(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞ホスホジエステラーゼを活性化する能力に起因した、yessotoxinsの腫瘍細胞に対する細胞毒性薬としての治療的な使用を提供する。【解決手段】yessotoxinsのヒト腫瘍細胞増殖抑制剤としての治療的な使用であり、yessotoxin（ＹＴＸ）及びその類似物の作用のメカニズムは、細胞ホスホジエステラーゼの活性化、したがってｃＡＭＰの細胞毒性レベルの減少に関連する。ＹＴＸの投与の後のこの活性化の結果としてヒト肝細胞癌細胞の増殖抑制となる。腫瘍プロセスの処置に役立つ薬剤を開発するために、この新生細胞へのＹＴＸの効果を用いることができる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞ホスホジエステラーゼ中に毒素によって生じる活性化に基づいた、yessotoxins（ＹＴＸｓ）のヒト腫瘍細胞増殖抑制剤としての治療的な使用であって、yessotoxin（ＹＴＸ）及び化学的な類似物（ＹＴＸｓ）の活性化作用の、細胞死活性剤としてのホスホジエステラーゼの活性についての使用、又は細胞標的としてＰＤＥｓを用いるための使用。
【請求項２】
新生細胞へのＹＴＸｓの効果の、抗腫瘍化合物としての請求項１に記載された使用。
【請求項３】
腫瘍プロセスの処置のために用いる化合物の製造での請求項１に記載されたＹＴＸｓ及びその誘導体の使用。
【請求項４】
ホスホジエステラーゼ修飾を伴う新生物形成の処置のために用いる化合物の製造での請求項１に記載されたＹＴＸｓ及びその誘導体の使用。
【請求項５】
ＹＴＸの高脂肪溶解性で低毒性に基づいた、新生物形成のプロセスの処置で有用であるその他の有効成分のための基材賦形剤としての使用。
【請求項６】
ＨＴＳ（ハイスループットスクリーニング）プロトコルでのＰＤＥｓの活性化の請求項１に記載された使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞ホスホジエステラーゼを活性化する能力に起因した、yessotoxinsの腫瘍細胞に対する細胞毒性薬としての治療的な使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
yessotoxin（以下ＹＴＸ）及びその天然の類似物は、Protoceratium reticulatumとLingolodinium polyedrum種の渦鞭毛藻によって生成され、本来はPatinopecten yessoensisの消化器官から単離される多環式エーテルである（Murata, M., Kumagai, M. ほか, 1987, Tetrahedron Letters, 28, 5869-5872）。その分子は、図１に示すように、エーテル基を持つ１１の環と、それに結合する異なるラジカルを有する不飽和側鎖とで形成される。５０以上の天然の誘導体の類似物があるが、この図はいくつかのＹＴＸ類似物を示す。
【０００３】
ＹＴＸは、経口時には毒性がない親油性化合物である（Aune, T., Sorby, R. ほか, 2002, Toxicon, 40, 77-82）。しかし、非常に高い用量を必要とするが腹腔内注射の後に死亡を引き起こす（Tubaro, A., Sosa, S. ほか, 2003, Toxicon, 41, 783-92）。
【０００４】
ＹＴＸ及びその類似物が有する作用のメカニズムは、その他の毒素のものとは異なる。しばしば一緒に検出されたため、当初下痢毒のグループにそれらを分類した。しかし、それらは下痢を引き起こさず、下痢毒の細胞標的である細胞ホスファターゼに影響しないという点で異なる。それらの作用のメカニズムは他の酵素に関連する。この意味で、ＹＴＸによれば、カルシウム依存のメカニズムによって細胞ホスホジエステラーゼの活性が増加するため、環状アデノシンリン酸（ｃＡＭＰ）の細胞質レベルが減少することが説明されてきた（Alfonso, A., de la Rosa, L.A. ほか, 2003, Biochem Pharmacol, 65, 193-208）。さらに、ＹＴＸは、細胞膜に位置するチャンネルを通してその入口を刺激することで、細胞質のカルシウムレベルを増加させる（De la Rosa, L.A., Alfonso, A. ほか, 2001, Biochem. Pharmacol., 61, 827-833; De la Rosa, L.A., Alfonso, A. ほか, 2001, Cell Signal, 13, 711-716）。汚染された軟体動物中のこれらの毒素の存在を検出する精密な方法を開発するために、ホスホジエステラーゼへの効果を用いてきた（Alfonso, A., Vieytes, M.R. ほか, 2004, Analytical Biochem., 326, 93-99; Pazos, M.J., Alfonso, A. ほか, 2004, Analytical Biochem., 335, 112-118）。１１ファミリーのホスホジエステラーゼがあるが、これは薬理学的な観点からとても重要であり、それらの調節が例えば喘息、慢性関節リウマチ及び癌などの病気の処置に関連する（Houslay, M.D. と Adams, D.R., 2003, Biochem J., 370, 1-18）。
