(57)【要約】【課題】メディエーターを用いたアンペロメトリー法の酵素電極式センサーにおいて、メディエーターとして通常状態で還元型の酸化還元性物質であるフェロセン誘導体を用いた場合、フェロセン誘導体の酸化電流値も同時に測定してしまうため、測定対象物質濃度に応じた酵素反応による反応電流が得られない。いくつかの方法が提案されているが、それらは使い捨ての酵素電極式センサーに応用するには未だ十分でない。【解決手段】作用極と対極と参照極とを有する３極式のバイオセンサーにおいて、作用極と参照極との間に第一の電位印加後に第二の電位を印加し、第二の電位印加時に試料溶液中の測定対象物質濃度を測定し、第一の電位が第二の電位よりも高電位である。【選択図】図1
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化還元性物質をメディエーターとして用いる作用極と対極と参照極とを有する３極式のバイオセンサーに使用されるバイオセンサーの測定方法であって、前記酸化還元性物質の少なくとも一部が、電位を印加する前の状態で還元型の酸化還元性物質であり、前記作用極と前記参照極との間に第一の電位を印加する工程と、前記作用極と前記参照極との間に前記第一の電位よりも低電位である第二の電位を印加し、試料中の測定対象物質の濃度を測定する工程とを有するバイオセンサーの測定方法。
【請求項２】
酵素と前記メディエーターとが前記作用極に固定化されていることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサーの測定方法。
【請求項３】
前記酸化還元性物質がフェロセン誘導体であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載のバイオセンサーの測定方法。
【請求項４】
前記第一の電位を印加する工程において、前記酸化還元性物質が前記還元型の酸化還元性物質から酸化型の酸化還元性物質に変化することを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のバイオセンサーの測定方法。
【請求項５】
前記第一の電位を印加する工程において、前記試料中に存在する還元性物質を酸化することを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載のバイオセンサーの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサーの測定方法に関し、特に生体試料中に含まれる測定対象物質を定量する酵素電極式バイオセンサーにおいて、微量な測定対象物質の定量を行うための測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体試料中の測定対象物質と特異的に反応する酸化還元酵素を用い、測定対象物質と酸化還元酵素の電子移動による酵素反応により生じた試料溶液中の物質を電極にて酸化還元し、流れる電流量に応じて測定対象物質の濃度を測定する酵素電極式バイオセンサーが開発されている。例えば、グルコースセンサーの場合はグルコースオキシダーゼとグルコースの反応により生成する過酸化水素を電極にて酸化しグルコース濃度を測定する方法がある。
【０００３】
しかしながら、過酸化水素の酸化電位が高いことから、酵素反応により生じた酸化型、あるいは還元型酵素と電子の授受をし、かつ酸化還元電位の低い酸化還元性物質をメディエーターとして用いた酵素電極式センサーが多く用いられている。
【０００４】
メディエーターとしてはフェリシアン化カリウム、ベンゾキノン化合物、オスミウム錯体、フェロセン誘導体等が用いられる。
【０００５】
上記メディエーターの中でも多くのグルコースセンサーでフェリシアン化カリウムが用いられているが、コスト面での優位性はあるものの、酵素との電子授受特性が低いことが知られている。
【０００６】
一方、フェロセン誘導体は酵素との電子授受特性が高いことが知られており、種々のセンサー形態が示されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００７】
【特許文献１】特開平２−２４０５５５号公報(図１)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記特許文献のフェロセン誘導体を用いたセンサーは光硬化性樹脂によりフェロセン誘導体としてジメチルフェロセンを電極に固定化して成るものであり、参照極と作用極の間にジメチルフェロセンの酸化電位以上である+200mVを印加し得られた電流値からグルコース濃度を求めている。
【０００９】
酸化還元性物質としてフェロセン誘導体を用いた場合、基質と反応した酵素との電子授受が可能なフェロセン誘導体は酸化型のフェロセン誘導体である。しかしながら、通常状態でフェロセン誘導体はそのほとんどが還元型フェロセン誘導体として存在する。
【００１０】
従って、フェロセン誘導体をメディエーターとして用い、フェロセン誘導体の酸化電位以上の電位を印加し得られる電流値は、電極で酸化される還元型のフェロセンの酸化電流と、電位印加前に含まれる酸化型のフェロセンと還元型のフェロセン誘導体を酸化することにより生成した酸化型フェロセン誘導体が仲介する測定対象物質と酵素との反応電流との和となる。
【００１１】
フェロセン誘導体をメディエーターとして用い反応電流を正確に測定するには、センサ
