(57)【要約】【課題】  目的物質の精度の高い検出が可能である金粒子を提供する。【解決手段】  金粒子表面に、重量平均分子量／数平均分子量で規定される分子量多分散度が１〜１.２であるポリマーをメルカプト末端基により固定化させ、該ポリマーの他末端に、目的物質に対して特異的親和性を有するリガンドを固定化させたことを特徴とする修飾金粒子。  ポリマーは刺激応答性ポリマーであることが好ましい。  前記修飾金粒子と、測定対象試料とを溶液中で混合し、リガンドが目的物質と特異的に結合した時にのみ形成される凝集体の有無により目的物質を検出する方法。  前記修飾金粒子と、測定対象試料とを溶液中で混合後、刺激を与えることにより修飾金粒子を凝集させ、金粒子及び／又は目的物質を分離回収する方法。【選択図】      図１
2007071832.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
金粒子表面に、重量平均分子量／数平均分子量で規定される分子量多分散度が１〜１.２であるポリマーをメルカプト末端基により固定化させ、該ポリマーの他末端に、目的物質に対して特異的親和性を有するリガンドを固定化させたことを特徴とする修飾金粒子。
【請求項２】
ポリマーが刺激応答性ポリマーであることを特徴とする請求項１に記載の修飾金粒子。
【請求項３】
下記（Ａ）〜（Ｃ）工程を含むことを特徴とする修飾金粒子の製造方法。
（Ａ）ラジカル重合性モノマーを、チオカルボニルチオ基を有する連鎖移動剤の存在下で、可逆的付加開裂連鎖移動重合させて、チオカルボニルチオ基を有するポリマーを得、
該ポリマーのチオカルボニルチオ基を、メルカプト基に変換し、メルカプト末端基を有するポリマーを得る工程。
（Ｂ）（Ａ）工程で得られたメルカプト末端基を有するポリマーと、金粒子とを溶媒中で混合し、金粒子表面にメルカプト末端基によりポリマーを固定化する工程。
（Ｃ）前記ポリマーの他末端に、目的物質に対して特異的親和性を有するリガンドを結合させる工程。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の修飾金粒子と、測定対象試料とを溶液中で混合し、リガンドが目的物質と特異的に結合した時にのみ形成される凝集体の有無により目的物質を検出する方法。
【請求項５】
請求項２に記載の修飾金粒子と、測定対象試料とを溶液中で混合後、刺激を与えることにより修飾金粒子を凝集させ、金粒子及び／又は目的物質を分離回収する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は修飾金粒子、その製造方法、及び修飾金粒子の特異的親和性を利用した分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
金粒子は、分散状態の変化によって、表面プラズモン吸収由来の吸収極大波長がシフトし、色調が変化することが知られている。そこで、金粒子の表面に目的物質に対して特異的親和性を有するリガンドを固定化すると、特異的反応による凝集に由来する色調変化の有無により目的物質を検出することが可能である。
例えば、特許文献１においては、試料中のウィルス等の抗原を視覚的に検出するため、抗体が結合した金コロイド粒子が利用されている。また特許文献２においては、１本鎖ＤＮＡが表面に固定した金コロイド粒子と、ターゲットＤＮＡとを溶液中でアニール後、凝集体形成の有無により、ターゲットＤＮＡの配列を検知する方法が記載されている。
【０００３】
現在、金コロイド溶液は、医薬品、化粧品、食品及び塗料等の広範な分野において利用されている。金コロイド溶液は、塩化金酸溶液に還元剤としてクエン酸塩溶液を加えて加熱し、金イオンを還元させてコロイドとする溶液内還元反応を用いて製造できる。（非特許文献１）。
しかし、一般に金コロイド粒子は水溶液中での分散安定性が悪く、わずかな塩の添加で凝集し、沈殿してしまうことが問題になっていた。
【０００４】
そこで、金粒子表面を水溶性のポリマー鎖で修飾し、金粒子の分散安定性を向上させ、該ポリマーの反対末端にリガンド分子を導入することが試みられている。例えば非特許文献２には、金粒子表面に、アニオン重合により合成されたポリマー（ポリエチレングリコール誘導体）を付着させ、該ポリマーの反対末端に糖を結合させた修飾金ナノ粒子が開示されており、これを用いて目的物質であるレクチンを捕捉する方法が記載されている。
【特許文献１】特開平０６−２１３８９１号公報
【特許文献２】特開２００４−２７５１８７号公報
【非特許文献１】化学工業  １９９８年４月  ｐ．２６９−２７７
【非特許文献２】J. AM. Chem. Soc., 123, 8226-8230 (2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、アニオン重合を効率よく、且つ十分に制御しながら進行させるには、反応系から水分を十分に除去する必要がある。そのため上記技術においては、金粒子に付着しているポリマーの分子量が不均一であり、目的物質の検出の精度が低いという問題があった。また目的物質の回収・解析が困難であると同時に、金粒子自体を回収して再利用することも困難であった。
本発明の目的は、目的物質の精度の高い検出が可能である金粒子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記事情を鑑み、本発明者等が鋭意検討を行った結果、金粒子表面に結合させるポリマーとして、可逆的付加開裂連鎖移動重合法（RAFT法）により合成した分子量分布の狭いポリマーを用いることにより、均一かつ分散性が高い金粒子を得ることができ、目的物質のより精度の高い検出が可能であることを見出した。
そして、上記ポリマーとして、刺激応答性ポリマーを用いることによって、目的物質との混合後に刺激を与えることにより金粒子を凝集させ、目的物質の回収・解析、及び金粒子の再利用が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明の第一の主題は、金粒子表面に、重量平均分子量／数平均分子量で規定される分子量多分散度が１〜１.２であるポリマーをメルカプト末端基により固定化させ、該ポリマーの他末端に、目的物質に対して特異的親和性を有するリガンドを固定化させたことを特徴とする修飾金粒子である。
前記修飾金粒子において、ポリマーは刺激応答性ポリマーであることが好ましい。
