(57)【要約】【課題】生理活性物質を固定化し得るヒドロゲルを、安全な原料を用いて簡便にバイオセンサーの表面に固定化する方法を提供すること。【解決手段】外部刺激により反応性基を生成する化合物を基板表面に結合させた後に、該反応性基と共有結合を形成可能な親水性ポリマーを基板に接触させた状態で外部刺激を与えることにより、該親水性ポリマーを該反応性基との共有結合を介して基板表面に結合することを含む、親水性ポリマーで被覆された基板からなるバイオセンサーの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
外部刺激により反応性基を生成する化合物を基板表面に結合させた後に、該反応性基と共有結合を形成可能な親水性ポリマーを基板に接触させた状態で外部刺激を与えることにより、該親水性ポリマーを該反応性基との共有結合を介して基板表面に結合することを含む、親水性ポリマーで被覆された基板からなるバイオセンサーの製造方法。
【請求項２】
外部刺激により反応性基を生成する化合物が光ラジカル発生剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
親水性ポリマーが二重結合を有する親水性ポリマーである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
親水性ポリマーがカルボキシル基を有する親水性ポリマーである、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
カルボキシル基を含有するポリマーが多糖類である、請求項１から４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
カルボキシル基を含有するポリマーの平均分子量が１０００〜５００００００である、請求項１から５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
親水性ポリマーを、基板上に薄膜を形成させた状態で、外部刺激により生成した反応性基と結合させる、請求項１から６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
スピンコート法またはスプレーコート法により、基板上に薄膜を形成させる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
基板が金属表面または金属膜である、請求項１から８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
金属が金、銀、銅、白金またはアルミニウムのいずれかである、請求項１から９の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
請求項１から１０の何れかに記載の方法により製造されるバイオセンサー。
【請求項１２】
非電気化学的検出に使用される、請求項１１に記載のバイオセンサー。
【請求項１３】
表面プラズモン共鳴分析に使用される、請求項１１又は１２に記載のバイオセンサー。
【請求項１４】
請求項１１から１３の何れかに記載のバイオセンサーと生理活性物質とを接触させて、該バイオセンサーに該生理活性物質を結合させる工程を含む、バイオセサンーに生理活性物質を固定化する方法。
【請求項１５】
生理活性物質が共有結合により表面に結合している請求項１１から１３の何れかに記載のバイオセンサーと被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法。
【請求項１６】
生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する、請求項１５又は１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサーの製造方法、及び該バイオセンサーを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に関する。特に本発明は、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに用いるためのバイオセンサーの製造方法、及び該バイオセンサーを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。
【０００３】
上記した技術においては、いずれの場合も、生理活性物質を固定化する表面が重要である。以下、当技術分野で最も使われている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を例として、説明する。
【０００４】
一般に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。
【０００５】
生理活性物質を固定化可能な官能基を有する検出表面として、例えば特許文献１に、ヒドロゲルの製造法が詳細に開示されている。具体的には、16-メルカプトヘキサデカノールの層が金膜に結合することでバリアー層を形成する。この金膜上でバリアー層のヒドロキシル基はエピクロロヒドリンで処理することによりエポキシ活性化される。次の段階でデキストランをエーテル結合を介してバリアー層に付着させる。次にデキストランマトリックスに対してブロモ酢酸を反応させることで、カルボキシメチル基を導入する。
【０００６】
この方法に基づき製造されたカルボキシメチル変性デキストラン表面にアミノ基を有する生理活性物質（例えばタンパク質やアミノ酸）を固定化するための手法としては、以下のような手法が開示されている。すなわち、カルボキシメチル変性デキストランにおけるカルボキシル基の一部を、反応性エステル機能を生ずるように例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）及びＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ'−エチルカルボジイミド（EDC）塩酸の水溶液で処理することにより変性される。残留電荷すなわち未反応カルボキシル基は、生理活性物質の検出表面への濃縮の遂行に寄与するであろう。このような検出表面に対し、アミノ基を含む生理活性物質（タンパク質やアミノ酸）の水溶液を接触させることで、アミノ基を含む生理活性物質をデキストランマトリックスに共有結合により結合させることができる。
【０００７】
上記した方法により製造されたヒドロゲルは、アミノ基を含む生理活性物質を３次元的に固定化可能であるため、バイオセンサーの検出表面として優れた性能を示す。しかし、上記した方法によるヒドロゲルの製造法は煩雑であり、製造時間が長く、エピクロロヒドリンやブロモ酢酸といった化合物を用いることが必要であるため、安全性の面で問題があった。
【０００８】
一方、光反応性基を利用した物質の固定化については、ポリマーに光反応性基（アジドフェニル基など）を導入し、タンパク質とともに基板に結合させること（特許文献２）、基板に光反応性基（ベンゾフェノン）を導入し、疎水性ポリマー（ポリスチレン、ポリエチルオキサゾリン）を結合すること（非特許文献１）、並びに固体表面にグラフトポリマーを介してＤＮＡ断片を固定化してＤＮＡチップを製造すること（特許文献３）などが報告されている。
【０００９】
【非特許文献１】J.Am.Chem.Soc., 121, 8766 (1999)
【特許文献１】特許第２８１５１２０号
【特許文献２】特開２００４−１２５７８１号公報
【特許文献３】特開２００３−１３０８７８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は上記した従来技術の問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち本発明は、生理活性物質を固定化し得るヒドロゲルを、安全な原料を用いて簡便にバイオセンサーの表面に固定化する方法、並びに上記方法により製造されるバイオセンサーを提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、外部刺激により反応性基を生成する化合物をセンサー基板表面に結合させた後、前記反応性基と共有結合を形成可能な親水性ポリマーを該基板に接触させた状態で外部刺激を与えることにより、親水性ポリマーが結合したバイオセンサー表面を簡便に製造できることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
