(57)【要約】【課題】  本発明は、ＰＣＲに応用可能な、ＤＮＡポリメラーゼ活性、および逆転写酵素活性を有する耐熱性組換えタンパク質、該組換えタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子であるＤＮＡを含む組換えベクターおよび該組換えベクターを含む形質転換体を提供することを目的とする。【解決手段】  新種の好熱性細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｋａｗａｒａｙｅｎｓｉｓ  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｋａｗａｒａｙｅｎｓｉｓのゲノムＤＮＡをクローニングして、ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を含む組換えベクターを構築し、該組換えベクターを形質導入した形質転換体において、本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを発現させ、精製する。【選択図】  図１
2007104909.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる組換えタンパク質。
【請求項２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性のうちいずれか一方または両方を有する組換えタンパク質。
【請求項３】
請求項１または２のいずれか１項に記載の組換えタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
請求項１に記載の組換えタンパク質をコードする遺伝子であって配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項５】
請求項３または４のいずれか１項に記載の遺伝子であるＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲに応用可能な耐熱性ＤＮＡポリマーゼに関し、より詳細には、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する、好熱性細菌サーマス・カワライェンシス由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ複製機構ならびにＤＮＡ修復における鍵酵素であり、種々の細胞から数多くのＤＮＡポリメラーゼが分離、同定されている。ＤＮＡポリメラーゼは、現在、そのアミノ酸配列に基づいて、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｘ、Ｙの６つのファミリーに分類されている。ファミリーＡには、細菌のＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼやミトコンドリアＤＮＡを複製するＤＮＡポリメラーゼγが含まれ、ファミリーＢには、真核生物のα、δ、ε型、アーキアのＢ型、および細菌のＰｏｌＩＩ型ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。ファミリーＣには、細菌のＰｏｌＩＩＩ型が含まれ、ファミリーＸには、真核生物のＤＮＡポリメラーゼβが含まれる。ファミリーＤとＹは、最近加えられたグループで、アーキア(Ａｒｃｈａｅａ）やヒトの一部のＤＮＡポリメラーゼなどが含まれる。同じファミリーに属するものは、よく保存された共通のアミノ酸配列を有しており、生化学的性質についても、おおむね類似していることがわかっている。
【０００３】
これらのＤＮＡポリメラーゼのうち、細菌のＰｏｌＩ型のＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鎖伸長活性が強いことがわかっており、その中でも、好熱細菌由来のＰｏｌＩ型のＤＮＡポリメラーゼは、強いＤＮＡ鎖伸長活性に加えて耐熱性を備えていることから、２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡにするための熱変性工程を必須工程として含むＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖反応法）において用いられ、その自動化に大きく貢献している。現在、ＰＣＲ用のＰｏｌＩ型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、米国のイエローストーン国立公園の温泉から分離された、好熱性細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼＩ（以下、ＴａｑＰｏｌＩという）をはじめとして、いくつかの好熱細菌由来のＤＮＡポリメラーゼが分離、精製されており、目的によって使い分けられている。
【０００４】
ＰｏｌＩ型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのなかには、特徴的な活性特性を有するものが報告されており、例えば、特開平９−２２４６８２号公報（特許文献１）には、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性（以下、単に、ＤＮＡポリメラーゼ活性という）に加えて、強いＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性（以下、逆転写酵素活性という）を有する、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼＩ（以下、ＴｔｈＰｏｌＩという）が開示されている。一方で、同じＴｈｅｒｍｕｓ属細菌に由来する上述したＴａｑＰｏｌＩは、ＴｔｈＰｏｌＩとのアミノ酸配列の一致度が８７％と非常に高いにも関わらず、ほとんど逆転写酵素活性を有しておらず、ＴｔｈＰｏｌＩのような強い逆転写酵素活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製例は、報告されていない。
【０００５】
現在、遺伝子工学技術において様々な手法が検討される中、現在のＰＣＲ技術およびその発展形を含むより汎用的な用途への可能性を備えた、さらなる有用な特性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製が求められていた。
