(57)【要約】【課題】ある特定の物質のみに特異的に結合し、他のタンパク質などとの非特異的な相互作用を制御する細胞固定化基材被覆膜用材料を提供すること。【解決手段】本発明の細胞固定化基材被覆膜用材料は、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンから誘導される構成単位（Ａ）と、疎水性のエチレン性不飽和化合物から誘導される構成単位（Ｂ）と、糖鎖を付加したエチレン性不飽和化合物から誘導される構成単位（Ｃ）と、の共重合体を含む。糖鎖は、グルコース、ガラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、フコース、キシロース、シアル酸及びこれらの誘導体により形成されていることが好ましい。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンから誘導される構成単位（Ａ）と、疎水性のエチレン性不飽和化合物から誘導される構成単位（Ｂ）と、糖鎖を付加したエチレン性不飽和化合物から誘導される構成単位（Ｃ）と、の共重合体を含む細胞固定化基材被覆膜用材料。
【請求項２】
前記糖鎖が、グルコース、ガラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、フコース、キシロース、シアル酸及びこれらの誘導体を含む請求項１記載の細胞固定化基材被覆膜用材料。
【請求項３】
前記構成単位（Ｂ）が、メタクリル酸ｎ−ブチルから誘導される構成単位である請求項１または２記載の細胞固定化基材被覆膜用材料。
【請求項４】
前記構成単位（Ａ）と、前記構成単位（Ｂ）と、のモル比が、０．５：９．５から５：５である請求項１から３いずれか記載の細胞固定化基材被覆膜用材料。
【請求項５】
前記構成単位（Ｃ）の含有量は、前記共重合体における全構成単位において０．５モル％以上３０モル％以下である請求項１から４いずれか記載の細胞固定化基材被覆膜用材料。
【請求項６】
前記共重合体の平均分子量が５，０００以上１，０００，０００以下である請求項１から５いずれか記載の細胞固定化基材被覆用材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞固定化基材被覆膜用材料に関し、特に肝細胞の機能誘導に有利に働く細胞固定化基材被覆膜用材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は５００種類以上の代謝反応（化学反応）を行っているとされている。このような肝臓の機能を総合的に人工的な装置で補うことは中長期的にみても極めて困難であり、生態の肝細胞を利用するしかないと考えられている。しかし、現在細胞培養に用いられているポリマーは細胞が機能するために適当な環境を提供しているとは言い難い。
【０００３】
下記の特許文献１には、ガラクトースを提示する化合物に、糖鎖構造特異的に、かつ、密度依存的に、肝臓細胞の代謝活性を向上させる機能があるため、この化合物を培養液に添加することで、肝臓細胞培養が効果的に行えることが記載されている。
【０００４】
また、下記の特許文献２には、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体及び／又は２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン含有成分の共重合体を含むタンパク質吸着防止剤が記載されている。
【特許文献１】特開２００２−０２７９７７号公報
【特許文献２】特開平０７−０８３９２３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記特許文献１に記載されている化合物を用いた培養方法では、化合物に特異的に接着する細胞のみでなく、他の細胞まで接着するという問題があった。また、特許文献２に記載されているタンパク質吸着防止剤は、分析法などに用いられるタンパク質の吸着防止を図るものであり、肝細胞の培養に用いることは想定していない。
【０００６】
本発明は以上のような課題に鑑みてなされたものであり、ある特定の物質（タンパク質、細胞など）のみを特異的に結合し、他のタンパク質などとの非特異的な相互作用を制御する細胞固定化基材被覆膜用材料を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意研究を重ねた結果、共重合体中に、タンパク質の変性、細胞の活性を惹起せず、優れた生体適合性を有する構成単位と、末端部に、特定の細胞に特異的に結合するリガンドである糖を有する構成単位を含むことにより、特定の物質のみを培養することができることを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。
