(57)【要約】  【課題】  迅速な処理と検出のためにシンプルな構成と高精度の送液系を組み込み、しかも精度の高い検出を可能とするマイクロリアクタ、マイクロ総合分析システムを提供すること。  【解決手段】  本発明の基材は、タンパク質およびｐＨ調整性凝集促進剤を表面に固定化させた基材である。基材の存在下で、タンパク質溶液のｐＨを、ｐＨ調整性凝集促進剤を添加して、該タンパク質の等電点もしくはその近傍に調整することにより、該基材表面に該タンパク質を吸着させることにより得られる。好適なタンパク質は、ストレプトアビジンまたはアルブミンである。また、ｐＨ調整性凝集促進剤は、グルコン酸、リン酸もしくはグルコノ−δ−ラクトンであることが望ましい。このような基材は、マイクロリアクタの基板もしくは流路エレメントとして好適な基材となり、マイクロリアクタにおいて適宜使用することにより、微量試料についての高感度分析が可能となる。【選択図】  図２
2007071555.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質およびｐＨ調整性凝集促進剤を表面に固定化させた基材。
【請求項２】
前記タンパク質がストレプトアビジンまたはアルブミンであることを特徴とする請求項１に記載の基材。
【請求項３】
前記ｐＨ調整性凝集促進剤が、グルコン酸、リン酸またはグルコノ−δ−ラクトンであることを特徴とする、請求項１に記載の基材。
【請求項４】
前記基材が、ソリッドフィルム、押出し成型されたプラスチック基板、またはポリマー・ビーズである請求項１に記載の基材。
【請求項５】
前記基材が、少なくともポリスチレン、またはポリプロピレンを含んでなることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の基材。
【請求項６】
表面にストレプトアビジンおよびｐＨ調整性凝集促進剤が固定化されており、ビオチン化物質を、ビオチン−ストレプトアビジン複合体を形成して捕捉するトラップ用基材であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の基材。
【請求項７】
基材の存在下で、タンパク質溶液のｐＨを、ｐＨ調整性凝集促進剤を添加して、該タンパク質の等電点もしくはその近傍に調整することにより、該基材表面に該タンパク質を吸着させて固定化させることを特徴とするタンパク質の基材への固定化方法。
【請求項８】
前記タンパク質がストレプトアビジンまたはアルブミンであり、前記ｐＨ調整性凝集促進剤が、酸であることを特徴とする請求項７に記載の固定化方法。
【請求項９】
基板上に流路用微細溝が形成され、少なくとも該微細溝の表面に、タンパク質およびｐＨ調整性凝集促進剤が固定化されていることを特徴とするマイクロリアクタ用基板。
【請求項１０】
一つのチップ内に、少なくとも
検体またはコントロールが注入される検体収容部と、
試薬類が収容される試薬収容部と、
これらの収容部に連通する流路と、
検体の処理または反応を行う処理・反応部と、ならびに
これらの収容部および流路内の液体を送液する別途のマイクロポンプに接続可能なポンプ接続部が各収容部の上流側に設けられ、
該処理・反応部から送出されるビオチン化物質をトラップするための、請求項１〜６のいずれかに記載の基材がその下流の流路に配置され、かつ
前記マイクロリアクタにポンプ接続部を介してマイクロポンプを接続し、検体収容部に収容された検体の処理、分離、反応、検出を行うように構成されていることを特徴とするマイクロリアクタ。
【請求項１１】
さらに、検体、コントロールまたは試薬類が流通する流路が、請求項９に記載の基板上に形成されていることを特徴とする請求項１０に記載のマイクロリアクタ。
【請求項１２】
前記マイクロリアクタが、遺伝子検査用マイクロリアクタであって、
前記マイクロリアクタにポンプ接続部を介してマイクロポンプを接続し、検体収容部に収容された検体もしくは検体から抽出したＤＮＡと、試薬収容部に収容された試薬とを流路へ送液し、流路内で混合して増幅反応させた後、増幅されたＤＮＡを含む反応液と変性
液とを混合し、増幅されたＤＮＡを一本鎖に変性処理して得られた処理液を、請求項６に記載のトラップ用基材を配置した流路に送液し、増幅されたＤＮＡを固定化すること、ならびに
増幅されたＤＮＡと、プローブＤＮＡ収容部から送液されたプローブＤＮＡとを流路内で混合してハイブリダイゼーションさせ、この反応生成物に基いて増幅反応の検出を行うように構成されていることを特徴とする、請求項１０または１１に記載のマイクロリアクタ。
【請求項１３】
少なくともマイクロポンプ、検出装置および制御装置が一体化された装置本体と、この装置本体に装着可能な、請求項１０〜１２のいずれかに記載のマイクロリアクタとからなり、装置本体にマイクロリアクタを装着することによりこれらのポンプ接続部にマイクロポンプが接続され、各マイクロポンプから駆動液を供給することにより試薬収容部から試薬を流路へ押し出して反応を開始するように構成され、処理、分離、反応もしくは検出を自動的に行うことを特徴とするマイクロ総合分析システム。
【請求項１４】
前記マイクロポンプが、流路抵抗が差圧に応じて変化する第１流路と、
差圧の変化に対する流路抵抗の変化割合が第１流路よりも小さい第２流路と、
第１流路および第２流路に接続された加圧室と、
該加圧室の内部圧力を変化させるアクチュエータと、
該アクチュエータを駆動する駆動装置とを備えることを特徴とする請求項１３に記載のマイクロ総合分析システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質が固定化された基材およびこれを用いるマイクロリアクタ、特に生体試料検査に好適に適用できるバイオリアクタを含むマイクロ総合分析システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、マイクロマシン技術および超微細加工技術を駆使することにより、従来の試料調製、化学分析、化学合成などを行うための装置、手段(例えばポンプ、バルブ、流路、セ
ンサーなど)を微細化して１マイクロリアクタ上に集積化したシステムが開発されている
。これは、μ−ＴＡＳ（Micro total Analysis System）、バイオリアクタ、ラブ・オン
・マイクロリアクタ（Lab-on-chips）、バイオマイクロリアクタとも呼ばれ、医療検査・診断分野、環境測定分野、農産製造分野でその応用が期待されている。とりわけ生体試料検査に見られるように、煩雑な工程、熟練した手技、機器類の操作が必要とされる場合には、自動化、高速化および簡便化されたミクロ化分析システムは、コスト、必要試料量、所要時間のみならず、時間および場所を選ばない分析を可能とすることによる恩恵は多大と言える（非特許文献１）。
【０００３】
これらの分析用マイクロリアクタにおける分析の定量性、解析の精度、経済性などが重要視される。そのためにはシンプルな構成で、高い信頼性の送液システムを確立することが課題となり、精度が高く、信頼性に優れるマイクロ流体制御素子が求められている。これに好適なマイクロポンプシステムを本発明者らはすでに提案している（特許文献１および２）。
【０００４】
マイクロリアクタに充填される試料は、通常、僅少量であるために、分析対象となる物質は極めて微量しか存在しないことが多い。マイクロリアクタにおいては、微量であっても高感度で精度良く分析することができるように技術的に対処することが求められる。そうした場合に微細流路で非特異的な吸着の問題が起きると、明らかに分析の微量化の障害となる。
【特許文献１】特開2001-322099号公報
【特許文献２】特開2004-108285号公報
【非特許文献１】「ＤＮＡマイクロリアクタ技術とその応用」、「蛋白質  核酸  酵素」43巻、13号（1998年）君塚房夫、加藤郁之進、共立出版（株）発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の基材は上記の実状に鑑みてなされたものであり、汎用性があり、分析の高感度化に好適である基材の提供、ならびにマイクロリアクタの基板もしくは流路エレメントとして使用することにより、迅速な処理および精度の高い検出を可能とするマイクロリアクタ、マイクロ総合分析システムの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の基材は、タンパク質およびｐＨ調整性凝集促進剤を表面に固定化させた基材である。
