(57)【要約】【課題】試料物質から、目的とする核酸情報を簡便に、短時間に、且つ正確に、回収することが可能な方法を提供する。【解決手段】特定疾病に曝された個体の核酸についての第１の情報と前記個体に存在する病原微生物からの核酸についての第２の情報とを得る方法であって、前記病原微生物が当該特定疾患に関連し、以下を具備する方法；  （ａ）当該個体からの核酸の抽出物と、第１のプローブと第２のプローブとを具備するプローブ固定化基体とを反応させることと、ここで、前記第１のプローブは当該病原微生物の特定の核酸配列の存在を検出し、前記病原微生物は前記特定疾患に関連し、および前記第２のプローブは前記個体の特定の核酸の存在を検出する；並びに  （ｂ）（ａ）の前記反応の結果、もしあれば、前記第１のプローブに対して結合した核酸の存在を検出することにより前記第１の情報を得ることと、およびもしあれば、前記第２のプローブに対して結合した核酸の存在を検出することにより第２の情報を得ること。【選択図】      図１
2007195565.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定疾病に曝された個体の核酸についての第１の情報と前記個体に存在する病原微生物からの核酸についての第２の情報とを得る方法であって、前記病原微生物が当該特定疾患に関連し、以下を具備する方法；
（ａ）当該個体からの核酸の抽出物と、第１のプローブと第２のプローブとを具備するプローブ固定化基体とを反応させることと、ここで、前記第１のプローブは当該病原微生物の特定の核酸配列の存在を検出し、前記病原微生物は前記特定疾患に関連し、および前記第２のプローブは前記個体の特定の核酸の存在を検出する；並びに
（ｂ）（ａ）の前記反応の結果、前記第１のプローブに対して結合した核酸の存在を検出することにより前記第１の情報を得ることと、および前記第２のプローブに対して結合した核酸の存在を検出することにより第２の情報を得ること。
【請求項２】
前記個体の前記核酸が当該疾患の治療に対する反応性に関連し、且つ前記病原微生物からの前記核酸と前記個体の核酸の両者の存在が、当該疾患の治療に対する反応性と相関する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）の前記反応に先駆けて、前記個体からの核酸の前記抽出物を増幅し、増幅された核酸を得ることに供することを更に具備する請求項１の方法。
【請求項４】
前記個体がヒトである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
核酸の前記抽出物が全血から調製される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記個体からの前記核酸がヒトゲノム核酸であり、且つ前記病原微生物からの前記核酸がゲノム核酸である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記個体からの核酸がヒトゲノム核酸であり、前記病原微生物からの核酸がＲＮＡであること、並びに前記（ａ）の反応させることに先駆けて逆転写反応を行う請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記個体からの核酸がヒトゲノム核酸であり、前記病原微生物からの核酸がＲＮＡであり、前記増幅に先駆けて逆転写反応を行う請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸の抽出物がヒトゲノム抽出用キットにより得られる請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒトゲノム抽出用キットがＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｄである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記特定疾患が肝炎であり、前記病原微生物が肝炎ウイルスである請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記疾患が肝炎であり、前記病原微生物が肝炎ウイルスである請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のプローブはＣ型肝炎ウイルスのゲノムを検出し、且つ前記第２のプローブはＭｘＡプロモーター領域のＳＮＰを検出する請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１のプローブはＣ型肝炎ウイルスのゲノムを検出し、且つ第２のプローブはＭＢＬ遺伝子の多型を検出する請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１プローブは１種類以上具備され、且つ少なくともその１種類が以下から選択される配列を含み；
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号５からなる群より選択される配列に示される塩基配列、
（ｂ）配列番号５、配列番号６および配列番号７からなる群より選択される配列に示される塩基配列、
（ｃ）（ａ）および（ｂ）から選択される塩基配列の相補配列；並びに
前記第２プローブは１種類以上具備され、且つ少なくともその１種類が以下から選択される配列を含む；
(at455) 下記配列表の配列番号16に示される塩基配列、
(bt455) 前記(at455)に示される塩基配列中の455位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ct455) 配列番号16の441〜455位に示される配列を含む塩基配列、
(dt455) 配列番号16の449〜459位に示される配列を含む塩基配列、
(et455) 前記(at455)〜(dt455)から選択される塩基配列の相補配列、
(ag455) 下記配列表の配列番号17に示される塩基配列、
(bg455) 前記(ag455)に示される塩基配列中の455位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cg455) 配列番号17の441〜455位に示される配列を含む塩基配列、
(dg455) 配列番号17の449〜459位に示される配列を含む塩基配列、
(eg455) 前記(ag455)〜(dg455)から選択される塩基配列の相補配列、
(aa455) 下記配列表の配列番号18に示される塩基配列、
(ba455) 前記(aa455)に示される塩基配列中の455位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ca455) 配列番号18の441〜455位に示される配列を含む塩基配列、
(da455) 配列番号18の449〜459位に示される配列を含む塩基配列、
(ea455) 前記(aa455)〜(da455)から選択される塩基配列の相補配列、
(ac455) 下記配列表の配列番号19に示される塩基配列、
(bc455) 前記(ac455)に示される塩基配列中の455位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cc455) 配列番号19の441〜455位に示される配列を含む塩基配列、
(dc455) 配列番号19の449〜459位に示される配列を含む塩基配列、
(ec455) 前記(ac455)〜(dc455)から選択される塩基配列の相補配列、
(aa420) 下記配列表の配列番号37に示される塩基配列、
(ba420) 前記(aa420)に示される塩基配列中の420位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ca420) 配列番号37の415〜425位に示される配列を含む塩基配列、
(da420) 前記(aa420)〜(ca420)から選択される塩基配列の相補配列、
(ac420) 下記配列表の配列番号38に示される塩基配列、
(bc420) 前記(ac420)に示される塩基配列中の420位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cc420) 配列番号38の415〜425位に示される配列を含む塩基配列、
(dc420) 前記(ac420)〜(cc420)から選択される塩基配列の相補配列、
(at420) 下記配列表の配列番号39に示される塩基配列、
(bt420) 前記(at420)に示される塩基配列中の420位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ct420) 配列番号39の415〜425位に示される配列を含む塩基配列、
(dt420) 前記(at420)〜(ct420)から選択される塩基配列の相補配列
(ag420) 下記配列表の配列番号40に示される塩基配列、
(bg420) 前記(at420)に示される塩基配列中の420位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cg420) 配列番号40の415〜425位に示される配列を含む塩基配列、
(dg420) 前記(ag420)〜(cg420)から選択される塩基配列の相補配列、
(ag221) 下記配列表の配列番号41に示される塩基配列、
(bg221) 前記(ag221)に示される塩基配列中の425位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cg221) 配列番号41の418〜432位に示される配列を含む塩基配列、
(dg221) 配列番号41の421〜430位に示される配列を含む塩基配列
(eg221) 前記(ag221)〜(dg221)から選択される塩基配列の相補配列、
(ac221) 下記配列表の配列番号42に示される塩基配列、
(bc221) 前記(ac221)に示される塩基配列中の425位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cc221) 配列番号42の418〜432位に示される配列を含む塩基配列、
(dc221) 配列番号42の421〜430位に示される配列を含む塩基配列
(ec221) 前記(ac221)〜(dc221)から選択される塩基配列の相補配列、
(aa221) 下記配列表の配列番号43に示される塩基配列、
(ba221) 前記(aa221)に示される塩基配列中の425位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ca221) 配列番号43の418〜432位に示される配列を含む塩基配列、
(da221) 配列番号43の421〜430位に示される配列を含む塩基配列
(ea221) 前記(aa221)〜(da221)から選択される塩基配列の相補配列、
(at221) 下記配列表の配列番号44に示される塩基配列、
(bt221) 前記(at221)に示される塩基配列中の425位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ct221) 配列番号44の418〜432位に示される配列を含む塩基配列、
(dt221) 配列番号44の421〜430位に示される配列を含む塩基配列
(et221) 前記(at221)〜(dt221)から選択される塩基配列の相補配列、
(ag54) 下記配列表の配列番号45に示される塩基配列、
(bg54) 前記(ag54)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cg54) 配列番号45の874〜876位に示される配列を含む塩基配列、
(dg54) 配列番号45の869〜880位に示される配列を含む塩基配列
(eg54) 前記(ag54)〜(dg54)から選択される塩基配列の相補配列、
(aa54) 下記配列表の配列番号46に示される塩基配列、
(ba54) 前記(aa54)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ca54) 配列番号46の874〜876位に示される配列を含む塩基配列、
(da54) 配列番号46の869〜880位に示される配列を含む塩基配列
(ea54) 前記(aa54)〜(da54)から選択される塩基配列の相補配列、
(ac54) 下記配列表の配列番号47に示される塩基配列、
(bc54) 前記(ac54)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cc54) 配列番号47の874〜876位に示される配列を含む塩基配列、
(dc54) 配列番号47の869〜880位に示される配列を含む塩基配列
(ec54) 前記(ac54)〜(dc54)から選択される塩基配列の相補配列、
(at54) 下記配列表の配列番号47に示される塩基配列、
(bt54) 前記(at54)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ct54) 配列番号48の874〜876位に示される配列を含む塩基配列、
(dt54) 配列番号48の869〜880位に示される配列を含む塩基配列
(et54) 前記(at54)〜(dt54)から選択される塩基配列の相補配列、
(ag52-57) 下記配列表の配列番号45に示される塩基配列、
(bg52-57) 前記(ag52-57)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cg52-57) 配列番号45の868〜885位に示される配列を含む塩基配列、
(dg52-57) 前記(ag52-57)〜(cg52-57)から選択される塩基配列の相補配列、
(aa52-57) 下記配列表の配列番号46に示される塩基配列、
(ba52-57) 前記(aa52-57)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ca52-57) 配列番号46の886〜885位に示される配列を含む塩基配列、
(da52-57) 前記(aa52-57)〜(ca52-57)から選択される塩基配列の相補配列、
(ac52-57) 下記配列表の配列番号47に示される塩基配列、
(bc52-57) 前記(ac52-57)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cc52-57) 配列番号47の886〜885位に示される配列を含む塩基配列、
(dc52-57) 前記(ac52-57)〜(cc52-57)から選択される塩基配列の相補配列、
(at52-57) 下記配列表の配列番号47に示される塩基配列、
(bt52-57) 前記(at52-57)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ct52-57) 配列番号48の886〜885位に示される配列を含む塩基配列、
(dt52-57) 前記(at52-57)〜(ct52-57)から選択される塩基配列の相補配列;
ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１プローブは１種類以上具備され、且つ少なくともその１種類が以下から選択される配列を含み；
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号５からなる群より選択される配列に示される塩基配列、
（ｂ）配列番号５、配列番号６および配列番号７からなる群より選択される配列に示される塩基配列、
（ｃ）（ａ）および（ｂ）から選択される塩基配列の相補鎖；並びに
前記第２プローブは１種類以上具備され、且つ少なくともその１種類が以下から選択される配列を含む；
(at455) 下記配列表の配列番号16に示される塩基配列、
(bt455) 前記(at455)に示される塩基配列中の455位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ct455) 配列番号16の441〜455位に示される配列を含む塩基配列、
(dt455) 配列番号16の449〜459位に示される配列を含む塩基配列、
(et455) 前記(at455)〜(dt455)から選択される塩基配列の相補配列、
(ag455) 下記配列表の配列番号17に示される塩基配列、
(bg455) 前記(ag455)に示される塩基配列中の455位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cg455) 配列番号17の441〜455位に示される配列を含む塩基配列、
(dg455) 配列番号17の449〜459位に示される配列を含む塩基配列、
(eg455) 前記(ag455)〜(dg455)から選択される塩基配列の相補配列、
(aa455) 下記配列表の配列番号18に示される塩基配列、
(ba455) 前記(aa455)に示される塩基配列中の455位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ca455) 配列番号18の441〜455位に示される配列を含む塩基配列、
(da455) 配列番号18の449〜459位に示される配列を含む塩基配列、
(ea455) 前記(aa455)〜(da455)から選択される塩基配列の相補配列、
(ac455) 下記配列表の配列番号19に示される塩基配列、
(bc455) 前記(ac455)に示される塩基配列中の455位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cc455) 配列番号19の441〜455位に示される配列を含む塩基配列、
(dc455) 配列番号19の449〜459位に示される配列を含む塩基配列、
(ec455) 前記(ac455)〜(dc455)から選択される塩基配列の相補配列、
(aa420) 下記配列表の配列番号37に示される塩基配列、
