(57)【要約】【課題】ミオスタチンタンパク質の一部分は保持しつつ、筋肉萎縮の予防および／または筋肉の発達の増強を可能とするミオスタチンタンパク質を発現しうるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することを課題とする。さらには、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分とする筋肉萎縮の予防および／または治療用薬剤を提供することを課題とする。【解決手段】ミオスタチンタンパク質合成系において、ミオスタチン遺伝子から転写されたmRNA前駆体からスプライシングによる成熟mRNAの生合成において、エクソン２をスキッピングさせうる機能を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドによる。さらに、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分とする筋肉萎縮の予防および／または治療用薬剤による。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミオスタチン遺伝子から転写されたmRNA前駆体のエクソン２に含まれる配列とハイブリッド形成することにより、該ミオスタチン遺伝子の成熟mRNAの生合成の過程で、エクソン２をスキッピングせしめる機能を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
以下の１）〜３）のいずれかより選択される塩基配列を含む請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド：
１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列の471〜620番目の領域から選択される部位とハイブリッド形成し、少なくとも17個のヌクレオチドからなる塩基配列；
２）以下の配列番号２〜４で示される配列のいずれかの塩基配列
CAT AGG TTT GAT GAG TCT CA  （配列番号２）
GTA GGA GTC TCG ACG GGT CT  （配列番号３）
AAA CAC TGT TGT AGG AGT CT  （配列番号４）；
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドが、ヌクレオチドの糖部位2', -4'が-CO-架橋により修飾されたLocked Nucleic Acid (LNA)を含むオリゴヌクレオチド類縁体である請求項１または２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
ミオスタチン遺伝子から転写されたmRNA前駆体のエクソン２に含まれる配列とハイブリッド形成することにより、該ミオスタチン遺伝子の成熟mRNAの生合成の過程で、エクソン２をスキッピングせしめる機能を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドのスクリーニング方法。
【請求項５】
以下の工程１）〜３）を含むミオスタチン遺伝子のエクソン２をスキッピングせしめる機能を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドのスクリーニング方法：
１）スクリーニングされるオリゴヌクレオチドをミオスタチン遺伝子から転写されたmRNA前駆体のエクソン２とハイブリッド形成させる工程；
２）上記ハイブリッドされたmRNA前駆体から成熟mRNAを生成させる工程；
３）上記生成された成熟mRNAを用いて、エクソン２のスキッピングを分析する工程。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含む筋肉萎縮の予防および／または治療用薬剤。
【請求項７】
筋肉萎縮が、老化、筋ジストロフィー、後天性免疫不全症候群(AIDS)、多発性硬化症、癌および外傷から選択される少なくとも一つに起因する筋肉萎縮である請求項６に記載の筋肉萎縮の予防および／または治療用薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミオスタチンのmRNA前駆体スプライシング制御オリゴヌクレオチドおよびそれを用いることを特徴とする筋肉萎縮の予防および／または治療用薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
成長および分化因子-8（GDF-8またはミオスタチン）（以下、本明細書においてこれらを「ミオスタチン」という。）は、形質転換成長因子-β（TGF-β）スーパーファミリーに属する（非特許文献１）。ヒトのミオスタチン遺伝子はクローニングされており（非特許文献２）、そしてミオスタチンの免疫反応性がヒト骨格筋において１型線維および２型線維の両方で検出され得ることが報告されている。ミオスタチンは、骨格筋の増殖および発達を負に調節することにおいて役割を果たしていると考えられる。筋肉発達の負への調節に関し、ミオスタチンのノックアウトマウスを用いた研究によりミオスタチンが重要な役割を果たし得ることが報告された（非特許文献１）。
【０００３】
上記知見より、例えば、老化、後天性免疫不全症候群（AIDS）、多発性硬化症およびガンなどにより筋肉が縮小した個体において、ミオスタチンを阻害することで、筋肉の発達を促進しうることが考えられた。ミオスタチンの阻害に関し、増殖分化因子インヒビターおよびそれらの用途（特許文献１）、およびミオスタチン遺伝子プロモーターおよびその活性化阻害（特許文献２）が開示されている。また、筋ジストロフィー治療薬として、ミオスタチンに結合し、その活性を抑制するモノクローナル抗体（MYO-029）について、米国ペンシルバニア州のワイス株式会社が国際臨床試験を開始したという報告もある。
【０００４】
しかしながら、これらの報告は、ミオスタチン活性を阻害するか、またはミオスタチンの発現を阻害するものであって、いずれもミオスタチンmRNA前駆体をターゲットにするものである。
【非特許文献１】McPherron, et al., Nature 387:83-90(1997)
【非特許文献２】Nestor, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 14938-43(1998)
【特許文献１】特表2003-517580号公報
