(57)【要約】      （修正有）【課題】多彩な機能を有し、免疫治療と重要な関係を持つ、腫瘍成長因子β受容体（TbR）を安定的に発現し、維持・増殖可能な細胞株、及びTbRに対するアプタマーを取得する場合の該細胞株の利用法の提供。【解決手段】TbR、特にTbRIIIを動物細胞株に組み込み安定に発現する細胞株ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０６０４を樹立し、更にこの細胞株を用いて膜タンパクである受容体に対するSELEX法を行い、該受容体を標的とするアプタマー取得に用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍成長因子β受容体を安定して発現する細胞株。
【請求項２】
前記細胞株が、チャイニーズハムスター卵巣細胞株であることを特徴とする請求項１に記載の細胞株。
【請求項３】
前記腫瘍成長因子β受容体が、腫瘍成長因子β受容体III型であることを特徴とする請求項1又は２に記載の細胞株。
【請求項４】
前記細胞株の受領番号が、FERM AP-20604であることを特徴とする請求項３に記載の細胞株。
【請求項５】
膜タンパク質のアプタマーを取得するための細胞株であって、腫瘍成長因子β受容体を安定して発現する細胞株。
【請求項６】
前記アプタマーがRNAであることを特徴とする請求項５に記載の細胞株。
【請求項７】
前記細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞株であることを特徴とする請求項５又は６に記載の細胞株。
【請求項８】
前記腫瘍成長因子β受容体が、腫瘍成長因子β受容体III型であることを特徴とする請求項５乃至７のいずれか一項に記載の細胞株。
【請求項９】
前記細胞株の受領番号が、FERM AP-20604であることを特徴とする請求項８に記載の細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍成長因子β受容体（transforming growth factor beta receptor、以下「TbR」という。）を安定して高密度に発現する細胞株に関する。
【背景技術】
【０００２】
本来人体には異物が体内に侵入すると、それを察知して排除する機能が備わっている。これを免疫機能といい、人体にとって非常に重要な機能であるが、この免疫機能に異常が生じたり、機能が低下すると、様々な障害や、疾病が発生する。
【０００３】
免疫機能の抑制・不全に関連する疾病は数多くあるが、癌においても免疫抑制は重要な役割を担っている。すなわち、がん細胞自身が宿主である患者の免疫機能を抑制することにより、体内で異常増殖・転移能を獲得すると考えられている。
【０００４】
がんの免疫抑制機能としては、抗原性の低下、細胞膜表面分子の発現異常、免疫抑制因子の産生などがあげられ、様々な物質が関与しているが、そのなかの一つに液性因子で免疫抑制に関わる腫瘍性成長因子β（以下、「TGFβ」という）の存在が知られている。
【０００５】
TGFβの機能は多岐にわたるが、例えば、現在TGFβのシグナル異常により増殖制御がうまくいかなくなることでがん化につながっていることがわかっている。また、TGFβシグナルの異常は浸潤・転移能の獲得にも関与することが示唆されている。更に、腫瘍周辺の正常組織ではTGFβが大量に産生されるため腫瘍に対して免疫抑制状態となり、それにより腫瘍は宿主の免疫機能による攻撃を回避することが可能となっている。
【０００６】
そこで、このようなシグナル異常や免疫抑制を解除すれば、がん細胞を患者自身の免疫機能により攻撃することも可能であると考えられ、TGFβについて様々な研究がなされている。
【０００７】
例えば、TGFβの機能を制御する目的でTGFβまたはその受容体に結合し、その活性を制御するアゴニスト、アンタゴニストの探索も盛んに行われている。
【０００８】
その中でも、近年、特定のタンパク質分子に相補的で、抗体などよりも高い親和性を持つRNA分子（RNAアプタマー）が注目されている。
【０００９】
RNAはその一次構造に基づいて、きわめて多様な立体構造をとることができる。この特性を利用してＲＮＡアプタマーを取得する方法として、試験管内人工進化法（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment ；SELEX法）があげられる。この方法では、ランダムなRNAのプールから、特定のタンパク質分子と相補的な立体構造を持って親和性を有するRNA分子（RNAアプタマー）を選択して増幅し、その中からさらに特定の機能を持つものを選択し増幅するため、効率よく目的とするRNAを得て試験管内で増幅することができる。
【００１０】
このように、SELEX法は特定のタンパク質をターゲットにしたRNAアプタマーを作製できることから、創薬への応用が広く期待される手法であり、TGFβやその受容体のような物質に対してもアプタマーが取得できれば、その応用範囲は広いと考えられる。
【００１１】