(ba420) 前記(aa420)に示される塩基配列中の420位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ca420) 配列番号37の415〜425位に示される配列を含む塩基配列、
(da420) 前記(aa420)〜(ca420)から選択される塩基配列の相補配列、
(ac420) 下記配列表の配列番号38に示される塩基配列、
(bc420) 前記(ac420)に示される塩基配列中の420位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cc420) 配列番号38の415〜425位に示される配列を含む塩基配列、
(dc420) 前記(ac420)〜(cc420)から選択される塩基配列の相補配列、
(at420) 下記配列表の配列番号39に示される塩基配列、
(bt420) 前記(at420)に示される塩基配列中の420位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ct420) 配列番号39の415〜425位に示される配列を含む塩基配列、
(dt420) 前記(at420)〜(ct420)から選択される塩基配列の相補配列、
(ag420) 下記配列表の配列番号40に示される塩基配列、
(bg420) 前記(at420)に示される塩基配列中の420位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cg420) 配列番号40の415〜425位に示される配列を含む塩基配列、
(dg420) 前記(ag420)〜(cg420)から選択される塩基配列の相補配列、
(ag221) 下記配列表の配列番号41に示される塩基配列、
(bg221) 前記(ag221)に示される塩基配列中の425位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cg221) 配列番号41の418〜432位に示される配列を含む塩基配列、
(dg221) 配列番号41の421〜430位に示される配列を含む塩基配列
(eg221) 前記(ag221)〜(dg221)から選択される塩基配列の相補配列、
(ac221) 下記配列表の配列番号42に示される塩基配列、
(bc221) 前記(ac221)に示される塩基配列中の425位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cc221) 配列番号42の418〜432位に示される配列を含む塩基配列、
(dc221) 配列番号42の421〜430位に示される配列を含む塩基配列
(ec221) 前記(ac221)〜(dc221)から選択される塩基配列の相補配列、
(aa221) 下記配列表の配列番号43に示される塩基配列、
(ba221) 前記(aa221)に示される塩基配列中の425位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ca221) 配列番号43の418〜432位に示される配列を含む塩基配列、
(da221) 配列番号43の421〜430位に示される配列を含む塩基配列
(ea221) 前記(aa221)〜(da221)から選択される塩基配列の相補配列、
(at221) 下記配列表の配列番号44に示される塩基配列、
(bt221) 前記(at221)に示される塩基配列中の425位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ct221) 配列番号44の418〜432位に示される配列を含む塩基配列、
(dt221) 配列番号44の421〜430位に示される配列を含む塩基配列
(et221) 前記(at221)〜(dt221)から選択される塩基配列の相補配列、
(ag54) 下記配列表の配列番号45に示される塩基配列、
(bg54) 前記(ag54)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cg54) 配列番号45の874〜876位に示される配列を含む塩基配列、
(dg54) 配列番号45の869〜880位に示される配列を含む塩基配列
(eg54) 前記(ag54)〜(dg54)から選択される塩基配列の相補配列、
(aa54) 下記配列表の配列番号46に示される塩基配列、
(ba54) 前記(aa54)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ca54) 配列番号46の874〜876位に示される配列を含む塩基配列、
(da54) 配列番号46の869〜880位に示される配列を含む塩基配列
(ea54) 前記(aa54)〜(da54)から選択される塩基配列の相補配列、
(ac54) 下記配列表の配列番号47に示される塩基配列、
(bc54) 前記(ac54)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cc54) 配列番号47の874〜876位に示される配列を含む塩基配列、
(dc54) 配列番号47の869〜880位に示される配列を含む塩基配列
(ec54) 前記(ac54)〜(dc54)から選択される塩基配列の相補配列、
(at54) 下記配列表の配列番号47に示される塩基配列、
(bt54) 前記(at54)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ct54) 配列番号48の874〜876位に示される配列を含む塩基配列、
(dt54) 配列番号48の869〜880位に示される配列を含む塩基配列
(et54) 前記(at54)〜(dt54)から選択される塩基配列の相補配列、
(ag52-57) 下記配列表の配列番号45に示される塩基配列、
(bg52-57) 前記(ag52-57)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cg52-57) 配列番号45の868〜885位に示される配列を含む塩基配列、
(dg52-57) 前記(ag52-57)〜(cg52-57)から選択される塩基配列の相補配列、
(aa52-57) 下記配列表の配列番号46に示される塩基配列、
(ba52-57) 前記(aa52-57)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ca52-57) 配列番号46の886〜885位に示される配列を含む塩基配列、
(da52-57) 前記(aa52-57)〜(ca52-57)から選択される塩基配列の相補配列、
(ac52-57) 下記配列表の配列番号47に示される塩基配列、
(bc52-57) 前記(ac52-57)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cc52-57) 配列番号47の886〜885位に示される配列を含む塩基配列、
(dc52-57) 前記(ac52-57)〜(cc52-57)から選択される塩基配列の相補配列、
(at52-57) 下記配列表の配列番号47に示される塩基配列、
(bt52-57) 前記(at52-57)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ct52-57) 配列番号48の886〜885位に示される配列を含む塩基配列、
(dt52-57) 前記(at52-57)〜(ct52-57)から選択される塩基配列の相補配列;
ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記増幅が、配列番号８および配列番号９からなる群より少なくとも１選択される塩基配列で示されるセンス鎖と、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４の群より少なくとも１選択される塩基配列で示されるアンチセンス鎖を使用するＰＣＲによって行うことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
基体と、
病原微生物の特定の核酸配列の存在を検出するために、当該基体に固定化されの第１プローブと、ここで、前記微生物は特定疾患に関連する、
個体の特定の核酸の存在を検出するための、前記基体に固定化され且つ第１プローブとは異なる塩基配列を有する第２のプローブと、ここで、前記個体の前記核酸は、当該疾患の治療に対する反応性に関係する、
を具備するプローブ固定化基体。
【請求項１９】
前記病原微生物がＣ型肝炎ウイルスであり、前記治療で用いる薬剤がＩＦＮである請求項１８に記載のプローブ固定化基体。
【請求項２０】
当該個体の前記核酸がＭｘＡのプロモーター領域である請求項１８に記載のプローブ固定化基体。
【請求項２１】
当該個体の前記核酸がＭＢＬをコードする遺伝子である請求項１８に記載のプローブ固定化基体。
【請求項２２】
前記第１のプローブがＣ型肝炎ウイルスの遺伝子型を検出する請求項１８に記載のプローブ固定化基体。
【請求項２３】
基体と、
前記基体に固定化され、且つ以下の配列；
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号５からなる群より選択される配列に示される塩基配列、
（ｂ）配列番号５、配列番号６および配列番号７からなる群より選択される配列に示される塩基配列、
（ｃ）（ａ）および（ｂ）から選択される塩基配列の相補配列；
から少なくとも１選択される配列を含む第１プローブと；
前記基体に固定化され、且つ以下の配列；
(at455) 下記配列表の配列番号16に示される塩基配列、
(bt455) 前記(at455)に示される塩基配列中の455位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ct455) 配列番号16の441〜455位に示される配列を含む塩基配列、
(dt455) 配列番号16の449〜459位に示される配列を含む塩基配列、
(et455) 前記(at455)〜(dt455)から選択される塩基配列の相補配列、
(ag455) 下記配列表の配列番号17に示される塩基配列、
(bg455) 前記(ag455)に示される塩基配列中の455位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cg455) 配列番号17の441〜455位に示される配列を含む塩基配列、
(dg455) 配列番号17の449〜459位に示される配列を含む塩基配列、
(eg455) 前記(ag455)〜(dg455)から選択される塩基配列の相補配列
(aa455) 下記配列表の配列番号18に示される塩基配列、
(ba455) 前記(aa455)に示される塩基配列中の455位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ca455) 配列番号18の441〜455位に示される配列を含む塩基配列、
(da455) 配列番号18の449〜459位に示される配列を含む塩基配列、
(ea455) 前記(aa455)〜(da455)から選択される塩基配列の相補配列
(ac455) 下記配列表の配列番号19に示される塩基配列、
(bc455) 前記(ac455)に示される塩基配列中の455位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cc455) 配列番号19の441〜455位に示される配列を含む塩基配列、
(dc455) 配列番号19の449〜459位に示される配列を含む塩基配列、
(ec455) 前記(ac455)〜(dc455)から選択される塩基配列の相補配列、
(aa420) 下記配列表の配列番号37に示される塩基配列、
(ba420) 前記(aa420)に示される塩基配列中の420位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ca420) 配列番号37の415〜425位に示される配列を含む塩基配列、
(da420) 前記(aa420)〜(ca420)から選択される塩基配列の相補配列
(ac420) 下記配列表の配列番号38に示される塩基配列、
(bc420) 前記(ac420)に示される塩基配列中の420位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cc420) 配列番号38の415〜425位に示される配列を含む塩基配列、
(dc420) 前記(ac420)〜(cc420)から選択される塩基配列の相補配列
(at420) 下記配列表の配列番号39に示される塩基配列、
(bt420) 前記(at420)に示される塩基配列中の420位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ct420) 配列番号39の415〜425位に示される配列を含む塩基配列、
(dt420) 前記(at420)〜(ct420)から選択される塩基配列の相補配列
(ag420) 下記配列表の配列番号40に示される塩基配列、
(bg420) 前記(at420)に示される塩基配列中の420位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cg420) 配列番号40の415〜425位に示される配列を含む塩基配列、
(dg420) 前記(ag420)〜(cg420)から選択される塩基配列の相補配列、
(ag221) 下記配列表の配列番号41に示される塩基配列、
(bg221) 前記(ag221)に示される塩基配列中の425位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cg221) 配列番号41の418〜432位に示される配列を含む塩基配列、
(dg221) 配列番号41の421〜430位に示される配列を含む塩基配列
(eg221) 前記(ag221)〜(dg221)から選択される塩基配列の相補配列、
(ac221) 下記配列表の配列番号42に示される塩基配列、
(bc221) 前記(ac221)に示される塩基配列中の425位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cc221) 配列番号42の418〜432位に示される配列を含む塩基配列、
(dc221) 配列番号42の421〜430位に示される配列を含む塩基配列
(ec221) 前記(ac221)〜(dc221)から選択される塩基配列の相補配列、
(aa221) 下記配列表の配列番号43に示される塩基配列、
(ba221) 前記(aa221)に示される塩基配列中の425位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ca221) 配列番号43の418〜432位に示される配列を含む塩基配列、
(da221) 配列番号43の421〜430位に示される配列を含む塩基配列
(ea221) 前記(aa221)〜(da221)から選択される塩基配列の相補配列、
(at221) 下記配列表の配列番号44に示される塩基配列、
(bt221) 前記(at221)に示される塩基配列中の425位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ct221) 配列番号44の418〜432位に示される配列を含む塩基配列、
(dt221) 配列番号44の421〜430位に示される配列を含む塩基配列
(et221) 前記(at221)〜(dt221)から選択される塩基配列の相補配列、
(ag54) 下記配列表の配列番号45に示される塩基配列、
(bg54) 前記(ag54)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cg54) 配列番号45の874〜876位に示される配列を含む塩基配列、
(dg54) 配列番号45の869〜880位に示される配列を含む塩基配列
(eg54) 前記(ag54)〜(dg54)から選択される塩基配列の相補配列、
(aa54) 下記配列表の配列番号46に示される塩基配列、
(ba54) 前記(aa54)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ca54) 配列番号46の874〜876位に示される配列を含む塩基配列、
(da54) 配列番号46の869〜880位に示される配列を含む塩基配列
(ea54) 前記(aa54)〜(da54)から選択される塩基配列の相補配列、
(ac54) 下記配列表の配列番号47に示される塩基配列、
(bc54) 前記(ac54)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cc54) 配列番号47の874〜876位に示される配列を含む塩基配列、
(dc54) 配列番号47の869〜880位に示される配列を含む塩基配列
(ec54) 前記(ac54)〜(dc54)から選択される塩基配列の相補配列、
(at54) 下記配列表の配列番号47に示される塩基配列、
(bt54) 前記(at54)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ct54) 配列番号48の874〜876位に示される配列を含む塩基配列、
(dt54) 配列番号48の869〜880位に示される配列を含む塩基配列
(et54) 前記(at54)〜(dt54)から選択される塩基配列の相補配列、
(ag52-57) 下記配列表の配列番号45に示される塩基配列、
(bg52-57) 前記(ag52-57)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cg52-57) 配列番号45の868〜885位に示される配列を含む塩基配列、
(dg52-57) 前記(ag52-57)〜(cg52-57)から選択される塩基配列の相補配列、
(aa52-57) 下記配列表の配列番号46に示される塩基配列、
(ba52-57) 前記(aa52-57)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ca52-57) 配列番号46の886〜885位に示される配列を含む塩基配列、
