(57)【要約】      （修正有）【課題】ターゲットとなる分子の標識を必要としない、分子間相互作用検出法を提供する。【解決手段】分子間相互作用を検出する方法であって、(a) プローブを固定化した担体で、該プローブの近傍に化学反応部位Ａを担持する該担体と、ターゲットとを接触させる工程、(b) 化学反応部位Ｂを有するブロック剤を該担体と接触させる工程、(c) (a)及び(b)の工程後に、未反応ターゲットと未反応ブロック剤を除去する工程、(d) (a)及び(b)の工程後に、プローブと結合したターゲットを除去する工程、(e) (d)の工程後に、化学反応部位Ｃを有する標識物質を該担体と接触させる工程、及び(f) (e)の工程後に、標識物質のシグナルを検出する工程を含む。ここで、プローブとターゲットの少なくとも一方が生体分子であり、化学反応部位Ａ，Ｂ及びＣは、特異的に反応して共有結合を形成するが、いずれの化学反応部位も生体分子とは反応性を有しないものである、前記方法。【選択図】  図１
2007071719.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子間相互作用を検出する方法であって、
(a) プローブ分子が固定化された担体であって、該プローブ分子の近傍に化学反応部位Ａを担持する該担体と、ターゲット分子とを接触させる工程、
(b) 化学反応部位Ｂを有するブロック剤を該担体と接触させる工程、
(c) (a)及び(b)の工程より後に、未反応のターゲット分子と未反応のブロック剤を除去する工程、
(d) (a)及び(b)の工程より後に、プローブ分子と結合したターゲット分子を除去する工程、
(e) (d)の工程より後に、化学反応部位Ｃを有する標識物質を該担体と接触させる工程、及び
(f) (e)の工程より後に、標識物質に由来するシグナルを検出する工程
を含み、
ここで、プローブ分子とターゲット分子の少なくとも一方が生体分子であり、化学反応部位Ｂと化学反応部位Ｃとは同一でも異なっていてもよく、化学反応部位Ａと化学反応部位Ｂ及び化学反応部位Ｃとは、特異的に反応して共有結合を形成するが、いずれの化学反応部位も生体分子とは反応性を有しないものである、
前記方法。
【請求項２】
化学反応部位Ａと化学反応部位Ｂ及びＣとが共有結合を形成する反応が、Staudinger反応である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ターゲット分子がタンパク質である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
プローブ分子がスペーサーを介して担体に固定化されており、化学反応部位Ａが該スペーサーに、直接又はさらなるスペーサーを介して結合している、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
化学反応部位Ａがホスフィン部位であり、かつ化学反応部位Ｂ及び化学反応部位Ｃがアジド基であるか、又は
化学反応部位Ａがアジド基であり、かつ化学反応部位Ｂ及び化学反応部位Ｃがホスフィン部位である、
請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ホスフィン部位が、以下の式I：
【化１】
2007071719.tif 000010
[式中、Ｒ１は、直接又はスペーサーを介して、担体、ブロック剤又は標識物質と結合している二価の有機基であり、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、一価の有機基である]
で表される基である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
式Ｉが、以下の式I’：
【化２】
2007071719.tif 000011
[式中、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、置換又は無置換フェニルであり、Ｒ４はアルキルである]
で表される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
プローブ分子が固定化された担体であって、該プローブ分子の近傍に、特定の化学反応部位と特異的に反応して共有結合を形成するが生体分子とは反応性を有しない化学反応部位を有する前記担体。
【請求項９】
プローブ分子がスペーサーを介して担体に結合されており、プローブ分子近傍の化学反応部位がアジド基又は以下の式I'：
【化３】
2007071719.tif 000012
[式中、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、置換又は無置換フェニルであり、Ｒ４はアルキルである]
で表される基であり、該スペーサーに直接又はさらなるスペーサーを介して結合している、請求項８記載の担体。
【請求項１０】
分子間相互作用を検出するためのキットであって、
(a) プローブ分子が固定化された担体であって、該プローブ分子の近傍に、化学反応部位Ａを担持する担体、
(b) 化学反応部位Ｂを有するブロック剤、及び
(c) 化学反応部位Ｃを有する標識物質
を含み、
ここで、化学反応部位Ｂと化学反応部位Ｃとは同一でも異なっていてもよく、化学反応部位Ａと化学反応部位Ｂ及び化学反応部位Ｃとは、特異的に反応して共有結合を形成するが、いずれも生体分子とは反応性を有しないものである、
前記キット。
【請求項１１】
化学反応部位Ａと化学反応部位Ｂ及びＣとが共有結合を形成する反応が、Staudinger反応である、請求項１０記載のキット。
【請求項１２】
ターゲット分子がタンパク質である、請求項１０又は１１記載のキット。
【請求項１３】
プローブ分子がスペーサーを介して担体に固定化されており、化学反応部位Ａが該スペーサーに、直接又はさらなるスペーサーを介して結合している、請求項１０〜１２のいずれか１項記載のキット。
【請求項１４】
化学反応部位Ａがホスフィン部位であり、かつ化学反応部位Ｂ及び化学反応部位Ｃがアジド基であるか、又は
化学反応部位Ａがアジド基であり、かつ化学反応部位Ｂ及び化学反応部位Ｃがホスフィン部位である、
請求項１０〜１３のいずれか１項記載のキット。
【請求項１５】
ホスフィン部位が、以下の式I：
【化４】
2007071719.tif 000013
[式中、Ｒ１は、直接又はスペーサーを介して、担体、ブロック剤又は標識物質と結合している二価の有機基であり、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、一価の有機基である]
で表される基である、請求項１４記載のキット。
【請求項１６】
式Ｉが、以下の式I’：
【化５】
2007071719.tif 000014
[式中、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、置換又は無置換フェニルであり、Ｒ４はアルキルである]
で表される、請求項１５記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
現在、核酸、糖鎖、タンパク質などの生体分子を担体上に固定化し、それにターゲットとなる生体分子を反応させて両分子の相互作用を研究する方法が広く使われている。上記のような生体分子間相互作用の研究においては、通常、ターゲットとなる生体分子に蛍光色素などの標識物質を付し、これを担体上に固定化されたプローブ分子と反応させ、未反応の生体分子を洗浄除去した後、標識物質に由来するシグナルを検出することにより、分子間相互作用が測定される。
【０００２】
例えば、高度な機能を有するタンパク質を迅速・簡便に検出する方法としては、現在のところ、抗体を用いる方法が主流である。この方法は、ターゲットとなるタンパク質に対し特異性の高い抗体を用いる点で信頼性ある結果を与えると考えられている。しかし、特異抗体を用いる方法では、ターゲットタンパク質を蛍光色素等で定量的に標識する方法の確立、又はターゲットタンパク質と結合する特異抗体の調製が不可欠であり、新たに単離精製されたタンパク質の結合特性評価の面から迅速性に欠ける。表面プラズモンバイオセンサや水晶発振子による検出も代替法として有力であるが、上述の抗体を用いる蛍光法と比べ多くのサンプル量が必要であり、多チャンネル化が現在検討中であるなど改良の余地を多く残している。
【０００３】
