(57)【要約】  【課題】  特定の配列を有する目的遺伝子サンプルを高感度に検出できる遺伝子検出方法を提供する。  【解決手段】  一本鎖に変性した遺伝子サンプルと、電気化学的に活性である物質で標識された、前記遺伝子サンプルのうちの一部の遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の標識プローブと、前記遺伝子サンプルのうちの一部の遺伝子配列に対して相補的な塩基配列で、且つ前記標識プローブと異なる塩基配列を有し、磁気ビーズに固定化された一本鎖の捕捉プローブとをハイブリダイズさせた複合体を形成する。その後、複合体を磁力により収集し、電解質とともに電極上に展開し、磁気ビーズに捕捉された電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出する。電解液には導電性微粒子が添加される。【選択図】  図１
2007232675.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の配列を有する遺伝子を検出する遺伝子検出方法であって、
前記検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製工程と、
電気化学的に活性である物質で標識された、前記遺伝子サンプルの一部の遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の標識プローブを作製する標識プローブ作製工程と、
前記遺伝子サンプルの一部の遺伝子配列に対して相補的な塩基配列で、且つ前記標識プローブと異なる塩基配列を有する一本鎖の捕捉プローブを作製し、該捕捉プローブを磁気ビーズに固定化する磁気ビーズ作製工程と、
前記磁気ビーズに固定された一本鎖の捕捉プローブと前記標識プローブ、及び検出すべき遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせた複合体を形成する複合体形成工程と、
前記複合体を磁力により収集し、ハイブリダイズしなかった遺伝子サンプルおよび標識プローブを除去する洗浄工程と、
収集した前記磁気ビーズを導電性微粒子が添加された電解液とともに電極上に展開し、前記複合体中の前記電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出する検出工程と、を含む遺伝子検出方法。
【請求項２】
請求項１に記載の遺伝子検出方法において、
前記導電性微粒子は、前記電気化学的に活性である物質を、酸化還元可能な物質である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項３】
請求項２に記載の遺伝子検出方法において、
前記導電性微粒子は、金、白金、銀、パラジウム、ロジウム、イリジウム、タングステン、カーボンから選ばれる微粒子である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項４】
請求項１に記載の遺伝子検出方法において、
前記導電性微粒子の粒径が、前記磁気ビーズの粒径以下である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項５】
請求項４に記載の遺伝子検出方法において、
前記導電性微粒子の粒径が、１ｎｍ〜５μｍである、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項６】
請求項５に記載の遺伝子検出方法において、
前記導電性微粒子の粒径が、１ｎｍ〜３００ｎｍである、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項７】
請求項１に記載の遺伝子検出方法において、
前記導電性微粒子を添加した前記電解液の吸収極大波長における前記導電性微粒子を添加した前記電解液の光学濃度が、０．０００１〜１である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項８】
請求項７に記載の遺伝子検出方法において、
