(57)【要約】【課題】コヒーレントアンチストークスラマン散乱法を利用する顕微鏡装置において、ロックインフリーな検出方法を提示し、かつ多種の振動モードを同時検出する目的に適った顕微鏡装置を提供する。【解決手段】第１の波長を持つ第１のパルスレーザ光Ｐ１及び第２の波長を持つ第２のパルスレーザ光Ｐ２を発生する光源部と、第１のパルスレーザ光Ｐ１及び第２のパルスレーザ光Ｐ２を分析対象４０に照射する光学系２５と、第１のパルスレーザ光Ｐ１の光源部２１から分析対象４０までの光路長を調整する光路長調整部３０と、第１及び第２のパルスレーザ光Ｐ１、Ｐ２の照射によって分析対象４０から発せられるコヒーレントアンチストークスラマン散乱光Ｃ１を検出する検出部５０とを備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の波長を持つ第１のパルスレーザ光及び前記第１の波長とは異なる第２の波長を持つ第２のパルスレーザ光を発生する光源部と、
前記第１のパルスレーザ光及び前記第２のパルスレーザ光を分析対象に照射する光学系と、
前記第１のパルスレーザ光の前記光源部から前記分析対象までの光路長を調整する光路長調整部と、
前記第１及び第２のパルスレーザ光の照射によって前記分析対象から発せられるコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を検出する検出部と
を備えることを特徴とする顕微鏡装置。
【請求項２】
前記光路長調整部は、前記第１のパルスレーザ光の光路長を周期的に変化させることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
前記光路長調整部は、
前記第１のパルスレーザ光を反射させて前記第１のパルスレーザ光に戻す直角ミラーと、
前記直角ミラーを前記第１のパルスレーザ光の前記入射及び反射方向に沿って振動させる振動手段と
を備えることを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
前記検出手段によって検出された前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光に対して、フーリエ変換を施すことにより、ラマン振動周波数を判定する処理部を備えることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
【請求項５】
前記検出手段によって検出された前記コヒーレントアンチストークスラマン散乱光の光強度の低周波成分を通過させた後、この低周波成分に基づいてラマン振動周波数を判定する処理部を備えることを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡装置。
【請求項６】
前記光源部は、
前記第１のパルスレーザ光を発生する第１の光源と、
前記第２のパルスレーザ光を発生する第２の光源と
を備えることを特徴とする請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
【請求項７】
前記光源部は、
光源と、
前記光源で発生するパルスレーザ光を分割する分割手段と、
前記分割手段によって分割された一方を広帯域化するフォトニック結晶ファイバと、
前記フォトニック結晶ファイバの出力を帯域制限するフィルタと、
を備え、前記フィルタの出力を前記第２のパルスレーザ光とすると共に、前記分割手段によって分割された他方を前記第１のパルスレーザ光とすることを特徴とする請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
【請求項８】
第１の波長を持つ第１のパルスレーザ光及び前記第１の波長とは異なる第２の波長を持つ第２のパルスレーザ光および前記第1および第2の波長とは異なる第3の波長を持つ第3のパルスレーザ光を発生する光源部と、
前記第１のパルスレーザ光、前記第２のパルスレーザ光及び前記第3のパルスレーザ光を分析対象に照射する光学系と、
前記第１のパルスレーザ光の前記光源部から前記分析対象までの光路長を調整する光路長調整部と、
前記第１、第２及び第3のパルスレーザ光の照射によって前記分析対象から発せられるコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を検出する検出部と
