(57)【要約】【課題】本発明は、ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）前駆体を産生するための核酸及びその利用を提供する。【解決手段】本発明の、ｓｈＲＮＡ前駆体を産生するための核酸は、以下の成分；１）ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系プロモーター；並びに、２）以下のｉ）−ｉｉｉ）からなるｓｈＲＮＡ前駆体コード領域、ｉ）Ｄｒｏｓｈａ認識部位を含むＤｒｏｓｈａ認識第一領域；ｉｉ）ｓｈＲＮＡ形成領域；及びｉｉｉ）Ｄｒｏｓｈａ認識部位を含むＤｒｏｓｈａ認識第二領域、を含み、ここにおいて、２−ｉｉ）のｓｈＲＮＡ形成領域は、ａ）ＲＮＡ干渉の標的となる標的遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と相同な塩基配列であるセンス配列をコードするセンス鎖領域、ｂ）塩基特異的ＲＮａｓｅで切断されるループ配列をコードするループ領域、及びｃ）標的遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と相同な塩基配列であるセンス配列と相補的なアンチセンス配列をコードするアンチセンス領域、からなるものである。【選択図】図１
2007104969.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）前駆体を産生するための核酸であって、
以下の成分；
１）ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系プロモーター；並びに
２）以下のｉ）−ｉｉｉ）からなるｓｈＲＮＡ前駆体コード領域
ｉ）Ｄｒｏｓｈａ認識部位を含むＤｒｏｓｈａ認識第一領域；
ｉｉ）ｓｈＲＮＡ形成領域；及び
ｉｉｉ）Ｄｒｏｓｈａ認識部位を含むＤｒｏｓｈａ認識第二領域
を含み、
ここにおいて、２−ｉｉ）のｓｈＲＮＡ形成領域は、ａ）ＲＮＡ干渉の標的となる標的遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と相同な塩基配列であるセンス配列をコードするセンス鎖領域、ｂ）塩基特異的ＲＮａｓｅで切断されるループ配列をコードするループ領域、及びｃ）標的遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と相同な塩基配列であるセンス配列と相補的なアンチセンス配列をコードするアンチセンス領域、からなる
前記核酸。
【請求項２】
２）ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域が、ヒトのｐｒｉ−ｍＲＮＡ構造をコードする、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
天然に存在するヌクレオチド及び／又は天然に存在しないヌクレオチドから構成される、請求項１又は２記載の核酸。
【請求項４】
２）ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域の合計塩基数が、１００塩基ないし４００塩基である、請求項１ないし３のいずれか１つに記載の核酸。
【請求項５】
２−ｉｉ−ａ）のセンス鎖領域がコードするセンス配列は、前記標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、下記（１）〜（４）の規則：
（１）３’末端の塩基が、アデニン、チミン又はウラシルである；
（２）５’末端の塩基が、グアニン又はシトシンである；
（３）３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる一種又は二種以上の塩基がリッチである；そして
（４）塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である
に従う規定配列と、相同な塩基配列である、請求項１〜４のいずれか１つに記載の核酸。
【請求項６】
前記規則（４）において、塩基数が１３〜２８である、請求項５記載の核酸。
【請求項７】
前記標的遺伝子の前記規定配列が、さらに下記（５）の規則：
（５）被検体の全遺伝子配列のうち、前記標的遺伝子以外の他の遺伝子の塩基配列中に、当該規定配列と９０％以上の同一性を有する配列が含まれない
に従う配列である、請求項５又は６記載の核酸。
【請求項８】
２−ｉｉ−ｂ）のループ領域によってコードされるループ配列の、３’末端がグアニンであり５’末端がシトシンであるか、又は、前記ループ配列の３’末端がシトシンであり５’末端がグアニンである、請求項１ないし７のいずれか１つに記載の核酸。
【請求項９】
２−ｉｉ−ｂ）のループ領域によってコードされるループ配列の塩基数が、約３〜３０塩基である、請求項１ないし８のいずれか１つに記載の核酸。
【請求項１０】
２−ｉｉ）−ｃ）のアンチセンス鎖領域は、コードするアンチセンス配列の３’末端にオーバーハング配列を与える塩基配列を含む、請求項１ないし９のいずれか１つに記載の核酸。
【請求項１１】
コンディショナルターゲティング法に適用される塩基配列をさらに含む、請求項１ないし１０のいずれか１つに記載の核酸。
【請求項１２】
前記コンディショナルターゲティング法に適用される塩基配列が、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムに利用されるｌｏｘＰ及び／又は誘導型プロモーターである、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
以下のＩないしＩＶのいずれかの構造を有する、請求項１２に記載の核酸：
Ｉ）  ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系プロモーター  −  ｌｏｘＰ  −  発現が制御される任意配列領域  −  ｌｏｘＰ  −  ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域；
ＩＩ）  ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系プロモーター  −  ｌｏｘＰ  −  ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域−  ｌｏｘＰ  −  発現が制御される任意配列領域；
ＩＩＩ）  逆位の発現が制御される任意配列領域  −  ｌｏｘＰ  −  逆位ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系プロモーター  −  逆位ｌｏｘＰ  −  ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域；又は
ＩＶ）  ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域  −  逆位ｌｏｘＰ  −  ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系プロモーター  −  ｌｏｘＰ  −逆位の発現が制御される任意配列領域。
【請求項１４】
発現が制御される任意配列領域が、標識配列領域又は第二のｓｈＲＮＡ前駆体コード領域である、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
二本鎖である、請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１６】
請求項１ないし１５のいずれか１つに記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１ないし１５のいずれか１つに記載の核酸を鋳型として、ＲＮＡポリメラーゼＩＩを用いて転写を行う工程を含む、ｓｈＲＮＡ前駆体の産生方法。
【請求項１８】
前記転写をインビボで行う、請求項１７記載のｓｈＲＮＡ前駆体の産生方法。
【請求項１９】
請求項１７又は１８記載の方法により産生された、ｓｈＲＮＡ前駆体。
【請求項２０】
以下のｉ）−ｉｉｉ）
ｉ）Ｄｒｏｓｈａ認識部位を含むＤｒｏｓｈａ認識第一領域；
ｉｉ）ｓｈＲＮＡ形成領域；及び
ｉｉｉ）Ｄｒｏｓｈａ認識部位を含むＤｒｏｓｈａ認識第二領域
を含む、ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）前駆体であって、
ここにおいて、ｉｉ）のｓｈＲＮＡ形成領域は、ａ）ＲＮＡ干渉の標的となる標的遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と相同な塩基配列であるセンス配列を有するセンス鎖領域、ｂ）塩基特異的ＲＮａｓｅで切断されるループ配列を有するループ領域、及びｃ）標的遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と相同な塩基配列であるセンス配列と相補的なアンチセンス配列を有するアンチセンス領域、からなる
ｓｈＲＮＡ前駆体。
【請求項２１】
ｉｉ−ａ）のセンス配列と、ｉｉ−ｃ）のアンチセンス配列とが、ｉｉ−ｂ）のループ配列を介して、分子内二本鎖を形成している、請求項２０に記載のｓｈＲＮＡ前駆体。
【請求項２２】
ヒトのｐｒｉ−ｍＲＮＡ構造を構成している、請求項２０又は２１に記載のｓｈＲＮＡ前駆体。
【請求項２３】
天然に存在するヌクレオチド及び／又は天然に存在しないヌクレオチドから構成される、請求項２０ないし２２のいずれか１つに記載のｓｈＲＮＡ前駆体。
【請求項２４】
合計塩基数が、１００塩基ないし４００塩基である、請求項２０ないし２３のいずれか１つに記載のｓｈＲＮＡ前駆体。
【請求項２５】
ｉｉ−ａ）のセンス配列は、前記標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、下記（１）〜（４）の規則：
（１）３’末端の塩基が、アデニン、チミン又はウラシルである；
（２）５’末端の塩基が、グアニン又はシトシンである；
（３）３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる一種又は二種以上の塩基がリッチである；そして
（４）塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である
に従う規定配列と、相同な塩基配列である、請求項２０ないし２４のいずれか１つに記載のｓｈＲＮＡ前駆体。
【請求項２６】
前記規則（４）において、塩基数が１３〜２８である、請求項２５記載のｓｈＲＮＡ前駆体。
【請求項２７】
前記標的遺伝子の前記規定配列が、さらに下記（５）の規則：
（５）被検体の全遺伝子配列のうち、前記標的遺伝子以外の他の遺伝子の塩基配列中に、当該規定配列と９０％以上の同一性を有する配列が含まれない
に従う配列である、請求項２５又は２６記載のｓｈＲＮＡ前駆体。
【請求項２８】
ｉｉ−ｂ）のループ配列の、３’末端がグアニンであり５’末端がシトシンであるか、又は、前記ループ配列の３’末端がシトシンであり５’末端がグアニンである、請求項２０ないし２７のいずれか１つに記載のｓｈＲＮＡ前駆体。
【請求項２９】
ｉｉ−ｂ）のループ配列の塩基数が、約３〜３０塩基である、請求項２０ないし２８のいずれか１つに記載のｓｈＲＮＡ前駆体。
【請求項３０】
請求項１６に記載の発現ベクター、又は、請求項２０ないし２９のいずれか１つに記載のｓｈＲＮＡ前駆体を含む、医薬組成物。
【請求項３１】
請求項１６に記載の発現ベクター、又は、請求項２０ないし２９のいずれか１つに記載のｓｈＲＮＡ前駆体を、発現を抑制しようとする標的遺伝子の発現系に導入し、当該標的遺伝子の発現を抑制する、遺伝子発現抑制方法。
【請求項３２】
遺伝子発現抑制が、コンディショナルターゲッティング法によって調節される、請求項３１に記載の遺伝子発現抑制方法。
【請求項３３】
請求項１６に記載の発現ベクター、又は、請求項２０ないし２９のいずれか１つに記載のｓｈＲＮＡ前駆体を含む、標的遺伝子の発現抑制方法に使用するためのキット。
【請求項３４】
請求項１６に記載の発現ベクター、又は、請求項２０ないし２９のいずれか１つに記載のｓｈＲＮＡ前駆体が導入された、形質転換体。
【請求項３５】
細胞、組織、器官、及び個体からなる群から選択される、請求項３４に記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）前駆体を産生するための核酸、特に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写系プロモーター（以下、ｐｏｌＩＩ系プロモーターと呼ぶ）を利用した転写合成によりｓｈＲＮＡ前駆体を産生することができる核酸、並びに当該核酸の利用に関する。当該核酸されたｓｈＲＮＡ前駆体は、ＲＮａｓｅによって切断され、ｓｈＲＮＡ、さらに、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ＲＮＡｉ）を引き起こすことが可能なポリヌクレオチド（以下、「ｓｉＲＮＡ」と呼ぶことがある）へと加工される。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉
細胞、組織又は個体内の標的遺伝子の発現抑制方法のひとつとして、これらに二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）を導入し、標的遺伝子の所定塩基配列に相同なｍＲＮＡの分解を促進する方法がある。かかる方法では、結果的に、ｍＲＮＡの鋳型となる前記標的遺伝子の発現を抑制することができる。このようなｄｓＲＮＡによる発現抑制は、「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ＲＮＡｉ）」と呼ばれる。
【０００３】
Ｆｉｒｅ等は、標的遺伝子と相同なＲＮＡ及びそれと相補的なＲＮＡからなる５０塩基以上のｄｓＲＮＡを線虫の細胞にトランスフェクト（導入）すると、標的遺伝子の発現抑制（すなわちＲＮＡ干渉）が生じることを報告している（例えば、非特許文献１、特許文献１参照。）。また、Ｔｕｓｃｈｌ等は、Ｆｉｒｅ等の提唱した長鎖のｄｓＲＮＡがインターフェロン応答を生じるため哺乳動物細胞に導入困難である点に鑑み、２１〜２３塩基数のｄｓＲＮＡを哺乳動物細胞にトランスフェクトし、それにより、インターフェロン応答を生じさせることなくＲＮＡ干渉を起こすことを報告している（例えば、特許文献２、非特許文献２、非特許文献３参照）。
【０００４】
ＲＮＡ干渉を起こすこの短いｄｓＲＮＡは、ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ（以下、ｓｉＲＮＡと表記する）と呼ばれる。詳細には、ｓｉＲＮＡは、２１−２３塩基対からなる小さな二本鎖ＲＮＡである。ＲＮＡｉの引き金分子となる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が長い場合、このＲＮＡはまずｓｉＲＮＡへとＤｉｃｅｒによって変換され、ｓｉＲＮＡ自身もＲＮＡｉをひきおこすことができる。ＲＮＡｉの過程において二本鎖ｓｉＲＮＡが一本鎖へと変換される。その後、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）というタンパク質に取り込まれ、配列特異的に標的ＲＮＡを認識する役割を果たす。標的ｍＲＮＡは、ＲＩＳＣ中のヌクレアーゼによって切断・分解される。
【０００５】
ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉は、遺伝子機能の同定や、有用物質生産に適した細胞株のスクリーニング等、種々の用途に利用可能である。特に、ｓｉＲＮＡは、哺乳動物細胞への導入が可能であることから、遺伝子機能解析、創薬開発等において有用性が高い。
【０００６】
ｍｉＲＮＡによる翻訳抑制機構
近年は、ｓｉＲＮＡと類似する作用機序を有するものとして、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）による遺伝子発現抑制機構が注目されている。ｍｉＲＮＡは、機能性ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡの中に見出される分子群で、約２１−２３塩基からなり、時空間特異的に生体内に発現し、翻訳抑制などを行うとされている。
【０００７】
ｍｉＲＮＡの作用機構は、おおまかに核内プロセシング（ステップ１）、細胞質内プロセシング（ステップ２）、ＲＩＳＣへの取り込み（ステップ３）、標的ｍＲＮＡの認識と翻訳抑制（ステップ４）の４つのステップに分けることができる。詳細には、始めに転写される塩基数十−数百のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、塩基対のミスマッチを含む複数（時としては単数）のヘアピン構造からなる。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡはＤｒｏｓｈａにより３’末端が２塩基突出した約７０−８０塩基のヘアピン構造状ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡへと変換され（ステップ１）、さらにＤｉｃｅｒによりｍｉＲＮＡ二本鎖へと切断され、さらに成熟型ｍｉＲＮＡへと変換される（ステップ２）。成熟型ｍｉＲＮＡを取り込んだＲＩＳＣは（ステップ３）、ｍｉＲＮＡをガイド分子として、標的ｍＲＮＡへと導かれ作用する。ｍｉＲＮＡ−ＲＩＳＣは、標的ｍＲＡＮの翻訳を配列特異的に阻害する機能や、ｓｉＲＮＡ様の標的ｍＲＮＡの切断・分解による遺伝子サイレンシングを引き起こす機能を有すると考えられてる。
【０００８】
なお、ｍｉＲＮＡ−ＲＩＳＣとｓｉＲＮＡ−ＲＩＳＣと遺伝子発現（転写、翻訳を含む）抑制機能の相違点は明確に区別されていない。本願の特許請求の範囲及び明細書において、「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）」と記載した場合には、特に明記しない限り、標的ｍＲＡＮの配列特異的な翻訳阻害と、標的ｍＲＮＡの切断・分解による遺伝子発現抑制阻害（狭義のＲＮＡｉ）の双方を含む、広い意味で用いられる。また、本願の特許請求の範囲及び明細書において、「ｓｉＲＮＡ」とは、特に明記しない限りｍｉＲＮＡを含む、広い意味で使用される。
【０００９】
ｍｉＲＮＡは、本願出願時の２００５年において、ヒトで２００−３００種類程度知られている。ショウジョウバエでも１００種類以上知られている。さらに、マウス、植物などからも新たなｍｉＲＮＡの存在が報告されている。
【００１０】
ｓｉＲＮＡの作製方法
ｓｉＲＮＡの作製には、化学合成による方法及び酵素合成による方法がある。例えば、酵素合成によるｓｉＲＮＡ作製方法では、鋳型の塩基配列からＲＮＡポリメラーゼを用いてｓｉＲＮＡを転写合成する（例えば、特許文献３参照。）。図１５は、ＲＮＡポリメラーゼを用いたｓｉＲＮＡの作製方法の一例を説明するための図である。
【００１１】
図１５に示すように、ＲＮＡポリメラーゼを用いる従来のｓｉＲＮＡ作製方法５００では、短鎖のＲＮＡの転写合成に適したＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ系（以下、「ｐｏｌＩＩＩ系」と呼ぶ）が用いられる。ｐｏｌＩＩＩ系によるｓｉＲＮＡの転写合成系では、転写制御配列であるｐｏｌＩＩＩ系のプロモーター（以下、「ｐｏｌＩＩＩ系プロモーター」と呼ぶ）領域５０１と、ｓｈＲＮＡ形成領域５０２と、を含むポリヌクレオチドが鋳型として用いられる。ｓｈＲＮＡ形成領域５０２は、センス鎖領域５０３と、ループ領域５０４と、アンチセンス鎖領域５０５と、ポリＴを含む終了シグナル領域とが５’から３’方向にこの順で配置されて構成される。
【００１２】
ｐｏｌＩＩＩ系プロモーター領域５０１に含まれるｐｏｌＩＩＩ系プロモーターとしては、例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、Ｔ７プロモーター等が用いられる。これらのプロモーターは、短鎖のＲＮＡを効率良く転写でき、ｐｏｌＩＩ系プロモーターを用いる場合に比べて転写量が多い。センス鎖領域５０３は、ＲＮＡ干渉の対象となる標的遺伝子の所定塩基配列と相同な配列（以下、「センス配列」と呼ぶ）を含んでおり、また、アンチセンス鎖領域５０５は、センス配列と相補的な配列（以下、「アンチセンス配列」と呼ぶ）を含んでいる。ループ領域５０４は、センス鎖領域５０３とアンチセンス鎖領域５０５との間に介在する所定塩基配列である。終了シグナル領域は、転写終了のシグナルを付与する配列を有し、ここでは４塩基数以上のＴを含んで構成される。
【００１３】
かかるポリヌクレオチドを鋳型とする転写合成では、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーター領域５０１の下流（３’側）に配置されたセンス鎖領域５０３の５’方向から３’  方向に向かって転写が行われる。図中の丸印は、ｓｈＲＮＡ形成領域５０２における転写開始位置を示している。転写は、さらにループ５０４領域、アンチセンス鎖領域５０５、及び終了シグナル領域（詳細には、当該領域の２つめのＴ）に至るまで連続して行われ、これら領域の５’方向から３’  方向に向かって進む。このような転写により、鋳型のポリヌクレオチドの塩基配列（センス配列）に相同な塩基配列を含むセンス鎖領域５０３ａと、ループ領域５０４ａと、当該塩基配列に相補的な塩基配列（アンチセンス配列）を含むアンチセンス鎖領域５０５ａとを含む、一本鎖のＲＮＡ５０６（ｓｈＲＮＡ前駆体）が合成される。
【００１４】
この一本鎖のＲＮＡ５０６は、ループ領域５０４ａがループ構造を形成し、当該ループ領域５０４ａを介して、センス鎖領域５０３ａとアンチセンス鎖領域５０５ａとが相補結合して二本鎖を形成する。それにより、ヘアピン構造を有するショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）５０７が形成される。
【００１５】
このようにして得られたｓｈＲＮＡ５０７は、ＲＮａｓｅＩＩＩ系の塩基特異的ＲＮＡ切断酵素であるＤｉｃｅｒ５０８によってセンス鎖領域５０３ａおよびアンチセンス鎖領域５０５ａの所定部位で切断され、それにより、ループ領域５０４ａが除去される。その結果、センス鎖領域５０３ａとアンチセンス鎖領域５０５ａとで二本鎖が形成されてなるｓｉＲＮＡ５０９が得られる。
【００１６】
ｓｈＲＮＡ５０７が中間体として形成される上記のｓｉＲＮＡ５０９の合成では、例えば、鋳型のポリヌクレオチドを導入したプラスミドベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトし、核内における転写合成によってｓｈＲＮＡ及びｓｉＲＮＡを形成する。このようにして核内で得られたｓｉＲＮＡ５０９は、核から細胞質に移動し、細胞質内でＲＮＡ干渉を引き起こす。
【００１７】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ及びｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを用いる上記の酵素合成では、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターの特性に鑑み、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーター領域５０１に続くセンス鎖領域５０３の転写開始位置の塩基配列が特定される。具体的には、センス鎖領域５０３の５’側末端の塩基配列がＡ又はＧに限定される。それゆえ、合成により取得されるｓｉＲＮＡ５０９の塩基配列は、かかるプロモーター特性により塩基配列の制限を受ける。すなわち、この場合には、鋳型ポリヌクレオチドのセンス鎖領域５０３の５’側末端がＡ又はＧとなり、よって、転写合成により取得されるｓｉＲＮＡ５０９のセンス鎖５０３ａの５’側末端は、必ずＡ又はＧに限定される。