従って、ターゲットとなる生体分子の標識を必要とせず、蛍光シグナル検出等既存の測定機器を利用できる生体分子間相互作用検出法の開発が望まれていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ターゲットとなる分子の標識を必要としない、プローブ分子との分子間相互作用を検出する方法、プローブ分子が固定された担体およびプローブ分子の分子間相互作用を検出するキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、ターゲットとなる分子と担体上のプローブ分子との複合体形成により、みかけの分子サイズが増大することに着目した。すなわち、ターゲットとなる分子の存在下、プローブ分子近傍で特異的な化学反応を起こさせ、プローブ分子と相互作用したターゲット分子が当該化学反応に対して立体障害を形成することを利用し、その化学反応を検出することで、分子間相互作用を検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）分子間相互作用を検出する方法であって、
(a) プローブ分子が固定化された担体であって、該プローブ分子の近傍に化学反応部位Ａを担持する該担体と、ターゲット分子とを接触させる工程、
(b) 化学反応部位Ｂを有するブロック剤を該担体と接触させる工程、
(c) (a)及び(b)の工程より後に、未反応のターゲット分子と未反応のブロック剤を除去する工程、
(d) (a)及び(b)の工程より後に、プローブ分子と結合したターゲット分子を除去する工程、
(e) (d)の工程より後に、化学反応部位Ｃを有する標識物質を該担体と接触させる工程、及び
(f) (e)の工程より後に、標識物質に由来する信号を検出する工程
を含み、
ここで、プローブ分子とターゲット分子の少なくとも一方が生体分子であり、化学反応部位Ｂと化学反応部位Ｃとは同一でも異なっていてもよく、化学反応部位Ａと化学反応部位Ｂ及び化学反応部位Ｃとは、特異的に反応して共有結合を形成するが、いずれの化学反応部位も生体分子とは反応性を有しないものである、
前記方法。
【０００７】
（２）化学反応部位Ａと化学反応部位Ｂ及びＣとが共有結合を形成する反応が、Staudinger反応である、（１）記載の方法。
（３）ターゲット分子がタンパク質である、（１）又は（２）記載の方法。
（４）プローブ分子がスペーサーを介して担体に固定化されており、化学反応部位Ａが該スペーサーに、直接又はさらなるスペーサーを介して結合している、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）化学反応部位Ａがホスフィン部位であり、かつ化学反応部位Ｂ及び化学反応部位Ｃがアジド基であるか、又は
化学反応部位Ａがアジド基であり、かつ化学反応部位Ｂ及び化学反応部位Ｃがホスフィン部位である、
（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
【０００８】
（６）ホスフィン部位が、以下の式I：
【化１】
2007071719.tif 000003
[式中、Ｒ１は、直接又はスペーサーを介して、担体、ブロック剤又は標識物質と結合している二価の有機基であり、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、一価の有機基である]
で表される基である、（５）記載の方法。
【０００９】
（７）式Ｉが、以下の式I’：
【化２】
2007071719.tif 000004
[式中、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、置換又は無置換フェニルであり、Ｒ４はアルキルである]
で表される、（６）記載の方法。
【００１０】
（８）プローブ分子が固定化された担体であって、該プローブ分子の近傍に、特定の化学反応部位と特異的に反応して共有結合を形成するが生体分子とは反応性を有しない化学反応部位を有する前記担体。
【００１１】
（９）プローブ分子がスペーサーを介して担体に結合されており、プローブ分子近傍の化学反応部位がアジド基又は以下の式I'：
【化３】
2007071719.tif 000005
[式中、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、置換又は無置換フェニルであり、Ｒ４はアルキルである]
で表される基であり、該スペーサーに直接又はさらなるスペーサーを介して結合している、（８）記載の担体。
【００１２】
（１０）分子間相互作用を検出するためのキットであって、
(a) プローブ分子が固定化された担体であって、該プローブ分子の近傍に、化学反応部位Ａを担持する担体、
(b) 化学反応部位Ｂを有するブロック剤、及び
(c) 化学反応部位Ｃを有する標識物質
を含み、
ここで、化学反応部位Ｂと化学反応部位Ｃとは同一でも異なっていてもよく、化学反応部位Ａと化学反応部位Ｂ及び化学反応部位Ｃとは、特異的に反応して共有結合を形成するが、いずれも生体分子とは反応性を有しないものである、
前記キット。
【００１３】
（１１）化学反応部位Ａと化学反応部位Ｂ及びＣとが共有結合を形成する反応が、Staudinger反応である、（１０）記載のキット。
（１２）ターゲット分子がタンパク質である、（１０）又は（１１）記載のキット。
（１３）プローブ分子がスペーサーを介して担体に固定化されており、化学反応部位Ａが該スペーサーに、直接又はさらなるスペーサーを介して結合している、（１０）〜（１２）のいずれかに記載のキット。
（１４）化学反応部位Ａがホスフィン部位であり、かつ化学反応部位Ｂ及び化学反応部位Ｃがアジド基であるか、又は
化学反応部位Ａがアジド基であり、かつ化学反応部位Ｂ及び化学反応部位Ｃがホスフィン部位である、
（１０）〜（１３）のいずれかに記載のキット。
（１５）ホスフィン部位が、以下の式I：
【００１４】
【化４】
2007071719.tif 000006
[式中、Ｒ１は、直接又はスペーサーを介して、担体、ブロック剤又は標識物質と結合している二価の有機基であり、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、一価の有機基である]
で表される基である、（１４）記載のキット。
（１６）式Ｉが、以下の式I’：
【００１５】
【化５】
2007071719.tif 000007
[式中、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、置換又は無置換フェニルであり、Ｒ４はアルキルである]
で表される、（１５）記載のキット。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、ターゲットとなる生体分子の標識を必要としない、分子間相互作用検出法が提供される。また、本発明においてタンパク質の相互作用を検出する場合は、ターゲットタンパク質に特異的な抗体を必要としない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の検出方法の概要を図１に示す。まずプローブ分子を担体上に固定化し、その近傍に化学反応部位Ａを配置する。次いで、ターゲット分子とプローブ分子を相互作用させ、未反応のターゲット分子を洗浄除去する。ここに化学反応部位Ｂを有するブロック剤を添加し、プローブ分子近傍の化学反応部位Ａと結合生成反応を行う。ターゲット分子と相互作用して複合体を形成しているプローブ分子近傍ではターゲット分子の嵩高さによる立体障害性が高く、ブロック剤との反応性は低いが、複合体を形成していないプローブ分子近傍では立体障害性が低く、ブロック剤との反応性は高い。そこで、未反応のターゲット分子及び未反応のブロック剤、並びにプローブ分子と複合体を形成したターゲット分子を除去し、化学反応部位Ｃを有する標識物質をプローブ分子近傍の化学反応部位Ａへ導入すると、プローブ分子毎にターゲット分子との親和性に依存したシグナル強度が得られる。
【００１８】
