(57)【要約】  【課題】  ポテンショスタットを用いて電流を測定するクロノアンペロメトリー法では、参照極と作用極間の設定電位と実際の電位印加時の差分を補正値として対極に印加制御する、いわゆるフィードバック回路を構成しており、しばしば回路自身が発振現象を引き起こし、測定誤差、測定の不安定性を引き起こし正確な濃度を算出することが困難であった。  【解決手段】本発明の濃度測定装置は、作用極の時間的な電位変化を測定し、その測定結果であるピーク電位、任意時間における電位あるいは、ピーク電位に至る電位幅もしくはその時間から水溶液中に含まれる特定物質の濃度を算出する。  したがって、フィードバック回路は必要とせず、そのため発振現象も発生しない。  極めて測定回路が簡便になり、信頼性、安定性に優れた濃度測定装置が実現できる。【選択図】図１
2007085763.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気化学的検出手段と、該電気化学的検出手段から得られる濃度と相関する電位または電位の変化を求める電位測定手段と、該電位測定手段により求めた結果を用いて濃度を算出する濃度算出手段と、該濃度算出手段で求めた濃度を表示する表示手段とを有する濃度測定装置。
【請求項２】
前記電気化学的検出手段は、作用極と対極と参照極からなる３電極式であることを特徴とする請求項１に記載の濃度測定装置。
【請求項３】
前記電位測定手段は、電位測定開始から任意時間における電位を求めることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の濃度測定装置。
【請求項４】
前記電位測定手段は、電位測定開始からのピーク電位を求めることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の濃度測定装置。
【請求項５】
前記電位測定手段は、ピーク電位に至る時間を求めることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の濃度測定装置。
【請求項６】
前記電位測定手段は、初期電位からピーク電位に至る電位変化幅を求めることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の濃度測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液などの生体試料中、あるいは水溶液中に含まれる特定の成分濃度を測定するための濃度測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
水溶液中に含まれる特定の成分濃度を求める手法として、一般に電気化学的手法が用いられる。
電気化学的手法とは、化学物質の特性変化を化学反応の変化量から直接、電気量に変換して測定するもので簡便、高感度、リアルタイム検出など優れた特徴を有している。
電気化学的手法で得られる値は、電位、電流、時間あるいはこれらの相関関係であり、これらの測定結果の値を利用して目的物質を定量することができる。
これは、電極反応によって反応する物質量は電流量に比例する。反応物が違っても、同一電流量の電気分解によって電極に析出する物質の質量は各々の化学当量に比例する、
というファラデーの法則に基づいている。
【０００３】
電気化学的手法では、作用極と対極からなる２電極間に一定の電位を印加して、水溶液と電極間で起こる酸化還元電流の時間的変化を求めることが行われる。
上記の２電極式では、２電極間の電位印加によって起こる拡散によって２電極間の電位は常に変化しており、実際に印加される作用極の電位は判らない。
そこで、参照極を加えた３電極式も一般的に用いられている。
３電極式では、ポテンショスタットと呼ばれる制御方法で、作用極と対極間の電圧を制御するのではなく、参照極と作用極間の電位が一定になるように作用極と対極間の電位を制御するものである。
参照極は、水溶液中での基準電位となるので電極自身が反応せず、電位変化に対して常に元の電位に戻り高インピーダンスであることが望まれる。
