(57)【要約】【課題】直流電界印加のみでＤＮＡ等の捕捉が可能であり、かつ伸張した状態でＤＮＡ等を固定することができるナノギャップアレイ及びそれを用いた生体高分子の診断方法を提供する。【解決手段】ナノギャップアレイ１０は、基板２と基板２に形成される流路１とこの流路の両端に配置されるマイクロ流路とを備え、流路１は二次元に配列される複数の障壁の間に設けると共に、複数の微細ギャップを有し、微細ギャップの幅がｎｍオーダーの寸法を有する。流路１の両端に電圧を印加し、流路内に遺伝子を含む生体高分子試料１４を流入し、遺伝子を含む生体高分子試料１４を伸張した状態で流路１内に固定し、流路１内にプローブ生体高分子を流入させることにより遺伝子を含む生体高分子試料を診断する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と基板に形成される流路と該流路の両端に配置されるマイクロ流路とを備え、
上記流路が、二次元に配列される複数の障壁の間に設けられると共に、複数の微細ギャップを有し、該微細ギャップの幅がｎｍオーダーの寸法を有することを特徴とする、ナノギャップアレイ。
【請求項２】
前記流路の一端には、複数のマイクロ流路が配置されていることを特徴とする、請求項１に記載のナノギャップアレイ。
【請求項３】
前記流路の両端には、電極が配置されていることを特徴とする、請求項１に記載のナノギャップアレイ。
【請求項４】
前記微細ギャップは、ナノギャップアレイ中に生体高分子を伸張した状態で固定する形状及び寸法を有することを特徴とする、請求項１に記載のナノギャップアレイ。
【請求項５】
基板と基板に形成される流路と該流路の両端に配置されるマイクロ流路とを備え、
上記流路が、二次元に配列される複数の障壁の間に設けられると共に、複数の微細ギャップを有し、該微細ギャップの幅がｎｍオーダーの寸法を有する、ナノギャップアレイを用いた生体高分子の診断方法であって、
上記流路の両端に電圧を印加し、
上記流路内に、遺伝子を含む生体高分子試料を流入し、
該遺伝子を含む生体高分子試料を伸張した状態で上記流路内に固定し、
上記流路内にプローブ生体高分子を流入させることにより上記遺伝子を含む生体高分子試料を診断することを特徴とする、ナノギャップアレイを用いた生体高分子の診断方法。
【請求項６】
前記プローブ生体高分子を、前記遺伝子を含む生体高分子試料とハイブリダイゼーションさせ、該生体高分子を診断することを特徴とする、請求項５に記載のナノギャップアレイを用いた生体高分子の診断方法。
【請求項７】
前記流路内に伸張固定させた生体高分子に特定の生体プローブを結合させることで、特定の生体高分子を検出することを特徴とする、請求項５に記載のナノギャップアレイを用いた生体高分子の診断方法。
【請求項８】
前記遺伝子が感染症ウイルスに由来した遺伝子であることを特徴とする、請求項５又は６に記載のナノギャップアレイを用いた生体高分子の診断方法。
【請求項９】
前記微細ギャップは、ナノギャップアレイ中に生体高分子を伸張した状態で固定する形状及び寸法を有することを特徴とする、請求項５に記載のナノギャップアレイを用いた生体高分子の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノギャップアレイ及びそれを用いた生体高分子の診断方法に関する。特に、本発明のナノギャップアレイを用いた生体高分子の診断方法は、末梢血などの血液試料等から抽出された生体高分子を、ナノギャップアレイ中の超微細流路に伸張固定し、そこに生体プローブを導入することによってその場で高速に診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高村らは、直列のテーパ状流路に水圧を印加すると共に、この水圧による圧力差流と逆方向に流れる向きに電界を印加すると、最小幅から最大幅の境界にＤＮＡが効率的に捕捉されることを見出した（特許文献１及び非特許文献1参照）。他の方法として、非特許文献２には、局所的に狭められたマイクロ流路にＡＣ電界を用いてＤＮＡを捕捉する手法が報告されている。
【０００３】
非特許文献３には、鷲津らにより、電気泳動の方向を連続的に変化させることでＤＮＡをマイクロサイズの柱の間に伸張固定させることが報告されている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−２１７号公報
【非特許文献１】Y. Takamura 他, Proc. of micro TAS, pp.1183-1186, California, USA, 2003
【非特許文献２】C. F. Chou 他, Proc. of micro TAS, pp.25-27, Nara, Japan, 2002
【非特許文献３】M. Washizu 他, Journal of Electrostatics, Vol.57, pp.395-405, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の特許文献１、非特許文献１及び２による方法では、マイクロ流路内に捕捉されたＤＮＡが凝集した状態であり、診断を行なうためには捕捉した場所から被測定生体高分子であるＤＮＡ等を取り出す必要がある。その場でのプローブＤＮＡを用いたハイブリダイゼーション検出や制限酵素によるダイジェストなどの取り扱いを行なうためには、被測定生体高分子であるＤＮＡを伸張させる工程が必要となるという課題があった。
