(57)【要約】【課題】  従来に比べ簡便で新規な糖または糖誘導体のリン酸エステルを製造する方法を提供する。【解決手段】  糖または糖誘導体とリン酸供与体とを酸性ホスファターゼ存在下で反応させることにより糖または糖誘導体のリン酸エステルを製造する方法。  また、糖または糖誘導体が第一級の水酸基を持つ化合物であり、リン酸供与体がポリリン酸又はその塩であり、酸性ホスファターゼがＳｈｉｇｅｌｌａ属に由来する酸性ホスファターゼである、前記の製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体とリン酸供与体とを酸性ホスファターゼの存在下で反応させる糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体のリン酸エステルの製造方法。
【請求項２】
糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体が第一級の水酸基を持つ化合物である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体を構成している糖が炭素数４以上６以下の糖である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体が、マンノース、フルクトース、ソルボース、タガトース、２―デオキシグルコース、グルコサミン、ソルビトール、ガラクチトール、マンニトール、リビトール、アラビトール、キシリトールまたはエリトリトールであり、糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体のリン酸エステルが、マンノースリン酸エステル、フルクトースリン酸エステル、ソルボースリン酸エステル、タガトースリン酸エステル、２―デオキシグルコースリン酸エステル、グルコサミンリン酸エステル、ソルビトールリン酸エステル、ガラクチトールリン酸エステル、マンニトールリン酸エステル、リビトールリン酸エステル、アラビトールリン酸エステル、キシリトールリン酸エステルまたはエリトリトールリン酸エステルである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
リン酸供与体がポリリン酸又はその塩である、請求項１〜４の何れか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
酸性ホスファターゼがＳｈｉｇｅｌｌａ属に由来する酸性ホスファターゼである、請求項１〜５の何れか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
酸性ホスファターゼがＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉに由来する酸性ホスファターゼである、請求項６に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体のリン酸エステルの製造方法に関する。さらに詳しくは、機能性食品や化粧品などの素材として有用な糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体のリン酸エステルの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖または糖誘導体のリン酸エステルは、ビタミンＤ様活性、腸管機能改善、毛穴収縮など様々な機能を有しており（特許文献１、特許文献２、特許文献３）、多くの用途が考えられる。この糖リン酸エステルを製造する方法として、ホスホリラーゼによるスクロースを過リン酸分解する方法が報告されている（特許文献４）。過リン酸分解では、グルコース―１―リン酸と共にフルクトースが副生するため多くの産業廃棄物が出てしまう。
【０００３】
また、キナーゼを糖ならびにリン酸供与体であるアデノシントリリン酸（ＡＴＰ）に作用させる方法も報告されている（非特許文献１）。しかしながら、この方法に用いられるＡＴＰは高価である。
【０００４】
安価なリン酸供与体としてピロリン酸を用いて、グルコース―６―ホスファターゼによる様々な糖および糖誘導体のリン酸化反応が報告されている（非特許文献２）。しかしながら、グルコース―６―ホスファターゼは調製や反応において厳密な条件を必要とし、調製するための時間とコストがかかるため、工業的に利用するのは難しい。
【０００５】
ホスファターゼは反応至適ｐＨの違いによって酸性ホスファターゼとアルカリホスファターゼに分類され、酸性ホスファターゼを用いたリン酸化反応としてグルコースおよびペントースの反応例が報告されているが（非特許文献３、特許文献５）、それ以外でいかなる化合物がリン酸化されるかは全くの未知であった。グルコースがリン酸化されるのであれば、グルコースのようなヘキソース類の化合物が基質になり得るのではないかと推定することは可能であるが、実際はそれほど単純ではない。我々が行った予備検討結果で、ヘキソースの中でもガラクトースのように酸性ホスファターゼによってリン酸化されないものが見出されたのである。つまり、グルコースとペントース以外の化合物については、酸性ホスファターゼの基質となり得るものが何であるかは現在まで明らかとされておらず、それを実際に特定することは、漠然と推定することとは全く異なり、容易なことではなかった。
【特許文献１】特開２００５―２０９０号公報
【特許文献２】特開２００５―２０８９号公報
