(57)【要約】      （修正有）【課題】２つのクラスのセマホリンレセプター、ＳＲ１とＳＲ２に関する方法と組成物を提供する。【解決手段】ヒト及びラット由来のセマホリンレセプターをコードするｃＤＮＡ配列を取得する。動物細胞（ＣＯＳ−７，２９３）をそれを用いて形質転換を行ない、発現させる。また、その特定の部分配列を含むポリペプチドを合成することによってＳＲ特異的結合薬剤（治療、薬剤サーチ等）を得る。該ポリペプチドはＳＲコード核酸からの形質転換宿主細胞から組換え的に産生されてもヒト細胞から精製してもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４のアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド、又はマウス、ニワトリもしくはショウジョウバエニューロピリン-１の何れにも見いだされない少なくとも８のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドであって、セマホリンに結合するポリペプチド。
【請求項２】
配列番号：２、１８又は２０のアミノ酸配列を含んでなる請求項１に記載の単離ポリペプチド、又は前記配列の部分配列を含んでなるポリペプチドであって、ヒトセマホリンレセプター（ＳＲ）配列を含んでなるポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３のストランドあるいは配列番号１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３の少なくとも２４の連続塩基を含んでなり、それぞれマウス、ニワトリ及びショウジョウバエニューロピリン-１ｃＤＮＡの存在下で、配列番号１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３を含んでなる第２の核酸と特異的にハイブリダイズするのに十分な、単離された又は組換え体の第１の核酸。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のポリペプチドをコードする組換え核酸。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸を含んでなる細胞。
【請求項６】
請求項１又は２に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項７】
以下の工程を含んでなるＳＲポリペプチドの製造方法：
請求項４に記載の核酸を宿主細胞又は細胞抽出物内へ導入する工程；
上記核酸が転写物として発現され、該転写物が上記ポリペプチドを含んでなる翻訳産物として発現される条件下で上記宿主細胞又は抽出物をインキュベートする工程；及び
上記翻訳産物を単離する工程。
【請求項８】
セマホリンとＳＲポリペプチドの少なくとも一つを含んでなる細胞を変調する方法において、相互作用のインヒビターを含んでなる有効量の組成物に細胞を接触させることによりＳＲポリペプチドとセマホリンの相互作用を変調する工程を含んでなり、ここで細胞の特性が変調され、上記細胞はニューロンで、上記特性は軸索成長及び／又は誘導であり、上記インヒビターは請求項１又は２に記載のポリペプチドである方法。
【請求項９】
ＳＲポリペプチドの結合標的に対する相互作用を変調する薬剤のスクリーニング方法において、
単離された上記ＳＲポリペプチド、上記ポリペプチドの結合標的、及び候補薬剤を含む混合物を、上記薬剤が存在しなかったら上記ポリペプチドが基準親和性をもって上記結合標的に特異的に結合する条件下で、インキュベートし、
上記結合標的に対する上記ポリペプチドの結合親和性を検出して薬剤偏向親和性を決定する工程を含んでなり、
薬剤偏向親和性と基準親和性の間の差が、上記結合標的に対する上記ポリペプチドの結合を上記薬剤が変調することを示す方法。
【請求項１０】
自然宿主細胞内で細胞をポリペプチドと接触させ、ＳＲ活性を変調させることを含んでなる細胞の機能を変調させるための方法に用いられる、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、Marc Tessier-Lavigne, Zhigang He及びHang Chenにより1997年7月8日に出願され、セマホリン(semaphorin)レセプターと題された米国特許出願第08/889,458号の35USC120の下での継続出願である。
主題となる出願における研究は、国立衛生研究所の助成金により一部支援された。政府は、この出願に対して発行される全ての特許に対して権利を有する。
本発明の分野は、神経細胞誘導に関与するタンパク質である。
【従来の技術】
【０００２】
神経組織が発達する間に、軸索は胚の所定経路に沿って泳動し、それらの目的とするシナプス標的に到達する（Tessier-Lavigne及びGoodman, 1996に概説されている）。正確な経路発見に貢献する一つのメカニズムは、化学的駆散、即ち、非標的細胞から分泌された拡散可能な化学駆散因子により非標的領域から離間した軸索の誘導である。軸索が組織培地の非標的組織に直面し、これらの組織によって離れた位置で抑圧される実験は、種々の類の軸索（Pini, 1993; Fitzgeraldら, 1993; Colamarino及びTessier-Lavigne, 1995; Tamadaら, 1995; Guthrie及びPini, 1995; Shirasakiら, 1996)並びに泳動性神経細胞（Hu及びRutisbauser, 1996）に対する拡散可能な化学駆散活性の存在を示している。分子レベルでは、誘導キューの２つのファミリー、即ちネトリン(netrin)及びセマホリンファミリーが、化学駆散剤として作用する成員を含むことが示されている。ケノラジチス・エレガンス(Caenorhaditis elegans)において、ネトリンＵＮＣ-６は、ネトリン供給源から泳動して離間する軸索を駆散し、これはこれらの軸索がある頻度でｕｎｃ-６変異体を誤って囲むためと考えられており；このことは、駆散が免疫グロブリンスーパーファミリーの成員であるＵＮＣ-５及びＵＮＣ-４０のレセプター候補によって媒介されて現れることを前提としている（Hedgecockら, 1990; Leung-Hagesteijnら, 1992; Hamelinら, 1993; Wadsworthら, 1996; Chanら, 1996）。同様に、脊椎動物においてネトリン-１は、ネトリン-１供給源から泳動して離間する運動軸索のサブセットを駆散でき（Colamarino及びTessier-Lavigne, 1994; Varela-Echavarriaら, 1997）、そのプロセスは、ネトリン結合タンパク質であることがわかったＵＮＣ-５及びＵＮＣ-４０の脊髄相同体を含むかもしれない（Leonardoら, 1997; Ackermannら, 1997; Keino-Masuら, 1996）。
【０００３】
セマホリンは、構造的に多様な分泌された膜貫通タンパク質の大ファミリーであり、それらのアミノ末端に保存された〜５００アミノ酸セマホリンドメインの存在によって特徴づけられる（Kolodkin, 1996に概説）。このファミリーは、昆虫における抗体摂動研究を通した軸索誘導に含まれると最初に記載された（Kolodkinら, 1992; Kolodkinら, 1993）。このファミリーの化学的駆散剤への結合は、細胞培地に急に添加した場合に感覚成長コーンの崩壊を起こすことのできる因子としてのチキンコラプシン-１(collapsin-1）の精製によってなされる（Luoら, 1993）。コラプシン-１及びその哺乳類相同体（セマホリンIII、セマホリンＤとしても知られる）は、分泌されたセマホリンであって、セマホリンドメインに加えて免疫グロブリンドメイン及び高度に塩基性のカルボキシ末端ドメインを有する（Luoら, 1993; Kolodkinら, 1993; Messersmithら, 1995; Pllschelら, 1995）。点源から臨床的に表現された場合、コラプシン-１／ＳｅｍａＩＩＩ／Ｄ（以下、ＳｅｍａＩＩＩと呼ぶ）は、感覚及び交感軸索を駆散でき、腹側の脊髄へのパターニング感覚軸索投射に含まれる（Messersmithら, 1995; Pllschelら, 1995, 1995; Beharら, 1996; Shepherdら, 1997）。ＳｅｍａＩＩＩに構造的に関連するＳｅｍａＥは、培地において交感軸索を駆散すると報告されている（Varela-Echavarria及びGuthrie, 1997で引用）。ショウジョウバエにおいて、分泌されたセマホリンＳｅｍａＩＩは、軸索末端分岐形成の阻害剤として含まれる（Matthesら, 1995）。しかし、セマホリンがそれらの駆散剤または阻害活性を生ずるメカニズムはわかっていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
セマホリンタンパク質がそれらの軸索への駆散活性を生ずるメカニズムを解明するために、我々は、感覚軸索の表面上のセマホリンに対する結合タンパク質を同定することを考えた。ここに、我々は、セマホリンの崩壊−誘導及び駆散活性に必要とされる機能を持つ軸索に発現される２つのクラスのセマホリンレセプターであるＳＲ１及びＳＲ２を同定する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、単離されたレセプタークラス１及び２（ＳＲ１及びＳＲ２、集合的にＳＲ）ポリペプチド、関連する核酸、それらのＳＲ−特異的構造及び活性を持つポリペプチドドメイン、及びＳＲ機能、特にセマホリン結合活性のモジュレータに関連する方法及び組成物を提供する。ＳＲポリペプチドは、細胞、特に神経細胞、機能及びモルホロジーを調節できる。これらのポリペプチドは、核酸をコードする主題ＳＲポリペプチドからの形質転換された宿主細胞から組み換えで生成させても、哺乳類細胞から精製してもよい。本発明は、開示されたＳＲ遺伝子と特異的にハイブリダイズできる単離されたＳＲハイブリダイゼーションプローブ及びプライマー、特異的抗体などのＳＲ-特異的結合剤、並びに主題組成物の製造方法、及び診断（例えば、ＳＲ転写のための遺伝子ハイブリダイゼーションスクリーン）、治療（例えば、神経細胞成長の促進のためのＳＲ阻害剤）及びバイオ製薬工業（例えば、免疫原、他のＳＲ類の単離のための試薬、先行製薬剤のための化学ライブラリーのスクリーニング剤等）における使用方法を提供する。
【発明の実施の形態】
【０００６】
ヒト、ラット及びマウスＳＲ１ポリペプチドをコードする天然ｃＤＮＡの例のヌクレオチド配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３及び５に示し、全概念的翻訳物をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４及び６に各々示した。天然ＳＲ２ｃＤＮＡは、２つの異なる遺伝子から誘導された（ａ）及び（ｂ）の形態で見られ、各々の翻訳物は、挿入物（下記）のサイズに応じて０、５、１７及び２２と命名した４つの選択的スプライシングされた形態で見られる。例えば、マウスＳＲ２（ａ）０、５、１７及び２２ポリペプチドをコードする天然ｃＤＮＡの例のヌクレオチド配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１１、１３及び１５に示し、全概念的翻訳物をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、１２、１４及び１６に各々示した。配列表に示した他の配列は、マウスＳＲ２（ｂ）０及び５ポリペプチドをコードする天然ｃＤＮＡの例（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１及び２３）並びにそれらの全概念的翻訳物（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２及び２４）；ラットＳＲ２（ａ）０ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）並びにその全概念的翻訳物（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）；ヒトＳＲ２（ａ）０及び１７ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７及び１９）並びにそれらの全概念的翻訳物（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８及び２０）；及びヒトＳＲ２（ｂ）０ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）並びにその全概念的翻訳物（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）を含む。本発明のＳＲポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３及び２５の不完全翻訳物、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４及び２６の欠失変異体を含み、それらの翻訳物及び欠失変異体は、ＳＲ−特異的アミノ酸配列、結合特異性または機能を有する。好ましい翻訳物／欠失変異体は、少なくとの６、好ましくは少なくとも８、より好ましくは少なくとも１０、最も好ましくは少なくとも１２残基のマウス、ショウジョウバエまたはチキンニューロピリン(neuropilin)−１に見られない翻訳物のドメインを有する。他の好ましい翻訳物は、少なくとも１つのＳＲ２及び／またはヒト特異的残基を有する。このようなドメインは、開示したＳＲ１及びＳＲ２ポリペプチド、例えば図１及び３のアライメントから容易に識別される。例えば、ヒト特異的残基は、Ｖ１１、Ｖ１５、Ｐ１８、Ａ１９、Ｎ２４、Ｅ２６、Ｄ２９、Ｓ３５、Ｄ６２、Ｍ６８、Ｆ９０、Ｎ９６、Ｈ９８、Ｆ９９、Ｒ１００、Ｔ１５３、Ｓ１５５、Ｓ１７０、Ｖ１７７、Ｐ１９６、Ｄ２１９、Ｉ２４２、Ｖ２６９、Ｓ２９８、Ａ３０３、Ｒ３２３、Ｋ３６０、Ｉ３６１、Ｖ３６３、Ｔ３７２、Ｉ３７３、Ｐ３７９、Ｖ３８０、Ｌ３８１、Ｖ３９３、Ａ３９４、Ｐ３９９、Ａ４０、Ｔ４１１、Ｓ４４９、Ｇ４５３、Ｓ４６９、Ａ４７６、Ｓ４７９、Ｉ４８１、Ｉ４８７、Ｅ４９１、Ｉ４９８、Ｇ５１８、Ｍ５２８、Ｔ５５３、Ｐ５５５、Ａ５５６、Ｇ５７２、Ａ５８７、Ｌ５９９、Ｄ６０１、Ｖ６３４、Ｎ６６７、Ｖ６６９、Ｋ６７２、Ｓ６７４、Ｎ７１７、Ｒ７３７、Ａ７５５、Ｉ７５６、Ｓ８０５、Ａ８１３、Ｐ８２０、Ｇ８３５、Ｅ８３８、Ｅ８５５、Ｔ９１６、Ｑ９１７及びＴ９１９を含む。
