(57)【要約】【課題】イヌのリンパ球を用いて腫瘍患者犬の治療をおこない、またその治療用の製剤の製造や培養および凍結保存をおこなう。【解決手段】固相化抗イヌCD3抗体とインターリューキン−２（IL-2）、さらに好ましくは抗イヌCD3抗体とヒトインターリューキン−２（rIL-2）の組み合わせにより、イヌ末梢血リンパ球を活性化・増幅してこの活性化リンパ球をがん患者犬に投与する。これにより犬の腫瘍の明確な縮小効果が認められるとともに、これによる重篤な副作用は認められず、元気が出て散歩距離が延びるとか毛艶が良くなる等のQOLの改善が認められた。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相化抗イヌCD3抗体とインターリューキン−２（IL-2）を組み合わせ存在下においてイヌ末梢血リンパ球を増殖培養あるいは活性化した後、これを腫瘍犬に投与するようにした腫瘍犬の治療方法。
【請求項２】
インターリューキン−２（IL-2）がヒトインターリューキン−２（ヒトrIL-2）であるところの請求項１に記載の腫瘍犬の治療方法。
【請求項３】
イヌ末梢血リンパ球を増殖培養あるいは活性化させる際の活性化培養の温度が37℃〜41℃の範囲内であるところの請求項１に記載の腫瘍犬の治療方法。
【請求項４】
イヌ末梢血リンパ球を増殖培養あるいは活性化させる際の活性化培養の温度が38.0℃〜40.0℃の範囲内であるところの請求項１に記載の腫瘍犬の治療方法。
【請求項５】
固相化抗イヌCD3抗体とインターリューキン−２（IL-2）を組み合わせ存在下においてイヌ末梢血リンパ球を増殖培養あるいは活性化して得られた腫瘍犬の治療用製剤。
【請求項６】
インターリューキン−２（IL-2）がヒトインターリューキン−２（ヒトrIL-2）であるところの請求項５に記載の腫瘍犬の治療用製剤。
【請求項７】
イヌ末梢血リンパ球を増殖培養あるいは活性化させる際の活性化培養の温度が37℃〜41℃の範囲内であるところの請求項５に記載の腫瘍犬の治療用製剤。
【請求項８】
イヌ末梢血リンパ球を増殖培養あるいは活性化させる際の活性化培養の温度が38.0℃〜40.0℃の範囲内であるところの請求項５に記載の腫瘍犬の治療用製剤。
【請求項９】
固相化抗イヌCD3抗体とインターリューキン−２（IL-2）を組み合わせ存在下においてイヌ末梢血リンパ球をインビトロで増殖培養あるいは活性化した後に凍結し、使用時に融解・復元して再活性化した後に投与用製剤とするようにした腫瘍犬治療用細胞の凍結保存方法。
【請求項１０】
インターリューキン−２（IL-2）がヒトインターリューキン−２（ヒトrIL-2）であるところの請求項９に記載の腫瘍犬の治療用細胞の凍結保存方法。
【請求項１１】
イヌ末梢血リンパ球をインビトロで増殖培養あるいは活性化させる際の活性化培養の温度が37℃〜41℃の範囲内であるところの請求項９に記載の腫瘍犬治療用細胞の凍結保存方法。
【請求項１２】
イヌ末梢血リンパ球をインビトロで増殖培養あるいは活性化させる際の活性化培養の温度が38.0℃〜40.0℃の範囲内であるところの請求項９に記載の腫瘍犬治療用細胞の凍結保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はイヌのリンパ球を用いた腫瘍患者犬の治療方法ならびにその治療用製剤、およびそれらの細胞の培養ならびに凍結保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イヌリンパ球の増殖がヒトインターリューキンー２（hIL-2）により可能であることは すでに J.H. Jardine らにより報告されている（ Veternary
Immnunology and Immunopathology
21巻、153-160頁、1989年）。またイヌリンパ球の増殖が PHA（Phytohemagglutinin）とhIL-2により可能であることも D.W.
