(57)【要約】【課題】  非特異吸着が少ない特異捕捉用磁性粒子およびその製造方法を提供する。【解決手段】  本発明の特異捕捉用磁性粒子は、粒径が０．１〜２０μｍの磁性粒子と、糖類と、を含み、前記磁性粒子および前記糖類が化学結合しており、かつ、目的物質を特異的に捕捉するためのプローブが前記糖類に化学結合している。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒径が０．１〜２０μｍの磁性粒子と、糖類と、を含み、
前記磁性粒子および前記糖類が化学結合しており、かつ、目的物質を特異的に捕捉するためのプローブが前記糖類に化学結合している、特異捕捉用磁性粒子。
【請求項２】
請求項１において、
前記糖類は多糖類である、特異捕捉用磁性粒子。
【請求項３】
請求項１または２において、
前記糖類はカルボキシメチル化されている、特異捕捉用磁性粒子。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれかにおいて、
前記磁性粒子および前記糖類の前記化学結合は、アミド結合およびエステル結合の少なくとも一方を含む結合基による、特異捕捉用磁性粒子。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれかにおいて、
前記磁性粒子は、核粒子と、前記核粒子の表面に形成された磁性体層とを含む母粒子の前記磁性体層上に、ポリマー層を重合により形成することにより得られ、
前記磁性体層は、Ｆｅ２Ｏ３およびＦｅ３Ｏ４の少なくとも一方を含む、特異捕捉用磁性粒子。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれかにおいて、
前記プローブは、タンパク質、ペプチド、核酸、糖鎖化合物、および化学物質から選ばれる少なくとも１種である、特異捕捉用磁性粒子。
【請求項７】
粒径が０．１〜２０μｍの磁性粒子と糖類とを化学結合させる工程と、
目的物質を特異的に捕捉するためのプローブを前記糖類に化学結合させる工程と、
を含む、特異捕捉用磁性粒子の製造方法。
【請求項８】
請求項７において、
前記磁性粒子と前記糖類とを化学結合させる際、
前記磁性粒子は、第１の官能基を有し、
前記糖類は、第２の官能基を有し、
前記第１の官能基と前記第２の官能基とを反応させることにより、前記磁性粒子と前記糖類とを結合させる、特異捕捉用磁性粒子の製造方法。
【請求項９】
請求項７または８において、
前記第１の官能基は、カルボキシル基、エポキシ基、アミノ基、およびトシル基から選ばれる少なくとも１種以上の官能基である、特異捕捉用磁性粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁性粒子および糖類を含む特異捕捉用磁性粒子およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、創薬などの分野で、分子間相互作用を利用して、ある特定の分子に特異的な相互作用を有する分子を探索する試みが盛んに行われている。具体的には、相互作用を有する片方の分子を担体に固定し、特異的相互作用を利用してもう片方の分子(ターゲット)を捕捉、精製することが広く行われている。例えば、アフィニティー樹脂を用いた免疫抑制剤ＦＫ５０６の細胞内結合タンパク質ＦＫＢＰ１２の発見などが知られている。このようなアフィニティー樹脂としては、アガロースなどの多孔質ゲルが一般的に用いられている。しかしながら、多孔質ゲルを用いる場合、ターゲット分子以外の分子がアフィニティー樹脂に吸着する、いわゆる、非特異吸着と呼ばれる現象が生じ、ターゲット分子の分離、精製が困難であるという問題が生じる。
【０００３】
かかる非特異吸着の解決策として、表面がグリシジルメタクリレートで覆われたスチレン−グリシジルメタクリレート重合体にスペーサを介してプローブを結合したミクロスフィア（特許文献―１，２）、粒子表面に親水性のスペーサを導入した粒子（特許文献―３，４）などが提案されている。しかしながら、これらはいずれも非特異吸着の低減効果が充分ではなく、さらに非特異吸着の少ない担体用粒子が求められている。
【特許文献１】特許第３０８６４２７号公報
【特許文献２】特許第３２９２７２１号公報
【特許文献３】ＷＯ  ２００４／０２５２９７  Ａ１号公報
【特許文献４】ＷＯ  ２００４／０４０３０５  Ａ１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、タンパク質、ペプチド、核酸、細胞などの生体関連物質の非特異吸着が極めて少ない特異捕捉用磁性粒子およびその製造方法を提供することである。
【０００５】
本発明の第１の態様の特異捕捉用磁性粒子は、
粒径が０．１〜２０μｍの磁性粒子と、糖類と、を含み、
前記磁性粒子および前記糖類が化学結合しており、かつ、目的物質を特異的に捕捉するためのプローブが前記糖類に化学結合している。
【０００６】
ここで、上記本発明の特異捕捉用磁性粒子において、前記糖類は多糖類であることができる。
【０００７】
ここで、上記本発明の特異捕捉用磁性粒子において、前記糖類はカルボキシメチル化されていることができる。
【０００８】
ここで、上記本発明の特異捕捉用磁性粒子において、前記磁性粒子および前記糖類の前記化学結合は、アミド結合およびエステル結合の少なくとも一方を含む結合基によることができる。
【０００９】
ここで、上記本発明の特異捕捉用磁性粒子において、前記磁性粒子は、核粒子と、前記核粒子の表面に形成された磁性体層とを含む母粒子の前記磁性体層上に、ポリマー層を重合により形成することにより得られ、前記磁性体層は、Ｆｅ２Ｏ３およびＦｅ３Ｏ４の少なくとも一方を含むことができる。
