(57)【要約】【課題】  乳幼児及び乳幼動物に多発するロタウイルス性下痢症からの回復に寄与する医薬組成物、食品及び家畜用の飼料を提供する。【解決手段】  常乳から得られる酸ホエイ（酸乳清）を限外濾過し、低分子量乳清タンパク質濃縮物をSephacryl S100のゲル濾過に供し、得られる分画物を繰り返しゲル濾過に供して精製された未変性のβ−ラクトグロブリン二量体、または、これを２５％トリフルオロエタノールを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０中）で２日間処理することによって得られるＳＤＳ安定性の二量体／オリゴマーを有効量含ませて、医薬組成物又は食品あるいは家畜用飼料とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−ラクトグロブリン二量体及び／又はそのＳＤＳ安定性二量体／オリゴマーからなるロタウイルス感染による下痢回復促進剤。
【請求項２】
有効量のβ−ラクトグロブリン二量体及び／又はそのＳＤＳ安定性二量体／オリゴマーを含むロタウイルス感染による下痢回復促進用医薬組成物。
【請求項３】
有効量のβ−ラクトグロブリン二量体及び／又はそのＳＤＳ安定性二量体／オリゴマーを含むロタウイルス感染による下痢回復促進用食品（ただし、乳製品を除く）。
【請求項４】
有効量のβ−ラクトグロブリンＳＤＳ安定性二量体／オリゴマーを含むロタウイルス感染による下痢回復促進用乳製品。
【請求項５】
ロタウイルス感染による下痢回復促進用乳製品であって、
β−ラクトグロブリン二量体及び／又はそのＳＤＳ安定性二量体／オリゴマーを常在量を超える量で含むように添加し、下痢回復作用を標榜可能にした下痢回復促進用乳製品。
【請求項６】
有効量のβ−ラクトグロブリン二量体及び／又はそのＳＤＳ安定性二量体／オリゴマーを含むロタウイルス感染による下痢回復促進用飼料。
【請求項７】
有効量のβ−ラクトグロブリン二量体及び／又はそのＳＤＳ安定性二量体／オリゴマーをヒト又はヒト以外の動物に投与して、ロタウイルス感染による下痢からの回復を促進する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ロタウイルス感染による下痢からの回復促進剤、さらに詳細に言うとロタウイルス感染による下痢からの回復促進効果を有するタンパク質、並びにそれを含むロタウイルス感染による下痢からの回復促進に有用な飲食品、医薬組成物及び飼料（主として家畜用）に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトロタウイルスを原因とする乳幼児冬季下痢症は、主に２歳以下の乳幼児に、発熱、嘔吐、下痢及び脱水症状を引き起こす疾患である。これまでにも、ヒトロタウイルス感染を阻害する食品成分あるいは組成物としてウシ乳清由来の高分子糖蛋白質混合物（特許文献１）などが提案されている。また、ウシ乳清の精密濾過保持液、遠心分離処理液及び／若しくは硫安処理溶液又はその乾燥物がヒトロタウイルス感染阻害活性を持つことが報告されている（特許文献２）。
【０００３】
しかしながら、ヒトロタウイルス感染による下痢からの回復を促進する効果に関する検討はほとんどされておらず、ロタウイルス感染後に必要となる整腸作用食品の登場が望まれている。
【特許文献１】特開平８−９９８９６号公報
【特許文献２】ＷＯ２００４−０８０４７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は上記背景技術に鑑みてなされたものであって、乳幼児及び乳幼動物に多発するロタウイルス性下痢症からの回復に寄与する医薬組成物、食品及び家畜用の飼料を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本願発明者らは上記課題を解決すべく鋭意努力したところ、常乳の乳清から得られる未変性のβ−ラクトグロブリン二量体及びそのＳＤＳ安定性二量体／オリゴマーに、ロタウイルス感染による下痢からの回復促進効果を見出し、本願発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、上記未変性のβ−ラクトグロブリン二量体及び／又はそのＳＤＳ安定性二量体／オリゴマーを有効成分とする医薬組成物又は食品組成物あるいは家畜用飼料を提供し、あるいは、それらをヒト又はヒト以外の動物に投与してロタウイルス感染による下痢からの回復を促進する方法を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明に係る下痢回復剤は、β−ラクトグロブリン二量体及び／又はそのＳＤＳ安定性二量体／オリゴマーからなり、これらのタンパク質は非常に強い下痢回復活性を有する。