(57)【要約】【課題】動脈硬化の新規生化学マーカー、該マーカーを指標とする動脈硬化およびその関連疾患の診断／その後の血管イベントの発症予測方法、並びに薬物の動脈硬化の進展抑制／動脈硬化性疾患の予防・治療／その後の血管イベントのリスク低減効果の評価方法の提供。【解決手段】被験動物より採取した試料中のPSMB2並びに／又はルミカンアイソフォーム1（LUM1）及び／もしくはルミカンアイソフォーム2（LUM2）を検出することを特徴とする、該動物における動脈硬化又はその関連疾患の診断方法、並びに化合物を投与された、動脈硬化もしくはその関連疾患の予防もしくは治療を必要とする動物より採取した試料中のPSMB2並びに／又はLUM1及び／もしくはLUM2を検出することを特徴とする、該化合物の動脈硬化もしくはその関連疾患の予防もしくは治療効果の評価方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験動物より採取した試料中のPSMB2並びに／又はルミカンアイソフォーム1及び／もしくは2を検出することを特徴とする、該動物における動脈硬化又はその関連疾患の診断方法。
【請求項２】
被験動物がヒトである請求項１記載の方法。
【請求項３】
試料が血清又は血漿である請求項１記載の方法。
【請求項４】
関連疾患が、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞、脳出血、脳血栓、脳塞栓、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症、腎不全、閉塞性動脈硬化症、PCI後再狭窄、急性冠症候群、冠動脈疾患及び末梢動脈閉塞症からなる群より選択される請求項１記載の方法。
【請求項５】
PSMB2に対する抗体並びに／又はルミカンアイソフォーム1に対する抗体及び／もしくはルミカンアイソフォーム2に対する抗体を用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
他の１以上の動脈硬化マーカーを検出することをさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項７】
化合物を投与された、動脈硬化又はその関連疾患の予防又は治療を必要とする動物より採取した試料中の、PSMB2並びに／又はルミカンアイソフォーム1及び／もしくは2を検出することを特徴とする、該化合物の動脈硬化又はその関連疾患の予防又は治療効果の評価方法。
【請求項８】
動物がヒトである請求項７記載の方法。
【請求項９】
動物が動脈硬化又はその関連疾患のモデルである請求項７記載の方法。
【請求項１０】
試料が血清又は血漿である請求項７記載の方法。
【請求項１１】
関連疾患が、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞、脳出血、脳血栓、脳塞栓、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症、腎不全、閉塞性動脈硬化症、PCI後再狭窄、急性冠症候群、冠動脈疾患及び末梢動脈閉塞症からなる群より選択される請求項７記載の方法。
【請求項１２】
PSMB2に対する抗体並びに／又はルミカンアイソフォーム1に対する抗体及び／もしくはルミカンアイソフォーム2に対する抗体を用いることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項１３】
他の１以上の動脈硬化マーカーを検出することをさらに含む請求項７記載の方法。
【請求項１４】
PSMB2を検出し得る物質並びに／又はルミカンアイソフォーム1を検出し得る物質及び／もしくはルミカンアイソフォーム2を検出し得る物質を含んでなる、動脈硬化もしくはその関連疾患の診断用及び／又は化合物の動脈硬化もしくはその関連疾患の予防・治療効果の評価用キット。
【請求項１５】
関連疾患が、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞、脳出血、脳血栓、脳塞栓、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症、腎不全、閉塞性動脈硬化症、PCI後再狭窄、急性冠症候群、冠動脈疾患及び末梢動脈閉塞症からなる群より選択される請求項１４記載のキット。
【請求項１６】
PSMB2を検出し得る物質並びに／又はルミカンアイソフォーム1を検出し得る物質及び／もしくはルミカンアイソフォーム2を検出し得る物質が抗体である請求項１４記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動脈硬化又はその関連疾患の疾患マーカー、あるいは該疾患の予防・治療薬の薬効評価マーカーとして有用な蛋白質、並びに該蛋白質の発現変動を指標とした動脈硬化又はその関連疾患の診断方法、あるいは化合物の該疾患予防・治療効果の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化とは、動脈壁が肥厚し、弾性を失った状態の総称であり、不安定狭心症（UA）や急性心筋梗塞（AMI）等の急性冠動脈症候群（ACS）、脳梗塞や脳出血等の脳血管障害（CVA）、腎不全などの、人命を脅かす重大疾病の根底病態である。動脈硬化は10代の頃から無症候のうちに進行し、血液の流れが悪くなって臓器障害が起こり始めてから、臨床症状が現れてくる場合が多い。したがって、動脈硬化性疾患によるイベント発症をいかに早期に予測し、効率よく予防していくかはきわめて重要な課題である。
【０００３】
動脈硬化の診断は、従来、触診のような感覚的な方法、あるいは機器を用いた侵襲的もしくは非侵襲的手法により行われてきた。従来的な侵襲的診断法としては、例えば、血管内エコー（IVUS）や血管内視鏡検査などが、非侵襲的診断法としては、例えば、頚動脈エコー、マルチスライスＣＴなどが挙げられる。しかしながら、侵襲的診断法は当然に使用が限定されるし、非侵襲的診断法は、高価で特殊な機器を必要とするために、利用できる医療施設が限定されたり、普及が進んだとしても、数をこなすことができないといった難点がある。
【０００４】
ある疾患において体液中でのレベルが顕著に変動する生体分子を測定することによる臨床診断は、侵襲性が小さく、必要な試薬が容易にキット化し得るので小さな医療施設でも行うことが可能であることから、病気の早期診断だけでなく、治療効果の判定などにも広く用いられている。したがって、動脈硬化の早期診断、特に心血管及び/又は脳血管イベントを早期に予測し得る生化学マーカー、とりわけ液性マーカーを同定することが望まれている。
【０００５】
