(57)【要約】【課題】ヘリコバクター・ピロリによる胃炎・胃潰瘍等の治癒を目的とした毒性発現を中和させる手段の提供。【解決手段】ガングリオシド、それらのリソ体及びそれらの化学修飾体（ガングリオシド等）からなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有してなるヘリコバクター・ピロリの空胞化毒素ＶａｃＡに対する結合剤、前記ＶａｃＡ結合剤を用いてＶａｃＡ活性を中和させることを特徴とする当該菌が関与する疾患の治療又は予防方法、前記ＶａｃＡ結合剤及びＶａｃＡを用いることを特徴とする、当該菌が関与する疾患の治療又は予防剤のスクリーニング方法、胃炎、胃潰瘍又は胃癌の治療又は予防剤を製造するための、ガングリオシド等からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物の使用、ならびにガングリオシド等からなる群より選ばれる少なくとも１種を含有してなる当該菌の作用を抑制する食品。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガングリオシド、それらのリソ体およびそれらの化学修飾体からなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有してなるヘリコバクター・ピロリの空胞化毒素ＶａｃＡに対する結合剤。
【請求項２】
前記ガングリオシドがＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ３およびＧＴ１ｂからなる群から構成されるものである請求項１記載のＶａｃＡ結合剤。
【請求項３】
前記ガングリオシドがＧＭ１である請求項１記載のＶａｃＡ結合剤。
【請求項４】
前記リソ体がＧＭ１のリソ体である請求項１記載のＶａｃＡ結合剤。
【請求項５】
請求項１〜４いずれか１項に記載のＶａｃＡ結合剤を用いてＶａｃＡ活性を中和させることを特徴とする、ヘリコバクター・ピロリが関与する疾患の治療または予防方法。
【請求項６】
前記疾患が胃炎、胃潰瘍または胃癌である請求項５に記載の治療または予防方法。
【請求項７】
請求項１〜４いずれか１項に記載のＶａｃＡ結合剤およびＶａｃＡを用いることを特徴とする、ヘリコバクター・ピロリが関与する疾患の治療または予防剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記疾患が胃炎、胃潰瘍または胃癌である請求項７に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
胃炎、胃潰瘍または胃癌の治療または予防剤を製造するための、ガングリオシド、それらのリソ体およびそれらの化学修飾体からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物の使用。
【請求項１０】
胃炎、胃潰瘍または胃癌の治療または予防剤を製造するための、胃の上皮細胞表面に存在するガングリオシドとＶａｃＡとの結合を抑制する作用を有する化合物の使用。
【請求項１１】
ガングリオシド、それらのリソ体およびそれらの化学修飾体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含有してなるヘリコバクター・ピロリの作用を抑制する食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘリコバクター・ピロリの空胞化毒素に対する結合剤およびその利用に関する。詳しくは、ヘリコバクター・ピロリの空胞化毒素ＶａｃＡに対する結合剤を用いた胃炎、胃潰瘍または胃癌の治療または予防の分野に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
