(57)【要約】      （修正有）【課題】タキサン類似体の効率的かつ環境的に安全に単離する方法の提供。【解決手段】工業的スケールにおける分取用高速液体クロマトグラフィーの使用。該方法は「ロードロック型アキシャル・コンプレッション・カラム」であり、カラムは、微小な粒子径（例えば、約１０μｍ）の媒体を含む任意の充填材料で充填される。また圧力を維持するためにピストンを使用するものであり、そのように圧力を効果的かつ実質的に維持することにより、床における空隙の形成が回避され、工程の効率が増大する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タキサン類似体を含む資源からタキサン類似体を単離及び精製するための方法であって、
前記タキサン誘導体を含む有機溶液をクラマトグラフィー用カラムに通す工程と、該工程は、前記カラム中の空隙を実質的に除くべく該カラム内の充填媒体を圧縮し、それにより不純物を含んだタキサン誘導体を含む有機溶液を提供することを含むことと、前記クロマトグラフィー用カラムを約３４４７５ｋＰａまでの圧力下にて維持する工程と、
からなる方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法は、前記不純物を含んだタキサン誘導体を含む有機溶液をクロマトグラフィー用カラムに通す工程を更に含み、
前記カラム中の充填媒体は該カラム内の空隙を除くべく圧縮されるとともに約２７５８ｋＰａまでの圧力にて維持される方法。
【請求項３】
請求項１乃至２に記載の方法において、
抽出された前記不純物を含んだタキサン誘導体を含む有機溶液をクロマトグラフィー用カラムであって、該カラム内の空隙を除くべく該カラム中の充填媒体が圧縮されるとともに約２７５８ｋＰａまでの圧力にて維持されたカラムに通す更なる工程と、それにより有機溶媒中に抽出されたパクリタキセルが得られることと、
前記有機溶媒中に抽出されたパクリタキセルのシロップをクロマトグラフィー用カラムであって、該カラム内の空隙を除くために充填材料が圧縮されるとともに約３４４．７５ｋＰａまでの圧力にて維持されたカラムに通す更なる工程と、
を実施することを含む方法。
【請求項４】
請求項１、２又は３に記載の方法において、
イチイ属のバイオマスを有機溶媒で抽出することと、前記溶液をヘキサン及び水で分配することと、ジクロロメタン若しくはクロロホルムと水とで前記溶液を再分配することと、最終的に粗パクリタキセルのジクロロメタン若しくはクロロホルム溶液を回収することと、からなる予備工程を含む方法。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法において、
前記タキサン類似体の溶液は、粗結晶パクリタキセルを、メタノール、エタノール、メタノールとエタノールとの混合物、ジクロロメタンとメタノールとの混合物、又はジクロロメタンとエタノールとの混合物中に含む溶液からなる方法。
【請求項６】
前記充填媒体は、ジフェニル基結合シリカゲル、Ｃ−１８結合シリカゲル、ポリスチレン−ＤＶＢ樹脂、ポリメタクリレート樹脂又はポリ芳香族樹脂である請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記カラムは、アセトン／水、メタノール／水又はアセトニトリル／水の勾配溶液で溶出される請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
流速は約３５０ｍｌ／分であり、かつ圧力は約４１３７乃至５５１６ｋＰａに維持される請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
流速は約１リットル／分乃至約２リットル／分である請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第一の工程における有機溶媒はジクロロメタンを含み、かつ前記第三の工程において前記カラムを通す溶出溶液は、アセトン／水、メタノール／水又はアセトニトリル／水を含む請求項１乃至９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記有機溶媒はジクロロメタンであり、更に前記カラムを通過する溶出溶液は、アセトン／水、メタノール／水、エタノール／水、イソプロパノール／水、又はアセトニトリル／水である請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記カラムの溶出物から不純物を含んだパクリタキセルを結晶化する更なる工程を含む請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記カラムの溶出物の一部から９−ジヒドロ−１，３−アセチルバカチンＩＩＩを結晶化する更なる工程を含む請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然に由来するイチイ属（Ｔａｘｕｓ）の種からのタキサン誘導体の単離及び精製に関する。
