第３オリゴヌクレオチドと２本鎖構造体を形成し、ＦＲＥＴによりａが発光する（図８（ｃ））。固体支持体上のＰ１の位置における、ａの蛍光強度の増強、又はｄの蛍光強度の減衰に基づいて、ＳＮＰとしてＴを検出することができる。
【００９０】
次に、第１オリゴヌクレオチドが蛍光エネルギー受容体を有する場合、一例としては、フラップ配列がアレルごとに異なるようにすると良い（より具体的な例を図９に挙げる）。具体的には、第１オリゴヌクレオチドI１は、アレル１に応じた相補配列と、アレル１の識別のためのフラップ配列ｆ１とを有する。第１オリゴヌクレオチドI２は、アレル２に応じた相補配列と、アレル２の識別のためのフラップ配列ｆ２とを有する。第１オリゴヌクレオチドI１とI２との蛍光エネルギー受容体は、それぞれ、第３オリゴヌクレオチドIII１とIII２との蛍光エネルギー受容体に対応していれば良く、互いに同じであっても良いし、互いに異なっていても良い。
【００９１】
そして、第３オリゴヌクレオチドIII１は、第１オリゴヌクレオチドI１のフラップ配列ｆ１に相補的な配列と、蛍光エネルギー供与体とを有し、アレル１の識別のための固体支持体上の特定の位置Ｐ１に固定化される。第３オリゴヌクレオチドIII２は、アレル２の識別のための、第１オリゴヌクレオチドI２のフラップ配列ｆ２に相補的な配列と、蛍光エネルギー供与体とを有し、固体支持体上のＰ１とは異なる位置Ｐ２に固定化される。第３オリゴヌクレオチドIII１とIII２との蛍光エネルギー供与体は、互いに同じであっても良いし、互いに異なっていても良い。
【００９２】
このような第１オリゴヌクレオチド及び第３オリゴヌクレオチドを、あるＳＮＰ部位がＴ（アレル１）又はＣ（アレル２）を取りうる場合に用いた例が図９に示される。この例では、第１オリゴヌクレオチドI１及びI２は、図９（ａ）のように模式的に表される。第３オリゴヌクレオチドの蛍光供与体は同じものとした。仮に鋳型核酸が有するＳＮＰがＴであった場合、第１オリゴヌクレオチドI１がハイブリダイズした鋳型核酸において、フラップエンドヌクレアーゼが認識可能な３本鎖構造体が形成され（図９（ｂ））、フラップ断片が遊離する。固体支持体上のＰ１の位置で、フラップ断片が第３オリゴヌクレオチドと２本鎖構造体を形成し、ＦＲＥＴによりａが発光する（図９（ｃ））。固体支持体上のＰ１の位置における、ａの蛍光強度の増強、又はｄの蛍光強度の減衰に基づいて、ＳＮＰとしてＴを検出することができる。
【００９３】
いずれの例においても、蛍光強度の変化があった場所によってＳＮＰ検出やタイピングを行うことができる。例えば、Ｐ１の位置のみで増強された蛍光が検出され、Ｐ２の位置で増強された蛍光が検出されなければ、ＳＮＰがＴ/Ｔのホモ接合体であるとのタイピングを行うことができる。また例えば、Ｐ１とＰ２との両方の位置で増強された蛍光が検出されれば、ＳＮＰがＴ/Ｃのヘテロ接合体であるとのタイピングを行うことができる。さらに例えば、Ｐ２の位置のみで増強された蛍光が検出され、Ｐ１の位置で増強された蛍光が検出されなければ、ＳＮＰがＣ/Ｃのホモ接合体であるとのタイピングを行うことができる。アレルごとに蛍光エネルギー供与体が異なる場合、或いはアレルごとに蛍光エネルギー受容体が異なる場合は、固体支持体上の位置の違いだけでなく蛍光の違いによって、確実かつ容易にＳＮＰ検出やタイピングを行うことができる点で好ましい。
【００９４】
また、いずれの例においても、第３オリゴヌクレオチドを固定化する固体支持体の種類及び形状、固体支持体への第３オリゴヌクレオチドの固定化方法及び条件、及び、固体支持体上の第３オリゴヌクレオチドへのアニーリング法及び条件などについては、当業者が適宜決定することができる。例えば、特開２００２−１７１９９２号公報に記載の方法に準じることができる。
【００９５】
