(57)【要約】【課題】本発明は、複数色の発光酵素を含む検体中の各発光酵素による相対光量を同時に測定・算出する方法に関する。さらには、複数色の発光酵素を含むプレートフォーマットの検体の測定において、より精度よく測定を行う方法に関する。【解決手段】N色の発光酵素を含む検体の測定において、N枚の光学フィルターを利用して測定し、あらかじめ決定された各発光酵素に由来する発光の各フィルター透過率と各フィルター透過光測定値より、各発光酵素に由来する相対光量を算出する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
N色の発光酵素を含む検体の各発光酵素の活性評価において、N枚の光学フィルターを利用して測定し、あらかじめ決定された各発光酵素に由来する発光の各フィルター透過率と各フィルター透過光測定値より、各発光酵素に由来する相対光量を算出する方法。
【請求項２】
Nが3以上である請求項２に記載の方法。
【請求項３】
N色の発光酵素が、緑色発光酵素、橙色発光酵素、赤色発光酵素よりなる群から選択される、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項４】
N色の発光酵素が、イリオモテボタル、鉄道虫由来ルシフェラーゼ及びそれらの変異体よりなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項５】
各発光酵素に由来する相対光量を、行列式を利用して算出する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
プレートフォーマットの検体の測定において、下記の工程をプレート単位で行う、N色の発光酵素を含む検体の測定方法：
(1) 発光基質を各検体を含むウェルにインジェクトする工程、
(2) 各フィルターの透過光を測定する工程、
この際、上記インジェクト工程と、フィルター１枚当たりの透過光を測定する各測定工程の所要時間がほぼ同じ時間となるように調整されている。
【請求項７】
N色の発光酵素を含む検体の測定において、N枚の光学フィルターを利用して測定し、あらかじめ決定された各発光酵素に由来する発光の各フィルター透過率と各フィルター透過光測定値より、各発光酵素に由来する相対光量を算出する解析ソフト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数色の発光酵素を含む検体中の各発光酵素による相対光量を同時に測定・算出する方法に関する。さらに詳しくは、N色の発光酵素を含む検体中の各発光酵素による相対光量をN枚の光学フィルターを利用して測定し、算出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レホ゜ーター遺伝子を用いた遺伝子発現制御解析は、レホ゜ーター遺伝子に連結されたシス作用性塩基配列要素(フ゜ロモーター、エンハンサー、サイレンサーなどの遺伝子発現制御配列)を含むフ゜ラスミト゛を細胞に導入して、ある条件下において発現されるレホ゜ーター酵素の活性を指標に遺伝子発現制御を評価する手法である。これまで多くのレホ゜ーター酵素がこの評価に用いられてきたが、ホタルルシフェラーセ゛の発光を利用したシステムは感度が高く、活性測定が簡便なことから、現在広く用いられている。
【０００３】
しかしながら、レホ゜ーター活性をサンフ゜ル間で評価する際には、トランスフェクション効率、細胞数、生育状態、細胞死等、遺伝子発現制御とは関係しない、レホ゜ーター酵素の絶対量の変化をもたらす要因が存在する。このため、被験配列に連結されたレホ゜ーター遺伝子とあわせて、一定発現(コントロール)フ゜ロモーターに連結された基質特異性、あるいは反応性の異なるレホ゜ーター分子を内部標準として加え、サンフ゜ル間で標準化処理を行う必要がある。このように2つ以上の遺伝子発現を同時に測定するために、これまで種々の遺伝子、特にホタルルシフェラーゼと異なった基質特異性を示すウミシイタケルシフェラーゼ（Renilla luciferase）がクローニングされ用いられてきた。しかし、この方法では発光の機構が異なるため、複数の反応及び測定を行わなければならず煩雑であった。
【０００４】