Mitchellら（ American Journal of Veternal Research 52巻、1132-1136頁、1991年）が報告している。
【０００３】
さらに、イヌリンパ球の増殖が固相化抗イヌCD3抗体とhIL-2により可能であることについても H. Itohらによって報告されている（Journal of Veternary Medical Science 65巻、329-333頁、2003年）。またイヌリンパ球を PHAとIL-2 を用いて培養温度38℃で培養を行うことについてもMizunoらにより報告されている（MizunoらExperimantal Animal 45巻、289-292ページ、1996年）。
【非特許文献１】Veternary Immnunologyand Immunopathology 21巻、153-160頁、1989年
【非特許文献２】AmericanJournal of Veternal Research 52巻、1132-1136頁、1991年
【非特許文献３】Journal of Veternary Medical Science 65巻、329-333頁、2003年
【非特許文献４】MizunoらExperimantal Animal 45巻、289-292ページ、1996年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、J.H.Jardineら、および D.W. Mitchellらの報告は hIL-2 単独でイヌリンパ球を増殖させており、しかも増殖する細胞は大型の顆粒を有するリンパ球（LGL）由来のLAK（Lymphokine  Activated Killer）細胞である。D.W.
Mitchellらの報告ではイヌ末梢血リンパ球をPHAとhIL-2で増殖させている。PHAはＴ細胞表面上のCD2分子を介してＴ細胞を活性化するが、抗CD3抗体はCD3を介してＴ細胞を活性化する。したがってこれにより増殖する細胞とは異なっている。
【０００５】
またH.Itohらはイヌリンパ球を固相化抗CD3抗体とhIL-2を用いて培養を行い、得られた活性化リンパ球をイヌに投与して副作用が無いことを確認しているが、in vivoでの抗腫瘍活性を確認していない。また、Mizunoらはイヌリンパ球を培養温度38℃でPHAとIL-2を用いて培養を行っているが、in
vivoでの抗腫瘍効果は確認していないし、リンパ球の活性化方法も異なっている。要するに上記した在来の手段によっては、腫瘍犬の効果的な治療法を実現することができない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
とくにイヌのがん治療については、これまでイヌ用に開発された抗ガン剤は無く、ヒト用に開発された抗ガン剤を体表面で換算して投与しており、イヌに対する安全性・抗腫瘍効果は充分確認されていない。また、活性化リンパ球を用いたがん治療はヒトで多くの臨床試験が行われているが、がん患者犬に活性化リンパ球を投与して安全性、QOLの改善および抗腫瘍効果を確認した報告は無い。
【０００７】
そこで本発明者らはイヌ末梢血リンパ球を固相化抗イヌCD3抗体とインターリューキン−２（IL-2）、さらに好ましくは抗イヌCD3抗体とヒトインターリューキン−２（ヒトrIL-2）の組み合わせにより活性化・増殖させ、これをがん患者犬に投与することによりがん患者犬のQOLの改善と抗腫瘍効果の確認を行った結果、一応満足のいく結果が得られ、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、請求項１に記載の発明は、固相化抗イヌCD3抗体とインターリューキン−２（IL-2）を組み合わせ存在下においてイヌ末梢血リンパ球を増殖培養あるいは活性化した後、これを腫瘍犬に投与するようにした腫瘍犬の治療方法に関する。また請求項２の発明は、インターリューキン−２（IL-2）がヒトインターリューキン−２（ヒトrIL-2）であるところの請求項１に記載の腫瘍犬の治療方法に関する。
