(57)【要約】【課題】  ニンニク産地を簡便に識別する方法を提供すること。【解決手段】  本発明のニンニク産地識別方法は、感染しているリークイエローストライプウイルスの遺伝子の地理的変異に基づいて行うことを特徴とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染しているリークイエローストライプウイルスの遺伝子の地理的変異に基づいて行うことを特徴とするニンニク産地識別方法。
【請求項２】
地理的変異を調べる領域が5'非翻訳領域とこれに隣接するP1蛋白質コード領域を少なくとも含むことを特徴とする請求項1記載のニンニク産地識別方法。
【請求項３】
地理的変異が塩基配列の欠失の有無であることを特徴とする請求項1または2記載のニンニク産地識別方法。
【請求項４】
地理的変異が塩基配列の欠失の長さであることを特徴とする請求項1または2記載のニンニク産地識別方法。
【請求項５】
配列番号1で表されてなることを特徴とするニンニク感染リークイエローストライプウイルス,W-KuのcDNA。
【請求項６】
配列番号2で表されてなることを特徴とするニンニク感染リークイエローストライプウイルス,1A3lのcDNA。
【請求項７】
配列番号3で表されてなることを特徴とするニンニク感染リークイエローストライプウイルス,3mEl7のcDNA。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニンニク産地を簡便に識別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
国際的な農産物の流通が活発になった今日、諸外国から国内に安価なニンニクが大量に輸入されるようになっている。このような状況下、国内のニンニク産地は、国際競争に勝ち残るために、より高品質なニンニクを生産するための栽培技術と特産品種を開発し、その保護育成を図ることで、国内産地の優位性を確立し、そして維持していく必要性に迫られている。このような目的を達成するためには、ニンニク産地を簡便に識別できることが重要となる。しかしながら、これまでにニンニク産地の識別方法について提案されたことはない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで本発明は、ニンニク産地を簡便に識別する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
ところで、世界各地で栽培されているニンニクは、休眠や発育に要する低温要求性など、その地域の環境に適応した品種が長い時間をかけて選抜・育成され、各地域の環境に最も適応したものが在来種として大切に維持保存されてきている。ニンニクは栄養体で繁殖されるため、一度ウイルスに感染するとその後代までずっとそのウイルスが引き継がれることになる。ニンニクのウイルス病としてはモザイク病が古くから知られており、世界中のニンニク産地での被害が報告されている。
リークイエローストライプウイルス（Leek yellow stripe virus：LYSV）は、世界中のニンニク産地で発生するモザイク病の病原ウイルスのうち、最も分布域の広いウイルスの一つとして知られている。病汁液や昆虫（アブラムシ）で容易に伝染するため、一度感染ニンニクが地域内に持ち込まれると、そこで瞬く間に感染が拡大する。実際に、世界中の一般圃場で栽培されているニンニクのほとんどはLYSVを保毒しており、日本も例外ではない。LYSVはRNA型ウイルスであり、そのゲノム解析は1990年代から始まり、既に、モザイク病症状を示す中国産ニンニクからの分離株の全ゲノム解析が報告されている（例えばChen,J., Chen,J.P. and Adams,M.J. Characterisation of some carla- and potyviruses from bulb crops in China. Arch. Virol. 147(2), 419-428(2002)を参照のこと）
【０００５】
本発明者らは、世界各地のニンニクから分離されたLYSVの遺伝子配列を比較・解析した結果、5'末端領域にニンニク産地と関連した塩基の多様な変異の存在を発見し、その特徴からそのウイルスが感染しているニンニクの産地を識別できることを見出した。
【０００６】