【背景技術】
【０００２】
タキソールは、１９７１年、ワニ（Ｗａｎｉ）らによりセイヨウイチイ、即ち、タクスス  ブレビフォリア（Ｔａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）から初めて単離された。タキソールはジテルペン類であるタキサン族の一つである。タキサンは製薬の分野において有用性が見出されているジテルペン化合物である。タキサンは植物材料から見出され得るとともに既に単離されている。パクリタキセルは種々の転移癌の治療のための周知の化学療法剤である。卵巣癌及び乳癌の治療に対して承認されている。
【０００３】
タキソール及び種々のタキサン誘導体は、非常に細胞毒性が高く、種々の白血病及び腫瘍系において強いインビボ活性を有する。タキソールは、格別に有用な癌の化学療法剤になり得ると考えられる。
【０００４】
タキソールの現在の唯一の入手源は、非常にゆっくりと成長するイチイ（イチイ属、イチイ科）の幾らかの種である。パクリタキセルはタイヘイヨウイチイ、即ち、タクスス  ブレビフォリアの樹皮から最初に抽出された天然産物であり、また、ティ．バカタ（Ｔ．ｂａｃｃａｔａ）、ティ．ワリシアナ（Ｔ．ｗａｌｉｃｉａｎａ）、ティ．ユナネンシス（Ｔ．ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ）及びティ．カナデンシス（Ｔ．ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）からも発見されている。現在実施されている単離法は非常に困難で収率も低い。メタノール溶液を使用してイチイ属の木からタキソールを抽出する方法が報告されている。しかしながら、タキサンは比較的少量にて植物材料中に存在しているので、例えばタキソールの場合、化合物源を形成する非常に成長の遅いイチイの木を多量に破壊することになる。更に、従来の液体抽出においては多量の有機溶媒を使用することになり、時間もかかる。
【０００５】
種々の原料におけるパクリタキセルの濃度は非常に低く、例えば、タイヘイヨウイチイの樹皮から約０．０００４乃至約０．０１％（ｗ／ｗ）のオーダーである。そのように低濃度であることから、原料から製薬で使用可能なグレードまで該化合物を抽出及び精製することは非常に困難であり、これまでに商業的なスケールにおける実用化には至っていない。種々の順相クロマトグラフィー技術が、原料の粗抽出物からパクリタキセルを精製するためにこれまでに使用されてきた。
【０００６】
低圧クロマトグラフィーが成功するかどうかはカラムの性質に依存する。分配システムにおいて固定相における従来の支持体であるシリカゲル及び三酸化アルミニウムを使用することには種々の問題が伴う。それらは大部分の溶媒系とは安定な固定相を形成するが、非常に吸着が強く、かつ分離工程にある程度関与するために、クロマトグラフィーの挙動及びサンプルの回収に影響を与える。
【０００７】
クロマトグラフィー法は、分析及び調製の理由により種々のイチイ属の種からパクリタキセルを検出及び単離するために開発されてきた。これらの単離法は主として小さな実験室スケールにて実施されているので、選択性及び回収量が低くかつ生産コストが高いという問題があり、価値のある抗癌化合物であるパクリタキセルを、その非常に類似したセファロマニン（ｃｅｐｈａｌｏｍａｎｉｎｅ）及び他の非常に関連したタキサンから分離する経済的かつ実用可能な方法の深刻かつ実現されていない必要性が存在する。
【０００８】
イチイ属の種の栽培可能及び再生可能な植物の部分、例えば、葉（針状葉）及び小枝を使用することは、パクリタキセルの供給を増やす最も実際的かつ魅力的な方法となるべきである。タクスス  カナデンシス（Ｔａｘｕｓ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）を含む数種類のイチイ属の種の針状葉が研究され、タクスス  ブレビフォリアの樹皮に匹敵する量のパクリタキセルを含んでいることが分かった。
【０００９】
タクスス  カナデンシス（Ｔａｘｕｓ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）はカナダ東部及びアメリカ合衆国北東部において主として見られる常緑の低木である。この種はタキサンの含量が特有である。針状葉は主要なタキサンである９−ジヒドロ−１３−アセチルバカチンＩＩＩ（９−ＤＨＡＢＩＩＩ，４）とともに、パクリタキセル（０．００９−０，０５％）、１０−デアセチルバカチンＩＩＩ（１０−ＤＡＢＩＩＩ，６）、バカチンＩＩＩ（５）、セファロマニン（３）及びその他わずかのタキサン類を含んでいる。針状葉中の９−ＤＨＡＢＩＩＩの濃度は、パクリタキセルの濃度の７乃至１０倍であると報告されている。９−ＤＨＡＢＩＩＩは、水に対する溶解性が増大した新たなクラスの半合成化学療法剤の重要な前駆体となり得る。
