(57)【要約】      （修正有）【課題】  改変型ＰＱＱＧＤＨを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法を提供する。【解決手段】改変型ＰＱＱＧＤＨを反応させる工程を含むグルコース測定において、改変型ＰＱＱＧＤＨを、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、リンゴ酸、フタル酸、２−ケトグルタル酸、３，３−ジメチルグルタル酸、ピメリン酸、スベリン酸、アジピン酸、マレイン酸及びクエン酸からなる群より選ばれる物質を、少なくとも1種類の存在下で反応させる工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定方法において、該改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、リンゴ酸、フタル酸、２−ケトグルタル酸、３，３−ジメチルグルタル酸、ピメリン酸、スベリン酸、アジピン酸、マレイン酸及びクエン酸からなる群より選ばれる物質を、少なくとも1種類の存在下で反応させる工程を含む、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
【請求項２】
さらに測定時のｐＨが７．０以下である請求項１に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
【請求項３】
さらにｐＨが６．０以下である請求項１もしくは２に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
【請求項４】
さらに組成物としてメディエーターを含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
【請求項５】
メディエーターがフェリシアン化物塩である請求項４に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
【請求項６】
アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼが、対応する野生型酵素と比較してマルトース作用性の低下したピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼである、請求項１に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
【請求項７】
改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程が、アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコース測定用試薬組成物においてなされることを含む、請求項１に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
【請求項８】
グルコース測定用組成物がグルコースアッセイキットに含まれる形態をとることを含む、請求項７に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
【請求項９】
改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程が、アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含み、かつ、少なくとも作用極と対極からなる電極を含むグルコースセンサーにおいてなされることを含む、請求項１に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
【請求項１０】
グルコースセンサーにおける反応が、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含む反応溶液に電圧を印加し、メディエーターの酸化電流を測定してなる、請求項９に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
【請求項１１】
アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、および、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、リンゴ酸、フタル酸、２−ケトグルタル酸、３，３−ジメチルグルタル酸、ピメリン酸、スベリン酸、アジピン酸、マレイン酸及びクエン酸からなる群より選ばれる物質を含む、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコース測定用組成物においてマルトースに対する作用性が低減したグルコース測定用組成物。
【請求項１２】
アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、および、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、リンゴ酸、フタル酸、２−ケトグルタル酸、３，３−ジメチルグルタル酸、ピメリン酸、スベリン酸、アジピン酸、マレイン酸及びクエン酸からなる群より選ばれる物質を含む、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースセンサーにおいてマルトースに対する作用性が低減したグルコースセンサー。
【請求項１３】
コハク酸、マロン酸、グルタル酸、リンゴ酸、フタル酸、２−ケトグルタル酸、３，３−ジメチルグルタル酸、ピメリン酸、スベリン酸、アジピン酸、マレイン酸及びクエン酸からなる群より選ばれる物質を含有させる工程を含む、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコース測定用組成物においてマルトースに対する作用性が低減したグルコース測定用組成物の製造方法。
【請求項１４】
コハク酸、マロン酸、グルタル酸、リンゴ酸、フタル酸、２−ケトグルタル酸、３，３−ジメチルグルタル酸、ピメリン酸、スベリン酸、アジピン酸、マレイン酸及びクエン酸からなる群より選ばれる物質を含有させる工程を含む、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースセンサーにおいてマルトースに対する作用性が低減したグルコースセンサーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ピロロキノリンキノンをＰＱＱ、グルコースデヒドロゲナーゼをＧＤＨ、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼをＰＱＱＧＤＨともそれぞれ記載する。）を反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法、該マルトースに対する作用性が低減したグルコース測定用組成物、グルコースセンサー、ならびに、それらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＱＱＧＤＨは、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼである。グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒することから、血糖の測定に用いることが可能である。血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーとして臨床診断上きわめて重要な指標である。現在、血中グルコース濃度の測定は、グルコースオキシダーゼを使用したバイオセンサーを用いる方法が主流となっているが、反応が溶存酸素濃度に影響されることから、測定値に誤差が生じる可能性があった。このグルコースオキシダーゼにかわる新たな酵素としてＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素が注目されている。
【０００３】
我々のグループは、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＮＣＩＭＢ１１５１７株が、ＰＱＱＧＤＨを産生することを見出し，遺伝子のクローニングならびに高発現系を構築した（たとえば、特許文献１を参照）。しかしながら、この野生型ＰＱＱＧＤＨはグルコースオキシダーゼに比べて、そのグルコース以外の糖基質に対する作用性（いわゆる基質特異性）、特にマルトースに対する作用性に問題があった。
