(57)【要約】【課題】  多種反応液を微細なノズル開口より微小液滴として噴射し、チップにマトリクスアレイ状に精密なスポット群として描画するDNAチップ製造装置において、チップに正確にスポット郡が形成されているかを調べることは非常に困難であった。【解決手段】  DNAチップ製造装置において、該チップ上の前記スポット群が描かれる描画領域を除く所定の位置に、該反応液と該ノズルによって別途検査パターンを描く。【選択図】  図１
2007071777.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブ液を微小液滴として噴射し、該液滴を被記録物体上でマトリクスアレイ状に精密なスポット群として配置するＤＮＡチップ製造装置において、該マトリクスアレイ領域に加え、該被記録物体上の該マトリクスアレイ領域を除いた所定の領域に該液滴を吐出させる工程を含むＤＮＡチップの製造方法。
【請求項２】
該所定位置に吐出する該液滴は、所定の仕様に基づく検査パターンであり、これを光学的検知手段によって検知し、その情報を元にＤＮＡチップの品質検査を行う工程を含む、請求項1のＤＮＡチップの製造方法。
【請求項３】
請求項２のＤＮＡチップの検査結果より、該ＤＮＡチップ製造装置自身の不吐出検査を行うことで、不吐出ノズルを特定し、該不吐出ノズルを回復手段によって回復する工程を含む、ＤＮＡチップの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は液体を微小液滴として噴射し、微小液滴を被記録物体上でマトリクスアレイ状に精密なスポット群として配置する液体噴射装置に関する。主要な利用分野としては、具体的にはDNAの解析、診断等に使用されるDNAチップの作成装置等が挙げられる。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の突然変異に起因する疾患に影響を与えているDNAを解析、診断する研究が盛んに行われている。DNAを解析する方法としては、既に解読されている互いに異なる既知の数千〜数万種のDNA断片（DNAプローブ）を通常約１〜３ｃｍ角のスライドガラスやシリコンチップ面に、マトリクスアレイ状に数百μm以下の間隔で、互いに重複せずに高密度に塗布されたDNAチップ、一般にDNAチップと称されるものを用いることが有効である。
【０００３】
例えばこのDNAチップ上に、生物体の細胞などから取り出したDNAを蛍光色素で標識した試料を滴下すると、DNA試料は、それと相補的な配列を有する上記DNAチップ上のDNAプローブとハイブリダイズするので、蛍光色素を励起する励起光をDNAチップに照射する事によって、その結合部分だけが蛍光を有することにより、光検出器を用いることによってDNAチップ上の発光位置に対応したDNAプローブを識別でき、従ってDNA試料の配列を解明することができる。
【０００４】
このようなDNAチップの一般的な作成方法には、（１）半導体産業で使用されているフォトリソグラフィーの技術を用いてチップ上でDNAプローブを合成し精製する方法、（２）予め合成したDNAプローブをチップ上にスポッティングしてチップと結合させる方法等が知られている。
【０００５】
上記（１）の方法でDNAチップを作成する場合、高度で大掛かりな設備を用意する必要がある。その為例えば研究者が独自のDNAプローブをDNAチップ上に固定したい場合、この要求を満たすことは簡単ではない。また、この製法はチップ上でDNAプローブを精製することが非常に困難であることが知られている。DNA試料の検出精度は、DNAプローブの精製度に大きく依存する為、高品質のDNAチップを作成するに当って、この方法には更なる改良が求められている。一方（２）の製造方法は、（１）の問題点を改善した製造方法となる。この製造方法はDNAプローブを予め合成する必要が生じるが、チップへ結合させる前にDNAプローブを精製することが容易に行える為、高品質のDNAプローブを作成できるという訳である。