(57)【要約】【課題】プロゾーン陽性試料の検定を簡易化する免疫測定方法を提供する。【解決手段】試料を所定の分析対象物質に特異的に結合できる免疫反応性物質、とりわけ抗体と混合することによって測定用試料を調製し、この試料を所定の反応時間にわたり反応させ、その反応時間にわたっての前記試料中での免疫反応性物質と分析対象物質との相互作用に関する信号を測定し、異なる時刻に測定した信号に基づいて当該試料中でプロゾーン効果が生じたか否かを調べ、それに応じてプロゾーン陽性試料を選定し、前記反応時間の間に測定した信号の少なくとも一つからプロゾーン効果を生じる分析対象物質濃度をカバーする一つの検量線または検量線の一つの部分をプロゾーン陽性試料に、プロゾーン効果を生じない分析対象物質濃度をカバーするもう一つの検量線または検量線のもう一つの部分は残りの試料に用いて、試料中の分析対象物質の濃度を算出することを包含する免疫測定方法。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の諸工程を包含する免疫測定方法：
（ａ）異なる複数の部分を含む検量線を作成するかまたは異なる複数の検量線を作成することであり、それぞれ、一つの部分または一つの検量線はプロゾーン効果を生じない分析対象物質濃度をカバーし、もう一つの部分またはもう一つの検量線はプロゾーン効果を生じる分析対象物質濃度をカバーするものとし、
（ｂ）試料を、所定の分析対象物質に特異的に結合できる免疫反応性物質、とりわけ抗体と混合することによって測定用試料を調製すること、
（ｃ）該試料を所定の反応時間にわたり反応させること、
（ｄ）該反応時間にわたって、該試料中で該免疫反応性物質と該分析対象物質との相互作用に関する信号を測定すること、
（ｅ）該工程ｄにおける異なる時刻に測定した信号に基づいて、該試料中でプロゾーン効果が生じたか否かを調べること、およびそれに応じてプロゾーン陽性試料を選定すること、並びに、
（ｆ）前記工程ｄにおいて測定した信号の少なくとも一つから、好ましくは、前記反応時間の終了時に取得した値から、前記工程ａで作成した適切な検量線または適切な検量線の部分を用いて試料中の分析対象物の濃度を測定することであり、一つの検量線または検量線の一つの部分はプロゾーン陽性試料に用いられ、他方は残りの試料に用いられるものとする。
【請求項２】
前記工程（ａ）から（ｆ）までの少なくともいくつかを自動分析器によって実施することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫反応性物質と分析対象物質との間の相互作用を濁度測定法によって検出することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ｄ）における信号が、光度計測法により、とりわけ濁度測定法により、測定できる光学的信号であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
使用する免疫反応性物質としての抗体または抗原が粒子、とりわけポリマービーズ、に結合されていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
試料がプロゾーン陽性であるか否かに応じて、当該方法を異なる条件下で実施することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫反応性物質、通常は抗体を試料に加えて、該試料中に含まれている可能性のある特定の分析対象物質を検出および／または定量する免疫測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ほとんどの場合、免疫測定方法に使用される免疫反応性物質は特定の抗体である。しかし、抗体が関心のある分析対象物質である場合には、抗原を用いることも可能である。
【０００３】
両場合とも、使用される免疫反応性物質は、問題の分析対象物質と、例えば、抗原抗体複合体を形成することによって、特異的に相互作用することができる。試料中のこのような複合体の形成（凝集）は、所定時間経過後の、例えば、濁度測定法によって、モニターすることができる。例えば、濁度測定によって測定された凝集の度合いが、試料中の当該分析対象物質の濃度を表示するものとなる。
【０００４】
通常、分析に先立って検量線などを作成し、濁度測定で得られた値を用いて、この検量線によって分析対象物質の濃度を算出する。
