(57)【要約】【課題】生体試料中の任意の相互作用を直接的かつ低侵襲に検出すること。特に、ＢＲＥＴのような微弱光信号の変化に起因する画像情報を細胞単位で撮像する方法および装置を提供すること。【解決手段】細胞等の生体試料中の相互作用を撮像する撮像方法であって、前記相互作用し得る物質の双方に対してそれぞれ発光物質と蛍光物質を標識した相互作用物質を１以上の細胞内に存在せしめ、相互作用による結果としての発光物質による蛍光物質へのエネルギー転移を光学的に撮像し、撮像した光学的情報を単一の細胞について画像化する工程を含み、画像表現が相互作用に起因する微弱光の有無および／または量を示していることを特徴とする。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体関連情報を画像情報として取得するための画像化方法において、
画像化すべき画像化対象に対して生物学的エネルギーにより光学的に検知可能な変化をもたらす生物学的励起物質を作用せしめ、
前記生物学的エネルギーが提供する出力に相当する画像関連情報を前記画像化対象から優先的に取得することを特徴とする生体関連情報の画像情報取得方法。
【請求項２】
細胞内の相互作用に関する画像情報を撮像する方法において、前記相互作用し得る物質の双方に対して生物学的励起物質としての発光物質および蛍光物質をそれぞれ標識した相互作用物質を１以上の細胞内に存在せしめ、相互作用による結果としての発光物質による蛍光物質へのエネルギー転移を光学的に撮像し、撮像した光学的情報を単一の細胞について画像化する工程を含み、画像表現が相互作用に起因する微弱光の有無および／または量を示していることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体試料が、生細胞を含んでいることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
生体関連情報の画像化装置において、画像化すべき画像化対象に照準する手段と、画像化対象に対して生物学的エネルギーにより光学的に検知可能な変化をもたらす生物学的励起物質を作用せしめた状態で、前記生物学的エネルギーが提供し得る出力を優先的に画像情報として取得する画像情報取得手段とを備えたことを特徴とする生体関連情報の画像情報取得装置。
【請求項５】
請求項１に記載の方法を自動的に実行するためのプログラム。
【請求項６】
請求項５に記載のプログラムを読み出し可能に書き込んでいるソフトウエア。
【請求項７】
請求項１に記載の方法により取得された画像情報に基づいて生体関連情報の解析を行なう解析方法。
【請求項８】
請求項７に記載の解析方法において、生物学的励起物質が、生物発光をもたらす成分を含んでいる解析方法。
【請求項９】
請求項７または８に記載の方法において、生物学的励起物質の活性に影響を与える薬剤との相互作用を評価する工程を含んでいる解析方法。
【請求項１０】
請求項４に記載の画像情報取得手段に適合する光特性を備えた試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種々の生体に関連する情報を画像化する方法および、細胞等の生体試料中の相互作用し得る物質について視覚的に相互作用を検出する方法および装置に関する。詳しくは、本発明は、細胞内の相互作用を生物発光を用いて定量的に検出するレポータアッセイに適用する方法に関する。一例として、本発明は、細胞内の発光による光エネルギーが近接する蛍光分子に移動したときの蛍光を指標とする生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）により転移したエネルギーでもって励起された、蛍光分子が発する蛍光を撮像する方法および装置を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体を内外から調べる技術が目覚ましく発展している。地球上のあらゆる生体は、有望な生物学的用途としての診断、治療、予防医療等の医学的成果に直接的かつ一義的に適用できる生体関連情報を有している。