(57)【要約】【課題】  既知の抗HIV剤に比べて強い抗AIDS作用を示し、かつ毒性の低い化合物を提供すること。【解決手段】  一般式：      [(BiW9O33)2V3O3]p-     （１）[式中、ｐは９〜12の整数を示す。]で表されるヘテロポリ酸イオンの塩を有効成分とする抗後天性免疫不全症候群ウイルス剤。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式：
[(BiW9O33)2V3O3]p-     （１）
[式中、ｐは９〜12の整数を示す。]
で表されるヘテロポリ酸イオンの塩を有効成分とする抗後天性免疫不全症候群ウイルス剤。
【請求項２】
前記ヘテロポリ酸イオンの塩が、K12[(BiW9O33)2V3O3]・29H2Oである、請求項１記載の抗後天性免疫不全症候群ウイルス剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘテロポリ酸イオンの塩を有効成分とする抗後天性免疫不全症候群ウイルス剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
後天性免疫不全症候群、通常、AIDS（Acquired Immuno Deficiency Syndrome）とは、麻薬などの薬物濫用者、男性との同性愛者などの間で流行している病気である。また、血液製剤からの感染も問題となっている。この病気に罹ると免疫機能が著しく低下し、感染症などの原因で死亡し、その死亡率は極めて高い。
【０００３】
このようなAIDS発症のメカニズムは種々提案されている。例えば、AIDSウイルス（HIV）が標的細胞であるCD-４抗原陽性のヘルパーＴ細胞に次々に感染し、ウイルス増殖と細胞破壊を繰り返すことにより、免疫不全を起すものと考えられている。しかしながら、AIDS発症のメカニズムについては未だ不明な点が多く残されている。この分野における分子生物学的研究には、めざましいものがあり、AIDSウイルスの特徴も徐々に明らかになりつつある。その結果、AIDSウイルスの特徴として、ウイルスの遺伝子構造が、他のレトロウイルスと比較して著しく複雑であり、感染能、増殖能という機能の面でも多様性を示すウイルスであること、非常に変異しやすいウイルスであること等が挙げられる。
【０００４】
近年、これらの知見に基づいて、AIDSウイルスの増殖阻害法、感染防止法などが提案されている。代表的なAIDSウイルス増殖抑制物質してはAZTが知られている。AZTは、MT-4細胞の新鮮感染系でも選択的にAIDSウイルスの増殖を制御する。しかしながら、長期投与では骨髄障害などの副作用がある。
【０００５】
一方、無機金属酸化物の抗ウイルス剤として、ヘテロポリ酸塩を含む抗ウイルス剤（例えば特許文献１及び２参照）が知られている。特に、特許文献２記載の抗ウイルス剤は、in vitroにおいてAIDSウイルスに対し極めて有効に作用し、かつ毒性も低い。
【特許文献１】特開2000-229864号公報
【特許文献２】特許第2993674号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、これらのウイルス剤は、抗ウイルス効果の大きさと副作用の低さの点で必ずしも十分とは言えず、また耐性ができやすいという問題点がある。従って、本発明は、公知の抗後天性免疫不全症候群ウイルス剤（抗HIV剤）に比べて強い抗AIDS作用を有し、かつ非常に副作用の低い抗HIV剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、斯かる実状に鑑み、鋭意研究を行った結果、下記一般式で表される化合物の塩が、公知の抗HIV剤に比べて強い抗AIDS作用を示し、かつ低毒性であることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、一般式：
[(BiW9O33)2V3O3]p-     （１）
[式中、ｐは９〜12の整数を示す。]
で表されるヘテロポリ酸イオンの塩を有効成分とする抗HIV剤を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の抗HIV剤は、AIDSウイルスを極めて有効に阻害し、かつ毒性が低い。従って、本発明のヘテロポリ酸イオンの塩は、抗HIV剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
