(57)【要約】【課題】  細胞特異的な遺伝子導入を実現する。【解決手段】  カルシウムイオン、無機リン酸イオン若しくは重炭酸イオン、所定の遺伝子、及び細胞認識タンパク質（例えば、アシアロ糖タンパク質、トランスフェリン、細胞外マトリクスタンパク質）を含む混合溶液を所定時間インキュベートし、又は、カルシウムイオン、無機リン酸イオン若しくは重炭酸イオン、及び所定の遺伝子を含む混合溶液を所定時間インキュベートした後、細胞認識タンパク質と共に所定時間インキュベートすることにより、アパタイト粒子に所定の遺伝子と細胞認識タンパク質とが結合した遺伝子−アパタイト粒子複合体を作製する。この遺伝子−アパタイト粒子複合体を特定細胞と共にインキュベートすることにより、所定の遺伝子を高効率に導入し、発現させることができる。【選択図】  図１１
2007043972.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞認識タンパク質が結合していることを特徴とするアパタイト粒子。
【請求項２】
上記細胞認識タンパク質は、アシアロ糖タンパク質、トランスフェリン、又は細胞外マトリクスタンパク質であることを特徴とする請求項１記載のアパタイト粒子。
【請求項３】
カルシウムイオン、無機リン酸イオン若しくは重炭酸イオン、及び細胞認識タンパク質を含む混合溶液を所定時間インキュベートし、又は、カルシウムイオン、及び無機リン酸イオン若しくは重炭酸イオンを含む混合溶液を所定時間インキュベートした後、細胞認識タンパク質と共に所定時間インキュベートすることを特徴とするアパタイト粒子の作製方法。
【請求項４】
上記細胞認識タンパク質は、アシアロ糖タンパク質、トランスフェリン、又は細胞外マトリクスタンパク質であることを特徴とする請求項３記載のアパタイト粒子の作製方法。
【請求項５】
アパタイト粒子に所定の遺伝子と細胞認識タンパク質とが結合していることを特徴とする遺伝子−アパタイト粒子複合体。
【請求項６】
上記細胞認識タンパク質は、アシアロ糖タンパク質、トランスフェリン、又は細胞外マトリクスタンパク質であることを特徴とする請求項５記載の遺伝子−アパタイト粒子複合体。
【請求項７】
上記アパタイト粒子にさらに親水性タンパク質が結合していることを特徴とする請求項５記載の遺伝子−アパタイト粒子複合体。
【請求項８】
カルシウムイオン、無機リン酸イオン若しくは重炭酸イオン、所定の遺伝子、及び細胞認識タンパク質を含む混合溶液を所定時間インキュベートし、又は、カルシウムイオン、無機リン酸イオン若しくは重炭酸イオン、及び所定の遺伝子を含む混合溶液を所定時間インキュベートした後、細胞認識タンパク質と共に所定時間インキュベートすることを特徴とする遺伝子−アパタイト粒子複合体の作製方法。
【請求項９】
上記細胞認識タンパク質は、アシアロ糖タンパク質、トランスフェリン、又は細胞外マトリクスタンパク質であることを特徴とする請求項８記載の遺伝子−アパタイト粒子複合体の作製方法。
【請求項１０】
さらに親水性タンパク質と共に所定時間インキュベートすることを特徴とする請求項８記載の遺伝子−アパタイト粒子複合体の作製方法。
【請求項１１】
請求項５乃至７のいずれか１記載の遺伝子−アパタイト粒子複合体を特定細胞と共にインキュベートすることにより、所定の遺伝子を上記特定細胞に導入することを特徴とする遺伝子導入方法。
【請求項１２】
カルシウム塩、無機リン酸塩又は重炭酸塩、及び細胞認識タンパク質を含むことを特徴とする遺伝子導入用キット。
【請求項１３】
上記細胞認識タンパク質は、アシアロ糖タンパク質、トランスフェリン、又は細胞外マトリクスタンパク質であることを特徴とする請求項１２記載の遺伝子導入用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞への遺伝子導入に用いて好適なアパタイト粒子及びその作製方法、遺伝子−アパタイト粒子複合体及びその作製方法、並びにその遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いた遺伝子導入方法及び遺伝子導入用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞への遺伝子導入は、遺伝子の構造、機能或いは制御機構を解析する際に不可欠な技術である。また、この技術は、医療分野で重要となるタンパク質の産業ベースでの生産、遺伝子治療、或いはＤＮＡワクチンにおいても極めて重要である。
【０００３】
従来、細胞に遺伝子を導入する方法としては、例えばウイルスＤＮＡに目的の遺伝子を組み込み、感染性ウイルスを生成して遺伝子導入を行うものが知られている。この方法は導入効率が極めて高いため、各種遺伝性疾患や後天性疾患に対する遺伝子治療のための画期的な方法として注目されている。しかしながら、このようなウイルスＤＮＡを用いた遺伝子導入では、ウイルスが広範囲の細胞に非特異的に感染するため、目的の細胞以外にも遺伝子が導入されてしまうという重大な問題がある。また、ウイルスゲノム本体が染色体に組み込まれ、将来予期せぬ副作用を引き起こす可能性がある。そこで、このようなウイルスベクタを用いたウイルス系システムに代わる非ウイルス系システムの構築が望まれていた。
【０００４】
既存の非ウイルス系システムとしては、リポソーム等の合成脂質、ポリ−Ｌ−リジン等のペプチド、ポリアミドアミン等のデンドリマ、ポリエチレンイミン等の他のポリマ、或いはリン酸アパタイト粒子（ヒドロキシアパタイト粒子）を用いる方法等が知られている。その中でもリン酸アパタイト粒子を用いる方法は、無機リン酸とカルシウムイオンとによって形成されたリン酸アパタイト粒子がＤＮＡと複合体を形成して共沈し、その複合体がエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれる現象に基づいており、遺伝子治療など、細胞への遺伝子導入に際して一般的に用いられている（非特許文献１〜３を参照）。
【０００５】
また、本件発明者らは、重炭酸イオンとカルシウムイオンとによって形成された炭酸アパタイト粒子を用いた非ウイルス系システムを開発しており、この炭酸アパタイト粒子によって細胞に遺伝子を高効率に導入し、発現させることができることを示している（特許文献１を参照）。
【０００６】
【非特許文献１】Fasbender, A. et al, 1998,“Incorporation of Adenovirus in calcium phosphate precipitates enhances gene transfer to airway epithelia in vitro and in vivo.”, J. Clin. Invest., 102, p.184-193
【非特許文献２】Toyoda, K. et al, 2000,“Calcium phosphate precipitates augmennt adenovirus-mediated gene transfer to blood vessels in vitro and in vivo.”, Gene Ther., 7, p.1284-1291
