(57)【要約】【目的】  蛍光法による核酸の検出法において、より高感度に、目的の核酸を検出できる方法およびそれに用いる試薬を提供することである。【解決手段】  以下のオリゴヌクレオチドとそれを用いて生体試料中の標的核酸を検出する方法並びに試薬キット。  標的核酸配列と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドで、その５’側（または３’側）に相補的でない塩基が付加されており、かつ５’末端（または３’末端）の塩基がＡ（アデニン）またはＴ（チミン）であって、該５’末端の塩基に蛍光剤が標識されていることを特徴とするオリゴヌクレオチド。 【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中の１種類以上の標的核酸またはその断片を検出するために使用する、以下の（ａ）および／または（ｂ）のオリゴヌクレオチド。
（ａ）標的核酸配列と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドの５’側に相補的でない塩基が付加されており、かつ５’末端の塩基がＡ（アデニン）またはＴ（チミン）であって、さらに該５’末端に蛍光剤が標識されていることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
（ｂ）標的核酸配列と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドの３’側に相補的でない塩基が付加されており、かつ３’末端の塩基がＡ（アデニン）またはＴ（チミン）であって、さらに該３’末端に蛍光剤が標識されていることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
相補的でない塩基の数が、１〜５塩基好ましくは１〜３塩基である請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
相補的でない塩基が、Ａ（アデニン）またはＴ（チミン）であることを特徴とする請求項１または２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
蛍光剤が、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ５３２、Ｃｙ３、ＨＥＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、ＴＡＭＲＡまたはＹａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗなる群より選ばれる請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
生体試料中の１種類以上の標的核酸またはその断片を検出する方法であって、以下の（ａ）および／または（ｂ）のオリゴヌクレオチドと、前記標的核酸またはその断片を反応させ、反応後の蛍光強度の増加を測定することを特徴とする核酸の検出法。
（ａ）標的核酸配列と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドの５’側に相補的でない塩基が付加されており、かつ５’末端の塩基がＡ（アデニン）またはＴ（チミン）であって、さらに該５’末端に蛍光剤が標識されていることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
（ｂ）標的核酸配列と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドの３’側に相補的でない塩基が付加されており、かつ３’末端の塩基がＡ（アデニン）またはＴ（チミン）であって、さらに該３’末端に蛍光剤が標識されていることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
相補的でない塩基の数が、１〜５塩基好ましくは１〜３塩基である請求項５記載の検出法。
【請求項７】
相補的でない塩基が、Ａ（アデニン）またはＴ（チミン）であることを特徴とする請求項５または６記載の検出法。
【請求項８】
蛍光剤が、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ５３２、Ｃｙ３、ＨＥＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、ＴＡＭＲＡまたはＹａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗなる群より選ばれる請求項５記載の検出法。
【請求項９】
請求項１〜４記載のオリゴヌクレオチドを用いた核酸の検出法であって、生体試料中の１種類以上の標的核酸またはその断片の増幅工程における蛍光強度の変化を、リアルタイムで測定することを特徴とする検出法。
【請求項１０】
請求項１〜４記載のオリゴヌクレオチドを用いた核酸の検出法であって、生体試料中の１種類以上の標的核酸またはその断片の増幅工程後の増幅産物の有無を、蛍光で測定することを特徴とする検出法。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドが、プライマーであることを特徴とする請求項５〜１０記載の検出法。
【請求項１２】
標的核酸またはその断片を増幅する方法が、ＬＡＭＰ法である請求項９または１０記載の検出法。
【請求項１３】