【００１８】
ここで、ｓｉＲＮＡ５０９によるＲＮＡ干渉では、ｓｉＲＮＡ５０９の塩基配列、特に、５’及び３’末端の塩基配列がＲＮＡ干渉効果に大きな影響を及ぼす。したがって、上記のようなプロモーター特性による塩基配列の制限は、ｓｉＲＮＡ５０９の配列設計に制約を与える。その結果、ＲＮＡ干渉効果の高いｓｉＲＮＡ５０９の設計が自由にできず、また、かかる制約によりＲＮＡ干渉効果が低減するおそれがある。さらに、かかる制約は、ＲＮＡ干渉効果だけでなく、例えば、転写合成系へ薬剤による転写調節システムを適用する場合等において制約を与えるおそれがある。
【００１９】
また、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターによる転写合成の別の制約として、鋳型ポリヌクレオチドの塩基配列中に４塩基以上の連続するＴが存在すると、当該領域で転写が終了する。したがって、センス鎖領域５０３、ループ領域５０４及びアンチセンス鎖領域５０５は、このようなＴの連続配列を含まないという制約を受け、ｓｉＲＮＡの配列設計の自由度がさらに狭まる。
【００２０】
一方、Ｕ６やＨ１等のｐｏｌＩＩＩ系プロモーターは、構成型呼ばれる、全ての組織で活性な非特異的なプロモーターである。それゆえ、組織特異的な遺伝子改変体の作製への適用は困難である。ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを含む発現ベクターを用いて特定の組織における遺伝子発現を抑制しようとすると、当該特定の組織に発現ベクターを直接導入（トランスフェクション）するか、あるいは、発現ベクターを体外で細胞に導入した後に十分な抑制効果が得られた細胞を当該特定の組織に移植する等の必要がある。しかしながら、これらの方法では、導入効率が低く、また、方法を適用可能な組織や細胞の種類が限定されるという制約を受ける。さらに、発現ベクター導入に伴う遺伝子発現抑制によって胎生致死が引き起こされる場合があり、目的とする成体が得られないことがある。これらの点から、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターでは、遺伝子改変体の実現は困難である。
【００２１】
【特許文献１】特表２００２−５１６０６２
【特許文献２】特表２００３−５２９３７４
【特許文献３】特開２００４−２６１００２号公報
【非特許文献１】Ｆｉｒｅ  Ａ．ら，１９９８年，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，  ｐ．ｐ．８０６−８１１
【非特許文献２】Ｔｕｓｃｈｌ  Ｔ．ら，１９９９年，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １３，  ｐ．ｐ．３１９１−３１９７
【非特許文献３】Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．ら，２００１年，Ｎａｔｕｒｅ  ４１１，ｐ．ｐ．４９４−４９８
【非特許文献４】実験医学  Ｖｏｌ．２２  Ｎｏ．１７（増刊）  ２００４
【非特許文献５】別冊  実験医学  ザ・プロトコールシリーズ  「ジーンターデティングの最新技術」（２０００年、羊土社）コンディショナルターゲティング法ｐ．１１５−１２０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明は、ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）前駆体を産生するための核酸を提供することを目的とする。本発明の核酸は、以下の成分；
１）ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系プロモーター；並びに
２）以下のｉ）−ｉｉｉ）からなるｓｈＲＮＡ前駆体コード領域
ｉ）Ｄｒｏｓｈａ認識部位を含むＤｒｏｓｈａ認識第一領域；
ｉｉ）ｓｈＲＮＡ形成領域；及び
ｉｉｉ）Ｄｒｏｓｈａ認識部位を含むＤｒｏｓｈａ認識第二領域
を含み、
ここにおいて、２−ｉｉ）のｓｈＲＮＡ形成領域は、ａ）ＲＮＡ干渉の標的となる標的遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と相同な塩基配列であるセンス配列をコードするセンス鎖領域、ｂ）塩基特異的ＲＮａｓｅで切断されるループ配列をコードするループ領域、及びｃ）標的遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と相同な塩基配列であるセンス配列と相補的なアンチセンス配列をコードするアンチセンス領域、からなる。
【００２３】
本発明の核酸において、好ましくは、２）ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域は、ヒトのｐｒｉ−ｍＲＮＡ構造をコードする。好ましくは、２）ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域の合計塩基数が、１００塩基ないし４００塩基である。
【００２４】
本発明の一態様において、２−ｉｉ−ａ）のセンス鎖領域がコードするセンス配列は、前記標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、下記（１）〜（４）の規則：
（１）３’末端の塩基が、アデニン、チミン又はウラシルである；
（２）５’末端の塩基が、グアニン又はシトシンである；
（３）３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる一種又は二種以上の塩基がリッチである；そして
（４）塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である
に従う規定配列と、相同な塩基配列である。
【００２５】
本発明の一態様において、前記標的遺伝子の前記規定配列は、さらに下記（５）の規則：
（５）被検体の全遺伝子配列のうち、前記標的遺伝子以外の他の遺伝子の塩基配列中に、当該規定配列と９０％以上の同一性を有する配列が含まれない
に従う配列である。
【００２６】
本発明の核酸はまた、一態様において、コンディショナルターゲティング法に適用される塩基配列をさらに含む。好ましくは、前記コンディショナルターゲティング法に適用される塩基配列は、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムに利用されるｌｏｘＰ及び／又は誘導型プロモーターである。
【００２７】
本発明はまた、本発明の核酸を含む、発現ベクターを提供することを目的とする。
本発明はさらに、ｓｈＲＮＡ前駆体の産生方法を提供することを目的とする。本発明の方法は、本発明の核酸を鋳型として、ＲＮＡポリメラーゼＩＩを用いて転写を行う工程を含む。本発明は、当該当該方法により産生されたｓｈＲＮＡ前駆体も提供する。
【００２８】
本発明はさらにまた、新規なｓｈＲＮＡ前駆体を提供することを目的とする。本発明のｓｈＲＮＡ前駆体は、以下のｉ）−ｉｉｉ）
ｉ）Ｄｒｏｓｈａ認識部位を含むＤｒｏｓｈａ認識第一領域；
ｉｉ）ｓｈＲＮＡ形成領域；及び
ｉｉｉ）Ｄｒｏｓｈａ認識部位を含むＤｒｏｓｈａ認識第二領域
を含む、ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）前駆体であって、
ここにおいて、ｉｉ）のｓｈＲＮＡ形成領域は、ａ）ＲＮＡ干渉の標的となる標的遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と相同な塩基配列であるセンス配列を有するセンス鎖領域、ｂ）塩基特異的ＲＮａｓｅで切断されるループ配列を有するループ領域、及びｃ）標的遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と相同な塩基配列であるセンス配列と相補的なアンチセンス配列を有するアンチセンス領域、からなる。
【００２９】
本発明のｓｈＲＮＡ前駆体は、一態様において、ｉｉ−ａ）のセンス配列と、ｉｉ−ｃ）のアンチセンス配列とが、ｉｉ−ｂ）のループ配列を介して、分子内二本鎖を形成している
本発明はまた、本発明の発現ベクター又はｓｈＲＮＡ前駆体を含む、医薬組成物を提供することを目的とする。
【００３０】
本発明はさらに、遺伝子発現抑制方法を提供することを目的とする。本発明の方法は、本発明の発現ベクター又はｓｈＲＮＡ前駆体を発現を抑制しようとする標的遺伝子の発現系に導入し、当該標的遺伝子の発現を抑制する、ことを含む。遺伝子発現抑制は、好ましくはコンディショナルターゲッティング法によって調節される。
【００３１】
本発明はさらにまた、本発明の発現ベクター又はｓｈＲＮＡ前駆体を含む、標的遺伝子の発現抑制方法に使用するためのキットを提供することを目的とする。
本発明はまた、本発明の発現ベクター又はｓｈＲＮＡ前駆体が導入された、形質転換体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を進め、本発明を想到した。よって、本発明は、ＲＮＡ干渉効果が高いＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）を高効率で産生するための方法、及び当該方法に使用するための核酸を提供する。また、本発明は、遺伝子発現抑制を容易に適宜所望に制御することが可能なＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドを提供する。
【００３３】
本発明は、非限定的に以下の態様を含む。
［１］
ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）前駆体を産生するための核酸であって、
以下の成分；
１）ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系プロモーター；並びに
２）以下のｉ）−ｉｉｉ）からなるｓｈＲＮＡ前駆体コード領域
ｉ）Ｄｒｏｓｈａ認識部位を含むＤｒｏｓｈａ認識第一領域；
ｉｉ）ｓｈＲＮＡ形成領域；及び
ｉｉｉ）Ｄｒｏｓｈａ認識部位を含むＤｒｏｓｈａ認識第二領域
を含み、
ここにおいて、２−ｉｉ）のｓｈＲＮＡ形成領域は、ａ）ＲＮＡ干渉の標的となる標的遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と相同な塩基配列であるセンス配列をコードするセンス鎖領域、ｂ）塩基特異的ＲＮａｓｅで切断されるループ配列をコードするループ領域、及びｃ）標的遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と相同な塩基配列であるセンス配列と相補的なアンチセンス配列をコードするアンチセンス領域、からなる
前記核酸。
【００３４】
［２］
２）ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域が、ヒトのｐｒｉ−ｍＲＮＡ構造をコードする、態様１の核酸。
【００３５】
［３］
天然に存在するヌクレオチド及び／又は天然に存在しないヌクレオチドから構成される、態様１又は２の核酸。
【００３６】
［４］
２）ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域の合計塩基数が、１００塩基ないし４００塩基である、態様１ないし３のいずれか１つの核酸。
【００３７】
［５］
２−ｉｉ−ａ）のセンス鎖領域がコードするセンス配列は、前記標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、下記（１）〜（４）の規則：
（１）３’末端の塩基が、アデニン、チミン又はウラシルである；
（２）５’末端の塩基が、グアニン又はシトシンである；
（３）３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる一種又は二種以上の塩基がリッチである；そして
（４）塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である
に従う規定配列と、相同な塩基配列である、態様１１〜４のいずれか１つの核酸。
【００３８】
［６］
前記規則（４）において、塩基数が１３〜２８である、態様５の核酸。
【００３９】
［７］
前記標的遺伝子の前記規定配列が、さらに下記（５）の規則：
（５）被検体の全遺伝子配列のうち、前記標的遺伝子以外の他の遺伝子の塩基配列中に、当該規定配列と９０％以上の同一性を有する配列が含まれない
に従う配列である、態様５又は６の核酸。
【００４０】
［８］
２−ｉｉ−ｂ）のループ領域によってコードされるループ配列の、３’末端がグアニンであり５’末端がシトシンであるか、又は、前記ループ配列の３’末端がシトシンであり５’末端がグアニンである、態様１ないし７のいずれか１つの核酸。
【００４１】
［９］
２−ｉｉ−ｂ）のループ領域によってコードされるループ配列の塩基数が、約３〜３０塩基である、態様１ないし８のいずれか１つの核酸。
【００４２】
［１０］
２−ｉｉ）−ｃ）のアンチセンス鎖領域は、コードするアンチセンス配列の３’末端にオーバーハング配列を与える塩基配列を含む、態様１ないし９のいずれか１つの核酸。
【００４３】
［１１］
コンディショナルターゲティング法に適用される塩基配列をさらに含む、態様１ないし１０のいずれか１つの核酸。
【００４４】
［１２］
前記コンディショナルターゲティング法に適用される塩基配列が、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムに利用されるｌｏｘＰ及び／又は誘導型プロモーターである、態様１１の核酸。
【００４５】
［１３］
以下のＩないしＩＶのいずれかの構造を有する、態様１２の核酸：
Ｉ）  ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系プロモーター  −  ｌｏｘＰ  −  発現が制御される任意配列領域  −  ｌｏｘＰ  −  ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域；
ＩＩ）  ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系プロモーター  −  ｌｏｘＰ  −  ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域−  ｌｏｘＰ  −  発現が制御される任意配列領域；
ＩＩＩ）  逆位の発現が制御される任意配列領域  −  ｌｏｘＰ  −  逆位ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系プロモーター  −  逆位ｌｏｘＰ  −  ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域；又は
ＩＶ）  ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域  −  逆位ｌｏｘＰ  −  ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系プロモーター  −  ｌｏｘＰ  −逆位の発現が制御される任意配列領域。
【００４６】
［１４］
発現が制御される任意配列領域が、標識配列領域又は第二のｓｈＲＮＡ前駆体コード領域である、態様１３の核酸。
【００４７】
［１５］
二本鎖である、態様１ないし１４のいずれか１つの核酸。
【００４８】
［１６］
態様１ないし１５のいずれか１つの核酸を含む、発現ベクター。
【００４９】
［１７］
態様１ないし１５のいずれか１つの核酸を鋳型として、ＲＮＡポリメラーゼＩＩを用いて転写を行う工程を含む、ｓｈＲＮＡ前駆体の産生方法。
【００５０】
［１８］
前記転写をインビボで行う、態様１７のｓｈＲＮＡ前駆体の産生方法。
【００５１】
［１９］
態様１７又は１８の方法により産生された、ｓｈＲＮＡ前駆体。
【００５２】
［２０］
以下のｉ）−ｉｉｉ）
ｉ）Ｄｒｏｓｈａ認識部位を含むＤｒｏｓｈａ認識第一領域；
ｉｉ）ｓｈＲＮＡ形成領域；及び
ｉｉｉ）Ｄｒｏｓｈａ認識部位を含むＤｒｏｓｈａ認識第二領域
を含む、ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）前駆体であって、
ここにおいて、ｉｉ）のｓｈＲＮＡ形成領域は、ａ）ＲＮＡ干渉の標的となる標的遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と相同な塩基配列であるセンス配列を有するセンス鎖領域、ｂ）塩基特異的ＲＮａｓｅで切断されるループ配列を有するループ領域、及びｃ）標的遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と相同な塩基配列であるセンス配列と相補的なアンチセンス配列を有するアンチセンス領域、からなる
ｓｈＲＮＡ前駆体。
【００５３】
［２１］
ｉｉ−ａ）のセンス配列と、ｉｉ−ｃ）のアンチセンス配列とが、ｉｉ−ｂ）のループ配列を介して、分子内二本鎖を形成している、態様２０のｓｈＲＮＡ前駆体。
【００５４】
［２２］
ヒトのｐｒｉ−ｍＲＮＡ構造を構成している、態様２０又は２１のｓｈＲＮＡ前駆体。
【００５５】
［２３］
天然に存在するヌクレオチド及び／又は天然に存在しないヌクレオチドから構成される、態様２０ないし２２のいずれか１つのｓｈＲＮＡ前駆体。
【００５６】
［２４］
合計塩基数が、１００塩基ないし４００塩基である、態様２０ないし２３のいずれか１つのｓｈＲＮＡ前駆体。
【００５７】
［２５］
ｉｉ−ａ）のセンス配列は、前記標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、下記（１）〜（４）の規則：
（１）３’末端の塩基が、アデニン、チミン又はウラシルである；
（２）５’末端の塩基が、グアニン又はシトシンである；
（３）３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる一種又は二種以上の塩基がリッチである；そして
（４）塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である
に従う規定配列と、相同な塩基配列である、態様２０ないし２４のいずれか１つのｓｈＲＮＡ前駆体。
【００５８】
［２６］
前記規則（４）において、塩基数が１３〜２８である、態様２５のｓｈＲＮＡ前駆体。
【００５９】
［２７］
前記標的遺伝子の前記規定配列が、さらに下記（５）の規則：
（５）被検体の全遺伝子配列のうち、前記標的遺伝子以外の他の遺伝子の塩基配列中に、当該規定配列と９０％以上の同一性を有する配列が含まれない
に従う配列である、態様２５又は２６のｓｈＲＮＡ前駆体。
【００６０】
［２８］
ｉｉ−ｂ）のループ配列の、３’末端がグアニンであり５’末端がシトシンであるか、又は、前記ループ配列の３’末端がシトシンであり５’末端がグアニンである、態様２０ないし２７のいずれか１つのｓｈＲＮＡ前駆体。
【００６１】
［２９］
ｉｉ−ｂ）のループ配列の塩基数が、約３〜３０塩基である、態様２０ないし２８のいずれか１つのｓｈＲＮＡ前駆体。
【００６２】
［３０］
態様１６の発現ベクター、又は、態様２０ないし２９のいずれか１つのｓｈＲＮＡ前駆体を含む、医薬組成物。
【００６３】
［３１］
態様１６の発現ベクター、又は、態様２０ないし２９のいずれか１つのｓｈＲＮＡ前駆体を、発現を抑制しようとする標的遺伝子の発現系に導入し、当該標的遺伝子の発現を抑制する、遺伝子発現抑制方法。
【００６４】
［３２］
遺伝子発現抑制が、コンディショナルターゲッティング法によって調節される、態様３１の遺伝子発現抑制方法。
【００６５】
［３３］
態様１６の発現ベクター、又は、態様２０ないし２９のいずれか１つのｓｈＲＮＡ前駆体を含む、標的遺伝子の発現抑制方法に使用するためのキット。
【００６６】
［３４］
態様１６の発現ベクター、又は、態様２０ないし２９のいずれか１つのｓｈＲＮＡ前駆体が導入された、形質転換体。
【００６７】
［３５］
細胞、組織、器官、及び個体からなる群から選択される、態様３４の形質転換体。
【００６８】
１．ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）前駆体を産生するための核酸
よって、本発明はショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）前駆体を産生するための核酸を提供する。本発明の核酸は、以下の成分；
１）ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系プロモーター；並びに
２）以下のｉ）−ｉｉｉ）からなるｓｈＲＮＡ前駆体コード領域
ｉ）Ｄｒｏｓｈａ認識部位を含むＤｒｏｓｈａ認識第一領域；
ｉｉ）ｓｈＲＮＡ形成領域；及び
ｉｉｉ）Ｄｒｏｓｈａ認識部位を含むＤｒｏｓｈａ認識第二領域
を含み、
ここにおいて、２−ｉｉ）のｓｈＲＮＡ形成領域は、ａ）ＲＮＡ干渉の標的となる標的遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と相同な塩基配列であるセンス配列をコードするセンス鎖領域、ｂ）塩基特異的ＲＮａｓｅで切断されるループ配列をコードするループ領域、及びｃ）標的遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と相同な塩基配列であるセンス配列と相補的なアンチセンス配列をコードするアンチセンス領域、からなる
ものである（態様１）。
【００６９】
本発明において、「ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）」とは、５’から３’に向かって、センス鎖領域−ループ領域−センス鎖と相補性を有する領域からなるアンチセンス鎖領域、を含む構造を有する、好ましくは長さ約５０ないし７０マー程度のＲＮＡで、センス鎖領域とアンチセンス鎖領域が塩基対を形成して、ヘアピン構造を形成しているもの若しくはヘアピン構造を形成しうるものを意味する。
【００７０】
「ｓｈＲＮＡ前駆体」とは、ＲＮＡヌクレアーゼによって切断される付加的な配列（例：Ｄｒｏｓｈａ認識第一領域及び同第二領域）を含む、ｓｈＲＮＡが形成される前の前駆体を意味する。
【００７１】
本明細書において「核酸」とは、一般に、１より多くのヌクレオチドが、５’→３’の方向に結合した核酸鎖の分子を意味する。本発明の核酸は、一本鎖又は二本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡを含む。二本鎖は、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ、又はＤＮＡ／ＲＮＡであってもよい。また、ＤＮＡには、ＲＮＡを鋳型として逆転写してなるｃＤＮＡも含まれる。好ましくは二本鎖（態様１５）、より好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００７２】