【００１０】
ここで、上記本発明の特異捕捉用磁性粒子において、前記プローブは、タンパク質、ペプチド、核酸、糖鎖化合物、および化学物質から選ばれる少なくとも１種であることができる。
【００１１】
本発明の第２の態様の特異捕捉用磁性粒子の製造方法は、
粒径が０．１〜２０μｍの磁性粒子と糖類とを化学結合させる工程と、
目的物質を特異的に捕捉するためのプローブを前記糖類に化学結合させる工程と、
を含む。
【００１２】
ここで、上記本発明の特異捕捉用磁性粒子の製造方法において、前記磁性粒子と前記糖類とを化学結合させる際、
前記磁性粒子は、第１の官能基を有し、
前記糖類は、第２の官能基を有し、
前記第１の官能基と前記第２の官能基とを反応させることにより、前記磁性粒子と前記糖類とを結合させることができる。
【００１３】
ここで、上記本発明の特異捕捉用磁性粒子の製造方法において、前記第１の官能基は、カルボキシル基、エポキシ基、アミノ基、およびトシル基から選ばれる少なくとも１種以上の官能基であることができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の特異捕捉用磁性粒子によれば、粒径が０．１〜２０μｍの磁性粒子と、糖類と、を含み、前記磁性粒子および前記糖類が化学結合しており、かつ、目的物質を特異的に捕捉するためのプローブが前記糖類に化学結合していることにより、非特異吸着が少ないという特徴を有する。これにより、目的物質の分離および精製を容易にかつ高精度にて行なうことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の特異捕捉用磁性粒子およびその製造方法について、詳細に説明する。
【００１６】
１．特異捕捉用磁性粒子
本発明の特異捕捉用磁性粒子は、磁性粒子と、糖類と、を含む。ここで、糖類は、磁性粒子の表面を被覆していてもよい。
【００１７】
また、本発明の特異捕捉用磁性粒子においては、磁性粒子および糖類が化学結合している。ここで、特に限定されないが、磁性粒子と糖類との化学結合は、アミド結合およびエステル結合の少なくとも一方を含む結合基によるものが好ましい。
【００１８】
さらに、本発明の特異捕捉用磁性粒子においては、目的物質を特異的に捕捉するためのプローブが前記糖類に化学結合している。ここで、特に限定されないが、糖類とプローブとは、例えば、−Ｏ−結合、−Ｓ−結合、−ＳＯ−結合、−ＳＯ２−結合、−ＣＯ−結合、−ＣＯ２−結合、−ＮＲ１Ｒ２−結合（ここで、Ｒ１，Ｒ２は独立して、アルキル基またはＨ）、−ＮＨＣＯ−結合、−ＰＯ２−結合などの化学結合を介して結合していることができる。例えば、糖類に含まれる官能基とプローブに含まれる官能基とを公知の方法により化学反応させることにより、糖類とプローブとを化学結合させることができる。
【００１９】
ここで、糖類に含まれる官能基およびプローブに含まれる官能基は特に限定されないが、例えば、水酸基、アシル基、メルカプト基、アミノ基、アミノアシル基、カルボニル基、ホルミル基、カルボキシル基、アミド基、スルホン酸基、リン酸基、エポキシ基、トシル基、アジド基、ビニル基、アリル基などの基が挙げられる。
【００２０】
また、本発明において、「目的物質」とは、本発明の特異捕捉用磁性粒子を用いた捕捉の対象となる物質をいう。目的物質としては、例えば生体関連物質が挙げられる。本発明において「生体関連物質」とは、生体に関わるすべての物質をいう。生体関連物質としては、例えば、生体に含まれる物質、生体に含まれる物質から誘導された物質、生体内で利用可能な物質が挙げられる。
【００２１】
より具体的には、生体関連物質は特に限定されないが、例えば、タンパク質（例えば、酵素、抗体、受容体等）、ペプチド（例えばグルタチオン、ＲＧＤペプチド等）、核酸（例えば、ＤＮＡやＲＮＡ等）、糖質、脂質、およびその他の細胞または物質（例えば、血小板、赤血球、白血球等の各種血球細胞を含む各種血液由来物質、各種浮遊細胞等）が挙げられる。
【００２２】
例えば、プローブがタンパク質である場合、タンパク質中の官能基（例えば、アミノ基、カルボキシル基）と、糖類中の官能基（例えばカルボニル基、水酸基、アミノ基）とを反応させることにより、プローブと糖類とを化学結合させることができる。この場合、プローブと糖類とをアミド結合またはエステル結合を介して結合させることができる。
【００２３】
また、例えば、プローブが核酸である場合、核酸中の官能基（例えば、リン酸基）と、糖類中の官能基（例えば水酸基）とを反応させることにより、プローブと糖類とを化学結合させることができる。この場合、プローブと糖類とをホスホジエステル結合を介して結合させることができる。
【００２４】
本発明の特異捕捉用粒子で使用可能なプローブは、特に限定されないが、例えば、タンパク質（例えば、抗体、抗原、酵素、受容体、ホルモンなど）、ペプチド、核酸（例えば、ＤＮＡ，ＲＮＡなど）、糖鎖化合物、および化学物質（例えば、薬物候補物質）であることができる。
【００２５】
例えば、プローブが抗体（または抗原）である場合、目的物質は前記抗体（または前記抗原）と特異的に結合する抗原（または抗体）であることができる。
【００２６】
また、例えば、プローブが核酸である場合、目的物質は前記核酸と特異的に結合する核酸であることができる。あるいは、例えば、プローブが酵素、受容体、またはホルモンの場合、目的物質は前記酵素、前記受容体、または前記ホルモンと特異的に結合する化合物であることができる。
【００２７】