いずれにしても、測定電極に一定の電位を印加して電流を求める、または、一定の電流を電極間に流して電位を求める方法により、目的とする水溶液中に含まれる特定の成分濃度を定量することができる。
前者はクロノアンペロメトリー法、後者はクロノポテンショメトリー法と呼ばれ、定量法では前者の手法が用いられることが多い。
【０００４】
水溶液中に含まれる特定の成分濃度を定量するクロノアンペロメトリー法とその構成について、作用極と対極と参照極の３電極を用いる方法を説明する。
図８は、従来技術における電気化学的検出手段であり、作用極と対極と参照極からなる３電極式によるポテンショスタットの構成を示す概略図である。
１０が作用極、１１が対極、１２が参照極、１３が第１の増幅器、１４が第２の増幅器、１５が差動増幅器、１６は電流検出抵抗、１７は検出電位、１８は設定電位である。
図８に示すように、参照極１２と作用極１０間に印加した電位の差分、この場合は、作用極を接地しているので、作用極１０に対する参照極１２の変化分を差動増幅器１５で検出電位１７を検出する。
そして、設定電位１８と検出電位１７との差分を検出量補正値として対極１１に帰還させて、常に参照極１２と作用極１０間の電位が設定した電位になるように対極１１の電位を制御している。
【０００５】
このように、参照極１２に対して作用極１０に電位を印加すると、作用極１０界面の電位は、作用極１０と水溶液の内部電位差のため、電位勾配ができる。この電位勾配の層を電気二重層という。
この電気二重層は、構造上容量として働き、水溶液である抵抗体を通して電流が流れると、電荷を充電または放電する。
この電流の時間変化は、指数関数的に減少し、その減衰速度は水溶液の抵抗と電気二重層容量との積、すなわち時定数で決まる。
ここで流れる電流は、電極反応とは無関係な電流である。
【０００６】
被測定対象である水溶液に酸化還元種が含まれている場合は、反応物質の濃度勾配の時間的変化、すなわち拡散の進行とともに電極に流れる電流が変化する。
この濃度勾配は、電解直後に最大となり、しだいに減少するため電流も減少する。
時間に対する電流変化は、電極形状、電極サイズにより異なるが、例えば、単純な平行平板電極を用いる場合は次のような関係式になる。
【数１】
2007085763.tif 000003
ここで、ｉは電流、ｎは係数、Ｆはファラデー定数、Ａは作用極面積、Ｄは拡散定数、Ｃは濃度、ｔは電解時間を表す。
この式は、コットレル式と呼ばれるもので、反応電流の拡散による時間変化を表す式である。
この式で求められる電流は、数１に示すようにファラデー電流であり、電解時間の平方根に反比例して減少するため、前述した電気二重層の充電電流とは異なる。
このように、反応電流は濃度に対し比例関係にあるので、測定した電流から目的物質の成分濃度を定量することができる。
【０００７】
例えば、クロノアンペロメトリー法を用いて目的物質の成分濃度を定量することは、特許文献１に記載されている。
これは、酵素電極を利用して生化学物質或いは酵素活性などを測定するための装置について記載されている。
一例として被測定対象である血液に含まれるグルコースを酸化酵素であるグルコースオキシダーゼを用いて酵素反応させ、グルコン酸と過酸化水素を生成させる。
この酵素反応は、試料中の酸素を消費して過酸化水素が生成されるので、酸素消費量或いは過酸化水素の生成量を測定すれば、グルコースの定量が可能となる。
過酸化水素を電気化学的に検出するには、０．７Ｖの電位が必要であるが、生体内の他物質、例えばアスコルビン酸なども検出してしまうため、現在では、酵素反応系に電子受容体を共存させ、検出目的以外の妨害物質を電極反応させない電位まで低下させるなどのセンサが開発されている。
【０００８】
【特許文献１】特公平１−５５４０５号公報（第１−２頁、第５図）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このように、ポテンショスタットによる制御を用いて、クロノアンペロメトリー法で求めた電流の時間変化から水溶液中に含まれる特定物質の成分濃度を定量することができる。
しかし、前述のように参照極１２と作用極１０間に設定した電位と測定中の電位変化の
差分を常に検出し、その補正分を対極１１に印加する方法は、フィードバック回路が必要になる。
