(57)【要約】【課題】塩基配列に関する新規な情報取得方法を提供する。【解決手段】標的核酸にプライマーがハイブリダイゼーションした試料又はプロモーター配列を含む標的核酸からなる試料と、ポリメラーゼと、電気化学的に変換し得る部分を有するヌクレオチド誘導体と、を用意し、当該三者を溶媒中で共存させ、前記プライマーまたは転写産物に該ヌクレオチド誘導体が導入されているか否かを、電気化学反応を用いて検出することを特徴とする塩基配列に関する情報取得方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基配列に関する情報取得方法であって、
電気化学的に脱離し得る脱離部を有する複数種のヌクレオチド誘導体と、
標的核酸とプライマーとにより二本鎖化した試料と、
ポリメラーゼと、を用意し、
前記試料と前記ポリメラーゼと前記ヌクレオチド誘導体とを溶媒中で共存させて、前記ヌクレオチド誘導体によって前記プライマーを１塩基分伸長し、
前記試料に電圧を印加し、前記プライマーに取り込まれた前記ヌクレオチド誘導体からの前記脱離部の脱離に起因した電気信号を検出する
ことを特徴とする情報取得方法。
【請求項２】
塩基配列に関する情報取得方法であって、
標的核酸にプライマーがハイブリダイゼーションした試料、またはプロモーター配列を含む標的核酸からなる試料と、
ポリメラーゼと、
電気化学的に変換し得る部分を有するヌクレオチド誘導体と、
を用意し、
該試料と、該ポリメラーゼと、該ヌクレオチド誘導体とを溶媒中で共存させて、該プライマーまたは転写産物に該ヌクレオチド誘導体が導入されているか否かを該電気化学的に変換し得る部分を、電気化学的に変換することにより検出する
ことを特徴とする塩基配列に関する情報取得方法。
【請求項３】
塩基配列に関する情報取得方法であって、
標的核酸にプライマーがハイブリダイゼーションした試料、またはプロモーター配列を含む標的核酸からなる試料と、
ポリメラーゼと、
各々が電気化学的に区別し得る電気化学的に変換し得る部分を有する複数種類のヌクレオチド誘導体と、を用意し、
該試料と、該ポリメラーゼと、該複数種類のヌクレオチド誘導体とを溶媒中で共存させて、該複数種類のヌクレオチド誘導体の内、該プライマー若しくは転写産物に導入されているヌクレオチド誘導体を、それらの電気化学的に変換し得る部分を電気化学的に変換することにより同定することを特徴とする塩基配列に関する情報取得方法。
【請求項４】
前記ヌクレオチド誘導体の前記電気化学的に変換し得る部分は、前記電気化学的変換に起因して、前記ヌクレオチド誘導体から脱離するか、前記ヌクレオチド誘導体を置換するか、あるいは前記ヌクレオチド誘導体に付加を受ける反応が惹起されることを特徴とする請求項２または３に記載の塩基配列に関する情報取得方法。
【請求項５】
塩基配列に関する情報取得装置であって、
電気化学的に変換し得る部分を有するヌクレオチド誘導体を含む試料に電圧を印加するための電圧印加部と、
該ヌクレオチド誘導体の該部分を電気化学的に変換することに起因する電気信号を取得するための電気信号取得部と、
を有することを特徴とする塩基配列に関する情報読取装置。
【請求項６】
前記電気信号取得部からの信号を用いて、前記ヌクレオチド誘導体を同定するための同定部を有することを特徴とする請求項５に記載の塩基配列に関する情報取得装置。
【請求項７】
導電性部材と、該導電性部材に固定化されたポリメラーゼを有する物品。
【請求項８】
標的核酸の情報取得対象位置にある塩基に関する情報を取得するための塩基配列情報取得方法において、
（１）標的核酸と、該標的核酸の塩基配列中の情報取得対象位置にある塩基の３'側方向で一つ前の塩基を含む３'側領域の少なくとも一部を認識し、該３'側領域にハイブリダイゼーションするプライマーと、ポリメラーゼと、電気化学的に変換し得る部分を有するヌクレオチド誘導体と、を用意する工程と、
（２）前記標的核酸の前記情報取得対象位置にある塩基の３'側方向での一つ前の塩基を含む３'側領域に前記プライマーをハイブリダイゼーションする工程と、
（３）前記ハイブリダイゼーションした部分を有する標的核酸に、前記ポリメラーゼの存在下で、前記ヌクレオチド誘導体を共存させる工程と、
（４）前記ヌクレオチド誘導体の有する電気化学的に変換し得る部分を電気化学的に変換することにより、前記プライマーを含む鎖の３'末端の前記情報取得対象位置にある塩基に対応する位置への前記ヌクレオチド誘導体の取り込みの有無を検出し、前記情報取得対象位置にある塩基に関する情報を取得する工程と、
を有することを特徴とする塩基配列情報取得方法。
【請求項９】
前記３'側領域全体を認識するプライマーを用いて前記ハイブリダイゼーションを行う請求項８に記載の塩基配列情報取得方法。
【請求項１０】
前記プライマーが前記３'側領域の一部を認識してハイブリダイゼーションし、前記標的核酸にハイブリダイゼーションしたプライマーの３'末端を伸長して前記３'領域を二本鎖化する請求項８に記載の情報取得方法。
【請求項１１】
前記標的核酸がＤＮＡであり、前記ポリメラーゼとしてＤＮＡポリメラーゼを用い、前記ヌクレオチド誘導体として、各々が電気化学的に区別し得る電気化学的に変換し得る部分を有する２'-デオキシアデノシン ５'-三リン酸誘導体、２'-デオキシシチジン ５'-三リン酸誘導体、２'-デオキシグアノシン ５'-三リン酸誘導体及び２'-デオキシチミジン ５'-三リン酸誘導体の１種以上を用いる請求項８乃至１０のいずれかに記載の情報取得方法。
【請求項１２】
標的核酸の解析対象領域の塩基配列を解析するための塩基配列解析方法において、
（１）標的核酸と、該標的核酸の塩基配列中の解析対象領域の３'側に隣接する塩基を含む３'側領域を認識し、該３'側領域にハイブリダイゼーションするプライマーと、DNAポリメラーゼと、以下のヌクレオチド誘導体のセット：
各々が電気化学的に区別し得る電気化学的に変換し得る部分を有する２'-デオキシアデノシン ５'-三リン酸誘導体、２'-デオキシシチジン ５'-三リン酸誘導体、２'-デオキシグアノシン ５'-三リン酸誘導体及び２'-デオキシチミジン ５'-三リン酸誘導体からなるセット
と、を用意する工程と、
（２）前記標的核酸に前記プライマーをハイブリダイゼーションさせる工程と、
（３）前記プライマーがハイブリダイゼーションした標的核酸に、前記ヌクレオチド誘導体のセットと、ＤＮＡポリメラーゼを、共存させ、前記ヌクレオチド誘導体のセットのうちの１種を前記標的核酸にハイブリダイゼーションしたプライマーの３'末端に取り込ませて、該プライマーを１塩基分伸長する工程と、
（４）前記プライマーの３'末端に取り込まれたヌクレオチド誘導体の電気化学的に変換し得る部分を電気化学的に変換することにより、該取り込まれたヌクレオチド誘導体を特定し、該取り込まれたヌクレオチド誘導体に対応する位置にある前記解析対象領域の塩基を同定する工程と、
（５）前記解析対象領域の塩基数が２以上である場合に、該塩基数に応じて前記（３）から（４）の工程を繰り返し行う工程と、
を有し、
前記（３）の工程で前記プライマーを1塩基分伸長した後には前記電気化学的に変換し得る部分の存在により、DNAポリメラーゼによる前記プライマーの更なる伸長反応が阻害され、
前記（４）の工程で電気化学的に変換し得る部分の電気化学的変換の後には電気化学的変換に起因して、前記取り込まれたヌクレオチド誘導体から脱離するか、置換するか、付加を受ける反応が惹起されることによって、伸長されたプライマーのポリメラーゼによる更なる伸長反応が阻害されない
ことを特徴とする塩基配列解析方法。
【請求項１３】
標的核酸の解析対象領域の塩基配列を解析するための塩基配列解析方法において、
（１）RNAポリメラーゼと、該RNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む標的核酸と、以下のヌクレオチド誘導体のセット：
各々が電気化学的に区別し得る電気化学的に変換し得る部分を有するアデノシン ５'-三リン酸誘導体、シチジン ５'-三リン酸誘導体、グアノシン ５'-三リン酸誘導体及びウリジン ５'-三リン酸誘導体からなるセット
と、を用意する工程と、
（２）前記標的核酸に、前記ヌクレオチド誘導体のセットと、前記RNAポリメラーゼを、共存させ、前記ヌクレオチド誘導体のセットのうちの１種を前記標的核酸に取り込ませて、前記プロモーター配列下流の該標的核酸を１塩基分転写する工程と、
（３）前記転写産物の３'末端に取り込まれたヌクレオチド誘導体の電気化学的に変換し得る部分を電気化学的に変換することにより、該取り込まれたヌクレオチド誘導体を特定し、該取り込まれたヌクレオチド誘導体に対応する位置にある前記標的核酸中の塩基を同定する工程と、
（４）前記解析対象領域の塩基数が２以上である場合に、該塩基数に応じて前記（２）から（３）の工程を繰り返し行う工程と、
を有し、
前記（２）の工程で前記標的核酸を1塩基分転写した後には前記電気化学的に変換し得る部分の存在により、RNAポリメラーゼによる更なる転写反応が阻害され、
前記（３）の工程で電気化学的に変換し得る部分の電気化学的変換の後には電気化学的変換に起因して、前記取り込まれたヌクレオチド誘導体から脱離するか、置換するか、付加を受ける反応が惹起されることによって、転写産物のポリメラーゼによる更なる転写反応が阻害されない
ことを特徴とする塩基配列解析方法。
【請求項１４】
前記ポリメラーゼを電極上に固定し、前記電気信号を、該電極を利用して測定する請求項１２または１３に記載の解析方法。
【請求項１５】
標的核酸中の解析対象領域の塩基配列に関する情報を取得するための装置において、
標的核酸の解析対象領域にある塩基に対して３'側方向で一つ隣りにある塩基を含む３'側領域にプライマーがハイブリダイゼーションした試料、もしくはRNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む標的核酸の試料に対して、電気化学的に変換し得る部分を有するヌクレオチド誘導体を反応させるための反応領域と、
前記反応領域内に設けられたポリメラーゼ固定化電極、対極及び参照電極を有する電極系と、
前記電極系に印加される電圧の制御部と、
前記電極系に印加される電圧と電流の時間変化をデータとして処理するコンピュータと、を少なくとも含む
ことを特徴とする標的核酸中の解析対象領域の塩基配列に関する情報を取得するための装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は標的核酸中に含まれる塩基に関する情報を取得するための情報取得方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の塩基配列を解析する方法として、ダイデオキシ法が知られている（非特許文献１）。ダイデオキシ法を用いて核酸塩基配列を決定する方法として特許文献１が知られている。
