(57)【要約】【課題】大量の原料から大量の有用多糖類を短時間のうちに得るための、単純かつ効率的な方法を提供する。【解決手段】生体組織抽出物をゲル濾過に供し、その素通し画分または高分子画分を得ることを特徴とする、生体組織からの多糖類の取得方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体組織抽出物をゲル濾過クロマトグラフィーに供し、その素通し画分または高分子画分を得ることを特徴とする、生体組織からの多糖類の取得方法。
【請求項２】
ゲル濾過の前に脱脂工程を行うことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
さらに蛋白分解工程を行うことを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
さらにイオン交換クロマトグラフィー工程を行うことを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
生体組織が軟体動物および魚類からなる群より選択される生物由来である請求項１ないし４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
生体組織がイカ由来である請求項５記載の方法。
【請求項７】
生体組織が食肉用家畜または家禽由来である請求項１ないし４のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
生体組織がニワトリ由来である請求項７記載の方法。
【請求項９】
生体組織が担子菌由来である請求項１ないし４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
多糖類がムコ多糖類である請求項１ないし９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
多糖類がコンドロイチン硫酸である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
生体組織がイカの胴体を除く部分である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
生体組織がウシ肝臓由来である請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
生体組織がニワトリ軟骨由来である請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
請求項１ないし１４のいずれか１項記載の方法に使用される、生体組織から多糖類を取得するためのシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体組織からの多糖類の取得または製造方法に関する。詳細には、生体組織試料をゲル濾過に供し、その素通し画分または高分子画分を得ることを特徴とする、生体組織からの多糖類の取得または製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多糖類は生体において様々な役割を果たしている。なかでも、最近注目されているのがコンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリンなどのムコ多糖類である。例えば、コンドロイチン硫酸は関節炎に対する効果や神経痛の改善効果などが認められており健康食品、サプリメントおよび医薬品等に用いられている。ヒアルロン酸は水分保持効果を有することから化粧品等に多く用いられている。ヘパリンは抗血液凝固作用があり、医療現場で用いられている。これらの物質は従来から医薬品として用いられており、最近では健康食品やサプリメントとしての需要が激増しているのが特徴である。これらの多糖類は生体組織を原料として得られている。その方法も多くのものが開発されているが、とりわけ透析工程、限外濾過工程、有機溶媒による沈殿工程などに時間がかかるので効率が良いとはいえず、かつ、大規模で複雑かつ高価な施設を要することが多い（特許文献１〜３等参照）。
【０００３】
また、ムコ多糖類をはじめとする有用多糖類は動物（陸生、水生を含む）や真菌類の組織由来のものがほとんどであり、ほとんどの場合、ヒトが食用としている動物の組織から得られている。最近では、資源の有効利用の面から、従来は廃棄されていた食用動物の不可食部（調理には適さない部位）から有用多糖類を得る試みもなされている。しかも食用動物の不可食部の量は膨大である。
【０００４】
かかる事情に鑑みると、単純かつ効率的な方法にて、大量の原料から大量の有用多糖類を短時間のうちに得るための方法が必要である。
【特許文献１】特開２０００−２７３１０２号公報
【特許文献２】特開２００３−２６８００４号公報
【特許文献３】特開２００４−１８９８２５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の解決課題は、単純かつ効率的な方法にて、大量の原料から大量の有用多糖類を短時間のうちに得るための方法を開発することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、ゲル濾過の素通し画分または高分子画分を取得することにより上記課題が解決されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
（１）生体組織抽出物をゲル濾過クロマトグラフィーに供し、その素通し画分または高分子画分を得ることを特徴とする、生体組織からの多糖類の取得方法；
（２）ゲル濾過の前に脱脂工程を行うことを特徴とする（１）記載の方法；
（３）さらに蛋白分解工程を行うことを特徴とする（１）または（２）記載の方法；
