(57)【要約】【課題】液滴に光を確実に照射し、その液滴からの光を確実に捕捉する。【解決手段】ノズル１１の開口１１ａに液滴１８を形成する。液滴１８には核酸を含んでいる。光源２０から光を発する。液滴１８に所定の波長域の光をビームにして照射する。球本体３２が液滴１８を照射したビームによる透過光３０及び液滴１８により散乱した散乱光３１を網羅的に捕らえる。透過光３０及び散乱光３１の光量が光検出器３３により検出される。制御演算部１５は、透過光３０及び散乱光３１の光量に基づいて、液滴１８の吸光度を算出する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定物質が含まれる液を液滴に形成する液滴形成器と、
前記液滴に対して所定の波長域の光をビームにして照射する照射光学系と、
前記液滴を照射したビームによる透過光及び前記液滴により散乱した散乱光を網羅的に捕らえ、前記透過光及び散乱光の光量を測定する測定器と、
前記測定器による透過光及び散乱光の光量に基づいて、前記液の吸光度を算出する吸光度算出部とを備えることを特徴とする吸光度測定装置。
【請求項２】
前記測定器は積分球であることを特徴とする請求項１記載の吸光度測定装置。
【請求項３】
前記照射光学系は、光源と、光源からの光を略平行光にする光学部材と、前記測定器で用いる波長域の光を透過させるフィルタ部材と、前記フィルタ部材を透過した光を集光する集光光学部材と、前記集光光学部材で集光された光を前記液滴に照射する光ファイバとを備えることを特徴とする請求項１または２記載の吸光度測定装置。
【請求項４】
前記照射光学系は、光源と、光源からの光を略平行光にする光学部材と、前記測定器で用いる波長域の光を透過させるフィルタ部材と、前記フィルタ部材を透過した光束径を絞り込むビームコンプレッション光学系と、前記ビームコンプレッション光学系から近軸平行光を取り出すピンホール部材とを備えることを特徴とする請求項１または２記載の吸光度測定装置。
【請求項５】
請求項１ないし４いずれか１項記載の吸光度測定装置と、この吸光度測定装置で算出した吸光度に基づき前記液中の特定物質の濃度を算出し、この特定した濃度に基づき前記特定物質が所定量含まれているか否かを判定する特定物質の有無判定部とを備えることを特徴とする特定物質の有無判定装置。
【請求項６】
前記特定物質は核酸であり、前記特定物質の有無判定部は、ＰＣＲ処理が可能な程度に前記核酸が含まれているか否かを判定することを特徴とする請求項５記載の特定物質の有無判定装置。
【請求項７】
前記照射光学系は、光を複数回液滴に照射し、その照射毎に光の波長を変えることを特徴とする請求項６記載の特定物質の有無判定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定物質、例えば核酸を含む液の吸光度を測定する吸光度測定装置及び特定物質の有無判定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定物質、例えば核酸を含む試料液に光を照射し、その試料液からの透過光及び散乱光に基づいて、試料液の吸光度を測定する方法がある。この方法によれば、試料液中の特定物質の濃度を測定することができる。
【０００３】
この方法を用いた装置として、特許文献１記載の粒子解析装置がある。この粒子解析装置によれば、フローセル内の試料液により散乱した光を検出する測定光学系内に焦点・光軸検出手段を設け、その散乱光の焦点及び光軸を調整することにより、検出の精度を向上させている。しかしながら、フローセル内部または外部に汚れやキズ等がある場合には、それら汚れ等よって光が反射して測定光学系に入ってしまうことがあり、検出を精度よく行うことができないおそれがあった。
【０００４】
これに対して、特許文献２記載の吸光度測定法は、ノズルを用いて試料液の液滴を形成し、この液滴に対して光を直接照射させることにより、上記問題の解決を図っている。
