(57)【要約】      （修正有）【課題】安全かつ効果的に細胞死の促進機能を阻害することにより、特に、脳梗塞などにおける神経細胞死を抑制する方法を提供すること。【解決手段】無血清培地や６−Ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ（６−ＯＨＤＡ）などにより神経細胞死を誘導したときのＢＥＣ−1遺伝子の発現や該遺伝子がコードするタンパク質の増加、およびＲＮＡｉ法によりＢＥＣ−1遺伝子をノックダウンしたときの神経細胞死の遅延が認められた。本遺伝子や該遺伝子がコードするタンパク質の発現を指標としたスクリーニング法により、細胞死を主因とする病態、神経変性（パーキンソン病、脳卒中、アルツハイマー病など）などの新たな治療薬の開発が可能である。また本遺伝子や該遺伝子がコードするタンパク質は抗腫瘍薬として効果を発揮する可能性があるこの機能を阻害することにより脳梗塞などにおける神経細胞死を抑制できる可能性がある。【選択図】図１
2007104941.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラット頭蓋内より脳組織を摘出して組織断片を作成し、
該組織断片の細胞を等張性ｐｅｒｃｏｌｌ溶液中に浮遊させ、
該浮遊した細胞を超遠心で分離して、
該分離した細胞において、中間第３層に含まれγＧＴＰに高い活性を示す画分を回収して、
該回収した細胞を、少なくとも、ＦＢＳ、ＥＣＧＦ、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ｍｉｘｔｕｒｅ
および、ブタヘパリンを添加したＤＭＥＭ培地で培養することを特徴とするラット脳血管内皮細胞の分離および培養方法。
【請求項２】
ラット胸部大動脈細胞から、ディスパーゼ、コラゲナーゼ溶液中で、内皮細胞を回収し、
該内皮細胞を、少なくとも、ＦＢＳ，Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ
ｇｒｏｗｔｈ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ｍｉｘｔｕｒｅ  、ブタヘパリンを添加した培地で培養することを特徴とするラット大動脈内皮細胞の分離および培養方法。
【請求項３】
３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養することを特徴とする請求項１から２いずれかに記載の分離および培養方法。
【請求項４】
上記分離培養した脳血管内皮細胞および大動脈内皮細胞から、ＩＳＯＧＥＮ  （Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ）にてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、
該ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  より、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０（ＴａＫａＲａ）にてｐｏｌｙ  Ａ＋  ＲＮＡを抽出して、
該ｐｏｌｙ  Ａ＋  ＲＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  （Ｇｉｂｃｏ）にて逆転写反応させcDNAライブラリを作製して、
該脳血管内皮cDNAをテスター、大動脈内皮cDNAをドライバーとして、両方を制限酵素RsaIで平滑末端のDNA断片に消化することを特徴とするＳｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ
Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ   Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＳＳＨ）法にて、ラット脳血管内皮細胞に優位に発現する遺伝子を検出する方法。
【請求項５】
上記テスターを分けてそれぞれにアダプター１，アダプター２Ｒを付加すし、該アダプター１付加テスターと十分量の上記ドライバーとをハイブリダイズし、
該アダプター２Ｒ付加テスターと十分量の上記ドライバーとをハイブリダイズし、
該両テスターおよび十分量の上記ドライバーをハイブリダイズしてＳｕｂｔｒａｃｔｅｄ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙを作成方法することを特徴とする請求項４に記載のラット脳血管内皮細胞に優位に発現する遺伝子を検出する方法。
【請求項６】
上記Ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙをテンプレートとして、  ＰＣＲサイクルを施行して、ラット脳血管内皮細胞に優位に発現する遺伝子を増幅させ、
該ＰＣＲプロダクトをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にてサブクローニングし、
ＴＯＰ１０Ｆ’コンピテントセル  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフォーメーションして、ＬａｃＺ非発現細胞（脳血管内皮に優位に発現する遺伝子断片が組み込まれたベクター陽性の細胞）を検出してピックアップし培養し、プラスミド抽出することを特徴とする請求項４に記載のラット脳血管内皮細胞に優位に発現する遺伝子を検出する方法。
【請求項７】
上記プラスミドを、９６ｗｅｌｌ  ｄｏｔ−ｂｌｏｔ  ｓｙｓｔｅｍ  （ＢＩＯ−ＲＡＤ）にてＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋  （Ａｍｅｒｓｈａｍ）にブロッティングし、
さらにＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｋｉｔ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてメンブレンと32Pで標識したテスター、ドライバーcDNAプローブとを各々ハイブリダイズし、
ホットスポットをＳＴＯＲＭ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎａｌｙｚｅｒ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ）で定量化し、
脳血管内皮に３倍以上多く発現している遺伝子断片を陽性として選択して、遺伝子断片の塩基配列を決定し、ホモロジー検索を行うことを特徴とする請求項４に記載のラット脳血管内皮細胞に優位に発現する遺伝子を検出する方法。
【請求項８】
請求項４から６のいずれかの方法により検出されたラット遺伝子断片。