本発明の特異捕捉用磁性粒子はそのままで使用することも可能であるが、化合物との反応を効率的に行なうために、分散媒に分散させた分散液として使用することも可能である。かかる分散媒としては、水、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、イソブチルアルコール、ｓｅｃ-ブチルアルコール、ｔ−ブチルアルコールなどのアルコール類、エチレングリコール、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノプロピルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテルアセテート、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテル、ジエチレングリコールジエチルエーテルなどのエチレングリコール誘導体、プロピレングリコール、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコールモノプロピルエーテル、プロピレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテートなどのプロピレングリコール誘導体、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、メチルアミルケトン、ジイソブチルケトン、シクロヘキサノンなどのケトン類、酢酸エチル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、乳酸エチル、γ―ブチルラクトンなどのエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどのアミド類、ジメチルスルホキシド、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素などが挙げられる。
【００２８】
本発明の特異捕捉用磁性粒子の粒径は、０．１〜２０μｍであり、好ましくは０．３〜１７μｍであり、より好ましくは０．５〜１０μｍである。ここで、粒径が０．１μｍ未満の場合、磁気分離などを用いた分離に長時間を要し、水などの洗浄溶媒と粒子との分離が不十分になるため、目的物質以外の物質の除去が不十分になり、充分な精製ができない場合がある。一方、粒径が２０μｍを超えると、表面積が小さくなり、目的物質の捕捉量が少ない場合がある。
【００２９】
次に、本発明の特異捕捉用磁性粒子の構成要素について詳細に説明する。
【００３０】
１．１．磁性粒子
本発明で使用する磁性粒子の平均粒子径は好ましくは０．１〜２０μｍ、より好ましくは０．３〜１７μｍ、さらに好ましくは０．５〜１０μｍである。磁性粒子の粒径が０．１μｍ未満であると、磁力による分離精製に長時間を要することがあり、２０μｍを超えると表面積が小さくなり、目的物質の捕捉量が少ない場合がある。
【００３１】
上述したように、本発明の特異捕捉用磁性粒子を溶媒に分散させる場合、分散媒に磁性粒子が溶解したり、あるいは溶媒によって磁性粒子が膨潤したりすると、目的物質の非特異吸着が増加する。このため、磁性粒子は、分散媒に溶解しないことが望ましい。
【００３２】
本発明で使用する磁性粒子の内部組成は均質であってもよいが、上記の好ましい粒径範囲にある均質な磁性体粒子は、常磁性である物質が多く、磁力による分離精製を繰り返すと媒質への再分散が困難になる場合がある。このため、本発明で使用する磁性粒子は、残留磁化の少ない磁性体微粒子を含む、不均質な内部組成を有することがより好ましい。このような不均質な内部組成を有する磁性粒子の内部構造としては、（ｉ）磁性体微粒子をポリマーなどの非磁性体の連続相中に分散した構造、（ii）磁性体微粒子の２次凝集体をコアとして、ポリマー層などからなる非磁性体をシェルとする構造、（iii）ポリマーなどの非磁性体（非磁性核粒子）をコアとして、磁性体層（磁性体微粒子の２次凝集体）をシェルとする構造などが挙げられる。ここで、コアとして使用できるポリマーとしては、例えば、磁性粒子を構成するポリマーとして列記された後述のポリマーであってもよい。また、（ｉ）〜（iii）において、磁性体微粒子としては、Ｆｅ２Ｏ３およびＦｅ３Ｏ４の少なくとも一方であることが好ましい。
【００３３】
上述の（iii）の場合、すなわち、ポリマーなどの非磁性体（非磁性核粒子）をコアとして、磁性体層（磁性体微粒子の２次凝集体）をシェルとする内部構造の場合、磁性体層上にポリマー層がさらに形成されていることが好ましい。また、この場合、ポリマー層は、核粒子（コア）と、前記核粒子の表面に形成された磁性体層（シェル）とを含む母粒子の表面に、重合により前記磁性体層上に形成することができる。ここで、磁性体層（シェル）は、Ｆｅ２Ｏ３およびＦｅ３Ｏ４の少なくとも一方を含む磁性体微粒子を含むことができる。なお、この場合、ポリマー層としては、例えば、磁性粒子を構成するポリマーとして列記された後述のポリマーであってもよい。
【００３４】
また、上述の（iii）の場合、磁性粒子は、例えば、非磁性核粒子と磁性体微粒子とを混合し、非磁性核粒子の表面に磁性体微粒子を物理的に吸着させることにより、磁性体層を製造することができる。なお、本発明において、「物理的吸着」とは、化学反応を伴わない吸着を意味する。「物理的吸着」の原理としては、例えば、疎水／疎水吸着、溶融結合または吸着、融着結合または吸着、水素結合、ファンデルワールス結合などが挙げられる。
【００３５】