【０００６】
上記非特許文献３の方法では装置の構造が複雑になり、デバイスの集積化が困難であるという課題があった。
【０００７】
本発明は上記課題に鑑み、最小幅をナノサイズ化したテーパ状流路等により直流（ＤＣ）電界印加のみでＤＮＡ等の捕捉が可能であり、かつ伸張した状態でＤＮＡ等を固定し、しかも、その場に生体プローブを流し込むことにより高速で遺伝子診断を実現できる、ナノギャップアレイ及びそれを用いた生体高分子の診断方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、所謂遺伝子診断に用いられるマイクロチップアレイのテーパ状流路を鋭意研究し、テーパ状流路において最小幅をナノサイズ化するとＤＣ電界印加のみでＤＮＡ等の生体高分子の捕捉が可能で、かつ、伸張した状態でＤＮＡ等を固定できることを見出した。さらに、プローブＤＮＡをその場に流し込むことにより捕捉したＤＮＡとハイブリダイゼーションすることを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明のナノギャップアレイは、基板と基板に形成される流路とこの流路の両端に配置されるマイクロ流路とを備え、流路が、二次元に配列される複数の障壁の間に設けられると共に、複数の微細ギャップを有し、微細ギャップの幅がｎｍオーダーの寸法を有することを特徴とする。
上記構成において、流路の一端には、好ましくは、複数のマイクロ流路が配置されている。流路の両端には電極が配置される。微細ギャップは、好ましくは、ナノギャップアレイ中に生体高分子を伸張した状態で固定する形状及び寸法を有する。
上記構成によれば、微細ギャップの幅がｎｍオーダーのナノギャップアレイを得ることができる。このナノギャップアレイは簡単な構造とすることができ、複雑な設備を導入することなく生体高分子、例えばＤＮＡを伸張固定することができる。
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明のナノギャップアレイを用いた生体高分子の診断方法は、基板と基板に形成される流路とこの流路の両端に配置されるマイクロ流路と、を備え、流路が、二次元に配列される複数の障壁の間に設けられると共に、複数の微細ギャップを有し、微細ギャップの幅がｎｍオーダーの寸法を有する生体高分子の診断方法であって、流路の両端に電圧を印加し、流路内に、遺伝子を含む生体高分子試料を流入し、遺伝子を含む生体高分子試料を伸張した状態で流路内に固定し、流路内にプローブ生体高分子を流入させることにより遺伝子を含む生体高分子試料を診断することを特徴とする。
上記構成において、プローブ生体高分子を、好ましくは遺伝子を含む生体高分子試料とハイブリダイゼーションさせ、生体高分子を診断する。流路内に伸張固定させた生体高分子に特定の生体プローブを結合させることで、特定の生体高分子を検出するようにすれば好ましい。遺伝子は感染症ウイルスに由来した遺伝子である。微細ギャップを、ナノギャップアレイ中に生体高分子を伸張した状態で固定する形状及び寸法を有するようにすれば好ましい。
上記構成によれば、ナノギャップアレイにより、簡単な構造で、複雑な設備を導入することなく生体高分子、例えばＤＮＡを伸張固定することができ、生体プローブ、例えば、蛍光修飾したプローブＤＮＡをその場に導入することによって生体高分子の診断を高速で行なうことができる。したがって、生体高分子に含まれる遺伝子を、安価に、しかも、高速で診断することができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ナノギャップアレイを用い、複雑な設備を導入することなく生体高分子、例えばＤＮＡを伸張固定することができる。しかも、生体プローブ、例えば蛍光修飾したプローブＤＮＡを、その場に導入することによって高速の遺伝子診断ができる。その結果、例えば、感染症の診断において従来大規模な化学検査装置が必要であったものに対して、高速で簡便な診断法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、図面に基づいて本発明の実施の形態を詳細に説明する。
最初に、本発明のナノギャップアレイについて説明する。
図１は本発明のナノギャップアレイの構造を模式的に示すもので、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＸ−Ｘ方向に沿う断面図、（ｃ）は流路の拡大平面図である。
図１（ａ）に示すように、本発明のナノギャップアレイ１０は、流路１が形成される基板２とこの基板２に対向して下側に設けた基板５とで構成されている。基板５には流路１は形成されず、流路１内に充填される生体高分子を含む溶液が漏れないように、基板２に密着して固定されている。
図１（ｂ）に示すように、基板２には、基板５と対向する面側に、何れも深さｄの流路１及びこの流路１の両端１ａ、１ｂに連接して配設されるマイクロ流路１ｃ，１ｄが形成されている。これらのマイクロ流路１ｃ，１ｄには、基板２を裏面まで貫通した貫通孔２ａ，２ｂが形成され、これらの貫通孔２ａ，２ｂ及びマイクロ流路１ｃ，１ｄを通して、流路１へ生体高分子を含む溶液の出し入れをすることができる。この溶液の電気泳動を行なう場合には、この貫通孔２ａ，２ｂに電極３，４を設ければよい。