【非特許文献３】Urabe, M. et al, 2000,“DNA/calcium phosphate mixed with media are stable and maintain high transfection efficiency.”, Anal. Biochem., 278, p.91-92
【特許文献１】国際公開第２００４／０４３４９５号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上述した非ウイルス系システムは、何れも細胞選択性がないため、細胞特異的に遺伝子を導入することが可能な非ウイルス系システムが望まれていた。
【０００８】
本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、細胞特異的な遺伝子導入を実現する非ウイルス系システムに用いられるアパタイト粒子及びその作製方法、遺伝子−アパタイト粒子複合体及びその作製方法、並びにその遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いた遺伝子導入方法及び遺伝子導入用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述した目的を達成するために、本発明に係るアパタイト粒子は、細胞認識タンパク質（例えば、アシアロ糖タンパク質、トランスフェリン、細胞外マトリクスタンパク質）が結合していることを特徴とする。
【００１０】
また、上述した目的を達成するために、本発明に係るアパタイト粒子の作製方法は、カルシウムイオン、無機リン酸イオン若しくは重炭酸イオン、及び細胞認識タンパク質を含む混合溶液を所定時間インキュベートし、又は、カルシウムイオン、及び無機リン酸イオン若しくは重炭酸イオンを含む混合溶液を所定時間インキュベートした後、細胞認識タンパク質と共に所定時間インキュベートすることを特徴とする。
【００１１】
また、上述した目的を達成するために、本発明に係る遺伝子−アパタイト粒子複合体は、アパタイト粒子に所定の遺伝子と細胞認識タンパク質とが結合していることを特徴とする。
【００１２】
また、上述した目的を達成するために、本発明に係る遺伝子−アパタイト粒子複合体の作製方法は、カルシウムイオン、無機リン酸イオン若しくは重炭酸イオン、所定の遺伝子、及び細胞認識タンパク質を含む混合溶液を所定時間インキュベートし、又は、カルシウムイオン、無機リン酸イオン若しくは重炭酸イオン、及び所定の遺伝子を含む混合溶液を所定時間インキュベートした後、細胞認識タンパク質と共に所定時間インキュベートすることを特徴とする。
【００１３】
また、上述した目的を達成するために、本発明に係る遺伝子導入方法は、上述の遺伝子−アパタイト粒子複合体を特定細胞とインキュベートすることにより、所定の遺伝子を特定細胞に導入することを特徴とする。
【００１４】
また、上述した目的を達成するために、本発明に係る遺伝子導入用キットは、カルシウム塩、無機リン酸塩又は重炭酸塩、及び細胞認識タンパク質を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、遺伝子とアパタイト粒子とからなる遺伝子−アパタイト粒子複合体に細胞認識タンパク質を結合させることにより、細胞特異的に遺伝子を導入し、発現させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を適用した実施の形態について、具体的な実験結果を参照しながら詳細に説明する。
【００１７】
（１）第１の実施の形態
細胞の培養
先ず、実験に用いる細胞を培養した。具体的には、７５ｃｍ２のフラスコ中に、１０％ ＦＢＳ（fetal bovine serum）、培地１ｍｌ当たり５０μｇのペニシリン及びストレプトマイシン、及び、培地１ｍｌ当たり１００μｇのネオマイシンを含有したＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle's medium）培地（Gibco BRL 社製）を加え、この培地中で３７℃、５％ ＣＯ２の条件下、ヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２と、マウス線維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３とをそれぞれ培養した。
【００１８】
細胞非特異的な遺伝子−アパタイト粒子複合体の作製、及びその遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いた細胞へのＤＮＡ導入
次に、予備実験として、細胞認識タンパク質が結合していない細胞非特異的な遺伝子−アパタイト粒子複合体を作製し、この遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いてＨｅｐＧ２細胞にＤＮＡを導入した。具体的には、３ｍＭ Ｃａ２＋、２μｇ プラスミドＤＮＡ（ルシフェラーゼ遺伝子、ＳＶ４０プロモータを有するｐＧＬ３）（Promega 社製）、及び２μｇ ＰＩ（propidium iodide）を含んだ１ｍｌのバイカーボネート緩衝ＤＭＥＭ培地（ｐＨ７．５）を混合して３７℃で３０分間インキュベートすることにより、ＰＩラベルされたプラスミドＤＮＡと炭酸アパタイト粒子とからなる遺伝子−アパタイト粒子複合体を作製した。そして、ＨｅｐＧ２細胞とこの遺伝子−アパタイト粒子複合体とを、ＦＢＳ又はＢＳＡ（bovine serum albumin）の非存在下、１０％ ＦＢＳの存在下、又は５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡの存在下で１時間インキュベートすることにより、細胞中にＤＮＡを導入した。
【００１９】
細胞を５ｍＭ ＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid）を含有したＰＢＳ（phosphate buffered saline）で２回洗浄し、細胞に導入されたＤＮＡを蛍光顕微鏡で観察した結果を図１に示す。図１（Ａ）はＦＢＳ又はＢＳＡの非存在下、図１（Ｂ）は１０％ ＦＢＳの存在下、図１（Ｃ）は５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡの存在下でＤＮＡ導入を行ったものである。図１（Ｃ）のスケールバーは５０μｍを表している。
【００２０】
図１から分かるように、ＦＢＳ又はＢＳＡの非存在下では、１０％ ＦＢＳ又は５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡの存在下よりも多くのＤＮＡが細胞中に導入されている。さらに、データは示さないが、血清タンパク質又はＢＳＡと接触した遺伝子−アパタイト粒子複合体がブラウン運動していることが顕微鏡で観察された。このことから、親水性タンパク質を結合させて遺伝子−アパタイト粒子複合体の表面を親水性にすることにより、細胞表面と周囲の遺伝子−アパタイト粒子複合体との非特異的な相互作用を抑制することができると考えられる。