グラム陰性桿菌であるヘリコバクター・ピロリは、世界人口の半数以上のヒトの胃粘膜に棲息している。感染者の大多数は無症候のまま経過するが、本菌の持続感染により胃炎からときとして消化性潰瘍を引き起こし、腸上皮化生、胃がん、ＭＡＬＴリンパ腫などとの関連が指摘されている。ヘリコバクター・ピロリの産生する空胞化毒素であるＶａｃＡは、標的細胞の細胞質内に空胞を形成させ、当該細胞を死滅させる毒素であり、本菌の病原性との関わりが指摘されている（非特許文献１）。現在までに、ＶａｃＡの宿主細胞への初期作用を理解するため、ヒト腎臓癌由来株化細胞Ｇ４０１細胞またはヒト胃癌由来株化細胞ＡＺ−５２１細胞よりＶａｃＡ受容体が精製され、ＶａｃＡ受容体が２種の受容体型チロシンフォスファターゼ(ＲＰＴＰ)、ＲＰＴＰαとＲＰＴＰβであることが明らかにされた（非特許文献２）。さらに、これら２種のＲＰＴＰのうちＲＰＴＰβをノックアウトしたマウスではＶａｃＡ投与によって認められる胃炎や潰瘍を発症しないことが明らかにされている（非特許文献３）。ＶａｃＡの結合には、ＲＰＴＰβの747-751残基に位置するＱＴＴＱＰの配列のＴｈｒに結合したＯ−リンクの糖鎖、さらにはその糖鎖の末端シアル酸が重要であることが報告されている（非特許文献４）。
【非特許文献１】Cover, T.L., Blake, S.R., Nat. Rev. Microbiol., 2005, 3, p.320- 332
【非特許文献２】Wada, A., Yamasaki, E., Hirayama, T., J. Biochem., 2004, 136, p.741- 746
【非特許文献３】Fujikawa, A., Shirasaka, D., Yamamoto, S., Ota, H., Yahiro, K., Fukada, M., Shintani, T., Wada, A., Aoyama, N., Hirayama, T., Fukamachi, H., Noda, M., Nat. Genet., 2003, 33, p.375- 381
【非特許文献４】Yahiro K., Wada A., Yamasaki E., Nakayama M., Nishi Y., Hisatsune J., Morinaga N., Sap J., Noda M., Moss J., Hirayama T., J. Biol. Chem., 2004, 279, p.51013-51021
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
現在、ヘリコバクター・ピロリによって引き起こされた疾患の治療は、菌自体を抗生物質で除菌することにより行っている。しかしながら、抗生物質を用いた治療方法は、耐性菌が出現して抗生物質が効かなくなり、対応できなくなる可能性が高い。したがって、本菌による毒性発現を中和させる手段で、胃炎・胃潰瘍等の治癒を行うことが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記問題点に鑑み、ヘリコバクター・ピロリの病原因子の中で、ＶａｃＡに注目し、ＶａｃＡの初期の受容体ＲＰＴＰとの相互作用を明らかにすべく鋭意検討した結果、ＶａｃＡに対して結合可能な物質により前記受容体への結合が阻害されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
即ち、本願発明は、以下に示す通りである。
〔１〕  ガングリオシド、それらのリソ体およびそれらの化学修飾体からなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有してなるヘリコバクター・ピロリの空胞化毒素ＶａｃＡに対する結合剤。
〔２〕  前記ガングリオシドがＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ３およびＧＴ１ｂからなる群から構成されるものである前記〔１〕記載のＶａｃＡ結合剤。
〔３〕  前記ガングリオシドがＧＭ１である前記〔１〕記載のＶａｃＡ結合剤。
〔４〕  前記リソ体がＧＭ１のリソ体である前記〔１〕記載のＶａｃＡ結合剤。
〔５〕  前記〔１〕〜〔４〕いずれか１項に記載のＶａｃＡ結合剤を用いてＶａｃＡ活性を中和させることを特徴とする、ヘリコバクター・ピロリが関与する疾患の治療または予防方法。
〔６〕  前記疾患が胃炎、胃潰瘍または胃癌である前記〔５〕に記載の治療または予防方法。
〔７〕前記〔１〕〜〔４〕いずれか１項に記載のＶａｃＡ結合剤およびＶａｃＡを用いることを特徴とする、ヘリコバクター・ピロリが関与する疾患の治療または予防剤のスクリーニング方法。
〔８〕  前記疾患が胃炎、胃潰瘍または胃癌である前記〔７〕に記載のスクリーニング方法。
〔９〕  胃炎、胃潰瘍または胃癌の治療または予防剤を製造するための、ガングリオシド、それらのリソ体およびそれらの化学修飾体からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物の使用。