【００１０】
従来技術の方法は、パクリタキセル及びその関連したタキサンを分離するための種々のクロマトグラフィー技術の使用を開示しており、該技術は、シリカゲル又は結合シリカゲルカラム上における順相クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーを含む。従来技術の方法は、低い収率、高い生産コストであったり、又は複数の工程が必要であったりして、より大きな工業化スケールによる生産までスケールアップすることが困難であった。
【００１１】
現在のところ、観賞用のイチイの針状葉、樹皮及び根からタキソールを生産することは、抽出時に抽出物中に不必要な不純物が極端に高い割合にて含まれる（乾燥植物材料の約４０乃至５０重量％）ことから経済的ではない。このように、観賞用イチイの針状葉において溶媒抽出物中に不純物が非常に高い割合であるということは、針状葉を乾燥する上における高コストとなることに加えこの材料源からのタキソール及びタキサンの精製を高コストかつ不経済にする。
【００１２】
現在の方法は、時間も費用も要し、又は実用面において分析的なスケールに制限を受ける。パクリタキセルは針状葉に低レベルにて存在しており、該針状葉は多量のロウを含んでいるので、針状葉から臨床的に許容可能な純度までパクリタキセルを単離及び精製することは、更に困難を極める。パクリタキセルと、針状葉及び樹皮に存在する該パクリタキセルに非常に関連した類似体であるセファロマニンとの分離は困難な作業である。二つの類似体は、セファロマニンとパクリタキセルの両方を含む混合物におけるセファロマニンの選択的化学変換により分離されてきた。この方法に伴う欠点としては、高価な、時として毒性の試薬の使用による更なるコスト、パクリタキセルから変換されたセファロマニンを分離するために必要となる更なるクロマトグラフィー、工程時におけるセファロマニン及び時としてパクリタキセルの破壊、及びセファロマニンの回収に必要である更なる化学変換を含む。
【００１３】
最も関連する従来技術は１９９９年１０月１９日にリウ（Ｌｉｕ）ら付与された米国特許第５９６９１６５号であると考えられるが、該特許は、タキサンを含む資源からタキサン類似体を高収率及び高純度にて得る方法を提唱した。該方法は、従来技術において現在提供されているような複雑かつ高価な単離／精製工程を使用することなく低圧下にて類似体を分離するための高分子樹脂吸着体を使用する。タキサンを含む資源からタキサン類似体を単離及び精製するその方法は、例えばジクロロメタンのような有機抽出体中においてタキサン源を抽出する第一の工程を含んでいた。第二の工程は、抽出体と吸着媒体とを接触させてカラム中に媒体を装填する工程を含んでいた。カラムは、例えば酸化アルミニウムのような吸着剤を含んでいた。次なる工程は、例えばヘキサンとアセトンの混合物のような有機溶媒混合物を用いて、約６８．９５乃至１３７．９ｋＰａ（１０乃至２０ｐｓｉ）の圧力にて溶出して、タキサン化合物を含むフラクションを生成することを含んでいた。次なる工程は、フラクションを結晶化して、固形タキサン化合物と母液を提供する工程と、該母液を濃縮する工程とを含んでいた。次なる工程は、極性溶媒混合物及び母液を用いて高分子樹脂にて溶出して、少なくとも第二のタキサン化合物を提供することを含んでいた。
【００１４】
従って、従来技術は、植物材料及び有機溶媒の使用を最小限にしてタキサンを得るために更に一層効率的かつ環境的に安全な方法を追求し続けてきた。
イチイ属の種からのパクリタキセル及びタキサンの単離及び精製を記載する種々の刊行物及び特許は増加しつつあるが、パクリタキセルを単離する現在周知の手順は非常に複雑かつ困難であり、しかも低収率である。以下に記載のそのような典型的な特許の一覧は、順相クロマトグラフィーから逆相クロマトグラフィーまで種々の単離技術を記載している。イチイ属の種々の種からのパクリタキセルの収率は、０．００５乃至０．０１７％の範囲である。
【００１５】
１９９１年にクリステン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎ）に付与された米国特許第５０１９５０４号；
１９９５年１月１０日にラオ（Ｒａｏ）に付与された米国特許第５３８０９１６号；
１９９８年１月１０日にラオ（Ｒａｏ）に付与された米国特許第５３８０９１６号；
１９９５年４月１８日にガベッタ（Ｇａｂｅｔｔａ）らに付与された米国特許第５４０７６７４号；
１９９７年４月１５日にホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）らに付与された米国特許第５６２０８７５号；