【００１３】
図１（ｃ）は、流路１を示す平面図であり、この場合には、略三角形の複数の障壁７が図において水平のＸ方向及び垂直のＹ方向に二次元配列して形成されている。この複数の障壁７の領域は、後述するが流路１を形成しない領域であり、他の領域８が流路となっている。したがって、流路１は、図において水平なＸ方向にテーパ形状が連続して、線状流路８ａとなっている。このテーパ形状の線状流路８ａが、複数、図示の場合には８ａ〜８ｎ、つまりｎ行が並列に配置されている。図示の場合、障壁となる三角形においては、テーパの一番狭い箇所であるＹ方向の辺の間口幅（Ｗｍｉｎ）、つまり、ギャップ８ｐをｎｍオーダーの寸法を有するように配置している。マイクロ流路１ｃ（１ｄ）から流入される生体高分子を含む溶液は、ギャップ８ｐにより狭く形成される複数の流路８ａ〜８ｎを通過する。本発明においては、ギャップ８ｐによりその幅がｎｍオーダーの寸法を有し、他の流路よりも狭く形成される流路を、微細ギャップ又はギャップ流路８ｐと呼ぶことにする。
【００１４】
ギャップ流路８ｐの形状や寸法には特に制限はないが、ギャップ流路８ｐの形状は、例えばテーパ形状とすることができる。テーパ形状以外に、複数の辺により構成される多角形でもよい。例えば、長方形、六角形、八角形等としても、楕円形に囲まれた流路としてもよい。これらの形状の二つ以上を組み合わせた形状でもよい。例えば、一部がテーパ形状であり、残りが方形に囲まれた流路１としてもよい。流路１の底は通常、平坦でよいが、凸面や凹面などの曲面とすることもできる。
【００１５】
ギャップ流路８ｐの形状や寸法は、ギャップ流路８ｐに固定されるべき生体高分子の種類、すなわち、生体高分子の形状や寸法等を考慮して、ナノギャップアレイ１０中に生体高分子が固定され、その場で診断できるように適宜決定される。生体高分子が伸張された状態で固定され、その場で診断できるようにするためには、例えば、ギャップ流路８ｐの開口幅（Ｗｍｉｎ）が、このギャップ流路８ｐに固定させようとしている生体高分子の慣性半径に対して、０．０２倍未満であることが適当である。
また、ギャップ流路８ｐの深さｄ（図１（ｂ）参照）は、ギャップ流路に固定させようとしている生体高分子の慣性半径に対して、０．０５倍以下であることが適当である。
【００１６】
ギャップ流路８ｐがテーパ形状の場合、その寸法は、例えば、最大開口幅（Ｗｍａｘ）を５〜１０μｍ程度とすることができる。例えば、慣性半径が約５μｍとなる１６０ｋｂｐｓ（ｂｐは塩基数）のＤＮＡを伸張固定する場合、ギャップ流路８ｐの最小開口幅（Ｗｍｉｎ）は、好ましくは、２０〜９０ｎｍ程度である。また、深さｄは、１００〜２００ｎｍとすることができる。ただし、ギャップ流路８ｐの寸法は、上述のように、ギャップ流路８ｐに伸張固定し、診断しようとする生体高分子の慣性半径とのギャップ流路８ｐの寸法に対する好適な比を考慮して適宜決定すればよい。
【００１７】
１つのナノギャップアレイ１０が有する流路８ａ〜８ｎの数（ｎ）は、特に制限はないが、生体高分子が全長約５０μｍのＤＮＡを最大開口幅（Ｗｍａｘ）５μｍ、長さ（ｌ）が５μｍのテーパ流路を配列する場合、縦（Ｌ１）５０〜１００μｍ、横（Ｌ２）１００〜３００μｍの範囲に、２００〜３０００個の範囲とすることができる。
また、上述のナノギャップアレイ１０を1セットとし、基板内に複数の流路１を形成し、その中にそれぞれ複数のセットのナノギャップアレイ１０を配置してもよい。
【００１８】
ナノギャップアレイ１０の材料は、例えば、石英、シリコン、ガラス、ポリマーの基板を加工したもの、あるいはそれらに堆積した絶縁体の単層膜や多層膜、もしくはそれらを複数組み合わせたものなどを挙げることができる。
【００１９】
次に、被測定物である生体高分子試料とプローブ高分子とを同時に導入できるナノギャップアレイについて説明する。
図２は、本発明の生体高分子試料とプローブ高分子とを同時に導入できるナノギャップアレイ２０の構造を模式的に示すもので、（ａ）は部分平面図、（ｂ）は（ａ）の部分拡大平面図である。
図２（ａ）に示すナノギャップアレイ２０が図１に示したナノギャップアレイ１０と異なるのは、プローブ高分子を導入するためのマイクロ流路１ｅと、このマイクロ流路１ｅと流路１との間に挿入される障壁９を設けた点である。図２（ｂ）に示すように、マイクロ流路１ｄからは生体高分子を含む溶液１４が導入され、マイクロ流路１ｅからは障壁９を介して、プローブ高分子を含む溶液１５が導入される。この場合には、流路１には、マイクロ流路１ｄから生体高分子を含む溶液１４が導入され、マイクロ流路１ｅからは障壁９を介して、プローブ高分子を含む溶液１５が導入される。
上記ナノギャップアレイ２０によれば、生体高分子を含む溶液１４及びプローブ高分子を含む溶液１５を、流路１に同時に導入することができるので、被測定物である生体高分子の診断を高速に行なうことができる。
【００２０】