【０００８】
本発明の第二の主題は、下記（Ａ）〜（Ｃ）工程を含むことを特徴とする修飾金粒子の製造方法である。
（Ａ）ラジカル重合性モノマーを、チオカルボニルチオ基を有する連鎖移動剤の存在下で、可逆的付加開裂連鎖移動重合させて、チオカルボニルチオ基を有するポリマーを得、
該ポリマーのチオカルボニルチオ基を、メルカプト基に変換し、メルカプト末端基を有するポリマーを得る工程。
（Ｂ）（Ａ）工程で得られたメルカプト末端基を有するポリマーと、金粒子とを溶媒中で混合し、金粒子表面にメルカプト末端基によりポリマーを固定化する工程。
（Ｃ）前記ポリマーの他末端に、目的物質に対して特異的親和性を有するリガンドを結合させる工程。
【０００９】
本発明の第三の主題は、前記修飾金粒子と、測定対象試料とを溶液中で混合し、リガンドが目的物質と特異的に結合した時にのみ形成される凝集体の有無により目的物質を検出する方法である。
また、前記修飾金粒子と、測定対象試料とを溶液中で混合後、刺激を与えることにより修飾金粒子を凝集させ、金粒子及び／又は目的物質を分離回収する方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の修飾金粒子は、表面に分子量多分散度が１〜１.２であるポリマーを固定化し、該ポリマーの他末端に、目的物質に対して特異的親和性を有するリガンドを固定化したものであるため分散安定性が非常に高く、これを利用して目的物質の精度の高い検出が可能である。
また本発明の修飾金粒子は、目的物質と結合後、遠心操作等により回収することができるが、特にポリマーとして刺激応答性ポリマーを使用した場合には、目的物質と結合後に刺激を与えることにより凝集が生じるため、容易に目的物質あるいは金粒子を回収することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態について詳述する。
本発明にかかる修飾金粒子は、金粒子表面に、重量平均分子量／数平均分子量で規定される分子量多分散度が１〜１.２であるポリマーが結合しており、該ポリマーの他末端に、目的物質に対して特異的親和性を有する物質が結合していることを特徴とする。
【００１２】
本発明に用いられる金粒子は、通常市販のものを用いればよいが、常法、例えば塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法により調製したものを用いることもできる。
本発明において金粒子は、金を含む合金又は金化合物であっても良い。金を含む合金としては、金合金を形成し得る金属（例えば、Ｐｔ、Ｃｕ、Ａｇ、Ｐｄ等の遷移金属等）を含む合金であって、金含有量が９０質量％以上、好ましくは９５質量％以上のものが例示される。金化合物としては、例えば、臭化金、塩化金、シアン化金、水酸化金、酸化金、シアン化金カリウム、塩化金ナトリウム、テトラクロロ金酸等が挙げられる。
本発明において、金粒子の粒径は特に限定されないが、１〜１０００ｎｍ程度、特に１０〜１００ｎｍであることが好ましい。
【００１３】
本発明において、金粒子表面に固定化するポリマーは、重量平均分子量／数平均分子量で規定される分子量多分散度が１〜１.２であることを特徴とする。分子量多分散度が大きいと、目的物質の検出の精度が低くなる。
また、Ｍｗ及びＭｎは特に限定されないが、Ｍｗは５０００以上、Ｍｎは５０００以上であることが好ましい。
なお本発明において、Ｍｗ、Ｍｎ及び多分散度はＧＰＣという方法で測定したものである。カラムはショーデックスのＫＦ−８０３Ｌカラムを用い、展開溶媒にＴＨＦ、流速１ｍＬ／ｍｉｎ、４０℃という条件で行った。
【００１４】
分子量多分散度が１〜１.２であるポリマーは、例えば可逆的付加開裂連鎖移動重合法（RAFT法）を利用した以下のような方法により、調製することができる。すなわち、ラジカル重合性モノマーを、チオカルボニルチオ基を有する連鎖移動剤の存在下で、可逆的付加開裂連鎖移動重合させて、チオカルボニルチオ基を有するポリマーを得、該ポリマーのチオカルボニルチオ基を、メルカプト基に変換し、メルカプト末端基を有するポリマーを得る方法である。
【００１５】
ラジカル重合性モノマーとしては、次の化合物が挙げられるが、これらに限定されない：
アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ｎ−プロピル、アクリル酸イソプロピル、アクリル酸ｎ−ブチル、アクリル酸ヘキシル、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸シクロヘキシル、アクリル酸オクチル、アクリル酸デシル、アクリル酸ドデシル、アクリル酸フェニル、アクリル酸トルイル、アクリル酸ベンジル、アクリル酸イソボルニル、アクリル酸２−メトキシエチル、アクリル酸３−メトキシブチル、アクリル酸２−ヒドロキシエチル、アクリル酸２−ヒドロキシプロピル、アクリル酸ステアリル、アクリル酸グリシジル、２−アクリロイルオキシプロピルジメトキシメチルシラン、２−アクリロイルオキシプロピルトリメトキシシラン、アクリル酸トリフルオロメチル、アクリル酸ペンタフルオロエチル、アクリル酸２，２，２−トリフルオロエチル、アクリル酸３−ジメチルアミノエチル、アクリル酸イソブチル、アクリル酸４−ヒドロキシブチル、アクリル酸ｔ−ブチル、アクリル酸ラウリル、アルキル変性ジペンタエリスリトールのアクリレート、エチレンオキサイド変性ビスフェノールＡジアクリレート、アクリル酸カルビトール、ε−カプロラクトン変性ジペンタエリスリトールのアクリレート、カプロラクトン変性テトラヒドロフルフリルアクリレート、カプロラクトン変性ヒドロキシピバリン酸ネオペンチルグリコールエステルジアクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラアクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサアクリレート、ジペンタエリスリトールペンタアクリレート、アクリル酸テトラエチレングリコール、アクリル酸テトラヒドロフルフリル、アクリル酸トリプロピレングリコール、トリメチロールプロパンエトキシトリアクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、ネオペンチルグリコールジアクリレート、ネオペンチルグリコールヒドロキシピバリン酸エステルジアクリレート、アクリル酸１，９−ノナンジオール、アクリル酸１，４−ブタンジオール、２−プロペノイックアシッド〔２−〔１，１−ジメチル−２−〔（１−オキソ−２−プロペニル）オキシ〕エチル〕−５−エチル−１，３−ジオキサン−５−イル〕メチルエステル、アクリル酸１，６−ヘキサンジオール、ペンタエリスリトールトリアクリレート、２−アクリロイルオキシプロピルハイドロジェンフタレート、３−メトキシアクリル酸メチル、アクリル酸アリル等のアクリル酸エステル；