【特許文献３】特開２００２―１８７８１７号公報
【特許文献４】特開２００５―５２０８０号公報
【特許文献５】ＷＯ２００５―０４５０５２号公報
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，６５７，１９８１
【非特許文献２】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４０，１９６５
【非特許文献３】Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．,１，２００３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体のリン酸エステルを簡便に製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体とポリリン酸との反応を酸性ホスファターゼの存在下で行うことにより、糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体のリン酸エステルが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体とリン酸供与体とを酸性ホスファターゼの存在下で反応させる糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体のリン酸エステルの製造方法に関するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、マンノースやソルビトール等の糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体とピロリン酸等のリン酸供与体とから、糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体のリン酸エステルを製造することができ、従来に比較してより簡便な方法で製造することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本明細書において、「糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体」とは、「ヘプトース、グルコースおよびガラクトースを除くアルドヘキソース、２位の水酸基が水素原子に置換されたアルドヘキソース、２位の水酸基がアミノ基に置換されたアルドヘキソース、ケトヘキソース、ケトペントース、テトロース、トリオース、ヘプトースを還元してできる糖アルコール、ヘキソースを還元してできる糖アルコール、ペントースを還元してできる糖アルコール、テトロースを還元してできる糖アルコールおよびトリオースを還元してできる糖アルコール」を意味するものと定義する。
【００１１】
本発明は、糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体とリン酸供与体とを酸性ホスファターゼの存在下で反応させることにより糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体のリン酸エステルを簡便に製造することができる。
【００１２】
本発明に使用される糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体としては、好ましくは、第１級の水酸基を持つ糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体であり、具体的には例えば、セドヘプツロース、マンノース、タロース、アルトロース、グロース、イドース、アロース、フルクトース、ソルボース、タガトース、プシコース、リブロース、キシルロース、エリスロース、スレオース、２―デオキシグルコース、２―デオキシマンノース、２―デオキシタロース、２―デオキシアルトロース、２―デオキシグロース、２―デオキシイドース、２―デオキシアロース、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、ガラクチトール、ソルビトール、マンニトール、アリトール、タリトール、イディトール、リビトール、アラビトール、キシリトール、エリトリトール、トレイトール、グリセルアルデヒドおよびジヒドロキシアセトン等が挙げられる。これらはＤ体であってもＬ体であっても構わない。
【００１３】
本発明に使用される糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体としてより好ましいのは、第１級の水酸基を持つ炭素数４以上６以下の糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体であり、例えば、マンノース、タロース、アルトロース、グロース、イドース、アロース、フルクトース、ソルボース、タガトース、プシコース、リブロース、キシルロース、エリスロース、スレオース、２―デオキシグルコース、２―デオキシマンノース、２―デオキシタロース、２―デオキシアルトロース、２―デオキシグロース、２―デオキシイドース、２―デオキシアロース、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、ガラクチトール、ソルビトール、マンニトール、アリトール、タリトール、イディトール、リビトール、アラビトール、キシリトール、エリトリトールおよびトレイトール等が挙げられる。これらはＤ体であってもＬ体であっても構わない。