本発明の方法によって検出できる分子間相互作用は、生体分子が関与する分子間相互作用であって、分子間で特異的な結合を形成するものである限り特に制限されず、生体分子間の相互作用及び生体分子とその他の分子との相互作用が含まれる。好ましくは高分子の生体分子が関与する分子間相互作用である。生体分子には、ＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸、ペプチド、タンパク質及び糖鎖、並びにこれらの複合体及びこれらとその他の分子との複合体などが包含される。従って、本発明における分子間相互作用には、例えば、タンパク質間の相互作用、タンパク質とペプチドの相互作用、核酸間の相互作用、タンパク質と核酸の相互作用、タンパク質と化合物との相互作用などが包含される。より具体的には、核酸相補鎖間のハイブリダイゼーション、抗原と抗体又はその断片との反応、酵素と基質又は阻害剤の結合反応、リガンドとレセプターの結合反応、アビジンとビオチンの結合反応、核酸と転写因子の結合反応、細胞接着因子の結合反応、糖鎖とタンパク質の結合反応、脂肪鎖とタンパク質の結合反応、リン酸基とタンパク質の結合反応、補欠因子とタンパク質の結合反応などが挙げられる。本発明は、タンパク質が関与する相互作用の検出に好ましく用いられる。本発明において、相互作用の検出には、相互作用の有無の検出、及び相互作用の定量が包含される。
【００１９】
本発明の検出方法では、通常、担体に固定化されたプローブ分子と試料に含まれるターゲット分子とを相互作用させる。プローブ分子とターゲット分子は、少なくとも一方が生体分子であり、上記のような相互作用に関与するそれぞれの分子をさす。好ましくはターゲット分子、より好ましくは両分子が生体分子である。プローブ分子は、ターゲット分子及び検出しようとする相互作用に基づき、当業者であれば適宜選択できる。本発明は、ターゲット分子がプローブ分子と結合したときの立体障害を利用することから、ターゲット分子が嵩高い分子や高分子である場合、特にタンパク質である場合に好適に用いられる。ターゲット分子がタンパク質である場合、プローブ分子としてはそのタンパク質と相互作用する分子を選択すればよく、例えば、目的のタンパク質と結合性のペプチドなどを用いることができる。また、ターゲットタンパク質が酵素である場合はその基質又は阻害剤をプローブ分子として用いることができ、ターゲットタンパク質がレセプターである場合はそのリガンドをプローブ分子として用いることができ、ターゲットタンパク質が抗体である場合はその抗原や抗原決定部位をプローブ分子として用いることができる。そして、該プローブ分子が固定化された担体と被検試料とを接触させ、本発明の方法により相互作用を検出することにより、該プローブ分子と相互作用するタンパク質が被検試料に含まれるかどうかを、又はその量を検出することができる。また、プローブ分子として特定の抗体に対する抗原を担体に固定化し、該担体と被検試料とを接触させることにより、被検試料に該抗原に対する抗体が含まれるかどうか、又はその量を検出することができる。担体に固定化するプローブ分子は、単一の種類でもよいし、複数種でもよい。
【００２０】
ターゲット分子がペプチド又はタンパク質である場合、本発明は、そのサイズが、通常、1〜1000 kDa、好ましくは1〜200 kDaのペプチド又はタンパク質に対し、好適に用いられる。また、ターゲット分子が核酸である場合、本発明は、そのサイズが、通常、3〜5000塩基対、好ましくは10〜1000塩基対の核酸に対し、好適に用いられる。また、ターゲット分子が糖鎖である場合、本発明は、そのサイズが、通常、1〜100糖、好ましくは1〜30糖の糖鎖に対し、好適に用いられる。
【００２１】
一方、プローブ分子がペプチド又はタンパク質である場合、本発明は、そのサイズが、通常、1〜1000 kDa、好ましくは1〜200 kDaのペプチド又はタンパク質に対し、好適に用いられる。また、プローブ分子が核酸である場合、本発明は、そのサイズが、通常、3〜5000塩基対、好ましくは10〜1000塩基対の核酸に対し、好適に用いられる。また、プローブ分子が糖鎖である場合、本発明は、そのサイズが、通常、1〜100糖、好ましくは1〜30糖の糖鎖に対し、好適に用いられる。
【００２２】
担体は、プローブ分子を固定化できるものであれば、特に制限されず、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されない。例えば、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステン及びそれらの化合物などの貴金属、及びグラファイト、カ−ボンファイバ−に代表される炭素などの導電体材料；単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などに代表されるシリコン材料、ＳＯＩ（シリコン・オン・インシュレータ）などに代表されるこれらシリコン材料の複合素材；ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラスなどの無機材料；ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、PEGA樹脂（bis-2-acrylamidoprop-1-yl polyethyleneglycol crosslinked dimethylacrylamide and acryloyl sarcosine methylester, M. Meldal Tetrahedron Lett. 1992, 33, 3077-3080）、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、ポリフェニレンオキサイド及びポリスルホンなどの有機材料等が挙げられる。担体の形状も特に制限されず、板状、糸状、ビーズ状、多孔質状、網状、円筒状などいずれも使用できる。
【００２３】
プローブ分子を担体に固定化する方法は、特に制限されず、担体の種類及びプローブ分子の種類に応じて、当業者であれば好適な方法を選択できる。固定化するプローブ分子がペプチド又はタンパク質である場合には、担体表面にポリリジン等の高分子を塗布して固定化する方法、担体上で固相合成を実施することによりペプチド鎖を伸長する方法などを利用できる。固定化するプローブ分子が核酸である場合には、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリエチレンイミン等）で表面処理した担体表面に試料をスポッティングして、核酸の荷電を利用して担体上に静電結合させる方法が一般的に利用される。また、担体表面の処理方法として、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有するシランカップリング剤を用いる方法も利用されている。この場合には、アミノ基、アルデヒド基等は、共有結合により担体表面に導入されるため、ポリ陽イオンによる場合と比較して安定に担体表面に存在する。
【００２４】
また、担体表面にプローブ分子と反応性の官能基を導入し、該官能基とプローブ分子との間で共有結合を形成させることにより、強固に固定化することもできる。このような官能基は、当業者であればプローブ分子に応じて適宜選択することができ、特に制限されないが、例えば、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、ヒドロキシル基、メルカプト基、カルボジイミド基、エポキシ基、活性エステル基、スルホ基、イミド基等が挙げられる。また、ニッケルキレート、コバルトキレート等の金属キレートを導入することも有効である。
【００２５】
アミノ基の導入は、例えば、担体上に、ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、無定形炭素、グラファイト、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロムまたは炭化バナジウムなどからなるカーボン層を形成し、カーボン層をアンモニアガス中で紫外線照射することにより実施できる。ダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）層が好ましい。または、カーボン層を塩素ガス中で紫外線を照射して塩素化し、さらにアンモニアガス中で紫外線照射することにより実施できる。または、メチレンジアミン、エチレンジアミンで等の多価アミン類ガス中を、塩素化したカーボン層と反応させることによって実施することもできる。カーボン層の形成は公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ（Chemical vapor deposit）法、ＥＣＲＣＶＤ（Electric cyclotron resonance chemical vapor deposit）法、ＩＣＰ（Inductive coupled plasma）法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ（Electric cyclotron resonance）スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザ蒸着法、ＥＢ（Electron beam）蒸着法、抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。
