(57)【要約】【課題】高分子量のタンパク質について分離等の処理を簡単、安価かつ確実に行うことができるタンパク質等溶液ろ過処理方法およびその装置を提供することを目的とする。【解決手段】２種類以上の気体の中から指定した気体の吸引吐出が可能な吸引吐出部によって吸引吐出された気体が通過可能な１または複数連のノズルに直接的または間接的に装着可能な装着用開口部を有する装着可能容器と、装着可能容器内に封入され、装着用開口部側においてノズルに装着された状態で液体が貯留可能なように仕切り、液体の通過によって所定物質を分離可能なフィルタとを有するフィルタ封入容器に、装着用開口部を通して、所定物質を含有する溶液を導入する導入工程と、溶液が導入されたフィルタ封入容器をノズルに装着する装着工程と、装着されたフィルタ封入容器に対して、ノズルから気体を吐出して所定物質を分離する加圧ろ過工程とを有するように構成する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２種類以上の気体の中から指定した気体の吸引または吐出が可能な吸引吐出部によって吸引または吐出された気体が通過可能な１または複数連のノズルに直接的または間接的に装着可能な装着用開口部を有する装着可能容器と、該装着可能容器内に封入され、前記装着用開口部側において前記ノズルに装着された状態で液体が貯留可能なように前記容器内を仕切り、該液体の通過によって所定物質を分離可能なフィルタとを有するフィルタ封入容器に、前記装着用開口部を通して、前記所定物質を含有する溶液を導入する導入工程と、
該溶液が導入された前記フィルタ封入容器を前記ノズルに直接的または間接的に装着する装着工程と、
装着された該フィルタ封入容器に対して、前記ノズルから前記気体を吐出して前記所定物質を分離する加圧ろ過工程とを有するタンパク質等溶液ろ過処理方法。
【請求項２】
前記加圧ろ過工程の後、前記ノズルから前記フィルタ封入容器を脱着する脱着工程と、前記フィルタ封入容器に封入されたフィルタと異なる種類のフィルタを有する他のフィルタ封入容器に、その装着用開口部を通して、前記加圧ろ過工程においてろ過された溶液を導入する再導入工程と、前記溶液が導入された該フィルタ封入容器を前記ノズルに直接的または間接的に装着する装着工程と、装着された該フィルタ封入容器に対して、前記ノズルから前記気体を吐出する加圧ろ過工程とを有する請求項１に記載のタンパク質等溶液ろ過処理方法。
【請求項３】
前記導入工程または前記再導入工程において、前記溶液中の前記所定物質は、タンパク質および該タンパク質を吸着しまたは吸着可能な所定粒子であって、前記フィルタは、該所定物質のサイズよりも小さいポア径を持つ孔または空隙を有する請求項１又は請求項２のいずれかに記載のタンパク質等溶液ろ過処理方法。
【請求項４】
前記導入工程、再導入工程または加圧ろ過工程には、前記フィルタ封入容器に導入した液量を検知する検知工程を有する請求項１または請求項３のいずれかに記載のタンパク質等溶液ろ過処理方法。
【請求項５】
前記２種類以上の気体の内１の種類は大気であり、前記導入工程は、大気の吸引および吐出を前記ノズルに装着した分注チップを用いて行うことで、前記フィルタ封入容器内に液体を導入し、前記装着工程は、前記ノズルから該分注チップを脱着した後に、前記フィルタ封入容器を装着し、前記加圧ろ過工程は、前記大気以外の気体を、大気と切り換えて前記ノズルを介して前記フィルタ封入部に吐出することによって行う請求項１ないし請求項４のいずれかに記載のタンパク質等溶液ろ過処理方法。
【請求項６】
前記大気以外の気体は、圧縮窒素ガスである請求項５に記載のタンパク質等溶液ろ過処理方法。
【請求項７】
前記加圧ろ過工程、導入工程または再導入工程において、前記ノズル内に残留する気体を他の気体と置換する置換工程を有する請求項１ないし請求項６のいずれかに記載のタンパク質等溶液ろ過処理方法。
【請求項８】
２種類以上の気体の中から指定した気体についての吸引または吐出が可能な吸引吐出部と、
該吸引吐出部によって吸引または吐出された気体が通過可能な１または複数連のノズルと、
該ノズルに直接的または間接的に装着可能な装着用開口部を有する装着可能容器、および該装着可能容器内に封入され、前記装着用開口部側において前記ノズルに装着された状態で液体が貯留可能なように前記容器内を仕切り、該液体の通過によって所定物質を分離可能なフィルタを有するフィルタ封入容器と、
前記ノズルに装着可能な部材、溶液、検体、または試薬を収容可能な複数の容器を有する容器群と、
前記ノズルヘッドを前記容器群に対して相対的に移動可能とする移動部とを有するタンパク質等溶液ろ過処理装置。
【請求項９】
前記ノズルからの吸引もしくは吐出について、その気体の種類、量もしくは圧力、回数、時間または位置を、前記ノズル、ノズルに装着可能な部材の構造、処理すべき溶液もしくはそこに含まれる物質の種類、その濃度、その量または該溶液の収容位置を含む座標位置からなる物質条件、および、該溶液に対する処理内容に基づいて制御する制御部を有する請求項８に記載のタンパク質等溶液ろ過処理装置。
【請求項１０】
前記吸引吐出部は、前記ノズルを介しての大気の吸引および吐出が可能な大気吸引吐出部と、大気以外の種類の気体を供給する気体供給部と、前記気体供給部と前記大気吸引吐出部とを切り換えて前記ノズルと接続させる切換部とを有する請求項８または請求項９のいずれかに記載のタンパク質等溶液ろ過処理装置。
【請求項１１】
前記大気以外の種類の気体は圧縮窒素ガスであり、前記気体供給部は、窒素ガス圧縮貯蔵器である請求項１０に記載のタンパク質等溶液ろ過処理装置。
【請求項１２】
前記所定物質は、前記溶液中の前記所定物質は、タンパク質および該タンパク質を吸着しまたは吸着可能な所定粒子であって、前記フィルタは、該所定物質のサイズよりも小さいポア径を持つ孔または空隙を有する請求項８に記載のタンパク質等溶液ろ過処理装置。
【請求項１３】
前記ノズルヘッドの前記ノズルに装着した部材を該ノズルから除去する脱着部を設けた請求項８ないし請求項１２のいずれかに記載のタンパク質等溶液ろ過処理装置。
【請求項１４】
前記フィルタ封入容器内または容器内の液量を検知する液量検知手段を設けた請求項８ないし請求項１３のいずれかに記載のタンパク質等溶液ろ過処理装置。
【請求項１５】
前記制御部による、前記ノズルからの吸引もしくは吐出について、その気体の種類、量もしくは圧力、回数、時間または位置の制御は、所定タンパク質の分離もしくは除去、または、タンパク質溶液の濃縮もしくはバッファ置換のいずれかの前記処理内容に基づいて行われる請求項８に記載のタンパク質等溶液ろ過処理装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質等溶液ろ過処理方法およびその装置（質量分析用血漿または血清サンプルの前処理自動化装置およびその方法）に係り、特に、ヒト等の生体由来の血漿または血清試料等の高分子タンパク質を質量分析計にかけるために、その前処理として、質量分析を妨害する可能性のある所定のタンパク質を除去または分離する前処理を自動化するタンパク質等溶液ろ過処理方法およびその装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ポストゲノムの時代において、生体内で機能するタンパク質の総体（プロテオ−ム）の構造や機能の研究(プロテオミクス)が世界的規模で盛んになってきている。特に、ヒトの血漿（プラズマ）プロテオームは、疾病の診断や治療の監視に有用な臨床マーカーを発見する研究手法として重要であると考えられてきている。血漿は主要な診断試料であり、ヒト臨床プロテオーム解析の対象として、質量分析計を用いた精力的な臨床マーカーの探索が行われている。血漿には、様々な「血漿タンパク質」が含まれるが、その濃度は血漿タンパク質の種類による幅広い分布を示す。血液中に最も多量に含まれるのは、1mLの血液中に30〜50mg含まれる血清アルブミンである。また、血液中には、多数の異なる免疫グロブリン（ＩｇＭ，ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＥ，ＩｇＤ）が含まれている。血漿中の微量タンパク質を解析する場合、アルブミンのように多量に含まれるタンパク質は、微量タンパク質の検出・定量を妨害することになるので、解析を行う場合には、これらのメジャータンパク質を何らかの方法で除去する必要がある。このようなヒト血漿を試料として、新規臨床マーカーを探索する質量分析計を用いた解析手法への期待が高まっている(非特許文献１，２，３)。
