(57)【要約】【課題】テレフタル酸を原材料とする、生分解性高分子物質の製造方法を提供する。【解決手段】テレフタル酸をプロトカテク酸及び／又は２−ピロン−４，６−ジカルボン酸に変換する反応に関与する遺伝子を含む組換え体ＤＮＡが導入された形質転換体を、テレフタル酸が添加された培地中で培養する工程を含むプロトカテク酸及び／又は２−ピロン−４，６−ジカルボン酸の製造方法。【選択図】図１
2007104942.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された配列を含み、かつ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号２に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項２】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号５に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された配列を含み、かつ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号４に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項３】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号９に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された配列を含み、かつ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼの電子伝達成分としての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号８に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号８に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼの電子伝達成分としての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号７に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された配列を含み、かつ、１，２−ジヒドロキシ−３，５−シクロヘキサジエン−１，４−ジカルボン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号６に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、１，２―ジヒドロキシ―３，５―シクロヘキサジエン―１，４−ジカルボン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項５】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された配列を含み、かつ、プロトカテク酸４，５−ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１５に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１５に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロトカテク酸４，５−ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項６】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１８に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された配列を含み、かつ、プロトカテク酸４，５−ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１７に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１７に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロトカテク酸４，５−ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項７】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号２０に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された配列を含み、かつ、４−カルボキシ−２−ヒドロキシムコン酸−６−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１９に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１９に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、４−カルボキシ−２−ヒドロキシムコン酸−６−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項８】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された配列を含み、かつ、テレフタル酸分解系遺伝子群のポジティブレギュレーターとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１１に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、テレフタル酸分解系遺伝子群のポジティブレギュレーターとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項９】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された配列を含み、かつ、テレフタル酸トランスポーターとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１３に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１３に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、テレフタル酸トランスポーターとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項１０】
少なくとも請求項１〜４記載の全ての遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ。
【請求項１１】
少なくとも請求項１〜４、８、及び９記載の全ての遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ。
【請求項１２】
少なくとも請求項５〜７記載の全ての遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ。
【請求項１３】
少なくとも請求項１〜７記載の全ての遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ。
【請求項１４】
少なくとも請求項１〜９記載の全ての遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ。
【請求項１５】
ターミネーターを含む請求項１０〜１４のいずれか記載の組換え体ＤＮＡ。
【請求項１６】
前記ターミネーターは、ρ非依存性転写ターミネーターである請求項１５記載の組換え体ＤＮＡ。
【請求項１７】
請求項１０〜１６いずれか記載の組換え体ＤＮＡを含むベクター。
【請求項１８】
請求項１７記載のベクターが導入された形質転換体。
【請求項１９】
テレフタル酸が添加された培地中で、請求項１８記載の形質転換体を培養する工程を含む２−ピロン−４，６−ジカルボン酸及び／又はプロトカテク酸の製造方法。
【請求項２０】
受領番号がＦＥＲＭ  ＡＰ−２０６７６であるコマモナス  スピーシーズ（Comamonas  sp.）に属する形質転換体。
【請求項２１】
受領番号がＦＥＲＭ  ＡＰ−２０６７７であるスフィンゴモナス  パウシモビリス（Sphingomonas  paucimobilis）に属する形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、テレフタル酸の代謝に関与する新規遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
テレフタル酸は、石油成分から分離される代表的な芳香族化合物である。テレフタル酸は、比較的安価に入手できることから、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）等の様々な高分子物質の原材料として活用されている（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】特開２００３−１６０６５０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、従来、テレフタル酸を原材料として開発されてきた高分子物質は、例えばＰＥＴのように、難分解性のものが主であった。
