(57)【要約】      （修正有）【課題】血液等の生体試料中に含まれるＰＧ類を正確かつ高感度で定量する方法を提供すること。【解決手段】プロスタグランジン類を含有する生体試料を第一次液体クロマトグラフィーに付して、プロスタグランジン類を含む溶出液とプロスタグランジン類を含まない溶出液に分離し、プロスタグランジン類を含む溶出液を濃縮カラムに導入して濃縮されたプロスタグランジン類溶出液を得て、これを第二次液体クロマトグラフィーに付してプロスタグランジン類を単離して溶出し、溶出液中の分離されたプロスタグランジン類をタンデム質量分析計で定量することを特徴とするプロスタグランジン類の分析方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロスタグランジン類を含有する生体試料を第一次液体クロマトグラフィーに付して、プロスタグランジン類を含む溶出液とプロスタグランジン類を含まない溶出液に分離し、
プロスタグランジン類を含む溶出液を濃縮カラムに導入して濃縮されたプロスタグランジン類溶出液を得て、
これを第二次液体クロマトグラフィーに付してプロスタグランジン類を単離して溶出し、
溶出液中の分離されたプロスタグランジン類をタンデム質量分析計で定量することを特徴とするプロスタグランジン類の分析方法。
【請求項２】
プロスタグランジン類がプロスタグランジンＡ1、プロスタグランジンＡ2、プロスタグランジンＡ3、プロスタグランジンＢ1、プロスタグランジンＢ2、プロスタグランジンＢ3、プロスタグランジンＣ1、プロスタグランジンＣ2、プロスタグランジンＣ3、プロスタグランジンＤ1、プロスタグランジンＤ2、プロスタグランジンＤ3、プロスタグランジンＥ1、プロスタグランジンＥ2、８−イソプロスタグランジンＥ2、プロスタグランジンＥ3、プロスタグランジンＦ1α、プロスタグランジンＦ2α、１３，１４−ジヒドロ−１５−ケト−プロスタグランジンＦ2α、８−イソプロスタグランジンＦ2α、８−イソ−１３，１４−ジヒドロ−１５−ケト−プロスタグランジンＦ2α、８−エピプロスタグランジンＦ2α、プロスタグランジンＦ3α、プロスタグランジンＦ1β、プロスタグランジンＦ2β、プロスタグランジンＦ3β、プロスタグランジンＧ1、プロスタグランジンＧ2、プロスタグランジンＧ3、プロスタグランジンＨ1、プロスタグランジンＨ2、プロスタグランジンＨ3、プロスタグランジンＩ1、プロスタグランジンＩ2、プロスタグランジンＩ3、プロスタグランジンＪ2、６−ケト−プロスタグランジンＦ1α、２，３−ジノル−６−ケト−プロスタグランジンＦ1α、１３，１４−ジヒドロ−１５−ケト−プロスタグランジンＥ2、７α−ヒドロキシ−５，１１−ジケト−テトラノル−プロスタ−１，１６−ジオン酸、５α，７α−ジヒドロキシ−１１−ケト−テトラノル−プロスタ−１，１６−ジオン酸及びそれらの誘導体から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
プロスタグランジン類がプロスタグランジンＥ1、プロスタグランジンＥ2、プロスタグランジンＦ2α、１３，１４−ジヒドロ−１５−ケト−プロスタグランジンＦ2α、プロスタグランジンＩ2及びそれらの誘導体から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項２に記載の分析方法。
【請求項４】
第一次液体クロマトグラフィーがＣ４−３０アルキル基、フェニル基又はω−フェニルＣ１−６直鎖アルキル基導入シリカゲル充填カラムを使用して行なわれることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の分析方法。
【請求項５】
第二次液体クロマトグラフィーがＣ４−３０アルキル基、フェニル基又はω−フェニルＣ１−６直鎖アルキル基導入シリカゲル充填カラムを使用して行なわれることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の分析方法。
【請求項６】
Ｃ４−３０アルキル基がオクタデシル基である請求項４又は５に記載の分析方法。
【請求項７】
第二次液体クロマトグラフィーの溶出液の流速が、第一次液体クロマトグラフィーの溶出液の流速に対して１／２〜１／５倍であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の分析方法。
【請求項８】
第二次液体クロマトグラフィーの溶出液がアセトニトリル／水系溶媒であることを特徴とする請求項７に記載の分析方法。
【請求項９】
生体試料が、血液、尿又は組織抽出液であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の分析方法。
【請求項１０】
プロスタグランジン類を含む溶出液を濃縮カラムに導入して濃縮されたプロスタグランジン類溶出液を得る工程が、第一次液体クロマトグラフィーで得られるプロスタグランジン類を含む溶出液を濃縮カラムに導入し、プロスタグランジン類を充分に濃縮カラムに保持させた後、切り替えバルブによって、第二次液体クロマトグラフィーに使用される展開溶媒を濃縮カラムに導入して、濃縮カラムに保持されたプロスタグランジン類を溶出して濃縮されたプロスタグランジン類溶出液を得ることを含んでなる請求項１に記載の分析方法。
【請求項１１】
プロスタグランジン類関連疾患の診断のための請求項１に記載の分析方法。
【請求項１２】
プロスタグランジン類関連疾患の予防及び／又は治療のために行なわれる請求項１に記載の分析方法。
【請求項１３】
プロスタグランジン類関連疾患予防及び／又は治療薬の有効量を決定するための請求項１に記載の分析方法。
【請求項１４】
プロスタグランジン類及び／又はそれらの誘導体の体内動態を究明するための請求項１に記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液等の生体試料中のプロスタグランジン（以下、ＰＧと略記することもある。）類を定量する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＧ類は、１９３０年に子宮筋を収縮又は弛緩させる物質として発見され、１９６０年にはＰＧＥ1及びＰＧＦ1αが単離された。ＰＧ類は、プロスタン酸を基本骨格とし、分子の中央に５員環をもち、２本の側鎖をもった炭素数２０個の脂肪酸である。５員環の構造によりＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ又はＩ等に、さらに側鎖の二重結合の数により１群、２群又は３群に分類されている。また、ＰＧＦについては９位の水酸基の立体配置の違いからαとβに区別されている。ＰＧ類は哺乳動物の臓器や体液中に広く分布し、微量でさまざまな生理活性を持つことが知られている。また、ＰＧ類は生体内のあらゆる細胞で生成可能である。多様な生理活性を有するＰＧ類は、重要な生理機能調節因子であるので、ＰＧ類の近縁化合物が多数合成され、臨床的に降圧剤、抗凝血剤、消化潰瘍剤又は抗癌剤等、多様な新薬としての可能性が検討されてきている。
しかし、ＰＧ類は生体内物質でもあり、またＰＧ類の感受性は個人差が大きくＰＧ類の投与に際しては、その投与量の管理が重要となっている。特に、妊娠末期における陣痛誘発又は陣痛促進を目的に、例えばＰＧＥ2が使用される場合、ＰＧＥ2の感受性は個人差が大きく、少量でも過強陣痛並びにそれに伴う子宮破裂や胎児仮死の危険性が起こりうる。このため、ＰＧＥ２製剤の投与は通常１回１錠を１時間毎に６回、１日総量６錠を１クールとして経口投与されているが症状および経過に応じて適宜増減する投与方法がとられているのが現状である。
【０００３】
血液等の生体試料中に含まれるＰＧ類の定量方法としては、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法；非特許文献１参照）、ＧＣ／ＭＳ（ガスクロマトグラフィー／質量分析機；非特許文献２参照）、一次元ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー−タンデム型質量分析計；非特許文献３参照）等が知られているが、例えば感度不足であったり、特異性が不十分であるか又は検討されていなかったり、また、ＰＧ類とその代謝物との同時測定が不可能である等の欠点がある。このため、生体内でのＰＧ類の薬物動態についての検討は十分であるとはいえない。
【非特許文献１】ジ・ホッファー（G. Hofer）、プロスタグランジンズ（Prostaglandins）、１９９３年、第４５巻、ｐ．４１３
【非特許文献２】ディ・ティシカス（D. Tsikas）、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー・ビー（J. Chromatography B）、１９９８年、第７１７巻、ｐ．２０１
