(57)【要約】【課題】ガス透過膜を有する培養容器において、高いガス交換能を有すると共に、厳重な湿度管理、滅菌水の定期的供給および庫内の加湿用水の紫外線照射による滅菌等の面倒な衛生管理が不要で、培養コストを節約することができる低湿度下においても、培養液の蒸発による組成濃度の変化が抑えられ、長期間の細胞培養が可能となる培養容器および培養方法を提供する。【解決手段】ガス透過膜を有し、規定内容量をＶ（ｍｌ）、ガス透過膜の膜面積をＳ（ｃｍ２）、３７℃おける酸素透過率をＰO2（ｍｌ/ｃｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ）、二酸化炭素透過率をＰCO2（ｍｌ/ｃｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ）、透湿度をＰH2O（ｇ/ｃｍ２・ｄａｙ）としたとき、ガス透過膜がＰO2×Ｓ/Ｖ＞２．０の酸素透過率、ＰCO2×Ｓ/Ｖ＞８．０の二酸化炭素透過率、かつ、ＰH2O×Ｓ/Ｖ＜０．０２の透湿度を有する培養容器。【選択図】図１
2007104975.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガス透過膜を有し、規定内容量をＶ（ｍｌ）、ガス透過膜の膜面積をＳ（ｃｍ２）、３７℃おける酸素透過率をＰO2（ｍｌ/ｃｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ）、二酸化炭素透過率をＰCO2（ｍｌ/ｃｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ）、透湿度をＰH2O（ｇ/ｃｍ２・ｄａｙ）としたとき、ガス透過膜がＰO2×Ｓ/Ｖ＞２．０の酸素透過率、ＰCO2×Ｓ/Ｖ＞８．０の二酸化炭素透過率、かつ、ＰH2O×Ｓ/Ｖ＜０．０２の透湿度を有することを特徴とする培養容器。
【請求項２】
全体として扁平な形状を有し、前記ガス透過膜を少なくとも片面に有する請求項１記載の培養容器。
【請求項３】
注入培養液重量をｍ（ｇ）、培養時間をｔ（ｈｒ）としたとき、請求項１〜３のいずれかに記載の培養容器を用いて、相対湿度５０％以下でＰH2O×Ｓ/ｍ×ｔ/２４≦０．１０となるように培養を行うことを特徴とする培養方法。
【請求項４】
培養の対象は動物細胞であることを特徴とする請求項３記載の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養容器および培養方法に関し、特に酸素・炭酸ガスのガス交換能に優れ、低湿度下での細胞、微生物等の培養に適した密閉系培養容器および培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に細胞、微生物等の培養に用いられるインキュベーターの庫内の湿度は９５％以上と非常に高く、カビや細菌の発生など衛生面での問題があり、この問題は特に医療用での細胞の培養においては重要である。したがって、湿度管理と共に衛生管理を厳重に行わなければならず、インキュベーター庫内に入れる加湿用水はカビや細菌の発生を防止するために予め滅菌しておく必要があり、かつ、この滅菌水を定期的に補充しなければならない。さらに、インキュベーター庫内に入れた後も、加湿用水の無菌性を保つために必要に応じて紫外線照射により滅菌しなければならないのでインキュベーター内に紫外線照射設備が必要である。このように、従来の細胞、微生物等の培養に関しては、インキュベーター内を高湿度に保つ必要があるため、湿度管理と衛生管理が面倒であり、培養のコストもかかるという問題点がある。
【０００３】
この衛生性等の問題を解決するため、従来種々の密閉系の培養容器が提案され、使用されてきた。たとえば、特許文献１〜４に開示されている培養バッグでは、酸素と二酸化炭素等のガス交換能を考慮して容器素材自体のガス透過性は高く設計されているが、培養液量が多く、培養液の中のガス拡散が律速となり、容器壁近傍と容器壁から最も離れた部分では溶存ガス濃度に差を生じ、最適溶存ガス濃度が達成できず、そのため開放系での培養と比較して培養効率に劣るという問題点を有していた。
