(57)【要約】【課題】マイクロ流体デバイス内の流路に極微量の試料を定量的に導入する試料導入方法及び微小なクロマトグラフを備えたマイクロ流体デバイスの提供。【解決手段】第一流入口と、第一流出口と、両者を結ぶ第一流路と、第一流路を二分する第一分岐部と、第一分岐部から分岐する第二流路と、第二流路の他端に設けた第二流入口とを有するマイクロ流体デバイスを使用し、第一流入口に接続し、移送用流体を吐出する第二ポンプを停止又は運転状態とし、且つ第一流出口に接続する第一ポンプを、第二ポンプの吐出速度より速い速度で吸引方向に運転し、第一流路内の移送用流体を第一ポンプ方向へ移送すると同時に、両方のポンプの速度差により生じた負圧により、第二流路内の試料を第一流路下流部へ移送する第一工程と、試料が所定量導入された時点で、両方のポンプの速度差をゼロにするか、逆転させて、試料の流入を停止する第二工程、を行う微量試料の導入方法。【選択図】図１
2007218838.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ流体デバイスの微細な流路に微量の試料を定量的に導入する方法であって、
該マイクロ流体デバイスとして、第一流入口と、第一流出口と、該第一流入口と該第一流出口を結ぶ第一流路と、該第一流路の途上に設けられ該第一流路を第一流路上流部と第一流路下流部に分ける第一分岐部と、該第一分岐部において該第一流路から分岐している第二流路と、該第二流路の他端に設けられた第二流入口とを有するマイクロ流体デバイスを使用し、
（１）該第一流路内には移送用流体を満たし、該第二流路内には試料又は移送用流体を満たし、
該第一流入口に接続された第二ポンプから該移送用流体を該第一流路内に吐出させ、かつ、該第一流出口に接続された第一ポンプを、該第二ポンプの吐出速度より大なる速度で吸引方向に運転するか、該第一ポンプを停止状態とし、更に該第二ポンプを吸引方向に運転することにより、
該第一流路内に充填された該移送用流体を該第一ポンプ方向へ移送すると同時に、該第一ポンプの吐出速度と該第二ポンプの吸引速度との差により生じた負圧により、前記第二流入口から該第二流路を経て試料を該第一流路下流部へ移送する第一工程と、
（２）該試料が該第一流路下流部に所定量導入された時点で、該第一ポンプの吸引速度から該第二ポンプの吐出速度を差し引いた値がゼロ又は負となる流速で該第一ポンプ及び該第二ポンプを運転することにより、
該試料が、該第二流路から該第一分岐部を経て、該第一流路下流部に流入することを停止する第二工程、
を行うことを特徴とする微量試料の導入方法。
【請求項２】
前記第二流路又は前記第一流路下流部内の一部において、前記試料が通過したことを検出し、その情報により前記第一工程から前記第二工程に切り替える請求項１に記載の微量試料の導入方法。
【請求項３】
前記マイクロ流体デバイスが、前記第一流路下流部の途中にクロマトグラフィー用分離カラムが設けられたクロマトグラフィー用マイクロ流体デバイスであり、前記移送用流体がクロマトグラフィー用の展開液である請求項１又は２に記載の微量試料の導入方法。
【請求項４】
前記マイクロ流体デバイスが、更に、第三流入口と、第二流出口と、該第三流入口と該第二流出口を結ぶ第三流路と、該第三流路の途上に設けられ、該第三流路を第三流路上流部と第三流路下流部に分ける第二分岐部とを有し、
該第二分岐部には前記第二流入口が接続し、
該第三流路内を該第三流入口から第二流出口へと流れる前記試料の一部を、該第二分岐部に接続する該第二流入口から第二流路を経て第一流路下流部へ導入する請求項１、２又は３に記載の微量試料の導入方法。
【請求項５】
微細な流路の一部にクロマトグラフィー用の分離カラムが設けられたマイクロ流体デバイスであって、
該マイクロ流体デバイスが、第一流入口と、第一流出口と、該第一流入口と該第一流出口を結ぶ第一流路と、該第一流路の途上に設けられ、該第一流路を第一流路上流部と第一流路下流部に分ける第一分岐部と、該第一分岐部において該第一流路から分岐し、その途上にバルブやポンプが設けられていない第二流路と、該第二流路の他端に設けられた第二流入口と、該第二流入口に接続され、該マイクロ流体デバイス外部に開口した受液槽と、該第一流路下流部の途上に設けられたクロマトグラフィー用分離カラムとを有するマイクロ流体デバイス。
【請求項６】
更に、第三流入口と、第二流出口と、該第三流入口と該第二流出口を結ぶ第三流路と、該第三流路の途上に設けられ、該第三流路を第三流路上流部と第三流路下流部に分ける第二分岐部とを有し、該第二分岐部に前記第二流入口が接続されている請求項５に記載のマイクロ流体デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流体デバイス内の流路や機構に、極微量の試料を定量的に導入する方法、及び、クロマトグラフを有するマイクロ流体デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロ流体デバイスは、内部に設けられた微細な毛細管状の流路中で反応や分析を行うデバイスである。マイクロ流体デバイスを使用することにより、反応や分析の迅速化、分析試料量の必要量の減少、省資源・省エネルギー、さらには廃棄物の減少が可能となる。このようなマイクロ流体デバイスを使用して、例えば濾過、抽出、反応などの試料の前処理部と、マイクロ・クロマトグラフィー、マイクロ電気泳動などの分離部と、蛍光や可視・紫外吸収などの検出部を一体化し、医療診断、生化学分析、化学分析の方面で微量の試料を分析するマイクロ・トータル・アナリシス・システム（μ−ＴＡＳ）を構築する試みが行われている。
【０００３】
しかしながら、マイクロ流体デバイスの流路の容量は、従来のポンプ、切り替えバルブ、シリンジ、ピペットなどの試料取り扱い手段や装置の容量に比べて桁違いに小さいため、マイクロ流体デバイスの流路に極微量の試料を定量的に注入することは相当困難であった。例えば、マイクロ・液体クロマトグラフィーやマイクロ・アフィニティー・クロマトグラフィーなどのマイクロ・クロマトグラフィーにおいては、展開距離を短くすることにより迅速に高分解能の分析を行うことが期待できるが、そのためには、試料を短いパルス状に分離カラムに注入する必要があった。しかしながら、マイクロシリンジやサンプリングバルブなどの従来法による試料注入手段では注入試料の体積が過大になりがちであり、そのため、クロマトグラムのピークの広がりやテーリングが生じ、短い展開距離では十分な分解能を得ることが出来なかった。
【０００４】
これを解決する方法として、特許文献１には、電気泳動分析に関する次の方法が開示されている。即ち、交差する２本の流路の一方の一端に試料を注入し、該流路の両端に電圧を印加して電気泳動又は電気浸透流にて試料を移送し、試料が交差部を通過している時点で該電圧の印加を停止し、次いで、他方の流路の両端に電圧を印加することによって、交差部内の試料のみを他方の流路へ注入する方法である。
【０００５】
しかし、この方法では、分岐部の容積だけの極微量の試料を他方の流路に注入することが可能であるが、電気泳動による試料移送であるため、試料は荷電試料に限られ、また、媒体も電解質媒体に限られるため、多くの液体クロマトグラフィーや、ガスクロマトグラフィーのように気相中へ試料を注入する用途には適用できなかった。
