(57)【要約】【課題】  マイクロ流体デバイスで電気泳動力あるいは光トラップ力を利用して成分の分離や分析をおこなう従来方法には、流路が短いために高い段数の分離、精度の良い分析が得られないという課題がある。【解決手段】  流路の一部を液体コア光ガイドで構成したマイクロ流体デバイスを用い、液体コア光ガイド部分の端面から波長の異なる２つのレーザー光を入射して移動干渉縞を生成し、液体コア光ガイドへ導入されて静止している試料溶液プラグへ、移動干渉縞からの光勾配力を作用させる。この方法により、短い流路内で鮮鋭なクロマトグラムを得ることが可能になり、マイクロ流体デバイスで精度の良い分離と分析が実現する。【選択図】  図６
2007083130.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板に埋め込まれた液体コア光ガイドのコアが流路の一部分を構成するマイクロ流体デバイスを用い、前記液体コア光ガイドに形成された光の干渉縞からの作用により、前記コア内へ導入された試料溶液を成分へ分離することを特徴とする分離方法
【請求項２】
請求項１の分離方法であって、波長の異なる２つのレーザー光を前記液体コア光ガイドの端面から入射して移動干渉縞を形成することを特徴とする分離方法
【請求項３】
請求項２の分離方法において、前記試料溶液を液体コア光ガイド部分のコア内へ導入してから流れを停止し、静止状態で成分へ分離することを特徴とする分離方法
【請求項４】
請求項３の分離方法を用い、前記液体コア光ガイドの端面からレーザー光を入射する光学系と、前記コア内へ試料溶液を導入する流体回路とを備えた分析装置
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流体デバイスを用いて生物物質などを分離する技術に係わり、特に、光の干渉縞を用いて試料を成分に分離する分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
分析速度の向上、試料の少量化、装置の小型化などの利点により、近年、多く用いられるようになったマイクロ流体デバイスでは、シンプルな構成でも比較的高い精度の分離が実現できる電気泳動法とその派生技術である電気浸透流を用いる方法、さらには試料を修飾して帯電させるミセル動電クロマトグラフィーなど、キャピラリー電気泳動法と総称される分離手法が広く応用されている。
【０００３】
しかし、本来のキャピラリー電気泳動法では３０ｃｍから１ｍ程度の長さの石英ガラスキャピラリーなどが用いられるが、マイクロ流体デバイスでは数ｃｍ程度の短い分離距離しか確保できない。そのためマイクロ流体デバイスに電気泳動法などの分離手法を適用しても、充分な分析精度が得られないという課題がある。また、マイクロ流体デバイスの流路形状や流路サイズは石英ガラスキャピラリーに比べてばらつきが大きく、これも分析精度を低下させる原因となっている。
【０００４】
また、マイクロ流体デバイスを用いた分離や分析では、検出感度向上のために試料に蛍光標識や化学的修飾を施すことが多い。しかし、タンパク質などの生物物質を試料とした場合、化学的修飾や化学薬品の投入は、試料に自然状態とは異なる相を示させる可能性があり、また分析後の試料を元の状態で回収することが難しいという課題がある。特にタンパク質の試料ではコンフォメーション変化や変質を生じ易い。
【０００５】
特許文献１に、試料の化学的な修飾あるいは標識が不要で、流路断面形状の精度の影響を受けにくい分離方法が開示されている。この方法は、干渉縞の光勾配力（光トラップ力）が、試料の成分ごとに異なる制動力として作用することを利用する。しかしこの方法も、固定相への吸着力を利用する従来からの液体クロマトグラフィーと同じように、分離距離と分離時間が長いほど高い分離性能が得られるという特性があり、マイクロ流体デバイスでは流路が短いという特有の条件に制限されるため、充分な分離性能が得られない。
【特許文献１】特許公開平７−２４３１１
