(57)【要約】【課題】優れた成膜精度でタンパク質を含む膜を形成し得るとともに、膜中のタンパク質が有する生理活性の低下を抑制または防止し得る膜形成方法、かかる膜形成方法により形成された膜を備える膜付基板、信頼性の高いセンサを提供すること。さらには、形成される膜中に含まれるタンパク質の生理活性の低下を防止または抑制し得、かつ、優れた成膜精度で膜を形成し得る液状組成物を提供すること。【解決手段】本発明の膜形成方法は、基板の一方の面側に、検出対象物を検出するための検出用物質を含有する検出用膜を形成するものであり、前記タンパク質と、重量平均分子量が２０００以下であるポリエーテル系化合物とを含有する液状組成物を用意する第１の工程と、前記液状組成物を、液滴吐出法を用いて前記一方の面側に供給して、液状被膜を形成する第２の工程と、前記液状被膜を乾燥して、前記検出用膜を形成する第３の工程とを有することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板の一方の面側に、検出対象物を検出するための検出用物質を含有する検出用膜を形成する膜形成方法であって、
前記検出用物質と、重量平均分子量が２０００以下であるポリエーテル系化合物とを含有する液状組成物を用意する第１の工程と、
前記液状組成物を、液滴吐出法を用いて前記一方の面側に供給して、液状被膜を形成する第２の工程と、
前記液状被膜を乾燥して、前記検出用膜を形成する第３の工程とを有することを特徴とする膜形成方法。
【請求項２】
前記液状組成物中における前記ポリエーテル系化合物の含有量をＡ［ｗｔ％］とし、前記検出用物質の含有量をＢ［ｗｔ％］としたとき、Ａ／Ｂが９〜１０５なる関係を満足する請求項１に記載の膜形成方法。
【請求項３】
前記液状組成物中における前記検出用物質の含有量は、１０ｗｔ％以下である請求項１または２に記載の膜形成方法。
【請求項４】
前記液状組成物中における前記ポリエーテル系化合物の含有量は、９０ｗｔ％以上である請求項１ないし３のいずれかに記載の膜形成方法。
【請求項５】
前記液状組成物は、常温での粘度が２０ｃＰ以下である請求項１ないし４のいずれかに記載の膜形成方法。
【請求項６】
前記液状組成物は、常温での表面張力が２０〜７０ｍＮ／ｍである請求項１ないし５のいずれかに記載の膜形成方法。
【請求項７】
前記液状組成物中における前記ポリエーテル系化合物の重量平均分子量をＣとしたとき、前記ポリエーテル系化合物のバラツキは、±０．２Ｃの範囲内である請求項１ないし６のいずれかに記載の膜形成方法。
【請求項８】
前記ポリエーテル系化合物は、ポリエーテルで構成される主鎖と、該主鎖の端部の少なくとも一方に、前記検出用物質と結合し得る結合基とを有する請求項１ないし６のいずれかに記載の膜形成方法。
【請求項９】
前記主鎖の端部の双方に、前記結合基を有する請求項８に記載の膜形成方法。
【請求項１０】
前記第１の工程において、前記ポリエーテル系化合物は、前記検出用物質と前記結合基とが結合することにより、前記検出用物質に連結される請求項８または９に記載の膜形成方法。
【請求項１１】
前記ポリエーテル系化合物は、ポリエチレングリコール系化合物を主成分とする請求項１ないし１０のいずれかに記載の膜形成方法。
【請求項１２】
前記検出用物質は、タンパク質である請求項１ないし１１のいずれかに記載の膜形成方法。
【請求項１３】
前記タンパク質は、酵素である請求項１２に記載の膜形成方法。
【請求項１４】
前記基板の一方の面側に、請求項１ないし１３のいずれかに記載の膜形成方法により形成された検出用膜を備えることを特徴とする膜付基板。
【請求項１５】
検出対象物を検出するための検出用物質を含有する検出用膜を含む膜付基板であって、
前記検出用膜は、前記検出用物質と、重量平均分子量が２０００以下であるポリエーテル系化合物とを含むことを特徴とする膜付基板。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の膜付基板を備えることを特徴とするセンサ。
【請求項１７】
生理活性を有する検出用物質と、重量平均分子量が２０００以下であるポリエーテル系化合物とを含有することを特徴とする液状組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜形成方法、膜付基板、センサおよび液状組成物等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、例えば、酵素や抗体等の生理活性を有するタンパク質を基板上に固定化させて、in vitroにおいて、これらのタンパク質が関与する生体反応をリアルタイムに観察（検出）することが行われている。
この生体反応をより精度よく観察するには、タンパク質を優れた成膜精度で基板上に担持させる必要があるが、このタンパク質を基板上に固定する方法として、タンパク質を含有する液体をインクとして用い、このインクを基板上に供給するインクジェット法が広く用いられている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
インクジェット法は、圧電素子により振動する振動板を振動させてインク室（空間）の容積を変動させ、インク室内に供給されたインクを、前記振動板と反対側に設けられた小孔から吐出させて、基板上に供給するものである。
このインクジェット法では、小孔から吐出される液体の吐出量が安定し、高精度であること、小孔から吐出される液滴の着弾位置精度が高いこと、小孔の目詰まりが生じにくいこと等が要求され、かかる要求を満足させることを目的に、インク（タンパク質を含有する液体）の粘度および表面張力が調整される。
【０００４】
ここで、インクの粘度および表面張力を調整する方法として、例えば、インクにポリエーテル系化合物を添加する方法が用いられる。
ところが、このようなインクを用いて基板上にタンパク質を固定化すると、インク中に含まれるポリエーテル系化合物とタンパク質とが接触することとなり、これに起因して、タンパク質の生理活性が低下（失活）するという問題がある。
このような問題は、タンパク質の他、核酸、および蛍光色素等を含む膜を、インクジェット法を用いて基板上に形成する場合においても同様に生じることが懸念される。
【０００５】
【特許文献１】特開昭６１−２４５０５１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の一つの目的は、優れた成膜精度で検出用物質を含む検出用膜を形成し得るとともに、検出用膜中の検出用物質が有する活性の低下を抑制または防止し得る膜形成方法、かかる膜形成方法により形成された検出用膜を備える膜付基板、信頼性の高いセンサを提供することにある。さらには、形成される検出用膜中に含まれる検出用物質の生理活性の低下を防止または抑制し得、かつ、優れた成膜精度で検出用膜を形成し得る液状組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