【特許文献２】特表2003-528574号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ミオスタチンタンパク質の一部分は保持しつつ、筋肉萎縮の予防および／または筋肉発達の増強を可能とするミオスタチンタンパク質を発現しうるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することを課題とする。さらには、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分とする筋肉萎縮の予防および／または治療用薬剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ミオスタチンタンパク質合成系において、ミオスタチン遺伝子から転写されたmRNA前駆体からスプライシングによる成熟mRNAの生合成において、エクソン２を欠落させうる機能を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることにより、上記課題を達成しうることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち本発明は以下よりなる。
１．ミオスタチン遺伝子から転写されたmRNA前駆体のエクソン２に含まれる配列とハイブリッド形成することにより、該ミオスタチン遺伝子の成熟mRNAの生合成の過程で、エクソン２をスキッピングせしめる機能を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２．以下の１）〜３）のいずれかより選択される塩基配列を含む前項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド：
１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列の471〜620番目の領域から選択される部位とハイブリッド形成し、少なくとも17個のヌクレオチドからなる塩基配列；
２）以下の配列番号２〜４で示される配列のいずれかの塩基配列
CAT AGG TTT GAT GAG TCT CA  （配列番号２）
GTA GGA GTC TCG ACG GGT CT  （配列番号３）
AAA CAC TGT TGT AGG AGT CT  （配列番号４）；
３．前記オリゴヌクレオチドが、ヌクレオチドの糖部位2', -4'が-CO-架橋により修飾されたLocked Nucleic Acid (LNA)を含むオリゴヌクレオチド類縁体である前項１または２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４．ミオスタチン遺伝子から転写されたmRNA前駆体のエクソン２に含まれる配列とハイブリッド形成することにより、該ミオスタチン遺伝子の成熟mRNAの生合成の過程で、エクソン２をスキッピングせしめる機能を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドのスクリーニング方法。
５．以下の工程１）〜３）を含むミオスタチン遺伝子のエクソン２をスキッピングせしめる機能を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドのスクリーニング方法：
１）スクリーニングされるオリゴヌクレオチドをミオスタチン遺伝子から転写されたmRNA前駆体のエクソン２とハイブリッド形成させる工程；
２）上記ハイブリッドされたmRNA前駆体から成熟mRNAを生成させる工程；
３）上記生成された成熟mRNAを用いて、エクソン２のスキッピングを分析する工程。
６．前項１〜３のいずれか一に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含む筋肉萎縮の予防および／または治療用薬剤。
７．筋肉萎縮が、老化、筋ジストロフィー、後天性免疫不全症候群(AIDS)、多発性硬化症、癌および外傷から選択される少なくとも一つに起因する筋肉萎縮である前項６に記載の筋肉萎縮の予防および／または治療用薬剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いれば、ミオスタチンのタンパク質の一部分は保持しつつ、ミオスタチン本来の機能を喪失し、筋肉萎縮の予防および／または筋肉の発達の増強を可能とするミオスタチンタンパク質を発現しうる。すなわち、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることにより、エクソン２をスキッピングしたミオスタチンタンパク質を生体内で生合成させることが可能となる。ミオスタチンタンパク質のエクソン２をスキッピングさせることで、筋肉萎縮の予防および／または筋肉の発達を増強させることができる。さらには、ミオスタチンタンパク質の一部分を維持することにより、ミオスタチンタンパク質の全体を阻害することによる予期せぬ副作用の発症を軽減化することが期待され、より適切に筋肉の発達を制御することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ミオスタチン遺伝子から転写されたmRNA前駆体のエクソン２の配列部分を含む領域とハイブリッド形成することにより、該ミオスタチン遺伝子の成熟mRNAの生合成の過程でスプライシングを制御し、エクソン２をスキッピングせしめる機能を有することを特徴とする。
【００１０】
遺伝子から転写された遺伝情報は、スプライシングによりイントロン配列が除去される等の修飾を受け、エクソン配列のみからなる成熟mRNAとなる。さらに、この成熟mRNAがそのリーディングフレームにしたがって翻訳され、遺伝子にコードされた遺伝情報に忠実に従ったタンパク質の合成が可能となる。mRNA前駆体のスプライシングに関し、mRNA前駆体の塩基配列のうちで、イントロン配列とエクソン配列を正確に決定する機構がある。その機構の一例としてイントロン・エクソン境界部の配列であって、一定ルールで全ての遺伝子に保存されるコンセンサス配列が知られている。
【００１１】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟mRNAの生合成の過程で、スプライシングを制御し、エクソン２特異的にスキッピングせしめる機能を有するものであるから、全ての遺伝子に作用するコンセンサス配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは含まれず、ミオスタチン遺伝子のエクソン２の領域から選択される。
【００１２】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ミオスタチン遺伝子から転写されたmRNA前駆体のエクソン２に含まれる配列とハイブリッド形成することにより、該ミオスタチン遺伝子の成熟mRNAの生合成の過程で、エクソン２をスキッピングせしめる機能を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、具体的には、以下の１）〜３）のいずれかから選択される塩基配列を含む。