【０００６】
また、同様の発想に基づく方法として、マイクロ流路による分析装置に関して、接合する二本のチャネルを有するデバイスを包含する装置が開示されている（特許文献２）。該デバイスにおいては、デバイス内のチャネルに圧力勾配を適用させて、試料注入チャネルに試料を流し、それと接合（交差）した分離チャネルの該接合部（交差部）に試料を配置するものである。しかし、該方法においては、次のような点で、試料注入方法としては不十分なものであった。（１）試料注入用流路と電気泳動分析用流路の圧力や、その制御のタイミングを精密に行う必要があるため、ポンプやバルブなどの機構が複雑かつ大がかりとなりがちであること、（２）該公知文献にはクロマトグラフィーの試料注入については記載されていないが、本発明者等の検討によれば、二つの流路の圧力を厳密に制御する必要があり、制御装置が大がかりなものに成りがちであること、（３）注入試料がテーリングを生じがちであり、それを抑制するためには、更に複雑な機構や圧力制御操作が必要なこと。
【０００７】
一方、本発明者等の出願になる特許文献３には、部材の内部に、毛細管状の上流側流路と、該上流側流路の上流端に位置する液体注入部と、一端が該上流側流路の末端に接続されている吸着カラムと、該吸着カラムを通過した液体を排出する下流側排出口を有する微小液体クロマトグラフィー機構（微小液体クロマトグラフ）が設けられたマイクロ流体デバイスであって、該上流側流路上に分岐部を有し、該分岐部から分岐流路が設けられていて、該分岐流路が、気体は透過させるが液体は透過させない気液分離体を介して該デバイス外に連絡していることを特徴とするマイクロ流体デバイスが開示されている。しかしながら、該デバイスは、試料導入量の定量性が低いものであった。
【０００８】
また、本発明者等の出願になる特許文献４には、第一流路上流部と、その途中の分岐部にて分岐した第一流路下流部と、分岐部近傍の第一流路下流部中に設けられた弁と、分岐部近傍の第一流路上流部の流路壁にあり、第一流路上流部の外部からの圧力により第一流路上流部の断面積を減少させる圧迫部とを有し、該弁が常態では閉じており、且つ圧迫部を圧迫することにより開いて第一流路上流部内の流体が第一流路下流部内に流入する弁であるマイクロ流体デバイスが開示されている。しかし、これも、弁を形成する必要があり、マイクロ流体デバイスの構造が複雑になる欠点があった。
【０００９】
さらに、本発明者等の出願になる特許文献５には、少なくとも２本の流路が交差又は接触した流路共有部に試料吸着性物質が固定化されてなり、該流路のうちの一つが試料を移送して該試料吸着性物質に試料を吸着させる流路であり、且つ該流路と交差又は接触する他の流路が該試料吸着性物質から脱離した試料を移送する流路であることを特徴とするマイクロ流体素子が開示されている。しかしながら、これも試料導入量の定量性が低いものであったし、クロマトグラフとしても、試料導入口と該流路共有部までの間にバルブやポンプを設ける必要があり、構造が複雑となった。
【００１０】
また、本発明者等の出願になる特許文献６には、外部へ開口した導入口と吐出口が設けられた毛細管状の流路を有するマイクロ流体素子への試料導入方法に関して、流路に導入用液体を充填した後に、導入口において試料を導入用液体に接触させ、吐出口から導入用液体を排出することで試料を流路中に導入する試料導入方法が開示されている。しかしながら、これは、流路全体に試料を満たす方法であり、極微量の試料を定量的にパル状に導入する方法については何の記載もなく、クロマトグラフィーの試料注入方法に用いることは出来なかった。
【００１１】
また、本発明者等の出願になる特許文献７には、シリコンゴムによる、マイクロシリンジ用のインジェクション部を有するクロマトグラフが開示されている。しかし、前述のように、マイクロシリンジによる試料注入の欠点を有し、クロマトグラフとしても、試料注入口はシリコンゴムで塞がれており、マイクロ流体デバイス外部に開口したものではない。
【００１２】
また、非特許文献１には、ガラス製のマイクロ流体デバイスに設けたスライド式マイクバルブが報告されており、これを試料の定量的導入に使用出来る。しかしながら、複雑な構造のバルブをマイクロ流体デバイスに形成する必要があり、微小なスライド式バルブの摺動部からのリークを防止するには極めて高い精度の工作が必要であり、必然的に高価なデバイスとなった。
【００１３】
【特許文献１】特開平１１−２７１２７３号公報
【特許文献２】特表２００２−５４２４８９号公報
【特許文献３】特開２００４−１４４５６８号公報
【特許文献４】特開２００６−１０３２７号公報
【特許文献５】特開２００５−２７４４０５号公報
【特許文献６】特開２００４−１９１２５６号公報
【特許文献７】特開２００５−０９１１３５号公報
【非特許文献１】第１１回化学とマイクロ・ナノシステム研究会予稿集、２００５年、８８頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明が解決しようとする課題は、マイクロ流体デバイス内の流路に、極微量の試料を定量的にパルス状に導入する試料導入方法であって、荷電試料だけでなく非イオン性試料の導入や、非水溶媒中への試料導入が可能であり、複雑で精密な装置を必要とせず、簡単な機構でテーリングもなく注入することが可能な試料導入方法を提供することにあり、特に、微小なクロマトグラフ（即ち、クロマトグラフィー用の機構）への試料注入方法を提供することにある。また、そのようなクロマトグラフが設けられたマイクロ流体デバイスを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、分岐した流路の両端部に接続した２つのポンプの、押し出し量と吸引量を制御することにより、該分岐部に接続した流路から試料を定量的に導入し移送できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１６】
即ち、本発明は、マイクロ流体デバイスの微細な流路に微量の試料を定量的に導入する方法であって、
該マイクロ流体デバイスとして、第一流入口と、第一流出口と、該第一流入口と該第一流出口を結ぶ第一流路と、該第一流路の途上に設けられ該第一流路を第一流路上流部と第一流路下流部に分ける第一分岐部と、該第一分岐部において該第一流路から分岐している第二流路と、該第二流路の他端に設けられた第二流入口とを有するマイクロ流体デバイスを使用し、
（１）該第一流路内には移送用流体を満たし、該第二流路内には試料又は移送用流体を満たし、
該第一流入口に接続された第二ポンプから該移送用流体を該第一流路内に吐出させ、かつ、該第一流出口に接続された第一ポンプを、該第二ポンプの吐出速度より大なる速度で吸引方向に運転するか、該第一ポンプを停止状態とし、更に該第二ポンプを吸引方向に運転することにより、
該第一流路内に充填された該移送用流体を該第一ポンプ方向へ移送すると同時に、該第一ポンプの吐出速度と該第二ポンプの吸引速度との差により生じた負圧により、前記第二流入口から該第二流路を経て試料を該第一流路下流部へ移送する第一工程と、
（２）該試料が該第一流路下流部に所定量導入された時点で、該第一ポンプの吸引速度から該第二ポンプの吐出速度を差し引いた値がゼロ又は負となる流速で該第一ポンプ及び該第二ポンプを運転することにより、