【特許文献１】特開平１１−２４３９４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、従来技術の課題を背景になされたもので、グルコース測定試薬もしくはグルコースセンサーにおけるＰＱＱＧＤＨの基質特異性の向上を課題としてその改良に関するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、ＰＱＱＧＤＨのかかる問題点を回避する方法として、アミノ酸置換等により酵素特性を改変する方法が知られている（たとえば、特許文献２参照）。しかしながら、グルコース以外の糖基質に対する作用性（いわゆる基質特異性）、特にマルトースに対する作用性をさらに低減させる余地を残していた。
【特許文献２】特開２００４−３１３１７２号公報
【０００６】
そこで本発明者らは遺伝子工学的手法による改変と並行して、さらに他の側面からの改善を鋭意検討した結果、アミノ酸配列に置換・挿入・欠失等の改変を施した改変型ＰＱＱＧＤＨを反応させる工程を含むグルコース測定方法において、改変型ＰＱＱＧＤＨ以外の組成を検討することによって基質特異性が改善されることを見出し、本出願に至った。
より具体的には、本発明は組成中の含有物質及び／又はｐＨ条件を適正化することで達成される。
即ち本発明は、以下の構成からなる。
［項１］
アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定方法において、該改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、リンゴ酸、フタル酸、２−ケトグルタル酸、３，３−ジメチルグルタル酸、ピメリン酸、スベリン酸、アジピン酸、マレイン酸及びクエン酸からなる群より選ばれる物質を、少なくとも1種類の存在下で反応させる工程を含む、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項２］
さらに測定時のｐＨが７．０以下である項１に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項３］
さらにｐＨが６．０以下である項１もしくは２に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項４］
さらに組成物としてメディエーターを含む項１〜３のいずれか１項に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項５］
メディエーターがフェリシアン化物塩である項４に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項６］
アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼが、対応する野生型酵素と比較してマルトース作用性の低下したピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼである、項１に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項７］
改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程が、アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコース測定用試薬組成物においてなされることを含む、項１に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項８］
グルコース測定用組成物がグルコースアッセイキットに含まれる形態をとることを含む、項６に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項９］
改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程が、アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含み、かつ、少なくとも作用極と対極からなる電極を含むグルコースセンサーにおいてなされることを含む、項１に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項１０］
グルコースセンサーにおける反応が、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを含む反応溶液に電圧を印加し、メディエーターの酸化電流を測定してなる、項８に記載の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法。
［項１１］
アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、および、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、リンゴ酸、フタル酸、２−ケトグルタル酸、３，３−ジメチルグルタル酸、ピメリン酸、スベリン酸、アジピン酸、マレイン酸及びクエン酸からなる群より選ばれる物質を含む、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコース測定用組成物においてマルトースに対する作用性が低減したグルコース測定用組成物。
［項１２］
アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、および、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、リンゴ酸、フタル酸、２−ケトグルタル酸、３，３−ジメチルグルタル酸、ピメリン酸、スベリン酸、アジピン酸、マレイン酸及びクエン酸からなる群より選ばれる物質を含む、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースセンサーにおいてマルトースに対する作用性が低減したグルコースセンサー。
［項１３］
コハク酸、マロン酸、グルタル酸、リンゴ酸、フタル酸、２−ケトグルタル酸、３，３−ジメチルグルタル酸、ピメリン酸、スベリン酸、アジピン酸、マレイン酸及びクエン酸からなる群より選ばれる物質を含有させる工程を含む、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコース測定用組成物においてマルトースに対する作用性が低減したグルコース測定用組成物の製造方法。
［項１４］
コハク酸、マロン酸、グルタル酸、リンゴ酸、フタル酸、２−ケトグルタル酸、３，３−ジメチルグルタル酸、ピメリン酸、スベリン酸、アジピン酸、マレイン酸及びクエン酸からなる群より選ばれる物質を含有させる工程を含む、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースセンサーにおいてマルトースに対する作用性が低減したグルコースセンサーの製造方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の組成物並びに測定方法は、臨床検査や食品分析などにおけるグルコースの測定に有用である。本発明をＰＱＱＧＤＨを使用するグルコースアッセイキットやグルコースセンサ等に適用することにより、より高精度な分析が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
本発明の一つの態様は、アミノ酸配列の改変を施した改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定方法において、該改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、リンゴ酸、フタル酸、２−ケトグルタル酸、３，３−ジメチルグルタル酸、ピメリン酸、スベリン酸、アジピン酸、マレイン酸及びクエン酸からなる群より選ばれる物質を、少なくとも1種類の存在下で反応させる工程を含む、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法である。
【００１０】
本発明に適用することができるＰＱＱＧＤＨは、ピロロキノリンキノンを補酵素として配位し、Ｄ−グルコースを酸化してＤ−グルコノ−１，５−ラクトンを生成するという反応を触媒する酵素（ＥＣ１．１．５．２（旧ＥＣ１．１．９９．１７））であり、由来や構造に関しては特に限定するものではない。