本発明の核酸は、ｓｈＲＮＡを産生するための核酸であって、１）ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系プロモーター；並びに２）以下のｉ）−ｉｉｉ）からなるｓｈＲＮＡ前駆体コード領域を含む。
【００７３】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系プロモーター
ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写系プロモーター（ｐｏｌＩＩ系プロモーター）領域は、一般に用いられる通常のｐｏｌＩＩ系プロモーターであれば特に限定されず、公知のものを使用可能である。かかるｐｏｌＩＩ系プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識可能であり、かつ、好ましくは組織や細胞に特異的なプロモーターである。ｐｏｌＩＩ系プロモーターは、誘導性プロモーターであっても、恒常性プロモーターであってもよい。好ましくは、誘導性プロモーターである。例えば、ｐｏｌＩＩ系プロモーターとして、当業者に周知のＣＭＶプロモーター、ＴＲＥプロモーターが用いられる。これらのプロモーターは、市販のベクターやキット（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の「Ｔ−ＲＥｘ（登録商標）システム」や、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社の「Ｔｅｔシステム発現ベクター）に用いられているものを利用できる。
【００７４】
ｐｏｌＩＩ系プロモーターは、従来使用されていたｐｏｌＩＩＩ系プロモーターのような転写開始のための塩基配列上の制約を必要としない。したがって、ｐｏｌＩＩ系プロモーターに続く領域（好ましくは、Ｄｒｏｓｈａ認識第一領域）の５’側末端の塩基配列は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれであってもよい。また、ｐｏｌＩＩ系プロモーターでは、本発明の核酸中のｓｈＲＮＡ前駆体コード領域中に４塩基以上の連続したＴが存在してもＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写合成が停止しない。このように、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターではプロモーター特性に起因した塩基配列上の制約がないため、任意の塩基配列を有するｓｈＲＮＡを産生が可能である。
【００７５】
なお、本発明の核酸はｐｏｌＩＩ系プロモーター以外に、エンハンサー等の他の発現制御要素を含んでもよい。
【００７６】
ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域
本発明の核酸中の、ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域は、以下の
ｉ）Ｄｒｏｓｈａ認識部位を含むＤｒｏｓｈａ認識第一領域；
ｉｉ）ｓｈＲＮＡ形成領域；及び
ｉｉｉ）Ｄｒｏｓｈａ認識部位を含むＤｒｏｓｈａ認識第二領域
からなる。
【００７７】
ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域は、ｐｏｌＩＩ系プロモーターが機能可能なように、ｐｏｌＩＩ系プロモーターに連結されている。「機能可能なように」とは、ｐｏｌＩＩ系プロモーターがｓｈＲＮＡ前駆体コード領域の転写を促進しうる態様で、両者が連結されていることを意味する。例えば、ｐｏｌＩＩ系プロモーターの３’の直後にｓｈＲＮＡ前駆体コード領域の５’が連結されていてもよく、あるいは、両者の間に数〜数十塩基程度の介在配列が適宜存在してもよい。介在配列の塩基配列は特に限定されない。
【００７８】
Ｄｒｏｓｈａは、ヒト、マウス、ショウジョウバエ、線虫、イネ科植物等において公知の核内内在性酵素である。Ｄｉｃｅｒと同様、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）結合ドメインとＲＮａｓｅＩＩＩドメインを有し、ヘアピン型構造を有するＲＮＡを切断するＲＮａｓｅ活性を奏する。Ｄｒｏｓｈａは、クラスＩＩのＲＮａｓｅＩＩＩに属し、ＲＩＩＩａとＲＩＩＩｂの２箇所のＲＮａｓｅＩＩＩドメインを有する。いかなる理論にも拘束されるわけではないが、両ドメインがＤｒｏｓｈａ分子内において二量体を形成することによって、２箇所の触媒部位を与え、標的ＲＮＡを２箇所で切断すると考えられている。具体的には、ＲＩＩＩａが３’側でＲＩＩＩｂが５’側で切断する。
【００７９】
本発明の核酸において、ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域中のｉ）Ｄｒｏｓｈａ認識部位を含むＤｒｏｓｈａ認識第一領域、及び、ｉｉｉ）Ｄｒｏｓｈａ認識部位を含むＤｒｏｓｈａ認識第二領域は、後述する本発明の核酸を鋳型として得られた転写産物であるｓｈＲＮＡ前駆体に、２箇所のＤｒｏｓｈａ認識部位を付与する。このようなＤｒｏｓｈａの認識部位が付与されたｓｈＲＮＡ前駆体では、Ｄｒｏｓｈａの作用により、両認識部位間に介在するｓｈＲＮＡ形成領域が切り出される。
【００８０】
Ｄｒｏｓｈａは、ループ構造を有するＲＮＡを認識・切断するが、その認識は標的ＲＮＡのループの構造と大きさが影響すると考えられている。ループ部の長さは、好ましくは１０マー以上、より好ましくは３０マー程度である。そして、Ｄｒｏｓｈａ認識領域の長さは、第一領域及び第二領域を合わせて、好ましくは約３０マーないし約３００マー、より好ましくは、約１００マーないし約２４０マー、さらに好ましくは約２００マーないし約２３０マーである。
【００８１】
Ｄｒｏｓｈａは、Ｄｉｃｅｒよりも基質特異性が高いが、認識配列は具体的に特定されていない。本発明のＤｒｏｓｈａ認識第一領域及び第二領域の塩基配列や塩基数は、同一であっても異なっていてもよく任意に選択可能である。標的ＲＮＡの２箇所の切断部位における５’端／３’端の組み合わせの例は、ｕ／ｇ、ｃ／ｕ、ｇ／ｕ、ｇ／ｃである。よって、切断部位の５’端／３’端におけるａは好ましくない。
【００８２】
また、Ｄｒｏｓｈａは生体内においてＤＧＣＲ８と呼ばれるタンパク質と複合体を形成して標的ＲＮＡに作用することが知られている。ＤＧＣＲ８タンパク質によって、標的タンパク質への作用位置が決められると考えられている。
【００８３】
Ｄｒｏｓｈａ認識第一領域及び第二領域の塩基配列は、本明細書の記載及び当該技術分野の技術常識に基づいて、例えば、ヒトのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの構造を考慮して、適切な配列を適宜選択することが可能である。例えば、ｍｉＲ１８７、ｍｉＲ２３ａ、ｍｉＲ３０ａ、ｍｉＲ２８７、ｍｉＲ３３２、ｍｉＲ１４５、ｍｉＲ２４３等の構造を考慮してＤｒｏｓｈａ認識第一領域及び第二領域の塩基配列を選択してもよい。後述の実施例では、ｍｉＲ１８７様構造を選択して以下の配列を採用した。
【００８４】
Ｄｒｏｓｈａ認識第一領域
ｃａｔｃｇｇｇａｔｇｃａｃａｇｃａａｇｔｃｇｇａｔｔｃｃｃｃ
ａａｇｃａｇａａｇｃｔｇｇｇｃａｇｃｃｃａｃｃｔｇｇａａｇａ
ｇｇａｇｇｃｃａｇｇｃａｇｇｔｇｃｔｇｃａｇｇｔｃｇｇｇｃｔ
ｃａｃｃａｔｇａｃａｃａｇｔｇｔｇａｃｃｃｔｃｃａ
（図７の枠内の配列において、ＢａｍＨ１下流（左端から９塩基目）からセンス鎖領域までの配列に相当；１１５マー）
Ｄｒｏｓｈａ認識第二領域
ｇａｇｇｇａｃｇｃａｇｇｔｃｃｇｃａｇｃａｇａｇｃｃｔｇｃｔ
ｃｃｇｃｔｔｇｔｃｃｔｇａｇｇｇａｃｔｃｇａｃａｃａｇｇｇｇ
ａｃｔｇｃａｃａｇａｇａｃｃａｔｇｇｇａａａｇｔｃｃａｇｇｃ
ｔｃｔｇｇｔｇｇｇ
（図７の枠内の配列において、アンチセンス鎖領域からＸｂａＩまでの配列に相当；９９マー）
【００８５】
上記配列を選択したより具体的な理由は、通常用いられる市販のベクターやプロモーターへの適用が容易であること、また、後述する図７の発現ベクターで詳述するように制限酵素サイトとｓｈＲＮＡ形成領域との相対配置が適切であることなどによる。
【００８６】
Ｄｒｏｓｈａの認識配列は上記に限定されないことは、当業者によって容易に理解されよう。即ち、ＲＮＡ干渉、ｍｉＲＮＡの生成・作用機構の研究は日々進歩しており、当業者は技術常識に基づいて適宜適切なＤｒｏｓｈａ認識配列を選択することが可能である。
【００８７】
本発明の核酸の２）ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域において、２−ｉｉ）のｓｈＲＮＡ形成領域は、ａ）ＲＮＡ干渉の標的となる標的遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と相同な塩基配列であるセンス配列をコードするセンス鎖領域、ｂ）塩基特異的ＲＮａｓｅで切断されるループ配列をコードするループ領域、及びｃ）標的遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と相同な塩基配列であるセンス配列と相補的なアンチセンス配列をコードするアンチセンス領域、からなる。
【００８８】
「ＲＮＡ干渉の標的となる標的遺伝子」は特に限定されず、本発明の核酸を含む発現ベクター又は当該発現ベクターから産生されるｓｈＲＮＡ前駆体若しくはｓｈＲＮＡを導入する、細胞、組織、あるいは個体（以下、これらを総称して「被導入体」と呼ぶ）において、ｍＲＮＡ、ウィルスＲＮＡ及び任意にタンパク質を産出するように翻訳され得るものであれば、如何なる遺伝子であってもよい。具体的には、被導入体の内在性の遺伝子であっても外来性の遺伝子であってもよい。外来性のものとしては、例えば、被導入体に感染可能なウィルス、バクテリア、真菌または原生動物のような病原体由来の遺伝子等が挙げられる。また、標的遺伝子の機能は、既知及び未知のいずれであってもよく、また、他生物の細胞内では機能が既知であるが被導入体内では未知であってもよい。さらに、染色体上に存在する遺伝子でも、染色体外の遺伝子でもよい。
【００８９】
「標的遺伝子」は一つのコード領域から構成されてもよく、あるいは複数のコード領域に渡って構成されてもよい。「標的遺伝子」には、遺伝子自体のみならず転写産物も包含され、また、これらの特定の部分配列であってもよい。「転写産物」は、転写後のスプライシングにより取得される、遺伝子自体には存在しない塩基配列を有してもよい。
【００９０】
標的遺伝子の一例としては、その発現量の変化（増減）又は欠如が疾病の原因となる遺伝子が挙げられる。例えば、白血病、大腸癌、脳腫瘍、肝癌、胃癌、肺癌、膀胱癌、卵巣癌、直腸癌、乳癌、腎臓癌、膵臓癌、口腔癌、甲状腺癌、グリオーマ、メラノーマ、皮膚癌、前立腺癌等に関与する遺伝子や、眼疾患、具体的には緑内障、加齢黄斑変性症等に関与する遺伝子や、アレルギー疾患、具体的には喘息・気道過敏症、アトピー等に関与する遺伝子や、関節リュウマチ等のリュウマチ疾患に関与する遺伝子や、骨粗鬆症等の骨疾患に関与する遺伝子や、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋ジストロフィー等の神経疾患に関与する遺伝子が挙げられる。また、感染症等に関与するウィルスの遺伝子を標的遺伝子としてもよい。
【００９１】
また、例えば、遺伝子オントロジー（Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ）に定義された属性等で示される各種生物学的機能を有する種々の遺伝子を標的遺伝子としてもよい。遺伝子オントロジーについては、例えば、Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、“Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ホームページ”、［ｏｎｌｉｎｅ］、１９９９年、Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、  ［平成１６年１０月２５日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／＞を参照されたい。
【００９２】
遺伝子オントロジーには、例えば、「ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  （ＧＯ：０００４８７１）」「ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  （ＧＯ：０００４８７２）」のような遺伝子の属性が定義されており、さらに「ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙという属性は、ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙという属性を受け継ぐ」というような属性間の継承関係が定義されている。属性の定義および属性間の継承関係は、ジーン・オントロジー・コンソシアム：Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／）より入手可能である。また、ヒトやマウスの各遺伝子と、Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙの属性との対応関係は、キャンサー・ゲノム・アナトミー・プロジェクト：Ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｔｏｍｙ  ｐｒｏｊｅｃｔ（ｈｔｔｐ：／／ｃｇａｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）等各種データベースより入手可能である。遺伝子のＧｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙとの対応データから、例えばヒトＺＹＸ遺伝子（ＮＭ＿００３４６１）はｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙを持つことがわかり、さらに属性間の継承関係を用いて、ＺＹＸ遺伝子は同時にｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙをもつことを導くことができる。
【００９３】
遺伝子オントロジーでは、遺伝子の属性（ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）について、各属性の定義や属性間の継承関係の定義がされている。この遺伝子のオントロジーにおける属性間の継承関係は、非循環有向グラフ（ＤＡＧ）を形成する。遺伝子オントロジーでは、「遺伝子の機能（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」、「生物学的現象（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓ）」、「細胞内局在（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」により遺伝子を分類・整理している。そして、各分類方法において、属性間の継承関係が定義されている。遺伝子オントロジーにおける属性のＩＤ番号がわかれば、当業者は当該番号から各属性の内容を把握することが可能である。
【００９４】
本発明におけるＲＮＡ干渉の標的遺伝子としては、例えば、その発現量の変化（増減）又は欠如が、キナーゼやその活性に関連する遺伝子、Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）やそれに関連する遺伝子、フォスファターゼやその活性に関連する遺伝子、イオンチャンネルに関連する遺伝子、レセプターに関連する遺伝子、アポトーシスに関連する遺伝子、細胞周期に関連する遺伝子、シグナル伝達系に関連する遺伝子、転写制御に関連する遺伝子等を選択することが可能である。
【００９５】
２）−ｉｉ）−ａ）のセンス鎖領域のセンス配列において、「ＲＮＡ干渉の標的となる標的遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と相同な塩基配列」とは、標的遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一な配列を意味する。ここで、「実質的に同一」とは、標的遺伝子の配列と５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の同一性を有することを意味する。ＲＮＡ干渉を生じさせるという機能を失わない範囲であれば、塩基配列の一部に欠失、置換、挿入などの変異を含んでもよい。また、アンチセンス鎖領域のアンチセンス配列について、「センス配列と相補的」とは、センス配列との間でＡとＴ（又はＵ）、ＧとＣの対を形成して結合し得る配列である。
【００９６】
なお、許容される変異の程度としての相同性を算出する場合、同一の検索アルゴリズム用いて算出された数値どうしを比較することが望ましい。検索アルゴリズムは特に限定されないが、局所的な配列の検索に適したものが好適であり、より具体的にはＢＬＡＳＴ、ｓｓｅａｒｃｈなどを好適に用いることができる。
【００９７】
より詳細には、核酸（ポリヌクレオチド）の同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、２つの核酸配列のパーセント同一性は、目視検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マジソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの核酸配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、および非同一物について０の値を含む）一元（ｕｎａｒｙ）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ＳｅｑｕｅｎｃｅおよびＳｔｒｕｃｔｕｒｅ）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６の加重アミノ酸比較マトリックス；または他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；またはヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：および（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、国立医学ライブラリーのウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌｓ．ｈｔｍｌにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎのＳＥＧプログラム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）により決定され；ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ，１９９６「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｂｉａｓｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：５４４−７１も参照されたい）、または、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ＣｌａｖｅｒｉｅおよびＳｔａｔｅｓ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、および（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ−スコア（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。
【００９８】
「ＲＮＡ干渉の標的となる標的遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と相同な塩基配列」として、標的遺伝子配列（又はその一部）にストリンジェントな条件下、例えば、中程度または高程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であり、そして、好ましくは、ＲＮＡ干渉を生じさせる活性を有するポリヌクレオチドを含む。
【００９９】
「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，第６−７章，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃、６×ＳＳＣのハイブリダイゼーション条件を含む。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度および／または低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、約６５℃、６×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣ、好ましくは６×ＳＳＣ、より好ましくは２×ＳＳＣ、最も好ましくは０．２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション）および／または洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、およびおよそ６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間行う。
【０１００】
当業者に知られていて、以下にさらに記載したように、ハイブリダイゼーション反応と二本鎖の安定性を支配する基本原理を適用することによって望ましい度合いのストリンジェンシーを達成するためには、洗浄温度と洗浄塩濃度を必要に応じて調整することが可能であると理解すべきである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１を参照されたい）。核酸を未知配列の標的核酸へハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さはハイブリダイズする核酸のそれであると仮定される。既知配列の核酸をハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さは核酸の配列を並列し、最適な配列相補性をもつ単数または複数の領域を同定することによって決定可能である。５０塩基対未満の長さであることが予測されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５−２５℃低くなければならず、Ｔｍは、以下の等式により決定される。長さ１８塩基対未満のハイブリッドに関して、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基数）。１８塩基対を超える長さのハイブリッドに関しては、Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋４１（モル分率［Ｇ＋Ｃ］）−０．６３（％ホルムアミド）−５００／ｎであり、ここで、Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、そして［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度である（１×ＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。