一方、ホタルルシフェラーゼ遺伝子から発光色の異なる変異体を見つける研究（Contag C. et al, Red Shifted luciferase, United Sates Patent 6,495,355 (2002)）（特許文献１）や、発光色の異なる4種類のヒカリコメツキムシ由来ルシフェラーゼの単離(Wood K.V., Lam Y.A., Seliger H.H., and McElroy W.D. 1989, 244, 700-702:Complementary DNA Coding Click Beetles Lusiferases Can Elicit Bioluminescence of Different Colors) （非特許文献１）、2色の鉄道虫由来のルシフェラーゼの研究（Viviani V.R., Bechara E.J.H., Ohmiya Y. 1999, Biochemistry, 38, 8271-8279）（非特許文献２）、イリオモテボタル由来ルシフェラーゼの変異体の研究（Viviani V., Uchida A., Suenaga N., Ryufuku M., and Ohmiya Y. 2001, Biochem. Biophys. Res. Commun. 280, 1286-1291）（非特許文献３）などが進められてきた。これらのルシフェラーゼは同じ基質で異なった発光色を示すことで注目された。特に、ホタルルシフェラーゼ変異体はpHにより発光スペクトルが変動してしまうことから、多色測定においてはコメツキムシ、鉄道虫、イリオモテボタル由来ルシフェラーゼなどのようにpHに対して発光スペクトルが変動しないルシフェラーゼが好ましく、3色の発光ルシフェラーゼを用いたアッセイシステムが実用化されている（近江谷ら、マルチ遺伝子転写活性測定システム、WO 2004/099421）（特許文献２）。しかし、これらのルシフェラーゼの発光スペクトルは完全に分離したものではないため、精度よく複数の発光を分離・測定する技術の開発が望まれていた。
【特許文献１】米国特許6,495,355
【特許文献２】WO 2004/099421
【非特許文献１】Wood K.V., Lam Y.A., Seliger H.H., and McElroy W.D. 1989, 244, 700-702:Complementary DNA Coding Click Beetles Lusiferases Can Elicit Bioluminescence of Different Colors
【非特許文献２】Viviani V.R., Bechara E.J.H., Ohmiya Y. 1999, Biochemistry, 38, 8271-8279
【非特許文献３】Viviani V., Uchida A., Suenaga N., Ryufuku M., and Ohmiya Y. 2001, Biochem. Biophys. Res. Commun. 280, 1286-1291
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、複数色の発光酵素を含む検体中の各発光酵素による相対光量を測定する方法を提供する。さらには、複数色の発光酵素を含むフ゜レートフォーマットの検体の測定において、より精度よく測定を行う方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するため、秋山らは(N-1)枚の透過波長帯域の広いフィルターを利用する方法を開示している(秋山ら、複数の発光成分の発光量測定法およびその発光測定装置、特開2004-333457)。本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、複数(N)色の発光のうち、最短波長の発光及び最長波長の発光の発光スヘ゜クトルの重なりの少ない領域に着目し、N枚の光学フィルターを用いて分離測定する方法を見出し、本発明を完成するに到った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
項1. N色の発光酵素を含む検体の各発光酵素の活性評価において、N枚の光学フィルターを利用して測定し、あらかじめ決定された各発光酵素に由来する発光の各フィルター透過率と各フィルター透過光測定値より、各発光酵素に由来する相対光量を算出する方法。
項2. Nが3以上である項２に記載の方法。
項3. N色の発光酵素が、緑色発光酵素、橙色発光酵素、赤色発光酵素よりなる群から選択される、項１〜３に記載の方法。
項4. N色の発光酵素が、イリオモテボタル、鉄道虫由来ルシフェラーゼ及びそれらの変異体よりなる群より選択される、項４に記載の方法。
項5. 各発光酵素に由来する相対光量を、行列式を利用して算出する、項１に記載の方法。
