(57)【要約】      （修正有）【課題】評価する幹細胞または幹細胞を含む細胞群のがん化状態を、正常細胞、前がん細胞またはがん化細胞のいずれかを判定する方法、前がん細胞の場合にはがん化の進行度合いを評価する方法の提供。【解決手段】判定する細胞にＯｃｔ３／４と、ｐ７５ＮＴＲを同時または個別に適用し、Ｏｃｔ３／４と、ｐ７５ＮＴＲの発現及び発現しない状態を判定基準とし、前記未分化状態と相関する転写因子が発現せず、なおかつｐ７５ＮＴＲが発現しない場合には、評価する細胞は正常細胞であると判定し、前記未分化状態と相関する転写因子が発現せず、なおかつニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲ  ｍＲＮＡまたは蛋白が発現した場合には取得した細胞が前がん状態であると判定し、前記未分化状態と相関する転写因子が発現し、なおかつｐ７５ＮＴＲが発現しない場合には、評価する細胞は進行がん細胞であると判定する。【選択図】図３
2007195533.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞、または幹細胞を含む細胞群からなる群より選択された細胞が、正常細胞、前がん細胞またはがん細胞のいずれかであることを判定する細胞の評価方法であって、
判定する細胞に未分化状態及び未分化状態の維持と相関するＯｃｔ３／４で例示する転写因子と、ニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲ  ｍＲＮＡまたは蛋白を同時または個別に適用し、前記転写因子と、ニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲ  ｍＲＮＡまたは蛋白の発現及び発現しない状態を判定基準とし、
前記未分化状態と相関する転写因子が発現せず（＋／−）、なおかつニューロトロフィン受容体蛋白ｐ７５ＮＴＲ又はｍＲＮＡが発現しない（＋／−）場合には、判定する細胞は正常細胞であると判定し、
前記未分化状態と相関する転写因子が発現し、なおかつニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲ  ｍＲＮＡまたは蛋白が発現した場合には取得した細胞が前がん状態であると判定し、
前記未分化状態と相関する転写因子が発現し、なおかつｐ７５ＮＴＲが発現しない場合には、判定する細胞は進行がん細胞であると判定する
ことを含むことを特徴とする細胞の評価方法。
【請求項２】
前記未分化状態と相関する転写因子がＯｃｔ３又はＯｃｔ４、あるいはＯｃｔ３／４であることを特徴とする請求項１に記載の細胞の評価方法。
【請求項３】
前記判定する細胞を前がん細胞と判定した場合、当該細胞のがん化の進行度を、発現強度が減するに従ってがん化が進行するニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲ  ｍＲＮＡまたは蛋白の発現強度に基づいて、判定することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の細胞の評価方法。
【請求項４】
前記発現パターンは、ＤＡＢ染色による発現パターンであり、
（ａ）  前記ＤＡＢ染色した未分化状態と相関する転写因子を発現する細胞の染色の強弱を光学的読み取り手段によりコンピュータ可読画像データに変換し、
（ｂ）  得られた画像データをソフトウェアによりＣＭＹＫイメージ変換し、ＣＭＹＫ変換した画像から青色を減色し、
（ｃ）  全体の画像中から黒要素測定値であるＫｘ値の割合を求め、
（ｄ）  前記ＤＡＢ染色したニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲ  ｍＲＮＡまたは蛋白発現細胞を光学的読み取り手段によりコンピュータ可読画像データに変換し、
（ｅ）  得られた画像データをソフトウェアによりＣＭＹＫイメージ変換し、ＣＭＹＫ変換した画像から青色を減色し、
（ｆ）  全体の画像中から黒要素測定値であるＫｐ７５ＮＴＲ値の割合を求め、
（ｇ）  得られたＫｘ値とＫｐ７５ＮＴＲ値とから判定する細胞のがん化状態を判定することを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の細胞の評価方法。
【請求項５】
判定する細胞がセルバンキングに供せられる細胞であること特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
判定する細胞が所定条件で培養された幹細胞または幹細胞を含む細胞群であって、培養前後の、未分化状態と相関する転写因子の発現パターンおよびニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲ  ｍＲＮＡまたは蛋白の発現パターンにより、前記所定の条件で培養された細胞が、正常細胞を維持する培養条件、正常細胞から前がん細胞へ誘導する培養条件、前がん細胞から正常細胞へ誘導する培養条件、前がん細胞を維持する培養条件、前がん細胞からがん細胞へ誘導する培養条件を判定することを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の細胞の評価方法。
【請求項７】
前記判定する細胞がヒト由来の細胞であることを特徴とする請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の細胞の評価方法。
【請求項８】
請求項６または請求項７に記載の細胞評価方法を用いた測定成分のがん化抑制またはがん化促進を判定する測定成分のがん化評価方法であって、
前記培養する細胞が前がん細胞であって、前記所定の培養条件が、前記前がん細胞が前がん状態を維持する条件、前がん細胞から進行がん細胞へ誘導する培養条件または前がん細胞から正常細胞へ誘導する培養条件のいずれか一つの既知の培養条件をコントロールとして培養し、
前記コントロールに所定量の測定成分を加える以外前記コントロールと同一条件で培養し、
前記コントロールとして培養した際に得られた分化状態と相関する転写因子の発現パターンおよびニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲ  ｍＲＮＡまたは蛋白の発現パターンを標準として、前記コントロールに所定量の測定成分を加える以外前記コントロールと同一条件で培養して得られた未分化状態と相関する転写因子の発現パターンおよびニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲ  ｍＲＮＡまたは蛋白の発現パターンにより測定成分のがん化抑制またはがん化促進を判定する
