(57)【要約】【課題】水溶解性が高く、供給性の良いＳＭＡ化合物を用いて、蛋白質を多量に固定化でき、非特異吸着が少ないバイオセンサーを提供すること。【解決手段】  １ｍＭの濃度において２５℃の水に溶解する下記式（１）で表される化合物を介して、生理活性物質を結合できる反応性基を有する親水性高分子が固定化されている基板からなるバイオセンサー。Ｘ−Ｌ−Ｙ          （１）（式中、Ｘは金属に結合することができる基を示し、Ｌは連結基を示し、Ｙは親水性高分子を結合するための官能基を示す。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１ｍＭの濃度において２５℃の水に溶解する下記式（１）で表される化合物を介して、生理活性物質を結合できる反応性基を有する親水性高分子が固定化されている基板からなるバイオセンサー。
Ｘ−Ｌ−Ｙ          （１）
（式中、Ｘは金属に結合することができる基を示し、Ｌは連結基を示し、Ｙは親水性高分子を結合するための官能基を示す。）
【請求項２】
下記式（１）で表される化合物を介して、生理活性物質を結合できる反応性基を有する親水性高分子が固定化されている基板からなるバイオセンサー。
Ｘ−Ｌ1−Ｙ          （１）
（式中、Ｘは金属に結合することができる基を示し、Ｌ1は、ヘテロ原子で中断されていてもよい炭素数２から１０の直鎖アルキレン基を示し、Ｙは親水性高分子を結合するための官能基を示す。）
【請求項３】
Ｘが、非対称又は対称スルフィド基、スルフィド基、ジセレニド基、セレニド基、チオール基、ニトリル基、イソニトリル基、ニトロ基、セレノール基、３価リン化合物、イソチオシアネート基、キサンテート基、チオカルバメート基、ホスフィン基、チオ酸基またはジチオ酸基である、請求項１又は２に記載のバイオセンサー。
【請求項４】
Ｙが、カルボキシ基、ヒドロキシル基、アミノ基、アルデヒド基、ヒドラジド基、カルボニル基、エポキシ基、又はビニル基である、請求項１から３の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項５】
Ｘがチオール基で、Ｙがアミノ基である、請求項１から４の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項６】
親水性高分子中の生理活性物質を結合できる反応性基が、活性カルボン酸エステル基である、請求項１から５の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項７】
基板表面が、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールとの混合物で被覆され、アミノ基を有するアルカンチオールを介して、生理活性物質を結合できる反応性基を有する親水性高分子が固定化されている、請求項１から６の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項８】
親水性基を有するアルカンチオールの該親水性基が、水酸基あるいはオリゴエチレングルコール基である、請求項７に記載のバイオセンサー。
【請求項９】
アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールとの混合物中のモル比が１／１〜１／１，０００，０００の範囲である、請求項７又は８に記載のバイオセンサー。
【請求項１０】
親水性高分子が多糖類である、請求項１から９の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項１１】
基板が金属表面または金属膜である、請求項１から１０の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項１２】
金属が金、銀、銅、白金またはアルミニウムのいずれかである、請求項１から１１の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項１３】
プラスチック支持体の上に基板が設置されている、請求項１から１２の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項１４】
表面プラズモン共鳴分析に使用される、請求項１から１３の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項１５】
１ｍＭ濃度で２５℃の水に溶解する下記式（１）で表される化合物で被覆されている基板に、生理活性物質を結合できる反応性基を有する親水性高分子を接触させることによって、式（１）で表される化合物に親水性高分子を結合する工程を含む、請求項１に記載のバイオセンサーの製造方法。
Ｘ−Ｌ−Ｙ          （１）
（式中、Ｘは金属に結合することができる基を示し、Ｌは連結基を示し、Ｙは親水性高分子を結合するための官能基を示す。）
【請求項１６】
下記式（１）で表される化合物で被覆されている基板に、生理活性物質を結合できる反応性基を有する親水性高分子を接触させることによって、式（１）で表される化合物に親水性高分子を結合する工程を含む、請求項２に記載のバイオセンサーの製造方法。
Ｘ−Ｌ1−Ｙ          （１）
（式中、Ｘは金属に結合することができる基を示し、Ｌ1は、ヘテロ原子で中断されていてもよい炭素数２から１０の直鎖アルキレン基を示し、Ｙは親水性高分子を結合するための官能基を示す。）
【請求項１７】
基板が、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールとの混合物で被覆されていて、アミノ基を有するアルカンチオールに親水性高分子を結合させる、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
親水性基を有するアルカンチオールの該親水性基が、水酸基あるいはオリゴエチレングルコール基である、請求項１５から１７の何れかに記載の方法。
【請求項１９】
アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールとの混合物中のモル比が１／１〜１／１，０００，０００の範囲である、請求項１５から１８の何れかに記載の方法。
【請求項２０】
生理活性物質を結合できる反応性基を有する親水性高分子を、基板上に薄膜を形成させた状態で、式（１）で表される化合物と反応させる、請求項１５から１９の何れかに記載の方法。
【請求項２１】
スピンコート法またはスプレーコート法により、基板上に薄膜を形成させる、請求項１５から２０の何れかに記載の方法。
【請求項２２】
請求項１５から２１の何れかに記載の方法により製造される、バイオセンサー。
【請求項２３】
請求項１から１４又は２２の何れかに記載のバイオセンサーと生理活性物質とを接触させて、該バイオセンサーに該生理活性物質を結合させる工程を含む、バイオセサンーに生理活性物質を固定化する方法。
【請求項２４】
生理活性物質が共有結合により表面に結合している請求項１から１４又は２２の何れかに記載のバイオセンサーと被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法。
【請求項２５】
生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサー、その製造方法、及び該バイオセンサーを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に関する。特に本発明は、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに用いるためのバイオセンサー、その製造方法。及び該バイオセンサーを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。
【０００３】
上記した技術においては、いずれの場合も、生理活性物質を固定化する表面が重要である。以下、当技術分野で最も使われている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を例として、説明する。
【０００４】
一般に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。
【０００５】
生理活性物質を固定化可能な官能基を有する検出表面としては、例えば特許文献１に、自己組織化膜を形成する化合物（ＳＡＭ化合物）を介してヒドロゲルマトリクスを結合させた表面が記載されている。具体的には、16-メルカプトヘキサデカノールの層が金膜に結合することでバリアー層を形成する。この金膜上でバリアー層のヒドロキシル基はエピクロロヒドリンで処理することによりエポキシ活性化される。次の段階で、デキストランをエーテル結合を介してバリアー層に付着させる。次にデキストランマトリックスに対してブロモ酢酸を反応させることで、カルボキシメチル基を導入する。
【０００６】
しかしながら、特許文献１に記載されている炭素鎖の炭素数が１０を超えるＳＡＭ化合物を用いてセンサーを量産化するためには、（１）ＳＡＭ化合物が水に不溶解のため、成膜に多量の溶剤を使用する必要があり、地球環境負荷が増大し、また生産人員の健康への影響が懸念される、（２）原料が流通していないため多段階の合成ステップを踏んで合成する必要があり、供給性に難があり、またコストが高い、並びに、（３）センサー基板がプラスチックである場合は、そのプラスチックの変性を助長する、という問題があった。
【０００７】
【特許文献１】特許第２８１５１２０号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は上記した従来技術の問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち本発明は、水溶解性が高く、供給性の良いＳＭＡ化合物を用いて、蛋白質を多量に固定化でき、非特異吸着が少ないバイオセンサーを提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、水溶解性が高く、供給性の良いＳＭＡ化合物を介してヒドロゲルを結合させることにより、蛋白質を多量に固定化でき、非特異吸着が少ないバイオセンサーを製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明によれば、１ｍＭの濃度において２５℃の水に溶解する下記式（１）で表される化合物を介して、生理活性物質を結合できる反応性基を有する親水性高分子が固定化されている基板からなるバイオセンサーが提供される。
Ｘ−Ｌ−Ｙ          （１）
（式中、Ｘは金属に結合することができる基を示し、Ｌは連結基を示し、Ｙは親水性高分子を結合するための官能基を示す。）
【００１１】
本発明の別の側面によれば、下記式（１）で表される化合物を介して、生理活性物質を結合できる反応性基を有する親水性高分子が固定化されている基板からなるバイオセンサーが提供される。
Ｘ−Ｌ1−Ｙ          （１）
（式中、Ｘは金属に結合することができる基を示し、Ｌ1は、ヘテロ原子で中断されていてもよい炭素数２から１０の直鎖アルキレン基を示し、Ｙは親水性高分子を結合するための官能基を示す。）
【００１２】
好ましくは、Ｘは、非対称又は対称スルフィド基、スルフィド基、ジセレニド基、セレニド基、チオール基、ニトリル基、イソニトリル基、ニトロ基、セレノール基、３価リン化合物、イソチオシアネート基、キサンテート基、チオカルバメート基、ホスフィン基、チオ酸基またはジチオ酸基である。
【００１３】
好ましくは、Ｙは、カルボキシ基、ヒドロキシル基、アミノ基、アルデヒド基、ヒドラジド基、カルボニル基、エポキシ基、又はビニル基である。
好ましくは、Ｘはチオール基で、Ｙはアミノ基である。
【００１４】
好ましくは、親水性高分子中の生理活性物質を結合できる反応性基は、活性カルボン酸エステル基である。
好ましくは、基板表面は、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールとの混合物で被覆され、アミノ基を有するアルカンチオールを介して、生理活性物質を結合できる反応性基を有する親水性高分子が固定化されている。
【００１５】
好ましくは、親水性基を有するアルカンチオールの該親水性基は、水酸基あるいはオリゴエチレングルコール基である。
好ましくは、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールとの混合物中のモル比は１／１〜１／１，０００，０００の範囲である。
好ましくは、親水性高分子は多糖類である。
【００１６】
好ましくは、基板は金属表面または金属膜である。
好ましくは、金属が金、銀、銅、白金またはアルミニウムのいずれかである。
好ましくは、プラスチック支持体の上に基板が設置されている。
【００１７】
好ましくは、本発明のバイオセンサーは、非電気化学的方法に使用され、より好ましくは表面プラズモン共鳴分析に使用される。
【００１８】
本発明のさらに別の側面によれば、１ｍＭ濃度で２５℃の水に溶解する下記式（１）で表される化合物で被覆されている基板に、生理活性物質を結合できる反応性基を有する親水性高分子を接触させることによって、式（１）で表される化合物に親水性高分子を結合する工程を含む、本発明のバイオセンサーの製造方法が提供される。
Ｘ−Ｌ−Ｙ          （１）
（式中、Ｘは金属に結合することができる基を示し、Ｌは連結基を示し、Ｙは親水性高分子を結合するための官能基を示す。）
