(57)【要約】      （修正有）【課題】スポッターを利用して選択結合性物質固定化担体を製造するにあたり、ピンの洗浄を十分に達成することができ、かつ、キャリーオーバーを低減した高品質な選択結合性物質固定化担体を製造することのできる手段を提供。【解決手段】選択結合性物質を含む溶液にピンを浸漬させた後、ピンを担体に接触させて担体に選択結合性物質を点着する工程、及び前記ピンを非プロトン性極性溶媒を含む溶液へ浸漬させる工程を含むことを特徴とする選択結合性物質結合担体の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択結合性物質固定化担体をスポッターを用いて製造するにあたり、
選択結合性物質を含む溶液にスポッターのピンを浸漬させた後、ピンを担体に接触させて担体に選択結合性物質を点着する工程、及び
前記ピンを非プロトン性極性溶媒を含む溶液へ浸漬させる工程
を含むことを特徴とする選択結合性物質結合担体の製造方法。
【請求項２】
前記ピンを選択結合性物質を含まない水又は水溶液に浸漬させる工程を更に含むことを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記ピンの浸漬には、流動式の溶液を用いることを特徴とする請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記選択結合性物質が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、糖、糖鎖又は脂質であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記非プロトン性極性溶媒が、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド、N−メチル−２−ピロリドン、又はγ−ブチルラクトンであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記担体は、表面に凹凸部を備える担体であって、凹凸部の凸部上面に選択結合性物質が点着されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、選択結合性物質固定化担体の製造方法に関し、詳しくは、スポッターのピンの洗浄を十分に達成することができ、かつ、キャリーオーバーを低減した高品質な選択結合性物質固定化担体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）は、ガラスの平面基板片上に、多数のＤＮＡ断片や蛋白質、糖鎖が高密度に整列固定化されたもの（マイクロアレイ又はＤＮＡチップ）を用いて、多数の遺伝子発現を一度に解析する分析法であり、各種生物の遺伝情報解析の研究や、遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰ）を検出する手段としても大きく期待されている。また、上記ＤＮＡチップを応用してＤＮＡ以外の核酸やタンパク質等を結合したチップの開発も進んでいる。
【０００３】
核酸等の選択結合性物質を基板上に固定化する技術として、スライドガラス等の平坦な基板の上に、ポリ−Ｌ−リシン、アミノシラン等をコーティングして、スポッターと呼ばれる点着装置を用い、各核酸を固定化する方法などが開発されている（例えば、特許文献１参照）。この方法では、スポッターのピンの先端に所望のＤＮＡを含む溶液を接触させてから、ピンを担体の所定の位置に接触させて点着し、この作業を繰り返して所定種類のＤＮＡを担体に点着する。
【０００４】
スポッターを用いる上記方法の場合、他のＤＮＡの混在を防ぎ所定の位置に所定のＤＮＡが点着されるように、ＤＮＡを含む溶液にピンを接触させる前に、ピンを洗浄することが望ましい。特に、スポッターを繰り返し利用する場合には混在を防ぐために点着ごとに確実に洗浄を行う必要がある。従来、ピンの洗浄液として、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）水溶液、純水、エタノール（静置槽）が用いられるスポッターがあった。
【０００５】
