(57)【要約】【課題】  対物レンズの焦点を試料位置に正確に合わせると云った処理が不要であり、測定中、励起光が一箇所に長い時間照射されて試料中の蛍光標識物質が劣化するのを防ぐことの出来る蛍光検出装置を提供する。【解決手段】  試料に励起光を照射してそこから発せられる蛍光を検出することで試料中の特定物質の測定を行う蛍光検出装置である。レーザ光を測定箇所に集束するとともに該測定箇所から発せられる蛍光を集光する対物レンズと、対物レンズを励起光のフォーカス方向および該フォーカス方向と交差する方向とに駆動するレンズアクチュエータとを備え、試料の測定時に、励起光の焦点が測定対象の試料をまたいで往復移動するようにレンズアクチュエータを動作させる。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起光となるレーザ光を出力するレーザ出力手段と、該レーザ光を測定箇所に集束させるとともに該測定箇所から発せられる蛍光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された蛍光の検出を行う蛍光センサと、前記レーザ光を前記レーザ出力手段から前記対物レンズまで導くとともに前記対物レンズにより集光された蛍光を前記蛍光センサまで導く光学系とを備え、試料に前記励起光を照射してそこから発せられる蛍光を検出することで試料中の特定物質の測定を行う蛍光検出装置であって、
前記対物レンズを前記励起光のフォーカス方向および該フォーカス方向と交差する方向に駆動するレンズアクチュエータと、
前記レンズアクチュエータの駆動制御を行う制御手段と、
前記蛍光センサの検出出力を入力して解析する解析手段とを備え、
前記制御手段は、試料の測定時に、前記励起光の焦点が測定対象の試料をまたいで該試料の存在する範囲の２倍〜１００倍の振り幅で往復移動し、且つ、前記対物レンズが１０〜２００ｍ／ｓ２の加速度で往復運動するように前記レンズアクチュエータを駆動させ、
前記解析手段は、前記レンズアクチュエータの駆動中に前記蛍光センサの出力が変化した期間のピーク値から前記試料の蛍光検出量を割り出すことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項２】
試料に励起光を照射してそこから発せられる蛍光を検出することで試料中の特定物質の測定を行う蛍光検出装置であって、
前記励起光を出力する光源と、
該励起光を測定箇所に集束させるとともに該測定箇所から発せられる蛍光を集光する対物レンズと、
該対物レンズにより集光された蛍光の検出を行う蛍光センサと、
前記励起光を前記光源から前記対物レンズまで導くとともに前記対物レンズにより集光された蛍光を前記蛍光センサまで導く光学系と、
前記対物レンズを変位させるレンズアクチュエータと、
該レンズアクチュエータの駆動制御を行う制御手段とを備え、
前記制御手段は、試料の測定時に、前記励起光の焦点が測定対象の試料をまたいで往復移動するように前記レンズアクチュエータを駆動させるように構成され、このレンズアクチュエータの駆動中に得られる前記蛍光センサの検出出力から試料の蛍光検出量が割出し可能にされていることを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項３】
前記蛍光センサの検出出力を入力して解析する解析手段を備え、
前記解析手段は、前記レンズアクチュエータの駆動中に前記検出出力が変化した期間のピーク値から前記試料の蛍光検出量を割り出すように構成されていることを特徴とする請求項２記載の蛍光検出装置。
【請求項４】
前記制御手段は、前記試料を泳動させるマイクロ流路の高さ方向、或いは、この高さ方向と当該マイクロ流路の幅方向とに前記対物レンズを往復運動させることを特徴とする請求項２又は３に記載の蛍光検出装置。
【請求項５】
前記制御手段は、前記試料が点状にスポットされたチップの表面に対して垂直方向、或いは、この垂直方向とチップ表面に沿った方向とに前記対物レンズを往復運動させることを特徴とする請求項２又は３に記載の蛍光検出装置。
【請求項６】
試料測定時における前記励起光の焦点の振り幅は、前記試料が存在する範囲の２倍〜１００倍の長さであることを特徴とする請求項２〜５の何れかに記載の蛍光検出装置。
【請求項７】
前記励起光の焦点を往復移動させるための前記対物レンズの往復運動は平均加速度１０〜２００ｍ／ｓ２で行われることを特徴とする請求項２〜６の何れかに記載の蛍光検出装置。
【請求項８】
励起光を対物レンズにより測定箇所に集束させるとともに、この測定箇所から発せられる蛍光を前記対物レンズにより集光して検出することで、測定試料中に含まれる特定物質の測定を行う蛍光検出処理方法であって、