該試料が、該第二流路から該第一分岐部を経て、該第一流路下流部に流入することを停止する第二工程、
を行うことを特徴とする微量試料の導入方法を提供するものである。
【００１７】
また、本発明は、微細な流路の一部にクロマトグラフィー用の分離カラムが設けられたマイクロ流体デバイスであって、
該マイクロ流体デバイスが、第一流入口と、第一流出口と、該第一流入口と該第一流出口を結ぶ第一流路と、該第一流路の途上に設けられ、該第一流路を第一流路上流部と第一流路下流部に分ける第一分岐部と、該第一分岐部において該第一流路から分岐し、その途上にバルブやポンプが設けられていない第二流路と、該第二流路の他端に設けられた第二流入口と、該第二流入口に接続され、該マイクロ流体デバイス外部に開口した受液槽と、該第一流路下流部の途上に設けられたクロマトグラフィー用分離カラムとを有するマイクロ流体デバイスを提供するものである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の微量試料の導入方法は、マイクロ流体デバイス内の流路に、極微量の試料を定量的にかつパルス状に導入することができる試料導入方法であって、荷電試料だけでなく非イオン性の試料や非水溶媒溶液の試料も、テーリングなく導入することが可能であるため、マイクロクロマトグラフなどの各種分析用マイクロ流体デバイスや、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの各種マイクロリアクターに適用可能である。勿論電気泳動分析用の試料導入も可能である。本発明の微量試料の導入方法は、単純な構造のマイクロ流体デバイスを用いて上記を実施可能であるため、マイクロ流体デバイスを安価に製造出来、使い捨てにすることも可能である。また、そのようなクロマトグラフが設けられたマイクロ流体デバイスを提供できる。
【００１９】
さらに、本発明の微量試料の導入方法は、試料を試料導入口に滴下するだけで、後は自動的に所定量を流路に吸引し導入し、マイクロ流体デバイス中の所定の機構に移送することが可能であるため、血液などの生体サンプルの全自動分析装置を容易に構築出来る。或いは、マイクロリアクター用のマイクロ流体デバイスにおいて、流路内を流れる反応液の一部を定量的に抜き出して、次段の反応用流路や分析機構などに導入することも可能であるため、反応部と分析部を持った研究用マイクロリアクターを容易に構築できる。また、そのようなクロマトグラフを有するマイクロリアクターを提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明について、詳細に説明する。
［マイクロ流体デバイス］
マイクロ流体デバイスとは、マイクロ・フルイディック・デバイス、マイクロ・ファブリケイテッド・デバイス、マイクロ流体素子、マイクロ流路、ラボ・オン・チップなどとも呼ばれるものを指し、マイクロ流体デバイス内に設けられた流路や各種の機構内で、化学や生化学の反応、分散・晶析・混合・分離・濃縮などの化学工学的処理、検出や測定などを行うデバイスをいう。
【００２１】
図１、図２は本発明に使用するマイクロ流体デバイスの例を示す平面図と側面図である。本発明に使用するマイクロ流体デバイスは、二つの流入口と一つの流出口と一つの分岐部を持つ毛細管状の流路を有する。即ち、第一流入口１１、第一流出口１２、該第一流入口１１と該第一流出口１２を結ぶ第一流路１０、該第一流路１０の途上に設けられ、該第一流路１０を第一流路上流部１０ａと第一流路下流部１０ｂに分ける第一分岐部１５、該第一分岐部１５において該第一流路１０から分岐している第二流路２０、および、該該第二流路２０の他端に設けられた第二流入口２１を有する。
【００２２】
図１は本発明に使用するマイクロ流体デバイスの第一の形態を示す平面図と側面図である。本第一の形態は、第二流入口２１はマイクロ流体デバイス外に開口した試料導入口２１とされている。即ち、本第一の形態のマイクロ流体デバイスは、Ｔ字型の流路構造を有し、試料導入口２１に配された試料を、第二流路２０を経て第一流路下流部１０ｂに導入する試料導入方法（本発明の第一態様）に使用される。また、本第一の形態に於いて、該第一流路下流部の途上にクロマトグラフィー用の分離カラムが形成されたマイクロ流体デバイス（即ち、クロマトグラフ）は本発明のクロマトグラフの第一の形態とされる。
【００２３】
図２は本発明に使用するマイクロ流体デバイスの第二の形態を示す平面図と側面図である。本第二の形態は、マイクロ流体デバイスがさらに、第三流入口３１、第二流出口３２、該第三流入口３１と該第二流出口３２を結ぶ第三流路３０、該第三流路３０の途上に設けられ、該第三流路３０を第三流路上流部３０ａと第三流路下流部３０ｂに分ける第二分岐部１６を有し、該第二流入口２１は該第二分岐部１６に接続されている。即ち、本第二の形態のマイクロ流体デバイスは、Ｈ字型の流路構造を有する。本第二の形態のマイクロ流体デバイスは、第３流入口３１から第二流出口３２へと、第三流路３０を流れる試料を、第二分岐部１６から第二流路２０を経て第一流路下流部１０ｂへ導入する試料導入方法（本発明の第二態様）に使用される。また、本第二の形態に於いて、該第一流路下流部の途上にクロマトグラフィー用の分離カラムが形成されたマイクロ流体デバイス（クロマトグラフ）は本発明のクロマトグラフの第二の形態とされる。
【００２４】
本発明の微小試料の導入方法に使用するマイクロ流体デバイスについて、さらに詳細に説明する。
【００２５】
（第一流入口１１）
第一流入口１１はマイクロ流体デバイス表面に開口しており、ポンプを接続する配管の接続部とされている。第一流入口１１にはポンプ（第二ポンプと称する）を接続する配管の接続部とされている。勿論、第一流入口１１は、濾過機構などを介して該第二ポンプに接続して良い。また、該第二ポンプとして本マイクロ流体デバイスに組み込まれたポンプ（内部ポンプと称する）を使用する場合には、第一流入口１１は該内部ポンプの吐出口に接続される。
【００２６】
（第一流路上流部１０ａ）
第一流路上流部１０ａは、第一流入口１１から導入される移送用流体を第一流路下流部１０ｂへ移送する為の流路としての役割を持つ。第一流路上流部１０ａの圧力損失は任意であるが、圧力損失は小さいことが、ポンプの耐圧が低くてよいため好ましい。第一流路上流部１０ａの断面積は、好ましくは１００μｍ２以上、さらに好ましくは４００μｍ２以上、最も好ましくは１０００μｍ２以上で、好ましくは１０ｍｍ２以下、さらに好ましくは１ｍｍ２以下、最も好ましくは０．１ｍｍ２以下である。
【００２７】
（第一分岐部１５）
第一分岐部１５に於いて、第一流路１０に第二流路２０が接続されている。
【００２８】
（第一流路下流部１０ｂ）
第一流路下流部１０ｂには、例えばクロマトグラフフィーカラムや反応槽のような、微量試料を導入する目的の機構が設けられる。
クロマトグラフィーカラムが設けられる場合には、該カラムの長さは任意であり、用途目的に応じて好適な長さをとり得る。例えば、１ｍｍ〜５００ｍｍが好ましく、５ｍｍ〜２００ｍｍが更に好ましい。上記下限以上とすることで、十分な分離能を得ることができ、上記上限以下とすることによって、マイクロ流体デバイスを小形化できる。
