(57)【要約】【課題】細胞の代謝状態、あるいは細胞に薬物刺激を与えたことによる応答の違いを比較計測する方法、さらに、比較計測に基づいて細胞分離を行なうことで、細胞を表現型に応じて精密に精製する方法を提案すること。【解決手段】流路中を流れる細胞のスナップ像を少なくても２回、所定の時間間隔で撮影し、この２回の撮影の間に細胞で変化した量（代謝量）を計測することで、細胞の代謝状態、あるいは細胞に刺激を与えたことによる応答の違いを比較計測する。さらに、比較計測結果に基づいて細胞分離を行なう。【選択図】図４
2007104929.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板に形成された細胞を搬送する流路を備え、該流路の上流端に細胞を注入する手段と、前記流路内の細胞を画像信号として検出する第１の細胞識別領域と、該第１の細胞識別領域の下流に形成された時間調整器と、該時間調整器の下流に形成された前記流路内の細胞を画像信号として検出する第２の細胞識別領域と、該第２の細胞識別領域の下流に形成された前記流路内の細胞を二つの流路に選択的に排出する流路と、からなるセルソーターチップ。
【請求項２】
前記第１の細胞識別領域と、前記時間調整器との間の流路に細胞を刺激する機構が付加された請求項１記載のセルソーターチップ。
【請求項３】
基板に形成された細胞を搬送する流路を備え、該流路の上流端に細胞を注入する手段と、該細胞を注入する手段の下流に形成された流路内の細胞を検出する領域と、該細胞を検出する領域の下流に形成された前記検出された細胞を特定するためのインデックス流体を注入する領域と、該インデックス流体を注入する領域の下流に形成された前記インデックス流体を検出する第１のインデックス検出領域と、該インデックス検出領域の下流に形成された前記流路内の細胞を画像信号として検出する第１の細胞識別領域と、該第１の細胞識別領域の下流に形成された時間調整器と、該時間調整器の下流に形成された前記インデックス流体を検出する第２のインデックス検出領域と、該インデックス検出領域の下流に形成された前記流路内の細胞を画像信号として検出する第２の細胞識別領域と、該第２の細胞識別領域の下流に形成された前記流路内の細胞を二つの流路に選択的に排出する流路と、からなるセルソーターチップ。
【請求項４】
前記第１の細胞識別領域と、前記時間調整器との間の流路に細胞を刺激する機構が付加された請求項３記載のセルソーターチップ。
【請求項５】
前記時間調整器が前記流路に連結されたアガロースゲル膜に形成される請求項１ないし４のいずれかに記載のセルソーターチップ。
【請求項６】
前記時間調整器が、前記基板に形成された複数の長さの異なる流路と、前記複数の長さの異なる流路の両端に連結されたアガロースゲル膜と、該アガロースゲル膜に連結された前記第１の細胞識別領域に連通した流路と前記第２のインデックス検出領域に連通した流路と、よりなる請求項１ないし４のいずれかに記載のセルソーターチップ。
【請求項７】
前記時間調整器が、前記第１の細胞識別領域に連通した流路と前記第２のインデックス検出領域に連通した流路のそれぞれを延伸して配列された流路と、前記流路をバイパスする並列に配列された流路と、該並列に配列された流路に設けられた止め弁と、よりなる請求項１ないし４のいずれかに記載のセルソーターチップ。
【請求項８】
基板に形成された細胞を搬送する流路と、該流路の上流端に細胞を注入する手段と、前記流路内の細胞を画像信号として検出する第１の細胞識別領域で前記流路を流下する細胞を撮像する手段と、該第１の細胞識別領域の下流に形成された時間調整器と、該時間調整器の下流に形成された前記流路内の細胞を画像信号として検出する第２の細胞識別領域で前記流路を流下する細胞を撮像する手段と、前記流路を流下する細胞を分類する手段と、前記第１の細胞識別領域で前記流路を流下する細胞を撮像する手段が与える画像信号と前記第２の細胞識別領域で前記流路を流下する細胞を撮像する手段が与える画像信号とを比較して前記細胞を分類する手段に選択の指示を与えるパソコンと、からなるセルソーター。
【請求項９】
前記第１の細胞識別領域と、前記時間調整器との間の流路に細胞を刺激する機構が付加された請求項８記載のセルソーター。
【請求項１０】
基板に形成された細胞を搬送する流路と、該流路の上流端に細胞を注入する手段と、該細胞を注入する手段の下流に形成された流路内の細胞を検出する領域で前記流路を流下する細胞の有無を検出する光学装置と、該細胞を検出する領域の下流に形成された前記検出された細胞を特定するためのインデックス流体を注入する領域にインデックス流体を注入する手段と、該インデックス流体を注入する領域の下流に形成された前記インデックス流体を検出する第１のインデックス検出領域で前記流路を流下するインデックス流体の構成を検知する光学装置と、と、該インデックス検出領域の下流に形成された前記流路内の細胞を画像信号として検出する第１の細胞識別領域で前記流路を流下する細胞を撮像する手段と、該第１の細胞識別領域の下流に形成された時間調整器と、該時間調整器の下流に形成された前記インデックス流体を検出する第２のインデックス検出領域で前記流路を流下するインデックス流体の構成を検知する光学装置と、該インデックス検出領域の下流に形成された前記流路内の細胞を画像信号として検出する第２の細胞識別領域で前記流路を流下する細胞を撮像する手段と、該第２の細胞識別領域の下流に形成された前記流路内の細胞を二つの流路に選択的に排出する流路と、前記光学装置から得られる信号を基礎に各種手段を制御し、かつ、前記第１の細胞識別領域で前記流路を流下する細胞を撮像する手段が与える画像信号と前記第２の細胞識別領域で前記流路を流下する細胞を撮像する手段が与える画像信号とを比較して前記細胞を分類する手段に選択の指示を与えるパソコンと、からなるセルソーター。
【請求項１１】
前記第１の細胞識別領域と、前記時間調整器との間の流路に細胞を刺激する機構が付加された請求項１０記載のセルソーター。
【請求項１２】
前記時間調整器が前記流路に連結されたアガロースゲル膜に形成される請求項８ないし１１のいずれかに記載のセルソーター。
【請求項１３】
前記時間調整器が、前記基板に形成された複数の長さの異なる流路と、前記複数の長さの異なる流路の両端に連結されたアガロースゲル膜と、該アガロースゲル膜に連結された前記第１の細胞識別領域に連通した流路と前記第２のインデックス検出領域に連通した流路と、よりなる請求項８ないし１１のいずれかに記載のセルソーター。
【請求項１４】
前記時間調整器が、前記第１の細胞識別領域に連通した流路と前記第２のインデックス検出領域に連通した流路のそれぞれを延伸した平行に配列された流路と、該平行に配列された流路をバイパスする並列に配列された流路と、該並列に配列された流路に設けられた止め弁と、よりなる請求項８ないし１１のいずれかに記載のセルソーター。
【請求項１５】
前記インデックス流体が複数の流体を断続的に配列したものである請求項８ないし１１のいずれかに記載のセルソーター。
【請求項１６】
基板に形成された細胞を搬送する流路と、該流路の上流端に細胞を注入する手段と、該細胞を注入する手段の下流に形成された流路内の細胞を検出する領域で前記流路を流下する細胞の有無を検出する光学装置と、該細胞を検出する領域の下流に形成された前記検出された細胞を特定するためのインデックス流体を注入する領域に磁性インデックス流体を注入する手段と、該インデックス流体を注入する領域の下流に形成された前記磁性インデックス流体を検出する第１のインデックス検出領域で前記流路を流下する磁性インデックス流体の構成を検知する装置と、該インデックス検出領域の下流に形成された前記流路内の細胞を画像信号として検出する第１の細胞識別領域で前記流路を流下する細胞を撮像する手段と、該第１の細胞識別領域の下流に形成された時間調整器と、該時間調整器の下流に形成された前記磁性インデックス流体を検出する第２のインデックス検出領域と、該インデックス検出領域の下流に形成された前記流路内の細胞を画像信号として検出する第２の細胞識別領域で前記流路を流下する細胞を撮像する手段と、該第２の細胞識別領域の下流に形成された前記流路内の細胞を二つの流路に選択的に排出する流路と、前記第２の細胞識別領域の下流の流路を前記第１のインデックス検出領域の上流の流路に選択的に接続する流路と、前記選択的に接続する流路に沿って前記磁性インデックス流体に移動磁界を付与する手段と、前記光学装置から得られる信号を基礎に各種手段を制御し、かつ、前記第１の細胞識別領域で前記流路を流下する細胞を撮像する手段が与える画像信号と前記第２の細胞識別領域で前記流路を流下する細胞を撮像する手段が与える画像信号とを比較して前記細胞を分類する手段に選択の指示を与えるパソコンと、からなるセルソーター。
【請求項１７】
基板に形成された細胞を搬送する流路を備え、該流路の上流端に細胞を注入する手段と、前記流路内の細胞の形状あるいは状態を画像信号として検出する細胞識別領域および検出手段と、該細胞識別領域の下流に形成された前記流路内の細胞に、前期細胞識別の結果に基づいて、不要な細胞のみに細胞を破壊あるいはアポトーシスを誘導する集束光を選択的に照射する光源および光学系からなるセルソーター。
【請求項１８】
前記光源の波長として、水の吸収がある近赤外光を用いた請求項１７記載のセルソーター。
