(57)【要約】【課題】免疫化学染色方法において、非特異的染色を簡便に軽減できる抗原の検出法を提供する。【解決手段】免疫化学的染色方法を用いて検体中の抗原を検出する抗原の検出方法であって、平板上に載置した検体に抗体液を滴下した後、該抗体液を抗体と反応性のない樹脂フィルムで被覆し、抗原抗体反応を行うことを特徴とする抗原の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫化学的染色方法を用いて検体中の抗原を検出する抗原の検出方法であって、平板上に載置した検体に抗体液を滴下した後、該抗体液を抗体と反応性のない樹脂フィルムで被覆し、抗原抗体反応を行うことを特徴とする抗原の検出方法。
【請求項２】
樹脂フィルムが、比重が０．７〜０．９である請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
樹脂フィルムが、１００倍希釈した抗体液とフィルム面との接触角が８０°〜１２０°である請求項１又は２記載の検出方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の抗原の検出方法において使用される抗体液を被覆するための樹脂フィルム。
【請求項５】
免疫化学的染色方法を用いて検体中の抗原を検出する抗原検出キットであって、検体を載置するための平板、抗体液、抗体と反応性のない樹脂フィルム及び発色試薬を含有する抗原検出キット。
【請求項６】
免疫化学的染色方法を用いて検体中の抗原を検出する方法において、平板上に載置した検体に抗体液を滴下した後、該抗体液を抗体と反応性のない樹脂フィルムで被覆し、抗原抗体反応を行い、次いで染色することを特徴とする染色検体の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は検体中の抗原の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫化学染色方法は、組織や細胞中の抗原を抗原抗体反応を用いて検出し、それらを可視化して同定・証明する方法であり、組織や細胞検索に汎用されているＨＥ染色や特殊染色だけでは検出できない酵素、ホルモン、腫瘍マーカー、免疫グロブリン、病原体、がん遺伝子関連抗原などの様々な物質を検出できる点で極めて有用な方法である（非特許文献１）。
【０００３】
一方、免疫化学染色方法においては、染色過程で非特異的染色が生じやすく、非特異的染色と特異的染色を判別するためには予め抗原の細胞内又は組織内分布の特徴について熟知したうえで、さらにＨＥ染色した検体との比較を行う等の経験に基づく部分が大きい（非特許文献２）。このため、細胞又は組織内分布の変化と非特異的染色を正確に判別することは困難であるという問題があった。
【０００４】
従来、抗原の染色性を向上させる方法としては、超音波を用いて抗体の検体への浸透を促進し抗体反応時間を短縮し、かつ抗体との反応性を改良する装置（特許文献１）や検体を蛋白分解酵素で前処理し、蒸発抑制液を用いて染色性を改良した方法（特許文献２）、検体の作成過程で抗原が失活した場合に賦活化し、染色性を向上する方法（非特許文献３、非特許文献４）などが報告されている。
【０００５】
しかし、斯かる技術では、抗原の染色性を向上することはできても、非特異的染色を軽減することはできず、却って操作が煩雑になり、また検体が剥離しやすくなるという問題があった。
【特許文献１】特開平８−３０４３８８号公報
【特許文献２】特開２００１−２３１５５２号公報
【非特許文献１】Medical technology 別冊  新染色法のすべて p200〜211
【非特許文献２】Pathology and Clinical Medicine, 23(3), p309-316, 2005
【非特許文献３】検査と技術, 28(11), p1331-1336, 2000、
【非特許文献４】検査と技術, 29(7), p910-915, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は免疫化学染色方法において、非特異的染色を簡便に軽減できる抗原の検出法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、免疫化学染色方法において、検体中の抗原に抗体液を添加した後、該抗体液を抗体と反応性のない樹脂フィルムにて覆うことで、抗体液中の抗体濃度を均一化できると共に検体の乾燥防止を図ることができ、非特異的染色を低減できることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、免疫化学的染色方法を用いて検体中の抗原を検出する抗原の検出方法であって、平板上に載置した検体に抗体液を滴下した後、該抗体液を抗体と反応性のない樹脂フィルムで被覆し、抗原抗体反応を行うことを特徴とする抗原の検出方法に係るものである。
【０００９】
また、本発明は、上記抗原の検出方法において使用される抗体液を被覆するための樹脂フィルムに係るものである。
【００１０】
また、本発明は、免疫化学的染色方法を用いて検体中の抗原を検出する抗原検出キットであって、検体を載置するための平板、抗体液、抗体と反応性のない樹脂フィルム及び発色試薬を含有する抗原検出キットに係るものである。