【００１６】
メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ｎ−ブチル、メタクリル酸イソブチル、メタクリル酸ｔ−ブチル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸ラウリル、メタクリル酸トリデシル、メタクリル酸ステアリル、メタクリル酸シクロヘキシル、メタクリル酸ベンジル、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル、メタクリル酸２−ヒドロキシプロピル、メタクリル酸Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル、メタクリル酸Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチル、メタクリル酸グリシジル、メタクリル酸テトラヒドロフルフリル、ジメタクリル酸エチレングリコール、ジメタクリル酸トリエチレングリコール、ジメタクリル酸テトラエチレングリコール、ジメタクリル酸１，３−ブチレングリコール、トリメタクリル酸トリメチロールプロパン、メタクリル酸イソプロピル、メタクリル酸ペンチル、メタクリル酸ヘキシル、メタクリル酸ヘプチル、メタクリル酸オクチル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸ノニル、メタクリル酸デシル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸フェニル、メタクリル酸トルイル、メタクリル酸イソボルニル、メタクリル酸２−メトキシエチル、メタクリル酸３−メトキシブチル、メタクリル酸２−アミノエチル、メタクリル酸トリエチレングリコール、２−メタクリロイルオキシプロピルトリメトキシシラン、２−メタクリロイルオキシプロピルジメトキシメチルシラン、メタクリル酸トリフルオロメチル、メタクリル酸ペンタフルオロエチル、メタクリル酸２，２，２−トリフルオロエチル等のメタクリル酸エステル；
【００１７】
スチレン、α−メチルスチレン、ジビニルベンゼン、ｐ−ヒドロキシスチレン、ｐ−カルボキシスチレン、ｐ−メトキシスチレン、ジエチルアミノスチレン、ジエチルアミノα−メチルスチレン、ｐ−ビニルベンゼンスルホン酸、ｐ−ビニルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ｍ，ｍ−ジメチルスチレン等のスチレン系化合物；
エチレン、プロピレン、１−ブテン、１−ヘプテン、１−ヘキセン、１−オクテン、イソブチレン、ブタジエン、イソプレン等の脂肪族末端オレフィン化合物；
フッ化ビニル、臭化ビニル、クロロプレン、塩化ビニリデン等のハロゲン含有オレフィン化合物；アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ−メチルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−ｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−ｔ−ブチルメタクリルアミド、Ｎ−ｎ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−ブチルメタクリルアミド、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−メチロールメタクリルアミド、Ｎ−エチロールアクリルアミド、Ｎ−エチロールメタクリルアミド、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、Ｎ−フェニルマレイミド、Ｎ−ブチルマレイミド、４−ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルカルバゾール等の窒素含有オレフィン化合物；
【００１８】
ｐ−ビニル安息香酸、安息香酸ビニル、イタコン酸、無水イタコン酸、α−メチルビニル安息香酸、酢酸ビニル、ブタン酸ビニル、無水マレイン酸、酢酸アリル、安息香酸アリル等のカルボキシ基含有不飽和化合物；
ジアリルアンモニウムクロライド、１，６−ヘプタジエン、２，６−ジシアノ−１，６−ヘプタジエン、及び２，４，４，６−テトラキス（エトキシカルボニル）−１，６−ヘプタジエンのような１，６−ヘプタジエン構造を有する化合物等の環化重合可能な化合物；
ジメチルビニルシラン、トリメチルビニルシラン、ジメチルフェニルビニルシラン、ジメトキシメチルビニルシラン、ジエトキシフェニルビニルシラン、トリメトキシビニルシラン、ペンタメチルビニルジシロキサン、トリメチルアリルシラン、トリメトキシアリルシラン、ジメトキシメチルアリルシラン、ヘプタメチルビニルシクロテトラシロキサン、１，１，３，３−テトラメチルジビニルジシロキサン等のケイ素含有不飽和化合物；
【００１９】
アリル末端ポリエチレンオキサイド、アリル末端ポリプロピレンオキサイド、アリル末端ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイド共重合体、ビニル末端ポリエチレンオキサイド、ビニル末端ポリプロピレンオキサイド、ビニル末端ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイド共重合体、メタリル末端ポリプロピレンオキサイド、ビニル末端ポリテトラメチレンオキサイド、アクリロイル末端ポリアクリル酸、メタクリロイル末端ポリメタクリル酸、アクリロイル末端ポリアクリル酸エステル、アクリロイル末端ポリメタクリル酸エステル、メタクリロイル末端アクリル酸エステル、メタクリロイル末端メタクリル酸エステル、ビニル末端ポリシロキサン、ビニル末端ポリカーボネート、アリル末端ポリカーボネート、ビニル末端ポリエチレンテレフタレート、ビニル末端ポリブチレンテレフタレート、ビニル末端カプロラクタム、ビニル末端ポリアミド、ビニル末端ポリウレタン等の不飽和基含有マクロモノマー等。