【０００８】
（１）  ２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（以下、「ＭＰＣ」ともいう。）から誘導される構成単位（Ａ）と、疎水性のエチレン性不飽和化合物から誘導される構成単位（Ｂ）と、糖鎖を付加したエチレン性不飽和化合物から誘導される構成単位（Ｃ）と、の共重合体を含む細胞固定化基材被覆膜用材料。
【０００９】
本発明の細胞固定化基材被膜形成用材料は、共重合体中に、上記構成単位（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を含有している。下記構造式（１）に示す２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンから誘導される構成単位が有するホスホリルコリン基は、細胞膜の構造に類似しているため、タンパク質の吸着、変性を起こしにくく、細胞の粘着及び活性化を抑制することができる。また、糖鎖を付加したエチレン性不飽和化合物から誘導される構成単位を含むことにより、糖鎖に特異的に結合する細胞のみを培養することができる。また、疎水性の置換基を有する構成単位を含むことにより、水に不溶な被覆膜とすることができ、細胞培養に好適に用いることができる。
【００１０】
【化１】
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【００１１】
（２）  前記糖鎖が、グルコース、ガラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、フコース、キシロース、シアル酸及びこれらの誘導体を含む（１）記載の細胞固定化基材被覆膜用材料。
【００１２】
この態様によれば、糖鎖は、上述した糖により形成されているため、上記糖に対応する細胞を特異的に結合することができる。
【００１３】
（３）  前記構成単位（Ｂ）が、メタクリル酸ｎ−ブチル（以下、「ＢＭＡ」ともいう。）から誘導される構成単位である（１）または（２）記載の細胞固定化基材被覆膜用材料。
【００１４】
この態様によれば、構成単位（Ｂ）が、メタクリル酸ｎ−ブチルであるため、容易に共重合体に含ませることができる。
【００１５】
（４）  前記構成単位（Ａ）と、前記構成単位（Ｂ）と、のモル比が、０．５：９．５から５：５である（１）から（３）いずれか記載の細胞固定化基材被覆膜用材料。
【００１６】
この態様によれば、構成単位（Ａ）と構成単位（Ｂ）とのモル比を上記範囲としているため、疎水性の細胞固定化基材被覆膜用材料を形成することができ、細胞培養に好適に用いることができる。
【００１７】
（５）  前記構成単位（Ｃ）の含有量は、前記共重合体における全構成単位において０．５モル％以上３０モル％以下である（１）から（４）いずれか記載の細胞固定化基材被覆膜用材料。
【００１８】
この態様によれば、構成単位（Ｃ）を共重合体における全構成単位において上記範囲内としているため、糖に対応する細胞を特異的に結合することができる。
【００１９】
（６）  前記共重合体の平均分子量が５，０００以上１，０００，０００以下である（１）から（５）いずれか記載の細胞固定化基材被覆用材料。
【００２０】
この態様によれば、共重合体の平均分子量が上記範囲内であるため、安定性に優れた被覆膜を形成することができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、本発明の細胞固定化基材被覆膜用材料を用いて、細胞を培養することにより、構成単位（Ｃ）の末端部に有する糖と特異的に結合する細胞のみを培養することができる。また、糖とレセプターとの相互作用を介してのみ粘着しているため、スフェロイド（球状集合体）を形成している。したがって、通常の培養よりも生存期間が長く、長期にわたり安定して機能を発揮する細胞を培養することができる。さらに、本発明の細胞固定化基材被覆膜用材料を用いて、生体肝機能を代替する装置の構築を期待することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の細胞固定化基材被膜用材料は、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンから誘導される構成単位（Ａ）と、疎水性のエチレン性不飽和化合物から誘導される構成単位（Ｂ）と、糖鎖を付加したエチレン性不飽和化合物から誘導される構成単位（Ｃ）との共重合体を含んでいる。以下それぞれの構成単位について説明する。
【００２３】
［構成単位（Ａ）］