項6.   プレートフォーマットの検体の測定において、下記の工程をプレート単位で行う、N色の発光酵素を含む検体の測定方法：
(1) 発光基質を各検体を含むウェルにインジェクトする工程、
(2) 各フィルターの透過光を測定する工程、
この際、上記インジェクト工程と、フィルター１枚当たりの透過光を測定する各測定工程の所要時間がほぼ同じ時間となるように調整されている。
プレートフォーマットの検体の測定において、下記の工程をプレート単位で行う、N色の発光酵素を含む検体の測定方法：
項7.N色の発光酵素を含む検体の測定において、N枚の光学フィルターを利用して測定し、あらかじめ決定された各発光酵素に由来する発光の各フィルター透過率と各フィルター透過光測定値より、各発光酵素に由来する相対光量を算出する解析ソフト。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法により、複数色の発光酵素を含む検体中の各発光酵素による相対光量を測定するため、複数の遺伝子の転写活性を同時にモニターするなど、複数のレポーターを用いた種々の生命現象の定量が可能となった。さらに、本発明の方法により複数色の発光酵素を含む検体をプレートフォーマットで解析が行えるため、様々な生命現象の指標となる複数のレポーター量の変動をハイスループットに解析することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下に本発明を詳細に説明する。
発光酵素を含む検体の測定には、微弱発光に適した光電子増倍管、CCDなどの検出器を含む測定機が用いられるが、これに限定されるものではない。本発明における光学フィルターとは透過する光を特定の波長帯域に制限するもので、検体と検出器の間に設置される。
【００１０】
まず、3色の発光酵素を含む検体の測定において、3色の発光酵素によって生成する発光成分Gr、Or、Reを3枚の光学フィルターを用いて同時に測定する方法を説明する。図1に3色の発光酵素によって生成する発光の発光スペクトル及び測定に用いる光学フィルターの光の透過帯域を模式的に示す。
【００１１】
検体の測定に先立ち、発光成分Grについて、フィルターを使用しない時に対する、フィルター1、2、3を使用したときの測定値から透過率T1g、T2g、T3gを決定する。同様に、発光成分Or、Reについても透過率T1o、T2o、T3o、T1r、T2r、T3rを決定する。3色の発光酵素を含む検体において、生成する発光成分Gr、Or、Reのシグナル値をG、O、R、フィルター1、2、3を用いて測定されるシグナル値をF1、F2、F3とする。各フィルター測定値は、各発光成分に対し当該フィルターを用いて計測される割合（透過率）を掛け合わせた和として表されることから、
F1 = T1g・G  + T1o・O + T1r・R 
F2 = T2g・G  + T2o・O + T2r・R
F3 = T3g・G  + T3o・O + T3r・R
の関係式が成り立つ。これを行列式で表すと数1となる。
【００１２】
【数１】
2007218774.tif 000002
【００１３】
この関係式より、測定値F1、F2、F3より各発光酵素によって生成するシグナル値G、O、Rは数2より算出される。
【００１４】
【数２】
2007218774.tif 000003
【００１５】
この方法は、2もしくは3色以上の発光酵素の検体の測定に応用できる。発光酵素がN色からなる場合、N枚のフィルターを用い、各フィルターの透過率をTij(i,j=1〜N)、フィルターjを用いたときの計測値Fi、各発光酵素により生成するシグナル値をLjとすると、次の関係式が得られる。
F1 = T11・L1 + T12・L2 + T13・L3 +  ・・・  + T1N・LN
F2 = T21・L1 + T22・L2 + T23・L3 +  ・・・  + T2N・LN
・・・
FN = TN1・L1 + TN2・L2 + TN3・L3 +  ・・・  + TNN・LN
この関係式から、各フィルター測定値と各発光酵素によるシグナル値の間には数3のように表される。
【００１６】
【数３】
2007218774.tif 000004
【００１７】
この関係式から、各フィルター測定値F1、F2、・・・、FNより、各発光酵素によって生成するシグナル値L1、L2、・・・、LNは数4より算出される。
【００１８】
【数４】
2007218774.tif 000005
【００１９】