（４）さらにイオン交換クロマトグラフィー工程を行うことを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項記載の方法；
（５）生体組織が軟体動物および魚類からなる群より選択される生物由来である（１）ないし（４）のいずれかに記載の方法；
（６）生体組織がイカ由来である（５）記載の方法；
（７）生体組織が食肉用家畜または家禽由来である（１）ないし（４）のいずれかに記載の方法；
（８）生体組織がニワトリ由来である（７）記載の方法；
（９）生体組織が担子菌由来である（１）ないし（４）のいずれかに記載の方法；
（１０）多糖類がムコ多糖類である（１）ないし（９）のいずれかに記載の方法；
（１１）多糖類がコンドロイチン硫酸である（１０）記載の方法；
（１２）生体組織がイカの胴体を除く部分である（１１）記載の方法；
（１３）生体組織がウシ肝臓由来である（１１）記載の方法；
（１４）生体組織がニワトリ軟骨由来である（１１）記載の方法；
（１５）（１）ないし（１４）のいずれかに記載の方法に使用される、生体組織から多糖類を取得するためのシステム
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、単純かつ効率的な方法にて、大量の原料から大量の有用多糖類を短時間のうちに得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
上述のごとく、本発明は、生体組織抽出物をゲル濾過クロマトグラフィーに供し、その素通し画分または高分子画分を得ることを特徴とする、生体組織からの多糖類の取得または製造方法に関するものである。本発明の方法に用いる生体組織はいずれの生物に由来するものであってもよい。目的の多糖類の種類に応じて生物種を選択すればよく、例えば、細菌、酵母、放線菌、カビなどの微生物、キノコ類、海草、植物、陸生および水生の動物、鳥類など様々な生物が挙げられる。取得した多糖類をヒトの医薬や食品、あるいは動物用の飼料に使用することを考慮すれば、毒性の低い、あるいは毒性のない生物から組織を得ることが望ましい。その意味からすれば、本発明に用いられる生体組織は、食用の魚類、イカ等の軟体動物、サメ等、あるいはウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリなどの食肉用家畜または家禽、アガリクス、サルノコシカケ、シイタケ等の無毒のキノコ類、あるいは食用植物に由来するものが好ましい。
【００１０】
有用多糖類を豊富に含有する生体組織としては、アガリクスなどの担子菌の菌糸体や子実体、魚類や動物の軟骨や内臓、イカの頭部などに由来するものが挙げられる。例えば、魚類（エイやサメを包含）の軟骨などからコンドロイチン硫酸を得ることができる。ニワトリのトサカなどからヒアルロン酸を得ることができる。あるいはブタ小腸粘膜などからヘパリンを得ることができる。さらに、食用生物の不可食部、例えば、ウシ、ブタ、ニワトリ等の家畜、サケ、イワシ等の魚類、イカ、タコ等の軟体動物、エビ、カニ等の甲殻類の不可食部は量的に膨大であり、その廃棄処分が問題となっているので、そのような生物の不可食部から本発明の方法を用いて有用多糖類を取得することも好ましい。クラゲなどの組織から本発明の方法を用いて多糖類を取得することもできる。もちろん、上記生物の可食部から多糖類を得る場合にも本発明の方法を適用できることはいうまでもない。本発明の方法を用いれば、これらの生体組織を原料として有用多糖類を大量かつ迅速に取得することができる。
【００１１】
本発明の方法により得られる多糖はいずれの種類のものであってもよい。例えば、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリンなどのムコ多糖類の取得や製造に本発明の方法を用いてもよい。例えば、本発明の方法を用いて、魚類（エイやサメを包含）の軟骨などからコンドロイチン硫酸を得ることができ、ニワトリのトサカなどからヒアルロン酸を得ることができ、あるいはブタ小腸粘膜などからヘパリンを得ることができる。本発明の方法を用いて、例えばソデイカ、スルメイカ、コウイカ、モンゴウイカ、ハリイカ、ケンサキイカ、ヤリイカ、アオリイカ、ジンドウイカ、アカイカ、マツイカなどのイカ、特にその胴体を除く部分（例えば頭部、足、皮、ひれ、眼球、軟骨ならびに他の不可食部）、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジなどの家畜や家禽類の臓器（例えば肝臓、腸、気道など）およびその他の部位（例えば、鼻軟骨などの軟骨、眼球、皮膚など）、特にニワトリ軟骨（例えば胸軟骨、関節軟骨など）、あるいは魚類軟骨などからコンドロイチン硫酸やその他の多糖類を取ることもできる。さらに本発明の方法を用いて、例えばアガリクスやサルノコシカケ等の担子菌からベータグルカン等の多糖類を得ることもできる。
【００１２】
生物由来の組織（生体組織）は、当業者に公知の手段・方法を用いて、生物の所望部位から取得することができる。例えば、動物の軟骨を包丁やハサミ等を用いて切り出してもよい。次いで、得られた生体組織から多糖類を含む抽出物を得て、ゲル濾過に供する。生体組織からの多糖類を含む抽出物の取得は、当業者に公知の手段・方法を用いて行うことができる。例えば、ミキサー、ミンチ、凍結粉砕、凍結乾燥等の手段を用いて生体組織を粉砕し、溶媒を用いて多糖類を含む抽出物を得てもよい。粉砕と抽出は同時に行ってもよく、粉砕後に抽出を行ってもよい。抽出溶媒としては水性溶媒が好ましく用いられ、例えば、水、中性付近の緩衝液（例えば、ｐＨ約５〜約９の酢酸緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液等）が例示されるがこれらに限らない。あるいは水性溶媒と有機溶媒（例えば、エタノール、アセトン等）との混合物を抽出に用いてもよい。