【００１９】
本発明のさらに別の側面によれば、下記式（１）で表される化合物で被覆されている基板に、生理活性物質を結合できる反応性基を有する親水性高分子を接触させることによって、式（１）で表される化合物に親水性高分子を結合する工程を含む、本発明のバイオセンサーの製造方法が提供される。
Ｘ−Ｌ1−Ｙ          （１）
（式中、Ｘは金属に結合することができる基を示し、Ｌ1は、ヘテロ原子で中断されていてもよい炭素数２から１０の直鎖アルキレン基を示し、Ｙは親水性高分子を結合するための官能基を示す。）
【００２０】
好ましくは、基板は、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールとの混合物で被覆されていて、アミノ基を有するアルカンチオールに親水性高分子を結合させる。
好ましくは、親水性基を有するアルカンチオールの該親水性基は、水酸基あるいはオリゴエチレングルコール基である。
好ましくは、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールとの混合物中のモル比は１／１〜１／１，０００，０００の範囲である。
【００２１】
好ましくは、生理活性物質を結合できる反応性基を有する親水性高分子を、基板上に薄膜を形成させた状態で、式（１）で表される化合物と反応させる。
好ましくは、スピンコート法またはスプレーコート法により、基板上に薄膜を形成させる。
【００２２】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の方法により製造される、バイオセンサーが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のバイオセンサーと生理活性物質とを接触させて、該バイオセンサーに該生理活性物質を結合させる工程を含む、バイオセサンーに生理活性物質を固定化する方法が提供される。
【００２３】
本発明のさらに別の側面によれば、生理活性物質が共有結合により表面に結合している上記した本発明のバイオセンサーと被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法が提供される。
好ましくは、生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定し、さらに好ましくは表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明では、水に溶解しやすいＳＡＭ化合物を用いることにより、溶剤の使用量を削減することができ、地球環境負荷が低減され、また生産環境も改善される。また、溶剤の使用量が少ないので、センサー基板がプラスチックである場合でもそのプラスチックの変性を助長するという問題がなく、これにより表面共鳴プラズモン測定中のノイズを抑制することができる。さらに、水に溶解しやすい炭素鎖の短いＳＡＭ化合物は、入手が容易で、かつ安価に入手することができる。本発明のバイオセンサーは、蛋白質を多量に固定化でき、かつ非特異吸着が少ない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。
【００２６】
本発明のバイオセンサーでは、金属表面又は金属膜を基板として用いることができる。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００２７】
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上１０ｎｍ以下であるのが好ましい。
【００２８】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００２９】
金属膜は好ましくは支持体上に配置されている。ここで、「支持体上に配置される」とは、金属膜が支持体上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が支持体に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる支持体としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂（プラスチック支持体）、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００３０】
本発明においては、１ｍＭの濃度において２５℃の水に溶解する下記式（１）で表される化合物を介して、生理活性物質を結合できる反応性基を有する親水性高分子が基板に固定化されている。
Ｘ−Ｌ−Ｙ          （１）
（式中、Ｘは金属に結合することができる基を示し、Ｌは連結基を示し、Ｙは親水性高分子を結合するための官能基を示す。）
【００３１】
また本発明では、下記式（１）で表される化合物を介して、生理活性物質を結合できる反応性基を有する親水性高分子を基板に固定化されていてもよい。
Ｘ−Ｌ1−Ｙ          （１）
（式中、Ｘは金属に結合することができる基を示し、Ｌ1は、ヘテロ原子で中断されていてもよい炭素数２から１０の直鎖アルキレン基を示し、Ｙは親水性高分子を結合するための官能基を示す。）
【００３２】
式（１）の化合物の水への溶解性は、２５℃において、０．１ｍＭで溶解するものが好ましく、１．０ｍＭで溶解するものが最も好ましい。本発明において、溶解の度合いは透過光濁度法によって定義する。光路長10mmの測定セルにて、水でベースラインをとり、化合物溶液の660nmの吸光度を測定する。化合物溶液の吸光度（660nm）が0.005以下であるときに、化合物が溶解した、と定義する。
【００３３】
式（１）の化合物を溶解する溶媒は水が好ましいが、水にエタノール、メタノール、ブチルアルコールなどの有機溶剤を混合してもよい。有機溶剤の混合比率は、５０％以下であることが好ましく、２０％以下であることがより好ましく、５％以下であることがさらに好ましい。水単独で溶解することが最も好ましい。混合する有機溶剤は、水混和性を有することが好ましく、具体的にはアルコール類が好ましく、エタノールが最も好ましい。
【００３４】
式（１）において、Ｘは金属に結合することができる基である。具体的には、非対称又は対称スルフィド（-SSR'Ｙ"、-SSRY）、スルフィド（-SR'Ｙ"、-SRY）、ジセレニド（-SeSeR'Ｙ"、-SeSeRY）、セレニド（SeR'Ｙ"、-SeRY）、チオール（-SH）、ニトリル（-CN）、イソニトリル、ニトロ（-NO2）、セレノール（-SeH）、３価リン化合物、イソチオシアネート、キサンテート、チオカルバメート、ホスフィン、チオ酸またはジチオ酸（-COSH、-CSSH）が好ましく用いられる。
【００３５】
式（１）において、Ｌ（並びに、ＲとＲ’）は連結基であり、好ましくは、場合によりヘテロ原子により中断されていてもよい、密な詰め込みのための直鎖（枝分かれしていない）であり、場合により二重及び／又は三重結合を含んでいてもよい炭化水素鎖である。鎖の長さは通常、２炭素原子以上であり、１０炭素原子以下であることが好ましく、９炭素原子以下がさらに好ましい。炭化水素鎖の炭素数は、４〜１０炭素原子がさらに好ましく、４〜８炭素原子が特に好ましい。炭素鎖は場合により過弗素化されることができる。
【００３６】
ＹとＹ”は、親水性高分子を結合させるための基である。ＹとＹ”は好ましくは同一であり、親水性高分子（例えば、ヒドロゲルなど）に直接又は活性化後結合できるような性質を持つ。具体的にはカルボキシル、ヒドロキシル、アミノ、アルデヒド、ヒドラジド、カルボニル、エポキシ、又はビニル基などを用いることができる。
【００３７】
密に詰め込まれた単層の形態にあるＸ−Ｌ−Ｙで表される化合物は、Ｘで表される基が金属に結合することにより、金属表面に付着することができる。
【００３８】
本明細書で言う自己組織化膜（ＳＡＭ）とは、外からの細かい制御を加えていない状態で、膜材料そのものがもつ機構によって形成される一定の秩序をもつ組織をもった単分子膜やＬＢ膜などの超薄膜のことを言う。この自己組織化により、非平衡な状況で長距離にわたって秩序がある構造やパターンが形成される。
【００３９】
例えば、自己組織化膜は、上記したような式（１）で表される化合物により形成することができる。含硫黄化合物によって金表面に自己組織化膜を形成することは、例えば、Nuzzo RG等（1983年）、J Am Chem Soc、105巻、4481〜4483頁、Porter MD等（1987年）、J Am Chem Soc、109巻、3559〜3568頁、Troughton EB等（1988年）、Langmuir、４巻、365〜385頁などに記載されている。
【００４０】
式（１）で表される化合物の合成については、例えば、Current Organic Chemistry, 2004, 8, 1763-1797、Applications, Properties and Synthesis of ω-Functionalized N-Alkanethiols and Disulfides - the Building Blocks of Self-Assembled Monolayers
著者：  Dariusz Witt他の10頁のScheme1に記載されている原料からの合成ルートに従って行うことができる。
【００４１】
また、自己組織化膜（ＳＡＭ）を用いた金属膜の被覆法は、ハーバード大のWhitesides教授らにより精力的に展開されており、その詳細は例えばChemical Review, 105, 1103-1169 (2005)に報告されている。金属として金を用いた場合、下記式１に示すアルカンチオール誘導体（式中、ｎは２から１０の整数を示す）を用いることにより、Au-S結合とアルキル鎖同士のvan der Waals力に基づき、配向性を持つ単分子膜が自己組織的に形成される。自己組織化膜は、アルカンチオール誘導体の溶液中に金基板を浸漬するという極めて簡便な手法で作成される。下記式１においてX=NH2である化合物を用いて自己組織化膜を形成させることで、アミノ基を有する有機層で金表面を被覆することが可能となる。
【００４２】
【化１】
2007256268.tif 000002
【００４３】
末端にアミノ基を有するアルカンチオールは、アルキル鎖を介してチオール基とアミノ基が連結している化合物（一般式１−１）（一般式１−１において、ｎは３から２０の整数を示す）でもよく、末端にカルボキシル基を有するアルカンチオール（一般式１−２、１−３）（一般式１−２においてｎは３から２０の整数を示し、一般式４においてｎはそれぞれ独立に１から２０の整数を示す）と大過剰のヒドラジドまたはジアミンを反応させた化合物でもよい。末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールと大過剰のヒドラジドまたはジアミンとの反応は、溶液状態で行ってもよく、また、末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールを基板表面に結合した後、大過剰のヒドラジドまたはジアミンを反応させてもよい。
【００４４】
【化２】
2007256268.tif 000003
【００４５】
１−１〜１−３のアルキル基の繰返し数は、3以上20以下が好ましく、さらに3以上16以下が好ましく、4以上8以下が最も好ましい。アルキル鎖が短いと自己組織化膜を形成しにくく、アルキル鎖が長いと水溶性が低下し、ハンドリングが困難になる。
【００４６】
本発明に用いるジアミンとしては、任意の化合物を用いることが可能であるが、バイオセンサー表面に用いる場合、水溶性ジアミンが好ましい。水溶性ジアミンとしては具体的に、エチレンジアミン、テトラエチレンジアミン、オクタメチレンジアミン、デカメチレンジアミン、ピペラジン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、ジヘキサメチレントリアミン、１．４−ジアミノシクロヘキサン等の脂肪族ジアミン、パラフェニレンジアミン、メタフェニレンジアミン、パラキシリレンジアミン、メタキシリレンジアミン、４，４‘−ジアモノビフェニル、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、４，４’−ジアミノジフェニルケトン、４，４‘−ジアミノジフェニルスルホン酸等の芳香族ジアミンが挙げられる。バイオセンサー表面の親水性を向上させるという観点から、２つのアミノ基をエチレングリコールユニットで連結した化合物（一般式１−４）を用いることも可能である。本発明に用いるジアミンとしては、好ましくはエチレンジアミンまたは一般式１−４（一般式１−４において、ｎ及びｍは、それぞれ独立に１から２０の整数を示す）で表される化合物であり、より好ましくは、エチレンジアミンまたは1,2-ビス(アミノエトキシ)エタン（一般式１−４において、n=2,m=1）である。
【００４７】
【化３】
2007256268.tif 000004
【００４８】