【特許文献１】特開平９−２２４６８２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記従来技術に鑑みてなされたものであり、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼ活性、および逆転写酵素活性を有する組換えタンパク質、該組換えタンパク質をコードする遺伝子であるＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクターおよび該組換えベクターを含む形質転換体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、群馬県の温泉から、進化系統的にＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの間に位置づけられる好気性の従属栄養細菌である新種の好熱性細菌サーマス・カワライェンシス（ＤＳＭ  Ｎｏ．１６２００）（以下、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｋａｗａｒａｙｅｎｓｉｓという）の分離、同定に成功した。本発明者は、この菌株から新規のＰｏｌＩを分離し、詳細にその性質を解析したところ、すでにＰＣＲ用の酵素として応用されているＴａｑＰｏｌＩおよびＴｔｈＰｏｌＩと同等のＤＮＡポリメラーゼ活性、および、ＴｔｈＰｏｌＩの約１．５倍の逆転写酵素活性を示すことを見出し、本発明に至ったのである。
【０００８】
すなわち、本発明によれば、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる組換えタンパク質、または、配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性のうちいずれか一方または両方を有する組換えタンパク質が提供される。
【０００９】
また、本発明によれば、上記組換えタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、および、該組換えベクターを含む形質転換体が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ＤＮＡポリメラーゼ活性、および高い逆転写酵素活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを提供することができる。また、本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、公知の逆転写酵素活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに比べて、その精製が非常に簡便であり、製造コストの低減が見込まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を実施の形態をもって説明するが、本発明は、以下に示した実施の形態に限定されるものではない。
【００１２】
本発明の好熱性細菌サーマス・カワライェンシス由来耐熱性ＤＮＡポリマーゼＩ（以下、ＴｋａＰｏｌＩという）は、以下に示す手順によって組換えタンパク質として製造することができる。
【００１３】
まず最初に、培養されたＴｈｅｒｍｕｓ  ｋａｗａｒａｙｅｎｓｉｓからゲノムＤＮＡを調整する。得られたゲノムＤＮＡを鋳型として、合計３回のＰＣＲを経て、ＴｋａＰｏｌＩ遺伝子（以下、ＴｋａｐｏｌＡという）のコード領域全長の増幅産物を得る。得られた増幅産物を用いて組換えベクターを構築し、構築した組換えベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体とする。最後に、所定の条件の下で形質転換体を培養した後、発現した組換えタンパク質を回収、精製し、単一な標品としてのＴｋａＰｏｌＩを得る。以下、製造工程を具体的に説明する。
【００１４】
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｋａｗａｒａｙｅｎｓｉｓと同じＴｈｅｒｍｕｓ属に属する好熱性細菌のＰｏｌＡの既知の塩基配列に基づいてＰＣＲプライマーを作成し、１回目のＰＣＲによりＴｋａｐｏｌＡ断片の増幅を行ったのち、塩基配列を決定する。次に、決定されたＴｋａｐｏｌＡ断片の上記塩基配列に基づいてＰＣＲプライマーを作成し、２回目のＰＣＲによりＴｋａｐｏｌＡの未知領域の増幅を行ったのち、塩基配列を決定する。決定されたＴｋａｐｏｌＡの未知領域の塩基配列と、先に決定されたＴｋａｐｏｌＡ断片の塩基配列とを合わせて、ＴｋａｐｏｌＡの全塩基配列を決定する。最後に、上記全塩基配列に基づき、５’末端に制限酵素認識部位が連結されたＰＣＲプライマーを作成し、３回目のＰＣＲによりＴｋａｐｏｌＡのコード領域全長の増幅を行う。
【００１５】
上述した手順で得られた上記増幅産物を所定のベクターに挿入して発現用の組換えベクターを構築する。上記発現用組換えベクターを用いて大腸菌を形質転換したのち培養し、得られた菌体を超音波破砕後に遠心分離を行って粗抽出液を得る。得られた粗抽出液に熱処理を加えたのち、さらに遠心分離を行って得られた上清画分についてイオン交換クロマトグラフィーを用いて最終精製を行う。本発明のＴｋａＰｏｌＩは、公知の逆転写酵素活性を有する耐熱性ＰｏｌＩと比較して、上述した最終精製における工程をより少なくすることが可能であり、製造コストを低減することができる。
【００１６】
本発明のＴｋａＰｏｌＩは、サーマス・カワライェンシス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｋａｗａｒａｙｅｎｓｉｓ）に由来し、配列番号１に表されるアミノ酸配列からなる分子量が約９４０００の組換えタンパク質、およびその誘導体である。
【００１７】
上記組換えタンパク質の誘導体とは、配列番号１で示されるアミノ酸配列において少なくとも1個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＤＮＡポリメラーゼ活性と逆転写酵素活性の両方あるいはそのいずれかの一方の酵素活性を有するタンパク質であって、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上の相同性を有するのが望ましい。上記誘導体は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｋａｗａｒａｙｅｎｓｉｓのＤＮＡポリメラーゼＩのＤＮＡポリメラーゼ活性と逆転写酵素活性の両方あるいはそのいずれかの酵素活性を損なわない範囲で、部位特異的変異誘発法等の人工的改変法を用いてＤＮＡ組換え技術によって得ることができる。
【００１８】
本発明のＴｋａＰｏｌＩをコードする遺伝子の具体例として、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡを挙げる事ができる。また、本発明のＴｋａＰｏｌＩである上記誘導体をコードする遺伝子は、例えば配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡを用いて、部位特異的変異誘発法等の人工的改変法を用いてＤＮＡ組換え技術によって得ることができる。
【００１９】
なお、本発明のＴｋａＰｏｌＩをコードする遺伝子は、配列番号３に表す塩基配列からなるセンスプライマーおよび配列番号４に表す塩基配列からなるアンチセンスプライマーを用い、３０サイクル（９５℃・３０秒、６２℃・３０秒、７２℃・１．５分）の条件でＰＣＲを行うことにより増幅される約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を、電気泳動により確認する事により検出することが出来る。既存の他のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は、上述したＰＣＲによっては増幅（検出）されない。本発明のＴｋａＰｏｌＩは、ＤＮＡポリメラーゼ活性、およびＴｔｈＰｏｌＩの約１．５倍という強い逆転写酵素活性を備える、至適温度が７０℃の耐熱性酵素であり、ＰＣＲにおける応用が充分に可能である。