【特許文献１】特表平１０−５０３８４１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上述の従来のスポッターのピンの洗浄液においては、洗浄が十分に行われない場合が多く、ＳＤＳ水溶液、純水、エタノールの３種類を組み合わせても洗浄が不十分な場合があった。特に感度の高いチップの場合、洗浄が不十分であると、顕著なキャリーオーバーが観察され、チップを利用した検出に支障が生じる場合があった。
本発明は、上記の課題に鑑みて、スポッターを利用して選択結合性物質固定化担体を製造するにあたり、ピンの洗浄を十分に達成することができ、かつ、キャリーオーバーを低減させることのできる手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の発明を提供するものである。
〔１〕  選択結合性物質固定化担体をスポッターを用いて製造するにあたり、
選択結合性物質を含む溶液にスポッターのピンを浸漬させた後、ピンを担体に接触させて担体に選択結合性物質を点着する工程、及び
前記ピンを非プロトン性極性溶媒を含む溶液へ浸漬させる工程
を含むことを特徴とする選択結合性物質結合担体の製造方法。
〔２〕  前記ピンを選択結合性物質を含まない水又は水溶液に浸漬させる工程を更に含むことを特徴とする上記〔１〕記載の製造方法。
〔３〕  前記ピンの浸漬には、流動式の溶液を用いることを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕に記載の製造方法。
〔４〕  前記選択結合性物質が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、糖、糖鎖又は脂質であることを特徴とする上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載の製造方法。
〔５〕  前記非プロトン性極性溶媒が、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド、N−メチル−２−ピロリドン、又はγ−ブチルラクトンであることを特徴とする、上記〔１〕〜〔４〕のいずれか一項に記載の製造方法。
〔６〕  前記担体は、表面に凹凸部を備える担体であって、凹凸部の凸部上面に選択結合性物質が点着されることを特徴とする上記〔１〕〜〔５〕のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、スポッターのピンの洗浄を十分に達成することができ、かつ、キャリーオーバーを低減した選択結合性物質固定化担体の製造方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の選択結合性物質結合担体の製造方法は、スポッターを用いる該担体の製造方法に関し、選択結合性物質を含む溶液にピンを浸漬させた後、ピンを担体に接触させて担体に選択結合性物質を点着する工程（工程（１））、及び前記ピンを非プロトン性極性溶媒を含む溶液へ浸漬させる工程（工程（２））を含むことを特徴とする。
【００１０】
まず、工程（１）について説明する。工程（１）では、選択結合性物質を含む溶液にスポッターのピンを浸漬させた後、ピンを担体に接触させて担体に選択結合性物質を点着する。
ピンとは、選択結合性物質を含む溶液を保持し、担体に接触させることで保持した溶液を点着させることができる構造物であり、溶液の保持量、点着時の効率によって様々な形状のものを用いることができる。先端の形状は特に限定されるわけではないが、先端端面（図１の符号Ｘ）の形状はフラットタイプ（例えば、図１）、一文字溝タイプ（例えば、図２）、十文字溝タイプ（例えば、図３）等が挙げられ、先端直径は、０．０１〜０．５ｍｍ程度が一般的に用いられる。また、先端端面だけでなく先端側面（図１の符号Ｙ）に溝加工を施したピンも用いることができる。素材は、ステンレス等の金属の他、各種樹脂等であっても良いが、ステンレス等の金属であることが好ましい。
【００１１】
このようなピンとして一文字溝タイプ（例えば図２）や十文字溝タイプ（例えば図３）等のピン先端端面に溝を有するピンを用いた場合には、例えば、以下のようにして選択結合性物質を含む溶液に浸漬させた後担体に接触させて担体に選択結合性物質を点着することができる。該ピンの先端を選択結合性物質を含む溶液に浸漬すると、毛管現象により溝に溶液が充填し、先端端面の溝部に液面が位置する。上述のようにして選択結合性物質を含む溶液にピンを浸漬させた後、例えば、ピンを該溶液から引き上げ、担体表面の点着されるべき位置の直上にピンの先端が来るまで移動させる。ピンを垂直に降下させ、担体表面と瞬時の接触をさせてピン先端を表面に軽く打ちつけると、ピン先端端面の溝中に充填された溶液が担体表面に引き出され、担体表面に点着される。