プライマーが、ＬＡＭＰ法で用いられるプライマーである請求項１１記載の検出法。
【請求項１４】
Ｑプローブと組み合わせる、請求項５〜１３記載の検出法。
【請求項１５】
生体試料中に１種類以上含む標的核酸またはその断片を検出するための試薬キットであって、以下の（ａ）および／または（ｂ）のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする核酸検出用試薬キット。
（ａ）標的核酸配列と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドの５’側に相補的でない塩基が付加されており、かつ５’末端の塩基がＡ（アデニン）またはＴ（チミン）であって、さらに該５’末端に蛍光剤が標識されていることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
（ｂ）標的核酸配列と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドの３’側に相補的でない塩基が付加されており、かつ３’末端の塩基がＡ（アデニン）またはＴ（チミン）であって、さらに該３’末端に蛍光剤が標識されていることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
相補的でない塩基の数が、１〜５塩基好ましくは１〜３塩基である請求項１５記載の試薬キット。
【請求項１７】
相補的でない塩基が、Ａ（アデニン）またはＴ（チミン）である請求項１５または１６記載の試薬キット。
【請求項１８】
蛍光剤が、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ５３２、Ｃｙ３、ＨＥＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、ＴＡＭＲＡまたはＹａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗなる群より選ばれる請求項１５記載の試薬キット。
【請求項１９】
少なくとも、さらに核酸合成酵素、基質および反応緩衝剤を含むことを特徴とする請求項１５記載の試薬キット。
【請求項２０】
Ｑプローブと組み合わせる、請求項１５または１９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料中の核酸の有無を検出する方法で、特に単一蛍光標識プライマーを用いた核酸の検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸塩基配列の相補性に基づく分析方法によって、その遺伝的な特徴を直接的に分析することが可能である。そのため、当該分析方法は遺伝的疾患、癌化、微生物の識別等には非常に有力な手段となっている。また、遺伝子そのものを検出対象とするために、例えば培養のような時間と手間のかかる操作を省略できる場合もある。しかしながら、試料中に存在する目的の核酸量が少ない場合の検出は一般に容易ではなく、標的核酸そのものを、あるいは検出シグナル等を増幅することが必要となる。
【０００３】
ここで、標的核酸の検出法としては、検出感度が高い蛍光法による検出法がよく利用されている。その中で、古くから知られている方法は、標的核酸を増幅させ、増幅反応後の溶液をアガロースゲル電気泳動にアプライし、エチジウムブロマイド等の蛍光インターカレーターを結合させて特異的な蛍光を観察するというものである。しかし、電気泳動を利用した方法は、煩雑で、コンタミネーションの問題がある。ここで、他のＤＮＡが混在するおそれがなく、増幅産物の有無のみを知りたい場合には、電気泳動を省略して増幅反応後の溶液に蛍光インターカレーターを加えて蛍光を観察する技術が開示されている（特許文献１参照）。
【０００４】
その他蛍光法を利用した検出法として、各種蛍光剤で標識したオリゴヌクレオチドプライマー（以下「プライマー」）を用いて増幅反応を行い、二本鎖増幅産物に取り込まれた蛍光剤を蛍光偏光法によって測定する方法が開示されている(特許文献２参照）。また、両端に蛍光剤と消光剤が標識されている線形プローブを標的核酸にハイブリダイズさせた後、別に用意したプライマーで標的核酸の増幅反応を行い、増幅に伴って起きる蛍光剤の遊離（ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によるプローブの分解）によって蛍光を起こさせるＴａｑｍａｎ法、さらにヘアピンループ構造を有する一本鎖オリゴヌクレオチドの両末端の一方に蛍光剤、他方には消光剤を標識し、標的核酸にハイブリダイズするとヘアピンループ構造が壊れ、それに伴って蛍光剤と消光剤の距離が大きくなるために蛍光が起こるようになるという分子ビーコン法が知られている。しかし、後の２つの方法は、いずれも蛍光剤と消光剤という２種類の色素を使用するため、コストが高くなるという問題は否めない。
【０００５】
ここで、近年開発された蛍光プローブによる核酸の検出法の代表的なものを列挙する。標的配列に相補的な核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドをプローブとして用い、このプローブの５’末端にインターカレーター性蛍光剤を標識したものをＰＣＲ核酸増幅用プライマーとして機能させ、増幅前後の蛍光変化を測定する方法が開示されている。この方法は、インターカレーター性蛍光剤を増幅反応後に単独で加える系と比較し、プライマーダイマーへの非特異的インターカレーションの影響がない、増幅から検出まで一段階で実施することが可能となる等のメリットがある（特許文献３参照）。