構成単位（Ａ）は、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンから誘導される構成単位である。２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンは、生体膜を構成するリン脂質ポリマーと同じ極性を持ち、タンパク質の変性や細胞の活性を惹起せず優れた生体適合性を持つポリマーである。
【００２４】
構成単位（Ａ）の含有量は、共重合体における全構成単位において、５モル％以上５０モル％以下であることが好ましい。より好ましくは、１０モル％以上３０モル％以下であり、さらに好ましくは２０モル％以上２５モル％以下である。構成単位（Ａ）の含有量を上記範囲とすることで、本発明の被覆用材料を用いて形成した細胞固定化基材上への細胞の粘着を防止することができる。
【００２５】
［構成単位（Ｂ）］
構成単位（Ｂ）は、疎水性のエチレン性不飽和化合物から誘導される構成単位であり、本発明の細胞固定化基材被覆用材料が疎水性を有し、水に不溶となれば、特に限定せずに用いることができる。構成単位（Ｂ）としては、例えば、アクリル酸ｎ−ブチル、アクリル酸ｔ−ブチルなどのアクリル酸エステル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸ｎ−ブチル、メタクリル酸ｔ−ブチル、メタアクリル酸ペンチル、メタクリル酸ヘキシル、メタクリル酸ヘプチル、メタクリル酸オクチル、メタクリル酸トリデシル、メタクリル酸２−エチルヘキシルなどのメタクリル酸エステル、メタクリル酸イソボルニル、メタクリル酸グリシジル、メタクリル酸ｎ−ブトキシメチル、メタクリル酸ニトリル、メタクリル酸ラウリル、メタクリル酸シクロへキシル、メタクリル酸１，３，５トリメチルシクロヘキシル、メタクリル酸フェニル、メタクリル酸ベンジル、スチレン、メチルスチレンなどから誘導される構成単位を挙げることができる。この中でも、共重合体を容易の合成することができる点からアクリル酸ｎ−ブチルであることが好ましい。
【００２６】
構成単位（Ｂ）の含有量は、構成単位（Ａ）と構成単位（Ｂ）とのモル比が０．５：９．５から５：５であることが好ましい。より好ましくは、０．５：９．５から３：７であり、さらに好ましくは１：９から３：７である。上記範囲とすることで、疎水性の細胞固定化基材被覆用材料を形成することができるため、水中での培養に好適に用いることができる。構成単位（Ｂ）の含有量が少ないと、被覆用材料が親水性となり、培養に用いることができないため好ましくない。
【００２７】
［構成単位（Ｃ）］
構成単位（Ｃ）は、糖鎖を付加したエチレン性不飽和化合物から誘導される構成単位である。糖鎖は、グルコース、ガラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、フコース、キシロース、シアル酸などの糖により形成されている。この糖鎖の先端にある糖は、培養する細胞の種類により適宜選択することができる。糖に特異的に結合する細胞としては、「糖鎖工学」糖鎖工学編；産業調査会（１９９２）に記載されている細胞を用いることができる。
【００２８】
また、エチレン性不飽和化合物としては、特に限定されずに、末端に糖鎖を誘導することができれば、特に限定せずに用いることができる。エチレン性不飽和化合物としては、例えば、メタクリル酸、アクリル酸ｎ−ブチル、アクリル酸ｔ−ブチルなどのアクリル酸エステル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸ｎ−ブチル、メタクリル酸ｔ−ブチル、メタアクリル酸ペンチル、メタクリル酸ヘキシル、メタクリル酸ヘプチル、メタクリル酸オクチルなどのメタクリル酸エステル、メタクリル酸ヒドラジド、２−アミノエチルメタクリル酸などのメタクリル酸アミノアルキルなどを挙げることができる。この中でも特に、メタクリル酸ヒドラジド、メタクリル酸２−アミノエチルなどの窒素原子を含む置換基を有することが好ましい。
【００２９】
糖鎖を付加したエチレン性不飽和化合物の合成方法としては、例えば、次のようにして合成することができる。糖鎖のカルボン酸誘導体を脱水アルコールに溶かし、２５℃から５０℃の温度、減圧の条件下、脱水を行い、酸性の先駆をラクトンに変換する。次にエチレン性不飽和化合物、または、エチレン性不飽和化合物の誘導体を添加し、室温で反応させることにより、糖鎖を付加したエチレン性不飽和化合物を合成する。
【００３０】
また、構成単位（Ｃ）の含有量は、共重合体における全構成単位において０．５モル％以上３０モル％以下であることが好ましい。より好ましくは、０．５モル％以上１０モル％以下であり、さらに好ましくは０．５モル％以上３モル％以下である。この範囲とすることで、糖に対応する細胞を特異的に結合することができる。