好適な前記タンパク質は、ストレプトアビジンまたはアルブミンである。
【０００７】
前記ｐＨ調整性凝集促進剤が、グルコン酸、リン酸またはグルコノ−δ−ラクトンであることが望ましい。
前記基材が、好ましくはソリッドフィルム、押出し成型されたプラスチック基板、またはポリマー・ビーズである。
【０００８】
前記基材が、少なくともポリスチレン、またはポリプロピレンを含んでなることを特徴としている。
本発明の一態様として、表面にストレプトアビジンおよびｐＨ調整性凝集促進剤が固定化されており、ビオチン化物質を、ビオチン−ストレプトアビジン複合体を形成して捕捉するトラップ用基材がある。他の態様として基板上に流路用微細溝が形成され、少なくとも該微細溝表面に、タンパク質およびｐＨ調整性凝集促進剤が固定化されていることを特徴とするマイクロリアクタ用基板もとり得る。
【０００９】
本発明の方法は、基材の存在下で、タンパク質溶液のｐＨを、ｐＨ調整性凝集促進剤を添加して、該タンパク質の等電点もしくはその近傍に調整することにより、該基材表面に該タンパク質を吸着させて固定化させることを特徴とするタンパク質の基材への固定化方法である。
【００１０】
前記タンパク質がストレプトアビジンまたはアルブミンであり、前記ｐＨ調整性凝集促進剤が、酸であることが望ましい。
本発明のマイクロリアクタは、
一つのチップ内に、少なくとも
検体またはコントロールが注入される検体収容部と、
試薬類が収容される試薬収容部と、
これらの収容部に連通する流路と、
検体の処理または反応を行う処理・反応部と、ならびに
これらの収容部および流路内の液体を送液する別途のマイクロポンプに接続可能なポンプ接続部が各収容部の上流側に設けられ、
該処理・反応部から送出されるビオチン化物質をトラップするための、請求項１〜６のいずれかに記載の基材がその下流の流路に配置され、かつ
前記マイクロリアクタにポンプ接続部を介してマイクロポンプを接続し、検体収容部に収容された検体の処理、分離、反応、検出を行うように構成されていることを特徴としている。
【００１１】
さらに、検体、コントロールまたは試薬が流通する流路が、請求項９に記載の基板上に形成されていてもよい。
好ましいマイクロリアクタの態様が、遺伝子検査用マイクロリアクタであり、これは
前記マイクロリアクタにポンプ接続部を介してマイクロポンプを接続し、検体収容部に収容された検体もしくは検体から抽出したＤＮＡと、試薬収容部に収容された試薬とを流路へ送液し、流路内で混合して増幅反応させた後、増幅されたＤＮＡを含む反応液と変性液とを混合し、増幅されたＤＮＡを一本鎖に変性処理して得られた処理液を、請求項６に記載のトラップ用基材を配置した流路に送液し、増幅されたＤＮＡを固定化すること、ならびに
増幅されたＤＮＡと、プローブＤＮＡ収容部から送液されたプローブＤＮＡとを流路内で混合してハイブリダイゼーションさせ、この反応生成物に基いて増幅反応の検出を行うように構成されているマイクロリアクタである。
【００１２】
本発明のマイクロ総合分析システムは、
少なくともマイクロポンプ、検出装置および制御装置が一体化された装置本体と、この装置本体に装着可能な、請求項１0〜１２のいずれかに記載のマイクロリアクタとからな
り、装置本体にマイクロリアクタを装着することによりこれらのポンプ接続部にマイクロポンプが接続され、各マイクロポンプから駆動液を供給することにより試薬収容部から試
薬を流路へ押し出して反応を開始するように構成され、処理、分離、反応もしくは検出を自動的に行うことを特徴としている。
【００１３】
前記マイクロポンプが、流路抵抗が差圧に応じて変化する第１流路と、
差圧の変化に対する流路抵抗の変化割合が第１流路よりも小さい第２流路と、
第１流路および第２流路に接続された加圧室と、
該加圧室の内部圧力を変化させるアクチュエータと、
該アクチュエータを駆動する駆動装置とを備えることが望ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の基材において、等電点近傍でタンパク質が基材表面に効率よく吸着され、しかも効果的に固定化されている。このような基材は、マイクロリアクタの基板もしくは流路エレメントとして好適である。本発明の基材を使用することにより微量の検体であっても感度の高い検出を可能とする汎用性マイクロリアクタを、低コストで作製することができる。
【００１５】
本発明のマイクロリアクタおよびマイクロ総合分析システムは、遺伝子発現解析、遺伝子機能解析、１遺伝子多型解析（ＳＮＰ）、医薬スクリーニング、医薬、農薬あるいは各種化学物質の安全性・毒性の検査、医療の臨床診断、食品検査、法医学、化学、醸造、農林業、漁業、畜産、農産製造等の分野で適用可能である。
[発明の詳細な説明]
本明細書において、「流体」とは、流体収容部などからマイクロポンプにより送出され、マイクロリアクタ内の流路を流れるものであり、適用する流体として液体、流動体、気体などであってもよい。対象とする流体は、実際は液体であることが多く、具体的には、各種の試薬類、試料液、変性剤液、洗浄液、駆動液などが該当する。なお、「流路エレメント」とは、マイクロリアクタに設置される機能部品をいう。「微細流路」は、本発明のマイクロリアクタ基板上に形成された微小な溝状の流路のことである。「検査チップ」は、本マイクロリアクタの一態様である。「遺伝子」とは、何らかの機能を発現する遺伝情報を担うＤＮＡまたはＲＮＡをいうが、単に化学的実体であるＤＮＡ、ＲＮＡの形でいうこともある。「ビオチン化物質」とは、ビオチンを結合させた物質をいう。分析対象である標的物質（分析対象物）を「アナライト」ということもある。
【００１６】
以下、本発明の基材、これを用いるマイクロリアクタおよびこのマイクロリアクタとマイクロポンプ、制御装置、検出装置とからなるマイクロ総合分析システムについて説明する。
基材
本発明の基材は、タンパク質およびｐＨ調整性凝集促進剤を表面に固定化させた基材である。そのような基材は、各種の形態をとり得るものであり、アッセイプレート、ビーズ、チップ、チューブ、メンブレンなどの分析用具のみならず、本発明であるマイクロリアクタの基板または流路エレメントとして好ましく用いられる。
【００１７】
上記タンパク質は、基材を部材として使用する目的に応じて適宜選択される。特に、酸性領域で等電点を有するタンパク質が好ましい。タンパク質を固定化した基材が、物質の選択的トラップ、分離、濃縮などに利用される場合には、生体分子の結合・分離に関わるタンパク質であれば特に限定されない。例えば、抗原、抗体、アビジン、ストレプトアビジンなどが挙げられる。生体物質の各種分析に広範に用いられているアビジン、ストレプトアビジンが望ましい。特にストレプトアビジンが好ましい。ストレプトアビジンは、ビオチン親和性タンパク質であり、ビオチンと高度に特異的に、しかも強固な結合（Ｋｄ＝10-15Ｍ）を形成する。したがって、ビオチン化物質の選択的捕捉に好適である。
【００１８】
前記基材は、ソリッドフィルム、押出し成型されたプラスチック基板、またはポリマー・ビーズ、シート、チューブなどの各種形態をとり得る。なお、延伸されたフィルムでは、タンパク質が面方向に薄く吸着され、緻密な固定化を図る観点からは問題がある。
【００１９】
前記基材は、ポリマー樹脂であることが好ましく、そうした基材ポリマーは、アクリル系、ビニル系、スチレン系などが挙げられるが、少なくともポリスチレン、またはポリプロピレンを含んでなることが望ましい。また、スチレン/アクリル系のコポリマーであっ
てもよい。
【００２０】