【０００４】
近年、地球環境保護の重要性の高まりを受け、環境に与える負荷が大きい難分解性高分子物質の代替物として、生分解性を有する高分子物質の開発が求められている。
【０００５】
そこで、本発明は、テレフタル酸を原材料として、生分解性高分子物質を製造できる手段、及び、生分解性高分子物質の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上述した課題に鑑み、鋭意研究を行った。その結果、テレフタル酸分解能を有する代表的な微生物であるコマモナス  スピーシーズ（Comamonas  sp.）及びスフィンゴモナス  パウシモビリス（Sphingomonas  paucimobilis）に各々属する新規微生物から単離した新規遺伝子群が、テレフタル酸から生分解性高分子物質のモノマーを生成する反応経路に関与することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明は、より具体的には、以下のようなものを提供する。
【０００８】
（１）  以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された配列を含み、かつ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号２に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【０００９】
（２）  以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号５に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された配列を含み、かつ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号４に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００１０】
（３）  以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号９に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された配列を含み、かつ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼの電子伝達成分としての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号８に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号８に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、テレフタル酸ジオキシゲナーゼの電子伝達成分としての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００１１】
（４）  以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号７に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された配列を含み、かつ、１，２−ジヒドロキシ−３，５−シクロヘキサジエン−１，４−ジカルボン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号６に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、１，２−ジヒドロキシ−３，５−シクロヘキサジエン−１，４−ジカルボン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００１２】
（５）  以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された配列を含み、かつ、プロトカテク酸４，５−ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１５に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１５に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロトカテク酸４，５−ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００１３】
（６）  以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１８に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された配列を含み、かつ、プロトカテク酸４，５−ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１７に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１７に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロトカテク酸４，５−ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００１４】
（７）  以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号２０に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された配列を含み、かつ、４−カルボキシ−２−ヒドロキシムコン酸−６−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１９に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１９に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、４−カルボキシ−２−ヒドロキシムコン酸−６−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００１５】
（８）  以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された配列を含み、かつ、テレフタル酸分解系遺伝子群のポジティブレギュレーターとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１１に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、テレフタル酸分解系遺伝子群のポジティブレギュレーターとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００１６】
ここで、「テレフタル酸分解系遺伝子群」は、テレフタル酸からプロトカテク酸を生成する反応に関わる遺伝子の一群を指し、具体的には、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ遺伝子（ｔｐｈＡ２遺伝子、ｔｐｈＡ３遺伝子及び、ｔｐｈＡ１遺伝子）及び、１，２−ジヒドロキシ−３，５−シクロヘキサジエン−１，４−ジカルボン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｔｐｈＢ遺伝子）からなる。
【００１７】
また、「ポジティブレギュレーター」は、テレフタル酸からプロトカテク酸を生成する反応に関わる遺伝子の一群の転写量及びタンパク質合成量を増加させることにより、細胞内における、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ及び１，２−ジヒドロキシ−３，５−シクロヘキサジエン−１，４−ジカルボン酸デヒドロゲナーゼの活性を高める作用を奏する。
【００１８】
（９）  以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された配列を含み、かつ、テレフタル酸トランスポーターとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１３に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１３に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、テレフタル酸トランスポーターとしての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００１９】
上述した（１）〜（９）における「ストリンジェントな条件でハイブリダイズできる塩基配列」とは、例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴｓｅａｒｃｈにより、各々に記載された塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡを挙げることができる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、通常のハイブリダイゼーション緩衝液中、４０〜７０℃（好ましくは、６０〜６５℃）で反応を行い、塩濃度１５〜３００ｍＭ（好ましくは、１５〜６０ｍＭ）の洗浄液中で洗浄を行う条件を挙げることができる。