【００３１】
本発明の細胞固定化基材被膜用材料に含まれる共重合体の平均分子量は、５，０００以上１，０００，０００以下であることが好ましい。より好ましくは、１０，０００以上５００，０００以下であり、さらに好ましくは１００，０００以上３００，０００以下である。上記範囲とすることで、安定性に優れた被覆膜を形成することができる。
【００３２】
［共重合体の重合方法］
共重合体の合成方法としては、上記成分を所定のモル比で溶媒に溶解し、重合開始剤を加え、５０から８０℃、特に好ましくは６０から８０℃において１０から５０時間重合させるのが好ましい。
【００３３】
重合反応に用いる溶媒としては、水、メタノール、エタノール、プロパノール、ｔ−ブタノール、ベンゼン、トルエン、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、クロロホルム又はこれらの混合物等を挙げることができる。
【００３４】
また、重合開始剤としては、通常のラジカル重合開始剤であれば特に限定されるものではない。例えば、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、過酸化ベンゾイル、ジイソプロピルペルオキシジカーボネート、ｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート、ｔ−ブチルペルオキシジイソブチレート、過硫酸塩又は過硫酸−亜硫酸水素塩等を挙げることができる。重合開始剤の使用量は、共重合体１００質量部に対して、０．１から１．０質量部が好ましく、更に０．２５から０．７５質量部が好ましい。
【００３５】
本発明の細胞固定化基材被覆膜用材料は、培養用のプレートに被覆することより、特定の細胞を培養する培養素材として好適に用いることができる。プレートなどへの被覆方法としては、特に制限されず、本発明の材料を溶媒の溶解させた溶液中に浸漬し、乾燥させることで、被覆膜を形成することができる。溶媒としては、本発明の材料を溶解させることができれば特に限定されず、例えば、エタノールなどを用いることができる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例を用いて本発明を更に詳細に説明する。
【００３７】
＜合成例１＞
（２−ラクトビオンアミドエチルメタクリレート（ＬＡＭＡ）の合成）
ガラクトースを持つ２−ラクトビオンアミドエチルメタクリレートの合成を行った。合成は、以下の反応式により行った。
【００３８】
【化２】
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【００３９】
５０℃で脱水メタノール（関東化学（株）製）１５０ｍＬ中へラクトビオン酸（和光純薬工業（株）製）２５．０ｇを溶かし、エバポレーションにて脱水メタノールを除去した。ラクトビオン酸の酸性の先駆がラクトンに完全に変換されるまで、この反応を２回繰り返し、ラクトビオノラクトン２０ｇを合成した。この時、触媒として少量のトリフルオロ酢酸（関東化学（株）製）を添加した。
次に、このラクトビオノラクトン１０．０ｇ（２９．４ｍｍｏｌ）をメタノールに４０℃で溶かし、室温まで冷却した。その後、２−アミノメチルメタクリル酸塩酸塩（ポリサイエンス（株）製）１０．０ｇ（６０．４ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（関東化学（株）製）１０．０ｍＬ、ヒドロキノンモノメチルエーテル（半井化学薬品（株）製）０．２５ｇを添加し、５時間攪拌した後、溶媒を留去、２−プロパノール（関東化学（株）製）で再沈殿を行い、２−ラクトビオンアミドエチルメタクリレート（ＬＡＭＡ）２０ｇを合成した。
【００４０】
（共重合体の合成）
モノマー濃度を１．０Ｍとし、ＭＰＣ（日本油脂（株）製）２０ｍｏｌ％、ＢＭＡ７９．５ｍｏｌ％、ＬＡＭＡ０．５ｍｏｌ％となるように、エタノール（関東化学（株）製）０．９２ｍＬ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（和光純薬工業（株）製）０．０３ｍＬ、純水０．０５ｍＬの混合溶液に溶解した。なお、ＢＭＡは、メタクリル酸ブチルに重合禁止剤として、ｔ−ブチルカテコールを加え、減圧蒸留（ｂ．ｐ．５５℃／１５ｍｍＨｇ）したものを使用した。次に、重合開始剤として、２−２’アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）（関東化学（株）製）０．５ｍＭを加え、６０℃、１０．５時間重合させ、下記に示す共重合体（２）（以下、「ＰＭＢＬ」ともいう。）を合成した。得られた共重合体をエタノールで２日透析、水で２日透析を行い凍結乾燥にて精製を行った。
