(57)【要約】【課題】移植用膵島の分離方法の提供。【解決手段】膵島分離回路中の溶存酸素濃度を外的かつ直接的に高めることを特徴とする、移植用膵島の分離方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵島分離回路中で膵臓を酵素で消化する工程を含む移植用膵島の分離方法において、膵島分離回路中の溶存酸素濃度を外的かつ直接的に高めることを特徴とする、移植用膵島の分離方法。
【請求項２】
膵島分離回路中の溶存酸素濃度が３０〜３８μｇ／ｍｌである、請求項１に記載の移植用膵島の分離方法
【請求項３】
膵島がブタ又はヒトに由来する、請求項１または請求項２に記載の移植用膵島の分離方法。
【請求項４】
膵島がブタ又はヒトの単一の個体に由来する、請求項３に記載の移植用膵島の分離方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の分離方法を用いることによって得られた、移植用膵島。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移植用膵島の分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エドモントンプロトコールの登場以降、膵島移植は世界中で注目されており、現在まさに一型糖尿病に対する理想的根治療法として確立されようとしている（非特許文献１）。日本においても２００４年４月より膵島移植が開始されたが、我国においては社会的および宗教的理由によって脳死ドナーが極端に少ないという特有の事情があり、膵島移植のための膵臓の供給源を心停止ドナーに頼らざるを得ないのが現状である。膵臓の供給源としての心停止ドナーにおける最大の問題点は、脳死ドナーに比べて温阻血時間が長いことから膵島の生理的活性が低下してしまうことである。そのため、一般に心停止ドナーからの膵島移植は不可能であるとされていたが、温阻血時間を短くすることにより、十分可能であることが近年の我国の成績より示された（非特許文献２）。
【０００３】
これまでのデータによると、温阻血時間が３０分を超えると得られる膵島の質および量が共に極端に低下することが知られている。また、我国においては、心停止ドナーからの膵島移植において温阻血時間を短くすること、すなわち、心停止後３０分以内に膵臓を摘出することは、実際には多くの場合困難であり、温阻血時間が３０分を越えても、膵島移植に十分な質および量の膵島を得ることができる技術の開発が望まれていた。
【０００４】
さらに最近、酸素化ＰＦＣをラット膵臓消化時に使用することにより膵島収量を２倍に高めることができることが報告されている（非特許文献３）。
【０００５】
しかし、ＰＦＣには、下記の問題点が知られている。
１．ＰＦＣ自体に毒性があることが知られているため、長時間膵島と接触させるのは好ましくないこと、すなわち、膵島は膵臓から分離すると、膵臓内にある場合に比べて遥かに脆弱となるため、膵臓内では問題とならないような毒性が致命的となることがある。
２．膵島移植において最も重要なことは、膵臓を効率よく分解し、より多くの膵島を回収することである。その過程において酵素の活性を維持することが最重要であり、回路内にＰＦＣを注入することはその活性に影響を与える可能性が高く、臨床応用を考慮した場合現実的とは思えない。
３．さらに、ＰＦＣは比重が極端に高く疎水性であるため、回路内において酵素溶液との融合がみられず、酵素の効果を最大限に発揮させることを妨げる。それによって、むしろ消化時間が延長されることが予想され、たとえ収量が増えようとも産物である膵島は多くのストレスを抱えることになり、最終的には膵島の「質の低下」を招く。短い消化時間は、膵島へのストレスを減らし、炎症性サイトカインの放出も減少させるため、膵島の「質」の向上に繋がることが知られている（非特許文献４）。
【０００６】
したがって、上記の問題点を有さない、膵島分離方法の開発が望まれていた。
【０００７】
【非特許文献１】James Shapiro他著、N Engl J Med、343(4):230、２０００年
【非特許文献２】松本慎一他、第32回膵・膵島移植研究会：Ｃ−１２、２００５年
【非特許文献３】黒田著、神戸大学ＣＯＥ成果報告書、２５−２７、２００５年