【００２６】
カルボキシル基の導入は、例えば、上記のようにアミノ化したカーボン層に適当な多価カルボン酸を反応させることにより実施できる。エポキシ基の導入は、例えば、上記のようにアミノ化したカーボン層に適当な多価エポキシ化合物を反応させることによって実施できる。あるいは、カーボン層が含有する炭素＝炭素２重結合に有機過酸を反応させることにより得ることができる。有機過酸としては、過酢酸、過安息香酸、ジペルオキシフタル酸、過ギ酸、トリフルオロ過酢酸などが挙げられる。ホルミル基の導入は、例えば、上記のようにアミノ化したカーボン層に、グルタルアルデヒドを反応させることにより実施できる。ヒドロキシル基の導入は、例えば、上記のように塩素化したカーボン層に、水を反応させることにより実施できる。活性化エステル基の導入は、例えば、塩素ガス中でカーボン層に紫外線を照射して表面を塩素化し、ついで、アンモニアガス中で紫外線を照射してアミノ化した後、適当な酸クロリドまたはジカルボン酸無水物を用いてカルボキシル化し、末端のカルボキシル基をカルボジイミドまたはジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと脱水縮合することにより実施できる。この処理により、アミド結合を介して炭化水素基の末端に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基等の活性化エステル基が結合した基を形成することができる（特開2001-139532）。
【００２７】
ＤＮＡおよびＲＮＡ等の核酸を保持する場合は、アミノ基、カルボジイミド基、エポキシ基、ホルミル基または活性化エステル基を導入するのが好ましい。タンパク質やペプチドを保持する場合は、アミノ基、カルボジイミド基、エポキシ基、ホルミル基、金属キレートまたは活性化エステル基を導入するのが好ましい。金属キレートを導入した担体を使用すると、ポリヒスチジン配列等の金属イオンと親和性のある標識を有するペプチドを効果的かつ安定に固定化することができる。金属キレートの導入は、例えば、カーボン層が形成された基板を塩素化し、次いでこれをアミノ化した後、クロロ酢酸等のハロカルボン酸を添加してキレート配位子を導入することにより実施できる。ポリヒスチジン配列等の標識は、当業者に公知の方法により導入することができる。
【００２８】
プローブ分子は、好ましくは、スペーサーを介して担体に固定化されている。その場合は、このスペーサーに上記プローブ分子と反応性の官能基を導入してもよい。
【００２９】
本発明においては、担体に固定化されたプローブ分子の近傍に化学反応部位Ａが存在する。近傍とは、該化学反応部位Ａが化学反応するときに、プローブ分子に結合したターゲット分子が該化学反応に対して立体障害をもたらすような位置を意味する。プローブ分子がスペーサーを介して担体に固定化されている場合、化学反応部位Ａは、該スペーサー部分に、直接又はさらなるスペーサーを介して結合される。
【００３０】
本発明においてスペーサーは、プローブ分子とターゲット分子との相互作用や、化学反応部位間の反応を阻害しない限り、特に制限されない。通常、二価の有機基、例えば、ペプチド鎖、核酸鎖、糖鎖、ヘテロ原子を有していてもよい二価の炭化水素基、例えば、置換又は無置換C1-12アルキレン、置換又は無置換C1-12ヘテロアルキレン、置換又は無置換C1-12ヘテロアルキレン、置換又は無置換C3-8シクロアルキレン、置換又は無置換C3-8ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、置換又は無置換C5-12ヘテロシクロアルキレンなどを使用することができる。ここで置換基としては、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選ばれるハロゲン原子、ヒドロキシル、カルボキシル、置換又は無置換アミノ、ニトロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、置換又は無置換C1-12アルキル、置換又は無置換C1-12ヘテロアルキル、置換又は無置換C3-12アルケニル、置換又は無置換C3-8シクロアルキル、アラルキル、置換又は無置換C1-12アルコキシ、置換又は無置換C1-12ヘテロアルコキシ、置換又は無置換C1-6アルコキシカルボニル、トリフルオロメチル等が挙げられる。
【００３１】
本発明において、アリール、ヘテロアリール、アリーレン及びヘテロアリーレンは、芳香属性を有する基、すなわち芳香環を含む基を意味する。
【００３２】
本発明におけるアリール及びヘテロアリールの具体例としては、フェニル、フルオロフェニル、クロロフェニル、ジフルオロフェニル、ジクロロフェニル、メチルフェニル、エチルフェニル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、メチルピリジル、クロロピリジル、メトキシピリジル、ジクロロピリジル、ジメトキシピリジル、ナフチル、フェナントリル、フルオレニル、アントリル、ピレニル、インダニル、テトラヒドロナフチル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、フタラジニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、インダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、メチレンジオキシフェニル、エチレンジオキシフェニル、フルオロナフチル、クロロナフチル、メチルナフチル、メトキシナフチル、クロロキノリルなどを挙げることができる。
【００３３】
ブロック剤は、化学反応部位Ａと特異的に反応して共有結合を形成する化学反応部位Ｂを有する。標識物質もまた、化学反応部位Ａと特異的に反応して共有結合を形成する化学反応部位Ｃを有する。化学反応部位Ｂ及びＣは、それぞれが化学反応部位Ａと特異的に反応し、生体分子と反応性を有しない限り、同一でも異なっていてもよい。
【００３４】
本発明における上記化学反応部位間の反応は、特異的であり、いずれの化学反応部位も生体分子におけるアミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基、イミダゾール基、グアニジノ基、インドール基、リン酸基などと反応しない。そのような特異的反応としては、特に制限されず、当業者であれば、プローブ分子やターゲット分子の種類に応じて、適宜選択することができ、好適な化学反応部位を設計することができる。生体分子と反応しない特異的反応としては、例えば、Staudinger反応、1,3-双極子環化付加反応、Diels-Alder反応などが挙げられる。Staudinger反応は、ホスフィンとアジドとの反応であり、化学反応部位としてホスフィン部位とアジド基（−N3）を用いる。1,3-双極子環化付加反応は、銅触媒存在下におけるアセチレンとアジドとの反応であり、代表例としては化学反応部位としてエチニル基とアジド基を用いる（C. W. Tornoe, C. Christensen, M. Meldal J. Org. Chem. 2002, 67, 3057-3064.  Q. Wang, T. R. Chan, R. Hilgraf, V. V. Fokin, K. B. Sharpless, M. G. Finn J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 3192-3193.）。Diels-Alder反応はエン化合物とジエン化合物との反応であり、代表例としては化学反応部位としてキノン基とシクロペンタジエン基を用いる(B. T. Houseman, J. H. Huh, S. J. Kron, M. Mrksich Nat. Biotechnol. 2002, 20, 270-274）。Staudinger反応は、金属触媒の外部添加や熱又は光照射等を必要としない穏和な反応であるという点で有利である。一般的なStaudinger反応の反応機構を図２の上に、本発明における好ましいStaudinger反応の反応機構を図２の下に示す。後者の反応（K. L. Kiick, E. Saxon, D. A. Tirrell, C. R. Bertozzi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002, 99, 19-24）においては、最終的にペプチド結合が形成される。従って、化学反応部位間の反応により、安定な共有結合が形成されるという観点から好ましい反応である。
