(57)【要約】【課題】アミロイドβ蛋白質がβシートを形成することを防ぎ、これによってアルツハイマー病の発症を防ぐアミロイドβ凝集阻害剤を提供する。【解決手段】アミロイドβ蛋白質の中央部にある疎水性ドメインと結合するペプチドからなる結合ドメインと、前記結合ドメインのC末端側に付加された親水性高分子からなる阻害ドメインとを備えたアミロイドβ凝集阻害剤である。なお、結合ドメインとしては、例えば、アミロイドβ蛋白質の中央部分にある疎水性ドメインと同じアミノ酸配列を有するペプチド等が挙げられ、親水性高分子としてはポリエチレングリコール（PEG）が挙げられる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミロイドβ蛋白質の中央部にある疎水性ドメインと結合するペプチドからなる結合ドメインと、
前記結合ドメインのC末端側に付加され、親水性高分子からなる阻害ドメインと、
を備えたアミロイドβ凝集阻害剤。
【請求項２】
ペプチドが、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチドである請求項１に記載のアミロイドβ凝集阻害剤。
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチド、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミロイドβのペプチドの中央部にある疎水性アミノ酸ドメインと結合するペプチド。
【請求項３】
ペプチドが、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチドである請求項１に記載のアミロイドβ凝集阻害剤。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列アミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミロイドβのペプチドの中央部にある疎水性アミノ酸ドメインと結合するペプチド。
【請求項４】
親水性高分子が、ポリエチレングリコールである請求項１に記載のアミロイドβ凝集阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、アルツハイマー病の原因であるアミロイドβ蛋白質の凝集を阻害するアミロイドβ凝集阻害剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
高齢化に伴ってアルツハイマー病の患者が増えている。このアルツハイマー病は、アミロイドβ蛋白質が互いに結合してβシート構造を形成することによって、脳内でアミロイド線維となり、このアミロイド線維が脳内に蓄積することが原因で発症すると考えられている。
【０００３】
さて、アミロイドβ蛋白質は図９に示すようなアミノ酸配列を有しており、この図に点線で囲って示すように、その中央部及びC末端側には疎水性ドメインが存在する。そして、図１０に示すように、この疎水部同士の相互作用が引き金となってβシート構造を形成し、線維状に並ぶことによってアミロイド線維を形成するメカニズムが、様々な分析手法による結果から推測されている（非特許文献１を参照。）。
【０００４】
そこで、この様な知見に基づいて、従来から、βシートの結合を阻害することにより、アルツハイマー病の発症を防ぐ医薬品の研究がなされている。例えば、特定のアミノ酸配列を有するペプチドにより、アミロイド線維等のタンパク質線維の形成を防ぐアミロイドβ凝集阻害剤が研究されている（特許文献１を参照。）。しかし、これら従来からあるアミロイドβ凝集阻害剤は、その効果が十分とはいえなかった。
【特許文献１】特表２００４‐５１３８７３号公報
【非特許文献１】エル  シー  サーペル（L.C.Serpell），「アルツハイマー病のアミロイド線維：構造と集合体」（Alzheimer's amyloid fibrils: structure and assembly）、（Biochimica et Biophysica Acta），エルゼヴィア出版（Elsevier），2000年，通巻1502号,p. 16-30