しかしながら、本方法に於いても課題はいくつか存在する。その第1は、DNAプローブをチップ上に高密度にスポッティングする方法にある。DNA解析を行うに当っては、多くの場合、被験体からのDNA試料は極微量にしか採取出来ず、少量のサンプルから出来る限り多くのDNA情報を獲得できなければならない。すなわちDNAチップには、出来うる限り多種のDNAプローブ（通常数千〜数万種）を約１〜３ｃｍ角のチップ上に、マトリクスアレイ状に数百μm以下の間隔で高密度に塗布されていることが要求される。課題の第2は、個々のDNAプローブを再現性良く塗布すること、すなわち個々のDNAプローブのドットサイズを均一に再現性を保って塗布する方法である。例えば分析物の定量性を判断する場合、個々のDNAプローブのスポット径はどれもがほぼ等しくなくてはならない。最近になってDNAチップの製造方法（２）が持つこれらの課題を解決する方法として、インクジェット技術を応用するスポッティング方法が提案されている（例えば、特許文献１等）。
【特許文献１】特開平１１−１８７９００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
インクジェット技術を用いたDNAチップ製造方法においては、一部のノズルにゴミ詰まり等が生じた場合や、ノズル開口から水分が蒸発した為に水分以外の溶剤の比率が局所的に上がって増粘した場合等、検知困難な理由によって突発的にノズルが故障したことが原因で吐出不良が生じ、DNAチップの品質が低下してしまうことがある。DNAチップは医療の現場で用いられることもあるので、スポット群形成過程の信頼性には十分過ぎるほどに注意を払うことが必要であり、個々のDNAチップについて、プローブ溶液が確かにスポットされているかを調べる為の検査する手段、工程を設けることが望ましい。
【０００７】
信頼性を確保する為には、不吐出ノズルを事前に検知する方法、もしくはDNAチップそのものを検査し、製造装置に情報をフィードバックする方法が必要となる。
【０００８】
不吐出ノズルを事前検知する方法としては、例えば特開２００２−２３８５４３の方法がある。この方法は予備吐出時に光学的に吐出・不吐出を検知する方法である。吐出ヘッドを退避域に退避させ、そこで予備吐を行うとともに、一対の検知用光線照射手段と受光手段からなる検知手段を用いてノズル単位で吐出・不吐出の判定を行い、必要な場合回復する。この方法は、光学検知手段を設けている為に予備吐時に吐出ヘッドを退避させる空間を広く作らなければならないことに加え、吐出させたプローブ溶液を受け止める受け皿を吐出ヘッドから離して設ける必要がある。ただこれが原因で、吐出時に主滴に付随するより微小な液滴、所謂サテライトが装置内部を浮遊し易くなるといった問題がある。つまり、サテライト滴があまりにも微小なもの（直径〜数μm）は、重力によって沈降する時間が長時間に及び、その間装置内に発生したわずかな空気流によって、いとも容易に浮遊し得るのである。浮遊したDNAプローブ溶液の液滴は、チップ上に無作為に付着してしまうことがあり、その場所は特定し得ないからDNAチップの信頼性をかえって害する恐れが生じるのである。
【０００９】
不吐出検査として最も確実な方法は、実際に記録媒体に記録して光学的検知手段によって確認することである。例えば別の記録媒体にプローブ溶液を吐出させ、それを何らかの手段を用いて検査する方法は容易に考えられる。しかしながらDNAチップとは、蛍光色素によって着色されたＤＮＡ試料とハイブリタイズしたプローブを後で確認するという用途で使用するが為に、プローブ溶液そのものは無色透明でなければならないことが多く（何故なら着色されていると蛍光を検知することが困難になる）、しかも１スポットが微小な為、光学的検知は非常に困難である。このような透明スポットを光学的に検知するには、例えば基板に紫外線を照射して、プローブのスポットされた箇所と、何も無い箇所との屈折率や散乱強度の違いを受光レンズで捉えるということも考えられるが、紫外線を照射することでプローブの塩基配列が破壊される恐れがあり、そうすると相補的なDNAと結合するプローブとしての役割を果たさないので、あまり好ましくない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題に鑑みて、本発明は次の構成を持つ液体噴射方法を提案することにより、課題の解決を達成するものである。
