(57)【要約】【課題】アワビ類の浮遊幼生及び着底変態直後の稚貝を容易かつ確実に同定・検出する新規な方法を提供する。【解決手段】アワビ類の浮遊幼生及び着底変態直後の稚貝が有する卵黄タンパク質に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を用いて、蛍光抗体法によってアワビ類の浮遊幼生及び着底変態直後の稚貝を検出する方法。また、試料に対し二次抗体の動物種と同じＩｇＧ抗体を作用させ、二次抗体の非特異吸着を防止した後で、モノクローナル抗体を作用させる方法を採ることが好ましい。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アワビ類の浮遊幼生及び着底変態直後の稚貝が有する卵黄タンパク質に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を用いて、蛍光抗体法によってアワビ類の浮遊幼生及び着底変態直後の稚貝を検出する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、試料に対し二次抗体の動物種と同じＩｇＧ抗体を作用させ、二次抗体の非特異吸着を防止した後で、モノクローナル抗体を作用させることとするアワビ類の浮遊幼生及び着底変態直後の稚貝を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアワビ類浮遊幼生及び微小稚貝の検出方法に関する。詳しくは、モノクローナル抗体を用いてアワビ類の浮遊幼生及びその微小稚貝を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アワビ類の漁獲量は年々減少の傾向にある。神奈川県だけをみても、アワビ類の年間漁獲量は、１９８０年代は４５〜６０トンであったが、年々減少し、２０００年以降は２０トン程度にまで低落している。また、アワビ類については人工種苗の放流が行なわれているが、主要漁場で捕獲されたアワビ類のうち、天然貝は１０％未満にすぎないことが漁獲物調査の結果明らかとなっている。すなわち、アワビ類漁獲量の減少要因は、天然貝発生量の激減によるものと考えられ、その対策が求められている。
【０００３】
そのため、天然アワビ類資源の減少要因を明らかにする必要があるが、アワビ類資源への影響が最も大きいと考えられる、産卵、幼生及び着底変態直後の稚貝の自然界での生態については、未だ十分な知見が得られていない。そのため、野外（フィールド）において生態解明のための調査を実施する必要がある。
【０００４】
従来、アワビ類の浮遊幼生や微小稚貝の同定は、殻の形態的特徴を観察することによって行なわれている。しかし、アワビ類の浮遊幼生や微小稚貝の大きさは、２５０μｍ〜４００μｍと非常に小さく、また、天然海域においてプランクトンネットやコレクタ−によって採取した野外試料には、アワビ類以外の巻貝、二枚貝、プランクトン、砂、珪藻、石灰藻などが大量に混ざっている。アワビ類の浮遊幼生や微小稚貝の定量的な調査を行なうためには、大量の試料を迅速に処理する必要があるが、採取した試料の多くは上記の状況にあるため、試料の中から目的とするアワビ類を同定するには、多くの時間が必要であると共に作業者に高度の判断能力が求められている。
【０００５】
そこで、本発明者らは、誰もが容易に操作でき、効率的なサンプル（試料）処理を可能とするためにアワビ類の浮遊幼生や微小稚貝の簡便な検出方法の開発を志向し、まず、特許文献を調査した。その結果、以下の公報が検索された。
【特許文献１】特開平１１−１９６８６６号公報
【特許文献２】特開２０００−２１２８９９号公報
【０００６】
特許文献１には、モノクローナル抗体を用いて、アサリ浮遊幼生を同定する方法が開示されてあり、この場合に用いるモノクローナル抗体は、アサリのベリジャー期幼生で免疫化したマウス脾細胞とマウス骨髄腫細胞とを融合させて得られたハイブリドーマが生産するアサリ浮遊幼生特異的モノクローナル抗体である。
【０００７】
特許文献２には、海水中に浮遊するズワイガニの幼生を完全個体の状態で認識しかつズワイガニ属に属する他の種の幼生を認識しないモノ又はポリクローナル抗体を用いて、完全個体の状態にある検体ズワイガニ属幼生が、ズワイガニ幼生であるかどうかの判別をするズワイガニ属幼生の種判別方法について開示されてあり、この場合に用いるモノクローナル抗体は、以下のようにして採取したものである。すなわち、まず、マウス、ラットなどの哺乳動物を予め種の知られているズワイガニ幼生を抗原として免疫し、最終免疫後、哺乳動物の脾臓からＢ細胞を含んだ細胞懸濁液を採取する。次に、このＢ細胞とミエローマ細胞（骨髄腫細胞）とを融合し、目的のハイブリドーマを選別して培養し、培地交換を行なって、ハイブリドーマ以外の細胞を死滅させ、このハイブリドーマ細胞からスクリーニングしてモノクローナル抗体を得ることができる。
