(57)【要約】【課題】標的分子と特異的に結合するリガンドを得る新規な方法を提供する。【解決手段】核酸間の結合以外の、標的分子に対する核酸リガンドのin vitroでの特異的結合を含む方法であって、ここで標的分子がタンパク質であるとき、その生物学的機能の一部として核酸に結合しないタンパク質であり、また核酸リガンドが以下のステップを含む方法によって同定されたものであり：（ａ）結合に有利な条件下で核酸混合物を標的と接触させる；（ｂ）標的分子に結合した核酸から非結合核酸を分離する；（ｃ）核酸−標的対を解離する；（ｄ）核酸−標的対から解離した核酸を増幅して、リガンドが濃度化した核酸の混合物を作る；（ｅ）結合、分離、解離および増幅の段階を望みの回数だけ繰り返し；これにより標的分子と特異的に結合するリガンドを得る方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸間の結合以外の、標的分子に対する核酸リガンドのin vitroでの特異的結合を含む方法であって、ここで標的分子がタンパク質であるとき、その生物学的機能の一部として核酸に結合しないタンパク質であり、また核酸リガンドが以下のステップを含む方法によって同定されたものであり：
（ａ）結合に有利な条件下で核酸混合物を標的と接触させる；
（ｂ）標的分子に結合した核酸から非結合核酸を分離する；
（ｃ）核酸−標的対を解離する；
（ｄ）核酸−標的対から解離した核酸を増幅して、リガンドが濃度化した核酸の混合物を作る；
（ｅ）結合、分離、解離および増幅の段階を望みの回数だけ繰り返し；
これにより標的分子と特異的に結合するリガンドを得る方法。
【請求項２】
前記方法が以下の目的のために使用される請求項1記載の方法：
・標的分子の検出、定量または精製用；
・標的タンパク質の検出、定量、単離または精製用；
・アッセイ；
・診断手順；
・細胞ソーティング；
・標的分子機能の阻害剤として；
・プローブ剤または金属イオン封鎖剤（sequestering agent）として；
・試料中の標的分子の存否の検出および／またはその量の測定用；
・標的分子の機能の修飾用；または
・タンパク質機能に影響、阻害または増強。
【請求項３】
リガンドが診断試験における試薬である請求項1記載の方法。
【請求項４】
核酸間の結合以外の、標的分子に対する核酸リガンドのin vivoでの特異的結合を含む治療法または診断法に用いる治療薬または診断薬の製造における核酸リガンドの使用であって、ここで標的分子がタンパク質であるとき、その生物学的機能の一部として核酸に結合しないタンパク質であり、また核酸リガンドが以下のステップを含む方法によって同定されたものであり：
（ａ）結合に有利な条件下で核酸混合物を標的と接触させる；
（ｂ）標的分子に結合した核酸から非結合核酸を分離する；
（ｃ）核酸−標的対を解離する；
（ｄ）核酸−標的対から解離した核酸を増幅して、リガンドが濃度化した核酸の混合物を作る；
（ｅ）結合、分離、解離および増幅の段階を望みの回数だけ繰り返し；
これにより標的分子と特異的に結合するリガンドを得るものである、前記使用。
【請求項５】
リガンドまたは薬剤が標的分子の機能を修飾するものである、請求項１−４のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項６】
リガンドまたは薬剤が標的の機能を阻害するものである、請求項１−４のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項７】
リガンドまたは薬剤が標的の機能を活性化するものである、請求項１−４のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項８】
標的がタンパク質であり、リガンドまたは薬剤が前記タンパク質の機能に影響、阻害または増強する、請求項１−４のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項９】
標的がタンパク質であり、リガンドがタンパク質の機能を阻害するものである、請求項１−４のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項１０】
リガンドまたは薬剤が以下のものである請求項１−４のいずれかに記載の方法または使用：、
（ｉ）酵素の酵素活性に影響する；
（ｉｉ）タンパク質受容体の機能性に影響する；
（ｉｉｉ）タンパク質多量体の形成に影響する；
（ｉｖ）受容体への結合を阻害する；
（ｖ）受容体への結合特異性を修飾する；
（ｖｉ）ホルモン作用を修飾する；または
（ｖｉｉ）タンパク質の輸送特性を修飾する。
【請求項１１】
リガンドまたは薬剤が以下の目的のために使用される請求項４記載の使用：
（ｉ）標的タンパク質の検出または定量用；
（ｉｉ）アッセイ；
（ｉｉｉ）診断手順；
（ｉｖ）金属イオン封鎖剤として；
（ｖ）薬剤送達ベヒクルとして；または
（ｖｉ）ホルモン作用の修飾剤として。
【請求項１２】
リガンドが毒素または他の治療薬を特定の標的部位へ方向づけるものである請求項４記載の使用。
【請求項１３】
リガンドが、患者の体の選択された位置に核酸を方向づけることのできる非核酸エレメントをさらに含む請求項４記載の使用。
【請求項１４】
核酸リガンドが1本鎖である請求項１−１３のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項１５】
リガンドが1本鎖ＲＮＡを含む請求項１−１３のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項１６】
リガンドが1本鎖ＤＮＡを含む請求項１−１３のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項１７】
リガンドが化学的に修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡを含む請求項１−１６のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項１８】
修飾がシトシン環外アミノまたはウラシルの５−ブロモ置換またはメチル化である請求項１７記載の方法または使用。
【請求項１９】
修飾が核酸の増幅を妨害しない請求項１７または１８に記載の方法または使用。
【請求項２０】
リガンドが少なくとも１５ヌクレオチドを含む請求項１−１９のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項２１】
リガンドが複数の標的特異的リガンド配列を含む請求項１−２０のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項２２】
リガンドが同じ標的に結合する複数の核酸配列を含む請求項１−２１のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項２３】
リガンドが非核酸エレメントをさらに含む請求項１−２２のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項２４】
リガンドがリガンド溶液の形であり、前記リガンド溶液が保存成分を定める共通に保持される三次元構造をもつ複数の核酸リガンドを含む、請求項１−２３のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項２５】
標的分子がタンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝物、阻害剤、薬剤、栄養物および成長因子から選択される、請求項１−２４のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項２６】
標的分子がタンパク質およびペプチドから選択される請求項１−２４のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項２７】
標的分子がタンパク質である請求項１−２４のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項２８】
標的がブラジキニンである請求項１−２４のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項２９】
標的がプロテアーゼである請求項１−２４のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項３０】
標的がセリンプロテアーゼである請求項１−２４のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項３１】
セリンプロテアーゼがヒト組織プラスミノーゲン活性化因子である請求項３０記載の方法または使用。
【請求項３２】
セリンプロテアーゼがトリプシンである請求項３０記載の方法または使用。
【請求項３３】
セリンプロテアーゼがエラスターゼである請求項３０記載の方法または使用。
【請求項３４】
セリンプロテアーゼがキモトリプシンである請求項３０記載の方法または使用。
【請求項３５】
セリンプロテアーゼがトロンビンである請求項３０記載の方法または使用。
【請求項３６】
セリンプロテアーゼがプラスミンである請求項３０記載の方法または使用。
【請求項３７】
標的が哺乳動物受容体である請求項１−２４のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項３８】
標的がヒトインスリンである請求項１−２４のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項３９】
標的が哺乳動物ホルモンまたは因子である請求項１−２４のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項４０】
ホルモンまたは因子がエピネフリンまたは甲状腺ホルモンである請求項３９記載の方法または使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、指数濃度化によるリガンドの計画的進化と題する、１９９０年６月１１日出願の、合衆国特許出願番号０７／５３6,４２８の一部継続出願である。本研究は国立衛生研究所を通じて合衆国政府のグラントにより援助された。合衆国政府は本発明に関して一定の権利を保有する。
【０００２】
ここでは望みの標的分子に特異的に結合する新しい種類の高親和性核酸リガンドについて述べる。希望するどんな標的分子にも特異的に結合する核酸リガンドを選択する方法を提示する。この方法は、指数濃度化によるリガンドの計画的進化の頭字語、SELEX と呼ばれる。本発明（SELEX)の方法は望みの標的分子に対する核酸リガンドを分離するのに有用である。本発明の核酸産物は結合反応がかかわるどんな目的、たとえばアッセイ法、診断法、細胞選別、標的分子機能の阻害剤として、プローブとして、隔絶物質としてなどのどんな目的に対しても有用である。さらに、本発明の核酸産物は触媒活性をもつことができる。標的分子としては蛋白質、多糖類、糖蛋白質、ホルモン、レセプターおよび細胞表面を含む天然ならびに合成ポリマー、および薬剤、代謝体、補助因子、遷移状態同族体および毒素のような小分子がある。
【背景技術】
【０００３】
大部分の蛋白質または小分子は特異的に核酸に結合しないことがわかっている。例外として知られている蛋白質は、核酸中に蓄えられた遺伝情報を細胞構造や遺伝物質の複製に際して転移させるときに生きた細胞中で機能するリプレッサー、ポリメラーゼ、活性化物質などのような調節蛋白質である。さらに、ＧＴＰのような小分子はいくつかのイントロンＲＮＡに結合する。
【０００４】
生物体は核酸の機能として大部分が情報の役割に限るように進化してきた。Crick が仮定したセントラルドグマによると、天然の形、伸びた形のいずれの核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡいずれも）も、鋳型核酸中の情報を“読みとり”相補的核酸を生ずるという複製過程を通じて他の核酸を合成するための鋳型として働らくことができる。遺伝学と遺伝子発現に関する実験的パラダイムのすべてはこのような核酸の性質に依存する：本質的に、塩基対の化学的概念の故に、そして複製過程でこの塩基対を比較的エラーのない仕方で用いることができるために、二重鎖核酸は情報的にゆとりがある。
【０００５】
蛋白質の各成分である２０の天然アミノ酸は、結合と触媒作用の両方に対して非常に広い幅の活性を提供するのに十分な化学的差異と活性を有している。しかし、核酸は蛋白質よりも狭い化学的可能性しかもたないが、遺伝情報がウイルスからウイルスへ、細胞から細胞へ、そして臓器から臓器へと送られるようにする情報的役割を有すると考えられている。このような関係で核酸成分、ヌクレオチドは、一つのワトソン−クリック塩基対内で情報のゆとりがあるようにさせる表面の塩基対だけを持つようにしなければならない。核酸成分は広い範囲の結合と触媒活性にとって十分な化学的差異と活性をもつ必要はない。
【０００６】
しかし、天然に存在するいくつかの核酸はある標的分子と結合したり、またごく少ないながら触媒作用の例も報告されている。この種の活性の範囲は蛋白質さらにはより特異的な抗体に比べれば狭い。たとえば、核酸が高い親和性と特異性である蛋白標的に結合することが知られているところでは、結合はＤＮＡまたはＲＮＡリガンドを構成するヌクレオチドの正確な配列に依存する。すなわち、短い二重鎖ＤＮＡ配列は、原核生物、真核生物両方での転写を抑制または活性化する標的蛋白質に結合することが知られている。他の短い二重鎖ＤＮＡ配列は、高い親和性と特異性で選択できる蛋白質標的、すなわち制限エンドヌクレアーゼに結合することが知られている。他の短いＤＮＡ配列は、クロモソームメカニックスに参加する特異蛋白質の結合に対するリガンドを作ることによって、クロモソーム上のセントロメアとテレメアとして働らいている。こうして二重鎖ＤＮＡは、ＤＮＡ結合に向かわせる機能をもつ標的蛋白質の隅や割れ目内に結合する、よく知られた能力をもっている。一重鎖ＤＮＡもまたある種の蛋白質に高い親和性と特異性をもって結合できるが、そのような例数はむしろ少ない。二重鎖ＤＮＡ結合蛋白質の既知の例から、アミノ酸側鎖をＢ型二重鎖ＤＮＡの大きな溝の中へ突き入れた種々の蛋白質特性を含むものとして結合反応を記述でき、これによって特異性を生じさせる塩基配列の検分ができる。
【０００７】
二重鎖ＲＮＡは時にある種の蛋白質、たとえば大腸菌のエンドヌクレアーゼＲＮaseIIIに対するリガンドとして働らく。一重鎖ＲＮＡリガンドに結合する標的蛋白質の例はもっとたくさん知られているが、これらの場合には一重鎖ＲＮＡはしばしば分子内二重鎖生成領域を含む複雑な三次元の形状を形成している。アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素は高い特異性をもってｔＲＮＡ分子に強固に結合する。ＲＮＡウイルスのゲノム内の短い領域はウイルスコート蛋白質に高い特異性をもって強固に結合する。ＲＮＡの短い配列も、これまた高い親和性と特異性でバクテリオファージＴ4 −エンコードＤＮＡポリメラーゼに結合する。こうして、特異的蛋白標的に対する結合の相手となる、二重鎖−または一重鎖ＲＮＡおよびＤＮＡリガンドを見出すことができる。大部分の既知ＤＮＡ結合蛋白質が二重鎖ＤＮＡに特異的に結合するのに対して、大部分のＲＮＡ結合蛋白質は一重鎖ＲＮＡを認識する。文献におけるこの統計的傾向は、疑いもなく現在の生物圏での統計的傾向が二重鎖ゲノムとしてＤＮＡを用い、ゲノムとして働らくのを除いたＲＮＡの演ずる多くの役割における一重鎖実体としてＲＮＡを用いていることの反映である。化学的には特異的蛋白質相互作用のための相手になりうるものとして一重鎖ＤＮＡを除外する強力な理由はない。
【０００８】
ＲＮＡとＤＮＡはより小さな標的分子とも結合することが見出されている。二重鎖ＤＮＡはアクチノマイシンＤのような種々の抗生物質と結合する。特異的一重鎖ＲＮＡは抗生物質チオストレプトンに結合する；特異的ＲＮＡ配列と構造はおそらくある他の抗生物質、とくに標的有機体中のリボソームを不活化させる機能をもつ抗生物質と結合する。進化的に関連したＲＮＡのファミリーは、特異性とかなりの親和性をもってヌクレオチドおよびヌクレオシドと結合し（Bass, B.and Cech, T.（１９８４）Nature３０８：８２０−８２６）、また同様に２０のアミノ酸の一つとも結合する（Yarus, M. （１９８８）Science ２４０：１７５１−１７５８）。同じく触媒活性をもつＲＮＡｓが現在では知られているが、これらの分子の化学的可能性の範囲は狭い範囲に限られ、フォスホジエステル転移反応と核酸の加水分解に限られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
これらの知られた例にもかかわらず、蛋白質および他の細胞成分のほとんどは生理的条件下では核酸に結合しないと考えられており、たとえ結合が観察されたとしてもそれは非特異的である。他成分に結合する核酸の能力は上記のような比較的少ない例に限られているか、あるいは特異な結合に対する核酸の化学的レパートリーが天然に生じた構造中には存在しないかである（あるものに対して選択される形で）。本発明は、化学化合物として核酸が実際上無制限の形状、大きさおよび立体配座をとることができ、生物系でみられる結合や触媒機能よりもはるかに広いレパートリーをもっているという発明者の基本的な見通しの上になされたものある。
【００１０】
化学的相互作用が蛋白質−核酸結合のいくつかの知られた例についてしらべられている。たとえば、バクテリオファージＲ１７コート蛋白質結合のＲＮＡ位置の大きさと配列がUhlenbeck および共同研究者により確認された。Ｒ１７コート蛋白質に対する最小天然ＲＮＡ結合位置（２１塩基長）を、蛋白質−ＲＮＡフラグメント複合体がフィルターに結合したままに留まるような、ニトロセルロースフィルター定量法でｍＲＮＡの種々の大きさの標識フラグメントを測ることによって決定した(Careyet al.（１９８３）Biochemistry２２：２６０１）。最小Ｒ１７コート蛋白質結合位置の異なる配列のバリアントのいくつかを、蛋白結合へのそれぞれの核酸の寄与を決定するためにin vitro で作った（Uhlenback etal. （１９８３）J. Biomol. Structure Dynamics １：５３９ and Romaniuk etal.（１９８７）Biochemistry ２６：１５６３）。蛋白結合のためには結合位置のヘアピンループ構造の保持が極めて重要なことがわかったが、さらに、ヘアピンステム中のバルジ（塩基対の相手のない）ヌクレオチドを含めて、結合位置中の一重鎖残基の大部分の位置でのヌクレオチド置換が結合に顕著に影響を与えることもわかった。類似の研究で、バクテリオファージＱβコート蛋白質の翻訳オペレーターに対する結合が験べられた（Witherell and Uhlenbeck （１９８９）Biochemistry２８：７１）。Ｑβコート蛋白質ＲＮＡ結合位置は大きさがＲ１７のそれと同じことがわかり、また予測した二次構造中ではそれは約２０の塩基から成り、その中にはバルジヌクレオチドと３塩基ループを含む８塩基ヘアピンが含まれる。Ｒ１７コート蛋白質結合位置とは反対に、ループの一重鎖残基の唯一つだけが結合に必須であり、バルジヌクレオチドの存在は必要ではない。翻訳調節に含まれる蛋白質−ＲＮＡ結合相互作用は顕著な特異性を示す。
【００１１】
核酸は溶液中で２次および三次構造を作ることが知られている。ＤＮＡの二重鎖型はいわゆるＢ型二重らせん、Ｚ−ＤＮＡおよび超らせんねじれを含む（Rich, A. et.al. （１９８４）Ann. Rev. Biochemi. ５３：７９１−８４６）。一重鎖ＲＮＡはヘアピンループおよびシュードノット（偽結び目）構造のような二次構造の局在化領域を形成する(Schimmel, P. （１９８９）Cell ５８：９−１２）。しかし、ループ構造の安定性に対する不対ループヌクレオチドの影響、ループ形成と変性のカイネティックス、熱力学についてはほんの僅かしかわかっていないし、三次構造と三次元形状についても、核酸中の三次折りたたみのカイネティックスと熱力学についてはほとんど何もわかっていない（Tuerk, C. et. al.（１９８８）Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８５：１３６４−１３６８）。
【００１２】
In vitro 進化の一つのタイプがＲＮＡバクテリオファージＱβの複製において報告された。Mills, D. R. et. al. （１９６７）Proc. Natl. Acad. Sci. USA ５８：２１７−２２４；Levinsohn, R. and Spiegelman, S.（１９６８） Proc. Natl. Acad. Sci. USA ６０：８６６−８７２；Levisohn, R. and Spiegelman, S. （１９６９）Proc. Natl.Acad. Sci. USA ６３：８０５−８１１；Saffhill, R. et.al. （１９７０）J. Mol.Biol.５１；５３１−５３９； Kacian, D. L. et al.（１９７２）Proc. Natl. Acad. Sci. USA６９：３０３８−３０４２； Mills, D. R. et al.（１９７３） Science１８０：９１６−９２７。ファージＲＮＡはファージ特異蛋白質の翻訳を行うポリ−シストロニックメッセンジャーＲＮＡとして働らき、またＱβＲＮＡレプリカーゼで触媒されるそれ自身の複製のための鋳型としても働らく。このＲＮＡレプリカーゼはそれ自身のＲＮＡ鋳型に対して高い特異性を有することが示された。in vitro での複製サイクルのコースの間に小さなバリアントＲＮＡｓが分離され、これらもまたＱβレプリカーゼで複製された。複製サイクルが実施される条件の小さな変化によって異なるＲＮＡｓの蓄積が起こることがわかり、これはおそらく変化した条件下でこれらＲＮＡｓの複製が有利に起こるためと思われた。これらの実験において、選択されたＲＮＡがレプリカーゼにより効率的に結合されて複製を開始し、そしてＲＮＡの延長の間速度論的に有利な鋳型として働らいたはずである。Kramer et al （１９７４）J. Mol. Biol. ８９：７１９はＱβレプリカーゼの変異ＲＮＡ鋳型の分離を報告したが、このレプリカーゼの複製は天然の鋳型よりもエチジウムブロミドによる阻害に対してより抵抗性であった。この変異体は最初のＲＮＡ集団中には存在せず、Ｑβレプリカーゼによるin vitro 複製のサイクルの間に次々と起こる突然変異によって生成した。選択の間の変異の唯一のソースはＱβレプリカーゼによる延長の間の固有のエラー率であった。“選択”と呼ばれるこれらの研究において、最初には同じＲＮＡ配列の限られた数の天然バリアントの１つあるいはそれ以上のものの優先的増幅が起きた。そこでは希望する結果を選択することはできず、ただＱβレプリカーゼの固有の作用モードに従うのみであった。
【００１３】
Joyce and Robertson (Joyce（１９８９）in RNA : Catalysis, Splicing, Evolution, Belfort and Shub (eds.), Elsevier, Amsterdam PP. ８３−８７；and Robertson and(Joyce （１９９０）Nature ３４４：４６７）は一重鎖ＤＮＡを特異的に切断するＲＮＡｓを同定する方法について報告した。触媒活性の選択の基礎は、リボザイムが基質ｓｓＲＮＡまたはＤＮＡの特定位置での切断に触媒し、さらに基質の３′−末端をリボザイムの３′−末端へ転移する能力である。望みの反応の生成物をオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを用いて選択したが、このプライマーは触媒反応によって作られた結合部を通じて完全な生成物だけに結合することができ、リボザイム配列の選択的逆転写を可能にする。選択された触媒活性配列はＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターがｃＤＮＡの３′−末端に付着することによって増幅され、そのあとＲＮＡへ転写される。少数のリボザイムバリアントの中から、選択された基質の切断に関して最も活性なバリアントを見分けるのにこの方法が用いられる。限られたバリアントの並びだけがテスト可能である。というのは変異は増幅の間に起こる単一のヌクレオチドの変化に依存するからである。
【００１４】
核酸が他の物質と相互作用する化学的機能に関して先行技術は限られた範囲のことしか教えまたは示唆していない：ある特定のオリゴヌクレオチド配列に結合するように作られた蛋白質リガンドに対する標的のようなもの；より最近ではある限られた範囲の活性を有する触媒などである。以前の“選択”実験は前に述べた機能の狭い範囲のバリアントに限定されている。いまでは、まず始めに、核酸は広い範囲にわたる機能を有することが理解できるであろうし、その能力を実現する方法についてここで明らかにする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明が提供する一群の産物は核酸分子であり、それぞれは独特の配列を有し、またそれぞれが望みの標的化合物または分子に特異的に結合する性質を有する。本発明のそれぞれの化合物は与えられた標的分子の特異的リガンドである。本発明は、核酸がいろいろの二次元および三次元構造を作るのに十分な能力をもっており、モノマーかポリマーかは問わず、実際上どんな化合物に対してもリガンドとして（特異的結合対を形成）作用するそれらのモノマー中に十分な化学的融通性があるという独特の洞察を基礎としている。より一般的でより好ましくは、治療的応用に対して、塩、温度およびpHが許容できる生理的限界付近における水溶液中で結合が起こるということである。
【００１６】
本発明はまたどんな望みの標的に対する核酸リガンドを作るのにも一般的に応用できる方法も提供する。この方法は、結合親和性と選択性について実質的にいかなる望みの規準でもなしとげるために、同じ一般的選択テーマを用いて、候補の混合物中からの選択と構造改善の段階的繰返しを行うことを含んでいる。好ましくは無作為配列のセグメントから成る核酸の混合体から出発して、SELEX とここで呼ばれる方法には以下のステップが含まれる：結合に有利な条件下で混合物を標的と接触させる；標的分子に結合した核酸と結合した核酸から非結合核酸を分離する；核酸−標的対を解離する；核酸−標的対から解離した核酸を増幅してリガンドが濃度化した核酸の混合物を作り、ついで結合、分離、解離および増幅の段階を望みの回数だけ繰り返す。
