(57)【要約】【課題】本発明の課題は、天然植物から抽出、分離した物質のチロシナーゼ活性阻害効果とその作用をなす有効成分の製法及び化学組成式を明らかにし、人皮膚における美白用剤、食品類の褐変防止剤等の用途に好適に使用しうるチロシナーゼ活性阻害剤を提供することにある。【解決手段】レモングラス（Cymbopogon citratus）から極性溶媒（Ａ）を用いて抽出される、チロシナーゼ活性阻害作用を有するレモングラス抽出物。更に、レモングラス（Cymbopogon citratus）から抽出した、次の化学式（Ｉ）および（II）で示されるゲラニックアシド化合物を含有するチロシナーゼ活性阻害剤。2007210965.tif 0000122007210965.tif 000013
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レモングラス（Cymbopogon citratus）から極性溶媒（Ａ）を用いて抽出される、チロシナーゼ活性阻害作用を有するレモングラス抽出物。
【請求項２】
次の抽出工程ａ−ｃまたはａ−ｄにより得られる請求項１に記載のレモングラス抽出物。
ａ．レモングラスを、極性溶媒（Ａ）を用いて抽出し抽出物を得る工程
ｂ．工程ａで得られた抽出物を非極性有機溶媒（Ｂ）と極性溶媒（Ｃ）を用いて分画し極性溶媒抽出物を得る工程
ｃ．工程ｂで得られた抽出物に対し有機溶媒（Ｄ）と水とを用いて分画し有機溶媒抽出物を得る工程
ｄ．工程ｃの水分画に対し有機溶媒（Ｅ）と水とを用いてさらに分画し有機溶媒抽出物を得る工程
【請求項３】
請求項１または２に記載のレモングラス抽出物を含有するチロシナーゼ活性阻害剤。
【請求項４】
請求項１または２に記載のレモングラス抽出物を含有する美白化粧料。
【請求項５】
請求項１または２に記載のレモングラス抽出物を含有する皮膚外用剤。
【請求項６】
請求項１または２に記載のレモングラス抽出物を含有する食品褐変防止剤。
【請求項７】
次の抽出工程ａ−ｃまたはａ−ｄにより得られる、チロシナーゼ活性阻害作用を持つレモングラス抽出物の製法。
ａ．レモングラスを、極性溶媒（Ａ）を用いて抽出し抽出物を得る工程
ｂ．工程ａで得られた抽出物を非極性有機溶媒（Ｂ）と極性溶媒（Ｃ）を用いて分画し極性溶媒抽出物を得る工程
ｃ．工程ｂで得られた抽出物に対し有機溶媒（Ｄ）と水を用いて分画し有機溶媒抽出物を得る工程
ｄ．工程ｃの水分画に対し有機溶媒（Ｅ）と水とを用いてさらに分画し有機溶媒抽出物を得る工程
【請求項８】
化学式（Ｉ）で示されるトランスゲラニックアシド、化学式（II）で示されるシスゲラニックアシド、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を含有するチロシナーゼ活性阻害剤。
【化１】
2007210965.tif 000010
【化２】
2007210965.tif 000011
【請求項９】
前記化学式（Ｉ）及び（II）の化合物がレモングラス由来である請求項７に記載のチロシナーゼ活性阻害剤。
【請求項１０】
前記化学式（Ｉ）及び（II）の化合物が次の抽出工程ｅ−ｈにより得られる請求項７に記載のチロシナーゼ活性阻害剤。
ｅ．レモングラスを、極性溶媒（Ａ）を用いて抽出し抽出物を得る工程
ｆ．工程ｅで得られた抽出物を非極性有機溶媒（Ｂ）と極性溶媒（Ｃ）を用いて分画し極性溶媒抽出物を得る工程
ｇ．工程ｆで得られた抽出物に対し有機溶媒（Ｄ）と水を用いて分画し有機溶媒抽出物を得る工程
ｈ．工程ｇの有機溶媒分画に対しカラムクロマトグラフィーを用いて分画する工程
【請求項１１】
化学式（Ｉ）で示されるトランスゲラニックアシド、化学式（II）で示されるシスゲラニックアシド、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を含有する美白化粧料。
【請求項１２】
化学式（Ｉ）で示されるトランスゲラニックアシド、化学式（II）で示されるシスゲラニックアシド、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を含有する皮膚外用剤。