(da52-57) 前記(aa52-57)〜(ca52-57)から選択される塩基配列の相補配列、
(ac52-57) 下記配列表の配列番号47に示される塩基配列、
(bc52-57) 前記(ac52-57)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cc52-57) 配列番号47の886〜885位に示される配列を含む塩基配列、
(dc52-57) 前記(ac52-57)〜(cc52-57)から選択される塩基配列の相補配列、
(at52-57) 下記配列表の配列番号47に示される塩基配列、
(bt52-57) 前記(at52-57)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ct52-57) 配列番号48の886〜885位に示される配列を含む塩基配列、
(dt52-57) 前記(at52-57)〜(ct52-57)から選択される塩基配列の相補配列;
から少なくとも１選択される配列を含む第２プローブと；
を具備するプローブ固定化基体。
【請求項２４】
当該特定の核酸の存在の検出が電気化学的に行われる請求項１８に記載のプローブ固定化基体。
【請求項２５】
当該特定の核酸の存在の検出が電気化学的に行われる請求項２３に記載のプローブ固定化基体。
【請求項２６】
以下を具備する個体の疾患の治療に対する反応性を決定する方法、ここで、当該疾患は当該個体における病原微生物の存在に関連する；  （ａ）前記個体からの核酸の抽出物と、当該病原微生物の核酸にハイブリダイズする第１の核酸プローブ（ここで当該病原微生物は前記疾患と関連する）および前記個体の標的核酸にハイブリダイズする第２の核酸プローブ（ここで、前記個体の当該標的核酸は個体の疾患の治療に対する反応性と関連する）とを反応させることと、
（ｂ）前記第１の核酸プローブに結合する前記病原微生物の前記核酸と、前記第２の核酸プローブに結合する前記個体の前記標的核酸とを検出すること（ここで、第１の核酸プローブに結合する前記病原微生物の前記核酸と前記第２の核酸プローブに結合する前記個体の前記標的核酸の両方の存在は、当該疾患の治療に対する反応性と相関する）。
【請求項２７】
当該プローブが基体に固定化されている請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
（ａ）の前記反応に先駆けて前記個体からの前記核酸を増幅することを更に具備する請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
以下を具備する疾患に対する個体の罹患性を決定する方法；
（ａ）前記個体からの核酸の抽出物と、疾患に関連する病原微生物の核酸にハイブリダイズする第１の核酸プローブおよび前記疾患に対する罹患性に関連する前記個体の標的核酸にハイブリダイズする第２の核酸プローブとを反応させることと、
（ｂ）前記第１の核酸プローブに結合する前記病原微生物の前記核酸と、前記第２の核酸プローブに結合する前記個体の前記核酸とを検出すること（ここで、前記第１の核酸プローブに結合する前記病原微生物の前記核酸と、前記第２の核酸プローブに結合する前記個体の前記核酸との両方の存在は、前記疾患に対する前記個体の罹患性と関連する）。
【請求項３０】
当該プローブが基体に固定化されている請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
（ａ）の前記反応に先駆けて前記個体からの前記核酸を増幅することを更に具備する請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
疾患に関連する病原微生物の特定の核酸の存在を検出する第１のプローブと、当該疾患の治療に対する反応性に関連する個体の特定の核酸の存在を検出する第２のプローブとを具備するプローブ固定化基体の製造方法であって、当該第１のプローブと当該第２のプローブとを基体に固定することを具備する方法。
【請求項３３】
前記基体がベースプレート、多孔質体、マイクロタイタープレート、ビーズ、球状物質、粒子状物質、磁性体、磁気ビーズからなる群より選択される請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、個体から得た疾患に関連する核酸についての情報を得る方法に関する。本発明は、個体の核酸に関する情報、並びに疾患に関して得られる核酸の情報、特に疾患に関連する病原微生物の核酸に付いての情報を得る方法に関する。
【０００２】
また、本発明はプローブ固定化基体、特に前記方法に使用するためのプローブ固定化チップに関する。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡチップによる遺伝子検査技術が注目は(Beattie et al., Clin Chem 39: 719-22, Fodor et al., Science, 251, 767 (1991), Khrapko et al., FEBS Lett, 256, 118 (1989), and Southern et al., Nucleic Acids Res., 22, 1368 (1994))に開示されている。ＤＮＡチップは、配列の異なる複数種類のＤＮＡプローブを固定化した数ｃｍ角のガラスやシリコンのチップである。このようなチップ上のＤＮＡプローブに対して、蛍光色素や放射線同位元素（ＲＩ）等で標識した試料核酸、あるいは未標識の試料核酸と標識オリゴヌクレオチドの混合物を反応させる。チップ上に固定化されたＤＮＡプローブに対して相補的な配列が試料中に存在すると、チップ上の特定部位において使用された標識に由来する信号が得られる。従って、固定化されたＤＮＡプローブの配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と位置が予め分っていれば、試料核酸中に存在する塩基配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を調べることができる(Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 5022 (1994), Parinov et al., Nucleic Acids Res., 24, 2998 (1996))。
【０００４】
患者から得た血液などの試料物質を得、その試料物質から核酸を抽出することにより、その患者固有の核酸が得られる。その患者固有の核酸を、更に、遺伝子解析に供すれば、ある疾病に対する罹患しやすさ、薬の効きやすさ、および／または副作用の生じやすさなど、患者の体質に関係する情報を得ることが可能である。その結果、その患者に特異的な情報を得ることが可能である。個々の患者に特異的に設計された治療法を「テーラーメイド医療」という。
【０００５】
テーラーメイド医療を行うに際しては、患者から抽出した試料物質から、より正確かつ簡便にその疾病に対する治療法を予測する方法の開発が求められている。
【非特許文献１】Beattie et al., Clin Chem 39: 719-22, Fodor et al., Science, 251, 767 (1991)
【非特許文献２】Khrapko et al., FEBS Lett, 256, 118 (1989)
【非特許文献３】Southern et al., Nucleic Acids Res., 22, 1368 (1994)
【非特許文献４】Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 5022 (1994)
【非特許文献５】Parinov et al., Nucleic Acids Res., 24, 2998 (1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、試料物質から、目的とする核酸情報を簡便に、短時間に、且つ正確に、回収することが可能な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の課題を解決するための手段は、特定疾病に曝された個体の核酸についての第１の情報と前記個体に存在する病原微生物からの核酸についての第２の情報とを得る方法であって、前記病原微生物が当該特定疾患に関連し、以下を具備する方法；
（ａ）当該個体からの核酸の抽出物と、第１のプローブと第２のプローブとを具備するプローブ固定化基体とを反応させることと、ここで、前記第１のプローブは当該病原微生物の特定の核酸配列の存在を検出し、前記病原微生物は前記特定疾患に関連し、および前記第２のプローブは前記個体の特定の核酸の存在を検出する；および
（ｂ）（ａ）の前記反応の結果、前記第１のプローブに対して結合した核酸の存在を検出することにより前記第１の情報を得ることと、および前記第２のプローブに対して結合した核酸の存在を検出することにより第２の情報を得ること：並びに
基体と、
病原微生物の特定の核酸配列の存在を検出するために、当該基体に固定化されの第１プローブと、ここで、前記微生物は特定疾患に関連する、
個体の特定の核酸の存在を検出するための、前記基体に固定化され且つ第１プローブとは異なる塩基配列を有する第２のプローブと、ここで、前記個体の前記核酸は、当該疾患の治療に対する反応性に関係する、
を具備するプローブ固定化基体：
である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、試料物質から、目的とする核酸情報を簡便に、短時間に、且つ正確に、回収することが可能な方法が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、疾患に曝されている個体からの核酸についての情報を得る方法に関する。当該個体は、前記疾患の初期または後期段階にある個体であってもよい。また、当該個体は、前記疾患に対する罹患が疑われる個体または将来罹患することが疑われる個体であってもよい。
【００１０】
本発明は、当該個体と当該疾患の両者からの核酸情報の相関関係に関する。ここで開示される態様において、当該個体は、例えば、ウイルス、バクテリア、酵母またはマイコプラズマなどの病原微生物に関連する疾患に曝されている。また、本発明は、前記個体に存在する病原微生物から得られた核酸情報と、前記個体からの核酸との相関関係に関する。
【００１１】
従って、１側面において、本発明は、
個体の特定の疾患に関連する核酸についての情報、特に、前記個体の疾患の治療に対する感受性と関連する核酸についての情報と、
前記個体に存在する病原微生物に由来する前記特的疾患に関連する核酸についても情報と
を得るための方法を提供する。
【００１２】
また、本発明は、前記個体からの核酸および前記病原微生物からの核酸の同定において使用される特異的核酸プローブに関連する。
【００１３】
幾つかの態様において、当該核酸プローブは、チップのような基体に固定化されている。また、本発明は、当該方法において使用するための、プローブ固定化基体、例えば、プローブ固定化チップ、に関する。その他の基体、例えば、ＤＮＡキャピラリ電気泳動装置、ビーズなど、メンブランベースアレイ、マイクロタイタープレート、電極、半導体を基礎とするデバイスなど、導波性物質など、表面プラスモン共鳴(Surface plasmon resonance; 以下SPRと記す)、クオーツクリスタルマイクロバランス(Quartz crystal microbalance; 以下QCMと記す)、および質量分析(Mass-spectroscopy)も本発明に使用され得る。更に、対立遺伝子特異的オリゴハイブリダイゼーション、制限方法（マイクロタイターアレイ・ダイアゴナル・ゲル電気泳動;microtitierarray diagonal gel electrophoresis）、ライゲーション法（パッドロックプローブ(padlock probe)、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ、色素標識オリゴヌクレオチドライゲーション）、ヌクレオチドインコーポレーション（ミニシーケンシング、テンプレート−ディレクテット・ダイ−ターミネーションアッセイ(template-directed dye-termination assay)）、およびインベーダーアッセイ(invader assay)も、本発明で使用することが可能である。他の一般的な溶液中でのハイブリダイゼーション技術も本発明において使用することが可能であり、例えば、増幅法（ポリメラーゼ連鎖反応;PCR）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列ベース増幅（nucleic acid sequence-based amplification;NASBA）、ストランドディスプレースメント増幅（strand displacement amplification;SDA）、ループ−メディエイト・イソサーマル増幅（loop-mediated isothermal amplification;LAMP）、核酸の等温キメラプライマー開始増幅(isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids; ICAN)、当該固体および当該病原微生物の核酸を検出するために使用できる枝分かれしたＤＮＡなどが使用でき得る。
【００１４】
前記個体から採取される核酸を含む試料物質は、全血、血液、血清、白血球、尿、便、精液、唾液、生検組織、培養細胞、喀痰等を用いてもよい。好ましい試料は血液である。また、試料物質は、疾患の治療に対する感受性と関連する前記個体に由来する核酸と、前記個体に存在する病原微生物に関連する核酸とを共に含むことが好ましい。ここで、前記病原微生物は前記疾患と関連している。また、試料は、必要に応じて、ホモジネートおよび抽出等の必要な任意の前処理を行ったものであってもよい。このような前処理は、対象となる生物試料に応じて当業者によって選択され得るであろう。
【００１５】
ここで開示する実例となる態様においては、まず、ヒトから全血試料を採取する。次に、この採取された全血試料から、例えば、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｄ（登録商標、ＱＩＡＧＥＮ、東京、日本）などの市販のヒトゲノム抽出用キットを用いてヒトゲノム由来と、前記ヒトに存在するウイルスゲノム由来の核酸を共に抽出する。ある態様においては、目的とする配列を含む核酸を増幅する。続いて、得られた増幅産物をプローブ固定化チップに対してハイブリダイズし、更にそのプローブ固定化チップに対して結合する核酸を検出することによって、得られた増幅物を解析する。このようにして、前記個体からの特定の疾患に関連する核酸の情報が、前記個体に存在する病原微生物から得られる特定疾患に関連する核酸についての情報と共に得られる。
【００１６】
上記の方法では、ヒト個体の例について記載したが、個体はヒトに限定するものではない。本発明の態様に従うと、対象となる「個体」の例は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、又はサルを含む任意の哺乳動物であり得る。しかしながらヒトが最も好適な個体である。また、本発明の側面に従うと、個体は健康な個体であっても、何らかの疾患に罹患している個体であってもよい。しかしながら、一般的には、病原微生物と、個体が有する核酸の型によって引き起こされる疾患に罹患している個体に対して行うことによって、本発明に従う方法は、より有効に使用されるであろう。本明細書において使用される「特定の疾患」の語は、病原性微生物、例えば、ウイルス、バクテリア、酵母またはマイコプラズマに関連する疾病並びに腫瘍学的疾患を含み、好ましくは、病原微生物に関連する疾患をいい、より好ましくは、当該疾患に罹患している個体に含まれる核酸の型および／またはそのような核を含む遺伝子の発現の有無に依存して、その発症および治療効果等が左右される疾患である。しかしながら、これらの疾患に特に限定されるものではない。
【００１７】
ここで使用される「標的核酸」の語は、検出および／または解析したい配列を含む核酸をいう。
【００１８】
本発明の態様に従って、抽出される個体由来核酸は、個体に由来する核酸であればよく、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、ゲノムＤＮＡであってもよい。また、抽出される病原微生物由来核酸は、対象となる病原微生物に由来する核酸であればよく、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
【００１９】
試料物質から核酸成分を抽出する方法は、上記の手段に特に限定されるものではなく、フェノールー−クロロホルム法等の液−液抽出法や担体を用いる固液抽出法を用いることもできる。また、これに限定するものではないが、例えば、核酸抽出方法ＱＩＡａｍｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）またはゲノムＤＮＡ精製キット（Promega社製）、スマイテスト（住友金属社製）等の市販のキットを利用することが可能である。続いて、ＰＣＲなどの増幅操作を行ってもよく、または行わなくてもよい。
【００２０】
抽出された核酸成分がＲＮＡである場合、直接ＨＣＶ−ＲＮＡを試料核酸として用いても良いし、ＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作成した後試料核酸として用いても良い。この場合も、個体由来の核酸と病原微生物由来の核酸を分離せずに行ってもよく、例えば、上述の方法において、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｄを用いて抽出を行った後に、逆転写を行い、続いてＰＣＲ増幅を行ってもよい。
【００２１】
本発明の態様に従って行う増幅は、それ自体公知の一般的に核酸を増幅する手段であれば何れでもよく、ポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと記す）により行うことが好ましい。また、試料物質が十分な量の核酸を含んでいれば、増幅することを省略してもよい。