このようなピンを備えたスポッターの具体例は、特開平１０−５０３８４１号公報に挙げられている。
【００１２】
担体とは、選択結合性物質を固定化することのできる物質を意味する。担体の形状としては、例えば、平板状、球状等のものがあり、平板状のものが好ましい。担体の材質としては、例えばガラス、セラミック、シリコンなどの無機材料、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、シリコーンゴム等のポリマーなどを拳げることができる。この中でも、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）エラストマー、ガラス、シリコンを特に好ましく用いることができる。担体の製造は、プラスチックの場合、射出成形法や、ホットエンボス法、ガラスやセラミックの場合、サンドブラスト法、シリコンの場合は公知の半導体プロセスなどによることができる。
【００１３】
本発明の製造方法においては、担体であればいずれであっても適用することができるが、中でも感度の高い担体であることが好ましい。感度の高い担体の代表的なものとしては、表面に凹凸部を備える担体を挙げることができる。このような構造を取る担体は、凹凸部の凸部に選択結合性物質を安定したスポット形状で結合することができ、従って定量性に優れるほか、光学的検出の際、非特異的に吸着した検体を検出することがないので、ノイズが小さく、結果的によりＳ／Ｎが良好な結果を得ることができる。更に、凹凸部の各凸部の間に微粒子等を格納することができ、これらを外力により動かすことで、柱状構造の上端面に結合した選択結合性物質を損傷することなく検体溶液を撹拌することができ、検査時間を短縮することができ、結果的に超高感度かつ高精度の検査が可能である。
【００１４】
凹凸部の凸部の高さに関しては、それぞれの凸部の上面の高さが略同一であることが好ましく、具体的には、高さの差が通常は５０μｍ以下であり、３０μｍ以下であることが好ましく、特に高さが同一であることがもっとも好ましい。また、凸部分の上面は、実質的に平坦であることが好ましい。ここで凸部上面が実質的に平坦とは、２０μｍ以上の凹凸がないことを意味する。また、担体の凹凸部を有する表面には、さらに平坦部が設けられていることが好ましい。凹凸部の凸部の上面の高さと平坦部分の高さは、略同一であることが好ましく、５０μｍ以下であることが好ましく、特に好ましい。
【００１５】
表面に凹凸部を備える担体の概略を示す具体例を図４に示す。図４に示す例において、選択結合性物質固定化基材ａの表面は、複数の凸部２、及び凹部３を含む凹凸部４により構成されており、その周りに平坦部１が設けられている。凸部上面２Ａに選択結合性物質を結合させることができる。
【００１６】
選択結合性物質とは、物質群の中に含まれる特定の物質に対して特異的に相互作用する物質を意味する。特異的な相互作用とは、特定の物質に対する直接的又は間接的な結合であって、選択性を有する結合と言い換えることができる。具体的に選択結合性物質としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びＰＮＡ等の核酸、ペプチド、アミノ酸なども含めたタンパク質、糖類、脂質及び他の抗原性化合物を挙げることができ、この中でＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、糖、糖鎖又は脂質であることが好ましく、特にＤＮＡ、ＲＮＡが好ましい。核酸の場合、塩基長さは１０〜１００塩基のものが好ましく、中でも２０〜１００塩基、特に４０〜１００塩基のものがもっとも好ましい。この塩基長さの範囲のものは、合成機で容易に人工的に合成が可能であり、また、核酸末端のアミノ基およびメルカプト基修飾が容易であるため、基材表面への固定化が容易であり、ハイブリダイゼーションを安定に行うことができる。
【００１７】