アミノ基を有するアルカンチオールは、単独で自己組織化膜を形成することも可能であり、また、他のアルカンチオールと混合して自己組織化膜を形成することも可能である。バイオセンサー表面に用いる場合、他のアルカンチオールとしては、生理活性物質の非特異吸着を抑制可能な化合物を用いることが好ましい。生理活性物質の非特異吸着を抑制可能な自己組織化膜に関しては、前述のWhitesides教授らにより詳細に検討されており、親水性基を有するアルカンチオールから形成された自己組織化膜が非特異吸着抑制に有効であることが報告されている（Langmuir,17,2841-2850, 5605-5620, 6336-6343 (2001)）。本発明において、アミノ基を有するアルカンチオールと混合単分子膜を形成するアルカンチオールは、前記論文に記載された化合物を好ましく用いることが可能である。非特異吸着抑制能に優れ、入手が容易であることから、アミノ基を有するアルカンチオールと混合単分子膜を形成するアルカンチオールとしては、水酸基を有するアルカンチオール（一般式１−５）あるいはエチレングルコールユニットを有するアルカンチオール（一般式１−６）（一般式１−５において、ｎは３から２０の整数を示し、一般式１−６において、ｎ及びｍは、それぞれ独立に１から２０の整数を示す）を用いることが好ましい。
【００４９】
【化４】
2007256268.tif 000005
【００５０】
アミノ基を有するアルカンチオールを他のアルカンチオールと混合して自己組織化膜を形成する場合、１−１〜１−３のアルキル基の繰返し数は、4以上20以下が好ましく、さらに4以上16以下が好ましく、4以上10以下が最も好ましい。また、１-５,１-６のアルキル基の繰返し数は、3以上16以下が好ましく、さらに5以上12以下が好ましく、5以上10以下が最も好ましい。
【００５１】
本発明において、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールは、任意の割合で混合することが可能であるが、アミノ基を有するアルカンチオールの割合が少ない場合には活性化されたカルボキシル基含有高分子（カルボキシル基含有ポリマー）の結合量が低下し、親水性基を有するアルカンチオールの割合が少ない場合には非特異吸着抑制能が減少する。それゆえ、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールの混合比は、１／１〜１／１，０００，０００の範囲であることが好ましく、１／４〜１／１０，０００の範囲であることがより好ましく、１／１０〜１／１，０００の範囲であることがさらに好ましい。活性化されたカルボキシル基を含有するポリマーと反応する場合の立体障害低減の観点から、アミノ基を有するアルカンチオールの分子長は、親水性基を有するアルカンチオールの分子長よりも長いことが好ましい。
【００５２】
本発明で用いるアルカンチオールは、Northwestern大学のGrzybowski教授らによる総説（Curr. Org. Chem., 8, 1763-1797(2004).）およびその引用文献に基づいて合成された化合物を用いても良く、また市販の化合物を用いてもよい。これらの化合物は、同仁化学（株）、Aldrich社、SensoPath Technologies社、Frontier Scientific Inc.社等から購入可能である。本発明においてアルカンチオールの酸化生成物であるジスルフィド化合物は、アルカンチオールと同様に用いることが可能である。
【００５３】
次に、本発明で用いる生理活性物質を結合できる反応性基を有する親水性高分子を説明する。本発明で用いる親水性高分子としては、ハロゲン化銀写真用の高分子硬膜剤、アセトアセチル基を有する親水性高分子、活性エステル化されたカルボキシル基含有ポリマーを好ましく用いることができる。以下、本発明で用いることができる高分子硬膜剤、アセトアセチル基を有する親水性高分子、および活性エステル化されたカルボキシル基含有ポリマーについて説明する。
【００５４】
高分子硬膜剤とは、ゼラチン等の親水性コロイドと結合反応する反応性官能基を分子内に複数有している高分子化合物であり、特開昭５６−６６８４１号公報、英国特許１，３２２，９７１号公報、米国特許３，６７１，２５６号公報，特開平７−６４２２６号公報，特開平７−１４０５９６号公報， 特開平１０−１１１５４５号公報， 特開２０００−６２６２９号公報，特開２００４−２０９１９号公報等の特許文献、及びジェームズ著ザ・セオリー・オブ・ザ・フォトグラフィック・プロセス（Ｊａｍｅｓ， Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ）第４版、８４頁（１９７７、マクミラン社）、キャンプベル他著ポリメリック・アミン・アンド・アンモニウム・ソルツ（Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｔａｌ；Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ａｍｉｎｅ ａｎｄ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓａｌｔｓ）３２１〜３３２頁（１９７９、パーガモンプレス社）などの成書に記載されている。
【００５５】
本発明に用いられる高分子硬膜剤は、バイオセンサー表面の官能基（即ち、式（１）中のＹで表される基）と結合可能な反応性官能基を有する高分子化合物であり、好ましくは下記の式（１）〜式（９）で表される反応性官能基を有する高分子化合物である。
式（１）：  −ＳＯ2ＣＨ＝ＣＨ2
式（２）：  −ＳＯ2ＣＨ2ＣＨ2Ｘ
式（２）中、Ｘは、式（２）で表される官能基が求核試薬あるいは塩基と反応する際、置換反応あるいは脱離反応によって離脱する基（例えば、−Ｃｌ、−ＯＳＯ2ＣＨ3、−ＯＳＯ2Ｃ6Ｈ4ＣＨ3、−ＯＣＯＣＨ3、−ＯＳＯ3- 、ピリジニウム等）である。
式（３）
【００５６】
【化５】
2007256268.tif 000006
【００５７】
式（３）中、Ｘは単結合、−Ｏ−、−ＮＲ−を表し、Ｒは水素原子、アルキル基、アラルキル基を表す。Ｙ、Ｚはハロゲン原子（例えば塩素原子、臭素原子）、アルコキシ基（例えばメトキシ）、水酸基及びその塩、置換されていてもよいアミノ基を表し、Ｙ，Ｚの少なくとも１つはハロゲン原子である。
【００５８】
式（４）：  −ＣＨＯ
式（５）：
【００５９】
【化６】
2007256268.tif 000007
【００６０】
式（６）：  −ＮＣＯ
式（７）：  −ＮＨＣＯＮＨＣＯＣＨ＝ＣＨ2
式（８）：  −ＮＨＣＯＮＨＣＯＣＨ2ＣＨ2Ｘ
式中、Ｘは式（２）のＸと同義である。
式（９）：  −ＣＯＸ
式中、Ｘは、式（９）で表される官能基がアミノ基と反応した際に容易に脱離する基（例えば、
【００６１】
【化７】
2007256268.tif 000008
【００６２】
であり、式（９）は一般的に活性エステル基あるいは混合酸無水物として知られているものを表す。
【００６３】
本発明に用いられる高分子硬膜剤を製造するに当たり、重合方法については特に制約はないが、例えば縮重合法によって製造されていてもよく、またエチレン性不飽和結合を有する化合物を用いてラジカル重合、アニオン重合等の方法によって製造されていてもよい。さらには天然高分子（例えば、デンプン、デキストラン、ゼラチン等）に前記の反応性官能基を導入することによって製造されていてもよい。本発明に用いられる親水性コロイドと反応可能な官能基（上記式（１）〜式（９）で表される官能基、以後反応性官能基と称する）の導入方法についても特に制約はなく、反応性官能基を有するモノマーを用いて重合反応を行って重合体を製造してもよいし、予め重合体を製造した後にいわゆる高分子反応により、前記の反応性官能基を導入してもよい。さらには反応性官能基の前駆体を有するモノマー化合物を用いて重合反応を行い、その後に適切な方法によって反応性官能基を生成させる方法も有効である。
【００６４】
本発明に用いられる高分子硬膜剤は、前記の反応性官能基（またはその前駆体）とエチレン性不飽和結合を同一分子内に有するモノマーをラジカル重合することによって製造されてもよい。反応性官能基を持つモノマーとしては以下に示す化合物が代表的な例である。
【００６５】
【化８】
2007256268.tif 000009
【００６６】
【化９】
2007256268.tif 000010
【００６７】
【化１０】
2007256268.tif 000011
【００６８】
本発明に用いられる重合体は反応性官能基を持つモノマーの単独重合体であってもよく、また他の１種あるいは２種以上のモノマーとの共重合体であってもよい。共重合体の場合、反応性官能基を持つモノマーの割合は１質量％以上であり、５質量％以上が好ましい。ラジカル共重合をする場合、他のモノマーはラジカル重合が可能であれば特に制限はないが、以下のモノマーを具体例として挙げることができる。また、他のモノマーが反応可能な官能基を有する場合、前記式（１）〜（９）で表される官能基と共重合時に反応を起こさない範囲内で、適宜モノマーの組み合わせを選択することが好ましい。
【００６９】
アクリル酸、メタクリル酸およびそのエステル類：例えば、アクリル酸、メチルアクリレート、ブチルアクリレート、ベンジルアクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ＣＨ2＝ＣＨＣＯＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＲ（Ｒは、水素原子、アルキル基、ｎは１以上の整数）、メタクリル酸、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、ベンジルメタクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、２−メトキシエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、２−スルホエチルメタクリレート等、
エチレン性不飽和カルボン酸のアミド類：アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（もしくはその塩）等、
芳香族単量体：スチレン、ビニルトルエン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、ｐ−ビニル安息香酸、ビニルナフタレン等、
その他のビニル単量体：エチレン、プロピレン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、トリフロロエチレン、トリフロロクロロエチレン、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ビニルアルコール、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルアセトアミド、アクリロニトリル、メタクリロニトリル等。
【００７０】
以下に本発明に用いられる高分子硬膜剤の具体例を示すが、本発明ではこれらに限定されるものではない。それぞれの化合物の共重合比率は質量百分率比を表す。
【００７１】
Ｐ−１：Ｍ−１／２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ソーダ共重合体（１０／９０）
Ｐ−２：Ｍ−１／２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ソーダ共重合体（３０／７０）
Ｐ−３：Ｍ−１／２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ソーダ共重合体（５０／５０）
Ｐ−４：Ｍ−１／メチルメタクリレート共重合体（２０／８０）
Ｐ−５：Ｍ−２／アクリル酸ソーダ共重合体（３０／７０）
Ｐ−６：Ｍ−２／２−ヒドロキシエチルメタクリレート共重合体（２０／８０）
Ｐ−７：Ｍ−３／ブチルアクリレート共重合体（６０／４０）
Ｐ−８：Ｍ−４／２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ソーダ共重合体（３０／７０）
Ｐ−９：Ｍ−６／エチルアクリレート共重合体（６０／４０）
Ｐ−１０：Ｍ−７／Ｎ−ビニルピロリドン共重合体（２０／８０）
【００７２】
Ｐ−１１：Ｍ−７／ジアセトンアクリルアミド共重合体（１０／９０）
Ｐ−１２：Ｍ−１０／メタクリル酸ソーダ共重合体（１５／８５）
Ｐ−１３：Ｍ−１０／メチルアクリレート／メチルメタクリレート共重合体（２０／４０／４０）
Ｐ−１４：Ｍ−１２／エチルメタクリレート共重合体（３３／６７）
Ｐ−１５：Ｍ−１２／２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ソーダ共重合体（１５／８５）
Ｐ−１６：Ｍ−１３／メチルメタクリレート共重合体（３３／６７）
Ｐ−１７：Ｍ−１３／２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ソーダ共重合体（２０／８０）
Ｐ−１８：Ｍ−１３／Ｎ−アクリロイルモルホリン共重合体（２０／８０）
Ｐ−１９：Ｍ−１３／メトキシポリエチレングリコール（２３量体）モノメタクリレート共重合体（５０／５０）
Ｐ−２０：Ｍ−１８／Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド共重合体（５／９５）
【００７３】
Ｐ−２１：Ｍ−１８／ブチルメタクリレート共重合体（３０／７０）
Ｐ−２２：Ｍ−１８／スチレン／ブチルアクリレート共重合体（２０／３０／５０）
Ｐ−２３：Ｍ−１９／２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ソーダ共重合体（２０／８０）
Ｐ−２４：Ｍ−２３／メチルアクリレート共重合体（２０／８０）
Ｐ−２５：Ｍ−２４／エチルアクリレート／スチレン共重合体（２０／５０／３０）