〔１０〕  胃炎、胃潰瘍または胃癌の治療または予防剤を製造するための、胃の上皮細胞表面に存在するガングリオシドとＶａｃＡとの結合を抑制する作用を有する化合物の使用。
〔１１〕  ガングリオシド、それらのリソ体およびそれらの化学修飾体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含有してなるヘリコバクター・ピロリの作用を抑制する食品。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のＶａｃＡ結合剤によると、ガングリオシドを基本構造とする化合物を有効成分とし、ＶａｃＡとその受容体ＲＰＴＰとの結合を阻害することから、有効かつ低毒性でＶａｃＡを介したヘリコバクター・ピロリの病原性を低減することができる。かかる結合剤をヘリコバクター・ピロリの感染者に適用した場合、ＶａｃＡの作用を中和することにより、ヘリコバクター・ピロリが関与する疾患を有効かつ副作用も少なく治療または予防することができる。本発明のスクリーニング方法によると、本発明の結合剤およびＶａｃＡを用いることにより、ヘリコバクター・ピロリが関与する状態の中でも病原性の高い疾患を治療または予防可能な薬剤をスクリーニングすることができる。本発明によれば、ガングリオシドを基本構造とする化合物を医薬品の製造のために使用することができる。また、本発明によれば、ガングリオシドを基本構造とする化合物の有効量を配合した食品を提供することにより、安全かつ容易にＶａｃＡを介したヘリコバクター・ピロリの作用を中和し、当該菌が関与する疾患の改善に寄与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明のヘリコバクター・ピロリの空胞化毒素ＶａｃＡに対する結合剤は、当該菌が産生し、分泌するタンパク質のうち、主としてＶａｃＡに結合するものである。
【０００８】
前記ＶａｃＡとは、ヘリコバクター・ピロリが産生する毒素であって、上皮細胞の空胞変性を引き起こす作用を有するものである。かかる空胞変性は、顕微鏡による上皮細胞の形態観察または空胞のニュートラルレッドの取り込みを調べることにより確認することができる。ヘリコバクター・ピロリのゲノム配列は、Gene Bank Accession No.NC_000921およびNC_000915に開示されており、ＶａｃＡをコードする塩基配列またはコードされるアミノ酸配列は、AY_737319、AB_190958、AB_190988などに開示されている。また、ＶａｃＡは、単量体であっても多量体（例、六量体）であってもよいが、酸処理により活性化された単量体または多量体（例、六量体）が好ましい。
【０００９】
本発明のＶａｃＡ結合剤（以下、単に結合剤と省略する場合がある）は、有効成分として、ガングリオシド、それらのリソ体およびそれらの化学修飾体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含有する。
【００１０】
前記ガングリオシドとは、シアル酸を含有する糖脂質をいい、天然物であっても化学合成されたものであってもよい。好ましいガングリオシドは、ＶａｃＡとの結合性の観点から、ＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ３またはＧＴ１ｂであり、より好ましくはＧＭ１である。
【００１１】
前記リソ体とは、前記ガングリオシドのセラミド部分から脂肪酸が遊離してアミノ基となったスフィンゴシンを含む構造をいう。好ましいリソ体は、ＶａｃＡとの結合性の観点から、ＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ３またはＴ１ｂのリソ体であり、より好ましくはＧＭ１のリソ体である。例えば、ＧＭ１およびそのリソ体は、図１に示す通りである。
【００１２】
前記ガングリオシドまたはそれらのリソ体の化学修飾体とは、当該ガングリオシドまたはリソ体を基本構造として、ＶａｃＡに対する結合がガングリオシドまたはリソ体の場合と同等以上であるように化学的に修飾した化合物をいう。修飾基の導入のしやすさという観点から、アミノ基を有するリソ体を基本構造とすることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００１３】