【０００４】
また、培養バッグに代わるものとして、特許文献５、６に開示されるようなガス透過膜を備えたリジッドな扁平薄型の培養容器が提案され、使用されている。この培養容器は、扁平薄型で培養液量に対し表面積が大きいため、ガス交換能はよいが、低湿度下で使用するには蒸発する水蒸気量が多過ぎ、培養液成分の濃度変化に伴って生じる種々の問題点がある。すなわち、水分が蒸発することによって、培養液中の緩衝系の濃度が高まりｐＨが上昇して、細胞活度の低下や培養効率の低下を引き起こし、さらには細胞を損傷することがある。
【０００５】
また、培養液に用いられている緩衝液にはHEPES緩衝液（N‐２‐ヒドロキシエチルピペラジン−N’−２−エタンスルホン酸緩衝液）やアール塩、ハンクス塩組成を用いた緩衝液等があるが、これらには細胞毒性があり、添加量が制限されていることから水分蒸発に伴う培養液の高濃度化は望ましくなく、また、カルシウムやマグネシウムの濃度に影響を与えてしまうため使用濃度が制限されており、培養液の高濃度化は培養に悪影響を及ぼす。その他、培養の阻害要因となる乳酸塩や尿素チッソ等の細胞自身が発生する老廃物濃度が高くなることや、さらには細胞の浸透圧に許容範囲があることからしても培養液中の緩衝系の高濃度化は望ましくない。
【０００６】
また、水蒸気が抜けるとその代わりに空気が容器内に入り込み、容器内に気泡が発生し、この気泡がはじけると細胞等を損傷するおそれがある。あるいはリジッドな容器では容器内が負圧になり細胞等を損傷するおそれがある。
【０００７】
一方、一般に、培養容器より蒸発する水分量は温度が高くなる程多くなる。これは容器を構成する素材の透湿度が高くなることにも因るが、主には相対湿度が低くなることに起因する。例えば、２５℃と３７℃の相対湿度を比較した場合、３７℃での飽和水蒸気圧は２５℃に対しほぼ２倍となるため、２５℃での相対湿度が５０％でも３７℃ではその半分の２５％となり、蒸発速度はおよそ１．５倍となる。調湿しない場合、３７℃の近傍の温度ではこうした低湿度となることは十分に考えられ、これを考慮することが重要であるが、こうしたことを考慮した培養容器はない。
【０００８】
従って、従来の培養容器は、一般的に３７℃で高湿度下の使用を前提としており、低湿度下での使用を考慮して設計されたものはない。また、上記文献の中でも容器に用いられているガス透過膜のガス透過係数、透湿度、材質などに関する記述はあるが、低湿度で容器を用いるためにガス透過膜の膜面積と培養液の内容量を考慮した知見や蒸発する水蒸気量をどこまで抑えればよいかということに関してはまったく記載されていない。
【０００９】
【特許文献１】特開昭６３−２１４１７８号公報
【特許文献２】実開平２−９３９９９号公報
【特許文献３】実開平４−１２９８００号公報
【特許文献４】特開平３−２７７２６８号公報
【特許文献５】特開２００４−１２９５６８号公報
【特許文献６】特表２００４−５１４４３２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記従来の細胞培養容器の問題点に鑑みてなされたものであって、厳重な湿度管理や衛生管理が必要な高湿度下よりも低湿度下で培養を行った方が衛生面、コスト、管理等すべての面において有利である点に着目し、一部がガス透過膜からなる培養容器において高いガス交換能を有するとともに、低湿度下においても培養液の水分蒸発による濃度変化が問題の生じない範囲内に抑えられ、長期間の細胞、微生物等の培養が可能となる培養容器および培養方法を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成する本発明の培養容器は、ガス透過膜を有し、規定内容量をＶ（ｍｌ）、ガス透過膜の膜面積をＳ（ｃｍ２）、３７℃における酸素透過率をＰO2（ｍｌ/ｃｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ）、二酸化炭素透過率をＰCO2（ｍｌ/ｃｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ）、透湿度をＰH2O（ｇ/ｃｍ２・ｄａｙ）としたとき、ガス透過膜がＰO2×Ｓ/Ｖ＞２．０の酸素透過率、ＰCO2×Ｓ/Ｖ＞８．０の二酸化炭素透過率、かつ、ＰH2O×Ｓ/Ｖ＜０．０２の透湿度を有することを特徴とするものである。