を備えることを特徴とする顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡装置に関し、特に２つ以上のパルスレーザ光を試料に入射し、その結果試料から発せられるコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を観察することにより、試料内の物質を分析する顕微鏡装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
顕微分光法による微量物質の検出は、分析装置における基本技術としての重要性が高く、多くの技術開発が行われてきた。一方、昨今の医療技術の進歩と共に、診断技術にもより一層の検出感度の向上が求められることとなり、微量物質検出技術の医療診断技術への応用が試みられている。
【０００３】
係る顕微分光技術として、コヒーレントアンチストークスラマン散乱法（Coherent Anti-stokes Raman Scattering;ＣＡＲＳ）が知られている。これは、二種類又はそれ以上の光パルスを試料に入射し、それらの間に起こる非線形光学過程によって試料から発せられるシグナル光を観察するものである。
【０００４】
例えば、図１１に示されるようなエネルギー準位を持った分子をＣＡＲＳによって観察することを考えると、まず、初期状態のエネルギー準位Ｌ１において、角周波数ω１を持った第１のパルス光の入射によって試料の分子が仮想的に励起され、そのエネルギー準位が矢印Ａで示すようにＬ３まで上がる。そして、角周波数ω２を持った第２のパルス光を入射させることにより、分子のエネルギー準位は、仮想的な光子放出により矢印Ｂで示すようにＬ３からＬ２に下がる。さらに角周波数ω３を持った第３のパルス光を入射させることにより、分子のエネルギー準位は、矢印Ｃで示すように、Ｌ３からＬ４に仮想的に上昇し、シグナル光の発生によって矢印Ｄで示すように、Ｌ４からＬ１に下がる。
【０００５】
このように、角周波数ω１、ω２、ω３を持った三種のパルス光の入射によって、いわゆる四光波混合過程が生じ、結果として角周波数ω１＋ω３−ω２を持つシグナル光が発生する。このようなシグナル光は、入射パルスの周波数差Δω=ω１−ω２が、観察すべき分子のエネルギー準位差に共鳴するときに特に強く現れる。現実に用いることの可能な光パルスを考慮すると、Δωが分子の振動モード周波数に一致するときに強いシグナルが得られることが考えられるため、このような振動モードを持つ分子の検出が可能となる。また、この手法は二種のパルス光を用いて上記第3のパルス光によって生ずる光学過程を第１のパルス光によって起こすことにより、2ω１―ω２の各周波数を持つシグナル光を検出することによっても実現される。
【０００６】
このような原理を利用した顕微分光装置としては、例えば、図１２に示される通り、二種のレーザパルス光源１１、１２、この光源からのパルス光を試料１３の同一箇所に照射するための光学系１４、試料１３より放出されるＣＡＲＳ光を検出する装置１５から構成されている（例えば、特許文献１、非特許文献１参照）。パルスレーザ光源１１及び１２から発せられるパルスレーザの波長を変化させることにより、試料１３に含まれる特定分子から発せられるＣＡＲＳ光を選択的に検出することが可能となるが、このシグナル光はその分子固有の性質によって検出の可否が決定されるという特徴を持っており、標識物質による染色を要しない。従って、ＣＡＲＳ光の観察による顕微分光装置は生体観察において他の方法に対して優位性を持っている。
【特許文献１】特開２００２−１０７３０１号公報
【非特許文献１】Journal of Physical Chemistry B105, p.1277(2001)
【非特許文献２】Applied Physics B 80, p.243-246 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところが、一般にＣＡＲＳ光は非線形光学効果を利用しているために、極めて強度が弱い。とりわけ、生体分子の観察においては、観察対象を保護するために照射光強度をなるべく低くすることが要求されており、その場合には信号光であるＣＡＲＳ光はさらに弱くなる。
【０００８】
このような弱い光を観測する際にはロックイン検出によることが一般的である。しかし、ロックイン検出にはロックインアンプやチョッパーといった装置が必要なため、装置の小型化には障害となる上にコストが高い。
【０００９】
さらに、ＣＡＲＳ光によって対象物に含まれる分子の振動モード周波数が検出可能なことを上述したが、この振動モード周波数から個々の分子の種別を特定することは必ずしも容易ではない。すなわち、複数種の分子がほぼ同一の振動モード周波数を持つことは決して稀ではなく、特に生体中に存在する分子においてはむしろ頻繁に起きることである。
【００１０】