【０００６】
また、蛍光剤が標識された核酸プローブを標的配列にハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション前後の蛍光強度の減少量を測定する方法が開示されている。いわゆるＱプローブと称されるプローブを使用するものであるが、この方法は、標識末端近傍のＧ（グアニン）が標的配列中のＣ（シトシン）と塩基対を形成することによって蛍光強度が減少する、すなわち消光現象を利用した方法である（特許文献４参照）。本技術は、特に一塩基の変異または置換等の遺伝子多型の解析に有用であり、標的配列に核酸プローブがハイブリダイズした後の蛍光強度の減少変化の確認によって目的の塩基が検出されるように、核酸プローブが設計される。
【０００７】
さらに、蛍光剤が標識された核酸プライマーを標的配列にハイブリダイズさせた後、ＰＣＲ反応に供し、増幅前後の蛍光剤の発光の増加量によって対立遺伝子を検出したり、また、プライマーダイマーの形成を除去する目的で、プライマーとしてヘアピンプライマー（５’側の塩基と３’側の塩基が相補的でありヘアピン構造を有する）も使用する技術が開示されている（特許文献５参照）。しかし、本技術で使用されるプライマーは、蛍光剤の標識される塩基の近隣の塩基配列に関しては何ら定義されていない。
【０００８】
【特許文献１】特開平５−２３７０００号公報
【特許文献２】特開平９−１８７２７５号公報
【特許文献３】特開平８−２１１０５０号公報
【特許文献４】特開２００１−２８６３００号公報
【特許文献５】特表２００３−５１００１７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、蛍光剤で標識されたオリゴヌクレオチドを用いた核酸の検出法において、より高感度に、目的の核酸を検出できる技術およびそれに用いる試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、単一蛍光標識オリゴヌクレオチドによる核酸の検出法を見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、１種類の蛍光剤を標識したオリゴヌクレオチドを使用したホモジーニアス系の核酸の検出法において、５’末端または３’末端に標的核酸の塩基配列と相補的でない塩基を数個付加し、かつ５’末端または３’末端に蛍光剤を標識したオリゴヌクレオチドを使用して核酸増幅またはハイブリダイズを行うと、蛍光強度が増加するという効果が得られ、特に、該５’末端あるいは該３’末端がＡ（アデニン）またはＴ（チミン）であれば、該オリゴヌクレオチドが標的核酸と２本鎖核酸を形成した場合に蛍光強度が増加することを見い出した。
【００１１】
ここで、蛍光標識オリゴヌクレオチドのうち、蛍光剤がＧ（グアニン）の近傍（；３次元的に位置が近い）に存在する場合は、特許文献４に記載されているように蛍光が消光することが知られているが、オリゴヌクレオチド配列上でＧ（グアニン）塩基の近くの塩基に蛍光剤を標識した場合に限らず、配列上の遠い位置に標識した場合、または別のオリゴヌクレオチドに標識した場合でも、立体構造的に蛍光剤がＧ（グアニン）の近くに位置していれば、この消光現象が観察される。例えば、Ｃ（シトシン）の近くの塩基を単一の蛍光剤で標識したオリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドと相補的配列とがハイブリダイゼーションすると、Ｃ（シトシン）の相補的塩基であるＧ（グアニン）の近傍に蛍光剤が配置されることとなり、蛍光は消光する。このことは、単一蛍光標識オリゴヌクレオチドの蛍光強度や、該オリゴヌクレオチドが相補的配列とハイブリダイゼーションした場合の蛍光強度の変化が、オリゴヌクレオチドの一次配列に大きく依存する（；一次配列により高次構造も決定される）ことを意味している。したがって、相補的配列とハイブリダイゼーションした際に蛍光強度が変化するような単一の蛍光剤が標識されたオリゴヌクレオチドを作製する場合は、オリゴヌクレオチドの一次配列により制約を受けることとなる。
【００１２】
本発明は、このような制約をを受けることなく、蛍光剤が標識された塩基の種類や標的核酸の塩基配列に応じたオリゴヌクレオチドを自由に設計できるという特徴を有している。その結果、核酸増幅またはハイブリダイズしただけでは蛍光強度がほとんど変化しない場合でも、オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端に、標的核酸の塩基配列と相補的でない塩基を数個加えることで、蛍光強度が増大するという効果が得られるようになる。
【００１３】
ここで、本発明は以下の構成からなる。
（１）生体試料中の１種類以上の標的核酸またはその断片を検出するために使用する、以下の（ａ）および／または（ｂ）のオリゴヌクレオチド。
（ａ）標的核酸配列と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドの５’側に相補的でない塩基が付加されており、かつ５’末端の塩基がＡ（アデニン）またはＴ（チミン）であって、さらに該５’末端に蛍光剤が標識されていることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
