(57)【要約】【課題】脈管内の、DNAコートステントを提供すること；DNAコートステントを使用してインビボで組換え遺伝子を発現する方法を提供すること；およびDNAコートステントを使用して、冠状および末梢血管疾患、特に再狭窄および静脈バイパス移植片を処置する方法を提供すること。【解決手段】重合可能マトリクスと、治療的に有用なタンパク質をコードするDNAとでコートされた脈管内ステントを含むデバイスであって、１つの実施形態において、前記ステントがポリマーステントまたは金属ステントであり、また、別の実施形態において、上述のステントがステンレス鋼である、デバイス。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書等に記載されるような、DNAでステントをコートする方法およびDNAでコートされたステントからのインビボでの組換え遺伝子の発現。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、脈管内の、DNAでコートされたステント（DNAコートステント）、およびDNAコートステントを使用してインビボで組換え遺伝子を発現する方法を提供する。DNAコートステントは、冠状および末梢血管疾患、特に再狭窄の処置に有用である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
冠状および末梢血管形成術は、冠状および末梢血管における閉塞性のアテローム硬化型障害の処置のために慣用的に行われる。これらの血管のバルーン拡張後、30〜40％の被験体は再狭窄を起こす。
【０００３】
再狭窄は、例えば動脈のバルーン拡張、切除、アテローム切除術またはレーザー処置によるような、動脈の狭窄部分を開く試みにより起こるその動脈への外傷後の末梢または冠状動脈の再閉鎖である。再狭窄は、動脈壁の外傷への自然の治癒反応であると考えられている。この治癒反応は傷害の部位で血栓機構を伴い開始する。複雑な治癒工程の最終結果は、動脈が再び狭窄または閉塞するまでの、内膜過形成つまり、細胞外マトリックス生産物を伴う、中間平滑筋細胞の制御されない転移および増殖であり得る。従って再狭窄は、異常な細胞増殖に加えた血管の弾性反跳または慢性狭窄の両方により特徴付けられる。
【０００４】
現在再狭窄は次の血管形成術手順をもって処置しなければならない。再狭窄を防止する試みにおいて、金属の脈管内ステントが冠状または末梢血管に持続的に移植されてきた。例えば、US5,304,122(Schwartzら)は、バルーン血管形成術または他の冠状インターベンショナル手順後の再狭窄の処置に有用な金属ステントを記述する。このステントは、典型的には、カテーテルによって血管内腔に挿入され、そして動脈壁の損傷部分に拡げて接触され、それにより内腔の機械的な支持が与えられる。しかし、再狭窄はこのようなステントが配置されてもなお発生し得ることが見出されるが、これは、おそらくこのステントは動脈の弾性反跳を防止するが、内膜過形成を導く細胞増殖を防止し得ないからであろう。さらにこのステント自体が、望ましくない局部の血栓症を引き起こし得る。血栓症の問題に対処するために、ステントを受けている被験体はまた抗凝固剤および抗血小板薬での著しい全身的な処置を受ける。
【０００５】
種々の組成物でコートされたステントが提案されている。例えば、Dichekら(Circulation  1989,80:1347-1353)は、バクテリアβガラクトシダーゼまたはヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子についてのレトロウィルス仲介遺伝子転移を受けたヒツジ内皮細胞で、ステンレス鋼ステントをコートすることを記述する。このステントはエクスビボで組織培養皿においてのみで研究された。動脈内にこのステントを移植する可能性は探索されなかった。細胞でステントをコートするこの手順は、細胞が患者から誘導されるべきなので、手数がかかり、厄介でかつ高価である。
【０００６】
ステントにより血管壁へ治療物質を供給する他の方法もまた提案された。例えば、”Intraluminal  Drug  Eluting  Prosthesis”と題されたWO91/12779および”Stent  With  Sustained  Drug  Delivery”と題されたWO90/13332は、再狭窄の発生率を減少させるために、抗血小板剤、抗凝固剤、抗微生物剤、抗炎症剤、抗代謝剤および他の薬物を用いてステントをコートすることを示唆する。同様に、US5,571,166および5,554,182（共にDinhら）はフィブリンおよびヘパリンでコートされた内腔ステントを記述する。このステントは再狭窄を処置するために使用される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明の要旨