選択結合性物質を含む溶液とは、上述の選択結合性物質を溶媒に溶解させた溶液を意味する。溶媒は、選択結合性物質が可溶なものであれば特に限定されない。また、溶液中における選択結合性物質の濃度は、必要に応じて適宜設定することができ、０．１〜１００μＭの濃度を好ましく用いることができる。選択結合性物質を含む溶液は、担体の各位置に点着する選択結合性物質ごとに分別して格納することのできる３８４プレート等に格納しておくことができる。
【００１８】
次に、工程（２）では、上述のピンを非プロトン性極性溶媒を含む溶液へ浸漬させる。この非プロトン性極性溶媒を含む溶液は、上記工程（１）の選択結合性物質を含む溶液との異なる洗浄用の溶液であり、選択結合性物質を含まない溶液である。
非プロトン性極性溶媒とは、通常の条件下に解離してプロトンを生じず、かつ、極性分子からなる溶媒を意味する。具体的には、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド、N−メチル−2−ピロリドン、又はγ−ブチルラクトンであることが好ましく、特にアセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、N−メチル−２−ピロリドンがより好ましい。工程（２）で用いる非プロトン性極性溶媒を含む溶液としては、これらの非プロトン性極性溶媒を別の溶媒中に含む溶液であってもよく、例えば非プロトン性極性溶媒を含む水溶液を好ましく用いることができる。
【００１９】
上記工程（２）において、浸漬時間等の条件は適宜設定することができる。特に、ピンを溶媒中に浸漬させた状態でピンを揺動することにより、洗浄効率をより高めることができるので好ましい。浸漬方法は、非プロトン性極性溶媒を含む溶液を入れた静置槽を設け、順番にピンを浸漬して行うこともできるが、流動式、すなわち各溶液を適当な速度で流動させた状態でピンに接触させることにより、洗浄効率をより高めることができるので好ましい。具体的には、浸漬時間は、１〜６０秒間、流動速度は、０．０２〜１０Ｌ／分の範囲とすることができる。また、溶媒に直接又は間接的に超音波を発することにより超音波洗浄方式とすることもできる。
工程（２）は、工程（１）の前後に行うことができる。また、所望のスポットが実現できるように工程（１）及び（２）を繰り返して選択結合性固定化担体を得ることができる。
【００２０】
本発明の製造方法は、上記の工程（１）及び（２）に加えて、ピンを選択結合性物質を含まない水又は水溶液に浸漬させる工程（工程（３））を更に含むことが好ましい。これにより、洗浄効率をより高めることができる。
選択結合性物質を含まない水又は水溶液は、選択結合性物質を含まないものであれば特に限定されない。
本工程（３）の順序は、工程（１）と工程（２）との間、及び工程（２）と工程（１）との間とすることができる。特に、工程（２）の後で適宜行うことが好ましく、工程（２）の後に毎回行うことが特に好ましい。
【００２１】
本発明の製造方法においては、各工程の間にはピンを乾燥するための乾燥工程（４）を加えることができる。乾燥工程（４）における乾燥方法としては、例えばバキューム乾燥、真空乾燥、温風乾燥等があるが、乾燥効率の点からバキューム乾燥であることが好ましい。乾燥工程を行うことにより、工程（２）における非プロトン性溶媒や、工程（３）における水又は水溶液に、ピンに付着した選択結合性物質を持ち込むことを回避することができ、よって、ピンの洗浄効率をより高めることができる。
【００２２】
本発明の製造方法においては、必要に応じて、各工程の間にＳＤＳ等の界面活性剤による洗浄工程、エタノール等のアルコールによる洗浄工程を行うこともできる。この場合も、洗浄後に上述の乾燥工程（４）を挿入することができる。
【００２３】
工程（３）の浸漬時間等の条件は、適宜設定することができる。浸漬方法は、各工程で用いる溶液を入れた静置槽を設け、順番にピンを浸漬して行うこともできるが、流動式、すなわち各溶液を適当な速度で流動させた状態でピンに接触させることにより、洗浄効率をより高めることができるので好ましい。具体的には、浸漬時間は、１〜６０秒間、流動速度は、０．０２〜１０Ｌ／分の範囲とすることができる。また、溶媒に直接又は間接的に超音波を発することにより超音波洗浄方式とすることもできる。
【００２４】
