(57)【要約】      （修正有）【課題】グルコース以外の少なくとも１つの選択された糖基質に対する作用性が、対応する野生型酵素と比較して低下した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱＧＤＨ）を提供する。【解決手段】アシネトバクター  バウマンニ  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列における特定の位置、あるいは他のアシネトバクター属または他の種由来のＰＱＱＧＤＨにおける、上記と同等の位置において少なくとも１つ以上のアミノ酸挿入、置換を有する、改変型ＰＱＱＧＤＨ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼであって、以下の少なくともいずれかの変異を有する、グルコース以外の少なくとも１つの選択された糖基質に対する作用性が、対応する野生型酵素と比較して低下した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。
（１）Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ（アシネトバクター  バウマンニ）  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列における７４位、７５位、７６位、１２６位、１２７位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、３４４位、３４５位及び４３０位のうち少なくとも１つの位置、あるいは、他のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属または他の種由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおける上記と同等の位置において少なくとも１つ以上のアミノ酸挿入を有する
【請求項２】
さらに、以下の少なくともいずれかの変異を有する、請求項１に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。
（１）Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ（アシネトバクター  バウマンニ）  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列における１２５位、１２８位、１４２位、１６８位、１６９位、１７０位、２２４位、２３０位、２３６位、２４４位、２５８位、３４５位、３５１位、４１６位及び４２８位のうち少なくとも１つの位置、あるいは、他のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属または他の種由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおける上記と同等の位置において少なくとも１つ以上のアミノ酸置換を有する
【請求項３】
さらに、以下の少なくともいずれかの変異を有する、請求項１または２に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。
（１）Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ（アシネトバクター  バウマンニ）  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列における１６位、２２位、４９位、６７位、６８位、６９位、７４位、７５位、７６位、８９位、１１６位、１２０位、１２７位、１２９位、１３０位、１３１位、１４３位、１４６位、１６７位、１７１位、１７４位、１７７位、１８５位、１８６位、１８８位、１８９位、２０７位、２１５位、２２７位、２３１位、２４５位、２４９位、２５３位、２５４位、２５５位、２７７位、２９５位、３００位、３０９位、３１８位、３４１位、３４２位、３４３位、３４４位、３４６位、３４７位、３４９位、３５０位、３５６位、３９７位、３９８位、４２３位、４２９位、４３２位、４３３位、４３４位および４３９位のうち少なくとも１つの位置、あるいは、他のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属または他の種由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおける上記と同等の位置において少なくとも１つ以上のアミノ酸置換を有する
【請求項４】
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ（アシネトバクター  バウマンニ）  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列における１６９位または４３０位のうち少なくとも１つの位置、あるいは、他のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属または他の種由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおける上記と同等の位置において少なくとも１つ以上のアミノ酸挿入を有する、請求項１または２に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項５】
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ（アシネトバクター  バウマンニ）  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列における１６８位、１６９位、１７０位、２４５位、３４２位及び４２９位のうち少なくとも１つの位置、あるいは、他のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属または他の種由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおける上記と同等の位置において少なくとも１つ以上のアミノ酸置換を有する、請求項３に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項６】
アミノ酸変異が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ（アシネトバクター  バウマンニ）  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列における、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｒ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｋ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｒ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｖ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｋ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｉ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｋ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｑ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｋ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｓ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｋ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｔ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）、のうちいずれか、あるいは、他のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属または他の種由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおける上記と同等の位置におけるアミノ酸変異である、請求項４または５に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項７】
グルコース以外の少なくとも１つの選択された糖基質がマルトースである、請求項１に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項８】
請求項１〜７のうちいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子。
【請求項９】
請求項８に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターで形質転換された形質転換体。  
【請求項１１】
請求項１０に記載の形質転換体を培養することを含む改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの製造法。
【請求項１２】
請求項１〜７のうちいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコース測定用組成物。
【請求項１３】
請求項１〜７のうちいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースアッセイキット。
【請求項１４】
請求項１〜７のうちいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセンサー。
【請求項１５】
請求項１〜７のうちいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコース測定方法。  
【請求項１６】
ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼに請求項１〜７のうちいずれかに記載のアミノ酸変異を行うことを含む、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのグルコース以外の少なくとも１つの選択された糖基質に対する作用性を対応する野生型酵素と比較して低下させる方法。
【請求項１７】
ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼに請求項１〜７のうちいずれかに記載のアミノ酸変異を行うことを含む、グルコース以外の少なくとも１つの選択された糖基質に対する作用性を対応する野生型酵素と比較して低下させたピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを製造する方法。
【請求項１８】
ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いるグルコース測定系において、請求項１〜７のうちいずれかに記載のアミノ酸変異を行ったピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含有することを含む、グルコース測定系における、測定の正確性を向上させる方法。
【請求項１９】
ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いるグルコース測定系において、請求項１〜７のうちいずれかに記載のアミノ酸変異を行ったピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含有させることを含む、測定の正確性が向上したグルコース測定用組成物を、製造する方法。
【請求項２０】
ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いるグルコース測定系において、請求項１〜７のうちいずれかに記載のアミノ酸変異を行ったピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含有させることを含む、測定の正確性が向上したグルコースセンサーを、製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は基質特異性が改良された改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ピロロキノリンキノンをＰＱＱ、グルコースデヒドロゲナーゼをＧＤＨ、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼをＰＱＱＧＤＨともそれぞれ記載する。）、上記改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子、上記改変型ＰＱＱＧＤＨの製造法及び上記改変型ＰＱＱＧＤＨのグルコース測定へのセンサー等への種々の適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＱＱＧＤＨは、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼである。グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒することから、血糖の測定に用いることが可能である。血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーとして臨床診断上きわめて重要な指標である。現在、血中グルコース濃度の測定は、グルコースオキシダーゼを使用したバイオセンサーを用いる方法が主流となっているが、反応が溶存酸素濃度に影響されることから、測定値に誤差が生じる可能性があった。このグルコースオキシダーゼにかわる新たな酵素としてＰＱＱＧＤＨが注目されている。
【０００３】
我々のグループは、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＮＣＩＭＢ１１５１７株が、ＰＱＱＧＤＨを産生することを見出し，遺伝子のクローニングならびに高発現系を構築した（たとえば、特許文献１を参照）。しかしながら、この野生型ＰＱＱＧＤＨはグルコースオキシダーゼに比べて、そのグルコース以外の糖基質に対する作用性（いわゆる基質特異性）、特にマルトースに対する作用性に問題があった。
【特許文献１】特開平１１−２４３９４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、従来技術の課題を背景になされたもので、ＰＱＱＧＤＨの基質特異性の向上を課題としてその改良に関するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題を解決するため、鋭意研究した結果、ＰＱＱＧＤＨの特定の領域においてアミノ酸を置換すること、および／または、アミノ酸を挿入することによる変異により基質特異性を向上させることを可能にし、本発明を完成するに到った。