【０００５】
なお、液滴に光を当てて、液滴の吸光度を測定する方法として、特許文献３記載の液下液滴検出装置の校正方法及び特許文献４記載の液下液滴検出装置が挙げられる。これらの発明は、液滴により散乱した光に基づいて液滴の径を算出し、その液滴の径を用いて液中の濃度を算出している。
【特許文献１】特開昭６１−１６７８３８号公報
【特許文献２】特開平８−２４７９３４号公報
【特許文献３】特開昭６３−２５５６０８号公報
【特許文献４】特開平２−１１５７０５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記特許文献２記載の発明については、以下のような問題点がある。この発明によれば、ノズルもしくは光源を水平方向に移動させることで、液滴が気流の乱れ等によって揺れ動かされたとしても、光を液滴の中央部に確実に照射している。しかし、ノズルに液滴を形成するごとに、わざわざノズル等を移動させなければならないため、光の検出に時間を要し、迅速性に欠けるという問題がある。逆に、ノズルの移動を行わないと、液滴位置のずれによる誤差が大きくなるという問題がある。また、レーザを用いるため特定の波長しか測定することができないという問題もある。
【０００７】
また、上記特許文献３及び４の発明については、散乱光から液滴の径を求め、その液滴の径に基づいて濃度を算出するため、その散乱光を精度よく検出する装置等が必要となる。
【０００８】
本発明は、液滴に光を確実に照射し、その液滴からの光を確実に捕らえる吸光度測定装置及び特定物質の有無判定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明の吸光度測定装置は、特定物質が含まれる液を液滴に形成する液滴形成器と、前記液滴に対して所定の波長域の光をビームにして照射する照射光学系と、前記液滴を照射したビームによる透過光及び前記液滴により散乱した散乱光を網羅的に捕らえ、前記透過光及び散乱光の光量を測定する測定器と、前記測定器による透過光及び散乱光の光量に基づいて、前記液の吸光度を算出する吸光度算出部とを備えることを特徴とする。
【００１０】
前記測定器は積分球であることが好ましい。前記照射光学系は、光源と、光源からの光を略平行光にする光学部材と、前記測定器で用いる波長域の光を透過させるフィルタ部材と、前記フィルタ部材を透過した光を集光する集光光学部材と、前記集光光学部材で集光された光を前記液滴に照射する光ファイバとを備えることが好ましい。前記照射光学系は、光源と、光源からの光を略平行光にする光学部材と、前記測定器で用いる波長域の光を透過させるフィルタ部材と、前記フィルタ部材を透過した光束径を絞り込むビームコンプレッション光学系と、前記ビームコンプレッション光学系から近軸平行光を取り出すピンホール部材とを備えることが好ましい。
【００１１】
本発明の特定物質の有無判定装置は、前述の吸光度測定装置と、この吸光度測定装置で算出した吸光度に基づき前記液中の特定物質の濃度を算出し、この特定した濃度に基づき前記特定物質が所定量含まれているか否かを判定する特定物質の有無判定部とを備えることを特徴とする。
【００１２】
前記特定物質は核酸であり、前記特定物質の有無判定部は、ＰＣＲ処理が可能な程度に前記核酸が含まれているか否かを判定することが好ましい。前記照射光学系は、光を複数回液滴に照射し、その照射毎に光の波長を変えることが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、特定物質が含まれる液を液滴に形成する液滴形成器と、前記液滴に対して所定の波長域の光をビームにして照射する照射光学系と、前記液滴を照射したビームによる透過光及び前記液滴により散乱した散乱光を網羅的に捕らえ、前記透過光及び散乱光の光量を測定する測定器と、前記測定器による透過光及び散乱光の光量に基づいて、前記液の吸光度を算出する吸光度算出部とを備えることにより、液滴の中央部に光を照射することが可能となるとともに、液滴からの透過光及び散乱光を網羅的に捕捉することが可能となる。したがって、液滴の吸光度を精度よく測定することが可能となる。