【０００９】
さらに請求項３の発明は、イヌ末梢血リンパ球を増殖培養あるいは活性化させる際の活性化培養の温度が37℃〜41℃の範囲内であるところの請求項１に記載の腫瘍犬の治療方法に関する。さらに請求項４の発明は、イヌ末梢血リンパ球を増殖培養あるいは活性化させる際の活性化培養の温度が38.0℃〜40.0℃の範囲内であるところの請求項１に記載の腫瘍犬の治療方法に関する。
【００１０】
さらに請求項５の発明は、固相化抗イヌCD3抗体とインターリューキン−２（IL-2）を組み合わせ存在下においてイヌ末梢血リンパ球を増殖培養あるいは活性化して得られた腫瘍犬の治療用製剤に関する。さらに請求項６の発明は、インターリューキン−２（IL-2）がヒトインターリューキン−２（ヒトrIL-2）であるところの請求項５に記載の腫瘍犬の治療用製剤に関する。
【００１１】
さらに請求項７の発明は、イヌ末梢血リンパ球を増殖培養あるいは活性化させる際の活性化培養の温度が37℃〜41℃の範囲内であるところの請求項５に記載の腫瘍犬の治療用製剤に関する。さらに請求項８の発明は、イヌ末梢血リンパ球を増殖培養あるいは活性化させる際の活性化培養の温度が38.0℃〜40.0℃の範囲内であるところの請求項５に記載の腫瘍犬の治療用製剤に関する。
【００１２】
さらに請求項９の発明は、固相化抗イヌCD3抗体とインターリューキン−２（IL-2）を組み合わせ存在下においてイヌ末梢血リンパ球をインビトロで増殖培養あるいは活性化した後に凍結し、使用時に融解・復元して再活性化した後に投与用製剤とするようにした腫瘍犬治療用細胞の凍結保存方法に関する。
【００１３】
さらに請求項１０の発明は、インターリューキン−２（IL-2）がヒトインターリューキン−２（ヒトrIL-2）であるところの請求項９に記載の腫瘍犬の治療用細胞の凍結保存方法に関する。
【００１４】
さらに請求項１１の発明は、イヌ末梢血リンパ球をインビトロで増殖培養あるいは活性化させる際の活性化培養の温度が37℃〜41℃の範囲内であるところの請求項９に記載の腫瘍犬治療用細胞の凍結保存方法に関する。さらに請求項１２の発明は、イヌ末梢血リンパ球をインビトロで増殖培養あるいは活性化させる際の活性化培養の温度が38.0℃〜40.0℃の範囲内であるところの請求項９に記載の腫瘍犬治療用細胞の凍結保存方法に関する。
【発明の効果】
【００１５】
上記した通り本発明の治療方法およびその製剤、ならびに凍結保存された腫瘍犬治療用細胞は、固相化抗イヌCD3抗体とインターリューキン−２（IL-2）、さらに好ましくは抗イヌCD3抗体とヒトインターリューキン−２（ヒトrIL-2）の組み合わせにより、イヌ末梢血リンパ球を活性化・増幅することが可能であり、この活性化リンパ球をがん患者犬に投与したところ、腫瘍の明確な縮小効果が認められた。またこれによる重篤な副作用は認められず、元気が出て散歩距離が延びるとか毛艶が良くなる等、一応満足できる程度のQOLの改善が認められた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下において本発明の具体的な内容を実施例をもとに説明する。
【実施例１】
【００１７】
健常犬について２検体のリンパ球の培養を以下の手順により２回ずつ行った
１．〔細胞培養用フラスコの調製〕
生理食塩水（発売元：光製薬株式会社）で5μL/mLに希釈調製した抗イヌCD3抗体（発売元：セロテック社：マウス抗イヌ CD3）溶液を、培養用フラスコ（住友ベークライト株式会社：75cm2）に5mL入れ、底面に溶液を均一に浸した。
【００１８】
４±２℃で一晩保管後、フラスコ内の抗イヌCD3抗体溶液を除去し、生理食塩水  20mLをフラスコに注ぎ込みフラスコの蓋を閉め激しく振った後、蓋を開け、液を捨てた。再度同様の操作を行い、フラスコ内と蓋に残っている液を除去し、使用時まで冷蔵庫にて保管した。
【００１９】
２．〔採血〕
健常犬１（体重2kg）から末梢血5mLおよび健常犬２（体重22kg）から末梢血5mLをそれぞれヘパリン加採血した。
【００２０】
３．〔末梢血単核球の分離〕