従って、本発明の一つの目的は、脈管内の、DNAコートステントを提供することである。
【０００８】
本発明の第二の目的は、DNAコートステントを使用してインビボで組換え遺伝子を発現する方法を提供することである。
【０００９】
本発明の第三の目的は、DNAコートステントを使用して、冠状および末梢血管疾患、特に再狭窄および静脈バイパス移植片を処置する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは今や、ステントの外側表面にDNAをコートする方法の発見を通じて、これらおよび他の目的を達成した。
【００１１】
本発明によって以下が提供される：
１．重合可能マトリクスと、治療的に有用なタンパク質をコードするDNAとでコートされた脈管内ステントを含むデバイス。
２．前記ステントがポリマーステントまたは金属ステントである、項目１に記載のデバイス。
３．前記ステントがステンレス鋼である、項目２に記載のデバイス。
４．項目１に記載のデバイスであって、前記治療的に有用なタンパク質が、抗血小板剤、抗凝固剤、抗有糸分裂剤、抗酸化剤、抗代謝剤、または抗炎症剤をコードする遺伝子である、デバイス。
５．前記治療的に有用なタンパク質が細胞の増殖を阻害する、項目１に記載のデバイス。
６．項目１に記載のデバイスであって、前記治療的に有用なタンパク質が、チミジンキナーゼ、p16、p21、p27、p57、網膜芽細胞腫、またはシトシンデアミナーゼである、デバイス。
７．前記治療的に有用なタンパク質が、チミジンキナーゼまたはシトシンデアミナーゼである、項目６に記載のデバイス。
８．前記ステントが、約50μg〜約５mgのDNAでコートされている、項目１に記載のデバイス。
９．前記重合可能マトリクスがフィブリノーゲンを含む、項目１に記載のデバイス。
１０．インビボで治療的に有用な量の組換え遺伝子を発現するための方法であって、患者の脈管構造にデバイスを配置する工程であって、ここで該デバイスは、ポリマーマトリクスと、治療的に有用なタンパク質をコードするDNAとでコートされたステントを含む、工程を包含する、方法。
１１．項目１０に記載の方法であって、前記治療的に有用なタンパク質が、抗血小板剤、抗凝固剤、抗有糸分裂剤、抗酸化剤、抗代謝剤、または抗炎症剤である、方法。
１２．前記治療的に有用なタンパク質が細胞の増殖を阻害する、項目１１に記載の方法。
１３．項目１２に記載の方法であって、前記治療的に有用なタンパク質が、チミジンキナーゼ、p16、p21、p27、p57、網膜芽細胞腫、またはシトシンデアミナーゼである、方法。
１４．前記治療的に有用なタンパク質が、チミジンキナーゼまたはシトシンデアミナーゼである、項目１３に記載の方法。
１５．脈管疾患を処置または予防するための方法であって、該方法は、患者の脈管構造にデバイスを配置する工程であって、ここで該デバイスは、ポリマーマトリクスと、脈管疾患を処置するための治療的に有用なタンパク質をコードするDNAとでコートされたテントを含む、工程を包含する、方法。
１６．項目１５に記載の方法であって、前記治療的に有用なタンパク質が、抗血小板剤、抗凝固剤、抗有糸分裂剤、抗酸化剤、抗代謝剤、または抗炎症剤である、方法。
１７．前記治療的に有用なタンパク質が細胞の増殖を阻害する、項目１５に記載の方法。
１８．項目１５に記載の方法であって、前記治療的に有用なタンパク質が、チミジンキナーゼ、p16、p21、p27、p57、網膜芽細胞腫、またはシトシンデアミナーゼである、方法。
１９．前記治療的に有用なタンパク質が、チミジンキナーゼまたはシトシンデアミナーゼである、項目１５に記載の方法。
２０．項目１５に記載の方法であって、前記脈管疾患が、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈バイパス移植片狭窄もしくは再狭窄、動脈−静脈フィステル狭窄もしくは再狭窄、または末梢性動脈狭窄もしくは再狭窄である、方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
好適な実施態様の詳細な説明
DNAコートステント
ステントは、冠状動脈閉塞を処置するために、そして脾臓、頸動脈、腸骨および膝窩脈管の切開または動脈瘤をシールするために経皮的に送達され得るデバイスである。本発明における有用な適したステントはポリマー性または金属性である。ポリマーステントの例には、ポリ（エチレンテレフタラート）、ポリアセタール、ポリ（乳酸）、およびポリ（エチレンオキシド）／ポリ（ブチレンテレフタラート）コポリマーのような生安定性(biostable)または生吸収性(bioabsorbable)ポリマーを用いて作製したステントがある。金属ステントの例にはタンタルまたはステンレス鋼から作製したステントがある。ステントは無数のデザインで入手可能であるが、その全てが本発明において使用でき、そして市販されているか文献に記述されているかである。例えば、弾力のあるポリマー材料の自己膨張ステントが”Intraluminal  Drug  Eluting  Prosthesis”と題されたWO91/12779に記述される。また、米国特許第4,886,062号は変形可能な金属針金ステントを記述する。ステントの商業的供給源としては、Johnson  &  Johnson、Boston  Scientific、Cordis、Advanced  Catheter  SystemsおよびU.S.Catheter,Inc.がある。