【００１４】
また、照射光学系が、光を複数回液滴に照射し、その照射毎に光の波長を変えることにより、液中における不純物の有無を検出することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の核酸有無判定装置の構成及び作用を以下に説明する。なお、この核酸有無判定装置は、単に吸光度を測定する吸光度測定装置として用いてもよい。
【００１６】
図１は、本発明の核酸有無判定装置１０の概略図である。この核酸有無判定装置１０は、ＰＣＲ処理装置（図示省略）内に設けられており、ＰＣＲの処理前に液滴を形成して、ＰＣＲ処理に必要十分な核酸が含まれているか否か、また、不純物が含まれているか否か等を判定する。
【００１７】
核酸有無判定装置１０は、ノズル１１、照射光学系１２、積分球１４、制御演算部１５を備えている。なお、前述の装置構成は一例であり、これに限定されない。
【００１８】
ノズル１１の下端には開口１１ａが形成されており、この開口１１ａから核酸を含む液の液滴１８が形成される。液滴１８の径は約１ｍｍ程度であるが、±０．５ｍｍ程度の誤差であれば許容される。ここに言う核酸を含む液とは、例えばヒトの血液などの試料液から核酸が抽出された液である。
【００１９】
照射光学系１２は光を液滴１８に複数回照射し、その照射毎に光の波長を変化させる。照射光学系１２は、光源２０、第１レンズ２１、第２レンズ２２、第１ないし第４フィルタ２３，２４，２５，２６、フィルタセット部２７、光ファイバ２８から構成される。この照射光学系１２は、その光軸２９が液滴１８の中央部に一致するように、配置されている。また、フィルタセット部２７は制御演算部１５に接続されている。
【００２０】
光源２０としては、紫外線領域の光、例えば波長が２３０ｎｍ〜６００ｎｍの光を発することが可能なものが用いられる。具体的には、重水素ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプなどが挙げられる。光源２０は、ドライバ２０ａを介して、制御演算部１５に接続されており、この制御演算部１５によって一定光量で発光するように制御される。
【００２１】
第１ないし第４フィルタ２３〜２６は、フィルタセット部２７により光軸２９に選択的にセットされる。第１レンズ２１は、光源２０から放射状に発せられた光を光軸２９に対して略平行にし、セットされた第１ないし第４フィルタ２３〜２６を透過させる。第１フィルタ２３は、波長が２６０ｎｍの光を透過させる。また、第２フィルタ２４は、波長が２８０ｎｍの光を透過させる。また、第３フィルタ２５は波長が２３０ｎｍの光を、第４フィルタ２６は波長が４００ｎｍの光を透過させる。
【００２２】
第２レンズ２２は、第１ないし第４フィルタ２３〜２６のいずれかを透過した光をファイバ２８の入射口２８ａに集める。光ファイバ２８は、入射口２８ａから入射された光を細径光束として、出射口２８ｂからノズル１１の液滴１８に向けて照射する。
【００２３】
積分球１４は、液滴１８からの光を受けて、その光量に応じた電気信号（以下「受光信号」とする）を出力する。液滴１８からの光は、液滴１８を透過した透過光３０と液滴１８により散乱した散乱光３１からなる。積分球１４は、球本体３２、この球本体３２に入射した光の光量を検出する光検出器３３から構成されている。球本体３２の液滴１８側には円形の入射口３２ａが形成されており、この入射口３２ａから透過光３０及び散乱光３１を入れる。
【００２４】