【特許文献１】特開平０５−１６８５００号公報
【非特許文献１】Proceedings of National Academy of Sciences,USA,74:5463 〜5467 (1977)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
前記特許文献１に記載の、ダイデオキシ法を用いた塩基配列の解析方法は、電気泳動による伸長ＤＮＡ鎖の分離という工程を含むため、解析結果を得るまでに長時間を要する。
【０００４】
そこで、本発明者らは、電気泳動を用いる場合よりも短時間で塩基配列に関する情報を取得できる方法の探索に注力した結果、本発明を想到するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明が解決しようとする課題は、電気泳動を用いる場合よりも短時間で、塩基配列に関する情報を取得できる情報取得方法及びそのための装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明にかかる第一の情報取得方法は、
塩基配列に関する情報取得方法であって、
電気化学的に脱離し得る脱離部を有する複数種のヌクレオチド誘導体と、
標的核酸とプライマーとにより二本鎖化した試料と、
ポリメラーゼと、を用意し、
前記試料と前記ポリメラーゼと前記ヌクレオチド誘導体とを溶媒中で共存させて、前記ヌクレオチド誘導体によって前記プライマーを１塩基分伸長し、
前記試料に電圧を印加し、前記プライマーに取り込まれた前記ヌクレオチド誘導体からの前記脱離部の脱離に起因した電気信号を検出する
ことを特徴とする。
【０００７】
本発明にかかる第二の情報取得方法は、
塩基配列に関する情報取得方法であって、
標的核酸にプライマーがハイブリダイゼーションした試料、またはプロモーター配列を含む標的核酸からなる試料と、
ポリメラーゼと、
電気化学的に変換し得る部分を有するヌクレオチド誘導体と、
を用意し、
該試料と、該ポリメラーゼと、該ヌクレオチド誘導体とを溶媒中で共存させて、該プライマーまたは転写産物に該ヌクレオチド誘導体が導入されているか否かを該電気化学的に変換し得る部分を、電気化学的に変換することにより検出する
ことを特徴とする。
【０００８】
本発明にかかる第三の情報取得方法は、
塩基配列に関する情報取得方法であって、
標的核酸にプライマーがハイブリダイゼーションした試料、またはプロモーター配列を含む標的核酸からなる試料と、
ポリメラーゼと、
各々が電気化学的に区別し得る電気化学的に変換し得る部分を有する複数種類のヌクレオチド誘導体と、を用意し、
該試料と、該ポリメラーゼと、該複数種類のヌクレオチド誘導体とを溶媒中で共存させて、該複数種類のヌクレオチド誘導体の内、該プライマー若しくは転写産物に導入されているヌクレオチド誘導体を、それらの電気化学的に変換し得る部分を電気化学的に変換することにより同定することを特徴とする。
【０００９】
本発明の第四の情報取得方法は、
標的核酸の情報取得対象位置にある塩基に関する情報を取得するための塩基配列情報取得方法において、
（１）標的核酸と、該標的核酸の塩基配列中の情報取得対象位置にある塩基の３'側方向で一つ前の塩基を含む３'側領域の少なくとも一部を認識し、該３'側領域にハイブリダイゼーションするプライマーと、ポリメラーゼと、電気化学的に変換し得る部分を有するヌクレオチド誘導体と、を用意する工程と、
（２）前記標的核酸の前記情報取得対象位置にある塩基の３'側方向での一つ前の塩基を含む３'側領域に前記プライマーをハイブリダイゼーションする工程と、
（３）前記ハイブリダイゼーションした部分を有する標的核酸に、前記ポリメラーゼの存在下で、前記ヌクレオチド誘導体を共存させる工程と、
（４）前記ヌクレオチド誘導体の有する電気化学的に変換し得る部分を電気化学的に変換することにより、前記プライマーを含む鎖の３'末端の前記情報取得対象位置にある塩基に対応する位置への前記ヌクレオチド誘導体の取り込みの有無を検出し、前記情報取得対象位置にある塩基に関する情報を取得する工程と、
を有することを特徴とする。
【００１０】
本発明の情報取得装置は、
塩基配列に関する情報取得装置であって、
電気化学的に変換し得る部分を有するヌクレオチド誘導体を含む試料に電圧を印加するための電圧印加部と、
該ヌクレオチド誘導体の該部分を電気化学的に変換することに起因する電気信号を取得するための電気信号取得部と、
を有することを特徴とする。
【００１１】
本発明の物品は、導電性部材と、該導電性部材に固定化されたポリメラーゼを有する物品である。
【００１２】
本発明の第一の塩基配列解析方法は、
標的核酸の解析対象領域の塩基配列を解析するための塩基配列解析方法において、
（１）標的核酸と、該標的核酸の塩基配列中の解析対象領域の３'側に隣接する塩基を含む３'側領域を認識し、該３'側領域にハイブリダイゼーションするプライマーと、DNAポリメラーゼと、以下のヌクレオチド誘導体のセット：
各々が電気化学的に区別し得る電気化学的に変換し得る部分を有する２'-デオキシアデノシン ５'-三リン酸誘導体、２'-デオキシシチジン ５'-三リン酸誘導体、２'-デオキシグアノシン ５'-三リン酸誘導体及び２'-デオキシチミジン ５'-三リン酸誘導体からなるセット
と、を用意する工程と、
（２）前記標的核酸に前記プライマーをハイブリダイゼーションさせる工程と、
（３）前記プライマーがハイブリダイゼーションした標的核酸に、前記ヌクレオチド誘導体のセットと、ＤＮＡポリメラーゼを、共存させ、前記ヌクレオチド誘導体のセットのうちの１種を前記標的核酸にハイブリダイゼーションしたプライマーの３'末端に取り込ませて、該プライマーを１塩基分伸長する工程と、
（４）前記プライマーの３'末端に取り込まれたヌクレオチド誘導体の電気化学的に変換し得る部分を電気化学的に変換することにより、該取り込まれたヌクレオチド誘導体を特定し、該取り込まれたヌクレオチド誘導体に対応する位置にある前記解析対象領域の塩基を同定する工程と、
（５）前記解析対象領域の塩基数が２以上である場合に、該塩基数に応じて前記（３）から（４）の工程を繰り返し行う工程と、
を有し、
前記（３）の工程で前記プライマーを1塩基分伸長した後には前記電気化学的に変換し得る部分の存在により、DNAポリメラーゼによる前記プライマーの更なる伸長反応が阻害され、
前記（４）の工程で電気化学的に変換し得る部分の電気化学的変換の後には電気化学的変換に起因して、前記取り込まれたヌクレオチド誘導体から脱離するか、置換するか、付加を受ける反応が惹起されることによって、伸長されたプライマーのポリメラーゼによる更なる伸長反応が阻害されない
ことを特徴とする。
【００１３】
本発明の第二の塩基配列解析方法は、
標的核酸の解析対象領域の塩基配列を解析するための塩基配列解析方法において、
（１）RNAポリメラーゼと、該RNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む標的核酸と、以下のヌクレオチド誘導体のセット：
各々が電気化学的に区別し得る電気化学的に変換し得る部分を有するアデノシン ５'-三リン酸誘導体、シチジン ５'-三リン酸誘導体、グアノシン ５'-三リン酸誘導体及びウリジン ５'-三リン酸誘導体からなるセット
と、を用意する工程と、
（２）前記標的核酸に、前記ヌクレオチド誘導体のセットと、前記RNAポリメラーゼを、共存させ、前記ヌクレオチド誘導体のセットのうちの１種を前記標的核酸に取り込ませて、前記プロモーター配列下流の該標的核酸を１塩基分転写する工程と、
（３）前記転写産物の３'末端に取り込まれたヌクレオチド誘導体の電気化学的に変換し得る部分を電気化学的に変換することにより、該取り込まれたヌクレオチド誘導体を特定し、該取り込まれたヌクレオチド誘導体に対応する位置にある前記標的核酸中の塩基を同定する工程と、
（４）前記解析対象領域の塩基数が２以上である場合に、該塩基数に応じて前記（２）から（３）の工程を繰り返し行う工程と、
を有し、
前記（２）の工程で前記標的核酸を1塩基分転写した後には前記電気化学的に変換し得る部分の存在により、RNAポリメラーゼによる更なる転写反応が阻害され、
前記（３）の工程で電気化学的に変換し得る部分の電気化学的変換の後には電気化学的変換に起因して、前記取り込まれたヌクレオチド誘導体から脱離するか、置換するか、付加を受ける反応が惹起されることによって、転写産物のポリメラーゼによる更なる転写反応が阻害されない
ことを特徴とする。
【００１４】
本発明にかかる、標的核酸中の解析対象領域の塩基配列に関する情報を取得するための装置は、
標的核酸の解析対象領域にある塩基に対して３'側方向で一つ隣りにある塩基を含む３'側領域にプライマーがハイブリダイゼーションした試料、もしくはRNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む標的核酸の試料に対して、電気化学的に変換し得る部分を有するヌクレオチド誘導体を反応させるための反応領域と、
前記反応領域内に設けられたポリメラーゼ固定化電極、対極及び参照電極を有する電極系と、
前記電極系に印加される電圧の制御部と、
前記電極系に印加される電圧と電流の時間変化をデータとして処理するコンピュータと、を少なくとも含む
ことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、電気泳動による伸長DNA鎖の分離という工程を経ることなく、塩基配列に関する情報が取得できるので、電気泳動に要する時間を省くことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
なお、本発明は、電気泳動を用いて塩基配列に関する情報を取得することを含む方法や装置を排除するものではない。例えば、本発明の特徴事項であるヌクレオチド誘導体が有する部分を電気化学的に変換する手法と、電気泳動を用いる手法とを併用することを本発明は排除するものではない。
また、本発明においていう、電気化学的な変換とは、導電性基体を通じた電子の授受に起因して、前記誘導体が有する部分が脱離することや、この電子の授受に起因して惹起される化学結合の切断や、再構成を意味する。
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本発明の核酸の塩基配列の解析方法における各工程を、図１を適宜参照して説明するが、図１（１）〜（４）の詳細を、拡大図として図６（１）、図６（２）、図７（１）及び図７（２）に示している。