【００１１】
請求項の１は、プローブ液を微小液滴として噴射し、該液滴を被記録物体上でマトリクスアレイ状に精密なスポット群として配置するＤＮＡチップ製造装置において、該マトリクスアレイ領域に加え、該被記録物体上の該マトリクスアレイ領域を除く所定の検査位置にも該液滴を吐出させるＤＮＡチップの製造方法である。
【００１２】
請求項の２は、該検査位置に記録された該液滴の描画パターンを光学的検知手段によって検知し、その情報を元に品質検査を行う請求項1のＤＮＡ製造方法によって製造されるＤＮＡチップの検査方法である。
【００１３】
請求項の３は、請求項２のＤＮＡチップの検査結果より、該ＤＮＡチップ製造装置の不吐出検査を行うことで、不吐出ノズルを特定し、該不吐出ノズルを回復手段によって回復するＤＮＡチップの製造方法である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明にかかるDNAチップの製造方法及びDNAチップの検査方法を用いれば、DNAチップの品質の向上、および信頼性が向上する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明で使用するDNAチップの製造装置は、複数の異種プローブ溶液を吐出する為に、それぞれのプローブ溶液を保持する流路は互いに流体的に独立しており、プローブ溶液リザーバタンクとそれに連通し開口部を含むノズルを複数有する吐出ヘッドと、それら複数のノズルの吐出を制御する吐出制御手段と、吐出ヘッドの位置を制御する位置制御手段とを有する。
【００１６】
吐出ヘッドは、例えば各々が流体的に独立した多数のノズルがライン状あるいはマトリクス状に配列されたものが好適に利用される。
【００１７】
吐出ヘッドにおける液体の吐出方式としては、インクジェット法において利用されている各種方式を用いることができる。例えば、ノズルに液体吐出のためのエネルギーを付与する吐出エネルギー付与手段を設け、この吐出エネルギー付与手段から吐出エネルギーをノズル内に供給された液体に付与することで、液体を吐出口から吐出させる方式を好適に利用できる。この吐出エネルギー付与手段としては、例えば圧電素子やヒーター素子などを利用することができる。
【００１８】
この吐出エネルギー付与手段は、電気信号等によって制御される。
【００１９】
位置制御手段は、吐出ヘッドに対するプローブ固定用のDNAチップの位置を制御するする手段であり、吐出ヘッドおよびDNAチップを保持するステージの少なくとも一方の移動および位置調整を行う制御系を有するものである。プローブ固定用DNAチップを保持するステージとしては、ステージのステージ面（DNAチップ面）と同方向における位置を、吐出口列における各吐出口配列ピッチ単位で制御し得る精密なステージ位置制御手段を有するものが好適に利用できる。
【００２０】
このような位置制御手段は、例えば、吐出ヘッドを移動させるキャリッジと、DNAチップを保持し、かつDNAチップの位置を制御し得るステージと、これらの動作を制御するコンピュータなどを用いた制御手段等から構成することができる。
【００２１】
DNAチップ上に固定されたプローブは、特定のターゲット（標的）によって認識され得るもので、しばしばリガンドと呼ばれる表面固定分子である。更に、このプローブには、特定の標的によって認識され得るオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチド、あるいはその他のポリマーなどが含まれる。文脈に依存して、用語「プローブ」は、個々のポリヌクレオチド分子などのプローブ機能を有する分子、および分散した位置に表面固定された同じ配列のポリヌクレオチドなどの同じプローブ機能を有する分子の集団の両方をいう。プローブおよび標的は、しばしば、文脈に依存して交換可能に使用され、プローブは、リガンド−抗リガンド対の一部として標的と結合し得るか、または結合するようになり得るものである。本発明におけるプローブ及び標的は、天然において見出されるような塩基、またはそのアナログを含み得る。
