(57)【要約】【課題】  生体の免疫力を向上させるために、生体から抜き出した樹状細胞の前駆体をインビトロで分化誘導し、生体に戻すことによって免疫力を向上させる治療方法（いわゆる免疫細胞治療）において、遺伝子工学によって得た組み換えサイトカインを誘導剤として用いたのでは、効果的な樹状細胞の分化誘導ができなかった。【解決手段】  樹状細胞を抜き出した生体と同種もしくは近似種の生体から得たＴ細胞を抗ＣＤ３抗体で刺激して得たサイトカインの全部（ＴＣＭ）を誘導剤としてインビトロで分化誘導する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌ科動物由来の樹状細胞の前駆体を含む懸濁液を
イヌ科動物由来のＴ細胞に刺激因子を作用させて得られるサイトカイン含有物と共にインビトロで培養し、
樹状細胞を取得することを
特徴とする樹状細胞の分化誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はイヌ科動物の樹状細胞を試験管内（インビトロ）で効率的に分化誘導する方法である。
【背景技術】
【０００２】
近年イヌは愛玩用動物としてだけでなく、伴侶動物（コンパニオンアニマル）として益々人間と密着した存在になってきている。そのため飼い主がイヌにそそぐ愛情も深く、イヌが病気になった場合の治療の要望も多い。一方で、イヌはヒトと同種のガンにかかることが知られており、ヒトのガン治療をイヌに応用することが望まれるところである。
ヒトのガン治療では、外科的に部位を摘出する治療の他に、免疫細胞療法が注目されている。その中でも個体の樹状細胞（Dendritic Cell）の前駆体を入手できる場合は、インビトロで分化誘導させた樹状細胞を個体に返す、いわゆるDC療法が有効である。DC療法の原理は以下のようなものである。
【０００３】
樹状細胞とは、多数の膜突起を有し、リンパ球と相互作用できる細胞である。生体に侵入した抗原に対する反応という観点から見ると、樹状細胞は抗原を取り込み、プロセシングした後、ヘルパーＴ細胞に抗原提示するという役割を担っている。抗原提示を行う細胞（抗原提示細胞）は、他にマクロファージやＢ細胞も知られているが、樹状細胞は抗原提示能力が最も高い細胞である。
【０００４】
ヘルパーＴ細胞への抗原提示は、抗原の無毒化やオプソニン化および抗原に感染した細胞の致死という免疫機能の起動点となる。つまり、抗原提示細胞の活性化は、免疫機能強化の方法として有望である。がん細胞は、本来免疫機能によって排除されるべき自己の異常細胞が、排除されずに増殖したものである。従って、抗原提示細胞ががん細胞の抗体をヘルパーＴ細胞へ提示させることができれば、免疫機能によってがん細胞を駆逐できることが期待される。
【０００５】
DC治療は、個体の樹状細胞の前駆体を取得し、インビトロで樹状細胞を効率的に誘導分化させ、
免疫機能が弱った生体に、がん抗原を提示した活性化樹状細胞をもどすことにより、がん細胞に対する免疫機能を高め、がんなどの治癒を促進させるというものである。
ところで、一般に知られている樹状細胞のインビトロでの分化誘導の方法は以下のようなものがある。
骨髄由来若しくは臍帯血由来の未分化なＣＤ３４陽性細胞、若しくは末梢血単球は樹状細胞の前駆細胞であり、この前駆細胞から、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）などの刺激により、樹状細胞へ分化誘導することが知られている。
【０００６】
また、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４で刺激することにより、樹状細胞の前駆細胞は、未成熟樹状細胞へ分化する。この細胞にさらにＴＮＦα、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０リガンド：ＣＤ４０の配位子）、ＬＰＳ（リボ多糖）等を作用させることにより成熟樹状細胞へと分化する。樹状細胞の前駆体はあらかじめＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦαの三種を同時に作用させることによっても成熟樹状細胞へと分化する。
より具体的に樹状細胞をインビトロで分化誘導させる方法としては、以下のものが紹介されている。
【０００７】