即ち、本発明によれば、外部刺激により反応性基を生成する化合物を基板表面に結合させた後に、該反応性基と共有結合を形成可能な親水性ポリマーを基板に接触させた状態で外部刺激を与えることにより、該親水性ポリマーを該反応性基との共有結合を介して基板表面に結合することを含む、親水性ポリマーで被覆された基板からなるバイオセンサーの製造方法が提供される。
【００１３】
好ましくは、外部刺激により反応性基を生成する化合物は光ラジカル発生剤である。
好ましくは、親水性ポリマーは二重結合を有する親水性ポリマーである。
好ましくは、親水性ポリマーはカルボキシル基を有する親水性ポリマーである。
好ましくは、カルボキシル基を含有するポリマーは多糖類である。
好ましくは、カルボキシル基を含有するポリマーの平均分子量は１０００〜５００００００である。
【００１４】
好ましくは、親水性ポリマーを、基板上に薄膜を形成させた状態で、外部刺激により生成した反応性基と結合させる。
好ましくは、スピンコート法またはスプレーコート法により、基板上に薄膜を形成させる。
【００１５】
好ましくは、基板は金属表面または金属膜である。
好ましくは、金属は金、銀、銅、白金またはアルミニウムのいずれかである。
【００１６】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の方法により製造されるバイオセンサーが提供される。
好ましくは、本発明のバイオセンサーは、非電気化学的検出に使用され、さらに好ましくは、表面プラズモン共鳴分析に使用される。
【００１７】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のバイオセンサーと生理活性物質とを接触させて、該バイオセンサーに該生理活性物質を結合させる工程を含む、バイオセサンーに生理活性物質を固定化する方法が提供される。
【００１８】
本発明のさらに別の側面によれば、生理活性物質が共有結合により表面に結合している本発明のバイオセンサーと被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法が提供される。
【００１９】
好ましくは、生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定し、さらに好ましくは生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、生理活性物質を固定化し得るヒドロゲルを、安全な原料を用いて簡便にバイオセンサーの表面に固定化することが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。
【００２２】
本発明のバイオセンサーでは、金属表面又は金属膜を基板として用いることができる。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００２３】
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上１０ｎｍ以下であるのが好ましい。
【００２４】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００２５】
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００２６】
本発明においてバイオセンサー表面、すなわち金属膜上には、外部刺激により反応性基を生成する化合物が結合している。外部刺激により反応性基を生成する化合物は、熱によりラジカルを発生する化合物（熱ラジカル発生剤）でも良く、光によりラジカルを発生する化合物（光ラジカル発生剤）でも良い。また、光アフィニティーラベル化剤として知られている化合物であっても良い。
【００２７】
熱ラジカル発生剤としては、公知の重合開始剤や結合解離エネルギーの小さな結合を有する化合物などを用いることができる。熱ラジカル発生剤としては例えば、有機ハロゲン化化合物、カルボニル化合物、有機過酸化化合物、アゾ系重合開始剤、アジド化合物、メタロセン化合物、ヘキサアリールビイミダゾール化合物、有機ホウ酸化合物、ジスルホン酸化合物、オキシムエステル化合物、オニウム塩化合物、等が挙げられる。これらの熱ラジカル発生剤は単独で用いられても良いし、２種類以上が併用されても良い。熱ラジカル発生剤の具体的な化合物骨格は、特開２００５−３３５３６６号公報の[化４]〜[化１４]に開示されている。
【００２８】
光ラジカル発生剤は、光により開裂する単結合を有する。この光により開裂する単結合としては、カルボニルのα開裂、β開裂反応、光フリース転位反応、フェナシルエステルの開裂反応、スルホンイミド開裂反応、スルホニルエステル開裂反応、Ｎ−ヒドロキシスルホニルエステル開裂反応、ベンジルイミド開裂反応、活性ハロゲン化合物の開裂反応、などを利用して開裂が可能な単結合が挙げられる。これらの反応により、光により開裂しうる単結合が切断される。この開裂しうる単結合としては、Ｃ−Ｃ結合、Ｃ−Ｎ結合、Ｃ−Ｏ結合、Ｃ−Ｃｌ結合、Ｎ−Ｏ結合、及びＳ−Ｎ結合等が挙げられる。光により開裂する単結合を有する基としては、芳香族ケトン基、フェナシルエステル基、スルホンイミド基、スルホニルエステル基、Ｎ−ヒドロキシスルホニルエステル基、ベンジルイミド基、トリクロロメチル基、ベンジルクロライド基、などが挙げられる。
【００２９】
また、光ラジカル発生剤は、基板表面に存在する官能基と反応して結合しうる反応性基（基材結合基）を有することが好ましく、その反応性基としては、具体的には、以下に示すような基が挙げられる。
【００３０】
【化１】
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【００３１】
光により開裂する単結合を有する基と基材結合基とは直接結合していてもよいし、連結基を介して結合していてもよい。この連結基としては、炭素、窒素、酸素、及びイオウからなる群より選択される原子を含む連結基が挙げられ、具体的には、例えば、飽和炭素基、芳香族基、エステル基、アミド基、ウレイド基、エーテル基、アミノ基、スルホンアミド基、等が挙げられる。また、この連結基は更に置換基を有していてもよく、その導入可能な置換基としては、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、等が挙げられる。
【００３２】
これらの光ラジカル発生剤は単独で用いられても良いし、２種類以上が併用されても良い。光ラジカル発生剤の具体的な化合物骨格としては、特開２００５−２７７２２５号公報の［化２］〜［化４］に記載されている以下のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３３】
【化２】
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【００３４】
【化３】
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【００３５】
【化４】
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【００３６】
光照射により反応性基を生成する化合物としては、光アフィニティーラベル化に用いられる化合物もまた、好ましく用いることが可能である。光照射により光アフィニティラベル化合物から発生する活性種としては、ナイトレン、カルベン、ラジカル、イオンラジカル、ジラジカル、励起三重項、カルボカチオン等の炭素求電子試薬などが挙げられる。光照射によりこれらの活性種を発生する光アフィニティラベル化合物の例は、例えば１９９５年発行のテトラへドロン誌（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）第５１巻、１２４７９乃至１２５２０ページのＳ．Ａ．Ｆｌｅｍｉｇの著した総説、および１９９８年発行の有機合成協会誌、第５６巻５８１乃至５９０ページの畑中保丸の著した総説に記載されている。すなわち、ナイトレンを発生する化合物としては、芳香族アジド、アルキルアジド、ヘテロ環アジドなどのアジド基を有する化合物であり、カルベンを発生する化合物としてはジアゾ基またはジアジリン環を有する化合物であり、ラジカルを発生する化合物としてはベンゾフェノン類やエノン類のような共役ケトン類、芳香族ハロゲン化物類、オレフィン類などであり、炭素求核試薬を発生する化合物としては芳香族ジアゾニウム塩、ニトロベンゼン類、スルホニウム塩、ホスホニウム塩、アンモニウム塩などである。これらの光反応性化合物はそれぞれ特徴があるので、使用条件に応じて選択して用いることができるが、安定性が比較的高い点では、ジアジリン環を有する化合物が好ましい。安定性と合成の容易さの点では、共役ケトン類、芳香族ハロゲン化物類、オレフィン類などが好ましい。これらの光アフィニティラベル化合物は単独で用いられても良いし、２種類以上が併用されても良い。光アフィニティラベル化合物の具体的な化合物骨格は、特開２００４−３０１６８１号公報の[化３]に記載されている以下のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３７】
