(57)【要約】【課題】病原性細菌に起因する疾患に有用な新規予防・改善剤を提供すること。【解決手段】配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、カスパーゼ阻害剤であるZ-VAD fmk、PI3P、MEK阻害剤であるU0126、アミノ酸誘導体であるAc-L-Ala-NH2等の物質は、宿主細胞に対して毒性が弱く、宿主細胞に侵入した細菌の生存を抑制することができる。従って、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチド、カスパーゼ阻害剤、PI3P、MEK阻害剤、アミノ酸誘導体等の物質、又は、それらの物質を２以上組み合わせた組成物は、病原性細菌に起因する疾患の予防・改善に有用である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内に侵入した病原性細菌に起因する疾患の予防・改善剤であって、
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する予防・改善剤。
【請求項２】
前記ペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の予防・改善剤。
【請求項３】
さらに、カスパーゼ阻害剤を含有することを特徴とする請求項１又は２に記載の予防・改善剤。
【請求項４】
前記カスパーゼ阻害剤がZ-VAD fmk（Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp (OMe) fluoromethylketone）であることを特徴とする請求項３に記載の予防・改善剤。
【請求項５】
前記病原性細菌が結核菌であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の予防・改善剤。
【請求項６】
細胞内に侵入した病原性細菌に起因する疾患の予防・改善剤であって、
カスパーゼ阻害剤を有効成分として含有する予防・改善剤。
【請求項７】
前記病原性細菌が結核菌であることを特徴とする請求項６に記載の予防・改善剤。
【請求項８】
前記カスパーゼ阻害剤がZ-VAD fmk（Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp (OMe) fluoromethylketone）であることを特徴とする請求項６又は７に記載の予防・改善剤。
【請求項９】
細胞内に侵入した病原性細菌に起因する疾患の予防・改善剤であって、
PI3P（phosphatidylinositol-3-phosphate）を有効成分として含有する改善剤。
【請求項１０】
前記細菌が結核菌であることを特徴とする請求項９に記載の予防・改善剤。
【請求項１１】
細胞内に侵入した病原性細菌に起因する疾患の予防・改善剤であって、
MEK（Mitogen-activated protein（MAP）kinases）阻害剤を有効成分として含有する予防・改善剤。
【請求項１２】
前記細菌が結核菌であることを特徴とする請求項１１に記載の予防・改善剤。
【請求項１３】
前記MEK阻害剤がU0126（1.4-diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(2-amino-phenylthio)butadiene）であることを特徴とする請求項１１又は１２に記載の予防・改善剤。
【請求項１４】
細胞内に侵入した病原性細菌に起因する疾患の予防・改善剤であって、
アミノ酸誘導体を有効成分として含有する予防・改善剤。
【請求項１５】
前記細菌が結核菌であることを特徴とする請求項１４に記載の予防・改善剤。
【請求項１６】
前記アミノ酸誘導体がAc-L-Ala-NH2（Acetyl-L-alanine amide）であることを特徴とする請求項１４又は１５に記載の予防・改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内に侵入した病原性細菌に起因する疾患の予防・改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞は、オートファジーによって細胞内に侵入した病原性細菌を分解・消化する機能を有する。細胞におけるオートファジーの誘導は、細胞内の病原性細菌の生存を抑制できるため（例えば、非特許文献１参照）、細胞内に侵入した病原性細菌に起因する疾患、特に、細胞内寄生性細菌に起因する疾患の予防・改善剤として有用であると考えられている。
【０００３】
しかしながら、オートファジーは細胞死にも関与している可能性があるため、オートファジー誘導剤を病原性細菌に起因する疾患に使用すると、宿主の細胞死を促進し、副作用を伴う恐れがある。