本発明の他の側面においては、全体として扁平な形状を有し、前記ガス透過膜を少なくとも片面に有する培養容器が提供される。
【００１２】
上記目的を達成する本発明の培養方法は、注入培養液重量をｍ（ｇ）、培養時間をｔ（ｈｒ）としたとき、上記培養容器を用いて、相対湿度５０％以下でＰH2O×Ｓ/ｍ×ｔ/２４≦０．１０となるように培養を行うことを特徴とするものである。
本発明に係る培養方法の１態様において、培養の対象は動物細胞であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る培養容器によれば、酸素、二酸化炭素ガスの高いガス交換能を有すると共に、厳重な湿度管理、滅菌水の定期的供給および庫内の加湿用水の紫外線照射による滅菌等の面倒な衛生管理が不要で、培養コストを節約することができる低湿度において、培養液の水分蒸発に起因する濃度変化を、問題の生じない範囲内に抑えることができる。
また、本発明に係る培養方法によれば、上記培養容器を用いて、相対湿度５０％以下で培養を行うことにより、厳重な湿度管理や衛生管理が不要で、衛生面、コスト、管理等で有利な低湿度下において、培養液の水分蒸発に起因する濃度変化が問題の生じない範囲内に抑えられ、最適条件で長期間の培養が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下添付図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。  
本発明に係る培養容器は、密閉型の培養容器であって、上記特許文献１〜４に記載されているような可撓性樹脂製シートからなる袋状の培養バッグで構成することもできるが、好ましい容器の形態は、上記特許文献５、６に記載されているように、剛性を有する材料からなる全体として扁平な形状の密閉容器であって、相互に離間して対向する２つの平面状表面とこれら平面状表面の間の側部を備え、該平面状表面の少なくとも一つにガス透過膜を有する容器である。
【００１５】
図１は本発明に係る培養容器の１実施形態を示すもので、（ａ）は斜視図、（ｂ）は図１（ａ）のＡ−Ａ断面図である。
細胞等の培養容器１は、全体として長方形で扁平形状の容器であって、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩化ビニル等のある程度の可撓性と共に剛性を有するプラスチックから成る。この枠体２は、射出成形等により長辺部３、短辺部４と窓部５が形成され、この枠体２の表裏に、枠体２の厚みの所定間隔で対向するように適宜手段によりガス透過膜５、５が形成されている。
なお、この枠体２は外周側が厚く、内周側が薄くなるように段差が設けられており、外周側は剛性を確保することと、内容液の充填・取り出しを行うための部材を取り付けるために必要な部位を確保することを目的として厚く、内周側の窓部は規定の内容液充填空間を確保するための厚さに調整されている。
そして、ガス透過膜５は培養ガスの通過を許容し、細胞を汚染する微生物等の通過を許容しない材質からなり、後述の樹脂の中から適宜のものが選択される。
【００１６】
この培養容器１は、枠体２とこの枠体２の表裏に形成されるガス透過膜５、５によって形成される空間６［（図１（ｂ）］が、細胞等の培養すべき内容液を収容する内容液充填空間を構成し、この空間６の容積が容器１の規定内容量となる。