【００１３】
１）配列表の配列番号１に表される1128塩基よりなる塩基配列（PNAS. USA, 94 (23), 12457-12461 (1997), GenBank Accession No.AF019627）の471〜620番目の領域から選択される部位とハイブリッド形成し、少なくとも17個のヌクレオチドからなる塩基配列。
２）以下の配列番号２〜４で示される配列のいずれかの塩基配列。
CAT AGG TTT GAT GAG TCT CA  （配列番号２）
GTA GGA GTC TCG ACG GGT CT  （配列番号３）
AAA CAC TGT TGT AGG AGT CT  （配列番号４）
【００１４】
上記１）における少なくとも17個のヌクレオチドとは、17〜100個から選択される数のヌクレオチドをいう。ヌクレオチド数が17個より少なければ、ミオスタチン遺伝子とは異なる遺伝子や、異なる領域とハイブリッド形成する可能性が否定できない。また、100個より多ければ、人工的に合成するのは困難である。合成の容易さを考慮すると、ヌクレオチド数は可能な限り短いのが好ましく、その意味で好適には17〜50個、より好適には17〜25個である。
【００１５】
上記１）のオリゴヌクレオチドとして、以下の配列番号５〜１７５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが例示される。
CAT AGG TTT GAT GAG TCT CAG  （配列番号５）
CAT AGG TTT GAT GAG TCT CAG G  （配列番号６）
CAT AGG TTT GAT GAG TCT CAG GA  （配列番号７）
CAT AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT  （配列番号８）
CAT AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT T  （配列番号９）
【００１６】
AT AGG TTT GAT GAG TCT CA  （配列番号１０）
AT AGG TTT GAT GAG TCT CAG  （配列番号１１）
AT AGG TTT GAT GAG TCT CAG G  （配列番号１２）
AT AGG TTT GAT GAG TCT CAG GA  （配列番号１３）
AT AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT  （配列番号１４）
AT AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT T  （配列番号１５）
AT AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT TT  （配列番号１６）
【００１７】
T AGG TTT GAT GAG TCT CA  （配列番号１７）
T AGG TTT GAT GAG TCT CAG  （配列番号１８）
T AGG TTT GAT GAG TCT CAG G  （配列番号１９）
T AGG TTT GAT GAG TCT CAG GA  （配列番号２０）
T AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT  （配列番号２１）
T AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT T  （配列番号２２）
T AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT TT  （配列番号２３）
T AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT TTG  （配列番号２４）
【００１８】
AGG TTT GAT GAG TCT CA  （配列番号２５）
AGG TTT GAT GAG TCT CAG  （配列番号２６）
AGG TTT GAT GAG TCT CAG G  （配列番号２７）
AGG TTT GAT GAG TCT CAG GA  （配列番号２８）
AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT  （配列番号２９）
AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT T  （配列番号３０）
AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT TT  （配列番号３１）
AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT TTG  （配列番号３２）
AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT TTG C  （配列番号３３）
【００１９】
T CAT AGG TTT GAT GAG TCT CA  （配列番号３４）
TT CAT AGG TTT GAT GAG TCT CA  （配列番号３５）
TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT CA  （配列番号３６）
C TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT CA  （配列番号３７）
TC TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT CA  （配列番号３８）
【００２０】
CAT AGG TTT GAT GAG TCT C  （配列番号３９）
T CAT AGG TTT GAT GAG TCT C  （配列番号４０）
TT CAT AGG TTT GAT GAG TCT C  （配列番号４１）
TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT C  （配列番号４２）
C TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT C  （配列番号４３）
TC TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT C  （配列番号４４）
GTC TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT C  （配列番号４５）
【００２１】
CAT AGG TTT GAT GAG TCT  （配列番号４６）
T CAT AGG TTT GAT GAG TCT  （配列番号４７）