【非特許文献１】Cell 119,753-766, 2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、病原性細菌に起因する疾患に有用な新規予防・改善剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は上記課題を解決すべく鋭意努力した結果、オートファジー誘導剤として知られているラパマイシン（Cell 119,753-766, 2004）は、宿主細胞に侵入したBCG（Bacillus Calmette-Guerin）の生存を抑制するとともにほとんどの宿主細胞に対して細胞死を誘導するのに対して、配列番号１に示されるアミノ酸配列（RSTDLPGLKAATHYTITIRGV）を有するペプチド（RSTDLPGLKAATHYTITIRGVC（配列番号２）；以下「TNIII」と称する。）、カスパーゼ阻害剤であるZ-VAD fmk（Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp (OMe) fluoromethylketone）、PI3P（phosphatidylinositol-3-phosphate）、MEK（Mitogen-activated protein（MAP）kinases）阻害剤であるU0126（1.4-diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(2-amino-phenylthio)butadiene）、アミノ酸誘導体であるAc-L-Ala-NH2（Acetyl-L-alanine amide）等の物質は、宿主細胞に感染したBCGの生存を抑制するが、宿主細胞に対して毒性が弱いことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明に係る予防・改善剤は、細胞内に侵入した病原性細菌に起因する疾患に対するものであって、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチド、そのペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド、カスパーゼ阻害剤、PI3P、MEK阻害剤、アミノ酸誘導体などの物質を１又は２以上、有効成分として含有する。前記カスパーゼ阻害剤は、例えば、Z-VAD fmkなどである。前記MEK阻害剤は、例えば、U0126などである。前記アミノ酸誘導体は、例えば、Ac-L-Ala-NH2などである。前記細胞内に侵入した病原性細菌に起因する疾患は、例えば、結核菌などである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、病原性細菌に起因する疾患に有用な新規予防・改善剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【０００９】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１０】
＝＝本発明に係る予防・改善剤＝＝
上述のように、TNIII、カスパーゼ阻害剤であるZ-VAD fmk、PI3P、MEK阻害剤であるU0126、アミノ酸誘導体であるAc-L-Ala-NH2等の物質は、細胞に侵入した細菌の生存を抑制することができ、特に、TNIII、MEK阻害剤であるU0126、アミノ酸誘導体であるAc-L-Ala-NH2等の物質に関しては細胞毒性が無いことが明らかになった。従って、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチド、そのペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド、カスパーゼ阻害剤、PI3P、MEK阻害剤、アミノ酸誘導体等の物質、又は、それらの物質を２以上組み合わせた組成物は、病原性細菌に起因する疾患の予防・改善に有用であると考えられる。
【００１１】
前記カスパーゼ阻害剤としては、例えば、Z-VAD fmk、Ac-WEHD-CHO（acetyl-Trp-Glu-His-Asp-aldehyde）、Ac-DEVD-CMK（acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-chloromethylketone）、Boc-D-FMK（benzyloxycarbonyl-Asp(OMe)fluoromethylketone)、Z-YVAD-FMK （Z-Tyr-Val-Ala-Asp(OMe)-CH2F）、Z-WEHD-FMK （Z-Trp-Glu(OMe)-His-Asp(OMe)-CH2F）、Z-LEHD-FMK （Z-Leu-Glu(OMe)-His-Asp(OMe)-CH2F）、Z-IETD-FMK （Z-Ileu-Glu(OMe)-Thr-Asp(OMe)-CH2F）等の公知の物質を用いることができる。また、前記MEK阻害剤としては、例えば、U0125（1,4-Diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(phenylthio)butadiene）、U0126、PD98059（2’-Amino-3’-methoxyflavone）等の公知の物質を用いることができる。