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、この発明は、アミロイドβ蛋白質がβシートを形成することを防ぎ、これによってアルツハイマー病の発症を防ぐアミロイドβ凝集阻害剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この発明のアミロイドβ凝集阻害剤は、アミロイドβ蛋白質の中央部にある疎水性ドメインと結合するペプチドからなる結合ドメインと、前記結合ドメインのC末端側に付加された親水性高分子からなる阻害ドメインとを備えていることを主要な特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
この発明のアミロイドβ凝集阻害剤は、アミロイドβ蛋白質と結合することにより、アミロイドβがアミロイド線維を形成することを防ぎ、これによってアルツハイマー病の発症を防ぐことができる。また、このアミロイドβ凝集阻害剤は、ペプチドとポリエチレングリコールなどからの親水ドメインとから構成されているため、人体への悪影響が少ないアルツハイマー病治療薬となる可能性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
この発明のアミロイドβ凝集阻害剤１は、図１の模式図に示すように、結合ドメイン
１１と阻害ドメイン１２とを備えている。そして、結合ドメイン１１がアミロイドβ蛋白質２の中央部分にある疎水性ドメイン２１と結合し、阻害ドメイン１２がアミロイドβのC末端側疎水性ドメイン２２同士の相互作用を抑制することによって、アミロイド線維の形成を阻害する。そこで、以下にこれら各ドメインについて詳説するとともに、アミロイドβ凝集阻害剤の製造方法についても説明する。
【０００９】
（１）結合ドメイン
結合ドメイン１１は、アミロイドβの中央部分にある疎水性ドメイン２１と結合し、且つβシートを形成する疎水性のアミノ酸配列を有するペプチドであれば、特に問題なく使用できる。
【００１０】
ただ、アミロイドβの中央部分にある疎水性ドメイン２１のアミノ酸配列（図９を参照。）と同じアミノ酸配列LVFFA（配列番号１）を有するペプチドであれば、疎水的相互作用により、アミロイドβ蛋白質との間にβ−シートを形成し易くなることから、このアミノ酸配列を備えたペプチドが好ましい。
【００１１】
また、前記アミロイドβ蛋白質の中央部分にある疎水性ドメイン２１は、図９に示すように、その両脇に正電荷を持つリシン（Lys）と、負電荷を持つグルタミン酸（Glu）及びアスパラギン酸（Asp）とを有している。そのため、前記ペプチドの両端にこれと反対の電荷を有するアミノ酸配列、例えば、ELVFFAKK（配列番号２）を有するペプチドは、結合部とアミロイドβ蛋白質との結合がさらに強くなるため、より好ましい。なお、ペプチドを構成するアミノ酸残基の数は8残基程度である。
【００１２】
(２)阻害ドメイン
阻害ドメイン１２は、結合ドメイン１１を構成するペプチドのC末端側に付加されており、アミロイドβ蛋白質のC末端側にある疎水性ドメイン２２同士の相互作用を抑制する親水性ポリマーから構成されている。親水性ポリマーとしては、ペプチドや蛋白質の修飾に使用するものであれば、特に限定することなく使用することができる。
【００１３】
具体的には、ポリエチレングリコール（以下、PEGと省略する）、多糖類などの非イオン性の親水性高分子等が挙げられるが、安全性、製造コスト、製造し易さ等を考慮すると、その中でもPEGがよい。また、その数平均分子量は、3000程度である。これはPEG分子量が小さすぎると効果的なアミロイドβ蛋白質の凝集阻害が期待できず、また大きすぎる場合は逆に立体的な要因により阻害剤とアミロイドβ蛋白質との結合を抑制する可能性があるためである。
【００１４】
（３）製造方法
前記のような結合ドメイン１１と阻害ドメイン１２とを備えたアミロイドβ凝集阻害剤１は、Fmoc法、Boc法などの公知のペプチド固相合成法によって、合成することができる。
【００１５】
なお、この発明は前記の実施の形態に限定されるわけではなく、特許請求の範囲に記載した発明の技術的範囲内で様々な変更を加えることができる。
【００１６】
例えば、結合ドメインと阻害ドメインの間に、ペプチド等からなるリンカーを設けることにより、アミロイドβ蛋白質と結合ドメインとの結合を強化してもよく、反対にアミロイドβ蛋白質と阻害ドメインとの相互作用を強化してもよい。
【００１７】
また、生体中でのペプチドの分解を抑制する公知の方法、具体的にはペプチドを構成するアミノ酸の一部をD体アミノ酸、非天然アミノ酸に変更する方法、アミノ酸の一部を糖鎖、ビオチン、リン酸等で修飾する方法、ペプチドの一部を環状にする方法等を適用してもよい。
【００１８】