本発明の結合剤において、ＶａｃＡに対する結合力は、ＶａｃＡとＲＰＴＰ（好ましくはＲＰＴＰβ）との結合またはＶａｃＡの上皮細胞での空胞形成を阻害することを指標に調べることができ、具体的な方法は、後述する実施例に記載されている。かかる結合力は、ガングリオシドまたはそれらのリソ体に含まれるシアル酸が重要な役割を果たしている。前記指標のいずれか、好ましくは両方において、有意な阻害活性を有する場合、本発明の結合剤として有用である。有意な阻害活性としては、結合剤を添加しない場合と比べて、約５０％以上の阻害率が例示され、約７０％以上の阻害率が好ましい。
【００１４】
本発明の結合剤は、前記有効成分を少なくとも１種含有していればよいが、本発明の目的を達成する限り、２種以上の有効成分を含有していてもよい。
【００１５】
本発明の結合剤は、前記有効成分そのままであってもよく、公知の薬学的に許容される担体などを含んでもよい。前記担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００１６】
前記有効成分の含有量は、所望の結合作用を奏することができる範囲で適宜設定することができるが、通常、０．０１〜１００重量％であり、好ましくは０．１〜９９．９重量％、より好ましくは０．５〜９９．５重量％である。
【００１７】
本発明の結合剤は、ＶａｃＡに結合して空胞化活性を中和することから、ヘリコバクター・ピロリの病原性を有意に低減することができ、このような作用を利用して、様々な用途が期待される。
【００１８】
本発明は、本発明のＶａｃＡ結合剤を用いてＶａｃＡ活性を中和させることを特徴とする、ヘリコバクター・ピロリが関与する疾患の治療または予防方法を提供する。
【００１９】
前記疾患としては、胃炎、胃潰瘍または胃癌が好ましく、特にＶａｃＡとの関連が示唆されている胃炎または胃潰瘍がより好ましい。
【００２０】
適用対象となる動物は、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物であり、ヒト以外の哺乳動物としてはサル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットなどがあげられる。
【００２１】
前記疾患の治療または予防に対する適用量は、疾患の重篤度、適用対象となる動物種、適用対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に設定することはできないが、通常、１回あたり有効成分量として０．００１ｍｇ〜１０ｇ程度があげられる。適用回数は、１日あたり３回〜１週間あたり１、２回を基本とする。
【００２２】
本発明は、前記ＶａｃＡ結合剤およびＶａｃＡを用いることを特徴とする、ヘリコバクター・ピロリが関与する疾患の治療または予防剤のスクリーニング方法を提供する。
【００２３】
ＶａｃＡ結合剤は、ＶａｃＡと結合することにより、空胞形成が抑制され、ヘリコバクター・ピロリの病原性を低減することができるため、例えば、ＶａｃＡ結合剤−ＶａｃＡの結合と同等以上の活性を有する化合物をスクリーニングすることにより、より有効なヘリコバクター・ピロリが関与する疾患の治療または予防剤の候補物質を選別することができる。
【００２４】
前記スクリーニング方法は、下記工程：
１）前記ＶａｃＡ結合剤、ＶａｃＡおよび被検物質を準備する工程、
２）被検物質の非存在下で、ＶａｃＡ結合剤とＶａｃＡが結合する条件下で、形成された結合体の程度を測定する工程、
３）被検物質の存在下で、前記結合体の程度を測定し、被検物質の存否による結合体形成の変動を比較する工程、ならびに
４）前記３）の比較結果に基づいて、前記結合体の形成に影響を与える（好ましくはＶａｃＡ−ＶａｃＡ結合剤の結合と競合可能な）被検物質を選択する工程、
を含む。
【００２５】
工程１）において、ＶａｃＡは、Yahiro, K., Niidome, T., Hatakeyama, T., Aoyagi, H., Kurazono, H., Padilla, P.I., Wada, A., Hirayama, T., Biochem. Biopys. Res. Commun., 1997, 238, p.629-632に記載の方法により精製し、単離したものを用いることができる。ＶａｃＡ結合剤としては、前記したガングリオシドまたはそれらのリソ体を用いることができる。かかるガングリオシドおよびリソ体は、市販品を好適に用いることができる。