【００１３】
上記のようにして得られた生体組織抽出物をゲル濾過クロマトグラフィー工程に供する。生体組織抽出物中に粒子状物質や濁りがある場合には、遠心分離や濾過などの公知方法により、あらかじめそれらを除去することができる。
【００１４】
ゲル濾過工程は当業者に公知の手段・方法を用いて行うことができる。一般的には、ゲル濾過担体をカラムに充填してカラムクロマトグラフィーを行うことにより、ゲル濾過クロマトグラフィー工程を行う。ゲル濾過に用いる担体の種類、カラムのサイズ、溶出液の組成等、流速等の条件は、生体組織の由来、必要な多糖類の種類（および分子量や荷電状態等）、量、純度などの要因に応じて、当業者が適宜選択・決定することができる。これらの条件の選択・決定に際しては、必要な多糖類がゲル濾過担体にトラップされずに、あるいはほとんどトラップされずに素通し画分または高分子画分に溶出され、他の成分がゲル濾過担体にトラップされるようにする。本発明の方法に用いられるゲル濾過担体としては、デキストラン、アガロース、ポリアクリルアミド、ガラスビーズ等がある。具体例としては、各種セファロース、各種セファデックス、各種セファクリル、各種トヨパール、各種スーパーデックス、各種スーパーロース等があり、それらは市販もされている。ゲル濾過工程に用いる溶出液としては、水、中性付近の緩衝液（例えばｐＨ約５〜約９の酢酸緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液等）などが例示されるがこれらに限らない。また、ゲル濾過担体と多糖類との相互作用を調節するために食塩等の塩類を溶出液に添加してもよい。ゲル濾過工程は自然落下式で行ってもよいが、液体クロマトグラフィーの装置を利用してもよい。工業的にはポンプにより加圧あるいは減圧して行ってもよい。本発明の方法において、ゲル濾過工程を複数回行ってもよいが、プロセスの迅速性を担保するという点からすれば、ゲル濾過工程の回数は少ないほど好ましく、１回であってもよい。ゲル濾過工程の回数は、必要な多糖類の量および純度、ならびに所要時間などによって決定されうる。実施例には１回のゲル濾過工程により十分な量あるいは実用的な純度の多糖類を得ることができた例を示した。
【００１５】
上記のクロマトグラフィー条件の選択において、好ましくは、目的とする多糖類が、送液開始後、ゲル濾過担体の総ベッド体積の約１３〜約３３％までの画分に溶出されるように、さらに好ましくはゲル濾過担体の総ベッド体積の約２０％までの画分中に溶出されるように、ゲル濾過クロマトグラフィー条件を選択する。したがって、本明細書において、「素通し画分または高分子画分」とは、試料の粘度や試料に含まれる多糖の種類、所望多糖の分子量、使用担体の種類などにもよるが、通常、担体の総ベッド体積の約３３％までの溶出液中に得られる画分をいう。例えば、ゲル濾過担体の総ベッド体積の約１３％〜約２０％までの溶出液中に得られる画分を「素通し画分または高分子画分」として集めて、多糖類を得てもよい。
【００１６】
ゲル濾過クロマトグラフィーからの画分中の多糖類の検出・確認には、種々の公知方法を用いることができ、例えば、カルバゾール法、ジメチルフェノール法、フェノール硫酸法、紫外吸収測定法、屈折率測定法などを用いてもよい。
【００１７】
本発明の方法では、ゲル濾過クロマトグラフィーによる素通し画分または高分子画分中に溶出される多糖類を取得するので、工程が単純であり、迅速かつ簡単に所望の多糖類を高収率かつ実用的な純度で得ることができる。また、ゲル濾過クロマトグラフィー工程にて、多糖類の取得とともに脱蛋白と脱塩を同時に行うこともできる。必要であれば、多糖類の分離・精製とは別に脱塩のためにゲル濾過クロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィーなどの手法を用いてもよい。さらに、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いる本発明の方法は設備費用やルーチンコストが低くて済むという利点を有する。そのうえ、ゲル濾過クロマトグラフィーはスケールアップが容易である。さらにゲル濾過クロマトグラフィーにおいては担体の再生を行う必要がなく、短時間のうちに繰り返し操作をすることができる。したがって、本発明の方法は、生体組織からの多糖類の迅速な大量生産に適している。
【００１８】
後で説明するように、ゲル濾過クロマトグラフィー工程により得られた多糖を必要に応じてさらに分画・精製してもよい。
【００１９】
生体組織が脂質成分を多く含む場合にはゲル濾過や蛋白分解等の酵素処理に悪影響が出ることがあるので、本発明の方法に脱脂工程を含ませてもよい。脱脂工程はゲル濾過クロマトグラフィーに供する前に行うのが好ましく、ゲル濾過工程前のいずれの段階で行ってもよい。例えば、脱脂工程を粉砕と同時に、あるいは粉砕後であって抽出前に、抽出中または抽出後に行うことができる。脱脂工程は、当業者に公知の手段・方法にて行うことができ、例えば、生体組織抽出物にアセトン等の脂溶性溶媒を添加することにより行ってもよい。
【００２０】
