(57)【要約】      （修正有）【課題】バイオレメディエーション技術の欠点の一つである低温期における活性低下を克服し、その汎用性を高めるために、低温でアルカン等の分解活性の高い微生物を分離し、それを利用したバイオオーギュメンテーション技術を提供する。【解決手段】産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された新規微生物ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）  ｓｐ．  ＳＣＲＣ−４０４１２（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６５０）菌株、またはロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）  ｓｐ．  ＳＣＲＣ−４２２３６（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６５１）菌株により、アルカン及び／又はアルケンを分解させる。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）  ｓｐ．  ＳＣＲＣ−４０４１２（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６５０）菌株。
【請求項２】
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）  ｓｐ．  ＳＣＲＣ−４２２３６（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６５１）菌株。
【請求項３】
請求項１または２に記載の菌株により、アルカン及び／又はアルケンを分解させることを特徴とする、アルカン及び／又はアルケンの分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルカンまたはアルケン（以下、アルカン類という）、例えばｎ−ヘキサデカン等を効率よく分解することができる新規微生物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
バイオレメディエーションは環境中の汚染物質を微生物の代謝能を利用して分解浄化する技術であり、環境負荷が小さく、処理コストが低いなどの利点を有しているが、冬季などの低温期に分解活性が低下する、高濃度汚染には適していないなどの欠点も有しており、石油類による汚染土壌の浄化技術は物理的化学的手法が主流になっている。従って、バイオレメディエーションを普及させるには、浄化対象となる土壌の温度においても生育して高い分解活性を示す分解菌の探索が望まれる。土壌温度は気温に影響され、地表面から深くなるほど変動が少ないので、浄化対象となる土壌温度は１日の平均気温に近づくと考えられる。
【０００３】
石油類分解に関する分解菌の基質分解率は一般に３０℃前後で測定されており、低温度下での分解率を記載した情報は少ない。例えばｎ−ヘキサデカンに関しては０．０５％濃度を２８℃下、２週間で９５％分解するフラボバクテリウム（例えば、特許文献１参照）、０．０１％濃度を２３℃下、２週間で約５０％無機化するロドコッカス属（例えば、非特許文献１参照）が知られている。しかしながら、例えば１９７１年から２０００年までの３０年間における１日の平均気温が２０℃以上の日数は、札幌が５２日、東京が１２６日、新潟が１０９日、名古屋が１３０日、大阪が１４１日、福岡が１３７日、鹿児島が１６２日、那覇が２４１日であり、平均気温が３０℃を越える都市はない。従って、平均的な環境温度における分解活性としては十分とは言えない。また、基質の初期濃度も実用的とは言えない。
【０００４】
【特許文献１】特開平６−８０号公報
【非特許文献１】Ｌ．  Ｇ．  Ｗｈｙｔｅ  ｅｔ．  ａｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ６４，  ２５７８−２５８４（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、バイオレメディエーション技術の欠点の一つである低温期における活性低下を克服し、その汎用性を高めるために、低温でアルカン等の分解活性の高い微生物を分離し、それを利用したバイオオーギュメンテーション技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、本発明者らの保存菌株を対象に平均的な環境温度領域、特に２０℃において高いｎ−ヘキサデカン分解活性を有する微生物を鋭意探索した結果、ロドコッカスｓｐ．  ＳＣＲＣ−４０４１２とロドコッカスｓｐ．  ＳＣＲＣ−４２２３６とを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
