(57)【要約】【課題】  測定試料中に含まれるタンパク質などの分子の荷電を評価することが可能なバイオセンサー、及びそれを用いた被測定物質の荷電を分析する方法を提供すること。【解決手段】  荷電が部位により変化している表面を有する基板からなるバイオセンサー。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
荷電が部位により変化している表面を有する基板からなるバイオセンサー。
【請求項２】
荷電を与える官能基が基板の表面に導入されており、該官能基の導入率が部位により変化していることにより、基板の表面の荷電が部位により変化している、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項３】
基板が、金属表面又は金属膜から成る基板である、請求項１又は２に記載のバイオセンサー。
【請求項４】
金属表面あるいは金属膜が、金、銀、銅、白金、及びアルミニウムからなる群より選ばれる自由電子金属からなるものである、請求項３に記載のバイオセンサー。
【請求項５】
基板が、疎水性高分子化合物又は水溶性高分子化合物でコーティングした金属表面又は金属膜であるか、あるいは自己組織化膜を有する金属表面又は金属膜である、請求項１から４の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項６】
荷電を与える官能基を有する高分子化合物を基板の表面にコートすることによって作成される、請求項１から５の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項７】
荷電を与える官能基が、カルボキシル基、硫酸エステル基、リン酸エステル基、又はスルホン酸基である、請求項１から６の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項８】
被測定物質の荷電を分析するために使用される、請求項１から７の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項９】
表面プラズモン共鳴分析により被測定物質の荷電を分析する、請求項８に記載のバイオセンサー。
【請求項１０】
被測定物質を請求項１から９の何れかに記載のバイオセンサーの表面に接触させ、該被測定物質と該表面との相互作用の有無を検出することを含む、被測定物質の荷電を分析する方法。
【請求項１１】
表面プラズモン共鳴分析により該被測定物質と該表面との相互作用の有無を検出する、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定試料中に含まれるタンパク質などの分子の荷電を分析するためのバイオセンサー、及びそれを用いた分子の荷電の分析方法に関する。より詳細には、本発明は、表面プラズモン共鳴分析などを用いて分子の荷電を分析するためのバイオセンサー、及びそれを用いた分子の荷電の分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーの開発において、センシング部の金属薄膜に修飾を施すことが必要である。例えば、ＳＰＲセンサーをバイオセンサーに応用するためには、官能基を有するポリマーで金属薄膜を修飾することが行われている。金属薄膜として金の薄膜を使用する場合、金へのチオール又はスルフィド類の自己吸着性（Self-Assembly）を利用する修飾法が知られている。例えば、ＳＰＲバイオセンサーにおけるセンサー表面へのリガンドの固定化のためには、金薄膜上に自己吸着したアルカンチオールをリンカー層として、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）層を導入し、そのＣＭＤ層にリガンドを固定化する方法が報告されている。ここで用いるＣＭＤ層の役割は、固定化するリガンド量の増加、金薄膜への生体分子の非特異的結合の防止などである。チオール又はスルフィド類による修飾方法は簡単な方法であり、例えば、Claire E. Jordanらの論文（非特許文献１）では１ｍＭのチオールのエタノール溶液に金薄膜を１時間浸すだけで９０％の吸着率を示すことが記載されている。また、吸着の評価は、Ｘ線電子分光法やＳＰＲ角変化の測定により行うことができる。
【０００３】
また、特許文献１には、金属表面に結合する層の上にヒドロゲルなどの生体適合性多孔質マトリックス層を設けてなる検出表面が記載されている。特許文献２には、二官能性又は多官能性分子を用いたセンサーユニットが記載されている。特許文献３には、センサー表面にリガンドが結合したセンサーを用いる巨大分子の特性の決定方法が記載されている。特許文献４には、可逆的結合受容体を含む固定化された結合パートナーを含む固体支持体を用いて試料中の関心のある分析対象物を検出する方法及び装置が記載されている。さらに、特許文献５には、自己吸着性単層膜（Self-Assembled Monolayer）上に膜形成蛋白質又は脂質を結合させた基質表面の製造方法が記載されている。
【０００４】
また、特許文献６には、生体分子もしくは生物分子集合体を固定化する部分（固定化部位）と固定化部位以外のバックグラウンド部を有する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定用バイオチップであり、分子量が２０００以上２００００以下のポリ−Ｌ−グルタミン酸を１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解しているｐＨ７．４のリン酸緩衝液が３０℃にてチップ表面に１０分間接触させた後に、リン酸緩衝液で１０分間洗浄した場合において、固定化部位に結合するポリ−Ｌ−グルタミン酸によって得られるＳＰＲによるシグナルと、固定化部位以外のバックグラウンド部への非特異吸着によるシグナルのシグナル比が２以上であるＳＰＲ測定用バイオチップが記載されている。このＳＰＲ測定用バイオチップは、バックグラウンド部には非特異的吸着がほとんどなく、結合部位に生体分子もしくは生物分子集合体の活性を保ったまま固定化できることを特徴とするものである。