Rossが動脈硬化は慢性炎症性疾患であるとの仮説を提唱して以来、種々の炎症マーカーが動脈硬化の診断マーカーとして報告されている。虚血性心疾患の血中炎症マーカーとして最も研究が進んでおり、AHAやCDCが臨床で唯一認めているのが、C反応性蛋白（CRP）である（例えば、特許文献１及び２参照）。その他にも、血清アミロイドA蛋白（SAA）、E-セレクチン等の接着分子、TNF-α、IL-6等のサイトカイン、MCP-1等のケモカイン、可溶性CD40リガンド等の免疫関連蛋白などの炎症マーカーが、ケース・コントロール解析等の結果、動脈硬化及びその後の心血管イベントと相関することが報告されている。
また、HDLコレステロールの構成分子であるアポリポ蛋白質AI（ApoAI）の分解産物や（特許文献３）、血中でApoAIと結合して存在し、LDLの酸化を抑制するパラオキソナーゼ（特許文献４）などのコレステロール代謝関連分子、脂肪細胞特異的に産生されるアディポサイトカインの１つであるアディポネクチン（非特許文献１）も、動脈硬化の血中生化学マーカーとなり得ることが開示されている。
【０００６】
しかしながら、炎症には、動脈硬化局所と全身性の両者が存在することから、用いられる炎症マーカーが動脈局所の炎症を反映する指標なのか、全身性の炎症を反映する指標なのかを区別する必要がある。最近の欧州での大規模解析において、CRPは冠動脈疾患（CAD）の予測因子としては「moderate（中程度）」であり、その予測価値は総コレステロールや喫煙などの主要な危険因子の補足的なものに過ぎないと報告された。他の提唱されているマーカーも、感度及び/又は特異度の面でいずれも不十分である。したがって、より鋭敏且つ特異性の高い生化学マーカーの探索及びその臨床応用は、今後も重要な課題であることに変わりはない。
【０００７】
Proteasome subunit beta type 2（以下、「PSMB2」と略称する）は、セリンプロテアーゼProteasomeを構成するサブユニットの１つである。Proteasomeは、細胞内で不要となった蛋白質や正常に構成もしくは機能していない蛋白質を分解除去する役割を果たしており、細胞分化や細胞周期などのあらゆる場面で必要とされている。Proteasomeは通常細胞内に局在するが、正常時でも血漿中に2μg/ml程度存在し、癌や自己免疫疾患患者ではさらに上昇することが知られており、これら疾患のバイオマーカーとしての可能性が示唆されている（非特許文献２）。また、動脈硬化病巣の細胞内でProteasome活性が上昇するとの仮説が提唱されている（非特許文献３）。しかしながら、Proteasomeの血中濃度と動脈硬化との関連についてはこれまで報告がなく、ましてやProteasomeの特定のサブユニットが動脈硬化と関連するか否かは全く不明であった。
【０００８】
ルミカン（Lumican）は、細胞分化や転移などへの関与が示唆されているロイシンリッチな小プロテオグリカン分子の１つである。ルミカンは血管平滑筋細胞での発現により、内膜過形成や内膜肥厚などを引き起こすことが報告されている（非特許文献４及び５）。しかしながら、ルミカンの血中濃度と動脈硬化との関連についての報告は皆無である。
【特許文献１】特表2001−525058号公報（全文）
【特許文献２】特表2003−508453号公報（全文）
【特許文献３】特開平08−160042号公報（全文）
【特許文献４】特開2000−333674号公報（全文）
【非特許文献１】松澤(Matsuzawa Y.) ら, 「アーテリオスクレローシス・スロンボーシス・アンド・ヴァスキュラー・バイオロジー (Arterioscler. Thromb. Vasc. biol.)」, (米国), 第24巻, pp. 29-34, 2004年
【非特許文献２】ゴラブ(Golab J.) ら, 「クリニカ・キミカ・アクタ (Clin. Chim. Acta)」, (蘭国), 第340巻, pp. 27-40, 2004年
【非特許文献３】ヘルマン(Herrmann J.) ら, 「カルジオバスキュラー・リサーチ (Cardiovasc. Res.)」, (蘭国), 第61巻, pp. 11-21, 2004年
【非特許文献４】タルサン(Talusan P.) ら, 「モレキュラー・アンド・セルーラー・プロテオミクス (Mol. Cell. Proteomics)」, (米国), 第4巻, pp. 1350-1357, 2005年
【非特許文献５】恩田(Onda M.) ら, 「イクスペリメンタル・アンド・モレキュラー・パッソロジー (Exp. Mol. Pathol.)」, (米国), 第72巻, pp. 142-149, 2002年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、動脈硬化病変の進展に伴って血中レベルが変動する新規生化学マーカーを同定し、該マーカーを指標とする動脈硬化及びその関連疾患の診断/その後の血管イベントの発症予測方法、並びに薬物の動脈硬化の進展抑制/動脈硬化性疾患の予防・治療/その後の血管イベントのリスク低減効果の評価方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく、高コレステロール血症と動脈硬化を自然発症することで知られるWHHL (Watanabe Heritable Hyperlipidemic) ウサギの大動脈における動脈硬化病変面積を、IVUSにより測定・病変面積率を算出し、病変が軽度のものから重度のものへ段階的にスコアをつけ、各スコアの動物から採取した血漿中の蛋白質を、病態プロテオミクスの手段として汎用されている二次元ゲル電気泳動法により分離・プロファイリングした。その結果、病変の進行に伴って発現が減少する蛋白質としてPSMB2及びルミカン（アイソフォーム1及び2）を同定することに成功した。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、
［１］被験動物より採取した試料中のPSMB2並びに／又はルミカンアイソフォーム1及び／もしくは2を検出することを特徴とする、該動物における動脈硬化又はその関連疾患の診断方法、
［２］被験動物がヒトである上記［１］記載の方法、
［３］試料が血清又は血漿である上記［１］記載の方法、
［４］関連疾患が、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞、脳出血、脳血栓、脳塞栓、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症、腎不全、閉塞性動脈硬化症、PCI後再狭窄、急性冠症候群、冠動脈疾患及び末梢動脈閉塞症からなる群より選択される上記［１］記載の方法、
［５］PSMB2に対する抗体並びに／又はルミカンアイソフォーム1に対する抗体及び／もしくはルミカンアイソフォーム2に対する抗体を用いることを特徴とする上記［１］記載の方法、
［６］他の１以上の動脈硬化マーカーを検出することをさらに含む上記［１］記載の方法、
［７］化合物を投与された、動脈硬化又はその関連疾患の予防又は治療を必要とする動物より採取した試料中の、PSMB2並びに／又はルミカンアイソフォーム1及び／もしくは2を検出することを特徴とする、該化合物の動脈硬化又はその関連疾患の予防又は治療効果の評価方法、