特に、これまで実質的に具体的検討がなされてこなかった「アミノ酸の挿入」に着目し詳細に検討することで、本発明を完成するに到った。
即ち本発明は、
［項１］
改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼであって、以下の少なくともいずれかの変異を有する、グルコース以外の少なくとも１つの選択された糖基質に対する作用性が、対応する野生型酵素と比較して低下した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。
（１）Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ（アシネトバクター  バウマンニ）  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列における７４位、７５位、７６位、１２６位、１２７位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、３４４位、３４５位及び４３０位のうち少なくとも１つの位置、あるいは、他のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属または他の種由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおける上記と同等の位置において少なくとも１つ以上のアミノ酸挿入を有する
［項２］
さらに、以下の少なくともいずれかの変異を有する、項１に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。
（１）Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ（アシネトバクター  バウマンニ）  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列における１２５位、１２８位、１４２位、１６８位、１６９位、１７０位、２２４位、２３０位、２３６位、２４４位、２５８位、３４５位、３５１位、４１６位及び４２８位のうち少なくとも１つの位置、あるいは、他のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属または他の種由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおける上記と同等の位置において少なくとも１つ以上のアミノ酸置換を有する
［項３］
さらに、以下の少なくともいずれかの変異を有する、項１または２に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。
（１）Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ（アシネトバクター  バウマンニ）  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列における１６位、２２位、４９位、６７位、６８位、６９位、７４位、７５位、７６位、８９位、１１６位、１２０位、１２７位、１２９位、１３０位、１３１位、１４３位、１４６位、１６７位、１７１位、１７４位、１７７位、１８５位、１８６位、１８８位、１８９位、２０７位、２１５位、２２７位、２３１位、２４５位、２４９位、２５３位、２５４位、２５５位、２７７位、２９５位、３００位、３０９位、３１８位、３４１位、３４２位、３４３位、３４４位、３４６位、３４７位、３４９位、３５０位、３５６位、３９７位、３９８位、４２３位、４２９位、４３２位、４３３位、４３４位および４３９位のうち少なくとも１つの位置、あるいは、他のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属または他の種由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおける上記と同等の位置において少なくとも１つ以上のアミノ酸置換を有する
［項４］
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ（アシネトバクター  バウマンニ）  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列における１６９位または４３０位のうち少なくとも１つの位置、あるいは、他のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属または他の種由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおける上記と同等の位置において少なくとも１つ以上のアミノ酸挿入を有する、項１または２に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。
［項５］
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ（アシネトバクター  バウマンニ）  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列における１６８位、１６９位、１７０位、２４５位、３４２位及び４２９位のうち少なくとも１つの位置、あるいは、他のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属または他の種由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおける上記と同等の位置において少なくとも１つ以上のアミノ酸置換を有する、項３に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。
［項６］
アミノ酸変異が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ（アシネトバクター  バウマンニ）  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列における、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｒ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｋ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｒ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｖ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｋ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｉ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｋ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｑ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｋ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｓ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）、（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｋ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｔ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）、のうちいずれか、あるいは、他のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属または他の種由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおける上記と同等の位置におけるアミノ酸変異である、項４または５に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。
［項７］
グルコース以外の少なくとも１つの選択された糖基質がマルトースである、項１に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ。
［項８］
項１〜７のうちいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子。
［項９］
項８に記載の遺伝子を含むベクター。
［項１０］
項９に記載のベクターで形質転換された形質転換体。  
［項１１］
項１０に記載の形質転換体を培養することを含む改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの製造法。
［項１２］
項１〜７のうちいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコース測定用組成物。
［項１３］
項１〜７のうちいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースアッセイキット。
［項１４］
項１〜７のうちいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセンサー。
［項１５］
項１〜７のうちいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコース測定方法。  
［項１６］
ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼに項１〜７のうちいずれかに記載のアミノ酸変異を行うことを含む、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのグルコース以外の少なくとも１つの選択された糖基質に対する作用性を対応する野生型酵素と比較して低下させる方法。
［項１７］
ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼに項１〜７のうちいずれかに記載のアミノ酸変異を行うことを含む、グルコース以外の少なくとも１つの選択された糖基質に対する作用性を対応する野生型酵素と比較して低下させたピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを製造する方法。
［項１８］
ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いるグルコース測定系において、項１〜７のうちいずれかに記載のアミノ酸変異を行ったピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含有することを含む、グルコース測定系における、測定の正確性を向上させる方法。
［項１９］
ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いるグルコース測定系において、項１〜７のうちいずれかに記載のアミノ酸変異を行ったピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含有させることを含む、測定の正確性が向上したグルコース測定用組成物を、製造する方法。
［項２０］
ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いるグルコース測定系において、項１〜７のうちいずれかに記載のアミノ酸変異を行ったピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含有させることを含む、測定の正確性が向上したグルコースセンサーを、製造する方法。
である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明による改変型ＰＱＱＧＤＨは野生型ＰＱＱＧＤＨよりもグルコース以外の糖基質、特にマルトースに対する作用性が低下した酵素である。本発明による改変型ＰＱＱＧＤＨをグルコースアッセイキットやグルコースセンサ等に使用することにより、野生型ＰＱＱＧＤＨを使用したものよりもより高精度な分析が可能となったり、より安定性の高いグルコースアッセイキットやグルコースセンサ等を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本願明細書において、アミノ酸は１文字記号または３文字記号で表す。また、アミノ酸の変異の位置については次のように表記する。
挿入に関して、例えば「１６９Ｒ」は、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来野生型ＰＱＱＧＤＨの１６８位の後の位置にＲ（Ａｒｇ）を挿入することを意味する。言い換えると、１６８位と１６９位の間にＲ（Ａｒｇ）を挿入することを意味する。
置換に関して、例えば「Ｑ１６８Ａ」は、１６８位のＱ（Ｇｌｎ）をＡ（Ａｌａ）に置換することを意味する。
また、多重変異体については、同様の原則によって表記したものをプラス（＋）でつなげて表記する。例えば、「Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｒ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｋ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ」は、１６８位のＱをＡに、１６９位のＬをＰに、１７０位のＡをＫに、２４５位のＥをＤに、３４２位のＭをＩに置換し、Ａに置換された１６８位の後にＲを挿入することを意味する。
なお、ここで取り扱っている数字は、アシネトバクター・バウマンニ  ＮＣＩＭＢ１１５１７株の野生型ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列上の位置に相当しており、前方のアミノ酸が挿入されたことによりアミノ酸の位置が後方へ１つずれたとしても、位置を表す数字の修正は行っていない。
アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来野生型ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列は配列番号１で示される。配列番号１において、アミノ酸の表記は、シグナル配列が除かれたアスパラギン酸を１として番号付けされている。
【０００９】
本発明は、その一つの態様において、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ（アシネトバクター  バウマンニ）  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列における７４位、７５位、７６位、１２６位、１２７位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、３４４位、３４５位及び４３０位のうち少なくとも１つの位置、あるいは、他のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属または他の種由来のＰＱＱＧＤＨにおける上記と同等の位置において少なくとも１つ以上のアミノ酸が挿入された変異を有する改変型ＰＱＱＧＬＤに関し、その改変型ＰＱＱＧＤＨは、対応する野生型ＰＱＱＧＤＨと比較して、グルコース以外の少なくとも１つの選択された糖基質に対する作用性が低下した基質特異性を有することに技術的特徴を有する。  
