(57)【要約】【課題】高い蛍光強度及び良好な経時安定性を有する蛍光性重合体微粒子を提供する。【解決手段】疎水性コアと親水性シェルからなるコアシェル構造を有する重合体微粒子と、該重合体微粒子に内蔵されると共にランタノイド陽イオンを含有する蛍光性ランタノイド色素と、を含む蛍光性樹脂微粒子であって、前記親水性シェルを形成する親水性ポリマーが（メタ）アクリルアミド系親水性ユニット又はビニルアミン系親水性ユニットを含み、且つ該親水性ポリマーの側鎖に、疎水性コアを形成する疎水性ポリマーが結合していることを特徴とする蛍光性重合体微粒子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性コアと親水性シェルからなるコアシェル構造を有する重合体微粒子と、該重合体微粒子に内蔵されると共にランタノイド陽イオンを含有する蛍光性ランタノイド色素と、を含み、前記親水性シェルを形成する親水性ポリマーが、（メタ）アクリルアミド系親水性ユニット及びビニルアミン系親水性ユニットから選ばれる少なくとも１種の親水性ユニットを含む蛍光性重合体微粒子。
【請求項２】
前記親水性ポリマーが、下記一般式（Ｉ）又は一般式（ＩＩ）で表される親水性ユニットの少なくとも１種を含むことを特徴とする請求項１に記載の蛍光性重合体微粒子。
【化１】
2007146149.tif 000049
［式中、Ｒ１及びＲ３は、それぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又はハロゲン原子を表す。Ｒ２は、水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、お互いに結合して含窒素環を形成してもよい。］
【請求項３】
前記親水性ポリマーの側鎖に、疎水性コアを形成する疎水性ポリマーが結合していることを特徴とする請求項１又は２に記載の蛍光性重合体微粒子。
【請求項４】
前記親水性ポリマーが、前記親水性ユニットと、側鎖にエチレン性不飽和結合を有するエチレン性不飽和結合基ユニットとを有する前駆体親水性ポリマーから誘導されたものであることを特徴とする請求項３に記載の蛍光性重合体微粒子。
【請求項５】
前記前駆体親水性ポリマーが、前記親水性ユニットと下記一般式（ＩＩＩ）で表されるエチレン性不飽和結合基ユニットとを含むことを特徴とする請求項４に記載の蛍光性重合体微粒子。
【化２】
2007146149.tif 000050
［上記一般式において、Ｒ６は水素原子又はメチル基を表す。Ｙ１は、酸素原子又は−Ｎ（Ｒ７）−を表す。Ｒ７は水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表す。Ｌ１は、２価の連結基表す。Ｚ１は、アリル基、アリルオキシエチル基、下記一般式（IIIＡ）、又は一般式（IIIＢ）で表される原子団を表す。
【化３】
2007146149.tif 000051
上記一般式において、Ｒ８、Ｒ９は水素原子又はメチル基を表す。ｍは１〜１２を表す。］
【請求項６】
疎水性コアと親水性シェルからなるコアシェル構造を有する重合体微粒子と、該重合体微粒子に内蔵されると共にランタノイド陽イオンを含有する蛍光性ランタノイド色素と、を含み、前記親水性シェルを形成する親水性ポリマーが親水性（メタ）アクリル系マクロモノマー又は親水性ビニル系マクロモノマーで構成され、前記疎水性コアを形成する疎水性ポリマーが、前記親水性（メタ）アクリル系マクロモノマー又は親水性ビニル系マクロモノマーの主鎖の片末端に結合している蛍光性重合体微粒子。
【請求項７】
前記親水性（メタ）アクリル系マクロモノマーが、下記一般式（ＩＶ）で表されるものであり、前記親水性ビニル系マクロモノマーが下記一般式（Ｖ）で表されるものであることを特徴とする請求項６に記載の蛍光性重合体微粒子。
【化４】
2007146149.tif 000052
［上記一般式において、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又はハロゲン原子を表す。Ｒ１５は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。Ｒ１６は、水素原子又はアシル基を表す。Ｒ１７及びＲ１８は、それぞれ独立に水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、互いに結合して含窒素環を形成してもよい。Ｌ１１は２価の連結基を表す。Ｚ１１はポリマー主鎖末端に結合する原子団を表す。ｘ及びｙは１以上の繰り返し数を表し、ｗは０以上の繰り返し数を表す。］
【請求項８】
前記親水性ポリマーが、反応性官能基ユニットを更に含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の蛍光性重合体微粒子。
【請求項９】
前記反応性官能基ユニットが、下記一般式（ＶＩ）で表されるアミノ基含有ユニットであることを特徴とする請求項８に記載の蛍光性重合体微粒子。
【化５】
2007146149.tif 000053
［上記一般式（ＶＩ）において、Ｒ１０は水素原子、メチル基を表す。］
【請求項１０】
重合体微粒子と、前記重合体微粒子に内蔵されると共に、下記一般式（Ｌ−Ｉ）で表される含窒素複素環配位子を少なくとも１個有する蛍光性ランタノイド色素とを含む蛍光性重合体微粒子。
【化６】
2007146149.tif 000054
［一般式（Ｌ−Ｉ）において、Ａ２１、Ａ２２、Ａ２３は、下記一般式（Ｌ−ＩＩ）〜（Ｌ−Ｖ）で表される原子団、または水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アリールアミノ基、ジアリールアミノ基を表し、互いに同一であってもよい。Ｂ２１、Ｂ２２は、それぞれ独立に、窒素原子または＝Ｃ(−Ｒ３０)−を表し、Ｒ３０は水素原子または置換基を表す。
【化７】
2007146149.tif 000055
式中Ｒ２１〜Ｒ２９は、それぞれ独立に水素原子又は置換基を表す。Ｒ２７とＲ２８、Ｒ２８とＲ２９及びＲ２７とＲ２９は、可能な場合には互いに結合して環を形成してもよい。ｎは０、１又は２を表す。Ｇは置換基を有してもよい炭素原子又は窒素原子を表す。Ｑは５員環又は６員環の含窒素複素環を形成するのに必要な原子団を表し、さらに該含窒素複素環は縮合環を形成してもよい。Ａｒ２１は芳香族炭素環又は芳香族複素環を表す。一般式（Ｌ−ＩＩ）〜（Ｌ−Ｖ）において、＃は一般式（Ｌ−Ｉ）で表される含窒素複素環と結合する位置を表す。］
【請求項１１】
前記重合体微粒子が、疎水性コアと親水性シェルからなるコアシェル構造を有することを特徴とする請求項１０に記載の蛍光性重合体微粒子。
【請求項１２】
前記蛍光性ランタノイド色素が、下記一般式（Ｌ−Ｉ）で表される含窒素複素環配位子を少なくとも１個有する蛍光性ランタノイド色素であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の蛍光性重合体微粒子。
【化８】
2007146149.tif 000056
一般式（Ｌ−Ｉ）において、Ａ２１、Ａ２２、Ａ２３は、下記一般式（Ｌ−ＩＩ）〜（Ｌ−Ｖ）で表される原子団、または水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アリールアミノ基、ジアリールアミノ基を表し、互いに同一であってもよい。Ｂ２１、Ｂ２２は、それぞれ独立に、窒素原子または＝Ｃ(−Ｒ３０)−を表し、Ｒ３０は水素原子または置換基を表す。
【化９】
2007146149.tif 000057
式中Ｒ２１〜Ｒ２９は、それぞれ独立に水素原子又は置換基を表す。Ｒ２７とＲ２８、Ｒ２８とＲ２９及びＲ２７とＲ２９は、可能な場合には互いに結合して環を形成してもよい。ｎは０、１又は２を表す。Ｇは置換基を有してもよい炭素原子又は窒素原子を表す。Ｑは５員環又は６員環の含窒素複素環を形成するのに必要な原子団を表し、さらに該含窒素複素環は縮合環を形成してもよい。Ａｒ２１は芳香族炭素環又は芳香族複素環を表す。一般式（Ｌ−ＩＩ）〜（Ｌ−Ｖ）において、＃は一般式（Ｌ−Ｉ）で表される含窒素複素環と結合する位置を表す。］
【請求項１３】
前記蛍光性ランタノイド色素が、下記一般式（Ｌ−ＶＩ）で表されるトリアジン環含有配位子を少なくとも１個有することを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の蛍光性重合体微粒子。
【化１０】
2007146149.tif 000058
［式中Ａ２１は前記一般式（Ｌ−Ｉ）のＡ２１と同じ意味を表す。Ｒ２１、Ｒ２２及びＧは、前記一般式（Ｌ−ＩＩ）のＲ２１、Ｒ２２及びＧと同じ意味を表す。］
【請求項１４】
前記蛍光性ランタノイド色素が、下記一般式（Ｌ−ＶＩＩ）で表されるトリアジン環含有配位子を少なくとも１個有することを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の蛍光性重合体微粒子。
【化１１】
2007146149.tif 000059
［式中Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２７、Ｇ及びＱは、前記一般式（Ｌ−ＩＩ）及び（Ｌ−ＩＶ）のＲ２１、Ｒ２２、Ｒ２７、Ｇ及びＱと同じ意味を表す。］
【請求項１５】
疎水性コアと親水性シェルからなるコアシェル構造を有する重合体微粒子と、該重合体微粒子に内蔵されると共にランタノイド陽イオンを含有する蛍光性ランタノイド色素と、を含む蛍光性重合体微粒子の製造方法であって、
（メタ）アクリルアミド系親水性ユニット及びビニルアミン系親水性ユニットから選ばれる少なくとも１種の親水性ユニットと重合性ユニットとを有する前駆体親水性ポリマーと、ラジカル発生剤との存在下、水系溶媒中で疎水性ラジカル重合性モノマーを分散重合して、親水性シェルを形成する親水性ポリマーに疎水性コアを形成する疎水性ポリマーが結合したコアシェル型の重合体微粒子を形成すること、
得られたコアシェル型の重合体微粒子に、前記ランタノイド色素を導入すること、
を含む蛍光性重合体微粒子の製造方法。
【請求項１６】
前記親水性ユニットが、下記一般式（Ｉ）又は一般式（ＩＩ）で表される親水性ユニットから選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１５に記載の蛍光性重合体微粒子の製造方法。
【化１２】
2007146149.tif 000060
［式中、Ｒ１及びＲ３は、それぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又はハロゲン原子を表す。Ｒ２は、水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、お互いに結合して含窒素環を形成してもよい。］
【請求項１７】
前記重合性ユニットが、エチレン性不飽和結合を側鎖として有するエチレン性不飽和結合基ユニットであることを特徴とする請求項１５又は１６に記載の蛍光性重合体微粒子の製造方法。
【請求項１８】
疎水性コアと親水性シェルからなるコアシェル構造を有する重合体微粒子と、該重合体微粒子に内蔵されると共にランタノイド陽イオンを含有する蛍光性ランタノイド色素と、を含む蛍光性重合体微粒子の製造方法であって、
ポリマー主鎖の片末端に重合性二重結合を有する親水性（メタ）アクリル系マクロモノマー又は親水性ビニル系マクロモノマーと、ラジカル発生剤との存在下、水系溶媒中で疎水性ラジカル重合性モノマーを分散重合して、親水性シェルを形成する親水性ポリマーに疎水性コアを形成する疎水性ポリマーが結合したコアシェル型の重合体微粒子を形成すること、
得られたコアシェル型の重合体微粒子に、前記ランタノイド色素を導入すること、
を含む蛍光性重合体微粒子の製造方法。
【請求項１９】
前記親水性（メタ）アクリル系マクロモノマーが下記一般式（ＩＶ）で表されるものであり、前記親水性ビニル系マクロモノマーが下記一般式（Ｖ）で表されるものであることを特徴とする請求項１８に記載の蛍光性重合体微粒子の製造方法。
【化１３】
2007146149.tif 000061
［上記一般式において、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又はハロゲン原子を表す。Ｒ１５は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。Ｒ１６は、水素原子又はアシル基を表す。Ｒ１７及びＲ１８は、それぞれ独立に水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、互いに結合して含窒素環を形成してもよい。Ｌ１１は２価の連結基を表す。Ｚ１１はポリマー主鎖末端に結合する原子団を表す。ｘ及びｙは１以上の繰り返し数を表し、ｗは０以上の繰り返し数を表す。］
【請求項２０】
前記親水性ポリマーが反応性官能基前駆体ユニットを更に含み、該反応性官能基前駆体ユニットの活性化によって反応性官能基を生成することを更に含む請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の蛍光性重合体微粒子の製造方法。
【請求項２１】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の蛍光性重合体微粒子と、該蛍光性重合体微粒子及び検出対象物質を連結可能な連結物質と、で構成された蛍光検出用複合体。
【請求項２２】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の蛍光性重合体微粒子と、該蛍光性重合体微粒子及び検出対象物質を連結可能な連結物質とを用いて、該検出対象物質を検出する蛍光検出方法。
【請求項２３】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の蛍光性重合体微粒子を含む蛍光検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光性重合体微粒子、蛍光性重合体微粒子の製造方法、蛍光検出キット及び蛍光検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微量な物質を視覚化又は定量するために、種々の標識物が開発されてきた。特に高感度を必要とする分野では、ラジオアイソトープが代表的な標識物であり、トリチウムや放射性ヨウ素等が代表例として用いられている。しかし、放射性物質の使用には、使用後の廃棄や取り扱いに多くの課題があるため、放射性物質に代わる手法が開発された。このような手法としては、例えば酵素標識法（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、又はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ等が利用）や、蛍光物質標識法（フルオレッセイン又はローダミン等が利用）が挙げられる。
しかしこれらの方法では、標識としての絶対的感度が不足するという欠点がある。
【０００３】
測定の精度及び感度を上昇させるために、蛍光物質標識法の一つの発展型として時間分解蛍光測定が開発された（例えば、特許文献１参照）。この方法は、ユーロピウムキレートに代表される蛍光消光時間の長い蛍光物質にパルスの励起光を照射し、直接の励起光や周辺物質に起因する短い蛍光が消光する一定時間の後に蛍光を測定して、ユーロピウム特異的蛍光を測定する方法である。
更に、感度を上げるために、このユーロピウムキレートや色素をポリスチレン粒子に閉じこめ、ポリスチレン粒子の表面に抗原又は抗体をコートして試薬とし、抗原抗体反応によって固定化されたポリスチレン粒子を視覚的に検出しようとする試みもなされている（例えば、特許文献２参照）。
【０００４】
しかし、色素や蛍光物質をポリスチレン粒子に閉じこめて標識物質とする公知の方法では、簡便な操作で或る程度の感度が得られるものであるが、感度的に満足できるものでなく、更なる高感度化が求められていた。
更に、表面が疎水性ポリスチレンであるという特質から、（１）コートしたい抗原又は抗体等の機能性分子を結合した後、非結合表面にタンパク質や種々の生体物質の類似物質をコートしてポリスチレンの疎水性を覆い隠す方法、あるいは、（２）反応時に液体中に界面活性剤を加えてポリスチレン粒子が相互に影響し合うのを防ぐ方法等といった種々の工夫をして用いてきた。しかし、それでも非特異的な反応による判定の誤りが生まれることがあった。
【０００５】
一方、ポリスチレン粒子に起因する非特異的反応を改良するために、水不溶性高分子化合物からなるコアの表面を、反応性基を有する親水性シェル部分でブラシ状に覆ったコアシェル型微粒子を作成し、コア部分に蛍光色素を封入する技術及び、これによって得られた高い蛍光強度を安定して有する蛍光分析用組成物などが開発された（例えば、特許文献３及び４参照）。
【特許文献１】特開昭６１−１２８１６８号公報
【特許文献２】特開２０００−３４５０５２号公報
【特許文献３】国際公開第２００２／０９７４３６号パンフレット
【特許文献４】特開２００５−４９２０７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、このコアシェル型微粒子を利用した方法では、非特異的な反応によるノイズが抑制できるものの、蛍光強度的には満足できるものでない。また、経時安定性が低く、使用期間中に蛍光強度が減少することがある。
本発明の目的は、高い蛍光強度及び良好な経時安定性を有する蛍光性重合体微粒子と、このような蛍光性重合体微粒子を用いて検出対象物質を高感度に検出することができると共に良好な保存安定性を有する蛍光検出用複合体、蛍光検出キット及び蛍光検出方法とを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記の目的を達成すべく、特に重合体微粒子合成時に用いる親水性ポリマー及び蛍光性ランタノイド色素に関して、鋭意検討した結果、本発明に到達した。
すなわち本発明は、以下の通りである。
【０００８】
（１）  疎水性コアと親水性シェルからなるコアシェル構造を有する重合体微粒子と、該重合体微粒子に内蔵されると共にランタノイド陽イオンを含有する蛍光性ランタノイド色素と、を含み、前記親水性シェルを形成する親水性ポリマーが、（メタ）アクリルアミド系親水性ユニット及びビニルアミン系親水性ユニットから選ばれる少なくとも１種の親水性ユニットを含む蛍光性重合体微粒子。