試料の測定時に、前記励起光の焦点が測定対象の試料をまたいで往復移動するように前記対物レンズを駆動させ、この対物レンズの駆動中に得られる前記蛍光センサの検出出力から試料の蛍光検出量を割出すことを特徴とする蛍光検出処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、試料に励起光を照射してそこから発せられる蛍光の光量を検出することで試料中の特定物質の測定を行う蛍光検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
以前より、測定試料を各種の試薬や稀釈液と混合し、これをマイクロ流路に注入するとともにマイクロ流路中を泳動する試料に励起光を照射してそこから発せられる蛍光量を検出することで、試料中に含まれる特定物質の測定を行う蛍光検出技術が知られている。
【０００３】
このような蛍光検出技術においては、微弱な蛍光をより多く発生させるために、光源として半導体レーザ励起ＹＡＧの二次高調波レーザなどを用いて、高出力の励起光を試料に照射するのが一般的である。
【０００４】
また、本発明に関連する公知技術としては、例えば、次のような技術の開示がある。すなわち、特許文献１には、対物レンズを上下に繰り返し往復移動させながら測定を行うことで試料表面の高さ分布を求める技術が開示されている。また、特許文献２や３には、レンズを観測対象に接近させたり離したりさせながら輝度やコントラストがピークとなる位置を探し出し、それによりレンズの最適な焦点位置を決定する技術が開示されている。また、特許文献４には、顕微鏡撮像装置において焦点位置を変化させたときに撮像装置の露出時間を自動で変更する技術が開示されている。
【特許文献１】特開２００４−１７０５０９号公報
【特許文献２】特開平０９−２７４１４２号公報
【特許文献３】特開２００３−００５０８８号公報
【特許文献４】特開２００５−０３７６８３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
蛍光検出装置では微量の蛍光の検出を行うために、対物レンズのフォーカスを測定箇所に正確に合わせてより多くの蛍光を集光する必要があるが、測定試料が例えばＤＬＣ（ダイアモンドライクカーボン）など光の反射率の非常に低い物質の上に固着されているような場合には、十分な反射光が得られないためフォーカスを合わせるのが難しいという課題があった。
【０００６】
また、蛍光検出処理に使用する蛍光標識物質は、光の照射により徐々に劣化していくという性質がある。そのため、試料の一箇所に長い時間高出力の励起光を照射しつづけると、蛍光標識物質が劣化して蛍光の発光量が低下し、正確な測定結果が得られなくなるという問題があった。
【０００７】
この発明の目的は、励起光の焦点位置を試料位置に正確に合わせると云った処理が不要であり、測定中、励起光が一箇所に長い時間照射されて資料中の蛍光標識物質が劣化するという事態を防ぐことの出来る蛍光検出装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、上記目的を達成するため、試料に励起光を照射してそこから発せられる蛍光を検出することで試料中の特定物質の測定を行う蛍光検出装置であって、前記励起光を出力する光源（レーザ出力手段など）と、該励起光を測定箇所に集束させるとともに該測定箇所から発せられる蛍光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された蛍光の検出を行う蛍光センサと、前記励起光を前記光源から前記対物レンズまで導くとともに前記対物レンズにより集光された蛍光を前記蛍光センサまで導く光学系と、前記対物レンズを変位させるレンズアクチュエータと、該レンズアクチュエータの駆動制御を行う制御手段とを備え、前記制御手段は、試料の測定時に、前記励起光の焦点が測定対象の試料をまたいで往復移動するように前記レンズアクチュエータを駆動させるように構成され、このレンズアクチュエータの駆動中に得られる前記蛍光センサの検出出力から試料の蛍光検出量を割出し可能にしたものである。
【０００９】
好ましくは、前記蛍光センサの検出出力を入力して解析する解析手段を備え、前記解析手段は、前記レンズアクチュエータの駆動中に前記検出出力が変化した期間のピーク値から前記試料の蛍光検出量を割り出すように構成すると良い。
【００１０】
また具体的には、試料測定時における前記励起光の焦点の振り幅は、前記試料が存在する範囲の２倍〜１００倍の長さとし、前記励起光の焦点を往復移動させるための前記対物レンズの往復運動は平均加速度１０〜２００ｍ／ｓ２で行うようにすると良い。
【００１１】