【００１３】
本発明に有用な治療タンパク質をコードする適切な遺伝子には、抗血小板剤、抗凝固剤、抗有糸分裂剤、抗酸化剤、抗代謝剤および抗炎症剤をコードする遺伝子が含まれる。治療タンパク質をコードする好ましい遺伝子には、細胞（特に血管平滑筋細胞(vsmc)）の増殖を阻害し得るタンパク質が含まれ、これは以下を含む：
HSVチミジンキナーゼ(McKnight,1980,Nucleic  Acids  Res.8:5949;Mansourら,1988,Nature  336:348-352)、
βガラクトシダーゼ、
p16(Chanら1995,Mol.Cell.Biol.15:2682-2688;Guanら,Genes  &  Dev.8:2939-2952)、
p21(Harperら,1993,Cell  75:805;Xiongら,1993,Nature366:701)、
p27(Toyoshimaら,1994,Cell  78:67-74;Polyakら,1994,Cell  78:59-66)、
p57(Leeら,1995,Genes  &  Dev.9:639-649;Matsuokaら,1995,Genes  &  Dev.9:650-662)、
網膜芽細胞種(Rb)(Changら1995,Science,267:518を参照)またはその変異体(例えば、Hamelら,1992,Mol.Cell.Biol.12:3431を参照)、および
シトシンデアミナーゼ(WO9428143;Wangら,1988,Can.Soc.Petrol.Geol.Mem.,14:71)。
これらの遺伝子産物の配列は文献中に既知である。これらの遺伝子産物をコードする任意のDNAが使用でき、これは文献中に記述されるcDNA配列を含む。あるいは、上記の融合タンパク質が使用され得る。好ましい遺伝子は、チミジンキナーゼ（HSV-tk）またはシトシンデアミナーゼ遺伝子をコードする。
【００１４】
上記の治療タンパク質をコードする任意のDNAが使用され得る。好ましくは、それらのタンパク質をコードするヒトcDNAのDNA配列が使用される。このDNAはネイキッド(naked)であり得るか、またはベクター中に組み込まれ得る。適したベクターには、シャトルベクター、発現ベクター、レトロウィルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクターおよびリポソームが含まれる。好ましくは、例えばDavidsonら(1993,Nature  Genet.3:219-223)により記述されるpAd-BglIIのような、複製欠陥アデノウイルスベクターが使用される。これらのベクターは、バルーン障害のラット頸動脈、ウサギ冠状およびブタ大腿部動脈における高レベルの遺伝子の発現をプログラムすることが証明された(Ohnoら,Science255:781(1994);Guzmanら,Circulation88:2838(1993)およびBarrら,Gene  Ther.1:51(1994))。
【００１５】
HSV-tk遺伝子をコードする種々のDNA構成物は、ATCC39371、ATCC39369およびVR-2036を含めAmerican  Type  Culture  Collection,Rockville,MD,から入手できる。HSV-tkを含むアデノウイルス構築物の構築は同時係属中の出願08/210,902の実施例１に記載される。
【００１６】
好ましいベクターのリストを以下の表１に示す。
【００１７】
【表１−１】
2007301402.tif 000002
【００１８】
【表１−２】
2007301402.tif 000003
【００１９】
このステントは、ヘパリン、ヒルジン、アンギオペプチン(angiopeptin)、ACEインヒビター、増殖因子（例えば、IL２−１０)、酸化窒素のような他の治療タンパク質またはこれらをコードするDNAで随意にコートされ得る。
【００２０】
このDNAのステントへの結合に有用で適切な重合可能なマトリックスには任意の単量体生適合材料が含まれ、これは生体適合性固体コーティングを形成し、水に懸濁され、DNAと混合され、そして続いて重合され得る。トロンビンで重合されたフィブリノーゲン（フィブリン）が好ましい。
【００２１】