Ｐ−２６：Ｍ−２６／アクリルアミド共重合体（２５／７５）
Ｐ−２７：Ｍ−２６／Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート共重合体（３０／７０）
【００７４】
【化１１】
2007256268.tif 000012
【００７５】
本発明に用いられる高分子硬膜剤の反応性官能基としては、好ましくは、活性オレフィン型高分子硬膜剤、ｓ−トリアジン型高分子硬膜剤、活性ハロゲン型高分子硬膜剤、アルデヒド型高分子硬膜剤、グリシジル型高分子硬膜剤等が用いられ、さらに好ましくは活性オレフィン型高分子硬膜剤あるいはその前駆体、ｓ−トリアジン型高分子硬膜剤、グリシジル型高分子硬膜剤が用いられ、ビニルスルホン型高分子硬膜剤あるいはその前駆体、ジクロロトリアジン型高分子硬膜剤が特に好ましい。
【００７６】
本発明において高分子硬膜剤は、バイオセンサー表面に固定化されヒドロゲルを形成することを目的とする。それゆえ、反応性官能基以外に親水性基を有することが望ましい。親水性基として具体的には、水酸基・エチレングリコール基がごときノニオン性基、スルホン酸基・カルボン酸・リン酸基がごときアニオン性基、４級アンモニウム基・ピリジニウム基がごときカチオン性基、ホスホリルコリン基がごとき両性イオン基が挙げられる。
【００７７】
本発明において、親水性基を有するモノマー単位として、以下のようなモノマーが挙げられる。
ノニオン性基を有するモノマー：２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、２−ヒドロキシ−３−クロロプロピルアクリレート、β−ヒドロキシエチル−β′−アクリロイルオキシエチルフタレート、１，４−ブチレングリコールモノアクリレート、ヒドロキシスチレン、アリルアルコール、メタアリルアルコール、イソプロペニルアルコール、１−ブテニルアルコール等。
【００７８】
アニオン性基を有するモノマー：ビニルスルホン酸、メタリルスルホン酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、スルホエチルメタクリレート、スチレンスルホン酸、アクリル酸、メタクリル酸、２−（ホスホノエチルオキシ）エチルメタクリレート等。
【００７９】
カチオン性基を有するモノマー：[２-(アクリロイルオキシ)エチル]トリメチルアンモニ
ウムクロリド、 [２−(メタクリロイルオキシ)エチル]トリメチルアンモニウムクロリド
等、
【００８０】
両性イオン基を有するモノマー： [２−(メタクリロイルオキシ)エチル] ジメチル−（３−スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド 、［２−（メタクリロイルオキシ）エチ
ル］ホスホリルコリン等。
【００８１】
高分子硬膜剤にカチオン性基あるいはアニオン性基を導入することにより、静電相互作用を用いて、反対電荷を有する生理活性物質を検出表面へと濃縮することが可能となる。例えば、等電点より高いｐＨの緩衝液に溶解されたタンパク質の場合、カチオン性基を有する高分子硬膜剤が結合したヒドロゲル表面に静電的に濃縮されるため、効率的に反応性官能基と結合させることが可能となる。一方、等電点より低いｐＨの緩衝液に溶解されたタンパク質の場合、アニオン性基を有する高分子硬膜剤が結合したヒドロゲル表面に静電的に濃縮されるため、効率的に反応性官能基と結合させることが可能となる。このような構造を有する化合物として具体的に、下記化合物が挙げることができる。また、特開昭54-65033号公報、特開昭56-142524号公報、特開昭60-61742号公報に記載の化合物もまた、好ましく用いることができる。
【００８２】
【化１２】
2007256268.tif 000013
【００８３】
次に、アセトアセチル基を有する親水性高分子について述べる。アセトアセチル基含有水溶性高分子は、複数のアルデヒド基、アミノ基、ヒドラジド基などを有する架橋剤と、室温で反応して硬化する性質がある。それゆえ、基材の一面にアセトアセチル基含有水溶性高分子を、他の基材の一面に架橋剤を塗付し、その両面を押付けることで、２つの基材を瞬間的に接着することが可能となる。また、アセトアセチル基含有水溶性高分子の水溶液に架橋剤を添加混合することにより、含水率が極めて大きく壊れにくいゲルを室温で容易に得ることが可能となる。このように、アセトアセチル基含有水溶性高分子は、水溶性接着剤として極めて優れた性質を有していることが、特開平5-112771、特開平5-156220、特開2002-285117等に開示されている。
【００８４】
アセトアセチル基含有水溶性高分子の製造法を説明する。アセトアセチル基含有水溶性高分子の代表的な化合物であるアセトアセチル化ポリビニルアルコールを製造するための方法としては、酢酸中にポリビニルアルコール系樹脂を分散させた状態でジケテンガスを添加する方法、ジメチルホルムアミド、ジオキサンなどの溶媒にポリビニルアルコール系樹脂を溶解させた状態でジケテンガスを添加する方法、ポリビニルアルコール粉末とジケテンガスを直接反応させる方法、ポリビニルアルコールとアセト酢酸エステルを溶液中で反応させエステル交換する方法、などが知られている。本発明におけるアセトアセチル化ポリビニルアルコールは、例えば特開2002-285117に記載されている手法で合成することが可能であり、また、市販されているアセトアセチル化ポリビニルアルコール、たとえば日本合成化学工業(株)製ゴーセファイマーZ100、Z200、Z200H、Z210、Z320等を購入して用いることも可能である。
【００８５】
アセトアセチル基含有水溶性高分子は、アセトアセチル基含有モノマーを水溶性モノマーと共重合することによっても製造することができる。アセトアセチル基含有モノマーとしては、アセトアセトキシエチルアクリレート、アセトアセトキシエチルメタクリレート、アセトアセトキシエチルクロトナート、アセトアセトキシプロピルアクリレート、アセトアセトキシプロピルメタクリレート、アセトアセトキシプロピルクロトナート、２−シアノアセトアセトキシエチルメタクリレート、Ｎ−（２−アセトキシエチル）アクリルアミド、Ｎ−（２−アセトキシアミノエチル）メタクリルアミド、アセト酢酸アリル、アセト酢酸ビニルなどが挙げられる。これらのモノマーは、官能基含有エチレン系不飽和単量体とジケテンとの反応、該単量体にアセトアセトキシアルキルエステルをエステル交換反応等により製造される。本発明におけるアセトアセチル化水溶性高分子は、例えば特許2777732号に記載されている手法で合成することが可能である。
【００８６】
本発明において、アセトアセチル基含有水溶性高分子は、アセトアセチル基含有モノマー以外に、様々なモノマーとの共重合体を用いることが可能である。このような共重合モノマー単位として、以下のようなモノマーが挙げられる。
【００８７】
アクリル酸、メタクリル酸およびそのエステル類：例えば、アクリル酸、メチルアクリレート、ブチルアクリレート、ベンジルアクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ＣＨ2＝ＣＨＣＯＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＲ（Ｒは、水素原子、アルキル基、ｎは１以上の整数）、メタクリル酸、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、ベンジルメタクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、２−メトキシエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、２−スルホエチルメタクリレート等、
【００８８】
エチレン性不飽和カルボン酸のアミド類：アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（もしくはその塩）等、
【００８９】
芳香族単量体：スチレン、ビニルトルエン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、ｐ−ビニル安息香酸、ビニルナフタレン等、
【００９０】
その他のビニル単量体：エチレン、プロピレン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、トリフロロエチレン、トリフロロクロロエチレン、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ビニルアルコール、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルアセトアミド、アクリロニトリル、メタクリロニトリル等。
【００９１】
本発明においてアセトアセチル基含有親水性高分子は、バイオセンサー表面に固定化されヒドロゲルを形成することを目的とする。それゆえ、反応性官能基以外に親水性基を有することが望ましい。親水性基として具体的には、水酸基・エチレングリコール基がごときノニオン性基、スルホン酸基・カルボン酸・リン酸基がごときアニオン性基、４級アンモニウム基・ピリジニウム基がごときカチオン性基、ホスホリルコリン基がごとき両性イオン基が挙げられる。
【００９２】
本発明において、親水性基を有するモノマー単位として、以下のようなモノマーが挙げられる。
ノニオン性基を有するモノマー：２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、２−ヒドロキシ−３−クロロプロピルアクリレート、β−ヒドロキシエチル−β′−アクリロイルオキシエチルフタレート、１，４−ブチレングリコールモノアクリレート、ヒドロキシスチレン、アリルアルコール、メタアリルアルコール、イソプロペニルアルコール、１−ブテニルアルコール等。
【００９３】
アニオン性基を有するモノマー：ビニルスルホン酸、メタリルスルホン酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、スルホエチルメタクリレート、スチレンスルホン酸、アクリル酸、メタクリル酸、２−（ホスホノエチルオキシ）エチルメタクリレート等。
【００９４】
カチオン性基を有するモノマー：[２-(アクリロイルオキシ)エチル]トリメチルアンモニウムクロリド、 [２−(メタクリロイルオキシ)エチル]トリメチルアンモニウムクロリド等、
【００９５】
両性イオン基を有するモノマー： [２−(メタクリロイルオキシ)エチル] ジメチル−（３−スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド 、２−［（メタクリロイルオキシ）エチル］ホスホリルコリン等。
【００９６】
アセトアセチル基含有水溶性高分子にカチオン性基あるいはアニオン性基を導入することにより、静電相互作用を用いて、反対電荷を有する生理活性物質を検出表面へと濃縮することが可能となる。例えば、等電点より高いｐＨの緩衝液に溶解されたタンパク質の場合、カチオン性基を有するアセトアセチル基含有親水性高分子が結合したヒドロゲル表面に静電的に濃縮されるため、効率的に反応性官能基と結合させることが可能となる。一方、等電点より低いｐＨの緩衝液に溶解されたタンパク質の場合、アニオン性基を有するアセトアセチル基含有水溶性高分子が結合したヒドロゲル表面に静電的に濃縮されるため、効率的にアセトアセチル基あるいはアセトアセチル基をアミノ酸と反応させることにより導入されたカルボン酸と結合させることが可能となる。
【００９７】
次に、本発明で用いる活性エステル化されたカルボキシル基を含有するポリマーについて説明する。本発明で用いる活性エステル化されたカルボキシル基を含有するポリマーは、カルボキシル基を含有するポリマーの該カルボキシル基を活性エステル化することにより調製することができる。カルボキシル基を含有するポリマーとしては、カルボキシル基含有合成ポリマーおよびカルボキシル基含有多糖類を用いることが可能である。カルボキシル基含有合成ポリマーとしては、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、およびこれらの共重合体、例えば特開昭５９−４４６１５号、特公昭５４−３４３２７号、特公昭５８−１２５７７号、特公昭５４−２５９５７号、特開昭５９−５３８３６号、特開昭５９−７１０４８号明細書に記載されているようなメタクリル酸共重合体、アクリル酸共重合体、イタコン酸共重合体、クロトン酸共重合体、マレイン酸共重合体、部分エステル化マレイン酸共重合、水酸基を有するポリマーに酸無水物を付加させたものなどが挙げられる。カルボキシル基含有多糖類は、天然植物からの抽出物、微生物発酵の生産物、酵素による合成物、または化学合成物の何れであってもよく、具体的には、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、デルマタン酸硫酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、セロウロン酸、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルデンプン等が挙げられる。カルボキシル基含有多糖類は、市販の化合物を用いることが可能であり、具体的には、カルボキシメチルデキストランであるＣＭＤ、ＣＭＤ−Ｌ、ＣＭＤ−Ｄ４０（名糖産業社製）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（和光純薬社製）、アルギン酸ナトリウム（和光純薬社製）、等を挙げることができる。