【非特許文献３】ピー・アロージョ（P. Araujo）、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー・ビー（J. Chromatography B）、２００６年、第８３０巻、ｐ．２１２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、血液等の生体試料中に含まれるＰＧ類を正確かつ高感度で定量することを可能にし、上記従来技術の問題点を一挙に解決し得る方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、血液等の生体試料中に含まれるＰＧ類を高感度で定量する方法について鋭意研究を行った結果、目的とするＰＧ類を含有する生体試料を第一次液体クロマトグラフィーに付して、目的とするＰＧ類を含む溶出液と目的とするＰＧ類を含まない溶出液に分離し、目的とするＰＧ類を含む溶出液を濃縮カラムに導入して濃縮された目的とするＰＧ類溶出液を得て、これを第二次液体クロマトグラフィーに付して目的とするＰＧ類を分離して溶出し、溶出液中の分離された目的とするＰＧ類をタンデム質量分析計で定量することにより、生体試料中に含まれるＰＧ類を容易に高感度で正確に検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、
［１］  ＰＧ類を含有する生体試料を第一次液体クロマトグラフィーに付して、ＰＧ類を含む溶出液とＰＧ類を含まない溶出液に分離し、ＰＧ類を含む溶出液を濃縮カラムに導入して濃縮されたＰＧ類溶出液を得て、
これを第二次液体クロマトグラフィーに付してＰＧ類を単離して溶出し、溶出液中の分離されたＰＧ類をタンデム質量分析計で定量することを特徴とするＰＧ類の分析方法、
［２］  ＰＧ類がＰＧＡ1、ＰＧＡ2、ＰＧＡ3、ＰＧＢ1、ＰＧＢ2、ＰＧＢ3、ＰＧＣ1、ＰＧＣ2、ＰＧＣ3、ＰＧＤ1、ＰＧＤ2、ＰＧＤ3、ＰＧＥ1、ＰＧＥ2、８−イソＰＧＥ2、ＰＧＥ3、ＰＧＦ1α、ＰＧＦ2α、１３，１４−ジヒドロ−１５−ケト−ＰＧＦ2α８−イソＰＧＦ2α、８−イソ−１３，１４−ジヒドロ−１５−ケト−ＰＧＦ2α、８−エピＰＧＦ2α、ＰＧＦ3α、ＰＧＦ1β、ＰＧＦ2β、ＰＧＦ3β、ＰＧＧ1、ＰＧＧ2、ＰＧＧ3、ＰＧＨ1、ＰＧＨ2、ＰＧＨ3、ＰＧＩ1、ＰＧＩ2、ＰＧＩ3、ＰＧＪ2、６−ケト−ＰＧＦ1α、２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ1α、１３，１４−ジヒドロ−１５−ケト−ＰＧＥ2、７α−ヒドロキシ−５，１１−ジケト−テトラノル−プロスタ−１，１６−ジオン酸、５α，７α−ジヒドロキシ−１１−ケト−テトラノル−プロスタ−１，１６−ジオン酸及びそれらの誘導体から選択される少なくとも１種であることを特徴とする前記［１］に記載の分析方法、
［３］  ＰＧ類がＰＧＥ1、ＰＧＥ2、ＰＧＦ2α、１３，１４−ジヒドロ−１５−ケト−ＰＧＦ2α、ＰＧＩ2及びそれらの誘導体から選択される少なくとも１種であることを特徴とする前記［２］に記載の分析方法、
［４］  第一次液体クロマトグラフィーがＣ４−３０アルキル基、フェニル基又はω−フェニルＣ１−６直鎖アルキル基導入シリカゲル充填カラムを使用して行なわれることを特徴とする前記［１］〜［３］のいずれかに記載の分析方法、
［５］  第二次液体クロマトグラフィーがＣ４−３０アルキル基、フェニル基又はω−フェニルＣ１−６直鎖アルキル基導入シリカゲル充填カラムを使用して行なわれることを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれかに記載の分析方法、
［６］  Ｃ４−３０アルキル基がオクタデシル基である前記［４］又は［５］に記載の分析方法、
［７］  第二次液体クロマトグラフィーの溶出液の流速が、第一次液体クロマトグラフィーの溶出液の流速に対して１／２〜１／５倍であることを特徴とする前記［１］〜［６］のいずれかに記載の分析方法、
［８］  第二次液体クロマトグラフィーの溶出液がアセトニトリル／水系溶媒であることを特徴とする前記［７］に記載の分析方法、
［９］  生体試料が、血液、尿又は組織抽出液であることを特徴とする前記［１］〜［８］のいずれかに記載の分析方法、
［１０］  ＰＧ類を含む溶出液を濃縮カラムに導入して濃縮されたＰＧ類溶出液を得る工程が、第一次液体クロマトグラフィーで得られるＰＧ類を含む溶出液を濃縮カラムに導入し、ＰＧ類を充分に濃縮カラムに保持させた後、切り替えバルブによって、第二次液体クロマトグラフィーに使用される展開溶媒を濃縮カラムに導入して、濃縮カラムに保持されたＰＧ類を溶出して濃縮されたＰＧ類溶出液を得ることを含んでなる前記［１］に記載の分析方法、
［１１］  ＰＧ類関連疾患の診断のための前記［１］に記載の分析方法。
［１２］  ＰＧ類関連疾患の予防及び／又は治療のために行なわれる前記［１］に記載の分析方法、
［１３］  ＰＧ類関連疾患予防及び／又は治療薬の有効量を決定するための前記［１］に記載の分析方法、及び
［１４］  ＰＧ類及び／又はそれらの誘導体の体内動態を究明するための前記［１］に記載の分析方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明に従えば、高感度で種々のＰＧ類を同時に測定（定量）できる。また、ヒト血漿中の微量のＰＧ類をも測定（定量）し得るので、内在性のＰＧ類の測定はもちろん、投与されたＰＧ類の薬物動態を測定することも可能となる。このことによってＰＧ類の投与量の管理が可能となり、例えば陣痛促進等に投与されるＰＧＥ2やＰＧＦ2αの過剰投与による過強陣痛や強直性子宮収縮等を防止し、さらには強直性子宮収縮等による胎児仮死、子宮破裂、頸管裂傷又は羊水栓塞等を事前に防止し得る。
また、本発明に従えば、高感度で種々のＰＧ類を測定（定量）し得るので、ＰＧ類の生体情報（例えば、ヒト血漿中におけるＰＧ類の濃度等）を数値化、定量化してヒト等におけるＰＧ類のバイオマーカーを設定し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明において、ＰＧ類としては、下記プロスタン酸；
【化１】
2007278750.tif 000002
を基本骨格とする、分子の中央に５員環をもち、２本の側鎖をもった炭素数２０個の脂肪酸又はその誘導体が挙げられる。前記誘導体にはプロスタン酸の５員環の代わりに６員環を有するもの、又は炭素数が２０未満（約１５〜１９）もしくは２０を超えるもの（約２１〜２５）も包含される。
【０００９】
ＰＧ類の具体例としては、例えばＰＧＡ1、ＰＧＡ2、ＰＧＡ3、ＰＧＢ1、ＰＧＢ2、ＰＧＢ3、ＰＧＣ1、ＰＧＣ2、ＰＧＣ3、ＰＧＤ1、ＰＧＤ2、ＰＧＤ3、ＰＧＥ1、ＰＧＥ2（ジノプロストン）、８−イソＰＧＥ2、ＰＧＥ3、ＰＧＦ1α、ＰＧＦ2α（ジノプロスト）、１３，１４−ジヒドロ−１５−ケト−ＰＧＦ2α、８−イソＰＧＦ2α、８−イソ−１３，１４−ジヒドロ−１５−ケト−ＰＧＦ2α、８−エピＰＧＦ2α、ＰＧＦ3α、ＰＧＦ1β、ＰＧＦ2β、ＰＧＦ3β、ＰＧＧ1、ＰＧＧ2、ＰＧＧ3、ＰＧＨ1、ＰＧＨ2、ＰＧＨ3、ＰＧＩ1、ＰＧＩ2、ＰＧＩ3、ＰＧＪ2、６−ケト−ＰＧＦ1α、２，３−ジノル−６−ケト−ＰＧＦ1α、１３，１４−ジヒドロ−１５−ケト−ＰＧＥ2、７α−ヒドロキシ−５，１１−ジケト−テトラノル−プロスタ−１，１６−ジオン酸、５α，７α−ジヒドロキシ−１１−ケト−テトラノル−プロスタ−１，１６−ジオン酸又はそれらの誘導体等が挙げられ、好ましくはＰＧＥ1、ＰＧＥ2、ＰＧＦ2α、１３，１４−ジヒドロ−１５−ケト−ＰＧＦ2α、ＰＧＩ2、１３，１４−ジヒドロ−１５−ケト−ＰＧＥ2、８−イソＰＧＦ2α、８−イソ−１３，１４−ジヒドロ−１５−ケト−ＰＧＦ2α又はそれらの誘導体である。ＰＧ類の誘導体としては、例えば、アルプロスタジル、オルノプロスチル、リマプロスト、ゲメプロスト、ベラプロスト、トリモプロスチル、ミソプロストール、アルバプロスチル又はエンプロスチル等が挙げられる。
【００１０】
また、ＰＧ類は遊離の塩基の状態のみならず、塩の状態も含まれる。ＰＧ類の塩としては、アルカリ金属（例えば、カリウム、ナトリウム等）の塩、アルカリ土類金属（例えば、カルシウム、マグネシウム等）の塩、アンモニウム塩、薬学的に許容される有機アミン（例えば、テトラメチルアンモニウム、トリエチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、シクロペンチルアミン、ベンジルアミン、フェネチルアミン、ピペリジン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、リジン、アルギニン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン等）又は酸付加塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩のような無機酸塩；又は酢酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、グルクロン酸塩、グルコン酸塩のような有機酸塩等）等が挙げられる。
【００１１】
本発明の分析方法に使用される生体試料としては、ＰＧ類を含有し生体由来の試料であれば制限されず、例えば、ヒトを含む動物の血液、尿、組織抽出液、唾液、涙液、その他の体液等が挙げられる。血液には、血漿又は血清等が含まれる。また、組織抽出液の組織には、各種の臓器（例えば、脾臓、小腸、脊髄、肺、胃、副睾丸、胸腺、脳、腎臓、精巣、子宮、骨髄、網膜、内耳等）又は皮膚等が含まれる。組織抽出液の抽出方法は特に制限はなく、公知の方法、例えば肝臓組織抽出液の場合には、肝臓組織を、インドメタシンを含む生理食塩液でホモジナイズし、その上清を固相抽出する方法等が挙げられる。
【００１２】