このような目的は、下記の本発明により達成される。
本発明の膜形成方法は、基板の一方の面側に、検出対象物を検出するための検出用物質を含有する検出用膜を形成する膜形成方法であって、
前記検出用物質と、重量平均分子量が２０００以下であるポリエーテル系化合物とを含有する液状組成物を用意する第１の工程と、
前記液状組成物を、液滴吐出法を用いて前記一方の面側に供給して、液状被膜を形成する第２の工程と、
前記液状被膜を乾燥して、前記検出用膜を形成する第３の工程とを有することを特徴とする。
【０００８】
これにより、優れた成膜精度で検出用物質を含む検出用膜を形成し得るとともに、検出用膜中の検出用物質が有する生理活性の低下を抑制または防止し得る膜形成方法とすることができる。
すなわち、形成される前記検出用膜に前記検出用物質に加えて重量平均分子量が２０００以下であるポリエーテル系化合物を添加する構成とすることにより、前記検出用膜中における前記検出用物質の安定性を向上させた状態で前記検出用膜を形成することが可能となる。
【０００９】
また、重量平均分子量が２０００以下であるポリエーテル系化合物は、タンパク質、核酸等の極性基を有する物質に対して高い親和性を有しているので、特に、前記検出用物質として極性基を有する物質を用いる場合に、本発明の膜形成方法のように、前記検出用物質と重量平均分子量が２０００以下であるポリエーテル系化合物とを含有する前記液状組成物を用いて検出用膜を形成する構成とすることは効果的である。
【００１０】
本発明の膜形成方法では、前記液状組成物中における前記ポリエーテル系化合物の含有量をＡ［ｗｔ％］とし、前記検出用物質の含有量をＢ［ｗｔ％］としたとき、Ａ／Ｂが９〜１０５なる関係を満足することが好ましい。
かかる関係を満足させることにより、検出用物質に対するポリエーテル系化合物の付着率が好ましい範囲内に設定され、検出用物質の生理活性が低下するのをより好適に抑制または防止することができる。
【００１１】
本発明の膜形成方法では、前記液状組成物中における前記検出用物質の含有量は、１０ｗｔ％以下であることが好ましい。
検出用物質の含有量をかかる範囲内に設定することにより、形成される検出用膜中において、検出用物質の反応を十分に生じさせることができる。
本発明の膜形成方法では、前記液状組成物中における前記ポリエーテル系化合物の含有量は、９０ｗｔ％以上であることが好ましい。
ポリエーテル系化合物の含有量が多すぎると、ポリエーテル系化合物の種類によっては、液体組成物の粘度が増大し、液滴吐出法により前記液体組成物を液滴として吐出させることが不可能となる場合がある。また、ポリエーテル系化合物の含有量が少なすぎると、前記液体組成物が乾き易くなるおそれがある。さらに、ポリエーテル系化合物の含有量をかかる範囲内に設定することにより、検出用物質に対するポリエーテル系化合物の付着率がより好ましい範囲内に設定され、検出用物質の生理活性の低下をより好適に抑制または防止することができる。
【００１２】
本発明の膜形成方法では、前記液状組成物は、常温での粘度が２０ｃＰ以下であることが好ましい。
液状組成物の粘度がこのような範囲であれば、液滴吐出法により液体組成物を液滴として安定的に吐出することができる。
本発明の膜形成方法では、前記液状組成物は、常温での表面張力が２０〜７０ｍＮ／ｍであることが好ましい。
液状組成物の表面張力をこのような範囲内に設定することにより、液滴吐出法により吐出された液滴により、均一な膜厚の液状被膜を形成することができる。
【００１３】
本発明の膜形成方法では、前記液状組成物中における前記ポリエーテル系化合物の重量平均分子量をＣとしたとき、前記ポリエーテル系化合物のバラツキは、±０．２Ｃの範囲内であることが好ましい。
これにより、検出用物質に接触するポリエーテル系化合物の分子量の大きさが均一化されることから、分子量の大きいポリエーテル系化合物に接触する確率を低減させることができる。その結果、分子量の大きいものと接触することによる検出用物質の生理活性の低下をより好適に防止または抑制することができる。
【００１４】
本発明の膜形成方法では、前記ポリエーテル系化合物は、ポリエーテルで構成される主鎖と、該主鎖の端部の少なくとも一方に、前記検出用物質と結合し得る結合基とを有することが好ましい。
これにより、液状組成物中において、検出用物質とポリエーテル系化合物とが接触した際に、この結合基と検出用物質とが結合することとなり、ポリエーテル系化合物が検出用物質に連結される。これにより、検出用物質とポリエーテル系化合物との密着性が向上することとなる。その結果、検出用物質の安定性がより向上することとなり、その生理活性の低下をより好適に抑制または防止することができる。
【００１５】
本発明の膜形成方法では、前記主鎖の端部の双方に、前記結合基を有することが好ましい。
これにより、検出用物質とポリエーテル系化合物との密着性がさらに向上して、その生理活性の低下をさらに好適に抑制または防止することができる。
本発明の膜形成方法では、前記第１の工程において、前記ポリエーテル系化合物は、前記検出用物質と前記結合基とが結合することにより、前記検出用物質に連結されることが好ましい。
これにより、検出用物質とポリエーテル系化合物との密着性が向上することとなる。その結果、検出用物質の安定性がより向上することとなり、その生理活性の低下をより好適に抑制または防止することができる。
【００１６】
本発明の膜形成方法では、前記ポリエーテル系化合物は、ポリエチレングリコール系化合物を主成分とすることが好ましい。
これにより、液状組成物の粘度および表面張力を好適な範囲内に比較的容易に設定することができる。
本発明の膜形成方法では、前記検出用物質は、タンパク質であることが好ましい。
前記検出用物質がタンパク質である場合に、本発明の膜形成方法を適用することにより、検出膜中における検出用物質の生理活性の低下をより顕著に抑制または防止することができる。
本発明の膜形成方法では、前記タンパク質は、酵素であることが好ましい。
これにより、酵素と基質との間の反応を、より安定的にかつ再現性よく進行させることができる。
【００１７】
本発明の膜付基板は、前記基板の一方の面側に、本発明の膜形成方法により形成された検出用膜を備えることを特徴とする。
これにより、検出用膜中の検出用物質が有する生理活性の低下が抑制または防止され、かつ、優れた成膜精度で形成された検出用膜を備える膜付基板とすることができる。
本発明の膜付基板は、検出対象物を検出するための検出用物質を含有する検出用膜を含む膜付基板であって、
前記検出用膜は、前記検出用物質と、重量平均分子量が２０００以下であるポリエーテル系化合物とを含むことを特徴とする。
これにより、検出用膜中の検出用物質が有する生理活性の低下が抑制または防止され、かつ、優れた成膜精度で形成された検出用膜を備える膜付基板とすることができる。
【００１８】
本発明のセンサは、本発明の膜付基板を備えることを特徴とする。
これにより、信頼性の高いセンサが得られる。
