(57)【要約】    【課題】  流体試料中の被測定物質を同時に測定でき、容易に定性分析することができると共に被測定物質の励起エネルギー間の測定誤差を減少させることができる検出方法及び当該検出方法を用いたマイクロ化学システムを提供する。    【解決手段】  検出光光源１６からＣＷ発振された波長７８０ｎｍの検出光を微細流路１内の被測定物質に照射し、波長がそれぞれ６５８ｎｍ及び５３２ｎｍである励起光を周波数がそれぞれ１ｋＨｚ、及び１．２ｋＨｚであるＤｕｔｙ５０％の複数の点滅励起光に変調して微細流路１内の被測定物質に照射し、照射された点滅励起光に起因して形成された熱レンズにより屈折した検出光を点滅励起光の周波数成分毎に同時に検出し、検出された検出光の信号をＰＤ２１からＩＶアンプ２２を介して信号処理装置としてのＰＣ２４に導いた。ＰＣ２４ではＦＦＴ処理を行い、各周波数成分毎に信号強度を測定した。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被測定物質に周波数が異なる複数の励起エネルギーを同時に付与する付与ステップと、前記付与された励起エネルギーによる被測定物質の物理化学的変化に基づく物理量変動を前記励起エネルギーの周波数成分毎に同時に検出する検出ステップを備えることを特徴とする検出方法。
【請求項２】
前記検出された物理量変動を前記励起エネルギーの周波数成分毎にフーリエ変換するフーリエ変換ステップを備えることを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
前記励起エネルギーは励起光であることを特徴とする請求項１又は２記載の検出方法。
【請求項４】
被測定物質に検出光を照射する検出光照射ステップと、前記被測定物質に周波数が異なる複数の点滅励起光を同時に照射する励起光照射ステップと、前記照射された点滅励起光に起因して形成された熱レンズにより屈折した検出光を前記点滅励起光の周波数成分毎に同時に検出する検出ステップとを備えることを特徴とする検出方法。
【請求項５】
前記検出された検出光の信号を前記点滅励起光の周波数成分毎にフーリエ変換するフーリエ変換ステップを備えることを特徴とする請求項４記載の検出方法。
【請求項６】
被測定物質に周波数が異なる複数の点滅励起光を同時に照射する励起光照射ステップと、前記照射された点滅励起光に起因して発生する蛍光を前記点滅励起光の周波数成分毎に同時に検出する検出ステップとを備えることを特徴とする検出方法。
【請求項７】
前記検出された蛍光の信号を前記点滅励起光の周波数成分毎にフーリエ変換するフーリエ変換ステップを備えることを特徴とする請求項６記載の検出方法。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載の検出方法を用いたことを特徴とするマイクロ化学システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出方法、特に、光熱変換分光法（ＰＴＳ（Photothermal Spectroscopy））に分類される熱レンズ分光法（ＴＬＳ（Thermal Lens Spectroscopy））に適用可能な検出方法、さらに詳しくは、熱レンズ顕微鏡（ＴＬＭ（Thermal Lens Microscope））に適用可能な検出方法、及び当該検出方法を用いたマイクロ化学システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来から、化学反応の高速化や微少量での反応、オンサイト分析等の観点から、化学反
応を微小空間で行うための集積化技術が注目されており、そのための研究が精力的に進め
られている。
【０００３】
このような集積化技術の１つとして、図３に示すように、マイクロチップ３０内部の微細流路３０ａで流体試料の混合、反応、分離、抽出、検出等を行うマイクロ化学システム３００がある。
【０００４】
マイクロチップ３０は、例えば溝が形成されたガラス基板３０ｂ上に、試料注入・排出用小穴が溝の対応位置に配置された他のガラス基板３０ｃ，ｄを接合したものをいい、接合後その溝部分が、前述の微細流路３０ａを形成するものである。
【０００５】