このような課題を解決するためには、複数種の振動モード周波数を検出し、それらの積信号によって分子種の特定をより明確に行なう手法が考えられる。例えば、非特許文献１に示される通り、広帯域光の照射によって複数モードの同時測定を行なうことは可能であるが、これもロックイン検出を行なう必要があるために、検出器において多チャンネル同時測定を行なうことを考えた場合、さらなるシステムの大規模化・高コスト化が避けられない。
【００１１】
顕微分光法による微量物質の同定という目的において、存在する特定物質・分子の存否を極めて高感度に判定することは、分析技術の高度化という観点からも極めて重要な技術課題であるが、それを簡単な装置構成によって実現することはさらに重要であるということができる。
【００１２】
このような技術的課題を解決するためになされた本発明の目的は、コヒーレントアンチストークスラマン散乱法を利用する顕微鏡装置において、ロックインフリーな検出が可能となり、かつ多種の振動モードを同時検出する目的に適った顕微鏡装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の実施の形態に係る特徴は、顕微鏡装置において、第１の波長を持つ第１のパルスレーザ光及び第２の波長を持つ第２のパルスレーザ光を発生する光源部と、第１のパルスレーザ光及び第２のパルスレーザ光を分析対象に照射する光学系と、第１のパルスレーザ光の光源部から分析対象までの光路長を調整する光路長調整部と、第１及び第２のパルスレーザ光の照射によって分析対象から発せられるコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を検出する検出部とを備えることである。
【００１４】
また本発明の実施の形態に係る特徴は、顕微鏡装置において、第１の波長を持つ第１のパルスレーザ光及び第１の波長とは異なる第２の波長を持つ第２のパルスレーザ光および第1および第2の波長とは異なる第3の波長を持つ第3のパルスレーザ光を発生する光源部と、第１のパルスレーザ光、第２のパルスレーザ光及び第3のパルスレーザ光を分析対象に照射する光学系と、第１のパルスレーザ光の光源部から分析対象までの光路長を調整する光路長調整部と、第１、第２及び第3のパルスレーザ光の照射によって分析対象から発せられるコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を検出する検出部とを備えることである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、ＣＡＲＳ光をロックイン検出無しに高ＳＮ比で検出することが可能となり、かつ分析対象の持つ複数の振動モード周波数を同時に判定する手段を得る。これによって、簡便な装置によって微量物質の同定が可能な顕微鏡装置を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照して詳細に説明する。以下の図面の記載において、同一の部分には同一の符号を付し、重複する記載は省略する。また、図面は模式的なものであり、各部の寸法等は現実のものと異なる。
【００１７】
（第１の実施の形態）
図１に示すように、本実施の形態に係る顕微鏡装置２０は、２種以上の波長を持つパルスレーザ光を発生する光源２１、２２と、この光源２１、２２から発生する複数のパルス光を分析対象に照射するための光学系２５と、光源から分析対象までの光路長を調整する光路長調整部３０と、分析対象より発生するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を検出する検出部５０とを備える。
【００１８】
すなわち、図１において、顕微鏡装置２０は、８００ｎｍに中心波長を持つフェムト秒パルスレーザ（パルスレーザ光Ｐ１）を発する第１の光源２１と、１０５８ｎｍに中心波長を持つフェムト秒パルスレーザ（パルスレーザ光Ｐ２）を発する第２の光源２２とを備え、第１の光源２１から発せられるパルスレーザ光Ｐ１の光路長を光路長調整部３０によって調整した後、このパルスレーザ光Ｐ１の光路と第２の光源２２から発せられるパルスレーザ光Ｐ２の光路とを、ハーフミラー２６によって一致させて光学系２５に導く。後述する光路長調整部３０における光源２１からのパルスレーザ光Ｐ１の光路長が基準の光路長となっている場合において、光源２１及び２２はそれぞれの位相が一致するように光路長が調整されている。因みに、光源２１、２２においては、発せられるパルスレーザ光Ｐ１、Ｐ２のパルス光の半値幅が１０fsec（フェムト秒）から１０psec（ピコ秒）の間の値に設定している。これは、半値幅が短くなりすぎると、含まれる光のスペクトル幅が広くなり過ぎることを考慮して１０fsec以上とするものであり、また、半値幅が長いほど瞬間的な強度が弱くなることを考慮して１０psec以下とするものである。