工程を含むことを特徴とする測定成分のがん化評価方法。
【請求項９】
請求項６または請求項７に記載の細胞評価方法を用いた測定成分のがん化抑制またはがん化促進を判定する測定成分のがん化評価方法であって、
前記培養する細胞が前がん細胞であって、前記所定の培養条件が、前記前がん細胞が前がん状態を維持する条件、前がん細胞から進行がん細胞へ誘導する培養条件または前がん細胞から正常細胞へ誘導する培養条件のいずれか一つの既知の培養条件をコントロールとして培養し、
前記コントロールに所定量の測定成分を加える以外前記コントロールと同一条件で培養し、
前記コントロールとして培養した際に得られた分化状態と相関する転写因子の発現パターンおよびニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲ  ｍＲＮＡまたは蛋白の発現パターンの発現パターンを標準として、前記コントロールに所定量の測定成分を加える以外前記コントロールと同一条件で培養して得られた未分化状態と相関する転写因子の発現パターンおよびニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲ  ｍＲＮＡまたは蛋白の発現パターンを前記標準と比較することにより測定成分のがん化抑制またはがん化促進を判定する
工程を含むことを特徴とする測定成分のがん化評価方法。
【請求項１０】
請求項６又は請求項７に記載の細胞評価方法を用いた測定成分のがん化抑制またはがん化促進を判定する測定成分のがん化評価方法であって、
前記培養する細胞が前がん細胞であって、前記所定の培養条件が、前記前がん細胞が前がん状態を維持する条件、前がん細胞から進行がん細胞へ誘導する培養条件または前がん細胞から正常細胞へ誘導する培養条件のいずれか一つの既知の培養条件をコントロールとして培養した際に、得られた分化状態と相関する転写因子の発現パターンおよびニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲ  ｍＲＮＡまたは蛋白の発現パターンの発現パターンを標準として、
前記コントロールに所定量の測定成分を加える以外前記コントロールと同一条件で培養し、前記コントロールに所定量の測定成分を加える以外前記コントロールと同一条件で培養して得られた未分化状態と相関する転写因子の発現パターンおよびニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲ  ｍＲＮＡまたは蛋白の発現パターンを前記標準と比較することにより測定成分のがん化抑制またはがん化促進を判定する
工程を含むことを特徴とする測定成分のがん化評価方法。
【請求項１１】
がん細胞の進行度を判定するがん細胞の評価方法であって、判定するがん細胞にニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲ  ｍＲＮＡまたは蛋白を適用し、
発現強度が減じるのに従ってがん化が進行するニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲ  ｍＲＮＡまたは蛋白の発現強度に基づいて、前記判定する細胞のがんの進行度を判定する段階を含むことを特徴とするがん細胞の評価方法。
【請求項１２】
未分化状態と相関する転写因子発現遺伝子産物反応素材、ニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲ  ｍＲＮＡまたは蛋白由来のｐ７５ＮＴＲ発現遺伝子産物反応素材、又は両反応素材を有し、前記未分化状態と相関する転写因子発現遺伝子産物反応素材、ｐ７５発現遺伝子産物反応素材、又は両者と体液及び細胞抽出液とを反応させて免疫染色して、反応素材における免疫染色の状態によって細胞のがん化状態又は前がん状態を判定する簡易判定キット。
【請求項１３】
底層と前記底層に設けられた未分化状態と相関する転写因子発現遺伝子を含む反応領域と、前記反応領域の上に設けられた体液透過性の表面層とから構成されていることを特徴とする請求項１２に記載のがん診断キット。
【請求項１４】
前記がん診断キットは内部に吸水性樹脂層を有する生理用ナプキン又は澱もの吸収シートであり、前記吸水性樹脂層内に未分化状態と相関する転写因子発現遺伝子を混入させて反応領域を構成したことを特徴とする請求項１２または請求項１３に記載のがん診断キット。
【請求項１５】
前記反応領域は、ニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲ  ｍＲＮＡまたは蛋白と接合された繊維状物から構成されていることを特徴とする請求項１２または請求項１３に記載のがん診断キット。
【請求項１６】
前記がん診断キットは、同一基材中に未分化状態と相関する転写因子発現遺伝子反応領域とニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲ  ｍＲＮＡまたは蛋白反応領域の両方を有していることを特徴とする請求項１０または請求項１１に記載のがん診断キット。
【請求項１７】
前記がん診断キットは、未分化状態と相関する転写因子発現遺伝子反応領域を有する第１のがん診断キットと、ニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲ  ｍＲＮＡまたは蛋白反応領域を有する第２の診断キットから構成されていることを特徴とする請求項１０に記載のがん診断キット。
【請求項１８】
体液及び細胞抽出液から採取した検体試料により当該生体組織中の細胞のがん化状態を判定する細胞の判定方法であって
未分化状態と相関する転写因子発現遺伝子、ニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲ  ｍＲＮＡまたは蛋白、又は両者と検体である体液とを反応させて免疫染色し、
反応領域における免疫染色の状態を観察し、
観察した結果に基づいて正常状態、前がん状態又はがん化状態を判定する
段階を含むことを特徴とする、検体中に含まれる細胞ががん化状態又は前がん状態のいずれかであると判定することを特徴する細胞の判定方法。
【請求項１９】
請求項３を実行するためのプログラムが格納されたコンピュータ可読媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、細胞の評価方法、この方法を用いたる測定成分のがん化評価方法、がん診断キットおよびコンピュータ可読媒体に関する。より詳しくは幹細胞、または幹細胞を含む細胞群からなる群より選択された細胞が、正常細胞、前がん細胞またはがん細胞のいずれかであることを判定する細胞の評価方法、この方法を用いたる測定成分のがん化評価方法、がん診断キットおよびコンピュータ可読媒体に関する。