【００１７】
調製の理論にしばられることなく、SELEX の根拠とするところは、多数の可能な配列と構造を含む核酸混合物中には与えられた標的に対する広範囲の結合親和性があるという発明者の洞察である。たとえば、無作為に選んだ２０個のヌクレオチドから成るセグメントは４20個の可能な候補を持ち得る。標的に対するより高い親和性定数を有するものが最も結合し易い。分離、解離および増幅の後、２番目の核酸混合物が作られ、より結合親和性の高い候補へと濃度が高められる。選択のラウンドを加える毎に最良のリガンドへと向い、ついには核酸混合物は大部分が１つまたはごく少数の配列だけを含むようになる。そうなるとこれらはクローン化と配列決定が可能となり、純粋なリガンドとして結合親和性についてそれぞれテストすることができる。
【００１８】
選択と増幅のサイクルを望みのゴールに達するまで繰り返す。最も一般的な場合、選択／増幅は、サイクルを繰り返しても顕著な改善がもはや得られなくなるときまで続けられる。繰返し選択／増幅法は、少なくとも６5,０００個の配列バリアントを含む混合物中の１個の配列バリアントの分離を可能とするのに十分なほど鋭敏である。この方法は１０14の配列を含む混合物中の少数の高親和性配列を分別できるほど鋭敏である。原理的にはこの方法は約１０18個にも及ぶ多くの異なる核酸種を試料として扱うことができる。テストする混合物の核酸は、効率的な増幅にとって必要な保存配列とともに無作為部分を含むことが好ましい。核酸配列の異なるバリアントは、無作為化核酸配列の合成および無作為に切断した細胞の核酸から大きさで選択するなどを含めたいくつかの方法で産生することができる。変化した配列部分は全体的または部分的に無作為化された配列になっている；それはまた無作為化配列が組み込まれた保存配列のサブポーションも含むことがある。テストする核酸中の配列の変化は選択／増幅の繰り返しの前またはその間に導入または増大させることができる。
【００１９】
本発明の一つの態様において、選択過程は選択された標的に最も強力に結合するような核酸リガンドの分離が非常に効率がよいため、たった１回の選択、増幅のサイクルが必要なだけである。このような効率的な選択は、たとえばクロマトグラフ型過程で起こることがある：そこではカラムに結合した標的と会合する核酸の能力が、カラムが最高親和性核酸リガンドの分離と分別を十分可能にするのと同じようなやり方で発揮される。多くの場合、単一の核酸リガンドが同定されるまで SELEX の繰り返しを実施することは必ずしも望ましくない。標的−特異的核酸リガンド溶液は、いくつかの保存配列および標的への核酸リガンドの親和性に顕著な影響を与えることなしに置換または付加ができるいくつかの配列を有する一群の核酸構造またはモチーフを含むであろう。完結に先立ってSELEX 過程を終了することによって、いくつかの核酸リガンド溶液ファミリーの配列を決定することかが可能になり、これによって核酸リガンド溶液の広汎な記述が可能になる。
【００２０】
核酸リガンドファミリーの記述のあと、ある場合には、SELEX 実験の間に受け入れた情報によって調製したSELEX をさらに実施することが望ましいこともある。一つの態様においては、SELEX の２番目のシリースを行うことによって、核酸リガンドファミリーの保存領域を固定させ、その間にリガンド構造中のすべての他の位置は無作為化される。他の態様では、SELEX 過程の基礎として最も代表的な核酸リガンドファミリーが用いられることがあり、そこでは核酸配列のもとのプールは完全には無作為化されていないで、最良の既知リガンドに向けてのバイアス（偏向）を含んでいる。これらの方法によって、最も好ましい核酸リガンドに到達するSELEX 過程を最適化することができる。
【００２１】
核酸の一次、二次および三次構造のいろいろのものが存在することが知られている。非ワトソン−クリック型相互作用に最も一般にみられる構造またはモチーフはヘアピンループ、対称および非対称バルジ、シュードノットおよびこれの無数の組み合わせである。このようなモチーフのほとんどすべての知られたケースから示唆されるのは、これらは３０個のヌクレオチド程度の核酸配列中に生成しうるということである。この故に、隣接する無作為化セグメントを用いたSELEX法は約２０−５０ヌクレオチドの無作為化セグメントを含む核酸配列で始めるのが好ましく、そして大部分の態様においてはヌクレオチドが２５と４０の間が好ましい。本発明は長さが少なくとも約１５ヌクレオチドの隣接する無作為配列を有する、約１０9から１０18の核酸配列の混合物を含有する溶液を含む。好ましい態様では、配列の無作為部分はリガンドの増幅を容易にする固定配列が一緒に横に並んでいる。
【００２２】
蛋白質のようなポリマー標的の場合、リガンド親和性は１番目の選択配列と２番目の無作為配列を含む候補の混合物にSELEX を適用することによって増大させることができる。結合と関連した１番目の選択リガンドの配列またはそれのサブポーションは、２番目のテスト混合物の核酸の無作為化部分中に導入することができる。SELEX の手続きを、標的への結合に関して選択された２つの配列を有する２番目の核酸リガンドを分離するために、２番目のテスト混合物について繰り返す。これによって分離した１番目の核酸リガンドに比べて２番目のものは結合力が増大しまたは結合の特異性が増える。標的への結合に関連する２番目の核酸リガンドの配列は、ついで３番目のテスト混合物の核酸の可変部分中に導入することができ、SELEX サイクルののち３番目の核酸リガンドが得られる。これらの手続きを、標的分子に対する望みの結合力または結合特異性を核酸リガンドがかち得るまで繰り返すことができる。選択された標的分子に結合する核酸配列要素の繰り返し選択と組み合わせの過程をここでは“ウォーキング（Walking)”と呼ぶ。この言葉は、最初の結合ドメインから出発して、高分子標的表面または割け目の受容可能な他の領域への最適の結合を意味する。リガンドと標的間の結合接触領域を増やすことによって結合反応の親和性定数を大きくすることができる。これらのウォーキング手法は、特定の標的分子への結合に関して高い特異性を有する核酸抗体を分離するのにとくに有用である。
【００２３】
ウォーキング手法のバリアントは、最初の結合ドメインとして標的分子に結合する“アンカー(anchor)”と呼ばれる非核酸リガンドを用いる（図９参照）。このアンカー分子は、原理的には標的分子に結合し、核酸に直接または間接に共有的に結合する非核酸分子ならどんなものでもよい。たとえば、標的分子が酵素のときは、アンカー分子はその酵素の阻害剤または基質でもよい。アンカーはまた、標的に対する抗体または抗体フラグメントであってもよい。アンカー分子は既知配列の核酸オリゴマーに共有的に結合して架橋分子を生成する。そのオリゴマーは最低約３−１０塩基から成ることが好ましい。ついで、候補核酸のテスト混合物を調製し、それは無作為部分と架橋分子の既知配列に相補的な配列を含むようにする。架橋分子は標的分子と複合体を作る。ついで SELEX を架橋分子と標的分子の複合体に結合する選択核酸に適用する。
【００２４】
複合体に結合する核酸リガンドを分離する。そのあと上述のウォーキング手法を、複合体に対する結合力の増加または結合特異性の増加した核酸リガンドを得るために適用する。ウォーキング手法は複合体または標的それ自身への結合に対する選択を用いることもできる。この方法は標的分子内の特定の位置に結合する核酸リガンドを分離するのにとくに有用である。テスト混合物中の相補配列は、標的分子に対して架橋分子の結合位置またはその付近で結合する核酸配列の分離を確かにするために働らく。もし架橋分子が標的分子の阻害剤から得られたならば、この方法は標的分子の機能を阻害する核酸リガンドを生ずることになる。この方法は、たとえば蛋白質機能を活性化または阻害する核酸を分離するのにとくに有用である。リガンドと標的の組み合わせは新しい、または強化された機能を持つことができる。
【００２５】
本発明の核酸リガンドは複数のリガンド成分を有することもある。上に述べたように、ウォーキング手法で得られた核酸リガンドは１個以上の核酸リガンド成分を持っていると考えてよい。本発明はまた、SELEX で同定された核酸リガンドと同じではないけれども、SELEX で得られた結果を基礎に構成された核酸抗体を含む。たとえば、核酸抗体が構成され、そこでは複数の同一リガンド構造が単一核酸の部分として作られる。他の態様では、SELEX は与えられた標的に対する核酸リガンドの１つのファミリー以上のものを同定するかもしれない。この場合、異なるリガンド構造を複数個含む単一核酸抗体が構成されるかもしれない。SELEX 実験はまた、最良の核酸抗体を同定するために、固定された同じまたは異なるリガンド構造が、無作為ヌクレオチド領域および／または固定リガンド構造間のいろいろの距離の領域で接合された形で実施されるだろう。
【００２６】
標的分子の機能に対する核酸リガンドの結合の影響を評価するため、スクリーン、選択またはアッセイをSELEX 法と容易に組み合わせることができる。とくに、酵素活性に対する阻害または活性化についてのスクリーンはSELEX 法と組合わせることができる。
【００２７】
より特異的な態様では、SELEX 法は核酸結合蛋白質と生物学的機能の一部として核酸に結合することは知られていない蛋白質のいずれをも含めた蛋白質に結合する核酸リガンドを分離し同定するための迅速な手段を提供する。核酸結合蛋白質は多くの他のポリメラーゼや逆転写酵素の中のものを含む。この方法はまたヌクレオチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド補助因子およびこれらと構造的に関連した分子に結合する蛋白質にも容易に適用できる。
【００２８】
いま一つの視点では、本発明は試料中の標的分子の存否を検出、および／またはその量を測定する方法を提供する。そしてこの方法ではここで述べた方法によって分離し得る核酸リガンドを用いる。標的分子の検出はその標的分子に特異的な核酸リガンドへのそのものの結合によって仲介される。核酸リガンドは標識することができ、たとえば放射標識できて定性的または定量的検出を可能にする。この検出法は標的分子が蛋白質であるときにとくに有用である。この方法は生物学的機能の一部として核酸に結合することが知られていない蛋白質の検出にとってより特別に有用である。したがって、本発明の核酸リガンドは従来の抗体を基にした診断法に似た診断法に用いられる。このような検出法および診断法における核酸リガンドの従来抗体に対する一つの有利さは、核酸はin vitro でたとえばＰＣＲ増幅または関連する方法によって増幅が可能であるということである。さらに、核酸リガンドの結合親和性は使用者の必要に応じて定めることができる。
【００２９】
小分子標的の核酸リガンドは診断アッセイ物質として有用であり、また隔絶物質、薬剤供給賦形剤およびホルモン作用の修飾剤として治療的用途をもっている。触媒活性核酸は本発明により選択し得る産物である。たとえば、酵素触媒反応の遷移状態同族体への結合に関する選択によって触媒活性核酸が選択できる。
【００３０】
また他の観点では、本発明はSELEX により分離し得る核酸リガンドを用いて標的分子の機能を修飾するための方法を提供する。標的分子に結合する核酸リガンドは、標的分子の機能を特異的に修飾するものを選択する、たとえば標的分子の機能の阻害剤または活性化物質などである。標的の機能を修飾するのに効果的な核酸リガンドの選択されたある量を標的分子と結合させて望みの機能的修飾を実現する。この方法はとくに標的が蛋白質であるときに適用可能である。この方法のとくに有用な適用は蛋白機能を阻害することであり、たとえばエフェクターへのレセプターの結合を阻害または酵素触媒作用を阻害する。この場合、標的蛋白質阻害に効果的な選択核酸分子を標的蛋白質と結合させて望みの阻害目的を達成する。
【発明の実施の形態】
【００３１】
定義に従ってここではつぎの言葉が用いられる。核酸はＤＮＡ，ＲＮＡ，一重鎖または二重鎖のいずれかを意味し、また選択核酸の増幅に干渉しない修飾に限り、核酸のどんな修飾も含まれる。このような修飾には以下のようなものが含まれるが、それらに限るわけではない：サイトシンエクソサイクリックアミン位置での修飾、５−ブロモウラシルの置換、バックボーン修飾、メチル化、正常でない塩基対組み合わせなどなど。リガンドは他の分子（標的）を結合した核酸を意味する。候補核酸の集団中で、リガンドは集団全体の中のどれよりも大きな親和性をもって結合するものである。候補混合物中に与えられた標的に対して１個以上のリガンドが存在し得る。リガンドは互いに標的分子に対する結合親和性が違いうる。
【００３２】
候補混合物は異なる配列の核酸の混合物であり、これから望みのリガンドを選択する。候補混合物のもとは天然に存在する核酸またはそれらのフラグメント、化学的に合成した核酸、酵素的に合成した核酸またはこれらの合成法の組み合わせで作られた核酸などである。
【００３３】
標的分子はそれに対してリガンドが求めるようなどんな化合物をも意味する。標的分子になり得るものには蛋白質、ぺプチド、炭水化物、多糖、糖蛋白質、ホルモン、レセプター、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝体、遷移状態同族体、補助因子、阻害剤、薬剤、色素、栄養物、成長因子などなど制限はない。
【００３４】
分離する（partitioning) とは、リガンド−標的対とここで呼んでいる、標的分子に結合したリガンドを標的分子に結合していない核酸から分別することを意味する。分離は技術的に知られているいろいろの方法により行うことができる。核酸−蛋白質対はニトロセルロースフィルターに結合するが蛋白質と結合していない核酸はそうではない。リガンド−標的対を特異的に保持するカラム（または結合した標的と複合体を作った結合リガンドを特異的に保持する）が分離に用いられる。滲透ゲル遅延や密度勾配遠心と同様、液体−液体分配も用いることができる。どんな分離法を選ぶかは標的およびリガンド−標的対の性質に依存し、通常の技術、熟練の中で知られている原理と性質に従って行うことができる。
【００３５】
増幅とは、分子または分子種のコピーの量または数を増やすなんらかのプロセスまたはプロセス段階の組み合わせを意味する。開示例中のＲＮＡ分子の増幅は一連の３つの反応で実施した：選択ＲＮＡｓのｃＤＮＡコピーを作り、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて各ｃＤＮＡのコピー数を増やし、そしてｃＤＮＡコピーを転写して選択ＲＮＡｓと同じ配列を有するＲＮＡ分子を得る。技術的に知られているどんな反応またはそれら反応の組み合わせでも適当なものとして使用することができる。そのようなものとしてこの技術に熟練した人達が認めるような、直接的ＤＮＡ複製、直接的ＲＮＡ増幅その他類似のものがある。増幅法は最初の混合物中の異なる配列の本質的な代表である増幅混合物の割合を結果とし得る。
【００３６】
特異的結合はそれぞれの場合に定義される言葉である。与えられたリガンドと与えられた標的の間の与えられた相互作用において、標的と候補リガンド混合物間で測定されたよりも高い親和性をもったリガンドと標的の結合相互作用が観察される。結合親和性を比較するためには、両結合反応の条件は同じでなければならず、意図する使用条件と同様のものであるべきである。最も精密な比較のためには、全体としてのリガンドと全体としての標的間の相互作用を反映するように測定が行われる。本発明の核酸リガンドは、以下のようにすることによって要求に対してできる限り特異的なものを選択できる。すなわちSELEX の間に必要な特異性を要求する選択条件を確立するか、またはSELEX の相互作用を用いて“ウォーキング”および他の修飾を通じてリガンドを作ったり修飾することである。
【００３７】
無作為化は、与えられた長さについて基本的にいかなる可能な配列を有する核酸のセグメントを記述するのに用いる言葉である。無作為配列は望みに従って、約８個から１００個以上のヌクレオチドにわたるいろいろの長さがある。無作為配列セグメントを作る化学反応あるいは酵素反応は、まだ知られていないバイアスまたはヌクレオチドの間に存在すると思われる優先権の差によって数学的な無作為配列は生じない。このような非理想的なことから導かれる可能性を反映させるために“手当りしだい（random) ”の代りに“無作為化（randomized）”という言葉を用いる。現在知られている技術、たとえば連続化学合成においては大きな偏りが起こることは知られていない。２０ヌクレオチドまたはそれ以下の短いセグメントに関しては、何らかの小さなバイアスが存在するとしても結果は無視できるであろう。１つの合成で配列が長ければ長いほど、どんなバイアスでもその影響はより大きくなる。 バイアスは、たとえば合成反応の前駆体ヌクレオシド（またはデオキシリボヌクレオシド）のモル比を変えることによって意識的に無作為配列中に導入できる。計画されたバイアスは、たとえば与えられた生物体中のそれぞれの塩基の割合に近づけるか、または二次構造に影響するようなものが望ましいであろう。
【００３８】
SELEX １０Ｎは、核酸リガンドを同定するSELEX の強力な能力を証明し、SELEX プロセス中のどの変異がプロセスの最適化に最大のインパクトをもつかを予測するのに用いる数学的解析とコンピューターシミュレーションのことを指す。SELEX １０Ｎは非線形解析による統合最適化を用いた指数濃度化によるリガンドの計画的進化の頭字語である。
【００３９】
核酸抗体は不連続な核酸構造から成る核酸リガンドの組、または標的分子に選択的に結合するモチーフを指すのに用いる言葉である。核酸抗体は二重鎖または一重鎖ＲＮＡまたはＤＮＡから作ることができるだろう。核酸抗体は合成され、好ましい態様ではリガンド溶液またはSELEX プロセスによって与えられた標的のための溶液を基礎に構成される。多くの場合、本発明の核酸抗体は天然にはそのままでは生じないが、他の状況においては天然に存在する核酸配列に非常によく類似することがある。
【００４０】
本発明の核酸抗体は１つの標的に対する特異的な結合親和性を有するすべての核酸を含むが、それに対して圧倒的にワトソン／クリック塩基対または三重らせん物質に依存するメカニズムを通じて核酸に結合するポリヌクレオチドが標的である場合は含まない（Riordan, M. et al.（１９９１）Nature３５０：４４２−４４３参照）；しかしながら、核酸抗体が二重鎖ＤＮＡであるときには標的は、生理的機能が二重鎖ＤＮＡへの特異的結合に依存するような天然の蛋白質ではない。
【００４１】
ＲＮＡモチーフはＲＮＡ分子の二次または三次構造を記述するのに一般に使われる言葉である。ＲＮＡの一次配列は一次元のヌクレオチド（Ａ，Ｃ，ＧおよびＵ）の特異的な糸である。第１印象では一次配列がＲＮＡの三次元立体配座に情報を与えるようにはみえないが、実際には三次元立体配座を指定するのは一次配列である。ある場合には、与えられた標的に対してSELEX を実施したあと得られたリガンド溶液は一次配列として最もよく表示されるであろう。このようなリガンド溶液に関する立体配座の情報はSELEX で得られた結果をもとにいつでも確かめ得るわけではないが、一次配列としてのリガンド溶液の表示は完全な三次構造の存在を否認するものと解釈さるべきではない。
【００４２】
ＲＮＡモチーフの二次構造は特異的ヌクレオチド間の二次元での接触で表示される。最も容易に認められる二次構造モチーフはワトソン／クリック塩基対Ａ：ＵとＣ：Ｇを含んでいる。しばしば安定性の低い非ワトソン／クリック塩基対が認められ、塩基対Ｇ：Ｕ，Ａ：Ｃ，Ｇ：ＡおよびＵ：Ｕを含む（塩基対は１回示す；ＲＮＡ分子では通常の塩基対表示Ｘ：ＹはＹに対してＸが５′であることを示し、それに対してＹ：Ｘも存在し得る）。図１３に一重鎖領域で結合した１組の二次構造を示す；二次構造に関する従来の命名にはヘアピンループ、非対称バルジヘアピンループ、対称ヘアピンループおよびシュードノットが含まれている。
【００４３】
一次配列の中でヌクレオチドが離れていてワトソン／クリックおよび非ワトソン／クリック塩基対を通して相互作用するとは思われないときも、これらの相互作用（しばしば二次元で描かれるが）もまた二次構造の部分である。
【００４４】
ＲＮＡモチーフの三次元構造はＲＮＡモチーフの空間の原子の単なる記述に過ぎない。ワトソン／クリック対を通じて十分に塩基対を作った二重鎖ＲＮＡは三次元で規則正しい構造をとるが、らせんバックボーンのすべての原子の正確な位置はＲＮＡ中の塩基の正確な配列に依存する。非常に多くの文献がＲＮＡモチーフの二次構造に関連し、ワトソン／クリック塩基対を含むこれらの二次構造はしばしばＡ型二重鎖ヘリックスを作ると考えられている。
【００４５】
Ａ型らせんから三次元での他のモチーフに向かって伸ばすことができる。非ワトソン／クリック塩基対であるヘアピンループ、バルジおよびシュードノットはらせん内およびらせん上で築かれる構造である。これらの付加したモチーフの構成は本文中でより詳細に述べる。
【００４６】
ＲＮＡの実際の構造は三次元中の分子のヌクレオチドのすべての原子を含む。完全に解決された構造は結合水と無機原子も含むが、このような解析が研究者によってなされるのは稀である。三次元でわかったＲＮＡ構造はすべての二次構造エレメントを含み（三次元構造として表示される）、また二次構造エレメントで抑制されないヌクレオチドの原子に対する固定位置も含む；塩基スタッキングその他の力によって広汎な一重鎖ドメインが固定構造をもつと思われる。
【００４７】
ＲＮＡの一次配列は固定二次構造がそうであるように、可能な三次元構造を制限する。ＲＮＡの三次元構造は二次元中の原子間の特異な接触によって制限され、ついでさらにエネルギー最小化で制限される。ここでいうエネルギー最小化とは１つの分子が自由回転可能なすべての結合を、結果として生ずる分子が同じ一次および二次配列と構造を有する他の立体配座体よりも安定であるように回転させる能力である。
【００４８】
最も重要なことは、ＲＮＡ分子は三次元での構造をもち、この構造は図１３に示したモチーフのどの数も含めたＲＮＡモチーフの集積を含むということである。
したがってＲＮＡモチーフは、核酸化合物が形成しうる最も安定な立体配座の群を一般的な言葉で記述することを可能にするすべての方法を含む。与えられた標的については、リガンド溶液および核酸抗体はここで記述したＲＮＡモチーフの１つまたはいくつかのＲＮＡモチーフのある組合せになるだろう。
【００４９】
リガンド溶液は共通に保持される三次元構造または SELEX を通じて同定された保存成分を定めるファミリーとして定義される。たとえば、特定の標的に対して同定されたリガンドは、二次元において以下のヘアピンによって表わすことのできる共通の一次配列(NNNCGNAANUCGN'N'N) を含むであろう：
【００５０】
【化１】
2007195559.tif 000002
【００５１】
このため三次元構造は５塩基対のうちの３つと５ループヌクレオチドのうちの２つの正確な配列に敏感ではないであろうし、また配列／構造のすべてまたは大部分の変化に関して、さらに使用する上での適切なリガンドになりうるであろう。こうしてリガンド溶液は、すべての正確な配列／構造溶液を含むファミリー記述によってそれぞれ確認された、適切な配列／構造の可能な大コレクションを表わすことを意味している。この定義を通じて、ＲＮＡモチーフ間の種々の成分間の数的に正確な等価性をもったメンバーだけをリガンド溶液が含む必要はないということが一層よくわかった。たとえば、あるリガンドは５ヌクレオチドのループをもつだろうが、同じ標的に対する他のリガンドが等価なループ中でより少いかあるいはより多いヌクレオチドを含むかもしれないが、それでもリガンド溶液の記述に含まれる。
【００５２】
SELEX により導出されたリガンド溶液は比較的大多数の可能なメンバーを含むだろうが、しかしリガンド溶液は標的特異性であり、大部分の場合リガンド溶液ファミリーの各メンバーは標的に対する核酸抗体として使用可能である。核酸抗体として使用されるべきリガンド溶液のファミリーからの特異的メンバーの選択は本文中に述べたようにして行うことができ、それは技術上の通常の熟練の１つに対して明らかであろうところのいくつかの実際的考案によって影響をうける。
【００５３】
本発明の方法はバクテリオファージ感染における翻訳調節の研究との関連で開発された。バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（gp４３）のようなある種のウイルス蛋白質合成の自動制御は、蛋白質のそれ自身のメッセージへ結合してその翻訳をブロックすることを含む。SELEX 法はgp４３ＲＮＡ結合部位の配列および構造上の必要条件を明らかにするのに用いられる。SELEX は無作為核酸配列の集団から好ましい結合配列を迅速に選択することを可能にする。ＲＮＡに結合することが知られている蛋白質に結合する核酸配列の分離と同定によって例証された一方で、本発明の方法は与えられたいかなる蛋白質にも結合できる核酸の選択にも一般的に適用される。本方法は、天然の活性または生物学的機能の一部として核酸に結合しない（または結合が知られていない）蛋白質に結合する核酸の選択に適用できる。SELEX 法は結合部位の構造または配列に関する知識を必要としないし、また標的蛋白質の構造または配列の知識も必要でない。
【００５４】
この方法は選択に関して精製標的蛋白質に依存しない。一般に、SELEX の適用によって最も豊富な標的のリガンドに関して濃縮化される。リガンドの混合物中で、与えられた標的のリガンドを分離する技法が利用できる。たとえば、望みの標的のもう１つのリガンド（たとえば基質、阻害剤、抗体）が、標的への結合に関する完全に特異的なものとして使用でき、そのことによって望みの核酸リガンドが他の諸標的のリガンドから分離できる。
【００５５】
より好ましい態様においては、SELEX から導出されたリガンドは一重鎖ＲＮＡ配列を含んでいる。本発明の極めて重要な要素は、本発明者がＲＮＡについて当該分野で一般に考えられているものとは反対の結論を得ることができ、そしてこれらの結論を用いてSELEX プロセスを作り上げてリガンド溶液から導出される核酸抗体を得るということである。