これらのタンパク質は乳に由来するため、食経験があり、安全性が高い。従って、ロタウイルス感染に対する防御能の発達が未熟な乳幼児の育児用調製粉乳、あるいはロタウイルス感染に対する防御能の低下した高齢者向けにその有効量を食品に添加してロタウイルス感染による下痢からの回復促進効果を有する食品組成物とすることができる。また、その有効量を添加し、医薬組成物とするほか、家畜飼料の原料に供することもできる。これらによって、ロタウイルス感染による下痢から迅速な回復が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明に係る未変性のβ−ラクトグロブリン二量体は、乳中に自然体として存在する乳タンパク質の一種であり、乳清（ホエイ）を処理することによって得られる。本発明において用いられる乳は、ウシの乳のみならず、ヒト、ブタ、ヤギ、ヒツジ等など各種哺乳動物の乳である。また、ホエイは、スィートホエイ（sweet whey）及び酸ホエイ（acid whey）に分けられるが、いずれのホエイであってもよい。ホエイは、動物の各泌乳期の乳、若しくはこれらの濃縮物または乾燥物を原料として、常法により調製したものである。ホエイは、一般に、原乳を清浄化し、７２〜７５℃で１５秒間加熱殺菌するＨＴＳＴ（High Temperature Short Time）殺菌及び１２０〜１５０℃で１〜３秒間加熱殺菌するＵＨＴ（Ultra High Temperature）殺菌等の殺菌処理を施した後、大きく分けると以下の二つの方法で製造できる。一つはスィートホエイの製造方法であり、殺菌した乳、又は殺菌した乳を約３０〜６０℃に加温し数百Ｇ以上の重力をかけて脂肪をクリームとして脱脂した脱脂乳に各種レンネット（動物、微生物および植物起源）を添加する方法である。すなわち、硬質、半硬質又は軟質チーズ及びレンネットカゼインを製造するときにホエイを溶液として排出する方法である。もう一つは酸ホエイの製造法であり、上述の方法と同様の方法で得た脱脂乳に酸（酢酸や乳酸などの有機酸又は塩酸や硫酸などの無機酸）を添加する方法である。すなわち、脱脂乳のｐＨを酸で４．６に調製し、等電点沈殿したカゼインを濾過や遠心分離などで除去することで酸ホエイが得られる。さらに、これら以外にも脱脂乳に乳酸菌を単独で、あるいは塩化カルシウムと酸の両者を添加し、生じるカゼインの沈殿を遠心分離等で除去した上清も酸ホエイとして利用することができる。
【０００９】
β−ラクトグロブリンは、分子量約１８．３ｋＤａの蛋白質であるが、通常の条件下では、ダイマー状態をとることが知られている。上記のホエイからβ−ラクトグロブリンを分画する方法については多くの報告〔例えば、桑田有：月刊フードケミカル，２月号，６８（１９９１）；米国特許第５，４２０，２４９号；特開平０７−１２３９２７号公報；特開平０７−２０３８６３号公報等〕があり、また、市販品として数々上市もされている。例えば、その一例を挙げると、ホエイを限外濾過し、低分子量ホエイ蛋白質濃縮物（ＬＷＰＣ）を得た後、ゲル濾過（例えば、Sepacryl S100 やSuperdex 75）に供して、分子サイズに基づき分離する方法がある。本発明におけるβ−ラクトグロブリン二量体とは、これらの方法により得られた未変性のβ−ラクトグロブリン（ネイティブダイマーβ−ラクトグロブリン）を言う。
【００１０】
また、本発明者らによって、腸細胞増殖作用を強く阻害する作用を示す牛乳タンパク質は、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、非解離性（ＳＤＳ安定性）のダイマー／オリゴマーの生成を伴うことが指摘されている（文献名：平成１６年度牛乳栄養学術研究会委託研究報告書、（社）日本酪農乳業協会、平成１７年５月、ｐ.１３６−１５０）。本発明におけるＳＤＳ安定性二量体／オリゴマーとは、この非解離性の重合体を意味し、ネイティブダイマーβ−ラクトグロブリンを還元条件下においてインキュベーションによって得られる二量体、三量体などのβ−ラクトグロブリンの多量体である。この生成物は主として二量体からなるが、それ以外の副成物と三量体などの多量体が含まれることもある。インキュベーション時の条件は、例えば、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施する際に利用されうるバッファー条件やＳＤＳ安定性二量体／オリゴマーを多量に生成するように改変されたバッファー条件が適宜選択される。その一例を示すと、２５％トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）を含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−塩酸バッファー（ｐＨ８．０）を用いた２日間の室温におけるインキュベーションである。また、インキュベーション時の温度（通例は室温下である。）や時間等も適宜設定することができる。