前記導電性微粒子を添加した前記電解液の吸収極大波長における前記導電性微粒子を添加した前記電解液の光学濃度が、０．０１〜０．３である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に存在する特定の遺伝子配列を検出する遺伝子検出方法に関し、特に、標識剤により電気化学的に遺伝子を検出する遺伝子検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、電気化学的に特定の遺伝子配列を検出する遺伝子検出方法として、検出すべき目的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを電極表面に固定化したＤＮＡチップを用いるものがある。この方法は、該核酸プローブと一本鎖に変性された目的遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせた後、該核酸プローブと目的遺伝子サンプルとで形成された二本鎖核酸に特異的に結合し且つ電気化学的に活性な標識剤を、該核酸プローブと遺伝子サンプルとの反応系に添加し、ＤＮＡチップの電極を介した電気化学的な測定により、前記二本鎖核酸に結合した標識剤を検出することで、目的遺伝子サンプルとハイブリダイズした前記核酸プローブを検出し、目的とする遺伝子の存在を確認する（例えば、特許文献１及び特許文献２参照）。
【０００３】
この手法で用いられる前記標識剤は、前記二本鎖の核酸を認識して、該二本鎖核酸と特異的に結合する物質を指す。前記標識剤は、何れも分子中にフェニル基等の平板状挿入基を有し、該挿入基が二本鎖核酸の塩基対と塩基対との間に挿入することによって、二本鎖核酸と結合する。この標識剤と二本鎖核酸との結合は、静電気的相互作用あるいは疎水的相互作用での結合であって、前記標識剤の二本鎖核酸の塩基対間への挿入、及びその塩基対間からの離脱が一定の速度で繰り返される平衡反応による結合である。
【０００４】
さらに、前述した標識剤には、電気的に可逆な酸化還元反応を起こす物質があり、このような電気化学的に可逆である酸化還元反応を起こす挿入剤を用いれば、電気化学的変化の測定によって、前記二本鎖核酸に結合した標識剤の存在を検出することができる。なお、この電気化学的変化の出力信号としては、酸化還元時に発生する電流や発光が挙げられる。
【０００５】
従って、このような従来の遺伝子検出方法においては、前記標識剤を二本鎖核酸にのみ特異的に結合させ、該二本鎖核酸に結合した標識剤の量を正確に検出することが重要となる。
【０００６】
しかし、前記標識剤は、一本鎖の核酸プローブや、該核酸プローブが固定される電極表面に非特異的に吸着してしまう。そして、この非特異的に吸着した標識剤は、前記二本鎖核酸に結合した標識剤の量の検出時に、バックグランドノイズとなり、検出感度を低下させる原因となる。
【０００７】
これを解消する手法の１つとして、磁気ビーズを用いた手法がある。この手法は、磁気ビーズに固定した捕捉プローブと、標識剤として電気化学的に活性である物質が結合した標識プローブと、遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせ、磁気ビーズに遺伝子サンプルを介して標識剤が結合した複合体を形成させる。そして、磁気ビーズを磁力で収集し、洗浄することで、ハイブリダイズしなかった未反応の遺伝子サンプルおよび標識プローブの除去（Ｂ／Ｆ分離）を行う。その後、磁気ビーズと電解液を電極上に展開し、電極に電圧を印加して、遺伝子サンプルに結合した標識プローブからの電気化学的な信号を検出することにより、目的とする遺伝子の存在を検出する手法である（特許文献３及び特許文献４参照）。
【０００８】
この手法は、いわゆるサンドイッチハイブリダイゼーションを用いた手法であり、前記捕捉プローブと、前記遺伝子サンプルと、前記標識プローブとが、各成分の特異的相互作用を介して複合体化されているため、特異性が高く、検出感度を向上させることが可能である。
【０００９】
さらに、前記磁気ビーズは、バルク体や膜に比べて比表面積が大きく、反応性を向上させることができ、また、磁力を利用してＢ／Ｆ分離を効率的に行うことで、バックグランドノイズの低減にも有効であるため、検出感度を向上させることが可能である。
【特許文献１】特開平５−１９９８９８号公報
【特許文献２】特開平９−２８８０８０号公報
【特許文献３】特開２００２−３４５６１号公報