さらに、上述の（iii）の場合、磁性粒子は、例えば、上記ビニル系モノマーの懸濁重合、あるいはポリマーバルクの粉砕によって得ることができる。例えば、磁性粒子は、特公昭５７−２４３６９号公報記載のシード粒子を用いる二段膨潤重合法、ジャーナル・オブ・ポリマーサイエンス・ポリマーレター・エディション，９３７頁，第２１巻，１９６３年（J. Polym. Sci., Polymer Letter Ed. ２１，９３７（１９６３））記載の重合方法、特開昭６１−２１５６０２号公報、特開昭６１−２１５６０３号公報、および特開昭６１−２１５６０４号公報記載の方法によって作製することができる。
【００３６】
また、上述の（iii）の場合、磁性粒子は、疎水／疎水吸着を利用する方法によって作製することができる。例えば、非磁性核粒子の表面および磁性体微粒子の表面が疎水性のものあるいは疎水化処理されたものを選択し、これらの非磁性核粒子および磁性体微粒子をドライブレンドするか、あるいは、非磁性核粒子および磁性体微粒子の双方を侵すことなく良分散性の溶剤（例えばトルエン、ヘキサン）中で充分分散させた後、混合条件下で溶剤を揮発させる方法が挙げられる。
【００３７】
あるいは、上述の（iii）の場合、物理的に強い力を外部から加えて、非磁性核粒子の表面に磁性体微粒子を吸着させる方法により、磁性粒子を作製することもできる。物理的に強い力を負荷する方法としては、例えば、乳鉢、自動乳鉢、ボールミル、ブレード加圧式粉体圧縮法、メカノフュージョン法のようなメカノケミカル効果を利用するもの、あるいはジェットミル、ハイブリダイザーなど高速気流中衝撃法を利用するものが挙げられる。効率よくかつ強固に複合化を実施するには、物理的吸着力が強いことが望ましい。その方法としては、攪拌翼付き容器中で攪拌翼の周速度が好ましくは１５ｍ／秒以上、より好ましくは３０ｍ／秒以上、さらに好ましくは４０〜１５０ｍ／秒で実施することが挙げられる。撹拌翼の周速度が１５ｍ／秒より低いと、非磁性核粒子の表面に磁性体微粒子を吸着させるのに十分なエネルギーを得ることができないことがある。なお、撹拌翼の周速度の上限については、特に制限はないが、使用する装置、エネルギー効率などの点から自ずと決定される。
【００３８】
本発明で使用する磁性粒子を構成するポリマーとしては、特に、ビニル系ポリマーが好ましい。ビニル系ポリマーを構成するビニル系モノマーとしては、スチレン、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレン、ジビニルベンゼンなどの芳香族ビニル単量体、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニルなどのビニルエステル類、アクリロニトリルなどの不飽和ニトリル、メチルアクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、ブチルアクリレート、ブチルメタクリレート、２−エチルヘキシルアクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ラウリルアクリレート、ラウリルメタクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレートなどのエチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステル、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレートなどの多官能性（メタ）アクリレート、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレートなどの官能基を有する（メタ）アクリレートなどを例示することができる。このビニル系ポリマーは単独重合体であっても、あるいは上記ビニル系モノマーから選ばれた２種以上のモノマーからなる共重合体であってもよい。また、上記ビニル系モノマーとブタジエン、イソプレンなどの共役ジオレフィン、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−メチロールメタクリルアミド、ジアリルフタレート、アリルアクリレート、アリルメタクリレートなどの共重合可能なモノマーとの共重合体も使用することができる。
【００３９】
１．２．糖類
本発明の特異捕捉用磁性粒子に用いられる糖類としては、例えば、フルクトース，アラビノース，キシロース，リボース，デオキシリボースなどのフラノース類、グルコ−ス，マンノース，ガラクトースなどのピラノース類、セプタノース類などの単糖類、トレハロース，ラクトース，コージオース，ニゲロース，マルトース，イソマルトース，ソホロース，ラミナリオース，セロビオース，ゲンチビオースなどの二糖類、デンプン，アミロース，アミロペクチン，デキストリン，グリコーゲン，シクロデキストリン，セルロース，アガロース，アルギン酸，イヌリン，グルコマンナン，キチン，キトサン，ヒアルロン酸などの多糖類を挙げることができる。磁性粒子と糖類とを化学結合させて、磁性粒子の表面を覆うためには、被覆効率の点で高分子量の多糖類が好ましい。なお、糖類は、例えばカルボキシメチルセルロースやカルボキシメチルデキストランのように、上述した糖類の分子内の官能基（例えば、水酸基、アミノ基、カルボキシル基など）の少なくとも一部が変換されたものであってもよく、その変換は必要に応じて多段階施されたものであってもよい。より好ましくは、糖類として、例えばカルボキシメチルセルロースやカルボキシメチルデキストランのように、カルボキシメチル化されているものを用いる。
【００４０】
２．特異捕捉用磁性粒子の製造方法