１９９７年９月２３日にラオ（Ｒａｏ）に付与された米国特許第５６７０６７３号；
２００３年１月７日にキム（Ｋｉｍ）らに付与された米国特許第６５０３３９６号；
１９９３年１１月８日にネア（Ｎａｉｒ）に付与されたカナダ国特許第２１２６６９８号；
１９９４年３月１８日にドゥランド（Ｄｕｒａｎｄ）らに付与されたカナダ国特許第２１５７９０５号；及び
１９９９年６月１５日にジー．キャロン（Ｇ．Ｃａｒｏｎ）らに付与されたカナダ国特許第２２１３９５２号である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
植物材料及び有機溶媒の使用を最小限にしてタキサンを得るためのより効率的かつ環境的に安全な方法を提供することは有利である。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明はそのような所望の結果を達成するとともに、容易に入手可能なバイオマスから市販の重要な天然産物を単離する方法を提供し、その他の化合物又は材料を含む混合物からタキサンを得るための効率的な方法を提供し、イチイ属の種の樹皮、針状葉又は細胞培養液からパクリタキセル及びその他のタキサンを工業的なスケールで産生すべく修正可能な単離工程を提供し、植物材料、好ましくは観賞用イチイの生の材料からタキソール及びその他のタキサンを高収率に単離及び分離し、タキサン誘導体の生産コストを大幅に低減する方法を提供し、かつ容易に入手可能かつ再生可能な資源から上述の天然産物の市販量を提供する方法を提供する。
【００１８】
第一の態様において、本発明は、タキサン類似体を含む資源からタキサン類似体を単離及び精製するための方法であって、タキサン誘導体を含む溶液をクロマトグラフィーカラムに通す工程を含む方法における改良を広く示唆する。該改良は、カラム内の空隙を実質的に除くために充填媒体を該カラム内にて圧縮し、不純物を含んだタキサン誘導体を含む有機溶液を提供する工程を含む。クロマトグラフィー用カラムは、例えば、約１７２３．７５乃至２７５８ｋＰａ（２５０乃至４００ｐｓｉ）の高圧、又は３４４７５ｋＰａ（５０００ｐｓｉ）までの高圧条件下に維持される。
【００１９】
本発明は第二の態様を提供し、該第二の態様は不純物を含んだタキサンを含有する有機溶液をクロマトグラフィーカラムに通す予備工程を含み、該工程において、カラム中の充填媒体は空隙を実質的に除くために圧縮され、かつ例えば約２０６８．５乃至２７５８ｋＰａ（３００乃至４００ｐｓｉ）の高圧にて、又は６８９５ｋＰａ（１０００ｐｓｉ）までの高圧にて維持される。
【００２０】
本発明は第三の態様を提供し、該第三の態様は有機溶媒中に抽出されたパクリタキセルシロップをクロマトグラフィーカラムに通す工程を含み、該工程において、充填媒体はカラム内の空隙を実質的に除くために圧縮され、かつ約６８９５ｋＰａ（１０００ｐｓｉ）までの圧力、例えば約２０６．８５乃至３４４．７５ｋＰａ（３０乃至５０ｐｓｉ）の圧力に維持される。
【００２１】
本発明は第四の態様を提供し、該第四の態様はイチイ属のバイオマスを有機溶媒で抽出する工程と、該溶液をヘキサン及び水で分配する工程と、次いで該溶液をジクロロメタン若しくはクロロホルムと水とで再分配する工程と、不純物を含んだパクリタキセルのジクロロメタン又はクロロホルム溶液を回収する工程とを含む。
【００２２】
本発明の第一の態様の一つの特徴は、不純物を含んだタキサン誘導体を含有する有機溶液をクロマトグラフィーカラムに通す更なる工程の実施を含み、該カラム中の充填媒体は該カラム内における空隙を除くために圧縮され、次いで約２７５８ｋＰａ（４００ｐｓｉ）までの圧力に維持される。
【００２３】
本発明の第一の態様のその他の特徴は以下を含む：
抽出された該不純物を含んだタキサン誘導体を含む有機溶液をクロマトグラフィーカラムに通す更なる工程を実施し、該カラムにおける充填媒体は該カラム内の空隙を除くために圧縮され、次いで約２７５８ｋＰａ（４００ｐｓｉ）までの圧力にて維持され、それにより有機溶媒に抽出されたパクリタキセルを提供する工程と、該有機溶媒中に抽出されたパクリタキセルシロップをクロマトグラフィーカラムに通し、該カラムにおける充填媒体は該カラム内の空隙を除くために圧縮され、かつ約３４４．７５ｋＰａ（５０ｐｓｉ）の圧力に維持する工程を実施することと；
イチイ属のバイオマスを有機溶媒で抽出する予備工程と、該溶液をヘキサン及び水で分配する工程と、次いで該溶液をジクロロメタン若しくはクロロホルムと水とに再分配する工程と、最終的には粗パクリタキセルのジクロロメタン又はクロロホルム溶液を回収する工程とを実施することと；
メタノール、エタノール、メタノール及びエタノールの混合物、ジクロロメタン及びメタノールの混合物、あるいはジクロロメタン及びエタノールの混合物としての有機溶液の選択と；
充填媒体としてジフェニル基結合シリカゲル又はＣ−１８結合シリカゲルを選択することと；
