(57)【要約】      （修正有）【課題】DNAトランスポゾンnDartの研究を行う過程で、アルビノ変異のイネを解析し、この変異体においてnDartの挿入により破壊されたことを確認し、易変性でアルビノとなる変異の原因遺伝子AL101(Albino101)を同定し、その利用法を提供する。【解決手段】（１）特定の塩基配列に少なくとも７０％相同の塩基配列から成る遺伝子。（２）特定のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、植物の光合成の制御活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記いずれかの遺伝子の植物の光合成を制御するための使用。
（１）配列番号１に記載の塩基配列に少なくとも７０％相同の塩基配列から成る遺伝子
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、植物の光合成の制御活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項２】
植物がイネ、シロイヌナズナ、タバコ、トマト、ペチュニア、アブラナ、ワタ又はトウモロコシである請求項１に記載の使用。
【請求項３】
下記いずれかの遺伝子が導入されて形質転換された植物。
（１）配列番号１に記載の塩基配列に少なくとも７０％相同の塩基配列から成る遺伝子
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、植物の光合成の制御活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項４】
宿主がイネ、シロイヌナズナ、タバコ、トマト、ペチュニア、アブラナ、ワタ又はトウモロコシである請求項３に記載の植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、主として国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１７年度独立行政法人農業・生物系特定産業技術研究機構「新技術・新分野創出のための基礎研究推進事業」、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの）である。
この発明は、イネのAL101遺伝子に関し、より詳細にはアルビノの原因であるAL101遺伝子及びこの遺伝子の発現を制御することにより光合成能を制御する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
色素を持たないアルビノ変異は自然界に頻繁に観察される突然変異であるが、通常は致死となってしまう。アルビノの原因遺伝子は様々であり、生育に必須な機能を担っている遺伝子の欠損によって生じるが、原因となる遺伝子の機能解析は十分に行われてはいない(例えば、非特許文献１参照。)。
一方、本発明者らは、易変性で葉緑素の蓄積が低下するpyl（pale-yellow leaf)変異の原因を解析した結果、イネにおいて通常の栽培条件下で転移活性をもつAc/Ds型トランスポゾンnDart（nonautonomous DNA-based active rice transposon）を確認した（特許文献１）。
【０００３】
【非特許文献１】Biochimie Volume 82, Issues 6-7, 7 June 2000, Pages 559-572
【特許文献１】WO2005/003349
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らは、本発明者らが発見したDNAトランスポゾンnDart（特許文献１）の研究を行う過程で、アルビノ変異のイネを解析した。即ち、本発明は、アルビノ変異の原因遺伝子を特定し、その機能を解析し、その利用法を提供することを目的とした。DNAトランスポゾンによって破壊された遺伝子は、その脱離によって、破壊された遺伝子の機能回復が期待できる。そのため未知遺伝子の機能同定を容易に行うことができる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、易変性のアルビノ突然変異体al101-m（albino101-mutable）であるイネを解析した結果、この変異体において、既に発明者らが見出していたトランスポゾンnDart（特許文献1）の挿入により破壊されたことを確認し、易変性でアルビノとなる変異の原因遺伝子AL101(Albino101)(配列番号1)を同定した。
この遺伝子は、イネの第4染色体の24.8 Mbp（Pseudmolecules Build3、http://rgp.dna.affrc.go.jp/）の領域にあり、AL101遺伝子と命名した。
DNAトランスポゾンによって破壊された遺伝子は、その脱離によって、破壊された遺伝子の機能回復が期待できる。そのため未知遺伝子の機能同定を容易に行うことができる。本発明者らは、イネにおいて新規遺伝子AL101を同定し、この遺伝子が植物の光合成を制御する機能を有することを確認した。
【０００６】
即ち、本発明は、下記いずれかの遺伝子の植物の光合成を制御するための使用である。
（１）配列番号１に記載の塩基配列に少なくとも７０％相同の塩基配列から成る遺伝子
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、植物の光合成の制御活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