本発明の特異捕捉用磁性粒子の製造方法は、粒径が０．１〜２０μｍの磁性粒子と、糖類とを化学結合させる工程と、目的物質を特異的に捕捉するためのプローブと糖類とを化学結合させる工程と、を含む。ここで、磁性粒子と、糖類とを化学結合させることにより、磁性粒子の表面を糖類で被覆することができる。
【００４１】
本発明において、磁性粒子と糖類とを化学結合させるための手法としては特に制限がなく、公知の化学反応を用いることができる。例えば、本発明の特異捕捉用磁性粒子を作製する際に使用する磁性粒子は、その表面に複数の官能基（第１の官能基）を有していてもよい。ここで第１の官能基とは、磁性粒子の粒子形状形成時に導入された官能基でもよいし、あるいはその官能基を粒子形状形成後に変換することによって得られた官能基でもよい。その際、官能基の変換は必要に応じて複数回行なってもよい。限定されないが、例えば磁性粒子の粒子形状を形成した際に導入された官能基がエポキシ基である場合、そのエポキシ基に大過剰のアンモニアあるいは適当なジアミン化合物を作用させて生じるアミノ基を第１の官能基とすることができるし、また例えば、磁性粒子の粒子形状を形成した際に導入された官能基が水酸基である場合、その水酸基をトシル基に変換した後、そのトシル基に大過剰の適当なジアミン化合物を作用させて生じるアミノ基を第１の官能基とすることができる。例えば、後述する実施例１〜２でそれぞれ得られる磁性粒子Ａｍ−１〜２においては、第１の官能基がアミノ基であることができる。
【００４２】
また、本発明の特異捕捉用磁性粒子を作製する際に使用する糖類は、その１分子中に複数個の官能基（第２の官能基）を有していてもよく、その官能基は糖類の官能基が変換されたものであってもよい。
【００４３】
第１の官能基および／または第２の官能基として使用可能な官能基としては、例えば、カルボキシル基、水酸基、エポキシ基、アミノ基、メルカプト基、ビニル基、アリル基、アクリル基、メタクリル基、トシル基、アジド基などが挙げられる。この場合、第１の官能基および第２の官能基は互いに対して反応性を有する。限定されないが、例えば、第１の官能基がエポキシ基である場合、第２の官能基はアミノ基であることができるし、また例えば、第１の官能基がアミノ基である場合、第２の官能基はカルボキシル基であることができる。
【００４４】
第１の官能基と第２の官能基とが反応することにより、磁性粒子と糖類とを化学的に結合させることができる。これにより、本発明の特異捕捉用磁性粒子を得ることができる。
【００４５】
また、本発明において、磁性粒子と糖類とを化学結合させるための手法としては特に制限がなく、公知の化学反応を用いることができる。例えば、上述したように、プローブに含まれる官能基と糖類に含まれる官能基とを化学反応させることにより、プローブと糖類とを化学結合させることができる。プローブに含まれる官能基および糖類に含まれる官能基の具体例は、上述した通りである。
【００４６】
本発明の特異捕捉用磁性粒子は、上述した工程によって作製された後、必要に応じて、ｐＨ調整を行ない、次いで、透析・限外ろ過・遠心分離等の精製処理によって表面を洗浄してから、担体粒子として使用することができる。
【００４７】
３．用途
本発明の特異捕捉用磁性粒子は、創薬・プロテオミクス分野および診断薬分野のプローブ結合用粒子として利用できる。
【００４８】
より詳しくは、磁性粒子の表面を被覆する糖類の官能基に、解析対象の化学物質（被解析化学物質）をプローブとして化学結合させることにより、磁性粒子の表面にプローブを固定化し、プローブと目的物質（タンパク質等の生体関連物質）との分子間相互作用を用いて当該相互作用を解析および／または測定することによって、プローブと特異的な相互作用を有する目的物質を選別し、精製することが可能である。
【００４９】
また、本発明の特異捕捉用磁性粒子は、タンパク質（例えば、抗体，抗原，酵素等）、核酸（例えば、ＤＮＡ，ＲＮＡなど）、糖鎖化合物、および化学物質（例えば、薬物候補物質）のうち少なくとも１種をプローブとして用い、粒子表面において、前記プローブと目的物質（生体関連物質）とを結合させることにより、目的物質（生体関連物質）を捕捉するための粒子として利用できる。
【００５０】
なお、本発明の特異捕捉用磁性粒子の用途は、上述した創薬・プロテオミクス分野および診断薬分野のプローブ結合用粒子に限定されるわけではなく、例えば、生化学分野、塗料、紙、電子写真、化粧品、医薬品、農薬、食品、触媒など広い分野で利用できる。
【００５１】
４．実施例
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例によって制限されるものではない。なお、本実施例において、「％」および「部」は重量基準である。
【００５２】
４．１．物性評価方法
４．１．１．粒径
直径１μｍ以上の粒子については、レーザ回折式粒度分布測定装置(（株）島津製作所製)ＳＡＬＤ−２００Ｖにより、直径１μｍ未満の粒子についてはレーザ散乱回折法粒度分布測定装置（型名：ＬＳ  １３  ３２０，（株）ベックマン・コールター製）により粒径を測定した。
【００５３】
４．１．２．赤外吸収スペクトル
フーリエ変換赤外分光光度計（日本電子株式会社製ＪＩＲ−５５００）を用い、ＫＢｒ法により赤外吸収スペクトルを測定した。
【００５４】
４．２．合成例
４．２．１．合成例１（磁性粒子Ａ−１の合成）
特開平７−２３８１０５号公報記載の重合方法を参考に、スチレン／ジビニルベンゼン＝９６／４共重合体粒子（平均粒子径１．５μｍ）を作製し、重合後遠心分離により粒子のみ取り出したものをさらに水洗し、乾燥、粉砕した。これをコア粒子（ａ−１）とする（コアの作製）。