また、本発明のようにポリエーテル系化合物の重量平均分子量を２０００以下とすることによって、前記基板上に設けた検出のための検出電極を利用して、当該検出電極と前記検出用物質、または前記検出用物質により検出される検出対象物との間の電子の授受等によって電気信号を取得するセンサに適用した場合、当該検出電極と、前記検出用物質または前記検出対象物との間の距離を電気信号の取得に適した距離に設定することが可能となる。
【００１９】
本発明の液状組成物は、生理活性を有する検出用物質と、重量平均分子量が２０００以下であるポリエーテル系化合物とを含有することを特徴とする。
これにより、形成される検出用膜中に含まれる検出用物質の生理活性の低下を防止または抑制し得、かつ、優れた成膜精度で検出用膜を形成し得る液状組成物とすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の膜形成方法、膜付基板、センサおよび液状組成物を、添付図面に示す好適実施形態に基づいて詳細に説明する。
＜センサ＞
まず、本発明のセンサの好適実施形態について説明する。
なお、本実施形態では、検出用物質を含有する検出用膜として、生理活性を有するタンパク質を含有する酵素電極層を備えるセンサを一例に説明する。
図１は、本発明のセンサの構成を模式的に示す縦断面図である。なお、以下の説明では、図１中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
【００２１】
図１に示すセンサ１は、液体試料２０を収納する試料収納空間２と、作用電極３と、対電極４と、参照電極５と、下地層６と、酵素電極層７とを有しており、これらの各部が基板８上に積層されて構成されている。このセンサ１は、試料収納空間２に供給された液体試料２０中のターゲット（検出対象物）２１の量を、一対の電極３、４間に電圧を印加した際に生じる電流値として検出するものであり、基板８上に複数個設けられている。
なお、本実施形態では、基板８と、基板８の上側に形成された酵素電極層７とにより本発明の膜付基板が構成される。換言すれば、本実施形態では、酵素電極層７が、後に説明するセンサの製造方法で詳述するように、本発明の膜形成方法により形成される。
【００２２】
ここで、液体試料２０としては、例えば、血液、尿、汗、リンパ液、髄液、胆汁、唾液等の体液や、これらの体液に各種処理を施した処理済み液等が挙げられる。
また、ターゲットは、後述するタンパク質と反応することにより、電子（ｅ−）を放出するものである。
ターゲットの具体例としては、例えば、グルコースのような糖類、単純タンパク質、糖タンパク質のようなタンパク質類、アルコール類、コレステロール、ステロイドホルモン、胆汁酸、胆汁アルコールのようなステロイド類、ビタミン類、ホルモン類、乳酸、ビリルビン、尿酸、クレアチニン等が挙げられる。
【００２３】
基板８は、センサ１を構成する各部を支持するものである。
基板８の構成材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリアクリル酸、エポキシ樹脂のような各種樹脂材料、各種ガラス材料、各種セラミックス材料等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。また、基板８の構成材料として、複合材料を用いる場合、例えば、ガラス繊維とエポキシ樹脂の複合材料からなる難燃性のプリント基板等を基板８として用いることができる。
【００２４】
基板８上には、複数の作用電極３が個別に設けられている。
この作用電極３、後述する対電極４および参照電極５の構成材料としては、それぞれ、例えば、金、銀、銅、プラチナ、白金またはこれらを含む合金のような金属材料、ＩＴＯのような金属酸化物系材料、カーボンのような炭素系材料等が挙げられる。
作用電極３上には、下地層（中間層）６を介して酵素電極層７が設けられている。
【００２５】
図１に示すように、酵素電極層７は、その少なくとも一部（本実施形態では上面）が試料収納空間２に露出するように設けられており、ターゲットとの間で電子（ｅ−）の放出を伴う反応を行う生理活性を有するタンパク質（以下、単に「タンパク質」という。）を含有する。
このタンパク質としては、特に限定されず、例えば、酵素、抗体のようなポリペプチドやオリゴペプチド等が挙げられるが、これらの中でも、酵素であるのが好ましい。これにより、タンパク質（酵素）とターゲット（基質）との間の反応において、より安定的にかつ再現性よく電子（ｅ−）を放出させることができる。すなわち、酵素と基質との間の反応を、より安定的にかつ再現性よく進行させることができる。
【００２６】
このような酵素としては、測定対象とするターゲットの種類に応じて適宜選択され、例えば、各種オキシダーゼや各種デヒドロゲナーゼ等を用いることができる。
オキシダーゼとしては、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、Ｄ−またはＬ−アミノ酸オキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ等を用いることができる。
【００２７】
また、デヒドロゲナーゼとしては、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールルデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ等を用いることができる。
また、本発明のセンサでは、酵素電極層（本発明の膜形成方法により形成される膜）７は、重量平均分子量が２０００以下であるポリエーテル系化合物を含有する。酵素電極層７に、重量平均分子量が２０００以下であるポリエーテル系化合物を含有させることにより得られる効果については、後に説明するセンサ１の製造方法において詳述する。
【００２８】
また、酵素電極層７には、放出された電子を下地層６側に媒介するメディエータ（媒介物質）を含むのが好ましい。これにより、メディエータが電子移動の媒介となり、酵素電極層７から電子を下地層６を介して作用電極３に効率よく移動させることができる。
メディエータとしては、例えば、フェロセンまたはフェロセン誘導体、フェリシアン化カリウム、ニッケロセンまたはニッケロセン誘導体、キノンまたはキノン誘導体（例えばｐ−ベンゾキノン、ピロロキノリンキノン等）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）のようなフラビン誘導体、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）のようなニコチンアミド誘導体、フェナジンメトサルファート、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、ヘキサシアノ鉄（III）酸塩、オクタシアノタングステンイオン等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２９】