（２）  前記親水性ポリマーが、下記一般式（Ｉ）又は一般式（ＩＩ）で表される親水性ユニットの少なくとも１種を含むことを特徴とする請求項１に記載の蛍光性重合体微粒子。
【０００９】
【化１】
2007146149.tif 000002
【００１０】
［式中、Ｒ１及びＲ３は、それぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又はハロゲン原子を表す。Ｒ２は、水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、お互いに結合して含窒素環を形成してもよい。］
（３）  前記親水性ポリマーの側鎖に、疎水性コアを形成する疎水性ポリマーが結合していることを特徴とする前記（１）又は（２）に記載の蛍光性重合体微粒子。
（４）  前記親水性ポリマーが、前記親水性ユニットと、側鎖にエチレン性不飽和結合を有するエチレン性不飽和結合基ユニットとを有する前駆体親水性ポリマーから誘導されたものであることを特徴とする前記（３）に記載の蛍光性重合体微粒子。
（５）  前記前駆体親水性ポリマーが、前記親水性ユニットと下記一般式（ＩＩＩ）で表されるエチレン性不飽和結合基ユニットとを含むことを特徴とする前記（４）に記載の蛍光性重合体微粒子。
【００１１】
【化２】
2007146149.tif 000003
【００１２】
［上記一般式において、Ｒ６は水素原子又はメチル基を表す。Ｙ１は、酸素原子又は−Ｎ（Ｒ７）−を表す。Ｒ７は水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表す。Ｌ１は、２価の連結基表す。Ｚ１は、アリル基、アリルオキシエチル基、下記一般式（IIIＡ）、又は一般式（IIIＢ）で表される原子団を表す。
【００１３】
【化３】
2007146149.tif 000004
【００１４】
上記一般式において、Ｒ８、Ｒ９は水素原子又はメチル基を表す。ｍは１〜１２を表す。］
（６）  疎水性コアと親水性シェルからなるコアシェル構造を有する重合体微粒子と、該重合体微粒子に内蔵されると共にランタノイド陽イオンを含有する蛍光性ランタノイド色素と、を含み、前記親水性シェルを形成する親水性ポリマーが親水性（メタ）アクリル系マクロモノマー又は親水性ビニル系マクロモノマーで構成され、前記疎水性コアを形成する疎水性ポリマーが、前記親水性（メタ）アクリル系マクロモノマー又は親水性ビニル系マクロモノマーの主鎖の片末端に結合している蛍光性重合体微粒子。
（６）  前記親水性（メタ）アクリル系マクロモノマーが、下記一般式（ＩＶ）で表されるものであり、前記親水性ビニル系マクロモノマーが下記一般式（Ｖ）で表されるものであることを特徴とする前記（６）に記載の蛍光性重合体微粒子。
【００１５】
【化４】
2007146149.tif 000005
【００１６】
［上記一般式において、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又はハロゲン原子を表す。Ｒ１５は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。Ｒ１６は、水素原子又はアシル基を表す。Ｒ１７及びＲ１８は、それぞれ独立に水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、互いに結合して含窒素環を形成してもよい。Ｌ１１は２価の連結基を表す。Ｚ１１はポリマー主鎖末端に結合する原子団を表す。ｘ及びｙは１以上の繰り返し数を表し、ｗは０以上の繰り返し数を表す。］
（８）  前記親水性ポリマーが、反応性官能基ユニットを更に含むことを特徴とする前記（１）〜（７）のいずれか１項に記載の蛍光性重合体微粒子。
（９）  前記反応性官能基ユニットが、下記一般式（ＶＩ）で表されるアミノ基含有ユニットであることを特徴とする前記（８）に記載の蛍光性重合体微粒子。
【００１７】
【化５】
2007146149.tif 000006
【００１８】
［上記一般式（ＶＩ）において、Ｒ１０は水素原子、メチル基を表す。］
【００１９】
（１０）  重合体微粒子と、前記重合体微粒子に内蔵されると共に、下記一般式（Ｌ−Ｉ）で表される含窒素複素環配位子を少なくとも１個有する蛍光性ランタノイド色素とを含む蛍光性重合体微粒子。
【００２０】
【化６】
2007146149.tif 000007
【００２１】
［一般式（Ｌ−Ｉ）において、Ａ２１、Ａ２２、Ａ２３は、下記一般式（Ｌ−II）〜（Ｌ−Ｖ）で表される原子団、または水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アリールアミノ基、ジアリールアミノ基を表し、互いに同一であってもよい。Ｂ２１、Ｂ２２は、それぞれ独立に、窒素原子または＝Ｃ(−Ｒ３０)−を表し、Ｒ３０は水素原子または置換基を表す。
【００２２】
【化７】
2007146149.tif 000008
【００２３】
式中Ｒ２１〜Ｒ２９は、それぞれ独立に水素原子又は置換基を表す。Ｒ２７とＲ２８、Ｒ２８とＲ２９及びＲ２７とＲ２９は、可能な場合には互いに結合して環を形成してもよい。ｎは０、１又は２を表す。Ｇは置換基を有してもよい炭素原子又は窒素原子を表す。Ｑは５員環又は６員環の含窒素複素環を形成するのに必要な原子団を表し、さらに該含窒素複素環は縮合環を形成してもよい。Ａｒ２１は芳香族炭素環又は芳香族複素環を表す。一般式（Ｌ−ＩＩ）〜（Ｌ−Ｖ）において、＃は一般式（Ｌ−Ｉ）で表される含窒素複素環と結合する位置を表す。］
（１１）  前記重合体微粒子が、疎水性コアと親水性シェルからなるコアシェル構造を有することを特徴とする前記（１０）に記載の蛍光性重合体微粒子。
【００２４】
（１２）  前記蛍光性ランタノイド色素が、下記一般式（Ｌ−Ｉ）で表される含窒素複素環配位子を少なくとも１個有する蛍光性ランタノイド色素であることを特徴とする前記（１）〜（９）のいずれか１項に記載の蛍光性重合体微粒子。
【００２５】
【化８】
2007146149.tif 000009
【００２６】
［一般式（Ｌ−Ｉ）において、Ａ２１、Ａ２２、Ａ２３は、下記一般式（Ｌ−II）〜（Ｌ−Ｖ）で表される原子団、または水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アリールアミノ基、ジアリールアミノ基を表し、互いに同一であってもよい。Ｂ２１、Ｂ２２は、それぞれ独立に、窒素原子または＝Ｃ(−Ｒ３０)−を表し、Ｒ３０は水素原子または置換基を表す。
【００２７】
【化９】
2007146149.tif 000010
【００２８】
式中Ｒ２１〜Ｒ２９は、それぞれ独立に水素原子又は置換基を表す。Ｒ２７とＲ２８、Ｒ２８とＲ２９及びＲ２７とＲ２９は、可能な場合には互いに結合して環を形成してもよい。ｎは０、１又は２を表す。Ｇは置換基を有してもよい炭素原子又は窒素原子を表す。Ｑは５員環又は６員環の含窒素複素環を形成するのに必要な原子団を表し、さらに該含窒素複素環は縮合環を形成してもよい。Ａｒ２１は芳香族炭素環又は芳香族複素環を表す。一般式（Ｌ−ＩＩ）〜（Ｌ−Ｖ）において、＃は一般式（Ｌ−Ｉ）で表される含窒素複素環と結合する位置を表す。］
【００２９】
（１３）  前記蛍光性ランタノイド色素が、下記一般式（Ｌ−ＶＩ）で表されるトリアジン環含有配位子を少なくとも１個有することを特徴とする前記（１）〜（１２）のいずれか１項に記載の蛍光性重合体微粒子。
【００３０】
【化１０】
2007146149.tif 000011
【００３１】
［式中Ａ２１は前記一般式（Ｌ−Ｉ）のＡ２１と同じ意味を表す。Ｒ２１、Ｒ２２及びＧが前記一般式（Ｌ−ＩＩ）のＲ２１、Ｒ２２及びＧと同じ意味を表す。］
（１４）  前記蛍光性ランタノイド色素が、下記一般式（Ｌ−ＶＩＩ）で表されるトリアジン環含有配位子を少なくとも１個有することを特徴とする前記（１）〜（１３）のいずれか１項に記載の蛍光性重合体微粒子。
【００３２】
【化１１】
2007146149.tif 000012
【００３３】
［式中Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２７、Ｇ及びＱは、前記一般式（Ｌ−ＩＩ）及び（Ｌ−ＩＶ）のＲ２１、Ｒ２２、Ｒ２７、Ｇ及びＱと同じ意味を表す。］
【００３４】
（１５）  疎水性コアと親水性シェルからなるコアシェル構造を有する重合体微粒子と、該重合体微粒子に内蔵されると共にランタノイド陽イオンを含有する蛍光性ランタノイド色素と、を含む蛍光性重合体微粒子の製造方法であって、（メタ）アクリルアミド系親水性ユニット及びビニルアミン系親水性ユニットから選ばれる少なくとも１種の親水性ユニットと重合性ユニットとを有する前駆体親水性ポリマーと、ラジカル発生剤との存在下、水系溶媒中で疎水性ラジカル重合性モノマーを分散重合して、親水性シェルを形成する親水性ポリマーに疎水性コアを形成する重合性ポリマーが結合したコアシェル型の重合体微粒子を形成すること、得られたコアシェル型の重合体微粒子に、前記ランタノイド色素を導入すること、を含む蛍光性重合体微粒子の製造方法。
（１６）  前記親水性ユニットが、下記一般式（Ｉ）又は一般式（ＩＩ）で表される親水性ユニットから選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする前記（１５）に記載の蛍光性重合体微粒子の製造方法。
【００３５】
【化１２】
2007146149.tif 000013
【００３６】
［式中、Ｒ１及びＲ３は、それぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又はハロゲン原子を表す。Ｒ２は、水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、お互いに結合して含窒素環を形成してもよい。］
（１７）  前記重合性ユニットが、エチレン性不飽和結合を側鎖として有するエチレン性不飽和結合基ユニットであることを特徴とする前記（１５）又は（１６）に記載の蛍光性重合体微粒子の製造方法。
【００３７】
（１８）  疎水性コアと親水性シェルからなるコアシェル構造を有する重合体微粒子と、該重合体微粒子に内蔵されると共にランタノイド陽イオンを含有する蛍光性ランタノイド色素と、を含む蛍光性重合体微粒子の製造方法であって、ポリマー主鎖の片末端に重合性二重結合を有する親水性（メタ）アクリル系マクロモノマー及び／又は親水性ビニル系マクロモノマーと、ラジカル発生剤との存在下、水系溶媒中で疎水性ラジカル重合性モノマーを分散重合して、親水性シェルを形成する親水性ポリマーに疎水性コアを形成する重合性ポリマーが結合したコアシェル型の重合体微粒子を形成すること、得られたコアシェル型の重合体微粒子に、前記ランタノイド色素を導入すること、を含む蛍光性重合体微粒子の製造方法。
（１９）  前記親水性（メタ）アクリル系マクロモノマーが下記一般式（ＩＶ）で表されるものであり、前記親水性ビニル系マクロモノマーが下記一般式（Ｖ）で表されるものであることを特徴とする前記（１８）に記載の蛍光性重合体微粒子の製造方法。
【００３８】
【化１３】
2007146149.tif 000014
【００３９】
［上記一般式において、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又はハロゲン原子を表す。Ｒ１５は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。Ｒ１６は、水素原子又はアシル基を表す。Ｒ１７及びＲ１８は、それぞれ独立に水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、互いに結合して含窒素環を形成してもよい。Ｌ１１は２価の連結基を表す。Ｚ１１はポリマー主鎖末端に結合する原子団を表す。ｘ及びｙは１以上の繰り返し数を表し、ｗは０以上の繰り返し数を表す。］
（２０）  前記親水性ポリマーが反応性官能基前駆体ユニットを更に含み、該反応性官能基前駆体ユニットの活性化によって反応性官能基を生成することを更に含む前記（１５）〜（１９）のいずれか１項に記載の蛍光性重合体微粒子の製造方法。
【００４０】
（２１）  前記（１）〜（１４）のいずれか１項に記載の蛍光性重合体微粒子と、該蛍光性重合体微粒子及び検出対象物質を連結可能な連結物質と、で構成された蛍光検出用複合体。
（２２）  前記（１）〜（１４）のいずれか１項に記載の蛍光性重合体微粒子と、該蛍光性重合体微粒子及び検出対象物質を連結可能な連結物質とを用いて、該検出対象物質を検出する蛍光検出方法。
（２３）  前記（１）〜（１４）のいずれか１項に記載の蛍光性重合体微粒子を含む蛍光検出キット。
【００４１】
本発明の蛍光性重合微粒子は、疎水性コアと親水性シェルからなるコアシェル構造を有する重合体微粒子を含んでいる。親水性シェルが特定の親水性ポリマーを含んでいることにより、この親水性シェルの蛍光性ランタノイド色素に対する親和性を低くすることができ、安定して疎水性コアに蛍光性ランタノイド色素を維持することができる。また、蛍光性ランタノイド色素として特定の蛍光性ランタノイド色素を含んでいることにより、可視光で励起することができると共に高い蛍光強度の蛍光性重合体微粒子を得ることができる。
【発明の効果】
【００４２】
本発明によれば、高い蛍光強度及び良好な経時安定性を有する蛍光性重合体微粒子と、このような蛍光性重合体微粒子を用いて検出対象物質を高感度に検出することができると共に良好な保存安定性を有する蛍光検出用複合体、蛍光検出キット及び蛍光検出方法とを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
本発明の蛍光性重合体微粒子は、疎水性コアと親水性シェルからなるコアシェル構造を有する重合体微粒子と、該重合体微粒子に内蔵されると共にランタノイド陽イオンを含有する蛍光性ランタノイド色素と、を含む蛍光性重合体微粒子であって、前記親水性シェルを形成する親水性ポリマーが、アクリルアミド系親水性ユニット及びビニルアミン系親水性ユニットから選ばれる少なくとも１種の親水性ユニットを含むことを特徴としている。
このような蛍光性重合体微粒子では、前記親水性シェルを形成する親水性ポリマーに、蛍光性ランタノイド色素に対する親和性が低い（メタ）アクリルアミド系親水性ユニット及びビニルアミン系親水性ユニットから選ばれる少なくとも１種が含まれている。この結果、重合体微粒子の表面（親水性シェル）との相互作用が抑制され、蛍光性ランタノイド色素が重合体微粒子コアに安定に取り込まれることを可能とする。
【００４４】
特に、本発明の重合体微粒子の疎水性コアを形成する疎水性ポリマーが、上記親水性ポリマーの側鎖に結合している場合には、親水性ポリマーが分岐した形で疎水性コアに結合する形（以下に一例を示す）となり、立体障害の効果から重合体微粒子が安定に分散され、また、重合体微粒子を構成する親水性シェルの密度を容易に高めて、蛍光性ランタノイド色素をより安定して疎水性コアに維持することができる。
以下、本発明を更に詳細に説明する。
【００４５】
【化１４】
2007146149.tif 000015
【００４６】
＜親水性ポリマー＞
本発明にかかる重合体微粒子の親水性シェルを構成する親水性ポリマーは、親水性に寄与すると共に蛍光性ランタノイド色素に対する親和性が低い（メタ）アクリルアミド系親水性ユニット及びビニルアミン系親水性ユニットから選ばれる少なくとも１種を有している。（メタ）アクリルアミド系親水性ユニットとしては、（メタ）アクリルアミド由来の骨格を有するものであればよく、ビニルアミン系親水性ユニットとしてはビニルアミン由来の骨格を有するものであればよい。
本発明においては、上記（メタ）アクリルアミド系親水性ユニットは、下記一般式（Ｉ）で表される親水性ユニットであることが好ましく、また、上記ビニルアミン系親水性ユニットは、下記一般式（ＩＩ）で表される親水性ユニットであることが好ましい。
【００４７】
【化１５】
2007146149.tif 000016
【００４８】
上記一般式（Ｉ）及び一般式（ＩＩ）において、Ｒ１及びＲ３は、それぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又はハロゲン原子を表す。中でも、粒子形成性の観点から、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基（メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基）又はハロゲン原子であることが好ましく、水素原子又はメチル基であることがより好ましい。
また、Ｒ２は、水素原子、炭素数１〜４のアルキル基（メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基等）を表し、このうち、Ｒ２としては、粒子形成性および脱保護によるアミノ基生成の観点から水素原子、メチル基が好ましい。
【００４９】
また、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６のアルキル基を表す。Ｒ４及びＲ５がアルキル基の場合、該アルキル基は置換基を有していてもよく、また、お互いに結合して含窒素環を形成してもよい。アルキル基の例として、メチル基、エチル基、プロピル基等を挙げることができる。お互いに結合して含窒素環を形成している場合の含窒素環の例としては、ピロリジン環、ピペラジン環、モルホリン環、ピロリドン環、ピロール環等を挙げることができる。これらのうち、Ｒ４及びＲ５として、は親水性ポリマーの親水性及び粒子形成性の観点から、Ｒ４がメチル基かつＲ５が水素原子であること、又は、Ｒ４とＲ５とでピロリドン環を形成することが好ましい。
【００５０】
本発明においては、一般式（Ｉ）で表される親水性ユニットが、Ｒ１が水素原子又はメチル基であって、Ｒ２が水素原子又はメチル基であることが好ましい。また、一般式（ＩＩ）で表される親水性ユニットが、Ｒ３が水素原子又はメチル基であって、Ｒ４がメチル基かつＲ５が水素原子又は、Ｒ４及びＲ５でピロリドン環を形成することが好ましい。
【００５１】
本発明にかかる重合体微粒子は、親水性ポリマーの高密度化の観点から、疎水性コアを形成する疎水性ポリマーが親水性ポリマーの側鎖に結合していることが好ましい。重合体微粒子を形成する親水性ポリマーは、（メタ）アクリルアミド系親水性ユニット又はビニルアミン系親水性ユニットと、重合性基を有する重合性ユニットとを含む前駆体親水性ポリマーを用いて得ることができるが、本発明における前駆体親水性ポリマーにおいては、前駆体親水性ポリマー中の重合性ユニットが側鎖に重合性基を有していることが好ましい。