【００５５】
次に、油性磁性流体（商品名：「ＥＸＰシリーズ」，（株）フェローテック製）にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、疎水化処理された表面を有するフェライト系の磁性体微粒子（平均一次粒子径：０．０２μｍ）を得た。
【００５６】
次いで、コア粒子（ａ−１）１５ｇおよび上記疎水化された磁性体微粒子１５ｇをミキサーでよく混合し、この混合物をハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−０型（奈良機械製作所（株）製）を使用して、羽根（撹拌翼）の周速度１００ｍ／秒（１６２００ｒｐｍ）で５分間処理し、平均数粒子径が２．０μｍの磁性体微粒子（Ｍ−１）からなる磁性体層を表面に有する粒子（１）を得た（磁性体層の作製）。
【００５７】
次に、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．２５重量％およびノニオン性乳化剤（商品名：「エマルゲン１５０」，花王（株）製）０．２５重量％を含む水溶液３７５ｇを、５００ｍＬセパラブルフラスコに投入し、次いで、前記磁性体層を表面に有する粒子（１）１５ｇを投入し、ホモジナイザーで分散した後、６０℃に加熱した。ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．２５重量％およびノニオン性乳化剤（商品名：「エマルゲン１５０」，花王（株）製）０．２５重量％を含む水溶液１５０ｇに、ＭＭＡ(メタクリル酸メチル)２７ｇ、ＴＭＰ(トリメチロールプロパントリメタクリレート)３ｇ、およびジ（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド（日本油脂社製；パーロイル３５５）０．６ｇを入れて分散させたプレエマルジョンを、６０℃にコントロールした前記５００ｍＬセパラブルフラスコに１時間３０分かけて滴下した(以上、ポリマー層形成のための１段目の重合)。
【００５８】
滴下終了後、６０℃に保持し１時間攪拌した後、次にドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．２５重量％およびノニオン性乳化剤（商品名：「エマルゲン１５０」，花王（株）製）０．２５重量％を含む水溶液７５ｇに、ＭＭＡ７．５ｇ、ＧＭＡ（グリシジルメタクリレート）６ｇ、ＴＭＰ１．５ｇ、およびジ（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド（日本油脂社製；パーロイル３５５）０．３ｇを入れて分散させたプレエマルジョンを、６０℃にコントロールした上記５００ｍＬセパラブルフラスコに１時間３０分かけて滴下した（以上、ポリマー層形成のための２段目の重合）。その後７５℃に昇温した後さらに２時間重合を続けて、反応を完了させた。得られたポリマー被覆磁性粒子の水分散液を磁気精製および重力沈降精製してから、固形分濃度１％の磁性粒子Ａ−１の水分散液を得た。この磁性粒子Ａ−１の平均数粒子径は２．９μｍであった。
【００５９】
４．２．２．合成例２（磁性粒子Ａ−２の合成）
ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．５重量％を含む水溶液２２５ｇを、５００ｍＬセパラブルフラスコに投入し、次いで、前記磁性体層を有する粒子（１）９ｇを投入し、ホモジナイザーで分散した後、６０℃に加熱した。ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．５重量％を含む水溶液９０ｇに、ＭＭＡ１６．２ｇ、ＴＭＰ１．８ｇ、およびジ（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド（日本油脂社製；パーロイル３５５）０．３６ｇを入れて分散させたプレエマルジョンを、６０℃にコントロールした前記５００ｍＬセパラブルフラスコに１時間３０分かけて滴下した(以上、ポリマー層形成のための１段目の重合)。
【００６０】
滴下終了後、６０℃に保持して１時間攪拌し、次にドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．５重量％を含む水溶液４５ｇに、ＧＭＡ８．１ｇ、ＴＭＰ０．９ｇ、およびジ（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド（日本油脂社製；パーロイル３５５）０．１８ｇを入れて分散させたプレエマルジョンを、６０℃にコントロールした上記５００ｍＬセパラブルフラスコに１時間３０分かけて滴下した(以上、ポリマー層形成のための２段目の重合)。その後７５℃に昇温した後さらに２時間重合を続けて、反応を完了させた。得られたポリマー被覆磁性粒子の水分散液を磁気精製および重力沈降精製してから、固形分濃度１％の磁性粒子Ａ−２の水分散液を得た。この磁性粒子Ａ−２の平均数粒子径は２．６μｍであった。
【００６１】
４．２．３．合成例３（糖類ＣＭＣ−１の合成）
日本製紙ケミカル株式会社製カルボキシメチルセルロースナトリウム塩ＡＰＰ−８４（平均分子量１７，０００でグルコース単位１個当たり平均０．７個のカルボキシル基を含有）の水溶液に液のｐＨが２以下になるまで希塩酸を加え、この液を透析した後、凍結乾燥することによりカルボキシメチルセルロースＣＭＣ−１を得た。
【００６２】
４．２．４．合成例４（糖類ＣＭＤ−１の合成）