上記式（１）で表されるヘテロポリ酸イオン（以下、「化合物（１）」という）は、一般的に、Biイオンをヘテロイオンとして中心に有するポリタングステン酸イオンがバナジウム酸イオンを介して互いに対称的に結合した構造を有し、欠損Keggin型サンドイッチ型ポリ酸と言われる。アニオンの価数は、９〜12であるが、これはアニオンを形成するバナジウムの原子価とその原子数によって異なる。
【００１０】
化合物（１）の塩は、例えば特開平2000-229864号公報記載の方法に準じて製造することができる。ヘテロポリ酸イオンの塩を形成するアルカリイオンとしては、ナトリウム、カリウム、セシウム等のアルカリ金属イオン；カルシウム、ストロンチウム、バリウム等のアルカリ土類金属イオン；メチルアンモニウム、エチルアンモニウム、ジメチルアンモニウム等のアルキルアンモニウムイオン；アニリニウム等の芳香族アンモニウムイオン；水素化金属イオンが挙げられる。当該ヘテロポリ酸塩は、50分子以内の結晶水を有していてもよい。化合物（１）の塩としては、特にK12[(BiW9O33)2V3O3]・29H2Oが好ましい。
【００１１】
上記の化合物（１）の塩は、後記実施例に示すように、公知の抗ウイルス剤、例えば特開2000-229864号公報に記載の抗ウイルス剤に比べて、in vivoで強い抗AIDSウイルス作用を示し、ヒトを含む動物における抗HIV剤として有用である。
【００１２】
本発明の抗HIV剤は、通常、固体又は液状の薬学的に許容される担体、好ましくは液状担体中に、少なくとも１種以上の化合物（１）の塩を含む。また、本発明の抗HIV剤は、公知の活性物質と併用することもできる。
【００１３】
本発明の抗HIV剤の投与形態は特に限定されず、例えば、経口、非経口、皮下、静脈、腹腔内等の投与形態が挙げられる。また軟膏剤、外用点眼剤等の剤型も好ましい。特に好ましい経口投与形態は、例えば錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤、油性又は水性の懸濁剤液等である。本発明の抗HIV剤が非経口的、皮下的、静脈的及び腹腔内経路で投与される場合には、液状担体としては無菌の蒸留水又は生理食塩水が好ましい。一般的に、注射剤は、液状担体中に化合物（１）の塩を10mg/ml（1.0％）含有する。
【００１４】
上記の各投与単位形態中に配合されるべき化合物（１）の塩の量は、これを適用すべき患者の症状により又はその剤型等により一定ではないが、一般に投与単位形態あたり経口剤では約0.25〜100mg、注射剤では約0.05〜20mgとするのが望ましい。
【実施例】
【００１５】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００１６】
製造例１
化合物（１）の塩は、特開平2000-229864号公報記載の方法に準じて製造した。得られた結晶は、Ｘ線構造解析により、K12[(BiW9O33)2V3O3]・29H2O (以下、PM-1208と称する）であることが確認された。対照化合物として、[PriNH3]6H[PTi2W10O38（O2)2]・H2O（以下、PM-523と称する)及びK11H[(SbW9O33)2V3O3]・27H2O（特開2000-229864号公報に記載、以下、PM-1002と称する）を同様な方法によって製造した。
【００１７】
実施例１
（１）ウイルス
抗ウイルス試験には、HIV env蛋白を発現する組み換えワクシニアウイルスvPE 16（CAT番号362；米国NIHエイズ研究センターより入手）及びHIV gap/pol蛋白を発現する組み換えワクシニアウイルス vp 1206（CAT番号4095；米国NIHエイズ研究センターより入手）を用いた。対照として、非組み換えウイルスであるワクシニアウイルス WR株（ATCCより入手）を用いた。これらのウイルスは、ウサギ腎臓細胞（RK-13）にて増殖を行った。増殖させたウイルスは、使用するまで−20℃にて保存した。
【００１８】
(２)抗HIV剤の至適濃度の検討
至適濃度の検討には、８週齢Balb/c雌性マウス（日本SLCから購入、体重25〜35g）を１群５匹用いた。当該マウスは、横浜市立大学の動物センターにて、昼12時間及び夜12時間のサイクルで飼育した。各マウスに対し、本発明の抗HIV剤 PM-1208、及び対照化合物PM-523及びPM-1002を1000mg/kg/日、500mg/kg/日、250mg/kg/日及び125mg/kg/日の濃度で腹腔内投与した。投与後、６時間ごとに、４日間マウスを観察し、マウスの生存率から至適濃度を決定した。結果を図１に示す。図１は上から順にPM-1208、PM-523、PM-1002を示し、-黒丸-は1000mg/Kg/日、-白丸-は500mg/Kg/日、-黒四角-は250mg/日、-白四角-は125mg/Kg/日を表す。