【０００５】
分析対象物質を高濃度に含有する試料において、凝集が起らない、あるいは低減することが時折観察される。このような試料を十分に希釈するならば、正常な凝集が起る。
【０００６】
高い分析対象物質濃度で凝集が起らない、または減少することは、プロゾーン（前地帯）効果または「フック（かぎ）効果」と呼ばれ、例えば、試料中の抗原が過剰なために、可視的凝集を生じるほどには群れ集まることのない小さい抗体抗原複合体が形成されることと関係している。一般に、抗体の濃度に比較して抗原の濃度が高いほど、観測される信号は小さくなると言える。
【０００７】
抗原濃度が増大が、抗体集団の認識する相対能力、及び、結合する相対能力を超えると、該信号が減少する。この結果は動的で、抗原抗体反応から、より高い確率で非凝集形態が支配的となるまでの、反応の平衡の変化を表わしている。
【０００８】
既知の免疫分析法は、プロゾーン効果が生じる試料を同定・確認するための種々のアプローチ法を提供している。既知のそれらの方法の大部分が、反応速度論を確立するために、所定時間にわたる試料の濁度測定を用いている。その反応速度論から、例えば、異なる時刻に得られた値を比較することによって、試料中でプロゾーン効果が生じたか否かを推論することが可能である。
【０００９】
プロゾーン効果を検出する方法について、ほんの２、３の例を挙げれば、例えば、特開２０００−２２１１９５号公報、特開平６−２１３８９３号公報または特開平６−０９４７１７号公報に開示されている。
【００１０】
現在のところ、免疫分析法のプロトコールは、プロゾーン効果が明確に検出される試料（プロゾーン陽性試料）を希釈し、希釈した試料を用いて新しく分析を行なうことと規定している。しかし、分析対象物質の濃度は未知であるから、与えられた試料についての適正な希釈率を見出すために、いくつかの希釈系列について実験しなければならない。かかる希釈系列は、試験の実施および結果の解析のための時間、分析機器のための空間ならびに追加の試薬および試料材料を要するために、不利である。
【００１１】
【特許文献１】特開２０００−２２１１９５号公報
【特許文献２】特開平６−２１３８９３号公報
【特許文献３】特開平６−０９４７１７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
それゆえ、本発明の目的は、プロゾーン陽性試料の検定を簡易化する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記の目的は、請求項１の方法によって達成される。
即ち、本発明の免疫測定方法は以下の諸工程を包含する：
（ａ）異なる複数の部分を含む検量線を作成するかまたは異なる複数の検量線を作成することであり、それぞれ、一つの部分または一つの検量線はプロゾーン効果を生じない分析対象物質濃度をカバーし、もう一つの部分またはもう一つの検量線はプロゾーン効果を生じる分析対象物質濃度をカバーするものとし、
（ｂ）試料を、所定の分析対象物質に特異的に結合できる免疫反応性物質、とりわけ抗体と混合することによって測定用試料を調製すること、
（ｃ）該試料を所定の反応時間にわたり反応させること、
（ｄ）該反応時間にわたって、該試料中で該免疫反応性物質と該分析対象物質との相互作用に関する信号を測定すること、
（ｅ）該工程ｄにおける異なる時刻に測定した信号に基づいて、該試料中でプロゾーン効果が生じたか否かを調べること、およびそれに応じてプロゾーン陽性試料を選定すること、並びに、
（ｆ）前記工程ｄにおいて測定した信号の少なくとも一つから、好ましくは、前記反応時間の終了時に取得した値から、前記工程ａで作成した適切な検量線または適切な検量線の部分を用いて試料中の分析対象物の濃度を測定することであり、一つの検量線または検量線の一つの部分はプロゾーン陽性試料に用いられ、他方は残りの試料に用いられるものとする。
【００１４】
既知の諸方法と同様に、本発明の方法も下記の諸工程を包含する：
−  試料を分析対象物質と特異的に結合できる免疫反応性物質、とくに抗体と混合することによって測定用試料を調製する工程、
−  前記試料を所定の反応時間にわたって反応させる工程、
−  前記反応時間にわたっての前記免疫反応性物質と分析対象物質との相互作用に関連した信号を、例えば、濁度測定法によって測定する工程、および