本発明の製造方法は、工程（１）に対応する選択結合性物質を含んだ溶液を満たした溶液槽、工程（２）に対応する非プロトン性極性溶媒を含む溶液を満たした洗浄槽、任意にて行う工程（３）に対応する水又は水溶液を満たした洗浄槽、並びにピンを各槽間を移動させ、上下間の高さ調整が可能な移動手段を備える装置を、スポッターに付属させることにより、洗浄の際にはスポッターを一時停止して各槽へピンを順次移動させることにより実施することができる。更に、各工程において流動式の溶液への浸漬、超音波洗浄等を行う場合には、各槽にポンプ等の流動手段、超音波発信機などを付設させることができ、また乾燥工程を設ける場合には乾燥手段を付設させることもできる。
【００２５】
このような本発明の製造方法によって製造される選択結合性物質固定化担体は、選択結合性物質に対して選択的に相互作用（例えば、結合、ハイブリダイズ）する物質を被検物質として、被検物質を含む可能性のある検体（検体溶液）をアプライすることにより、検体中の被検物質の分析に用いることができる。
【実施例】
【００２６】
本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２７】
実施例１
（ＤＮＡ固定化担体の作製）
公知の方法であるＬＩＧＡ（Lithographie Galvanoformung Abformung）プロセスを用いて、射出成形用の型を作製し、射出成型法により後述するような形状を有するポリメチルメタアクリレート（ＰＭＭＡ）製の担体を得た。なお、この実施例で用いたＰＭＭＡの平均分子量は５万であり、ＰＭＭＡ中には１重量％の割合で、カーボンブラック（三菱化学製  ＃３０５０Ｂ）を含有させており、担体は黒色である。この黒色担体の分光反射率と分光透過率を測定したところ、分光反射率は、可視光領域（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）のいずれの波長でも５％以下であり、また、同範囲の波長で、透過率は０．５％以下であった。分光反射率、分光透過率とも、可視光領域において特定のスペクトルパターン（ピークなど）はなく、スペクトルは一様にフラットであった。なお、分光反射率は、ＪＩＳ  Ｚ  ８７２２の条件Ｃに適合した照明・受光光学系を搭載した装置（ミノルタカメラ製、ＣＭ−２００２）を用いて、担体からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。
【００２８】
担体の形状は、大きさが縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚み１ｍｍであり、担体の中央部分を除き表面は平坦であった。担体の中央には、直径１０ｍｍ、深さ０．２ｍｍの凹んだ部分が設けてあり、この凹みの中に、直径０．２ｍｍ、高さ０．２ｍｍの凸部を６４（８×８）箇所設けた。凹凸部分の凸部上面の高さ（６４箇所の凸部の高さの平均値）と平坦部分との高さの差を測定したところ、３μｍ以下であった。また、６４個の凸部上面の高さのばらつき（最も高い凸部上面の高さと最も低い凸部上面との高さの差）、さらには、凸部上面の高さの平均値と平坦部上面の高さの差を測定したところそれぞれ３μｍ以下であった。さらに、凹凸部凸部のピッチ（凸部中央部から隣接した凸部中央部までの距離）は０．６ｍｍであった。
【００２９】
上記のＰＭＭＡ担体を１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に７０℃で１２時間浸漬した。これを、純水、０．１ＮのＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄し、担体表面にカルボキシル基を生成した。
【００３０】
（担体へのスポッティング）
配列番号１（６０塩基、５’末端アミノ化）のプローブＤＮＡを合成した。この配列番号１のＤＮＡは５’末端がアミノ化されている。
【００３１】