【００２１】
実際、データは示さないが、本件発明者らは、親水性タンパク質であるＢＳＡ（反応液１ｍｌ当たり１μｇ）が炭酸アパタイト粒子に結合することをBio-Rad 社のプロテインアッセイキットで確認した。
【００２２】
ここで、炭酸アパタイト粒子にタンパク質が結合する傾向は、それぞれ炭酸アパタイト粒子の構成要素であるカルシウム及びカーボネートに由来した陰イオン結合部位及び陽イオン結合部位の存在を仮定することにより説明できる。レーザ粒子解析器（Photal、大塚電子株式会社製）を用いて炭酸アパタイト粒子の平均ゼータ電位を測定したところ−１７．８であり、５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを結合させると−２４．４に変化した。この結果は、ＢＳＡのような酸性タンパク質がヒドロキシアパタイト粒子の陰イオン結合部位に結合することで、全体の表面電位がより陰性になるという従来の実験結果を支持するものである（文献「Lopes MA, Monteiro JD, Santos JD, Serro AP, Saramago B, 1999,“Hydrophobicity, surface tension and zeta potential measurements of glass-reinforced hydroxyapatite composite.”, J. Biomed. Mater. Res., 45(4), p.370-375」等を参照）。
【００２３】
細胞特異的な遺伝子−アパタイト粒子複合体の作製
次に、細胞認識タンパク質が結合した細胞特異的な遺伝子−アパタイト粒子複合体を作製した。細胞認識タンパク質としては天然リガンドであるアシアロフェツインを用いた。アシアロフェツインは、肝細胞又はＨｅｐＧ２細胞のような肝由来細胞にＡＳＧＰＲを介して特異的に結合する。ＡＳＧＰＲは、肝細胞の細胞膜のみに存在し、アシアロ糖タンパク質のガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を特異的に認識するＣ型レクチンである。
【００２４】
具体的には、３〜６ｍＭ Ｃａ２＋、及び２μｇ プラスミドＤＮＡを含んだ１ｍｌのバイカーボネート緩衝ＤＭＥＭ培地（ｐＨ７．５）を混合して３７℃で３０分間インキュベートすることにより、ＤＮＡと炭酸アパタイト粒子とからなる遺伝子−アパタイト粒子複合体を作製した。その後、この遺伝子−アパタイト粒子複合体をアシアロフェツインと共に３７℃で３０分間インキュベートし、さらにＦＢＳ又はＢＳＡと共に３７℃で３０分間インキュベートすることにより、細胞特異的な遺伝子−アパタイト粒子複合体を作製した。
【００２５】
１０〜２００μｇ／ｍｌのアシアロフェツインと共にインキュベートした段階でのアシアロフェツインの結合プロファイルを図２に示す。図２は、インキュベート後のサンプルを１０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、沈殿を１００ｍＭ ＥＤＴＡに溶解してＳＤＳ−ＰＡＧＥ（sodium dodecylsulfate-polyacrylamidegel electrophoresis）によって泳動したものである。レーンＡ〜Ｅはそれぞれ１０，５０，１００，１５０，２００μｇ／ｍｌのアシアロフェツインと共にインキュベートした遺伝子−アパタイト粒子複合体を泳動したものであり、レーンＦは１０μｇのアシアロフェツインを泳動したものである。
【００２６】
また、作製された遺伝子−アパタイト粒子複合体のＳＥＭ（scanning electron microscopy）画像を図３に示す。図３（Ａ）は、タンパク質で被覆されていない遺伝子−アパタイト粒子複合体を示したものであり、図３（Ｂ）は、１０μｇ／ｍｌ アシアロフェツインと５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡとで被覆された遺伝子−アパタイト粒子複合体を示したものである。何れについても、１０倍希釈したサンプルをカーボン被覆されたＳＥＭステージに滴下し、乾燥させた後にＳＥＭ（S-800、株式会社日立製作所製）で観察した。図３から分かるように、タンパク質で被覆された遺伝子−アパタイト粒子複合体も被覆されていない遺伝子−アパタイト粒子複合体も同様の形状であり、各遺伝子−アパタイト粒子複合体の平均粒子径は約１００ｎｍであった。
【００２７】
さらに、アシアロフェツインが炭酸アパタイト粒子に結合していることを確認する実験を行った。具体的には、６ｍＭ Ｃａ２＋を含んだ１ｍｌのバイカーボネート緩衝ＤＭＥＭ培地（ｐＨ７．５）を混合して３７℃で３０分間インキュベートすることにより炭酸アパタイト粒子を作製し、この炭酸アパタイト粒子を０〜１００μｇ／ｍｌのアシアロフェツインと共に３７℃で３０分間インキュベートし、さらに１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡと共に３７℃で３０分間インキュベートすることにより、アシアロフェツインとＢＳＡとで被覆された炭酸アパタイト粒子を作製した。そして、この炭酸アパタイト粒子を１μｇ／ｍｌのビオチンラベルされたＰＮＡ（peanut agglutinin；ガラクトース特異的なレクチン）と共に１時間インキュベートし、さらに１μｇ／ｍｌのＦＩＴＣラベルされたストレプトアビジンと共に２時間インキュベートした。
【００２８】
炭酸アパタイト粒子を共焦点レーザ走査顕微鏡で観察した結果を図４に示す。図４（Ａ）は１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡのみで被覆された炭酸アパタイト粒子、図４（Ｂ）は１０μｇ／ｍｌ アシアロフェツインと１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡとで被覆された炭酸アパタイト粒子、図４（Ｃ）は１００μｇ／ｍｌ アシアロフェツインと１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡとで被覆された炭酸アパタイト粒子を示したものである。図中のスケールバーは５０μｍを表している。図４から分かるように、ＢＳＡと共に被覆された後も、アシアロフェツインの末端のガラクトース残基は有効に存在している。
【００２９】
細胞特異的な遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いた細胞へのＤＮＡ導入
次に、細胞特異的な遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いてＨｅｐＧ２細胞にＤＮＡを導入した。具体的には、ＰＩラベルされたプラスミドＤＮＡと炭酸アパタイト粒子とからなる遺伝子−アパタイト粒子複合体を０〜２００μｇ／ｍｌのアシアロフェツインと共に３７℃で３０分間インキュベートし、さらに１０％ ＦＢＳと共に３７℃で３０分間インキュベートすることにより、細胞特異的な遺伝子−アパタイト粒子複合体を作製した。そして、ＨｅｐＧ２細胞とこの遺伝子−アパタイト粒子複合体とを１時間インキュベートすることにより、細胞中にＤＮＡを導入した。
