(57)【要約】  【課題】  溶液中の測定対象物質を定量するQCMセンサーにおいて、得られる周波数変化は抗原−抗体反応等の生体反応、あるいは吸着反応により電極表面に付着した測定対象物質の質量に比例するが。しかし試料溶液中の測定対象物質の分子量が小さい場合、あるいは存在濃度が極めて低い場合、その周波数変化は非常に小さくなり、定量が極めて困難になることから、溶液中で周波数変化の小さい安定なQCMセンサーが必要となる。水晶振動子の構造や実装方法の改良等の提案がされているが、未だ十分でない。  【解決手段】  水晶振動子実装基板の電極を作用極とし、アルカリ溶液中にて特定電位を印加した後、酸処理を含む洗浄工程を施したQCMセンサーチップを用い、測定対象物質と反応性を有する機能膜や生体物質にて電極を修飾したQCMセンサーを使用する。【選択図】    無し【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液中の測定対象物質を定量するQCMセンサーチップの製造方法であって、液相側の電極を作用極とし、三電極系でアルカリ溶液中にて前記作用極に特定電位を印加する工程と、前記作用極に酸処理を行うとともに洗浄する工程とを有するQCMセンサーチップの製造方法。
【請求項２】
前記電極が金からなり、基板との間の密着層としてNiを用いることを特徴とする請求項１に記載のQCMセンサーチップの製造方法。
【請求項３】
前記アルカリ溶液が水酸化ナトリウム溶液、または水酸化カリウム溶液であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載のQCMセンサーチップの製造方法。
【請求項４】
前記特定電位が、β-Ni(OH)2が形成される電位であることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のQCMセンサーチップの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液試料に含まれる微量な測定対象物質を認識、定量するQCMセンサーに用いるQCMセンサーチップの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
水晶振動子を利用したセンサーで、水晶電極表面上を特定の測定対象物質を認識し特異的反応を生じる機能性膜や生体物質で修飾し、試料溶液中に存在する測定対象物質が機能膜や生体物質と反応し、水晶電極表面に吸着した際の質量変化を周波数変化として捉え、測定対象物質濃度を測定するQCMセンサーが開発されている。
【０００３】
たとえば、電極上に特定のにおい分子を吸着する脂質膜等の機能膜を形成し、におい分子の吸着に伴い周波数変化を生じるQCMにおいセンサーが存在する。
【０００４】
また、電極上に生体物質として特定の抗原と反応する抗体を担持し、抗原−抗体反応により生体試料中の抗体を定量するQCM免疫センサーが存在する。
【０００５】
たとえばQCMセンサーを免疫センサーとして用いる場合、得られる周波数変化は抗原−抗体反応等による生体反応、あるいは吸着反応により電極表面に付着した測定対象物質の質量に比例する。しかし多くの場合、試料溶液中の測定対象物質の分子量は小さく、存在濃度が低いため、得られる周波数変化は非常に小さくなることから、反応系側ではより大きな周波数変化が得られる工夫が、QCMセンサーチップ側では溶液中でより周波数変化を小さくする工夫が求められている。
【０００６】
反応系側の工夫として、抗原との反応効率の高い抗体を用いる方法や、抗原−抗体反応により電極上に担持された抗体と抗原が結合した後に、更に抗体を吸着させたラテックス粒子を加え、更なる抗原−抗体反応により結合したラテックス粒子の質量により周波数変化を増幅させる方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００７】
一方、QCMセンサーチップ側の工夫として、微量な周波数変化を検出するために水晶振動子の電極周辺に溝を設け、機械的接続部に起因する周波数の不安定化を抑制する方法も提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【０００８】
QCMセンサーチップは、水晶基板上の両面に蒸着法、またはスパッタリング法等で金属電極を設け、これら金属電極と水晶基板との密着性を高める目的で密着層を設けた水晶振動子を用いたものである。
【０００９】
金属電極としてはチオール基やアミノ基との反応性を有することで機能膜や生体物質の固定化に有利な金電極を用いることが多いが、金は水晶基板との密着性はきわめて低いことから金と水晶基板の間に密着層が必要となり、密着層は汎用性の高いNiを用いることが多い。
【００１０】
【特許文献１】特開２００２−７１５４０号公報（図１）
【００１１】
【特許文献２】特開平８−２２８１２３号公報（図１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