【００２０】
（１０）  少なくとも（１）〜（４）記載の全ての遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ。
【００２１】
（１１）  少なくとも（１）〜（４）、（８）、及び（９）記載の全ての遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ。
【００２２】
（１２）  少なくとも（５）〜（７）記載の全ての遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ。
【００２３】
（１３）  少なくとも（１）〜（７）記載の全ての遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ。
【００２４】
（１４）  少なくとも（１）〜（９）記載の全ての遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ。
【００２５】
（１５）  ターミネーターを含む（１０）〜（１４）のいずれか記載の組換え体ＤＮＡ。
【００２６】
（１６）  前記ターミネーターは、ρ非依存性転写ターミネーターである（１５）記載の組換え体ＤＮＡ。
【００２７】
（１７）  （１０）〜（１６）いずれか記載の組換え体ＤＮＡを含むベクター。
【００２８】
（１８）  （１７）記載のベクターが導入された形質転換体。
【００２９】
（１９）  テレフタル酸が添加された培地中で、（１８）記載の形質転換体を培養する工程を含む２−ピロン−４，６−ジカルボン酸及び／又はプロトカテク酸の製造方法。
【００３０】
（２０）  受領番号がＦＥＲＭ  ＡＰ−２０６７６であるコマモナス  スピーシーズ（Comamonas  sp．）に属する形質転換体。
【００３１】
（２１）  受領番号がＦＥＲＭ  ＡＰ−２０６７７であるスフィンゴモナス  パウシモビリス（Sphingomonas  paucimobilis）に属する形質転換体。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の新規遺伝子によれば、テレフタル酸を出発物質とする特定の反応経路が促進されるので、２−ピロン−４，６−ジカルボン酸を生成できる。そして、この２−ピロン−４，６−ジカルボン酸を石油系高分子材料（例えば、前述したＰＥＴ）と共重合等することにより、生分解性高分子物質を製造できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下、本発明の実施形態について、図面を参照しながら説明する。
本発明は、新規遺伝子等を利用することにより、テレフタル酸を原材料とし、プロトカテク酸を経由して、２−ピロン−４，６−ジカルボン酸を生成する製造方法である。
【００３４】
図１は、テレフタル酸を原材料とし、プロトカテク酸を経由して、２−ピロン−４，６−ジカルボン酸が生成される反応経路の概略を示す図である。
即ち、まず、テレフタル酸に対し、テレフタル酸ジオキシゲナーゼが作用することにより、不安定な中間生成物である１，２−ジヒドロキシ−１，４−ジカルボキシ−３，５−シクロヘキサジエンが生成される。次に、この１，２−ジヒドロキシ−１，４−ジカルボキシ−３，５−シクロヘキサジエンに対し、１，２−ジヒドロキシ−１，４−ジカルボキシ−３，５−シクロヘキサジエンデヒドロゲナーゼが作用することにより、プロトカテク酸が生成される。
そして、プロトカテク酸に対して、プロトカテク酸４，５−ジオキシゲナーゼが作用することにより、不安定な中間生成物である４−カルボキシ−２−ヒドロキシムコン酸−６−セミアルデヒドが生成される。次に、この４−カルボキシ−２−ヒドロキシムコン酸−６−セミアルデヒドに対して、４−カルボキシ−２−ヒドロキシムコン酸−６−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼが作用することにより、２−ピロン−４，６−ジカルボン酸が生成される。
【００３５】
＜遺伝子＞
［テレフタル酸からプロトカテク酸を生成する反応に関与する遺伝子］
前述した（１）〜（４）記載の遺伝子は、テレフタル酸からプロトカテク酸を生成する反応に関与する。
【００３６】
即ち、（１）記載の遺伝子の産物であるｔｐｈＡ２タンパク質、（２）記載の遺伝子の産物であるｔｐｈＡ３タンパク質、（３）記載の遺伝子の産物であるｔｐｈＡ１タンパク質は、互いに会合することにより、テレフタル酸を分解して１，２−ジヒドロキシ−１，４−ジカルボキシ−３，５−シクロヘキサジエンを生成する、テレフタル酸ジオキシゲナーゼのサブユニットとしての活性を示す。
また、（４）記載の遺伝子の産物であるｔｐｈＢタンパク質は、１，２−ジヒドロキシ−１，４−ジカルボキシ−３，５−シクロヘキサジエンを分解してプロトカテク酸を生成する、１，２−ジヒドロキシ−１，４−ジカルボキシ−３，５−シクロヘキサジエンデヒドロゲナーゼとしての活性を示す。
【００３７】
また、前述した（８）〜（９）記載の遺伝子は、（１）〜（４）記載の遺伝子による、テレフタル酸からプロトカテク酸の生成をより促進することに関与する。
即ち、（８）記載の遺伝子の産物であるｔｐｈＲタンパク質は、テレフタル酸の分解反応を促進するポジティブレギュレーター（ｔｐｈＲタンパク質）としての活性を示し、テレフタル酸の細胞内取り込み及び分解代謝に関与する遺伝子の発現を促す。
また、（９）記載の遺伝子の産物であるｔｐｈＣタンパク質は、反応が行われる場となる細胞内にテレフタル酸を取り込む（換言すれば、テレフタル酸の膜透過機能を有する）テレフタル酸トランスポーターとしての活性を示す。
【００３８】
配列番号３、５、９記載のアミノ酸配列を有する３種類のポリペプチド（ｔｐｈＡ２タンパク質、ｔｐｈＡ３タンパク質、ｔｐｈＡ１タンパク質）は、互いに会合することにより、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ酵素活性を示す。このテレフタル酸ジオキシゲナーゼ酵素活性により、テレフタル酸は、不安定な中間生成物１，２−ジヒドロキシ−１，４−ジカルボキシ−３，５−シクロヘキサジエンに変換される。配列番号７記載のポリペプチド（ｔｐｈＢタンパク質）は、１，２−ジヒドロキシ−１，４−ジカルボキシ−３，５−シクロヘキサジエンデヒドロゲナーゼ活性を示す。この１，２−ジヒドロキシ−１，４−ジカルボキシ−３，５−シクロヘキサジエンデヒドロゲナーゼ活性により、１，２−ジヒドロキシ−１，４−ジカルボキシ−３，５−シクロヘキサジエンは、安定なプロトカテク酸に迅速に変換される。
【００３９】
［プロトカテク酸から２−ピロン−４，６−ジカルボン酸を生成する反応に関わる遺伝子］
前述した（５）〜（７）記載の遺伝子は、プロトカテク酸から２−ピロン−４，６−ジカルボン酸を生成する反応に関与する。
【００４０】
即ち、（５）記載の遺伝子の産物であるｌｉｇＡタンパク質、（６）記載の遺伝子の産物であるｌｉｇＢタンパク質は、互いに会合することにより、プロトカテク酸を分解して４−カルボキシ−２−ヒドロキシムコン酸−６−セミアルデヒドを生成する、プロトカテク酸４，５−ジオキシゲナーゼとしての活性を示す。
また、（７）記載の遺伝子の産物であるｌｉｇＣタンパク質は、４−カルボキシ−２−ヒドロキシムコン酸−６−セミアルデヒドを分解して２−ピロン−４，６−ジカルボン酸を生成する、４−カルボキシ−２−ヒドロキシムコン酸−６−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼとしての活性を示す。
【００４１】
配列番号２１記載の塩基配列（ρ非依存性の転写ターミネーター配列）をテレフタル酸から２−ピロン−４，６−ジカルボン酸およびプロトカテク酸を生成する反応に関与する遺伝子の最下流に配置した組換え体ＤＮＡ、即ち（１６）記載の組換え体ＤＮＡは、テレフタル酸から２−ピロン−４，６−ジカルボン酸を生成する反応に関与する遺伝子の転写量、及びタンパク質合成量を増加させることにより、２−ピロン−４，６−ジカルボン酸を生成する反応に関与する酵素の一群の活性を高めることができる。
【００４２】
［遺伝子の取得方法］
上述した遺伝子は、例えば、以下のような方法で取得することができる。
即ち、まず、所定の微生物のゲノムＤＮＡを抽出し、抽出したゲノムＤＮＡを制限酵素により切断することで、ゲノムＤＮＡ断片を得る。一方、ファージ、プラスミド等のベクターを、同じ制限酵素末端を得られる制限酵素により切断することで、制限酵素末端を得る。次いで、これらゲノムＤＮＡ断片及び制限酵素末端を、ＤＮＡリガーゼにより結合させることで、ゲノムＤＮＡ断片を含むベクターが得られる。
そして、これらのベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体群を作製する。この形質転換体群の中から、本発明の遺伝子であるゲノムＤＮＡ断片を含むベクターが導入された形質転換体を選択し、選択した形質転換体からベクターを分離することにより、本発明の遺伝子を取得できる。
【００４３】
（所定の微生物）