【背景技術】
【０００２】  近年のＣＴやＮＭＲなどの機器の進歩により微少初期がんの発見が可能になり、がんの早期発見率は向上している。がんが顕在化するまでには長期の潜伏期間（通常１５〜２０年）が存在し、この間のがん化危険度の上昇した細胞（前がん細胞）を特定し、その悪性化の指標を同定できればがんを阻止または予防する手段が提供されることとなるであろう。
がん細胞の検出方法としては、抗体によるがん関連抗原の検出方法等がすでに利用されている。しかし、これらの方法は、がんに対する感度および特異性が必ずしも高くないという問題がある。例えば、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）やα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）などががんのマーカーとして知られているが、いずれも限定されたがんで６割程度の疾患感度しかなく、がん以外の疾患でも非特異的に陽性を呈する等の問題がある。また疾患関連性遺伝子においても限られた症例で検出されるだけで普遍的ながんを検出するマーカーには至っていない。【０００３】  一方、幹細胞は発生過程における形態形成や成体における各組織、臓器の恒常性、生殖細胞の維持に働く一群の細胞であり、長年にわたる多くの科学者の研究により、成体哺乳類動物の造血系、皮膚、腸管系等に存在し、血液、皮膚、腸管粘膜の再生に寄与していることが知られている。この幹細胞は、複数の違った種類の細胞に分化する多分化能および対称的あるいは非対称的な分裂を行い新たな幹細胞を生み出す自己再生能を持ち合わせており、通常は組織の特定の場所に位置し、ごくゆっくり増殖しているかあるいは細胞分裂体止状態にあるが、組織の再生維持に関与する特異的な増殖刺激や創傷、炎症などによる物理科学的刺激などの特定条件下では素早く増殖を誘導することができる。
本発明者らはこのような幹細胞を含む長期生存細胞には、発がんの起源細胞を含むことを提唱し、さらに長期生存細胞は低親和性神経成長因子受容体（以下、これを「ＮＧＦＲｐ７５］、インテグリンβ４あるいはｂｃｌ−２の発現を指標として同定できることを開示している（特許文献１：特開２０００−４９００号公報）。【０００４】  しかし、これらの上皮幹細胞マーカーを発現する細胞は、通常の上皮組織にも存在し、またその全てががん化するものではないため、組織中にこの細胞が存在することにより該組織ががん化の危険度が高いと判断することはできなかった。
ある組織のがん化の危険度を同定する方法は、発がんに関連する遺伝子の発現レベルで同定する方法（特許文献２：特表２０００−５１０３３０号公報）、あるいは発がんに関連する染色体ＤＮＡの変異の有無で個体レベルで予測する方法（特許文献３：特開２００２−０９５４８４号公報）等が提案されている。しかし、これらの方法によっても、発がんの時期や危険度の予測は不可能であった。
【特許文献１】  特開２０００−４９００号公報
【特許文献２】  特表２０００−５１０３３０号公報
【特許文献３】  特開２００２−０９５４８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  本発明の課題は、取得した幹細胞または幹細胞を含む細胞群のがん化状態を、正常細胞、前がん細胞またはがん化細胞のいずれかを判定する方法、特に前がん細胞の場合にはがん化の進行度合いを評価する方法を提供することである。
本発明の別の課題は、食品、サプリメント、薬剤、およびこれらの薬効成分の細胞に及ぼす影響、すなわちこれらががん化を促進するのか抑制するのかを判定することが可能な方法を提供することである。
本発明のさらに別の課題は、取得した細胞ががん化状態を、正常細胞、前がん細胞またはがん化細胞のいずれかを判定できる標準となる細胞株を基準とするがん診断キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】  前記課題を解決する本発明は、幹細胞、または幹細胞を含む細胞群からなる群より選択された細胞が、正常細胞、前がん細胞またはがん細胞のいずれかであることを判定する細胞の評価方法であって、
判定する細胞に未分化状態及び未分化状態の維持と相関する転写因子（好ましくは、Ｏｃｔ３又はＯｃｔ４、あるいはＯｃｔ３／４、特に好ましくはＯｃｔ３／４）と、ニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲ  ｍＲＮＡまたは蛋白（以下、単に、ｐ７５ＮＴＲという）を同時または個別に適用し、前記転写因子と、ｐ７５ＮＴＲの発現及び発現しない状態を判定基準とし、前記未分化状態と相関する転写因子が発現せず、なおかつｐ７５ＮＴＲが発現しない場合には、判定する細胞は正常細胞であると判定し、前記未分化状態と相関する転写因子が発現し、なおかつニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲ  ｍＲＮＡまたは蛋白が発現した場合には取得した細胞が前がん状態であると判定し、前記未分化状態と相関する転写因子が発現し、なおかつｐ７５ＮＴＲが発現しない場合には、判定する細胞は進行がん細胞であると判定することを含む。【０００７】  本発明の細胞の評価方法の一実施形態において、判定する細胞が所定条件で培養された幹細胞または幹細胞を含む細胞群であって、培養前後の、未分化状態と相関する転写因子の発現パターンおよびニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲ  ｍＲＮＡまたは蛋白の発現パターンにより、前記所定の条件で培養された細胞が、正常細胞を維持する培養条件、正常細胞から前がん細胞へ誘導する培養条件、前がん細胞から正常細胞へ誘導する培養条件、前がん細胞を維持する培養条件、前がん細胞からがん細胞へ誘導する培養条件を判定する。この一実施形態を用いて、薬効成分・薬剤、サプリメント、食品等の単一成分または混合成分のがん化抑制またはがん化促進を判定する測定成分のがん化評価方法が提供される。【０００８】  本発明は、さらに未分化状態と相関する転写因子発現遺伝子産物反応素材、ｐ７５ＮＴＲ発現遺伝子産物反応素材、又は両反応素材を有し、前記未分化状態と相関する転写因子発現遺伝子産物反応素材、ｐ７５発現遺伝子産物反応素材、又は両者と体液及び細胞抽出液とを反応させて免疫染色して、反応素材における免疫染色の状態によって細胞のがん化状態又は前がん状態を判定する簡易判定キットに関する。【０００９】  本発明は、さらに体液から採取した細胞のがん化状態を判定する細胞の判定方法であって未分化状態と相関する転写因子発現遺伝子、ｐ７５発現遺伝子、又は両者と検体である体液及び細胞抽出液とを反応させて免疫染色し、反応領域における免疫染色の状態を観察し、観察した結果に基づいて正常状態、前がん状態又はがん化状態を判定することを特徴とする、検体中に含まれる細胞ががん化状態又は前がん状態のいずれかであると判定することを特徴する細胞の判定方法に関する。