クリーンベンチ（SHOWA社：S-1100PRV）内で無菌的に（以下、単に「無菌的に」と略す）、15mL遠心管（グライナー社：188271）に末梢血を分注し、遠心分離機（株式会社コクサン：H-700FR）にて遠心分離温度２４℃、回転数1800rpm１０分間遠心分離を行った。
【００２１】
遠心後、上層の血漿層を１５mL遠心管に回収し、冷蔵保存した。さらに下層の血球層を約２倍量の洗浄用培地〔培地（株式会社日研生物医学研究所：RPMI1640）500mL、1N 塩酸（和光純薬工業社）３mL、1M HEPES液（SIGMA社：H0887）１０mL含有〕を５０mL遠心管（グライナー社：227216）に分注し、血球層と混和した。５mLピペット（コーニング社：4487）を用いてリンホセパール１（株式会社免疫生物研究所：23010）を１５mL遠心管に３mL入れ、次に洗浄用培地で希釈した末梢血１０mLをゆっくりと重層した。これを遠心分離機にて温度２４℃、回転数1600rpm ３０分間ブレーキOFFの状態で遠心分離を行った。
【００２２】
遠心後、中間層のリンパ球画分を５mLのピペットを用いて５０mL遠心管（グライナー社：227216）に回収し、これに洗浄用培地を加え全量２０〜３０mLとし、これをよく混和した。ここから末梢血単核球測定用に１０μL、細胞表面抗原の測定用に５mLラウンドチューブ（日本ベクトンディッキンソン株式会社：352008）３本に５００μLずつサンプリングした。
【００２３】
４．〔回収された細胞数の測定〕
前記３．において末梢血単核球測定用に採取したサンプル１０μLを４０μLのチュルク氏液（武藤化学薬品株式会社）と混合し、改良ノイバウエル血球計算盤（エルマ販売株式会社）に１０μLアプライし、光学顕微鏡下で細胞数を測定した。その結果、末梢血から分離された末梢血単核球数は健常犬１で2.1×107個、1.1×107個、健常犬２で6.4×106個、6.9×106個であった。
【００２４】
５．〔細胞表面抗原解析〕
前記３．において細胞表面抗原測定用に採取したサンプルを遠心分離機にて温度24℃、回転数1800rpm で５分間遠心分離し、上清除去した。その３本のチューブにぞれぞれ、（１）コントロールγ1/γ1（日本ベクトンディッキンソン株式会社：349526）5μL、（２）FITC標識マウス抗イヌCD3抗体（セロテック社：MCA1774F）とPE標識マウス抗イヌB cell抗体（セロテック社：MCA178PE）の等量混合を5μLを、（３）FITC標識ラット抗イヌ CD4/PE標識ラット抗イヌCD8抗体（セロテック社：DC048）5μLを 加え、これを４℃下で１０分間以上反応させた。
【００２５】
反応後、２％ヒトアルブミン添加アイソフロー（日本ベクトンディッキンソン株式会社：C412006）2mLをそれぞれのチューブに添加しボルテックス（ SCIENTIFIC INDUSTRY社：4781487）で混和後、遠心分離機にて温度24℃、回転数1800rpm ５分間遠心分離した。その後上清をできるだけ除去し、当日中に測定を行う場合は２％ヒトアルブミン添加アイソフローを500μL、翌日以降に測定を行う場合はセルフィックス（ベクトンディッキンソン株式会社：340181）500μLを加えた。さらに FACS Calibur 4A（日本ベクトンディッキンソン株式会社）を用いて細胞表面抗原解析を行った。測定結果は表１に記した通りである。
【００２６】
【表１】
2007055906.tif 000002
【００２７】
６．〔末梢血単核球の培養〕
サンプリング後の末梢血単核球浮遊液を遠心分離機にて、温度24℃、回転数1600rpm １０分間遠心分離の後、上清をデカントで除きペレットをボルテックスで分散させた。これを培養用培地［培地（株式会社日研生物医学研究所：RPMI1640+7S）400mL、35,000/mL rIL-2（PROLEUKIN:カイロン社）4.5mL、FBS（ＪＲＨ社）45mL含有］20mLで洗浄しながら前記１．で調製した細胞培養用フラスコに回収し、これをテーハー式大型CO2培養器にて温度37℃±0.2℃、CO2濃度5.0±0.2％、湿度95％±5.0％の条件下で培養を開始した。