【００１９】
ハーフミラー２６によって合成されたパルスレーザ光Ｐ３は、光学系２５の対物レンズによって分析対象である試料４０に集光される。試料４０は、例えばポリスチレン水溶液であり、図２に示すように、液体槽４１に貯留されている。この液体槽４１の内底部には、石英ガラスで形成された測定用の治具４２が載置される。この治具４２は、パルスレーザ光の入射側である上面側に突出した凸形状部４２Ａが複数並列に形成されており、この凸形状部４２Ａ間の凹部４２Ｂに貯留されたポリスチレン水溶液にパルスレーザ光を集光させてそれに含まれる微量物質を測定するようになされている。なお、分析対象はポリスチレン水溶液に限られるものではなく、また固体であってもよい。
【００２０】
光学系２５は、この試料４０に対して、その上方（凸形状部４２Ａの形成側）からパルスレーザ光Ｐ３を集光させる。このパルスレーザ光Ｐ３は、角周波数差を持った２つのパルスレーザ光Ｐ１、Ｐ２を同一光路に導いたものであるため、これらのパルスレーザ光Ｐ１、Ｐ２が集光した試料４０においては、その角周波数差に応じたＣＡＲＳ光が発生する。光学系２５の対物レンズは、このＣＡＲＳ光を集光させる。光学系２５において集光したＣＡＲＳ光Ｃ１は、ハーフミラー２７、フィルタ２８及び結像レンズ２９を通って検出部５０のフォトダイオード検出器５１に結像される。
【００２１】
フォトダイオード５１は、ＣＡＲＳ光Ｃ１を光電変換することによりＣＡＲＳ光信号Ｓ１を生成し、これをアンプ５２に出力する。アンプ５２は、ＣＡＲＳ光信号Ｓ１を増幅した後（Ｓ２）、コンピュータ５３に出力する。コンピュータ５３は、ＣＡＲＳ光信号Ｓ２に対して後述する信号処理を施すことにより、試料４０に含まれる物質に応じた測定結果を得るようになされている。なお、試料４０は、ＸＹＺステージ４５によって支持されており、コンピュータ５３は、このＸＹＺステージ４５をＸＹＺ方向に移動させることができる。これにより、コンピュータ５３は、試料４０を３次元方向に移動させることにより、試料４０に集光されるパルスレーザ光の位置を変化させて、ＣＡＲＳ信号Ｓ２の３次元画像を得ることができる。
【００２２】
ここで、光路長調整部３０は、第１の光源２１から発せられるパルスレーザ光Ｐ１の光路長を調整するようになされている。すなわち、光路長調整部３０は、直角ミラー３１と、振動器付き直角ミラー３２と、ハーフミラー３３、３４、３５とを備える。光源２１から発せられたパルスレーザ光Ｐ１は、ハーフミラー３３において直角ミラー３１の方向と振動器付き直角ミラー３２の方向とに振り分けられる。直角ミラー３１で反射したパルスレーザ光Ｐ１Ａと、振動器付き直角ミラー３２で反射したパルスレーザ光Ｐ１Ｂとは、ハーフミラー３５において同一光路に導かれてハーフミラー２６に入射される。
【００２３】
振動器付き直角ミラー３２は、図１において矢印Ｘで示す方向に所定の周波数及び振幅で振動するようになされている。すなわち、振動器付き直角ミラー３２は、例えばピエゾ素子等の振動源３６により、この直角ミラー３２に対するパルスレーザ光の入射及び出射方向と一致する方向（Ｘ方向）に振動するように構成されている。この実施の形態の場合、振動器付き直角ミラー３２は、振幅４０μｍ、周波数１KHzで振動するようになされているが、これに限られるものではない。
【００２４】
ここで、光路長調整部３０において、振動器付き直角ミラー３２が振動せずに基準位置で停止している状態においては、直角ミラー３１で反射してハーフミラー３５から出てくるパルスレーザ光Ｐ１Ａと、振動器付き直角ミラー３２で反射してハーフミラー３５から出てくるパルスレーザ光Ｐ１Ｂとは、それぞれの位相が一致するように各光路長が調整されている。
【００２５】
そして、振動器付き直角ミラー３２を矢印Ｘ方向に振動させると、振動器付き直角ミラー３２で反射してハーフミラー３５から出てくるパルスレーザ光Ｐ１Ｂの光路長が変化することにより、その位相も変化する。図３は、振動器付き直角ミラー３２の振動によってパルスレーザ光Ｐ１Ｂの位相が変化した場合における、パルスレーザ光Ｐ１Ｂと直角ミラー３１で反射した光路長が変化しないパルスレーザ光Ｐ１Ａとの関係を示すグラフである。図３に示すように、振動器付き直角ミラー３２が振動により変位して、パルスレーザ光Ｐ１Ｂの光路が長くなった場合、このパルスレーザ光Ｐ１Ｂのスペクトル３７Ｂは、光路長が変化しないパルスレーザ光Ｐ１Ａのスペクトル３７Ａに対して位相が遅れた状態となり、互いに重なり合わない。また、振動器付き直角ミラー３２が振動により変位して、パルスレーザ光Ｐ１Ｂの光路が短くなった場合、このパルスレーザ光Ｐ１Ｂのスペクトル３７Ｃは、光路長が変化しないパルスレーザ光Ｐ１Ａのスペクトル３７Ａに対して位相が進んだ状態となり、互いに重なり合わない。これに対して、パルスレーザ光Ｐ１Ｂの光路長及びパルスレーザ光Ｐ１Ａの光路長が同じ場合は、両者のスペクトルが重なり合うことにより強め合い、これらの重なったスペクトル３７Ｄの強度は、それぞれが重なり合わない場合に比べて大きくなる。