【００２２】
また、DNAチップ上に支持されるプローブの一例としては、標的核酸とハイブリダイゼーション可能な塩基配列よりなるオリゴヌクレオチドの一部に、リンカーを介して蛍光色素と、DNAチップとの結合物とを有するもので、DNAチップとの結合部においてDNAチップ表面に連結された構造を有するものを挙げることができる。なお、このような構成の場合における蛍光色素とDNAチップとの結合部のオリゴヌクレオチドの分子内での位置は、所望とするハイブリダイゼーション反応を損なわない範囲内において特に限定されない。
【００２３】
本発明の方法が適用されるプローブ・アレイに採用されるプローブは、その使用目的に応じて、適宜選択されるものであるが、本発明の方法を好適に実施する上では、製造される前記二次元プローブ・アレイが、そのプローブはＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）、ＰＮＡ、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、その他の核酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、酵素に対する基質、抗体、抗体に対するエピトープ、抗原、ホルモン、ホルモンレセプター、リガンド、リガンドレセプター、オリゴ糖及びポリ糖のから選択される少なくとも１種であることが好ましい。
【００２４】
一方、本発明の方法により製造されるプローブ・アレイは、DNAチップ表面に結合可能な構造を有したプローブを含んでいることが好ましく、このDNAチップ上へのプローブの固定は、前記プローブをDNAチップ表面に結合させてなすことが望ましい。
【００２５】
その際、プローブが有する前記DNAチップ表面に結合可能な構造は、アミノ基、スルフィドリル基、カルボキシル基、水酸基、酸ハライド化物（ハロホルミル基；−ＣＯＸ）、ハライド化物（−Ｘ）、アジリジン、マレイミド基、スクシイミド、イソチオシアネート、スルフォニルクロリド（−ＳＯ2Ｃｌ）、アルデヒド（ホルミル基；−ＣＨＯ）、ヒドラジン及びヨウ化アセトアミドなどの有機官能基の少なくとも１種を導入する処理により形成されたものであることが好ましい。また、プローブ側のDNAチップへの結合に必要な構造に応じて、DNAチップの表面に必要とされる処理を施してもよい。
【実施例１】
【００２６】
次に、本発明について、その特徴を、図を用いて具体的に説明する。
【００２７】
図１は、本発明のDNAチップ製造装置である。
【００２８】
図１において、プローブ溶液を吐出する吐出ヘッド１０１は、キャリッジ１１１に固定されており、キャリッジ１１１は、精密ガイドレール（Ｘ方向）１２１に取り付けられている。精密ガイドレール（Ｘ方向）１２１には、パルスモーターＸ（精密ガイドレール（Ｘ方向）用）１２２が取り付けられている事により、キャリッジ１１１は、精密にＸ方向の移動が出来る様になっている。プローブ溶液吐出ヘッド１０１は、ノズル部１０２を有しており、ノズル部１０２は、吐出口を構成の一部とした多数のノズルを有し、各ノズルの開口端である吐出口１０３が一定のピッチで精密にマトリクス配列された吐出口を有している。図６は吐出口側より吐出ヘッドを見た図であるが、例えば、図６（ａ）のように複数の列が等間隔でマトリクス配列されたもの、図６（ｂ）のように吐出口列が主走査方向から見て重ならないように一定のピッチでずれているものでもよい。もちろん、吐出ヘッドのノズル構成はこれに限られるものではなく、ノズルがライン状に整列しているものも本発明を適用することの妨げとはならない。
【００２９】