以下に、この発明を実施例に従ってさらに詳しく説明するが、この発明の特許請求の範囲は如何なる意味においても下記の実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００１９】
（１）アミロイドβ凝集阻害剤の製造
ペプチド合成装置（東京理化器械社製、CCS-150M）を使用して、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドのC末端側にPEGを付加した化合物ELVFFAKK-PEG（以下、阻害剤とする。）を定法により製造した。そして、製造した阻害剤は、高速液体クロマトグラフィー(BIO-RAD社製、BioLogic DuoFlow40)により精製した。なお、比較のため同じアミノ酸配列を有するペプチドの逆末端側にPEGを付加した化合物PEG-ELVFFAKK（以下、比較物とする。）も製造した。
【００２０】
つぎに、製造した阻害剤及び比較物の分子量及び分子構造をそれぞれMALDI-TOFMS、1H-NMRにより分析し、目的とする化合物が製造できたことを確認した。その結果を図２に示す。ここで、図２（ａ）は阻害剤の分子量と構造式であり、図１（ｂ）はMALDI-TOFMSによる分析結果を示しており、図２（ｃ）は1H-NMRによる分析結果を示している。
【００２１】
これらの図からも明らかなように、目的とする阻害剤を製造したことを確認した。なお、記載はしていないものの、比較物についても同様の結果が得られた。なお、MALDI-TOFMS分析は、阻害剤及び比較物の水溶液(10pmol/mL)を飛行時間型質量分析装置（島津製作所社製、KOMPACT MALDI III）により、2，5-DHBA(10mg/mL水溶液)をマトリックスとし使用して行った。また、1H-NMR分析は、NMR分析装置（JEOL社製、AL400）により、溶媒としてDMSO-d6を使用し、内部標準としてTMSを使用して50℃で行った。
【００２２】
（２）二次構造の確認
（１）で製造した阻害剤と比較物を40μMの濃度で含むリン酸緩衝液中（pH7.0）を作製し、円二色性分散計（日本分光社製、J-720）を使用して阻害剤と比較物の二次構造、及びその経時変化（１時間後及び20時間後）を調べた。その結果を図３に示す。なお、図３（ａ）阻害剤の円二色性スペクトルを示しており、図３（ｂ）は比較物の円二色性スペクトルを示している。
【００２３】
この図からも明らかなように、阻害剤及び比較物の何れの化合物も、198 nmに負の吸収を示すことから、その二次構造はランダムコイル構造であることが分った。また、何れの化合物においても、測定開始時と20時間後においてほぼ同様の円二色性スペクトルを示していることから、その二次構造は経時変化しないことが分った。
【００２４】
つぎに、このアミロイドβ凝集阻害剤及び比較物について、20時間後に原子間力顕微鏡(AFM)写真を撮影した。その結果、阻害剤および比較物は図４（ａ）および（ｂ）に示すようにいずれも球状構造であることがわかった。
【００２５】
以上の結果から、このように製造した阻害剤が、求めるような化合物であることが確認できた。そこで、この阻害剤の凝集阻害効果について以下に示すような方法で調べた。なお、以下の実験で使用したアミロイドβ蛋白質は、人由来のアミロイドβ蛋白質（1-40）であり、(株)ペプチド研究所から入手した。
【００２６】
（３）円二色性スペクトルによる分析
阻害剤又は比較物をアミロイドβ蛋白質水溶液に添加して、添加が円二色性スペクトルに与える影響について調べた。具体的には、アミロイドβ蛋白質を40μMの濃度で含むリン酸緩衝液中（pH7.4）2 mlに、（１）で製造した阻害剤又は比較物の何れかを40μMの濃度で含むリン酸緩衝液（pH7.4）2 mlを添加し、この混合液の190nm〜250nmの波長範囲における円二色性スペクトルの変化を37℃で保温しながら添加直後から24時間に渡って測定した。その結果を図５に示す。なお、図５（ａ）は阻害剤を加えた場合、図５（ｂ）は比較物を加えた場合、図５（ｃ）は何も添加しなかった場合の円二色性スペクトルの変化を示している。
【００２７】
この図からも明らかなように、阻害剤を加えた場合には215 nmにおけるモル楕円率の経時変化がほとんどないのに対して、比較物を添加した場合、及び何も添加しなかった場合には図中矢印に示したようにモル楕円率が大きく変化している。このことは、図５中でβシート構造に由来する吸収である215nmにおけるモル楕円率の変化を比較した図６からも明らかである。
【００２８】