【請求項１３】
化学式（Ｉ）で示されるトランスゲラニックアシド、化学式（II）で示されるシスゲラニックアシド、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を含有する食品褐変防止剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素チロシナーゼの作用を阻害し、メラニン生成を抑制する効果のあるチロシナーゼ活性阻害剤に関し、天然植物から抽出される成分、特にレモングラス（Cymbopogon citratus）の葉の抽出物又はこれに含まれる化合物を有効成分として含有するチロシナーゼ活性阻害剤とその製法及び用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
過剰な紫外線刺激による人皮膚の黒色化やシミ・ソバカスなどの生成は、一般に
人皮膚細胞中の酵素チロシナーゼが、チロシンないしドーパを酸化して生成した黒色のメラニンによることが知られている（特許文献１）。さらに人皮膚の美白用皮膚外用剤としてハイドロキノン、コウジ酸、アルブチン或いはビタミンＣ等のチロシナーゼ活性阻害剤がよく知られている（特許文献２）。しかし、これらのチロシナーゼ活性阻害剤においては、それぞれ安定性、安全性、性能等において一長一短が指摘されており、依然改良の余地が残されている。
【０００３】
一方、レモングラスは古来より食薬用ハーブとしてその葉は食品や料理の賦香、矯臭、またハーブティーやアロマテラピィーオイルとして健康増進目的に愛用されている。また、レモングラスから抽出、分離して得られる物質については、消化器系機能調整、中枢神経系機能調整、抗菌など種々の作用を持つとして知られている。例えば、レモングラスの溶剤抽出物が抗酸化作用を示すこと（特許文献３）、レモングラスの水蒸気蒸留水や水溶性溶媒抽出物が過酸化脂質生成抑制作用、保湿作用、抗菌作用を示すこと（特許文献４）、レモングラス抽出物がリパーゼ阻害活性を有すること（特許文献５）、レモングラス抽出物がＴＮＦ産生促進作用を示すこと（特許文献６）などが開示されている。しかしながら、レモングラスから抽出、分離して得られる物質がチロシナーゼ活性阻害作用を有することについては知られていない。
【０００４】
【特許文献１】特公平４−２５６２号公報
【特許文献２】特開２００１−３１６２６８号公報
【特許文献３】特開平３−５６５８５号公報
【特許文献４】特開平７−２７７９２０号公報
【特許文献５】特開２００１−１２０２３７号公報
【特許文献６】特開２００３−３２１３８５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明の課題とするところは、天然植物の抽出物についてチロシナーゼ活性阻害能を調査・研究し、チロシナーゼ活性阻害剤の新しい供給源となり得る植物を開発することにより、人皮膚における美白用剤、或いはチロシン又はチロシナーゼの基質となりうるフェノール成分を含む食品類の褐変防止剤等の用途に好適に使用しうるチロシナーゼ活性阻害剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、前記課題を解決するに当たり、亜熱帯に位置し多様な植生を有する沖縄地方において栽培される伝統的薬草や食用植物３６種５３部位（以下「サンプル」という）についてチロシナーゼ活性阻害作用を調査研究し、その中から前記阻害作用の強いサンプルを選択し、選択したサンプルの抽出物について有効成分の化学組成を分析確認した。その結果、特にレモングラスの葉の抽出物が特に強いチロシナーゼ活性阻害作用を呈することを見出し、さらに前記抽出物中に含まれるチロシナーゼ活性成分のうち顕著な活性をもつ化合物として、公知の化合物ゲラニックアシドである下記化学式（Ｉ）および（II）で示される化合物を見出して、本発明を完成した。
【０００７】
【化３】
2007210965.tif 000002
【０００８】
【化４】