【００１０】
本発明に適用することができるＰＱＱＧＤＨは、ピロロキノリンキノンを補酵素として配位し、Ｄ−グルコースを酸化してＤ−グルコノ−１，５−ラクトンを生成するという反応を触媒する酵素（ＥＣ１．１．５．２（旧ＥＣ１．１．９９．１７））であり、由来や構造に関しては特に限定するものではない。
ＰＱＱＧＤＨは、可溶性型（可溶型とも記載する。）と膜結合型（膜型とも記載する。）に分類することができる。上記のうち、アシネトバクター属由来のものは可溶性ＰＱＱＧＤＨとして知られている。一方、エシェリヒア・コリなどに存在するものは膜結合型ＰＱＱＧＤＨとして知られている。
【００１１】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨの改変の基になる野生型のＰＱＱＧＤＨとしては、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株に由来するものが挙げられ、そのアミノ酸配列は配列番号１で、遺伝子配列は配列番号２でそれぞれ示される（たとえば、特許文献１を参照）。なお、アシネトバクター・バウマンニＮＣＩＭＢ１１５１７株は、分類当初はＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓとされていた。
【００１２】
また、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨの基になる野生型のＰＧＧＧＤＨとしては、アシネトバクター・バウマンニ  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株以外のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来のＰＱＱＧＤＨを用いることもできる。
【００１３】
そのようなものとして、例えば、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）  ＬＭＤ７９．４１株に由来するものが知られ、そのアミノ酸配列、遺伝子配列、高次構造などが公知である（たとえば、特許文献２および３、非特許文献１、２、３および４を参照。）
アシネトバクター・バウマンニ  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列（配列番号１）と、アシネトバクター・カルコアセティカス  ＬＭＤ７９．４１株由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列を比較すると、相違箇所はわずかで、相同性は９２．３％（シグナル配列含む）となり、非常に類似している（図１）。
したがって、当業者であれば配列番号１におけるある残基が、アシネトバクター・カルコアセティカス  ＬＭＤ７９．４１株由来ＰＱＱＧＤＨのどのアミノ酸残基（同等の位置）に該当するかを容易に認識することができる。そして、そのような１またはそれ以上の箇所においてアミノ酸変異を行うことにより、グルコース以外の少なくとも１つの選択された糖基質に対する作用性が、対応する野生型ＰＱＱＧＤＨと比較して低下した改変型ＰＱＱＧＤＨを得ることができる。
これらの改変型ＰＱＱＧＤＨも本発明の範囲内に含まれる。
【特許文献２】ＷＯ００／６１７３０
【特許文献３】ＷＯ００／６６７４４
【非特許文献１】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８９，３１９−３３３（１９９９）
【非特許文献２】ＰＮＡＳ，９６（２１），１１７８７−１１７９１（１９９９）
【非特許文献３】Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１８（１９），５１８７−５１９４（１９９９）
【非特許文献４】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，９，１２６５−１２７３（２０００）
【００１４】
あるいは、そのようなものとして、例えば、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）  ＩＦＯ  １２５５２株に由来するものが知られ、そのアミノ酸配列、遺伝子配列などが公知である（たとえば、特許文献４を参照。）
アシネトバクター・バウマンニ  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列（配列番号１）と、アシネトバクター・カルコアセティカス  ＩＦＯ  １２５５２株由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列を比較すると、相違箇所はわずかで、相同性は９１．３％（シグナル配列含む）となり、非常に類似している（図２）。
したがって、当業者であれば配列番号１におけるある残基が、アシネトバクター・カルコアセティカス  ＩＦＯ  １２５５２株由来ＰＱＱＧＤＨのどのアミノ酸残基（同等の位置）に該当するかを容易に認識することができる。そして、そのような１またはそれ以上の箇所においてアミノ酸変異を行うことにより、グルコース以外の少なくとも１つの選択された糖基質に対する作用性が、対応する野生型ＰＱＱＧＤＨと比較して低下した改変型ＰＱＱＧＤＨを得ることができる。
これらの改変型ＰＱＱＧＤＨも本発明の範囲内に含まれる。
【特許文献４】特開２００４−１７３５３８
【００１５】
さらに、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨの基になる野生型のＰＧＧＧＤＨとしては、アシネトバクター・バウマンニ  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来、あるいは、アシネトバクター・カルコアセティカス  ＬＭＤ７９．４１株およびアシネトバクター・カルコアセティカス  ＩＦＯ  １２５５２株以外のアシネトバクター属由来以外の、他のアシネトバクター属のＰＱＱＧＤＨ、さらには、他の任意の種由来のＰＱＱＧＤＨを用いることもできる。
当業者は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を参照し、これらとの相同性が高い（好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有する）他の起源に由来する改変型ＰＱＱＧＤＨについても、配列番号１に対応する位置（同等の位置）を探し出し、当該領域でアミノ酸変異を行うことにより、グルコース以外の少なくとも１つの選択された糖基質に対する作用性が、対応する野生型ＰＱＱＧＤＨと比較して低下した改変型ＰＱＱＧＤＨを得ることができる。
これらの改変型ＰＱＱＧＤＨも本発明の範囲内に含まれる。
【００１６】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨの基になる野生型のＰＱＱＧＤＨの由来となりうる他の種として、例えば微生物では、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）（例えば、非特許文献５を参照。）等の酸化細菌やアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（例えば、非特許文献６を参照。）、クレブシーラ・エーロジーンズ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等の腸内細菌、ブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｒｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）などを挙げることができる。
【非特許文献５】Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２９，２０６（１９９１）
【非特許文献６】Ａ．Ｍ．Ｃｌｅｔｏｎ−Ｊａｎｓｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，６３０８（１９９０）  これらはいずれも、アミノ酸配列、遺伝子配列が公知であるか、酵素の精製法が確立されていてその理化学的性質も明らかになっているものであり、当業者であれば精製された酵素あるいは遺伝子の単離を容易に行うことができる。
【００１７】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨの基になる野生型ＰＱＱＧＤＨの由来としては、特に限定されるものではないが、上記のうち好ましいのは、アシネトバクター属由来のＰＱＱＧＤＨである。これらは可溶型酵素であり水系において易溶である。さらに好ましいのは、アシネトバクター・カルコアセティカスもしくはアシネトバクター・バウマンニのいずれかに由来するＰＱＱＧＤＨである。さらにより好ましいのは、アシネトバクター・バウマンニ  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来、アシネトバクター・カルコアセティカス  ＬＭＤ７９．４１株由来、もしくは、アシネトバクター・カルコアセティカス  ＩＦＯ  １２５５２株のＰＱＱＧＤＨである。もっとも好ましいのは、アシネトバクター・バウマンニ  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来のＰＱＱＧＤＨである。
【００１８】
本発明において、グルコース以外の少なくとも１つの選択された糖基質に対する作用性とは、ＰＱＱＧＤＨが当該糖基質を脱水素する作用を意味する。
グルコース以外の少なくとも１つの選択された糖基質としては、ガラクトース、マンノース、キシロースなどの単糖類、マルトース、シュクロース、ラクトース、セロビオースなどの二糖類、マルトトリオース、マルトテトラオースなどのオリゴ糖類、イコデキストリン（グルコースポリマー）などの多糖類（オリゴ糖類は２〜１０分子の単糖が、多糖類は１１分子以上の単糖がグリコシド結合などにより結合したものを意味し、それらの結合形態は問わない。）二糖類以上の場合はその構成はホモであってもヘテロであっても良い。）、さらには糖アルコール、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、３−ｏ−メチル−Ｄ−グルコースなどそれらの誘導体が該当しうるが、中でも特に、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを糖尿病患者の臨床診断や血糖値コントロール等の目的で行われる血中グルコース濃度測定のために用いる際に問題となりうる、各種糖類が選択されることが好ましい。このような糖としては、マンノース、アロース、キシロース、ガラクトースまたはマルトースなどが挙げられ、さらに好ましくはガラクトース、ラクトースまたはマルトースが例示される。最も好ましくはマルトースが例示される。
なお本願明細書では、グルコース以外の少なくとも１つの選択された糖基質に対する作用性が、対応する野生型ＰＱＱＧＤＨと比較して低下したことを、基質特異性の向上とも表現する。
【００１９】
グルコース以外の少なくとも１つの選択された糖基質に対する作用性が低下しているかどうかの判断は、次のように行う。
野生型ＰＱＱＧＤＨを用いて、（ａ）Ｄ−グルコースを基質とした場合のＰＱＱＧＤＨ活性値と、（ｂ）Ｄ−グルコースのかわりにグルコース以外の１つの選択された糖を基質とした場合のＰＱＱＧＤＨ活性値を測定し、グルコースを基質とした場合の測定値を１００とした場合に対する相対値（（ｂ）／（ａ）×１００）を求める。次いで、改変型ＰＱＱＧＤＨを用いて同様の操作を行い、その値を比較して判断する。
活性測定は、後述の試験例１に記載の活性測定法により行われる。
【００２０】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコース濃度の測定において、グルコース以外の少なくとも１つの選択された糖基質に対する作用性が野生型ＰＱＱＧＤＨを用いた場合と比較して低下したものである。グルコース以外の少なくとも１つの選択された糖基質に対する作用性は、好ましくは野生型ＰＱＱＧＤＨの５０％以下、より好ましくは４０％以下、さらに好ましくは３０％以下、最も好ましくは２０％以下である。
【００２１】
好ましくは、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコース以外の少なくとも１つの選択された糖基質に対する作用性がグルコースに対する作用性の５０％以下である。より好ましくは４０％以下、さらに好ましくは３０％以下、最も好ましくは２０％以下である。
【００２２】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコース以外の少なくとも１つの選択された糖基質に対する作用性が野生型ＰＱＱＧＤＨより低下していれば、グルコースに対する作用性は上昇、不変、低下のいずれであっても本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨに包含される。
実用上、グルコースに対する作用性が本質的に維持されていれば、対応する野生型酵素と比較して低下していてもかまわない。グルコースに対する作用性が対応する野生型酵素と比較して２０％以上維持されていれば、グルコース測定が可能な程度に維持されており、グルコースに対する作用性が本質的に維持されていると考えられる。好ましくは、グルコースに対する作用性が対応する野生型酵素と比較して２０％以上維持できていれば良い。より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％以上であることが望ましい。
【００２３】
好ましくは、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、次の（ａ）〜(ｃ)に示すいずれかの特徴を有する。
（ａ）グルコース以外の少なくとも１つの選択された糖基質（最も好ましくはマルトース）に対する作用性が野生型ＰＱＱＧＤＨの５０％以下、より好ましくは４０％以下、さらに好ましくは３０％以下、最も好ましくは２０％以下であり、かつ、
（ｂ）グルコース以外の少なくとも１つの選択された糖基質（最も好ましくはマルトース）に対する作用性がグルコースに対する作用性の５０％以下、より好ましくは４０％以下、さらに好ましくは３０％以下、最も好ましくは２０％以下であり、かつ、
（ｃ）グルコース以外の少なくとも１つの選択された糖基質（最も好ましくはマルトース）に対する作用性が対応する野生型酵素と比較して２０％以上維持できていれば良い。より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％以上である。