第一流路下流部１０ｂの圧力損失、即ち、第一分岐部１５から第一流出口１２までの間の圧力損失は、上記のような機構も含めて、使用状態で１００ｋＰａ未満、好ましくは３０ｋＰａ以下、更に好ましくは、１０ｋＰａ以下であるようにする。圧力損失の下限は、限りなくゼロに近くて良い。圧力損失は、化学工学の分野で公知の式、例えば、「新版化学機械の理論と計算」、亀井三郎編、産業図書（株）、（1959年）に記載の式で計算できる。圧力損失を上記の範囲にする為に、第一流路下流部１０ｂの断面積は、好ましくは１００μｍ２以上、さらに好ましくは４００μｍ２以上、最も好ましくは１０００μｍ２以上が好ましい。第一流路下流部１０ｂの断面積の上限は、大きいほど圧力損失は小さくなるが、マイクロ流体デバイスが微小であることによるメリットを失わない意味で、好ましくは１０ｍｍ２以下、さらに好ましくは１ｍｍ２以下、最も好ましくは０．１ｍｍ２以下である。圧力損失は使用方法である流速に依存するが、流路断面積を上記の範囲とすることにより、流速の許容範囲が広くなり、運転の制約が少なくなる。
【００２９】
（第一流出口１２）
第一流出口１２はマイクロ流体デバイス表面に開口しており、ポンプ（第一ポンプと称する）と接続する配管の接続部とされている。勿論、第一流出口１２は、濾過機構などを介して該第一ポンプに接続して良い。また、該第一ポンプとして本マイクロ流体デバイスに組み込まれた内部ポンプを使用する場合には、第一流出口１２は該内部ポンプの吸引口に接続される。
【００３０】
（第二流入口２１）
第二流入口２１は、試料の導入口であり、本発明で使用するマイクロ流体デバイスの第一の形態では、マイクロ流体デバイス外に開口し、該開口部に受液槽が設けられた形状とされている。しかし一般には、そこから試料が導入される構造であれば任意であり、上記の他に、例えばマイクロ流体デバイス外と連絡する配管が接続された配管接続部、マイクロ流体デバイス中の他の機構、例えば第一流路や第二流路以外の流路、貯液槽、或いは濾過機構などとの接続部等であり得る。また、本発明で使用するマイクロ流体デバイスの第二の形態では、マイクロ流体デバイス内に設けられた第三流路３０の途上に設けられた第二分岐部１６に連結されている。いずれの場合も、第一流路下流部１０ｂ側から吸引して液体の試料を導入することが可能なように、第二流入口２１は、大気圧に連絡しているか、十分な容量の気体と接触しているか、或いは、ポンプなどにより吸引される分だけ送り出される必要がある。
【００３１】
（第二流路２０）
第二流路２０は、第二流入口２１から導入される試料を第一流路下流部１０ｂへ移送する為の流路としての役割を持つ。第二流路２０の圧力損失は、第一流路下流部１０ｂと同様である。第二流路２０は単なる移送用の流路であって良く、その途上に開閉バルブ、逆止弁、またはポンプは設ける必要はない。そのため、マイクロ流体デバイスの構造を非常に単純にすることが出来る。第二流路２０の長さは任意であるが、短いことが、必要とされる試料の量が少なくて済むため好ましい。
試料を繰り返し導入する場合、例えば、本発明の微量試料の導入方法の第二態様において、第三流路３０中の試料を繰り返し第一流路下流部１０ｂへ導入する場合には、前回の導入試料との混合を避けるため、第二流路２０の長さを実質的にゼロにすること、即ち、第一分岐部１５と第二分岐部１６を接合することが好ましい。
【００３２】
（第一ポンプ）
第一ポンプは第一流出口１２に接続されるポンプであり、吸引型の定量ポンプ、即ち、設定した流量で吸引出来るポンプである。該定量ポンプとしては、吸引速度の流体圧力依存性が小さなものが好ましい。そのようなポンプとしては、例えば、シリンジポンプ、プランジャーポンプ、ギヤポンプ、しごきポンプを例示できる。第一ポンプは、吸引と吐出の両方が出来るものが、マイクロ流体デバイスの流路に移送用流体を充填することが容易であり、更に好ましい。
第一ポンプは独立したポンプであってもよいし、マイクロ流体デバイスに組み込まれた内部ポンプであっても良い。該内部ポンプは第一流路下流部１０ｂの途上の任意の位置に組み込むことが出来る。
第一ポンプは、マイクロ流体デバイスの流路にあらかじめ充填された第一の移送用流体を吸引するが、流路中の第一の移送用流体を吸引した後は、試料を吸引し、続いて第二の移送用流体を吸引する。試料や第二の移送用流体による第一ポンプの汚染を防ぐために、第一流出口１２と第一ポンプの間にバッファータンクを挿入することが好ましい。第一流出口１２と第一ポンプを接続する配管自体に該バッファータンクの役目を持たせることも出来る。
【００３３】
（第二ポンプ）
第二ポンプは第一流入口１１に接続されるポンプであり、吐出型の定量ポンプ、即ち、設定した流量で吐出することが出来、かつ、ポンプ停止時には吐出口を吸引しても実質的に吐出されないポンプである。この時の、吐出口を吸引する圧力は、本発明の第一工程に於ける、第二流入口２１から試料を吸引する圧力であり、大気圧下で使用する場合には、最大でマイナス１００ｋＰａ（ゲージ圧）である。また、該定量ポンプとしては、吐出速度の背圧依存性が小さなものが好ましい。このようなポンプとしては、例えば、シリンジポンプ、ギヤポンプ、しごきポンプを例示できる。
第二ポンプは独立したポンプであってもよいし、マイクロ流体デバイスに組み込まれた内部ポンプであっても良い。該内部ポンプは第一流路上流部１０ａの途上の任意の位置に組み込むことが出来る。第二ポンプは第二の移送用流体を吐出してもよいし、あらかじめ第一流路上流部１０ａに充填された第二の移送用流体の後に接する別の移送用流体を吐出してもよい。
【００３４】
（第三流入口３１）
図２では、本発明に使用する第二の形態のマイクロ流体デバイスが有する第三流入口３１は、マイクロ流体デバイス表面に開口しており、吐出型のポンプを接続する配管の接続部とされている。しかし、一般には、第三流入口３１には、第三流路３０に試料を流す為の流体移送機構が接続されれば良く、該流体移送機構としてマイクロ流体デバイスに組み込まれた内部移送機構を使用する場合には、第三流入口３は該内部移送機構の吐出口に接続される。該流体移送機構は任意であり、該第二ポンプと同様のポンプの他、ダイヤフラムポンプなどの任意のポンプであってよいし、圧力気体や重力により移送する機構であってもよい。また、第二流出口３２を吸引して第三流路３０に試料を移送する場合には、貯液槽に接続されていてよい。
【００３５】
（第三流路上流部３０ａ）
本発明に使用する第二の形態のマイクロ流体デバイス、及び、本発明のクロマトグラフの第二の形態が有する第三流路３０の、該第二分岐部１６から上流側が第三流路上流部３０ａとされている。第三流路上流部３０ａは、任意の流路であってよく、例えば、試料を流す単なる連絡流路、マイクロリアクタの反応管、分離機構などであって良い。第三流路上流部３０ａの圧力損失は、特に制約はなく、上記第一流路上流部１０ａと同様であってよい。
【００３６】
（第二分岐部１６）
本発明に使用する第二の形態のマイクロ流体デバイス、及び、本発明のクロマトグラフの第二の形態では、第二分岐部１６に於いて、第三流路３０に第二流路２０の流入口２１が接続されている。
【００３７】
（第三流路下流部３０ｂ）
第三流路３０の第二分岐部１６から下流側の部分である第三流路下流部３０ｂは、第二分岐部１６から第二流路２０へ導入されなかった余剰の試料を排出する流路であり、任意の流路であり得る。第三流路下流部３０ｂの圧力損失は、特に制約はなく、上記第一流路上流部１０ａと同様であってよい。