【請求項９】
上記ラット遺伝子断片より、Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ
ｒａｔ  Ｋｉｄｎｅｙ  ｃＤＮＡ  （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をテンプレートとして、５‘−ＲＡＣＥにて５’側の未知部分をクローニングすることを特徴とする請求項８により検出されたラット遺伝子全長のクローニング方法。
【請求項１０】
上記クローニングより検出されたラット脳血管内皮細胞に優位に発現する遺伝子。
【請求項１１】
上記プライマーセットで増幅したＰＣＲ産物の精製品を希釈したものを標準サンプルとして、
該ＰＣＲ産物を更に希釈したものを鋳型にして、同一のプライマーセットでＰＣＲしたことを特徴とするラット正常組織におけるｍＲＮＡの発現方法。
【請求項１２】
請求項１０の遺伝子がコードするタンパク質に特異的に結合する抗体。
【請求項１３】
請求項１１により発現する上記ｍＲＮＡよりコードされるラット正常組織におけるタンパク質。
【請求項１４】
Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によりｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、
ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＸＬ  （ＴａＫａＲａ）にて逆転写し、
無血清培地で神経細胞を培養し、請求項８で検出された遺伝子を発現増加する方法。
【請求項１５】
ネガティブコントロールとしてＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ＧＬ２  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションして、
請求項１０で検出された遺伝子をノックダウンすることにより、
請求項１１のｍＲＮＡの発現を抑制することを特徴とする神経細胞死の遅延方法。
【請求項１６】
６−ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ（６−ＯＨＤＡ）にて神経細胞死を誘導したことを特徴とする請求項１０記載の遺伝子の発現増加方法。
【請求項１７】
ＰＣ−１２細胞を、神経細胞様に分化させたことを特徴とする請求項１０記載の遺伝子の発現増加方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
既に知られているように、本来、細胞死（アポトーシス）は、生体の恒常性を保つために必要な自然死であり、その破綻は、癌や自己免疫疾患などの重篤な疾患を招く。アポトーシス誘因は、例えば、TNF、TRAIL、FasL等が報告されている。これらは、標的細胞上の特異的な受容体と結合し、アポトーシスを誘導する。ところが、アポトーシス異常昂進は、神経細胞の場合、脳梗塞、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病等の細胞死を伴う疾患の進行を早める。そこで、近年、これを阻止あるいは遅らせる可能性が探求され、神経系のアポトーシスの抑制に関する研究が進んでいる。
【０００２】
例えば、カスペースの阻害作用などによりアポトーシスを阻害する薬剤が脳虚血による神経障害、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー等の神経変性疾患の動物モデルにおいて有効な治療効果を示すことが報告されている。
しかし、抗体に代表されるアポトーシス阻害剤は、特異性は高いが分子量が大きいタンパク質であるので、抗原性、投与方法、安定性などに問題がある。天然のTNF結合タンパク質のTNF結合機能部分を探索して得られた合成ペプチドであるアポトーシス阻害剤は、天然のTNF結合タンパク質との競合による有効性の低下、血液中の滞留時間が短い等の問題がある。また、低分子有機化合物のアポトーシス阻害剤は、アポトーシスの基本経路を阻害するので、選択性が低いことによる副作用が課題となる。（特許文献１、２）以上から、より効果的で安全なアポトーシス阻害方法および阻害剤の開発が求められている。
【０００３】
一方、最新の研究により、脳血管系から神経細胞への物質輸送は、血液脳関門（Blood brain barrier; 以下BBBとする。）により厳格に制御され、これが、他の血管系にはみられない特異な構造であり、その構築に脳血管内皮細胞が重要な役割を果たしていることが知られている。（非特許文献１）
【特許文献１】特開２００４−２０１５６６号公報
【特許文献２】特開２００４−２５６４９８号公報
【非特許文献１】Reese, TS., Karnovsky,MJ.; J Cell Biol., (1967), 34: 207-217DeBault, LE.,Cancilla, PA.; Science., (1980), 207: 653-655Inomata, K., et al. ;Acuta Anat., (1984), 118 : 243-248Kalaria, RN., Harik,SI. ; J Neurochem., (1987), 49 : 856-864Seulberger, H., et al. ;EMBO J., (1990), 2151-2158
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明はかかる事情に鑑みてなされたものであり、安全かつ効果的に細胞死の促進機能を阻害することにより、特に、脳梗塞などにおける神経細胞死を抑制する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するため、本発明者は、ヒトの疾患に関係する遺伝子にほぼすべてにオーソログがあるラットの脳血管内皮細胞におけるさまざまな遺伝子の発現状況を検討することにより、脳血管内皮細胞の分化やBBBの形成に関与する機能特異的遺伝子を推測できるのではないか、と鋭意研究した結果、脳血管内皮細胞をpercoll gradient法により分離、培養する系を確立した。また、酵素法により大動脈内皮細胞を分離、培養して、細胞死の促進機能を有する遺伝子が、配列公知遺伝子（以下BEC-1とする。）であることを知見して、該遺伝子がコードするタンパク質の機能を阻害することにより、上記課題を解決することを提供する。
【発明の効果】
【０００６】