また、必要とされる多糖類の純度、多糖類の用途、多糖類の活性、生体組織の蛋白含有量、その他の要因により、本発明の方法に蛋白分解（除蛋白）工程を含ませてもよい。蛋白分解工程は、蛋白分解酵素を用いて行うのが一般的であり、そのような蛋白分解酵素およびそれらの反応条件は当業者に公知である。また、蛋白分解工程は酸またはアルカリでの処理、有機溶媒での沈殿、硫安等での塩析などの方法によっても行うことができる。蛋白分解工程は、いずれの段階で行ってもよいが、生体組織抽出物をゲル濾過クロマトグラフィーに供する前に行うことが好ましい。その理由は、蛋白分解により生じたアミノ酸やペプチドがゲル濾過により除去され、長時間を要する透析工程が省略可能になるからである。さらに、必要とされる多糖類の純度、多糖類の用途、多糖類の活性、生体組織の核酸含有量、その他の要因により、本発明の方法に核酸分解（除核酸）工程を含ませてもよい。除核酸法は当業者に公知である。除核酸工程は、いずれの段階で行ってもよいが、蛋白分解工程について述べたのと同様の理由で、生体組織抽出物をゲル濾過クロマトグラフィーに供する前に行うことが好ましい。
【００２１】
さらに、必要とされる多糖類の純度、多糖類の用途、多糖類の活性、その他の要因により、当業者に公知の手段・方法により、さらなるクロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなど）、有機溶媒による分別沈殿、遠心分離、濾過、除核酸等の処理を１つあるいはそれ以上行ってもよい。
【００２２】
かかる態様の例として、本発明の方法において、他のクロマトグラフィー工程を含めることにより、得られる多糖類の純度を飛躍的に向上させることができる。このような他のクロマトグラフィー工程として好ましいものとしてイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどがあり、極性基を有する多糖類を得る場合にはイオン交換クロマトグラフィーを用いることができる。イオン交換クロマトグラフィー工程は、ゲル濾過工程の前、後いずれに行ってもよいが、ゲル濾過クロマトグラフィー工程により多糖類の純度を高めておいてからイオン交換クロマトグラフィー工程を行うのが好ましい。本発明の方法において行うイオン交換クロマトグラフィーの回数についても特に制限はなく、必要とされる多糖類の純度および収量を考慮して決定することができる。本発明のプロセスの迅速性を担保する見地から、イオン交換クロマトグラフィー工程の回数は２回以内、好ましくは１回である。イオン交換クロマトグラフィー工程の回数は、必要な多糖類の量および純度、ならびに所要時間などによって決定されうる。
【００２３】
本発明の方法において使用するイオン交換体は、必要な多糖類の種類、必要とされる純度、原料の種類や量、必要とされる多糖類の収量などを考慮して、適宜選択することができる。イオン交換体は様々なものが市販されており、それらから選択することもできる。陰イオン交換体としては、ダウエックス、アンバーライト、ムロマックなどの陰イオン交換樹脂、ハイドロタルサイト、キトパール”ベーシック”、ＤＥＡＥ−キトパール、Ｃａｐｔｏ  Ｑ、Ｍｏｎｏ  Ｑ、ＳＡＸ、イグゼなどの陰イオン交換体、ＤＥＡＥ−セルロース、ＤＥＡＥ−セファデックスなどの陰イオン交換セルロースなどが挙げられ、市販もされている。硫酸基を有する多糖類の分離・精製には弱陰イオン交換体を用いることができ、例えば、ＤＥＡＥ−セルロース、ＤＥＡＥ−セファデックス、ダウエックスなどの陰イオン交換体を用いることができる。イオン交換クロマトグラフィー工程において、目的の多糖類を精製するためには、通常、目的の多糖類をイオン交換体に吸着させておいて、その後、例えば溶離液のイオン強度を上昇させる等の手法により目的の多糖類をイオン交換体から溶出させる。イオン強度の上昇法としては、ステップワイズ法、グラジエント法などがある。また、目的の多糖類を吸着しない、逆の電荷を有するイオン交換体によるクロマトグラフィー工程を用いることにより、目的の多糖類の純度をさらに高めることもできる。この目的には陽イオン交換体が好ましく用いられる。陽イオン交換体としては、ダウエックス、アンバーライト、ムロマックなどの陽イオン交換樹脂、ゼオライト、カルボキシル化キトパール、スルホン化キトパール、Ｃａｐｔｏ  Ｓ、Ｍｏｎｏ  Ｓ、ＳＣＸ、イグゼなどの陽イオン交換体などが挙げられ、市販もされている。本発明に用いるイオン交換クロマトグラフィー工程は、カラム式、バッチ式のいずれで行ってもよい。イオン交換クロマトグラフィー工程で使用するイオン交換体の選択、溶離液の種類、組成、各成分の濃度、ｐＨ、温度、流速などの条件の選択は、当業者が通常に行いうる範囲のことである。
【００２４】
さらに本発明は、上で説明した生体組織から多糖類を得るための本発明方法を実施するために用いられるシステムにも関する。本発明のシステムは、生体組織からの多糖類を得るために必要な手段を含む。本発明のシステムは、ゲル濾過工程に必要な手段を必須として含む。ゲル濾過に必要な手段としては、ゲル濾過担体、それを充填するカラム、送液手段（例えばポンプ等）、配管、弁などが挙げられる。本発明のシステムは、ゲル濾過クロマトグラフィーに必要な手段のほかに、イオン交換クロマトグラフィー工程などの他の分離・精製工程を行うための手段を含んでいてもよい。さらに本発明のシステムは、生体組織の粉砕、抽出のためのスライサー、ミキサー、ミンチ、粉砕などの手段、乾燥手段（例えば、凍結乾燥や噴霧乾燥を行うための手段、送風手段など）、遠心分離や沈殿槽などの手段、脱脂工程のための手段等を含んでいてもよい。本発明のシステムは大量生産に適したプラントの形態にすることもできる。
【００２５】
以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、本発明は実施例に限定して解釈されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
（Ａ）ソデイカ頭部からの多糖（糖鎖）成分の抽出
（ｉ）脂質除去
以下の操作（ｉ）〜（ｉｉｉ）に用いた水は、すべてミリＱ水であった。遠心分離には冷却遠心分離機を０℃で用いた。