【０００７】
主題とするドメインは、ＳＲ−特異的細胞、特にモジュレーションまたは阻害活性モジュレーションをするニューロン、セマホリン結合または結合阻害活性といったＳＲドメイン特異的活性または機能を提供し、ＳＲ−特異的活性または機能は、インビトロ細胞ベースのあるいはインビボのアッセイ、例えば動物（遺伝子治療、トランスジーン等）におけるインビトロ結合アッセイ、細胞培養アッセイ等によって便利に測定される。結合アッセイは、ＳＲポリペプチドの結合標的との分子相互作用が評価される任意のアッセイを含む。結合標的は、ＳＲ活性またはその局在化を直接モジュレートするセマホリン、ＳＲ調節タンパク質または他のレギュレータ等の天然の細胞内結合標的でも、抗体といった特異的免疫タンパク質等の非−天然の結合標的でも、以下に述べるようなスクリーニングアッセイで同定されるもの等のＳＲ特異的薬剤でもよい。ＳＲ−結合特異性は、結合平衡定数（通常は少なくとも１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０８Ｍ−１、より好ましくは少なくとも１０９Ｍ−１）、主題ペプチドの、ＳＲ−発現細胞における陰性変異体として機能する能力、異種宿主（例えば齧歯類またはラビット）においてＳＲ特異的抗体を誘起する能力等によって検定される。とにかく、主題ＳＲポリペプチドのＳＲ結合特異性は、マウス、チキン及びショウジョウバエのニューロピリン−１とは必ず相違している。
【０００８】
例えば、ａ１、ａ２、ｂ１、ｂ２、ｃ、ＴＭ及びＣｙドメイン（図４Ａ）、及び、図４Ｂ及び４Ｃに示した挿入物を含むポリペプチドは、ＳＲ特異的結合性を示すことがわかる。同様に、ｓｅｍａＩＩＩ及び抗ＳＲ抗体等のＳＲ−特異的結合薬剤を用いた高スループットのスクリーニング（例えば下記参照）は、開示したＳＲポリペプチドの広範な欠失変異体においてＳＲ特異的結合薬剤を簡便に示すのに使用される。例えば、アッセイでＳＲ特異的活性を示すヒトＳＲ１ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、残基２４−３４；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、残基５７−６８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、残基８５−１１１；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、残基１４７−１５５；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、残基１６６−１７８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、残基２８８−２９９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２  、残基３５４−３６６；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、残基３６８−６９０；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、残基６９７−４１５；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、残基５９５−６１５；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、残基６７１−６８９；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、残基９１１−９１９を含む。アッセイでＳＲ特異的活性を示すヒトＳＲ２ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、残基１４−３５；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、残基２６１−２７８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、残基２８５−３０１；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、残基４７１−４８５；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、残基６１６−６２８；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、残基６５１−６８５；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、残基６８２−６９６；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、残基７１９−７４５；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、残基８０２−８２５；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、残基８１５−８３０；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、残基８２７−８３９；及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、残基８９８−９２９を含む。
【０００９】
特許請求したＳＲポリペプチドは、単離された又は純粋なものであり：「単離された」ポリペプチドは、その天然状態に存在する物質の少なくとも数個を伴わず、与えられたサンプルの全ポリペプチドの好ましくは少なくとも約０．５％、より好ましくは少なくとも約５重量％を占め、純粋なポリペプチドは、与えられたサンプルのゼンポリペプチドの少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９９％を占める。ここで用いるポリペプチドとは、アミノ酸の重合体であり、少なくとも６残基、好ましくは少なくとも約１０残基、より好ましくは少なくとも約２５残基、最も好ましくは少なくとも約５０残基の長さである。ＳＲポリペプチド及びポリペプチドドメインは、組み換え技術によって合成または製造しても、哺乳類、好ましくはヒトの細胞から精製してもよい。主題の組成物の生化学的合成、分子発現及び精製のための広範な分子及び生化学的方法が利用でき、例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook等, Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (Eds. Ausubel等, Greene publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY)または当該分野で他に知られている文献を参照されたい。
【００１０】
本発明は、天然細胞内結合標的等を含む特許請求したＳＲポリペプチドに特異的な結合薬剤、それらの薬剤の同定及び製造方法、及びそれらの診断、治療及び医薬品開発における使用を提供する。例えば、特異的結合薬剤は、広範な診断及び治療への応用、特に疾患または疾患予後が不当または望ましくない軸索のアウトグロース又は配向を伴う場合において有用である。新規なＳＲ特異的結合薬剤は、特異的抗体またはＴ細胞抗原レセプター等の体性組み換えされたポリペプチド（例えば、Harlow及びLane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory参照）といったＳＲ特異的レセプター類、セマホリン及び他の１-、２-及び３-ハイブリッドスクリーンで同定される天然細胞内結合薬剤、以下に述べる化学ライブラリーのスクリーンで同定される非−天然細胞内結合薬剤等を含む。特に興味深い薬剤は、ＳＲ機能、例えばセマホリン媒介細胞モジュレーションをモジュレートする。例えば、広範なＳＲ活性阻害剤が、ＳＲ、特にＳＲ−セマホリン相互作用を含む細胞機能化に用いられる。ＳＲ活性阻害剤の例は、ＳＲ由来ペプチド、特に、優性のネガティブ欠失変異体等を含み、以下の実験の項を参照のこと。
【００１１】
従って、本発明は、例えば細胞をＳＲ阻害剤と接触させることによりＳＲ活性をモジュレートする工程を含む細胞機能をモジュレートするための方法を提供する。細胞は、培地またはその場、即ち天然宿主内に滞留させてよい。好ましい阻害剤は、哺乳類宿主において経口活性である。診断用途のために、阻害剤または他のＳＲ結合薬剤は、蛍光物質、放射活性物質、化学発光物質、または他の検出が容易な分子でラベルされることが多く、それらのラベルは、結合薬剤に直接複合しているか、結合薬剤に特異的なプローブに複合しているかの何れかである。
【００１２】
開示したＳＲポリペプチドのアミノ酸配列は、選択された発現系に最適化されたＳＲペプチドをコードする核酸を逆翻訳するために用いられ（Holler等, (1993) Gene 136, 323-328; Martin等, (1995) Gene 154, 150-166）、あるいは、天然のＳＲコード核酸配列の単離で使用するための変性したオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブを生成させるのに用いられる（"GCG" software, Genetics Computer Group, Inc. Madison, WI）。ＳＲコード核酸配列は、例えばトランスジェニック動物の発現及びスクリーニングのために、例えばＳＲモジュレートした細胞機能を伴う疾患のために候補となる薬物の効力といった機能の研究のために、ＳＲ発現ベクター内で用いられ、組み換え宿主細胞に導入される。
【００１３】
また本発明は、核酸ハイブリダイゼーションプローブ及び複製／増幅プライマーを提供し、それらは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３または２５を含み、それらと特異的にハイブリダイゼーションをなす、即ち、マウス、ショウジョウバエ及びチキンニューロピリンｃＤＮＡの存在下で、各々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３または２５と特異的にハイブリダイズするのに十分なＳＲｃＤＮＡ特異的配列を有する。このようなプライマー又はプローブは、少なくとも１２、好ましくは少なくとも２４、より好ましくは少なくとも３６、最も好ましくは少なくとも９６塩基の長さである。特異的ハイブリダイゼーションの展示は、一般的に緊縮条件を必要とし、それは、例えば、５×ＳＳＰＥ(０．１８Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍ  ＮａＰＯ４、ｐＨ７．７、０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ)緩衝液中の３０％ホルムアミドを含む緩衝液中での４２℃においてハイブリダイズし、４２℃で０．２×ＳＳＰＥで洗浄しても結合を維持し、好ましくは５×ＳＳＰＥ緩衝液中５０％ホルムアミドを含む緩衝液中４２℃でハイブリダイズし、４２℃で０．２×ＳＳＰＥで洗浄しても結合を維持する。またＳＲ核酸は、BLASTX(Altschul等, (1990) Basic Local Alignment Search Tool, J. Mol. Biol. 215, 403-410)アライメントアルゴリズムを用いても識別される。
【００１４】
主題の核酸は、合成／非−天然配列のもの及び／または単離されたもの、即ち、その天然状態のものが有する材料の少なくとも幾つかを伴わず、好ましくは、与えられた画分に存在する全核酸の少なくとも約０．５％、好ましくは少なくとも約５重量％を占め、通常は組み換え体であり、非−天然配列または天然染色体に結合しているもの以外のヌクレオチドに結合した天然配列を含むことを意味する。主題の組み換え核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３または２５のヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含み、それらの配列またはフラグメントを末端に有し、それらは、天然染色体に結合しているもの以外の配列に隣接し（即ち連続し）、あるいは１０ｋｂ好ましくは２ｋｂより少ない天然のフランキング領域に隣接し、その領域は、末端にあるか、天然染色体に結合しているもの以外の配列に隣接している。核酸は、通常ＲＮＡまたはＤＮＡであるが、修正された安定性等を得るために他の塩基を含む核酸またはヌクレオチド類似物を用いることが有利な場合も多い。