このような手段によれば、測定時、励起光の焦点の往復移動範囲の中に試料位置が含まれるように試料位置の設定をすればよく、励起光の焦点を試料箇所へ正確に合わせる必要ない。また、測定時に励起光が試料の一箇所に長時間集束されることもなく、試料中の蛍光標識物質の劣化も防ぐことが出来る。
【００１２】
具体的には、前記測定対象の試料がマイクロ流路中を泳動するようにセットされている場合には、前記制御手段は、前記対物レンズを前記マイクロ流路の高さ方向、或いは、この高さ方向と前記マイクロ流路の幅方向とに往復運動させるようにすると良い。
【００１３】
また、前記測定対象の試料がチップ上に点状にスポットされている場合には、前記制御手段は、前記対物レンズを前記チップの表面に垂直な方向、或いは、この垂直な方向とチップ表面に沿った方向とに往復運動させるようにすると良い。なお、２方向に往復移動させる場合には、それぞれの振動周波数を異ならせて励起光の焦点が二次元平面の振幅範囲中で所定箇所に偏在しないようにすると良い。
【００１４】
このような手段により、比較的簡単に励起光の焦点を測定対象の試料の存在箇所を通過するようにでき、それにより、高速な測定と、正確な測定結果を得ることが出来る。
【発明の効果】
【００１５】
以上説明したように、本発明に従うと、測定時に励起光の焦点を試料箇所へ正確に合わせる必要がないため、蛍光検出の処理を高速に行うことが出来る。また、測定時に励起光の焦点が試料の同一箇所に長時間照射されることがなく、試料中の蛍光標識物質の劣化が防止されるので、正確な測定結果が得られるという効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。
【００１７】
図１は、本発明の実施の形態の蛍光検出装置を概観する斜視図、図２は、この蛍光検出装置の光学系と信号処理系を示した構成図である。
【００１８】
この実施の形態の蛍光検出装置１０は、例えば唾液などの検体、稀釈液、各種抗体や蛍光標識物体を含んだ試薬とを混合した試料に対して、例えば波長５３２ｎｍの励起光を照射して、そこから発せられる例えば波長５７０ｎｍの蛍光の光量を測定することで、検体に含まれる特定物質（例えば分泌型免疫"ＩｇＡ"）の測定を行うものである。
【００１９】
試料は、例えば、スライドガラス３上に形成されたマイクロ流路４…にマイクロチューブ５…を介して注入しつつ、マイクロ流路４…の両端に電圧を印加して電気泳動によりマイクロ流路４…中を移動するようにセットされる。このマイクロ流路４…は、例えば、スライドガラス３上に溝の形成されたＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン： polydimethylsiloxane）２を貼り付け、この溝を流路とすることで形成される。マイクロ流路４の大きさは例えば高さが１０μｍで幅が５０μｍなどである。なお、マイクロ流路４の高さや幅は５μｍ〜２００μｍ程度の範囲で適宜変更可能である。
【００２０】
蛍光検出装置１０は、図２に示すように、励起光を出力する光源であるレーザ出力器１１と、レーザ光を透過又は遮断するシャッタースイッチ１２と、励起光の波長域を反射して蛍光の波長域を透過するダイクロイックミラー１３と、励起光を測定箇所に集束させるとともにそこから発せられる蛍光を集光する対物レンズ１４と、対物レンズ１４により集光されダイクロイックミラー１３を透過してきた光から蛍光波長域の光のみを透過させて抽出するエミッタフィルター１５と、エミッタフィルター１５により抽出された蛍光の光量検出を行う蛍光センサ１６と、対物レンズ１４をその光軸に沿ったＺ方向（フォーカス方向）およびＺ方向に垂直なＸ方向に微小変位させることが可能なレンズアクチュエータ１８と、レンズアクチュエータ１８の駆動制御等を行う制御回路２０と、蛍光センサ１６の出力を増幅し電圧変換するアンプ２１と、この出力を所定周波数でデジタルサンプリングするサンプルホールド回路２２と、サンプルホールド回路の出力から信号値が高くなるタイミング部分を検出しさらにそのピーク値を検出して出力するＭＡＸ検出処理回路（解析手段）２３とを備えている。
【００２１】
その他、この蛍光検出装置１０には、図示は省略するが、試料が載置されたスライドガラス等を保持するステージや、このステージの位置を垂直方向や水平方向に移動させる調整機構が設けられている。
【００２２】
上記のレーザ出力器１１は、例えば、半導体レーザ励起ＹＡＧ（イットリウム・アルミニウム・ガーネット）の二次高調波レーザなどを用いることが出来る。その他、光源として高輝度ＬＥＤ（発光ダイオード）を使用することも出来る。
【００２３】