生体関連情報の一例として、生体内または生体外で生きた状態の細胞（ないし細胞を含む生物学的材料）から得られる生物学的相互作用（以降、相互作用と略称する）を得る場合がある。生細胞における相互作用を調べる技術の多くは光信号を発生するレポータ物質を細胞の外部から検出する方法および装置によって実現される。かかるレポータ物質として、例えばオワンクラゲに由来する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は，生細胞の画像解析に多く用いられている。ＧＦＰのような光信号を発生し得る物質を合成する機能を有するタンパク質は多様な取扱いが可能であり、そのタンパク質を構成する遺伝子をクローニングし、さらに遺伝子工学的な改変が施すことによって、輝度，吸収・蛍光波長，ｐＨ感受性などの所望の光特性および生物学的特性を有するような変異体が作られている。これらの蛍光タンパク質の遺伝子に細胞内で局在を示すシグナルを付加し，細胞に導入・発現させることによって，細胞内の特異的な領域を可視化できる。また，機能的なタンパク質と融合させることにより，細胞内でのタンパク質の局在や挙動を観察することができる。さらに，相互作用するタンパク質を，それぞれ異なる色の蛍光タンパク質で標識すれば，相互作用によってタンパク質同士が接近した場合，一方の蛍光のエネルギーが他方の蛍光分子を励起し，長波長にシフトした蛍光が観察される（ＦＲＥＴ）。この波長シフトを可視化することにより，細胞内での分子間相互作用を検出することができる。
【非特許文献１】Ｏｔｕｊｉ  ｅｔ．  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３２９（２００４）２３０−２３７,Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｂｙ  ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｕｓｉｎｇ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ＦＲＥＴ測定を行うには，細胞に励起光を当てなければならない。数十時間また数日にわたるような長時間測定の場合，細胞は励起光の光毒性によりダメージを受けてしまう。一方，励起光を使わず，エネルギーのドナーとなる蛍光タンパク質をルシフェラーゼなどの発光タンパク質に置き換えた生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を利用した分子間相互作用の計測方法がある。発光による光エネルギーでアクセプターとなる蛍光タンパク質を励起し，発光波長と蛍光波長の光強度の比を測定することになる（Otsuji et al, 2004）。この場合，励起光を細胞に照射する必要はないので，光毒性の影響はない。しかし，生細胞内での発光強度は極めて弱いため，この発光から転移したエネルギーによって励起された蛍光もまた微弱であり、概ね発光の半分の光強度となると見込まれる。従って、従来のＣＣＤカメラまたは光電子増倍管の走査法では、細胞の発光およびＢＲＥＴに起因するアクセプターからの蛍光を撮像する能力が無かった。
【０００４】
従って、本発明は、生体試料中の任意の相互作用を直接的かつ低侵襲に検出することを目的とする。また、本発明は、特に、ＢＲＥＴのような微弱光信号の変化に起因する画像情報を細胞単位で撮像する方法および装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ルシフェラーゼ遺伝子を導入した細胞の発光像およびＢＲＥＴによる蛍光像を，以下の条件を満たす光学系で撮像する。発明者の光学的実験によれば、対物レンズの開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）の２乗の値が０．０１以上の光学系で撮像することによって、単一の細胞から発生する発光だけで画像化できることが証明された（特願２００５−２６７５３１号参照）。驚くべきことに、この撮像条件は、ＢＲＥＴにおける微弱な蛍光画像にも適用でき、短い時間（例えば１分〜２０分）で生物発光のような微弱な発光成分による細胞画像を撮像できる。さらに、発明者が追究した光学的条件によれば、撮像装置の対物レンズを開口数（ＮＡ）／投影倍率（β）の２乗で表される光学的条件が０．０７１以上である場合に、１〜５分以内で画像化でき、画像解析も可能な細胞画像を提供できること突き止めた。