【００１５】
主題の核酸は、翻訳可能な翻訳物、ハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマー、診断用核酸等としての使用；ＳＲ遺伝子及び遺伝子翻訳物の存在の検出における使用、及びさらなるＳＲ相同体及び構造的類似物をコードする核酸の検出または増幅における使用を含む種々の用途が見出された。診断において、ＳＲハイブリダイゼーションプローブは、臨床的及び実験室的サンプル中の野生型及び変異型ＳＲ対立遺伝子の同定における用途が見出された。変異体対立遺伝子は、高スループットの臨床的診断のための対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブを生成する。治療においては、治療的ＳＲ核酸は、活性ＳＲの細胞発現または細胞内濃度または利用能をモジュレートするために使用される。
【００１６】
本発明は、ＳＲモジュレートの可能な細胞機能のレベルで活性な薬剤のための試薬、化合物または先行化合物の効率的な同定方法を提供する。一般に、これらのスクリーニング方法は、セマホリン等の天然ＳＲ結合標的とのＳＲの相互作用をモジュレートする化合物について検定することを含む。結合薬剤について広範なアッセイが提供され、ラベルされたインビトロタンパク質−タンパク質結合アッセイ、イムノアッセイ、細胞ベースアッセイ等が含まれる。これらの方法は、自動化が可能で、先行化合物の化学ライブラリーについてのコスト効率が良くスループットの高いスクリーニングとしやすい。同定された試薬は、動物及びヒトについての製薬工業における用途が見出され、例えば、試薬は、医薬開発のための活性を最適化し毒性を最小化するためにインビトロ及びインビボで誘導体化されて再スクリーニングされる。
【００１７】
インビトロ結合アッセイは、ＳＲポリペプチドを含む成分の混合物を用い、そのポリペプチドは、例えば検出または固定のためのタグ等の他のペプチドまたはポリペプチド都の融合産物の一部であってもよい。アッセイ混合物は、天然細胞内ＳＲ結合標的を含む。特別な実施態様では、結合標的は、セマホリンポリペプチドである。天然全長結合標的を用いることもできるが、その一部（例えばペプチド）を用いるのが好ましいことが多い。ただし、その一部が主題のＳＲポリペプチドに対して、アッセイにおいて便利に測定可能な結合親和性及び結合活性を示す場合に限る。アッセイ混合物は、候補となる製薬剤も含む。候補薬剤は、多くの化学的分類を含むが、典型的には有機化合物であり；好ましくは小さな有機化合物であって、合成または天然化合物のライブラリーを含む広範な供給源から得られる。当該混合物は、種々の他の試薬を含有してもよい。これらは、塩、緩衝剤、中性タンパク質、例えばアルブミン、洗浄剤、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤等を含み、使用できる。
【００１８】
得られた混合物は、候補となる製薬剤の存在のためではなく、参照用結合親和性を有するＳＲポリペプチドが細胞性結合標的、その一部または類似物と特異的に結合する条件下でインキュベートする。混合物の成分は必要とする結合のために任意の順序で添加することができ、インキュベーションは最適な結合を促進する任意の温度で行うことができる。インキュベーション時間は、同様に、最適な結合のために選択されるが、迅速で高スループットのスクリーニングを促進するために最短化される。
【００１９】
インキュベーションの後、ＳＲポリペプチドと１つ又はそれ以上の結合標的との間の薬剤を介した結合を、任意の便利な方法によって検出する。ＳＲまたは結合標的ポリペプチドの少なくとも一方がラベルを含んでいる場合、そのラベルは放射活性、蛍光、光学または電子密度としての直接検出、あるいは、エピトープタグ等のような間接的検出を提供する。ラベルを検出するために、ラベル及び他のアッセイ成分の性質に応じて、例えば、光学または電子密度、放射線放出、非放射性エネルギー移動等、または抗体複合体等での間接的検出を通して種々の方法が用いられる。
【００２０】
試薬不存在下での標的に対するＳＲポリペプチドの結合親和性の、試薬存在下での結合親和性との相違が、試薬がＳＲポリペプチドのＳＲ結合標的への結合性をモジュレートすることを示す。例えば、以下に記載する細胞ベースのアッセイにおいても、試薬の有無における軸索アウトグロース又は配向のＳＲ依存性のモジュレーションにおける相違は、試薬がＳＲ機能をモジュレートすることを示している。ここで用いる相違とは、統計学的に有意なものであり、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも９０％の相違である。
以下の実験の項及び実施例は、例示を提供するものであり、何ら限定するものではない。
【実施例】
【００２１】
実験
ＳｅｍａＩＩＩ-結合タンパク質をコードするｃＤＮＡの発現クローニング
ＳｅｍａＩＩＩ-結合タンパク質の発現クローニングを通した単離を促進するために、我々は、ＳｅｍａＩＩＩのコード領域を容易に検出可能な組織化学的リポーターであるアルカリホスファターゼ（ＡＰ）に融合させ、得られたキメラタンパク質をヒト胚腎臓２９３細胞で発現させた。このタンパク質は、条件媒質中でのウェスタンブロットで、これらの細胞からＳｅｍａＩＩＩ及びＡＰの結合したサイズと一致する〜１８０ｋＤａの主要バンドとして検出でき、明らかな分解産物である小さな生成物も媒質中に僅かに検出された。この媒質を脊髄神経節（ＤＲＧ）からの解離性感覚ニューロンに適用すると、軸索及びＥ１８ＤＲＧではなくＥ１４ＤＲＧ〜のニューロンの細胞体上にＡＰ-活性を検出することができた。２９３細胞で発現されたＡＰのみは、何れの年齢の細胞にも結合しなかった。Ｓｅｍａ-ＡＰのＥ１８ではなくＥ１４ＤＲＧ細胞への結合は予期されなかったが、これは、Ｅ１４ＤＲＧ軸索においては、脊髄への突出が開始され、腹側の脊髄から分泌されるＳｅｍａＩＩＩのような因子によって駆散され得るが（Fitzgerald等, 1993; Mesersmith等, 1995; Shepherd等, 1997）、Ｅ１８では腹側脊髄組織によって駆散されることはなく（Fitzgerald等, 1993）、おそらくそれらのＳｅｍａＩＩＩに対する反応性のダウンレギュレーションを反映していると考えられたからである。
【００２２】
Ｅ１４ラットＤＲＧニューロン上のＳｅｍａＩＩＩ結合タンパク質を同定するため、ＣＯＳ細胞発現ベクター中に、Ｅ１４ＤＲＧ組織から誘導したｃＤＮＡを用いてｃＤＮＡ発現ライブラリーを構築した（実験方法参照）。ライブラリーからの〜１０００−２０００ｃＤＮＡのプールをＣＯＳ細胞にトランスフェクトし、ＳｅｍａＩＩＩ-ＡＰに結合する細胞の存在についてスクリーニングした。陽性プールは、７０プールのスクリーニング後に決定した。このプールからのサブプールを３ラウンドスクリーニングした後、ＳｅｍａＩＩＩ-ＡＰ結合活性をコードする単一のｃＤＮＡを同定した。このｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＯＳ-７細胞は、ＳｅｍａＩＩＩ-ＡＰに特異的に結合するが、ＡＰまたは値とリン-Ｆｃ融合タンパク質には結合しない（Keino-Masu等, 1996）。
【００２３】
全５ｋＢのｃＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列は、とにかく長いオープンリーディングフレームであることが解り、マウス、チキン及びツメガエルニューロピリンに類似した配列を持つ９２１アミノ酸のタンパク質（ラットＳｅｍａホリンレセプター１、ｒＳＲ１）をコードすると予想された（Takagi等,1991, 1995; Kawakami等, 1996）。我々は、ヒト胎児脳ライブラリーから我がセマホリン結合タンパク質のヒト相同体（ｈＳＲ１）をコードするｃＤＮＡをさらに単離し（実験方法参照）、図１Ａは、我々のラット及びヒトタンパク質とマウスニューロピリンとの全概念的翻訳したアミノ酸配列のアライメントを示す。ラット及びヒトタンパク質は、マウスタンパク質と高度の配列相同性を有し（アミノ酸レベルで各々９７％及び９３％の同一性）、他の種からのニューロピリンについて既に述べた、短いが高度に保持された細胞内ドメインを含むドメイン構造を有していると予想される（図１Ｂ）。
【００２４】
次に我々は、ＳｅｍａＩＩＩ-ＡＰのｒＳＲ１を発現するＣＯＳ-７細胞への結合が、ＳｅｍａＩＩＩとｒＳＲ１との直接的相互作用を反映しているのか、あるいはＣＯＳ-７細胞によって作られる細胞性因子を必要とするのかを試験するために共免疫沈降実験を行った。この目的のために、我々は、ＡＰに融合したｒＳＲ１の表面ドメインの可溶型を構築した。ｍｙｃでタグしたＳｅｍａＩＩＩタンパク質は、このＳＲ-ＡＰ融合物を複合させたビーズによって沈降したが、コントロール融合タンパク質であるｃ-ｋｉｔ-ＡＰ（Flanagan及びLeder, 1990）を複合させたビーズでは沈降せず、ＳＲ１表面ドメインとＳｅｍａＩＩＩとの直接的相互作用が示された。
【００２５】
ＳＲ１はセマホリン及びＳｅｍａＩＩＩのＣ末端ドメインの両方に結合する。
ＳｅｍａＩＩＩは、固有のセマホリンドメイン、単一の免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン、及びカルボキシ末端（Ｃ）ドメインをからなり、塩基性残基が豊富である（Luo等, 1993; Kolodkin等, 1993; Messersmith等, 1995; Puschel等, 1995）。セマホリンドメインが、セマホリンファミリーの異なる成員の間で変換されることは（Lavigne及びGoodman, 1996; Kolokin, 1996）、このドメインが機能に対して重要であり得ることを示唆している。他の２つのドメインの機能は知られていないが、Ｃドメインの塩基性は、このドメインの細胞表面または細胞外マトリクスとの相互作用を媒介することにおける役割を示唆している（Luo等, 1993）。ＳｅｍａＩＩＩの何れのドメインがＳｅｍａＩＩＩとＳＲ１との相互作用を媒介するかを決定するために、ＡＰのＳｅｍａＩＩＩの異なるタンパク質への種々の融合体をコードする構築物をＣＯＳ細胞で発現させた。これらの細胞で条件付けされた媒質をＳＲ１を発現するＣＯＳ-７細胞に適用し、ＡＰ融合タンパク質の結合について試験し；ポジティブコントロール実験では、ＡＰのみではなく全長のＳｅｍａＩＩＩ-ＡＰを含む媒質で観察された。また、結合は、セマホリンとＩｇドメインを含むＡＰ融合タンパク質（ＡＰ-ＳＩ）及びセマホリンドメインのみを含む融合タンパク質（ＡＰ-Ｓ）でも観察されたが、切断したセマホリンドメインを含む融合タンパク質では観察されず、結合のためにはセマホリンドメインの全体が必要であることが示唆された。驚くべきことに、結合は、Ｃドメインのみを含むＡＰ融合タンパク質（ＡＰ-Ｃ）及びＩｇ及びＣドメインを含む融合タンパク質でも観察された。これらの結果は、ＳｅｍａＩＩＩのセマホリンとＣドメインの両方がＳＲ１に結合しうるとの証拠を提供した。Ｃドメインの結合が、Ｃドメインの塩基性から生ずる非特異的相互作用を反映していることは解らなかった。これは、やはり高度に塩基性だがＳｅｍａＩＩＩと配列の相同性を持たないネトリン-１のＣ末端ドメイン（Serafini等, 1994）がＳＲ１と結合しなかったためである。
【００２６】
次に我々は、全長及び２つの切断された融合リガンド（ＡＰ-Ｓ及びＡＰ-Ｃ）のＳＲ１発現細胞への結合親和性を、上清中のＡＰ活性及び細胞に結合した相対量に基づく平衡結合実験で測定した（図２）。これらの実験の一つの制限は、我々が部分的に精製された条件媒質を用いたことであり（実験方法参照）、ＳｅｍａＩＩＩ-ＡＰ及びＡＰ-Ｃの場合、全長融合タンパク質並びにおそらくタンパク質分解によって生じた切断形態の両方を含む。これらの融合体の各々について、見積もられた解離定数は、ＡＰ活性を持つ全ての変性タンパク質が無傷のタンパク質と同じ親和性で結合する場合にのみ正確であり、この場合には、媒質がＡＰまたはＡＰフラグメントに相当することはわかったが、ＳＲ１には結合しないタンパク質種を含むので当てはまらない。ＡＰ-Ｓの場合、上清に全長の種しか見いだされないので、この制限には適合せず；従って見積もられた解離定数は、ＳＲ１発現細胞に対するＡＰ-Ｓの親和性を正確に反映している。これらのことに注意して、我々は、ＳＲ１を発現する細胞に対するＳｅｍａＩＩ-ＡＰ、ＡＰ-Ｓ及びＡＰ-Ｃの特異的結合曲線が飽和を示し、Hillの等式で近似できることを見いだした（図２Ａ−Ｃ）。ＳｅｍａＩＩＩ-ＡＰ、ＡＰ-Ｓ及びＡＰ-ＣのＳＲ１発現細胞に対する結合について予想された解離定数（Ｋｄ）は、各々０．３２５ｎＭ、１．４５ｎＭ、及び０．８４ｎＭであった。比較のため、崩壊(collapse)アッセイいおいて、０．４４ｎＭのＳｅｍａＩＩＩ-ＡＰを含む条件媒質での半最大崩壊反応を観察した。この値は、ＳｅｍａＩＩＩ-ＡＰとＳＲ１との相互作用について見積もられたＫｄに匹敵するものであった。これらの結果は、因果律に媒介された崩壊においてＤＲＧ軸索に対するＳｅｍａＩＩＩとＳＲ１との相互作用の役割を支持する。
【００２７】