【００３５】
一実施形態においては、化学反応部位Ａがホスフィン部位であり、かつ化学反応部位Ｂ及び化学反応部位Ｃがアジド基である。別の実施形態においては、化学反応部位Ａがアジド基であり、かつ化学反応部位Ｂ及び化学反応部位Ｃがホスフィン部位である。
【００３６】
ホスフィン部位とは、ホスフィン由来の部分をさし、好ましくは、トリ置換ホスフィン由来の部分であって、その置換基部分が、直接又はスペーサーを介して、担体、ブロック剤又は標識物質と結合する。
【００３７】
一実施形態において、ホスフィン部位は、以下の式I：
【化６】
2007071719.tif 000008
[式中、Ｒ１は、直接又はスペーサーを介して、担体、ブロック剤又は標識物質と結合している二価の有機基であり、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、一価の有機基である]
で表される基である。Ｒ１〜Ｒ３は、式Ｉのホスフィン部位がアジド基とStaudinger反応する限り特に制限されないが、嵩高い基であることが好ましい。二価の有機基とは、直接又はスペーサーを介して、担体、ブロック剤又は標識物質とリン原子とを結合する、２つの結合手を有する有機基を意味し、二価の分岐鎖も含まれる。
【００３８】
Ｒ１としては、ヘテロ原子を有していてもよい二価の炭化水素基、例えば、アリーレン、ヘテロアリーレン、置換又は無置換C1-12アルキレン、置換又は無置換C1-12ヘテロアルキレン、置換又は無置換C3-8シクロアルキレン、置換又は無置換C3-8ヘテロシクロアルキレン、置換又は無置換C3-12アルケニレン、置換又は無置換C3-12ヘテロアルケニレン、置換又は無置換C3-12アルキニレン、置換又は無置換C3-12ヘテロアルキニレンが挙げられる。好ましくは、アリーレン及びヘテロアリーレンである。アリーレン及びヘテロアリーレンとしては、フェニレン、ピリジレン、ピリダジニレン、ピリミジニレン、ピラジニレン、フリレン、チエニレン、ピロリレン、イミダゾリレン、チアゾリレン、オキサゾリレン、ナフチレン、アントリレン、ピレニレン、インダニレン、テトラヒドロナフチレン、キノリレン、イソキノリレン、シンノリニレン、キナゾリニレン、キノキサリニレン、ナフチリジニレン、フタラジニレン、インドリレン、イソインドリレン、ベンゾフリレン、ベンゾチエニレン、インダゾリレン、ベンゾイミダゾリレン及びベンゾチアゾリレン、並びにこれらの基を一部に含む基が挙げられる。また、これらの基は置換されていてもよい。
【００３９】
Ｒ１における置換基としては、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選ばれるハロゲン原子、ヒドロキシル、カルボキシル、置換又は無置換アミノ、ニトロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、置換又は無置換C1-12アルキル、置換又は無置換C1-12ヘテロアルキル、置換又は無置換C3-12アルケニル、置換又は無置換C3-8シクロアルキル、アラルキル、置換又は無置換C1-12アルコキシ、置換又は無置換C1-12ヘテロアルコキシ、置換又は無置換C1-12アルコキシカルボニル、トリフルオロメチル等が挙げられ、好ましくは置換又は無置換C1-12アルコキシカルボニルである。
【００４０】
Ｒ１は、好ましくはアザイリドの受容基を有する有機基であり、より好ましくはエステル結合又はチオエステル結合を有する有機基である。
【００４１】
好ましくは、Ｒ１は、置換又は無置換C1-6アルコキシカルボニル置換フェニレン、又は-X-C(O)-Y-Z-（式中、Xは直接結合、置換又は無置換C1-6アルキレン、置換又は無置換C1-6ヘテロアルキレン、置換又は無置換C3-8シクロアルキレン、置換又は無置換C3-8ヘテロシクロアルキレン、置換又は無置換C3-6アルケニレン、置換又は無置換C3-6ヘテロアルケニレン、置換又は無置換C3-6アルキニレン、置換又は無置換C3-6ヘテロアルキニレン、アリーレン又はヘテロアリーレンであり；YはO又はSであり；Zは置換又は無置換C1-6アルキレン、置換又は無置換C1-6ヘテロアルキレン、置換又は無置換C3-8シクロアルキレン、置換又は無置換C3-8ヘテロシクロアルキレン、置換又は無置換C3-6アルケニレン、置換又は無置換C3-6ヘテロアルケニレン、置換又は無置換C3-6アルキニレン、置換又は無置換C3-6ヘテロアルキニレン、アリーレン又はヘテロアリーレンである）である。-X-C(O)-Y-Z-においては、Zがリン原子に結合する場合も、Xがリン原子に結合する場合も含まれる。
【００４２】
Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して、ヘテロ原子を有していてもよい一価の炭化水素基、例えば、アリール、ヘテロアリール、置換又は無置換C1-12アルキル、置換又は無置換C1-12ヘテロアルキル、置換又は無置換C3-8シクロアルキル、置換又は無置換C3-8ヘテロシクロアルキル、置換又は無置換C3-12アルケニル、置換又は無置換C3-12ヘテロアルケニル、置換又は無置換C3-12アルキニル、置換又は無置換C3-12ヘテロアルキニル等が挙げられる。好ましくはアリール及びヘテロアリールである。好ましくは、置換又は無置換フェニルである。
【００４３】
Ｒ２及びＲ３における置換基としては、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選ばれるハロゲン原子、ヒドロキシル、カルボキシル、置換又は無置換アミノ、ニトロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、アリールオキシ、アリールアミノ、アリールC1-6アルキル、ヘテロアリールC1-6アルキル、置換又は無置換C1-12アルキル、置換又は無置換C1-12ヘテロアルキル、置換又は無置換C3-12アルケニル、置換又は無置換C3-8シクロアルキル、アラルキル、置換又は無置換C1-12アルコキシ、置換又は無置換C1-12ヘテロアルコキシ、置換又は無置換C1-6アルコキシカルボニル、トリフルオロメチル等が挙げられる。
【００４４】
本発明においてヘテロ原子は、酸素、窒素及び硫黄から選択される。
好ましくは、以下の式I’：
【化７】
2007071719.tif 000009
[式中、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、置換又は無置換フェニルであり、Ｒ４はアルキル、好ましくは置換又は無置換C1-12アルキル、より好ましくは置換又は無置換C1-6アルキルである]
であるホスフィン部位を用いるのが好ましい。
【００４５】
ホスフィン部位は、ホスフィン誘導体を合成し、これを担体、ブロック剤又は標識物質と反応させることにより、又はこれらに結合したスペーサーと反応させることにより形成することができる。ホスフィン誘導体は、担体、ブロック剤又は標識物質、又はこれらに結合したスペーサーにおける官能基と共有結合を形成するための官能基を有するように合成される。官能基は保護された形態で合成してもよい。そのような官能基としては、活性エステル基、エポキシ基、アミノ基、メルカプト基、クロロ基、ジスルフィド基、アルデヒド基、マレイイミド基、カルボジイミド基、イソチオシアネート基、イソシアネート基等が挙げられる。例えば、アミノ基は、活性エステル基、エポキシ基、アルデヒド基、カルボキシ基、カルボジイミド基、イソチオシアネート基及びイソシアネート基と反応性を有し、メルカプト基は、マレイミド基及びジスルフィド基と反応性を有する。
【００４６】