【００３８】
（第二流出口３２）
図２に於いて、本発明に使用する第二の形態のマイクロ流体デバイスが有する第二流出口３２は、マイクロ流体デバイス表面に開口しており、第三流路下流部３０ｂから排出された液体を溜めることができるような、大気圧に開放された貯液槽とされている。しかし一般には、第二流出口３２の形態は任意であり、例えば、マイクロリアクタに於ける次段の反応用流路に接続されていていてもよいし、配管の接続部とされていてもよいし、吸引可能な流体移送機構に接続されていてもよい。該流体移送機構は任意であり、該第一ポンプと同様のポンプの他、ダイヤフラムポンプなどの任意のポンプであってよいし、減圧気体や多孔質吸収体であってもよい。
【００３９】
［試料と移送用流体］
本発明の試料導入方法が対象とする試料と、使用する移送用流体について説明する。
【００４０】
（試料）
本発明でマイクロ流体デバイスの流路に導入する試料は流体であり、流体は、気体、液体、又は超臨界流体であってよい。また、分散液、蒸気、ミストなでも良い。これらの中で、液体（分散液を含む、以下同様）であることが、試料導入量の精度が向上するため好ましい。
試料が溶液や分散液である場合の溶媒や分散媒は任意であり、水系液体、非水液体、電解質、非電解質であり得る
試料が溶液である場合の溶質も任意であり、化学物質、生化学物質、有機物質、無機物質、揮発性物質、不揮発性物質、ノニオン性物質、カチオン性物質、アニオン性物質、両性イオン性物質、親水性物質、疎水性物質、両新馬異性物質、などであり得る。
試料が分散液である場合の分散室も任意であり、有機化合物、無機化合物、細胞や細胞内組織などの生物物質、荷電物質、非荷電物質などであり得る。
【００４１】
（移送用流体）
本発明の試料導入方法に於いては、試料を、第一ポンプに吸引する移送用流体と、第二ポンプから吐出する移送用流体を介して該試料を導入し、移送する。即ち、試料は移送方向の前方と後方がそれぞれ移送用流体に接して挟まれた状態で第一流路下流部１０ｂに導入され、移送される。これら試料前後の移送用流体は同じものであっても、異なるものであってもよい。試料の移動方向の前方の移送用流体を第一の移送用流体、後方のものを第二の移送用流体と称することにする。
【００４２】
（第一の移送用流体）
第一の移送用流体は任意であり、気体、液体、又は超臨界流体であってよいが、液体を使用することが好ましい。第一の移送用流体として液体を使用することにより、試料導入量の精度が向上する。第一の移送用流体は、試料や第二の移送用流体と混合するものであっても混合しないものであっても良く、用途目的に応じて選択できる。後述の第二の移送用流体が液体である場合には、本第一の移送用流体として、第二の移送用流体と同じものが好ましく用いられる。
【００４３】
（第二の移送用流体）
第二の移送用流体も任意であり、気体、液体、又は超臨界流体であってよいが、液体であることが、本発明の効果がより発揮されるため好ましい。液体である場合には、試料と混合するものであっても混合しないものであっても良く、用途目的に応じて選択できる。例えば、本発明の試料導入方法がマイクロクロマトグラフへの試料注入である場合には、第二の移送用流体としてクロマトフラフィーの展開液を使用する。
【００４４】
［本発明のマイクロ流体デバイス］
本発明のマイクロ流体デバイスは、本発明の試料導入方法で使用するマイクロ流体デバイスの中で、第一流路下流部１０ｂの途上、第三流路上流部１０ａの途上、又はその両方にクロマトグラフが設けられたものである。上記の第一の形態のマイクロ流体デバイスでクロマトグラフを有するものを、本発明のマイクロ流体デバイスの第一の形態と称し、上記の第二の形態のマイクロ流体デバイスでクロマトグラフを有するものを、本発明のマイクロ流体デバイスの第二の形態と称する。
【００４５】
［試料導入方法］
本発明の試料導入方法は、次の手順による。
（１）第一工程
該第一流路上流部の端に接続された第二ポンプから、第二の移送用流体を吐出方向に運転するか又は停止させ、かつ、該第一流路下流部の端に接続された第一ポンプを、該第二ポンプの吐出速度より大なる速度で吸引方向に運転することにより、少なくとも該第一流路下流部に充填されていた第一の移送用流体を該第一ポンプ方向へ移送すると同時に、該移送用流体の移送による吸引力により、試料を、該第二流入口から、該第二流路及び該第一分岐部を経て、第一流路下流部へ移送する。
このとき第二流路には、あらかじめ第一の移送用流体が充填されていても、試料が充填されていても良いが、液体である第一の移送用流体が充填されていることが、試料導入量の定量性が増すため好ましい。
【００４６】
（２）第二工程、
該試料が該第一流路下流部に所定量導入された時点で、該第一ポンプの吸引速度から該第二ポンプの吐出速度を差し引いた値がゼロ又は負となる流速で各ポンプを運転することにより、該第一流路下流部に流入する流体を試料から該第一の移送用流体に切り替える。
以上の第一工程と第二工程により、該第二の移送用流体と該第一の移送用流体に挟まれたパルス状に、所定量の試料を第一流路下流部１０ｂに導入し、所定の位置まで移送する。
【００４７】
以下、上記の手順について詳細に説明する。
〔微量試料の導入方法の第一態様〕
本発明の試料導入方法の第一態様は、該第一の形態のマイクロ流体デバイスを使用する。流路中に圧縮性の流体である気体が存在すると、試料導入量の定量性が低くなる。そのため、少なくとも第一流路下流部１０ｂ内にあらかじめ液体の移送用流体を充填しておくことが好ましい。第二流路２０には、あらかじめ第一の移送用流体が充填されていても、試料が充填されていても良いが、あらかじめ液体の第一の移送用流体が充填されていることが、流路からの気体の除去が容易であり、微量試料の導入量の定量性が増すため好ましい。この場合、上記流路内、各配管接続部内、及びマイクロ流体デバイスとポンプを結ぶ各配管内にも気体（気泡）を残さないようにすることが、試料の導入量の定量性を向上させるために好ましい。本微量試料の導入方法を繰り返す場合、後述の第二工程に於ける第一ポンプと第二ポンプの流量差がゼロの場合には、２回目以降の試料導入に於いては、第二流路２０には試料が充填されている状態で第一工程を開始する。
【００４８】
該移送用流体を該流路中に充填する方法は任意であり、第二ポンプや第一ポンプを接続する前に充填しておいてもよいし、両ポンプを接続した後に、該ポンプから移送用流体を吐出して充填しても良い。例えば、第二ポンプと第一ポンプからそれぞれ移送用流体を吐出すると、第二ポンプから吐出された移送用流体は、第一流入口１１、第一流路上流部１０ａ、第一分岐部１５、第二流路２０を流れて第二流入口２１から流出し、第一ポンプから吐出された移送用流体は、第一流出口１２、第一流路下流部１０ｂ、第一分岐部１５、第二流路２０を経て第二流入口２１から流出する。よって、この方法では、第一流路下流部１０ｂには第一ポンプから吐出された移送用流体が充填され、第一流路上流部１０ａには第二ポンプから吐出された移送用流体が充填された状態が得られる。第二流路２０に充填される移送用流体は、両ポンプの運転順序によって変わり、後から流した移送用流体が充填される。同時に流せば、混合流体が充填される。第一流路下流部１０ｂに充填された移送用流体が第一の移送用流体となり、第二流路２０に充填された移送用流体が第二の移送用流体となる。