がん細胞に対するワクチンを得る目的で、骨髄や臍帯血の造血未分化細胞、もしくは末梢血単球などの樹状細胞の前駆体に、ケモカインを添加して培地で誘導分化する方法（特許文献１参照）。
免疫寛容性を誘導する樹状細胞を得るために、骨髄液、臍帯血、若しくは末梢血由来の樹状細胞の前駆体を、可溶性ファイブロネクチン、あるいは固相化ファイブロネクチンの存在下で適切な誘導剤と共に培養する方法（特許文献２参照）。
ＥＳ細胞（胚性幹細胞）から樹状細胞を選択的に、かつ効率よく産生する方法（特許文献３参照）。
【特許文献１】特開２０００−１４３５３４号公報
【特許文献２】特開２００２−６５２５３号公報
【特許文献３】特開２００４−３１３０３８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記のように、イヌのガンに対してDC療法を行おうとすると、イヌの樹状細胞をインビトロで効率的に分化誘導する方法が必要となる。
しかし、上記のように樹状細胞をインビトロで分化誘導する方法の開示はあるが、イヌ若しくはイヌ科の動物の樹状細胞に関してのものはない。また、樹状細胞をインビトロで分化誘導するためには、分化誘導剤を用いるが、開示されている分化誘導剤はすべてサイトカインのうちの特定された物質（以後「サイトカイン特定物質」という）、もしくはサイトカイン特定物質の混合物である。
【０００９】
具体的には、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、ＩＬ−１、−２、−３、−４、ＧＭ−ＣＳＦ、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、エリトロポエチン、ＴＮＦ−αなどである。これらの物質は遺伝子工学を用いた遺伝子組み換え体として得られたものが、分化誘導剤として使用される。
ここで、サイトカインについて若干説明しておく。サイトカインとは、細胞から分泌された液性因子をいう。その名称は、リンパ球が抗原などの刺激によって、白血球の分化、増殖、運動能を調整する因子を分泌することが報告され、Ｄｕｍｏｎｄｅら（１９６９）がこれらの活物質をリンフォカインと呼ぶことを提唱したことから始まる。
【００１０】
このような活物質はリンパ球に限らずマクロファージも産生していることがわかり、これをモノカインと呼んだ。その後、リンパ球、マクロファージだけでなく、線維芽細胞、上皮細胞もリンフォカインに似た活物質を産生していることが判明した。Ｃｏｈｅｎらはこれらを総称してサイトカインと呼ぶことを提唱した（１９７７）。
以後の研究で、サイトカインに属する活物質は、次々に特定されていったが、その全様が解明されたわけではない。すなわち、未だに特定されていない活物質の存在の可能性があり、またサイトカイン特定物質間の相互作用についても未知の部分が多い。
その上、ヒト以外の動物のサイトカインでは、実験用として多用されるマウス以外は、ほとんど確認されていないのが実情である。
【００１１】
サイトカインについては、以上のような事情がある。従って、ヒトだけでなく、他の動物の樹状細胞を分化誘導するにも、誘導剤としてヒト由来の遺伝子組み換え体サイトカイン特定物質を用いていた。
しかし、種が異なると同じサイトカイン特定物質でも分化誘導剤としてヒトの細胞に対するのと同程度の効果が発揮できないないという問題がある。また、種によって樹状細胞の分化誘導に要求されるサイトカイン濃度（ドーズ）が異なる可能性もある。さらに、それらの相互作用についても不明な部分があることから、イヌ若しくはイヌ科動物の樹状細胞を効果的に分化誘導を行うことができないという課題があった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明はかかる課題を解決するためになされたものであり、イヌ科動物のＴ細胞を刺激して得られる分泌物であるサイトカインをそのまま全部誘導剤として用い、イヌ科動物の樹状細胞の分化誘導を促進させようとするものである。
上記のようにサイトカインとは、リンパ球、マクロファージ、線維芽細胞、上皮細胞、などが産生する活性物質を総称するものであり、産生元の細胞が異なれば産生する活性物質も異なる。また、細胞等への刺激方法が異なれば、産生する物質も異なる。従って、産生元の細胞と刺激方法を特定して得た天然のサイトカインは、既知の組み換え体として得られるサイトカイン特定物質の混合物とは異なる。