下地層６は、作用電極３と酵素電極層７との間で、これらの双方に接触するように設けられている。下地層６を設けることにより、作用電極３と酵素電極層７とが直接接触すること、すなわち、作用電極３の構成材料とタンパク質とが接触することが確実に防止される。これにより、作用電極３の構成材料との接触によりタンパク質が変質・劣化すること、すなわち、タンパク質の生理活性が低下（失活）するのを好適に抑制または防止することができる。
【００３０】
下地層６の構成材料としては、特に限定されないが、例えば、生体関連高分子（動物由来の高分子）や植物由来の高分子のような天然の高分子、合成高分子（合成樹脂）、またはこれらの変性物等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。これらの中でも、生体由来高分子を主成分とするものが好ましい。このもので下地層６を構成することにより、下地層６を介した酵素電極層７から作用電極３への電子の受け渡しを確実に行うことができるとともに、タンパク質の生理活性が失活するのをより好適に防止することができる。
【００３１】
このような生体関連高分子としては、例えば、アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン：ＢＳＡ）、グロブリン、ミオグロビン等が挙げられ、下地層６としては、例えば、このような生体関連高分子を主成分として含有するものとしてカルボキシメチルセルロースとＢＳＡとの混合ポリマー、ポリビニルピロリドンとＢＳＡとの混合ポリマーおよびポリエチレングリコールとＢＳＡとの混合ポリマー等が好適に用いられる。
なお、この下地層６は、タンパク質と作用電極３の構成材料の組み合わせによっては、これらが接触したとしてもタンパク質の生理活性の低下を抑制または防止し得ることから、その形成を省略することもできる。
【００３２】
作用電極３に対向し、かつ、少なくとも一部（本実施形態では下面）が試料収納空間２に露出するように、対電極４が設けられている。
この対電極４は、作用電極３との間に電圧を印加する電極である。試料収納空間２に液体試料２０を供給した状態で、作用電極３が正と対電極４が負となるように、これらの電極間に電圧を印加すると、ターゲットとタンパク質との反応により放出（生成）された電子が作用電極３側に移動することとなり、作用電極３と対電極４との間で通電する。
【００３３】
作用電極３と対電極４との間に印加する電圧は、１．０Ｖ以下であるのが好ましく、０．１〜０．５Ｖ程度であるのがより好ましい。印加電圧の値を前記範囲とすることにより、作用電極３と対電極４との間での通電を、特に、迅速かつ確実に行うことができるようになる。また、水の電気分解等による電子の発生を確実に防止（阻止）することもできる。
【００３４】
参照電極５は、その一部が試料収納空間２内に位置するように、封止部（隔壁部）１０に固定されている。この参照電極５は、作用電極３に対する標準電位を規定（設定）するために用いられる電極である。この参照電極５を設け、標準電位を規定することにより、ターゲットの量の測定精度や再現性の向上を図ること（異なるセンサ１や液体試料２０を用いた際に、測定値にバラツキが生じるのを低減すること）ができる。
このようなセンサ１は、前述したように、液体試料２０中のターゲットの量を検出するのに用いられ、例えば、糖尿病患者の血糖値のモニタリング等に適用される。
【００３５】
以上のようなセンサ１では、試料収納空間２内に液体試料２０を供給すると、液体試料２０中含まれるターゲットが、酵素電極層７内に拡散する。酵素電極層７に拡散したターゲットは、タンパク質と反応することにより、電子が放出される。
例えば、ターゲットがグルコースであり、タンパク質がグルコースオキシダーゼである場合には、下記式１に示すように、グルコースが、グルコースオキシダーゼの触媒作用により酸化され、グルコン酸に分解され、この際に電子が発生、放出される。
【００３６】
Ｃ６Ｈ１０Ｏ６＋２Ｈ２Ｏ＋２Ｏ２  →  Ｃ６Ｈ８Ｏ６＋３Ｈ２Ｏ２
→  Ｃ６Ｈ８Ｏ６＋３Ｏ２＋６Ｈ＋＋６ｅ−  ……式１
そして、メディエータがフェリシアン化カリウムである場合には、上記式１で発生した電子により、下記式２に示すように、フェリシアン化イオンがフェロシアン化イオンに還元される。
【００３７】
［Ｆｅ(III)(ＣＮ)６］３−＋ｅ−  →  ［Ｆｅ(II)(ＣＮ)６］４−  ……式２
このとき、作用電極３が正、対電極４が負となるように、これらの電極３、４の間に電圧を印加しておくと、作用電極３付近においてフェロシアン化イオンがフェリシアン化イオンに酸化され、その結果、電子すなわち電流が発生する。
したがって、作用電極３と対電極４との間に一定の電圧を印加した際に、これらの電極間に流れる電流値を検出することにより、液体試料２０中に含まれるターゲットの量を間接的に測定することができる。
【００３８】
具体的には、ターゲットの量が既知である複数のサンプルを用意し、各サンプルを用いて作用電極３と対電極４との間に流れる電流値を測定し、ターゲットの量と測定された電流値との関係を求める。すなわち、検量線またはテーブルを作製する。そして、実際の測定に供する液体試料２０を用いて、作用電極３と対電極４との間で流れる電流値を測定し、測定された値から、予め作製した検量線またはテーブルに基づいて、ターゲットの量に換算する。これにより、液体試料２０中に含まれるターゲットの量を求めることができる。
【００３９】
なお、通常、これらの作業を行うプログラムがリーダー（測定装置）に内蔵されており、測定者は、リーダーにセンサ１を装着して、センサ１の試料収納空間２に液体試料２０を供給するだけで、ターゲットの量を知り得るようになっている。
以上説明したように、このセンサ１では、ターゲットとタンパク質との反応により放出された電子を、作用電極３と対電極４との間で流れる電流値として検出（測定）し、液体試料２０中に含まれるターゲットの量を測定することができる。
【００４０】
なお、本実施形態では、センサ１は、ターゲットとタンパク質との反応を電流値として検出し、その電流値の大きさに従ってターゲットの量を検出する方式のものについて説明したが、本発明のセンサでは、ターゲットとタンパク質との反応を、呈色反応を示す試薬を用い、例えば、この試薬の吸光度の変化を観察することにより間接的に測定するもの、すなわち、光学的にターゲットの量を検出する方式のものであってもよい。
【００４１】
＜センサの製造方法＞
このようなセンサ１は、例えば、次のようにして製造することができる。
図２は、それぞれ、図１に示すセンサの製造方法を説明するための縦断面図である。なお、以下の説明では、図２中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
［１］  まず、図２（ａ）に示すように、基板８を用意する。
そして、図２（ｂ）に示すように、この基板８上に、作用電極３を形成する。この作用電極３は、例えば、次のようにして形成することができる。