【００４９】
第二ポンプと第一ポンプの双方から移送用の液体を吐出する代わりに、第二ポンプの吐出速度が第一ポンプの吸引速度より大きな条件で両ポンプを運転し、流路中にあった空気が第一ポンプに吸引されて該ポンプから排出されるまで運転する方法によっても良い。この場合には、第一流路及び第二流路の全体に第二ポンプから吐出された移送用流体が充填される。第二ポンプと第一ポンプを上記の逆にすると、流路全体に第一ポンプから吐出された移送用流体が充填される。
上記の充填操作により第二流入口２１に設けられた受液槽に溜まった余剰の移送用流体（液体）は、ピペットやシリンジなどで吸引除去すればよい。
【００５０】
（１）第一工程
該第二ポンプを、第二の移送用の流体を吐出させるように運転するか又は停止させ、同時に該第一ポンプを、該第二ポンプの吐出速度より大なる速度で吸引方向に運転することにより、該第二流入口２１に設けられた受液槽に配された試料を吸引し、該試料を第二流路２０から第一分岐部１５を越えて第一流路下流部１０ｂへ導入する。この時、第二ポンプは停止させておくことが、導入された試料が第一分岐部１５にて第二ポンプから吐出された移送用流体で希釈されることがないため好ましい。上記のポンプ運転状態は、該二つのポンプの双方を停止させた状態から、第一ポンプのみを運転することにより実施しても良いし、該二つのポンプを同一の吐出速度と吸引速度で運転している状態から、第二ポンプのみを停止させることにより実施しても良い。このように第二ポンプの吐出速度が第一ポンプの吸引速度を下回ると、その差の流量で、第二流入口２１から試料が第二流路２０に吸引され、第一分岐部１５を経て第一流路下流部１０ｂへ導入される。このとき、各流路の圧力損失を該の範囲になるように、流路断面積や流速を調節すると、流路壁の撓みなどによる吸引の遅れが無く、定量性良く試料が導入される。
【００５１】
（２）第二工程
該試料が該第一流路下流部１０ｂに所定量導入された時点で、該第一ポンプの吸引速度から該第二ポンプの吐出速度を差し引いた値がゼロ又は負となる流速で、即ち、該第二ポンプの吐出速度が、該第一ポンプの吸引速度以上となる流速で、各ポンプを運転する。そうすると、第一分岐部１５において、第二流路２０からから第一流路下流部１０ｂへ流れていた試料の代わりに、第一流路上流部１０ａから第二の移送用流体が第一流路下流部１０ｂへ流入して、第二流路２０からの試料の流入は止まる。このとき、該第二ポンプの吐出速度を該第一ポンプの吸引速度より高くすると、第一流路上流部１０ａから第一分岐部１５へ流入する第二の移送用液体は第一分岐部１５にて分流し、一部は第一流路下流部１０ｂへ流れ、残余は第二流路２０へ流れて、第二流路２０内の試料を第二流入口２１へ押し戻す。そのため、第一流路下流部１０ｂへの試料の流入のテーリングが防止される。第二ポンプの運転速度をプログラム制御し、第一工程から第二工程への切り替え後一定時間だけ第一ポンプの流量より大とし、その後、等しくすることも好ましい。
【００５２】
試料が第一流路下流部へ所定量導入されたことは、ポンプ運転時間の計測による方法の他、任意の手段で試料の導入量を検出する方法を採ることが出来る。例えば、第一分岐部１５から所定長だけ離れた第一流路下流部１０ｂの一部に検出部（図示略）を設け、該検出部に試料が到達したことを検出して第二工程へ切り替える方法が好ましい。該検出部は、分岐部や第二流路の一部に設けても良い。検出部を分岐部や第二流路２０の一部に設ける場合には、該部分に試料が到達した時刻から、所定の遅れ時間の後に第二工程へ切り替える方法を採ることが出来る。試料の検出手段は任意であり、例えば、紫外可視吸収、赤外吸収、蛍光強度などの光学的手段、電気伝導度や起電力などの電気的方法を例示できる。上記の第一工程と第二工程を繰り返して、試料を複数回導入することも可能である。
【００５３】
本発明の微量試料の注入方法によれば、使用するマイクロ流体デバイス中の流路径や、検出部の位置を上記のように設計することにより、微少量、特に０．１ｐｌ（但し、ｐｌ＝ｎｍ３）〜３００ｎｌ（但し、ｎｌ＝ｐｍ３）、さらに好ましくは１ｐｌ〜３０ｎｌ、最も好ましくは１０ｐｌ〜１０ｎｌ程度の微少量の試料を定量的に注入することが可能である。さらに、該第二工程に於いて、該第一ポンプの吸引速度から該第二ポンプの吐出速度を差し引いた値が負となる流速で各ポンプを運転することにより、上記微少量の試料をテーリングなしにパルス的に注入することが可能である。
【００５４】
〔微量試料の導入方法の第二態様〕
本発明の微量試料の導入方法の第二態様は、該第二の形態のマイクロ流体デバイスを使用する。本第二態様は、第三流路３０中の試料を、第二分岐部１６に接続された第二流入口２１から導入すること以外は該第一態様と同じである。
該第三流路中を試料を移送する方法は任意であり、例えば第三流入口３１に接続されたポンプや、該第二流出口３２に接続されたポンプを使用できる。勿論、第三流路上流部３０ａや第三流路下流部３０ｂに設けられた内部ポンプを使用しても良い。
【００５５】
本発明の微量試料の導入方法の第二態様は、クロマトグラフィーや電気泳動などによって分離された試料スポットを選択的に第一流路下流部１０ｂへ導入することも出来る。例えば、第三流路上流部３０ａにクロマトグラフィー用カラムを設けることによって、分離された試料スポットの化合物を第一流路下流部１０ｂにおける反応に供することが出来る。また、前述のように、第一流路下流部１０ｂにもクロマトグラフィー用カラムを設け、第三流路のクロマトグラフィーと第一流路のクロマトグラフィーを異なる条件（例えば、ｐＨや温度）で行うことにより、分離しにくい物質を容易に分離出来る。このとき、第三流路３０の第二分岐部１６付近に、第三流路３０内の試料を検知する機構、例えば光学測定用の窓を設けたマイクロ流体デバイスを使用し、該部分で試料スポットを検知して該試料スポットを第一流路下流部１０ｂへ導入することも好ましい。
【００５６】
上記の微量試料の導入方法の第二の態様は、クロマトグラフィーや電気泳動によって分離された試料スポットを選択的に第三流路３０から除去し、残余を第三流路下流部３０ｂへ移送する方法としても利用できる。この方法によって、例えば、特定の試料スポットを除去した試料を第二流出口３２から採取したり、該試料スポットを除去した試料を第三流路下流部３０ｂにおける反応に供することが出来る。
【００５７】
本微量試料の導入方法の第二態様において、第三流路３０中の試料を繰り返し第一流路下流部１０ｂに導入することも出来る。この方法は、第三流路３０がマイクロリアクターの反応用流路であり、該反応用流路中の反応液を一定時間毎に試料として第一流路下流部１０ｂに導入し、分析する場合などに有用である。この場合、当該回の導入試料に、第二流路２０中に残っていた前回の導入試料の残余が混入しないようにするため、例えば次の方法（第一の方法）を採りうる。即ち、前回の試料導入の第二工程において、該第一ポンプの吸引速度から該第二ポンプの吐出速度を差し引いた値が負となる流速で、各ポンプを運転する。そうすると、第一ポンプから吐出される移送用流体の一部は第二流路２０へ流れ、第二流路２０内の試料を第二分岐部１６から第三流路へ押し戻して、第二流路２０は該移送用流体で置換される。このため、当該回の試料導入に於いて、前回の試料が混入することはない。第三流路３０に押し戻された試料を第三流路下流部３０ｂへと移送し、当該回の試料導入時に混入しないようにすることが出来る。該移送用流体として液体を用いると、第二流路には該液体が充填されるため、次回の試料導入の際に、改めて第二流路２０に液体を充填する操作は不要である。また、前回の試料導入操作により、第一流路下流部１０ｂには移送用流体が充填されているため、当該回の試料導入に際して、改めて第一流路下流部１０ｂに液体を充填する操作は不要である。