即ち本発明は、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）  ｓｐ．  ＳＣＲＣ−４０４１２（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６５０）菌株である。また本発明は、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）  ｓｐ．  ＳＣＲＣ−４２２３６（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６５１）菌株である。さらに本発明は、これらの菌株により、アルカン類を分解させることを特徴とする、アルカン類の分解方法である。以下に本発明を更に詳細に説明する。
【０００８】
本発明者らは、アルカン類を分解するロドコッカスｓｐ．ＳＣＲＣ−４０４１２及びＳＣＲＣ−４２２３６を次のようにして見出した。まず、グリセロールを含む溶媒に懸濁凍結してある保存菌株を栄養培地で前培養した。次に中試験管にペプトン０．０５％、酵母エキス０．０１％からなる液体培地３ｍＬを入れ、ｎ−ヘキサデカン３０ｍｇを加えた後、保存菌株の前培養液を植菌して２０℃振盪培養を行い、培養液の白濁度を目視で観察した。
【０００９】
次に３０ｍＬガラス遠沈管にペプトン０．０５％、酵母エキス０．０１％からなる液体培地３ｍＬを入れ、ｎ−ヘキサデカン３０ｍｇを加えた後、上記培養液の白濁度の高い菌株を栄養培地で前培養して植菌し、２０℃で振盪培養を行った。適当な培養時間の後、全培養液からクロロホルムメタノール混合溶媒で培養液中のｎ−ヘキサデカンを抽出して、シリカゲル薄層クロマトグラフィー―水素炎イオン化検出法により分析して、この定量値から各菌株の分解率を算出して比較した。この分解率の比較により、分解率の高いロドコッカスｓｐ．ＳＣＲＣ−４０４１２及びＳＣＲＣ−４２２３６を選抜した。なお、ＳＣＲＣ−４０４１２は能取湖で捕獲した貝類から分離した新規細菌であり、ＳＣＲＣ−４２２３６は九十九里近海で捕獲した魚類の腸内容物から分離した新規細菌である。
【００１０】
このロドコッカスｓｐ．ＳＣＲＣ−４０４１２及びＳＣＲＣ−４２２３６株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列相同性の解析結果（％）は表１のとおりである。
【００１１】
【表１】
2007104936.tif 000002
１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列解析では両菌株ともロドコッカスグラベルラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｌｏｂｅｒｕｌｕｓ）に最も近い。
【００１２】
またロドコッカスｓｐ．ＳＣＲＣ−４０４１２及びＳＣＲＣ−４２２３６の菌学的性質は表２のとおりである。
【００１３】
【表２】
2007104936.tif 000003
なお、生育温度の上限は、ＳＣＲＣ−４０４１２は３５℃、ＳＣＲＣ−４２２３６は３２℃であった。
【００１４】
ＳＣＲＣ−４０４１２及びＳＣＲＣ−４２２３６は以上の菌学的性質から分類学上の位置を「バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー」に従って検索した結果、ロドコッカス属に属すると考えられた。しかし、１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列では最も近縁のロドコッカスグラベルラスと比較して、生育温度と糖の発酵性に違いが見られた。又、ＳＣＲＣ−４０４１２はイノシトールとグルコン酸ナトリウムを資化する点でロドコッカスグラベラスとは異なる。ロドコッカス属の中には生育温度の上限が３０℃で、ヘキサデカンを分解する種も知られているが、２０℃における分解率の記載がなく、１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列はロドコッカスエリスロポリスと９９．８％の相同性を有する点でＳＣＲＣ−４０４１２およびＳＣＲＣ−４２２３６とは異なる（Ｐ．  Ｒａｐｐ  ａｎｄ  Ｌ．Ｈ．  Ｅ．  Ｇａｂｒｉｅｌ−Ｊｕｒｇｅｎｓ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  １４９，  ２８７９−２８９０（２００３））。現在のところ、１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列及び菌学的性質がＳＣＲＣ−４０４１２およびＳＣＲＣ−４２２３６と一致する種は見当たらないので、これらの菌株は新菌株と考えられる。これらの菌株は、産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６５０（ＳＣＲＣ−４０４１２）及びＦＥＲＭ  Ｐ−２０６５１（ＳＣＲＣ−４２２３６）として寄託されている。