TT CAT AGG TTT GAT GAG TCT  （配列番号４８）
TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT  （配列番号４９）
C TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT  （配列番号５０）
TC TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT  （配列番号５１）
GTC TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT  （配列番号５２）
C GTC TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT  （配列番号５３）
【００２２】
CAT AGG TTT GAT GAG TC  （配列番号５４）
T CAT AGG TTT GAT GAG TC  （配列番号５５）
TT CAT AGG TTT GAT GAG TC  （配列番号５６）
TTT CAT AGG TTT GAT GAG TC  （配列番号５７）
C TTT CAT AGG TTT GAT GAG TC  （配列番号５８）
TC TTT CAT AGG TTT GAT GAG TC  （配列番号５９）
GTC TTT CAT AGG TTT GAT GAG TC  （配列番号６０）
C GTC TTT CAT AGG TTT GAT GAG TC  （配列番号６１）
CC GTC TTT CAT AGG TTT GAT GAG TC  （配列番号６２）
【００２３】
GTA GGA GTC TCG ACG GGT CTC  （配列番号６３）
GTA GGA GTC TCG ACG GGT CTC A  （配列番号６４）
GTA GGA GTC TCG ACG GGT CTC AA  （配列番号６５）
GTA GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA  （配列番号６６）
GTA GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA T  （配列番号６７）
【００２４】
TA GGA GTC TCG ACG GGT CT  （配列番号６８）
TA GGA GTC TCG ACG GGT CTC  （配列番号６９）
TA GGA GTC TCG ACG GGT CTC A  （配列番号７０）
TA GGA GTC TCG ACG GGT CTC AA  （配列番号７１）
TA GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA  （配列番号７２）
TA GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA T  （配列番号７３）
TA GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA TA  （配列番号７４）
【００２５】
A GGA GTC TCG ACG GGT CT  （配列番号７５）
A GGA GTC TCG ACG GGT CTC  （配列番号７６）
A GGA GTC TCG ACG GGT CTC A  （配列番号７７）
A GGA GTC TCG ACG GGT CTC AA  （配列番号７８）
A GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA  （配列番号７９）
A GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA T  （配列番号８０）
A GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA TA  （配列番号８１）
A GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA TAT  （配列番号８２）
【００２６】
GGA GTC TCG ACG GGT CT  （配列番号８３）
GGA GTC TCG ACG GGT CTC  （配列番号８４）
GGA GTC TCG ACG GGT CTC A  （配列番号８５）
GGA GTC TCG ACG GGT CTC AA  （配列番号８６）
GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA  （配列番号８７）
GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA T  （配列番号８８）
GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA TA  （配列番号８９）
GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA TAT  （配列番号９０）
GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA TAT A  （配列番号９１）
【００２７】
T GTA GGA GTC TCG ACG GGT CT  （配列番号９２）
TT GTA GGA GTC TCG ACG GGT CT  （配列番号９３）
GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT CT  （配列番号９４）
T GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT CT  （配列番号９５）
CT GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT CT  （配列番号９６）
【００２８】
GTA GGA GTC TCG ACG GGT C  （配列番号９７）
T GTA GGA GTC TCG ACG GGT C  （配列番号９８）
TT GTA GGA GTC TCG ACG GGT C  （配列番号９９）
GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT C  （配列番号１００）
T GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT C  （配列番号１０１）
CT GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT C  （配列番号１０２）
ACT GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT C  （配列番号１０３）