【０００５】
ＹＴＸは、カスパーゼ活性のためにヒト神経芽腫細胞及びヒト頚癌細胞（ＨｅＬａ株）にアポトーシス（プログラム化された細胞死）を誘発する（Leira, F., Alvarez, C. ほか, 2001, Toxicology in vitro, 15, 277-283、 Malaguti, C., Ciminello, P. ほか, 2002, Toxicol in Vitro, 16, 357-363）。さらに、この毒素は、ヒト肝細胞癌細胞（ＨＥＰ−Ｇ２）とＨｅＬａ２２９細胞への細胞毒性効果を有する。したがって、推測的に、抗腫瘍薬として用いる余地がある。
【０００６】
この二次メッセンジャーの両方のレベルと、タンパク質キナーゼＡで生じる活性化のため、ｃＡＭＰ経路は細胞増殖に関係する。抗腫瘍薬（例えばシスプラチン）に対する耐性がこのタンパク質の不活性化に関連があることが説明されてきたが（Cvijic, M.E., Yang, W.L. ほか, 1998, Pharmacol Ther, 78, 115-28）、タンパク質キナーゼＡの抑制は抗腫瘍活性を引き起こす（Wang, H., Cai, Q. ほか, 1999, Proc Natl Acad Sci U S A, 96, 13989-94）。ちなみに、ｃＡＭＤのレベルが次第に細胞毒性と薬剤に対する耐性に関連する（Mann, S.C., Andrews, P.A. ほか, 1991, Int J Cancer, 48, 866-72、 von Knethen, A., Lotero, A. ほか, 1998, Oncogene, 17, 387-94）。言い換えると、ｃＡＭＰ経路は、細胞増殖を調整するときに重要で複雑な役割を果たす。この理由から、ホスホジエステラーゼに影響する天然又は合成分子、及びＨＴＳ（ハイスループットスクリーニング）プロトコルに適用可能であるこれらの酵素の活性を研究するための方法についての説明は、新しい処置を開発するためにとても役立つ道具である。この意味で、腫瘍細胞増殖へのＹＴＸｓの抑制効果についての説明は、可能な治療用途のためにこれらの分子が薬理学的に重要であることを示唆する。さらに、それらの低い毒性のために、ＹＴＸは毒素ではなく、むしろ異なる薬理学的な使用による天然物と考えるべきであると一部の著者は指摘する。
【０００７】
毒素のファミリー、ＹＴＸｓの特定の特性及びそれらの作用のメカニズムについてのより詳しい説明は、本発明に関連するもとの出願及び分割出願の詳細な説明に示される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明では、細胞ホスホジエステラーゼを活性化する能力に従った、ＹＴＸｓの細胞増殖抑制剤としての使用について説明する。
【００１０】
使用：ホスホジエステラーゼを活性化するＹＴＸ及び化合物の新生細胞増殖抑制剤としての使用。
【００１１】
新生細胞増殖抑制剤は、新薬の抗新生物特性を説明するために広く用いられる抗腫瘍活性の指標である。ＹＴＸはヒト肝細胞癌細胞に対し細胞毒性であることがわかってきた。さらに、この毒素は神経芽腫細胞にアポトーシスを誘発することが説明されている（Leira, F., Alvarez, C. ほか, 2001, Toxicology in vitro, 15, 277-283）。これは全て、ＹＴＸを抗腫瘍薬として用いる余地があることを示す。肝臓癌腫瘍細胞に対する細胞毒性薬としてのＹＴＸの能力をこの使用では定量する。文献に説明された異なるプロトコルに従って、細胞増殖抑制を決定することができる。以下で説明されるこれらのプロトコルの１つでは、クリスタルバイオレットの染色と引き続くアセチル化によってＨＥＰ−Ｇ２の細胞株で反応を定量する。
【００１２】
（実施の形態）
ａ．マイクロ滴定プレート上にウェルあたり１００００細胞の密度でＨＥＰ−Ｇ２細胞を播種する。３７℃の成長培地で２４時間、５％のＣＯ２でそれらをインキュベートする。
【００１３】
ｂ．異なる濃度のＹＴＸを添加し、３７℃で４８時間、５％のＣＯ２でそれをインキュベートする。
【００１４】
ｃ．１０μＬの１１％グルタルアルデヒドを添加し細胞を固定し、１５分間それをインキュベートする。蒸留水で３〜４回それを洗浄する。
【００１５】
ｄ．クリスタルバイオレットの０．１％溶液を添加し、１５分間プレートを振動する。
【００１６】
ｅ．蒸留水で洗浄することで染料を取り除き、続けてそれを乾燥する。
【００１７】
ｆ．１０％の酢酸を添加し、１５分間振動を維持する。
【００１８】
ｇ．５９５ナノメートルの分光光度計で吸光度を読み取る。
【００１９】
ｈ．このプロトコルで１０μＭのＹＴＸが約８２＋／−１％の細胞増殖の抑制を誘発することがわかった。
【００２０】
（文献）
Alfonso, A., de la Rosa, L. A., Vieytes, M. R., Yasumoto, T. and Botana, L. M. (2003). "Yessotoxin a novel phycotoxin, activates phosphodiesterase activity. Effect of yessotoxin on cAMP levels in human lymphocytes." Biochem Pharmacol 65: 193-208.