【請求項１９】
前記光源の波長として、細胞を変性させ破壊する機能がある近紫外光を用いた請求項１７記載のセルソーター。
【請求項２０】
前記光源の光の集束手段として、シリンダー型のレンズを用いて、流路に垂直な方向に直線状に流路全体にまたがるように集束線領域を有する請求項１７記載のセルソーター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、個別の細胞を分離解析し、細胞を一細胞毎に分離回収するセルソーターチップおよびセルソーターに関する。
【背景技術】
【０００２】
２０世紀の初頭に細胞を観察しようとすると、顕微鏡以外に手立ては無かった。１９４８年にＷａｌｌａｃｃｅ  Ｃｏｕｌｔｅｒがセルソーターの検出部の原型と言える“コールターカウンター”（Coulter, W. Means for counting particles suspended in a fluid. US2,656,508 (1949)）を開発し、はじめて個々の細胞の特性を調べることが可能になった。コールターの技術にＪｅｔ−Ｉｎ−Ａｉｒ型のシースフロー技術（Crosland-Taylor, P.J. A device for counting small particles suspended in a fluid through a tube. Nature 171, 37-38(1956)）と静電的な細胞分離技術（Fluwer, M.J. Electronic separation of biological cells by volume. Science 150, 910-911(1965)）が組み合わさり、それまで困難であった細胞を１個毎に分離して性質を調べることが可能であるとともに、実際に細胞を分離回収する近代的なフローサイトメーターあるいはセルソーターが実現した。これらは細胞解析や分離の自動機器として改良され、ライフサイエンス分野での細胞解析技術、細胞分離技術の核となっている。
【０００３】
セルソーターとしてはベックマンコールター社や、ベクトンデッキンソン社から全自動の装置が発売されている。これらの装置は、最高３万細胞／秒の細胞処理が可能である。そのほか、臨床検査装置で実績のあるＤａｋｏグループのＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社は１０万細胞／秒の処理ができる高速セルソーターＭｏＦｌｏを実用化している。日本国内では１９９５〜２０００年にＮＥＤＯプロジェクトとして６億６８００万円を投じた「微量情報検出システム」の研究開発（ＮＥＤＯ「微量細胞情報検出システム」事後評価報告書、コード０６０００１５３８（２００２））が行われている。開発されたセルソーターでは、光学検出部からチューニング部分をなくすことで、ソーティング設定条件設定を容易にしている。ＮＥＤＯ成果を基に、Ｂｅｙ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社がデスクトップセルソータＪＳＡＮ（処理能力：４５０００細胞／秒）を開発し、販売している。
【０００４】
これらの装置では、細胞の検出は一般的にはシースフローセル内で行われる。シースフローの登場する以前のコールター型のセルソーターでは、細孔の開いた仕切りの外側と内側に電極を置き、外側の溶液から細孔を通して細胞を吸い上げたときに電極間に流れる電流の低下を測定する原理（Coulter, W. Means for counting particles suspended in a fluid. US2,656,508 (1949)）に基づいている。シースフローを用いる系では光学的な検出が用いられる［Hulett, H. R., Bonner, W.A., Barrett, J. and Herzenberg, L.A. Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence. Science 166, 747-9(1969); Kamaensky, L.A., Melamed, M.R., and Derman,H. Spectorphotometer: New instrument for ultrarapid cell analysis. Science 150, 630-631(1965)］。シースフローセルにレーザーを照射し、細胞がレーザー光を横切った時に散乱する光を検出する方法と、予め細胞を蛍光標識しておき、レーザーを横切ったときに発生する蛍光を検出する方法がある。散乱光を測定する系では、細胞が数μｍであるときに、大きさにしたがって入射光の進行方向に対して散乱する前方散乱と、より小さな粒子、すなわち細胞内の顆粒により散乱する側方散乱を検出する方法がある。現状のＪｅｔ−Ｉｎ−Ａｉｒ型のセルソーターでは前方散乱と側方散乱と蛍光のいずれも測定できるようになっている。蛍光に関しては６色蛍光を分離検出する装置が一般的になっている。散乱光や蛍光はレーザーパワーを大きくすれば短時間で計測を終えることができる。このため現在最も処理能力の高いセルソーターでは１０万イベント（測定液滴数）／秒の処理能力が得られている。セルにレーザーを照射して細胞を計測する部分では２５０μｍ径で、セルの先端部のノズル部分は１００μｍ程径となっている。レーザー照射を行なうために正方形の断面を持つ流路のセルを用いることもある。
【０００５】
一般的なフローサイトメーターやセルソーターは高価であること、装置が大型であること、試料が多量に必要であること、液滴を作成する段階で細胞に損傷を与える可能性があること、直接、試料を観察できないことなどの問題がある。これらの問題を解決するため、近年、マイクロ加工技術を用いて微細な流路を作成し、流路内の層流中を流れる細胞を直接顕微鏡観察しながら分離するセルソーターが開発されている（Micro Total Analysis, 98, pp.77-80 (Kluwer Academic Publishers, 1998);Analytical Chemistry, 70, pp.1909-1915 (1998)）。しかし、このマイクロ加工技術を用いて作成するセルソーターでは観察手段に対する試料分離の応答速度が遅く、実用化するためには、より応答の速い処理方法が必要である。
【０００６】
また、細胞を精製するためには、細胞を分離する方法以外にも、不用な細胞のみの機能を失活させることで、細胞を分離することと同様の成果を得ることができる。細胞の機能を失活させる技術としては、集束光を細胞に照射して細胞の機能を失活させる技術があり、たとえば、培養皿上で培養している白血球細胞に波長５２３ｎｍの集束光レーザーを照射し、細胞内に取り込ませた吸収ピーク波長５０４ｎｍの色素に吸収させることで１０−６秒の照射で細胞を加熱し失活させることができたことが報告されている［Koller, M.R., Hanania, E.G., Stevens, J., Eisfeld, T.M., Sasaki, G.C., Fieck, A., Palsson, B. High-throughput laser-mediated in situ cell purification with high purity and yield. Cytometry Part A 61A: 153-161 (2004)］。しかし、この手法では、静止している細胞の位置を１細胞単位で同定して、その細胞位置に集束点を持ってゆくものであり、幅広い流路中をランダムに高速に流れてくる細胞の位置を同定し、その細胞のみに選択的に集束光を照射することは困難であった。
【０００７】
本願の発明者らは、このような問題点を解消するため、マイクロ加工技術を活用して、試料の微細構造と試料中の蛍光分布に基づいて試料を分画し、回収する試料に損傷を与えることなく、簡便に細胞試料を分析分離することのできる細胞分析分離装置を提案している（特開２００３−１０７０９９号公報、特開２００４−８５３２３号公報、国際公開第２００４／１０１７３１号パンフレット）。また、Journal of Nanobiotechnology Vol.2:5（オンラインジャーナルhttp://www.jnanobiotechnology.com/content/pdf/1477-3155-2-5.pdf)）にも、類似の技術が開示されている。
【０００８】
【非特許文献１】Coulter, W. Means for counting particles suspended in a fluid. US2,656,508 (1949)）
【非特許文献２】Crosland-Taylor, P.J. A device for counting small particles suspended in a fluid through a tube. Nature 171, 37-38(1956)
【非特許文献３】Fluwer, M.J. Electronic separation of biological cells by volume. Science 150, 910-911(1965)
【非特許文献４】「微量細胞情報検出システム」事後評価報告書、コード０６０００１５３８（２００２）
【非特許文献５】Coulter, W. Means for counting particles suspended in a fluid. US2, 656,508 (1949)