【００９８】
カルボキシル基を含有するポリマーは、好ましくはカルボキシル基を含有する多糖類であり、より好ましくはカルボキシメチルデキストランである。
【００９９】
本発明に用いるカルボキシル基を含有するポリマーの分子量は特に制限されないが、平均分子量が１０００〜５００００００であることが好ましく、平均分子量が１００００〜２００００００であることがより好ましく、平均分子量が１０００００〜１００００００であることがさらに好ましい。この範囲より平均分子量が小さい場合には生理活性物質の固定量が小さくなってしまい、この範囲より平均分子量が大きい場合には高い溶液粘度のため取り扱いが困難となる。
【０１００】
本発明に使用する親水性高分子は、水溶液中の膜厚が１ｎｍ以上300ｎｍ以下であることが好ましい。膜厚が薄いと生理活性物質固定量が減少し、またセンサー表面の水和層が薄くなるため生理活性物質自身の変性で被検体物質との相互作用が検出しにくくなる。膜厚が厚いと被検体物質が膜内に拡散する障害となり、また特にセンサー基板の親水性高分子固定面の反対側から相互作用を検出する場合は検出表面から相互作用形成部までの距離が長くなり、検出感度が低くなる。水溶液中の親水性高分子膜厚はＡＦＭ、エリプソメトリーなどで評価することができる。
【０１０１】
カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法としては、公知の手法、例えば、水溶性カルボジイミドである1-(3-Dimethylaminopropyl)-3 ethylcarbodiimide（EDC）とN-Hydroxysuccinimide（NHS）により活性化する方法、EDC単独で活性化する方法、特願２００４−２３８３９６号（特開２００６−５８０７１号公報）に記載の方法（即ち、特定の構造を有するウロニウム塩、ホスホニウム塩、又はトリアジン誘導体のいずれかの化合物を用いてカルボキシル基を活性化する方法）、特願２００４−２７５０１２号（特開２００６−９０７８１号公報）に記載の方法（即ち、カルボジイミド誘導体又はその塩で活性化し、水酸基を有する含窒素ヘテロ芳香族化合物、電子吸引性基を有するフェノール誘導体又はチオール基を有する芳香族化合物のいずれかの化合物を用いてカルボキシル基を活性化する方法）等を好ましく用いることができる。これらの手法で活性化されたカルボキシル基を含有するポリマーを、アミノ基を有する基板と反応させることで、本発明のバイオセンサーを製造することが可能となる。
【０１０２】
本発明において、生理活性物質を結合できる反応性基を有する親水性高分子は、溶液として基板と反応させてもよく、また、スピンコート等の手法を用いて基板上の薄膜を形成させた状態で反応させてもよい。好ましくは、薄膜を形成させた状態での反応である。
【０１０３】
基板上に薄膜を形成させる方法は、公知の方法を用いることが可能であるが、具体的には、エクストルージョンコート法、カーテンコート法、キャスティング法、スクリーン印刷法、スピンコート法、スプレーコート法、スライドビードコート法、スリットアンドスピン方式、スリットコート方式、ダイコート法、ディップコート法、ナイフコート法、ブレードコート法、フローコート法、ロールコート法、ワイヤバーコート方式、転写印刷法、等を用いることが可能である。これらの薄膜形成法については、「コーティング技術の進歩」原崎勇次著、総合技術センター(1988)、「コーティング技術」技術情報協会(1999)、「水性コーティングの技術」シーエムシー(2001)、「進化する有機薄膜  成膜編」住べテクノリサーチ(2004)、「高分子表面加工学」岩森暁著、技報堂出版(2005)、等に説明されている。膜厚制御された塗布膜を簡便に作成可能であることから、本発明において基板上に薄膜を形成させる方法としては、スプレーコート法またはスピンコート法が好ましく、スピンコート法がさらに好ましい。
【０１０４】
スプレーコート法とは、微細化されたポリマー溶液を基板に吹きつけた状態で、基板を移動させることで、基板上にポリマー溶液を均一塗布する方法である。スプレーガンの引き金を引くと空気バルブとニードルバルブが同時に開き、ノズルからポリマー溶液が霧状に噴出し、ノズル先端にある空気キャップから噴出する空気で霧状のポリマー溶液がさらに微細化される。微細化されたポリマー溶液による塗布膜を基板表面に形成させた後、溶媒を蒸発させることで、膜厚の制御されたポリマーフイルムが容易に作成される。ポリマー溶液濃度、基板の移動速度等により、ポリマー薄膜の膜厚制御が可能となる。
【０１０５】
スピンコート法とは、水平に設置した基板上にポリマー溶液を滴下した後に高速回転させ、遠心力によって基板全体にポリマー溶液を均一塗布する方法である。遠心力によるポリマー溶液の飛散と溶媒の蒸発に伴い、膜厚の制御されたポリマーフイルムが容易に作成される。回転数、ポリマー溶液濃度、溶剤の蒸気圧等により、ポリマー薄膜の膜厚制御が可能となる。本発明においてスピンコート時の回転数は特に制限されないが、回転数が低すぎる場合には基板上に溶液が残存し、回転数が高すぎる場合には使用可能な装置が制限されてしまう。それゆえ本研究においてはスピンコート時の回転数は、500rpm〜10000rpmであることが好ましく、1000rpm〜7000rpmであることがさらに好ましい。
【０１０６】
本発明において、カルボキシル基を含有するポリマーは、公知の方法、例えば、水溶性カルボジイミドである1-(3-Dimethylaminopropyl)-3 ethylcarbodiimide（EDC）とN-Hydroxysuccinimide（NHS）により活性化され、アミノ基を有する生理活性物質を固定化することが可能となる。カルボン酸を活性化する手法としては、特願２００４−２３８３９６号に記載の方法（即ち、基板の表面に存在するカルボキシル基を特定の構造を有するウロニウム塩、ホスホニウム塩、又はトリアジン誘導体のいずれかの化合物を用いて活性化することによりカルボン酸アミド基を形成する方法）、並びに特願２００４−２７５０１２号に記載の方法（即ち、基板の表面に存在するカルボキシル基を、カルボジイミド誘導体又はその塩で活性化し、水酸基を有する含窒素ヘテロ芳香族化合物、電子吸引性基を有するフェノール誘導体又はチオール基を有する芳香族化合物のいずれかの化合物でエステルとした後に、アミンと反応させることによりカルボン酸アミド基を形成する方法）を好ましく用いることもできる。
【０１０７】
なお、上記した特願２００４−２３８３９６号における特定の構造を有するウロニウム塩、ホスホニウム塩、又はトリアジン誘導体とは、下記一般式１で表されるウロニウム塩、下記一般式２で表されるホスホニウム塩、又は下記一般式３で表されるトリアジン誘導体を示す。
【０１０８】
【化１３】
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【０１０９】
（一般式１において、Ｒ1とＲ2はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基を示すか、又は互いに一緒になって炭素数２から６のアルキレン基を形成してＮ原子と共に環を形成し、Ｒ3は炭素数６から２０の芳香環基又は少なくとも１以上のヘテロ原子を含むヘテロ環基を示し、Ｘ-はアニオンを示す。一般式２において、Ｒ4とＲ5はそれぞれ独立に炭素数１から６のアルキル基を示すか、又は互いに一緒になって炭素数２から６のアルキレン基を形成してＮ原子と共に環を形成し、Ｒ6は炭素数６から２０の芳香環基又は少なくとも１以上のヘテロ原子を含むヘテロ環基を示し、Ｘ-はアニオンを示す。一般式３において、Ｒ7はオニウム基を示し、Ｒ8及びＲ9はそれぞれ独立に電子供与基を示す。）
【０１１０】
親水性高分子が有する生理活性物質を結合できる反応性基としては、上記したようなカルボキシル基（又は活性エステル化されたカルボキシル基）以外のものとして、ハロゲン原子、アミノ基、もしくは保護基により保護されたアミノ基、もしくは脱離基を有するカルボニル基、水酸基、保護基により保護された水酸基、アルデヒド基、-ＮＨＮＨ2、-Ｎ=Ｃ=Ｏ、-Ｎ=Ｃ=Ｓ、エポキシ基、又はビニル基などでもよい。
【０１１１】
本発明において、生理活性物質の固定化基として、高分子（ポリマー）に導入する反応基は、カルボキシル基やアミノ基などの官能基の他に、例えば、ビオチン結合性タンパク（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等）、プロテインA、プロテインG、抗原、抗体（例えば、抗GST抗体等の公知のtag抗体）などの生理活性物質をあらかじめ固定し、この生理活性物質の上に、さらに下記に示すような生理活性物質を固定化する態様が可能である。また、ポリマーにアルカンを導入した固定化層を用いれば、脂質などの膜構造を有した生理活性物質を固定することが可能になる。また、用途に応じて、ポリマー鎖の長さ、ポリマーの厚み、ポリマーの密度、あるいは、ポリマーに導入する反応基の量を調整することにより、多様な蛋白に対応することが可能になる。またポリマーに固定基として、NTA（nitrilotriacetic acid）等などを導入すれば、金属キレートを介してHis-tagリガンド等を固定することができる。
【０１１２】
本発明のバイオセンサーに固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【０１１３】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。
【０１１４】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【０１１５】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
【０１１６】
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
【０１１７】
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
【０１１８】
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【０１１９】
これらの生理活性物質は、生理活性物質を含む溶液を親水性高分子が固定された基板上に塗布し、乾燥することによって固定化することが好ましい。
【０１２０】
生理活性物質を含む溶液（塗布液）の濃度は、基板表面に固定する生理活性物質の濃度が高い方が好ましい。生理活性物質により異なるが、０.１ｍｇ/ｍＬから１０ｍｇ/ｍＬで使用することが好ましく、さらに好ましくは１ｍｇ/ｍＬから１０ｍｇ/ｍＬである。
【０１２１】
生理活性物質を含む溶液の乾燥過程において、生理活性物質は塗布した溶液の外周部または、塗布液が乾固直前まで液が残った部分に析出する傾向がある。これにより基板表面に固定される生理活性物質の量に分布が発生し好ましくない。基板表面の生理活性物質固定量を均一にするため、塗布液の粘度は生理活性物質の基板表面への結合を阻害しない範囲で高くすることが好ましい。塗布液粘度を高くすることで、乾燥過程における塗布液中の生理活性物質の基板表面に対して水平方向の移動が抑えられ、結果として生理活性物質固定量のばらつきを抑えられる。乾燥過程における塗布液の粘度は０．９ｃＰ以上に保つことが好ましい。
【０１２２】
本発明の乾燥する工程とは、生理活性物質を含む溶液の塗布後、その溶液を、静置することによる自然乾燥や、加熱や送風などによって溶液が乾燥する速度を上げ、意図的に乾燥させる工程をいう。ここで、生理活性物質を含む溶液（塗布液）の乾燥速度を上げることは生理活性物質固定量のばらつきを抑えることに効果がある。乾燥速度を上げ、生理活性物質の水平方向の移動速度に対して、十分早く乾燥を終了させることで、生理活性物質が実質的に移動する前に乾燥が終了し、ばらつきを抑えることが可能となる。乾燥速度を上げる方法は特に限定されないが、塗布液温度、乾燥環境温度を上げる、赤外線、レーザーなどの照射で蒸発エネルギーを加える、送風などで乾燥時の溶媒蒸気圧を下げる、溶液を薄層塗布して塗布量に対する蒸発面積を大きくするなどの方法が挙げられる。特に、塗布液が水を含む場合、乾球温度と湿球温度差の大きい環境で乾燥させることで乾燥速度は早くなる。乾球温度と湿球温度との温度差が７℃以上の環境で乾燥させることが好ましく、さらに好ましくは１０℃以上、さらに好ましくは１３．５℃以上である。また、製造工程上、乾燥時間としては１０分以内が好ましく、より好ましくは５分以内、特に好ましくは１分以内である。
【０１２３】
生理活性物質を含む溶液を塗布する方法としては、特に塗布液を定量吐出するディスペンサーを使用する方法が挙げられる。ディスペンサーの吐出口を基板上で一定速度、一定間隔で動作させることで基板上の任意の場所に均一塗布することが可能である。ディスペンサーで塗布する場合、基板と吐出口の間隔を極力狭くし、塗布液厚みを薄くすることで生理活性物質の厚みを均一にすることができ、また乾燥速度を上げることができ、好ましい。また生理活性物質を含む溶液を塗布する好ましい方法として、スピンコートも挙げられる。この方法は、特に塗布膜厚を薄くする場合に好ましい。均一厚みの溶液を形成した後に乾燥させるため、スピンコーターは回転中の溶媒の蒸発を防ぐことが好ましい。このため、回転時に基板を密閉容器に入れておくなどの方法で、基板周辺の溶媒濃度が高い環境に保つことで、回転中の薄膜形成と薄膜形成後の乾燥速度を制御できるため、特に好ましい。これらの塗布工程後、温度・湿度を一定に保った条件下で乾燥させることが好ましい。