請求項１に係る発明は、ラット頭蓋内より脳組織断片を作成し、該脳組織断片の細胞を等張性ｐｅｒｃｏｌｌ溶液中に浮遊させ、該浮遊した細胞を超遠心で分離して、該分離した細胞において、中間第３層に含まれγＧＴＰに高い活性を示す画分を回収して、該回収した細胞を、少なくとも、ＦＢＳ、ＥＣＧＦ、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ｍｉｘｔｕｒｅ、ブタヘパリンを添加したＤＭＥＭ培地で培養することを特徴とするラット脳血管内皮細胞の分離および培養方法に関する。
【０００７】
請求項２に係る発明は、ラット胸部大動脈より単離した細胞より、ディスパーゼ、コラゲナーゼ溶液中で内皮細胞を回収し、該内皮細胞を、少なくとも、ＦＢＳ，Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ
ｇｒｏｗｔｈ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ｍｉｘｔｕｒｅ  、ブタヘパリンを添加したＭ１９９培地で培養することを特徴とするラット大動脈内皮細胞の分離および培養方法に関する。請求項３に係る発明は、ラット脳血管内皮細胞培養方法およびラット大動脈内皮細胞の培養が、いずれも、３７℃、５％ＣＯ２の条件下である培養方法に関する。
【０００８】
請求項４に係る発明は、上記分離・培養したラット脳血管内皮細胞およびラット大動脈内皮細胞から、ISOGEN
(Nippongene)にてtotal RNAを抽出し、該total
RNA より、Oligotex-dT30 (TaKaRa)にてpoly
A＋ RNAを抽出し、該poly A＋
RNAを、SuperScript II reverse
transcriptase (Gibco)にて逆転写反応させ、cDNAライブラリを作製して、該脳血管内皮cDNAをテスター（以下テスター）、該大動脈内皮cDNAをドライバー（以下ドライバー）として、両方を制限酵素RsaIで短い平滑末端のDNA断片に消化することを特徴とするＳｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ
Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ   Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＳＳＨ）法によるラット脳血管内皮細胞に優位に発現する遺伝子を検出する方法に関する。
【０００９】
請求項５に係る発明は、上記テスターを分けて、それぞれにアダプター１，アダプター２Ｒを付加し、該アダプター１付加テスターと十分量のドライバーとをハイブリダイズし、該アダプター２Ｒ付加テスターと十分量の上記ドライバーとをハイブリダイズし、該両テスターおよび十分量の上記ドライバーをハイブリダイズしてSubtracted cDNA libraryを作成することを特徴とするラット脳血管内皮細胞に優位に発現する遺伝子を検出する方法に関する。
【００１０】
請求項６に係る発明は、上記Subtracted cDNA libraryをテンプレートとして、 PCRサイクルを施行して、ラット脳血管内皮細胞に優位に発現する遺伝子を増幅させ、酵素法により、該PCRプロダクトをpCR2.1-TOPO (Invitrogen)にてサブクローニングし、TOP10F’コンピテントセル (Invitrogen)にトランスフォーメーションして、LacZ非発現細胞（脳血管内皮に優位に発現する遺伝子断片が組み込まれたベクター陽性の細胞）を検出してピックアップして培養して、プラスミド抽出することを特徴とするラット脳血管内皮細胞に優位に発現する遺伝子を検出する方法に関する。
【００１１】
請求項７に係る発明は、上記のように抽出したプラスミドを、96well dot-blot system
(BIO-RAD)にてHybond N+ (Amersham)にブロッティングし、さらにPCR-Select Differential Screening kit (Clontech)を用いて、メンブレンと32Pで標識したテスター、ドライバーcDNAプローブとを各々ハイブリダイズし、ホットスポットをSTORM imaging
analyzer (Amersham)で定量化し、脳血管内皮に３倍以上多く発現している遺伝子断片を陽性として選択して、該遺伝子断片の塩基配列を決定し、ホモロジー検索を行うことを特徴とする請求項４に記載のラット脳血管内皮細胞に優位に発現する遺伝子を検出する方法に関する。
【００１２】
請求項８に係る発明は、上記により検出されたラット遺伝子断片（Ｇ６とする）に関する。
【００１３】
請求項９に係る発明は、上記ラット遺伝子断片Ｇ６より、Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ
ｒａｔ  Ｋｉｄｎｅｙ  ｃＤＮＡ  （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をテンプレートとして、５‘−ＲＡＣＥにて５’側の未知部分をクローニングすることを特徴とする請求項８により検出されたラット遺伝子全長のクローニング方法に関する。
請求項１０に係る発明は、上記クローニングより検出されたラット脳血管内皮細胞に優位に発現する遺伝子（ＢＥＣ−１とする）に関する。
請求項１１に係る発明は、上記プライマーセットで増幅したＰＣＲ産物の精製品を希釈したものを標準サンプルとして、該ＰＣＲ産物を更に希釈したものを鋳型にして、同一のプライマーセットでＰＣＲしたことを特徴とするラット正常組織におけるｍＲＮＡの発現方法に関する。
【００１４】
請求項１２に係る発明は、請求項１０の遺伝子がコードするタンパク質に特異的に結合する抗体に関する。
【００１５】
請求項１３に係る発明は、上記BEC-1遺伝子によるmRNAよりコードされたラット正常組織におけるタンパク質に関する。
【００１６】
請求項１４に係る発明は、Kit (QIAGEN)によりtotal RNAを抽出し、AMV Reverse Transcriptase XL (TaKaRa)にて逆転写を特徴とする無血清培地で神経細胞を培養し、請求項１０で検出された遺伝子の発現増加する方法に関する。
【００１７】
請求項１５に係る発明は、ネガティブコントロールとしてLuciferase GL2 siRNAをトランスフェクションして、請求項８で検出された遺伝子をノックダウンにより、請求項１１のmRNAの発現を抑制することを特徴とする神経細胞死の遅延方法に関する。
【００１８】
請求項１６に係る発明は、６−ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ（６−ＯＨＤＡ）にて神経細胞死を誘導したことを特徴とする請求項１０記載の遺伝子の発現増加方法に関する。
【００１９】
請求項１７に係る発明は、ＰＣ−１２細胞を、神経細胞様に分化させたことを特徴とする請求項１０記載の遺伝子の発現増加方法に関する。
【００２０】