アセトン／水、メタノール／水又はアセトニトリル／水の勾配溶液を用いてカラムを溶出することと；
約３５０ｍｌ／分の流速を選択し、かつ約４１３７乃至５５１６ｋＰａ（６００乃至８００ｐｓｉ）にて維持される圧力を選択することと；及び
ほぼ純粋なパクリタキセルを再結晶及び回収する工程。
【００２４】
本発明の第二の態様の特徴は以下を含む：
アセトン／水、エタノール／水又はイソプロパノール／水を有機溶液として選択することと；
カラム中の充填媒体として、ポリスチレン−ＤＶＢ樹脂、ポリメタクリレート樹脂又はポリ芳香族樹脂を選択することと；
アセトン／水、メタノール／水又はアセトニトリル／水の勾配溶液を用いて、例えば、約１リットル／分の流速にてカラムを溶出することと；及び
カラムの溶出物から不純物を含んだパクリタキセルを再結晶する工程。
【００２５】
本発明の第三の態様の特徴は以下を含む：
充填媒体として、ポリスチレン−ＤＶＢ樹脂、ポリメタクリレート樹脂又はポリ芳香族樹脂を選択することと；
カラムの溶出の選択は、アセトン／水、メタノール／水又はアセトニトリル／水の段階勾配（ｓｔｅｐ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用いることと；
溶出物のカラムを通過する流速として、約３５０ｍｌ／分を選択し、かつ約４１３７乃至５５１６ｋＰａ（６００乃至８００ｐｓｉ）の圧力あるいは約６８９５ｋＰａ（１０００ｐｓｉ）までの圧力を選択することと；及び
カラムからの溶出物の一部から９−ジヒドロ−１，３−アセチルバカチンＩＩＩを再結晶する更なる工程。
【００２６】
本発明の第四の態様の特徴は、粗結晶パクリタキセルエタノール溶液としてタキサン類似体の溶液を選択する工程を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
要するに、より一般的な用語にて、本発明は、工業的なスケールの分取高速液体クロマトグラフィーのための「ロードロック型（Ｌｏａｄ  ａｎｄ  Ｌｏｃｋ）アキシャル・コンプレッション・カラム（Ａｘｉａｌ  Ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｎ）」を用いることによりパクリタキセルの有機溶液を抽出する精製技術を示唆する。
【００２８】
分取高速液体クロマトグラフィーにおいて中程度の直径及び大きな直径のカラムの使用を成功させるには、適切なハードウェアを必要とする。「ロードロック型アキシャル・コンプレッション・カラム」は、クラマトグラフィー床を充填又は抜き出し（ｕｎｐａｃｋ）するために、かつ使用時に床の圧縮を維持するためにピストンが使用されるものである。これは、床における空隙の形成を効率的かつ実質的に回避する。カラムは、小さな粒子径（約１０μｍ）の媒体を含む任意の充填材料にて充填され、かつ非常に高い段数（ｐｌａｔｅ  ｎｕｍｂｅｒ）が生成される。床の長さは、カラムを調製するために使用される充填材料の量を制御するために調整される。
【００２９】
本発明においてそのような「ロードロック型アキシャル・コンプレッション・カラム」を使用することにより、イチイ属の種からパクリタキセルを抽出するための市販の経済的な工程が提供される。該工程は一連の手順工程を含む。最後の重要な工程は、第三の工程により調製されるか、又は調製されない不純物を含んだパクリタキセル溶液において実施され得る。同様に、第三の工程は、第二の工程により調製されるか、又は調製されない不純物を含んだパクリタキセル溶液において実施され得る。付随的に、第二の工程は、第一の工程により調製されるか、又は調製されない不純物を含んだパクリタキセル溶液において実施され得る。
【００３０】
好ましい実施形態において、第一の工程は、イチイ属の種、好ましくはタクスス  カナデンシス（カナダイチイ）の植物材料からの抽出を含む。一つ以上のタキサンを含む植物の任意の部分として、例えば、樹皮、根、葉又は針状葉、枝、小枝、種又は苗木全体が使用され得る。好ましくは、切り落とされた針状葉及び小枝は乾燥され、かつ粉砕される。植物材料の粉砕は、例えば、チッパー及び／又は粉砕ミルの使用によるような従来技術の手段により達成され得る。タキサンは、植物全体から、或いは例えば、ステップ（ｓｔｅｐｓ）、根、葉（針状葉）、種又はそれらの混合物のような植物の一部から抽出され得る。抽出されるべき材料は、生のものであるか、又は乾燥したものである。好ましくは針状葉が使用される。
【００３１】
植物材料は好ましくは最初に乾燥され、通常は約０．００１乃至約１０ｍｍ３の範囲である適切な粒子径に粉砕される。植物材料は、例えばメタノール、エタノール、メタノールとエタノールとの混合物、ジクロロメタンとメタノールとの混合物或いはジクロロメタンとエタノールとの混合物のような有機溶媒を用いて抽出される。抽出物からのろ過物は水と混合され、液体の容量を減らすために濃縮される。濃縮物は、脱脂工程を可能にするためにヘキサンと水とに分配される。水性の液体は、例えばジクロロメタン、クロロホルム又は酢酸エチルのような有機溶媒と水とで再分配され、濃シロップに濃縮される。