このようなマイクロ化学システム３００においては、試料の量が微量であるので、試料の高感度な検出方法が必須である。高感度な検出方法としては、例えば、熱レンズ効果を利用した光熱変換分光分析法を利用する熱レンズ分光分析法や蛍光検出法がある。
【０００６】
熱レンズ分光分析法は、図４に示すように、被測定物質に吸収されない波長の検出光４１をその焦点４２が微細流路３０ａのほぼ中心となるように照射し、微細流路３０ａ及びピンホール３３を通過した検出光４１をフォトディテクター（ＰＤ）３４で測定することにより実行されるが、図５に示すように、被測定物質に吸収される波長の励起光５１を微細流路３０ａのほぼ中心に照射すると、吸収された光のエネルギーが熱に変換されて、励起光５１の焦点付近の溶媒の温度が局部的に上昇して局部的な屈折率勾配が生じる。これにより、励起光５１の焦点付近にあたかも凹レンズ、いわゆる熱レンズ５２が発生する。この熱レンズ５２により検出光４１が屈折され、ピンホール３３を通過する光量が変化し、この光量の変化を読み取ることによって被測定物質の物理量、例えば、濃度を測定することができる。通常、励起光５１は１ｋＨｚ程度の周波数で点滅させて（図６（ａ）及び図７（ａ））、熱レンズにより屈折された検出光４１を所定周波数の信号の振幅Ａ（図６（ｂ）及び図７（ｂ））及び振幅Ｂ（図６（ｃ）及び図７（ｃ））として検出する。ここで、図６（ｂ）及び図７（ｂ）に示される振幅Ａは被測定物質が高濃度の場合において検出される検出光の信号における振幅を示し、図６（ｃ）及び図７（ｃ）に示される振幅Ｂは被測定物質が低濃度の場合において検出される検出光の信号における振幅を示す。
【０００７】
一方、蛍光検出法は、このマイクロチップ３０内部の微細流路３０ａを流れる試料に集光するようにマイクロチップ３０表面に励起光を照射し、照射された励起光を試料中の溶質が吸収して発生した蛍光の強度をフォトディテクター（ＰＤ）３４で測定することによって行う。この蛍光検出法においても、ノイズと信号との分離を容易にするため、照射する励起光５１を変調器３５によって所定の周波数に変調する。
【０００８】
フォトディテクター（ＰＤ）３４によって検出された測定信号は、微小信号検出装置３６としてのロックインアンプによって、試料溶液に対応する周波数成分が抽出され、抽出された周波数成分の強度を、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）等の情報処理装置３７によって分析し、試料溶液の濃度が求められる（例えば、特許文献１参照）。
【０００９】
なお、通常の分光分析において、横軸に波長、縦軸に吸収をプロットし、各波長毎の吸収を測定することにより、被測定物質が定量分析される。
【特許文献１】特開２００２−３６５２５２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、マイクロ化学システム１００において、検出光４１の微小な振幅をロックインアンプを用いて検出しているので、励起光として１つの波長しか使用することができず、被測定物質を定量分析することはできても、被測定物質の同定、即ち、定性分析をすることができなかった。
【００１１】
また、マイクロ化学システム１００において、例えば、赤色・緑色・青色の３色の波長を順番に照射して被測定物質を測定し、異なる３波長における検出データを得て被測定物質を定性分析することはできるものの、この赤色・緑色・青色の３色の波長を順番に照射するため、同時測定ができないという問題があった。
【００１２】
本発明の目的は、流体試料中の複数の被測定物質を同時に測定でき、容易に定性分析及び定量分析することができると共に被測定物質の励起エネルギー間の測定誤差を減少させることができる検出方法及び当該検出方法を用いたマイクロ化学システムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成するために、請求項１記載の検出方法は、被測定物質に周波数が異なる複数の励起エネルギーを同時に付与する付与ステップと、前記付与された励起エネルギーによる被測定物質の物理化学的変化に基づく物理量変動を前記励起エネルギーの周波数成分毎に同時に検出する検出ステップを備えることを特徴とする。
【００１４】