【００１２】
前記アミノ酸誘導体としては、例えば、Ac-L-Ala-NH2、Ac-L-Met-NH2、Ac-L-Val-NH2、Ac-L-Leu-NH2、Ac-L-Gln-NH2等のアミノ酸（特にL-アミノ酸）誘導体（N末端がアセチル基等の公知の保護基により保護されており、C末端がアミド化されているもの）を用いることができる。
【００１３】
本発明に係る予防・改善剤を適用する疾患としては、細胞内に侵入した病原性細菌（特に細胞内寄生細菌）、例えば、BCG（カルメット−ゲラン杆菌）、結核菌、A群レンサ球菌、黄色ブドウ球菌、病原性大腸菌、インフルエンザ菌、肺炎球菌、肺炎桿菌、ボツリヌス菌、病原性大腸菌、赤痢菌、レジオネラ菌、リステリア菌、ジンジバリス菌、ブドウ球菌など、に起因する疾患であれば特に制限されるものではないが、例えば、結核、咽頭炎、扁桃炎、肺炎、猩紅熱、劇症型溶血性レンサ球菌感染症、中毒症、細菌性赤痢、歯周病、ボツリヌス症、敗血症、髄膜炎、炎症性腸疾患、血管炎、IV型アレルギー性疾患、ブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群、MRSA感染症、リッター病、新生児における水疱性インペチゴ、関節炎、化膿性疾患、腸炎、菌血症、眼感染などを挙げることができる。
【００１４】
＝＝本発明に用いられるペプチド＝＝
上述の配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチド、又は、そのペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドとしては、細胞毒性がなく、細胞に侵入した細菌の生存を抑制することができるものであればどのようなものでもよく、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、若しくは、そのペプチドの作用を増強させるため、２つのペプチドのＣ末端にCysを付加して作製したペプチドTNIII、又はそれらのペプチドにタグ（例えば、Hisタグ、GSTタグなど）が結合したペプチドなどを挙げることができる。
【００１５】
本発明に用いられるペプチドは、その配列情報に基づいて有機化学的に合成することができる。また、適切なエンハンサー／プロモーターをもつ発現ベクターに、本発明に用いられるペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入し、この組換えベクターを大腸菌、サルモネラ菌等の菌や、イースト、動物細胞などに導入し、発現させ、生成したペプチドを、常法を用いて精製してもよい。また、この組換えベクターをin vitroで転写させて得られたmRNAを、ウサギ網状赤血球抽出液、大腸菌Ｓ３０抽出液、麦芽抽出液、小麦胚抽出液などを用いたインビトロ翻訳システムにより翻訳させて、合成されたペプチドを精製してもよい。
【００１６】
ここで、発現ベクターを作製する際、Hisタグ、GSTタグなどのタグをコードするポリヌクレオチドと、本発明に用いられるペプチドをコードするポリヌクレオチドとを融合した融合ポリヌクレオチドをベクターに挿入し、融合タンパク質として発現させるのがより好ましい。タグを利用して、目的のペプチドを容易に精製することが可能になるからである。なお、タグは、最終段階で除去し、HPLC（high-performance(-speed) liquid chromatography）などで本発明に用いられるペプチドだけを精製することもできる。
【００１７】
なお、本発明に用いられるペプチドを細胞外に分泌させるため、シグナルペプチドを付加してもよく、そのような融合ペプチドを発現することのできる組換えベクターは、上述のように、適切なエンハンサー／プロモーターをもつ発現ベクターに、融合ペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入することで作製することができる。
【００１８】