ＰＱＱＧＤＨは、可溶性型（可溶型とも記載する。）と膜結合型（膜型とも記載する。）に分類することができる。上記のうち、アシネトバクター属由来のものは可溶性ＰＱＱＧＤＨとして知られている。一方、エシェリヒア・コリなどに存在するものは膜結合型ＰＱＱＧＤＨとして知られている。
【００１１】
本発明に使用するＰＱＱＧＤＨは、野生型ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列に改変を施した改変型ＰＱＱＧＤＨである。ここでアミノ酸配列の改変とは、遺伝子工学的手法により元来のアミノ酸配列に少なくとも１以上のアミノ酸残基の置換・挿入・欠失を実施することをいう。中でも、かかるアミノ酸配列の改変を施すことによって、対応する野生型酵素と比較してマルトースへの作用性が低下した改変型ＰＱＱＧＤＨを用いるのが好ましい。
かかる改変型ＰＱＱＧＤＨに、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、リンゴ酸、フタル酸、２−ケトグルタル酸、３，３−ジメチルグルタル酸、ピメリン酸、スベリン酸、アジピン酸、マレイン酸及びクエン酸からなる群より選ばれる物質を、少なくとも1種類の存在下で反応させることにより、グルコース測定におけるマルトースへの作用性をさらに低下させることができる。
【００１２】
本発明において、マルトースに対する作用性とは、ＰＱＱＧＤＨが当該糖基質を脱水素する作用を意味する。
本発明において改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコース以外の少なくとも１つのマルトース以外の選択された糖基質に対する作用性が低下している酵素であってもよい。
グルコース以外の少なくとも１つのマルトース以外の選択された糖基質としては、ガラクトース、マンノース、キシロースなどの単糖類、シュクロース、ラクトース、セロビオースなどの二糖類、マルトトリオース、マルトテトラオースなどのオリゴ糖類、イコデキストリン（グルコースポリマー）などの多糖類（オリゴ糖類は２〜１０分子の単糖が、多糖類は１１分子以上の単糖がグリコシド結合などにより結合したものを意味し、それらの結合形態は問わない。）二糖類以上の場合はその構成はホモであってもヘテロであっても良い。）、さらには糖アルコール、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、３−ｏ−メチル−Ｄ−グルコースなどそれらの誘導体が該当しうる。
上記の中でも特に、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを糖尿病患者の臨床診断や血糖値コントロール等の目的で行われる血中グルコース濃度測定のために用いる際に問題となりうる、各種糖類が選択されることが好ましい。このような糖としては、マンノース、アロース、キシロース、ガラクトースまたはマルトースなどが挙げられ、さらに好ましくはガラクトース、ラクトースまたはマルトースが例示される。最も好ましくはマルトースが例示される。
なお本願明細書では、マルトース、あるいは、グルコース以外の少なくとも１つのマルトース以外の選択された糖基質に対する作用性が、対応する野生型ＰＱＱＧＤＨと比較して低下したことを、基質特異性の向上とも表現する。
【００１３】
ある糖類に対する作用性が低下しているかどうかの判断は、次のように行う。
後述の試験例１に記載の活性測定法において、野生型ＰＱＱＧＤＨを用いて、Ｄ−グルコースを基質溶液とした場合のＰＱＱＧＤＨ活性値（ａ）と、Ｄ−グルコースのかわりに当該糖類を基質溶液とした場合のＰＱＱＧＤＨ活性値（ｂ）を測定し、グルコースを基質とした場合の測定値を１００とした場合に対する相対値（（ｂ）／（ａ）×１００）を求める。次いで、改変型ＰＱＱＧＤＨを用いて同様の操作を行い、その値を比較して判断する。
活性測定は、後述の試験例１に記載の活性測定法により行われる。
【００１４】
本発明に用いる改変型ＰＱＱＧＤＨは、例えば、野生型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を取得し、次いでそれを改変して改変型ＰＱＱＧＤＨをコードするポリヌクレオチドを構築し、次いで当該ポリペプチドを適当な発現系において発現させることによって作製されうる。
【００１５】
本発明に用いる改変型ＰＱＱＧＤＨの改変の基になる野生型のＰＱＱＧＤＨとしては、由来は特に限定されない。例えば微生物では、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）（例えば、特許文献１を参照。）、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）（例えば、非特許文献１および２を参照。）、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）（例えば、非特許文献３を参照。）等の酸化細菌やアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（例えば、非特許文献４を参照。）、クレブシーラ・エーロジーンズ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等の腸内細菌、ブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｒｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）などを挙げることができる。
【非特許文献１】Ａ．Ｍ．Ｃｌｅｔｏｎ−Ｊａｎｓｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０，２１２１（１９８８）
【非特許文献２】Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１７，４３０（１９８９）
【非特許文献３】Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２９，２０６（１９９１）
【非特許文献４】Ａ．Ｍ．Ｃｌｅｔｏｎ−Ｊａｎｓｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，６３０８（１９９０）
【００１６】
上記のうち好ましいのは、アシネトバクター属由来のＰＱＱＧＤＨである。これらは可溶型酵素であり水系において易溶である。さらに好ましいのは、アシネトバクター・カルコアセティカスもしくはアシネトバクター・バウマンニのいずれかに由来するＰＱＱＧＤＨである。さらにより好ましいのは、アシネトバクター・バウマンニ  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来（例えば、特許文献１を参照。）、アシネトバクター・カルコアセティカス  ＬＭＤ７９．４１株由来（例えば、非特許文献１および２を参照。）、もしくは、アシネトバクター・カルコアセティカス  ＩＦＯ  １２５５２株（例えば、特許文献３を参照。）のＰＱＱＧＤＨである。もっとも好ましいのは、アシネトバクター・バウマンニ  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来のＰＱＱＧＤＨである。なお、アシネトバクター・バウマンニＮＣＩＭＢ１１５１７株は、分類当初はＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓとされていた。
【特許文献３】特開２００４−１７３５３８
【００１７】
これらはいずれも、アミノ酸配列、遺伝子配列が公知であるか、酵素の精製法が確立されていてその理化学的性質も明らかになっているものであり、このような知見を基に、当業者であれば改変型ＰＱＱＧＤＨを容易に作製することができる。
このような改変は当該技術分野における公知技術を用いて当業者であれば容易に実施することが出来る。例えば、蛋白質に部位特異的変異を導入するために当該蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を置換または挿入するための種々の方法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ,  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。  
【００１８】