【化５】
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【００３８】
基板表面におけるパターン化が容易なことから、外部刺激により反応性基を生成する化合物は、光ラジカル発生剤か光アフィニティーラベル化合物であることが好ましい。
【００３９】
本発明において、外部刺激により反応性基を生成する化合物は、自己組織化膜により被覆された金属膜上に結合することが望ましい。自己組織化膜（SAMs）を用いた金属膜の被覆法は、ハーバード大のWhitesides教授らにより精力的に展開されており、その詳細は例えばChemical Review, 105, 1103-1169 (2005)に報告されている。金属として金を用いた場合、有機層形成化合物として一般式１（一般式１において、ｎは３から２０の整数を示し、Ｘは官能基を示す）に示すアルカンチオール誘導体を用いることにより、Au-S結合とアルキル鎖同士のvan der Waals力に基づき、配向性を持つ単分子膜が自己組織的に形成される。自己組織化膜は、アルカンチオール誘導体の溶液中に金基板を浸漬するという極めて簡便な手法で作成される。外部刺激により反応性基を簡便に結合可能である、という観点から、本発明においては、アミノ基を有する自己組織化膜を用いることが好ましい。一般式１においてX=NH2である化合物を用いて自己組織化膜を形成させることで、アミノ基を有する有機層で金表面を被覆することが可能となる。
【００４０】
【化６】
2007256270.tif 000007
【００４１】
上記一般式１のアルキル基の繰返し数は、3以上20以下が好ましく、さらに3以上16以下が好ましく、4以上8以下が最も好ましい。アルキル鎖が短いと自己組織化膜を形成しにくく、アルキル鎖が長いと水溶性が低下し、ハンドリングが困難になる。
【００４２】
末端にアミノ基を有するアルカンチオールは、アルキル鎖を介してチオール基とアミノ基が連結している化合物（一般式２）（一般式２において、ｎは３から２０の整数を示す）でもよく、末端にカルボキシル基を有するアルカンチオール（一般式３、４）（一般式３においてｎは３から２０の整数を示し、一般式４においてｎはそれぞれ独立に１から２０の整数を示す）と大過剰のヒドラジドまたはポリアミンを反応させた化合物でもよい。末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールと大過剰のヒドラジドまたはポリアミンとの反応は、溶液状態で行ってもよく、また、末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールを基板表面に結合した後、大過剰のヒドラジドまたはポリアミンを反応させてもよい。
【００４３】
【化７】
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【００４４】
本発明に用いるポリアミンとしては具体的に、エチレンジアミン、テトラエチレンジアミン、オクタメチレンジアミン、デカメチレンジアミン、ピペラジン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、ジヘキサメチレントリアミン、１．４−ジアミノシクロヘキサン等の脂肪族ジアミン、パラフェニレンジアミン、メタフェニレンジアミン、パラキシリレンジアミン、メタキシリレンジアミン、４，４‘−ジアモノビフェニル、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、４，４‘−ジアミノジフェニルケトン、４，４‘−ジアミノジフェニルスルホン酸等の芳香族ジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、スペルミジン、スペルミン、ポリエチレンイミン等のポリアミンを好ましく用いることが可能である。バイオセンサー表面の親水性を向上させるという観点から、２つのアミノ基をエチレングリコールユニットで連結した化合物（一般式５）を用いることも可能である。
【００４５】
【化８】
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【００４６】
アミノ基を有するアルカンチオールは、単独で自己組織化膜を形成することも可能であり、また、他のアルカンチオールと混合して自己組織化膜を形成することも可能である。バイオセンサー表面に用いる場合、他のアルカンチオールとしては、生理活性物質の非特異吸着を抑制可能な化合物を用いることが好ましい。生理活性物質の非特異吸着を抑制可能な自己組織化膜に関しては、前述のWhitesides教授らにより詳細に検討されており、親水性基を有するアルカンチオールから形成された自己組織化膜が非特異吸着抑制に有効であることが報告されている（Langmuir,17,2841-2850, 5605-5620, 6336-6343 (2001)）。本発明において、アミノ基を有するアルカンチオールと混合単分子膜を形成するアルカンチオールは、前記論文に記載された化合物を好ましく用いることが可能である。非特異吸着抑制能に優れ、入手が容易であることから、アミノ基を有するアルカンチオールと混合単分子膜を形成するアルカンチオールとしては、水酸基を有するアルカンチオール（一般式６）あるいはエチレングルコールユニットを有するアルカンチオール（一般式７）（一般式６において、ｎは３から２０の整数を示し、一般式７において、ｎ及びｍは、それぞれ独立に１から２０の整数を示す）を用いることが好ましい。
【００４７】
【化９】
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【００４８】
アミノ基を有するアルカンチオールを他のアルカンチオールと混合して自己組織化膜を形成する場合、一般式２〜４のアルキル基の繰返し数は、4以上20以下が好ましく、さらに4以上16以下が好ましく、4以上10以下が最も好ましい。また、一般式６, ７のアルキル基の繰返し数は、3以上16以下が好ましく、さらに5以上12以下が好ましく、5以上10以下が最も好ましい。
【００４９】
本発明において、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールは、任意の割合で混合することが可能であるが、アミノ基を有するアルカンチオールの割合が少ない場合には活性エステル化されたカルボキシル基含有ポリマーの結合量が低下し、親水性基を有するアルカンチオールの割合が少ない場合には非特異吸着抑制能が減少する。それゆえ、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールの混合比は、１／１〜１／１，０００，０００の範囲であることが好ましく、１／４〜１／１０，０００の範囲であることがより好ましく、１／１０〜１／１，０００の範囲であることがさらに好ましい。活性エステル化されたカルボキシル基を含有するポリマーと反応する場合の立体障害低減の観点から、アミノ基を有するアルカンチオールの分子長は、親水性基を有するアルカンチオールの分子長よりも長いことが好ましい。
【００５０】
本発明で用いるアルカンチオールは、Northwestern大学のGrzybowski教授らによる総説（Curr. Org. Chem., 8, 1763-1797(2004).）およびその引用文献に基づいて合成された化合物を用いても良く、また市販の化合物を用いてもよい。これらの化合物は、同仁化学（株）、Aldrich社、SensoPath Technologies社、Frontier Scientific Inc.社等から購入可能である。本発明においてアルカンチオールの酸化生成物であるジスルフィド化合物は、アルカンチオールと同様に用いることが可能である。
【００５１】