ポリスチレンは疎水性であり、後述するようにタンパク質を吸着する傾向が強い性質を利用することにより、微細流路上の下流地点に、ビオチン結合性タンパク質（例えばアビジン、ストレプトアビジンなど）を吸着させた流路エレメント、例えば検出部位を形成することも行なわれる。具体的態様の一例として、遺伝子検査用マイクロリアクタにおいては、表面にストレプトアビジンおよびｐＨ調整性凝集促進剤が固定化されており、ビオチン標識されたＤＮＡ（ビオチン化ＤＮＡ）を、ビオチン−ストレプトアビジン複合体を形成してトラップすることによりＤＮＡを検出するための流路エレメントとして、本発明の基材が使用される。
【００２１】
このような基材にタンパク質を効率よく、しかも効果的に固定化させるには、そのタンパク質の等電点もしくはその付近で行うことが望ましい。等電点でそのタンパク質の溶解度が最小となるためである。これは、等電点電気泳動法や等電点沈殿法に見られるように、タンパク質が一般にその固有の等電点およびその近傍では、表面電荷について中和状態となり、静電的反発作用が弱くなる反面、疎水結合などの他の相互作用が相対的に強化される。したがって、同種のタンパク質同士が凝集しやすくなり、タンパク質の露出した疎水部分が基材疎水性表面との疎水結合相互作用が促進される。
【００２２】
タンパク質の固定化を促進するために、本発明では、タンパク質凝固剤を使用する。タンパク質凝固剤には、エタノール、アセトン、ＤＭＳＯなどの変性剤、ポリエチレングリコールなどの凝集剤、２価金属イオンを含む塩などのタンパク質沈殿剤を中心に各種のものが知られている。本発明では、好ましい凝固剤として、タンパク質溶液のｐＨを等電点もしくはその近傍へ移行させるためのｐＨ調整性凝集促進剤を使用する。ここで「ｐＨ調整性凝集促進剤」とは、主としてタンパク質溶液のｐＨを調整することにより、その溶解度を可変させ得ることのできる凝固剤を意味している。このようなｐＨ調整性凝集促進剤には、溶液のｐＨを調整するための酸が一般に使用される。その酸として、鉱酸、有機酸を問わない。例えば、グルコン酸、グルコノ−δ−ラクトン、リン酸、アスコルビン酸、フィチン酸などが挙げられる。特に好ましいｐＨ調整性凝集促進剤は、グルコン酸、リン酸もしくはグルコノ−δ−ラクトンである。溶液中ではグルコン酸とグルコノ−δ−ラクトンとは、互いにｐＨにより変化する平衡状態をとる。
【００２３】
本発明の方法における、タンパク質の基材への固定化方法は、固定化の担体である基材が存在する状況の下でｐＨ調整性凝集促進剤を添加し、タンパク質を含む溶液のｐＨをその等電点もしくはその近傍に調整することにより、該基材表面に該タンパク質を吸着させて固定化させることを特徴としている。この場合の好ましい固定化の態様として、基材が存在する状況のもとに、ｐＨ調整性凝集促進剤を添加することによりタンパク質溶液のｐＨをその等電点近傍へ急速に（いわばショック的に）移行させて、タンパク質の溶解度の急激な低下に伴う凝集と基材表面への固着を同時的に引き起こすことが望ましい。
【００２４】
特に前記タンパク質がストレプトアビジンであり、前記ｐＨ調整性凝集促進剤が、酸であることが望ましい。酸としては、グルコン酸、グルコノ−δ−ラクトンまたはリン酸が好ましい。
ブロッキング処理されたマイクロリアクタ用基板
タンパク質およびｐＨ調整性凝集促進剤を表面に固定化させた本発明の基材のもう一つの好ましい態様は、マイクロリアクタ用基板である。すなわち、基板上に流路用微細溝が形成され、少なくとも該微細溝表面に、上記のようにしてｐＨ調整性凝集促進剤およびタンパク質が固定化されていることを特徴としている。
【００２５】
上記マイクロ化分析システムを用いる分析において、複数の流体、例えば試薬、試料をマイクロリアクタの微細流路内を流通させて混合することが、ほとんど例外なく必要な工程として組み込まれる。マイクロリアクタでは、小さいプレートに微細な流路、流路エレメントが設けられることから、そのような微細空間内で詰りを起こすか、空気が混入し、気泡が生じる事態になると、流体が円滑に流れ、分割され、混合し、反応することが効率よく行なわれない。さらに微量物質を分析する場合に、流路途中で吸着されてロスが生じることがある。酵素などを含む試薬液も、流路内壁に該酵素が吸着されると必要な試薬量が増大する。
【００２６】
そこで溝形成基板など流路を形成加工する基板の基材は、吸水による流路の変形などが起こりにくく、微量の検体液が途中でロスすることなく送液されるように疎水性、溌水性のプラスチックが好ましい。このような材質には、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリエチレンビニルアルコール、ポリカーボネート、ポリメチルペンテン、フルオロカーボン、飽和環状ポリオレフィンなどの樹脂が例示される。溝形成基板には、特にポリスチレン系樹脂が好ましい。ポリスチレンが、透明性、機械的特性および成型性に優れて微細加工がしやすく、次のようなブロッキング処理もしやすいからである。
【００２７】
本発明のマイクロリアクタ用基板は基板上に流路用微細溝が形成されが、少なくとも該微細溝表面に、タンパク質およびｐＨ調整性凝集促進剤が固定化されている（ブロッキング処理）。固定化の方法は、上記したように、固定化の担体である基板が存在する状況の下で、ｐＨ調整性凝集促進剤を添加して、タンパク質を含む溶液のｐＨをその等電点もしくはその近傍に調整することにより、該基材表面に該タンパク質を吸着させて固定化させる。好適なタンパク質として、アルブミン、カゼイン、ゼラチンまたはヘパリンが挙げられる。そのうちの1種でもよいが、２種以上併用してもよい。特に好ましくは、アルブミ
ン、とりわけ牛血清アルブミン（BSA）が安価であり容易に入手できる。
【００２８】
このような基板を用いることにより、マイクロリアクタの流体が流通する微細流路のうち、少なくとも検体が流れる微細流路またはタンパク質を含む試薬が流れる微細流路の内壁がタンパク質によりコーティングされているために、その流路内壁への生体物質の非特異的な結合もしくは吸着が防止される。マイクロリアクタでは、かかる基板とともに上述のストレプトアビジンなどを固定化した基材も目的に応じて適宜の部位で使用してもよい。
マイクロリアクタおよびマイクロ総合分析システム
本発明のマイクロリアクタ、マイクロ総合分析システムについて説明する。
【００２９】
本発明のマイクロ総合分析システムは、
少なくともマイクロポンプ、検出装置および制御装置が一体化された装置本体と、この装置本体に装着可能な、下記のマイクロリアクタとからなり、
その装置本体は、少なくとも
ベース本体と、そのベース本体内に一体的に配置され、
そのマイクロリアクタに連通させるための流路開口を有するマイクロリアクタ接続部と複数のマイクロポンプとを含むマイクロポンプユニットと、
検出・処理のための検出装置と、
少なくとも温度、該マイクロポンプユニットの機能と該検出装置の機能とを制御する制御装置と、
を備え、
装置本体にマイクロリアクタを、該マイクロリアクタのポンプ接続部と該マイクロポンプユニットのマイクロリアクタ接続部とを液密に密着させた状態で装着することによりこれらのポンプ接続部にマイクロポンプが接続され、各マイクロポンプから駆動液を供給することにより試薬収容部から試薬を流路へ押し出して反応を開始するように構成され、処理、分離、反応もしくは検出を自動的に行うことを特徴としている。
【００３０】
上記マイクロリアクタは、
一つのチップ内に、少なくとも
検体またはコントロールが注入される検体収容部と、
試薬類が収容される試薬収容部と、
これらの収容部に連通する流路と、
検体の処理または反応を行う処理・反応部と、ならびに
これらの収容部および流路内の液体を送液する別途のマイクロポンプに接続可能なポンプ接続部が各収容部の上流側に設けられ、
該処理・反応部から送出されるビオチン化物質をトラップするための、請求項１〜６のいずれかに記載の基材がその下流の流路に配置され、かつ
前記マイクロリアクタにポンプ接続部を介してマイクロポンプを接続し、検体収容部に収容された検体の処理、分離、反応、検出を行うように構成されていることを特徴としている。
【００３１】
この場合のマイクロリアクタは、分析チップまたは検査チップとも称される分析用マイクロリアクタである。以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。