【００５６】
ＲＮＡは最初は遺伝子であるＤＮＡ配列と酵素とその他の蛋白質内に見出される蛋白質配列との間の情報メッセンジャーとして評価された。ワトソンとクリックがＤＮＡの構造およびＤＮＡ配列と蛋白質配列との間の相関関係を記載した後の最初の時点から、蛋白質が合成されるその方法は多くの実験生化学の中心になった。結局メッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は遺伝子と蛋白質の間の化学的中間物ということが確認された。有機体中に存在する大半のＲＮＡ種はｍＲＮＡであり、したがってＲＮＡは主として情報分子としてずっと見られてきた。ＤＮＡがヌクレオチドの一次配列を通じて遺伝子物質としてその機能を果たすのと同じように、ＲＮＡは主としてヌクレオチドの一次配列を通じて情報分子としての役割を果たす；すなわち、核酸中の情報は一次元で表示することができる。
【００５７】
遺伝子発現の生化学の研究によって、その役割が情報的でないいくつかのＲＮＡ分子が細胞内に発見された。リボソームは、その上でｍＲＮＡが蛋白質に翻訳される実体として発見され、その中に非常に重要なＲＮＡ（リボソーマルＲＮＡｓ、すなわちｒＲＮＡ）を含むことが見出された。ｒＲＮＡは長い間構造的なものと考えられていた。すなわち、リボソームの蛋白質成分がその上に“つり下げられる”足場のようなもので、それによってリボソームの蛋白合成作用を行わせるものと考えられていた。さらにＲＮＡの大きな組として転移ＲＮＡｓ（ｔＲＮＡ）が予測され、そして発見された。ｔＲＮＡは化学的に２つの作用をもつアダプターであり、それらはｍＲＮＡ内のコドンを認識することと蛋白質中に組み込まれるアミノ酸を運ぶことである。ｔＲＮＡの構造は１９７４年にＸ線解析により決定されたけれども、最も重要なこととして、ＲＮＡはつぎの１０年間は主として一次元の“ストリング（糸）”として考えられた。ｒＲＮＡは研究の世界では奇妙な位置を占めた。長い期間にわたりいろいろの種からのｒＲＮＡ中の深い類似性の背後にある理由やＲＮＡ分子の本当の化学的能力に思い至らなかった。幾人かの研究者はＲＮＡはかつては情報的役割よりもむしろ酵素的役割を果たしたと仮定したが、これらの仮説はＲＮＡの現在の機能について予測させるようなものではなかった。
【００５８】
ＲＮＡ分子の新しい一組であるリボソームについてのTom Cechの研究はＲＮＡの機能的能力についての見方を拡げた。グループＩイントロンは自触媒的にスプライスすることができ、したがって少なくともいくらかの限られた触媒活性がＲＮＡの範囲内に存在する。触媒活性のこの範囲内の、AltmanとPaceによって発見された活性、つまりＲＮase ＰのＲＮＡ成分の活性である。Cechと Altmanはかれらのこの研究によってノーベル化学賞を受け、この研究によってＲＮＡ分子の役割は情報的なものに限られるという従来の考えが根本から変えられた。CechとAltmanの研究によって、いまではｒＲＮＡはリボソームの活性中心と考える人達もおり、もはや単なる構造的なものとは考えられないようになった。
【００５９】
ＲＮＡ分子は結合その他の能力に関して、それが研究者の世界で低く評価されたままになっているというのが本研究の前提である。リボザイムはＲＮＡ機能を目指した研究を著るしく増大させたが、本申請から考えられることは、ＲＮＡ分子（おそらくＤＮＡも）に関する形状の可能性が、事実上なんらかの結合機能をもったＲＮＡｓを見出すためのSELEX を使用する機会を与えるということである。ＲＮＡに関して可能な触媒機能の範囲は、蛋白質のそれほど広くは必ずしもなかったが、現在知られている伝統的な知識を越えて広い。
【００６０】
いくつかのＲＮＡｓの三次元的形状はＸ−線解析またはＮＭＲ的方法から直接知られている。存在するデータセットはまばらである。４つのｔＲＮＡの構造は、より小さい３つのＲＮＡ分子すなわち２つの小さなヘアピンと１つの小さなシュードノットと同様に解像されている。関連する種々のｔＲＮＡはユニークな構造の要素を有する；たとえば、エロンゲーターｔＲＮＡのアンチコドン塩基は溶媒に向けて表示されるのに対して、イニシエーターｔＲＮＡのアンチコドン塩基は溶媒からより離れて位置する。これらの差のいくらかは結晶の重なりの力から生ずるが、いくらかは疑いもなく同族二次および三次元構造内の異なる一重鎖配列による特有のエネルギー最小化の結果である。
【００６１】
配列の変化はもちろん極めて大きい。もし１個のＲＮＡヘアピンの一重鎖が８個のヌクレオチドを含むと、その“スペース”を埋める配列として６５，５３６個の異なる配列がありうる。この主張のような説には縛られないが、本発明者はそのセットの各メンバーはエネル最小化を通じて最も安定な構造をとるだろうことを信ずるし、これらの構造の全体は微妙に異なる化学的表面を溶媒または蛋白質など相互作用の可能性のある標的分子に対して提供するであろう。こうして、特定の構造モチーフ内での６５，５３６個の配列すべてがバクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼに対してテストされた場合、その中の２つの配列が他のすべてのものよりもよく結合した。このことはこれら２つの配列の構造的外観がその標的に対して特異的であること、そしてまた残りの６５，５３４個の配列は標的への結合には適しないことを示唆する。これら６５，５３６個の配列中には他の標的との相互作用に最も適するだろうようなメンバーまたはそれらのセットがあることは十分確かなことである。
【００６２】
ＲＮＡ構造のこの記述における基本的考え方は、たといＲＮＡが構造を作らない要素である無作為のコイルまたはフロッピー（登録商標）を示唆するように画かれているとしても、どの配列もそれ自身の最も安定な構造をもつということである。ワトソン／クリック塩基対を形成できないＲＮＡのホモポリマーはしばしば非無作為構造をとることが見出されているが、これは近接する塩基が互いに位置を固定することによって得られるスタッキングエネルギーによる。明らかに４個すべてのヌクレオチドを含む配列は固定構造の局所領域を含み、たといワトソン／クリック塩基対がなくても一様でない配列は当初予想したよりも多くの構造を持つかもしれない。ＲＮＡループ中の固定構造についての場合はもっと強い。ｔＲＮＡのアンチコドンループは１つの構造を有し、そのためおそらく、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼに最もよく結合する２つのウィンニング（勝利）配列をもっている。
【００６３】
ＲＮＡ中の相補的配列の逆平行鎖は、ループ配列が現れそして戻るＡ型らせんを生ずる。たといループ配列が相互作用する強い能力を持たないとしても、エネルギー最小化はエネルギー的な自由構造最適化である（すなわち、活性化のエネルギーが明らかでないことからループ配列のエネルギー最小化をブロックする）。反応論的に最適化の出発点になりそうなのはＲＮＡステムの塩基対を閉じるループであろうし、これはループヌクレオチドおよび塩基の最適スタッキングがその上で起るような平たい表面を提供する。基本的にＲＮＡのループは逆平行のα−らせんまたはβ−鎖を連結する蛋白質のループと等価である。これらの蛋白質ループはしばしばランダムコイルと呼ばれているが、それらはランダムでもなければコイルでもない。このようなループは“オメガ”構造と呼ばれており、比較的互いに接近してループが現われたり戻ったりすることを反映している(Leszczynski, J.and Rose,G. et al. （１９８６）Science ２３４：８４９−８５５）；蛋白質中のこれらの位置はＲＮＡヘアピンの塩基対を閉じるループに概念的には等価である。
【００６４】
Ｘ線回折によって多くのオメガ構造が解析され、それらの構造は特有であった。明らかに各構造は末端が互いに接近したループに作用するユニークなエネルギー最小化の結果である。蛋白質、ＲＮＡのいずれにおいてもこれらのループは、第一次近似としてアミノ酸の対または塩基対を閉じるループを除いた残りの構造の残りからの情報なしにこれらのループはエネルギーを最小化するであろう。蛋白質オメガループとＲＮＡヘアピンループ両方にとって、自由に回転できるすべての結合は自由エネルギーを最小化する試みに参加するだろう。ＲＮＡは蛋白質よりも静電力により反応し易いであろうが、一方蛋白質はＲＮＡｓよりもずっと多くの自由度を持つだろう。したがって、エネルギー最小化を通じてのＲＮＡ構造の計算は蛋白質に関する同様の計算よりも正確な解像構造が得られそうである。
【００６５】
ＲＮＡｓおよび蛋白質両者の一重鎖領域は可能な構造を展開するように保持されるであろう。すなわち、もし一重鎖ループがα−ヘリックスまたはβ−鎖の平行鎖からなる蛋白構造中に現われ、そして戻るならば、現われ戻るポイントはオメガ構造中におけるよりも互いに離れている。さらに、ぺプチドの一本鎖が伸びた距離は平行なα−ヘリックスまたはβ−鎖の長さによって変えることができる。
【００６６】
固定された蛋白二次構造上に存在する単鎖をもつ蛋白質構造に関して、本質的に、結果として起こるエネルギー最小化は一本鎖ドメインと基本構造との間の相互作用を可能にさせる。二次構造における塩架橋を形成できるアミノ酸側鎖は規則正しい二次構造の頂上に在る伸びた一本鎖中で同じことをするようである。このような蛋白質領域の正確な構造はここでもまた特有のものであり、配列に大きく依存する。この場合、配列依存性は一本鎖と二次構造の基礎配列の両方を含むであろう。
【００６７】
興味のあることに、シュードノットとして知られるＲＮＡ構造はこれら伸びた蛋白質モチーフと類似しており、溶媒／標的または基礎にあるＲＮＡ二次構造のいずれかに向けて特有の形で並んだ塩基をもつＲＮＡの一重鎖を伸ばした標的分子または溶媒に向けて拡がるのを助けるであろう。シュードノットは、平行鎖間のループをもとにした蛋白質モチーフと共通に、一重鎖の長さやヘリックスの配列を変える能力を有する。
【００６８】
こうして、蛋白質モチーフと全く同じように、基礎となる二次構造中の配列との共変によって、一重鎖ヌクレオチドおよび塩基を溶媒または基礎構造に向けて拡げることが可能であり、これによって標的と相互作用する機能的化学グループと静電力を変える。このような構造変化はエネルギー最小化のあとに起こることを記すのは重要であるが、低い解像においてすらたった１つのシュードノット構造しか知られていない。しかしながら、本発明の価値はシュードノットからの可能な形状と機能的表示はユニークな品質中でほとんど無限であるという認識から生ずる。
【００６９】
シュードノットのヘアピンループと一重鎖ドメインは逆平行ＲＮＡらせん上に作られる。ＲＮＡのらせんはバルジと呼ばれる不規則性を含んでいる。バルジはらせんの一方の鎖または両方の鎖中に存在しうるし、標的認識に有用な特有の構造上の特性を提供する。さらに、らせんの不規則が規則正しいらせん間の角度の関連を提供しうる。
【００７０】
ＲＮＡの一重鎖上の大きなバルジ（図１３参照）は、ループを閉じる塩基対がバルジをゆらゆらさせている２つの塩基対で置き換えられていることを除いて、ヘアピンループと同等である。対称的バルジ（図１３参照）は、バルジを横切って接触するヌクレオチドによって安定化されているところの延長した不規則構造を提供するだろう。これらの接触はワトソン／クリック相互作用または他の水素結合や塩基１タッキングを含めた、なんらかの他の安定化配置を含むであろう。
【００７１】
最後に、固定化ＲＮＡ形状またはモチーフをよくよく考えるとき、どのような実質的差がＲＮＡと蛋白質との間に存在するかを考慮するのは有益である。触媒作用および高度の特異的認識を含めて現在蛋白質やペプチドによって完全に成し遂げられている活性に関して進化の間に蛋白質はＲＮＡと置き換わったと考えられるので、蛋白質の化学的性質はいろいろの形状と活性を作り上げる上でＲＮＡよりも有用と思われる。標準的推論は以下のことを含めることになる：２０のアミノ酸に対する僅か４個のヌクレオチド、リジン、アルギニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸が蛋白質側にあるのに対してＲＮＡ塩基中にはこれらに対応するものがないこと、核酸の強い負電荷の糖−燐バックボーンに対して比較的中性のペプチドバックボーン、中性付近のpkをもつヒスチジンの存在、アミノ酸の側鎖α−らせんとβ鎖いずれについても溶媒の方に向いていること、および蛋白質の規則正しい二次構造である。ＲＮＡを含めた二重鎖核酸においては塩基対は塩基が互いに向き合っていて一次元レベルで存在する化学的情報の多くを用いている。こうして、形状の多様性と機能に寄与するために現在理解されているあらゆる角度からみて、蛋白質はＲＮＡを含めた核酸に対して大きく優れていると考えられる。進化の間に蛋白質はＲＮＡを越えて認識と触媒作用に関して選ばれ、このために現在広く行き渡っている見解が支持されている。
【００７２】
反対に、そして本発明の中心として、ＲＮＡについてはぼう大な数の配列と形状がおそらく可能であり、ＲＮＡは僅かに４個のヌクレオチドから成り、またＲＮＡのバックボーンは非常に高度に荷電しているとしてもすべての望みの機能と結合親和性もテストされなかった。すなわち、上述の適切な配列特異性をもつＲＮＡモチーフは、大部分の標的への強固で特異な結合を提供するのに必要な化学的機能を空間に作り出すだろう。ＲＮＡは免疫系と同じように多才であることが示唆されるだろう。すなわち、免疫系はどんな望みの標的に対してもフィットするものを用意するが、ＲＮＡもこれら同じ機会を用意する。ここで述べる可能な方法論は１０18の配列を用いることができ、したがってぼう大な数の構造を試みることによって、ＲＮＡに対して蛋白質が本来優位でありまたは抗体が特異性においてＲＮＡより優れていたとしても、これらはＲＮＡリガンドを選択する可能な "プール" のぼう大さによって打ち勝つことができる。加えて、修飾ヌクレオチドを用いることにより、天然のＲＮＡｓよりも本質的により化学的に変化に富むＲＮＡを用いることができる。
【００７３】
SELEX 法は選択された核酸の増幅によって標的分子、たとえばある蛋白質に結合する核酸リガンドの選択の組み合わせを含む。選択／増幅ステップの繰返しサイクリングによって非常に多数の核酸を含むプールから標的に最も強く結合する１個または少数の核酸の選択が可能になる。
【００７４】
選択／増幅のサイクリングは選択ゴールに達するまで続けられる。たとえば、テスト混合物中の核酸の結合が望みのレベルに達するまでサイクリングを続けることができるし、あるいは混合体の核酸成分の数が最小値に達するまで続けられる（究極のケースとしてはテスト混合物中にただ１個の核酸種が残る）。多くの場合、それ以上結合の改善が得られなくなるまでサイクリングを続けるのが望ましい。それは核酸のあるテスト混合物が、選択／増幅のサイクリングの間にバックグランドレベルよりも結合に関して改善が限界を示した場合である。このような場合、テスト混合物中の配列変化を増やすべきであり、その中にはより多くの可能な配列バリアントを含めるべきであり、あるいは配列無作為化領域の長さを結合の改善が達成されるまで増やすべきである。同じようにアンカリングプロトコールおよび／またはウォーキング技法も用いることができる。
【００７５】
特に、この方法はまずはじめに候補核酸のテスト混合物を調製することを必要とする。それぞれのテスト核酸は混合物中のすべての核酸中に保存されている配列を近くにもつ無作為領域を含むことができる。保存領域は増幅を容易にし核酸を選択するために用意される。技術的にこのような配列は沢山知られているので、配列の選択は増幅についての望みの方法を心に抱きつつ、技術的に通常の熟練したやり方のいずれかの方法によって行う。無作為領域は全体または部分的な無作為配列をもつことができる。さもなければ、核酸のこの部分は混合物中のすべての核酸種中で一定に保たれているサブポーションに沿って無作為化されたサブポーションを含むことができる。たとえば、結合するとわかっているかまたは標的蛋白質への結合に関して選択された配列領域は、結合または結合の特異性の改善を達成するために無作為領域と一体にすることができる。テスト混合物中の配列の可変性も、選択／増幅プロセスの間にテスト混合物中の核酸中に突然変異を作り出すことによって導入または増強することができる。基本的には、テスト混合物に用いた核酸はそれらが増幅可能な長さであればどんな長さでもよい。本発明の方法は大多数の配列バリアントからの選択について最も実際的に使用できる。こうして、本方法は約４個の塩基から得られるどんな大きさまでの長さにわたる核酸配列の結合を評価するのに使用することが好ましいであろうと考えられる。
【００７６】
テスト混合物中の核酸の無作為部分はいろいろの方法で得ることができる。たとえば、完全な、または部分的配列無作為化は核酸（またはそれに対応する蛋白質）の直接の化学合成または標的の合成によって容易に達成できる：そして適切な酵素を用いることによってこの標的から核酸（またはそれに対応する蛋白質）が調製できる。４つすべてのヌクレオチド三燐酸の無制限の濃度の存在下におけるターミナルトランスフェラーゼの触媒作用で最終の付加としてセグメントに対し無作為配列を加えることができる。テスト核酸中の配列可変性も、ゲノムＤＮＡ調製物または細胞性ＲＮＡ調製物のような、大きな天然核酸の部分的消化（または切断）調製物の大きさを選択したフラグメントを用いることによって達成できる。無作為配列を用いるこのような場合には、テスト混合物がすべての可能なバリアント配列を含む必要はない（または長い無作為セグメントから可能な）。一般には、結合可能な配列の最大数が同定されることを保証するために、テスト混合物は選択に関して実際的である限りできるだけ多数の配列バリアントを含むことが望ましい。３０ヌクレオチドの無作為配列は計算上１０18個の異なる候補配列を含むであろう。実際問題として、１回の選択で約１０18個の候補をサンプルするのが便利である。実際的問題として合成カラム上の標的の数、さらに溶液中の標的やＲＮＡの溶解性も考慮する（もちろん、候補混合物中の配列数に理論的限界はない）。したがって、３０ヌクレオチドより長い無作為セグメントを有する候補混合物は、１回の選択で都合よくサンプルするには多過ぎる可能な配列をもつことになる。本発明の核酸リガンドを選択する候補核酸のすべての可能な配列をサンプルする必要はない。テスト混合物の核酸が増幅できるということがこの方法にとって基本的なことである。したがって、テスト核酸中で用いるいかなる保存領域も増幅を邪魔する配列を含んでいないことが好ましい。
【００７７】
上に述べた種々のＲＮＡモチーフは約３０ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドによってほとんどいつでも定義できる。SELEX プロセスの物理的束縛の故に、約３０ヌクレオチドを含む無作為混合物は、使用しうる無作為セグメントとしてはおそらく最長のものであり、実質的に可能なバリアントのすべてをテストすることができる。したがって、本発明の好ましい態様は、隣接する無作為領域を用いるときは、少なくとも１５ヌクレオチドの無作為配列を用いて少なくとも約１０9 個の核酸を含むことであり、最も好ましい態様は少なくとも２５個のヌクレオチドを含むことである。
【００７８】
本発明は少なくとも１５ヌクレオチドからなる隣接無作為セグメントのすべての可能なバリアントを含む候補混合物を含む。候補混合物中のそれぞれのメンバーは、選択核酸配列の増幅において手助けとなる固定配列が無作為セグメントの隣りに位置するようになっている。
【００７９】
候補混合物は無作為配列と固定配列両方を含むように調製することもできるだろうし、そこで固定配列は増幅プロセスに加えて１つの機能を行う。本発明の１つの態様において、候補混合物中の固定配列は、与えられた核酸モチーフを有する候補混合物中の核酸の百分率を大きくするために選択されるであろう。たとえば、適切な固定ヌクレオチドの取り込みは候補混合物中のシュードノットまたはヘアピンループの百分率を増大することを可能にするであろう。したがって、与えられた核酸構造上のモチーフの百分率を強める固定配列を含むように調製された候補混合物は、本発明の１部をなす。ここで述べたような種々の核酸抗体を日常業務的に検分する上での技術上の１つの熟練によって、不適当な実験を行うことなくこのような候補混合物を構成混合物を構成することができるてあろう。以下の例２と８では好ましいＲＮＡモチーフを最大限に作る候補混合物の特異性な例を述べる。
【００８０】
種々の固定配列を含む候補混合物または目的に応じて部分的無作為配列を用いた候補混合物は、リガンド溶液または部分的リガンド溶液をSELEX によって得た後に用いることもできる。するとリガンド溶液によってインフォームされた候補混合物によって新しいSELEX プロセスが開始されるであろう。
【００８１】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は核酸増幅のための典型的方法である。ＰＣＲ法の記載はたとえば以下の文献にみられる：Saiki et al.（１９８５）Science ２３０：１３５０−１３５４；Saiki et al.（１９８６）Nature３２４：１６３−１６６；Scharf et al.(１９８６) Science ２３３：１０７６−１０７８；Innis et al.（１９８８) Proc. Natl. Acad. Sci.８５：９４３６−９４４０；and in U.S. Patent 4,6８３,1９５(Mullis et al.) and U.S. Patent 4,６８3,２０２(Mullis et al.) 基本的な形では、ＰＣＲ増幅はssＤＮＡの３′と５′末端に相補的な特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて望みの一重鎖ＤＮＡ（またはＲＮＡのｃＤＮＡコピー）の複製サイクルを繰返すこと、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーのエクステンションおよびＤＮＡ変性を含む。１つのプライマーからエクステンションで生じた生成物は他のプライマーからのエクステンションのための鋳型として働らく。ＰＣＴ公刊申請ＷＯ８９／０１０５０（Burg et al.)に記載された関連増幅法は、二重鎖中間体を与えるために、増幅すべき配列の上流のプロモーター配列の存在または導入を必要とする。中間体を含む二重鎖プロモーターの多重ＲＮＡコピーはそのあとＲＮＡポリメラーゼを用いて産生される。その結果生じたＲＮＡコピーを逆転写酵素で処理して中間体を含む二重鎖プロモーターをさらに産生し、これをＲＮＡポリメラーゼによる増幅のもう１つのラウンドに用いることができる。これに代わる増幅法は選択ＲＮＡｓの選択ＤＮＡｓまたはｃＤＮＡコピーを適当なベクター中へクローニングしてそのベクターを宿主有機体中へ導入、そこでベクターとクローン化ＤＮＡｓを複製させて増幅する(Guatelli, J. C. et al.(１９９０） Proc. Natl. Acad. Sci. ８７：１８７４）．一般に、本発明の方法では選択核酸配列の正確で効率的増幅を行わせるどんな手段でも用いることができる。増幅後の配列に比例した表示は最低増幅前の混合物中の配列の相対的割合を大まかに反映するだけでよい。
【００８２】
ＲＮＡｓを増幅させるための本発明の特異な態様は Innis et al. (１９８８) supra を基礎としている。テスト混合物中のＲＮＡ分子と標的分子は、増幅とＰＣＲの後に、それらの５′部分中の必須のＴ７プロモーター配列を与えるように設計されている。選択ＲＮＡ分子の完全長ｃＤＮＡコピーは選択ＲＮＡｓの３′配列に相補的なオリゴマーでプライムした逆転写酵素を用いて作られた。その結果生成したｃＤＮＡｓを、選択ＤＮＡｓ中のＴ７プロモーター配列を提供することによって、ＴaqＤＮＡポリメラーゼチェインエクステンションによって増幅した。この増幅プロセスの結果としての二重鎖産物をつぎにin vitro で転写した。転写体はつぎの選択／増幅サイクルに使用した。この方法では適当な核酸精製ステップを選ぶこともできる。
【００８３】
本発明の方法においては、一般に核酸が他の分子、たとえば蛋白質または最も一般的なケースとしてなんらかの標的分子と特異的に結合する能力を基礎に核酸の選択を可能にするなんらかのプロトコールを用いることができる。選択は増幅の可能な核酸を分離する必要だけである。たとえば、テスト核酸混合物を標的蛋白質とインキュベートした例１において述べたように、フィルター結合選択では核酸／蛋白質混合物はそのあとニトロセルロースフィルターを通じて濾過され、遊離の核酸を除去するために適当な緩衝液で洗滌する。蛋白質／核酸はしばしばフィルターに結合したままに残る。インキュベート混合物中のテスト核酸に対する蛋白質の相対濃度は選択するための結合の強さに影響する。核酸が過剰のときは、利用可能な結合部位に対する競合が起こり最も強く結合する核酸が選択される。これとは逆に、過剰の蛋白質が用いられた時は、蛋白質に結合するどんな核酸でも選択されるだろう。望みの選択を達成するために用いる核酸に対する蛋白質の相対濃度は、蛋白質の型、結合相互作用の力および存在するなんらかのバックグランド結合のレベルに依存する。望みの選択結果を達成するのに必要な相対濃度は実験することなしに経験的に容易に決定できる。同じように、バックグランド結合を最小にするために濾過洗滌操作を最適化することも必要かもしれない。濾過洗滌操作のこのような最適化は通常の技工の熟練の範囲内のことである。
【００８４】
SELEXIONと呼ばれるSELEX の数学的評価は本発明者らによって用いられてきた。この適用に対する付録ＡにはSELEXIONから導かれるSELEX に関する一般化を得るのに用いた数学的解析の短いレビューが含まれている。
【００８５】
SELEXIONから得られる一般化は以下の通りである：1)SELEX の各ラウンドで最も良く結合するＲＮＡを回収する見込みは、存在するこれら分子の数、全体のＲＮＡプール対これらの結合優位性および用いた蛋白質の総数に比例して増える。結合における差異をいかにして最大にするかを前もって知ることは必ずしもいつでも直観的に明らかではないが、最も良く結合するＲＮＡの回収の見込みは試料として用いるＲＮＡ分子と標的分子の数を最大にすることによって増大させることができる；２）SELEX の種々のラウンドで用いるべき理想的な核酸と蛋白質濃度はいくつかの因子に依存する。SELEXIONで示唆された実験的パラメータはここでの例で用いたものと並行する。たとえば、最終リガンド溶液の相対的親和性がわかっていない場合、─このようなことはSELEX を実施した場合ほとんど避けられないが─蛋白質標的に対して核酸全体の約３から７％の間の結合が起こるように蛋白質と核酸混合物濃度を選ぶことが好ましい。この規準を用いることによってSELEX の各ラウンドごとに高親和性リガンドで１０倍から２０倍の濃度化が達成されるだろうことが期待できる。