【００２２】
本発明の態様に従って使用し得るプローブ固定化チップなどのプローブ固定化基体は、互いに異なる塩基配列を有する第１プローブ及び第２プローブを基体上に固定化してなるプローブ固定化チップである。前記第１プローブは、特定疾病に関連する病原微生物に由来する特定の核酸配列の存在を検出するためのプローブである。前記第２プローブは、前記特定疾病に関連し、個体に由来する特定の核酸配列の存在を検出するためのプローブである。
【００２３】
このようなプローブ固定化基体は、個体と病原微生物という異なる２の由来から得た核酸に関して同一の基体を用いることにより解析を同時に行うことが可能である。このようなプローブ固定化チップは本出願人によって始めて開示されるものである。本発明従うと、このようなプローブ固定化基体も本発明の１側面として提供される。
【００２４】
本発明の態様に従うプローブ固定化チップにおいて、第１プローブは、例えば、ヒト患者からの全血などの試料物質中に含まれる病原微生物由来の核酸配列の存在を検出するものである。そのようなプローブは、対象となる個体（例えば、ヒト患者）が感染している可能性のある病原微生物に由来する染色体ＤＮＡ、遺伝子（ＲＮＡ）に対応する塩基配列を有していてもよく、又はそのｃＤＮＡ又はｃＲＮＡ、染色体ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびｃＲＮＡの断片又はそれらの相補配列に対応する塩基配列を有していてもよい。
【００２５】
また、試料物質中の病原微生物の量の測定も前記した第１プローブ、すなわち病原微生物に由来する核酸配列、その断片又はそれらの相補配列、に対応する塩基配列を有するプローブを用いて測定することが可能である。
【００２６】
更に、前記第１プローブは、試料物質中の前記病原微生物の存在のみならず前記病原微生物の遺伝子変異を検出するプローブであることが望ましい。
【００２７】
試料物質中の病原微生物が発現した核酸（ＲＮＡ）の測定も前記した第１プローブ、すなわち病原微生物に由来する核酸配列、その断片又はそれらの相補配列、に対応する塩基配列を有するプローブを用いて測定が可能である。この場合の核酸鎖はＲＮＡ又はｃＤＮＡ又はｃＲＮＡを検出あるいは定量することができる。
【００２８】
当該病原微生物がウイルスである場合の１態様においては、ウイルスの増殖期には特定の遺伝子が大量に発現されるので、その発現パターン（量、質）を測定すると薬効を予測することが可能になる。
【００２９】
本発明の態様に従うプローブ固定化チップにおいて、第２プローブとしては、個体が有する、疾病に関わる染色体ＤＮＡ配列、遺伝子（ＲＮＡ）又はそのｃＤＮＡ又はｃＲＮＡ、それらの断片又はそれらの相補配列、に対応する塩基配列が挙げられる。個体が有する「疾病に関わる核酸配列」とは、前記個体の細胞内にある染色体中に存在する核酸配列であり、治療に対する反応性を予測できる核酸配列である。より詳しくは、当該核酸配列は、例えば疾病に対する個体の反応性を予測したり、投与する薬の効きやすさおよび／または副作用の生じやすさ等を決定する核酸配列である。
【００３０】
第２のプローブにより、個体における特定の核酸配列の存在並びに特定の遺伝子の発現量および個体における遺伝子の発現パターンなどを検出することが可能である。
【００３１】
本発明に従う第１プローブまたは第２プローブは、少なくとも１１塩基、好ましくは少なくとも１２塩基、より好ましくは少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０塩基の長さの塩基配列を有するものであることが望ましい。基体に固定化する塩基配列の長さが過度に長いと、１個の塩基の相違を識別することが困難になる。一方、基体に固定化する塩基配列の長さが過度に短いと試料中に含まれる塩基配列の塩基配列の決定が困難になる。
【００３２】
また、第１プローブ又は第２プロープとしては、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、メチルフォスホネート核酸、Ｓ−オリゴなどのオリゴヌクレオチドや、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡなどのポリヌクレオチドなどの核酸を用いることができる。
【００３３】
本発明の態様に従うと、プローブ固定化基体は、基板、多孔質体(Beattie et al., Clin. Chem., 41, 700 (1995))、マイクロタイタープレート(Kawai et al., Anal. Biochem., 209, 63 (1993))、ビーズ(Mirkin et al., Nature, 382, 607 (1996)、球状物質、粒子状物質、磁性体、磁気ビーズ(Miller et al., J. Magnet. Magn. Mater., 225, 138 (2001), DNA capillary electrophoresis chip (Chou et al., Proc. Natl. Acd. Sci., 96, 11 (1999)、メンブランベースアレイ(Lemieux et al., Molecular Breeding, 4, 277 (1998)、半導体を基礎にしたデバイスなど(Thewes et al., 2002 IEEE International Solid-State Circuits Conference, 350 (2002)、導波性物質など(Piunno et al., Anal. Chim. Acta, 288, 205 (1994))、SPR(Nelson et al., Anal. Chem., 73, 1 (2001)、QCM(Ito et al., Anal. Chim. Acta, 327, 29 (1996)、質量分析(Amexis et al., Proc. Natl. Acd. Sci., 98, 12097 (2001)等で形成された基体に、前記塩基配列からなる第１プローブ及び第２プローブを固定化することによって作成することができる。核酸を固定化すべき基体の材質、大きさ、形状などは特に限定されるものではなく、核酸を固定化することが可能な任意の基体を使用してよい。前記プローブ固定化基体を用いた試料物質中の核酸の配列の検出は、例えば、個体から採取した試料物質から核酸成分の抽出を行った後、前記試料核酸とプローブ固定化チップなどのプローブ固定化基体とを接触させ、プローブ固定化基体上のプローブと試料核酸とのハイブリダイゼーション反応を検知すればよい。
【００３４】
本発明は、前記プローブ固定化チップ上のプローブと試料中の核酸成分とのハイブリダイゼーション反応を検知するための手段として、主に、（１）標識物質を用いる方法、および（２）電気化学的方法の２種類を包含してもよい。
【００３５】
（１）の標識物質を用いる方法の場合には、試料核酸は、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５若しくはローダミンなどの蛍光色素、またはビオチン、ハプテン、オキシダーゼ若しくはポスファターゼ等の酵素、またはフェロセン若しくはキノン類等の電気化学的に活性な物質で標識される。或いは前述した物質で標識したセカンドプローブを用いることで検出を行う。複数の標識物質を同時に使用してもよい。
【００３６】
（２）の電気化学的方法の場合、プローブを固定化する基体として導電性物質を用い、プローブ固定化チップを電極として使用する。この電極を用いたハイブリダイゼーション反応の存在の検出は他の一般的な電気化学的検出法と同じように、この電極の他に、対極や参照極を使用する。参照極を配置する場合、例えば、銀／塩化銀電極や水銀／塩化水銀電極などの一般的な参照極を使用し得る。異なる塩基配列を有するプローブは、それぞれ別々の異なる導電性基体に固定化して同一の基板などに配設されたチップを構成してよい。これにより精度の高い測定を行うことが可能である。その場合、各電極から得られる電気化学的信号がどのプローブに対応したものであるのか検知する。
【００３７】
幾つかの態様においては、試料物質から抽出した核酸成分とプローブ固定化チップに固定化されたプローブとのハイブリダイゼーション反応は、例えば、以下のように行う。即ち、ハイブリダイゼーション反応溶液は、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液中で行う。この溶液中にはハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキストラン、並びに、サケ精子ＤＮＡ、牛胸腺ＤＮＡ、ＥＤＴＡおよび界面活性剤などを添加してもよい。ここに抽出した核酸成分を添加し、９０℃以上で熱変性させる。プローブ固定化チップの挿入は、変性直後、あるいは０℃に急冷後に行ってよい。また、基体上に液を滴下することでハイブリダイゼーション反応を行うことも可能である。反応中は、撹拌、あるいは振とうなどの操作で反応速度を高めてもよい。反応温度は、例えば、１０℃〜９０℃の範囲で、反応時間は１分以上１晩程度で行えばよい。ハイブリダイゼーション反応後、電極を取り出し洗浄を行う。洗浄には、例えば、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いる。
【００３８】
（１）の標識物質を用いる方法の場合、ハイブリダイゼーション反応の検出は、標識の種類に応じた適宜の検出装置を用いて、試料中の標識された塩基配列又は２次プローブ中の標識を検出することによって行う。標識が蛍光物質の場合には、例えば、蛍光検出器を用いて標識を検出すればよい。
【００３９】
（２）の電気化学的方法の場合、以下のような手順で検出を行う。基体は洗浄後、電極表面に形成した二本鎖部分に選択的に結合する二本鎖認識体を作用させ、電気化学的な測定を行う。ここで用いられる二本鎖認識体は特に限定されるものではないが、例えば、ヘキスト３３２５８、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーターおよびポリインターカレーター等を用いることが可能である。更に、これらのインターカレーターを電気化学的に活性な金属錯体、例えば、フェロセン、ビオロゲン等で修飾しておくことも可能である。ＤＮＡ結合物質の濃度は、その種類によって異なるが、一般的には１ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの範囲で使用する。この際には、イオン強度０．００１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いる。電極を二本鎖認識体と反応させた後、洗浄し、電気化学的な測定を行う。
【００４０】
電気化学的な測定では、二本鎖認識体が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加し、二本鎖認識体に由来する反応電流値を測定する。この際、電位は定速で掃引するか、あるいはパルスで印加するか、あるいは、定電位を印加することができる。測定には、例えば、ポテンショスタット、デジタルマルチメーターおよびファンクションジェネレーター等の装置を用いて電流、電圧を制御する。得られた電流値を基に、検量線から標的核酸の濃度が算出され得る。
【００４１】
電極を用いた塩基配列検出装置は、例えば、核酸抽出部、核酸反応部、二本鎖認識体反応部、電気化学測定部および洗浄部等から構成される。
【００４２】
また、電気化学的な手法に基づくＤＮＡチップの他の例は、例えば、以下の文献に開示されている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４，  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８）。橋本らは、ＤＮＡプローブで修飾された金電極と電気化学的に活性な色素を用いる配列特異的遺伝子検出を報告した。色素に由来する陽極の電流は、標的ＤＮＡの濃度に相関する。ワンらは、インディケーターフリーの電気化学的なＤＮＡのハイブリダイゼーションを報告した。このバイオセンサーの構成は、カーボンペースト電極へのイノシン置換プローブ（グアニンを含まない）の固定化と、当該標識のグアニン酸化ピークの存在による二重鎖の形成のクロノポテンショメトリック検出を含む。これらの文献は引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００４３】
電気化学的な手法は試料核酸の標識が不要である。また検出は電気信号を測定することによって行われる。従って、蛍光検出に必要とされるような複雑なシステムは不要である。従って、このような手法ではシステムの小型化も期待できる。
【００４４】
以上のような本発明の態様に従うと、患者などの個体から採取した血液などの試料物質から、患者自体が持つ前記疾病に関わる核酸配列と、患者が感染した病原微生物の核酸配列に関する情報とを簡便に得ることが可能である。
【００４５】
本発明の態様に係るプローブ固定化基体は、疾病に曝された個体における適切な治療方法を予測するために使用される。当該プローブ固定化基体は、同一の基体上に固定化された第２のプローブと第１のプローブを具備する。第２のプローブは、個体の細胞内にある染色体中に存在する前記疾病にリンク（連鎖）する核酸配列に関する情報を得るためのプローブ（第２プローブ）であり、第１のプローブは、前記疾病を誘起する病原微生物の核酸配列に関連する情報を得るためのプローブ（第１プローブ）である。当該プローブ固定化基体の長所により、個体から抽出した試料物質から、前記個体および病原微生物に由来する特定の疾病および／または特定の疾患の治療の反応性の予測に関連する情報を共に且つ簡便に得ることが可能である。
【００４６】
幾つかの態様において、当該方法およびプローブ固相化基体は、Ｃ型肝炎の治療効果を予測することが可能である。もう１つの態様は、ＡＩＤＳの治療を評価する（例えば、ＨＩＶの定量および変異の検出等）ために使用される当該方法およびプローブ固定化基体である。更なる態様は、Ｂ型肝炎の治療を評価する（例えば、ＨＢＶの定量、型および変異の検出等）ために使用される当該方法およびプローブ固定化基体である。
【００４７】
例えば、Ｃ型肝炎に感染すると、肝硬変を経て肝癌に進行することが知られている。その治療法の１つにインターフェロン（以下、ＩＦＮと記す）を投与するＩＦＮ治療がある。多くはＩＦＮαおよびβが治療に使用されている。しかし、ＩＦＮの有効性には大きなばらつきがあることが知られている。例えば、日本人のヒト患者ではＩＦＮ治療は約２〜３割の人にしか効果がなく、効果があっても非常に強い副作用が報告されている。このような個体の違いによる治療効果の違いは、個体が感染したＣ型肝炎ウイルス（以下、ＨＣＶと記す）の遺伝子型（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ３４，  ２５１６  （１９９６））及びウイルス量と、個体自身が有する核酸配列の個体差に起因していると考えられる。
【００４８】
ＨＣＶの異なる領域のヌクレオチドおよび予測されるアミノ酸配列の比較を基に、少なくとも６つの主な遺伝子型が報告されている(Forns et al., J. Clin. Microbiol., 34, 2516 (1996),  Andonov et al., J. Clin. Microbiol., 33, 254 (1995)。
【００４９】
従って、本発明の態様に従って、Ｃ型肝炎に対するＩＦＮ治療の効果を予測することが可能である。ここで、本明細書において「インターフェロン（ＩＦＮ）」とは、インターフェロンα、β、γおよび／またはωを示す語として使用する。例えば、感染したウイルスの型が１ｂ型（日本人に多い）の場合にはＩＦＮ治療の効果は少ない。これは、血清中のＨＣＶ−ＲＮＡ、ＨＣＶ抗体、ＧＯＰおよびＧＰＴが、ＩＦＮ療法により減少されないことを意味する。２ａ型の場合には治療の効果はより高い。これは、血清中のＨＣＶ−ＲＮＡ、ＨＣＶ抗体、ＧＯＰおよびＧＰＴがＩＦＮ療法により減少することを意味する。また、ウイルス量が１０6ｃｏｐｙ／ｍＬ以上と多い場合にも効果が少ない。従って、感染したウイルスの遺伝子型及びウイルス量を核酸レベルで調べるための第１プローブを使用する。
【００５０】
例えば、試料物質中のＣ型肝炎ウイルス（以下、ＨＣＶとも記す）の核酸配列の存在の検出に用いられるプローブとしては、ＨＣＶ−ＲＮＡ、その断片またはそれらの相補配列、に対応する塩基配列が挙げられる。本発明の態様に従うプローブは、望ましくは、ＨＣＶ−ＲＮＡの遺伝子型または変異を検出するための少なくとも１１塩基、好ましくは少なくとも１２塩基、より好ましくは少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９および３０塩基の配列を有する。或いは、また、当該プローブは、少なくとも３０、好ましくは約４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００塩基よりも長くても、ＨＣＶゲノムの検出には好ましい。１１から３０の長さがチップ形成には適切であり、３０塩基よりも長いプローブは一般的なハイブリダイゼーション形成に適切である。例えば配列表に示される配列番号１、２、３、４またはそれらの相補配列に対応する塩基配列を有するものを用いることが可能である。これらの配列は、全てのＨＣＶの遺伝子型においてもっとも保存されている(Andonov et al., J. Clin. Microbiol., 33, 254 (1995)。
【００５１】