【００１１】
このようにして得られたネイティブβ−ラクトグロブリン二量体又はそのＳＤＳ安定性二量体／オリゴマーは、ロタウイルスによる感染そのものからの回復を促進し（感染率の低下）、感染による下痢症状を速やかに改善する効果を発揮する。つまり、本発明における下痢回復促進効果は、ロタウイルス感染による下痢症状の回復という対処療法的なものだけではなく、ロタウイルスによる感染から回復させるという根本的なものである。
【００１２】
これらの乳タンパク質は、タンパク質だけで下痢回復促進剤として利用できるが、通例は、ロタウイルス感染による抗下痢回復促進用の医薬組成物として、また、乳製品又は乳製品以外の食品として、あるいは動物用、特に家畜用の飼料として提供される。本発明の医薬組成物は、有効量のβ−ラクトグロブリン二量体及び／又はＳＤＳ安定性二量体／オリゴマーと薬理学的に影響を及ぼさない担体とを含み、例えば、薬理学的な散剤や顆粒剤、錠剤、カプセル剤、エアゾル剤、液剤、注射剤、輸液剤等の剤型に調製される。用いられる担体としてはデンプンや乳糖などのような賦形剤、水やエタノールなどの溶剤が例示され、その他コーティング剤や滑沢剤、着色剤、矯味剤、着香料などと共に製剤化される。この医薬組成物は、剤型や投与対象等に応じてその有効量がヒト及び動物に投与される。
【００１３】
本発明の乳製品は、ロタウイルス感染による下痢の回復促進という機能を発揮し、又はその旨を標榜しうる食品（例えば特定保健用食品として流通しうる食品）であって、少なくとも有効量のβ−ラクトグロブリンＳＤＳ安定性二量体／オリゴマーを含む。ここにいう乳製品とは、乳を主原料に調製された食品であって、乳製品の種類は特に限定されるものではなく、上記で得られたβ−ラクトグロブリンＳＤＳ安定性二量体／オリゴマーを他の原材料に加えて常法に従って調製される。調製されうる乳製品には、牛乳はもちろんのこと、コーヒ飲料等の加工乳、チーズ、ヨーグルト、バター、クリーム、スキムミルク、アイスクリーム、成分調整済みの粉ミルク（例えば乳幼児用）などが例示される。また、未変性のβ−ラクトグロブリン二量体を人工的に加え、いわゆる未変性のβ−ラクトグロブリン二量体が強化された乳製品に調整してもよい。
【００１４】
本発明の乳製品以外の食品とは、ロタウイルス感染による下痢の回復促進という機能を発揮させ、又はその旨を標榜しうる食品（例えば、特定保健用食品として流通しうる食品）であって、少なくとも有効量の未変性のβ−ラクトグロブリンダイマー及び／又は少なくとも有効量のβ−ラクトグロブリンＳＤＳ安定性二量体／オリゴマーを含む。ここにいう乳製品以外の食品とは、摂食可能な形態の全てを意味し、その形態は問わず、固形食品、流動食品、ペースト状などの半固形食品、液状食品が例示される。これらの乳タンパク質は、各種の加工食品の原材料として用いられるものであって、加工食品等の種類は特に限定されるものではない。当該加工食品には、乳幼児用に加工された離乳食用の食品、ゼリーやグミ様の食品、ウエハースやキャラメル等の嗜好品、ジュース等の清涼飲料水、高齢者向けの流動食品などが例示される。また、医薬品の形状（例えば錠剤やカプセル剤）に加工した、いわゆる健康食品としても提供される。もっとも、乳タンパク質を各種の食品（加工用の素材を含む）に添加して服用しても差し支えない。
【００１５】
本発明の飼料は、ロタウイルス感染による下痢の回復促進という機能を発揮させるものであって、少なくとも有効量の未変性のβ−ラクトグロブリン二量体及び／又は少なくとも有効量のβ−ラクトグロブリンＳＤＳ安定性二量体／オリゴマーを含む。飼料は、ヒトを除く動物、例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の家畜やイヌ、ネコ等のペットを始めとして、その他ロタウイルス感染が考えられ得る動物に与えられる飼料を言う。飼料の形態は問われないが、その摂取や調製を考えると、いわゆるドッグフードやキャットフードのように、他のタンパク質や糖類、脂質、ビタミンなどを１種若しくは数種含有する成分調整済みの固形飼料や液体飼料、半固形飼料などとして調整されたものが好ましい。
【００１６】