ファルマシア  ＡＢ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＡＢ）社製デキストランＴ５００（平均分子量５００，０００）の１０ｗｔ％水溶液２．５ｇに水酸化ナトリウム０．７２ｇおよびブロモ酢酸１．０４ｇを加え、均一になるまで数分間攪拌した。次に、この溶液を４０℃に６０時間保持した後、氷冷し、次いで、液のｐＨが２以下になるまで希塩酸を加え、この液を透析した後、凍結乾燥することにより、カルボキシメチルデキストランＣＭＤ−１を得た。滴定により、ＣＭＤ−１に含まれるカルボン酸を定量したところ、ＣＭＤ−１は、グルコース単位１個当たり平均０．４個のカルボン酸基を含有していた。
【００６３】
４．３．実施例１
４．３．１．担体ポリマー粒子の作製
合成例１で得られた磁性粒子Ａ−１の水分散液から遠心分離により単離した粒子をアセトンに分散させ、磁気分離して洗浄する操作を５回繰り返した後、再びアセトンに分散させ、遠心分離により上清を除去した後、乾燥させた。次に、この粒子０．５０ｇを１００ｍｌフラスコに入れ、エチレンジアミン２５ｇを加えた後、間接超音波を２０分間照射して分散させてから、窒素雰囲気下で５０℃にて６時間加熱攪拌し、その後、遠心分離により前記粒子を単離した。次いで、この粒子をメタノールで５回洗浄した後、乾燥させることにより、０．４９ｇのアミノ化粒子Ａｍ−１を茶色粉末として得た。さらに、エチレンジアミン処理前の赤外吸収スペクトル（磁性粒子Ａ−１の赤外吸収スペクトル）と比較して、このアミノ化粒子Ａｍ−１（エチレンジアミン処理後）の赤外吸収スペクトルにおいては、１級アミンに典型的なピークが３３００ｃｍ−１付近および３４００ｃｍ−１付近に新たに観測された。以上の結果から、アミノ化粒子Ａｍ−１は、磁性粒子Ａ−１にアミノ基が導入されて得られたものであることが確認された。
【００６４】
次に、上記合成例３で得たＣＭＣ−１の１％水溶液３．７５ｇに上記アミノ化粒子Ａｍ−１を１５０ｍｇ加え、氷冷しながら間接超音波を２０分間照射して分散させた。次いで、この分散液に塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを２５．０５ｍｇ加え氷冷下で２０時間攪拌した。続いて、磁気分離により粒子を単離し、純水に分散させ磁気分離して洗浄する操作を５回繰り返した後、再び純水に分散させ遠心分離により上清を除去した後、乾燥させることにより、１４７ｍｇの担体ポリマー粒子Ｐ−１を得た。
【００６５】
４．３．２．プローブ結合粒子の作製
実施例１で得られた担体ポリマー粒子を、濃度が１ｗｔ％になるように純水に希釈分散して、水分散液を調製した。次に、この水分散液５００μｌをエッペンドルフチューブに取り、磁気スタンド（Ｍａｇｉｃａｌ  Ｔｒａｐｐｅｒ，東洋紡（株）製）にて磁気分離し、上澄みを除去した。５０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ６（Ｂｕｆｆｅｒ−１）にて３回洗浄後、５００μｌのＢｕｆｆｅｒ−１に分散し、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）０．8ｍｇおよび1−エチルー３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）０．８８ｍｇを加え撹拌した後、目的物質（α−フェトプロテイン，以下「ＡＦＰ」ともいう）を特異的に捕捉するためのプローブとなるタンパク質（抗α−フェトプロテイン抗体）を０．０５ｍｇを添加し、室温下２時間撹拌を行った。反応終了後、磁気分離して上澄みを除去した。次いで、１％エタノールアミンを含むＰＢＳ（−）緩衝液５００μｌを加え、室温で２時間撹拌を行った。さらに、ＰＢＳ（−）緩衝液にて５回洗浄した後、ＰＢＳ（−）緩衝液５００μｌで粒子を分散させることにより、プローブ（抗体）結合粒子の分散液を得た。
【００６６】
４．３．３．特異捕捉性評価
本実施例で得られたプローブ結合粒子について、特異捕捉性の評価を下記に示す方法にしたがって行なった。
【００６７】
４．３．３Ａ．目的物質（タンパク質）吸着反応工程
上記プローブ結合粒子の分散液１００μＬを別のチューブに取り磁気分離して上澄みを除去した。これに、目的物質であるタンパク質（ヒトα−フェトプロテイン（ＡＦＰ））２００ｎｇ／ｍＬを含むヒト血清溶液５００μｌを注ぎ、さらにタッチミキサーで振動を与えて前記粒子を分散させた後、常温にて２時間回転倒混和させた。
【００６８】
４．３．３Ｂ．洗浄工程
引き続きこのチューブを磁気分離した後、上澄みを除去し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ１ｍｌを注いでタッチミキサーで前記粒子を分散させた。同様の処理をさらに２回繰り返した後、内容物を別の未使用のエッペンドルフチューブに移し、磁気分離を行なった後、上澄みを除去した。
【００６９】
４．３．３Ｃ．剥離工程
引き続きこのチューブに０．５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）水溶液５０μｌを注いでタッチミキサーでごく軽く振動を与えて前記粒子を分散させた。１０分間放置した後、磁気分離を行ない、上澄みの２０μｌを採取した。
【００７０】
４．３．３Ｅ．電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