【００２４】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型ＰＱＱＧＤＨに、アシネトバクター  バウマンニ  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列における７４位、７５位、７６位、１２６位、１２７位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、３４４位、３４５位及び４３０位のうち少なくとも１つの位置、あるいは、他のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属または他の種由来のＰＱＱＧＤＨにおける上記と同等の位置において少なくとも１つ以上のアミノ酸を挿入する変異を導入したものである。
好ましくは、１６９位および／または４３０位への挿入が好ましい。さらには、１６９位へのＲ（アルギニン）、Ｋ（リジン）、Ｆ（フェニルアラニン）またはＹ（チロシン）の挿入、および／または、４３０位へのＰ（プロリン）の挿入が好ましい。
【００２５】
本発明は、その好ましい別の態様において、アシネトバクター  バウマンニ  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列における７４位、７５位、７６位、１２６位、１２７位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、３４４位、３４５位及び４３０位のうち少なくとも１つの位置、あるいは、他のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属または他の種由来のＰＱＱＧＤＨにおける上記と同等の位置において少なくとも１つ以上のアミノ酸が挿入された変異を有し、さらに、該ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列における１２５位、１２８位、１４２位、１６８位、１６９位、１７０位、２２４位、２３０位、２３６位、２４４位、２５８位、３４５位、３５１位、４１６位及び４２８位のうち少なくとも１つの位置、あるいは、他のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属または他の種由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおける上記と同等の位置において少なくとも１つ以上のアミノ酸置換を有する改変型ＰＱＱＧＬＤに関し、その改変型ＰＱＱＧＤＨは、対応する野生型ＰＱＱＧＤＨと比較して、グルコース以外の少なくとも１つの選択された糖基質に対する作用性が低下した基質特異性を有することに技術的特徴を有する。
本発明は、さらに別の好ましい態様において、上記のアミノ酸置換箇所は、該ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列における１６位、２２位、４９位、６７位、６８位、６９位、７４位、７５位、７６位、８９位、１１６位、１２０位、１２７位、１２９位、１３０位、１３１位、１４３位、１４６位、１６７位、１７１位、１７４位、１７７位、１８５位、１８６位、１８８位、１８９位、２０７位、２１５位、２２７位、２３１位、２４５位、２４９位、２５３位、２５４位、２５５位、２７７位、２９５位、３００位、３０９位、３１８位、３４１位、３４２位、３４３位、３４４位、３４６位、３４７位、３４９位、３５０位、３５６位、３９７位、３９８位、４２３位、４２９位、４３２位、４３３位、４３４位および４３９位のうち少なくとも１つの位置、あるいは、他のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属または他の種由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおける上記と同等の位置において少なくとも１つ以上であってもよい。
【００２６】
本発明は、さらに別の好ましい態様において、上記のアミノ酸置換箇所は、該ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列における１６８位、１６９位、１７０位、２４５位、３４２位及び４２９位のうち少なくとも１つの位置、あるいは、他のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属または他の種由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおける上記と同等の位置において少なくとも１つ以上であってもよい。
１６８位は好ましくはＡ，Ｇ，Ｄ，Ｅ，Ｌ，Ｓ，Ｆ，Ｈ，Ｙのうちいずれかに、１６９位は好ましくはＡ，Ｇ，Ｍ，Ｗ，Ｋ，Ｑ，Ｆにうちいずれかに、１７０位は、２４５位は好ましくはＤに、３４２位は好ましくはＩ，Ｐ，Ｖ，Ｗ，Ｆ，Ｔ，Ａのうちいずれかに、４２９位は好ましくはＴ，Ｉ，Ｐ，Ｖのうちいずれかに置換することが好ましい。
【００２７】
本発明において、挿入箇所の数には特に制限はなく、改変の基になる野生型のＰＱＱＧＤＨの基質特異性以外の特性を、実質的に大きく損ねることがない程度にグルコース測定が可能な程度に維持されていれば特に限定されるものではないが、いわゆる「１または数箇所」程度以内であることが好ましい。さらには、挿入箇所が「１または数箇所」程度以内であることが好ましく、さらには挿入箇所が３箇所以内がより好ましく、最も好ましくは２箇所以内である。
また、置換を含めたトータルの変異箇所についても特に制限はないが、改変の基になる野生型のＰＱＱＧＤＨの基質特異性以外の特性を、実質的に大きく損ねることがない程度にグルコース測定が可能な程度に維持されていれば特に限定されるものではないが、測定可能な程度に活性が維持されるという観点からは、経験上、変異箇所は１０個以内が適当と思われる。変異部位の導入は野生型と比べ、グルコースに対する活性も低下させる頻度が高いことから、少ない変異箇所で十分な効果を満たすことが望ましい。例えば、Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｄ＋４３０Ｐの変異において、８重変異体（変異箇所８個以内）でも測定可能な活性を有しているが、Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐや、Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｆ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐの７重変異体（変異箇所７個以内）でも、著しい基質特異性の向上効果が見られており、更に、Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ｅ２４５Ｄ＋４３０Ｐの５重変異体（変異箇所５個以内）でも、実質的にマルトースに作用しないと言える程度の作用性になっている。
【００２８】
対応する野生型ＰＱＱＧＤＨと比較して、グルコース以外の少なくとも１つの選択された糖基質に対する作用性が低下した本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨとしては、例えばアシネトバクター  バウマンニ  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列における以下のいずれかの改変型ＰＱＱＧＤＨ、あるいは、他のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属または他の種由来のＰＱＱＧＤＨにおける上記と同等の位置におい他の種における上記と同等の位置におけるアミノ酸変異のうちいずれかを有する改変型ＰＱＱＧＤＨが例示される。
（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｒ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｋ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）
（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｒ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｖ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）
（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｋ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｉ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）
（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｋ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｑ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）
（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｋ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｓ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）
（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｋ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｔ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）
（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｎ４２９Ｄ＋４３０Ｐ）
【００２９】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨとしては、このほか次のようなものであっても良い。
（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ｎ４２９Ｄ＋４３０Ｐ）
（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）
（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｆ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｌ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋４３０Ｐ）
（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｋ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）
【００３０】
なお、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコースに対する作用性が本質的に維持され、かつ、グルコース以外の少なくとも１つの選択された糖基質に対する作用性に対して実質的な悪影響を及ぼさない限り、さらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換・挿入等されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加または置換等されていてもよい。
さらに、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコースに対する作用性が本質的に維持され、かつ、グルコース以外の少なくとも１つの選択された糖基質に対する作用性に対して実質的な悪影響を及ぼさない限り、ＰＱＱＧＤＨにヒスチジンタグなどのタグを結合または挿入させた態様、ＰＱＱＧＤＨの少なくとも一方の末端に他のペプチドや他の蛋白質（たとえばストレプトアビジンやシトクロム）を融合させた態様、糖鎖や他の化合物により化学修飾された態様、ＰＱＱＧＤＨ分子内および／または分子間でジズルフィド結合などにより架橋されたものやリンカーペプチドなどを介して連結されたもの等の態様を含みうる。あるいは、いくつかの由来の野生型ＰＱＱＧＤＨの断片を組み合わせて構成したものを含みうる。
【００３１】
本発明に用いる改変型ＰＱＱＧＤＨは、例えば、野生型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を取得し、次いでそれを改変して改変型ＰＱＱＧＤＨをコードするポリヌクレオチドを構築し、次いで当該ポリペプチドを適当な発現系において発現させることによって作製されうる。
このような改変は当該技術分野における公知技術を用いて当業者であれば容易に実施することが出来る。例えば、蛋白質に部位特異的変異を導入するために当該蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を置換または挿入するための種々の方法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ,  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。  
【００３２】
本発明の別の一つの態様は、ＰＱＱＧＤＨに請求項１〜７のうちいずれかに記載のアミノ酸変異を行うことを含む、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼのグルコース以外の少なくとも１つの選択された糖基質に対する作用性を、対応する野生型酵素と比較して低下させる方法を含む。
【００３３】
本発明はさらに、改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を含む。
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子は、微生物など種々の起源（由来）より得られる野生型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を改変することにより得られる可能性がある。具体的には、例えばアシネトバクター・カルコアセティカス、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、グルコノバクター・オキシダンス等の酸化細菌やアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリヒア・コリ、クレブシーラ・エーロジーンズ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等の腸内細菌を挙げることができる。