【特許文献４】特表平６−５０９４１２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
前述した特許文献３及び特許文献４の方法では、磁気ビーズ表面に遺伝子サンプルを介して結合した標識剤が、電極との間で電子の授受を行い、酸化または還元されることにより発生する電流や発光を検出するものである。そして、前述の標識剤と電極との電子の授受は、電気二重層と呼ばれる電極表面から数ｎｍの領域といった非常に狭い範囲で行われる。
【００１１】
しかしながら、前述の手法で用いる磁気ビーズは、ノルウェーのＤｙｎａｌ社から販売されているＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商品名）に代表されるように、電気絶縁材料であるポリスチレンに酸化鉄のような可磁化物質を分散させたものであり、ポリスチレンが主成分であるため、上記磁気ビーズは全体として絶縁体である。
【００１２】
そのため、磁気ビーズ表面に遺伝子サンプルを介して結合した標識剤のうち、電極表面に接触する標識剤のみしか電極との電子授受が起こらない、すなわち、磁気ビーズ表面の一部のみしか電気化学反応に関与せず、標識剤の利用効率が悪い、という課題があった。
【００１３】
本発明は、前記課題を解決するためにされたものであって、磁気ビーズに固定化された標識剤の利用効率を向上させ、検出対象である遺伝子サンプルを高感度に検出できる遺伝子検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記課題を解決するため、本発明の遺伝子検出方法は、特定の配列を有する遺伝子を検出する遺伝子検出方法であって、前記検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製工程と、電気化学的に活性である物質で標識された、前記遺伝子サンプルの一部の遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の標識プローブを作製する標識プローブ作製工程と、前記遺伝子サンプルの一部の遺伝子配列に対して相補的な塩基配列で、且つ前記標識プローブと異なる塩基配列を有する一本鎖の捕捉プローブを作製し、該捕捉プローブを磁気ビーズに固定化する磁気ビーズ作製工程と、前記磁気ビーズに固定された一本鎖の捕捉プローブと前記標識プローブ、及び検出すべき遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせた複合体を形成する複合体形成工程と、前記複合体を磁力により収集し、ハイブリダイズしなかった遺伝子サンプルおよび標識プローブを除去する洗浄工程と、収集した前記磁気ビーズを導電性微粒子が添加された電解液とともに電極上に展開し、前記複合体中の前記電気化学的に活性である物質を、電気化学的な測定により検出する検出工程と、を含むものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の遺伝子検出方法によれば、電気化学測定の際に、電解液に分散した導電性粒子を介して、電気二重層領域が電極表面から離れた部分にも広がり、電極表面に接触していない部分の標識剤でも電気化学反応が起きるため、標識剤の利用効率を高めることができ、高感度な検出が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下に、本発明の遺伝子検出方法について詳細に説明する。なお、以下の実施の形態における遺伝子サンプルとは、例えば、血液、白血球、血清、尿、糞便、精液、唾液、培養細胞、各種臓器細胞のような組織細胞、その他遺伝子を含有する任意の試料から、該試料中の細胞を破壊して二本鎖核酸を遊離させ、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖の核酸に解離させたものである。また、本実施の形態における遺伝子サンプルは、制限酵素で切断して電気泳動による分離等で精製した核酸断片でもよい。
【００１７】
（実施の形態１）
以下、実施の形態１における遺伝子検出方法について説明する。まず、検査対象となる遺伝子サンプルを作製する。この遺伝子サンプルは、前述したように、任意の試料中の細胞を破壊して二本鎖核酸を遊離させ、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖に変性させる。
