(57)【要約】【課題】発病初期段階での川崎病としての診断が確定しがたい時期において、川崎病を診断する上で有力な免疫学的検出試薬を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、nSm-hPAFの全長、組み換えSm-hPAF（rSm-hPAF）の全長あるいは組み換えSm-hPAFのＮ−末端から数えて１８６残基〜２０５残基のペプチドを抗原とした川崎病の免疫学的検出試薬を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
nSm-hPAFの全長を抗原とした川崎病の免疫学的検出試薬。
【請求項２】
組み換えSm-hPAFの全長を抗原とした川崎病の免疫学的検出試薬。
【請求項３】
Sm-hPAFのＮ−末端から数えて１８６残基〜２０５残基のペプチドを抗原とした川崎病の免疫学的検出試薬。
【請求項４】
nSm-hPAFの全長を抗原として用いて、被診断対象者から採取した血液中の血漿あるいは血清中の抗体量を測定することによる、川崎病の免疫学的検出方法。
【請求項５】
組み換えSm-hPAFの全長を抗原として用いて、被診断対象者から採取した血液中の血漿あるいは血清中の抗体の量を測定することによる、川崎病の免疫学的検出方法。
【請求項６】
組み換えSm-hPAFのＮ−末端から数えて１８６残基〜２０５残基のペプチドを抗原として用いて、被診断対象者から採取した血液中の血漿あるいは血清中の抗体の量を測定することによる、川崎病の免疫学的検出方法。
【請求項７】
組み換えSm-hPAFのＮ−末端から数えて１８６残基〜２０５残基からなるペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、川崎病を診断する上で有力な免疫学的検出法に関する。より詳しくは、本発明は、ｎSm-hPAF、ｒSm-hPAFの全長、あるいはｒSm-hPAFのN-末端(第1番目アミノ酸塩基)から数えて第1８６番目のアミノ酸残基から第２０５番目のアミノ酸残基までの部分のペプチドを抗原とした川崎病の免疫学的検出試薬及びそれを用いた川崎病の免疫学的検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
川崎病は、「急性熱性皮膚粘膜淋巴腺症候群」とも呼ばれ、急速に発熱し、全身に発疹が見られ、目が充血し、舌が赤くなり、頸部リンパ腺の腫脹、手足が腫れ、回復期には指先から皮膚が剥ける等の病像を呈する。川崎病は、従来臨床的所見により診断され、発病の初期段階には他の熱性、発疹性疾患との鑑別は必ずしも容易ではなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は上記従来の問題点に鑑みて、発病初期段階での川崎病としての診断が確定しがたい時期において、川崎病を診断する上で有力な血清学的診断法を提供することを目的とし、抗原抗体反応を利用する川崎病の免疫学的検出試薬ならびに該抗原抗体反応を用いて川崎病の免疫学的検出方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、nSm-hPAFの全長を抗原とした川崎病の免疫学的検出試薬を提供するものである。
【０００５】
本発明は、さらに組み換えSm-hPAF（rSm-hPAF）の全長を抗原とした川崎病の免疫学的検出試薬を提供するものである。
【０００６】
本発明は、さらに組み換えSm-hPAFのＮ−末端から数えて１８６残基〜２０５残基のペプチドを抗原とした川崎病の免疫学的検出試薬を提供するものである。
【０００７】
本発明は、nSm-hPAFの全長を抗原として用いて、被診断対象者から採取した血液中の血漿あるいは血清中の抗体の量を測定することによって、川崎病の免疫学的検出方法を提供するものである。
【０００８】
本発明は、さらに組み換えSm-hPAFの全長を抗原として用いて、被診断対象者から採取した血液中の血漿あるいは血清中の抗体の量を測定することによって、川崎病の免疫学的検出方法を提供するものである。
【０００９】
本発明は、さらに組み換えSm-hPAFのＮ−末端から数えて１８６残基〜２０５残基のペプチドを抗原として用いて、被診断対象者から採取した血液中の血漿あるいは血清中の抗体の量を測定することによって、川崎病の免疫学的検出方法を提供するものである。