【００１８】
Ａ）第１の実施形態
本実施形態は、例えば、所定部分の塩基配列の確定診断用に適用できる。まず、標的核酸とプライマーとにより二本鎖化した試料（標的核酸にプライマーがハイブリダイズした試料）と、ポリメラーゼと、電気化学的に変換し得る部分を有するヌクレオチド誘導体とを用意する（図１（１））。
【００１９】
ヌクレオチド誘導体とは、例えばヌクレオシド ５'-三リン酸誘導体であり、少なくとも以下のものが該当する。
・アデノシン ５'-三リン酸誘導体、
・シチジン ５'-三リン酸誘導体、
・グアノシン ５'-三リン酸誘導体、
・ウリジン ５'-三リン酸誘導体、
・２'-デオキシアデノシン ５'-三リン酸誘導体、
・２'-デオキシシチジン ５'-三リン酸誘導体、
・２'-デオキシグアノシン ５'-三リン酸誘導体、
・２'-デオキシチミジン ５'-三リン酸誘導体
以下、Ｂ）以降の実施形態においても、上記したヌクレオチド誘導体として例示した材料が適宜用いられる。なお、図では、複数種類のヌクレオチド誘導体を記載しているが、必要に応じて、複数種でも、１種類でもよい。
【００２０】
そして、該試料と該ポリメラーゼと該ヌクレオチド誘導体とを溶媒中で共存させる（図１（１））。ここで、当該ヌクレオチドが、プライマーの３'末端に導入される場合（図１（２）（３））と、導入されない場合がある。その後、該プライマーに該ヌクレオチド誘導体が導入されているか否かを、電気化学反応を用いて検出する。検出手法については、後述する。
【００２１】
例えば、１種類のヌクレオチド誘導体のみを試料と共存させた場合に、試料に導入されていれば、当該ヌクレオチド誘導体に対応した塩基が所定部分にあることが分かる。測定結果、導入されていないことが分かれば、当該ヌクレオチド誘導体に対応した塩基は、少なくとも、所定部分には無いことが分かる。こうして、標的核酸の塩基配列に関する情報を取得する。
【００２２】
ここで、情報には、認識しようとする位置における、塩基がアデニン(Ａ)、シトシン(Ｃ)、グアニン(Ｇ)、チミン(Ｔ)などの内、何であるかということは勿論、少なくとも何（例えば、Ａ）ではないということも含む。以下の実施形態においても、同様である。
【００２３】
なお、溶媒とは、例えば、水溶液やゲル状の物質である。
【００２４】
また、ヌクレオチド誘導体の電気化学的に変換し得る部分における、「変換」は、導電性基体を通して行われる電子の授受を通じて生じる化学結合の切断や再構成を意味する。そして、前記「変換」には、前記部分および該部分を含む上位のグループのヌクレオチド誘導体からの脱離、置換、あるいは付加を受ける反応なども含まれる。前記ヌクレオチド誘導体において、電気化学的に変換し得る部分とは、前記電気化学反応により、前記ヌクレオチド誘導体から脱離するか、前記ヌクレオチド誘導体を置換するか、あるいは前記ヌクレオチド誘導体に付加される部位のことである。また、前記部分は、付加される反応が惹起される部分であると捉えることもできる。
電気化学的に活性な（導電性基体と電子の授受をする）官能基として例えば金属錯体がある。この金属錯体のように、中心金属の酸化あるいは還元により酸化数が変化するだけで、化学結合の切断や再構成を伴わないようなものは本発明においては電気化学的に変換し得る部分とは言わない。以下の実施形態でも同様である。
【００２５】
Ｂ）第２の実施形態
標的核酸の塩基配列を読み取る方法について説明する。まず、標的核酸とプライマーとにより二本鎖化した試料(標的核酸にプライマーがハイブリダイゼーションした試料)と、ポリメラーゼと、各々が電気化学的に区別し得る電気化学的に変換し得る部分を有する複数種類のヌクレオチド誘導体と、を用意する。電気化学的に区別し得るとは、それぞれのヌクレオチド誘導体の電気化学的変換に要する電子の数や印加電圧などがそれぞれ異なり、通常の電気化学的測定手段により識別し得ることである。
【００２６】
該試料と、該ポリメラーゼと、該複数種類のヌクレオチド誘導体とを溶媒中で共存させる。これにより、標的核酸の塩基に相補的な塩基をもつヌクレオチド誘導体がプライマーの３'末端に重合される。この際、ヌクレオチド誘導体に導入されている電気化学的に変換し得る部分の存在により、ポリメラーゼによるプライマーの更なる伸長反応が阻害されるようにしておく。このことにより、例え標的核酸が複数分子存在していても、一塩基伸長される毎に重合反応が停止するので、全体の合成反応を同期させることが可能になる。
【００２７】
そして、該複数種類のヌクレオチド誘導体の内、該プライマーの３'末端に導入されているヌクレオチド誘導体を、その電気化学的に変換し得る部分を電気化学的に変換することにより同定する。この際、ヌクレオチド誘導体に導入されている電気化学的に変換し得る部分は、電気化学的変換に起因して惹起される脱離、置換もしくは付加反応によって、ポリメラーゼによる伸長反応が再度可能になるようにしておく。
【００２８】
同定後、ポリメラーゼによる伸長反応は自発的に再開することとなる。従ってポリメラーゼが一塩基分伸長反応をするのに必要な時間だけ待った後に、次の同定のため工程を繰り返し行うことで、標的核酸の塩基配列を逐次読み取ることができる。一般にポリメラーゼによる伸長反応は一塩基あたり500分の1秒で終了するので、高速な塩基配列の解読が可能である。
【００２９】
Ｃ）第３の実施形態
まず、標的核酸とプライマーとにより二本鎖化した試料(標的核酸にプライマーがハイブリダイズした試料)と、ポリメラーゼと、電気化学的に変換し得る部分を有するヌクレオチド誘導体とを溶媒中で共存させる。そして、該溶媒と電気的に接続されている導電性部材から電気信号を検出する。ここでいう電気信号は、前記プライマーに導入された前記ヌクレオチド誘導体の前記部分を、電気化学反応により変換することに起因する信号である。
Ｄ）第４の実施形態
塩基配列に関する情報取得装置は、以下の構成よりなる。すなわち、この装置は、電気化学的に変換し得る部分を有するヌクレオチド誘導体を含む試料に電圧を印加するための電圧印加部（例えば、導電性部材で構成される第１の電極）を有する。更に、この装置は、該ヌクレオチド誘導体の該部分を電気化学的に変換することに起因する電気信号を取得するための電気信号取得部（例えば、第２の電極）を有する。更に、この装置は、前記電気信号取得部からの信号を用いて、前記ヌクレオチド誘導体を同定するための同定部を有することも好ましい。
Ｅ）第５の実施形態
導電性部材と、該導電性部材に固定化されたポリメラーゼとを含み構成される物品は、上記ＡからＤに係る実施形態に好適に利用され得る。
【００３０】
Ｆ）第６の実施形態
既述の電気化学的に変換し得る部分を有し、該電気化学的に変換し得る部分の電気化学的変換に起因して脱離、置換、もしくは付加をうける反応が惹起されるヌクレオチド誘導体は、上記ＡからＤに係る本発明に好適に利用され得る。なお、図１における（１）は、標的核酸の例としてのＤＮＡとプライマーとが２本鎖を形成した試料(標的核酸にプライマーがハイブリダイズした試料)と、複数種のヌクレオチド誘導体と、ポリメラーゼとを用意している場合を示す。同図の（２）と（３）は、伸長工程を示す。（４）は、伸長後、ヌクレオチド誘導体が有する電気化学反応により変換し得る部分が、脱離する様子を示している。
【００３１】
上記第1から第６の実施形態においては、ポリメラーゼとして特にRNAポリメラーゼと、標的核酸にプライマーがハイブリダイズした試料のかわりに以下の試料を用いることもできる。例えば、RNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む試料である。そして、この試料と、電気化学的に変換し得る部分を有するヌクレオチド誘導体を用いて、転写反応を行い、転写産物への該ヌクレオチド誘導体の導入を検知することもできる。
【００３２】
以下、より詳細に、本発明を説明する。
【００３３】
本発明に用いる標的核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、デオキシリボオリゴヌクレオチド（deoxyribooligonucleotides）、リボオリゴヌクレオチド(ribooligonucleotides)等を挙げることができる。これら標的核酸は一本鎖又は二本鎖であってもよい。また標的核酸は必ずしも精製されている必要はなく、標的核酸を含む生体試料であってもよい。
【００３４】
本発明に用いるプライマーは、標的核酸がＤＮＡ、またはＲＮＡである場合に、標的核酸とハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドである。その長さについては限定されないが、好ましくは１５merから６０mer程度の長さのオリゴヌクレオチドであることが望ましい。プライマーは、標的核酸の情報を取得したい位置にある塩基配列よりも３'側の上流領域（３'側領域）を二本鎖化（ハイブリダイゼーション）するために用いられる。プライマーは、この３'側領域の全域を認識する塩基配列を有するものでもよいし、この３'側領域の一部を認識するものでもよい。３'側領域の一部を認識するプライマーを用いる場合は、情報取得対象の塩基に対して３'側で１つ隣り（上流）の塩基まで必要に応じた伸長反応を行ってから、後述するポリメラーゼを用いたヌクレオチド誘導体の取り込み反応に用いる。
【００３５】
例えば図４（ａ）に示すように、標的ＤＮＡ側のプライマーが認識する３'側領域（情報取得対象の塩基Ｘ１より３'側の領域）が「Ｇ〜ＡＡＣＡＴ」である場合に、これに相補的である「Ｃ〜ＴＴＧＴＡ」の塩基配列からなるプライマーを３'側領域に結合させる。これにより、３'側領域を二本鎖化できる。また、図４（ｂ）に示すように、「Ｇ〜ＡＡＣＡＴ」である３'領域のＸ1より二つ前の塩基を含む３'側領域を認識するプライマー「「Ｃ〜ＴＴＧＴ」を３'側領域に結合させてから、伸長反応を行い「Ａ」と付加する。これにより、情報取得対象の塩基Ｘ１より３'側の領域を二本鎖化できる。なお、図４（ｂ）の場合において、Ｘ1より３つ以上前までの３'側領域を認識するプライマーを用いた場合は、その３'末端をＸ1より一つ前の塩基まで順次伸長反応を行う。
【００３６】
３'側領域の全域を認識する塩基配列を有するプライマーを用いた情報取得方法としては、以下の工程を有する方法を挙げることができる。
（１）標的核酸と、該標的核酸の塩基配列中の情報取得対象位置にある塩基の３'方向での一つ前の塩基を含む３'側領域全体を認識し、該３'側領域の二本鎖化のためのプライマーを用意する。更に、ポリメラーゼと、測定用の置換基を有するヌクレオチド誘導体と、を用意する工程。
