(57)【要約】【課題】免疫疾患等の疾患に対する新たな作用機序を有する医薬品、およびその開発に必要な方法の提供。【解決手段】被験物質が、クラスターを形成し得る細胞表面レセプターを含有するマイクロクラスター（ＭＣ）（例、ＴＣＲ含有ＭＣ）の形成を調節するか否かを評価することを含む、細胞活性化を制御し得る物質のスクリーニング方法：クラスターを形成し得る細胞表面レセプターを含有するＭＣの構成分子の発現ベクターまたは該発現ベクターが導入されたＴ細胞を含む、細胞活性化を制御し得る物質のスクリーニング用キット：クラスターを形成し得る細胞表面レセプターを含有するＭＣの形成を調節し得る物質を含む、細胞活性化制御剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質が、クラスターを形成し得る細胞表面レセプターを含有するＭＣの形成を調節するか否かを評価することを含む、細胞活性化を制御し得る物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
免疫シナプスを形成し得る細胞の活性化を制御し得る物質のスクリーニング方法である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節するか否かを評価することを含む、Ｔ細胞活性化を制御し得る物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
ＴＣＲ含有ＭＣが免疫シナプス辺縁部におけるＴＣＲ含有ＭＣである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
被験物質がＴＣＲ含有ＭＣの形成を抑制するか否かを評価することを含むＴ細胞活性化を阻害し得る物質のスクリーニング方法である、請求項３または４記載の方法。
【請求項６】
ＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節するか否かの評価が、ＴＣＲ含有ＭＣへのキナーゼ分子および／またはアダプター分子のリクルートの評価である、請求項３または４記載の方法。
【請求項７】
キナーゼ分子およびアダプター分子がそれぞれ、ＺＡＰ−７０およびＳＬＰ−７６である、請求項４記載の方法。
【請求項８】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、請求項３記載のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質、Ｔ細胞、およびＴ細胞活性化抗原をロードした脂質二重層含有媒体を接触させる工程：
（ｂ）被験物質の存在下において、二重層含有媒体を接触させたＴ細胞におけるＴＣＲ含有ＭＣの形成能を測定し、該形成能を、該被験物質の不在下における形成能と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、該形成を調節する被験物質を選択する工程。
【請求項９】
脂質二重層含有媒体が、抗原提示能を有する平面二重層または抗原提示細胞である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
細胞活性化を制御し得る物質のスクリーニング用キットであって、
クラスターを形成し得る細胞表面レセプターを含有するＭＣの構成分子の発現ベクターまたは該発現ベクターが導入されたＴ細胞を含み、
該構成分子が検出可能に標識されている、キット。
【請求項１１】
クラスターを形成し得る細胞表面レセプターを含有するＭＣの形成を調節し得る物質を含む、細胞活性化制御剤。
【請求項１２】
免疫シナプスを形成する細胞の活性化制御剤である、請求項１１記載の剤。
【請求項１３】
ＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節し得る物質を含む、Ｔ細胞活性化制御剤。
【請求項１４】
ＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節し得る物質が、免疫シナプス辺縁部におけるＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節し得る物質である、請求項１３記載の剤。
【請求項１５】
ＴＣＲ含有ＭＣの形成を抑制し得る物質を含むＴ細胞活性化阻害剤である、請求項１３記載の剤。
【請求項１６】
ＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節し得る物質が、ＴＣＲ含有ＭＣへのキナーゼ分子および／またはアダプター分子のリクルートを調節し得る物質、または細胞骨格の形成を調節し得る物質である、請求項１３または１４記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞活性化を制御し得る物質のスクリーニング方法、および細胞表面レセプター含有ＭＣの形成を調節し得る物質などを提供する。
【背景技術】
【０００２】
免疫応答は、抗原（Ａｇ）処理Ａｇ提示細胞（ＡＰＣ）（例、樹状細胞（ＤＣ））とＡｇ特異的Ｔ細胞との間の相互作用により媒介される特定のＡｇの認識によるＴ細胞の活性化により誘発される。この相互作用は、細胞間境界面での特定構造−免疫シナプス（immunological synapse：ＩＳ）の形成を介して生じる。細胞接触後１０−１５分以内に、細胞表面分子と膜会合性細胞内分子の会合を伴う動的な再構成が生じる。ＩＳ形成は、細胞骨格およびレセプターの会合を誘導するＴＣＲ媒介シグナル伝達に依存し、エフェクター機能を誘導する。ＴＣＲ刺激は、表面分子の特異的な凝集を誘導する：ＴＣＲ−ＣＤ３複合体は、他の分子（例、ＣＤ４／ＣＤ８、ＣＤ２、ＣＤ２８）とともにcentral (c-) supra molecular activation cluster（ＳＭＡＣ）として界面の中心に蓄積するものの、接着分子（例、ＬＦＡ−１）は、辺縁部（peripheral：p-）ＳＭＡＣとして周囲の領域に蓄積する。さらに、ＣＤ４３、ＣＤ４５のような大きな分子は、ＩＳから排除され、遠位（distal：d-）ＳＭＡＣへと位置付けられる。ＩＳのこれらの構造的特徴、特にｃ−ＳＭＡＣにおけるＴＣＲの蓄積から、ｃ−ＳＭＡＣは、Ｔ細胞のＡｇ認識および活性化を媒介し、ｐ−ＳＭＡＣは細胞接着を支持し、ＩＳを維持するために働くと従来考えられていた。
【０００３】
しかし、Ｔ細胞の初期活性化（チロシンリン酸化、カルシウム動員およびホスホイノシチド代謝を含む）は、ＩＳ形成よりもはるかに早く誘導される。実際、Ｌｅｅらは、ＬｃｋおよびＺＡＰ−７０のリン酸化が成熟ＩＳ形成よりも早く生じることを報告している（非特許文献１）。ＣＤ２ＡＰ欠損マウスの解析も同様に、Ｔ細胞活性化が成熟ＩＳの非存在下で誘導されることを示した（非特許文献２）。さらに、部分アゴニストペプチドは、成熟ＩＳの非存在下でＴ細胞を誘発し得た（非特許文献３、４）。これらの結果から、ＩＳ形成は、初期Ｔ細胞活性化に必要ではないかもしれず、従って、Ｔ細胞活性化におけるＩＳの機能および活性化の部位は理解し難い。対照的に、ＴＣＲ刺激により誘導されるシグナル伝達経路が、生化学的および遺伝学的アプローチにより広範に解析されている。ＴＣＲによるＡｇ認識は、ＳｒｃキナーゼＬｃｋによる、ＣＤ３分子、特にＣＤ３ζ鎖のＩＴＡＭのリン酸化を誘導し、ＺＡＰ−７０をリン酸化ＩＴＡＭにリクルートする。次いで、ＺＡＰ−７０が活性化され、２つの重要なアダプターＬＡＴおよびＳＬＰ−７６を含む幾つかのアダプター分子をリン酸化する。膜アダプター分子ＬＡＴは、脂質ラフトに局在し、Ｇａｄｓとの会合を介してＳＬＰ−７６をリクルートする。リン酸化ＬＡＴおよびＳＬＰ−７６は、多くの下流シグナル伝達分子をリクルートし、それにより種々のエフェクター機能の活性化が生じる。
【０００４】
Ｔ細胞の初期活性化におけるシグナル伝達分子の動的なリクルートが、固定化抗ＣＤ３Ａｂでの刺激により種々のＥＧＦＰ融合タンパク質を発現するJurkat細胞を用いて、Bunnellらにより解析された（非特許文献５）。それらの研究は、ＴＣＲ、キナーゼおよびアダプター分子を含む特殊なクラスターがＴ細胞の刺激後速やかに誘導されることを明らかに示している。しかし、固定化抗ＣＤ３Ａｂによる刺激を利用するこのシステムは、活性化の初期の解析が限定的なものとなり、そのため、生理学的条件下におけるＩＳ形成までの全プロセスは依然として不明である。一方、ＩＳ構造は、Ｔ細胞活性化に必要とされる持続シグナルの維持に必要とされることが示されている（非特許文献６）。ＭＡＰＫ活性化、カルシウム動員およびＡｋｔ活性化を含む持続シグナル伝達が、サイトカイン分泌およびエフェクター機能を誘導するＴ細胞活性化に必要とされることは周知である。ＩＳはシグナルの持続の維持に必要とであると考えられているが、このような持続シグナルの誘導のための真の部位は依然として不明である。
【非特許文献１】Lee et al., Science 295, 1539-42 (2002)