【００２９】
GTA GGA GTC TCG ACG GGT  （配列番号１０４）
T GTA GGA GTC TCG ACG GGT  （配列番号１０５）
TT GTA GGA GTC TCG ACG GGT  （配列番号１０６）
GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT  （配列番号１０７）
T GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT  （配列番号１０８）
CT GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT  （配列番号１０９）
ACT GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT  （配列番号１１０）
C ACT GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT  （配列番号１１１）
【００３０】
GTA GGA GTC TCG ACG GG  （配列番号１１２）
T GTA GGA GTC TCG ACG GG  （配列番号１１３）
TT GTA GGA GTC TCG ACG GG  （配列番号１１４）
GTT GTA GGA GTC TCG ACG GG  （配列番号１１５）
T GTT GTA GGA GTC TCG ACG GG  （配列番号１１６）
CT GTT GTA GGA GTC TCG ACG GG  （配列番号１１７）
ACT GTT GTA GGA GTC TCG ACG GG  （配列番号１１８）
C ACT GTT GTA GGA GTC TCG ACG GG  （配列番号１１９）
AC ACT GTT GTA GGA GTC TCG ACG GG  （配列番号１２０）
【００３１】
AAA CAC TGT TGT AGG AGT CTC  （配列番号１２１）
AAA CAC TGT TGT AGG AGT CTC G  （配列番号１２２）
AAA CAC TGT TGT AGG AGT CTC GA  （配列番号１２３）
AAA CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC  （配列番号１２４）
AAA CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC G  （配列番号１２５）
【００３２】
AA CAC TGT TGT AGG AGT CT  （配列番号１２６）
AA CAC TGT TGT AGG AGT CTC  （配列番号１２７）
AA CAC TGT TGT AGG AGT CTC G  （配列番号１２８）
AA CAC TGT TGT AGG AGT CTC GA  （配列番号１２９）
AA CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC  （配列番号１３０）
AA CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC G  （配列番号１３１）
AA CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC GG  （配列番号１３２）
【００３３】
A CAC TGT TGT AGG AGT CT  （配列番号１３３）
A CAC TGT TGT AGG AGT CTC  （配列番号１３４）
A CAC TGT TGT AGG AGT CTC G  （配列番号１３５）
A CAC TGT TGT AGG AGT CTC GA  （配列番号１３６）
A CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC  （配列番号１３７）
A CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC G  （配列番号１３８）
A CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC GG  （配列番号１３９）
【００３４】
CAC TGT TGT AGG AGT CT  （配列番号１４０）
CAC TGT TGT AGG AGT CTC  （配列番号１４１）
CAC TGT TGT AGG AGT CTC G  （配列番号１４２）
CAC TGT TGT AGG AGT CTC GA  （配列番号１４３）
CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC  （配列番号１４４）
CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC G  （配列番号１４５）
CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC GG  （配列番号１４６）
【００３５】
C AAA CAC TGT TGT AGG AGT CT  （配列番号１４７）
AC AAA CAC TGT TGT AGG AGT CT  （配列番号１４８）
CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT CT  （配列番号１４９）
G CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT CT  （配列番号１５０）
TG CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT CT  （配列番号１５１）
【００３６】
AAA CAC TGT TGT AGG AGT C  （配列番号１５２）
C AAA CAC TGT TGT AGG AGT C  （配列番号１５３）
AC AAA CAC TGT TGT AGG AGT C  （配列番号１５４）
CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT C  （配列番号１５５）
G CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT C  （配列番号１５６）
TG CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT C  （配列番号１５７）
TTG CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT C  （配列番号１５８）
【００３７】
AAA CAC TGT TGT AGG AGT  （配列番号１５９）