【特許文献２】特許公開２００３−２７９４７１
【特許文献３】ＷＯ  ００／３９６１５（ＰＣＴ／ＵＳ９９／３０７７４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のように、マイクロ流体デバイスで電気泳動力あるいは光トラップ力を利用した成分の分離、分析をおこなう従来方法には、短い流路内で高い理論段数の分離、精度の良い分析が得られないという課題がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、流路の一部を液体コア光ガイドで構成したマイクロ流体デバイスを用い、液体コア光ガイド部分の端面から波長の異なる２つのレーザー光を入射して移動干渉縞を生成し、液体コア光ガイド内に導入されて静止している試料溶液プラグへ、移動干渉縞からの光勾配力を作用させて分離をおこなうことにより前記課題を解決する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の分離方法により、流れ（移動相）を作用させずに、短い流路内で鮮鋭なクロマトグラムを得ることが可能になる。したがって本発明は、特にマイクロ流体デバイスに適した分離方法であり、マイクロ流体デバイスを用いた高段数、低ノイズの分離と、精度の良い分析装置を実現する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明による光の移動干渉縞を用いた分離方法と、それに基づくマイクロ流体デバイスと分析装置を、詳細に説明する。
【実施例１】
【００１０】
まず最初に、本発明の原理的な背景を説明する。光勾配力は、光強度（あるいは電界の２乗）の勾配、屈折率の２乗（あるいは誘電率）、粒子の体積（あるいは粒子径の３乗）に比例する力で、バイオ研究の分野では、細胞やバクテリア、金粒子などをマニピュレートするレーザーピンセットとして利用されている。この光勾配力は粒子の体積（あるいは径の３乗）に比例するので、粒子径が１０ｎｍ以下のタンパク質分子のサイズとなると非常に弱くなり、熱ゆらぎ（ブラウン運動）より弱くなるため、レーザーピンセットのように完全に粒子を捕捉し続けることは難しくなる。
【００１１】
完全な捕捉は難しい小さな粒子でも、統計的にある時間の比率で光干渉縞への捕捉と離脱を繰り返し、しかも小さめの分子は短め（大きめの分子は長め）の捕捉時間割合となる。そのため流れの場においては、干渉縞領域内での速度が粒子の小さい順に速い（速度が、大き目の分子＜小さ目の分子＜キャリヤー液体）あるいは、干渉縞領域を横断する時間は粒子の小さい順に短い（横断時間が、大き目の分子＞小さ目の分子＞キャリヤー液体）という効果が現れるので、粒子のサイズによる分離が可能である。つまり液体クロマトグラフィーに例えるならば、光干渉縞が固定相、キャリヤー液体が移動相に相当する役割を担う。
【００１２】
しかし流れの場を使うかぎり、マイクロ流体デバイスのように短い流路に制限される装置では、高精度の分離や分析が難しい。また、特許文献１に開示されている技術のように、マイクロ流体デバイスの上面から、マイクロ流路を横断する方向へ干渉縞を入射する構成では、入射レーザービーム径よりも広い幅の干渉縞を形成することは難しい。そこで本発明では次の２つの概念、（１）静止した試料溶液に移動干渉縞を作用させることと、（２）流路の流れ方向へレーザー光を入射することによりこの問題を解決した。
【００１３】
上記の概念（１）は、固定相の役割をする干渉縞を移動させ、本来は移動相である試料溶液を逆に静止させるという、従来の液体クロマトグラフィーとは逆の考え方であり、そしてこれは、光の干渉縞が、物質とは異なり無限に通過させ続けることができるので可能となる技術である。干渉縞の移動速度は２つの干渉光の周波数の差で決定することができる。
【００１４】