【００３０】
細胞を５ｍＭ ＥＤＴＡを含有したＰＢＳで２回洗浄し、細胞に導入されたＤＮＡを蛍光顕微鏡で観察した結果を図５に示す。図５（Ａ）は１０％ ＦＢＳのみで被覆された遺伝子−アパタイト粒子複合体、図５（Ｂ）は１０μｇ／ｍｌ アシアロフェツイン、及び１０％ ＦＢＳで被覆された遺伝子−アパタイト粒子複合体、図５（Ｃ）は５０μｇ／ｍｌ アシアロフェツイン、及び１０％ ＦＢＳで被覆された遺伝子−アパタイト粒子複合体、図５（Ｄ）は２００μｇ／ｍｌ アシアロフェツイン、及び１０％ ＦＢＳで被覆された遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いた結果を示したものである。図５（Ｄ）のスケールバーは５０μｍを表している。
【００３１】
図５から分かるように、１０μｇ／ｍｌ アシアロフェツインと共にインキュベートした遺伝子−アパタイト粒子複合体では、細胞へのＤＮＡ導入効率が著しく向上しているが、アシアロフェツインの濃度が上昇するに従って、ＤＮＡ導入効率は減少している。これは、遺伝子−アパタイト粒子複合体から遊離したアシアロフェツインによってＡＳＧＰＲ
（asialoglycoprotein receptor）が飽和したことを示しており、遺伝子−アパタイト粒子複合体の細胞への取り込みがＡＳＧＰＲを介していることを証明している。
【００３２】
同様に、ＦＢＳの代わりにＢＳＡを用いて細胞に導入されたＤＮＡを観察した結果を図６に示す。図６（Ａ）は５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡで被覆された遺伝子−アパタイト粒子複合体、図６（Ｂ）は１０μｇ／ｍｌ アシアロフェツイン、及び５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡで被覆された遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いた結果を示したものである。図６（Ｂ）のスケールバーは５０μｍを表している。また、蛍光強度を定量的に解析するため、細胞を２００μｌの溶解バッファ（NP-40）で溶解し、バリアブル・イメージ・アナライザ（Typhoon8600、Amersham Biosciences 社製）で蛍光を検出した結果を図７に示す。
【００３３】
図６及び図７から分かるように、アシアロフェツインによってＡＳＧＰＲを介して効率的に細胞へと遺伝子−アパタイト粒子複合体が取り込まれ、ＤＮＡが導入されている一方、ＢＳＡによって細胞への非特異的な遺伝子−アパタイト粒子複合体の取り込みは抑制されている。
【００３４】
さらに、ＡＳＧＰＲが存在しないＮＩＨ３Ｔ３細胞に対してもＤＮＡを導入した。細胞に導入されたＤＮＡを蛍光顕微鏡で観察した結果を図８に示す。図８（Ａ）はタンパク質で被覆されていない炭酸アパタイト粒子、図８（Ｂ）は５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡで被覆された炭酸アパタイト粒子、図８（Ｃ）は１０μｇ／ｍｌ アシアロフェツイン、及び５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡで被覆された炭酸アパタイト粒子を用いた結果を示したものである。図８（Ｃ）のスケールバーは５０μｍを表している。
【００３５】
図８から分かるように、ＢＳＡで被覆された遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いた場合、ＤＮＡの導入効率が減少している。これは、ＢＳＡによって遺伝子−アパタイト粒子複合体の取り込みが阻害されることを示している。一方、アシアロフェツイン及びＢＳＡで被覆された遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いた場合も、ＤＮＡの導入効率は向上していない。このことから、ＨｅｐＧ２細胞への遺伝子−アパタイト粒子複合体の取り込みがＡＳＧＰＲを介していることが再度確認された。
【００３６】
遺伝子−アパタイト粒子複合体中のプラスミドＤＮＡのコンホメーションの確認
効率的な遺伝子導入・遺伝子発現には、プラスミドＤＮＡのコンホメーションも重要な要素となるため、遺伝子−アパタイト粒子複合体中のプラスミドＤＮＡのコンホメーションを確認した。具体的には、３ｍＭ Ｃａ２＋、及び２μｇ プラスミドＤＮＡを含んだ１ｍｌのバイカーボネート緩衝ＤＭＥＭ培地（ｐＨ７．５）を混合して３７℃で３０分間インキュベートすることにより、ＤＮＡと炭酸アパタイト粒子とからなる遺伝子−アパタイト粒子複合体を作製した。そして、この遺伝子−アパタイト粒子複合体を１０μｇ／ｍｌ アシアロフェツインと共に３７℃で３０分間インキュベートし、さらに１０％ ＦＢＳ、又は５μｇ／ｍｌ ＢＳＡと共に３７℃で３０分間インキュベートすることにより、細胞特異的な遺伝子−アパタイト粒子複合体を作製した。その後、１５０００ｒｐｍで２分間遠心分離して遺伝子−アパタイト粒子複合体を回収し、１０〜２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡで溶解した。
【００３７】
１／４量のコントロールのプラスミドＤＮＡと、１／５量の単離したプラスミドＤＮＡとをアガロースゲル電気泳動によって泳動した結果を図９に示す。レーンＡはコントロールのプラスミドＤＮＡを示し、レーンＢはＦＢＳで被覆された遺伝子−アパタイト粒子複合体から放出されたプラスミドＤＮＡを示し、レーンＣはアシアロフェツイン及びＦＢＳで被覆された遺伝子−アパタイト粒子複合体から放出されたプラスミドＤＮＡを示し、レーンＤはＢＳＡで被覆された遺伝子−アパタイト粒子複合体から放出されたプラスミドＤＮＡを示し、レーンＥはアシアロフェツイン及びＢＳＡで被覆された遺伝子−アパタイト粒子複合体から放出されたプラスミドＤＮＡを示す。
【００３８】
図９から分かるように、遺伝子−アパタイト粒子複合体中に取り込まれた後であっても、プラスミドＤＮＡは、コントロールのプラスミドＤＮＡと同様に３種類のコンホメーション（直鎖状、開環状、閉環状）を保っている。
【００３９】
細胞特異的な遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いて導入された遺伝子の細胞内での発現
次に、細胞特異的な遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いて導入された遺伝子の細胞内での発現を確認した。ここでは、アシアロフェツインの他にトランスフェリンを細胞認識タンパク質として用いた。
【００４０】