2007210965.tif 000003
【０００９】
すなわち、本発明は下記（１）〜（１３）に掲げる態様を含むものである。
（１）レモングラス（Cymbopogon citratus）から極性溶媒（Ａ）を用いて抽出される、チロシナーゼ活性阻害作用を有するレモングラス抽出物。
（２）次の抽出工程ａ−ｃまたはａ−ｄにより得られる前記（１）に記載のレモングラス抽出物。
ａ．レモングラスを、極性溶媒（Ａ）を用いて抽出し抽出物を得る工程
ｂ．工程ａで得られた抽出物を非極性有機溶媒（Ｂ）と極性溶媒（Ｃ）を用いて分画し極性溶媒抽出物を得る工程
ｃ．工程ｂで得られた抽出物に対し有機溶媒（Ｄ）と水とを用いて分画し有機溶媒抽出物を得る工程
ｄ．工程ｃの水分画に対し有機溶媒（Ｅ）と水とを用いてさらに分画し有機溶媒抽出物を得る工程
（３）前記（１）または（２）に記載のレモングラス抽出物を含有するチロシナーゼ活性阻害剤。
（４）前記（１）または（２）に記載のレモングラス抽出物を含有する美白化粧料。
（５）前記（１）または（２）に記載のレモングラス抽出物を含有する皮膚外用剤。
（６）前記（１）または（２）に記載のレモングラス抽出物を含有する食品褐変防止剤。
（７）次の抽出工程ａ−ｃまたはａ−ｄにより得られる、チロシナーゼ活性阻害作用を持つレモングラス抽出物の製法。
ａ．レモングラスを、極性溶媒（Ａ）を用いて抽出し抽出物を得る工程
ｂ．工程ａで得られた抽出物を非極性有機溶媒（Ｂ）と極性溶媒（Ｃ）を用いて分画し極性溶媒抽出物を得る工程
ｃ．工程ｂで得られた抽出物に対し有機溶媒（Ｄ）と水を用いて分画し有機溶媒抽出物を得る工程
ｄ．工程ｃの水分画に対し有機溶媒（Ｅ）と水とを用いてさらに分画し有機溶媒抽出物を得る工程
（８）前記化学式（Ｉ）で示されるトランスゲラニックアシド、前記化学式（II）で示されるシスゲラニックアシド、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を含有するチロシナーゼ活性阻害剤。
（９）前記化学式（Ｉ）及び（II）の化合物がレモングラス由来である前記（７）に記載のチロシナーゼ活性阻害剤。
（１０）前記化学式（Ｉ）及び（II）の化合物が次の抽出工程ｅ−ｈにより得られる前記（７）に記載のチロシナーゼ活性阻害剤。
ｅ．レモングラスを、極性溶媒（Ａ）を用いて抽出し抽出物を得る工程
ｆ．工程ｅで得られた抽出物を非極性有機溶媒（Ｂ）と極性溶媒（Ｃ）を用いて分画し極性溶媒抽出物を得る工程
ｇ．工程ｆで得られた抽出物に対し有機溶媒（Ｄ）と水を用いて分画し有機溶媒抽出物を得る工程
ｈ．工程ｇの有機溶媒分画に対しカラムクロマトグラフィーを用いて分画する工程
（１１）前記化学式（Ｉ）で示されるトランスゲラニックアシド、前記化学式（II）で示されるシスゲラニックアシド、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を含有する美白化粧料。
（１２）前記化学式（Ｉ）で示されるトランスゲラニックアシド、前記化学式（II）で示されるシスゲラニックアシド、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を含有する皮膚外用剤。
（１３）前記化学式（Ｉ）で示されるトランスゲラニックアシド、前記化学式（II）で示されるシスゲラニックアシド、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を含有する食品褐変防止剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によると、レモングラスの抽出物が優れたチロシナーゼ活性阻害効果を有していること、また、レモングラスから抽出された化合物が、特に前記化合物（Ｉ）は、従来からよく知られている非常に強力な活性を有するコウジ酸に匹敵するチロシナーゼ阻害活性を有し、また、前記化合物（Ｉ）および（II）ともに、これも従来から良く知られているアルブチンと比較しても、遙かに優れたチロシナーゼ活性阻害効果を示すことが明らかとなり、且つその有効成分の製法及び化学式が明らかとなったことにより、天然物由来の新規なチロシナーゼ活性阻害剤が人皮膚の美白用剤、食品褐変防止剤等の用途に、従来にまして容易に提供できることとなり、又、レモングラスの活用による農業生産性の向上、地域産業の活性化への波及効果も期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に、本発明の実施の形態を詳しく説明する。