【非特許文献２】Lee et al., Science 302, 1218-22 (2003)
【非特許文献３】Irvine et al., Nature 419, 845-9 (2002)
【非特許文献４】Purtic et al., Proc Natl Acad Sci USA 102, 2904-9 (2005)
【非特許文献５】Bunnell et al., J Cell Biol 158, 1263-75 (2002)
【非特許文献６】Huppa et al., Nat Immunol 4, 749-55 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
Ｔ細胞等の細胞の活性化の機序の解明は、免疫疾患等の疾患に対する新たな作用機序を有する医薬品の開発につながる。本発明は、このような疾患に対する治療薬のスクリーニング方法などを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ＩＳ形成の動的プロセス、特に、活性化シグナルを誘導するＴＣＲシグナル伝達複合体の形成とのその関連性をリアルタイムで精密に解析するため、正常なＡｇ特異的Ｔ細胞のための平面二重層および全反射照明蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）の組合せシステムを利用した。このアプローチは、Ｔ細胞活性化におけるシグナル分子のナノスケールの移動の解析を可能とする。本発明者らは、本システムを利用することで、ＴＣＲ、キナーゼおよびアダプター分子を含むマイクロクラスター（ＭＣ）を同定し、二重層に対する細胞の接触直後からＩＳ形成の終了までに及ぶ全プロセスのモニターに成功した。本発明者らはまた、ＩＳではなくＭＣが初期および持続活性化シグナルの発生のための部位であることを見出した。ＭＣにおけるＴＣＲシグナル伝達複合体の形成は、活性化の誘導に必要である。ＩＳ形成後、このようなシグナル誘導性ＭＣはＩＳの辺縁部でのみ生じる。このことは、持続活性化シグナルがＩＳの辺縁部で生じ、ｃ−ＳＭＡＣからは生じないことを示唆する。本発明者らはまた、Ｔ細胞に限らず、クラスターを形成し得る細胞表面レセプターを有する細胞、特に免疫シナプスを形成し得る細胞でも同様にＭＣが形成され、細胞活性化が誘導され得ることを想起し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は下記の通りである。
〔１〕被験物質が、クラスターを形成し得る細胞表面レセプターを含有するＭＣの形成を調節するか否かを評価することを含む、細胞活性化を制御し得る物質のスクリーニング方法。
〔２〕免疫シナプスを形成し得る細胞の活性化を制御し得る物質のスクリーニング方法である、上記〔１〕の方法。
〔３〕ＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節するか否かを評価することを含む、Ｔ細胞活性化を制御し得る物質のスクリーニング方法。
〔４〕ＴＣＲ含有ＭＣが免疫シナプス辺縁部におけるＴＣＲ含有ＭＣである、上記〔３〕の方法。
〔５〕被験物質がＴＣＲ含有ＭＣの形成を抑制するか否かを評価することを含むＴ細胞活性化を阻害し得る物質のスクリーニング方法である、上記〔３〕または〔４〕の方法。
〔６〕ＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節するか否かの評価が、ＴＣＲ含有ＭＣへのキナーゼ分子および／またはアダプター分子のリクルートの評価である、上記〔３〕または〔４〕の方法。
〔７〕キナーゼ分子およびアダプター分子がそれぞれ、ＺＡＰ−７０およびＳＬＰ−７６である、上記〔４〕の方法。
〔８〕以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、上記〔３〕のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質、Ｔ細胞、およびＴ細胞活性化抗原をロードした脂質二重層含有媒体を接触させる工程：
（ｂ）被験物質の存在下において、二重層含有媒体を接触させたＴ細胞におけるＴＣＲ含有ＭＣの形成能を測定し、該形成能を、該被験物質の不在下における形成能と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、該形成を調節する被験物質を選択する工程。
〔９〕脂質二重層含有媒体が、抗原提示能を有する平面二重層または抗原提示細胞である、上記〔８〕の方法。
〔１０〕細胞活性化を制御し得る物質のスクリーニング用キットであって、
クラスターを形成し得る細胞表面レセプターを含有するＭＣの構成分子の発現ベクターまたは該発現ベクターが導入されたＴ細胞を含み、
該構成分子が検出可能に標識されている、キット。
〔１１〕クラスターを形成し得る細胞表面レセプターを含有するＭＣの形成を調節し得る物質を含む、細胞活性化制御剤。
〔１２〕免疫シナプスを形成する細胞の活性化制御剤である、上記〔１１〕の剤。
〔１３〕ＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節し得る物質を含む、Ｔ細胞活性化制御剤。
〔１４〕ＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節し得る物質が、免疫シナプス辺縁部におけるＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節し得る物質である、上記〔１３〕の剤。
〔１５〕ＴＣＲ含有ＭＣの形成を抑制し得る物質を含むＴ細胞活性化阻害剤である、上記〔１３〕の剤。
〔１６〕ＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節し得る物質が、ＴＣＲ含有ＭＣへのキナーゼ分子および／またはアダプター分子のリクルートを調節し得る物質、または細胞骨格の形成を調節し得る物質である、上記〔１３〕または〔１４〕の剤。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のスクリーニング方法は、細胞、例えば免疫シナプスを形成し得る細胞、特にＴ細胞の活性化を制御し得る物質の取得を可能とする。本発明のキットは、本発明のスクリーニング方法を簡便に行うことを可能とする。本発明の剤は、細胞の活性化の制御を可能とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、細胞活性化を制御し得る物質のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、被験物質が、クラスターを形成し得る細胞表面レセプターを含有するＭＣの形成を調節（例、促進または抑制）するか否かを評価することを含み得る。
【０００９】
クラスターを形成し得る細胞表面レセプター（以下、必要に応じて細胞表面レセプターと省略する）とは、細胞表面レセプターに対する刺激（例、リガンド刺激）の受容後に集積し、細胞内へとシグナルを伝達する細胞表面レセプターをいう。従って、本発明によれば、このような細胞表面レセプターを有する任意の細胞の活性化を制御し得る物質のスクリーニングが可能となる。このような細胞表面レセプターを有する細胞は特に限定されるものではないが、例えば、血液細胞（例、リンパ球（例、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞）、樹状細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好中球、好塩基球）、肝細胞、脾細胞、骨髄細胞、ランゲルハンス細胞、内皮細胞、肥満細胞、破骨細胞、骨芽細胞、またはこれらの幹細胞が挙げられる。これらの細胞のなかでも、血液細胞が好ましいが、免疫シナプスを形成し得る細胞であるＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、マクロファージがより好ましく、Ｔ細胞が最も好ましい。
【００１０】
好ましい実施形態では、本発明のスクリーニング方法は、被験物質が、クラスターを形成し得る細胞表面レセプターとして抗原レセプターを含有するマイクロクラスター（ＭＣ）の形成を調節（例、促進または抑制）するか否かを評価することを含み得る。抗原レセプターとしては、抗原刺激を細胞内に伝達するレセプターをいい、例えば、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）、Ｂ細胞レセプター（ＢＣＲ）、ＮＫ細胞レセプターが挙げられる。
【００１１】
抗原レセプター含有ＭＣは、抗原レセプターおよびその細胞内効果器、キナーゼ分子およびアダプター分子を含む、細胞活性化に必要なシグナル伝達を担うクラスターである。本発明者らは、かかる抗原レセプター含有ＭＣが細胞の活性化シグナルを発生する部位であり得ることを見出した。抗原レセプター含有ＭＣとしては、ＴＣＲ含有ＭＣが好ましい。
【００１２】