具体的には、先ず、ＤＮＡを導入する前日に、増殖過程に同調させたＨｅｐＧ２細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞のそれぞれを２４穴プレート中に５００００個／ウェルとなるように播種し、培養した。
【００４１】
続いて、プラスミドＤＮＡと炭酸アパタイト粒子とからなる遺伝子−アパタイト粒子複合体を０〜２００μｇ／ｍｌのアシアロフェツイン、又は０〜１０００μｇ／ｍｌのトランスフェリンと共に３７℃で３０分間インキュベートし、さらに１０％ ＦＢＳと共に３７℃で３０分間インキュベートすることにより、細胞特異的な遺伝子−アパタイト粒子複合体を作製した。
【００４２】
続いて、ＨｅｐＧ２細胞又はＮＩＨ３Ｔ３細胞とこの遺伝子−アパタイト粒子複合体とを１時間インキュベートすることにより、細胞中にＤＮＡを導入した。そして、細胞を５ｍＭ ＥＤＴＡを含有したＰＢＳで２回洗浄し、１０％ ＦＢＳを含有したＤＭＥＭ培地でさらに１日培養した。その後、ＨｅｐＧ２細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞における遺伝子発現状況をコマーシャルキット（Promega 社製）と光量子カウンタ（TD-20/20 Luminometer, Promega 社製）とを用いて確認した。
【００４３】
ＨｅｐＧ２細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞における遺伝子発現状況を図１０に示す。この図１０は、遺伝子発現効率を細胞タンパク質１ｍｇ当たりの発光量で表したものである。図１０（Ａ）はアシアロフェツインで被覆された遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いてＨｅｐＧ２細胞にＤＮＡを導入したときの発光量を示し、図１０（Ｂ）はトランスフェリンで被覆された遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いてＨｅｐＧ２細胞にＤＮＡを導入したときの発光量を示し、図１０（Ｃ）はトランスフェリンで被覆された遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いてＮＩＨ３Ｔ３細胞にＤＮＡを導入したときの発光量を示したものである。
【００４４】
図１０（Ａ）、（Ｂ）から分かるように、遺伝子発現効率は遺伝子−アパタイト粒子複合体が１０μｇ／ｍｌのアシアロフェツイン又はトランスフェリンで被覆されているときに最大となり、アシアロフェツイン又はトランスフェリンの濃度が上昇するに従って減少している。これは、遺伝子−アパタイト粒子複合体が対応するレセプターを介して細胞に取り込まれていることを再度確認するものである。なお、アシアロフェツインの好ましい濃度範囲はトランスフェリンの好ましい濃度範囲よりも狭くなっているが、これは、ＨｅｐＧ２細胞にはより多くのトランスフェリンレセプターが存在するためと考えられる。また、図１０（Ｃ）から分かるように、トランスフェリンで被覆された遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いた場合には、ＮＩＨ３Ｔ３細胞においても遺伝子発現効率が向上している。これは、ＨｅｐＧ２細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞の双方にトランスフェリンレセプターが存在することを示している。
【００４５】
同様に、ＦＢＳの代わりにＢＳＡで被覆された遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いて導入された遺伝子の細胞内での発現も確認した。ＨｅｐＧ２細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞における遺伝子発現状況を図１１に示す。図１１（Ａ）はＨｅｐＧ２細胞に対してＤＮＡを導入したときの発光量を示し、図１１（Ｂ）はＮＩＨ３Ｔ３細胞に対してＤＮＡを導入したときの発光量を示している。なお、ＢＳＡの濃度は５μｇ／ｍｌとし、アシアロフェツイン及びトランスフェリンの濃度は１０μｇ／ｍｌとした。
【００４６】
図１１（Ａ）から分かるように、アシアロフェツイン又はトランスフェリンで被覆された遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いてＨｅｐＧ２細胞にＤＮＡを導入した場合には、ＢＳＡのみで被覆された遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いてＤＮＡを導入した場合よりも、遺伝子発現効率が５〜５０倍向上した。また、図１１（Ｂ）から分かるように、トランスフェリンで被覆された遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いてＮＩＨ３Ｔ３細胞にＤＮＡを導入した場合には、ＢＳＡのみで被覆された遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いてＤＮＡを導入した場合よりも、遺伝子発現効率が向上したが、アシアロフェツインで被覆された遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いてＮＩＨ３Ｔ３細胞にＤＮＡを導入した場合には、遺伝子発現効率が減少した。これは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞にはトランスフェリンに対応したレセプターがあるのに対して、アシアロフェツインに対応したレセプターはなく、且つ、ＢＳＡによって細胞との非特異的な相互作用が阻害されているためと考えられる。
【００４７】
以上示したように、アシアロフェツイン又はトランスフェリンで被覆された遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いることにより、対応するレセプターを介して細胞特異的に遺伝子を導入し、高効率に発現させることができる。また、この遺伝子導入方法を応用することで、カルシウム塩、重炭酸塩、及び細胞認識タンパク質を含む遺伝子導入用キットを実現することができる。
【００４８】
（２）第２の実施の形態
細胞の培養
先ず、実験に用いる細胞を培養した。具体的には、２５ｃｍ２のフラスコ中に、１０％ ＦＢＳ、培地１ｍｌ当たり５０μｇのペニシリン及びストレプトマイシン、及び、培地１ｍｌ当たり１００μｇのネオマイシンを含有したＤＭＥＭ培地（Gibco BRL 社製）を加え、この培地中で３７℃、５％ ＣＯ２の条件下、ヒト子宮頸部癌細胞株ＨｅＬａと、ＮＩＨ３Ｔ３細胞とをそれぞれ培養した。
【００４９】
細胞特異的な遺伝子−アパタイト粒子複合体の作製
次に、細胞認識タンパク質が結合した細胞特異的な遺伝子−アパタイト粒子複合体を作製した。細胞認識タンパク質としてはＥＣＭ（extracellular matrix）タンパク質であるＩ型コラーゲン及びフィブロネクチンを用いた。
【００５０】