入射口３２ａの径は、液滴１８が気流の乱れ等により揺れ動かされた場合であっても、透過光３０及び散乱光３１を全て入れることが可能な径とされている。本実施形態では、入射口３２ａの径が約１０ｍｍで、球本体３２の直径が約５０ｍｍのものを使用しているが、これに限定はされない。なお、球本体３２の内面には、透過光３０及び散乱光３１に対して高い拡散反射率を有する白色粉末物質が塗布されている。白色粉末物質としては、酸化マグネシウム、硫酸バリウム、硫酸マグネシウム、酸化鉛、テフロン（登録商標）などのいずれかが挙げられる。
【００２５】
球本体３２の内面にて拡散及び反射された透過光３０及び散乱光３１は、光検出器３３によりその光量が検出される。検出された光量は光電変換され、受光信号に変えられる。受光信号は増幅器３８により増幅された後に、制御演算部１５に送られる。なお、光検出器３３は、例えばフォトダイオードやフォトマルチプライヤが用いられるが、その他の受光センサを用いてもよい。
【００２６】
制御演算部１５は、光源２０及びフィルタセット部２７を駆動制御するとともに、前述の受光信号を光量データにデジタル変換し、この光量データに基づいて、液の吸光度を算出する。吸光度はｌｏｇ１０（Ｉ／Ｉｄ）で表され、Ｉはノズル１１に液滴１８を形成しない状態で検出された光の光量データを、Ｉｄはノズル１１に液滴１８を形成した状態で検出された光の光量データを示している。さらに、制御演算部１５は、算出した吸光度に基づいて、液中における核酸の濃度の算出やその他の判定を行う。
【００２７】
次に、本発明の作用を図１及び図２を用いて説明する。まず、ノズル１１に液滴１８を形成しない状態で、第１ないし第４フィルタ２３〜２６をセットした場合の光量データを算出する。以下にその手順を示す。まず、フィルタセット部２７により、第１レンズ２１と第２レンズ２３との間に第１フィルタ２３をセットする。次に、光源２０から光を生じさせる。第１フィルタ２３は、波長が２６０ｎｍの光を透過させる。透過した光は光ファイバ２８を通って光軸２９と略平行のビームとなり、このビームは入射口３２ａを介して、球本体３２に入射する。入射した光は拡散反射されて、光検出器３３により受光信号に変換される。この受光信号は増幅器３８により増幅され、制御演算部１５に送られる。制御演算部１５は受光信号をデジタル変換し、光量データＩ２６０として制御演算部１５内のメモリ１５ａに記録する。
【００２８】
その後に、第１フィルタ２３に代えて、第２フィルタ２４をフィルタセット部２７によりセットする。第１フィルタ２３をセットした場合と同様にして、光量データＩ２８０を算出してメモリ１５ａに記録する。さらに、第３及び第４フィルタ２５，２６についても同様の処理を行う。第３フィルタ２５をセットした場合の光量データをＩ２３０と、第４フィルタ２６をセットした場合の光量データをＩ４００とし、それぞれメモリ１５ａに記録する。
【００２９】
次に、ノズル１１に液滴１８を形成した状態で、第１ないし第４フィルタ２３〜２６をセットした場合の光量データを算出する。これら光量データの算出は、上述のノズル１１に液滴１８を形成しない場合の処理と同様にして行う。第１フィルタ２３をセットした場合の光量データをＩｄ２６０と、第２フィルタ２４をセットした場合の光量データをＩｄ２８０と、第３フィルタ２５をセットした場合の光量データをＩｄ２３０と、第４フィルタ２６をセットした場合の光量データをＩｄ４００とし、それぞれメモリ１５ａに記録する。
【００３０】
次に、メモリ１５ａに記録された光量データＩ２６０，Ｉ２８０，Ｉ２３０，Ｉ４００と光量データＩｄ２６０，Ｉｄ２８０，Ｉｄ２３０，Ｉｄ４００から前述の吸光度の算出式に基づいて、制御演算部１５により吸光度Ａ２６０，Ａ２８０，Ａ２３０，Ａ４００を算出する。
【００３１】