このステントは、好ましくは約50μg〜約５mgのDNAでコートされる。このDNAを含む重合可能なマトリックスの厚さは、典型的には約５〜500μmである。このマトリックスは、好ましくはステントの全表面をカバーする。
【００２２】
DNAを用いてステントをコートする方法
表面をコートする方法は当該分野において周知であり、例えばスプレーコーティング、液浸コーティング(immersion  coating)などが含まれる。任意のこれらの方法が本発明において使用され得る。例えば、液体単量体マトリックスはこのDNAと混合され、そして重合が開始され得る。次にこのステントは、ポリマーがその全表面に形成するように、重合溶液に添加され得る。次にこのコートされたステントは除去され、そして乾燥される。改良されたコーティング均一性、およびこのステントに適用したDNA量の改良された制御を提供するために、複数の適用段階が使用され得る。
【００２３】
好ましい実施態様において、DNAおよびヒトトロンビンの水性の混合物はフィブリノーゲンの水懸濁液に添加される。この懸濁液のフィブリノーゲン濃度は典型的には約10〜50、好ましくは約20〜40であり、より好ましくは約30mg/mlである。この水性混合物のDNA濃度は典型的には約１〜20、好ましくは約５〜15、より好ましくは約10μg/mlである。水性混合物中のヒトトロンビンの量は典型的には約0.5〜５、好ましくは約１Uである。このDNAおよびヒトトロンビンはまず互いに添加されて混合物を形成し、次いでその混合物はフィブリノーゲン懸濁液に添加される。その後、この重合溶液にステントが浸される。混合物が凝固した後、このステントは除去される。
【００２４】
DNAコートステントを脈管内に配置する方法
このステントはバルーンカテーテルの末端でバルーン上に配置され、そして従来の経皮の方法（例えば、血管形成手順におけるような）によって、処置すべき制限または開鎖部位に送達され得、次にそれはバルーンの膨張により拡げて身体内腔に接触され得る。次にこのカテーテルは回収され得、本発明のステントを処置部位に配置して残す。従って、このステントは処置部位での内腔支持構造、およびこの内腔壁でのDNAの注入部位の両方を提供し得る。この注入部位は動脈壁または静脈壁のどちらかであり得る。
【００２５】
バルーンカテーテルを使用する動脈壁でのDNA溶液の部位特異的滴下は本発明者らにより、現在特許許可されているU.S.S.N.08/376,522に既に記述されている。従って、動脈細胞への「ネイキッドDNA」の組み込み、および続くそのDNAの発現の可能性は以前に証明されている。
【００２６】
このステントは任意の末梢または冠状動脈または静脈中に配置され得る。このステントは、好ましくは機械的な脈管傷害の後直ちにあるいはすみやかに、傷害部位に配置される。
【００２７】
DNAコートステントを使用してインビボで組換え遺伝子を発現する方法
患者の動脈または静脈において本発明のDNAコートステントを移植することによって、組換え遺伝子が、インビボで発現され得る。遺伝子発現は連続的であり、そしてsmc、特にsm  22∝のような、ウィルスプロモーターまたは細胞特異的プロモーターを用いて随意に制御され得る。
【００２８】
SM  22∝は、マウス胚形成の間の心筋、平滑筋および骨格筋系統におよび成体smcに発現する推定のカルシウム結合タンパク質である（Lees-Millerら,1987,J.Biol.Chem.262:2988;Dubandら,1993,Differentiation,55:1;Shanahanら,1993,Circ.Res.73:193）。smcのプロモーターは、血管であって内蔵でない平滑筋細胞に特異的な導入遺伝子発現を導くので、特に興味深い。
【００２９】
DNAコートステントを用いた冠状および末梢脈管疾患の処置方法
再狭窄、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈バイパス移植片狭窄、静脈バイパス移植片狭窄または再狭窄、動脈−静脈フィステル狭窄または再狭窄、末梢性動脈狭窄または再狭窄を含む冠状および末梢疾患は、本発明のDNAコートステントを患者の冠状または末梢動脈または静脈に移植することにより処置され得る。適切な患者には、イヌ、ウマ、ウシ、ヒトなどのような哺乳動物が含まれる。ヒトは好ましい患者である。
【００３０】
別の実施態様において、DNAコートステントはこの患者に移植され、そして抗血小板剤、抗凝固剤、抗微生物剤、抗炎症剤、抗代謝剤、抗有糸分裂剤または他の薬剤が再狭窄の発生率を減少するために投与される。適切な抗凝固剤には、ヘパリン、コウマジン(coumadin)、プロタミン、ヒルジンおよびダニ抗凝固タンパク質のような薬物が含まれ得る。適切な抗有糸分裂剤および抗代謝剤には、コルヒチン、メトトレキセート、アザチオプリン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、フルオロウラシル、アドリアマイシンおよびムタマイシン(mutamycin)のような薬物が含まれ得る。好ましくは、ガンシクロビルまたはアシクロビルが投与される。