【０００８】
すなわち、特許文献１にはアサリ浮遊幼生を同定する方法が開示されてあり、特許文献２にはズワイガニの幼生を認識する方法が開示されているが、両文献には、アワビ類の浮遊幼生や微小稚貝を同定・検出する方法については何ら開示されていない。よって、本発明者らは、特許文献１と特許文献２に記載の方法とは無関係に、作業者の熟練や判断能力を要することなく、誰でも容易に操作できて、アワビ類の浮遊幼生及び着底変態直後の稚貝を容易かつ確実に同定・検出する方法を独自に開発した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、アワビ類の浮遊幼生及び着底変態直後の稚貝を容易かつ確実に同定・検出する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するための本発明のうち特許請求の範囲・請求項１に記載する発明は、アワビ類の浮遊幼生及び着底変態直後の稚貝が有する卵黄タンパク質に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を用いて、蛍光抗体法によってアワビ類の浮遊幼生及び着底変態直後の稚貝を検出する方法である。
【００１１】
さらに、同請求項２に記載する発明は、請求項１に記載の方法において、試料に対し二次抗体の動物種と同じＩｇＧ抗体を作用させ、二次抗体の非特異吸着を防止した後で、モノクローナル抗体を作用させることとするアワビ類の浮遊幼生及び着底変態直後の稚貝を検出する方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係るアワビ類浮遊幼生及び微小稚貝の検出方法は、作業者の熟練や判断能力を要することなく、アワビ類の浮遊幼生や着底変態直後の稚貝を容易かつ確実に同定・検出できる。また、本発明の検出方法は、予め二次抗体の非特異的な吸着をブロッキングするので、より鮮明な判別が可能である。その上、本発明によって、アワビ類の浮遊幼生や微小稚貝を一時に大量に同定・検出できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明において「アワビ類」とは、マダカアワビ、メガイアワビ、クロアワビ、エゾアワビなどの総称である。アワビ類は、いずれも種苗生産が可能であり、各地の種苗センターや漁業協同組合の事業として盛んになっている。
【００１４】
一般に、アワビ類の受精卵は、水温２２℃、１２時間くらいでトロコフォアラ（担輪子幼生）として産卵・孵化し、２４時間後にはベリジャー（被面子幼生）となって水中に浮遊する。浮遊幼生は一切摂餌しない。これら浮遊幼生は、孵化後３〜５日すると着底し、匍匐生活に入り、さらに変態して摂餌器官（歯舌）が完成して稚貝となる。
【００１５】
本発明では、トロコフォアラ幼生とベリジャー幼生及び着底し匍匐していてもベラムを有する状態までを合わせて幼生ないし浮遊幼生と称する。また、ベラムを切り離してもっぱら匍匐生活を送る状態以降を稚貝と称する。変態後の稚貝は餌を食べ始めるので、栽培漁業センターなどでは小形藻類を付着・繁殖させたプラスチック製の付着板などに付着させることが多い。アワビ類の浮遊幼生及び着底変態直後の稚貝は、その大きさは数百μｍで非常に小さい。本発明は、プランクトンネットや付着板などを用いて野外で採取した試料の中から上記アワビ類の浮遊幼生及び着底変態直後の稚貝を容易かつ確実に同定・検出するための方法に関する。
【００１６】
上記のとおり、本発明におけるアワビ類の「浮遊幼生」には、一般の浮遊幼生の他に、着底しているが変態する前の幼生も含む。すなわち、本発明の「アワビ類の浮遊幼生及び着底変態直後の稚貝」とは、卵黄タンパク質を持っていて、これを栄養分として成長する期間の幼生ないし稚貝のことをいう。そのため、本発明では、アワビ類の浮遊幼生及び着底変態直後の稚貝を検出するために、これら浮遊幼生や微小稚貝が有する卵黄タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体を用いることを特徴とする。アワビ類の浮遊幼生や微小稚貝が卵黄タンパク質を有する期間（すなわち、アワビ類が浮遊幼生及び着底変態直後の稚貝である期間）は、孵化後２週間程度（変態は孵化後１週間程度で完了する。）である。