【００２６】
従って、振動器付き直角ミラー３２を振動させて、一方のパルスレーザ光Ｐ１Ｂの光路長を変化させると共に、他方のパルスレーザ光Ｐ１Ａの光路長を一定にすることにより、ハーフミラー３５から出てくるこれらの合成されたパルスレーザ光は、パルスレーザ光Ｐ１Ａ及びパルスレーザ光Ｐ１Ｂの光路長差が変化することに応じて、その強度が変化する光となる。この場合、試料４０において発生するＣＡＲＳ光Ｃ１には、パルスレーザ光Ｐ１Ａ及びＰ１Ｂの光路長差に応じた変調が与えられることになる。ここで、光路長差は、パルス光の照射時間差であることから、いわゆる時間分解分光をＣＡＲＳ光に行っていることに相当し、この変調によりフォトダイオード５１から得られる変調信号（ＣＡＲＳ光信号Ｓ１）を時刻差の関数として表すことができる。一般にはパルス光には多くの周波数成分が含まれているため、ある特定の周波数を持つＣＡＲＳ光を検出した場合でも、そのような周波数に対応するＣＡＲＳ過程を表す３次非線形分極の表式には、複数の振動状態からの寄与が含まれている。
【００２７】
従って、ＣＡＲＳ光の変調成分には、複数の周波数成分が同時に表れることとなる。ここで、時刻差の関数としての変調信号（ＣＡＲＳ光信号Ｓ１）は、分子内の振動状態の振動周波数と関連があることが分かっている。すなわち、２つのパルスレーザ光Ｐ１Ａ及びＰ１Ｂのタイミングをずらして試料４０に照射した場合、試料４０において得られるＣＡＲＳ光Ｃ１にかかる変調は、試料４０に含まれる分子振動の状態を直接に反映している。すなわち、２つのパルスレーザ光Ｐ１Ａ及びＰ１Ｂの間の時間遅れを横軸にとり、ＣＡＲＳ光Ｃ１の強度を縦軸にとって示した場合に、例えば図４に示すような変化が認められる。この変化は、試料４０に含まれる物質の分子振動周波数と対応したものであり、この変化の周波数成分をフーリエ変換によって求めることにより、試料４０に含まれる物質を同定することができる。
【００２８】
このように、２つのパルスレーザ光Ｐ１Ａ及びＰ１Ｂに対して、図４に示すような時間差を持たせるために、本実施の形態においては、光路長調整部３０を設け、一方のパルスレーザ光Ｐ１Ｂの光路長を変化させるようになされている。
【００２９】
なお、光路長調整部３０においては、振動器付き直角ミラー３２がＸ方向に振動する場合の位置を例えば光センサ等（図示せず）によって検出するようになされており、コンピュータ５３では、この検出された振動器付き直角ミラー３２の位置情報に基づいて、２つのパルスレーザ光Ｐ１Ａ及びＰ１Ｂの光路長差を求める。そして、この光路長差を光速で除することにより２つのパルスレーザ光Ｐ１Ａ及びＰ１Ｂの遅延時間ｔを求める。コンピュータ５３では、この遅延時間ｔに対応したＣＡＲＳ光信号Ｓ２の信号強度を計測して行くことにより、遅延時間ｔの関数としてのＣＡＲＳ光強度Ｉ（ｔ）を求める。
【００３０】
かくして顕微鏡装置２０では、試料４０から得られたＣＡＲＳ光Ｃ１をフーリエ変換することによって周波数領域でのデータに変換し、ＣＡＲＳ光に関与している振動モードの周波数を精密に求めることが可能となる。本実施の形態に係る顕微鏡装置２０においては、このような方法によって、分析対象固有の振動モード周波数を複数同時に検出することが可能となっている。
【００３１】
また、振動器付き直角ミラー３２を周波数１KHz程度で周期的に動作させることにより、ＣＡＲＳ光Ｃ１の変調成分は、ＣＡＲＳ光Ｃ１の光強度の低周波成分として現れる。従って、アンプ５２に内蔵されたローパスフィルタによってＣＡＲＳ信号Ｓ１の低域成分のみを取り出すことにより、バックグラウンドノイズをキャンセルすることができ、高ＳＮ比でＣＡＲＳ光を検出することができる。これにより、ＣＡＲＳ光をロックイン検出無しに高ＳＮ比で検出することができる。
【００３２】