このような前駆体親水性ポリマーは、水系溶媒中に溶解し、後述の疎水性ラジカル重合性モノマーとラジカル発生剤との反応によって生成したラジカル種と反応することができる。その結果、疎水性ラジカル重合性モノマーの重合体を疎水性コアとし、親水性ポリマーを親水性シェルとする微粒子を形成することができる。ここで親水性ポリマーは、側鎖に重合性基を有しているので、疎水性コア表面に結合したときに、立体反発による重合体微粒子の良好な分散安定化の作用を示すことができる。
【００５２】
上記前駆体親水性ポリマー中の重合性基ユニットは、下記一般式（ＩＩＩ）で表される重合性エチレン性不飽和基ユニットであることが、粒子形成性の観点から好ましい。
【００５３】
【化１６】
2007146149.tif 000017
【００５４】
上記一般式（ＩＩＩ）において、Ｒ６は水素原子、メチル基を表す。Ｙ１は、酸素原子又は−Ｎ（Ｒ７）−を表す。Ｒ７は水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基（メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等）を表し、分岐または環状構造をとってもよい。
Ｌ１は、２価の連結基を表し、例として、単結合、炭素数１〜６のアルキレン基、炭素数１〜６のアルキレンオキシ基、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−およびこれらの組み合わせによって形成される２価の原子団を表す。
Ｚ１は、アリル基、アリルオキシエチル基、下記一般式（IIIＡ）又は一般式（IIIＢ）で表される原子団を表す。下記一般式（IIIＡ）及び（IIIＢ）において、Ｒ８、Ｒ９は水素原子、メチル基を表す。また一般式（IIIＡ）において、ｍは１〜１２を表し、ポリマーの親水性及び粒子の形成性の観点から好ましくは１〜６である。
【００５５】
【化１７】
2007146149.tif 000018
【００５６】
本発明にかかる親水性ポリマーは、後述する連結物質［例えば、生理活性物質（例えば、抗体、酵素、又は核酸等）］と連結可能な反応性官能基を有することが好ましい。
反応性官能基は、上記親水性ポリマー中のユニットとして前駆体親水性ポリマー形成時に導入してもよく及び／又は、後述するコア部分表面に結合させた後に親水性ポリマーに導入することもできる。前駆体親水性ポリマー形成時に反応性官能基ユニットとして導入することが、反応性官能基反応性の導入率を調整することができるため好ましい。
【００５７】
これらの反応性官能基は、いずれも水（又は水系溶媒）中で安定であり、しかも、本発明の蛍光性重合体微粒子を標識物質として使用する際の連結物質［例えば、生理活性物質（例えば、抗体、酵素、又は核酸等）］と反応可能な官能基である限り、特に限定されるものではない。重合体微粒子表面に設ける官能基として好適なのは、アルデヒド基、カルボキシル基、メルカプト基、酸塩化物基等の酸ハロゲン化物基、酸無水物基、エステル基、アミド基、マレイミド基、ビニルスルホン基、メタンスルホニルオキシ基、チオール基、水酸基、およびアミノ基等で、中でもアルデヒド基、カルボキシル基、酸塩化物基、酸無水物基、マレイミド基、チオール基、アミノ基等が更に好適で、アルデヒド基、マレイミド基、チオール基及びアミノ基が最も好適である。なお、エステル基は加水分解により容易にカルボキシル基に変換できるので、エステル基を表面に有する重合体微粒子は有用な中間体である。
これらの連結物質を結合するための官能基量は、本発明の重合体微粒子の単位質量当たりの官能基当量として表現すると、通常、０．００１〜０．５ミリ当量／グラム、好ましくは０．００５〜０．２ミリ当量／グラム、より好ましくは０．０１〜０．１ミリ当量／グラム、更に好ましくは０．０２〜０．０７ミリ当量／グラム、最も好ましくは０．０３〜０．０５ミリ当量／グラムである。
【００５８】
アミノ基を導入するための反応性官能基ユニットとしては、下記一般式（ＶＩ）で表されるアミノ基含有ユニットであることが、粒子形成性および連結物質としての生理活性物質との結合親和性の観点から好ましく、このアミノ基含有ユニットは、前駆体親水性ポリマー中の下記一般式（ＶＩ−１）で表されるアミノ基前駆体ユニットから誘導されたものであることが好ましい。
【００５９】
【化１８】
2007146149.tif 000019
【００６０】
上記一般式において、Ｒ１０は水素原子又はメチル基を表す。Ｒ２０はアシル基を表す。Ｒ２０で表されるアシル基としては、ホルミル基又はアセチル基が好ましい。
上記一般式（ＶＩ−１）で表されるアミノ基前駆体ユニットを前駆体親水性ポリマーに導入することにより、本発明の蛍光性重合体微粒子の表面に例えば抗原又は抗体を結合するために反応性基として好ましいアミノ基を、主鎖中に多数導入することができる。特に、本親水性ポリマーは、側鎖に重合性ポリマーが結合しているので、主鎖中のアミノ基の位置に制限はなく、いずれの位置にも導入することができる。
【００６１】
本発明における前駆体親水性ポリマーは、例えば、カルボン酸含有ポリマーを合成し、該ポリマーにエチレン性不飽和基を含有する化合物を反応させることで得ることができる。カルボン酸含有ポリマーを合成するには、例えば下記一般式（ＶＩＩ）又は下記一般式（ＶＩＩＩ）で表される公知のラジカル重合性モノマーと、下記一般式（ＩＸ）で表される公知のラジカル重合性モノマーとを、後述のラジカル発生剤の存在下でラジカル重合することによって合成することができる。ここで下記一般式（ＶＩＩ）又は下記一般式（ＶＩＩＩ）で表される公知のラジカル重合性モノマーは１種単独でも２種以上を組合せて用いてもよく、下記一般式（ＩＸ）で表される公知のラジカル重合性モノマーは１種単独でも２種以上を組合せて用いてもよい。
また反応性官能基ユニットを親水性ポリマーに導入する場合には、例えば下記一般式（Ｘ）で表される公知のラジカル重合性モノマーを前述と同様に使用して、反応性官能基ユニットを有する親水性ポリマーを得ることができる。
【００６２】
【化１９】
2007146149.tif 000020
【００６３】
上記一般式（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）及び（Ｘ）において、Ｌ１、Ｒ1、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１０、及びＲ２０は、前記一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＶＩ）及び（ＶＩ−１）におけるＬ１、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１０、及びＲ２０と同じ意味を表す。
一般式（ＶＩＩ）又は（ＶＩＩＩ）で表されるモノマーの量は、目的とする前駆体親水性ポリマーのサイズ及び種類によって異なるが、ポリマーの親水性、粒子分散性の観点から、反応する全モノマー中０〜９９モル％の範囲が好ましく、１０〜９０モル％が更に好ましく、２０〜８０モル％が特に好ましい。
一般式（ＩＸ）で表されるモノマーの量は、目的とする前駆体親水性ポリマーのサイズ及び種類によって異なるが、粒子形成に必要なエチレン性不飽和結合導入量の観点から、反応する全モノマー中０．１〜５０モル％の範囲が好ましく、０．５〜２０モル％が更に好ましく、１〜１０モル％が特に好ましい。
一般式（Ｘ）で表されるモノマーの量は、目的とする前駆体親水性ポリマーのサイズ及び種類によって異なるが、生理活性物質との結合量の観点から、反応する全モノマー中１〜９９モル％の範囲が好ましく、２〜８０モル％が更に好ましく、５〜６０モル％が特に好ましい。
【００６４】
前駆体親水性ポリマーを形成する重合反応において、溶媒としては、親水性ポリマー形成用のラジカル重合性モノマーを溶解する溶媒、例えば、エタノール、１−メトキシ−２−プロパノール、ジメチルアセトアミド、水、ジメチルスルホキシドおよびこれらの混合物を使用できる。モノマー濃度は、分子量制御及び反応安定性の観点から、モノマーと溶媒の合計質量に対して１０〜５０質量％の範囲が好ましく、１５〜４０質量％の範囲がより好ましい。ラジカル発生剤は、必要とする分子量に応じ適宜使用量を設定できるが、モノマーの総量に対し、安定な重合性、親水性ポリマーを用いた粒子形成性の観点から０．０１〜２モル％の範囲が好ましく、０．１〜１モル％の範囲がより好ましい。反応温度は、使用する開始剤の分解温度に応じて適宜設定できるが、４０℃〜１００℃が好ましく、６０〜８０℃がより好ましい。
【００６５】
次に、上記で得られたカルボン酸含有ポリマーを、エチレン性不飽和基を含有する化合物と反応させることにより、エチレン性不飽和結合を含有する前駆体親水性ポリマーを合成することができる。
例えば、エチレン性不飽和結合を有する化合物として、アリルアルコール、アリルオキシエチルアルコール、アクリル酸ヒドロキシエチル、メタクリル酸ヒドロキシエチル等のアルコールを用い、カルボン酸とのエステル化反応により、ポリマー側鎖にエチレン性不飽和結合を導入することができる。この場合、触媒として、硫酸、塩酸、トルエンスルホン酸等の酸を使用できる他、縮合剤として、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等のカルボジイミド化合物を用いることもできる。更に、エチレン性不飽和結合を有する化合物として、メタクリル酸グリシジル等のエポキシド化合物を用い、エポキシドの開環反応により、ポリマー側鎖にエチレン性不飽和結合を導入することも可能である。この場合、触媒としてテトラブチルアンモニウムクロリド、テトラブチルアンモニウムブロミド等の４級アンモニウム化合物、テトラブチルホスホニウムブロミド等の４級ホスホニウム化合物または、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｎ−ドデシルアミン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン、４−ジメチルアミノピリジン等のアミン化合物を用いることができる。
【００６６】
本発明にかかる前駆体親水性ポリマーの数平均分子量は、特に制限されないが、親水性および粒子形成性の観点から５００〜２０，００００が好ましく、１，０００〜１００，０００が更に好ましい。
前駆体親水性ポリマーを合成するためには、親水性、溶剤溶解性等を調節する目的で、上記（ＶＩＩ）〜（Ｘ）で表されるモノマーに加えて、公知のラジカル重合性モノマーを上記モノマーに共重合することもできる。
公知のラジカル重合性モノマーとしては、例えば、スチレン、メチルスチレン、クロロメチルスチレン、４−メトキシスチレン、４−アセトキシスチレン等のスチレン系モノマー、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸ヘキシル、（メタ）アクリル酸オクチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル、（メタ）アクリル酸シクロヘキシル、（メタ）アクリル酸ドデシル、（メタ）アクリル酸ステアリル、（メタ）アクリル酸フェニル、（メタ）アクリル酸ベンジル、（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチル等の（メタ）アクリル酸エステル類、酢酸ビニル、ビニルイミダゾール等のビニルモノマーを挙げることができる。これらのラジカル重合性モノマーの共重合量としては、全親水性ポリマーに対して０〜３０モル％が好ましく、０〜１０モル％がより好ましい。
【００６７】
以下に本発明にかかる前駆体親水性ポリマーの具体例として、例示化合物Ｐ−１〜Ｐ３９を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではない。また、式中の組成比は、モル比を表す。
【００６８】
【化２０】
2007146149.tif 000021
【００６９】
【化２１】
2007146149.tif 000022
【００７０】
【化２２】
2007146149.tif 000023
【００７１】
【化２３】
2007146149.tif 000024
【００７２】
【化２４】
2007146149.tif 000025
【００７３】
（合成例）
＜例示化合物Ｐ−１の合成＞
窒素気流下、アクリルアミド１９．１９ｇ、メタクリル酸０．７７ｇ、Ｎ−ビニルアセトアミド１．７９ｇを、Ｎ，Ｎ―ジメチルアセトアミド９０ｇに溶解し、６０℃に加熱した。次に２,２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）０．３７ｇを加え、６０℃で２時間攪拌した後、７０℃に昇温して２時間攪拌した。室温まで冷却後、反応混合物をエタノールに注ぎ、析出したポリマーを吸引ろ過し、室温で真空乾燥した。２１．５ｇのポリマーが得られた。０．１Ｎの水酸化カリウム水溶液で、滴定し酸価を測定したところ、このポリマー１ｇあたり、０．４１ミリモルの酸が含有されていた。またＧＰＣ測定からこのポリマーの数平均分子量Ｍｎは６５００であった。
【００７４】
次に、上記で得られたポリマー２０ｇ、アリルアルコール９．５ｇ、ジメチルアミノピリジン０．１ｇを蒸留水１００ｇに溶解し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩１５ｇを添加し、室温で１昼夜攪拌した。この反応混合物を、エタノール１Ｌ中に注ぎ、沈殿したポリマーを吸引ろ過後、室温で真空乾燥し、１９．８ｇのポリマー（前駆体親水性ポリマーＰ−１）を得た。０．１Ｎ水酸化カリウム水溶液による滴定では、酸含有量がポリマー１ｇあたり、０．０１ミリモル以下であり、カルボン酸がほぼアリルアルコールでエステル化されていることが判った。
【００７５】
＜例示化合物Ｐ−２９＞
窒素気流下、Ｎ−ビニルホルムアミド１３．３６ｇ、Ｎ−ビニルピロリドン２２．２３ｇ、ＮＫエステルＳＡ（新中村化学（株）製）２．７６ｇを、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１１４ｇに溶解し、６０℃に加熱した。次に２,２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）０．５ｇを加え、６０℃で４時間攪拌した後、７５℃に昇温して２時間攪拌した。室温まで冷却後、反応混合物にＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド５０ｇを加えて希釈した。次にこれを酢酸エチル２．５Ｌに注ぎ、析出したポリマーを吸引ろ過し、室温で真空乾燥した。３７ｇのポリマー（ＰＰ−１）が得られた。０．１モル／Ｌの水酸化カリウム水溶液で、滴定し酸価を測定したところ、このポリマー１ｇあたり、０．２８ミリモルの酸が含有されていた。またＧＰＣ測定からこのポリマーの数平均分子量Ｍｎは９０００であった。
【００７６】
次に、上記で得られたポリマー（ＰＰ−１）２４ｇをジメチルスルホキシド９６ｇに溶解し、アリルアルコール４．７ｇ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン０．２７ｇ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド５．１ｇを加え、４０℃で４時間攪拌した。次に、酢酸２ｇ、３０ｇのエタノールを加え、４０℃で２時間攪拌し、室温まで冷却した。次にこの反応混合物を、酢酸エチル２Ｌ中に注ぎ、沈殿したポリマーを吸引ろ過後、室温で真空乾燥し、２３ｇの前駆体親水性ポリマーＰ−２９を得た。０．１モル／Ｌの水酸化カリウム水溶液による滴定では、酸が検出されず、ポリマー中のカルボン酸がアリルアルコールとの反応によって消失していることが判った。またＧＰＣ測定からこの前駆体親水性ポリマーＰ−２９の数平均分子量Ｍｎは９０００であった。
【００７７】
＜例示化合物Ｐ−３２の合成＞
上記親水性ポリマーＰ−２９の合成の過程で得られたポリマー（ＰＰ−１）１２ｇをジメチルスルホキシド４８ｇに溶解し、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル５．２６ｇ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン０．１３ｇ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド２．６ｇを加え、４０℃で４時間攪拌した。次に、酢酸１ｇ、２０ｇのエタノールを加え、４０℃で２時間攪拌し、室温まで冷却した。次にこの反応混合物を、酢酸エチル１．５Ｌ中に注ぎ、沈殿したポリマーを吸引ろ過後、室温で真空乾燥し、９ｇの前駆体親水性ポリマーＰ−３２を得た。０．１モル／Ｌの水酸化カリウム水溶液による滴定では、酸が検出されず、ポリマー中のカルボン酸がメタクリル酸ヒドロキシエチルとの反応によって消失していることが判った。またＧＰＣ測定からこの前駆体親水性ポリマーＰ−３２の数平均分子量Ｍｎは９１００であった。
【００７８】
本発明の蛍光性重合体微粒子は、疎水性コアと親水性シェルからなるコアシェル構造を有する重合体微粒子と、該重合体微粒子に内蔵されると共にランタノイド陽イオンを含有する蛍光性ランタノイド色素と、を含む蛍光性重合体微粒子であって、前記親水性シェルを形成する親水性ポリマーが親水性（メタ）アクリル系マクロモノマー又は親水性ビニル系マクロモノマー（以下、両者をまとめて「親水性マクロモノマー」ということがある）で構成され、前記疎水性コアを形成する疎水性ポリマーが、前記親水性（メタ）アクリル系マクロモノマー又は親水性ビニル系マクロモノマーの主鎖の片末端に結合していることを特徴としている。
【００７９】
本発明の蛍光性重合体微粒子では、蛍光性ランタノイド色素に対する親和性が低い親水性（メタ）アクリル系マクロモノマー又は親水性ビニル系マクロモノマーにより親水性シェルが形成されていると共に、この親水性（メタ）アクリル系マクロモノマー主鎖又は親水性ビニル系マクロモノマー主鎖の片末端に、疎水性コアを形成する疎水性ポリマーが結合している。この結果、重合体微粒子の表面（親水性シェル）との相互作用が抑制され、蛍光性ランタノイド色素が重合体微粒子コアに安定に取り込まれることが可能となる。これにより、安定して疎水性コアに蛍光性ランタノイド色素を維持し、高い蛍光強度で且つ経時安定性に優れた蛍光性重合体微粒子とすることができる。