【００２０】
以上、本発明のＴｋａＰｏｌＩについて説明してきたが、本発明のＴｋａＰｏｌＩの製造方法は、上述した実施形態に限定するものではなく、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｋａｗａｒａｙｅｎｓｉｓ株由来のゲノムＤＮＡから、遺伝子工学技術におけるその他の公知の手法および生物資源を用いて本発明の組換えタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、および、該組換えベクターを含む形質転換体を製造することができる。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明のＴｋａＰｏｌＩについて、実施例を用いてより具体的に説明を行うが、本発明は、後述する実施例に限定されるものではない。
【００２２】
（実施例１）
以下の手順に従って、本発明のＴｋａＰｏｌＩを精製した。
（１）Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｋａｗａｒａｙｅｎｓｉｓゲノムＤＮＡの調整
まず、最初に、本発明者により群馬県の温泉から分離されたＴｈｅｒｍｕｓ  ｋａｗａｒａｙｅｎｓｉｓの遺伝子のクローニングと一次構造の同定を行った。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｋａｗａｒａｙｅｎｓｉｓは、−８０℃で、保存されていたものを用いた。培養はＭ７４ｂ培地(０．４％ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ、０．２％ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、０．２％ＮａＣｌ、ｐＨ７．５)を用いて行った。５ｍｌの上記培地を試験管に移し、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｋａｗａｒａｙｅｎｓｉｓの上記凍結菌体５０μｌを植菌した後、７０℃のアルミブロックで静置培養した。菌体が定常期に至ったものは、そのつど新しい培地に継代培養した。なお、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｋａｗａｒａｙｅｎｓｉｓの生育至適温度および至適ｐＨは、それぞれ６８℃およびｐＨ７で、至適条件下での倍加時間は２．８時間であった。
【００２３】
上述した手順で調整したＴｈｅｒｍｕｓ  ｋａｗａｒａｙｅｎｓｉｓの一晩培養液５ｍｌを１５ｍｌコーニングチューブに移し、遠心分離(８０００×ｇ、４℃、１０分間)により集菌し、上清を除いた。得られた菌体を１００μｌのＳＥ溶液(０．１５Ｍ・ＮａＣｌ、０．１Ｍ・ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０)に懸濁し、全量をエッペンドルフチューブに移した。さらに、上記懸濁液に５μｌの１０％ＳＤＳを加え、軽く混ぜ、６０℃で１０分間保温した。続いて、氷上で５分間冷却した後、１００μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）飽和フェノール−クロロホルム混液（Ｔｒｉｓ飽和フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１）を加え、ボルテックスで1分間撹拌した後、遠心分離(２１０００×ｇ、４℃、１０分間)を行い、上清を新しいエッペンドルフチューブに移した。上記上清に１５０μｌのエタノールを加え、軽く混ぜ、遠心分離(２１０００×ｇ、４℃、５分間)した後、上清を除いて沈殿しているＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡに、５００μｌの７０％エタノールを加え、遠心分離(２１０００×ｇ、４℃、５分間)を行い、上清を除いて風乾した後、１００μｌのＴＥバッファに再懸濁し、１μｌのＲＮａｓｅＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えて−２５℃で保存した。上述した手順で得られたＴｈｅｒｍｕｓ  ｋａｗａｒａｙｅｎｓｉｓのゲノムＤＮＡを鋳型として以下に示す手順でＰＣＲを行った。
【００２４】
（２）ＰＣＲによるＴｋａｐｏｌＡ断片の増幅と塩基配列の決定
ＴｋａｐｏｌＡおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＰｏｌＡにおいて保存性の高い領域の塩基配列に基づいて、ＰＣＲプライマーとして、配列番号５に表す塩基配列からなるフォーワードプライマーおよび配列番号６に表す塩基配列からなるリバースプライマーを作成した。次に、上述した手順で得られたＴｈｅｒｍｕｓ  ｋａｗａｒａｙｅｎｓｉｓゲノムＤＮＡ（２００ｎｇ）、上記各ＰＣＲプライマー（各２５ｐｍｏｌ）、ｄＮＴＰ（２００μＭ）、ＭｇＳＯ４（１ｍＭ）、1×ＫＯＤ-ｐｌｕｓ  ｂｕｆｆｅｒおよび１Ｕ  ＫＯＤ−ｐｌｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績（株）製）によって調製したＰＣＲ反応液５０μｌを９４℃で３分間保温することにより初期変性を行った後、２５サイクル（９４度・３０秒、６０度・３０秒、６８度・２分）の条件でＰＣＲを行ったところ、約１８００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
【００２５】
増幅された上記ＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（−）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）のＥｃｏＲＶサイトに挿入した後、塩基配列を決定した。決定した塩基配列とＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｐｏｌＡの塩基配列とをそれぞれ比較したところ、ともに８８%以上の一致度を示したことから、増幅されたＤＮＡ断片がＴｋａｐｏｌＡの断片であることが確認された。
【００２６】
（３）ＴｋａｐｏｌＡ全長のクローニングと塩基配列の決定