バイオラッド社製プレミックスサンプルバッファー中での濃度が２ｗｔ％になるように２−メルカプトエタノールを溶解させ（以下、これを「サンプルバッファー」とする）、このうち２０μｌをエッペンドルフチューブに採取した。これに上記剥離工程で採取した上澄み２０μｌを混ぜ、チューブヒーターにて１００℃で５分間加熱した。
【００７１】
一方、コントロールとして、１ｍｇ／ｍＬのＡＦＰ／ＰＢＳ（−）溶液をＳＤＳ溶液で１００倍、２００倍、５００倍に希釈したものを２０μｌ取り、サンプルバッファー２０μｌと混ぜ、ブロックヒーターにて１００℃で５分間加熱した。これらを参照用希釈ＡＦＰと呼ぶ。
【００７２】
バイオラッド社製縦型電気泳動システム「ミニプロティアン３」、バイオラッド社製プレキャストポリアクリルアミドゲル「レディーゲルＪ（１５％）」、およびバイオラッド社製プレミックス泳動バッファーを用いて、ゲル１レーンあたり２０μｌをアプライし、電気泳動を行った。染色はバイオラッド社製シルバーステインプラスキットを用いて標準的な手法で行った。染色されたゲルはバイオラッド社製デンシトメーター「ＧＳ−７００」でスキャンして画像化し、解析ソフトウェア「Ｍｕｌｔｉ−Ａｎａｌｙｓｔ」を用いて、ゲルにおけるＡＦＰのバンドの濃度と面積との積を定量した。
【００７３】
参照用希釈ＡＦＰにおいては、ゲル１レーンあたりに流れるＡＦＰの重量が既知であるため、参照用希釈ＡＦＰを用いた場合におけるバンド濃度と面積との積から検量線を作成し、この検量線に基づいて、前記粒子から剥離したＡＦＰの重量を重量単位で換算した。なお、この重量は、粒子０．２ｍｇあたりに吸着していたＡＦＰの重量に相当する。
【００７４】
４．４．実施例２
４．４．１．担体ポリマー粒子の作製
磁性粒子Ａ−２を用いた以外は上記実施例１と同様の操作を行なうことにより、０．４８ｇのアミノ化粒子Ａｍ−２を得た。次に、上記合成例４で得られたＣＭＤ−１（１５０ｍｇ）を純水６ｇに溶解し、ここにアミノ化粒子Ａｍ−２を１５０．５ｍｇ加え、間接超音波を２０分間照射して分散させた。次いで、この分散液を氷冷し、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの５ｗｔ％水溶液１．４０ｇを加え、氷冷下で１２時間攪拌した。続いて、磁気分離により粒子を単離し、純水に分散させ磁気分離して洗浄する操作を５回繰り返した後、再び純水に分散させ遠心分離により上清を除去した後、乾燥させることにより、１４７ｍｇの担体ポリマー粒子Ｐ−２を得た。
【００７５】
４．４．２．プローブ結合粒子の作製および特異捕捉性評価
本実施例で得られた担体ポリマー粒子Ｐ−２を用いて、上記実施例１と同様のプローブ結合工程を行なうことにより、プローブ（抗体）結合粒子を得た。このプローブ結合粒子について、特異捕捉性の評価を上記実施例１と同様の方法にしたがって行なった。
【００７６】
４．５．比較例１
比較例１においては、ＪＳＲ（株）製磁性粒子（商品名「ＭＡＧ２１０１」）を用いて上記実施例１と同様のプローブ結合工程を行ない、プローブ結合粒子を得た。次いで、このプローブ結合粒子について、特異捕捉性の評価を上記実施例１と同様の方法にしたがって行なった。なお、比較例１で用いた磁性粒子は、表面が糖類で被覆されていない。
【００７７】
４．６．特異捕捉性評価結果
図１は、実施例１，２および比較例１それぞれにおいて得られたプローブ結合粒子の特異捕捉性の評価結果（プローブ結合粒子に吸着したタンパク質の電気泳動パターン）を示す写真である。
【００７８】
図１において、レーン１は実施例１の担体ポリマー粒子Ｐ−１を用いて形成されたプローブ結合粒子によって捕捉されたタンパク質を示し、レーン２は実施例２の担体ポリマー粒子Ｐ−２を用いて形成されたプローブ結合粒子によって捕捉されたタンパク質を示し、レーン３は比較例１の磁性粒子を用いて形成されたプローブ結合粒子によって捕捉されたタンパク質を示し、レーン４はコントロールである目的物質（ＡＦＰ）２０ｎｇを示し、レーン５はコントロールである目的物質（ＡＦＰ）５０ｎｇを示し、レーン６はコントロールである目的物質（ＡＦＰ）１００ｎｇを示し、レーン７は分子量マーカを示す。
【００７９】
図１を参照すると、実施例１のポリマー結合粒子Ｐ−１を用いて形成されたプローブ結合粒子からは、目的物質であるＡＦＰのバンドのみが血清中から回収され、その回収量は粒子０．２ｍｇ当たり１１ｎｇであった。また、実施例２のポリマー結合粒子Ｐ−２を用いて形成された抗体結合粒子からは、目的物質であるＡＦＰのバンドのみが血清中から回収され、その回収量は粒子０．２ｍｇ当たり１５ｎｇであった。一方、比較例１の粒子からは、非特異的に回収された血清タンパク質のバンドが多数確認されたが、目的物質であるＡＦＰのバンドを確認することは困難であった。
【００８０】
以上により、実施例１，２のプローブ結合粒子は、タンパク質の非特異吸着が少ないことが確認された。この結果から、実施例１，２のプローブ結合粒子によれば、表面が糖類で被覆されており、かつ、目的物質を特異的に捕捉するためのプローブが前記糖類に化学結合しているため、非特異吸着が少ないことが理解できる。一方、比較例１の磁性粒子は、タンパク質の非特異吸着が多かった。このことから、比較例１の粒子のように、表面が糖類で被覆されていないと、非特異吸着が多いことが理解できる。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１は、実施例１，２および比較例１において得られたプローブ結合粒子の特異捕捉性評価結果（プローブ結合粒子に吸着したタンパク質の電気泳動パターン）を示す写真である。
【図１】
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