また、前記組換えベクターを含有する細胞（組換え細胞）は、例えば、動物細胞に、前記組換えベクターをエレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、アデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターなどを用いたウイルス感染法、又はカルシウムを用いたトランスフェクション法等によって導入することにより作製できる。
【００１９】
＝＝本発明に係る予防・改善剤の使用＝＝
本発明に係る予防・改善剤を、細胞内に侵入した病原性細菌に起因する疾患の予防・改善のために、ヒト又はヒト以外の脊椎動物に対して投与する場合には、導入対象の患部の近傍に直接投与してもよいが、経口又は静脈内、腹腔内等の非経口に投与してもよい。なお、TNIII、カスパーゼ阻害剤、PI3P、MEK阻害剤、アミノ酸誘導体等の物質のうち２以上の物質を投与する場合には、同じ部位又は異なる部位に投与することとしてもよい。
【００２０】
上述の予防・改善剤を経口投与する場合には、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの製剤にしてもよく、腹腔内又は静脈内に投与する場合には、注射剤、点滴剤などの製剤にしてもよい。なお、前記製剤は、従来使用されている製剤添加物（例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、矯味矯臭剤、溶剤、安定剤など）を用いて、常法により製造することができる。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例を用いてより詳細に説明する。
【００２２】
［実施例１］
貪食細胞であるマクロファージ由来Raw264.7細胞（6×106 cell）を、10% FBS（fetal bovine serum）を含むDMEM（ダルベッコ改変イーグル培地）の入った10cm dishで培養して接着させ、BCG（6×107個；日本ビーシージー製造株式会社製）を加えて37℃で1時間感染させた。その後、PBSで4回洗浄して細胞外のBCGを除去し、細胞をスクレーパーで回収した。これを2% FBSを含むDMEMに懸濁し、BCG感染細胞溶液（5〜10×105cell/mL）として以下の実験に用いた。また、Raw264.7細胞をBCGの添加なしで同様の処理を行い、対照用非感染細胞溶液（5〜10×105cell/mL）として以下の実験に用いた。
【００２３】
mTOR（mammalian target of Rapamycin）阻害剤であるラパマイシン（50μg/mL；和光純薬製）、MEK阻害剤であるU0126（2μM；Calbiochem社製）、若しくは、ラパマイシン（50μg/mL）及びU0126（2μM）を添加したBCG感染細胞溶液、何も添加していないBCG感染細胞溶液（コントロール）、あるいは非感染細胞溶液（未感染）を、10μg/mL ヒト由来血漿性フィブロネクチン（ヒト血漿から精製；Fukai et al. J Biol Chem 266: 8807-8813, 1991）溶液（FNのPBS溶液）で37℃，1時間インキュベートすることによりコートした6ウェルプレートの各ウェルに播種し、37℃で1日又は2日間インキュベートした。その後、細胞をスクレーパーで回収し、遠心分離した（2000rpm×5分間）。遠心分離後、上清を除去し、RIPA1/2溶液（0.05％ SDS、0.5％ TritonX-100、5mM Tris-HCl、75mM NaCl、2.5mM EDTA）を1 mL加えて室温で10分間放置し、細胞を溶解した。細胞溶解液を遠心分離した後（3000rpm×5分間）、上清を除去し、沈査のBCGをPBSで3回洗浄した。
【００２４】
洗浄後、沈査のBCGをPBSで1mLとなるように懸濁し、96ウェルプレートの各ウェルに200μLずつ注入した。その後、10％ Alamar Blue（Biosouce社製）を各ウェルに20μLずつ加えて撹拌し、37℃で2時間インキュベートした。インキュベート後、蛍光プレートリーダー（Ex530nm，Em590nm；Perseptive Biosystems社製）を用いて蛍光強度を測定することにより細胞内で生存していたBCGの数を評価した。その結果を図１に示す。
【００２５】
図１に示すように、mTOR阻害剤であるラパマイシン、MEK阻害剤であるU0126、ラパマイシン＋U0126で処理した感染細胞は、コントロールと比べて顕著にBCGの数が減少していることが明らかになった。
【００２６】
［実施例２］
次に、ラパマイシンやU0126などの代わりにTNIII（80μg/ml）、カスパーゼ阻害剤であるZ-VAD fmk（100μM；Sigma 社製）、又は、TNIII（80μg/ml）及びZ-VAD fmk（100μM）を用いて37℃で1日又は2日間インキュベートする他は実施例１に記載の方法と同様に、細胞内に生存するBCGの数を評価した。その結果を図２に示す。