フィードバック回路は、電気回路では一般的に多く用いられる手法であるが、フィードバック回路を構成する増幅器の定数と被測定水溶液のインピーダンスとの関係からしばしば、回路自身が発振するという現象が起こる。
特に、この発振現象は被測定水溶液が高インピーダンスの場合に起こりやすく、測定電流を誤って検出してしまう。
本来、クロノアンペロメトリー法で測定される電流は直流成分である。
しかし、発振現象が起こると、電流が任意の周波数で振幅しているため、その平均値を検出する、測定値に雑音成分を多く含む、検出電流に再現性がないなどの測定不安定性、低信頼性が大きな問題となる。
特に目的物質の成分濃度が極めて低く、検出電流が非常に小さい、または測定感度が低い場合などは問題が顕著に表れる。
【００１０】
さらに、測定器を構成する上で上記の問題を解決するためにフィルタ回路を設ける、雑音対策をするなどの回路的工夫も必要となるなど回路構成が複雑となる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明の成分濃度測定装置は以下に示す構成を採用する。
【００１２】
本発明の成分濃度測定装置は、電気化学的検出手段と、電気化学的検出手段から得られる濃度と相関する特定の電位或いは、電位の変化を求める電位測定手段と、電位測定手段により求めた結果を用いて特定の濃度を算出する濃度算出手段と、濃度算出手段で求めた特定の濃度を表示する表示手段を有することを特徴とする。
【００１３】
電気化学的検出手段は、作用極と対極と参照極からなる３電極式であることが好ましい。
【００１４】
電位測定手段は、電位測定開始から任意時間における電位を求めることが好ましい。
【００１５】
電位測定手段は、電位測定開始からピーク電位を求めることが好ましい。
【００１６】
電位測定手段は、ピーク電位に至る時間を求めることが好ましい。
【００１７】
電位測定手段は、初期電位からピーク電位に至る電位変化幅を求めることが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の濃度測定装置は、電気化学的検出手段と、電気化学的検出手段から得られる濃度と相関する特定の電位或いは、電位の変化を求める電位測定手段と、電位測定手段により求めた結果を用いて特定の濃度を算出する濃度算出手段と、濃度算出手段で求めた特定の濃度を表示する表示手段を有するものである。
本発明の構造によれば、従来多く用いられてきたフィードバック回路を有するポテンショスタットを使用せず、参照極に対する作用極の時間的電位変化から目的物質の成分濃度を算出することができる。
この作用極の時間的電位変化は、電極と水溶液間に形成される濃度勾配による拡散電位変化を示しているので、電位変化幅、電位安定点、電位安定時間いずれの値を用いても成分濃度を算出することができる。
このように本発明の構造によれば、従来のようなフィードバック回路を必要としないため、回路自身の発振現象もなく、またその対策も必要としないため、回路構成が非常に簡便になり、検出感度も低下することがないという効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、図面を用いて本発明の実施形態における濃度測定装置の構成について説明する。
図１は、本発明の濃度測定装置の構造を示した概略図である。
１は電気化学的検出手段、２は電位測定手段、３は濃度算出手段、４は表示手段である。電気化学的検出手段１は、従来例として示した図８の作用極１０、対極１１、参照極１２の３電極から構成されるセンサとする。
【００２０】
電気化学的検出手段１を構成する各電極は、例えばポリエチレンテレフタレート（Ｐｏｌｙ  Ｅｔｈｙ−ｌｅｎｅ  Ｔｅｒｅｐｈｔａｌａｔｅ：ＰＥＴ  以下、ＰＥＴと記述する）にスクリーン印刷によって印刷された導電性インクである。
ここでは、作用極１０はカーボン微粒子とバインダと溶剤とからなるカーボンペースト電極、対極１１と参照極１２は銀と塩化銀が任意割合で混合された微粒子とバインダと溶剤とからなる銀／塩化銀ペースト電極である。
これら３つの電極が水溶液で浸漬するようにする。