【０００６】
従って、本発明の方法は、生体関連情報を画像情報として取得するための画像化方法において、画像化すべき画像化対象に対して生物学的エネルギーにより光学的に検知可能な変化をもたらす生物学的励起物質を作用せしめ、前記生物学的エネルギーが提供する出力に相当する画像関連情報を前記画像化対象から優先的に取得することを特徴とする。
【０００７】
また、本発明の方法は、細胞内の相互作用に関する画像情報を撮像する方法において、前記相互作用し得る物質の双方に対して生物学的励起物質としての発光物質および蛍光物質をそれぞれ標識した相互作用物質を１以上の細胞内に存在せしめ、相互作用による結果としての発光物質による蛍光物質へのエネルギー転移を光学的に撮像し、撮像した光学的情報を単一の細胞について画像化する工程を含み、画像表現が相互作用に起因する微弱光の有無および／または量を示していることを特徴とする。
【０００８】
ここで、前記生体試料が、生細胞を含んでいるのが好ましい。
また、本発明の装置は、生体関連情報の画像化装置において、画像化すべき画像化対象に照準する手段と、画像化対象に対して生物学的エネルギーにより光学的に検知可能な変化をもたらす生物学的励起物質を作用せしめた状態で、前記生物学的エネルギーが提供し得る出力を優先的に画像情報として取得する画像情報取得手段とを備えたことを特徴とする。
【０００９】
また、本発明は、上記の方法を自動的に実行するためのプログラムを包含する。また、本発明は、上記のプログラムを読み出し可能に書き込んでいるソフトウエアを包含する。また、本発明は、上記の方法により取得された画像情報に基づいて生体関連情報の解析を行なう解析方法を包含する。上記の解析方法は、生物学的励起物質として生物発光をもたらす成分を含んでいることが好ましい。発光成分としては、発光用の基質や、発光用酵素ないし発光用酵素をコードする遺伝子を融合する発光タンパク質が挙げられる。上記の方法は、さらに、生物学的励起物質の活性に影響を与える薬剤との相互作用を評価する工程を含んでいる場合には、医学的調査に貢献し、創薬研究や、薬効、毒性評価等を生存する生命体における調査と同等の条件で実行できる。また、本発明は、上記の装置における画像情報取得手段に適合する光特性を備えた試薬キットを包含する。
【００１０】
なお、本発明では、特別に説明する場合を除いて「発光」とは生物発光を意味し、「発光物質」とはＢＲＥＴにおいて蛍光物質に対し励起エネルギーを与えることができる任意の発光を有する物質を意味する。
【発明の効果】
【００１１】
細胞内における分子間相互作用の測定には，蛍光タンパク質を用いたＦＲＥＴが利用される。この方法では，細胞に励起光を当てなければならないので，長時間の光照射は細胞にダメージを与えてしまう。ＦＲＥＴにおけるエネルギーのドナー側の蛍光タンパク質をルシフェラーゼなどの発光タンパク質に置き換えたＢＲＥＴの系にすることで，細胞への光照射による影響を排除することができる。そのため，数日から数週間以上にわたる長期的な観察が可能となり，これを経時的に撮像することで，細胞内の分子間相互作用を画像として表示できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を図面を用いて詳細に説明する。図１は、本発明の方法を実施するための装置の概要を示すものである。図１に示すように、本発明にかかる撮像方法を実施するための装置は、撮像対象であるサンプル１を短い露出時間で、ひいてはリアルタイムに撮像するためのものであり、対物レンズ２と集光レンズ３とＣＣＤカメラ４とモニタ５とで構成されている。なお、当該装置は図示の如くズームレンズ６をさらに備えてもよい。
【００１３】