生ソデイカの頭部８７０ｇに、−２０℃のアセトン１４００ｍｌを加え、約１分間ミキサーで粉砕した。これを吸引濾過し、濾過物を−２０℃のアセトン１４００ｍｌに懸濁させ、再び吸引濾過した。この濾過物をデシケーター内で乾燥させ、１９６ｇの粉末を得ることができた。
【００２７】
（ｉｉ）たんぱく質の酵素分解
（ｉ）で得られた粉末の１９６ｇのうち１．００ｇを水（８ｍｌ）に懸濁させ、湯浴（１００℃）で１０分間加熱し、これに０．５Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ７．５３に調整した緩衝液（ホウ酸９．３１ｇ／水１００ｍｌ）１０ｍｌを加え、アクチナーゼＥ（科研製薬）３１．２ｍｇを加えた。反応液のｐＨは７．５に１Ｍ  ＮａＯＨで調整し、６０℃の恒温槽で振とうした。２日後、アクチナーゼＥ  ３１．２ｍｇを追加し、引き続き６０℃の恒温槽で２日間振とうした。その後氷冷し、吸引濾過した。
【００２８】
（ｉｉｉ）ゲル濾過精製
（ｉｉ）で得られた酵素反応液を濃縮し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０［ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株）］カラム（内径２．２ｃｍ  ｘ  高さ８８ｃｍ、１％酢酸水溶液）により分離精製した。送液開始後７５〜１１１ｍＬの画分にコンドロイチン硫酸が含まれることを、カルバゾール反応により確認した。この画分のコンドロイチン硫酸の収量は４２．９ｍｇ、純度は１９％であった。この程度の純度であれば、食品素材として使用するには十分である。図１にカルバゾール反応の吸光度グラフを示す。なお、この工程により得られるコンドロイチン硫酸を、イオン交換クロマトグラフィー工程等によって、さらに純度の高いものに精製してもよい。
【００２９】
（Ｂ）得られた糖鎖の酵素分解と成分分析
（ｉ）コンドロイチナーゼ分解
コンドロイチナーゼＡＢＣを用いてクジラ軟骨由来のコンドロイチン硫酸の消化を行ったSugaharaらの報告（K.Sugahara et al., Carbohydr. Res., 255, 145 (1994)）を参考に、以下の操作を行った。以下の操作で用いた水は全て市販のＨＰＬＣ用蒸留水であった。
ゲル濾過精製で得られた糖鎖懸濁液（１ｍｇ／水１ｍｌ）２００μｌに、２０μｌの牛血清アルブミン水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ  MP Biomedicals, Inc）、０．５Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ８．０に合わせた２５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液４０μｌを混合し、コンドロイチナーゼＡＢＣ（５Ｕ／ｍｌ）（生化学工業）を１００μｌ加えて、３７℃の恒温槽で３０時間インキュベートした。開始後６時間と３０時間の反応液をそれぞれ１０μｌとり、ＨＰＬＣの試料とした。
【００３０】
（ｉｉ）ＨＰＬＣ分析
ＨＰＬＣでの分析には、アミン結合型カラム上でＮａＨ２ＰＯ４の直線濃度勾配をかけるYoshidaらの方法（K.Yoshida et al., Anal. Biochem., 177, 327 (1989)）を参考に、以下の操作を行った。カラムはＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＰＡ（Ｓ５μｍ，２５０×４．６ｍｍ）カラムを用い、溶離液（Ａ：１６ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  Ｂ：８００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４）は、すべてＨＰＬＣグレードを使用し、さらにＰＴＦＥ  ＦＩＬＴＥＲ（ポアサイズ０．２μｍ）（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）で濾過し、ヘリウム置換を行った。ＨＰＬＣは２４８７、４７４、６１６、６００（Waters社製）システムを使用し、２３２ｎｍの吸収を測定した。ＮａＨ２ＰＯ４の濃度は、１６ｍＭに対して８００ｍＭを６０分間に１ｍｌ／分の流速で０％から４７％まで上昇させた。
図２のチャート（ＶＩＩ、ＶＩＩＩ）から、イカから得られた糖鎖は、主にコンドロイチン硫酸Ｅ型とＡ型二糖および硫酸化されていないコンドロイチン二糖で構成されているといえる。いくつかの不飽和コンドロイチン硫酸二糖（生化学工業）を標準サンプルとしてＨＰＬＣ分析した結果（チャートＩＩＩ、ＩＶ）から、Ｃ型二糖も若干存在していることが確認されたものの、他のコンドロイチン硫酸単位は確認されなかった。なお、それ以外のピークは、酵素またはバッファー由来のものである。
【実施例２】
【００３１】
（Ａ）ウシ肝臓からの多糖（糖鎖）成分の抽出
（ｉ）脂質除去
新鮮なウシ生肝臓２６３ｇに、−２０℃のアセトン５２６ｍｌを加え、約１分間ミキサーで粉砕した。これを吸引濾過し、濾過物を−２０℃のアセトン５２６ｍｌに懸濁させ、再び吸引濾過した。この濾過物をデシケーター内で乾燥させ、６７ｇの粉末を得ることができた。
【００３２】
（ｉｉ）たんぱく質の酵素分解
（ｉ）で得られた粉末の６７ｇのうち１．００ｇを水（８ｍｌ）に懸濁させ、湯浴（１００℃）で１０分間加熱した。この懸濁液を実施例１と同様に、アクチナーゼＥによりタンパク分解を行った。
【００３３】
（ｉｉｉ）ゲル濾過精製