また、前記第１プローブは、試料物質中の前記病原微生物の存在のみならず前記病原微生物の遺伝子変異を検出するプローブを使用することも好ましい。Ｃ型肝炎の場合、ウイルスの核酸配列の特定の部位の変異によってＩＦＮ治療の効果が異なることが報告されている（Nagayama et al.,Hepatology, 31, 745 (2000)）。試料物質中のウイルスの核酸配列の特定の部位の変異を検出するための第１プローブの例は、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，  ３１，  ７４５  （２０００）に記載のＨＣＶのｐｏｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎの４３４、５８０、９３８、９６２、１１７６、あるいは２７７４番目のアミノ酸の相違を決定する塩基配列を有するプローブを用いることが可能である。肝細胞癌（以下ＨＣＣと記す）患者からのＨＣＶ−１ｂのゲノム配列は、無症候性キャリア（以下ＡＳＣと記す）からのものよりも、より多くが変異型残基を有する傾向がある。これらを使用することにより精度の高い予測が可能となる。
【００５２】
上述の通り、ＨＣＶの遺伝子型によってＩＦＮ治療の効果が異なることが報告されている。従って、第１プローブは、ＨＣＶ−ＲＮＡ、その断片またはそれらの相補配列、に対応する塩基配列であってもよい。例えばＨＣＶの１型（配列番号５）、２型（配列番号６）、３型（配列番号７）の遺伝子型をそれぞれ特異的に検出するプローブを、検出したい遺伝子型に応じて第１プローブとして用いてもよい。即ち、それぞれ配列表に示される配列番号５、配列番号６、配列番号７またはそれらの相補配列に相当する配列を有する核酸を第１プローブとして用いてもよい。
【００５３】
遺伝子型を検出可能なプローブを用いる際は、異なる遺伝子型に対応する複数のプローブを基体上に同時に固定化して用いることにより精度の高い検出が可能となる。
【００５４】
また、試料物質中の病原微生物の遺伝子型を検出するには、１態様においては、試料物質中の病原微生物の核酸配列に対して予めその遺伝子型に特徴的なプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、その後それらの遺伝子型を考慮することなしに全てのＣ型肝炎ウイルスを検出することが可能なユニバーサルプローブを固定化したプローブで検出することも可能である(Andonov et al., J. Clin. Microbiol., 33, 254 (1995)。
【００５５】
Ｃ型肝炎の場合は、センス鎖としては配列番号８あるいは配列番号９に示される塩基配列のものを用いて、アンチセンス鎖として１ａ型には配列番号１０、１ｂ型には配列番号１１、２ａ型には配列番号１２、２ｂ型には配列番号１３、３ａ型には配列番号１４の塩基配列のものを用いてＰＣＲ反応を行い、ユニバーサルプローブとして配列番号１５の塩基配列のものを用いてもよい。
【００５６】
試料物質中の病原微生物の量の測定も前記した第１プローブ、すなわち病原微生物に由来する核酸配列、その断片又はそれらの相補配列、に対応する塩基配列を有するプローブを用いて測定することが可能である。
【００５７】
例えばＣ型肝炎の場合は血液中のＨＣＶ量によってＩＦＮ療法の効果が異なることが報告されている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ３３，  ２５４  （１９９５））。ＩＮＦは、その患者が血清中に有するＨＣＶが１０6コピー／ｍＬを超えると、効果を得られにくい(Yeh et al., J. Med. Biol., 66, 481 (2002)。そこで、ウイルス量を定量的に評価するためのプローブとしても、ＨＣＶ−ＲＮＡ、その断片又はそれらの相補配列、に対応する塩基配列が挙げられる。ウイルス量は試料物質中の核酸を蛍光標識している場合にはチップ上のプローブと試料物質中の核酸をハイブリダイズさせた後に基体上における標識の蛍光強度から濃度を算定する。電気化学的な方法を用いる場合は、チップ上のプローブと試料物質中の核酸をハイブリダイズさせた後、チップから得られる電流値から濃度を算出する。
【００５８】
本発明のプローブ固定化チップにおいて、第１プローブとして上記したプローブ、配列番号５、６および／または７を用いれば、個体が感染した病原微生物のウイルスの遺伝子型又はウイルス量、特定部位の変異、発現遺伝子の量と質などの知見が得られ、ウイルスの型が日本人に多い１ｂ型であればＩＦＮ療法の効果は少ないが２ａ型であれば効果的に作用すること、またウイルス量が１０6ｃｏｐｙ／ｍＬ以上と多い場合にはＩＦＮ療法の効果が少ないと予測でき、それにより前記個体に対するＩＦＮ療法の有効性を予測することができる。
【００５９】
Ｃ型肝炎に関するＩＦＮ治療の効果を予測する別の方法を、本出願人は特願２００１−６２３７１号及び特願２００１−６２３７２号で報告している。即ち、ヒト遺伝子のＭｘＡたんぱく質をコードする遺伝子のプロモーター領域、即ち、ＭｘＡのプロモーター領域の−８８位（以下、ＭｘＡ−８８と記す）に存在する特定の一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、以下ＳＮＰと記す）がＩＦＮ治療効果の大小を決定するため、そのＳＮＰを調べることによりＩＦＮ治療効果の大小を予測する方法である。即ち、ＩＮＦは、ＭｘＡプロモーター領域のＳＮＰの特定の型を有する患者においては有効である。したがって、そのＳＮＰの存在をチェックすることにより、ＩＦＮ療法の効果が評価される。従って、本発明の１態様において、個体の核酸を検出するための第２のプローブが、ＭｘＡにおけるＳＮＰを検出するものが使用される。
【００６０】
上記の知見では、当該ＭｘＡのプロモーター領域の−８８位（以下、ＭｘＡ−８８と記す）がＧ／Ｇ型の場合にはＩＦＮ治療効果が低く、Ｇ／ＴおよびＴ／Ｔ型の場合には治療効果が高いこと、同領域の−１２３位（以下、ＭｘＡ−１２３と記す）がＣ／Ｃ型の場合にはＩＦＮ治療効果が低く、Ｃ／ＡおよびＡ／Ａ型の場合には治療効果が高いことを基にＩＦＮの治療効果を予測する。ここで「−８８位」および「−１２３位」の表記は、ＭｘＡ遺伝子の転写開始部位を＋１とした場合の位置である。ＷＯ０１／７１００１の図１は、ＭｘＡ遺伝子の当該プロモーター領域のヌクレオチド配列を示す。
【００６１】
従って、本発明の態様に従ってＣ型肝炎に関するＩＦＮ治療効果を予測する場合には、例えば、ＨＣＶの遺伝子の存在、さらにはＨＣＶの遺伝子型あるいは遺伝子変異を検知するための第１プローブと、個体が有するＭｘＡたんぱく質をコードする遺伝子のプロモーター領域のＳＮＰにおける塩基の種類を検知するための第２プローブとを固定化したプローブ固定化チップを用い、個体から採取した試料物質の中のＨＣＶの遺伝子診断及び個体が有するＭｘＡたんぱく質をコードする遺伝子のプロモーター領域の遺伝子診断を行うことにより、そのＩＦＮ治療の効果を簡単に予測することができる。
【００６２】
また更に、Ｃ型肝炎に関するＩＦＮ治療の効果を予測する方法としては、マンノース結合レクチン（以下、ＭＢＬと記す）の遺伝子の２箇所のＳＮＰのタイプによって、ＩＦＮ治療効果の大小を予測する方法が知られている（Ｍ．Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，  ２９；６９５−７００，  １９９８）。ＭＢＬは、生来の免疫系の重要な因子であり、遺伝子多型が存在する。ＭＢＬ遺伝子型のグループ「ＸＢ」は、ＩＦＮに反応しない。ローセンは、ＭＢＬの配列について報告している(Immunology, 93, 421 (1998)）。この文献は引用することにより本明細書に組み込まれる。従って、上記のようなＭｘＡたんぱく質をコードする遺伝子のプロモーター領域の遺伝子診断の共に、またはそれに代わってマンノース結合レクチン（以下、ＭＢＬと記す）の遺伝子に関する遺伝子診断を行ってもよい。
【００６３】
ＩＦＮの効果に影響を及ぼすＭＢＬの多型部位は、ＭＢＬ遺伝子のプロモータ領域の−２２１位（以下、ＭＢＬ−２２１と記す）と、ＭＢＬ遺伝子のエクソン１のコドン５２、５４および５７に存在する。ここで「−２２１位」の表記は、ＭＢＬ遺伝子の転写開始部位を＋１とした場合の位置である。
【００６４】
ＭＢＬ−２２１の遺伝子型の取り得る塩基は、ＣまたはＧであり、Ｃの場合にはタイプＸと称し、Ｇの場合にはタイプＹと称す（この命名法はマッドセンらに従う；Ｍａｄｓｅｎ  ＨＯ，  Ｇａｒｒｅｄ  Ｐ，  Ｔｈｉｅｌ  Ｓ，  Ｋｕｒｔｚｈａｌｓ  ＪＡＬ，  Ｌａｍｍ  ＬＵ，  Ｒｙｄｅｒ  ＬＰ，  ｅｔ  ａｌ．  「プロモータと構造遺伝子との間の相互作用はヒトマンナン結合蛋白質の最低血清レベルをコントロールする」  Ｊ  Ｉｍｍｕｏｌ  １９９５；１５５：３０１３−２０）。この文献は引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００６５】
また、ＭＢＬ遺伝子のエクソン１のコドン５２、５４および５７は、構造遺伝子であるコラーゲン様ドメイン内に存在する。コドン５２の取り得る遺伝子型は、ＣＧＴまたはＴＧＴであり、マッドセンらの分類によると前者がタイプＡ、後者がタイプＤである。同様に、コドン５４の取り得る遺伝子型は、ＧＧＣまたはＧＡＣであり、同分類によると前者がタイプＡ、後者がタイプＢである。また、コドン５７の取り得る遺伝子型はＧＧＡまたはＧＡＡであり、同分類によると前者がタイプＡ、後者がタイプＣである。これら全てコドンにおいて、タイプＡは野生型対立遺伝子であり、その他のタイプＢ、ＣおよびＤは変異型対立遺伝子である。コドン５２、５４および５７の対立遺伝子が全てタイプＡである場合には、他の場合、即ち、少なくとも何れかの対立遺伝子がタイプＡではない場合に比較してＩＦＮの効果は高い。
【００６６】
上記ＭＢＬ−２２１がタイプＹであり、且つコドン５２、５４および５７の対立遺伝子がタイプＡである、ＹＡ−ＹＡホモ接合である患者の場合、他のタイプの患者に比べてＩＦＮの効果は得られやすい。また、上記ＭＢＬ−２２１がタイプＹであり、且つコドン５２、５４および５７の対立遺伝子の何れかがタイプＡではない場合、即ち、ＹｎｏｎＡ−ＹＡヘテロ接合またはＹｎｏｎＡ−ＹｎｏｎＡホモ接合である患者の場合には、ＹＡ−ＹＡホモ接合の患者に比べてＩＦＮの効果は得られにくい。
【００６７】
以上の知見から第２プローブを決定することが可能である。
【００６８】
当該疾患がＣ型肝炎であり、当該薬剤がＩＦＮである１態様において、個体の核酸に対するハイブリダイゼーションにおいて使用される（プローブ固定化チップ上での使用も含む）第２のプローブは、上述したようなＭｘＡプロモーターのＳＮＰを検出するプロモーターである。当該疾患がＣ型肝炎であり当該薬剤がＩＦＮであるその他の態様においては、個体の核酸に対するハイブリダイゼーションにおいて使用される（プローブ固定化チップ上での使用も含む）第２のプローブは、上述したように、ＩＦＮの効果に関連するＭＢＬの多型を検出するプローブである。
【００６９】
４５５位と４２０位に存在するＳＮＰを含むヒトＭｘＡ遺伝子のプロモーター領域のこれらの塩基配列の各々がＩＦＮ療法の効果に関連する。従って、配列番号１６、１７、１８、１９、３７、３８、３９および４０により示される塩基配  更なる態様において、第２のプローブは以下からなる群より選択される：
(at455) 下記配列表の配列番号16に示される塩基配列、
(bt455) 前記(at455)に示される塩基配列中の455位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列；ＭＢＬの多型を検出するための修飾されたプローブはＭＢＬをコードする個々の核酸に対してハイブリダイズできる能力を維持している。修飾されたプローブに使用される当該ハイブリダイゼーション条件は一般的なプローブのそれとは異なる。望ましくは、本発明に従う修飾されたプローブは、ＨＣＶ−ＲＮＡの遺伝子型または変異を検出するための少なくとも１１塩基、好ましくは少なくとも１２塩基、より好ましくは少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９および３０塩基の配列を有する。或いは、また、当該プローブは、少なくとも３０、好ましくは約４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００塩基よりも長くても、ＨＣＶゲノムの検出には好ましい。１１から３０の長さがチップ形成には適切であり、３０塩基よりも長いプローブは一般的なハイブリダイゼーション形成に適切である。
【００７０】
(ct455) 配列番号16の441〜455位に示される配列を含む塩基配列、
(dt455) 配列番号16の449〜459位に示される配列を含む塩基配列、
(et455) 前記(at455)〜(dt455)から選択される塩基配列の相補配列、
(ag455) 下記配列表の配列番号17に示される塩基配列、
(bg455) 前記(ag455)に示される塩基配列中の455位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cg455) 配列番号17の441〜455位に示される配列を含む塩基配列、
(dg455) 配列番号17の449〜459位に示される配列を含む塩基配列、
(eg455) 前記(ag455)〜(dg455)から選択される塩基配列の相補配列
(aa455) 下記配列表の配列番号18に示される塩基配列、
(ba455) 前記(aa455)に示される塩基配列中の455位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ca455) 配列番号18の441〜455位に示される配列を含む塩基配列、
(da455) 配列番号18の449〜459位に示される配列を含む塩基配列、
(ea455) 前記(aa455)〜(da455)から選択される塩基配列の相補配列
(ac455) 下記配列表の配列番号19に示される塩基配列、
(bc455) 前記(ac455)に示される塩基配列中の455位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cc455) 配列番号19の441〜455位に示される配列を含む塩基配列、
(dc455) 配列番号19の449〜459位に示される配列を含む塩基配列、
(ec455) 前記(ac455)〜(dc455)から選択される塩基配列の相補配列、
からなる群より選択される塩基配列を使用してもよい。
【００７１】
配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０の塩基配列は、ヒトＭｘＡ遺伝子のプロモーター領域を包含する塩基配列であり、これらの塩基配列の４５５位および４２０位に存在するＳＮＰがＩＦＮ療法の効果に対する応答性に関与している
配列番号１６〜１９の塩基配列は４５５位の塩基を除き共通の配列を有する。配列番号１６の４５５位はチミンである。配列番号１７の４５５位はグアニンである。また、配列番号１８の４５５位アデニンである。配列番号１９の４５５位はシトシンである。
【００７２】
これらの４５５位の塩基がチミンである配列番号１６の核酸配列を有するＨＣＶ感染者は、ＩＦＮ療法が有効であるのに対して、４５５位の塩基がチミンである配列番号１６の核酸配列を持たないＨＣＶ感染者は、ＩＦＮ療法が有効でない。つまり、４５５位の塩基配列がチミンである配列番号１６の核酸と、４５５位の塩基配列がグアニンである配列番号１７の核酸をヘテロ接合で有する（以下、Ｇ／Ｔヘテロと略記する）ＨＣＶ感染者、又は４５５位の塩基配列がチミンである配列番号１６の核酸をホモ接合で有する（以下、Ｔ／Ｔホモと略記する）ＨＣＶ感染者と比べて、４５５位の塩基配列がグアニンである配列番号１７の核酸をホモ接合で有する（以下、Ｇ／Ｇホモと略記する）ＨＣＶ感染者はＩＦＮ療法が有効でない。
【００７３】
あるいは、Ｔ／ｎｏｎ−Ｔヘテロ又はＴ／ＴホモのＨＣＶ感染者と比べて、４５５位の塩基配列がチミンでないＭｘＡ遺伝子のプロモーター領域をホモ接合で有するＨＣＶ感染者（以下、ｎｏｎ−Ｔ／ｎｏｎ−Ｔホモと略記する）は、ＩＦＮ療法が有効でないことが示された。ｎｏｎ−Ｔ／ｎｏｎ−Ｔホモの組み合わせとしてはＧ／Ｇ、Ｇ／Ａ、Ｇ／Ｃ、Ａ／Ａ、Ａ／Ｃ、Ｃ／Ｃがある。Ｔ／ｎｏｎ−Ｔの組み合わせとしては、Ｔ／Ｇ、Ｔ／Ａ、Ｔ／Ｃがある。
【００７４】
配列番号３７〜４０の塩基配列は４２５位の塩基を除き共通の配列を有する。配列番号３７の４２５位はアデニンである。配列番号３８の４２５位はシトシンである。また、配列番号３９の４２５位はチミンである。配列番号４０の４２５位はグアニンである。
【００７５】
本発明のプローブ固定化チップにおいて、個体の有する核酸の配列を検出する第２プローブとして前記ＳＮＰ部位を含み当該ＳＮＰ部位の塩基配列がチミンである配列番号１６の塩基配列、その断片又はそれらの相補配列（（ａｔ４５５）〜（ｅｔ４５５））を使用すると、個体が有するヒトＭｘＡ遺伝子のプロモーター領域を包含する塩基配列の前記ＳＮＰ部位がチミンであるか否かを治療の前に調べることができる。それにより前記個体に対するＩＦＮ療法の有効性を予測することができる。
【００７６】
従って、ＩＦＮ療法の実施に先立って、例えばＨＣＶ感染者が有するヒトＭｘＡ遺伝子のプロモーター領域を包含する塩基配列における前記ＳＮＰ部位の塩基を決定することによって、該ＨＣＶ感染者に対して、ＩＦＮ療法が有効性を検知することができる。
【００７７】
また、本発明のプローブ固定化チップにおいて、個体の有する核酸の配列を検出する第２プローブとして、前記ＳＮＰ部位を含み、当該ＳＮＰ部位の塩基配列がグアニンである配列番号１７の塩基配列、その断片またはそれらの相補配列（（ａｇ４５５）〜（ｅｇ４５５））又は当該ＳＮＰ部位の塩基配列がアデニンである配列番号１８の塩基配列、その断片またはそれらの相補配列（（ａａ４５５）〜（ｅａ４５５））、又は当該ＳＮＰ部位の塩基配列がシトシンである配列番号１９の塩基配列、その断片またはそれらの相補配列（（ａｃ４５５）〜（ｅｃ４５５））を用いれば、個体が有するヒトＭｘＡ遺伝子のプロモーター領域を包含する塩基配列の前記ＳＮＰ部位の配列を調べることができ、それにより前記個体に対するＩＦＮ療法の有効性を予測することができる。（特願２００１−６２３７１号及び特願２００１−６２３７２号）。
【００７８】
当該疾患がＣ型肝炎であり、当該薬剤がＩＦＮである１態様において、個体の核酸に対するハイブリダイゼーションにおいて使用される（プローブ固定化チップ上での使用も含む）第２のプローブは、以下；
(aa420) 下記配列表の配列番号37に示される塩基配列、