（ｂ）標的核酸配列と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドの３’側に相補的でない塩基が付加されており、かつ３’末端の塩基がＡ（アデニン）またはＴ（チミン）であって、さらに該３’末端に蛍光剤が標識されていることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
（２）相補的でない塩基の数が、１〜５塩基好ましくは１〜３塩基である（１）記載のオリゴヌクレオチド。
（３）相補的でない塩基が、Ａ（アデニン）またはＴ（チミン）であることを特徴とする（１）または（２）記載のオリゴヌクレオチド。
（４）蛍光剤が、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ５３２、Ｃｙ３、ＨＥＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、ＴＡＭＲＡまたはＹａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗなる群より選ばれる（１）記載のオリゴヌクレオチド。
（５）生体試料中の１種類以上の標的核酸またはその断片を検出する方法であって、以下の（ａ）および／または（ｂ）のオリゴヌクレオチドと、前記標的核酸またはその断片を反応させ、反応後の蛍光強度の増加を測定することを特徴とする核酸の検出法。
（ａ）標的核酸配列と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドの５’側に相補的でない塩基が付加されており、かつ５’末端の塩基がＡ（アデニン）またはＴ（チミン）であって、さらに該５’末端に蛍光剤が標識されていることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
（ｂ）標的核酸配列と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドの３’側に相補的でない塩基が付加されており、かつ３’末端の塩基がＡ（アデニン）またはＴ（チミン）であって、さらに該３’末端に蛍光剤が標識されていることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
（６）相補的でない塩基の数が、１〜５塩基好ましくは１〜３塩基である（５）記載の検出法。
（７）相補的でない塩基が、Ａ（アデニン）またはＴ（チミン）であることを特徴とする（５）または（６）記載の検出法。
（８）蛍光剤が、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ５３２、Ｃｙ３、ＨＥＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、ＴＡＭＲＡまたはＹａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗなる群より選ばれる（５）記載の検出法。
（９）（１）〜（４）記載のオリゴヌクレオチドを用いた核酸の検出法であって、生体試料中の１種類以上の標的核酸またはその断片の増幅工程における蛍光強度の変化を、リアルタイムで測定することを特徴とする検出法。
（１０）（１）〜（４）記載のオリゴヌクレオチドを用いた核酸の検出法であって、生体試料中の１種類以上の標的核酸またはその断片の増幅工程後の増幅産物の有無を、蛍光で測定することを特徴とする検出法。
（１１）オリゴヌクレオチドが、プライマーであることを特徴とする（５）〜（１０）記載の検出法。
（１２）標的核酸またはその断片を増幅する方法が、ＬＡＭＰ法である（９）または（１０）記載の検出法。
（１３）プライマーが、ＬＡＭＰ法で用いられるプライマーである（１１）記載の検出法。
（１４）Ｑプローブと組み合わせる、（５）〜（１３）記載の検出法。
（１５）生体試料中に１種類以上含む標的核酸またはその断片を検出するための試薬キットであって、以下の（ａ）および／または（ｂ）のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする核酸検出用試薬キット。
（ａ）標的核酸配列と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドの５’側に相補的でない塩基が付加されており、かつ５’末端の塩基がＡ（アデニン）またはＴ（チミン）であって、さらに該５’末端に蛍光剤が標識されていることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
（ｂ）標的核酸配列と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドの３’側に相補的でない塩基が付加されており、かつ３’末端の塩基がＡ（アデニン）またはＴ（チミン）であって、さらに該３’末端に蛍光剤が標識されていることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
（１６）相補的でない塩基の数が、１〜５塩基好ましくは１〜３塩基である（１５）記載の試薬キット。
（１７）相補的でない塩基が、Ａ（アデニン）またはＴ（チミン）である（１５）または（１６）記載の試薬キット。
（１８）蛍光剤が、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ５３２、Ｃｙ３、ＨＥＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、ＴＡＭＲＡまたはＹａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗなる群より選ばれる（１５）記載の試薬キット。