（１）〜（４）、（８）〜（９）記載の遺伝子を取得する場合、所定の微生物は、テレフタル酸からプロトカテク酸を生成する酵素である、テレフタル酸ジオキシゲナーゼ、１，２−ジヒドロキシ−１，４−ジカルボキシ−３，５−シクロヘキサジエンデヒドロゲナーゼを合成できる微生物であれば特に限定されず、例えば、コマモナス  スピーシーズ（Comamonas  sp.）Ｅ６株を挙げることができる。なお、コマモナス  スピーシーズ（Comamonas  sp.）Ｅ６株は、例えば、ＬＢ培地中、２８℃で２３時間培養することにより、充分量の菌体量にまで増殖させることができる。
【００４４】
また、（５）〜（７）記載の遺伝子を取得する場合、所定の微生物は、プロトカテク酸から２−ピロン−４，６−ジカルボン酸を生成する酵素である、プロトカテク酸４，５−ジオキシゲナーゼ、４−カルボキシ−２−ヒドロキシムコン酸−６−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼを合成できる微生物であれば特に限定されず、例えば、スフィンゴモナス  パウシモビリス（Sphingomonas  paucimobilis）ＳＹＫ−６株を挙げることができる。なお、スフィンゴモナス  パウシモビリス（Sphingomonas  paucimobilis）ＳＹＫ−６株は、例えば、ＬＢ培地中、２８℃で２３時間培養することにより、充分量の菌体量にまで増殖させることができる。
【００４５】
更に、２−ピロン−４，６−ジカルボン酸又はプロトカテク酸の分解酵素機能や、テレフタル酸および中間生成物に対する修飾・変換酵素機能を消失させた形質転換体を用いてもよい。
【００４６】
例えば、（１）〜（４）、（８）〜（９）記載の遺伝子を取得する場合、上述したコマモナス  スピーシーズ（Comamonas  sp.）Ｅ６株の２−ピロン−４，６−ジカルボン酸分解酵素遺伝子を欠損させた形質転換体であるコマモナス  スピーシーズ（Comamonas  sp.）ＤＰＩ株（受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０６７６）が挙げられる。
【００４７】
（ゲノムＤＮＡの抽出）
これらの微生物からのゲノムＤＮＡの抽出は、例えば、以下のような方法で行うことができる。
即ち、まず、所定時間培養した微生物の菌体を集菌し、プロテアーゼＫにより菌体を溶菌する。溶菌した後、アルコールを添加して塩析されたゲノムＤＮＡを遠心分離により沈殿させることにより、ゲノムＤＮＡを取得できる。ここで、除タンパク質処理（例えば、フェノール抽出法）、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理等を適宜組み合わせて行うのが、取得するゲノムＤＮＡの純度を向上させる点で、好ましい。
【００４８】
（ベクター）
取得したゲノムＤＮＡの断片化は、例えば、このゲノムＤＮＡの制限酵素の消化により行うことができる。
【００４９】
また、ゲノムＤＮＡ断片を挿入するベクターとしては、導入された細胞内で自律的に増殖できるファージ、プラスミドであれば特に限定されないが、操作を容易化する点で、組換えベクターを目的として構築されたものを用いるのが好ましい。組換えベクターを目的として構築されたプラスミドとしては、例えば、大腸菌を宿主とする「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ」、「ｐＵＣ１１９」、「ｐＵＣ１１８」、「ｐＫＴ２３０ＭＣ」（後述する図２、３、５参照）等が挙げられる。
【００５０】
これらのベクターは、例えば制限酵素を用いてＤＮＡ断片が挿入可能な制限酵素末端を作成し、必要に応じてこの制限酵素末端を脱リン酸化処理した後に用いられる。また、ゲノムＤＮＡ断片及び制限酵素末端の結合は、公知のＤＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ）を用いて行うことができる。
【００５１】
（宿主細胞）
ベクターを導入する宿主細胞としては、このベクターが安定的かつ自律的に複製でき、更に、外来性遺伝子の形質を安定的に発現できるものであれば特に限定されず、例えば大腸菌やシュードモナス  プチダ（Pseudomonas  putida）を挙げることができる。
【００５２】
また、宿主細胞にベクターを導入する方法としては、周知の方法、例えば、接合法、エレクトロポレーション法、コンピテントセル法を挙げることができる。そして、形質転換体群は、導入したベクターに含まれる選択マーカー（例えば、薬剤耐性）を指標に選抜できる。
【００５３】
（選択）
これらの形質転換体群の中から本発明の遺伝子を含むベクターが導入された形質転換体を選択するのは、例えば、本発明の遺伝子のＤＮＡ断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法により行うことができる。なお、このプローブの標識は、例えば、放射性同位元素、ジゴキシゲニン、酵素処理により行うことができる。
【００５４】
選択された形質転換体からのベクターの抽出は、宿主細胞として用いた微生物の種類に応じて、適宜選択すればよい。例えば、アルカリ溶菌法（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ発行、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９年））が挙げられる。なお、抽出したベクターは、必要に応じて、周知のＤＮＡ組換え技術を利用して再度組換えることもできる。
そして、抽出したベクターから本発明の遺伝子を分離するのは、例えば、制限酵素処理により行うことができる。
【００５５】
このようにして得られる本発明の遺伝子は、例えばダイデオキシ法により塩基配列を解読し、決定できる。配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９記載の塩基配列は、このようにして決定される、本発明の遺伝子の塩基配列の一例である。
【００５６】
＜組換え体ＤＮＡ＞
【００５７】
取得した本発明の遺伝子は、所定の組み合わせで、組み換えることができる。
【００５８】
例えば、上流から順に、配列番号３、５、９記載のアミノ酸配列を各々有する３種類のポリペプチド（ｔｐｈＡ２タンパク質、ｔｐｈＡ３タンパク質、ｔｐｈＡ１タンパク質）を各々コードする遺伝子の塩基配列（ｔｐｈＡ２遺伝子；配列番号２、ｔｐｈＡ３遺伝子；配列番号４、ｔｐｈＡ１遺伝子；配列番号８）を有し、さらに、ｔｐｈＡ３遺伝子の塩基配列とｔｐｈＡ１遺伝子の塩基配列との間に、配列番号７記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ｔｐｈＢタンパク質）をコードする遺伝子の塩基配列（ｔｐｈＢ遺伝子；配列番号６）を備える組換え体ＤＮＡ（配列番号１記載の塩基配列）は、前述した（１０）記載の組換え体ＤＮＡの一例として、適用できる。
この組換え体ＤＮＡによれば、ｔｐｈＢ遺伝子をｔｐｈＡ３遺伝子とｔｐｈＡ１遺伝子との間に配置したので、１，２−ジヒドロキシ−１，４−ジカルボキシ−３，５−シクロヘキサジエンデヒドロゲナーゼが、テレフタル酸ジオキシゲナーゼと同調して合成されるから、テレフタル酸からプロトカテク酸への生成反応を効率的に行うことができる。
【００５９】
さらに、その下流にターミネーターをコードする遺伝子の塩基配列を備える組換え体ＤＮＡは、前述した（１５）記載の組換え体ＤＮＡの一例として、適用できる。このターミネーターは、ρ非依存性の転写ターミネーターであることが好ましく、この一例として、配列番号２１記載の塩基配列を備えるターミネーターが挙げられる（前述した（１６）記載の組換え体ＤＮＡの一例）。
【００６０】
また、この配列番号１記載の塩基配列の上流に、配列番号１２および１４記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ｔｐｈＲタンパク質、ｔｐｈＣタンパク質）を各々コードする遺伝子の塩基配列（ｔｐｈＲ遺伝子；配列番号１１、ｔｐｈＣ遺伝子；配列番号１３）を含む配列番号１０記載の塩基配列を備える組換え体ＤＮＡは、前述した（１１）記載の組換え体ＤＮＡの一例として、適用できる。
【００６１】
さらに、その下流にターミネーターをコードする遺伝子の塩基配列を備える組換え体ＤＮＡは、前述した（１５）記載の組換え体ＤＮＡの一例として、適用できる。このターミネーターは、ρ非依存性の転写ターミネーターであることが好ましく、この一例として、配列番号２１記載の塩基配列を備えるターミネーターが挙げられる（前述した（１６）記載の組換え体ＤＮＡの一例）。
【００６２】
また、上流から順に、配列番号１６、１８、２０記載のアミノ酸配列を各々有する３種類のポリペプチド（ｌｉｇＡタンパク質、ｌｉｇＢタンパク質、ｌｉｇＣタンパク質）を各々コードする遺伝子の塩基配列（ｌｉｇＡ遺伝子；配列番号１５、ｌｉｇＢ遺伝子；配列番号１７、ｌｉｇＣ遺伝子；配列番号１９）を備える組換え体ＤＮＡは、前述した（１２）記載の組換え体ＤＮＡの一例として、適用できる。
【００６３】
さらに、その下流にターミネーターをコードする遺伝子の塩基配列を備える組換え体ＤＮＡは、前述した（１５）記載の組換え体ＤＮＡの一例として、適用できる。このターミネーターは、ρ非依存性の転写ターミネーターであることが好ましく、この一例として、配列番号２１記載の塩基配列を備えるターミネーターが挙げられる（前述した（１６）記載の組換え体ＤＮＡの一例）。