増幅されたＴｋａｐｏｌＡ断片の塩基配列に基づいて、配列番号７〜１０に表す塩基配列からなるプライマーを作成し、ＰＣＲによりＴｋａｐｏｌＡの未知領域の増幅を行った。ＰＣＲは、ＬＡ  ＰＣＲ（登録商標）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ（株）製）を用いて行った。配列番号５に表す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号６に表す塩基配列からなるプライマーを用いてＴｋａｐｏｌＡの５’末端未知領域の約６００ｂｐを、配列番号７に表す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号８に表す塩基配列からなるプライマーを用いてＴｋａｐｏｌＡの３’末端未知領域の約２００ｂｐをそれぞれ増幅し、塩基配列を決定した。既に決定されていた上述したＴｋａｐｏｌＡ断片の塩基配列と新たに決定された上記塩基配列とを合わせ、ＴｋａｐｏｌＡの全塩基配列を決定した。決定された配列番号２に表される全塩基配列からＴｋａＰｏｌＩは２５０２ｂｐからなる遺伝子にコードされ、配列番号１に表されるアミノ酸８３３残基からなることがわかり、分子量は約９４０００と推定された。ＴｋａＰｏｌＩのアミノ酸配列は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓのＰｏｌＩのアミノ酸配列とそれぞれ８６．９％、８９．８％、７８．５％の一致度を示し、また、ＴｋａＰｏｌＩのアミノ酸配列中には、細菌のＰｏｌＩに一般的に保存されている６つのモチーフ配列の存在が確認された。
【００２７】
続いて、組換えベクターとして発現用プラスミドを構築し、大腸菌において発現させ、ＴｋａＰｏｌＩの組換えタンパク質を精製した。以下、その手順を説明する。
【００２８】
（４）発現用プラスミド（組換えベクター）の構築
ＴｋａｐｏｌＡのコード領域全長を以下に示す手順でＰＣＲによって増幅した。まず、上述したＴｋａｐｏｌＡの全塩基配列に基づいてＰＣＲプライマーとして、配列番号１１に示す塩基配列からなるフォーワードプライマーおよび配列番号１２に示す塩基配列からなるリバースプライマーを作成した。
上記フォーワードプライマーとリバースプライマーの５’末端には、制限酵素認識部位として、それぞれＮｄｅＩサイトおよびＢｇｌＩＩサイトを設けた。
【００２９】
次に、上述した手順で得られたＴｈｅｒｍｕｓ  ｋａｗａｒａｙｅｎｓｉｓゲノムＤＮＡ（２００ｎｇ）、上記各ＰＣＲプライマー（各２５ｐｍｏｌ）、ｄＮＴＰ（２００μＭ）、ＭｇＳＯ４（１ｍＭ）、1×ＫＯＤ-ｐｌｕｓ  ｂｕｆｆｅｒおよび１Ｕ  ＫＯＤ−ｐｌｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績（株）製）によって調製したＰＣＲ反応液５０μｌを９４℃で３分間保温することにより初期変性を行った後、２５サイクル（９４度・３０秒、６０度・３０秒、６８度・３分）の条件でＰＣＲを行った。
【００３０】
ＰＣＲ反応終了後、増幅されたＴｋａｐｏｌＡをＮｄｅＩおよびＢｇｌＩＩで制限酵素処理し、発現ベクターｐＥＴ３ｃ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＴ７プロモーターの下流に位置するＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し、発現用プラスミドｐＫＷＰ１ｅｘｐを構築した。図１は、発現用プラスミドｐＫＷＰ１ｅｘｐの構築工程を概略的に示した図である。
【００３１】
（５）組換えタンパク質の精製
上述した発現用プラスミドｐＫＷＰ１ｅｘｐを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓ−ＲＰを形質転換し、１ｌの三角フラスコに用意したアンピシリン（０．１ｍｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地（１％ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）１００ｍｌに植菌して、３７℃で一晩振盪培養した。上記培養液を２本の５０ｍｌコーニングチューブに分注し、遠心分離（８０００×ｇ、４℃、１５分間）により集菌し、上清を除いた。細胞を７ｍｌのバッファーＡ(５０ｍＭ・Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ・ｐＨ８．０、２ｍＭ・ＭｇＣｌ２、１ｍＭ・ＤＴＴ、１ｍＭ・ＰＭＳＦ)で懸濁した後、１５ｍｌコーニングチューブ中で超音波処理した（Ｏｕｔｐｕｔ１．５、Ｄｕｔｙ  ｃｙｃｌｅ  ５０％、氷冷下、１５分間）。超音波破砕液を遠心分離（８０００×ｇ、４℃、１５分間）し、上清を新しい１５ｍｌコーニングチューブに回収し、これを粗抽出液とした。
【００３２】
次に、上記粗抽出液についての熱処理工程を経て、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを順に行った。また、各精製画分について、後に詳説する方法によってＤＮＡポリメラーゼ活性の測定を行なうとともに、各精製画分を１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＣＢＢで染色した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。以下、詳細に説明する。
【００３３】
まず、上記粗抽出液を７５℃のアルミブロック恒温槽にセットして２０分間加熱した。加熱後、４０分間室温で放置した後、遠心分離（８０００×ｇ、４℃、１５分間）し、上清（５．８ｍｌ）を新しい１５ｍｌコーニングチューブに回収した。この上清に、最終濃度が１０％になるようにグリセロールを加え熱処理品とした(６．５ｍｌ)。この熱処理品６ｍｌを、５ｍｌの陰イオン交換カラム（Ｑ−Ｓｐｈａｒｏｓｅ、ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社製）にアプライし、ＮａＣｌをそれぞれ５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ含むバッファーＢ（５０ｍＭ・Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ・ｐＨ７．５、１ｍＭ・ＤＴＴ、３ｍＭ・ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール)をそれぞれ２０ｍｌずつ用いて順次溶出を行った。ＮａＣｌを２００ｍＭ含む画分から最も高いＤＮＡポリメラーゼ活性が検出された。ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する画分（５ｍｌ）をバッファーＢに対して透析した。透析した溶液を５ｍｌの陽イオン交換カラム(ＣＭ−Ｓｐｈａｒｏｓｅ、ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社製)にアプライし、ＮａＣｌをそれぞれ０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ含むバッファーＢをそれぞれ３０ｍｌ、１５ｍｌ、１５ｍｌ用いて順次溶出を行った。ＮａＣｌを５０ｍＭ含む画分から最も高いＤＮＡポリメラーゼ活性が検出された。ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する画分(４ｍｌ)を回収し、最終濃度が５０％になるようにグリセロールを加え（７．２ｍｌ)、−３０℃で保存した。
【００３４】