【００８６】
好ましい態様において種々の標的に対する核酸リガンドを選択するのに用いる実験条件は、標的がin vivo で存在するような環境に似たものを選択すべきである。以下に示す例１０は選択条件を変えると特定の標的を受け容れるリガンド溶液にどんな影響を与えるかを示したものである。塩が高いそして低い条件下ではＮＧＦに対するリガンド溶液は非常によく類似しているけれども、差異も観測された。標的のin vivo 環境を正確に反映するように変えられるような調節可能な条件としては全イオン強度、二価カチオンの濃度および溶液のpHが含まれるがしかしこれらに限定されない。技術的に１つの熟練したやり方で、与えられた標的に関する知識をもとに適切な分離条件を容易に選択できるだろう。
【００８７】
増幅ステップへ進むためには、分離のあと選択核酸を標的から遊離させなくてはならない。この過程は選択核酸の化学的分解なしになされなければならず、その結果として増幅可能な核酸が得られるのでなければならない。特異な態様においては、選択ＲＮＡ分子はニトロセルロースフィルターで溶出したが、その場合用いたのは７Ｍ尿素２００μｌ、２０mMクエン酸ナトリウム（pH5.０）、５００μｌのフェノールと混合した１mM ＥＤＴＡ溶液（0.１Ｍ酢酸ナトリウム、pH5.２で平衡化した）を含む新たに作った溶液であった。５００μｌのフェノールと７Ｍ尿素２００μｌの混合溶液がうまく用いられた。選択ＲＮＡの溶出液をそのあとエーテルで抽出、エタノール沈澱し、沈渣を水中に再懸濁した。フィルターからの選択ＲＮＡの溶出のためのいくつかの異なる緩衝液の条件を用いることができる。たとえば、グアニジニウムクロライド、グアニジニウムチオシアネートなど、技術的に知られているような、非界面活性水溶性蛋白質変性剤を制限なしに用いることができる。フィルターからの核酸の溶出に用いる特異な溶液は技術的に通常の熟練の一つによって日常業務的に選択できる。
【００８８】
標的、とくに蛋白質に結合した核酸を分離するための代わりの分離プロトコールが技術的に利用可能である。たとえば、固体支持物質に結合した標的分子を含むカラムを通してのテスト核酸混合物の通過によって結合と分離が達成できる。標的に結合するこれらの核酸はカラム上に保持され、非結合核酸はカラムから洗い出される。
【００８９】
本申請を通じて、SELEX プロセスは望みの選択性が達成されるまで選択と増幅が繰り返されるところの繰り返しプロセスとして定義されてきた。本発明の１つの態様において、選択過程は、たった１回の分離ステップ後にはリガンド溶液を与えるのに十分な効率をもっている。たとえば、理論上は候補混合物を導入するカラムは標的を支えているが─適正な条件と十分長いカラムの条件下─リガンド溶液を得るのに十分な標的への親和性をもとに、核酸を分離しうるものでなければならない。たった１つのステップの後にリガンド溶液を生ずるほどもとの選択ステップが十分選択的であるような程度なら、このようなプロセスもまた本発明の範囲内に含まれるであろう。
【００９０】
本発明の１つの態様において、増幅に引続いて１個または離ればなれの少数の核酸リガンドが候補混合物中に残るまでSELEX をくり返し実施した。このような場合、リガンド溶液は単一核酸配列として表示されるだろうし、標的に対する同等の結合親和性をもつ配列のファミリーは含まないであろう。
【００９１】
本発明のもう１つの代わりの態様においては、SELEX 繰返しは候補混合物がより高い結合親和性核酸リガンド中で濃度化されたときに終了させるが、それでもなお異なる配列の比較的大多数が含まれている。この点を決めるのは技術上の熟練の１つであり、候補混合物全体の配列の無作為化の程度を定期的に分析するか、または標的への全体としての親和性を定量することによって行う。
【００９２】
この時点でSELEX を終了させ、クローンを調製して配列決定を行なった。もちろん、配列決定できるクローンの数はほとんど無限に近い。しかし、以下の例にみられるように、２０と５０の間のクローンの配列決定ののち、一般的には最も優勢な配列を検出し、リガンド溶液の特性を定義することが可能である。仮説的例においては、３０の配列をクローン化してのち、６の配列は同じであることがわかった一方で、他の配列のうちの２０のある配列部位は "ウインニング”配列内での配列と密接に関連している。最も優勢な配列はその標的に対するリガンド溶液と考えられるかもしれないが、クローン化された配列の多くに共通の特性を含む配列のファミリーから成るリガンド溶液を記述または構成するのがしばしばより適当である。
【００９３】
本発明のさらなる態様において、はっきりとしたいくつかの特性（たとえば、リガンド溶液がAAGUNNGUNNCNNNN で、Ｎは４つのヌクレオチドのいずれか）を有する配列の１つのファミリーとして表示されるリガンド溶液が付加的SELEX プロセスを始めるのに用いられるだろう。この態様では、候補混合物は部分的に固定、部分的に無作為化されたヌクレオチドから成り、固定ヌクレオチドは最初のSELEX プロセスで受容されたリガンド溶液をもとに選択される。この方式では、もしもリガンド溶液ファミリーの他のメンバーよりもよく結合する単一ヌクレオチド配列があれば、それは直ちに同定されるであろう。
【００９４】
本発明のさらに代わりの態様においては、SELEX プロセス中に受容されたリガンド溶液を基に第２のSELEX 実験もまた用いられる。この態様では、単一の最も圧倒的な配列（たとえばAAGUCCGUAACACAC)を用いて２番目のSELEX プロセスにインフォームするのに用いる。この２番目のSELEX プロセスで選択ウインナー（勝者）を基礎にした配列を生ずるために候補混合物を調製し、その一方で配列のそれぞれが十分な無作為化になることを確かめる。この候補混合物は無作為化よりもむしろ傾向をもったヌクレオチド出発物質を用いて産生されるであろう。たとえば、Ａ溶液は７５％のＡと２５％のＵ，ＣおよびＧを含む。核酸合成器は圧倒的なヌクレオチドを生ずるようにセットされるが、Ａ溶液中の他のヌクレオチドの存在はＡが圧倒的に多い核酸配列を生ずるとしても、この位置がＡと異なるものも生ずるであろう。また、最初のSELEX プロセスで得られた結果でインフォームされる２番目のSELEX ラウンドは与えられた標的に対する最良のリガンド溶液を得る確率を最大にするだろう。また、リガンド溶液は単一の好ましい核酸リガンドから成るだろうということ、あるいはそれは本質的に同じ結合親和性を有する構造的に関連した１つのファミリーから成ることが明らかにされねばならない。
【００９５】
実際上、時には単一配列が得られるまでSELEX プロセスを実施しない方が好ましいこともあるかもしれない。SELEX プロセスは何回かのSELEX ののち候補混合物中である配列の優勢に影響するだろういくつかのバイアス点−これらは標的に対するその配列の結合親和性に関係しない−を含んでいる。たとえば、ある配列に好都合または不都合な１つのバイアスが選択後に回収されたＲＮＡからのｃＤＮＡの産生中、あるいは増幅プロセス中に起こるかもしれない。このような予知できないバイアスの影響は、反応混合物中で唯１個または少数の配列が優勢になる前にSELEX を止めることによって最小にすることができる。
【００９６】
上述のように、テスト核酸混合物中の配列変化は突然変異で起こさせたり増やしたりすることができる。たとえば、ＰＣＲ増幅中に効率的に核酸配列に突然変異を起こさせる方法が記載されている（Leung et al.１９８９) . この方法または機能的に等価な方法を本発明における増幅方式と随意に組み合わせることができる。あるいはまた、ＤＮＡ突然変異のための従来法を核酸増幅の中に組み込むこともできる。適用可能な突然変異生起の方法には化学的誘起突然変異とオリゴヌクレオチドサイト−デイレクテッド突然変異が含まれる。
【００９７】
本発明はまた核酸のさらに興味ある能力及び蛋白質のような標的と相互作用する知られているあるいは今後明らかになると思われる反応様式を利用することにまで拡大することができる。例えばSELEX 法は蛋白質とミハエル付加物を形成するリガンドのスクリーニングに使用することができる。ピリミジンはそれが蛋白質内の正常な位置、通常は重要なシステイン又は求核基の近くに存在する時には、その求核基と反応してミハエル付加物を生成することができる。ミハエル付加物が生成される機構はピリミジン塩基の６位を求核攻撃して過渡的（併しゆっくりと逆戻りする）中間体すなわち５，６−ジヒドロロピリミジンを生成する機構である。ＲＮＡと標的蛋白質との間に、蛋白質を適当な変性剤で変性させた後でも、結合が起こるかどうかを観察することによってこのような中間体が存在することを調べることができる。すなわち、標的の結合ポケットが破壊された時、共有相互反応が連続して起こることを調べるのである。しかしながら、ミハエル付加物は屡々可逆的であり、時として非常に速いので、この試験によってミハエル付加物が確認できなくても、ある重要な瞬間にこれが存在しなかったことを示すことにはならない。
【００９８】
酵素や他の蛋白質標的に対して極めて強い親和性すなわち自殺基質に近い結合を作る為にミハエル付加物を利用するようにSELEX を行うことができる。無作為化ＲＮＡ混合物と標的物質が結合した後、濾過やその他の方法で分離する前に標的物質が変性することが予想される。その後の分離、ミハエル付加物の反転、遊離されたＲＮＡ上でのｃＤＮＡ合成、SELEX サイクルの休止は変性前の標的物質に結合するＲＮＡｓを濃縮し、科学者によってミハエル付加物が反転されるまで共有結合を続けると思われる。このリガンドは、in vivo では永続的に標的蛋白質を阻害する性質を持っていると思われる。蛋白質のｔＲＮＡ−ウラシルメチル転位酵素（ＲＵＭＴ）はミハエル付加物を通して基質のｔＲＮＡと結合する。ＲＵＭＴがE.coli中に高濃度に発現される時には大部分ＲＮＡに共有結合された状態で見出されるが、このことはほとんど不可逆的な阻害物質がSELEX によって認めることができることを強く示唆するものである。
【００９９】
本発明の方法は応用範囲が広い。例えば本方法は蛋白のＤＮＡやＲＮＡへの結合部位を同定したり特徴付けをしたりするのを手助けするために使用することができる。このような結合部位は遺伝子発現の転写調節あるいは翻訳調節において機能している。例えば、プロモーター部位での転写アクチベータあるいはリプレッサー、転写複合体の結合部位として、複製の基点あるいはその近辺での複製補助蛋白とＤＮＡポリメラーゼの結合部位として、またリボゾーム結合部位でのリボゾームと翻訳リプレッサーとの結合部位として機能している。このような結合部位の配列情報は、調節領域を特徴づけるための危介で徹底した方法を回避して、この領域を分離して同定するために用いることができる。単離したＤＮＡ調節領域は例えば異型構成体において遺伝子の発現を選択的に変えるのに使用することができる。
【０１００】
本発明が予期しなかったことではあるが重要なことは、ここに記載した方法が、希望する標的分子のいずれとも特異的に結合する核酸分子を同定し単離しあるいは生産するために使用することができることである。このように、この方法は特定の標的に特異的に結合する核酸を生成するのに使用することができる。このような核酸リガンドは多くの面において機能的に抗体に似ている。抗体の結合機能と同様な結合機能を有する核酸リガンドが本発明の方法によって単離することができる。このような核酸リガンドをここでは核酸抗体と名付け、ポリクロナール抗体あるいはモノクロナール抗体が適用できる応用面において一般に有用である。核酸抗体はin vitroあるいはin vivo のいずれにおいても一般に抗体の代りになり得る。ただ、核酸抗体が使用される條件下で、核酸が実質的に分解されないことが必要である。核酸抗体の応用には、すべての原料からの標的分子の特異的、定性的あるいは定量的検出；標的分子の核酸への特異的結合に基づく標的分子の精製；毒素あるいは他の治療薬を特定の標的部位へ特異的に方向づけることによる種々の治療法などかある。
【０１０１】
標的分子としては蛋白質が好ましいが、炭水化物、ペプチドグリカン及び種々の低分子のものでもよい。従来の蛋白質性抗体と同様に、核酸抗体は生物学的構造の内在部分である分子と特異的に相互作用することによって、細胞表面やウイルスのような生物学的構造物を標的として使用することができる。核酸抗体は従来の抗体のように自己寛容による制限を受けないという利点がある。また核酸抗体は合成したり生産するために動物や細胞培養を必要としない。それはSELEX がすべてin vitroプロセスであるからである。よく知られているように、核酸は相補的核酸配列に結合する。核酸のこの性質は核酸分子の検出、定量及び単離に広く利用されている。従って、本発明の方法は既知の核酸間の結合能力を包含することを意図してはいない。特に核酸抗体の使用に関する本発明の方法は、核酸分子間の既知の結合親和性を包含することを意図していない。
【０１０２】
多くの蛋白質が、核酸のオぺレーター配列に結合している調節蛋白質のように、核酸配列へ結合することによって機能することが知られている。ある種の核酸結合蛋白質がそれらの自然の部位へ結合するという既知の能力は、例えば、このような蛋白質の検出、定量、単離及び精製に使用されている。核酸抗体の使用に関する本発明の方法は、核酸結合蛋白質と、それらが結合することが知られている核酸配列との間の既知の結合親和性を包含することを意図してはいない。しかしながら蛋白を結合する同じ核酸へ結合する新規の天然には存在しない配列はSELEX を用いて開発することができるのである。SELEX は蛋白質へ結合する核酸の配列を極めて速やかに決定することができ、また、したがって、未知のオペレーターの構造や結合部位の配列を決定するのに容易に使用することができ、その決定された配列が、つぎにここに記述した応用に使用することができるということは注目すべきことである。
【０１０３】
本発明は核酸と結合することが知られていない蛋白質の検出、定量、単離及び精製に核酸分子を一般的に使用する最初の開示であると信じられる。以下に論じられるように、SELEX によって単離可能なある種の核酸抗体はまた特定の標的分子あるいは構造の機能に影響を与えるために、例えばその機能を阻害したり、高めたりあるいは活性化したりするために使用することができる。特に、核酸抗体は蛋白質の機能を阻害したり、高めたり、あるいは活性化したりするのに使用することができる。
【０１０４】
核酸に結合する既知の能力を有する蛋白質（例えばＤＮＡポリメラーゼ、その他のレプリカーゼ、ＲＮＡ上の部位を認識するがそれ以上触媒作用に関与しない蛋白質）はSELEX によって、標的蛋白質の活性部位に結合する高親和性のＲＮＡリガンドを与える。したがってＨＩＶ−１の逆転写酵素の場合、生成したＲＮＡリガンド（実施例２で1.１と呼ぶ）は、プライマーＤＮＡ、ＲＮＡ鋳型、及び４種のデオキシヌクレオチド三燐酸の存在でｃＤＮＡ合成を阻止する。
【０１０５】
ＲＮＡ構造に関する発明者の理論は、殆んどすべての蛋白質はSELEX の標的になることを示唆するものである。非核酸結合蛋白質についての最初の実験を、一般に核酸あるいは特にＲＮＡと相互反応するとは考えられない３種の蛋白質で実施した。３種の蛋白質とは組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、神経成長因子（ＮＧＦ）及び成長因子レセプターの細胞外領域（gfＲ−Xtra) であった。これらの蛋白質すべてについて、ニトロセルロース濾紙上に無作為化混合ＲＮＡs を保留するかどうかをみるために試験した。ｔＰＡとＮＧＦはＵＭのちょうど下のkd′s で、無作為化ＲＮＡに対する親和性を示した。gfＲ−xtraは測定できるほどの親和性では結合しなかったけれども、これはもしその蛋白質に対するＲＮＡ抗体が存在すれば、他の大部分のＲＮＡs に対して親和性を持たない部位へそれが結合するに違いないことを示唆するものである。
【０１０６】
ｔＰＡ及びＮＧＦは３０の無作為化位置を有するＲＮＡｓを用いてSELEX ドリルによって得られた。ｔＰＡ及びＮＧＦはSELEX ドリルでリガンド溶液を与えたが、これは各蛋白質上のある部位が、その部位（あるいは他のもう１つの部位）が他のＲＮＡｓと結合するよりもそれを引き付ける配列とより強固に結合したことを示唆するものである。引き付ける配列は２種の蛋白質について異なる。
【０１０７】
ｔＰＡ及びＮＧＦがSELEX ドリルで非常によく作用したので、ランダムに集めた蛋白質及ペプチドについて、それらがＲＮＡに対して何らかの親和性を持っているかどうかについて試験した。一般に低い親和性を与える標的の同じ領域に接触するより高い親和性配列をSELEX ドリルが与えるＲＮＡに対して、蛋白質が何らかの親和性を有するのではないかと論理的に考えられた。一組の蛋白質とペプチドについて、ランダム化されたＲＮＡｓ（４０のランダム化された位置を含んでいる）がニトロセルロースの濾紙上に保留されるかどうかをみるために試験した。試験した蛋白の約２／３がＲＮＡに結合し、少数の蛋白はＲＮＡにきわめて強く結合した。実施例９を参照。
【０１０８】
ＲＮＡをニトロセルロース濾紙に結合させない蛋白質は、ＲＮＡ抗体を高める可能性について何もしていないという些細な理由のために失敗しているかも知れない。一例としてブラジキニンはニトロセルロースに結合しない、したがって上記実験においては失敗するだろう。ペプチドのアミノ末端を通して固体のマトリックスに結合させたブラジキニンを調製したら、ランダム化したＲＮＡが強固にマトリックスに結合したのがみられた（実施例７参照）。したがって最初の実験において、２つの短いペプチド、ブラジキニンとボンベスチンはランダム化ＲＮＡｓに強固結合する。これらのペプチド標的を用いてSELEX で得られた高親和性のＲＮＡリガンドは恐らくこれら活性ペプチドの拮抗体であると思われ、治療上有用であろうと思われる。きわめて小さなペプチドに、そのほとんどすべての活性に対して不活性にすることなく結合する約３０のヌクレオチドからなるＲＮＡを推測することは困難なことである。
【０１０９】
以下の実施例４，７，９及び１０に示すように、天然では核酸と相互反応するとは考えられない蛋白質が、核酸のランダム混合物と重要な程度にまで結合することが発見された。さらにＲＮＡ混合物に非特異的に結合することが認められた蛋白質に対しては、SELEX によってリガンド溶液を得ることができることが示されている。したがってこれはSELEX 実施前に、与えられた標的物質が核酸のランダム混合物に何らかの結合を示すかどうかを決定するための潜在的に価値のあるスクリーンである。ここに記述した方法が、特定の標的分子に特異的に結合する核酸分子を同定し、単離しあるいは生産するのに使用することができるということ、またそま分子の機能に影響を与えるために使用することができるということは第二に重要なことであり、また予期しなかった面である。この面においても標的分子は蛋白質が好ましいが、他のものでも、特に特異的な核酸結合をする炭水化物や種々の小分子などでもよい。小分子に結合する核酸リガンドは、小分子の天然のリガンドと相互作用することから隔離することによって、あるいはそれらを妨げることによって小分子の機能に影響を与えることができる。
【０１１０】
例えば、ある酵素の活性はその酵素の基質と結合する核酸リガンドによって影響される。小分子の核酸リガンド、すなわち核酸抗体は診断試験（あるいはその他の定量）の試薬として特に有用である。例えば、結合代謝産物や正常代謝産物の異常量などの被制御物質の存在は本発明の核酸リガンドを用いて検出及び測定が可能である。触媒活性を有する核酸リガンドは標的の化学変化を触媒することによって小分子の機能に影響を与えることができる。可能な触媒活性の範囲は少なくとも蛋白質によって示される範囲と同様の広さである。希望する反応の遷移状態にある類似体に対するリガンドを選択する方策は触媒核酸リガンドを選択することができる一方法である。
【０１１１】
蛋白質の機能に影響を与えて阻害したり高めたりするために核酸分子を一般的に使用することを開示するのは本発明が初めてと信ずる。本発明の結合選択法は、選択された核酸に結合させて標的分子機能を修飾するための二次的選択法あるいはスクリーニング法と容易に組み合せることができる。SELEX で試験することのできるバリアント核酸配列が多数あることは、希望する結合能力と標的分子活性を変更する機能を有する核酸配列を見つけ出す確率を高めるものである。
【０１１２】
本発明の方法は、蛋白質の自然の生物学的活性の一部として核酸に結合する蛋白質、及び蛋白質の生物学的機能の一部として核酸と結合することが知られていない蛋白質を含むすべての標的蛋白質の機能に選択的に影響を与えることができる核酸リガンドを選択するために有用である。ここに記述した方法は次のものと結合する蛋白質に結合してその機能を修正する核酸リガンドを単離あるいは生産するのに使用することができる。蛋白質として、ＤＮＡ又はＲＮＡ、一本鎖又は二本鎖等の核酸と結合する蛋白質；プリンやピリミジン塩基又はそれらから誘導される塩基を含むヌクレオシドあるいはヌクレオチト、特にアデニン、チミジン、グアニン、ウラシル、シトシン及びヒポキサンチン塩基及びそれらの誘導体、特にメチル化誘導体などと結合する蛋白質；特にニコチンアミドヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド及びコエンザイムＡ等の補酵素ヌクレオチド類と結合する蛋白質などがあげられる。
【０１１３】
本発明の方法は、標的酵素の触媒活性に影響を与える、すなわち触媒作用を阻害したりあるいは基質結合を変更する核酸分子、蛋白質レセプターの官能性に影響を与える、すなわちレセプターへの結合を阻害しあるいはレセプターへの結合の特異を変更する核酸分子；蛋白質多量体の形成に影響を与える、すなわち蛋白質サブユニットの四次構造を破壊する核酸分子；及び蛋白質の輸送性を変更する、すなわち蛋白質による小分子又はイオンの輸送を破壊する核酸分子等の核酸分子を同定し、単離しあるいは生産するために使用し得ることが期待される。
【０１１４】
SELEX プロセスはここではリガンド溶液が得られるまで繰り返される候補核酸混合物の反復選択及び増幅と定義される。このプロセスの次の段階は与えられた標的に対する核酸抗体の製造である。与えられたプロセスに対して得られたリガンド溶液が単一配列であっても、そのリガンド溶液を含む核酸抗体は合成されなければならない。例えば、SELEX 実験によって、SELEX 候補混合物に用いられた３０のランダム化ヌクレオチド配列のうち２０のみからなるむしろ好ましい単一リガント溶液が得られるかも知れない。治療的に価値のある核酸抗体は、重要でないヌクレオチドやSELEX の増幅段階で必要な固定配列はむしろ含まない方がよいと思われる。一旦核酸抗体の好ましい構造がリガンド溶液に基づいて決定されると、核酸抗体の実際の合成は、この方面でよく知られた種々の技術にしたが実施される。
【０１１５】
核酸抗体はまた与えられた標的に対する一群の配列からなるリガンド溶液に基づいて構成される可能性がある。このような場合、通常の実験では、得られる配列はリガント溶液の標的に対する相対親和力に関係なく環境によってむしろ選択されると考えられる。このような考え方は当業の通常の技術を有するものにとっては明白なことである。
【０１１６】
本発明の別の実施例においては、核酸抗体は同じ標的に対して多数の核酸リガンドを含む可能性がある。例えば、SELEX は２つの別々のリガンド溶液を確認することがある。２つのリガンド溶液は異なった位置で標的に結合するので、核酸抗体はむしろ両方のリガンド溶液を含んでいる方がよいかも知れない。もう一つの実施例では、核酸抗体は単一リガンド溶液を１つ以上含んでいる可能性がある。このような多価核酸抗体はただ１個のリガンドを有する当量の核酸抗体では得られない標的に対する強い親和力を有する。
【０１１７】
さらに核酸抗体は次のようなその他の要素を含んでいてもよい。すなわち1)標的に対する独立した親和力を核酸抗体に与える要素；2)標的に対する核酸リガンドの親和性を依存的に高める要素；3)in vivo で治療が必要とされる適当な局所へ核酸抗体を導びき局在させる要素；4)局所におけるある種の追加的反応に影響を与えるために、核酸リガンドの標的に対する特異性を利用する要素、などである。
【０１１８】
本発明の方法は標的蛋白質の機能を阻害する核酸を得るのに有用である、特に蛋白が核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド及びそれらの誘導体や類似体と結合する機能を阻害する核酸を得るのに有用である。本発明の方法は核酸阻害剤、例えば核酸やヌクレオチドあるいはヌクレオシドが基質あるいは補助因子となっているポリメラーゼ、逆転写酵素、及びその他の酵素の核酸阻害剤を与えることができる。
【０１１９】
SELEX と組み合せることのできる二次的選択方法には、とりわけ酵素の阻害、基質結合の変更、官能性の喪失、構造の破壊等に対する選択又はスクリーニングがある。当該技術分野において通常の技量を有する者は多くの方法がある中で、ここに記載した方法と両立できる選択方法あるいはスクリーニング方法を選択することは可能である。
【０１２０】
ある場合には、すなわちある標的分子に対しては、あるいはある種の応用にとってはリガントとしてＤＮＡ分子よりはＲＮＡ分子を使用する方が、一方他の場合にはＲＮＡよりＤＮＡリガンドを使用した方が好ましいということは当該技術分野の技量を有するものにとっては自明のことである。
【０１２１】
本発明の選択方法はまた分子複合体、例えば基質−蛋白複合体あるいは阻害剤−蛋白質複合体に特異的に結合する核酸を選択するのに用いることもできる。複合体分子に特異的に結合するが非複合体分子には結合しないこれらの核酸の中には、複合体形成を阻害する核酸がある。例えば、基質−酵素複合体へ特異的に結合する核酸リガンドを選択した場合には、その核酸リガンド中から基質の酵素への結合を阻害して酵素による触媒作用を阻害あるいは破壊する核酸を容易に選択することができる。