ＴＣＲ含有ＭＣは、ＴＣＲ−ＣＤ３複合体、キナーゼ分子およびアダプター分子を含む、Ｔ細胞活性化に必要なＴＣＲシグナル伝達（ＭＡＰＫ活性化、カルシウム動員およびＡｋｔ活性化を含む）を担うクラスターである。本発明者らは、かかるＴＣＲ含有ＭＣがＴ細胞の活性化シグナル（初期および持続活性化シグナルを含む）を発生する部位であり得ることを見出した。ＴＣＲ含有ＭＣに含まれるキナーゼ分子としては、活性化シグナルを下流に伝達し得るものである限り特に限定されないが、例えば、ＺＡＰ−７０、Ｌｃｋが挙げられる。ＴＣＲ含有ＭＣに含まれるアダプター分子としては、活性化シグナルを下流に伝達し得るものである限り特に限定されないが、例えば、ＳＬＰ−７６、ＬＡＴ、Ｎｃｋが挙げられる。本明細書中、ＴＣＲ含有ＭＣに含まれる任意の分子を意図する場合、ＴＣＲ含有ＭＣ構成分子と呼ぶ場合がある。
【００１３】
ＴＣＲ含有ＭＣは、Ｔ細胞と抗原提示細胞との接着面（免疫シナプス：ＩＳ）全体に形成され、初期活性化シグナルに重要な役割を果たし得るＴＣＲ含有ＭＣ、ならびに上記ＴＣＲ含有ＭＣのＩＳの中心への集合後にＩＳの辺縁部に形成される、持続活性化シグナルに重要な役割を果たし得るＴＣＲ含有ＭＣに大別できる。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、ＩＳの「辺縁部」とは、接着面の中心から、半径の約５〜２０％の距離、好ましくは半径の約５〜１５％の距離、より好ましくは半径の約５〜１０％の距離に位置する領域をいう。例えば、細胞直径１ｍｍ（半径５００ｎｍ）の場合、免疫シナプスの辺縁部は、接着面の中心から約４０〜５０ｎｍに位置し得る領域であり得る。
【００１５】
スクリーニング方法に供される被験物質は、いかなる公知化合物および新規化合物であってもよく、例えば、核酸（例、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）、糖質（例、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖）、脂質（例、飽和または不飽和の直鎖、分岐鎖および／または環を含む脂肪酸）、アミノ酸、蛋白質（例、オリゴペプチド、ポリペプチド）、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
【００１６】
本発明のスクリーニング方法は、被験物質が細胞表面レセプター含有ＭＣの形成を調節するか否かを可視的に評価可能である限り如何なる形態でも行われ得るが、例えば、細胞表面レセプター含有ＭＣへの所定の分子（例、キナーゼ分子、アダプター分子）のリクルートを可視的に評価することが挙げられる。これらは、顕微鏡下で観察する等の自体公知の方法により行うことができる。なお、本発明のスクリーニング方法は、他の指標と組合せて行うこともできる。このような他の指標としては、細胞表面レセプター含有ＭＣのキナーゼ分子およびアダプター分子の活性化・リン酸化、細胞内カルシウムシグナル、細胞骨格の形成などが挙げられる。
【００１７】
より詳細には、本発明のスクリーニング方法は、以下の工程（ａ１）〜（ｃ１）または（ａ２）〜（ｃ２）を含み得る：
（ａ１）被験物質、Ｔ細胞等の細胞（またはＢ細胞等の細胞：本方法論においてＴ細胞等の細胞はＢ細胞等の細胞と読み替え可能であるが、以下では必要に応じて省略する）、およびＴ細胞活性化抗原等の抗原をロードした脂質二重層含有媒体（または抗原自体）を接触させる工程：
（ｂ１）被験物質の存在下において、二重層含有媒体を接触させたＴ細胞細胞等の細胞におけるＴＣＲ等のレセプター（または抗原を接触させたＢＣＲ等のレセプター：本方法論においてＴＣＲ等のレセプターはＢＣＲ等のレセプターと読み替え可能であるが、以下では必要に応じて省略する）含有ＭＣの形成能を測定し、該形成能を、該被験物質の不在下における形成能と比較する工程；
（ｃ１）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、該形成を調節する被験物質を選択する工程。
以下、Ｔ細胞等の細胞を単にＴ細胞と、ＴＣＲ等のレセプターをＴＣＲと、Ｔ細胞活性化抗原等の抗原をＴ細胞活性化抗原と必要に応じて記載するが、それらに限定されるものではない。
【００１８】
（ａ２）被験物質、およびクラスターを形成し得る細胞表面レセプターを含有する細胞を接触させる工程：
（ｂ２）被験物質の存在下において、該細胞における、クラスターを形成し得る細胞表面レセプターを含有するＭＣの形成能を測定し、該形成能を、該被験物質の不在下における形成能と比較する工程；
（ｃ２）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、該形成を調節する被験物質を選択する工程。
【００１９】
上記工程（ａ１）では、Ｔ細胞、およびＴ細胞活性化抗原をロードした脂質二重層含有媒体に対して、被験物質が適切な培地中にて共存下におかれる。培地および培養条件は、Ｔ細胞が活性化し、ＴＣＲ含有ＭＣの観察が可能となり得るような条件である限り特に限定されない。上記工程（ａ２）は、Ｔ細胞活性化抗原をロードした脂質二重層含有媒体を使用しないこと以外は、工程（ａ１）と同様の方法により行われ得る。なお、工程（ａ２）は、細胞表面レセプターに対するリガンド（例、アゴニスト）の共存下で行われ得る。
【００２０】
本発明のスクリーニング方法で用いられる細胞は、当該細胞における細胞表面レセプター含有ＭＣの形成のモニターを可能とするため、検出可能であるように標識された、細胞表面レセプター含有ＭＣの構成分子が導入されたものであり得る。従って、本発明のスクリーニング方法でＴ細胞が用いられる場合、Ｔ細胞は、ＴＣＲ、ＣＤ３、上記キナーゼ分子（例、ＺＡＰ−７０）および上記アダプター分子（例、ＳＬＰ−７６）から選ばれる少なくとも１つの分子が蛍光標識された融合タンパク質を発現し得る。一方、本発明のスクリーニング方法でＢ細胞が用いられる場合、Ｂ細胞は、ＢＣＲ、Ｉｇａ／Ｉｇｂ、キナーゼ分子（例、Ｓｙｋ）、およびアダプター分子（例、ＢＬＮＫ）から選ばれる少なくとも１つの分子が蛍光標識された融合タンパク質を含み得る。なお、蛍光標識された複数種の分子（例、２または３種の分子）を発現するようにリンパ球を改変することもまた適切であり得る。このようなリンパ球は、例えば、蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現するベクター（後述）を導入することにより作製できる。用いられる蛍光タンパク質としては、例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ｍＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙが挙げられる。なお、用いられる細胞は、動物細胞、例えばマウス、ラット、サル、ヒト等の哺乳動物細胞由来であり得る。細胞はまた、初代培養細胞および細胞株のいずれでもよい。
【００２１】
Ｔ細胞活性化抗原等の抗原は、Ｔ細胞等の細胞に対する抗原として機能し得る限り特に限定されない。このような抗原としては、例えば、チトクロームｃ、卵白アルブミン等のタンパク質、ペプチドが挙げられるが、リンパ球活性化の強さおよび合成・精製のし易さ、ならびに脂質二重層への結合性の観点より、アミノ酸１０個程度の抗原ペプチドが好ましい。
【００２２】
脂質二重層含有媒体は、上記Ｔ細胞活性化抗原による抗原刺激をＴ細胞に導入できるものである限り特に限定されず、例えば、人工的に作製した平面二重層、抗原提示細胞（例、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、ランゲルハンス細胞）が挙げられる。
【００２３】
本発明において使用され得る平面二重層は、抗原提示に必要な分子を脂質二重層（例、リポソーム）に組み込むことにより作製できる。抗原提示に必要な分子としては、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子、ＩＣＡＭ−１が挙げられる。抗原提示に必要な分子は、アンカー（例、ＧＰＩ）を有し得る。抗原提示能を有する平面二重層は、自体公知の方法により作製できる（例、Dustin et al., Science 283, 649-50 (1999) 参照）。
【００２４】
抗原提示細胞は、動物細胞、例えばマウス、ラット、サル、ヒト等の哺乳動物細胞由来であり得る。抗原提示細胞はまた、初代培養細胞および細胞株のいずれでもよい。脂質二重層含有媒体として抗原提示細胞が使用される場合、Ｔ細胞と同種動物由来の細胞を用いることが好ましい。
【００２５】
脂質二重層含有媒体としては、上記のいずれも用いることができるが、ＴＣＲ含有ＭＣの形成を精密にモニターし得るという観点より、平面二重層が好ましく用いられる。
【００２６】