特に、片末端に疎水性ポリマーが結合するため、親水性（メタ）アクリル系マクロモノマー又は親水性ビニル系マクロモノマーの主鎖を容易に機能化することができ、例えば反応性官能基を多量に導入することができる（以下に、１例を示す）。
【００８０】
【化２５】
2007146149.tif 000026
【００８１】
＜親水性マクロモノマー＞
本発明における親水性マクロモノマーは、重合性二重結合をポリマー主鎖末端に有する（メタ）アクリル系マクロモノマー又はビニル系マクロモノマーであることが特徴であり、水系溶媒中において、後述の疎水性ラジカル重合性モノマーと重合開始剤の反応で生成したラジカル種と反応し、親水性マクロモノマーを親水性シェルとし、この末端に結合した疎水性ラジカル重合性モノマーから構成された疎水性ポリマーを疎水性コアとするコアシェル型樹脂微粒子を形成する。ここで親水性マクロモノマーが、粒子表面に結合していることによって、立体反発による粒子の分散安定化の作用を示す。
【００８２】
また上記親水性マクロモノマーは、後述する連結物質［例えば、生理活性物質（例えば、抗体、酵素、又は核酸等）］と連結可能な反応性官能基を有することが好ましい。
前記反応性官能基は、上記親水性マクロモノマー形成時に導入してもよく、及び／又は、後述するコア部分表面に結合させた後から親水性ポリマーに導入することができる。親水性マクロモノマー形成時に反応性官能基として導入することが、反応性官能基反応性の導入率を調整することが容易にできるため好ましい。
反応性官能基については、前記＜親水性ポリマー＞の項で説明した反応性官能基についての事項をそのまま適用することができる。
【００８３】
本発明における親水性マクロモノマーとしては、蛍光性ランタノイド色素との相互作用の観点、粒子形成性の観点及び後述する連結物質との反応性の観点から、下記一般式（ＩＶ）又は一般式（Ｖ）で表される親水性マクロモノマーであることが好ましい。
【００８４】
【化２６】
2007146149.tif 000027
【００８５】
上記一般式において、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、又はハロゲン原子を表す。アルキル基の具体例として、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基を挙げることができ、直鎖、環状のいずれであってもよい。また、アルキル基は、置換基を有してもよく、置換基の例としてアリール基、水酸基、アミノ基、複素環基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルコキシ基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシ基、アミド基、ウレイド基、ハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、及びシアノ基などが挙げられる。ここで挙げた置換基の例において、水素原子以外の原子数は１〜５０が好ましく、より好ましくは１〜３０であり、１〜２０が最も好ましい。アリール基が置換基を有している場合、好ましい置換基の例としてはアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロ環基、シリル基、アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アシルアミノ基、アルキル又はアリールスルホニルアミノ基、アシル基、アルキル又はアリールスルホニル基、ホルミル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、スルファモイル基、ハロゲン原子、シアノ基、スルホ基及びカルボキシル基などが挙げられる。Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４としては、粒子形成の観点から水素原子又はメチル基が好ましい。
【００８６】
Ｒ１５は水素原子または炭素数１〜４のアルキル基を表す。アルキル基の具体例として、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基をあげることができ、このうち、Ｒ１５としては、マクロモノマーの親水性の観点から水素原子又はメチル基が好ましく、水素原子が特に好ましい。
Ｒ１６は、水素原子又はアシル基を表し、アシル基としては、ホルミル基又はアセチル基が好ましい。
Ｒ１７、Ｒ１８は、それぞれ独立に水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表す。Ｒ１７、Ｒ１８がアルキル基の場合、該アルキル基は置換基を有していてもよく、お互いに結合して含窒素環を形成してもよい。アルキル基の例として、メチル基、エチル基、プロピル基等を挙げることができる。お互いに結合して含窒素環を形成している場合の、含窒素環の例として、ピロリジン環、ピペラジン環、モルホリン環、ピロリドン環、ピロール環を挙げることができる。Ｒ１７、Ｒ１８としては、マクロモノマーの親水性、粒子形成性の観点から、Ｒ１７がメチル基かつＲ１８が水素原子又は、Ｒ１７、Ｒ１８でピロリドン環を形成することが好ましい。
【００８７】
Ｌ１１は、単結合、炭素数１〜４のアルキレン基（例えばメチレン基、エチレン基、プロピレン基等）、炭素数１〜６のアルキレンオキシ基（例えばエチレンオキシ基、プロピレンオキシ基等）、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−（ＣＨ２）ｔＣＯＯ−、−（ＣＨ２）ｋＯＣＯ−、−Ｏ−、−ＳＯ２−、−ＣＯＮＨＣＯＯ−、−ＣＯＮＨＣＯＮＨ−、−ＣＯＮ（Ｒ１９）−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ１９）−（ここでＲ１９ は水素原子または炭素数１〜２２のアルキル基等の炭化水素基を示し、ｔは、１〜３の整数を示し、ｋは１〜４の整数を示す）、または、下記一般式（ＩＶ−Ａ）で表される原子団、
【００８８】
【化２７】
2007146149.tif 000028
【００８９】
（ここでＬ１２は単結合、メチレン、−Ｏ−、−ＯＣＯ−又は−ＣＯＯ−を表わす）、およびこれらの組み合わせによって形成される２価の原子団を表す。Ｌ１１が、アルキレン基、アルキレンオキシ基、又は一般式（ＩＶ−Ａ）で表される原子団の場合、置換基を有していてもよく、置換基の例としては、炭素数１〜６のアルキル基および前述の一般式（ＩＶ）におけるＲ１１がアルキル基である場合の置換基と同じものを挙げることができる。
また、Ｌ１１において、−ＣＯＮ（Ｒ１９）−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ１９）−の連結基におけるＲ１９は、好ましくは水素原子又はメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、デシル基、ドデシル基等のアルキル基を表す。
【００９０】
Ｚ１１は、ポリマー主鎖の片末端に直接連結する結合、または任意の連結基を介した結合基を表す。
結合基としては炭素原子−炭素原子結合（一重結合あるいは二重結合）、炭素原子−ヘテロ原子結合（ヘテロ原子としては例えば、酸素原子、イオウ原子、窒素原子、ケイ素原子等）、ヘテロ原子−ヘテロ原子結合の原子団の任意の組合せで構成されるものである。例えば、以下の結合基を挙げることができる。
【００９１】
【化２８】
2007146149.tif 000029
【００９２】
Ｚ２１、Ｚ２２は各々独立に水素原子、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等）、シアノ基、ヒドロキシル基又はアルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等）等を表す。Ｚ２３、Ｚ２４は各々独立に水素原子、炭素数１〜８の炭化水素基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ベンジル基、フェネチル基、フェニル基及びトリル基等）又は−ＯＺ２５等を表し、Ｚ２５は、Ｚ２３における炭化水素基と同じ意味を表す。
【００９３】
ｘおよびｙは、１以上の繰り返し数を表す。
ｘとｙの合計を仮に１００とした場合、ｘは、マクロモノマーの親水性の観点から１０〜９９の範囲が好ましく、２０〜９９が更に好ましく、６０〜９９が特に好ましい。この場合、ｙは、連結物質の導入量の観点から１〜６０の範囲が好ましく、２〜５０が更に好ましく、５〜４０が特に好ましい。
【００９４】
また、ｗは０以上の繰り返し数を表す。
ｗとｙの合計を仮に１００とした場合、ｗは、マクロモノマーの親水性の観点から０〜９９の範囲が好ましく、５〜９０が更に好ましく、１０〜８０が特に好ましい。この場合、ｙは、連結物質の導入量の観点から１〜６０の範囲が好ましく、２〜５０が更に好ましく、５〜４０が特に好ましい。
【００９５】
本発明における親水性（メタ）アクリル系マクロモノマー又は親水性ビニル系マクロモノマーは、まず下記一般式（ＸＩ）、（ＸＩＩ）および（ＸＩＩＩ）で表される公知の重合性モノマーを用い、従来公知のラジカル重合（例えばiniferter 法等）、アニオン重合あるいはカチオン重合によって得られるポリマーの末端に種々の二重結合基を含有する試薬を反応させるか、あるいはこのポリマーの末端に特定の反応性基（例えば−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＰＯ３Ｈ２、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、
【００９６】
【化２９】
2007146149.tif 000030
【００９７】
、−ＣＯＣｌ、−ＳＯ２Ｃｌ等）を含有した試薬を反応させた後、高分子反応により重合性二重結合基を導入する方法（イオン重合法による方法）、または分子中に上記特定の反応性基を含有する重合開始剤および／または連鎖移動剤を用いてラジカル重合させた後、重合体主鎖の片末端に結合した特定の反応性基を利用して高分子反応を行うことにより重合性二重結合基を導入する方法等の合成法によって容易に製造することができる。
【００９８】
具体的には、大津隆行、高分子、33 (No.3) 、222 (1984)、P.Dreyfuss & R.P.Quirk, Encycl. Polym. Sci. Eng., 7 , 551 (1987)、中條善樹、山下雄也「染料と薬品」、30, 232 (1985)、上田明、永井進「化学と工業」、60、57 (1986)、P.F.Rempp & E.Franta, Advances in Polymer Science 、58、1 (1984)、伊藤浩一「高分子加工」、35、262(1986)、V.Percec, Applied Polymer Science 、285 、97 (1984) 等の総説およびそれに引用の文献等に記載の方法に従って重合性二重結合基を導入することができる。
【００９９】
【化３０】
2007146149.tif 000031
【０１００】
［一般式（ＸＩ）、（ＸＩＩ）および（ＸＩＩＩ）において、Ｒ１２〜Ｒ１８は、前述の一般式（ＩＶ）及び（Ｖ）におけるＲ１２〜Ｒ１８と同じ意味を表す。］
【０１０１】
さらに、具体的には、（ａ）一般式（ＸＩ）、（ＸＩＩ）および（ＸＩＩＩ）で示される繰り返し単位に相当する単量体の少なくとも１種、および分子中に上記特定の反応性基を含有する連鎖移動剤の混合物を重合開始剤（例えばアゾビス系化合物、過酸化物等）により重合する方法、（ｂ）上記連鎖移動剤を用いずに、分子中に上記特定の反応性基を含有する重合開始剤を用いて重合する方法、あるいは（ｃ）連鎖移動剤および重合開始剤のいずれにも分子中に上記特定の反応性基を含有する化合物を用いる方法、等により重合体主鎖の片末端に特定の反応性基を結合した重合体を合成し、次にこの特定の反応性基を利用して、高分子反応により重合性二重結合基を導入する方法が挙げられる。
【０１０２】
用いる連鎖移動剤としては、例えば特定の反応性基または特定の反応性基に誘導しうる置換基を含有するメルカプト化合物｛例えば、チオグリコール酸、チオリンゴ酸、チオサリチル酸、２−メルカプトプロピオン酸、３−メルカプトプロピオン酸、３−メルカプト酪酸、Ｎ−（２−メルカプトプロピオニル）グリシン、２−メルカプトニコチン酸、３−［Ｎ−（２−メルカプトエチル）カルバモイル］プロピオン酸、３−［Ｎ−（２−メルカプトエチル）アミノ］プロピオン酸、Ｎ−（３−メルカプトプロピオニル）アラニン、２−メルカプトエタンスルホン酸、３−メルカプトプロパンスルホン酸、４−メルカプトブタンスルホン酸、２−メルカプトエタノール、１−メルカプト−２−プロパノール、３−メルカプト−２−ブタノール、メルカプトフェノール、２−メルカプトエチルアミン、２−メルカプトイミダゾール、２−メルカプト−３−ピリジノール等｝、あるいは特定の反応性基または特定の反応性基に誘導しうる置換基を含有するヨード化アルキル化合物（例えばヨード酢酸、ヨードプロピオン酸、２−ヨードエタノール、２−ヨードエタンスルホン酸、３−ヨードプロパンスルホン酸等）が挙げられる。好ましくはメルカプト化合物が挙げられる。
【０１０３】
また、特定の反応性基または特定の反応性基に誘導しうる置換基を含有する重合開始剤としては、例えば、アゾビス化合物｛例えば、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸クロライド）、２，２’−アゾビス（２−シアノプロパノール）、２，２’−アゾビス（２−シアノペンタノール）、２，２’−アゾビス［２−（５−ヒドロキシ−３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２−イル）プロパン］、２，２’−アゾビス｛２−メチル−Ｎ−［１，１−ビス（ヒドロキシメチル）−２−ヒドロキシエチル］プロピオアミド｝、２，２’−アゾビス｛２−メチル−Ｎ−［１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル］プロピオアミド｝、２，２’−アゾビス［２−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−プロピオアミド］、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）｝、チオカルバメート化合物｛例えば、ベンジル−Ｎ−メチル−Ｎ−ヒドロキシエチルジチオカルバメート、２−カルボキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメート、３−ヒドロキシプロピル−Ｎ，Ｎ−ジメチルジチオカルバメート｝等が挙げられる。
【０１０４】
これらの連鎖移動剤または重合開始剤の使用量は、各々全単量体１００質量部に対して０．０１〜１０質量部であり、粒子形成の観点から好ましくは０．０５〜５質量部である。親水性マクロモノマーの数平均分子量は、特に制限されないが、粒子形成の観点から、５００〜２００，０００が好ましく、１，０００〜１００，０００がより好ましく、２０００〜５００００が更に好ましい。
【０１０５】
親水性マクロモノマーを合成するためには、親水性、溶剤溶解性等を調節する目的で、上記一般式（ＸＩ）、（ＸＩＩ）および（ＸＩＩＩ）で表される重合性モノマーに加えて、公知の重合性モノマーを共重合することができる。
公知の重合性モノマーとしては、例えば、スチレン、メチルスチレン、クロロメチルスチレン、４−メトキシスチレン、４−アセトキシスチレン等のスチレン系モノマー、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸ヘキシル、（メタ）アクリル酸オクチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル、（メタ）アクリル酸シクロヘキシル、（メタ）アクリル酸ドデシル、（メタ）アクリル酸ステアリル、（メタ）アクリル酸フェニル、（メタ）アクリル酸ベンジル、（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチル等の（メタ）アクリル酸エステル類、酢酸ビニル、ビニルイミダゾール等のビニルモノマーを挙げることができる。これらの重合性モノマーの共重合量としては、全重合性モノマーに対して０．１〜３０モル％が好ましく、1〜１０モル％がより好ましい。
以下に親水性マクロモノマーの具体例として、例示化合物ＭＭ−１〜ＭＭ３６を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１０６】
【化３１】
2007146149.tif 000032
【０１０７】
【化３２】
2007146149.tif 000033
【０１０８】
【化３３】
2007146149.tif 000034
【０１０９】
【化３４】
2007146149.tif 000035
【０１１０】
また、本発明において粒子形成性補助の観点から、上記親水性マクロモノマー以外の親水性マクロモノマーを併用することができる。その具体例として、ポリアルキレンオキシ基含有親水性マクロモノマーを挙げることができ、市販のマクロモノマーを使用することができる。市販品の具体例としては、日本油脂株式会社製のブレンマー（登録商標、以下同じ）ＰＥ−９０、ブレンマーＰＥ−２００、ブレンマーＰＥ−３５０、ブレンマーＡＥ−９０、ブレンマーＡＥ−２００、ブレンマーＡＥ−３５０、ブレンマー７０ＰＥＰ−３５０Ｂ、ブレンマーＡＥＰ、ブレンマー５５ＰＥＴ−８００、ブレンマーＰＭＥ−１００、ブレンマーＰＭＥ−２００、ブレンマーＰＭＥ−４００、ブレンマーＰＭＥ−１０００、ブレンマーＰＭＥ−４０００、ブレンマーＡＭＥ−４００、新中村化学工業株式会社製のメトキシポリエチレングリコールアクリレートＡＭ−９０Ｇ、メトキシポリエチレングリコールアクリレートＡＭ−２３０Ｇ、メトキシポリエチレングリコールメタクリレートＭ−９０Ｇ、メトキシポリエチレングリコールメタクリレートＭ−２３０Ｇを挙げることができる。
【０１１１】
（合成例）
＜例示化合物ＭＭ−１＞