【００１８】
このとき、前記試料中の細胞の破壊は、常法により行うことができ、例えば、振とう、超音波等の物理的作用を外部から加えて行うことができる。また、核酸抽出溶液（例えば、ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、Ｔｗｅｅｎ−２０等の界面活性剤、又はサポニン、ＥＤＴＡ、プロテア−ゼ等を含む溶液等）を用いて、細胞から核酸を遊離させることもできる。
【００１９】
次に、前記一本鎖の遺伝子サンプルに、後述する標識プローブを含む溶液を接触させる。これにより、前記標識プローブがもつ標識結合用プローブと、該標識結合用プローブと相補的な配列を有する遺伝子サンプルがハイブリダイズし、標識化遺伝子サンプルが形成される。この標識プローブと遺伝子サンプルをハイブリダイズさせる方法は周知であるため、ここでは説明を省略する。
【００２０】
以下、本発明に用いられる標識プローブについて説明する。標識プローブは、検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有し、且つ電気化学的に活性である物質で標識された一本鎖核酸である。
【００２１】
前述の電気化学的に活性である物質は、電気化学的に検出可能な物質であれば特に制限無く何を用いてもよく、例えば、可逆な酸化還元反応時に生じる酸化還元電流を測定することで物質の検出が可能な、酸化還元性を有する化合物が挙げられる。そしてこのような酸化還元性を有する化合物としては、例えば、フェロセン、カテコールアミン、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンもしくはビオローゲン等がある。
【００２２】
なお、前述した、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンには、酸化還元反応時に電気化学発光を生じるものもあり、後述する検出工程にてその発光を測定することで、遺伝子サンプルの検出を行うこともできる。
【００２３】
また、前述の配位子に複素環系化合物を有する金属錯体としては、酸素や窒素等を含む複素環系化合物、例えば、ピリジン部位、ピラン部位等を配位子に有する金属錯体等を挙げることができ、特に、ピリジン部位を配位子に有する金属錯体が好ましく、該ピリジン部位を配位子に有する金属錯体としては、例えば、金属ビピリジン錯体、金属フェナントロリン錯体等が例に挙げられる。
【００２４】
さらに、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属としては、例えば、ルテニウム、オスニウム、亜鉛、コバルト、白金、クロム、モリブデン、タングステン、テクネチウム、レニウム、ロジウム、イリジウム、パラジウム、銅、インジウム、ランタン、プラセオジム、ネオジム、サマリウム等を挙げることができる。特に該中心金属が、ルテニウム、オスニウムである錯体は、良好な電気化学発光特性を有し、このような良好な電気化学発光特性を有する物質としては、例えば、ルテニウムビピリジン錯体、ルテニウムフェナントロリン錯体、オスニウムビピリジン錯体、オスニウムフェナントロリン錯体等を挙げることができる。
【００２５】
そしてこの後、前述したようにして形成された標識化遺伝子サンプルを含む溶液を、磁気ビーズに固定化された捕捉プローブに接触させる。これにより、前記捕捉プローブと、該捕捉プローブと相補的な配列を有する遺伝子サンプルとがハイブリダイズし、前記標識化遺伝子サンプルが磁気ビーズに固定化される。この前記捕捉プローブと前記標識化遺伝子サンプルをハイブリダイズさせる方法は周知であるため、ここでは説明を省略する。
【００２６】
前記捕捉プローブとしては、化学合成で得た一本鎖の核酸、あるいは生物試料から抽出した核酸を制限酵素で切断し、電気泳動による分離等で精製した核酸を用いることができる。なお、生物試料から抽出した核酸の場合には、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖の核酸に解離させておくことが好ましい。
【００２７】