（１９）少なくとも、さらに核酸合成酵素、基質および反応緩衝剤を含むことを特徴とする（１５）記載の試薬キット。
（２０）Ｑプローブと組み合わせる、（１５）または（１９）記載の方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、例えば、５’末端または３’末端にある特定の蛍光剤を標識したオリゴヌクレオチドを用いて核酸増幅反応を行うと、増幅に伴って蛍光強度の増加が観察される。また、５’末端に標的配列と相補的でない塩基を数個に付加させたプライマーを使用することで、付加なしでは蛍光強度が増大しない場合でも、増大させることができる。さらに、別の蛍光剤を適宜選択して標識することによって、各蛍光剤に適した波長での検出ができるため、試料中に存在する異なる標的核酸、例えばＨＢＶとＨＣＶをターゲットをした２項目同時測定が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明で使用される「核酸試料」とは、動植物例えばヒトや家畜の遺伝子等の内在性のＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸を含む生体試料や、細菌あるいはウイルスを含む微生物等の外来性の核酸を含む試料であり、血液、毛髪、細胞組織、汗、尿・糞等の排泄物、培養物等が挙げられる。また、部分的にあるいは完全に人工的の合成された核酸も本発明の核酸試料に含まれる。
【００１６】
本発明における「標的核酸」とは、増幅に供する核酸または検出を目的とする核酸のことを言うが、精製の有無にも問われず、また核酸濃度の高低も問わず、さらには増幅または検出を目的とする核酸以外の核酸が含まれていてもよい。
【００１７】
本発明の「オリゴヌクレオチド」は、プライマーまたは核酸プローブとして使用することができる。「プライマー」とは、３’末端から標的核酸に対して伸長反応が可能なオリゴヌクレオチドで、核酸増幅用プライマーや単に標的核酸とハイブリダイズする検出用プライマーいわゆる核酸プローブを含む。また、オリゴヌクレオチドの代わりにＰＮＡ（ペプチド核酸）も使用可能である。
【００１８】
前記オリゴヌクレオチドは、５’末端または３’末端に蛍光剤が標識されているものが挙げられる。５’末端に蛍光剤が標識されているオリゴヌクレオチドの場合は、標的核酸配列と相補的な塩基配列を有しており、その相補的塩基配列の５’側には、相補的でない塩基が１〜５個好ましくは１〜３個付加されており、かつ５’末端の塩基がＡ（アデニン）またはＴ（チミン）であって、該５’末端には蛍光剤が標識されている。一方、３’末端に蛍光剤が標識されているオリゴヌクレオチドの場合は、標的核酸配列と相補的な塩基配列を有しており、その相補的塩基配列の３’側には、相補的でない塩基が１〜５個好ましくは１〜３個付加されており、かつ３’末端の塩基がＡ（アデニン）またはＴ（チミン）であって、該３’末端には蛍光剤が標識されている。
【００１９】
本発明で使用される「核酸増幅法」としては、例えば、「ＬＡＭＰ（ Loop−mediated isothermal amplification ）法」が好適である。「ＬＡＭＰ法」は、納富らが開発した技術（ Nucleic Acids Research, Vol.28, No.12, 2000 e63 ）であり、鋳型となるヌクレオチドに自身の３’末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とすると共に、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法である。また、「ＬＡＭＰ法」では、プライマーの３’末端が常に試料に由来する領域に対してアニールするために、塩基配列の相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能する。その結果、特異性の高い遺伝子配列の増幅反応を可能となる。
【００２０】
ＬＡＭＰ法で使用される「プライマー」は、鋳型核酸の塩基配列上の計６領域の塩基配列を認識する少なくとも４種類のオリゴヌクレオチドからなるプライマー（「インナープライマーＦ（以下「ＩＰＦ」）」、「インナープライマーＲ（以下「ＩＰＲ」）」、「アウタープライマーＦ（以下「ＯＰＦ」）」および「アウタープライマーＲ」（以下「ＯＰＲ」）が使用されるが、増幅反応の進行に伴い、自己を鋳型としながら合成起点となる３’末端を有した、両端にそれぞれループ構造を有することを特徴とするダンベル型のヌクレオチドが形成される。そして、さらに、このダンベル構造の５’末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的な塩基配列を持つプライマー（「ループプライマーＦ（以下「ＬＰＦ」）」および／または「ループプライマーＲ（以下「ＬＰＲ」）」）を用いた場合、核酸合成の起点が増え、反応時間の短縮と検出感度の上昇を図ることができる。
【００２１】