生体試料は、後記液体クロマトグラフィー（以下、ＬＣと略記する。）に付す前に、生体試料中に含まれる例えばタンパク質等を除去するために前処理を施されることが好ましい。前処理としては、除タンパク、抽出（例えば、液液抽出法、固相抽出法）又は濃縮操作等が挙げられる。除タンパクの方法としては、公知の方法でよいが、例えば有機溶媒処理（例えば、フェノール、クロロホルム、クロロホルム−メタノール混液、アセトン等）又は熱処理等が挙げられる。液液抽出法において、ＰＧ類を抽出する溶媒としては、例えば、酢酸エチル、クロロホルム又は酢酸エチル−ｎ-へキサン混液等が挙げられる。固相抽出法は、例えば、ＰＧ類に合致した固相にＰＧ類を保持（吸着）させ、次いで溶出溶媒により固相に保持（吸着）されたＰＧ類を溶出させる公知の方法により実施できる。濃縮操作は、例えば減圧濃縮等が挙げられる。これら前処理は1種又は複数組み合わせて行うことができるが、処理時間の短縮化、簡便性、迅速性又は省力化等の観点から固相抽出法を含むことが好ましい。固相抽出法における固相としては、例えば、オクタデシルシリル化シリカゲル（ＯＤＳ）、弱塩基性陰イオン交換体、シリカゲル、スチレンジビニルベンゼン共重合体（ＳＤＢ）、プロピルスルホニルシリル化シリカゲル、ベンゼンスルホニルプロピルシリル化シリカゲル、アクリルアミド共重合体結合グリセリルプロピルシリル化シリカゲル、アミノプロピルシリル化シリカゲル、アルミナ、エチルシリル化シリカゲル、エチレンジアミン−Ｎ−プロピルシリル化シリカゲル、カルボキシメチルシリル化シリカゲル、強塩基性陰イオン交換体又はグリセリルプロピルシリル化シリカゲル等が挙げられるがこれらに限定されない。また、これら固相は１種又は２種以上を組み合わせて使用できる。好ましい固相の組み合わせとしては、例えばＯＤＳ、弱塩基性陰イオン交換体、シリカゲル、ＳＤＢの組み合わせである。固相抽出法は、上記固相が充填された市販のカートリッジ又はミニカラム等を用いることができる。そのようなカートリッジ又はミニカラム等としては、例えばＢｏｎｄ  Ｅｌｕｔ  Ｃ１８（Varian製；ＯＤＳ系固相）、Ｂｏｎｄ  Ｅｌｕｔ  ＬＲＣ−Ｃ１８（Varian製；ＯＤＳ系固相）、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｖａｃ  Ｃ１８（Waters社製；ＯＤＳ系固相）、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８（Waters社製；ＯＤＳ系固相）、Ｂｏｎｄ  Ｅｌｕｔ  ＤＥＡ（Varian製；弱塩基性陰イオン交換体固相）、ａｂｓｅｌｕｔ  ＮＥＸＵＳ（Varian製；ＳＤＢ系固相）又はＳｅｐ−Ｐａｋ  Ｐｌｕｓ  ＰＳ−２（Waters社製；ＳＤＢ系固相）等が挙げられるが、これらに限定されない。前記カートリッジ又はミニカラム等は１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。また、固相抽出法には、固相マイクロ抽出法（ＳＰＭＥ）が含まれる。ＳＰＭＥとしては、上記固相を結合させた細いニードル等が挙げられる。固相抽出法における、固相に保持（吸着）されたＰＧ類を溶出する溶媒としては、例えばＯＤＳ系やＳＤＢ系固相では酢酸エチル、クロロホルム、メタノール又はアセトニトリル等が挙げられ、例えば弱塩基性陰イオン交換体固相では、水−アルコール混液［例えば、水／酢酸混液（約１００：１〜８０：１（Ｖ／Ｖ））／メタノ��ル（約９：１〜５：５（Ｖ／Ｖ））］等が挙げられる。
【００１３】
また、固相は、試料注入前にＰＧ類を保持（吸着）し得るようコンディショニングすることが好ましい。コンディショニングは、固相により異なり、例えば、ＯＤＳ系やＳＤＢ系固相ではまず溶出溶媒（例えば、酢酸エチル、クロロホルム等）、次いで極性の高い溶媒（例えば、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル等）、次いで水性溶媒［例えば、水、水／酢酸混液（約１００：１〜８０：１（Ｖ／Ｖ））、塩酸（０．１〜０．５Ｎ）等］の一定量を、また、例えば弱塩基性陰イオン交換体固相では、有機溶媒（例えば、酢酸エチル、メタノール等）の一定量を、固相が充填されたカートリッジ又はミニカラムに通すことにより実施できる。
【００１４】
ＰＧ類を保持した固相は、例えば水性溶媒［例えば、水、水／酢酸混液（約１００：１〜８０：１（Ｖ／Ｖ））、塩酸（０．１〜０．２Ｎ）等］の一定量で洗浄されるのが好ましい。該洗浄により、固相に負荷された試料に含まれるＰＧ類以外の夾雑物を除去し得る。
【００１５】
生体試料の前処理には、内標準物質を添加することが好ましい。内標準物質の添加により、試料中に夾雑物が存在し、ＰＧ類の測定に影響を与える場合においても、正確にＰＧ類の測定を行うことができる。内標準物質としては、測定するＰＧ類に近い保持時間をもち、いずれのピークとも完全に分離する安定な物質が好ましい。内標準物質としては、測定するＰＧ類の重水素（ｄ4〜ｄ6）置換体等が挙げられ、例えばＰＧＥ2に対してはｄ4−ＰＧＥ2；ＰＧＦ2α、ＰＧＦ9α、１１β−ＰＧＦ2及び８−ｅｐｉＰＧＦ2αに対してはｄ5−ＰＧＦ2α又はｄ4−ＰＧＦ2a；６−ケトＰＧＦ1αに対してはｄ4−６−ケトＰＧＦ1α；ＰＧＥ1に対してはｄ4−ＰＧＥ1；及びＰＧＤ2に対してはｄ4−ＰＧＤ2等が挙げられる。
【００１６】
上記前処理を施した生体試料におけるＰＧ類の分析は、好ましくは例えば以下の工程１乃至４を含む工程により実施し得る。
工程１：目的とするＰＧ類を含む試料又はその処理物をまず第一次ＬＣに付して、目的とするＰＧ類を含む溶出液と目的とするＰＧ類を含まない溶出液に分離する。
工程２：工程１における目的とするＰＧ類を含む溶出液を濃縮カラムに導入して濃縮する。
工程３：工程２において濃縮された目的とするＰＧ類を含む溶出液を第二次ＬＣに付して、目的とするＰＧ類を、夾雑物をほとんど含まず実質的に純粋な状態に単離された目的とするＰＧ類として溶出する。
工程４：工程３において単離された目的とするＰＧ類を含む溶出液を、ＭＳ／ＭＳに導入し、単離された溶出液中の目的とするＰＧ類の各質量を測定する。
上記工程１乃至４を含む工程を実施する装置としては二次元ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム、例えば図１に示す装置が挙げられる。
以下、各工程につき説明する。
【００１７】
工程１：
第一次ＬＣにおけるカラム（図１で示すＣ１）は、Ｃ４−３０アルキル基導入シリカゲル充填カラム（炭素数４−３０アルキル基を導入したシリカゲルを充填したカラム）、フェニル基導入シリカゲル充填カラム又はω−フェニルＣ１−６直鎖アルキル基導入シリカゲル充填カラムが好ましい。Ｃ４−３０アルキル基、フェニル基又はω−フェニルＣ１−６直鎖アルキル基導入シリカゲルは、シリカゲルの表面に存在するシラノールに、シリル化剤、例えばトリメチルシリル化剤のメチル基がＣ４−３０アルキル基、フェニル基又はω−フェニルＣ１−６直鎖アルキル基の１個又は２個で置換されたシリル化剤を化学結合させたシリカゲル等が挙げられる。Ｃ４−３０アルキル基、フェニル基又はω−フェニルＣ１−６直鎖アルキル基導入シリカゲルは、シリカゲルの表面に存在するシラノールにＣ４−３０アルキル基、フェニル基又はω−フェニルＣ１−６直鎖アルキル基を化学結合させた後に残ったシラノールを、所望により不活性化処理（例えば、エンドキャッピング等）されたものを包含する。Ｃ４−３０アルキル基導入シリカゲル充填カラムとしては、例えば、ブチル基結合シリカゲル（Ｃ４）カラム、オクチル基結合シリカゲル（Ｃ８）カラム、オクタデシル基結合シリカゲル（Ｃ１８；ＯＤＳ）カラム又はトリアコンチル基結合シリカゲル（Ｃ３０）カラム等が挙げられる。中でもＯＤＳカラムが好ましい。フェニル基導入シリカゲル充填カラムとしては、例えばフェニルシリル化シリカゲル（Ｐｈ）カラム等が挙げられる。ω−フェニルＣ１−６直鎖アルキル基導入シリカゲル充填カラムとしては、例えばフェニルエチルシリル化シリカゲルカラム（例えば、コスモシール  ＮＰＥカラム等）等が挙げられる。カラムに充填される充填剤の粒子径は、約５μｍ以下、好ましくは約３μｍ以下がＰＧ類の分離能等の点から好ましい。ＯＤＳカラムとしては、例えばＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＵＧ１２０（株式会社資生堂製）、Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ  ＯＤＳ（化学品検査協会製）、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ＵＧ−５（野村化学株式会社製）、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ＨＧ−５（野村化学株式会社製）、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８ＭＳ（ナカライテスク株式会社製）、Ｊ−ｓｐｈｅｒｅ  ＯＤＳ  Ｍ８０（株式会社ＹＭＣ製）、ＴＳＫ  ＧＥＬ  ＯＤＳ  ８０ＴＳ（東ソー株式会社製）、Ｋａｓｅｉｓｏｒｂ  ＬＣ  ＯＤＳ  Ｓｕｐｅｒ（東京化成株式会社製）、Ｗａｋｏｓｉｌ  ５Ｃ１８  ＨＧ（和光純薬工業株式会社製）、Ｗａｋｏｓｉｌ  ５Ｃ１８  ＲＳ（和光純薬工業株式会社製）、ＵＬＴＲＯＮ  ＶＸ  ＯＤＳ（信和化工株式会社製）、日本分光  Ｃｒｅｓｔｐａｋ  Ｃ１８Ｓ（日本分光株式会社製）、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２（ジーエルサイエンス株式会社製）、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（ジーエルサイエンス株式会社製）、Ｐｕｒｅｓｉｌ  ＯＤＳ（ウォーターズ社製）、Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒｅ  ＲＰ−１８（メルク社製）、Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８（インタクト株式会社製）又はＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８（株式会社ワイエムシー）等を挙げることができる。中でも、ＯＤＳ粒子が約３μｍのＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（φ２．１×５０ｍｍ）やＣａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８（φ２��０×５０ｍｍ）等が好ましく挙げられる。