C AAA CAC TGT TGT AGG AGT  （配列番号１６０）
AC AAA CAC TGT TGT AGG AGT  （配列番号１６１）
CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT  （配列番号１６２）
G CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT  （配列番号１６３）
TG CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT  （配列番号１６４）
TTG CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT  （配列番号１６５）
T TTG CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT  （配列番号１６６）
【００３８】
AAA CAC TGT TGT AGG AG  （配列番号１６７）
C AAA CAC TGT TGT AGG AG  （配列番号１６８）
AC AAA CAC TGT TGT AGG AG  （配列番号１６９）
CAC AAA CAC TGT TGT AGG AG  （配列番号１７０）
G CAC AAA CAC TGT TGT AGG AG  （配列番号１７１）
TG CAC AAA CAC TGT TGT AGG AG  （配列番号１７２）
TTG CAC AAA CAC TGT TGT AGG AG  （配列番号１７３）
T TTG CAC AAA CAC TGT TGT AGG AG  （配列番号１７４）
AT TTG CAC AAA CAC TGT TGT AGG AG  （配列番号１７５）
【００３９】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを合成する通常の方法にしたがって調製することができる。例えば市販の自動合成機等一般に用いられるヌクレオチドの合成手法により、合成することができる。また、合成されたオリゴヌクレオチドは、通常この分野で用いられる方法、例えば、高速液体クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、溶媒抽出、塩析等を用いて精製することができる。
【００４０】
天然型（リボースまたはデオキシリボース）糖およびホスホジエステル結合を含むオリゴヌクレオチドは、血清および細胞内のヌクレアーゼにより速やかに分解される。このことは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として、例えば医薬として生体に投与するには、有用性を制限することとなる。
【００４１】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾されたオリゴヌクレオチド類縁体も含む。ヌクレアーゼ安定性を改善するために、糖部分、塩基部分の修飾、および／またはヌクレオチド間ホスホジエステル結合を修飾し、オリゴヌクレオチド類縁体とすることができる。代表的なものとして、天然型ヌクレオチドの糖部位2', -4'を-CO-で架橋したLNA(Locked Nucleic Acid )や、糖部位2', -4'をエチレンで架橋したENA(2'-O,4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids)などのオリゴヌクレオチド類縁体が挙げられる。特に好適にはLNAであり、DNAと同様にアミダイト体として存在するので、ホスホアミダイト法により、合成することができる。精製は、逆相カラムによるHPLCの手法により行うことができる。その他の代表的なオリゴヌクレオチド類縁体として、ホスホジエステル結合の酸素の一部または全部を硫黄原子で置換したホスホロチオエート またはホスホロジチオエート型のオリゴヌクレオチドが挙げられる。そのほか、ボラノホスフェート、ホスホロセレネート、アミデート結合を含むオリゴヌクレオチドも利用することができる。
【００４２】
さらに、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、薬学的に許容しうる塩の形態で修飾されていてもよい。薬学的に許容される塩とは、薬学的に許容される無機および有機酸および塩基などをいう。具体的には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン−ｐ−スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸およびベンゼンスルホン酸などが挙げられる。適当な塩基の例として、アルカリ金属(例えばナトリウム)、アルカリ土類金属(例えばマグネシウム)、アンモニウムおよびNR4+(ここで、RはC1-4アルキル)塩などが挙げられる。
【００４３】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、該アンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分とする筋肉萎縮の予防および／または治療用薬剤に利用することができる。筋肉萎縮は、筋ジストロフィー、後天性免疫不全症候群(AIDS)、多発性硬化症、癌などの疾患に起因するものに限られず、例えば老化や外傷などに起因するものも挙げられる。
【００４４】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として、上記予防および／または治療用薬剤として利用するために、製剤として薬学的に許容される担体と、そして所望により他の予防的および／または治療的成分と共に含むことができる。薬学的に許容できる担体は受容者に有害でなく、また他の予防的および／若しくは治療的成分を含む場合に、これら他の成分と適合することが必要とされる。
【００４５】
本発明の予防および／または治療用薬剤は、適宜、担体、香料、色素等を用いて、ペレット、錠剤、顆粒等に加工したり、ゼラチン等で被覆してカプセルに加工して利用することもできる。薬剤の形態として、当業者に公知の種々の形態の医薬製剤、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤及びトローチ剤等の経口剤、並びに軟膏、ローション、クリーム等の経皮吸収剤、注射剤、および坐剤等の非経口剤が挙げられる。
【００４６】