図１は、本発明のマイクロ総合分析システムの一実施形態における構成を示した概念図である。かかる実施形態では、図示したように検査チップ（マイクロリアクタ）２、ならびにこのマイクロリアクタを収容する装置として、反応のための加熱・冷却ユニット（ペルティエ素子３、ヒーター４）と、送液用マイクロポンプ11、駆動液タンク10およびマイクロリアクタ接続部を有するマイクロポンプユニットと、その送液、温度、反応の各制御に関わる制御装置（図示せず）と、光学検出系（ＬＥＤ６、ホトダイオード５など）と、データの収集（測定）および処理を受け持つ検出処理装置（図示せず）とを備えているシステム本体１とから構成されている。
【００３２】
検査チップ２は、例えば樹脂、ガラス、シリコン、セラミックスなどを材料とし、そこに微細加工技術によりその幅および高さが約１０μｍ〜数百μｍのマイクロオーダーのサイズを有する微細流路を形成したものである。その縦横のサイズは、通常、数十ｍｍ、高さが数ｍｍ程度である。
【００３３】
上記検査チップ２では、各種試薬の収容部、検体収容部などの各収容部内の液体が、マイクロポンプに連通させるための流路開口を有するポンプ接続部12によってこれらの各収容部に連通された上記マイクロポンプ11で送液される。
【００３４】
検査チップ２以外の構成要素については、これらを一体化したシステム装置本体１とし、検査チップ２をこの装置本体に着脱するように構成することが望ましい。またマイクロポンプ11は、検査チップ２に設けることも可能であるが、通常、複数のマイクロポンプが装置本体に組み込まれる。これら複数のマイクロポンプと、マイクロリアクタに連通させるための流路開口を有するマイクロリアクタ接続部とを含むマイクロポンプユニットが、本発明システム本体のベース本体内に配置されている。図示したように検査チップ２を該装置本体に装着し、面同士で重ね合わせることにより検査チップ２のポンプ接続部を装置
本体のマイクロポンプユニットにあるマイクロリアクタ接続部のポートに接続するようになっている。
【００３５】
マイクロポンプ11を制御する電気制御系統の装置は、流量の目標値を設定し、それに応じた駆動電圧をマイクロポンプに供給している。そうした制御を受け持つ制御装置についても、本発明システムの装置本体に組み込んで、マイクロリアクタのポンプ接続部を装置本体のマイクロポンプユニットのマイクロリアクタ接続部に接続させた場合に作動制御させるようにしてもよい。
【００３６】
少なくとも前記マイクロポンプユニットの機能と検出処理装置の機能とを制御する制御装置が本発明システムの装置本体に組み込まれている。その制御装置は、さらに温度管理、測定データの記録と処理なども含めてシステムを統括的に制御支配させてもよい。この場合の制御装置は、予め送液順序、容量、タイミングなどに関して設定された諸条件を、マイクロポンプおよび温度の制御とともにプログラムの内容として有する。
【００３７】
測定試料である検体の前処理、反応および検出の一連の分析工程は、前記のマイクロポンプ、検出処理装置および制御装置とが一体化されたシステム装置本体１に、マイクロリアクタを装着した状態で分析が行なわれる。装着したマイクロリアクタに試料を注入してから、あるいは試料を注入したマイクロリアクタを装置本体に装着してから分析を開始してもよい。試料および試薬類の送液、前処理、混合に基づく所定の反応および光学的測定が、一連の連続的工程として自動的に実施され、測定データが、必要な条件、記録事項とともにファイル内に格納される形態が望ましい。
【００３８】
光学系検出手段として特に限定されないが、例えば可視分光法、蛍光測光法などの手法が適用され、LED、光電子増倍菅、CCDカメラなどが検出処理装置の構成要素としてシステム装置本体内に適宜設置される。
【００３９】
・マイクロリアクタ
本発明に係るマイクロリアクタは、血液などの検体をマイクロリアクタの検体注入部に注入することにより、マイクロリアクタ内で所定の反応、例えば合成反応、化学反応、抗原抗体反応、遺伝子増幅反応および反応・検出に必要なその他の処理（前処理、分離、濃縮など）を自動的に行い、多項目について同時に、かつ短時間で検査ができるような構成が可能である。
【００４０】
本発明のマイクロリアクタには、流路などが形成されたマイクロリアクタにマイクロポンプを接続して使用するものの他に、マイクロリアクタにマイクロポンプが予め接続されたもの、および、マイクロリアクタとともにマイクロポンプ、弁などを制御する制御系統を備えた態様のものも含まれる。また、マイクロポンプなどを備えた別途の装置本体にマイクロリアクタを装着して反応、検出を行う態様のものであってもよく、この装置本体は、送液、温度、反応の各制御に関わる制御系、光学検出、データの収集および処理を受け持つユニットなどにより構成される。遺伝子検査の用途では、この装置本体は、これにマイクロリアクタを装着することにより検体サンプルに対して共通で使用されるので、多数の検体があっても効率よく迅速に処理できる。
【００４１】
上記のマイクロリアクタは、いずれのコンポーネントも小型化され、持ち運びに便利な形態としているために、使用する場所および時間に制約されず、作業性、操作性が良好である。
【００４２】
本発明のシステムに用いられるマイクロリアクタは、検査チップ２として化学分析、各種検査、試料の処理・分離、化学合成などに利用されるように、各流路エレメントまたは
構造部が、機能的に適当な位置に微細加工技術により配設されている（図２）。検査チップ２には、流体収容部として検体を収容する検体収容部のほか、各試薬を収容するための複数の試薬収容部が設けられ、この試薬収容部には所定の反応に用いる試薬類、洗浄液、変性処理液などが収容される（図２）。これは、場所や時間を問わず迅速に検査ができるように、予め試薬類が収容されていることが望ましいためである。マイクロリアクタ内に内蔵される試薬類などは、蒸発、漏失、気泡の混入、汚染、変性などを防止するため、その試薬収容部の表面が密封処理されている。
【００４３】
本発明のマイクロリアクタにおける好ましいその構造は、溝形成基板および被覆基板なる基本的基板を用いて、構造部として、ポンプ接続部、弁基部および液溜部（試薬収容部、検体収容部、洗浄液収容部などの各収容部、廃液貯留部）、送液制御部、逆流防止部、試薬定量部、混合部、廃液貯留部など）の構造部を必要に応じて配置されるとともに、流路が少なくとも該溝形成基板上に形成されている。該溝形成基板におけるこれらの構造部、該流路および検出部を、被覆基板が密着して覆っており、少なくとも検出部を光透過性の被覆基板を密着して覆うことが望ましい。
【００４４】
本発明のマイクロリアクタを使用する好ましい検査の態様では、必要な試薬類があらかじめ所定の量、封入されており、該マイクロリアクタが検体ごとに使用される。例えば遺伝子検査用のマイクロリアクタは、検体のＤＮＡ（検体から抽出したＲＮＡを逆転写反応により合成したＤＮＡも含む）とＤＮＡ増幅反応用試薬類との増幅反応、ならびに増幅産物の検出を行うユニットとして使用される。すなわち遺伝子検査用として好適なマイクロリアクタは、次のように構成されている。
【００４５】
前記マイクロリアクタにポンプ接続部を介してマイクロポンプを接続し、検体収容部に収容された検体もしくは検体から抽出したＤＮＡと、試薬収容部に収容された試薬とを流路へ送液し、流路内で混合して増幅反応させた後、増幅されたＤＮＡを含む反応液と変性液とを混合し、増幅されたＤＮＡを一本鎖に変性処理して得られた処理液を、上記トラップ用基材を配置した流路に送液し、増幅されたＤＮＡを固定化すること、ならびに
増幅されたＤＮＡと、プローブＤＮＡ収容部から送液されたプローブＤＮＡとを流路内で混合してハイブリダイゼーションさせ、この反応生成物に基いて増幅反応の検出を行う。
【００４６】