図１から明らかなように、本発明の抗HIV剤は125mg/kg/日の投与濃度では全く毒性が認められず、これは２種の対照化合物と同等であった。
【００１９】
(３)PM-1208、PM-523及びPM-1002のin vivo試験
本発明の抗HIV剤のin vivo試験には、８週齢Balb/c雌性マウス（日本SLCから購入、体重25〜35g、１群５匹）を用いた。vPE 16、vP 1206及びWR株を10７プラーク形成単位（PFU）/ml、すなわちマウス１匹当たりに、10６pfu/mlのウイルスを100μlずつ腹腔内投与した。ウイルスの投与２日目から、本発明の抗HIV剤、PM-523及びPM-1002を12.5mg/kg/日及び125mg/kg/日で３日間投与した。最終投与から２日後に、マウスの卵巣を摘出し、１mlのイーグルのMEM培地にて１分間ホモジナイズし、当該懸濁液を15,000rpmにて４℃で10分間遠心した。遠心後の上清をプラーク・アッセイの試料とした。忻らの方法（J Gene Med, 5: 438-445）に従ってプラーク・アッセイを行い、卵巣中のウイルス力価を測定した。結果を図２に示す。
【００２０】
一方、組み換えウイルスvPE 16及びvp 1206が卵巣に感染し、それぞれenv蛋白、gap/pol蛋白を発現することから、PM-1208、PM-523及びPM-1002の存在下において当該蛋白の発現量に変化が見られたかをイムノブロットによって確認した。すなわち、ホモジナイズした卵巣上清各100μlを群ごとに集め、２倍のイムノブロット試料用希釈液（125mM Tris-HCl, pH 6.8, 4％ SDS, 20％ グリセロール, 0.01％ブロモフェノールブルー及び10％ β-メルカプトメタノール）を用いて希釈し、10分間煮沸を行い、イムノブロット試料とした。イムノブロットは、10％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行った後、ニトロセルロース膜（Amersham Pharmacia Biotech社製）にゲル上の蛋白質を転写し、抗env及び抗gap/pol抗体をそれぞれ反応させた。次いで、ホースラデッシュ・ペルオキシダーゼ（HRP）で標識した二次抗体を室温にて反応させた。反応後、セルロース膜をラジオグラフXフィルムに感光させて、蛋白質バンドをECLウェスタンブロッティング検出装置（Amersham Pharmacia Biotech社製）により確認した。結果を図３に示す。
【００２１】
図２及び３から明らかなように、本発明のPM-1208は、vPE 16ウイルス及びvP 1206ウイルスに対して、対照化合物PM-523及びPM-1002とほぼ同等の抗ウイルス作用を示し、特にvP 1206ウイルスに対しては対照化合物に比べて高い抗ウイルス作用を示すことが判った。一方、薬剤未処置群では３日後も発現蛋白量が変化しなかった。
【００２２】
(４)細胞内サイトカイン測定
細胞内サイトカイン測定には、Cytofix/Cytoperm Plus Kit（BD Bioscience Pharmingen社製）を用いた。すなわち、vPE 16を接種後、PM-523、PM-1002及びPM-1208の各薬剤 125mg/kg/日にて３日間処置したマウスの脾臓を摘出し、リンパ球を単離し、20μg/mlのHIV envペプチド（NNTRKRIQRGPGRAFVTIGKIGN）を加え、37℃、５％のCO2存在下で24時間培養した。対照として薬剤非処置のマウスについても同様に行った。培養後、１μg/mlのGolgi Plug（BD Bioscience Pharmingen社製）を添加し、更に２時間培養した。培養したリンパ球は、緩衝液（0.1％アジ化ナトリウムを含む３％FCSのPBS溶液）にて３回洗浄した。洗浄後、４％標準マウス血清で、４℃、30分間ブロッキングした。ブロッキングを行ったリンパ球を、緩衝液で３回洗浄した後、PE（Phycoerythrin Ebioscience Inc, VSA）で標識した抗マウスCD8a抗体（Ly-2；BD Bioscience Pharmingen社製）で染色した。染色後、250μlのCytofix/Cytoperm溶液で４℃、20分間反応させた。次いで、FITC（Fluorescein-4-isothiocyanate）で標識した抗マウスINF-γ抗体（BD Bioscience Pharmingen社製）で４℃、30分間染色した後、緩衝液で３回洗浄し、フローサイトメトリーで解析した。結果を表１に示す。