遺伝子多型検出法においては、試料中の複数の多型部位を検出ターゲットにする場合が多い。この場合、第１オリゴヌクレオチドは、検出すべき複数の多型部位の箇所それぞれに応じて設計されている。例えば、第１オリゴヌクレオチドとしては、アレル特異的な２種の第１オリゴヌクレオチドのセットを、多型部位の種類の数だけ用いることができる。この場合、第３オリゴヌクレオチドとしては、第１オリゴヌクレオチドのそれぞれに対応するように設計されたオリゴヌクレオチドを用いる。そして、これら多型部位に応じて設計された第１オリゴヌクレオチドから生じるフラップ断片のそれぞれが、蛍光発色後に識別可能となるように、第１オリゴヌクレオチド及び対応する第３オリゴヌクレオチドを設定することができる。蛍光発色後のフラップ断片から多型部位の識別を可能にする具体的な方法としては、多型部位ごとに異なる蛍光が発光するようにする方法と、固体支持体上において多型部位ごとに異なる位置で蛍光が発光するようにする方法とが挙げられる。第１オリゴヌクレオチドの設計の仕方によっては、多型部位ごとに、蛍光及び固体支持体上における位置の両方が異なるようにすることも可能である。これらの具体的な方法については、上述の、蛍光からアレルの識別を可能にする具体的な方法において、アレルごとに異なるように設計されたオリゴヌクレオチド（具体的には、アレル１に特異的なオリゴヌクレオチドI１及びアレル２に特異的なオリゴヌクレオチドI２）を、多型部位ごとに異なるように設計されたオリゴヌクレオチド（具体的には、部位１に特異的なオリゴヌクレオチドI１及び部位２に特異的なオリゴヌクレオチドI２）として読み代えることで、上述の方法と同様に説明することができる。
【００９６】
本発明を実施するためには、以下の操作手順を行うことができる。例えば、検出したい多型を有する鋳型核酸を含む試料を、適当な希釈液と混合し、第１オリゴヌクレオチド、第２オリゴヌクレオチド、及びフラップエンドヌクレアーゼを含む反応液と混合し、すでに述べた条件下で反応を行う。第３オリゴヌクレオチドは、前記反応前の試料と混在させても良いし、前記反応液と混在させても良いし、前記反応終了後の反応液と混在させても良い。第３オリゴヌクレオチドを支持体に固定しない場合は、例えばウェルなどの容器を用い、検出対象となる多型のアレル及び/又は多型部位に応じて反応液を配置し、配置された反応液に対して試料を分注しても良いし、試料を検出対象となる多型のアレル及び/又は多型部位の数に基づいて配置し、配置された試料に対して前記アレル及び/又は多型部位に応じた反応液を分注しても良い。また、支持体に固定された第３オリゴヌクレオチドを用いる場合は、検出対象となる多型のアレル及び/又は多型部位に応じて定められた位置に第３オリゴヌクレオチドが固定された支持体を用い、各位置に対して反応液や試料を分注することができる。
【００９７】
蛍光検出の際は、すでに述べたように、特別に励起光と蛍光とのスペクトルを変えなくても、蛍光エネルギー供与体側の蛍光にあわせた測定を行えば検出ができる。従って、検出機器としては特に限定することなく、さまざまな機種を用いることができる。
さらに、本発明の方法では、従来のインベーダー法のように蛍光物質が遊離することがないため、第３オリゴヌクレオチドを固体支持体上に固定し、予め決められた場所で蛍光を検出することができる。このため、従来のインベーダー法と異なり、開放系での検出が可能になる。したがって、マイクロアレイのイメージャーやその他の蛍光イメージャーを利用することができる。
【００９８】
本発明においては、ゲノムから直接３本鎖構造体形成及びフラップエンドヌクレアーゼによる切断反応を行ってもよいし、検出すべき多型を含む特定の配列を含む領域を予め増幅させておいても良い。特定の配列を含む領域を増幅させるための方法としては特に限定されないが、例えばＰＣＲを行うことができる。試料中の複数の多型を検出する場合は、相当する複数の特定の配列に対し、マルチプレックスＰＣＲを行うことができる。
【００９９】
核酸増幅においては、ホットスタート法を用いることが好ましい。ホットスタート法を用いることによって、プライマーのミスアニーリングやオリゴマー化を防止することができ、望ましくない核酸増幅を防止することができる。また、ホットスタート法を用いると、多くの領域を同時に増幅することができるため、効率よく多型検出を行うことを可能にする。
【０１００】
ゲノムの増幅において、１つの多型部位を増幅するためにはその多型部位をはさんで結合する１対のプライマーを用いる。対象となる試料中の検出すべき多型が複数である場合、検出すべき多型部位が互いに離れた位置に存在する場合には、多型部位の種類の数の２倍のプライマーを用いる。しかし、例えば複数の多型、たとえば２つの多型が接近している場合には、２つの多型部位それぞれを挟んでプライマーを結合させて増幅を行っても良い、２つの多型部位の間にプライマーを結合させず、２つの多型部位の両端に１対のプライマーを結合させて増幅を行っても良い。