【００１８】
本発明において、第一次ＬＣにおけるカラム温度としては、室温〜約５０℃が挙げられ、好ましくは約３５〜４５℃である。
【００１９】
本発明において、第一次ＬＣにおける溶出液（移動層）としては、低級アルコール／水系溶媒（低級アルコールと水との混合物）が好適に用いられる。低級アルコールとしては、例えば炭素数１〜３のアルコールが挙げられ、具体的には、メタノール、エタノール、プロパノール又はイソプロパノール等が挙げられるが、メタノールが好ましい。水系溶媒としては、精製水、蒸留水又はＨＰＬＣ用水等が挙げられる。水系溶媒には、例えばギ酸、酢酸、ギ酸アンモニウム又は酢酸アンモニウム等の揮発性物質が添加されること及び、例えばｐＨ約３〜４の酸性に調整されることが好ましい。揮発性物質の濃度は、例えば約０．１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、約１〜７ｍｍｏｌ／Ｌがより好ましい。低級アルコールと水系溶媒の比率は、約６０／４０％（Ｖ／Ｖ）〜約４０／６０％（Ｖ／Ｖ）が好ましい。
前処理を行った目的とするＰＧ類を含む試料は、第一次ＬＣにおけるオートサンプラー（図１におけるＡＳ）からサンプリングされ得る。また、第一次ＬＣにおける溶出液は、図１におけるポンプ１（Ｐ１）から送液され得る。
【００２０】
目的とするＰＧ類を含む溶出液と目的とするＰＧ類を含まない溶出液の分離は、あらかじめ第一次ＬＣのカラムから溶出される溶出液に含まれる目的とするＰＧ類の溶出時間を測定して、その溶出時間に溶出する溶出画分を採取し、それ以外の溶出画分から分離することにより行われる。上記溶出時間の測定は、目的とするＰＧ類を含む試料を、公知の一次元ＬＣ／ＭＳ／ＭＳに付すことにより実施し得る。具体的には、まず前処理を行った目的とするＰＧ類を含む試料を第一次ＬＣに付し、その溶出液を直接ＭＳ／ＭＳに導入して、得られたＭＳ／ＭＳにおける目的とするＰＧ類の分離パターンから目的とするＰＧ類が検出されている時間（保持時間）と検出されない時間とを認識する。目的とするＰＧ類を含む溶出液と目的とするＰＧ類を含まない溶出液の分離は、目的とするＰＧ類を含む溶出液のカラムからの溶出開始から溶出を終える時間まで（保持時間）に溶出する溶出液と目的とするＰＧ類を含まない溶出液がカラムから溶出している時間の溶出液とを分離することにより実施できる。前記分離により、ＭＳ／ＭＳにおける第一次ＬＣの目的とするＰＧ類の分離パターンから、例えば第一次ＬＣにおいてある目的とするＰＧがカラムから溶出を始める時間から溶出を終える時間まで（保持時間）の溶出液を、目的とするＰＧ類を含む溶出液とすることができる。また、例えば第一次ＬＣにおいて最初の目的とするＰＧ類がカラムから溶出を始めるまでの時間の溶出液、又はある目的とするＰＧがカラムから溶出を終える時間から次の目的とするＰＧがカラムから溶出を始める時間までの時間の溶出液を、目的とするＰＧ類を含まない溶出液とする。このある目的とするＰＧ又は次の目的とするＰＧのカラムからの溶出には、複数種類の目的とするＰＧが完全又は部分的に重複して溶出される場合が含まれる。
また、上記一次元ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにおける目的とするＰＧ類の保持時間から、本発明における二次元ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにおける下記バルブの切換時間及びバルブポジションを設定し得る。上記一次元ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにおける目的とするＰＧ類の保持時間中は、例えば図１におけるバルブ（Ｖ）のバルブポジションをＢとなるように設定し（バルブ（Ｖ）における溶出液の流れを図３の矢印で示す。）、それ以外の時間はバルブポジションをＡとなるように設定する（バルブ（Ｖ）における溶出液の流れを図２の矢印で示す。）ことが好ましい。
【００２１】
目的とするＰＧ類を含む溶出液は、工程２の濃縮カラムに導入され、目的とするＰＧ類を含まない溶出液は廃棄されてよい。溶出液の濃縮カラムへの導入と廃棄への切り換えは、上記一次元ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにおける目的とするＰＧ類の溶出時間のパターンに従い一定時間毎にバルブ（図１におけるＶ）を切り換えることにより実施できる。すなわち、第一次ＬＣにおけるカラムから溶出された目的とするＰＧ類を含む溶出液は、例えば図１におけるバルブのバルブポジションがＡからＢに切換えられることにより、第一次ＬＣにおけるカラムから濃縮カラム（図１におけるＣ２）に導入され得る（図３）。第一次ＬＣにおけるカラムから溶出される目的とするＰＧ類を含まない溶出液は、例えば図１におけるバルブのバルブポジションがＡに切換えられることにより、廃棄される（図２）。廃棄される目的とするＰＧ類を含まない溶出液は目的とするＰＧ類以外の夾雑物を通常は含む。
【００２２】
工程２：
工程２において、使用される濃縮カラム（図１におけるＣ２）としては、Ｃ４−３０アルキル基導入シリカゲル充填カラム、フェニル基導入シリカゲル充填カラム［フェニルシリル化シリカゲル（Ｐｈ）カラム］又はω−フェニルＣ１−６直鎖アルキル基導入シリカゲル充填カラム（例えば、フェニルエチルシリル化シリカゲルカラム）等が好ましい。Ｃ４−３０アルキル基導入シリカゲル充填カラムとしては、上記第一次ＬＣにおけるＣ４−３０アルキル基導入シリカゲル充填カラムと同様のものが挙げられる。濃縮カラムは、目的とするＰＧ類を濃縮できればよく、第一次ＬＣにおけるカラムより細くてかつ短い（約１０〜２０ｍｍ）ものが好ましい。具体的には例えば、ＯＤＳ粒子が約５μｍのＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（φ１．０×１０ｍｍ）やＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８（φ１．０×１０ｍｍ）等が好ましく挙げられる。
【００２３】
本発明において濃縮カラムにおけるカラム温度としては、約５〜５０℃が挙げられ、好ましくは室温である。
【００２４】
目的とするＰＧ類はこの濃縮カラムにいったん保持され、目的とするＰＧ類以外の夾雑物は廃棄、除去されるので、工程２によって試料中の目的とするＰＧ類が濃縮されることになる。
【００２５】
工程１において分離された目的とするＰＧ類を含む溶出液は、濃縮カラムに導入され、目的とするＰＧ類は濃縮カラムに保持（吸着）される（図３）。この場合、濃縮カラム内で目的とするＰＧ類が保持（吸着）され得るように、例えば第一次ＬＣから溶出された溶出液の極性を上げることが好ましい。溶出液の極性を上げる方法としては、極性の高い溶液を前記溶出液に混合する方法が挙げられる。極性の高い溶液としては、水等が好ましく挙げられる。水としては、精製水、蒸留水又はＨＰＬＣ用水等が挙げられ、該水にはギ酸、酢酸、ギ酸アンモニウム又は酢酸アンモニウム等の揮発性物質が添加されてもよい。添加される揮発性物質の濃度は、例えば約１〜２０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。極性の高い溶液を前記溶出液に混合する方法としては、第一次ＬＣのカラムから溶出され濃縮カラムに至るラインの途中で、前記極性の高い溶液（移動相）が異なるポンプ（図１におけるＰ２）から送液され、送液ライン中で両溶液が混合されることが好ましい。
この工程においては、例えば図１におけるバルブのバルブポジションはＢに切換えられているので濃縮カラムから溶出された目的とするＰＧ類を含まない溶液は廃棄される（図３）。
【００２６】
工程３：
次いで、濃縮カラムに保持（吸着）された目的とするＰＧ類を含む溶液、すなわち濃縮された目的とするＰＧ類溶出液を第二次ＬＣに付して目的とするＰＧ類を分離する。複数の目的とするＰＧ類はそれぞれの種類の目的とするＰＧに単離される。本工程３において、第二次ＬＣにおいて使用されるカラム（図１におけるＣ３）としては、Ｃ４−３０アルキル基導入シリカゲル充填カラム、フェニル基導入シリカゲル充填カラム［フェニルシリル化シリカゲル（Ｐｈ）カラム］又はω−フェニルＣ１−６直鎖アルキル基導入シリカゲル充填カラム［例えば、フェニルエチルシリル化シリカゲルカラム（例えば、コスモシール  ＮＰＥカラム等）］が好ましい。Ｃ４−３０アルキル基導入シリカゲル充填カラムとしては、上記第一次ＬＣにおけるＣ４−３０アルキル基導入シリカゲル充填カラムと同様のものが挙げられる。カラムに充填される充填剤の粒子径は、約３μｍ以下が好ましい。第二次ＬＣにおいて使用されるカラムは、濃縮カラムに保持（吸着）された目的とするＰＧ類をさらに高性能に分離できるカラムが好ましく、第一次ＬＣにおけるカラムよりも約、１．５〜１０倍、好ましくは約３〜６倍長いものが好ましい。具体的には、例えば、ＯＤＳ粒子が約３μｍのＣａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８（φ１．０×２５０ｍｍ）等が好ましく挙げられる。