【００４２】
まず、基板８の上面（電極形成面）を覆うように金属膜（金属層）を形成する。これは、例えば、プラズマＣＶＤ、熱ＣＶＤ、レーザーＣＶＤのような化学蒸着法（ＣＶＤ）、真空蒸着、スパッタリング、イオンプレーティング等の乾式メッキ法、電解メッキ、浸漬メッキ、無電解メッキ等の湿式メッキ法、溶射法、ＭＯＤ法、金属箔の接合等により形成することができる。
【００４３】
次いで、この金属膜上に、レジスト材料を塗布（供給）した後、硬化させて、作用電極３の形状に対応する形状のレジスト層を形成する。
次いで、このレジスト層をマスクとして、金属膜の不要部分を除去する。この金属膜の除去には、例えば、プラズマエッチング、リアクティブイオンエッチング、ビームエッチング、光アシストエッチング等の物理的エッチング法、ウェットエッチング等の化学的エッチング法等のうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００４４】
その後、レジスト層を除去することにより、作用電極３を得ることができる。
また、作用電極３は、例えば、導電性粒子を含む導電性材料を基板８上に塗布（供給）した後、必要に応じて、この塗膜に対して後処理（例えば加熱、赤外線の照射、超音波の付与等）を施すことにより形成することもできる。
ここで、塗布法には、例えば、スピンコート法、キャスティング法、マイクログラビアコート法、グラビアコート法、バーコート法、ロールコート法、ワイヤーバーコート法、ディップコート法、スプレーコート法、スクリーン印刷法、フレキソ印刷法、オフセット印刷法、インクジェット法、マイクロコンタクトプリンティング法等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。塗布法としては、これらの中でも、特に、インクジェット法を用いるのが好ましい。インクジェット法によれば、基板８の所望の領域に導電性材料を供給することができることから、前述したようなレジスト層を形成することなく、所望の形状の作用電極３を形成することができる。
【００４５】
［２］  次に、図２（ｃ）に示すように、作用電極３上に、下地層６を形成する。
前記生体由来高分子を用いて下地層６を構成する場合、この下地層６は、次のようにして形成することできる。
まず、生体由来高分子を溶媒に溶解して液状材料を調製する。
この溶媒としては、例えば、リン酸、硝酸、硫酸、アンモニア、過酸化水素、水等の無機溶媒や、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）等のアミド系溶媒、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、スルホラン等の硫黄化合物系溶媒、または、これらを含む混合溶媒等が挙げられる。
【００４６】
前記液状材料中における生体由来高分子の濃度（含有量）は、２０ｗｔ％以下であるのが好ましく、１〜１０ｗｔ％程度であるのがより好ましい。
次いで、調製した液状材料を作用電極３上に供給した後、乾燥することにより形成することができる。液状材料を作用電極３上に供給する方法としては、例えば、前述したような塗布法のうち、特に、インクジェット法を用いるのが好ましい。
【００４７】
［３］  次に、図２（ｄ）に示すように、下地層６上に、酵素電極層７を形成する。
酵素電極層７は、その層（膜）中にタンパク質を含み、かつ、下地層６の形状に対応して形成されることから、この酵素電極層７の形成に、本発明の膜形成方法が適用される。
ここで、下地層６上のような所定の領域に対して選択的に酵素電極層７等の膜を形成する場合には、タンパク質を含む液状組成物を、インクジェット法を用いて所定の領域に供給する方法が好適に用いられる。
【００４８】
ところが、前述した背景技術で説明したように、インクジェット法を用いて膜を形成すると、インク（液状組成物）の粘度や表面張力を調整することを目的に含有されるポリエーテル系化合物とタンパク質とが接触し、このことに起因して、タンパク質の生理活性が低下（失活）するという問題がある。
本発明者は、かかる問題点に鑑み鋭意検討した結果、タンパク質が失活するのは、タンパク質に接触するポリエーテル系化合物の重量平均分子量と密接に関係していることが判ってきた。
【００４９】
そして、本発明者は、さらに検討を重ねた結果、ポリエーテル化合物の重量平均分子量を２０００以下に設定することにより、タンパク質の安定性が向上して、その生理活性が低下するのを好適に防止または抑制し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
以下、本発明の膜形成方法を適用して、酵素電極層７を形成する方法について詳述する。
【００５０】
［３−１］  まず、タンパク質と、重量平均分子量２０００以下であるポリエーテル系化合物とを含有する液状組成物（本発明の液状組成物）を用意（調製）する。（第１の工程）。
液状組成物を調製する際に用いる溶媒としては、例えば、リン酸、硝酸、硫酸、アンモニア、過酸化水素、水等の無機溶媒や、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）等のアミド系溶媒、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、スルホラン等の硫黄化合物系溶媒、または、これらを含む混合溶媒等が挙げられる。
【００５１】
ここで、ポリエーテル系化合物は、優れた成膜精度で下地層６上に酵素電極層７を形成（成膜）し得るよう、液状組成物の粘度および表面張力を調整することを目的に、液体組成物中に含有される。
このようなポリエーテル系化合物は、その重量平均分子量が、２０００以下、好ましくは３００〜１０００程度に設定される。前記重量平均分子量をかかる範囲内に設定することにより、液状組成物の粘度および表面張力を好適な範囲内に設定することができる。さらに、ポリエーテル系化合物がタンパク質に接触する際に、ポリエーテル系化合物がタンパク質の活性部位に対する立体障害となり難い。そのため、タンパク質の安定性が向上して、その生理活性が好適に維持されることとなる。
【００５２】
さらに、このポリエーテル系化合物の重量平均分子量をＣとしたとき、前記ポリエーテル系化合物のバラツキは、±０．２Ｃの範囲内であるのが好ましく、±０．１Ｃの範囲内であるのがより好ましい。これにより、タンパク質に接触するポリエーテル系化合物の分子量の大きさが均一化されることから、分子量の大きいポリエーテル系化合物に接触する確率を低減させることができる。その結果、分子量の大きいものと接触することによるタンパク質の生理活性の低下をより好適に防止または抑制することができる。
【００５３】