【０００５】
しかしながら、上記した何れの文献にも、バイオセンサーを用いて分子の荷電を分析することについては記載がない。
【０００６】
【非特許文献１】Jordan, C.E. et al., Langmuir, 1994, 10, 3642-3648
【特許文献１】特表平４−５０１６０５号公報
【特許文献２】特表平４−５０１６０６号公報
【特許文献３】特表平４−５０１６０７号公報
【特許文献４】特表平７−５０７８６５号公報
【特許文献５】国際公開ＷＯ９６／１０１７８号公報
【特許文献６】特開２００４−１２５６２５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、測定試料中に含まれるタンパク質などの分子の荷電を評価することが可能なバイオセンサー、及びそれを用いた被測定物質の荷電を分析する方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、荷電が部位により変化している表面を有する基板からなるバイオセンサーを作製し、当該バイオセンサーの表面に荷電を有するタンパク質を接触させ、センサーチップ表面の各部位へのタンパク質の濃縮の程度を調べることによって、荷電が部位により変化している表面を有する基板からなるバイオセンサーを用いたＳＰＲ測定により、タンパク質の荷電を評価できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００９】
即ち、本発明によれば、荷電が部位により変化している表面を有する基板からなるバイオセンサーが提供される。
【００１０】
好ましくは、荷電を与える官能基が基板の表面に導入されており、該官能基の導入率が部位により変化していることにより、基板の表面の荷電が部位により変化している。
好ましくは、基板は、金属表面又は金属膜から成る基板である。
好ましくは、金属表面あるいは金属膜は、金、銀、銅、白金、及びアルミニウムからなる群より選ばれる自由電子金属からなるものである。
【００１１】
好ましくは、基板は、疎水性高分子化合物又は水溶性高分子化合物でコーティングした金属表面又は金属膜であるか、あるいは自己組織化膜を有する金属表面又は金属膜である。
【００１２】
好ましくは、本発明のバイオセンサーは、荷電を与える官能基を有する高分子化合物を基板の表面にコートすることによって作成される。
好ましくは、荷電を与える官能基は、カルボキシル基、硫酸エステル基、リン酸エステル基、又はスルホン酸基である。
【００１３】
好ましくは、本発明のバイオセンサーは、被測定物質の荷電を分析するために使用される。
好ましくは、表面プラズモン共鳴分析により被測定物質の荷電を分析する。
【００１４】
本発明の別の側面によれば、被測定物質を本発明のバイオセンサーの表面に接触させ、該被測定物質と該表面との相互作用の有無を検出することを含む、被測定物質の荷電を分析する方法が提供される。
好ましくは、表面プラズモン共鳴分析により該被測定物質と該表面との相互作用の有無を検出する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のバイオセンサーによれば、測定試料中に含まれるタンパク質などの分子の荷電を評価することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明のバイオセンサーは、荷電が部位により変化している表面を有する基板からなることを特徴とする。
【００１７】
生理活性物質は、その等電点以外のｐＨを有する緩衝液に溶解した場合はプラスあるいはマイナスいずれかの荷電を帯びる。これに対して、同時に同じ緩衝液中で荷電を持つポリマーを用意した場合、静電引力によって生理活性物質がポリマー上に濃縮される。この際、ポリマーがもつ荷電の量やプラス、マイナスを変化させた場合、生理活性物質の荷電量に応じて、ポリマーへの濃縮度合いが変化する。ＳＰＲセンサー表面にこのようなポリマーを用意すれば、ポリマーへの濃縮度合いを検出できる。すなわち、荷電を変化させた膜を有するバイオセンサーにより、測定サンプルに含まれる生理活性物質の荷電を評価することが可能となる。生理活性物質として蛋白質を考えた場合、タンパクの荷電を評価する方法として等電点電気泳動があるが、本発明では、まったく新しい原理に基づいて測定サンプルに含まれるタンパク質の荷電を評価することができる。
【００１８】
荷電が部位により変化している表面を有する基板としては、同じ荷電を有する複数の基板を同一平面上に並べることにより、荷電が部位により変化している表面を有する基板を構築してもよいし、あるいは一枚の基板において、その部位により荷電が変化している表面を有する基板を作製してもよい。
【００１９】
膜に荷電を与える官能基としては、好ましくは、カルボキシル基、硫酸エステル基、リン酸エステル基、スルホン酸基のいずれかである。
【００２０】
本発明に用いられるポリマーに対する膜に荷電を与える官能基の導入方法は特に限定されず、通常のモノマー分子と荷電を与える官能基を有するモノマーとの共重合反応を行って重合体（ポリマー）を製造してもよいし、予め重合体を製造した後にいわゆる高分子反応により、前記の荷電を与える官能基を導入してもよい。本発明に用いられるポリマーは、荷電を与える官能基モノマー成分以外に、他のモノマー成分が共重合されていてもよい。