その後に、制御演算部１５は、吸光度Ａ２６０，Ａ２８０，Ａ２３０，Ａ４００に基づいて、液中の核酸の濃度を算出するとともに、液に不純物が混入しているかどうかを判定する。図３に、その処理手順を示す。不純物としては、細胞から核酸を抽出する際に混入するタンパク質、血液から核酸を抽出する際に混入するヘモグロビン、タンパク質変性剤であるカオトロピック塩などが挙げられる。
【００３２】
まず、制御演算部１５は、吸光度Ａ２６０に基づいて、液中の核酸の濃度を算出する。吸光度Ａ２６０が「１」であるときに、核酸の濃度は、５０μｇ／ｍｌ（ＤＮＡ）もしくは４０μｍ／ｍｌ（ＲＮＡ）であることが知られている。したがって、液中の核酸の濃度は、核酸がＤＮＡの場合であればＡ２６０×５０μｇ／ｍｌ（ＤＮＡ）と、核酸がＲＮＡの場合であればＡ２６０×４０μｇ／ｍｌ（ＲＮＡ）として算出される。核酸の濃度が、所定の濃度α以上の場合には、液中に所望の量の核酸が含まれていると判定し、一方、所定の濃度α未満の場合には、液中に所望の量の核酸が含まれていないと判定する。
【００３３】
液中に所望の核酸が含まれていると判定された場合には、制御演算部１５は、液中に不純物が混入しているかどうかを判定する。まず、液中におけるヘモグロビンの混入の有無を、吸光度Ａ４００基づいて、判定する。吸光度Ａ４００が所定の値β１以下の場合には、液中にヘモグロビンが混入してないと判定し、一方、吸光度Ａ４００が所定の値β１よりも大きい場合には、液中にはヘモグロビンが混入していると判定する。
【００３４】
そして、制御演算部１５は、液中におけるタンパク質の混入の有無を、吸光度比Ａ２６０／Ａ２８０（以下「Ａ２６０／２８０」と表す）に基づいて、判定する。具体的には、吸光度比Ａ２６０／２８０が１．８（ＤＮＡ）もしくは２．０（ＲＮＡ）以上のときに、核酸の純度が高い、すなわちタンパク質の混入が少ないとされている。したがって、吸光度比Ａ２６０／２８０が１．８もしくは２．０以上の場合には液中にタンパク質が混入していないと判定し、一方、吸光度比Ａ２６０／２８０が１．８もしくは２．０未満の場合には液中にはタンパク質が混入していると判定する。
【００３５】
さらに、制御演算部１５は、液中におけるカオトロピック塩の混入の有無を、吸光度比Ａ２６０／Ａ２３０（以下「Ａ２６０／２３０」と表す）基づいて、判定する。吸光度比Ａ２６０／２３０が所定の値β２以上の場合には、液中にカオトロピック塩が混入していないと判定し、一方、吸光度比Ａ２６０／２３０が所定の値β２未満の場合には、液中にはカオトロピック塩が混入していると判定する。
【００３６】
制御演算部１５は、核酸の濃度の算出及び不純物の有無の判定が完了した後に、これらの結果をディスプレイ（図示省略）に表示する。また、核酸の濃度が所望の濃度でない場合、もしくは液中にヘモグロビン、タンパク質、及びカオトロピック塩が混入されていると判定された場合には、アラーム（図示省略）を発する。このアラームにより、オペレータは再度試料液から核酸を抽出し直す。核酸が所望濃度であり、他の物質等の混入が無い場合は、液滴１８をノズル１１内に戻し、次のＰＣＲ処理に移行する。
【００３７】
ＰＣＲ処理では、微量な核酸を短時間で大量に増やす。処理に要する時間は、通常は１．５時間程度である。そのため、ＰＣＲ処理のために必要十分な核酸量が確保されていない場合にＰＣＲ処理を行うと、核酸を増やすことができず無駄な処理となってしまうおそれがある。
【００３８】
なお、本実施形態では、照射光学系１２内でファイバ２８を用いて光を液滴１８に照射したが、ファイバ２８に代えて、図３に示すようなビームコンプレッション光学系４０とピンホール４３ａを有する窓状の板４３を設けてもよい。
【００３９】