上記のように構成された本発明においては、無血清培地や６-Hydroxydopamine (6-OHDA)などにより神経細胞死を誘導したときのBEC-1遺伝子の発現増加、およびRNAi法によりBEC-1遺伝子をノックダウンしたときの神経細胞死の遅延することが知見された。従って、本発明の遺伝子は細胞死を促進していることが結論づけられたため、この機能を阻害することにより脳梗塞などにおける神経細胞死を抑制できる可能性がある。また本遺伝子や該遺伝子がコードするタンパク質は抗腫瘍薬として効果を発揮する可能性がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下に、この発明の実施形態（以下本発明という）を図面により説明する。
【００２２】
（実施例１）
本発明の実施の形態（以下、単に本発明という）について、以下に図面に基づき説明する。請求項１から３に係るラット脳血管内皮細胞の分離および培養方法分離・培養を説明する。
【００２３】
上記のように、脳血管系から神経細胞への物質輸送は血液脳関門（Blood brain barrier; BBB）により厳格に制御されていることが知られているが、これは他の血管系にはみられない特異な構造である。その構築に脳血管内皮細胞が重要な役割を果たしていることが知られている。そこで、脳血管内皮細胞におけるさまざまな遺伝子の発現状況を検討することにより、脳血管内皮細胞の分化やBBBの形成に関与する機能特異的遺伝子を推測できるのではないかと考えた。そこで、まず本発明者は、ウィスターラットより脳血管内皮細胞をpercoll gradient法により分離、培養する系を確立した。同じく酵素法により大動脈内皮細胞を分離、培養した（Takeo et al, 2003）。
【００２４】
以下に詳細に説明する。３〜５週齡の雄ウィスターラットをエーテルにて麻酔し、断頭する。頭蓋内より脳組織を摘出し細かく切り刻む。次に、50%等張性percoll溶液に細胞を浮遊させる。超遠心にて分離された中間第３層に含まれ、γGTPに高い活性を示す画分が脳血管内皮細胞である。γGTP活性はIatroset kit (Iatron)にて測定した。該細胞を回収し、PBSで何度か洗い、20%FBS、150μg/ml ECGF、penicillin-streptomycin mixture (50U/ml)、ブタヘパリン(10U/ml)を添加したDMEM培地にて培養した。
【００２５】
一方、大動脈内皮細胞は３〜５週齡の雄ウィスターラットの胸部大動脈より単離した。胸部大動脈を摘出しシート状に切り開く。ディスパーゼ、コラゲナーゼ溶液中で内腔をかき取り、内皮細胞を回収する。10%FBS、50μg/ml
Endothelial growth supplement、penicillin-streptomycin
mixture (50U/ml)、ブタヘパリン(10U/ml)を添加したM199培地にて培養した。いずれの細胞も３７℃、5% CO2の条件下で培養した。
（実施例２）
【００２６】
以下に請求項４から７に係るSuppression Subtractive Hybridization (SSH)法にて脳血管内皮細胞に優位に発現する遺伝子の検出方法と、請求項８に係り、該検出されたラットBEC-1遺伝子断片について説明する。次に、脳血管内皮細胞に優位に発現する遺伝子を解析するために、Suppression subtractive hybridization (SSH)法を選択した（Diatchenko L et al, 1996）。
上記方法にて分離培養した脳血管内皮細胞、大動脈内皮細胞を用意する。両方からISOGEN (Nippongene)にてtotal RNAを抽出する。Oligotex-dT30 (TaKaRa)にてpoly A＋
RNAを抽出した。5μgのpoly A＋ RNAをSuperScript II reverse transcriptase (Gibco)にて逆転写反応させcDNAライブラリを作製した。SSHにはPCR-Select
cDNA subtraction kit (Clontech)を使用した。脳血管内皮cDNAをテスター、大動脈内皮cDNAをドライバーとして、両方を制限酵素RsaI消化し短い平滑末端のDNA断片に消化した。
【００２７】
次に、テスターを等量に分けてそれぞれにアダプター１，アダプター２Ｒを付加する。アダプター１付加テスターと十分量のドライバーとをハイブリダイズする（98℃1.5分、68℃８時間）。同様にアダプター２Ｒ付加テスターと十分量のドライバーとをハイブリダイズする。さらに両テスターおよび十分量のドライバーをハイブリダイズする（68℃16時間）。これによりSubtracted
cDNA libraryが完成する。
【００２８】
これをテンプレートとしてFirst PCR 30サイクル（94℃30秒、66℃30秒、72℃1.5分）、Second PCR 14サイクル（94℃30秒、68℃30秒、72℃1.5分）を施行することにより、脳血管内皮細胞に優位に発現する遺伝子のみが増幅する。酵素はLA-Taq (TaKaRa)を使用。PCRプロダクトをpCR2.1-TOPO (Invitrogen)にてサブクローニングし、TOP10F’コンピテントセル (Invitrogen)にトランスフォーメーションしてLacZ非発現細胞（脳血管内皮に優位に発現する遺伝子断片が組み込まれたベクター陽性の細胞）をX-galにて検出してピックアップ。LB培地にて大量培養し、BioRobot (QIAGEN)にてプラスミド抽出した。
【００２９】
さらに、96well
dot-blot system (BIO-RAD)にてHybond N+
(Amersham)にプラスミドをブロッティングした。PCR-Select Differential
Screening kit (Clontech)を用いてメンブレンと32Pで標識したテスター、ドライバーcDNAプローブとを各々ハイブリした。ホットスポットをSTORM imaging analyzer (Amersham)で定量化し、脳血管内皮に３倍以上多く発現している遺伝子断片を陽性として選択した。3700 Sequencing system (Applied Biosystems)にて遺伝子断片の塩基配列を決定し、BLAST (NCBI, NIH)にてホモロジー検索を行った。
以上から、結果２４の機能既知遺伝子、７のESTを含む２０の配列公知機能未知遺伝子、新規遺伝子断片G6を検出した。
（実施例３）
【００３０】
以下に請求項９に係るBEC-1遺伝子のクローニングおよび請求項１０に係る遺伝子について説明する。
上記によりラット脳血管内皮細胞から検出した新規遺伝子断片G6について、Marathon-Ready rat Kidney cDNA (Clontech)をテンプレートとして5’-RACEにて5’側の未知部分をクローニングした。