上記工程（ｂ１）では、先ず、被験物質の存在下において、抗原をロードした二重層含有媒体を接触させたＴ細胞（または抗原を接触させたＢ細胞）におけるＴＣＲ（またはＢＣＲ）含有ＭＣの形成能が測定される。ＴＣＲ含有ＭＣの形成能の測定は、自体公知の方法により行われ得る。例えば、ＴＣＲ含有ＭＣに見出される、標識された構成分子をモニターすることにより行われ得る。上記工程（ｂ２）では、細胞表面レセプター含有ＭＣの形成能の測定および以下の比較は、工程（ｂ１）と同様の方法により行われ得る。
【００２７】
次いで、被験物質の存在下において、抗原をロードした二重層含有媒体を接触させたＴ細胞におけるＴＣＲ含有ＭＣの形成能が、被験物質の不在下における、二重層含有媒体を接触させたＴ細胞におけるＴＣＲ含有ＭＣの形成能と比較される。形成能の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質の不在下における形成能は、被験物質の存在下における形成能の測定に対し、事前に測定したものであっても、同時に測定したものであってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定したものであることが好ましい。
【００２８】
上記方法の工程（ｃ１）では、二重層含有媒体を接触させたＴ細胞（または抗原を接触させたＢ細胞）におけるＴＣＲ（またはＢＣＲ）含有ＭＣの形成を調節する被験物質が選択される。例えば、該形成を促進する被験物質は、Ｔ細胞活性化が所望される疾患の予防・治療などのために使用され得る。Ｔ細胞活性化が所望される疾患としては、例えば、免疫不全症、感染症（例、ＨＩＶ、ＥＢＶ、ＨＣＶ）、癌が挙げられる。一方、該形成を抑制する被験物質は、Ｔ細胞活性化の阻害が所望される疾患の予防・治療などのために使用され得る。Ｔ細胞活性化の阻害が所望される疾患としては、例えば、自己免疫疾患（例、全身性エリトマトーデス、強皮症、シェーグレン症）、関節リウマチ、I型糖尿病、アレルギー（例、気管支喘息、花粉症、アトピー）が挙げられる。上記工程（ｃ２）は、工程（ｃ１）と同様の方法により行われ得る。なお、例えば、細胞としてＢ細胞を用いた場合には、Ｂ細胞活性化が所望される疾患、およびＢ細胞活性化の阻害が所望される疾患の予防・治療などに有用な物質を得ることができる。Ｂ細胞活性化が所望される疾患としては、例えば、免疫不全症（先天性免疫不全症を含む）、ＡＩＤＳ、感染症、慢性腎炎症候群が挙げられる。Ｂ細胞活性化の阻害が所望される疾患としては、例えば、自己免疫疾患（例、全身性エリトマトーデス、リウマチ）、溶血性貧血、重症筋無力症が挙げられる。
【００２９】
なお、本発明のスクリーニング方法においては、初期活性化シグナルに重要な役割を果たし得るＴＣＲ含有ＭＣ、ならびに持続活性化シグナルに重要な役割を果たし得るＴＣＲ含有ＭＣのいずれか一方および／または双方の形成を、被験物質が調節し得るか否かを評価することもできる。なお、初期活性化シグナルを調節し得る被験物質のスクリーニングは、被験物質がＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節するか否かを可視的に評価することに加え、ＣＤ３、Ｌｃｋ、ＺＡＰ−７０、ＬＡＴ、ＳＬＰ−７６のリン酸化、細胞内カルシウム動員、イノシトールリン脂質の代謝、細胞骨格の形成等の他の指標と組合せて行うことができる。持続活性化シグナルを調節し得る被験物質のスクリーニングは、ＭＡＰＫ（例、Ｅｒｋ）の持続的リン酸化、ＮＦ−kＢの活性化、Ａｋｔ、ＰＩ３Ｋの持続的活性化と細胞膜への局在、サイトカイン産生、細胞増殖、細胞骨格の形成等の他の指標と組合せて行うことができる。持続活性化シグナルは、漸増効果および機能的エフェクターＴ細胞分化に必要とされることが示されている（例、Huppa et al., Nat Immunol 4, 749-55 (2003); Dustin et al., Immunity 21, 305-14 (2004); Stoll et al., Science 296, 1873-6 (2002); Miller et al., Science 296, 1869-73 (2002); Maldonado et al., Nature 431, 527-32 (2004)参照）。従って、本発明のスクリーニング方法においては、特に、持続活性化シグナルの発生に重要な役割を担い得る、ＩＳの辺縁部におけるＴＣＲ含有ＭＣの形成を評価することもまた好ましい。
【００３０】
本発明はまた、上記スクリーニング方法を簡便に実施することを可能とするスクリーニング用キットを提供する。
【００３１】
本発明のキットは、上述のように、クラスターを形成し得る細胞表面レセプターを含有するＭＣの構成分子（この構成分子は検出可能に標識されている）の発現ベクターまたは該発現ベクターが導入されたＴ細胞等の細胞を含み得る。本発明のキットはさらに、抗原および／または脂質二重層含有媒体を含んでいてもよい。
【００３２】
発現ベクターで使用されるプロモーターは、導入対象であるＴ細胞で機能し得るものであれば特に制限されず、例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター、ならびにβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーターなどが挙げられる。また、使用されるプロモーターとしては、Ｔ細胞に特異的なプロモーターを用いてもよい。このようなプロモーターは、Ｔ細胞に特異的に発現している任意の遺伝子のプロモーターであり得るが、例えば、ＣＤ２プロモーター、ＣＤ４プロモーター、Ｌｃｋプロモーターを使用できる。
【００３３】
発現ベクターとして使用される基本骨格のベクターは、プラスミドまたはウイルスベクターであり得る。好適なウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスなどのウイルス由来のベクターが挙げられる。
【００３４】
本発明はさらに、クラスターを形成し得る細胞表面レセプター（例、ＴＣＲ）を含有するＭＣの形成を調節し得る物質を含む、細胞（例、Ｔ細胞）活性化制御剤を提供する。
【００３５】
クラスターを形成し得る細胞表面レセプターを含有するＭＣの形成を調節し得る物質としては特に限定されるものではなく、例えば、該ＭＣの構成分子に対するアンチセンス核酸、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、抗体、ドミナントネガティブ変異体の他、有機低分子化合物が挙げられる。好ましくは、このような物質としては、ＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節し得る物質が挙げられる。
【００３６】
ＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節し得る物質としては、例えば、ＴＣＲ含有ＭＣへのキナーゼ分子および／またはアダプター分子のリクルートを調節し得る物質、細胞骨格の形成を調節し得る物質が挙げられる。より詳細には、ＴＣＲ含有ＭＣの形成を調節し得る物質としては、ＴＣＲ含有ＭＣの形成を抑制し得る物質を用いることができる。ＴＣＲ含有ＭＣの形成を抑制し得る物質としては、例えば、Ｓｒｃファミリーキナーゼインヒビター（例、ＰＰ２）、アクチン重合インヒビター（例、サイトカラシンＢ、ラトランキュリンＡ）、脂質ラフト阻害剤（例、メチルβサイクロデキストリン）、マイクロチューブル阻害剤（例、タキソール）が挙げられる。
【００３７】
本発明の剤は、ＭＣの形成を調節し得る物質に加え、任意の担体、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００３８】
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤、あるいは散剤、顆粒剤等である。
【００３９】
非経口的な投与（例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【００４０】
本発明の剤の投与量は、有効成分の活性や種類、投与様式（例、経口、非経口）、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．００１ｍｇ〜約２．０ｇである。
【００４１】
本発明の剤は、例えば、医薬または試薬として有用である。本発明の剤が医薬または試薬として使用される場合、Ｔ細胞等の細胞の活性化またはその阻害のために、あるいは上述したようなＴ細胞等の細胞の活性化が所望される疾患またはＴ細胞等の細胞の活性化の阻害が所望される疾患の予防・治療のために用いることができる。
【００４２】
本明細書中で挙げられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【００４３】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。
【実施例】
【００４４】
材料及び方法
試薬