【００１４】
本発明に使用される糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体として、天然に存在する糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体はかなり好ましい。
【００１５】
本発明に使用される糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体としてさらに好ましいのは、マンノース、フルクトース、ソルボース、タガトース、２―デオキシグルコース、グルコサミン、ソルビトール、ガラクチトール、マンニトール、リビトール、アラビトール、キシリトールおよびエリトリトールである。これらはＤ体であってもＬ体であっても構わない。
【００１６】
本発明に使用されるリン酸供与体としては、酸性ホスファターゼの存在下で糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体にリン酸基を与えて糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体のリン酸エステルを製造しうるものであればよく、特に制限はないが、例えば、ポリリン酸またはその塩が挙げられる。
【００１７】
ポリリン酸またはその塩としては、ピロリン酸、トリポリリン酸、テトラポリリン酸、およびこれらのナトリウム塩もしくはカリウム塩等のアルカリ金属塩が挙げられる。
【００１８】
これらのリン酸供与体は単独で使用してもよく、また二種類以上を併用することもできる。
【００１９】
前記のリン酸供与体の中でも、ピロリン酸またはピロリン酸のカリウム塩は好ましい。
【００２０】
本発明に使用される酸性ホスファターゼとしては、糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体の第一級の水酸基にリン酸基を導入する反応を触媒するものであれば特に制限はなく、種々の生物由来の酸性ホスファターゼが使用できる。例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｉｃｕｕｍ等のカビに由来するフィターゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ等の酵母に由来するフィターゼ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｂｌａｔｔａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｔｕａｒｔｉｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ等の細菌に由来する酸性ホスファターゼ、ニワトリ等の動物に由来する酸性ホスファターゼ、ジャガイモ等の植物に由来する酸性ホスファターゼ等が挙げられ、これらは市販品として入手できるものもある。これらの中でも、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ属）由来の酸性ホスファターゼは好ましい。
【００２１】
近年の分子生物学および遺伝子工学の進歩により、目的遺伝子を公知の遺伝子工学的手法により製造および取得することが容易になった。そのため、前記の微生物が産生する酸性ホスファターゼの分子生物学的な性質やアミノ酸配列等を解析することにより、該酸性ホスファターゼをコードする遺伝子を該微生物株より取得し、該遺伝子および発現に必要な制御領域が挿入された遺伝子組換えプラスミドを構築し、これを任意の宿主に導入し、酸性ホスファターゼを産生する遺伝子組換え体を作出することができる。
【００２２】
ここでいう発現に必要な制御領域とは、プロモーター配列（転写を制御するオペレーター配列を含む）・リボソーム結合配列（ＳＤ配列）・転写終結配列等を示している。バクテリアを宿主とした場合、プロモーター配列の具体例としては、大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐオペレーター、ラクトースオペロンのｌａｃオペレーター、ラムダファージ由来のＰＬプロモーターおよびＰＲプロモーター、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター、アルカリプロテアーゼプロモーター、中性プロテアーゼプロモーター、α―アミラーゼプロモーター等が挙げられる。また、ｔａｃプロモーターのように独自に改変・設計された配列も利用できる。リボソーム結合配列としては、大腸菌由来または枯草菌由来の配列が挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。例えば、１６ＳリボソームＲＮＡの３‘末端領域に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作成してこれを利用してもよい。また、酸性ホスファターゼの上流に位置しているＳＤ配列が利用できるのであれば、そのＳＤ配列を利用するのが好ましい。転写終結配列は必ずしも必要ではないが、ρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミテーター、ｔｒｐオペロンターミネーター等が利用できる。