【００２１】
荷電を変化させた膜を製造するためには、荷電をもつ官能基を、水溶性高分子が結合している表面、疎水性高分子が結合している表面、又は自己組織化単分子膜に、濃度勾配をつけて官能基を導入することができる。
【００２２】
荷電を変化させた膜を製造するためには、荷電をもつ官能基の導入時、膜表面の一点から荷電をもつ官能基を導入することにより、拡散速度の差により、濃度勾配を作成する方法を用いることができる。
【００２３】
荷電を変化させた膜を製造するためには、荷電をもつ官能基の導入時、官能基の濃度を変化させて、官能基を導入する方法を用いることができる。また、荷電を変化させた膜を製造するためには、荷電をもつ官能基の導入時、官能基の種類を変化させる方法を用いることもできる。
【００２４】
さらに、荷電を変化させた膜を製造するためには、荷電をもつ官能基の導入時、水溶性高分子、あるいは疎水性高分子、又は自己組織化単分子膜と官能基との反応時間を変化させる方法を用いることもできる。
【００２５】
本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。
【００２６】
本発明のバイオセンサーでは、金属表面又は金属膜を基板として用いることができる。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００２７】
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上、１０ｎｍ以下であるのが好ましい。
【００２８】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００２９】
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００３０】
本発明において好ましくは、基板は、疎水性高分子化合物又は水溶性高分子化合物でコーティングした金属表面又は金属膜であるか、あるいは自己組織化膜を有する金属表面又は金属膜である。以下、疎水性高分子化合物、水溶性高分子化合物及び自己組織化膜について説明する。
【００３１】
本発明で用いることができる疎水性高分子化合物は、一般的には吸水性を有しないか吸水性が低い高分子化合物であり、水への溶解度（２５℃）は好ましくは１０％以下であり、より好ましくは１％以下であり、最も好ましくは０．１％以下である。
【００３２】
疎水性高分子としては、具体的には、ポリアクリル酸誘導体、ポリメタクリル酸誘導体、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリブタジエン、ポリメチルペンテン、シクロオレフィンポリマー、ポリスチレン（ＰＳ）、アクリロニトリル／ブタジエン／スチレン共重合体（ＡＢＳ）、スチレン／無水マレイン酸共重合体・ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）、ナイロン６、ナイロン６６、酢酸セルロース（ＴＡＣ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、変性ポリフェニレンエーテル（ｍ−ＰＰＥ）、ポリフェニレンサルファイド（ＰＰＳ）、ポリエーテルケトン（ＰＥＫ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリスルホン（ＰＳＦ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリフェニレンサルファイド（ＰＰＳ）、液晶ポリマー（ＬＣＰ）などを挙げることができる。これら疎水性高分子表面に、荷電を与える官能基を導入した場合も、生理活性物質を２次元表面にその物質がもつ荷電により種別することが可能となる。
【００３３】
疎水性高分子化合物の基板へのコーティングは常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。
【００３４】
疎水性高分子化合物のコーティング厚さは特に限定されないが、好ましくは０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であり、特に好ましくは１ｎｍ以上３００ｎｍ以下である。
【００３５】
本発明で用いる水溶性高分子化合物としては、例えば、ポリヒドロキシ高分子化合物を挙げることができ、例えば多糖類（例えばアガロース、デキストラン、カラギーナン、アルギン酸、デンプン、セルロース）、または合成高分子化合物（例えばポリビニルアルコール）などを挙げることができる。本発明においては、多糖類が好ましく用いられ、デキストランが最も好ましい。
【００３６】
本発明においては、好ましくは、平均分子量１万以上２００万以下のポリヒドロキシ高分子化合物が用いられる。好ましくは２万以上２００万以下、さらに好ましくは３万以上１００万以下、最も好ましくは２０万以上８０万以下のポリヒドロキシ高分子化合物を用いることができる。
【００３７】