【００１０】
さらに、本発明は、組み換えSm-hPAFのＮ−末端から数えて１８６残基〜２０５残基からなるペプチドを提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、川崎病と疑われるヒトに対して、nSm-hPAFの全長、rSm-hPAFの全長あるいは組み換えSm-hPAFのＮ−末端から数えて１８６残基〜２０５残基のペプチドを抗原として用いて、被診断対象者から採取した血液中の血漿あるいは血清中の抗体の量を測定することによって、川崎病に罹患しているか否かを診断する上で有益な知見をえることができ、他の臨床的所見からの診断知見とあわせて、被診断者が川崎病に罹患しているかどうかをより正確に診断することが可能となる。
【００１２】
上記川崎病の免疫学的検出試薬は、適当な緩衝液に溶解し、得られた溶液を試験管等に入れ、緩衝液を洗滌除去して試験管等の壁部に免疫学的検出試薬を付着させ、被診断者からの血液の血漿あるいは血清を該試験管等に入れて、従来より既知のＥLISA法を用いて該血漿あるいは血清中の抗体量を測定することによって、川崎病であるか否かの診断をするのを支援するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明で用いているnSm-hPAFの全長、rSm-hPAFの全長及びｒSm-hPAFのN-末端基(第1番目)アミノ酸塩基から数えて第1８６番目のアミノ酸残基から第２０５番目のアミノ酸残基までの部分のペプチドは、以下の方法によって製造される。nSm-hPAFの全長及びrSm-hPAFの全長自体はすでに報告されているが、川崎病との関連は本発明によって初めて明らかにされたものであり、またSm-hPAFのN-末端基(第1番目アミノ酸塩基)から数えて第1８６番目のアミノ酸残基か第２０５番目のアミノ酸残基までの部分のペプチドは川崎病の診断において有効な抗原となり得ることが本発明によって初めて特定され、かつ同定されたものである。
【００１４】
（１）nSm-hPAFの全長
川崎病患児の口腔から得られたストレプトコッカス  ミティス（Streptococcu.mitis、S.mitisと略す）Nm-65株の培養上清中にはヒトの血小板（血漿中に浮遊した血小板、Platelet rich plasma、PRPと略す）を凝集する因子（S.mitis由来ヒト血小板凝集因子、S.mitis-derived human platelet aggregation factor, native Sm-hPAF、nSm-hPAF）が発見され、報告された（非特許文献１参照）。
【非特許文献１】Ohkuni, H. et. al., “Biologically active extracellular products of oral viridans streptococci and the aetiology of Kawasaki disease”, J. Med. Microbiol, Vol. 39, pp352-362, 1993
【００１５】
S.mitisの代謝物質からｎSm-ｈPAFを精製し、その性状が検討され、ｎSm-ｈPAFのＮ−末端からから１５残基のアミノ酸配列がHAsp-Glu-Gln-Gly-Asn-Arg-Pro-Val-Glu-Thr-Glu-Asn-Ile-Ala-Arg-であることが決定された（非特許文献２）。
【非特許文献２】Ohkuni H. et.al., “Purification and partial characterization of a novel human platelet aggregation factor in extracellular products of Streptococcus mitis, strain  Nm-65”、FEMS Immunology and Medical Mircobiology 17(1997)121-129
【００１６】
Sm-hPAFの全塩基配列の決定手順は、以下の通りである。
（１）nSm-hPAFのN-末端アミノ酸の塩基配列の決定
S.mitisの培養上清から精製して得られたヒト血小板凝集因子、nSm-hPAFのN-末端アミノ酸配列（上記）を基に混合オリゴヌクレオチド・プライマー（Mixed oligonucleotide-primed）ＰＣＲ法(MOP PCR)を行い、そのPCR産物をsm-65とした。この産物をE. coli, JM109を用いて、クローニング及びシーケンス（遺伝子配列）解析を行い、N-末端アミノ酸の塩基配列を決定した。