【０１０１】
２−ｉｉ−ｂ）のループ領域の塩基配列は、核から細胞質へｓｈＲＮＡの移送を効率良く行うことができ、かつ、核内及び細胞質内におけるｓｈＲＮＡの安定性を実現する塩基配列であることが好ましい。ｓｈＲＮＡの核から細胞質への移送にはｅｘｐｏｒｔｉｎ５が関与することから、当該酵素の作用に適した塩基配列構成が好ましいと推定される。限定されるわけではないが、このようなループ領域は、例えば、ヒトのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、具体的にはｍｉＲ３０ａ等のループ配列と同様の塩基配列により実現される。また、ループ領域は、後述するように、塩基特異的ＲＮａｓｅであるＤｉｃｅｒにより切断除去可能な塩基配列を有する必要がある。
【０１０２】
ＤｉｃｅｒがＧ及びＣに特異的であることから、センス鎖領域とループ領域との切断部、及び、ループ領域とアンチセンス鎖領域との切断部は、Ｇ又はＣである。よって、本発明の一態様において、好ましくは、ループ領域によってコードされるループ配列の、３’末端がグアニンであり５’末端がシトシンであるか、又は、前記ループ配列の３’末端がシトシンであり５’末端がグアニンである（態様８）。
【０１０３】
ループ領域によってコードされるループ配列の塩基数は、非限定的に、例えば約３〜３０塩基であることが好ましい（態様９）。より好ましくは１０〜２０、さらに好ましくは１３〜１７塩基数程度である。
【０１０４】
さらに、本発明のｓｈＲＮＡ前駆体は、好ましくは、Ｄｒｏｓｈａ認識第二領域の３’側に、終了シグナル領域を有する。終了シグナル領域は、転写の停止を指示する配列（すなわち、ポリＡシグナル）を規定する、好ましくは４塩基数以上のポリＡ配列から構成される。
【０１０５】
２）のｓｈＲＮＡ前駆体コード領域は、その一態様において好ましくは、ヒトのｐｒｉ−ｍＲＮＡ構造をコードする（態様２）。Ｄｒｏｓｈａは、核内でｐｒｉ−ｍｉＲＮＡに作用してこれを切断し、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの形成に関与する酵素として見出されたＲＮａｓｅ酵素である。本明細書において、ｐｒｉ−ｍＲＮＡとは、タンパク質をコードする遺伝子間にコードされているｍｉＲＮＡ遺伝子の転写産物を意味する。これは、いくつかのｍｉＲＮＡをタンデムに含んでいるものもあれば、１つしかもたないものも含む。
【０１０６】
本発明の一態様において、本発明の核酸は、天然に存在するヌクレオチド及び／又は天然に存在しないヌクレオチドから構成されてよい（態様３）。即ち、本発明の核酸は、天然に存在するヌクレオチドから構成されるものに限定されず、天然には存在しない構成であってもよい。例えば、本発明にかかる核酸は、天然に存在するヌクレオチドを化学修飾した構成であってもよく、また、天然に存在するものの一部が付加、欠失、置換及び／又は変化により改変された構成であってもよい。
【０１０７】
本発明において、ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域の合計塩基数は、Ｄｒｏｓｈａが機能しやすい長さを考慮すると、好ましくは１００ないし１０００塩基程度である。当業者は、本願明細書の記載及び背景技術、又は将来の技術の進歩等に伴い、さらに、ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域の合計塩基数が上記範囲外の場合にも、本願発明を実施することが可能である。より好ましくは、１００ないし４００塩基程度である。
【０１０８】
ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域の合計塩基数は、さらにより好ましくは、例えば、生体内におけるＤｒｏｓｈａとヒトｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの態様を考慮すると、２５０塩基ないし３５０塩基程度である。最も好ましくは、約２７０−３００塩基数程度であり、そのうち、ｓｈＲＮＡ形成領域７が約７０塩基数程度である。例えば、本明細書において後述する実施例では、ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域の合計塩基数が約２７０塩基で（図７）、効率よくＲＮＡｉが観察された。
【０１０９】
限定されるわけではないが、本発明の第５の態様において、２−ｉｉ−ａ）のセンス鎖領域がコードするセンス配列は、前記標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、下記（１）〜（４）の規則：
（１）３’末端の塩基が、アデニン、チミン又はウラシルである；
（２）５’末端の塩基が、グアニン又はシトシンである；
（３）３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる一種又は二種以上の塩基がリッチである；そして
（４）塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である
に従う規定配列と、相同な塩基配列である（態様５）。
【０１１０】
上記（１）−（４）の条件を満たす規定配列と相同な塩基配列を選択することにより、高いＲＮＡ効果のｓｈＲＮＡを作製することが可能となる。
ここで、上記規則において、標的遺伝子の規定配列がＤＮＡの配列であればＴが、ＲＮＡの配列であればＵが対応する。また、（３）における「リッチ」とは、特定の塩基が現れる頻度が高いことを意味しており、割合を概略的に示すと、３’末端側の５〜１０塩基、好ましくは７塩基の配列中にＡ、Ｔ及び／又はＵが少なくとも４０％以上、より好ましくは５０％以上含まれることを意味する。
【０１１１】
また、（４）について、生物の種類等の条件により、塩基数があまりに大きすぎると当該規定配列に対応したｓｉＲＮＡが細胞毒性を生じることが知られている。かかる点を考慮しなければ、規定配列の鎖長はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長までのいずれの長さ（例えば、１９〜５００塩基数の範囲内）であってもよいが、哺乳類動物由来の細胞においては、３０塩基数以上の鎖長を有するｓｉＲＮＡを導入するとインターフェロン応答が生じることが知られている。
【０１１２】
そこで、規定配列の塩基数の上限は、ＲＮＡ干渉を生じさせようとする生物の種類などにより異なるが、いずれの種にせよ３０以下、好ましくは２８以下である。哺乳動物の塩基数にあっては、好ましくは２４以下、より好ましくは２２以下、さらに好ましくは２０以下である。また、下限はＲＮＡ干渉を生じさせるｓｉＲＮＡを取得可能な限りにおいて特に制限されるものではないが、好ましくは１３以上、より好ましくは１５以上、さらにより好ましくは１８以上、より好ましくは２０以上である。
【０１１３】
よって、前記規則（４）において、標的遺伝子の規定配列は塩基数が１３〜２８であることが好ましい（態様６）。
標的遺伝子の規定配列は、かかる上限及び下限をふまえた塩基数であることが特に好ましく、ここでは、例えば１９塩基である。この１９塩基中、（３）の規定に鑑み、規定配列の３’末端側の７塩基のうち好ましくは少なくとも３塩基以上、より好ましくは４塩基以上、特に好ましくは５塩基以上が、Ａ、Ｔ及び／又はＵである。
【０１１４】
上記のような規定配列の塩基数に鑑み、センス鎖領域のセンス配列の塩基数は、哺乳類動物由来の被導入体を用いる場合、１３〜２８、好ましくは１５〜２３、さらに好ましくは１９〜２１塩基数である。また、センス配列と相補的なアンチセンス鎖領域のアンチセンス配列の塩基数についてもセンス配列と同様である。
【０１１５】
センス鎖領域は、センス配列の３’末端にさらにオーバーハング配列を与える塩基配列（オーバーハング部）を含んでもよい。また、アンチセンス鎖領域は、センス配列と相補的なアンチセンス配列の３’末端にさらにオーバーハング配列を与える塩基配列（オーバーハング部）を含んでもよい（態様１０）。オーバーハング部は、センス配列及び／アンチセンス配列の３’末端にさらに１〜５塩基、好ましくは１〜３塩基、さらに好ましくは２塩基配置されて構成される。本発明の実施例１では、センス配列及びアンチセンス配列の３’末端に、２塩基からなるオーバーハング部がそれぞれ設けられている。オーバーハング部を構成する塩基配列については特には限定しない。
【０１１６】
さらに、限定されるわけではないが、センス鎖領域及びアンチセンス鎖領域は、Ｄｒｏｓｈａに次いでＤｉｃｅｒがこれらの領域に作用する部位（即ち、Ｄｉｃｅｒによる切断部位）が本来の設計・予定された位置から仮にずれて作用した場合においても、上記規則を満たす標的遺伝子に対して高いＲＮＡ干渉効果を奏するように配列設計されることが好ましい。それにより、ＲＮＡ干渉効果の高いものの取得率が向上する。例えば、センス鎖領域において、本来の切断部位に位置する塩基に隣接する前後１塩基が、当該本来の切断部位の塩基と同一であることが好ましい。
【０１１７】
なお、上記（１）〜（４）等の規則は、Ｕｉ−Ｔｅｉらによるガイドライン（Ｕｉ−Ｔｅｉ，Ｋ．，Ｎａｉｔｏ，Ｙ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｆ．，Ｈａｒａｇｕｃｈｉ，Ｔ．，Ｏｈｋｉ−Ｈａｍａｚａｋｉ，Ｈ．，Ｊｕｎｉ，Ａ．，Ｕｅｄａ，Ｒ．，Ｓａｉｇｏ，Ｋ．の「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｓｉＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ａｎｄ  ｃｈｉｃｋ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．３，９３６−９４８）に基づくものである。
【０１１８】
本発明の核酸中のセンス鎖領域のセンス配列は、上記（１）−（４）の規則の他、さらに下記（５）の規則に従う標的遺伝子の規定配列に相同な塩基配列を有することが好ましい。即ち好ましくは、前記標的遺伝子の前記規定配列は、さらに下記（５）の規則：
（５）被検体の全遺伝子配列のうち、前記標的遺伝子以外の他の遺伝子の塩基配列中に、当該規定配列と９０％以上の同一性を有する配列が含まれない
に従う配列である（態様７）。
【０１１９】
詳細には、標的遺伝子と関係のない遺伝子におけるＲＮＡ干渉を抑制するために、標的遺伝子の上記（１）−（４）に従う規定配列は、これと同一又は類似の配列が他の遺伝子に含まれていない塩基配列であることが好ましい。当該規定配列又はその相補配列と同一／類似配列を有する塩基配列を除外することにより、標的遺伝子のみに特異的にＲＮＡ干渉を生じさせることが可能となる。当該規定配列又はその相補配列と同一／類似の配列を検索する方法としては、一般的なホモロジー検索を行うソフトウェア等を用いた方法が挙げられる。
【０１２０】
例えば、ＢＬＡＳＴ等を利用して標的遺伝子の規定配列と同一又は類似の配列を他の遺伝子について検索し、当該他の遺伝子に塩基配列のミスマッチ数が小さい類似配列が存在するという検索結果が得られた場合には、このような標的遺伝子の規定配列は除外する。それにより、標的遺伝子に対する特異性の高い配列を選別することができる。具体的に、標的遺伝子の規定配列の塩基数が１９である場合には、他の遺伝子にミスマッチが２塩基以下、より好ましくは３塩基以下、さらに好ましくは４塩基以下の類似配列が存在する配列を規定配列から除外することが好ましい。類似性判断の閾値となるミスマッチ数の値の増加に伴って、特異性が高くなる。また、標的遺伝子の規定配列のみならずこれと相補的な配列の両方についても検索を行うことにより、さらに特異性の高い配列が得られる。
【０１２１】
ここで、塩基配列の類似性を判断する基準となるミスマッチ数は、塩基配列の塩基数によっても異なるため、一概に規定することは難しい。そこで、この場合には、塩基配列のミスマッチ数を相同性で規定し、（５）の規定に従う配列であるか検索することにより類似性を判断して塩基配列を選別する。
【０１２２】
ここでは９０％以上の同一性と規定したが、かかる相同性は適宜設定されるものであり、当業者は、所望により規定配列と８５％以上、８０％以上、７５％以上のように適宜設定することが可能である。ここで規定配列との同一性を低く設定するほど標的配列と類似する他の遺伝子が存在しないこととなる。
【０１２３】
さらに、センス鎖領域のセンス配列は、上記（１）−（４）あるいは（１）−（５）の規則の他、さらに下記（６）の規則に従う標的遺伝子の規定配列に相同な塩基配列を有することが好ましい。
【０１２４】
（６）１０塩基以上Ｇ又はＣが連続する配列を含まない。
かかる（６）について、１０塩基以上Ｇ及び／又はＣが連続するというのは、例えば、Ｇ又はＣの一方のみが連続する場合と、Ｇ及びＣが混在する配列となっている場合の双方を含む。
【０１２５】
標的遺伝子の規定配列は、上記のような塩基配列上の規則だけでなく、これ以外の点に鑑みて適宜選択されてもよい。例えば、上記（１）〜（４）等の規則を満たす規定配列を標的遺伝子から複数選択した後、さらに、当該選択された規定配列の中から、別の条件を付加して配列の選択を行ってもよい。
【０１２６】
本発明のｐｏｌＩＩ系プロモーターを備えた核酸では、前述のように、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを用いる従来技術の場合のような、転写開始配列に関する制約がない。よって、ｐｏｌＩＩ系プロモーター領域に連結するＤｒｏｓｈａ認識第一領域の塩基配列を、任意に選択可能な所望配列とすることができる。また、Ｄｒｏｓｈａ認識第一に連結するセンス鎖領域は、Ｄｒｏｓｈａ認識第一領域の３’末端にかかる塩基配列の制約がないため、転写開始の塩基配列が制約を受けない。したがって、かかる構成では、センス鎖領域のセンス配列について、前述の特に（１）及び（２）の規則に従う塩基配列を高効率で実現することが可能である。さらに、ｐｏｌＩＩ系プロモーターを用いる本発明では、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを用いる従来技術の場合のような転写終了の塩基配列に関する制約（すなわち、ポリＴ配列を含まないという制約）がない。よって、途中で終了することなく最後まで転写が行われる。
【０１２７】
本発明の核酸の実施態様１
本発明の説明のために、本発明の実施態様の１つを、図１を参照しながら説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において種々態様で実施し得る。
【０１２８】
図１に示すように、本発明のｓｉＲＮＡの作製方法１００では、本発明の核酸１０１が、ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１と、その上流（５’側）に配設されたｐｏｌＩＩ系プロモーター領域２とから構成される。
【０１２９】
ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１は、Ｄｒｏｓｈａ認識第一領域３Ａと、ｓｈＲＮＡ形成領域７と、Ｄｒｏｓｈａ認識第二領域３Ｂと、終了シグナル領域８とを含み、これらの領域３Ａ、７、３Ｂ、８が、５’から３’方向にこの順で配置されている。Ｄｒｏｓｈａ認識領域３Ａ、３Ｂの塩基配列は、例えば、ヒトのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの構造を考慮して適切な配列が選択される。
【０１３０】
ｓｈＲＮＡ形成領域７中は、センス鎖領域４と、ループ領域５と、アンチセンス鎖領域６とが、５’から３’方向にこの順で配置されて構成される。センス鎖領域４は、ＲＮＡ干渉の標的遺伝子と相同な配列（センス配列）を含んでおり、また、アンチセンス鎖領域６は、センス鎖領域４のセンス配列と相補的な配列（アンチセンス配列）を含んでいる。センス配列に相補的なアンチセンス配列とは、具体的には、センス配列と逆方向反復配列である。
【０１３１】
かかる構成を有する本発明の核酸１０１は、ＲＮＡ干渉効果を示すｓｈＲＮＡの転写合成において鋳型となり、当該鋳型を用いてｓｈＲＮＡ１４が作製される。ｓｈＲＮＡ１４はさらに、Ｄｉｃｅｒによって切断されて実際にＲＮＡ干渉効果を示すｓｉＲＮＡとなる。
【０１３２】
Ｄｒｏｓｈａ認識領域３Ａ、３Ｂは、ｓｈＲＮＡ前駆体１０の切断に関与するＤｒｏｓｈａ１１の認識部位を、転写産物として取得されるｓｈＲＮＡ前駆体１０に付与する。このようなＤｒｏｓｈａ１１の認識部位が付与されたｓｈＲＮＡ前駆体１０では、Ｄｒｏｓｈａ１１の作用により、両認識部位間に介在するｓｈＲＮＡ形成領域７が切り出される。
【０１３３】
Ｄｒｏｓｈａ１１は、核内に内在する酵素であって、Ｄｉｃｅｒ１３と同様、ｄｓＲＮＡ結合ドメインとＲＮａｓｅＩＩＩ活性をもつ。Ｄｒｏｓｈａ１１は、生体内において核内でｐｒｉ−ｍｉＲＮＡに作用してこれを切断し、複数のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの形成に関与する。Ｄｒｏｓｈａ１１によって切り出されたｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、ループ領域を介して二本鎖ＲＮＡを形成し、約７０塩基数程度のヘアピン型構造を形成する。
【０１３４】
本発明では、Ｄｒｏｓｈａ１１のこのようなヘアピン型切り出し作用をｓｈＲＮＡ１２の作製に利用している。生体内におけるＤｒｏｓｈａ１１とヒトｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとの相関に鑑み、Ｄｒｏｓｈａ認識領域３Ａの５’末端からＤｒｏｓｈａ認識領域３Ｂの３’末端までの距離は、約３００塩基数程度であることが好ましい。
【０１３５】
終了シグナル領域８は、転写の停止を指示する配列（すなわち、ポリＡシグナル）を規定する４塩基数以上のポリＡ配列から構成される。以上のような各領域２、３Ａ，３Ｂ、４〜６、８から構成される本発明の核酸１０１では、Ｄｒｏｓｈａ認識第一領域３Ａの５’末端からＤｒｏｓｈａ認識第二領域３Ｂの３’末端に至るまでのｓｈＲＮＡコード領域の全塩基数が約３００塩基数程度であり、そのうち、ｓｈＲＮＡ形成領域７が約７０塩基数程度である。
【０１３６】
本発明の核酸からのｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡの産生の実施態様
次いで、本発明の核酸からのｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡの産生の実施態様を説明する。
具体的には、本発明の核酸１０１を鋳型し、ｓｈＲＮＡ１２が転写合成される。ｓｈＲＮＡ１２の転写合成では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩが、ｐｏｌＩＩ系プロモーター領域２の下流に配置されたＤｒｏｓｈａ認識第一領域３Ａを５’方向から３’  方向に向かって転写し、さらに、センス鎖領域４、ループ領域５、アンチセンス鎖領域６、Ｄｒｏｓｈａ認識第二領域３Ｂ、及び終了シグナル領域８に至るまで、５’方向から３’  方向に向かって連続転写する。図中の丸印は、転写合成の開始位置を示している。
【０１３７】
この転写合成により、本発明の核酸１０１のｓｈＲＮＡ前駆体コード量領域に相同な塩基配列を有するｓｈＲＮＡ前駆体１０が合成される。このｓｈＲＮＡ前駆体１０は、Ｄｒｏｓｈａ認識第一領域３Ａの転写産物３ａ（以下、「Ｄｒｏｓｈａ認識領域３ａ」と呼ぶ）と、センス鎖領域４の転写産物４ａ（以下、「センス鎖領域４ａ」と呼ぶ）と、ループ領域５の転写産物５ａ（以下、「ループ領域５ａ」と呼ぶ）と、アンチセンス鎖領域６の転写産物６ａ（以下、「アンチセンス鎖領域６ａ」と呼ぶ）と、Ｄｒｏｓｈａ認識領域３Ｂの転写産物３ｂ（以下、「Ｄｒｏｓｈａ認識領域３ｂ」と呼ぶ）、そして、終了シグナル領域８の転写産物８ａ（以下、「終了シグナル領域８ａ」と呼ぶ）とが連続して一本鎖ＲＮＡを形成するものである。
【０１３８】
転写合成されたｓｈＲＮＡ前駆体１０は、アンチセンス鎖領域６ａのアンチセンス配列がセンス鎖領域４ａのセンス配列と逆方向反復配列を有することから、自己相補性を有する。それゆえ、ｓｈＲＮＡ前駆体１０において、ループ領域５ａがループ形状を形成し、当該ループ領域５ａを介してセンス鎖領域４ａとアンチセンス鎖領域６ａとが相補結合し、Ｄｒｏｓｈａ認識領域３ａ、３ｂ及び終了シグナル領域８ａも含んで二本鎖を形成する。その結果、ｓｈＲＮＡ前駆体１０がヘアピン構造を形成する。
【０１３９】
続いて、Ｄｒｏｓｈａ１１が、ｓｈＲＮＡ前駆体１０の各領域３ａ、３ｂ領域を認識し、領域３ａの３’末端と領域３ｂの５’末端に作用して両者の間に介在するｓｈＲＮＡ形成領域７に対応したセンス鎖領域４ａ、ループ領域５ａ及びアンチセンス領域６ａを切り出す。それにより、センス鎖領域４ａ、ループ領域５ａ、及びアンチセンス鎖領域６ａから構成されるｓｈＲＮＡ１２が形成される。
【０１４０】
このようにして得られたｓｈＲＮＡ１２は、さらに、ＲＮａｓｅＩＩＩ系の塩基特異的ＲＮＡ切断酵素であるＤｉｃｅｒ１３により、センス鎖領域４ａおよびアンチセンス鎖領域６ａの所定部位で切断され、ループ領域５ａが除去される。その結果、センス鎖４ａとアンチセンス鎖６ａとから構成される二本鎖のｓｉＲＮＡ１４が得られる。ここでは、１９塩基数のセンス配列の３’末端に２塩基のオーバーハング部が付加された２１塩基数のセンス鎖４ａと、１９塩基数のアンチセンス配列の３’末端に２塩基のオーバーハング部が付加された２１塩基数のアンチセンス鎖６ａとから構成される２３塩基数の二本鎖ｓｉＲＮＡ１４が得られる。
【０１４１】
なお、ここでは詳細な説明を省略するが、本発明にかかるｓｉＲＮＡの作製方法は、上記のように取得されたｓｉＲＮＡ１４にさらに種々の処理を施す工程を含んでもよい。例えば、ｓｉＲＮＡ１４に化学修飾を施す工程を含んでもよい。
【０１４２】
以上のように、本発明の核酸１０１では、従来のようなプロモーター特性に起因する塩基配列の制約を受けない。そのため、塩基配列の設計の自由度が高く、所望の塩基配列を実現することが可能となる。したがって、上記のような塩基配列設計ガイドラインに従ってＲＮＡ干渉効果の高いｓｈＲＮＡ１２（そして、ｓｉＲＮＡ１４）を高効率で合成することが可能となる。例えば、本発明にかかる核酸１０１を利用すれば、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを用いた従来の系では塩基配列上の制約により実現不可であったｓｈＲＮＡ１２の構成を実現することが可能となる。したがって、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを用いた従来技術の系に比べて、ＲＮＡ干渉効果の高いものを幅広くかつ高効率で取得することが可能となる。
【０１４３】
また、上記のようにｓｈＲＮＡ１２の塩基配列設計の自由度が高くなることに伴い、本発明にかかる核酸１０１では、前述の（５）の規則、すなわちミスマッチ数が高い（例えば３以上の）条件を付与した場合でも、当該条件を従来の系で適用する場合に比べて、設計可能な塩基配列の範囲が広くなる。したがって、本発明によれば、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉効果が高く、かつ、標的遺伝子以外の遺伝子に対してはＲＮＡ干渉効果を示さない（すなわち、ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果の低い）ｓｈＲＮＡ１２（ｓｉＲＮＡ１４）を取得することが可能となる。