チロシナーゼ活性阻害作用を有する本発明のレモングラス抽出物は、レモングラス（Cymbopogon citratus）を極性溶媒(A)で抽出することにより得られる。
【００１２】
前記レモングラスとしては、植物そのものやその乾燥物、あるいは市販の乾燥粉末などが使用される。使用するレモングラスの部位は、葉または茎、若しくはその混合物など部位によらず好適に利用可能であるが、特に好ましくは、レモングラスの葉を使用する。また、レモングラスの葉や茎、あるいはその乾燥物はそのまま抽出を行うこともできるが、粉砕・裁断した後に抽出を行ってもよい。
【００１３】
本発明のレモングラス抽出物は、上述したレモングラスを極性溶媒（Ａ）で抽出すること（下記抽出工程ａ）により得られるが、次の抽出工程ａ−ｃまたはａ−ｄによっても得られる。
ａ．レモングラスを、極性溶媒（Ａ）を用いて抽出し抽出物を得る工程
ｂ．工程ａで得られた抽出物を非極性有機溶媒（Ｂ）と極性溶媒（Ｃ）を用いて分画し極性溶媒抽出物を得る工程
ｃ．工程ｂで得られた抽出物に対し有機溶媒（Ｄ）と水を用いて分画し有機溶媒抽出物を得る工程
ｄ．工程ｃの水分画に対し有機溶媒（Ｅ）と水を用いてさらに分画し有機溶媒抽出物を得る工程
【００１４】
次に、本発明のレモングラス抽出物の具体的な抽出方法を例示する。
ａ．レモングラス乾燥物を、室温下、１０〜１５倍（重量比）の極性溶媒（Ａ）中、５〜１０時間攪拌しながら浸積することにより、レモングラスの抽出液を得る。得られた抽出液から溶媒を減圧下で蒸発させ、レモングラスの抽出物を得る。
ｂ．工程ａで得られた抽出物を極性溶媒（Ｃ）に懸濁し、これに非極性有機溶媒（Ｂ）を加えて分配する。次いでそれぞれに分画して濃縮することにより、非極性有機溶媒分画（以下「分画１」という。）と残余の極性溶媒可溶部を得る。
ｃ．工程ｂの残渣の極性溶媒可溶部を水に懸濁し、これに有機溶媒（Ｄ）を加えて分配し、濃縮により有機溶媒分画（以下「分画２」という。）を得る。
ｄ．工程ｃの残余の水懸濁液は、有機溶媒（Ｅ）と分配し、それぞれ濃縮することにより、有機溶媒分画（以下「分画３」という。）及び残余の水分画（以下「分画４」という。）を得る。
【００１５】
上記極性溶媒（Ａ）としては、メタノール、エタノール、アセトン等の極性有機溶媒、水、水酸化ナトリウム水溶液等のアルカリ性水溶液、メタノール−水混合物等の極性有機溶媒−水混合物溶液等が使用でき、特にメタノールが好適に使用できる。
【００１６】
上記非極性有機溶媒（Ｂ）としては、ヘキサン、ヘプタン等の非極性有機溶媒、特にへキサンが好適に使用できる
【００１７】
上記極性溶媒（Ｃ）としては、メタノール、エタノール等のアルコール溶媒、水、メタノール−水混合物等のアルコール−水混合物溶液等が使用でき、好ましくはメタノール−水水溶液、特にメタノール−水を９：１の割合で混合した溶液が好適に使用できる。
【００１８】
上記有機溶媒（Ｄ）としては、酢酸エチル、エーテル、ジクロロメタン、クロロホルム、ブタノール等の有機溶媒が広く使用でき、好ましくは酢酸エチルが好適に使用できる。
【００１９】
上記有機溶媒（Ｅ）としては、酢酸エチル、エーテル、ジクロロメタン、クロロホルム、ブタノール等の有機溶媒が広く使用でき、好ましくはブタノールが好適に使用できる。
【００２０】
（チロシナーゼ阻害活性率の測定）