サンプル１は、発光試料であり、例えば、発光タンパク質（例えば導入された遺伝子（ルシフェラーゼ遺伝子など）から発現された発光タンパク質）や、発光性の細胞や、発光性の細胞の集合体や、発光性の組織試料や、発光性の臓器や、発光性の個体（動物など）などである。また、サンプル１は、具体的には、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した発光細胞でもよい。対物レンズ２は、開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）の2乗の値が０．０１以上のものである。集光レンズ３は、対物レンズ２を介して到達したサンプル１からの発光を集める。ＣＣＤカメラ４は、０℃程度の冷却ＣＣＤカメラであり、対物レンズ２や集光レンズ３を介してサンプル１を撮像する。モニタ５はＣＣＤカメラ４で撮像した画像を出力する。
【実施例】
【００１４】
ルシフェラーゼと緑色蛍光タンパク質を用いたＢＲＥＴによるアポトーシスの検出
アポトーシス誘導によって活性化されるカスパーゼ３の活性を発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）によって検出する。ドナーとなる発光タンパク質の遺伝子にはウミシイタケ由来のルシフェラーゼ遺伝子（phRL，プロメガ社），アクセプターとなるＧＦＰ遺伝子にはpEGFP（クロンテック社）を用い，ルシフェラーゼとＧＦＰの間にアポトーシス誘導時に活性化されるカスパーゼ３の認識配列（ＤＥＶＤ；アミノ酸一時表記，アスパラギン酸，グルタミン酸，バリン，）を導入したベクターを作る。また，ルシフェラーゼとＤＥＶＤ配列およびＤＥＶＤとＧＦＰの間にはグリシン（Ｇ）セレン（Ｓ）などのアミノ酸をリンカーとして入れている。
【００１５】
この状態では，ルシフェラーゼによる発光のエネルギーはＦＲＥＴが起こり，隣接するＧＦＰに移動しＧＦＰから蛍光（510 nm）が発せられる（ＢＲＥＴ）。アポトーシスが誘導されカスパーゼが活性化されると，ルシフェラーゼ-ＧＦＰ分子が消化されＢＲＥＴが解消されるため，ルシフェラーゼによる発光(450 nm)が観察されることになる。
【００１６】
哺乳細胞での発現ベクターの作製
哺乳細胞での発現ベクターであるpCDNA3.1(インビトロゲン社)を制限酵素BamHIおよびEcoRIで消化し精製する。また，ＰＣＲ法によってウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子およびＧＦＰを増幅する。ルシフェラーゼ遺伝子のForward側のＰＣＲプライマーには，５'に制限酵素BamHIの認識配列を含み，Reverse側のプライマーには，３'側にカスパーゼ認識配列と制限酵素KpnIの認識配列を含んでいる。ＧＦＰ遺伝子Forward側のプライマーには，５'にKpnI認識配列，reverse側のプライマーには，３'にEcoRI認識配列を含んでいる。それぞれの遺伝子をＰＣＲで増幅・精製後，制限酵素BamHIとKpnIおよびKpnIとEcoRIで消化・精製する。
【００１７】
次に，制限酵素で消化したcPDNA, ルシフェラーゼ遺伝子，ＧＦＰ遺伝子をDNAリガーゼで連結し,図２のようなルシフェラーゼ-ＧＦＰベクターを構築する。
【００１８】
細胞への遺伝子導入と測定準備
Ｄ−ＭＥＭで培養しているHeLa細胞にリポフェクチン法によって作製したルシフェラーゼ-ＧＦＰベクターを導入する。翌日に培養液を捨て，細胞をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で洗い，ＨＢＳＳ１mlに置換する。これに発光基質であるセレンテラジン（EnduRen, プロメガ社）を最終濃度60μMで添加し，３７℃で１時間インキュベートする。
【００１９】
測定
アポトーシスを誘導するため抗Fas抗体（医学生物学研究所）１μlとシクロヘキサイミド（最終濃度10μM）を添加し測定を開始した。最初にフィルター無しの状態で５分間撮影し，その後510 nmのロングパスフィルターを通して５分間撮影する。これを３０分間隔で６時間撮影する。ＧＦＰの蛍光量は510 nmのフィルター後の値とし，ルシフェラーゼによる発光量は，フィルター無しの光量からフィルター後の光量を差し引いた値とした。