【００６４】
配列番号１記載の塩基配列、かつ配列番号２２記載の塩基配列を備える組換え体ＤＮＡは、前述した（１３）記載の組換え体ＤＮＡの一例として、適用できる。
【００６５】
配列番号１０記載の塩基配列、配列番号１記載の塩基配列、かつ配列番号２２記載の塩基配列を備える組換え体ＤＮＡは、前述した（１４）記載の組換え体ＤＮＡの一例として、適用できる。
【００６６】
配列番号１０記載の塩基配列、配列番号１記載の塩基配列、かつ配列番号２２記載の塩基配列を備える組換え体ＤＮＡは、前述した（１５）又は（１６）記載の組換え体ＤＮＡの一例として、適用できる。
【００６７】
配列番号２２記載の塩基配列は、その一部に配列番号１６、１８、２０記載のアミノ酸配列を有する３種類のポリペプチドをコードする遺伝子（ｌｉｇＡ遺伝子；配列番号１５、ｌｉｇＢ遺伝子；配列番号１７、ｌｉｇＣ遺伝子；配列番号１９）を含み、更に、その下流に配列番号２１記載の塩基配列を含むターミネーターを有する。このターミネーターにおいては、ｌｉｇＣ遺伝子領域の終止コドン配列から２４塩基下流に、逆向き相補配列（インバーティドリピート）が存在し、この逆向き相補配列の直後（位置２６８８〜２７０６）に６個のチミンが連続するρ非依存性の転写ターミネーターが配置されている。
【００６８】
ｌｉｇＢ遺伝子の下流の領域には、ｌｉｇＣ遺伝子のプロモーター配列が重複して配置されている。このｌｉｇＣプロモーターの働きにより、ｌｉｇＣ遺伝子の転写量が増加し、より多くのｌｉｇＣタンパク質が合成される。配列番号２２記載の塩基配列を広宿主域性のベクター（例えば、後述する「ｐＫＴ２３０ＭＣ」）が備えるプロモーターの下流に連結して作製されるベクターは、このプロモーターの作用により、多様な微生物で複製・増殖される。このため、このベクターが導入された形質転換体によれば、ｌｉｇＡタンパク質、ｌｉｇＢタンパク質、ｌｉｇＣタンパク質を同調的に合成して、プロトカテク酸から２−ピロン−４，６−ジカルボン酸の生成反応を安定的に進めることができる。
【００６９】
＜ベクター＞
［テレフタル酸を分解してプロトカテク酸を生成する反応に関与する遺伝子を含むベクター］
配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片の上流域に、配列番号１０記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片を結合させたＤＮＡ断片、あるいは、さらにこのＤＮＡ断片に配列番号２１記載のターミネーターを結合したＤＮＡ断片を、「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ」、「ｐＵＣ１１９」、「ｐＵＣ１１８」および、「ｐＫＴ２３０ＭＣ」等のベクターに、そのマルチクローニングサイトにおいて結合させたベクターは、（１７）記載のベクターの一例として適用できる。
【００７０】
配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片、あるいは、配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片に配列番号２１記載のターミネーターを結合したＤＮＡ断片を、「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ」、「ｐＵＣ１１９」、「ｐＵＣ１１８」および、「ｐＫＴ２３０ＭＣ」などのベクターに、そのマルチクローニングサイトにおいて結合させたベクターは、（１７）記載のベクターの一例として適用できる。
配列番号１０記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片、配列番号１記載のＤＮＡ断片および、配列番号２１記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片を「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ」、「ｐＵＣ１１９」、「ｐＵＣ１１８」および、「ｐＫＴ２３０ＭＣ」等のベクターに、そのマルチクローニングサイトにおいて結合させたベクターは、（１７）記載のベクターの一例として適用できる。
【００７１】
これらのベクターによれば、大腸菌などの形質転換体において、テレフタル酸からプロトカテク酸を高効率で生成できる。
【００７２】
［プロトカテク酸を分解して２−ピロン−４，６−ジカルボン酸を生成する反応に関与する遺伝子を含むベクター］
配列番号２２記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片を、「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ」、「ｐＵＣ１１９」、「ｐＵＣ１１８」および、「ｐＫＴ２３０ＭＣ」等のベクターに、そのマルチクローニングサイトにおいて結合させたベクターは、（１７）記載のベクターの一例として適用できる。
このベクターによれば、大腸菌などの形質転換体において、プロトカテク酸から２−ピロン−４，６−ジカルボン酸を高効率で生成できる。
【００７３】
［テレフタル酸を分解して２−ピロン−４，６−ジカルボン酸を生成する反応に関与する遺伝子を含むベクター］
配列番号１０記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片、配列番号１記載のＤＮＡ断片および、配列番号２２記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片を「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ」、「ｐＵＣ１１９」、「ｐＵＣ１１８」および、「ｐＫＴ２３０ＭＣ」等のベクターに、そのマルチクローニングサイトにおいて結合させたベクターは、（１７）記載のベクターの一例として適用できる。
このベクターによれば、大腸菌などの形質転換体において、テレフタル酸から２−ピロン−４，６−ジカルボン酸を高効率で生成できる。
【００７４】
＜形質転換体＞
本発明に係る形質転換体は、前述したベクターを、常法に従って所定の宿主細胞に導入することにより作製できる。
【００７５】
所定の宿主細胞としては、２−ピロン−４，６−ジカルボン酸に対する分解酵素機能を保持しない細胞、あるいは消失させた形質転換体であればよく、例えば、大腸菌、シュードモナス属細菌、テレフタル酸分解微生物コマモナス  スピーシーズ（Comamonas  sp.）Ｅ６株のｐｍｄＩ（２−ピロン−４，６−ジカルボン酸に対する分解酵素遺伝子）欠損株であるコマモナス  スピーシーズ（Comamonas  sp.）ＤＰＩ株が挙げられる。
【００７６】
宿主細胞にベクターを導入する方法としては、例えば、接合法、エレクトロポレーション法、コンピテントセル法が挙げられる。そして、薬剤耐性等のマーカーにより、形質転換体を選抜する。
【００７７】
＜コマモナス  スピーシーズに属する形質転換体＞
受領番号がＦＥＲＭ  ＡＰ−２０６７６であるコマモナス  スピーシーズ（Comamonas  sp.）ＤＰＩ株は、コマモナス  スピーシーズ（Comamonas  sp.）Ｅ６株から、ｐｍｄＩ遺伝子（２−ピロン−４，６−ジカルボン酸分解酵素遺伝子）が欠損された形質転換体である。
この形質転換体によれば、２−ピロン−４，６−ジカルボン酸の分解が抑制されるから、生成された２−ピロン−４，６−ジカルボン酸を高効率で蓄積できる。
【００７８】
このコマモナス  スピーシーズの形質転換体は、例えば、後述するベクター「ｐＨＥ９６Ｒ−ＬＡＢＣＴ／ｐＫＴ２３０ＭＣ」を導入することで作製でき、テレフタル酸を原材料とする２−ピロン−４，６−ジカルボン酸の製造方法に使用できる。
【００７９】
ｐｍｄＡＢＣ（プロトカテク酸分解酵素遺伝子）が欠損された、コマモナス  スピーシーズ（Comamonas  sp.）に属する形質転換体は、コマモナス  スピーシーズ（Comamonas  sp.）Ｅ６株から、公知の形質転換法により作成することができる（例えば、特開２００３−６１６７０号公報、段落番号００７７〜段落番号００８０参照）。
この形質転換体によれば、プロトカテク酸の分解が抑制されるから、生成されたプロトカテク酸を高効率で蓄積できる。
なお、このｐｍｄＡＢＣ遺伝子が欠損された形質転換体は、コマモナス  スピーシーズ（Comamonas  sp.）Ｅ６からのみではなく、受領番号がＦＥＲＭ  ＡＰ−２０６７６であるコマモナス  スピーシーズ（Comamonas  sp.）ＤＰＩ株からでも作製できる。
【００８０】
このコマモナス  スピーシーズの形質転換体は、例えば、後述するベクター「ｐＨＥ９６Ｒ−Ｔ／ｐＫＴ２３０ＭＣ」を導入することで作製でき、テレフタル酸を原材料とするプロトカテク酸の製造方法に使用できる。
【００８１】
＜２−ピロン−４，６−ジカルボン酸の製造方法＞
２−ピロン−４，６−ジカルボン酸は、例えば、以下のような方法で生成できる。
即ち、まず、後述するベクター「ｐＨＥ９６Ｒ−ＬＡＢＣＴ／ｐＫＴ２３０ＭＣ」が導入された形質転換体（例えば、シュードモナス属細菌、コマモナス属細菌）を、約５ＬのＬＢ培地内で、２７〜２８℃で約１６時間培養する。培地には、ベクターの脱落を防止するために、抗生物質（例えば、カナマイシン）を添加しておく。