マイクロリアクタの基本構造は、通常は１以上の成形材料を適宜組み合わせて作製されるが、その成型材料として様々な成形材料が使用可能であり、個々の材料特性に応じて使用される。例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレンなどのフルオロカーボン樹脂、ポリジメチルシロキサンなどのポリシロキサン系ポリマー、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、エチレン−ビニルアルコール共重合体などのポリオレフィン系ポリマー、ポリエチレンテレフタレートやポリブチレンテレフタレートなどのポリエステル系ポリマー、６−ナイロン、６，６−ナイロンなどのポリアミド系ポリマー、環状シクロオレフィン樹脂、ポリアリレート樹脂、酢酸セルロースやニトロセルロースのようなセルロース系ポリマー、各種の無機ガラス、シリコン、セラミックス、金属などが挙げられる。なかでもポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサンなどのポリシロキサン系ポリマー、シリコン、ガラスなどが好ましい。もっとも本発明はこれらの例示に限定されるものではない。
【００４７】
このように材料の選択肢は幅広く各種の材料を用いることができるが、加工性、耐薬品性、耐熱性、廉価性などを満たすことが望まれる。このような要求すべてに応え得る、優れた単一の材料はないために、マイクロリアクタの構造、用途、検出方法などを考慮して
マイクロリアクタ材料を適切に選択することが求められる。例えば、半導体製造技術で培われたフォトリソグラフィー、エッチングといった加工技術が活かせるシリコンは、不透明で高価であるという難点がある。透明な耐熱性の材料であるガラスでは、生体物質が非特異的に吸着され、加工性が必ずしも良好でないという問題点がある。そこで複数の材料を適宜組み合わせたマイクロリアクタも作製されている。また多数の測定検体、とりわけ汚染、感染のリスクのある臨床検体を対象とするマイクロリアクタに対しては、ディスポーサブルであることが望まれ、さらに多用途対応性、量産性などを具えることが望ましい。
【００４８】
以上の観点から本発明のシステムに使用されるマイクロリアクタにおいては、その流路、流路エレメントおよび躯体は、マイクロリアクタを製造容易なディスポーサブルタイプとするために、量産可能であり、軽量で衝撃に強く、焼却廃棄が容易なプラスチック樹脂で形成される。用いられるプラスチック樹脂は、好ましくは加工成形性、非吸水性、耐薬品性、耐熱性、廉価性などの特性が良好であることが望まれる。これらの材質特性を少しでも多く有するプラスチックを使用すれば、マイクロリアクタを構成する部材の種類は少なくなり、加工製造の工程も複雑化しない。これに対して複雑な微細加工を基板に施し、各種の流路エレメントを配設した複数の基板を組み合わせて作製する集積型マイクロリアクタでは、システムの複雑化、精度の低下、製造コストの上昇を招きやすい。
【００４９】
分析の都合により100℃近くに加熱する必要がある場合には、耐熱性に優れる樹脂、例
えばポリカーボネート、ポリイミド、ポリエーテルイミド、ポリベンツイミダゾール、ポリエーテルエーテルケトンなどに変更する必要がある。
【００５０】
アナライトの検出を行う反応を進行させるために、マイクロリアクタの流路の所定箇所または反応部位を所望する温度まで加熱することが多い。加熱領域において局所的に加熱する温度は、通常１００℃程度までである。他方、高温では不安定になる検体、試薬類を冷却する必要に迫られることもある。マイクロリアクタ内のそうした局所的な温度の昇降を考慮して、適切な熱伝導率の材料を選択することが望ましい。このような材質としては、樹脂材、ガラス材などを挙げることができ、熱伝導率が小さい材質でこれらの領域を形成することにより、面方向への熱伝導が抑制され、加熱領域のみ選択的に加熱することができる。
【００５１】
蛍光物質または呈色反応の生成物などを光学的に検出するために、マイクロリアクタ表面のうち少なくとも微細流路の検出部位を覆うその検出部分は、光透過性である部材であることが必要である。したがって、光透過性の被覆基板は、透明な材料、アルカリガラス、石英ガラス、透明プラスチック類が使用可能である。その被覆基板は、透明板として、該溝形成基板上の、少なくともこれらの構造部、該微細流路および検出部を覆う形態となるように、溝形成基板と接着されている。なお、そうした被覆基板が、マイクロリアクタ上面全体を覆う形態でも構わない。
【００５２】
透明性の他に、可撓性も要求される場合には、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリジメチルシロキサンなどの材質が好ましい。
・微細流路
マイクロリアクタとしての検査チップ上の流路は、基板上に目的に応じて予め設計された流路配置に従って、形成される（図２）。流体が流れる流路は、例えば幅数十〜数百μｍ、好ましくは10〜200μｍ、深さ5〜500μｍ程度、好ましくは10〜300μｍに形成されるマイクロメーターオーダー幅の微細流路である。流路幅が50μｍ未満であると、流路抵抗が増大し、流体の送出および検出上不都合である。幅500μｍを超える流路ではマイクロ
スケール空間の利点が薄まる。その形成方法は、従来の微細加工技術による。典型的にはフォトリソグラフィー技術による感光性樹脂による微細構造の転写が好適であり、その転
写構造を利用して、不要部分の除去、必要部分の付加、形状の転写が行われる。マイクロリアクタの構成要素を型どるパターンをフォトリソグラフィー技術により作製し、このパターンを樹脂に転写成形する。したがって、マイクロリアクタの微細流路を形成する基本的基板の材料は、サブミクロンの構造も正確に転写でき、機械的特性の良好なプラスチックが好ましく用いられる。ポリスチレン、ポリジメチルシロキサンなどは形状転写性に優れる。必要であれば射出成形、押し出し成形などによる加工も使用してもよい。
【００５３】
・流路がブロッキング処理されたマイクロリアクタ
微細空間では、毛細管力、流路抵抗の影響により流体の粘性は上昇する。このような状況で微細流路内を流通する流体の流路抵抗に流路の材質もまた影響する。したがって、親水性よりも疎水性の流路壁の方が、水性流体との相互作用は少ないために流路抵抗の上昇を招かない。加えて流体の流れを止めたり、緩めたりなどする流体運動の制御に好都合である。そこで微細流路を形成する基板に、溌水性のプラスチック樹脂を使用すれば、流路内を特に撥水コーティングは必要ない。
【００５４】
反面、疎水性のプラスチック樹脂を使用すると、試薬中の酵素、抗体タンパク質などが流路の底面もしくは側面に吸着されてしまい、反応部位へ到達する前に著しいロスが生じる。あるいは検体由来の夾雑物タンパク質が吸着されて微細流路に残留して層流を乱すか、流路を部分的にも狭隘にする可能性がある。それ以上に深刻な問題は、特に検体液が少量である場合、アナライトとしての標的物質が微量しか含まれていない希薄な検体液の場合、そのような標的物質の流路途中でのロスは、分析の精度、感度に著しく影響する。さらに、核酸、細胞なども非特異的吸着を起こし得る。このようなサンプルのロスは、流路を構成するプラスチック上への非特異的吸着によるものである。
【００５５】
タンパク質、ＤＮＡなどの生体分子の流路内壁への非特異的な吸着を防止するには、流路壁に吸着されやすく、かつ反応などに影響を及ぼさない物質で、予め微細流路の内表面をコーティングしてもよい。ここで「ブロッキング」とは、一般には反応性を有する基を試薬などの反応物質から遮蔽することにより両者間で反応することを防止することであるが、本発明では、特に対象物質または標的物質などの生体分子が流路壁を含む固体表面に非特異的に結合もしくは吸着することを阻害することである。その作用を発現させるように行なう処理がブロッキング処理であり、使用する上記物質を含む組成物をブロッキング剤という。
【００５６】
例えば、プラスチックへのタンパク質の非特異的な結合もしくは吸着は、その種類と濃度に依存し、また個々のタンパク質の高次構造における相対的な疎水性の程度により、その吸着程度が変化する。 使用前にプラスチック部位にブロッキング処理をおこなうこと
で希薄な検体液についての分析の感度を上げることができる。プラスチック内壁にブロッキング剤を均一にコーティングしてもよいが、必ずしもそれは必要とされない。一様でなくとも標的物質などが非特異的に結合もしくは吸着されなければよいからである。
【００５７】