標識する蛍光剤の種類としては、オリゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズした後や、増幅反応に伴って蛍光強度が増加するものが好適である。例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ５３２、Ｃｙ３、ＨＥＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、ＴＡＭＲＡまたはＹａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ等が挙げられるが、特に限定されるものではない。また、核酸試料中の２つ以上の標的核酸（例えばＨＣＶとＨＢＶ）を同時に検出しようとする場合は、各々の標的核酸に特異的にハイブリダイズする別々のオリゴヌクレオチドに、各々異なる蛍光波長を有する蛍光剤を標識することで、目的が達せられる。あるいは、一方のオリゴヌクレオチドをＱプローブ（前出）にすることでも、目的が達せられる。
【００２２】
本発明で、蛍光剤が標識される「オリゴヌクレオチド」の塩基数は、１０〜１００、好ましくは１０〜３０、特に好ましくは１５〜２５である。ＬＡＭＰ法のプライマーとして「ＩＰＦ」または「ＩＰＲ」で使用される場合は、２０〜８０であり、好ましくは３０〜７０、特に好ましくは、４０〜６０である。一方、「ＬＰＦ」または「ＬＰＲ」で使用される場合は、１０〜４０であり、好ましくは１０〜３０、特に好ましくは、１５〜２５である。
【００２３】
本発明において核酸を検出する方法は、例えば、核酸増幅法と組み合わせることによって、蛍光法によるリアルタイムあるいはエンドポイント法が適用できる。
【実施例】
【００２４】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００２５】
実施例１．λＤＮＡ増幅系における検出
（１）プライマーの合成
鋳型にとなるλＤＮＡ配列（配列番号１）の一部から選ばれた塩基配列、またはそれと相補的な配列から選ばれた塩基配列として、以下の基本となる６種類のＬＡＭＰ用プライマーを設計した。プライマーの合成は、ＤＮＡ合成を専門に取り扱う機関に委託した。なお、この増幅系では、インナープライマーであるＩＰＦに蛍光剤ＴＡＭＲＡを標識し、そのバリエーションとして、ＩＰＦ−１〜１２（配列番号８〜１９）の標識プライマーを作製した。
・λＤＮＡ増幅系ＬＡＭＰ用プライマー
ＩＰＦ：5'-ATGCGAAATGAAGTGGTCTGATCCTGTTTTGCTTTGCTCGACAT-3'（配列番号２）
ＩＰＲ：5'-AACTCGTTGCCCGGTAACAAGCAGCAGAATCATCACCATGTT-3'（配列番号３）
ＯＰＦ：5'-CAATGCTGTTGGGATGGC-3'（配列番号４）
ＯＰＲ：5'-CGGCTGACGAATACCTGAAA-3'（配列番号５）
ＬＰＦ：5'-GTCTGATATCGTAGATGGAT-3'（配列番号６）
ＬＰＲ：5'-GCCAGTTCCATTGCAAGTCT-3'（配列番号７）
（２）試薬組成及び濃度
ＬＡＭＰ最終反応溶液２５μＬ中の各試薬濃度が以下になるよう調整した。
・２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ ｐＨ８．８ ）
・１０ｍＭ ＫＣｌ
・１０ｍＭ （ＮＨ4）2ＳＯ4
・  ８ｍＭ ＭｇＳＯ4
・０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
・１．４ｍＭ ｅａｃｈ ｄＮＴＰ
・０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ
・  ８Ｕ   Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ( New England Biolab 社 )
・１０8ｃｏｐｉｅｓ／反応  鋳型核酸
・ＬＡＭＰ用プライマー
１．６μＭ ＴＡＭＲＡ標識ＩＰＦ−１〜１２（配列番号８〜１９）のいずれか
１．６μＭ ＩＰＲ（配列番号３）
０．４μＭ ＯＰＦ（配列番号４）及びＯＰＲ（配列番号５）
０．８μＭ ＬＰＦ（配列番号６）及びＬＰＲ（配列番号７）
（３）ＬＡＭＰ法による反応
０．２ｍＬの専用チューブに、鋳型核酸およびＬＡＭＰ反応溶液２５μＬを加え、ABI PRISMTM 7700 Sequnce Detector （ Applied Biosystems 社製 ）を用いて、６０℃で９０分間リアルタイムによる蛍光測定を行った。
（４）ハイブリダイゼーション法
前記ＩＰＦ−１〜１２の各々とＩＰＦ（配列番号２）に相補的なオリゴヌクレオチドの混合物を、以下の反応液組成において、９５℃で１分間熱変性させた後、３０秒間で１℃の割合で５℃まで冷却させ、上記（３）と同様の機種で、蛍光値の変化を観察した。
（反応液組成）
・２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ ｐＨ８．８ ）
・１０ｍＭ ＫＣｌ
・１０ｍＭ （ＮＨ4）2ＳＯ4
・  ２ｍＭ ＭｇＳＯ4
・０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
【００２６】
その結果を表１に示す。ＩＰＦ（配列番号２）の５’末端の塩基を標識したＩＰＦ−６（配列番号１３）を基準に考えると、５’末端から１塩基削ったＩＰＦ−５を使用した場合は蛍光の上昇が弱くなり、２〜４塩基削ったＩＰＦ−４〜２では蛍光は観察されなかった。しかし、５塩基削ったＩＰＦ−１では、新たに蛍光の上昇が確認された。また、５’末端側に１塩基ずつ伸ばしたＩＰＦ−７、８では、ＩＰＦ−６と同程度の蛍光の増大が観察された。一方、ＩＰＦ−６の３’末端側の塩基を１塩基ずつ削ったもの（ＩＰＦ−９〜１２）に関しては、蛍光の増大に差はみられなかった。また、ＬＡＭＰ反応による蛍光の増大は、ハイブリダイゼーション法の結果とよく一致していた。これらのことは、蛍光剤を、プライマーの５’末端に最も近いＧから１から３塩基離れたＡまたはＴに標識しておけば、核酸増幅産物を蛍光により検出できることを示唆している。