（ｉｉ）で得られた酵素反応液を濃縮し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０［ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株）］カラム（内径２．２ｃｍ  ｘ  高さ８８ｃｍ、１％酢酸水溶液）により分離精製した。送液開始後７５〜１１１ｍＬの画分にコンドロイチン硫酸が含まれることを、カルバゾール反応により確認した。収量は１３５．２ｍｇであった。図３に、カルバゾール反応の吸光度グラフを示す。
【００３４】
（Ｂ）得られた糖鎖の酵素分解と成分分析
（ｉ）コンドロイチナーゼ分解とＨＰＬＣ分析
（Ａ）（ｉｉｉ）で得られた粗糖鎖（１ｍｇ）を、実施例１と同様にコンドロイチナーゼＡＢＣにより分解し、ＨＰＬＣ分析を行った（図４の上のチャート）。さらにこの粗糖鎖をＤＥＡＥ−セルロースカラム（溶離液として０．１５Ｍ、０．５Ｍ、１．０Ｍおよび２．０Ｍ塩化リチウム水溶液を使用）により精製し、その１．０Ｍ画分から得られた糖鎖のコンドロイチナーゼＡＢＣ分解の結果を図４の下のチャートに示す。ウシ肝臓に存在する主なコンドロイチン種はコンドロイチン硫酸Ａであり、少量のＣとＥも存在することがわかったが、肝臓重量全体に占めるコンドロイチン硫酸の含有量は少ない（肝臓１００ｇあたりコンドロイチン硫酸２．９ｍｇ）。そのため、ゲル濾過で得たサンプルを酵素反応して検出される二糖のピークは低い（図４の上のチャート）。これらの結果から、ウシ肝臓の脱脂物には、ヘパリンやヘパラン硫酸など、コンドロイチナーゼで分解できない他のグリコサミノグリカンなどの多糖も多く含まれていると考えられる。
【実施例３】
【００３５】
（Ａ）冷凍ソデイカのひれからの多糖（糖鎖）成分の抽出
（ｉ）脂質除去
冷凍ソデイカのひれ１７３４．７ｇに−２０℃のアセトン３．４６ｌを加え、約１分間ミキサーで粉砕した。これを吸引濾過し、濾過物を−２０℃のアセトン３．４６ｌに懸濁させ、再び吸引濾過した。この濾過物をデシケーター内で乾燥させ、３５６．３８ｇの脱脂粉末を得ることができた。
【００３６】
（ｉｉ）たんぱく質の酵素分解
（ｉ）で得られた脱脂粉末の３５６．３８ｇのうち１０．００ｇを水（８０ｍｌ）に懸濁させ、湯浴（１００℃）で１０分間加熱し、これに０．５Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整した緩衝液（ホウ酸３０．９ｇ／水１０００ｍｌ）１００ｍｌを加え、プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ［天野エンザイム（株）］７２５ｍｇを加えた。その反応液を、５５℃の恒温槽で２日間振とうした。その後氷冷し、吸引濾過した。
【００３７】
（ｉｉｉ）ゲル濾過精製
（ｉｉ）で得られた酵素反応液を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０［ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株）］カラム（内径４．８ｃｍ  ｘ  高さ１３６ｃｍ、１％酢酸水溶液）により分離精製した。送液にはぺリスタポンプ（８．３ｍｌ／ｍｉｎ）を用いた。コンドロイチン硫酸の検出にはカルバゾール反応を用いた。このゲル濾過パターンを図５に示す。送液開始後３２５ｍｌ以降の画分にコンドロイチンが含まれていることをカルバゾール反応により確認した。２３０ｎｍのＵＶ吸収による追跡でも、同様の結果が得られた。ピークの立ち上がりである画分Ａ（送液開始後３２５〜４７５ｍｌ）と、それに続く画分Ｂ（送液開始後４７５〜６２５ｍｌ）、画分Ｃ（送液開始後６２５〜７７５ｍｌ）に分けて凍結乾燥を行い、それぞれから２４．７ｍｇ、３８８．９ｍｇ、３６７．１ｍｇの生成物が得られた。
【００３８】
（Ｂ）得られた糖鎖の酵素分解と成分分析
（ｉ）コンドロイチナーゼ分解とＨＰＬＣ分析
画分Ａ〜Ｃから得られた生成物１ｍｇずつを、それぞれコンドロイチナーゼＡＢＣにより分解し、ＨＰＬＣ分析を行った。画分ＡおよびＢのＨＰＬＣチャートを図６に示す。その結果、含まれる糖鎖は、硫酸基のついていないコンドロイチンがほぼ１００％を占めた。ピーク面積と検量線から算出された画分ＡとＢ由来の糖鎖成分の純度は、それぞれ９７％と４０％であった。画分Ｃには糖鎖成分は検出されなかった。脱脂粉末１００ｇ（湿重量４８７ｇ）あたりに換算すると、画分ＡとＢの領域には、それぞれ２４０ｍｇと１５４９ｍｇの糖鎖（コンドロイチン）が含まれていることになる。
【実施例４】
【００３９】
（Ａ）冷凍ニワトリ胸軟骨からの多糖（糖鎖）成分の抽出
（ｉ）脂質除去
冷凍ニワトリ胸軟骨１０５．０ｇに−２０℃のアセトン２００ｍｌを加え、約２分間ミキサーで粉砕した。これを吸引濾過し、濾過物を−２０℃のアセトン２００ｍｌに懸濁させ、再び吸引濾過した。この濾過物をデシケーター内で乾燥させ、２２．９５ｇの脱脂粉末を得ることができた。
【００４０】
（ｉｉ）たんぱく質の酵素分解
（ｉ）で得られた脱脂粉末の２２．９５ｇのうち１．０２ｇを水（８．０ｍｌ）に懸濁させ、湯浴（１００℃）で１０分間加熱し、これに０．５Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ７．５３に調整した緩衝液（ホウ酸９．３１ｇ／水１００ｍｌ）１０ｍｌを加え、アクチナーゼＥ（科研製薬）３３．４ｍｇを加えた。その反応液を、６０℃の恒温槽で２日間振とうした。２日後、アクチナーゼＥ  ３３．４ｍｇを追加し、引き続き６０℃の恒温槽で２日間振とうした。その後氷冷し、吸引濾過した。
【００４１】
（ｉｉｉ）ゲル濾過精製