【特許文献１】特開2002-326949号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ところが、SELEX法は現在のところは可溶性タンパク質に対する使用に限られているという問題がある。そのため、受容体のような細胞膜結合タンパク質に対して、医薬品への応用可能なアプタマーを作製するには、可溶性物質を標的とする場合とは異なる新しい技術の開発が必要である。受容体に対して特異的で親和性の高い物質を、どのような受容体に対しても、より簡単な手法で作製することが出来れば、受容体関連医薬品はさらに飛躍的な広がりを期待することができ、きわめて大きな経済効果を産むことになる。
【００１３】
しかしながらそのためには、自然な立体構造をもつTbRを大量に調製して、SELEX法に用いる必要があり、恒常的に提供することは難しい。
【００１４】
本発明は上記事情に基づいてなされたものであり、多彩な機能を有し、がん免疫治療と重要な関係を持つTbRを安定的に発現し、維持・増殖可能な細胞株、及びTbRに対するアプタマーを取得する場合の該細胞株の利用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
従来、TbRを常に安定して発現させる細胞株を樹立することは困難であった。また、TbRが存在する環境では、通常の細胞はなかなか増殖することが難しく、細胞株を樹立してもそれを安定して維持することが困難であった。
【００１６】
上述した状況の下、発明者らは鋭意研究を続けた結果、本発明を完成した。
【００１７】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（９）の発明を提供する。
【００１８】
（１）腫瘍成長因子β受容体を安定して発現する細胞株。
【００１９】
（２）前記細胞株が、チャイニーズハムスター卵巣細胞株であることを特徴とする（１）に記載の細胞株。
【００２０】
（３）前記腫瘍成長因子β受容体が、腫瘍成長因子β受容体III型であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の細胞株。
【００２１】
（４）前記細胞株の受領番号が、FERM AP-20604であることを特徴とする（３）に記載の細胞株。
【００２２】
（５）膜タンパク質のアプタマーを取得するための細胞株であって、腫瘍成長因子β受容体を安定して発現する細胞株。
【００２３】
（６）前記アプタマーがRNAであることを特徴とする（５）に記載の細胞株。
【００２４】
（７）前記細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞株であることを特徴とする（５）又は（６）に記載の細胞株。
【００２５】
（８）前記腫瘍成長因子β受容体が、腫瘍成長因子β受容体III型であることを特徴とする（５）乃至（７）のいずれかに記載の細胞株。
【００２６】
（９）前記細胞株の受領番号が、FERM AP-20604であることを特徴とする（８）に記載の細胞株。
【００２７】
本発明における細胞株は膜タンパク質の一種である腫瘍成長因子β受容体を安定して発現している。すなわち、該受容体を恒常的に発現し、増殖することができる。
【００２８】
また、本発明におけるアプタマーはペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ等様々なアプタマーを意味し、どれかに限定することなく幅広くアプタマーの取得に用いることができる。
【発明の効果】
【００２９】
以上、本発明によれば、従来は可溶性タンパク質のみに使用できたSELEX法を膜タンパク質へも応用することが可能となり、更に様々なアプタマーを取得することが可能となる。
【００３０】
特に免疫受容体関連医薬品は、がんや感染症を対象とした、副作用の少ない免疫療法のための医薬品となる可能性が高い。最近研究が進められている人工進化RNAの技術を利用して、受容体に親和性を持つ物質を創出する手法を確立し、これを特に免疫分野の創薬に応用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下、本発明の実施形態について説明する。
【００３２】
まず、本発明の細胞株について説明する。
【００３３】
本発明の細胞株はTbR遺伝子を発現するプラスミドを組み込み、人為的に高発現させたものである。TbR遺伝子の導入対象とする細胞は、TbRを高発現できる細胞であれば、基本的にはどのような細胞であっても好適に用いることができる。好ましくは動物細胞が良く、特にチャイニーズハムスター卵巣（Chiniese Hamster Ovary, CHO）細胞が好ましい。この細胞株は各種細胞株の保存機関から入手することが可能であるし、従来公知の方法を用いて作製することもできる。
【００３４】
TGFβにはI型、II型、III型の３種類が存在し、その受容体もTbRI型（TbRI）、TbRII型（TbRII）、TbRIII型（TbRIII）の３種類が存在する。本発明の細胞株で発現させる受容体は、TbRI、TbRII、TbRIIIのいずれでもよいが、TbRIIIを発現させるのが好ましい。TbRI遺伝子、TbRII遺伝子、及びTbRIII遺伝子は既知の遺伝子であり、その塩基配列はGenBank等の遺伝子バンクに登録されている。例えば、ヒト由来のTbRI遺伝子はaccession No. L11695で、ヒト由来のTbRII遺伝子はaccession No.M85079で、ヒト由来のTbRIII遺伝子はaccession No.L07594で登録されている。