なお、表中のハイブリダイゼーションおよびＬＡＭＰ反応の「＋」、「−」、「０」は、各々蛍光値が「増加」、「減少」、「変化無し」を示し、以下の表でも同様の意味として取り扱う。
【００２７】
【表１】
2007075052.tif 000002
【００２８】
実施例２．haptoglobin 増幅系における検出
（１）プライマーの合成
haptoglobin 遺伝子の特定領域から選ばれた塩基配列、またはそれと相補的な配列から選ばれた塩基配列として、以下の基本となる６種類のＬＡＭＰ用プライマーを設計した。なお、この系においては、ループプライマーであるＬＰＲに蛍光剤ＴＡＭＲＡを標識し、そのバリエーションとして、ＬＰＲ−１〜１２（配列番号２６〜３７）の標識プライマーを作製した。
・haptoglobin 増幅系ＬＡＭＰ用プライマー
ＩＰＦ：5'-TTCCTGGTACTTGGTGAGGCGGGGTCCAGCCTATCTTGAA-3'（配列番号２０）
ＩＰＲ：5'-GCAGTGCCTTTGCCATTCATTGTCAAAGCTCAGGATCCCA-3'（配列番号２１）
ＯＰＦ：5'-TGCCCGAGAAGAAAAACTTG-3'（配列番号２２）
ＯＰＲ：5'-CACACCATACTCAGCGACAG-3'（配列番号２３）
ＬＰＦ：5'-GCCAGCACAGAAGGTGTG-3'（配列番号２４）
ＬＰＲ：5'-GAGGAGGACACCTGGTACGC-3'（配列番号２５）
（２）試薬組成及び濃度
ＬＡＭＰ用プライマーは以下を使用したが、試薬組成および濃度はすべて実施例１．（２）と同濃度で用いた。
１．６μＭ ＩＰＦ（配列番号２０）およびＩＰＲ（配列番号２１）
０．４μＭ ＯＰＦ（配列番号２２）およびＯＰＲ（配列番号２３）
０．８μＭ ＬＰＦ（配列番号２４）
０．８μＭ ＴＡＭＲＡ標識ＬＰＲ１〜１２（配列番号２６〜３７）のいずれか
（３）ＬＡＭＰ法による反応
実施例１．（３）と同様に実施した。
（４）ハイブリダイゼーション法
前記ＬＰＦ−１〜１２の各々とＬＰＲ（配列番号２５）に対し相補的なオリゴヌクレオチドを使用した以外、実施例１．（４）と同様に実施した。
【００２９】
その結果を表２に示す。基準プライマーであるＬＰＦ−６（配列番号３１）は、５’末端がＧであるにもかかわらず若干の蛍光上昇が観察されたが、５’側にさらに３塩基伸ばし、かつＧから２塩基離れたＡに標識したＬＰＦ−５の蛍光は増大した。また、相補性にとらわれず、Ａのみ３塩基またはＴのみ３塩基付加したもの（ＬＰＦ−４またはＬＰＦ−３）でも 、ＬＰＦ−５と同程度の、さらにＧのみ３塩基付加したもの（ＬＰＦ−２）でも蛍光の上昇が観察された。これに対し、Ｃのみを３塩基付加したもの（ＬＰＦ−１）については、相補鎖にあるＧによる消光のため、蛍光は減少した。次に、５’末端塩基の違いによる影響を調べるために、５’側に付加する３塩基を、５’−ＣＡＡ（ＬＰＦ−７）、５’−ＧＡＡ（ＬＰＦ−８）、５’−ＴＡＡ（ＬＰＦ−９）または５’−ＡＡＡ（ＬＰＦ−４）と５’末端の塩基だけ異なるもので蛍光強度の比較を行った。その結果、５’末端がＡまたはＴの場合は蛍光値の増大が見られ、ＧあるいはＣの場合は蛍光値の減少が観察された。末端がＣの場合は、前述同様、相補鎖のＧによる消光作用が関与していると考えられる。また、ＬＰＦ−１０〜１２において、３’末端をリン酸化してプライマーとしての機能を消失させたところ、ＬＰＦ−１０および１１については蛍光の上昇が観察されたが、これは、ハイブリダイズによる蛍光の上昇と考えられる。なお、ＬＰＦ−１２に関しては、Ｇ（グアニン）への標識であるため、蛍光の上昇は起こらなかった。
【００３０】
【表２】
2007075052.tif 000003
【００３１】
実施例３．Ａ（アデニン）またはＴ（チミン）の付加数の検討
実施例２．で使用したＴＡＭＲＡ標識ＬＰＲ−１２（配列番号３７）の５’末端に最も近いＧ（グアニン）に、Ａ（アデニン）を５’側に向かって１〜５塩基付加したＬＰＲ−１３〜１７と、Ｔ（チミン）を５’側に向かって１〜５塩基付加したＬＰＲ−１８〜２２を用い、実施例２．に準じて、ＬＡＭＰ反応を行い、各々の塩基の付加数による蛍光の変化を観察した。
【００３２】
その結果を表３に示す。Ａ（アデニン）に関しては、１〜３塩基の付加で蛍光値の増大が観察されたが、それ以上の付加では逆に蛍光値が減少する傾向にあった。一方、Ｔ（チミン）は、１〜５塩基の付加のいずれにおいても蛍光値の増大が観察された。これらの結果は、実施例１．および２の結果を示唆していると考えられた。
【００３３】
【表３】
2007075052.tif 000004
【００３４】
実施例４．３’末端側の標識
実施例２．で使用したＴＡＭＲＡ標識ＬＰＲ−６（配列番号３１）の３’末端に最も近いＧ（グアニン）から、３’側に向かって１〜４塩基付加したＬＰＲ−２３〜２５とを用い、実施例２．に準じて、ＬＡＭＰ反応を行い、蛍光値の変化を観察した。
【００３５】
その結果を表４に示す。実施例１．〜３．で、５’末端に蛍光剤を標識したプライマー同様、３’末端に蛍光剤を標識しても、蛍光の増大が確認された。
【００３６】
【表４】
2007075052.tif 000005
【００３７】