【００３２】
好ましい実施形態において、第二の工程は、該濃シロップをカラムに通す工程を含む。このイオン交換に好ましい溶液は、第一の工程において調製された濃シロップであり、該シロップは例えばアセトン、エタノール又はイソプロパノールのような有機溶媒を用いて希釈される。しかしながら、抽出されたパクリタキセルを含む任意の適切な有機溶液はこの第二の工程における出発物質である。
【００３３】
例えば、ジクロロメタン／アセトン／水中のシロップは、高分子吸着樹脂を含む中圧カラムに注入することにより複数のフラクションに分けられる。高分子吸着樹脂は、例えば、ポリスチレンＤＶＢ樹脂、ポリメタクリレート樹脂、又は任意のその他適切なポリ芳香族樹脂であり得る。高分子吸着樹脂において使用される最も一般的なタイプの樹脂は架橋ジビニルベンゼンを有するポリスチレンポリマーである。高分子吸着樹脂は適切な粒子径を有するべきであり、それにより、カラムのサイズ、指定された作用圧及び流速において適切となる。一つの非限定的な例は、約５乃至１００メッシュの粒子径である。
【００３４】
例えば、アセトン／水、メタノール／水、エタノール／水又はアセトニトリル／水のような適切な水混和性溶媒の段階勾配を備えた溶出溶液をカラムに通過させる。流速は可変的であり、種々の操作条件に従って変更可能である。一つの非限定的な例は、約２リットル／分の流速である。
【００３５】
約４５％までのアセトン／水を含むフラクションは、９−ジヒドロ−１，３−アセチルバカチンＩＩＩの結晶の形成を可能にする。
約４５％以上のアセトン／水を含むフラクションは、アセトンの大部分を除去するために濃縮される。それらは、例えば酢酸エチル、ＣＨ３ＣＬ又はＣＨ２Ｃｌ２のような適切な有機溶媒を用いて抽出され、かつパクリタキセルの粗固形残渣を提供するために濃縮される。
【００３６】
第三の工程は、粗固形パクリタキセルの精製を含む。好ましくは、この粗固形パクリタキセルは第二の工程の生成物である。しかしながら、生成された粗固形パクリタキセルがこの第三の工程の出発物質であり得る。
【００３７】
粗固形パクリタキセルは、脱脂工程を可能にするために、例えばアセトンのような適切な水混和性溶媒中に溶解され、かつそのアセトン／水溶液のような水混和性有機溶媒／水溶液は、アキシャル・コンプレッション・カラム・クロマトグラフィーにより溶出される。このシステムは、例えば約１７２３．７５乃至２７５８ｋＰａ（２５０乃至４００ｐｓｉ）又は約３４４７５ｋＰａ（５０００ｐｓｉ）のような高圧を提供するとともにその圧力にて維持するための手段を備えた高速液体クロマトグラフィーである。
【００３８】
上述のような適切なイオン交換樹脂を含んだこのカラムにパクリタキセル溶液が装填され、例えば、上述の高圧にてアセトン／水の勾配にて溶出される。そのようなアセトン／水中にパクリタキセルを含んだフラクションは結晶化され、かつ乾燥され、半ば純粋な（ｓｅｍｉ−ｐｕｒｅ）パクリタキセルが提供される。
【００３９】
最終工程は、半純粋パクリタキセルを精製することを含む。好ましくは、半純粋パクリタキセルは第三の工程の生成物である。しかしながら、生成された半純粋パクリタキセルがこの最終工程の出発物質となり得る。
【００４０】
最終工程にて使用されるカラムは、第三の工程にて使用されるカラムと同一である。カラム中のイオン交換樹脂又は充填媒体は、ジフェニル基結合シリカゲル若しくはＣ−１８結合シリカゲル、又は任意のその他逆相充填材料であり得る。
【００４１】
半純粋パクリタキセルは、例えばアセトニトリル、エタノール又はメタノールのような適切な水混和性溶媒に溶解される。この溶液は充填カラムに装填され、例えば、アセトニトリル／水のような水混和性有機溶媒／水溶液の勾配溶媒を用いて、例えば、約３５０ｍｌ／分のような適切な速度かつ例えば約４１３７乃至５５１６ｋＰａ（６００乃至８００ｐｓｉ）或いは約６８９５ｋＰａ（１０００ｐｓｉ）まで高く維持された適切な圧力にて溶出される。
【００４２】
純粋なパクリタキセルを含むフラクションは結晶化可能であり、かつ該結晶はアセトン／ヘキサンから再結晶された。純粋な白色粉末状のパクリタキセルが得られた。
【実施例１】
【００４３】
バイオマスの抽出
植物材料（カナダイチイ、タクスス  カナデンシス）は、カナダのプリンスエドワード島及びニューブランスウィック地区にて２００２年の秋に採集されたものであり、約０．０３２％のパクリタキセルを含んでいた。カナダイチイの新鮮な伐採物を粉砕するまえに、約６０乃至７０℃にて乾燥窯中にて乾燥させた。
【００４４】