また、枠体２の長辺部３の一方３ａには、内容液充填管７及び取り出しを行う管８が取り付けられており、上記内容液充填管７から細胞と培養液の混合液である内容液を容器１内に充填し、適宜公知の手段で密封し、内容液の充填密封終了後、所定の温度、湿度、ガス組成および濃度で所定時間培養を実施し、培養を完了した後に内容液を内容液取出し管８から取出す。
【００１７】
尚、上記容器１は、内容積を変えることが可能な形態でも良く、この場合、規定内容量Vは可変となるが、ガス透過膜５の面積Sが一定であるため、培養すべき細胞等、充填する培養液量に合わせて容器１の規定内容量を可変としても、決定した培養可能内容量の範囲内で培養することが可能となる。
【００１８】
ガス透過膜５は、酸素および炭酸ガスのガス交換能に優れ、低湿度下での培養に適するよう透湿度が極めて小さい材質であることが必要であり、３７℃における酸素透過率をＰO2、二酸化炭素透過率をＰCO2、透湿度をＰH2Oとしたとき、ガス透過膜５がＰO2×Ｓ/Ｖ＞２．０の酸素透過率、ＰCO2×Ｓ/Ｖ＞８．０の二酸化炭素透過率、かつ、ＰH2O×Ｓ/Ｖ＜０．０２の透湿度を有することが必要である。
そして、上記ガス透過膜５は、酸素透過率、二酸化炭素透過率及び透湿度が相対湿度に影響されない材質であり、このような要求を満たすものとして、ポリオレフィンまたはフッ素樹脂を主成分とする単層ないし多層からなるものが好ましい。
【００１９】
このような条件を満たすガス透過膜の材質としては、エチレン、プロピレン、ブテン、ペンテン、ヘキセン、ヘプテン、オクテンなどのオレフィン類、およびノルボルネンやテトラシクロドデセンなどの環状オレフィン類の内の１種乃至数種のオレフィン系モノマーから重合されるホモポリマーあるいは共重合体樹脂、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブテン−１、ポリ−４−メチル−ペンテン−１、環状オレフィン共重合体等のポリオレフィンが挙げられ、またその他に材質として、ポリスチレン、四フッ化エチレン−六フッ化プロピレン共重合体等のフッ素樹脂、シリコーンポリマー等を挙げることができ、これらの樹脂の中から培養すべき細胞の種類、インキュベーターの湿度等の培養条件に合わせて適当なものを選択することが好ましい。
また、ガス透過膜５は、枠体に形成した際に弛まないようにある程度の張力を有し、可視光線透過性に優れていることが好ましい。
以下に本発明の実施例を示す。
【実施例】
【００２０】
［測定］
１．培養容器の規定内容量
培養容器の規定内容量Ｖ（ｍｌ）はガス透過膜と枠体とに囲まれた空間において、ガス透過膜が対面と平衡を維持した状態で、かつ培養空間を完全に培養液で満たした状態での培養液量とする。
【００２１】
２．ガス透過膜の膜面積
ガス透過膜の膜面積Ｓ（ｃｍ２）は膜表面の微細な凹凸等を考慮せず、枠体に囲まれた平滑な膜と仮定して算出された膜の面積とする。
【００２２】
３．酸素透過率および二酸化炭素透過率
酸素透過率および二酸化炭素透過率はガス透過率測定装置（GPM−250：GL Sciences社）により、窒素（６５％）、酸素（１５％）と二酸化炭素（２０％）からなる混合ガスを供給ガスとして用い、３７℃で測定した。
【００２３】
４．透湿度
透湿度は透湿度測定装置（PERMATRAN−W３/３０：Mocon社）により３７℃で測定した。
【００２４】
［評価］
１．培養液（内容液）蒸発割合
培養液と細胞からなる所定濃度の懸濁液を培養容器に規定内容量Ｖ（ｍｌ）充填した後、容器総重量Ｗｏ（ｇ）を測定し、これより予め測定しておいた容器の単体重量ｗ（ｇ）を差し引いて、培養液の初期充填重量（Ｗｏ−ｗ）を求めた。また、培養を行った後、同様に容器総重量Ｗ（ｇ）を測定し、培養前の容器総重量Ｗｏ（ｇ）からこれを差し引いて、蒸発した培養液重量（Ｗｏ−Ｗ）を求めた。培養液の蒸発割合は蒸発した培養液重量（Ｗｏ−Ｗ）を培養液の初期充填重量（Ｗｏ−ｗ）で除して、（Ｗｏ−Ｗ）／（Ｗｏ−ｗ）として求めた。
【００２５】
２．増殖倍率