具体的には、１８ｍＭ ＣａＣｌ２、及び０〜１００μｇ／ｍｌのＩ型コラーゲン、フィブロネクチン、又はコントロールとしてのＢＳＡを含有した１００μｌのＨＢＳ（Hepes-buffered solution；２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、７５ｍＭ ＮａＣｌ、０．７５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４；ｐＨ７．５）に、１μｇのプラスミドＤＮＡ（ルシフェラーゼ遺伝子、ＳＶ４０プロモータを有するｐＧＬ３）（Promega 社製）を加えて３７℃で３０分間インキュベートすることにより、細胞特異的な遺伝子−アパタイト粒子複合体を作製した。
【００５１】
SmartSpecTM 3000（Bio-Rad 社製）を用いて３２０ｎｍにおける溶液の濁度を測定した結果を図１２に示す。図１２から分かるように、リン酸アパタイト粒子のＰＯ４３−リッチドメインに結合可能な塩基性タンパク質（等電点がｐＨ７以上）であるＩ型コラ−ゲンは、濃度が上昇するに従って粒子形成を若干阻害しているが、高濃度では粒子形成を促進している。一方、リン酸アパタイト粒子のＣａ２＋リッチドメインに結合可能な酸性タンパク質（等電点がｐＨ７以下）であるフィブロネクチン及びＢＳＡは、濃度が上昇するに従って粒子形成を促進している。これは、酸性タンパク質が粒子形成の核として機能することにより、粒子数が増加したことを示している。
【００５２】
また、ＥＣＭタンパク質が確実にリン酸アパタイト粒子に結合していることを確認する実験を行った。具体的には、ＦＩＴＣラベルされた０〜１００μｇ／ｍｌのＩ型コラーゲンを用いて同様に遺伝子−アパタイト粒子複合体を作製した。そして、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離することでその遺伝子−アパタイト粒子複合体を回収し、５０ｍＭ ＥＤＴＡを含有したＰＢＳに溶解して９６穴プレートの各ウェルに１００μｌずつ滴下した。
【００５３】
蛍光を測定した結果を図１３に示す。図１３（Ａ）は各ウェルの蛍光を示し、図１３（Ｂ）は各ウェルの蛍光強度をバリアブル・イメージ・アナライザ（Typhoon8600、Amersham Biosciences 社製）で定量化したものである。図１３から分かるように、加えたコラーゲンの大部分はリン酸アパタイト粒子に結合している。
【００５４】
さらに、加えたＥＣＭタンパク質の量とリン酸アパタイト粒子に結合するプラスミドＤＮＡの量との関係を確認した。具体的には、０〜１００μｇ／ｍｌのＩ型コラーゲンを用いて同様に遺伝子−アパタイト粒子複合体を作製した。そして、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離することでその遺伝子−アパタイト粒子複合体を回収し、５０ｍＭ ＥＤＴＡを含有したＰＢＳに溶解して９６穴プレートの各ウェルに１００μｌずつ滴下した。
【００５５】
蛍光を測定した結果を図１４に示す。図１４（Ａ）は各ウェルの蛍光を示し、図１４（Ｂ）はＤＮＡ量と蛍光強度との関係を示したものであり、図１４（Ｃ）は各ウェルの蛍光強度をバリアブル・イメージ・アナライザ（Typhoon8600、Amersham Biosciences 社製）で定量化し、遺伝子−アパタイト粒子複合体に取り込まれたＤＮＡの割合を推定したものである。図１４から分かるように、コラーゲンの濃度が上昇し、リン酸アパタイト粒子に結合するコラーゲン量が増加するのに伴い（図１３参照）、遺伝子−アパタイト粒子複合体に取り込まれるプラスミドＤＮＡの量がある程度減少している。これは、ＤＮＡとＩ型コラーゲンとは競合的にリン酸アパタイト粒子に結合することを示している。また、コラーゲンの濃度が１００μｇ／ｍｌと十分に高い場合には遺伝子−アパタイト粒子複合体に取り込まれるプラスミドＤＮＡの量が増加しているが、これは粒子形成が促進される結果（図１２参照）、粒子数が増加したためと考えられる。なお、遺伝子−アパタイト粒子複合体に取り込まれるＤＮＡの割合は最低で５０％であるが、この程度のＤＮＡ量でも細胞への遺伝子導入には十分である。
【００５６】
また、作製された遺伝子−アパタイト粒子複合体のＳＥＭ画像を図１５に示す。図１５（Ａ）は、タンパク質が結合していない遺伝子−アパタイト粒子複合体を示したものであり、図１５（Ｂ）はＢＳＡが結合した遺伝子−アパタイト粒子複合体を示したものであり、図１５（Ｃ）はＩ型コラーゲンが結合した遺伝子−アパタイト粒子複合体を示したものであり、図１５（Ｄ）はフィブロネクチンが結合した遺伝子−アパタイト粒子複合体を示したものである。何れについても、１０倍希釈したサンプルをカーボン被覆されたＳＥＭステージに滴下し、乾燥させた後にＳＥＭ（S-800、株式会社日立製作所製）で観察した。図１５から分かるように、タンパク質が結合した遺伝子−アパタイト粒子複合体も結合していない遺伝子−アパタイト粒子複合体も同様の形状であり、各遺伝子−アパタイト粒子複合体の平均粒子径は１００ｎｍ以下であった。
【００５７】
細胞特異的な遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いた細胞へのＤＮＡ導入
次に、ＥＣＭタンパク質が結合した遺伝子−アパタイト粒子複合体が細胞への遺伝子導入を促進するか否かを確認するため、細胞特異的な遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いてＨｅＬａ細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞にＤＮＡを導入した。具体的には、ＰＩラベルされたプラスミドＤＮＡとリン酸アパタイト粒子と１〜１００μｇ／ｍｌのＩ型コラーゲン又はフィブロネクチンとからなる遺伝子−アパタイト粒子複合体を作製し、この遺伝子−アパタイト粒子複合体とＨｅＬａ細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞とを１０％ ＦＢＳを含有したＤＭＥＭ培地で４時間インキュベートすることにより、細胞中にＤＮＡを導入した。
【００５８】
ＨｅＬａ細胞を５ｍＭ ＥＤＴＡを含有したＰＢＳで２回洗浄し、細胞に導入されたＤＮＡを蛍光顕微鏡で観察した結果を図１６に示す。図中のスケールバーは５０μｍを表している。図１６から分かるように、Ｉ型コラーゲン及びフィブロネクチンの双方に対するインテグリンを発現しているＨｅＬａ細胞では、ある濃度範囲のＥＣＭタンパク質が結合した遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いた場合に、細胞に導入されるＤＮＡ量が著しく増加している。一方、ＢＳＡが結合した遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いた場合や高濃度（１００μｇ／ｍｌ）のＩ型コラーゲンが結合した遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いた場合には、細胞に取り込まれるＤＮＡ量は増加していない。細胞に導入されるＤＮＡ量が増加しない１つの原因としては、ＨｅＬａ細胞にＢＳＡに対するレセプターが存在せず、また、Ｉ型コラーゲンに対するレセプターが飽和していることが挙げられる。また、他の原因としては、これらの遺伝子−アパタイト粒子複合体は、親水性の層で覆われていることが挙げられる。