これらは、単独で用いてもよく、複数を組み合わせて用いてもよい。
【００２０】
これらのモノマーのうち、特にスチレン、ブタジエン、イソプレン、クロロプレン、塩化ビニリデン、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、アクリルアミド、メタクリルアミド、アクリロニトリル、及び酢酸ビニルを用いることが好ましい。
【００２１】
本発明におけるチオカルボニルチオ基を有する連鎖移動剤は、下記の一般式（１）または（２）で示される化合物からなる群より選択される１種又は２種以上である。
（化１）
2007071832.tif 000003
（式中、Ｒ１は炭素数１以上のｐ価の有機基であり、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、ハロゲン原子、ケイ素原子、リン原子、及び金属原子のうちの１種又は２種以上を含んでいてもよく、高分子量体であってもよく；Ｚ１は水素原子、ハロゲン原子、又は炭素数１以上の１価の有機基であり、該１価の有機基は、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、ハロゲン原子、ケイ素原子、及びリン原子のうちの１種又は２種以上を含んでいてもよく、高分子量体であってもよく；Ｚ１が複数個存在する場合には、互いに同一でも異なっていてもよく；ｐは１以上の整数である）
【００２２】
（化２）
2007071832.tif 000004
（式中、Ｒ２は互いに独立して炭素数１以上の１価の有機基であり、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、ハロゲン原子、ケイ素原子、リン原子、及び金属原子のうちの１種又は２種以上を含んでいてもよく、高分子量体であってもよく；Ｚ２は酸素原子（ｑ＝２の場合）、硫黄原子（ｑ＝２の場合）、窒素原子（ｑ＝３の場合）、又は炭素数１以上のｑ価の有機基であり、該ｑ価の有機基は、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、ハロゲン原子、ケイ素原子、及びリン原子のうちの１種又は２種以上を含んでいてもよく、高分子量体であってもよく；ｑは２以上の整数である）
【００２３】
具体的には、トリチオ炭酸エステル、ジチオ脂肪酸エステル若しくはその誘導体、ジチオ安息香酸エステル若しくはその誘導体、ジチオナフトエ酸エステル、テトラチオテレフタル酸エステル又はチオベンゾイルチオアルキルベンゼン等を使用することができる。
トリチオ炭酸エステルとしては、トリチオ炭酸ジベンジル等を挙げることができる。
ジチオ脂肪酸エステル又はその誘導体としては、ジエトキシホスフィニルジチオギ酸ベンジル、ジチオ酢酸エトキシカルボニルメチル、ジチオ酢酸ベンジル等を挙げることができる。
ジチオ安息香酸エステル又はその誘導体としては、ジチオ安息香酸ｔ−ブチル、ジチオ安息香酸１,１,３,３−テトラメチルブチル、ジチオ安息香酸カルボキシメチル、ジチオ安息香酸１−アセトキシエチル、ジチオ安息香酸１−シアノ−１−メチルエチル、ジチオ安息香酸１−エトキシカルボニル−１−メチルエチル、ジチオ安息香酸１−シアノ−１−メチル−３−カルボキシプロピル、ジチオ安息香酸ベンジル、ジチオ安息香酸ｍ−ビニルベンジル、ジチオ安息香酸ｐ−ビニルベンジル、ジチオ安息香酸１−フェニルエチル、ジチオ安息香酸１−メチル−１−フェニルエチル、ジチオ安息香酸１−(ｐ−メトキシフェニル)エチル、ジチオ安息香酸１−(ｐ−クロロフェニル)−１−メチル、ｐ−クロロジチオ安息香酸１−メチル−１−フェニルエチル、トリチオ過安息香酸ｔ−ブチル等を挙げることができる。
【００２４】
ジチオナフトエ酸エステルとしては、ジチオ−１−ナフトエ酸１−メチル−１−フェニルエチル等を挙げることができる。
テトラチオテレフタル酸エステルとしては、テトラチオテレフタル酸ジベンジル等を挙げることができる。
チオベンゾイルチオアルキルベンゼンとしては、１,４−ビス(チオベンゾイルチオメチル)ベンゼン、１,２,４,５−テトラキス(チオベンゾイルチオメチル)ベンゼン、ヘキサキス(チオベンゾイルチオメチル)ベンゼン、１,４−ビス[(１−メチル−１−チオベンゾイルチオ)エチル]ベンゼン等を挙げることができる。
上記の連鎖移動剤は、１種を単独で、あるいは２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２５】
本発明においては、可逆的付加開裂連鎖移動重合の際に、アゾ系重合開始剤を用いることが好ましい。本発明で使用されるアゾ系重合開始剤としては、特に制限はないが、例えば一般式（３）で示される化合物を例示することができる。
（化３）
2007071832.tif 000005
（式中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜４のカルボキシ置換アルキル基、置換基を有していてもよいフェニル基を示し、同じ炭素原子に結合しているＲ３とＲ４とで脂肪族環を形成していても良く、Ｒ５はシアノ基、アセトキシ基、カルバモイル基、（炭素数１〜４のアルコキシ）カルボニル基を示す。）
【００２６】
本発明で用いられる一般式（３）のアゾ系重合開始剤において、Ｒ３、Ｒ４の炭素数１〜１０のアルキル基としてはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基等が例示できる。また炭素数１〜４のカルボキシ置換アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基等が例示できる。同じ炭素原子に結合しているＲ３とＲ４とで形成される脂肪族環としては例えばシクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基等が例示できる。なお、フェニル基には、例えば水酸基、メチル基、エチル基、メトキシ基、エトキシ基、ニトロ基、アミノ基、アセチル基、アセチルアミノ基等の置換基が置換されていてもよい。Ｒ５の（炭素数１〜４のアルコキシ）カルボニル基としては例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基等が例示できる。