以上説明したように、本発明のナノギャップアレイ１０，２０によれば、基板２，５の間に流路１を有し、かつ流路１内に複数のナノメータサイズのギャップ流路８ｐを有しており、後述するように、複数のギャップ流路８ｐの間に生体高分子、例えばＤＮＡを伸張した状態で固定することができる。このため、ギャップ流路８ｐは、生体高分子が入り込む際に、伸張する程度のサイズで、かつ、生体高分子が固定される形状を有している。
【００２１】
次に、本発明のナノギャップアレイ１０の製造方法について説明する。
最初に、ガラスなどから基板２をマスク材で被覆し、このマスク材を公知のリソグラフィ法により、流路１及びマイクロ流路１ｃ，１ｄとなる領域だけを開口する。リソグラフィ法において、露光は電子ビーム露光、紫外線露光等を使用することができ、例えば、ｎｍオーダーのギャップ流路８ｐを含む流路１のパターンを電子ビーム露光で形成し、マイクロ流路１ｃ，１ｄのパターンを、紫外線露光で形成する。
次に、基板２の流路１及びマイクロ流路１ｃ，１ｄとなる領域だけを流路１の所定の深さｄとなるように、上記マスクを用いて選択エッチングを行ない、流路１及びマイクロ流路１ｃ，１ｄとなる領域を基板２の表面に凹状に形成する。さらに、基板２のマイクロ流路１ｃ，１ｄとなる領域に基板の裏面迄貫通する貫通孔２ａ，２ｄを形成する。
最後に、上記基板２の流路を形成した面を基板５に貼り合わせることでナノギャップアレイ１０を製造することができる。本発明のナノギャップアレイ２０についても、同様にして製造することができる。このように、本発明のナノギャップアレイ１０，２０は、半導体作製工程技術である電子線リソグラフィ技術、フォトリソグラフィ技術、ドライエッチング技術を利用して作製することができる。
【００２２】
次に、本発明のナノギャップアレイ１０を用いた生体高分子の診断方法について説明する。
図３は、本発明のナノギャップアレイ１０を用いた生体高分子の診断方法を模式的に示す断面図である。図３に示すように、石英基板２中に形成された流路１中に、生体高分子１４ａを含む溶液１４を導入し、白金電極３，４を差し込んで電圧を印加することによって生体高分子１４ａを電気泳動させ、図示しないギャップ流路中に生体高分子１４ａを伸張固定することができる。例えば、ＤＮＡの場合は負の電荷を有するため、マイナス側の電極４からプラス側の電極３に向かって電気泳動する。
次に、必要に応じて、生体プローブ、例えば、蛍光修飾したＤＮＡを含む溶液などを導入してハイブリダイゼーションさせることにより、生体高分子の診断を行なうことができる。
【００２３】
最初に、ナノギャップアレイ内にターゲットとなる生体高分子を伸張固定する方法について説明する。
図４は、ナノギャップアレイ内の生体高分子が伸張固定される２形態、（ａ）及び（ｂ）を模式的に説明する図である。図中の矢印（→）は生体高分子１４ａの電気泳動方向である。
図４（ａ）に示すように、その一形態は、生体高分子１４ａが流路１の線状流路８ａ内に伸張されたままの状態で滞留する。この場合、ＤＮＡなどの生体高分子１４ａは、溶液１４の通過方向（図４の矢印（→）方向参照）に行状に配列されたナノメータサイズのギャップ流路８ｐの間を伸張して通過しようとするが、ギャップ流路８ｐが所定の間隔で連続して配置されているため、流路壁に衝突することから受ける抵抗によりＤＮＡ１４ａは徐々に減速し、最終的に停止して線状流路８ａ内に伸張されたままの状態で滞留する。
二番目の形態は、図４（ｂ）に示すように、ＤＮＡ１４ａの両端が、異なる行の線状流路８ａ，８ｂに入り、伸びた状態でナノギャップアレイ１０に絡め取られる。
上記の形態以外には、ＤＮＡ１４ａを伸張固定した線状流路８ａを、次のＤＮＡ１４ａが通過、もしくは、重なって伸張固定される場合がある。さらに、適切な長さのプローブＤＮＡを選択することにより、ターゲットＤＮＡとハイブリダイゼーションする場合以外はプローブＤＮＡを通過させることが可能である。
【００２４】
上記生体プローブとしては、例えば、蛍光体あるいは放射性同位体などで標識したオリゴヌクレオチド，ＤＮＡ，ＲＮＡ，抗体，ペプチドなどが挙げられる。
例えば、感染症の診断を行なう場合、患者の血漿に含まれる感染症ウイルスのＤＮＡを抽出してナノギャップアレイ中で伸張固定し、各種の感染症ウイルスの固有なシークエンスに対応する、蛍光標識したプローブＤＮＡを作製して、これをナノギャップアレイ１０中に導入して診断を行なう。このプローブＤＮＡとしては、蛍光分子を結合したＤＮＡが挙げられる。このようなプローブＤＮＡとしては、例えば、株式会社ニッポンイージーティー製のカスタムメイドにより合成され、５’位に蛍光分子ＦＡＭを結合したオリゴヌクレオチドが挙げられる。感染症ウイルスとしては、ＨＩＶ，肝炎，インフルエンザ等が挙げられる。
【００２５】
本発明のナノギャップアレイを用いた生体高分子の診断方法によれば、生体の末梢血などの血液試料から抽出された生体高分子を、ナノギャップアレイ１０，２０中の超微細流路に伸張固定し、そこに生体プローブを導入することによってその場で高速に診断することができる。特に、生体高分子及び生体プローブを含む溶液を同時に導入できるナノギャップアレイ２０を用いた場合には、高速に診断することができる。
【実施例１】
【００２６】
以下、実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明する。
実施例1として、テーパ形状流路を用いたナノギャップアレイ１０を製作した。