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子の由来としては、特に限定されるものではないが、上記のうち好ましいのは、アシネトバクター属由来のＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子である。さらに好ましいのは、アシネトバクター・カルコアセティカスもしくはアシネトバクター・バウマンニのいずれかに由来するＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子である。さらにより好ましいのは、アシネトバクター・バウマンニ  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来、アシネトバクター・カルコアセティカス  ＬＭＤ７９．４１株由来、もしくは、アシネトバクター・カルコアセティカス  ＩＦＯ  １２５５２株のＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子である。もっとも好ましいのは、アシネトバクター・バウマンニ  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来のＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子である。
【００３４】
本発明の遺伝子は、さらに、野生型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子の改変により得られた改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子について、ＰＱＱＧＤＨの発現を向上させるように、さらにコドンユーセージ（Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）を変更したものを含みうる。
【００３５】
これらのＰＱＱＧＤＨは、当該技術分野における公知技術を用いて当業者であれば容易に製造することが出来る。
【００３６】
例えば、野生型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を変異させてから、発現用ベクター（多くのものが当該技術分野において知られている。例えばプラスミド。）に挿入し、適当な宿主（多くのものが当該技術分野において知られている。例えば大腸菌。）に形質転換させた形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じてＥＤＴＡなどのキレート剤や界面活性剤等を添加して可溶化し、ＰＱＱＧＤＨを含む水溶性画分を得ることができる。または適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したＰＱＱＧＤＨを直接培養液中に分泌させることが出来る。
【００３７】
上記のようにして得られたＰＱＱＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＰＱＱＧＤＨを得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００３８】
これらは、例えば、以下の文献に従って進めることができる。
（ａ）タンパク質実験プロトコール第１巻 機能解析編，第２巻 構造解析編 （秀潤社） 西村善文，大野茂男 監修
（ｂ）改訂 タンパク質実験ノート  上 抽出と分離精製 （洋土社） 岡田雅人，宮崎香 編集
（ｃ）タンパク質実験の進めかた （洋土社） 岡田雅人，宮崎香 編集
あるいは以下に例示する方法によって進めることもできる。
【００３９】
野生型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００４０】
本発明はさらに、改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を含むベクター、さらには該ベクターで形質転換された形質転換体を含む。  
作製された改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物中に移入され、改変タンパク質を生産する形質転換体となる。
ベクターとしてプラスミドを用いる場合、例えば、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場合にはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ，ｐＵＣ１８などが使用できる。宿主微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリー  Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５αなどが利用できる。宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＪＭ１０９；東洋紡績製）を用いても良い。
【００４１】
このような遺伝子はこれらの菌株より抽出してもよく、また化学的に合成することもできる。さらに、ＰＣＲ法の利用により、ＰＱＱＧＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることも可能である。
【００４２】
本発明において、ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を得る方法としては、次のような方法が挙げられる。例えばアシネトバクター・バウマンニ  ＮＣＩＢ１１５１７  の染色体を分離、精製した後、超音波処理、制限酵素処理等を用いてＤＮＡを切断したものと、リニアーな発現ベクターと両ＤＮＡの平滑末端または付着末端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。該組換えベクターを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーと酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、ＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する微生物を得る。
なお、アシネトバクター・バウマンニ  ＮＣＩＢ１１５１７は、ＮＣＩＭＢまたはＵＫＮＣＣから入手することができる。
【００４３】
次いで、上記組換えベクターを保持する微生物を培養して、該培養微生物の菌体から該組換えベクターを分離、精製し、該発現ベクターからＧＤＨをコードする遺伝子を採取することができる。例えば、遺伝子供与体であるアシネトバクター・バウマンニ  ＮＣＩＢ１１５１７  の染色体ＤＮＡは、具体的には以下のようにして採取される。
【００４４】
該遺伝子供与微生物を例えば１〜３日間攪拌培養して得られた培養液を遠心分離により集菌し、次いで、これを溶菌させることによりＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨ遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶菌の方法としては、例えばリゾチーム等の溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用される。さらに、凍結融解やフレンチプレス処理のような物理的破砕方法と組み合わせてもよい。
【００４５】
上記のようにして得られた溶菌物からＤＮＡを分離精製するには、常法に従って、例えばフェノール処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理などの方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。
【００４６】
微生物から分離、精製されたＤＮＡを切断する方法は、例えば超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができる。好ましくは特定のヌクレオチド配列に作用するＩＩ型制限酵素が適している。
【００４７】
クローニングする際のベクターとしては、宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばエシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合にはＬａｍｂｄａ  ｇｔ１０  、Ｌａｍｂｄａ  ｇｔ１１  などが例示される。また、プラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９  、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  などが例示される。
【００４８】
クローニングの際、上記のようなベクターを、上述したＧＤＨをコードする遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素で切断してベクター断片を得ることができるが、必ずしも該微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる必要はない。微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とを結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、例えば微生物ＤＮＡ断片の付着末端とベクター断片の付着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮＡリガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片との組換えベクターを作製する。必要に応じて、アニーリングの後、宿主微生物に移入して生体内のＤＮＡリガーゼを利用し組換えベクターを作製することもできる。
【００４９】
クローニングに使用する宿主微生物としては、組換えベクターが安定であり、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質発現できるものであれば特に制限されない。一般的には、エシェリヒア・コリＷ３１１０  、エシェリヒア・コリＣ６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１  、エシェリヒア・コリＪＭ１０９  、エシェリヒア・コリＤＨ５  αなどを用いることができる。
【００５０】
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリの場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いることができる。
【００５１】
上記のように得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＧＤＨを安定に生産し得る。宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐性マーカーとＰＱＱの添加によりＧＤＨ活性を同時に発現する微生物を検索すればよい。例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつＧＤＨを生成する微生物を選択すればよい。
【００５２】
上記の方法により得られたＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨ遺伝子の塩基配列は、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ，第２１４巻，１２０５（１９８１）に記載されたジデオキシ法により解読した。また、ＧＤＨのアミノ酸配列は上記のように決定された塩基配列より推定した。
【００５３】
上記のようにして、一度選択されたＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨ遺伝子を保有する組換えベクターより、ＰＱＱ生産能を有する微生物にて複製できる組換えベクターへの移入は、ＧＤＨ遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法によりＧＤＨ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。また、これらのベクターによるＰＱＱ生産能を有する微生物の形質転換は、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いることができる。
【００５４】
ＰＱＱ生産能を有する微生物としては、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属等のメタノール資化性細菌、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ）属やグルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ）属の酢酸菌、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス属、アシネトバクター属等の細菌を挙げることができる。なかでも、シュードモナス属細菌とアシネトバクター属細菌が利用できる宿主−ベクター系が確立されており利用しやすいので好ましい。
【００５５】
シュードモナス属細菌では、シュードモナス・アエルギノサ、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・プチダなどを用いることができる。また、アシネトバクター属細菌ではアシネトバクター・カルコアセティカス、アシネトバクター・バウマンニ等を用いることができる。
【００５６】
上記微生物にて複製できる組換えベクターとしては、ＲＳＦ１０１０  由来のベクターもしくはその類似のレプリコンを有するベクターがシュードモナス属細菌に利用可能である。例えば、ｐＫＴ２４０、ｐＭＭＢ２４等（Ｍ．Ｍ．Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ  ら，Ｇｅｎｅ，２６，２７３（１９８３））、ｐＣＮ４０  、ｐＣＮ６０  等（Ｃ．Ｃ．Ｎｉｅｔｏ  ら，Ｇｅｎｅ，８７，１４５（１９９０））やｐＴＳ１１３７  等を挙げることができる。また、ｐＭＥ２９０等（Ｙ．Ｉｔｏｈら、Ｇｅｎｅ，３６，２７（１９８５））、ｐＮＩ１１１、ｐＮＩ２０Ｃ（Ｎ．Ｉｔｏｈら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，６１４（１９９１））も利用できる。
【００５７】
アシネトバクター属細菌では、ｐＷＭ４３  等（Ｗ．Ｍｉｎａｓ  ら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ，５９，２８０７（１９９３））、ｐＫＴ２３０、ｐＷＨ１２６６  等（Ｍ．Ｈｕｎｇｅｒら，Ｇｅｎｅ，８７，４５（１９９０））がベクターとして利用可能である。
【００５８】
本発明はさらに、改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された形質転換体を培養することを含む改変型ＰＱＱＧＤＨの製造法に関する。
【００５９】