【００２６】
工程１）において、被検物質としては、いかなる公知物質および新規物質であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分などがあげられる。
【００２７】
工程２）において、結合体を形成させる方法は特に限定されるものではないが、例えば、約０〜４０℃の溶液中でＶａｃＡとＶａｃＡ結合剤とを所定の濃度で混合する方法、ＶａｃＡを固相に固定し、ＶａｃＡ結合剤と結合させる方法、ＶａｃＡ結合剤を固相に固定し、ＶａｃＡと結合させる方法、あるいは培養細胞で発現したＶａｃＡと培地に添加したＶａｃＡ結合剤とを結合させる方法などがあげられる。
【００２８】
工程３）および４）において、前記結合体の形成は、以下の例にあげるような方法で測定することができる。
３−１）ＶａｃＡまたはＶａｃＡ結合剤に対する抗体を用いて免疫沈降し、免疫沈降で使用しなかった抗体でイムノブロッティングを行う方法。
３−２）ＶａｃＡまたはＶａｃＡ結合剤をSepharose等の樹脂に固相化させ、約０〜４０℃の溶液中でＶａｃＡとＶａｃＡ結合剤とを所定の濃度で混合した後、当該樹脂とともに回収される被検物質を被検物質に応じた検出方法で測定する方法。
３−３）ＶａｃＡを、ポリヒスチジンもしくはＧＳＴなどの標識との融合タンパク質として発現させ、またはビオチン化させ、ポリヒスチジンはニッケルに、ＧＳＴはグルタチオンに、ビオチンはアビジンに結合することから、それらを利用して結合体を回収し、３−１）と同様のイムノブロッティングで測定する方法。
３−４）ＶａｃＡをセンサーチップに固相化して、ＶａｃＡ結合剤の結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のシステムを用いて測定する方法。
【００２９】
工程３）において、被検物質の存否による結合体形成の変動を比較するには、前記測定方法により得られる結果を測定方法に応じて定性的または定量的に比較することによって行う。
【００３０】
工程４）において、被検物質の存在下で、前記工程２）で形成された結合体が少なくとも維持されているか（好ましくは被検物質の非存在下のときに比べて、より強固に形成されているか）または解離しているかについて、結合体の有無（好ましくはその程度）を比較することによって評価する。前者の場合、被検物質は、ヘリコバクター・ピロリが関与する疾患の治療剤の候補として選択することができる。後者の場合、被検物質が新たにＶａｃＡとの結合体を形成しているときは、ヘリコバクター・ピロリが関与する疾患の治療剤の候補として選択することができる。被検物質は、ヘリコバクター・ピロリの作用調節剤または研究用試薬としても有用である。
【００３１】
本スクリーニング方法における前記疾患は、胃炎、胃潰瘍または胃癌であることが好ましい。本スクリーニング方法により選択される被検物質は、胃炎、胃潰瘍または胃癌の治療または予防剤を製造するために用いることができる。
【００３２】
本発明は、胃炎、胃潰瘍または胃癌の治療または予防剤を製造するため、前記結合剤の有効成分であるガングリオシド、それらのリソ体およびそれらの化学修飾体からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物の使用を提供する。
【００３３】
また、本発明は、胃炎、胃潰瘍または胃癌の治療または予防剤を製造するため、胃の上皮細胞表面に存在するガングリオシドとＶａｃＡとの結合を抑制する作用を有する化合物の使用を提供する。ここで用いられる化合物としては、生体外から投与されるガングリオシドまたはそれらのリソ体またはそれらの化学修飾体が例示されるが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
さらに、本発明は、ガングリオシド、それらのリソ体およびそれらの化学修飾体からなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有してなるヘリコバクター・ピロリの作用を抑制する食品を提供する。当該食品を摂取する場合、摂取する有効成分の量は特に限定されるものではないが、ガングリオシドに換算して１日当たり０.００１〜１００ｍｇ／ｋｇが推奨される。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例等により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら制限されるものではない。