【００２７】
一般式（３）のアゾ系重合開始剤は、具体的には、２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）、２，２’−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、１，１’−アゾビス（１−シクロヘキサンカルボニトリル）、ジメチル−２，２’−アゾビスイソブチレート、４，４’−アゾビス（４−シアノバレリアン酸）、１，１’−アゾビス（１−アセトキシ−１−フェニルエタン）、２，２’−アゾビス（２−メチルブチルアミド）、１，１’−アゾビス（１−シクロヘキサンカルボン酸メチル）等が挙げられる。
【００２８】
重合の際に使用される溶剤としては、ヘプタン、オクタン、ミネラルスピリット等の炭化水素系溶剤；酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル、酢酸イソブチル、エチレングリコールモノメチルエーテルアセテート、ジエチレングリコールモノブチルエーテルアセテート等のエステル系溶剤；メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジイソブチルケトン、シクロヘキサノンなどのケトン系溶剤；メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、イソブタノール等のアルコール系溶剤；テトラヒドロフラン、ｎ−ブチルエーテル、ジオキサン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル等のエーテル系溶剤；トルエン、キシレン等の芳香族石油系溶剤等の溶剤が挙げられるが、これらに限定されない。これらは単独で用いてもよく、複数を組み合わせて用いてもよい。使用する溶剤の種類及び量については、使用するモノマーの溶解度や濃度、連鎖移動剤や重合開始剤濃度等を考慮して決定される。
【００２９】
ラジカル重合においては、重合開始剤の分解により開始剤ラジカルが発生し、開始剤ラジカルにモノマーが付加することにより、生長ラジカルが生成して重合が開始される。
一般のラジカル重合においては、２個の生長ラジカルが、再結合又は不均化することにより反応して生長が停止し、安定な重合体が生成する。また連鎖移動剤が存在すると、生長ラジカルから連鎖移動剤への連鎖移動が起こり、生長ラジカルは安定なポリマーとなり、発生した連鎖移動剤ラジカルがあらたな重合を開始する。
このように一般のラジカル重合においては、停止反応と移動反応が起こるために、分子量が小さいポリマーが生成し、ポリマーの分子量分布が広くなる。
【００３０】
これに対し、本発明のRAFT法に用いる連鎖移動剤（チオカルボニルチオ化合物）は、再結合又は不均化による停止反応が起こらない連鎖移動剤である。
（化４）
2007071832.tif 000006
したがってRAFT法によれば、ポリマーの分子量の制御が可能であり、分子量多分散度が狭いポリマーを調製することができる。
【００３１】
RAFT法にて得られたポリマーのチオカルボニルチオ基を、メルカプト基（−ＳＨ）に変換し、メルカプト末端基を有するポリマーを得る反応は、塩基、酸、及び水素−窒素結合含有化合物よりなる群から選択される１種又は２種以上である処理剤を使用することにより行われる。上記処理剤はアンモニア、沸点１００℃以下の１級アミン化合物及び２級アミン化合物であることが好ましい。
【００３２】
金粒子の分散安定性を良くするために、本発明においてポリマーは、水溶性あるいは水に対する親和性が高いポリマーであることが好ましい。
また上記ポリマーは、刺激応答性ポリマーであることが好ましい。
刺激応答性ポリマーとは、温度変化、ｐＨ変化、光照射、電場印加、化学物質の添加等の、刺激の付与（環境変化）に応じて、形状や物性を著しく変える物質である。刺激としては、温度変化及び／又はｐＨ変化を含むことが好ましい。
【００３３】
温度応答性ポリマー鎖を誘導するモノマーとしては、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド等のＮ−アルキル置換アクリルアミド類；（メタ）アクリロイルオキシエチルピロリドン、ビニルメチルエーテル等のビニルエーテル類等が挙げられるが、温度応答能に影響を及ぼさない範囲で、他のビニルモノマーと共重合しても構わない。具体的な例としてはメチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステル類；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル類；スチレン、塩化ビニル、Ｎ−ビニルピロリドン等のビニル化合物；（メタ）アクリルアミド類等が利用できる。
【００３４】
ｐＨ応答性ポリマー鎖を誘導するモノマーとしては、（メタ）アクリル酸、スチレンスルホン酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸及びこれらの塩等が挙げられるが、ｐＨ応答能に影響を及ぼさない範囲で、上述のような他のビニルモノマーと共重合可能である。
【００３５】
〔金粒子表面へのポリマーの固定化〕
上記RAFT法で得られたポリマーは、ＳＨ末端基を有するので金粒子に付着しやすい。
液相系又は気相系において無秩序に互いに相関なく分布していた分子が、ある特定の物質表面を系に共存させるだけで、その表面上に担持され、二次元状に集合して分子一層に成長し、その集合した中で分子全てが同じ配向で表面に沿って広く規則的に並ぶことがある。このように、ある特定の担体表面上で起こるこのような分子の吸着及び分子一層の秩序構造形成の自発的な過程を経て、分子一個分の大きさに相当する厚さで形成される単分子層状の秩序構造体および境界相を自己組織化単分子膜という。本発明においてＳＨ末端基を有するポリマーは、金粒子表面に自己組織化単分子膜を構築する。
【００３６】
〔ポリマーの他末端へのリガンドの固定化〕
上記ＳＨ末端基を有するポリマーの他末端へのリガンドの固定化方法としては、具体的には以下の方法が挙げられるが、これに限定されない。
ポリマーの末端がアミノ基の場合、アミノ基にグルタルアルデヒドの片方のアルデヒド基を反応させ、もう一方のアルデヒド基にリガンドのアミノ基を反応させ、リガンドを結合させる。