【００１１】
また、本発明は、免疫化学的染色方法を用いて検体中の抗原を検出する方法において、平板上に載置した検体に抗体液を滴下した後、該抗体液を抗体と反応性のない樹脂フィルムで被覆し、抗原抗体反応を行い、次いで染色することを特徴とする染色検体の作製方法に係るものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法によれば、様々な手法の免疫化学染色方法において、抗原や抗体の種類に関係なく非特異的染色を簡便な操作で低減することができる。そして、この方法は、検体の性状に関係なく適応できることから、免疫化学染色を必要とする組織検索や病理組織検索だけでなく、培養細胞や血液細胞や生検材料における様々な抗原の発現の確認や分布について検討する際にも有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の抗原の検出方法は、免疫化学的染色方法を用いて検体中の抗原を検出する抗原の検出方法であって、平板上に載置した検体に抗体液を滴下した後、該抗体液を抗体と反応性のない樹脂フィルムで被覆し、抗原抗体反応を行うことを特徴とするものである。
免疫化学的染色方法とは、組織や細胞上で抗原抗体反応を利用して特定の抗原を可視化する染色方法である。免疫化学染色方法をはじめとする免疫学的測定法には、検出目的である抗原に対する抗体に標識物質を結合させた標識抗体（１次抗体）を直接抗原に反応させた後に可視化する直接法と、抗原に対する抗体（１次抗体）を抗原に反応させた後、当該抗体を認識する抗体に標識物質を結合させた標識抗体（２次抗体）を反応させて可視化する間接法とがあるが、本発明においてはそれらの何れでもよく、検体中の抗原と抗体の種類に応じて検査毎に適宜選択すればよい。
標識物質としては、蛍光物質、酵素等を使用することができるが、酵素を用いるのが好ましい。
【００１４】
本発明の抗原の検出法において用いられる検体としては、いかなる組織や細胞でも使用することができ、生体組織や生態から採取した細胞等の生体材料、培養細胞のいずれも用いることができる。
このうち、生体組織については、パラフィン包埋し薄切した組織切片（パラフィン切片）や、凍結した後、薄切した組織切片（凍結切片）を用いるのが好ましい。
当該検体は、検出抗原の種類に応じて、検体の剥離や破損が起こらない範囲で、適宜公知の抗原賦活化処理を行うことができる。斯かる処理としては、例えばオートクレーブやマイクロウエーブによる加熱やタンパク分解酵素処理が挙げられる。
【００１５】
当該検体は平板上に載置されるが、固定の有無や固定方法については、検体及び抗体の種類等に応じて検査毎に公知の方法を適宜選択すればよく、細胞を用いる場合は、そのまま載置することでも、平板上に塗抹することでもよい。
尚、平板は、検体を載置でき、樹脂フィルムを保持可能なものであれば、その材質は制限されるものではないが、光学顕微鏡下で標本を観察しやすい点から、プラスチック製、ガラス製の平板等が挙げられる。標本の剥離が少ない観点から特に組織標本作製用のシランコートスライドガラスを用いることが好ましい。
【００１６】
本発明に用いる樹脂フィルムは、抗体との反応性がなく抗体液を覆うことができるシートであればよい。
具体的には、抗体液よりも比重が充分に軽くかつ撥水性を有しており、抗体液に浮きながら充分な抗体液を検体上に保持できるものであり、更に充分な柔軟性を有していて剥離時に検体を傷つけることなく剥離できる樹脂フィルムが好ましい。
【００１７】
斯かる樹脂フィルムとしては、比重が０．７〜０．９、更に０．７５〜０．８５、特に０．８０±０．１０  ｍｇ／ｃｍ３であるものが好ましく、また１００倍希釈した抗体液とフィルム面との接触角が８０°〜１２０°、更に８５°〜１１５°、特に９８．０±１０．５°である撥水性を有するものが望ましい。
ここで、抗体液とフィルム面との接触角とは、抗体液（１００倍希釈抗体を用いた場合）のフィルムとの接線とフィルム面がなす角度をいう。
【００１８】
柔軟性は、バルクソフトネス法（ＪＩＳ規格）にて座屈試験を行った場合の最大点加重が、３．０Ｎ〜６．０Ｎ、更に３．３Ｎ〜５．６Ｎ、特に４．６±０．９Ｎであるものがより好ましい。
【００１９】
また樹脂フィルムの厚さとしては、０．０８ｍｍ〜０.１４ｍｍ、更に０．９ｍｍ〜０．１３ｍｍ、特に０．１２±０．０７ｍｍであるものがより好ましい。
【００２０】
また、フィルムは抗体液との間に気泡が入ことを防ぐ等、実験操作の確実性と簡便性を増すという観点から透明又は半透明のものがより好ましい。
このような樹脂フィルムの一例としては、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）やＰＴＴ（ポリトリエチレンテレフタレート）等のポリエステル系樹脂フィルム、ポリプロピレン等のポリオレフィン系樹脂フィルム、ナイロンフィルム等のポリアミド系樹脂フィルムＰＶＣ（ポリ塩化ビニル）樹脂フィルム、ポリ塩化ビニリデン樹脂フィルム等が挙げられる。また、「サランラップTM」等の市販のフィルム等を使用することもでき、特に「パラフィルムTM」が好ましい。
【００２１】
抗体液を樹脂フィルムで被覆した状態で、抗原抗体反応が行われる。これにより、抗体液中の抗体濃度の均一化された状態で、反応を行うことができる。また同時に検体の乾燥防止を図ることができる。