−  時を異にして測定された信号に基づいて、当該試料においてプロゾーン効果が生じたか否かをチェックし、それに従ってプロゾーン陽性試料を選び出す工程。
【００１５】
既知の方法とは異なって、本発明は、当該試料がプロゾーン陽性であるか否かに応じて、異なる複数の検量線もしくは単一の検量線の異なる複数の部分を用いて、分析対象物質の濃度を算出することを規定する。
【００１６】
単一の検量線を使用する既知の方法に比して、本発明の方法は、１つはプロゾーン陽性試料用、他方は残りの試料用の、２つの異なる、検量線（較正曲線）または較正システムを使用する。
【００１７】
驚くべきことに、プロゾーン効果を惹起する高濃度の分析対象物質を含有する試料を例えば、濁度測定に付しても、プロゾーン域内の異なる濃度について、依然として濃度に依存した値が再現性をもって得られることが判明した。
【００１８】
従って、プロゾーン陽性試料中の分析対象物質の少なくとも概略計算を可能にする特定の検量線を作成することが可能であった。
【発明の効果】
【００１９】
プロゾーン陽性試料について本発明の方法によって得られた濃度値は、直接使用することができ、あるいは適正な希釈率を算出するために用いることができる。
【００２０】
最適なことに、本発明の方法によれば、例えば、概略結果でも試験に対する医療上の要求にこたえられる場合には、プロゾーン陽性試料の再試験が回避される。再試験が必要と考えられたとしても、プロゾーン陽性試料について得られた濃度値は、希釈系列を実施することなく試料を正規の濃度範囲へ適正に希釈することが可能なほどに正確である。
【００２１】
本発明の方法には、例えば、分析対象物質濃度の算出のために適切な検量線を選択することが必要なだけである。これは、反応の速度論の解析を通じて遂行する。これにより、分析がずっと容易に、迅速になる。
【００２２】
本発明の免疫分析法は、粒子エンハンスメント（粒子による増強）を行なうまたは行なわないすべての既知の凝集または赤血球凝集試験について有効に作用する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の方法には、例えば、抗体と抗原との間の相互作用を測定するために濁度測定法を使用することが好ましい。しかし、該相互反応を定量することを可能ならしめ、プロゾーン効果を経験する他の手法、ほんのいくつかの例を挙げれば、例えば、化学発光法、酵素免疫測定法、蛍光法、ネフェロメトリーも利用できる。そのため、本明細書では主として濁度測定法に言及するが、本発明がこの手法の使用に限定されるものではない。
【００２４】
本発明の方法によって分析可能な典型的な試料は、例えば、血液、血清、尿である。一般に、免疫測定方法で試験可能な試料なる語には、あらゆる体液または組織抽出物が包含される。
【００２５】
典型的な反応時間は、３０秒間〜１０分間の間で変動する。
濁度測定は、分光光度計または濁度計を用いて実施できる。使用される波長は分析方法に依存する。一般に、凝集は、３４０ｎｍ〜８００ｎｍの範囲内でもっともよく測定できる。
【００２６】
試料におけるプロゾーンを検出し、それに従って試料を選別するための既知のいずれの方法も、本発明において使用できる。
試料を用いてプロゾーンを検出できる自動分析器で本発明の方法を用いれば、とくに有利である。その分析器は、例えば、試料がプロゾーン陽性であるという情報を得た場合に、一方の検量線から他方の検量線へ切り替わるようにプログラム制御することができる。
【００２７】
本発明のさらなる具体化態様では、免疫反応性物質をミクロ粒子に、特に、例えば、ラテックスビーズなどのポリマービーズに、固定化する旨を規定することができる。しかし、通常の免疫分析法またはミクロ粒子増強光散乱凝集検定法でそれぞれ使用できるあらゆる粒子が適している。直接凝集法と比較しての利点は、ミクロ粒子に結合させた免疫反応性物質を用いることにより、検定法の感度が向上することである。
【００２８】
実際、「フック効果」の反応速度論に該当するいずれの免疫検定検出法でも、本明細書に記載したものに類似の任意のソフトウェア介在フラッギングプロセスを用いて適合させることができる。これには、非競合免疫分析法の大部分が含まれ、そのうちのいくつかは、神経回路網分類器システムを用いて検出が行なわれている（Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ（臨床化学と検査室医学）、１９９９年４月；３７（４）：４７１−６参照）。
【００２９】