また、前記捕捉プローブを固定化する磁気ビーズとしては、特に限定されるものではなく、医用で一般的に用いられている磁気ビーズが使用可能である。前記磁気ビーズは、電気絶縁材料であるポリスチレンやデキストランのようなポリマーに酸化鉄のような可磁化物質を分散させたものである。前記磁気ビーズの粒径は、１０ｎｍ〜１０μｍと幅広く選択可能であり、特に限定されるものではないが、溶液中での分散性および分離、回収性から、３００ｎｍ〜５μｍが好ましい。
【００２８】
前記捕捉プローブを前記磁気ビーズに固定化する方法としては、例えば、磁気ビーズにアビジンコーティングを施し、末端をビオチン修飾した核酸プローブと結合させるなどの公知の方法が用いることができる。
【００２９】
なお、前述の説明では、まず遺伝子サンプルと標識プローブとをハイブリダイズさせて標識化遺伝子サンプルを形成する遺伝子サンプル標識化工程の後、該標識化遺伝子サンプルと磁気ビーズに固定化された捕捉プローブとをハイブリダイズさせて、遺伝子サンプルを磁気ビーズに固定化する遺伝子サンプル捕捉工程を行なうものとしたが、前記遺伝子サンプル捕捉工程と前記遺伝子サンプル標識化工程とを同時に行うものでもよい。この場合、遺伝子サンプルと、標識プローブと、磁気ビーズに固定化した捕捉プローブとを同時に接触させて、標識された遺伝子サンプルを磁気ビーズに固定化する。
【００３０】
前述のようにして前記標識化遺伝子サンプルを磁気ビーズに固定化後、磁気ビーズを磁力で収集し、未反応の遺伝子サンプルと標識プローブを除去することで、Ｂ／Ｆ分離を行う。
【００３１】
Ｂ／Ｆ分離を行った後、磁気ビーズを電解液とともに電極上に展開し、前記磁気ビーズは磁力により電極表面に捕捉する。そして、電極に電圧を印加することで、該磁気ビーズに固定化された前記標識化遺伝子サンプルの、電気化学的に活性である物質由来の電気化学的な信号を測定する。
【００３２】
電気化学的な信号の測定は、標識された電気化学的に活性である物質によって異なり、前記電気化学的に活性である物質として、酸化還元電流を生じる電気化学的に活性である物質を用いた場合には、該電気化学的に活性である物質由来の電気化学的な信号を、前記ポテンショスタット、ファンクションジェネレータ等からなる計測系で測定できる。一方、前記電気化学的に活性である物質として、電気化学発光を生じる物質を用いた場合には、フォトマルチプライヤー等を用いて計測が可能である。
【００３３】
以下、本発明に用いられる電解液について説明する。本発明の電解液は、導電性微粒子が添加されたものであり、電解液に分散した導電性粒子を介して、電気二重層領域が電極表面から離れた部分にも広がり、電極表面に接触していない部分の電気化学的に活性である物質でも電気化学反応が起きるため、標識剤の利用効率を高めることが可能となる。
【００３４】
前記導電性粒子は、金属電極と前記電気化学的に活性である物質との間で電子の移動が可能であり、前記電気化学的に活性である物質を、酸化還元することができる物質であれば、特に制限無く何を用いてもよい。
【００３５】
好適な材料としては、化学的に安定であり、溶解電位が高い金属材料、例えば、金、白金、銀、パラジウム、ロジウム、イリジウム、タングステン等、また、酸化および還元方向の電位窓の広いカーボン等が挙げられる。
【００３６】
また、前記導電性粒子の粒径は、特に限定されるものではないが、磁気ビーズの粒径以下であることが好ましい。前記磁力により電極表面に捕捉された磁気ビーズは、凝集、積層した状態で電極表面に存在するため、前述の粒径をもつ導電性粒子を使用することにより、導電性粒子が磁気ビーズの間隙に入り込み、入り込んだ導電性粒子を介して、凝集、積層した磁気ビーズに結合した標識剤を反応させることができ、標識剤の利用効率を高めることが可能となる。
【００３７】
さらに、前記導電性粒子の粒径は、１ｎｍ〜５μｍがより好ましく、特に１ｎｍ〜３００ｎｍが好ましい。このような粒径の小さい導電性粒子を用いることにより、凝集、積層した磁気ビーズの間隙に入り込みやすくなる。
【００３８】
このような導電性微粒子としては、例えば、免疫測定の呈色剤や燃料電池の触媒等で使用されるコロイド粒子等が挙げられる。
【００３９】
また、前記導電性微粒子の電解液への添加量は、前記導電性微粒子を添加した電解液の光学濃度を測定することで決定する。一般に、溶液中の微粒子の濃度は、微粒子を含む溶液の光学濃度で示され、光学濃度の測定は、微粒子を含む溶液の吸収極大波長の光を用いて、吸光光度計により測定される。例えば、導電性微粒子に金コロイドを用いた場合、５２０ｎｍの波長の光を用いて測定されている。