特に、生体における単球から樹状細胞への分化誘導は、感染等の刺激によってT細胞から産生されるサイトカインによるものである。
【００１３】
このサイトカインは、インビトロにおいては、末梢血あるいは脾臓のT細胞を刺激することによって得ることができる。
すなわち、本発明は、イヌ科動物の末梢血単球をスタート材料として、イヌ科の動物のＴ細胞を刺激して得たサイトカインを分離することなく誘導剤として用いることにより、樹状細胞の分化誘導を図る方法である。以後、本発明において用いるＴ細胞を刺激して得たサイトカインをＴＣＭ（Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ）と呼ぶ。なお、ＴＣＭは、ＴＣＭを適当な溶媒で希釈したものを含む。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、イヌ科動物の樹状細胞とイヌ科動物のの生体から得たＴ細胞を抗ＣＤ３抗体で刺激して得たサイトカインを誘導剤としてインビボの状態に近い環境（カルチャー）で樹状細胞を誘導分化させるため、効果的に増殖させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明では、分化誘導剤として、生体と同種もしくは近種から得たＴ細胞を刺激することによって得たＴＣＭを用いる。Ｔ細胞は、生体から得た末梢血単核細胞をナイロンウールカラムに通すことによって、容易に得ることができる。
これに刺激物質を加えてＴＣＭを得る。刺激物質としては抗ＣＤ３抗体が好ましい。
フィトヘムアグリューチニン（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｅ：ＰＨＡ）あるいはコンカナバリンＡ（ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ：Ｃｏｎ  Ａ）などのレクチンも、Ｔ細胞の活性化、増殖をひきおこし、固相ＣＤ３抗体と同様にＴＣＭの産生も高めることができる。
【００１６】
しかしながら、これらのレクチンが生体内に入った場合、微量でも毒性を示すので、ＴＣＭを得る方法としては、望ましくない。
樹状細胞の前駆体として臍帯血、末梢血および骨髄液などを利用できる。樹状細胞の前駆体は生体から採取したものが望ましい。有核細胞を血液から分離するには、フィコール−パックの高比重液を利用する方法が用いられる。
得られた有核細胞からCD１４陽性細胞を分離するには、磁気細胞分離システム（MACS）法などを利用することができる。
【００１７】
樹状細胞の分化誘導は、得られた前駆体をあらかじめ調整したＴＣＭとともに培地で培養する。培地にはＲＰＭＩ−１６４０倍地、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、など市販の培地を用いることができる。また、これらの培地には、ＦＢＳ（牛胎児血清）、ペニシリンやストレプトマイシン等の添加物を適量加えてもよい。
培養環境（カルチャー）は、摂氏３６度から３８度で、二酸化炭素含有量が３〜８％、好ましくは摂氏３７度で二酸化炭素含有量５％の環境がよい。
培養期間は８日以上、１６日以下がよく、１２日前後がより好ましい。
【実施例】
【００１８】
Ｔ細胞の分離
リンパ球分離液（比重１．０７７ｇ／ｍｌ、ナカライテスク社製）を用い、定法にしたがって、健常犬より採取した末梢血から末梢血単核細胞を回収した。ここで、定法は例えば文献（Ｓｕｇｉｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．  （２００４）２０９：６１９−６２７）記載の方法である。
得られた末梢血単核細胞からのＴ細胞の分離は、ナイロンウールファイバー（和光純薬工業）を充填したカラム（ナイロンウールカラム）を用いて、マウスのＴ細胞分離ための公知の方法（栗林ら  「免疫実験操作法Ｖ」１４６１項、日本免疫学会、１９７６）を以下のように改変して行った。
【００１９】
（１）５ｍｌのシリンジにＣａ2+およびＭｇ2+不含りん酸緩衝食塩水（ＰＢＳ（−））に浸漬しておいた０．２５ｇのナイロンウールファイバーを充填し（容積：約３ｍｌ）、高圧蒸気滅菌をした後、シリンジの先に滅菌済み三方活栓（TERUMO（登録商標））および滅菌済み注射針（２３Ｇ×1″、TERUMO）を装着し、３７℃に加温した牛胎児血清（ＦＢＳ）加（１０％）ＲＰＭＩ１６４０培地（加温ＲＰＭＩ１０％ＦＢＳ）で上記ＰＢＳ（−）を置換する。