［８］動物がヒトである上記［７］記載の方法、
［９］動物が動脈硬化又はその関連疾患のモデルである上記［７］記載の方法、
［１０］試料が血清又は血漿である上記［７］記載の方法、
［１１］関連疾患が、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞、脳出血、脳血栓、脳塞栓、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症、腎不全、閉塞性動脈硬化症、PCI後再狭窄、急性冠症候群、冠動脈疾患及び末梢動脈閉塞症からなる群より選択される上記［７］記載の方法、
［１２］PSMB2に対する抗体並びに／又はルミカンアイソフォーム1に対する抗体及び／もしくはルミカンアイソフォーム2に対する抗体を用いることを特徴とする上記［７］記載の方法、
［１３］他の１以上の動脈硬化マーカーを検出することをさらに含む上記［７］記載の方法、
［１４］PSMB2を検出し得る物質並びに／又はルミカンアイソフォーム1を検出し得る物質及び／もしくはルミカンアイソフォーム2を検出し得る物質を含んでなる、動脈硬化もしくはその関連疾患の診断用及び／又は化合物の動脈硬化もしくはその関連疾患の予防・治療効果の評価用キット、
［１５］関連疾患が、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞、脳出血、脳血栓、脳塞栓、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症、腎不全、閉塞性動脈硬化症、PCI後再狭窄、急性冠症候群、冠動脈疾患及び末梢動脈閉塞症からなる群より選択される上記［１４］記載のキット、および
［１６］PSMB2を検出し得る物質並びに／又はルミカンアイソフォーム1を検出し得る物質及び／もしくはルミカンアイソフォーム2を検出し得る物質が抗体である上記［１４］記載のキットなどを提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明で同定された新規マーカーは、動脈硬化病変の進行に伴ってその発現が減少する液性マーカーであることから、当該マーカーの体液中レベルを指標として、簡便かつ高感度・高精度に、動脈硬化の進展及びそれに付随する各種疾患の診断、さらには当該疾患の予防・治療薬の薬効評価等を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、PSMB2並びに／又はルミカン（アイソフォーム1及び／もしくは2）をマーカーとして、被験動物由来の生体試料におけるその発現を検出することによる、該動物における動脈硬化又はその関連疾患の診断方法を提供する。ここで「関連疾患」とは、動脈硬化病変の進展に付随して引き起こされる種々の疾患や、結果として動脈硬化病変の進展を引き起こす疾患を包含する意味で用いられる。例えば、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞、脳出血、脳血栓、脳塞栓、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症、腎不全、閉塞性動脈硬化症、PCI後再狭窄、急性冠症候群、冠動脈疾患、末梢動脈閉塞症等の疾患が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書においては、以下、動脈硬化及びその関連疾患を包括して「動脈硬化性疾患」という場合がある。また、ここで「診断」とは、既に動脈硬化性疾患に罹患しているか否かの判定だけでなく、まだ当該疾患に罹患していないが、近い将来罹患する可能性が高いか否かを判定することを包含する意味で使用される。
本発明の診断方法の被験対象となり得る動物は、血管系を有し、PSMB2並びに／又はルミカン（アイソフォーム1及び／もしくは2）を産生するものであれば特に制限はなく、例えば、哺乳動物（例：ヒト、サル、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ハムスター、モルモット、マウス、ラット等）、鳥類（例：ニワトリ等）などが挙げられる。好ましくは、哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【００１４】
試料となる被験動物由来の生体試料は特に限定されないが、動物への侵襲が少ないものであることが好ましく、例えば、血液、血清、血漿、唾液、精液、粘膜、涙、尿などの人から分泌されるものや、生検から採取されるものが挙げられる。より好ましくは、血液、血清、血漿であり、さらに好ましくは血清又は血漿である。
血清や血漿を用いる場合、常法に従って被験動物から採血し、液性成分を分離することにより調製することができる。検出対象であるPSMB2、ルミカン（アイソフォーム1及び2）の物性に応じて、予めそれらの蛋白質を含有する画分から、夾雑物を分離除去しておくこともできる。例えば、ゲル電気泳動などにより検出を行う際には、PSMB2の場合、Blue-sepharose/Protein Aカラム処理及びカクテルIgYカラム高発現蛋白質除去カラム処理等、ルミカンアイソフォーム1及び2の場合は、上記処理に加えてさらにConAカラム処理等を施すことが好ましい。また、PSMB2について検出対象をmRNAとする場合には、採取した血液から常法を用いて全RNAもしくはポリ(A)+RNA画分を抽出・精製しておいてもよい。
【００１５】
生体試料におけるPSMB2の発現は、該蛋白質もしくはそれをコードするmRNAを、従来公知の方法を用いてそれぞれ検出することにより調べることができる。例えば、PSMB2蛋白質を検出する場合は、ゲル電気泳動（例：SDS-PAGE、二次元ゲル電気泳動など）や、各種の分離精製法（例：イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動など）、イオン化法（例：電子衝撃イオン化法、フィールドディソープション法、二次イオン化法、高速原子衝突法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）法、エレクトロスプレーイオン化法など）、質量分析計（例：二重収束質量分析計、四重極型分析計、飛行時間型質量分析計、フーリエ変換質量分析計、イオンサイクロトロン質量分析計など）を組み合わせる方法等に供することにより行うことができる。
【００１６】