ポリヒドロキシ高分子化合物は、例えば塩基性条件下でブロモ酢酸と反応させることでカルボキシ化できる。反応条件の制御により、ポリヒドロキシ化合物が初期状態で含有するヒドロキシ基の一定の割合をカルボキシ化できる。本発明においては例えば、１〜９０％のヒドロキシ基をカルボキシ化することができる。なお、任意のポリヒドロキシ高分子化合物で表面被覆された表面について、例えば、以下の方法でカルボキシ化率を算出することができる。膜表面をジ−tert−ブチルカルボジイミド／ピリジン触媒を用いてトリフルオロエタノールで50℃、16時間、気相修飾し、ＥＳＣＡ（electron spectroscopy for chemical analysis）でトリフルオロエタノール由来のフッ素量を測定し、膜表面の酸素量との比率（以下、Ｆ／Ｏ値と呼ぶ）を算出する。全てのヒドロキシ基がカルボキシ化された場合の理論的なＦ／Ｏ値をカルボキシ化率１００％とし、任意の条件でカルボキシ化した時のＦ／Ｏ値を測定することで、その時のカルボキシ化率を算出することができる。
【００３８】
ポリヒドロキシ高分子化合物は有機分子Ｘ1−Ｒ1−Ｙ1を介して金属膜に付着させることができる。有機分子Ｘ1−Ｒ1−Ｙ1について詳細に説明する。
【００３９】
Ｘ1は金属膜に対する結合性を有する基である。具体的には、非対称又は対称スルフィド（−SSR11Ｙ11、−SSR1Y1）、スルフィド（−SR11Ｙ11、−SR1Y1）、ジセレニド（−SeSeR11Ｙ11、−SeSeR1Y1）、セレニド（SeR11Ｙ11、−SeR1Y1）、チオール（−SH）、ニトリル（−CN）、イソニトリル、ニトロ（−NO2）、セレノール（−SeH）、３価リン化合物、イソチオシアネート、キサンテート、チオカルバメート、ホスフィン、チオ酸またはジチオ酸（−COSH、−CSSH）が好ましく用いられる。
【００４０】
Ｒ1（とＲ11）は場合によりヘテロ原子により中断されており、好ましくは適当に密な詰め込みのため直鎖（枝分かれしていない）であり、場合により二重及び／又は三重結合を含む炭化水素鎖である。鎖の長さは10原子を越えることが好ましい。炭素鎖は場合により過弗素化されることができる。
【００４１】
Ｙ1とＹ11はポリヒドロキシ高分子化合物を結合させるための基である。Ｙ1とＹ11は好ましくは同一であり、ポリヒドロキシ高分子化合物に直接又は活性化後結合できるような性質を持つ。具体的にはヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、アルデヒド、ヒドラジド、カルボニル、エポキシ、又はビニル基などを用いることができる。
【００４２】
有機分子Ｘ1−Ｒ1−Ｙ1の具体例としては、10-カルボキシ-1-デカンチオール、4,4'-ジチオジブチリックアシッド、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオールなどが挙げられる。
【００４３】
自己組織化膜（自己組織化単分子膜）について説明する。チオールやジスルフィド類などの硫黄化合物は金等の貴金属基板上に自発的に吸着し単分子サイズの超薄膜を与える。またその集合体は基板の結晶格子や吸着分子の分子構造に依存した配列を示すことから自己組織化膜と呼ばれている。自己組織化単分子膜としては、金表面のアルカンチオール類、ガラス表面のアルキルシラン類、シリコン表面のアルコール類等が挙げられる。アルカンチオール類の具体例としては、7−カルボキシ−１−ヘプタンチオール、10-カルボキシ-1-デカンチオール、4,4'-ジチオジブチリックアシッド、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオールなどを使用することができる。
【００４４】
本発明における被測定物質としては、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【００４５】
本発明では、被測定物質と該表面との相互作用を、非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。
【００４６】
本発明の好ましい態様によれば、本発明のバイオセンサーは、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。
【００４７】
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【００４８】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【００４９】
表面プラズモン共鳴測定装置とは、表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析するための装置である。本発明で用いられる表面プラズモン共鳴測定装置は、金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備える。
【００５０】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００５１】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【００５２】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【００５３】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【００５４】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【００５５】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００５６】
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
【００５７】
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。