（ｉｉ）で得られた酵素反応液を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０［ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株）］カラム（内径３．０ｃｍ  ｘ  高さ８０ｃｍ、１％酢酸水溶液）により分離精製した。コンドロイチン硫酸の検出にはカルバゾール反応を用いた。このゲル濾過パターンを図７に示す。送液開始後８４〜１０８ｍｌの画分（Ｘ）、１０８〜１３２ｍｌの画分（Ｙ）、１３２〜１５３ｍｌの画分（Ｚ）にカルバゾール反応陽性を確認した。収量はそれぞれ６１．６ｍｇ（５９．８ｍｇ）、８０．６ｍｇ（６３．０ｍｇ）、６８．８ｍｇ（３１．６ｍｇ）であった。カッコ内の値は、（Ｂ）の（ｉ）の操作によって求めた純度を考慮して計算した「実際に含まれるコンドロイチン硫酸とコンドロイチンの重さ」を示す。
【００４２】
（Ｂ）得られた糖鎖の酵素分解と成分分析
（ｉ）コンドロイチナーゼ分解とＨＰＬＣ分析
（Ａ）の（ｉｉｉ）で得られた糖鎖成分Ｘ、Ｙ、Ｚのそれぞれ１ｍｇを、コンドロイチナーゼＡＢＣにより分解し、ＨＰＬＣ分析を行った。その結果、Ｘに含まれる糖鎖は、硫酸基のついていないコンドロイチンが２２％、４位に硫酸基を持ったコンドロイチン硫酸Ａ型が５８％、６位に硫酸基を持ったコンドロイチン硫酸Ｃ型が２０％であった。また、Ｙに含まれる糖鎖は、コンドロイチンが４％、４位に硫酸基を持ったコンドロイチン硫酸Ａ型が７４％、６位に硫酸基を持ったコンドロイチン硫酸Ｃ型が２２％であった。Ｚに含まれる糖鎖は、コンドロイチンが１４％、４位に硫酸基を持ったコンドロイチン硫酸Ａ型が６６％、６位に硫酸基を持ったコンドロイチン硫酸Ｃ型が２０％であった。ピーク面積と検量線から算出されたニワトリ丸軟骨由来の糖鎖成分の純度は、Ｘが９７％、Ｙが７８％、Ｚが４６％であった。脱脂粉末１００ｇ（湿重量４５８ｇ）あたりに換算すると、合計（５８８５＋６１３７＋３１０５＝）１５１２７ｍｇの糖鎖（コンドロイチン硫酸とコンドロイチン）が含まれていることになる。図８に糖鎖成分Ｘ、ＹおよびＺのＨＰＬＣチャートを示す。
【実施例５】
【００４３】
（Ａ）冷凍ニワトリ丸軟骨からの多糖（糖鎖）成分の抽出
（ｉ）脂質除去
冷凍ニワトリ丸軟骨９１４．７５ｇに−２０℃のアセトン１．８Ｌを加え、約２分間ミキサーで粉砕した。これを吸引濾過し、濾過物を−２０℃のアセトン１．８Ｌに懸濁させ、再び吸引濾過した。この濾過物をデシケーター内で乾燥させ、１５９．４４ｇの脱脂粉末を得ることができた。
【００４４】
（ｉｉ）たんぱく質の酵素分解
（ｉ）で得られた脱脂粉末の１５９．４４ｇのうち４．３７ｇを水（３４．８ｍｌ）に懸濁させ、湯浴（１００℃）で１０分間加熱し、これに０．５Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整した緩衝液（ホウ酸３０．９ｇ／水１０００ｍｌ）４３．５ｍｌを加え、プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ［天野エンザイム（株）］３２８ｍｇを加えた。その反応液を、５５℃の恒温槽で２日間振とうした。その後氷冷し、吸引濾過した。
【００４５】
（ｉｉｉ）ゲル濾過精製
（ｉｉ）で得られた酵素反応液を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０［ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株）］カラム（内径４．８ｃｍ  ｘ  高さ１３６ｃｍ、１％酢酸水溶液）により分離精製した。送液にはぺリスタポンプ（８．３ｍｌ／ｍｉｎ）を用いた。このゲル濾過のパターンを図９に示す。送液開始後３４２ｍｌ以降の画分にコンドロイチン硫酸が含まれていることをカルバゾール反応により確認した。ピークの立ち上がりである画分Ｄ（送液開始後３４２〜５０４ｍｌ）と，それに続く画分Ｅ（送液開始後５０４〜７２８ｍｌ）に分けて凍結乾燥を行い，それぞれ５９１．７ｍｇと２２７９．９ｍｇの生成物が得られた。（Ｂ）の（ｉ）で述べるコンドロイチナーゼ処理の結果、画分Ｅにはコンドロイチン硫酸もコンドロイチンも含まれていなかった。画分Ｄのコンドロイチン硫酸とコンドロイチンの純度は４０％であった。
【００４６】
（ｉｖ）ＤＥＡＥ精製
（ｉｉｉ）で得られた生成物（Ｄ）の５９１．７ｍｇのうち５４８．５ｍｇをＤＥＡＥ−セルロースカラム（内径４．２  ｘ  高さ１９ｃｍ、溶離液として０．１５〜２．０Ｍ（０．１５Ｍ、０．５Ｍ、１．０Ｍおよび２．０Ｍ塩化リチウム水溶液を使用）により分離精製した。このイオン交換クロマトグラフィーのパターンを図１０に示す。送液開始後の９２８〜１３１２ｍｌ（０．５Ｍ画分Ｆ）と１６００〜１８４０ｍｌ（１．０Ｍ画分Ｇ）がカルバゾール反応に陽性を示した。２３０ｎｍのＵＶ吸収による追跡でも、同様の結果が得られた。（Ｂ）の（ｉ）で述べるコンドロイチナーゼ処理の結果、画分Ｆにはコンドロイチン硫酸もコンドロイチンもほとんど含まれていなかった。
【００４７】
（ｖ）ゲル濾過脱塩
（ｉｖ）で得られた画分Ｇを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０［ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株）］カラム（内径４．８ｃｍ  ｘ  高さ１３６ｃｍ、１％酢酸水溶液）により脱塩した。脱塩カラムのパターンを図１１に示す。送液開始後の３４２〜８２８ｍｌの画分（Ｏ〜Ｑ）がカルバゾール反応陽性を示した。２３０ｎｍのＵＶ吸収による追跡でも、同様の結果が得られた。収量は、それぞれ５２．３ｍｇと１５８．６ｍｇであった。
【００４８】
（Ｂ）得られた糖鎖の酵素分解と成分分析
（ｉ）コンドロイチナーゼ分解とＨＰＬＣ分析