好ましくは、本発明の診断方法におけるPSMB2の検出は、それに対する抗体を用いて行われる。PSMB2に対する抗体は、例えば、該蛋白質を、これを発現する動物（好ましくは、被験動物と同種の動物）の生体試料から単離・精製し、該蛋白質もしくはその部分ペプチドを抗原として動物を免疫することにより調製することができる。あるいは、公知のPSMB2のアミノ酸配列（例えば、ヒトPSMB2の場合、配列番号２に表されるアミノ酸配列）に基づいて、その部分ペプチドを公知のペプチド合成の手法により合成し、これを抗原（ハプテン）として利用することもできる。さらには、常法に従ってPSMB2をコードするcDNAを得て、該cDNAを適当な発現ベクターに組み込んで適当な宿主細胞に導入し、得られる形質転換体を培養して組換え蛋白質を採取し、公知の蛋白質分離精製法を用いてPSMB2を精製するか、上記のようにして得られるcDNAを鋳型として、無細胞転写・翻訳系を用いて該蛋白質を取得して、抗原として用いることもできる。
【００１７】
PSMB2に対する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製することができる。また、該抗体は完全抗体分子だけでなくそのフラグメントをも包含し、例えば、Fab、F(ab')2、ScFv、minibody等が挙げられる。
【００１８】
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製
PSMB2は、哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常2〜6週毎に１回ずつ、計2〜10回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられるが、マウス及びラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された哺乳動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓又はリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化PSMB2と抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法［Nature, 256, 495 (1975年)］に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはPEGが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、NS-1、P3U1、SP2/0などが挙げられるが、P3U1が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は1:1〜20:1程度であり、PEG（好ましくは、PEG1000〜PEG6000）が10〜80%程度の濃度で添加され、約20〜40℃、好ましくは約30〜37℃で約1〜10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００１９】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、蛋白質等の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）又はプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体又はプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識した蛋白質等を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はHAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別及び育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、1〜20%、好ましくは10〜20%のウシ胎児血清を含むRPMI 1640培地、1〜10%のウシ胎児血清を含むGIT培地（和光純薬工業（株））又はハイブリドーマ培養用無血清培地（SFM-101、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常20〜40℃、好ましくは約37℃である。培養時間は、通常5日〜3週間、好ましくは1週間〜2週間である。培養は、通常5%炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００２０】
（ｂ）モノクロナール抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、DEAE）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相又はプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【００２１】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
PSMB2に対するポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（蛋白質等の抗原）とキャリアー蛋白質との複合体を作り、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行なうかニワトリに免疫を行ない、該免疫動物からPSMB2に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
哺乳動物及びニワトリを免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類及びキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン1に対し、約0.1〜20、好ましくは約1〜5の割合でカプルさせる方法が用いられる。
又ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、哺乳動物又はニワトリに対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約2〜6週毎に1回ずつ、計約3〜10回程度行なうことができる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水、母乳など、好ましくは血液から採取することができ、ニワトリの場合は血液及び卵黄から採取できる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００２２】
一方、ルミカンは多様な糖鎖修飾を受けるため、同一のアミノ酸配列（例えば、ヒトルミカンの場合、配列番号３に表されるアミノ酸配列）を有しながら物性（例えば、分子量、等電点など）の異なる種々のアイソフォームが存在する。本発明の動脈硬化血中マーカーであるルミカンの2つのアイソフォームは、二次元ゲル電気泳動により、約50〜約65kDaの間でほぼ同一の分子量を有し、且つ等電点約4〜約5の間でその差（ΔpI）が約0.1である等電点をそれぞれ有する糖蛋白質分子として定義づけられる。本明細書においては、便宜的に、より小さい等電点を有する分子をアイソフォーム1（以下、「LUM1」と略称する場合がある）、より大きな等電点を有する分子をアイソフォーム2（以下、「LUM2」と略称する場合がある）と称するものとする。