本発明に用いる改変型ＰＱＱＧＤＨのうちで好ましいのは、活性中心近傍に少なくとも1箇所以上のアミノ酸配列の改変を施したＰＱＱＧＤＨが例示され、またこれに加えて活性中心近傍以外にも併せてアミノ酸配列の改変を施していてもよい。さらに詳細には、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＮＣＩＭＢ１１５１７株由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列における、６７位Ｐｒｏ、６８位Ｇｌｕ、６９位Ｉｌｅ、７６位Ｇｌｎ、８９位Ｌｙｓ、１２９位Ｇｌｕ、１３０位Ｌｙｓ、１３１位Ｐｒｏ、１６７位Ａｓｎ、１６８位Ｇｌｎ、１６９位Ｌｅｕ、１７０位Ａｌａ、１７１位Ｔｙｒ、１７４位Ｌｅｕ、１８８位Ａｓｎ、１８９位Ｓｅｒ、２０７位Ｓｅｒ、２１５位Ｐｈｅ、２２４位Ｔｈｒ、２３６位Ａｌａ、２４５位Ｇｌｕ、２４９位Ａｓｎ、３００位Ｌｙｓ、３４１位Ｇｌｕ、３４２位Ｍｅｔ、３４３位Ａｌａ、３４９位Ｔｈｒ、３５１位Ａｌａからなる群から選ばれる少なくとも１つの位置、あるいは、他のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属または他の種由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおける上記と同等の位置において少なくとも１つの位置をターゲットに改変を行ったＰＱＱＧＤＨを例示することができる。なお、アシネトバクター・バウマンニＮＣＩＭＢ１１５１７株由来野生型ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列は配列番号１に示す。該改変型ＰＱＱＧＤＨが２箇所以上のアミノ酸残基を改変されている場合においては、上記の群から選ばれる少なくとも１つの位置をターゲットとした改変を１つ以上含む改変型ＰＱＱＧＤＨを例示することができる。
なお、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来野生型ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列は配列番号１で示される。配列番号１において、アミノ酸の表記は、シグナル配列が除かれたアスパラギン酸を１として番号付けされている。
【００１９】
アシネトバクター・バウマンニ  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列（そのアミノ酸配列は配列番号１で、遺伝子配列は配列番号２でそれぞれ示される。）と、アシネトバクター・カルコアセティカス  ＬＭＤ７９．４１株由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列、ならびに、アシネトバクター・カルコアセティカス  ＩＦＯ  １２５５２株由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列を比較すると、相違箇所はわずかで、相同性はそれぞれ９２．３％、９１．３％（いずれもシグナル配列含む）となり、非常に類似している（図１および図２）。
したがって、当業者であれば配列番号１におけるある残基が、アシネトバクター・カルコアセティカス  ＬＭＤ７９．４１株由来ＰＱＱＧＤＨのどのアミノ酸残基（同等の位置）に該当するかを容易に認識することができる。そして、そのような１またはそれ以上の箇所においてアミノ酸変異を行うことにより、グルコース以外の少なくとも１つの選択された糖基質に対する作用性が、対応する野生型ＰＱＱＧＤＨと比較して低下した改変型ＰＱＱＧＤＨを得ることができる。
【００２０】
なお、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコースに対する作用性が本質的に維持され、好ましくはさらにマルトースに対する作用性に関して実質的な悪影響を及ぼさない限り、さらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換・挿入等されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加または置換等されていてもよい。
さらに、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコースに対する作用性が本質的に維持され、好ましくはさらにマルトースに対する作用性に関して実質的な悪影響を及ぼさない限り、ＰＱＱＧＤＨにヒスチジンタグなどのタグを結合または挿入させた態様、ＰＱＱＧＤＨの少なくとも一方の末端に他のペプチドや他の蛋白質（たとえばストレプトアビジンやシトクロム）を融合させた態様、糖鎖や他の化合物により化学修飾された態様、ＰＱＱＧＤＨ分子内および／または分子間でジズルフィド結合などにより架橋されたものやリンカーペプチドなどを介して連結されたもの等の態様を含みうる。あるいは、いくつかの由来の野生型ＰＱＱＧＤＨの断片を組み合わせて構成したものを含みうる。
【００２１】
これらのＰＱＱＧＤＨは、当該技術分野における公知技術を用いて当業者であれば容易に製造することが出来る。
【００２２】
例えば、野生型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を変異させてから、発現用ベクター（多くのものが当該技術分野において知られている。例えばプラスミド。）に挿入し、適当な宿主（多くのものが当該技術分野において知られている。例えば大腸菌。）に形質転換させた形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じてＥＤＴＡなどのキレート剤や界面活性剤等を添加して可溶化し、ＰＱＱＧＤＨを含む水溶性画分を得ることができる。または適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したＰＱＱＧＤＨを直接培養液中に分泌させることが出来る。
【００２３】
上記のようにして得られたＰＱＱＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＰＱＱＧＤＨを得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００２４】
これらは、例えば、以下の文献に従って進めることができる。
（ａ）タンパク質実験プロトコール第１巻 機能解析編，第２巻 構造解析編 （秀潤社） 西村善文，大野茂男 監修
（ｂ）改訂 タンパク質実験ノート  上 抽出と分離精製 （洋土社） 岡田雅人，宮崎香 編集
（ｃ）タンパク質実験の進めかた （洋土社） 岡田雅人，宮崎香 編集
【００２５】
本発明の一つの態様は、アミノ酸配列の改変を施した改変型ＰＱＱＧＤＨを反応させる工程を含むグルコース測定方法において、該改変型ＰＱＱＧＤＨを、少なくとも１種類の、１分子あたり２以上のカルボシキル基を有する物質の存在下で反応させる工程を含む、改変型ＰＱＱＧＤＨを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法である。
【００２６】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法において、ＰＱＱＧＤＨと共存させる物質としては、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、リンゴ酸、フタル酸、２−ケトグルタル酸、３，３−ジメチルグルタル酸、ピメリン酸、スベリン酸、アジピン酸、マレイン酸及びクエン酸からなる群より選ばれる物質のうち少なくとも1種類である。これらの共通する特徴は、１分子あたり２以上のカルボキシル基を有する物質であり、さらに分子中に水酸基やケト基のような別の官能基を有していてもよいということである。あるいは、ジカルボン酸もしくはトリカルボン酸とも特徴付けられる。
【００２７】
本発明の、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法にはさらにバッファー成分、界面活性剤、ＰＱＱＧＤＨの活性および安定性を最大限発揮させるための金属塩、親水性ポリマー及び各種安定化剤等を含んでいてもよい。バッファー成分としては特に限定しないが、例えば、リン酸カリウム塩、リン酸ナトリウム塩、ＰＩＰＥＳやＭＥＳなどのＧＯＯＤの緩衝剤、酢酸、グリシン、ホウ酸等を挙げることができる。また界面活性剤は特に限定しないが、各種Ｔｒｉｔｏｎ、Ｔｗｅｅｎ、胆汁酸、ＳＤＳ等を挙げることができる。また、金属塩としては活性中心に結合することが知られているカルシウムを含む化合物がより好適である。安定化剤としては例えば牛血清アルブミン・卵白アルブミン等のタンパク質、グルタミン・リジン及びグルタミン酸に代表されるアミノ酸等を挙げることができる。
【００２８】