電位測定手段２では、参照極１２に対する作用極１０の時間的電位変化を測定する。
【００２１】
濃度算出手段３では、電位測定手段２によって求めた参照極１２に対する作用極１０の時間的電位変化のピーク電位あるいは、ピーク電位に至るまでの時間あるいは、任意時間における電位などの値から、あらかじめ求めておいた検量線にしたがって測定対象とした水溶液中の特定物質の濃度を算出する。
【００２２】
表示手段４では、例えば液晶表示器などを使って成分濃度算出手段３で計算した値を表示する。
【実施例】
【００２３】
次に、本発明の実施例について具体的に説明する。
図２は、本発明の濃度測定装置を用いて特定物質の濃度を測定して表示するまでのフローチャートを示したものである。
まず、被測定水溶液を電気化学的検出手段１の電極が浸潤するようにする。
電気化学的検出手段１を構成する電極は、厚さ５００μｍの絶縁性基板であるＰＥＴ板上に、作用極１０と対極１１と参照極１２の電極となる領域をスクリーン印刷したセンサを用いる。
作用極１０は、カーボン微粒子とバインダと溶剤とからなるカーボンペーストで、対極１１と参照極１２は、銀と塩化銀の微粒子が任意割合で配合された銀／塩化銀ペーストを作用極１０と同様スクリーン印刷したものである。
各々の電極は、ＰＥＴ板の表面に厚さ２００μｍの銀箔を貼り合せ、規定の形状にパターニングしたものを配線材として用いて配線抵抗を減少させている。
【００２４】
電極領域上部は、被測定水溶液の量を規定するためスペーサを用いて容積を決定する。
スペーサは、厚さ１５０μｍ程度の両面テープを用いる。この両面テープは、テープ両面に粘着剤が塗布されたものである。
このスペーサ上にはさらにＰＥＴ板で蓋をして、水溶液の充填空間を規定する。
水溶液は、このセンサの吸入口から毛細管現象によって吸引し、規定量の水溶液を電極上に充填する。
【００２５】
次に参照極１２に対して、作用極１０の時間的な電位変化を電位測定手段２により測定する。
ここでは、参照極１２に対して作用極１０の時間的な電位変化を測定できたかどうかを判断し、測定不可の場合、表示手段４によりエラーであることを表示する。
電位測定が正しく終了すると、濃度算出手段３によってあらかじめ求めておいた検量線に従って、測定電位から濃度に換算する。
この場合の検量線は、電位測定開始から任意時間における電位或いは、電位測定開始からのピーク電位或いは、ピーク電位に至る時間或いは、初期電位からピーク電位に至る電位変化幅、いずれでもよく、電位測定方法と整合性をとる。
測定電位から求めた濃度値は、表示手段により表示する。
【００２６】
図３は、参照極１２に対する作用極１０の時間的電位変化を測定した一例を示したものである。
横軸は測定開始後からの経過時間、縦軸は参照極１２に対する作用極１０の電位を示している。
これは、電解質液中における酵素と電子受容体を用いた酵素反応から時間的電位変化の基質濃度依存性を求めた結果である。
ここでは、酸化酵素にフルクトシルアミンオキシダーゼ（Ｆｒｕｃｔｏｓｙｌａｍｉｎｅ  ｏｘｉｄａｓｅ  以下、ＦＡＯＤと記述する）、電子受容体にメトキシＰＭＳ（１−Ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ  以下、ｍＰＭＳと記述する）、基質にフルクトシルバリン（Ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ  ｖａｌｉｎ  以下、ＦＶと記述する。）を用いた例である。
図３中に示す曲線は、各々基質であるＦＶ濃度が異なるもので、２１は０μＭ、２２は１００μＭ、２３は２００μＭ、２４は５００μＭ、２５は１０００μＭを示している。
図３に示すように、参照極１２に対する作用極１０の電位は、電位測定開始から時間経過とともに正電位側、つまりグラフの上側にシフトしており、基質であるＦＶ濃度によって時間的電位変化が異なることが判る。
【００２７】
このような電位変化がどのようにして起こるかを説明する。
図３の例で用いた酵素反応は、基質であるＦＶが酸化酵素であるＦＡＯＤによって酸化され、酸化された基質は電子受容体であるｍＰＭＳを還元する。