従って、本発明の診断方法におけるLUM1及びLUM2の検出は、被験動物由来の生体試料を二次元ゲル電気泳動に付し、LUM1及びLUM2のスポットを、それらの分子量及び等電点並びにそれらの差に基づいて相対的に同定し（例えば、ウシ血清アルブミン、ウシ筋肉アクチン、大豆トリプシンインヒビター等の蛋白質を分子量・等電点のマーカーとして用いることができる）、正常動物由来の生体試料におけるそれらのスポットの強度と比較することにより行うことできる。あるいは、被験動物由来試料と正常動物由来試料（対照）とを異なる標識物質（例えば、Cy2、Cy3、Cy5等）でそれぞれ標識して同一ゲル上で電気泳動を行い、各標識を別個に検出することにより、両サンプルにおけるLUM1及びLUM2を容易に同定・比較することができる。尚、生体試料として血漿や血清などを用いる場合には、例えば、Blue-sepharose/Protein Aカラム処理、カクテルIgYカラム高発現蛋白質除去カラム処理、さらにConAカラム処理等の前処理を施して、夾雑物質を予め除去しておくことが好ましい。
【００２３】
また、上記したPSMB2に対する抗体の作製法と同様にして、LUM1とLUM2の両方を検出し得る抗体を作製し、これと二次元ゲル電気泳動、あるいは一次元の等電点ゲル電気移動とを組み合わせてLUM1およびLUM2のスポットもしくはバンドを検出することも可能である。
【００２４】
より簡便なLUM1及び／又はLUM2の検出法としては、LUM1及び／又はLUM2を特異的に認識し、ルミカンの他のアイソフォームを認識しない抗体、好ましくはモノクローナル抗体を用いる方法が挙げられる。そのような抗体は、LUM1及び／又はLUM2に特異的で他のルミカンアイソフォームにはない糖鎖または該糖鎖を含むLUM1又はLUM2の部分ペプチドを免疫原として、上記PSMB2に対するモノクローナル抗体の作製方法と同様の方法を実施することにより取得することができる。しかしながら、LUM1またはLUM2分子もしくはその任意のフラグメントを免疫原として無作為にモノクローナル抗体を作製し、得られた各モノクローナル抗体を用いて、二次元に展開したルミカン含有試料（好ましくは生体試料）に対してイムノブロットを行い、LUM1及び／又はLUM2とのみ反応するモノクローナル抗体を選択することによっても、そのような特異的抗体を得ることができる。以下、PSMB2に対する抗体と上記LUM1及び／又はLUM2特異的な抗体とを包括して、「本発明の抗体」と言う場合がある。
【００２５】
本発明の抗体を用いる本発明の診断方法は、特に制限されるべきものではなく、被験試料中の抗原量に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的又は物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法及びサンドイッチ法等が好適に用いられる。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン-アビジン系を用いることもできる。
【００２６】
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。
サンドイッチ法においては、不溶化した本発明の抗体に被験試料を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明の抗体を反応させ（２次反応）た後、不溶化担体上の標識剤の量（活性）を測定することにより、被験試料中の本発明のペプチド量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。
【００２７】
PSMB2（LUM1及び／又はLUM2）に対するモノクローナル抗体を、サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることもできる。
競合法では、被験試料中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原(Ｆ)と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被験試料中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、及び、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被験試料の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被験試料中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被験試料中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被験試料中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【００２８】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
【００２９】
あるいは、本発明の抗体を用いる別の本発明の診断方法として、該抗体を後述の質量分析計に適合し得るプローブの表面上に固定化し、該プローブ上の該抗体に被験試料を接触させ、該抗体に捕捉された生体試料成分を質量分析にかけ、PSMB2（LUM1及び／又はLUM2）のピークを検出する方法が挙げられる。
【００３０】
本発明の診断方法におけるPSMB2（LUM1及び／又はLUM2）の検出において、他の好ましい測定法として、クロマトグラフィー技術と飛行時間型質量分析（TOF-MS）を組み合わせて、クロマト担体（例：カチオン交換体、アニオン交換体、疎水性クロマト担体、金属イオンなど）に一定条件下で捕捉されるすべての生体試料成分の質量を一括して測定する方法、とりわけ飛行時間型質量分析に使用するプローブの表面に該クロマト担体を固定し、このプローブ表面と被験試料を接触させ、適当な条件で洗浄した後、該プローブ表面に捕捉された成分の質量を飛行時間型質量分析計で測定する方法などが挙げられる。飛行時間型質量分析計に適合可能なプローブとしては、サイファージェン・バイオシステムズ社製の各種プロテインチップ等が挙げられるが、それらに限定されない。洗浄は水又は緩衝液を用いて行うことができるが、例えば、pHは、各々の試料のターゲットマーカーの等電点に合わせて適宜選択される。例えば、pH 4〜8のトリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液等が用いられる。質量分析は適当なマトリックスを用いてMALDI法で行うことが好ましく（MALDI-TOFMS）、使用するマトリックス分子としては、例えばシナピン酸（SPA）、飽和2,5-ジヒドロキシ安息香酸（DHB）、インドールアクリル酸（IAA）、桂皮酸などが挙げられる。