【発明の効果】
【００１０】  本発明によると、取得した幹細胞または幹細胞を含む細胞群のがん化状態を、正常細胞、前がん細胞またはがん化細胞のいずれかを判定することが可能であり、また前がん細胞の場合にはがん化の進行度合いを判定することが可能である。
したがって、これらの細胞及び細胞株を培養するための培養環境の指標を提供するとともに、食品、サプリメント、薬剤、およびこれらの薬効成分の細胞に及ぼす影響、すなわちこれらががん化を促進するのか抑制するのかを判定することが可能となる。
さらに、この評価方法に基づいてがん診断キットを提供可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】  以下、本発明の実施形態を説明する。
本発明は、細胞に転写因子として、未分化状態及び未分化状態の維持と相関する転写因子と、ｐ７５ＮＴＲを同時または個別に適用した際に、正常細胞、前がん状態の細胞、進行がんの細胞の各細胞の状態における未分化状態及び未分化状態の維持と相関する転写因子の発現パターンと、ｐ７５ＮＴＲの発現パターンが、異なるという知見に基づくものである。
すなわち、本発明者等は、転写因子の発現パターンと、ｐ７５ＮＴＲの発現パターンを判断基準にして、細胞の状態を評価可能であることを見出した。
一般に、未分化状態及び未分化状態の維持と相関する転写因子は、正常細胞に対して発現せず（±：全体の細胞の５％以下）、前がん状態の細胞および進行がんの細胞に対して発現し（＋）、一方、ｐ７５ＮＴＲは、正常細胞に対しては発現せず（±）、前がん状態の際に発現し（＋＋＋から＋）、がんの進行に従って発現強度が減少していき進行がん細胞に対しては発現が消失する（−）。【００１２】  そのため、判定するある細胞集団（組織片等）が、未分化状態と相関する転写因子が発現せず（あるいは検出限界以下で）、なおかつニューロトロフィン受容体蛋白ｐ７５ＮＴＲ又はｍＲＮＡが発現しない、あるいは検出限界以下である場合には、この細胞集団には、正常細胞が優位に存在し、慢性的炎症下あるいは何らかの癌化初期に特徴的な異常を持つ細胞の存在は発生していない可能性が非常に高い。
すなわち、医学生物学における測定の問題（常に不確定要素）を含むという条件で、この場合には正常細胞であると判定される。
換言すると、医学生物学的な不確定要素がほとんど含まない環境下（例えば、純化した細胞を評価対象の細胞とした場合）、あるいは他の判定と本発明の評価方法とを組合せて総合的に判定することにより、判定の精度が増加するものと考えられる（以下、同様）。【００１３】  一方、判定するある細胞集団（組織片等）が、前記未分化状態と相関する転写因子が発現せず、なおかつｐ７５ＮＴＲが発現した場合には取得した細胞が前癌状態と相関することは極めて低いと判定できる。
すなわち、医学生物学における測定の問題（不確定要素）を含むという条件で、この場合には前がん状態の細胞を含むと判定できる。
また、前記未分化状態と相関する転写因子が発現し、なおかつｐ７５ＮＴＲが発現しない場合には、取得した細胞は進行癌細胞である可能性が極めて高い（医学生物学における測定の問題（不確定要素）を含むという条件で、この場合には前がん状態の細胞を含む）と判定できる。【００１４】  なお、本発明で使用する用語は、下記の意義を有している。
幹細胞、または幹細胞を含む細胞群からなる群より選択された細胞とは、ヒト、哺乳類由来の幹細胞そのものあるいはこれらを含む細胞群のいずれであってもよく、単離されたものであっても、純化されていないもの、これらを含む組織片であってもよい。特に上皮細胞が好ましい。上皮組織は、上皮組織に限定されず、上皮細胞を含むサンプルであれば何れのものでもよい。具体的には、例えば、未だがん細胞は見出されていないが発がんの可能性のあるヒト個体または腫瘍摘出予後のヒト個体等から取り出された上皮組織や、痰、血液、血漿、血清、脳脊髄液、胸膜液、膵液、尿等が好ましく用いられる。上皮組織としては、がん化の可能性のある上皮組織であって、生検が行えるものであれば如何なるものであってもよいが、例えば、肺、食道、胃、乳管、子宮内膜、子宮頸部、大腸、結腸、腎臓あるいは膀胱等の上皮組織が挙げられる。
上皮組織は、通常生検に用いられる方法により生体から取り出され、また上皮細胞を含むサンプルもそれぞれに適した既知の方法により取得される。取得された生物学的サンプルからは適当な方法により上皮細胞を取得して下述する老化度の解析を行う。上皮細胞の取得方法として具体的には、例えば、サンプルが上皮組織である場合には、特開２０００−４９００号公報に記載の方法等が挙げられる。【００１５】  正常細胞とは、正常に細胞増殖制御機能及び分化機能や細胞死（アポトーシス）が誘発される正常な成体を構成する機能等を保持し、且つ分裂老化する細胞であり、
前がん細胞とは、がん細胞の特性の内、無制限増殖能を獲得している場合が多くテロメア短縮を回避する機能を獲得しており分裂老化しない細胞として特徴付けられ、上記正常細胞の特性の一部または多くを保持しているがその程度は様々である。細胞の増勢能力はあるがヒト及びマウスなどの実験動物にがん腫を形成しないかその能力はきわめて低く、
がん細胞（進行がん）とは、多くの細胞特性が記載されるが、最も特徴的には、細胞増殖制御機能を失っているか極めて厳弱し、高い頻度（８０％以上）で無限増殖能力を獲得しており、その多くは浸潤転移能力も備えている事が多い。その結果ヒトを死に至らしめる悪性新生物と位置付けられる細胞であることを意味する。
転写因子の転写パターンとは、転写パターンの発現が判別できれば特に限定されるものではなく。当該技術分野に周知の方法、例えば免疫染色法またはＰＣＲにより測定された転写パターンを用いることができる。【００１６】  未分化状態または未分化状態と相関する転写因子とは、細胞が正常状態の場合には、すなわち正常細胞では発現が検出され難く、細胞が前がん状態および完全にがん化された状態では発現が顕著に検出される転写因子を意味するものである。