これらの実験について、コントロールの２９３-ＥＢＮＡ細胞、即ちラットＳＲ１を安定に発現する２９３-ＥＢＮＡ細胞を、表示した濃度のＳｅｍａＩＩＩ-ＡＰ（Ａ）、ＡＰ-Ｓ（Ｂ）、またはＡＰ-Ｃ（Ｃ）を含有する濃縮条件媒質で９０分間処理した。ＨＡＢＡ緩衝液で６回洗浄した後、細胞を溶解させ、内因性ＡＰ活性を熱で不活性化させた。結合した組み換えＡＰ融合タンパク質から誘導されるＡＰ活性を熱量分析（４０５ｎｍでの光学密度）で測定した。特異的結合は、ＳＲ１発現細胞への結合から得た値をコントロールへの値から差し引くことにより決定し、このようにして得られた値はHillの等式に適合した。図２中の差し込み図は生のデータを示す（丸印、ＳＲ１発現細胞に対する全結合；三角印、コントロール細胞に対する全結合）。ＳｅｍａＩＩＩ-ＡＰ、ＡＰ-Ｓ及びＡＰ-ＣとＳＲ１との相互作用についてのＫｄは、各々、５５．３±６．５ｎｇ／ｍｌ、２１８．６±１１．０ｎｇ／ｍｌ、及び６７．２±３．０ｎｇ／ｍｌであった（１ｎＭは、ＳｅｍａＩＩＩ-ＡＰ、ＡＰーＳ及びＡＰ-Ｃについて各々１７０ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ及び８０ｎｇ／ｍｌに相当する）。バーは、３回のｓ．ｅ．ｍ．を示す。ＳｅｍａＩＩＩ-ＡＰ、ＡＰ-Ｓ及びＡＰ-ＣについてのHill係数は、各々１．５１±０．２４、１．７０±０．１０、及び１．４４±０．０７であった。
【００２８】
ＳｅｍａＩＩＩの駆散作用にはＳＲ１機能が必要とされる。
我々は、ＳＲ１表面ドメインの一部に対する抗体を生じさせ、ＳｅｍａＩＩＩへの反応媒介におけるＳＲ１の機能的役割の試験に用いた（実験方法参照）。抗血清の潜在的有用性を実証するために、我々はまず、それが軸索のＳＲ１タンパク質を検出できるかを試験した。ＳＲ１発現の空間的及び時間的パターンが、この抗血清で、ラット胚のトラバース断面において、その場でのハイブリダイゼーションによって検出されたＳＲ１遺伝子発現に相当する脊髄レベルで検出され、あらかじめマウス及びチキン胚で観察したパターンと一致した（Kawakami等, 1995; Takagi等, 1995）。Ｅ１４において、ＤＲＧニューロンの求心性繊維の背側脊髄への貫通が始まり（Windle及びBaxter, 1936; Smith, 1983; Altman及びBayer, 1994; Takagi等, 1995）、ＤＲＧ並びに腹側及び背側脊髄にＳＲ１翻訳物が見られ、対応するＳＲ１タンパク質への免疫反応性は感覚及び運動軸索並びに背側脊髄に検出された。ＳＲ１免疫反応性は、軸索上のこの抗血清及び培地におけるＥ１４ラットＤＲＧニューロンの成長コーンでも検出することができ、これはチキン軸索によるニューロピリンについて既に示された通りである（Takagi等, 1995）。Ｅ１８においては、ＤＲＧ及び前角において、より低いレベルのＳＲ１翻訳物が検出された（マウス及びチキンにおけるニューロピリンでの類似の結果について、Kawakami等, 1995; Takagi等, 1995参照）。ＤＲＧにおける発現のタイミングは、培地におけるＥ１４及びＥ１８ＤＲＧ細胞へのＳｅｍａＩＩＩ-ＡＰの結合パターン、及びＳｅｍａＩＩＩレセプターの予測されるものと一致した（Fitzgerald等, 1993; Messersmith等, 1995; 及びそれらの中の議論参照）。
【００２９】
ＳｅｍａＩＩＩの機能の媒介においてＳＲ１が含まれることを試験するために、プロテインＡ−精製抗ＳＲ１抗血清を用いた。培養媒質における抗血清の含有は、コラーゲンゲル培地中のＳｅｍａＩＩＩ-ＡＰ及びＥ１４ラットＤＲＧ軸索上のＳｅｍａＩＩＩの駆散効果を投与量依存的に阻害したが、やはりプロテインＡ精製したプレイムン(preimmune)ＩｇＧは駆散効果を阻害しなかった。この中和効果が抗血清中のＳＲ１に対する抗体によることを実証するために、ＳＲ１表面ドメインの一部と複合したビーズとともにインキュベートすることにより、抗血清のアリコートに免疫抑制を施して抗血清（抑制抗血清）とするか、コントロールビーズで処理した（疑似抑制抗血清）。模擬抑制抗血清は、ウェスタンブロットによりＳＲ１表面ドメイン−ＡＰ融合タンパク質をまだ検出し、ＳＥｍａＩＩＩ-ＡＰの阻害効果をまだブロックした。対照的に、抑制抗血清は、ウェスタン部ロットによりＳＲ１表面ドメイン-ＡＰ融合タンパク質を検知せず、ＳｅｍａＩＩＩ-ＡＰの阻害活性をブロックせず、最初の抗血清がＳＲ１機能を妨害することによりＳｅｍａＩＩＩ-ＡＰ活性をブロックするという仮説に適合した。ＳＲ１に対する抗血清が軸索駆散に必要な一般的メカニズムに影響される可能性を除外するために、同じプロテインＡ精製抗血清を、ＳｅｍａＩＩＩいにょって駆散される軸索の群である（Serafini等, 1996; Varela-Echavaria等, 1997）滑車運動軸索（Colamarino及びTessier-Lavigne）のネトリン媒介駆散に対するその効果を試験した。抗ＳＲ１抗血清はこれらの軸索を染色するが、これらの軸索のネトリン-１の駆散効果はブロックせず、ＳＲ１がＳｅｍａＩＩＩ媒介駆散に特異的に含有されることに合致する。
【００３０】
ＳｅｍａＩＩＩの崩壊誘発効果にもＳＲ１機能は必要とされる。
慢性的に存在する場合にはＤＲＧ軸索を点原から遠ざけるのに加えて、ＳｅｍａＩＩＩも、培地の成長コーンに急激かつ均一に添加する場合、ＤＲＧ成長コーンの崩壊誘発に含ませることができる（Luo等, 1993）。従って我々は、抗ＳＲ１抗血清が崩壊アッセイにおけるＳｅｍａＩＩＩの活性に影響するかを試験した。抗ＳＲ１抗血清はＳｅｍａＩＩＩ-ＡＰまたはＳｅｍａＩＩＩ-ｍｙｃによって誘起されたＥ１４ラットＤＲＧ成長コーンの崩壊を阻害し；ブロッキング効果は、駆散のブロックに観察されたように投与量依存的であることが示された（表１）。予測したように、疑似抑制抗血清も崩壊をブロックしたが、抑制抗血清はしなかった。このブロック現象の特異性を試験するために、我々は、リゾホスファチド酸（ＬＰＡ）もＤＲＧ成長コーンを生じうるという事実を用いた（Jalink等, 1994）。プレイムン抗血清も抗ＳＲ１抗血清もＬＰＡに誘発されたＤＲＧ成長コーンの崩壊を阻害せず、抗血清がＳｅｍａＩＩＩ誘発性崩壊を、ＳＲ１機能の特異的阻害によってブロックするという仮説に合致した。
【００３１】
ＳＲ２をコードするｃＤＮＡのクローニング
ＳＲファミリーのさらなる成員を同定するために、我々は、ＣＵＢおよびＳＲ１のＭＡＭモチーフの両方を含むラットｃＤＮＡを特異的に増幅するＰＣＲプライマーを設計した。ＳＲ１相同体の９３６アミノ酸をコードする単一のｃＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、設計したＳＲ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）を同定した。これらのデータにより、我々は、公共データデースのＥＳＴ類を同定かつ合成し、ｈＳＲ２をコードするｃＤＮＡを生成することができた。このクローンを含むＣＤＮＡ類も、ヒト胎児脳ライブラリーから単離された（実験方法参照）。セマホリン結合及びニューロン軸索アウトグロース及び／または配向モジュレーション活性を含むＳＲ特異的機能は、ここに、ＳＲ１ポリペプチドについて記載したように示された。
【００３２】
ＳＲ１はＳｅｍａＩＩＩレセプターである。
ニューロピリンは膜貫通タンパク質であり、最初にFujisawa及び共同研修社によって、ツメガエル神経系の成長における軸索の特異的サブセットをラベルするモノクローナル抗体（Ａ５）に認識されるエピトープとして同定された（Takagi等, 1987; Fujisawa等, 1989; Takagi等, 1991）。ニューロピリンは、その細胞外ドメインに２つのいわゆるＣＵＢモチーフを含み、それらは補体成分Ｃ１ｒ及びＣ１ｓ及び幾つかの金属タンパク質分解酵素類の非触媒領域に見られる（概説は、Bork及びBeckman, 1993参照）。これらのドメインは、ニューロピリンにおいて、凝集因子Ｖ及びＶＩＩＩのＣ１及びＣ２ドメイン（Toole等, 1984; Jenny等, 1987）、乳脂粒子膜タンパク質（ＭＦＧＰ）（Stubbs等, 1990）、及びジスコイジンレセプター（ＤＤＲ）（Johnson等, 1993; Sanchez等, 1994）を含む多くのタンパク質に有意な類似性を持つ２つのドメインに続く。膜貫通領域により近いのはＭＡＭドメイン、即ちタンパク質−タンパク質相互作用に含まれるタイプのモチーフである（Beckmann及びBork, 1993）。ニューロピリンの細胞内ドメインは短く（４０アミノ酸）、明確なモチーフは持たないが、ツメガエル、マウス及びチキンに高度に保持されている（Takagi等, 1995; Kawakami等, 1996）。これら３つの種の神経系の成長において、種々の異なる類の軸索（運動及び感覚軸索を含む）によって、それらがその標的に突出するように動的に発現される（例えば、takagi等, 1987, 1991, 1995; Kawakami等, 1996）。ニューロピリンは、インビトロにおける軸索アウトグロースを促進し（Hirata等, 1993）、トランスジェニックマウスにおけるβ-アクチンプロモータの制御下のニューロピリンの発現を強制して軸索の関節離開をもたらす（Kitsukawa等, 1995）。ニューロピリンの強制された異所性の発現も、ニューロピリンが発現される非ニューロン領域の２つである心臓及び四肢の発達における異常性を導き、それは神経系外の器官形成におけるニューロピリンの役割を示唆した（Kitsukawa等, 1995）。
【００３３】
我々は、ニューロピリンタンパク質に配列類似性を持つＳＲ１及びＳＲ２セマホリンレセプターを同定した。ＳＲ１の時空的発現パターンは、ＳＲ１のＳｅｍａＩＩＩレセプターとしての役割と合致する。発達中の脊髄の領域において、ＳＲ１は、ＤＲＧの感覚神経、特に脊髄神経、後根、及び後索におけるそれらの軸索によって最も優勢に発現され、ＳＲ１は、培地中の解離したＤＲＧニューロンから誘導された軸索の成長コーン上でも検出された。ＳＲ１及びニューロピリンがＤＲＧニューロン（マウスＥ９及びＥ１５．５の間）によって発現され、その後急激に減少する時間は、ＳｅｍａＩＩ反応性ＤＲＧ軸索の脊髄への突出の突出タイミングに相当する。この時間中、ＳｅｍａＩＩＩは腹側脊髄において高レベルで発現され、通常は背側脊髄において終端するＮＧＦ反応性軸索の不適当な標的化を防止する拡散可能な化学駆散剤として関与する（Messersmith等, 1995;Pueschel等, 1995, 1996; Shepherd等, 1997）。我々のその場でのハイブリダイゼーション研究は、ＳＲ１がラットＤＲＧ細胞の幾つかの集団においてのみＥ１４で−おそらくはＳｅｍａＩＩＩ反応性のＮＧＦ反応性ニューロンで発現されることを示唆した。さらに、発達しているＤＲＧ軸索に対して、交感軸索（Pueschel等, 1996）、脊髄運動軸索（Shepherd等, 1996; Varela-Echavarria等, 1997）、及び滑車、三叉運動神経、舌咽及び迷走神経軸索（Serafini等, 1996; Varela-Echavarria等, 1997）等の多くの頭側運動軸索を含む他の類の発達中の軸索が、ＳｅｍａＩＩＩによって駆散され、あるいはそれに対して崩壊する。これらの軸索の全てがＳＲ１を発現する。
【００３４】
またＳＲ１は、神経系外のＳｅｍａＩＩＩの媒介作用においても役割を果たす。ＳＲ１、ニューロピリン及びＳｅｍａＩＩＩは、発達中の心臓血管系及び四肢を含む種々の非−ニューロン組織において発現される（Takagi等, 1987, 1991, 1995; Kitsukawa等, 1995;Pueschel等, 1995; Behar等, 1996）。トランスジェニックマウスにおけるβ-アクチンプロモータの制御下でのｍ-ニューロピリンの異所性発現は、軸索の新芽形成及び関節離断に加えて、非神経組織における種々のモルホロジー的異常性を生じ、それは、過剰な毛細管及び血管の形成、血管拡張、心臓奇形、及び余分な指を含む（Kitsukawa等, 1995; また、軸索、心臓及び骨格発達における障害は、ＳｅｍａＩＩＩノックアウトマウスも参照, Behar等, 1996）。
【００３５】
我々の実験は、ＳｅｍａＩＩＩのＣドメイン及びセマホリンドメインの両方が独立にＳＲ１に結合できるという証拠を提供する。全長ＳｅｍａＩＩＩ分子の両極のＳＲ１に結合する能力は、全長ＳｅｍａＩＩＩがＳＲ１に対して個々のドメイン単独よりも高い親和性を有することを示唆するデータの説明を与え、これは、各ＳｅｍａＩＩＩ分子の２つのドメインの細胞膜において隣接するＳＲ１への配列的結合が、より高い見かけの親和性をもたらしたからである。この観察は、ＳｅｍａＩＩＩに応じたシグナリングが、単独のＳｅｍａＩＩＩ分子によってもたらされたＳＲ１分子の二両体化によってトリガーされ、それはまた、セマホリンドメインまたはＣドメインへのＡＰの融合体であるＡＰ-Ｓ及びＡＰ-Ｃが、インビトロでのＤＲＧの駆散の誘発または崩壊の発生をしないという観察によっても支持される。
【００３６】