実施例５．蛍光剤のスクリーニング
実施例２．に基づいたhaptoglobin 遺伝子増幅系で、蛍光剤標識プライマーはＬＰＦ−５（配列番号３０）の５’末端のＡ（アデニン）に表５に示す種々の蛍光剤を標識したプライマーを作製し、実施例１．（３）同様にＬＡＭＰ反応を行った。
【００３８】
その結果を表５に示す。ＴＡＭＲＡ以外の蛍光剤として、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ５３２、Ｃｙ３、ＨＥＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗについて、蛍光値の上昇すなわちＬＡＭＰ反応が観察された。このことより、ＴＡＭＲＡ以外の蛍光剤でも適用できることが示唆された。
【００３９】
【表５】
2007075052.tif 000006
【００４０】
実施例６．ＴＡＭＲＡ標識プライマーによる遺伝子特異性検出の確認
実施例１．に基づいたλＤＮＡ増幅系（ＴＡＭＲＡ標識プライマーはＩＰＦ−６を使用）を、一つはそのままの系で、もう一つはインターカレーター（ＹＯ）の系で、 ABI PRISM 7700 を用いたリアルタイムによる蛍光測定を行った。別に、後述の実施例７．に基づいたＧＡＰＤＨ増幅系（なお、ＬＰＲには蛍光剤は標識されていない）に、ＧＡＰＤＨと配列が無関係なＴＡＭＲＡ標識プライマー（ＩＰＦ−６）を添加し、前述と同様に、一つはそのままの系で、もう一つはインターカレーターの系による蛍光測定を行った。
【００４１】
その結果を図１に示す。λＤＮＡ増幅系（ＡおよびＢ）では、ＬＡＭＰ反応に伴うＴＡＭＲＡおよびインターカレーターの蛍光値の上昇が観察された。一方、ＧＡＰＤＨ増幅系（ＣおよびＤ）においては、ＧＡＰＤＨのＬＡＭＰ反応に伴うインターカレーターの蛍光値の上昇（Ｄ）が確認されたが、ＧＡＰＤＨと配列が無関係なλＤＮＡ増幅系ＴＡＭＲＡ標識プライマーを添加した系（Ｃ）においては、ＴＡＭＲＡの蛍光値の上昇は確認されなかった。このことより、蛍光剤を標識したプライマーは、目的遺伝子の増幅のみ特異的に検出できることが示唆された。
【００４２】
実施例７．マルチプレックスＬＡＭＰ法への応用
同一試料中の異なる遺伝子の同時検出の試みとして、以下の実験系を組んだ。
同一の反応チューブに、解糖系酵素の一種であるＧＡＰＤＨおよび haptoglobin の鋳型を入れ、ＧＡＰＤＨ増幅用には以下のプライマー（標識プライマーは、ＬＰＦの５’末端のＡ（アデニン）にＴＡＭＲＡを標識したプライマー）、そして haptoglobin 増幅用には、実施例２．（１）で使用したプライマー（標識プライマーは、ＩＰＦ−６のＴＡＭＲＡをＲ１１０に換えたプライマー）を用いて、同一チューブ内で、同時にＬＡＭＰ反応を行った。また、比較対照として、ＧＡＰＤＨの鋳型のみ、または haptoglobin の鋳型のみを含む試料について、それぞれＬＡＭＰ反応を行った。なお、測定には、ABI PRISMTM 7700 Sequnce Detector を用い、ＴＡＭＲＡ由来の蛍光は、Ｄｙｅ  ＬａｙｅｒをＴＡＭＲＡに設定し、Ｒ１１０由来の蛍光は、Ｄｙｅ  ＬａｙｅｒをＦＡＭに設定し、リアルタイム測定を行った。
・ＧＤＰＤＨ増幅系ＬＡＭＰ用プライマー
ＩＰＦ：5'-TGCATTGCTGACAATCTTGAGTGATGCCCCCATGTTTGTGAT-3'（配列番号５１）
ＩＰＲ：5'-CTGCACCACCAACTGCTTAGCCCTTCCACAATGCCAAAGT-3'（配列番号５２）
ＯＰＦ：5'-AAACGGGTCATCATCTCCG-3'（配列番号５３）
ＯＰＲ：5'-AGTGATGGCATGGACTGTG-3'（配列番号５４）
ＬＰＦ：5'-AGTTGTCATATTTCTCGTGGTTC-3'（配列番号５５）
ＬＰＲ：5'-CTGGCCAAGGTCATCCAT-3'（配列番号５６）
・ＧＤＰＤＨ増幅系ＬＡＭＰ用プライマー濃度
１．６μＭ ＩＰＦ（配列番号５１）およびＩＰＲ（配列番号５２）
０．４μＭ ＯＰＦ（配列番号５３）およびＯＰＲ（配列番号５４）
０．８μＭ ＴＡＭＲＡ標識ＬＰＦ（配列番号５５）
０．８μＭ ＬＰＲ（配列番号５６）
【００４３】
その結果を図２に示す。ＴＡＭＲＡ由来の蛍光（Ａ）は、ＧＡＰＤＨの鋳型のみを含む反応液とＧＡＰＤＨおよび haptoglobin 両方の鋳型を含む反応液で観察され、Ｒ１１０由来の蛍光（Ｂ）は、 haptoglobinの鋳型のみを含む反応液とＧＡＰＤＨおよび haptoglobin 両方の鋳型を含む反応液で観察された。このことから、波長の重ならない蛍光剤を組み合わせることで、ＬＡＭＰ法による同一試料中の異なる遺伝子の検出、すなわちマルチプレックスＬＡＭＰ法への適用が可能であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
以上のように、本発明は、従来のような煩雑な操作を必要とせず、簡単に、核酸を検出できる技術およびそれに用いる試薬を提供することによって、同一試料中の異なる遺伝子を同時に測定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ＴＡＭＲＡ標識プライマーによる遺伝子特異的検出を示すグラフである。
【図２】マルチプレックスＬＡＭＰ法による遺伝子同時検出を示すグラフである。
【図１】
2007075052.tif 000007
【図２】
2007075052.tif 000008
【配列表】
2007075052000001.app