チロシナーゼ阻害活性は、ドーパの酸化物であり、黒色メラニン生成の中間たるドーパクロームの生成度を、４７５ｎｍにおける吸光度の変化を測定することにより測定する。具体的には、抽出物のリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）をマイクロプレートに入れ、そこにドーパ（シグマ社製  Ｄ９６２８）を加え、次にチロシナーゼを加えて、マイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）を用い４７５ｎｍの吸光度の増加度（ａ）を読み取る。一方、抽出物を加えないもの（コントロール実験と呼ぶ）で、同様な操作を行い、得られた吸光度の増加度(ｂ)を用い、式[(ｂ−ａ)/ｂ]×１００を用いてチロシナーゼ活性阻害率（％inhibition±ＳＤ）を得る。
この方法を用いて、上記工程ａで得られたレモングラスの抽出物についてチロシナーゼ阻害活性を測定した所、高いチロシナーゼ阻害活性を見いだすことができた。また、前記各工程で得られた分画１〜４についてもチロシナーゼ阻害活性を測定した所、チロシナーゼ阻害活性は分画２及び分画３において特に高いことを見いだすことができた。
【００２１】
（化合物の同定）
前記各工程で得られた分画１〜４のうち、最強の阻害率を示した分画２について、有効成分をシリカゲルやセファデックスＬＨ−２０を用いたクロマトグラフィーにより単離し、核磁気共鳴吸収スペクトル（ＮＭＲスペクトル）、質量分析スペクトル（ＭＳスペクトル）による測定解析すること、また市販のゲラニックアシド（アルドリッチ社製  16333-3）とシリカゲルＴＬＣおよびＮＭＲで比較することにより、本発明の下記化学式（Ｉ）および（II）で示されるゲラニックアシド化合物を確認した。
【００２２】
【化５】
2007210965.tif 000004
【００２３】
【化６】
2007210965.tif 000005
【００２４】
前記化学式（Ｉ）で示されるトランスゲラニックアシド、前記化学式（II）で示されるシスゲラニックアシドは、高いチロシナーゼ活性阻害作用を有するため、チロシナーゼ活性阻害剤として有用である。また、前記化学式（Ｉ）および（II）で示されるゲラニックアシドは、塩の形でもチロシナーゼ活性阻害剤として使用可能である。前記化学式（Ｉ）および（II）で示されるゲラニックアシドは揮発性を有するが、塩の形にすることで揮発性を容易にコントロールすることが可能となる。前記塩としては、本発明の効果に悪影響を与えないものであれば特に制限はされないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属、その他アンモニウム塩や有機アミン塩等が挙げられる。
【００２５】
本発明のチロシナーゼ活性阻害剤は、前記化学式（Ｉ）で示されるトランスゲラニックアシド、前記化学式（II）で示されるシスゲラニックアシド、及び上述したようなこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有する。
【００２６】
前記化合物（Ｉ）および（II）で示されるゲラニックアシドは、レモングラス等の植物から抽出することにより得ることもできるし、公知の方法により製造することもできる。また、これら化合物の塩も公知の方法により製造することができる。
【００２７】
以上詳述したように、本発明によれば、上記ａ工程で得られたレモングラスの抽出物、上記ａ−ｃ工程またはａ−ｄ工程で得られたレモングラス抽出物が優れたチロシナーゼ阻害活性効果を持つこと、また、レモングラス抽出物に含まれる成分の一つである前記化学式（Ｉ）および（II）で示されるゲラニックアシドが優れたチロシナーゼ活性阻害作用を持つことが明らかになったことにより、天然物由来のチロシナーゼ活性阻害剤の原料としてレモングラスの利用、また、有効成分の製法及び有効成分の各種用途への利用が可能になる。
【００２８】
（用途）本発明のチロシナーゼ活性阻害剤は、従来のチロシナーゼ活性阻害剤と同様に、医薬品、医薬部外品、化粧料、食品、食品添加物、飼料等の有効成分として利用可能であり、特に、美白効果を目的とした皮膚外用剤や化粧料、食品の褐変防止剤の有効成分として好適に用いられる。この場合、チロシナーゼ阻害剤の添加量は、特に限定されるものではなく、皮膚外用剤や化粧料、食品褐変防止剤の種類によって異なるが、レモングラス抽出物として０．１〜５０．０重量％、好ましくは１〜２０重量％、上記化学式（Ｉ）および（II）で示されるゲラニックアシド化合物として、０．０１〜１０．０重量％程度、好ましくは０．１〜５．０重量％程度であり、目的に合わせて適宜配合すればよい。