【００２７】
本発明において第二次ＬＣにおけるカラム温度としては、約５〜５０℃が挙げられ、好ましくは室温である。
【００２８】
濃縮カラムに保持（吸着）された目的とするＰＧ類の溶出は、第二次ＬＣに使用される展開溶媒を濃縮カラムに導入することにより実施し得る。展開溶媒としては、アセトニトリル／水系溶媒（アセトニトリルと水系溶媒の混合液）が好ましく挙げられる。水系溶媒としては、精製水、蒸留水又はＨＰＬＣ用水等が挙げられる。該水系溶媒には、ギ酸又は酢酸、ギ酸アンモニウム又は酢酸アンモニウム等の揮発性物質が添加されることが好ましい。揮発性物質の濃度は、例えば約０．１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは約０．５〜５ｍｍｏｌ／Ｌである。アセトニトリルと水系溶媒の比率は、約３０／７０％（Ｖ／Ｖ）〜約７０／３０％（Ｖ／Ｖ）が好ましい。
【００２９】
濃縮カラムへ導入する第一次ＬＣからの溶出液と第二次ＬＣに使用される展開溶媒との交換は、切り替えバルブ（図１におけるＶ）により行うことができる。具体的には、例えば図１におけるポンプ１（Ｐ１）及びポンプ２（Ｐ２）からの送液を、ポンプ３（Ｐ３）から送液される展開溶媒に切り換えることにより実施できる。該切り換えは、上記一次元ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにおける目的とするＰＧ類の溶出時間のパターンに従い一定時間毎にバルブ（図１におけるＶ）を切り換えることにより実施できる。例えば第一次ＬＣにおいて最初の目的とするＰＧが溶出を終えた時間から第２番目の目的とするＰＧが溶出するまでの時間は、上記したようにバルブのバルブポジションはＡに切り換えられている。このため、バルブポジションＡの状態でポンプ３から送液される展開溶媒が、濃縮カラムに導入され、濃縮カラムに保持（吸着）された目的とするＰＧ類を溶出して濃縮された目的とするＰＧ類を含む展開溶媒を第二次ＬＣにおけるカラム（図１におけるＣ３）に導入され得るようにポンプ３からの送液回路が設定されることが好ましい（図２）。
第二次ＬＣのカラムにおける展開溶媒の流速は、ＭＳ／ＭＳにおける検出感度を向上させるために、第一次ＬＣのカラムにおける溶出液の流速よりも遅く（例えば、約１／２〜１／５倍）することが好ましい。具体的には、第一次ＬＣのカラムにおける目的とするＰＧ類を含む溶出液の流速が例えば約２００μＬ／分である場合、第二次ＬＣのカラムにおける展開溶媒の流速は、約４０〜１００μＬ／分とするのが好ましい。
【００３０】
また、濃縮カラムに保持（吸着）された目的とするＰＧ類が濃縮カラムから溶出され第二次ＬＣのカラムに導入されている間、第一次ＬＣのカラムから次の目的とするＰＧ類が溶出しない様に第一次ＬＣのカラムに導入される溶出液の流速を低下させることが好ましい。この場合、バルブポジションはＡに切り換えられているので、第一次ＬＣからの溶出液は廃棄される（図２）。
【００３１】
濃縮カラムに保持（吸着）された目的とするＰＧ類が濃縮カラムから溶出され第二次ＬＣのカラムに導入された後に、バルブポジションはＢに切り換えられてよい。この場合、第二次ＬＣのカラムに導入される展開溶媒は、濃縮カラムを通らず図１におけるポンプ３（Ｐ３）から第二次ＬＣのカラムに直接導入されるように該導入経路が同時に切り換えられることが好ましい（図３）。このように切り換えを行うことにより、第二次ＬＣのカラムにおいて、目的とするＰＧ類の分離が中断されることなく行われ得る。濃縮カラムから溶出され第二次ＬＣのカラムに導入される溶出液は、好ましくは目的とするＰＧ類を含むが目的とするＰＧ類以外の夾雑物をほとんど含まない。
【００３２】
工程４：
【００３３】
第二次ＬＣにおいて分離された目的とするＰＧ類はＭＳ／ＭＳに導入され分析される。ＭＳ／ＭＳは、２台の直列に接続された質量分析計（タンデム質量分析計）で、衝突誘起解離を行い、構造情報をもったスペクトルを得る方法を含む。具体的には、第二次ＬＣにおいて夾雑物から分離され単離された目的とするＰＧ類はＭＳ／ＭＳのイオン化室に導入されイオン化される。第一段目の質量分析計（ＭＳ１）でプリカーサーイオンを選択し、ついでコリジョンセルと呼ばれる衝突室でターゲットガスと衝突させてプリカーサーイオンを解離（イオン化）させ新しいイオン群を発生させるのが好ましい。この新しいイオン群のうち最大のピークを示すイオンが通常プロダクトイオンとして選択され、第２段目の質量分析計（ＭＳ２）で分析される。ターゲットガスとしては、例えば、窒素ガス、アルゴンガス、キセノンガス等が挙げられる。プリカーサーイオンを解離（イオン化）させる方法としては、例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）又は大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）等が挙げられる。この中でもＥＳＩが好ましく、ＥＳＩターボイオンスプレー法がより好適に用いられる。生成したプロダクトイオンの検出方法としては、一般に、フルスキャン法、選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）法又はマルチリアクションモニタリング（ＭＲＭ）法等が挙げられるが、本発明においてはＭＲＭ法が好適に用いられる。このＭＲＭ法においては、例えば、目的とするＰＧ類がＰＧＥ2の場合、ＰＧＥ2のプリカーサーイオンとして、ｍ／ｚ３５１．０付近のイオンのみを選択し、次に、このイオンを窒素ガスやアルゴンガス等の不活性ガスに衝突させ分解させた際に生じるプロダクトイオンのうちｍ／ｚ２７１．０付近のイオンを選択してそのイオンの量をモニターすることにより、ＰＧＥ2を高感度で定量することができる。同様に例えばＰＧＦ2αのプリカーサーイオンとして、ｍ／ｚ３５３．０付近のイオンを選択し、且つプロダクトイオンとして、ｍ／ｚ１９３．０付近のイオンを選択し、１３，１４−ジヒドロ−１５−ケト−ＰＧＦ2αのプリカーサーイオンとして、ｍ／ｚ３５３．０付近のイオンを選択し、且つプロダクトイオンとして、ｍ／ｚ２７５．０付近のイオンを選択し、ＰＧＦ2α又は１３，１４−ジヒドロ−１５−ケト−ＰＧＦ2αが高感度に定量され得る。このとき、内部標準物質のｄ4−ＰＧＥ2のプリカーサーイオンとして、ｍ／ｚ３５５．０付近のイオンを選択し、且つプロダクトイオンとして、ｍ／ｚ２７５．０付近のイオンを選択し、ｄ4−ＰＧＦ2αのプリカーサーイオンとして、ｍ／ｚ３５７．０付近のイオンを選択し、且つプロダクトイオンとして、ｍ／ｚ１９７．０付近のイオンを選択するのがよい。
【００３４】
本発明において上記第４工程は好ましくは二次元ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムにより実施し得る。二次元ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムとしては、例えばＡＰＩ４０００を含むＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム（アプライドバイオシステム社製）、４０００  Ｑ  ＴＲＡＰを含むＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム（アプライドバイオシステム社製）、Ｑ  ＴＲＡＰを含むＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム（アプライドバイオシステム社製）、ＡＰＩ３０００を含むＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム（アプライドバイオシステム社製）、ＡＰＩ５０００を含むＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム（アプライドバイオシステム社製）、ＴＳＱ  ＱＵＡＮＴＵＭを含むＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム（サーモエレクトロン社製）又はＴＳＱ７０００を含むＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム（サーモエレクトロン社製）等が挙げられる。
【００３５】
ＰＧ類の濃度の算出手段としては、例えばＰＧ類の標準溶液を用いて作成した検量線を用いて行う手段が挙げられる。具体的には、検量線はＰＧ類の標準溶液に内標化合物を添加した溶液を用いて上記工程１〜４を実施して得られる測定値から作成され得る。