【００３６】
実施例１：ＶａｃＡに対する中和活性の測定
ＶａｃＡの毒性の一つとして、培養細胞に空胞化形成を引き起こすことが知られている。このＶａｃＡの空胞化形成をみる実験系にガングリオシドを添加して空胞化形成に対する中和活性が認められるかどうか調べた。２ｘ１０４個の胃上皮癌株化細胞ＡＺ−５２１細胞（JCRB細胞バンクより入手）を９６穴プレートにまいて、３７℃で２４時間ＣＯ２インキュベーターに置いておいた。２０μｇ／ｍｌのＶａｃＡをＡＺ−５２１細胞に添加し、このアッセイ系に種々の濃度のガングリオシドを添加して３時間インキュベートした。その後、ニュートラルレッドアッセイ法により、細胞に形成された空胞の度合いを細胞に取り込まれたニュートラルレッドの量をＯＤ５４０ｎｍの吸光度を測定することにより、ＶａｃＡの毒性を評価した。
【００３７】
実施例２：ＶａｃＡの受容体への結合阻害活性
ＶａｃＡとその受容体(ＲＰＴＰβ)への結合をみる実験系にガングリオシドを添加してＶａｃＡのＲＰＴＰβへの結合に対する結合阻害活性が認められるかどうか調べた。ＲＰＴＰβの発現が認められる胃上皮癌株化細胞ＡＺ−５２１細胞（１０ｃｍシャーレに約９０％の密度で生育している）を１ｍｌの１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む可溶化溶液に溶かした。遠心分離後（２０ｍｉｎ, １５０００ｇ）遠心上清を分取し、この遠心上清にＶａｃＡと種々の濃度のガングリオシドを加え、４℃で1時間攪拌しながらＶａｃＡとＲＰＴＰβの複合体を形成させた。前記複合体が形成された上清にさらに抗ＶａｃＡ抗体を加え、１時間インキュベートして、ProteinA-Sepharose（Amersham製）を加え、１時間さらにインキュベートし、その後遠心分離し、沈澱にＶａｃＡと結合しているＲＰＴＰβの複合体を得た。この複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥをおこない、抗ＲＰＴＰβ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、ＶａｃＡのＲＰＴＰβへの結合活性を評価した。
【００３８】
実施例３：ＶａｃＡのガングリオシドへの結合
ガングリオシドの1種であるリソ（Lyso）-ＧＭ１を樹脂に結合させ、この樹脂にＶａｃＡが結合するかどうか調べることにより、ＶａｃＡのガングリオシドへの結合能を評価した。Lyso-GM１-SepharoseまたはコントロールのSepharoseと、ヘリコバクター・ピロリの培養上清を硫安沈澱させ透析したサンプルとを４℃でインキュベートした。遠心分離後（２０ｍｉｎ, １５０００ｇ）、沈澱したSepharoseを洗った。このLyso-GM１-SepharoseまたはコントロールのSepharoseに結合した蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析をおこない、Lyso-ＧＭ１に特異的に結合している蛋白質を解析した。また、常法によりＶａｃＡタンパク質をウサギに免疫して作製した抗ＶａｃＡ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、ＶａｃＡが特異的にLyso-ＧＭ１に結合しているのかどうか確認した。
【００３９】
実験結果
本実施例で用いたガングリオシドは、種々の細菌毒素の受容体として機能するガングリオシドと同様の構造である。しかしながら、現在までにＶａｃＡの機能発現にガングリオシドが関与しているという報告はない。そこで、ＶａｃＡを作用させたＡＺ−５２１細胞にガングリオシド混合物を外から添加したところ、ガングリオシド混合物の濃度に依存してＶａｃＡの空胞化形成が阻害を受けた（図２）。さらに、種々のガングリオシド(ＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ３、ＧＴ１ｂ)をアッセイ系に添加すると、いずれのガングリオシドにも空胞化活性の阻害が認められるものの、なかでもＧＭ１が最も強い空胞化阻害活性を示した（図３）。また、ＧＭ１からシアル酸を除いたアシアロＧＭ１は顕著に阻害活性がなくなり、シアル酸がＶａｃＡの活性阻害に重要なことを示唆していた。