【００２９】
本発明のチロシナーゼ活性阻害剤を皮膚外用剤として利用する場合、その形態としては、軟膏剤、クリーム剤、乳剤、ゲル剤、ローション剤、トリートメント剤、貼付剤等が挙げられる。又、本発明のチロシナーゼ活性阻害剤を化粧料として利用する場合、その形態としては、クリーム、乳液、化粧水、ローション、ジェル、美容液、パックなどの基礎化粧品、又、日焼け止めクリーム、日焼け止めローション、日焼け止めリップクリームなどの日焼け止め化粧料、又、メイクアップベースクリーム、パウダーファンデーション、リキッドファンデーション、口紅などのメイクアップ化粧料、さらには、ハンドクリーム、レッグクリーム、ボディローション、浴用剤などのボディ用化粧料などが挙げられる。
【００３０】
上述したような皮膚外用剤や化粧料には、有効成分である本発明のチロシナーゼ活性阻害剤の他に、通常外用剤や化粧料などの製造に使用される原料、例えば界面活性剤、油分、水、保湿剤、アルコール類、増粘剤、安定剤、防腐剤、酸化防止剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、香料、色素、顔料、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、各種ビタミン類、各種アミノ酸類などを配合することもできる。さらに、他のチロシナーゼ活性阻害剤などの美白剤を配合することもできる。このような皮膚外用剤や化粧料を製造するには、常法にしたがい、皮膚外用剤や化粧料の製造の任意の段階で、本発明のチロシナーゼ活性阻害剤を適量添加すればよい。
【００３１】
さらに本発明のチロシナーゼ活性阻害剤を食品褐変防止剤として利用する場合、その対象となる食品としては、各種フルーツ、椎茸、マッシュルームなどのきのこ類、カニやエビなどの海産物などが挙げられる。その使用方法としては、本発明のチロシナーゼ活性阻害剤を適当な媒体で希釈し、この溶液を対象物に噴霧、浸漬、または共存揮発させることで食品表面の褐変を防止することができる。
【実施例１】
【００３２】
本発明の実験例を基に具体的に説明するが、本発明の主旨とするところは、決してこれに限定されるものではない。
（植物の成分抽出とチロシナーゼ阻害活性）
沖縄地方において栽培される伝統的薬草や食用植物３６種５３部位の植物乾燥体をサンプルとし、エタノールで抽出した。抽出は、室温下で、サンプル約３０ｇをエタノール３５０ｍｇに浸漬し、６時間攪拌しながら行った。続いてエタノールを減圧下で蒸発させ、抽出物を得た。次に得られた抽出物のチロシナーゼ阻害活性率を測定し、比較的高い阻害率を示すサンプルを選別した。選別されたサンプルの抽出植物名（部位）と測定結果を表１に示す。
【００３３】
なお、前記３６種５３部位の各サンプル名は、リュウキュウヨモギ（地上部）、バンジロウ（葉部）及び同（実部）、ロブスターユーカリ（葉部）、ボタンボウフウ（地上部）、ガジュツ（根茎部）、ヨモギ（地上部）、ハルウコン（根茎部）、ニガウリ（実部）、ビョウヤナギ（葉部）、同（枝部）及び同（地下部）、フウトウカズラ（地上部）、クチナシ（枝部）及び同（葉部）、ゲットウ（葉部）、同（葉柄部）、同（実部）及び同（根茎部）、アカメガシワ（枝部）及び同（葉部）、ブッソウゲ（枝部）、同（葉部）及び同（花部）、トウガン（実部）、サキシマスオウノキ（葉部）及び同（枝部）、ニガニガグサ（地上部）、トウアズキ（茎葉部）、ヒハツモドキ（地上部）、ジュズダマ（葉部）、サツマイモ（カライモ種）（地上部）及び同（塊根部）、サルカケミカン（枝葉部）及び同（茎部）、クミスクチン（地上部）、レモングラス（地上部）、キダチアロエ（葉部）、クコ（葉部）、ナンテン（葉部）、コヘンルーダ（茎葉部）、ホソバハダン（地上部）、ヒレザンショウ（実部）、同（葉部）及び同（枝部）、ツルグミ（枝部）及び同（葉部）、オモト（全草）、エビスグサ（種子部）、シマトウガラシ（実部）、サツマイモ（シモン種）（塊根部）、シークワシャー（枝部）及び同（葉部）である。