代表的な転写因子としては、このような作用を示す転写因子であれば特に限定されるものではないが、Ｏｃｔ３又はＯｃｔ４、あるいはＯｃｔ３／４と表現されるものが挙げられるが、このように表現されるものはすべて同一の転写因子であることを意味している。本発明においては、特にＯｃｔ３／４が好んで使用される。【００１７】  ｐ７５ＮＴＲ（ニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲ  ｍＲＮＡまたは蛋白）とは、神経細胞の膜表面に存在するニューロトロフィン低親和型受容体であるが神経細胞以外の細胞にも発現するものであり、本発明者等のうちの一人が、膵臓がんのマーカとして先に特許出願したものである（特開２００４−２４８５７５膵癌検出用マーカー森村さんとの共同出願でよろしいですね）。しかし、この出願では、ｐ７５ＮＴＲが細胞のがん化が進行することにより、発現が消失するという知見はなく、このことは本発明によって初めて明らかにされた。【００１８】（第一実施形態）
まず、図１から図４に基づいて本発明で用いるｐ７５ＮＴＲ（図中、Ｐ７５Ｎ＋）を用いてがんの発生過程を示す。図１は、がん発生過程を示す模式図であり、図２は発生したがん組織（食道がんで例示）でのＰ７５ＮＴＲの発現を示す図面であり、図３は細胞のがん化過程における幹細胞指標分子（転写因子Ｏｃｔ４ｍＲＮＡ）の発現パターンを示す図面であり、そして図４は不死化ケラチノサイトで細胞数が増幅したｐ７５ＮＴＲ発現幹細胞を示す図面である。【００１９】  図１に示す通り、がん細胞の大半は再生能力を有する組織に存在する幹細胞の分裂老化の過程で発生することを示す模式図であるが、これは特開２０００−６０５４２号公報、特開２００４−２６７１６７号公報、非特許文献（Ｏｋｕｍｕｒａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００３），及び本発明の成果によって成立するがん細胞の発生起源とその発生経路を示す。これらの文献は参考として本明細書に組み込まれる。【００２０】  図２に示す通り、成長したがん組織中でｐ７５ＮＴＲを発現しているがん細胞の分布をｐ７５ＮＴＲ受容体蛋白の抗体を用いた免疫染色（ＤＡＢ法）の結果である。Ｐ７５ＮＴＲ蛋白を発現する細胞はがん腫と正常上皮細胞領域との接点で混在しており、ｐ７５ＮＴＲを発現するがん細胞はｐ７５ＮＴＲを発現する正常上皮組織領域を分断するように割り込んで成長していることを示す。その領域のがん細胞にもｐ７５ＮＴＲを発現していることがＤＡＢ染色法によって明示されている。その反対領域（図面では下方に広がる浸潤したがん細胞ではｐ７５ＮＴＲの発現が検出されなくなっている事も明示されている。このことを模式図で表現したものが右図であり、この図はがんの発生がｐ７５ＮＴＲ発現上皮幹細胞から発生し発がん初期のｐ７５ＮＴＲ発現がん細胞の増幅が伴っており、さらにがんの悪性化が進行しながら浸潤と広がりが伴うに従いｐ７５ＮＴＲの発現が消長していることを意味する。【００２１】  このように、ｐ７５ＮＴＲは、上皮組織に存在するわずかの幹細胞に限局して発現しているため組織のどの領域でも検出される指標ではないが、慢性的炎症や持続的な刺激によって誘発される前がん状態及び無制限増殖能力（不死化）を伴う発がん初期で発現し容易に検出される頻度が高くなり、浸潤、転移などをともなって悪性化の度合い（単にがん化の度合い）が進行するのに従って、ｐ７５ＮＴＲの発現強度は小さくなる（消失する）ことを見出した。【００２２】  さらに、図３に示す通りｐ７５ＮＴＲは、不死化を獲得するがん化初期において強い強度で発現し、そしてがん化が進行して悪性化したがん種より分離して樹立されたがん細胞株ではｐ７５ＮＴＲの発現は検出できなくなる。
したがって、前がん状態であると判定された細胞は、そのｐ７５ＮＴＲの発現強度により、がん化過程での進行状況を把握することが可能になる。
したがって、発現の程度を標準化することによって、取得した細胞（すなわち、判定する細胞）のがんの進行度合いを数値評価することが可能である。
以下に、数値評価する一例をＤＡＢ免疫染色を例示して説明する。【００２３】  図４に示す通り、がん化初期に相当である本発明で例示された不死化細胞株でのｐ７５ＮＴＲ発現強度の増強がｐ７５ＮＴＲ発現幹細胞の増幅によってもたらされる証拠がフローサイトメトリによって明示される【００２４】  この方法は、まず当該技術分野に公知の方法により取得した細胞を免疫染色し、染色した細胞の顕微鏡画像をコンピュータ可読画像データ（ＲＧＢデータ）に変換する。
得られた画像データ（ＲＧＢデータ）をソフトウェア例えばＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標名）によりＣＭＹＫイメージ変換する。ＤＡＢ免疫染色法により染色した箇所（本実施形態ではＯｃｔ３／４またはｐ７５ＮＴＲ（本実施形態ではまとめて転写因子という）を免疫染色した箇所、すなわち、転写因子発現細胞は）、通常褐色で表されているので、この画像から青色を減色すると、画像中転写因子発現細胞だけが黒色要素（Ｋ）を含んでいることとなる。【００２５】  このようにして変換した画像は、免疫染色された箇所が黒色要素（Ｋ）として数値評価することが可能となる。例えば、全体の細胞群における免疫染色された箇所が面積比として数値評価可能となる。【００２６】  本発明の好ましい実施形態において、このようにしてＫ値で示された染色細胞（転写因子発現細胞）の染色の程度を、Ｋ値の分布として示すことが可能となる。図示しないが、Ｋ値（すなわち、染色濃度）の濃度分布を分布曲線として示すことも可能であるが、例えば転写因子発現の強度を、Ｋ値の所定の区画、無し（ｎ）「１０００未満」、弱（ｍ）「１０００以上、５０００未満」、中（ｍ）「５０００以上９０００未満」、強（ｓ）「９０００以上」の四段階評価で示すことができる。本実施形態におけるＫ値の所定の区画、無し（ｎ）「１０００未満」、弱（ｍ）「１０００以上、５０００未満」、中（ｍ）「５０００以上９０００未満」、強（ｓ）「９０００以上」はあくまでも恣意的に決定したものであるので任意に変更することも可能であり、また３段階評価、５段階評価等の区画数も任意である。【００２７】  このように構成することによって従来数値評価することが不可能であり、特に発現程度とその分布を調べることが困難であった転写因子発現細胞を評価することが可能となる。【００２８】  より具体的には、ＤＡＢ（３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｎｚｉｄｉｎｅ）反応よって得られた転写因子発現箇所の褐色の画像ファイルを画像処理ソフト、例えばＰｈｏｔｐｓｈｏｐによって開き、“イメージ”メニューから“モード”の“ＣＭＹＫカラー”を選択する。ＣＭＹＫはシアン（Ｃ）、マジェンタ（Ｍ）、黄色（Ｙ）．黒色（Ｋ）の色成分で表現される。【００２９】  次いで、画像処理ソフトのスポイトツールを選択してＤＡＢ陽性褐色部分（この場合は細胞核内で機能する転写因子であるため、褐色の染色を示す細胞核）を選択する。