図３は，刺激開始から３時間後のフィルター無しと有の画像である。この中の四角い領域におけるルシフェラーゼの発光とＧＦＰの蛍光強度の経時変化を示したのが図４である。最初はＢＲＥＴによりＧＦＰの蛍光量が強いが，カスパーゼによりルシフェラーゼ-ＧＦＰ複合体がされＢＲＥＴが解消されるとルシフェラーゼによる発光量が強くなってくるのが分かる。このようにルシフェラーゼの発光強度とＧＦＰの蛍光強度の比をモニターすることによってカスパーゼの活性すなわちアポトーシスの程度を検出できる。
【００２０】
以上、本発明を生細胞のＢＲＥＴを画像解析する例によって説明したが、本発明は、上述した実施の形態および実施例に内在し、且つこの出願より前に他人（または他社）によって出願等されたあらゆる発明によっても自明でないような、あらゆるカテゴリーに属する技術思想を包含するものであり、その技術思想が及ぶ均等物ないし本発明で開示されないあらゆる下位概念の発明を包括する権利範囲を有する。
【００２１】
なお、本発明は、次のような考察に基づき派生する種々の変形例も直接的かつ一義的に包含する。なぜなら、種々の変形例は、本発明と共通する考察を必ず経由して種々の応用に種々転用されるだけだからである。
【００２２】
本発明に関する考察
ＢＲＥＴ、ＦＲＥＴは生体内外のタンパク相互作用の有無を着実に反映する典型的手法である。相互作用を光強度だけで検出しようとすると、非特異的反応や挟雑物ないし自家蛍光等のノイズ信号により信頼性が低くなる。一般に蛍光は、外部から照射された励起光の照射エネルギーにより励起される。従来の生体に関する画像化方法は、なるべく視覚的に見えるように可視化するような過大な照射エネルギーを利用している。ＦＲＥＴに比べＢＲＥＴは励起が要らないので、実験し易い。また、蛍光は強度変化が不安定だが、発光は安定である。励起光照射による過大なエネルギーによる蛍光検出から発想できない（非自明な）視点として、生物発光またはこれに伴う蛍光（例えばＢＲＥＴ）は変化量の評価（例えば、遺伝子発現の変動のモニタリング）や連続的かつ広視野の受光に適している。換言すると（上位化すると）、細胞内の活性変化に応じて光強度が変わるような検査項目は、過大な光エネルギーによる画像情報からは実行困難である。また、分光測定やフォトンカウントによる生物発光の検出からは発想できない（非自明な）視点として、同一視野ないし同一試料中の複数の検出対象を個別に比較したり、個々の変化量を評価することである。そもそも、生物発光、さらには生物発光の光エネルギーにより励起される生物発光由来蛍光（例えばＢＲＥＴ）は、暗すぎて、肉眼または顕微鏡による接眼レンズによって観察できない。従来の顕微鏡がそうであったように、暗すぎて画像を取得できなかった場合、細胞１個づつ取り出したり、別々の容器に遠ざけて検査するしかないので、非常に時間も工数も必要となる。ましてや、細胞内の検査を、１個づつ細胞を溶解したり、すり潰す手技を施すことは面倒である。別々の容器や個別の手技を用いることは、生きた細胞ないし組織を継続的ないし複数調べるには不適である。本発明の方法を適用すれば、１個づつの細胞等の試料について個別に遺伝子発現等の変化を継続的かつ複数調べることができる。さらに、何度でも同じ細胞からデータが取れるという魅力もある。これらの考察内容を総合すれば、本発明の新規性および進歩性は容易に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の方法を実施するための装置の概要を示す図である。
【図２】本発明の方法に使用するルシフェラーゼ-ＧＦＰベクターの一例を示す図である。
【図３】刺激開始から３時間後のフィルター無しと有の画像を示す模式図である。
【図４】図３中の四角い領域におけるルシフェラーゼの発光とＧＦＰの蛍光強度の経時変化を示した図である。
【符号の説明】
【００２４】
１：サンプル
２：対物レンズ
３：集光レンズ
４：ＣＣＤカメラ
５：モニタ
６：ズームレンズ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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