（Ａ）の（ｖ）で得られた糖鎖成分Ｏ、Ｐ、Ｑのそれぞれ１ｍｇを、コンドロイチナーゼＡＢＣにより分解し、ＨＰＬＣ分析を行った。画分Ｏ〜ＱのＨＰＬＣチャートはほぼ同じ傾向を示した。画分Ｏ〜Ｑに含まれる糖鎖は、硫酸基のついていないコンドロイチンが約３０％、４位に硫酸基を持ったコンドロイチン硫酸Ａ型が約５３％、６位に硫酸基を持ったコンドロイチン硫酸Ｃ型が約１７％であった。ピーク面積と検量線から算出されたニワトリ丸軟骨由来のコンドロイチン硫酸とコンドロイチンの純度は１００％であった。脱脂粉末１００ｇ（湿重量５４３ｇ）あたりに換算すると、３７０２ｍｇの糖鎖（コンドロイチン硫酸とコンドロイチン）が画分Ｏ〜Ｑに含まれていることになる。図１２に画分ＰのＨＰＬＣチャートを示す。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明によれば多糖類を迅速かつ簡単に、しかも大量に得られるので、本発明は、健康食品、サプリメント、医薬品等の製造分野において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１はソデイカ頭部からの多糖（糖鎖）成分の抽出におけるＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーの溶出パターンを示す図である。吸光度は５３０ｎｍにおけるものである。
【図２】図２は標準サンプルおよびソデイカ頭部から抽出された多糖（糖鎖）のＨＰＬＣの結果を示すチャートである。各チャートは以下のごとし：Ｉ，酵素反応液のみ（基質なし）ＩＩ，コンドロイチン硫酸Ｅ型不飽和二糖（ΔＤｉ−ｄｉ４−６Ｓ）（標準サンプル）ＩＩＩ，コンドロイチン硫酸Ａ型不飽和二糖（ΔＤｉ−４Ｓ）（標準サンプル）ＩＶ，コンドロイチン硫酸Ｃ型不飽和二糖（ΔＤｉ−６Ｓ）（標準サンプル）Ｖ，コンドロイチン不飽和二糖（ΔＤｉ−０Ｓ）（標準サンプル）ＶＩ，コンドロイチン硫酸Ｅ（多糖（生化学工業製））の酵素反応（６時間）の結果ＶＩＩ，ソデイカから得られた糖鎖（ＤＥＡＥカラム精製、１．０Ｍ塩化リチウム画分）の酵素反応（６時間）の結果ＶＩＩＩ，ソデイカから得られた糖鎖（ゲル濾過精製）の酵素反応（６時間）の結果。横軸は保持時間、縦軸は２３２ｎｍにおける紫外光の吸収強度である。
【図３】図３はウシ肝臓からの多糖（糖鎖）成分の抽出におけるＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーの溶出パターンを示す図である。吸光度は５３０ｎｍにおけるものである。
【図４】図４の上のチャートは、ウシ肝臓から得られた脱脂物をタンパク分解後、ゲル濾過精製によって得た粗糖鎖の酵素反応（６時間）のＨＰＬＣ結果を示す。図４の下のチャートは、脱脂物を同様にタンパク分解、透析し、ＤＥＡＥカラムで精製した糖鎖の酵素反応（５時間）の結果を示す。横軸は保持時間、縦軸は２３２ｎｍにおける紫外光の吸収強度である。
【図５】図５は冷凍ソデイカのひれからの多糖（糖鎖）成分の抽出におけるＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーの溶出パターンを示す図である。吸光度は５３０ｎｍにおけるものである。
【図６】は冷凍ソデイカのひれからの多糖（糖鎖）成分の抽出におけるＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーにより得られた画分Ａ（上パネル）およびＢ（下パネル）のコンドロイチナーゼ分解物のＨＰＬＣ分析チャートを示す。横軸は保持時間、縦軸は２３２ｎｍにおける紫外光の吸収強度である。
【図７】図７は冷凍ニワトリ胸軟骨からの多糖（糖鎖）成分の抽出におけるＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーの溶出パターンを示す図である。
【図８】図８は冷凍ニワトリ胸軟骨からの多糖（糖鎖）成分の抽出におけるＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーにより得られた画分Ｘ（上パネル）、Ｙ（中パネル）およびＺ（下パネル）のコンドロイチナーゼ分解物のＨＰＬＣ分析チャートを示す。横軸は保持時間、縦軸は２３２ｎｍにおける紫外光の吸収強度である。
【図９】図９は冷凍ニワトリ丸軟骨からの多糖（糖鎖）成分の抽出におけるＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーの溶出パターンを示す図である。吸光度は５３０ｎｍにおけるものである。
【図１０】図１０は冷凍ニワトリ丸軟骨からの多糖（糖鎖）成分の抽出におけるＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーにより得られた画分ＤのＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマトグラフィーの溶出パターンを示す図である。吸光度は５３０ｎｍにおけるものである。
【図１１】図１１は冷凍ニワトリ丸軟骨からの多糖（糖鎖）成分の抽出における画分ＤのＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマトグラフィーにより得られた画分Ｇの、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーによる脱塩の際の溶出パターンを示す図である。吸光度は５３０ｎｍにおけるものである。
【図１２】図１２は図１１のＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーによる脱塩の際に得られた画分Ｐのコンドロイチナーゼ分解物のＨＰＬＣ分析チャートを示す。横軸は保持時間、縦軸は２３２ｎｍにおける紫外光の吸収強度である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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