【００２３】
【表１】
2007055904.tif 000002
【００２４】
表１から明らかなように、PM-523、PM-1002、PM-1208の各薬剤で処置したマウス及び非処置マウスのCD8陽性、INF-γ産生Tリンパ球を比較すると、これらにほとんど差は認められなかった。このことより、vPE 16接種マウスにおいてウイルス排除に免疫反応が関与していないことが示唆され、ウイルスの排除は薬剤によるものであると考えられる。
【００２５】
(５)ELISA
組み換えウイルスvPE 16及びvP 1206をそれぞれ接種したマウスの血清中の抗env及びgap/polに対する抗体価を確認するためにELISAを行った。ELISA抗原として430Aペプチド合成機（Applied Biosystems, USA）にて合成したenvペプチド（100μg/ml）とgap/polペプチド（100μg/ml）を用い、96ウェルプレート（Nunc Band Producs Denmark社製）に４℃で一晩、当該抗原を固相化した。固相化したプレートを、PBS/T（0.05％Tween20を含むPBS）にて３回洗浄した後、１ウェル当たり200μlの１％牛胎児血清アルブミンを含むPBS/Tを加え、４℃にて一晩ブロッキングを行った。ブロッキング終了後、４倍から段階希釈した感染前と感染後の血清を各ウェルに100μlずつ加え、37℃で２時間反応させた。反応後、プレートをPBS/Tで３回洗浄し、ホースラデッシュ・ペルオキシダーゼ（HRP）で標識した抗マウスIgGを各ウェルに100μlずつ加え、37℃で２時間反応させた。反応後、プレートをPBS/Tで３回洗浄し、酵素基質液で発色させ、492nmの吸光度を測定し、抗体価を測定した（図４）。図４より、PM-1208、PM-1002及びPM-523を投与したいずれのマウスにおいても、env及びgap/polに対する免疫が存在しないことが確認された。
【００２６】
(６)中和抗体価の測定
ウイルス接種による中和抗体の影響を調べるために、血清中のvPE 16、vP 1206及びWR株に対する中和抗体価を測定した。すなわち、感染前のマウス、及びvPE 16、vP 1206及びWR株による感染後のマウスより採血した。採血後、分離した血清を56℃、30分間非動化した後、当該血清をイーグルのMEM培地で４倍に階段希釈した。希釈した血清25μLに、同量の100 PFU/mlのvPE 16、vP 1206及びWR株を加え、37℃にて２時間中和した。中和後、各血清に200μlのBSC-1細胞（4.0×10５細胞/ml）を加え、５％炭酸ガス下で５日間培養した。培養後、プラークの形成により抗体価を判定した。抗体価の測定の結果、マウスの血清中には接種したウイルスに対する中和抗体は認められなかった。このことからウイルスの排除には、中和抗体の影響がないことが推察された。結果を表２に示す。
【００２７】
【表２】
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【００２８】
併せて図２の結果を有意義検定したものを図５に示した。図５中の *P<0.01及び **P<0.05は、非処置群との有意差(Fisherの直接確率計算法による)を示す。
【００２９】
表２及び図５から明らかなように、本発明の抗HIV剤は、対照化合物PM-523及びPM-1002に比較して、ウイルスvPE 16及びウイルスvP 1206のいずれに対しても極めて強い抗ウイルス作用を示すことが判った。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、各濃度のPM-1208、PM-523及びPM-100で処置したマウスの生存率を示す図である。
【図２】図２は、ウイルス接種後にPM-1208、PM-523及びPM-1002で処置した場合の卵巣中のウイルス力価を示す図である。
【図３】図３は、ウイルス接種後にPM-1208、PM-523及びPM-1002で処置した場合のenv蛋白及びgap/pol蛋白の発現の変化を示すイムノブロットである。
【図４】図４は、envペプチド及びgap/polペプチドに対する血清IgG力価を示す図である。
【図５】図５は、図２のグラフを棒グラフに有意義検定を行った図である。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図３】
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