請求項２記載の検出方法は、請求項１記載の検出方法において、前記検出された物理量変動を前記励起エネルギーの周波数成分毎にフーリエ変換するフーリエ変換ステップを備えることを特徴とする。
【００１５】
請求項３記載の検出方法は、請求項１又は２記載の検出方法において、前記付与された励起エネルギーは励起光であることを特徴とする。
【００１６】
上記目的を達成するために、請求項４記載の検出方法は、被測定物質に検出光を照射する検出光照射ステップと、前記被測定物質に周波数が異なる複数の点滅励起光を同時に照射する励起光照射ステップと、前記照射された点滅励起光に起因して形成された熱レンズにより屈折した検出光を前記点滅励起光の周波数成分毎に同時に検出する検出ステップとを備えることを特徴とする。
【００１７】
請求項５記載の検出方法は、請求項４記載の検出方法において、前記検出された検出光の信号を前記点滅励起光の周波数成分毎にフーリエ変換するフーリエ変換ステップを備えることを特徴とする。
【００１８】
上記目的を達成するために、請求項６記載の検出方法は、被測定物質に周波数が異なる複数の点滅励起光を同時に照射する励起光照射ステップと、前記照射された点滅励起光に起因して発生する蛍光を前記点滅励起光の周波数成分毎に同時に検出する検出ステップとを備えることを特徴とする。
【００１９】
請求項７記載の検出方法は、請求項６記載の検出方法において、前記検出された蛍光の信号を前記点滅励起光の周波数成分毎にフーリエ変換するフーリエ変換ステップを備えることを特徴とする。
【００２０】
請求項８記載のマイクロ化学システムは、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の検出方法を用いたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２１】
請求項１記載の検出方法によれば、被測定物質に周波数が異なる複数の励起エネルギーを同時に付与し、付与された励起エネルギーによる被測定物質の物理化学的変化に基づく物理量変動を励起エネルギーの周波数成分毎に同時に検出するので、流体試料中の複数の被測定物質を同時に測定でき、容易に定性分析することができると共に被測定物質の励起エネルギー間の測定誤差を減少させることができる。
【００２２】
請求項２記載の検出方法によれば、検出された物理量変動を励起エネルギーの周波数成分毎にフーリエ変換するので、物理量変動を励起エネルギーの周波数成分毎に同時に容易に測定することができる。
【００２３】
請求項４記載の検出方法によれば、被測定物質に検出光を照射し、被測定物質に周波数が異なる複数の点滅励起光を同時に照射し、照射された点滅励起光に起因して形成された熱レンズにより屈折した検出光を点滅励起光の周波数成分毎に同時に検出するので、被測定物質を高感度で容易に定性分析することができると共に被測定物質の測定誤差を減少させることができる。
【００２４】
請求項５記載の検出方法によれば、検出された検出光の信号を点滅励起光の周波数成分毎にフーリエ変換するので、検出光の信号を点滅励起光の周波数成分毎に同時に容易に測定することができる。
【００２５】
請求項６記載の検出方法によれば、被測定物質に周波数が異なる複数の点滅励起光を同時に照射し、照射された点滅励起光に起因して発生する蛍光を点滅励起光の周波数成分毎に同時に検出するので、被測定物質を容易に定性分析することができると共に被測定物質の測定誤差を減少させることができる。
【００２６】
請求項７記載の検出方法によれば、検出された蛍光の信号を点滅励起光の周波数成分毎にフーリエ変換するので、蛍光の信号を点滅励起光の周波数成分毎に同時に容易に測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明の実施の形態に係る検出方法について図面を参照しながら説明する。
【００２８】
図１は、本実施の形態に係る検出方法が適用される熱レンズ分光分析システムの構成を概略的に示す図である。
【００２９】