プローブ固定用のDNAチップ３０１は、精密スライドステージＢ（Ｙ方向）３０２にセットされる。精密スライドステージＢ（Ｙ方向）３０２には、パルスモーターＢ（精密スライドステージＢ（Ｙ方向）用）３０３が取り付けられている事により、DNAチップ３０１は、精密にＹ方向の移動が出来る様になっている。
【００３０】
プローブ溶液リザーバタンク４０１は、スタンド４０３により固定・保持されており、チューブ４０２を介して、プローブ溶液吐出ヘッド１０１と接続されている。
【００３１】
吐出ヘッド１０１、パルスモーターＸ（精密ガイドレール（Ｘ方向用））１２２、パルスモーターＡ（精密スライドステージＡ（Ｙ方向）用）３０３は、ケーブルを介して、コンピュータ５０１に接続されており、全ての機能をコントロールする事ができる。すなわち、このコンピュータ中に、DNAチップへの吐出口からの液体吐出のための指令、吐出口とDNAチップとの位置調整、検査手段による不吐出の有無と不吐出の吐出口の特定及びその記録、不吐出の吐出口があった場合の吐出回復操作の指令などのプログラムを設定しておくことで、各種の機能のコントロールを行うことが可能となる。
【００３２】
以上、説明した構成は、全て定盤６０１の上に構成されており、本構成のＤＮＡ製造装置によって、プローブ溶液はＤＮＡチップ３０１上に精密なマトリクスアレイスポット群を形成することが可能である。
【００３３】
本発明は、以上のＤＮＡチップ製造装置を用い、図２、図３、図４もしくは図５に示すような、本来の目的で作成されるマトリクスアレイスポット群に加え、ＤＮＡチップ３０１に検査領域として別途余分な領域を設け、その領域にもマトリクスアレイスポットを作成するのと同じ方法で、プローブ溶液を微小液滴にして滴下し、検査パターンを描画することを特徴とする。プローブ溶液で描く検査パターンは、確実な検知を行う為にプローブ溶液の微小液滴を、数十〜百発使用したものが好ましいが、これは検知としての役割以外に、吐出口からの水分蒸発によってノズル内部の組成が変化したプローブ溶液を、ノズルから除外し、フレッシュな溶液を再充填する、所謂予備吐出の役割をも担う。
【００３４】
図２の検査パターンは、図６（ａ）の吐出ヘッドを用いて、キャリッジ１１１を主走査（Ｘ）方向に動かして描画する最も単純な検査パターンで、主走査（Ｘ）方向に平行なスポット列に対する検査ができる。
【００３５】
図３の検査パターンは、図６（ｂ）の吐出ヘッドを用いて、キャリッジ１１１を主走査（Ｘ）方向に動かして描画する検査パターンである。各ノズルは主走査（Ｘ）方向から見て重なっていないので、検査パターンも各ノズルで重ならないように描画できる。従って、パターンから不良ノズルの個別特定ができる。
【００３６】
図４の検査パターンは、図２と基本的には同じものであるが、検査領域をマトリクスアレイの前後に設けている。これは２重検査を行っているという考え方と、また、検査ノズルをこの２つの領域に分けることで品質検査をより正確に行うという意味を持っている。
【００３７】
図５の検査パターンは、図２のパターン描画の直後にステージを副走査（Ｙ）方向に移動させ、副走査（Ｙ）方向に平行なノズル列に対する検査パターンを描いたものである。この２つの検査パターンから、品質検査と異常ノズルの特定を行う。
【００３８】
検査位置にプローブ溶液で描画した検査パターンを、検査手段２０１によって検査することで、ＤＮＡチップの品質を管理する。本実施例では、検査手段２０１はキャリッジ１１１に搭載されており、キャリッジ１１１の移動に追随して検査手段２０１も移動する。この検査手段２０１は、ＤＮＡチップ３０１の検査パターンが読み取れれば良いので、例えば常磐６０１に固定されているものであってもかまわない。
【００３９】