また、本工程において用いる検量線は、真度（ＲＥ）が±２０％以内であり、好ましくは±１５％以内であり、精度（ＣＶ）が±２０％以内であり、好ましくは±１５％以内であり、かつ相関係数が０．９９以上である検量線を用いるのが好ましい。内標化合物を用いた場合には、たとえば、ＰＧ類のピーク面積値と内標化合物のピーク面積値との比を求め、この比をグラフ上にプロットすることにより信頼性の高い検量線を作成することができる。上記真度は、測定値（定量値）の平均から添加濃度を減じた値を添加濃度で除することで算出される。上記精度は、測定値（定量値）の標準誤差を測定値（定量値）の平均で除することで算出される。上記相関係数は、例えば最小２乗法を用いて算出できる。
【００３６】
本発明の分析方法を用いれば、例えば、試料として血漿を用いる場合、約１ｍＬの血漿量で血漿中のＰＧ類の定量を行うことが可能となる
【００３７】
本発明に係る分析方法は、高感度でかつ特異的にＰＧ類を測定（定量）できるので、ＰＧ類の関連疾患の診断に利用しうる。ＰＧ類の関連疾患としては、例えばＰＧ類が受容体に作動して誘発される疾患等が挙げられる。ＰＧ類の受容体としては、例えばＰＧＥ2受容体サブタイプ（ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３、ＥＰ４）を含むＥＰ、ＰＧＦ2α受容体であるＦＰ、ＰＧＤ2受容体であるＤＰ又はＰＧＩ2受容体であるＩＰ等が挙げられる。
【００３８】
ＥＰ１介在性疾患としては、例えば疼痛、発熱、頻尿（神経因性膀胱、神経性膀胱、刺激膀胱、不安定膀胱、前立腺肥大に伴う頻尿等）、尿失禁又は下部尿路症等が挙げられる。
【００３９】
ＥＰ２介在性疾患としては、例えば免疫疾患（筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス等の自己免疫疾患、臓器移植後の拒絶反応等）、アレルギー性疾患（例えば、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー等）、神経細胞死、月経困難症、早産、流産、禿頭症、緑内障等の網膜神経障害、勃起不全、関節炎、肺傷害、肺線維症、肺気腫、気管支炎、慢性閉塞性呼吸器疾患、肝傷害、急性肝炎、肝硬変、ショック、腎炎（例えば、急性腎炎、慢性腎炎）、腎不全、循環器系疾患（例えば、高血圧、心筋虚血、慢性動脈閉塞症、振動病等）、全身性炎症反応症候群、敗血症、血球貪食症候群、マクロファージ活性化症候群、スチル（Still）病、川崎病、熱傷、全身性肉芽腫、潰瘍性大腸炎、クローン病、透析時の高サイトカイン血症、多臓器不全又は骨疾患（例えば、骨折、再骨折、難治性骨折、骨癒合不全、偽関節、骨軟化症、骨ページェット症、硬直性脊椎炎、癌骨転移、変形性関節症及びそれらの類似疾患における骨・軟骨の破壊等）等が挙げられる。
【００４０】
ＥＰ４介在性疾患としては、例えば免疫疾患［筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リューマチ、全身性エリテマトーデス等の自己免疫疾患、臓器移植後の拒絶反応、ＡＩＤＳ等］、喘息、神経細胞死、関節炎、変形性関節症、肺傷害、肺線維症、肺気腫、気管支炎、慢性閉塞性呼吸器疾患、肝傷害、急性肝炎、腎炎（例えば、急性腎炎、慢性腎炎）、腎不全、高血圧、心筋虚血、全身性炎症反応症候群、敗血症、血球貪食症候群、マクロファージ活性化症候群、スチル（Still）病、川崎病、熱傷、全身性肉芽腫、潰瘍性大腸炎、クローン病、透析時の高サイトカイン血症、多臓器不全、ショック、消化管潰瘍（例えば、胃潰瘍、十二指腸潰瘍等）、口内炎、禿頭症、脱毛症、骨疾患［例えば、原発性骨粗鬆症（例えば、加齢に伴う原発性骨粗鬆症、閉経に伴う原発性骨粗鬆症、卵巣摘出術に伴う原発性骨粗鬆症等）、二次性骨粗鬆症（例えば、グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症、甲状腺機能亢進性骨粗鬆症、固定誘発性骨粗鬆症、ヘパリン誘発性骨粗鬆症、免疫抑制誘発性骨粗鬆症、腎不全による骨粗鬆症、炎症性骨粗鬆症、クッシング症候群に伴う骨粗鬆症、リューマチ性骨粗鬆症等）、癌（例えば、癌形成、癌増殖、癌の臓器転移、癌骨転移、癌の骨転移に伴う高カルシウム血症等）、ページェット病、骨欠損（例えば、歯槽骨欠損、下顎骨欠損、小児期突発性骨欠損等）、関節リウマチ、骨形成異常等］、骨壊死、睡眠障害、血栓症（例えば、血小板凝集）、歯槽膿漏、歯肉炎、歯周病、慢性頭痛（例えば、片頭痛、緊張型頭痛又はそれらの混合型頭痛、又は群発性頭痛）、血管炎、静脈不全、静脈瘤、痔瘻、尿崩症、新生児動脈管開存症、胆石症又は緑内障等が挙げられる。
【００４１】
ＥＰ３介在性疾患としては、例えば疼痛（例えば、癌性、骨折時、手術後、抜歯後等）、アロディニア、ハイパーアルゲシア、掻痒、蕁麻疹、アトピ−性皮膚炎、接触性皮膚炎、ウルシ皮膚炎、アレルギー性結膜炎、透析時の種々の症状、喘息、鼻炎、アレルギー性鼻炎、鼻閉、くしゃみ、乾癬、頻尿（例えば、神経因性膀胱、神経性膀胱、刺激膀胱、不安定膀胱、前立腺肥大に伴う頻尿等）、排尿障害、射精障害、発熱、全身性炎症反応、学習障害、アルツハイマー、血管新生、ガン（例えば、ガン形成、ガン増殖、ガンの臓器転移、ガンの骨転移、ガンの骨転移に伴う高カルシウム血症等）、網膜症、赤斑、紅斑、白斑、皮膚のしみ、熱傷、火傷、ステロイド焼け、腎不全、腎症、急性腎炎、慢性腎炎、血液電解質異常、切迫早産、切迫流産、月経過多、月経困難症、子宮内膜症、月経前症候群、子宮腺筋症、生殖障害、ストレス、不安、鬱、心身症、精神障害、血栓症、塞栓症、一過性虚血発作、脳梗塞、アテローム、臓器移植、心筋梗塞、心不全、高血圧、動脈硬化、循環障害とこれに伴う潰瘍、神経障害、血管性痴呆、浮腫、下痢、便秘、胆汁排泄障害、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性大腸炎、ステロイド剤使用後のリバウンド現象の軽減又はステロイド剤の減量及び離脱の補助等が挙げられる。
【００４２】
ＤＰ介在性疾患としては、例えばアレルギー性疾患（例えば、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、食物アレルギー等）、全身性肥満細胞症、全身性肥満細胞活性化障害、アナフィラキシーショック、気道収縮、蕁麻疹、湿疹、にきび、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、副鼻腔炎、片頭痛、鼻茸、過敏性血管炎、好酸球増多症、接触性皮膚炎、痒みを伴う疾患（例えば、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、接触性皮膚炎等）、痒みに伴う行動（例えば、引っかき行動、殴打等）により二次的に発生する疾患（例えば、白内障、網膜剥離、炎症、感染、睡眠障害等）、炎症、慢性閉塞性肺疾患、虚血再灌流障害、脳血管障害、自己免疫疾患、脳外傷、肝障害、移植片拒絶、慢性関節リウマチ、胸膜炎、変形性関節症、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、間質性膀胱炎、筋ジストロフィー、多発性筋炎、多発性硬化症又は睡眠障害（例えば、ナルコレプシー等）等が挙げられる。
また、ＰＧ類の関連疾患としては、閉塞性血栓血管炎又は脊柱管狭窄症等も包含される。
【００４３】
本発明に係る分析方法は、高感度でかつ特異的にＰＧ類を測定（定量）できるので、ＰＧ類関連疾患の予防及び／又は治療薬の有効量決定に利用し得る。ＰＧ類関連疾患の予防及び／又は治療薬としては、上記したＰＧ類の受容体（例えば、ＥＰ、ＦＰ、ＤＰ、ＩＰ等）の作動薬又は拮抗薬等が挙げられる。また、前記の他、ＰＧ類の受容体の作動薬又は拮抗薬は、例えば骨の手術後の骨形成（例えば、骨折後の骨形成、骨移植後の骨形成、人工関節術後の骨形成、脊椎固定術後の骨形成、多発性骨髄腫、肺癌、乳癌等の外科手術後の骨形成、その他骨再建術後の骨形成等）の促進・治癒促進剤、骨移植代替療法、また、歯周疾患等における歯周組織の再生促進剤等、あるいは子宮頸管熟化（促進）剤等としても用いられ得る。
【００４４】
本発明に係る分析方法は、高感度でかつ特異的にＰＧ類を測定（定量）できるので、ＰＧ類及び／又はそれらの誘導体の体内動態を究明するために利用し得る。また、ＰＧ類及び／又はそれらの誘導体の体内動態を究明することにより、例えばＰＧ類を陣痛促進等に使用する場合において、過強陣痛や強直性子宮収縮等による胎児仮死、子宮破裂、頸管裂傷又は羊水栓塞等を事前に防止し得る。
【００４５】
以下に実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、以下の実施例において、比は容積比を示す。
【実施例１】
【００４６】
ＰＧ類の定量
１．標準物質
ＰＧ類の標準物質として、以下を使用した。
（１）ＰＧＥ2［純度１００％（分析方法：ＨＰＬＣ法）、Cayman Chemical社製］
【化２】
2007278750.tif 000003
【００４７】
（２）ＰＧＦ2α［純度９９．４％（分析方法：ＨＰＬＣ法）、Cayman Chemical社製］
【化３】
2007278750.tif 000004
【００４８】
（３）１３，１４−ジヒドロ−１５−ケト−ＰＧＦ2α［以下、Ｆ2α−Ｍと略記する；純度９８％（分析方法：ＴＬＣ法）、Cayman Chemical社製］
【化４】
2007278750.tif 000005
【００４９】
２．内標準物質
ＰＧ類の内標準物質として、以下を使用した。
（１）ｄ4−ＰＧＥ2［ＰＧＥ2測定用；純度９８．９％（分析方法：ＨＰＬＣ法）、Cayman Chemical社製］
【化５】
2007278750.tif 000006
【００５０】