本発明の、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法に含まれる、分子中に２以上のカルボキシル基を有する物質の含有量は、基質特異性の向上に効果がある範囲であればよく、特に限定しないが、該組成物が凍結乾燥品のような固体状の場合は好ましくは０．４％以上であり、より好ましくは２％〜８０％である。また該組成物が液状の場合、分子中に２以上のカルボキシル基を有する物質の濃度は好ましくは１ｍＭ以上であり、より好ましくは５ｍＭ〜１００ｍＭである。
また、別の観点からは、固体状もしくは液体状の該組成物における分子中に２以上のカルボキシル基を有する物質の好適な含有量は、共存するＰＱＱＧＤＨ１分子あたり１０分子以上であり、さらに好ましくは共存するＰＱＱＧＤＨ１分子あたり１０３〜１０７分子であるのがよい。
【００２９】
また、本発明の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法は、該ＰＱＱＧＤＨの等電点未満であり、ＰＱＱＧＤＨ表面の電荷が正に傾倒するｐＨ範囲であれば効果を奏すると考えられ、その範囲の上限はおおむねｐＨ９．０以下である。但し、よりマルトース作用性の絶対値を低めるには好ましくは測定反応時のｐＨが７．０以下であり、さらに好ましくは反応測定時のｐＨが６．０以下であるのがよい。下限は、ＰＱＱＧＤＨが活性を示す限りとくに限定されないが、好ましくはｐＨ４．０以上であり、さらに好ましくはｐＨ５．０以上である。
【００３０】
ｐＨの調整は組成物の作製時にあらかじめ行ってもよく、また測定直前に行ってもよい。ｐＨ調製の方法は常法に従えばよく、ｐＨをモニタリングしながら例えばＨＣｌ、リン酸、酢酸のような酸あるいはＫＯＨやＮａＯＨのようなアルカリを適宜添加することでなされる。
【００３１】
本発明の改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法においては、添加したカルボン酸のカルボキシル基は、ＰＱＱＧＤＨにあって溶媒に接する部分の正電荷を帯びた残基すなわちリジンやアルギニンンのような残基と電荷的な親和性を有すると考えられる。ここで物質１分子あたりに２以上のカルボキシル基を添加するのは、ＰＱＱＧＤＨ表面と電気的親和性により吸着するカルボキシル基の他に１以上のフリーのカルボキシル基が必要なためである。本発明に用いる改変型ＰＱＱＧＤＨは、二糖類に対する反応性が低下している場合にあっては、アミノ酸配列の改変によって反応中心と基質との相互作用の様式に変化が生じている。二糖としてマルトースを例に挙げるならば、ＰＱＱＧＤＨとの反応でマルトースの一方の環の１位水酸基が酸化されてケトンとなると考えられるが、基質特異性に変化のある改変型ＰＱＱＧＤＨにおいては、反応に寄与しない、すなわち活性中心に認識されない側の環への物理化学的作用の影響を受けやすくなっており、これが基質特異性の変化という結果に結びついていると考えられる。このような状態にあっては、ＰＱＱＧＤＨの表面に吸着したカルボン酸が有するフリーのカルボキシル基がマルトースの活性中心部位との親和性を損ねるに寄与していると推察することができる。こうした効果に直接寄与しているカルボン酸分子が吸着するＰＱＱＧＤＨ上の部位としては、２８位、１４２位、２９２位、３００位のリジン残基もしくは４５位アルギニン残基が考えられる。この部位に電荷的に結合したカルボン酸のフリーのカルボキシル基が二糖の活性中心への親和性を損ねる作用を及ぼしているものと推察される。また、本発明はより好適には測定時のｐＨが７．０以下、さらに好ましくは６．０以下であるのがよいが、これは該ＰＱＱＧＤＨの溶媒に接する部分の正電荷がより強い状態において上記作用がより効果的になされるためであると考えられる。
【００３２】
こうした理論に基づけば、もともとの特性として野生型に比し基質特異性に向上の見られる改変型ＰＱＱＧＤＨであれば、程度の違いはあれ本発明の実施によりグルコース測定反応時におけるさらなる基質特異性の向上に効果があると予想される。
【００３３】
本発明はまた、組成物として、電子の授受に寄与するメディエーターを含む、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法を包含する。本特許に記載するメディエーターは特に限定されないが、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、２，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ−ｉｎｄｏｐｈｅｎｏｌ（ＤＣＰＩＰ）、フェロセンおよびその誘導体、フェリシアン化物等を例示することができる。さらに、メトキシ−フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）と２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）との組み合わせ、ＰＭＳとニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）との組み合わせ、ＤＣＰＩＰ単独、フェリシアン化物イオン（化合物としてはフェリシアン化カリウムなど）単独、フェロセン単独などが例示できる。より好適にはフェリシアン化物塩、最も好適にはフェリシアン化カリウムを用いるのがよい。
これらの各メディエーターは感度に様々な違いが存在するするために、添加濃度を一律に規定する必要性はないが、一般的には１ｍＭ以上の添加が望ましい。
これらのメディエーターは測定時に添加してもよいし、後記するグルコース測定用試薬、グルコースアッセイキットあるいはグルコースセンサーを作製するときに予め含有させておくこともできる。なお、その際には、液体状態、乾燥状態などの形態は問われず、測定時に反応時に解離してイオンの状態になるようにしておけばよい。
【００３４】
本発明の別の一つの態様は、改変型ＰＱＱＧＤＨを反応させる工程が、アミノ酸配列の改変を施した改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコース測定用試薬組成物においてなされることを含む、改変型ＰＱＱＧＤＨを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法を含む。
このときさらに別の態様として、グルコース測定用組成物がグルコースアッセイキットに含まれる形態であってもよい。また、カルボキシル基を有する化合物は、測定対象であるグルコース含有検体を添加する直前に加えてもよく、また組成物作製時にあらかじめ添加しておいてもよい。また、本発明の方法においては、測定時に各種バッファー成分、金属塩、界面活性剤、親水性ポリマー及び各種安定化剤等を組成物にあらかじめ含んでおくかあるいは測定時に添加してもよい。このような成分の例は、記載のとおりである。
【００３５】
本発明の別の一つの態様は、改変型ＰＱＱＧＤＨを反応させる工程が、アミノ酸配列の改変を施した改変型ＰＱＱＧＤＨを含み、かつ、少なくとも作用極と対極からなる電極を含むグルコースセンサーにおいてなされることを含む、改変型ＰＱＱＧＤＨを反応させる工程を含むグルコース測定においてマルトースに対する作用性を低減させる方法を含む。
このときさらに別の態様として、グルコースセンサーにおける反応が、改変型ＰＱＱＧＤＨを含む反応溶液に電圧を印加し、メディエーターの酸化電流を測定してなる形態であってもよい。あるいは、さらに参照極を具備するものであってもよい。またこのようなグルコースセンサーは、デバイス中にＰＱＱＧＤＨおよびメディエーターを流出不可能な状態に封入するかもしくは基盤上に固定化した連続測定可能な形態のものでもよく、またＰＱＱＧＤＨおよびメディエーターを交換可能なチップ上に装備させる形態のものでもよい。
【００３６】
本発明の別の一つの態様は、アミノ酸配列の改変を施した改変型ＰＱＱＧＤＨ、および、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、リンゴ酸、フタル酸、２−ケトグルタル酸、３，３−ジメチルグルタル酸、ピメリン酸、スベリン酸、アジピン酸、マレイン酸及びクエン酸からなる群より選ばれる、１分子あたり２以上のカルボシキル基を有する物質を含む、改変型ＰＱＱＧＤＨを用いたグルコース測定用組成物においてマルトースに対する作用性が低減したグルコース測定用組成物、または、グルコースセンサーを含む。
【００３７】