【００４０】
そして、前記導電性微粒子を添加した前記電解液の光学濃度は、０．０００１〜１が好ましく、特に０．０１〜０．３が好ましい。このような光学濃度にすることにより、前記導電性微粒子の良好な分散状態が得られ、標識剤の利用効率を高めることが可能となる。さらに、前記標識剤に電気化学発光を生じる物質を用いた場合には、前記電解液の光学濃度が高くなると、前記導電性微粒子が標識剤からの発光を阻害する効果も高くなるため、前述のような光学濃度にすることにより、電界液に添加した前記導電性微粒子が標識剤からの発光を阻害する影響を低く抑えることもできる。
【実施例１】
【００４１】
以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
（１）遺伝子サンプル
遺伝子サンプルには、ヒト由来Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ−４５０の遺伝子配列の５’−末端より５９９−６９８番目に位置するＡＡＴＴＧＡＡＴＧＡ  ＡＡＡＣＡＴＣＡＧＧ  ＡＴＴＧＴＡＡＧＣＡ  ＣＣＣＣＣＴＧＧＡＴ  ＣＣＡＧＡＴＡＴＧＣ  ＡＡＴＡＡＴＴＴＴＣ  ＣＣＡＣＴＡＴＣＡＴ  ＴＧＡＴＴＡＴＴＴＣ  ＣＣＧＧＧＡＡＣＣＣ  ＡＴＡＡＣＡＡＡＴＴの配列を有する１００塩基のオリゴデオキシヌクレオチドを使用した。
【００４２】
（２）磁気ビーズ表面への核酸プローブの固定化
磁気ビーズには、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製のＣＭ０１Ｎ／５８９６ストレプトアビジン磁気ビーズを用いた（粒径０．３５μｍ）。捕捉プローブには、５’末端よりＡＡＴＴＴＧＴＴＡＴ  ＧＧＧＴＴＣＣＣＧＧ  ＧＡＡＡＴＡＡＴＣＡの遺伝子サンプルと相補的な配列を有し、５’末端のリン酸基を介してビオチンを修飾したプローブを使用した。
【００４３】
まず、磁気ビーズを１ｍｇ採取し、ＴＴＬバッファー（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）：Ｔｗｅｅｎ２０：２Ｍ塩化リチウム：超純水＝２：１０：５：３の体積比になるよう調製）で洗浄後、２０μＬのＴＴＬバッファーに置換した。その後、１００ｎＭの核酸プローブを５μＬ添加し、室温で１５分穏やかに振とうした。
【００４４】
この溶液をデカントし、残留した磁気ビーズを０．１５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液で洗浄後、ＴＴバッファー（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）：Ｔｗｅｅｎ２０：超純水＝１：２：１の体積比になるよう調製）で洗浄した。
【００４５】
洗浄後、ＴＴＥバッファーに溶液を置換し、８０℃で１０分間インキュベートすることにより、不安定な結合を除去した。これにより、捕捉プローブが固定化された磁気ビーズを得た。
【００４６】
さらに、本実施例１においては、比較対象として、遺伝子サンプルと非相補的な配列を有する捕捉プローブを使用して、前記捕捉プローブと同様の処理を行った。なお、ここでは、非相補的な捕捉プローブとして、３０ｍｅｒのＰｏｌｙ−Ａ、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ  ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ  ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡの配列を有する５’末端のリン酸基を介してビオチンを修飾したプローブを使用した。
【００４７】
（３）標識プローブ
標識プローブには、５’末端からＴＧＣＴＴＡＣＡＡＴ  ＣＣＴＧＡＴＧＴＴＴ  ＴＣＡＴＴＣＡＡＴＴの配列を有し、５’末端のリン酸基を介して、電気化学的に活性である物質であるルテニウム錯体を修飾し、下記（化１）に示すような３０塩基のオリゴデオキシヌクレオチドを使用した。
【００４８】
【化１】
2007232675.tif 000003