本発明で用いることの出来る親水性ポリマーとしては、公知の化合物を用いることが出来るが、センサー表面としての用途を考えた場合、生理活性物質のアミノ基と共有結合形成が可能である、カルボキシル基を含有するポリマーであることが好ましい。これらの親水性ポリマーは、外部刺激により生成した反応性基と共有結合する必要がある。それゆえ、これらの親水性ポリマーには、水素引き抜き可能なC-H結合、不飽和二重結合、エポキシ基、オキセタン基などの官能基があることが好ましい。合成的な観点からは、二重結合を導入した親水性ポリマーが好ましい。親水性ポリマー中の、カルボキシル基、アミノ基若しくはそれらの塩、水酸基、及びエポキシ基などの官能基との反応を利用することで、親水性ポリマーへの二重結合の導入が可能となる。この反応において二重結合を導入するために用いられる化合物としては、（メタ）アクリル酸、グリシジル（メタ）アクリレート、アリルグリシジルエーテル、２−イソシアナトエチル（メタ）アクリレート，2-アミノエチル（メタ）クリレートなどがある。またこれらの化合物の他にも，2−メチル−2−ブロモプロピオン酸のような官能基を導入した後，塩基処理により二重結合を導入する方法もある。
【００５２】
本発明で用いるカルボキシル基を含有するポリマーとしては、カルボキシル基含有合成ポリマーおよびカルボキシル基含有多糖類を用いることが可能である。カルボキシル基含有合成ポリマーとしては、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、およびこれらの共重合体、例えば特開昭５９−４４６１５号、特公昭５４−３４３２７号、特公昭５８−１２５７７号、特公昭５４−２５９５７号、特開昭５９−５３８３６号、特開昭５９−７１０４８号明細書に記載されているようなメタクリル酸共重合体、アクリル酸共重合体、イタコン酸共重合体、クロトン酸共重合体、マレイン酸共重合体、部分エステル化マレイン酸共重合、水酸基を有するポリマーに酸無水物を付加させたものなどが挙げられる。カルボキシル基含有多糖類は、天然植物からの抽出物、微生物発酵の生産物、酵素による合成物、または化学合成物の何れであってもよく、具体的には、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、デルマタン酸硫酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、セロウロン酸、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルデンプン等が挙げられる。カルボキシル基含有多糖類は、市販の化合物を用いることが可能であり、具体的には、カルボキシメチルデキストランであるＣＭＤ、ＣＭＤ−Ｌ、ＣＭＤ−Ｄ４０（名糖産業社製）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（和光純薬社製）、アルギン酸ナトリウム（和光純薬社製）、等を挙げることができる。
【００５３】
カルボキシル基を含有するポリマーは、好ましくはカルボキシル基を含有する多糖類であり、より好ましくはカルボキシメチルデキストランである。
【００５４】
本発明に用いるカルボキシル基を含有するポリマーの分子量は特に制限されないが、平均分子量が１０００〜５００００００であることが好ましく、平均分子量が１００００〜２００００００であることがより好ましく、平均分子量が１０００００〜１００００００であることがさらに好ましい。この範囲より平均分子量が小さい場合には生理活性物質の固定量が小さくなってしまい、この範囲より平均分子量が大きい場合には高い溶液粘度のため取り扱いが困難となる。
【００５５】
本発明において親水性ポリマーは、溶液として基板と反応させてもよく、また、スピンコート等の手法を用いて基板上の薄膜を形成させた状態で反応させてもよい。好ましくは、薄膜を形成させた状態での反応である。
【００５６】
上記の通り、本発明において親水性ポリマーは、薄膜状態で基板と反応させることが好ましい。基板上に薄膜を形成させる方法は、公知の方法を用いることが可能であるが、具体的には、エクストルージョンコート法、カーテンコート法、キャスティング法、スクリーン印刷法、スピンコート法、スプレーコート法、スライドビードコート法、スリットアンドスピン方式、スリットコート方式、ダイコート法、ディップコート法、ナイフコート法、ブレードコート法、フローコート法、ロールコート法、ワイヤバーコート方式、転写印刷法、等を用いることが可能である。これらの薄膜形成法については、「コーティング技術の進歩」原崎勇次著、総合技術センター(1988)、「コーティング技術」技術情報協会(1999)、「水性コーティングの技術」シーエムシー(2001)、「進化する有機薄膜  成膜編」住べテクノリサーチ(2004)、「高分子表面加工学」岩森暁著、技報堂出版(2005)、等に説明されている。膜厚制御された塗布膜を簡便に作成可能であることから、本発明において基板上に薄膜を形成させる方法としては、スプレーコート法またはスピンコート法が好ましく、スピンコート法がさらに好ましい。
【００５７】
スプレーコート法とは、微細化されたポリマー溶液を基板に吹きつけた状態で、基板を移動させることで、基板上にポリマー溶液を均一塗布する方法である。スプレーガンの引き金を引くと空気バルブとニードルバルブが同時に開き、ノズルからポリマー溶液が霧状に噴出し、ノズル先端にある空気キャップから噴出する空気で霧状のポリマー溶液がさらに微細化される。微細化されたポリマー溶液による塗布膜を基板表面に形成させた後、溶媒を蒸発させることで、膜厚の制御されたポリマーフイルムが容易に作成される。ポリマー溶液濃度、基板の移動速度等により、ポリマー薄膜の膜厚制御が可能となる。
【００５８】
スピンコート法とは、水平に設置した基板上にポリマー溶液を滴下した後に高速回転させ、遠心力によって基板全体にポリマー溶液を均一塗布する方法である。遠心力によるポリマー溶液の飛散と溶媒の蒸発に伴い、膜厚の制御されたポリマーフイルムが容易に作成される。回転数、ポリマー溶液濃度、溶剤の蒸気圧等により、ポリマー薄膜の膜厚制御が可能となる。本発明においてスピンコート時の回転数は特に制限されないが、回転数が低すぎる場合には基板上に溶液が残存し、回転数が高すぎる場合には使用可能な装置が制限されてしまう。それゆえ本研究においてはスピンコート時の回転数は、500rpm〜10000rpmであることが好ましく、1000rpm〜7000rpmであることがさらに好ましい。
【００５９】
本発明に使用する親水性ポリマーは、水溶液中の膜厚が１ｎｍ以上300ｎｍ以下であることが好ましい。膜厚が薄いと生理活性物質固定量が減少し、またセンサー表面の水和層が薄くなるため生理活性物質自身の変性で被検体物質との相互作用が検出しにくくなる。膜厚が厚いと被検体物質が膜内に拡散する障害となり、また特にセンサー基板の親水性高分子固定面の反対側から相互作用を検出する場合は検出表面から相互作用形成部までの距離が長くなり、検出感度が低くなる。水溶液中の親水性高分子膜厚はＡＦＭ、エリプソメトリーなどで評価することができる。
【００６０】
カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法としては、公知の手法、例えば、水溶性カルボジイミドである1-(3-Dimethylaminopropyl)-3 ethylcarbodiimide（EDC）とN-Hydroxysuccinimide（NHS）により活性化する方法、EDC単独で活性化する方法、特願２００４−２３８３９６号（特開２００６−５８０７１号公報）に記載の方法（即ち、特定の構造を有するウロニウム塩、ホスホニウム塩、又はトリアジン誘導体のいずれかの化合物を用いてカルボキシル基を活性化する方法）、特願２００４−２７５０１２号（特開２００６−９０７８１号公報）に記載の方法（即ち、カルボジイミド誘導体又はその塩で活性化し、水酸基を有する含窒素ヘテロ芳香族化合物、電子吸引性基を有するフェノール誘導体又はチオール基を有する芳香族化合物のいずれかの化合物を用いてカルボキシル基を活性化する方法）等を好ましく用いることができる。これらの手法で活性化されたカルボキシル基を含有するポリマーを、アミノ基を有する基板と反応させることで、本発明のバイオセンサーを製造することが可能となる。
【００６１】
なお、上記した特願２００４−２３８３９６号における特定の構造を有するウロニウム塩、ホスホニウム塩、又はトリアジン誘導体とは、下記一般式１で表されるウロニウム塩、下記一般式２で表されるホスホニウム塩、又は下記一般式３で表されるトリアジン誘導体を示す。
【００６２】
【化１０】
2007256270.tif 000011
【００６３】