染色抗体および試薬は、以下の販売元から購入した：ビオチン化抗CD3ε (2C11)，eBioscienceから; 抗リン酸化ZAP-70, Cell Signalingから; 抗リン酸化チロシン, Upstateから； ストレプトアビジンAlexa Fluor 633および抗ウサギIgG Alexa Fluor 647, Molecular Probesから; 抗マウスIgG Cy3, Amercham Biosciencesから。Indo-1 AMは、Molecular Probesから購入した。PP2-Srcキナーゼインヒビターは、Calbiochemから購入した。
【００４５】
プラスミド構築
マウスCD3ζ-EGFP、ZAP-70-EGFP、SLP-76-EGFPおよびZAP-70-mRFP融合タンパク質は、マウスcDNAおよびpEGFP-N1 (BD Clontech, NJ, USA) またはpRSETB-mRFP1 (Campbell et al., Proc Natl Acad Sci USA 99, 7877-82 (2002)) (Dr.Roger Y. Tisien, UCSDより供与) を用いて組換えPCRにより作製し、レトロウイルスベクターpMX (T. Kitamura, Tokyo Universityより供与) にサブクローニングした。全ての融合タンパク質はリンカー配列を含まない。
【００４６】
初代培養細胞および導入
構築物は、リポフェクタミン (Invitrogen, CA, USA) を用いて、パッケージング細胞Phoenix (Dr. G. Norlan, Stanford Universityより供与) に一過性に導入した。レトロウイルス上清を、8000gで12時間遠心分離し、10倍に濃縮した。CD4+ T細胞をRag2-/-バックグラウンドAND-Tgマウスから精製し、3μm PCC88-104 (KAERADLIAYLKQATAK：配列番号１) と放射線処理したC3H/HeNマウス由来の全脾細胞とで刺激した。刺激の1日および2日後、細胞をレトロウイルス上清中に懸濁し、8μg/mlポリブレン (Sigma, MO, USA) および200 U/mlヒト組換えIL-2 (Ajinomonoto, Japan) の存在下で、1000gで90分間遠心分離した。4日目に、EGFPを発現している60-80%のT細胞を、FACSAria (BD, NJ, USA) により選別し、蛍光強度の点で均質な集団を得た。細胞を、組換えIL-2とRPMI培地＋10% FCSで5-14日間維持した。Srcキナーゼブロッキングアッセイでは、CD3ζ-EGFPまたはZAP-70-EGFP発現AND-Tg細胞を、培養培地においてSrcキナーゼブロッカーPP2 (10μM) とともに37℃で20分間予めインキュベートした。この薬物を、実験を通じてアッセイ培地中に含ませた。
【００４７】
平面二重層
グリコホスファチジルイノシトール (GPI) アンカーを有するマウスクラスII分子I-Ek (Ek-GPI) およびGPIアンカーを有するマウスICAM-1 (ICAM-1-GPI) を、トランスフェクトしたCHOおよびBHK細胞からそれぞれ精製し、DOPCリポソーム (Avanti Polar Lipid, AL. USA) に組み込んだ。Ek-GPIおよびICAM-1-GPIを含む平面二重層を、フローセルチャンバーシステム (Bioptechs, PA, USA) で形成させた。I-Ekの定量のため、C3Hマウス由来の活性化B細胞およびEk-GPI含有DOPCリポソームをロードしたシリカビーズ (Bangs Laboratories, USA) を、FITC標識抗I-Ek mAbs (14-4-4) で染色し、FACSにより解析した。二重層のI-Ekの密度は、活性化B細胞上での密度よりも2.3倍高かった。pH4.5クエン酸緩衝液中において、平面二重層に100μM PCC88-104を37℃で一晩ロードし、5%脱脂粉乳PBS中にて37℃で1時間ブロッキングし、その上にＴ細胞をのせた。各GPIアンカータンパク質の移動度を、実験前に蛍光標識した同じGPIアンカータンパク質を用いた解析において調べた。平面二重層の全ての実験を、1%ヒト血清アルブミン、2 mM MgCl2、および1 mM CaCl2を含むHBS培地を用いて行った。
【００４８】
TIRF画像化
細胞を、既報（Axelrod, D. J Cell Biol 89, 141-5 (1981); Tokunaga et al., Biochem Biophys Res Commun 235, 47-53 (1997)）のTIRFMasを用いて画像化した。固相状態レーザーからのビーム (488nm, 20mW, SAPPHIRE 488-20-OPS, COHERENT, CA) を、照射のために倒立顕微鏡 (IX-81, Olympus, Japan) に導入した。画像を、EB-CCDカメラ (C-7190-23, Hamamatsu Photonics, Japan) で捕捉した。画像記録および解析は、AquaCosmos Software (Hamamatsu Photonics, Japan) を用いて行った。本発明者らのTIRF顕微鏡システムの高い感度および解像度は、Photo bleachingに起因する最小の蛍光減衰により、蛍光MCの形成およびシグナル伝達プロセスの観察を可能とする。
【００４９】
脂質二重層を用いた蛍光画像化
平面二重層上の細胞を、示された時点で固定し、4%パラホルムアルデヒドで一晩固定した。次いで、細胞を一次および二次抗体で室温にて30分間染色した。細胞内分子の染色前に、細胞を、0.05% Triton X-100 PBS中にて室温にて1時間、3% BSA PBS中にて室温にて30分間、それぞれ、透過処理 (permeabilization) およびブロッキング処理した。各抗体を以下の濃度で用いた: 抗CD3ε, 5μg/ml; 抗pZAP-70, 1μg/ml; 抗リン酸化チロシン, 2μg/ml; 抗マウスIgG, 10μg/ml; 抗ウサギIgG, 10μg/ml。全ての画像を、Leica DMIRES2システムで収集し、データをLeica confocal softwareを用いて解析および表した。
【００５０】
カルシウム誘導アッセイ
CD3ζ-EGFP発現AND-Tg CD4+ T細胞を、1%ウシ血清アルブミンを含む20μM Indo-1 HBSS緩衝液中で37℃で20分間インキュベートした。細胞を2回洗浄し、アッセイ培地に再懸濁し、平面二重層上にロードした。15秒毎にCD3ε-EGFPとIndo-1の405nm/495nm波長強度を測定し、MC形成と細胞内カルシウム濃度を同時に観察した。Olympus IX81蛍光顕微鏡により全ての画像を収集し、蛍光強度の測定および算出は、MetaMorph (Universal Imaging Corporation, PA, USA) により行った。
【００５１】
T-B細胞相互作用アッセイ
B細胞をC3H/HeN脾細胞から精製し、10μg/ml LPSおよび3μM PCCを含む培養培地中でインキュベートした。24-36時間後、死細胞を、Lympholyte-M（Cedarlane,Canada）によりLPS刺激B細胞から除き、AND-Tg CD4+ T細胞のためのAPCとして用いた。ポリ-Lリジンでコーティングしたカバースリップ上にB細胞をアプライし、その後、T細胞をロードした。結合後、細胞を4%パラホルムアルデヒトで示された時間固定し、ビオチン化抗CD3ε抗体およびAlexa Fluor標識ストレプトアビジンで染色した。全ての画像を、Leica DMIRES2顕微鏡により収集した。CD3ζ-EGFP、ZAP-70-EGFPおよびSLP-76-EGFPをそれぞれ、野生型、ZAP-70-欠損 (p116) およびSLP-76欠損Jurkat T細胞 (J14) に導入した。Jurkat T細胞を、記載されるようにSEEで予めパルスしたRaji細胞に結合させた。
【００５２】
画像処理およびデータ解析
MC中の分子数を、単一EGFP分子の平均蛍光強度で除算した単一MCの蛍光強度として算出した。キモグラフおよび表面プロットをそれぞれ、「Montage」および「Surface plot」により表した。個々のMCを、「Manual tracking」により追跡し、各MCの面積および強度をImageJ (NIH, MD, USA) における「Analyze particles」により算出した。
【００５３】
実施例１：pMHCとの初期接触部位でのTCRマイクロクラスター
本発明者らは、IS形成のマクロ構造の基礎を解析することを意図したため、GPIアンカー型ICAM-1およびハトチトクロームcペプチド88-104 (PCC88-104) をロードしたMHCクラスII (I-Ek) を取り込んだ平面二重層（Dustin et al., Science 283, 649-50 (1999)）と、T細胞のAg刺激の際にクラスター化分子の動的なリクルートを検出するための指向型TIRFMとの組合せシステムを利用した。インビトロで活性化され、レトロウイルス媒介遺伝子移入によりEGFPタグ化CD3ζ、ZAP-70およびSLP-76に感染したAND TCRトランスジェニック (AND-Tg) マウス由来のPCC88-104特異的T細胞を平面二重層上にアプライした。既報（Monks et al., Nature 395, 82-6 (1998); Grakoui et al., Science 285, 221-7 (1999)）の通り、細胞-二重層の接触後5-10分で、TCRから構成されるc-SMACとLFA-1から構成されるp-SMACが観察され、ISが形成された。