また、本発明のさらに別の一つの態様は、ＰＱＱＧＤＨに請求項１〜７のうちいずれかに記載のアミノ酸変異を行うことを含む、グルコース以外の少なくとも１つの選択された糖基質に対する作用性を、対応する野生型酵素と比較して低下させたピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを製造する方法を含む。
【００６０】
例えば上記のようにして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量の改変タンパク質を安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【００６１】
培地の栄養源としては，微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００６２】
培養温度は菌が成育し、改変型ＰＱＱＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、上記のようなＰＱＱ生産能を有する微生物の場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、改変型ＰＱＱＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地のｐＨは菌が発育し、改変型ＰＱＱＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度の範囲である。
【００６３】
培養物中の改変型ＰＱＱＧＤＨを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、改変型ＰＱＱＧＤＨが培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、改変型ＰＱＱＧＤＨ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。改変型ＰＱＱＧＤＨが菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加してＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００６４】
上記のようにして得られたＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＧＤＨを得ることができる。
【００６５】
例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ファルマシアバイオテク）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ  （ファルマシアバイオテク）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ  （ファルマシアバイオテク）等のカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００６６】
上記のようにして得られた精製酵素を、例えば凍結乾燥、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化して流通させることが可能である。その際、精製酵素はリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液やＧＯＯＤの緩衝液に溶解しているものを用いることができる。好適なものはＧＯＯＤの緩衝液であり、なかでも、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳもしくはＭＯＰＳ緩衝液が特に好ましい。また、カルシウムイオンまたはその塩、およびグルタミン酸、グルタミン、リジン等のアミノ酸類、さらに血清アルブミン等を添加することによりＧＤＨをより安定化することができる。
【００６７】
本発明の改変タンパク質の製造方法は、特に限定されないが、以下に示すような手順で製造することが可能である。タンパク質を構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作製される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００６８】
本発明では、配列番号１に示されるＰＱＱＧＤＨの１６８位、１６９位、１７０位、２４５位、及び３４２位に着目し、これらのアミノ酸部位へ上記変異導入キットを用いてランダムに変異を導入したライブラリーを作製し、基質特異性の変化を指標にスクリーニングしたところ、基質特異性が改善されたＰＱＱＧＤＨ改変体を得ることができた。基質特異性に関しては、
（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｒ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｋ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）、
（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｒ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｖ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）、
（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｋ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｉ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）、
（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｋ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｑ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）、
（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｋ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｓ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）、
（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｋ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｔ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）、
（Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｙ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｎ４２９Ｄ＋４３０Ｐ）の多重変異体が特に好ましい。
【００６９】
本発明の別の一形態は、請求項１〜７のうちいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコース測定用組成物を含む。
本発明の別の一形態は、請求項１〜７のうちいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを含む。
本発明の別の一形態は、請求項１〜７のうちいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースセンサーを含む。
【００７０】
上記各形態においては、単一で構成されていてもよいし、いくつかのパーツに分割されていてグルコース測定あるいはアッセイ時にそれらを適宜組合わせて使用するように構成されていても良い（たとえばＰＱＱＧＤＨを含む試薬とメディエータを含む試薬の組合せ。）。あるいは、改変型ＰＱＱＧＤＨを含む任意の１以上の成分から構成されていてグルコース測定あるいはアッセイ時に欠けている部分を適宜追加して使用するように構成されていても良い（たとえば改変型ＰＱＱＧＤＨを含む凍結乾燥品。使用時に緩衝液または精製水を添加して使用する。）。
【００７１】
上記各形態において、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨ、グルコース測定用組成物、グルコースアッセイキットならびにグルコースセンサーは、液状（水溶液、懸濁液等）、粉末、凍結乾燥など種々の形態をとることができる。凍結乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。
【００７２】
凍結乾燥組成物中においては、ＰＱＱＧＤＨ含有量は、酵素の起源によっても異なるが、通常は約５〜５０％（重量比）の範囲で好適に用いられる。酵素活性に換算すると、１００〜２０００Ｕ／ｍｇの範囲で好適に用いられる。
【００７３】
さらに上記各形態において、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨ、グルコース測定用組成物、グルコースアッセイキットならびにグルコースセンサーは、その形態や使用方法に応じて、精製された状態であっても良いし、必要により他の成分、例えば界面活性剤、安定化剤、賦形剤など種々の添加物が加えられていても良い。
本発明へのそれらの添加物の配合法は特に制限されるものではない。例えばＰＱＱＧＤＨを含む緩衝液に安定化剤を配合する方法、安定化剤を含む緩衝液にＰＱＱＧＤＨを配合する方法、あるいはＰＱＱＧＤＨと安定化剤を緩衝液に同時に配合する方法などが挙げられる。
【００７４】
例えば、改変型ＰＱＱＧＤＨタンパク質に（１）アスパラギン酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、リンゴ酸、α−ケトグルコン酸、α−サイクロデキストリンおよびそれらの塩からなる群から選ばれた１種または２種以上の化合物および（２）アルブミンを共存せしめることにより、改変型ＰＱＱＧＤＨをさらに安定化することができる。
アスパラギン酸、グルタミン酸、αーケトグルタル酸、リンゴ酸、及びαーケトグルコン酸の塩としては、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、及びマグネシウム等の塩が挙げられるが特に限定されるものではない。上記化合物とその塩及びα−シクロデキストリンの添加量は、１〜９０％（重量比）の範囲で添加することが好ましい。これらの物質は単独で用いてもよいし、複数組み合わせてもよい。
【００７５】
また、カルシウムイオンを添加しても安定化効果が得られる。すなわち、カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させることにより、改変タンパク質を安定化させることができる。カルシウム塩としては、塩化カルシウムまたは酢酸カルシウムもしくはクエン酸カルシウム等の無機酸または有機酸のカルシウム塩などが例示される。また、水性組成物において、カルシウムイオンの含有量は、１×１０−４〜１×１０−２Ｍであることが好ましい。
カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させることによる安定化効果は、グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されたアミノ酸を含有させることにより、さらに向上する。
グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されるアミノ酸は、１種または２種以上であってもよい。前記の水性組成物において、グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されたアミノ酸の含有量は、０．０１〜０．２重量％であることが好ましい。
このほか、凍結乾燥安定剤として、Ｎ−カルバモイル−β−Ｄ−グルコピラノシルアミンなどのグルコシルウレイド化合物を用いることもできる。
【００７６】
含有される緩衝液としては特に限定されるものではないが、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられるが、カルシウムと不溶性の塩を形成しない緩衝液はすべて使用可能である。該緩衝液のｐＨは５．０〜１０．０程度の範囲で使用目的に応じて調整される。凍結乾燥物中においては緩衝剤の含有量は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．１％（重量比）以上、特に好ましくは０．１〜３０％（重量比）の範囲で使用される。
【００７７】
また、さらに血清アルブミンを含有させてもよい。前記の水性組成物に血清アルブミンを添加する場合、その含有量は０．０５〜０．５重量％であることが好ましい。
使用できるアルブミンとしては、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）などが挙げられる。特にＢＳＡが好ましい。該アルブミンの含有量は、好ましくは１〜８０％（重量比）、より好ましくは５〜７０％（重量比）の範囲で使用される。
【００７８】
一方、上記各形態において、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨ、グルコース測定用組成物、グルコースアッセイキットならびにグルコースセンサーは、宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有しない構成とすることもできる。
宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分としては、例えばＢＳＡ等の生体由来物質が挙げられる。
このような構成にすることにより、グルコース測定系における非特異反応が低減する可能性が考えられる。
【００７９】
この場合、組成物は、改変型ＰＱＱＧＤＨとカルシウムまたはカルシウム塩、及び緩衝剤から基本的に成る。
【００８０】
カルシウムの供給形態としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の無機酸または有機酸のカルシウム塩を挙げることができる。また、粉末組成物において、カルシウムの含有量（Ｗ／Ｗ）は、０．０５％〜５％であることが望ましい。
【００８１】
緩衝剤としては、一般的に使用されるものであれば良く、通常、組成物のｐＨを５〜１０とするものが好ましい。但し、リン酸バッファーのようにカルシウムと不溶性の塩を形成する可能性のあるものはその添加条件に留意する必要がある。またトリスアミノメタンのようにアミノ基末端を有するものは、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼのＰＱＱ結合を不安定とする可能性があるためその添加条件に留意する必要がある。このため、緩衝剤としてさらに好ましくは、ホウ酸や酢酸といった緩衝剤や、ＢＥＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＣＨＥＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅといったグッド緩衝剤が挙げられる。