作用極電位がｍＰＭＳの酸化電位よりも高く、電流経路が存在すれば、作用極表面近傍にあるｍＰＭＳの還元体は、作用極表面で２電子を放出して酸化され、酸化体に変わり、放出された電子により電流経路に電流として流れる。
ｍＰＭＳの酸化体は、再度ＦＡＯＤによって酸化されたＦＶを還元するというサイクルになる。基質は一度ＦＡＯＤによって酸化されると消失し、時間経過とともに基質濃度は減少していく。このように、ｍＰＭＳの還元体は、基質濃度に応じて決まり、時間経過とともに基質濃度が低下していく。
ｍＰＭＳの酸化電位は、参照極である銀／銀塩化銀に対して、負電位側にピークを持っており、電流経路が存在し作用極に酸化電位以上の電位が印加されれば電流が流れることになる。
【００２８】
作用極表面近傍の水溶液に存在するｍＰＭＳの還元体が作用極表面で時間経過とともに酸化消費され、この付近のｍＰＭＳの還元体濃度が低下していく。
電極表面付近のｍＰＭＳの還元体濃度が低下すると、作用極表面から距離のある領域からＦＡＯＤによって酸化された基質から生成させるｍＰＭＳの還元体が拡散してくる。
ｍＰＭＳの還元体の拡散速度が速いとき、界面で電荷移動が連続的に起こり多くの電流が流れる。
逆にｍＰＭＳの還元体の拡散速度が遅いときは、電荷移動速度と物質移動速度の両方が電流を支配する要因になる。
本例の系では、流れる電流は拡散律速であり、また、作用極の電位が０Ｖでも酸化反応が起こる。
上述のように電極反応が起これば、さらに拡散によって電位は時間的に変化していく。初期電位、拡散電位、平衡状態に向かう拡散時間は、基質濃度に依存するため、時間的電
位変化の測定結果から成分濃度を換算することができる。
【００２９】
しかし、本例では参照極に対して作用極電位を測定しているだけで、本来電流経路は存在しない。
この場合、酸化酵素であるＦＡＯＤで基質が酸化され生成されるｍＰＭＳの還元体は、作用極表面で電子を放出し酸化体に変化するのではなく、水溶液中の溶存酸素によって酸化体となる。
つまり、基質濃度に比例して生成されるｍＰＭＳの還元体は、水溶液中の溶存酸素によって酸化体に変化し、時間経過とともに溶存酸素濃度が低下し０になるまでこの反応が継続する。
その後、ｍＰＭＳの還元体濃度は酸化体に変ることなく増加していく。この反応は、基質濃度に比例する。
結局、参照極に対する作用極電位の変化は、作用極表面近傍に存在するｍＰＭＳの還元体と酸化体との両者の濃度比によって決まることになる。
作用極表面近傍への移動は、前述した拡散によってのみ起こる。
【００３０】
図３に示す曲線の変化で、初期時間から時間経過とともに正電位側にシフトしていくのは、基質濃度に比例して生成したｍＰＭＳの還元体が溶存酸素によって酸化体に変化し、溶存酸素濃度が低下していく過程を表しており、ピーク電位付近で溶存酸素がほぼ０になったと考えることができる。
基質濃度が高いほど、初期時間から短い時間でピークを迎えているのは、より短時間で溶存酸素が０に近づくことを示している。
ピークを迎えた後の曲線の変化は、溶存酸素がなくなり、ｍＰＭＳの還元体濃度が増加する領域を表していると考えることができる。この変化も、基質濃度に比例している。
【００３１】
図４は、図３の結果から各基質濃度における参照極に対する作用極でのピーク電位をプロットした図を示している。
横軸はＦＶ濃度、縦軸は参照極に対する作用極電位ピークを示している。
作用極ピーク電位は、溶存酸素がほぼ０になった点で、基質濃度に応じて決まる初期電位からの拡散電位と考えられ、図４に示すように、基質濃度が高いほど負電位側になる。
【００３２】
図５は、基質濃度に対する電位測定開始５分後の電位をプロットした図である。
横軸はＦＶ濃度、縦軸は電位測定開始５分後の電位を示している。
基質濃度に応じて溶存酸素がほぼ０になる点で、溶存酸素が０になるピーク電位付近以降での任意時間における電位は、基質濃度依存性を示すことが判る。
【００３３】
図６は、基質濃度に対するピーク電位に至る時間をプロットした図である。
横軸はＦＶ濃度、縦軸はピーク電位に至る時間を示している。
基質濃度が高いほど、溶存酸素が０になるまでの時間が短く、同様に基質濃度依存性を示すことが判る。
【００３４】
図７は、基質濃度に対する初期電位からピーク電位に至る電位変化幅をプロットした図である。