（5’-RACE）
cDNA：Marathon-Ready
cDNA rat Kidney (Clontech)
primer(5’→3’)
G6-R4      tcaagtcccgataaggataacgtgc
G6-R2      ctgggttggccatgttgact
Anchor primer(5’→3’)
AP1     ccatcctaatacgactcactatagggc
AP2     actcactatagggctcgagcggc
AP1とG6-R2の組み合わせでPCRを行い、そのPCR産物を鋳型にしてAP2とG6-R4でnested PCRを行い、得られた断片の塩基配列を決定した。
一方3’側はRat Adipose Tissue 3'-RACE cDNA (Biochain)をテンプレートとしてクローニングした。
（3’-RACE）
cDNA：3’-RACE
cDNA rat Adipose (Biochain)
primer(5’→3’)
G6-F12     tggagcagaatggtcacagcctac
LOST1-F1   gatcctggcttcagactgttag
Anchor primer(5’→3’) ggatccactgcagtggaattc
【００３１】
さらに、G6-F12とAnchor primerの組み合わせでPCRを行い、さらにLOST1-F1 primerとAnchor primerとの組み合わせでnested PCRにより得られた断片にポリA配列を確認した。その結果全長3410bpの配列を得た。ORFはその配列中に完結しており、522bpであった。推測されたアミノ酸配列は173アミノ酸残基であった。ラット脳血管内皮細胞から検出した遺伝子であったことから、BEC-1
(Brain Endothelial Cell derived gene-1)と名付けた。この遺伝子はBLASTにてhuman LOST-1遺伝子（GenBank Accession Number:
NM_172367）と非常に高いホモロジーを示した（Identity 85%）。またこのORFは上記２種類のcDNAライブラリからPCRで増幅できたことも併せて、ラットのLOST-1遺伝子であると判断した。
【００３２】
上記により得られた結果を図１及び図２に示す。図１はラットBEC-1 mRNAのcDNA配列および推測したアミノ酸配列。下線はポリＡ付加シグナルを示す。図２は、推測されたラットBEC-1、ヒト、マウスLOST-1タンパク質のアライメントである。ClustalWにて作製した。同一アミノ酸を黒色、同種アミノ酸を灰色で示した。
また3410bpの3’末端にはpoly Aサイトも検出できたことから、配列はラットLOST-1 mRNAの全長である可能性が高いと考えられた（図１）。LOST-1は肺癌などの悪性腫瘍で欠失している頻度が高い遺伝子座、17p13.3に存在する遺伝子としてクローニングされた遺伝子で、それゆえ癌抑制遺伝子候補とされるが（Konishi, H., et al.; Oncogene., (2003), Mar 27; 22 (12): 1892-905）、その生理機能は明らかにはなっていない。
（実施例４）
【００３３】
請求項１１に係るラット正常組織においてBEC-1 mRNAの発現について説明する。ラット正常組織においてBEC-1 mRNAの発現はほぼユビキタスであったが、肺、腎などに多くみられた。
（標準線用サンプルの調製）
上のプライマーセットで増幅したPCR産物の精製品を10倍段階希釈したものを標準専用サンプルとした。具体的には、以下の通りである。
（PCR条件）
template DNA         1ng
primer set           各5pmole
酵素(※)             12.5μL
滅菌水               total
25μLになるように調整
↓
50℃２分→95℃2分→（95℃15秒、60℃1分）×40サイクル
↓
電気泳動でサイズ確認
GAPDH：177bp
BEC-1：73bp
↓
このPCR産物を更に100倍希釈したものを鋳型にして同じプライマーセットでPCRした。（量を確保するため）
↓
PCR産物(×100倍)    8μL
Primer set           各20pmole
酵素（※）           50μL
滅菌水               total
100μLになるように調整
↓
フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿で精製。
滅菌水に溶解し、10倍段階希釈した。（10-7まで）
（※）Platinum qPCR
Supermix-UDG(Invitrogen#11730-025)を使用。
（TaqMAN Probe）（QuencherはすべてTAMRA）
（GAPDH）TaqMAN Rodent GAPDH Control Reagents(Applied Biosystems)同封のプローブ。（配列は非公開なので、購入して使用。）ReporterはVIC。
（BEC-1）Primer Express Version 1.5で設計。ReporterはFAM。
BEC-1：CCTTATCgggACTTgAAAAAACCCAA
【００３４】
（TaqMAN反応液の調製）
GAPDH、BEC-1それぞれについて以下の反応液を作る。
(サンプル) (Std) (水)
cDNA(CLONTECH cDNA
panel RAT MTC Panel1) 2.5      −  
−
標準線用サンプル(10-4〜-7)                −       2     −
滅菌水                                   −       −  
2
primer set                              5pmole    〃   
〃
TaqMAN probe                            5pmole    〃   
〃
酵素(※)                                12.5μL   〃    〃
滅菌水                                  Total
25μLに調整。
↓
ABI PRISM
7000で測定。
50℃２分→95℃2分→（95℃15秒、60℃1分）×40サイクル
【００３５】
図３にこの結果を示す。ラット正常組織におけるBEC-1 mRNAの発現。RT-PCRにて検討した。棒グラフは各組織ごとのΔCt (BEC1-GAPDH)を示す。ラット正常組織においてBEC-1 mRNAはブロードに発現がみられたが特にLungに多い傾向であった。ラット正常組織においてBEC-1 mRNAの発現はほぼユビキタスであったが肺、腎にやや多い傾向がみられた（図３）。