【００１７】
（２）組み換えSm-hPAF（rSm-hPAF）の全長
次いでPCRカセット（既知の塩基配列を基に他の周辺領域を増幅する方法）で全長のSm-hPAFの遺伝子をBamHI部位とHindIII部位をプライマーとして増幅した。増幅した遺伝子(sm-hpaf)をpＱＥ-9ベクターのBamHI部位とHindIII部位で切断される部分に挿入し、E. coliの遺伝子と連結させ、E. coli、JM109で組み換え体を作製した。このE. coliを培養し、この菌体から組み換えSm-hPAF(rSm-hPAF)を精製した。上記方法を図１に示す。（非特許文献３参照）。
【非特許文献３】長宗秀明等、「川崎病由来S.mitisヒト血小板凝結因子」、第77回日本細菌学会総会、２７２頁、2004年4月
【００１８】
このrSm-hPAFの全塩基配列を決定した。rSm-hPAFの全塩基配列を図２に示す。sm-hpafの読み取り枠（ORF）の上流の２５２塩基と下流の９８塩基を含めrSm-hPAFの遺伝子の完全なシークエンスを同定した。ORFのヌクレオチドのシークエンスはそのシグナルシークエンスを含め６６５アミノ酸残基からなるたんぱく質をコード化することが可能であった。全体あるいは６３３のアミノ酸残基が野生型たんぱく質としてコード化され、システインは含んでいなかった。
【００１９】
rSm-hPAFの遺伝子の完全なシークエンスをアミノ酸配列に置換し、ホモロジー検索を行ったところ、S. intermediusやS.pneumoniaなどの産出する既知の溶血毒のいくつかときわめて相同性が高いことが明らかになった（図３ａ〜図３ｃ，図４，図５参照）。図５は、アミノ酸配列の長さを比較した図で、Sm-hPAFが他の溶血毒よりもアミノ酸配列が長く、言い換えれば分子量が大きく、Domain1-4の部分で相同性があることを示している。Domain0-4で相同性のある部分とない部分は図３a〜図３cのアミノ酸配列の比較から分かる。塩基配列の前半のドメイン０の部分はｒＳｍ-ｈＰＡＦの特有の配列であり、他の溶血毒には見られない配列である。一方、他の溶血毒と並行して書かれているrSm-hPAFのアミノ酸配列は比較的相同性のある部分である。この塩基配列を基にした全アミノ酸配列は図３ａ〜図３ｃの最上段のｒSm-hPAFの行で示す。
【００２０】
（３）Ｎ−末端から数えて１８６残基〜２０５残基（TQVGDRTAPVVDQTSALKD）までのペプチド（図３ａ参照）
ｒSm-hPAFのアミノ酸の一次構造から二次構造および三次構造を予測し、種々のアミノ酸残基ポリペプチドを合成した。川崎病を診断する上で有力な血清学的診断法を確立すべく、これらのポリペプチドから本発明に係るN-末端から１８６−２０５アミノ酸残基を選択した。Ｎ−末端から１８６−２０５アミノ酸残基（TQVGDRTAPVVDQTSALKD）は、たんぱく質の立体構造の上で分子表面に露出していると考えられる。
【実施例１】
【００２１】
ｎSm-hPAF,  ｒSm-hPAF並びにＮ−末端から数えて１８６残基〜205残基のペプチドを抗原として川崎病をはじめとする各種疾患、健常者血清ないし血漿中の抗体をELISAで測定した。具体的実験方法は以下の通りである。
【００２２】
まず、抗原であるrSm-hPAFを0.1μｇ（マイクログラム）ないしは合成ペプチド0.05μｇを試験管（マイクロプレートのウエル、well）に入れ、試験管に吸着させた。次いで、1:100ないしは1:800に希釈されたヒト血清ないしは血漿の100μl (0.1ml)を抗原吸着した試験管に加え、37℃で一定時間反応させた。反応後、マウスで作られた抗ヒトIgG抗体ないしは抗ヒトIgM抗体を加え、37℃で一定時間反応後、羊で作られた抗マウス酵素標識抗IgG抗体ないしは抗マウス酵素標識IgM抗体を加え、さらに基質を加え、発色させ、比色計で波長（OD）405nmでの色の強さを測定し抗体値とした。
【００２３】