また、ポリエーテル系化合物は、ポリエーテルで構成される主鎖と、この主鎖の端部の少なくとも一方に、タンパク質と結合し得る結合基（以下、単に「結合基」という。）とを有するものであるのが好ましい。これにより、液状組成物中において、タンパク質とポリエーテル系化合物とが接触した際に、この結合基とタンパク質とが結合することとなり、ポリエーテル系化合物がタンパク質に連結される。これにより、タンパク質とポリエーテル系化合物との密着性が向上することとなる。その結果、タンパク質の安定性がより向上することとなり、その生理活性の低下をより好適に抑制または防止することができる。
【００５４】
さらに、ポリエーテル系化合物は、結合基を、前記端部の双方に有するのがより好ましい。これにより、タンパク質とポリエーテル系化合物との密着性がさらに向上して、前述したような効果をより顕著に発揮させることができる。
具体的には、結合基としては、特に限定されず、例えば、アミノ基、カルボキシル基、Ｎ−ハイドロキシサクシミドエステル（ＮＨＳ）基、チオール基、マレイミド基、下記化１のようなジスルフィド基を含む結合基およびハロゲン基等をその末端に含むものが挙げられる。
【００５５】
【化１】
2007256260.tif 000002
【００５６】
例えば、アミノ基は、タンパク質が有するカルボキシル基とアミド結合を形成することにより、タンパク質とポリエーテル系化合物とが結合する。カルボキシル基は、タンパク質が有するアミノ基とアミド結合を形成することにより、タンパク質とポリエーテル系化合物とが結合する。Ｎ−ハイドロキシサクシミドエステル基は、タンパク質が有するアミノ基に置換することにより、タンパク質とポリエーテル系化合物とが結合する。さらに、上記化１で表される結合基は、タンパク質が有するチオール基に置換することにより、タンパク質とポリエーテル系化合物とが結合する。
【００５７】
なお、ポリエーテル系化合物は、上述したように、その少なくとも一方の端部がタンパク質と結合し得る結合基で置換されているものの他、例えば、その少なくとも一方の端部がタンパク質と結合し得ない置換基で置換されているものや、無置換のものであってもよい。
このような置換基としては、特に限定されないが、例えば、アルキル基や、フェニル基、ビフェニル基、シクロヘキサン基のような炭化水素環基、ヒドロキシル基等が挙げられる。
【００５８】
ポリエーテルで構成される主鎖としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびポリメチレングリコール等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができるが、これらの中でも、主としてポリエチレングリコールで構成されているのが好ましい。換言すれば、ポリエーテル系化合物は、ポリエチレングリコール系化合物を主成分として構成されているのが好ましい。これにより、液状組成物の粘度および表面張力を好適な範囲内に比較的容易に設定することができる。
以上のようなポリエーテル系化合物の具体例としては、例えば、次のようなポリエチレングリコール系化合物が挙げられる。
【００５９】
【化２】
2007256260.tif 000003
【００６０】
ただし、前記各式中、ｎは、１以上の整数を表し、例えば、ポリエチレングリコール系化合物の重量平均分子量を３００〜１０００程度に設定する場合、ｎは、５〜２０程度に設定される。
また、液状組成物中におけるポリエーテル系化合物の含有量をＡ［ｗｔ％］とし、タンパク質の含有量をＢ［ｗｔ％］としたとき、Ａ／Ｂが９〜１０５なる関係を満足するのが好ましく、２０〜１０４なる関係を満足するのがより好ましい。ポリエーテル系化合物の含有量とタンパク質の含有量とが前記関係を満足することにより、タンパク質に対するポリエーテル系化合物の付着率が好ましい範囲内に設定され、タンパク質の生理活性が低下するのをより好適に抑制または防止することができる。
【００６１】
なお、液体組成物中におけるタンパク質の含有量は、１０ｗｔ％以下であるのが好ましく、０．０１〜５ｗｔ％程度であるのがより好ましい。これにより、形成される酵素電極層７中において、液体試料２０中に含まれるターゲットとの間で十分な反応を生じさせることができる。その結果、電子を効率よく放出させることができる。
液体組成物中におけるポリエーテル系化合物の含有量は、９０ｗｔ％以上であるのが好ましく、９５〜９９．９ｗｔ％程度であるのがより好ましい。ポリエーテル系化合物の含有量が多すぎると、ポリエーテル系化合物の種類によっては、液体組成物の粘度が増大し、インクジェット法により液体組成物を液滴として吐出させることが不可能となる場合がある。また、ポリエーテル系化合物の含有量が少なすぎると、液体組成物が乾き易くなるおそれがある。さらに、ポリエーテル系化合物の含有量をかかる範囲内に設定することにより、タンパク質に対するポリエーテル系化合物の付着率がより好ましい範囲内に設定され、タンパク質の生理活性の低下をより好適に抑制または防止することができる。
なお、液状組成物中には、必要に応じて、メディエータ等を添加しておく。
【００６２】
液状組成物中にメディエータを含む場合、その含有量は、０．１〜１．０ｗｔ％程度であるのが好ましく、０．１ｗｔ％程度であるのがより好ましい。メディエータの含有量を前記範囲とすることにより、後工程［３−３］において形成された酵素電極層７においてターゲットから放出された電子を、下地層６を介して作用電極３に確実かつ迅速に移動させることができる。
【００６３】
上述したような液状組成物（インク）の粘度は、特に限定されないが、通常は、常温での粘度が２０ｃＰ以下であるのが好ましく、４〜１０ｃＰ程度であるのがより好ましい。粘度がこのような範囲であれば、インクジェット法により液体組成物を液滴として安定的に吐出することができる。
また、溶媒の表面張力は、特に限定されないが、通常は、２０〜７０ｍＮ／ｍ程度であるのが好ましく、３０〜５０ｍＮ／ｍ程度であるのがより好ましい。表面張力をこのような範囲内に設定することにより、インクジェット法により吐出された液滴により、下地層６上において、均一な膜厚の液状被膜を形成することができる。
【００６４】
［３−２］  次いで、液状組成物を、インクジェット法を用いて下地層６上（一方の面側）に供給して、液状被膜を形成する（第２の工程）。
ここで、液状組成物の粘度および表面張力が前述したような範囲内に設定されていることから、下地層６上に、液状組成物を液滴として安定的に吐出（供給）することができるとともに、均一な膜厚の液状被膜を形成することができる。
【００６５】
［３−３］  次に、下地層６上に形成した液状被膜を乾燥することにより、酵素電極層７を形成する（第３の工程）。
ここで、酵素電極層７に含まれるポリエーテル系化合物の重量平均分子量を、本発明のように２０００以下とすることにより、本実施形態のように、作用電極３を利用して、作用電極３とタンパク質、またはターゲットとの間の電子の授受等によって電気信号を取得するセンサ１に適用した場合、作用電極３と、タンパク質またはターゲットとの間の距離が、電気信号の取得に適した距離に設定されることとなる。
液状被膜を乾燥する際の雰囲気の温度は、２０〜８０℃程度であるのが好ましく、２０〜４５℃程度であるのがより好ましい。