筋肉内、皮下および静脈内投与に適した予防および／または治療用薬剤としては、アンプル、充填済注射器、少量輸液などの投与形態とすることができる。安定性の点から、バイアル、アンプル、充填済注射器等に充填後、冷凍し、通常の凍結乾燥処理により水分を除き、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。薬剤は、医薬の分野で自体公知の方法により、あるいは今後開発される方法により製剤化することができる。組成物は、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液、またはエマルジョンの形であってもよく、懸濁、安定化および／または分散剤のような製剤用薬剤であってもよい。
【００４７】
経口投与用の錠剤およびカプセルは、結合剤、充填剤、滑沢剤、崩壊剤または湿潤剤のような慣用の賦形剤を含むことができる。錠剤は当分野で既知の方法によりコーティングすることができる。経口液体製剤は、例えば、水性または油性懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップまたはエリキシルの形であってもよく、または使用前に水または適当な媒体で構成するための乾燥製品であってもよい。このような液体調製物は、懸濁剤、乳化剤、非水性媒体または防腐剤のような慣用の添加剤を含んでいてもよい。
【００４８】
本発明は、ミオスタチン遺伝子から転写されたmRNA前駆体のエクソン２に含まれる配列とハイブリッド形成することにより、該ミオスタチン遺伝子の成熟mRNAの生合成の過程で、エクソン２をスキッピングせしめる機能を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドのスクリーニング方法にも及ぶ。
【００４９】
スクリーニングの方法は、以下の工程１）〜３）を含む方法による。
１）スクリーニングされるオリゴヌクレオチドをミオスタチン遺伝子から転写されたmRNA前駆体のエクソン２とハイブリッド形成させる工程；
２）上記ハイブリッドされたmRNA前駆体から成熟mRNAを生成させる工程；
３）上記生成された成熟mRNAを用いて、エクソン２のスキッピングを分析する工程。
【００５０】
エクソン２のスキッピングの分析は、成熟mRNAを、例えばRT-PCRなどの核酸増幅手段を用いて増幅した核酸の塩基配列を分析したり、電気泳動による分析法により行うことができる。
【実施例】
【００５１】
以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【００５２】
（実施例１）アンチセンスオリゴヌクレオチドの調製
以下のMyo 11, Myo 13, Myo 21 のオリゴヌクレオチドを各々調製した。
以下のオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列表の配列番号１に示すミオスタチン遺伝子（GenBank Accession No.AF019627）のヌクレオチド番号521〜540、481〜500、491〜510各々に相補的な配列である。これらのオリゴヌクレオチドは、天然型ヌクレオチドの糖部位2', -4'を-CO-で架橋したオリゴヌクレオチド類縁体（Locked Nucleic Acid (LNA)）からなる。
(Myo 11) CAT AGG TTT GAT GAG TCT CA  （配列番号２）
(Myo 13) GTA GGA GTC TCG ACG GGT CT  （配列番号３）
(Myo 21) AAA CAC TGT TGT AGG AGT CT  （配列番号４）
【００５３】
上記オリゴヌクレオチドは、核酸自動合成機（パーキンエルマー社製ABI model 394 DNA/RNA synthesizer）を用い、40 nmolスケールで調製した。LNAは、DNAと同様にアミダイト体としてあるので、これをホスホアミダイト法を用いて合成し、オリゴヌクレオチド類縁体とした。
【００５４】
目的配列を有する保護されたオリゴヌクレオチド類縁体を濃アンモニア水で処理することによってオリゴマーを支持体から切り出すとともに、リン原子上の保護基シアノエチル基と核酸塩基上の保護基をはずした。溶媒を減圧下留去し、残った残渣を逆相HPLC（島津製作所製LC-10VP、カラム（Merck, Chromolith Performance RP-18e(4.6×100mm)）、A溶液：5%アセトニトリル、0.1M酢酸トリエチルアミン水溶液(TEAA), pH7.0、B溶液:25％アセトニトリル、B％:10％→45％(10min, linear gradient); 60℃; 2ml/min; 254nm)にて精製し、各々目的分画を回収した。溶媒を減圧留去した後、80％酢酸水を加え２０分放置し、DMTr基を除去した。溶媒留去後、水0.5mLに溶解し、Ultrafree-MC（ミリポア製、product No. UFC4 OHV25）でろ過し、溶媒留去後目的の化合物（オリゴヌクレオチド）を得た。本化合物は、逆相HPLC（カラム（Merck, Chromolith Performance RP-18e(4.6×100mm)）、A溶液：5％アセトニトリル、0.1M酢酸トリエチルアミン水溶液(TEAA), pH7.0、B溶液:25％アセトニトリル、0.1M TEAA、B％:15％→60％(10min, linear gradient); 60℃; 2ml/min; 254nm)により溶出した。
【００５５】
（実施例２）エクソン２が欠落したミオスタチンmRNAの確認
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入した筋芽細胞初代培養系で発現したmRNAについて確認した。
【００５６】
１．筋芽細胞初代培養系作製
以下のようにして、筋芽細胞の初代培養系を作製した。
１）デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者より無菌的に採取した筋組織を細切し、リン酸緩衝液(PBS)によって２回洗浄した。
２）１）の筋組織をDifco BactoTM トリプトン250の5％溶液により37℃で30分間処理することにより、酵素的に遊離細胞を得た。
３）２）の遊離細胞を20％ウシ胎児血清(FBS)を含むDMEM培地（SIGMA社）により２回洗浄した。
４）３）の細胞を20％FBS及び4％ ultroserG（CIPHERGEN社）を含むDMEM培地に浮遊させた。
５）４）の浮遊細胞を、メッシュ（セルストレイナー35-2360 (Becton Dekinson社)）を通して遊離細胞のみ回収した。
６）５）で回収した細胞を20％FBSを含むDMEM培地で、ゼラチンコートしたディッシュに播種した。
７）上記細胞を37℃ 5％CO2 in air中にて培養した。
８）培養細胞を６穴プレート（ゼラチンコート）に播き、コンフルエントになるまで37℃ 5％CO2 in air中にて培養した。
【００５７】
２．トランスフェクション
以下のようにして、実施例１で調製した各オリゴヌクレオチドを筋芽細胞にトランスフェクションした。