Alfonso, A., Vieytes, M. R., Yasumoto, T. and Botana, L. M. (2004). "A rapid microplate fluorescent method to detect yessotoxins based on their capacity to activate phosphodiesterases." Analytical Biochem. 326: 93-99.
Aune, T., Sorby, R., Yasumoto, T., Ramstad, H. and Landsverk, T. (2002). "Comparison of oral and intraperitoneal toxicity of yessotoxin towards mice." Toxicon 40(1): 77-82.
Cvijic, M. E., Yang, W. L. and Chin, K. V. (1998). "Cisplatin resistance in cyclic AMP-dependent protein kinase mutants." Pharmacol Ther 78(2): 115-28.
De la Rosa, L. A., Alfonso, A., Vilarino, N., Vieytes, M. R. and Botana, L. M. (2001). "Modulation of cytosolic calcium levels of human lymphocytes by yessotoxin, a novel marine phycotoxin." Biochem. Pharmacol. 61(7): 827-833.
De la Rosa, L. A., Alfonso, A., Vilarino, N., Vieytes, M. R., Yasumoto, T. and Botana, L. M. (2001). "Maitotoxin-induced calcium entry in human lymphocytes - Modulation by yessotoxin, Ca2+ channel blockers and kinases." Cell Signal 13(10): 711-716.
Houslay, M. D. and Adams, D. R. (2003). "PDE4 cAMP phosphodiesterases: modular enzymes that orchestrate signalling cross-talk, desentization and compartmentalization." Biochem J. 370: 1-18.
Leira, F., Alvarez, C., Vieites, J. M., Vieytes, M. R. and Botana, L. M. (2001). "Okadaic acid and yessotoxin induce caspase-3 mediated apoptosis in neuroblastoma cells. Characterization of distinct apoptotic changes induced by these phycotoxins in the BE(2)-M17 cell line by means of new fluorimetric microplate assays." Toxicology in vitro 15: 277-283.
Malaguti, C., Ciminello, P., Fattorusso, E. and Rossini, G. P. (2002). "Caspase activation and death induced by yessotoxin in HeLa cells." Toxicol in Vitro 16(4): 357-363.
Mann, S. C., Andrews, P. A. and Howell, S. B. (1991). "Modulation of cis-diamminedichloroplatinum(II) accumulation and sensitivity by forskolin and 3-isobutyl-1-methylxanthine in sensitive and resistant human ovarian carcinoma cells." Int J Cancer 48(6): 866-72.
Murata, M., Kumagai, M., Lee, J. S. and Yasumoto, T. (1987). "Isolation and structure of Yessotoxin, a novel polyether compound implicated in diarrhetic shellfish poisoning." Tetrahedron Letters 28: 5869-5872.
Pazos, M. J., Alfonso, A., Vieytes, M. R., Yasumoto, T., Vieites, J. M. and Botana, L. M. (2004). "Resonant mirror biosensor detection method based on yessotoxin-phosphodiesterase interactions." Analytical Biochem. 335: 112-118.
Tubaro, A., Sosa, S., Carbonatto, M., Altinier, G., Vita, F., Melato, M., Satake, M. and Yasumoto, T. (2003). "Oral and intraperitoneal acute toxicity studies of yessotoxin and homoyessotoxins in mice." Toxicon 41(7): 783-92.
von Knethen, A., Lotero, A. and Brune, B. (1998). "Etoposide and cisplatin induced apoptosis in activated RAW 264.7 macrophages is attenuated by cAMP-induced gene expression." Oncogene 17(3): 387-94.
Wang, H., Cai, Q., Zeng, X., Yu, D., Agrawal, S. and Zhang, R. (1999). "Antitumor activity and pharmacokinetics of a mixed-backbone antisense oligonucleotide targeted to the RIalpha subunit of protein kinase A after oral administration." Proc Natl Acad Sci U S A 96(24): 13989-94.
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は側鎖置換で区別されるＹＴＸのいくつかの自然類似物である。
【図１】
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