また、本発明は、これらのいずれかの遺伝子が導入されて形質転換された植物である。その宿主としては、イネ、シロイヌナズナ、タバコ、トマト、ペチュニア、アブラナ、ワタ又はトウモロコシなどが挙げられる。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のアルビノ遺伝子AL101は、植物においてその変異が致死となるため、植物の生育に必須な機能を有していると考えられる。このアルビノ遺伝子AL101の発現制御によって、光合成能を高め生育状態の良好な作物を作出することにより、収量の増加や耐病性を向上することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
アルビノの原因は、生育に必須な機能を担っている遺伝子の欠損によって生じるが、その多くが致死となるため原因となる遺伝子の機能解析は十分になされてはいない。本発明は変異体の生存が可能である易変性系統を用いて、イネのアルビノ変異の原因遺伝子（AL101）を特定した。このAL101遺伝子は機能解析の済んでいる既知の遺伝子との相同性を殆ど持たない新規の遺伝子である。
【０００９】
本発明で同定されたAL101遺伝子は下記いずれかの遺伝子である。
（１）配列番号１に記載の塩基配列に少なくとも７０％、好ましくは９０％相同の塩基配列から成る遺伝子
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸（例えば、全アミノ酸の５％）が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、植物の光合成の制御活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
【００１０】
ヒトゲノムコンソーシアムによるヒトゲノム解析プロジェクトの報告論文中（Science 2001, 291(5507), 1304-1351）で、ゲノム配列中の遺伝子をコンピュータプログラム（Ottoシステム）で自動遺伝子注釈する時の判断基準として、既知遺伝子情報がある場合、その配列情報との相同性からゲノム中の遺伝子領域を特定する基準をポリヌクレオチドの相同性で92％以上としている。また同じ論文中で、遺伝子重複で複数に増えた遺伝子（その後の進化の過程で変異が入り、塩基配列に部分的な違いが生じている）を探す場合のポリヌクレオチドの相同性基準を70％においている。従って、本発明において配列番号１の塩基配列と相同性が70%以上、好ましくは90%以上であれば、近縁ではあるが異なる植物種への適用される植物の光合成の制御活性を有する遺伝子として機能するものと考えられる。
【００１１】
また、「植物の光合成の制御活性」は以下のようにして確認することができる。制御活性を知りたい配列の上流に、本来のプロモーター又は任意のプロモーターを接続した測定用のコンストラクトを作成しする。このコンストラクトに使用するプラスミドは、TiプラスミドやpBI121等のバイナリーベクターを用いることができる。作成した測定用のコンストラクトを用いて、アグロバクテリウムや遺伝子銃などを用いた遺伝子導入法によって形質転換を行う。このコンストラクトの作成及び形質転換の方法は、公知の「遺伝子組換え技術」や「形質転換法」を用いて実施することができる。形質転換が成功した植物を選抜し、成育状態と収穫量の多寡によって植物の光合成を測定し、遺伝子の植物の光合成の制御活性を明らかにすることができる。
具体的測定においては、形質転換した植物の一部からＲＮＡを抽出し、逆転写酵素と反応させてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型として定量的ＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、形質転換した植物における遺伝子の発現量を測定する。遺伝子の発現量が低いと植物の光合成の活性が低くなるので、遺伝子の発現量によって制御活性を表すことができる。
【００１２】
このAL101遺伝子の発現を制御することにより、その植物の光合成能力を向上させることができる。
例えば、プロモーターを置き換えることにより、AL101遺伝子の発現量を変化させることができる。具体的には、pBI121などの一般的なプラスミドに遺伝子をクローニングしてプロモーターを置き換え、アグロバクテリウムを用いた形質転換法により遺伝子を植物内に導入して、成育状態が向上した植物を選抜することができる。
【００１３】
また、遺伝子機能の抑制手法としてRNA干渉等が挙げられる。
また、上記遺伝子の一部分やｃＤＮＡをプロモーターに対して逆に連結させたものを導入した生物において、その標的遺伝子の発現を抑制することができる（「アンチセンス RNA による抑制」と呼ばれる。）。また、順方向に連結してｍＲＮＡを大量に発現させた場合にも、異物として認識されてｍＲＮＡの分解が促進されて、結果として発現が抑制される（「コサプレッション技術」や「トランスウイッチ技術」と呼ばれている。）。このような公知の手法を本発明の遺伝子に用いることにより、該遺伝子の発現を抑制することができる。
【００１４】
また、これらの遺伝子が導入されたプラスミドを用いて植物を形質転換することができる。プラスミドとして、Ｔｉプラスミド、ｐＢＩ−１２１プラスミド等のバイナリーベクターを用いることができる。