【非特許文献６】Hulett, H. R., Bonner, W.A., Barrett, J. and Herzenberg, L.A. Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence. Science 166, 747-9(1969)
【非特許文献７】Kamaensky, L.A., Melamed, M.R., and Derman,H. Spectorphotometer: New instrument for ultrarapid cell analysis. Science 150, 630-631(1965)
【非特許文献８】Micro Total Analysis, 98, pp.77-80 (Kluwer Academic Publishers, 1998);Analytical Chemistry, 70, pp.1909-1915 (1998)
【非特許文献９】Koller, M.R., Hanania, E.G., Stevens, J., Eisfeld, T.M., Sasaki, G.C., Fieck, A., Palsson, B. High-throughput laser-mediated in situ cell purification with high purity and yield. Cytometry Part A 61A: 153-161 (2004)
【非特許文献１０】Journal of Nanobiotechnology Vol.2:5（オンラインジャーナルhttp://www.jnanobiotechnology.com/content/pdf/1477-3155-2-5.pdf)
【特許文献１】特開２００３−１０７０９９号公報
【特許文献２】特開２００４−８５３２３号公報
【特許文献３】国際公開第２００４／１０１７３１号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記Ｊｅｔ−Ｉｎ−Ａｉｒ型のセルソーターあるいは、上記文献、さらには、本願の発明者らの提案する特願２００４−３７９３２７号記載、特願２００４−２９７１８４号記載のセルソーターでは、流路中を流れる細胞の一瞬のスナップ写真から、細胞のそのときの状態を１回だけ解析し、これに基づいて細胞の種類を識別、分離するものである。この技術では、細胞が表面に発現しているタンパク質などの識別は出来るが、代謝状態などの、同一細胞の時間的変化を比較計測して初めて分かる細胞状態を計測することは出来ない。強いてやろうとすると、分離した細胞を一旦、回収し、所定時間インキュベーションした後に再度フローサイトメーターやセルソーターで分析することになる。
【００１０】
しかし、Ｊｅｔ−Ｉｎ−Ａｉｒ型のセルソーター等の従来のセルソーターでは繰り返し解析をするにしても、細胞を特定して繰り返し解析する構成にはなっていない。手段として分離した細胞群を再度セルソーターで分離回収することしかできない。したがって、細胞の代謝状態、あるいは細胞に薬物刺激を与えたことによる応答の違いを比較計測する方法、さらに、比較計測に基づいて細胞分離を行なうことで、細胞を表現型に応じて精密に精製する方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明では、流路中を流れる細胞のスナップ像を少なくても２回、所定の時間間隔で撮影し、この２回の撮影の間に細胞で変化した量（代謝量）を計測することで、細胞の代謝状態、あるいは細胞に刺激を与えたことによる応答の違いを比較計測する。さらに、比較計測結果に基づいて細胞分離を行なう。
【００１２】
また上記課題のうち、細胞を選別するために、本発明では、細胞を分岐を持つ微細流路中で各分岐に分離する方法を用いる。あるいは、流路中を流れる細胞に、細胞を破壊あるいは細胞に細胞死（アポトーシス）を誘導する手段によって流路を通過することでほしい細胞のみ生存して通過する細胞精製を行なう。
【発明の効果】
【００１３】
この時間比較型セルソーター技術により、表現型のそろった細胞の精製が可能となる。これにより、たとえば基板上に細胞を任意に配置する細胞チップ（臓器モデルチップ）を作成する上で、品質のそろった細胞チップを構成することができる様になる。同時に、単独で成立する分析技術として、浮遊状態で流れる細胞の代謝の違いや薬物に対する応答を、１回目のスナップ写真と２回目のスナップ写真の比較で直接計測するスクリーニング系として独立に利用することが可能となる。このとき、代謝系に特徴を持つ細胞であれば、薬剤に対する代謝などの応答特性を調べることが可能となる。
【００１４】
また、細胞を選別するために分岐流路を用いた細胞分離手段を用いることで、分離したい細胞種類の数だけの分岐によって、複数の種類の細胞を１回の分離操作で分離精製することができる。さらに、一直線の分岐を持たない流路を流れる細胞のうち、必要でない細胞を破壊あるいはアポトーシスを誘導する手段を組み込むことで、光学的照射手段のみによって、上記流路の分岐を用いた分離手段と異なり、細胞に外力を加えて細胞の移動方向を制御する手法が必要なくなり、光学的照射手段のみによって細胞を精製することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、流路中を流れる細胞のスナップ像を少なくても２回、所定の時間間隔で撮影し、この２回の撮影の間に細胞で変化した量（代謝量）を計測することで、細胞の代謝状態、あるいは細胞に刺激を与えたことによる応答の違いを比較計測し、比較計測結果に基づいて細胞分離を行なうものであるから、もっと単純な構成としては、流路中を流れる細胞を所定の時間を置いて２回撮影して比較することでよい。
【００１６】
図１は、本発明の最も基本的な処理工程を表す図である。細胞は流路の中を最上流から１方向に移動する。１は試料細胞（以下、細胞という）を含む懸濁液をセルソーターの流路の最上流に添加する工程である。流路の最上流に添加された細胞は流路中を下流の方向に流れる。２は流下の過程で第１の細胞識別処理により細胞の種類と状態を指定したパラメータにより１個ずつ識別する第１の識別工程である。３は細胞を流路下流の方向に流下させる時間調整工程である。４は時間調整工程３の時間が経過した後、第１の細胞識別処理で識別したのと同じ細胞を第２の細胞識別処理により再度細胞の種類と状態を指定したパラメータにより１個ずつ識別する第２の識別工程である。第２の識別工程でも細胞の種類と状態を指定したパラメータにより１個ずつ識別する。第１の細胞識別処理と第２の細胞識別処理による識別工程の間の時間は、時間調整工程３の流路長を設定することで任意の経過時間で識別することができる。５は第１の識別工程２で得られる情報と第２の識別工程４で得られる情報を比較する比較解析工程である。６は細胞分別器による細胞分別工程であり、比較解析工程５でパラメータの変化量が所定の閾値を超えていると判定された細胞については、細胞回収容器７に回収し、所定の閾値を超えていないと判定された細胞については、その他の細胞回収容器８に回収する。
【００１７】
ここで、細胞を含む懸濁液は流路の断面積と懸濁液の粘度により、予め予想される流速で第１の細胞識別工程２と第２の細胞識別工程３と細胞分別工程６を通過する。第１の細胞識別工程２を通過した細胞が第２の細胞識別工程３を通過するまでは時間的な差があり、この間に細胞の代謝に変化があるものは第１の細胞識別工程２と第２の細胞識別工程３での測定結果の差が生じる。実質的に状態に変化の無い細胞では両識別工程で差が出ない。このため、細胞の状態変化を指標に細胞を分離することができる。
【００１８】
図２は、図１に示した基本的な処理工程と比べ、細胞を刺激する工程が加わった処理工程を示す図である。図１と図２とを対比して明らかなように、図２では、第１の細胞識別工程２と第２の細胞識別工程３との間に、細胞を刺激する工程２３が設けられる点において、図１に示す基本的な処理工程と異なる。細胞を刺激する工程２３が加わったことから、細胞刺激により、同じ時間でも、より効果的な細胞の変異の発生が期待でき、細胞刺激により細胞がどのような変化を示すか効率よく検証できる。
【００１９】
細胞刺激工程２３では、薬剤を流路に注入し細胞を化学的に刺激する。あるいは、流路内または流路を挟むように、電極を儲け、通過する細胞を電界により刺激する。または、流路を流れる細胞に特定波長の光や電磁波を照射して刺激し、あるいは、熱で刺激する。熱による刺激（温度ストレス）では、流路内の一定部分に光吸収体を設けて、この部分に集束光を照射して加熱したり、ペルチェ素子を流路の特定領域に接触させて、特定細胞が流路中を流れてきたときのみ温度を上げたり下げたりできる構造とすることで達成できる。
【００２０】