これにより、阻害剤を添加することによって、アミロイドβ蛋白質がランダムコイルの状態を維持できることが分った。反対に、比較物を添加しても、ランダムコイルの状態を維持することできず、アミロイドβ蛋白質だけの場合の場合と同程度又はそれ以下しか、ランダムコイル状態を維持できないことが分った。
【００２９】
（４）原子間力顕微鏡による分析
まず、（３）で調製した混合液を37℃で4時間保温したのち、この溶液を雲母製の基板に滴下し30分静置し、その後ろ紙を使って水を除去することでアミロイドβ蛋白質を基板上に固定した。
【００３０】
つぎに、この基板を原子間力顕微鏡（Digital Instrument社製、Nanoscope IIIa）にセットして、タッピングモードにより顕微鏡写真を撮影した。その結果を図７に示す。
【００３１】
これらの図からも明らかなように、阻害剤を加えた場合にはアミロイドβ蛋白質が分散してアミロイド線維が生じていない（図７（ａ）を参照。）。これに対して、比較物を添加した場合（図７（ｂ）を参照。）、及び何も添加しなかった場合（図７（ｃ）を参照。）にはアミロイド線維が生じている。このことから、阻害剤を加えることによって、アミロイドβ蛋白質のアミロイド線維化を防止することができることが分かった。
【００３２】
（５）チオフラビンT結合アッセイによる分析
アミロイドβの終濃度が10μM、チオフラビンTの終濃度が5μM、阻害剤又は比較物の終濃度が10μMとなるように、50mMグリシン-NaOH緩衝液（pH9.0）に加え、蛍光分光計（日本分光社製、FP-770）を使用して、その蛍光スペクトルを調べた。なお、蛍光分析計の励起波長は435nm、発光波長は482nmであった。その結果を図８（ａ）に示す。また、アミロイド線維に結合したチオフラビンTに由来する波長482nmにおける蛍光強度を図８（ｂ）に示す。
【００３３】
これらの図から明らかなように、阻害剤を加えることによって、チオフラビンTの蛍光光度が低下している。また、チオフラビンTとアミロイド線維とは選択的に結合することから、蛍光強度と生成したアミロイド線維の量とが比例することは、一般的に知られている。したがって、（１）で製造したアミロイドβ凝集阻害剤を加えることによって、アミロイド線維の生成が阻害されていることが分かる。
【００３４】
以上の結果から、アミロイドβ凝集阻害剤は、その結合ドメインがアミロイドβと結合し、その阻害ドメインがアミロイドβのC末端側疎水性ドメイン間の相互作用を抑制することによって、アミロイド線維の形成を阻害していることが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】この発明のアミロイドβ凝集阻害剤とアミロイドβ蛋白質の結合を模式的に示す図である。
【図２】（ａ）は阻害剤の分子量と構造式であり、（ｂ）はMALDI-TOFMSによる分析結果を示す図であり、（ｃ）は1H-NMRによる分析結果を示す図である。
【図３】（ａ）阻害剤と（ｂ）比較物の円二色性スペクトルを示す図である。
【図４】（ａ）阻害剤と（ｂ）比較物の原子間力顕微鏡(AFM)写真である。
【図５】阻害剤又は比較物の添加が、アミロイドβ蛋白質水溶液の円二色性スペクトルに与える影響を調べた結果を示す図である。なお、（ａ）は阻害剤を加えた場合、（ｂ）は比較物を加えた場合、（ｃ）は何も添加しなかった場合の結果を示す図である。
【図６】阻害剤又は比較物の添加が、アミロイドβ蛋白質水溶液の円二色性スペクトルに与える影響を波長215nmで測定した結果を示す図である。
【図７】阻害剤又は比較物の添加が、アミロイド線維形成に与える影響を原子間力顕微鏡で調べた結果を示す図である。なお、（ａ）は阻害剤を加えた場合、（ｂ）は比較物を加えた場合、（ｃ）は何も添加しなかった場合の結果を示す図である。
【図８】阻害剤又は比較物の添加が、アミロイド線維形成に与える影響をチオフラビンT結合アッセイにより調べた結果を示す図である。（ａ）は蛍光スペクトルを計測した結果を示す図であり、（ｂ）は482nmにおける計測結果を示す図である。
【図９】アミロイドβ蛋白質の構造を示す模式図である。
【図１０】アミロイド線維の形成を示す模式図である。
【符号の説明】
【００３６】
１    アミロイドβ凝集阻害剤
１１  結合ドメイン
１２  阻害ドメイン
【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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