【００２８】
７．〔細胞の増幅培養〕
前記６．により培養を開始した細胞を光学顕微鏡で観察し、細胞増殖に伴い培養開始後３〜７日に、さらに同培養液を10〜30mL加えた。フラスコ内培養液が50mLになるまで培養液を追加し培養を継続した。培養開始後４〜８日に増殖した細胞を培養液とともに培養用フラスコに移し、培養細胞を50mLを追加し、さらに培養を続けた。培養開始後６〜１０日に、ヒトrIL-2 175IU/mL、FBS 10%含有した培養液150mLを加え８〜１６日間培養を行った。
【００２９】
８．〔自己血清処理〕
前記３．にて採取した血漿成分を５７℃ウォーターバスにて５０分間非動化処理を行った後、これを４℃にて保存した。
【００３０】
９．〔細胞の安全性確認試験〕
培養８〜１６日目の投与用最終製品の調製を行う前日に細胞の安全性確認試験として、エンドトキシン試験、無菌試験、細胞表面抗原の測定を行う。試験サンプルとして、培養中のフラスコ内から5mLシリンジ（テルモ株式会社）と18G×1 1/2"注射針を用いて約3mL採取し、エンドトキシン試験用に5mL蓋付ラウンドチューブ（日本ベクトンディッキンソン株式会社：352054）に約1mL、無菌試験としてチョコレート寒天培地（日研生物医学研究所）に500μL、5mLラウンドチューブ３本にそれぞれ500μLずつサンプリングした。
【００３１】
１０．〔エンドトキシン試験〕
前記８．で採取した試験用サンプルを遠心分離機にて24℃、1800rpm ５分間遠心分離を行った。あらかじめ調製を行い5mLラウンドチューブに分注した主剤溶液（トキシカラー LS-50Sセット：生化学工業株式会社：020130）に80μLの蒸留水と共に20μLの培養上清を混和し、３７℃ウォーターバスにて３５分間反応させた。同時にブランクとして主剤溶液に100μLの蒸留水を加えたもの、また標準液としてエンドトキシン標準液 （CSE-Lセット：生化学工業株式会社：020055）を同様に100μL添加したものをサンプルと共に反応させた。
【００３２】
反応後に0.8mol/L酢酸溶液を400μL添加し、さらにこれを９６穴マイクロプレートに３８０μL分注する。マイクロプレートリーダーを用いて測定波長405nm対象波長６５５nmの条件で吸光度を測定する。標準液は約０．１EU/mLになるよう調製されているので、試験サンプルの測定値の５倍値が標準液の測定値以下ならば判定基準内とした。判定結果についてはすべて判定基準内であった。
【００３３】
１１．〔無菌試験〕
前記９．でサンプルを撒いたチョコレート寒天培地を37℃培養器にて保管する。判定は翌日に、投与形態の調製前に行った。この場合菌の発育が認められなければ判定基準内としたところ、判定結果はすべて判定基準内であった。
【００３４】
１２．〔投与形態の調製前の細胞表面抗原の測定〕
細胞表面抗原の測定法については前記６．と同様の方法で行った。測定結果は表２に記した通りである。
【００３５】
【表２】
2007055906.tif 000003
【００３６】
１３．〔細胞の投与形態への調整〕
培養８〜１２日目に、前日に実施したエンドトキシン試験、無菌試験、細胞表面抗原の測定結果が判定基準値内であることが確認された後、投与用の最終製品の調製をつぎのように行った。すなわち培養中のフラスコ内培養液の全量２５０mLを遠心管に移し、遠心分離機にて遠心分離温度２４℃、回転数１５００rpm ８分間遠心分離を行った。上清をデカントで除去しボルテックスにて細胞を分散させ、前項８．にて処理を行った自己血清０．５%含有生理食塩水５０mLを加え混和した。
【００３７】
再び遠心分離機にて２４℃、１７００rpm ８分間遠心分離を行い上清を除去しボルテックスにて細胞を分散させた。自己血清２％含有生理食塩水を体重１０kg以下のイヌには１０mL、２０kg以上のイヌには３０mL使用し細胞をよく懸濁させた。セルストレーナー（日本ベクトンディッキンソン株式会社：352360）で細胞を濾過し、細胞数測定のため１０μL採取し、２％アルブミン含有生理食塩水１mLに懸濁した。