【００１７】
以下、本発明の検出方法について、具体的な手法の一例を説明する。
プランクトンネットで海水を濾過して採取した試料や野外に一定期間設置しておいたコレクターで採取した試料を回収し、１０％エタノール海水によって剥離させ、−２０℃以下、好ましくは−８０℃程度で凍結させ、保存しておく。なお、採取した試料は８０％エタノール溶液での保存も可能である。
【００１８】
この試料を解凍した後、ＴＢＳ（Tris buffered saline：緩衝溶液）で洗浄し、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（二次抗体）の非特異吸着を防ぐため、二次抗体の動物種と同じＩｇＧを使用し、室温下で１時間程度反応させる。
【００１９】
次いで、ＴＢＳで十分に（例えば３〜４回）洗浄した後、アワビ類の浮遊幼生及び着底変態直後の稚貝が有する卵黄タンパク質に対して特異的に反応するモノクローナル抗体を加えて、室温下で約１時間反応させる。
【００２０】
さらに、ＴＢＳで十分に（３〜４回）洗浄した後、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体をＴＢＳで５０倍に希釈したものを、室温下で１時間程度反応させる。ＦＩＴＣ標識抗体（二次抗体）は、市販品を用いても差し支えない。
【００２１】
次いで、ＴＢＳで十分に（３〜４回）洗浄した後、蛍光装置付きの実体顕微鏡などで試料を観察する。試料中、蛍光発色するものがアワビ類の浮遊幼生又は着底変態直後の稚貝である。なお、同じミミガイに属するトコブシについては、本発明によるモノクローナル抗体には反応しないため、検出されない。
【００２２】
また、蛍光発色により検出されたアワビ類について、クロアワビ、マダカアワビといった種判別が必要な場合は、蛍光を発する稚貝を取り出し、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Polymerase chain reaction-Restriction fragment length polymorphism：制限酵素断片長多型ポリメラーゼ連鎖反応）によって種の判別を行なう。なお、種の判別を要しない場合においては、試料の保存方法は、凍結保存の他、ホルマリンによって固定する方法でも、蛍光発色による検出は可能である。
【００２３】
すなわち、アワビ類の各種は、遺伝子的にみて非常に近い種間関係にあるため、ＰＣＲではどれも同じようにＤＮＡの一部が増幅される。増幅されたＤＮＡは、特定の制限酵素により切断できるかどうかが種により異なるため、この特徴を利用して種の判別を行なうことができる。
【００２４】
本発明で用いる蛍光抗体法は、免疫蛍光法とも呼ばれ、組織標本中の酵素、構造タンパク質、微生物などの抗原性物質を蛍光標識抗体と結合させ、蛍光顕微鏡下に検出する方法である。抗体の蛍光標識には、ＦＩＴＣ（Fluorescein isothiocyanate）がよく用いられる。すなわち、一次抗体（例えばアワビ類の卵黄タンパク質）に特異的に抗原抗体反応する二次抗体（特定の動物種の免疫グロブリンを認識する抗体が用いられる。）をＦＩＴＣで標識し、ＦＩＴＣに対応する波長の励起光を当てると、緑色の蛍光を発することにより識別が可能となる。
【００２５】
本発明に係るアワビ類浮遊幼生及び微小稚貝の検出方法を簡潔に説明すれば、（１）採取した試料に対してアワビ類の浮遊幼生及び微小稚貝が有する卵黄タンパク質に特異的な一次抗体（モノクローナル抗体）を付着させ、（２）試料に付着した一次抗体に二次抗体（ＦＩＴＣ標識抗体）を付着させ、（３）二次抗体のＦＩＴＣ標識に紫外線を当てて緑色に蛍光させることによって、試料がアワビ類の浮遊幼生又は着底変態直後の稚貝であるか否かを判断する方法であるということができる。
【００２６】
また、本発明に係るアワビ類浮遊幼生及び微小稚貝の検出方法は、二次抗体（ＦＩＴＣ標識抗体）の非特異的な吸着を防ぎ、より判別が鮮明になるようにブロッキングを施している点にも特色がある。
【００２７】
《試験例１》
＜モノクローナル抗体の選抜試験＞
（１）試験方法
アワビ類浮遊幼生に特異的なモノクローナル抗体７種類（Ａ〜Ｇ）を作成した。これらの培養上清を、人工的に採卵して孵化させたマダカアワビの浮遊幼生及び微小稚貝に反応させ、次いで市販のＦＩＴＣ標識抗体を反応させた後、抗体の反応性を蛍光顕微鏡で観察した。以下にその結果を示す。