また、粉末組成物において、緩衝剤の含有量（Ｗ／Ｗ）は、１．０％〜５０％であることが望ましい。
【００８２】
また、改変型ＰＱＱＧＤＨとカルシウムまたはカルシウム塩、及び緩衝剤から基本的に成る組成物に、アミノ酸、あるいは有機酸をさらに加えてもかまわない。    
また、これらを含有するものであれば、水性組成物、凍結乾燥物を問わない。
【００８３】
本発明の別の一形態は、請求項１〜７のうちいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコース測定方法を含む。
本願発明は、また、ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコース測定系において、請求項１〜７のうちいずれかに記載のアミノ酸変異を行ったＰＧＧＧＤＨを含有することを含む、グルコース測定系における、測定の正確性を向上させる方法を含む。
本願発明は、また、ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコース測定系において、請求項１〜７のうちいずれかに記載のアミノ酸変異を行ったＰＱＱＧＤＨを含有させることを含む、測定の正確性が向上したグルコース測定用組成物を、製造する方法を含む。
本願発明は、また、ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコース測定系において、請求項１〜７のうちいずれかに記載のアミノ酸変異を行ったＰＱＱＧＤＨを含有させることを含む、測定の正確性が向上したグルコースセンサーを、製造する方法を含む。
後述の実施例にも記載されているように、本願発明の改変型ＰＱＱＧＤＨではグルコース以外の糖であるマルトースの作用性が野生型ＰＱＱＧＤＨに対して著しく低下している。このことは、例えば、腎臓合併症を有する（特に透析を行っている）糖尿病患者より得られる臨床サンプルにおけるグルコース測定の正確性を著しく向上させることは明らかである。
【００８４】
本発明においては以下の種々の方法によりグルコースを測定することができる。
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
【００８５】
グルコース測定用試薬
本発明のグルコース測定用試薬は、典型的には、ＰＱＱＧＤＨ、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明のＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
【００８６】
グルコースアッセイキット
本発明のグルコースアッセイキットは、典型的には、ＰＱＱＧＤＨ、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明のＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
【００８７】
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、ＰＱＱを別の層としてまたは溶液中で提供することもできる。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００８８】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、ＰＱＱおよびＣａＣｌ２、およびメディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【実施例】
【００８９】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。
実施例１  ：ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素遺伝子の発現プラスミドの構築
野生型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の発現プラスミドｐＮＰＧ５は、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）のマルチクローニング部位にアシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）  ＮＣＩＭＢ１１５１７株由来のＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする構造遺伝子を挿入したものである。その塩基配列を配列表の配列番号２に、また該塩基配列から推定されるＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
【００９０】
実施例２：変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の作製
野生型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素遺伝子を含む組換えプラスミドｐＮＰＧ５と変異導入部位のアミノ酸をコードするトリプレットを中央に含む４０ｍｅｒ程度の合成オリゴヌクレオチドを基に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って変異処理操作を行い、Ｑ１６８Ａ，１６９Ｒ，Ｌ１６９Ｐ，Ｅ２４５Ｄ，Ｍ３４２Ｉの変異を導入した、基質特異性が改善された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｒ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）を取得した。次に、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｒ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉを基に、先と同様の変異導入キットを用いて、１７０位にランダムにアミノ酸置換変異を導入した多重変異ライブラリーを作製した。そして、ＰＭＳ，ＤＣＰＩＰをメディエーターとした活性測定法とフェリシアン化カリウムをメディエーターとした活性測定法の２つの方法にて基質特異性の変化を指標にスクリーニングした。得られた候補株の塩基配列を決定して、配列番号１記載のアミノ酸配列の１７０番目のアラニンがイソロイシンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｒ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｉ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）を取得した。同ライブラリーから同様のスクリーニング方法によって、１７０番目のアラニンがグルタミンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｒ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｑ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）、１７０番目のアラニンがセリンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｒ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｓ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）、１７０番目のアラニンがトレオニンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｒ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｑ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）を取得した。
また、基質特異性が改善された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｋ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）を基に、１７０位にランダムにアミノ酸置換変異を導入した多重変異ライブラリーを作製した。そして、同様に基質特異性の変化を指標にスクリーニングして、１７０番目のアラニンがリシンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｋ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｋ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）を取得した。
各々の組換えプラスミドで大腸菌コンピテントセル（エシェリヒア・コリーＪＭ１０９；東洋紡績製）を形質転換して、該形質転換体をそれぞれ取得した。
【００９１】
実施例３：シュードモナス属細菌で複製できる発現ベクターの構築
実施例２で得た組換えプラスミドｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｒ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｉ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２ＩのＤＮＡ５μｇを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ（東洋紡績製）で切断して、変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の構造遺伝子部分を単離した。単離したＤＮＡとＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断したｐＴＭ３３（１μｇ）とＴ４ＤＮＡリガーゼ１単位で１６℃、１６時間反応させ、ＤＮＡを連結した。連結したＤＮＡはエシェリヒア・コリＤＨ５αのコンピテントセルを用いて形質転換を行った。得られた発現プラスミドをｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｒ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｉ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉと命名した。
ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｒ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｑ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｒ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｓ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｒ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｑ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｋ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉの各組換えプラスミドについても上記方法と同様にして発現プラスミドを取得した。得られた発現プラスミドそれぞれｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｒ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｑ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｒ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｓ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｒ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｑ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｋ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉと命名した。
【００９２】
実施例４：シュードモナス属細菌の形質転換体の作製
シュードモナス・プチダＴＥ３４９３（微工研寄１２２９８号）をＬＢＧ培地（ＬＢ培地＋０．３％グリセロール）で３０℃、１６時間培養し、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間）により菌体を回収し、この菌体に氷冷した３００ｍＭシュークロースを含む５ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）８ｍｌを加え、菌体を懸濁した。再度遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間）により菌体を回収し、この菌体に氷冷した３００ｍＭシュークロースを含む５ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．４ｍｌを加え、菌体を懸濁した。
該懸濁液に実施例３で得た発現プラスミドｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｒ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｉ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉを０．５μｇ加え、エレクトロポレーション法により形質転換した。１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に生育したコロニーより、目的とする形質転換体を得た。
ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｒ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｑ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｒ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｓ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｒ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｑ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｋ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉの各発現プラスミドについても上記方法と同様にして、該形質転換体をそれぞれ取得した。