【００３８】
１４．〔調製後の細胞数測定〕
前項１３で調製した最終製品から１０μLサンプリングし、４と同様に細胞数を測定した。また、同サンプル１０μLを２０μLのトリパンブルー染色液（SIGMA社：T8154）に混和して改良ノイバウエル血球計算盤に１０μLアプライし光学顕微鏡下で細胞が染色されている数を測定し、細胞生存率の測定を行った。測定の結果最終的に回収された細胞は、健常犬１では３．３×１０９個、２．２×１０９個、健常犬２では４．１×１０９個、３．０×１０９個であった。細胞生存率はすべて９５％以上の好成績であった。
【００３９】
１５．〔活性化リンパ球の投与〕
前項１３にて調製した自己の細胞浮遊液を健常犬１および健常犬２に投与した。軽微な体温上昇は認められたが、その他の有害事象は認められなかった。
【実施例２】
【００４０】
患者犬９頭に実施例１と同様の方法で得た活性化リンパ球を１〜１２回投与したところ、旺盛な食欲がでたり、毛並みが良くなったり、あるいは散歩の距離が倍増するなど明らかなＱＯＬの改善が認められた。実施した結果を表３に示す。
【００４１】
【表３】
2007055906.tif 000004
【実施例３】
【００４２】
健常犬３および４の末梢血リンパ球を実施例１の方法により分離した。イヌリンパ球の培養は培養温度を３７±０．２℃、３８±０．２℃および３９±０．２℃で行った以外は実施例１と同様に行い、最終的に約１５〜２０倍に増殖したときの結果を表４（健常犬３）、５（健常犬４）、および６、さらに図１のグラフ（培養温度による細胞増殖の比較）に記した。その結果によれば、培養温度３７℃〜３９℃の温度範囲ではとくに３９℃での細胞の増殖が良好であった。
【００４３】
【表４】
2007055906.tif 000005
【００４４】
【表５】
2007055906.tif 000006
【００４５】
【表６】
2007055906.tif 000007
【００４６】
上記の表６により明らかなように、培養開始から増殖細胞数が１０倍に達するまでの日数をみると、３７℃で７．３日、３８℃で６．２日に対して、３９℃では５．３日となり、１〜２日の培養日数の短縮が可能となることを確認した。
【実施例４】
【００４７】
実施例１の方法において、培養条件をテーハー式大型CO2培養器にて温度３８℃〜３９℃、CO2濃度５．０±０．２％、湿度９５％±５．０％の条件下で培養を行い、それ以外の方法は実施例１と同様の方法によって得られた活性化リンパ球を患者犬５頭にそれぞれ１〜２回投与したところ、旺盛な食欲がでたり、毛並みが良くなったり、あるいは散歩の距離が倍増するなど明らかなＱＯＬの改善が認められた。実施した結果を表７に示す。
【００４８】
【表７】
2007055906.tif 000008
【００４９】
なお表３および７において患者犬５については、活性化リンパ球を計６回投与した後に癌以外の病因で死亡したが、死亡後の検査により手術で除去しきれなかった腫瘍が消失していることが確認された。
【実施例５】
【００５０】
実施例３の方法において、培養条件をテーハー式大型CO2培養器にて温度３８℃〜３９℃、CO2濃度5.0±0.2％、湿度95％±5.0％の条件下で培養培養した活性化リンパ球を一部凍結保存し、解凍培養した細胞を用いて投与を行った。培養開始までは前項１〜６と同様の方法で行った。
【００５１】
１６．〔細胞の一部凍結保存〕
培養中の細胞の活性化及び増幅にあわせ培養後3〜5日にて同培養液を10〜30mL同フラスコに加えた。フラスコ内培養液が50mLになるまで培養液を追加し4〜7日目に細胞数を測定し、1.0×106/mL以上のとき凍結保存を実施した。
【００５２】
培養中の培養液30〜50mLを50mL遠心管に分注し、遠心分離機を用いて遠心分離温度24℃、回転数1200rpm 5分間遠心分離を行った。上清をデカントで除き、細胞凍結保存液（バンバンカー：株式会社リンフォテック）を1本あたり1.8mL加えボルテックスでよく混和した。これを2mLチューブ（コーニング社：430289）に1.8mLずつ分注し、バイセル（日本フリーザー株式会社）に入れ-85℃に設定した超低温フリーザー（三洋電機株式会社：MDF-192）で保存し、翌日以降に生物試料保存用液体窒素タンク（マイサイエンス株式会社：XC47/11-6）へ移動し保管した。