次に、描画色のパレットをクリックしカラーピッカーのウインドウを開きＣＭＹＫのＫ値（黒色％値）を確認し、さらにＤＡＢ陰性細胞核（細胞質及び細胞膜に存在するＤＡＢの非特異的発色含む青色が優勢な部分）を選択しカラーピッカーで同様にＫ値を測定する。
前者が後者よりＫ値（％）が十分高い％値であることを確認しカラーピッカーのウインドウを閉じる。この時の前者と後者のＫ値（％）が大きくない場合は非特異的ＤＡＢ発色の占める割合が高いと判定されるため、より信頼できるＫ値を得るためには非特異的染色が少ない良質の免疫染色標本を再度得ることが好ましい。【００３０】  例えばある標本のＫ値は前者が５８〜６０％、後者が２２〜２４％となる。“ウインドヴ”メニューから「ブラック」のチャンネルを選択クリックし画面を白黒で表現する。“選択範囲”メニューから画像全てを選択し“編集”から“コピー”機能によってクリップボードにコピーする。【００３１】  “ファイル”メニューから「新規」を選択し、モードをグレースケールとする。ＯＫをクリックする。“編集”メニューから“ペースト”機能によって新規ファイルにＤＡＢ発色の画像を移す。“ウインドウ”メニューから“レイヤー”を表示し、背景レイヤーとペースト画像の二つが確認されたら、プルダウンメニューから“画像の統合”選択し画像を統合する。【００３２】  “ファイル”メニューから保存を選択し、ファイルタイプを、例えばＴＩＦＦ（拡張子．ｔｉｆ）とし保存する。例えば、画像解析ソフトＣｌｏｎｔｅｃｈＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（ＴＭ）でのＯｃｔ４染色値を測定する場合，「色調補正」から「階調の反転」を選択し白黒画像を反転しておく。本解析で例示されるＣｌｏｎｔｅｃｈＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（ＴＭ）で与えられた個々の細胞核の黒色濃度の測定値はほぼ３００〜２００００までの任意の値を記録した。この実際の測定値（Ｖａｌｕｅ）は異なった標本（組織、培養細胞）におけ転写因子のＤＡＢ発色による免疫染色標本ごとでほぼ一定の域値を得ることが出来ることから、再現性が認められる。【００３３】  このように本発明の評価方法は、取得した画像をコンピュータにより一連の処理を行うことが可能である。
このようにして解析した結果、例えば、前記の転写因子発現細胞を含む細胞群の場合には、細胞全体における染色された細胞の割合、無し（ｎ）、弱（ｗ）、中（ｍ）、強（ｓ）の各々の割合をプリントアウトして、サンプリングした細胞群を保存する容器に貼ることによってその細胞の様子を後段の研究、適用に用いることが可能となる。
このような転写因子の発現パターンをＯｃｔ３／４等の未分化状態と相関する転写因子であるＯｃｔ３／４とｐ７５ＮＴＲとの評価を別個に行うことによって、各々数値評価または段階評価できる。【００３４】  なお、Ｋ値の所定の区画、無し（ｎ）「１０００未満」、弱（ｍ）「１０００以上、５０００未満」、中（ｍ）「５０００以上９０００未満」、強（ｓ）「９０００以上」の四段階評価で示すことができる。本実施形態におけるＫ値の所定の区画、無し（ｎ）「１０００未満」、弱（ｍ）「１０００以上、５０００未満」、中（ｍ）「５０００以上９０００未満」、強（ｓ）「９０００以上」は説明するための例示であり、各々の細胞の種類毎に適切に設定されることは容易に理解できる。【００３５】  このような、細胞のがん化状態を評価することは、がんの診断に応用できるだけでなく、最近注目されているがん幹細胞の評価にも応用可能である。すなわち、がん化状態を特定した細胞をバンキングに供することが本発明によって初めて可能となる。【００３６】（第２実施形態：  培養液への応用）
以上説明した通り、本発明では、転写因子であるＯｃｔ３／４とｐ７５ＮＴＲの発現パターンにより細胞の状態を評価することが可能であるが、このことを応用して、例えば幹細胞の培養を行う際の培養の条件付けに本発明を応用することが可能である。【００３７】  この実施形態では、所定条件で培養された幹細胞または幹細胞を含む比較用細胞群（コントロール培養した細胞群）に対して培養液、培養条件等のパラメータを変化させて（条件付けされて）培養された細胞群を判定する細胞（サンプル細胞）として用いる。
すなわち、コントロール培養前後の比較用細胞群のＯｃｔ３／４の発現パターンおよびｐ７５ＮＴＲの発現パターンと、条件付けされた培養された細胞群の培養後のＯｃｔ３／４の発現パターンおよびｐ７５ＮＴＲの発現パターンとを比較することによって、培養条件の変化に応じて、判定する細胞の正常細胞を維持する培養条件、正常細胞から前がん細胞へ誘導する培養条件、前がん細胞から正常細胞へ誘導する培養条件、前がん細胞を維持する培養条件、前がん細胞から進行がん細胞へ誘導する培養条件を判定する方法を提供する。
なお、Ｏｃｔ３／４の発現パターンおよびｐ７５ＮＴＲの発現パターンと比較方法は、培養前後の発現パターンの差、標準の発現パターンを予め設定してその発現パターンとの比、あるいは、所定の細胞系列に対して予め発現パターンとがんの進行度の関係を標準化し（例えばグラフ化し）、これと比較することによって行うことなどが挙げられる。【００３８】  例えば、代表的なサンプル細胞例として上皮細胞に適した培養液として、容量比１：４で混合したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）とハムＭＣＤＢ１５３培地に、ヒドロコルチゾン（０．２・Ｍ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）（１０ｎｇ／ｍｌ）、エタノールアミン（５μＭ）、ｏ−ホスホエタノールアミン（５μＭ）、トランスフェリン（１０μＭ）、インシュリン（５μｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（５−１０ｎｇ／ｍｌ）牛脳下垂体抽出液（１５０μｇ／ｍｌタンパク量）を補充したものが挙げられるが、このような培地を例えば標準培地として、標準の培養法により培養したものの培養前後の両転写因子の発現パターンを標準とし、添加物（例えば、発がんプロモータ、ＰＭＡ（ホルボールミリステートアセテート）などのＰｈｏｒｂｏｌ  ｅｓｔｅｒの添加、ある成分の添加量の変化をおこなって培養液を変化させることによる、サンプル細胞の培養液に依存するがん化の促進または抑制を評価することが可能となる。【００３９】  また、サンプル細胞として初期がん状態の幹細胞を含む細胞を用いて、紫外線等の光照射、ラジカル添加等を行うことによるがん化の促進または抑制を評価することが可能となる。同様に正常細胞からなる細胞群をサンプル細胞として用いがん化促進条件を設定することも可能である。【００４０】  例えばラジカルは、ラジカル種、その量に応じてがん化を促進する場合もあり、また培養に好影響を与えることもあるので、連続的に量を変化させて評価することによって、例えばラジカル量の最適化を測ることが可能となる。