図５（ａ）〜（ｋ）は、実施例１のナノギャップアレイ１０の製造方法を示す模式的な斜視図である。
最初に、図５（ａ）に示すように、石英基板２上に、膜厚約１００ｎｍのケイ化モリブデン薄膜３１をスパッタリング法によって堆積した。
次に、図５（ｂ）に示すように、ケイ化モリブデン薄膜３１の表面上に、ポジ型電子線レジスト３２（日本ゼオン（株）製、ＺＥＰ５２０Ａ等）を塗布し、図５（ｃ）に示すように、電子線描画などによって、ナノギャップアレイ１０の流路１の電子線レジストパターン３２ａを形成する。
次に、図５（ｄ）に示すように、塩素ガス及び酸素ガスなどを用いたプラズマドライエッチング技術などを用いて、ケイ化モリブデン３１が露出した部分を選択的にエッチングして、図５（ｅ）に示すように、レジスト剥離液などによって電子線レジスト３２を除去する。
続いて、図５（ｆ）に示すように、この表面上に、ポジ型フォトレジスト３３（東京応化工業（株）ＯＦＰＲ８００３ｄ等）を塗布し、図５（ｇ）に示すように、紫外線露光などによって、ナノギャップアレイ１０，２０に接続したマイクロ流路１ｃ，１ｄのフォトレジストパターン３３ａを形成した後、図５（ｈ）に示すように、塩素ガス及び酸素ガスなどを用いたプラズマドライエッチング技術などを用いてケイ化モリブデン３１が露出した部分を選択的にエッチングする。
次に、図５（ｉ）に示すように、レジスト剥離液などによってフォトレジスト３３ａを除去する。実施例では、フロンガスなどを用いたプラズマドライエッチング技術を用いて石英基板２が露出した部分を選択的にエッチングした。このエッチングにより流路１及びマイクロ流路１ｃ，１ｄが形成される。流路１の深さｄは１５０ｎｍとした。
次に、図５（ｊ）に示すように、塩素ガス及び酸素ガスなどを用いたプラズマドライエッチング技術を用いてケイ化モリブデン３１を除去する。
最後に、図５（ｋ）に示すように、石英基板２の裏面から、サンドブラスト法などを用いて、溶液導入用の貫通孔２ａ、２ｂを形成する。フッ酸溶液に浸した後に、プレス機を用いて石英基板２の表面に石英基板５を貼り付けることによって、実施例１のナノギャップアレイ１０を製造した。
【００２７】
図６は、実施例１の流路を形成した石英基板表面の走査型電子顕微鏡像を示すもので、それぞれ、（ａ）は流路１を、（ｂ）は（ａ）の拡大図を、（ｃ）はギャップ流路８ｐを示している。
図６（ａ）から明らかなように、流路１が幅約１００μｍのマイクロ流路の間に形成されている。各テーパ状の１本の流路８ａはテーパの広いところ（Ｗｍａｘ）が５μｍであり（図６（ｂ）参照）、ギャップ流路８ｐの幅（Ｗｍｉｎ）が５０ｎｍであることが分かった（図６（ｃ）参照）。
【００２８】
次に、実施例１で製造したナノギャップアレイ１０を用いた生体高分子の診断方法について説明する。
図３を用いて説明した方法で、1６６ｋｂｐｓで長さが約５０μｍのＤＮＡ（日本ジーン（株）製、Ｔ４ＤＮＡ）１４ａを、蛍光剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（株）製、ＹＯＹＯ−１）で修飾し、この蛍光修飾したＤＮＡ１４ａを含んだ溶液１４をナノギャップアレイ１０に導入した。ナノギャップアレイ１０は、複数のテーパ形状の線状流路８から成る流路１を用いてＤＮＡの診断を行なう場合、ＤＮＡ１４ａは、マイナス電極４からプラス電極３の方向に電気泳動し、テーパの開口幅が広い方から狭い方に流れる。
【００２９】
図７は、実施例１のナノギャップアレイ１０を用いたＤＮＡの電気泳動結果を示す蛍光顕微鏡像を示す図である。図７において、白い部分が、蛍光体が発光している領域、すなわち、ＤＮＡ１４ａである。図７から明らかなように、ナノギャップアレイ１０中の流路１には、Ｔ４ＤＮＡ１４ａが伸張固定されていることが分かる。
【００３０】
実施例１のナノギャップアレイ１０を用いた生体高分子の診断方法として、ＤＮＡを、プローブＤＮＡによる診断を行なった。プローブＤＮＡ（日本ジーン（株）製）は、Ｔ４ＤＮＡ１４ａの塩基配列のうち３０塩基を選択して設計され、蛍光修飾されている。プローブとはならないネガティブコントロールＤＮＡは、プローブＤＮＡと同様に蛍光修飾された３０塩基からなるＤＮＡであるが、塩基配列の一部がプローブＤＮＡとは異なる。上記のように、既にＴ４ＤＮＡ１４ａが伸張固定されているナノギャップアレイ１０に、プローブＤＮＡを含む溶液１５を流し、直流電圧２０Ｖで電気泳動させた。
図８は、プローブＤＮＡによる診断方法の測定結果を示す蛍光顕微鏡像を示すもので、それぞれ、（ａ）はプローブＤＮＡを用いた場合、（ｂ）はネガティブコントロールＤＮＡを用いた場合である。
図８（ａ）から明らかなように、プローブＤＮＡを電気泳動させた場合には、Ｔ４ＤＮＡ１４ａとプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションにより、ナノギャップアレイ１０中に強い蛍光が発現することが分かる。一方、図８（ｂ）から明らかなように、ネガティブコントロールＤＮＡを電気泳動させた場合には、蛍光が発現せず、Ｔ４ＤＮＡ１４ａとはハイブリダイゼーションしないことが判明した。
【実施例２】
【００３１】