【００５８】
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。
【００５９】
本発明のバイオセンサーを表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、上記したような各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。
【００６０】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００６１】
実施例１：タンパク質の荷電を評価するためのセンサーチップの作製
（１）試料１の作成（比較例）
カルボキシメチルデキストランが結合した表面として、Biacore社センサーチップCM-5（research  grade）を、そのまま用いた。
【００６２】
（２）試料２、３及び４の作成（実施例）
荷電を変化させた膜を表面に有するセンサーを製造するために、Biacore社センサーチップCM-5（research  grade）のカルボキシル基を、タウリンで置換した表面を用いた。
【００６３】
CM-5を Biacore社製の表面プラズモン共鳴装置であるBiacore3000にセットし、0.4MのEDC（1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide：同仁化学製）および2.8mMのHODhbt （3,4-Dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine：東京化成）を含む水溶液と５分接触させ、さらにタウリン（2-アミノエタン-1-スルホン酸：和光純薬製）の1.0M溶液（NaOHにてpH10.0に調整）との接触させることでカルボキシメチルデキストランのカルボキシル基がスルホン酸基に一部置換された表面が作製される。この際、接触時間を５分（試料２）、１０分（試料３）、２０分（試料４）と変化させることでスルホン酸基への置換率を変化させたCM-５を用意した。EDC/HODhbtによる活性化時間、タウリンの反応時間、さらにこの操作の繰り返し回数により、スルホン酸基への置換率を制御することが可能である。
【００６４】
カルボン酸のｐＫａより低いpH1.5のグリシンバッファー中では、カルボキシル基はプラスに帯電し、スルホン酸基はマイナスに帯電している。よって試料１、２、３、４となるにしたがって、マイナス荷電が多くなっている。試料１ではプラス荷電である。上記の通り、荷電を変化させた膜を４枚作成できた。
【００６５】
実施例２：タンパク質溶液の作製
荷電を評価するタンパク質としては、ｐ５３（Calbiochem製）とｐ３８（Upstate製）を用いた。二つの蛋白の等電点（ｐＩ）は、ATTO社のAE-8150を用いた電気泳動実験で、同時測定したマーカー（Broad pI Kit, pH 3.5-9.3：Amersham Biosciences社製）との比較から、ｐ５３はｐＩ=４．０程度であり、ｐ３８はｐＩ=５．６程度であることを確認した。
【００６６】
1mgのｐ５３を1mlのHBS-EPバッファー（ビアコア社製、pH7.4）に溶解した溶液を10μl秤量し、90μlのグリシンバッファー（ビアコア社製、pH1.5）を加えることで、0.1mg/mlのｐ５３溶液（pH1.5, 0.1mg/ml）を調整した。
【００６７】
1mgのｐ３８を1mlのHBS-EPバッファー（ビアコア社製、pH7.4）に溶解した溶液を10μl秤量し、90μlのグリシンバッファー（ビアコア社製、pH1.5）を加えることで、0.1mg/mlのｐ３８溶液（pH1.5, 0.1mg/ml）を調整した。
【００６８】
実施例３：センサーチップ表面への蛋白質の濃縮
実施例１で作製したセンサーチップ（試料１、２、３、４）のそれぞれを順次Biacore社製の表面プラズモン共鳴装置であるBiacore3000にセットし、ｐ５３とｐ３８を、各々９０秒流し、センサーチップ表面への蛋白質の濃縮について検討した。ｐ５３についての結果を図１に示し、ｐ３８についての結果を図２に示す。
【００６９】
ｐ５３は試料１のセンサーでは濃縮がみられず、試料２、３、４となるに従い、濃縮が多くなった。これはｐH１．５中では、ｐ５３はプラス荷電となり、センサー表面のマイナス荷電が多くなるにしたがって濃縮効果が大きくなるからである。
【００７０】
ｐ３８も試料１のセンサーでは濃縮がみられず、試料２、３、４となるに従い、濃縮が多くなった。これもｐH１．５中では、ｐ３８はプラス荷電となることによる。
【００７１】
試料２及び３でのｐ５３とｐ３８の濃縮効果を比較した場合、ｐ３８の方がより濃縮効果が高かった。これはｐ３８の方が等電点が高いため、同じpH1.5中でもｐ５３と比べてより強くプラスに帯電しているためと結論づけられた。
【００７２】
以上の結果より、荷電を変化させた膜を用いたSPR測定により、測定サンプルに含まれるタンパクの荷電を評価できることが証明された。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１は、試料１〜４のセンサーチップにｐ５３を流した場合のセンサーチップ表面への蛋白濃縮について検討した結果を示す。
【図２】図２は、試料１〜４のセンサーチップにｐ３８を流した場合のセンサーチップ表面への蛋白濃縮について検討した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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