ポリマーの末端が水酸基の場合、水酸基を臭化シアンを用いて活性化する。ここにリガンドのアミノ基を反応させ、リガンドを結合させる。
ポリマーの末端がカルボキシル基の場合、カルボキシル基にＮ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、１-エチル-３-（３-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミドの溶液に浸し、粒子の表面を活性エステル化する。ここにリガンドのアミノ基を反応させ、リガンドを結合させる。
ポリマーの末端がエポキシ基の場合、エポキシ基にリガンドのアミノ基、チオール基、ヒドロキシル基のどれか一つを反応させ、リガンドを結合させる。
ポリマーの末端がチオール基の場合、チオール基にリガンドのチオール基を反応させ、リガンドを結合させる。
なお、ポリマー末端の反応基に、任意の官能基を有する化合物を反応させて、その官能基にリガンドを結合させても良い。またポリマー末端とリガンドの間に任意のスペーサーを使用しても良い。
【００３７】
リガンド及び目的物質は、生体成分、薬剤、ウィルス等である。
目的物質と、目的物質に対して特異的親和性を有するリガンドとして具体的には、例えば抗体−抗原が挙げられる。
【００３８】
本発明に於いて使用される抗体としては、例えば「免疫実験学入門、第２刷、松橋直ら、（株）学会出版センター、1981」等に記載の方法に準じて、馬、牛、羊、兎、山羊、ラット、マウス等の動物に測定対象を免疫して作製されるポリクローナル性抗体でも、或はまた常法、即ちケラーとミルスタイン（Nature,256巻,495頁,1975）により確立された細胞融合法に従い、マウスの腫瘍ラインからの細胞と測定対象物で予め免疫されたマウスの脾細胞とを融合させて得られるハイブリドーマが産生する単クローン性抗体でも何れにてもよく、これらを単独で或はこれらを適宜組み合わせて用いる等ができる。また、これら抗体は、要すればペプシン，パパイン等の酵素を用いて消化してＦ(ab')2、Ｆab'、或はＦabとして使用しても良い。
【００３９】
具体的に抗体としては、抗インフルエンザウイルス抗体、抗アデノウイルス抗体、抗ＲＳウイルス抗体、抗ＨＡＶ抗体、抗ＨＢｃ抗体、ＨＣＶ抗体、抗ＨＩＶ抗体、抗ＥＢＶ抗体、抗ＮＬＶノーウォーク様ウィルス抗体等のウィルス抗体、抗クラミジア・トラコマティス抗体、抗溶連菌抗体、抗百日咳菌抗体、抗ヘリコバクター・ピロリ抗体、抗レプトスピラ抗体、抗トレポネーマ・パリダム抗体、抗トキソプラズマ・ゴンディ抗体、抗ボレリア抗体、抗炭疽菌抗体、抗ＭＲＳＡ抗原等の細菌抗体、抗マイコプラズマ脂質抗体、抗大腸菌抗体、抗サルモネラ抗体、抗ブドウ球菌抗体、抗カンピロバクター抗体、抗ウェルシュ菌抗体、抗腸炎ビブリオ菌抗体、抗ベロトキシン抗体、抗ヒトトランスフェリン抗体、抗ヒトアルブミン抗体、抗ヒト免疫グロブリン抗体、抗マイクログロブリン抗体、抗ＣＲＰ抗体、抗トロポニン抗体、抗ＨＣＧ抗体、抗クラミジア・トラコマティス抗体、抗ストレプトリジンＯ抗体、抗ヘリコバクター・ピロリ抗体、抗β−グルカン抗体、抗ＨＢｅ抗体、抗ＨＢｓ抗体、抗アデノウイルス抗体、抗ＨＩＶ抗体、抗ロタウイルス抗体、抗パルボウイルス抗体、抗ＲＳウイルス抗体、抗ＲＦ抗体、あるいは、ヒト繊毛製ゴナドトロピン等のペプチドホルモン、ステロイドホルモン等のステロイド、エピネフリンやモルヒネ等の生理活性アミン類、ビタミンＢ類等のビタミン類、プロスタングランジン類、テトラサイクリン等の抗生物質、細菌等が産生する毒素、各種腫瘍マーカー、農薬などに対する抗体、または、病原微生物に由来する核酸成分に相補的なヌクレオチド等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００４０】
図１に本発明の修飾金粒子１０の一例を示す。これは金粒子１２表面に、温度応答性ポリマー１４をメルカプト末端基により固定化させ、該ポリマーの他末端にリガンド１６を固定化させているものである。温度応答性ポリマーは、水素結合性部分を有し，水分子がポリマー鎖のまわりに強く付着し、その結果室温において水に溶解している。しかし、温度を上げると水素結合が切断され、水と相分離し縮んでしまう。このような現象を下限臨界溶解現象といい、相分離を起こす温度を下限臨界溶解温度(Lower Critical Solution Temperature :LCST)と言う。
例えば、側鎖としてアミド基とイソプロピル基を有するポリ-N-イソプロピルアクリルアミド(ＰＮＩＰＡＭ)のLCSTは32℃付近である。32℃以下ではアミド結合部分がより多くの水を抱え込もうとするので溶解(水和)する。一方32℃以上では、イソプロピル基による結合の方が強くなり、水を弾き出すので凝集(脱水和)する。よって、水中において32℃以下で溶解、32℃以上で凝集する特徴を持っている。
【００４１】
本発明における目的物質の検出方法は、上記修飾金粒子と、測定対象試料とを溶液中で混合し、リガンドが目的物質と特異的に結合した時にのみ形成される凝集体の有無により検出する方法である。
具体的には、上記修飾金粒子と、測定対象試料（例えば血液、血漿、血清、髄液、尿、糞便等の生体由来の試料やこれらを適宜緩衝液等で希釈したもの等）とを混合し、その結果生ずる特異的反応に起因する金コロイド粒子の吸光度変化を測定し、その結果を、予め作成しておいた金コロイド粒子の吸光度変化と測定対象物質量との関係を表わす検量線に当てはめる等することにより、容易に実施し得る。
【００４２】
特にポリマーとして刺激応答性ポリマーを使用した場合には、目的物質と結合後に刺激を与えることにより凝集が生じるため、容易に目的物質あるいは金粒子を回収することができる。
本発明について以下に実施例を挙げてさらに詳述するが、本発明はこれにより何ら限定されるものではない。配合量は特記しない限り、その成分が配合される系に対する質量％で示す。
【実施例１】
【００４３】
I．金コロイドの調製
塩化金酸(61.74mg、0.15mmol)を283mLの水に溶解し、110℃で15分間還流した(三口フラスコ使用)。その後、クエン酸三ナトリウム(177.27mg、0.6mmol)を溶解した水溶液15mLを加え、約10分間加熱した。反応後、室温で放冷した。
【００４４】
II．メルカプト末端基（−ＳＨ）を有するポリマーの合成