（２）前記標的核酸の前記情報取得対象位置にある塩基の３'方向での一つ前の塩基を含む３'側領域に前記プライマーを結合させて二本鎖化する工程。
（３）前記二本鎖化した部分を有する標的核酸に、前記ポリメラーゼの存在下で、前記ヌクレオチド誘導体を共存あるいは反応させる工程。
（４）前記ヌクレオチド誘導体の有する測定用の置換基を利用して、前記情報取得対象位置にある塩基に関する情報を取得する工程である。具体的には、前記標的核酸の二本鎖うちの前記プライマーを含む鎖の３'末端の前記情報取得対象位置にある塩基に対応する位置への前記ヌクレオチド誘導体の取り込みの有無を検出する。
【００３７】
３'側領域の一部を認識するプライマーを用いた情報取得方法としては、以下の工程を有する方法を挙げることができる。
（１）標的核酸と、該標的核酸の塩基配列中の情報取得対象位置にある塩基の３'方向での二つ前の塩基を含む３'側領域を認識し、該３'側領域の二本鎖化を可能とするプライマーを用意する。更に、ポリメラーゼと、測定用の置換基を有するヌクレオチド誘導体と、を用意する。
（２）前記標的核酸に前記プライマーを結合させる。
（３）前記標的核酸に結合したプライマーの３'末端を伸長させ、該標的核酸の塩基配列中の情報取得対象位置にある塩基の３'方向での一つ前の塩基を含む３'側領域を二本鎖化する。
（４）前記伸長後のプライマーが結合した標的核酸に、前記ポリメラーゼの存在下で、前記ヌクレオチド誘導体を反応させる。
（５）前記ヌクレオチド誘導体の有する測定用の置換基を利用して、前記情報取得対象位置にある塩基に関する情報を取得する。具体的には、前記標的核酸の前記情報取得対象位置にある塩基に対応する位置への前記ヌクレオチド誘導体の取り込みの有無を検出する。
【００３８】
本発明では、標的核酸と伸長される核酸の種類によりポリメラーゼの種類が選択される。伸長される核酸がＤＮＡの場合はＤＮＡポリメラーゼ（核酸依存的DNAポリメラーゼ）が、伸長される核酸がＲＮＡである場合にはＲＮＡポリメラーゼ（核酸依存的RNAポリメラーゼ）が選択される。  標的核酸がDNA、またはデオキシリボオリゴヌクレオチドである場合には、DNA依存的DNAポリメラーゼ(DNA-dependent DNA polymerase)またはDNA依存的RNAポリメラーゼ(DNA-dependent RNA polymerase)を選択して用いる。また標的核酸がRNA、またはリボオリゴヌクレオチドである場合には、RNA依存的DNA ポリメラーゼ（RNA-dependent DNA polymerase）またはRNA依存的RNA ポリメラーゼ（RNA-dependent RNA polymerase）を選択して用いる。
【００３９】
本発明に用いることのできるDNA依存的DNAポリメラーゼ(DNA-dependent DNA polymerase)は、酵素番号EC 2.7.7.7に分類され、以下の反応を触媒する酵素であれば、その由来については限定されない。
deoxynucleoside triphosphate + DNA(n) = diphosphate + DNA(n+1)
本発明に用いることのできるDNA依存的RNAポリメラーゼ(DNA-dependent RNA polymerase)は、酵素番号EC 2.7.7.6に分類され、以下の反応を触媒する酵素であれば、その由来については限定されない。
【００４０】
nucleoside triphosphate + RNA(n) = diphosphate + RNA(n+1)
本発明に用いることのできるRNA依存性RNA ポリメラーゼ（RNA-dependent RNA polymerase）は、酵素番号EC 2.7.7.48に分類され、以下の反応を触媒する酵素であれば、その由来については限定されない。
【００４１】
nucleoside triphosphate + RNA(n) = diphosphate + RNA(n+1)
本発明に用いることのできるRNA依存性DNA ポリメラーゼ（RNA-dependent DNA polymerase）は、酵素番号EC 2.7.7.49に分類され、以下の反応を触媒する酵素であれば、その由来については限定されない。
【００４２】
deoxynucleoside triphosphate + DNA(n) = diphosphate + DNA(n+1)
上記各ポリメラーゼのいずれにおいても、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性は欠失していることが望ましい。
【００４３】
本発明では、標的核酸の情報取得対象の塩基に対応する位置へのヌクレオチド誘導体の取り込みの有無を測定することで、この塩基に対する情報を得ることができる。この取り込みの有無は、ヌクレオチド誘導体に付与した電気化学的に変換し得る部分を利用することにより行われる。すなわち、電気化学的に変換し得る部分を有するヌクレオチド誘導体の、標的核酸上のプライマーあるいはプライマー伸長物の３'末端（例えば、図４における「Ｙ」の位置）への取り込みを、電気化学的に変換し得る部分の取り込みにより判定する。例えば、伸長される核酸がＤＮＡである場合には、以下に例示されるヌクレオチド誘導体の１種以上をプライマーにより二本鎖が形成されている標的ＤＮＡに反応させる。
【００４４】
ヌクレオチド誘導体としては、各々が区別し得る電気化学的に変換し得る部分を有する２'-デオキシアデノシン ５'-三リン酸誘導体、２'-デオキシシチジン ５'-三リン酸誘導体、２'-デオキシグアノシン ５'-三リン酸誘導体及び２'-デオキシチミジン ５'-三リン酸誘導体が挙げられる。
【００４５】
ここで、用いるヌクレオチド誘導体の種類を選択することで、以下に示す塩基に関する情報取得を行うことができる。
【００４６】
（１）図４に示す「Ｘ1」が「Ａ」である場合に、２'-デオキシアデノシン ５'-三リン酸誘導体、２'-デオキシシチジン ５'-三リン酸誘導体及び２'-デオキシグアノシン ５'-三リン酸誘導体の少なくとも１種を反応系に添加しておく。すると、電気化学的に変換し得る部分の「Ｙ」の位置への取り込みは測定されない。「Ｘ１」には反応系に添加したヌクレオチドに相補的なヌクレオチドは存在しないと結論することができる。
（２）図４に示す「Ｘ1」が「Ａ」である場合に、少なくとも２'-デオキシチミジン ５'-三リン酸誘導体を反応系に添加しておくと、電気化学的に変換し得る部分の「Ｙ」の位置へ２'-デオキシチミジン ５'-三リン酸誘導体が取り込まれる。そして、この取り込みを２'-デオキシチミジン ５'-三リン酸誘導体の有する電気化学的に変換し得る部分を利用して測定することができる。
【００４７】
なお、伸長される核酸がＲＮＡの場合は、ヌクレオチド誘導体として、以下の誘導体を１種以上用いる。即ち、各々が区別し得る測定用の置換基を有するアデノシン ５'-三リン酸誘導体、シチジン ５'-三リン酸誘導体、グアノシン ５'-三リン酸誘導体及びウリジン ５'-三リン酸誘導体である。
【００４８】
ヌクレオチド誘導体に付与される電気化学的に変換し得る部分は、電気化学的変換に起因して構造変化を生じるものである。この構造変化により、ポリメラーゼによる伸長反応が停止していた状態から、伸長反応が再開可能な状態になる。この構造変化としては、ヌクレオチド誘導体からの電気化学的に変換可能な部分を含む置換基の不可逆的な脱離であることが更に好ましい。
【００４９】
以下、電気化学的に変換可能な部分を有するヌクレオチド誘導体について説明する。
【００５０】
本発明における「電気化学的に変換可能な部分）とは、例えば、ヌクレオシド ５'−三リン酸を構成する何れかの原子に対して結合した、原子若しくは原子団であり、かつ次の（１）から（３）の性質を有するものである。すなわち、
（１）標的核酸とプライマーとの相補的結合対、あるいは標的核酸とプライマーから伸長された伸長鎖との相補的結合対における、プライマー若しくは伸長鎖の３'末端の水酸基に対して、ポリメラーゼの酵素触媒作用によるリン酸エステル結合を形成し得る。
（２）上記（１）の結果、プライマー若しくは伸長鎖の３'末端の水酸基に対してリン酸エステル結合を介して結合した後には、ポリメラーゼの酵素触媒作用による他のヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体との更なるリン酸エステル結合の形成を阻害する。すなわち、本発明において使用するヌクレオチド誘導体は、キャッピングとしての機能を有する。
（３）電気化学的に還元若しくは酸化され得る部分を含む。
【００５１】
なお、上記の（１）から（３）の性質に加え、更に（４）の性質を有しているのが良い。
（４）上記（３）の結果、電気化学的に還元若しくは酸化されたことに起因する脱離・置換・もしくは付加反応が惹起され、ポリメラーゼの酵素触媒作用による更なるリン酸エステル結合を形成が可能となる。
【００５２】
電気化学的に変換可能な部分によるキャッピングは、その電気化学的性質の違いによって、電気化学的に脱離可能な脱離基、電気化学的に置換可能な置換基に分類される。いずれの分類でも、前記（１）から（３）の性質（好ましくは（４）も含む。）を満たすならば本発明に用いることができる。電気化学的に脱離可能な脱離基は、式１に示すR2、あるいは式３に示すR６のように２電子還元により脱離を受ける原子または原子団である。また、式２に示すR４、あるいは式４に示すR８のように２電子酸化により脱離を受ける原子または原子団である。
【００５３】
【化１】
2007195548.tif 000002
【００５４】
ただしR1、R3、R５及びR７はヌクレオチドであり、R2、 R4、R6及びR8は電気化学的に脱離可能な脱離基である。脱離基としては具体的には、典型金属化合物、ホウ素化合物、遷移有機金属錯体等を挙げることができる。
【００５５】
電気化学的に置換可能な置換基は式５及び式６に示すR10のような１電子還元により、ラジカルあるいはアニオンとして脱離を受ける原子または原子団である。あるいは式７及び式８に示すR12のような1電子酸化により、ラジカルあるいはカチオンとして脱離を受ける原子または原子団である。
【００５６】
【化２】
2007195548.tif 000003
【００５７】
ただし、R9およびR11はヌクレオチドであり、R10およびR12は電気化学的に置換可能な置換基である。この置換基としては、具体的にはハロゲン、アルキルチオ、スルフィニル、ヒドロキシ、アシルオキシ、アミノ、過酸化、スルホニウムである。また、この置換基として、有機金属錯体、ニトロキシ、2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxyl（TEMPO）、ハイドロキノリル、メトキノリル、フェノチアジル等を挙げることもできる。