実施例２として、生体高分子試料とプローブ高分子を同時に導入することができるナノギャップアレイ２０を、実施例１と同様にして製造した。この場合、実施例１のナノギャップアレイ１０と異なるのは、マイクロ流路１ｅ及び障壁９（図２参照）を形成するマスクパターンだけである。
図９は、実施例２のナノギャップアレイにおいて、流路１及び生体高分子試料とプローブ高分子を同時に導入するマイクロ流路１ｄ，１ｅの光学顕微鏡像を示す図である。
実施例２の場合には、実施例１で用いたＴ４ＤＮＡを含む溶液１４とプローブＤＮＡを含む溶液１５とを同時に、マイクロ流路１ｄ，１ｅからナノギャップアレイ２０に導入することで、Ｔ４ＤＮＡ１４ａを流路１に伸張固定させると共に、同時にプローブＤＮＡによる診断を行なうことができた。これにより、生体高分子試料とプローブ高分子を同時に導入することができるナノギャップアレイ２０の場合には、生体高分子の診断方法を高速化できることが分かった。
【実施例３】
【００３２】
長方形状の障壁パターンを用いた以外は、実施例１と同様にして実施例３のナノギャップアレイを製造した。
図１０は、実施例３の長方形障壁４１を有するナノギャップアレイ４０の流路の形状を模式的に示す部分平面図である。図１０に示すように、長方形の障壁４１の間にナノギャップを有する流路４２を形成することにより、テーパ形状よりも長いナノギャップ領域を設置する。これにより、ＤＮＡなどの生体高分子１４ａがナノギャップを有する流路４２間を通過する際の壁との接触により受ける抵抗が増し、伸張固定の効率を上げることができる。また、テーパ型と同様に、上記の生体高分子及びプローブ高分子の同時導入型との組み合わせも可能であった。
【実施例４】
【００３３】
ひし形状の障壁パターンを用いた以外は、実施例１と同様にして実施例４のナノギャップアレイを製造した。
図１１は、実施例４のひし形障壁ナノギャップアレイ４５における流路の形状を模式的に示す部分平面図である。図１１に示すように、複数のひし形障壁４６の間にナノギャップを有するギャップ流路４７を複数形成している。テーパ形状が左右両方に開いているため、例えば、ナノギャップアレイ４５の両側から生体高分子１４ａを導入して伸張固定することができる。これによって、電気泳動の向きを変えなくても、正の電荷を持つ生体高分子と、負の電荷を持つ生体高分子の両方を同時に伸張固定することが可能である。これは、上記テーパ形状でも可能だが、ギャップの配置を密にして、上記長方形障壁４１と同様に壁との接触頻度を上げ、伸張固定の効率を上げることができる。上記と同様に、生体高分子及びプローブ高分子の同時導入型との組み合わせも可能であった。
【実施例５】
【００３４】
ステップ型の障壁パターンを用いた以外は、実施例１と同様にして実施例５のナノギャップアレイを製造した。
図１２は、実施例５のステップ型ナノギャップアレイ５０における流路の形状を模式的に示す部分平面図である。図１２に示すように、ひし形障壁５１の間隔を変えて、ナノギャップが段階的に狭くなるギャップ流路５２〜５５を有しており、ターゲットとなる生体高分子１４ａに付着した不純物１４ｂを、広いギャップ流路５２，５３，５４で除去することができる。したがって、広いギャップ流路５２，５３，５４は不純物を捕獲する流路として作用する。図示するように、生体高分子１４ａは、ナノサイズの幅を有するギャップ流路５５において、伸張固定することができる。上記と同様に、生体高分子及びプローブ高分子の同時導入型との組み合わせも可能であった。
【実施例６】
【００３５】
円柱挿入型の障壁パターンを用いた以外は、実施例１と同様にして実施例６のナノギャップアレイを製造した。
図１３は、実施例６の円柱挿入型ナノギャップアレイ６０における流路の形状を模式的に示す部分平面図である。図１３に示すように、ひし形障壁６１の間に、円柱形障壁６２をナノメータ間隔で配列し、ナノサイズのギャップ流路６３を形成している。円柱形障壁６２のみのナノギャップアレイでは、例えばＤＮＡの場合、良く伸張するがそのままナノギャップアレイをすべて通過し、固定されない。このため、ナノギャップアレイ間に円柱形障壁６２を挿入することでターゲットとなる生体高分子１４ａの伸張固定の効率を上げることができる。上記と同様に、生体高分子及びプローブ高分子の同時導入型との組み合わせも可能であった。上記ステップ型ナノギャップアレイ５０と組み合わせる、もしくは円柱挿入型ナノギャップアレイ自体をステップ型にすることも可能である。また、円柱挿入型と同様にして、上記のナノギャップパターンを２種類、もしくは３種類以上混在させることも可能である。
【実施例７】
【００３６】
ターゲット閉じ込め型の障壁パターンを用いた以外は、実施例１と同様にして実施例７のナノギャップアレイを製造した。
図１４は、実施例７のターゲット閉じ込め型ナノギャップアレイ６５における流路の形状を模式的に示す部分平面図である。図１４に示すように、複数の細長い障壁６６をｎｍオーダーの間隔で並べ、ｎｍオーダーの幅を有するギャップ流路６７を複数形成する。生体高分子１４ａは、ギャップ流路６７に直線的に閉じ込めることができる。これにより、上述したように、異なるナノギャップを有する流路８ａ，８ｂにまたがって伸張固定されることが少なくなる。上記と同様に、生体高分子及びプローブ高分子の同時導入型との組み合わせも可能であった。また、上記ステップ型ナノギャップアレイ５０と組み合わせる、もしくは、ターゲット閉じ込め型ナノギャップアレイ６５自体をステップ型にすることも可能である。また、円柱挿入型ナノギャップアレイ６０と同様にして、上記のナノギャップパターンを２種類もしくは３種類以上混在させることも可能である。