【非特許文献４】後藤昌史他著、Transplantation:78(9):1367、２００４年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、移植用膵島の分離方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究を続けた結果、膵島分離回路中の溶存酸素濃度を高めることによって、膵島移植に十分な質および量の膵島を得ることができることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、下記に関する。
１．膵島分離回路中で膵臓を酵素で消化する工程を含む移植用膵島の分離方法において、膵島分離回路中の溶存酸素濃度を外的かつ直接的に高めることを特徴とする、移植用膵島の分離方法、
２．膵島分離回路中の溶存酸素濃度が３０〜３８μｇ／ｍｌである、上記１に記載の移植用膵島の分離方法、
３．膵島がブタ又はヒトに由来する、上記１または上記２に記載の移植用膵島の分離方法、
４．膵島がブタ又はヒトの単一の個体に由来する、上記３に記載の移植用膵島の分離方法、
５．上記１〜４のいずれか１項に記載の分離方法を用いることによって得られた、移植用膵島。
【００１１】
本発明で「膵島」とは、平均約２０００個の膵島細胞より構成される細胞塊である。この細胞塊自身が血糖感知能を有しているため、移植に使用する際は、膵島細胞ではなく膵島の状態である方が望ましい。
【００１２】
本発明で「膵島分離回路」とは、膵臓より膵島を抽出するための酵素溶液を含んだ灌流回路のことである。その中には、膵臓を留置するRicordi Chamber (Ricordi C著、Diabetes:38:suppl 1:140:1989)、酵素の至適活性温度である３７℃を保つための加温器、回路を灌流させるためのペリスタポンプ等が含まれる（図１参照）。
【００１３】
本発明で「溶存酸素濃度を外的かつ直接的に高める」とは、酸素を膵島分離回路の外部から、酸素運搬媒体、例えば、ＰＦＣを介することなく膵島分離回路内に付与することにより膵島分離回路内の溶存酸素濃度を高めることをいう。
【００１４】
本発明で「移植用膵島」とは、ヒトのような哺乳動物に移植した場合に１型糖尿病の病的状態を回復するのに十分な機能を有する膵島をいう。この機能は、例えばインビボ膵島機能テストにより確認することができる。
【００１５】
数ある膵島の機能テストの中で、最も信頼に足るものは、実際に糖尿病となった動物をその膵島でもって治癒することができるかどうかを確認する、いわゆる「インビボ膵島機能テスト」であることは古くより知られている。このテストが実際の膵島機能を最もよく反映することは周知の事実であるにも関わらず、臨床上あまり使用されていないのは、このテストにはインビトロテストに比べてより大量の膵島を必要とし、移植の結果がはっきり分かるまでに数日を要するといった欠点を有しているためである。
【００１６】
移植に使用するレシピエントは、同種同系であれば免疫反応を回避できるため、結果は全て膵島の機能に依存することとなる。ただし、ブタの膵島分離の場合には同系のブタを揃えることは事実上不可能であるし、近年の遺伝子技術を使用するにしてもかなりの高額を要する。そこで、ブタの場合には、免疫反応の影響を除外できるヌードマウス（胸腺を持っていないためにＴ細胞を欠如しており、免疫反応が起きないマウス）へ移植することにより、膵島の機能評価を行っている。この方法は、古くより確立されており、多くの論文に取り入れられている（Rayat GR著、Transplantation:69(6):1084:2000）。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の方法は、１型糖尿病に対する理想的根治療法である膵島移植に用いることができる移植物を調製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の移植用膵島の分離方法のための溶存酸素濃度を外的かつ直接的に高める手段としては、従来公知の手段であれば特に限定されないが、好ましくは、酸素ボンベ等の酸素保存機器から回路内に直接酸素を注入する注気法である。迅速化のため、酸素の純度は、１００％が好ましく、注入圧は、酸素１Ｌ／分が好ましい。
【００１９】