図２は、上述した各精製画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示した図である。図中のＬａｎｅ１は粗抽出液、Ｌａｎｅ２は熱処理上清、Ｌａｎｅ３はＱ−Ｓｐｈａｒｏｓｅ溶出液、Ｌａｎｅ４はＣＭ−Ｓｐｈａｒｏｓｅ溶出液、ＬａｎｅＭは分子量マーカーを示す。
【００３５】
上述した各精製画分におけるＤＮＡポリメラーゼ活性を表１にまとめて示す。
【００３６】
【表１】
2007104909.tif 000003
図２および表１に示されるように、１００ｍｌの培養液から組換えタンパク質として比活性４６．４Ｕ／ｍｇのＴｋａＰｏｌＩが０．４ｍｇ精製された。また、図２のＬａｎｅ３に示されるように、本発明のＴｋａＰｏｌＩは、１回目の陰イオン交換カラムの溶出液において、既に、ほぼ単一な標品として精製されており、現在知られている逆転写酵素活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと比較すると、格段にその精製が簡便であることがわかった。この理由は明らかではないが、他の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに比べて、組換えタンパク質の発現効率が高いことが原因ではないかと考えられる。
【００３７】
（実施例２）
上述した手順で精製されたＴｋａＰｏｌＩについて、ＤＮＡポリメラーゼ活性の特性（温度依存性、ｐＨ依存性、塩濃度依存性、金属イオン要求性および熱安定性）ならびに逆転写酵素活性について調べた。なお、７０℃で、３０分間に１０ｎｍｏｌｅｓの全ヌクレオチドを取り込む酵素活性を１Ｕとした。
【００３８】
ＴｋａＰｏｌＩの活性測定に際し、活性化ｃａｌｆ−ｔｈｙｍｕｓＤＮＡを調整した。活性化ｃａｌｆ−ｔｈｙｍｕｓＤＮＡは、１０ｍｇ・ｃａｌｆ−ｔｈｙｍｕｓＤＮＡ（ＮａｃａｌａｉＴｅｓｑｕｅ社製）、５０ｍＭ・Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ・ｐＨ７．５、５ｍＭ・ＭｇＣｌ２、０．１５Ｕ・ＤＮａｓｅＩからなる反応液４．５ｍｌを、３７℃で３０分間保温した後、８０℃で１０分間加熱することによりＤＮａｓｅＩを失活させて調整した。
【００３９】
ＴｋａＰｏｌＩの活性測定には、鋳型として上記活性化ｃａｌｆ−ｔｈｙｍｕｓＤＮＡを、基質としてｄＮＴＰおよび３Ｈ−ｄＴＴＰを含む反応液を調整し、後述する様々な条件で反応を行った後、反応液を氷上に移して冷却することにより反応を止めた。この反応液６μｌを陰イオン交換フィルター（ＤＥ８１）に滴下し、室温で風乾した。このフィルターを洗浄液（５％Ｎａ２ＨＰＯ４）に浸し、室温で９分間、途中で２度洗浄液を交換して、穏やかに振盪させた。フィルターをイオン交換水中に移し、室温で６分間、途中で一度イオン交換水を交換して、穏やかに振盪させることによりＮａ２ＨＰＯ４を除去した。次に、フィルターをエタノール中に移し、室温で５分間、穏やかに振盪させた後、キムタオル上に並べて、５０℃で１５分間乾燥させた。完全に乾燥させた上記フィルターを液体シンチレーションカクテル（ＡＱＵＡＳＯＬ−２、ＰＡＣＫＡＲＤ社製）に浸し、液体シンチレーションカウンター(ＴＲＩ−ＣＡＲＢ２７９９ＴＲシリーズ、ＰＡＣＫＡＲＤ社製)で、合成されたＤＮＡに取り込まれたトリチウムの放射線量を測定した。また逆転写酵素活性については、Ｐｏｌｙ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）を鋳型に、３Ｈ−ｄＴＴＰを基質として用い、その他の測定条件についてはＤＮＡポリメラーゼ活性の測定条件と同様に行った。
【００４０】
なお、先に述べた発現タンパク質精製時の各精製画分についてのＤＮＡポリメラーゼ活性測定は、反応液５０μｌ（５μｇ・活性化ｃａｌｆ−ｔｈｙｍｕｓＤＮＡ、２００μＭ・各ｄＡＴＰ,ｄＣＴＰ,ｄＧＴＰ、４０ｐｍｏｌ（２．５μＣｉ）３Ｈ−ｄＴＴＰ、５０ｍＭ・Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ・ｐＨ８．０、５ｍＭ・ＭｇＣｌ２、1ｍＭ・ＤＴＴ、２μｌ・精製画分)を調整し、７０℃で１０分間反応を行った後、上述したのと同様の手順で測定を行った。
【００４１】
以下、ＴｋａＰｏｌＩの活性特性について、各実験条件の詳細とその結果について述べる。なお、以下に述べる説明中、相対活性（％）とは、活性測定の結果最も高い活性を示した条件におけるヌクレオチドの取り込み量を１００％として算出した相対値を意味する。
【００４２】
（ａ）温度依存性
反応液５０μl(５μg・活性化ｃａｌｆ−ｔｈｙｍｕｓＤＮＡ、２００μＭ・各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、４０ｐｍｏｌ(２．５μＣｉ）３Ｈ−ｄＴＴＰ、５０ｍＭ・Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ・ｐＨ８．０、５ｍＭ・ＭｇＣｌ２、１ｍＭ・ＤＴＴ、０．００８Ｕ・ＴｋａＰｏｌＩ)を調整し、反応温度を３５〜９０℃の範囲で５℃ずつ変化させて１０分間反応を行い、活性を測定した。
【００４３】
図３は、相対活性（％）と反応温度の関係を示した図である。図３が示すように、反応温度が５５℃〜８０℃の範囲で８０％以上の高い活性を示し、３５℃でも４０％の活性を示し、その至適温度は７０℃であることがわかった。一方、ＴａｑＰｏｌＩおよびＴｔｈＰｏｌＩも７０℃〜７５℃付近が至適温度であり、本発明のＴｈｅｒｍｕｓ  ｋａｗａｒａｙｅｎｓｉｓ由来耐熱性ＤＮＡポリマーゼの活性の温度依存性はＴａｑＰｏｌＩおよびＴｔｈＰｏｌＩのそれと非常に類似していることが示された。
【００４４】
（ｂ）ｐＨ依存性
リン酸およびホウ酸Ｂｕｆｆｅｒを用いて、反応液５０μｌ(５μｇ・活性化ｃａｌｆ−ｔｈｙｍｕｓＤＮＡ、２００μＭ・各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、４０ｐｍｏｌ（２．５μＣｉ）・３Ｈ−ｄＴＴＰ、２５ｍＭ・Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４(ｐＨ５．７〜７．１ａｔ７０℃)、もしくはＨ３ＢＯ３／ＮａＯＨ（ｐＨ７．５〜９．５ａｔ７０℃）、５ｍＭ・ＭｇＣｌ２、１ｍＭ・ＤＴＴ、０．００８Ｕ・ＴｋａＰｏｌＩ)を調整し、ｐＨ５．７〜９．５の範囲で、７０℃で１０分間反応を行い、活性を測定した。
【００４５】
図４は、相対活性（％）とｐＨの関係を示した図である。図４が示すように、ｐＨ７．０〜８．０の範囲で最も高い活性を示しており、本発明のＴｈｅｒｍｕｓ  ｋａｗａｒａｙｅｎｓｉｓ由来耐熱性ＤＮＡポリマーゼの活性のｐＨ依存性についても他のｔｈｅｒｍｕｓ属細菌由来のＰｏｌＩのそれと非常に類似していることが示された。
【００４６】
（ｃ）塩濃度依存性
塩化カリウムおよび塩化アンモニウムを用いて、反応液５０μｌ(５μｇ・活性化ｃａｌｆ−ｔｈｙｍｕｓＤＮＡ、２００μＭ・各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、４０ｐｍｏｌ・（２．５μＣｉ）３Ｈ−ｄＴＴＰ、５０ｍＭ・Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ・ｐＨ８．０、０〜２００ｍＭ・ＫＣｌ/０〜２００ｍＭ・ＮＨ４Ｃｌ、５ｍＭ・ＭｇＣｌ２、１ｍＭ・ＤＴＴ、０．００８Ｕ・ＴｋａＰｏｌＩ)を調整し、７０℃で１０分間反応を行い、活性を測定した。