（２）ｄ4−ＰＧＦ2a［ＰＧＦ2α及びＦ2α−Ｍ測定用；純度９９％（分析方法：ＴＬＣ法）、Cayman Chemical社製］
【化６】
2007278750.tif 000007
【００５１】
３．検量線の作成
以下の手順に従い、検量線を作成した。
（１）ＰＧ類混合標準溶液の調製：ＰＧＥ2及びＰＧＦ2α５ｍｇ以上をそれぞれ５０ｍＬの別のメスフラスコに精密に秤量し、エタノール／酢酸エチル混液（１：１）で溶解して正確に５０ｍＬとした。これらをエタノール／酢酸エチル混液（１：１）で希釈し、それぞれ２０μｇ／ｍＬの溶液を調製した。またＦ2α−Ｍ（１０ｍｇ／ｍＬ酢酸メチル溶液）２０μＬを、マイクロシリンジを用いて２０ｍＬのメスフラスコに分取し、窒素気流下溶媒を乾固した後、エタノール／酢酸エチル混液（１：１）で溶解して正確に２０ｍＬとした（１０μｇ／ｍＬ）。このＰＧＥ2、ＰＧＦ2α及びＦ2α−Ｍを２０ｍＬのメスフラスコにそれぞれ１ｍＬ、５ｍＬ及び１０ｍＬずつ採取した後、エタノール／酢酸エチル混液（１：１）を加えて正確に２０ｍＬにし、ＰＧＥ2：１μｇ／ｍＬ、ＰＧＦ2α及びＦ2α−Ｍ：５μｇ／ｍＬの濃度の調製液を調製した。この調製液を順次エタノール／酢酸エチル混液（１：１）で希釈して、ＰＧＥ2／（ＰＧＦ2α、Ｆ2α−Ｍ）が０．０５００ｎｇ／ｍＬ／０．２５０ｎｇ／ｍＬ、０．１００ｎｇ／ｍＬ／０．５００ｎｇ／ｍＬ、０．２００ｎｇ／ｍＬ／１．００ｎｇ／ｍＬ、０．５００ｎｇ／ｍＬ／２．５０ｎｇ／ｍＬ、１．００ｎｇ／ｍＬ／５．００ｎｇ／ｍＬ、２．００ｎｇ／ｍＬ／１０．０ｎｇ／ｍＬ、４．００ｎｇ／ｍＬ／２０．０ｎｇ／ｍＬ及び５．００ｎｇ／ｍＬ／２５．０ｎｇ／ｍＬであるＰＧ類混合標準溶液を調製した。
【００５２】
（２）内標準物質混合溶液（以下、内標準溶液と略記する）の調製：ｄ4−ＰＧＥ2（０．５ｍｇ／ｍＬ酢酸メチル溶液）及びｄ4−ＰＧＦ2α（０．５ｍｇ／ｍＬ酢酸メチル溶液）をマイクロシリンジで２０μＬずつ同じ２０ｍＬメスフラスコに分取し、窒素気流下溶媒を乾固した。これをエタノール／酢酸エチル混液（１：１）で溶解して正確に２０ｍＬとした後、エタノール／酢酸エチル混液（１：１）で希釈して、ｄ4−ＰＧＥ2及びｄ4−ＰＧＦ2αともに０．５００ｎｇ／ｍＬの内標準溶液を調製した。
【００５３】
（３）検量線用試料の調製：ガラス試験管に内標準溶液２０μＬ及びＰＧ類混合標準溶液１０μＬ（ＢＫＧ及びＩＳＤは除く）を添加し、溶媒を減圧下乾固した後、リン酸緩衝液１ｍＬを加え、検量線用試料［ＰＧＥ2／（ＰＧＦ2α、Ｆ2α−Ｍ）が０．５００ｐｇ／ｍＬ／２．５ｐｇ／ｍＬ、１．００ｐｇ／ｍＬ／５．００ｐｇ／ｍＬ、２．００ｐｇ／ｍＬ／１０．０ｐｇ／ｍＬ、５．００ｐｇ／ｍＬ／２５．０ｐｇ／ｍＬ、１０．０ｐｇ／ｍＬ／５０．０ｐｇ／ｍＬ、２０．０ｐｇ／ｍＬ／１００ｐｇ／ｍＬ、及び５０．０ｐｇ／ｍＬ／２５０ｐｇ／ｍＬ］を調製した。ブランクはリン酸緩衝液を用いた。
【００５４】
（４）前処理
検量線用試料は、以下に記載のように吸引マニホールド（Waters社製）を用いて前処理を行った。マニホールドの吸引は、マニホールド用ポンプ（ＡＰＮ−２１５ＭＶ−１−５０；Ｉｗａｋｉ社製）を用いて行った。
（i）まず、検量線用試料に水／酢酸混液（１００：１）２ｍＬを添加して攪拌溶解し、試料溶液を調製した。
（ii）Ｂｏｎｄ  Ｅｌｕｔ  ＬＲＣ−Ｃ１８（Varian社製；以下、固相カラム１という。）による固相抽出
固相カラム１を吸引マニホールドに設置し、酢酸エチル２ｍＬ、メタノール２ｍＬ、水／酢酸混液（１００：１）２ｍＬでコンディショニングした。上記（i）の検量線用試料を固相カラム１に負荷した。上記（i）の試料溶液が入っていたガラス試験管を水／酢酸混液（１００：１）２ｍＬで洗浄した。この洗浄液を固相カラム１に負荷し、検量線用試料を固相カラム１に保持（吸着）させた。固相カラム１を水２ｍＬで洗浄した。次いで固相カラム１をヘキサン２ｍＬで洗浄した。固相カラム１を吸引マニホールドから外した。
（iii）Ｂｏｎｄ  Ｅｌｕｔ  ＤＥＡ（Varian社製；以下、固相カラム２という。）による固相抽出
固相カラム２を吸引マニホールドに設置し、酢酸エチル２ｍＬでコンディショニングした。次いでアダプターを使って固相カラム２の上に上記（ii）の検量線用試料を保持（吸着）させた固相カラム１を装着した。次いで、酢酸エチル４ｍＬで固相カラム１に保持（吸着）させた検量線用試料を溶出させると同時に検量線用試料を含む溶出液を固相カラム２に負荷した。固相カラム１及びアダプターを取り外した後、固相カラム２を水／酢酸混液（１００：１）２ｍＬで洗浄し、検量線用試料に含まれる標準物質及び内標準物質を固相カラム２に保持（吸着）させた。固相カラム２を吸引マニホールドから外した。
（iv）ａｂｓｅｌｕｔ  ＮＥＸＵＳ（Varian社製；以下、固相カラム３という。）による固相抽出
固相カラム３を吸引マニホールドに設置し、酢酸エチル２ｍＬ、メタノール２ｍＬ、水／酢酸混液（１００：１）２ｍＬでコンディショニングした。アダプターを使って固相カラム３の上に上記（iii）で検量線用試料に含まれる標準物質及び内標準物質を保持（吸着）させた固相カラム２を装着し、（水／酢酸混液（１００：１））／メタノール混液（７：３）２ｍＬで２回溶出した。固相カラム２及びアダプターを取り外し、固相カラム３を約１５００ｇ（３０００ｒｐｍ）で１分間遠心した。酢酸エチル２ｍＬで２回溶出した。遠心エバポレーター（非加熱）で前記溶出液を乾固した。５ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウム、ｐＨ３．５／メタノール混液（３：２）１２５μＬを添加して前記乾固物を溶解した後、約５秒間攪拌し、約１５００ｇ（３０００ｒｐｍ）で１分間遠心した。その上清をＨＰＬＣ用試料とした。
【００５５】
（５）測定
前記（４）の前処理を施したＨＰＬＣ用試料１００μＬを二次元ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム〔ＡＰＩ４０００  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム（ＡＢ／ＭＤＳ  ＳＣＩＥＸ製）〕に注入し、ＨＰＬＣ用試料に含まれる標準物質及び内標準物質を測定した。二次元ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムは以下の測定条件で行った。
【００５６】
なお、下記ポンプ１及びポンプ３のグラジエント条件及びバルブポジションを決定するため、事前に上記ＨＰＬＣ用試料（ＰＧＥ2／（ＰＧＦ2α、Ｆ2α−Ｍ）：５０／２５０ｐｇ／ｍＬ）を一次元ＬＣ／ＭＳ／ＭＳに付した。すなわち、ＨＰＬＣ用試料を第一次ＬＣのカラム（Ｃ１）に付し、当該カラムからの溶出液を直接ＭＳ／ＭＳシステム（ＡＰＩ４０００、アプライドバイオシステム社製）に接続し、ＭＳ／ＭＳシステムにおいて検出されるＰＧＥ2、ＰＧＦ2α及びＦ2α−Ｍの保持時間を確認した。移動相Ａ（ポンプ１）の流速は２００μＬ／分と設定した。このときのＰＧＥ2の保持時間（ＰＧＥ2溶出開始からＦ2α−Ｍの溶出終了までの時間（以下、ＰＧＥ2／Ｆ2α−Ｍの保持時間という。）は１２．３分から３０．０分であった。得られたＰＧＥ2の保持時間、及びＰＧＥ2／Ｆ2α−Ｍの保持時間から、バルブポジションを下記条件に設定した。すなわち、ＰＧＥ2の保持時間、及びＰＧＥ2／Ｆ2α−Ｍの保持時間をバルブポジションＡとなるよう、それ以外の時間をバルブポジションＢとなるようにバルブ切換時間を設定した。また、ポンプ１及びポンプ３のグラジエント条件は下記条件に設定した。また、試験期間中は随時カラム１における、ＰＧＥ2、ＰＧＦ2α及びＦ2α−Ｍの保持時間を確認した。変動が認められた場合、ＬＣ条件のバルブ切替時間及びポンプ１のグラジエント条件を変更した。
【００５７】
測定条件：
本発明における二次元ＬＣ／ＭＳ／ＭＳは、例えばＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズ、Agilent Technologies製）とＭＳ／ＭＳシステム（ＡＰＩ４０００、アプライドバイオシステム社製）から構成され、その流路図を図１に示した。また、測定条件を以下に示した。
ＬＣ条件
移動相（溶出液）            
移動相Ａ（ポンプ１）：５ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウム、ｐＨ３．５
移動相Ｂ（ポンプ１）：メタノール
移動相Ｃ（ポンプ２）：１０ｍｍｏｌ／Ｌギ酸
移動相Ｄ（ポンプ３）：１ｍｍｏｌ／Ｌギ酸
移動相Ｅ（ポンプ３）：アセトニトリル
【００５８】
【表１】
2007278750.tif 000008
【００５９】
【表２】
2007278750.tif 000009
【００６０】
【表３】
2007278750.tif 000010
【００６１】
【表４】
2007278750.tif 000011
【００６２】
カラム温度
カラム１：４０℃
カラム２：室温
カラム３：室温
オートサンプラー温度               ４℃
注入量                             １００μＬ
分析時間                           ６０分
【００６３】
ＭＳ／ＭＳ条件
イオン化法：ターボイオンスプレー
検出モード：ＭＲＭ（Multiple reaction monitoring）
Polarity：Negative
【００６４】
【表５】