【０００３】
現在このようなヒト血漿解析に有効な方法として、質量分析計による解析が主としてなされており、質量分析を妨害する血漿中のアルブミン・ＩｇＧ（免疫グロブリン）などのメジャータンパク質を市販の抗体カラム等を用いて除去した後、通過画分を質量分析計で解析する手法が用いられている（特許文献５）。
【０００４】
ところで、抗体カラム等のカラム法ではキャリーオーバーによるコンタミネーションのおそれや、分析量および分析数（スループット）の拡大が困難であるという問題点があった。さらに、ヒト血漿を扱う臨床領域では、キャリーオーバーの問題や、バイオハザード対応などは深刻な問題となり、カラム法が必ずしも適当な方法ではないという問題点を有していた。
【０００５】
一方、この改善策として、前記アルブミンおよびＩｇＧを除去するために、前記ヒト血漿試料を収容した容器を回転（遠心分離）させ、または振盪させることで処理を行うものがあった。この場合には、装置構造または装置構造が複雑化し、自動化装置の製作が困難であることや設備費用または運用費用がかかるおそれがあるという問題点を有していた。
【０００６】
また、本願発明者の一人は、既に、フィルタを封入したチップをノズルに装着した分注チップに嵌合させて装着させたものを用いて、または、フィルタを封入したチップを分注チップを介さずにノズルに装着して分離を行う技術について、出願し、または特許を受けている（特許文献１，２，３，４）。しかしながら、これらの方法は、分注チップに嵌合させて、大気を吸引吐出することで、分注しかつろ過するものであるため、生体等の分離には適しているが、タンパク質分子のような微細な物質の分離については適当でない場合がある。これは、タンパク質分子のような微細な物質については、ポア径の小さいフィルタを用いる必要があるため、液が該フィルタを通過可能とするためには大きな圧力を必要とし、そのためには、大きな体積をもつシリンダ内の気体を小さい体積にまで圧縮可能とする必要がある。しかし、シリンダの容量を大きくすると、微小量の液体の吸引吐出を正確な定量性をもたせて行うことが困難になるおそれがあるという問題点を有していた。また、種々の気体中でまたは同種の気体についての種々の条件の下で処理を行う必要性があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、以上の問題点を解決する為になされたものであり、本発明の第１の目的は、簡単な装置で、安価にかつ確実に、アルブミン、免疫グロブリン等の高分子量のタンパク質等を分離または除去等の処理を含む種々の処理を行うことができる多様性または汎用性があるタンパク質等溶液ろ過処理方法およびその装置を提供することである。また、第２の目的は、アルブミン、免疫グロブリン等の高分子量のタンパク質等の分離または除去等の処理を一貫して自動化することができる手間のかからない、また信頼性・再現性の高いタンパク質等溶液ろ過処理方法およびその装置を提供するである。さらに、第３の目的は、アルブミン、免疫グロプリン等の高分子料のタンパク質等の分離または除去等の処理を、正確かつ効率的に行うことができるタンパク質等溶液ろ過処理方法およびその装置を提供することである。
【０００８】
【特許文献１】特許第３６３０４９３号
【特許文献２】ＷＯ９６／２９６０２
【特許文献３】特願２００５−１４４７２８
【特許文献４】特願２００５−３２５１
【特許文献５】米国特許第６６６０１４９号
【非特許文献１】ベックマン・コウルタ社(Beckman Coulter, Inc.)のカタログ(PROTEOMELAB IGY, PROTEOME PARTITIONING SOLUTIONS, (BR-9976A))、米国、発行2005年
【非特許文献２】生命科学のための最新マススペクトロメトリー  講談社  原田健一等著、発行2002年
【非特許文献３】ポストゲノム・マススペクトロメトリー  化学同人  丹羽利充著  発行2002年
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第１の発明は、２種類以上の気体の中から指定した気体の吸引または吐出が可能な吸引吐出部によって吸引または吐出された気体が通過可能な１または複数連のノズルに直接的または間接的に装着可能な装着用開口部を有する装着可能容器内に封入され、前記装着用開口部側において前記ノズルに装着された状態で液体が貯留可能なように前記容器内を仕切り、該液体の通過によって所定物質を分離可能なフィルタとを有するフィルタ封入容器に、前記装着用開口部を通して、前記所定物質を含有する溶液を導入する導入工程と、該溶液が導入された前記フィルタ封入容器を前記ノズルに直接的または間接的に装着する装着工程と、装着された該フィルタ封入容器に対して、前記ノズルから前記気体を吐出して前記所定物質を分離する加圧ろ過工程とを有するタンパク質等溶液ろ過処理方法である。
【００１０】
ここで、「２種類以上の気体」には、例えば、大気、窒素、二酸化炭素、酸素、アルゴン、またはこれらの中から選択した２以上の気体を種々の割合で混合した気体がある。また、これらの気体について成分が同一種類でもその圧力、温度等が異なれば異なる種類の気体に属するものである。例えば、同一気体についての圧縮ガスと希薄ガスのような場合である。
【００１１】
「フィルタ」は所定のサイズ（ポア径または平均的な空隙の径または長さ）を持つ多数の貫通性の孔または空隙によって液体を通過させて、液体中の所定の物質を分離して、捕獲または除去するための貫通性多孔質の固体である。その形状は、例えば、ブロック状、薄膜状、薄板状、膜状、板状である。フィルタの材料としては、ゴム、シリコーン、セルロース（再生セルロースを含む）、ナイロン、ポリエーテルスルホン等の繊維物質や樹脂、金属、セラミックス等で形成された、ゲル、多孔質体、貫通性多孔質、含水性のものがある。薄膜状担体としては、例えば、タンパク質の限外ろ過を行う限外ろ過膜等がある。ここで、「ブロック状」には、円柱状、角柱状、球状等を含む。
【００１２】
ここで、「所定物質」とは、前記フィルタの前記孔または空隙の所定のサイズによって分離され得るサイズの分子量（例えば、該フィルタの孔または空隙のサイズの約２倍前後が適当である）をもつ物質であって、例えば、核酸等の遺伝物質、タンパク質、糖、糖鎖、ペプチド、色素等の生体高分子または低分子を含む生体物質、または、生体物質として、細胞、ウィルス、プラスミド等を含む。タンパク質の場合には、例えば、1000個のアミノ酸分子からなる場合には、前記フィルタの孔または空隙のサイズは、例えば、数nmから数10nmである。
【００１３】
または、所定物質は前記物質を吸着可能な所定粒子であっても良い。ここで、「所定粒子」とは、マイクロサイズの大きさ、例えば、1μmから数100μmをもち、ナノサイズ、例えば、1nmから数10nmのサイズの所定物質を吸着することで保持可能な担体であり、これによって、例えば、0.1μmから数100μm程度のポア径をもつフィルタを用いて、前記所定粒子が懸濁する溶液としての懸濁液を通過させることで、前記所定粒子を分離して、懸濁液をろ過することができる。
【００１４】