同様に、正常細胞（正常細胞の維持、正常細胞からがん化方向の評価）または初期がん細胞（初期がん状態の維持、初期がん状態から正常細胞への変化（アポトーシス誘導））、初期がん状態からがん化への進展の評価）を用いて、温度条件、培養時間など培養パラメータを変化（好ましくは連続的に変化）させることによって、細胞の維持条件、変化条件を評価することが可能となる。【００４１】  なお、ある細胞についての標準培養条件およびその培養前後の比較用細胞群のＯｃｔ３／４の発現パターンおよびｐ７５ＮＴＲの発現パターンとが十分に確立されている場合には、確立された比較用細胞群のＯｃｔ３／４の発現パターンおよびｐ７５ＮＴＲの発現パターンを用いて、コントロール培養およびコントロール培養前後の発現パターンを省略して、その細胞を条件付けした培養した後のＯｃｔ３／４の発現パターンおよびｐ７５ＮＴＲの発現パターンを、確立されている標準培養前後のＯｃｔ３／４の発現パターンおよびｐ７５ＮＴＲの発現パターンと比較することにより、培養条件の設定を行うことも可能である。【００４２】（第３実施形態：  単一成分／混合成分のがん化促進・抑制効果の評価）
前述した未分化状態と相関する転写因子とｐ７５ＮＴＲを用いた培養系およびその培養条件（例えば、正常細胞の維持、正常細胞からがん化方向の評価付けされた培養系、初期がん状態の維持、初期がん状態から正常細胞への変化（アポトーシス誘導））、初期がん状態からがん化への進展の評価付けされた培養系およびこれらの培養条件）を標準として、これらに評価すべき添加物を添加して、添加物のがん化挙動を評価することも可能である。【００４３】  すなわち、本発明は、前述の培養条件を判定する細胞の評価方法を用いた測定成分のがん化抑制またはがん化促進を判定する測定成分のがん化評価方法にも関する。
この際に、第２実施形態において培養する細胞が前がん細胞であって、コントロール培養培養条件が、前記前がん細胞が前がん状態を維持する条件、前がん細胞から末期がん細胞へ誘導する培養条件または前がん細胞から正常細胞へ誘導する既知の培養条件を標準とする。【００４４】  このようなコントロール培養条件に、評価する成分（単一成分または混合物、例えば、薬効成分、発がん性が疑われている成分、サプリメント、食品等）を加えて培養する。またこれらの評価する成分の量を変化させることによって、コントロール条件における未分化状態と相関する転写因子とｐ７５ＮＴＲ発現パターンと比較して、評価する成分の細胞に与える影響（前癌状態の維持、前癌状態から正常細胞への変化、前がん状態から進行がんへの進行）の量的依存性を評価することが可能である。【００４５】  さらに、コントロール条件に所定の成分を添加した培地を用いて、この成分に対する他の成分の細胞のがん化に対する相乗作用、拮抗作用を評価することも可能である。【００４６】  この際に、前がん状態の細胞ががん化方向へ進行する培養条件として、例えば紫外線照射、発ガンプロモータの添加、ラジカル付加（量的問題）、牛、人などの血清（１％から２０％程度）。前がん状態から正常細胞へと変化する培養条件として、既知の所定量の抗がん剤、所定量のラジカル消去剤等が挙げられる。【００４７】  さらに、これらの既知の薬剤等の添加物を培養液に添加することにより、これらの添加物と測定すべきサンプルとの正常細胞維持、がん化促進、抑制に対する相乗作用・拮抗作用を測定できるものと予測される。そして、これにより添加物の添加量の臨界点（上限・下限とも）、がん化促進方向、アポトーシス誘導方向を評価できるものと推測される。【００４８】  なお、前述したある成分の添加による十分に確立された培養系における細胞のがん挙動の評価だけでなく、ラジカル種の負荷、光（紫外線、ガンマ線等）の照射による細胞のがん挙動の評価も同様に本発明により行うことができる。【００４９】（変更態様：がん化状態簡易検定キット）
本発明は、例えば、Ｏｃｔ３／４発現遺伝子産物反応素材、ｐ７５ＮＴＲ発現遺伝子産物反応素材、又は両反応素材を有し、例えば基材上に抗Ｏｃｔ３／４抗体分子、抗ｐ７５ＮＴＲ抗体分子を吸着させたものから構成された細胞のがん化状態又は前がん状態を判定する簡易判定キットも提供される。この場合Ｏｃｔ３／４およびｐ７５ＮＴＲを特異的に認識する基材の種類を問わない。この簡易判定キットは、キット中に含まれる転写因子とｐ７５ＮＴＲを特異的に検出可能な基材を体液、組織等のサンプルを接触させ、転写因子とｐ７５ＮＴＲの発現パターンからサンプル中の細胞のがん化状態を簡易判定するものである。【００５０】  例えば、底層と前記底層に設けられたＯｃｔ３／４発現遺伝子を含む反応領域と、この反応領域の上に設けられた体液透過性の表面層とから構成することもでき、内部に吸水性樹脂層を有する生理用ナプキン又は澱もの吸収シートであり、前記吸水性樹脂層内にＯｃｔ３／４認識基材を混入させて反応領域を構成したこともできる。
また反応領域は、ｐ７５ＮＴＲ認識基材と接合された繊維状物から構成してもよい。
また、本発明のがん診断キットは、同一基材中にＯｃｔ３／４発現遺伝子反応領域とｐ７５発現遺伝子反応領域の両方を有していることもできる。
また、本発明のがん診断キットは、Ｏｃｔ３／４発現遺伝子反応領域を有する第１のがん診断キットと、ｐ７５発現遺伝子反応領域を有する第２の診断キットから構成されていてもよい。【００５１】  本発明の簡易キットを用いて、体液（例えば、膣からの体液）から採取した細胞のがん化状態（例えば、子宮がん）を以下の通りに判定する。
体液と判定キットの各反応領域とを接触させる。
接触後の判定キットを従来公知の方法により前処理し（例えば、ホルムアルデヒド、またはパラホルムアルデヒドによる固定化）検出することも可能であるが、前処理不要の検出方法を排除するものではない。例えばＯｃｔ３／４蛋白が特異的に認識して結合する塩基配列Ｏｃｔ３／４ｂｏｘを利用した検出基材も可能である。このようにＯｃｔ３／４及びｐ７５ＮＴＲを特異的に認識するいかなる基材も利用する事を制限するものではないが、簡便には未分化状態と相関する転写因子発現遺伝子、ｐ７５発現遺伝子、又は両者と検体である体液とを反応させて免疫染色し、反応領域における免疫染色の状態を観察し、観察した結果に基づいて正常状態、前がん状態又はがん化状態を判定することを特徴とする、検体中に含まれる細胞ががん化状態又は前がん状態のいずれかであると判定することを特徴する細胞の判定方法である。
【実施例】