【００５３】
１７．〔凍結保存細胞の解凍培養〕
前項１６で凍結保存を行った細胞を用いて解凍培養を行った。液体窒素タンクから保存中の凍結チューブを取り出しヒートブロック（タイテック社：ドライサーモユニット：DTU-28）にて４分間加温解凍し、パスツールピペットで10mLの洗浄用培地に全量移しいれ、遠心分離機にて遠心分離温度24℃、回転数1200rpm ３分間遠心分離を行った。
【００５４】
上清を廃棄し分散させたペレットを培養用培地（培地RPMI1640+7S 400mL、35,000/mL rIL-2  4.5mL、FBS 45mL含有） 15〜20mLで50mLチューブに回収し、カウント用に10μLをトリパンブルー染色液にサンプリングした。残りの細胞浮遊培地を未処理の24ウェルプレート（住友ベークライト株式会社：MS-80240）1ウェルに1〜2mLずつ分注後、テーハー式大型CO2培養器にて温度37℃±0.5℃、CO2濃度5.0±0.2％、湿度95％±5.0％の条件下で培養を開始した。
【００５５】
２０mL以下の培養液から開始した細胞は、培養中に光学顕微鏡で観察した上、細胞の活性化及び増幅にあわせ培養1〜3日後に、さらに培養液を1ウェルあたり1〜2mLずつ加えた。カウント用サンプルはよく混和し、改良ノイバウエル血球計算盤に10μLアプライし光学顕微鏡下で染色されていない生細胞と染色されている死細胞数を測定し、細胞数と細胞生存率の測定を行った。
【００５６】
１８．〔凍結保存細胞の活性化培養〕
前項１７により培養を開始した細胞を光学顕微鏡で観察し、細胞の活性化及び増幅にあわせ培養後2〜4日後に培養中のウェルから細胞をピペッティングにより前項１．と同様に調製した細胞培養用フラスコに回収後培養用培地（培地RPMI1640+7S 400mL、35,000/mL rIL-2  4.5mL、FBS 45mL含有）20〜30mLを添加して培養を継続した。
【００５７】
１９．〔凍結保存細胞の増幅培養〕
前記２により培養中の細胞を光学顕微鏡で観察し、細胞の活性化及び増幅にあわせ培養後4〜6日後に、培養中のフラスコを殴打し底面に付着している細胞を剥がした。これを225cm2培養用フラスコ（コーニング・コースター社：3000）に全量移しいれ、さらに培養用培地（培地RPMI1640+7S 400mL、35,000/mL rIL-2  4.5mL、FBS 45mL含有）50mLを添加し培養を継続した。
【００５８】
さらに、培養中の細胞を光学顕微鏡で観察し、細胞の活性化及び増幅にあわせ6〜8日後に培養用培地（培地RPMI1640+7S 400mL、35,000/mL rIL-2  2.25mL、FBS 45mL含有）150mLを加え患者犬への投与形態の調製まで培養を行った。
【００５９】
２０．〔凍結保存細胞の検査〕
前項９〜１２と同様の方法で培養した凍結保存細胞の検査を行った。
【００６０】
２１．〔凍結保存細胞の投与形態への調製と細胞数測定〕
前項１３〜１４と同様の方法で培養した凍結保存細胞の投与形態への調整と細胞数測定を行った。
【００６１】
２２．〔凍結保存細胞の投与〕
前項１３にて調製した自己の細胞浮遊液を患者犬に１回投与したところ、旺盛な食欲がでたり、毛並みが良くなったり、あるいは散歩の距離が倍増するなど明らかなＱＯＬの改善が認められた。実施した結果を表８に示す。
【００６２】
【表８】
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【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】培養温度による細胞増殖の比較をあらわしたグラフ
【図１】
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