本発明は、上記の知見に基づいてなされたものであり、本発明のニンニク産地識別方法は、請求項1記載の通り、感染しているリークイエローストライプウイルスの遺伝子の地理的変異に基づいて行うことを特徴とする。
また、請求項2記載のニンニク産地識別方法は、請求項1記載のニンニク産地識別方法において、地理的変異を調べる領域が5'非翻訳領域とこれに隣接するP1蛋白質コード領域を少なくとも含むことを特徴とする。
また、請求項3記載のニンニク産地識別方法は、請求項1または2記載のニンニク産地識別方法において、地理的変異が塩基配列の欠失の有無であることを特徴とする。
また、請求項4記載のニンニク産地識別方法は、請求項1または2記載のニンニク産地識別方法において、地理的変異が塩基配列の欠失の長さであることを特徴とする。
また、本発明のニンニク感染LYSV,W-KuのcDNAは、請求項5記載の通り、配列番号1で表されてなることを特徴とする。
また、本発明のニンニク感染LYSV,1A3lのcDNAは、請求項6記載の通り、配列番号2で表されてなることを特徴とする。
また、本発明のニンニク感染LYSV,3mEl7のcDNAは、請求項7記載の通り、配列番号3で表されてなることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、ニンニク産地を簡便に識別する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明のニンニク産地識別方法は、感染しているリークイエローストライプウイルスの遺伝子の地理的変異に基づいて行うことを特徴とするものである。地理的変異を調べる領域としては、多様な変異としての欠失の有無や欠失の長さの相違が存在する5'末端領域、具体的には5'非翻訳領域とこれに隣接するP1蛋白質コード領域を少なくとも含む領域が好適である。本発明者らは、今般、青森県内の複数の産地で栽培されているニンニクから3種類のLYSV（黒石市産ニンニクから強毒株であるW-Kuと1A3l、六戸町産ニンニクから弱毒株である3mEl7）を分離し、ゲノムRNAから逆転写反応によりcDNAを合成してその塩基配列を解析することで、W-Kuは配列番号1で表される10296塩基からなること、1A3lと3mEl7はそれぞれ配列番号2と配列番号3で表される10297塩基からなることを決定し（W-Kuは1A3lと3mEl7が有する10258位のG残基を欠失している）、3種類の塩基配列は互いに約99%という高い相同性を有することを突き止めた。また、これらの青森産ニンニクから分離されたLYSVのcDNAの塩基配列と、配列番号4で表される10142塩基からなる公知の中国産ニンニクから分離されたLYSVのcDNAの塩基配列（前出の文献参照, DDBJ登録番号AJ307057）を比較検討した結果、両者の間には5'非翻訳領域とこれに隣接するP1蛋白質コード領域において相違（欠失の有無）が存在することを見出した。
【０００９】
例えば、前記の青森県六戸町産ニンニクから分離された3mEl7のcDNAの5'非翻訳領域は配列番号3で表される塩基配列の1位〜123位であり、P1蛋白質コード領域は124位〜1395位であるのに対し、前記の中国産ニンニクから分離されたLYSVのcDNAの5'非翻訳領域は配列番号4で表される塩基配列の1位〜90位であり、P1蛋白質コード領域は91位〜1176位である。3mEl7と中国産ニンニクから分離されたLYSVのそれぞれのcDNAの5'非翻訳領域を比較すると、両者は5'末端側では相同性を有するが、後者の3’末端側には30塩基以上の欠失がある。また、両者のP1蛋白質コード領域を比較すると、両者はその両末端では相同性を有するが、後者の中央部付近には50塩基以上の欠失がある。
【００１０】