対物レンズ１４は、試料から発せられる微小な蛍光をなるだけ多く集光できるように開口数の高い（例えばＮＡ＝０．３やＮＡ＝０．４５など）ものを利用すると良い。
【００２４】
蛍光センサ１６は、微小な蛍光を高感度で検出することのできるフォトマルチプライア（ＰＭＴ）などを用いることが出来る。その他、アバランシェ・フォトダイオードなどを用いても良い。
【００２５】
レンズアクチュエータ１８は、例えば、光ディスクのデータの読み書きを行う光ピックアップに用いられているものと同様の構成を適用することが出来る。一般的なレンズアクチュエータは、例えば、対物レンズ１４を保持するレンズホルダと、このレンズホルダを片持ち支持する複数のワイヤーと、レンズホルダの側面等に貼り付けられた電磁コイルと、レンズホルダの周囲に配置された磁石などから構成される。そして、上記のワイヤーを介してレンズホルダの電磁コイルに電流を流すことで、電磁力の作用によりレンズホルダを上下左右に変位可能とされる。なお、本発明のレンズアクチュエータとしては、このワイヤー片持ち構成のレンズアクチュエータに限られず、光ピックアップの分野で採用されている種々のレンズアクチュエータの構成を適用することが出来る。
【００２６】
次に、上記構成の蛍光検出装置１０の動作説明を行う。
【００２７】
図３には、蛍光検出装置１０によりマイクロ流路に照射される励起光の焦点の移動方法の一例を表わした斜視図を、図４には、測定時におけるレンズアクチュエータ１８のフォーカス駆動信号と蛍光センサ１６の出力とを表わした波形図を示す。
【００２８】
上記構成の蛍光検出装置１０を用いて蛍光検出測定を行うには、先ず、マイクロ流路４に試料が注入されたスライドガラス３を蛍光検出装置１０のステージにセットする。そして、ステージの位置を調整して、蛍光検出装置１０より出力される励起光の焦点位置とマイクロ流路４の測定箇所とが重なるように大まかに合わせておく。この位置調整では、焦点位置と測定箇所とを正確に合わせる必要はないので、予め焦点位置の確認等を行っておくことで目視と手動調整等により容易に行うことが出来る。
【００２９】
また、このとき、マイクロ流路４の流路方向をレンズアクチュエータ１４の水平方向の移動方向（Ｘ方向）と直交する向きに設定しておく。
【００３０】
このようにスライドガラス３をセットしたら、図示しない操作パネルを操作して装置に測定開始の指令を入力する。すると、制御回路２０の駆動制御が開始され、レンズアクチュエータ１８の駆動により対物レンズ１４がＺ方向とＸ方向とに所定振幅で且つ所定加速度で往復運動を開始する。
【００３１】
この往復運動の振幅は、例えばＺ方向とＸ方向とにそれぞれ±５００μｍ、また、往復運動の少なくとも一方向の加速度が例えば平均で５０ｍ／ｓ２以上になるように設定されている。また、Ｚ方向の周波数とＸ方向の周波数とが大きく異なるように設定され、Ｘ−Ｚ平面で見た場合に縦（Ｚ方向の振幅）×横（Ｘ方向の振幅）の全領域を、励起光の焦点が細かい網目状の経路で移動するようにされる。また、横軸を時間軸として表わした上記往復運動の運動波形は、三角波、鋸波、正弦波など種々の動作波形として良い。
【００３２】
さらに、上記のレンズアクチュエータ１８の駆動に伴って、ステージがマイクロ流路４の流路方向にゆっくりと移動する。なお、この流路方向の駆動は必ずしも行う必要はなく、また、駆動する場合でも、ステージを移動させる代わりにレンズアクチュエータ１８を流路方向に移動可能な構成にして、レンズアクチュエータ１８の移動により行うようにしても良い。
【００３３】
また、これらの動作とほぼ同時に、レーザ出力器１１を駆動してシャッタースイッチ１２を開にすることで励起光となるレーザ光を出力する。
【００３４】
これらにより、スライドガラス３のマイクロ流路４に対して励起光の焦点が図３に示すように高速に移動する。なお、図３では簡略化してＺ方向の往復移動とＸ方向の往復移動とを独立的に描いているが、実際は両者が合成された移動経路となる。また、焦点の振り幅もマイクロ流路４の大きさに対してもっと大きなものとなる。
【００３５】
そして、励起光の焦点がマイクロ流路４を通過するタイミングに、その焦点位置周辺から蛍光が発光されて対物レンズ１４等を介して蛍光センサ１６に入射される。例えば、Ｘ方向の焦点位置が流路４と重なる位置に来ている期間であれば、図４に示すように、フォーカス駆動信号の一周期毎に励起光の焦点が２回だけマイクロ流路４を通過することとなり、その通過期間に蛍光センサ１６の出力が高く変化する。ＭＡＸ検出処理回路２３はこの信号の変化を検出するとともに、そのピーク値を検出してそれを測定値として出力する。
【００３６】
このようにして得られた蛍光の測定値は試料中の蛍光標識の濃度と高い精度で比例関係にあり、そのため予め定めておいた検量線とこの測定値とを照合することで検体である唾液中の特定免疫物質の分泌量を精度よく判定することが出来る。