本発明の高められた溶存酸素濃度は、好ましくは、３０〜３８μｇ／ｍｌ、より好ましくは、３５〜３８μｇ／ｍｌ、もっとも好ましくは３８μｇ／ｍｌである。
【００２０】
本発明における溶存酸素濃度の測定方法は、従来公知の方法であれば特に限定されないが、例えば、溶存酸素計タフネス（佐藤商事）による回路内溶液の溶存酸素濃度測定である。
【００２１】
本発明における移植用膵島の分離方法は、従来公知の方法であれば特に限定されないが、好ましくは、Ricordi変法と呼ばれるもので、Ricordiチャンバーの中に酵素を充填された膵臓を留置し、予め３７度に加温しておいた膵島分離溶液をペリスタポンプにより２００ｍｌ／分で灌流することにより、化学的かつ物理的に膵臓を消化し、最終目的産物である膵島のみを抽出する方法である(後藤昌史他著、Transplantation:78(9):1367、２００４年参照)。
【００２２】
本発明における移植用膵島の供給源は、哺乳動物、好ましくはヒトであるが、異種膵島移植を行う場合のブタも含むことができる。また、この供給源は、好ましくは、単一の個体に由来する。
【００２３】
また、本発明は、本発明の分離方法を用いることによって得られた、移植用膵島にも関する。
【実施例】
【００２４】
我々は、臨床心停止ドナーからの膵島移植のモデルとして、温阻血を４０分被った心停止ブタからの膵島分離・移植実験を行った。ブタは、膵島が非常に脆弱であり、膵島分離が最も難しい哺乳類の一つといわれているが、膵臓の大きさやインスリンのアミノ酸配列がヒトとよく類似しているため、良いモデルになることから、ブタをモデル動物として選択した。
【００２５】
従来の分離法だと、ブタモデルにおいては、膵島の収量が極端に少なく、また膵島の「質」も低下しているため、産物である膵島を移植しても糖尿病マウスを治癒させることはできなかった。一方、注気法を行った場合は糖尿病マウスを治癒することが可能となり、インビトロの結果からも産物である膵島の「質」が向上していることが証明された。
【００２６】
本来、膵島の「質」の向上を目指し注気法を導入したので、ここまでは予想の範囲内であったが、驚くべきことに、膵島の収量自体も大幅に増加することが判明した。これは、長い温阻血により膵島がストレスに基づくダメージを受け壊死を起こしていたのが、注気法による酸素化導入により生き残る膵島が多くなったためと推測できる。
【００２７】
原則として酸素注入は持続的に行った。図２に示すように、持続的酸素注入開始後、約５分で最大容量である３８μｇ／ｍｌに達する。その後、バブリングを停止すると溶存酸素濃度は速やかに１８μｇ／ｍｌまで低下し、少なくとも１５分はその濃度が維持される。
【００２８】
したがって、実際の膵島分離のケースに適用すると、消化停止過程までは通常約２０分を要するので、持続的酸素注入を行うことによって目的とする３８μｇ／ｍｌの溶存酸素濃度が十分に維持された。次に、消化停止後であるが、酵素による膵臓分解産物を回収するために、新たな１Ｌの点滴ボトル溶液にて２００ｍｌ／分の速度で洗浄を開始した。溶液を使い切る５分の間には、溶存酸素濃度は最大容量である３８μｇ／ｍｌには到達しないことから、あらかじめ溶存酸素濃度を最大容量にするために、点滴ボトルのプリバブリングを行った。
【００２９】
そうすることにより、点滴ボトル変更後も速やかに最大容量である３８μｇ／ｍｌを維持することが可能となった。洗浄溶液は通常約７Ｌ必要とされるため、点滴ボトルを使用する代わりに、大きなビーカーに７本分の溶液をひとまとめにしてバブリングする方法も考えられたが、その場合閉鎖回路ではなくなるのでコンタミネーションのリスクが高まり、臨床応用を考慮した場合、得策とはいえない。
【００３０】
グラフト免疫染色像：モデル糖尿病マウスを作成する場合、通常はＳＴＺという毒物を注射し、膵島のβ細胞を選択的に破壊し、あたかも１型糖尿病患者のような病態を作り上げている。通常、２５０ｍｇ／ｋｇでＳＴＺを尾静脈より注射すれば、ほぼ１００％のマウスが糖尿病を発症するが、中にはごく稀に、ＳＴＺに耐性を示し、自身のβ細胞の一部が残存するマウスが見られることが知られている。そうした場合、移植後の血糖値正常化が、グラフトによるものなのか、もしくは自身のβ細胞の回復によるものなのかがはっきりしないことになる。したがって、そういった場合は、グラフトの摘出を行いマウスが再び糖尿病へ回帰するか観察を行い、評価することとなる。その際、併せてグラフトのインスリン免疫組織染色を行い、グラフトが実際にインスリンを有しているか、またその程度を確認することは非常に重要であり、既に確立したグラフト評価法である。