（実施例５）
【００３６】
請求項１２に係るラットおよびヒトBEC-1ポリクローナル抗体について説明する。
１）   ラットBEC-1抗体
（抗体作成用ペプチド）
G6 (NH2-CSGSPSRASSRRA-COOH)
2.0mg
（ウサギ抗血清）
受託番号  AS-2537（タカラバイオ）
抗原  BEC-1
動物番号  KBL-Rb030224-10
採血日  2003年5月8日
抗血清量  71ml（防腐剤非添加）
抗体精製なし
２）   ヒトLOST-1抗体
（抗体作成用ペプチド）
G6N20PEP(NH2-MAHPVQSEFPSAQEPGSAAC-COOH)4.2mg
（ウサギ抗血清）
受託番号  PU41147B（北山ラベス）
抗原  BEC-1N20PEP
動物番号  G6N20PEP-No.1
採血日  2004年12月21日
抗血清量  40.5ml；0.05%NaN3含有
抗体精製なし
（実施例６）
【００３７】
請求項１３に係るBEC-1タンパク質について説明する。ラット正常組織においてBEC-1タンパク質は肝、脾、副腎などに多く発現していた。ラットにおいて、BEC-1タンパク質の発現状況をウェスタンブロット法にて解析した。５週齢雄ウィスターラットより正常組織を摘出した。摘出臓器、組織をホモジナイズしLysis bufferにてタンパク質を溶出させ遠心して上清を回収した。吸光度計（SmartSpec3000,
BIO-RAD社）にてタンパク質定量。SDS化して終濃度5mg/mlのタンパク質溶液とした。うち20μLをSuperSep 10-20％（Wako）で泳動し、メンブレンに転写し、スキムミルクにてブロッキングしラットBEC-1ポリクローナル抗体を500倍希釈にてハイブリ。二次抗体（Anti-Rabbit IgG, Amersham）処理後、Hyperfilm ECL (Amersham)にてバンドを検出した。
【００３８】
結果を図４に示す。ラット正常組織におけるBEC-1タンパク質の発現。Western blottingにて検討。ラットBEC-1ポリクローナル抗体にて約26kDaのタンパク質を検出した。1)脳 2)小脳 3)視床 4)大脳皮質 5)嗅球 6)脾臓 7)副腎 8)心臓 9)肺 10)肝臓 11)腎臓 12)胃 13)小腸 14)骨格筋 15)膵臓 16)胸腺 17)食道 18)胸部大動脈 19)膀胱 20)精嚢 21)前立腺 22)精巣 23)精巣上体。ラット正常組織においてBEC-1タンパク質はブロードに検出されたが、副腎、肝、脾に多い傾向が認められた。結果、ラット正常組織においてBEC-1タンパク質は比較的ブロードに発現がみられたが、特に肝、脾、副腎に多い傾向であった。
（実施例７）
【００３９】
請求項１４に係るBEC-1遺伝子の発現増加についてさらに説明する。ラット褐色細胞腫PC-12を無血清培地で培養したとき、BEC-1遺伝子は継時的にその発現を増加する。ラット褐色細胞腫Cell lineであるPC-12細胞は、無血清培地で培養するとカスパーゼ依存的にアポトーシスをおこすことが知られている（Batistatou, A., Greene, LA.; J Cell Biol., (1991), 115: 461-471）。我々は本実験系にてBEC-1 mRNAおよびタンパク質の発現変化を検討した。
【００４０】
図５及び図６にその結果を示す。ラット褐色細胞腫PC-12のアポトーシスにおけるBEC-1タンパク質発現。PC-12をSerum
freeのRPMI1640にて培養しアポトーシスへ導入したときTime
courseでBEC-1 mRNA、タンパク質発現を検討した。図５上段はBEC-1の継時変化をRT-PCRにて検討したものを示す。下段は生存細胞（Alive、実線）、死細胞（Dead、破線）の細胞数をトリパンブルー染色にてカウントし、その継時的変化を示した。PC-12のアポトーシスにおいてBEC-1 mRNAは時間依存性にその発現を増加した。図６上段は生存細胞（Alive、実線）、死細胞（Dead、破線）の細胞数をトリパンブルー染色にてカウントし、その継時的変化を示した。下段はLOST-1の継時変化をWestern blottingにて検討したものを示す。PC-12のアポトーシスにおいてLOST-1タンパク質も同様に時間依存性にその発現を増加した。
【００４１】
さらに、これを説明する。Non-neuronal
PC-12を6 well plateに5x106/wellで蒔き、血清培地（RPMI1640+10%Horse Serum+5%FBS+1%ABPM）にて２４時間培養した。その後PBSにて細胞を２回洗い、無血清培地（RPMI1640のみ）に交換する。0, 2, 6, 12, 24時間で細胞を回収した。トリパンブルー染色にて生存細胞（染色されない）と死細胞（青く染まる）は評価した。BEC-1 mRNAの継時的な発現変化はRT-PCR法にて検討した。Rneasy Mini Kit (QIAGEN)によりtotal RNAを抽出。AMV Reverse Transcriptase XL (TaKaRa)にて逆転写を行った。内部標準としてはβ-actinを選択。
【００４２】
プライマー配列はBEC-1F: 5’-GTGCAGCCTCAGCTTCAAGA-3’、BEC-1R:
5’-AGAGCCCCTGACAGAGACTT-3’、β-actinF:
5’-GTAGCCATCCAGGCTGTGTT-3’、β-actinR:
5’-CCCTCATAGATGGGCACAGT-3’。PCR条件はBEC-1（アニーリング58℃、30サイクル）、β-actin（アニーリング55℃、25サイクル）。Peltier Thermal Cycler (PTC-200, MJ Research社)にてPCR施行。PCRサンプルをアガロースゲルにて泳動した。結果、BEC-1のメッセージは時間依存性に増加した（図５）。β-actinは常にほぼ一定の発現量を保っていた。
【００４３】
一方、タンパク発現変化はWestern blottingにて解析した。同様条件にて培養し、0, 6, 12,
18, 24, 36, 48時間で細胞を回収した。ペレットの６〜７倍量のIP bufferでライセートをつくり8mg/mlに調整。2x SDSにてSDS化し終濃度4 mg/mlに調整した。SuperSep 10-20%（Wako）に20μl/wellアプライして泳動。メンブレンに転写して、上述のラットBEC-1ポリクローナル抗体を500倍希釈で室温３時間ハイブリした。ウサギ二次抗体にて処理し、Hyperfilm ECL (Amersham)にて目的のバンドを検出した。一方コントロールとして上記血清培地にて継続して培養したものを同じタイムコースで回収した。
【００４４】