(ba420) 前記(aa420)に示される塩基配列中の420位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ca420) 配列番号37の415〜425位に示される配列を含む塩基配列、
(da420) 前記(aa420)〜(ca420)から選択される塩基配列の相補配列
(ac420) 下記配列表の配列番号38に示される塩基配列、
(bc420) 前記(ac420)に示される塩基配列中の420位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cc420) 配列番号38の415〜425位に示される配列を含む塩基配列、
(dc420) 前記(ac420)〜(cc420)から選択される塩基配列の相補配列
(at420) 下記配列表の配列番号39に示される塩基配列、
(bt420) 前記(at420)に示される塩基配列中の420位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ct420) 配列番号39の415〜425位に示される配列を含む塩基配列、
(dt420) 前記(at420)〜(ct420)から選択される塩基配列の相補配列
(ag420) 下記配列表の配列番号40に示される塩基配列、
(bg420) 前記(at420)に示される塩基配列中の420位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cg420) 配列番号40の415〜425位に示される配列を含む塩基配列、
(dg420) 前記(ag420)〜(cg420)から選択される塩基配列の相補配列
からなる群より選択される塩基配列が使用されてもよい。
【００７９】
これらの４２５位の塩基がアデニンである配列番号３７の核酸配列を有するＨＣＶ感染者は、ＩＦＮ療法が有効であるのに対して、４２５位の塩基がアデニンである配列番号３７の核酸配列を持たないＨＣＶ感染者は、ＩＦＮ療法が有効でない。配列と有効性に関する詳細は、上述の４５５位のＳＮＰのための記載と同様に理解することができるであろう。
【００８０】
また更に、前記疾病がＩＦＮ療法の有効性が確認された疾病、例えばＣ型肝炎である場合、前記第２プローブは、例えば、後述する（ｉ）から（ｔ）までのような配列であってもよい。これらはＭＢＬ−２２１の遺伝子型とコドン５２、５４および５７の多型の存在を決定するために使用するために好適な核酸である。
【００８１】
ＭＢＬ−２２１とコドン５２、５４および５７にコードされる多型を含むＭＢＬ遺伝子を配列番号４１から配列番号５６に示す。ＭＢＬ−２２１はこれらの配列の４２５位に存在する。
【００８２】
また、エクソン１はこれらの配列の６４６位から始まり、コドン５２は同８６８から８７０位に、コドン５４は同８７４から８７６位に、コドン５７は同８８３から８８５位に存在する。コドン５２のＳＮＰは同８６８位に、コドン５４のＳＮＰは同８７５位に、コドン５７のＳＮＰは同８８４位に存在する。
【００８３】
（ｉ）  前記ＭＢＬ−２２１のＳＮＰ部位を含む配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４の核酸断片であって、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４の４１８〜４３２位に相当する配列を有する核酸を含む断片。
【００８４】
（ｊ）  前記ＭＢＬ−２２１のＳＮＰ部位を含む配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４の核酸断片であって、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４の４２１〜４３０位に相当する配列を有する核酸を含む断片。
【００８５】
（ｋ）  上記（ｉ）および（ｊ）に記載の相補配列。
【００８６】
（ｌ）  前記コドン５２、５４および５７のＳＮＰ部位を含む配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６の核酸の断片であって、これらの配列の８６８から８８５位に相当する配列を有する核酸を含む断片。例えば、配列番号４５から配列番号５６に示す核酸を含む断片。
【００８７】
（ｍ）  前記コドン５２および５４のＳＮＰ部位を含む配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６の核酸の断片であって、これらの配列の８６８から８７６位に相当する配列を有する核酸を含む断片。例えば、配列番号４５から配列番号５６に示す核酸を含む断片。
【００８８】
（ｎ）  前記コドン５４および５７のＳＮＰ部位を含む配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６の核酸の断片であって、これらの配列の８７４から８８５位に相当する配列を有する核酸を含む断片。例えば、配列番号４５から配列番号５６に示す核酸を含む断片。
【００８９】
（ｏ）  前記コドン５４のＳＮＰ部位を含む配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６の核酸の断片であって、これらの配列の８７４から８７６位に相当する配列を有する核酸を含む断片。例えば、配列番号４５から配列番号５６に示す核酸を含む断片。特に８６９位〜８８０位を含む断片が望ましい。
【００９０】
（ｐ）  前記コドン５２のＳＮＰ部位を含む配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６の核酸の断片であって、これらの配列の８６８から８７０位に相当する配列を有する核酸を含む断片。例えば、配列番号４５から配列番号５６に示す核酸を含む断片。特に８６４位から８７３位を含む断片が望ましい。
【００９１】
（ｑ）  前記コドン５７のＳＮＰ部位を含む配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６の核酸の断片であって、これらの配列の８８３から８８５位に相当する配列を有する核酸を含む断片。例えば、配列番号４５から配列番号５６に示す核酸を含む断片。特に８８０〜８９０位を含む断片が望ましい。
【００９２】
（ｒ）  前記コドン５４のＳＮＰ部位を含む配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６の核酸の断片であって、当該コドン５４のＳＮＰが存在する前記配列の８７５位を含む核酸を含む断片。例えば、配列番号４５から配列番号５６に示す核酸を含む断片。
【００９３】
（ｓ）  前記（ｉ）から（ｍ）に示される核酸断片であって、長さが１１から３０である核酸断片。好ましいプローブ配列は、ＭＢＬ遺伝子に関しては、少なくとも第４２０位から第４３０位、第８６４位から第８７４位、第８７０から第８８０位および第８７９位から第８８９位を含む。またＭｘＡ遺伝子に関しては、少なくとも第４５０位から第４６０位を含むことが好ましい。
【００９４】
（ｔ）  前記（ｉ）から（ｍ）に示される核酸断片であって、当該多型部位を除く１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、または付加された修飾核酸。
【００９５】
本明細書の配列表に記載した各配列中、「Ｎ」および「ｎ」はアデニン、チミン、グアニンまたはシトシンの何れかの塩基を示す。
【００９６】
本発明のプローブ固定化チップにおいて、個体が発現した核酸（ＲＮＡ）の測定も前記した第２プローブ、すなわち個体に由来する核酸配列、その断片又はそれらの相補配列、に対応する塩基配列を有するプローブを用いて測定が可能である。この場合、核酸鎖はＲＮＡ又はｃＤＮＡ又はｃＲＮＡであり、これらを検出あるいは定量することができる。例えば、ＩＦＮの効き目は個人の体質により異なるので、投与の際の遺伝子発現パターン（量、質）を測定すると薬効を予測することが可能になる。
【００９７】
上述した通り本発明の態様に従って対象となる疾病は、病原性微生物に誘起される疾病であれば、特に限定されるものではない。本発明は、病原微生物に関する疾患を含む。また、本発明は腫瘍学的疾患も含む。例えば、ＩＦＮ治療の有効性を予測する場合には、Ｃ型肝炎以外の疾病であってもＩＦＮ治療の有効性が確認されている疾病であれば同様に治療効果が予測できる。そのような例は、肝炎ウイルス（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ型）、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ヘルペス群ウイルス、アデノウイルス、ヒトポリオーマウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトパルボウイルス、ムンプスウイル素、ヒトロタウイルス、エンテロウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルスおよびＨＴＬＶ等のウイルス感染症、黄色ブドウ球菌、溶血性連鎖球菌、病原性大腸菌、腸炎ビブリオ菌、ヘリコバクターピロリ菌、カンピロバクター、コレラ菌、赤痢菌、サルモネラ菌、エルシニア、淋菌、リステリア菌、レプトスピラ、レジオネラ菌、スピロヘータ、肺炎マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア、マラリア、赤痢アメーバおよび病原真菌等の細菌感染症、寄生虫、並びに真菌に起因する疾病などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００９８】
また更に、遺伝性疾患、網膜芽細胞腫、ウイルムス腫瘍、家族性大腸ポリポーシス、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、神経腺維腫症、家族性乳ガン、色素性乾皮症、脳腫瘍、口腔癌、食道癌、胃ガン、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、肺ガン、甲状腺腫瘍、乳腺腫瘍、泌尿器腫瘍、男性器腫瘍、女性器腫瘍、皮膚腫瘍、骨・軟部腫瘍、白血病、リンパ腫および固形腫瘍等の腫瘍性疾患についてもＩＦＮ治療の有効性を予測することが可能である。
【００９９】
本発明の態様に従って検出し得る病原微生物は、特に限定されるものではないが、例えばＩＦＮ治療の有効性を予測する場合は、ＩＦＮ治療の有効性が確認されている疾病を誘起する病原微生物が挙げられ、例えばＨＣＶが挙げられるが、ＩＦＮ治療の有効性が確認されている疾病に関連する病原微生物であれば特に限定されるものではない。病原性微生物が、当該疾患またはその疾患の症状と直接的または間接的に相互関係がある場合、その病原性微生物はその疾患と関連する。
【０１００】
例えば、肝炎ウイルス（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ型）、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ヘルペス群ウイルス、アデノウイルス、ヒトポリオーマウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトパルボウイルス、ムンプスウイル素、ヒトロタウイルス、エンテロウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルスおよびＨＴＬＶ等のウイルス、黄色ブドウ球菌、溶血性連鎖球菌、病原性大腸菌、腸炎ビブリオ菌、ヘリコバクターピロリ菌、カンピロバクター、コレラ菌、赤痢菌、サルモネラ菌、エルシニア、淋菌、リステリア菌、レプトスピラ、レジオネラ菌、スピロヘータ、肺炎マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア、マラリア、赤痢アメーバおよび病原真菌等の細菌、寄生虫並びに真菌の検出に用いることができる。
【０１０１】
上記の例では、ＩＦＮ療法と各疾患と個体遺伝子に関する解析の例を示した。しかしながら、本発明はこれに限定するものではない。幾つかの態様においては、例えば、個体に存在するヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus; 以下ＨＩＶと記す）と当該個体遺伝子を解析することにより、エイズ（acquired immunodeficiency syndrome; AIDS）の罹患性を予測することが可能である。また更に、ＨＩＶの遺伝子型および／またはコピーと、当該個体遺伝子の特定の多型を分析した後に、得られた情報から、以下のような薬剤、例えば、リトナビル（以下ＲＴＶと記す）およびサキナビル（以下ＳＱＶと記す）などのプロテアーゼインヒビター、並びにアジドチミジン（以下ＡＺＴ）およびジダノシン（以下ｄｄｌと記す）などの逆転写阻害剤の治療効果を予測してもよい。更なる幾つかの態様では、個体に存在する水痘帯状疱疹ウイルス（Varicella Zoster Virus; VZV）と当該個体遺伝子を解析することにより、水痘(varicella)または帯状疱疹（zona）の罹患性を予測することが可能である。また、得られた核酸に関する情報からアシクロビルなどの抗ウイルス薬の有効性を解析してもよい。或いは、インフルエンザウイルス（influenza virus）の遺伝子型およびコピー数、並びに個体の遺伝子型を解析することにより、インフルエンザの罹患性やタミフル（Tamifulu）などの抗ウイルス薬の有効性が解析されてもよい。
【０１０２】
抽出された核酸成分がＨＣＶ−ＲＮＡである場合、直接ＨＣＶ−ＲＮＡを試料核酸として用いても良いし、ＨＣＶ−ＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作成した後試料核酸として用いても良い。
【０１０３】
また、遺伝子型を検出可能なプローブを用いる際は、異なる遺伝子型に対応する複数のプローブを基体上に同時に固定化して用いることにより精度の高い検出が可能となる。
【０１０４】
以下の例は、本発明を説明することを意図するものであり、本発明を制限することを目的とするものではない。
【０１０５】
例
例１は、ヒト対象から核酸を抽出するための方法を記載する
１．  患者患者からのヒトゲノム及びウイルスゲノムの抽出法
ＨＣＶ感染患者の血液を、ＥＤＴＡ２Ｋ入りの真空採血管中に約３ｍＬ程度ずつ採血した。その後、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて核酸抽出を行った。得られた抽出産物に含まれるＨＣＶゲノムＲＮＡについて逆転写反応を行った。この逆転写反応は、前記抽出産物の一部に対して、Ｈｅｘａ−ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｘｔｕｒｅ（ＴＡＫＡＲＡ）とＭ−ＭＬＶＲｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）とを用いて、４２℃、３０分間行った。
【０１０６】
２．  ヒトゲノム抽出用キットを使用してＨＣＶゲノムＲＮＡを抽出する際の抽出効率についての検討
ＨＣＶゲノムＲＮＡを抽出する際、通常は、全血ではなく血清を用いる。更に、不要な蛋白等の夾雑物をできるだけ除いた状態にした後、グアニジンバッファー等を用いてＨＣＶゲノムＲＮＡを抽出する。しかしながら、本発明の態様に従う方法では、ヒトゲノムＤＮＡとの同時抽出を行う。従って、全血を用いてヒトゲノム抽出用のキットを使用してヒトゲノムＤＮＡを抽出した場合のＨＣＶゲノムの抽出効率を調べた。
【０１０７】
通常法としてＳｅｐｅＧｅｎｅＲＶ−Ｒ（三光純薬）を用いて血清１００μＬからＨＣＶゲノムの抽出を行う方法と、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて全血からＨＣＶゲノムを抽出する方法とを比較した。全血から抽出する方法については、更にＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  ＫｉｔでＨＣＶゲノムを抽出した後、それにより得られた抽出産物をエタノール沈殿して精製する場合とエタノール沈殿を行わない場合について、逆転写反応に供して得られる結果についての比較も行った。
【０１０８】
抽出効率の評価には、ＨＣＶゲノムの５’ＵＴＲの配列を利用したｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＰＣＲ（Ｋ．Ｃｈａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．  ８，  Ｓ４０−４４，  １９９３）を用いた。
【０１０９】
結果を表１に示す。
【表１】
2007195565.tif 000003
【０１１０】
その結果、通常のＨＣＶ  ＲＮＡ抽出法に比してＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔを用いた方法では、ＨＣＶ  ＲＮＡの抽出効率が約１０倍程度下がることがわかった。よって、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔを用いた抽出法は、血中のウイルス量が極めて低い検体に対して行われる場合には、測定不能になる場合が生じたり、チップを用いたウイルスの定量等の用途には使用しにくいと考えられた。しかしながら、逆に通常法でのウイルス量が、全血中で１０ｃｏｐｙ／ｍｌ以上の濃度を占める検体では、理論的には、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔを使用したＤＮＡおよびＲＮＡの同時抽出が可能であると示唆された。即ち、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔを使用した抽出産物を用いて、ウイルスを定性的に測定できることが示唆された。
【０１１１】
上述の通りに逆転写反応を行って得たサンプルについて、ヒトゲノムとＨＣＶゲノムの同時増幅を行った。
【０１１２】