このＤＮＡを、純水に０．３ｎｍｏｌ／μｌの濃度で溶かして、ストックソリューションとした。担体に点着する際は、ＰＢＳ（ＮａＣｌを８ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏを２．９ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、ＫＨ2ＰＯ4を０．２ｇ純水に溶かし１ｌにメスアップしたものにｐＨ調整用の塩酸を加えたもの、ｐＨ５．５）でプローブＤＮＡの終濃度を０．０３ｎｍｏｌ／μｌとし、かつ、担体表面のカルボン酸とプローブＤＮＡの末端のアミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍｌとしたものをプローブ溶液とした。また、プローブ溶液からプローブＤＮＡを抜いたもの（スポット溶液１、２）を別途調製した。このプローブ溶液、スポット溶液１、２を３８４プレートに分注し、専用スポッター（GTMAS StampII：日本レーザ電子株式会社製）を用いて、スポット溶液１の点着、ピン洗浄、プローブ溶液の点着、ピン洗浄、スポット溶液２の点着の順でスポッティングを行った。用いたピンは、先端径０．１５ｍｍの一文字溝タイプである。ピンの洗浄方法は、基板に点着後、純水、洗浄液Ａとしてアセトニトリル、純水の順で各１０秒間浸漬させ、その後バキューム乾燥を１５秒間行った。
【００３２】
（基板のインキュベート）
次いで、担体を密閉したプラスチック容器に入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートして、純水で洗浄した。この反応スキームを図５に示す。
【００３３】
（検体ＤＮＡの調製）
検体ＤＮＡとして、上記ＤＮＡ固定化担体に固定化されたプローブＤＮＡとハイブリダイズ可能な塩基配列を持つ配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡ（９６８塩基、以下、配列番号４のＤＮＡと記載することがある）を用いた。調製方法を以下に示す。
【００３４】
配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、配列番号２のＤＮＡと記載することがある）と配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、配列番号３のＤＮＡと記載することがある）を合成した。これを純水にとかして濃度を１００μＭとした。次いで、ｐＫＦ３  プラスミドＤＮＡ（タカラバイオ（株）製品番号；３１００）（配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡ：２２６４塩基、以下、配列番号５のＤＮＡと記載することがある）を用意して、これをテンプレートとし、配列番号２および配列番号３のＤＮＡをプライマーとして、ＰＣＲ反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により増幅を行った。
【００３５】
ＰＣＲの条件は以下の通りである。すなわち、ＥｘＴａｑ  ２μｌ、１０×ＥｘＢｕｆｆｅｒ  ４０μｌ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  ３２μｌ（以上はタカラバイオ（株）製  製品番号ＲＲ００１Ａに付属）、配列番号２のＤＮＡ溶液を２μｌ、配列番号３のＤＮＡ溶液を２μｌ、テンプレート（配列番号５のＤＮＡ）を０．２μｌ加え、純水によりトータル４００μｌにメスアップした。これらの混合液を、４つのマイクロチューブに分け、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲ反応を行った。これを、エタノール沈殿により精製し、４０μｌの純水に溶解した。ＰＣＲ反応後の溶液の一部をとり電気泳動で確認したところ、増幅したＤＮＡの塩基長は、およそ９６０塩基であり配列番号４のＤＮＡが増幅されていることを確認した。
【００３６】
次いで、９塩基のランダムプライマー（タカラバイオ（株）製；製品番号３８０２）を６ｍｇ／ｍｌの濃度に溶かし、上記のＰＣＲ反応後精製したＤＮＡ溶液に２μｌ加えた。この溶液を１００℃に加熱した後、氷上で急冷した。これらにＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ（株）製；製品番号２１４０ＡＫ）付属のバッファーを５μｌ、ｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰの濃度はそれぞれ２．５ｍＭ、ｄＣＴＰの濃度は４００μＭ）を２．５μｌ加えた。