【００１５】
これらの菌株は、アルカン類を炭素源として利用するので、結果としてアルカン類を分解することができる。アルカン類としては特に限定はないが、好ましくは炭素数１４〜３６のアルカン類であり、例えばｎ−ヘキサデカン等をあげることができる。また環状構造を有するものであってもよい。
【００１６】
アルカン類の分解方法には特に限定はなく、これらの菌株に無機質、水分、および空気の存在下、アルカン類を接触させればよい。菌株の使用にあたり、菌体としてはその生細胞、凍結物、または凍結乾燥物のいずれを用いることもできる。また分解させる時の温度は、分解させるアルカン類の種類に応じて適宜選択すればよいが、３０℃以下で効率よくアルカン類を分解することができる。また平均的な環境温度において充分な分解活性を有し、例えばｎ−ヘキサデカンでは２０℃前後で充分に分解することができる。
【００１７】
また本発明の方法により、土壌または水中などの環境中に存在するアルカン類を分解することができるため、汚染された環境の浄化を行うことができる。特に本発明による微生物は、３０℃以下で効率よくアルカン類を分解することができ、また平均的な環境温度下で顕著な分解活性を有しながらも、前述のように生育温度の上限が低いため、環境中で無制限に増殖する恐れが小さい。従って、本発明による微生物は、環境浄化に用いられるだけでなく、開放系でのバイオレメディエーションにも好適に用いることができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明による微生物は、アルカン類を環境温度下で効率よく分解することができ、その一方で生育温度の上限が低いために、環境浄化、特に開放系でのバイオレメディエーションに用いることができる。ことに石油類汚染土壌・地下水などの浄化は社会的に要求されており、平成１７年３月に経済産業省と環境省の統一指針が告示されたことなどから、分解微生物を用いる環境浄化技術の開発と利用が促進されると見込まれ、本発明はその技術の一つとして利用される可能性が高い。
【実施例】
【００１９】
以下に実施例を挙げて本発明を説明する。しかし本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００２０】
実施例−１
ロドコッカスｓｐ．ＳＣＲＣ−４０４１２及び４２２３６を表３に示した培地１の３ｍＬそれぞれに植菌し、２０℃で２４時間培養した。ｎ−ヘキサデカン１０ｍｇを入れた３０ｍＬガラス遠沈管に各々の培養液を１ｍＬづつ添加して、通気性のあるシリコ栓を取り付け、２０℃で振盪培養を開始した。なお、分解実験は２系列で行った。
【００２１】
振盪培養１２日目にクロロホルム／メタノール（１：２，ｖ／ｖ）を３ｍＬ、内部標準物質としてドコサン酸メチルエステル１０ｍｇを含むクロロホルム１ｍＬ、蒸留水を１ｍＬ加えてｎ−ヘキサデカンを振盪抽出した。更にクロロホルム１ｍＬを加えた振盪抽出を２回繰り返し、抽出液を併せてその一部をシリカゲル薄層クロマトグラフィー―水素炎イオン化検出法により分析した。表４に用いた両株の培養液の濁度（ＯＤ６１０ｎｍ）と培養１２日目のｎ−ヘキサデカンの量を示した。尚、培養液の代わりに未植菌の同じ培地１ｍＬを添加した試料をコントロールとした。
【００２２】
未植菌の培地を添加したコントロールのｎ−ヘキサデカンが７．４±０．３ｍｇであったのに対し、ロドコッカスｓｐ．ＳＣＲＣ−４０４１２と４２２３６の培養液を添加した試料は各々３．６±０．３ｍｇと１．８±０．２ｍｇであり、おのおのコントロールに対して０．４９±０．０４と０．２５±０．０２に減少した。
【００２３】
【表３】
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【００２４】
【表４】
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実施例−２
ロドコッカスｓｐ．ＳＣＲＣ−４０４１２をｎ−ヘキサデカン１．０％を含む表３に示した培地１の３ｍＬに植菌し、２０℃で２４時間培養した後、濁度（ＯＤ６１０ｎｍ）を測定したところ２．１５であった。この培養液を氷冷遠心して菌体を集め、培地１の０．１ｍＬに懸濁した。次に、３０ｍＬガラス遠沈管にｎ−ヘキサデカン１０ｍｇを入れ、表３の培地１、表５の培地２又は表６の培地３の１ｍＬを入れて懸濁し、上記菌体懸濁液を０．１ｍＬづつ添加した。通気性のあるシリコ栓を取り付け、２０℃で振盪培養を開始した。なお、分解実験は２系列で行った。