【００５８】
ヌクレオチド誘導体は、前記電気化学的に脱離可能な脱離基あるいは電気化学的に置換可能な置換基によって修飾されたヌクレオシド ５'−三リン酸である。具体的には本発明において使用するポリメラーゼの種類に応じて選択されるものであり、ポリメラーゼが、DNA依存的DNAポリメラーゼ(DNA-dependent DNA polymerase)またはRNA依存性DNA ポリメラーゼ（RNA-dependent DNA polymerase）である場合には、以下の４種の少なくとも１種を用いる。
・  2'-デオキシアデノシン5'-三リン酸誘導体(dATP derivative)
・  2'-デオキシシチジン5'-三リン酸誘導体(dCTP derivative)
・  2'-デオキシグアノシン5'-三リン酸誘導体(dGTP derivative)
・  2'-デオキシチミジン5'-三リン酸誘導体(dTTP derivative)
また本発明において使用するポリメラーゼがDNA依存的RNAポリメラーゼ(DNA-dependentRNA polymerase)またはRNA依存性RNA ポリメラーゼ（RNA-dependent RNA polymerase）である場合には以下の４種の少なくとも１種を用いる。
・  アデノシン5'-三リン酸誘導体(ATP derivative)
・  シチジン5'-三リン酸誘導体(CTP derivative)
・  グアノシン5'-三リン酸誘導体(GTP derivative)
・  ウリジン5'-三リン酸誘導体(UTP derivative)
ヌクレオチド誘導体における電気化学的に脱離可能な脱離基の付加される原子、すなわち、式１におけるR1及び式２におけるR3を構成する原子としては、キャッピングに関する前記（１）から（４）の性質が満たされれば特に制限されない。
例えば、2'-デオキシアデノシン5'-三リン酸 (dATP)、2'-デオキシシチジン5'-三リン酸 (dCTP)、2'-デオキシグアノシン5'-三リン酸 (dGTP)、および2'-デオキシチミジン5'-三リン酸 (dTTP)に対しては、それらのリボースの１'、２'、４'位の炭素、３'位水酸基の酸素などが挙げられる。また、アデノシン5'-三リン酸 (ATP)、シチジン5'-三リン酸 (CTP)、グアノシン5'-三リン酸 (GTP)、およびウリジン5'-三リン酸 (UTP)に対しては、それらのリボースの２'位水酸基の酸素、３'位水酸基の酸素などが挙げられる。
【００５９】
また、式３におけるR5、式４におけるR7を構成する原子としては、キャッピングに関する前記（１）から（４）の性質がすべて満たされるのであれば制限されない。例えば、dATP、dCTP、dGTP、およびdTTPに対しては、それらのリボースの３'位の炭素が挙げられ、またATP、CTP、GTP、およびUTPに対しては、それらのリボースの２'位の炭素、３'位の炭素などが挙げられる。
【００６０】
ヌクレオチド誘導体における電気化学的に置換可能な置換基の付加される原子、すなわち式５におけるR９、式６におけるR９を構成する原子としては、キャッピングに関する前記（１）から（４）の性質がすべて満たされるのであれば制限されない。例えば、dATP、dCTP、dGTP、およびdTTPに対しては、それらのリボースの１'、２'、４'位の炭素、３'位水酸基の酸素などが挙げられる。またATP、CTP、GTP、およびUTPに対しては、それらのリボースの２'位水酸基の酸素、３'位水酸基の酸素などが挙げられる。
【００６１】
また、式７におけるR11、式８におけるR11を構成する原子としては、キャッピングに関する前記（１）から（４）の性質がすべて満たされるのであれば制限されない。例えば、dATP、dCTP、dGTP、およびdTTPに対しては、それらのリボースの３'位の炭素が挙げられる。また、ATP、CTP、GTP、およびUTPに対しては、それらのリボースの２'位の炭素、３'位の炭素などが挙げられる。
【００６２】
本発明に用いられる電気化学的に変換可能な構造でキャッピングされたヌクレオチド誘導体は、対応するヌクレオチドあるいはヌクレオシドを原料として製造することが可能である。すなわち、キャッピングを結合させる原子以外の、プリン、ピリミジンなどの塩基部分と糖水酸基を選択的に適宜保護した後、電気化学的に脱離可能な脱離基あるいは置換可能な置換基の付加を行うことにより合成することができる。
【００６３】
それぞれのヌクレオシド ５'−三リン酸のキャッピングに用いられる電気化学的に変換可能な構造は、電気化学的に変換可能な部分の電気化学的変換と、これにより惹起されるこの部分を含む構造の構造変換により、この構造を有するヌクレオチドを区別できるものであればよい。例えば、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびチミン（Ｔ）あるいはウラシル（Ｕ）の各々に対応して、それぞれのキャッピングの電気化学的還元若しくは酸化を受ける電位が相異なる値であればよい。この条件を満たす範囲で、４種のヌクレオチド誘導体の有する測定用置換基としては、異なる４種の測定用置換基を用いても、重複して同じ種類のものを用いてもよい。これは、変換可能な構造が同一種類のものであっても、塩基の種類に対応してキャッピングの結合する原子の位置がそれぞれ相異なるものとすることで一般に可能となる。さらにたとえ導入される原子の位置が同じであっても、リボース又はデオキシリボースに結合した塩基の種類に対応してそれぞれのキャッピングの電気化学的還元若しくは酸化を受ける電位が相異なる値であれば、電気化学的に変換可能な構造として同一種類のものを用いることができる。
【００６４】
キャッピングの電気化学的還元若しくは酸化を受ける電位については、使用する電極の種類や、溶媒により規定されるそれら電極系の電位窓内にあればその値は限定されないが、−１００Ｖから＋１００Ｖ（ｖｓ．ＳＣＥ）である。好ましくは、−１０Ｖから＋１０Ｖ（ｖｓ．ＳＣＥ）であり、更に好ましくは、−１．２Ｖ〜＋１．０Ｖ（ｖｓ．ＳＣＥ）程度が好ましい。
【００６５】
（解析方法）
次に本発明の核酸塩基配列の解析方法の手順について説明する。本発明の核酸塩基配列の解析方法における第１の工程に先立ち、標的核酸とプライマーとのハイブリダイゼーションによる相補的結合対を形成させる。これは標的核酸とプライマーとを混合し、熱処理によってそれらの二次構造を破壊した後、プライマーの融解温度（Tm）以下の温度にまで冷却することにより達成される。なお、本発明の核酸塩基配列の解析方法における第１の工程に先立ち、RNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む試料を調製することができる。このような試料は、プロモーター配列を含むプライマーを用いたPCR増幅によって、あるいはプロモーター配列と標的核酸をライゲーションした後に適当な宿主を用いてクローニングすることによって、調製することができる。
【００６６】
また、本発明の核酸塩基配列の解析方法における第１の工程に先立ち、以下の固定化電極を用意する。即ち、標的核酸を含む試料が標的核酸とプライマーとの相補的結合対である場合には核酸依存的DNAポリメラーゼを、導電性基体上に固定化した核酸依存的DNAポリメラーゼ固定化電極を用意する。なお、標的核酸を含む試料が、RNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む場合には、核酸依存的RNAポリメラーゼを、導電性基体上に固定化した核酸依存的RNAポリメラーゼ固定化電極を用意する。
【００６７】
導電性基体としては、導電性が高く、電極が使用される条件において充分な電気化学安定性を有する材料が好適に使用できる。このような導電性部材の構成材料の例としては、金属、導電性高分子、金属酸化物、及び炭素材料などを挙げることができる。また、ポリメラーゼの固定化は、酵素電極作製について酵素を導電性基体の物理的近傍に捕捉するために用いられる当業者にとって公知の方法によって作製しうるものである。具体的方法としては、例えば以下に述べる（１）から（３）の方法を挙げることができる。
【００６８】
（１）共有結合法
導電性基体表面に直接官能基を導入し、この官能基とポリメラーゼとを共有結合させてポリメラーゼを固定化する。あるいは、導電性基体に接触して配置した担体に官能基を導入し、この官能基とポリメラーゼとを共有結合させて酵素を固定化する。このような共有結合に利用できる官能基として例えば、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、ヒドラジノ基、チオシアネート基、エポキシ基、ビニル基、ハロゲン基、酸エステル基、リン酸基、チオール基、ジスルフィド基、ジチオカルバメート基、ジチオホスフェート基、ジチオホスホネート基、チオエーテル基、チオ硫酸基、チオ尿素基を挙げることができる。
【００６９】
また、アルキルチオールのチオール基が金などの金属に作用して結合し容易に単分子膜（自己組織化単分子膜）を形成できることを利用し、アルキルチオールのアルキル基に予め導入した官能基を介して共有結合により酵素を金属に結合させて酵素を固定化する。アルキルチオールのアルキル基に予め導入した官能基と酵素との共有結合は、例えば二官能性試薬を用いて形成することができる。
【００７０】
代表的な二官能性試薬としては、グルタルアルデヒド、過ヨウ素酸、Ｎ，Ｎ'−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ−スクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スクシニミジルマレイミド酢酸、Ｎ−スクシニミジル−４−マレイミド酪酸、Ｎ−スクシニミジル−６−マレイミドヘキサン酸、Ｎ−スルホスクシニミジル−４−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸、Ｎ−スルホスクシニミジル−３−マレイミド安息香酸、Ｎ−（４−マレイミドブチリロキシ）スルホスクシンイミド・ナトリウム塩、Ｎ−（６−マレイミドカプロイロキシ）スルホスクシンイミド・ナトリウム塩、Ｎ−（８−マレイミドカプリロキシ）スルホスクシンイミド・ナトリウム塩、Ｎ−（１１−マレイミドウンデカノイロキシ）スルホスクシンイミド・ナトリウム塩、Ｎ［２−（１−ピペラジニル）エチル］マレイミド・二塩酸、ジスルホン化合物（例えば、ジビニルスルホン化合物など）等が挙げられる。
【００７１】