（一般式１において、Ｒ1とＲ2はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基を示すか、又は互いに一緒になって炭素数２から６のアルキレン基を形成してＮ原子と共に環を形成し、Ｒ3は炭素数６から２０の芳香環基又は少なくとも１以上のヘテロ原子を含むヘテロ環基を示し、Ｘ-はアニオンを示す。一般式２において、Ｒ4とＲ5はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基を示すか、又は互いに一緒になって炭素数２から６のアルキレン基を形成してＮ原子と共に環を形成し、Ｒ6は炭素数６から２０の芳香環基又は少なくとも１以上のヘテロ原子を含むヘテロ環基を示し、Ｘ-はアニオンを示す。一般式３において、Ｒ7はオニウム基を示し、Ｒ8及びＲ9はそれぞれ独立に電子供与基を示す。）
【００６４】
本発明において、生理活性物質の固定化基として、ポリマーに導入する反応基は、カルボキシル基やアミノ基などの官能基の他に、例えば、ビオチン結合性タンパク（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等）、プロテインA、プロテインG、抗原、抗体（例えば、抗GST抗体等の公知のtag抗体）などの生理活性物質をあらかじめ固定し、この生理活性物質の上に、さらに下記に示すような生理活性物質を固定化する態様が可能である。また、ポリマーにアルカンを導入した固定化層を用いれば、脂質などの膜構造を有した生理活性物質を固定することが可能になる。また、用途に応じて、ポリマー鎖の長さ、ポリマーの厚み、ポリマーの密度、あるいは、ポリマーに導入する反応基の量を調整することにより、多様な蛋白に対応することが可能になる。またポリマーに固定基として、NTA（nitrilotriacetic acid）等などを導入すれば、金属キレートを介してHis-tagリガンド等を固定することができる。
【００６５】
本発明のバイオセンサーに固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【００６６】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。
【００６７】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００６８】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
【００６９】
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
【００７０】
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
【００７１】
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【００７２】
これらの生理活性物質は、生理活性物質を含む溶液を親水性高分子が固定された基板上に塗布し、乾燥することによって固定化することが好ましい。
【００７３】
生理活性物質を含む溶液（塗布液）の濃度は、基板表面に固定する生理活性物質の濃度が高い方が好ましい。生理活性物質により異なるが、０.１ｍｇ/ｍＬから１０ｍｇ/ｍＬで使用することが好ましく、さらに好ましくは１ｍｇ/ｍＬから１０ｍｇ/ｍＬである。
【００７４】
生理活性物質を含む溶液の乾燥過程において、生理活性物質は塗布した溶液の外周部または、塗布液が乾固直前まで液が残った部分に析出する傾向がある。これにより基板表面に固定される生理活性物質の量に分布が発生し好ましくない。基板表面の生理活性物質固定量を均一にするため、塗布液の粘度は生理活性物質の基板表面への結合を阻害しない範囲で高くすることが好ましい。塗布液粘度を高くすることで、乾燥過程における塗布液中の生理活性物質の基板表面に対して水平方向の移動が抑えられ、結果として生理活性物質固定量のばらつきを抑えられる。乾燥過程における塗布液の粘度は０．９ｃＰ以上に保つことが好ましい。
【００７５】
本発明の乾燥する工程とは、生理活性物質を含む溶液の塗布後、その溶液を、静置することによる自然乾燥や、加熱や送風などによって溶液が乾燥する速度を上げ、意図的に乾燥させる工程をいう。ここで、生理活性物質を含む溶液（塗布液）の乾燥速度を上げることは生理活性物質固定量のばらつきを抑えることに効果がある。乾燥速度を上げ、生理活性物質の水平方向の移動速度に対して、十分早く乾燥を終了させることで、生理活性物質が実質的に移動する前に乾燥が終了し、ばらつきを抑えることが可能となる。乾燥速度を上げる方法は特に限定されないが、塗布液温度、乾燥環境温度を上げる、赤外線、レーザーなどの照射で蒸発エネルギーを加える、送風などで乾燥時の溶媒蒸気圧を下げる、溶液を薄層塗布して塗布量に対する蒸発面積を大きくするなどの方法が挙げられる。特に、塗布液が水を含む場合、乾球温度と湿球温度差の大きい環境で乾燥させることで乾燥速度は早くなる。乾球温度と湿球温度との温度差が７℃以上の環境で乾燥させることが好ましく、さらに好ましくは１０℃以上、さらに好ましくは１３．５℃以上である。また、製造工程上、乾燥時間としては１０分以内が好ましく、より好ましくは５分以内、特に好ましくは１分以内である。
【００７６】
生理活性物質を含む溶液を塗布する方法としては、特に塗布液を定量吐出するディスペンサーを使用する方法が挙げられる。ディスペンサーの吐出口を基板上で一定速度、一定間隔で動作させることで基板上の任意の場所に均一塗布することが可能である。ディスペンサーで塗布する場合、基板と吐出口の間隔を極力狭くし、塗布液厚みを薄くすることで生理活性物質の厚みを均一にすることができ、また乾燥速度を上げることができ、好ましい。また生理活性物質を含む溶液を塗布する好ましい方法として、スピンコートも挙げられる。この方法は、特に塗布膜厚を薄くする場合に好ましい。均一厚みの溶液を形成した後に乾燥させるため、スピンコーターは回転中の溶媒の蒸発を防ぐことが好ましい。このため、回転時に基板を密閉容器に入れておくなどの方法で、基板周辺の溶媒濃度が高い環境に保つことで、回転中の薄膜形成と薄膜形成後の乾燥速度を制御できるため、特に好ましい。これらの塗布工程後、温度・湿度を一定に保った条件下で乾燥させることが好ましい。
【００７７】
生理活性物質と被検体物質との相互作用を検出する場合、センサー表面の生理活性物質の固定量の変動は相互作用の定量的、速度論的評価の誤差の原因となる。この誤差を最小限に抑える目的で、生理活性物質の固定量を均一にすることが好ましい。相互作用の検出に使用される基板表面の生理活性物質の固定量のばらつきがＣＶ値（変動係数）（標準偏差／平均値）で１５％以下が好ましく、さらに好ましくは１０％以下である。ＣＶ値は、基板表面の少なくとも２点以上、好ましくは１０点以上、さらに好ましくは１００点以上の固定量から算出することができる。均一性は、生理活性物質を固定する前後のセンサー基板上の物質の量を定量することでも評価可能であるが、生理活性物質と結合することが知られている物質を蛍光標識して、この標識物質をセンサー基板に固定した後に蛍光顕微鏡などを用いて蛍光強度を測定することでも可能である。また、ＳＰＲイメージャー、エリプソメーター、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ、ＡＴＲ−ＩＲ装置などで生理活性物質の定量も可能である。
【００７８】
また、本発明において、基板上に固定化した生理活性物質の保存安定性を向上させる目的で、水素結合を形成しうる残基を有する化合物（以下、化合物Ｓとする）を使用してもよい。
【００７９】
一般に蛋白質などの生理活性物質は水溶液中で水分子が配位することで三次元構造を維持しているが、乾燥されると三次元構造を保持できず失活する。また、基板表面の親水性高分子中に担持されている場合には、乾燥されることで生理活性物質同士が接近し凝集が発生する。本発明の水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは、水分子に代って生理活性物質の三次元構造を保持することで失活を抑制、または生理活性物質を被覆して立体効果で凝集を抑制する目的で使用することができる。
【００８０】