検査手段２０１は、検査光をＤＮＡチップ３０１に照射する送光手段２０２と、ＤＮＡチップ３０１からの検査光の散乱光を受光するカメラ２０３からなる。つまり検査手段２０１は、DNAチップ上に描かれた検査パターンを光学的に読み取って電気信号に変換するものであり、ここで得た電気信号をコンピュータに送信することで、コンピュータ上で画像処理等を組合せて、ＤＮＡチップの品質の管理と、不良品発生時に不良ノズルの特定を自動的に行うものである。つまり本発明のＤＮＡチップの品質の検査とは、検査パターンからの検査光の散乱強度によって行い、散乱強度が低ければ、該当する列のいずれかのノズルが不吐出であることが判定されるので、その判定結果に応じて適切な処理を行うというものである。
【００４０】
検査位置に記録される無色透明のプローブ液の微小な描画パターンを正確に読み取る為、送光手段２０２によって照射する検査光には波長の短い光、例えば紫外線を用いる。
【００４１】
検査領域に検査光を照射する。ＤＮＡチップにプローブ溶液がスポットされていれば、その部分は他のスポットされていない箇所と比較して、屈折、散乱状態が異なるので、受光カメラ２０３によってこれを捉えることができる。受光カメラ２０３はコンピュータに接続され、カメラから送られる情報を元にＤＮＡチップの品質の検査、管理を瞬時にして行うことができる。
【００４２】
ＤＮＡチップ毎の品質検査が可能になることは、仮にＤＮＡチップに不良品が発生した場合、不良位置のノズルの特定も可能になるということである。不良ノズルを特定後、当該ノズルを回復する指令が回復手段に入力され、該回復手段によって当該ノズルの回復が行われる。回復は、ノズルの開口側から吸引を行う操作及び予備吐出する操作があり、これら２以上の操作を組合せてもよい。
【００４３】
これらは、すべてコンピュータによって一元に管理・制御される。
【００４４】
また実際に本発明のDNAチップを用いてDNAの解析を行う場合、大部分のDNAが該検査用の領域に描画されたプローブと結合しないよう、該領域はテープなどでマスキングをすることが、実用上好ましいが、このマスキング工程も、品質検査後であれば自動で行ってもよい。
【実施例２】
【００４５】
ＤＮＡプローブは、それと相補的な配列を持つ構造のDNAと結合する。したがってＤＮＡ製造装置に用いられるＤＮＡプローブの全種類と結合するような、全ての相補的プローブを含んだ溶液を合成することができる。この溶液を蛍光色素で標識し、スポッティング後の検査領域にのみ塗布し、更にこの蛍光色素を励起する励起光を検査領域に照射する。こうすると、検査パターンが蛍光を有して浮かび上がる。光検出器を用いることによってこの蛍光からＤＮＡチップの品質を管理することができる。
【００４６】
以上、説明した様に、本発明のＤＮＡチップ製造装置によれば、万が一にプローブ溶液吐出ヘッドに不吐出ノズルが発生した場合でも、自動で検出・補完を行う事が可能となるため、信頼性の高いＤＮＡチップを製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明にかかる液体吐出装置の構成概略図。
【図２】検査パターンとスポットアレイの例。
【図３】検査パターンとスポットアレイの例。
【図４】検査パターンとスポットアレイの例。
【図５】検査パターンとスポットアレイの例。
【図６】吐出口側から見た吐出ヘッド正面図。
【符号の説明】
【００４８】
１０１  吐出ヘッド
１０２  ノズル部
１０３  吐出口
１０３ａ  吐出口列
１２１  精密ガイドレール（Ｘ方向）
１２２  パルスモーターＸ（精密ガイドレール（Ｘ方向）用）
２０１  検査手段
２０２  送光手段
２０３  受光カメラ
３０１  DNAチップ
３０２  精密スライドステージＢ（Ｙ方向）
３０３  パルスモーターＢ（精密スライドステージ30Ｂ（Ｙ方向）用）
４０１  プローブ溶液リザーバタンク
４０２  チューブ
４０３  スタンド
５０１  コンピュータ
５０２  ケーブル
６０１  定盤
【図１】
2007071777.tif 000003
【図２】
2007071777.tif 000004
【図３】
2007071777.tif 000005
【図４】
2007071777.tif 000006
【図５】
2007071777.tif 000007
【図６】
2007071777.tif 000008