結果を図６に示す。無血清培地にて時間依存性に細胞死が進み、これに一致してBEC-1タンパク質発現は増加した。このことによりBEC-1はPC-12においてアポトーシスの制御に関連している可能性が示唆された。
（実施例８）
【００４５】
請求項１５に係るBEC-1遺伝子をノックダウンについて説明する。RNAiによりBEC-1遺伝子をノックダウンしたときの神経細胞死が遅延する。これについて、図７に説明する。RNAiによりBEC-1遺伝子をノックダウンしたときの神経細胞死（アポトーシス）の検討。PC-12にBEC-1 siRNAをトランスフェクションし無血清培地（RPMI1640）にて培養した。ネガティブコントロールとしてLuciferase GL2
siRNAをトランスフェクションした。Ａ．BEC-1 mRNA発現変化をRT-PCRにて検討した。結果、コントロールでは時間依存性にBEC-1発現が増加していくのに対して、BEC-1遺伝子のノックダウンによりBEC-1 mRNA発現が抑制された。Internal controlはβ-actin。Ｂ．トリパンブルー染色によりAliveとDeadをカウントした。結果BEC-1遺伝子のノックダウンによりコントロールに比べてアポトーシスが有意に遅延した。
【００４６】
上記の結果からBEC-1はPC-12のアポトーシスを促進している可能性が示唆されたそこで本発明者は、BEC-1のDominant negativeではPC-12のアポトーシスが遅延するのではないかと予想した。以下にこれを説明する。
22塩基対前後の二本鎖RNAが目的遺伝子のmRNAの発現を抑制する現象が報告された（Fire, A., et al.; Nature., (1998), Feb 19; 391 (6669): 806-11.）。この現象はRNA interference (RNAi)とよばれ、簡単に特定の遺伝子の機能を抑制（ノックダウン）することができるため世界中で広く用いられている。今回我々はPC-12を無血清条件でアポトーシスへ導いたとき、RNAi法を用いてBEC-1遺伝子をノックダウンするとアポトーシスの速度が変化するかについて検討した。
Non-neuronal
PC-12を6 well plateに2x106 /wellで蒔き、血清培地（RPMI1640+10%Horse Serum+5%FBS+1%ABPM）にて２４時間培養。その後PBSにて細胞を２回洗い、無血清培地（RPMI1640のみ）に交換する。BEC-1 siRNAを200pmol/wellずつLipofectamine2000 (Invitrogen)にてPC-12にトランスフェクションし、0, 12, 24, 48, 72, 96, 120時間で細胞を回収した。
【００４７】
ネガティブコントロールにはLuciferase GL2 siRNA (Dharmacon)を使用した。トリパンブルー染色にて生存細胞（染色されない）と死細胞（青く染まる）は評価した。BEC-1 mRNAの継時的な発現変化はRT-PCR法にて検討した。RNeasy Mini Kit (QIAGEN)によりtotal RNAを抽出。AMV Reverse Transcriptase XL (TaKaRa)にて逆転写を行った。内部標準としてはβ-actinを選択した。プライマー配列はBEC-1F:
5’-GTGCAGCCTCAGCTTCAAGA-3’、BEC-1R:
5’-AGAGCCCCTGACAGAGACTT-3’、β-actinF:
5’-GTAGCCATCCAGGCTGTGTT-3’、β-actinR:
5’-CCCTCATAGATGGGCACAGT-3’。PCR条件はBEC-1（アニーリング58℃、30サイクル）、β-actin（アニーリング55℃、25サイクル）。Peltier Thermal Cycler (PTC-200, MJ Research社)にてPCR施行。PCRサンプルをアガロースゲルにて泳動した。
【００４８】
その結果、BEC-1のメッセージ発現はトランスフェクション後２４時間以降抑制が確認できた（図７）。アポトーシスした細胞数はコントロールに比して２４時間以降少なく、BEC-1遺伝子の発現低下によりアポトーシスが遅延した可能性が示唆された（図７）。以上からBEC-1はPC-12においてアポトーシスを促進している可能性が考えられた。
（実施例９）
【００４９】
請求項１６に係る6-hydroxydopamine (6-OHDA)にて神経細胞死を誘導したときBEC-1遺伝子の発現について説明する。6-hydroxydopamine (6-OHDA)にて神経細胞死を誘導したときBEC-1遺伝子はその発現を増加する。6-hydroxydopamine (6-OHDA)は神経毒の一種であり、その脳内への投与により黒質線条体損傷と類似した損傷を引き起こすため、パーキンソン病モデル動物の作製などに広く用いられている。6-OHDAの25μM以下の投与ではアポトーシスのみが誘導されることが報告されている（Walkinshaw, G., et al.; Neuroscience., (1994),Dec; 63 (4): 975-87. ）。
【００５０】
図８にこれを説明する。6-hydroxydopamine (6-OHDA)による神経細胞死におけるBEC-1遺伝子発現の検討。Ａ．6-OHDA添加（0、5、10、20、40、50μM）にて、PC-12は濃度依存性、時間依存性に細胞死へ誘導された。Ｂ．6-OHDA (20μM)の添加により細胞死を導入したときのLOST-1遺伝子発現変化をRT-PCRにより解析した。Mはマーカー、Cはコントロール（0 hr）を意味する。6-OHDAにて神経細胞死を誘導したときBEC-1遺伝子は１２時間後にその発現を増加した。
【００５１】
さらに、これを説明する。まず神経細胞死の誘導に最適な6-OHDA濃度を検討した。Non-neuronal PC-12を6 well plateに2x106/wellで蒔き、6-OHDAを各濃度（1, 5, 10, 20, 40, 50μM）で添加。以後6時間後、12時間後に細胞を回収した。トリパンブルー染色にて生存細胞（染色されない）と死細胞（青く染まる）は評価した。
【００５２】
その結果、時間依存性に細胞死が誘導され、濃度依存性に死細胞が増加した (図８)。上記論文と併せて、今回我々は6-OHDAを20μM添加したときにBEC-1
mRNAの発現がどう変化するのかをRT-PCR法にて検討した。Non-neuronal
PC-12を血清培地（RPMI1640+10%Horse Serum+5%FBS+1%ABPM）にて培養し、6-OHDAを20μMの終濃度で添加し0, 2, 4, 6, 8, 12, 24時間で細胞を回収した。Rneasy Mini
Kit (QIAGEN)によりtotal RNAを抽出。AMV