本発明の方法は、抗原や抗体の種類に関係なく適用できるものであり、抗体液における抗体の濃度等は、抗体の活性や特異性等から、染色感度が高くなるよう検査毎に最適濃度を適宜決定すればよい。また、抗体の反応時間は反応温度と密接に関係するが、検査毎に最適な反応時間と温度を設定すればよく、市販の抗体であればその推奨する反応時間や温度で反応させればよい。
【００２２】
本発明の方法を用いた抗原の検出手順を以下に説明する（図１参照）。
１）検体を平板上に載置する。
２）抗体液を検体に滴下する。
抗体液の滴下は、マイクロピペット等にて行えばよい。
３）抗体液の上に樹脂フィルムを被せ、抗体液全体を樹脂フィルムで被覆する。
樹脂フィルムは、塵が入らないようにして抗体液の上に被せるようにする。その際、ピンセットなどを用いて穏やかに被覆してフィルムと抗体液の間の気泡を除去することが好ましい。
４）特定の条件下にインキュベートして抗原・抗体反応を行う。
５）反応終了後、樹脂フィルムを取り外し、洗浄、染色のための発色試薬等を添加して抗原を可視化し、測定のための染色検体を作製する。
尚、測定に間接法を用いる場合は、１次抗体を含有する抗体液を添加し、抗体液を樹脂フィルムで被覆した後、抗原抗体反応を行う。反応終了後、樹脂フィルムを取り外して、一次抗体を洗浄、除去した後、標識抗体（２次抗体）を含有する抗体液を添加し、樹脂フィルムで当該抗体液を被覆して反応を行った後、染色すればよい。
６）可視化された抗原（染色検体）を測定する。
測定手段としては、例えば、光学顕微鏡下での観察が挙げられる。
【００２３】
本発明のキットは、上述した本発明の抗原測定方法を実施するためのキットであり、少なくとも検体を載置するための平板、抗体液、抗体と反応性のない樹脂フィルム及び発色試薬を含有するものである。
【００２４】
斯くして本発明の方法を用いれば、後記実施例に示すように、抗原や抗体の種類に関係なく非特異的染色を低減することができ、染色むらを低減することができ、より正確に抗原を可視化して同定・証明することができる。
【実施例】
【００２５】
実施例１  アポトーシスを検出するためのアビジンビオチン法によるTUNEL染色
ラット組織中のアポトーシスを検出する目的でApoptosis in situ detection kit（和光純薬、No. 295-5301）を用いて直接法により免疫染色を実施した。脱パラフィン（キシレン、5分×3回）し、親水化（エタノール、5分×3回）した組織切片を充分に水洗（Milli-Q水、5分×3回）した後、添付の蛋白分解酵素（Milli-Qにて2000倍希釈）により蛋白分解処理（37℃/30分間）により抗原を賦活化した。続いて切片をPBS(pH 7.4(-))にて染色バット内で洗浄(2分×4回)した。検体中のアポトーシスにより断片化したDNAの3'末端に添付のTdTを用いてビオチン標識deoxyuridine triphosphate (以下b-dUTPとする)を付加（50μl/37℃/30分間）させた。B-dUTPを付加後、切片はPBSにて染色バット内で洗浄（5分×3回）した。切片は内因性ペルオキシダーゼを3%過酸化水素水で不活化（室温/5分間）し、PBSにて染色バット内で洗浄（5分×2回）した。つづいてb-dUTP伸長鎖にペルオキシダーゼ標識一次抗体（1切片あたり100μl：好ましくは200μlだが、樹脂フィルムを用いることで抗体液の量を半減することができる）をスライド上に添加し、樹脂フィルムにて抗体液を被覆した（この操作過程の模式図を図１に示す）。フィルムと抗体液の間の気泡を除去した後、切片をインキュベート（37℃/30分間又は4℃/オーバーナイト）した。切片はPBSにて染色バット内で洗浄（5分×3回）し余分の抗体を除いた後、顕微鏡下でDAB反応液（200μl）を切片上に添加し発色を行った。切片は、水道水中にてDABの発色を停止させ、5%メチルグリーン（室温/5分）にて核染色を行った後、脱水（エタノール、10秒×3回）、透徹（キシレン、10秒×3回）、封入し（ビオライト）、鏡検に用いた。結果を従来のシートを用いない方法で染色した場合と共に図２に示す。
【００２６】
図２により、本発明の方法を用いず従来の方法で染色した標本（Ｂ）と比較して、樹脂フィルムを用いた本発明の方法により免疫染色を実施した標本（Ａ）においては、非特異的染色、特に標本周辺部に認められる非特異的染色が軽減可能であることが明らかになった。これは、本発明の方法では、抗体液中の抗体濃度が均一化された状態で反応が行なわれること、同時に検体の乾燥を防止したことによると考えられた。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、抗体液を樹脂フィルムにて被覆する際の実験工程を示した図である。
【図２】図２は、ラット肝臓のホルマリン固定、パラフィン包埋標本のTUNEL染色の結果を示した図である。（Ａ）：樹脂フィルムを使用した場合、（Ｂ）：樹脂フィルムを使用しない場合
【図１】
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【図２】
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