【００５８】
当該回の導入試料に、第二流路２０中に残っていた前回の導入試料の残余が混入しないようにする第二の方法は、本発明で使用するマイクロ流体デバイス（及び本発明のクロマトグラフを有するマイクロ流体デバイス）の第二の形態において、第二流路２０の長さを実質的にゼロにする方法である。換言すれば、第一分岐部１５と第二分岐部１６は接しておおり、該分岐部に於いて、第一流路１０と第三流路３０は接合された形状とする方法である。これにより第二流路の体積はゼロになる。そのため、第二工程に於いて、第一ポンプの吸引速度と第２ポンプの吐出速度を同じにしても、前回の導入試料が第二流路２０に残留することがない。また、第一流路下流部１０ｂに関しても、上記第一の方法と同じ理由で、改めて液体を充填する操作は不要である。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例を用いて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例の範囲に限定されるものではない。
本実施例における紫外線照射、および蛍光特性測定の方法を以下に示す。
【００６０】
（紫外線ランプ１による照射）
３０００Ｗメタルハライドランプを光源とするアイグラフィックス株式会社製のＵＥ０３１−３５３ＣＨＣ型ＵＶ照射装置を用い、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を特に指定が無い限り室温、窒素雰囲気中で照射した。
【００６１】
（紫外線ランプ２による照射）
２５０Ｗ高圧水銀ランプを光源とするウシオ電機株式会社製のマルチライト２５０Ｗシリーズ露光装置用光源ユニットを用い、３６５ｎｍにおける紫外線強度が５０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を、特に指定が無い限り室温、空気雰囲気中で照射した。
【００６２】
（実施例１）
本実施例では、本発明のクロマトグラフを有するマイクロ流体デバイスの第一の形態の製造方法と、それを用いた、本発明の微小試料の導入方法の第一態様を示す。図１に本実施例で作製したマイクロ流体デバイスの平面図模式図と側面図模式図を示す。
【００６３】
［マイクロ流体デバイスの作製］
〔組成物（Ｘ１）の調製〕
エネルギー線重合性化合物（ａ）として平均分子量２０００の３官能ウレタンアクリレートオリゴマー「ユニディックＶ−４２６３」（大日本インキ化学工業株式会社製）７０部、ヘキサンジオールジアクリレート「ニューフロンティアＨＤＤＡ」（第一工業製薬株式会社製）３０部、光重合開始剤として１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン「イルガキュアー１８４」（チバガイギー社製）３部、及び重合遅延剤として２，４−ジフェニル−４−メチル−１−ペンテン（関東化学株式会社製）０．５部を混合して、組成物（Ｘ１）を調製した。
【００６４】
〔組成物（Ｘ２）の調製〕
エネルギー線重合性化合物として上記「ユニディックＶ−４２６３」８０部、上記「ニューフロンティアＨＤＤＡ」２０部、光重合開始剤として上記「イルガキュアー１８４」２部を混合して、蓋用組成物を調製した。
【００６５】
〔製膜液（Ｙ１）の調製〕
エネルギー線重合性化合物（ｂ）として、上記「ユニディックＶ−４２６３」７２質量部、ジシクロペンタニルジアクリレート「Ｒ−６８４」（日本化薬株式会社製）１８質量部、メタクリル酸グリシジル（和光純薬工業株式会社製）１０質量部、貧溶剤（Ｒ）としてデカン酸メチル（和光純薬工業株式会社製）を１８０質量部、揮発性の良溶剤としてアセトンを１０質量部、紫外線重合開始剤として上記「イルガキュアー１８４」３質量部を、均一に混合して製膜液（Ｙ１）を調製した。
【００６６】
〔孔質層３の形成〕
厚さ１ｍｍのアクリル樹脂製の基板１にスピンコーターを用いて、組成物Ｘ２を塗布し、紫外線ランプ１にて１秒間紫外線を照射して塗膜を半硬化させて接着層２とし、その上にスピンコーターにて製膜液（Ｙ１）を塗工し、紫外線ランプ２により、フォトマスクを通して多孔質層３を形成する範囲に紫外線を４０秒照射して該塗膜を硬化させ、ｎ−ヘキサンで貧溶剤を洗浄除去して多孔質層３を形成した。
【００６７】
〔流路となる溝の形成〕
上記多孔質層３が形成された基板１の上に、バーコーターを用いて組成物（Ｘ１）を塗工し、第一流路上流部１０ａ、第一分岐部１５、第一流路下流部１０ｂ、及び第二流路２０と成すべき部分以外の部分にフォトマスクを通して紫外線ランプ２による紫外線照射を１２０秒行って組成物（Ｘ１）を中間層４となる半硬化塗膜と成し、非照射部分の未硬化の該組成物（Ｘ１）をエタノールで除去して、第一流路上流部１０ａ、第一分岐部１５、第一流路下流部１０ｂ、及び第二流路２０となる溝を形成した。このとき、第一流路下流部１０ｂと多孔質層３とが重なった部分の流路底面には多孔質層３が露出した状態となり、それ以外の部分における多孔質層３は組成物（Ｘ１）が充填されて硬化した。この部材を、基板側部材とした。
【００６８】
〔プローブＤＮＡの固定〕
（アミノ基の注入）
上記基板側部材の第一流路下流部１０ｂの底面に露出した多孔質層３の上に５質量％ポリアリルアミン（分子量１５０００、日東紡株式会社製）水溶液を接触させ、６０℃、１時間静置して、ポリアリルアミンのアミノ基の一部を多孔質層３のエポキシ基と反応させた後、流水で１５分洗浄して、多孔質層へアミノ基を導入した。
【００６９】
（アルデヒド基の導入）
上記アミノ基を導入した後、上記基板側部材をグルタルアルデヒド（和光純薬工業株式会社製）の５質量％水溶液中に浸漬し、５０℃に２時間保つことによって、ポリアリルアミンのほぼ全てのアミノ基をグルタルアルデヒドの一方のアルデヒド基と反応させ、流水で１０分洗浄して、多孔質層にアルデヒド基を導入した。
【００７０】
（ＤＮＡの固定）
上記アルデヒド基を導入した多孔質層３に、５’末端にアミノ修飾した長さ２０塩基のＤＮＡ（Ｎ０と称する、エスペックオリゴサービス株式会社製）の５０μＭ水溶液を２μｌ滴下し、湿度１００％、５０℃にて１５時間保つことにより、ＤＮＡ（Ｎ０）の末端アミノ基を多孔質層のアルデヒド基と反応させた後、０．２質量％のテトラヒドロ硼酸ナトリウム水溶液中に入れ、５分間還元反応させ、次いで、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液でリンスし、次に、０．２×ＳＳＣと蒸留水でリンスした後自然乾燥して、多孔質層３にプローブＤＮＡとしてＤＮＡ（Ｎ０）を固定した。（ここで、０．２×ＳＳＣは０．０３Ｍ ＮａＣｌ，３ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液であり、０．１％ＳＤＳは０．１質量％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液である。）