また、ＣＡＲＳ信号Ｓ１は、ＣＨ基の伸縮振動モードを反映したものであり、3055cm−１（検出波長は643nm）に相当する。しかし、測定用治具４２の凸形状部４２Ａ（図２）に照射したパルスレーザ光による散乱光が、フィルタ２８（図１）で除去しきれない場合等は、フォトダイオード５１にバックグラウンドノイズとして検出されることになるが、このバックグラウンドノイズは、ＣＡＲＳ信号Ｓ１に比べて周期的な強弱が小さいため、コンピュータ５３の制御により、振動器付き直角ミラー３２の周期とフォトダイオード５１の光電変換動作を同期させることによって大幅に除去することができる。これにより、微弱信号であるＣＡＲＳ光信号Ｓ１の検出感度を向上させることができ、一段と鮮明な３次元画像を取得することができる。
【００３３】
図５は、コンピュータ５３によるＣＡＲＳ光取得時の処理手順を示し、コンピュータ５３は、ステップＳＴ１において、現在の試料４０の位置（ＸＹＺステージ４５の現在位置）において、パルスレーザ光Ｐ１Ａに対するパルスレーザ光Ｐ１Ｂの遅延時間ｔの関数としてのＣＡＲＳ光強度Ｉ（ｔ）を計測する。
【００３４】
そして、ステップＳＴ２において、コンピュータ５３は、ステップＳＴ１で計測したＣＡＲＳ光強度Ｉ（ｔ）をフーリエ変換し、周波数領域での信号強度Ｊ（ω）を計算する。この実施の形態の場合、試料４０として、ポリスチレン水溶液を用いていることにより、４８THz及び９２THzの周波数成分が顕著な大きさを持つことが分かる。これらは、ポリスチレンのフェニル基及びＣ−Ｈボンドの振動周波数に対応している。このように、フーリエ変換により得られた周波数領域での信号強度Ｊ（ω）により、各周波数成分での信号強度を求めることができ、これにより試料４０に含まれる物質を特定することができる。
【００３５】
コンピュータ５３は、ステップＳＴ３において、ω＝４８THz及びω＝９２THzに対応する信号強度Ｊ１、Ｊ２を決定する。この信号強度Ｊ１、Ｊ２は、現在、試料４０に対してパルスレーザ光があたっている位置での信号強度であり、コンピュータ５３は、ステップＳＴ４において、画像１（ω＝４８THzに対応する信号強度による画像）の現在の照射位置（画素）での値をＪ１とし、また、画像２（ω＝９２THzに対応する信号強度による画像）の現在の照射位置（画素）での値をＪ２とする。これにより、現在の照射位置での信号強度Ｊ１、Ｊ２を取得することができ、コンピュータ５３は、続くステップＳＴ５に移って、全画素についての信号強度を取得したか否かを判断する。
【００３６】
このステップＳＴ５において否定結果が得られると、このことは、全画素についての信号強度を取得していないことを意味しており、コンピュータ５３は、ステップＳＴ５からステップＳＴ６に移り、ＸＹＺステージ４５を移動させることにより、試料４０におけるパルスレーザ光の集光位置を移動させた後、上述のステップＳＴ１に戻ってステップＳＴ１〜ステップＳＴ５の処理を繰り返す。このようにして全ての画素についての信号強度Ｊ１、Ｊ２を取得すると、コンピュータ５３はステップＳＴ５において肯定結果を得ることにより、ステップＳＴ５からステップＳＴ７に移って、全画素について取得した信号強度Ｊ１、Ｊ２に応じた画像１、画像２を再構成する。これにより、ω＝４８THzに対応する信号強度Ｊ１によって1枚の画像が構成され、またω＝９２THzに対応する信号強度Ｊ２によって１枚の画像が構成される。画像１は、試料４０であるポリスチレンのフェニル基の振動周波数に対応した信号強度Ｊ１の様子を試料４０の全体に亘って表したものであり、また画像２は、試料４０であるポリスチレンのＣ−Ｈボンドの振動周波数に対応した信号強度Ｊ２の様子を試料４０の全体に亘って表したものである。
【００３７】
この画像１及び画像２によって、試料４０（ポリスチレン）のフェニル基及びＣ−Ｈボンドの分布を把握することができる。
【００３８】
以上説明したように、本実施の形態に係る顕微鏡装置２０によれば、ロックイン検出機構を持たない高ＳＮ比のコヒーレントアンチストークスラマン顕微鏡を得ることができる。また、本実施の形態に係る顕微鏡装置２０によれば、従来の顕微鏡装置と比較して、一段と簡便な機構による高感度検出を実現しており、装置の小型化、低コスト化にも資することとなる。また、時間分解分光機構の付与によって、分析対象の持つ複数の振動モード周波数を同時に検出することが可能となり、分析対象に含有される分子種の特定が一段と短時間に行うことができる。
【００３９】
なお、上述の第１の実施の形態においては、光路長を変化させる構成として、光路長調整部３０を用いる場合について述べたが、本発明はこれに限られるものではなく、例えば図６に示すような構成の光路長調整部６０を用いるようにしてもよい。
【００４０】
すなわち、図１との対応部分に同一符号を付して示す図６において、光路長調整部６０は、第１の光源２１からのパルスレーザ光Ｐ１を振動器付き直角ミラー３２に受け、この反射光をハーフミラー２６に導くようになされている。ハーフミラー２６には、第２の光源から発せられるパルスレーザ光Ｐ２を受け、ここで振動器付き直角ミラー３２において反射したパルスレーザ光Ｐ１と合成される。この合成されたパルスレーザ光Ｐ３は、光学系２５に導かれる。