【００３１】
一般的に本発明を記述したが、より一層の理解は、いくつかの特定の実施例を参照することによって得ることができ、これらの実施例は本明細書に例示の目的のためのみに提供され、そして他の旨が特定されない限り、限定的なものではない。
【実施例】
【００３２】
トロンビンで重合したフィブリノーゲン（フィブリン）を使用してステントをコートする手順
ヒトフィブリノーゲンを30mg/mlの濃度で水に溶解した。100μlの異なる濃度のフィブリノーゲンを調製物に使用した。フィブリノーゲンは必要であれば水に希釈し、そしてエッペンドルフチューブに移した。
【００３３】
プラスミドCAT(pCMV-CAT)は10mg/mlの濃度で水に溶解した。このDNAはエッペンドルフチューブ内で、最終量100μg/mlまで水で希釈した。１UのヒトトロンビンをこのDNA溶液に添加し、そして緩やかに混合した。
【００３４】
このDNAおよびトロンビンの混合物をフィブリノーゲン溶液に添加した。簡単な混合後、この混合物を一端をシールしたTygon管(1/8”ID;1”〜1  1/4”長、処方S-50-HL)に載せた。Jonson  &  Jonson金属ステント5.0mmを、この管内で、DNA/フィブリノーゲン/トロンビン混合物に直ちに挿入し、そしてこの混合物が凝固するまでインキュベートした。このフィブリンコートステントを除去し、そして空気乾燥した。
【００３５】
このコートしたステントを、慣用の外科手順を使用して左右のブタ腸骨大腿部動脈内に据え付けた。
【００３６】
ステントを据え付けてから３日後、この動脈を切除し、そしてガラスドエル(glass  dowel)を使用して均質化した。このタンパク質抽出物を、凍結−解凍を３回、65℃で15分間熱失活させ、そして上澄液が回収された。300μgの可溶性タンパク質をCATアッセイに使用した。この結果はCATのアセチル化を測定するBetagen  machineを使用して読んだ。
【００３７】
脈管におけるDNAコートステントの移植
どちらの性の子供国産ブタ（３ヶ月、15〜20kg）にも、外科処置の２日前および研究期間中毎週３回、アスピリン(10mg/kg)を経口投与した。
【００３８】
ブタはテトラゾール(6.0mg/kg  IM)およびキシラジン(2.2  mg/kg  IM)を使用して麻酔し、そして気管内チューブを用いて挿管した。１％のイソフルランを外科手順の間を通じて投与した。150units/kgのヘパリンを外科処置前に静脈間に（IV）投与する。
【００３９】
調製およびドレーピング(draping)後、正中腺腹部切開がなされ、皮膚および筋膜を通じて恥骨まで尾側に伸張し、腹部筋肉組織はこの正中線において分割された。この腹膜腔を切開し、そしてBalfour  牽引器(retractor)を使用して、腸を頭側に引っ込めた。鈍いおよび鋭い切開を併用して、腸骨および大腿部動脈の各々を、尾側に大腿部動脈の分岐を越えて、それらの頭側範囲から単離した。
【００４０】
内部の腸骨動脈は２−０silkで最も尾側の点で連結した。結び目は近くの腸骨および大腿部動脈を輪で囲み、次いで仮留めされた。内部腸骨動脈の動脈切開はこの縫い合わせの直近でなされた。バルーン膨張可能なステントは腸骨動脈に進められ、そしてこのバルーンは膨張デバイスを使用して６気圧で膨張された。このバルーンは収縮し、そしてバルーンカテーテルを除去し、次いで内部腸骨動脈を連結し、その後輪をはずした。動脈血流の回復が確認された。腹膜および筋肉を1−0vicrylでの連続的な縫合で閉じ、そして筋膜層は1-0vicrylでの断続的な縫合で閉じた。皮膚はステープルで閉じた。
【００４１】
結果
以下のデータは、DNAコートステントの移植後の、インビボでのブタ動脈中の、レポーター遺伝子、CATの発現を示す。
【００４２】
【表１Ａ】
2007301402.tif 000004
【００４３】
上記のデータを使用して、DNAおよびフィブリノーゲンの最適用量を決定した。このデータは、DNAコートステントを患者に移植でき、その遺伝子はタンパク質として発現され、そして十分量のタンパク質が産生されてその測定を可能にするという原理を支持する。
【００４４】
ここまで本発明を十分に記述したが、本明細書中に記述されたように本発明の精神または範囲から離れることなしに、多くの改変および修飾がなされ得ることは当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１はプラスミドpCMV-CAT(VR1332)の制限酵素地図である。
【図１】
2007301402.tif 000005