本発明の好適なブロッキング剤はタンパク質であり、特に限定されない。ただし、試薬、特に標的物質と検出のために接触させる反応試薬などと相互作用、反応などを起こさないことも必要である。
【００５８】
ブロッキング処理は、微細流路の内壁に吸着されるタンパク質を含む溶液をブロッキング剤として用いるが、より具体的にはアルブミン、カゼイン、ゼラチンまたはヘパリンの水溶液である。そのうちの1種でもよいが、２種以上併用してもよい。特に好ましくは、
アルブミン、とりわけ牛血清アルブミン（BSA）が安価であり容易に入手できる。かかる
ブロッキング処理は、マイクロリアクタ用基板の流路において、タンパク質を0.1〜10重
量％、好ましくは0.5〜5重量％、さらに好ましくは１〜3重量％含む溶液に、上記ｐＨ調
整性凝集促進剤を添加してｐＨをそのタンパク質の等電点またはその近傍に調整することにより、そのタンパク質およびｐＨ調整性凝集促進剤を基板表面に吸着させて行なわれる。
タンパク質濃度が0.1重量％未満であるとブロッキング処理の効果が出ず、また10重量％
を超えると、吸着されない分が無駄になる部分として出てくる。
【００５９】
一定時間、例えば５分〜２時間、好ましくは10分〜１時間だけ流路を満たして静置すると、タンパク質が微細流路内壁に吸着され覆うようになる。その後、洗浄液を流して余剰のブロッキング剤、気泡、ゴミなども微細流路から除去することを必要に応じて行う。マイクロリアクタを使用する時まで保管する都合上、流路に適用されたブロッキング剤は乾燥させることが望ましい。乾燥後はブロッキング剤のタンパク質は内壁に残留し、使用時には流体中の吸着性物質にはマスク作用を示す。
【００６０】
流路内壁とは、結合、吸着、付着などいずれの形態で付いてもよい。ブロッキング処理の溶液の溶媒は、特に限定はないが、流路内壁の表面性状に影響が少なく、溶液の伸展性が過度に大きくない水が好適である。
【００６１】
前記のブロッキング処理される流路が、マイクロリアクタのすべての微細流路について行なう必要は必ずしもない。しかしながら少なくともタンパク質を含有する試薬液、検体液またはその検体処理液が通過する流路は、ブロッキング処理することが望ましい。
【００６２】
上記ブロッキング処理により、微細流路内壁の表面にはＢＳＡなどが存在することとなり、流体中のタンパク質などの生体物質が結合することができなくなる。したがって流路内でのタンパク質等の非特異的な吸着が防止され、流路内の流体は、スムースに流れ、流体の混合、分割なども円滑に行なわれる。また気泡の発生も抑制されるか、空気が流路から抜けやすくなる。
【００６３】
・マイクロポンプユニット
本発明のシステム本体１は、ベース本体とともにそのベース本体内に配置され、該マイクロリアクタに連通させるための流路開口を有するマイクロリアクタ接続部と、複数のマイクロポンプとを含むマイクロポンプユニットを構成単位として有している。
【００６４】
マイクロポンプ11は、例えば複数のマイクロポンプがフォトリソグラフィー技術などにより形成されたマイクロリアクタ状のポンプユニットとして装置本体１に組み込まれていてもよい。マイクロポンプとしては、アクチュエータを設けた弁室の流出入孔に逆止弁を設けた逆止弁型のポンプなど各種のものが使用できるが、ピエゾポンプを用いることが好適である。図３（ａ）は、ピエゾポンプの一例を示した断面図、図３（ｂ）は、その上面図である。このマイクロポンプには、第１液室48、第１流路46、加圧室45、第２流路47、および第２液室49が形成された基板42と、基板42上に積層された上側基板41と、上側基板41上に積層された振動板43と、振動板43の加圧室45と対向する側に積層された圧電素子44と、圧電素子44を駆動するための駆動部（図示せず）とが設けられている。この駆動部と、圧電素子44表面上の２つの電極とは、フレキシブルケーブルなどによる配線で接続されており、かかる接続を通じて当該駆動部の駆動回路によって圧電素子44に特定波形の電圧を印加する構成となっている。
【００６５】
この例では、基板42として、厚さ５００μｍの感光性ガラス基板を用い、深さ１００μｍに達するまでエッチングを行なうことにより、第１液室48、第１流路46、加圧室45、第２流路47および第２液室49を形成している。第１流路46はその幅を２５μｍ、長さを２０μｍとしている。また、第２流路47は、その幅を２５μｍ、長さを１５０μｍとしている。
【００６６】
ガラス基板である上側基板41を、基板42上に積層することにより、第１液室48、第１流路46、第２液室49および第２流路47の上面が形成される。上側基板41の加圧室45の上面に当たる部分は、エッチングなどにより加工されて貫通している。
【００６７】
上側基板41の上面には、厚さ５０μｍの薄板ガラスからなる振動板43が積層され、その上に、例えば厚さ５０μｍのチタン酸ジルコン酸鉛（ＰＺＴ）セラミックスなどからなる圧電素子44が積層されている。
【００６８】
駆動部からの駆動電圧により、圧電素子44とこれに貼付された振動板43が振動し、これにより加圧室45の体積が増減する。第１流路46と第２流路47とは、幅および深さが同じで、長さが第１流路よりも第２流路の方が長くなっており、第１流路46では、差圧が大きくなると、流路内で渦を巻くように乱流が発生し、流路抵抗が増加する。一方、第２流路47では、流路幅が長いので差圧が大きくなっても層流になり易く、第１流路に比べて差圧の変化に対する流路抵抗の変化割合が小さくなる。
【００６９】
例えば、圧電素子44に対する駆動電圧により、加圧室45の内方向へ素早く振動板43を変位させて大きい差圧を与えながら加圧室45の体積を減少させ、次いで加圧室45から外方向へゆっくり振動板43を変位させて小さい差圧を与えながら加圧室45の体積を増加させると、流体は同図のＢ方向へ送液される。逆に、加圧室45の外方向へ素早く振動板43を変位させて大きい差圧を与えながら加圧室45の体積を増加させ、次いで加圧室45から内方向へゆっくり振動板43を変位させて小さい差圧を与えながら加圧室45の体積を減少させると、流体は同図のＡ方向へ送液される。
【００７０】
なお、第１流路と第２流路における、差圧の変化に対する流路抵抗の変化割合の相違は、必ずしも流路の長さの違いによる必要はなく、他の形状的な相違に基づくものであってもよい。
【００７１】
上記のように構成されたピエゾポンプによれば、ポンプの駆動電圧および周波数を変えることによって、所望する流体の送液方向、送液速度を制御できるようになっている。図３の（ａ）（ｂ）には図示されていないが、第１液室48には、駆動液タンク10につながるポート72が設けられており、その第１液室は、「リザーバ」の役割を演じ、ポート72で駆動液タンク10から駆動液の供給を受けている。第２液室49はマイクロポンプユニットの流路を形成し、その流路の先にマイクロリアクタ接続部のポート73があり、マイクロリアクタの「ポンプ接続部」12とつながる。
【００７２】
図３（ｃ）に、このポンプの他の例を示した。この例では、ポンプをシリコン基板71、圧電素子44、および図示しないフレキシブル配線から構成している。シリコン基板71は、シリコンウエハをフォトリソグラフィー技術により所定の形状に加工したものであり、エッチングにより加圧室45、ダイヤフラム43、第１流路46、第１液室48、第２流路47、および第２液室49が形成されている。第１液室48にはポート72が、第２液室49にはマイクロリアクタ接続部のポート73がそれぞれ設けられており、例えばこのピエゾポンプを図１の検査チップ２とは別体とする場合には、このポート73を介して検査チップ２のポンプ接続部12と連通する。例えば、ポート72、73が穿孔された基板74と、マイクロリアクタのポンプ接続部近傍とを上下に重ね合わせることによって、ポンプを検査チップ２に接続することができる。また、前述したように、１枚のシリコン基板に複数のポンプを形成することも可能である。この場合、検査チップ２と接続したポートの反対側のポートには、駆動液タンク10が接続されていることが望ましい。ポンプが複数個ある場合、それらのポートは共通の駆動液タンクに接続されてもよい。
【００７３】