【実施例８】
【００３７】
ターゲット閉じ込め型の曲線テーパを有する障壁パターンを用いた以外は、実施例１と同様にして実施例８のナノギャップアレイを製造した。
図１５は、実施例８のターゲット閉じ込め型曲線テーパナノギャップアレイ７０における流路の形状を模式的に示す部分平面図である。図１５に示すように、複数の細長い楕円の障壁７１をｎｍオーダーの間隔で並べ、曲線のテーパ形状を有し、その幅がｎｍオーダーのギャップ流路７２を複数形成する。生体高分子１４ａは、ギャップ流路７２に直線的に閉じ込めることができる。これにより、上述した、直線的な閉じ込め型ナノギャップアレイよりも、ギャップ内への生体高分子の導入が容易になる。上記と同様に、生体高分子及びプローブ高分子の同時導入型との組み合わせも可能であった。上記ステップ型ナノギャップアレイ５０と組み合わせるかもしくはターゲット閉じ込め型曲線テーパナノギャップアレイ７０自体をステップ型にすることも可能である。円柱挿入型と同様にして、上記のナノギャップパターンを２種類もしくは３種類以上混在させることも可能である。
【実施例９】
【００３８】
十字型の障壁パターンを用いた以外は、実施例１と同様にして実施例９のナノギャップアレイを製造した。
図１６は、実施例９の十字型障壁ナノギャップアレイ７５における流路の形状を模式的に示す部分平面図である。図１６に示すように、複数の十字型の障壁７６をｎｍオーダーの間隔で並べ、その幅がｎｍオーダーのギャップ流路７７を複数形成する。このギャップ流路７７間に、生体高分子１４ａを伸張固定する。ナノサイズのギャップ流路７７が対称的に縦横に配列されているため、生体高分子１４ａが折れ曲がって固定された場合でも、これを、上記の生体高分子及びプローブ高分子の同時導入型と組み合わせることにより、ハイブリダイゼーションの確率は、上記ナノギャップアレイ１０よりも高くすることができる。上記ステップ型ナノギャップアレイ５０と組み合わせる、もしくは、十字障壁型ナノギャップアレイ７５自体をステップ型にすることも可能である。また、円柱挿入型と同様にして、上記のナノギャップパターンを２種類もしくは３種類以上混在させることも可能である。
【実施例１０】
【００３９】
六角形の障壁パターンを用いた以外は、実施例１と同様にして実施例１０のナノギャップアレイを製造した。
図１７は、実施例１０の六角形障壁ナノギャップアレイ８０における流路の形状を模式的に示す部分平面図である。図１７に示すように、複数の六角形の障壁８１をｎｍオーダーの間隔で並べ、その幅がｎｍオーダーのギャップ流路８２を複数形成する。このギャップ流路８２の間に、生体高分子１４ａを伸張固定する。これにより、上述した、長方形障壁ナノギャップアレイ４０とひし形障壁のナノギャップアレイ４５の効果を同時に得ることができる。すなわち、テーパ形状によって導入し、かつ、長いナノギャップ領域により生体高分子をトラップできる。上記と同様に、生体高分子及びプローブ高分子の同時導入型との組み合わせも可能であった。上記ステップ型ナノギャップアレイ５０と組み合わせる、もしくは、六角形障壁ナノギャップアレイ８０自体をステップ型にすることも可能である。円柱挿入型のナノギャップアレイ６０と同様にして、上記のナノギャップパターンを２種類もしくは３種類以上混在させることも可能である。
【実施例１１】
【００４０】
八角形の障壁パターンを用いた以外は、実施例１と同様にして実施例１１のナノギャップアレイを製造した。
図１８は、実施例１１の八角形障壁ナノギャップアレイ８５における流路の形状を模式的に示す部分平面図である。図１８に示すように、複数の八角形の障壁８６をｎｍオーダーの間隔で並べ、その幅がｎｍオーダーのギャップ流路８７を複数形成する。このギャップ流路８７の間に、生体高分子１４ａを伸張固定する。これにより、上述した、六角形障壁ナノギャップアレイ８０と十字型障壁ナノギャップアレイ７５の効果を同時に得ることができる。すなわち、テーパ形状によって導入し、かつ、長いナノギャップ領域により生体高分子１４ａをトラップできる。さらに、生体高分子及びプローブ高分子の同時導入型を組み合わせることにより、ハイブリダイゼーションの確率を上げることができる。上記ステップ型ナノギャップアレイ５０と組み合わせる、もしくは、八角形障壁ナノギャップアレイ８５自体をステップ型にすることも可能である。円柱挿入型と同様にして、上記のナノギャップパターンを２種類もしくは３種類以上混在させることも可能である。
【実施例１２】
【００４１】
星形の障壁パターンを用いた以外は、実施例１と同様にして実施例１２のナノギャップアレイを製造した。