【０１４４】
さらに、本発明にかかる核酸１０１を用いたｓｉＲＮＡ１２の作製方法１００では、生体に内在するＤｒｏｓｈａ１１を用いて、既存の生体反応であるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの生成系と同様の系によりｓｈＲＮＡ１２が得られる。このため、容易かつ効率的な合成系を、副作用等の影響を受けることなく実現することが可能となる。また、前述のように、ｐｏｌＩＩ系プロモーターは細胞や組織に特異的プロモーターであるので、細胞・組織等特異的な遺伝子発現抑制を実現することができる。
【０１４５】
ここで、Ｄｒｏｓｈａ１１を利用する本発明の特徴的構成の利点について、さらに詳細に説明する。組織特異的なプロモーターであるｐｏｌＩＩ系プロモーターは、前述のように、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターでは実現不可である組織特異的な遺伝子発現抑制の実現に適しているが、本発明のようにＤｒｏｓｈａ１１を利用しない構成とすると、以下のような問題が生じる。
【０１４６】
すなわち、Ｄｒｏｓｈａ認識領域３ａ、３ｂを含まない長鎖のｓｈＲＮＡ前駆体１０をｐｏｌＩＩ系プロモーターにより転写合成すると、当該長鎖のｓｈＲＡＮ前駆体１０が速やかに細胞質に移送され、ＰＫＲキナーゼと２’，５’オリゴアデニンシンセターゼとを活性化する。それにより、非特異的にタンパク質合成が抑制され、結果として非特異的な発現抑制が生じるおそれがある。これに対して、本発明のようにＤｒｏｓｈａ認識領域３ａ、３ｂをｓｈＲＮＡ前駆体１０に付与すると、ｓｈＲＡＮ前駆体１０が核内でＤｒｏｓｈａ１１により切断されて所定塩基数に分解されるので、細胞質に移送された際に前述のような非特異的反応を引き起こすことがない。したがって、所望の特異的反応のみを実現することが可能となる。
【０１４７】
なお、本発明にかかる核酸１０１の構成は、図１の上記の構成に限定されるものではなく、これ以外であってもよい。例えば、図１ではｓｈＲＮＡ形成領域７が５’から３’方向に向かってセンス鎖領域４とループ領域５とアンチセンス鎖領域６とをこの順で有するが、これ以外に、５’から３’方向に向かってアンチセンス鎖領域７、ループ領域６及びセンス鎖領域５をこの順で有する構成であってもよい。
【０１４８】
また、上記においては、ＲＮＡ干渉の対象とする標的遺伝子の規定配列が（１）〜（４）の規則を基幹とするいわゆるＵｉ−Ｔｅｉガイドラインに従った塩基配列である場合について説明したが、本発明は、これ以外の塩基配列設計ガイドラインを適用した場合にも適用可能である。
【０１４９】
また、図１においてはＤｉｃｅｒ１１によりループ領域５が切断される場合を例示したが、Ｄｉｃｅｒ１１以外のＲＮａｓｅによりループ領域５が除去される構成であってもよい。例えば、塩基特異的ＲＮａｓｅとして、ＲＮａｓｅＴ１等のＧ特異的ＲＮａｓｅ、ＲＮａｓｅＵ２等のＡ及びＧ特異的ＲＮａｓｅ、ＲＮａｓｅＣＬ３等のＣ特異的ＲＮａｓｅ、ＲＮａｓｅＡやＲＮａｓｅＩ等のＣ及びＵ特異的ＲＮａｓｅ、ＲＮａｓｅＰｈｙＭ等のＡ及びＵ特異的ＲＮａｓｅを用いることも可能である。これらのＲＮａｓｅを用いる場合には、ＲＮａｓｅの特性に対応するよう、ループ領域５の塩基配列、特に、切断部位の塩基配列を適宜設計する。
【０１５０】
本発明の核酸の実施態様２
本発明の核酸の別の実施態様を図２に基づいて説明する。
図２は、図１の実施形態の変型を示す図である。図１においては、核酸１０１がｓｈＲＮＡ形成領域７（図１参照）を一つ含み、当該ｓｈＲＮＡ形成領域７から一つのｓｈＲＮＡ１２が形成される場合を例示したが、図２に示すように、本発明の実施形態の変型例として、核酸１０２は、複数のｓｈＲＮＡ形成領域７を含み、これらのｓｈＲＡＮ形成領域７から複数のｓｈＲＮＡ１２が同時に形成される構成を有する。かかる変型の構成の核酸１０２を用いるｓｈＲＮＡの作製方法２００では、単一の核酸１０２から複数のｓｈＲＮＡ１２を効率よく合成することが可能となる。
【０１５１】
図１及び図２に示すｓｈＲＮＡの作製方法１００、２００は、インビボ及びインビトロのいずれにおいても適用可能であるが、生体内に本来的に備わったＲＮＡポリメラーゼＩＩ、Ｄｒｏｓｈａ１１及びＤｉｃｅｒ１３を用いることから、インビボでの実施に特に適する。
【０１５２】
２．ＲＮＡ干渉のオンオフ制御可能な核酸
本発明は、その側面の１つにおいてＲＮＡ干渉のオンオフの制御が可能な核酸を提供する。
【０１５３】
「ＲＮＡ干渉がオン」とは、ｓｉＲＮＡが標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉を生じさせる状態であり、一方、「ＲＮＡ干渉がオフ」とは、ＲＮＡ干渉を生じさせない状態である。また、ＲＮＡ干渉のオンオフ制御とは、所定の条件下でＲＮＡ干渉がオフからオンになることであり、このような制御は、いわゆるコンディショナルターゲティング法の適用により実現される。
【０１５４】
よって、本発明は１つの側面において、コンディショナルターゲティング法に適用される塩基配列をさらに含む（態様１１）。コンディショナルターゲティング法の利用により、時期特異的及び／又は組織特異的に、ＲＮＡ干渉のオンオフを制御することが可能となる。時期特異的及び／又は組織特異的に遺伝子の発現を制御するコンディショナルターゲティング法として、例えば、Ａ）リコンビネースタンパク質／リコンビネース標的配列システムを利用した遺伝子組換え誘導型の方法、Ｂ）転写合成のオンオフ制御可能な誘導型プロモーターを利用した方法（例：テトラサイクリンアクティベーターなどを用いた遺伝子発現制御型の方法）、並びにＡ）及びＢ）を組み合わせた方法などが知られている（例えば、別冊  実験医学  ザ・プロトコールシリーズ  「ジーンターデティングの最新技術」（２０００年、羊土社）コンディショナルターゲティング法ｐ．１１５−１２０；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第３版，ＣＯＬＤ  ＳＰＲＩＮＧ  ＨＡＲＢＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＰＲＥＳＳ，２００１年，４．８２−４．８５）。
【０１５５】
Ａ）のリコンビネースタンパク質／リコンビネース標的配列システムを利用した、遺伝子組換え誘導型の方法は、特定のリコンビネースタンパク質がリコンビネース標的配列を認識し、その部分でＤＮＡの組換えを起こすことを利用するものである。リコンビネース標的配列は特定のリコンビネースが存在しない限り組換えを起こさない。リコンビネースタンパク質を時期特異的及び／又は組織特異的に投与することによって、ＲＮＡ干渉のオンオフを時期特異的及び／又は組織特異的に制御することができる。あるいは、リコンビネースタンパク質を時期特異的及び／又は組織特異的発現させた非ヒト遺伝子改変哺乳動物と、リコンビネース標的配列が導入された同種の非ヒト遺伝子改変哺乳動物とを掛け合わせ、リコンビネースによる組換えを時期特異的及び／又は組織特異的に生じさせ、ＲＮＡ干渉を時期特異的及び／又は組織特異的に制御することを可能にする。あるいは、必要に応じ、Ｃｒｅを恒常的に発現させて恒常的に組換えを生じさせる態様も含まれる。
【０１５６】
限定されるわけではないが、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅリコンビネースタンパク質とＣｒｅタンパク質によって認識される３４塩基対のｌｏｘＰ配列を利用したＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムが好ましい。この場合、Ｃｒｅタンパク質によって認識されるｌｏｘＰ配列を、コンディショナルターゲティング法に適用される塩基配列として本発明の核酸に含ませる。その他、酵母由来のＦＬＰ／ＦＲＴシステム（Ｊｕｎｇ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５，ｐ．１０３−、１９９４）（哺乳動物細胞、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）でも相同組換えを生じる）、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉのｐＳＲ１リコンビネース（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで機能しうる）等も知られている。
【０１５７】
Ｂ）の転写合成のオンオフ制御可能な誘導型プロモーターを利用した方法は、転写合成のオンオフ制御可能な誘導型プロモーターを利用して、遺伝子発現の調節を正確、可逆的、そして好ましくは定量的に行う方法である。このような誘導型プロモーターには、例えば、テトラサイクリン（Ｔｃ）オペレーターが含まれる。
【０１５８】
Ｔｃオペレーターを利用したシステムには、Ｔｅｔ−ＯｆｆシステムとＴｅｔ−Ｏｎシステムの２種類が存在する。Ｔｅｔ−Ｏｆｆシステムでは、テトラサイクリン（Ｔｃ）又はテトラサイクリン誘導体ドキシサクリン（Ｄｏｘ）が除去されると遺伝子発現（本発明の場合にはｓｈＲＮＡ前駆体の発現）がオンになる、一方、Ｔｅｔ−ＯｎシステムではＤｏｘの添加による発現がｏｎになる。これらのシステムは、大腸菌テトラサイクリン耐性オペロンから得られた２種類の調節性因子、Ｔｅｔリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）とＴｅｔオペレーターＤＮＡ配列（ｔｅｔＯ）に基づくシステムである。
【０１５９】
本システムで重要な成分の１つはＴｅｔＲを基盤とする調節タンパク質である。これは、Ｔｅｔ−ＯｆｆシステムではＴｅｔＲのアミノ酸残基１−２０７と単純ヘルペスウイルスＶＰ１６活性化ドメイン（ＡＤ）のＣ末端の１２７アミノ酸残基の融合体である。ＶＰ１６ドメインにより、ＴｅｔＲが転写リプレッサーから転写活性化因子に転換され、その結果できるハイブリッドタンパク質はテトラサイクリン制御トランス活性化因子（ｔＴＡ）となる。Ｔｅｔ−ＯｎシステムはＴｅｔ−Ｏｆｆシステムと類似しているが、調節タンパク質はＴｅｔＲのアミノ酸残基４つを改変して作成された”逆（ｒｅｖｅｒｓｅ）”Ｔｅｔリプレッサー（ｒＴｅｔＲ）となっており、その結果生じるタンパク質はｒｔＴＡ（逆ｔＴＡ）である。
【０１６０】
ｔＴＡ及びｒｔＴＡは、ｔｅｔＯを含むテトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）に結合することによって、最小プロモーターを活性化し下流の遺伝子の転写を促進する。例えばＴＲＥ２は、ｔｅｔＯを含む４２ｂｐ配列がそのまま７回反復したもので、最小のプロモーター（本発明のｐｏｌＩＩ系プロモーター）のすぐ上流に位置している。Ｔｅｔ−Ｏｆｆシステムでは、Ｔｃ又はＤｏｘ非存在下でｔＴＡがＴＲＥと結合して転写を活性化する。Ｔｅｔ−Ｏｎシステムでは、Ｄｏｘ存在下でｒｔＴＡがＴＲＥと結合して転写を活性化する。Ｔｅｔ−Ｏｆｆシステム及びＴｅｔ−Ｏｎシステムは、例えば、ＢＤＴＭ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＣｌｏｎｔｅｃｈのＢＤＴＭ  Ｔｅｔ−ＯｆｆおよびＢＤＴＭ  Ｔｅｔ−Ｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓを利用することが可能である。
【０１６１】
好ましくは、本発明の核酸に含まれるコンディショナルターゲティング法に適用される塩基配列は、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムに利用されるｌｏｘＰ及び／又は誘導型プロモーター（例えば、Ｔｅｔシステムに利用可能なＴＲＥ）である（態様１２）。
【０１６２】
本発明の、ＲＮＡ干渉のオンオフ制御可能な核酸には、以下のようなＩないしＩＶのいずれかの構造を有する核酸が含まれる（態様１３）。
Ｉ）  ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系プロモーター  −  ｌｏｘＰ  −  発現が制御される任意配列領域  −  ｌｏｘＰ  −  ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域；
ＩＩ）  ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系プロモーター  −  ｌｏｘＰ  −  ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域−  ｌｏｘＰ  −  発現が制御される任意配列領域；
ＩＩＩ）  逆位の発現が制御される任意配列領域  −  ｌｏｘＰ  −  逆位ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系プロモーター  −  逆位ｌｏｘＰ  −  ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域；又は
ＩＶ）  ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域  −  逆位ｌｏｘＰ  −  ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系プロモーター  −  ｌｏｘＰ  −逆位の発現が制御される任意配列領域。
【０１６３】
発現が制御される任意配列領域は、コンディショナルターゲティング法によって、発現が制御される任意の配列の領域である。当該領域は、コンディショナルターゲティング法によってｓｈＲＮＡ前駆体コード領域の転写がＯＮの場合にその転写がＯＦＦであり、逆にｓｈＲＮＡ前駆体コード領域の転写がＯＦＦの場合にその転写がＯＮというように、ｓｈＲＮＡ前駆体と逆の態様で発現が制御される。
【０１６４】
任意配列領域は特に限定されないが、例えば、標識配列領域又は第二のｓｈＲＮＡ前駆体コード領域である（態様１４）。標識配列領域を採用した場合、標識配列の転写・発現により検出が可能な場合にはＲＮＡ干渉が生じておらず、検出がされない場合には、ＲＮＡ干渉が生じていると判断される。また、第二のｓｈＲＮＡ前駆体コード領域を採用した場合は、第一と第二のｓｈＲＮＡ前駆体の一方のみを選択的に制御して発現させることが可能である。
【０１６５】
標識配列は公知の任意の配列を採用可能である。例えば、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＧＦＰの変異体であるＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＹＦＰ、ＹＦＰの変異体であるＥＹＦＰ、ＥＹＦＰのさらなる変異体であるＶｅｎｕｓ等の蛍光タンパク質をコードする配列を利用可能である。蛍光タンパク質以外にも、発光タンパク質、生成酵素、分解酵素等をコードする配列であってもよく、また、耐性遺伝子等の配列を利用し得る。例えば、これらの配列にかかる発現産物が検出されるか否かによって、ＲＮＡ干渉が生じているか否かを判断することができる。具体的に、蛍光タンパク質や発光タンパク質をコードする配列を用いた場合には、蛍光または発光を検出することによりＲＮＡ干渉が生じているか否かを判断することができる。また、生成酵素や分解酵素等（例えば、β―ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ等）をコードする配列を用いた場合には、当該酵素が触媒する反応によって生じる産物を検出することによりＲＮＡ干渉が生じているか否かを判断することができる。また、耐性遺伝子（例えば、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等）の配列を用いた場合には、当該耐性遺伝子が導入された細胞等の耐性を分析することによりＲＮＡ干渉が生じているか否かを判断することができる。
【０１６６】
「逆位の発現が制御される任意配列領域」、「逆位ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系プロモーター」、「逆位ｌｏｘＰ」における「逆位」とは、核酸中において、「ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域」の５’→３’の向きに対して、「発現が制御される任意配列領域」、「ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系プロモーター」、「ｌｏｘＰ」の各配列が、逆向き、即ち３’→５’の向きに配置されていることを意味する。
【０１６７】
ＲＮＡ干渉のオンオフ制御可能な核酸の実施態様
以下においては、ＲＮＡ干渉のオンオフを制御するシステムとして、既存のＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用いる場合を例示する。Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムの概要を説明すると、Ｃｒｅは、バクテリオファージＰ１由来の３８ＫＤタンパクでリコンビナーゼの一種であり、３４塩基数の所定塩基配列であるｌｏｘＰサイトを認識して特異的にこの部位でＤＮＡのリコンビネーションを生じさせる。ここで、ｌｏｘＰサイトの方向性は中心の８塩基の配列によって決まり、２つのｌｏｘＰサイトの方向性が同じであれば、ｌｏｘＰ間に配置されたヌクレオチドの欠損が生じ、当該方向性が逆であれば逆位が生じる。
【０１６８】
Ｃｒｅオンとは、Ｃｒｅの存在下においてＲＮＡ干渉がオン状態となる系であり、一方、Ｃｒｅオフとは、Ｃｒｅの存在下においてＲＮＡ干渉がオフとなる（言い換えれば、Ｃｒｅの非存在下においてＲＮＡ干渉がオンとなる）系である。
【０１６９】
以下においては、まず、ｌｏｘＰ間でヌクレオチドの欠損が生じるいわゆる欠損型の系について説明し、次に、ｌｏｘＰ間でヌクレオチドの逆位が生じるいわゆる逆位型の系について説明する。
【０１７０】
ｉ）実施態様Ｉ（図３）
図３Ａ及び図３Ｂは、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用いた本発明にかかる核酸の構成及びＲＮＡ干渉のオンオフ制御動作の一態様を示す図である。図３Ａ及び図３Ｂに示すように、ここでは、方向性が同じ２つのｌｏｘＰサイト３０が、本発明の核酸１０３内に配置されるとともに、当該２つのｌｏｘＰサイト３０の間に、任意配列領域３１と終了シグナル領域８とが配置されている。したがって、この場合は、ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１がｌｏｘＰサイト３０間に挟まれず、一対のｌｏｘＰサイト３０の下流（３’側）にｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１が配置された構成となる。任意配列領域３１は、ＲＮＡ干渉の標的となる標的遺伝子以外の遺伝子をコードする領域であって、ｓｈＲＮＡ１２（図１参照）の形成に寄与しない領域であり、任意の塩基配列を有する。
【０１７１】
かかる構成の核酸１０３では、欠損型のＣｒｅオン制御系が実現される。具体的に、核酸１０３では、図３Ａに示すように、Ｃｒｅの非存在下において図中の丸印を転写開始位置として任意配列領域３１及び終了シグナル領域８の転写が行われ転写産物３２が合成される。この場合、転写合成は終了シグナル領域８で止まるため、当該領域８の下流に配置されたｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１の転写合成は行われない。したがって、核酸１０３では、Ｃｒｅ非存在下においてＲＮＡ干渉がオフとなり、ＲＮＡ干渉効果が奏されない。
【０１７２】
一方、図３Ｂに示すように、Ｃｒｅの存在下では、２つのｌｏｘＰ３０間に配置された任意配列領域３１及び終了シグナル領域８が欠損するため、図中の丸印を転写開始位置としてｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１の転写が行われ、ｓｈＲＮＡ前駆体１０が合成される。したがって、核酸１０３では、Ｃｒｅ存在下においてＲＮＡ干渉がオンとなり標的遺伝子の発現抑制が実現される。
【０１７３】
ｉｉ）実施態様ＩＩ（図４）
図４Ａ及び図４Ｂは、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用いた本発明にかかる核酸の構成及びＲＮＡ干渉のオンオフ制御動作の他の態様を示す図である。図４Ａ及び図４Ｂに示すように、ここでは、方向性が同じ２つのｌｏｘＰサイト３０が核酸１０４内に配置され、当該２つのｌｏｘＰサイト３０の間に、ｓｈＲＮＡ１２（図１参照）の形成に寄与するｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１が狭まれて配置されている。
かかる構成の核酸１０４では、欠損型のＣｒｅオフ制御系が実現される。具体的に、核酸１０４では、図４Ａに示すように、Ｃｒｅの非存在下において、図１の場合と同様にしてｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１の転写が行われる。それにより、ｓｈＲＮＡ前駆体１０が合成される。したがって、核酸１０４では、Ｃｒｅ非存在下においてＲＮＡ干渉がオンとなり標的遺伝子の発現抑制が実現される。
【０１７４】
一方、図４Ｂに示すように、Ｃｒｅの存在下では、２つのｌｏｘＰ３０間に配置されたｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１が欠損するため、当該領域１の転写は行われず、代わりに、図中の丸印を転写開始位置として、任意配列領域３１及び終了シグナル領域８の転写が行われて転写産物３２が合成される。したがって、核酸１０４では、Ｃｒｅの存在下においてＲＮＡ干渉がオフとなり、標的遺伝子の発現抑制が実現されない。
【０１７５】
ｉｉｉ）実施態様ＩＩＩ（図５）
図５Ａ及び図５Ｂは、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用いた本発明にかかる核酸の構成及びＲＮＡ干渉のオンオフ制御動作のさらに他の態様を示す図である。図５Ａ及び図５Ｂに示すように、核酸１０５では、方向性が異なる２つのｌｏｘＰサイト５０間にｐｏｌＩＩ系プロモーター領域２が挟まれ、さらにこの２つのｌｏｘＰサイト５０が、任意配列領域５１及び終了シグナル領域８からなる領域と、ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１とで挟まれた構成となっている。ｐｏｌＩＩ系プロモーター領域２は、図中の矢印尖端方向に転写を行う。また、任意配列領域５１は前述の任意配列３１と同様の構成である。
【０１７６】
かかる構成の核酸１０５では、逆位型のＣｒｅオン制御系が実現される。具体的に、核酸１０５では、図５Ａに示すように、Ｃｒｅの非存在下において図中の丸印を転写開始位置として任意配列領域５１及び終了シグナル領域８の転写が行われ、転写産物５２が合成される。この場合、転写方向と反対方向に配置されたｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１の転写合成は行われない。したがって、核酸１０５では、Ｃｒｅ非存在下においてＲＮＡ干渉がオフとなり、標的遺伝子の発現抑制が実現されない。