窒素気流下、アクリルアミド１９．１９ｇ、Ｎ−ビニルアセトアミド２．５３ｇ、メルカプトプロピオン酸２．７１ｇを、Ｎ，Ｎ―ジメチルアセトアミド９０ｇに溶解し、６０℃に加熱した。次に２,２’−アゾビスイソブチロニトリル０．８４ｇを加え、６０℃で４時間攪拌した後、７０℃に昇温して２時間攪拌し、更に８５℃に昇温して２時間攪拌した。室温まで冷却後、反応混合物をエタノールに注ぎ、析出したポリマーを吸引ろ過し、室温で真空乾燥した。２１．２ｇのポリマーが得られた。０．１Ｎの水酸化カリウム水溶液で、滴定し酸価を測定したところ、このポリマー１ｇあたり、０．４３ミリモルの酸が含有されていた。またＧＰＣ測定からこのポリマーの数平均分子量Ｍｎは２４００であった。
【０１１２】
次に、上記で得られたポリマー２０ｇ、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル１０ｇ、ジメチルアミノピリジン０．１１ｇを蒸留水１００ｇに溶解し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩１５．７５ｇを添加し、室温で１昼夜攪拌した。この反応混合物を、エタノール１Ｌ中に注ぎ、沈殿したポリマーを吸引ろ過後、室温で真空乾燥し、１９．８ｇの親水性マクロモノマーＭＭ−１を得た。０．１Ｎ水酸化カリウム水溶液による滴定では、ポリマー１ｇあたり、０．０１１ミリモルの酸が検出され、カルボン酸がメタクリル酸２−ヒドロキシエチルとの反応によってほぼエステル化されていることが判った。またＧＰＣ測定からこの親水性マクロモノマーＭＭ−１の数平均分子量Ｍｎは２５００であった。
【０１１３】
＜例示化合物ＭＭ−３１の合成＞
窒素気流下、Ｎ−ビニルアセトアミド４２．５６ｇ、メルカプトプロピオン酸５．３１ｇを、エタノール１２７ｇに溶解し、６０℃に加熱した。次に２,２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）２．４８ｇを加え、６０℃で４時間攪拌した後、７５℃に昇温して２時間攪拌した。室温まで冷却後、反応混合物にエタノール５０ｇを加えて希釈した。次にこれを酢酸エチル２Ｌに注ぎ、析出したポリマーを吸引ろ過し、室温で真空乾燥した。３４．７ｇのポリマーが得られた。０．１モル／Ｌの水酸化カリウム水溶液で、滴定し酸価を測定したところ、このポリマー１ｇあたり、０．２９ミリモルの酸が含有されていた。またＧＰＣ測定からこのポリマーの数平均分子量Ｍｎは３５００であった。
【０１１４】
次に、上記で得られたポリマー３３ｇをジメチルスルホキシド１３２ｇに溶解し、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル１５．１ｇ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン０．３９ｇ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド７．３ｇを加え、４０℃で４時間攪拌した。室温まで冷却後、３０ｇのエタノールを加え希釈した。次にこの反応混合物を、酢酸エチル２Ｌ中に注ぎ、沈殿したポリマーを吸引ろ過後、室温で真空乾燥し、３１．３ｇの親水性マクロモノマーＭＭ−３１を得た。０．１モル／Ｌの水酸化カリウム水溶液による滴定では、酸が検出されず、ポリマー中のカルボン酸がメタクリル酸ヒドロキシエチルとの反応によって消失していることが判った。またＧＰＣ測定からこの親水性マクロモノマーＭＭ−３１の数平均分子量Ｍｎは３６００であった。
【０１１５】
＜例示化合物ＭＭ−３２の合成＞
窒素気流下、Ｎ−ビニルアセトアミド１４．２２ｇ、Ｎ−ビニルピロリドン２２．２３ｇ、メルカプトプロピオン酸３．４ｇを、エタノール１０６ｇに溶解し、６０℃に加熱した。次に２,２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）１．０ｇを加え、６０℃で４時間攪拌した後、７５℃に昇温して２時間攪拌した。室温まで冷却後、反応混合物にエタノール５０ｇを加えて希釈した。次にこれを酢酸エチル２Ｌに注ぎ、析出したポリマーを吸引ろ過し、室温で真空乾燥した。３５ｇのポリマーが得られた。０．１モル／Ｌの水酸化カリウム水溶液で、滴定し酸価を測定したところ、このポリマー１ｇあたり、０．３４ミリモルの酸が含有されていた。またＧＰＣ測定からこのポリマーの数平均分子量Ｍｎは３０００であった。
【０１１６】
次に、上記で得られたポリマー２５ｇをジメチルスルホキシド１００ｇに溶解し、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル１３．０８ｇ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン０．３４ｇ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド６．３４ｇを加え、４０℃で４時間攪拌した。室温まで冷却後、３０ｇのエタノールを加え希釈した。次にこの反応混合物を、酢酸エチル２Ｌ中に注ぎ、沈殿したポリマーを吸引ろ過後、室温で真空乾燥し、２３ｇの親水性マクロモノマーＭＭ−３２を得た。０．１モル／Ｌの水酸化カリウム水溶液による滴定では、酸が検出されず、ポリマー中のカルボン酸がメタクリル酸ヒドロキシエチルとの反応によって消失していることが判った。またＧＰＣ測定からこの親水性マクロモノマーＭＭ−３２の数平均分子量Ｍｎは３１００であった。
【０１１７】
＜疎水性ラジカル重合性モノマー＞
本発明における疎水性ラジカル重合性モノマーとしては、エチレン性不飽和結合基に結合可能な公知のラジカル重合性モノマーの疎水性モノマーを使用することができるが、水または水混和性溶媒中に溶解するものも使用することができる。
公知のラジカル重合性モノマーとしては、例えば、スチレン、メチルスチレン、クロロメチルスチレン、４−メトキシスチレン、４−アセトキシスチレン等のスチレン系モノマー、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸ヘキシル、（メタ）アクリル酸オクチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル、（メタ）アクリル酸シクロヘキシル、（メタ）アクリル酸ドデシル、（メタ）アクリル酸ステアリル、（メタ）アクリル酸フェニル、（メタ）アクリル酸ベンジル、（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチル等の（メタ）アクリル酸エステル類、酢酸ビニル、塩化ビニル、ビニルイミダゾール、ビニルピリジン等のビニルモノマーを挙げることができる。これらのモノマーは、単独で重合することも可能であり、２種以上のモノマーを共重合してもよい。
【０１１８】
また、疎水性コア粒子の強度向上の観点から、粒子ポリマーに架橋構造を導入することが可能である。このためには、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメタクリレート等の２価のラジカル重合性モノマーを使用することが好ましい。２価のラジカル重合性モノマーは、粒子を形成する全ラジカル重合性モノマーに対し、１〜２０モル％の範囲で使用することができ、２〜１０モル％が更に好ましい。
【０１１９】
＜重合体微粒子＞
本発明における重合体微粒子を構成する重合体としては、後述するスチレン系樹脂または（メタ）アクリル系樹脂が好ましく、特に紫外域での透明性の点からは（メタ）アクリル系樹脂が更に好ましい。このような重合体は、ラジカル重合性モノマーを、後述のラジカル発生剤の存在下ラジカル重合することにより得ることができる。ラジカル重合性モノマーとしては、例えば、スチレン、メチルスチレン、クロロメチルスチレン、４−メトキシスチレン、４−アセトキシスチレン等のスチレン系モノマー、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸ヘキシル、（メタ）アクリル酸オクチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル、（メタ）アクリル酸シクロヘキシル、（メタ）アクリル酸ドデシル、（メタ）アクリル酸ステアリル、（メタ）アクリル酸フェニル、（メタ）アクリル酸ベンジル、（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチル等の（メタ）アクリル酸エステル類を挙げることができる。
【０１２０】
重合体微粒子の粒径には特に制限はないが、通常、体積平均粒径として０．０１〜２０μｍの範囲とする。特に蛍光検出用複合体として用いる場合には、体積平均粒径が０．０５〜２μｍであることが好ましい。この体積平均粒径を２μｍ以下とすることで沈降性等の問題の発生を抑制することができる。また、０．０５μｍ以上とすることで操作性が良好になる。こうした理由で、本発明の重合体微粒子の体積平均粒径はより好ましくは０．０５〜１μｍ、更に好ましくは０．０５〜０．５μｍ、最も好ましくは０．０５〜０．３μｍとする。
【０１２１】
また、本発明における重合体微粒子としては、非特異的反応を抑制する観点から、特開平７−３１６２４４号公報、特開平８−１８３７６０号公報、ＷＯ２００２／０９７４３６号公報等に記載の、疎水性コアと親水性シェルからなるコアシェル型粒子を用いることが好ましい。
コア部分を形成するのに用いることのできる水不溶性高分子化合物は、水に溶解しない高分子化合物であって、しかも、コア部分を形成した際に、その内部にシグナル生成物質を封入することができる高分子化合物である限り、特に限定されるものではない。前記水不溶性高分子化合物としては、例えば、疎水性ポリマー［例えば、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、ポリイソプレン、ポリ塩化ビニル、ポリ乳酸、ポリラクトン、又はポリラクタムなどを挙げることができる。前記のコア部分は、前記の水不溶性高分子化合物１種類のみから実質的に形成されているか、又は前記の水不溶性高分子化合物２種類以上の組み合わせから実質的に形成されていることができる。
水不溶性高分子化合物の数平均分子量は、特に制限されないが、重合体粒子分散性の観点から５００〜１０００００、好ましくは１０００〜１００００である。
前記コア部分の形状は特に限定されるものではないが、一般的には大略球状あるいは大略楕球状である。また、前記コア部分の寸法も特に限定されるものではなく、用途に応じて適宜変化させることができるが、大略球状のコア部分の直径は、一般的には５ｎｍ〜５００ｎｍ程度である。
【０１２２】
シェル部分を形成するのに用いることのできる親水性高分子化合物は、直鎖状の高分子化合物であり、その一部でコア部分の表面と結合することができると共に、別部分に反応性官能基を有するか、又は、反応性官能基を導入することができ、しかも前記コア部分の表面にブラシ状に配置することができる可能である限り、特に限定されるものではない。
【０１２３】
本発明において、「コア部分の表面をブラシ状に覆うシェル部」とは、シェル部が多数の直鎖状親水性高分子化合物からなり、それら直鎖状親水性高分子化合物の各々が、その一部でコア部分の表面と結合し、少なくとも１つの自由末端が、少なくとも親水性高分子化合物と連結物質（例えば、抗原、抗体、酵素又は核酸等）とを反応させる反応液中において、その反応液の系中に糸状又は棒状に表面から突出していることを意味する。
また、これらのブラシ状の親水性高分子化合物鎖の自由末端又は鎖上には、それぞれ連結物質［例えば、生理活性物質（例えば、抗体、酵素、又は核酸等）］と結合可能な反応性官能基が存在するので、シェル部分の最外殻は、多数の反応性官能基で覆われている。
【０１２４】
前記親水性高分子化合物（親水性ポリマー）としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸ジメチルアミノエチル、ポリアリルアミン等のほか、前記一般式（Ｉ）又は一般式（ＩＩ）で表される親水性ユニットを含む親水性ポリマー、（メタ）アクリル系マクロモノマー又はビニル系マクロモノマー等の親水性マクロモノマーなどを挙げることができる。
【０１２５】
本発明においては、ＰＥＧ、ポリビニルアルコール、前記一般式（Ｉ）又は一般式（ＩＩ）で表される親水性ユニットを含む親水性ポリマー、（メタ）アクリルアミド系マクロモノマー又はビニルアミン系マクロモノマー等の親水性マクロモノマーであることが好ましい。中でも、前記一般式（Ｉ）又は一般式（ＩＩ）で表される親水性ユニットを含む親水性ポリマー、（メタ）アクリル系マクロモノマー又はビニル系マクロモノマー等の親水性マクロモノマーであることがより好ましい。
前記一般式（Ｉ）又は一般式（ＩＩ）で表される親水性ユニットを含む親水性ポリマー、（メタ）アクリル系マクロモノマー又はビニル系マクロモノマー等の親水性マクロモノマーの詳細については、＜親水性ポリマー＞及び＜親水性マクロモノマー＞の項で既に説明した。
【０１２６】
本発明における親水性高分子化合物の分子量として特に制限されないが、重合体粒子の粒径制御、分散安定性の観点から数平均分子量５００〜２００，０００であることが好ましく、１０００〜１００，０００であることが更に好ましい。
【０１２７】
本発明において、シェル部を構成する親水性高分子化合物鎖は、各親水性高分子化合物鎖が前記の親水性高分子化合物１種類のみから実質的に形成されているか、又は各親水性高分子化合物鎖が相互に異なる前記の親水性高分子化合物２種類以上の組み合わせから実質的に形成されていることができる。
【０１２８】
前記コア部分の直径と前記シェル部分の厚さとの比率は、用途に応じて適宜変化させることができる。例えば、コア部分の直径を、例えば、５ｎｍ〜５００ｎｍとすることができ、また、シェル部分の厚さを、例えば、５ｎｍ〜５００ｎｍとすることができる。
このようなコア部分とシェル部分との比率は、用いられる親水性ポリマーと疎水性ラジカル重合性モノマーとの量比及び種類によって適宜調整することができる。
【０１２９】
前記親水性高分子化合物鎖の自由末端に反応性官能基が存在する場合には、前記親水性高分子化合物の一方の末端（結合末端）をコア部分表面に結合させる前からもう一方の末端（自由末端）に存在するか、あるいは、前記親水性高分子化合物の一方の末端（結合末端）をコア部分表面に結合させた後からもう一方の末端（自由末端）に導入することができる。
【０１３０】
＜重合体微粒子の製造方法＞
本発明にかかる重合体微粒子は、スチレン誘導体やアクリル酸誘導体等のラジカル重合性モノマーを水または含水有機溶媒中に分散し、適当な分散安定剤とラジカル発生剤の存在下ラジカル重合させて製造される。かかる製造形式に合致する汎用手法として、分散安定剤のミセルを最初に形成させた系にモノマー類を加えてゆく方法である乳化重合、あるいは分散安定剤で安定化されたモノマー類液滴を最初に形成させてから重合させる方法であるミニエマルション重合やマイクロエマルション重合、モノマー類にラジカル発生剤を添加した溶液を懸濁させて重合する方法である懸濁重合、あるいは重合体超微粒子等の固体核を分散した系にモノマー類を加えて重合させる方法であるシード重合等が挙げられる。
【０１３１】
本発明における重合体微粒子は、特にコアシェル型の重合体粒子の場合には、一般的に分散重合と呼ばれている重合方法を用い製造することができる。すなわち前記のスチレン誘導体やアクリル酸誘導体等の疎水性ラジカル重合性モノマーを水または含水有機溶媒中に分散し、片末端にラジカル重合性基およびもう一方の末端に反応性基を有する親水性マクロモノマーとラジカル発生剤の存在下ラジカル重合させて製造することができる。
【０１３２】
特に、本発明における重合体微粒子は、（メタ）アクリルアミド親水性ユニット及びビニルアミン系親水性ユニットから選ばれる少なくとも１種の親水性ユニットと重合性ユニットとを有する前駆体親水性ポリマーと、ラジカル発生剤との存在下、水系溶媒中で疎水性ラジカル重合性モノマーを分散重合することで、親水性シェルを形成する親水性ポリマーに疎水性コアを形成する疎水性ポリマーが結合したコアシェル型の重合体微粒子として形成される。
また、ポリマー主鎖の片末端に重合性二重結合を有する親水性（メタ）アクリル系マクロモノマー及び／又は親水性ビニル系マクロモノマーとラジカル発生剤との存在下、水系溶媒中で疎水性ラジカル重合性モノマーを分散重合することで、親水性シェルを形成する親水性ポリマーに疎水性コアを形成する疎水性ポリマーが結合したコアシェル型の重合体微粒子として形成される。
【０１３３】
重合においては、疎水性ラジカル重合性モノマーと、前駆体親水性ポリマー又は親水性マクロモノマーとを全量、水系溶媒中、即ち水または含水有機溶媒中に混合溶解し、ラジカル発生剤（重合開始剤）を添加する方法が可能であるが、反応温度、及び粒子径を制御するために、前駆体親水性ポリマー又は親水性マクロモノマーをあらかじめ溶解した水または含水有機溶媒中に、疎水性重合性モノマー及びラジカル発生剤を徐々に添加する方法も好ましい。
前駆体親水性ポリマー又は親水性マクロモノマーは、粒子形成性の観点から疎水性ラジカル重合性モノマーの全質量に対し、１〜２００質量％の範囲で使用することができ、１０〜１００質量％が更に好ましい。
【０１３４】
好適な水系溶媒としては、例えば、水とメタノール、エタノール、アセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、テトラヒドロフラン等との混合物が挙げられる。
ラジカル発生剤として一般的なものは、水溶性のラジカル発生剤、例えば過硫酸ナトリウム、過硫酸カリウム、過硫酸リチウム、過硫酸アンモニウム等の過硫酸塩等、ラジカル重合性モノマーまたは含水有機溶媒に溶解性のもの、例えば、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル等の過酸化物等であるが、異種のラジカル発生剤を併用しても構わない。ラジカル発生剤は、ラジカル重合性モノマーの全重量に対し０．０１〜５質量％の範囲で使用することが好ましく、０．１〜３質量％より好ましい。
反応温度は、使用する開始剤の分解温度に応じ適宜設定できるが、４０℃〜１００℃が好ましく、６０〜８０℃がより好ましい。
【０１３５】
なお、本発明の蛍光重合体微粒子において、本発明の趣旨を著しく損なわない限りにおいて任意の添加剤、例えばトリオクチルホスフィンオキシドやトリブチルホスフィンオキシド等の有機リン化合物のように、ランタノイド陽イオンに配位することで水和等による蛍光強度の低下を抑制することのできる添加剤を使用することも可能であり、かかる添加剤は重合時のモノマー溶液にあらかじめ添加しておくことが好適である。