【００３４】
【表１】
2007210965.tif 000006
【００３５】
表１に記載する活性測定法の詳細は次のとおりである。最終植物抽出物の測定濃度が０．１５ｍｇ／ｍｌとなるように調製した１／１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）１２０μｌを９６穴マイクロプレートに入れ、そこに２．５ｍＭのドーパ（シグマ社製  Ｄ９６２８）４０μｌを加え、４０Ｕ/ｍｌのチロシナーゼ（シグマ社製）４０μｌを２３℃で加えると同時に攪拌後、マイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）を用い、２ないし５分後の４７５ｎｍの吸光度の増加度（ａ）を読み取る。一方、何もサンプルを加えないもの（コントロール実験と呼ぶ）で、同様な操作を行い、得られた吸光度の増加度(ｂ)を用い、式[(ｂ−ａ)/ｂ]×１００を用いてチロシナーゼ活性阻害率（％inhibition±ＳＤ）を得る。
【００３６】
前記の阻害活性測定法においては、吸光度の増加の測定は、ドーパの酸化物であり黒色物質メラニン生成の重要な中間体であるドーパクロームの生成度を、４７５ｎｍの吸光度を用いて、吸光度測定器・マイクロプレートリーダー（バイオラッド製  Ｍｏｄｅｌ５５０）を用いて測定することによる。阻害度は、酵素チロシナーゼによる着色度合によることから、阻害度が大きいほどドーパクロームの生成が少ないので吸光度が低く、透過率が高い。すなわちチロシナーゼ無添加のサンプル混合液の透過率を１００％としたときの検体液の透過率を「阻害率％±ＳＤ（標準偏差）」（％inhibition±ＳＤ）で表現している。
【００３７】
（測定結果）
表１から明らかなとおり、ゲットウ（根茎部）、サキシマスオウノキ（枝部）、レモングラス（地上部）、ナンテン（葉部）及びツルグミ（枝部）の５サンプルに阻害活性が認められた。なお、レモングラスはナンテンの葉部に続く強度の阻害活性を示すことが判明した。
【００３８】
（溶媒分画）
前項でナンテンに注ぐ阻害活性が認められたレモングラスについて、再度溶剤抽出を行った。なお、用いた植物体は、レモングラス地上部のほとんどを占める葉部を用い、抽出溶剤としては、前記で用いたエタノールと比較的同じ成分を抽出できると考えられる安価なメタノールを用いた。この方法により、レモングラス葉部４ｋｇから得られた抽出物を、さらに有機溶剤を用いて分画した。これを図１に示す。レモングラスについては、抽出物の分画原料２００ｇを含水メタノール１Ｌに懸濁し、ヘキサン１Ｌと分配して、それぞれ濃縮し、ヘキサン分画３１ｇ（分画１）と残りのメタノール可溶部を得た。メタノール可溶部は濃縮後、再度１Ｌの水に懸濁し、酢酸エチル１Ｌで分配した。酢酸エチル分画（分画２）を濃縮により５４ｇを得た。一方、水懸濁液は、再度ブタノール１ｌと分配し、それぞれ濃縮することにより、ブタノール分画３４ｇ（分画３）、水分画（総収量不明）（分画４）を得た。結果を以下の表２に示す。
【００３９】
【表２】
2007210965.tif 000007
【００４０】
（可溶画分のチロシナーゼ活性阻害率）
上記分画法で得られた分画１ないし４について、前記活性測定法にてチロシナーゼ阻害活性を測定した。その結果を図２に示す。図２から明らかなとおり、レモングラスの葉の抽出物の可溶画分の中でも、特に酢酸エチル分画（分画２）が最も阻害率が高く、次にブタノール分画（分画３）という結果を得た。なお、Ｈ２Ｏ分画の活性は−４１％でむしろ活性促進効果を示した。
【００４１】
（レモングラス葉部抽出物の酢酸エチル可溶分画からチロシナーゼ阻害活性物質の同定）