【０１７７】
一方、図５Ｂに示すように、Ｃｒｅの存在下では、逆位が生じてｐｏｌＩＩ系プロモーター領域２の転写方向が図５Ａの場合と逆になるため、図中の丸印を転写開始位置として図１の場合と同様にｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１の転写が行われる。それにより、ｓｈＲＮＡ前駆体１０が合成される。したがって、核酸１０５では、Ｃｒｅの存在下においてＲＮＡ干渉がオンとなり標的遺伝子の発現抑制が実現される。
【０１７８】
ｉｖ）実施態様ＩＶ（図６）
図６Ａ及び図６Ｂは、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用いた本発明にかかる核酸の構成及びＲＮＡ干渉のオンオフ制御動作のさらに他の態様を示す図である。図６Ａ及び図６Ｂに示すように、核酸１０６では、任意配列領域５１及び終了シグナル領域８からなる領域とｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１との位置関係が図５Ａ及び図５Ｂの場合と逆になっている。
【０１７９】
かかる構成の核酸１０６では、逆位型のＣｒｅオフ制御系が実現される。具体的に、核酸１０６では、図６Ａに示すように、Ｃｒｅの非存在下において、図中の丸印を転写開始位置として図１の場合と同様にしてｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１の転写が行われる。それにより、ｓｈＲＮＡ前駆体１０が合成される。したがって、核酸１０６では、Ｃｒｅ非存在下においてＲＮＡ干渉がオンとなり標的遺伝子の発現抑制が実現される。
【０１８０】
一方、図６Ｂに示すように、Ｃｒｅの存在下では、逆位が生じてｐｏｌＩＩ系プロモーター領域２の転写方向が図６Ａの場合と逆となるため、図中の丸印を転写開始位置として任意配列領域３１及び終了シグナル領域８の転写が行われて転写産物５２が合成される。したがって、核酸１０６では、Ｃｒｅの存在下においてＲＮＡ干渉がオフとなり、標的遺伝子の発現抑制が実現されない。
【０１８１】
以上のように、本発明にかかる核酸１０３〜１０６では、Ｃｒｅの存在・非存在、言い換えればＣｒｅの導入により、容易に適宜ＲＮＡ干渉をオンオフ制御可能な系が実現できる。このような系を利用し、例えば、ある細胞に特異的、あるいは、ある時期に特異的にＣｒｅを導入することにより、細胞特異的あるいは時期特異的にＲＮＡ干渉を生じさせることが可能となる。
【０１８２】
上記の制御系において、Ｃｒｅは、細胞等の被導入体に直接導入してもよく、あるいは、被導入体に内在するＣｒｅ遺伝子の発現をプロモーターにより制御して細胞特異的、時期特異的にＣｒｅ遺伝子を発現する構成としてもよい。また、上記実施の形態におけるＣｒｅの非存在とは、Ｃｒｅが存在しない場合のみならず、所定濃度未満で存在する場合も含む。
【０１８３】
上記においては、Ｃｒｅの導入によってｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１及び任意配列領域３１、５１のいずれを転写するかが選択され、当該選択に則してｓｈＲＮＡ前駆体１０及び任意の転写物３２、５３のいずれか一方が得られる構成を例示したが、本発明は、これ以外の構成にも適用可能である。
【０１８４】
例えば、異なる標的遺伝子に対してそれぞれＲＮＡ干渉効果を奏する複数のｓｈＲＮＡ１２（図１参照）のうちいずれのｓｈＲＮＡ１２を転写合成するかをＣｒｅにより制御可能な構成、具体的には、異なるｓｈＲＮＡ１２を与える複数のｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１を含み、各ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１はｌｏｘＰサイト３０、５０との配置関係によって転写合成が制御される構成であってもよい。このような構成では、Ｃｒｅによる欠損型あるいは逆位型の制御により、Ｃｒｅ存在下において１つのｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１は転写されるが第二のｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１は転写されず、よって、前記一のｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１に対応するｓｈＲＮＡ１２（図１参照）のみを選択的に合成することが可能となる。したがって、かかる構成では、Ｃｒｅの導入によりＲＮＡ干渉の標的を切り換え可能な系を実現することが可能となる。
【０１８５】
なお、上記においては、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用いてＲＮＡ干渉のオンオフを制御する場合を説明したが、本発明では、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステム以外のシステムを利用したコンディショナルターゲティング法を適用してＲＮＡ干渉のオンオフ制御を行ってもよい。また、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステム等の制御システムと、他のＲＮＡ干渉制御システムとを組み合わせた構成であってもよい。例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムと、転写合成のオンオフ制御可能な誘導型プロモーターとを組み合わせた構成であってもよい。かかるプロモーターとして、特定の条件下でのみ転写合成を誘導することができるプロモーター、具体的にはＴＲＥ２等のＴｅｔ誘導プロモーター等を用いてもよい。このような制御システムの組み合わせにより、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムのみによりＲＮＡ干渉のオンオフ制御を行う場合よりも、より正確に良好な制御を行うことが可能となる。
【０１８６】
３．ｓｈＲＮＡ前駆体の産生方法
本発明はまた、ｓｈＲＮＡ前駆体の産生方法を提供する。本発明の産生方法は、本発明の核酸を鋳型として、ＲＮＡポリメラーゼＩＩを用いて転写を行う工程を含む（態様１７）。転写はインビボで行っても、インビトロで行ってもよい。好ましくはインビボで転写を行う（態様１８）。
【０１８７】
本発明はさらに、本発明の核酸を含む発現ベクターを提供する（態様１６）。本発明の発現ベクターは、ｓｈＲＮＡ前駆体の産生方法のために、及び／又はｓｈＲＮＡ発現による遺伝子発現抑制のために使用することができる。
【０１８８】
本発明のｓｈＲＮＡ前駆体の産生方法に使用される核酸は、「１．ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）前駆体を産生するための核酸」であり、そのうち特に、「２．ＲＮＡ干渉のオンオフ制御可能な核酸」で記載した核酸であってもよい。
【０１８９】
本発明の核酸を含む核酸発現ベクターは、被導入体である細胞、組織、個体に導入（トランスフェクト）される。被導入体及び導入方法については詳細を後述するが、かかる被導入体は、標的遺伝子の発現系を備えたものである。「標的遺伝子の発現系」とは、標的遺伝子が発現している体系のことであり、具体的には、少なくとも標的遺伝子のｍＲＮＡが形成される反応系を備える系である。標的遺伝子の発現系としては、インビトロ、インビボのいずれであってもよい。また、培養細胞、培養組織等を発現系としてもよく、無細胞系の発現系であってもよい。
【０１９０】
核酸発現ベクターが導入されると、被導入体では、図１を参照して前述したように、ｓｈＲＮＡの転写合成が行われる。このように被導入体内で転写合成されたｓｈＲＮＡは、好ましくは、さらにｓｉＲＮＡに加工され、被導入体内においてＲＮＡ干渉を引き起こし、それにより、標的遺伝子の発現が抑制される。
【０１９１】
本明細書において、「ベクター」とは、結合した別の核酸を運搬することが可能な核酸分子であり、ＲＮＡベクター及びＤＮＡベクターのいずれであってもよい。また、ベクターは、宿主細胞の染色体ＤＮＡに統合することのできるベクターであってもよく、あるいは、染色体外での複製が可能なベクターであってもよい。
【０１９２】
本発明の核酸を導入する被導入体は、標的遺伝子がその内部でＲＮＡに転写、又はタンパク質に翻訳され得るものであればいかなるもの（すなわちいかなる細胞、組織、個体）であってもよい。被導入体となる細胞としては、生殖系列細胞、体性細胞、分化全能細胞、多分化能細胞、分割細胞、非分割細胞、実質組織細胞、上皮細胞、不滅化細胞、又は形質転換細胞等のいずれのものであってもよい。例えば、幹細胞のような未分化細胞、器官又は組織由来の細胞やその分化細胞等が挙げられる。
【０１９３】
分化細胞としては、例えば、脂肪細胞、繊維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、神経細胞、グリア、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球、ケラチン生成細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞及び内分泌腺又は外分泌腺の細胞等が挙げられる。このような細胞の具体例としては、ＣＨＯ細胞、ショウジョウバエＳ２細胞、ヒトＨｅＬａ細胞等が挙げられる。
【０１９４】
被導入体となる組織としては、単一細胞胚又は構成性細胞、又は多重細胞胚、胎児組織等が挙げられる。また、個体としては、植物、動物、原生動物、ウィルス、バクテリア又は真菌種に属するもの等が挙げられる。植物は単子葉植物、双子葉植物又は裸子植物であってもよい。動物は、脊椎動物または無脊椎動物であってもよい。脊椎動物の具体例としては、魚類や、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ハムスター、マウス、ラット、サル及びヒトを含む哺乳動物が挙げられる。無脊椎動物の具体例としては、線虫類や、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）等の昆虫が挙げられる。
【０１９５】
また、宿主細胞としての大腸菌、酵母又は昆虫細胞は、具体的には、大腸菌（ＤＨ５α、Ｍ１５、ＪＭ１０９、ＢＬ２１等）、酵母（ＩＮＶＳｃ１（サッカロマイセス属）、ＧＳ１１５、ＫＭ７１（以上ピキア属）など）、昆虫細胞（Ｓｆ２１、ＢｍＮ４、カイコ幼虫等）などが例示される。
【０１９６】
本発明にかかる核酸発現ベクターは、その内部に、ｐｏｌＩＩ系プロモーターを備えた核酸を有する。なお、核酸発現ベクターにおいて、ｐｏｌＩＩ系プロモーターは、もとのベクター構成に初めから備わっていてもよく、また、もとのベクター構成には初めから備わってはいないが後から挿入されたものであってもよい。
【０１９７】
一般に発現べクターは、プロモーターの他に、少なくとも、開始コドン、所望の挿入配列、およびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他の制限酵素部位など）を用いることができる。
【０１９８】
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現べクターは、少なくとも、プロモーター／オペレーター領域、開始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターおよび複製可能単位から構成される。宿主細胞として酵母、植物細胞、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合、一般に発現べクターは、少なくとも、プロモーター、関始コドン、所望の挿入配列、終止コドン、ターミネーターを合んでいることが好ましい。またシグナルペブチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、選択マーカー領域または複製可能単位などを適宜含んでいてもよい。
【０１９９】
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡを意味し、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたプラスミド）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとしては、Ｅ．ｃｏｌｉではブラスミドｐＱＥ３０、ｐＥＴ又はｐＣＡＬ若しくはそれらの人工的修飾物（ｐＱＥ３０、ｐＥＴ又はｐＣＡＬを適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母ではプラスミドｐＹＥＳ２若しくはｐＰＩＣ９Ｋが、また昆虫細胞ではプラスミドｐＢａｃＰＡＫ８／９等があげられる。
【０２００】
本発明のべクタ−の好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴＧ）が例示される。また、終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡなど）が例示される。また、エンハンサー配列、ターミネーター配列については、例えば、それぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
【０２０１】
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。
【０２０２】
本発明による発現べクターの宿主細胞への導入（形質転換又は形質移入とも称される）は、従来公知の方法を用いて行うことができる。細菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ，  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ等）の場合、例えばＣｏｈｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ６９，  ２１１０  （１９７２）］、プロトプラスト法［Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １６８，  １１１  （１９７９）］やコンピテント法［Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ５６，  ２０９  （１９７１）］によって、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合は、例えばＨｉｎｎｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７５，  １９２７  （１９７８）］やリチウム法［Ｊ．  Ｂ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １５３，  １６３  （１９８３）］によってそれぞれ形質転換することができる。植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２７，  １２９  （１９８５）］、エレクトロポレ−ション法［Ｎａｔｕｒｅ，  ３１９，  ７９１  （１９８６）］によって、動物細胞の場合は、例えばＧｒａｈａｍの方法［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ５２，  ４５６  （１９７３）］、昆虫細胞の場合は、例えばＳｕｍｍｅｒらの方法［Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ３，  ２１５６−２１６５  （１９８３）］によってそれぞれ形質転換することができる。
【０２０３】
核酸発現ベクターは、プラスミドやその他の従来のベクターを用いて、既知の方法により作製することができる。例えば、ＴＲＥ２やＣＭＶ等のｐｏｌＩＩ系プロモーターを備えたプラスミド等を用いることができる。また、核酸発現ベクターは、アンピシリン等の薬剤耐性マーカーや、蛍光タンパク質等の標識タンパク質等を適宜含んでもよい。例えば、標識タンパク質を含むものでは、被導入体への核酸の導入や、被導入体内における標的遺伝子の発現阻害の確認を行うことが可能となる。そして、このような確認方法を利用すれば、ＲＮＡ干渉効果が高い細胞等を一次スクリーニングすることができ効率のよい解析を行うことが可能となる。
【０２０４】
図７は、核酸発現ベクターの一構成例を示す模式図である。図７に示すように、核酸発現ベクターは、ｐｏｌＩＩ系プロモーターであるＴＲＥ２を備えたプラスミドＤＮＡで構成され、当該プラスミドの適切な位置、この場合はＢａｍＨ１／ＸｂａＩクローニングサイト（すなわち、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ））に、核酸のｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１が挿入された構成を有する。このような核酸発現ベクターでは、所定の位置に適宜イントロンが挟みこまれており、核酸発現ベクターそのものが鋳型とならないように設計されている。
【０２０５】
かかる構成の核酸発現ベクターは、非限定的に、例えば、以下の方法により作製される。まず、ｐｏｌＩＩ系プロモーターを備えたベクターを用意し、当該ベクターのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）に、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ１８７を転写産物として与える塩基配列（すなわち、ｍｉＲ１８７と相同な配列であり、以下「ｍｉＲ１８７塩基配列」と呼ぶ）を挿入する。
【０２０６】
続いて、ＤｒａＩＩＩとＰｓｈＡ１とを制限酵素として用いてｍｉＲ１８７塩基配列の所定領域を切断し、当該領域の塩基配列を除去する。そして、除去した塩基配列に代わって、図１の核酸１０１のｓｈＲＮＡ形成領域７（図１参照）を含む塩基配列（以下、「挿入配列」と呼ぶ）を挿入する。それにより、ｍｉＲ１８７塩基配列由来のＤｒｏｓｈａ認識領域３Ａ、３Ｂ（図１参照）と、挿入配列由来のｓｈＲＮＡ形成領域７（図１参照）とを備えた核酸発現ベクターが得られる。
【０２０７】
上記のような核酸発現ベクターの作製方法では、挿入配列、特に、当該挿入配列中のｓｈＲＮＡ形成領域の塩基配列を適切に設計することにより、所望の塩基配列を有する種々のｓｈＲＮＡを作製することが可能となる。なお、ここではｍｉＲ１８７構成を用いて核酸発現ベクターを作製する場合について説明したが、本発明にかかる核酸発現ベクターは、ｍｉＲ１８７以外のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ構成を与えるｍｉＲ塩基配列を含んで作製されてもよい。ｍｉＲ１８７塩基配列を用いると、ｍｉＲ１８７塩基配列中の二つの制限酵素サイトがｓｈＲＮＡ形成領域の近傍に存在するので、制限酵素サイト間の距離（塩基数）を小さくすることができる。その結果、挿入配列の塩基数を低減できるので好ましい。
【０２０８】
核酸発現ベクターの被導入体への導入方法は、特に限定されず、既知の導入方法を用いることが可能である。被導入体の全体又は局所的に当該ベクターが導入される。プラスミドベクターを宿主細胞に導入する方法としては、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．７４（１９８９）に記載のリン酸カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１２９（１９８５）］、エレクトロポレ−ション法［Ｎａｔｕｒｅ，３１９，７９１（１９８６）］、アグロバクテリウムを用いる方法（Ｈｏｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，  １２９（１９８５）、Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，６，  ２７１−２８２（１９９４））、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法、マイクロインジェクション法、微小物衝突法などが知られている。
【０２０９】
例えば、被導入体が植物の場合には、植物体の体腔または間質細胞等への注入または噴霧等が挙げられる。また、動物個体の場合には、経口、局所（皮下、筋肉内及び静脈内投与を含む）非経口、経腔、経直腸、経鼻、経眼、腹膜内投与等によって全身的に導入する方法が用いられる。経口導入のための方法には、例えば、埋め込み長期放出製剤等として投与、核酸発現ベクターが導入された被導入体を摂取させる等の方法が挙げられる。
【０２１０】
また、適切なデリバリーシステムと併用してＲＮＡ干渉の対象となる被導入体の所望部位に核酸発現ベクターを到達させてもよい。特に、本発明の核酸発現ベクターを遺伝子治療や疾患予防等に利用する場合には、リポソーム等を使用するドラッグ・デリバリー・システムを適宜用いて被導入体の目的部位に当該ベクターを到達させてもよい。
【０２１１】
導入する核酸発現ベクターの量は、当該ベクターの構成や、標的遺伝子の種類、ＲＮＡ干渉の条件等に応じて適宜決定するが、細胞あたり少なくとも１コピー導入されるに十分量を導入することが好ましい。例えば、ヒトＨｅＬａ培養細胞に導入する場合、１×１０５細胞／ｍｌに対し、０．１〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜８００ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは５〜５００ｎｇ／ｍｌの核酸発現ベクターを導入する。また、かかる導入は一回で行ってもよく、複数回に分けて行ってもよい。
【０２１２】
また、遺伝子発現抑制方法の場合には、その目的に応じて、同一の被導入体に対し、同時又は時期をずらして複数種類の核酸発現ベクターを導入してもよい。ここで、複数種類の核酸発現ベクターとは、それぞれ異なる標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉効果を奏するもののことである。
【０２１３】
４．ｓｈＲＮＡ前駆体
本発明はさらに、本発明の方法によって産生されたｓｈＲＮＡ前駆体を提供する（態様１９）。
【０２１４】
本発明のｓｈＲＮＡ前駆体は、好ましくは
以下のｉ）−ｉｉｉ）
ｉ）Ｄｒｏｓｈａ認識部位を含むＤｒｏｓｈａ認識第一領域；
ｉｉ）ｓｈＲＮＡ形成領域；及び
ｉｉｉ）Ｄｒｏｓｈａ認識部位を含むＤｒｏｓｈａ認識第二領域
を含み、
ここにおいて、ｉｉ）のｓｈＲＮＡ形成領域は、ａ）ＲＮＡ干渉の標的となる標的遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と相同な塩基配列であるセンス配列を有するセンス鎖領域、ｂ）塩基特異的ＲＮａｓｅで切断されるループ配列を有するループ領域、及びｃ）標的遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と相同な塩基配列であるセンス配列と相補的なアンチセンス配列を有するアンチセンス領域、からなる（態様２０）。
【０２１５】
「Ｄｒｏｓｈａ認識第一領域」、「ｓｈＲＮＡ形成領域」、「Ｄｒｏｓｈａ認識第二領域」等の用語の意味は、「１．ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）前駆体を産生するための核酸」において前述した通りである。