これらの投与量（有効量）は、具体的には、その症状、年齢、体重、動物種などにより異なるが、概ねβ−ラクトグロブリン二量体（又はβ−ラクトグロブリンＳＤＳ安定性二量体／オリゴマー）として１日０．１μｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇであって、好ましくは１μｇ〜３００ｍｇ／ｋｇで、１日１回又は数回に分けて投与される。また、β−ラクトグロブリンは、牛乳中約２００〜４００ｍｇ／１００ｍｌ含まれると言われており、本発明における乳製品の常在量とは、原料である乳に由来して含有される量であって、例えば、ヨーグルトであれば、ほぼ原料牛乳中の量とほぼ同量が含まれる。従って、例えば、本発明に係る乳製品が牛乳であれば、本発明に係る牛乳には、少なくとも約２００〜４００ｍｇ／１００ｍｌを越える量、好ましくはその５〜１０倍量のβ−ラクトグロブリン二量体であって、少なくとも常食量によって効果を発揮する量が含まれる。また、本発明に係る乳製品がヨーグルトであれば、本発明に係る牛乳には、少なくとも約２００〜４００ｍｇ／１００ｇ、好ましくはその２〜３倍量のβ−ラクトグロブリン二量体（β−ラクトグロブリンＳＤＳ安定性二量体／オリゴマー）であって、少なくとも常食量により効果を発揮する量が含まれる。もっとも、常在量は乳製品の種類、製造工程等によってそれぞれ異なるのは言うまでもなく、本発明の乳製品は、有効性を発揮させるために少なくとも常在量を越える量のβ−ラクトグロブリン二量体等を含むように調整される。なお、上記常食量とは、健常人が通常１度の摂食により摂取する平均的な量である。従って、本発明の乳製品は、ロタウイルスの罹患者を主たる対象とするため、その摂食量は健常人における常食量よりも少なくなる。また、罹患者には水分の多い飲料は好ましいものではない。このため、牛乳などの乳飲料の形態は好ましいものではなく、飲料形態で提供する場合には高濃度にβ−ラクトグロブリンを含ませる必要がある。このため、本発明の乳製品中におけるβ−ラクトグロブリン二量体等の含有量は、常在量の少なくとも２倍量、好ましくは５倍量、望ましくは１０倍量以上となるように調整される。
【実施例１】
【００１７】
以下、本発明について下記実施例に基づいて本発明についてさらに具体的に説明する。なお、本発明は下記実施例に限定されないのは言うまでもない。
【００１８】
[試験例１]：試料の調製
（１）乳清タンパク質濃縮物からの未変性β−ラクトグロブリン二量体の調製
常法により、常乳を脱脂後、酸添加によりカゼインを沈殿除去して乳清（酸ホエイ）を分離した。次に分画分子量３００万の膜を用いた限外濾過を行い、低分子量の乳清タンパク質濃縮物を得た。濃度９ｍｇ／ｍｌに調製し、Sephacryl S-100を充填したカラムに３００ｍｌアプライし、溶出バッファーには、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、０.０２％ＮａＮ３を含む０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーを用い、２８０ｎｍの吸光度における３番目のピークに相当する画分を採取した。このピークに関してSephacryl S-100のゲル濾過を繰り返すことで精製未変性β−ラクトグロブリン二量体を得た。
【００１９】
Sephacryl S-100を充填したカラムからの分離を示すクロマトグラフを図１に示したが、この図から分かるようにこの分画操作からでは５つのフラクションが得られた。このうち、Ｓ３が分子量３７Ｋに相当する。また、図２には、図１で分画されたＳ１〜Ｓ５の５つのフラクションについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥイムノブロッティングパターンを示した。上段はＣＢＢ染色したもの、下段は抗ウシβ−ラクトグロブリンモノクローナル抗体で処理したもの、各図のＳは分子量マーカーである。ＣＢＢ染色ではＳ３に分子量１８Ｋのバンドが主として見られた。抗体処理では予期されたようにＳ３には強い反応性を示す１８Ｋのバンドが現れ、ゲル濾過で３７Ｋのピークに溶出したダイマーを形成するネイティブ分子が還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥでモノマーに解離した結果と考えられた。そして、Ｓ３には他のバンドがほとんど認められないことから、Ｓ３のフラクションは、ネイティブのβ−ラクトグロブリンダイマー（β−ラクトグロブリン二量体）であると確認された。
【００２０】
（２）未変性β−ラクトグロブリン二量体からのＳＤＳ安定性二量体/オリゴマーの調製
前記（１）で得られた未変性β−ラクトグロブリン二量体を、２５％トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）を含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.０）中で未変性のβ−ラクトグロブリン二量体を２日間室温処理した。
【００２１】