【０１０１】
ＰＣＲ反応液は、ｐＨ緩衝液、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌなどの塩類、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類、及び熱安定性合成酵素を含む。その他に、界面活性剤やタンパク質などの物質を必要に応じて添加することができる。
【０１０２】
ｐＨ緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと、塩酸、硝酸、硫酸などの鉱酸とを組み合わせたもの、及び、その他種々のｐＨ緩衝液を用いることができる。ｐＨ調製された緩衝液は、ＰＣＲ反応液の中で１０ｍＭから１００ｍＭの間の濃度で使用することが好ましい。
【０１０３】
プライマーはＰＣＲ反応による核酸合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは合成したものであっても良く、生物界から単離したものであっても良い。
熱安定性合成酵素はプライマー付加による核酸合成のための酵素であり、化学合成系も含む。適切な合成酵素としては、E.coliのＤＮＡポリメラーゼ、E.coliのＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメント、T4ＤＮＡポリメラーゼ、TaqＤＮＡポリメラーゼ、T.litoralisＤＮＡポリメラーゼ、TthＤＮＡポリメラーゼ、PfuＤＮＡポリメラーゼ、Hot Start Taqポリメラーゼ、KODＤＮＡポリメラーゼ、EX TaqＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などがあるが、これらに限定されるものではない。なお、熱安定性とは、高温下、好ましくは６５〜９５℃でもその活性を保持する化合物の性質を意味する。
【０１０４】
増幅反応におけるその他の条件としては特に限定されず、公知の方法における条件に基づいて反応を行うことができる。試料に生体試料や生体由来試料を用いる場合は、増幅反応を、２５℃におけるｐＨが８．５〜９．５となる反応液中で行うことが好ましい。そうすることにより、生体試料又は生体由来試料に、直接核酸増幅反応液を作用させ、反応を行うことも可能である。
【０１０５】
本発明はまた、遺伝子多型検出キットを提供する。本発明の遺伝子多型検出キットは、上記の遺伝子多型検出方法に好適に用いることができるものである。本発明の遺伝子多型検出キットは、フラップ配列を有する第１オリゴヌクレオチドと、第２オリゴヌクレオチド（第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドは、検出すべき多型を有する特定の核酸にハイブリダイズして、ダブルフラップ構造とよばれる３本鎖構造体を形成することができるもの）と、フラップ配列にハイブリダイズすることができる第３オリゴヌクレオチドと、フラップエンドヌクレアーゼとを含む。核酸断片と第３オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズの際に双方間で蛍光共鳴エネルギー移動が可能となるように、第１オリゴヌクレオチド及び第３オリゴヌクレオチドには、蛍光エネルギー供与体や蛍光エネルギー受容体が設けられている。各々のオリゴヌクレオチド及びフラップエンドヌクレアーゼの詳細については、上記遺伝子多型検出方法において説明したとおりである。
【０１０６】
特に、第３オリゴヌクレオチドは、上記方法で述べたとおり、固体支持体に固定化されていても良い。したがって、第３オリゴヌクレオチドは、固体支持体に整然と固定化されたチップとして含まれていても良い。この場合、第３オリゴヌクレオチドは、多型の各アレル及び/又は多型の各部位に応じて設計されたものが、それぞれ決められた位置に並んでおり、蛍光が発せされた位置から多型検出やタイピングを行うことができる。
【実施例】
【０１０７】
＜実験例１：反応系の確認＞
以下に、本実験例で用いたオリゴヌクレオチドの配列を挙げる。右肩に＊印を付している塩基は、多型部位として想定した塩基、又はその塩基に対応する相補塩基又は非相補塩基である。
Inv_A1：AGTCTGTACTAATTGCACATC*TATTGTTGGGGATTTTCCAT（配列番号1）