ＳＲ１が、そのアミノ末端に２つのＣＵＢドメインを含み、タンパク質−タンパク質相互作用に含まれるモチーフは、その構造が、２つの接着ドメイン、免疫グロブリン様ドメイン及びフィブロネクチンタイプＩＩＩリピートと同様に逆平行β−樽型と予想される（Bork等, 1993,; Bork及びBeckmann,1993）。補体Ｃ１ｒ／ｓのＣＵＢドメインは、Ｃ１ｒ／ｓ二両体間にカルシウム依存的な複合体形成をすること、並びにそれらがＣ１ｑと結合して成熟Ｃ１複合体を形成する（Busby及びIngham, 1988, 1990）ことがわかったが、金属タンパク質分解酵素のＣＵＢドメインＴｏｌｌｏｉｄ（ＢＭＰ-１関連）は、遺伝的証拠から、ＢＭＰファミリー成員デカペンタプレジックとの相互作用を媒介することが示唆された（Childs及びO'Connor, !994; Fineli等, 1995）。ＳＲ１分子の中心部では、ｂ１及びｂ２ドメインが、凝集因子Ｖ及びＶＩＩＩ（Toole等, 1984; Jenny等, 1987）、ＭＦＧＦ（Larocca等, 1991）及び２つのレセプタータンパク質-チロシンキナーゼＤＤＲ（Johnson等, 1993）及びＰｔｋ-３（Sanchez等, 1994）と相同性を示す。最後に、ＳＲ１は、ＭＡＭドメイン、多様な膜貫通タンパク質に見られる〜１７０アミノ酸モジュールも含み（Beckmann及びBork, 1993）、それらは同種親和性相互作用を媒介することが示唆された（Zondag等, 1995）。我々は、ＳＲ１の切断された形態であって、ほぼ２６４アミノ酸末端を欠くものが、ＳｅｍａＩＩＩ-ＡＰへの結合能力を維持し、ＳｅｍａＩＩＩのセマホリン及びＣドメインの少なくとも一方が、ＳＲ１のドメインｂ１またはｂ２またはＭＡＭドメインと相互作用することを示唆していることを見いだした。ＳｅｍａＩＩＩはまた、ＳＲ１のＳＲ１結合パートナーとの相互作用をモジュレートする。駆散アッセイにおいてＳｅｍａＩＩＩの最も顕著な効果は、束形成パターンにおける変化ではなく、ＤＲＧ軸索をＳｅｍａＩＩＩの局在化供給源から遠ざけることである（Messersmith等, 1995）。さらに、個々の成長コーンは、インビトロでＳＲ１依存的にＳｅｍａＩＩＩに対する崩壊で誘発され得（Luo等, 1993）、ＳＲ１を含む明確なシグナリング経路がＳｅｍａＩＩＩによってトリガーされうることを示している。
【００３７】
セマホリンファミリーは、分泌された膜貫通タンパク質である２０を越えるタンパク質を含み、それらは、配列及び構造の類似性に基づいて５つのサブファミリーに分類された（Tessier-Lavigne及びGoodman, 1996; Kolodkin, 1996に概説されている）。我々は、分泌されたセマホリンＳｅｍａＡ、ＳｅｍａＥ、及びＳｅｍａＩＶは、幾つかのサブファミリーにＳｅｍａＩＩＩとして属するが、ＳＲ１とセマホリンファミリーのこのサブファミリーの成員との間の相互作用における混乱を示唆していることを見いだした。セマホリンタンパク質の多様性の混乱は、これらのタンパク質及びそれらのレセプターの相互作用にある単純さを隠す可能性があり、エフリン-ＡサブクラスのＧＰＩ-固定化リガンドが第１かつ無差別にＥｐｈＡサブクラスレセプターと結合し、エフリン-Ｂサブクラスが第１かつ無差別にＥｐｈＢクラスレセプターと相互作用するするＥｐｈレセプターとエフリン(ephrin)リガンドの混乱が単純な結合関係を隠すのと同じである（Gale等, 1996; Eph Nomenclature Committee, 1997）。
【００３８】
実験方法：ＡＰ融合タンパク質の構築及び発現
ＳｅｍａＩＩＩ-ＡＰ融合タンパク質を製造するために、全長ＳｅｍａＩＩＩをコードするｃＤＮＡをＰＣＲで増幅し、ＡＰＴａｇ-１にサブクローンした（Flanagan及びLeder, 1990）。得られたプラスミドから、ＳｅｍａＩＩＩ及びＡＰの両方をコードするフラグメントを発現ベクターｐＣＥＰ４（Invitrogen）に移し、２９３細胞（Invitrogen）のトランスフェクションに用いた。ゲネチシン(geneticin)及びヒグロマイシン(hygromycin)で選択した後、Ｓｅｍａ-Ａｐを安定に発現する細胞系を確立した。細胞をコンフルエンスまで成長させ、次いでOptimen媒質(BRL)中で３日間培養した。条件媒質を回収し、Centripep-100（Amicon）を用いて部分的に精製した。ＡＰに融合させたＳＲ１の表面ドメインをコードする構築物を同様にｐＣＥＰ４内に作製し、安定な細胞系の誘導に用いた。これからの条件媒質を同じ方法で精製した。
【００３９】
他のＡＰ融合タンパク質について、Ｓｅｍａドメイン及びＩｇドメイン（アミノ酸２５から６５４）、Ｓｅｍａドメインのみ（アミノ酸２５から５８５）、切断したＳｅｍａドメイン（アミノ酸２５から５２６）、Ｉｇドメイン及びＣドメイン（アミノ酸５８６から７５５、またはＣドメインのみ（アミノ酸６５５から７５５）をコードする配列をＰＣＲで増幅し、ＡＰをコードする配列に融合させ、発現ベクターｐＳｅｃＴａｇＢ（Invitrogen）のＩｇｋ鎖シグナル配列の後のクローニング部位にサブクローンした。これらの得られた構築物を、リポフェクタミン（GIBCO BRL）とともにＣｏｓ-１またはＣｏｓ-７細胞に一時的にトランスフェクトした。条件媒質を上記のように回収した。
【００４０】
発現ライブラリー構築及びスクリーニング
８０ｍｇのＤＲＧ組織を２リトッルのＥ１４ラット胚から切り出し（K. Wangの助力）、ドライアイス上で凍結させた。これらのラットＤＲＧから、QuickPrepｍＲＮＡ精製キット（Pharmacia）を用いてｍＲＮＡを単離し、StratageneｃＤＮＡ合成キットを用いて、製造者の指示に従ってｃＤＮＡの生成に用いたが、ｃＤＮＡは、ＤＮＡサイズ分画カラム（GIBCO BRL）を用いてサイズ分画した。５００ｂぴょり大きなｃＤＮＡを含む画分を回収し、ＣＯＳ細胞発現ベクターｐＭＴ２１（Genetics Institute）のＥｃｏＲＩＸｈｏＩ部位にリゲートした。リゲートしたＤＮＡは、エタノール沈降させ、１０ｎｇ／μｌで水中に再懸濁させ、ＳＵＲＥ２スーパーコンピーテント(supercompetent)細胞（Stratagene）（４０μｌ細菌に１μｌＤＮＡ）中に電気穿刺し、得られた形質転換体を〜１０００から２０００コロニーのプールに分けた。
【００４１】
ライブラリーをスクリーニングするために、各プールの細菌からSNAP miniprepキット（Invitrogen）を用いてＤＮＡを抽出し、リポフェクタミン（GIBCO BRL）を有する６ウェルプレートにおいてＣＯＳ-１細胞に一時的にトランスフェクトした。４８時間後、細胞をハンクスの等張塩溶液（HABA, Cheng及びFlanagan, 1994）で一度洗浄し、次いで、５０−１００ｎｇ／ｍｌのＳｅｍａＩＩＩ-ＡＰ融合タンパク質を含むＨＡＢＡ中、室温で７５分間インキュベートした。プレートをＨＡＢＡ中で６回洗浄し、アセトン-ホルムアルデヒドで固定し、次いでCheng及びFlanagan(1994)に記載されているようにＨＢＳで２回洗浄した。プレートを６５℃のインキュベータ内に２時間保持して、ＣＯＳ細胞の内因性アルカリホスファターゼ活性を不活性化した。プレート内の細胞を、Cheng及びFlanagan(1994)に既に記載されているように，ＡＰ基質ＢＣＩＰ及びＮＢＴ（GIBCO BRL）を含むＡＰ緩衝液中で２−６時間染色した。細胞の染色は、解剖顕微鏡を用いて監視した。
【００４２】
陽性プールを同定した後、プールからの１０ｎｇのＤＮＡをＤＨ５αコンピーテント細胞にトランスフェクトし、形質転換体を２００−３００コロニーのサブプールに分けた。これらのサブプールを上記のように再スクリーニングし、陽性のサブプールを、単一の陽性プラスミド（ｐ２８）が単離されるまで、さらに２ラウンドの再分割をした。ｐ２８プラスミドの挿入ＤＮＡを、Licorの（Ｌ４０００）自動化シークエンサ並びに３３Ｐサイクルシークエンシングを用いて両方の鎖から配列分析した。
【００４３】
ヒトｃＤＮＡライブラリースクリーニング
ラットＳＲ１（ｐ２８）の配列での、ヒトの発現された配列タグ（ＥＳＴ）デー手ベースの検索により、その中間部分に相同性を持つ多数の短い配列が明らかになった。Genome System Inc.からＥＳＴクローン（遺伝子バンク承認番号Ｒ６１６３２）が得られ、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（Stratagene）の高緊縮でのスクリーニングのプローブとして用い、ヒトＳＲ１の全長コード領域をカバーする４つの重複するｃＤＮＡの単離を導いた。
【００４４】
インサイチュー・ハイブリダイゼ−ション
４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で前もって固定したＥ１４ラット胚の上腕領域から凍結断片（１０μｍ）を作製した。これらの断片のその場でのハイブリダイゼーションを、Schaeren-Wiemers及びGerfin-Moser(1993)及びKennedy等(1994)に記載されているように実施した。５’-非翻訳領域の４９０ｂｐ及び５’ＳＲ１コード領域の７９５ｂｐを含む１２８５ｂｐフラグメントｗｐ、ｐ２８プラスミドのＰｓｔＩ消化によって放出させ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Stratagene）にサブクローンした。アンチセンス及びセンスＲＡＮプローブを、ジオキシゲニン-ＵＴＰ（Boehringer Mannheim）の存在下、Ｔ７及びＴ３ポリメラーゼを用いて、製造者が推奨するように転写した。
【００４５】
細胞表面結合及び動力学分析
ＳｅｍａＩＩＩ-ＡＰの解離したＤＲＧ細胞への結合を試験するために、Ｅ１４またはＥ１８ラット胚から取り出したＤＲＧを、０．２５％トリプシンとともに３７℃で１０分間消化し、炎研磨したピペットで粉砕する事によりさらに分解した。未解離の組織塊を沈降で除去した後、解離した細胞を４３０×ｇのスピン５分間によって回収し、次いで８ウェルチャンバースライドで、０．５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び２５ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ（Bioproducts for Science Inc.）を含むＦ１２／Ｎ３媒質中、５％ＣＯ２、３７℃で２０分間培養した。結合活性を試験するために、細胞を同定した組み換えタンパク質を含むＨＡＢＡ緩衝液中で９０分間インキュベートし、次いで洗浄、固定、加熱及び染色を上記のように行った。
【００４６】
全長ラットＳＲ１タンパク質を安定に発現する２９３-ＥＢＮＡ細胞を、ｐＣＥＰ４-ＳＲ１プラス水殿トランスフェクション及びゲネチシン及びヒグロマイシンでの選択によって確立した。平衡結合実験を、ほぼ上記の通り（Flanagan及びLeder, 1990; Cheng及びFlanagan, 1994）、ポリ-Ｄ-リシンでコートした６ウェルプレートで培養したコントロール２９３-ＥＢＮＡ細胞またはＳＲ１発現性２９３-ＥＢＮＡ細胞を用いて行った。
【００４７】
ＳｅｍａＩＩＩ及びＳＲ１に対する抗体の生成
ＳｅｍａＩＩＩ、生成したＡＰ-Ｓ、ＡＰのＳｅｍａＩＩＩのＳｅｍａドメインへの融合物についてのウェスタンブロット実験を、ラビット抗血清を生じさせるために用いた。ＳＲ１の機能ブロック実験のために、ＳＲ１のアミノ酸２６５から８５７をコードする１７７５ｂｐのＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅し、細菌発現ベクターｐＱＥ-９（Qiagen）にサブクローンして、アミノ末端に６つのヒスチジン残基を持つ融合タンパク質を大腸菌で生成させた。Ｈｉｓ-タグＳＲ１は、ＸＬ１-Ｂｌｕｅ細胞で発現され、製造者の推奨の通りに精製し、ラビット抗ＳＲ１抗血清を生じさせるために用いた。抗ＳＲ１または免疫前血清における免疫グロブリンは、プロテインＡ−アガロース（GIBCO BRL）カラムで精製した。この血清をカラムに適用した後、まず１５bed容量の１００ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、次いでさらに２０bed容量の１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、で洗浄した後、５bed容量の５０ｍＭグリシン（ｐＨ３．０）で溶離した。カラムからの溶離液を即座に１／１０容量の１ＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）でを加えて中和し、次いでCentricon-10装置（Amicon）で濃縮した。抗ＳＲ１抗体を抗血清から除くために、等量のニッケル-アガロースビーズを、精製したＨｉｓ-ＳＲ１タンパク質とともに（コントロールではこれ無しに）、４℃で４時間インキュベートした。Ｆ１２媒質で３回洗浄した後、ビーズを等量の抗ＳＲ１血清とともに４℃で３時間インキュベートした。上清を回収し、次いでプロテインＡ親和性精製を上記のように施した。
【００４８】
免疫沈降及びウェスタン分析
ＡｐまたはＡｐ融合タンパク質をウェスタンブロットによって検出するために、濃縮条件媒質のアリコートをＳＤＳ-ＰＡＧＥ（８％ゲル）によって溶解した。ニトロセルロース（Amersham）に移した後、タンパク質をラビット抗ＡＰ抗体（DAKO）でプローブした。ブロットは、基質としてＢＣＩＰ及びＮＢＴで行った。
【００４９】