増幅のためのプライマーには、ヒトゲノムのためにはＭｘＡＦ０１とＭｘＡＲ０２を用いた。ＨＣＶゲノムのためにはｎｃ２（Ｋ．Ｃｈａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．  ８，  Ｓ４０−４４，  １９９３，  ｎｔ２７−４５）とｐｒｉｍｅｒ３３（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｐｎ  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  ６０，  ２１５−２２２，  １９９０）を用いた。増幅は１本のチューブ内で行った。なお、ＰＣＲは９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を５０  サイクル行い、その前に９４℃で４分、後に７２℃で７分の処理を行った。
【０１１３】
Ｐｒｉｍｅｒの配列  ：  
MxAF01 : 5’-ACACACCCGTTTCCACCCTGGAGAGGCCAG-3’
MxAR02 : 5’-TGCGCAGTGCTGGAGTGCGGCCTCCGCTCT-3’
NC2 : 5’-CCT GTG AGG AAC TAC TGT C-3’
33 :  5’-GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC-3’。
【０１１４】
その結果、ヒトゲノム由来の産物（ｓｉｚｅ  ：  ６１０ｂｐ）とＨＣＶゲノム由来の産物（ｓｉｚｅ  ：  ３００ｂｐ）は両者とも増幅された。よって、ゲノムの抽出から特定領域の増幅までの行程は、ヒトゲノムＤＮＡとＨＣＶゲノムＲＮＡの両者に対して同一の処理を行うことによって達成されることが明かとなった。
【０１１５】
このような本発明の態様によれば、個体から抽出した試料物質から、簡便に且つ短時間にその疾病に対する治療法を予測することが可能となる。また、このような態様によれば、個体から得た１試料から同時に複数の情報を得ることができるので、検査の途中で生じ得る試料の取り違いを防止できる。また、危険性の高い試料を扱う場合であっても、そのような試料による汚染の範囲の広がりを従来よりも狭くすることが可能であり、且つ試料による汚染事故の危険性も最小限に留めることが可能である。
【０１１６】
例２は、ＩＦＮ療法の効果を評価するためのＤＮＡチップを記載する
ＩＦＮ治療効果予測用ＤＮＡチップ
まず、患者（ヒト）の血液からヒトの染色体ＤＮＡとＨＣＶ−ＲＮＡを採取した。染色体ＤＮＡは、配列番号２０、配列番号２１のプライマーを用いて１３５ｂｐの断片を増幅した。また、ＨＣＶ−ＲＮＡは逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作製した。
【０１１７】
以上の工程により得られた核酸サンプルに対して、ファルマシア社製のキットを用いてＦＩＴＣ標識を行った。
【０１１８】
図１に本実施例のＤＮＡチップの概略図を示す。ポリリジンをコートしたスライドガラスからなる基体６上に第２プローブとして配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６のＤＮＡプローブ及び第１プローブとして配列番号５、配列番号６、配列番号７のＤＮＡプローブ（図１中第１プローブ及び第２プローブは１〜５で示す）を２００ｎＬずつスポットして、乾燥した。その後、ＵＶ照射を行ってプローブを基体６上に固定化した。配列番号２２〜２５の塩基配列は、それぞれ配列番号１６〜１９の塩基配列の４５５位のＳＮＰ部位を含む断片である。配列番号５〜７の塩基配列はそれぞれＨＣＶウイルスの１型、２型、３型の遺伝子型を検出するプローブである。
【０１１９】
ＦＩＴＣ標識した核酸サンプルを２ｘＳＳＣ−１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ溶液に溶解した。これを、容量２０μＬのリアクションチャンバーにいれ、プローブ固定化スライドグラスでふたをした。５０℃、１２時間の反応を行った後、０．２ｘＳＳＣ−１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ溶液で２回洗浄し、スライドガラス上の蛍光を測定した。
【０１２０】
その結果、配列番号２２のプローブを固定化したスポットからのみ有意な蛍光が観察された。この試料物質に含まれるヒト由来核酸におけるＭｘＡ−８８の遺伝子型はＴ／Ｔホモ型であると考えられた。また、この試料物質に含まれるウイルスは、２型である判定された。更に得られた蛍光強度から、ウイルス濃度は１０6ｃｏｐｙ／ｍＬ以下であると見積もられた。従って、この試料物質が採取された患者には、ＩＦＮが有効に働くことが予測された。
【０１２１】
例３は、ＩＦＮ療法の効果を評価するためのＰＮＡチップを記載する
ＩＦＮ治療効果予測用ＰＮＡチップ
まず、患者（ヒト）の血液からヒトの染色体ＤＮＡとＨＣＶ−ＲＮＡを採取した。次に、染色体ＤＮＡは配列番号２０、２１のプライマーを用いて１３５ｂｐの断片を増幅した。また、ＨＣＶ−ＲＮＡは逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作製した。得られたｃＤＮＡを鋳型にして配列番号８（これはセンスである）、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４（これらはアンチセンスである）のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。
【０１２２】
図２に本実施例のＰＮＡチップの概略図を示す。ガラス基板１２上に１０個の金電極１３をパターニングしたプローブ固定化チップに、Ｎ末端にシステインを修飾した第２プローブとして配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１のＰＮＡプローブ、第１プローブとして配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６のＰＮＡプローブ７〜１１を、それぞれ２００ｎＬずつスポットし、１時間放置した。
【０１２３】
配列番号２７〜３０の塩基配列は、それぞれ配列番号１６〜１９の塩基配列の４５５位のＳＮＰ部位を含む断片である。配列番号３２〜３６の塩基配列はそれぞれＨＣＶウイルスの１ａ型、１ｂ型、２ａ型、２ｂ型、３ａ型の遺伝子型を検出するプローブである。
【０１２４】
次に、サンプルを２ｘＳＳＣ−１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ溶液に溶解した。これを容量２０μＬのリアクションチャンバーにいれ、プローブ固定化チップでふたをした。５０℃、１時間の反応を行った後、０．２ｘＳＳＣ−１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ溶液で２回洗浄した。次に、これに１０μｍｏｌ／Ｌのヘキスト３３２５８溶液を滴下した。別途対極と参照電極を設置し、金電極と対極間に電圧を印加したときのヘキスト３３２５８からの酸化電流を測定した。
【０１２５】
その結果、配列番号２７と配列番号２８と配列番号３４のプローブを固定化した金電極１３から有意な電流変化が観察され、この試料物質に含まれるヒト由来核酸におけるＭｘＡ−８８の遺伝子型はＧ／Ｔヘテロ型であると考えられた。また、この試料物質に含まれるウイルスは、２ａ型であると判定された。従って、この試料物質が採取された患者には、ＩＦＮが有効に働くことが予測された。
【０１２６】
例４
本発明に従うと、Ｃ型肝炎感染者の感染しているＨＣＶのウイルス型、感染者のＭｘＡ−８８、ＭｘＡ−１２３、ＭＢＬ−２２１およびＭＢＬのコラーゲン様ドメインのコドン５４の遺伝子型から、Ｃ型肝炎感染者におけるＩＦＮ療法の有効性を予測することが可能である。
【０１２７】
以下に図３を用いてウイルスの型、ＭＢＬおよびＭｘＡの遺伝子型よりＩＦＮ療法の効果を予測する方法の１例を説明する。
【０１２８】
ステップ３ａでは、実施者が、ＩＦＮを投与されるべき個体から血液サンプル等のサンプルを採取し、予測を開始する。採取されたサンプルは、必要に応じて精製および抽出などの処理がなされた後で、ウイルスの型、並びにＭＢＬおよびＭｘＡの遺伝子型、即ち、ＭｘＡ−８８とＭｘＡ−１２３の遺伝子型、ＭＢＬ−２２１の遺伝子型、ＭＢＬのコラーゲン様ドメインのコドン５４の遺伝子型を決定し、ステップ３ｂへ進む。
【０１２９】
ステップ３ｂでは、ステップ３ａで決定したウイルスの型にタイプ１が含まれている場合ステップ３ｃへ進むと判定し、タイプ２のみであれば（３ｄ）へ進むと判定する。
【０１３０】
ステップ３ｃでは、ステップ３ａで決定したＭＢＬおよびＭｘＡの遺伝子型を基に、遺伝子型とＩＦＮの効果を対応付けたテーブル２を検索して対応するＩＦＮの効果を抽出し、それによってＩＦＮ療法の有効性を予測し、全予測工程を終了する。
【０１３１】
ステップ３ｄでは、ステップ３ａで決定したＭＢＬおよびＭｘＡの遺伝子型を基に、遺伝子型とＩＦＮの効果を対応付けたテーブル３を検索し対応するＩＦＮの効果を抽出し、それによってＩＦＮ療法の有効性を予測し、全予測工程を終了する。
【０１３２】
ここで使用されるテーブルは遺伝子型とＩＦＮ感受性を対応付けた情報である。各テーブルを表として示したものがそれぞれのテーブル番号に対応する表である。上述の方法において使用した各表は例として示したものである。ここで使用されるテーブルおよび表は、各遺伝子型とＩＦＮの効果を対応付けたものであればよい。例えば、表２は、タイプ１のＨＣＶに感染している患者における遺伝子型とＩＦＮの効果の関係を示す表である。一方、表３は、タイプ２のＨＣＶに感染している患者における遺伝子型とＩＦＮの効果の関係を示す表である。また、使用される表は、そのうちの何れかの成分のみを含む表であってもよく、或いは他の組合せの成分からなる表であってもよい。上述の例ではステップ３ｃとステップ３ｄにて参照したテーブルとして、それぞれ表２と表３を使用し、夫々のステップ毎に必要な項目を予め選択して作製した２つの表を使用している。しかしながら、これらをあわせて作製した１つの表を用いてもよい。或いは他の組合せの成分からなる表であってもよい。成分の選択は、例えば、ステップ３ｃで使用されるテーブルには、タイプ１のＨＣＶ感染者における遺伝子型と著効または非著効の関連を示す情報を選択し、ステップ３ｄではタイプ２のＨＣＶ感染者における遺伝子型と著効または非著効の関連を示す情報を選択すればよい。しかしながらこれに限られるものではなく、成分の選択は実施者が任意に行ってよい。
【０１３３】
また、ここで使用される表２および３に記載される成分としての数値は、遺伝子型とＩＦＮ感受性またはＩＦＮの効果を対応付けた情報を示す表示の１例であり、当該表に記載の数値に限定されるものではない。即ち、遺伝子型と著効または非著効との相関関係を実質的に示すことが可能な表記であれば、例えば、「○」、「×」、「△」であっても、簡略化された数値によるスコア（例えば、１、２、３、４および５等）であってもよい。
【表２−１】
2007195565.tif 000004
【０１３４】
【表２−２】
2007195565.tif 000005
【０１３５】
【表３】
2007195565.tif 000006
【０１３６】
以上のような本発明の態様に従い、多くの項目を検討することにより、より正確な予測が可能になる。
【０１３７】
上述の本発明の態様に従う方法およびプローブ固相化チップを用いることにより、試料物質から、目的とする核酸情報を簡便に、短時間に、且つ正確に、回収することが可能である。
【０１３８】
また、上述の態様は本発明の１例であり本発明を制限することを目的として記載されるものではない。
【０１３９】
更なる利益および変更が当業者に容易に見出されるであろう。従って、その広範な側面における本発明は、ここに示し且つ記載した詳細および代表的な態様に制限するものではない。従って、種々の変更は、添付された請求の範囲およびそれらの均等物により明示されるような精神または一般的な本発明の概念の範囲から逸れることなく行われ得る。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】本実施例に係るＤＮＡチップの概略図。
【図２】本実施例に係るＰＮＡチップの概略図。
【図３】本実施例に係る方法を示すフローチャート。
【符号の説明】
【０１４１】
１・・・ＤＮＡプローブ
２・・・ＤＮＡプローブ
３・・・ＤＮＡプローブ
４・・・ＤＮＡプローブ
５・・・ＤＮＡプローブ
６・・・基体
７・・・ＰＮＡプローブ
８・・・ＰＮＡプローブ
９・・・ＰＮＡプローブ
１０・・・ＰＮＡプローブ
１１・・・ＰＮＡプローブ
１２・・・基体
１３・・・金電極
１４・・・接続部
【図１】
2007195565.tif 000007
【図２】
2007195565.tif 000008
【図３】
2007195565.tif 000009
【配列表】
2007195565000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月1日(2007.5.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定疾患に曝された個体に存在する病原微生物の核酸の第１の核酸と、前記個体の核酸の第２の核酸を検出するための方法であって、ここで、前記病原微生物は特定疾患に関連し、当該個体の核酸及び当該病原微生物の核酸が、当該何れの核酸も単離することなく、前記個体から抽出した試料物質から抽出され、前記方法は以下を具備する方法：
（ａ）前記個体からの核酸の前記抽出物を当該何れの核酸も単離することなく逆転写すること、
（ｂ）（ａ）の前記逆転写することにより得られた逆転写産物と、第１のプローブと第２のプローブとを具備するプローブ固定化基板とを反応させることと、ここで、前記第1のプローブは、当該病原微生物の特定の核酸配列の存在を検出し、前記病原微生物は前記特定疾患に関連し、および前記第2のプローブは前記個体の特定の核酸の存在を検出する；
（ｃ）（ｂ）の前記反応の結果、前記第１のプローブに対して結合した核酸の存在を検出することによって第１の核酸の存在を検出することおよび、前記第2のプローブに結合した核酸の存在を検出することによって第２の核酸の存在を検出すること。
【請求項２】
（ｂ）の前記反応に先駆けて、前記逆転写産物を増幅し、増幅された核酸を得ることに供することを更に具備する請求項１の方法。
【請求項３】
特定疾患に曝された個体に存在する病原微生物の核酸の第１の核酸と、前記個体の核酸の第２の核酸を検出するための方法であって、ここで、前記病原微生物は特定疾患に関連し、当該個体の核酸及び当該病原微生物の核酸が、当該何れの核酸も単離することなく、前記個体から抽出した試料物質から抽出され、前記方法は以下を具備する方法：
（ａ）前記個体からの核酸の前記抽出物を逆転写すること、
（ｂ）前記逆転写により得られた逆転写産物を増幅することと、ここで、前記核酸の抽出から増幅までの工程が何れの核酸も分離されることなく同一の処理で行われる；
（ｃ）（ｂ）の増幅することにより得られた増幅物と、第１のプローブと第２のプローブとを具備するプローブ固定化基板とを反応させることと、ここで、前記第１のプローブは、当該病原微生物の特定の核酸配列の存在を検出し、前記病原微生物は前記特定疾患に関連し、および前記第２のプローブは前記個体の特定の核酸の存在を検出する；
（ｄ）（ｃ）の前記反応の結果、前記第１のプローブに対して結合した核酸の存在を検出することによって第１の核酸の存在を検出することおよび、前記第2のプローブに結合した核酸の存在を検出することによって第２の核酸の存在を検出すること。
【請求項４】
前記個体の前記核酸が当該疾患の治療に対する反応性に関連し、且つ前記病原微生物からの前記核酸と前記個体の核酸の両者の存在が、当該疾患の治療に対する反応性と相関する請求項１から３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記個体がヒトである請求項１から４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１から５の何れか１項に記載の方法であって、前記試料物質が、全血であり、ここで、当該核酸の単離なしに、個体の核酸は当該試料物質に含まれる核酸に由来し、および病原微生物は当該試料物質の血清に由来する核酸を同時に検出することを具備する方法。
【請求項７】
前記個体からの前記核酸がヒトゲノム核酸であり、且つ前記病原微生物からの前記核酸がゲノム核酸である請求項１から６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸の抽出物がヒトゲノム抽出用キットにより得られる請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒトゲノム抽出用キットがＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（登録商標）である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記特定疾患が肝炎であり、前記病原微生物が肝炎ウイルスである請求項１から９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記病原微生物がＣ型肝炎ウイルスであり、前記治療のために使用される薬剤がＩＦＮである請求項４から７および１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のプローブはＣ型肝炎ウイルスのゲノムを検出し、且つ前記第２のプローブはＭｘＡプロモーター領域のＳＮＰを検出する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のプローブはＣ型肝炎ウイルスのゲノムを検出し、且つ第２のプローブはＭＢＬ遺伝子のＳＮＰを検出する請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１プローブは１種類以上具備され、且つ少なくともその１種類が以下から選択される配列を含み；