本発明において水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは、水溶液で基板上の生理活性物質を固定した層に添加することが好ましい。添加方法としては、生理活性物質との混合溶液として基板表面に塗布しても良く、生理活性物質を基板表面に固定した後オーバーコートなどによりして添加しても良い。化合物Ｓと生理活性物質との混合溶液として塗布した場合、生理活性物質の固定量ばらつきを抑えることもできる。化合物Ｓ水溶液は薄膜状態で基板に添加することが好ましい。基板上に薄膜を形成させる方法は、公知の方法を用いることが可能であるが、具体的には、エクストルージョンコート法、カーテンコート法、キャスティング法、スクリーン印刷法、スピンコート法、スプレーコート法、スライドビードコート法、スリットアンドスピン方式、スリットコート方式、ダイコート法、ディップコート法、ナイフコート法、ブレードコート法、フローコート法、ロールコート法、ワイヤバーコート方式、転写印刷法、等を用いることが可能である。膜厚制御された塗布膜を簡便に作成可能であることから、本発明において基板上に薄膜を形成させる方法としては、スプレーコート法またはスピンコート法が好ましく、スピンコート法がさらに好ましい。
【００８１】
化合物Ｓの塗布液濃度は塗布性、生理活性物質を含む層への浸透の問題がない範囲で特に限定されないが、０．１重量％以上５重量％以下であることが好ましい。また、塗布液は、塗布性、ｐＨ調整の観点で界面活性剤、緩衝剤、有機溶剤、塩などを添加してもよい。
【００８２】
水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓとしては、常温常圧で不揮発性のものが好ましく、平均分子量が３５０より大きく５００万より小さいものが好ましく、さらに好ましくは１２００以上２００万以下であり、最も好ましくは１２００以上７万以下である。分子内に水酸基を含む化合物Ｓは糖類が好ましく、糖類は、単糖、多糖類でも良い。ｎ糖類の場合ｎが４以上１２００以下であることが好ましく、さらに好ましくはｎが２０以上６００以下である。
【００８３】
化合物Ｓの平均分子量が低いと基板表面で結晶化して、生理活性物質を固定した親水性高分子層の破壊および生理活性物質の三次元構造の破壊の原因となり、反対に平均分子量が高いと生理活性物質の基板への固定の障害となったり、生理活性物質を含む層に含浸できない、層分離を発生するなどの問題が発生する。
【００８４】
基板上に固定した生理活性物質の劣化を抑制する目的で、前記水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは、デキストラン骨格、又はポリエチレンオキシド骨格を有することが好ましく、本発明の目的を達成する範囲において、どの置換基を使用してもよい。また、基板上に固定した生理活性物質の劣化を抑制する目的で、解離性基を有しないノニオン性化合物であることが好ましい。また、前記水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは水分子との親和性の高い化合物が好ましく、水とｎ-オクタノールとの分配係数ＬｏｇＰ値が１以上であることが好ましい。ＬｏｇＰ値は、ＪＩＳ規格のＺ７２６０−１０７（２０００）「分配係数（1-オクタノール/水）の測定―振とう法」などに記載の方法で測定することができる。
【００８５】
具体的な水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓとしては、ポリビニルアルコールなどの多価アルコール類、コラーゲン、ゼラチン、アルブミンなどのタンパク質、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、デンプン、セルロース、アルギン酸、デキストランなど多糖類、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド、プルロニックなどポリエチレンキシ-ポリプロピレンオキシド縮合物などのポリエーテル類、トゥイーン２０、トゥイーン４０、トゥイーン６０、トゥイーン８０などの２種以上の残基から成る化合物、またはこれら化合物の誘導体および重合体などが挙げられる。その内、多糖類、ポリエーテル類が好ましく、多糖類がより好ましい。具体的には、デキストラン、セルロース、トゥイーン２０、トゥイーン４０、トゥイーン６０、トゥイーン８０が好ましく用いられる。さらに、特開２００６−１７０８３２に記載の不揮発性モノマー、不揮発性水溶性オリゴマーを用いることもできる。例えば不揮発性モノマーとしては水酸基が保護基で保護されていてもよいテトロース、ペントース、ヘプトース、ヘキトース及びそのグリコキシドでも良く、メチルグルコシドや水酸基が保護基で保護されていてもよいサイクリトール類でもよい。また不揮発性水溶性オリゴマーが、式（１）、（２）または（３） -[CH2-CH(CONH2)-]n- （１） -[CH2-CH2-O-]n- （２） -[CH2-CH(OH)-]n- （３）（式（１）〜（３）中、ｎは１０〜２００のいずれかの整数を示す。）で表されるオリゴマー、水酸基が保護基で保護されていてもよいｎ糖（但し、２≦ｎ≦１０）のオリゴ糖を用いることもできる。さらに、US２００３／０１７５８２７、DE２０３０６４７６A1に記載の糖類、例えば、トレハロース、スクロース、マルトース、ラクトース、キシリトール、フルクトース、マニトール、グルコース、キシロール、マルトデキストラン、サッカロース、ポリビニルピロリドンなどを使用しても良い。また、これらの化合物Ｓは、本発明において使用している親水性高分子の基本骨格と実質同一であることが好ましい。ここで、基本骨格とは、例えば、糖の環構造のことをいい、官能基や長さが異なっていても、環構造が同一であれば、実質同一であるという。
【００８６】
基板上の、水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓの含有量としては、平均分子量の比で、親水性高分子の平均分子量に対する前記化合物Ｓの平均分子量の割合が０．００５以上０．２以下であることが好ましい。割合がこれよりも低い場合は化合物Ｓが結晶化しやすく、高い場合は親水性高分子層への浸透が困難であり、この範囲内に設定することでこれらの問題を解消し、生理活性物質の失活抑制効果、凝集抑制効果をより高く得ることができる。
【００８７】
上記のようにして生理活性物質を固定化したバイオセンサーは、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。
【００８８】
本発明では、センサー用基板に固定化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。
【００８９】
本発明の好ましい態様によれば、本発明のバイオセンサーは、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。
【００９０】
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【００９１】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【００９２】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００９３】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【００９４】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【００９５】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【００９６】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【００９７】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００９８】
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
【００９９】
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。
【０１００】
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。
【０１０１】
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩgＧ抗体を特定物質として用いることができる。
【０１０２】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特開２００３−１０６９２６参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。
【０１０３】