Inv_FCwC：CGCGCCGAGGG*ATGTGCAATTAGTACAGACT（配列番号2）
Inv_B1：ATGGAAAATCCCCAACAATAT*（配列番号3）
InvFR_w：TCTCGTCTCGGTTTTCCGAGACCTCGGCGCG（配列番号4）
【０１０８】
１．ダブルフラップ構造を構成するオリゴヌクレオチドの合成
鋳型核酸として、配列番号1に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドInv_A1と、第１オリゴヌクレオチドとして、配列番号2に示される塩基配列を有し且つ5’ 末端がCy5で標識されたオリゴヌクレオチドInv_FCwCと、第２オリゴヌクレオチドとして、配列番号3の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドInv_B1と、第３オリゴヌクレオチドとして、配列番号4に示される塩基配列を有し且つ3’ 末端をフルオレセインで標識されたオリゴヌクレオチドInvFR_wとについて、プロリゴ・ジャパン株式会社に合成を委託し、合成されたそれぞれのオリゴヌクレオチドを、ＤＷ（蒸留水）で100pmol/mlになるように調製した。
【０１０９】
ここで、鋳型核酸Inv_A1の21番目の塩基をＳＮＰとして想定する。第１オリゴヌクレオチドInv_FCwCが有する塩基配列（配列番号2）は、11〜31番目の塩基配列として、鋳型核酸が有する塩基配列（配列番号1）の1〜21番目の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、1〜10番目の塩基配列としてフラップ配列を有する。第２オリゴヌクレオチドInv_B1の塩基配列（配列番号3）は、鋳型核酸が有する塩基配列（配列番号1）の22番目以降の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、鋳型核酸と無関係な塩基を有する。第３オリゴヌクレオチドInvFR_wの塩基配列（配列番号4）は、22〜31番目の塩基配列として、第１オリゴヌクレオチドにおける1〜10番目のフラップ配列と相補的な塩基配列を有する。
【０１１０】
２．FRET（蛍光共鳴エネルギー移動）による蛍光シグナルの確認
Cy5で標識されたInv_FCwCと、フルオレセインで標識されたInvFR_wとを等量混合した混合試料をポジティブコントロール、フルオレセインで標識されたInvFR_wの単独試料をネガティブコントロールとし、それぞれについて、分光蛍光光度計(RF-5300PC:島津製作所製)を用いた測定を行った。励起波長486nmとし、蛍光強度をスキャンニングしたものを図１０に示した。図１０において、横軸は蛍光波長（nm）、縦軸は蛍光強度を示す。図１０が示すように、ネガティブコントロール（Negative）では、490nm付近で蛍光スペクトルのピークがあるのに対し、ポジティブコントロール（Positive）では、490nm付近の蛍光スペクトルのピークが消失し、630nm付近に蛍光スペクトルのピークが出現している。
【０１１１】
３．ダブルフラップ構造の形成、フラップの切断、及びシグナル検出
以下の成分をＤＷ中に含む反応溶液3μlを調製した。
Inv_A1（鋳型核酸）                        20pM
Inv_FCwC（第１オリゴヌクレオチド）        20nM
Inv_B1（第２オリゴヌクレオチド）          20pM
InvFR_w（第３オリゴヌクレオチド）        20nM
Enzyme Mix（フラップエンドヌクレアーゼ）  0.15μl
Buffer（0.04mg/ml PEG6000, 0.2mmol/ml MOPS, 10mM MgCl2）0.15μl  
なお、Enzyme Mixは、Invader DNA Assay (THIRD WAVE TECHNOLOGIES)のKitに含まれているものを使用した。
【０１１２】
反応溶液3μlを、0.5mlマイクロチューブに入れ、さらに、蒸発を防ぐため、ミネラルオイルを反応溶液に重層した。リアルタイムPCR装置MX-3000p(Stratagene社製)にマイクロチューブをセットし、95℃3分の処理後、60℃で反応を行った。10秒毎に一回の測定を行った。
【０１１３】
４．特異性の確認