【００２７】
図２に示すように、TNIII、及び、カスパーゼ阻害剤であるZ-VAD fmkも、コントロールに比べて顕著にBCGの数を減少することが明らかになった。
【００２８】
［実施例３］
次に、マクロファージに対する各物質（ラパマイシン、U0126、TNIII、Z-VADなど）の細胞障害作用の有無を調べるため、以下の実験を行った。
【００２９】
96-ウェルプレートに、実施例１で準備したBCG感染細胞溶液又は非感染細胞溶液を200μlずつ播種し、最終濃度で25又は50μg/mLとなるようにラパマイシンを添加し、37℃で1日間培養した。なお、コントロールとして、ラパマイシンを添加しないで培養したBCG感染細胞溶液及び非感染細胞溶液を用いて同様に実験を行った。
【００３０】
培養後、MTT（3-(4,5-dimethlthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）アッセイ法に準じてCell Counting Kit (同仁化学社製)を用いて生細胞数を評価した（マイクロプレートリーダー（BioRad社製）を用いて吸光度（測定波長450 nm，リファレンス側655 nm）を測定した）。その結果を図３に示す。
【００３１】
また、96-ウェルプレートに、Raw264.7細胞の懸濁液（2％ FBSを含むDMEM）（1×104/200μl/well）を200μlずつ播種し、ラパマイシンの代わりにU0126（2μM）、TNIII（40又は80μg/mL）、又はZ-VAD（100μM）を添加し、37℃で1、2、又は3日間インキュベートし、Raw264.7細胞に対する細胞障害試験を行った。その結果を図４に示す。
【００３２】
図３に示すように、ラパマイシンで処理した宿主細胞はほとんどが細胞死を起こすのに対して、図４に示すように、U0126及びTNIIIはマクロファージに対して傷害作用を示さないことがわかった。また、図４に示すように、Z-VAD fmkはマクロファージに対する傷害作用を有するもののラパマイシンに比べてその作用が弱いことがわかった。これらのことから、MEK阻害剤、TNIII、カスパーゼ阻害剤などは、正常細胞には毒性を有さず、病原性細菌が侵入した細胞の生存や増殖を抑制することができるため、細胞に侵入した病原性細菌に起因する疾患の予防・改善に有用であると考えられる。
【００３３】
［実施例４］
次に、ラパマイシンやU0126などの代わりにアミノ酸誘導体であるAc-L-Ala-NH2（20mM；Bachem 社製）、又はPI3P（10μM；Sigma 社製）を用いて37℃で1日間インキュベートする他は実施例１に記載の方法と同様に、細胞内に生存するBCGの数を評価した。その結果を図５に示す。
【００３４】
図５に示すように、アミノ酸誘導体であるAc-L-Ala-NH2、及び、PI3Pも、コントロールに比べてBCGの数を減少することが明らかになった。
【００３５】
また、ラパマイシンの代わりにAc-L-Ala-NH2を用いて37℃で1又は2日間インキュベートする他は実施例３に記載の方法と同様に、非感染細胞に対する細胞障害試験を行ったところ（図６）、Ac-L-Ala-NH2もマクロファージに対して傷害作用を示さないことがわかった。これらのことから、アミノ酸誘導体、PI3Pなどは、正常細胞には毒性を有さず、病原性細菌が侵入した細胞の生存や増殖を抑制することができるため、細胞に侵入した病原性細菌に起因する疾患の予防・改善に有用であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の一実施例において、ラパマイシン、U0126、又は、ラパマイシン及びU0126が細胞に感染したBCGの生存に与える影響を調べた結果を示す図である。
【図２】本発明の一実施例において、TNIII、Z-VAD fmk、又は、TNIII及びZ-VAD fmkが細胞に感染したBCGの生存に与える影響を調べた結果を示す図である。
【図３】本発明の一実施例において、マクロファージに対するラパマイシンの細胞障害作用を調べた結果を示す図である。
【図４】本発明の一実施例において、マクロファージに対する各物質（U0126、TNIII、Z-VADなど）の細胞障害作用を調べた結果を示す図である。
【図５】本発明の一実施例において、Ac-L-Ala-NH2、又は、PI3Pが細胞に感染したBCGの生存に与える影響を調べた結果を示す図である。
【図６】本発明の一実施例において、マクロファージに対するAc-L-Ala-NH2の細胞障害作用を調べた結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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