2007278750.tif 000012
【００６５】
（６）結果
検量線用試料を測定した。ＰＧＥ2、ＰＧＦ2α及びＦ2α−Ｍは、それぞれ異なるリテンションタイムで分離できた。各ＰＧＥ2、ＰＧＦ2α又はＦ2α−Ｍの濃度（Ｘ）とピーク面積比（Ｙ：ＰＧｓのピーク面積／ＩＳのピーク面積）から線形最小二乗法により直線回帰して傾きと切片及び相関係数（ｒ）を求めた。また、ＰＧＥ2については０．５００〜５０．０ｐｇ／ｍＬ、ＰＧＦ2α及びＦ2α−Ｍについては２．５０〜２５０ｐｇ／ｍＬの範囲で検量線を作成した（ｎ＝３；図４）。相関係数（ｒ）はいずれも０．９９００以上であった。
なお、前記ピーク面積値は二次元ＬＣ／ＭＳ／ＭＳに接続されたコンピュータ（Analyst、アプライドバイオシステム社製）によって自動的に算出される。
本結果から、本発明によれば、複数のＰＧ、例えばＰＧＥ2、ＰＧＦ2α及びＦ2α−Ｍを同時に定量的に測定できることが分かった。また、ＰＧ類の濃度は、５ｐｇ／ｍＬ以下の非常に低い濃度でも測定できることが分かった。
【実施例２】
【００６６】
ヒト血漿中ＰＧＥ2、ＰＧＦ2α及びＦ2α−Ｍの測定
（１）方法
ヒト生体試料（血液）はボランティアより採取した。ヒト血液は、前腕部皮静脈よりインドメタシン／ＥＤＴＡ混液を添加した注射筒を用いて採血した。インドメタシン／ＥＤＴＡ混液は、１５％ＥＤＴＡ・２Ｎａ／０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．６）と１８ｍｇ／ｍＬインドメタシン−エタノール溶液を２０：１の割合で混合した溶液を採血時に血液１０ｍＬに対して０．２ｍＬの割合で注射筒に添加した。
採血した血液を４℃、約１５００ｇ（３０００ｒｐｍ）で１０分間遠心分離して血漿を分離した。分離した血漿は、試験に供するまで超低温庫（設定温度−８０℃）にて保管した。
ガラス試験管に内標準溶液２０μＬを添加し溶媒を減圧下乾固した後、ヒト血漿１ｍＬを加えＨＰＬＣ用ヒト血漿試料とした。該試料を、上記実施例１における（４）前処理及び（５）測定に従い二次元ＬＣ／ＭＳ／ＭＳに付し、ヒト血漿中ＰＧＥ2、ＰＧＦ2α及びＦ2α−Ｍを測定した。対照として、ＨＰＬＣ用ヒト血漿試料を一次元ＬＣ／ＭＳ／ＭＳに付した。
（２）結果
ＨＰＬＣ用ヒト血漿試料を一次元ＬＣ／ＭＳ／ＭＳに付した結果を図５に、二次元ＬＣ／ＭＳ／ＭＳに付した結果を図６に示した。ヒト血漿を一次元ＬＣ／ＭＳ／ＭＳに付した場合、ＰＧＥ2、ＰＧＦ2α及びＦ2α−Ｍの検出はできなかった（図５）。一方、ヒト血漿を二次元ＬＣ／ＭＳ／ＭＳに付した場合、ＰＧＥ2、ＰＧＦ2α及びＦ2α−Ｍは、いずれも単一の成分として分離ができ（図６）、かつ実施例１で得られた検量線からそれぞれの濃度を算出することができた。実施例１の検量線から算出したヒト血漿中ＰＧＥ2、ＰＧＦ2α及びＦ2α−Ｍの濃度を表６に示す。
【表６】
2007278750.tif 000013
【実施例３】
【００６７】
ヒト血漿を用いた再現性試験
（１）試験方法
（１−１）同時再現性試験
ガラス試験管に内標準溶液２０μＬ及びＰＧ類混合標準溶液１０μＬを添加し、溶媒を減圧下乾固した後、ヒト血漿１ｍＬを加え、ヒト血漿再現性用試料［ＰＧＥ2／（ＰＧＦ2α、Ｆ2α−Ｍ）が１．００ｐｇ／ｍＬ／５．００ｐｇ／ｍＬ、５．００ｐｇ／ｍＬ／２５．０ｐｇ／ｍＬ、４０．０ｐｇ／ｍＬ／２００ｐｇ／ｍＬ］を調製した。各濃度ｎ＝５とした。ヒト血漿再現性用試料の調製にはすべて同一ロットのヒト血漿を用いた。ＰＧ類非添加血漿及び前記３濃度（各ｎ＝５）のヒト血漿再現性用試料の濃度測定を３日間実施し、測定日ごとに得られた測定値より各濃度におけるＲＥ及びＣＶを求め同時再現性を検討した。以下の判定基準を３日間ともに満たした時、同時再現性があると判定した。
なお、理論値はヒト血漿（ブランク）の測定値の平均値に添加濃度を加えたものとし、ヒト血漿（ブランク）については真度を算出しない。
＜判定基準＞
ＲＥが±１５．０％以内かつＣＶが１５．０％以内であること。
【００６８】
（１−１）日間再現性試験
上再現性記同時で得られた測定値（各濃度ｎ＝１５）より各濃度におけるＲＥ及びＣＶを求め、日間再現性を検討した。以下の判定基準を満たした時、日間再現性があると判定した。
なお、理論値はヒト血漿（ブランク）の測定値の平均値に添加濃度を加えたものとし、ヒト血漿（ブランク）については真度を算出しない。
＜判定基準＞
ＲＥが±１５．０％以内かつＣＶが１５．０％以内であること。
【００６９】
（２）結果
（２−１）同時再現性
各濃度におけるＰＧＥ2、ＰＧＦ2α及びＦ2α−Ｍは、いずれも同時再現性の判定基準を満たした。
（２−１）日間再現性
各濃度におけるＰＧＥ2、ＰＧＦ2α及びＦ2α−Ｍは、いずれも日間再現性の判定基準を満たした。
【実施例４】
【００７０】
特異性の検討
（１）試験方法
ＰＧＥ2、ＰＧＦ2α及びＦ2α−Ｍと分子量が近似した表７のＰＧ類について、エタノール／酢酸エチル混液（１：１）を用いてそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬの溶液を調製した。各溶液１００μＬずつを1本のガラス試験管に分注し、窒素気流下溶媒を乾固した。これに５ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウム（ｐＨ３．５）／メタノール溶液（３：２）１．２５ｍＬを加えて再溶解した後、１００μＬを前述の二次元ＬＣ／ＭＳ／ＭＳに注入し、ＰＧＥ2、ＰＧＦ2α又はＦ2α−Ｍの保持時間にピークが認められるかどうか検討した。
【表７】
2007278750.tif 000014
【００７１】
（２）試験方法
ＰＧＥ2、ＰＧＦ2α又はＦ2α−Ｍの保持時間にピークは認められなかった。すなわち、本測定方法は構造の類似したＰＧ類を効果的に分離できる極めて特異性を有することが示された。
【実施例５】
【００７２】
ヒト血漿中ＰＧＥ2、ＰＧＦ2α及びＦ2α−Ｍ以外のＰＧ類の測定
実施例３と同様の方法で、ＰＧＤ2、８−イソＰＧＦ2α、１３，１４−ジヒドロ−１５−ケト−ＰＧＥ2、８−イソ−１３，１４−ジヒドロ１５−ケト−ＰＧＦ2α、ＰＧＥ1及び８−イソＰＧＥ1を測定した。３個体の測定結果を表８に示す。ＰＧＤ2、８−イソＰＧＦ2α、１３，１４−ジヒドロ−１５−ケト−ＰＧＥ2及び８−イソ−１３，１４−ジヒドロ１５−ケト−ＰＧＦ2αは、いずれも単一の成分として分離ができ、かつ各々の濃度を算出することができた。ＰＧＥ1及び８−イソＰＧＥ1は、いずれの個体も血漿中濃度は０．５ｐｇ／ｍＬ以下、及び１ｐｇ／ｍＬ以下であった。
【表８】
2007278750.tif 000015
【００７３】
以上の結果から、本発明の方法に従えば、ヒト血漿中のＰＧ類の測定、なかんずく複数のＰＧ類を同時に分離定量することができることが分かった。このことは、いままで不可能であったヒト血漿中のＰＧ類のバイオマーカーを決定することを可能にさせるものであり、さらに、いままで不可能であったＰＧ類の薬物動態測定を可能とするものである。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明は、ＰＧ類を同時に測定（定量）できるので、ＰＧ類の投与量の管理等に有用である。またＰＧ関連疾患に対する治療薬を開発する上でバイオマーカーとしてＰＧ濃度を定量することは有用である。例えばＰＧＥ2はＥＰ1受容体を介し疼痛を生じることが知られている。血液中並びに尿中のＰＧＥ2及びその代謝物濃度が高い患者ではＥＰ1拮抗剤の奏効率が高い可能性が考えられる。またＰＧＤ2は喘息に関与している。血液中並びに尿中のＰＧＤ2又はその代謝物濃度が亢進している患者ではＤＰ拮抗剤が有効に働く可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は二次元ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（ＡＰＩ４０００）装置の概略図の例を示す。図中、ＡＳは、オートサンプラーを、Ｐ１はポンプ１を、Ｐ２はポンプ２を、Ｐ３はポンプ３を示し、Ｖはバルブを示し、Ｃ１は第一次ＬＣにおけるカラムを、Ｃ２は濃縮カラムを、Ｃ３は第二次ＬＣにおけるカラムを示す。
【図２】図２は二次元ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（ＡＰＩ４０００）装置においてバルブポジションをＡに切り替えた時のバルブにおける溶出液の流れを示す例である。図中、矢印は溶出液の流れを示す。
【図３】図３は二次元ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（ＡＰＩ４０００）装置においてバルブポジションをＢに切り替えた時のバルブにおける溶出液の流れを示す例である。図中、矢印は溶出液の流れを示す。
【図４】図４はＰＧＥ2、ＰＧＦ2α及びＦ2α−Ｍの検量線の例を示す。（実施例１）
【図５】図５はヒト血漿を一次元ＬＣ／ＭＳ／ＭＳに付した結果を示す。
【図６】図６はヒト血漿を二次元ＬＣ／ＭＳ／ＭＳに付した結果を示す。
【図１】
2007278750.tif 000016
【図２】
2007278750.tif 000017
【図３】
2007278750.tif 000018
【図４】
2007278750.tif 000019
【図５】
2007278750.tif 000020
【図６】
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