【００３５】
本発明の細胞株は、従来公知の方法を適宜用いて作製することができる。具体的には、以下のような手順で行えば良い。
【００３６】
１）TbR遺伝子から転写されたmRNAから、RT-PCR法でcDNAを増幅してTbR cDNAを得た後、適当なプラスミドに組み込む。
【００３７】
２）宿主とする細胞株に該プラスミドを導入し、培地中で培養した後、抗生物質を含む培地でセレクションを行う。
【００３８】
３）更に、抗体結合ビーズを用いて組換タンパク（受容体遺伝子）を高発現している細胞を濃縮する。
【００３９】
４）上記ビーズにより濃縮された細胞を選択し、該細胞を限界希釈法やフローサイトメトリ（セルソーター）によってクローニングを行い、安定して高発現している細胞株を選択する。
【００４０】
上記手法において、用いることができるプラスミドの例としては以下のものを挙げることができる。
【００４１】
pRc/CMV、pZeoSV2、pBudCE4-1、pcDNA/V5-His等。
【００４２】
また、培地の例としては以下のものを挙げることができる。
【００４３】
イーグルMEM、ダルベッコMEM、RPIM1640等。
【００４４】
また、抗生物質の例としては以下のものを挙げることができる。
【００４５】
ネオマイシン、ゼオシン、ブラスチジン、ハイグロマイシン等。
【００４６】
本発明の細胞株の一例として、ヒト由来のTbRIIIを発現するCHO細胞である「Chinese Hamster CHO/TbRIII」株を挙げることができる。この細胞株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている（受領番号：FERM AP-20604、受領日：2005年7月26日）。
【００４７】
次に、本発明の細胞株のアプタマー取得のための利用について説明する。
【００４８】
本発明の細胞株は、TbRIIIを常に安定して発現し、増殖可能であるため、新規物質を探索する等、新規物質に対する標的物質が大量に必要とされるスクリーニングなどにおいても有用に用いることができる。特に、抗体等よりも標的物質との結合性が高いアプタマーの探索に好適に用いることができる。ここで、アプタマーとしては、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ等様々なものを探索することができるが、中でもRNAアプタマーの探索に好適に用いることができる。
【００４９】
ここで、RNAアプタマーの探索方法としては種々従来の方法を用いることが可能であるが、特にSELEX法に用いることが好ましい。
【００５０】
従来のSELEX法では、可溶性タンパクにしか用いることができなかったが、本発明によれば、常に安定して膜タンパク質（受容体）を発現している細胞を提供することができるため、新たに膜タンパクへ質の応用も可能となった。
【００５１】
このように、本発明の細胞株を用いたSELEX法では、ランダムなRNA群から、TbRIII特異的に結合したものを取得し、更にそれを濃縮して目的とするRNAアプタマーを大量に作製することができる。
【００５２】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明する。ただし、本発明がこれに限定されるものでないことは言うまでもない。
【実施例】
【００５３】
〔実施例１〕  TbRIII安定発現細胞の樹立
既製健常人末梢血単核球由来cDNA ライブラリー から、下記に示す特異的なプライマーを使用しPCR 法でTbRIIIの全長 cDNA を増幅した。
【００５４】
TbRIII (Sense)：TTCAAGCTTACCATGACTTCCCATTATGTGATTGCC（配列番号１）
TbRIII (Antisense)：GCCTCTAGAGGGCTAGGCCGTGCTGCTGC（配列番号２）
次にTbRIIIの全長 cDNAをコードしているDNA断片を制限酵素Hind III、Xba I処理し、哺乳類細胞用発現ベクターpRc/CMVのHind IIIとXba I部位の間に挿入した後クローニングし、TbRIII発現プラスミドpRc/CMV-TGFb/T3Rを作製した。挿入されたTbRIIIのcDNAの塩基配列をシーケンサーで確認した。
【００５５】
次に、CHO細胞（HS財団細胞バンクより入手）を直径35mmのシャーレを用いて、無血清培地100μlで培養した。この細胞に上述の手順で得たTbRIIIのcDNA断片を含むプラスミド6μgを、TransIT（トランスフェクション試薬）12μgを用いてリポフェクション法で導入した。
【００５６】
導入48時間後、一過性のTbRIIIを発現していることを、一次抗体に抗ヒトTbRIII抗体、二次抗体に抗ヤギIg-FITCを用いてフローサイトメーターで確認し、その後G418（400μg/ml）を含む培地で培養して選択した。さらに、選択された細胞を限界希釈法によって単一細胞からクローニングし、TbRIIIを安定に高発現する細胞株を得た。
【００５７】
図１に当該細胞株の樹立を示すフローサイトメトリーの結果を示す。
【００５８】