横軸はＦＶ濃度、縦軸は初期電位からピーク電位に至る電位変化幅を示している。
基質濃度が高いほど、初期電位からピーク電位に至る電位変化幅は小さくなり、基質濃度依存性を示すことが判る。
【００３５】
このように作用極における電極反応が電荷移動速度の速い拡散律速で可逆反応である場合、酸化体と還元体の作用極表面の濃度比によって作用極電位が変化することを示した。
本例では、時間経過とともに基質濃度に比例し、ｍＰＭＳの還元体が生成され、溶存酸
素によって還元体に変化する。
作用極表面ではｍＰＭＳの還元体とｍＰＭＳの酸化体がある濃度比で存在し、時間経過とともに拡散が進行し、ｍＰＭＳの還元体と酸化体との濃度比が常に変化している。
これが作用極電位の時間変化という形で測定される。
【００３６】
図４から図７に示した、いずれからも基質濃度依存性が求められ、その値は、Ａ／Ｄ変換によってディジタル化され、成分濃度算出手段３である演算器によって処理し、表示手段４である液晶表示器により十進数に変換し表示する。
あらかじめ、基質濃度に対する作用極電位の変化を検量線として求めておけば、未知の基質濃度を求めることができる。
【００３７】
本実施例では、ＰＥＴ材にスクリーン印刷で作製したセンサにおいて、作用極にカーボンペースト、対極と参照極に銀と塩化銀が任意割合で混合されたペーストを用いた例を説明したが、センサの形態が変わっても本発明が有効であることは言うまでもない。
また、酵素と電子受容体を用いたものに限らないことも明白である。
【００３８】
従来は、ポテンショスタットを用いたクロノアンペロメトリー法によって求めた電流値から特定物質の濃度を定量していた。
ポテンショスタットは、参照極と作用極間の設定電位と実際の電位印加時の差分を補正値として対極に印加する。
これは、フィードバック回路を必要とし、しばしば発振現象を引き起こす。
これに対して、本発明における成分濃度測定装置の構成では、フィードバック回路はなく発振も発生せず、また発振対策も必要としない。
その結果、回路構成が単純で小型の測定器も製作しやすい。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明によれば、フィードバック回路を必要としないため発振現象は発生せず、また発振対策も必要としない。
その結果、回路構成が単純で小型の測定器も製作しやすく、本発明を用いることの効果は非常に高い。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明の濃度測定装置を示す概略図である。
【図２】本発明の濃度測定装置を示すフローチャートである。
【図３】本発明の濃度測定装置における電位測定手段による測定結果を示す図であ          る。
【図４】本発明の濃度測定装置における電位測定手段から得られる成分濃度算出方法            を示す図である。
【図５】本発明の濃度測定装置における電位測定手段から得られる成分濃度算出方法          を示す図である。
【図６】本発明の濃度測定装置における電位測定手段から得られる成分濃度算出            方法を示す図である。
【図７】本発明の濃度測定装置における電位測定手段から得られる成分濃度算出            方法を示す図である。
【図８】従来の濃度測定装置に使われる電気化学的検出手段を示す概略図である。
【符号の説明】
【００４１】
１    電気化学的検出手段
２    電位測定手段
３    濃度算出手段
４    表示手段
１０  作用極
１１  対極
１２  参照極
１３  第１の増幅器
１４  第２の増幅器
１５  差動増幅器
１６  電流検出抵抗
１７  検出電位
１８  設定電位
【図１】
2007085763.tif 000004
【図２】
2007085763.tif 000005
【図３】
2007085763.tif 000006
【図４】
2007085763.tif 000007
【図５】
2007085763.tif 000008
【図６】
2007085763.tif 000009
【図７】
2007085763.tif 000010
【図８】
2007085763.tif 000011