菌体濃度がＯＤ６６０において１３〜１４程度になるまで培養した形質転換細胞の懸濁液に、テレフタル酸約１６ｇを溶解させたＮａＯＨ溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ８〜９）約５００ｍＬを、５〜６時間かけて添加する。反応の進行に伴って生成される２−ピロン−４，６−ジカルボン酸による培地ｐＨの低下を防ぐため、ＮａＯＨ溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ）を少量ずつ添加する。この反応を、２７〜２８℃で行う。反応時間については、得たい２−ピロン−４，６−ジカルボン酸の収量に応じて、適宜設定することができるが、たとえば、４８時間以上反応させることが好ましい。
反応液に塩酸を加え、ｐＨを２〜３とすることで、反応を停止させる。この反応液を遠心分離し、菌体成分を沈殿させて除去する。得られた上清に、更に塩酸を添加することにより、ｐＨを約１に低下させる。この上清を低温（４〜５℃）で静置することにより、２−ピロン−４，６−ジカルボン酸が沈殿となり、この沈殿を分離することで２−ピロン−４，６−ジカルボン酸が得られる。
なお、得られた２−ピロン−４，６−ジカルボン酸は、活性炭処理により、さらに純度を向上できる。
【００８２】
この製造方法によれば、２−ピロン−４，６−ジカルボン酸を高収率で得ることができる。
【００８３】
＜プロトカテク酸の製造方法＞
プロトカテク酸は、例えば、以下のような方法で製造できる。
即ち、後述するベクター「ｐＨＥ９６Ｒ−Ｔ／ｐＫＴ２３０ＭＣ」が導入された形質転換体（例えば、シュードモナス属細菌、コマモナス属細菌）を、約５ＬのＬＢ培地内で、２７〜２８℃で約１６時間培養する。培地には、ベクターの脱落を防止するために、抗生物質（例えば、カナマイシン）を添加しておく。
菌体濃度がＯＤ６６０において１３〜１４程度になるまで培養した形質転換細胞の懸濁液に、テレフタル酸約１６ｇを溶解させたＮａＯＨ溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ８〜９）約５００ｍＬを、５〜６時間かけて添加する。反応の進行に伴って生成されるプロトカテク酸による培地ｐＨの低下を防ぐため、ＮａＯＨ溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ）を少量ずつ添加する。この反応を、２７〜２８℃で行う。反応時間については、得たいプロトカテク酸の収量に応じて、適宜設定することができるが、たとえば、４８時間以上反応させることが好ましい。
この反応液から、酢酸エチルエステルで抽出分離することにより、プロトカテク酸が得られる。
【００８４】
この製造方法によれば、プロトカテク酸を高収率で得ることができる。
【実施例】
【００８５】
＜実施例１＞  ｐＨＥ９６／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）
図２は、本発明に係る組換え体ＤＮＡを含むベクターの製法及び構造を示す概略図である。そして、「ｐＨＥ９６／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）」は、（１１）記載の組換え体ＤＮＡを含むベクター、換言すれば、（１７）記載のベクターの一例である。
即ち、ベクター「ｐＨＥ９６／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）」は、配列番号１０記載の塩基配列を含むＤＮＡ断片が配列番号１記載の塩基配列を含むＤＮＡ断片の上流に結合された組換え体ＤＮＡを、公知の大腸菌プラスミド「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）」内に挿入して構成したものである。なお、この組換え体ＤＮＡは、この「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）」が備えるマルチクローニングサイト内に存在する制限酵素ＥｃｏＲI切断部位に挿入した。
【００８６】
＜実施例２＞  ｐＨＥ９６Ｒ−／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）
図４は、本発明に係る組換え体ＤＮＡを含むベクターの製法及び構造を示す概略図である。そして、「ｐＨＥ９６Ｒ−／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）」は、（１１）記載の組換え体ＤＮＡを含むベクター、換言すれば、（１７）記載のベクターの一例である。
即ち、ベクター「ｐＨＥ９６Ｒ−／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）」は、配列番号１３記載の塩基配列を備え、ｔｐｈＣ遺伝子をコードする遺伝子の塩基配列の上流に制限酵素ＢａｍＨＩ切断部位を有するように設計されたＤＮＡ断片と、配列番号１に示される塩基配列を持つＤＮＡ断片とからなる組換え体ＤＮＡとを公知の大腸菌プラスミド「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）」に挿入したものである。なお、この組換え体ＤＮＡは、この「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）」が備えるマルチクローニングサイト内に存在する制限酵素ＢａｍＨＩ切断部位及び制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位において挿入されている。
【００８７】
これにより、配列番号１３記載の塩基配列を含むＤＮＡ、および配列番号１記載の塩基配列を含むＤＮＡは、「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）」が備えるｌａｃＺプロモーターの下流に位置するように配置される。
【００８８】
（ｐＨＥ９６Ｒ−／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）の作製法）
「ｐＨＥ９６Ｒ−／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）」は、例えば、以下のような方法で作製した。
即ち、まず、ベクター「ｐＨＥ９６／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）」内に挿入されているｔｐｈＣ遺伝子領域を、Ｕｎｉプライマー（制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列を含む）およびＲｅｖプライマー（制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ認識配列を含む）を用いてＰＣＲ法により、選択的に増幅した。なお、Ｕｎｉプライマー及びＲｅｖプライマーの塩基配列は、次の通りであった。
Ｕｎｉプライマー配列：５’−AGTCGGTCCCATCCTCATACTGCAGTTC−３’
Ｒｅｖプライマー配列：５’−ATCGCTCGAGAATTCGATGAACTGAGCAGTCTTG−３’
【００８９】
次に、この選択的に増幅した断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよび制限酵素ＸｈｏＩにより切断することにより得られるＤＮＡ断片を、「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）」をマルチクローニングサイトに存在する制限酵素ＢａｍＨＩおよび制限酵素ＸｈｏＩにより切断して得られる制限酵素末端と、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより結合することにより、ハイブリッドプラスミド「ｐｔｐｈＣ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）」を作製した（図３の中段）。
【００９０】
そして、この「ｐｔｐｈＣ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）」を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよび制限酵素ＥｃｏＲＩにより切断し、「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）」に由来する塩基配列を含むＤＮＡ断片を抽出した。この抽出したＤＮＡ断片を、「ｐＨＥ９６／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）」をマルチクローニングサイトに存在する制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよび制限酵素ＥｃｏＲＩにより切断して得られるＤＮＡ断片と、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより結合することにより、ベクター「ｐＨＥ９６Ｒ−／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）」を作製した。
【００９１】
＜実施例３＞  ｐＬＧ２００／ｐＵＣ１１９
図４は、本発明に係る組換え体ＤＮＡを含むベクターの製法及び構造を示す概略図である。そして、「ｐＬＧ２００／ｐＵＣ１１９」は、（１２）記載の組換え体ＤＮＡを含むベクター、換言すれば、（１７）記載のベクターの一例である。