【００４１】
【化３】
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【００４２】
＜合成例２〜４＞
実施例１と同様の方法により、ＬＡＭＡのｍｏｌ％を、１．０ｍｏｌ％（合成例２）、３．０ｍｏｌ％（合成例３）、２．５ｍｏｌ％（合成例４）とし、共重合体を合成した。ＭＰＣ、ＢＭＡの濃度、溶媒の濃度は表１の組成により合成を行った。
【００４３】
＜合成例５＞
モノマー濃度を１．０Ｍとし、ＭＰＣ３０ｍｏｌ％、ＢＭＡ７０ｍｏｌ％となるようにエタノール１．０ｍＬに溶解し、ＡＩＢＮ０．５ｍＭを重合開始剤として加え、６０℃５時間重合させた。共重合体をエーテル／クロロホルム（１／１）で再沈殿し精製した。
【００４４】
＜合成例６＞
ＭＰＣ５０ｍｏｌ％、ＢＭＡ５０ｍｏｌ％となるように添加した以外は比較例１と同様の方法により合成した。
【００４５】
合成例１から６の構成単位のモル比、溶媒の組成比を表１に示す。ＭＰＣはＤＭＳＯに溶解せず、ＬＡＭＡはエタノールに溶解しないため、モノマーの仕込み量により、溶媒の組成比を調節した。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
なお、共重合体の組成は、ＬＡＭＡはＮＭＲ解析、アントロン硫酸法にて、ＭＰＣはリンの定量により測定した。各測定方法について、以下に示す。
【００４８】
合成例１のＮＭＲ解析のチャートを図１に示す。図１よりＬＡＭＡが合成できていることが確認できる。なお、図１に記載されている記号は、上記化学式（２）に記載されている置換基の記号に対応する。
【００４９】
（糖の定量：アントロン硫酸法）
合成例１から４の共重合体１２．５ｍｇを１０ｍＬメスフラスコに入れ、エタノール（関東化学（株）製）でメスアップした。その溶液を１ｍＬ試験管に採取して１２０℃で乾固させた。次にアントロン（関東化学（株）製）を０．２質量％となるように溶かした濃硫酸（関東化学（株）製）２ｍＬを加え、よく撹拌し室温で５〜６分放置した。溶液は、緑色を呈し、さらにしばらくすると青緑色になる。この吸収極大波長６２０ｎｍの吸光度を紫外可視吸光度計（Ｖ−５００；日本分光（株）製）にて測定した。
また、１０ｍＭのＬＡＭＡを０、１０、２０、４０、８０、１２０ｍＬ採取して同様に吸光度を測定し、検量線とし、構成単位の組成比を算出した。
【００５０】
（リンの定量）
各サンプル６ｍｇを１０ｍＬメスフラスコに入れ、エタノールでメスアップした。その溶液を５０ｍＬ試験管に採取して１２０℃で乾固させた。次に、７０％過塩素酸２６０ｍＬを加えて１８０℃、２０分間加熱分解した。冷却後、蒸留水１９００ｍＬ、モリブテン酸アンモニウム水溶液４００ｍＬ、アスコルビン酸水溶液４００ｍＬを加えて１００℃の湯浴で５分間加湿して発色させ吸光度を紫外可視吸光度計（Ｖ−５００；日本分光（株）製）にて測定した。
また、１．０ｍＭリン酸水素二ナトリウム水溶液を０、１０、２０、４０、８０、１２０ｍＬ採取して同様に吸光度を測定し、検量線とし、ＰＭＢの構成単位の組成比を算出した。
【００５１】
≪細胞固定化基材被覆膜の形成≫
＜実施例１＞
ポリメタクリル酸ブチル（ＰＢＭＡ）（アルドリッチ（株）製）の１０％トルエン溶液を作り、テフロン（登録商標）製の型に流し込み一晩乾燥させ、ＰＢＭＡの膜を得た。ＰＢＭＡ膜を合成例１の共重合体０．５質量％エタノール溶液に浸漬した後、乾燥させ、ＰＢＭＡ膜上にＰＭＢＬの被膜を形成した。
【００５２】
＜実施例２、３、比較例１＞
合成例２共重合体を用いた被膜を実施例２、合成例３を実施例３、合成例５を比較例１とした以外は、実施例１と同様の方法により形成した。
【００５３】
＜比較例２＞
実施例１と同様にＰＢＭＡの膜を形成し、ＰＭＢＬの被膜を形成しなかったものを比較例２とした。
【００５４】
（試験例１：膜表面解析）
膜表面解析として、水の接触角測定及び、Ｘ線光電子分光計測定を行い、被覆状態を確認した。Ｘ線光電子分光計測定は光電子の放出角を９０°として行った。接触角の結果を表２に、実施例１、比較例１、２のＸ線光電子分光の表面解析の結果を図２に示す。
【００５５】
【表２】
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【００５６】
ＭＰＣが含まれている合成例５のポリマーを被覆した比較例１において、後退接触角が減少しており、ＰＢＭＡ膜の比較例２に比べ表面が親水化していることが確認できた。また、ＰＭＢＬを被覆した実施例１から３の表面の接触角はいずれも等しく、被覆状態が同様であることが確認できた。また、図２の表面解析の結果より、実施例１において、比較例１と同様に、リン（Ｐ）と窒素（Ｎ）のピークが確認できたことより、表面にＭＰＣの存在が確認された。