図１、図２では、同一の細胞を所定の時間間隔で、種類と状態に着目して細胞変化を識別する工程を示しているが、識別の対象となる細胞を同定することについては説明していない。図３は、識別の対象となる細胞の同定を確実に行なうための工夫を盛り込んだ細胞変化を識別する工程を示す図である。３０は細胞を含む懸濁液をセルソーターの流路の最上流に添加する工程である。３１は細胞を１個だけ含むように懸濁液にスペーサーを挿入するスペーサー挿入工程である。すなわち、細胞を含む懸濁液の細胞ごとにスペーサーを挿入する。工程３０と工程３１は、順序を逆にしても良い。工程３１を先に実施する場合は、細胞を１個ずつに区切るスペーサーを作成するためのオイルや気相を流路内に挿入する工程でできたオイルや気相によるスペーサーで区切られた個々の領域に細胞を１個だけ含む溶液を挿入することになる。スペーサーはインデックスとして使用する。すなわち、スペーサーを構成しているオイルや気相の長さ、あるいは、オイルや気相の挿入のパターンを、このスペーサーに続いて流下して来る細胞のＩＤとして利用するのである。３９は細胞の配列情報としてのスペーサーインデックスを検出する工程である。３２はスペーサーで区切られた細胞の種類や状態を識別する工程である。工程３２を通過した細胞は工程３３−１に移動する。工程３３−１は細胞に刺激を与える工程である。刺激を受けた細胞は工程３６−１に移動する。工程３６−１は時間調整工程であるとともに、ここで所定時間インキュベーションする工程である。工程３６−１は、例えば、所定の温度に維持された所定の長さの流路をスペーサーで挟まれた細胞を含む懸濁液が通過する構成で実現される。工程３６−１でインキュベーションされた細胞は、再び、スペーサーインデックス検出工程３９、細胞識別工程３２に戻り、ここで、再度、スペーサーインデックスの検出、細胞の状態をチェックする。工程３８は細胞分別器で細胞を分別する工程である。スペーサーインデックス検出工程３９、細胞識別工程３２で得られる細胞情報を比較解析工程４２で処理し、所定のパラメータが所定の範囲にある細胞の情報が細胞分離工程３８に与えられている。比較解析工程４２から与えられる情報が所定の条件を満足しているものは容器４０−１に回収される。所定の条件を満足していない細胞は容器４０−２に回収される。
【００２１】
図３に示す工程は、識別の対象となる細胞がインデックスであるスペーサーと対になって扱われるから、細胞に刺激を与える工程３３−１と所定時間インキュベーションする工程３６−１を経過した細胞と、この工程に入る前の細胞との比較は、スペーサーによって同定されるから、異なった細胞の比較を行なうことは確実に防止できる。
【００２２】
なお、比較解析工程４２から与えられる情報が所定の条件を満足していない細胞に対しては、破線で示すように、細胞に刺激を与える工程３３−２および時間調整工程と所定時間インキュベーションする工程３６−２を経て、細胞識別工程３２に戻して、先に得られている情報と新たに得られた情報を工程４２で比較処理し、工程４２の指令により、再度、細胞分別工程３８で分別することにしても良い。ここで所定の条件を満足している場合は容器４０−１に回収され、そうでないものは４０−２に回収される。この処理が可能になるのは、識別の対象となる細胞がインデックスであるスペーサーと対になって扱われるからである。すなわち、どういうルートでどのように扱われても、スペーサーの持っている細胞を特定するための情報が細胞と対として一緒に検出できるからである。なお、この場合、再評価のために独立したスペーサーインデックス検出工程３９、細胞識別工程３２が備えられていないときは、工程３０，３１による新たな細胞の流下は停止することが必要である。また、工程３０，３１による新たな細胞の流下を停止すれば、細胞に刺激を与える工程３３−１および時間調整工程と所定時間インキュベーションする工程３６−１を繰り返し実行し、その繰り返しの都度、細胞の状態を評価した後、繰り返し実行の評価結果を工程４２で比較解析して細胞分別工程３８で分別することにしても良い。
【００２３】
（実施例１）
図４は本発明のセルソーターチップと、このチップを利用したセルソーターの実施例１の概要を示す平面図である。実施例１は図３で説明した処理工程に基づく実施例（ただし、破線で示す処理は含まないものとした）である。細胞を流路に添加した後に細胞間にスペーサーを導入し、細胞を１個ずつ区切る機構と、個々の細胞に刺激を与える機構と、刺激を与える前後で細胞の状態を測定する、すなわち細胞スペーサーによるインデックスで特定し、細胞状態を２回測定する機構を有するセルソーターである。
【００２４】
６１はセルソーターチップ基板であり、ポリメタクリル樹脂あるいはシクロオレフィン系樹脂を、金型に対して、射出成型あるいはホットエンボス法で作成する。一般的には、射出成型で作成するほうが微細な構造を作成する上で良い結果が得られる。基板６１の底面には流路パターンが射出成型で形成され、全面をプラスチックシートで覆って流路６４が形成される。流路６４に細胞を添加し、あるいは、スペーサー用のオイル、細胞刺激用の薬剤を添加するためには、流路６４の適当な位置に基板表面まで貫通する開口を有する添加口を形成する。また、流路から細胞を排出するためには流路６４の適当な位置に基板表面まで貫通する開口を有する外部コネクターを形成する。
【００２５】
６３−１は細胞添加口ハウジングであり、流路６４の最上流部に設けられる。６２−１は流路６４から基板６１の表面まで連通している開口である。１６１はシリンジポンプ１６３のニードルであり、細胞添加口ハウジング６３−１の上面を貫通して開口６２−１に対して垂直方向から細胞を含む懸濁液を連続して添加する。１６４はシリンジポンプ１６３の駆動装置であり、後述するパソコン３００の与える信号により操作される。６７−１はシース液供給路であり、開口６２−１にポンプ１６５-１から送り込まれるシース液を供給する。１６６はシース液溜めである。ポンプ１６５-１は後述するパソコン３００の与える信号により操作される。図５（Ａ），（Ｂ）に細胞添加口ハウジング６３−１の部分の断面を示す。（Ａ）は流路６４に沿った面で断面にしてシース液供給路６７−１の方向に見た断面図、（Ｂ）はシース液供給路６７−１に沿った面で断面にして流路６４の方向に見た断面図である。６１は基板であり、底面に流路６４が形成される。６８はプラスチックシートであり、基板６１の裏面に形成される流路６４のパターンを覆って流路６４を完成する。開口６２−１が基板６１の裏面に形成される流路６４から基板６１の表面まで延びている。シース液供給路６７−１は基板６１の表面で開口６２−１と結合する。
【００２６】
ニードル１６１は細胞添加口ハウジング６３−１の上部を貫通して、開口６２−１の中心部に突き出る構造とされ、シース液供給路６７−１から供給されるシース液はニードル１６１の周りを流れる構造となっているので、ニードル１６１より添加される細胞を含む懸濁液の周囲には流路６７−１より供給されるシース液の相が形成される。ニードル１６１より添加された細胞４１はシース液により流路６４の中央部に１列に整列され、かつ、細胞間隔はシース液により引き伸ばされる。各部のサイズを見ると、基板６１の厚さは１〜２ｍｍ、流路６４は２０〜５０μｍ（高さ）×２０〜５０μｍ（幅）、プラスチックシート６８の厚さは５０〜１７０μｍ、開口６２−１は５００〜６００μｍφ、ニードル１６１は２００μｍφ、ニードル１６１の開口は細胞より大きければよい、といった程度である。
【００２７】
図４に戻り説明する。５６は細胞検出領域で、細胞添加口ハウジング６３−１の下流の流路６４に設けられる。細胞４１が流路６４を流れてくるとき、この領域で細胞を検出する。細胞検出領域５６で細胞を検出するのは、細胞で光の透過が阻止される時間を検出することで容易に検出できる。細胞検出領域５６で細胞が検出されたことは後述するパソコン３００に入力する。細胞検出領域５６の下流の流路６４にはインデックス用のオイルが供給される流路６４−２が連結されている。流路６４−２の端部には、オイル添加コネクター６３−２が設けられる。６２−２は流路６４−２の端部から基板６１の表面まで連通しており、配管６７−２が結合している。６７−２はオイル供給路であり、コネクター６２−２を介した流路６４−２にポンプ１６５-２から送り込まれるオイルを供給する。１６７はオイル溜めである。ポンプ１６５-２は後述するパソコン３００の与える信号により操作される。図６はオイル添加コネクター６３−２の部分の断面を示す図である。流路６４−２に沿った面で見た断面図である。６１は基板であり、底面に流路６４−２が形成される。６８はプラスチックシートである。開口６２−２が基板６１の裏面に形成される流路６４−２から基板６１の表面まで延びている。オイル供給路６７−２は基板６１の表面で開口６２−２と結合する。
【００２８】
図４に戻り説明する。流路６４の流路６４−２より下流部には流路６４−２より注入されたインデックス用のオイルを検出するインデックス検出領域５７−１が設けられるとともに、これに続けて、細胞識別領域５８−１が設けられる。インデックス検出領域５７−１でオイルを検出するのは、オイルで光の透過が阻止される（あるいは低減される）時間を検出することで容易に検出できる。さらに、オイルに色素を混入させることで、より検出を容易にすることができる。検出領域５７−１でオイルが検出されたことは後述するパソコン３００に入力する。細胞識別領域５８−１では、後述するパソコン３００により与えられる撮像タイミング信号により、流路６４を流下している細胞を撮像する。
【００２９】