本発明の別の一つの態様は、コハク酸、マロン酸、グルタル酸、リンゴ酸、フタル酸、２−ケトグルタル酸、３，３−ジメチルグルタル酸、ピメリン酸、スベリン酸、アジピン酸、マレイン酸及びクエン酸からなる群より選ばれる、１分子あたり２以上のカルボシキル基を有する物質を含有させる工程を含む、改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコース測定用組成物においてマルトースに対する作用性が低減したグルコース測定用組成物、または、グルコースセンサーの製造方法を含む。
【００３８】
上記各形態において、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨ、グルコース測定用組成物、グルコースアッセイキットならびにグルコースセンサーは、液状（水溶液、懸濁液等）、粉末、凍結乾燥など種々の形態をとることができる。凍結乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。
【００３９】
凍結乾燥組成物中においては、ＰＱＱＧＤＨ含有量は、酵素の起源によっても異なるが、通常は約５〜５０％（重量比）の範囲で好適に用いられる。酵素活性に換算すると、１００〜２０００Ｕ／ｍｇの範囲で好適に用いられる。
【００４０】
さらに上記各形態において、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨ、グルコース測定用組成物、グルコースアッセイキットならびにグルコースセンサーは、その形態や使用方法に応じて、精製された状態であっても良いし、必要により他の成分、例えば界面活性剤、安定化剤、賦形剤など種々の添加物が加えられていても良い。
本発明へのそれらの添加物の配合法は特に制限されるものではない。例えばＰＱＱＧＤＨを含む緩衝液に安定化剤を配合する方法、安定化剤を含む緩衝液にＰＱＱＧＤＨを配合する方法、あるいはＰＱＱＧＤＨと安定化剤を緩衝液に同時に配合する方法などが挙げられる。
【００４１】
例えば、改変型ＰＱＱＧＤＨタンパク質に（１）アスパラギン酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、リンゴ酸、α−ケトグルコン酸、α−サイクロデキストリンおよびそれらの塩からなる群から選ばれた１種または２種以上の化合物および（２）アルブミンを共存せしめることにより、改変型ＰＱＱＧＤＨをさらに安定化することができる。
アスパラギン酸、グルタミン酸、αーケトグルタル酸、リンゴ酸、及びαーケトグルコン酸の塩としては、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、及びマグネシウム等の塩が挙げられるが特に限定されるものではない。上記化合物とその塩及びα−シクロデキストリンの添加量は、１〜９０％（重量比）の範囲で添加することが好ましい。これらの物質は単独で用いてもよいし、複数組み合わせてもよい。
【００４２】
また、カルシウムイオンを添加しても安定化効果が得られる。すなわち、カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させることにより、改変タンパク質を安定化させることができる。カルシウム塩としては、塩化カルシウムまたは酢酸カルシウムもしくはクエン酸カルシウム等の無機酸または有機酸のカルシウム塩などが例示される。また、水性組成物において、カルシウムイオンの含有量は、１×１０−４〜１×１０−２Ｍであることが好ましい。
カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させることによる安定化効果は、グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されたアミノ酸を含有させることにより、さらに向上する。
グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されるアミノ酸は、１種または２種以上であってもよい。前記の水性組成物において、グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されたアミノ酸の含有量は、０．０１〜０．２重量％であることが好ましい。
このほか、凍結乾燥安定剤として、Ｎ−カルバモイル−β−Ｄ−グルコピラノシルアミンなどのグルコシルウレイド化合物を用いることもできる。
【００４３】
含有される緩衝液としては特に限定されるものではないが、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられるが、カルシウムと不溶性の塩を形成しない緩衝液はすべて使用可能である。該緩衝液のｐＨは５．０〜１０．０程度の範囲で使用目的に応じて調整される。凍結乾燥物中においては緩衝剤の含有量は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．１％（重量比）以上、特に好ましくは０．１〜３０％（重量比）の範囲で使用される。
【００４４】
また、さらに血清アルブミンを含有させてもよい。前記の水性組成物に血清アルブミンを添加する場合、その含有量は０．０５〜０．５重量％であることが好ましい。
使用できるアルブミンとしては、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）などが挙げられる。特にＢＳＡが好ましい。該アルブミンの含有量は、好ましくは１〜８０％（重量比）、より好ましくは５〜７０％（重量比）の範囲で使用される。
【００４５】
一方、上記各形態において、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨ、グルコース測定用組成物、グルコースアッセイキットならびにグルコースセンサーは、宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分を含有しない構成とすることもできる。
宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分としては、例えばＢＳＡ等の生体由来物質が挙げられる。
このような構成にすることにより、グルコース測定系における非特異反応が低減する可能性が考えられる。
【００４６】
この場合、組成物は、改変型ＰＱＱＧＤＨとカルシウムまたはカルシウム塩、及び緩衝剤から基本的に成る。
【００４７】
カルシウムの供給形態としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の無機酸または有機酸のカルシウム塩を挙げることができる。また、粉末組成物において、カルシウムの含有量（Ｗ／Ｗ）は、０．０５％〜５％であることが望ましい。
【００４８】
緩衝剤としては、一般的に使用されるものであれば良く、通常、組成物のｐＨを５〜１０とするものが好ましい。但し、リン酸バッファーのようにカルシウムと不溶性の塩を形成する可能性のあるものはその添加条件に留意する必要がある。またトリスアミノメタンのようにアミノ基末端を有するものは、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼのＰＱＱ結合を不安定とする可能性があるためその添加条件に留意する必要がある。このため、緩衝剤としてさらに好ましくは、ホウ酸や酢酸といった緩衝剤や、ＢＥＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＣＨＥＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅといったグッド緩衝剤が挙げられる。
また、粉末組成物において、緩衝剤の含有量（Ｗ／Ｗ）は、１．０％〜５０％であることが望ましい。
【００４９】
また、改変型ＰＱＱＧＤＨとカルシウムまたはカルシウム塩、及び緩衝剤から基本的に成る組成物に、アミノ酸、あるいは有機酸をさらに加えてもかまわない。    
また、これらを含有するものであれば、水性組成物、凍結乾燥物を問わない。
【００５０】
本発明の測定方法においてはグルコースの測定はメディエーターあるいは発色試薬の発色・減色に起因する特定波長の吸光度の増減を指標とする、いわゆる比色法を採用することもでき、あるいは反応溶液に電圧を印加しメディエーターの酸化電流値を元に測定することもできる。
【００５１】
本発明におけるグルコース測定方法においては、検体中のグルコースすべてをＰＱＱＧＤＨと反応させた後に蓄積された還元型メディエーターを測定する、いわゆるエンドポイント測定を行ってもよく、また基質であるグルコース濃度依存的なＰＱＱＧＤＨ酵素活性を測定する、いわゆるレート測定を行ってもよい。
【００５２】
グルコース測定用試薬