【００４７】
図５は、相対活性（％）と塩濃度の関係を示した図である。図５が示すように、反応系への塩化カリウムおよび塩化アンモニウムの添加は、いずれの場合もＤＮＡポリメラーゼ活性を低下させた。ＴａｑＰｏｌＩおよびＴｔｈＰｏｌＩの至適ＫＣｌ濃度が５０ｍＭ付近であることと比較すると、本発明のＴｈｅｒｍｕｓ  ｋａｗａｒａｙｅｎｓｉｓ由来耐熱性ＤＮＡポリマーゼは塩に対して感受性が高いことが示唆された。
【００４８】
（ｄ）金属イオン要求性
現在までに報告されている全てのＤＮＡポリメラーゼは、２価の金属イオンを補助因子として要求する。そこで、本発明のＴｈｅｒｍｕｓ  ｋａｗａｒａｙｅｎｓｉｓ由来耐熱性ＤＮＡポリマーゼのマグネシウムイオンおよびマンガンイオンの要求性について検討するべく、反応液５０μｌ(５μｇ・活性化ｃａｌｆ−ｔｈｙｍｕｓＤＮＡ、２００μＭ・各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、４０ｐｍｏｌ・（２．５μＣｉ）・３Ｈ−ｄＴＴＰ、５０ｍＭ・Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ・ｐＨ８．０、０〜３０ｍＭ・ＭｇＣｌ２／０〜３０ｍＭ・ＭｎＣｌ２、１ｍＭ・ＤＴＴ、０．００８Ｕ・ＴｋａＰｏｌＩ)を調整し、７０℃で１０分間反応を行い、活性を測定した。
【００４９】
図６は、相対活性（％）と金属イオン濃度の関係を示した図である。図６が示すように、塩化マグネシウムの至適濃度は５〜１０ｍＭであるのに対し、塩化マンガンの至適濃度は１ｍＭであった。また、マンガンイオンを用いた場合の最大活性は、マグネシウムイオンを用いた場合に比べ約２５％の値であり、それ以上の濃度で加えるとほとんど活性を示さなかった。この結果は他のＰｏｌＩ型酵素の性質とよく一致するものであった。
【００５０】
（ｅ）熱安定性
ＴｋａＰｏｌＩの酵素溶液をあらかじめ５５℃、７５℃、９５℃においてそれぞれ１５〜６０分間保温した後、反応液５０μｌ(５μｇ・活性化ｃａｌｆ−ｔｈｙｍｕｓＤＮＡ、２００μＭ・各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、４０ｐｍｏｌ（２．５μＣｉ）・３Ｈ−ｄＴＴＰ、５０ｍＭ・Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ・ｐＨ８．０、５ｍＭ・ＭｇＣｌ２、１ｍＭ・ＤＴＴ、０．００８Ｕ・ＴｋａＰｏｌＩ)を調整し、７０℃で１０分間反応を行い、活性を測定した。
【００５１】
図７は、相対活性（％）と反応系に加える前の酵素溶液の保温温度および保温時間との関係を示した図である。図７が示すように、５５℃および７５℃では、３０分間保温しても活性は全く失われなかったが、９５℃では１５分間の保温で活性がほとんど消失することがわかった。
【００５２】
（ｆ）逆転写酵素活性
ＴｋａＰｏｌＩの逆転写酵素活性について検証すべく、反応液５０μｌ（１μｇ・Ｐｏｌｙ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）、４０ｐｍｏｌ（２．５μＣｉ）・３Ｈ−ｄＴＴＰ、１０ｍＭ・Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ・ｐＨ８．０、８０ｍＭ・ＫＣｌ、１．５ｍＭ・ＭｎＣｌ２、５μｇ・ＢＳＡ、０．００８Ｕ・ＴｋａＰｏｌＩ)を調整し、６０℃で１５分間反応させた。併せて、陽性コントロールとしてＴｔｈＰｏｌＩ（ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、東洋紡績（株）製）を、陰性コントロールとしてＴａｑＰｏｌＩ（ｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、東洋紡績（株）製）を用いて同様の条件で反応を行ない、それぞれについて活性測定を行なった。
【００５３】
本発明のＴｋａＰｏｌＩ、ＴａｑＰｏｌＩおよびＴｔｈＰｏｌＩについて、それぞれのＤＮＡポリメラーゼ活性および逆転写酵素活性を表２に示す。
【００５４】
【表２】
2007104909.tif 000004
表２に示されるように、本発明のＴｋａＰｏｌＩは、ＤＮＡポリメラーゼ活性において、ＴｔｈＰｏｌＩと同等の活性を示すのみならず、逆転写酵素活性においては、ＴｔｈＰｏｌＩの約１．５倍にあたる、顕著な活性特性を示すことがわかった。
【００５５】
（実施例３）
本発明のＴｋａＰｏｌＩのＰＣＲにおける最適条件を検討すべく、ＰＣＲ反応系でのＫＣｌ、ＮＨ４Ｃｌ、ＭｇＣｌ２、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＢＳＡ、およびＤＴＴ濃度依存性および伸長反応の温度依存性について調べた。
【００５６】
鋳型ＤＮＡとしてＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓゲノムＤＮＡを用い、１６ＳｒＤＮＡ約１５００ｂｐを増幅するために、ＰＣＲプライマーとして、配列番号１３に示す塩基配列からなるフォーワードプライマーおよび配列番号１４に示す塩基配列からなるリバースプライマーを作成した。ＰＣＲ反応液は、２００ｎｇ・Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓゲノムＤＮＡ、２５ｐｍｏｌ・各プライマー、２００μＭ・ｄＮＴＰ、５０ｍＭ・Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ・ｐＨ８．０、０．０２Ｕ・ＴｋａＰｏｌＩからなる基本構成に、各種添加剤を加えて５０μｌとし、各添加剤の濃度を変化させて反応を行った。ＰＣＲサイクルについては、９５℃で３分間保温する事により初期変性を行った後、２５サイクル（９５℃・３０秒、６０℃・３０秒、７０℃・２分）の条件で行った。上述の手順でＰＣＲを行ったのち、ＤＮＡ断片の増幅を１％アガロースゲル電気泳動によって確認した。以下、各実験条件の詳細とその結果について述べる。
【００５７】
（イ）ＫＣｌおよびＮＨ４Ｃｌ濃度依存性
反応液５０μｌ(上記基本構成、１．５ｍＭ・ＭｇＣｌ２、０〜１２０ｍＭ・ＫＣｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ・ＢＳＡ、０．０１％・ＴｒｉｔｏｎＸ−１００)、および、反応液５０μｌ(上記基本構成、１．５ｍＭ・ＭｇＣｌ２、０〜１２０ｍＭ・ＮＨ４Ｃｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ・ＢＳＡ、０．０１％・ＴｒｉｔｏｎＸ−１００)を調整し、ＫＣｌ濃度およびＮＨ４Ｃｌ濃度を０〜１２０ｍＭの範囲で変化させて、それぞれについてＰＣＲを行った。
【００５８】