「ノズルに直接的または間接的に装着可能」とは、前記装着用開口部とノズルとを嵌合、または螺合等によって直接接続して装着させ、または、通気性をもちノズルに装着されるノズル装着部材、例えばチップまたはアダプタ等、を介して装着用開口部にノズルを間接的に装着する場合がある。「チップ」とは、太径管及び該太径管と連通し前記太径管よりも細く形成された細径管を有し、太径管には、ノズルに装着され又は装着可能な装着用開口部を有し、細径管には、気体の吸引吐出によって液体の流入および流出が可能な口部を有するもので、例えば、分注チップを含む。なお、ノズルへの装着は、例えば、前記ノズルを上部から前記装着用開口部内へ挿入してノズルを前記装着用開口部へ嵌合させることによって行う。
【００１５】
「装着可能容器」とは、少なくとも、前記吸引吐出に用いられる部材に装着され又は装着可能な装着用開口部を有し、内部に液体を貯留可能である容器をいう。装着可能容器にはチップ状容器を含む。「チップ状容器」とは、装着可能容器であって、前記装着用開口部の他に前記気体の吸引または吐出によって液体の入出が可能な口部を有する容器である。「フィルタ封入容器」は、前記装着可能容器内にフィルタが封入された容器であって、前記フィルタは、前記装着用開口部側において前記ノズルに装着された状態で液体が貯留可能なように前記容器内を仕切るように設けられている。
【００１６】
前記装着可能容器がチップ状容器の場合には、前記フィルタ封入容器はフィルタ封入チップと呼ぶ。前記フィルタは、前記装着用開口部と前記口部との間を、前記装着用開口部側において前記ノズルに装着された状態で液体が貯留可能なように仕切り、液体の通過によって所定物質を分離可能である。前記チップ状容器は、太径管および細径管のような典型的なチップ形状をもつ場合に限られない。さらに、前記フィルタは、例えば、チップ状容器が太管および細管を有する場合には、例えば、前記太管に相当する部分または太管と細管との間の移行部に相当する部分に収容される。前記チップ状容器の容積は、例えば、数μlから数100μl程度以上の液体を扱うことが可能であるのが好ましい。また、装着可能容器は、一体的に形成する場合と、２つまたは３つに分割可能に形成するようにしても良い。なお、前記口部は、必ずしも１の場合に限られず、複数の口部があっても良い。また、細管が複数あっても良い。細管は、容器と嵌合できるように外径は太管と同じ径をもたせ、内径のみ、太管よりも細く形成するようにしても良い。この場合、細管を複数穿設するようにしても良い。  
【００１７】
装着可能容器の材料は、光学的観測を可能にするために透光性の素材が好ましい。装着可能容器の材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル等の樹脂、ガラス、金属、金属化合物等がある。サイズは、例えば、細管において数マイクロリットルから数ミリリットルの液体を収容可能な大きさである。なお、加圧工程の際に、前記口部は、外部に設けた容器の上方に位置しまたは容器内に挿入した状態で行うのが好ましい。
【００１８】
「導入」には、例えば、吸引吐出が可能なノズルに分注チップを装着して、容器から液体を吸引し、前記フィルタ封入容器の収容位置にまで液体を移送し、前記装着用開口部内に前記液体を吐出させることによって行う。
【００１９】
なお、前記フィルタが封入された装着可能容器の内、液体を収容可能な空間の容積は、例えば、数マイクロリットルから数ミリリットル程度である。この例の場合には、前記フィルタ封入容器外に設けた前記液収容部は、前記数マイクロリットルから数ミリリットルの液体を、前記細管の口部を通して前記細管内に吸引可能となるように収容可能でなければならない。
【００２０】
また、前記導入工程で導入される溶液は、例えば、血漿を有し、該溶液に懸濁する所定粒子としては、例えば、表面において、アルブミン、免疫グロブリン、α２−マクログロブリン、α１−リポプロテインまたはα１酸性糖タンパク等の血漿・血清中に含まれるメジャータンパク質を吸着して保持可能である。
【００２１】
ここで、血漿とは、血液中から固体成分、すなわち細胞である血球を除いた液状部分をいう。この血漿中には、分子量が大きいものから小さいものまで多種類のタンパク質が含有されている。タンパク質血漿中に含まれるタンパク質には、免疫グロブリン、アルブミン（分子量66,000Da）、α１−ＭＧ（分子量33,000Da）、β２−ＭＧ（分子量11,800Da）がある。さらに、前記免疫グロブリンには、ＩｇＭ（分子量90万Da）、ＩｇＧ（分子量16万Da）、ＩｇＡ（分子量15万Da）等がある。ここで、「Ｄａ」は、原子質量単位のダルトンを表し、約1.660×10-27kgである。
【００２２】
第２の発明は、前記加圧ろ過工程の後、前記ノズルから前記フィルタ封入容器を脱着する脱着工程と、前記フィルタ封入容器に封入されたフィルタと異なる種類のフィルタを有する他のフィルタ封入容器に、その装着用開口部を通して、前記加圧ろ過工程においてろ過された溶液を導入する再導入工程と、前記溶液が導入された該フィルタ封入容器を前記ノズルに直接的または間接的に装着する装着工程と、装着された該フィルタ封入容器に対して、前記ノズルから前記気体を吐出する加圧ろ過工程とを有するタンパク質等溶液ろ過処理方法である。
【００２３】
第３の発明は、前記導入工程または前記再導入工程において、前記溶液中の前記所定物質は、前記溶液中の前記所定物質は、タンパク質または該タンパク質を吸着しまたは吸着可能な所定粒子であって、前記フィルタは、該所定物質のサイズよりも小さいポア径を持つ孔または空隙を有するタンパク質等溶液ろ過処理方法である。
【００２４】
前記再導入工程における前記フィルタは、例えば、タンパク質を分離可能な限外ろ過膜または前記所定粒子を分離可能な精密ろ過膜であるタンパク質等溶液ろ過処理方法である。
【００２５】
ここで、「限外ろ過膜」とは、ポア径が、1nmから100nmの範囲の多孔質膜をいう。「精密ろ過膜」は、0.01μmから数μm程度の溶質または粒子をろ過するために用いる膜である。「所定粒子」については、第１の発明で説明した通りである。
【００２６】
第４の発明は、前記導入工程、再導入工程または加圧ろ過工程には、前記フィルタ封入容器に導入した液量を検知する検知工程を有するタンパク質等溶液ろ過処理方法である。
【００２７】
第５の発明は、前記２種類以上の気体の内１の種類は、大気であり、前記導入工程は、大気の吸引および吐出を前記ノズルに装着した分注チップを用いて行うことで、前記フィルタ封入容器内に液体を導入し、前記装着工程は、前記ノズルから該分注チップを脱着した後に、前記フィルタ封入容器を装着し、前記加圧ろ過工程は、前記大気以外の気体を、大気と切り換えて前記ノズルを介して前記フィルタ封入部に吐出することによって行うタンパク質等溶液ろ過処理方法である。
【００２８】
ここで、「分注チップ」とは、チップ状容器であって前記所定物質を分離可能なフィルタが封入されていないものであって、液体を分注チップ内に吸引し吐出可能なものであって液体の分注、移送に用いられるものである。
【００２９】
第６の発明は、前記大気以外の気体は、圧縮窒素ガスであるタンパク質等溶液ろ過処理方法である。
【００３０】
ここで、前記窒素ガス圧縮貯蔵器内の窒素ガスの圧力は、例えば、10kgf/cm2であり、減圧して前記ノズルを通して前記フィルタに加える圧力は、例えば、0.1kgf/cm2〜数kgf/cm2である。ここで、「ｋｇｆ」は、重量キログラムを表す。
【００３１】
また、この圧力値は、圧力調節器を設けることによって、変動可能にするのが好ましい。また、減圧弁を設けるのが好ましい。このようにすれば、所定物質として、所定粒子を分離する場合と、直接タンパク質を分離する場合等の処理目的またはフィルタ封入容器の構造等に基づいて、圧力値を変更することができるので、最適な処理を行うことができる。
【００３２】