本発明において用いられる光学フィルターはバンドパスフィルター、ロングパスフィルターいずれも使用可能であるが、透過波長帯域が著しく狭いカットフィルターでは光量が著しく低下することからルシフェラーゼ発光のような微弱発光を検出には向かない。バンドパスフィルターについても透過波長帯域が35 nm以上、より好ましくは50 nm以上であることが好ましい。
【００２０】
光学フィルターの透過波長帯域は、発光スペクトルが安定している発光酵素ではいずれの帯域と限定されるものではないが、少なくとも2枚のフィルターは、発光スペクトルの重なりの少ない最短発光スペクトルの短波長側、最長発光スペクトルの長波長側のものを使用することが好ましく、第3以上の発光成分の透過が出来る限り小さくなることが好ましいようである。
【００２１】
一方、市販される発光基質は測定に必要とされる時間の間、発光強度が一定になるように工夫されている。しかしながら、基質添加による発光開始時間から異なった時間ポイントで計測を行うと、サンプル間の相対強度にバラツキが含まれてしまうことが多い。そこで、多数の検体を測定する場合には、96ウェル、384ウェルなどのプレートを用いられるが、基質の自動分注機能を保持した測定機を用いることができる場合、発光基質を添加する工程の所要時間と1枚のフィルターを用いて測定する工程の所要時間をでき得る限り同じになるように調整して、サンプル毎に基質添加から計測までの測定ポイントを一定にすることが好ましい。
【００２２】
本発明では、上記インジェクト工程と、フィルター１枚当たりの透過光を測定する各測定工程の所要時間（基質分注時間と読取り時間）がほぼ同じ時間となるように調整されていることが好ましい。測定に使用する機器の仕様により多少の相違は生じるが、基質分注時間と読取り時間の差は、好ましくは１分以内、更に好ましくは３０秒以内を目安とする。    これにより、各ウェルが同じような時間経過で測定され、データのバラツキが低減される。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明の実施例を例示することによって、本発明の効果をより一層明確なものとする。
【００２４】
実施例1  緑色、橙色、赤色発光酵素のライセートの混合サンプルの測定(1)
CHO-K1細胞を90mmディッシュ3枚に播種し、10% FCSを含むHam's F12培地（日水製薬）中で培養した。翌日、pSLG-SV40 control（東洋紡績、緑色発光酵素）、pSLO-SV40 control（東洋紡績、橙色発光酵素）、pSLR-SV40 control（東洋紡績、赤色発光酵素）の各プラスミド5μgに、500μl Opti-MEM（GIBCO）で希釈された15μl GeneJuice（Novagen）を加え、CHO-K1細胞へトランスフェクションを実施した。翌日、培地を除去後、MultiReporter Assay System -TriplucR- Detection Reagents（東洋紡績）の3 ml Lysis Solutionを加え、各発光酵素を含む細胞ライセートを調製した。このライセートを様々な混合比で混合し、発光基質を加え、測定、算出が適切に行われるかを検証した。
【００２５】
測定にはプレートリーダー1420 ARVOMX（パーキンエルマー）に、バンドパスフィルター510/60、595/60、660/100をセッティングして行った。
【００２６】
まず、算出に必要な透過率を決定するために、それぞれのライセート25μlにMultiReporter Assay System -TriplucR- Detection Reagents（東洋紡績）の発光基質Assay Reagent 125μlを加え、各フィルターを用いて測定した。測定値を表1に示す。この測定値より透過率を算出した。その結果を表2に示す。
【００２７】
【表１】
2007218774.tif 000006
【００２８】
【表２】
2007218774.tif 000007
【００２９】
つづいて、各発光酵素のライセートを混合し、測定を実施した。測定値をMicrosoftR Excelに入力し、MINVERSE関数、MMULT関数を用いて数2の関係式より各発光酵素のシグナル値を算出した。結果を表３に示す。また、図2は、SLGについては12サンプルの算出シグナル強度平均値を100%として、SLO、SLRについてはそれぞれSLO(%)/(SLO+SLR)が100または0の時を100%として相対値化してプロットしたグラフである。
【００３０】
【表３】
2007218774.tif 000008
【００３１】
実施例2  測定パラメーターの最適化