【０１２２】
蛋白質あるいはその他の標的分子の特定の官能部位又は活性部位に結合する核酸の同定あるいは単離に特に有用である本発明実施例においては、選択・増幅プロセスを標的分子内の希望する部位で又はその近くで結合する核酸リガンドのサブセット方向へ方向づけるために、標的蛋白質内の希望する部位へ結合することが知られている、あるいは結合するように選択された分子を用いる。単純な例では、標的分子中の希望する部位に結合することが知られている核酸配列が、結合が試験されているすべての核酸の無作為化された領域の近くに組み込まれている。次にSELEX がこれらバリアントの選択に使用される（図９）。
【０１２３】
これらバリアントはすべて既知の結合配列を持っており、標的分子に最も強く結合する。標的分子に一層強く結合するか、あるいは標的に一層特異的に結合することが期待されるより長い結合配列はこのようにして選択することができる。この長い結合配列が次に核酸試験混合物の無作為化された領域の近くに組み込まれ、さらに長い結合配列を選択するために選択・増幅ステップが繰り返される。これらのステップ（すなわち選択した配列の試験混合物中への組込み、改良された又はより特異性のある結合の選択・増幅）の反復が、結合力又は特異性が希望するレベルに達するまで繰り返される。この反復「歩行」法は特定の標的分子又は標的分子内の特定の部位に対して高い特異性を有する核酸の選択を可能にする。この反復「歩行」法のもう一つの実施例は、必ずしも核酸ではない「アンカー」分子を使用している（図１０、１１参照）。
【０１２４】
この実施例においては、希望する標的に結合する分子、例えば標的酵素の基質又は阻害剤、は既知の配列のオリゴヌクレオチドへ共有結合することができるように化学的に修飾される（図１０の「ガイドオリゴヌクレオチド」）。標的に結合する「アンカー」分子に化学的に結合されるガイドオリゴヌクレオチドはまた標的分子に結合する。ガイドオリゴヌクレオチドの配列補体は試験核酸混合物の無作為化された領域の近くに組み込まれる、次に標的分子又はアンカー複合体に最も強く結合するこれらの配列を選択するためにSELEX を行う。標的への結合力又は結合特異性が高いより長い核酸分子を選択し生成させるために反復歩行法を使用することができる。「アンカー」法を使用することにより、標的分子内の希望する部位に、又はその近辺に結合する核酸リガンドの単離をより速やかに行うことができることが期待される。特に反復「歩行」法と組み合わせて「アンカー」法を用いることにより、特異性の高い蛋白機能阻害剤である核酸が得られることが期待される（図１１）。
【０１２５】
SELEX の実施に当っては、選択プロセスが核酸配列の標的への親和力とは関係のない何らかの因子によってゆがめられていないことを確認するために、選択プロセスと共にプラス／マイナススクリーニングを実施することが望ましい。例えば蛋白質を結合するニトロセルロースを用いて選択を行う場合には、ある種の核酸配列が優先的にニトロセルロースに保留され、SELEX プロセス中に選択されることがみられている。ニトロセルロースに保留される性質があるために選択されてしまうこれらの配列を選択的に取り除くために、前述のSELEX 混合物がニトロセルロースを通過するステップをさらに組み入れることによって候補混合物からこれらの配列を除去することができる。このようなスクリーニング及び選択法は標的が不純物を含んでいる場合や選択プロセスが標的への親和性に関係のない傾向をもたらす時にはいつでも実施した方がよい。
【０１２６】
SELEX はgp４３とも呼ばれているバクテリオファージＴ4 ＤＮＡの機能を結合して阻害するＲＮＡ分子の単離への適用によって立証されている。Ｔ4 ＤＮＡポリメラーゼの新規なＲＮＡリガンドはＴ4 ＤＮＡポリメラーゼの特異的定量試薬として有用である。Ｔ4 ＤＮＡポリメラーゼの合成は自己発生的に制御されている。機能性蛋白質が存在しない場合には、アンバーフラグメントや突然変異蛋白質が、複製欠失感染における野生型蛋白質の合成速度と比較した場合、過剰発現される（Russel（１９７３）J. Mol. Biol. ７９：８３−９４) 。gp４３のＮ末端フラグメントのin vitro翻訳は精製gp４３の添加によって特異的に抑えられ、そしてｇｐ４３はリボソーム結合部位近くのｍＲＮＡの別の部分をヌクレアーゼの攻撃から守る（Andrake et al. (１９８８) Proc. Natl. Acad. Sci. USA８５：７９４２−７９４６) 。gp４３が結合するＲＮＡ翻訳オペレータの大きさ及び配列、及びその結合の強さは確立されている。gp４３オペレーターの最小の大きさは図１に示されているように約３６個のヌクレオチドからなる配列で、そこに示されているようにヘアピンループ構造を有するものと想像されている。オペレーターの最小の大きさはオペレーターの末端標識加水分解フラグメントのgp４３への結合を分析することによって決定された。ヘアピン及びループ配列におけるオペレーター変異体の結合の分析からgp４３のオペレーターへの結合はヘリックス中の一次塩基の変化に対して敏感であることがわかる。ポリメラーゼへの結合はヘアピンの安定性を顕著に低下させる変化によって一層低下する。オペレーターの結合はループ配列に対してきわめて敏感であることが認められた。gp４３の複製とオペレーター結合とは相互に排他的な活性であることが判明した。完全なオペレーターを含む精製ＲＮＡを数マイクロモル添加するとgp４３によるin vitroでの複製が強力に阻害されることが判明した。
【０１２７】
蛋白質に結合する核酸分子を単離する選択／増幅プロセスの能力を評価するために、無作為化された配列領域を含むＲＮＡ分子の混合物の最初の設計には、野生型gp４３オペレーター（図１）を基礎として用いた。ＲＮＡ試験混合物は１１０塩基の一本鎖ＤＮＡ鋳型からin vitroでの転写によって調製された。鋳型は図１に示されているように、ループ配列を除いて野生型オペレーター配列の大部分をエンコードするように組み立てられた。８塩基のループ配列は、各塩基が完全にランダムになるように合成された無作為化配列によって置換された。鋳型はまた効果的な増幅に必要な配列を含んでいる：すなわち３′末端はポリメラーゼチェーン反応における逆転写用及び増幅用プライマーに相補的となっており、またＴ７ＲＮＡポリメラーゼの転写開始及び完全な配列のために必要なその５′末端の配列はinvitro 転写のｃＤＮＡに相補的となっている。ＤＮＡ鋳型はループ配列バリアント全部の混合物であり、理論的には６5,５３６個の種類を含んでいる。
【０１２８】
野生型ループＲＮＡの解離定数は約５×１０-9Ｍであることが判明した。ループ配列バリアント集団の解離定数は約2.５×１０-7と測定された。ループ配列の無作為化は結合親和性を５０倍低下させた。
【０１２９】
ループ配列バリアントを含むin vitro転写は精製gp４３を混合してインキュベートした。混合物をニトロセルロース濾紙で濾過した。蛋白質−ＲＮＡ複合体が濾紙上に保持され、非結合ＲＮＡは保持されない。選択されたＲＮＡを次に実施例１に示すように濾紙から溶出した。選択したＲＮＡをGauss et al.（１９８７）supra に記載されている方法で3 ′−プライマーの存在下で伸張させた。得られたｃＤＮＡをInnis et al.（１９８６）supra に記載されている方法で、５′−プライマー存在下でＴagＤＮＡポリメラーゼで３０サイクル増幅した。選択増幅されたＤＮＡは選択増幅されたＲＮＡ転写物を生産するためのin vitro転写用鋳型として役立った。このＲＮＡ転写物は結合選択／増幅のもう１つのラウンドかけられる。結合選択混合物中のＲＮＡ／蛋白質比は選択サイクルを行っている間一定に保った。反復選択／増幅は数種の異なったＲＮＡ／蛋白質モル比を用いて実施した。すべての実験においてＲＮＡは過剰にあった；実験ＡではＲＮＡ／gp４３が１０／１（モル／モル）；実験ＢではＲＮＡ／gp４３が１０００／１；実験ＣではＲＮＡ／gp４３が１０００／１であった。
【０１３０】
選択プロセスの進行はこの方法の各サイクルの終了時に増幅ｃＤＮＡの標識転写物を濾紙結合定量法によってモニターした。実験Ｂでは選択の進行をモニターするために、各ラウンドからのＲＮＡ生成物についてバッチの配列決定も行った。選択／増幅の２，３及び４ラウンド後のＲＮＡ生成物についての配列決定ゲルのオートラジオグラムを図３に示す。第３回選択後までに導入された明瞭なループ配列傾向はなかったことは明らかである。選択の第４ラウンド後には、８塩基ループ配列に対する明瞭な共通配列がＡ（a/g)(u/c) ＡＡＣ（u/c)(u/c) と識別できる。実験Ａ，Ｂ，Ｃについて選択の第４ラウンド後の選択されたＲＮＡのバッチ配列が図４に比較されている。異なったＲＮＡ／蛋白質比を用いた３つの独立したSELEX 法のすべてが同様な明らかな共通配列を与えた。しかし実験Ａ及びＣから得られた選択されたＲＮＡにおいては野生型ループ配列（AAUAACUC）に対するある明らかな偏向があった。
【０１３１】
選択されたＲＮＡｓ中にどんな許容できる配列組合せが実際に存在したかを決定するために、実験Ｂの第４ラウンドの選択後に選択されたＲＮＡｓから個々のＲＮＡをクローン化した。実験Ｂからのバッチ配列は、ループ配列の４個の可変位置の各々を構成する２個の許容ヌクレオチドの一様な分布を示すように思われた。各々はSambrook, J. etal. ( １９８９）Molecular Cloning : A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor, N.Y.), Section 1.1３；1.８５−1.８６記載の方法にしたがってｐＵＣ１８へクローンされた。３′プライマーへのコロニーフィルターハイブリッド形成法によって確認された２０個の各クローンが配列されていた。ループ配列の外側のオペレーター配列のどの位置においても配列されたクローンは変異体ではなかった。図７に示すごとく、ただ５個のバリアント配列のみが観察され、驚くことに２つの配列バリアントだけが選択された混合物の主たる成分であった。配列された２０の各単離物中の各配列の頻度も図７に示されている。野生型配列AAUAACUCとループAGCAACCUとは実験Ｂの選択ＲＮＡ中に略等量存在した。他の選択バリアントは２つの主なバリアントの１塩基変異体であった。配列バリアントの結合力を各精製クローン単離物から得られた標識invitro 転写物を用いて濾紙結合定量法により比較した。図６に示すように、gp４３に対するＲＮＡの結合親和性と選択された配列の量との間には大体の相関々係が観察された。主な２つのループ配列バリアントは略等しい結合親和性をgp４３に対して示した。
【０１３２】
選択／増幅プロセスによって単離されたループ配列バリアントＲＮＡは図７に示されているように、野生型オペレータ配列について示されているのと同様に、gp４３ポリメラーゼ活性の阻害剤としてすべて作用する。
【０１３３】
SELEX 利用の一例にはバクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（gp４３）の新規ＲＮＡリガンドの選択がある（Andrake et al.（１９８８）Proc. Natl.Acad. Sei. USA ８５：７９４２−７９４６）。
【０１３４】
本発明はＨＩＶ−１逆転写酵素、Ｒ１７コート蛋白質、ＨＩＶ−１ rev蛋白質、ＨＳＶ ＤＮＡポリメラーゼ、E. coli リボソーム蛋白質Ｓ１、ｔＰＡ及びＮＧＦへの親和性が増加していることが示されている、SELEX プロセスによって得られる、特異的なリガンド溶液を含む。これらのリガンド溶液は各種標的物質に対する核酸抗体を合成するために当該技術分野における技量を有する者によって利用され得る。
【０１３５】
次に広範囲の標的にSELEX を適用して成功した例を示す。標的は一般に２つのカテゴリ−に分けられる−核酸結合蛋白質と、核酸と相互反応することが知られていない蛋白質の２つのカテゴリーである。各々の場合についてリガンド溶液が得られる。ある場合にはヘアピンループ、非対称の膨らみ又は擬結び目のような核酸モチーフとしてリガンド溶液を発現することが可能である。他の例においてはリガンド溶液は一次配列として発現される。このような場合、リガンド溶液は明確な四次構造を含まないことを暗示することを意味するものではない。
【０１３６】
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼに加えて、SELEX を実施して成功する標的としてバクテリオファージＲ１７コート蛋白質、ＨＩＶ逆転写酵素（ＨＩＶ−ＲＴ）、ＨＩＶ−１rev 蛋白質、ＨＳＶ ＤＮＡポリメラーゼ±補助因子、E. coli リボソーム蛋白質Ｓ１ｔＰＡ及びＮＧＦがある。次の実験も無作為化核酸候補混合物の種々の蛋白質に対する全体の結合親和性を試験するプロトコールを示すものである。また例７はブラジキニンの固定化及び無作為化核酸のブラジキニンに対する多くの結合試験の結果を示している。
【０１３７】
ここに示す実施例及び図解はいずれにおいても制限を意味するものではない。本発明の基礎となる基本的な考え方は化合物としての核酸は実質的に無限に多様な大きさ、形、及び立体配置を形成することができ、結合及び触媒機能の巨大な宝庫であり、そのうち生物学的系に存在することが知られているものはほんのわずかである。
【実施例】
【０１３８】
実施例
全体を通して、次の材料と方法を用いた。
転写ベクターＰＴ−２は、商品を利用できる（U.S.Biochemical Company, Cleveland, OH) 。プラスミド ＰＵＣ１８は、Norrander らによって記述されている（１９８３）。遺伝子２４：１５−２７もまた、New England Biolabs から商品で利用できる。新らしい組換えプラスミドを作るためのＤＮＡの操作は、別に述べたものを除き、Maniatisらの（１９８２）分子クローニング：実験室手引き、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York に記述されているように行った。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、Gauss らによる（１９８７）Mol. Gen. Genet.２０６：２４−３４に記載のように合成し、精製した。
【０１３９】
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによるin vitroの転写とＲＮＡゲル−精製は、Milliganらの（１９８７）Nucl. Acids Res.１５：８７８３−８７９８の記述によったが、標識化反応中のＡＴＰ，ＣＴＰとＧＴＰの濃度はそれぞれ0.５mMとし、またＵＴＰ濃度は0.０５mMとした。ＵＴＰは、約２０ci／mmolの32Ｐでアルファ位置に標識した。Ｔ４感染からの粗ｍＲＮＡの製造、オリゴの標識化、及びＡＭＶ逆転写によるプライマー伸長は、すべてGauss ら（１９８７）のsupra に従った。
【０１４０】
標識し、ゲル精製したＲＮＡと精製したgp４３の稀釈は、２００mM酢酸カルシウム、５０mMトリス−塩酸pH7.７中４℃で行った。ニトロセルローズ濾過結合分析において、精製したgp４３は、つづいて稀釈され、蛋白質の各稀釈液の分割量３０μｌを、稀釈し、標識し、ゲル精製したＲＮＡの分割量３０μｌに添加した。ＲＮＡ稀釈液（５０μｌ）を新鮮なニトロセルローズフィルターにスポットし、乾燥し、チューブ当りのカウントを計測した。反応液中の蛋白質の濃度は１０-10 Ｍから１０-8Ｍであり、各実験におけるＲＮＡｓの濃度は約１０-12 Ｍであった。４℃で３０分間の培養後、各試験管を３７℃で３分間放置後、各試料の５０μｌを予め湿らせたニトロセルローズフィルター（Millipore # ＨＡＷＰ０２５００）を通して濾過し、２００mM酢酸カリウム３mlと、５０mMトリス−塩酸pH7.７で洗浄した。
【０１４１】
フィルターを乾燥し、Ecolume TMシンチレーション液（ＩＣＮ Biomedicals,Inc.) 中で計測した。gp４３を含まない状態で処理した対照品から、バックグランド（常に入力カウントの約５％以内）を測定した。各測定セットからバックグランドを差し引き、フィルターに残っている全入力カウントのパーセントを計算した。各セットのデータポイントから、等式からの曲線作成のため修正された発行プログラム（Caceci及びCacheris, １９８４supra ）版を用い、最適二分子結合曲線を作成した。
【０１４２】
等式 Ｑ＝Ａ〔gp４３〕／（Kd＋〔gp４３〕）において、Ｑはフィルターに結合する全ＲＮＡの断片であり、Ａは飽和結合するＲＮＡのパーセント（この蛋白質−ＲＮＡ相互作用では約６０％）、〔gp４３〕は、入力gp４３濃度であり、Kdは二分子反応の解離定数である。この式は、Bisswanger（１９７９）の酵素反応動力学の理論と方法、Verlag Chemie, Weinheim,ＦＲＧ、P.９からの方程式〔１−５〕の代数的再整理であり、記載の実験では妥当な、蛋白質濃度はＲＮＡ−蛋白質複合物の濃度をはるかに超えるという仮定で簡略化している。
【０１４３】
実施例１．Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼのＲＮＡ疎害剤の選択 
In vitroの、転写のための１１０塩基一本鎖ＤＮＡ鋳型が、図２に示すように、二つのキャッピングオリゴヌクレオチド（表１と２）の存在下で３つの合成オリゴヌクレオチド（表１，３，４と５）によって作られた。鋳型−製造オリゴの一つはまた、in vitroの転写の逆転写にそしてその後のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲｓ）の増幅に、３′プライマーとして用いられた（Innis 等、（１９８８）Proc. Natl. Acad. Sci. USA８５：９４３６−９４４０）。キャッピングオリゴ(1) の一つは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ転写開始に必要な情報と、ＰＣＲ増幅段階に５′プライマーとして役立つin vitroの転写のｃＤＮＡに相補的な十分な配列を含んでいる。
【０１４４】
ＤＮＡ鋳型は、ランダム配列が完全に、野生型ループ配列AAUAACUCをエンコードすべき配列に代って置換された場合以外は、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼのため完全なＲＮＡ認識部位を含むＲＮＡをエンコードした。ランダム配列は、４つのすべてのｄＮＴＰ'sが反応混合液中に等モル量で、オリゴヌクレオチドナンバー４（表１）の配列中Ｎで示されるそれぞれの位置に存在した場合を除けば、市販のＤＮＡ合成剤(Applied Biosystems) を用いて常用の化学合成により導入された。ランダム配列は、ＰＣＲに用いられる５′と３′オリゴのためのプライマーアニーリング配列情報により隣接されている。ＤＮＡ鋳型は、こうして、すべてのループ配列のバリアントの混合であり、理論的には、６5,５３６の個別種を含んでいる。野生型ループバリアントＲＮＡ配列の解離定数は、約５×10-9Ｍであり、配列の集団は約2.５×１０-7Ｍ、５０倍低い結合親和力であることが測定された。
【０１４５】
【表１】
2007195559.tif 000003
【０１４６】
ループ配列バリアントを含むin vitroの転写物は、選択の複数ラウンドを通して、三つの異なるＲＮＡ−蛋白質比で、精製gp４３と混合させた。（Ａ及びＢとしては、gp４３の濃度が３×１０-8Ｍ、 "低蛋白質" 、またＣとしては、gp４３の濃度が３×１０-7Ｍ、“高蛋白質”であった。Ａについては、ＲＮＡの濃度は約３×１０-7Ｍ、 "低ＲＮＡ" であり、ＢとＣについては、ＲＮＡの濃度が約３×１０-5Ｍ、 "高ＲＮＡ" であった。）一ラウンドは、次の段階からなりたっている。
【０１４７】
1) 選択。ＲＮＡと蛋白質は上記の望みの比率で混合し、３７℃で培養し、ニトロセルローズフィルターを通して洗い、ＲＮＡを、supra に記述のようにフィルターから溶出させた。
【０１４８】
2) 増幅。フィルターから溶出させたＲＮＡは、Gauss らが（１９８７）supra で述べたような條件下で、５０μｌの反応液中に５０ピコモルの３′プライマーの存在下で、ＡＭＶ逆転写酵素によって伸長させた。その結果得られたｃＤＮＡ合成物に５０ピコモルの５′プライマーを添加し、１００μｌの反応容量で、Innis （１９８８）supra の記載のように、標識ＤＮＡポリメラーゼにより３０回転増幅させた。
【０１４９】
3) 転写。In vitroの転写は、選ばれた増幅鋳型で、Milliganら（１９８７）supra の記載のように行われ、その後、デオキシリボヌクレアーゼが、ＤＮＡ鋳型を除くために添加される。その結果選択されたＲＮＡ転写物は、次のラウンドの段階１に用いられた。サイクルの各段階で作られた生成物のわずか２０分の１が選択の歴史を追跡することができるように次のサイクルで用いられた。選択法の進行は各ＰＣＲ反応からの標識転写物のフィルター結合分析によって検定された。選択と増幅の第４ラウンド後、標識選択されたＲＮＡ生成物は、野生型対照ＲＮＡのそれに当量のgp４３との結合物を生成した。１つの実験（B)の各ラウンドからのＲＮＡ生成物と、３つの実験すべての第４ラウンドからのそれをゲル精製し、配列決定した。図３に、実験Ｂの第２、第３、第４ラウンドの選択と増幅から得た精製したinvitroの転写物の配列を示す。第３選択の後まで、明瞭なループ配列のかたよりは導入されないことは明らかである。選択のこの点により、第４ラウンドの完了後、明瞭な共通配列Ａ（a/g)(u/c)AAC(u/c)(u/c)として偏りが検出された。試験Ａ，Ｂ及びＣの第４回目の選択と増幅後のＲＮＡ転写物のバッチ配列を図４に示す。異なった蛋白質／ＲＮＡ比率による３つの独立した実験はすべて、同じような結果であった。実験ＡとＣの４つの "可変”位置のそれぞれに、野生型配列のいくつかの明瞭な偏りがある。
【０１５０】
実際にどんな組み合わせが許容できるのか見出すため、文献（Samrock ら（１９８９）supra ；Innis ら、（１９８８）supra ）のように、個別にＰＵＣ１８にクローンされた実験Ｂの第４ラウンドから得たＲＮＡからの配列を増幅するため、制限部位の情報を含む２つの "クローニング" オリゴヌクレオチドを用いた。実験Ｂの選択されたバッチは、おのおのが４つの "可変" 位置からなる２つの許容ヌクレオチドの分布さえあるように思われたので、さらに調査を進めるために選ばれた。３′プライマーへのコロニーフィルターハイブリダイゼーションにより、確認された２０の個別のクローンが配列決定された。これらの個々のどれも、変化したループ配列位置の外側の作動配列のどの場所においても変異体ではなかった。配列分布は図７に要約されている。驚くべきことに、選択されたＲＮＡ混合物は、実際に２つの主なループ配列からなっていた。１つは野生型配列、AAUAACUCで２０の中９個分離された。他の１つ、AGCAACCU，は、４つの位置が変異体で、２０クローンの中の８個に存在していた（図７参照）。検出された他の３つのループ配列は、これらの２つの主要な配列のシングル変異体であった。これらのクローンの分離体の各々から得られた標識したin vitroの転写物によるフィルター結合実験は、ＲＮＡのgp４３に対する結合親和性と選択された存在量の間にはラフな相関々係がみられた（図７参照）。
【０１５１】
実施例２：ＨＩＶ逆転写酵素のための特異性ＲＮＡリガンドの単離
ＨＩＶ−１の逆転写酵素活性は、普通のアミノ末端をもつ２つのサブユニット（Ｐ５１とＰ６６）のヘテロ二量体からできている。さらに大きなペプチドの外部カルボキシ末端領域は、逆転写酵素のリボヌクレアーゼＨドメインからなる；そのドメインの構造は最近高い解析能で決定された。
【０１５２】
ＨＩＶ−１逆転写酵素は、同族体のプライマーｔ−ＲＮＡLys3と、実験的にアンチコドンループとステムにおいて架橋結合するような直接的また特異的な相互作用のあることが先に示されてきた。また、ヘテロ二量体だけがこの特異的なＲＮＡ認識を示し、このｔＲＮＡと特異的に結合する逆転写酵素のホモ二量体種では生じないことが見出された。
【０１５３】
２つの鋳型集団（約１０14のそれぞれ異なる配列）が、SELEX に用いるために連結によって作られた。１つの鋳型集団は、ｃＤＮＡ合成とＰＣＲ増幅を与えるためランダム化領域の末端にある固定配列を用いて、３２以上のヌクレオチドの位置をランダム化した。第２の鋳型集団は、ＲＮＡの５′末端の追加の固定配列として、ｔＲＮＡLys3のアンチコドンのループとステムをもっていた。（この操作に用いたすべてのオリゴは、表２に示してある）。２つのランダム化集団のＨＩＶ−１逆転写酵素〔ＲＴ〕に対する親和性に相違はなかった（そして、示されているように、選択されたＲＮＡは、特異性結合において、どちらの５′領域も利用しなかった）。各集団によるSELEX の９ラウンドは標的蛋白質としてヘテロ二量体ＨＩＶ−ＲＴを用いて行った。
【０１５４】
オリゴヌクレオチドの連結と架橋を利用してランダム化ＤＮＡが作られた機構は、先に述べられた。このような方法は１マイクロモル規模のＤＮＡ合成によって強いられる理論的限界から、出発集団内の異なった配列の全体の数を減らすことができる。
【０１５５】
これらの連結反応では、約１ナノモルの各オリゴヌクレオチドが用いられた。連結生成物は、約５０％の収率でゲル−精製が行われた。この精製された鋳型は、前記のようにＴ７ＲＮＡポリメラーゼで転写された。ＨＩＶＲＴは、ニトロセルローズ解析で測定されたように約７×１０-7Ｍで、最大結合量の半分までこのランダム集団と飽和的に結合することができた。すべてのＲＮＡ−蛋白質結合反応は、２００mM酢酸カリウム、５０mMトリス−塩酸pH7.７、１０mMジチオスレイトルの結合緩衝液中で行われた。ＲＮＡと蛋白質稀釈液を混合し、氷の上に３０分置いた後３７℃で５分間置いた（結合分析では反応容量は６０μｌ、内５０が分析される；SELEX ラウンドにおける反応容量は１００μｌである）。各反応液は予め湿らせた（結合緩衝液により）ニトロセルローズフィルターを通して吸引され、３mlの結合緩衝液で洗った後乾燥し、分析のための計測またはSELEX 計画の一部として溶出処理に向けられた。９ラウンドが行われた。９ラウンドすべてのＲＮＡ濃度は約３×１０-5Ｍであった。ＨＩＶ−ＲＴは、最初の選択で２×１０-8Ｍそして２−９の選択では１×１０-8Ｍであった。