また、導電性基体に接触して配置する担体としてはアガロース、アガロース分解物、κ−カラギーナン、寒天、アルギン酸、ポリアクリルアミド、ポリイソプロピルアクリルアミド、ポリビニルアルコール、およびこれらの共重合体等が挙げられる。
【００７２】
（２）吸着法（その１）
導電性基体とポリメラーゼとの疎水性相互作用や静電相互作用を利用した物理的吸着法によりポリメラーゼを固定化する。導電性基体へのポリメラーゼの物理的吸着が不可能あるいは不十分である場合には、ポリメラーゼが物理的吸着を起こす担体を介してポリメラーゼを固定化できる。このような担体としては、ポリアリルアミン、ポリリジン、ポリビニルピリジン、アミノ基で変性したデキストラン（たとえばＤＥＡＥ−デキストラン）、キトサン、ポリグルタメート、ポリスチレンスルホン酸、硫酸デキストラン等のポリアニオンやポリカチオンからなる担体を用いることができる。担体とポリメラーゼとの静電相互作用を利用したイオン結合法によりポリメラーゼを担体に固定し、このポリメラーゼ固定化担体を導電性基体に接触させ配置する。
【００７３】
（３）吸着法（その２）
遺伝子組換えタンパク質の精製を容易にするために用いられる各種のアフィニティータグを利用して固定化する。例えば、ＨＡ（ヘマグルチニン）、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジンタグを利用してポリメラーゼを固定化する。本発明のポリメラーゼ固定化電極におけるポリメラーゼの固定量は、特に限定されず、広い範囲で変えることができる。
【００７４】
次に、このようにして作製したポリメラーゼ固定化電極に、標的核酸とプライマーとの相補的結合対もしくはRNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む試料を添加する。これにより標的核酸とプライマーとの相補的結合対もしくはRNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む試料は、ポリメラーゼ固定化電極上のポリメラーゼにより捕捉される。
【００７５】
本発明の核酸塩基配列の解析方法における第１の工程では、標的核酸とプライマーとの相補的結合対を含む試料、またはRNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む試料を捕捉しているポリメラーゼ固定化電極を用意する。そして、本発明に係るヌクレオチド誘導体を前記ポリメラーゼと共存させる。このヌクレオチド誘導体の塩基部分は、アデニン(Ａ)、シトシン(Ｃ)、グアニン(Ｇ)、及びチミン(Ｔ)（又はウラシル(U)）の各々に対応して、電気化学的測定手段にて得られる電気信号が相異なる構造でキャッピングされている。勿論、同定できるのであれば、複数種のヌクレオチド誘導体を同じ構造体でキャッピングしておいても構わない。ヌクレオチド誘導体としては、例えば、ヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体や、ヌクレオシド ５'−二リン酸誘導体や、ヌクレオシド ５'−モノリン酸誘導体や、ヌクレオシド ３'−リン酸誘導体が挙げられる。ポリメーラーゼとヌクレオチド誘導体を含む混合物においては、各種ヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体を相等しい濃度で含むことが好ましい。
【００７６】
この結果、標的核酸とプライマーとの相補的結合対を試料とした場合には、
標的核酸とプライマー（またはその伸長物）との相補的結合対におけるプライマー側の３'末端の水酸基と、標的核酸と相補的な塩基を含むヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体における５'リン酸基との間で、リン酸エステル結合が形成される。その際に、ピロリン酸が脱離する。
【００７７】
ポリメラーゼによる、この1塩基伸長反応は通常1秒以内、特に大腸菌のDNAポリメラーゼIIIを利用した場合には最短500分の１秒で終了することが知られている。これまでのプロセスの一例を図１（１）から（３）に示す。また、RNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む試料を用いた場合には、プロモーター下流の転写開始点より転写が開始される。
【００７８】
次に、本発明の核酸塩基配列の解析方法における第２の工程では、ポリメラーゼ固定化電極に対して時間と共に漸次変化する電圧を印加する。電圧を変化させる方向は、還元反応を行う場合には自然電位より負の方向、また酸化反応を行う場合には正の方向である。変化のさせかたは自然電位から一定速度で掃引するか、ステップ状にあるいはパルス状に印加電圧を増加させていく。電位の絶対値を常に増加させる方向に変化させることによって、ヌクレオチド誘導体に結合したキャッピングの種類に依存して、それらの電気化学的変換に要する電圧の絶対値が小さいものから順に、当該変換がおきることになる。この反応の一例を、図１（４）に示す。ヌクレオチド誘導体の電気化学的変換に際して、反応液中に酵素の活性を阻害しない種類および濃度の支持塩を添加しておいてもよい。支持塩としてはＮａ2ＨＰＯ4、ＮａＨ2ＰＯ4、ＫＣｌ等を挙げることができるが、Ｎａ2ＨＰＯ4及びＮａＨ2Ｐ０4を用いれば同時に緩衝液としても作用するのでこれらを用いるのが好ましい。
【００７９】
第２の工程における印加した電圧値と、そのとき電極系に流れる電流値をモニターする。標的核酸と相補的な塩基を含むヌクレオチド誘導体に結合したキャッピングの種類に依存した電圧で、還元反応または酸化反応が惹起され、この反応に伴う電流を観測することができる。反応にともなう電流を観測した時点での、電極に印加されている電圧は、ヌクレオチド誘導体に結合したキャッピングの種類に応じて異なるので、この電圧の値から伸長鎖の３'末端の塩基の種類、すなわちこれと相補的な標的核酸の塩基の種類を知ることができる。
【００８０】
一塩基多型のような単一の塩基を解析する場合には、使用するプライマーを解析したい部位に隣接した連続配列とすれば、上記工程１および２により解析することができる。この際使用するヌクレオシド５'−三リン酸誘導体は、塩基部分がＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴ若しくはU全ての混合物である必要はなく、解析したい多型を構成する塩基の少なくとも１種類を使用すればよい。これに対応して一塩基多型を解析する場合には、ポリメラーゼ固定化電極に対して印加する電圧を時間と共に漸次変化させることは必ずしも必要ではなく、使用したヌクレオチド誘導体の電気化学的変換に必要な電圧を印加すればよい。
【００８１】
引き続き標的核酸の塩基を連続して知りたい場合、すなわち塩基配列として解析したい場合には、上記の工程１および工程２を繰返せばよい。ここで、工程１から工程２の間で溶液中に残存する未反応のヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体を除去する操作は、必ずしも必要ではない。また、最初に系に添加するヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体の量が十分であれば、工程２から工程１に戻って繰返す場合にもヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体を補充する必要はない。
【００８２】
なお、3'伸長末端のヌクレオチドに修飾されたキャップ構造を電気化学的に変換するために電圧を印加すると、溶液中に残存する未反応のヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体までも電極上で電気化学的に変換されてしまう場合がある。しかしながら溶液中に残存する未反応のヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体が電極上で電気化学的に変換されてしまうことによる「誤シグナルの寄与」は、例えば次のようにして、排除若しくは低減することができる。
【００８３】
一般にポリメラーゼのようなタンパク質内部の誘電率は水の誘電率とは異なる。このため、伸長鎖の３'末端に付加しているヌクレオチド誘導体のキャップ構造を電気化学的に変換するための電位と、溶液中に残存する未反応のヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体のキャップ構造を電気化学的に変換するための電位との間には相違が生じる。この相違を印加電圧の違いとして識別することにより、誤シグナルの寄与を排除することが可能となる。
【００８４】
また、伸長鎖の３'末端に付加しているヌクレオチド誘導体は導電性基体の近傍に捕捉されている。一方、溶液中に残存する未反応のヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体は溶液中を浮遊している。このため、両者の拡散係数の間には相違が生じる。この拡散係数の違いは例えばインピーダンス法により測定することが可能である。そこでこの拡散係数の違いを利用して誤シグナルの寄与を低減させることが可能となる。例えば印加電圧の時間変化を急峻にすることによって、溶液中に残存する未反応のヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体が導電性基体に拡散して到達する前に、導電性基体の近傍に捕捉されている結合したヌクレオチド誘導体の電気化学反応を実行する。このことよって、誤シグナルの寄与を低減させることが可能となる。
【００８５】
さらに溶液中に残存する未反応のヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体におけるリン酸基は、通常ポリメラーゼが触媒活性を有する条件で解離し、負電荷を有している。このため、伸長鎖末端の誘導体を例えば還元するために電極に負の電圧を印加すると、溶液中に残存する未反応のヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体は電極との間で静電的反発を受け、電極に近づけないことになる。従って、伸長鎖末端の誘導体を還元して検出する場合には、本来的に誤シグナルの寄与は少ないと考えられる。また、伸長鎖末端の誘導体を酸化して検出する場合であっても、酸化電位の印加の前に一旦電極電位を負側に一定時間保持することによって、溶液中に残存する未反応のヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体を電極近傍から遠ざけることが出来、これにより誤シグナルの寄与を低減させることが可能となる。