ーチップを電解質溶液中に浸漬し長時間フェロセン誘導体の酸化電位以上の電位を印加した後に、電流値が安定したところで測定対象物質を含む試料溶液を加え電流値変化を測定する方法があるが、多くの自己血糖測定器に用いられている様な使い捨てのセンサーとして用いることが出来ないという問題がある。
【００１２】
本発明は、フェロセン誘導体をメディエーターとした使い捨ての酵素電極式バイオセンサーに有用な測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明のバイオセンサーの測定方法は酸化還元性物質をメディエーターとして用いる作用極と対極と参照極とを有する３極式のバイオセンサーに使用されるバイオセンサーの測定方法であって、メディエーターとして用いる酸化還元性物質の少なくとも一部が、電位を印加する前の状態で還元型の酸化還元性物質であり、作用極と参照極との間に第一の電位を印加する工程と、作用極と参照極との間に第一の電位よりも低電位である第二の電位を印加し、試料溶液中の測定対象物質濃度を測定する工程とを有することを特徴とするものである。
【００１４】
第一の電位、並びに第二の電位はどちらもメディエーターとして用いる酸化還元性物質の酸化電位以上であり、第一の電位は、酸化還元性物質の酸化電位と還元電位から求められる半波電位E1/2に対して+200mVから+600mV以内の電位であることが好ましい、但し、参照極に対する作用極の電位は、水の分解等が生じる＋1.0V以下とすることが望ましい。更に第二の電位は酸化還元性物質の半波電位E1/2に対して+50mVから+300mV以内の電位であることが好ましい。
【００１５】
また、本発明のバイオセンサーの測定方法は、酵素とメディエーターとが作用極と参照極と対極のうち、少なくとも作用極に固定化されていることが好ましい。
【００１６】
酵素とメディエーターを固定化する方法としては、従来から用いられているポリビニルアルコールやカルボキシメチルセルロース等の水溶性高分子、ポリビニルブチラールやナフィオン等の疎水性高分子を用いることが出来る。また、酵素とメディエーターは混合状態で固定化されていてもそれぞれ個別に積層されていても良い。酵素の固定化にはグルタルアルデヒドを用いても良い。
【００１７】
更に、本発明のバイオセンサーの測定方法は、メディエーターである酸化還元性物質がフェロセン誘導体であることが好ましい。
【００１８】
用いるフェロセン誘導体としては、フェロセンの他にフェロセンカルボン酸1,1'-フェロセンジカルボン酸、フェロセンメタノール、1,1'-フェロセンジメタノール、フェロセンエタノール、メチルフェロセン、1,1'-ジメチルフェロセン等を用いることが出来るが、酸化電位が低く、固定化する際の高分子への溶解性が高いフェロセンメタノール、1,1'-フェロセンジメタノール等を用いることが好ましい。
【００１９】
また、本発明のバイオセンサーの測定方法は、第一の電位を印加する工程が、メディエーターを酸化型に変化させる工程を有することが好ましい。
【００２０】
電極に固定化されたフェロセン誘導体は第一の電位の印加により、酸化型へと変化することで第二の電位印加工程で反応電流を正確に測定する事が可能となる。電極に固定化するフェロセン誘導体の濃度は、電極面積、測定試料中の測定対象物質濃度、あるいは酵素活性等により変化するが、電極に対して0.02から1μmol/cm2、更に0.05から0.4μmol/cm2が好ましい。電極に固定化するフェロセン誘導体の濃度が上記範囲より低い場合は、高濃
度域での測定対象物質応答性が低くなり、またフェロセン誘導体の濃度が上記範囲より高い場合は、第一の電位印加工程で十分にフェロセン誘導体の酸化が行われず、第二の電位印加時に引き続きフェロセン誘導体の酸化電流が観測され、実際の反応電流に誤差が生じてしまう。
【００２１】
また、本発明のバイオセンサーの測定方法では、第一の電位を印加する工程が、試料中に存在する還元性物質を酸化する工程を含むのが好ましい。
【００２２】
上記還元性物質としては、例えば生体試料中に存在するアスコルビン酸、ビリルビン、尿酸、アセトアミノフェンなどがあげられる。これらの還元性物質はメディエーターである酸化還元性物質を還元する作用、あるいはそれら自身が電位印加により酸化されることにより見かけの反応電流値が高くなるという阻害効果がある。
【００２３】
（作用）
本発明の方法によると、第一の電位印加により、酸化還元性物質であるメディエーターを酸化すると共に生体試料中に含まれる還元性物質をも酸化型に変換する事により、第二の電位印加工程でより正確な反応電流測定を測定することが可能となる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、フェロセン誘導体をメディエーターとして用いた酵素電極式バイオセンサーにおいて反応電流値の測定誤差要因であるメディエーターの酸化電流、生体試料中の還元性物質に起因する酸化電流を無視しうる程度に低減化することが可能となるので、生体試料中に低濃度で存在する測定対象物質の定量が可能となると共に、測定精度の向上が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