【０１５６】
ｔＲＮＡLys3アンチコドンループとステムを含むＲＮＡを用いた実験が最初に完了した。第９ラウンドに行われたニトロセルローズフィルター結合分析は、ＲＮＡ集団か開始時の候補混合体に比較して、ＨＩＶ−１ ＲＴへの親和性が約１００倍増加したが、蛋白質不在の場合のニトロセルローズフィルターとのバックグランド結合は投入したＲＮＡの２％から１５％まで増加した。個々の配列は、この集団（フィルター自体による保持のため選択される、バックグランドの高い可能性があるいくつかの配列を除くため、ニトロセルローズフィルターを通した濾過後）からクローン化され、表３にリストされている。ＨＩＶ−ＲＴに対する選択配列の親和性のニトロセルローズフィルター結合分析は、図１４に示されている。配列のいくつかは、ＨＩＶ−ＲＴのリガンドとして選択され、リガンド1.１及び1.３ａの結合曲線によって例示され、表４と５により明らかなようにいくつかの配列相同を示す。いくつかのリガンド配列は、蛋白質の不在下で、ニトロセルローズフィルター上に十分な保持時間を示し、リガンド1.４（図１４）によって例示され、プリン反復要素（表４に示す）のループをもった長いらせんによって特徴づけられているように見える。クローニングの前に、この実験で、それらを除くための我々の最少のおくれた努力にも拘らず、これらの配列は、この実験から集められたものの中の有意な部分を表していた。
【０１５７】
結果的に、実験（異なった５′固定配列をもつ）は、第１，３，６，９ラウンドの選択の前にニトロセルローズを通して事前に濾過を行った。この実験から集めた配列は表６に示されている。表４と５に示すように、実験１からの高い親和性をもつそれらに相同する多くの配列が再びみられる。ニトロセルローズのみによって保持される配列のモチフに適する配列は、あるにしても非常に少ない。この実験からの選択されたリガンド配列のニトロセルローズ結合分析の、リガンド1.１のそれとの比較が図１５に示されている。
【０１５８】
最も普通の配列（1.１）と、同じような配列（１−３ａ）をもつ高親和性リガンドＲＮＡｓは、ＨＩＶ−１ ＲＴへの高親和結合のために必要な情報の範囲をきめるためにさらに分析された。これらの実験の結果は図１６に示されている。これらの実験は、これらの配列、UUCCGNNNNNNNNCGGGAAA、に共通のモチーフが、同じように認識ドメイン内に位置していることを立証している。このモチーフの配列UUCCG とCGGGA は、８塩基ループをもつＲＮＡらせんを形成する塩基対であろう。これらの固定配列以外にＨＩＶ−１ ＲＴへの高親和性結合に何が貢献しているかを見つけるために、表７に示すように、これらの２つの配列とは異なるヌクレオチドの位置に、ランダム結合を含む候補の混合鋳型を作った。SELEX の８ラウンド後、個々の配列をクローン化し、配列を決定した。４６の配列が表７に示されている。これらの配列の検査から、中央８ｎ可変領域と下流４ｎ可変領域と隣接領域間の広範な塩基の対向；上に討論したそれとの組合わせによりＲＮＡシュードノットを示すであろう塩基の対合が示されている。この進化した集団の中で、特異的な配列の支配がみられないことは、選択が一次配列のレベルではみられず、純粋に二次構造に基づいて起ること、すなわち、ＨＩＶ−１ ＲＴへの同様の親和性を与える多くの配列組合わせがあり、競合すべき有利性をもつものがないことを示唆している。第１，第２SELEX 実験の結果は、UUCCG---CGGGANAAモチーフに相同性をもつこれらの集団からなる個々の配列もまた、このシュードノット塩基対合の強い可能性を示すことを明らかにしている。
【０１５９】
図３１はシュードノットとしてここに関係するものの模式図を示している。シュードノットは２つのらせん部分と３つのループ部分からなる。すべてのシュードノットがすべて３つのループをもつとは限らない。得られたデータを解明する目的で、図３１に示すようにシュードノットの色々な部分を標識化した。たとえば、表５に、実験１と２で得られたいくつかの配列が、色々な配列によって仮定されたシュードノットの立体配置に従ってリストされている。
【０１６０】
表５に限定される、実験１と２の結果からＳ１（ａ），Ｓ１（ｂ）とＬ３の配列を固定した実験３が導かれた。再び、SELEX から引き出された核酸が、ほとんど独占的に、シュードノット内に立体配置された。各々の実験の結果の調査から、ＨＩＶ−ＲＴへの核酸溶液はシュードノットとして立体配置される最も基礎の共通の要素をもつ、かなり大きなメンバーを含むことが明らかにされている。ＨＩＶ−ＲＴのための核酸溶液を定義する他の一般論は次の通りである：
1) Ｓ１（ａ）は、しばしば配列５′−ＵＵＣＣＧ−３′からなり、またＳ１（ｂ）は、しばしば配列５′−ＣＧＧＧＡ−３′からなる。しかしながら、塩基対フリップが可能となり、ステムは短くなるだろう。
2) Ｌ１は、短くなるか長くなるだろうがしかし、しばしば、最上の結合核酸内の２つのヌクレオチドからなる。Ｌ１内の５′ヌクレオチドは、しばしばＵかまたはＡである。
3) Ｓ２は、通常５または６塩基対からなり、独立した配列であると思われる。このステムは、非ワトソン／クリック対を含むだろう。
4) Ｌ２は、ヌクレオチドからできてはいないが、しかしそれが存在する時は、ヌクレオチドはむしろＡ′ｓである。
5) Ｌ３は、一般に３またはそれ以上のヌクレオチドで、Ａ内に豊富である。
6) SELEX で得られるほとんどの配列において、Ｌ１、Ｓ２（ａ）及びＬ２のヌクレオチドの全部の数は、８で同じである。
【０１６１】
この実験の最初の目的は、ＨＩＶ−１ ＲＴへのリガンド溶液をみつけることであった。進化したリガンドクローン1.１と実験１の開始集団との、逆転写酵素の活性疎害能力を比較し、図１７に示している。ＲＴに対する阻害剤ＲＮＡの濃度が同じであっても、逆転写酵素は有意に、リガンド1.１によって疎害される。逆に、わずか１０mM（または２００倍過剰）の開始集団ＲＮＡは、ＨＩＶ−１ＲＴの有意な疎害剤である。かくして、ＨＩＶ−１ ＲＴへの高親和性リガンドは、妨害するかまたは直接酵素の触媒部位と相互作用を起す。
【０１６２】
この疎害の特異性を試験するため、色々な濃度のリガンド１：１について、ＭＭＬＶ，ＡＭＶまたＨＩＶ−１逆転写酵素の疎害を分析した。その実験の結果は、図１８に示され、リガンド1.１の疎害は、ＨＩＶ−１逆転写酵素に特異的なことを示している。
【０１６３】
実施例３ バクテリオファージＲ１７コート蛋白質のための特異性ＲＮＡリガンドの単離
SELEX がバクテリオファージＲ１７コート蛋白質について行われた。蛋白質は、Carey らのBiochemistry，２２，２６０１（１９８３）により記載されているように精製した。結合緩衝液は、１００mMの酢酸カリウム＋１０mMジチオスライトル＋５０mMトリス−酢酸pH7.５であった。蛋白質とＲＮＡを３７℃で３分間共に培養し、次に、蛋白質結合ＲＮＡを遊離のＲＮＡから分離するためにニトロセルローズフィルターで濾過した。フィルターを５０mMトリス−酢酸pH7.５で洗浄した。蛋白質は、SELEX の最初の４ラウンドでは1.２×１０-7Ｍで、５から１１ラウンドでは４×１０-8Ｍであった。
【０１６４】
開始ＲＮＡは、先に述べたように、ＤＮＡから転写された。ＤＮＡ配列は、標準技術に従ってＲＮＡを合成させるバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ促進配列を含んでいる。SELEX サイクルの増幅部分の間にｃＤＮＡ合成が、配列：
ｃＤＮＡプライマー（ＰＣＲプライマー１）：
５′GTTTCAATAGAGATATAAAATTCTTTCATAG ３′のＤＮＡによって開始される。
【０１６５】
ｃＤＮＡを増幅するために用いられるＤＮＡプライマーは、従って、Ｔ７プロモーター、３２ランダム化位置、ＡＴジヌクレオチド、そしてＰＣＲプライマー１に相補的な固定配列を含んだ配列であった。SELEX の第一サイクルを開始するために用いられるＲＮＡは、従って、配列：
pppGGGAGCCAACACCACAAUUCCAAUCAAG-32N-AUCUAUGAAAGAAUUUUAUCUCUAUUGAAAC をもっている。
【０１６６】
SELEX の第１１ラウンド後からのクローンのセットが得られ、配列決定された。４７クローン内に得られた３８の異なった配列の中に、３配列が１回以上発見された。１つの配列は６回、１つの配列は４回、残りは２回であった。残りの３５配列は、それぞれ１回だけ見つけられた。２つの配列は、初期配列または多分第二次構造に関して、他のものとは同じではなかった。そしてそれ以上の分析は行わなかった。３６配列は、普通、突出したヘアピンのテトラヌクレオチドループとして位置する配列ＡＮＣＡをもつ；突出したヌクレオチドは、３６のすべての場合アデニンであった。ヘアピンループの４つのヌクレオチドの並んだ全体のセットが表８に与えられている。開始ＲＮＡ（ＡＵ）のランダム領域への２つのヌクレオチド３′は、ｃＤＮＡプライマーが、相補的な２つのヌクレオチドを含まないので変化するのもまたは欠失するのも自由である；多くのクローンは、これらのヌクレオチドの１つまたは両方を変化させた。
【０１６７】
図１９に示すウイニングＲＮＡのモチーフは、部位−指向性突然変異生成と結合試験を通して早くから確認されたコート結合部位への直接的な関係を提示している。Uhlenbeck ら、supra （１９８３）；Ramaniukら、supra （１９８７）参照。しかしながら、配列のいくつかは、このセットでは、期待したよりもよく保存されている。ループ配列ＡＵＣＡは支配的であるが、初期の結合データは、ＡＮＣＡ配列がすべて同等であることが示唆されてきた。Ｒ１７ゲノム上の自然の結合部位は、下記に示す配列と構造を含んでいる。
【０１６８】
【化２】
2007195559.tif 000004
【０１６９】
自然の構造は、配列ＧＧＡＧを含み、リボソーム結合とＲ１７レプリカーゼコーディング領域の翻訳開始を促進することに役立っている。SELEX 中は、その必要が存在せず、ウイニング配列は、ループと突出部分の周りに、Ｇ：Ｃ塩基対よりも、よりしばしばＣ：Ｇ塩基対を含んでいる。それ故SELEX は、生物と進化の歴史の制限をゆるめて、自然のリガンドよりももっと高い親和性をもったリガンドへ誘導する。同様に、３６配列のそれぞれに見出されるループシチジンは、自然の部位におけるウリジンであり、ｃはｕよりもより高い親和性を与えることが知られている。進化の間、自然の部位は、最高に堅い結合では、生物に不利益を引き起すので、最高の親和性よりもむしろ適当な親和性をもたなければならないのだろう。
【０１７０】
実施例４： セリンプロテアーゼのための核酸リガンドの単離
セリンプロテアーゼは、蛋白質内のペプチド結合を切断する蛋白質酵素である。セリンプロテアーゼは、哺乳動物中の遺伝子族のメンバーであり、哺乳動物の生命の中で最も重要な酵素である。セリンプロテアーゼが核酸と結合することは、知られていない。セリンプロテアーゼの例は、組織のプラスミノーゲン活性化物質、トリプシン，エラスターゼ，キモトリプシン，スロンビンまたプラスミンなどである。多くの疾病状態、たとえば、血液凝固不全や血栓形成は、セリンプロテアーゼに結合した核酸リガンドによって治療することができる。セリンプロテアーゼ以外のプロテアーゼもまた、哺乳動物にとって重要であり、これらもまた、ここに開示される発明に従って得られた適当な親和性によって核酸リガンドとして標的になるだろう。
【０１７１】
商業源から利用できる、ヒトの組織プラスミノーゲン活性化物質（ｈｔＰＡ）が、本発明のSELEX 法を通して、セリンプロテアーゼとして選ばれた。用いられるＲＮＡ候補の混合物は、以下ＨＳＶ ＤＮＡポリメラーゼ実験における例１１に記載するものと同じであった。
【０１７２】
SELEX の間、結合は、５０mM塩化ナトリウム＋５０mMトリス−酢酸塩pH7.５中に３分間、３７℃において行われた。SELEX は１０ラウンド行われた。３０Ｎの候補混合体が、１５０mM酢酸ナトリウム＋５０mMトリス−酢酸塩pH7.５で、７×１０（−８）Ｍの親和力（Ｋｄ）でｔＰＡに結合した；SELEX の９ラウンド後に存在するRNA の親和力は、約３倍強かった。９クローンを単離し、配列を決定し、これらのいくつかを、純粋なＲＮＡｓとして、ｔＰＡへの結合のために試験した。低い塩として得られた９クローンの配列は、次の通りであった。
【０１７３】
【化３】
2007195559.tif 000005
【０１７４】
試験した配列はすべて、開始時の３０Ｎ候補混合物よりも少なくとも幾分かよく結合した。しかしながら、Ａシリーズは、ｔＰＡの不在下で、候補混合体よりもニトロセルローズによく結合し、まるで分けられた配列モチーフが、それ自身によって、ニトロセルローズ基質上に保持される原因になっているかのようであった。そのモチーフは、上に示す配列に下線が引かれている。他のSELEX の実験で、ＡＧＧ繰返し体は、リガンド溶液を、ＨＩＶ−１逆転写酵素、ヒト生長ホルモンレセプター細胞外ドメインまた最初の歩行実験におけるＲ１７コート蛋白質に対しても、同定を試みた際に単離された。試験される時、これらの配列は、標的蛋白質が存在することなく、ニトロセルローズに適度なまたは確実な結合を示す。ＡＧＧ繰返し体は、ヘアピンループ内に見出されるかも知れない。SELEX は、大抵の実施例で反復の工程であるので、このような結合モチーフが出現しても驚くには当らない。
【０１７５】
ニトロセルローズ結合モチーフの存在は、いくつかの分りやすい戦略の１つまたはそれ以上によって避けられるだろう。このようなモチーフを除くためSELEXの前にＲＮＡをニトロセルローズフィルターを通して濾過するのがよいかも知れない。SELEX の別のラウンドに、別の基質、たとえばグラスファイバーフィルターを用いてもよい。別の分配システム、たとえば、カラム、ショ糖密度勾配などを用いてもよい。与えられたどんな単一工程も、反復工程において標的との結合を増加させず、しかし選択工程により選択されるモチーフを助長するような傾向になりがちなことは明らかである。それ故これらのモチーフを除くためには別の方法またはスクリーニング方法を用いることが重要である。ＡＧＧ繰返し体は、標的が独立している偏りとして単離された他のモチーフのように、標的にとって最上の配列の親和性がむしろ低い時または、最上の配列の親和性が、開始時の候補混合体の親和性よりもほんのわずか良い時に最も多く出現しやすい傾向のあることが示された。
【０１７６】
実施例５： 哺乳動物の受容体のための核酸リガンドの単離 
哺乳動物の受容体は、しばしば、細胞の細胞質膜内に存在する、そしてこれらの細胞の外側を循環する分子に反応する蛋白質である。受容体のほとんどは、核酸に結合することは知られていない。ヒトの生長ホルモン受容体は、循環するヒト成長ホルモンに応答するが、一方インスリン受容体は、循環するインスリンに応答する。受容体は、しばしば、膜の細胞外の側面に球状部分をもち、その球状部分は、特異的にホルモン（自然のリガンド）に結びつく。多くの疾病状態を、受容体に結合する核酸リガンドによって治療することができる。
【０１７７】
ヒト生成ホルモン受容体（shGHR)の可溶性球状ドメインに結合する核酸リガンドは、例４の候補混合体を用いて同定し精製される。再び、結合緩衝液は、遊離のＤＴＴである。ヒト生長ホルモン受容体の可溶性球状ドメインは、市場及び大学出所品を利用でき、一般的には、膜結合受容体蛋白質への完全な遺伝子のエンコード化に利用する組換えＤＮＡ技術によって作られている。SELEX が、リガンドが見出されるまで反復して用いられる。リガンドはクローン化され、配列が決定され、可溶性受容体に対する結合親和性が測定される。結合親和性は、同じリガンドを用い、他の可溶性受容体に対し、たとへ、ほとんどの受容体が、他の受容体の細胞外ドメインとの強い蛋白質相同性を示さなくとも、特異性を確めるために測定される。リガンドは、核酸リガンドと自然リガンド（ホルモン）間の競合する結合度を測定することによってshGHR の正常な結合活性の疎害を測定することに用いられる。
【０１７８】
実施例６ ：哺乳動物のホルモンまたは因子のための核酸リガンドの単離
哺乳動物のホルモンまたは因子は、動物体内を循環し、細胞の細胞質膜にある受容体と結合することによって影響を及ぼす蛋白質、たとえば、生長ホルモン、または小分子（たとえば、エピネフリン，チロイドホルモン）である。たとえば、ヒト成長ホルモンは、ヒト成長ホルモン受容体と最初の相互作用によって細胞を刺戟するが、一方、インスリンは、インスリン受容体との最初の相互作用によって細胞を刺戟する。多くの成長因子、たとえば、顆粒球集落刺戟因子（ＧＣＳＦ）は、細胞型に特異的な何かを含み、標的細胞上の受容体と最初に相互作用を起す。ホルモンや因子は、従ってある受容体にとっては自然のリガンドである。ホルモンや因子は、通常、核酸と結合することは知られていない。多くの疾病状態、たとえば、甲状腺機能亢進症、慢性低血糖症は、ホルモンまたは因子と結合する核酸リガンドによって治療することができる。
【０１７９】
ヒトインスリンと結合するリガンドは、例３の出発物質を用いて、同定し、精製される。ヒトインスリンは、商品出所源から求められ、通常、組換えＤＮＡ技術で作られている。SELEX は、リガンドが見出されるまで、反復して用いられる。リガンドは、クローン化され、配列決定され、ヒトインスリンに対する結合親和性が測定される。結合親和性は、たとへ、ほとんどのホルモンや因子がヒトインスリンとの強い蛋白質相同性を示さなくても、特異性の確認のために、同じリガンドについて、他のホルモンや因子に対して測定される。しかしながら、いくつかのホルモンや因子の遺伝子族は、ＩＧＦの小さな族またはインスリン様増殖因子を含んで存在している。核酸リガンドは、自然リガンドであるヒトインスリンの存在または不在下で、インスリン受容体と核酸リガンドによる競合的結合の測定によって、受容体に対するヒトインスリンの正常な結合活性の阻害度を測定するために用いられる。
【０１８０】
実施例７： SELEX のためのカラム基質の製造
以下の例９に述べるような方法の後で、ポリペプチドブラジキニンは、ニトロセルローズにより保持されないことが示された。ブラジキニンについてのSELEX過程を可能にするため、蛋白質は、標準方法に従い、支持基質として、活性化ＣＨセファローズ４Ｂ（Pharmacia LKB)に接触させた。結果として基質は、ニンヒドリン分析により、2.０mMブラジキニンであることが測定された。Crestfieldら、J. Biol. Chem. vol. ２３８、pp. ２３８、pp. ６２２−６２７、（１９６３）；Rosen Arch. Biochem. Biophys., vol. ６７，pp. １０−１５（１９５７）参照。支持基質上に残る活性基はトリスによって遮断された。Pharmacia,親和性クロマトグラフィー：原理と方法、Liungforetagen ＡＢ，Uppsida, Sweden （１９８８）参照。
【０１８１】
回転カラム分離が、候補混合物の溶液をビーズ状の基質に接触させるために用いられた。SELEX の選択段階を実施する一般的な方法において、反応緩衝液中の標的セファローズの５０：５０のスラリーの４０μｌを0.５mlのエッペンドルフ管に移す。ＲＮＡ候補混合体が６０μｌの反応緩衝液と共に添加され、反応混合液は３７℃、３０分間平衡化される。チューブの底に穴をあけ、チューブを大きなエッペンドルフ管に置き、両方のキャップを除き、溶出液を分離するためチューブを回転する（１０００ＲＰＭ，１０″，２１℃）。小さいチューブを新らしい大きなチューブに移し、内容液を選択した緩衝液５０μｌで層別して４回洗浄し、回転した。結合分析を行うため、放射性ＲＮＡを含むチューブを新しいエッペンドルフ管に移し、回転乾燥する。
【０１８２】
バルク結合実験は、３０の核酸ランダムセグメントからなるＲＮＡ候補混合体をブラジキニンセファローズ基質に適用して行われた。回転カラム技術を用い、バルク３０Ｎ ＲＮＡの色々な基質との結合物が、高い塩濃度の下で、セファローズとの結合物のバックグランドを最小にするような最適條件を定めるために測定された。ＲＮＡのセファローズとの結合のバックグランドは、セファローズ上の活性基をトリスにより遮断することにより、また１０mM ＤＥＭと１０−２０mM ＫＯＡＣの結合緩衝液を用いて、最少にした。この緩衝液條件で、ＲＮＡのランダム化バルク溶液の結合曲線は、約1.０×１０-5のバルクKdを生産した。図２０参照。曲線は、ブラジキニンセファローズを遮断した活性化セファローズに対する稀釈によって決定された。
【０１８３】
実施例８ ＲＮＡモチーフ構造における増加した候補混合体の製造
好ましい実施例で、SELEX に用いられる候補混合体は、２０と５０のランダム化核酸の間の隣接領域からなる。ランダム化セグメントは、選択された核酸の増幅を可能にする固定配列が両端に接している。
【０１８４】
別の実施例では、与えられた核酸モチーフをもつ候補混合体中の核酸のパーセンテージを増すように候補混合体が作られる。２つの特殊な例がここに与えられているが、この発明はそれに限定されるものではない。技術に熟達した人は、同じ一般的な結果が得られるような同等の候補混合体を作ることができるだろう。
【０１８５】
図２１の配列Ａとして示される１つの特殊な例において、候補混合体中のほとんどの核酸が、４と８塩基対の間のらせん領域と、また２０または２１の隣接したランダム配列の“ループ”を形成する傾向をもつように作られる。配列混合液の５′と３′末端の両方共に、核酸の増幅に必要な固定配列を含むだろう。これらの機能的な固定配列に隣接して、ランダム化領域のもう一方の側に固定配列をもつ塩基対が固定配列として選ばれるだろう。配列の５′から３′末端へ向って５つの異なった配列があるだろう：1)増幅のための固定配列；2)らせん構造を形成するための固定配列；3)２０または２１のランダム核酸残基；4)領域２配列をもつらせん構造を形成する固定配列；そして5)増幅のための固定配列である。図２１のＡ候補配列は、ヘアピンループと、対称及び非対称の、突出部をもつモチーフに富んでいるだろう。好ましい実施例で、候補混合体は、ランダム領域が２０及び２１塩基長である等量の配列を含んでいる。
【０１８６】
図２１に配列Ｂとして示される第二の例は、シュードノットモチーフに含まれる核酸をもつ候補混合体に富むようにデザインされている。この候補混合体中では、固定増幅配列は、１２のランダムな位置をもつ、３つの領域に隣接している。３つのランダム化領域は、４つのヌクレオチドからなる２つの固定領域に分離され、固定配列は、４つの塩基対のらせん構造を好んで作るように選択される。配列の５′から３′末端に向って、７つの異なった領域があるだろう：1)増幅のための固定配列；2)１２のランダム化ヌクレオチド；3)らせん構造を形成する固定配列；4)１２のランダム化ヌクレオチド；5)領域３のヌクレオチドによりらせん構造を形成する固定配列；6)１２のランダム化ヌクレオチド；そして7)増幅のための固定配列である。
【０１８７】
好ましい候補混合体の中に、交互にＧＣ，ＣＧ，ＧＣ，ＣＧ塩基対を生産するように工学的らせん領域がデザインされている。この塩基対モチーフは、特に安定したらせん構造を与えるように示されてきた。
【０１８８】
実施例９ 核酸結合が知られていない蛋白質へのランダム化ＲＮＡ配列のバルク結合
SELEX のため例１に記述したような一般的なニトロセルローズ選択方法につづいて、ランダムに選んだ蛋白質のグループが、ＲＮＡ配列のバルクの候補混合体に親和性を示すか否かを決めるために試験を行った。それぞれの実験に利用された候補混合体は、結合のパーセントを検出するため放射化標識された４０Ｎ ＲＮＡ溶液（４０のランダムな核酸セグメントをもつランダム化混合体）から出来ていた。候補混合体は結合緩衝液（２００mM酢酸カリウム，５０mMトリス−酢酸pH7.７、１０mM ＤＴＴ）に稀釈され、６０μＬ結合反応液中の３０μＬが用いられた。それぞれの反応液に、各蛋白質２０μＬ、１０μＬまたは１μＬが添加された。結合緩衝液が、全容量６０μＬに達するまで添加された。反応液は、３７℃で５分間培養され、次にフィルター結合にかけられた。
【０１８９】
試験した蛋白質は、アセチルコリンエステラーゼ（ＭＷ２３0,０００）；Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＭＷ１８0,０００）；アクチン（ＭＷ４3,０００）；アルコール脱水素酵素（２４0,０００）；アルデヒド脱水素酵素（ＭＷ２０0,０００）；アンギオテンシン（ＭＷ１２９７）；アスコルベート酸化酵素（ＭＷ１４0,０００）；心房性ナトリウム利尿因子（ＭＷ3,０６４）；及びボンベシン（ＭＷ１６２１）であった。蛋白質は、Bochringer Ingelheimから購入し、それらが販売されている緩衝液組成で利用した。
【０１９０】
それぞれの実験に用いたＲＮＡ候補混合体は、１0,７２６カウントの放射能を含み、結合バックグラウンドは約７２カウントであることが分った。その結果は表９にまとめられている。アセチルコリンエステラーゼ、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ及びアクチンを除く、試験した蛋白質はすべて、いくらかのバルクRNA 親和性があることが見出された。Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼは、購入時の溶液濃度が低いため、この蛋白質の結果は明確ではない。加えて、もしも試験した蛋白質がニトロセルローズと結合しなければ----ブラジキニンがそのケースである----この実験では親和性は検出されないだろう。ブラジキニンを保持したカラムについて検討された例７は、この実験でバルク結合を示さないことが、その蛋白質についてバルク結合は存在しないことを意味するものではないことを明らかにした。
【０１９１】
実施例１０： 神経成長因子のためのＲＮＡリガンド溶液の単離
神経成長因子（ＮＧＦ）は、標的細胞の外部表面にある受容体を通して作用する蛋白質因子である。成長因子やその他のホルモンへの拮抗薬は、受容体を遮断することにより、あるいは、因子またはホルモンを滴定することによって作用することができる。ＲＮＡは、直接NFG に結合するSELEX 法により求められた。始動するＲＮＡは、ＨＳＶ ＤＮＡポリメラーゼ（例１１）のように正確に作られた。