乾燥時間は、１０〜１５０分間程度であるのが好ましく、３０〜１００分間程度であるのがより好ましい。
【００６６】
液状被膜を乾燥する際の条件をかかる範囲内に設定することにより、液状被膜中に含まれるタンパク質の生理活性の低下を確実に防止することができるとともに、液状被膜を迅速かつ確実に乾燥させて、均一な膜厚の酵素電極層７を形成することができる。
また、ポリエーテル系化合物の端部に結合基を有する場合には、液状被膜を乾燥する際の条件を前述のような範囲内に設定することにより、液状被膜中に含まれるタンパク質と結合基とをより確実に結合させて、ポリエーテル系化合物のタンパク質に対する結合（連結）率をより確実に向上させることができる。
【００６７】
以上のような工程を経ることにより、タンパク質が有する生理活性の低下を好適に抑制または防止した状態で、優れた成膜精度の酵素電極層７を下地層６上に形成することができる。
なお、重量平均分子量が２０００以下であるポリエーテル系化合物は、酵素のような生理活性を有するタンパク質や、核酸等のように極性基を有する物質に対して高い親和性を有しているので、本実施形態のように、検出用物質として酵素を用いる場合に、本発明の膜形成方法を用いて検出用膜を形成することは特に効果的である。
また、本実施形態では、所定の領域に液滴として液状材料を供給する方法、すなわち、液滴吐出法として、インクジェット法を用いる場合について説明したが、このような場合に限定されず、液滴吐出法として、例えば、バブルジェット法（「バブルジェット」は登録商標）等を用いるようにしてもよい。
【００６８】
［４］  次に、図２（ｅ）に示すように、作用電極３に対向するように、対電極４を配置するとともに、参照電極５を所定の箇所に配置した状態で、例えば、接着剤を外周部に供給した後、硬化させることにより、封止部１０を形成する。これにより、酵素電極層７と対電極４と封止部１０とで、試料収納空間２が画成される。
接着剤としては、例えば、エポキシ系接着剤、アクリル系接着剤、ゴム系接着剤等が挙げられる。
なお、このとき、封止部１０には、液体試料２０を試料収納空間２内に供給するための注入口（供給口）１０１を形成しておく。
【００６９】
以上の工程により、図１に示すセンサ１が得られる。
以上、本発明の膜形成方法、膜付基板、センサおよび液状組成物を図示の実施形態に基づいて説明したが、本発明は、これらに限定されるものではない。
例えば、本発明の膜形成方法は、任意の目的の工程が１または２以上追加されていてもよい。
【００７０】
さらに、本発明の膜付基板は、上述したようなセンサに適用できる他、例えば、基板上に生理活性を有するタンパク質が担持されたタンパク質用マイクロアレイ、遺伝子解析チップ等に適用することもできる。
また、本発明のセンサを構成する各部は、同様の機能を発揮し得る任意の構成のものと置換することができる。
【００７１】
例えば、各層の間には、センサの特性の低下を招かない範囲で、任意の目的（密着性の向上）の層を１層以上設けるようにしてもよい。
なお、本実施形態では、検出用物質として生理活性を有するタンパク質を用い、ターゲットとの反応により生じる電子を検出するセンサを代表にして説明したが、このような場合に限定されるものではない。
【００７２】
例えば、検出用物質としては、生理活性を有するタンパク質以外のもの、および生理活性を有さないタンパク質以外のものを用いることができる。
なお、生理活性を有するタンパク質以外のものとしては、例えば、ＤＮＡやＲＮＡのような核酸およびステロイドホルモン等が挙げられる。
生理活性を有さないタンパク質以外のものとしては、例えば、蛍光色素等が挙げられる。
これらのものを検出用物質として用いた場合でも、生理活性を有するタンパク質を用いた場合と同様の効果が得られる。但し、酵素のように生理活性を有するタンパク質を検出用物質として用いて検出用膜を形成する場合に適用すれば、前述したような効果が特に顕著に認められることから好ましい。
【実施例】
【００７３】
次に、本発明の具体的実施例について説明する。
１．液状組成物の調製
（サンプルＮｏ．１）
グルコースオキシダーゼ（３００ｕｎｉｔｓ／ｍｇ；タンパク質）と、下記化３で表されるポリエチレングリコール系化合物（ポリエーテル系化合物）と、フェロセン（メディエータ）とを、リン酸緩衝液（１０ｍＭ；ｐＨ７．８）に溶解して、液状組成物を調製した。
【００７４】
【化３】
2007256260.tif 000004
【００７５】
なお、液状組成物中におけるタンパク質、ポリエチレングリコール系化合物およびメディエータは、それぞれ、液状組成物中における濃度が、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ／ｍＬおよび０．０１ｍｍｏｌ／ｍＬとなるように混合した。
【００７６】
（サンプルＮｏ．２）
ポリエーテル系化合物として、前記化３で表されるポリエチレングリコール系化合物に代えて、下記化４で表されるポリエチレングリコール系化合物を用いた以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして液状組成物を作製した。
【００７７】
【化４】
2007256260.tif 000005
【００７８】
（サンプルＮｏ．３）
ポリエーテル系化合物として、前記化３で表されるポリエチレングリコール系化合物に代えて、下記化５で表されるポリエチレングリコール系化合物を用いた以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして液状組成物を作製した。
【００７９】
【化５】
2007256260.tif 000006
【００８０】
（サンプルＮｏ．４）
ポリエーテル系化合物として、前記化３で表されるポリエチレングリコール系化合物に代えて、下記化６で表されるポリエチレングリコール系化合物を用いた以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして液状組成物を作製した。
【００８１】
【化６】
2007256260.tif 000007
【００８２】
（サンプルＮｏ．５）
ポリエーテル系化合物として、前記化３で表されるポリエチレングリコール系化合物に代えて、下記化７で表されるポリエチレングリコール系化合物を用いた以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして液状組成物を作製した。
【００８３】
【化７】
2007256260.tif 000008
【００８４】
（サンプルＮｏ．６）
ポリエーテル系化合物およびメディエータの添加を省略した以外は、前記サンプルＮｏ．１と同様にして液状組成物を作製した。
【００８５】
２．センサの作製
以下の各実施例および比較例において、センサを５個ずつ製造した。
（実施例１）
＜１＞  まず、ガラス基板を用意し、真空蒸着により、平均厚さ２００ｎｍのＡｇ電極（作用電極）を形成した。