粉砕した針状葉及び小枝のバイオマス６００ｋｇを反射濃縮器を備えた３０００抽出機に入れた。次に、２４００リットルのメタノールを加えた。メタノールを用いてバイオマスを約３時間還流し、溶媒をろ過し、第一のろ過物を回収した。２０００リットルのメタノールをろ過後のバイオマス残渣に加え、約２時間還流し、ろ過した。第二のろ過物を回収し、バイオマスを廃棄した。第一及び第二のろ過物を合わせて、約１０％の水を加えた。水溶液を真空下、最初の容量の約１５％となるまでエバポレータで濃縮した。
【００４５】
濃縮物は、該濃縮物を脱脂するために、ヘキサンと水で２回分配した。水層を回収し、ジクロロメタン（又はクロロホルム）と水で２回再分配した。有機層を回収し、真空下にて濃シロップとなるまでエバポレータで濃縮した。ヘキサン層を回収し、水層を廃棄した。
【００４６】
約４５ｋｇのシロップが６００ｋｇのバイオマスから得られた。ジクロロメタンシロップは約１乃至１．３％のパクリタキセルを含んでいた。
【実施例２】
【００４７】
パクリタキセルの一次精製
実施例１から得られた２３ｋｇのジクロロメタンシロップを、機械的撹拌器を備えた容器中にて、必要に応じて暖めながら１０リットルのアセトンで希釈した。撹拌は一秒当り１．５回に調整し、１０分間にわたり、３リットルの脱イオン水を徐々に加えた。ジクロロメタンシロップの水溶液を、中圧定量ダイアフラム・ポンプを備えたステンレス製、かつ工業的スケールの中圧カラムにより複数のフラクションに分離した。
【００４８】
約５０乃至１００メッシュの粒子径を備えた１２０ｋｇのポリスチレン−ＤＶＢ樹脂（Ｒｏｈｍ−Ｈａｓｓ  ＸＡＤ−１６００）のメタノール液からなるスラリーを直径が３００ｍｍで、長さが３０００ｍｍのカラムに注入した。溶媒を２０６．８５乃至３４４．７５ｋＰａ（３０乃至５０ｐｓｉ）にてポンプ注入しながらカラムを固定後、カラムが平衡になるまでメタノールを約３０％のアセトン水に置き換えた。
【００４９】
希釈されたシロップサンプルはカラムの頂部に移動した。容器は数リットルの３０％のアセトン水ですすぎ、スラリーをカラムに移した。次にカラムを密封し、溶出溶液をカラムにポンプで注入しながら流し始めた。次に、カラムを３５、４５、５０、６０、６５、７０及び８０％のアセトン／水の段階勾配を用いて溶出した。流速は、１分当り約２リットルに制御した。各々が約２０リットルのフラクションを、約２０６．８５乃至３４４．７５ｋＰａ（３０乃至５０ｐｓｉ）に圧力を維持した状態にて回収した。
【００５０】
最初に８０％のアセトン／水を用いて洗浄後、カラムを純粋なアセトンで洗浄し、最初はかなり暗色である流出物が無色になるまで、アセトン／酢酸エチル（１：１）の混合物を用いて洗浄した。
【００５１】
洗浄後、カラムを、再び３０％のアセトン水を用いて、再生成され、かつ次の工程に進む準備常態である平衡状態とした。
回収されたフラクションは、分析用ＨＰＬＣを用いて２２７／ｎｍの紫外線吸収により監視し、かつ１０％の水エタノール溶液を噴霧することによりＴＬＣにより監視した。９−ジヒドロ−１３−アセチルバカチンＩＩＩを含むフラクション（大部分は４５％アセトン／水中にある）を合わせて、大部分のアセトンを除去するための濃縮し、結晶化が完了するまで一晩フード内に放置した。結晶を濾取し、メタノールで再結晶し、白色針状結晶である純粋な９−ジヒドロ−１３−アセチルバカチンＩＩＩを２４０グラム得た。収率：０．０８％。
【００５２】
パクリタキセルを含むフラクション（大部分は６５％アセトン／水中にある）を合わせてし、大部分のアセトンを除去すべく濃縮した。水溶液を酢酸エチルで抽出した。有機層を回収し、乾燥するまで濃縮した。残渣を分析用ＨＰＬＣで分析した。残渣（粗パクリタキセル材料）は約１０乃至１５％のパクリタキセルを含んでいた。パクリタキセルの回収率は、ジクロロメタンシロップから約９０乃至１００％であった。
【実施例３】
【００５３】
パクリタキセルの二次精製
二次精製は、「アキシャル・コンプレッション・カラム・クロマトグラフィー」と称される分取高速液体クロマトグラフィー系を使用した。使用されたカラムは、バリアン（Ｖａｒｉａｎ）ロードロック型アキシャル・コンプレッション・カラム（直径２５０ｍｍ×全長１０００ｍｍ）であった。クロマトグラフィー系は、バリアンＳＴ−４０００システムであり、二つの高圧ダイアフラム・ポンプと、サンプルインレットポートと、ＵＶ検出器と、バリアンコントロールソフトウェアシステムとを備えていた。カラムは、該カラムを充填する及び抜き出すための油圧ピストンとロックアダプタとを備えていた。５０リットルのポリスチレン−ＤＶＢ樹脂（Ｒｏｈｍ−ＨａｓｓＣＧ−１６１ｍ、粒子径約７５μｍ）のエタノール溶液をカラムに完全に充填した後、油圧ピストンを作動した。カラムの充填媒体を約２０６８５ｋＰａ（３０００ｐｓｉ）の圧力にて圧縮するために、ピストンを徐々に押し出した。カラムが圧縮される間、該カラムをロックするためにロックをそのロッキング位置に切り替えた。従って、カラムは非常に高い段数を生成した。溶媒を１７２３．７５乃至２０６８．５ｋＰａ（２５０乃至３００ｐｓｉ）にてポンプ注入しながらカラムを固定後、カラムが平衡になるまでエタノールを約３０％のアセトン水に置き換えた。