【００８６】
更にまた、本発明の核酸塩基配列の解析方法の１つの態様である一塩基多型を解析する場合には、電極の洗浄操作によって溶液中に残存する未反応のヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体を取り除くことも有効である。
【００８７】
次に本発明の核酸塩基配列の解析装置について説明する。
【００８８】
図２は、本発明の情報取得装置をＤＮＡ配列解析装置として利用した場合の一例を示す図である。このDNA塩基配列解析装置における電極系は、ポリメラーゼ固定化電極（作用電極）、対極、参照電極を用いた３極セルを構成しており、これらはポテンショスタットに接続されている。電極電位設定のためのファンクションジェネレーター、および計測およびデータ処理のためのコンピュータが更にポテンショスタットに接続されている。作用電極に印加される電圧は、ファンクションジェネレーターによりプログラムされており、ポテンショスタットを経て印加される。印加された電圧とこのとき観測される電流値はコンピュータに送られ収集される。コンピュータでは、電流が観測された時点でのポリメラーゼ固定化電極に印加されていた電圧から伸長鎖に結合したヌクレオチド誘導体の種類すなわち伸長された塩基の種類を同定する。
【実施例】
【００８９】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明の方法は、これらの実施例のみに限定されるものではない。
【００９０】
（実施例１）
標的核酸として、ヒトHLA遺伝子より＜A/G＞一塩基多型を含むNCBI Assay ID ss38346831をモデルとして想定し、配列番号１および配列番号２で表される一本鎖合成デオキシリボオリゴヌクレオチドを用いる。またプライマーとして配列番号３で表される合成デオキシリボオリゴヌクレオチドを用いる。
【００９１】
ポリメラーゼ固定化電極は、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）の２ユニットを含む以下の組成の緩衝液Aの50マイクロリットルを、グラッシーカーボン電極上に塗布し、物理吸着法によりポリメラーゼを固定化して作製する。
緩衝液A
・３３ｍＭ トリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．９）
・６・６ｍＭ 酢酸カリウム
・１０ｍＭ 酢酸マグネシウム
・０．５ｍＭ ジチオトレイトール
・０．０１％（ｗ/ｖ）ウシ血清アルブミン
作製したポリメラーゼ固定化電極は緩衝液Aで洗浄し、固定化されていないポリメラーゼを除去する。まず、１０ピコモルの標的核酸と１０ピコモルのプライマーとを50マイクロリットルのTEバッファー中で混合し、96℃で20秒加熱後、25℃で放置することにより、標的核酸に対する該プライマーの相補的結合対を調製する。次に、作製したポリメラーゼ固定化電極に、標的核酸とプライマーとの混合物を接触させ、37℃で5分間保持し、その後緩衝液Aで洗浄し、ポリメラーゼ固定化電極に捕捉されなかった標的核酸とプライマーとの混合物を除去する。
【００９２】
アデニン(Ａ)、シトシン(Ｃ)、グアニン(Ｇ)、チミン(Ｔ)より選ばれた少なくとも１つの塩基を有するヌクレオシド５'−三リン酸に対して電気化学的に変換可能な構造でキャッピングされたヌクレオシド５'−三リン酸誘導体として、以下に示すものを用いる。
具体的には、2'-iodo-2'-deoxyadenosine-5'-triphosphate(2'I-dATP)（JENA  BIOSCIENCE社製）を用いる。
【００９３】
2'I-dATPの５０μＭ水溶液（ｐH７．０）を、ポリメラーゼ固定化電極と接触させ、３７℃で１０秒保温する。次に、３３ｍＭ トリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．９）で電極を洗浄し、未反応の2'I-dATPを除去する。次にポリメラーゼ固定化電極を作用電極として、図２に示す構成のDNA塩基配列解析装置で解析する。白金線を対電極、銀／塩化銀電極を参照電極として用いる。印加電圧を自然電位から負の方向へ１０ｍV/secの一定速度で掃引していくと、配列番号１で表される合成DNAを標的核酸として用いた場合にのみ一過的な還元電流を観測する。配列番号２で表される合成DNAを標的核酸として用いた場合には還元電流を観測できない。このことから、配列番号１で表される標的核酸を用いた場合にのみ、標的核酸とプライマーとの相補的結合対におけるプライマーの３'末端に、標的核酸と相補性を有する2'I-dATPが伸長されたことを検出できる。さらに電気化学的変換に伴う還元電流の有無により、配列番号１で表される標的核酸と配列番号２で表される標的核酸における単一の塩基の相違を検出できることが明らかになる。
【００９４】
（実施例２）
標的核酸として、配列番号１で表される合成オリゴデオキシヌクレオチドをモデルとして用いる。また、プライマーとして配列番号４で表される合成オリゴデオキシヌクレオチドを用いる。ポリメラーゼ固定化電極は実施例１で作製したものを用いる。まず、１０ピコモルの標的核酸と１０ピコモルのプライマーとを50マイクロリットルのTEバッファー中で混合し、96℃で20秒加熱後、25℃で放置する。次に、ポリメラーゼ固定化電極を作用電極として、図２に示す構成のDNA塩基配列解析装置で解析する。白金線を対電極、銀／塩化銀電極を参照電極として用いる。
【００９５】
アデニン(Ａ)、シトシン(Ｃ)、グアニン(Ｇ)、およびチミン(Ｔ) の各々に対応して相異なる電気化学的に変換可能な構造でキャッピングされたヌクレオシド５'−三リン酸誘導体の混合物として、以下の材料を用いる。
2'-iodo-2'-deoxyadenosine-5'-triphosphate(2'I-dATP)
2'-bromo-2'-deoxyguanosine-5'-triphosphate(2'Br-dGTP)
2'-chloro-2'-deoxythymidine-5'-triphosphate(2'Cl-dTTP)
2'-fluoro-2'-deoxycytidine-5'-triphosphate(2'F-dCTP)
これらの一部は、商業的に入手可能（JENA BIOSCIENCE社、あるいはTriLink BioTechnologies社など）である。また特開平07-97391号公報、特公平08-5908号公報、GruenM.他(Nucleosides Nucleotides 18, 137-151 (1999))、"Oligonucleotide Synthesis; apractical approach" M. J. Gait (ed), IRL PRESS, (1984)などの方法に従って合成することもできる。
【００９６】
上記解析装置に、標的核酸とプライマーとの混合物を添加し、電極系に接触させる。
37℃で5分間保持し、その後緩衝液Aで洗浄し、ポリメラーゼ固定化電極に捕捉されなかった標的核酸とプライマーとの混合物を除去する。次に、2'I-dATP、2'Br-dGTP、2'Cl-dTTP、2'F-dCTPの各々５０μＭ水溶液（ｐH７．０）を、ポリメラーゼ固定化電極と接触させ、３７℃で保持する。次に、図３（A）で表される時間変化の電圧を印加し、またそのときの電流値をモニターする。図３（A）で表される電圧の時間変化は、自然電位を基準とし、負の方向に一定速度で掃引していくフェーズと自然電位で保持するフェーズからなる変化の繰返しとなっており、最初から5回分の繰返し単位を図示している。このとき図３（B）で表される電流値変化を観測する。各繰り返し単位ごとに一過的な電流値を観測するが、電圧を掃引し始めてからピーク電流を観測するまでの時間（τ1、τ2、τ3、τ4、およびτ5）は各繰返し単位ごとに変化しており、その序列はτ1 > τ3 = τ4 > τ5 > τ2であることがわかる。
【００９７】
各デオキシヌクレオシド一リン酸誘導体、2'I-dAMP、2'Br-dGMP、2'Cl-dTMP、および2'F-dCMPを用いて各々の電気化学的な変換に要する電圧を測定すると、その絶対値の大きさの序列は、2'F-dCMP > 2'Cl-dTMP > 2'Br-dGMP > 2'I-dAMPである。このことから、以下のことが判明する。
（１）繰返し単位1回目のτ1は３'末端に結合した2'F-dCMP由来の信号であること。
（２）繰返し単位2回目のτ2は３'末端に結合した2'I-dAMP由来の信号であること。
（３）繰返し単位3回目のτ3は３'末端に結合した2'Cl-dTMP由来の信号であること。
（４）繰返し単位4回目のτ4は３'末端に結合した2'Cl-dTMP由来の信号であること。
（５）繰返し単位5回目のτ5は３'末端に結合した2'Br-dGMP由来の信号であること。
【００９８】
すなわち、プライマーから伸長された塩基配列は、5'- CATTG・・・-3'であることがわかる。またこれに対応する標的核酸の塩基配列は3'-GTAAC・・・-5'であることがわかる。各繰り返し単位において、遊離のヌクレオチド５'−三リン酸誘導体による影響は、ほとんど観測されず、また電圧印加中に次の塩基が伸長してしまうこともないことがわかる。これは負電圧の印加により、負電荷をもつ遊離のヌクレオチド５'−三リン酸誘導体は電極に接近できず、電極反応を起こさないこと、さらにDNAポリメラーゼにも接近できず、伸長反応の基質にもならないためと考えられる。
【００９９】
なお、上記の信号に基づく判断を、予めコンピュータに組み込んだプログラムにより行わせて、解析結果をメモリーに収納したり、表示あるいはプリントアウトするようにしてもよい。また、測定時の電圧の印加は、図３に示すものに限定されず、階段状に電圧を上げていく印加方法や、所定電圧のパルスを順次印加する方法を用いることができる。図５にはこのプログラムの流れを示すフローチャートの一例を示す。まず、条件を設定する。ここでいう条件とは、印加電圧のプロファイルや終了条件の設定などである。そして、例えば、自然電位で保持したまま、プライマー伸長工程を行う。その後、設定された条件で、電圧印加を行うとともに、電流値を計測する。そして、ヌクレオチド誘導体が電気科学的に変換された際の電圧値を決定する。そして、予めデータベースに備えられている情報（例えば、Ａの場合の脱離れる電圧値の値など）と比較し、伸長鎖の３'末端のヌクレオチドを同定する。同定された情報は、逐次ストックしていく。そして、終了条件を満たす場合には、測定を終了する。