図１において、熱レンズ分光分析システム１００は、中に流体試料が注入された微細流路１を有するマイクロ化学チップ２と、微細流路１の上方においてマイクロ化学チップ２上に配設され、光ファイバー５から伝播された光を微細流路１に集光して熱レンズ信号を生成する円柱状の屈折率分布型ロッドレンズ６と、光ファイバー５に接続され、光ファイバー５を介してマイクロ化学チップ２の微細流路１内の流体試料に励起光を照射すると共に、当該照射された励起光によって流体試料に生成される熱レンズに検出光を照射する光源ユニット７と、マイクロ化学チップ２の下方に配設され、光源ユニット７から照射された励起光によってマイクロ化学チップ２の微細流路１内の流体試料に生成された熱レンズを介して検出光を検出する検出装置８とを備える。
【００３０】
マイクロ化学チップ２は、熱レンズ分光分析システム１００により流体試料の混合、攪拌、合成、分離、抽出、及び検出等の操作の際に流体試料を流す微細流路１を有している。
【００３１】
マイクロ化学チップ２の材料は耐久性、耐薬品性の面からガラスが望ましく、さらに、細胞等の生体試料、例えばＤＮＡ解析用としての用途を考慮すると、耐酸性、耐アルカリ性の高いガラス、具体的には、硼珪酸ガラス、ソーダライムガラス、アルミノ硼珪酸ガラス、及び石英ガラス等が好ましい。しかし、用途を限定することによってプラスチック等の有機物を用いることもできる。
【００３２】
光源ユニット７は、励起光を出力する励起光光源１１と、励起光光源１１に接続され、励起光光源１１から出力される例えば波長５３２ｎｍの励起光を例えば１．２ｋＨｚの周期でＤｕｔｙ５０％で点滅する（Ｏｎ、Ｏｆｆする）ように変調する変調器１２と、励起光を出力する励起光光源１４と、励起光光源１４に接続され、励起光光源１４から出力される例えば波長６５８ｎｍの励起光を例えば１ｋＨｚの周期でＤｕｔｙ５０％で点滅する（Ｏｎ、Ｏｆｆする）ように変調する変調器１５と、例えば波長７８０ｎｍの検出光をＣＷ（連続波）発振する検出光光源１６と、励起光光源１４及び検出光光源１６に夫々光ファイバー１７，１８を介して接続され、励起光光源１４から出力される励起光及び検出光光源１６から出力される検出光を合波して光ファイバー９に入射させる合波器１９と、励起光光源１１及び合波器１９に接続され、励起光光源１１から出力される励起光及び合波器１９から出力される合波光を合波して光ファイバー５に入射させる合波器１０とから成る。
【００３３】
検出装置８は、光の一部のみを透過させるピンホール２０ａが形成された透過部材２０と、透過部材２０とマイクロ化学チップ２の間にあって、励起光を通さず検出光のみを通すフィルタ２３と、透過部材２０の下側であって、微細流路１に面する位置に配設され、励起光及び検出光の光量及び熱レンズ信号強度を検出するためのフォトディテクター（ＰＤ）２１と、フォトディテクター（ＰＤ）２１にＩＶアンプ２２を介して接続されたパーソナルコンピュータ（ＰＣ）２４とから成る。
【００３４】
検出光光源１６からＣＷ発振された波長７８０ｎｍの検出光を微細流路１内の被測定物質に照射し、波長がそれぞれ６５８ｎｍ及び５３２ｎｍである励起光を周波数がそれぞれ１ｋＨｚ、及び１．２ｋＨｚであるＤｕｔｙ５０％の点滅励起光に変調して微細流路１内の被測定物質に照射し、照射された点滅励起光に起因して形成された熱レンズにより屈折した検出光をフォトディテクター２１で検出し、検出された検出光の信号をＩＶアンプ２２を介して信号処理装置としてのＰＣ２４に導いた。ＰＣ２４ではＦＦＴ（ファーストフーリエ変換）処理を行い、各周波数成分毎に信号強度を測定した。
【００３５】
なお、被測定物質サンプルとしてNi phthalocyanine tetrasulfonic acid 4Na salt（Ｎｉ錯体）の１×１０-5ｍｏＬ／Ｌ水溶液と、サンセットイエローの１×１０-4ｍｏＬ／Ｌとを等量加えた液を用い、この被測定物質サンプルをマイクロ化学チップ内に作製した深さ１００μｍの微細流路１としてのチャネルに流す。
【００３６】
図２は、図１の熱レンズ分光分析システムにより測定された被測定物質サンプルのＦＦＴ演算結果を示すグラフであり、横軸が周波数を示し、縦軸がその周波数成分における信号強度を示す。
【００３７】
図２において、二つの周波数成分が明確に分離されているので、５３２ｎｍの波長で吸収されるサンセットイエロー溶液濃度に依存する信号Ｂの信号強度と、６５８ｎｍの波長で吸収されるＮｉ錯体溶液濃度に依存する信号Ａの信号強度とをそれぞれ測定することができる。
【００３８】