〔実施例２〕  細胞株を用いたアプタマーの取得
次に実施例１で樹立した本発明の細胞株を用い、SELEX法によってRNAアプタマーを取得した（図２）。
【００５９】
SELEX法によるRNAアプタマーの取得はEllingtonらの方法（Ellington A.D. and Szostak J.W., In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands, Nature, 346:818-22, 1990）及びTuerkらの方法（Tuerk C. and Gold L., Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase, Science, 249:505-510, 1990）を改良して行った。SELEXに用いたランダムRNAプールは化学合成した以下のプライマー及びランダム配列テンプレート（北海道システムサイエンス社に合成依頼）より作製した。ランダム配列テンプレートはExTaq DNA polymerase (Takara-Bio社)をもちいたPCRによって増幅させ、このDNA断片を転写のテンプレートとして、プライマーF-1に含まれるT7 RNAポリメラーゼのプロモーター配列より、DuraScribe T7 transcription kit (Epicentre Technologies社)をもちいてin vitroで転写し、フェノール抽出とゲルろ過により精製した。なお、この方法で得られるRNAはピリミジンヌクレオチドのリボースの2'位がフルオロ化されている。RNAプールの細胞への結合はバッファーA[20 mM HEPES-NaOH(pH7.6), 150 mM NaCl, 1.5 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2]中で行った。RNAプールを、TbRIII細胞を培養したディッシュに投入し37℃で保温した後、細胞に結合しなかったRNAをふくむ溶液を除去し、細胞に結合したRNAをEDTA溶液（PBS-based cell dissociation buffer, Gibco/Invitrogen社）によって遊離させた。これをRT-PCRで増幅の後、in vitroで転写を行ない、次のラウンドのRNAプールを得た。毎ラウンド、RNAプールはTbRIII細胞に結合させる前後に、MOCK細胞を培養したディッシュに投入しこれに結合するRNAを取り除いた。10ラウンドのSELEXを行った後、PCR産物はpGEM-T Easy vector（Promega社）にクローニングし、大腸菌株DH5α（Novagen社製）に形質転換し、単一クローンを得た。これらは、plasmidを抽出後DNA sequencer（model 3100, ABI社製）で、以下のsequence primerを用いて塩基配列を決定した。得られた単一クローンの塩基配列を配列番号３に示す。
【００６０】
forward primer (F-1), 5’-TAATACGACT CACTATAGGG CCAGGCAGCG AG-3’ (T7プロモーター配列を下線で示した)（配列番号４）
reverse primer (R-1), 5’-TCTCGGACGC GTGTGGTCGG-3’（配列番号５）
ランダム配列テンプレート：5’-TCTCGGACGC GTGTGGTCGG-N60-CTCGCTGCCT GGCCCTATAG TGAGTCGTAT TA-3’（配列番号６）
sequence primer:  5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'（配列番号７）
【産業上の利用可能性】
【００６１】
以上説明したように、本発明によれば、従来は可溶性タンパクのみに使用できたSELEX法を膜タンパクへも応用することが可能となり、様々なアプタマーを取得することが可能となる。
【００６２】
特に免疫受容体関連医薬品は、がんや感染症を対象とした、副作用の少ない免疫療法のための医薬品となる可能性が高いと考えられる。本発明の技術を利用して、受容体に親和性を持つ物質を創出する手法を確立し、これを特に免疫分野の創薬に応用することできる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本発明の細胞株の樹立を示すフローサイトメータのグラフである。
【図２】SELEX法の概略を示す図。T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列とランダム領域を含むDNAを鋳型として、RNAプールを調製する。MOCK細胞をもちいたネガティブセレクションによる細胞表層の非標的物質へ結合するRNAの除去と、TbRIII細胞をもちいたポジティブセレクションの後、回収したRNAからRT-PCRにより次のラウンドへの鋳型を得る。本発明ではこれを10ラウンド繰り返した。最終ラウンドでのRT-PCR産物をクローニング、シークエンスに回す。
【図１】
2007043918.tif 000002
【図２】
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【配列表】
2007043918000001.app