（化１）で示される標識プローブは、以下のようにして得る。まず、ＴＨＦ６０．０ｍＬに溶解させた４，４’−ジメチル−２，２’ビピリジン２．５０ｇ（１３．５ｍｍｏｌ）溶液を窒素雰囲気の容器に注入した後、リチウムジイソプロピルアミド２Ｍ溶液１６．９ｍＬ（２７．０ｍｍｏｌ）を滴下し、冷却しながら３０分撹拌した。一方、同様に窒素気流中で乾燥させた容器に、１，３−ジブロモプロパン４．２ｍＬ（４１．１ｍｍｏｌ）とＴＨＦ１０ｍＬとを加え、冷却しながら撹拌させた。この容器に、先程の反応液をゆっくり滴下させて２．５時間反応させた。反応溶液は２Ｎの塩酸で中和し、ＴＨＦを留去した後、クロロホルムで抽出した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Ｃを得た（収率４７％）。
【００４９】
窒素雰囲気の容器に、前記生成物Ｃ１．０ｇ（３．２８ｍｍｏｌ）、フタルイミドカリウム０．６７ｇ（３．６１ｍｍｏｌ）、及びジメチルホルムアミド（脱水）３０．０ｍＬを加え、オイルバスで１８時間還流した。反応後、クロロホルムで抽出し、０．２Ｎ水酸化ナトリウム５０ｍＬで蒸留水洗浄した。溶媒を留去して酢酸エチルとヘキサンから再結晶を行い、生成物Ｄを得た（収率６１・５％）。
【００５０】
塩化ルテニウム(III)（２．９８ｇ、０．０１ｍｏｌ）、及び２，２’−ビピリジン（３．４４ｇ、０．０２２ｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（８０．０ｍＬ）中で６時間還流した後、溶媒を留去した。その後、アセトンを加え、一晩冷却することで得られた黒色沈殿物を採取し、エタノール水溶液１７０ｍＬ（エタノール：水＝１：１）を加え１時間加熱還流を行った。ろ過後、塩化リチウムを２０ｇ加え、エタノールを留去し、さらに一晩冷却した。析出した黒色物質は吸引ろ過で採取し、生成物Ｅを得た(収率６８．２％)。
【００５１】
窒素置換した容器に、前記生成物Ｄ０．５０ｇ(１．３５ｍｍｏｌ)、前記生成物Ｅ０．７８ｇ（１．６１ｍｍｏｌ）、及びエタノール５０ｍＬを加えた。９時間窒素雰囲気で還流した後、溶媒を留去し、蒸留水で溶解させ、１．０Ｍの過塩素酸水溶液で沈殿させた。この沈殿物を採取し、メタノールで再結晶を行い、生成物Ｆを得た（収率８１．６％）。
【００５２】
さらに、前記生成物Ｆ１．０ｇ（１．０２ｍｍｏｌ）、及びメタノール７０．０ｍＬを１時間還流した。室温まで冷却した後、ヒドラジン一水和物０．２１ｍＬ（４．２１ｍｍｏｌ）を加え再び１３時間還流した。反応後、蒸留水を１５ｍＬ加え、メタノールを留去した。
【００５３】
次に、濃塩酸を５．０ｍＬ加え、２時間還流して得られた反応液を一晩冷蔵し、不純物を自然ろ過で除去した。
【００５４】
これを炭酸水素ナトリウムで中和した後、水を留去し、無機物をアセトニトリルで除去した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Ｇを得た(収率７１．４％)。
【００５５】
アルミホイルで遮光した容器に、前記生成物Ｇ０．６５ｇ（０．７６ｍｍｏｌ）を加え、アセトニトリル１０ｍＬに溶解させた。次に、トリエチルアミン０．２３ｇ（２．２９ｍｍｏｌ）を加えた後、アセトニトリル２０ｍＬに溶解したグルタル酸無水物０．８７ｇ（７．６２ｍｍｏｌ）を滴下した。
【００５６】
９時間反応後、エバポレーターでアセトニトリルを留去して得た粗生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製し、下記（化２）に示すルテニウム錯体を得た(収率８７．５％)。
【００５７】
【化２】
2007232675.tif 000004
下表は、前述のようにして得た（化２）に示す物質の1Ｈ-ＮＭＲ結果である。
【００５８】
1Ｈ-ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ  ｄ−６）
σ：
１．４６      （２Ｈ，ｍ）
１．６９      （４Ｈ，ｍ）
２．１０      （４Ｈ，ｍ）
２．５４      （３Ｈ，ｓ）
２．８１      （２Ｈ，ｔ）
３．０８      （２Ｈ，ｍ）
７．４１      （２Ｈ，ｔ）
７．５７      （６Ｈ，ｍ）
７．７７      （４Ｈ，ｍ）
８．１９      （１Ｈ，ｔ）
８．７９      （４Ｈ，ｔ）