（１）ＲＡＦＴ法によるｐＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＮａの合成
末端にカルボン酸ナトリウムを持つポリ(Ｎ-イソプロピルアクリルアミド)は、連鎖移動剤に１-フェニルジチオアセテートｐ-エチルベンゾイックアッシドのナトリウム塩(ＰＤＰＥＢＮａ)、開始剤に２、２'-アゾビス(４-メトキシ-２、４-ジメチルバレロニトリル)(Ｖ-７０)を用いて、Ｎ-イソプロピルアクリルアミド(ＮＩＰＡＭ)をＲＡＦＴ重合することで得られる。
まず、以下の表１のように試薬を計量した。
（表１）
M.W      Weight      mmol    mol ratio  
ＮＩＰＡＭ        113.16    2.502(g)    0.0221    149.2
ＰＤＰＥＢＮａ    338.44    50.17(mg)   0.1482    1.000
Ｖ-７０           308.42     9.66(mg)   0.0313    0.211
メタノール         36.07    15.459(g)    ----     ----      
【００４５】
計量したＮＩＰＡＭ、ＰＤＰＥＢＮａ及びＶ-７０をメタノールに溶解し、ナスフラスコに入れた（表１）。アルゴン置換を30分間行った後、50℃のオイルバス上で12時間反応させた。反応後、メタノールをエバポレートして適度に除き、良溶媒にメタノール、貧溶媒にエーテルを用いた再沈殿法にて未反応のモノマーを除去した。この操作は２回行った。収量は0.6567g、収量から求めた転換率は26.2％であった。
【００４６】
（化５）
2007071832.tif 000007
【００４７】
得られたポリマーの分子量と展開溶媒をＴＨＦとしたＧＰＣの結果を表２及び図２に示す。
（表２）                                         
数平均分子量      重量平均分子量    多分散度
Ｍｎ                Ｍｗ        Ｍｗ/Ｍｎ  
11066               11955          1.08     
【００４８】
（２）ｐＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＮａの末端チオール化
ｐＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＮａのジチオエステルをエタノールアミンで分解してチオール化し、ＨＳ-ＰＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＮａを得る。
ｐＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＮａ（559.0mg）を水／ＴＨＦ＝１／９（v／v）の混合溶媒に溶解し、濃度を50mg／Lとした。アルゴン置換を30分間行った後、エタノールアミンを加えた。撹拌しながら１時間反応させた。反応後、溶媒をエバポレートして適度に除き、貧溶媒にエーエルを用いた再沈殿法によりポリマーを回収した（収量450.2mg）。
【００４９】
（化６）
2007071832.tif 000008
【００５０】
得られたポリマーの分子量と展開溶媒をＴＨＦとしたＧＰＣの結果を表３及び図３に示す。
（表３）                                                 
数平均分子量      重量平均分子量    多分散度
ピークNo.      Ｍｎ                Ｍｗ        Ｍｗ/Ｍｎ  
１        20144                20327        1.009     
２        10577                11633        1.1       
ＡＬＬ      12160                14017        1.153     
高分子量側（ピークNo.1）にＨＳ-ｐＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＮａがジスルフィド結合により二量体（（-S-ｐＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＮａ）２）を形成したと考えられるピークが見られた。
【００５１】
（３）ジスルフィド結合の切断
上述のようにして得られたＨＳ-ｐＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＮａには、二量体（-Ｓ-ｐＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＮａ）２が含まれていたので、ＤＬ-ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を用いてジスルフィド結合を切断することにした。まず、以下の表４のように試薬を計量した。
（表４）
M.W.      質量(mg)      mmol      mol ratio  
(-S-pNIPAM-COONa)２    20144      436.1          0.022       1
ＤＴＴ                154.25     268.7          1.742      80.46    
ＤＭＦ                 72.11    3437.5          ----        ----    
【００５２】
計量した（-Ｓ-ｐＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＮａ）２、ＤＴＴをＤＭＦに溶解しナスフラスコに入れた（（-Ｓ-ｐＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＮａ）２：100mg／L）。アルゴン置換を１時間行った後、60℃のオイルバス上で48時間反応させた。反応後、200mLのエーテルで再沈殿法により回収した。回収したポリマーをメタノールに溶解し、200mLのエーテルで再沈殿法により回収した。収量は270mgであった。
【００５３】
（化５）
2007071832.tif 000009
【００５４】