ＳＲ１とＳｅｍａＩＩＩとの相互作用を検出するために、１００μｌプロテインＡ-アガロースビーズ（GIBCO BRL）を、まず５μｇの抗ＡＰモノクローナル抗体（Medix Biotech）とともにＩＰ緩衝液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、及び０．０２％ＮＰ-４０）中で２時間、４℃でインキュベートした。１ｍｌのＩＰ緩衝液で３回洗浄した後、ビーズの半分（５０μｌ）を２μｇのＫｉｔ-ＡＰ（Flanagan及びLeder,1990）またはＳＲ１-ＡＰタンパク質（全ＳＲ１表面ドメインを含む）とともに４℃で２時間インキュベートした。組み換えタンパク質と複合したビーズは、次いでＩＰ緩衝液で３回洗浄し、２μｇのｍｙｃ-タグＳｅｍａＩＩＩタンパク質を含む４０μｌのＩＰ緩衝液に再懸濁した。混合物を４℃で３時間インキュベートした後、ビーズを１ｍｌのＩＰ緩衝液で６回洗浄した。結合したタンパク質は、５０μｌのＳＤＳ-含有サンプル緩衝液中でビーズを煮沸することにより放出させ、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ（８％ゲル）及びＣ末端Ｍｙｃ-エピトープタグに対するモノクローナル抗体（９Ｅ１０）でのウェスタンブロットにより分析した。
【００５０】
免疫組織化学
Ｅ１４ラット脊髄におけるＳＲ１の発現を検出するための免疫染色のために、固定していない凍結胚から凍結断片（１０μｍ）を回収し、アセトンで５分間固定した。染色は、一次抗体としての免疫前血清（１：５００）または抗ＳＲ１血清（１：５００）、及び二次抗体としてのビオチニル化ヤギ抗ラビットＩｇ（５ｎｇ／ｍｌ、Biorad）で行った。発色源としてジアミノベンジジン（Sigma）を用い、Vectactain Elite ABCキット（Vector）でシグナルを向上させた。細胞の染色のために、Ｅ１４ラットＤＲＧを上記のように２０時間培養し、抗ＳＲ１抗血清または免疫前血清（１／５００希釈）とともに１時間室温でインキュベートし、３回洗浄し、メタノールで固定し、結合した抗体をＣｙ３-複合二次抗体（Jackson Immunological Laboratories）を用いて可視化させた。
【００５１】
崩壊アッセイ
崩壊アッセイは、実質的にRaper及びKapfhammer(１９９０)及びLuoら(１９９３)に記載されたようにして、最小の修正を加えて行った。簡潔に言えば、Ｅ１４ラット胚からＤＲＧ外植片を切り取り、０．５％ＦＣＳ及び２５ｎｇ／ｍｌの２．５ＳＮＧＦを含むＦ１２／Ｎ３中のポリ-Ｄ-リシン（Sigma）及びラミニン（Becton Dickinson Labware）でコートした６ウェルプレートにおいて、５％ＣＯ２中３７℃で１６−２０時間培養した。ＡＰ、ＳｅｍａＩＩＩ-ＡＰ、またはＳｅｍａＩＩＩ-ｍｙｃを含む濃縮条件媒質の少量を培養媒質に徐々に添加し、培地を３７℃に１時間維持した。外食片を、１０％スクロースを含むＰＢＳ中の４％ＰＦＡで１５分間固定し、次いでＰＨＴＸ（ＰＢＳ／１％熱不活性化したヤギ血清／１％ＴｒｉｔｏｎＸ-１００）で１５分間インキュベートした。次いで、外食片を２μｇ／ｍｌのローダミン-ファロイジン（Molecular Probes）で３０分間染色し、洗浄し、Fluoromount G(Fisher)でマウントした。コントロールとして、Ｌ-ａ-リソホスファチジン酸（LPA, Sigma）のアリコートを最終濃度１μＭ（Jalink等, 1994）で培地に添加し、培地を３７℃で３分間インキュベートした後、固定して染色した。免疫前または抗ＳＲ１抗血清の効果を試験するために、各抗血清のアリコートを外食片培地に添加し、ＳｅｍａＩＩＩタンパク質またはＬＰＡの添加の前に３７℃で３０分間保持した。
反発アッセイ
反発アッセイは本質的に過去に記載されたようにした(Messersmithら,１９９５)。簡単に述べれば、Ｅ１４ラットＤＲＧ外植片を切り取り、対照２９３ＥＢＮＡ細胞又はＳｅｍａＩＩＩ-ＡＰを発現する２９３ＥＢＮＡ細胞とともにコラーゲンゲルに埋め込んだ。抗体の示された量を培地(０．５％ＦＣＳと２５ｎｇ／ｍｌの２．５Ｓ ＮＧＦを含むＦ１２／Ｎ３倍地)内に含めた。３７℃で４０時間インキュベート後、外植片をＰＢＳに４％のＰＦＡが入ったもので２時間固定し、神経フィラメント特異的抗体(ＮＦ-Ｍ,１：１５００；Leeら,１９８７)及び西洋わさびペルオキシダーゼ抱合二次抗体(Boehringer-Mannheim；１：２５０)で、開示されているようにして(Kennedyら,１９９４；Messersmithら,１９９５)免疫染色した。神経突起の成長の定量化は開示されているようにして実施した(Messersmithら,１９９５)。
【００５２】
ニューロピリン−２の同定
ニューロピリン−１の細胞外ドメインを、幾つかの予測される構造ドメイン：２つのＣＵＢモチーフ（ドメインａ１及びａ２）、凝集因子Ｖ及びＶＩＩＩに相同な２つのドメイン（ドメインｂ１及びｂ２）及びＭＡＭドメイン（ドメインｃ）で構築した（Takagi等, 1991; Kawakami等, 1996）（図１及び２ａ）。ニューロピリン−１が関連分子ファミリーの成員であるかを決定するため、我々は、
正変性プライマーの３つのセット（５．１、５．２及び５．３）及び逆変性プライマー（３．１、３．２及び３．３）を用いた逆転写ＰＣＲ（ＲＴ-ＰＣＲ）によって関連物を検索した。プライマーは、ａ２と他のＣＵＢドメインタンパク質（プライマーセット５．１）、ドメインｂ１及び／またはｂ２と凝集因子Ｖ及びＶＩＩＩ（プライマーセット５．２、５．３及び３．１）、ドメインｃと他のＭＡＭドメインタンパク質（プライマーセット３．２）、または異なる種からのニューロピリン相同体間に高度に保持された細胞内ドメインの配列（プライマーセット３．３）の間に保持された配列に基づいて設計した（実験方法参照）配列は、全Ｅ１１マウス胚ｍＲＮＡ及び成熟マウス脳ｍＲＮＡから、（５．３及び３．１を除く）５’及び３’プライマーセットの全ての対となる組み合わせを用いて増幅した。全ての場合において、ニューロピリン−１に予測されたサイズの産物が増幅されサブクローンされた。プライマーセットの各対について１ダースより多いｃＤＮＡが配列分析され、全ての場合においてマウスニューロピリン−１配列が回収された。さらに、プライマーセット５．２（ｂ１ドメイン、KEWIQVD）及び３．３（細胞内ドメイン、ENYNFE）を用いてＲＴ-ＰＣＲで得られたｃＤＮＡの幾つかが重複する配列をコードし、それらはニューロピリン−１配列の一部に関連するが同一ではなかった。これらの配列を、ｃＤＮＡライブラリースクリーニングとＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の高速増幅）との組み合わせを用いて、５’及び３’の両方向に延長した（実験方法参照）。
【００５３】
実験から、新規なニューロピリン-１-関連分子の全長が組み立てられ（図３）、それをニューロピリン−２と命名した。発現された配列タグ（ＥＳＴ）データベースのスクリーニングにより、我々はまたヒトニューロピリン−２の配列を予測する数種のヒトＥＳＴの配列を組み立て、それらは、マウスニューロピリン−２と高い相同性（９０％同一性）を有していた。ニューロピリン−２に予測された全構造は、ニューロピリン−１のものと同一であり、全ての同じ機能性ドメインを有する（図４Ａ）。アミノ酸レベルでは、ニューロピリン−２の配列は、ヒトとマウスの両方においてニューロピリン−１と４４％の同一性であった。相同性は、タンパク質の全長に渡って分布し、膜貫通ドメインにおいて最も高い相同性を示した。
【００５４】
これらの実験を通して（実験方法参照）、我々はまた、選択的スプライシングによって生ずるニューロピリン−２の選択的(alternative)形態の存在についての証拠も発見した。第１に、分岐したカルボキシ末端を持つ選択的形態が同定され、我々はそれをニューロピリン−２（ａ０）と命名した（オリジナルのアイソフォームを呼ぶのに、ニューロピリン−２及びニューロピリン−２（ａ０）を互換的に使用する）。ニューロピリン２（ｂ０）の配列は、ニューロピリン−２（ａ０）の配列から、ニューロピリン−２（ａ０）のＭＡＭドメイン及び膜貫通ドメインの間のアミノ酸８０９で分岐している（図４Ｃ）
ニューロピリン−２（ｂ０）は、疎水性分析から、ニューロピリン−２（ａ０）に類似した長さの細胞内ドメインに続く膜貫通ドメインを有すると予測されたが、これら２つのドメインはニューロピリン−２（ａ０）から高度に分岐し、１０％の同一性しか持たない。この分岐配列の部分に相当するヒト配列（３４６ｂｐフラグメント）をコードする発現された配列タグ（ＥＳＴ）もｄｂＥＳＴデータベース中に見られた（ＡＡ２５８４０）（図４Ｃ）。ニューロピリン−２（ｂ０）が膜貫通タンパク質であるという予測を確かめるために、我々は、このタンパク質のカルボキシ末端をｍｙｃ-エピトープでタグし、タグ構築物をＣＯＳ７細胞に一時的トランスフェクトして発現させ、発現されたタグタンパク質を、エピトープタグを指向するモノクローナル抗体９Ｅ１０を用いて試験した（Evan等, 1985）。免疫染色によるニューロピリン−２（ｂ０）のカルボキシ末端におけるｍｙｃ-タグの検出は、トランスフェクトされた細胞の洗浄剤透過性を必要とし、ニューロピリン−２は確かに膜貫通タンパク質であった。
【００５５】
さらに、我々は、ニューロピリン−２（ａ０）のアミノ酸８０９、即ち、ニューロピリン−２のａ及びｂアイソフォームの分岐部位において５、１７または２２（５＋１７）アミノ酸の挿入物を持つアイソフォームを含むニューロピリン−２（ａ０）の他アイソフォームも見いだした（図４Ｂ）。２２アミノ酸挿入物は、５及び１７アミノ酸挿入物の和である（図４Ｂ）。我々は、これらのアイソフォームを、ニューロピリン−２（ａ５）、ニューロピリン−２（ａ１７）及びニューロピリン−２（ａ２２）と名付けた。Kolodkin等,(1997)に報告されたアイソフォームは、明らかにラットニューロピリン−２（ａ１７）アイソフォームである。同様に、我々は、アミノ酸８０９に全く同じ５アミノ酸挿入物を持つニューロピリン−２（ｂ０）のアイソフォームを見いだし、ニューロピリン−２（ｂ５）と名付けた。異なるニューロピリン−２アイソフォームにおいて観察された５及び１７アミノ酸挿入物の組み合わせパターンは、これら異なるアイソフォームが、５及び１７アミノ酸鎖をコードする別のエクソンのスプライシングから生じたことを示している。
【００５６】
ニューロピリン−２のａ及びｂアイソフォームが異なる時間的発現パターンを示すかを決定するために、我々は、全てのニューロピリン−２アイソフォームが共通して有する配列に対して設計された５’プライマー、及びニューロピリン−２（ａ）及びニューロピリン−２（ｂ）の細胞内ドメインの配列に独特の３’プライマーを用いたＲＴ-ＰＣＲを実施した（実験方法参照）。Ｅ１１全マウス胚ｍＲＮＡをテンプレートとして用い、我々は、Ｅ１１において、ニューロピリン−２（ａ）に相当する増幅産物のみが検出されたことを見いだした。しかしながら、テンプレートとして成熟マウス脳ｍＲＮＡを用いると、ニューロピリン−２（ａ）及びニューロピリン−２（ｂ）の両方に相当する増幅産物が検出された。これらの結果を考え合わせると、ニューロピリン−２の異なるアイソフォームは、選択的スプライシングによって生じ、このスプライシングは時間依存的または細胞型依存的に調節されることが示された。
【００５７】
ニューロピリン−２は、発達中のニューロンの特別な類によって発現される。ニューロピリン−２等のニューロピリンが軸索成長または誘導に含まれるレセプターの候補であるかを決定するために。我々は、ニューロピリン−２ｍＲＮＡが、軸索伸長期間中に胚ニューロンによって発現されるかを、その場でのハイブリダイゼーションによって試験した。存在することが明らかなニューロピリン−２の多数のアイソフォームを与えられたが、我々は最初の調査において、ニューロピリン−２（ａ０）のドメインｂ２から細胞内ドメインに延設される配列に相当するプローブを用いることに決めた（実験方法参照）。このプローブのほとんどは、全てのアイソフォームが共通に有する配列の相当する。
【００５８】
脊髄。我々は、まず発達中のマウス脊髄の領域における、運動及び感覚ニューロンの軸索伸長期間の（Ｅ９．５から）、前四肢レベルでのニューロピリン−２の発現パターンを検査した。このパターンは高度に動的であった。ニューロピリン−２ｍＲＮＡは、発達中の運動ニューロンを含むＥ９．５胚の背側脊髄において検出された。また、底板及び体節及び予定後根神経節（ＤＲＧ類）を含むが脊索は含まない神経管に隣接する組織において強い発現が観察された。Ｅ１０．５からＥ１３．５の間に、我々は、ニューロピリン−２の発現をニューロピリン−１と比較したが、これは既に述べた（Kawakami等, 1996）。Ｅ１０．５までに、脊髄におけるニューロピリン−２発現のレベルが増大した。定板を含む脊髄の背側半分全体は重くラベルされたが、交連ニューロン細胞体を含む脊髄の背側面の側方縁に局在する細胞における発現も強かった。脊髄背側においてニューロピリン−１発現も検出されたが運動ニューロンにおいてのみであり、底及び根板では極めて弱いか皆無であった。ニューロピリン−２及びニューロピリン−１ｍＲＮＡは予定ｄＲＧで共発現されたが、ニューロピリン−２発現は、脊髄を囲む非ニューロン組織においても高かった。ニューロピリン−２発現の同様のパターンはＥ１１．５でも見られた。Ｅ１３．５では、ニューロピリン−２発現は減少し、脊髄の腹側に制限された。両方のニューロピリンは、運動ニューロンではまだ発現されたが、ニューロピリン−２発現細胞が脊髄腹側全体に見られたのに対し、ニューロピリンー１の発現パターンはより制限されていた。さらに、ニューロピリン−１は、いまや背側脊髄及びＤＲＧでは強く発現されるが、ＤＲＧでのニューロピリン−２発現は極めて弱く、バックグラウンドレベルを僅かに上回るのみであった。この段階で底板におけるニューロピリン−１の弱い発現も見られたが、ニューロピリン−２は底板には無かった。Ｅ１５．５におけるニューロピリン−２の発現は、脊髄では変化せず、この段階でＤＲＧにおける発現は検出されなかった。