上記３．の反応溶液から酵素及び/又は鋳型を除いた反応溶液を、比較用に調製した。すなわち、反応系Ａ用に、Inv_A1とEnzyme Mixとを除いた以外は上記３．と同様の反応溶液3μlを、反応系Ｂ用に、Enzyme Mixを除いた以外は上記３．と同様の反応溶液3μlを、及び、反応系Ｃ用に、Inv_A1を除いた以外は上記３．と同様の反応溶液3μlを調製した。それぞれ、0.5mlマイクロチューブに加え、さらに、蒸発を防ぐため、ミネラルオイルを反応溶液に重層した。リアルタイムPCR装置MX-3000p(Stratagene社製)にマイクロチューブをセットし、95℃3分の処理後、60℃で反応を行った。励起波長495nm /蛍光波長520nmで、10秒毎に一回の測定を行った。
【０１１４】
上記３．を反応系Ｄ（すなわち本発明の反応系）とし、反応系Ｄと、上記４．の比較用の反応系Ａ、Ｂ及びＣとについて、MX-3000pによる測定で得られたシグナルをプロットした結果を、図１１及び１２に示す。図１１及び図１２において、横軸は時間（サイクル(cycle)として表示）、縦軸は蛍光強度を示す。図１１は、反応系Ｃ及びＤについて、ＦＩＴＣの蛍光強度の経時変化を示しており、測定条件は、励起波長492nm/蛍光波長520nm：ＦＩＴＣである。図１２は、反応系Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤについて、ＦＩＴＣの蛍光強度の経時変化を示しており、測定条件は、励起波長492nm/蛍光波長520nm：ＦＩＴＣである。
【０１１５】
図１１では、反応系ＣのシグナルとＤのシグナルとの間で少しの差が見られる程度であるが、特に図１２において、経時変化に伴い若干の蛍光強度の下降を示した反応系Ｄのシグナルは、経時変化に伴い若干の蛍光強度の上昇を示した他の反応系のシグナルと比較して、明らかに異なる挙動を示していることから、本発明の反応系の特異性が確認できた。
【０１１６】
＜実験例２：ＳＮＰ部位認識の特異性確認＞
以下に、本実験例で用いたオリゴヌクレオチドの配列を挙げる。右肩に＊印を付している塩基は、多型部位として想定した塩基、又はその塩基に対応する相補塩基又は非相補塩基である。
Inv_A1：AGTCTGTACTAATTGCACATC*TATTGTTGGGGATTTTCCAT（配列番号1）
Inv_A40merA：AGTCTGTACTAATTGCACATT*TATTGTTGGGGATTTTCCAT（配列番号5）
Inv_A50mer：AAAAGTTTACAGTCTGTACTAATTGCACATG*TATTGTTGGGGATTTTCCATGTTTTCTAAA（配列番号6）
Inv_FCwC：CGCGCCGAGGG*ATGTGCAATTAGTACAGACT（配列番号2）
Inv_B1：ATGGAAAATCCCCAACAATAT*（配列番号3）
InvFR_w：TCTCGTCTCGGTTTTCCGAGACCTCGGCGCG（配列番号4）
【０１１７】
１．特異性確認のためのオリゴヌクレオチドの合成
鋳型核酸として、配列番号1に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドInv_A1、配列番号5に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドInv_A40merA、及び配列番号6に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドInv_A50merと、第１オリゴヌクレオチドとして、配列番号2に示される塩基配列を有し且つ5’ 末端がCy5で標識されたオリゴヌクレオチドInv_FCwCと、第２オリゴヌクレオチドとして、配列番号3の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドInv_B1と、第３オリゴヌクレオチドとして、配列番号4に示される塩基配列を有し且つ3’ 末端をフルオレセインで標識されたオリゴヌクレオチドInvFR_wとについて、プロリゴ・ジャパン株式会社に合成を委託し、合成されたそれぞれのオリゴヌクレオチドを、ＤＷ（蒸留水）で100pmol/mlになるように調製した。
【０１１８】