【００３１】
本発明の診断方法において、LUM1及び／又はLUM2だけでなくPSMB2蛋白質の検出においても、従来公知の二次元ゲル電気泳動法を用いることができる。この場合、被験試料として、例えば血漿等を用いる場合には、前処理としてBlue-sepharose/Protein Aカラム処理、カクテルIgYカラム高発現蛋白質除去カラム処理などを行うことがより好ましい。
【００３２】
本発明の診断方法において、生体試料におけるPSMB2の発現を、該蛋白質をコードするmRNAを検出することにより行う場合、該mRNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸（プローブ）や、該mRNAの一部もしくは全部を増幅するプライマーとして機能し得るオリゴヌクレオチドのセットを用いて、ノーザンハイブリダイゼーションやRT-PCRなどにより行うことができる。プローブとして用いられる核酸は、DNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。好ましくはDNAが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNA又はDNA:RNAのハイブリッドでもよい。該核酸の長さは標的mRNAと特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はなく、例えば約15塩基以上、好ましくは約30塩基以上である。該核酸は、標的mRNAの検出・定量を可能とするために、標識剤により標識されていることが好ましい。標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔32P〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、プローブと標識剤との結合にビオチン−（ストレプト）アビジンを用いることもできる。
【００３３】
プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドのセットとしては、PSMB2をコードするmRNAの塩基配列（センス鎖）及びそれに相補的な塩基配列（アンチセンス鎖）とそれぞれ特異的にハイブリダイズすることができ、それらに挟まれるDNA断片を増幅し得るものであれば特に制限はなく、例えば、各々約15〜約100塩基、好ましくは各々約15〜約50塩基の長さを有し、約100bp〜数kbpのDNA断片を増幅するようにデザインされたオリゴDNAのセットが挙げられる。
【００３４】
微量RNA試料を用いてPSMB2の遺伝子発現を定量的に解析するためには、競合RT-PCR又はリアルタイムRT-PCRを用いることが好ましい。競合RT-PCRとは、目的のDNAを増幅し得るプライマーのセットにより増幅され得る既知量の他の鋳型核酸をcompetitorとして反応液中に共存させて競合的に増幅反応を起こさせ、増幅産物の量を比較することにより、目的ＤＮＡの量を算出する方法をいう。従って、競合RT-PCRを用いる場合、上記プライマーセットに加えて、該プライマーセットにより増幅され、目的DNAと区別することができる増幅産物（例えば、目的のDNAとはサイズの異なる増幅産物、制限酵素処理により異なる泳動パターンを示す増幅産物など）を生じる核酸をさらに含有することができる。このcompetitor核酸はDNAであってもRNAであってもよい。DNAの場合、RNA試料から逆転写反応によりcDNAを合成した後にcompetitorを添加してPCRを行えばよく、RNAの場合は、RNA試料に最初から添加してRT-PCRを行うことができる。後者の場合、逆転写反応の効率も考慮に入れているので、元のmRNAの絶対量を推定することができる。
一方、リアルタイムRT-PCRは、PCRの増幅量をリアルタイムでモニタリングできるので、電気泳動が不要で、より迅速に本発明のペプチドの遺伝子発現を解析可能である。通常、モニタリングは種々の蛍光試薬を用いて行われる。これらの中には、SYBR Green I、エチジウムブロマイド等の二本鎖ＤＮＡに結合することにより蛍光を発する試薬（インターカレーター）の他、上記プローブとして用いることができる核酸（但し、該核酸は増幅領域内で標的核酸にハイブリダイズする）の両端をそれぞれ蛍光物質（例：FAM、HEX、TET、FITC等）及び消光物質（例：TAMRA、DABCYL等）で修飾したもの等が含まれる。
【００３５】
上記プローブとして用いる核酸は、PSMB2をコードするcDNAやその断片であってよく、あるいはその塩基配列情報（例えば、ヒトPSMB2の場合、配列番号１に表される塩基配列）に基づいて、市販のDNA/RNA自動合成機等を用いて化学的に合成することによって得られるものであってもよい。また、上記プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドのセットは、上記塩基配列情報に基づいて、該塩基配列及びその相補鎖配列の一部を市販のDNA/RNA自動合成機等を用いて化学的に合成することによって得ることができる。
【００３６】
本発明の診断方法は、被験動物から時系列で生体試料を採取し、各試料におけるPSMB2並びに／又はLUM1及び／もしくはLUM2の発現の経時変化を調べることにより行うことが好ましい。生体試料の採取間隔は特に限定されないが、動脈硬化病変の進展の早期発見という目的を考慮すれば、被験対象のQOLを損なわない範囲でできるだけ頻繁にサンプリングすることが望ましく、例えば、血液（血清、血漿）を試料とする場合には、約1〜約12ヶ月の間隔で採血を行うことが好ましい。しかし、狭心症などの症状が既に認められる場合は、他の関連疾患に急速に発展する可能性もあるので、数日間隔での採血を必要となる場合もある。各試料について上記のようにしてPSMB2並びに／又はLUM1及び／もしくはLUM2の発現を調べ、経時的にPSMB2並びに／又はLUM1及び／もしくはLUM2の発現が減少した場合には、動脈硬化病変が進展している、並びに動脈硬化性疾患に罹患しているか、もしくは近い将来該疾患に罹患する可能性が高いと判定することができる。
【００３７】