一般的にQCMセンサーは機能膜や生体物質を電極上に修飾する前に、電極表面を清浄化する目的で、界面活性剤処理とともに塩酸、硫酸、ピランハ等の酸処理により表面に付着した脂質やタンパク質を除去するが、密着層としてNiを用いた場合、酸洗浄処理により未洗浄のQCMに比べて溶液中での周波数安定性が大きく低下するという問題があった。
【００１３】
本発明は、溶液中での周波数安定性の高いQCMセンサーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は溶液中の測定対象物質を定量するQCMセンサーチップの製造方法であって、液相側の電極を作用極とし、三電極系でアルカリ溶液中にて作用極に特定電位を印加する工程と、作用極に酸処理を行うと共に洗浄する工程とを有することを特徴とするものである。
【００１５】
三電極のうち、対極はアルカリ溶液中で安定な金属であればどのようなものを用いても良いが、電気化学的挙動が良く知られているPtなどを用いるのが好ましい。
【００１６】
参照極としては、電位が安定しており再現性に優れるものであればどのようなものを用いても良いが、取り扱い易いAg/AgCl電極を用いるのが好ましい。
【００１７】
また本発明の電極が金からなり、基板との間の密着層としてNiを用いることが好ましい。
【００１８】
密着層の厚みは数百〜千Å、金属電極の厚みは千〜数千Åであることが好ましい。
【００１９】
更に本発明のQCMセンサーチップの製造方法においてアルカリ溶液が水酸化ナトリウム溶液、あるいは水酸化カリウム溶液であることが好ましい。
【００２０】
アルカリ溶液の濃度は特に限定されないが、特に濃厚な溶液を必要としないので作業安全上取り扱いやすい0.1N〜1.0N程度の濃度が好ましい。
【００２１】
また、本発明の特定電位が、β-Ni(OH)2が形成される電位であることが好ましい。
【００２２】
印加電位は、参照極の種類や電解質溶液の組成により変化するものであるが、アルカリ溶液が0.1NのNaOH，参照電極がAg/AgClの場合、−0.2Vから0.4V間のいずれかの電位を印加することが好ましい。
【００２３】
（作用）
QCMセンサーチップの溶液中での周波数の不安定原因について種々の検討を行った結果、水晶振動子の製造工程で生じる密着層のマスクと金属電極のマスクの微妙なズレや、金属電極のピンホールにより密着層のNiが溶液と接することとなり、Niが酸処理により酸化あるいは溶解することで、電極の周囲やピンホール部分から金属電極が剥離することが原因と考えた。
【００２４】
マスクのズレやピンホールをゼロにすることは困難であり、また金属電極材料である金と水晶基板の密着層としてNiは有用である。
【００２５】
本発明のQCMセンサーチップの製造方法によると、溶液と接している水晶振動子の密着層のNi表面が、電気化学的処理により化学的に安定なβ-Ni(OH)2となることから、酸洗浄によるダメージを受けず金電極の剥離が生じなくなるため、溶液中での周波数の安定性が向上するものと考えられる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、低濃度物質の生体物質の定量、例えば高感度測定が必要なウイルス性感染症の迅速検査、炎症マーカーの定量等が可能となる。
【００２７】
また本発明によれば、数百から数千の低分子量物質の定量、例えば種々の疾病に関連する生体代謝物質1,5-AGやクレアチニン、あるいはダイオキシン、PCBなどの大気汚染物質の定量等が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明のQCMセンサーチップの製造方法について参照極としてAg/AgClを、アルカリ溶液として0.1NのNaOHを用いた実施例を示し、更に詳しく説明する。
【００２９】
（実施例１）
ガラス基板上に密着層として用いるNiをスパッタリング法で1000Åの厚さで成膜しこれを作用極とし、参照極としてAg/AgClを、対極としてPtを用い、0.1NのNaOH中で走査速度100mM/sec、走査範囲−1.2V〜1.0V間でCV（サイクリックボルタンメトリー）測定を行った結果を図１に示す。図１中の−1V付近のピークはNiへの還元ピーク、−0.5V付近はNiからα-Ni(OH)2への酸化ピーク、0.8V付近のピークはNi(OH)2からNiOOHの酸化ピーク、0.5V付近のピークはNiOOHの還元ピークである。α-Ni(OH)2は準安定な結晶形であり、−0.2V〜0.4V付近の酸化電流が流れている領域で、安定なβ-Ni(OH)2に変化するものと考えられる。
【００３０】
次に図１の結果を基にQCMセンサーチップの作製を行った。
【００３１】
水晶基板上に500ÅのNi密着層を、その上に1500ÅのAu電極を設けた38MHzの水晶振動子をエポキシ基板上に実装し、片側の電極が溶液に触れないようにシリコーン樹脂で片面を封止した水晶振動子実装基板を作製した。
【００３２】
未洗浄の水晶振動子実装基板をPBS（pH；7.2）中に浸漬し周波数変化を観察した。その結果を図２に示す。浸漬10分後の周波数変化は0.8Hz/minであった。
【００３３】
次に前処理としてこの水晶振動子実装基板の液相側の電極を作用極とし、参照極としてAg/AgClを、対極としてPtを用い、0.1NのNaOH中にて−0.05Vの電位を10分間印加した。