第７の発明は、前記加圧ろ過工程、導入工程または再導入工程において、前記ノズル内に残留する気体を他の気体と置換する置換工程を有するタンパク質等溶液ろ過処理方法である。ここで、置換を行うには、例えば、残留気体を有するノズルに対して、新たな気体をノズルに供給し、または吸引吐出を繰り返すことによって行う。
【００３３】
第８の発明は、２種類以上の気体の中から指定した気体についての吸引または吐出が可能な吸引吐出部と、該吸引吐出部によって吸引または吐出された気体が通過可能な１または複数連のノズルと、該ノズルに直接的または間接的に装着可能な装着用開口部を有する装着可能容器、および該装着可能容器内に封入され、前記装着用開口部側において前記ノズルに装着された状態で液体が貯留可能なように前記容器内を仕切り、該液体の通過によって所定物質を分離可能なフィルタを有するフィルタ封入容器と、前記ノズルに装着可能な部材、溶液、検体、または試薬を収容可能な複数の容器を有する容器群と、前記ノズルヘッドを前記容器群に対して相対的に移動可能とする移動部とを有するタンパク質等溶液ろ過処理装置である。
【００３４】
ここで、「２種類以上の気体の中から指定した気体についての吸引または吐出」は、前記ノズルへの気体の供給を弁による切換部によって切り換えることによって行う。「ノズルに装着可能な部材」とは、例えば、前記装着用開口部をもつ装着可能容器、フィルタ封入容器（フィルタ封入チップを含む）、分注チップ、アダプタ等である。
【００３５】
第９の発明は、前記ノズルからの吸引もしくは吐出について、その気体の種類、量もしくは圧力、回数、時間または位置を、前記ノズルもしくはノズルに装着可能な部材の構造、処理すべき溶液もしくはそこに含まれる物質の種類、その濃度、その量または該溶液の収容位置を含む座標位置からなる物質条件、および、該溶液に対する処理内容に基づいて制御する制御部を有するタンパク質等溶液ろ過処理装置である。
【００３６】
ここで、物質の種類には、その物質の性質、サイズをも含む。また、前記液体の量とは、前記フィルタ封入容器もしくは前記分注チップ内の液量、または容器内の液量であって、例えば、後述する液量検知手段によって検知される。この制御部によって、例えば、前記フィルタ封入容器内に貯留されているろ過前の溶液、混合液または懸濁液の量を検知すれば、その量に応じて、溶液、混合液または懸濁液の希望する濃縮化が可能である。
【００３７】
第１０の発明は、前記吸引吐出部は、前記ノズルを介しての大気の吸引および吐出が可能な大気吸引吐出部と、大気以外の種類の気体を供給する気体供給部と、前記気体供給部と前記大気吸引吐出部とを切り換えて前記ノズルと接続させる切換部とを有するタンパク質等溶液ろ過処理装置である。なお、前記大気吸引吐出部は、一方向系の機構によって駆動されるのが好ましい。ここで、「一方向系の機構」とは、正方向の動作は小さな力で容易に行うことができるが、逆方向の動作は大きな力を必要として、その実行が困難となる機構をいう。例えば、ボール螺子またはすべり螺子を用いて回転駆動を、ボール螺子またはすべり螺子に螺合するナット部の直線運動に変更する機構がある。
【００３８】
さらに具体的には、前記大気吸引吐出部として、例えば、シリンダと、該シリンダ内に該シリンダの軸方向に沿って摺動可能に内蔵されたプランジャとを有し、該プランジャは、前記シリンダと平行な軸方向をもつボール螺子またはすべり螺子に螺合するナット部に連結して、前記ボール螺子またはすべり螺子の正逆両方向の回転駆動によって、シリンダ内を軸方向に沿って往復運動をする。この場合、前記プランジャに前記圧縮窒素ガスによる圧力がかかったとしても、前記ナット部と連結されているプランジャは、前記圧力によって軸方向に沿ってほとんど動かないので前記圧縮窒素ガスの導入による影響を防止することができる。
【００３９】
また、前記ノズルは、その下端に気体が流入流出する入出口を有し、その上端で前記大気吸引吐出部と連通し、その側面において前記気体供給部と連通する少なくとも１の気体流入口を有するように形成する。これによって、装置全体の構造を簡単化でき、さらに、前記流入口からの気体の流入によっても、前記プランジャは、その気体の圧力によって軸方向に沿ってほとんど動かず、高い圧力を維持したまま導入することができる。
【００４０】
第１１の発明は、前記大気以外の種類の気体は圧縮窒素ガスであり、前記気体供給部は、窒素ガス圧縮貯蔵器であるタンパク質等溶液ろ過処理装置である。
【００４１】
第１２の発明は、前記所定物質は、前記溶液中の前記所定物質は、タンパク質または該タンパク質を吸着しまたは吸着可能な所定粒子であって、前記フィルタは、該所定物質のサイズよりも小さいポア径を持つ孔または空隙を有するタンパク質等溶液ろ過処理装置である。ここで、「タンパク質」は、前述したように、例えば、血漿中のアルブミン、免疫グロブリン、α１−ＭＧまたはβ２−ＭＧ等である。
【００４２】
第１３の発明は、前記ノズルヘッドの前記ノズルに装着した部材を該ノズルから除去する脱着部を設けたタンパク質等溶液ろ過処理装置である。
【００４３】
ここで、前記ノズルに装着した部材とは、ノズルに装着した「ノズルに装着可能な部材」をいい、例えば、ノズルに装着された前記装着可能容器、フィルタ封入容器または分注チップ、アダプタ等をいう。
【００４４】
第１４の発明は、前記フィルタ封入容器内または容器内の液量を検知する液量検知手段を設けたタンパク質等溶液ろ過処理装置である。
【００４５】
第１５の発明は、前記制御部による、前記ノズルからの吸引もしくは吐出について、その気体の種類、量もしくは圧力、回数、時間または位置の制御は、所定タンパク質の分離もしくは除去、または、タンパク質溶液の濃縮もしくはバッファ置換のいずれかの前記処理内容に基づいて行われるタンパク質等溶液ろ過処理装置である。
【発明の効果】
【００４６】
第１の発明または第８の発明によれば、２種類以上の気体の中から指定した気体の吸引または吐出が可能な吸引吐出部を設け、所定物質を含有した液体を、前記吸引吐出部によって大気を吸引吐出することによってノズルを介して前記フィルタ封入部に導入し、該フィルタ封入部を前記ノズルに装着して、再度前記吸引吐出部によって気体を吐出して加圧し、前記フィルタを用いてろ過することで前記所定物質を分離することができる。
【００４７】
したがって、前記ノズル、吸引吐出部を用いることで、微小量の液体の処理と、高い圧力を必要とする処理とを同じ装置を用いて実行可能とすることで、溶液中の所定物質のフィルタを用いた処理を一貫して自動化することができる。したがって、この処理を人手を介さずに行うことができるので信頼性の高い処理を行うことができる。さらに、所定物質の種類に応じた適切な気体、フィルタおよび条件を選択することができるので、所定物質に応じた最適な条件で処理を行うことができる。
【００４８】
第２の発明または第１３の発明によれば、目的の所定物質を分離した後、そこで用いたフィルタ封入容器を除去し、新たなフィルタ封入容器に、前記ろ過液を再導入し、装着して加圧ろ過を行うものである。したがって、例えば、血漿中の希少な有用タンパク質の分離処理を行う場合には、一旦、所定物質として、アルブミン等の高分子量のタンパク質を分離した後に、該物質とは異なる種類の目的の前記希少なタンパク質を分離することができる。また、例えば、一旦、所定粒子に吸着させた目的物質を含む物質を、所定粒子ごと分離した後、該所定粒子から前記物質を解離した後に、さらに目的物質を分離するような、複雑で、多様な処理を自動的に行うことができる。
【００４９】
第３の発明または第１２の発明によると、所定物質として、タンパク質を吸着可能な所定粒子およびタンパク質とし、これらを分離可能なフィルタを用いている。したがって、一旦、例えば、マイクロサイズの所定粒子に吸着させた上で、液体は通すが該所定粒子を通過させないフィルタを用いて分離するようにすれば、比較的低い圧力で加圧して目的のタンパク質を分離することができる。これによって、簡単に、安価にかつ確実にタンパク質を分離することができる。また、複雑な処理を一貫して自動化することができる。