得られたＨＳ-ＰＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＮａのＧＰＣ測定と１Ｈ-ＮＭＲ測定（solvent：Ｄ２Ｏ）を行った。結果を表５と図４に示す。
（表５）                                         
数平均分子量      重量平均分子量    多分散度
Ｍｎ                Ｍｗ        Ｍｗ/Ｍｎ  
10977               11724          1.068    
二量体のジスルフィド結合が切断されたことが確認された。
【００５５】
（４）ＨＳ-ｐＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＨ水溶液の調製
（３）で得られたＨＳ-ｐＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＮａ（1.12mg）をイオン交換水に溶解して０．９７８３８ｇ／Ｌのポリマー水溶液を調製した。この水溶液に１Ｍ ＨＣｌを加えてｐＨを４に調製した。
【００５６】
III．金粒子表面へのＨＳ-ｐＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＨの固定化
Iで得られた金コロイド溶液6g、IIで得られたポリマー水溶液15.0g、イオン交換水9.0gをスクリュー管で混合した。混合後のｐＨは５．０であった。得られた金コロイド溶液中の金濃度は0.1mM、ポリマー濃度は500mg／L、クエン酸三ナトリウム濃度は0.4mMであった。
【００５７】
IV．ウシアルブミン抗体の固定化
未反応のＨＳ-ｐＮＩＰＡＭ-ＣＯＯＨを取り除くため、作製した金コロイド溶液1mLを遠心力加速度400,000g、1時間遠心した後上清を取り除いた。さらにイオン交換水1mLを加えて超音波処理を行った後、遠心力加速度400,000g、1時間遠心した後上清を取り除き、この操作を3回行った。次にカルボキシル基の活性化試薬であるNHS（N-hydroxysuccinimide：イオン交換水で11.5mg/mLに希釈）を100μlとEDC（1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl)-carbodiimide hydrochloride：イオン交換水で75.0mg/mLに希釈）を100μl加えて、1時間反応させた。未反応のNHS、EDCを取り除くため、金コロイド溶液1mLを遠心力加速度400,000g、1時間遠心した後上清を取り除いた。さらにイオン交換水1mLを加えて超音波処理を行った後、遠心力加速度400,000g、1時間遠心した後上清を取り除き、この操作を3回行った。  次に抗ウシアルブミン抗体（PBSで1mg/mLに希釈）を100μl加えて、1時間反応させた。未反応の抗ウシアルブミン抗体を取り除くため、金コロイド溶液1mLを遠心力加速度400,000g、1時間遠心した後上清を取り除いた。さらにイオン交換水1mLを加えて超音波処理を行った後、遠心力加速度400,000g、1時間遠心した後上清を取り除き、この操作を3回行った。  最後にイオン交換水を加えて1mLの抗体感作金コロイド溶液とした。
【実施例２】
【００５８】
各濃度に調製されたウシアルブミンを10μlと抗体感作金コロイド溶液100μlを96ウェルプレート上で混合し、8時間後の各濃度におけるΔA（=A0-A）／Aの値をプロットしたグラフを図５に示す。Aはλ=523nmでの吸光度、A0はウシアルブミンの濃度が0μg／mlの時のλ=523nmでの吸光度である。
※他のポリマー（多分散度1.2を超えるもの）を使用した場合との比較。
【００５９】
抗体感作金コロイド溶液1mLを40℃、10分加熱すると青色の凝集物が得られた。この凝集物を取り出し、イオン交換水1mLに入れて超音波処理を行い、凝集物を溶解させた。この金コロイド溶液を遠心力加速度400,000g、1時間遠心した後上清を取り除いた。さらにグリシン−塩酸緩衝液（0.2M、pH2.0）1mLを加えて超音波処理を行った後、遠心力加速度400,000g、1時間遠心した後上清を取り除いた。さらにイオン交換水1mLを加えて超音波処理を行った後、遠心力加速度400,000g、1時間遠心した後上清を取り除き、この操作を3回行った。最後にMQ水1mLを加えて超音波処理を行い、再生金コロイド溶液が得られた。
【００６０】
各濃度に調製されたウシアルブミンを10μlと再生抗体感作金コロイド溶液100μlを96ウェルプレート上で混合し、8時間後の各濃度におけるΔA（=A0-A）／Aの値をプロットしたグラフを図６に示す。Aはλ=523nmでの吸光度、A0はウシアルブミンの濃度が0μg／mlの時の吸光度である。
以上のように、ポリマーとして、重量平均分子量／数平均分子量で規定される分子量多分散度が１〜１.２であるポリマーを用いることにより、本発明の修飾金粒子は、目的物質の精度の高い検出が可能であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本発明の修飾金粒子の一例を示した図である。
【図２】実施例工程AにおけるGPCチャートを示した図である。
【図３】実施例工程BにおけるGPCチャートを示した図である。
【図４】実施例工程CにおけるGPCチャート及び1H-NMRを示した図である。
【図５】各濃度のウシアルブミン液と抗体感作金コロイド液との混合液のΔA／A[ΔA=A0-A、Aは523nm吸光度、A0はウシアルブミン濃度0μg／mlの時の523nm吸光度]の値をプロットした図である。
【図６】各濃度のウシアルブミン液と再生抗体感作金コロイド液との混合液のΔA／A[ΔA=A0-A、Aは523nm吸光度、A0はウシアルブミン濃度0μg／mlの時の523nm吸光度]の値をプロットした図である。
【符号の説明】
【００６２】
１０        修飾金粒子
１２        金粒子
１４        温度応答性ポリマー
１６        リガンド
【図１】
2007071832.tif 000010
【図２】
2007071832.tif 000011
【図３】
2007071832.tif 000012
【図４】
2007071832.tif 000013
【図５】
2007071832.tif 000014
【図６】
2007071832.tif 000015