図８（ａ）は、ＫＣｌの濃度を変化させた場合の１％アガロースゲル電気泳動を示した図であり、図８（ｂ）は、ＮＨ４Ｃｌの濃度を変化させた場合の１％アガロースゲル電気泳動を示した図である。なお、ＮＨ４Ｃｌを添加したものに関しては、コントロールのために、ＫＣｌ・６０ｍＭの条件で得られた増幅産物についても同時に電気泳動を行った。
【００５９】
図８（ａ）および（ｂ）が示すように、ＫＣｌおよびＮＨ４Ｃｌのいずれも、４０〜６０ｍＭの濃度で良好な増幅が行われた。また、図８（ｂ）に示されるように、ＮＨ４Ｃｌに比べＫＣｌを用いた場合のほうが多くのＤＮＡ断片の増幅が確認されることがわかった。
【００６０】
（ロ）ＭｇＣｌ２濃度依存性
一般に、ＰＣＲにおいて酵素の特異性や反応の効率に影響を及ぼすとされているＭｇＣｌ２濃度依存性を検討すべく、反応液５０μｌ(上記基本構成、０〜３ｍＭ・ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ・ＫＣｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ・ＢＳＡ、０．０１％・ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を調整し、ＰＣＲを行った。
【００６１】
図９は、ＭｇＣｌ２の濃度を変化させた場合の１％アガロースゲル電気泳動を示した図である。図９が示すように、０．５〜１．０ｍＭの範囲で良好な増幅が行われていた。標準的なＰＣＲ緩衝液のＭｇ２＋濃度が１．０〜２．０ｍＭであることに鑑みれば、本発明のＴｋａＰｏｌＩは、現行の他の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと同様にＰＣＲにおいて最適な活性を示すことがわかった。
【００６２】
（ハ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００濃度依存性
界面活性剤を反応系に加えると、ＤＮＡ増幅効率の向上が見られる場合があることから、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の濃度依存性を検討すべく、反応液５０μｌ(上記基本構成、１．５ｍＭ・ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ・ＫＣｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ・ＢＳＡ、０〜０．３％・ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を調整し、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００濃度を０〜０．３％の範囲で変化させてＰＣＲを行った。
【００６３】
図１０は、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の濃度を変化させた場合の１％アガロースゲル電気泳動を示した図である。図１０が示すように、０．０１％加えた場合に最も多くのＤＮＡ断片の増幅が確認された。また、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を反応系に加えないとほとんどＤＮＡ断片の増幅が確認できないことから、ＴｋａＰｏｌＩのＰＣＲにおける反応系には界面活性剤を添加することが望ましいことがわかった。
【００６４】
（ニ）ＢＳＡ濃度依存性
界面活性剤と同様に、反応効率の向上が見られることが確認されているＢＳＡの濃度依存性を検討すべく、反応液５０μｌ(上記基本構成、１．５ｍＭ・ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ・ＫＣｌ、０〜０．５ｍｇ／ｍｌ・ＢＳＡ、０．０１％・ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を調整し、ＰＣＲを行った。
【００６５】
図１１は、ＢＳＡの濃度を変化させた場合の１％アガロースゲル電気泳動を示した図である。図１１が示すように、０．０５〜１ｍｇ／ｍｌの濃度において最もよい結果が得られたことから、ＢＳＡの反応系への添加も非常に有効であることが確認された。
【００６６】
（ホ）ＤＴＴ濃度依存性
反応液５０μｌ(上記基本構成、１．５ｍＭ・ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ・ＫＣｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ・ＢＳＡ、０．０１％・ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０〜５ｍＭ・ＤＴＴ）を調整し、ＤＴＴ濃度を０〜５ｍＭの範囲で変化させてＰＣＲを行った。
【００６７】
図１２は、ＤＴＴの濃度を変化させた場合の１％アガロースゲル電気泳動を示した図である。図１２が示すように、ＤＴＴの反応系への添加は、いずれの濃度においてもＰＣＲ増幅を阻害することがわかった。
【００６８】
（ヘ）伸長反応温度依存性
ＰＣＲサイクル中の伸長反応の温度依存性を検討すべく、反応液５０μｌ(上記基本構成、０．７５ｍＭ・ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ・ＫＣｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ・ＢＳＡ、０．０１％・ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を調整し、９５℃で３分間保温する事により初期変性を行った後、伸長工程の温度を６４〜７４℃の範囲で変化させて、２５サイクル（９５℃・３０秒、６０℃・３０秒、６４〜７４℃・２分）の条件でＰＣＲを行った。
【００６９】
図１３は、伸長工程の温度を６４〜７４℃の範囲で変化させた場合の１％アガロースゲル電気泳動を示した図である。図１３が示すように、７０℃で最も多くのＤＮＡ断片の増幅が確認された。
【００７０】
上述した検討事項に基づいて、本発明のＴｋａＰｏｌＩのＰＣＲにおける最適条件は、０．７５ｍＭ・ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ・ＫＣｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ・ＢＳＡおよび０．０１％・ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の添加剤を含むＰＣＲ反応液において、伸長工程の温度が７０℃であるということがわかった。この最適条件において、ＴａｑＰｏｌＩをコントロールとしてＰＣＲを行った。その詳細について以下に示す。
【００７１】
（ト）ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとの比較