【０１９２】
２つの異なった実験をＮＧＦについて行った。第１は、低い塩の結合緩衝液を用い、SELEX の間、３７℃、３分の培養後濾過し、同じ緩衝液で洗浄する、１０ラウンドSELEX であった。低い塩の結合緩衝液は、５０mM塩化ナトリウム＋５０mMトリス酢酸pH7.５であった。第２実験は、結合緩衝液として２００mM塩化ナトリウム＋５０mMトリス酢酸pH7.５を用い、濾過後、５０mMトリス酢酸pH7.５で洗浄した；このSELEX 実験はわずか７ラウンドで完了した。
【０１９３】
低塩実験は、３６クローン配列を生じた。クローンの１５はほとんど同じであった。すなわち、＃′２，３，４，５，６，８，１１，１３，１９，２２，２８，３３，及び３４は同じであった、しかし＃′１５と２５はただ一つの違いであった：
【０１９４】
【化４】
2007195559.tif 000006
【０１９５】
６回発見された、２番目に多い配列は、
CCUCAGAGCGCAAGAGUCGAACGAAUACAG（＃′１２，２０，２７，および ３１）であった。
高温SELEX からは、１０クローンが配列決定された。しかし、それらの中の８つは同じで、明らかに低塩実験から得たアバンダント（しかし少量）な第２級に関係していた。ウィニング配列は：
----CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA----である。
【０１９６】
２つの実験の間で、全部で１４の異なった配列が得られた（１つの違いをもつ配列は、この分析では一緒にまとめてある）；それらはここにリストされており、類似物は、マークが重ねられ、頻度も記録されている。ngf.a からngf.k は、低塩実験からであり、一方、hsngf.a からhsngf.c は高塩実験から得られたものである：
【０１９７】
【化５】
2007195559.tif 000007
【０１９８】
似たような配列の中に、はっきりした二次構造は何も組み込まれていないけれども、ウイニング配列が、NGF 結合部位によく適合する構造の中に重要なヌクレオチドを置いているように思われる。
【０１９９】
核酸hsngf.a のＮＧＦとの結合分析が行れ、この核酸は、バルク３０Ｎ候補混合体よりも約２０から３０倍高いKdをもつことが見出された。同じ核酸はまた、Ｒ１７コート蛋白質と、ｔＰＡに対する親和性が、３０Ｎ候補混合体より低いかまたは同等であることが見出された。従って、SELEX から得た核酸リガンドhsngf.a は、NGF に対する選択的なリガンドである。
【０２００】
実施例１１： ＨＳＶ−１ ＤＮＡポリメラーゼのための核酸リガンドの単離
単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ−１）は、哺乳動物のＤＮＡ−含有ウィルスである。ＨＳＶ−１は、多くのＤＮＡ含有ウィルスのように、それ自身のＤＮＡポリメラーゼをエンコードする。ＨＳＶ−１ ＤＮＡポリメラーゼは、２つの形で精製された。それらは異なった性質をもつが、その各々はin vitroでＤＮＡ複製を触媒するだろう。１つのポリペプチドからなる単純な形は、クローン遺伝子を発現する細胞から精製され、Hernandez ，T.R.及びLehman，I.R.，J. Biol. Chem., ２６５，１１２２７−１１２３２（１９９０）による。ＤＮＡポリメラーゼの第２の形、ヘテロ二量体は、ＨＳＶ−１感染細胞から精製され、Crute ，J.J.及びLehman，I.R.，J. Biol. Chem., ２６４，１９２６６−１９２７０（１９８９）によっている；ヘテロ二量体は、ポリメラーゼそれ自体に相当する１つのペプチドと、これもまたＨＳＶ−１によってエンコードされた他のＵＬ４２を含んでいる。
【０２０１】
シングルポリペプチドとヘテロ二量体の両方に、SELEX が行われた。それぞれの場合に、結合緩衝液は５０mM酢酸カリウム＋５０mMトリス酢酸、pH7.５、及び１mMジチオスライトルであった。結合したＲＮＡを分離するための濾過は、３７℃で４分間の培養後に行われた；フィルターは、結合緩衝液からジチオスライトルを除いた液で洗浄された。
【０２０２】
ＲＮＡ候補混合体は、前に述べたように、ＤＮＡから転写された。他の実施例でそうであるように、ＤＮＡ配列は、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ促進配列を含んでおり、標準技術に従って、ＲＮＡを合成することが可能である。SELEX の増幅部分の間、ｃＤＮＡの合成は、次の配列のＤＮＡにより開始される：
cDNAプライマー（ＰＣＲプライマー１）：
５′GCCGGATCCGGGCCTCATGTGAA３’。
【０２０３】
SELEX サイクルの増幅の部分において、cDNAを増幅するために用いられるＤＮＡプライマーは、それらの一つにＴ７プロモーターを含む；そのＰＣＲプライマーは次の配列をもつ：
PCR プライマー２：
５′CGAAGCTTAATACGACTCACTATAGGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA３′。
【０２０４】
最初のランダム化ＤＮＡは、Ｔ７プロモーターをもつ配列；３０のランダム化位置、そしてＰＣＲプライマー１に相補的な固定配列を含んでいた。SELEX の第１サイクルを始めるために用いられたＲＮＡは、そこで次の配列をもっている：
pppGGGAGCUCAGAAUAAACGCUCAA-30N-UUCGACAUGAGGCCCGGAUCCGGC。
【０２０５】
SELEX は７ラウンド行われ、先に述べたように、cDNAが作られ、クローン化された。“Ｈ”と名づけた配列のシリーズが、標的としての単純ＨＳＶ ＤＮＡポリメラーゼによって得られ、一方、“Ｕ”シリーズが、ＵＬ４２ポリペプチドを含むヘテロダイメリックポリメラーゼによって得られた。
【０２０６】
Ｈシリーズからの配列の約２５％は、ランダム化領域（大文字は、ランダム化領域からである）の５′末端における１２ヌクレオチドの正確な配列を含んでいる。いくつかの配列では、固定化プライマー間の長さは、正確に３０ヌクレオチドではなく、ある場合（Ｈ２）はランダム化領域内に大きな欠失がみつけられた。このＨサブセットのメンバーは次のものを含む：
【０２０７】
【化６】
2007195559.tif 000008
【０２０８】
Ｕシリーズの２つのメンバーは、このプライマー配列モチーフを分け合っている：
【０２０９】
【化７】
2007195559.tif 000009
【０２１０】
Ｈ及びＵシリーズの残りの配列は、はっきりした普通の配列を示さない；加えて、第７ラウンドからの配列は、どちらのシリーズもウイニング単一配列としては出現しなかった。これは、SELEX のそれ以上のラウンドは、ＨＳＶ ＤＮＡポリメラーゼを阻害するための最上のリガンド族をみつける必要があるだろうことを示唆している。
【０２１１】
一次配列 --cgcucaaUAAGGAGGCCAC ．．．．は、拮抗薬種としての候補になるかも知れないように思われるが、しかし、シリーズのこれらのメンバーは、ＤＮＡ合成の阻害剤として、まだ試験されねばならない。UAAGGAGGCCACへ丁度５′の固定化配列が、このサブセットの出現に加わらなければならないように思われる、さもなければ、分担した１２ヌクレオチドは、ランダム化領域内で、可変的に位置づけられただろう。
【０２１２】
実施例１２： 大腸菌リボソーム蛋白質Ｓ１のための核酸リガンドの単離
大腸菌３０Ｓリボソーム蛋白質Ｓ１は、最大の２１ ３０Ｓ蛋白質である。蛋白質は、ポリピリミジンとのその高い親和性に基づいて精製されてきた。そしてピリミジンの多い一本鎖ポリヌクレオチドとむしろ堅く結合すると考えられる。SELEX によりリガンド溶液として同定されるＲＮＡが、ピリミジン中リッチな一本鎖ＲＮＡよりもとに角より情報がリッチであったかどうかが疑問であった。
【０２１３】
ＲＮＡｓ，ＤＮＡｓ，ｃＤＮＡプライマー（ＰＣＲプライマー１）、そしてＰＣＲプライマー２は、ＨＳＶ−１ ＤＮＡポリメラーゼ（例１１参照）のために用いられたそれらのものと同じであった。結合緩衝液は、１００mM塩化アンモニウム＋１０mM塩化マグネシウム＋２mMジチオスライトル＋１０mM塩化トリス、pH7.５であった。室温で結合し、複合体は再度ニトロセルローズ濾過で分離された。この蛋白質は、I. Boni ら．，European J. Biochem., １２１，３７１（１９８２）に従って精製された。
【０２１４】
１３SELEX ラウンド後、２５配列のセットが得られた。これらの配列の中２０以上はシュードノットを含み、これらのシュードノットは、共通の要素を含んでいる。
一般的なシュードノットの構造は、ステム１ａ−ループ１−ステム２ａ−ステム１ｂ−ループ２−ステム２ｂのように図式化される（図３１参照）。Ｓ１蛋白質リガンドの大部分は以下を含む：４から５塩基対のステム，Ｇと５′によりループ１へ約３ヌクレオチドのループ１，しばしばＡＣＡ６から７塩基対のステム，直接ステム１の上に重なっている、５から７ヌクレオチドのループ２，しばしばＧＧＡＡＣで終結している。
【０２１５】
これらのデータの合理的解釈は、蛋白質Ｓ１の活性部位への一本鎖の結合を簡単にしまた強化する形に、そのループをしっかり保持するように、ループ２がステム１を越えて伸びているということである。２つの面に共通するシュードノットの図は、このように見えるだろう：
【０２１６】
【化８】
2007195559.tif 000010
【０２１７】
この図で、塩基対は線とダッシュで示され、ランダム化領域からの塩基の選択は大文字で、Ｙはピリミジン、Ｒはプリンであり、Ｎ−Ｎ′は塩基対を意味し、Ｎはヌクレオチドそして小文字は、ＰＣＲ増幅に用いられた固定化配列からのものである。蛋白質内の一本鎖ポリヌクレオチド結合蛋白質とドメインは、しばしばSELEXの間にシュードノットを選択し、これが、ループ２と呼ばれる伸長した堅い一本鎖を蛋白質の結合部位へ相互作用を最大にするような方式で与えられるように見える。従って、ＨＩＶ−１ ＲＴシュードノットが出現した時は、一本鎖ドメインループ２は、複製中鋳型鎖を保持するＲＴの領域内に結合されていると考えるのが合理的である。すなわち、ほとんどの複製酵素（ＤＮＡポリメラーゼ，ＲＮＡポリメラーゼ，RNA レプリカーゼ、逆転写酵素）は、SELEX から選ばれるリガンドとしてシュードノットを好む鋳型鎖を保つドメインを持つだろうと考えるのが合理的であるように見える。
【０２１８】
実施例１３： ＨＩＶ−１ レブ蛋白質への核酸リガンドの単離
ＨＩＶ−１ レブ蛋白質のＲＮＡ認識部位は複雑であるようで、その機能は、流行性ウイルス疾患の感染を生じさせるに必須である。Olsen ら，Science ，vol.２４７，pp. ８４５−８４８（１９９０）参照 この蛋白質について、認識要因をさらに調べ、標的蛋白質に対するリガンドを単離するため、SELEX 方法を行った。
【０２１９】
候補混合体は、例２に述べたように、３２ヌクレオチド長のランダム化領域によって作られた。レブ蛋白質は、ニトロセルローズ分析により決定された１×（１０-7）Ｍで、生ずる最大値の半分の結合力で開始候補混合体と飽和的に結合することが見出された。ＲＮＡ−蛋白質のすべての結合反応は、２００mM酢酸カリウム、５０mMトリス−塩酸pH7.７、１０mMジチオスライトルの結合緩衝液中で行われた。ＲＮＡと蛋白質稀釈液を、混合し、氷上に３０分置いた後移動し、３７℃で５分間置いた。（結合分析では反応容量が６０μｌであり、内５０μｌが分析される；SELEX ラウンドでは反応容量は１００μｌである）。各反応液は、予め湿らせた（結合緩衝液で）ニトロセルローズフィルターへ吸引され、３mlの結合緩衝液で洗浄後乾燥し、分析のため計数するかあるいは、SELEX 計画の一部である溶出へ向けられる。SELEX の１０ラウンドは、約３×１０（−５）Ｍの濃度のＲＮＡを用いて行われた。レブ蛋白質の濃度は、第１ラウンドでは１×１０（−７）であり、その後のラウンドでは、すべて2.５×１０（−８）であった。最初の候補混合体は、ニトロセルローズとの高い親和性をもつ配列の数を減少するため、ニトロセルローズフィルターをあふれさせた。この行程は、３，６，及び９ラウンドの後にも繰り返した。ｃＤＮＡ生成物は、SELEX のラウンドの繰返しによって典型的に生ずる、異常な大きさの種類を避けるために、選択の３ラウンド毎に精製された。１０ラウンド後、ＲＮＡ集団の可変領域の配列は、ジデオキシ−鎖終結配列決定による測定から、ランダムではなかった。５３単離液がクローン化され、配列決定がなされた。
【０２２０】
それぞれのクローン配列は、表１０に記載されている。すべての配列が、Zucker ＲＮＡ二次構造予測プログラムにより分析された。Zucker，Science ，vol.２４４，pp. ４８−５２（１９８９）；Iaegerら．，Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ，vol.８６，pp. ７７０６−７７１０（１９８９）参照。共通の二次構造に基づき、すべての配列が、表１１に示すように、三つの共通モチーフに群別された。モチフＩとIIは、らせんにより各末端で閉じられた突出したループを含み、立体配座が同じであった。この一般構造は、表１２に図式的に説明され、討論を容易にするためドメインが標識された；それは、５′から３′ステム１ａ（塩基対は３′ステム１ｂへ），ループ１，ステム２ａ，ループ３，ステム２ｂ，ループ２，そしてステム１ｂである。色々のドメインに適合する配列が、表１２に個別の配列として記載されている。（配列３ａでは、相同する一列が１８０°回転すれば、ループによって閉じられるステム１であることに注意せよ）ＲＮＡ分子（固定した側面を接する配列を含む）の折りたたみのエネルギーは表１３に示されている。
【０２２１】
レブのＨＩＶ−１転写物への結合に少なくとも最少限含まれることが決定された野性型レブ応答要素（RRE ）もまたこのプログラムによって折りこまれ、表１２と１３に含まれている。
【０２２２】
配列はまた、Hertz ら，Comput. Appl. Biosci.,vol.６．pp. ８１−９２（１９９０）に基づく方法により、関係した副次配列についても調査された。２つの重要なパタンが同定された。各単離体はそのパタンへの最上の調和を鑑定するため評点され、その結果を表１３にみることができる。関係する副次構造のモチフは、同じ様な立体配座の中の共通した二次構造によって示される；すなわち、最初の配列ＵＵＧＡＧＡＵＡＣＡは、普通ループ１＋３′末端ＣＡとして見出され、第２の情報リッチの配列ＵＧＧＡＣＵＣ（普通ループ３）の５′末端でＵＧと対を作る。そこにはまた、配列IIのＣＵＣへ配列ＩのＧＡＧの塩基対合の強い予測がある。ＣＡのＵＧへの同じ様な対合により、配列ＧＡＵＡＣＡＧがループとして、反対側のＣＵＧＧＡＣＡＣを支配することではモチーフIIはモチフＩと同じである。モチフIIは、ループの大きさと、ループを横切る予想される塩基対がない場合に特にいくつかの配列が異なっている。野性型ＲＲＥのあるドメインがモチフIIによく似ている。モチフIII は、ほかのすべての配列と最も似ていないが、モチフＩの中のように、塩基対ＧＡ−ＵＣに近接する２つの突出したＵ′Ｓによって特徴づけられる。不幸にして、それ以上の比較は困難であり、それは、モチフIII の折り込みパタンが、厳密な二次構造内に３′固定配列領域を含むこと；これらの配列が不変であり、それらの中のどれかの重要性を分析する方法がないためである。各モチフの代表的な折りたたみ配列は、野性型ＲＲＥの折りたたまれた配列によって図２３に示されている。
【０２２３】
配列は、さらに、レブ蛋白質へのそれらの親和性について分析された。鋳型は、in vitroで標識化され、転写物が作られ、個々にそれらのレブ蛋白質への結合能力が分析された多くのクローンの中から得たＰＣＲ′ｄであった。これらの結合曲線は、図２４から２８に示されている。野性型ＲＲＥを含む、オリゴヌクレオチド鋳型からの標識転写物もまた合成され、高度に安定な立体配座内の共通のモチフであることが推定されている。実験的変動を調節するため、最高の結合配列、単離６ａをすべての結合実験の標準として分析された。ＲＮＡ−蛋白質は先に記載の通りに処理されたが、稀釈したＲＮＡ′ｓは、９０℃で１分加熱後、氷上で冷却し、その後に混合した。単離体６ａの平均Ｋａは8.５×１０（−８）Ｍであり、この実験の結果は表１３に示されている。
【０２２４】
図２４の結合曲線は、進化した集団（Ｐ）が開始候補混合体へのレブ蛋白質の結合割合の約３０倍改善されたことを示している。野性型ＲＲＥの結合は、最も豊富なクローン，ＩＣのそれによく似ている。この実験はまた、レブ結合相互作用が二次構造に対して如何に敏感であるかを示している。単離体６ａと６ｂは、高情報含有領域内で同じであるが、しかし、二次構造のレベルで全く異なり、結果として、三つのヌクレオチドの位置が異なっている。ステム１の塩基対合が予測されるこれらの変化は、６ｂの親和性が２４倍低い。二次構造の異常に対する感受性は、図２５に示すように、単離配列１７の結合により、さらに明らかに示される。単離配列１７は、表１２に示すように、最大の情報得点をもっている。しかしながら、表１１に示すように、ループ１の５′末端に余分な突出したＵがある。単離配列１７′ｓのこの余分なＵが、モチフＩの他の配列に比較してレブに対する親和性を減少させる結果をもたらしている。逆に、ループ２配列の１ヌクレオチドの欠失は、交差突出塩基対合の見込みを減少させるものであっても、レブ相互作用によって良くもちこたえられている。
【０２２５】
他の注目すべき共有性は、ＣＡがＵＧとの対合によりステム２が始まる配列ＡＣＡ対ＵＧＧの保存である。この配列は、野性型ＲＲＥと同じく、モチフＩとIIによって分担されている。配列１１と１２は、この位置（表１２参照）で塩基対の置換を示し、配列１２は、試験されて、他のモチフＩ配列の大部分に比較して親和性が減少した。
【０２２６】
SELEX によって決定された、レブリガンドになるべきＲＮＡ配列は、一次及び二次構造によって級分けされるだろう。立体配置される２つのらせんが隣接する、非対称の突出部の共通の発生は、特異的に一本鎖と二本鎖ヌクレオチドを保護する。突出部分を越える、塩基の対合が、分離された配列（モチフＩ）の多くについて予測されるけれども、それは、レブの相互作用にとって必須でもなく重要でもないだろう。９または３の大きさでは不都合な点がみられるループ１にとって、最適の大きさは８（モチフＩ）、または６（モチフIII ）であるように思われる。ループIII のための最適の大きさは５と４である。それに加えて、これらのリガンドの色々なドメインとレブの交互作用は、付加的なものであろう。モチフIIは、ステム２におけるループ１と３の接続点で、第一に、モチフＩと似ている。モチフIII は、ステム１でのループ１と３の接続点で、モチフＩと似ている。ＨＩＶ−ｒｅｖのためのモチフＩとIIの核酸溶液の共通の図解が表２９と３０に示されている。
【０２２７】
クローン集団における配列の存在量は、厳密には、レブ蛋白質への親和性に相関しない。SELEX 法を通して用いられたレブ蛋白質の濃度は、すべてのこれらの単離集団を有意なパーセンテージで結合するのに十分であった可能性がある。結論として、レブへの結合のための厳密さの欠けた選択に、ＰＣＲの間の、ｃＤＮＡとＤＮＡの複製能力の選択性が重なったかも知れない。これらのリガンドの高度に組立てられた性質と、これらの鋳型におけるｃＤＮＡ合成の効率上の可能性のある差異が、この潜在的な複製の偏りを強めている。また、SELEX 工程中いくつかの突然変異が発生する。配列６ａは６ｂに非常に似ているので、それらは共通の祖先をもっているに違いない。SELEX のラウンド中、この比較的おそい出現は、標的への高い親和性にかかわりなく、この配列の不足を説明できるかも知れない。同じように、出現したいくつかのリガンドは、最初の候補混合体に存在し、クローン集団には表れない、祖先の配列からの選択の間に、比較的最近変異を生じたのかも知れない。
【０２２８】
ここに開示した発明は、ここに開示した実施例の範囲に限定されない。開示されたように、この発明は、多くの核酸リガンドと標的に関する技術に普通に習熟している人々に適用することができる。この技術を個々の場合に適用する際、適当な修飾、応用、便法を用いることができ、ここに開示し、権利を主張する範囲内で、熟練者に理解されるだろう。
【０２２９】
【表２】
2007195559.tif 000011
【０２３０】
【表３】
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【０２３１】
【表４】
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【０２３２】
【表５】
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【０２３３】
【表６】
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【０２３４】
【表７】
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【０２３５】
【表８】
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【０２３６】
【表９】
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【０２３７】
【表１０】
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【０２３８】
【表１１】
2007195559.tif 000020
【０２３９】
【表１２】
2007195559.tif 000021
【０２４０】
【表１３】
2007195559.tif 000022
【０２４１】
【表１４】
2007195559.tif 000023
【０２４２】
【表１５】
2007195559.tif 000024
【０２４３】
【表１６】
2007195559.tif 000025
【０２４４】
【表１７】
2007195559.tif 000026
【０２４５】
【表１８】
2007195559.tif 000027
【０２４６】
【表１９】
2007195559.tif 000028
【０２４７】
【表２０】
2007195559.tif 000029
【０２４８】
選択。よく混合した溶液中での可逆的な蛋白質−ＲＮＡ複合体に関する簡単な速度論的機構は、次のように記述される。
【０２４９】
【数１】
2007195559.tif 000030
【０２５０】
ここで、〔Ｐｆ〕は、遊離蛋白質濃度であり、〔ＲＮＡｆi 〕は、遊離ＲＮＡ種-iの濃度であり、〔Ｐ：ＲＮＡi 〕は、蛋白質−ＲＮＡ種i 複合体の濃度であり、ｋ+iは、遊離蛋白質と遊離ＲＮＡ種-iの会合の速度定数であり、ｋ-iは、蛋白質−ＲＮＡ種i 複合体の解離定数であり、ｎは、ユニークな速度定数のセットをもつRNA 配列の数である。多重結合部位または協同作用を含む別の機構が、この単純な式の適当な延長により、その後の処理に関し、考察することができた。上式により表わされたシステムのため、時間の函数として、各蛋白質−ＲＮＡ種i 複合体の濃度変化を示す基礎的な化学−速度論または質量−作用等式：
【０２５１】
【数２】
2007195559.tif 000031
【０２５２】
ここで、〔Ｐｆ〕，〔ＲＮＡfi〕及び〔Ｐ：ＲＮＡi 〕は、遊離蛋白質、遊離ＲＮＡ種i 及び蛋白質−ＲＮＡ種-i複合物の、時間ｔにおける濃度である。
遊離蛋白質の濃度は、全蛋白質濃度と全蛋白質−ＲＮＡ複合体間の差（〔Ｐ〕−Σ〔Ｐ：ＲＮＡk 〕）である；同様に、遊離ＲＮＡ種-iの濃度は、全ＲＮＡ種-i濃度と蛋白質−ＲＮＡ種-i複合体濃度間の差（〔ＲＮＡi 〕−〔Ｐ：ＲＮＡi〕）である：
【０２５３】
【数３】
2007195559.tif 000032
【０２５４】
これらの動力学的方程式は、速度または平衡分析の何れにも用いることができる。連続微分形は、各プロセスの平均速度が、そのプロセスにおける変動に比較してはるかに大きければ常に有効である。あるいは云いかえれば、等式(3) は、それぞれの独自の速度定数で代表される数分子をもつプールされたＲＮＡの記述としては正確である。最適結合ＲＮＡのわずか１分子、またはわずかの分子がありさえすれば、結合の統計的記述は、最適結合ＲＮＡの回収の高い可能性を与える條件の決定に用いることができる。これらの統計式は成功の可能性について、次項において誘導される。平衡状態では、各蛋白質−ＲＮＡ種-i複合体の濃度は０に等しい。
【０２５５】
【数４】
2007195559.tif 000033
【０２５６】
等式(3) に定義するシンボルと、蛋白質−ＲＮＡ種-i複合物の平衡解離定数であるKdi により（Kdi ＝Ｋ-i／Ｋ+i）。
ただし１つのＲＮＡ種だけを考慮すると（すなわちｎ＝１）、蛋白質−ＲＮＡ複合物の平衡濃度のための分析溶液は、次の２次方程式により解が求められる：
【数５】
2007195559.tif 000034
【０２５７】
２つの実数ルートの内、１つは物理的に理解できる：
【０２５８】
【数６】
2007195559.tif 000035
【０２５９】
もちろん、Michaelis-Menten式の中のそれのように、複合物の平衡または準定常状態の濃度について、多くの古典的近似値があるが、SELEX で用いる全ＲＮＡ及び蛋白質濃度の範囲にわたり、十分な精度をもつものはない。（古典的近似値のいくつかの落し穴と限界に関する討論を知るためには、Savageau, １９９１；Straus & Goldstein, １９４３；Webb, １９６３を参照のこと）。蛋白質上に単一の結合部位をもつ単一ＲＮＡ種の簡単な可逆性解離に関する２次反応式の分析溶液は、SELEX で用いられる全ＲＮＡと蛋白質濃度の範囲にわたり正確であるけれども、そしてまた２つの競合する種の結合濃度を、三次方程式の分析溶液によって計算することができるけれども、３つまたはそれ以上の競合するＲＮＡ種が考えられる場合は、蛋白質−ＲＮＡ複合体の平衡濃度を計算するには、反復の多くの方法が要求される。
【０２６０】