【００８６】
＜２＞  次に、生体関連高分子としてアルブミンを純水に溶解して、アルブミン含有溶液を調製した。
そして、このアルブミン含有溶液を、作用電極上にインクジェット法を用いて供給して液状被膜を形成した後、大気圧雰囲気下、６０℃×３０分の条件で乾燥して、下地層を得た。
【００８７】
＜３＞  次に、サンプルＮｏ．１の液状組成物を、インクジェットプリンタ（セイコーエプソン社製、「ＰＭ７００」）が備えるインク室内に供給した後、このインク室に設けられた圧電素子を作動させることにより、下地層上に液滴として供給した。これにより、下地層上に液状被膜を形成した。なお、液状組成物の粘度および表面張力は、それぞれ、３．６ｃＰおよび３２ｍＮ／ｍであり、圧電素子の振動は、駆動電圧２８Ｖ、周波数１０ＫＨｚの条件で行った。
次いで、この液状被膜を、大気圧雰囲気下、５０℃×４０分の条件で乾燥して、下地層上に平均厚さ５０ｎｍの酵素電極層を形成した。
【００８８】
＜４＞  次に、作用電極に対向するように、プラチナ製の対電極を配置するとともに、カーボン製の参照電極を所定の箇所に配置した状態で、エポキシ系接着剤を外周部に供給した後、硬化させることにより、封止部を形成した。これにより、反応層と対電極と封止部とで、試料収納空間が画成される。
なお、このとき、封止部には、液体試料を試料収納空間内に供給するための注入口を形成しておいた。
以上のようにして、センサを得た。
【００８９】
（実施例２）
前記工程＜３＞において、液状組成物として、サンプルＮｏ．１のものに代えて、サンプルＮｏ．２のものを用いた以外は、前記実施例１と同様にしてセンサを作製した。
（実施例３）
前記工程＜３＞において、液状組成物として、サンプルＮｏ．１のものに代えて、サンプルＮｏ．３のものを用いた以外は、前記実施例１と同様にしてセンサを作製した。
【００９０】
（実施例４）
前記工程＜３＞において、液状組成物として、サンプルＮｏ．１のものに代えて、サンプルＮｏ．４のものを用いた以外は、前記実施例１と同様にしてセンサを作製した。
（比較例）
前記工程＜３＞において、液状組成物として、サンプルＮｏ．１のものに代えて、サンプルＮｏ．５のものを用いた以外は、前記実施例１と同様にしてセンサを作製した。
【００９１】
３．評価
３−１．液状組成物の評価
各サンプルＮｏ．の液状組成物１ｍＬに対して、ＨＲＰ（Horse radish peroxidase）、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）およびフェノールを含有する評価用試薬１ｍＬを添加した。
【００９２】
なお、評価用試薬中におけるＨＲＰ、４−ＡＡおよびフェノールは、それぞれ、評価用試薬中の濃度が、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ／ｍＬおよび１．０ｍｍｏｌ／ｍＬとなるように混合した。
このような評価用試薬が添加された各サンプルＮｏ．の液状組成物に０．００１ｍｍｏｌ／ｍＬグルコース水溶液１ｍＬを添加した。
これにより、前記式１の第１段階で生成された過酸化水素により、下記式３に示すような反応を進行させて赤色キノン系色素を生成させた。
【００９３】
【化８】
2007256260.tif 000009
【００９４】
そして、この赤色キノン系色素の生成量を、波長５０５ｎｍでの吸光度を測定することにより、各サンプルＮｏ．の液状組成物中に含まれるグルコースオキシダーゼ（タンパク質）の活性度を間接的に測定した。
また、吸光度（活性度）の測定は、各サンプルＮｏ．の液状組成物について、それぞれ、５回行った。
そして、サンプルＮｏ．６で測定されたグルコースオキシダーゼの活性度を基準値として、各実施例で測定された活性度を、それぞれ、以下の４段階の基準に従って評価した。
【００９５】
◎：サンプルＮｏ．６の活性度に対し、０．８０倍以上、１．００倍以下である
○：サンプルＮｏ．６の活性度に対し、０．６０倍以上、０．８０倍未満である
△：サンプルＮｏ．６の活性度に対し、０．４０倍以上、０．６０倍未満である
×：サンプルＮｏ．６の活性度に対し、０．４０倍未満である
これらの評価結果を、それぞれ、以下の表１に示す。
【００９６】
【表１】
2007256260.tif 000010
【００９７】
表１に示すように、サンプルＮｏ．１〜４の液状組成物（本発明の液状組成物）は、いずれも、サンプルＮｏ．５の液状組成物（比較例）と比較して、液状組成物中に含まれるグルコースオキシダーゼ（タンパク質）の活性度が大きくなる結果が得られた。
これにより、本発明の液状組成物中において、タンパク質（酵素）の生理活性の低下（失活）が好適に抑制また防止されていることが明らかとなった。
【００９８】
また、ポリエチレングリコール系化合物と連結しているグルコースオキシダーゼ（タンパク質）を含有するサンプルＮｏ．２〜４の液状組成物は、ポリエチレングリコール系化合物と連結していないタンパク質を含有するサンプルＮｏ．１の液状組成物と比較して、グルコースオキシダーゼ（タンパク質）の活性度がより大きくなる傾向を示した。
さらに、ポリエチレングリコール系化合物の重量平均分子量がより適切な大きさに保たれているもの、すなわち、サンプルＮｏ．４の液状組成物は、その活性度が、サンプルＮｏ．６の液状組成物の活性度とほぼ等しい結果が得られたことから、液状組成物中のグルコースオキシダーゼ（タンパク質）がほとんど失活していないことが明らかとなった。
【００９９】
３−２．センサの評価
各実施例および比較例のセンサについて、それぞれ、試料収納空間内に０．００１ｍｍｏｌ／ｍＬグルコース水溶液（液体試料）を供給した後、作用電極と対電極との間に電圧を印加した。そして、これらの電極間に流れる電流の最大値（以下、単に「電流値」という。）（μＡ）を測定した。
また、電流値は、各実施例および比較例において、それぞれ、５個のセンサについて測定した。
【０１００】
なお、電流値の測定は、作用電極と対電極との間に０．５Ｖの電圧を印加することで行った。
その結果、各実施例で測定された電流値は、いずれも、比較例で測定された電流値に対して大きくなり、その大きさは、実施例１〜４の順に対して逆順となっていた。
この結果は、液状組成物の評価で測定された各サンプルＮｏ．の液状組成物中に含まれるグルコースオキシダーゼの活性度の差を反映したようなものであった。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】本発明のセンサの構成を模式的に示す縦断面図である。
【図２】図１に示すセンサの製造方法を説明するための縦断面図である。
【符号の説明】
【０１０２】
１‥‥センサ  ２‥‥試料収納空間  ２０‥‥液体試料  ３‥‥作用電極  ４‥‥対電極  ５‥‥参照電極  ６‥‥下地層  ７‥‥酵素電極層  ８‥‥基板  １０‥‥封止部  １０１‥‥注入口
【図１】
2007256260.tif 000011
【図２】
2007256260.tif 000012