【００４１】
光路長調整部６０の振動器付き直角ミラー３２は、振動源３６により矢印Ｘ方向に振動するようになされている。この振動によって、第１の光源２１からのパルスレーザ光Ｐ１の光路長を変化させることができる。
【００４２】
かかる構成の光路長調整部６０を用いることにより、図１に示した光路長調整部３０を用いる場合に比べて、構成を簡単にすることができる。
【００４３】
なお上述の実施の形態においては、２つの光源２１、２２を用いる場合について述べたが、本発明はこれに限られるものではない。すなわち、図７に示すように、顕微鏡装置２０´は、図６について上述した顕微鏡装置２０に比べて、３つの光源を用いる点が異なる。従って、図６と同一の部分には同一符号を付して、重複する説明は省略する。すなわち、図６との対応部分に同一符号を付して示す図７において、第3の光源２３（波長５３２ｎｍ、半値幅１psec）からのパルスレーザ光Ｐ４はハーフミラー２４によってＰ２と合成され、さらにハーフミラー２６によってＰ１と合成されたパルスレーザ光Ｐ３として光学系２５に導かれる。
【００４４】
光路長調整部６０の振動器付き直角ミラー３２は、振動源３６により矢印Ｘ方向に振動するようになされている。この振動によって、第１の光源２１からのパルスレーザ光Ｐ１の光路長を変化させることができる。このときＣＡＲＳシグナルの検出波長は４５７ｎｍとなる。パルスレーザを2本用いる場合に比べて本構成は複雑となるが、しかし、3本のパルスレーザを時間的に重ねて照射する必要が必ずしもなくなるため、振動器付き直角ミラー３２の振動幅は、上述の顕微鏡装置２０の場合に比較して大きく取ることができる。これは振動によるＣＡＲＳ光の変調を大きくかけられることを意味しており、より微弱な信号を取得する際の利点となる。
【００４５】
（第２の実施の形態）
本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡装置７０は、図１について上述した顕微鏡装置２０に比べて、１つの光源を用いる点が異なる。従って、図１と同一の部分には同一符号を付して、重複する説明は省略する。
【００４６】
すなわち図８において、顕微鏡装置７０は、フェムト秒パルスレーザ光Ｐ１１を発する１つの光源７１（中心波長８００ｎｍ、パルス幅１００fsec、平均出力１４０ｍＷ）を備え、この光源７１から発せられるパルスレーザ光Ｐ１１を、偏光ビームスプリッタ７２によって２分割した後、一方のパルスレーザ光Ｐ１２を、フォトニック結晶ファイバ７３（Blaze photonics 社製 PM-NL750）に導入し、パルス強度に応じて広帯域化した出力光を得る。そして、このフォトニック結晶ファイバ７３からの出力光をレンズ７４によってコリメート光とした後、フィルタ７５を用いて９００ｎｍ以下の波長を持つ成分を除去することによって、９００ｎｍから１４００ｎｍまでの波長を持つ光Ｐ１４を得る。
【００４７】
一方、ビームスプリッタ７２によって２分割された他方のパルスレーザ光Ｐ１３は、光路長調整部３０に導かれ、さらにハーフミラー３３によって、直角ミラー３１の方向と振動器付き直角ミラー３２の方向とに振り分けられる。そして、直角ミラー３１で反射いたパルスレーザ光Ｐ１３Ａと、振動器付きミラー３２で反射したパルスレーザ光Ｐ１３Ｂとは、ハーフミラー３５において同一光路に導かれ、ミラー７６を介してハーフミラー７７に入射される。
【００４８】
ハーフミラー７７は、フォトニック結晶ファイバ７３からの出力光Ｐ１４と、光路長調整部３０を介して出力されるパルスレーザ光とを光学系２５に導く。これにより、これらの光は、試料４０の同一個所に集光され、その結果、ＣＡＲＳ光Ｃ１が発生する。このＣＡＲＳ光Ｃ１は、ハーフミラー７７、フィルタ２８及び結像レンズ２９を介して、光電子増倍管７８に入射される。光電子増倍管７８は、入射した光を増倍させた後、アンプ５２を介してコンピュータ５３に出力する。
【００４９】
コンピュータ５３は、図１に示した第１の実施の形態に係る顕微鏡装置２０の場合と同様にして、光電子増倍管７８によって検出されたＣＡＲＳ光Ｃ１に基づいて、図５に示した処理を実行することにより、試料４０に含まれる複数の物質を同定することができる。
【００５０】