本発明のマーカーに加えて、他の１以上の動脈硬化マーカーの変動を調べることにより、より精度よく動脈硬化病変の進展及び動脈硬化性疾患の罹患（リスク）を判定することができ得る。そのような他のマーカーとしては、例えば、上述のCRP、SAA、E-セレクチン等の接着分子、TNF-α、IL-6等のサイトカイン、MCP-1等のケモカイン、可溶性CD40リガンド等の免疫関連蛋白などの炎症マーカーや、アポリポ蛋白質AI（ApoAI）の分解産物、パラオキソナーゼ1などのコレステロール代謝関連分子、酸化LDLなどに対する抗体、アディポネクチン、第10凝固因子、Myeloperoxidase、Fetuin-A、α1-アンチトリプシン、フィブリノーゲン、ApoA4、ApoJ、プラスミノーゲン類似蛋白、パラオキソナーゼ、ApoE、ApoB-100、補体C3、補体H、プラスミノーゲンなどの公知のマーカーが挙げられる。さらに、本発明者らが以前に同定した新規動脈硬化マーカーであるCORS26及びα-フェトプロテイン（特願2005-194047）も好ましく使用することができる。これらのマーカーもPSMB2について上記した各種方法に従って検出することができるが、各マーカーについて周知慣用の検出法をそれぞれ用いることもできる。
【００３８】
PSMB2（LUM1及び/又はLUM2）の発現は、動脈硬化病変の進展が抑制された場合には増加又は横ばい傾向を示す。従って、本発明の診断方法は、動脈硬化の進展が認められるか、もしくはその危険性が高いと診断される被験対象における予防・治療効果（予防・治療手段が投薬の場合は、該薬物の薬効）の早期判定にも用いることができる。
即ち、本発明は、化合物を投与された、動脈硬化性疾患の予防もしくは治療を必要とする被験動物由来の生体試料中のPSMB2並びに／又はLUM1及び／もしくはLUM2を検出することによる、該化合物の当該疾患の予防もしくは治療効果の評価方法を提供する。
【００３９】
本発明はまた、PSMB2を検出し得る物質及び／又はLUM1及び／又はLUM2を検出し得る物質を含んでなる、動脈硬化性疾患の診断用及び／又は化合物の動脈硬化性疾患の予防・治療効果の評価用キットを提供する。PSMB2を検出し得る物質、LUM1及び／又はLUM2を検出し得る物質としては、例えば、上記した本発明の抗体が好ましく挙げられるが、それらに限定されない。該キットはPSMB2並びに／又はLUM1及び／もしくはLUM2の検出に必要もしくは便利な他の構成要素、例えば、標識物質、反応緩衝液、反応容器等をさらに含むことができる。
【００４０】
本明細書及び図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ          ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ        ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ            ：アデニン
Ｔ            ：チミン
Ｇ            ：グアニン
Ｃ            ：シトシン
ＲＮＡ          ：リボ核酸
ｍＲＮＡ        ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ        ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ        ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ        ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ        ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ          ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ        ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ          ：ドデシル硫酸ナトリウム
【００４１】
Ｇｌｙ          ：グリシン
Ａｌａ          ：アラニン
Ｖａｌ          ：バリン
Ｌｅｕ          ：ロイシン
Ｉｌｅ          ：イソロイシン
Ｓｅｒ          ：セリン
Ｔｈｒ          ：スレオニン
Ｃｙｓ          ：システイン
Ｍｅｔ          ：メチオニン
Ｇｌｕ          ：グルタミン酸
Ａｓｐ          ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ          ：リジン
Ａｒｇ          ：アルギニン
Ｈｉｓ          ：ヒスチジン
Ｐｈｅ          ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ          ：チロシン
Ｔｒｐ          ：トリプトファン
Ｐｒｏ          ：プロリン
Ａｓｎ          ：アスパラギン
Ｇｌｎ          ：グルタミン
ｐＧｌｕ        ：ピログルタミン酸
Ｍｅ            ：メチル基
Ｅｔ            ：エチル基
Ｂｕ            ：ブチル基
Ｐｈ            ：フェニル基
ＴＣ            ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
【００４２】
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００４３】
［材料および方法］
（サンプル）
世界中で高コレステロールや動脈硬化症などの研究に用いられているWHHLウサギの血漿を使用した。ウサギは血管内超音波（IVUS）により、aorta病変（動脈硬化）面積を算出。病変の軽い方から重いほうへ0〜5のスコアをつけ、IVUSスコア0のグループをコントロールとして発現比較に使用した。
（血漿の前処理）
蛋白質発現解析時に血漿中の高発現蛋白質の影響を少なくするため、下記のいずれかの方法にて血漿を前処理した。
１．アルブミン・IgG除去：Blue sepharoseとProtein Aのカラムでウサギ血漿を処理して血漿中のアルブミン及びIgGを除去。
２．血中高発現蛋白質除去：抗体アフィニティカラムによりウサギ血漿を処理して血漿中のトランスフェリン、ヘモペキシン、アルファ１アンチトリプシン及びフィブリノーゲンを除去。
３．レクチン分画：レクチンのカラムにてウサギ血漿を処理。高発現蛋白質の影響が最も少ない画分を選択。
（二次元電気泳動による蛋白質発現解析）
各前処理・分画法で得た血漿蛋白質を二次元電気泳動ゲルにて展開（一次元：等電点、二次元：分子量）した。発現解析用のゲルは、Cy dye（Amersham Bioscience社）により染色、蛋白質同定用のゲルはSyproRuby(Molecular Probe社)にて染色した。蛋白質発現はAmersham社のDecyderソフトにより解析した。
（蛋白質同定）