本発明のグルコース測定用試薬は、典型的には、ＰＱＱＧＤＨ、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明のＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
【００５３】
グルコースアッセイキット
本発明のグルコースアッセイキットは、典型的には、ＰＱＱＧＤＨ、緩衝液、メディエーターなど測定に必要な試薬、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のキットは、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明のＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
【００５４】
本発明のグルコース測定用組成物およびグルコース測定方法は、より具体的には以下の形態をとることができる。
【００５５】
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従うグルコース測定用組成物を含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
【００５６】
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従うグルコース測定用組成物を用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはメディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、ＰＱＱを別の層としてまたは溶液中で提供することもできる。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００５７】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、ＰＱＱおよびＣａＣｌ２、およびメディエーターを加えて一定温度に維持する。作用電極として本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【実施例】
【００５８】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、いうまでもなく本実施例は本特許出願の範囲を限定するものではない。
【００５９】
実施例１：変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の遺伝子組換え生産菌作製
野生型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の発現プラスミドｐＮＰＧ５は、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）のマルチクローニング部位にアシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）  ＮＣＩＭＢ１１５１７株由来のＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする構造遺伝子を挿入したものである。この組換えプラスミドｐＮＰＧ５と変異導入部位のアミノ酸をコードするトリプレットを中央に含む４０ｍｅｒ程度の合成オリゴヌクレオチドを基に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って変異処理操作を行い、１６８位ＧｌｎをＡｌａに、１６９位ＬｅｕをＰｒｏに、１７０位ＡｌａをＭｅｔに、２４５位ＧｌｕをＡｓｐに、３４２位ＭｅｔをＩｌｅに、３５１位ＡｌａをＴｈｒにそれぞれ置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ａ３５１Ｔ）を取得した。このｐＮＰＧ５−Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ａ３５１ＴのＤＮＡ５μｇを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ（東洋紡績製）で切断して、変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の構造遺伝子部分を単離した。単離したＤＮＡとＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断したｐＴＭ３３（１μｇ）とＴ４ＤＮＡリガーゼ１単位で１６℃、１６時間反応させ、ＤＮＡを連結した。連結したＤＮＡはエシェリヒア・コリＤＨ５αのコンピテントセルを用いて形質転換を行った。得られた発現プラスミドをｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ａ３５１Ｔと命名した。この発現プラスミドをシュードモナス・プチダＴＥ３４９３（微工研寄１２２９８号）にエレクトロポレーションにより形質転換し、得られた形質転換体を改変型ＰＱＱＧＤＨ生産菌とした。
【００６０】
試験例１
ＧＤＨ活性の測定方法
測定原理
Ｄ−グルコース＋ＰＭＳ＋ＰＱＱＧＤＨ  →  Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン  ＋  ＰＭＳ（ｒｅｄ）
ＰＭＳ（ｒｅｄ）  ＋  ＤＣＰＩＰ  →  ＰＭＳ  ＋  ＤＣＰＩＰ（ｒｅｄ）
フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）（ｒｅｄ）による２，６−ジクロロフェノール-インドフェノール（ＤＣＰＩＰ）の還元により形成されたＤＣＰＩＰ（ｒｅｄ）の存在は、６００ｎｍで分光光度法により測定した。
単位の定義
１単位は、以下に記載の条件下で１分当たりＤＣＰＩＰ（ｒｅｄ）を１．０ミリモル形成させるＰＱＱＧＤＨの酵素量をいう。
（３）方法
試薬
Ａ．Ｄ−グルコース溶液：１．０Ｍ（１．８ｇ  Ｄ−グルコース（分子量１８０．１６）／１０ｍｌ  Ｈ２Ｏ）
Ｂ．ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液，  ｐＨ６．５：５０ｍＭ（６０ｍＬの水中に懸濁した１．５１ｇのＰＩＰＥＳ（分子量３０２．３６）を、５Ｎ  ＮａＯＨに溶解し、２．２ｍｌの１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加える。５Ｎ  ＮａＯＨを用いて２５℃でｐＨを６．５±０．０５に調整し、水を加えて１００ｍｌとした。）
Ｃ．ＰＭＳ溶液：２４ｍＭ（７３．５２ｍｇのフェナジンメトサルフェート（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｄ．ＤＣＰＩＰ溶液：２．０ｍＭ（６．５ｍｇのニトロテトラゾリウムブルー（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｅ．酵素希釈液：１ｍＭ  ＣａＣｌ２，  ０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  ０．１％  ＢＳＡを含む５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）
手順
遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した（用時調製）
１．    ４．５ｍｌ  Ｄ−グルコース溶液          （Ａ）
２１．９ｍｌ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）    （Ｂ）
２．０ｍｌ  ＰＭＳ溶液                              （Ｃ）
１．０ｍｌ  ＤＣＰＩＰ溶液                              （Ｄ）
【００６１】
上記アッセイ混合物中の濃度は次のとおり。
ＰＩＰＥＳ緩衝液  ３６ｍＭ
Ｄ−グルコース  １４８ｍＭ
ＰＭＳ  １．５８ｍＭ
ＮＴＢ  ０．０６６ｍＭ
【００６２】
３．０ｍｌの反応混合液を試験管（プラスチック製）に入れ、３７℃で５分間予備加温した。
０．１ｍｌの酵素溶液を加え、穏やかに反転して混合した。
６００ｎｍでの水に対する吸光度の減少を３７℃に維持しながら分光光度計で４〜５分間記録し、曲線の初期直線部分からの１分当たりのΔＯＤを計算した（ＯＤテスト）。
同時に、酵素溶液に代えて酵素希釈液（Ｅ）加えることを除いては同一の方法を繰り返し、ブランク（ΔＯＤブランク）を測定した。