（２）試験結果
Ａ．浮遊幼生用抗体／抗体番号：Ｙ１−１１−３−１
イ）アワビ類浮遊幼生及び初期稚貝の軟体部は半透明の殻に覆われているため、殻を破壊  しないで外部から抗原抗体反応を確認するためには、殻を通過するほどに強い蛍光を発  することが必要である。また、蛍光する部位についても、外部からの観察が容易な部位  であることが望ましい。
ロ）Ｙ１−１１−３−１を用いた場合、非常に強い蛍光がベラム基部の卵黄球周辺で認め  られる。この蛍光は殻の外部から容易に観察できるほど強く、また、蛍光部位も観察が  容易な場所にある。
ハ）したがって、蛍光の強さ及び蛍光部位の特徴からみて、本抗体は卵、浮遊幼生期及び  着底初期稚貝の卵黄タンパク質の検出に適していると考えられる。
Ｂ．浮遊幼生用抗体／抗体番号：Ｙ１−７−１０−５
イ）卵黄に蛍光反応が認められるが、弱い。
ロ）殻が壊れているものについては、蛍光は強い。
Ｃ．浮遊幼生用抗体／抗体番号：Ｙ２−３−１１−５
卵黄球に蛍光反応を認めるが、強くない。
Ｄ．浮遊幼生用抗体／抗体番号：Ｙ２−５−３−４
殻口の周辺に蛍光を認めるが、非特異的な蛍光程度で、弱い。
Ｅ．浮遊幼生用抗体／抗体番号：Ｍ２−１９−３−１
殻口の周辺に蛍光を認めるが、非特異的な蛍光程度で、弱い。
Ｆ．浮遊幼生用抗体／抗体番号：Ｍ２−８−１−４
非常に弱い。
Ｇ．初期稚貝用抗体／抗体番号：Ｍ２−１−３−２
殻蓋の下が多少蛍光するが、非常に弱い。
【００２８】
（３）所見
抗体Ａ〜Ｄは卵黄タンパク質に反応する抗体であり、このうち３種（Ａ〜Ｃ）について蛍光反応が確認された。これらのうち強い蛍光をを発したのは１種（Ａ：Ｙ１−１１−３−１）のみであった。一方、抗体Ｅ〜Ｇは筋肉タンパク質に反応する抗体であるが、この生育段階のアワビの筋肉にはいずれもほとんど反応しないことが確認された。すなわち、本試験例によってアワビ類の浮遊幼生及び微小稚貝の検出には、これらの有する卵黄タンパク質に特異的に反応するモノクローナル抗体を用いる必要があることが確認された。
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明する。
【実施例１】
【００２９】
＜アワビ類の浮遊幼生と微小稚貝の蛍光発色の確認＞
イ）神奈川県水産技術センターで採卵・飼育し、保存していたアワビ類（ここではマダカ  アワビを用いた。）の浮遊幼生とその微小稚貝を試料として−８０℃で保存した後、解  凍し、ＴＢＳで洗浄する。
ロ）このイ）の試料をそのまま蛍光顕微鏡下で観察したところ、微小稚貝の一部にＦＩＴ  Ｃ標識による緑色の蛍光とは異なるオレンジ色の蛍光を発するものがあった。
ハ）上記イ）の試料に市販のＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体をＴＢＳで５０倍に希  釈したものを室温で１時間反応させた後、ＴＢＳで３回洗浄したものを、蛍光顕微鏡下  で観察したところ、貝殻のオレンジ色の蛍光はそのままで、軟体部に弱いＦＩＴＣ標識  による蛍光が認められた。
ニ）上記イ）の試料に、アサリ浮遊幼生用の一次抗体（Ｙ２−４４）を室温で１時間反応  させた後、ＴＢＳで３回洗浄し、さらに市販のＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体を  ＴＢＳで５０倍に希釈したものを室温で１時間反応させた後、ＴＢＳで３回洗浄したも  のを、蛍光顕微鏡下で観察したところ、上記ハ）と同様、貝殻のオレンジ色の蛍光はそ  のままで、軟体部に弱いＦＩＴＣ標識による蛍光が認められた。
ホ）上記の試験結果から、アワビ類の浮遊幼生及び微小稚貝は、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩ  ｇＧヤギ抗体を非特異的に吸着することが明らかとなった。
【００３０】
そこで、上記のイ）の試料を解凍したものを、ＴＢＳで洗浄後、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体の動物種を同じＩｇＧを５０倍に希釈したものを使用し、室温下で１時間反応させた後、ＴＢＳで３回洗浄し、上記のハ）及びニ）の反応条件にしたがって蛍光顕微鏡下で観察したところ、それぞれ蛍光を発するものは見られず、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体の非特異的な吸着は防げることが明らかとなった。なお、微小稚貝の貝殻の蛍光については、発色がオレンジ色であり、容易にＦＩＴＣ標識による緑色の発光と区別できるので、問題ない。