【００５４】
実施例２で得られた残渣約１．５ｋｇを全ての固形物が溶解するまで４リットルのアセトンに溶解した。撹拌しながら２リットルの水を徐々に加え、必要に応じてろ過した。次に水溶液をサンプルインレットポートからカラム内にポンプ注入した。
【００５５】
次にカラムをアセトン／水勾配溶媒（５０％アセトン水から始まり、１００％アセトンで終了する）を用いて溶出した。流速は、１分当り１リットルに制御した。各々が約５リットルのフラクションを約２０６８．５乃至２７５８ｋＰａ（３００乃至４００ｐｓｉ）に圧力を維持した状態にて回収した。
【００５６】
回収されたフラクションは、分析用ＨＰＬＣを用いて２２７／ｎｍの紫外線吸収により監視し、かつ１０％の水エタノール溶液を噴霧することによりＴＬＣにより監視した。パクリタキセルを含むフラクション（大部分は７０％アセトン／水中にある）を合わせて、大部分のアセトンを除去するために濃縮し、結晶化が完了するまで一晩フード内に放置した。結晶を濾取し、７０％メタノール水溶液で再結晶し、真空オーブンで乾燥し、わずかに白色の針状結晶を２３５グラム得た。この半純粋パクリタキセルは約７０乃至８０％の純度である。収率：粗パクリタキセル材料から約９０乃至９５％。
【実施例４】
【００５７】
パクリタキセルの最終的な精製
最終的な精製には分取高速液体クロマトグラフィー及びアキシャル・コンプレッション・クロマトグラフィー用カラムを使用した。使用したカラムはバリアンロードロック型アキシャル・コンプレッション・カラム（直径１００ｍｍ×全長１０００ｍｍ）であった。クロマトグラフィー系は、バリアンＳＤ−２分取ＨＰＬＣシステムであり、サンプルインレットポートと、ＵＶ検出器と、バリアンコントロールソフトウェアシステムとを備えていた。カラムは、該カラムを充填する及び抜き出すための油圧ピストンとロックアダプタとを備えていた。使用された充填媒体はジフェニル基結合シリカゲル又はＣ−１８結合シリカゲルであった。
【００５８】
エタノール中の６リットルの充填媒体を用いてカラムを完全に充填した後、油圧ピストンを作動した。カラムの充填媒体を約２０６８５ｋＰａ（３０００ｐｓｉ）の圧力にて圧縮するために、ピストンを徐々に押し出した。カラムが圧縮される間、該カラムをロックするためにロックをそのロッキング位置に切り替えた。精製においてカラムを使用する前に、カラムが平衡になるまでエタノールを約３０％のアセトニトリル水に置き換えた。
【００５９】
実施例３で得られた粗パクリタキセル約５０ｇを全ての固形物が溶解するまで２００ｍｌのアセトニトリルに溶解した。撹拌しながら１００ｍｌの水を徐々に加え、必要に応じてろ過した。次に水溶液をサンプルインレットポートからカラム内にポンプ注入した。
【００６０】
次にカラムをアセトニトリル／水勾配溶媒（３０％アセトニトリル水から始まり、１００％アセトニトリルで終了する）を用いて溶出した。流速は、１分当り３５０ｍｌに制御した。各々が約１リットルのフラクションを約４１３７乃至５５１６ｋＰａ（６００乃至８００ｐｓｉ）に圧力を維持した状態にて回収した。
【００６１】
回収されたフラクションは、２２７／ｎｍの吸光度にて紫外線検出器により監視し、かつ１０％の水エタノール溶液を噴霧することによりＴＬＣで監視した。純粋なパクリタキセルを含むフラクションを合わせて、大部分のアセトニトリルを除去するために濃縮し、結晶化が完了するまで一晩フード内に放置した。結晶を濾取し、アセトン：ヘキサン（１：１）から再結晶化し、真空オーブンで乾燥し、３６．５グラムの白色粉末得た。この純粋なパクリタキセルは約９９％を超える純度である。収率：７０乃至８０％の純粋な粗パクリタキセルから約８５乃至９０％。
【００６２】
全収率は約７３％を超えていた。
上記したように、本発明の態様による方法は簡単である。パクリタキセル及びその他のタキサンを高収率かつ工業的スケールの純度にて与える。従って、本発明は、植物源又は組織培養、特にタクスス  カナデンシスからパクリタキセル及びその他の関連するタキサンの大量生産のための効率的なコストによる方法を提供する。本発明の方法は、イチイ属（イチイ科）の植物からのパクリタキセル及び関連したタキサンの大量生産を提供する。
【００６３】
本発明の態様による単離及び精製法は、天然に由来するイチイ属の種から純粋な形態にてタキサン誘導体を高効率にて回収する。改良点は、タキサンの高い回収率及び単離されたタキサンの純度に反映される。
【外国語明細書】
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