【０１３６】
＜蛍光性ランタノイド色素＞
本発明に用いられる蛍光性ランタノイド色素とは、ランタノイド陽イオンと有機配位子を少なくとも１個有する蛍光色素である。この蛍光色素は、可視光で励起することができ、また配位子の増感作用（配位子を励起する光のエネルギーによりランタノイド陽イオンが発光する現象）を示す。
本発明においては、配位子として、高蛍光強度及び長い蛍光寿命を有する一般式（Ｌ−Ｉ）で表される含窒素複素環含有配位子を用いることが好ましい。
【０１３７】
【化３５】
2007146149.tif 000036
【０１３８】
一般式（Ｌ−Ｉ）において、Ａ２１、Ａ２２及びＡ２３は、下記一般式（Ｌ−II）〜（Ｌ−Ｖ）で表される原子団、水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アリールアミノ基、又はジアリールアミノ基を表し、互いに同一であってもよい。アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アリールアミノ基、ジアリールアミノ基である場合には、それぞれ重合体微粒子への取り込まれやすさ、溶剤溶解性の観点から炭素数１〜１２であることが好ましい。
Ａ２１、Ａ２２及びＡ２３は、蛍光強度、励起波長の調節、ランタノイドイオンとの親和性調節、重合体微粒子への取り込まれやすさ、溶剤溶解性の観点から下記一般式（Ｌ−II）〜（Ｌ−Ｖ）で表される原子団であることが好ましい。
【０１３９】
【化３６】
2007146149.tif 000037
【０１４０】
各式中Ｒ２１およびＲ２２は、それぞれ独立に水素原子または置換基を表すが、置換基の例としてアルキル基、アリール基、アミノ基、複素環基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アミド基、ウレイド基およびハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）などが挙げられる。ここで挙げた置換基の例において、水素原子以外の原子数は１〜５０が好ましく、より好ましくは１〜３０であり、１〜２０が最も好ましい。また、置換基がアルキル基を含む場合には環状であっても、鎖状であってもよく、鎖状の場合には直鎖でも分枝しているものであってもよく、飽和であっても不飽和結合を含むものであってもよい。アルキル基やアリール基が置換基を有している場合、好ましい置換基の例としてはアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロ環基、シリル基、アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アシルアミノ基、アルキル又はアリールスルホニルアミノ基、アシル基、アルキル又はアリールスルホニル基、ホルミル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、スルファモイル基、ハロゲン原子、シアノ基、スルホ基またはカルボキシル基などが挙げられる。
【０１４１】
Ｒ２３〜Ｒ２６はそれぞれ独立に水素原子または置換基を表す。Ｒ２３〜Ｒ２６が置換基を表す場合、好ましい例としては置換されてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、複素環基、シリル基、アルコキシ基、アミノ基、アシルアミノ基、アルキル又はアリールスルホニルアミノ基、アシル基、アルキル又はアリールスルホニル基、ホルミル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、スルファモイル基、ハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、シアノ基、スルホ基またはカルボキシル基であり、より好ましくは置換されてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アシルアミノ基、スルホニルアミノ基、ハロゲン原子またはシアノ基である。
Ｒ２３〜Ｒ２６に関して、水素を除いた原子数は１〜６０が好ましく、１〜４５がより好ましく、１〜３５が最も好ましい。
【０１４２】
Ｒ２７、Ｒ２８及びＲ２９はそれぞれ独立に水素原子または置換基を表し、Ｒ２７とＲ２８、Ｒ２８とＲ２９及びＲ２７とＲ２９は互いに結合して環を形成してもよい。ここで、置換基とは、アルキル基、アリール基、カルボアミド基、スルホンアミド基、アルキオチオ基、複素環基、アルコキシ基、アリールオキシ基及びこれらの組合せからなる群から選択される置換基を示す。ｎは０、１又は２を表す。
Ｒ２７〜Ｒ２９に関して、水素を除いた原子数は１〜６０が好ましく、１〜４５がより好ましく、１〜３５が最も好ましい。
Ｇは、炭素原子又は窒素原子を表すが、炭素原子の場合には置換基を有していてもよく、この場合の置換基としてはＲ２１およびＲ２２の例で挙げたものが使用できる。
Ｑは５又は６員の含窒素複素環を形成するのに必要な原子群を表し、さらに該含窒素複素環は縮合環を形成していてもよい。また、Ｒ２７、Ｒ２８又はＲ２９と結合して環を形成してもよい。
【０１４３】
以下にＱとして好ましい複素環の例を挙げる。以下の例においては複素環の骨格を表すものであり、部分的に飽和された骨格として用いられてもよく、ヘテロ原子の位置はそれぞれの環系で適宜選択が可能であり、縮合環については任意の位置で縮合してもよい。また、これらの環の組み合わせで表される環であってもよい。
ピロール、ピラゾール、イミダゾール、トリアゾール、テトラゾール、チオフェン、フラン、オキサゾール、チアゾール、オキサジアゾール、チアジアゾール、セレナゾール、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、トリアジン、テトラジン、オキサジン、チアジン、オキサジアジン、チアジアジン、ピロロピロール、インドール、ピロロピラゾール、ピロロイミダゾール、ピロロトリアゾール、ピロロテトラゾール、チエノピロール、ピロロオキサゾール、チエノピロール、ピロロオキサゾール、ピロロチアゾール、ピロロピリジン、ピロロピリミジン、ピロロピラジン、ピロロピリダジン、ピロロトリアジン、ピロロテトラジン、ピロロオキサジン、ピロロチアジン、ピロロオキサジン、ピロロチアジアジン、インダゾール、ベンズイミダゾール、ベンゾトリアゾール、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、ベンゾオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾオキサジアゾール、ベンゾチアジアゾール、ベンゾセレナゾール、キノリン、キナゾリン、キノキサリン、フタラジン、ベンゾトリアジン、ベンゾオキサジン、ベンゾチアジン、ピラゾロピラゾール、ピラゾロオキサゾール、ピラゾロチアジアゾール、ピラゾロピリジン、ピラゾロピリミジン、ピラゾロピラジン、ピラゾロピリダジン、ピラゾロトリアジン、ピラゾロオキサジン、ピラゾロチアジン、ピラゾロチアジアジン、イミダゾロピラゾール、ピラゾロトリアゾール、ピラゾロテトラゾール、チエノピラゾール、フロピラゾール、ピラゾロオキサゾール、イミダゾロイミダゾール、イミダゾロトリアゾール、イミダゾロテトラゾール、チエノイミダゾール、フロイミダゾール、イミダゾロオキサゾール、チエノイミダゾール、イミダゾロオキサジアゾール、イミダゾロチアジアゾール、イミダゾロセレナゾール、イミダゾロピリジン、イミダゾロピリミジン、イミダゾロピラジン、イミダゾロピリダジン、イミダゾロトリアジン、イミダゾロオキサジン、イミダゾロチアジン、イミダゾロオキサジアジン、イミダゾロチアジアジン、トリアゾロトリアゾール、チエノトリアゾール、フロトリアゾール、トリアゾロオキサゾール、トリアゾロチアゾール、トリアゾロオキサジアゾール、トリアゾロチアジアゾール、トリアゾロピリジン、トリアゾロピリミジン、トリアゾロピラジン、トリアゾロピリダジン、トリアゾロトリアジン、トリアゾロオキサジン、トリアゾロチアジン、トリアゾロオキサジアジン、トリアゾロチアジアジン、テトラゾロオキサゾール、テトラゾロチアゾール、テトラゾロピリジン、テトラゾロピリミジン、テトラゾロピラジン、テトラゾロピリダジン、テトラゾロオキサジン、テトラゾロチアジン、チエノチオフェン、チエノフラン、チエノオキサゾール、チエノチアゾール、チエノオキサジアゾール、チエノチアジアゾール、チエノセレナゾール、チエノピリジン、チエノピリミジン、チエノピラジン、チエノピリダジン、チエノトリアジン、チエノテトラゾール、チエノオキサジン、チエノチアジン、チエノオキサジアジン、チエノチアジアジン、フロオキサゾール、フロチアゾール、フロオキサジアゾール、フロチアジアゾール、フロピリジン、フロピリミジン、フロピラジン、フロピリダジン、フロトリアジン、フロオキサジン、フロチアジン、オキサゾロオキサゾール、チアゾロオキサゾール、オキサゾロオキサジアゾール、オキサゾロチアジアゾール、オキサゾロピリジン、オキサゾロピリミジン、オキサゾロピラジン、オキサゾロピリダジン、オキサゾロトリアジン、オキサゾロオキサジン、オキサゾロチアジン、オキサゾロオキサジアジン、オキサゾロチアジアジン、チアゾロチアゾール、チアゾロオキサジアゾール、チアゾロオキサジアゾール、チアゾロセレナゾール、チアゾロピリジン、チアゾロピリミジン、チアゾロピラジン、チアゾロピリダジン、チアゾロトリアジン、チアゾロオキサジン、チアゾロチアジン、チアゾロオキサジアジン、チアゾロチアジアジン、ジチオール、ジオキソール、ベンゾジチオール、ベンゾジオキソール。
Ｑに関して、水素を除いた原子数は４〜７０が好ましく、５〜５５がより好ましく、６〜４５が最も好ましい。
【０１４４】
Ｂ２１、Ｂ２２は、それぞれ独立に、窒素原子または＝Ｃ（−Ｒ３０）−を表し、Ｒ３０は水素原子または置換基を表す。Ｂ２１及びＢ２２のうち少なくとも一方が窒素原子を表すことが好ましい。
Ｒ３０は水素原子または置換基を表す。Ｒ３０が置換基を表す場合、好ましくは置換されてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、複素環基、シリル基、アルコキシ基、アミノ基、アシルアミノ基、スルホニルアミノ基、アシル基、スルホニル基、ホルミル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、スルファモイル基、ハロゲン原子、シアノ基、スルホ基またはカルボキシル基であり、より好ましくは置換されてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アシル基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ハロゲン原子またはシアノ基である。Ｒ３０に関して、水素原子以外の原子数は１〜３０が好ましく、１〜２０がより好ましく、１〜１０が最も好ましい。
【０１４５】
Ａｒ２１は炭素数６〜３０の芳香族炭素環、芳香族複素環を表す。芳香族炭素環の例としては、ベンゼン環、チオフェン環、フラン環、ピロール環、ピラゾール環、トリアゾール環、チアゾール環、イミダゾール環、オキサゾール環、オキサジアゾール環、チアジアゾール環などが好ましく、これらの環に対してさらに環が縮合していてもよい。Ａｒ２１は置換基を有する場合、置換基の例としては、前述のＲ２１、Ｒ２２の置換基の例と同じ基を挙げることができる。
一般式（Ｌ−II）〜（Ｌ−Ｖ）において、＃は一般式（Ｌ−Ｉ）で表される含窒素複素環と結合する位置を表す。
【０１４６】
本発明にかかる含窒素複素環配位子としては、蛍光強度、吸収波長および重合体微粒子への取り込まれやすさの観点から、下記一般式（Ｌ−ＶＩ）で表されるものが好ましく、更に好ましくは下記一般式（Ｌ−ＶＩＩ）で表されるものである。
【０１４７】
【化３７】
2007146149.tif 000038
【０１４８】
式中Ａ２１は前記一般式（Ｌ−Ｉ）のＡ２１と同じ意味を表す。Ｒ２１、Ｒ２２及びＧは、前記一般式（Ｌ−ＩＩ）のＲ２１、Ｒ２２及びＧと同じ意味を表す。
【０１４９】
【化３８】
2007146149.tif 000039
【０１５０】
式中、Ｒ２１、Ｒ２２及びＧは、前記一般式（Ｌ−ＩＩ）のＲ２１、Ｒ２２及びＧと同じ意味を表す。
Ｒ２７は、水素原子又は置換基を表す。この場合の置換基としては、アルキル基、アリール基、カルボアミド基、スルホンアミド基、アルキルチオ基、複素環基、アルコキシ基、アリールオキシ基及びこれらの組合せからなる群から選択される置換基を意味する。Ｒ２７について、水素を除いた原子数は１〜６０が好ましく、１〜４５がより好ましく、１〜３５がもっとも好ましい。
Ｑは、前記一般式（Ｌ−ＩＶ）におけるＱと同じ意味を表す。
以下に、本発明にかかる含窒素複素環含有配位子の具体例として、例示化合物１〜３２を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１５１】
【化３９】
2007146149.tif 000040
【０１５２】
【化４０】
2007146149.tif 000041
【０１５３】
【化４１】
2007146149.tif 000042
【０１５４】
【化４２】
2007146149.tif 000043
【０１５５】
上記例示化合物は公知の化合物を用い、公知の反応条件において反応することにより合成することができる。一般式（Ｌ−Ｉ）で表される化合物は、好ましくは、シアヌル酸クロリドへの、Ａ２１〜Ａ２３原子団の求核置換反応により合成できる。
例えば、下記一般式（ＬＰ−Ｉ）で表される化合物と一般式（ＬＰ−III）で表される化合物を反応させることにより合成することができる。
【０１５６】
【化４３】
2007146149.tif 000044
【０１５７】
一般式（ＬＰ−Ｉ）中、Ａは前記Ａ２１、Ａ２２、Ａ２３で記述したものと同様であり、Ｅは、離脱性の基またはＡを表し、一般式（ＬＰ−III）中、Ｒ２７は前述したものと同様である。Ｒ４１は、置換されてもよいアルキル基、置換されてもよいアリール基（ヘテロアリール基を含む）を表すが、好ましくは炭素数１乃至３０のものであり、１乃至２０がより好ましく、１乃至１２がさらに好ましい。
Ｒ４２およびＲ４３は、それぞれ水素原子または置換基を表し、Ｒ４１とＲ４２およびＲ４２とＲ４３は可能な場合には互いに結合して環を形成してもよい。Ｒ４２およびＲ４３が置換基を表す場合、好ましい置換基としてはアルキル基、アリール基、アミノ基、複素環基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アミド基、ウレイド基およびハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）などが好ましい。ここで挙げた置換基の例において、水素を除いた原子数は１乃至６０が好ましく、より好ましくは１乃至４５であり、１乃至３５が最も好ましい。
Ｄ−は、一般式（ＬＰ−III）中のアンモニウムイオンの対イオンを表す。Ｊは、酸素原子、−Ｃ（Ｒ４４）（Ｒ４５）−、−Ｎ（Ｒ４６）−、硫黄原子を表し、可能な場合にはＲ２７と互いに結合して環を形成してもよい。ここでＲ４４、Ｒ４５、Ｒ４６は、置換されてもよいアルキル基またはアリール基を表すが、アルキル基の例としては炭素数１乃至３０が好ましく、１乃至２０がより好ましく、１乃至１０が最も好ましく、環状であっても、鎖状であってもよく、鎖状の場合には直鎖でも分枝しているものであってもよく、飽和であっても不飽和結合を含むものであってもよい。
【０１５８】
一般式（ＬＰ−Ｉ）におけるＥとしての離脱性の基の例には、ハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、アリールオキシ基（フェノキシ基、４−ニトロフェノキシ基など）、アリールチオ基（フェニルチオ基、４−ブロモフェニルチオ基など）、スルホニルオキシ基（ｐ−トルエンスルホニルオキシ基、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基など）、カルバモイルオキシ基（ジメチルカルバモイルオキシ基、モルホリノカルボニルオキシ基など）が好ましく、ハロゲン原子が最も好ましい。
【０１５９】
一般式（ＬＰ−III）におけるＤ−としての対イオンには、好ましくは、ハライドイオン（フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン）、硫酸イオン、過塩素酸イオン、硝酸イオン、硫酸水素イオン、スルホン酸イオン（ｐ−トルエンスルホン酸イオン、ｐ−クロルベンゼンスルホン酸イオンなど）、硫酸エステルイオン（モノメチル硫酸イオンなど）、テトラフルオロボレートイオン、ヘキサフルオロホスフェートイオンなどが挙げられる。
【０１６０】
本発明における含窒素複素環含有配位子は、一般式（ＬＰ−Ｉ）で表される化合物と一般式（ＬＰ−III）で表される化合物とを、好ましくは溶媒を用いて混合し、好ましくは塩基の存在下、適切な温度にて反応を行うことにより得ることができる。
【０１６１】
この場合、塩基としては、通常有機合成で用いられる塩基であればほとんどのものが使用できるが、好ましくはピリジン類（ピリジン、２，６−ルチジンなど）、３級アミン類（トリエチルアミン、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、トリブチルアミンなど）、グアニジン類（トリフェニルグアニジン、１，１，３，３−テトラメチルグアニジンなど）、アミジン類（１，８−ジアザビシクロ〔５．４．０〕−７−ウンデセン、１，５−ジアザビシクロ〔４．３．０〕−５−ノネンなど）、アニリン類（Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリンなど）、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水素化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキンド、ナトリウム−ｔ−ブトキシド、カリウム−ｔ−ブトキシド、酢酸カリウム、酢酸ナトリウムなどを好ましく用いることができるが、ピリジン類、３級アミン類、グアニジン類、アミジン類がより好ましい。
【０１６２】