【０１２４】
生理活性物質と被検体物質との相互作用を検出する場合、センサー表面の生理活性物質の固定量の変動は相互作用の定量的、速度論的評価の誤差の原因となる。この誤差を最小限に抑える目的で、生理活性物質の固定量を均一にすることが好ましい。相互作用の検出に使用される基板表面の生理活性物質の固定量のばらつきがＣＶ値（変動係数）（標準偏差／平均値）で１５％以下が好ましく、さらに好ましくは１０％以下である。ＣＶ値は、基板表面の少なくとも２点以上、好ましくは１０点以上、さらに好ましくは１００点以上の固定量から算出することができる。均一性は、生理活性物質を固定する前後のセンサー基板上の物質の量を定量することでも評価可能であるが、生理活性物質と結合することが知られている物質を蛍光標識して、この標識物質をセンサー基板に固定した後に蛍光顕微鏡などを用いて蛍光強度を測定することでも可能である。また、ＳＰＲイメージャー、エリプソメーター、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ、ＡＴＲ−ＩＲ装置などで生理活性物質の定量も可能である。
【０１２５】
また、本発明において、基板上に固定化した生理活性物質の保存安定性を向上させる目的で、水素結合を形成しうる残基を有する化合物（以下、化合物Ｓとする）を使用してもよい。
【０１２６】
一般に蛋白質などの生理活性物質は水溶液中で水分子が配位することで三次元構造を維持しているが、乾燥されると三次元構造を保持できず失活する。また、基板表面の親水性高分子中に担持されている場合には、乾燥されることで生理活性物質同士が接近し凝集が発生する。本発明の水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは、水分子に代って生理活性物質の三次元構造を保持することで失活を抑制、または生理活性物質を被覆して立体効果で凝集を抑制する目的で使用することができる。
【０１２７】
本発明において水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは、水溶液で基板上の生理活性物質を固定した層に添加することが好ましい。添加方法としては、生理活性物質との混合溶液として基板表面に塗布しても良く、生理活性物質を基板表面に固定した後オーバーコートなどによりして添加しても良い。化合物Ｓと生理活性物質との混合溶液として塗布した場合、生理活性物質の固定量ばらつきを抑えることもできる。化合物Ｓ水溶液は薄膜状態で基板に添加することが好ましい。基板上に薄膜を形成させる方法は、公知の方法を用いることが可能であるが、具体的には、エクストルージョンコート法、カーテンコート法、キャスティング法、スクリーン印刷法、スピンコート法、スプレーコート法、スライドビードコート法、スリットアンドスピン方式、スリットコート方式、ダイコート法、ディップコート法、ナイフコート法、ブレードコート法、フローコート法、ロールコート法、ワイヤバーコート方式、転写印刷法、等を用いることが可能である。膜厚制御された塗布膜を簡便に作成可能であることから、本発明において基板上に薄膜を形成させる方法としては、スプレーコート法またはスピンコート法が好ましく、スピンコート法がさらに好ましい。
【０１２８】
化合物Ｓの塗布液濃度は塗布性、生理活性物質を含む層への浸透の問題がない範囲で特に限定されないが、０．１重量％以上５重量％以下であることが好ましい。また、塗布液は、塗布性、ｐＨ調整の観点で界面活性剤、緩衝剤、有機溶剤、塩などを添加してもよい。
【０１２９】
水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓとしては、常温常圧で不揮発性のものが好ましく、平均分子量が３５０より大きく５００万より小さいものが好ましく、さらに好ましくは１２００以上２００万以下であり、最も好ましくは１２００以上７万以下である。分子内に水酸基を含む化合物Ｓは糖類が好ましく、糖類は、単糖、多糖類でも良い。ｎ糖類の場合ｎが４以上１２００以下であることが好ましく、さらに好ましくはｎが２０以上６００以下である。
【０１３０】
化合物Ｓの平均分子量が低いと基板表面で結晶化して、生理活性物質を固定した親水性高分子層の破壊および生理活性物質の三次元構造の破壊の原因となり、反対に平均分子量が高いと生理活性物質の基板への固定の障害となったり、生理活性物質を含む層に含浸できない、層分離を発生するなどの問題が発生する。
【０１３１】
基板上に固定した生理活性物質の劣化を抑制する目的で、前記水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは、デキストラン骨格、又はポリエチレンオキシド骨格を有することが好ましく、本発明の目的を達成する範囲において、どの置換基を使用してもよい。また、基板上に固定した生理活性物質の劣化を抑制する目的で、解離性基を有しないノニオン性化合物であることが好ましい。また、前記水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは水分子との親和性の高い化合物が好ましく、水とｎ-オクタノールとの分配係数ＬｏｇＰ値が１以上であることが好ましい。ＬｏｇＰ値は、ＪＩＳ規格のＺ７２６０−１０７（２０００）「分配係数（1-オクタノール/水）の測定―振とう法」などに記載の方法で測定することができる。
【０１３２】
具体的な水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓとしては、ポリビニルアルコールなどの多価アルコール類、コラーゲン、ゼラチン、アルブミンなどのタンパク質、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、デンプン、セルロース、アルギン酸、デキストランなど多糖類、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド、プルロニックなどポリエチレンキシ-ポリプロピレンオキシド縮合物などのポリエーテル類、トゥイーン２０、トゥイーン４０、トゥイーン６０、トゥイーン８０などの２種以上の残基から成る化合物、またはこれら化合物の誘導体および重合体などが挙げられる。その内、多糖類、ポリエーテル類が好ましく、多糖類がより好ましい。具体的には、デキストラン、セルロース、トゥイーン２０、トゥイーン４０、トゥイーン６０、トゥイーン８０が好ましく用いられる。さらに、特開２００６−１７０８３２に記載の不揮発性モノマー、不揮発性水溶性オリゴマーを用いることもできる。例えば不揮発性モノマーとしては水酸基が保護基で保護されていてもよいテトロース、ペントース、ヘプトース、ヘキトース及びそのグリコキシドでも良く、メチルグルコシドや水酸基が保護基で保護されていてもよいサイクリトール類でもよい。また不揮発性水溶性オリゴマーが、式（１）、（２）または（３） -[CH2-CH(CONH2)-]n- （１） -[CH2-CH2-O-]n- （２） -[CH2-CH(OH)-]n- （３）（式（１）〜（３）中、ｎは１０〜２００のいずれかの整数を示す。）で表されるオリゴマー、水酸基が保護基で保護されていてもよいｎ糖（但し、２≦ｎ≦１０）のオリゴ糖を用いることもできる。さらに、US２００３／０１７５８２７、DE２０３０６４７６A1に記載の糖類、例えば、トレハロース、スクロース、マルトース、ラクトース、キシリトール、フルクトース、マニトール、グルコース、キシロール、マルトデキストラン、サッカロース、ポリビニルピロリドンなどを使用しても良い。また、これらの化合物Ｓは、本発明において使用している親水性高分子の基本骨格と実質同一であることが好ましい。ここで、基本骨格とは、例えば、糖の環構造のことをいい、官能基や長さが異なっていても、環構造が同一であれば、実質同一であるという。
【０１３３】
基板上の、水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓの含有量としては、平均分子量の比で、親水性高分子の平均分子量に対する前記化合物Ｓの平均分子量の割合が０．００５以上０．２以下であることが好ましい。割合がこれよりも低い場合は化合物Ｓが結晶化しやすく、高い場合は親水性高分子層への浸透が困難であり、この範囲内に設定することでこれらの問題を解消し、生理活性物質の失活抑制効果、凝集抑制効果をより高く得ることができる。
【０１３４】
上記のようにして生理活性物質を固定化したバイオセンサーは、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。
【０１３５】
本発明では、センサー用基板に固定化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。
【０１３６】
本発明の好ましい態様によれば、本発明のバイオセンサーは、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。
【０１３７】
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【０１３８】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【０１３９】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【０１４０】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【０１４１】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【０１４２】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【０１４３】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【０１４４】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【０１４５】
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
【０１４６】
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。
【０１４７】
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。
【０１４８】
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩgＧ抗体を特定物質として用いることができる。
【０１４９】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特開２００３−１０６９２６号参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。
【０１５０】
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。
【０１５１】
また、本発明のバイオセンサーは、例えば基板表面に導波路構造を保持した、屈折率変化を導波路を用いて検出するバイオセンサーとして用いることができる。この場合、基板表面の導波構造物は、回折格子と場合によっては付加層とを有している、この導波構造物は、薄い誘電層からなる平面的な導波体から成る。導波体に集光された光線は全反射によりこの薄い層内に導かれる。この導かれる光波（以降モードと呼ぶ）の伝播速度は、Ｃ／Ｎの値をとる。ここでＣは、真空中での光速であり、Ｎは導波体内を導かれるモードの有効屈折率である。有効屈折率Ｎは、一面では導波体の構成により、他面では薄い導波層に隣接する媒体の屈折率により決まる。光波の伝導は、薄い平面層内のみでなく、別の導波構造物、特にストリップ状の導波体によっても行われる。その場合は、導波構造物はストリップ状のフィルムの形状にされる。有効屈折率Ｎの変化は、導波層に隣接する媒体の変化と導波層自身もしくは導波層に隣接する付加層の屈折率および厚さの変化とにより生じることがバイオセンサーにとって重要な要素である。
【０１５２】
この方式のバイオセンサーの構成については、例えば特公平６−２７７０３号公報４ページ４８行目から１４ページ１５行目および第１図から第８図、米国特許第 6,829,073号のcolumn6の31行目からcolumn7の47行目および第9図A,Bに記載されている。
【０１５３】