【０１００】
（実施例３）
電気化学的に変換し得る部分を有するヌクレオチド誘導体として以下のものを本発明に用いる。
次の式で表されるヌクレオチド誘導体：
【０１０１】
【化３】
2007195548.tif 000004
【０１０２】
2'-deoxy-3'-(2-azidomethyl)benzoyl-nucleoside 5'-triphosphateである。
【０１０３】
ただし式中Baseはアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、またはチミンなど一般に核酸を構成する塩基である。
【０１０４】
このヌクレオチド誘導体は、
Tetrahedron Letters 42 (2001) 1069-1072,
Acta Biochimica et Biophysica Academiae Scientiarum Hungaricae 16 (1981) 131-133
に開示された情報に基づき、例えば次のようにして合成することができる。
【０１０５】
すなわち、先ずメチル2-メチルベンゾエート（methyl 2-methylbenzoate）（１等量）を、テトラクロロメタン（tetrachloromethane）溶媒中で、ブロモスクシンイミド（bromosuccinimide）（1．1等量）と1時間還流することによって反応させる。このとき、ベンゾイルペルオキシド（benzoyl peroxide）（0.02等量）を触媒として用いる。
この反応により、メチル2-(ブロモメチル)ベンゾエート（methyl 2-(bromomethyl)benzoate）ができる。
次にメチル2-(ブロモメチル)ベンゾエート（methyl 2-(bromomethyl)benzoate）（１等量）を、四塩化炭素−メタノール混合溶媒中(1:1, v/v)で、テトラメチルグアニジニウム アザイド（tetramethylguanidinium azide）（１．５等量）と1．5時間還流する。これにより、メチル2-(アザイドメチル)ベンゾエート（methyl 2-(azidomethyl) benzoate）とする。
次にメチル2-(アザイドメチル)ベンゾエート（methyl 2-(azidomethyl) benzoate）（１等量）を２M水酸化ナトリウム水溶液−メタノールの混合溶媒中(1:1, v/v)で、室温で30分間ゆっくり攪拌する。こうして、アザイドメチルベンゾイル酸（2-(azidomethyl) benzoic acid）ができる。
【０１０６】
次に、アザイドメチルベンゾイル酸（2-(azidomethyl) benzoic acid）（１等量）をチオニルクロライド（thionyl chloride）（1．5等量）中で1時間還流することで アザイドメチルベンゾイル酸クロライド（2-(azidomethyl) benzoyl chloride）とする。アザイドメチルベンゾイル酸クロライド（2-(azidomethyl) benzoyl chloride）を塩基や５'水酸基等の活性部位を保護したヌクレオシドとピリジン溶媒中で2時間ゆっくり攪拌する。これにより、ヌクレオシドを構成するD−リボースの３'位水酸基に2-アザイドメチルベンゾイル基を導入し、ヌクレオシド誘導体とする。次に、ヌクレオシド誘導体の５'位水酸基の保護基を脱離した後、その1等量を、脱水リン酸トリメチルエステル（phosphoric acid, trimethyl ester,）溶媒中で、ホスホリルクロライド（phosphoryl chloride）(1.5等量)と混合し、0℃で1.5時間攪拌する。次に、ビス-トリ-n-ブチルアンモニウム ピロフォスフェート（bis-tri-n-butylammonium pyrophosphate）の脱水ジメチルホルムアミド溶液（５M）と、トリブチルアミンの混合(10:1, v/v)溶液を加え1分間攪拌する。その後1Mトリエチルアミン−炭酸緩衝液 pH7.5を加える。エヴァポレーション後、陰イオンクロマトグラフィーを用いて分画し、目的画分を分取し、脱保護することによって目的のヌクレオチド誘導体を得る。上の式で表されたヌクレオチド誘導体はD-リボースの５' 位に三リン酸がエステル結合しているために、ポリメラーゼの基質として働き、伸長鎖の３' -OH末端に付加される。
【０１０７】
伸長鎖の３' -OH末端に付加されたヌクレオチド誘導体は、D-リボースの３' 位に(2-azidomethyl)benzoyl基が付加されているために、ポリメラーゼによる更なるヌクレオチドの付加を阻害することができる。
【０１０８】
上の式で表されたヌクレオチド誘導体における、電気化学的に変換し得る部分は、アザイド（N3−）基である。文献Bioelectrochemistry and Bioenergetics 26 (1991) 441-455には、アザイド基を有する複数種類のヌクレオシドにおけるアザイド基の酸化還元電位が、それぞれ異なる値であることが開示されている。このことから、本発明者らは、本実施例のヌクレオチド誘導体においても、そのBaseの種類に応じて、アザイド基の酸化還元電位は異なる値になると考える。
【０１０９】
必要であれば、酸化還元電位の値がBaseの種類の違いに応じてより顕著な差異を持つように、(2-azidomethyl)benzoyl基部分にBase毎に異なる官能基を更に修飾してもよい。
文献Bioelectrochemistry and Bioenergetics 26 (1991) 441-455には、アザイド基が電気化学的還元をうけてアミノ基に変換されることが示されている。また文献Tetrahedron Letters 42 (2001) 1069-1072には、(2-azidomethyl)benzoyl基を、糖水酸基の保護基として利用した例が開示されている。そして、この保護基は化学的還元剤の添加によりアザイド基がアミノ基に変換されると、脱離反応を起こして、糖水酸基を再生することが開示されている。
【０１１０】
従って、本実施例のヌクレオチド誘導体におけるD-リボースの３' 位に付加された(2-azidomethyl)benzoyl基は、電気化学的に還元されるとそのアザイド基がアミノ基に変換され、さらに脱離反応をおこしてD-リボースの３' 位水酸基を再生する。
【０１１１】
【化４】
2007195548.tif 000005
【０１１２】
電気化学的還元に引き続き惹起される脱離反応によって、伸長鎖の３' 位に水酸基が再生されると、ポリメラーゼの触媒作用による新たなヌクレオチドの付加が可能になる。したがって本実施例のヌクレオチド誘導体は、電気化学的に変換し得る部分を有し、本発明に好適に利用することができる。
【０１１３】
（実施例４）
電気化学的に変換し得る部分を有するヌクレオチド誘導体として、以下の例を示す。
【０１１４】
次の式で表されるヌクレオチド誘導体：
【０１１５】
【化５】
2007195548.tif 000006
【０１１６】
2'-O-(4-methoxy-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyl) - nucleoside-5'-triphosphateである。
【０１１７】
文献Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids  (2004),  23(11),  1723-1738.には 2'-O-(4-methoxy-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyl)-5-methyl- Uridineの合成例がある。これを参考にして各種ヌクレオシドのD-リボース２'位にTEMPO(2,2,6,6-Tetramethyl-1-piperidinyloxy)基を導入することができる。
【０１１８】
更に文献Acta Biochimica et Biophysica Academiae Scientiarum Hungaricae 16 (1981) 131-133に開示された方法に従って、D-リボースの５' 位に三リン酸をエステル結合させることにより、目的のヌクレオチド誘導体を得ることが出来る。
【０１１９】
上の式で表されたヌクレオチド誘導体はD-リボースの５' 位に三リン酸がエステル結合しているために、ポリメラーゼの基質として働き、伸長鎖の３' -OH末端に付加される。伸長鎖の３' -OH末端に付加されたヌクレオチド誘導体は、D-リボースの２' 位にメトキシTEMPO(2,2,6,6-Tetramethyl-1-piperidinyloxy)基が付加されている。そのために、その立体的障壁のためポリメラーゼによる更なるヌクレオチドの付加を阻害することができる。上の式で表されたヌクレオチド誘導体における、電気化学的に変換し得る部分は、メトキシTEMPO基である。TEMPOは安定ラジカル種として既知であり、電気化学的還元により脱離反応を起こして、D-リボースの２' 位水素を再生する。
【０１２０】
【化６】
2007195548.tif 000007
【０１２１】
これによって、伸長鎖の３' 位水酸基に、ポリメラーゼの触媒作用による新たなヌクレオチドの付加が可能になる。したがって本実施例のヌクレオチド誘導体は、電気化学的に変換し得る部分を有し、本発明に好適に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】本発明の核酸の塩基配列の解析方法における各工程を説明する模式図である。
【図２】本発明の核酸の塩基配列の解析方法を実行するDNA塩基配列解析装置の構成例を示す模式図である。
【図３】本発明の実施例２において取得されるデータを示す模式図である。
【図４】標的核酸上でのプライマーの認識位置を示す図である。
【図５】本発明のDNA塩基配列解析装置において実行されるプログラムの流れを示すフローチャートの例である。
【図６】図１（１）及び図１（２）の拡大図であり、（１）は図１（１）に（２）は図１（２）に相当する。
【図７】図１（３）及び図１（４）の拡大図であり、（１）は図１（３）に（２）は図１（４）に相当する。
【図１】
2007195548.tif 000008
【図２】
2007195548.tif 000009
【図３】
2007195548.tif 000010
【図４】
2007195548.tif 000011
【図５】
2007195548.tif 000012
【図６】
2007195548.tif 000013
【図７】
2007195548.tif 000014
【配列表】
2007195548000001.app