ここで、鋳型核酸Inv_A1の21番目の塩基ＣをＳＮＰとして想定する。鋳型核酸Inv_A40merAは、21番目の塩基を鋳型核酸Inv_A1のＳＮＰ（Ｃ）と異なるＳＮＰ（Ｔ）として想定する。鋳型核酸Inv_A50merは、31番目の塩基を、鋳型核酸Inv_A1のＳＮＰ（Ｃ）及び鋳型核酸Inv_A40merAのＳＮＰ（Ｔ）のいずれとも異なるＳＮＰ（Ｇ）として想定するとともに、1〜10番目の塩基配列及び52〜61番目の塩基配列がさらに加わった配列としている。
【０１１９】
２．ダブルフラップ構造の切断とシグナル検出  
以下の成分をＤＷ中に含む反応溶液3μlを、反応系Ｆ、Ｇ及びＨ構築用にそれぞれ調製した。
（鋳型核酸）                              20pM
Inv_FCwC（第１オリゴヌクレオチド）        20nM
Inv_B1（第２オリゴヌクレオチド）          20pM
InvFR_w（第３オリゴヌクレオチド）        20nM
Enzyme Mix（フラップエンドヌクレアーゼ）  0.15μl
Buffer（0.04mg/ml PEG6000, 0.2mmol/ml MOPS, 10mM MgCl2）0.15μl  
なお、Enzyme Mixは、Invader DNA Assay (THIRD WAVE TECHNOLOGIES)のKitに含まれているものを使用した。
具体的には、反応系Ｆ（すなわち本発明の反応系）構築用反応溶液には、鋳型核酸として、Inv_A1とInv_A40merAとの等量混合物を用い、反応系Ｇ（すなわち本発明の反応系）構築用反応溶液には、鋳型核酸として、Inv_A1とInv_A50merとの等量混合物を用い、反応系Ｈ（比較用）構築用反応溶液には、鋳型核酸として、Inv_A40merAとInv_A50merとの等量混合物を用いた。
さらに別途、反応系Ｅ（比較用）構築用に、鋳型核酸を加えない以外は上記と同じ組成の反応溶液を調製した。
【０１２０】
反応溶液3μlを、0.5mlマイクロチューブに入れ、さらに、蒸発を防ぐため、ミネラルオイルを反応溶液に重層した。リアルタイムPCR装置MX-3000p(Stratagene社製)にマイクロチューブをセットし、95℃3分の処理後、60℃で反応を行った。上記実験例１の４．で、本発明の反応系と比較用の反応系との差が明らかであった、励起波長492nm/蛍光波長520nm：ＦＩＴＣの条件で、10秒毎に一回の測定を行った。
【０１２１】
反応系Ｅ（比較用）、Ｆ（本発明の反応系）、Ｇ（本発明の反応系）及びＨ（比較用）について、MX-3000pによる測定で得られたシグナルをプロットした結果を、図１３に示す。図１３において、横軸は時間（サイクル(cycle)として表示）、縦軸は蛍光強度を示す。
【０１２２】
３．特異性の確認
ＳＮＰ部位においてInvF_CwCに相補的な塩基を持つInv_A1を鋳型とした反応系Ｆ及びＧにおいては、２サイクル目まで蛍光強度の上昇がみられるものの、３サイクル以降、明らかなシグナルの減少が確認できた。それに対し、Inv_A1を鋳型として含まない反応系、すなわちＳＮＰ部位においてInvF_CwCに非相補的な塩基を持つInv_A40merA及びInv_A50merを鋳型とした反応系Ｈや、鋳型を含まない反応系Ｅにおいては、反応系Ｆ及びＧで見られたような蛍光強度の下降が見られなかった。このことから、本実験例において、一塩基の違いを認識することができたと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】本発明の鋳型核酸、第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドが３本鎖構造体を形成したときの一例を示した模式図である。
【図２】第１オリゴヌクレオチドとして設計したオリゴヌクレオチドが多型部位において鋳型核酸とマッチすることにより形成した本発明の３本鎖構造体の模式図（ａ）、３本鎖構造体がフラップエンドヌクレアーゼによって切断反応を受け、フラップ断片が遊離した様子を示す模式図（ｂ）、及び遊離したフラップ断片が蛍光を発した様子を示す模式図（ｃ）である。
【図３】第１オリゴヌクレオチドとして設計したオリゴヌクレオチドが多型部位において鋳型核酸とマッチしない場合を表した模式図である。