試験例１
ＧＤＨ活性の測定方法１
測定原理
Ｄ−グルコース＋ＰＭＳ＋ＰＱＱＧＤＨ  →  Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン  ＋  ＰＭＳ（ｒｅｄ）
ＰＭＳ（ｒｅｄ）  ＋  ＤＣＰＩＰ  →  ＰＭＳ  ＋  ＤＣＰＩＰ（ｒｅｄ）
フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）（ｒｅｄ）による２，６−ジクロロフェノール-インドフェノール（ＤＣＰＩＰ）の還元により形成されたＤＣＰＩＰ（ｒｅｄ）の存在は、６００ｎｍで分光光度法により測定した。また、基質特異性の検討では、Ｄ−グルコースの部分を他の糖類に変更して、それぞれの基質に対する特異性を測定した。
単位の定義
１単位は、以下に記載の条件下で１分当たりＤＣＰＩＰ（ｒｅｄ）を１．０ミリモル形成させるＰＱＱＧＤＨの酵素量をいう。
方法
試薬
Ａ．Ｄ−グルコース溶液：１．０Ｍ（１．８ｇ  Ｄ−グルコース（分子量１８０．１６）／１０ｍｌ  Ｈ２Ｏ）
Ｂ．ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液，  ｐＨ６．５：５０ｍＭ（６０ｍＬの水中に懸濁した１．５１ｇのＰＩＰＥＳ（分子量３０２．３６）を、５Ｎ  ＮａＯＨに溶解し、２．２ｍｌの１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加える。５Ｎ  ＮａＯＨを用いて２５℃でｐＨを６．５±０．０５に調整し、水を加えて１００ｍｌとした。）
Ｃ．ＰＭＳ溶液：２４ｍＭ（７３．５２ｍｇのフェナジンメトサルフェート（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｄ．ＤＣＰＩＰ溶液：２．０ｍＭ（６．５ｍｇのニトロテトラゾリウムブルー（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｅ．酵素希釈液：１ｍＭ  ＣａＣｌ２，  ０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  ０．１％  ＢＳＡを含む５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）
手順
１．  遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した（用時調製）
４．５ｍｌ  Ｄ−グルコース溶液                          （Ａ）
２１．９ｍｌ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）    （Ｂ）
２．０ｍｌ  ＰＭＳ溶液                                  （Ｃ）
１．０ｍｌ  ＤＣＰＩＰ溶液                              （Ｄ）
【００９３】
上記アッセイ混合物の反応液中の濃度は次のとおり。
ＰＩＰＥＳ緩衝液  ３６ｍＭ
Ｄ−グルコース  １４８ｍＭ
ＰＭＳ        １．５８ｍＭ
ＤＣＰＩＰ  ０．０６６ｍＭ
【００９４】
２．  ３．０ｍｌの反応混合液を試験管（プラスチック製）に入れ、３７℃で５分間予備加温した。
３．  ０．１ｍｌの酵素溶液を加え、穏やかに反転して混合した。
４．  ６００ｎｍでの水に対する吸光度の減少を３７℃に維持しながら分光光度計で４〜５分間記録し、曲線の初期直線部分からの１分当たりのΔＯＤを計算した（ＯＤテスト）。
同時に、酵素溶液に代えて酵素希釈液（Ｅ）加えることを除いては同一の方法を繰り返し、ブランク（ΔＯＤブランク）を測定した。
アッセイの直前に氷冷した酵素希釈液（Ｅ）で酵素粉末を溶解し、同一の緩衝液で０．０５−０．１０Ｕ／ｍｌに希釈した（該酵素の接着性のためにプラスチックチューブの使用が好ましい）。
基質特異性を評価する目的には、上記活性測定操作はグルコース溶液の代わりにマルトース溶液を基質として実施した。
計算
活性を以下の式を用いて計算する：
Ｕ／ｍｌ＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤテスト−  ΔＯＤブランク）×Ｖｔ×ｄｆ｝／（１６．８×１．０×Ｖｓ）
Ｕ／ｍｇ＝（Ｕ／ｍｌ）×１／Ｃ
Ｖｔ：総体積（３．１ｍｌ）
Ｖｓ：サンプル体積（０．１ｍｌ）
１６．８：上記測定条件でのＤＣＰＩＰのミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）
１．０：光路長（ｃｍ）
ｄｆ：希釈係数
Ｃ：溶液中の酵素濃度（ｃ  ｍｇ／ｍｌ）
グルコース以外の糖類に対する作用性が低下しているかどうかの判断は、Ｄ−グルコースを基質溶液とした場合の活性値（ａ）と、Ｄ−グルコースのかわりにその他の糖類を基質溶液とした場合の活性値（ｂ）を測定し、グルコースを基質とした場合の活性値を１００とした場合に対する相対値（（ｂ）／（ａ）×１００）を求め、行った。
【００９５】
試験例２
ＧＤＨ活性の測定方法２
測定原理
ＰＱＱＧＤＨ
Ｄ−グルコース＋フェリシアン化物イオン→  
Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン  ＋  フェロシアン化物イオン
Ｄ−グルコースの部分を他の糖類に変更して、それぞれの基質に対する特異性を測定した。フェリシアン化物イオンの還元により生じたフェロシアン化物イオンの存在は、分光光度法により波長４２０ｎｍでの吸光度の減少を測定することで確認した。
方法
試薬
Ａ．Ｄ−グルコース溶液：５０．７４ｍＭ（９１．３ｍｇ  Ｄ−グルコース（分子量１８０．１６）／１０ｍｌ  Ｈ２Ｏ）
Ｂ．リン酸カルシウム緩衝液ｐＨ６．５：５０ｍＭ
Ｃ．フェリシアン化カリウム溶液：５０ｍＭ（０．１６５ｇ  フェリシアン化カリウム（分子量３２９．２５）を  １０ｍｌ  蒸留水にて溶解した）
Ｄ．酵素希釈液：１ｍＭ  ＣａＣｌ２，  ０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  ０．１％  ＢＳＡを含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
手順
１．  遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した（用時調製）
５．６ｍｌ  Ｄ−グルコース溶液                    （Ａ）
４９．６ｍｌ  リン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ６．５）  （Ｂ）
４．０ｍｌ  フェリシアン化カリウム溶液            （Ｃ）
【００９６】
上記アッセイ混合物の反応液中の濃度は次のとおり。
リン酸カルシウム緩衝液  ４０．５ｍＭ
Ｄ−グルコース            ４．６ｍＭ
フェリシアン化Ｋ          ３．３ｍＭ
【００９７】
２．  ３．０ｍｌの反応混合液を試験管（プラスチック製）に入れ、３７℃で５分間予備加温した。
３．  ０．１ｍｌのグルコース溶液を加え、穏やかに混合した。
４．  ４２０ｎｍでの水に対する吸光度の減少を３７℃に維持しながら分光光度計で１〜３分間記録し、曲線の初期直線部分からの１分間当たりのΔＯＤを計算した（ΔＯＤテスト）。同時に、グルコース溶液に代えて蒸留水を加えることを除いては同一の方法を実施し、ブランク（ΔＯＤブランク）を測定した。
アッセイの直前に氷冷した酵素希釈液（Ｅ）で酵素粉末を溶解し、同一の緩衝液で１５０−１５００Ｕ／ｍｌに希釈した（該酵素の接着性のためにプラスチックチューブの使用が好ましい）。
基質特異性を評価する目的には、上記活性測定操作はグルコース溶液の代わりにマルトース溶液を基質として実施した。
【００９８】
計算
活性を以下の式を用いて計算する：
Ｕ／ｍｌ＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤテスト−  ΔＯＤブランク）×Ｖｔ×ｄｆ｝／（１．０４×１．０×Ｖｓ）
Ｕ／ｍｇ＝（Ｕ／ｍｌ）×１／Ｃ
Ｖｔ：総体積（３．１ｍｌ）
Ｖｓ：サンプル体積（０．１ｍｌ）
１．０４：上記測定条件でのフェリシアン化Ｋのミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）
１．０：光路長（ｃｍ）
ｄｆ：希釈係数
Ｃ：溶液中の酵素濃度（ｃ  ｍｇ／ｍｌ）
グルコース以外の糖類に対する作用性が低下しているかどうかの判断は、Ｄ−グルコースを基質溶液とした場合の活性値（ａ）と、Ｄ−グルコースのかわりにその他の糖類を基質溶液とした場合の活性値（ｂ）を測定し、グルコースを基質とした場合の活性値を１００とした場合に対する相対値（（ｂ）／（ａ）×１００）を求め、行った。
【００９９】
実施例５：ホロ型発現精製酵素の調製
５００ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ  ｂｒｏｔｈを２Ｌ容坂口フラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したストレプトマイシンを１００μｇ／ｍｌになるように添加した。この培地に１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＰＹ培地で予め３０℃、２４時間培養したシュードモナス・プチダＴＥ３４９３（ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｒ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｉ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ）の培養液を５ｍｌ接種し、３０℃で４０時間通気攪拌培養した。培養終了時のＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素活性は、前記活性測定において、培養液１ｍｌ当たり約３０Ｕ／ｍｌであった。
上記菌体を遠心分離により集菌し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、超音波処理により破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液をＨｉＴｒａｐ−ＳＰ（アマシャム−ファルマシア）イオン交換カラムクロマトグラフィーにより分離・精製した。次いで１０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）で透析した後に終濃度が１ｍＭになるように塩化カルシウムを添加した。最後にＨｉＴｒａｐ−ＤＥＡＥ（アマシャム−ファルマシア）イオン交換カラムクロマトグラフィーにより分離・精製し、精製酵素標品を得た。本方法により得られた標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一なバンドを示した。
ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｒ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｑ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｒ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｓ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｒ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｑ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ、ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋１６９Ｋ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉによるシュードモナス・プチダＴＥ３４９３形質転換体についても上記方法と同様にして精製酵素標品を取得した。
このようにして取得した精製酵素を用いて性能を評価した。
【０１００】
基質特異性
上記の活性測定方法に従い、ＰＱＱＧＤＨの活性を測定した。グルコースを基質溶液とした場合の脱水素酵素活性値とマルトースを基質溶液とした場合の脱水素酵素活性値を測定し、グルコースを基質とした場合の測定値を１００とした場合の相対値を求めた。
【０１０１】
【表１】
2007043983.tif 000002
【０１０２】
野生型ＰＱＱＧＤＨでは、グルコースとマルトースの作用性がほぼ等しくなっているのに対し、本願発明の改変型ＰＱＱＧＤＨではマルトースの作用性が著しく低下している。ＰＭＳ，ＤＣＰＩＰをメディエーターにした時にはマルトースの作用性が５％前後まで低下した多重変異体が散見できるが、これらの中でも、フェリシアン化カリウムをメディエーターとした時には、各々の変異体で作用性が異なり、特に、請求項１，２で挙げた多重変異体でのみマルトースの作用性が２０％以下となることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明によれば、基質特異性が改善されたＰＱＱＧＤＨを得ることができる。この改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコースアッセイキット、グルコースセンサーに利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】アシネトバクター・バウマンニ  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列（本図上段の配列）と、アシネトバクター・カルコアセティカス  ＬＭＤ７９．４１株由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列（本図下段の配列）比較。なお本願明細書中での、アシネトバクター・バウマンニ  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列は、本図においてのみ、シグナル配列を含む開始メチオニンを１としてつけられている。配列番号１の１番目のアスパラギン酸は本図では２６番目にあたる。
【図２】アシネトバクター・バウマンニ  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列（本図上段の配列）と、アシネトバクター・カルコアセティカス  ＩＦＯ  １２５５２株由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列（本図下段の配列）比較。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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