流路６４の細胞識別領域５８−１の下流に細胞刺激領域５９が設けられる。細胞刺激領域５９では細胞刺激用の刺激物質溶液が供給される流路６４−３が流路６４に連結されている。流路６４−３の端部には、刺激物質溶液添加口ハウジング６３−３が設けられる。６２−３は流路６４−３の端部から基板６１の表面まで連通している開口である。６７−３は刺激物質溶液供給路であり、開口６２−３にポンプ１６５-３から送り込まれるオイルを供給する。１６８は刺激物質溶液溜めである。ポンプ１６５-３は後述するパソコン３００の与える信号により操作される。刺激物質溶液添加口ハウジング６３−３の構成は、図６で説明したオイル添加コネクター６３−２と同じであるから、断面図による説明は省略する。
【００３０】
流路６４の細胞刺激領域５９の下流に時間調整器６０が設けられる。時間調整器６０には、流路６４に連結された流路６０−１が備えられ、流路６４を流下する細胞に必要な時間インキュベーションを行なう。流路６０−１は流路６４と同じ断面積の流路でよい。この領域は、必要により温度制御を施すものとするのがよい。
【００３１】
流路６４の時間調整器６０の下流にインデックス用のオイルを検出するインデックス検出領域５７−２が設けられるとともに、これに続けて、細胞識別領域５８−２が設けられる。インデックス検出領域５７−２はインデックス検出領域５７−１と同様に、オイルで光の透過が阻止される（あるいは低減される）時間を検出することで容易にオイルを検出できる。検出領域５７−２でオイルが検出されたことは後述するパソコン３００に入力する。細胞識別領域５８−２では、細胞識別領域５８−１と同様、後述するパソコン３００により与えられる撮像タイミング信号により、流路６４を流下している細胞を撮像する。
【００３２】
流路６４の細胞識別領域５８−２の下流に回収用流路６４−５、６４−６を接続し、それぞれに止め弁６５―１，６５−２を設け、外部コネクター６６−１または６６−２からそれぞれの回収用流路を流下してくる細胞を回収する。止め弁６５―１，６５−２の操作は後述するパソコン３００により制御される。止め弁６５の構造を図２０（Ａ）に示す。基板６１の止め弁部には穴９９９が開いており、シリコンラバーの構造体１０００が装着さている。シリコンラバー構造体は外部からのピン１００１による押し付けで、図２０（Ｂ）のように流路６４をふさぐことができる。ピン１００１の圧力を除くと図２０（Ａ）のようにシリコンラバーの弾性で基に戻り、流路６４が貫通する。
【００３３】
図７は、セルソーターチップの細胞検出領域５６、インデックス検出領域５７−１，５７−２、細胞識別領域５８−１、５８−２と、それぞれの領域の光学系の関係の概略を示す図であり、図８は、パソコンによる操作の処理に関するフローチャートの概要を示す図である。図７において、セルソーターチップの基板６１は細胞添加口ハウジング６３−１が端部に設けられた流路６４に沿った断面とされているが、インデックス検出領域５７−２、細胞識別領域５８−２は、便宜上、この流路６４に存在するものとして表示した。
【００３４】
流路６４の最上流には、細胞添加口ハウジング６３−１が設けられ、細胞検出領域５６、インデックス検出領域５７−１、細胞識別領域５８−１、インデックス検出領域５７−２、細胞識別領域５８−２が流路に沿って設けられる。細胞検出領域５６、インデックス検出領域５７−１，５７−２では、光の有無、あるいは強弱を検出できればよいから、光源１１とフォトダイオード１２からなる簡易な光学系が設けられる。細胞識別領域５８−１、５８−２では、領域を通過する細胞の像を撮る必要があるから、いわゆる顕微鏡の機能を持つ光源１３と撮像装置１４からなる光学系が設けられる。細胞検出領域５６、インデックス検出領域５７−１，５７−２のフォトダイオード１２−１，１２−２，１２−３のオン、オフ信号はパソコン３００に入力される。細胞識別領域５８−１、５８−２の映像は、パソコン３００の指示により撮像装置１４−１，１４−２によって撮影され、この画像信号はパソコン３００に入力される。パソコン３００には、これらの計測データのほかに、使用者が与える各種の設定値等のデータ（操作入力）が入力される。
【００３５】
パソコン３００では、これらの入力に応じて、あらかじめ与えられているプログラムに従って所定の操作を行なう。この処理に関するフローチャートの概要を図８に示す。ＳＴＡＲＴは使用者が分別したい細胞を含む懸濁液をシリンジポンプ１６３に入れて、ニードル１６１を細胞添加口ハウジング６３−１に装着した後、パソコン３００にスタート指示を入力したことを意味する。この段階で、パソコン３００はセルソーターチップの初期化を実行する。例えば、ポンプ１６５-１，１６５-２および１６５-３を短時間運転する指示をだす。その結果、流路６４は全領域がシース液で満たされ、流路６４−２は全領域がオイルで満たされ、流路６４−３は全領域が細胞刺激用の刺激物質溶液で満たされる。このことは、以後の処理に対して、パソコン３００の指示に遅滞無く応答できるようになることを意味する。
【００３６】
ステップ３０１はポンプ１６５-１の運転指示である。ステップ３０２は駆動装置１６４の運転指示である。ステップ３０３は細胞検出領域５６で細胞が検出されたか否かをチェックする。すなわち、ステップ３０３で細胞が検出されたと判定されるまで、シース液を供給しながら、細胞を含む懸濁液を流路６４に供給する。ステップ３０３で細胞が検出されたと判定されると、ステップ３０４でポンプ１６５−１の運転停止を指示し、さらに、ステップ３０５で駆動装置１６４の運転停止を指示することにより、細胞を流路６４の細胞検出領域５６近傍に保持する。一方、且つ、ステップ３０６でポンプ１６５−２の運転を指示し、次いで、ステップ３０７で、細胞の検出ごとに決まるポンプ１６５−２の所定の運転時間が経過したか否かをチェックする。すなわち、ステップ３０７でポンプ１６５−２の運転時間が細胞の検出ごとに決められている所定時間に達したと判定されるまで、検出された細胞が流路６４を流下するのを停止し、インデックス用のオイルを流路６４−２から流路６４に供給する。すなわち、細胞の検出の順番に応じた長さのインデックス用のオイルを流路６４に注入することになる。ステップ３０７で所定時間に達したと判定されると、ステップ３０８でポンプ１６５−２の運転停止を指示するとともに、ステップ３０１に戻り、流路６４に細胞を含む懸濁液とシース液を注入する。
【００３７】
この結果、再び、ステップ３０３で細胞が検出されたと判定されるまで、インデックス用のオイルに続いて最初に検出された細胞を流路６４に流下させることができる。再び、ステップ３０３で細胞が検出されたと判定されると、細胞の流下を停止して、長さの異なるインデックス用のオイルを流路６４に挿入した後、ステップ３０１に戻り、流路６４に細胞を含む懸濁液とシース液を注入する処理を繰り返す。
【００３８】
流路６４には、したがって、インデックス用のオイルと細胞の対が、次々に流下することになる。ステップ３０９で、インデックス検出領域５７−１の信号を検出し、パソコン３００に送る。ステップ３１０で、パソコン３００はインデックス検出領域５７−１の信号の検出に応じて撮像装置１４−１に細胞識別領域５８−１の映像の取得指示を与える。これにより撮像装置１４−１によって細胞識別領域５８−１の映像が撮影され、この画像信号がパソコン３００に入力される。ステップ３１１で、インデックス検出領域５７−１の信号の検出から所定時間が経過したか判定する。すなわち、分別されるべき細胞が流路６４の細胞識別領域５８−１の下流の細胞刺激領域５９に到達したか否かが判定される。ステップ３１１で所定時間が経過したと判定されると、ステップ３１２でポンプ１６５−３の運転を指示する。ポンプ１６５−３の運転により、細胞刺激領域５９の流路６４に細胞刺激用の刺激物質溶液が供給される。ステップ３１３でポンプ１６５−３の運転時間が所定時間を経過したか否か判定される。所定時間を経過したと判定されるとステップ３１４でポンプ１６５−３の運転停止が指示される。この所定時間内に細胞刺激領域５９で流路６４に供給される刺激物質溶液の量がインデックス用のオイルで区切られた領域にある懸濁液およびシース液量の２０％程度までなら、微量であるので、駆動装置１６４および他のポンプ１６５−１，１６５−２を停止する必要は無い。
【００３９】
ステップ３１５で、インデックス検出領域５７−２の信号を検出し、パソコン３００に送る。ステップ３１６で、パソコン３００はインデックス検出領域５７−２の信号の検出に応じて撮像装置１４−２に細胞識別領域５８−２の映像の取得指示を与える。これにより撮像装置１４−２によって細胞識別領域５８−２の映像が撮影され、この画像信号がパソコン３００に入力される。ステップ３１７で、インデックス検出領域５７−１，５７−２の信号が同じレベルにあるインデックスに続いて現れる細胞の映像比較を行なう。ステップ３１８で、同じレベルにあるインデックスの細胞の差が所定値を越えているときは止め弁６５―１，６５−２を操作し、止め弁６５―１を閉、６５−２を開として流路６４を回収用流路６４−６に接続し、外部コネクター６６−２から細胞を回収し、所定値内にあれば、、止め弁６５―１を開、６５−２を閉として流路６４を回収用流路６４−５に接続し、外部コネクター６６−１から細胞を回収する。
【００４０】
このように、実施例１では、細胞刺激用の刺激物質溶液で刺激を受ける前後の細胞の映像がパソコンで比較されるに際し、インデックスオイルで同一のコードが与えられた細胞について行われるから、異なった細胞のデータを比較するということは無い。
【００４１】