従って、識別対象となるニンニクが青森県六戸町産か中国産かのいずれかである場合、例えば、3mEl7のcDNAの塩基配列と中国産ニンニクから分離されたLYSVのcDNAの塩基配列の間で共通する連続した15塩基〜25塩基を選択し、選択した塩基からなるプライマーを用いて識別対象となるニンニクから分離したLYSVのゲノムRNAから逆転写反応によりcDNAを合成した後、後者が有する欠失の位置を考慮して、欠失の5'末端側に位置する前者の塩基配列と後者の塩基配列の間で共通する連続した15塩基〜25塩基に相同的なプライマーと、欠失の3'末端側に位置する前者の塩基配列と後者の塩基配列の間で共通する連続した15塩基〜25塩基に相補的なプライマーを用い、後者が有する欠失を挟み込む格好で逆転写反応により合成したcDNAを遺伝子増幅すれば、得られるcDNA断片の塩基数は前者由来のものと後者由来のもので異なるので（後者の方が前者よりも塩基数は欠失分だけ少なくなる）、予め予測されるcDNA断片の塩基数の相違を利用して産地の識別を行うことができる。また、前者に特異的な塩基配列に基づく連続した15塩基〜25塩基に相同的なプライマーと相補的なプライマーを用いて遺伝子増幅すれば、識別対象となるニンニクが青森県六戸町産である場合にのみcDNA断片が得られ、後者に特異的な塩基配列に基づく連続した15塩基〜25塩基に相同的なプライマーと相補的なプライマーを用いて遺伝子増幅すれば、識別対象となるニンニクが中国産である場合にのみcDNA断片が得られるので、予め予測されるcDNA断片が増幅されるか否かの相違を利用して産地の識別を行うこともできる。
【００１１】
なお、識別対象となるニンニクに感染しているLYSVのゲノムRNAの取得は、例えば、ニンニクのLYSV感染部分（葉茎や鱗茎など）から市販のRNA抽出試薬などを用いて行えばよい。
【００１２】
配列番号1〜配列番号3で表されるW-Ku,1A3l,3mEl7のそれぞれのcDNAは、例えば、識別対象となるニンニクが青森県産であるか否かを識別するための標準品として利用することができる。
【実施例】
【００１３】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は、以下の記載に何ら限定して解釈されるものではない。
【００１４】
参考例：
（1）青森県産ニンニクからのLYSVの分離
3種のLYSV分離株（強毒株2株、弱毒株1株）は、青森県産ニンニク（品種：福地ホワイト）から以下のように分離した。強毒野生株（W-Ku）は黒石市の圃場で激しいモザイクと黄化症状を示すニンニクから分離した。もう一つの強毒株（1A3l）は黒石市の圃場で激しいモザイク症状を示すニンニクからLYSVの局部斑点宿主であるキノア（Chenopodium quinoa）で単一病斑分離を行って分離した。弱毒株（3mEl7）は青森県六戸町の圃場で弱いモザイク症状を示すニンニクから分離されたLYSV分離株（LY3mE）からキノアで単一病斑分離を繰り返して分離した。
【００１５】
（2）cDNA合成とその塩基配列決定
分離したLYSVのゲノムRNAは、精製ウイルス粒子からプロテイネースKとSDS存在下でフェノール抽出して得るか、或は、ゲノムRNAを含む全核酸をISOPLANT植物RNA抽出キット（ニッポンジーン、和光純薬、大阪）を用いて、生の或は乾燥させた感染ニンニク葉から直接抽出して得た。LYSVのcDNAは、純化ゲノムRNA或は全核酸を鋳型としてランダムヘキサマー或いはLYSV特異的合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、クローン化AMVファーストストランドcDNA合成キット（インビトロジェン、東京）を用いて逆転写反応により合成した。なお、LYSV特異的合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーは、前出の配列番号4で表される10142塩基からなる公知の中国産ニンニクから分離されたLYSVのcDNAの塩基配列に基づいて設計した。このようにして得られたLYSVのcDNA溶液2μlを、Takara LA Taq（0.5U）、0.8μMのPCRプライマーセット、1×PCR緩衝液、2.5mMの塩化マグネシウム溶液、0.2mMのdNTPsを含む25μlのPCR溶液に入れ、30サイクルのPCR反応でcDNA断片の増幅を行った。増幅したcDNA断片は7.5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、pGEM-Tベクター（プロメガ、東京）に組み込んだ。組換えプラスミドで大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit （キアゲン、東京）で組換えプラスミドを再分離して塩基配列を決定した。