【００３７】
以上のように、この実施の形態の蛍光検出装置１０によれば、測定時に対物レンズの焦点位置とマイクロ流路の測定箇所とをおおまかに合わせるだけで蛍光検出の測定を行うことが出来るので、高速に測定処理を行うことが出来る。また、高出力の励起光が試料の一箇所に長く照射されるといったことがないので、光の照射による蛍光標識物質の劣化が防止され、それにより正確な測定値を得ることが出来るという効果が奏される。
【００３８】
［その他の実施の形態］
図５には、測定試料のその他の載置パターンを示す検査チップの平面図を、図６には、図５の検査チップを用いて蛍光検出処理を行う場合の励起光の移動方法の一例を表わした側面図を、それぞれ示す。
【００３９】
上述した実施の形態では、試料をマイクロ流路中に泳動させながら蛍光検出の測定を行う場合を示したが、本発明の蛍光検出装置はこれに限られず、その他の様々な形態で固定された試料に対しても蛍光検出の処理を行うことが出来る。
【００４０】
例えば、図５に示すように、点状の試料スポット７，７…が表面に形成されている検査チップ６を用いて蛍光検出の処理を行うことも出来る。この検査チップ６は、例えば、ガラス基板６ａの一面をＤＬＣ（ダイアモンドライクカーボン）６ｂにより覆って構成されたものであり、光の反射率が非常に低いＤＬＣ６ｂの特性のためフォーカス方向の位置合わせが非常に難しいものである。
【００４１】
このような検査チップ６に対しては、先ず、試料スポット７…の列とステージの移動方向とを合わせ、さらに、図６に示すように、励起光の焦点が大まかに試料スポット７と重なるようにステージの水平方向の調整と高さ調整を行う。
【００４２】
そして、測定時において、レンズアクチュエータ１８をフォーカス方向に往復運動させながら、ステージが試料スポット７…の列方向にゆっくりと移動するように駆動させる。
【００４３】
このような動作により、一列に配列された複数の試料スポット７…に対して、順に励起光の焦点が複数回上下方向に通過するよう移動され、前述した実施形態の測定処理と同様に、それぞれの試料スポット７…について蛍光検出の測定値を取得していくことが出来る。
【００４４】
なお、本発明は、上記実施の形態に限られるものではなく、様々な変更が可能である。例えば、この実施形態において、レンズアクチュエータ１８をフォーカス方向の駆動と並行してＸ方向にも駆動させ、励起光の焦点が横方向にも往復移動するようにしても良い。また、１列に並んだ複数の試料スポット７…を順次測定していくのに、ステージをスライド移動させるのではなく、ステージを固定したままレンズアクチュエータ１８をスライド移動させて行うようにしても良い。また、レンズアクチュエータ１８の駆動方向を一方向追加して３軸方向の駆動を可能とし、レンズアクチュエータ１８の一方向の駆動により、励起光を試料スポット７の列方向に移動させるようにしても良い。
【００４５】
また、以上の実施の形態においては、唾液中の特定分泌物質の測定に蛍光検出装置１０を用いた例を示したが、例えば検体は生体試料に限られず、測定物質もタンパク質でなく高分子などの化学物質を対象とすることも出来る。その他、実施の形態で示した具体的な細部構成および処理手順などは発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の実施の形態の蛍光検出装置を概観する斜視図である。
【図２】この蛍光検出装置の光学系と信号処理系を示す構成図である。
【図３】マイクロ流路に対する励起光の焦点の移動方法の一例を示した斜視図である。
【図４】対物レンズのフォーカス駆動信号と蛍光センサの検出出力とを示した波形図である。
【図５】測定試料のその他の載置パターンを説明する検査チップの平面図である。
【図６】図５の検査チップで蛍光検出処理を行う場合の励起光の焦点の移動方法の一例を示した側面図である。
【符号の説明】
【００４７】
３    スライドガラス
４    マイクロ流路
５    マイクロチューブ
６    検査チップ
７    試料スポット
１０  蛍光検出装置
１１  レーザ出力器
１４  対物レンズ
１６  蛍光センサ
１８  レンズアクチュエータ
２０  制御回路
２２  サンプルホールド回路
２３  ＭＡＸ検出処理回路
【図１】
2007278783.tif 000003
【図２】
2007278783.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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