【００５０】
第４の発明または第１４の発明によれば、フィルタ封入容器内に導入した液量を検知することによって、例えば、フィルタ封入容器内に導入する液量、ろ過後のフィルタ封入容器内の液量を検知することによりその液量の濃度を知ることができ、処理の信頼性を高めることができる。
【００５１】
第５の発明または第１０の発明によれば、大気と大気以外の気体とを切り換えて吸引吐または吐出を行うことで、ノズルに装着した分注チップに対する液体の吸引、移送、吐出に利用することができるのみならず、ノズルに装着したフィルタ封入容器への、より高圧の気体を用いた加圧ろ過をも行うことができる。したがって、目的物質が含有する液体の前記フィルタ封入容器への導入から加圧ろ過までのフィルタ処理を一貫して人が触れることなく処理することが可能であり、信頼性が高い。
【００５２】
第６の発明または第１１の発明によると、前記気体として、大気と、圧縮窒素ガスを用いている。したがって、容器内への溶液の導入に適切な気体と、加圧ろ過に適した気体とを使い分けることで、簡単な構造で処理を効率的かつ安価に行うことができる。また、窒素ガスは化学的に安定しており、かつ、安価で容易に入手することができる。
【００５３】
第９の発明または第１５の発明によれば、前記ノズルからの吸引もしくは吐出について、その気体の種類、量、もしくは圧力、回数、時間または位置を、前記ノズルの構造等の物質条件および処理内容に基づいて制御するようにしている。したがって、ノズル等の構造、および処理内容にあった適切な条件で加圧ろ過を行うことができる。また、所定タンパク質の分離もしくは除去、または、タンパク質溶液の濃縮もしくはバッファ置換の処理内容に応じたノズルの吸引もしくは吐出に関する制御を行うことで、タンパク質溶液についての適切な処理を行うことができる。
【００５４】
第７の発明によれば、比重の異なる気体を順次ノズルに通過または導入する場合に、ノズル内に残留する気体があると、新たな気体をノズル内に導入しにくくする場合がある。そこで、新たな気体で処理を開始する前に、残留気体の除去を行うことによって処理を円滑に進めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
続いて、図面に基づいて、本発明の実施の形態に係るタンパク質溶液ろ過処理装置について説明する。
図１（ａ）には、本実施の形態に係るタンパク質溶液ろ過処理装置１０の全体外観斜視図を示す。該装置１０は、本体部１１と、窒素ガスを圧縮して貯蔵する窒素ガス圧縮貯蔵器１２と、前記本体部１１に設けた後述するノズルと前記窒素ガス圧縮貯蔵器１２とを接続する管路１３とを有する。該本体部１１は、略直方体状の筐体１４を有し、該筐体１４の２側面は、一部切り取られるとともに、そこに透明板で形成された蓋体１４ａが嵌められて外部より内部のろ過処理部１５が透視可能となっている。該蓋体１４ａには、取手１４ｂが取り付けられている。
【００５６】
また、筐体１４の側面には、使用者が、指示を与え、各種データを入力し、また必要な表示がされる操作用のキーボード１４ｃが設けられている。ただし、該本体部１１はこの形態に限られるものではなく、例えば、前記本体部１１の筐体１４を設けずに、冷蔵施設内で設置した状態で用いても良い。
【００５７】
図１（ｂ）は、前記本体部１１の前記筐体１４から前記蓋体１４ａを外した状態を示すものである。
【００５８】
図２、図３、および図４は各々前記ろ過処理部１５を模式的に示す斜視図、平面図および側面図である。
該ろ過処理部１５は、要するに、内部を摺動可能なプランジャ１７を内蔵し、大気の吸引または吐出を行ない、図上Ｘ方向に配列された複数連（この例では８連）のシリンダ１８と、該シリンダ１８の下側には、該シリンダ１８と各々連通する８本のノズル１９とを有するノズルヘッド１６と、該ノズル１９に装着可能な部材（後述するフィルタ封入チップを含む）、各種溶液、検体、または試薬を収容可能な複数の容器を有する容器群２２と、前記ノズルヘッド１６を前記容器群２２に対し図上Ｙ方向およびＺ方向に移動可能とする移動部（図６、図７に示す）とを有している。この移動部によって、前記ノズルヘッド１６は、前記容器群２２の全域を覆うように該容器群２２の各容器に前記ノズル１９が移動可能である。
【００５９】
前記各ノズル１９の上端の開口部は、前記シリンダ１８と連通し、ノズル１９の下端は、気体の流入流出が可能な入出口を有し、ノズル１９の側面のやや上側には、前記管路１３および弁３４を介して前記窒素ガス圧縮貯蔵器１２と連通する８本の分岐管路３５が各々接続する気体流入口を有している。該分岐管路３５または管路１３を、可撓性のあるゴム管等で形成することで、前記ノズルヘッド１６の移動に伴って変形することで前記ノズルヘッド１６の移動に伴う影響を吸収する。
【００６０】
前記弁３４は、前記切換部に相当し、例えば、電磁弁、止め弁、仕切り弁、逆止弁またはコックである。これによって、前記大気を吸引吐出する場合には、その影響を前記管路１３に与えないようにする。弁３４として電磁弁を用いた場合には、図示しない制御部によって、接続遮断の指示を与え、また、圧力センサ２１の検知結果に基づいて、接続または遮断の指示を行うようにしても良い。
【００６１】
該ノズルヘッド１６に設けられた８本のノズル１９は、前記チップ状容器が装着可能に形成されている。前記各ノズル１９は前記シリンダ１８および前述した窒素ガス圧縮貯蔵器１２と、前記管路１３および弁３４および分岐管路３５を介して流体力学的に接続している。前記弁３４は、前記切換部に相当するものであって、前記窒素ガス圧縮貯蔵器１２との間の接続を切り換えるものである。なお、前記弁３４、管路１３、および前記窒素ガス圧縮貯蔵器１２は、前記ノズルヘッド１６と別個に設け、該ノズルヘッド１６と一体に移動可能ではない。
【００６２】
前記ノズル１９の前記分岐管路３５との接続部分の下側には、前記ノズル１９が貫通する複数個（この例では、８個）の貫通孔が設けられた細長いプレート状の脱着部２０が前記ノズルヘッド１６に対して上下動可能に該ノズルヘッド１６とともに移動可能に設けられている。前記貫通孔の内径は、貫通する前記ノズル１９よりも少し大きいが該ノズル１９が嵌合する前記チップ状容器の上端開口部の外径よりも小さな内径をもつように形成されている。
【００６３】
前記ノズルヘッド１６の１側面には、各ノズル１９の内部の圧力を検知するための圧力センサ２１が８個、各ノズル１９に対応する位置に、隣接するノズル１９間の間隔と同一の間隔で設けられている。また、該ノズルヘッド１６は、後述するように、該ノズルヘッド１６の他方の側面において図示しない前記移動部の前記各アームと結合することによって、本体部１１に支持されている。
【００６４】
前記容器群２２は、８本の前記フィルタ封入チップとして、限外ろ過フィルターユニット（Sartorius社製  Vivspin2）２３と、該フィルターユニット２３の下方に設けられフィルターユニット２３からの液体を受け入れるドレイン槽２４と、種々の試薬、例えば重炭酸アンモニウムバッファおよび予備の分注用の２列に配列された分注チップ２５と、例えば、50mM重炭酸アンモニウムバッファ液を収容する容器２６と、別種類の前記フィルタ封入チップとしての限外ろ過フィルターユニット（Sartorius 社製  Vivaspin6）２７と、該フィルターユニット２７に対する加圧用のアダプタキャップ２８と、前記所定粒子として、アルブミンおよびＩｇＧ吸着用のレジン、および、ＰＢＳバッファ液の懸濁液を収容する容器２９と、例えば、70μl以上の血漿液を収容するサンプル用容器３０と、２列に配列された攪拌用または非吸着分移送用分注チップ３１と、血漿分注用および予備の２列に配列された分注チップ３２とを、図４に示す処理ステージ３３上に、前記ノズルヘッド１６の各ノズル１９に対応して各々８行ずつ、計１２列×８行のマトリクス状に配列したものである。