【００５２】  以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
（実施例１）
がんの発生過程におけるＰ７５ＮＴＲの発現変動を示す図面の実施例。
がん細胞の大半は再生能力を有する組織に存在する幹細胞の分裂老化の過程で発生することを示す模式図であるが、これは特許文献（ニプロの長期生存細胞の取得方法）、（老化幹細胞の分離方法）、および非特許文献（Ｏｋｕｍｕｒａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００３），及び本発明の成果によって成立するがん細胞の発生起源とその発生経路を示す。【００５３】（実施例２）
本実施例は、細胞のがん化過程における幹細胞指標分子（転写因子）の発現パターンを示す図面の実施例である（図２）。成長したがん組織中でｐ７５ＮＴＲを発現しているがん細胞の分布をｐ７５ＮＴＲ受容体蛋白の抗体を用いた免疫染色（ＤＡＢ法）の結果である。Ｐ７５ＮＴＲ蛋白を発現する細胞はがん腫と正常上皮細胞領域との接点で混在しており、ｐ７５ＮＴＲを発現するがん細胞はｐ７５ＮＴＲを発現する正常上皮組織領域を分断するように割り込んで成長していることを示す。その領域のがん細胞にもｐ７５ＮＴＲを発現していることがＤＡＢ染色法によって明示されている。その反対領域（図面では下方に広がる浸潤したがん細胞ではｐ７５ＮＴＲの発現が検出されなくなっている事も明示されている。このことを模式図で表現したものが右図であり、この図はがんの発生がｐ７５ＮＴＲ発現上皮幹細胞から発生し発がん初期のｐ７５ＮＴＲ発現がん細胞の増幅が伴っており、さらにがんの悪性化が進行しながら浸潤と広がりが伴うに従いｐ７５ＮＴＲの発現が消長していることを意味する。上皮組織に存在するわずかの幹細胞に限局して発現しているため組織のどの領域でも検出される指標ではないが、慢性的炎症や持続的な刺激によって誘発される前がん状態及び無制限増殖能力（不死化）を伴う発がん初期で発現し容易に検出される頻度が高くなり、浸潤、転移などをともなって悪性化の度合い（単にがん化の度合い）が進行するのに従って、ｐ７５ＮＴＲの発現強度は小さくなる（消失する）ことを見出した。【００５４】（実施例３）
本実施例は、細胞のがん化過程における幹細胞指標分子（転写因子）の発現パターンをＲＴ−ＰＣＲ法によってｍＲＮＡ量を推定することによって示す図面の実施例である。実施例１で示した正常細胞から各々の発がんの段階、即ち、ヒトパピローマウイルス１６型の癌誘発遺伝子（各々Ｅ６，Ｅ７）の導入によって進行した分裂老化の過程にあるヒト上皮細胞、テロメラーゼの活性化が伴った不死化過程に導かれた４種類の細胞株（内一種類Ｎｓｖ２１はより癌化程度が進行した不死化細胞を作る能力が高いＳＶ４０の導入されたもの）、及び癌化がさらに進んだ、即ち悪性化がんと判定されるがん組織由来細胞株から全ＲＮＡを任意のＲＮＡ抽出法、例えば全ＲＮＡ抽出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）によって抽出し、アガロース電気泳動法によってＲＮＡの品質を検査し、２マイクログラムＲＮＡから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をｏｌｉｇｏ（ｄＴ）をプライマーとして１マイクロリットルのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ−ＲＴ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって４２度Ｃで１時間増幅した。得られたｃＤＮＡを任意の濃度に希釈し（例えば１：１０希釈）し、一部（例えば１−４マイクリットル）を用いてＰＣＲ法によってｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲの設定は例えば、９４℃で５分１サイクル、続いて９４℃で２０秒、５０−６０℃で３０秒、７２℃で６０秒の条件で実施した。増幅されたｃＤＮＡはアガロースゲル電気泳動によって評価した。ヒトｐ７５ＮＴＲは、不死化を獲得するがん化初期において強い強度で発現し、そしてがん化が進行して悪性化したがん種より分離して樹立されたがん細胞株ではｐ７５ＮＴＲの発現は検出できなくなる。
したがって、前がん状態であると判定された細胞は、そのｐ７５ＮＴＲの発現強度により、がん化過程での進行状況を把握することが可能になる。
なお、ＰＣＲ−ｐｒｉｍｅｒｓ塩基配列は以下の通りである。
ｐ７５ＮＴＲ−Ｆ：５’−ＴｇＡｇＴｇＣＴｇＣＡＡＡｇＣＣＴｇＣＡＡ−３’
ｐ７５ＮＴＲ−Ｒ：５’−ＴＣＴＣＡＴＣＣＴｇｇＴＡｇＴＡｇＣＣｇＴ−３’
ＨｕＯＣＴ３／４−Ｆ：５’−ｇＡＡｇＣＴｇｇＡｇＡＡｇｇＡｇＡＡｇＣＴｇ−３’
ＨｕＯＣＴ３／４−Ｒ：５’−ＣＣＡｇｇｇＣＣｇＣＡｇＣＴＴＡＣＡＣＡＣＡＴｇＴＴＣ−３’
ＨｕＩｎｔｅｇｒｉｎβ１−Ｆ：５’−ｇＴｇＴｇｇＣＣＣＡＡｇＡＣＡｇＴＴＣＴ−３’
ＨｕＩｎｔｅｇｒｉｎβ１−Ｒ：５’−ｇｇＴＴＡＣＣＣＣＡＣＣＣＴＣＴｇＡＣＴ−３’【００５５】（実施例４）
本実施例は、不死化ケラチノサイトで増幅したｐ７５ＮＴＲ発現幹細胞を示す図面（図４）の実施例である
培養皿に接着している培養細胞を例えばトリプシンなどのタンパク分解酵素で処理し、培養皿から脱着した細胞２ｘ１０５を０．０２％のＮａＮ３（アジ化ナトリウム）と０．５％ＢＳＡを含むリン酸緩衝液（染色用緩衝液）５０ｍｌに懸濁する。細胞をｐ７５ＮＴＲ抗体を１マイクロリットル／ｍｌの濃度で加え室温（約２５℃）５分間反応させ細胞を染色用緩衝液で洗浄し、細胞を５０マイクロリットルに再度懸濁し１マイクロリットル／ｍｌの濃度でＦＩＴＣが結合した二次抗体で５分間室温で反応させ、表面膜にｐ７５ＮＴＲを発現している幹細胞数をフローサイトメーターで測定した。
がん化初期に相当である本発明で例示された不死化細胞株でのｐ７５ＮＴＲ発現強度の増強がｐ７５ＮＴＲ発現幹細胞の増幅によってもたらされる証拠がフローサイトメトリによって明示される
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】がん発生過程を示す模式図。
【図２】がんの発生過程におけるＰ７５ＮＴＲの発現変動を示す図面。
【図３】細胞のがん化過程における幹細胞指標分子（転写因子）の発現パターンを示す図面。不死化ケラチノサイトで増幅したｐ７５ＮＴＲ発現幹細胞を示す図面。
【図４】不死化ケラチノサイトで細胞数が増幅したｐ７５ＮＴＲ発現幹細胞を示す図面。
【図１】
2007195533.tif 000003
【図２】
2007195533.tif 000004
【図３】
2007195533.tif 000005
【図４】
2007195533.tif 000006