【００３１】
本発明のグラフトでは、移植後約２ヶ月経過後であっても豊富なインスリンを有しており、明らかに良好なグラフトであることが認められた。
【００３２】
注気法による回路内溶存酸素濃度
溶存酸素計は、溶液が静止した状態においては正確に計測を行うことができず、また最低６cmの水面を要するため、直接点滴ボトル内へ留置し、再び閉鎖回路状態を保つため、溶存酸素計注入部をガムテープにて厳重に封鎖した。膵島分離回路、及び膵島分離溶液は通常ブタ膵島分離に使用しているものと全く同じものを再現し、行った。結果は図２に示す通りである。
【００３３】
温阻血約４０分のブタからの膵島収量
ブタの膵臓は、仙台市の許可のもと、仙台食肉市場センターへ立ち入り、直接他の内蔵より分離し使用させて頂いた。ブタの心停止後、２５分より膵臓摘出を開始し、摘出後トリミングを行い、膵体尾部のみを冷却化したＵＷ溶液に浸し搬送した。実験室にて、主膵管より５００ｍｇのリベラーゼという膵臓消化用酵素を注入し、次いで膵臓周囲の脂肪や血管、膜組織のトリミングを行った。十分にトリミングを行った後、膵臓を６片に細切し、膵島分離回路中のRicordi chamber内に留置した。膵島分離回路をペリスタポンプを使用し、２００ｍｌ／分の速度で灌流し、化学的、物理的に膵臓の消化を促進した。経時的に回路よりサンプルを取り出し、膵臓の消化具合を確認し、十分に膵島が他の組織より遊離された時点で回路内消化物の回収にとりかかった。回収された細胞ペレットには外分泌細胞も含まれているため、血球分離器であるＣＯＢＥ２９９１を使用し比重分離を行った。最終的に、膵島が多く含まれている分画を選び出し、収量を顕微鏡下に計測した上で培養液に混ぜ、３７度保温器にて培養を行った。結果は図３に示す通りである。
【００３４】
糖負荷膵島機能テスト
直径が１５０μｍである膵島を６０個無作為に選び出し、１．６７ｍＭ低濃度グルコースを含んだ３本のチューブに分配した。３７度で３０分間インキュベートした後、上清を回収し、次に１６．７ｍＭの高濃度グルコースで３０分インキュベートし、同様に上清を回収した。各上清のインスリン濃度をＥＬＩＳＡ（Mercodia社製）にて測定し、高濃度グルコース溶液時に放出されたインスリンの量を、低濃度グルコース溶液時に放出されたインスリン量で割った値をStimulation Indexと呼び、評価に使用した。結果は図４に示す通りである。
【００３５】
糖尿病胸腺欠損マウスに対する膵島移植
胸腺欠損マウスを予め２５０ｍｇ／ｋｇのＳＴＺにて糖尿病状態としておいた。そのマウスの腎臓皮膜下に約３０００  ＩＥＱｓのブタ膵島を移植し、マウスの血糖状態を観察し、グラフトの評価に使用した。８週間経過したところで、グラフトを含む腎臓を摘出し、グラフトの効果を再確認した。結果は図５に示す通りである。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、膵島分離回路である。
【図２】図２は、注気法による回路内溶存酸素濃度である。縦軸は、酸素濃度（μｇ／ｍｌ）を表す。
【図３】図３は、温阻血約４０分のブタからの膵島収量である。ＡＰＩとはAdult Pig Islets（成熟ブタ）の略語である。ＩＥＱｓとはIslet Equivalents（膵島当量）の略語であり、直径が１５０μｍの膵島を１と規定する、膵島のボリュームを示す国際単位のことである。したがって、グラフの縦軸は膵臓重量１ｇ当たりから得られた膵島の量を示すことになる。
【図４】図４は、糖負荷膵島機能テストである。縦軸はStimulation Index（グルコース刺激指数）を示している。
【図５】図５は、糖尿病胸腺欠損マウスに対する膵島移植の結果である。縦軸は、血中グルコース濃度（ｍｇ／ｄｌ）であり、横軸は、移植後の日数である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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