続いて最強の阻害活性を示したナンテンの葉部の抽出物酢酸エチル可溶画分（分画４）をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分画し、チロシナーゼ阻害活性を測定した。分画によって得た各フラクションの収量とそのチロシナーゼ阻害活性データを図３に示す。図３から明らかなように、フラクション５が活性、収量ともに最も高いデータを示した。このフラクション５をさらに、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、セファデックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィー、シリカゲルＴＬＣによる精製を繰り返し、化合物（Ｉ）および化合物（II）を得た。これらの核磁気共鳴吸収スペクトル（１Ｈ  ＮＭＲおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル）、質量分析スペクトル（ＭＳスペクトル）よる測定解析および市販のゲラニックアシド（アルドリッチ社製  16333-3）とシリカゲルＴＬＣおよびＮＭＲを用いた比較実験の結果、化学構造を決定した。すなわち各化合物は前記化学式（Ｉ）で表されるトランスゲラニックアシドおよび前記化学式（II）で表されるシスゲラニックアシドであることが確認された。化合物（Ｉ）および（II）の前記機器分析データは表３および４に示す通りであった。
【００４２】
【表３】
2007210965.tif 000008
【００４３】
【表４】
2007210965.tif 000009
【００４４】
（チロシナーゼ活性阻害率比較）
精製単離した化合物（Ｉ）および（II）と従来からチロシナーゼ活性阻害剤として多用されているコウジ酸およびアルブチンのチロシナーゼ活性阻害率を測定し、比較した。その結果を図４に示す。図４から明らかなとおり、本発明の化合物（Ｉ）（ＩＣ50＝2.4×10-2  ｍＭ）がコウジ酸（ＩＣ50＝1.1×10-2  ｍＭ）に匹敵し、また化合物（Ｉ）（II）（ＩＣ50＝1.4×10-１  ｍＭ）ともにアルブチン（本実験では、活性が弱くＩＣ50値が得られなかった）に比べて極めて高いチロシナーゼ活性阻害率を示し、新しいチロシナーゼ活性阻害剤として好適な物質であることが明らかとなった。また同時に、これらを含有する前記レモングラスの葉部がその原料として極めて有用であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明のゲラニックアシド化合物は、酵素チロシナーゼの作用を阻害し、メラニン生成を抑制する効果、又はポリフェノールの酸化を抑制する効果、いわゆるチロシナーゼ阻害活性を有する。しかも、食用ハーブとしてよく知られているレモングラスから抽出、分離して得られる物質であるため、安全性も高い。従って、チロシナーゼ活性阻害剤として非常に有用であり、従来のチロシナーゼ活性阻害剤と同様に、医薬品、医薬部外品、化粧料、食品、食品添加物、飼料等の有効成分として利用可能である。特に、人皮膚の黒色化やシミ・ソバカスなどの色素沈着の防止・改善を目的とした美白用の皮膚外用剤や化粧料、さらに各種フルーツ、きのこ類、カニやエビなどの海産物などの食品褐変防止剤として好適に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明のレモングラス抽出物の抽出方法を示すフロー図である。
【図２】本発明のレモングラス抽出物のチロシナーゼ阻害活性を示すグラフ図である。
【図３】本発明のレモングラス抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分画して得られた各フラクションの収量とチロシナーゼ阻害活性を示すグラフ図である。
【図４】本発明のレモングラス抽出物から得た化合物（Ｉ）と化合物（II）のチロシナーゼ阻害活性を、コウジ酸およびアルブチンと比較したグラフ図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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