ブロック剤は、その化学反応部位Ｂが、担体に担持された化学反応部位Ａと共有結合を形成することにより標識物質の化学反応部位Ｃと化学反応部位Ａとの反応をブロックすることができ、プローブ分子とターゲット分子の相互作用を阻害しない限り、その構造は特に制限されない。ブロック剤は、例えば、核酸断片やペプチド、タンパク質等の生体由来分子、又は合成若しくは天然抽出高分子とすることができる。具体的には、分子量1〜1000 kDa、好ましくは1〜200 kDaのペプチド又はタンパク質の一部に、又は塩基数3〜5000、好ましくは10〜1000の核酸の一部に、又は分子量100〜1000000、好ましくは100〜100000の合成若しくは天然抽出高分子の一部に、直接又はスペーサーを介して化学反応部位Ｂが結合したものとすることができる。
【００４７】
標識物質としては、当技術分野で通常用いられるものを使用でき、例えば、蛍光標識（Cy3及びCy5などのCyDye、FITC、RITC、ローダミン、テキサスレッド、TET、TAMRA、FAM、HEX、ROX、GFP、クマリン、量子ドットなど）、発光標識（ルシフェリンなど）、酵素標識（西洋わさびペルオキシダーゼなど）、放射性標識（32P、35Sなど）などが挙げられる。標識物質としてビオチンを用い、続いて色素、酵素標識又は核酸分子等を付したアビジンをビオチンに反応させ、色素シグナルを検出するような方法、酵素活性を検出するような方法又は、核酸を用いるRCA (Rolling Circle Amplification)によりシグナルを増幅する方法も、標識由来のシグナルの検出に包含される。使用できる。これらの標識物質に化学反応部位Ｃを、直接又はスペーサーを介して結合させる。
【００４８】
本発明の検出方法は、以下の(a)〜(f)の工程を含む：
(a) プローブ分子が固定化された担体であって、該プローブ分子の近傍に化学反応部位Ａを担持する該担体と、ターゲット分子とを接触させる工程、
(b) 化学反応部位Ｂを有するブロック剤を該担体と接触させる工程、
(c) (a)及び(b)の工程より後に、未反応のターゲット分子と未反応のブロック剤を除去する工程、
(d) (a)及び(b)の工程より後に、プローブ分子と結合したターゲット分子を除去する工程、
(e) (d)の工程より後に、化学反応部位Ｃを有する標識物質を該担体と接触させる工程、及び
(f) (e)の工程より後に、担体標識物質に由来するシグナルを検出する工程。
【００４９】
(a)の工程で、担体上のプローブ分子と試料に含まれるターゲット分子が接触し、プローブ分子と相互作用するターゲット分子がプローブ分子に結合する。
【００５０】
(b）の工程で、ブロック剤の化学反応部位Ｂと担体に担持された化学反応部位Ａとが特異的に反応して共有結合を形成する。このときプローブ分子にターゲット分子が結合していると、プローブ分子の近傍に存在する化学反応部位Ａと化学反応部位Ｂとの反応は、ターゲット分子によって引き起こされる立体障害により反応速度が低下し、その結果、ターゲット分子が結合しているプローブ分子近傍の化学反応部位Ａにはブロック剤が結合しにくくなる。一方、ターゲット分子が結合していないプローブ分子においては立体障害が存在しないので、化学反応部位Ａと化学反応部位Ｂは効率的に反応し、プローブ分子近傍の化学反応部位Ａにブロック剤が結合しやすい。(a)と(b)の工程は同時に行ってもよいし、(a)の工程を先に行ってもよい。
【００５１】
続いて、(c)の工程では、例えば、バッファーや水で担体を洗浄することにより、未反応のターゲット分子と未反応のブロック剤を除去する。さらに(d)の工程で、プローブ分子と結合したターゲット分子も除去する。プローブ分子と結合したターゲット分子の除去は、より厳しい条件で洗浄を行うことにより実施できる。(d)の工程は、(c)の工程の後に実施してもよいし、(c)の工程と同時に実施してもよい。その結果、ターゲット分子が相互作用したプローブ分子近傍の化学反応部位Ａにはブロック剤があまり結合しておらず、ターゲット分子が相互作用しなかったプローブ分子近傍の化学反応部位Ａにはブロック剤が多く結合した状態が形成される。
【００５２】
続いて、(e)の工程で、化学反応部位Ｃを有する標識物質を担体と接触させる。化学反応部位Ｃは化学反応部位Ａと反応性を有するが、化学反応部位Ａがすでに化学反応部位Ｂと反応したためブロック剤が結合している場合は、これと反応することができない。一方、化学反応部位Ｃは、ブロック剤が結合していない化学反応部位Ａとは特異的に反応して共有結合を形成するので、標識物質が結合する。その結果、ブロック剤がその近傍に結合しているプローブ分子、すなわち(a)の工程でターゲット分子が相互作用しなかったプローブ分子近傍の化学反応部位Ａには標識物質が結合し、ブロック剤がその近傍に結合していないプローブ分子、すなわち(a)の工程でターゲット分子が相互作用したプローブ分子近傍の化学反応部位Ａには標識物質が結合することとなる。
【００５３】
未反応の標識物質を洗浄により除去した後、工程(f)で標識物質に由来するシグナルを検出することにより、プローブ分子とターゲット分子の相互作用を検出することができる。すなわち、その近傍に標識物質が多く結合したプローブ分子（標識由来のシグナル強度が強い場合）は、ターゲット分子と強く相互作用したことを示し、標識物質があまり結合しなかったプローブ分子（標識由来のシグナル強度が弱い場合）は、ターゲット分子と弱く相互作用したことを示す。
【００５４】
本発明はまた、分子間相互作用を検出するためのキットであって、
(a) プローブ分子が固定化された担体であって、該プローブ分子の近傍に、化学反応部位Ａを担持する担体、
(b) 化学反応部位Ｂを有するブロック剤、及び
(c) 化学反応部位Ｃを有する標識物質
を含む、前記キットに関する。上記と同様に、化学反応部位Ｂと化学反応部位Ｃとは同一でも異なっていてもよく、化学反応部位Ａと化学反応部位Ｂ及び化学反応部位Ｃとは、特異的に反応して共有結合を形成するが、いずれも生体分子とは反応性を有しないものである。本発明のキットは、上記(a)〜(c)の要素を含み、本発明の分子間相互作用の検出に使用するためのものであることを除き、公知公用のキットに用いられている各要素によって構成することができる。例えば、バッファー、マトリックス溶媒、洗浄バッファー、試料希釈液、反応停止液、標準物質等を含みうる。
【００５５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５６】
プローブ分子が固定化された担体であって、プローブ分子の近傍に化学反応部位Ａを担持した担体として、FLAG及びアジド基がスペーサーを介してPEGA樹脂に結合した機能性樹脂を合成した。化学反応部位Ｂを有するブロック剤として、ホスフィン部位を結合したペプチドを合成した。化学反応部位Ｃを有する標識物質として、ホスフィン部位をスペーサーを介して結合したクマリン色素を合成した（図３）。
【００５７】
（実施例１）ホスフィン誘導体の合成
ホスフィン誘導体は、文献に記載の方法に従って合成した（K. L. Kiick, E. Saxon, D. A. Tirrell, C. R. Bertozzi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002, 99, 19-24）（図４）。
【００５８】
化合物2の合成
化合物1（2.50 g,12.8 mmol）に35% HCl(75 mL)を加え50℃で20分攪拌した。これを5℃に冷却した後、NaNO2(900 mg,13.2 mmol)の水溶液(5 mL)を滴下し、室温で30分攪拌した。これをKI(21.0 g,125 mmol)を溶解した水溶液(35 mL)中にろ紙を通して滴下し、攪拌した室温で1時間撹拌した。反応混合液に飽和Na2SO3水溶液（125 mL）を加え、析出した結晶を吸引ろ過した。MeOH-H2Oから再結晶を行い、化合物2を得た(2.21 g,7.24 mmol,57%)。
【００５９】
化合物3の合成
化合物2(2.21 g、7.23 mmol)およびPd(OAc)2(24.3 mg,108 μmol)をナス形フラスコに入れ窒素で置換した。これに窒素で脱気した乾燥MeOH-ジイソプロピルエチルアミン(DIEA) (10:1, 27 mL)次いで、HPPh2 (1.90 mL,11.1 mmol)を加え、窒素雰囲気下85℃で一晩攪拌した。反応混合液にH2O-CHCl3を加え、有機層を水で洗浄し、濃縮した。粗製生物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(MeOH:CH2Cl2＝1:18)で精製した。残渣にH2Oを加えガラス棒でこすり粉末にした後吸引ろ過をし、P2O5上で真空乾燥し化合物3を得た(1.11 g,3.06 mmol,42%)。MALDI-TOFMS（obsd: 366.1 [M+H]+; calcd: 366.0）。