【００６５】
また、該容器群２２には、図２のＸ軸方向に沿って移動可能で前記限外ろ過フィルターユニット２３、限外ろ過フィルターユニット２７内の液面を検知する前記液量検知手段としてのＣＣＤ撮像素子を備えた液面センシング部３６を有している。
【００６６】
図４に示すように、前記限外ろ過フィルターユニット２３は、装着可能容器としてのチップ状容器３８およびチップ状容器３８の内部に封入されたフィルタ３９とを有するものである。該チップ状容器３８は、太管４２と、該太管４２の下側に設けられ該太管４２の内径よりも細い内径をもつ細管４１が１または複数本形成されている。該太管４２と細管４１との間の移行部に段差を有し、前記フィルタ３９は段差の上側に設けられている。前記太管４２の上端は、前記ノズル１９に加圧用アダプタ４０を介して間接的に装着可能な装着用開口部４２ａを有し、前記細管４１の先端には、前記窒素ガスの吐出によって液体の流出が可能な口部４１ａを有している。前記フィルタ３９は、前記装着用開口部４２ａと前記口部４１ａとの間を、前記装着用開口部４２ａ側において前記ノズル１９に装着された状態で液体が貯留可能なように仕切られている。なお、符号４３は、前記細管４１が穿設され、前記太管４２と略同一の外径をもつ円柱状部材である。
【００６７】
図４に示すように、限外ろ過フィルターユニット２７は、チップ状容器４５およびチップ状容器４５の内部に封入されたフィルタ４６とを有するものである。該チップ状容器４５は、太管４７と、該太管４７の下側に設けられ該太管４７の内径よりも細く形成された１または２以上の細管４８と、該太管４７と細管４８との間の移行部に段差を有し、前記フィルタ４６は段差の上側に設けられている。前記太管４７の上端は、前記ノズル１９に加圧用アダプタキャップ２８を介して間接的に装着可能な装着用開口部４７ａを有し、前記細管４８の先端には、前記窒素ガスの吐出によって液体の流出が可能な口部４８ａを有している。前記フィルタ４６は、前記装着用開口部４７ａと前記口部４８ａとの間を、前記装着用開口部４７ａ側において前記ノズル１９に装着された状態で液体が貯留可能なように仕切られている。
【００６８】
なお、符号５０は、前記細管４８が穿設されている円柱状部材であり、前記太管４７の外径と略同一の大きさをもつ。また、符号４９は、その上端部が前記円柱状部材５０に嵌合可能な容器であって、前記細管４８から吐出される液体を受け止めるものである。
【００６９】
また、図４中、符号５１，５２，５３，５４，５５，５６は、前記処理ステージ３３に設けられた各分注チップを収容する容器である。
【００７０】
図５は、そのノズル１９に限外ろ過フィルターユニット２７、限外ろ過フィルターユニット２３が装着された前記ノズル１９と前記窒素ガス圧縮貯蔵器１２の給気口５７との間を接続する空圧経路概念図を示すものである。該管路１３は、途中、ガス量を調節することで、最大圧力2.7kgf/cm2となるように圧力を調節する圧力レギュレータ５８と、減圧弁５９、圧力計６０とを有している。前記管路１３は、弁３４を介して分岐管路３５と接続し、分岐管路３５は、分注機能をもつ空気の吸引吐出機構であるシリンダ１８および前記フィルターユニット２７と接続する。
【００７１】
なお、本実施の形態に係るタンパク質溶液ろ過処理装置１０には、図示しないＣＰＵ、各種メモリ、キーボード、各種スイッチ、マウス等の入力手段、表示手段等を有する情報処理部を有しまたは情報処理部と接続可能に設ける。該情報処理部には、前記ノズルの吐出の量、圧力、回数、時間または位置を、前記ノズル、ノズルに装着される部材もしくはフィルタ封入チップの構造、処理すべき溶液もしくは該溶液中に含まれる物質の種類、濃度もしくは量、またはその収容位置を含む座標位置からなる物質条件、および、該液体に対する処理内容に基づいて制御する制御部が設けられている。
【００７２】
続いて、図６および図７において、前記本体部１１の機構を詳細に説明する。
該本体部１１は、前述したように、ノズルヘッド１６と、下方に設けた容器群２２とを有する。
【００７３】
該ノズルヘッド１６には、８本の前記ノズル１９および該ノズル１９に各々連通する８連のシリンダ１８を有し（図６および図７には示されていない）、前記シリンダ１８には、その内部を摺動可能なプランジャ１７が設けられている。８本の前記プランジャ１７はその上端部でプランジャ駆動板６９に取付けられている。該プランジャ駆動板６９は、ボール螺子６５に螺合するナット部６４と連結し、前記ボール螺子６５の回転に伴って上下動するナット部６４と連動して、８本の前記プランジャ１７を一斉に上下動させる。
【００７４】
該ボール螺子６５は、前記ノズルヘッド１６が取り付けられたヘッド取付板７０に取り付けられた逆Ｌ字状のボール螺子支持部材６８により軸支されている。該ボール螺子支持部材６８の水平板上には、位置センサ９６が設けられ、前記プランジャ駆動板６９に上方に突出するように設けられたロッド９５が前記位置センサ９６の発光素子および受光素子間を遮ることによって、前記プランジャ１７の位置を検知している。
【００７５】
該ボール螺子６５は、前記ヘッド取付板７０にやはり取り付けられたモータ６２のモータ軸６３と前記ボール螺子６５の上端部６６に掛け渡されたタイミングベルト（図示せず）によって回転駆動される。
【００７６】
前記脱着部２０の上側の前記ノズル１９には、図７（ａ）に示すように、孔２１ａが穿設され、ゴムチューブ２１ｂを介して前記圧力センサ２１と連通させて、ノズル１９内の圧力を測定可能としている。また、前記孔２１ａが設けられた側と反対側のノズル１９の部分には、前記圧縮窒素ガスを導入するための前記分岐管路３５と接続する連結部３５ａが設けられている。
【００７７】
前記ノズルヘッド１６を取り付けているヘッド取付板７０は、図７（ｂ）の側面図に示すように、その両縁部近傍には２個のガイド部材７１ａ，７２ａが設けられ、各々２本の上下方向に伸びるガイド柱７３，７４と係合して上下方向に摺動可能に設けられている。また、該ヘッド取付板７０は、ばね７５，７６を介してヘッド上下駆動板７７と連結している。前記ノズル１９の下端が容器の底等と接触すると、前記ヘッド取付板７０とヘッド上下駆動板７７との間隔が狭まり、センサ（図示せず）によって検知可能であり、かつ、接触の際の反力を吸収可能である。前記ヘッド上下駆動板７７は、その両縁部近傍に２個のガイド部材７１ｂ、７２ｂが設けられ、各々２本の上下方向に伸びるガイド柱７３，７４と係合して上下方向に摺動可能に支持されている。また、前記ヘッド上下駆動板７７は、その中央部において、上下方向に伸びるボール螺子７８と螺合するナット部７９に取付けられている。該ボール螺子７８は、モータ８０によって、連結器８１を介して回転駆動される。該モータ８０は、ラック８２上に設けられ、該ラック８２は、枠体８３上に設けられている。前記ガイド柱７３，７４および前記ボール螺子７８、したがって、前記ノズルヘッド１６は、全体として図６の図面上、前記容器群２２または前記筐体１４に対して、左右方向（Ｙ方向）に移動可能な枠体８３に設けられている。
【００７８】
また、前記Ｙ方向に沿いかつ前記枠体８３と離間して、軌道支持用の大垂直板８６および小垂直板８９が前記枠体８３を挟むようにして前記筐体１４に固定して設けられている。図６、図７に示すように、該大垂直板８６には、前記Ｙ軸方向に沿って、レール８７，８８が設けられ、前記枠体８３の前記大垂直板８６に向かい合う壁部８３ｂの外側の対応する位置に駒８４，８５が設けられて前記レール８７，８８と摺動可能に係合している。また、前記小垂直板８９には、前記Ｙ軸方向に沿って、レール９０が設けられ、前記枠体８３の前記小垂直板８９に向い合う壁部８３ａの内側の対応する位置に駒９１が設けられて前記レール９０と摺動可能に係合している。
【００７９】