図1に酵素電極式のバイオセンサーのセンサーチップの1例を平面図及び断面図を用いて示す。図1の（ａ）はセンサーチップの平面図であり、図1の（ｂ）は図1の（ａ）の平面図をＡ−Ａ’で切断したときの断面図である。絶縁基板１上に銀箔１０にて電極と配線下地が形成されている。作用極２、対極３、並びに接続端子５に通じる配線はカーボンペースト１１を用いてスクリーン印刷することで形成されている。同様に銀塩化銀ペースト１２を用いて参照極４、並びに接続端子５に通じる配線がスクリーン印刷にて形成されている。作用極、対極、並びに参照極からの配線は絶縁材１３にて被覆される。
【００２６】
以下、上記センサーチップを用い、本発明のバイオセンサーの測定方法について測定対象物質としてグルコースを、酵素としてグルコースオキシダーゼを、メディエーターとしてフェロセン誘導体である1,1'-フェロセンジメタノールを用いた実施例を示し、更に詳しく説明する。尚、1,1'-フェロセンジメタノールの酸化電位と還元電位から求められる半波電位E1/2は＋140mVであり、第一の電位を+500mV、第二の電位を+350mVとした。
【００２７】
（実施例１）
4mg/mLのグルコースオキシダーゼと2mMの1,1'-フェロセンジメタノールを溶解した1wt%のカルボキシメチルセルロース水溶液中3μLを7mm2の作用極上に滴下し乾燥させ酵素メディエーター固定化電極とした。
【００２８】
このように作製したセンサーチップを用い、種々のグルコース濃度のPBS溶液を作用極と対極と参照極全体を覆うように10μL添加した。添加直後に作用極と参照極間に+500mVを30秒間印加後、直ちに+350mVに切り替え10秒後の電流値を測定した。結果を図２に示す。
【００２９】
図２より、グルコース濃度200μMから10mMの濃度域まで直線関係が得られていることが判る。
【００３０】
（比較例１）
実施例１と同様に作製したセンサーチップを用い、種々のグルコース濃度のPBS溶液を作用極と対極と参照極全体を覆うように10μL添加した。添加直後に作用極と参照極間に+350mVの電位を印加し10秒後の電流値を測定した。結果を図３に示す。
【００３１】
図３より、特にグルコース濃度が低濃度域でのデータが直線からずれていることが判る。更に、200μMから1mMのグルコース濃度域での測定値の再現性を調べたところ、データのバラツキが大きいことが明らかとなった。
【００３２】
（実施例２）
1mMグルコースのPBS溶液中にアスコルビン酸を100μMとなるように溶解しグルコース−アスコルビン酸溶液を調製した。実施例１と同様に作製したセンサーチップを用い、上記アスコルビン酸溶液を作用極と対極と参照極全体を覆うように10μL添加した。添加直後に作用極と参照極間に+500mVの電位を30秒間印加後、直ちに電位を+350mVに切り替え10秒後の電流値を測定した結果、電流値は8.43μAであり、実施例1の結果とほとんど変化がなかった。
【００３３】
（比較例２）
実施例２と同様のグルコース−アスコルビン酸溶液と実施例１と同様に作製したセンサーチップを用い、上記アスコルビン酸溶液を作用極と対極と参照極全体を覆うように10μL添加した。添加直後に作用極と参照極間に+350mVの電位を印加し10秒後の電流値を測定した結果、25.3μAとなり、実施例2に比べて非常に高い電流値が観測された。
【００３４】
実施例１と比較例１より、本発明の測定方法が測定対象物質の広い濃度域において測定対象物質濃度と電流値が直線関係を保つことが判る。比較例1のような従来の測定方法ではセンサーチップ製造時に生じる電極上のメディエーター濃度ばらつき、あるいはセンサーチップの保存状態による酸化型の酸化還元性物質であるメディエーターと還元型の酸化還元性物質であるメディエーターの存在比率の変化により測定電流値が大きくばらついてしまう。
【００３５】
一方、本発明の測定法によれば電極に固定化されているメディエーターの多くを第一の電位印加工程で酸化するので酵素と測定対象物質の反応電流の正確な測定が可能となる。
【００３６】
更に実施例２と比較例２の結果より、本発明の測定方法によれば測定対象物質濃度を測定するに当たっての阻害物質である試料溶液中の還元性物質の影響も大きく低減化が可能であることが判る。
【００３７】
上記実施例では第一の電位印加後の直後に第二の電位を印加しているが、それらの間に開回路状態で待ち時間を設けても構わない。上記実施例は、本発明を説明する一つの事例に過ぎず、本発明のバイオセンサーの測定方法は、測定対象物質の種類やそれに対応する酵素の選択やメディエーターの選択により、種々の条件が設定可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明のバイオセンサーの測定方法に用いるセンサーチップの一例を示す平            面図および断面図である。
【図２】本発明のバイオセンサーの測定方法を用いた実施例１の測定結果を示す図で            ある。
【図３】従来のバイオセンサーの測定方法を用いた比較例１の測定結果を示す図であ            る。
【符号の説明】
【００３９】
１      絶縁性基板
２      作用極
３      対極
４      参照極
５      接続端子
１０    銀箔
１１    カーボンペースト
１２    銀塩化銀ペースト
１３    絶縁材
【図１】
2007256069.tif 000003
【図２】
2007256069.tif 000004
【図３】
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