【００５９】
また、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を５ｍＭ ＥＤＴＡを含有したＰＢＳで２回洗浄し、細胞に取り込まれたＤＮＡを蛍光顕微鏡で観察した結果を図１７に示す。図中のスケールバーは５０μｍを表している。図１７から分かるように、ＮＩＨ３Ｔ３細胞では、Ｉ型コラーゲンが結合した遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いた場合にも、細胞に取り込まれるＤＮＡ量は増加していない。これは、ＮＩＨ３Ｔ３にはＩ型コラーゲンに対するレセプターが全く存在しないか、又は殆ど存在しないことを示している。
【００６０】
そこで、ＮＩＨ３Ｔ３細胞にＩ型コラーゲンに対するレセプターが全く存在しないか、又は殆ど存在しないことを確認するため、細胞接着実験を行った。具体的には、０，１０，１００μｇ／ｍｌのＩ型コラーゲンがコートされたプレートにＨｅＬａ細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞を播種し、２時間以内の間インキュベートした後、細胞を光学顕微鏡で観察した。細胞がＩ型コラーゲンを介してプレートに接着した場合には細胞がプレート全体に拡がるため、細胞がプレート上に拡がっている場合には、細胞表面にインテグリンが発現していることが強く推認される。
【００６１】
細胞接着実験の結果を図１８に示す。図１８から分かるように、ＨｅＬａ細胞は、Ｉ型コラーゲンがコートされたプレートに拡がっているが、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、Ｉ型コラーゲンがコートされたプレートにおいても、Ｉ型コラーゲンがコートされていないプレートと同様に、丸い形状のままである。このことから、ＥＣＭタンパク質が結合した遺伝子−アパタイト粒子複合体の細胞への取り込みは、対応する特定のレセプターを介していることが分かる。
【００６２】
細胞特異的な遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いて導入された遺伝子の細胞内での発現
次に、細胞特異的な遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いて導入された遺伝子の細胞内での発現を確認した。
【００６３】
具体的には、先ず、ＤＮＡを導入する前日に、増殖過程に同調させたＨｅＬａ細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞のそれぞれを２４穴プレート中に５００００個／ウェルとなるように播種し、１０％ ＦＢＳを含有した１ｍｌのＤＭＥＭ培地中で培養した。
【００６４】
続いて、０〜１００μｇ／ｍｌのＩ型コラーゲン、フィブロネクチン、又はコントロールとしてのＢＳＡを用いて上述と同様に細胞特異的な遺伝子−アパタイト粒子複合体を作製し、ＨｅＬａ細胞又はＮＩＨ３Ｔ３細胞とこの遺伝子−アパタイト粒子複合体とを３７℃で１時間インキュベートすることにより、細胞中にＤＮＡを導入した。そして、新しい培地に換えて細胞を３７℃でさらに３６時間培養した。その後、ＨｅＬａ細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞における遺伝子発現状況をコマーシャルキット（Promega 社製）と光量子カウンタ（TD-20/20 Luminometer, Promega 社製）とを用いて確認した。
【００６５】
ＨｅＬａ細胞における遺伝子発現状況を図１９に示す。この図１９は、遺伝子発現効率を細胞タンパク質１ｍｇ当たりの発光量で表したものである。図１９から分かるように、ＥＣＭタンパク質が結合した遺伝子−アパタイト粒子複合体では、Ｉ型コラーゲンの濃度が１０μｇ／ｍｌ、フィブロネクチンの濃度が５０μｇ／ｍｌのときに遺伝子発現効率が１０〜５０倍に上昇しており、ＥＣＭタンパク質の濃度が上昇するに従って遺伝子発現効率は低下している。遺伝子発現効率が低下する１つの原因としては、遊離のＥＣＭタンパク質によってレセプターが飽和したことが考えられ、他の原因としては、遺伝子−アパタイト粒子複合体の表面が親水性になることにより非特異的な取り込みが阻害されたことが考えられる。一方、ＢＳＡが結合した遺伝子−アパタイト粒子複合体では、遺伝子−アパタイト粒子複合体の表面が親水性になることにより、ＢＳＡの濃度が上昇するに従って遺伝子発現効率が低下している。
【００６６】
また、ＮＩＨ３Ｔ３細胞における遺伝子発現状況を図２０に示す。この図２０も、遺伝子発現効率を細胞タンパク質１ｍｇ当たりの発光量で表したものである。図２０から分かるように、ＮＩＨ３Ｔ３細胞にはＩ型コラーゲンに対するレセプターが全く存在しないか、又は殆ど存在しないため（図１８参照）、Ｉ型コラーゲンの濃度が１０μｇ／ｍｌのときにも遺伝子発現効率は殆ど上昇していない。また、Ｉ型コラーゲンの濃度が上昇するに従って遺伝子発現効率はＨｅＬａ細胞の場合よりも急激に低下している。これは、Ｉ型コラーゲンが１０μｇ／ｍｌと高濃度の場合においてもインテグリンを介した遺伝子−アパタイト粒子複合体の取り込みは増加するにも拘わらず（図１６参照）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞にはＩ型コラーゲンに対するインテグリンが全く存在しないか、又は殆ど存在しないため、遺伝子−アパタイト粒子複合体はインテグリンを介して結合することができず、且つ、遺伝子−アパタイト粒子複合体の表面が親水性になることにより非特異的な相互作用も抑制されているためと考えられる。
【００６７】
さらに、Ｉ型コラーゲンが結合した細胞特異的な遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いてＨｅＬａ細胞に遺伝子を導入したときの遺伝子発現状況と、従来のリポフェクション法を用いてＨｅＬａ細胞に遺伝子を導入したときの遺伝子発現状況とを比較する実験を行った。具体的には、上述と同様にしてＩ型コラーゲンが結合した遺伝子−アパタイト粒子複合体を作製すると共に、ＤＮＡとLipofectamineTM（Invitrogen 社製）とを１：５の重量比で混合して遺伝子−脂質複合体を作製した。そして、ＨｅＬａ細胞とこれらの複合体とを３７℃で１時間インキュベートすることにより、細胞中にＤＮＡを導入した。そして、新しい培地に換えて細胞を３７℃でさらに１日培養した。その後、ＨｅＬａ細胞における遺伝子発現状況をコマーシャルキット（Promega 社製）と光量子カウンタ（TD-20/20 Luminometer, Promega 社製）とを用いて確認した。
【００６８】