用いる溶媒に関してはプロトン性溶媒、非プロトン性溶媒のいずれも用いることができるが、非プロトン性溶媒が好ましく、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノンなどが好ましい。
反応温度は反応によってそれぞれ適当な温度が設定されるべきであるが、本発明においては一般に−２０℃乃至１５０℃が好ましく、０℃乃至１２０℃がより好ましく、０℃乃至１００℃が最も好ましい。
反応の仕込み順はどの順に仕込んでもよいが、一般式（ＬＰ−Ｉ）で表される化合物と一般式（ＬＰ−III）で表される化合物を溶媒に溶解または懸濁し、撹拌しながら塩基を添加するのが好ましい。
【０１６３】
（合成例）
＜例示化合物４の合成＞
例えば、上記例示化合物４は、下記の方法により合成することができる。
１８．４ｇの塩化シアヌルを１００ｍＬのジメチルアセトアミドに溶解し、室温で６９．２ｇの３，５−ジメチルピラゾールを添加した。ついで反応温度を８０℃として２時間反応した。
冷却後、反応液を水に注ぎ、析出した結晶を濾取し、ジメチルホルムアミドから再結晶して、下記（ＬＰ−Ｉ−１）を得た。収量２１．０ｇ、収率５７．９％
ｎｍｒスペクトルデータ（重クロロホルム）：６．１１（３Ｈ，ｓ）、２．８１（９Ｈ，ｓ）、２．３３（９Ｈ，ｓ）
【０１６４】
【化４４】
2007146149.tif 000045
【０１６５】
４１９ｍｇの６−クロロ−５−シアノ−１，３−ジエチル−２−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾリウムｐ−トルエンスルホナートと３６３ｍｇの上記化合物（ＬＰ−Ｉ−１）を８ｍＬのジメチルスルホキシドに懸濁し、０．５ｍＬのテトラメチルグアニジンを加えて、８０℃で３０分間反応した。
冷却後、水を加えて析出した結晶に減圧ろ過を施して、得られた結晶をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製を行った。さらに、メタノールと酢酸エチルの混合溶媒から再結晶を行い、目的物を得た。収量２８７ｍｇ、収率５５．７％。
ｎｍｒスペクトルデータ（重クロロホルム）：７．３４（１Ｈ，ｓ）、７．２１（１Ｈ，ｓ）、６．０４（２Ｈ，ｓ）、５．３１（１Ｈ，ｓ）、４．５３（２Ｈ，ｑ）、４．３９（２Ｈ，ｑ）、２．７０（６Ｈ，ｓ）、２．３３（６Ｈ，ｓ）、１．３１（３Ｈ，ｔ）、１．２８（３Ｈ，ｔ）
他の例示化合物も、Ａ２１〜Ａ２３に相当する部分を、対応する化合物に変更することにより、例示化合物４と同様に合成することができる。
【０１６６】
本発明にかかる含窒素複素環配位子は、ランタノイド陽イオンに対して、０．１〜１０当量の範囲で使用することができ、より好ましくは１〜５当量の範囲で使用することができる。
【０１６７】
ランタノイド陽イオンとしては、２〜４価の陽イオンをあげることができ、具体例として、Ｃｅ３＋，Ｐｒ１３＋，Ｎｄ３＋，Ｎｄ４＋，Ｓｍ２＋，Ｓｍ３＋，Ｅｕ２＋，Ｅｕ３＋，Ｔｂ３＋，Ｄｙ３＋，Ｄｙ４＋，Ｈｏ３＋，Ｅｒ１３＋，Ｔｍ２＋，Ｔｍ３＋，Ｙｂ２＋，Ｙｂ３＋等が挙げられ、中でも、Ｐｒ１３＋，Ｎｄ３＋，Ｓｍ３＋，Ｅｕ３＋，Ｔｂ３＋，Ｄｙ３＋，Ｈｏ３＋，Ｅｒ１３＋，Ｔｍ３＋，Ｙｂ３＋等の３価陽イオンは、紫外〜近赤外領域、長い寿命、狭い波長幅等の特徴を持つ蛍光を発することから好適であり、中でもＮｄ３＋，Ｓｍ３＋，Ｅｕ３＋，Ｔｂ３＋，Ｄｙ３＋，およびＴｍ３＋が更に好適であり、Ｅｕ３＋およびＴｂ３＋が発光強度の点で最も好適である。
【０１６８】
一般式（Ｌ−Ｉ）以外の配位子に代えて又はこれを組み合わせて、蛍光強度、ランタノイド色素合成の容易さの観点から公知のランタノイド陽イオンの有機配位子を用いることもできる。
他の有機配位子の例としては、芳香族アミン類（Helv.Chim.Acta,Vol.79,P.789,1966）、β―ジケトン類（Anal.Chem.Vol.70,P.596-601,1998）、芳香族基含有カルボン酸類（Chem.Mater.,Vol.10,286-296，特開２０００−３４５０５２号公報）をあげることができる。具体例として、４，４，４−トリフルオロ−１−（２−チエニル）−１，３−ブタンジオン、４，４，４−トリフルオロ−１−フェニル−１，３−ブタンジオン、４，４，４−トリフルオロ−１−（２−ナフチル）−１，３−ブタンジオンを挙げることができる。芳香族カルボン酸としては、フォーカルポイントにカルボキシレート基を有しかつ繰り返し単位に芳香環を有するデンドロンを挙げることができる。
【０１６９】
また、これらの配位子とともに、ランタノイド色素の蛍光強度低下を抑制する目的で、ホスフィンオキシド類、リン酸エステル類、スルホキシド類、亜リン酸エステル類、ホスフィン類、スルフィド類、アミン類、窒素含有芳香族複素環化合物を同時に用いることができる。
【０１７０】
ランタノイド元素含有溶液に、本発明における配位子を少なくとも含む配位子溶液を加えることにより、蛍光性ランタノイド錯体、即ち本発明における蛍光性ランタノイド色素を、容易に合成することができる。蛍光性ランタノイド錯体が、溶液中から析出する場合には、ろ別することができる。蛍光性ランタノイド錯体が析出しない場合は、溶媒を留去して結晶を得た後、必要に応じ精製して使用することができる。
本発明の重合体微粒子中の蛍光性ランタノイド錯体の濃度に制限はないが、通常、重合体微粒子の質量に対して、０．０１〜５０質量％、輝度の点で好ましくは０．０５〜２０質量％、より好ましくは０．１〜１０質量である。
【０１７１】
＜蛍光性重合体微粒子の製造方法＞
本発明の蛍光性重合体微粒子は、本発明にかかる重合体微粒子を得た後に、蛍光性ランタノイド色素を導入（内蔵）することにより製造することができる。
色素の導入は次のように行うことができる。重合体微粒子の疎水性部を形成する水不溶性高分子化合物を膨潤させる有機溶媒（例えば、アセトン又はトルエン等）が一定比率で含まれる溶液中に、重合体微粒子及び蛍光性ランタノイド色素を浸漬させる。前記浸漬により、前記水不溶性高分子化合物は膨潤し、その膨潤に伴って蛍光性ランタノイド色素が重合体微粒子に取り込まれる。続いて、この混合物から、有機溶媒を除去すると、前記水不溶性高分子化合物は収縮するが、疎水的な蛍光性ランタノイド色素は重合体微粒子から外に出ることができず、微粒子に封入される。所望により、重合体微粒子に取り込まれなかった蛍光性ランタノイド色素を除去することにより、本発明の蛍光性重合体微粒子を得ることができる。
【０１７２】
上記製造方法において、前記混合物から有機溶媒を除去する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、エバポレートなどにより有機溶媒を蒸発乾固する方法、あるいは、非溶媒中で収縮させる方法（例えば、有機溶媒を含有する溶液を、前記有機溶媒を含有しない溶液に置換する方法）などを挙げることができる。
また、重合体微粒子を膨潤するのに用いる前記有機溶媒含有溶液における有機溶媒の割合は、蛍光性ランタノイド色素が水不溶性高分子化合物に取り込まれる程度まで、前記水不溶性高分子化合物を膨潤させることができる割合である限り、特に限定されるものではないが、例えば、４０〜６０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％であることができる。
上記の方法の他に、重合性モノマー、マクロモノマーを含有する液体に蛍光性ランタノイド色素を溶解し、次いで重合することにより、重合体微粒子形成と同時に蛍光性ランタノイド色素を導入する方法をとることも可能である。
【０１７３】
本発明にかかる親水性ポリマーに反応性官能基ユニットが含まれる場合には、反応性官能基前駆体ユニットの活性化によって反応性官能基を生成することを更に含むことが好ましい。このような活性化としては、反応性官能基ユニットの種類によって適宜選択することができる。
例えば反応性官能基前駆体ユニットとしてアミノ基前駆体構造を含む場合には、アミノ基前駆体構造をアミノ基に変換するために、重合体微粒子に対して酸またはアルカリ性処理を行う。酸としては、塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酢酸等の有機酸が使用できる。ｐＨとしては、５以下が好ましく、３以下がより好ましい。アルカリとしては、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液が使用できる。ｐＨとしては、９以上が好ましく、１１以上がより好ましい。反応温度としては、２５〜１００℃が好ましく、４０〜９０℃がより好ましい。
このような活性化処理は、適用される具体的な処理に応じて蛍光性ランタノイド色素の導入工程の前及び後のいずれに行ってもよい。
【０１７４】
＜蛍光検出用複合体＞
本発明の蛍光検出用複合体は、本発明の蛍光性重合体微粒子と、蛍光性重合体微粒子及び検出対象物質を連結可能な連結物質とから構成されている。これにより、標的物質の検出を、連結物質を介した蛍光性重合体微粒子の蛍光発光に基づいて効率よく且つ高感度に行うことができる。
連結物質としては、抗原又は抗体を挙げることができる。このような抗体としては、ウサギ、ヤギ等のポリクローナル抗体、マウスのモノクローナル抗体のＩｇＧ、ＩｇＭ、またはこれらを酵素処理又は還元剤処理して得るＦ（ａｂ’)２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’分画等が挙げられる。一方、抗原としては、タンパク質、ポリペプチド、ステロイド、多糖類、脂質、薬物、花粉など種々のものが挙げられる。
【０１７５】
かかる抗体又は抗原の結合方法としては、重合体微粒子のアミノ基に対して抗体又は抗原の糖鎖を過ヨウ素酸を使用して結合する方法、重合体微粒子のアミノ基に対して抗体又は抗原のアミノ基をグルタルアルデヒドを使用して結合する方法、重合体微粒子のアミノ基に対して、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（スルフォスクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサンー１−カルボキシレート）との反応によりマレイミド基を導入し、抗体のメルカプト基と結合させる方法等をあげることができる。その結合量としては、重合体微粒子１ミリグラム当たりの質量として、通常５０ナノグラム〜５００マイクログラムが好ましく、５００ナノグラム〜２００マイクログラムがより好ましい。これにより、蛍光能を有する免疫分析試薬（蛍光免疫分析試薬）として使用可能である
【０１７６】
また、連結物質としては、抗原及び抗体の他に、アレルゲン、酵素、酵素基質、補酵素、酵素阻害剤、ホスト化合物、ホルモン、ホルモンレセプター、タンパク質、血液タンパク質、組織タンパク質、細胞、細胞破砕物、核物質、ウイルス、ウイルス粒子、代謝産物、神経伝達物質、ハプテン、薬物、核酸、金属、金属錯体、微生物、寄生虫、細菌、ビオチン、アビジン、レクチン、糖、生理活性物質、生理活性物質受容体、環境物質、化学種又はこれらの誘導体などから、検出対象物質に応じて適宜選択してもよい。例えば、予め検出対象物質をアビジン化処理することが可能である場合には、ビオチンを連結物質とすることができる。検出対象物質が所定のリガンドである場合、該リガンドに特異的に結合するレセプター及びその断片であってもよい。また、標的物質が核酸である場合、該核酸に特異的に結合するタンパク質やペプチド（アプタマー）であってもよい。
これらの連結物質との結合方法は、前述と同様に行ってもよく、その他の既知の結合方法によって結合してもよい。
このような連結物質は、検出対象物質そのものであってもよく、また蛍光性重合体微粒子と同様に検出対象物質に対して結合処理することにより、本蛍光検出用複合体によって検出可能としてもよい。
【０１７７】
＜蛍光検出方法＞
本発明の蛍光検出方法は、上記蛍光性重合体微粒子と、蛍光性重合体微粒子及び検出対象物質を連結可能な連結物質、即ち、蛍光検出用複合体を用いて検出対象物質を検出することを含む。これにより、蛍光強度が高く高感度に検出可能な本発明の蛍光性重合体微粒子を用いて、高感度に検出対象物質を検出することができる。
蛍光検出用複合体については、上記事項をそのまま適用することができる。
【０１７８】
蛍光検出方法は、蛍光物質を利用した公知の蛍光検出方法における手順及び条件をそのまま適用することができ、測定対象物質と、蛍光検出用複合体とを接触させて検出試料を調製すること、蛍光検出用複合体を励起する励起光を照射すること、該照射による蛍光発光を測定することを含む。
【０１７９】
また本発明の蛍光検出方法は、発光寿命の長いランタノイド錯体（特にユーロピウム、テルビウム、ルテニウム）を蛍光色素として用いているので、バックグランド蛍光が消滅した後に、目的の蛍光を検出する遅延蛍光分析法であることが好ましい。例えば、ユーロピウム錯体の発光寿命は、数百μｓｅｃからｍｓｅｃであり、一般的な有機色素の１０万〜１００万倍である。さらに２５０ｎｍ以上の大きいストークスシフト、シャープな蛍光ピーク等の特徴を有している。分析のためには、ランタノイドイオンの配位子を励起し、発生する遅延を時間分解蛍光測定装置で測定する。
【０１８０】
また、本発明における上記蛍光性ランタノイド色素は、可視光、例えば４００ｎｍ程度の光による励起が可能である。このため、ＵＶのような高エネルギーの励起光を使用する必要がなく、励起光源の選択の幅を広くすることができる。
これにより、低エネルギーの励起光源による蛍光検出を高感度に行うことができる。
本蛍光検出方法は、時間分解蛍光測定によるものであることが、測定の精度及び感度の観点から更に好ましい。時間分解蛍光測定における条件は、選択された金属イオンに応じて適宜選択することができる。
【０１８１】
＜蛍光検出キット＞
本発明の蛍光検出キットは、本発明の蛍光性重合体微粒子を含むものである。
これにより、標的物質の検出を、連結物質を介した蛍光性重合体微粒子の蛍光発光に基づいて効率よく且つ高感度に行うことができる。
本蛍光検出キットにおける蛍光性重合体微粒子は、連結物質と共に含まれるものであってもよく、また蛍光検出用複合体として含まれるものであってもよい。
また連結物質の種類に応じて、検出対象物質を蛍光検出用複合体によって検出可能にするための試薬を含むものであってもよい。このような試薬としては、例えば、蛍光検出用複合体中の連結物質としてビオチンを選択した場合では、検出対象物質をアビジン化するための試薬が挙げられる。
【実施例】
【０１８２】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これにより本発明は限定されるものではない。
実施例１
＜蛍光性重合体微粒子の合成＞
Anal. Chem. 2003, 75, 6124-6132に記載の方法に従い、下記式で表される末端にアミノ基を有するラジカル重合性マクロモノマーを合成した。ＧＰＣ測定から数平均分子量は７０００であった。
【０１８３】
【化４５】
2007146149.tif 000046
【０１８４】
スチレンと前記マクロモノマー（スチレンに対し５モル％）及び１，４−ジビニルベンゼン（スチレンに対し２モル％）を、ラジカル発生剤Ｖ−６５（スチレンに対し２モル％、和光純薬（株）製）の共存下、エタノール／蒸留水＝４／１（体積比）中で７０℃に６時間加熱し、ラジカル重合を行った。反応物中のポリマー固形物をろ過し、ろ液に対して、蒸留水を用いて一日透析（分画分子量＝１２０００〜１４０００）を行い精製し、表面にアミノ基を有する微粒子の分散物を得た。粒度分布測定装置（コールターＮ４Ｐｌｕｓ、ベックマン・コールター株式会社製）を用いて粒径を測定したところ平均粒径が１２０ｎｍであった。蒸留水を用いて希釈し、粒子濃度を５０ｍｇ／ｍＬとした。
【０１８５】
次に、トリス（４，４，４−トリフルオロ−１−（２−チエノイル）−１，３−ブタンジオノ）ユーロピウム（III）と、前記例示化合物４の配位子を等モル量混合した後、メタノールで溶解し、ユーロピウム色素の０．２質量％溶液を作成した。
前記で合成した表面にアミノ基を有する微粒子の分散液５０ｍＬに３８０ｍｇのユーロピウム色素溶液を加え、室温で３時間攪拌した。その後、アスピレータを用いて分散液中のメタノールを減圧留去した。不溶物をフィルターろ過し、ゲルろ過により精製し、ユーロピウム色素染色蛍光性重合体微粒子の分散液を得た。
【０１８６】
＜抗体連結微粒子の合成＞
次に、通常のヒンジ法（「酵素免疫測定法第３版」；石川栄治等編、医学書院）により上記で合成した蛍光性重合体微粒子へ抗体Ｆａｂ’の導入を行った。
上記で合成した表面にアミノ基を有し、ユーロピウム色素染色した蛍光性重合体微粒子を、濃度１４ｍｇ／ｍｌで０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）緩衝液に分散した。この微粒子分散液１ｍｌにＳｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ（同仁化学）０．６ｍｇを添加し室温で１時間反応させ、ＰＤ−１０カラム（ファルマシアバイオサイエンス）で精製し表面にマレイミド基を有する蛍光性重合体微粒子分散液を得た。
次に、抗テオフィリン抗体７．２ｍｇからペプシン処理、メルカプトエチルアミン還元により精製したＦａｂ’分画３．９ｍｇを、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し濃度を１ｍｇ／ｍｌとした。表面にマレイミド基を有する蛍光性重合体微粒子分散液（１ｍｇ／ｍｌ ０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））と等容量混合し、４℃で一晩攪拌した後、ゲルろ過により精製、抗体連結蛍光微粒子（蛍光検出用複合体）を得た。
【０１８７】
＜テオフィリン結合ポリ−Ｌ−リジンの調製と石英基板への結合と検出＞
０．１％ポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ）４０ｍｌと０．１Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）１０ｍｌを混合し、Theophylline-8-Butanoic Acid（Sigma）３５ｍｇ、ＷＳＣ（同仁化学）３０ｍｇ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（Pierce）３４ｍｇを添加し室温で６時間反応させた。反応液をセファデックスＧ−２５でゲルろ過し、テオフィリン結合ポリ−Ｌ−リジンを精製した。表面をアルカリ処理した合成石英基板を精製水で十分に洗浄した後、テオフィリン結合ポリ−Ｌ−リジン溶液に室温で２時間浸漬した。精製水で洗浄、風乾し以下の実験に用いた。