【００３１】
次に、以下の手順にしたがって、蛍光顕微鏡下で観察したところ、アワビ類の浮遊幼生及び微小稚貝が、アワビ類の卵黄タンパク質に特異的に反応する抗体（Ｙ１−１１−３−１）を用いることにより、強い蛍光発色が認められた。
イ）アワビ類（ここではマダカアワビを用いた。）浮遊幼生とその微小稚貝を試料として  −８０℃で一旦保存した後、解凍し、ＴＢＳで洗浄する。
ロ）ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体の動物種と同じＩｇＧを５０倍に希釈したものを使  用し、室温下で１時間反応させた後、ＴＢＳで３回洗浄する。
ハ）アワビ類に特異的に反応する一次抗体（Ｙ１−１１−３−１）を室温で１時間反応さ  せた後、ＴＢＳで３回洗浄する。
ニ）さらに市販のＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体をＴＢＳで５０倍に希釈したもの  を室温で１時間反応させた後、ＴＢＳで３回洗浄する。
【実施例２】
【００３２】
＜蛍光発色する稚貝の判定例＞
神奈川県三浦市沖に設置したアワビ稚貝採集用の付着板の混入生物を実施例１と同じ方法（上記イ）〜ハ）の手順）にしたがって処理した後、蛍光顕微鏡で観察したところ、ＦＩＴＣ標識による蛍光発色が認められるものが存在した。この蛍光発色が認められる試料は、形態学的特徴からアワビ類の稚貝と判定された。また、アワビ類以外の稚貝（巻貝、二枚貝）には蛍光発色をするものは認められなかった。なお、石灰藻や貝殻片の一部において、オレンジ色や薄い黄色など波長の異なる蛍光発色をするものが認められたが、アワビ類の蛍光発色とは明らかに異なっていた。
【００３３】
《試験例２》
＜モノクローナル抗体の効力確認試験＞
（１）試験方法
アワビ類浮遊幼生の卵黄タンパク質又は筋肉タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を７種類作成した。これらの培養上清を、人工的に採卵して孵化させたマダカアワビの浮遊幼生及び微小稚貝に反応させ、次いで市販のＦＩＴＣ標識抗体を反応させた後、抗体の反応性を蛍光顕微鏡で観察した。また、このうち強い反応性が確認された抗体を用いて、神奈川県で生産したトコブシ種苗に対する反応性を観察した。
（２）試験結果
マダカアワビの浮遊幼生及び微小稚貝に対し、１種の抗体が強い蛍光を示すことが判明した。しかし、この抗体は、トコブシの浮遊幼生や稚貝には反応せず、また、野外に設置した付着板から得られたアワビ類以外の付着物に対しても、貝殻片などに若干波長の異なる蛍光反応が見られる程度でほとんど反応しなかった。また、この抗体は、他のアワビ類３種に対しても強い反応を示した。このモノクローナル抗体は、アゼビ類の卵黄タンパク質に特異的に反応する抗体（Ｙ１−１１−３−１）である。よって、このモノクローナル抗体は、アワビ類全般にわたって浮遊幼生及び微小稚貝の検出が可能であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
以上詳細に説明するとおり、本発明によれば、アワビ類の浮遊幼生及び着底変態直後の微小稚貝が有する卵黄タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を用いることにより、従来熟練を要していたアワビ類の浮遊幼生及び着底変態直後の微小稚貝の同定・検出を誰でもが簡便に、見落とすことなく確実に行なうことが可能となった。よって、本発明は、アワビ類の資源調査に活用でき、天然資源の変動要因の解明に不可欠な稚貝発生量の定量的な評価が容易となる、きわめて有用な方法である。
【００３５】
本発明の方法を用いてアワビ類浮遊幼生や微小稚貝を同定・検出することによって、その水域におけるアワビ類幼生の生息密度、その幼生の産卵や孵化の時期などを知ることができるので、アワビ類に応じた産卵の盛期や産卵に適正な自然環境などを定量的に把握することができ、アワビ類の生態解明の貴重な知見を得ることができる。
【００３６】
また、全国的にアワビ類資源が減少しているため、全国各地で禁漁区の設定、人工種苗の放流、親貝場の造成などの資源回復策が講じられている。このような施策が発生量の増大に結びついたかどうかを定量的に把握して検証する上でも、本発明はきわめて有用な方法である。