CD3ζ-EGFP発現T細胞におけるc-SMACをこのシステムで解析したとき、本発明者らは、既報（Freiberg et al., Nat Immunol 3, 911-7 (2002); Bunnell et al., J Cell Biol 158, 1263-75 (2002); Barda-Saad et al, Nat Immunol 6, 80-9 (2004)）により示唆されるように、c-SMACが単に蓄積したCD3ζからではなく多量のCD3ζ-MCから構成されることを見出した。次いで、本発明者らは、これらのMCの起源に疑問をもち、初期細胞−二重層接触を再度追跡した（タイム０）。CD3ζ-MCは、平面二重層との細胞接触後5秒で生じた（図１Ａａ）。最初の1-2分間、T細胞は接触領域上で増殖し、多数のMCがexpansion phase全体にわたって生じた。MC形成が、pMHCとの相互作用により誘導された。なぜなら、MCは、Agの非存在下では平面二重層で生じず、また、細胞内にも観察されなかったためである。このことは、MCが予め形成されなかったことを示す。expansion phaseの間、各CD3ζ-MCは移動せず、同じ位置に残存した。最大の細胞スプレッディングに到達後、CD3ζ-MCは中心に移動し始め、5分でc-SMACを形成した（contraction phase）（図１Ｂａ、１Ｃａ、ｄ、ｇ）。移動の時間経過をキモグラフに示す（図１Ｂ）。この画像から、CD3ζ-MCのサイズおよび強度が、MCが中心に移動するにつれて増加したことは明らかである。このことは、MCが中心へのそれらの路で融合したことを示唆する。CD3ζを含む個々のMCの移動の軌跡は、殆どのCD3ζタンパク質がc-SMACにトランスロケートしたことを明確に示した（図１Ｃｄ、ｇ）。
このような個々の追跡により、本発明者らは、平均速度および移動距離を定量した。expansion phaseの間、CD3ζ-MCは、最初に中心に、次いで辺縁部に出現し、同じ位置に残存した。平均速度は、中心では6.8±1.9 nm/sであり、辺縁部では19.0±7.9 nm/sであった。contraction phaseの間、より遠位の領域にある辺縁部MCは、中心領域のもの (4.4±1.9 nm/s) よりも、中心に向かってより早く移動した (92.5±31.0 nm/s)。contraction phaseの後、速度は、定常速度 (24.9±12.6 nm/s) に減少した。CD3ζ-MCの大部分が中心に到達し、平均移動距離は、中心MCについては0.84±0.45μm/sであり、辺縁部MCについては3.1±1.2μm/sであった。
単一MC内のCD3ζ-EGFPタンパク質数は、蛍光強度から評価する限り、このシステムではおよそ30-100であった。CD3ζ-EGFPおよび内因性CD3ζの発現レベルは、細胞内染色により比較すると、前者が後者よりも2-3倍高く発現していることが見出された（データ示さず）。従って、本発明者らは、1つのMC内のCD3ζタンパク質数はおよそ40-150であると見積もった。
本発明者らはまた、MC内に蓄積したCD3ζ-EGFPの占有度を知るため、個々のCD3ζ-MCの面積および相対蛍光強度を定量した。MCの面積および相対強度の平均合計は、バックグランドと比較したとき全接触面積のうち9.0±3.0%および32.4±7.5%であった。MCの内側の蛍光強度は、MCの外側のものよりも10.4±4.7倍であった。これらのデータは、検出不能な小さなクラスターの潜在的存在に起因して、MC数および蛍光強度をより少なく見積もっているのかもしれない。
【００５４】
実施例２：初期マイクロクラスターは、TCR、キナーゼおよびアダプタータンパク質を含む
MCの生成およびトランスロケーションにおけるTCRシグナル伝達複合体の空間-時間ダイナミズムを理解するため、本発明者らは、CD3に会合する重要なキナーゼとしてZAP-70-EGFPを、活性化シグナルを下流に伝達する重要なアダプター分子としてSLP-76-EGFPをそれぞれ発現するT細胞を解析した。ZAP-70-EGFPおよびSLP-76-EGFPの双方はそれぞれ、ZAP-70欠損およびSLP-76欠損Jurkat細胞におけるIL-2産生のTCRシグナル伝達を回復させ得た（データ示さず）。ZAP-70およびSLP-76は、細胞-二重層の接触後速やかにMCとして出現し、MC数は、CD3ζ-EGFPと同様に、最大細胞スプレッドに到達するまで増加する（図１Ａｂ、ｃ）。これらのMCは、expansion phaseの間移動しなかった（図１Ｂｂ、ｃ、およびＣｂ、ｃ）。しかし、それらの挙動は、contraction phase後のCD3ζのものとは異なっていた。ZAP-70-MCの大部分は中心に到達せず、辺縁部付近に留まり消失した（図１Ａｂ、Ｂｂ）が、幾らかのZAP-70は、c-SMAC付近に蓄積した。これと一致して、ZAP-70-MCの総移動距離は、はるかに短かった（図１Ｃｅ）。対照的に、SLP-76-EGFPを含む初期MCが、expansion phaseにCD3ζおよびZAP-70と同様に形成されたが、幾らかのSLP-76-MCが初期のcontraction phaseに中心に移動し（図１Ｃｃ、ｆ、ｉ）、殆ど全てがcontraction phase後に消失した（図１Ｂｃ）。これらの結果は、ZAP-70およびSLP-76がIS形成に冗長ではない機能を有し得ることを実証する。ZAP-70およびSLP-76を含むMCの消失は、CD3ζとは異なり、ZAP-70-およびSLP-76-MCの大部分がcontraction phase後に辺縁部でのみ生じ、c-SMACにトランスロケートしないことを示唆する。
単一のMCがT細胞活性化に必要とされる全ての分子を含むか否かを試験するため、TCR、ZAP-70およびSLP-76の共局在を解析した。ZAP-70-EGFP（図２Ａ、Ｂ）およびSLP-76-EGFP（図２Ｃ、Ｄ）をトランスフェクトしたAND-Tg T細胞を、細胞-二重層接触後の種々の時点で固定し、次いで抗CD3εAbで染色した。接触開始時およびexpansion phaseの間（1分）、ZAP-70およびCD3ε、SLP76およびCD3εは、同じMCに共局在した（図２Ａａ−ｄ、Ｃａ−ｄ）。ZAP-70およびSLP-76は、CD3εが中心にトランスロケートし始めてから３分で辺縁部に主に存在した（contraction phase、図２Ａｅ−ｈおよびＣｅ−ｈ）。次いで、ZAP-70およびSLP-76の共局在を解析するため、ZAP-70-mRFPおよびSLP-76-EGFP融合タンパク質の構築物をAND-Tg T細胞に共トランスフェクトし、細胞を平面二重層上にのせた。ZAP-70およびSLP-76の共局在は、細胞−二重層接触の初期に認められた（図２Ｅ−Ｆ）。本発明者らはさらに、タンパク質の３つの異なる組合せにおける８つの代表的な細胞における全てのMCを計測することによって、これらの３つの分子の共局在を統計学的に解析し（例、図２Ａａ−ｄ、Ｃａ−ｄおよびＥａ―ｄ）、２つの分子の共局在を試験した。ZAP-70およびCD3ζ、SLP-76およびCD3ζ、ZAP-70およびSLP-76の共局在の百分率はそれぞれ、90.2±7.7%、85.3±6.5%および88.5±7.2%であった。このことは、大部分のMCが共局在を示すことを示唆する。これらの結果は、CD3ζ、ZAP-70およびSLP-76が全ての初期MCにおいて共局在することを示す。
次いで、本発明者らは、これらのMCがより生理学的条件下で生成されるかを試験した。本発明者らは2つの局面（低濃度のアゴニスティックペプチドによる刺激および細胞間接触のMC）を解析した。PCC88-104の濃度をインビトロ刺激の至適下濃度まで希釈した場合、c-SMACのサイズおよび密度の双方が徐々に減少した。しかし、全てのCD3ζ-、ZAP-70-およびSLP-76-MCが、0.8μMの至適下PCC88-104濃度で有意に検出された。これらの特徴は、全ての濃度のPCC88-104でZAP-70-およびSLP-76-MCで同様に観察された。次いで、T細胞-APC相互作用下にあるMC形成を解析するため、本発明者らは、CD3ζ、ZAP-70またはSLP-76を発現するJurkat T細胞株を作製し、これらの細胞を、SEEをロードしたRaji細胞に結合させた。これらの分子のそれぞれのMC形成は、細胞間接触部位で明確に観察された。成熟ISの形成後、CD3ζおよびZAP-70の一部がc-SMACに蓄積され、TCRと共局在した。SLP-76は、サイトゾル中に主に検出され、刺激の非存在下では接触部位に検出されなかった（図４Ｃｄ−ｇ）。これらの結果は、T細胞-二重層相互作用からの本発明らのデータと一致する。さらに、本発明者らはまた、細胞間接触の初期のMC形成を、SLP-76-EGFPを発現するAND-Tg T細胞およびPCC88-104をパルスした活性化B細胞を用いて試験した。実際、MCは、細胞接触の非常に初期に界面上に観察された。成熟ISの形成後、SLP-76はMCに局在しないようであった。小さなMCではなく輝くクラスターのみがこのシステムで検出され得たことは注目すべきである。