塩基配列は、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit （アプライドバイオシステムズ、東京）とABI PRISM 310 Genetic Analyzer （アプライドバイオシステムズ、東京）、或は Thermo Sequenase fluorescent labeled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP （アマシャム・ファルマシアバイオテク、東京）とLi-COR DNA sequencer model 4000（Li-COR、Lincoln、USA）を使用して決定した。W-Ku,1A3l,3mEl7のそれぞれのcDNAの塩基配列は配列番号1〜配列番号3の通りである。
【００１６】
実施例：
実験A：
（工程1）
市販の青森県六戸町産と中国産のニンニクを識別対象とし、参考例に記載の方法と同様にして、それぞれの乾燥鱗片から感染しているLYSVのゲノムRNAを含む全核酸を抽出した。
【００１７】
（工程2）
配列番号3で表される塩基配列の1018位〜1037位および配列番号4で表される塩基配列の799位〜818位に相当する共通する20塩基に相補的なプライマーLY1037R（TCGAGCTGTCTATCATGCAC：配列番号5）を用いて逆転写反応によりLYSVのcDNAを合成した。具体的には、工程1で得たゲノムRNAを含む核酸溶液1μl、LY1037Rプライマー（20pmol/μl）1μl、各2mMのdNTPs 5μl、5倍ファーストストランド緩衝液（インビトロジェン、東京）4μl、0.1Mのジチオスレイトール1μl、SuperscriptIII Reverse transcriptase（インビトロジェン、東京）（200U/μl）1μl、滅菌蒸留水7μlを混合して、55℃で60分、逆転写反応を行った。反応後、70℃で15分間処理し、LYSVのcDNAを得た。
【００１８】
（工程3）
配列番号3で表される塩基配列の5位〜24位および配列番号4で表される塩基配列の12位〜31位に相当する共通する20塩基に相同的なプライマーLY5P（AATCTCAACACAACTTATRC：配列番号6、19番目の塩基は前者がAで後者がG）と、配列番号3で表される塩基配列の931位〜951位および配列番号4で表される塩基配列の712位〜732位に相当する共通する21塩基に相補的なプライマーLY2M（AGTACGTTGCCTGCTCTGTAG：配列番号7）を用いて、LYSVのcDNAを遺伝子増幅した。具体的には、工程2で得たcDNAを含む核酸溶液2μl、LY5Pプライマー（20pmol/μl）1μl、LY2Mプライマー（20pmol/μl）1μl、各2mMのdNTPs 5μl、10倍LA PCR緩衝液（インビトロジェン、東京）5μl、25mMの塩化マグネシウム溶液5μl、LA Taqポリメラーゼ（インビトロジェン、東京）（5U/μl）0.5μl、滅菌蒸留水5.5μlを混合して、95℃で1分の加熱変性後、94℃で30秒、50℃で1分、72℃で3分のサイクルを35回繰り返した。最後に72℃で7分間処理し、cDNA断片の増幅を完了した。
【００１９】
（工程4）
工程3で得た増幅させたcDNA断片を含む反応液の一部を1.5%アガロースゲル或は7.5%ポリアクリルアミドゲルにマウントし、アガロースゲルを用いる場合は50Vの定電圧で、ポリアクリルアミドゲルを用いる場合は25mAの定電流で、1時間〜1時間30分電気泳動した。泳動後、ゲルを臭化エチジウム（10μg/μl）で染色して写真撮影を行った。
【００２０】
（結果）
識別対象が青森県六戸町産ニンニクの場合、予測された947塩基からなるcDNA断片の増幅が観察された。また、識別対象が中国産ニンニクの場合、予測された721塩基からなるcDNA断片の増幅が観察された。よって、検査対象としたニンニクに感染しているLYSVの遺伝子の地理的変異としての塩基配列の欠失の有無や欠失の長さの相違に基づく増幅されたcDNA断片の長さの相違によって、検査対象としたニンニクをそれぞれの産地別に区別することができた。
【００２１】
実験B：