さらなる実施態様は、ある試料がプロゾーン陽性であると確認されたならば、異なる設定で当該試料のさらなる処理を行なうことを規定する。
【００３０】
例えば、プロゾーン陽性試料の濁度測定を正常試料に対して用いた波長とは異なる波長で行なうことを規定することができる。上述のように、試料中のプロゾーン現象は、解離した凝集体が大部分を占めている可能性が増加するために、形成された複合体の量が減少することによって惹起される。波長の変更は、すでに測定段階の間に、あるいはその後の測定で実施できる。特定の状況では、観察された現象が、試験における試料のプロゾーン現象に似ていることがあるが、実際には、形成された複合体の寸法の増大によって惹起されているという場合がある。これらの複合体は、適切なことに、最適条件未満のデバイ（Ｄｅｂｅｙｅ）またはミー様（Ｍｉｅ−ｌｉｋｅ）光散乱効果による測定波長において干渉できないので、観測された効果は、あたかもこれが形成された複合体の寸法の減少によって惹起されたごとく類似している。それゆえ、波長も増大させれば、より定量的な信号の測定が、これらの条件下で可能である。
【００３１】
上述の波長の変更に加えて、プロゾーン陽性試料について異なる反応時間またはインキュベーション時間を用いることも可能である。
【実施例】
【００３２】
以下、図面を参照しながら、実施例によって本発明を説明する。
２つの検量線を作成した。正常検量線（第一の検量線）は、直線領域をカバーする濃度のミクロアルブミン材料を用いて作成した（図１参照）。第二の検量線は、この検定法のプロゾーン領域の中にある濃度の材料を用いて作成した。この第二の検量線を「プロゾーン検量線」として用いた（図２参照）。図１および図２において、最低線（横軸）は検量線作成に用いた試料の異なる濃度（単位：ｍｇ／ｌ）を示している。左側（縦軸）には、波長３４０ｎｍおよび二次波長８００ｎｍで測定したＯＤ（光学濃度）信号が示されている。
【００３３】
本発明に従った方法の信頼性を示すために、種々濃度のミクロアルブミン（ヒト尿中アルブミン）を含有する試料を用いて免疫検定を実施した。免疫反応性物質としては、ヤギ抗ヒトアルブミン抗体を適切な濃度の０．５ｍｇ／ｌで用いた。
【００３４】
上記試料を上記抗体と混合し、試料の濁度測定を約５分間にわたり、一次波長３４０ｎｍおよび二次波長８００ｎｍで実施した。
結果を図３に示す。最低線（横軸）は、検定した試料中の異なるミクロアルブミン濃度（単位：ｍｇ／ｌ）を示している。左側（縦軸）には、正常検量線およびプロゾーン検量線を用いて算出した実際の回収量が示されている。
【００３５】
図３の曲線の最初の部分（０〜２２００ｍｇ／ｌの間）は、濁度測定のＯＤ値を図１の正常検量線により計算して得ることのできる濃度値を示している。この曲線は、５〜３００ｍｇ／ｌの間の直線範囲を示しており、信頼できる結果を得ることのできる正常測定範囲を表わしている。３００ｍｇ／ｌを超えると、値の信頼できる計算はもはや可能ではなくなる。
【００３６】
ほぼ２２００ｍｇ／ｌの試料濃度から始まって、試料がプロゾーン効果を示し始める。これらの試料については、図２に示したプロゾーン検量線を用いて結果を再計算した。再計算結果を、図３の曲線の枠内部分によって示す。プロゾーン検量線を用いて結果を再計算すると、試料の濃度になおほぼ対応する濃度値が得られることが理解できる。少なくとも、再計算結果は実際の試料濃度に余りにも近接しているので、希釈系列を実行することなく５〜３００ｍｇ／ｌの間の濃度までの適正な希釈が可能であろう。
【００３７】
プロゾーン検量線範囲の効果は、このミクロアルブミン測定の範囲を少なくとも８５倍（３００ｍｇ／ｌから２６０００ｍｇ／ｌまで）に事実上拡大することにある。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
プロゾーン陽性試料の検定を簡易化する免疫測定方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】正常検量線を示す。
【図２】プロゾーン検量線を示す。
【図３】正常検量線によって算出した濃度値とプロゾーン検量線によって再計算した値（枠内）との比較を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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