二次元ゲル解析で有意に発現差異の認められた蛋白質スポットの同定は質量分析法により行った。発現変動スポットをSyproRuby染色したゲルより切り出し、蛋白質をゲル内でトリプシンにより消化した。その後、質量分析装置(Q-TOF型)によりMS及びMS/MSで測定した。この方法で得た質量分析データを、下記いずれかの方法で解析して蛋白質を同定した。
a. プロダクトイオン検索法：親ペプチドの質量を基に蛋白質データベースを検索し、ヒットした候補のアミノ酸配列にMS/MSスペクトルを照合してスコアを決定した。この方法は、データベースに蛋白質が登録してある場合に有効であるが、登録されていない蛋白質の同定は困難である。
b. de Novoシーケンス：MS/MSスペクトルから直接アミノ酸配列を読み取り、予測された配列を基にデータベース検索を行った。この方法は、該当する蛋白質がデータベースにない場合でも、配列の類似した蛋白質（例えば別の種に存在する同一蛋白質）を見つけることができ、蛋白質同定の手がかりとすることができる。
【００４４】
実施例１  二次元ゲル電気泳動による発現変動解析
（１）J-0およびJ-4,5のウサギからそれぞれ採取した血漿（n=4）をBlue sepharose/Protein Aカラム、次いで抗体アフィニティカラムで処理し、さらにレクチン分画を行った後、異なるCy dyeで標識して同一ゲル上で二次元電気泳動に付した結果、動脈硬化の進行に伴って発現が減少する蛋白質として、ほぼ同じ分子量で、等電点が約0.1異なる2つのスポットが見出された。各スポットについての発現変動を図１に示す。
（２）J-0およびJ-2,3、J-0およびJ-4,5、あるいはJ-2,3およびJ-4,5のウサギからそれぞれ採取した血漿（各組み合わせについてそれぞれn=2）をBlue sepharose/Protein Aカラム、次いで抗体アフィニティカラムで処理した後、異なるCy dyeで標識して同一ゲル上で二次元電気泳動に付した結果、動脈硬化の進行に伴って発現が減少する蛋白質のスポットが見出された。これらのスポットの１つについての発現変動を図２に示す。
【００４５】
実施例２  蛋白質の同定
実施例１で得られた蛋白質の部分アミノ酸配列を、プロダクトイオン検索法およびde Novoシーケンスにより決定した。その結果、実施例１（１）で得られた2つのスポットから分離された蛋白質は、いずれもルミカン（図３にウサギルミカンの部分アミノ酸配列を示す）であることが明らかとなった。ルミカンには翻訳後修飾の異なる多数のアイソフォームが存在することが知られており、これら2つのスポットは異なる2つのルミカンアイソフォームに相当すると考えられる。2つのアイソフォームのうち、より小さい等電点を有するもの（LUM1）に相当するスポットにおけるアミノ酸配列解析により同定された部分アミノ酸配列を図３に下線で示す。
一方、実施例１（２）で得られたスポットから分離された蛋白質の部分ペプチドとして、プロダクトイオン検索により２本およびde Novo配列解析により１本のペプチドのアミノ酸配列が同定された（図４(a)）。ホモロジーサーチの結果、この蛋白質は、PSMB2であることが明らかとなった（図４(b)にヒトPSMB2のアミノ酸配列を示す）。
【００４６】
実施例３  ルミカンアイソフォームのキャラクタリゼーション
実施例１（１）で得られた、動脈硬化の進行に伴って血中での発現が減少する2つのルミカンアイソフォーム（LUM1およびLUM2）について、分子量及び等電点並びにそれらの相対的位置関係をさらに詳細に分析した。実施例２における蛋白質同定用ゲルのSyproRuby染色像を図５(a)に示す。同様の条件下で、分子量および等電点既知の蛋白質である卵白コンアルブミン（分子量：76kDa、等電点：6.0、6.3、6.6）、ウシ血清アルブミン（分子量：66.2kDa、等電点：5.4、5.5、5.6）、ウシ筋肉アクチン（分子量：43kDa、等電点：5.0、5.1）およびウシカルボニックアンヒドラーゼ（分子量：31kDa、等電点：5.9、6.0）を二次元ゲル電気泳動に付し、泳動後ゲルを染色した（図５(b)）。両者の比較から、LUM1およびLUM2は、(i)約50〜約65kDaの間でほぼ同一の分子量を有すること、および(ii)約4〜約5の間の等電点をそれぞれ有し、両者の差（ΔpI）は約0.1であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の方法によれば、患者の血液サンプル等を用いて、非侵襲的にかつ高精度・高感度に動脈硬化病変の進展及び動脈硬化性疾患の診断が可能である。また、動脈硬化の進展抑制薬、動脈硬化の進展に伴う各種血管イベントの予防・治療薬の薬効評価を実験動物、治験者、患者等の血液サンプル等を用いて行うこともできる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】各スコア（aorta病変面積率：J-0、J-4,5）のWHHLウサギから採取した血漿におけるルミカンアイソフォームLUM1（図１(a)）およびLUM2（図１(b)）の発現を示す二次元ゲル電気泳動スポットの大きさの変動を示す図である。縦軸はStandardized Log Abundanceを示す。図中、丸印は各測定値（n=4）を示し、＋印はその平均値を示す。
【図２】各スコア（aorta病変面積率：J-0、J-2,3、J-4,5）のWHHLウサギから採取した血漿におけるPSMB2の発現を示す二次元ゲル電気泳動スポットの大きさの変動を示す図である。縦軸はStandardized Log Abundanceを示す。図中、丸印は各測定値（n=4）を示し、＋印はその平均値を示す。
【図３】質量分析法により検出された、LUM1に相当するスポットから分離した蛋白質の部分ペプチドのアミノ酸配列とウサギルミカン部分アミノ酸配列を示す図である。下線部が検出されたペプチドのアミノ酸配列と同一の配列を示す。
【図４】各種配列解析法により検出された、PSMB2に相当するスポットから分離した蛋白質の部分ペプチドの本数及びそれらのアミノ酸配列（a）、並びに得られた部分アミノ酸配列とヒトPSMB2のアミノ酸配列との比較（b）を示す図である。図４(b)中、下線部が検出されたペプチドのアミノ酸配列と同一の配列を示す。
【図５】ウサギ血漿サンプル由来の蛋白質画分を二次元ゲル電気泳動に付し、SyproRubyで染色したもの（a）、並びに分子量および等電点既知の種々の蛋白質を同一条件下で二次元ゲル電気泳動に付し、SyproRubyで染色したもの（b）を示す図である。図５(a)中、丸印と数字で示された部分がそれぞれLUM1及びLUM2のスポット検出位置を示す。
【図１】
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【図２】
2007278907.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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