８．８８      （６Ｈ，ｍ）
次に、オリゴデオキシヌクレオチド７８６μｇ（８３．４ｐｍｏｌ）を蒸留水０．３ｍＬに溶解させ、該オリゴデオキシヌクレオチドの水溶液に、ルテニウム錯体０．５ｍｇ（０．１２μｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド０．３ｍｇ（２．５μｍｏｌ）、ＷＳＣ１．４ｍｇ（７．５μｍｏｌ）、０．１Ｍトリエチルアミン２．５μＬ（０．２５μｍｏｌ）を添加し、２日間室温で反応させた。ＨＰＬＣで精製後、目的物のフラクションを採取し、溶液を留去して式（１）に示す標識プローブを得た（収率７４．１％）。
【００５９】
（４）ハイブリダイゼーション
前記捕捉プローブを固定した磁気ビーズに、２ＸＳＳＣを１４μＬ加え、そこに５μＭに調製した遺伝子サンプル及び標識プローブをそれぞれ４μＬ添加し、７０℃で穏やかに振とうさせた。１時間振とうさせた後、磁石で磁気ビーズを収集後、溶液をデカントし、４０℃に加温した２ＸＳＳＣで洗浄し、二本鎖核酸が形成された磁気ビーズαを得た。
【００６０】
なお、非相補的な捕捉プローブを固定した磁気ビーズについても、上記と同様の処理を行い、二本鎖核酸が形成されていない磁気ビーズβを得た。
【００６１】
（５）電気化学測定
以上の工程の後、二本鎖核酸が形成された磁気ビーズα及び二本鎖核酸が形成されていない磁気ビーズβに０．２ＭのＰＢＳを１０μＬと０．２Ｍのトリエチルアミンを１０μＬ混合した溶液を加え、懸濁した後、それぞれ５μＬずつ電極に滴下した。
【００６２】
前記電極には、ガラス基板上にスパッタ装置（アルバック製ＳＨ−３５０）によりチタン１０ｎｍを下地に金２００ｎｍを成膜し、フォトリソグラフィ工程により電極パターンを形成したものを使用した。また、電極の下には永久磁石のシートを取り付けており、作用極のみに磁気ビーズが集約するようにした。
【００６３】
５分静置後、前記磁気ビーズα、βが集約した電極ｘα、ｙβそれぞれに、電解液を７５μＬ滴下した。
【００６４】
ここで、前記電解液には、０．２ＭのＰＢＳを５００μＬ、０．２Ｍのトリエチルアミンを５００μＬ混合した溶液に、さらに導電性微粒子として金コロイド（フナコシ株式会社製ＥＭＧＣ２０、粒径２０ｎｍ、５２０ｎｍの光学濃度１．０）を１００μＬ添加して調整した電解液Ａを使用した。
【００６５】
また、導電性微粒子の添加効果を明らかにするための比較対象として、０．２ＭのＰＢＳを５００μＬ、０．２Ｍのトリエチルアミンを５００μＬ混合しただけの金コロイドを添加しない電解液Ｂも調整し使用した。
【００６６】
その後、それぞれの電極ｘα、ｙβに電圧を印加し、この時に生じた電気化学発光の測定を行った。なお、電圧の印加は、０Ｖから１．３Ｖまで走査し、３秒間電気化学測定を行った。電気化学発光量の測定は、光電子増倍管（浜松ホトニクス製Ｈ７３６０−０１）を用いて行い、電圧走査中における最大発光量を測定した。
【００６７】
図１は、二本鎖核酸が形成された磁気ビーズの電極ｘα、及び二本鎖核酸が形成されていない磁気ビーズの電極ｙβにおいて検出された最大電気化学発光量を示したものである。
【００６８】
図１から、二本鎖核酸が形成された磁気ビーズ電極ｘαでの発光量は、電解液Ａの方が高くなっており、金コロイドの添加により発光量が増加していることが分かる。また、二本鎖核酸が形成されていない磁気ビーズ電極ｙβでの発光量は、電解液Ａおよび電解液Ｂの間に差異はなく、金コロイドの添加によるバックグラウンドノイズの変化はないことも分かる。
【００６９】
したがって、金コロイドの添加により、バックグラウンドノイズを増加させることなく、発光量のみを増加させることができ、高感度に二本鎖核酸、すなわち目的遺伝子サンプルを検出できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明にかかる遺伝子検出方法は、特定の配列を有する遺伝子を高感度に検出することができ、遺伝子診断、感染症診断、ゲノム創薬等の用途に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】本発明の実施例１における最大電気化学発光量を測定した図
【図１】
2007232675.tif 000005
【配列表】
2007232675000001.app