反応液５０μｌ(２００ｎｇ・Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓゲノムＤＮＡ、２５ｐｍｏｌ・各プライマー、２００μＭ・ｄＮＴＰ、５０ｍＭ・Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ・ｐＨ８．０、０．７５ｍＭ・ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ・ＫＣｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ・ＢＳＡ、０．０１％・ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．この０２Ｕ・ＴｋａＰｏｌＩ)、および、コントロールとして反応液５０μｌ(２００ｎｇ・Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓゲノムＤＮＡ、２５ｐｍｏｌ・各プライマー、２００μＭ・ｄＮＴＰ、１０ｍＭ・Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ・ｐＨ８．３、５０ｍＭ・ＫＣｌ、１．５ｍＭ・ＭｇＣｌ２、５Ｕ・ｒＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績（株）製）)を調整し、９５℃で３分間保温する事により初期変性を行った後、２５サイクル（９５℃・３０秒、６０℃。・３０秒、７０℃・２分）の条件でＰＣＲを行った。
【００７２】
図１４は、本発明のＴｋａＰｏｌＩによるＰＣＲ増幅産物、および、ＴａｑＰｏｌＩによるＰＣＲ増幅産物の１％アガロースゲル電気泳動を示した図である。図１４が示すように、ＴａｑＰｏｌＩと同様に、本発明のＴｋａＰｏｌＩによる良好なＤＮＡ断片の増幅が確認された。実験に用いたＴｋａＰｏｌＩは５０μｌ当りの使用量が０．０２Ｕと非常に少なかったことに鑑みれば、本発明のＴｋａＰｏｌＩのＰＣＲへの応用が充分に可能であることがわかった。
【００７３】
なお、文中において使用した省略記号について、以下にまとめて示す。
ｂｐ…ｂａｓｅ  ｐａｉｒｓ、ｋｂ…ｋｉｒｏ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒｓ、Ｔｒｉｓ…Ｔｒｉｓ［ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ、ＳＤＳ…ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ、ＥＤＴＡ…ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ  ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、ＤＴＴ…ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、ｄＮＴＰ…ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ(ｄＡＴＰ・ｄＣＴＰ・ｄＧＴＰ・ｄＴＴＰ)、ＢＳＡ…ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、ＣＢＢ…Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ、ＰｏｌＩ…ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩ、ｐｏｌＡ…ＰｏｌＩをコードする遺伝子、ＰＭＳＦ…Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ  Ｆｌｕｏｒｉｄｅ
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、その好適な活性特性から、遺伝子工学分野をはじめとして臨床、食品、法医学、環境、衛生などの多くの分野で活用されているＰＣＲ技術およびその周辺技術において幅広く応用することが可能であり、さらに、その精製の簡便さも相まって、今後、ＰＣＲ技術のさらなる改良に資することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】本発明の組換えベクターである発現用プラスミドｐＫＷＰ１ｅｘｐの構築工程を概略的に示した図。
【図２】本発明のＴｋａＰｏｌＩの精製画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示した図。
【図３】本発明のＴｋａＰｏｌＩのＤＮＡポリメラーゼ活性の相対活性（％）と反応温度の関係を示した図。
【図４】本発明のＴｋａＰｏｌＩのＤＮＡポリメラーゼ活性の相対活性（％）とｐＨの関係を示した図。
【図５】本発明のＴｋａＰｏｌＩのＤＮＡポリメラーゼ活性の相対活性（％）と塩濃度の関係を示した図。
【図６】本発明のＴｋａＰｏｌＩのＤＮＡポリメラーゼ活性の相対活性（％）と金属イオン濃度の関係を示した図。
【図７】本発明のＴｋａＰｏｌＩのＤＮＡポリメラーゼ活性の相対活性（％）と反応系に加える前の酵素溶液の保温温度および保温時間との関係を示した図。
【図８】図８（ａ）は、ＫＣｌの濃度を変化させた場合の本発明のＴｋａＰｏｌＩによるＰＣＲ増幅産物の１％アガロースゲル電気泳動を示した図であり、図８（ｂ）は、ＮＨ４Ｃｌの濃度を変化させた場合の本発明のＴｋａＰｏｌＩによるＰＣＲ増幅産物の１％アガロースゲル電気泳動を示した図。
【図９】ＭｇＣｌ２の濃度を変化させた場合の本発明のＴｋａＰｏｌＩによるＰＣＲ増幅産物の１％アガロースゲル電気泳動を示した図。
【図１０】ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の濃度を変化させた場合の本発明のＴｋａＰｏｌＩによるＰＣＲ増幅産物の１％アガロースゲル電気泳動を示した図。
【図１１】ＢＳＡの濃度を変化させた場合の本発明のＴｋａＰｏｌＩによるＰＣＲ増幅産物の１％アガロースゲル電気泳動を示した図。
【図１２】ＤＴＴの濃度を変化させた場合の本発明のＴｋａＰｏｌＩによるＰＣＲ増幅産物の１％アガロースゲル電気泳動を示した図。
【図１３】伸長工程の温度を６４〜７４℃の範囲で変化させた場合の本発明のＴｋａＰｏｌＩによるＰＣＲ増幅産物の１％アガロースゲル電気泳動を示した図。
【図１４】最適条件における本発明のＴｋａＰｏｌＩによるＰＣＲ増幅産物、および、ＴａｑＰｏｌＩによるＰＣＲ増幅産物の１％アガロースゲル電気泳動を示した図。
【図１】
2007104909.tif 000005
【図２】
2007104909.tif 000006
【図３】
2007104909.tif 000007
【図４】
2007104909.tif 000008
【図５】
2007104909.tif 000009
【図６】
2007104909.tif 000010
【図７】
2007104909.tif 000011
【図８】
2007104909.tif 000012
【図９】
2007104909.tif 000013
【図１０】
2007104909.tif 000014
【図１１】
2007104909.tif 000015
【図１２】
2007104909.tif 000016
【図１３】
2007104909.tif 000017
【図１４】
2007104909.tif 000018
【配列表】
2007104909000001.app