【０２１６】
本発明のｓｈＲＮＡ前駆体は、ｉｉ−ａ）のセンス配列と、ｉｉ−ｃ）のアンチセンス配列とが、ｉｉ−ｂ）のループ配列を介して、分子内二本鎖を形成することができる（態様２１）。本発明のｓｈＲＮＡ前駆体は、好ましくはＤｒｏｓｈａによって認識・切断されてｓｈＲＮＡを形成する。ｓｈＲＮＡはさらに好ましくはＤｉｃｅｒによって認識・切断されたｓｉＲＮＡを産生し、ＲＮＡ干渉を生じうる。
【０２１７】
本発明のｓｈＲＮＡ前駆体は、好ましくは、一態様において以下のいずれかの要件を満たす。
ｉ）ヒトのｐｒｉ−ｍＲＮＡ構造を構成している（態様２２）。
【０２１８】
ｉｉ）天然に存在するヌクレオチド及び／又は天然に存在しないヌクレオチドから構成される（態様２３）。
ｉｉｉ）合計塩基数が、１００塩基ないし４００塩基である（態様２４）。
【０２１９】
ｉｖ）  ｉｉ−ａ）のセンス配列は、前記標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、下記（１）〜（４）の規則：
（１）３’末端の塩基が、アデニン、チミン又はウラシルである；
（２）５’末端の塩基が、グアニン又はシトシンである；
（３）３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる一種又は二種以上の塩基がリッチである；そして
（４）塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である
に従う規定配列と、相同な塩基配列である（態様２５）。
【０２２０】
ｖ）態様２５の規則（４）において、塩基数が１３〜２８である（態様２６）。
ｖｉ）態様２５又は２６において、前記標的遺伝子の前記規定配列が、さらに下記（５）の規則：
（５）被検体の全遺伝子配列のうち、前記標的遺伝子以外の他の遺伝子の塩基配列中に、当該規定配列と９０％以上の同一性を有する配列が含まれない
に従う配列である（態様２７）。
【０２２１】
ｖｉｉ）ｉｉ−ｂ）のループ配列の、３’末端がグアニンであり５’末端がシトシンであるか、又は、前記ループ配列の３’末端がシトシンであり５’末端がグアニンである（態様２８）。
【０２２２】
ｖｉｉｉ）ｉｉ−ｂ）のループ配列の塩基数が、約３〜３０塩基である、態様２０ないし２８のいずれか１つのｓｈＲＮＡ前駆体（態様２９）。
【０２２３】
５．遺伝子発現抑制方法
本発明はまた、標的遺伝子の発現を抑制する、遺伝子発現抑制方法を提供する。本発明の遺伝子発現抑制方法は、本発明の発現ベクター、又は、本発明のｓｈＲＮＡ前駆体を、発現を抑制しようとする標的遺伝子の発現系に導入し、当該標的遺伝子の発現を抑制することを含む（態様３１）。
【０２２４】
本発明の遺伝子発現抑制方法において、好ましくは、遺伝子発現抑制がコンディショナルターゲッティング法によって調節される（態様３２）。本態様のためには、「２．ＲＮＡ干渉のオンオフ制御可能な核酸」で前述した核酸を利用することができる。
【０２２５】
標的遺伝子の発現抑制とは、その発現を完全に抑制（阻害）することだけでなく、例えば、ｍＲＮＡ若しくはタンパク質の発現量を実質的に減少させる場合も含む。ｍＲＮＡ若しくはタンパク質の発現量が実質的に減少していれば、その変化の幅の大小にかかわらず、発現抑制が実現されている。遺伝子発現抑制の効果の判断は、遺伝子発現抑制の利用目的にもよるが、例えば、当該発現量が約８０％以下、好ましくは約５０％以下となる場合を発現抑制が生じたと判断してもよい。特に、判断の基準を約２０％以下とすれば、確実性及び効果に優れた遺伝子発現抑制が実現できる。
【０２２６】
標的遺伝子の発現抑制の程度は、例えば、標的遺伝子のｍＲＮＡの蓄積量又は標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現量（産出量）を、核酸発現ベクターを導入した場合と導入しない場合とで比較することにより測定できる。ｍＲＮＡの発現量の解析方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、定量的リバーストランスフェレースＰＣＲ、あるいはｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション等が挙げられる。また、タンパク質の発現量の解析方法としては、標的遺伝子がコードするタンパク質を抗原とする抗体によるウェスタンブロッティング法や、標的遺伝子がコードするタンパク質が有する酵素活性を測定する方法等が挙げられる。
【０２２７】
本発明の遺伝子発現抑制方法は、本発明の発現ベクターを前述した方法によって発現を抑制しようとする標的遺伝子の発現系に導入してもよい。あるいは、発現ベクターの代わりに本発明のｓｈＲＮＡ前駆体を、発現を抑制しようとする標的遺伝子の発現系に直接導入してもよい。
【０２２８】
本発明の遺伝子発現抑制方法は、被導入体内における標的遺伝子の機能の解析や同定、あるいは、被導入体への特定性質の付与に利用することができる。
例えば、標的遺伝子の機能の解析を行う場合には、本発明の核酸発現ベクター又は核酸の導入による標的遺伝子の発現抑制の結果として生じる表現型の変化を解析する。それにより、標的遺伝子の機能を同定することが可能となる。変化を解析すべき表現型は、特には制限されないが、例えば、被導入体の形態、内部物質量、被導入体が分泌する物質量、被導入体内物質の動態、非導入体間接着、被導入体の運動、あるいは被導入体の寿命等の生命体行動が挙げられる。標的遺伝子の機能が、他の被導入体において既知の場合には、その機能に連関する表現型について解析することが好ましい。
【０２２９】
被導入体の形態の変化を解析する場合には、顕微鏡又は肉眼で変化を検出して解析を行ってもよい。また、被導入体の内部物質量の変化を解析する場合には、前述のように標的遺伝子に対応するｍＲＮＡやタンパク質の物質量の変化を解析してもよい。本発明の核酸発現ベクター又は核酸を導入した場合のみ現れる表現型の変化は、標的遺伝子の発現抑制の結果生じているものである。したがって、当該変化に基づき、表現型に関わる機能を標的遺伝子の機能として同定することができる。
【０２３０】
一方、本発明の核酸発現ベクター又はｓｈＲＮＡ前駆体を用いた標的遺伝子の発現抑制により細胞等に特定の性質を付与する場合、特定の性質とは、標的遺伝子の発現抑制の結果として被導入体に現れる性質をさす。被導入体に付与する性質としては、例えば、細胞内生産の阻害、細胞外分泌の阻害、細胞やＤＮＡに対する障害の修復機能の阻害、特定の疾患に対する耐性機能の阻害等が挙げられる。
【０２３１】
例えば、特定のタンパク質の発現量の上昇が特定の疾患の原因となる場合において、標的遺伝子が当該タンパク質をコードする遺伝子であると、標的遺伝子の発現抑制によって、特定の疾患に対する耐性機能が付与される。具体例としては、標的遺伝子が、癌化／腫瘍化表現型の保持に必要である遺伝子であり、被導入体が、癌性細胞又は腫瘍組織等である場合であり、かかる場合には、本発明の核酸発現ベクター又は核酸を、標的遺伝子が関連する疾患（ここでは癌）の治療又は予防に利用することができる。この場合、標的遺伝子の発現抑制に付随した被導入体の形質変化として、増殖能の亢進や、細胞接着能の低下、あるいは運動（転移）能の亢進等が生じる。
【０２３２】
６．医薬組成物等
本発明はまた、本発明の発現ベクター又はｓｈＲＮＡ前駆体を含む、医薬組成物を提供する（態様３０）。発現ベクターからの転写産物であるｓｈＲＮＡ前駆体あるいは、直接投与されたｈＲＮＡ前駆体から得られる、ｓｈＲＮＡ，続くｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉によって、標的遺伝子の発現が抑制される。本発明の医薬組成物はこのような標的遺伝子の発現が関与する疾患の治療及び／又は予防に有効である。
【０２３３】
本発明の発現ベクター及び／又はｓｈＲＮＡ前駆体を、医薬組成物の有効成分として用いる場合に、これらを単独で用いてもよく、あるいは、薬学的に許容され得る担体と配合して用いてもよい。この場合における当該担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で適宜選択され得る。例えば、発現ベクター及び／又はｓｈＲＮＡ前駆体は、生理学的に許容されるバッファーや生理食塩水等の溶液中に存在、又はミセル構造を形成して存在してもよい。このような医薬組成物は、従来の投与形態等を利用して投与することができ、また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
【０２３４】
さらに、医薬組成物としての利用以外に、発現ベクター及び／又はｓｈＲＮＡ前駆体を、医薬部外品やヘルスケア製品の有効成分として利用してもよい。医薬部外品としては、例えば、薬用化粧品類、養毛剤、除毛剤、染毛剤、パーマネントウェーブ溶剤、浴用剤、口中清涼剤、腋臭防止剤（例えば、制汗剤等）、てんか粉類（例えば、ベビーパウダー等）等が挙げられる。薬用化粧品の具体例としては、クリーム、乳液、ハンドクリーム、化粧用油、化粧水、薬用石鹸、シャンプー、リンス、日焼け止め剤、髭剃り用剤、パック等が挙げられる。
【０２３５】
また、ヘルスケア製品としては、例えば、健康の維持や増進を目的として摂取する食品（飲料も含む）や、美容目的のために摂取する食品（飲料も含む）等が挙げられる。このような食品は、特定保健用食品であってもよく、栄養機能食品であってもよい。医薬部外品やヘルスケア製品に利用される場合、発現ベクター及び／又はｓｈＲＮＡ前駆体は、上記の医薬組成物に利用する場合と同様の態様の中から適切な態様で利用され得る。
【０２３６】
生体リズムを調整する遺伝子を標的遺伝子とする場合には、標的遺伝子の発現抑制により付与される性質として、例えば、細胞固有の慨日リズムの消失等が挙げられる。また、環境変異原によるＤＮＡ損傷の修復等に関与する遺伝子を標的遺伝子とする場合には、標的遺伝子の発現抑制により付与される性質として、変異原に対する感受性等が挙げられる。
【０２３７】
なお、上記においては、本発明にかかるｓｈＲＮＡ前駆体を、ベクターを用いて被導入体に導入する場合について説明したが、ベクターを用いる方法以外の方法によりｓｈＲＮＡ前駆体を被導入体に導入してもよい。例えば、本発明にかかるｓｈＲＮＡ前駆体を被導入体に導入する方法として、被導入体が細胞あるいは組織の場合、カルシウムフォスフェート法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ウィルス感染、核酸溶液への浸漬、あるいは形質転換法等の従来の方法を適切に用いた方法が挙げられる。
【０２３８】
また、核酸をベクターによらずに胚に導入する方法として、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション法、あるいはウィルス感染等の従来の方法を適切に用いて導入を行ってもよい。被導入体が植物の場合には、植物体の体腔または間質細胞等への注入または噴霧等による方法であってもよく、また、動物個体の場合には、経口、局所（皮下、筋肉内及び静脈内投与を含む）非経口、経腔、経直腸、経鼻、経眼、腹膜内投与等によって全身的に導入してもよい。
【０２３９】
７．ｓｈＲＮＡ前駆体が導入された遺伝子改変体
本発明はさらにまた、本発明の発現ベクター又はｓｈＲＮＡ前駆体が導入された形質転換体を提供する（態様３４）。本発明の形質転換体は、好ましくは、細胞、組織、器官、及び個体からなる群から選択される（態様３５）。
【０２４０】
本発明にかかる発現ベクター又はｓｈＲＮＡ前駆体は、前述のように、特定の細胞や組織においてＲＮＡ干渉効果を奏し遺伝子発現抑制を生じさせる。それゆえ、これらを細胞、組織、器官、個体等に導入して培養することにより、遺伝子改変された細胞、組織、器官、個体等が得られる。以下においては、このような細胞、組織、個体を総称して「遺伝子改変体」と呼ぶ。
【０２４１】
遺伝子改変体は、例えば、目的の遺伝子を被導入体で発現させる非ヒトのトランスジェニク動物（具体的には、トランスジェニックマウス等）や、所定の遺伝子（すなわち標的遺伝子）を人為的に破壊し遺伝子機能を欠損させた非ヒトのノックアウト動物（具体的には、ノックアウトマウス等）を含む。
【０２４２】
病態モデルによる治療効果や治療法の評価は医薬品を開発していく上で重要なプロセスであり、当該プロセスでは個体レベルで解析が行われる。個体レベルの解析は、ヒトを使っての研究が困難であるため、マウス、ラット、サル等のモデル動物を用いて行われる。特に、マウスのゲノム解読が行われたことに伴い、ヒトのモデルとしてのマウスの重要性が高く、遺伝子改変マウス（特にトランスジェニックマウス）の有用性は高い。
【０２４３】
病態モデルとなる遺伝子改変体において、標的遺伝子は、その発現量の変化（増減）又は欠如が疾病の原因となる遺伝子である。かかる遺伝子の一例としては、白血病、大腸癌、脳腫瘍、肝癌、胃癌、肺癌、膀胱癌、卵巣癌、直腸癌、乳癌、腎臓癌、すい臓癌、口腔癌、甲状腺癌、グリオーマ、メラノーマ、皮膚癌、前立腺癌等に関与する遺伝子や、眼疾患、具体的には緑内障、加齢黄斑変性症等に関与する遺伝子や、アレルギー疾患、具体的には喘息・気道過敏症、アトピー等に関与する遺伝子や、関節リュウマチ等のリュウマチ疾患に関与する遺伝子や、骨粗しょう症等の骨疾患に関与する遺伝子や、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋ジストロフィ等の神経疾患に関与する遺伝子が挙げられる。
【０２４４】
一般的に、哺乳動物個体でのＲＮＡｉによる遺伝子発現抑制が可能であることは、ｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡ自体、あるいはこれらを発現する核酸発現ベクターを、例えばマウス等の哺乳動物個体へ直接注射することによって確認されている。さらに、個体で長期間の遺伝子発現抑制を行うには、染色体に二本鎖ＲＮＡを発現するＤＮＡ構築物を挿入する必要がある。その方法としては、受精核前核への顕微注入による方法、レンチウイルスによる方法、ＥＳ細胞を利用する方法等が確立されている。当業者は、これらの公知の方法を利用して、ＲＮＡｉを誘起するＤＮＡ構築物が生殖系列に組み込まれた遺伝子改変動物（トランスジェニック動物）を作製することが可能である。
【０２４５】
本発明にかかる発現ベクター又はｓｈＲＮＡ前駆体は、前述のように、細胞・組織特異的に遺伝子発現を抑制するものである。したがって、このような標的遺伝子の発現系を備えたヒト由来の培養細胞に導入することにより、上記の疾患についてヒト型の疾病モデル細胞を取得することができる。また、マウスに導入することにより、上記の疾患にかかる病態モデルとなるトランスジェニックマウスを取得することができる。そして、得られた疾病モデル細胞やトランスジェニックマウスを利用すれば、上記疾病の治療や予防に関する医薬組成物のスクリーニングや評価等を行うことが可能である。
【０２４６】
特に、上述のＲＮＡ干渉のオンオフ制御が可能な核酸を含む発現ベクターが導入された遺伝子改変体は、以下の点に鑑み、より有用性が高い。すなわち、例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを適用した核酸が導入されたトランスジェニックマウスでは、遺伝子破壊を行うと胎生致死を引き起こす遺伝子を標的遺伝子とする場合、従来では胎生致死が生じるので成体を取得することが困難であったが、本発明を適用すれば遺伝子破壊の時期を調節することが可能となるので、生体まで生育させてから当該遺伝子を破壊することができる。それゆえ、目的とする標的遺伝が破壊されたトランスジェニックマウスの作製が実現可能となる。
【０２４７】
以上のように、本発明によれば、研究目的に合致した最適設計の実験用遺伝子改変体を取得することが可能となり、目的とする遺伝子の機能の解明や開発中の薬剤等の治療効果の評価等において十分な根拠に基づく適正なデータを提供することが可能となる。したがって、特に、創薬分野等における研究開発において有用である。
【０２４８】
８．標的遺伝子の発現抑制方法に使用するためのキット
本発明はさらに、標的遺伝子の発現抑制方法に使用するためのキットを提供する。本発明のキットは、本発明の発現ベクター及び／又はｓｈＲＮＡ前駆体を含む。
【０２４９】
本発明の発現ベクター及び／又はｓｈＲＮＡ前駆体の他に、本発明のキットは、必要に応じ、所望の酵素、バッファー等の試薬類、発現ベクター及び／又はｓｈＲＮＡ前駆体導入のための試薬類等を含む。なお、かかるキットは、発現ベクター及び／又はｓｈＲＮＡ前駆体を含めば上記全てを含む必要はなく、また、これ以外のものを含んでもよい。試薬類等の組み合わせや量等は、目的とするＲＮＡ干渉に応じて適宜決定される。
【発明の効果】
【０２５０】
本発明により、ＲＮＡ干渉効果が高いｓｉＲＮＡを高効率で産生することが可能となる。
【実施例】
【０２５１】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【０２５２】
（実施例１）
実施例１では、本発明の核酸を鋳型として利用した、本発明のｓｈＲＮＡ前駆体から産生されるｓｉＲＮＡを用いたホタルルシフェラーゼの活性抑制効果を検討した。
【０２５３】
具体的には、図１の１００に示すｓｉＲＮＡ作製方法１００に従って、本発明の核酸１０１を鋳型にした転写によって得られたｓｈＲＮＡ前駆体１０からｓｉＲＮＡ１４を産生し、ＲＮＡ干渉を生じさせた。また、比較のため、化学合成により作製した二本鎖ｓｉＲＮＡを用いて同様にＲＮＡ干渉効果を検討した。さらに、図１５に示すｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを用いた従来の方法によりｓｉＲＮＡ５０９を作製して同様にＲＮＡ干渉効果を検討した。以下に詳細を説明する。
【０２５４】
１．ＲＮＡ干渉効果を測定するための標的遺伝子
ＲＮＡ干渉効果を測定するための標的遺伝子として、ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ，Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ）のｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子（Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ  ｌｕｃ遺伝子：ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｕ４７２９６）を用いた。また、当該標的遺伝子を含む発現ベクターとして、ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いた。Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ  ｌｕｃ遺伝子断片はこのベクター中でＳＶ４０のプロモーターとポリＡシグナルで挟まれた構成になっている。また、内部コントロール遺伝子としてウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，Ｒ．ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｌｕｃ遺伝子を用い、当該遺伝子を含む発現ベクターとしてｐＲＬ−ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いた。
【０２５５】
２．細胞培養
本実施例では、ヒトＨｅＬａ細胞を用いた。ヒトＨｅＬａ細胞の培地としては、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ：Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）に、非慟化１０％牛胎児血清（ＦＢＳ：三菱化学社製）及び抗生物質としてペニシリン（明治製菓社製）１０Ｕ単位／ｍｌ、ストレプトマイシン（明治製菓社製）５０μｇ／ｍｌを添加して調製した培地を用いた。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２とした。
【０２５６】
３．ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド
以下の実施例１、比較例１、比較例２の方法により、図１０に示すＦＬ７７４、ＦＬ３０９、ＦＬ４２８、ＦＬ６５８、及びＦＬ１４の各塩基配列を有するｓｉＲＮＡを作製した。
【０２５７】
（３−１）本発明の方法によるｓｉＲＮＡの作製（実施例１）
実施例のｓｈＲＮＡは、図１に示すように、本発明の核酸１０１を用いてｓｉＲＮＡの作製方法１００に従って作製した。
【０２５８】
具体的には、ＴＲＥ２プロモーターをＣＭＶプロモーターに置換したｐＴＲＥ２ベクターをベクター本体として用い、図７に示すように、かかるベクターのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）にｍｉＲ１８７塩基配列を挿入した。さらに、ｍｉＲ１８７塩基配列の所定領域を制限酵素ＤｒａＩＩＩとＰｓｈＡ１とで切断して除去し、当該塩基配列に代わり、ｓｈＲＮＡ形成領域７を含む挿入配列を導入した。
【０２５９】
実施例１では、先ず、挿入配列の異なる複数の核酸発現ベクターを作製した。各核酸発現ベクターの挿入配列に含まれるｓｈＲＮＡ形成領域７は、図１０に示すセンス鎖及びアンチセンス鎖からなるｓｉＲＮＡ１４（図１参照）を合成可能な構成を有し、ループ領域５は、全ベクター共通でｍｉＲ３０ａのループを与える構成を有する。当該構成は、図７の枠内に示すように、所定の塩基配列とともに核酸発現ベクターのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）に挿入される。ＦＬ３０９、ＦＬ４２８、ＦＬ６５８，ＦＬ１４の塩基配列を挿入配列に含む場合についても、上記のＦＬ７７４の場合と同様にしてそれぞれ核酸発現ベクターを作製した。なお、７７４、３０９、４２８、６５８，１４の各数値は、標的遺伝子であるｌｕｃ遺伝子（ＦＬ）における対応する標的配列の位置を示しており、アンチセンス配列の３´末端に対応する、ルシフェラーゼのコード領域内のヌクレオチドの位置を示す。
【０２６０】
（３−２）化学合成によるｓｉＲＮＡの作製（比較例１）
上記実施例の方法により作製されたｓｉＲＮＡとの比較のため、図１０に示すＦＬ７７４、ＦＬ３０９、ＦＬ４２８、ＦＬ６５８、ＦＬ１４の構成を有する二本鎖ｓｉＲＮＡを、化学合成により作製した。
【０２６１】
ｓｉＲＮＡの合成は、プロリゴ・ジャパン株式会社に委託した。合成方法として、ここでは、図１０に示す塩基配列を有するセンス鎖とアンチセンス鎖とを、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭのＮａＣｌ反応溶液中、９０℃で３分間加熱した。そして、３７℃で１時間インキュベートし、その後、室温になるまで放置して会合させ二本鎖ｓｉＲＮＡを形成した。このようにして形成した二本鎖ｓｉＲＮＡは、ＴＢＥ緩衝液中で２％アガロースゲルを用いる電気泳動に供し、それによりセンス鎖とアンチセンス鎖との会合の確認を行った。
【０２６２】
（３−３）ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを用いたｓｉＲＮＡの作製（比較例２）
上記実施例のｓｈＲＮＡとの比較のため、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを用いた図１５に示す従来の方法により、比較例のｓｉＲＮＡ５０９（図１５参照）を作製した。