また光の直進性を考慮すると、特許文献２に開示されている技術のように、１００μｍ前後の断面サイズであるマイクロ流路の中を、数十ｍｍの距離にわたりレーザー光を通過させることは、マイクロ流路の加工精度や光学系の調整の面でも非常に難しい。しかし近年、水よりも屈折率の低い透明材料のキャピラリーチューブが市販され、特許文献３に開示されている技術のように、液体コア光ガイド（あるいは、リキッド・コア・ウェイブガイドと呼ばれる）が容易に作成できるようになった。上記の概念（２）は、この液体コア光ガイドの使用により可能となる技術である。
【００１５】
図１に本発明の実施例による分析装置の全体構成図を示す。マイクロ流体デバイス２０には、キャリヤー液体流入ウェル２３を通じてキャリヤー液体３２を流入させるためのキャリヤー液体供給ポンプ１２、流出ウェル２９を通じて廃液３３を流出させる廃液回収ポンプ１３がチューブを介して接続され、流体回路を形成している。
【００１６】
また、マイクロ流体デバイス２０の流路位置に焦点を合わせた分光計測顕微鏡１６にはデーター解析装置１７が、データー解析装置１７にはさらにプロセス制御装置１８がインターフェースラインを介して接続されていて、プロセス制御装置１８はデーター解析装置１７からの情報による状況判断も加えながらプログラミングされたプロセスを運行し、他のインターフェースラインを介して接続されているキャリヤー液体供給ポンプ１２、廃液回収ポンプ１３、レーザー光学系１４、電気泳動用電源１５を制御する。
【００１７】
レーザー光学系装置１４は、本発明の重要な働きを担う光の移動干渉縞をマイクロ流体デバイス２０内に形成するための、２つの異なる波長のレーザー光の発振と制御、また、マイクロ流体デバイス２０内にレーザービームを入射するための光学系調節をおこなう。
【００１８】
図２に、本発明の実施例に使用するマイクロ流体デバイスの概略平面図を示す。マイクロ流体デバイス２０の基板内のマイクロ流路２１はＨ字状に掘られており、試料溶液注入ウェル２２、キャリヤー液体流入ウェル２３、２つの廃液流出ウェル２９の４つのウェルが終端を構成している。Ｈ字状のマイクロ流路２１を構成する流路のうち、２つのＴ字状交差点を結ぶ流路部分は本発明における試料分離をおこなう部分であり、基板に埋め込まれた液体コア光ガイド２４のコア部分が流路を担っている。
【００１９】
また、Ｈ字状流路内の２つのＴ字状交差点はマイクロ流体デバイスの側面から液体コア光ガイド２４の端面に向けてレーザー光を入射する部分であり、その外側にレーザー光学系装置１４に備えられた上流側レンズ２５と下流側レンズ２６の２つのレンズが設置される。入射されるレーザー光は、これらのレンズを介して液体コア光ガイド２４の端面付近で焦点を結び、さらに広がる光となり、液体コア光ガイド２４の内面で反射する光として流路を伝播する。
【００２０】
また、本実施例には、キャリヤー液体３２として硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）などのミセルを含む電気泳動液を使い、スウィーピング法による試料濃縮をおこなうための上流側電気泳動電極２７と下流側電気泳動電極２８を備えている。ただし、これらの電気泳動電極は必須ではなく、試料濃縮なしで分離する程度の精度でよい用途であれば、無くても構わない。
【００２１】
次に図３、図４、図５、図６を用いて本実施例の動作を説明する。図３は、実施例における試料溶液導入方法の説明図である。図３（ａ）で示すように、全体プロセスがスタートすると、キャリヤー液体供給ポンプ１２の圧力によりキャリヤー液体流入ウェル２３からキャリヤー液体３２が送り込まれ、全ての流路を満たし、余分の液体は廃液回収ポンプ１３の負圧（吸引）により廃液流出ウェル２９から排出される。全ての流路が新たに供給されたキャリヤー液体３２で満たされた後、図３（ｂ）で示すように、試料溶液３１が、試料溶液注入ピペット１１から試料溶液注入ウェル２２へ点滴により注入される。本実施例では、試料溶液注入ウェル２２をオープン状態（大気圧）で扱う。
【００２２】