（２）回収した末梢血単核細胞（８．３×１０7個以下）を１ｍｌの加温ＲＰＭＩ１０％ＦＢＳに浮遊させて、ナイロンファイバーの上にのせ、三方活栓をゆるめてナイロンファイバー中に浸透させる。浸透し終わった時点でさらに少量の加温ＲＰＭＩ１０％ＦＢＳを加え、三方活栓を閉じる。
【００２０】
（３）滅菌したアルミ箔でシリンジの上部を覆い、３７℃５％ＣＯ2の環境下で９０分間インキュベートする。
（４）インキュベーションが終わったら、クリーンベンチ内で、上部アルミ箔の覆いをとり、加温ＲＰＭＩ１０％ＦＢＳを加え、三方活栓をゆるめて、Ｔ細胞を滴下回収する。この場合、回収する容積は、３ｍｌ（ナイロンファイバーの充填容積に同じ）以下にする。
【００２１】
ＴＣＭの作製
ＴＣＭは、固相化した抗ＣＤ３抗体によってＴ細胞を刺激することによって作製した。抗ＣＤ３抗体の固相化およびＴ細胞の培養の方法は、公知の方法（Ｇｅｐｐｅｒｔ  ＴＤ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：１６６０−１６６６）を下記のように改変したものを用いた。
（１）精製した抗イヌＣＤ３抗体（１ｍｇ／ｍｌ：Ｓｅｒｏｔｅｃ  Ｌｔｄ）をＰＢＳ（−）で希釈して５μｇ／ｍｌとし、その１０ｍｌを直径１０ｃｍのカルチャーディシュに入れる。そのカルチャーディシュを３７℃で４時間あるいは６−８℃で１８時間インキュベートして抗ＣＤ３抗体をカルチャーディシュ底面に吸着させる（固相化）。インキュベーションが終わったら、ＰＢＳ（−）でカルチャーディシュ底面を１〜２回緩やかに洗浄して、非吸着の抗ＣＤ３抗体を除く。
【００２２】
（２）２×１０7個の分離T細胞（先述）を１０ｍｌのＲＰＭＩ１０％ＦＢＳに浮遊して、抗ＣＤ３抗体を固相化したカルチャーディシュに加え、３７℃５％ＣＯ2の環境下で２４〜９６時間培養して、T細胞のサイトカイン産生を誘導する。培養後、上清を回収してＴＣＭとする。
【００２３】
ＣＤ１４陽性細胞の取得方法（樹状細胞の前駆体の取得）
ＣＤ１４陽性細胞の分離は、先述の方法によって回収した末梢血単核細胞から（１）抗ヒトＣＤ１４モノクローナル抗体とヤギ抗マウスＩｇＧマイクロビーズ（鉄コロイド標識抗体）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）を用いた磁気細胞分別（ＭＡＣＳ）法と（２）それに続くプラスチックへの付着によって行った。
（１）（ａ）１０8の末梢血単核細胞を１０ｍｌの抗ヒトCD14モノクローナル抗体（ハイブリドーマ株３Ｃ１０の培養上清）に浮遊し、４℃（氷上）で３０分間インキュベートする。その後、冷ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、０．８ｍｌのＦＢＳを２％（ｖ／ｖ）含有するＰＢＳ（−）（ＰＢＳ２％ＦＢＳ）に浮遊する。そこへ０．２ｍｌのヤギ抗マウスIgGマイクロビーズを加え６〜８℃で３０分間インキュベートした後、冷ＰＢＳ（−）で2回洗浄し、１ｍｌの２ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ２％ＦＢＳ（ＰＢＳ−ＥＤＴＡ−ＦＢＳ）に浮遊し、氷上に立てておく。
【００２４】
（ｂ）ＭＡＣＳカラム（ＬＳサイズ：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）をＭＡＣＳセパレーター（磁石）に装着し、カラム内を冷ＰＢＳ−ＥＤＴＡ−ＦＢＳで浸漬する。カラム内にインキュベートした末梢血単核細胞を加えて流す。このときＣＤ１４陽性細胞は、磁気を帯びたカラム中の鉄製のマトリックスに接着することになる。次に、５〜８ｍｌの冷ＰＢＳ−ＥＤＴＡ−ＦＢＳをカラムに加えて流すことによって、カラム内に残っている非接着細胞（ＣＤ１４陰性細胞）を洗い流す。その後、カラムをＭＡＣＳセパレーターよりはずし、マトリックスが磁気を帯びていない環境で、３〜５ｍｌの冷ＰＢＳ−ＥＤＴＡ−ＦＢＳをカラムに流すことによって、マトリックスに接着した細胞を回収する。
【００２５】
（２）回収した細胞を１×１０6／ｍｌの濃度で加温ＲＰＭＩ１０％ＦＢＳに浮遊し、カルチャーディシュ（直径６〜１０ｃｍ）に加え、３７℃５％ＣＯ2の環境下で９０分間インキュベートする。インキュベーションが終わったら、加温ＲＰＭＩ１０％ＦＢＳで緩やかに洗浄することにより、非付着細胞を除く。その後、４℃に冷やした５ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ（−）をカルチャーディシュに加えてディシュ底面に付着している細胞を浮遊させ、回収する。