例えば、一つの実施形態として、薄層が平面状の導波路層が基材（たとえばパイレックス（登録商標）・ガラス）上に設けられている構造がある。導波路層と基材とは、一緒にいわゆる導波体を形成する。導波路層は、たとえば酸化物層（ＳｉＯ２，ＳｎＯ２、Ｔａ２Ｏ５，ＴｉＯ２，ＴｉＯ２-ＳｉＯ２，ＨｆＯ２，ＺｒＯ２，Ａｌ２Ｏ３，Ｓｉ３Ｎ４，ＨｆＯＮ，ＳｉＯＮ，酸化スカンジウムまたはこれらの混合物）、プラスチック層（例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネートなど）、など多層の積層体が可能である。光線が全反射により導波路層内を伝播するには、導波路層の屈折率が隣接媒体（たとえば基材や後述の付加層）の屈折率より大でなければならない。基材もしくは測定物質に向いた導波路層表面もしくは導波路層体積内には、回折格子が配置されている。回折格子は、型押し、ホログラフィまたはその他の方法によって基板内に形成することができる。次いでより高い屈折率を有する薄い導波路膜を回折格子の上表面に被覆する。回折格子は導波路層への入射光線を集束したり、既に導波路層内を導かれているモードを放出したり、そのモードの一部を進行方向へ透過させ、一部を反射させたりする機能を持つ。導波路層は、格子域を付加層でカバーしておく。付加層は必要に応じて多層膜とすることができる。この付加層は、測定物質に含まれている物質の選択的検知を可能にする機能を持たせることができる。好ましい態様として付加層の最表面に、検知機能を持つ層を設けることができる。このような検知機能を持つ層として、生理活性物質を固定化し得る層を用いることができる。
【０１５４】
別の実施形態として、回折格子導波路のアレイがマイクロプレートのウェル内に組み込まれる形態も可能である（特表2007-501432）。すなわち回折格子導波路がマイクロプレートのウェル底面にアレイ状に配列されていれば、スループットの高い薬物または化学物質のスクリーニングを可能にすることができる。
【０１５５】
回折格子導波路は、回折格子導波路の上層（検知領域）上の生理活性物質検出を可能にするために、入射光線、および反射光を検出して屈折特性の変化を検出する。この目的のため、１つまたはそれより多くの光源（例えば、レーザ、ダイオード）及び１つまたはそれより多くの検出器（例えば、分光計、ＣＣＤカメラまたはその他の光検出器）を用いることができる。屈折率変化を測定するための方法として、２つの異なる動作モード−分光法、及び角度法がある。分光法においては、入射光として広帯域ビームが回折格子導波路に送られ、反射光が集められて、例えば分光計で測定される。共鳴波長（ピーク）のスペクトル位置を観測することにより、回折格子導波路の表面またはその近傍での屈折率変化すなわち結合を測定することができる。また、角度法においては、公称上単一波長の光がある範囲の照射角を生じるように集束されて、回折格子導波路内に向けられる。反射光がＣＣＤカメラまたはその他の光検出器によって測定される。回折格子導波路によって反射された共鳴角の位置を測定することにより、回折格子導波路の表面またはその近傍での屈折率変化すなわち結合を測定することができる。
【０１５６】
本発明のバイオセンサーを表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、上記したような各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。
【０１５７】
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１５８】
実施例１
下記のＳＡＭ化合物について、表１に示す濃度になるように水と混合し、25℃で１日静置後に観察した。目視で析出、沈殿が生じているものを×、白濁が生じているものを△、無色透明なものを○とした。結果を表１に示す。
16-Hydroxy-1-hexadecanethiol（16-ヒドロキシ-1-ヘキサデカンチオール）（Frontier Scientific社製）
11-Hydroxy-1-undecanethiol（11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール）（Aldrich社製）
8-Hydroxy-1-octanethiol（8-ヒドロキシ-1-オクタンチオール）（Aldrich社製）
6-Hydroxy-1-hexanethiol（6-ヒドロキシ-1-ヘキサンチオール）（Aldrich社製）
11-Amino-1-undecanethiol, hydrochloride（11-アミノ-1-ウンデカンチオール塩酸塩）（同仁化学社製）
8-Amino-1-octanethiol, hydrochloride（8-アミノ-1-オクタンチオール塩酸塩）（同仁化学社製）
6-Amino-1-hexanethiol, hydrochloride（6-アミノ-1-ヘキサンチオール塩酸塩）（同仁化学社製）
【０１５９】
【表１】
2007256268.tif 000015
【０１６０】
8-Hydroxy-1-octanethiol、6-Hydroxy-1-hexanethiol、8-Amino-1-octanethiol, hydrochloride、6-Amino-1-hexanethiol, hydrochlorideは水溶解性が良好であることがわかる。一方、16-Hydroxy-1-hexadecanethiol、11-Hydroxy-1-undecanethiol、11-Amino-1-undecanethiol, hydrochlorideは水溶液系で金属膜状に自己組織化膜（SAM）を形成することができない。
【０１６１】
実施例２
水溶解性の高いSAM化合物を用いて蛋白を固定できるヒドロゲル膜を作成し、蛋白質の固定量、および非特異吸着性能を評価した。
【０１６２】
（１）基板の作成
6-Hydroxy-1-undecanethiol（Aldrich社製）と8-Amino-1-octanethiol, hydrochloride（同仁化学社製）の混合水溶液（6-Hydroxy-1-undecanethiol 4.995mM /8-Amino-1-octanethiol, hydrochloride 0.005mM）を作成した。この溶液をA液と呼ぶ。
【０１６３】
次に、ゼオネックス（日本ゼオン社製）を射出成型して得られたプラスチックプリズムの上面に以下の方法で金薄膜を製膜した。スパッタ装置の基板ホルダにプリズムを取付け、真空（ベースプレッシャー1×10-3Pa以下）に引いてからArガスを導入し（1Pa）、基板ホルダを回転（20rpm）させながら、基板ホルダにRFパワー（0.5kW）を約9分間印加してプリズム表面をプラズマ処理する。次に、Arガスを止めて真空に引き、Arガスを再び導入し（0.5Pa）、基板ホルダを回転（10〜40rpm）させながら、8inchのCrターゲットにDCパワー（0.2kW）を約30秒間印加して2nmのCr薄膜を成膜する。次に。Arガスを止めて再び真空に引き、Arガスを再び導入し、（0.5Pa）、基板ホルダを回転（20rpm）させながら、8inchのAuターゲットにDCパワー（1kW）を約50秒間印加して50nm程度のAu薄膜を成膜する。
【０１６４】
上記で得られたAu薄膜を成膜したセンサースティックを、A液に40℃１時間浸漬し、超純水で10回洗浄した。
【０１６５】
（２）CMD(カルボキシメチルデキストラン）の活性エステル化
0.1重量%のCMD（名糖産業製：分子量100万）溶液4.95mlを溶解した後、全量反応した場合にカルボキシル基の2%が活性化される計算量のEDC（1-Ethyl-3-[3-Dimethylaminopropyl]carbodiimide Hydrochloride）(0.4M) / NHS（N-hydroxysulfosuccinimide）(0.1M)混合溶液50μlを加え、室温で攪拌した。
【０１６６】
（３）CMDの基板への結合反応
（１）で作成された基板の上に、（２）で作成された活性エステル化されたCMD溶液を500μl滴下し、1000 rpmで45 秒スピンコートすることで、アミノ基を有する基板上に活性エステル化されたカルボキシメチルデキストラン薄膜を形成させた。室温で1 時間反応させた後、0.1 N NaOHで5回、超純水で5回洗浄することで、試料１を得た。
【０１６７】
比較例１
（ｉ）OH基を有する基板の作成
16-Hydroxy-1-hexadecanethiol（Frontier Scientific社製）の5mM溶液（エタノール/水=8/2）を作成した。この溶液をB液と呼ぶ。次に、実施例２と同様にしてセンサースティックに50nmの金膜を形成し、B液に40℃60分間浸漬し、エタノールで５回、50mlのエタノール／水（80/20）で1回、50mlの超純水で５回洗浄した。で5回洗浄した。
【０１６８】
（ｉｉ）エピクロロヒドリンによる処理
20mlの0.4M水酸化ナトリウム、20mlのジエチレングリコールジメチルエーテル、2.0mlのエピクロロヒドリンの混合溶液中に、上記基板を浸漬し、25℃の振盪インキュベーター中で４時間反応後、50mlのエタノールで２回、50mlの水で５回洗浄した。
【０１６９】
（ｉｉｉ）デキストランによる処理
水40.5ml、デキストラン（T500, Pharmacia）13.5g、1M水酸化ナトリウム4.5mlの混合
溶液中に、上記基板を浸漬し、25℃の振盪インキュベーターで20時間反応後、50mlの50℃の水で15回洗浄した。
【０１７０】
（ｉｖ）ブロモ酢酸による処理
ブロモ酢酸3.5g、2M水酸化ナトリウム溶液27gの混合溶液中に、上記基板を浸漬し、28
℃の振盪インキュベーターで16時間反応後、水洗した。再度、ブロモ酢酸溶液による16時間反応、水洗を行い、試料２を得た。
【０１７１】
実施例３
実施例３は、実施例２および比較例１で得られたセンサー試料に対する蛋白質の固定に関するものである。蛋白質としては、CA（Carbonic Anhydrase：SIGMA社製）を用いた。
【０１７２】
実施例２および比較例１で作成した試料１、２を、表面プラズモン共鳴装置にセットした。PBSバッファーを注入し、ベースラインを確認した後（この時の共鳴角を基準点とする）、0.2MのEDC（1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide）および50mMのNHS （N-Hydroxysuccinimide）を含む水溶液を注入し7分静置、次にPBSバッファーを注入し1分静置、次に0.1mg/ml のCA溶液（酢酸バッファーpH5.0）を注入し15分静置、次にPBSバッファーを注入し1分静置、次に1Mエタノールアミン溶液（ビアコア社）を注入し7分静置、次にPBSバッファーを注入し1分静置、次に10mM NaOHを注入し1分静置を3回行い、最後にPBSバッファーを注入し1分静置し、この時の共鳴角と原点の共鳴角の差をCA固定量とした。ここで共鳴角1/10000度を1RUと表す。
【０１７３】
CA固定量は、5200RU（試料１）、5000RU（試料２）であった。水溶性の高いSAM化合物を用いて作成した表面においても、多量の蛋白質を固定化できることがわかった。
【０１７４】
実施例４
実施例４は、実施例２および比較例１で得られたセンサー試料に対する、低分子化合物の非特異吸着に関するものである。低分子化合物としては、Cyclin-Dependent KinasesのinhibitorであるCGP74514、および界面活性剤であるTween20を選択し、センサー試料表面への非特異吸着抑制能について検討した。
【０１７５】
実施例２および比較例１で作成した試料１、２を表面プラズモン共鳴装置にセットした。PBSバッファーを注入し、ベースラインを確認した後（この時の共鳴角を基準点とする）、CGP74514のPBSバッファー溶液（50μM）あるいは、Tween20のPBSバッファー溶液（0.005重量％）を注入し2分静置、最後にPBSバッファーを注入し2分静置し、この時の共鳴角と原点の共鳴角の差を非特異吸着量とした。
【０１７６】
試料１に対する非特異吸着量は、CGP74514が3RU、Tween20が5RUであった。試料２に対する非特異吸着量は、CGP74514が5RU、Tween20が9RUであった。水溶性の高いSAM化合物を用いて作成した表面においても、低分子化合物の非特異吸着を抑制できることがわかった。
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月9日(2007.5.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．１ｍＭの濃度において２５℃の水に溶解する下記式（１）で表される化合物を介して、生理活性物質を結合できる反応性基を有する親水性高分子が固定化されている基板からなるバイオセンサー。
Ｘ−Ｌ−Ｙ          （１）
（式中、Ｘは金属に結合することができる基を示し、Ｌは連結基を示し、Ｙは親水性高分子を結合するための官能基を示す。）
【請求項２】
１ｍＭの濃度において２５℃の水に溶解する下記式（１）で表される化合物を介して、生理活性物質を結合できる反応性基を有する親水性高分子が固定化されている基板からなるバイオセンサー。
Ｘ−Ｌ−Ｙ          （１）
（式中、Ｘは金属に結合することができる基を示し、Ｌは連結基を示し、Ｙは親水性高分子を結合するための官能基を示す。）
【請求項３】
下記式（１）で表される化合物を介して、生理活性物質を結合できる反応性基を有する親水性高分子が固定化されている基板からなるバイオセンサー。
Ｘ−Ｌ1−Ｙ          （１）
（式中、Ｘは金属に結合することができる基を示し、Ｌ1は、ヘテロ原子で中断されていてもよい炭素数２から１０の直鎖アルキレン基を示し、Ｙは親水性高分子を結合するための官能基を示す。）
【請求項４】
Ｘが、非対称又は対称スルフィド基、スルフィド基、ジセレニド基、セレニド基、チオール基、ニトリル基、イソニトリル基、ニトロ基、セレノール基、３価リン化合物、イソチオシアネート基、キサンテート基、チオカルバメート基、ホスフィン基、チオ酸基またはジチオ酸基である、請求項１から３の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項５】