Reverse Transcriptase XL (TaKaRa)にて逆転写を行った。内部標準としてはβ-actinを選択。プライマー配列はBEC-1F: 5’-GTGCAGCCTCAGCTTCAAGA-3’、BEC-1R:
5’-AGAGCCCCTGACAGAGACTT-3’、β-actinF:
5’-GTAGCCATCCAGGCTGTGTT-3’、β-actinR:
5’-CCCTCATAGATGGGCACAGT-3’。PCR条件はBEC-1（アニーリング58℃、30サイクル）、β-actin（アニーリング55℃、25サイクル）。Peltier Thermal Cycler (PTC-200, MJ Research社)にてPCR施行。PCRサンプルをアガロースゲルにて泳動した。
【００５３】
その結果、6-OHDA添加後12時間でBEC-1のメッセージは増加した（図８）。一方β-actinは常にほぼ一定の発現量を保っていた。以上より、BEC-1は6-OHDAによるアポトーシスも制御している可能性が示唆された。またパーキンソン病の病態に関与している可能性も考えられた。
（実施例１０）
【００５４】
請求項１７に係るPC-12細胞を神経細胞様への分化について説明する。図９に、Nerve growth
factor (NGF)にてPC-12細胞を神経細胞様に分化させたときのBEC-1遺伝子発現検討。Ａ．NGF添加にて培養するとPC-12は突起を延ばし神経細胞様に変化する（矢印）。Ｂ．このときのBEC-1遺伝子発現をRT-PCRにて検討した。
【００５５】
結果BEC-1遺伝子の発現は４８時間後に増加した。さらに、これを、説明する。PC-12細胞を神経細胞様に分化させたとき、BEC-1の発現は４８時間後に増加する。PC-12細胞はNGF添加によって神経細胞様に分化することが知られている。PC-12細胞を10cm dishに5x106/wellで蒔き、NGF添加培地（NGF 100ng/ml, 0.1%BSA, 1%ペニシリンストレプトマイシン）にて培養し、0, 12, 24, 48, 72, 96時間後に細胞を回収した。このTime
courseにおけるrat BEC-1mRNAの発現変化をRT-PCR法によって検討した。Rneasy Mini Kit (QIAGEN)によりtotal RNAを抽出。AMV Reverse Transcriptase XL (TaKaRa)にて転写を行った。内部標準としてはβ-actinを選択。プライマー配列はBEC-1F:5’-GTGCAGCCTCAGCTTCAAGA-3’、BEC-1R: 5’-AGAGCCCCTGACAGAGACTT-3’、β-actinF:
5’-GTAGCCATCCAGGCTGTGTT-3’、β-actinR:
5’-CCCTCATAGATGGGCACAGT-3’。PCR条件はBEC-1（アニーリング58℃、30サイクル）、β-actin（アニーリング55℃、25サイクル）。Peltier Thermal Cycler (PTC-200, MJ Research社)にてPCR施行。PCRサンプルをアガロースゲルにて泳動した。
【００５６】
その結果、NGF添加後４８時間でBEC-1のメッセージは増加した（図９）。β-actinは常にほぼ一定の発現量を保っていた。従ってBEC-1はPC-12の神経細胞への分化に関与している可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
無血清培地や６-Hydroxydopamine (6-OHDA)などにより神経細胞死を誘導したときのBEC-1遺伝子の発現や該遺伝子がコードするタンパク質の増加、およびRNAi法によりBEC-1遺伝子をノックダウンしたときの神経細胞死の遅延が認められた。本発明の遺伝子や該遺伝子がコードするタンパク質は細胞死を促進していることが結論づけられたため、このタンパク質の抑制が細胞死を主因とする病態、神経変性(パーキンソン病、脳卒中、アルツハイマー病など)などの治療薬になる可能性がある。本遺伝子や該遺伝子がコードするタンパク質の発現を指標としたスクリーニング法により、細胞死を主因とする病態、神経変性(パーキンソン病、脳卒中、アルツハイマー病など)などの新たな治療薬の開発が可能である。また本遺伝子や該遺伝子がコードするタンパク質は抗腫瘍薬として効果を発揮する可能性があるこの機能を阻害することにより脳梗塞などにおける神経細胞死を抑制できる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】ラットBEC-1 mRNAのcDNA配列および推測したアミノ酸配列。
【図２】推測されたラットBEC-1、ヒト、マウスLOST-1タンパク質のアライメント。
【図３】ラット正常組織におけるBEC-1 mRNAの発現を示すグラフ。
【図４】ラット正常組織におけるBEC-1タンパク質の発現を示すグラフ。
【図５】ラット褐色細胞腫PC-12のアポトーシスにおけるBEC-1タンパク質発現を示す図。上段はBEC-1の継時変化をRT-PCRにて検討したものを示す。下段は生存細胞（Alive、実線）、死細胞（Dead、破線）の細胞数をトリパンブルー染色にてカウントし、その継時的変化を示したもの。
【図６】上段は生存細胞（Alive、実線）、死細胞（Dead、破線）の細胞数をトリパンブルー染色にてカウントし、その継時的変化を示したもの。下段はLOST-1の継時変化をWestern blottingにて検討したものを示す。
【図７】RNAiによりBEC-1遺伝子をノックダウンしたときの神経細胞死（アポトーシス）の抑制を示すグラフ。Ａ．RT-PCR で検討したBEC-1 mRNA発現変化Ｂ．トリパンブルー染色によりAliveとDeadのPC-12細胞をカウントした結果。
【図８】6-hydroxydopamine(6-OHDA)による神経細胞死におけるBEC-1遺伝子発現を示すグラフ。Ａ．6-OHDA添加（0、5、10、20、40、50μM）による、PC-12の細胞死誘導状況。Ｂ．6-OHDA (20μM)の添加により細胞死を導入したときのLOST-1遺伝子発現変化。
【図９】Nervegrowth factor (NGF)にてPC-12細胞を神経細胞様に分化させたときのBEC-1遺伝子発現検討。Ａ．NGF添加にて培養するとPC-12は突起を延ばし神経細胞様に変化。（矢印）。Ｂ．BEC-1遺伝子発現状況
【図１】
2007104941.tif 000003
【図２】
2007104941.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2007104941.tif 000008
【図７】
2007104941.tif 000009
【図８】
2007104941.tif 000010
【図９】
2007104941.tif 000011