また、前記大垂直板８６には、Ｙ軸方向へ伸びるボール螺子９３が設けられ、該ボール螺子９３には、ナット部９４が螺合し、前記枠体８３は、前記ナット部９４と連結している。また、図７（ａ）に示すように、該ボール螺子９３は、モータ９２によって回転駆動される。
【００８０】
続いて、図８に基づいて、前記タンパク質溶液ろ過処理装置１０の動作について説明する。
ステップＳ１で、該処理を行うに際して、予め、血漿を−80℃（タンパク質濃度60−80mg/ml）、500μlで保存していたものを室温融解する。
【００８１】
次に、ステップＳ２で、該血漿を、例えば、前記ノズルに装着した分注チップを用い、ポア径が0.22μmのフィルタ(例えば、Millipore Millex GV0.22μmシリンジフィルタ)をチップに封入した、フィルタ封入チップ（図示せず）を前記ノズル１９に装着して前記シリンダ１８を用いて吸引吐出すること等によって加圧ろ過し、そのろ過液100-400μlを前記容器群２２のサンプル用容器３０内に収容しておく。また、容器２９には、アルブミンおよびＩｇＧ吸着用レジン（Amersham Biosciences社製）およびＰＢＳバッファ液を収容し、50mM重炭酸アンモニウムバッファ液を約9〜10mlを各レーンの容器２６に収容しておく。
【００８２】
ステップＳ３において、前記ノズルヘッド１６の各ノズル１９を1ml用の前記分注チップ３２の位置にまで、Ｙ軸方向に移動させた後、Ｚ軸方向に移動させて、該分注チップ３２の上端開口部に該ノズル１９を挿入させ、押し付けるようにして装着させる。次に、該分注チップ３２を装着したノズルヘッド１６を、前記容器３０の位置にまで移動させて、前記弁３４を用いて前記分岐管路３５と前記ノズル１９とを接続させた状態で、前記シリンダ１８を用いて該容器３０から70μlの血漿液を吸引する。該血漿液を吸引した状態で、該ノズルヘッド１６を前記アルブミンおよびＩｇＧ吸着用レジンおよびＰＢＳ液が収容されている容器２９にまでＹ軸方向に沿って移動し、Ｚ軸方向に移動させて、前記シリンダ１８を用いて該血漿を該容器２９に吐出させて混合する。ここで、該容器２９内には、予め前記アルブミン・ＩｇＧ吸着レジン1.2mlがＰＢＳ液2.8mlで懸濁されている。
【００８３】
なお、前記容器２９に収容されている前記アルブミン・ＩｇＧ吸着用レジンは、1.2mlのアルブミン・ＩｇＧ吸着レジン（Amersham製、スラリー量は4ml）に、予め別の前記フィルターユニット２７内で、2.8mlＰＢＳ液を添加して、例えば、遠心ろ過（1000g）を５回行い、または、前記フィルターユニット２７を前記ノズル１９に装着させて、前記窒素ガス圧縮貯蔵器１２を用いて、加圧ろ過を行うことによってレジンの洗浄とＰＢＳに対する平衡化を予め行っておいたものである。
【００８４】
ステップＳ４で、前記容器２９内に収容した血漿、アルブミン・ＩｇＧ吸着レジンおよびＰＢＳ液が収容され、前記分注チップ３２が各ノズル１９に装着された前記ノズルヘッド１６は、前記分注チップ３２の元の収容位置である容器５１の位置にまでY軸方向に移動し、その収容位置において、前記分注チップ３２は前記脱着部２０を下方向に動かすことによって脱着される。該分注チップ３２が脱着した前記ノズルヘッド１６は、４mlの容量をもつ分注チップ３１の位置にまでＹ軸方向に移動し、Ｚ軸方向に前記ノズル１９を該分注チップ３１の上端部に挿入しさらに押し下げることで該分注チップ３１を装着する。
【００８５】
次に、ノズルヘッド１６は、前記容器２９にまで移動し、さらに、該分注チップ３１を前記容器２９内にＺ方向に移動して挿入させる。この状態で、室温（20〜25℃）で、前記分注チップ３１によって、前記弁３４によって分岐管路３５を介して前記シリンダ１８を前記ノズル１９と接続させて、吸引吐出を繰り返すことによって攪拌する。これによって、前記レジンに、血漿中のアルブミンおよびＩｇＧを吸着させる。
【００８６】
ステップＳ５において、前記容器２９に収容され、血漿中のアルブミンおよびＩｇＧを吸着したレジンが懸濁する懸濁液を4ml分、前記分注チップ３１によって前記シリンダ１８を用いて吸引し、Ｙ軸方向に移送して、前記限外ろ過フィルターユニット２７に位置させ、該限外ろ過フィルターユニット２７内に吐出させる。次に、ノズルヘッド１６を前記分注チップ３１を収容する容器５４，５３の位置にまでY軸に沿って移動させ、そこで前記脱着部２０によって分注チップ３１を脱着する。
【００８７】
次に、ノズルヘッド１６を前記限外ろ過フィルターユニット２７の加圧用アダプタキャップ２８の位置にまで移動させて、Ｚ軸方向に該ノズルヘッド１６を下降させて、該アダプタキャップ２８をノズル１９に装着させる。次に、該ノズルヘッド１６を前記限外ろ過フィルターユニット２７の位置にまで移動させ、Ｚ軸に沿って該ノズルヘッド１６を下降させて、該ノズル１９を前記アダプタキャップ２８を介して、前記懸濁液が収容された前記限外ろ過フィルターユニット２７の上端部で装着させる。
【００８８】
次に、前記弁３４を切り換えて、前記ノズル１９と前記気体吸引吐出部である前記シリンダ１８との接続を解除して、前記窒素ガス圧縮貯蔵器１２と管路１３を介して接続する。ここで、前記圧力レギュレータ５８を調節し、かつ減圧弁５９を用いることによって、前記限外ろ過フィルターユニット２７内の懸濁液を加圧ろ過（０.１kgf/cm2）を3分間行い、前記アルブミン、およびＩｇＧの吸着したレジンとＰＢＳをフィルタ４６で分離する。これらの時間または吐出量は前記制御部によって指示される。ここで、分離したレジンからＩｇＧ溶出画分の2.8mlを保存する。なお、ノズルヘッド１６のノズル１９に、アダプタキャップ２８および限外ろ過フィルターユニット２７を装着する前に、前記弁３４を切り換えて、前記窒素ガス圧縮貯蔵器１２と管路１３とを接続して、窒素ガスをノズル１９内に供給してノズル内の大気を窒素ガスと置換させるようにするのが好ましい。
【００８９】
ステップＳ６において、前記レジン分離後、前記ノズルヘッド１６から、前記脱着部２０を用いて、前記限外ろ過フィルターユニット２７を脱着した後、新たな分注チップ３１の位置にまで該ノズルヘッド１６を移動させ、Ｚ軸方向に移動することによってノズルの先端部を該分注チップ３１に押し込むようにして分注チップ３１を装着させる。また、前記弁３４を切り換えて、大気吸引吐出部である前記シリンダ１８と前記ノズル１９とを接続させる。該ノズルヘッド１６を前記限外ろ過フィルターユニット２７の下側に設けた容器４９にまで移送し、ろ過液を2.8ml吸引して、前記限外ろ過フィルターユニット２３位置にまで移送して、該限外ろ過フィルターユニット２３内に収容する。該限外ろ過フィルターユニット２３には、３ｋＤａの限外ろ過膜からなるフィルタ３９が封入されている。次に、前記弁３４を再び切り換えて、前記ノズル１９と前記窒素ガス圧縮貯蔵器１２とを前記管路１３を介して接続する。
【００９０】
次に、ステップＳ７で、該限外ろ過フィルターユニット２３を4℃の温度条件で、加圧（2.7kgf/cm2）により0.2mlまで濃縮する。その際、該限外ろ過フィルターユニット２３に貯留されている前記液の液面を検知することで、その液量を前記液量検知手段によって検知し、その液量に応じて加圧し、前記濃縮を達成する。その後、前記容器２６から50mM重炭酸アンモニウム溶液を2.6ml添加し、再び加圧ろ過を行う。この重炭酸アンモニウム溶液への濃縮バッファ交換作業の３回を含み、計４回の加圧を行う。これによって、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を用いた質量分析計（ＭＳ）による解析（ＬＣ−ＭＳ）に悪影響を与える溶媒中の不揮発性溶質が除去され揮発性の成分のみになる。また、トリプシン消化のためにｐＨを９程度にすることによって、次工程の酵素消化処理に必要なｐＨに調整されることになる。
【００９１】