市販の青森県六戸町産と中国産のニンニクを識別対象とし、実験Aと同様の実験を行った。実験Aに記載のLY5Pプライマーと、配列番号4で表される塩基配列に特異的な283位〜302位に相当する20塩基に相補的なプライマーLYCh1M（ATGCGCTTTGCACATAACGC：配列番号8）を用いて、LYSVのcDNAを遺伝子増幅した。その結果、識別対象が青森県六戸町産ニンニクの場合、cDNA断片の増幅は観察されなかったが、識別対象が中国産ニンニクの場合、予測された291塩基からなるcDNA断片の増幅が観察された。
【００２２】
実験C：
市販の青森県六戸町産と中国産のニンニクを識別対象とし、実験Aと同様の実験を行った。配列番号4で表される塩基配列に特異的な283位〜302位に相当する20塩基に相同的なプライマーLYCh2P（GCGTTATGTGCAAAGCGCAT：配列番号9）と、実験Aに記載のLY2Mプライマーを用いて、LYSVのcDNAを遺伝子増幅した。その結果、識別対象が青森県六戸町産ニンニクの場合、cDNA断片の増幅は観察されなかったが、識別対象が中国産ニンニクの場合、予測された450塩基からなるcDNA断片の増幅が観察された。
【００２３】
実験D：
市販の青森県六戸町産と中国産のニンニクを識別対象とし、実験Aと同様の実験を行った。実験Aに記載のLY5Pプライマーと、配列番号3で表される塩基配列に特異的な301位〜320位に相当する20塩基に相補的なプライマーLYAo1M（ATGCGTTGCGCACATAGAGC：配列番号10）を用いて、LYSVのcDNAを遺伝子増幅した。その結果、識別対象が青森県六戸町産ニンニクの場合、予測された316塩基からなるcDNA断片の増幅が観察されたが、識別対象が中国産ニンニクの場合、cDNA断片の増幅は観察されなかった。
【００２４】
実験E：
市販の青森県六戸町産と中国産のニンニクを識別対象とし、実験Aと同様の実験を行った。配列番号3で表される塩基配列に特異的な640位〜658位に相当する19塩基に相同的なプライマーLYLeAo2P（GGAAGCTTCGAAACACCCG：配列番号11）と、実験Aに記載のLY2Mプライマーを用いて、LYSVのcDNAを遺伝子増幅した。その結果、識別対象が青森県六戸町産ニンニクの場合、予測された312塩基からなるcDNA断片の増幅が観察されたが、識別対象が中国産ニンニクの場合、cDNA断片の増幅は観察されなかった。
【００２５】
実験F：
市販の佐賀県産と沖縄県産のニンニクを識別対象とし、実験A〜実験Eと同様の実験を行った。
実験Aに記載のLY5PプライマーとLY2Mプライマーを用いてLYSVのcDNAを遺伝子増幅した。その結果、識別対象が佐賀県産ニンニクの場合、970塩基からなるcDNA断片の増幅が観察された。また、識別対象が沖縄県産ニンニクの場合、955塩基からなるcDNA断片の増幅が観察された。
実験Bに記載のLY5PプライマーとLYCh1Mプライマーを用いてLYSVのcDNAを遺伝子増幅した。その結果、識別対象が佐賀県産ニンニクの場合、294塩基からなるcDNA断片の増幅が観察された。また、識別対象が沖縄県産ニンニクの場合、321塩基からなるcDNA断片の増幅が観察された。
実験Cに記載のLYCh2PプライマーとLY2Mプライマーを用いてLYSVのcDNAを遺伝子増幅した。その結果、識別対象が佐賀県産ニンニクの場合、696塩基からなるcDNA断片の増幅が観察された。また、識別対象が沖縄県産ニンニクの場合、654塩基からなるcDNA断片の増幅が観察された。
実験Dに記載のLY5PプライマーとLYAo1Mプライマーを用いてLYSVのcDNAを遺伝子増幅した。その結果、識別対象が佐賀県産ニンニクの場合も沖縄県産ニンニクの場合も、cDNA断片の増幅は観察されなかった。
実験Eに記載のLYLeAo2PプライマーとLY2Mプライマーを用いてLYSVのcDNAを遺伝子増幅した。その結果、識別対象が佐賀県産ニンニクの場合も沖縄県産ニンニクの場合も、cDNA断片の増幅は観察されなかった。
以上の結果から、識別対象とした佐賀県産と沖縄県産のニンニクは、青森県産ニンニクよりも中国産ニンニクに近似するが、増幅されたcDNA断片の塩基数が全て異なることから、このようにして得られたcDNA断片を地域標準断片とすることで、ニンニクの産地を識別できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明は、ニンニク産地を簡便に識別する方法を提供することができる点において、産業上の利用可能性を有する。
【配列表】
2007043976000001.app