【図４】蛍光エネルギー供与体の蛍光強度の減衰に基づいて多型検出を行う本発明の形態における、蛍光エネルギー供与体を有する第１オリゴヌクレオチド（ａ）、各第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドの鋳型核酸へのハイブリダイズ（ｂ）、及びフラップ断片と第３オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズによる蛍光発光（ｃ）を表した模式図である。
【図５】蛍光エネルギー受容体の蛍光強度の増強に基づいて多型検出を行う本発明の形態における、蛍光エネルギー供与体を有する第１オリゴヌクレオチド（ａ）、各第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドの鋳型核酸へのハイブリダイズ（ｂ）、及びフラップ断片と第３オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズによる蛍光発光（ｃ）を表した模式図である。
【図６】蛍光エネルギー供与体の蛍光強度の減衰に基づいて多型検出を行う本発明の形態における、蛍光エネルギー受容体を有する第１オリゴヌクレオチド（ａ）、各第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドの鋳型核酸へのハイブリダイズ（ｂ）、及びフラップ断片と第３オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズによる蛍光発光（ｃ）を表した模式図である。
【図７】蛍光エネルギー受容体の蛍光強度の増強に基づいて多型検出を行う本発明の形態における、蛍光エネルギー受容体を有する第１オリゴヌクレオチド（ａ）、各第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドの鋳型核酸へのハイブリダイズ（ｂ）、及びフラップ断片と第３オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズによる蛍光発光（ｃ）を表した模式図である。
【図８】固体支持体上の位置に基づいて多型検出を行う本発明の形態における、蛍光エネルギー供与体を有する第１オリゴヌクレオチド（ａ）、各第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドの鋳型核酸へのハイブリダイズ（ｂ）、及びフラップ断片と第３オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズによる蛍光発光（ｃ）を表した模式図である。
【図９】固体支持体上の位置に基づいて多型検出を行う本発明の形態における、蛍光エネルギー受容体を有する第１オリゴヌクレオチド（ａ）、各第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドの鋳型核酸へのハイブリダイズ（ｂ）、及びフラップ断片と第３オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズによる蛍光発光（ｃ）を表した模式図である。
【図１０】実験例１で得られた、ＦＩＴＣを有するオリゴヌクレオチド及びＣｙ５を有するオリゴヌクレオチドの混合試料（Positive）と、ＦＩＴＣを有するオリゴヌクレオチドの単独試料（Negative）との蛍光スペクトルである。
【図１１】実験例１で得られた、比較用の反応系Ｃと、本発明の反応系Ｄとについて、ＦＩＴＣの蛍光強度の経時変化を示すグラフである。
【図１２】実験例１で得られた、比較用の反応系Ａ、Ｂ及びＣと、本発明の反応系Ｄとについて、ＦＩＴＣの蛍光強度の経時変化を示すグラフである。
【図１３】実験例２で得られた、比較用の反応系Ｅ及びＨと、本発明の反応系Ｆ及びＧとについて、ＦＩＴＣの蛍光強度の経時変化を示すグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【０１２４】
配列番号１は、合成オリゴヌクレオチドである。
配列番号２は、合成オリゴヌクレオチドである。
配列番号３は、合成オリゴヌクレオチドである。
配列番号４は、合成オリゴヌクレオチドである。
配列番号５は、合成オリゴヌクレオチドである。
配列番号６は、合成オリゴヌクレオチドである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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