１）Opti-MEN 培地(GIBCO-BRL社) 100μlに、実施例１で調製したオリゴヌクレオチド（Milli Q滅菌水で100pmol/μlとしたもの）を各々200pmol溶解した。
２）１）の溶液へ6μlのプラス試薬(plus reagent:GIBCO-BRL社)を加え、15分間室温で放置した。
３）別のチューブで、Opti-MEN培地(GIBCO-BRL社) 100μlにリポフェクタミン(GIBCO-BRL社) 8μlを溶解した。
４）２）の処理後、処理液に３）を加え、さらに15分間室温で放置した。
５）筋芽細胞をPBSによって１回洗浄した後、Opti-MEN培地(GIBCO-BRL社) 800μlを加えた。
６）４）の処理後、処理液を５）の細胞に加えた。
７）６）の細胞を37℃ 5％CO2 in air中にて３時間培養した後、60％FBSを含むDMEM培地を500μl各ウェルに加えた。
８）さらに培養を継続した。
【００５８】
３．RNAの抽出
以下のようにしてRNAの抽出を行った。
１）各オリゴヌクレオチドをトランスフェクションした細胞を、各々２日間培養した後、PBSにて１回洗浄し、RNA抽出用試薬(ISOGEN; ニッポンジーン社）500μlを細胞に添加した。
２）５分間室温に放置した後、ウェル内のRNA抽出用試薬をチューブに回収した。
３）ISOGENのプロトコールに従ってRNAを抽出した。
４）最終的にDEPW（ジエチルピロカーボネイト処理滅菌水）20μlにRNAを溶解した。
【００５９】
４．逆転写反応
以下のようにして逆転写反応を行った。
１)RNA 2μgにDEPWを加え、7μlとした。
２)１)の溶液に、ランダムヘキサマー（random hexmer; Invitrogen社）3μg/μl（Milli Q滅菌水で20倍希釈したもの）を1μl、dNTPs（Takara Ex Taq(タカラバイオ社)に添付）4μlを加えた。
３）65℃で5分間加熱した。
４）上記の反応液に、M-MLV Reverse Transcriptase 200U/μl(MMLV RT 200U/μl; Invitrogen社) 1μl、ヒト胎盤由来RNA分解酵素阻害剤(ヒト胎盤由来Ribonuclease Inhibitor;タカラバイオ製 40U/μl) 1μl、ジチオスレイトール100mM(DTT 100mM; MMLV RTに添付) 2μl、緩衝液 (250 mM Tris-HCl(pH 8.3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl2; MMLV RTに添付) 4μlを加え、25℃で10分間おいた。
５）37℃で55分間保温し、その後70℃で15分間加熱した。
６）反応後は-20℃で保存した。
【００６０】
５．ポリメラーゼチェーンリアクション(PCR)反応
以下のようにしてPCR反応を行った。
１）下記成分を混和後、94℃で4分間加熱した。
逆転写反応産物3μl
フォワードプライマー（10pmol/μl）1μl
リバースプライマー（10pmol/μl）1μl
PCR用DNA ポリメラーゼ(Takara Ex Taq; タカラバイオ社) 0.1μl
dNTPs (Takara Ex Taqに添付) 2μl
20mM Tris-HCl 緩衝液(pH8.0) (Takara Ex Taqに添付) 2μl
Milli Q滅菌水11μl
２）94℃1分・60℃1分・72℃1分の処理を35サイクル行った。
３）72℃で7分間加熱した。
なお、PCR反応に用いたフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列は以下の通りである。
フォワードプライマー：TTC GTC TGG AAA CAG CTC CT（exon 1）（配列番号１７６）
リバースプライマー：AGA GGG TAA CGA CAG CAT CG（exon 3）（配列番号１７７）
【００６１】
６．PCR反応の反応産物の確認
１）PCR反応の反応産物を2％アガロースゲル電気泳動によって解析した。
泳動したゲルをエチジウムブロミドで染色し、得られたエクソン２がスキップしたバンド(A)と得られたエクソン２がスキップしなかったバンド(B)をゲル撮影装置を用いて可視化した。その結果を図１に示した。
２）得られたエクソン２がスキップしたmRNA (A)と得られたエクソン２がスキップしなかったmRNA (B)についてのPCR反応の反応産物をBig Dye Terminator v1.1 Cycle Sequencing kit （アプライドバイオシステムズ社）を用い、ABI PRISM 310 Genetic analyzer（アプライドバイオシステムズ社）によってシークエンス反応を行って、塩基配列を確認した。反応手順はマニュアルに従った。その結果を図２および３に示した。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いれば、ミオスタチンのタンパク質の一部分は保持しつつ、筋肉萎縮の予防および／または筋肉の発達の増強を可能とするミオスタチンタンパク質を発現しうる。すなわち、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることにより、エクソン２がスキッピングされたミオスタチンタンパク質を生体内で生合成させることが可能となる。ミオスタチンタンパク質のエクソン２をスキッピングさせることで、筋肉萎縮の予防および／または筋肉の発達を増強させることができる。
【００６３】
したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として、筋肉萎縮の予防および／または治療用薬剤として利用することができる。筋肉萎縮は、筋ジストロフィー、後天性免疫不全症候群(AIDS)、多発性硬化症、癌などの疾患に起因するものに限られず、例えば老化や外傷などに起因するものも挙げられる。このような分野に利用されることにより、ミオスタチンの全体を阻害することによる予期せぬ副作用の発症が軽減化され、より適切に筋肉の発達を制御可能となることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】PCR反応産物の電気泳動よる解析結果を示した図である。（実施例２）
【図２】エクソン２がスキップしたmRNA (A)の塩基配列（配列番号１７８）を示す図である。（実施例２）
【図３】エクソン２がスキップしなかったmRNA (B)の塩基配列（配列番号１７９、１８０）を示す図である。（実施例２）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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