【００６０】
（実施例２）ホスフィン部位を有する標識物質の合成
クマリン色素を活性化し、ジアミンと縮合して化合物を得た。これとホスフィン誘導体を縮合し、蛍光標識を得た（図５）。
【００６１】
化合物5の合成
化合物4 (146 mg, 560 μmol)およびN-ヒドロキシスクシンイミド(HOSu) (321 mg,2.79 mmol)を少量のDMFに溶解し氷冷した。これに少量のDMFに溶解したWSC (535 mg,2.79 mmol)を加え0℃で60分攪拌した。HOSu (193 mg,1.68 mmol)およびWSC (322 mg,1.68 mol)を追加して室温で1時間攪拌した。激しく攪拌下、1,2-ビス(2-アミノエトキシ)エタン (829 mg,5.60 mmol)を滴下し、室温で3時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣にAcOEt-H2O を加え、有機層を飽和食塩水で洗浄後Mg2SO4で乾燥した。吸引ろ過後、ろ液を濃縮してからP2O5と共に真空乾燥し化合物5を得た(216 mg,553 μmol,98%)。
【００６２】
化合物6の合成
化合物5 (90.2  mg,231 μmol)、化合物3 (70.0  mg,193 μmol)、HOSu (65.7 mg, 571 μmol)、WSC (109 mg,571 μmol)、DIEA (59 μL,,192 μmol)を窒素ガスで脱気した脱水DMFに溶解し0℃で30分攪拌した。これを室温に戻しさらに一晩窒素雰囲気下で攪拌した。濃縮後シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製(MeOH:CH2Cl2=1:39)、真空乾燥し、化合物6を得た(18 mg,23 μmol,10 %)。MALDI-TOFMS（obsd: 738.0 [M+H]+; calcd: 738.5）。
【００６３】
（実施例３）ホスフィン部位を有するブロック剤の合成
ブロック剤の合成はホスフィン誘導体を活性化し、あらかじめ調製したペプチド部分と縮合することで行った（図６）。
【００６４】
化合物7の合成
化合物3 (38.2 mg,105 μmol)およびHOSu (36.0 mg,315 μmol)を少量のDMFに溶解し、WSC (60.0 mg,315 μmol)のDMF溶液を加え、0℃で30分攪拌した。これを室温に戻し窒素雰囲気下で4時間攪拌した。WSC (20 mg,105 μmol)を加え室温、窒素雰囲気下で1時間攪拌し化合物7を得た。
【００６５】
化合物8の合成
Fmoc固相法の常法によってペプチド8を得た。使用した樹脂はRink Amide MBHA Resin (0.78 mmol/g,1 g)、アミノ酸はFmoc-Gly-OH (267 mg,300 μmol)、Fmoc-Lys(Mtt)-OH (374 mg,600 μmol)、Fmoc-Arg(Pbf)-OH (389 mg,600 μmol)、Fmoc-βAla-OH (186 mg,600 μmol)、カップリング試薬HBTU (227 mg,600 μmol)、HOBt (91 mg,600 μmol)、DIEA (209 μL,1.20 mmol)を用いた。脱保護前の重量は1.23 g (190 μmol)だった。これを455 mg (70 μmol)量りとりN-メチルピロリドン(NMP)で1時間膨潤後、無水酢酸 (67 μL,700 μmol)、DIEA (24.3 μL,140 μmol)のNMP溶液を加え30分室温で反応させた。乾燥後トリフルオロ酢酸(TFA):H2O:トリイソプロピルシラン(TIS)=95:2.5:2.5を用いて脱保護をおこなった。濃縮後、エーテルで沈殿を生じさせ、デカント、真空乾燥して化合物8を得た。
【００６６】
化合物9の合成
化合物8(約70 μmol)全量をPBS (150 mM NaCl,pH 7.4):DMF=1:2(6 mL)に溶解した。pHが8以上にならないように注意しながら化合物７(105 μmol相当)のDMF溶液を滴下した。pHが上がってきたらHOSuを加え攪拌した(室温、6時間)。反応液を濃縮しゲルろ過で精製した(Sephadex LH-60/MeOH)。濃縮後、エーテルで固化、デカント、真空乾燥し、化合物9を得た(41.2 mg,36.5 μmol,52%)。MALDI-TOFMS（obsd: 1131.0 [M+H]+; calcd: 1131.3）。
【００６７】
（実施例４）担体に固定化されたプローブ分子の合成
図３に示すようにアジド基を有するプローブ分子を設計した。プローブ分子として、抗FLAG抗体が認識するFLAGペプチドを採用し、担体としてのPEGA樹脂上に導入した。具体的には、スペーサ分子（化合物13）を合成し、PEGA樹脂上にペプチド鎖を伸長した。次いで、アジド誘導体（化合物16）を合成し（Zaloom, J.; Roberts, D. C.; J. Org. Chem. 1981, 46, 5173-5176、Soellner, M. B.; Nilsson, B. L.; Raines, R. T. J. Org. Chem. 2002, 67, 4993-4996、David, O.; Meester, W. J. N.; Bieraugel, H.; Schoemaker, H. E.; Hiemstra, H.; van Maarseveen, J. H. Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42, 4373-4375）、樹脂へ導入し中間体を得た。中間体中のLys側鎖保護基を除去し、ブロモアセチル化後FLAGペプチドを結合することで抗FLAG抗体検出用PEGA樹脂（化合物17）を合成した（図７）。
【００６８】
化合物11の合成
化合物10 (4.45 g,30.0 mmol)をCH3CN:H2O=1:1 (20 mL)に溶解し、これにBoc2O (2.18 g,10.0 mmol)、DIEA (1.74 ml,10 mmol)のCH3CN溶液(5 mL)を滴下し、室温で一晩攪拌した。濃縮後、4％ NaHCO3水溶液次いでNaCl粉末を加え水層を飽和させた後、酢酸エチルによる抽出を行った。有機層をNa2SO4で乾燥後、濃縮、真空乾燥し化合物11を得た。
【００６９】
化合物12の合成
得られた化合物11全量をCH3CN (10 mL)に溶解し無水コハク酸(1.50 g,15.0 mmol)、DIEA (1.74 mL,10 mmol)を加え室温で2時間攪拌した。濃縮後、4％ NaHCO3水溶液を加えエーテルで洗浄をおこなった。水層にクエン酸一水和物を加えpH 3に調整した。NaCl粉末を加え水層を飽和させた後、酢酸エチルによる抽出を行った。有機層をNa2SO4で乾燥させた後、濃縮、真空乾燥して化合物12(3.3 g,10 mmol)を得た。
【００７０】
化合物13の合成
化合物12全量にTFA(10 mL)を加え0℃で30分攪拌した。濃縮後エーテルの添加、デカントを3回繰り返し、1時間真空乾燥した。H2O (3 mL)に溶解後、Et3N (3.9 mL,24 mmol)、Fmoc-OSu (3.88 g,11.5 mmol)を加え室温で一晩攪拌した。50 mLの4% NaHCO3を加え50 mLのエーテルで3回洗浄した。水層にクエン酸一水和物を加えpH 4にし50 mLの酢酸エチルで3回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、Na2SO4で乾燥し濃縮した。エーテルを加えデカントし、この操作を3回繰り返し、真空乾燥して化合物13を得た(1.33 g,2.93 mmol,29 %)。
【００７１】
化合物15の合成
H2O (27 mL)-ジクロロメタン(DCM) (45 mL)中にNaN3 (10.8 g,167 mmol)を溶解し、0℃に冷却した。これに化合物14 (0.93 mL,5.55 mmol)を滴下し、10℃に保ちながら2時間攪拌した。有機層を飽和Na2CO3水溶液で洗浄して化合物15のDCM溶液(65 mL)を得た。