図４は、実施例における試料プラグ生成方法の説明図である。図４（ａ）のように、キャリヤー液体供給ポンプ１２を停止状態として廃液回収ポンプ１３を駆動すると、廃液回収ポンプからの吸引力により、大気圧下にある試料溶液ウェル２２の試料溶液３１が流路内に流入する。図４（ａ）のように、一定量の試料溶液３１が液体コア光ガイド２４のコア内に流入した時点で廃液回収ポンプ１３を停止し、次の試料濃縮行程へ進む。
【００２３】
図５は、実施例における試料濃縮行程の説明図である。液体コア光ガイド２４のコア内に一定量の試料溶液３１が流入した状態で、図５（ａ）のように、電気泳動用電源１５から上流側電気泳動電極２７と下流側電気泳動電極２８の間に電圧が印加されると、キャリヤー液体３２内のミセルが電気泳動を開始する。電気泳動流れの途中に挟まる形で存在する試料溶液の内部をミセルが通過する際に、試料はミセルに囲まれて下流側へと電気泳動で移動し、図５（ｂ）のように、下流側のキャリヤー液との界面付近に濃縮され、試料溶液プラグ３４を形成する。つまり本実施例では、キャピラリー電気泳動法で使用される試料濃縮手法の１つであるスウィーピング法を適用する。濃縮された試料溶液プラグ３４が形成されたら電気泳動用電源１５からの電圧印加を停止し、次の分離行程へ進む。
【００２４】
図６は、実施例における試料成分の分離方法と分析行程の説明図である。図６（ａ）に示すように、液体コア光ガイド２４の左方（上流側）に設置した上流側レンズ２５を通して第１のレーザー光４１を入射し、右方（下流側）に設置した下流側レンズ２６を通して第２のレーザー光４２を入射すると、２つのレーザー光は液体コア光ガイド２４内で干渉縞を形成する。２つのレーザーの周波数（あるいは波長）が等しい場合には、空間的に静止した干渉縞が形成されるが、周波数（あるいは波長）が少し異なる場合には移動干渉縞４３が生成される。この移動干渉縞４３の移動方向は周波数の高い方のレーザー光が進む方向であり、かつ、移動干渉縞４３の移動速度は２つのレーザー光周波数の差に比例する。
【００２５】
静止した試料溶液プラグ３４に移動干渉縞４３を照射すると、干渉縞の最大傾斜部分（ほぼ光の波長の半分の周期で繰返す）から作用する光勾配力により、試料成分は干渉縞が移動する方向へ力を受けて移動し、含有成分に応じてバンド状に並ぶ分離試料パターン３５を形成する。図６（ｂ）のように、分離試料パターン３５は分光計測顕微鏡１６により流路に沿ってスキャンされ、電気信号に変換されたクロマトグラム３６が得られる。
【００２６】
光勾配力の大きさは、粒子の体積、粒子の誘電率（屈折率の２乗）に比例する。粒子体積や誘電率に応じて試料成分ごとに異なる大きさの力が、光干渉縞の移動方向へ作用し、試料成分ごとに異なる移動速度差あるいは移動距離となり、分離が進行する。この分離過程で重要なことは、通常の液体クロマトグラフィーのように流れの作用を必要としない点である。固定相に相当する光干渉縞が移動し、移動相に相当する流体は静止しているので、試料溶液プラグの原点は移動しない。したがって、分離用流路の全体を使って長い分離試料パターン３５を形成することができ、精度の良いクロマトグラム３６が得られる。
【００２７】
以上のように本実施例により、短い流路内で精度の良い分離が可能で、特に、流路長さに制限があるマイクロ流体デバイスに適した分離方法が実現する。
【００２８】
（変形例）
本発明の実施例においては、Ｈ字形をした流路形状のマイクロ流体デバイスを用いたが、本発明の主旨はレーザー光を導入しやすい流路の形状であればよく、それ以外に流路形状や分枝流路の数などに何ら制限を与えるものではない。したがってΠ字形やＴ字形の流路形状でも構わない。また分離に使われる主流路に光ガイドが用いられているので、光を通すために直線状である必要はなく、Ｕ字形や半円形のような曲線でも構わない。
【００２９】