【０２６３】
図９は、比較例における核酸発現ベクターの構成を示す図である。図９に示すように、ここでは、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターとしてＨ１プロモーターを備えたｐＳｉｌｅｎｃｅｒ  ３．０−Ｈ１（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用い、当該ベクターのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩクローニングサイトに、ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域５０２を含む塩基配列を挿入した。
【０２６４】
比較例２のｓｈＲＮＡ前駆体コード領域５０２は、図１０に示すＦＬ７７４、ＦＬ３０９、ＦＬ４２８、ＦＬ６５８、ＦＬ１４の各ｓｉＲＮＡを合成可能な構成を有し、ループ領域５０３としてｍｉＲ２３のループを与える構成を有する。例えば、ＦＬ７７４を転写産物として与える図７の核酸発現ベクターは、クローニングサイトに、図８に示す挿入配列が挿入されて構成される。
【０２６５】
４．ＲＮＡ干渉効果の測定
１×１０５細胞／ｍｌの濃度でヒトＨｅＬａ細胞を含む細胞懸濁液１ｍｌを、トランスフェクトの２４時間前に１．５ｃｍ径ウェルの２４穴プレートに植付けた。そして、各ウェルについて、ｌｕｃ遺伝子の発現ベクターである前述のｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌベクター１μｇと、内部コントロール遺伝子であるウミシイタケのｌｕｃ遺伝子の発現ベクターである前述のｐＲＬ−ＳＶ４００．１μｇと、（３−１）記載の本発明の核酸発現ベクター５００ｎｇとを添加し、それにより、ヒトＨｅＬａ細胞にこれらベクターを導入した。
【０２６６】
細胞導入には、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用した。導入後、７２時間培養し、その後、細胞を回収した。回収した細胞は、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、二種類のルシフェラーゼ（Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ  ｌｕｃ及びＲ．ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ｌｕｃ）のタンパクの発現量（言い換えれば、ルシフェラーゼ活性）を測定した。発光量の測定はＬｕｍａｔ  ＬＢ９５０７  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（ＥＧ＆Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製）を用いて行った。
【０２６７】
また、比較のため、（３−１）記載の本発明の核酸発現ベクターの代わりに、（３−２）記載のｓｉＲＮＡ（比較例１）、及び（３−３）記載の核酸発現ベクター（比較例２）をそれぞれ用いて上記と同様の操作を行い、これら比較例におけるＲＮＡ干渉効果の測定を行った。
【０２６８】
比較例１の場合は、５０ｎＭの（３−２）記載の各ｓｉＲＮＡを導入し、その後、２４時間培養してから細胞を回収した。また、比較例２の場合は、（３−３）記載の核酸発現ベクターを、（３−１）記載の核酸発現ベクターの場合と同様に、５００ｎｇ／ｍｌの濃度で導入し、その後、７２時間培養してから細胞を回収した。
【０２６９】
５．結果
実施例１、比較例１及び比較例２の各方法で作成されたｓｉＲＮＡにつき、ＦＬ７７４、ＦＬ３０９、ＦＬ４２８、ＦＬ６５８、ＦＬ１４の各ＲＮＡ干渉効果を図１１に示した。図１１から明らかなように、実施例のｓｉＲＮＡでは、ＦＬ７７４、ＦＬ３０９、ＦＬ４２８、６５８に対してＲＮＡ干渉効果が有効に奏されるが、ＦＬ１４では奏されないことが示された。また、比較例１のｓｉＲＮＡでは、本発明の実施例１のｓｉＲＮＡと同様に、ＦＬ７７４、ＦＬ３０９、ＦＬ４２８、ＦＬ６５８に対してＲＮＡ効果が有効に奏されるが、ＦＬ１４では奏されないことが示された。また、比較例２のｓｉＲＮＡでは、ＦＬ７７４に対してはＲＮＡ効果が有効に奏されるが、ＦＬ３０９、ＦＬ４２８、ＦＬ６５８、ＦＬ１４に対しては奏されないことが示された。
【０２７０】
上記結果を考察すると、実施例１の本発明の方法で作製されたｓｉＲＮＡがＦＬ１４に対してＲＮＡ干渉効果を奏さないのは、ＦＬ１４がＲＮＡ干渉の標的とする標的遺伝子の規定配列が本願の請求の範囲及び明細書に記載の（２）の規則を満たさないことに起因すると考えられる。また、比較例１のｓｉＲＮＡがＦＬ１４に対してＲＮＡ干渉効果を奏さないのもこれと同じ理由によると考えられる。実施例１の方法で作成されたｓｉＲＮＡと比較例１の方法で化学合成されたｓｉＲＮＡが、同様のｓｉＲＮＡ干渉効果を示すことは、本発明のｓｈＲＮＡ前駆体を産生するための核酸、及び当該核酸を利用したｓｈＲＮＡ前駆体の産生方法が有効に機能して、ｓｈＲＮＡ前駆体が産生されたこと、そして、ｓｈＲＮＡ前駆体から、ｓｈＲＮＡ次いでｓｉＲＮＡが産生されたことを意味する。
【０２７１】
一方、比較例２の方法で作製されるｓｉＲＮＡがＦＬ３０９に対してＲＮＡ干渉効果を奏さないのは、Ｈ１プロモーターの特性、具体的には転写開始配列上の制限（すなわち転写開始配列がＡ又はＧであることが必要）に起因すると考えられる。また、ＦＬ４２８に対してＲＮＡ干渉効果を奏さないのは、Ｈ１プロモーターの特性、具体的には転写開始配列上の制限（すなわち転写開始配列がＡ又はＧであることが必要）と転写終了配列上の制限（すなわち配列途中に４塩基以上のＴを含まないことが必要）に起因すると考えられる。また、ＦＬ６５８に対してＲＮＡ干渉効果を奏さないのは、Ｈ１プロモーターの特性、具体的には転写終了配列上の制限に起因すると考えられる。即ち、これらの場合には、挿入配列の塩基配列がＨ１プロモーターの特性に合致しないため、転写が実質的に行われない、あるいはＲＮＡ干渉が観察されるほど十分なｓｉＲＮＡが産生されるほど十分には転写が行われない、ことを意味する。また、ＦＬ１４に対してＲＮＡ干渉効果を奏さないのは、Ｈ１プロモーターの特性、具体的には転写開始配列上及び転写終了配列上の制限に起因するとともに、実施例及び比較例１の方法で作成されたｓｉＲＮＡと同様の理由に、ＲＮＡ干渉の標的とする標的遺伝子の規定配列が本願の請求の範囲及び明細書に記載の（２）の規則を満たさないことに起因すると考えられる。
【０２７２】
（実施例２）
実施例２においては、本発明のｓｉＲＮＡの塩基配列について検討を行った。
【０２７３】
１．核酸発現ベクターの作製  
実施例２では、図７に示す核酸発現ベクターのマルチクローニングサイトＭＣＳのｍｉＲ１８７塩基配列に、図１２Ａ〜図１２Ｅに示す各塩基配列を転写産物に与える塩基配列を挿入し、ｐＴＲＥ２−ＦＬ７７４−３０ａＬ１、ｐＴＲＥ２−ＦＬ７７４−３０ａＬ２、ｐＴＲＥ２−ＦＬ７７４−３０ａＭ１、ｐＴＲＥ２−ＦＬ７７４−３０ａＭ１＊、ｐＴＲＥ２−ＦＬ７７４−３０ａＭ２をそれぞれ作製した。このようにして作製した各核酸発現ベクターでは、ｓｈＲＮＡ形成領域７（図７参照）から、図１０に示すＦＬ７７４のセンス配列及びアンチセンス配列とｍｉＲ３０ａのループ配列とを有するｓｈＲＮＡが得られる。図１２Ａ〜図１２Ｅにおいて、図中に印をつけた部分は、塩基配列の異なる部分である。
【０２７４】
また、対照として、図１２Ｆに示す塩基配列を転写産物に与える塩基配列を挿入した核酸発現ベクターを作製した。なお、実施例２及び対照の核酸発現ベクターの作製では、ベクター本体として用いたｐＴＲＥ２ベクターのＴＲＥ２プロモーターをＣＭＶに置換せずにそのまま利用した。
【０２７５】
２．ＲＮＡ干渉効果の測定
実施例の核酸発現ベクターｐＴＲＥ２−ＦＬ７７４−３０ａＬ１、ｐＴＲＥ２−ＦＬ７７４−３０ａＬ２、ｐＴＲＥ２−ＦＬ７７４−３０ａＭ１、ｐＴＲＥ２−ＦＬ７７４−３０ａＭ１＊、ｐＴＲＥ２−ＦＬ７７４−３０ａＭ２と、Ｃｏｎｔｒｏｌの核酸発現ベクターとを用いて、実施例１と同様の方法によりＲＮＡ干渉効果の測定を行った。ここでは、実施例及び対照の核酸発現ベクターの導入濃度を５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ及び１５０ｎｇ／ｍｌとし、それぞれの場合について、導入後に７２時間培養した細胞のＲＮＡを抽出してＲＮＡ干渉効果を測定した。
【０２７６】
３．結果
図１３は、ＲＮＡ干渉効果の測定結果を示す図である。図１３に示すように、核酸発現ベクターｐＴＲＥ２−ＦＬ７７４−３０ａＬ１、ｐＴＲＥ２−ＦＬ７７４−３０ａＬ２、ｐＴＲＥ２−ＦＬ７７４−３０ａＭ１、ｐＴＲＥ２−ＦＬ７７４−３０ａＭ１＊、ｐＴＲＥ２−ＦＬ７７４−３０ａＭ２は、ＲＮＡ干渉効果を奏することが明らかとなった。
【０２７７】
（実施例３）
実施例３においては、Ｔｅｔ  ｏｆｆシステムを導入した本発明にかかる核酸発現ベクターのＲＮＡ干渉オンオフ制御について検討した。
【０２７８】
ここでは、ＴＲＥ２プロモーターを備えた図７に示すｐＴＲＥ２ベクターを用い、ＦＬ７７４のｓｉＲＮＡを合成可能な構成とｍｉＲ３０ａのループを与える構成とを有する核酸発現ベクターを作製した。
【０２７９】
図１４は、核酸発現ベクターの濃度が５、５０、５００ｎｇ／ｍｌの各場合におけるドキシサイクリン（Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）濃度とＲＮＡ干渉効果との関係を示す図である。図１４に示すように、核酸発現ベクターの濃度が５０、５００ｎｇ／ｍｌの場合には、ドキシサイクリンの濃度が０．１ｎｇ／ｍｌ以下となるとＲＮＡ干渉効果が有効に奏される。したがって、ドキシサイクリン濃度０．１ｎｇ／ｍｌより高いとＲＮＡ干渉がオフとなるいわゆるＴｅｔ  ｏｆｆシステムが実現されることが示された。核酸発現ベクターの濃度が５ｎｇ／ｍｌの場合には、作製されるｓｈＲＮＡが低濃度となるため、５０、５００ｎｇ／ｍｌの場合のような顕著なＲＮＡ干渉効果は得られなかった。この場合においても、Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅの非存在下（濃度０．０ｎｇ／ｍｌ）の場合にＲＮＡ干渉効果が有効に奏されること、言い換えれば、発現ベクターの濃度が５ｎｇ／ｍｌの場合においてもＴｅｔ  ｏｆｆシステムが実現されることが示された。
【０２８０】
（実施例４）
実施例４においては、上記実施例３のＴｅｔ  ｏｆｆシステムの代わりにＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムを導入して、ＲＮＡ干渉オンオフ制御を行う場合を検討した。
【０２８１】
具体的には、実施例４では、実施例３と同様のｐＴＲＥ２ベクターを使用し、１）図３Ａに示すように、ｌｏｘＰサイト３０に挟まれたＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）コード領域３１がｐｏｌＩＩ系プロモーター領域２とｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１との間に配置された構成を有するベクター、および、２）図４Ａに示すようにｌｏｘＰサイト３０に挟まれたｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１がｐｏｌＩＩ系プロモーター領域２とＥＧＦＰコード領域３１との間に配置された構成を有するベクター、をそれぞれ作製した。各ベクターをそれぞれ細胞に導入した。そして、上記１）のベクターが導入された細胞、および上記２）のベクターが導入された細胞の各々について、Ｃｒｅ非存在／存在の各場合におけるベクター導入から３日後の蛍光発光を蛍光顕微鏡で観察するとともに、実施例３と同様にしてＲＮＡ干渉効果を調べた。ここでは、「Ｃｒｅ存在」の場合のＣｒｅ濃度を０．１μｇ／ｍｌとした。
【０２８２】
以下、図１６Ａ、１６Ｂ、１７Ａ，１７Ｂを参照して実施例４の結果を述べる。なお、各図において、左側の図は、通常状態で観察した細胞表面を示しており、右側の図は、蛍光発光可能な状態で観察した細胞表面を示している。当該右側の図において、白く現れている部分が蛍光発光した部分である。
【０２８３】
図１６Ａは、ｌｏｘＰサイト３０間にＥＧＦＰコード領域３１が配置された上記１）のベクター（図３Ａ参照）を導入した細胞のＣｒｅ非存在下における蛍光発光を示す図である。図１６Ａに示すように、この場合は、ＥＧＦＰコード領域３１（図３Ａ参照）が欠損しないため、ＥＧＦＰが転写合成されて発現し、蛍光が観察される。一方、ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１（図３Ａ参照）の転写は行われないため、ＦＬ７７４が形成されず、よって、ＲＮＡ干渉効果は奏されなかった（データ示さず）。
【０２８４】
図１６Ｂは、１）のベクターを導入した細胞のＣｒｅ存在下における蛍光発光を示す図である。図１６Ｂに示すように、この場合は、ＥＧＦＰコード領域３１（図３Ａ参照）が欠損するため（図３Ｂ参照）、ＥＧＦＰが発現せず、よって、蛍光が観察されない。一方、当該欠損によりｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１（図３Ｂ参照）の転写が行われるため、この場合にはＦＬ７７４が形成されて実施例３と同様のＲＮＡ干渉効果が奏された（データ示さず）。
【０２８５】
以上のように、図１６Ａおよび図１６Ｂに示す結果から、１）のベクターによれば、Ｃｒｅ非存在下でＲＮＡ干渉がオフとなりＣｒｅ存在下でオンとなる、いわゆるＣｒｅ−Ｏｎシステムが実現されることが示された。
【０２８６】
図１７Ａは、ｌｏｘＰサイト３０間にｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１が配置された上記２）のベクター（図４Ａ参照）を導入した細胞のＣｒｅ非存在下における蛍光発光を示す図である。図１７Ａに示すように、この場合は、ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１（図４Ａ参照）が欠損しないため、ＥＧＦＰコード領域３１（図４Ａ参照）は転写されずＥＧＦＰが発現せず、よって、蛍光は観察されない。一方、ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１（図４Ａ参照）では転写が行われてＦＬ７７４が形成されるため、実施例３と同様のＲＮＡ干渉効果が奏された（データは示さず）。
【０２８７】
図１７Ｂは、上記２）のベクターを導入した細胞のＣｒｅ存在下における蛍光発光を示す図である。図１７Ｂに示すように、この場合は、ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１（図４Ａ参照）が欠損するため（図４Ｂ参照）、ＥＧＦＰコード領域３１（図４Ｂ参照）の転写が行われてＥＧＦＰが発現し蛍光が観察される。一方、当該欠損によりｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１（図３Ｂ参照）の転写が行われずＦＬ７７４が形成されないため、この場合にはＲＮＡ干渉効果が奏されなかった（データは示さず）。
【０２８８】
以上のように、図１７Ａおよび図１７Ｂに示す結果から、２）のベクターによれば、Ｃｒｅ存在下でＲＮＡ干渉がオフとなりＣｒｅ非存在下でオンとなる、いわゆるＣｒｅ−Ｏｆｆシステムが実現されることが示された。
【０２８９】
さらに、図５Ａおよび図６Ａに示す逆位型構成を有するベクターをそれぞれ作製し、上記と同様の方法により蛍光発光およびＲＮＡ干渉効果を調べた。
図５Ａに示す構成のベクターを導入した細胞では、Ｃｒｅ存在下において、図５Ａに示すようにＥＧＦＰコード領域５１の転写が行われてＥＧＦＰが発現し蛍光が観察されるが、ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１の転写が行われないためＦＬ７７４は形成されず、よって、ＲＮＡ干渉効果は奏されなかった（データは示さず）。一方、Ｃｒｅ非存在下では、図５Ｂに示すように、ｐｏｌＩＩプロモーターの逆位が生じるため、ＥＧＦＰコード領域５１の転写は行われずＥＧＦＰが発現しないので蛍光は観察されないが、ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１の転写が行われてＦＬ７７４が形成されるのでＲＮＡ干渉効果が奏された（データは示さず）。以上のように、図５Ａに示す構成のベクターによれば、Ｃｒｅ非存在下でＲＮＡ干渉がオフとなりＣｒｅ存在下でオンとなる、いわゆるＣｒｅ−Ｏｎシステムが実現されることが示された。
【０２９０】
また、図６Ａに示す構成のベクターを導入した細胞では、Ｃｒｅ非存在下において、図６Ａに示すようにＥＧＦＰコード領域５１の転写が行われないためＥＧＦＰは発現せず蛍光が観察されないが、ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１の転写は行われるのでＦＬ７７４が形成されＲＮＡ干渉効果が奏された（データは示さず）。一方、Ｃｒｅ非存在下では、図６Ｂに示すようにｐｏｌＩＩプロモーターの逆位が生じるため、ＥＧＦＰコード領域５１の転写が行われてＥＧＦＰが発現し蛍光が観察されるが、ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域１の転写は行われずＦＬ７７４が形成しないのでＲＮＡ干渉効果は奏されなかった（データは示さず）。以上のように、図６Ａに示す構成のベクターによれば、Ｃｒｅ存在下でＲＮＡ干渉がオフとなりＣｒｅ非存在下でオンとなる、いわゆるＣｒｅ−Ｏｆｆシステムが実現されることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０２９１】
本発明は、遺伝子解析、創薬ターゲットの探索、創薬、遺伝子治療／予防、生物種間の差の研究等のＲＮＡ干渉を利用する様々な試験、研究、開発、製造等において有用に利用される。特に、本発明によれば、トランスジェニック動物の作製が可能となることから、その有用性は高い。
【図面の簡単な説明】
【０２９２】
【図１】図１は、本発明のショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）前駆体を産生するための核酸の構造、並びに、当該核酸を利用した本発明のｓｈＲＮＡ及びｓｉＲＮＡの作製方法の一例を、模式的に示す図である。
【図２】図２は、本発明の核酸を利用した本発明のｓｈＲＮＡ及びｓｉＲＮＡの作製方法の、他の例を模式的に示す図である。
【図３】図３は、Ｃｒｅ−ｌｏｘシステムによりＲＮＡ干渉のオンオフ制御可能な、本発明の核酸の構成例を模式的に示す図である。
【図４】図４は、Ｃｒｅ−ｌｏｘシステムによりＲＮＡ干渉のオンオフ制御可能な、本発明の核酸の構成例を模式的に示す図である。
【図５】図５は、Ｃｒｅ−ｌｏｘシステムによりＲＮＡ干渉のオンオフ制御可能な、本発明の核酸の構成例を模式的に示す図である。
【図６】図６は、Ｃｒｅ−ｌｏｘシステムによりＲＮＡ干渉のオンオフ制御可能な、本発明の核酸の構成例を模式的に示す図である。
【図７】図７は、本発明のｓｈＲＮＡ発現ベクターの構成を説明するための図である。図７はさらに、発現ベクターに挿入されるｍｉＲ１８７塩基配列を示す。ｍｉＲ１８７塩基配列は、ＦＬ７７４（センス鎖領域＋アンチセンス領域）＋ｍｉＲ３０ａからなるｓｈ形成領域を含む。本明細書において、例えば、「ＦＬ７７４（センス鎖領域＋アンチセンス領域）＋ｍｉＲ３０ａの塩基配列」は、文意により、「ＦＬ７７４（センス鎖領域＋アンチセンス領域）＋ｍｉＲ３０ａ」を含むｓｈＲＮＡ前駆体若しくはｓｈＲＮＡ中のＲＮＡ配列、又はこれらＲＮＡを産生するための鋳型ＤＮＡ中のＤＮＡ配列、のいずれか又は双方を意味する。
【図８】図８は、実施例１中の比較例２において、発現ベクターに挿入される、ＦＬ７７４−ｍｉＲ２３を産生するためのＤＮＡ塩基配列を示す。ＦＬ７７４−ｍｉＲ２３塩基配列は、ＦＬ７７４（センス鎖領域＋アンチセンス領域）＋ｍｉＲ２３からなるｓｈＲＮＡ形成領域を含む。
【図９】図９は、実施例１中の比較例２において使用した、従来のｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを備えるｓｈＲＮＡ発現ベクターの構成を説明するための図である。
【図１０】図１０は、実施例１において、実施例１及び比較例２で発現ベクターのクローニングサイトに挿入された、あるいは、比較例１で化学合成された、センス鎖及びアンチセンス鎖の塩基配列を示す。
【図１１】図１１は、実施例１及び比較例１、２におけるＲＮＡ干渉効果測定結果を示す図である。濃い黒色バー、白いバー、及び薄い黒色バーは各々、実施例１、比較例１及び比較例２を示す。
【図１２】図１２は、実施例２のｓｈＲＮＡ前駆体の塩基配列を説明するための図である。
【図１３】図１３は、実施例２におけるＲＮＡ干渉効果の測定結果を示す図である。白いバー、濃い黒色バー及び薄い黒色バーは各々、発現ベクターを５ｎｇ、５０ｎｇ及び１５０ｎｇ使用した場合の結果である。
【図１４】図１４は、実施例３におけるＲＮＡ干渉効果の測定結果を示す図である。白いバー、濃い黒色バー及び薄い黒色バーは各々、発現ベクターを５ｎｇ、５０ｎｇ及び５００ｎｇ使用した場合の結果である。
【図１５】図１５は、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを含む、従来のｓｈＲＮＡ及びｓｉＲＮＡの作製方法を、当該方法に使用するための核酸の構造とともに記載する。
【図１６】実施例４において、図３Ａ及び３Ｂの核酸を利用して、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムに基づくＲＮＡ干渉オンオフ制御を行った、結果を示す。各図において、左側の図は、通常状態で観察した細胞表面を示しており、右側の図は、蛍光発光可能な状態で観察した細胞表面を示している。当該右側の図において、白く現れている部分が蛍光発光した部分である。
【図１７】実施例４において、図４Ａ及び４Ｂの核酸を利用して、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムに基づくＲＮＡ干渉オンオフ制御を行った、結果を示す。各図において、左側の図は、通常状態で観察した細胞表面を示しており、右側の図は、蛍光発光可能な状態で観察した細胞表面を示している。当該右側の図において、白く現れている部分が蛍光発光した部分である。
【符号の説明】
【０２９３】
１    ｓｈＲＮＡ前駆体コード領域
２    ｐｏｌＩＩ系プロモーター
３Ａ，３Ｂ  Ｄｒｏｓｈａ認識領域
４，４ａ    センス鎖領域
５，５ａ    ループ領域
６，６ａ    アンチセンス鎖領域
７    ｓｈＲＮＡ形成領域
８    終了シグナル領域
１０  ｓｈＲＮＡ前駆体
１１  Ｄｒｏｓｈａ
１２  ｓｈＲＮＡ
１３  Ｄｉｃｅｒ  
１４  ｓｉＲＮＡ
３０，５０  ｌｏｘＰサイト
１００，２００    ｓｉＲＮＡ作製方法
１０１〜１０６    本発明のｓｈＲＮＡ前駆体を産生するための核酸
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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