さらに、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ（アマシャムファルマシアバイオテク製；製品番号ＰＡ５３０２１）を２μｌ加えた。この溶液に１０ＵのＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔを加え、３７℃で２０時間インキュベートし、Ｃｙ３で標識された検体ＤＮＡを得た。なお、標識の際ランダムプライマーを用いたので検体ＤＮＡの長さには、ばらつきがある。最も長い検体ＤＮＡは配列番号４のＤＮＡとなる。なお、検体ＤＮＡの溶液を取り出して、電気泳動で確認したところ、９６０塩基に相当する付近にもっとも強いバンドが現れ、それより短い塩基長に対応する領域に薄くスメアがかかった状態であった。そして、これをエタノール沈殿により精製し、乾燥した。
【００３７】
この標識化された検体ＤＮＡを、１重量％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、５×ＳＳＣ（５×ＳＳＣとは、２０×ＳＳＣ（シグマ製）を純水にて４倍に希釈したもの。また、２０×ＳＳＣを純水で２倍に希釈したものを１０×ＳＳＣと表記し、２０×ＳＳＣの２倍希釈液を１０×ＳＳＣ、１００倍希釈液を０．２×ＳＳＣと表記する。）、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡの溶液（各濃度はいずれも終濃度）、４００μｌに溶解し、ハイブリダイゼーション用のストック溶液とした。
【００３８】
以下の実施例、比較例において、ハイブリダイゼーションの際の検体溶液は、特に断りのない限り、上記で調製したストック溶液を、１重量％ＢＳＡ、５×ＳＳＣ、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡ、０．１重量％ＳＤＳの溶液（各濃度はいずれも終濃度）で２００倍に希釈したものを用いた。なお、この溶液の検体ＤＮＡの濃度を測定したところ、１．５ｎｇ／μＬであった。
【００３９】
（ガラスビーズの修飾）
直径が１５０μｍのガラスビーズ１０ｇを１０Ｎ  ＮａＯＨ溶液に浸漬した後、純水で洗浄した。ついで、ＡＰＳ（３−アミノプロピルトリエトキシシラン；信越化学工業（株）製）を２重量％の割合で純水に溶解した後、上記のガラスビーズを１時間浸漬し、この溶液から取り出した後に１１０℃で１０分間乾燥した。このようにして、ガラスビーズの表面にアミノ基を導入した。
【００４０】
ついで、５．５ｇの無水コハク酸を１−メチル−２−ピロリドン３３５ｍｌに溶解させた。１Ｍの５０ｍｌのホウ酸ナトリウム（ホウ酸３．０９ｇとｐＨ調整用の水酸化ナトリウムを加えて、純水で５０ｍｌにメスアップしたもの。ｐＨ８．０）に上記コハク酸溶液に加えた。この混合液に上記のガラスビーズを２０分間浸漬した。浸漬後、純水で洗浄および乾燥した。このようにして、ガラスビーズの表面のアミノ基と無水コハク酸を反応させて、ガラスビーズ表面にカルボキシル基を導入した。
【００４１】
（カバー部材の接着）
厚さ１ｍｍのＰＭＭＡ板から切削加工により図６に示す貫通孔５を４つ有するカバー部材ｂを作製し、これを両面テープ（厚さ１００μｍ）を用いてプローブＤＮＡ固定化領域に被さるように担体と接着した。この時、上記の手順で修飾したガラスビーズ２ｍｇを担体の凹部に入れてからカバー部材を接着した。
【００４２】
（ハイブリダイゼーション）
上記で得られたプローブＤＮＡを固定化した担体に上記検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた。具体的には、マイクロピペットを用いてハイブリダイゼーション用の溶液５０μｌを貫通孔より注入する。その後、カプトンテープ（アズワン  ５−５０１８−０１）で貫通孔を塞ぎ、これをマイクロチューブローテーター（アズワン製、商品番号：１−４０９６−０１）の回転面に設けたプラスチック容器内に固定し、４２℃、１６時間インキュベートした。その際、ローテーターの回転数は３ｒｐｍとし、ローテーターの回転面は、水平面と直角となるようにした。さらに担体のプローブＤＮＡ固定化面は、ローテーターの回転面に対し直角となるようにした。以上のようにすることでガラスビーズが重力方向に移動し続けることになり、検体溶液を攪拌しながらハイブリダイゼーションを行うことができる。インキュベート後、担体からカバー部材と両面テープを脱離後に担体を洗浄、乾燥した。