【００５９】
交感神経節。Ｅ１１．５ほどの早期では、ニューロピリン−２は交感鎖の神経節に検出された。この発現は、Ｅ１３．５まではより強く、Ｅ１５．５までに僅かに減少した。この段階で、ニューロピリン−２ｍＲＮＡは上頸神経節のニューロンにも検出された。発現は、内臓神経系の領域にも観察された。
【００６０】
嗅覚系。臭覚系の全ての成分において高レベルのニューロピリン−２発現が検出された。鋤鼻器並びにその前脳での標的テリトリーである副臭覚バルブにおいて、Ｅ１３．５及びＥ１５．５で強い染色が観察された。ニューロピリン−１は、副臭覚系では発現されなかった（Kawakami等, 1996）。
【００６１】
Ｅ１５．５まで、臭覚角膜上皮がニューロピリン−２を強く発現したが、この発現は均質ではなく高度にとがったものであった。高レベルのニューロピリン−２ｍＲＮＡが、前方臭覚核及び扁桃、梨状皮質及び内皮質等の臭覚バルブに結合した終脳領域に観察された。
【００６２】
新皮質。皮質におけるニューロピリン−２発現は、Ｅ１３．５近傍で最初に検出され、皮質の背側及び側方領域の媒介ゾーンに制限されていた。皮質を被う間葉細胞も、ニューロピリン-２の高レベルでの発現を示した。Ｅ１５．５まで、染色はまだ媒介ゾーンに限られており、その下方部分で強かった。誕生時、ニューロピリン−２発現は、帯状皮質での発現以外に皮質には検出されなかった。
【００６３】
海馬形成。ニューロピリン−２の発現パターンは、海馬形成の成分において特に興味深い。ニューロピリン−２は、Ｅ１３．５の早期に海馬に検出でき、Ｅ１５．５までＣＡ３及びＣＡ１領域の両方の歯状回における発現は明白であった。ハイブリダイゼーションシグナルは解釈されず、新皮質の媒介ゾーンのニューロピリン−２発現細胞でとともに連続体を形成する。Ｐ０まで、歯状回、門細胞の粒状細胞、及び錐体細胞層、媒介ゾーン、及びＣＡ３−ＣＡ１領域のインターニューロンにおけるニューロピリン−２の発現はまだ極めて高い。また、発現は、鉤状回にも観察されたが、鉤状回前駆体または近傍には観察されなかった。この段階において、ニューロピリン−２の発現は、海馬に突出する脳領域のほとんどにおいて極めて強かった。いわゆる穿孔性経路を通して歯状回、海馬、及び鉤状回に塊状で突出する内皮質のニューロンは、ニューロピリン−２を発現した。中隔領域の細胞（内中隔、ブロカ対角帯）、海馬形成への他の求心性繊維の主要な供給源も、Ｅ１５．５及び誕生時にニューロピリン−２を強く発現した。
【００６４】
視覚系。Ｅ１１．５において、ニューロピリン−２は、アイカップを囲む間葉及び視神経において極めて高く発現されるが、網膜には発現されない。Ｅ１５．５において、ニューロピリン−２ｍＲＮＡは神経節細胞層に低レベルで検出され、網膜軸索の標的の１つである上小丘において拡散発現が観察された。Ｐ０まで、ニューロピリン−２は、上小丘の表面層のほとんどで極めて高いレベルで発現され、他の層では低レベルで発現された。発現は、小丘の上方と内部との境界において急激に停止した。誕生時の視床の側方膝核においては発現は観察されなかった。
【００６５】
視床。ニューロピリン−２は、誕生時において、内側手綱などの幾つかの視床核で発現された。
【００６６】
小脳。ニューロピリン−２発現は、Ｅ１５．５の早期に小脳原基で検出され、Ｅ１５．５までにレベルが向上した。Ｐ０において、ニューロピリン−２は深核ニューロン並びにプリキンエ細胞のストライプにおいて発現された。対照的に、ニューロピリン−１は、小脳において発現された（Kawakami等1996）。
【００６７】
菱脳核。ニューロピリン−２は、Ｅ１５．５及び誕生時（Ｐ０）に、三叉神経、顔及び舌下運動核等の鰓運動核の幾つかにおいて検出されたが、迷走の背側運動核にはされなかった。我々は、これらの核における発現がいつ開始されるかを測定しなかった。オリーブ及び前庭核の領域では低レベルの発現が観察された。発現は、ニューロピリン−１を高レベルで発現することが知られた脳橋では検出されなかった（Kawakami等, 1996）。
【００６８】
非ニューロン組織におけるニューロピリン−２の発現。ＣＮＳにおける発現に加えて、ニューロピリン−２は、多くの非ニューロン組織でも検出された。Ｅ１０．５において、背側及び腹側の筋肉マスの領域における肢芽の限定領域で発現された。その後、発現は発達中の骨、特に椎骨、肋骨及び指において観察される。ニューロピリン−２の発現は、背筋及び舌などの幾つかの筋肉においても観察され、最も強い発現は、腸の平滑筋の領域に観察された。また、腸管上皮、並びに腎臓、顎下腺、肺、鼻のウィスカー小胞、及び内耳の細胞において観察された。ニューロピリン−１（Kawakami等, 1996）とは異なり、ニューロピリン−２発現は心臓または微小管においては検出されなかったが、背側の大動脈には見られた。
【００６９】
ニューロピリン−１及びニューロピリン−２の異なるセマホリンファミリー成員に対する異なる結合パターン。ニューロピリン−２が、ニューロピリン−１と同様に、ＳｅｍａＩＩＩのレセプターであるかを試験するために、我々はニューロピリン−１、ニューロピリン−２（ａ０）、−２（ａ５）、−（ａ２２）、及び−２（ｂ５）をＣＯＳ−７細胞に一時的に発現させ、結合実験に使用した。我々は、ニューロピリン−１及びニューロピリン−２の異なるアイソフォームのＣＯＳ細胞における発現を、ニューロピリン−１に対するポリクローナル抗体（He及びTessier-Lavigne, 1997）、または全てのニューロピリン−２アイソフォームのカルボキシ末端のｍｙｃ-タグに対するモノクローナル抗体９Ｅ１０のいずれかを用いた免疫染色により検出することができた。ウェスタンブロット分析により、ＣＯＳ細胞中で発現したニューロピリン−２アイソフォームが、〜１２０ｋＤａの予測サイズを有することが示された。ＳｅｍａＩＩＩとの相互作用について試験するために、我々は、ＳｅｍａＩＩＩがそのカルボキシ末端で組織科学的リポーターアルカリホスファターゼに融合したキメラ分子を用いた（Sema-III-AP: He及びTessier-Lavigne, 1997）。ＳｅｍａＩＩＩ-ＡＰを含む部分的に精製された条件媒質を、ニューロピリンを発現するＣＯＳ細胞とインキュベートし、結合したタンパク質は、アルカリホスファターゼ組織化学によって検出した。予想されたように、ＳｅｍａＩＩＩ-ＡＰはニューロピリン−１発現細胞に結合し（He及びTesier-Lavigne, 1997）、アルカリホスファターゼタンパク質（ＡＰ）自体は、疑似トランスフェクト細胞、ニューロピリン−１発現細胞、または任意のニューロピリン−２アイソフォームには結合しなかった。驚くべきことに、試験したニューロピリンのアイソフォームには、ＳｅｍａＩＩＩ-ＡＰの検出可能な結合を持つものなかった。我々は、ニューロピリン−２がＳｅｍａＩＩＩのＣ末端に結合する可能性、及び結合の欠如がＡＰのＳｅｍａＩＩＩのカルボキシ末端部分への融合、即ち結合部位の隠蔽による人工産物である可能性を考えた。この可能性を解決するために、ＡＰがＳｅｍａＩＩＩのＣアミノ酸末端に融合したキメラ分子（ＡＰ-Ｃ；He及びTesier-Lavigne）を使用した。ＡＰ-Ｃタンパク質は、ニューロピリン−１に結合したが、ニューロピリン−２アイソフォームの任意のものを発現する死亡には結合しなかった。即ち、全長ＳｅｍａＩＩＩ-ＡＰの異なるニューロピリン−２アイソフォームへの結合の欠如は、ＳｅｍａＩＩＩのニューロピリン−２への結合の真実の欠如を反映している。
【００７０】
ＳｅｍａＩＩＩ自体はニューロピリン−２に結合しないことが明らかでないので、我々はニューロピリン−２がセマホリンファミリーの他の成員についてのレセプターとなるか否かがわからなかった。ＳｅｍａＩＩＩはセマホリンファミリー内の構造的に関連する分子のサブファミリーの成員であり、ＳｅｍａＥ／コラプシン-３（Luo等, 1995; Puschel等, 1995）、ＳｅｍａＩＶ／Ｓｅｍａ３Ｆ（Sekido等, 1996; Roche等, 1996; Xiang等, 1996）、ＳｅｍａＡ／ＳｅｍａＶ（Sekido等, 1996）及びＳｅｍａＨを含む。ＳｅｍａＩＩＩと同様に、これらのタンパク質全ては、セマホリンドメイン、免疫グロブリンドメイン及び塩基性カルボキシ末端ドメインを有する分泌されたタンパク質である（Pushel等, 1995; Luo等, 1995）。従って我々は、これた分子の２つ、ＳｅｍａＥ及びＳｅｍａＩＶがニューロピリン−１及び／またはニューロピリン−２のリガンドであるかを試験した。さらに、我々は、配列においてより関係の遠い他の分泌されたセマホリンであるショウジョウバエＳｅｍａＩＩ（Kolodkin等, 1993）、並びにより分岐したセマホリンである膜貫通ＳｅｍａＶＩａ（Zhou等、1997）を試験した。ＳｅｍａＩＩＩのように、我々はニューロピリン−１またはニューロピリン−２を発現するＣＯＳ細胞の、アルカリホスファターゼをＳｅｍａＥ、ＳｅｍａＩＶ、ショウジョウバエＤ-ＳｅｍａＩＩまたはＳｅｍａＶＩａの表面ドメインに融合させたキメラ分子に結合する能力を試験した（実験方法参照）。これらのＡｐ融合タンパク質は、タンパク質の各々を発現する細胞からの部分的に精製された条件媒質の形態の細胞に提示され、媒質はＡＰ活性に合致させた。我々は両方のニューロピリン及びニューロピリン−２発言細胞の異なるアイソフォームがＳｅｍａＥ-ＡＰ及びＳｅｍａＩＶ-ＡＰに結合することを見いだした。対照的に、ニューロピリン−１もＣＯＳ細胞で発現された任意のニューロピリン−２アイソフォームも、Ｄ-ＳｅｍａＩＩまたはＳｅｍａＶＩａ表面ドメインを持つＡＰ融合物と検出可能な結合を示さなかった。コントロール実験において、我々は、ＳｅｍａＥ-ＡＰ及びＳｅｍａＩＶ-ＡＰが疑似トランスフェクトされたＣＯＳ細胞またはネトリン-１レセプターＤＣＣを発現するＣＯＳ細胞に結合しないことを見いだした。
【００７１】
我々は、ＳｅｍａＩＩＩ、ＳｅｍａＥ及びＳｅｍａＩＶのＡＰ融合物の、ニューロピリン−１またはニューロピリン−２を発現する細胞に対する親和性を平衡結合実験で見積もった。これらの実験について、我々は、ニューロピリン−２のａ５アイソフォームを用いた。これらの分子の特異的結合曲線は、飽和を示し、Hillの等式に合致した（図５Ａ−５Ｃ）。ニューロピリン−１及びニューロピリン−２へのＳｅｍａＥの結合について見積もられた解離定数（Ｋｄ）は、各々、５ｎＭ及び１８ｎＭであった。ニューロピリン−１及びニューロピリン−２へのＳｅｍａＩＶについての値は、各々３０ｎＭ及び５ｎＭであった。ＳｅｍａＩＩＩのニューロピリン−２発現細胞への検出可能な結合は検出されなかったが、ニューロピリン−１に対するＳｅｍａＩＩＩ結合について見積もられたＫｄは０．３２５ｎＭであった（He及びTesssier-Lavigne, 1997も参照）。ニューロピリン−２のｂ５アイソフォームを用いても同様のＫｄ値が得られ、異なるセマホリン類の細胞への結合の程度は、全てのアイソフォームで類似していることは明らかである。
【００７２】
ニューロピリン−１に相補的なニューロピリン−２の動的発現。ニューロピリン−２の発現の特異的パターンは、種々の異なる軸索類、特に脊髄、臭覚系、及び海馬の誘導において、ＳｅｍａＩＩＩ自体ではなく、ＳｅｍａＩＩＩサブファミリーの成員が含まれることを示している。
【００７３】
脊髄では、拡散可能な化学駆散剤ネトリン-１に少なくとも部分的に反応して、交連軸索は背腹方向の経路に沿って誘導される（Serafini等, 1996）。ニューロピリン−２翻訳物は、交連ニューロン細胞体の領域で検出され、交連ニューロンがニューロピリン−２を発現することを示している。ＳｅｍａＥは背側脊髄で発現されるので（Puschel等, 1995）、このセマホリンは交連軸索の誘導に寄与しうる。我々のその場でのハイブリダイゼーションはまた、異なる運動ニューロン集団がニューロピリンの異なる補体を発現し、それゆえ、末梢に発現された異なる分泌セマホリンに対して分化的に反応すると思われる（Puschel等, 1995; Wright等, 1995; Giger等, 1996）。即ち、異なるセマホリンは運動ニューロンの別の末梢標的への突出パターンに寄与しうる（Tsushida等, 1994）。臭覚系はニューロピリン−２発現の他の重要な部位であり、ＳｅｍａＩＩＩとは別の分泌されたセマホリン類の、この系での誘導における役割を示唆する。臭覚バルブからの軸索は、特定されていない中隔誘導性化学駆散剤によって駆散される（Pini, 1993）。ニューロピリンー２翻訳物は、バルブのこの軸索の起源の細胞体の領域において発現され、分泌されたセマホリンが中隔誘導性化学駆散剤として機能しうることを示している。他の挿入により、臭覚上皮におけるニューロピリン−２が（おそらく一次臭覚ニューロンにより）均一ではな異ことが見いだされ、分泌されたセマホリンが、臭覚マップの生成に寄与する一次臭覚軸索の異なる補体の分化的誘導において役割を果たしうることを示している。
【００７４】
ニューロピリンは、求心性の海馬への突出の起源の部位でも発現される。海馬への求心性は局所解剖学的に、中隔、海馬、及び内側軸索とともに組織化され、別の樹状位置または顆粒及び錐体ニューロンに突出することが知られている（Paxinos, 1995）。ニューロピリン−１及び−２は、中隔及び海馬ニューロンによって発現されるが、ニューロピリン−２のみは内側ニューロンによって発現される。ＳｅｍａＥ及びＳｅｍａＩＶは海馬で高度に発現され（Puschel等, 1995; Sekido等, 1996）、これらのセマホリンは、従って、海馬求心性突出のパターン形成にも寄与しうる。