上記マイクロポンプと、図１に示した本発明システムとの関係を以下説明する。図１の例では、マイクロポンプは、検査チップ２とは別の装置としてシステム本体に属し、駆動液タンクと連通している。マイクロポンプは、検査チップ２とは、両者が互いに所定の形態で接合したときに、マイクロポンプユニットにあるマイクロリアクタ接続部のポート73と、マイクロリアクタにあってマイクロポンプに連通させるための流路開口を有するポンプ接続部12とが連結してマイクロリアクタの流路と連通するようになる。
【００７４】
図４は、マイクロポンプとしてのピエゾポンプを図１の検査チップ２とは別体とした場合における検査チップ２のポンプ接続部周辺の構成を示す。この図でマイクロポンプの流体送出用のポートからマイクロリアクタの流路へと連通するポンプ接続部12から下流の流路がマイクロリアクタ上にある。（ａ）は駆動液を送液するポンプ部の構成を示し、同図（ｂ）は試薬を送液するポンプ部の構成を示している。ここで、24は駆動液の収容部であり、図１の駆動液タンクに相当する。駆動液は鉱物油などのオイル系、あるいは水系のいずれであってもよい。25は、予め収容された試薬を封止する封止液の収容部である。この封止液は、微細流路への漏出により試薬が反応してしまうこと等を防止するためのものであり、使用前に、マイクロリアクタが保管される冷蔵条件下では、固化もしくはゲル化しており、使用時、検査に適した温度にすると融解し流動状態となる。封止液は、微細流路中に充填してもよく、あるいは封止液用に設けられた貯留部に充填してもよい。
【００７５】
なお、別の態様として、マイクロポンプそのものもマイクロリアクタ上に組み込むことも可能である。特にマイクロリアクタ上の流路が比較的単純であり、繰り返し使用を前提とするような目的または用途、例えば化学合成反応用のマイクロリアクタ・マイクロリアクタとする場合にはこの形態を採り得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７６】
・マイクロリアクタの実施態様
検査チップ２は、例えば５０×７６×２ｍｍの大きさの矩形板状であり、好ましくは透明性、機械的特性および成型性に優れて微細加工がしやすいポリスチレン系樹脂からなる。
【００７７】
検査チップ２には、分析用または化学合成用の微細流路がパターニングされている。微細流路の寸法形状の例を挙げると、幅が１００μｍ程度、深さが１００μｍ程度の断面矩形の溝である。マイクロリアクタ内には、ポンプ接続部、微細流路、検体収容部、試薬収容部、送液制御部、反応部、検出部などが設けられ、それぞれ流路で連絡されている。さらに送液の精度を高めるために、逆流防止部、定量送液機構なども配設することが望ましい。上記以外の種々の構成および材料を採用することができる。
【００７８】
・分析の実施態様
本発明のマイクロ総合分析システムは、
前記マイクロリアクタのポンプ接続部と前記マイクロポンプユニットのマイクロリアクタ接続部とを液密に密着させた状態で該マイクロリアクタをベース本体内に装着した後、
検体液または該検体を流路内で処理した処理液に含まれるアナライト（標的物質）と、
試薬収容部に収容された試薬とを、
反応部位を構成する流路へ送液して合流させ、
これらを反応させた後、得られた反応生成物質もしくはその処理物質を、
検出部位を構成する流路へ送液してその検出を前記検出処理装置により自動的に行なうことが望ましい。
【００７９】
典型的には、図５に示されるように最上流部に位置する複数の試薬収容部18（18a、18b、18c）に収容された各試薬31が、試薬収容部より下流側の流路15で混合され、混合試薬
が下流の分析流路に送液される。分析流路において、検体19と混合試薬とがＹ字流路などから合流して混合され、昇温等により反応が開始され、流路15の下流に設けられた検出部位において反応が検出される。
【００８０】
本発明のマイクロ総合分析システムの好ましい一態様として、生体試料検査装置が提示される。特に本発明のシステムは、遺伝子または核酸（DNA、RNA）の検査に好適に用いることができる。その場合、検査チップ２の微細流路は、図６または図７に示されるようにＰＣＲ増幅に適した構成とされるが、遺伝子検査以外の生体物質についても基本的な流路構成はほぼ同一になるといえる。通常は検体前処理部、試薬類、プローブ類を変更すればよく、その場合、送液エレメントの配置、数などは変化するであろう。当業者であれば、例えばイムノアッセイ法のために必要な試薬類などを検査チップ２に搭載し、若干の流路エレメントの変更、仕様の変更を含む修正を施すことにより、分析の種類を容易に変更することができる。ここにいう遺伝子以外の生体物質とは、各種の代謝物質、ホルモン、タンパク質（酵素、抗原なども含む）などのアナライトをいう。
【００８１】
・生体試料検査
検査チップ２の好ましい一態様では、一つのマイクロリアクタ内において、
検体もしくは検体から抽出したアナライト（例えば、ＤＮＡ、RNA、遺伝子）が注入さ
れる検体収容部と、
検体の前処理を行なう検体前処理部と、
プローブ結合反応、検出反応（遺伝子増幅反応または抗原抗体反応なども含む）などに用いる試薬が収容される試薬収容部と、
ポジティブコントロールが収容されるポジティブコントロール収容部と、
ネガティブコントロールが収容されるネガティブコントロール収容部と、
プローブ（例えば、遺伝子増幅反応により増幅された検出対象の遺伝子にハイブリダイズさせるプローブ）が収容されるプローブ収容部と、
これらの各収容部に連通する微細流路と、
前記各収容部および流路内の液体を送液する別途のマイクロポンプに接続可能なポンプ接続部と、が設けられている（図６、図７）。
【００８２】
この検査チップ２には、ポンプ接続部12を介してマイクロポンプが接続され、検体収容部20に収容された検体19もしくは検体から抽出した生体物質（例えばＤＮＡまたはそれ以外の生体物質）と、試薬収容部18に収容された試薬31とを流路15へ送液し、微細流路の反応部位、例えば遺伝子増幅反応（タンパク質の場合、抗原抗体反応など）の部位で混合して反応させた後、その下流側流路にある検出部へ、この反応液を処理した処理液と、プローブ収容部に収容されたプローブとを送液し、流路内で混合してプローブと結合（またはハイブリダイゼーション）させ、この反応生成物に基づいて生体物質の検出を行なう（図６、図７）。
【００８３】
また、ポジティブコントロール収容部に収容されたポジティブコントロールおよびネガティブコントロールに収容されたネガティブコントロールについても同様に上記反応および検出を行なう。
【００８４】
検査チップ２における検体収容部20は、検体注入部に連通し、検体の一時収容および混合部への検体供給を行なう。検体収容部20の上面から検体を注入する検体注入部は、外部への漏失、感染および汚染を防ぎ、密封性を確保するために、ゴム状材質などの弾性体からなる栓が形成されているか、あるいはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などの樹脂、強化フィルムで覆われていることが望ましい。例えば、当該ゴム材質の栓を突き刺したニードルまたは蓋付き細孔を通したニードルでシリンジ内の検体を注入する。前者の場合、ニードルを抜くとその針穴が直ちに塞がることが好ましい。あるいは他の検体注入機構
を設置してもよい。
【００８５】
検体収容部20に注入された検体19は、必要に応じて、試薬31との混合前に、予め流路15に設けられた検体前処理部にて、例えば検体19と処理液とを混合することによって前処理される。そのような検体前処理部は、分離フィルター、吸着用樹脂、ビーズなどを含んでもよい。好ましい検体前処理として、アナライトの分離または濃縮、除タンパクなどが含まれる。例えば１％ＳＤＳ混合液などの溶菌剤を用いて溶菌処理・ＤＮＡ抽出処理を行なう。この過程では、細胞内部からＤＮＡが放出され、ビーズまたはフィルターの膜面に吸着する。
【００８６】
検査チップ２の試薬収容部18には、必要な試薬類31が予め所定の量だけ封入されている。したがって使用時にその都度、試薬31を必要量充填する必要はなく、即使用可能の状態になっている。検体中の生体物質を分析する場合、測定に必要な試薬類は、通常それぞれ公知である。例えば、検体に存在する抗原を分析する場合、それに対する抗体、好ましくはモノクローナル抗体を含有する試薬が使用される。抗体は、好ましくはビオチンおよびＦＩＴＣで標識されている。