【００５５】
実施例３：T細胞活性化の開始のための部位としてのTCRマイクロクラスター
活性化シグナルを生じる部位を同定するため、本発明者らは、CD3ζ-EGFP発現T細胞におけるチロシンリン酸化状態を、抗リン酸化ZAP-70 (ZAP-70) mAb（図３Ａ、Ｂ）および抗リン酸化チロシン(pY) mAb（図３Ｃ、Ｄ）を用いて試験した。expansion phaseの間、殆どのCD3ζ含有MCは、抗pZAP-70（図３Ａｃ）および抗pYAbs（図３Ｃｃ）で共染色されたが、辺縁部のMCのみが収縮の開始後に染色された（図３Ａｇ、Ｃｇおよび図３Ｅｃ、Ｆｃ）。この共局在は、辺縁部に限定され、細胞の内側には限定されなかった。このことは、ZAP-70および他の分子のリン酸化がexpansion phaseにおいて殆どのMCで誘導され、次いでcontraction phase後においてMCの辺縁部で主に誘導されることを示唆する。T細胞活性化の再設定を示唆するFreibergらの報告によれば、pZAP-70の中心クラスター化が、T細胞-APC接触の3分後ではなく７分後に一過的に示された。従って、本発明者らは、成熟ISの形成を通じてT細胞-二重層接触におけるpZAP-70含有MCのキネティクスを注意深く解析した。しかし、およそ７分でのpZAP-70の蓄積は明らかではなかった。pZAP-70は、１分以内にTCR-MCと共局在した。初期pZAP-70-MCはまもなく消失し、辺縁部pZAP-70-MCのみ残存した。これは、おそらく、ZAP-70-MCが辺縁部で持続的に生じ、pZAP-70-MCがそこで新生されたためである。
TCR、キナーゼおよびアダプター分子を含有するMCが、初期活性化シグナルを生じる部位であるという知見をさらに証明するため、本発明者らは、MC形成のキネティクスおよび細胞内カルシウムレベルを同時にモニターした。CD3ζ-EGFPを発現するAND-Tg T細胞を、Indo-1で標識し、PCC88-104をパルスした平面二重層上にのせた。図４Ａに示されるように、細胞内カルシウムレベルは、細胞-二重層接触の30秒以内に速やかに上昇し、実験期間全体（少なくとも10分）を通じて保持された。これらのカルシウム動員は、expansion phaseにおける幾らかのMCの形成と並行して誘発された。持続的カルシウムレベルは、contraction phaseにおけるc-SMAC形成により変化せず、細胞内カルシウムレベルの振幅は認められなかった。本発明者らがペプチドをパルスすることなく、平面二重層上にIndo-1ロード細胞をのせたとき、細胞は、MC形成も細胞内カルシウム上昇も示さなかった（図４Ｂ）。これらの結果は、MCがリン酸化およびカルシウムフラックスの開始に十分であること、ならびにシグナル伝達分子が刺激後にMCへと速やかにリクルートされることを示唆する。
【００５６】
実施例４：機能的マイクロクラスターのチロシンキナーゼ依存性形成
SrcファミリーキナーゼLckおよびFynは、CD3ζのリン酸化およびZAP-70のリクルートによる近位TCRシグナル伝達に重要なチロシンキナーゼである。従って、本発明者らは、SrcキナーゼインヒビターPP2の存在下でMC形成およびZAP-70のリクルートを試験した。CD3ζ-EGFPまたはZAP-70-EGFPを発現するAND-Tg T細胞をPP2で処理し、平面二重層上にのせた。予期された通り、ZAP-70のMC形成は、未処理T細胞で観察されたZAP-70-MC（図５Ａｅ−ｈ）に比し、初期および後期の双方のタイムコースにおいてPP2によりブロックされた（図５Ｂｅ−ｈ）。予想外なことに、CD3ζ-MCは、PP2処理T細胞でさえも生じ（図５Ａｅ−ｈ）、中心領域にトランスロケートした（図５Ｂａ−ｄ）が、未処理細胞のものとは様式が異なっていた。PP2処理T細胞では、CD3ζクラスターは、多方向に移動し、互いに融合し、c-SMAC様蓄積を生じたが、細胞はスプレッディングしなかった。これらの結果は、CD3ζ-MC形成がSrcファミリーキナーゼ非依存性様式で初期に誘発され得るが、機能的MCのその後の生成およびc-SMACを形成するMCの単一方向へのトランスロケーションが、キナーゼ依存性様式で進行することを示唆する。
【００５７】
実施例５：ISの辺縁部での新しいマイクロクラスターにおける持続シグナルの発生
シグナル伝達MCの迅速なアッセンブリーとは対照的に、TCR媒介シグナル伝達は、T細胞-APCの結合後数時間にわたり持続し、IS形成が連続的なTCRシグナル伝達に必要とされる（Huppa et al., Nat Rev Immunol 3, 973-83 (2003)）。成熟IS形成後でさえもシグナル伝達が持続する部位を同定するため、本発明者らは、IS形成の終了後、TIRFMにより、CD3ζ、ZAP-70およびSLP-76含有MCを解析した。驚くべきことに、lamellipodia様構造の多数のCD3ζ-MCが、辺縁部で連続的に生じ、中心に連続的にトランスロケートした（図６Ａａ−Ｄａ）。一つのMCを構成するCD3ζタンパク質の数は、細胞がc-SMACを有する場合、辺縁部でおよそ40-110であり、c-SMACにより近い位置では110-290であると推定された。対照的に、ZAP-70-MCもまた、辺縁部で生じ、ZAP-70-MCの大部分は、図６Ａｂ−Ｄｂに示されるように中心への路にディスロケートした。同様に、SLP-76-MCは、辺縁部に広く連続的に生じたが、完全に消失した（図６Ａｃ−Ｄｃ）。これらの結果は、個々のMCを追跡、定量することにより確認できた。ZAP-70-およびSLP-76-MCの移動距離 (それぞれ0.64±0.43および0.59±0.38μm/s) は、CD3ζ-MCのもの (2.18±0.81μm/s) よりもはるかに短かった。これらの結果は、CD3ζが中心に蓄積するものの、細胞内シグナル伝達分子ZAP-70およびSLP-76が、ISの辺縁部にあるMCのTCR-CD3のみと主に会合することを示す。これを確認するため、本発明者らは、新たに生成したMCにおけるCD3ζおよびZAP-70の共局在を試験した。図７に示されるように、これらの分子は、成熟IS形成後に辺縁部で同じMCに共局在した。さらに、pZAP-70およびリン酸化チロシン染色は、成熟ISの中心よりもむしろISの辺縁部に主に局在した（図３Ａｊ、ｋおよびＣｊ、ｋ）。このことは、リン酸化が、連続的に生成した新たな辺縁部MCにて主に生じていることを示唆する。まとめると、これらの結果は、シグナル伝達分子が、持続性シグナルが進行する辺縁部にて、TCR-MCと一過的に会合することを示唆する。
【００５８】
実施例６：細胞骨格形成インヒビターによるマイクロクラスター形成の阻害
細胞骨格形成インヒビターとして、アクチン重合を阻害するサイトカラシンＢを用いた。CD3ζ-EGFPを遺伝子導入したAND-Tg T細胞を、サイトカラシンBの存在下にて、抗原がのせてある脂質二重層に接着させた。T細胞と脂質二重層との接着面上にCD3ζ-MCが形成され、また、抗リン酸化ZAP-70抗体にて染色されたことより、このCD3ζ-MCが機能的であることが判明した。しかし、T細胞はスプレッディングせず、それ以降のCD3ζ-MCやc-SMACしいてはISも形成されなかった。以上より、細胞骨格形成の阻害によりMC形成が阻害されることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１Ａ】細胞-二重層接触を通じて空間-時間的様式で動的に分布する、CD3ζ、ZAP-70およびSLP-76のマクロクラスターを示す図である。CD3ζ-EGFP (a)、ZAP-70-EPGF (b) またはSLP-76-EGFP (c) を発現するAND-Tg T細胞を、未標識I-EkおよびICAM-1を含有する平面二重層 (PCC88-104で予めパルス) 上にのせ、TIRFMを用いて映像速度 (30フレーム/秒) で画像化した。各画像を示された時点にて一つだけ選んだ。
【図１Ｂ】細胞-二重層接触を通じて空間-時間的様式で動的に分布する、CD3ζ、ZAP-70およびSLP-76のマクロクラスターを示す図である。CD3ζ- (a)、ZAP-70- (b) またはSLP-76- (c) MCの、中心への移動および蓄積または消失を、キモグラフで水平要素により示す。