図１９は、実施例１２の星形障壁ナノギャップアレイ９０における流路の形状を模式的に示す部分平面図である。図１９に示すように、複数の星形の障壁９１をｎｍオーダーの間隔で並べ、その頂点同士の幅がｎｍオーダーのギャップ流路９２を複数形成する。このギャップ流路９２の間に、生体高分子１４ａを伸張固定する。これにより、上述したひし形障壁ナノギャップアレイ４５と十字型障壁ナノギャップアレイ７５の効果を同時に得ることができる。生体高分子の種類によっては、八角形障壁ナノギャップアレイ８５ではすぐにナノサイズのギャップ流路８７が詰まってしまう可能性が懸念されるが、テーパ形状型のように、ナノギャップ流路を鋭利な形状にすることにより避けることができる。さらに、上記の生体高分子及びプローブ高分子の同時導入型と組み合わせることにより、ハイブリダイゼーションの確率を上げることができる。上記ステップ型ナノギャップアレイ５０と組み合わせる、もしくは、星形障壁ナノギャップアレイ９０自体をステップ型にすることも可能である。円柱挿入型と同様にして、上記のナノギャップパターンを２種類もしくは３種類以上混在させることも可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明のナノギャップアレイ１０，２０，４０，４５，５０，６０，６５，７０，７５，８０，８５，９０では、感染症などを遺伝子レベルで迅速に診断できるＤＮＡチップとして、将来、医療器具としての需要が高まると考えられる。また、作製にはナノメータサイズの超微細加工技術を要するが、ナノインプリント技術などの普及により、ポリマー製の安価な使い捨てチップとすることが期待されるため、産業化も将来容易となる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明のナノギャップアレイの構造を模式的に示すもので、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＸ−Ｘ方向に沿う断面図、（ｃ）は流路の拡大平面図である。
【図２】本発明の生体高分子試料とプローブ高分子とを同時に導入できるナノギャップアレイの構造を模式的に示し、（ａ）は部分平面図、（ｂ）は（ａ）の部分拡大平面図である。
【図３】本発明のナノギャップアレイを用いた生体高分子の診断方法を模式的に示す断面図である。
【図４】ナノギャップアレイ内の生体高分子の伸張固定される２形態（ａ）及び（ｂ）、を模式的に説明する図である。
【図５】（ａ）〜（ｋ）は、実施例１のナノギャップアレイの製造方法を示す模式的な斜視図である。
【図６】実施例１の流路の形成した石英基板表面の走査型電子顕微鏡像を示し、（ａ）は流路、（ｂ）は（ａ）の拡大図、（ｃ）はギャップ流路を示す図である。
【図７】実施例１のナノギャップアレイを用いたＤＮＡの電気泳動結果を示す蛍光顕微鏡像を示す図である。
【図８】プローブＤＮＡによる診断方法の測定結果を示す蛍光顕微鏡像を示すもので、（ａ）はプローブＤＮＡを用いた場合、（ｂ）はネガティブコントロールＤＮＡを用いた場合である。
【図９】実施例２のナノギャップアレイにおいて、流路及び生体高分子試料とプローブ高分子を同時に導入するマイクロ流路の光学顕微鏡像を示す図である。
【図１０】実施例３の長方形障壁を有するナノギャップアレイの流路の形状を模式的に示す部分平面図である。
【図１１】実施例４のひし形障壁ナノギャップアレイにおける流路の形状を模式的に示す部分平面図である。
【図１２】実施例５のステップ型ナノギャップアレイにおける流路の形状を模式的に示す部分平面図である。
【図１３】実施例６の円柱挿入型ナノギャップアレイにおける流路の形状を模式的に示す部分平面図である。
【図１４】実施例７のターゲット閉じ込め型ナノギャップアレイにおける流路の形状を模式的に示す部分平面図である。
【図１５】実施例８のターゲット閉じ込め型曲線テーパナノギャップアレイにおける流路の形状を模式的に示す部分平面図である。
【図１６】実施例９の十字型障壁ナノギャップアレイにおける流路の形状を模式的に示す部分平面図である。
【図１７】実施例１０の六角形障壁ナノギャップアレイにおける流路の形状を模式的に示す部分平面図である。
【図１８】実施例１１の八角形障壁ナノギャップアレイにおける流路の形状を模式的に示す部分平面図である。
【図１９】実施例１２の星形障壁ナノギャップアレイにおける流路の形状を模式的に示す部分平面図である。
【符号の説明】
【００４４】
１：流路
１ａ，１ｂ：流路端
１ｃ，１ｄ，１ｅ：マイクロ流路
２：流路が形成される基板
２ａ，２ｂ：貫通孔
３，４；電極
５：基板
７，９：障壁
８：線状流路
８ｐ，４２，４７，５５，６７，６３，７２，７７，８２，８７，９２：ギャップ流路
１０，２０，４０，４５，５０，６０，６５，７０，７５，８０，８５，９０：ナノギャップアレイ
１４：生体高分子を含む溶液
１４ａ：生体高分子（ＤＮＡ）
１５：プローブ高分子を含む溶液
３１：ケイ化モリブデン薄膜
３２：ポジ型電子線レジスト
３３：ポジ型フォトレジスト
３３ａ：フォトレジストパターン
４１：長方形障壁
４６，６１：ひし形障壁
５２，５３，５４：不純物を捕獲する流路
６２：円柱形障壁
７１：細長い楕円の障壁
７６：十字型の障壁
８１：六角形の障壁
８６：八角形の障壁
９１：星形の障壁
【図２】
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【図１３】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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