Ｙが、カルボキシ基、ヒドロキシル基、アミノ基、アルデヒド基、ヒドラジド基、カルボニル基、エポキシ基、又はビニル基である、請求項１から４の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項６】
Ｘがチオール基で、Ｙがアミノ基である、請求項１から５の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項７】
親水性高分子中の生理活性物質を結合できる反応性基が、活性カルボン酸エステル基である、請求項１から６の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項８】
基板表面が、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールとの混合物で被覆され、アミノ基を有するアルカンチオールを介して、生理活性物質を結合できる反応性基を有する親水性高分子が固定化されている、請求項１から７の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項９】
親水性基を有するアルカンチオールの該親水性基が、水酸基あるいはオリゴエチレングルコール基である、請求項８に記載のバイオセンサー。
【請求項１０】
アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールとの混合物中のモル比が１／１〜１／１，０００，０００の範囲である、請求項８又は９に記載のバイオセンサー。
【請求項１１】
親水性高分子が多糖類である、請求項１から１０の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項１２】
親水性高分子が、カルボキシル基含有多糖類である、請求項１１に記載のバイオセンサー。
【請求項１３】
親水性高分子の膜厚が１ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、請求項１に記載のバイオセンサー。  
【請求項１４】
親水性高分子の平均分子量が１００００以上２０００００である、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項１５】
水素結合を形成しうる残基を有する化合物をさらに添加してなる、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項１６】
基板が金属表面または金属膜である、請求項１から１５の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項１７】
金属が金、銀、銅、白金またはアルミニウムのいずれかである、請求項１から１６の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項１８】
プラスチック支持体の上に基板が設置されている、請求項１から１７の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項１９】
表面プラズモン共鳴分析に使用される、請求項１から１８の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項２０】
０．１ｍＭ濃度で２５℃の水に溶解する下記式（１）で表される化合物で被覆されている基板に、生理活性物質を結合できる反応性基を有する親水性高分子を接触させることによって、式（１）で表される化合物に親水性高分子を結合する工程を含む、請求項１に記載のバイオセンサーの製造方法。
Ｘ−Ｌ−Ｙ          （１）
（式中、Ｘは金属に結合することができる基を示し、Ｌは連結基を示し、Ｙは親水性高分子を結合するための官能基を示す。）
【請求項２１】
下記式（１）で表される化合物で被覆されている基板に、生理活性物質を結合できる反応性基を有する親水性高分子を接触させることによって、式（１）で表される化合物に親水性高分子を結合する工程を含む、請求項３に記載のバイオセンサーの製造方法。
Ｘ−Ｌ1−Ｙ          （１）
（式中、Ｘは金属に結合することができる基を示し、Ｌ1は、ヘテロ原子で中断されていてもよい炭素数２から１０の直鎖アルキレン基を示し、Ｙは親水性高分子を結合するための官能基を示す。）
【請求項２２】
基板が、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールとの混合物で被覆されていて、アミノ基を有するアルカンチオールに親水性高分子を結合させる、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
親水性基を有するアルカンチオールの該親水性基が、水酸基あるいはオリゴエチレングルコール基である、請求項２０から２２の何れかに記載の方法。
【請求項２４】
アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールとの混合物中のモル比が１／１〜１／１，０００，０００の範囲である、請求項２０から２３の何れかに記載の方法。
【請求項２５】
生理活性物質を結合できる反応性基を有する親水性高分子を、基板上に薄膜を形成させた状態で、式（１）で表される化合物と反応させる、請求項２０から２４の何れかに記載の方法。
【請求項２６】
請求項２０から２５の何れかに記載の方法により製造される、バイオセンサー。
【請求項２７】
請求項１から１９又は２６の何れかに記載のバイオセンサーと生理活性物質とを接触させて、該バイオセンサーに該生理活性物質を結合させる工程を含む、バイオセンサーに生理活性物質を固定化する方法。
【請求項２８】
生理活性物質が共有結合により表面に結合している請求項１から１９又は２６の何れかに記載のバイオセンサーと被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法。
【請求項２９】
生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する、請求項２８に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成19年8月3日(2007.8.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される化合物の水溶液で基板を被覆する工程と、生理活性物質を結合できる反応性基を有する多糖類を上記基板に接触させる工程とを含む工程により製造されるバイオセンサー。
Ｘ−Ｌ1−Ｙ          （１）
（式中、Ｘは金属に結合することができる基を示し、Ｌ1は、ヘテロ原子で中断されていてもよい炭素数２から１０の直鎖アルキレン基を示し、Ｙは多糖類を結合するための官能基を示す。）
【請求項２】
０．１ｍＭの濃度において２５℃の水に溶解する下記式（１）で表される化合物を介して、生理活性物質を結合できる反応性基を有する多糖類が固定化されている基板からなる、請求項１に記載のバイオセンサー。
Ｘ−Ｌ1−Ｙ          （１）
（式中、Ｘは金属に結合することができる基を示し、Ｌ1は、ヘテロ原子で中断されていてもよい炭素数２から１０の直鎖アルキレン基を示し、Ｙは多糖類を結合するための官能基を示す。）
【請求項３】
１ｍＭの濃度において２５℃の水に溶解する下記式（１）で表される化合物を介して、生理活性物質を結合できる反応性基を有する多糖類が固定化されている基板からなる、請求項１に記載のバイオセンサー。
Ｘ−Ｌ1−Ｙ          （１）
（式中、Ｘは金属に結合することができる基を示し、Ｌ1は、ヘテロ原子で中断されていてもよい炭素数２から１０の直鎖アルキレン基を示し、Ｙは多糖類を結合するための官能基を示す。）
【請求項４】
Ｘが、非対称又は対称スルフィド基、スルフィド基、ジセレニド基、セレニド基、チオール基、ニトリル基、イソニトリル基、ニトロ基、セレノール基、３価リン化合物、イソチオシアネート基、キサンテート基、チオカルバメート基、ホスフィン基、チオ酸基またはジチオ酸基である、請求項１から３の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項５】
Ｙが、カルボキシ基、ヒドロキシル基、アミノ基、アルデヒド基、ヒドラジド基、カルボニル基、エポキシ基、又はビニル基である、請求項１から４の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項６】
Ｘがチオール基で、Ｙがアミノ基である、請求項１から５の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項７】
多糖類中の生理活性物質を結合できる反応性基が、活性カルボン酸エステル基である、請求項１から６の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項８】
基板表面が、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールとの混合物で被覆され、アミノ基を有するアルカンチオールを介して、生理活性物質を結合できる反応性基を有する多糖類が固定化されている、請求項１から７の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項９】
親水性基を有するアルカンチオールの該親水性基が、水酸基あるいはオリゴエチレングルコール基である、請求項８に記載のバイオセンサー。
【請求項１０】
アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールとの混合物中のモル比が１／１〜１／１，０００，０００の範囲である、請求項８又は９に記載のバイオセンサー。
【請求項１１】
多糖類が、カルボキシル基含有多糖類である、請求項１から１０の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項１２】
多糖類の水中膜厚が１ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、請求項１から１１の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項１３】
多糖類の平均分子量が１０００００以上２００００００以下である、請求項１から１２の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項１４】
基板が金属表面または金属膜である、請求項１から１３の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項１５】
金属が金、銀、銅、白金またはアルミニウムのいずれかである、請求項１から１４の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項１６】
プラスチック支持体の上に基板が設置されている、請求項１から１５の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項１７】
表面プラズモン共鳴分析に使用される、請求項１から１６の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項１８】
下記式（１）で表される化合物の水溶液で基板を被覆する工程と、生理活性物質を結合できる反応性基を有する多糖類を上記基板に接触させる工程とを含む、請求項１に記載のバイオセンサーの製造方法。
Ｘ−Ｌ1−Ｙ          （１）
（式中、Ｘは金属に結合することができる基を示し、Ｌ1は、ヘテロ原子で中断されていてもよい炭素数２から１０の直鎖アルキレン基を示し、Ｙは多糖類を結合するための官能基を示す。）
【請求項１９】
基板が、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールとの混合物で被覆され、アミノ基を有するアルカンチオールに多糖類を結合させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
親水性基を有するアルカンチオールの該親水性基が、水酸基あるいはオリゴエチレングルコール基である、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールとの混合物中のモル比が１／１〜１／１，０００，０００の範囲である、請求項１８から２０の何れかに記載の方法。
【請求項２２】
生理活性物質を結合できる反応性基を有する多糖類を、基板上に薄膜を形成させた状態で、式（１）で表される化合物と反応させる、請求項１８から２１の何れかに記載の方法。
【請求項２３】
請求項１８から２２の何れかに記載の方法により製造される、バイオセンサー。
【請求項２４】
請求項１から１７又は２３の何れかに記載のバイオセンサーと生理活性物質とを接触させて、該バイオセンサーに該生理活性物質を結合させる工程を含む、バイオセンサーに生理活性物質を固定化する方法。
【請求項２５】
生理活性物質が共有結合により表面に結合している請求項１から１７の何れかに記載のバイオセンサーと被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法。
【請求項２６】
生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する、請求項２５に記載の方法。