【００７２】
化合物16の合成
Boc2O (1.09 g,5.00  mmol)、DIEA (0.87 mL,8.34  mmol)および化合物10 (2.23 g,15.0 mmol)を用いて上で示したのと同じ方法で化合物11を合成した(709 mg,2.86 mmol)。この化合物11全量、K2CO3 (593 mg,4.29 mmol)、CuSO4・5H2O (7.0 mg,28 μmol)、化合物15溶液 (10 mL,5.7 mmol)をCH3OH:H2O=2:1(20 mL)に溶解し、室温で一晩攪拌した。溶媒を留去後、CHCl3(20 mL)を加え、10 %クエン酸(30 mL)で洗浄した。次に飽和食塩水で有機層を洗浄後、有機層をMgSO4で乾燥した。濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し(CHCl3：MeOH＝39:1)、濃縮、真空乾燥し化合物16を得た(774 mg,2.82 mmol,98%)。
【００７３】
FLAGペプチド（Ac-C-βA-D-Y-K-D-D-D-D-K-G-NH2）の合成
Rink Amid樹脂 (0.61 mmol/g,124 mg)、アミノ酸Fmoc-Gly-OH (16.5 mg,55.4 μmol)、Fmoc-Lys(Boc)-OH (56.2 mg,120 μmol)x2、Fmoc-Asp(OtBu)-OH (51.4 mg,120 μmol)x5、Fmoc-Tyr(tBu)-OH (55.1 mg,120 μmol)、Fmoc-βAla-OH (37.3 mg,120 μmol)、Fmoc-Cys(Trt)-OH (70.2 mg,120 μmol)、カップリング試薬は1残基目はHBTU (20.9 mg,55.4 μmol)、HOBt (8.1 mg,55.4 μmol)、DIEA (17.5 μL,111 μmol)2残基目以降はHBTU (45.5 mg,120 μmol)、HOBt (18.3 mg,120 μmol)、DIEA (41.8 μL,240 μmol)を用いFmoc固相法の常法に従ってFLAGペプチド合成をおこなった。1残基目及び最終残基導入後は無水酢酸でアセチル化した。乾燥後m-クレゾール (0.1 mL)、エタンジチオール(0.3 mL)、チオアニソール(0.3 mL)およびTFA(10 mL)の混合溶液を加え室温で1時間攪拌し脱保護を行った。濃縮後、エーテル沈殿、デカントを繰り返し、高速液体クロマトグラフィーで精製し、凍結乾燥後、FLAGペプチドを得た(25.9 mg,17.1 μmol)。MALDI-TOFMS（obsd: 1286.3 [M+H]+; calcd: 1286.4）。
【００７４】
プローブ分子及びアジド基がスペーサーを介して結合した担体（機能性樹脂17）の合成
PEGA樹脂(0.35 mmol/g,2.0 g)にFmoc-SAL-Resin Linker(26.9 mg,50 μmol)、HBTU(56.8 mg,150 μmol)、HOBt(22.8 mg,150 μmol)およびDIEA(34 μL,200 μmol)のNMP溶液を加え室温で1.5時間攪拌した。無水酢酸でアセチル化後、Fmoc固相法の常法に従って機能性樹脂の主鎖を伸長させた。このとき用いた伸長試薬はFmoc-Gly-OH (44.5 mg,150 μmol)、化合物13 (31 mg,66 μmol)x２、Fmoc-Lys(Mtt)-OH (41 mg,66 μmol)、無水コハク酸 (22 mg,220 μmol)、カップリング試薬はHBTU (25 mg,66 μmol)、HOBt (10 mg,66 μmol)、DIEA (22 μL,132 μmol)を用いた。続いて無水コハク酸(22 mg,220 μmol)、DIEA(7 μL,22 μmol)を用いた。最後に化合物16 (19 mg,66 μmol)、HBTU (25 mg,66 μmol)、HOBt (10 mg,66 μmol)およびDIEA(30 μL,176 μmol)を用いて機能性樹脂17の主鎖の伸長反応を完了させた。次に、先ほど導入したLysの側鎖のMtt基をDCM:TIS:TFA = 94:5:1で選択的に切断後、樹脂を2等分し、片方にFmoc-βAla-OH (21 mg,66 μmol) 、HBTU (25 mg,66 μmol)、HOBt (10 mg,66 μmol)、DIEA (22 μL,132 μmol)のNMP溶液を反応させLys側鎖にFmoc-βAlaを導入した。この樹脂をさらに半分に分け片方のFmoc-βAlaのFmoc基を切断した。ここに、あらかじめブロモ酢酸 (7.6 mg,55 μmol)およびWSC (5.2 mg、28 μmol) から調製しておいた対称酸無水物を加えて暗所、室温で1時間反応させた。ここに1 mLのPBSに溶解したFLAGペプチド (2.57 mg,2.0 μmol)を加え暗所、室温で1時間攪拌し、洗浄後に機能性樹脂17を得た。
【００７５】
（実施例５）分子間相互作用の検出
蛍光測定用サンプルの調製（図８）
実施例４で合成した機能性樹脂17（16 nmol相当）を取り出し、PBS緩衝液(150 mM NaCl, pH7.4)で洗浄、ターゲットタンパク質（抗FLAG抗体）の溶液(25 μL)を加え、室温で1時間プローブ分子（FLAGペプチド）と相互作用させた。遊離のタンパク質をPBS緩衝液で洗浄後、ブロック剤(化合物9,10 eq,100 μL)を加え、室温で1時間ブロッキング反応をおこなった。0.4%TFA含有50%アセトニトリル水溶液でタンパク質および未反応のブロック剤を洗浄除去し、蛍光色素分子(化合物6,5 eq)を100 μLのH2O:DMF=1:1条件下で加え室温で1時間標識化をおこなった。得られた樹脂を96穴マイクロタイタープレートに分注し液量を100 μLに調整し、樹脂上に結合したクマリンの蛍光強度を蛍光プレートリーダを用いて測定した。
【００７６】
抗原抗体反応の検出
コントロール実験としてタンパク質非存在下、ブロック剤の有無による蛍光強度の違いを測定した。図９に示すように、ブロック剤で処理しない樹脂は処理した樹脂の約2倍の蛍光強度を与えた。これはブロック剤とプローブ分子近傍のアジド基がStaudinger反応により化学結合が生成し、蛍光標識の導入を妨げたことを示し、得られた蛍光強度は本検出法におけるシグナルの上限および下限となる。
【００７７】
次に、抗FLAG抗体を用い、抗原抗体反応の検出を行った（図１０）。抗FLAG抗体量を0.01〜10 μgと変化させたところ、0.1〜1 μg程度までの抗FLAG抗体が検出可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明の分子間相互作用検出法は、特異抗体や検体の標識化を必要としない全く新しい検出法として化学・生物・医療分野において広く汎用技術としての利用が有望視される。例えば、本発明の検出法は、タンパク質の検出において抗体を必要としないので、タンパク質が新規に単離精製された場合でも、通常2〜3ヶ月間程度の抗体作製期間を待たずに即座に結合特性を評価できる点で飛躍的に研究効率を向上させることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】本発明の検出方法の概要を示す。
【図２】Staudinger反応の反応機構を示す。
【図３】実施例で合成した、プローブ分子が固定化された担体であって、プローブ分子の近傍に化学反応部位Ａを担持した担体、化学反応部位Ｂを有するブロック剤及び化学反応部位Ｃを有する標識物質の構造を示す。
【図４】ホスフィン誘導体の合成スキームを示す。
【図５】ホスフィン部位を有する標識物質の合成スキームを示す。
【図６】ホスフィン部位を有するブロック剤の合成スキームを示す。
【図７】プローブ分子が固定化され、プローブ分子近傍にアジド基が存在する担体（抗FLAG抗体検出用PEGA樹脂）の合成スキームを示す。
【図８】蛍光測定用サンプルの調製方法を示す。
【図９】コントロール実験としてタンパク質非存在下、ブロック剤の有無による蛍光強度の違いを測定した結果を示す。
【図１０】抗FLAG抗体を用い、抗原抗体反応の検出を行った結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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