抗原としてrSm-hPAFを用いた実験結果を図６に、合成ペプチドを抗原として用いた結果を図７に示す。ｒSm-hPAF並びに合成ペプチドに対する川崎病急性期の抗体（IgGクラス）は対照群である他の熱性疾患や健常者のそれに比して、有意に高い値が示された（図６，図７）。図示してないが、nSm-hPAFを用いた時も結果は同じ傾向にあった。rSm-hPAF抗原中の抗原決定基（エピトープ、抗体が直接反応する部位）は恐らくは合成ペプチド中に存在するものと思われる。但し、別な抗原決定基がrSm-hPAF中にある可能性はある。
【００２４】
他の溶血毒による吸収実験は、1:100に希釈された血清ないしは血漿（220μl）にILY, Ply, SLOなどの溶血毒（50μｇ/ml）を20μlを加え, 37℃で30分、4℃で一晩インキュベートとし、その後、前記したELISA法を行った。対照としてrSm-hPAFも同様に用いた。その結果、図１0に示すように、rSm-hPAFでは吸収されたが、他の溶血毒では吸収されず、抗体値も低下していないことが示された。
【００２５】
これら抗原については、IgM抗体には有意差が認められなかった（図8、図9）。一般的には、IgM抗体は感染初期に上昇し、その後低下する、IgM抗体が低下する前後からIgGクラスの抗体が上昇してくる。今回のデーターでIgMクラスの抗体が低値で、対照群と有意差がなかった理由は必ずしも明確ではないが、この菌（S.mitis）の感染がもし川崎病の発病の少し前に成立していればIgM抗体は高値になった可能性がある。しかし、IgM抗体は低値であるので、恐らくは感染がもっと前に起こり、入れかわてIgG抗体が上昇してきた時期に抗体の量を測定したことに基づく可能性がある。推測の域を出ないが、IgG抗体が上昇した時期が川崎病の臨床的な発症と一致しているのかも知れない。また、IgM抗体はELISA法での測定の上で、抗原であるSm-hPAFに対して親和性（Affinity）の低い性質を持っている可能性もある。
【００２６】
なお、これらの抗体はrSm-hPAFと相同性のあるS.intermedius由来Intermedilysin (ILY),  S. pneumoniar由来Pneumolysis （PLY）,Ｓ.pyogenes由来Streptolysin-O （SLO）での吸収実験で低下が認められず(図１０)、特異性の高い反応と思われる。
【００２７】
川崎病は臨床的所見から診断され、発病初期には他の熱性、発疹性疾患との鑑別は必ずしも容易ではない。本抗原を用いた測定方法は発病初期において川崎病を疑う、ないしは診断する上で一つの有力な血清学的診断法となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】組み換えＳｍ−ｈＰＡＦの発現ベクターを構築する方法を示す。
【図２】ｒSm-hPAFの遺伝子の塩基配列を示す。
【図３ａ】ｒSm-hPAFのアミノ酸配列とS. intermediusやS.pneumoniaなどの産出する既知の溶血毒のアミノ酸配列とを比較する。
【図３ｂ】ｒSm-hPAFのアミノ酸配列とS. intermediusやS.pneumoniaなどの産出する既知の溶血毒のアミノ酸配列とを比較する。
【図４】ｒSm-hPAFのアミノ酸配列とS. intermediusやS.pneumoniaなどの産出する既知の溶血毒との間のホモロジーの割合について示す。
【図５】ｒSm-hPAFのアミノ酸配列とS. intermediusやS.pneumoniaなどの産出する既知の溶血毒との間でアミノ酸配列の長さを比較した図である。
【図６】抗原としてrSm-hPAFを用いた実験結果を示す。
【図７】合成ペプチドを抗原として用いた実験結果を示す。
【図８】rSm-hPAF抗原についてのIgM抗体に対する実験結果を示す。
【図９】合成ペプチド抗原についてのIgM抗体に対する実験結果を示す。
【図１０】rSm-hPAF、S.intermedius由来Intermedilysin (ILY),  S. pneumoniar由来Pneumolysis （PLY）,Ｓ.pyogenes由来Streptolysin-O （SLO）でのIgGクラス抗体の吸収実験の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年7月31日(2006.7.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007085783000001.app