これら制御領域の組換えプラスミド上での配列順序は、５’末端側上流からプロモーター配列、リボソーム結合配列、酸性ホスファターゼをコードする遺伝子、転写終結配列の順に並ぶことが望ましい。ここでいうプラスミドの具体例としては、大腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II  ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３―３、ｐＳＣ１０１や、枯草菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１、φ１０５等をベクターとして利用することができる。また、２種類以上の宿主内で自律複製が可能なプラスミドの例として、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７およびｐＢＳ７等をベクターとして利用することができる。
【００２３】
ここでいう任意の宿主には、後述の実施例に記載したような大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が代表例として挙げられるが、大腸菌に限定されるものではなく、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も含まれる。
【００２４】
酵母を宿主とした場合、プロモーター配列の具体例としては、ｅｎｏ−１プロモーター、ガラクトシダーゼプロモーター、アルコールオキシダーゼプロモーター等が挙げられる。プラスミドの具体例としては、酵母内で自律複製可能なｐＥＳＣ、ｐＰＩＣ、ｐＡＯ、ｐＭＥＴ、ｐＹＥＳ、ｐＴＥＦ、ｐＮＭＴ等が挙げられるが、これらは大腸菌内でも自律複製可能である。宿主の具体例としては、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓやＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ等が挙げられる。
【００２５】
本発明の製造方法には、酸性ホスファターゼ産生能を有する微生物および高等生物由来の細胞、酸性ホスファターゼをコードする遺伝子で形質転換された細胞そのものおよびこれら細胞の破砕物を使用することもできるが、該細胞、該細胞の破砕物および該細胞の破砕物を硫安沈殿やカラムクロマトグラフィー等の処理を行って精製した酸性ホスファターゼ活性を含む画分を担体に担持させた固定化物を使用することもできる。
【００２６】
前記の反応に使用する糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体とリン酸供与体のモル比は特に制限されないが、通常、どちらか一方が他方に対して１倍モルより多く存在する条件下で反応は行われる。例えば、リン酸供与体が糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体に対して１倍モルより多く２０倍モル以下存在する条件下で行われる。しかしながら、リン酸供与体が糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体に対して多く存在する条件下で反応させることで糖（但しガラクトースを除く）または誘導体のリン酸エステルの生成量は増加するが、リン酸供与体が糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体に対して多く存在しすぎると、リン酸の産業廃棄物が多く発生してしまいプロセス上好ましくない。よって、好ましくはリン酸供与体が糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体に対して１倍モルより多く７倍モル以下存在する条件下で行われる。
【００２７】
反応液中の糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体の濃度は特に制限されないが、通常、０．０５〜４Ｍの範囲で行われる。
【００２８】
反応液中のリン酸供与体の濃度は、酸性ホスファターゼの酵素活性が阻害されない範囲であればよく、特に制限されないが、通常、０．０５〜２Ｍの範囲で行われる。
【００２９】
反応液中の酸性ホスファターゼの活性値は、糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体のリン酸エステルが生成する量が存在すればよく、特に制限されないが、通常、１〜１０００Ｕ／ｍＬの範囲で行われる。
【００３０】
反応温度は、糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体のリン酸エステルが生成する温度範囲であればよく、特に制限されないが、通常、５〜４０℃の範囲で行われ、好ましくは１０〜３０℃の範囲で行われる。
【００３１】
反応液のｐＨは、糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体のリン酸エステルが生成する範囲であればよく、特に制限されないが、通常、ｐＨは３．０〜６．０の範囲で行われ、好ましくは３．５〜４．０の範囲で行われる。
【００３２】
酸性ホスファターゼの中にはマグネシウムイオン等の二価の金属イオンでホスファターゼ活性の向上が見られるものもあるため、必要に応じて二価の金属イオンのような多価金属化合物等を反応液中に存在させることができる。
【００３３】