【００７５】
最後に、ニューロピリン−２が多くの非ニューロン組織で発現されるという観察も、ＳｅｍａＩＩＩ以外のセマホリンが神経系外の器官形成に含まれることを示している。腫瘍抑制における分泌されたセマホリンの役割は、ニューロピリン−２が肺で発現されたという事実によって示されたが、これは、小細胞肺ガンにおいて欠けていることが多く、肺ガンに対する腫瘍抑制遺伝子に含まれると考えられている染色体３ｐの領域にＳｅｍａＩＶ及びＳｅｍａＡ／Ｖがマッピングするからである（Roche等, 1995; Sekido等, 1996; Xiang等, 1996）。
【００７６】
実験方法：ニューロピリン−２及びそのスプライシング変異体の単離。
Ｅ１１善マウス肺及び成熟マウス脳から単離したｍＲＮＡに対するｐｆｕポリメラーゼ（Sigma）を用いたＲＴ-ＰＣＲを実施するのに、全変性オリゴヌクレオチドの６つのセットを用いた。プライマーは、ニューロピリンのａ２ドメイン、ｂ１ドメイン、ｂ２ドメイン、ＭＡＭドメイン及び細胞内ドメインにおけるアミノ酸配列を保持するように設計した。各反応について、ニューロピリン−１でサイズ予測したＤＮＡバンドを切断し、ゲル精製したＤＮＡに、同じプライマーだが、順方向プライマーの５’末端のＥｃｏＲＩ部位及び逆方向プライマーのＸｂａＩ部位を持つプライマーを用いて二次ＰＣＲ増幅を施した。ＰＣＲ産物は、ｐｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（−）にクローンし、配列分析した。これらの反応の１つから、ニューロピリン−２に相当する新規な配列を単離した（結果参照）。ニューロピリン−２の１．２ｋｂのフラグメントを、成熟マウス脳ｇｔ１１ラムダファージライブラリー（Clontech）のスクリーン用プローブとして用いた。このようにして単離した部分的ｃＤＮＡフラグメントは、２つの予定分化スプライシングアイソフォームａ及びｂ形態に相当し、５、１７および２２アミノ酸挿入物を含むものと含まないものがある（図４）。全長ｃＤＮＡを得るために、Ｅ１１マウス全胚及び成熟マウス脳から単離したｃＤＮＡに５’ＲＡＣＥを実施した。５’-ＲＡＣＥ産物は、５’ＮｏｔＩ及び３’ＸｈｏＩ部位を持つｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（−）にクローンし、配列分析した。ニューロピリン−２ｎｏａ及びｂアイソフォームの全コード領域を含むｃＤＮＡを、５、１７及び２２アミノ酸挿入物の組み合わせ有無において組み立てた（結果参照）。
【００７７】
その場でのハイブリダイゼーション。ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）-ラベルした、及び３５Ｓ−ラベルしたアンチセンス及びセンスＲＮＡプローブの生成に、ニューロピリン−２の１２００ヌクレオチドのフラグメントを用いた。その場でのハイブリダイゼーションは、Ｐ０マウス脳のビブラトーム断片に対して、ＤＩＧ−ラベルプローブで行い、Ｅ９．９からＰ０の間の種々の段階で取り出した凍結断片について放射活性プローブを用いた。ジゴキシゲニン−ラベルプローブを用いたその場でのハイブリダイゼーションは、既に記載されており（Chedotal等, 1996）、放射活性プローブを用いた方法は、Messesmith等, (1995)に記載された通りである。
【００７８】
プラスミド構築。シグナル配列を欠く選択的スプライシング形態のニューロピリン−２のコード領域を、発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ-Ａ（Invitrogen）に、ＨｉｎｄＩＩＩ（５’末端）及びＸｂａＩ（３’末端）部位にサブクローンし、リポフェクタミン（GIBCO BRL）を用いてＣＯＳ７細胞に一時的トランスフェクトした。ニューロピリン−２アイソフォームの発現は、免疫細胞化学及び（ニューロピリン−２アイソフォームのＣ末端のｍｙｃタグに対する）モノクローナル抗体９Ｅ１０を用いたウェスタン分析により検出した。
【００７９】
セマホリンＩＩＩ-Ａｐ融合タンパク質は既に記載されている（He及びTessier-Lavigne, 1997）。Ｐ０マウス脳ｃＤＮＡから、ＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲにより、マウスＳｅｍａＥクロンを得た。増幅されたバンドを発現ベクターである分泌されたアルカリホスファターゼをコードする配列を持つＡＰｔａｇ-４ベクターにサブクローンした。ヒトＳｅｍａＩＶクローンは、やはり分泌されたアルカリホスファターゼをコードする配列を含みｐＳｃｃＴａｇ-Ａ（Invitrogen）にサブクローンした。
【００８０】
セマホリン-ＡＰ融合タンパク質結合アッセイ。セマホリン-ＡＰ融合タンパク質結合実験は、バックグラウンド結合を抑制するために、２μｇ／ｍｌのヘパリンを結合混合物に含有させたことを除いて、Cheng及びFlanagan (1994)に記載された通りであった。簡潔に言えば、ニューロピリン−１及びニューロピリン−２発現構築物を、上記のようにＣＯＳ７細胞で一時的に発現させた。トランスフェクションの４８時間後、発現細胞をＨＡＢＡ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含むHankの等張塩溶液  ｐＨ７．０、０．０５％アジ化ナトリウム）でリンスした（Cheng及びFlanagan, 1994）。セマホリン-ＡＰ融合タンパク質を含む濃縮した上清を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び０．０５％アジ化ナトリウムの存在下で、発現ＣＯＳ細胞とともに室温で７５分間インキュベートし、次いで、内因性アルカリホスファターゼを熱不活性化し、洗浄し、Cheng及びFlanagen(1994)に記載されたように発色させた。
【００８１】
高スループットＳＲ-ＳｅｍａＩＩＩ結合アッセイ。
Ａ．試薬：
中和物アビディン：２０μｇ／ｍｌＰＢＳ。
ブロッキング緩衝液：５％ＢＳＡ、ＰＢＳ中０．５％Ｔｗｅｅｎ２０；室温で１時間。
アッセイ緩衝液：１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．６、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％グリセロール、０．５％ＮＰ-４０、５０ｍＭβ-メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、プロテアーゼ阻害剤混合物。
３３ＰＳＲポリペプチド１０×ストック：１０−８−１０−６Ｍ”コールド”Ｓｒポリペプチド特異的ＳＲドメインに、２００，０００−２５０，０００ｃｐｍのラベルしたＳＲ（Beckmanカウンター）を添加した。スクリーニングの間、４℃のマイクロ冷蔵庫に配置。
プロテアーゼ阻害剤混合物（１０００×）：１０ｍｌＰＢＳ中、１０ｍｇトリプシン阻害剤（BMB#109894）、１０ｍｇアプロチニン（BMB#236624）、２５ｍｇベンズアミジン（Sigma#B-6506）、２５ｍｇロイペプチン（BMB#101728)、１０ｍｇＡＰＭＳＦ（BMB#917575）、及び２ｍｇＮａＶＯ３（Sigma#S-6508）。
【００８２】
ＳｅｍａＩＩＩ：ＰＢＳ中の１０−７−１０−３Ｍビオチニル化ＳｅｍａＩＩＩ。
Ｂ．アッセイプレートの調製：
・ウェル毎に１２０μｌのストックＮ-アビディンで４℃において終夜コート。
・２００μｌのＰＢＳで２回洗浄。
・１５０μｌのブロッキング緩衝液でブロック。
・２００μｌのＰＢＳで２回洗浄。
【００８３】
Ｃ．アッセイ：
・１ウェル当たり４０μｌのアッセイ緩衝液添加。
・１０μｌの化合物または抽出物添加。
・１０μｌの３３Ｐ-ＳＲ（２０−２５，０００ｃｐｍ／０．１−１０ｐｍｏｌｅｓ／ウェル＝１０−９−１０−７Ｍ最終コーン）添加。
・２５℃で１５分間振とう。
・さらに２５℃で４５分間インキュベーション。
・４０μＭのビオチニル化ＳｅｍａＩＩＩ（アッセイ緩衝液中０．１−１０ｐｍｏｌｅｓ／４０μｌ）添加。
・室温で１時間インキュベーション。
・２００μＭのＰＢＳで４回洗浄して反応を停止。
・１５０μＭのシンチレーション混合物添加。
・Topcountで計数。
【００８４】
Ｄ．全てのアッセイについてのコントロール（各プレートに配置）：
ａ．非特異的結合
ｂ．８０％阻害における可溶性（非ビオチニル化ＳｅｍａＩＩＩ）
【００８５】
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【００８６】
この明細書に引用した全ての出版物及び特許出願は、各々の出版物または特許出願が特にかつ独立に出典を明示して取り込まれると示されているように、ここに出典を明示して取り込まれるものとする。上記の発明は、理解を明確にすることを目的とした例示及び実施例により幾分詳細に記載されているが、当業者には、この発明の教示に鑑みて、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、ある種の変形及び修正がなされてもよいことは容易に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１Ａは、ラット及びヒトＳＲ１の構造を示す図であり、マウス、ラット及びヒトＳＲ１のアミノ酸配列のアライメントを示す。図１Ｂは、ラット及びヒトＳＲ１の構造を示す図であり、異なる種の間に保存されたＳＲ１類のモジュラー構造、及び５つのＳＲ１ドメイン（ａ１、ａ２、ｂ１、ｂ２、ｃ）を示す図である。Ｓ：シグナルペプチド；Ｃ１ｒ／ｓ、補体Ｃ１ｒ／ｓ相同体ドメイン（ＣＵＢドメイン）；ＦＶ／ＶＩＩＩ領域、凝集因子Ｖ及びＶＩＩＩ、ＤＤＲチロシンキナーゼ、及びＭＦＧＰに相同な領域；ＭＡＭ、ＭＡＭドメイン；ＴＭ、膜貫通ドメイン。
【図２】ＡＰの融合タンパク質及びＳｅｍａＩＩＩの他のタンパク質のＳＲ−１発現細胞への平衡結合を示す。
【図３】ニューロピリン−１（ＳＲ１）及びニューロピリン−２（ＳＲ２）のアミノ酸配列のアライメントである。マウスニューロピリン−１（ｍ-ｎｐｎ-１）、マウスニューロピリン−２（ｍ-ｎｐｎ-２）及びヒトニューロピリン−２（ｈ-ｎｐｎ-２）配列のアライメントは、Clustal V プログラムを用いて行った。Kawakamiら(1996)（図２参照）に従って命名した分子の異なるドメインを示した。ニューロピリン−２のａ０アイソフォーム（図２参照）は、アライメントを作り出すために用いた。
【図４】ニューロピリン−２のドメイン構造及びアイソフォームである。（Ａ）マウスニューロピリン−１（Kawakamiら, 1996）及び全長マウスニューロピリン−２（ａ０）及びニューロピリン−２（ｂ０）アイソフォームを示す図である。ｓ：シグナルペプチド；ａ１及びａ２ドメインはＣＵＢドメインである（Busby及びIngham, 1990; Bork及びBeckmann, 1993）；ｂ１及びｂ２ドメインは凝集因子Ｖ及びＶＩＩＩ及び乳脂球状膜タンパク質のＣ１及びＣ２ドメインとの相同性を示す；ｃドメインはメタロエンドペプチダーゼのメプリン(meprin)及びレセプターチロシンホスファターゼμ、λ及びκに見られるＭＡＭドメインを含む；ＴＭ：膜貫通ドメイン；Ｃｙ：細胞内ドメイン。点線及び矢印は、ニューロピリン−２におけるニューロピリン−２ａ及び−２ｂアイソフォームが分岐する部位を示す；これは、５−、１７−及び２２−アミノ酸挿入物の部位でもある（図２（Ｂ）参照）。（Ｂ）アミノ酸８０９の後に０、５、１７及び２２のアミノ酸挿入物を持つニューロピリン−２（ａ）のアイソフォーム（各々、アイソフォーム２(ａ０)、２(ａ５)、２(ａ１７)及び２(ａ２２)）、及び５アミノ挿入物有無のニューロピリン−２（ｂ）のアイソフォーム（各々、アイソフォーム２(ｂ０)及び２(ｂ５)）である。挿入物の配列であり、挿入物まで３アミノ酸のＮ末端（ＡＦＡ）及び挿入物まで４アミノ酸のＣ末端（ニューロピリン−２ａのＤＥＹＥ、ニューロピリン−２ｂのＧＧＴＬ）を示した。（Ｃ）ニューロピリン−２（ｂ０）の配列、及び、ＥＳＴ（ＡＡ２５８０４）からのヒトニューロピリン−２（ｂ０）の、ニューロピリン−２（ｂ０）の配列がニューロピリン−２（ａ０）から分岐している領域の部分配列である。分岐部位まで３アミノ酸のＮ末端（ＡＦＡ）を示した。
【図５】セマホリン−ＡＰ融合タンパク質の、ニューロピリン発現細胞への平衡結合を示す。トランスフェクトした、またはコントロールＣＯＳ細胞を表示した濃度のセマホリン−ＡＰ融合タンパク質を含む濃縮媒質とともにインキュベートした。結合した融合タンパク質から誘導されるＡＰ活性は、４０５ｎｍでの熱量で測定し；特異的結合はコントロール細胞からのバックグラウンドを差し引いた後に得た。ニューロピリン−１（黒丸印）またはニューロピリン−１（黒四角印）を発現する細胞への特異的結合曲線を、ＳｅｍａＩＩＩ-ＡＰ（Ａ）、ＳｅｍａＥ-ＡＰ（Ｂ）及びＳｅｍａＩＶ-ＡＰ（Ｃ）について示した。ニューロピリン−２−発現細胞との相互作用についての解離定数は、ＳｅｍａＥ-ＡＰでは０．２９、ＳｅｍａＩＶ-ＡＰでは０．０９ｎＭであった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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