ＨｅＬａ細胞における遺伝子発現状況を図２１に示す。この図２１は、遺伝子発現効率を細胞タンパク質１ｍｇ当たりの発光量で表したものである。図２１から分かるように、Ｉ型コラーゲンが結合した遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いた場合には、従来のリポフェクション法よりも少なくとも３倍、遺伝子発現効率が高くなっている。
【００６９】
以上示したように、ＥＣＭタンパク質が結合した遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いることにより、インテグリンを介して細胞特異的に遺伝子を導入し、高効率に発現させることができる。また、この遺伝子導入方法を応用することで、カルシウム塩、リン酸塩、及び細胞認識タンパク質を含む遺伝子導入用キットを実現することができる。
【００７０】
なお、本発明は上述した第１，第２の実施の形態のみに限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能であることは勿論である。
【００７１】
例えば、第１，第２の実施の形態では、細胞認識タンパク質として、アシアロ糖タンパク質、トランスフェリン、ＥＣＭタンパク質（Ｉ型コラーゲン、フィブロネクチン）を用いたが、他の細胞認識タンパク質を用いるようにしても構わない。  
【００７２】
また、第１の実施の形態では炭酸アパタイト粒子を用い、第２の実施の形態ではリン酸アパタイト粒子を用いたが、その逆を用いるようにしても構わない。
【００７３】
さらに、第１の実施の形態では、細胞認識タンパク質で被覆された遺伝子−アパタイト粒子複合体をさらに親水性タンパク質（ＢＳＡ等）で被覆し、第２の実施の形態では、遺伝子導入に際して培地中に親水性タンパク質（ＢＳＡ等）を加えたが、細胞への非特異的な取り込みを抑制するためには、何れの方法を用いることも可能である。
【００７４】
さらにまた、第１，第２の実施の形態では、カルシウムイオン、無機リン酸イオン若しくは重炭酸イオン、所定の遺伝子、及び細胞認識タンパク質を含む混合溶液を所定時間インキュベートし、又は、カルシウムイオン、無機リン酸イオン若しくは重炭酸イオン、及び所定の遺伝子を含む混合溶液を所定時間インキュベートした後、細胞認識タンパク質と共に所定時間インキュベートすることにより、アパタイト粒子を作製すると同時に、アパタイト粒子に所定の遺伝子を結合させていたが、細胞認識タンパク質が結合したアパタイト粒子を予め作製しておき、そのアパタイト粒子と所定の遺伝子とを所定時間インキュベートすることにより結合させるようにしても構わない。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】細胞非特異的な遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いて、ＦＢＳ又はＢＳＡの存在下、非存在下でＨｅｐＧ２細胞にＤＮＡを導入した結果を示す図である。
【図２】遺伝子−アパタイト粒子複合体を１０〜２００μｇ／ｍｌのアシアロフェツインと共にインキュベートした際のアシアロフェツインの結合プロファイルを示す図である。
【図３】作製された細胞特異的な遺伝子−アパタイト粒子複合体のＳＥＭ画像を示す図である。
【図４】炭酸アパタイト粒子に被覆されたアシアロフェツインのガラクトース残基を共焦点レーザ走査顕微鏡で検出した結果を示す図である。
【図５】細胞特異的な遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いてＨｅｐＧ２細胞に導入されたＤＮＡを蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【図６】ＦＢＳの代わりにＢＳＡを用いた場合に、ＨｅｐＧ２細胞に導入されたＤＮＡを蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【図７】蛍光強度を定量的に解析した結果を示す図である。
【図８】細胞特異的な遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いてＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入されたＤＮＡを蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【図９】遺伝子−アパタイト粒子複合体から回収したプラスミドＤＮＡとコントロールのプラスミドＤＮＡとをアガロースゲル電気泳動によって泳動した結果を示す図である。
【図１０】ＨｅｐＧ２細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞における遺伝子発現状況を示す図である。
【図１１】ＨｅｐＧ２細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞における遺伝子発現状況を示す図である。
【図１２】ＥＣＭタンパク質等を加えて遺伝子−アパタイト粒子複合体を作製したときの溶液の濁度を測定した結果を示す図である。
【図１３】リン酸アパタイト粒子に結合したＩ型コラーゲンの割合を示す図である。
【図１４】リン酸アパタイト粒子に結合したプラスミドＤＮＡの割合を示す図である。
【図１５】作製された細胞特異的な遺伝子−アパタイト粒子複合体のＳＥＭ画像を示す図である。
【図１６】細胞特異的な遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いてＨｅＬａ細胞に導入されたＤＮＡを蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【図１７】細胞特異的な遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いてＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入されたＤＮＡを蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【図１８】Ｉ型コラーゲンがコートされたプレートでＨｅＬａ細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞の細胞接着実験を行った結果を示す図である。
【図１９】ＨｅＬａ細胞における遺伝子発現状況を示す図である。
【図２０】ＮＩＨ３Ｔ３細胞における遺伝子発現状況を示す図である。
【図２１】Ｉ型コラーゲンが結合した遺伝子−アパタイト粒子複合体を用いてＨｅＬａ細胞に遺伝子を導入したときの遺伝子発現状況と、従来のリポフェクション法を用いてＨｅＬａ細胞に遺伝子を導入したときの遺伝子発現状況とを比較して示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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