【００４３】
（測定）
ＤＮＡチップ用のスキャナー（Axon Instruments社のGenePix 4000Ｂ）に上記処理後の担体をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態で測定を行った。その結果を表１に示す。ここで、蛍光強度とは各スポット内の蛍光強度の平均値であり、プローブ溶液を点着した凸部、スポット溶液１、２を点着した凸部、バックグラウンドノイズは、プローブＤＮＡを固定化していない凸部の蛍光強度である。
【００４４】
本実験では、スポット溶液１と２の蛍光強度を比較することで、選択結合性物質のキャリーオーオーバーを評価することができる。つまり、スポット溶液１よりスポット溶液２の方で蛍光強度が強いと、キャリーオーバーがあったと評価する。表１に示すように、ピンの洗浄にアセトニトリルを用いた実施例１においては、選択結合性物質のキャリーオーバーはなかった。
【００４５】
比較例１
実施例１の洗浄液Ａにアセトニトリルを用いた代わりに、純水を用いて同様の実験を行った。即ち、純水への浸漬を３回（１０秒／１回）行った。結果を表１に示す。
スポット溶液２の蛍光強度がスポット溶液１の３倍の強度を示し、前点着のプローブ溶液を持ち込んだ結果であると考えられる。よって、純水では選択結合性物質のキャリーオーバーが見られ、実施例１のアセトニトリルを用いた方が洗浄効果が高いことが分かった。
【００４６】
実施例２〜６
実施例１の洗浄液Ａにアセトニトリルを用いた代わりに、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド、γ−ブチルラクトンをそれぞれ用いて、実施例１と同様の実験を行った。結果を表１に示す。
【００４７】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドンの両溶媒ではスポット溶液１、２で同等の蛍光強度を示しており、選択結合性物質のキャリーオーバーはなく、アセトニトリルと同等の洗浄効果であることが分かった。また、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド、γ−ブチルラクトンのいずれの溶媒も、比較例１の純水場合よりも洗浄効果が高いことが分かった。
【００４８】
実施例７
実施例１の実験のピンの洗浄方法において、ピンの浸漬時間を各５秒間とした実験を行った。結果を表１に示す。
比較例１の純水で洗浄した場合よりも浸漬時間が短いにもかかわらず、十分洗浄効果があることがわかった。
【００４９】
実施例８
実施例７で用いたスポッターにポンプを取り付け、純水、アセトニトリル、純水の順でピンを洗浄する工程を、ポンプを用いて各溶液を流動（１Ｌ／ｍｉｎ）させ、浸漬時間を各５秒間とした実験を行った。結果を表１に示す。
浸漬時間が５秒間であってもスポット溶液１と２が同等の蛍光強度を示し、この方法で実施例１と同等の十分なピン洗浄が可能であることがわかった。すなわち、ピンを流動式の溶液へ浸漬させることで短時間に効率良く洗浄を行うことができることがわかった。
【００５０】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、フラットタイプのスポッターピン先端部の一例を示す図である。
【図２】図２は、一文字溝タイプのスポッターピン先端部の一例を示す図である。
【図３】図３は、十文字溝タイプのスポッターピン先端部の一例を示す図である。
【図４】図４は、凹凸部が設けられている担体の一例を概略的に示す斜視図である。
【図５】図５は、実施例の反応スキームを示す概略図である。
【図６】図６は、図４に示す担体とカバー部材の組み合わせの一例を概略的に示す斜視図である。
【符号の説明】
【００５２】
Ｘ  ピン先端端面
Ｙ  ピン先端側面
１  平坦部
２  凸部
２Ａ  凸部上面
３  凹部
４  凹凸部
５  貫通孔
ａ  選択結合性物質固定化担体
ｂ  カバー部材
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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