【００４０】
ガングリオシドは糖の部分とセラミド部分からなるが、セラミド部分から脂肪酸を除きスフィンゴシンに変えたLyso-ＧＭ１、Lyso-ＧＭ２およびLyso-ＧＭ３を用いて阻害活性を調べた結果、ＶａｃＡの空胞化阻害活性が認められ（図４）、ガングリオシドの脂肪酸部分はＶａｃＡの活性阻害に重要ではないことがわかった。また、ＧＭ３のオリゴ糖部分の化合物ではＶａｃＡの空胞化阻害活性は認められず（図５）、オリゴ糖とセラミドのＯ−リンクの結合部位はＶａｃＡの活性阻害に重要であることがわかった。
【００４１】
次に、上記外から添加したガングリオシドによるＶａｃＡの空胞化活性の阻害は、ＶａｃＡとガングリオシドの直接の結合による受容体への結合阻害か、それともガングリオシドが細胞に影響を与えその結果ＶａｃＡの作用が阻害を受けているのかどうか明らかにすることを試みた。そこで、ＶａｃＡを作用させたときの細胞の中への取り込みにLyso-ＧＭ１の存在の有無によって変化があるか調べたところ、Lyso-ＧＭ１存在下においてＶａｃＡの細胞内への取り込みが減少することがわかった(図６)。次に、ＶａｃＡとガングリオシドが直接結合するかどうかを調べた。ＶａｃＡと抗ＶａｃＡ抗体を用いたＶａｃＡ受容体であるＲＰＴＰβの免疫沈降のアッセイ系にLyso-ＧＭ１を添加したところ、ＶａｃＡとＲＰＴＰβの結合はLyso-ＧＭ１の濃度に依存して阻害を受けた(図７)。また、ＶａｃＡのトリプシン消化の実験系にLyso-ＧＭ１を添加していったところ、Lyso-ＧＭ１の濃度に依存してＶａｃＡのトリプシン消化が早まり、Lyso-ＧＭ１存在下においてＶａｃＡの構造の変化が起こっていることが示唆された（図８）。以上の結果より、ＶａｃＡがLyso-ＧＭ１と相互作用していることが推察された。さらに、ＶａｃＡとLyso-ＧＭ１の直接の結合の確証を得るために、Lyso-ＧＭ１を固相化したLyso-ＧＭ１樹脂（Sepharose）を作製し、ＶａｃＡと直接結合するかどうか調べたところ、コントロール（Lyso-ＧＭ１が結合していない）樹脂（Sepharose）では認められないＶａｃＡの結合が、Lyso-ＧＭ１樹脂に対しては認められた（図９）。さらに、ヘリコバクター・ピロリの培養上清の硫安透析産物を用いてLyso-ＧＭ１樹脂に結合する蛋白質を調べたところ、硫安透析産物に含まれる種々雑多な蛋白質のうちLyso-ＧＭ１に特異的に結合する蛋白質はＶａｃＡであることがわかった（図１０）。以上の結果はＶａｃＡがガングリオシドと結合することを示しており、これらの知見は、ＶａｃＡの糖鎖認識を理解するうえで重要な知見であり、ガングリオシドのＶａｃＡへの結合および毒性の中和が胃炎・胃潰瘍の治癒へつながることを示唆している。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、ガングリオシドＧＭ１およびそのリソ体の構造を示す。
【図２】図２は、ガングリオシド混合物のＶａｃＡにより誘導された空胞における作用を示すグラフである。
【図３】図３は、個々のガングリオシドがＶａｃＡにより誘導された空胞における作用を示すグラフである。
【図４】図４は、ガングリオシドのリソ体がＶａｃＡにより誘導された空胞における作用を示すグラフである。
【図５】図５は、ガングリオシドのシアル酸部分がＶａｃＡの中和活性に重要であることを示すグラフである。
【図６】図６は、リソＧＭ１がＶａｃＡの取り込みを阻害することを示す。
【図７】図７は、リソＧＭ１がＶａｃＡのＲＰＴＰβへの結合を阻害することを示す電気泳動の写真である。
【図８】図８は、リソＧＭ１がトリプシンによるＶａｃＡの分解を促進させることを示す電気泳動の写真である。
【図９】図９は、ＶａｃＡがリソＧＭ１−セファロースに結合することを示す電気泳動の写真である。
【図１０】図１０は、リソＧＭ１−セファロースがヘリコバクター・ピロリの産生するタンパク質の中でＶａｃＡを特異的に結合することを示す電気泳動の写真である。
【図３】
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【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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