【００３４】
前処理後、水晶振動子実装基板の水晶振動子の液相側電極に1.2N−HClを滴下し5分間放置することで酸洗浄を行いQCMセンサーチップとした。図４にQCMセンサーチップの形状を示す。エポキシ基板１上にシリコーン樹脂３により水晶振動子２が実装されてあり、水晶振動子２表面には液相側の電極４と裏面の電極５が形成されている。
【００３５】
酸洗浄後、先ほどと同様にPBS中にQCMセンサーチップを浸漬し周波数変化を観察した結果を図３に示す。浸漬10分後の周波数変化は1.0Hz/min程度と良好であった。
【００３６】
（実施例２）
実施例１で作製したQCMセンサーチップの液相側の電極上に100ug/mLの抗マウスIgG抗体のPBS溶液を乗せ、湿潤箱中で1時間室温放置しその後、PBS溶液で洗浄することで、電極上に抗マウスIgG抗体を固定化しQCMセンサーを作製した。
【００３７】
作製した抗マウスIgG抗体固定化QCMセンサーを、25℃に保った2mLのPBS溶液入りガラス製反応容器中に浸漬した。浸漬10分後の周波数変化は0.6Hz/minであった。
【００３８】
次に上記反応容器中に100ug/mLのマウスIgGのPBS溶液を10uL添加した（マウスIgG濃度；200ng/mL）。滴下直前の周波数をF1、滴下10分後の周波数をF2としたところ、それらの差は234Hzであった。
【００３９】
図５にQCMセンサーチップの断面図を、図６にQCMセンサーの反応模式図を示す。
エポキシ基板１上にシリコーン樹脂３により水晶振動子２が実装されてあり、水晶振動子２表面には液相側の電極４と裏面の電極５が形成されている。図６のQCMセンサーの液相側の電極４上には抗体６が固定化されており、抗体６に対応した抗原７を作用させると、抗原−抗体反応により抗体６と抗原７が結合し、結合した抗原７の質量に応じてQCMセンサーの周波数が変化する。
【００４０】
同様に抗マウスIgG抗体固定化QCMセンサーを作製し、種々の濃度のマウスIgG溶液を添加しマウスIgG濃度に対する周波数変化を求めた結果を図７に示す。
【００４１】
図７の結果よりマウスIgG濃度が10ng/mL程度まで測定が可能であることがわかる。
【００４２】
（比較例１）
実施例１と同様に未洗浄の状態で水晶振動子実装基板のPBS中での周波数変化を測定した結果、実施例１と同程度に浸漬10分後の周波数変化は0.9Hz/minであった。
【００４３】
次に前処理を行わず、実施例１と同様に水晶振動子実装基板の液相側の電極に1.2−HClを滴下し5分間放置することで酸洗浄を行いQCMセンサーチップとした。
酸洗浄後、PBS中にQCMセンサーチップを浸漬し周波数変化を測定した結果を図８に示す。浸漬10分後の周波数変化は非常に大きく、また不連続であった。
【００４４】
（比較例２）
比較例１と同様に前処理を行わず酸洗浄を行ったQCMセンサーチップの液相側の電極上に100ug/mL濃度の抗マウスIgG抗体のPBS溶液を乗せ、湿潤箱中で1時間室温放置しその後、PBS溶液で洗浄することで、電極上に抗マウスIgG抗体を固定化しQCMセンサーを作製した。
【００４５】
作製した抗マウスIgG抗体固定化QCMセンサーを、25℃に保った2mLのPBS溶液入りガラス製反応容器中に浸漬した。浸漬10後も周波数変化は著しく大きく、かつ揺らぎが大きくQCMセンサーとして使用に耐えるものではなかった。
【００４６】
以上、実施例１と比較例１の結果より、本発明のQCMセンサーチップの製造方法は、酸洗浄により引き起こされるQCMセンサーチップの溶液中での周波数変化の不安定化を抑制する効果があることがわかる。
【００４７】
更に実施例２と比較例２の結果より、本発明のQCMセンサーは溶液中での周波数変化が小さく安定しており、測定対象物質が低濃度であっても測定可能であることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】Ni電極のCV−電流電位曲線を示す図である。
【図２】未洗浄水晶振動子実装基板のPBS中における周波数変化を示す図である。
【図３】本発明のQCMセンサーチップのPBS中における周波数変化を示す図であ              る。
【図４】本発明のQCMセンサーチップの形状を示す図である。
【図５】本発明のQCMセンサーチップの断面形状を示す図である。
【図６】本発明のQCMセンサーチップを用いたQCM免疫センサーの一例を示              す図である。
【図７】実施例２の抗マウスIgG抗体固定化QCMセンサーのマウスIgG濃度に対す              る周波数変化を示す図である。
【図８】比較例１のQCMセンサーチップのPBS中における周波数変化を示す図であ              る。
【符号の説明】
【００４９】
１  エポキシ基板
２  水晶振動子
３  シリコーン樹脂
４  電極
５  電極
６  抗体
７  抗原
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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