即ち、ベクター「ｐＬＧ２００／ｐＵＣ１１９」は、配列番号２２記載の塩基配列を含む組換え体ＤＮＡを、公知の大腸菌プラスミド「ｐＵＣ１１９」に挿入して構成したものである。なお、この組換え体ＤＮＡは、この「ｐＵＣ１１９」が備えるマルチクローニングサイト内に存在する制限酵素ＸｂａＩ切断部位において挿入した。
【００９２】
＜実施例４＞  ｐＫＴＬＡＢＣＴ
図５は、本発明に係る組換え体ＤＮＡを含むベクターの製法及び構造を示す概略図である。そして、「ｐＫＴＬＡＢＣＴ」は、（１２）記載の組換え体ＤＮＡを含むベクター、換言すれば、（１７）記載のベクターの一例である。
即ち、広宿主域性を有するベクター「ｐＫＴＬＡＢＣＴ」は、配列番号２２記載の塩基配列を含む組換え体ＤＮＡを、公知の広宿主域プラスミド「ｐＫＴ２３０ＭＣ」に挿入したものである。なお、この組換え体ＤＮＡは、この「ｐＫＴ２３０ＭＣ」が備えるマルチクローニングサイト内に存在する制限酵素ＸｂａＩ切断部位において挿入した。
このｐＫＴＬＡＢＣＴは、シュードモナス属細菌（例えば、Pseudomonas  putida）やコマモナス属細菌（例えば、Comamonas  sp.）等において複製できる。
【００９３】
＜実施例５＞  ｐＨＥ９６Ｒ−ＬＡＢＣＴ／ｐＫＴ２３０ＭＣ
図６は、本発明に係る組換え体ＤＮＡを含むベクターの製法及び構造を示す概略図である。そして、「ｐＨＥ９６Ｒ−ＬＡＢＣＴ／ｐＫＴ２３０ＭＣ」は、（１３）記載の組換え体ＤＮＡを含むベクター、換言すれば、（１７）記載のベクターの一例である。
即ち、広宿主域性を有するベクター「ｐＨＥ９６Ｒ−ＬＡＢＣＴ／ｐＫＴ２３０ＭＣ」は、ｌａｃＺプロモーター、配列番号１３で示される塩基配列、配列番号１で示される塩基配列を、ベクター「ｐＫＴＬＡＢＣＴ」に挿入することにより構成したものである。なお、この組換え体ＤＮＡは、この「ｐＫＴＬＡＢＣＴ」内に存在する制限酵素ＸｂａＩ切断部位のうち、配列番号２２記載の塩基配列の上流に存在するＸｂａＩ切断部位において、挿入したものである。
【００９４】
（ｐＨＥ９６Ｒ−ＬＡＢＣＴ／ｐＫＴ２３０ＭＣの作製法）
ベクター「ｐＫＴＬＡＢＣＴ」を、このベクター内に存在する２つの制限酵素ＸｂａＩ切断部位のうち、ｌｉｇＡ遺伝子の塩基配列の上流に存在するＸｂａＩ切断部位のみにおいて、切断した。この制限酵素ＸｂａＩによる部分切断によって得られるＤＮＡ断片に、「ｐＨＥ９６Ｒ−／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）」を制限酵素ＶｓｐＩ及びＥｃｏＲＩにより切断して得られるＤＮＡ断片を、配列番号２２記載の塩基配列がｌａｃＺプロモーターの下流に位置するように、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結することにより、ベクター「ｐＨＥ９６Ｒ−ＬＡＢＣＴ／ｐＫＴ２３０ＭＣ」を作製した。
【００９５】
＜実施例６＞  ｐＨＥ９６Ｒ−Ｔ／ｐＫＴ２３０ＭＣ
図７は、本発明に係る組換え体ＤＮＡを含むベクターの製法及び構造を示す概略図である。そして、「ｐＨＥ９６Ｒ−Ｔ／ｐＫＴ２３０ＭＣ」は、（１０）記載の組換え体ＤＮＡを含むベクター、換言すれば、（１７）記載のベクターの一例である。
即ち、広宿主域性を有するベクター「ｐＨＥ９６Ｒ−ＬＡＢＣＴ／ｐＫＴ２３０ＭＣ」は、ベクター「ｐＨＥ９６Ｒ−ＬＡＢＣＴ／ｐＫＴ２３０ＭＣ」から、配列番号１５、配列番号１７および、配列番号１９記載の塩基配列を含むＤＮＡ断片が除去されて構成したものである。
【００９６】
これにより、ベクター「ｐＨＥ９６Ｒ−Ｔ／ｐＫＴ２３０ＭＣ」は、「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）」に由来するｌａｃＺプロモーターを有し、このｌａｃＺプロモーターの下流に配列番号１３記載の塩基配列および、配列番号１記載の塩基配列が配置されている。
【００９７】
（ｐＨＥ９６Ｒ−Ｔ／ｐＫＴ２３０ＭＣの作製法）
前述したベクター「ｐＨＥ９６Ｒ−ＬＡＢＣＴ／ｐＫＴ２３０ＭＣ」を、このベクター内に存在する制限酵素ＮｄｅＩおよび制限酵素ＳａｌＩ切断部位において切断し、ＤＮＡ断片を抽出した。このＤＮＡ断片に対して、平滑化酵素による末端平滑化処理を行った後、平滑化された末端同士をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結することにより、ベクター「ｐＨＥ９６Ｒ−Ｔ／ｐＫＴ２３０ＭＣ」を作製した。
【００９８】
＜実施例７＞  シュードモナス  プチダ（Pseudomonas  putida）ＰｐＹ１１００（ｐＨＥ９６Ｒ−ＬＡＢＣＴ／ｐＫＴ２３０ＭＣ）株、コマモナス  スピーシーズ（Comamonas  sp.）ＤＰＩ（ｐＨＥ９６Ｒ−ＬＡＢＣＴ／ｐＫＴ２３０ＭＣ）株の作製
前述したベクター「ｐＨＥ９６Ｒ−ＬＡＢＣＴ／ｐＫＴ２３０ＭＣ」を大腸菌ＨＢ１０１株に導入し、２５ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（１００ｍＬ）で、３７℃で１８時間振とう培養することで、このベクターが導入された大腸菌を選抜した。この大腸菌から、ベクター「ｐＨＥ９６Ｒ−ＬＡＢＣＴ／ｐＫＴ２３０ＭＣ」を抽出した。
【００９９】
一方、２−ピロン−４，６−ジカルボン酸分解酵素機能を消失させた微生物であるシュードモナス属細菌（Pseudomonas  putida  ＰｐＹ１１００株）及びコマモナス  スピーシーズ（Comamonas  sp.）ＤＰＩ株を、ＬＢ液体培地５００ｍＬで２８℃、２３時間培養した後、氷中で３０分間冷却した。冷却後、４℃、１０分、１００００ｒｐｍで遠心分離により集菌し、５００ｍＬの０℃蒸留水で温和に洗浄した後、再び遠心分離により集菌した。続いて、２５０ｍＬの０℃蒸留水で温和に洗浄した後、再度、遠心分離により集菌した。さらに、１２５ｍＬの０℃蒸留水で温和に洗浄した後、遠心分離により集菌した。この集菌した菌体を１０％グリセロールを含む蒸留水に懸濁した後、０℃にて静置した。
【０１００】
ベクター「ｐＨＥ９６Ｒ−ＬＡＢＣＴ／ｐＫＴ２３０ＭＣ」のＤＮＡ約０．０５μｇが溶解された蒸留水４μＬを０．２ｃｍのキュベットに入れ、このキュベットに、１０％グリセロールを含む蒸留水に懸濁した各々の細胞液４０μＬを加え、（２５μＦ、２５００Ｖ、１２ｍ秒）の条件で、エレクトロポレーション処理を行った。
【０１０１】
エレクトロポレーション処理を行った各細胞の全量を、各々、１０ｍＬのＬＢ液体培地に接種し、２８℃で６時間培養した。培養後、遠心分離によって各細胞の菌体を集菌し、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ平板培地上に展開した後、２８℃で４８時間培養することで、ベクター「ｐＨＥ９６Ｒ−ＬＡＢＣＴ／ｐＫＴ２３０ＭＣ」が導入された形質転換株を得た。
【０１０２】
なお、この形質転換体を、各々、シュードモナス  プチダ（Pseudomonas  putida）ＰｐＹ１１００（ｐＨＥ９６Ｒ−ＬＡＢＣＴ／ｐＫＴ２３０ＭＣ）株、コマモナス  スピーシーズ（Comamonas  sp.）ＤＰＩ（ｐＨＥ９６Ｒ−ＬＡＢＣＴ／ｐＫＴ２３０ＭＣ）株と呼ぶ。
【０１０３】
＜実施例８＞  シュードモナス  プチダ（Pseudomonas  putida）ＰｐＹ１１００（ｐＨＥ９６Ｒ−Ｔ／ｐＫＴ２３０ＭＣ）株の作製
まず、ベクター「ｐＨＥ９６Ｒ−Ｔ／ｐＫＴ２３０ＭＣ」を大腸菌ＨＢ１０１株に導入し、２５ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（１００ｍＬ）で、３７℃で１８時間振とう培養することで形質転換体を選抜した。選抜された形質転換体から、ベクター「ｐＨＥ９６Ｒ−Ｔ／ｐＫＴ２３０ＭＣ」を抽出した。
【０１０４】
このベクター「ｐＨＥ９６Ｒ−Ｔ／ｐＫＴ２３０ＭＣ」を導入した点が異なる他は、実施例７と同様の手順で、形質転換体の作製を行った。
なお、このようにして得られた形質転換体を、シュードモナス  プチダ（Pseudomonas  putida）ＰｐＹ１１００（ｐＨＥ９６Ｒ−Ｔ／ｐＫＴ２３０ＭＣ）株と呼ぶ。
【０１０５】
＜実施例９＞  ２−ピロン−４，６−ジカルボン酸の製造
シュードモナス  プチダ（Pseudomonas  putida）ＰｐＹ１１００（ｐＨＥ９６Ｒ−ＬＡＢＣＴ／ｐＫＴ２３０ＭＣ）株およびコマモナス  スピーシーズ（Comamonas  sp.）ＤＰＩ（ｐＨＥ９６Ｒ−ＬＡＢＣＴ／ｐＫＴ２３０ＭＣ）株を、各々、２００ｍＬのＬＢ液体培地（２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む）に接種した後、２８℃で１６時間培養することで前培養菌体懸濁液を得た。ＬＢ液体培地８Ｌおよび消泡剤（Ａｎｔｉｆｏｒｍ  Ａ）３ｍＬを１０Ｌ容量のジャーファーメンター（発酵槽）により混合することで培地を調製し、この調整した培地に前培養菌体懸濁液２００ｍＬを混合した後、２８℃、５００ｒｐｍ／分の通気攪拌条件のもと、菌体濃度がＯＤ６６０において１３程度になるまで培養した（約１１時間）。培養に伴う増殖曲線を図８に示す。図８に示されるように、時間経過とともに菌体濃度が順調に増加していたことから、上述の培養条件で、シュードモナス  プチダ（Pseudomonas  putida）ＰｐＹ１１００（ｐＨＥ９６Ｒ−ＬＡＢＣＴ／ｐＫＴ２３０ＭＣ）株は順調に増殖していたことが分かった。