【００７１】
〔カバー層５の固着〕
片面がコロナ放電処理された厚さ３０μｍの２軸延伸ポリプロピレンシート（二村化学株式会社製）を一時的な支持体（図示略）として、この上に組成物（Ｘ２）をバーコーターを用いて塗工し、紫外線ランプ１により紫外線を２秒照射し、該組成物の半硬化塗膜を形成し、カバー層側部材とした。
上記カバー層側部材を該基板側部材の中間層４に積層して密着させ、紫外線ランプ１により紫外線を４０秒照射して完全に硬化させてカバー層５を固着した。次いで、該一時的な支持体を剥離除去して、毛細管状の第一流路上流部１０ａ、第一分岐部１５、第一流路下流部１０ｂ、及び第二流路２０を有するマイクロ流体デバイス前駆体を形成した。
【００７２】
〔その他の構造の形成〕
この後、上記カバー層５を貫通し第一流路上流部１０ａの端部、第一流路下流部１０ｂの端部及び第二流路２０の端部に於いて、ドリルを用いて直径０．５ｍｍの孔４１、４２、４３を開けて、それぞれ、第一流入口１１、第一流出口１２、第二流入口２１を形成し、各口にルアーフィッティング５１、５２、５３を接着して、クロマトグラフを有するマイクロ流体デバイスを得た。
本マイクロ流体デバイスの各部の寸法は、全体の寸法は７５ｍｍ×２５mm×１．１４５ｍｍであり、各層の厚みは、基板１が１．０ｍｍ、接着層２は１５μｍ、多孔質層３は３μｍ、多孔質層３を除く中間層３の厚みは３０μｍ、カバー層は１００μｍであり、各流路の長さは、第一流路上流部１０ａが１５ｍｍ、第二流路下流部１０ｂが約１３０ｍｍ、第一流路下流部１０ｂの底面の一部に露出している多孔質層３の長さは１００ｍｍ、第二流路２０が約２５ｍｍであり、第一流路１０、第二流路の幅は共に１００μｍである。また、第一流路下流部１０ｂの第一分岐部からの距離が約０〜１ｍｍの範囲を、マイクロ流体デバイス上面から第一流路１０を観察できる窓である検出部３３とし、第一流路下流部１０ｂの、多孔質層３形成部と第一流出口１２の間の、多孔質層３がない部分を、マイクロ流体デバイス上面から第一流路１０を観察できる窓であるクロマトグラフ検出部３４とした。
【００７３】
［試料導入試験］
〔料の調製〕
（プローブＤＮＡと相補的なＤＮＡ試料）
５’末端を蛍光色素ＦＩＴＣにて修飾し、プローブＤＮＡ（Ｎ０）に相補的な塩基配列を持つ長さ２０塩基のＤＮＡ（Ｆ０と称する）（エスペックオリゴサービス株式会社製、濃度５００μＭ）を０．２×ＳＳＣ溶液で希釈して、濃度０．３μＭのクロマトグラフィー測定用試料Ｆ０とした。
【００７４】
（プローブＤＮＡと一塩基ミスマッチを有するＤＮＡ試料）
ＤＮＡが、プローブＤＮＡ（Ｎ０）と１塩基ミスマッチとなる塩基配列を有するＤＮＡ（Ｆ１と称する）であること以外は、試料Ｆ０と同様にして試料Ｆ１を調製した。
【００７５】
〔試料Ｆ０のクロマトグラフィー〕
マイクロ流体デバイスを４０℃に温度調節されたヒートブロック上に固定し、第一流出口１２に第一ポンプとしてマイクロシリンジポンプ（図示略）を、また、第一流入口１１に第二ポンプとしてマイクロシリンジポンプ（図示略）を接続した。配管は、内径５００μｍのポリ四フッ化エチレン（ＰＴＦＥ）製のチュ−ブを用いた。第二流入口には配管を接続せず、ルアーフィッティング５３を試料の受液槽として使用した。
先ず、第一ポンプ、第二ポンプの双方から緩衝液（０．２×ＳＳＣ）を２μｌ／分で吐出し、全流路中に緩衝液を充填した。第二流入口のルアーフィッティング５３内に溜まった緩衝液はピペットで吸引除去した。
【００７６】
（第一工程）
次いで、ルアーフィッティング５３の内側にピペットで試料１００μｌを滴下し、第一ポンプを０．２μｌ／分で吸引方向に運転したところ、試料は第二流入口２１から吸引され、第二流路２０を経て第一分岐部１５から第一流路下流部１０ｂに移送された。
【００７７】
（第二工程）
ニコン製蛍光実体顕微鏡（図示略）を用いて検出部３３に於ける試料の蛍光を観察し、試料が第一分岐部１５を通過し、第一流路下流部１０ｂに約０．５ｍｍ入った時点で、第二ポンプを１．１μｌ／分で吐出方向に運転したところ、試料の代わりに移送用流体が第一流路上流部１０ａから第一流路下流部１０ｂに流入した。そして、既に第一流路上流部１０ａに導入されていた長さ約０．５ｍｍの試料は引き続き第一流路下流部１０ｂ中を下流方向に向かって移送された。一方、第二流路２０中にあった試料は、今度は第二流路２０中を第二流入口２１方向に向かってゆっくりと押し出された。このようにして、極微量の試料が第一流路下流部１０ｂにパルス状に注入された。
その後、両ポンプを１μｌ／分で運転し、第一流路下流部１０ｂのクロマトグラフ検出部３４においてニコン製蛍光実体顕微鏡を用いて蛍光強度変化を測定した。その結果、ＤＮＡ（Ｆ０）試料は約１０５秒にピークを持つクロマトグラム、ＤＮＡ（Ｆ１）試料が８８秒にピークを持つ、テーリングのないクロマトグラムが得られた。また、該クロマトグラムのピーク面積と検量線から、試料注入量は約１．５ｎｌと計算された。
【００７８】
（実施例２）
本実施例では、本発明のマイクロ流体デバイスの第二の形態の製造方法と、それを用いた、本発明の微小試料の導入方法の第二態様を示す。
【００７９】
［マイクロ流体デバイスの作製］
本実施例は、図２に示したように、マイクロ流体デバイスに、第三流入口３１、第三流路上流部１０ａ、第二分岐部１６、第三流路下流部３０ｂ、第二流出口３２を設け、第三流入口３１と第二流出口３２にそれぞれルアーフィッティング５４、５５を接着したこと、及び第二流入口２１は該第二分岐部１６に接続されていること、以外は実施例１と同様にして作製した。第三流路の幅は２００μｍとした。
【００８０】
［試料導入方法］
シリンジポンプ（図示略）を第三流入口３１のルアーフィッッティング５４に接続したこと、試料をシリンジポンプから第三流路３０に１ｍｍ３／分の一定流速で流したこと、以外は、実施例１と同様の試料導入試験を行い、実施例１と同様の結果を得た。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】実施例１で作製した本発明のマイクロ流体デバイスの（ａ）平面図模式図および（ｂ）側面図模式図である。
【図２】実施例２で作製した本発明のマイクロ流体デバイスの（ａ）平面図模式図および（ｂ）側面図模式図である。
【符号の説明】
【００８２】
１      基板
２      接着層
３      多孔質層
４      中間層
５      カバー層
１０      第一流路  
１０ａ    第一流路上流部
１０ｂ    第一流路下流部
１１      第一流入口
１２      第一流入口
１５      第一分岐部
１６      第二分岐部
２０      第二流路
２１      第二流入口
３０      第三流路
３０ａ    第三流路上流部
３０ｂ    第三流路下流部
３１      第三流入口
３２      第二流出口
３３      検出部
３４      クロマトグラフ検出部
４１、４２、４３、４４、４５    孔
５１、５２、５３、５４、５５    ルアーフィッティング
【図１】
2007218838.tif 000003
【図２】
2007218838.tif 000004