本実施の形態によれば、波長７８０ｎｍの検出光を微細流路１内の被測定物質に照射し、波長がそれぞれ６５８ｎｍ及び５３２ｎｍである励起光を周波数がそれぞれ１ｋＨｚ、及び１．２ｋＨｚであるＤｕｔｙ５０％の複数の点滅励起光に変調して微細流路１内の被測定物質に照射し、照射された点滅励起光に起因して形成された熱レンズにより屈折した検出光を点滅励起光の周波数成分毎に同時にフォトディテクタ２１で検出し、ＩＶアンプ２２を介して信号処理装置としてのＰＣ２４に導き、ＰＣ２４でＦＦＴ（ファーストフーリエ変換）処理を行うので、流体試料中の複数の被測定物質を同時に測定でき、容易に定性分析及び定量分析することができると共に被測定物質の励起エネルギー間の測定誤差を減少させることができる。
【００３９】
本実施の形態によれば、従来の熱レンズ分光分析では、特定波長での吸収に基づいた定量分析しかできなかったのに対して、装置を大型化することなく、またコストをかけることなく、複数の波長の励起光を使用することができ、もって、被測定物質の定量分析だけでなく、定性分析も可能となる。
【００４０】
本実施の形態では、励起光の点滅及び周波数解析の組み合わせを熱レンズ分光分析システムに適用しているが、これに限定されるものではなく、蛍光測定に適用してもよい。蛍光測定に適用した場合、複数波長の点滅励起光をそれぞれ変調することにより、複数波長の励起光それぞれの周波数に依存した蛍光信号を検出することができる。一般に、蛍光信号を検出する場合、バックグランドが小さいため、励起光を変調せずに、高感度の検出装置を用いて信号強度の積分で測定することが多く、励起光を点滅させてロックイン等で振幅を見るような測定はあまりされていない。
【００４１】
本実施の形態では、励起光の点滅及び周波数解析の組み合わせを熱レンズ分光分析システムに適用しているが、これに限定されるものではなく、電気化学反応で与えるエネルギー（光子のエネルギー、即ち、波長、電気エネルギー等）の大きさにより、反応形態が変わるものについても応用できる。即ち、所定の被測定物質サンプルに閾値Ａを越えるエネルギーを与えると物理化学的変化ａが起こり、更に閾値Ｂを越えると物理化学的変化ｂが起こるような場合において、閾値ＡとＢの間のエネルギーをある周波数で与える一方、閾値Ｂを越えるエネルギーを別の周波数で与えることにより、被測定物質サンプルの物理化学的変化ａ，ｂに基づく物理量変動をエネルギーの周波数成分毎に同時に検出することができる。これにより、複数の反応を同一地点から同時に測定することができ、もって測定時の情報量を飛躍的に向上することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本実施の形態に係る検出方法が適用される熱レンズ分光分析システムの構成を概略的に示す図である。
【図２】図１の熱レンズ分光分析システムにより測定された被測定物質サンプルのＦＦＴ演算結果を示すグラフであり、横軸が周波数を示し、縦軸がその周波数成分における信号強度を示す。
【図３】従来の熱レンズ分光分析システムの構成を概略的に示す図である。
【図４】従来の熱レンズ分光分析システムにおいて検出光が照射された状態を示す図である。
【図５】従来の熱レンズ分光分析システムにおいて検出光及び励起光が照射された状態を示す図である。
【図６】従来の熱レンズ分光分析システムにおける励起光及び検出光を説明する図であり、（ａ）は励起光の出力タイミングを示し、（ｂ）は被測定物質が高濃度の場合において検出される検出光の信号を示し、（ｃ）は被測定物質が低濃度の場合において検出される検出光の信号を示す。
【図７】従来の熱レンズ分光分析システムにおける励起光及び検出光を説明する図であり、（ａ）は励起光の出力タイミングを示し、（ｂ）は被測定物質が高濃度の場合において検出される検出光の信号を示し、（ｃ）は被測定物質が低濃度の場合において検出される検出光の信号を示す。
【符号の説明】
【００４３】
２  マイクロ化学チップ
１１  励起光光源
１２  変調器
１４  励起光光源
１５  変調器
１６  検出光光源
２２  ＩＶアンプ
２３  フィルタ
２４  パーソナルコンピュータ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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