【００２５】
振盪培養１４日目に、実施例−１と同様の操作で試料中のｎ−ヘキサデカンを抽出し、シリカゲル薄層クロマトグラフィー―水素炎イオン化検出法により定量した。その結果を表７に示した。ロドコッカスｓｐ．ＳＣＲＣ−４０４１２株を加えていないコントロールのｎ−ヘキサデカンが７．５±０．２  ｍｇであったのに対して、培地１、２及び３の試料は２．５±０．１  ｍｇ、６．６±０．１  ｍｇ及び１．５±０．０  ｍｇであり、各々コントロールの０．３３±０．０２、０．８８±０．０３と０．２０±０．０１に減少した。
【００２６】
【表５】
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【００２７】
【表６】
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【００２８】
【表７】
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実施例−３
ロドコッカスｓｐ．ＳＣＲＣ−４０４１２を表３に示した培地１の４０ｍＬに植菌し、２０℃で２４時間培養した後、濁度（ＯＤ６１０ｎｍ）を測定したところ１．９２であった。この培養液０．１４ｍＬと２．９ｍＬを遠心して菌体を集め、同じ培地０．１ｍＬに懸濁した。次に、ｎ−ヘキサデカン１０ｍｇを入れた３０ｍＬガラス遠沈管に表６の組成の培地１ｍＬを入れ、上記菌体懸濁液を添加した。通気性のあるシリコ栓を取り付け、２０℃で振盪培養を開始した。なお、分解実験は２系列で行った。
【００２９】
振盪培養１４日目に、実施例−１と同様の操作で試料中のｎ−ヘキサデカンを抽出し、シリカゲル薄層クロマトグラフィー―水素炎イオン化検出法により定量した。その結果を表８に示した。ロドコッカスｓｐ．ＳＣＲＣ−４０４１２を加えていないコントロールのｎ−ヘキサデカンが７．６±０．３ｍｇであったのに対して、ロドコッカスｓｐ．ＳＣＲＣ−４０４１２の培養液２．９ｍＬ相当を加えた試料のｎ−ヘキサデカンは０．４±０．３ｍｇであり、コントロールの５％に低下した。
【００３０】
【表８】
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実施例−４
ロドコッカスｓｐ．ＳＣＲＣ−４０４１２を表３に示した培地１の４０ｍＬに植菌し、２０℃で２４時間培養した後、培地１で７０％に希釈した。次に、ｎ−ヘキサデカン１０ｍｇを入れた３０ｍＬガラス遠沈管に菌体を懸濁した培地１ｍＬ、オートクレーブで１２０℃、２０分間加熱した土壌を０、０．１又は０．３ｇを入れ、上記菌体懸濁液０．１５ｍＬを添加した。通気性のあるシリコ栓を取り付け、２０℃で振盪培養を開始した。なお、分解実験は２系列で行った。培養１４日目に実施例１と同様にｎ−ヘキサデカンを抽出し定量した。その結果を表９に示した。
【００３１】
土壌０．３ｇが共存しているスラリー系において、ロドコッカスｓｐ．ＳＣＲＣ−４０４１２を加えていないコントロールのｎ−ヘキサデカンが７．１±０．４ｍｇであったのに対して、ロドコッカスｓｐ．ＳＣＲＣ−４０４１２を加えた試料のｎ−ヘキサデカンは３．４±０．１ｍｇであり、コントロールの４７％に低下した。
【００３２】
【表９】
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実施例−５
ロドコッカスｓｐ．ＳＣＲＣ−４２２３６を表３に示した培地１の１９ｍＬに植菌し、２０℃で２４時間培養した後、遠心で菌体を集めた。次に表６に示した培地３の０．８ｍＬに懸濁した。次に、ｎ−ヘキサデカン１０ｍｇを入れた３０ｍＬガラス遠沈管に菌体を懸濁した培地１ｍＬ、オートクレーブで１２０℃、２０分間加熱した土壌を０、０．３又は１．０ｇを入れ、上記菌体懸濁液０．１ｍＬを添加した。通気性のあるシリコ栓を取り付け、２０℃で振盪培養を開始した。なお、分解実験は２系列で行った。培養１５日目に、実施例１と同様にｎ−ヘキサデカンを抽出し定量した。その結果を表１０に示した。
【００３３】
土壌１．０ｇが共存しているスラリー系において、ロドコッカスｓｐ．ＳＣＲＣ−４２２３６を加えていないコントロールのｎ−ヘキサデカンが６．６±０．０ｍｇであったのに対して、ロドコッカスｓｐ．ＳＣＲＣ−４２２３６を加えた試料のｎ−ヘキサデカンは３．８±０．０ｍｇであり、コントロールの５７％に低下した。
【００３４】
【表１０】
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