ここで、オイル区切によるインデックスの具体例についてみると、流路６４が幅２０μｍで深さ２５μｍの場合、オイル長さが４０μｍ以上１０００μｍ程度までの範囲で作成するのが実用的に有効である。オイル長の差はオイル長さが４０μｍから２００μｍ程度までは２０μｍの差で作成すれば容易に区別できる。すなわち、４０μｍ、６０μｍ、８０μｍ、１００μｍなどは長さの区別がきる。２００μｍより長いオイル区切りを区別するには長さそのものの誤差があるのでオイル長の２０％の差をつけることでお互いに長さの違うオイル区切りを区別できる。
【００４２】
なお、実施例１に示す基板６１には、図７からも明らかなように、細胞検出領域５６、インデックス検出領域５７−１，５７−２および細胞識別領域５８−１，５８−２に、それぞれの細胞検出器、インデックス検出器、細胞識別器が実装されるわけではない。これらの装置は、光の遮蔽で物質が認識できる程度の光学系、あるいは、細胞を識別できるレベルの顕微鏡の機能を持った光学系で構成されるので、本発明によるセルソーターをこの光学系に装着して細胞分離を行なうことになる。このことは、ポンプによる液体の注入についても同様であり、各ポンプに連結された供給路を各添加口ハウジングに、適当な連絡具、例えば、キャピラリーチューブで連結するものとされる。
【００４３】
（実施例２）
実施例２では、細胞刺激領域５９が物理的な刺激を与える構成である場合の例を説明する。セルソーターの構成としては、図４に示す細胞刺激領域５９が変更される他は、実施例１と同じ構成である。物理的な刺激の第１例では通過する細胞を電気的に刺激する方法である。この場合には、図４に示した流路６４−３から刺激物質溶液溜め１６８の構成は不要となり、代わりに流路６４に電極を設けることが必要となる。図９は流路６４に配置された細胞刺激領域５９に電極５９−２と５９−３を設けた例を示す平面図である。電極５９−２と５９−３にはそれぞれ外部から電気的な入力を与えるためのリード部分５９−４と５９−５が接続されている。いずれも薄膜であり、基板６１を成形した段階で流路６４の細胞刺激領域５９の領域に作成される。電極５９−２と５９−３は基板上にクロムを蒸着した後に白金を蒸着して作成する。電気刺激としては、細胞が通過するときに電極５９−２と５９−３間に数ｋＨｚから数十ＭＨｚの高周波、直流矩形波など必要に応じて使用する。
【００４４】
一例として、５ｋＨｚの高周波（サイン波）を外部に接続したパルスジェネレーターで発生させ、電極５９−２と５９−３の間に常に印加する。両電極の流路方向の長さは２５μｍで、間隔は２５μｍである。電極部位の流路６４の流路断面は２５×２５μｍの矩形である。細胞は１００μｍ／ｓで流れてくるように調整してある。両電極は同一平面上に作成しているので、電気力線のかかり方は実質電極５９−２と電極５９−３の間の２５μｍ領域程度となる。したがって高周波にさらされるのは約２５０ｍｓということになる。電圧は１ｋＶとする。ヒト白血球の混合物を流路６４に流し、細胞識別領域５８−１通過後に図９の電極構造を用いて上記条件の高周波刺激を与える。時間調整器６０の流路６０−１の流路長を６０ｍｍとすると、他の流路を通過する時間も含めて細胞識別領域５８−２を同じ細胞が通過する間隔はおおよそ１４分かかる。この間に、細胞の形状が球形から変化するものが約１２％存在する。細胞形状を細胞識別領域５８−１，５８−２から得られる画像信号をパソコン３００で逐次処理し比較する。同一細胞の２枚の画像の比較結果から自動的にパソコン３００が判断してバルブ６５に指令を出し、形状の変化が見られる細胞を外部コネクター６６−２のほうへ振り分ける。形状に変化の見られないと判断される細胞は外部コネクター６６−１のほうに振り分ける。
【００４５】
物理的な刺激の他の例としては、流路を流れる細胞に特定波長の光や電磁波を照射して刺激する方法である。図１０は光照射で細胞を刺激する場合の照射光学系と細胞刺激領域５９の構成を示す断面図である。特定波長の光を発生する光源５９−６の光をレンズで絞って集束光５９−７として、プラスチックシート６８、基板６１を通して、流路６４を流れる細胞４１に照射する。細胞がシロイヌナズナの細胞、集束光５９−７の波長を５１４ｎｍで、０．３ｍＷ、時間調整器６０の流路６０−１の流路長を６０ｍｍとして集束光被爆前と被爆後の細胞を細胞識別領域５８−１，５８−２で観察し、画像をパソコンに取り込んで比較する。この場合、シロイヌナズナの細胞は集束光被爆前に比較し、集束光被爆後では細胞質の葉緑体が配向し、見かけ上面積が少なくなったような状態の細胞が検出される。この変化に着目して、細胞を分離できる。ＵＶ光やＸ線も外部から細胞刺激領域５９に照射することが可能である。
【００４６】
光の照射に代えて、細胞刺激領域５９で細胞を磁場にさらすことも可能である。この場合はコーン状に絞ったサマリウム／コバルト系やネオジウム系のような強力な希土類磁石を用いる。磁石先端から細胞までの距離は１００μｍ程度で数Ｔの磁場に曝露する前後の細胞状態比較から特定の細胞群を分離することを試みることができる。細胞内のスピンラジカル反応は強磁場の影響を受ける可能性があるので、磁場感受性の細胞を検出分離することができる可能性がある。
【００４７】
細胞刺激領域５９で、細胞を熱による刺激（温度ストレス）にさらすことができる。細胞刺激領域５９の流路６４のプラスチックシート６８の外面に光吸収体を固着させ、これに集束光を照射して加熱することができる。あるいは、光吸収体に代えて、ペルチェ素子を固着させ、細胞が流路６４を流下してきたときのみ温度を上げたり下げたりできる構造とすることで達成できる。
【００４８】
（実施例３）
実施例３では、他のインデックス用オイルのパターンの作成例を示す。実施例１では、インデックス用オイルの長さを細胞に対応させるものとして説明したが、実施例３では“１”、“０”でコード化されたパターンとする例について、図１１を参照して説明する。図１１は、図４の細胞検出領域５６の下流の流路６４に連結されているインデックス用のオイルが供給される流路６４−２に対応する部分を示す図である。流路６４−２の流路６４とオイル添加口ハウジング６３−２との間に流路６４−４を連結し、流路６４−４の端部には水添加口ハウジング６３−４を設ける。６２−４は流路６４−４の端部から基板６１の表面まで連通している開口である。水添加口ハウジング６３−４の開口６２−４に水供給路６７−４を介して、開口６２−４にポンプ１６５-４から送り込まれる液を供給する。１６９は水溜めである。ポンプ１６５-４はポンプ１６５-２と同様にパソコン３００の与える信号により操作される。
【００４９】
実施例１では、細胞検出領域５６で細胞が検出されたときは、ポンプ１６５−１の運転が停止、駆動装置１６４の運転が停止され、細胞検出領域５６近傍に細胞を保持する（ステップ３０３−３０５）とともにポンプ１６５−２が運転される。実施例１では、ポンプ１６５−２の運転時間を制御して細胞のインデックス用オイルの長さを細胞に対応させるものとした（ステップ３０６−３０７）。実施例３では、このステップ３０６−３０７に対応する制御をポンプ１６５−２、ポンプ１６５−４に対してパソコン３００から行なうことにより、オイルと水とを利用したコードとして構成する。
【００５０】
ポンプ１６５−２が運転されるときは流路６４−２にあるオイルまたは水が流路６４に注入され、ポンプ１６５−４が運転されるときは流路６４−２に水が注入される。したがって、ポンプ１６５−２，１６５−４をパソコンの指示によって適当に運転すれば、オイルまたは水の混在とそれぞれの長さを制御されたコードを流路６４に挿入することができる。図１１では、細胞４４−１に対して“１０１０１０１”のコードを、細胞４４−２に対して“１１０１０１１”のコードを付与し、細胞４４−３に対して“１０１０１１０”のコードを付与しようとしているところを示す。
【００５１】
ここで、オイルと水によるインデックスの具体例についてみると、流路６４が幅２０μｍで深さ２５μｍの場合、オイル長さの単位長が４０μｍ、水の長さの単位長が４０μｍとなるようにして、“１”または“０”をこの単位長とするのが好ましい。インデックス検出領域５７−１では、フォトダイオード１２−１はオイルの部分と水の部分に対して、異なった信号（例えば、検出光強度の大きさ）をパソコン３００に送ることになる。実施例３では、パソコン３００は細胞の検出に対応して所定のコードを与えるようにプログラムされているとともに、これに応じて、ポンプ１６５−２，１６５−４を運転する。ステップ３０７は、したがって、「ポンプ１６５−２，１６５−４のトータルの運転時間は所定時間を経過したか」、あるいは、「ポンプ１６５−２，１６５−４は所定の運転パターンの運転を完了したか」と読み替えたものとなる。
【００５２】
（実施例４）
実施例４は、１回の細胞刺激と流路６０−１を細胞が通過する時間によるインキュベーション時間では、十分な細胞の変化が期待できないとき、ｎ０回の細胞刺激とｎ０回の流路６０−１を細胞が通過する時間によるインキュベーションを実行するセルソーターの例を示す。
【００５３】