前記の反応により、反応に使用する糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体に対応する糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体のリン酸エステルが得られる。Ｄ体の糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体からはＤ体の糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体のリン酸エステルが、Ｌ体の糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体からはＬ体の糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体のリン酸エステルが得られる。
【００３４】
本発明者らは、酸性ホスファターゼとピロリン酸を用いることで、幅広い種類の糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体をリン酸化することができることを見出した。すなわち、本発明の製造方法は、糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体のリン酸エステルを製造する方法として有用である。
【００３５】
例えば、マンノース、フルクトース、ソルボース、タガトース、２―デオキシグルコース、グルコサミン、ソルビトール、ガラクチトール、マンニトール、リビトール、アラビトール、キシリトールまたはエリトリトールと、ピロリン酸またはピロリン酸のカリウム塩とを、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ属）由来の酸性ホスファターゼの存在下で反応させることにより、マンノースリン酸エステル、フルクトースリン酸エステル、ソルボースリン酸エステル、タガトースリン酸エステル、２―デオキシグルコースリン酸エステル、グルコサミンリン酸エステル、ソルビトールリン酸エステル、ガラクチトールリン酸エステル、マンニトールリン酸エステル、リビトールリン酸エステル、アラビトールリン酸エステル、キシリトールリン酸エステルまたはエリトリトールリン酸エステルがそれぞれ得られる。
【００３６】
本発明の製造方法の一実施態様としては、例えば、所望のｐＨに調整したバッファー中に糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体とリン酸供与体を存在させ、そこに酸性ホスファターゼを加えて反応させる方法が挙げられる。
【００３７】
前記の反応で得られる糖（但しガラクトースを除く）または糖誘導体のリン酸エステルは、反応液から金属塩として沈殿させる方法やカラムクロマトグラフィー等の公知の分離方法を用いて分離することができる。
【００３８】
以下、実施例により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、以下の実験において生成した目的化合物の分析は高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＨＰＬＣ」と略記する。）に依った。ＨＰＬＣ分析の条件を次に示す。
【００３９】
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ―５０  ４Ｅ（昭和電工）
移動相：１００ｍＭ  リン酸二水素ナトリウム
検出器：示差屈折率計
【００４０】
また、培養して得られた菌体のホスファターゼ活性は、ｐ―ニトロフェニルリン酸エステルからｐ―ニトロフェノール（ε＝１６６００Ｍ−１ｃｍ−１、ｐＨ６．０）への変化を４１０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより求めた。ホスファターゼ活性の測定条件は次のとおりである。
【００４１】
１００ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ６．０）、１０ｍＭのｐ―ニトロフェニルリン酸エステルを含む溶液に、参考例１で調製した培養菌体を添加して、３７℃で１５分間反応させた。１ＮのＮａＯＨを添加して反応を停止し、４１０ｎｍにおける吸光度の増加を測定した。１ユニット（Ｕ）の定義を１分間に１μｍｏｌのｐ―ニトロフェニルを遊離することができる酵素量とした。
【００４２】
［参考例１］
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８，１９９６に記載のＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ２ａ  ＹＳＨ６０００に由来する酸性ホスファターゼ配列をもとに、配列番号１および配列番号２に示した２種のプライマーを作成し、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ２ａ  ＹＳＨ６０００由来の酸性ホスファターゼをコードする遺伝子（ｐｈｏＮ）を含むプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行った。１０ｍＭのＫＯＤ―ｐｌｕｓバッファー、１．