【００２６】
このようにして回収した細胞は、ほぼ１００％ＣＤ１４陽性である。この細胞に上述のＴＣＭを作用させて樹状細胞を得る。
【００２７】
樹状細胞の分化誘導
上記の様にして得た樹状細胞の前駆体である末梢血単球１×１０6個を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０にＴＣＭを２５％含ませた培地で分化誘導を行った。環境は３７℃５％ＣＯ2である。
【００２８】
結果
図１に培養開始から１２日後に得た、ＴＣＭによって分化誘導した末梢血単球由来樹状細胞の形態を示す。中央にくびれを持った核と広い細胞質をもち、特徴的な長い樹状突起を有する大型の細胞が認められる。
図２に、このような樹状細胞の分化誘導された数と培養日数の関係を示す。図２Ａは、図１に示したような樹状細胞の割合を、そして、図２Ｂは絶対数を示す。それぞれ、培養開始後４日、８日および１２日において測定した結果を同時に示す。さらに、ＴＣＭを含む場合と、ＴＣＭを含まない、すなわちＦＢＳを含む培地のみとの比較も同時に示す。
【００２９】
図２Ａを参照して、ＴＣＭを含む培地での樹状細胞の割合は、培養開始後１２日まで増加し、その後横ばいを示した。また、図２Ｂを参照して、樹状細胞の絶対数は、培養開始後８日をピークとして減少した。一方、ＴＣＭを含有しない培地（培地のみ）では、樹状細胞の絶対数は、日数の経過とともに減少して行き、培養開始後１２日で樹状細胞を含むすべての細胞がほとんどみられなくなった。
図３に樹状細胞への分化誘導能におけるＴＣＭとＭｏｎｏｃｙｔｅ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＣＭ：モノカイン）の比較を示す。
ＭＣＭは次のようにして末梢血単核細胞を培養しただけで得られる分泌物として調製した。
【００３０】
（１）末梢血単球（ＣＤ１４陽性細胞）を上記の方法により、末梢血中の単核細胞より分離する。
（２）１×１０7個の分離単球を５ｍｌのＲＰＭＩ１０％ＦＢＳに浮遊して、カルチャーディシュ（直系６ｃｍ）に加え、３７℃５％ＣＯ2の環境下で４８時間培養する。
（３）培養後、上清を回収してＭＣＭとする。
ＴＣＭを２５％含む培地あるいはＭＣＭを２５％含む培地によって末梢血単球（ＣＤ１４陽性細胞）を８日間培養して、樹状細胞の分化誘導能をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ、べクトン・ディッキンソン社製）によって比較した。
【００３１】
ＴＣＭを培地で培養した細胞のほとんどが、樹状細胞の特徴（サイズが大きく、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）クラスＩＩやＣＤ１ａ抗原の発現が高い（枠内１および２の部分）を示したのに対して、ＭＣＭを含む培地では、非常に少数であった（枠内３および４の部分）。
【００３２】
本発明で使用したＴＣＭはＴ細胞を抗ＣＤ３抗体で刺激した結果得たサイトカインである。このＴＣＭは、マクロファージから得たサイトカインであるモノカイン（ＭＣＭ）より、樹状細胞の分化誘導には有用であることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明はイヌおよびイヌ科動物の樹状細胞の分化誘導に有効な方法を提供するものであり、インビトロで分化誘導した樹状細胞を生体に戻すことによって、生体の免疫機能を向上させるという治療剤に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明で得られた樹状細胞の写真である。
【図２Ａ】本発明の樹状細胞の培養による分化誘導された比率と培養日数の関係を示す図である。
【図２Ｂ】本発明の樹状細胞の培養による分化誘導された絶対数と培養日数の関係を示す図である。
【図３】分化誘導剤としてのＴＣＭとＭＣＭの比較を示す図である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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