図１２は、実施例４のセルソーターチップと、このチップを利用したセルソーターの概要を示す平面図である。図１２と図４とを対比して容易に分かるように、セルソーターチップ自体は以下の点で異なるに過ぎない。すなわち、流路６４の細胞識別領域５８−２の下流部と流路６４のインデックス検出領域５７−１の上流部とを結ぶバイパス流路６４−７が設けられ、この流路６４−７に止め弁６５−３が設けられる。また、バイパス流路６４−７に沿って、細胞識別領域５８−２の下流部と流路６４のインデックス検出領域５７−１の上流部の方向に向かうリニアポンプ１６５−５用の移動磁界発生コイルが備えられる。また、図には表れないが、インデックス用にオイル溜め１６７に保持されるオイルが磁性オイルとされる。ここで、磁性オイルとはオイルにナノ磁性体を分散させたものである。もっとも、インデックス用に利用できる流体であれば、オイルである必要は無く、磁性流体であれば良い。この点に関しては、他の実施例でもオイルに代えて、インデックス用に利用できる流体が利用できる。また、この例では、水溜め１６９は、色違いのオイル溜め１６９としてオイルにナノ磁性体を分散させたものを利用するのが良い。こうすれば、オイルの色の違いで光学的な明るさの違いが検出でき、インデックスとして利用できるとともに、リニアポンプ１６５−５の動作に有利である。
【００５４】
図１２に示す構成においては、細胞識別領域５８−２に最初の細胞が到達した時点には、細胞検出領域５６以下の流路６４の範囲は、すべて、インデックス用オイルと対になった細胞とが入っているということを意味する。したがって、この両端をバイパス用の流路６４−７で短絡した閉ループとして、インデックス用オイルと対になった細胞とを移動磁界発生コイルと磁性オイルとの関係で実現されるリニアポンプ１６５−５により循環させるとともに、この循環のたびに細胞を刺激し、細胞の映像を撮ることにする。これにより、細胞に十分な刺激を与え、且つ、刺激に応じた映像を得ることができる。
【００５５】
図１３は、実施例４の動作を実現する処理フローを示す図である。図１３と図８とを対比して容易に分かるように、ステップ３０１からステップ３１６までの処理は実施例１と同一である。図１３では、ステップ３１６で細胞識別領域５８−２の映像取得をした後、ステップ３２１で、これが所定の映像取得に該当するか否かチェックする。最初の映像取得であれば、当然、該当しないからステップ３２２に進みカウンターを１だけ進ませた後、ステップ３２３で止め弁６５‐３開、ポンプ１６５−１，１６５−２および駆動装置１６４の運転停止をパソコン３００は指令する。続けて、ステップ３２３でリニアポンプ１６５−５の運転を指令する。その後、ステップ３０９に進む。これにより、細胞検出領域５６から細胞識別領域５８−２の範囲の流路６４はバイパス用の流路６４−７で短絡された閉ループとなり、この閉ループにある細胞および磁性流体がリニアポンプ１６５−５で循環されながら、細胞刺激領域５９にポンプ１６５−３により供給される刺激物質溶液により繰り返し刺激されるとともに、時間調整器６０の流路６０−１の前後の細胞の映像を繰り返し得ることができる。この例では、繰り返し刺激を与え、それにより応答する細胞を分離する形になっているが、工程３１２、３１３、３１４に係る刺激物質添加用のポンプ駆動をスキップすることで、最初の刺激からの細胞応答の時間経過を追跡し、所定の状態になった細胞を分離することもできる。
【００５６】
ステップ３２１で、これが所定の映像取得に該当すると判定されたときは、パソコン３００は止め弁６５‐３を閉とし、ポンプ１６５−１の運転を指令する。すなわち、細胞検出領域５６から細胞識別領域５８−２の範囲の流路６４はバイパス用の流路６４−７で短絡された閉ループを解消するとともに、流路６４内にあるインデックス用オイルと対になった細胞を外部コネクター６６−１または６６−２の方に排出して細胞を回収する。そのため、ステップ３１７，３１８に進んで、得られた細胞の映像から選択をすることになる。実施例４では、繰り返し細胞を撮像しているから、実施例１よりも豊富な情報がパソコン３００に蓄積されている。したがって、図１３のステップ３１７，３１８に表示されているよりも多様な評価ができる。本発明を用いると、刺激を与えて細胞の変化が起きる場合、刺激応答が速く、２回目の測定で細胞に変化をきたしたものと、応答が遅く、より長時間インキュベーションしないと細胞の変化が見られないものとを分離することができる。
【００５７】
（実施例５）
上述の実施例では、時間調整器６０の流路６０−１の長さが固定されていた。このため、インキュベーション時間は、流路６０−１を細胞が通過する時間で、常に一定となり、使用者の都合で変えることができない。細胞の種類や刺激物質によってこのインキュベーション時間を変えたい場合も多い。基板１の成形時に、これに対応するためには、流路６０−１の長さを変えた多種類の金型を用意する必要がある。一方、基板１上でインキュベーション時間を可変にできるようになれば、色々な長さの流路６０−１を持つチップを予め用意しておく必要が無いので、製造者にとって好都合であるとともに、使用者にとっても、特異なケースの注文により高価なものを購入する必要がなくなり、ユーザーにとっても利点がある。実施例５ではセルソーターチップの時間調整器６０の流路６０−１の長さを可変として、任意の時間でインキュベーションを行なえるようにする１例に関する。
【００５８】
図１４（Ａ）は、実施例５のセルソーターチップの時間調整器６０の部分に着目した平面図、（Ｂ）は、図１４（Ａ）のＡ−Ａ位置で矢印方向に見た断面図、（Ｃ）は、図１４（Ａ）のＢ−Ｂ位置で矢印方向に見た断面図である。６１は基板、６４は流路、６０は時間調整器の領域、６８はプラスチックシートである。実施例５では、時間調整器の領域６０は、流路６４と同じ高さのアガロースゲル膜が組み込まれている。６０−２，６０−３はアガロースゲルを注入するための開口である。アガロースゲルの注入について説明すると以下のようである。終濃度が重量／容量％で１．５％のアガロース粉末を懸濁した０．１５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を沸騰させてアガロースを溶解させる。アガロース溶解液を６５℃前後まで冷却し、直ちにアガロース注入口６０−２から注入する。このときチップそのもの熱容量があるので、チップも６５℃に加熱しておくのがよい。過剰なアガロース溶解液は排出口６０−３からオーバーフローさせる。３０分間室温に放置するとアガロースがゲル状に凝固する。実施例５のセルソーターチップはアガロースゲル膜を組み込んだだけで製造者から使用者に提供されて、使用者が自由に流路６０-１を設定しても良いし、使用者の注文に応じて製造者が流路６０-１を設定して、提供することにしても良い。
【００５９】
図１５はレーザー集束光照射装置を用いて、時間調整器６０の領域のアガロースゲル膜にレーザー集束光を照射する方法を説明する概念図である。セルソーターチップの基板６１をステージ４０１にのせて加工する。ステージ４０１はＸＹ駆動機構４０２で自在に動かすことができる。レーザー光源４０３から発せられるレーザー光はダイクロイックミラー４０４を通過し、レンズ４０５でセルソーターチップ６１の時間調整器６０の領域のアガロースゲル膜にフォーカスする。レーザーとしては水に吸収のある１４８０ｎｍの波長を用いることができる。ＸＹ駆動機構４０２を動かすことで流路を作成することができる。流路作成の進行は光源４０６からの白色光でチップ基板６１を照明し、得られる像をレンズ４０５から可視光を透過するダイクロイックミラー４０４を介してＣＣＤカメラ４０７で検出する。４０８は制御用のコンピューターで、画像から加工された線幅を算出し、移動速度をＸＹ駆動機構４０２に伝え、一定の線幅で加工ができるようになっている。また、コンピューター４０８は、予め記憶した経路に従い加工を行なうようＸＹ駆動機構４０２の移動と、レーザー４０３の出力をコントロールする。
【００６０】
図１６（Ａ）は時間調整器６０の領域のアガロースゲル膜にレーザー照射して流路６０−１を作成している様子を模式的に示す平面図、（Ｂ）は断面図である。レーザーに照射された部分が極所加熱されアガロースゲルを溶融除去する。１００は時間調整器６０の領域のアガロースゲル膜にフォーカスし、移動しながら流路６０−１を作成しているレーザー光を示す。フォーカスしたレーザー光により溶解したアガロースは周辺のアガロースゲル膜の隙間に拡散してしまうので、流路６０−１は半恒久的に残る。図１６では基板６１に形成された流路６４から時間調整器６０の領域のアガロースゲル膜に流路６０−１を作成している過程を示す。
【００６１】
図１７は、時間調整器６０の領域のアガロースゲル膜に流路６０−１を完成させたときの一例を示す平面図である。流路６０−１は、両端で流路６４と連結している。図１７の流路６０−１の長さと、図４の流路６０−１の長さとを比較して明らかなように、図１７の流路６０−１の長さは短い。このように、アガロースゲル膜をレーザーで加熱して流路を作成すれば、時間調整器６０の流路６０−１の長さは、任意の長さに作成できるので、使用目的に合わせた最適なインキュベーション時間に調整できる。
【００６２】
図１８は、時間調整器６０の流路の長さ調整の他の例を示す平面図である。図１７から分かるように、流路の全長をアガロースゲル膜に使用者が作成するのは、流路が長くなるほど負担が大きくなる。図１８では、このため、時間調整器６０の領域にあらかじめ、いくつかの長さの異なる流路を基板１の成形時に形成しておき、使用者は、いずれの流路を使用するかの選択に応じたパスだけを形成すれば良いように工夫したものである。６０ａはアガロースゲル膜の領域であり、これに接するように、長さを異にする流路６０−３，６０−４，６０−５，６０−６および６０−７が設けられている。これらの流路は基板６１にあらかじめ形成されている。また、流路６４もアガロースゲル膜の領域６０ａまで延伸されている。したがって、使用者は、長い流路を使用したければ、アガロースゲル膜の領域６０ａに６０−１ａ，６０−１ｂのように、選択した流路と流路６４とをつなぐ流路のみを形成すればよい。