抗体連結蛍光微粒子（微粒子濃度３．０×１０−６Ｍ）溶液と、その希釈液（×１０、×１００）をそれぞれ１μｌ石英基板上にスポットし、室温で２時間静置後、精製水で洗浄した。表面の水滴を除き、基板の時間分解蛍光量を時間分解蛍光光度計（ワラック社製）で測定した（励起光：４２０ｎｍ、蛍光発光：６１５ｎｍ）。その結果、蛍光微粒子濃度に依存した遅延蛍光が観察された。また、抗体連結蛍光微粒子分散液を３５℃の環境下で１週間放置した後、再び石英基板上にスポットし、前記と同様に蛍光測定を行った。石英基板上の蛍光強度は変化せず、保存性に優れた蛍光検出試薬であることを確認した。
【０１８８】
実施例２〜５
実施例１の蛍光性重合体微粒子の合成において、例示化合物４の配位子の代わりに、それぞれ例示化合物２、６、１１、１７の配位子を用いた他は、実施例１と同様に蛍光微粒子を作成し、更に実施例１と同様にして抗体を結合した粒子を作成し、各化合物に応じた蛍光測定を行った。蛍光粒子濃度に依存した遅延蛍光が観測され、３５℃の環境下で１週間放置した後、再び蛍光測定を行った場合も、蛍光強度は変化せず、保存性に優れた蛍光検出試薬であることを確認した。
【０１８９】
実施例６
＜蛍光性重合体微粒子の合成＞
親水性ポリマーの例示化合物Ｐ−１  ２．５ｇを、蒸留水１００ｇ中に溶解し、毎分４０ｍＬの窒素を流しつつ、７０℃に加熱した。次に、この溶液中に、メタクリル酸メチル１０ｇ、エチレングリコールジメタクリレート０．５ｇ、２,２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）０．２ｇおよびエタノール１０ｇからなる溶液を、１時間かけて滴下した。滴下終了後７０℃で２時間攪拌し、更に８５℃で１時間攪拌し、室温まで冷却した。蒸留水を用いて分散物を一日透析（分画分子量＝１２０００〜１４０００）して、精製を行った。更に遠心分離機を用い粒子を分離した後、蒸留水を用いて希釈再分散し、粒子濃度を５質量％とした。粒度分布測定装置（コールターＮ４Ｐｌｕｓ、ベックマン・コールター株式会社製）を用いて粒径を測定したところ平均粒径が１５０ｎｍであった。
【０１９０】
粒子分散物に塩酸を加え、ｐＨを１とした後、８０℃で２４時間攪拌し、粒子表面に結合した親水性ポリマー中のアセトアミド基の加水分解を行いアミノ基に変換した。室温まで冷却し、ｐＨを７とし、蒸留水を用いて一日透析を行って精製し、無機物を除去した後、蒸留水で濃度調節し、４質量％の分散液とした。
次に、トリス（４，４，４−トリフルオロ−１−（２−チエノイル）−１，３−ブタンジオノ）ユーロピウム（III）と、例示化合物４のトリアジン環を有する配位子を等モル量混合した後、メタノールで溶解し、ユーロピウム色素の２質量％溶液を作成した。
前記で合成した表面にアミノ基を有する微粒子の分散液１０ｇに０．４ｇのユーロピウム色素溶液を加え、室温で３時間攪拌した。その後、アスピレータを用いて分散液中のメタノールを減圧留去した。不溶物をフィルターろ過し、蛍光性重合体微粒子の分散液を得た。
【０１９１】
＜抗体連結微粒子の合成＞
次に、通常のヒンジ法（「酵素免疫測定法第３版」；石川栄治等編、医学書院）により上記で合成した蛍光微粒子へ抗体Ｆａｂ’の導入を行った。
上記で合成した表面にアミノ基を有するユーロピウム色素染色粒子を、濃度１４ｍｇ／ｍｌで０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）緩衝液に分散した。微粒子分散液１ｍｌにＳｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ（同仁化学）０．６ｍｇを添加し室温で１時間反応させ、ＰＤ−１０カラム（ファルマシアバイオサイエンス）で精製し表面にマレイミド基を有する蛍光微粒子溶液を得た。
次に、抗テオフィリン抗体７．２ｍｇからペプシン処理、メルカプトエチルアミン還元により精製したＦａｂ’分画３．９ｍｇを、ｐＨ７．４ ０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解し濃度を１ｍｇ／ｍｌとした。表面にマレイミド基を有する蛍光微粒子溶液（１ｍｇ／ｍｌ ０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））と等容量混合し、４℃で一晩攪拌した後、ゲルろ過により精製、抗体連結蛍光微粒子を得た。
【０１９２】
＜テオフィリン結合ポリ−Ｌ−リジンの調製と石英基板への結合と検出＞
０．１％ポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ）４０ｍｌと０．１Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）を１０ｍｌを混合し、Theophylline-8-Butanoic Acid（Ｓｉｇｍａ）３５ｍｇ、ＷＳＣ（同仁化学）３０ｍｇ、Sulfo−ＮＨＳ（Ｐｉｅｒｃｅ）３４ｍｇを添加し室温で６時間反応させた。反応液をセファデックスＧ−２５でゲルろ過しテオフィリン結合ポリ−Ｌ−リジンを精製した。表面をアルカリ処理した合成石英基板を精製水で十分に洗浄した後、テオフィリン結合ポリ−Ｌ−リジン溶液に室温で２時間浸漬した。精製水で洗浄、風乾し以下の実験に用いた。
抗体連結蛍光微粒子（微粒子濃度３．０×１０−６Ｍ）溶液と、その希釈液（×１０、×１００）をそれぞれ１μｌ石英基板上にスポットし、室温で２時間静置後、精製水で洗浄した。表面の水滴を除き、基板の時間分解蛍光量を時間分解蛍光光度計（ワラック社製）で測定した。その結果、蛍光微粒子濃度に依存した遅延蛍光が観察された。また、蛍光微粒子分散液を４０℃の環境下で２週間放置した後、再び石英基板上にスポットし、前記と同様に蛍光測定を行った。石英基板上の蛍光強度はほとんど変化せず、保存性に優れた蛍光検出試薬であることを確認した。
【０１９３】
実施例７〜１０
実施例６において用いた親水性ポリマーＰ−１、メタクリル酸メチル及びエチレングリコールジメタクリレートの代わりに、それぞれ表１に示す種類と量の親水性ポリマーおよびラジカル重合性モノマーを用いた他は、実施例６と同様に蛍光性重合体微粒子を作製した。平均粒径を、表１に示す。更に実施例６と同様にして抗体を結合した粒子を作製し蛍光測定を行った。蛍光粒子濃度に依存した遅延蛍光が観測され、４０℃の環境下で２週間放置した後、再び蛍光測定を行った場合も、蛍光強度はいずれもほとんど変化せず、保存性に優れた蛍光検出試薬であることを確認した。
【０１９４】
更に、実施例１と実施例６の結果を比較したところ、実施例１における蛍光強度は実施例６に比べ５０％であった。また、４０℃の環境下で２週間放置した後、再び蛍光測定を行ったところ、蛍光強度は保存前の５０％に減少した。
【０１９５】
【表１】
2007146149.tif 000047
【０１９６】
実施例１１
＜蛍光性重合体微粒子分散液の合成＞
親水性ポリマーの例示化合物Ｐ−２９（数平均分子量９０００）１．５ｇを、蒸留水１４ｇとエタノール１３ｇの混合溶液中に溶解し、毎分５０ｍＬの窒素を流しつつ、７０℃に加熱した。次に、この溶液中に、メタクリル酸メチル１．５ｇ、２,２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）０．０４ｇおよびエタノール８ｇからなる溶液を、２時間かけて滴下した。滴下終了後７０℃で３時間攪拌し、更に７５℃で１時間攪拌し、室温まで冷却した。分散物を、蒸留水を用いて一日透析（分画分子量＝１２０００〜１４０００）して精製を行った。更に遠心分離機を用いて粒子を分離した後、蒸留水を用いて希釈再分散し、粒子濃度を５質量％とした。粒度分布測定装置（コールターＮ４Ｐｌｕｓ、ベックマン・コールター株式会社製）を用いて粒径を測定したところ体積平均粒径が１５０ｎｍであった。
粒子分散物に塩酸を加え、ｐＨを１とした後、２５℃で１４時間攪拌し、粒子表面に結合した親水性ポリマー中のアセトアミド基の加水分解を行いアミノ基に変換した。室温まで冷却し、ｐＨを７とし、蒸留水を用いて一日透析精製を行い、水溶性物質を除去した後、遠心分離機を用いて粒子を分離した後、蒸留水を加えて希釈濃度調節し、４質量％の表面にアミノ基を有する微粒子分散液を得た。
次に、トリス（４，４，４−トリフルオロ−１−（２−チエニル）−１，３−ブタンジオノ）ユーロピウム（III）７．０ｍｇと、例示化合物１２のトリアジン環を有する配位子４．５ｍｇを、メタノール０．５ｇで溶解した。次にこれを、上記で合成した表面にアミノ基を有する微粒子分散液１０ｇに加え、室温で３時間攪拌した。その後、アスピレータを用いて分散液中のメタノールを減圧留去した。不溶物をフィルターろ過後、４５℃で３日間静置した後、室温に冷却して、蛍光性重合体微粒子分散液を得た。この蛍光性重合体微粒子分散液は、４２０ｎｍの励起光の照射により、６１５ｎｍに強い蛍光を示した。
【０１９７】
実施例６の＜抗体連結微粒子の合成＞において、実施例６で合成した蛍光性重合体微粒子分散液の代わりに、上記で得た蛍光性重合体微粒子分散液を用いた以外は、実施例６と同様にして抗体連結微粒子を合成した。
【０１９８】
＜テオフィリン結合ポリ−Ｌ−リジンの調製と石英基板への結合と検出＞
０．１％ポリ−Ｌ−リジン（ＳＩｇｍａ）４０ｍｌと０．１Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）１０ｍｌを混合し、Theophylline-8-Butanoic Acid（Sigma）３５ｍｇ、ＷＳＣ（同仁化学）３０ｍｇ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（Pierce）３４ｍｇを添加し室温で６時間反応させた。反応液をセファデックスＧ−２５でゲルろ過し、テオフィリン結合ポリ−Ｌ−リジンを精製した。表面をアルカリ処理した合成石英基板を精製水で十分に洗浄した後、テオフィリン結合ポリ−Ｌ−リジン溶液に室温で２時間浸漬した。精製水で洗浄、風乾し以下の実験に用いた。
抗体連結蛍光微粒子（微粒子濃度３．０×１０−６Ｍ）溶液と、その希釈液（×１０、×１００）をそれぞれ１μｌ石英基板上にスポットし、室温で２時間静置後、精製水で洗浄した。表面の水滴を除き、基板の時間分解蛍光量を時間分解蛍光光度計（ワラック社製）で測定した（励起光：４２０ｎｍ、蛍光発光：６１５ｎｍ）。その結果、蛍光微粒子濃度に依存した遅延蛍光が観察された。また、蛍光微粒子分散液を３５℃の環境下で１週間放置した後、再び石英基板上にスポットし、前記と同様に蛍光測定を行った。石英基板上の蛍光強度は変化せず、保存性に優れた蛍光検出試薬であることを確認した。
【０１９９】
実施例１２
＜蛍光性重合体微粒子の合成＞
親水性マクロモノマーの例示化合物ＭＭ−１  ５ｇを、蒸留水８０ｇ中に溶解し、毎分４０ｍＬの窒素を流しつつ、６０℃に加熱した。次に、この溶液中に、メタクリル酸メチル５ｇ、エチレングリコールジメタクリレート０．２ｇ、２,２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）０．１ｇおよびエタノール５ｇからなる溶液を、２時間かけて滴下した。滴下終了後７０℃で２時間攪拌し、更に８５℃で１時間攪拌し、室温まで冷却した。分散物を、蒸留水を用いて一日透析（分画分子量＝１２０００〜１４０００）して精製を行った。更に遠心分離機を用いて粒子を分離した後、蒸留水を用いて希釈再分散し、粒子濃度を５質量％とした。粒度分布測定装置（コールターＮ４Ｐｌｕｓ、ベックマン・コールター株式会社製）を用いて粒径を測定したところ平均粒径が１２０ｎｍであった。
粒子分散物に塩酸を加え、ｐＨを１とした後、８０℃で２４時間攪拌し、粒子表面に結合した親水性ポリマー中のアセトアミド基の加水分解を行いアミノ基に変換した。室温まで冷却し、ｐＨを７とし、蒸留水を用いて一日透析精製を行い、水溶性物質を除去した後、蒸留水で濃度調節し、４質量％の分散液とした。
【０２００】
次に、トリス（４，４，４−トリフルオロ−１−（２−チエノイル）−１，３−ブタンジオノ）ユーロピウム（III）と、化合物例４のトリアジン環を有する配位子を等モル量混合した後、メタノールで溶解し、ユーロピウム色素の２質量％溶液を作成した。
前記で合成した表面にアミノ基を有する微粒子の分散液１０ｇに０．４ｇのユーロピウム色素溶液を加え、室温で３時間攪拌した。その後、アスピレータを用いて分散液中のメタノールを減圧留去した。不溶物をフィルターろ過し蛍光性重合体微粒子の分散液を得た。
【０２０１】
実施例６の＜抗体連結微粒子の合成＞において、実施例６で得た蛍光性重合体微粒子の分散液の代わりに、上記で得た蛍光性重合体微粒子の分散液を用いた以外は、実施例６と同様にして実施例１２の抗体連結微粒子を得た。
実施例６の＜テオフィリン結合ポリ−Ｌ−リジンの調製と石英基板への結合と検出＞において、実施例６の抗体連結微粒子の代わりに、上記で得た抗体連結微粒子を用いた以外は実施例６と同様にして、蛍光測定を行った。その結果、蛍光微粒子濃度に依存した遅延蛍光が観察された。また、蛍光微粒子分散液を４０℃の環境下で２週間放置した後、再び石英基板上にスポットし、前記と同様に蛍光測定を行った。石英基板上の蛍光強度はほとんど変化せず、保存性に優れた蛍光検出試薬であることを確認した。
【０２０２】
実施例１３〜１６
実施例１２で用いた親水性マクロモノマー及びラジカル重合性モノマーの代わりに、表２に示した種類と量の親水性マクロモノマー及びラジカル重合性モノマーを用いた以外は実施例１２と同様にして蛍光性重合体微粒子を作製した。平均粒径を、表２に示す。更に実施例１２と同様にして抗体を結合した粒子を作製し、蛍光測定を行った。蛍光粒子濃度に依存した遅延蛍光が観測され、４０℃の環境下で２週間放置した後、再び蛍光測定を行った場合も、蛍光強度はいずれもほとんど変化せず、保存性に優れた蛍光検出試薬であることを確認した。
【０２０３】
【表２】
2007146149.tif 000048
【０２０４】
実施例１７
＜蛍光性重合体微粒子の合成＞
親水性マクロモノマーの例示化合物ＭＭ−３２（数平均分子量３１００）３．１ｇを、蒸留水３２ｇとエタノール１０ｇの混合溶液中に溶解し、毎分５０ｍＬの窒素を流しつつ、６０℃に加熱した。次に、この溶液中に、メタクリル酸メチル１ｇ、２,２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）０．０３ｇおよびエタノール１０ｇからなる溶液を、４時間かけて滴下した。滴下終了後７０℃で３時間攪拌し、更に７５℃で２時間攪拌し、室温まで冷却した。分散物を、蒸留水を用いて一日透析（分画分子量＝１２０００〜１４０００）して精製を行った。更に遠心分離機を用いて粒子を分離した後、蒸留水を用いて希釈再分散し、粒子濃度を５質量％とした。粒度分布測定装置（コールターＮ４Ｐｌｕｓ、ベックマン・コールター株式会社製）を用いて粒径を測定したところ体積平均粒径が３５０ｎｍであった。
粒子分散物に塩酸を加え、ｐＨを１とした後、２５℃で１４時間攪拌し、粒子表面に結合した親水性ポリマー中のアセトアミド基の加水分解を行いアミノ基に変換した。室温まで冷却し、ｐＨを７とし、蒸留水を用いて一日透析精製を行い、水溶性物質を除去した後、遠心分離機を用いて粒子を分離した後、蒸留水を加えて希釈濃度調節し、４質量％の表面にアミノ基を有する微粒子分散液を得た。
次に、トリス（４，４，４−トリフルオロ−１−（２−チエニル）−１，３−ブタンジオノ）ユーロピウム（III）７．０ｍｇと、化合物例１２のトリアジン環を有する配位子４．５ｍｇを、メタノール０．５ｇで溶解した。次にこれを、上記で合成した表面にアミノ基を有する微粒子分散液１０ｇに加え、室温で３時間攪拌した。その後、アスピレータを用いて分散液中のメタノールを減圧留去した。不溶物をフィルターろ過後、４５℃で３日間静置した後、室温に冷却して、蛍光微粒子分散液を得た。この蛍光微粒子分散液は、４２０ｎｍの励起光の照射により、６１５ｎｍに強い蛍光を示した。
【０２０５】
実施例１２の＜抗体連結微粒子の合成＞において、実施例１２で得た蛍光性重合体微粒子の分散液の代わりに、上記で得た蛍光性重合体微粒子の分散液を用いた以外は、実施例６と同様にして実施例１７の抗体連結微粒子を得た。
【０２０６】
＜テオフィリン結合ポリ−Ｌ−リジンの調製と石英基板への結合と検出＞
０．１％ポリ−Ｌ−リジン（ＳＩｇｍａ）４０ｍｌと０．１Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）１０ｍｌを混合し、Theophylline-8-Butanoic Acid（Sigma）３５ｍｇ、ＷＳＣ（同仁化学）３０ｍｇ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（Pierce）３４ｍｇを添加し室温で６時間反応させた。反応液をセファデックスＧ−２５でゲルろ過し、テオフィリン結合ポリ−Ｌ−リジンを精製した。表面をアルカリ処理した合成石英基板を精製水で十分に洗浄した後、テオフィリン結合ポリ−Ｌ−リジン溶液に室温で２時間浸漬した。精製水で洗浄、風乾し以下の実験に用いた。
抗体連結蛍光微粒子（微粒子濃度３．０×１０−６Ｍ）溶液と、その希釈液（×１０、×１００）をそれぞれ１μｌ石英基板上にスポットし、室温で２時間静置後、精製水で洗浄した。表面の水滴を除き、基板の時間分解蛍光量を時間分解蛍光光度計（ワラック社製）で測定した（励起光：４２０ｎｍ、蛍光発光：６１５ｎｍ）。その結果、蛍光微粒子濃度に依存した遅延蛍光が観察された。また、蛍光微粒子分散液を３５℃の環境下で１週間放置した後、再び石英基板上にスポットし、前記と同様に蛍光測定を行った。石英基板上の蛍光強度は変化せず、保存性に優れた蛍光検出試薬であることを確認した。
【０２０７】
比較例１
実施例１において、例示化合物４の代わりに、トリオクチルホスフィンオキシドを用いた他は、実施例１と同様に蛍光性重合体微粒子を作製し、更に実施例１と同様にして抗体を結合した粒子を作製し、蛍光測定を行った（励起光：４２０ｎｍ、蛍光発光：６１５ｎｍ）。蛍光粒子濃度に依存した遅延蛍光が観測されたが、蛍光強度は実施例１〜５に比べ１０％以下であった。３５℃の環境下で１週間放置した後、再び蛍光測定を行ったところ、蛍光強度は保存前の５０％に減少し、本発明の蛍光性重合体微粒子に比べ保存性に劣っていた。