この宿主である植物としては、イネ、シロイヌナズナ、タバコ、トマト、ペチュニア、アブラナ、ワタ又はトウモロコシ好ましい。いずれも形質転換の方法が確立しており、研究、産業及び園芸上で重要な植物である。
野生型植物にAL101遺伝子を新たに導入すると、前色素体から葉緑体への分化能が上がり、光合成活性が上昇することにより、活力の高い植物となることが期待できる。結果として増収量及び耐病性の向上が予想される。
【実施例】
【００１５】
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
実施例１
本実施例では、イネの易変性のアルビノ突然変異体al101-m（albino101-mutable）とその後代から安定なアルビノ変異体al101-stb（al101-stable）を分離した（図１）。
このal101変異体が成長して現れた新たな分けつには、アルビノを示さない正常なものも含まれていた。
通常のアルビノ変異体は、植物個体全体がアルビノとなるので種子の栄養が無くなる第3葉期以上には成長することができない。しかし、al101変異体（al101-m、al101-stb）は、後記の実施例２，３に示すようにDNA型のトランスポゾンnDartが挿入したものであるが、nDartが成育中に脱離することがあり、この場合、nDartが脱離したal101遺伝子は機能を回復し正常となる。上記のアルビノを示さないal101変異体が成長して現れた新たな分けつは、アルビノの中に緑の斑の入った易変性の表現型であり、このような株と考えられる。通常は死んでしまうアルビノ変異体であるが、緑の葉の部分が光合成を行うことによって、アルビノ変異による欠損を補い、その結果変異体の生存できるようになるものと考えられる。このことは、AL101遺伝子が、植物の光合成を制御する機能を有していることを示している。
【００１６】
実施例２
本実施例では、このal101変異の原因遺伝子を同定することを目的とした。
nDart系因子は、日本晴ゲノム中には少なくとも60コピーあまりが分布していることがわかっており、そのすべてを増幅してしまうと解析が複雑になるため、転移活性が最も高くal101変異の原因となっている可能性の高いnDart1-Oだけを増幅するために、iPCR法（Trigrlia, T., Peterson, M. G. and Kemp, D. J.(1988)Nucl. Acids Res. 16, 8186）の変法であるNAiPCR（nDart- homologues Non Amplified iPCR）法を確立した(図２)。
NAiPCRに使用する鋳型は、制限酵素AluIでal101-stb変異体のゲノミックDNA 2.5μgを消化したのち、フェノール・クロロフォルム処理(P/C処理)し、サンプルをセルフライゲーションした。その後再びP/C処理したサンプルをBmtIで消化し、P/C処理を繰り返して10μlに可溶化した。
そのうち2.5μlを鋳型として20μlの系でPCR反応を行い、1 x GC buffer、250μM dNTPS、1 pM プライマー（5'-CGGGCCGTGCCGGCTACAGGTTC-3'（配列番号４）、5'-CGTGCCGTGCTTGGGC-3'（配列番号５）、LA-Taq 0.5 unitに滅菌水で液量を調節した。PCRの反応は 94℃で2分の後、94℃で1分・65℃で1分・72℃で3分を１サイクルとして20サイクルの後、最後に72℃で5分間伸長させた反応産物を100倍希釈したもの1μlを2度目のPCR反応の鋳型とした。
2度目のPCRは、最初のPCRと同じ系を用いて内側に設計したプライマーセット（5'-GCTACAGGTTCCGCCGTGCCTCGG-3'（配列番号６）、5'-GGGCCGGCACGGCACGGCACAG-3'（配列番号７））を用いた。PCRの反応は94℃で2分の後、94℃で1分・60℃で1分・72℃で3分を１サイクルとして23サイクルの後、最後に72℃で5分間伸長させ、アガロースゲルで分画した(図３)。図３のレーン２のNAiPCR法では、BmtIを用いた消化によりnDart1-O以外からのバンドの増幅が抑制された。その結果、約450bpと約270bpの増幅産物が確認された。
【００１７】
上記で増幅されたPCR産物を確認するために、TAクローニングをして増幅産物の塩基配列を決定した。上記のPCR産物1μlをTAクロニーングキットを（Invitrogen社）用いてクローンし、シークエンサー（PRISM3100、Applied Biosystem社）にて塩基配列を決定し各種のソフトウェアを用いて塩基配列の解析を行った。その結果、270bpの増幅産物（図４Ｂ、図３、配列番号１２）から新たにnDart1-0が挿入した部位の周辺領域として187bp（図４Ｂ（配列番号１２）に示す配列の62-248番目、図２左）が明らかになり、図４Ａに示すように、イネの第4染色体（全長36.1Mbp）の24.8Mbp（Pseudmolecules Build3、http://rgp.dna.affrc.go.jp/）の領域と一致した。
この領域の遺伝子を検索したところ、イネ完全長cDNAデータベースに登録されているAK100471クローン（配列番号1）が検出され、この遺伝子がAL101であることが示された。AL101は、およそ2.1 KbpのmRNAで、1つのエキソンから構成されており、628アミノ酸からなるタンパク質（配列番号2）の読み取り枠を有していた。