【００６３】
図１９は、時間調整器６０の流路の長さ調整のさらに他の例を示す平面図である。この例では、時間調整器６０の領域に流路６４を平行に延伸し、これの間を平行したパス６０-８,６０-９，６０−１０および６０−１１で結ぶとともに、各パスに止め弁６５−４，６５−５，６５−６および６５−６を設けたものである。したがって、使用者は、これらの止め弁の一つのみを残して他のすべてを閉とすれば、開のまま残された止め弁に対応する長さの流路長が得られる。
【００６４】
図２１は、１つの直線状の流路を持つチップ中の流路を流れる細胞を光学的に認識し、不要な細胞を集束光によって不活性化あるいは破壊する細胞精製装置の構成の一例を示す図である。細胞を流す流路が内部に構成されているチップに、チップ内の状態を観察するための透過光光源となる透過照明２１０１、チップに流れる液を供給する、溶液貯め２１０４、ポンプ２１０３が接合され、この供給路にサンプルインジュエクタ２１０２が配置されることで、サンプル細胞がチップ中で流れるように構成されている。透過照明２１０１によって照明されたチップ２１０５中の直線状の流路の一部に流れる細胞を観察する観察・判定領域２１０７の像が、対物レンズ２１０７を通過して、ミラー２１０８および、観察したい波長の光を選択するフィルター２１１０を通過して、高速カメラ２１１１の受光素子面に結像する。また、同様に、ミラー２１０８および、観察したい波長の光を選択するフィルター２１１０を通過して、フォトン・カウンター２１１２の光電素子面に結像する構成となっている。他方、細胞の蛍光像を観察するために、特定の冷機波長の蛍光を供給する蛍光光源２１１３がミラー２１０８を経由して光路上に配置されており、これによって観察・判定領域２１０６を通過する細胞の計構造を観察するための蛍光励起光を供給できる校正となっている。、また、さらにミラー２１０９を経由して、光路上に細胞破壊あるいは細胞死（アポトーシス）を誘導するレーザー集束光を照射するためのレーザー光源２１１４が配置されており、高速カメラ２１１１あるいはフォトン・カウンターから得られた細胞情報に基づいて、不要な細胞には集束レーザー光を照射することができる。このとき、レーザー光源としては、細胞破壊を行なう場合は、３５０ｎｍより短波長の紫外光、細胞死を起こす場合は、細胞を加熱することが可能な、水の吸収がある波長の赤外光、たとえば１４８０ｎｍの近赤外光を用いることが望ましい。また、レーザー光源２１１４の集束光については、装置の出光口にレンズを配置することで、チップ上での集束位置、集束光の直径を制御することができる。また、円形レンズに替わって、シリンダー型レンズを用いることで、チップ中の流路の流れに直行する方向に楕円型の形状に集束して、流路全体に効率的に集束光を照射することができる。また、本実施例では、本細胞精製手段を説明するために、細胞識別については、従来の１回の観察のみのものを用いたが、上記、別実施例において記載した、２回以上の観察の結果を比較して、その結果に基づいて細胞にレーザー光を照射することができる。
【００６５】
図２２は、１つの直線状の流路を持つチップ中の流路を流れる細胞を光学的に認識し、不要な細胞を集束光によって不活性化あるいは破壊する手順を説明する図である。（１）は判定領域に細胞が到達する前、（２）は細胞が判定領域に到達したとき、（３）は細胞の種類、状態の判別、（４ａ）、（４ｂ）は判断の結果、（５ａ）は必要な細胞と判断された場合の細胞の通過、（５ｂ）は不要な細胞と判断された場合の細胞の破壊を示す。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明の最も基本的な処理工程を表す図である。
【図２】図１に示した基本的な処理工程と比べ、細胞を刺激する工程が加わった処理工程を示す図である。
【図３】識別の対象となる細胞の同定を確実に行なうための工夫を盛り込んだ細胞変化を識別する工程を示す図である。
【図４】本発明のセルソーターチップと、このチップを利用したセルソーターの実施例１の概要を示す平面図である。
【図５】（Ａ），（Ｂ）に細胞添加口ハウジングの部分の断面を示す。
【図６】オイル添加口ハウジングの部分の断面を示す図である。
【図７】セルソーターチップの細胞検出領域、インデックス検出領域、細胞識別領域とそれぞれの領域の光学系の関係の概略を示す図である。
【図８】パソコンによる操作の処理に関するフローチャートの概要を示す図である。
【図９】流路に配置された細胞刺激領域に電極を設けた例を示す平面図である。
【図１０】光照射で細胞を刺激する場合の照射光学系と細胞刺激領域の構成を示す断面図である。
【図１１】図４の細胞検出領域の下流の流路に連結されているインデックス用のオイルが供給される流路に対応する部分を示す図である。
【図１２】実施例４のセルソーターチップと、このチップを利用したセルソーターの概要を示す平面図である。
【図１３】実施例４の動作を実現する処理フローを示す図である。
【図１４】（Ａ）は、実施例５のセルソーターチップの時間調整器の部分に着目した平面図、（Ｂ）は、図１４（Ａ）のＡ−Ａ位置で矢印方向に見た断面図、（Ｃ）は、図１４（Ａ）のＢ−Ｂ位置で矢印方向に見た断面図である。
【図１５】レーザー集束光照射装置を用いて、時間調整器の領域のアガロースゲル膜にレーザー集束光を照射する方法を説明する概念図である。
【図１６】（Ａ）は時間調整器の領域のアガロースゲル膜にレーザー照射して流路を作成している様子を模式的に示す平面図、（Ｂ）は断面図である。
【図１７】時間調整器の領域のアガロースゲル膜に流路を完成させたときの一例を示す平面図である。
【図１８】時間調整器の流路の長さ調整の他の例を示す平面図である。
【図１９】時間調整器６０の流路の長さ調整のさらに他の例を示す平面図である。
【図２０】（Ａ）、（Ｂ）は止め弁の構造を示す図であり、（Ａ）は開。（Ｂ）は閉の状態を示す図である。
【図２１】１つの直線状の流路を持つチップ中の流路を流れる細胞を光学的に認識し、不要な細胞を集束光によって不活性化あるいは破壊する細胞精製装置の構成の一例を示す図である。
【図２２】１つの直線状の流路を持つチップ中の流路を流れる細胞を光学的に認識し、不要な細胞を集束光によって不活性化あるいは破壊する手順を説明する図である。（１）は判定領域に細胞が到達する前、（２）は細胞が判定領域に到達したとき、（３）は細胞の種類、状態の判別、（４ａ）、（４ｂ）は判断の結果、（５ａ）は必要な細胞と判断された場合の細胞の通過、（５ｂ）は不要な細胞と判断された場合の細胞の破壊を示す。
【符号の説明】
【００６７】
１１，１３，５９−６…光源、１２−１，１２−２，１２−３…フォトダイオード、１４−１，１４−２…撮像装置、４１，４１−１，４１−２，４１−３…細胞、５６…細胞検出領域、５７−１，５７−２…インデックス検出領域、５８−１，５８−２…細胞識別領域、５９…細胞刺激領域、５９−２，５９−３…電極、５９−４，５９−５…リード部分、５９−７…集束光、６０…時間調整器、６０ａ…アガロースゲル膜の領域、６０-８,６０-９，６０−１０，６０−１…パス、６０−２，６０−３…アガロースゲルを注入するための開口、６１…セルソーターチップ基板、６２−１，６２−２．６２−３，６２−４…コネクター、６３−１…細胞添加口ハウジング、６３−２…オイル添加口ハウジング、６３−３…刺激物質溶液添加口ハウジング、６０−３，６０−４，６０−５，６０−６，６０−７，６０−１，６０−１ａ，６０−１ｂ，６４，６４−２,６４−３，６４−４，６４−５，６４−６，６４−７…流路、止め弁６５―１，６５−２,６５−４，６５−５，６５−６，６５−６…止め弁、６６−１，６６−２…外部コネクター、６７−１…シース液供給路、６７−２…オイル供給路、６７−３…刺激物質溶液供給路、６８…プラスチックシート、１００…レーザー光、１６３…シリンジポンプ、１６１…ニードル、１６４…駆動装置、１６５-１,１６５−２，１６５−３，１６５−４…ポンプ、１６５-５…リニアポンプ、１６７…オイル溜め、１６８…刺激物質溶液溜め、３００…パソコン、４０１…ステージ、４０２…ＸＹ駆動機構、４０３…レーザー光源、４０４…ダイクロイックミラー、４０５…レンズ、４０６…光源、４０７…ＣＣＤカメラ、４０８…制御用のコンピューター、２１０１…透過照明、２１０２…サンプルインジェクタ、２１０３…ポンプ、２１０４…溶液貯め、２１０５…チップ、２１０６…観察・判定領域、２１０７…対物レンズ、２１０８…ミラー、２１０９…ミラー、２１１０…フィルター、２１１１…高速カメラ、２１１２…フォトン・カウンター、２１１３…蛍光光源、２１１４…アポトーシス用レーザー、２２０２…細胞、２２０３…判定領域、２２０１…流路、２２０４…レーザー。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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