５μＭのフォワードおよびリバースプライマー、１ｍＭの硫酸マグネシウム、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、２ＵのＫＯＤ―ｐｌｕｓポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）、５０ｎｇ／μＬの鋳型ＤＮＡからなる反応溶液を作成した。９４℃で２分間保持した後、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で１分間のサーマルサイクルを３０サイクル行った後、最後に６８℃で１０分間保持した。その結果、約０．７５ｋｂの増幅断片が得られたので、得られた断片をＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ処理し、ｐＵＣ１９に連結してｐＵＣ１９−ｐｈｏＮを作成した。作成したｐＵＣ１９−ｐｈｏＮの塩基配列を解析したところ、データベース（ＮＣＢＩ  ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｄ８２９６６）に収録されている塩基配列と全て一致した。得られたｐｈｏＮの塩基配列を配列番号３に示した。こうして得られたｐＵＣ１９−ｐｈｏＮを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換して、ホスファターゼ活性の発現株を作成した。
【００４３】
バッフル付フラスコにＬＢ  ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）を調製し、１２０℃、２０分間殺菌後、作成したホスファターゼ活性の発現株を植菌して、３７℃、１２０ｒｐｍで振とう培養した。遠心分離によって菌体を回収したところ、１Ｌの培養液から湿重量で３．３７ｇの菌体が得られた。なお、この菌体の活性値は４９３０Ｕであった。
【実施例１】
【００４４】
１００ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ３．５）、２００ｍＭのピロリン酸とピロリン酸カリウムの混合溶液（ｐＨ３．５）、１００ｍＭの糖を含む溶液に、参考例１で調製した培養菌体を用いて反応液中の活性値が１．５Ｕ／ｍＬ（１ｍｇ湿菌体／ｍＬ）となるように調整した菌体液を添加して、３０℃で４時間反応させた。基質として用いた糖は、Ｄ―マンノースおよびＤ―フルクトースである。反応液をＨＰＬＣ分析した結果、Ｄ―マンノースより２６．２ｍＭのＤ―マンノース―６―リン酸エステル、Ｄ―フルクトースより１６．４ｍＭのＤ―フルクトース―１―リン酸エステルが生成していた。
【００４５】
［比較例１］
１００ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ３．５）、２００ｍＭのピロリン酸とピロリン酸カリウムの混合溶液（ｐＨ３．５）、１００ｍＭのＤ―ガラクトースを含む溶液に、参考例１で調製した培養菌体を用いて反応液中の活性値が１．５Ｕ／ｍＬ（１ｍｇ湿菌体／ｍＬ）となるように調整した菌体液を添加して、３０℃で４時間反応させた。反応液をＨＰＬＣ分析した結果、Ｄ―ガラクトース―６―リン酸エステルのピークは検出されなかった。
【実施例２】
【００４６】
１００ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ３．５）、２００ｍＭのピロリン酸とピロリン酸カリウムの混合溶液（ｐＨ３．５）、１００ｍＭの糖誘導体を含む溶液に、参考例１で調製した培養菌体を用いて反応液中の活性値が１．５Ｕ／ｍＬ（１ｍｇ湿菌体／ｍＬ）となるように調整した菌体液を添加して、３０℃で４時間反応させた。基質として用いた糖誘導体は、２―デオキシ―Ｄ―グルコース、Ｄ―グルコサミンである。反応液をＨＰＬＣ分析した結果、２―デオキシ―Ｄ―グルコースより５６ｍＭの２―デオキシ―Ｄ―グルコース―６―リン酸エステル、Ｄ―グルコサミンより６９．０ｍＭのＤ―グルコサミン―６―リン酸エステルが生成していた。
【実施例３】
【００４７】
１００ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ３．５）、５００ｍＭのピロリン酸とピロリン酸カリウムの混合溶液（ｐＨ３．５）、２００ｍＭの糖または糖誘導体を含む溶液に、参考例１で調製した培養菌体を用いて反応液中の活性値が７．５Ｕ／ｍＬ（５ｍｇ湿菌体／ｍＬ）となるように調整した菌体液を添加して、３０℃で４時間反応させた。基質として用いた糖または糖誘導体は、Ｌ―ソルボース、Ｄ―タガトース、Ｄ―ソルビトール、Ｄ―ガラクチトール、Ｄ―マンニトール、リビトール、Ｄ―アラビトール、キシリトール、Ｄ―エリトリトールである。反応液より生成物を回収してＭＳ分析した結果、Ｌ―ソルボースよりＬ―ソルボースリン酸エステル、Ｄ―タガトースよりＤ―タガトースリン酸エステル、Ｄ―ソルビトールよりＤ―ソルビトールリン酸エステル、Ｄ―ガラクチトールよりＤ―ガラクチトールリン酸エステル、Ｄ―マンニトールよりＤ−マンニトールリン酸エステル、リビトールよりリビトールリン酸エステル、Ｄ―アラビトールよりＤ―アラビトールリン酸エステル、キシリトールよりキシリトールリン酸エステル、Ｄ―エリトリトールよりＤ―エリトリトールリン酸エステルと推定される分子量の生成物が生成していた。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明は、機能性食品や化粧品などの素材として有用な糖または糖誘導体のリン酸エステルを製造する方法として有用である。
【配列表】
2007195401000001.app