【００８７】
遺伝子検査用の試薬類には、遺伝子増幅に用いられる各種試薬、検出に使用されるプローブ類、発色試薬とともに、必要であれば前記の検体前処理に使用する前処理試薬も含めてもよい。また洗浄液収容部には、必要とされる洗浄液が適宜収容されている（例えば２１ｄ）。マイクロポンプから駆動液を供給することにより各収容部から検体液および試薬液を押し出してこれらを合流させることによって、遺伝子増幅反応、アナライトのトラップまたは抗原抗体反応といった分析に必要な反応が開始される。
【００８８】
試薬と試薬との混合、および検体と試薬との混合は、単一の混合部で所望の比率で混合してもよく、あるいは何れかもしくは両方を分割して複数の合流部を設け、最終的に所望の混合比率となるように混合してもよい。
【００８９】
そうした反応部位の態様は特に限定されるものではなく、様々な形態および様式が考えられる。一例としては、試薬を含む２以上の液体を合流させる合流部（流路分岐点）から先に、各液が拡散混合される微細流路が設けられ、この微細流路の下流側端部から先に設けられた、該微細流路よりも広幅の空間からなる液溜めにおいて反応が行われる。
【００９０】
ＤＮＡ増幅方法としては、改良点も含めて各種文献などに記載され、多方面で盛んに利用されているＰＣＲ増幅法を使用することができる。ＰＣＲ増幅法においては、３つの温度間で昇降させる温度管理が必要になるが、マイクロリアクタに好適な温度制御を可能とする流路デバイスが、すでに本発明者らにより提案されている（特開２００４−１０８２８５号）。このデバイスシステムを本発明のマイクロリアクタの増幅用流路に適用すればよい。これにより、熱サイクルが高速に切り替えられ、微細流路を熱容量の小さいマイクロ反応セルとしているため、ＤＮＡ増幅は、手作業で行う従来の方式よりはるかに短時間で行うことができる。
【００９１】
最近開発されたＩＣＡＮ（Isothermal  chimera  primer  initiated  nucleic  acid 
amplification）法は、５０〜６５℃における任意の一定温度の下にＤＮＡ増幅を短時間で実施できるため（特許第３４３３９２９号）、本発明システムにおいても好適な増幅技術である。手作業では、１時間かかる本法は、本発明のシステムにおいては、１０〜２０分、好ましくは１５分で解析まで終わる。
【００９２】
検査チップ２の微細流路における反応部位よりも下流側には、アナライト、例えば増幅された遺伝子を検出するための検出部位が設けられている。少なくともその検出部分は、
光学的測定を可能とするために透明な材質、好ましくは透明なプラスチックとなっている。
【００９３】
さらに微細流路上の検出部位に固定化されているビオチン親和性タンパク質（例えばストレプトアビジン）はプローブ物質に標識されたビオチン、または遺伝子増幅反応に使用されるプライマーの５’末端に標識されたビオチンと特異的に結合する。これにより、ビオチンで標識されたプローブまたは増幅された遺伝子が本検出部位でトラップされる。このような検出部位は、上記トラップ用基材を配置して構成することができる。
【００９４】
分離されたアナライトまたは増幅された目的遺伝子のＤＮＡを検出する方法は特に限定されないが、好ましい態様として基本的には以下の工程で行われる。
（１ａ）  検体もしくは検体から抽出したＤＮＡ、あるいは検体もしくは検体から抽出したＲＮＡから逆転写反応により合成したｃＤＮＡと、５’位置でビオチン修飾したプライマーとを、これらの収容部から下流の微細流路へ送液する。
【００９５】
反応部位の微細流路内で、遺伝子を増幅する工程、微細流路内で増幅された遺伝子を含む増幅反応液と変性液とを混合して、増幅された遺伝子を変性処理により一本鎖にし、これと末端をＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）で蛍光標識したプローブＤＮＡとをハイブリダイズさせる。
【００９６】
次いで、ビオチン親和性タンパク質を吸着させた微細流路内の検出部位に送液し、前記増幅遺伝子を微細流路内の検出部位にトラップする（増幅遺伝子を検出部位でトラップした後に蛍光標識したプローブＤＮＡとをハイブリダイズさせてもよい。）。
（１ｂ）  検体に存在する抗原、代謝物質、ホルモンなどのアナライトに対する特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を含有する試薬を検体と混合する。その場合、抗体は、ビオチンおよびＦＩＴＣで標識されている。したがって抗原抗体反応により得られる生成物は、ビオチンおよびＦＩＴＣを有する。これをビオチン親和性タンパク質（好ましくはストレプトアビジン）を吸着させた微細流路内の検出部位に送液し、ビオチン親和性タンパク質とビオチンとの結合を介して該検出部位に固定化する。
（２）  上記微細流路内にＦＩＴＣに特異的に結合する抗ＦＩＴＣ抗体で表面を修飾した金コロイド液を流し、これにより固定化したアナライト・抗体反応物のＦＩＴＣに、あるいは遺伝子にハイブリダイズしたＦＩＴＣ修飾プローブに、その金コロイドを吸着させる。
（３）  上記微細流路の金コロイドの濃度を光学的に測定する。
【００９７】
以上、本発明のマイクロリアクタの実施形態について説明したが、本発明は、これらの実施形態に限定されることはなく、本発明の趣旨に沿って任意の変形、変更が可能であり、それらは本発明に含まれる。すなわち、本発明のマイクロリアクタの全体または一部について、構造、構成、配置、形状形態、寸法、材質、方式、方法などを本発明の趣旨に合致する限り、種々のものにすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】図１は、マイクロリアクタと装置本体とからなるマイクロ総合分析システムであり、マイクロ総合分析システムの一つの実施形態として概略構成を示す。
【図２】図２は、図１の検査チップ（マイクロリアクタ）の概略図である。
【図３】図３は、ピエゾポンプを示し、図３（ａ）は、このポンプの一例を示した断面図、図３（ｂ）は、その上面図である。図３（ｃ）は、ピエゾポンプの他の例を示した断面図である。
【図４】図４は、ピエゾポンプをチップとは別体とした場合におけるチップのポンプ接続部周辺の構成を示した図である。
【図５】図５は、検査チップでの試薬収容部を示す部分拡大図である。この図で流体の合流および混合が行なわれる流路構成の一例を示す。
【図６】図６は、ＤＮＡ検査用検査チップ上の微細流路系統の一態様を示す。
【図７】図７は、図６とは微細流路系統が異なる態様を示す。
【符号の説明】
【００９９】
１  装置本体
２  検査チップ
３  ペルチェ
４  ヒーター
５  ホトダイオード
６  ＬＥＤ
１０  駆動液タンク
１１  マイクロポンプ（ピエゾポンプ）
１２  ポンプ接続部
１３  送液制御部
１５  微細流路
１６  逆流防止部
１７ａ  試薬貯留部
１７ｂ  検体貯留部
１８  試薬収容部
１９  検体
２０  検体収容部
２１ａ  停止液収容部
２１ｂ  変性液収容部
２１ｃ  ハイブリダイゼーションバッファー収容部
２１ｄ  洗浄液収容部
２１ｅ  金コロイド収容部
２１ｆ  プローブＤＮＡ収容部
２１ｇ  インターナルコントロール用プローブＤＮＡ収容部
２１ｈ  ポジティブコントロール収容部
２１ｉ  ネガティブコントロール収容部
２１ｊ  バッファー収容部
２２  検出部
２３  廃液貯留部
２４  駆動液収容部
２５  封止液収容部
２６  空気抜き用流路
３１  試薬
４１  上側基板
４２  基板
４３  振動板
４４  圧電素子
４５  加圧室
４６  第１流路
４７  第２流路
４８  第１液室
４９  第２液室
７１  シリコン基板
７２  ポート
７３  ポート
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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