96ウェルプレートに3色のライセートの混合液を25μlずつ分注し、MultiReporter Assay System -TriplucR- Detection Reagents（東洋紡績）の発光基質Assay Reagent 125μlを加え、プレートリーダー1420 ARVOMX（パーキンエルマー）を用いて測定した。測定値より各色発光シグナルを算出した。96ウェルプレートのcolumn A及びHのデータを図3に示す。この時、1420 ARVOMXのログを確認し96ウェルへの発光基質の分注に約5分20秒（Injection mode、aspVol=dispVol）、フィルター1枚あたり96ウェルの読取りに2分18秒（1ウェルあたりの測定時間、1sec）要した。
【００３２】
次に、プログラムを96ウェルへの発光基質の分注とフィルター1枚あたりの96ウェルの読取り所要時間をできるだけ揃えるようにプログラムを調整し、96ウェルプレートに3色のライセートの混合液を25μlずつ分注し、測定した。具体的には、96ウェルへの発光基質の分注に約4分55秒（Injection modeをaspVol=dispVolからaspVol=syringeVolへ変更）、96ウェルの読取りにフィルター1枚あたり4分42秒（1ウェルあたりの測定時間を1secから2.5secへ変更）になるようにプログラムを変更した。96ウェルプレートのcolumn A及びHのデータを図4に示す。基質分注時間と読取り時間が調整され、各ウェルが同じような時間経過で測定され、データのバラツキが低減されることが確認された。
【００３３】
実施例３  緑色、橙色、赤色発光酵素のライセートの混合サンプルの測定(２)
96ウェルプレートの各ウェルに、表4に示すような割合で調整されたライセートを25μlずつ分注し、、MultiReporter Assay System -TriplucR- Detection Reagents（東洋紡績）の発光基質Assay Reagent 125μlを加え、プレートリーダー1420 ARVOMX（パーキンエルマー）を用いて測定した。測定値より各色発光酵素によるシグナルを算出した。測定プログラムは、96ウェルへの発光基質の分注に約4分55秒（Injection mode、aspVol=syringeVol）、96ウェルの読取りにフィルター1枚あたり4分42秒（1ウェルあたりの測定時間、2.5sec）とした。測定値より各色発光シグナルを算出し、一定量加えられているSLGで標準化されたSLO、SLRをプロットしたグラフを図5に示す。96ウェルのプレートフォーマットにおいて、精度よく測定が行われることが確認された。
【００３４】
【表４】
2007218774.tif 000009
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明における多色発光の測定方法は、近年注目される多色発光酵素を用いたアッセイ系の測定に用いられ、このアッセイ系は複雑な細胞内転写制御解析、遺伝子転写を指標としたシグナル伝達系などの解析、さらには化合物スクリーニングの系として利用することができ、創薬・医療などの産業界に寄与することが大である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】3色の発光酵素（緑、橙、赤色発光酵素）による発光スペクトルと3枚の光学フィルターの透過帯域の関係を示す概念図である。
【図２】緑、橙、赤色発光酵素からなる検体を測定し、それぞれのシグナル値を算出した結果を示すものである。
【図３】緑、橙、赤色発光酵素からなる検体を、96ウェルプレートフォーマットでパラメーターを調整せずに測定した際の最前列及び最後列のデータを示す図である。
【図４】緑、橙、赤色発光酵素からなる検体を、96ウェルプレートフォーマットで基質添加所要時間、96ウェル読取り所要時間を調整して測定した際の最前列及び最後列のデータを示す図である。
【図５】緑、橙、赤色発光酵素からなる検体を、96ウェルプレートフォーマットで測定した際のデータを示す図である。
【図１】
2007218774.tif 000010
【図２】
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【図３】
2007218774.tif 000012
【図４】
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【図５】
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