【０１０６】
また同様の手順で、コマモナス  スピーシーズ（Comamonas  sp.）ＤＰＩ（ｐＨＥ９６Ｒ−ＬＡＢＣＴ／ｐＫＴ２３０ＭＣ）株を、菌体濃度がＯＤ６６０において１３程度になるまで培養した（約１１時間）。培養に伴う増殖曲線を図９に示す。図９に示されるように、時間経過とともに菌体濃度が順調に増加していたことから、上述の培養条件で、コマモナス  スピーシーズ（Comamonas  sp.）ＤＰＩ（ｐＨＥ９６Ｒ−ＬＡＢＣＴ／ｐＫＴ２３０ＭＣ）株は順調に増殖していたことが分かった。
【０１０７】
このシュードモナス  プチダ（Pseudomonas  putida）ＰｐＹ１１００（ｐＨＥ９６Ｒ−ＬＡＢＣＴ／ｐＫＴ２３０ＭＣ）培養液（発酵槽内）に、基質であるテレフタル酸（１６ｇ）の０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ溶液（ｐＨ８〜９）５００ｍＬを、ペリスタポンプを用いて５時間に亘り添加した。反応の進行に伴って生成する２−ピロン−４，６−ジカルボン酸の生成による培地ｐＨの低下を予防するために、ｐＨセンサーに連結したペリスタポンプにより、０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ溶液を添加することで、培地のｐＨを維持した。ここで、反応の進行状況を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって確認した結果を図１０に示す。
【０１０８】
図１０において、Ａはテレフタル酸を、Ｂは２−ピロン−４，６−ジカルボン酸を、Ｃはシュードモナス  プチダ（Pseudomonas  putida）ＰｐＹ１１００（ｐＨＥ９６Ｒ−ＬＡＢＣＴ／ｐＫＴ２３０ＭＣ）株の培養液中の基質を示す。図１０に示されるように、反応開始後４８時間において、テレフタル酸を添加したシュードモナス  プチダ（Pseudomonas  putida）ＰｐＹ１１００（ｐＨＥ９６Ｒ−ＬＡＢＣＴ／ｐＫＴ２３０ＭＣ）株の培養液中、テレフタル酸が殆ど視認されないことから、培養液中、ほぼすべてのテレフタル酸が分解され、２−ピロン−４，６−ジカルボン酸が生成されたことが分かった。
【０１０９】
また、同様の手順で、コマモナス  スピーシーズ（Comamonas  sp.）ＤＰＩ（ｐＨＥ９６Ｒ−ＬＡＢＣＴ／ｐＫＴ２３０ＭＣ）株についても反応を行い、反応の進行状況を確認した結果を図１１に示す。
【０１１０】
図１１において、Ａはテレフタル酸を、Ｂは２−ピロン−４，６−ジカルボン酸を、コマモナス  スピーシーズ（Comamonas  sp.）ＤＰＩ（ｐＨＥ９６Ｒ−ＬＡＢＣＴ／ｐＫＴ２３０ＭＣ）株の培養液中の基質を示す。図１１に示されるように、反応開始後４８時間において、テレフタル酸を添加したコマモナス  スピーシーズ（Comamonas  sp.）ＤＰＩ（ｐＨＥ９６Ｒ−ＬＡＢＣＴ／ｐＫＴ２３０ＭＣ）株の培養液中、テレフタル酸が殆ど視認されないことから、培養液中、ほぼすべてのテレフタル酸が２−ピロン−４，６−ジカルボン酸に生成されたことが分かった。
【０１１１】
発酵槽内の培地をプラスチック容器（バケツ）に移した後、塩酸を添加して、反応液をｐＨ３とすることで反応を停止させた。反応液を遠心分離（６０００ｒｐｍ、２０℃）により菌体成分を沈殿させ、沈殿物を除去して得られた上清に塩酸を更に添加することにより、ｐＨ１．０に低下させた。このｐＨを低下させた上清を低温（４℃）で、２４時間以上静置することにより、２−ピロン−４，６−ジカルボン酸を沈殿として分離した。
【０１１２】
このようにして回収された２−ピロン−４，６−ジカルボン酸は、シュードモナス  プチダ（Pseudomonas  putida）ＰｐＹ１１００（ｐＨＥ９６Ｒ−ＬＡＢＣＴ／ｐＫＴ２３０ＭＣ）培養液（発酵槽）では約１２ｇであり、コマモナス  スピーシーズ（Comamonas  sp.）ＤＰＩ（ｐＨＥ９６Ｒ−ＬＡＢＣＴ／ｐＫＴ２３０ＭＣ）培養液（発酵槽）では約１３ｇであった。
【０１１３】
図１２左側に、回収した２−ピロン−４，６−ジカルボン酸を活性炭処理等した後の精製物についての、ガス液体クロマトグラム（図１２左側）を示す。
図１２左側に示されるように、反応開始後８時間において、反応開始後０時間において視認されていたテレフタル酸を示すシグナルが消失し、２−ピロン−４，６−ジカルボン酸を示すシグナルが現れていたことから、反応液中のテレフタル酸から２−ピロン−４，６−ジカルボン酸が生成されていたことが分かった。
【０１１４】
また、上述した精製物について、カルボキシル基にトリメチルシリル基を結合させた誘導体として質量分析（ＧＣ−ＭＳ）を行った。この結果である質量分析スペクトルを図１２右側に示す。
図１２の右上側に示されるように、テレフタル酸の誘導体（分子量３１０）及びこの誘導体からメチル基（分子量１５）が順次脱離した化合物に対応するピークが視認されたことから、図１２左上のシグナルはテレフタル酸を示すものであることが確認された。
また、図１２の右下側に示されるように、２−ピロン−４，６−ジカルボン酸の誘導体（分子量３２８）及びこの誘導体からメチル基（分子量１５）が順次脱離した化合物に対応するピークが視認されたことから、図１２左下のシグナルは２−ピロン−４，６−ジカルボン酸を示すものであることが確認された。
【０１１５】
＜実施例１０＞  プロトカテク酸の製造
シュードモナス  プチダ（Pseudomonas  putida）ＰｐＹ１１００（ｐＨＥ９６Ｒ−Ｔ／ｐＫＴ２３０ＭＣ）株を、２００ｍＬのＬＢ液体培地（２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む）に接種し２８℃で１６時間培養し前培養菌体懸濁液とした。８ＬのＬＢ液体培地および消泡剤（Ａｎｔｉｆｏｒｍ  Ａ）３ｍＬを１０Ｌ容量のジャーファーメンター（発酵槽）を用いて調製し、そこに培養したシュードモナス  プチダ（Pseudomonas  putida）ＰｐＹ１１００（ｐＨＥ９６Ｒ−Ｔ／ｐＫＴ２３０ＭＣ）株の前培養菌体懸濁液２００ｍＬを混合し、２８℃、５００ｒｐｍ／分の通気攪拌下、ＯＤ６６０が１３程度になるまで培養した（約１１時間）。
【０１１６】
ＯＤ６６０が１３程度に達した発酵槽の培養液に、基質であるテレフタル酸（１６ｇ）の０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ溶液（ｐＨ８〜９）５００ｍＬを、ペリスタポンプを用いて５時間に亘り添加した。反応の進行に伴って生成するプロトカテク酸の生成による培地ｐＨの低下を予防するために、ｐＨセンサーに連結したペリスタポンプにより、０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ溶液を添加することで、培地のｐＨを維持した。反応の進行は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって確認した。この結果を図１３に示す。
【０１１７】
図１３において、Ａはプロトカテク酸を、Ｂはテレフタル酸を、Ｃはシュードモナス  プチダ（Pseudomonas  putida）ＰｐＹ１１００（ｐＨＥ９６Ｒ−Ｔ／ｐＫＴ２３０ＭＣ）株の培養液中の基質を示す。図１３に示されるように、反応開始後４８時間において、テレフタル酸を添加したシュードモナス  プチダ（Pseudomonas  putida）ＰｐＹ１１００（ｐＨＥ９６Ｒ−Ｔ／ｐＫＴ２３０ＭＣ）株の培養液中、テレフタル酸が殆ど視認されないことから、培養液中、ほぼすべてのテレフタル酸がプロトカテク酸に生成されたことが分かった。
【０１１８】
そして、消失を確認した反応液からプロトカテク酸を酢酸エチルエステルで抽出分離することで、プロトカテク酸を得た。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】テレフタル酸を原材料とし、プロトカテク酸を経由して、２−ピロン−４，６−ジカルボン酸が生成される反応経路の概略を示す図である。
【図２】本発明に係るベクターの作製方法及び構造の概略を示す図である。
【図３】本発明に係るベクターの作製方法及び構造の概略を示す図である。
【図４】本発明に係るベクターの作製方法及び構造の概略を示す図である。
【図５】本発明に係るベクターの作製方法及び構造の概略を示す図である。
【図６】本発明に係るベクターの作製方法及び構造の概略を示す図である。
【図７】本発明に係るベクターの作製方法及び構造の概略を示す図である。
【図８】本発明実施例に係る形質転換体の増殖曲線を示す図である。
【図９】本発明実施例に係る形質転換体の増殖曲線を示す図である。
【図１０】本発明に係る形質転換体によるテレフタル酸の分解反応の経時的変化を示す図である。
【図１１】本発明に係る形質転換体によるテレフタル酸の分解反応の経時的変化を示す図である。
【図１２】本発明に係る製造方法によるテレフタル酸から２−ピロン−４，６−ジカルボン酸への変換の状況を示す図である。
【図１３】本発明に係る製造方法によるテレフタル酸からプロトカテク酸への変換の状況を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【配列表】
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