図４Ｂに示すように、AL101遺伝子の翻訳開始メチオニンから199bp上流のプロモーター領域にnDart１?O（配列番号３）の挿入が起きている。通常、遺伝子のプロモーターとして機能する領域は、1〜2kbが考えられているので、この領域へのnDart１?Oの挿入がアルビノ変異の原因であることが示された。
【００１８】
実施例３
本実施例では、実施例２で確認したnDartの挿入をトランスポゾンディスプレイで確認し、アルビノ変異の原因がAL101遺伝子であることを再確認した。
トランスポゾンディスプレイ法による解析には、al101-stbを用いた。トランスポゾンディスプレイ法には、制限酵素MseI用のアダプター(5'-GAGGATGAGTCCTGAG-3'（配列番号８）、5'-CGCTCAGGACTCAT-3'（配列番号９）)とプライマー(5'- GAGGATGAGTCCTGAGCGG-3'（配列番号１０）)を用いた。ゲノミックDNAは、１μgをMseIで消化したのち、アダプターとライゲーション反応を行いPCR反応の鋳型として8 ngを用いた。PCRの反応は20μlの系で行ない、1 xのAdvantageGC Taq、200μM dATP、200μM dGTP、200μM dCTP、200μM dTTP（BD社）、0.48μMのプライマーセットに、滅菌水で液量を調整した。最初のPCRの反応は、94℃で5分の後、94℃で30秒・48℃で1分・72℃で2分を１サイクルとして20サイクルの後、最後に72℃で2分間伸長させたのち0.2μlを2度目のPCRの鋳型に用いた。2度目のPCRはプライマーの末端配列選択的に増幅を行うためにローダミンをラベルしたプライマー（5'-AGTCCTGAGCGGCCCNTTTG-3'（配列番号１１））を0.24μMにして用いた。PCRの反応は、94℃で2分の後、94℃で30秒・57℃で30秒（1サイクル毎に0.8℃ずつ温度を下げる）・72℃で1分を１サイクルとして13サイクルの後、94℃で30秒・48℃で30秒・72℃で30秒を１サイクルとして30サイクル行ない、最後に72℃で2分間反応させた。反応産物は、5 ％アクリルアミドゲルにて分画した。その結果を図５に示す。
図５において、野生型である台中65号には存在しないバンドが安定なアルビノ変異体であるal101-stb及び易変性のアルビノ変異体であるal101-mにおいて観察された。このバンドを切り出し、塩基配列を決定したところ、al101遺伝子と一致しており、トランスポゾンディスプレイ法によってもnDartがal101遺伝子に挿入していることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】イネの易変性のアルビノ突然変異体(al101-m)の写真である。（１）は結実したal101変異体を示し（2）はal101変異体の葉の拡大写真を示す。
【図２】実施例１で実施したNAiPCR法の原理を示す図である。二重線はトランスポゾン(nDart)を表し、一重線は周辺配列を表す。矢印はプライマーとその増幅方向を示す。図の左に示すように、nDartの周辺領域にランダムに分布している制限酵素AluIの認識領域（AGCT）を利用し、消化したゲノムをセルフライゲーションし、nDart内部に設計したプライマーで増幅を行う。NAi-PCRの場合は、図右に示すようにnDart1-O以外のnDart1に存在する制限酵素BmtIの認識部位を用いて消化を行い増幅を抑制する。
【図３】NAiPCR法によるal101-stb（安定なアルビノ変異体）の解析結果を示す図である。
【図４】アルビノ遺伝子(AL101)の構造とnDartの挿入部位を示す図である。長方形の箱がエキソンを表し、黒部分は読み取り枠を示す。アルビノ遺伝子がイネの第4染色体の24.8 Mbpの領域にあり、翻訳開始メチオニンから199bp上流のプロモーター領域にトランスポゾン(nDart、配列番号３)の挿入が起きている。Ｂは、実施例２の増幅産物(270bp、配列番号１２)を示し、周辺領域（62-248番目, 187bp）が含まれている。下線部(1-25番目, 249-270番目)はプライマー（配列番号６，７）を示す。トランスポゾン挿入により生じた重複配列（62-69番目, 黒枠）の上流にはトランスポゾンnDart（配列番号３）の一部(1-61番目)が見られる。この配列の下流にはAL101遺伝子（配列番号１）が連なっている。
【図５】トランスポゾンディスプレイ法によるアルビノ遺伝子(AL101)へのトランスポゾン(nDart)の挿入を示す図である。１は、al101-stb（安定なアルビノ変異体）及びal101-m（易変性のアルビノ変異体）にのみ増幅されたバンド（425bp）を示す。
【図２】
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【図４】
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【図１】
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【図３】
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【図５】
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【配列表】
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