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。
【０１０４】
本発明のバイオセンサーを表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、上記したような各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。
【０１０５】
また、本発明のバイオセンサーは、例えば基板表面に導波路構造を保持した、屈折率変化を導波路を用いて検出するバイオセンサーとして用いることができる。この場合、基板表面の導波構造物は、回折格子と場合によっては付加層とを有している、この導波構造物は、薄い誘電層からなる平面的な導波体から成る。導波体に集光された光線は全反射によりこの薄い層内に導かれる。この導かれる光波（以降モードと呼ぶ）の伝播速度は、Ｃ／Ｎの値をとる。ここでＣは、真空中での光速であり、Ｎは導波体内を導かれるモードの有効屈折率である。有効屈折率Ｎは、一面では導波体の構成により、他面では薄い導波層に隣接する媒体の屈折率により決まる。光波の伝導は、薄い平面層内のみでなく、別の導波構造物、特にストリップ状の導波体によっても行われる。その場合は、導波構造物はストリップ状のフィルムの形状にされる。有効屈折率Ｎの変化は、導波層に隣接する媒体の変化と導波層自身もしくは導波層に隣接する付加層の屈折率および厚さの変化とにより生じることがバイオセンサーにとって重要な要素である。
【０１０６】
この方式のバイオセンサーの構成については、例えば特公平６−２７７０３号公報４ページ４８行目から１４ページ１５行目および第１図から第８図、米国特許第 6,829,073号のcolumn6の31行目からcolumn7の47行目および第9図A,Bに記載されている。
【０１０７】
例えば、一つの実施形態として、薄層が平面状の導波路層が基材（たとえばパイレックス（登録商標）・ガラス）上に設けられている構造がある。導波路層と基材とは、一緒にいわゆる導波体を形成する。導波路層は、たとえば酸化物層（ＳｉＯ２，ＳｎＯ２、Ｔａ２Ｏ５，ＴｉＯ２，ＴｉＯ２-ＳｉＯ２，ＨｆＯ２，ＺｒＯ２，Ａｌ２Ｏ３，Ｓｉ３Ｎ４，ＨｆＯＮ，ＳｉＯＮ，酸化スカンジウムまたはこれらの混合物）、プラスチック層（例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネートなど）、など多層の積層体が可能である。光線が全反射により導波路層内を伝播するには、導波路層の屈折率が隣接媒体（たとえば基材や後述の付加層）の屈折率より大でなければならない。基材もしくは測定物質に向いた導波路層表面もしくは導波路層体積内には、回折格子が配置されている。回折格子は、型押し、ホログラフィまたはその他の方法によって基板内に形成することができる。次いでより高い屈折率を有する薄い導波路膜を回折格子の上表面に被覆する。回折格子は導波路層への入射光線を集束したり、既に導波路層内を導かれているモードを放出したり、そのモードの一部を進行方向へ透過させ、一部を反射させたりする機能を持つ。導波路層は、格子域を付加層でカバーしておく。付加層は必要に応じて多層膜とすることができる。この付加層は、測定物質に含まれている物質の選択的検知を可能にする機能を持たせることができる。好ましい態様として付加層の最表面に、検知機能を持つ層を設けることができる。このような検知機能を持つ層として、生理活性物質を固定化し得る層を用いることができる。
【０１０８】
別の実施形態として、回折格子導波路のアレイがマイクロプレートのウェル内に組み込まれる形態も可能である（特表2007-501432）。すなわち回折格子導波路がマイクロプレートのウェル底面にアレイ状に配列されていれば、スループットの高い薬物または化学物質のスクリーニングを可能にすることができる。
【０１０９】
回折格子導波路は、回折格子導波路の上層（検知領域）上の生理活性物質検出を可能にするために、入射光線、および反射光を検出して屈折特性の変化を検出する。この目的のため、１つまたはそれより多くの光源（例えば、レーザ、ダイオード）及び１つまたはそれより多くの検出器（例えば、分光計、ＣＣＤカメラまたはその他の光検出器）を用いることができる。屈折率変化を測定するための方法として、２つの異なる動作モード−分光法、及び角度法がある。分光法においては、入射光として広帯域ビームが回折格子導波路に送られ、反射光が集められて、例えば分光計で測定される。共鳴波長（ピーク）のスペクトル位置を観測することにより、回折格子導波路の表面またはその近傍での屈折率変化すなわち結合を測定することができる。また、角度法においては、公称上単一波長の光がある範囲の照射角を生じるように集束されて、回折格子導波路内に向けられる。反射光がＣＣＤカメラまたはその他の光検出器によって測定される。回折格子導波路によって反射された共鳴角の位置を測定することにより、回折格子導波路の表面またはその近傍での屈折率変化すなわち結合を測定することができる。
【０１１０】
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１１１】
実施例１：光ラジカル発生剤（化合物Ａ）の合成：
（１）中間体１の合成
２９．３３ｇ(０．１５０ｍｏｌ)の４−Ｃｙａｎｏ−４‘−ｈｙｄｒｏｘｙｂｉｐｈｅｎｙｌと７５ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを、冷却管を設置した３００ｍｌ容の三口フラスコに入れて撹拌し均一溶液とした。その溶液に２２．８１ｇ(０．１６５ｍｏｌ)の炭酸カリウムを加えてオイルバスで８０度に加熱し、３８．７８ｇ(０．１６６ｍｏｌ)の１１−ブロモ−１−ウンデセンを徐々に滴下した。１．５時間後に反応液を１００度に昇温し、さらに１．５時間反応させた。原料の消失はＴＬＣで確認した。反応終了後、反応液を水２３０ｍｌに投入し、析出した白色固体を濾別および水で洗浄した。得られた固体をアセトニトリルで再結晶し、４３．１１ｇの中間体１を得た。収率は８２．６％だった。
【０１１２】
（２）中間体２の合成
塩化カルシウム管を設置した３００ｍｌ容の三口フラスコに２０．００ｇ(５７．５６ｍｍｏｌ)の中間体１を入れ、氷冷下で１５０ｇ(１．０ｍｏｌ)のトリクロロアセトニトリルに溶かして均一溶液とした。その溶液に１．５４ｇ(５．７６ｍｍｏｌ)の臭化アルミニウムを加え、溶液を撹拌しながら塩酸ガスを４時間バブリングした。さらに４時間撹拌した後、一晩静置した。生成物を酢酸エチルで抽出し、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝３／１）で中間体２を単離した。収量は３６．４４ｇ、収率は９９．５％だった。
【０１１３】
（３）化合物Ａの合成
塩化カルシウム管を設置した５０ｍｌ容の三口フラスコに２．０１ｇ(３．１５９ｍｍｏｌ)の中間体（Ｂ）を入れ、３ｍｌのテトラヒドロフランに溶かした。その溶液を０度に冷却し、６ｍｌのトリクロロシランを添加して撹拌した。さらにＳｐｅｉｒ  ｃａｔａｌｙｓｔ（塩化白金(ＩＶ)酸六水和物／２−プロパノール  ０．１Ｍ）を加えて室温で撹拌を続けた。５時間後、未反応のトリクロロシランを減圧留去し、化合物Ａを得た。
【０１１４】
【化１１】
2007256270.tif 000012
【０１１５】
実施例２：CMDへの二重結合の導入
化合物１
カルボキシメチルデキストラン（略称：CMD-D40、名糖産業製，分子量４万） 5.0g（0.02mol / 1ユニット、0.02mol / カルボン酸ナトリウム）と2-アミノエチルメタクリレート塩酸塩（90％） 3.7g（0.02mol）を蒸留水40gに溶かした。それをアイスバスで冷やし、蒸留水 12gに溶かした1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド塩酸塩（略称：WSC、同仁化学研究所製） 4.2g（0.022mol）を添加した。室温で一晩撹拌した後、反応液をアセトン 500mlに投入し析出した固体を濾過して取り出した。その固体を、メタノールでリスラリーして乾燥し、4.1gの薄い褐色の粉末を得た。NMRで構造を確認したところ、CMD-D40に含まれるカルボン酸ナトリウムのうち約20mol％が2-アミノエチルメタクリレートと反応してアミド化したことが分った。
【０１１６】
化合物２