培養後、回収した総細胞数を計測し、培養開始時に播種した総細胞数から増殖倍率を求めた。回収時のロスや計数のばらつきを考慮し、相対湿度１００％の条件下で培養した細胞（コントロール）に対して９０％以上の増殖倍率を与えるものを○で表し、それ以下の増殖倍率となるものを×で表した。
【００２６】
［実施例１］
長辺部の長さ：１２７ｍｍ、短辺部の長さ：８５ｍｍ、厚み：５．８ｍｍの高密度ポリエチレンからなる枠体の内側を薄くして、長辺部の長さ：８３．３ｍｍ、短辺部の長さ：６０ｍｍ、厚み：２ｍｍの窓部を設けた。この枠体の窓部の表裏に、厚み：２０μｍのポリプロピレン（ＰＰ）層と厚み：８０μｍのメタロセン系触媒による線状低密度ポリエチレン（ＬＬＤＰＥ）層とから成る厚み：１００μｍの共押出しフィルムをガス透過膜とし、該ＬＬＤＰＥ層を内側にしてヒートシールし、表１に示す図１の構成の培養容器を作成した。
この培養容器に、無血清培養液（細胞科学研究所製  AlyS505N 、 IL-2 700IU/ml含有）にマウス由来細胞障害性T−cell CTLL−2を４０００cells/ｍｌの濃度で播種した規定内容量の内容液１０ｍｌを内容液充填管から容器内に充填し密封した。
次いで、３７℃、相対湿度２０％、二酸化炭素濃度５％の雰囲気で９５時間培養を行い、培養液（内容液）の蒸発割合、増殖倍率の評価を行った。
その結果を表２に示す。
【００２７】
［実施例２］
表１に示すように、培養容器のガス透過膜を、厚み：３０μｍのＴＰＸ（三井化学製  ポリ−４−メチルペンテン−１）と厚み：７０μｍのＬＬＤＰＥをウレタン系接着剤でラミネートした多層フィルムとした以外は、実施例１と同様に培養を行い、評価を行った。
【００２８】
［実施例３］
表１に示すように、培養容器のガス透過膜を、厚み：３０μｍのＦＥＰ（ダイキン工業製  テトラフルオロエチレン・ヘキサフルオロプロピレン共重合体）と厚み：７０μｍのＬＬＤＰＥをウレタン系接着剤でラミネートした多層フィルムとした以外は、実施例１と同様に培養を行い、評価を行った。
【００２９】
［比較例１］
ポリスチレン（ＰＳ）製の枠体を用い、かつ表１に示すように、培養容器のガス透過膜を、厚み：１００μｍのＰＳフィルムとした以外は、実施例１と同様に培養を行い、評価を行った。
【００３０】
［比較例２］
厚み：１００μｍのＬＬＤＰＥフィルムを四方シールして、内側の非ヒートシール部が長辺部の長さ：２１５ｍｍ、短辺部の長さ：１５０ｍｍの培養バッグを作成し、このバックの容器壁を透過膜として表１に示す培養容器とした以外は、実施例１と同様に培養を行い、評価を行った。
【００３１】
［比較例３］
実施例１において、枠体の窓部の厚みを６ｍｍとすることにより、培養容器の規定内容量を３倍とした以外は、実施例１と同様に培養を行い、評価を行った。
【００３２】
表１
2007104975.tif 000003
【００３３】
表２
2007104975.tif 000004
【００３４】
表１、２の結果から明らかなように、実施例１〜３の細胞培養容器は、いずれも酸素交換能、二酸化炭素交換能、水蒸気バリア能のすべてにおいて、本発明の要求性能の値を満たしており、低湿度下での細胞培養に適した細胞培養容器であることを示している。
これに対し、比較例１の細胞培養容器は、酸素透過率（酸素交換能）、二酸化炭素透過率（二酸化炭素交換能）及び透湿度（水蒸気バリア能）の全てにおいて、また、比較例２及び３の細胞培養容器は、酸素透過率（酸素交換能）及び二酸化炭素透過率（二酸化炭素交換能）において、本発明の要求性能に達しておらず、低湿度下での培養容器としては不適であることが判る。
【００３５】
また、本発明にかかる培養容器は微生物の培養にも使用可能であるが、特に動物細胞の培養用として好適である。
尚、培養時の温度は、動物細胞等は３５〜４０℃、大腸菌等の微生物は１５〜６０℃で行われるのが一般的である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の１実施形態に係る細胞培養容器を示すもので、（ａ）は斜視図、（ｂ）は図１（ａ）のＡ−Ａ断面図である。
【図１】
2007104975.tif 000005