また、振動器付き直角ミラー３２を周波数１KHz程度で周期的に動作させることによってＣＡＲＳ光Ｃ１の変調成分がＣＡＲＳ光Ｃ１の光強度の低周波成分として現れるようにし、この低域成分をアンプ５２に内蔵されたローパスフィルタによって取り出すことにより、バックグラウンドノイズをキャンセルすることができ、高ＳＮ比でＣＡＲＳ光を検出することができる。これにより、ＣＡＲＳ光をロックイン検出無しに高ＳＮ比で検出することができる。
【００５１】
このように、１つの光源７１からのパルスレーザ光Ｐ１１を偏光ビームスプリッタ７２によって２つのパルスレーザ光Ｐ１１に分割する構成の顕微鏡装置９０においても、図１について上述した顕微鏡装置２０の場合と同様にして、時間分解分光によって試料４０に含まれる物質を同定することができると共に、振動器付き直角ミラー３２によってパルスレーザ光Ｐ１３の光路長を１KHz程度で周期的に変化させ、アンプ５２に内蔵されたローパスフィルタによってＣＡＲＳ光信号Ｓ１の低域成分のみを通過させることにより、ＣＡＲＳ光信号Ｓ１に含まれるバックグラウンドノイズをキャンセルすることができ、高ＳＮ比でＣＡＲＳ光を検出することができる。
【００５２】
なお、上述の第２の実施の形態においては、光路長を変化させる構成として、光路長調整部３０を用いる場合について述べたが、本発明はこれに限られるものではなく、例えば図９に示すような構成の光路長調整部８０を用いるようにしてもよい。
【００５３】
すなわち、図８との対応部分に同一符号を付して示す図９において、光路長調整部８０は、偏光ビームスプリッタ７２から出力されるパルスレーザ光Ｐ１３を、ミラー８３を介して振動器付き直角ミラー３２に受け、この反射光をハーフミラー７７に導くようになされている。ハーフミラー７７は、振動器付き直角ミラー３２で反射した光と、フォトニック結晶ファイバ７３からの光とを光学系２５に導く。
【００５４】
光路長調整部８０の振動器付き直角ミラー３２は、振動源３６により矢印Ｘ方向に振動するようになされている。この振動により、偏光ビームスプリッタ７２において分割されてなる一方のパルスレーザ光Ｐ１３の光路長を変化させることができる。
【００５５】
かかる構成の光路長調整部８０を用いることにより、図８に示した光路長調整部３０を用いる場合に比べて、構成を簡単にすることができる。
【００５６】
また、上述の第２の実施の形態においては、光電子増倍管７８を用いたが、これに代えて、図１０に示すようにフォトダイオード９１を用いるようにしてもよい。この顕微鏡装置９０において、フォトダイオード９１は、フィルタ２８及び結像レンズ２９を介して出力されるＣＡＲＳ光Ｃ１を光電変換することにより、ＣＡＲＳ光信号Ｓ１を得る。コンピュータ５３は、アンプ５２を介して増幅されたＣＡＲＳ光信号Ｓ２に基づいて、図５について上述した処理によりフーリエ変換を実行することにより、試料４０に含まれる物質を同定する。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】第１の実施の形態に係る顕微鏡装置を示すブロック図である。
【図２】図１の顕微鏡装置に用いられる測定用の治具を示す斜視図である。
【図３】光路長が変化するパルスレーザ光と光路長が変化しないパルスレーザ光との関係を示すグラフである。
【図４】２つのパルスレーザ光の間の時間遅れとＣＡＲＳ光の強度との関係を示すグラフである。
【図５】コンピュータによるＣＡＲＳ光取得時の処理手順を示すフローチャートである。
【図６】他の実施の形態に係る顕微鏡装置を示すブロック図である。
【図７】他の実施の形態に係る顕微鏡装置を示すブロック図である。
【図８】第２の実施の形態に係る顕微鏡装置を示すブロック図である。
【図９】他の実施の形態に係る顕微鏡装置を示すブロック図である。
【図１０】他の実施の形態に係る顕微鏡装置を示すブロック図である。
【図１１】コヒーレントアンチストークスラマン散乱法の説明に供する略線図である。
【図１２】コヒーレントアンチストークスラマン顕微鏡を示すブロック図である。
【符号の説明】
【００５８】
２０、２０´、７０、８０、９０  顕微鏡装置
２１、２２、２３、７１  光源
２５  光学系
２８、７５  フィルタ
２９  結像レンズ
３０  光路長調整部
３１  直角ミラー
３２  振動器付き直角ミラー
３６  振動源
４０  試料
４２  治具
４５  ＸＹＺステージ
５０  検出部
５１、９１  フォトダイオード
５２  アンプ
５３  コンピュータ
７８  光電子増倍管
７２  偏光ビームスプリッタ
７３  フォトニック結晶ファイバ
７４  レンズ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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