カルボキシメチルデキストラン（略称：CMD-D40、名糖産業製，分子量４万） 5.0g（0.02mol / 1ユニット、0.02mol / カルボン酸ナトリウム）と2-アミノエチルメタクリレート塩酸塩（90％） 1.8g（0.01mol）を蒸留水40gに溶かした。それをアイスバスで冷やし、蒸留水 12gに溶かした1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド塩酸塩（略称：WSC、同仁化学研究所製） 2.1g（0.011mol）を添加した。室温で一晩撹拌した後、反応液をアセトン 500mlに投入し析出した固体を濾過して取り出した。その固体を、メタノールでリスラリーして乾燥し、薄い褐色の粉末を得た。NMRで構造を確認したところ、CMD-D40に含まれるカルボン酸ナトリウムのうち約8mol％が2-アミノエチルメタクリレートと反応してアミド化したことが分った。
【０１１７】
化合物３
カルボキシメチルデキストラン（略称：CMD、名糖産業製，分子量１００万） 5.0g（0.02mol / 1ユニット、0.013mol / カルボン酸ナトリウム）と2-アミノエチルメタクリレート塩酸塩（90％） 2.4g（0.013mol）を蒸留水320gに溶かした。それをアイスバスで冷やし、蒸留水 12gに溶かした1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド塩酸塩（略称：WSC、同仁化学研究所製） 2.7g（0.0143mol）を添加した。室温で一晩撹拌した後、反応液をアセトン 3000mlに投入し析出した固体を濾過して取り出した。その固体を、メタノールでリスラリーして乾燥し、4.6gの薄い褐色の粉末を得た。NMRで構造を確認したところ、CMDに含まれるカルボン酸ナトリウムのうち9.4mol％が2-アミノエチルメタクリレートと反応してアミド化したことが分った。
【０１１８】
化合物４
カルボキシメチルデキストラン（略称：CMD、名糖産業製，分子量１００万） 1.0g（4×10-3mol / 1ユニット、2.5×10-3mol / カルボン酸ナトリウム）と2-アミノエチルメタクリレート塩酸塩（90％） 0.92g（5.0×10-3mol）を蒸留水100gに溶かした。それをアイスバスで冷やし、蒸留水 5gに溶かした1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド塩酸塩（略称：WSC、同仁化学研究所製） 1.05g（5.5×10-3mol）を添加した。室温で一晩撹拌した後、反応液をアセトニトリル 2000mlに投入し析出した固体をデカンテーションで取り出した。その固体を、メタノールでリスラリーして乾燥し、0.94gの薄い褐色の粉末を得た。NMRで構造を確認したところ、CMDに含まれるカルボン酸ナトリウムのうち13.7mol％が2-アミノエチルメタクリレートと反応してアミド化したことが分った。
【０１１９】
化合物５
カルボキシメチルデキストラン（略称：CMD、名糖産業製，分子量１００万） 1.0g（4×10-3mol / 1ユニット、2.5×10-3mol / カルボン酸ナトリウム）と2-アミノエチルメタクリレート塩酸塩（90％） 1.84g（10.0×10-3mol）を蒸留水100gに溶かした。それをアイスバスで冷やし、蒸留水 5gに溶かした1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド塩酸塩（略称：WSC、同仁化学研究所製） 2.11g（11.0×10-3mol）を添加した。反応液をアセトニトリル 2000mlに投入し析出した固体をデカンテーションで取り出した。その固体を、メタノールでリスラリーして乾燥し、0.89gの薄い褐色の粉末を得た。NMRで構造を確認したところ、CMDに含まれるカルボン酸ナトリウムのうち18.2mol％が2-アミノエチルメタクリレートと反応してアミド化したことが分った。
【０１２０】
実施例３：
本実施例は、タンパク質を固定するためのセンサーチップの作製に関するものである。（１）試料１（比較例）の作成
カルボキシメチルデキストランが結合した表面として、Biacore社センサーチップCM-5（research grade）を、そのまま試料１として用いた。
【０１２１】
（２）試料２（本発明）の作成
（２−１）アミノ基を有する基板の作成
センサーチップ上に金膜のみが形成されている表面として、Biacore社センサーチップAuを用いて実験を行った。センサーチップAuを12分間、UVオゾン処理を行った後、8mLのエタノールと2mLの超純水に45μmol の11-Hydroxy-1-undecanethiol（Aldrich社製）と4μmol の16-Mercaptohexadecanoic acid（Aldrich社製）を溶解させた溶液中で40℃１時間反応させ、エタノールで１回、超純水で１回洗浄した。上記基板上にEDC(0.4M) / NHS(0.1M)混合溶液を100 μl滴下し、室温で15 分反応させ活性化した後、超純水で１回洗浄した。上記基板に1,2-ビス(アミノエトキシ)エタンを50 μl滴下し、室温で1 時間反応させた後、超純水で１回洗浄した。
【０１２２】
（２−２）光ラジカル発生剤（化合物Ａ）の結合
化合物Ａを脱水MEKに溶かして0.5wt％の溶液とした。（３−１）で作成した金チップに、光開始剤溶液をスピンコート（1000rpm、20sec）して乾燥（80℃、5分）した後、MEKをかけて表面を洗浄した。
【０１２３】
（２−３）化合物２の金基板への光固定化
化合物２   0.4gをアセトニトリル 1.0gと水 2.0gに溶かして12wt％の溶液とし、シリンジ型のフィルターでろ過して不溶物を除いた。この溶液を、光開始剤を固定化した金チップ表面にスピンコート（750rpm、20sec）して乾燥（80℃、2分）し、乾膜とした。UV露光装置UVX-02516S1LP01（高圧水銀灯、USHIO製）で1分間露光し、水に48時間浸漬して現像することで、試料２を得た。
【０１２４】
（３）試料３（本発明）の作成
化合物３ 0.05gを水 5.0g、飽和食塩水 1滴、アセトニトリル 1.5gに溶かし0.76wt%の溶液とした。（３−２）で作成した金チップ表面に、＃36バーを用いて本溶液をバー塗布して乾燥（80℃、2分）し、乾膜とした。UV露光装置UVX-02516S1LP01（高圧水銀灯、USHIO製）で0.5分および1分間露光し、水に12時間浸漬して現像した。また、表面に残ったポリマーは水中超音波で５分間洗浄することで取り除いた。
【０１２５】
実施例４
本実施例は、実施例３で得られたセンサーチップに対するタンパク質の固定に関するものである。タンパク質としては、CA（Carbonic Anhydrase：SIGMA社製）を用いた。用いたCAは、ATTO社のAE-8150を用いた電気泳動実験で、同時測定したマーカー（Broad pI Kit, pH 3.5-9.3：Amersham Biosciences社製）との比較から、等電点が5.8程度であることを確認した。1mgのCAを1mlのHBS-EPバッファー（ビアコア社製、0.01M HEPES pH7.4, 0.15M NaCl, 0.005％Surfactant P20, 3mM EDTA）に溶解した溶液を10μl秤量し、90μlの酢酸バッファー（ビアコア社製、pH5.0）を加えることで、0.1mg/mlのCA溶液（pH5.0, 0.1mg/ml）を調整した。
【０１２６】
実施例３で作成した試料１〜３をBiacore社製の表面プラズモン共鳴装置であるBiacore3000にセットし、0.4MのEDCおよび0.1MのNHSを含む水溶液、CA溶液（pH5.0, 0.1mg/ml）、エタノールアミン溶液（ビアコア社）を、各々５分間流した後、10mM NaOHを１分間×２回流した場合の固定化について検討した。ランニングバッファーはHBS-Nバッファー（ビアコア社製、0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl）を用いた。得られたセンサーグラムを図１に示す。
【０１２７】
CA固定量は各々、7757RU（試料１：比較例）、13983RU（試料２：本発明）、34807RU（試料３：本発明）、であった。市販のCMD結合表面よりもタンパク固定量大きなCMD結合表面が、本発明により簡便に作成可能であることが証明された。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】図１は、実施例３で作成した試料１〜３を表面プラズモン共鳴装置にセットし、EDC/NHS溶液、CA溶液、及びエタノールアミン溶液を各々５分間流した後、NaOHを流すことによって得られたセンサーグラムを示す。
【図１】
2007256270.tif 000013