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群より選択される配列に示される塩基配列、
（ｂ）配列番号５、配列番号６および配列番号７からなる群より選択される配列に示される塩基配列、
（ｃ）（ａ）および（ｂ）から選択される塩基配列の相補配列；並びに
前記第２プローブは１種類以上具備され、且つ少なくともその１種類が以下から選択される配列を含む；
(at455) 配列表の配列番号16に示される塩基配列、
(bt455) 前記(at455)に示される塩基配列中の455位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ct455) 配列番号16の441〜455位に示される配列を含む塩基配列、
(dt455) 配列番号16の449〜459位に示される配列を含む塩基配列、
(et455) 前記(at455)〜(dt455)から選択される塩基配列の相補配列、
(ag455) 配列表の配列番号17に示される塩基配列、
(bg455) 前記(ag455)に示される塩基配列中の455位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cg455) 配列番号17の441〜455位に示される配列を含む塩基配列、
(dg455) 配列番号17の449〜459位に示される配列を含む塩基配列、
(eg455) 前記(ag455)〜(dg455)から選択される塩基配列の相補配列、
(aa455) 配列表の配列番号18に示される塩基配列、
(ba455) 前記(aa455)に示される塩基配列中の455位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ca455) 配列番号18の441〜455位に示される配列を含む塩基配列、
(da455) 配列番号18の449〜459位に示される配列を含む塩基配列、
(ea455) 前記(aa455)〜(da455)から選択される塩基配列の相補配列、
(ac455) 配列表の配列番号19に示される塩基配列、
(bc455) 前記(ac455)に示される塩基配列中の455位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cc455) 配列番号19の441〜455位に示される配列を含む塩基配列、
(dc455) 配列番号19の449〜459位に示される配列を含む塩基配列、
(ec455) 前記(ac455)〜(dc455)から選択される塩基配列の相補配列、
(aa420) 配列表の配列番号37に示される塩基配列、
(ba420) 前記(aa420)に示される塩基配列中の420位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ca420) 配列番号37の415〜425位に示される配列を含む塩基配列、
(da420) 前記(aa420)〜(ca420)から選択される塩基配列の相補配列、
(ac420) 配列表の配列番号38に示される塩基配列、
(bc420) 前記(ac420)に示される塩基配列中の420位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cc420) 配列番号38の415〜425位に示される配列を含む塩基配列、
(dc420) 前記(ac420)〜(cc420)から選択される塩基配列の相補配列、
(at420) 配列表の配列番号39に示される塩基配列、
(bt420) 前記(at420)に示される塩基配列中の420位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ct420) 配列番号39の415〜425位に示される配列を含む塩基配列、
(dt420) 前記(at420)〜(ct420)から選択される塩基配列の相補配列
(ag420) 配列表の配列番号40に示される塩基配列、
(bg420) 前記(at420)に示される塩基配列中の420位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cg420) 配列番号40の415〜425位に示される配列を含む塩基配列、
(dg420) 前記(ag420)〜(cg420)から選択される塩基配列の相補配列、
(ag221) 配列表の配列番号41に示される塩基配列、
(bg221) 前記(ag221)に示される塩基配列中の425位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cg221) 配列番号41の418〜432位に示される配列を含む塩基配列、
(dg221) 配列番号41の421〜430位に示される配列を含む塩基配列
(eg221) 前記(ag221)〜(dg221)から選択される塩基配列の相補配列、
(ac221) 配列表の配列番号42に示される塩基配列、
(bc221) 前記(ac221)に示される塩基配列中の425位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cc221) 配列番号42の418〜432位に示される配列を含む塩基配列、
(dc221) 配列番号42の421〜430位に示される配列を含む塩基配列
(ec221) 前記(ac221)〜(dc221)から選択される塩基配列の相補配列、
(aa221) 配列表の配列番号43に示される塩基配列、
(ba221) 前記(aa221)に示される塩基配列中の425位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ca221) 配列番号43の418〜432位に示される配列を含む塩基配列、
(da221) 配列番号43の421〜430位に示される配列を含む塩基配列
(ea221) 前記(aa221)〜(da221)から選択される塩基配列の相補配列、
(at221) 配列表の配列番号44に示される塩基配列、
(bt221) 前記(at221)に示される塩基配列中の425位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ct221) 配列番号44の418〜432位に示される配列を含む塩基配列、
(dt221) 配列番号44の421〜430位に示される配列を含む塩基配列
(et221) 前記(at221)〜(dt221)から選択される塩基配列の相補配列、
(ag54) 配列表の配列番号45に示される塩基配列、
(bg54) 前記(ag54)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cg54) 配列番号45の874〜876位に示される配列を含む塩基配列、
(dg54) 配列番号45の869〜880位に示される配列を含む塩基配列
(eg54) 前記(ag54)〜(dg54)から選択される塩基配列の相補配列、
(aa54) 配列表の配列番号46に示される塩基配列、
(ba54) 前記(aa54)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ca54) 配列番号46の874〜876位に示される配列を含む塩基配列、
(da54) 配列番号46の869〜880位に示される配列を含む塩基配列
(ea54) 前記(aa54)〜(da54)から選択される塩基配列の相補配列、
(ac54) 配列表の配列番号47に示される塩基配列、
(bc54) 前記(ac54)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cc54) 配列番号47の874〜876位に示される配列を含む塩基配列、
(dc54) 配列番号47の869〜880位に示される配列を含む塩基配列
(ec54) 前記(ac54)〜(dc54)から選択される塩基配列の相補配列、
(at54) 配列表の配列番号47に示される塩基配列、
(bt54) 前記(at54)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ct54) 配列番号48の874〜876位に示される配列を含む塩基配列、
(dt54) 配列番号48の869〜880位に示される配列を含む塩基配列
(et54) 前記(at54)〜(dt54)から選択される塩基配列の相補配列、
(ag52-57) 配列表の配列番号45に示される塩基配列、
(bg52-57) 前記(ag52-57)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cg52-57) 配列番号45の868〜885位に示される配列を含む塩基配列、
(dg52-57) 前記(ag52-57)〜(cg52-57)から選択される塩基配列の相補配列、
(aa52-57) 配列表の配列番号46に示される塩基配列、
(ba52-57) 前記(aa52-57)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ca52-57) 配列番号46の886〜885位に示される配列を含む塩基配列、
(da52-57) 前記(aa52-57)〜(ca52-57)から選択される塩基配列の相補配列、
(ac52-57) 配列表の配列番号47に示される塩基配列、
(bc52-57) 前記(ac52-57)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cc52-57) 配列番号47の886〜885位に示される配列を含む塩基配列、
(dc52-57) 前記(ac52-57)〜(cc52-57)から選択される塩基配列の相補配列、
(at52-57) 配列表の配列番号47に示される塩基配列、
(bt52-57) 前記(at52-57)に示される塩基配列中の875位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ct52-57) 配列番号48の886〜885位に示される配列を含む塩基配列、
(dt52-57) 前記(at52-57)〜(ct52-57)から選択される塩基配列の相補配列;
ことを特徴とする請求項１から１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記増幅が、配列番号８および配列番号９からなる群より少なくとも１つ選択される塩基配列で示されるセンス鎖と、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４の群より少なくとも１つ選択される塩基配列で示されるアンチセンス鎖を使用するＰＣＲによって行うことを特徴とする請求項２から１４の何れか１項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
上記の課題を解決するための手段は、特定疾病に曝された個体に存在する病原微生物からの核酸についての第１の情報と前記個体の核酸についての第２の情報とを得る方法であって、前記病原微生物が当該特定疾患に関連し、以下を具備する方法；
（ａ）当該個体からの核酸の抽出物と、第１のプローブと第２のプローブとを具備するプローブ固定化基体とを反応させることと、ここで、前記第１のプローブは当該病原微生物の特定の核酸配列の存在を検出し、前記病原微生物は前記特定疾患に関連し、および前記第２のプローブは前記個体の特定の核酸の存在を検出する；および
（ｂ）（ａ）の前記反応の結果、前記第１のプローブに対して結合した核酸の存在を検出することにより前記第１の情報を得ることと、および前記第２のプローブに対して結合した核酸の存在を検出することにより第２の情報を得ること：
並びに
基体と、
病原微生物の特定の核酸配列の存在を検出するために、当該基体に固定化されの第１プローブと、ここで、前記微生物は特定疾患に関連する、
個体の特定の核酸の存在を検出するための、前記基体に固定化され且つ第１プローブとは異なる塩基配列を有する第２のプローブと、ここで、前記個体の前記核酸は、当該疾患の治療に対する反応性に関係する、
を具備するプローブ固定化基体：
である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
ここで開示する実例となる態様においては、まず、ヒトから全血試料を採取する。次に、この採取された全血試料から、例えば、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ、東京、日本）などの市販のヒトゲノム抽出用キットを用いてヒトゲノム由来と、前記ヒトに存在するウイルスゲノム由来の核酸を共に抽出する。ある態様においては、目的とする配列を含む核酸を増幅する。続いて、得られた増幅産物をプローブ固定化チップに対してハイブリダイズし、更にそのプローブ固定化チップに対して結合する核酸を検出することによって、得られた増幅物を解析する。このようにして、前記個体からの特定の疾患に関連する核酸の情報が、前記個体に存在する病原微生物から得られる特定疾患に関連する核酸についての情報と共に得られる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
抽出された核酸成分がＲＮＡである場合、直接ＨＣＶ−ＲＮＡを試料核酸として用いても良いし、ＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作成した後試料核酸として用いても良い。この場合も、個体由来の核酸と病原微生物由来の核酸を分離せずに行ってもよく、例えば、上述の方法において、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔを用いて抽出を行った後に、逆転写を行い、続いてＰＣＲ増幅を行ってもよい。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
ここで、行頭の括弧内の記号は特定の塩基配列を示し、その配列の内容は当該括弧内の記号の右側に記載される：
(ct455) 配列番号16の441〜455位に示される配列を含む塩基配列、
(dt455) 配列番号16の449〜459位に示される配列を含む塩基配列、
(et455) 前記(at455)〜(dt455)から選択される塩基配列の相補配列、
(ag455) 配列表の配列番号17に示される塩基配列、
(bg455) 前記(ag455)に示される塩基配列中の455位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cg455) 配列番号17の441〜455位に示される配列を含む塩基配列、
(dg455) 配列番号17の449〜459位に示される配列を含む塩基配列、
(eg455) 前記(ag455)〜(dg455)から選択される塩基配列の相補配列
(aa455) 配列表の配列番号18に示される塩基配列、
(ba455) 前記(aa455)に示される塩基配列中の455位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ca455) 配列番号18の441〜455位に示される配列を含む塩基配列、
(da455) 配列番号18の449〜459位に示される配列を含む塩基配列、
(ea455) 前記(aa455)〜(da455)から選択される塩基配列の相補配列
(ac455) 配列表の配列番号19に示される塩基配列、
(bc455) 前記(ac455)に示される塩基配列中の455位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cc455) 配列番号19の441〜455位に示される配列を含む塩基配列、
(dc455) 配列番号19の449〜459位に示される配列を含む塩基配列、
(ec455) 前記(ac455)〜(dc455)から選択される塩基配列の相補配列、
からなる群より選択される塩基配列を使用してもよい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
当該疾患がＣ型肝炎であり、当該薬剤がＩＦＮである１態様において、個体の核酸に対するハイブリダイゼーションにおいて使用される（プローブ固定化チップ上での使用も含む）第２のプローブは、以下；
(aa420) 配列表の配列番号37に示される塩基配列、
(ba420) 前記(aa420)に示される塩基配列中の420位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ca420) 配列番号37の415〜425位に示される配列を含む塩基配列、
(da420) 前記(aa420)〜(ca420)から選択される塩基配列の相補配列
(ac420) 配列表の配列番号38に示される塩基配列、
(bc420) 前記(ac420)に示される塩基配列中の420位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cc420) 配列番号38の415〜425位に示される配列を含む塩基配列、
(dc420) 前記(ac420)〜(cc420)から選択される塩基配列の相補配列
(at420) 配列表の配列番号39に示される塩基配列、
(bt420) 前記(at420)に示される塩基配列中の420位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(ct420) 配列番号39の415〜425位に示される配列を含む塩基配列、
(dt420) 前記(at420)〜(ct420)から選択される塩基配列の相補配列
(ag420) 配列表の配列番号40に示される塩基配列、
(bg420) 前記(at420)に示される塩基配列中の420位の塩基を除く数個の塩基が欠失、置換され、又は1以上の塩基が付加された修飾塩基配列、
(cg420) 配列番号40の415〜425位に示される配列を含む塩基配列、
(dg420) 前記(ag420)〜(cg420)から選択される塩基配列の相補配列
からなる群より選択される塩基配列が使用されてもよい。
ここで、上記行頭の括弧内の記号は特定の塩基配列を示し、その配列の内容は当該記号の右側に記載される。