【図１Ｃ】細胞-二重層接触を通じて空間-時間的様式で動的に分布する、CD3ζ、ZAP-70およびSLP-76のマクロクラスターを示す図である。代表的なCD3ζ- (a, d, g)、ZAP-70- (b, e, h) およびSLP-76- (c, f, i) MCを、細胞-二重層接触後に追跡し、移動経路を3つのphase (expansion phase (aおよびbでは0-75秒、ならびにcでは0-35秒)、contraction phase (dおよびeでは75-150秒、ならびにfでは35-70秒)、ならびにc-SMACによる post-contraction phase (gおよびhでは150-225秒、ならびにiでは70-105秒) において別々に示す。
【図２Ａ】細胞-二重層接触直後にCD3ζ-MCにリクルートされるZAP-70を示す図である。ZAP-70-EGFP発現AND-Tg T細胞を、I-EkおよびICAM-1を含む平面二重層上にのせた。細胞を1分 (a-d)、3分 (e-h) または30分 (i-l) 後に固定し、CD3ε (Alexa Fluor633) について染色した。EGFP融合タンパク質およびCD3εはそれぞれ、偽着色した緑および赤である (スケールバー=5μm)。
【図２Ｂ】対角線 (図２Ａにおける黄色線) 上のZAP-70-EGFP (a, c, e)、ならびにCD3ε (b, d, f) の蛍光強度の定量を示す図である。
【図２Ｃ】細胞-二重層接触直後にCD3ζ-MCにリクルートされるSLP-76を示す図である。SLP-76-EGFP発現AND-Tg T細胞を、I-EkおよびICAM-1を含む平面二重層上にのせた。細胞を1分 (a-d)、3分 (e-h) または30分 (i-l) 後に固定し、CD3ε (Alexa Fluor633) について染色した。EGFP融合タンパク質およびCD3εはそれぞれ、偽着色した緑および赤である (スケールバー=5μm)。
【図２Ｄ】対角線 (図２Ｃにおける黄色線) 上のSLP-76-EGFP (a, c, e)、ならびにCD3ε (b, d, f) の蛍光強度の定量を示す図である。
【図２Ｅ】細胞-二重層接触直後にCD3ζ-MCにリクルートされるZAP-70およびSLP-76を示す図である。SLP-76-EGFPおよびZAP-70-mRFPを同時に発現するAND-Tg T細胞を、I-EkおよびICAM-1を含む平面二重層上にのせた。細胞を1分 (a-d)、3分 (e-h) または30分 (i-l) 後に固定した。EGFPおよびmRFP融合タンパク質はそれぞれ、偽着色した緑および赤である (スケールバー=5μm)。
【図２Ｆ】細胞-二重層接触直後にCD3ζ-MCにリクルートされるZAP-70およびSLP-76を示す図である。対角線 (図２Eにおける黄色線) 上のSLP-76-EGFP (a, c, e)、ならびにZAP-70-mRFP (b, d, f) の蛍光強度を定量した。
【図３Ａ】ISの辺縁部でのみリン酸化ZAP-70を含むCD3ζ-MCを示す図である。CD3ζ-EGFP発現AND-Tg T細胞を、示された時点で固定し、pZAP-70 (Alexa Fluor633) について染色した。白四角で囲まれた領域を、図３Ｅで拡大した (スケールバー=5μm)。
【図３Ｂ】対角線 (図３Ａにおける黄色線) 上のCD3ζ-EGFP (a, c, e)、およびpZAP-70 (b, d, f) の蛍光強度を示す図である。
【図３Ｃ】ISの辺縁部でのみチロシンリン酸化タンパク質を含むCD3ζ-MCを示す図である。CD3ζ-EGFP発現AND-Tg T細胞を、示された時点で固定しリン酸化チロシン (Alexa Fluor633) について染色した。白四角で囲まれた領域を、図３Ｆで拡大した (スケールバー=5μm)。
【図３Ｄ】対角線 (図３Ｃにおける黄色線) 上のCD3ζ-EGFP (a, c, e)、およびリン酸化チロシン (b, d, f) の蛍光強度を示す。
【図３Ｅ】図３Ａの四角領域の拡大画像を示す図である。矢頭は、CD3ζおよびpZAP-70 (a-c) の双方を含むMCを示す。
【図３Ｆ】図３Ｃの四角領域の拡大画像を示す図である。矢頭は、CD3ζおよびリン酸化チロシン (Fa-c) の双方を含むMCを示す。
【図４Ａ】初期接触部位におけるMCの形成によるカルシウムインフラックス (influx) の誘導を示す図である。CD3ζ-EGFP発現AND-Tg T細胞にIndo-1をロードし、I-EkおよびICAM-1を含む、PCC88-104パルスした平面二重層上にのせた。CD3ζ-MC (a) およびカルシウムインフラックス (b) を、EGFPおよびIndo-1の同時モニタリングよる蛍光顕微鏡により検出した。5つの代表的な細胞を異なる色で示す。(a) における1フレームおよび (b) における1ポイントはそれぞれ、30および15秒に対応する。
【図４Ｂ】初期接触部位におけるMCの形成によるカルシウムインフラックス (influx) の誘導を示す図である。CD3ζ-EGFP発現AND-Tg T細胞を、ペプチドをパルスしなかった平面二重層上にのせた。CD3ζ-MC (a) およびカルシウムインフラックス (b) を 図４Ａと同様の方法により検出した。
【図５Ａ】Srcファミリーキナーゼによる、MCへのZAP-70リクルートの調節、およびCD3ζ-MC形成の非調節を示す図である。CD3ζ-EGFP (a-d) またはZAP-70-EGFP (e-h) を発現するAND-Tg T細胞を、I-EkおよびICAM-1を含む、PCC88-104パルスした平面二重層上にのせた。細胞を、細胞接触の3または30分後に固定し、共焦点顕微鏡により画像化した (スケールバー=5μm)。
【図５Ｂ】Srcファミリーキナーゼによる、MCへのZAP-70リクルートの調節、およびCD3ζ-MC形成の非調節を示す図である。同じ細胞を、10μM PP2とともに37℃で20分間予めインキュベートし、図５Ａに記載されるように画像化した。
【図６Ａ】成熟IS形成後に辺縁部に連続的に生じる、CD3ζ-、ZAP-70-およびSLP-76-MCを示す図である。CD3ζ-EGFP (a)、ZAP-70-EGFP (b) またはSLP-76-EGFP (c) を発現するAND-Tg T細胞を、未標識I-EkおよびICAM-1を含む、PCC88-104で予めパルスした平面二重層上にのせた。細胞-二重層接触の15分後の画像を、TIRFMにより映像速度 (30フレーム/秒) で収集した。
【図６Ｂ】CD3ζ- (a)、ZAP-70- (b) およびSLP-76- (c) MCのTIRF画像の表面プロッティングを示す図である。
【図６Ｃ】CD3ζ- (a)、ZAP-70- (b) またはSLP-76- (c) MCの90秒の移動を示すキモグラフである。
【図６Ｄ】代表的CD3ζ- (a)、ZAP-70- (b)またはSLP-76- (c) MCの追跡による移動経路を示す図である。
【図７】成熟IS形成後に辺縁部に新たに生じたMCにおけるTCRおよびZAP-70の共局在を示す図である。ZAP-70-EGFP発現AND-Tg T細胞を、TCRβ (赤) について染色し、平面二重層上にのせた。細胞を、細胞接触の20分後に固定し、共焦点顕微鏡により画像化して、ZAP-70およびTCR (a-d) の共局在を解析した。(e-h) (a-d) における四角領域の拡大画像。矢頭は、pZAP-70およびTCRβの双方を含むMCを示す (スケールバー=5μm)。
【図１Ａ】
2007104944.tif 000002
【図１Ｂ】
2007104944.tif 000003
【図１Ｃ】
2007104944.tif 000004
【図２Ａ】
2007104944.tif 000005
【図２Ｂ】
2007104944.tif 000006
【図２Ｃ】
2007104944.tif 000007
【図２Ｄ】
2007104944.tif 000008
【図２Ｅ】
2007104944.tif 000009
【図２Ｆ】
2007104944.tif 000010
【図３Ａ】
2007104944.tif 000011
【図３Ｂ】
2007104944.tif 000012
【図３Ｃ】
2007104944.tif 000013
【図３Ｄ】
2007104944.tif 000014
【図３Ｅ】
2007104944.tif 000015
【図３Ｆ】
2007104944.tif 000016
【図４Ａ】
2007104944.tif 000017
【図４Ｂ】
2007104944.tif 000018
【図５Ａ】
2007104944.tif 000019
【図５Ｂ】
2007104944.tif 000020
【図６Ａ】
2007104944.tif 000021
【図６Ｂ】
2007104944.tif 000022
【図６Ｃ】
2007104944.tif 000023
【図６Ｄ】
2007104944.tif 000024
【図７】
2007104944.tif 000025
【配列表】
2007104944000001.app