また本発明の実施例においては、キャピラリー電気泳動で用いる代表的な試料濃縮方法であるスウィーピング法を適用して、幅の狭いプラグの生成をおこなったが、他の濃縮法であっても構わない。例えば、速い電気泳動速度の試料溶液を、試料を含まない遅い電気泳動速度の液体に向かって電気泳動させて２つの液体の境界に濃縮試料プラグを形成するスタッキング法であっても良い。本実施例のような流路でスタッキング法による試料濃縮をおこなう場合には、２つある廃液流出ウェルの片方を、電気泳動速度の遅いバッファ液を導入するための流入ウェルへ変更することで実現できる。
【００３０】
さらには、本発明の実施例において用いた濃縮過程は、必ずしも必要となるものではなく、分離精度が低くても良い用途であるならば電気泳動による濃縮過程を使用せずに、単なるキャリヤー液と切り取った試料プラグだけで分離する方法であっても構わない。
【００３１】
また本発明の実施例においては、液体コア光ガイドへ干渉光を導入するためのレンズを、レーザー光学系装置１４に受け持たせたが、これらのレンズはマイクロ流体デバイス基板に一体化して形成することも可能である。基板と一体形成のレンズにすれば、レーザー光導入のための光路調整が楽なマイクロ流体デバイスにすることができる。
【００３２】
また本発明の実施例においては、２つのレーザー光を液体コア光ガイドの両端から導入しているが、図７に示す変形例のように一端から２波長のレーザー干渉光を導入しても構わない。また、干渉光の導入方向は、図７とは逆の流出ウェル側の側面からであってもよい。
【００３３】
また本発明の実施例においては、分離状態の検出に分光計測顕微鏡を使ったが、充分高濃度のプラグであれば通常の顕微鏡によるクロマトグラムの取得でもよく、他の特殊な検出方法、例えば熱レンズ顕微鏡でも構わない。
【００３４】
また本発明の実施例においては、送液方法としてポンプを用いたが、送液方法はオープン状態の液体リザーバーの高さで水圧を調整する落差方式であってもよい。また試料の量が充分にあるならば、試料液体供給方法は、ウェルへの点滴ではなく、ポンプや落差による供給であっても構わない。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
以上述べたように、本発明による分離方法は、短い流路で鮮鋭なクロマトグラムを得ることができる。したがって、従来方法では充分な分離性能が得られなかったマイクロ流体デバイスを用いた分離に適しており、さらに、マイクロ流体デバイスを用いて生物物質や生理物質などの成分を精度良く分析する分析装置の用途に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の実施例による分析装置の全体構成図
【図２】本発明の実施例に使用するマイクロ流体デバイスの概略平面図
【図３】実施例における試料溶液導入方法の説明図
【図４】実施例における試料プラグ生成方法の説明図
【図５】実施例における試料濃縮行程の説明図
【図６】実施例における試料成分の分離方法と分析行程の説明図
【図７】本発明の変形例を示す図
【符号の説明】
【００３７】
１１  試料溶液注入ピペット
１２  キャリヤー液体供給ポンプ
１３  廃液回収ポンプ
１４  レーザー光学系装置
１５  電気泳動用電源
１６  分光計測顕微鏡  
１７  データー解析装置
１８  プロセス制御装置
２０  マイクロ流体デバイス
２１  マイクロ流路
２２  試料溶液注入ウェル
２３  キャリヤー液体流入ウェル
２４  液体コア光ガイド
２５  上流側レンズ
２６  下流側レンズ
２７  上流側電気泳動電極
２８  下流側電気泳動電極
２９  廃液流出ウェル
３１  試料溶液
３２  キャリヤー液体
３３  廃液
３４  試料溶液プラグ
３５  分離試料パターン
３６  クロマトグラム
４１  第１のレーザー光  
４２  第２のレーザー光
４３  移動干渉縞
４４  ハーフミラー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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