ビームコンプレッション光学系４０は第３レンズ４１を備えており、この第３レンズ４１は、第２レンズ２２と液滴１８との間に、その光軸４２を光源２０の光軸２９とを一致させるように、配置される。第３レンズ４１の焦点距離を、第２レンズ２２の焦点距離に比べて小さく設定する。さらに、第３レンズ４１と第２レンズ２２との間隔は、第３レンズ４１のバックフォーカス長と第２レンズ２２のバックフォーカス長の和とする。本実施形態では、第３レンズ４１の焦点距離を１０ｍｍ、第２レンズ２２の焦点距離を５０ｍｍとし、フィルタ２３の位置でφ５ｍｍのビーム径D１を、第３レンズ４１の位置でφ１ｍｍのビーム径D２に絞っている。
【００４０】
第３レンズ４１からの光は板４３に集められる。板４３は、第３レンズ４１と液滴１８との間に設けられる。板４３にはピンホール４３ａが形成されており、このピンホール４３ａにより、光軸４２近傍の光のみが取り出される。取り出された光はビームとして液滴１８に照射される。
【００４１】
なお、第３レンズ４１を用いずに、第２レンズ２２の焦点を液滴の中央部に一致させるようにしてもよい。すなわち、第２レンズ２２と液滴１８の中央部との距離を第２レンズ２２の焦点距離と一致させるようにしてもよい。
【００４２】
本実施形態では、第１ないし第４フィルタ２３〜２６をそれぞれ独立させて、各フィルタをフィルタセット部２７により第１レンズ２１と第２レンズ２２との間にセットしたが、図５に示すように、第１ないし第４フィルタ５１〜５４を配列させたフィルタ板５０を用いて、各フィルタをセットしてもよい。図５に示す第１ないし第４フィルタ５１〜５４は、本実施形態の第１ないし第４フィルタ２３〜２６にそれぞれ対応している。
【００４３】
図６に示すように、フィルタ板５０には孔５０ａが形成されており、この孔５０ａに回転軸５５が挿通されている。回転軸５５はモータ５７に取り付けられており、フィルタ板５０は、フィルタセット部２７の駆動指示により、光軸２９と第１ないし第４フィルタ５１〜５４のいずれかの中央部とが一致するように、回転する。なお、図６において、図１と同一部材等には同一の符号を付してある。
【００４４】
本実施形態では、透過光及び散乱光を積分球により捕らえたが、これに代えてそれら光を網羅的に捉えることが可能な受光板を用いてもよい。この受光板として、例えば受光面積が大きい受光器や複数のフォトダイオードをマトリクス状に配列させた受光板などが挙げられる。
【００４５】
本実施形態では、核酸を含む液について記載しているが、核酸に限る必要はなく、種々の特定物質の吸光度を測定する際にも、本発明の吸光度測定装置を用いることができる。
【００４６】
本実施形態では、ＰＣＲ処理装置内に核酸有無判定装置を設けたが、本発明の核酸有無判定装置は核酸抽出装置に設けてもよい。この場合には、核酸抽出後に液滴を形成して、核酸の有無を判定する。また、核酸有無判定装置を単体で用いてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明の核酸有無判定装置を示す概略図である。
【図２】本発明の作用を示すフローチャートである。
【図３】核酸の濃度の算出及び液中の不純物の有無を検出する手順を示すフローチャートである。
【図４】別実施形態の核酸有無判定装置を示す概略図である。
【図５】第１〜第４フィルタが配列されたフィルタ板を示す正面図である。
【図６】フィルタ板の周辺を示す正面図である。
【符号の説明】
【００４８】
１０  核酸有無判定装置
１１  ノズル
１１ａ  開口
１２  照射光学系
１４  積分球
１５  制御演算部
１８  液滴
２０  光源
２１  第１レンズ
２２  第２レンズ
２３  第１フィルタ
２４  第２フィルタ
２５  第３フィルタ
２６  第４フィルタ
２８  光ファイバ
２９  光軸
３０  透過光
３１  散乱光
３２  球本体
３３  光検出器
４０  ビームコンプレッション光学系
４３  （窓状の）板
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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