アッセイの直前に氷冷した酵素希釈液（Ｅ）で酵素粉末を溶解し、同一の緩衝液で０．０５−０．１０Ｕ／ｍｌに希釈した（該酵素の接着性のためにプラスチックチューブの使用が好ましい）。
計算
活性を以下の式を用いて計算する：
Ｕ／ｍｌ＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤテスト−  ΔＯＤブランク）×Ｖｔ×ｄｆ｝／（１６．８×１．０×Ｖｓ）
Ｕ／ｍｇ＝（Ｕ／ｍｌ）×１／Ｃ
Ｖｔ：総体積（３．１ｍｌ）
Ｖｓ：サンプル体積（０．１ｍｌ）
１６．８：上記測定条件でのＤＣＰＩＰのミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）
１．０：光路長（ｃｍ）
ｄｆ：希釈係数
Ｃ：溶液中の酵素濃度（ｃ  ｍｇ／ｍｌ）
【００６３】
実施例２：ホロ型発現精製酵素の調製
５００ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ  ｂｒｏｔｈを２Ｌ容坂口フラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したストレプトマイシンを１００μｇ／ｍｌになるように添加した。この培地に１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＰＹ培地で予め３０℃、２４時間培養したシュードモナス・プチダＴＥ３４９３（ｐＮＰＧ６−Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ａ１７０Ｍ＋Ｅ２４５Ｄ＋Ｍ３４２Ｉ＋Ａ３５１Ｔ）の培養液を５ｍｌ接種し、３０℃で４０時間通気攪拌培養した。培養終了時のＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素活性は、前記活性測定において、培養液１ｍｌ当たり約５Ｕ／ｍｌであった。
上記菌体を遠心分離により集菌し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、超音波処理により破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液をＨｉＴｒａｐ−ＳＰ（アマシャムバイオサイエンス）イオン交換カラムクロマトグラフィーにより分離・精製した。次いで１０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）で透析した後に終濃度が１ｍＭになるように塩化カルシウムを添加した。最後にＨｉＴｒａｐ−ＤＥＡＥ（アマシャムバイオサイエンス）イオン交換カラムクロマトグラフィーにより分離・精製し、精製酵素標品を得た。本方法により得られた標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一なバンドを示した。
【００６４】
実施例３：改変型ＰＱＱＧＤＨの基質特異性確認
実施例２で作製した精製改変型ＰＱＱＧＤＨのマルトースに対する作用性を、野生型ＰＱＱＧＤＨ（東洋紡製ＧＬＤ−３２１）と比較した。それぞれを試験例１の方法（但し、アッセイ混合物中の基質濃度は４．８ｍＭとした）で、基質としてグルコースを用いた場合とマルトースを用いた場合とでそれぞれ活性を算出し、グルコース使用時に対するマルトース使用時の活性値の割合を計算しマルトース作用性とした。結果、野生型のマルトース作用性は１１０％であったのに対し、改変型ＰＱＱＧＤＨのマルトース作用性は１３％であり、基質特異性の向上を達成していることを確認した。
【００６５】
実施例４：改変型ＰＱＱＧＤＨを装着したグルコース電極の作製
乳鉢にカーボングラファイト０．５ｇをのせ、流動パラフィン０．３ｍＬを加えて乳棒で３０分練り、カーボンペーストを作製した。作製したカーボンペーストは白金電極上に練りこみ、さらに実施例２で作製した改変型ＰＱＱＧＤＨ溶液（２，０００Ｕ／ｍＬ）を１０μＬ添加して室温で３０分風乾した。風乾した酵素電極上に分子量８，０００カットのセルロース半透膜を被せ、プラスチック製のＯリングで半透膜を固定した。こうして作製したグルコース電極は、あらかじめ氷冷した反応用溶媒に３０分浸漬した後使用した。
【００６６】
実施例５：グルコース測定における基質特異性と溶質との関連性確認
溶質として、表１に記載の物質を用意し、それぞれ終濃度５０ｍＭのバッファー（ｐＨ５．５）を作製した。それぞれの溶媒は表に記載の溶質の他に活性化・安定化剤として１ｍＭの塩化カルシウム及び界面活性剤として０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含んでいる。作製した各溶媒には終濃度０．１Ｍとなるようフェリシアン化カリウムを溶解し、反応液とした。２５℃に保温したキュベットに２０ｍｌの反応液を入れ、これに実施例４のグルコース電極（作用極）、対極として白金電極、及び参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌ電極を浸し、＋０．３５Ｖの電圧を印加した。電流値が一定になった後にグルコースもしくはマルトースを終濃度４ｍＭとなるよう添加し、これに応答する電流値をモニタリングした。マルトース作用性は、グルコースを添加した場合の応答電流値をＡ、マルトースを添加したときの応答電流値をＢとして、マルトース作用性＝Ｂ／Ａ×１００（％）として算出した。各溶質を用いた場合のマルトース作用性を表１に示す。
【００６７】
【表１】
2007043982.tif 000002
【００６８】
汎用バッファー成分であるリン酸、ＧＯＯＤ緩衝材のＭＥＳおよびモノカルボン酸である酢酸を用いた場合に比べ、ジカルボン酸およびトリカルボン酸を用いた場合ではマルトース作用性の低減がみられた。
【００６９】
実施例６：グルコース測定におけるｐＨ条件の基質特異性への影響確認
１ｍＭの塩化カルシウムおよび０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む５０ｍＭのリン酸もしくはピメリン酸溶液（ｐＨはそれぞれ５．０、６．０、７．０の３種類）を作製した。それぞれについて実施例５の方法に従ってグルコース電極のマルトース作用性を調べた。結果を表２に示す。
【００７０】
【表２】
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【００７１】
結果からわかるように、ピメリン酸を溶質としｐＨを低減した場合でよりマルトース作用性が低減することが確認された。本明細中に記載の理論からは分子中に２以上のカルボシキル基を有する他の物質を用いた場合でも同様の結果が得られると推測される。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明によれば、基質特異性が改善されたグルコース測定用組成物もしくはグルコース測定方法を得ることができる。このグルコース測定用組成物もしくはグルコース測定方法は、グルコースアッセイキット、グルコースセンサーに利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】アシネトバクター・バウマンニ  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列（本図上段の配列）と、アシネトバクター・カルコアセティカス  ＬＭＤ７９．４１株由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列（本図下段の配列）比較。なお本願明細書中での、アシネトバクター・バウマンニ  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列は、本図においてのみ、シグナル配列を含む開始メチオニンを１としてつけられている。配列番号１の１番目のアスパラギン酸は本図では２６番目にあたる。
【図２】アシネトバクター・バウマンニ  ＮＣＩＭＢ  １１５１７株由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列（本図上段の配列）と、アシネトバクター・カルコアセティカス  ＩＦＯ  １２５５２株由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列（本図下段の配列）比較。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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