【００５７】
（試験例２：細胞粘着試験）
プラスチックシートを２４ウェル培養用プレートにひき、その上に直径１．４ｃｍに打ち抜いた実施例１から３、及び、比較例１、２の膜をセットし、シリコンリングで固定した。１５０ｍＭのＰＢＳ（ＤＵＬＢＥＣＣＯ’Ｓ  ＰＨＯＳＰＨＡＴＥ  ＢＵＦＦＲＥＤ  ＳＡＬＩＮＥ）を、各ウェルに１ｍＬ加え、クリーンベンチ内でＵＶ滅菌を１晩（１７時間）行った。滅菌後、ＰＢＳを取り除き、予め前培養していたＨｅｐＧ２（ヒト肝癌細胞）をトリプトシン処理し、懸濁液とした（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、Ｄ−ＭＥＭ）。細胞懸濁液を各ウェル内に１ｍＬずつ分注した（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。５％ＣＯ２、３７℃インキュベーター内で２４、９６時間培養した。培養後、シリコンリングを除き、Ｄ−ＭＥＭ（３７℃）で３回洗浄し、粘着していない細胞を除いた。各ウェルに、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ナカライテスク（株）製）の０．１質量％ＰＢＳ溶液５００μＬ加え、１分間軽くピペッティングし、新しい１．５ｍＬチューブに移した。その後、遠心（５０００ｒｐｍ、５分）し、上清を５０μＬずつ９６ウェルプレートに分注した。それらに発色液（ＬＤＨ−細胞毒性テストワコー；和光純薬（株）製）を５０μＬずつ加え、２５℃の恒温槽中で２０〜４０分間反応させた。反応停止液を各ウェルに１００μＬずつ分注し、反応を停止させた。
また、検量線を作成するために培養用プレート（６ウェル）に懸濁液（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を２ｍＬずつ分注し、５％ＣＯ２、３７℃インキュベーター内で２４、９６時間培養した。培養後、Ｄ−ＭＥＭ（３７℃）で洗浄し、６ウェルの内、３ウェルにトリプシンを加え細胞を接がした後、血球計測板での細胞数測定を行なった。残りのウェルは上述した、実施例、比較例と同様に発色させ、検量線とした。マイクロプレートリーダー（Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  Ｍｏｄｅｌ４５０；ＢｉｏＲａｄ（株）製）により５７０ｎｍの吸光度を測定した。培地の交換は１日目に行い、その後３日置きに行った。
【００５８】
２４時間後、９６時間後の細胞粘着数を図３に、細胞の増殖率を表３に示す。細胞の増殖率は、９６時間後の細胞粘着数÷２４時間の細胞粘着数を増殖率とした。
【００５９】
【表３】
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【００６０】
図３より、比較例１では、粘着数が少ないのに対し、実施例１から３では、ＬＡＭＡの含有量に従い、粘着数が増加していることが確認できた。また、表３より、増殖率は、実施例３では、比較例２の約１．６倍を示した。
【００６１】
膜上での細胞の増殖の形を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（ＳＥＭ−５４００；日本電子（株）製）にて確認した。結果を図４に示す。
２４時間後では、実施例２と比較例２とで差がなく増殖していた。１６８時間経過後は形状に差がみられ、比較例２では培地により吸着した細胞接着性タンパク質による細胞粘着をしていて、伸展して増殖していた。これに対し、実施例２では肝細胞であるＨｅｐＧ２が、ガラクトースとアシアロ糖タンパク質レセプター（ＡＳＧＰＲ）の相互作用を介してのみ粘着しているため、スフェロイド（球状集合体）を形成していることが確認できた。スフェロイドは、通常の培養よりも生存期間が長く、最大直径も大きい。また、アルブミン産生量などの肝機能が長期にわたり安定して行われる。したがって、本発明の細胞固定化基材被覆膜用材料を用いて、生体肝機能を代替する装置の構築を期待することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】合成例１のＮＭＲ解析のチャート図である。
【図２】Ｘ線光電子分光の表面解析のチャート図である。
【図３】試験例２における細胞粘着数を示す図である。
【図４】試験例２の試験後の細胞形状のＳＥＭ写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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