我々は、各蛋白質−ＲＮＡ種-i 複合体〔Ｐ：ＲＮＡi 〕、与えられた蛋白質濃度〔Ｐ〕、ＲＮＡ種-i濃度分布〔ＲＮＡi 〕、そして平衡解離定数の分布Kdiの平衡濃度を解くためのコンピュータープログラムを開発した。ニュートン法（たとえばLeunberger, １９７３；Press et al., １９８８参照）による等式(4)の絶対溶液におけるヤコビアンマトリックス（たとえばLeunberger, １９７３参照）は、次の式を用いて計算される：
【０２６１】
【数７】
2007195559.tif 000036
【０２６２】
ここでａijは、ヤコビアンマトリックスのｉ行、ｊ列、δii＝１そしてδij＝０ i≠jしばしば、ニュートン法の成功は、溶液についての最初の判断の良さによっており（たとえばLeunberger, １９７３；Press et al., １９８８）、この場合は、各蛋白質−ＲＮＡ種-i 複合体〔Ｐ：ＲＮＡi 〕の平衡濃度である。プールした全ＲＮＡのバルクKdを用いることにより、すべての蛋白質−ＲＮＡ複合体中の蛋白質濃度を推定することができる：
【０２６３】
【数８】
2007195559.tif 000037
【０２６４】
ここで〔Ｐ：ＲＮＡ〕は、全蛋白質−ＲＮＡ複合体の濃度であり、〔ＲＮＡ〕は、プールした全ＲＮＡの濃度であり、＜Kd＞はプールした全ＲＮＡのバルク平衡解離定数であり、次式を用いて計算した。
【０２６５】
【数９】
2007195559.tif 000038
【０２６６】
ここで〔ＲＮＡ〕[P]/2 は蛋白質の半分と結合する全ＲＮＡ濃度であり、Ｆi0 ＝〔ＲＮＡi 〕／〔ＲＮＡ〕である。複合体中の蛋白質に関するこの評価により、各蛋白質−ＲＮＡ種-i 複合体の濃度に関する初期近似値は、次式を用いて求めることができる。
【０２６７】
【数１０】
2007195559.tif 000039
【０２６８】
(4) 式を満足する〔Ｐ：ＲＮＡi 〕の値をもつ溶液は(7) 式を用いるニュートン法の反復適用により高レベルの精度で精製することができる。この遂行において、我々は、ニュートンの方法の４または５回以下の反復で、１２桁以上の有効数字をもつ溶液に到達する。精密な溶液へのこの急速な集中化は、手始めに−各ＲＮＡ種の平衡解離定数と数度による−代表的に１またはそれ以上の有効数字を与える式(10)における最初の近似のためである。このレベルの精度を得る一つの理由は、〔Ｐ〕−〔Ｐ：ＲＮＡ〕がKdi よりも大きい時、たとえば〔ＲＮＡ〕がKdi より小さいかまたはKdi が＜Kd＞より小さい場合は、〔Ｐ：ＲＮＡ〕におけるエラーが式(10)の中で消されることである。面白いことに、これは、蛋白質−ＲＮＡ種−ｉ複合体にとってよりよい結合は、バルクＲＮＡプールよりも、精度が高くなる傾向があることを意味する。濃縮度計算の初期精度の代表例−各ラウンド毎、最適結合ＲＮＡ種で構成される全ＲＮＡプールの断片の増加として定義され、また式(10)を式(20)−に置換することによって近似する。
【０２６９】
全体としての精度は、すべての蛋白質−ＲＮＡ種-i複合体について式(10)を用い計算した平衡濃度の精度の反映である。次の項で、我々は、最大の濃縮のための最適ＲＮＡと蛋白質濃度を計算するため、この精度を利用する。
【０２７０】
分配。フィルター結合（Tuerk 及びGold, １９９０）、ゲル−運動性移動（Blackwell 及びWeintraub,１９９０）、親和性クロマトグラフィー（Ellingtor 及びSzostak,１９９０；Green et al., １９９０；Oliphant及びStruhl, １９８７；Oliphat 及びStruhl, １９８８）、抗体沈澱、相分配、または核開裂の防禦（Robertson 及びJoyce,１９９０）を含む核酸配列の異なる種の分配方法がSELEX による利点として用いられる。たとえば、フィルター結合により、大抵の蛋白質−ＲＮＡ複合体はニトロセルローズに突きささるが、大部分の遊離ＲＮＡ分子は流される（Uhlen beck et al.,１９８３；Yarus,１９７６；Yarus 及びBerg, １９６７；Yarus 及びBerg, １９７０）。突きささり、次にフィルターから回収することのできる蛋白質−ＲＮＡ複合体の実際の断片は、次のセクションで処理される。
【０２７１】
遊離ＲＮＡ分子の断片もまた非特異的バックグランドとしてフィルターに突きささるので、フィルター上に集められた各ＲＮＡ種-iの全量は、蛋白質−ＲＮＡ複合体中の最適結合ＲＮＡ分子からの望ましいシグナルと、蛋白質−ＲＮＡ複合体中に非特異的バックグランド＋競合的ＲＮＡ分子として集められた遊離ＲＮＡ分子からのノイズの両方を考慮する次式を用いて計算される。
【０２７２】
【数１１】
2007195559.tif 000040
【０２７３】
ここでＲＮＡi filtは、集められたＲＮＡ種-iの分子の数であり、Ｖolは、フィルターを通過した反応混合液の容量であり、〔Ｐ：ＲＮＡi 〕は、前項で述べたように計算された蛋白質−ＲＮＡ種-i複合体の平衡濃度であり、ＢＧは、非特異的バックグランドとして集められた遊離ＲＮＡの断片であり、また〔ＲＮＡi〕は、全ＲＮＡ種-i濃度である。どの分配方法であっても、典型的には、結合及び非結合リガンドの完全な分離よりは少ない結果となるので、それぞれのラウンドで、結合したリガンドにより、バックグランドとして集められた遊離リガンドの断片の測定が必要である。
【０２７４】
既に述べたように、溶液中のすべての蛋白質−ＲＮＡ複合体がフィルター上に集められるとは限らない。さらに、強く結合した複合体中のＲＮＡは、弱く結合した複合体中のＲＮＡよりもフィルター上によりよく保持されるだろう。これが真実である限り、強く結合したＲＮＡ分子としての濃縮は、SELEX の各ラウンドでさらに強化されるだろう。一方、もしいくらかの分子が、他と同じようにフィルターから溶出されなければ、それらの濃縮度は減少するだろう。
【０２７５】
増幅と再標準化。フィルターから回収された各ＲＮＡ 種-iの量は、次式により計算される。
【０２７６】
【数１２】
2007195559.tif 000041
【０２７７】
ここでＦＲは、フィルターから回収することができるＲＮＡの断片であり、ＲＮＡi filtは、式(11)により計算されるフィルター上に集められたＲＮＡ種-iの分子数である。この処理で、ＦＲの値は、一定であると推測され、フィルターに突きささる蛋白質−ＲＮＡの断片と、回収されるこれらの複合物中のＲＮＡの断片の両方から決定され、ＰＣＲのためのｃＤＮＡを作るために逆転写によりコピーされる。ＦＲはすべての種で一定であるという仮定は、十分な時間が与えられているので、合理的な出発点であり、すべての分子がＰＣＲのために同じプライマー部位をもち、また過剰なプライマーが用いられる時は、各種−少なくても多くても−プライマー分子によるアニーリングの可能性は、実質的には同じである。
【０２７８】
また、各ＲＮＡ分子は、同じ長さであるので、大きさに基づく増幅速度の差はない。もちろん、もしどれかのＲＮＡ種が、ｃＤＮＡ合成のためのプライマーアニーリングの妨害をするような二次構造をもつか、あるいはまた、相当するｃＤＮＡの一次または二次構造がＰＣＲ増幅中のＤＮＡポリメラーゼの速度をおそくするならば、その種の濃縮は減少する。どんな構造が実際に差をもたらすのか予測する良い法則もないので、我々はこれらの影響は取り入れない。これらの構造に対する研究がさらに進めば、有効な影響をSELEX の数学的記述に加えることができる。
【０２７９】
フィルターから回収されたＲＮＡの全量は、ＰＣＲ増幅用としてｃＤＮＡのコピーを作るために集められた各種の分子数を集計して計算される。
【０２８０】
【数１３】
2007195559.tif 000042
【０２８１】
ＰＣＲプライマー部位がなければこれらの分子は増幅しないので、“担体”または“非特異的競合剤”は、式(13)における全数から除外すべきである。親和性測定の計画は、しばしばこれらの非特異的競合ＲＮＡ分子を含み、そしてこのような分子がまた、SELEX で使用されるならば、明らかにそれらは非増殖的である筈である。面白いことに、非特異的競合分子が、最適結合リガンド分子のように、同じ部位において蛋白質と相互作用があれば添加競合剤の主な結果は、選択に利用される特異性部位の数の減少である。そこで、非特異的競合分子の高濃度の存在下で、望ましい量の増幅可能なリガンド分子と結合する蛋白質の濃度を決定するために、各適定におけるこれらの分子の適当な濃度を含めて修正した結合曲線を作らなければならない。高濃度の非特異的、非増幅性競合分子をSELEX の各ラウンドに用いる利点は、ラブウェア上の非特異的な部位への増幅性リガンド分子の吸収の減少と、標的蛋白質上の非特異的部位への増幅性リガンド分子の結合の減少あるいは“偽似分配”部位−しかし、このような部位が有意な数で存在し、用いられた非特異的競合分子の量で有効に飽和される場合のみ−上で非特異的バックグランドとして集められる遊離の増幅性分子の断片の減少を含むことができる点である。もしもこれらの條件が適合しなければ、非特異的競合分子の添加の効果は、本質的には、用いた蛋白質の量を減少することと同じである。
【０２８２】
(13)式の全量に比較して、1 ラウンド後に回収した各増幅性ＲＮＡ種-iの量は次のように計算される：
【０２８３】
【数１４】
2007195559.tif 000043
【０２８４】
ｃＤＮＡコピーのＰＣＲ増幅と、in vitroの転写( すべてのｃＤＮＡ分子上の同じプロモーター部位から）により元の濃度に戻るＲＮＡプールの再標準化後、SELEX の１ラウンド後の各ＲＮＡ種の濃度は：
【０２８５】
【数１５】
2007195559.tif 000044
【０２８６】
ここで〔ＲＮＡi 〕は、ＲＮＡプールの全濃度である。SELEX の各追加ラウンドのため、開始断片がＦi 0 （式(9) 参照) である１ラウンドから各ＲＮＡ種としてのＦi 1 によって、あらゆるＲＮＡ種の濃度を、式(7) −(15)の再反復によって算定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０２８７】
【図１】図１はバクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子４３メッセンジャーＲＮＡのリボヌクレオチド配列の図である。図示した部分はgp４３に結合することが知られている領域中の配列である。太字の大文字はgp４３の結合に必要な情報の範囲を示す。８個からなるループはSELEX のための１つの候補集団を生ずるために無作為配列で置換されたものである。
【図２】図２はＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（gp４３）に結合するＲＮＡｓに関するループ配列バリアントを選択するためのSELEX 過程の模式図を例示したものである。ＲＮＡのテスト混合物の調製のためのＤＮＡ標的は、表１infra に与えられた配列を有する、オリゴマー３，４および５の連結反応によってステップａに示されたようにして調製された。ステップａでの正しい連結反応が起こったかどうかはオリゴマー３と４および４と５をそれぞれ架橋する相補配列（表１に示す）を有するオリゴマー１および２とハイブリダイズさせることによって確かめられた。その結果得られた１１０−塩基標的をゲル精製し、オリゴ１とアニールし、そしてin vitro 転写反応に用いて(Miligan et al. （１９８７）Nucl. Acids. Res.１５：８７８３−８７９８）、８−塩基ループの無作為配列を含む最初のＲＮＡ混合物も産生した（ステップｂ）。その結果得られた転写体をゲル精製し、gp４３への結合に関してニトロセルロースフィルター上で選択を行った（ステップｃ）。このことは例１に述べた通りである。選択したＲＮＡｓを３ステップの過程を通じて増幅した：(d) オリゴ５（表１）を用いて選択されたＲＮＡｓのｃＤＮＡコピーを逆転写合成酵素を用いて作った； (e) Innis et al.（１９８８）Proc. Natl. Acad. Sci.USA ８５：９４３６が記載したように、必須のＴ７プロモーター配列を有する、オリゴ１（表１）のＴag ＤＮＡポリメラーゼチェイン延長とオリゴ５を用いてｃＤＮＡを増幅した；そして(f) 増幅した二重鎖ＤＮＡ産物をin vitro で転写した。その結果選択された増幅ＲＮＡs をつぎの回の選択で用いた。
【図３】図３はgp４３へのＲＮＡループバリアントの結合に関してSELEX から得られたin vitro 転写体の電気泳動バッチ配列決定反応のオートラジオグラフのコンポジットである。図は実験Ｂの選択条件に関する選択サイクルの数（２，３および４サイクル）の関数としてのループ配列成分における変化を示す：ここで実験Ｂにおいては全選択サイクルに関してgp４３の濃度は約３×１０-8Ｍ、ＲＮＡの濃度は約３×１０-5Ｍであった。配列決定はGauss et al.（１９８７）Mol. Gen.Genet.２０６：２４−３４に述べた方法で実施した。
【図４】図４は異なる結合条件を用いてgp４３に対するＲＮＡループバリアントの結合に関するSELEX 増幅の４回目のラウンドから選択されたＲＮＡｓのバッチＲＮＡ配列のオートラジオグラフのコンポジットである。実験Ａにおけるgp４３の濃度は約３×１０-8ＭでＲＮＡ濃度は約３×１０-7Ｍであった。実験Ｂではgp４３は約３×１０-8Ｍ、ＲＮＡは約３×１０-5Ｍであった。実験Ｃではgp４３は約３×１０-7ＭでＲＮＡは約３×１０-5Ｍであった。
【図５】図５は実験Ｂの選択条件下でのgp４３に対する結合に関して選択されたループバリアントに関する３つの配列決定ゲルのオートラジオグラフのコンポジットである（例１参照）。左方の配列ゲルは選択／増幅の４回目のラウンドの後の選択ＲＮＡのバッチ配列決定である。真中と右側の配列ゲルはバッチＲＮＡｓから得られた２つのクローン化分離物の二重鎖ＤＮＡ配列決定ゲルである。選択されたＲＮＡのバッチは２つの主要なバリアントから成り、その１つは野性型配列（真中配列ゲル）、他は新しい配列である（右側ゲル）。
【図６】図６は異なる選択ＲＮＡループ配列バリアントおよび無作為ループ配列を有するＲＮＡに対するgp４３濃度の関数としてgp４３に結合したＲＮＡの百分率のグラフである。野性型ループ配列AAUAACUCの結合を中空丸と実線で示した；主バリアントループ配列AGCAACCUを“Ｘ”と点線；主（メジャー）バリアントループ配列AAUAACUUを中空四角形と実線；マイナーバリアントループ配列AAUGACUCは黒丸と点線；マイナーバリアントループ配列AGCGACCUを×印と点線；そしてループ配列の無作為混合物（NNNNNNNN) の結合を中空丸と点線で示す。
【図７】図７は８個の塩基対ループ中で無作為化された候補集団から新しいgp４３結合ＲＮＡを選択するSELEX の４回目のラウンドの後に達成された結果を図で要約したものである。SELEX は図４に示されたバッチ配列から期待される“見かけの”コンセンサスを生じなかったが、その代りに野生型と単一主バリアントがほぼ同じ割合のほか３個の単一変異体を生じた。２０のクローン化分離物のうちの各スピーシスの頻度を、図６に示したフィルター結合アッセイから得られたそれぞれの近似親和力定数（Kd）とともに示した。
【図８】図８は酵素ターミナルトランスフェラーゼ（ＴＤＴ）とＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ pol）を用いた候補核酸リガンドの合成を示す一連のダイアグラムである。５′プライマーまたは一次リガンド配列に対して、４つのデオキシリボヌクレオチドトリフォスフェート（ｄＮＴＰｓ）の存在下ターミナルトランスフェラーゼとインキュベートすることによって無作為配列のテール(tail)を提供する。単一のデオキシリボヌクレオチドトリフォスフェート（たとえばｄＣＴＰ）の存在下、同じ酵素を用いて無作為セグメントのホモポリマーテーリングはポリ−Ｇテール３′プライマーに対するアニーリング部位を提供する。アニーリングののち、ＤＮＡポリメラーゼの作用によって二重鎖分子の生成が完了する。もし希望すれば、ポリメラーゼ連鎖反応によって混合物をさらに増幅させる。
【図９】図９は標的蛋白質と空間的に分離した２つの結合相互作用を有する大きな核酸リガンドを選択するためにSELEX を用いたプロセスを示すダイアグラムである。このプロセスは２つの段階を含み、２番目の段階は１番目の段階の延長であることから“ウォーキング”と名付けられている。図の上の部分はSELEX の最初のラウンドで選択された核酸リガンドが蛋白質に１番目の結合部位で結合した標的（“同題にしている蛋白質”）を示す。末端トランスフェラーゼによって触媒された反応は生成した一次リガンドの長さを伸ばして、一次リガンドを含む保存領域を有する新しい１組の無作為配列候補を生ずる。図の下の部分は蛋白質の２次結合部位での二次リガンド相互作用から得られた、増進された結合を基にしたSELEX の２番目のラウンドの結果を示す。“一次”と“二次”という語は単なる操作を示す言葉で一方が他よりも高い親和性を有するということを意味しない。
【図１０】図１０と図１１は２つのステージにおいてSELEX を用いた選択過程のダイアグラムである。図１０では、特異的結合体、たとえば標的蛋白質の阻害剤に結合した架橋オリゴヌクレオチドと複合体を形成した標的上の２番目の結合部位に結合するリガンドを選択するのにSELEX を適用した。架橋オリゴヌクレオチドは近接しうる２番目の結合部位に結合するリガンドの選択がうまくいくようにガイドとして作用する。
【図１１】図１１では、初めから選択された二次部位と一次標的ドメインの両方に結合するリガンドを作るのに２番目のSELEX が適用される。そこで生ずる核酸は非常に強く結合するだろうし、それらは標的蛋白質の阻害剤として振舞い、あるいは標的蛋白質の阻害剤または基質に対して拮抗するかもしれない。
【図１２Ａ】図１２は例２で用いた候補混合物の構成に用いるオリゴマーの配列と配置を示す。最上列はオリゴマー１ｂと２ｂそれぞれの配列を左から右へ示す（表２infra 参照）。２列目は左から右へオリゴマー３ｂ，４ｂおよび５ｂの配列を示す（表２）。オリゴマーの正しい連結反応は配列が相補的であるオリゴマー１ｂと２ｂとのハイブリダイゼーションで確かめた。生成した連結標的をゲル精製し、オリゴマー１ｂにアニールしてin vitro 転写反応に使用し(Milligan et al.（１９８７）) 、図の最下列に“in vitro 転写体”と記したＲＮＡ候補混合物を生成した。図に示すように、候補混合物は３２個のヌクレオチド無作為セグメントを含んでいる。
【図１２Ｂ】図１２は例２で用いた候補混合物の構成に用いるオリゴマーの配列と配置を示す。最上列はオリゴマー１ｂと２ｂそれぞれの配列を左から右へ示す（表２infra 参照）。２列目は左から右へオリゴマー３ｂ，４ｂおよび５ｂの配列を示す（表２）。オリゴマーの正しい連結反応は配列が相補的であるオリゴマー１ｂと２ｂとのハイブリダイゼーションで確かめた。生成した連結標的をゲル精製し、オリゴマー１ｂにアニールしてin vitro 転写反応に使用し(Milligan et al.（１９８７）) 、図の最下列に“in vitro 転写体”と記したＲＮＡ候補混合物を生成した。図に示すように、候補混合物は３２個のヌクレオチド無作為セグメントを含んでいる。
【図１３】図１３はＲＮＡがとることが知られているいろいろの二次構造を含む仮想的なＲＮＡ配列を示す。図に含まれるのはつぎのものである：Ａヘアピンループ、Ｂバルジ、Ｃ非対称バルジ、Ｄシュードノット。
【図１４】図１４はＨＩＶ−ＲＴに対するリガンド親和性のニトロセルロースフィルター結合アッセイを示す。示してあるのはいろいろの濃度のＨＩＶ−ＲＴのニトロセルロースフィルターに結合したインプットＲＮＡの百分率である。
【図１５】図１５はＨＩＶ−ＲＴに対するリガンド親和性のニトロセルロースフィルター結合アッセイをさらに付加して行った結果を示す。
【図１６Ａ】図１６はＨＩＶ−１ＲＴリガンド1.１および1.３ａ ａ）3 ′境界決定に関する情報を示す。ＲＮＡを５′末端標識し、部分アルカリ加水分解してニトロセルロースフィルターで選択し、変性した８％ポリアクリルアミドゲルで分離してオートラジオグラフにかけた。約９０ピコモルの標識ＲＮＡと８０ピコモルのＨＩＶ−１ＲＴを0.５、2.５、および５mlの緩衝液中で混合して、ニトロセルロースフィルターを通して洗滌する前に３７℃で５分間インキュベートした。溶出ＲＮＡｓを各実験に用いたＨＩＶ−１ＲＴの最終濃度の下に示した。また部分的なＲＮase Ｔ１分解産物も示したが、これによって、矢印b)５′境界決定によって隣接配列上の情報境界を同定することができる。上述と同じa)条件下で５′境界を決定した。
【図１６Ｂ】図１６はＨＩＶ−１ＲＴリガンド1.１および1.３ａ ａ）3 ′境界決定に関する情報を示す。ＲＮＡを５′末端標識し、部分アルカリ加水分解してニトロセルロースフィルターで選択し、変性した８％ポリアクリルアミドゲルで分離してオートラジオグラフにかけた。約９０ピコモルの標識ＲＮＡと８０ピコモルのＨＩＶ−１ＲＴを0.５、2.５、および５mlの緩衝液中で混合して、ニトロセルロースフィルターを通して洗滌する前に３７℃で５分間インキュベートした。溶出ＲＮＡｓを各実験に用いたＨＩＶ−１ＲＴの最終濃度の下に示した。また部分的なＲＮase Ｔ１分解産物も示したが、これによって、矢印b)５′境界決定によって隣接配列上の情報境界を同定することができる。上述と同じa)条件下で５′境界を決定した。
【図１６Ｃ】図１６はＨＩＶ−１ＲＴリガンド1.１および1.３ａ ａ）3 ′境界決定に関する情報を示す。ＲＮＡを５′末端標識し、部分アルカリ加水分解してニトロセルロースフィルターで選択し、変性した８％ポリアクリルアミドゲルで分離してオートラジオグラフにかけた。約９０ピコモルの標識ＲＮＡと８０ピコモルのＨＩＶ−１ＲＴを0.５、2.５、および５mlの緩衝液中で混合して、ニトロセルロースフィルターを通して洗滌する前に３７℃で５分間インキュベートした。溶出ＲＮＡｓを各実験に用いたＨＩＶ−１ＲＴの最終濃度の下に示した。また部分的なＲＮase Ｔ１分解産物も示したが、これによって、矢印b)５′境界決定によって隣接配列上の情報境界を同定することができる。上述と同じa)条件下で５′境界を決定した。
【図１７】図１７はＲＮＡリガンド1.１によるＨＩＶ−１ＲＴの阻害を示す。３２Ｎ候補混合ＲＮＡの３倍希釈の系列と１０μＭから4.６nMにわたる最終反応濃度のものをＨＩＶ−ＲＴと前もって混合し、２００mM ＫＯＡｃ，５０mM Ｔris-HCl,pH7.７，１０mMジチオスレイトール、６mM Mg(OAc)2 および0.４mM ＮＴＰＳの６μＬ中で３７℃、５分間インキュベートした。別の試験管中ではＲＮＡ標的（オリゴ７と９を用いてU. S. Biochemical Corp. から入手したＴ７−１のＰＣＲ産物から転写）と標識オリゴ９を混合して９５℃で１分間加熱し、ついで１０mMＴris-HCl, pH７，0.１mM ＥＤＴＡ中、氷上で１５分間冷却した。この標的の４μｌを酵素−阻害剤混合物の各６μｌに加えて反応をスタートさせて３７℃で５分間インキュベートしたのち反応を停止させた。すべての反応における最終濃度はＨＩＶ−１ＲＴ，ＲＮＡ標的および標識プライマーがそれぞれ１６nM，１３nMおよび１５０nMであった。各反応の延長産物を示した。
【図１８】図１８はリガンド1.１によるＨＩＶ−１ＲＴ阻害とＭＭＬＶ ＲＴおよびＡＭＶ ＲＴへの作用を比較したものである。図に示した結果として生じた濃度で調製した５倍希釈の阻害剤を用いたことを除いて、実験は図１７と同じように実施した。希釈およびゲルバンド強度をクーマシー青（Coomasie blue) と銀染色、Biored蛋白質濃度アッセイおよび活性アッセイと比較することによって各ＲＴの濃度をＨＩＶ−ＲＴの濃度に規格化した。
【図１９】図１９はＲ−１７コート蛋白質リガンド溶液を表わす選択ヘアピンのコンセンサス配列を示す。各位置のヌクレオチドの表示を格子内に示した。“バルジ”と表記した欄は、対応するステム塩基対間のステムの一方または両サイド上のエクストラーヘリカルヌクレオチドを有するクローンの数を示す。“エンド”と表記した欄はヘアピンがその前の塩基対位置で終っているクローンの数を表わす。
【図２０】図２０はブラディキニンに対する３０ＮバルクＲＮＡの結合曲線を示す。分析はスピンカラム；１０mM ＫＯＡｃ，１０mM ＤＥＭ，pH7.５；ＲＮＡ濃度1.５×10-8Ｍを用いて行なった。
【図２１】図２１はある構造モチーフ中で濃度化される候補混合物の生成で用いる標的を示す。標的Ａはヘアピンループ中で候補混合物を濃度化するように設計されている。標的Ｂはシュードノット中の候補混合物を濃度化するように設計されている。
【図２２】図２２はＨＩＶ−rev リガンド溶液のモチーフＩおよびIIに対するステム−ループ配置の模式図である。ループ１と３の間のステム１と２中の点線は塩基対の可能性を示す。
【図２３】図２３は分離体６ａ，１ａおよび８のrev リガンドサブドメインの折りたたみ二次構造を示し、これらはそれぞれモチーフＩ，IIおよびIII を示している。また比較のために野性型ＲＲＥ ＲＮＡの予想される折りたたみ構造である。
【図２４】図２４は種々のＨＩＶrev 蛋白質濃度のニトロセルロースフィルターに結合したＲＮＡのインプットカウントに対する百分率である。また３２Ｎ出発集団（＃）の結合曲線、１０ラウンドののちに生じた集団（Ｐ）の結合曲線、およびオリゴ８と９（Ｗ）から成る標的から転写された野性型ＲＲＥ配列の結合曲線も示す。
【図２５】図２５はモチーフＩ(a)revリガンドの比較である。パラメータは図２４と同じである。“コンセンサス”構成体（Ｃ）の結合曲線も示してある。
【図２６】図２６はモチーフＩ(b)revリガンドの比較である。パラメータは図２４と同じである。
【図２７】図２７はモチーフII revリガンドの比較である。パラメータは図２４と同じである。
【図２８】図２８はモチーフIII rev リガンドの比較である。パラメータは図２４と同じである。
【図２９】図２９はモチーフＩと呼ばれるＨＩＶrev に対するコンセンサス核酸リガンド溶液を示す。
【図３０】図３０はモチーフIIと呼ばれるＨＩＶrev に対するコンセンサス核酸リガンド溶液を示す。
【図３１】図３１はシュードノットの模式表示である。シュードノットはここでステムＳ1 とＳ2 およびループ１，２，３と呼ばれる２つのステムと３つのループから成る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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