図３に、ＴＦＥ含有バッファー処理前後のβ−ラクトグロブリン二量体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ／イムノブロッティングパターンを示す。処理前には１８Ｋのモノマーバンドと極めてわずかな３７Ｋダイマーが認められたが、処理後の試料中には３７Ｋの安定性ダイマーバンド（矢印）が増加するとともにゲル先端付近のオリゴマーの生成が明らかに認められた。なお、図中のＳは分子量マーカーである。
【００２２】
[試験例２]：ロタウイルス感染からの回復促進効果（下痢発症率の軽減）
生後５日齢の乳飲みマウスへヒトロタウイルスＭＯ株（２×１０７ＦＣＦＵ）を経口接種させ、その１日後に感染を確認してから経口摂取させた試料による下痢からの回復期間の短縮を評価した。すなわち、感染後２４、４８および７２時間の時点で５０μｌのβ−ラクトグロブリン試料（未変性のβ−ラクトグロブリン二量体又はそのＳＤＳ安定性二量体／オリゴマー）溶液（５０ｍｇ／ｍｌ）を経口投与した。ウイルス投与後９６時間までの各時点での糞便を検査し、下痢の発症を観察した。コントロールは生理食塩水投与マウスである。
【００２３】
その結果を図４に示す。未変性のβ−ラクトグロブリン二量体の経口投与群（図中では処理前と示されている。）では、７２時間後の時点で下痢発症率が２０％以下のレベルまで急激に低下し、９６時間後には全く観察されなかった（コントロール群は７２時間後で６０％、９６時間後で３０％）。β−ラクトグロブリンのＳＤＳ安定性二量体/オリゴマーの経口投与群（図中では処理後と示されている。）では、７２時間後の時点で下痢発症率が４０％以下のレベルまで低下し、９６時間後には全く観察されなかった。
【００２４】
[試験例３]：ロタウイルス感染からの回復促進効果（感染率の軽減）
生後５日齢の乳飲みマウスへヒトロタウイルスＭＯ株（２×１０７ＦＣＦＵ）を経口接種させ、その１日後に感染を確認してから経口摂取させた試料による感染状態からの回復期間の短縮を評価した。すなわち、感染後２４、４８および７２時間の時点で５０μｌのβ−ラクトグロブリン試料溶液(５０ｍｇ／ｍｌ)を経口投与した。ウイルス投与後９６時間までの各時点での糞便を検査した。下痢、軟便、正常便のスコアをそれぞれ２、１、０とし、各群中のマウスすべてが下痢を起こしているとした場合のトータルスコアを１００とした場合の実際のトータルスコアの割合を感染率として求めた。コントロールは生理食塩水投与マウスである。
【００２５】
その結果を図５に示す。未変性のβ−ラクトグロブリン二量体の経口投与群（図中では処理前と示されている。）では、７２時間後の時点で感染率が２３％まで低下し、９６時間後には０％となった（コントロール群は７２時間後で６３％、９６時間後で３４％であった）。β−ラクトグロブリンのＳＤＳ安定性二量体／オリゴマーの経口投与群（図中では処理後と示されている。）では、７２時間後の時点で感染率が４３％まで低下し、９６時間後には７％となった。
【００２６】
このように、未変性のβ−ラクトグロブリン二量体及び／又はβ−ラクトグロブリンＳＤＳ安定性二量体／オリゴマーは、ロタウイルス感染からの回復を促進させると共にロタウイルス感染による下痢症状の回復をも促進した。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明により、ロタウイルス感染による下痢からの回復促進効果を有する下痢回復促進剤が提供される。該回復剤は、その有効量を飲食品や医薬組成物、家畜飼料の原料として利用することができ、極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】低分子量乳清タンパク質濃縮物（ＬＷＰＣ）からのβ−ラクトグロブリン二量体（ネイティブ）の分離を示すクロマトグラフである。
【図２】Sephacryl S100で分離したＳ１〜Ｓ５フラクション（図１参照）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ／イムノブロッティングパターンを示す図である。
【図３】ＴＦＥ含有バッファー処理前後のβ−ラクトグロブリン二量体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ／イムノブロッティングパターンを示す図である。
【図４】ＴＦＥ含有バッファー処理前後のβ−ラクトグロブリン二量体の経口投与がロタウイルスによる乳飲みマウスの感染に影響を示す図であって、下痢発症率の軽減を示す。
【図５】ＴＦＥ含有バッファー処理前後のβ−ラクトグロブリン二量体の経口投与がロタウイルスによる乳飲みマウスの感染に影響を示す図であって、感染率の軽減を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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