続いて、本発明の実施の形態に係るタンパク質溶液ろ過処理装置によって処理したヒト血漿中のタンパク質測定結果と、同様の処理を、前記フィルタ封入チップの遠心装置への設置等のための手作業が必ず伴う遠心装置を用いたろ過、すなわち遠心ろ過によって行った場合の測定結果とを対比することによって、遠心ろ過および手作業を行わなくても、安定性および繰返し再現性が高い処理を本処理装置によって行うことができることを以下に示す。
【００９２】
図８のステップＳ５の工程、すなわち、ヒト血漿よりアルブミン、ＩｇＧを除去する工程を、遠心装置を用いた手作業と本発明の実施の形態に係る加圧ろ過工程によるものとで比較した。処理後の血漿はタンパク質分解酵素によりペプチド断片化し高速液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析計（ＭＳ）で測定した。
【００９３】
本発明の実施の形態に係るタンパク質溶液ろ過処理装置を用いた血漿のろ過処理と、遠心ろ過およびそれに伴う手作業で行った際の処理結果の比較は、測定結果データの繰返し再現性（repeatability）を評価することで行った。すなわち、本発明の実施の形態に係るタンパク質溶液ろ過処理装置で処理された血漿中のタンパク質を、前述のＬＳ−ＭＳ装置にて測定した３回の結果を、後述するアライメント法によって重ね合わせ、ピーク検出処理を行って得られた各シグナルピークに対して、３回の測定でどれだけ測定値が変動したかを相対標準偏差で示したものを指標とし、その結果を、同様の計算を遠心ろ過および手作業による処理で得られた６回の測定結果と比較検討した。
【００９４】
３回の測定結果を重ね合わせる際には、測定の都度変動するＬＣの溶出時間を揃えるため、Ｉ−ＯＰＡＬ法（国際出願PCT/JP2004/004621）を用いて時間軸を揃えた上で、Ｉ−ＯＰＡＬ解析ツールのピーク検出プログラムによってシグナルピークを検出した（Ｉ−ＯＰＡＬアライメントプログラムで時間軸を揃える際のマーカーとして使用する標準物質は、あらかじめサンプル測定前に添加されたトリ卵白リゾチームと、ヒト血漿中に存在するα-1-antitrypsin由来のペプチド分子イオンシグナル３つを使用した。）。
【００９５】
Ｉ−ＯＰＡＬ法による３つないし６つの測定結果を重ね合わせた際の一致度の指標となる相関係数（cosine correlation）は、本発明の実施の形態に係る装置を用いた３階の測定では、それぞれ0.9233、0.9251、0.9445であったのに対し、遠心ろ過および手作業による前処理を経た6回の測定結果では、0.8816から0.9489の間であり、平均は、0.9269であった。このことは、本発明の実施の形態に係る装置での測定結果は、測定データの重ね合わせ処理を行うのに十分な再現性があることを示している。
【００９６】
また、重ね合わせ後、ピーク検出処理を行った結果、得られたシグナルピークの個数は、本発明の実施の形態に係る装置を用いた３回の測定からは25229個、手作業による前処理を経たものの６回の測定からは27475個であった。得られたシグナルピーク毎に、アライメントによって重ね合わせる前の測定ごとのピーク強度がどの程度変動しているかを相対標準偏差（ＲＳＤ）で表すと、本発明の実施の形態に係るタンパク質溶液ろ過処理装置を用いた場合が15.8％、遠心ろ過および手作業によった場合が13.7％であった。また、ＲＳＤが20％を超過したシグナルピークの個数は、本発明の実施の形態に係る装置を用いた場合には、6292個、遠心ろ過および手作業によった場合には、5548個であり、何れも4分の１以下であった。
【００９７】
以上の結果から、本発明の実施の形態に係る装置を用いてサンプルを処理した結果は、遠心ろ過および手作業によって処理されたものと略同程度の再現性を有するものと判断される。図９（ａ）および図９（ｂ）は、それぞれ、本発明の実施の形態に係る装置を用いて処理した場合と、遠心ろ過および手作業で前処理を行った場合について、３回ないし６回の測定結果を重ね合わせて、シグナル強度の変動を相対標準偏差（ＲＳＤ）で表した際に、ＲＳＤ値の頻度分布を示したものである。横軸は、10％刻みで区切ったＲＳＤ値で、一番左が0から10％までの領域、また、一番右が50％を越える領域に相当する。縦軸はＲＳＤ値が該当範囲にあるシグナルピークの個数を表す。本発明の実施の形態に係る装置と遠心ろ過および手作業を用いたものとほぼ同数の分布形状が得られることがわかり、本発明の実施の形態に係る装置を用いれば、遠心ろ過および手作業を行うことなく処理可能であり、簡単な装置構造および規模で、ユーザの手間を除去または緩和できることが示された。
【００９８】
以上の例は、タンパク質として、アルブミン、およびＩｇＧの場合についてのみ説明したが、この例に限られるものではない。例えば、その他の免疫グロブリンであっても良い。また、フィルタ封入チップについても、図示した形状に限られず、前述した種々の形状のものがありうる。
【００９９】
例えば、図２に示したように、各ノズル１９に対応して、前記圧縮窒素ガス貯蔵器との接続および遮断を行う弁をのみ設けたが、前記分岐管路３５の各支路毎に電磁弁を設けて、前記各シリンダに対応する各圧力センサの検知結果に基づいて、接続および遮断を制御するようにしても良い。これで、ノズル内の圧力に異常が検知された場合には、該当する支路の弁を遮断して、該ノズルへの圧縮ガスの供給を中止して、事故の未然防止または無駄な処理の中止を行うことができる。また、前記窒素ガス圧縮貯蔵器をノズルの本数用意して、各ノズルごとに接続して設けるようにしても良い。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明は、タンパク質等溶液ろ過処理方法およびその装置に関する。本発明は、免疫系、血漿・血清中等の生体内タンパク質タンパク質の取扱いが要求される分野、例えば、工業分野、食品、農産、水産加工等の農業分野、製剤分野、衛生、保健、免疫、疾病、遺伝等の医療分野、化学もしくは生物学等の理学の分野等、あらゆる分野に関係するものである。本発明は、特に、多数の試薬や物質を用いた一連の処理を所定の順序に連続的に実行する場合に有効な方法である。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】本発明の実施の形態に係るタンパク質等溶液ろ過処理装置の外観を示す斜視図である。
【図２】本発明の実施の形態に係るタンパク質等溶液ろ過処理装置のろ過処理部を模式的に示す斜視図である。
【図３】本発明の実施の形態に係るタンパク質等溶液ろ過処理装置のろ過処理部を示す平面図である。
【図４】本発明の実施の形態に係るタンパク質等溶液ろ過処理装置のろ過処理部を模式的に示す側面図である。
【図５】本発明の実施の形態に係るタンパク質等溶液ろ過処理装置の空圧経路概念図である。
【図６】本発明の実施の形態に係るタンパク質等溶液ろ過処理装置の本体部の機構を示す正面図である。
【図７】本発明の実施の形態に係るタンパク質等溶液ろ過処理装置の本体部の機構を示す側面図である。
【図８】本発明の実施の形態に係る処理の流れ図である。
【図９】本発明の実施の形態に係るタンパク質等溶液ろ過処理装置を用いた処理と遠心ろ過および手作業による処理結果を示す相対標準偏差の頻度分布図である。
【符号の説明】
【０１０２】
１０    タンパク質等溶液ろ過処理装置
１２    窒素ガス圧縮貯蔵器（窒素ガス供給部、吸引吐出部）
１３，３５    管路
１５    フィルタ処理部
１６    ノズルヘッド
１８    シリンダ（大気吸引吐出部）
１９    ノズル
２２    容器群
２３，２７    限外ろ過フィルターユニット（フィルタ封入容器）
３４    弁（切換部）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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