(57)【要約】【課題】植物生育に有用な植物活着安定剤を提供する。【解決手段】セラミックスを放線菌懸濁液に浸漬し、該放線菌をセラミックス上で増殖させることで、放線菌をセラミックス上に定着させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セラミックスに定着した放線菌を含有する植物活着安定剤。
【請求項２】
上記放線菌が植物の根伸長、種子の発根、苗の発根又は苗の活着を促進する機能を有するものであることを特徴とする、請求項１記載の植物活着安定剤。
【請求項３】
上記放線菌がストレプトミセス属(Streptomyces)又はミクロバイスポラ属(Microbispora)に属する放線菌であることを特徴とする、請求項１記載の植物活着安定剤。
【請求項４】
上記放線菌が受託番号NITE P-169で特定される微生物であることを特徴とする、請求項１記載の植物活着安定剤。
【請求項５】
上記植物がツツジ科、ラン科、イネ科、サトイモ科、ナス科、マメ科、ウコギ科、キク科、シソ科、ツバキ科、アカザ科、アブラナ科、ウリ科、ショウガ科、スイレン科、セリ科、タデ科、バラ科、ユリ科、ヒルガオ科、アヤメ科、イワタバコ科、キンポウゲ科、キョウチクトウ科、ケシ科、コショウ科、ゴマノハグサ科、サクラソウ科、スミレ科、シュウカイドウ科、ツユクサ科、ツリフネソウ科、ナデシコ科、パイナップル科、フウロソウ科、ベンケイソウ科、リンドウ科、ヤシ科、ユキノシタ科、アオイ科、スギ科、トウダイグサ科、ニシキギ科、ノウゼンカズラ科、ヒノキ科、マツ科、ミズキ科及びモクセイ科に属する植物から成る群より選択される植物であることを特徴とする、請求項１記載の植物活着安定剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載の植物活着安定剤を土壌に施用する工程と、
前記土壌において植物を生育する工程と、
を含む、植物の活着を促進する方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項記載の植物活着安定剤を、湿度70％以下及び温度25℃〜40℃の条件下で保存することを特徴とする、植物活着安定剤の保存方法。
【請求項８】
セラミックスを放線菌懸濁液に浸漬する工程と、
前記放線菌を前記セラミックス上で増殖させる工程と、
を含む植物活着安定剤の製造方法。
【請求項９】
上記放線菌が植物の根伸長、種子の発根、苗の発根又は苗の活着を促進する機能を有するものであることを特徴とする、請求項８記載の植物活着安定剤の製造方法。
【請求項１０】
上記放線菌がストレプトミセス属(Streptomyces)又はミクロバイスポラ属(Microbispora)に属する放線菌であることを特徴とする、請求項８記載の植物活着安定剤の製造方法。
【請求項１１】
上記放線菌が受託番号NITE P-169で特定される微生物であることを特徴とする、請求項８記載の植物活着安定剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えばセラミックスに定着した植物生育に有用な放線菌を含有する植物活着安定剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、植物の組織培養苗、幼苗又は苗木の発根を促し、土壌への活着を促進させるために、土壌への定植前に苗を植物ホルモン（例えば、インドール酪酸など）で処理する方法がとられてきた。しかしながら、この植物ホルモンを用いた方法では、発根までに数ヶ月を要する場合がある。特に、当該方法を過湿状態で発根を促す組織培養苗に適用すると、長い時間を要し、且つ過湿状態のために、病虫害を含む苗の生育障害が生じやすい。そこで、組織培養苗の発根を促し、土壌への活着を促進させる際には、過湿状態の保持期間を短縮できる方法が望まれる。
【０００３】
一方、植物の内生放線菌は、落葉、落枝及び根から分離されることが知られている。あるいは、自然に生育している生きた植物の根、葉又は茎からも内生放線菌が分離される。
【０００４】
ツツジ科植物のシャクナゲやカルミアから分離された内生ストレプトミセス属(Streptomyces)に属する菌株を、シャクナゲやカルミアの組織培養苗又は土壌移植苗に処理し、内生させると、同植物の耐病性及び耐乾燥性が増強されることが知られている。耐病性増強の機構としては、放線菌が付着した植物細胞において、ウオールアポジション（Wall apposition）及びファイトアレキシンが誘導されることに起因すると考えられている（特許文献１）。一方、耐乾燥性の機構としては、放線菌が内生した植物の細胞浸透圧の増大、ヘミセルロースやリグニン増大による細胞壁の強化によるものと考えられている。
【０００５】
従来、放線菌、細菌、糸状菌などの有用微生物を土壌に投入する場合には、菌懸濁液又は固形培地で培養した菌体を土壌に直接混和する方法、あるいは菌を有機物において生育させ、生育した菌を担体に付着させ、土壌に混合する方法が用いられてきた。従来より利用される有機系固体担体としては、例えば、ゼラチン、セルロース、アルギン酸、ラミナリンなどの天然由来の高分子物質が挙げられる。また、無機系固体担体としては、例えば、粘土、タルク、石英、珪藻土が挙げられる。さらに、液体担体としては、例えば、緩衝液、生理食塩水、各種液体培地が挙げられる。あるいは、担体と微生物との付着及び微生物の活性を保持するために、界面活性剤(例えば、ポリオキシエチレン-脂肪酸エステル、アルキルスルホネートなど)や補助剤(例えば、デンプン、乳糖、スキムミルクなど)が使用される場合がある（特許文献２）。
【０００６】
一方、粘土、長石、珪石などを主原料とするセラミックスを作製する段階で、放線菌や細菌などの有用微生物又はそれらの抽出物を混入し、焼成してセラミックス化することが知られている。
【０００７】
例えば、特許文献３には、有用微生物群抽出物及び酸化カルシウムや酸化アルミニウムなどのカルシウムアルミネート系化合物を含有する粘土を混練し、高温焼成することにより製造される有用微生物群抽出物含有セラミックスが開示されている。また、特許文献４には、粘土、長石、珪石などを主原料とするセラミックスを作製する段階で、木節粘土の有機質と有用微生物を原料に混和し、高温焼成することで製造される炭化セラミックスが開示されている。さらに、特許文献５には、有機質を含んで産出し、光合成細菌、乳酸菌、酵母菌、放線菌などの有用微生物を一種以上含有した粘土及びこれらの有用微生物を含有しない陶磁器原料を高温焼成した、有用微生物を焼きこんだセラミックスが開示されている。
【０００８】
しかしながら、セラミックスを有用微生物の担体として利用することは、以前には知られていなかった。
【０００９】
【特許文献１】特許第3629212号公報
【特許文献２】特開2004-143102号公報
【特許文献３】特開2000-186270号公報
【特許文献４】特開平11-79864号公報
【特許文献５】特開平10-212156号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上述した実情に鑑み、例えばセラミックスに定着した植物生育に有用な放線菌を含有する植物活着安定剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、植物の発根や根伸長を促進する放線菌を単離し、且つ放線菌をセラミックスに定着させることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明は以下を包含する。
（１）セラミックスに定着した放線菌を含有する植物活着安定剤。
（２）上記放線菌が植物の根伸長、種子の発根、苗の発根又は苗の活着を促進する機能を有するものであることを特徴とする、（１）記載の植物活着安定剤。
（３）上記放線菌がストレプトミセス属(Streptomyces)又はミクロバイスポラ属(Microbispora)に属する放線菌であることを特徴とする、（１）記載の植物活着安定剤。
（４）上記放線菌が受託番号NITE P-169で特定される微生物であることを特徴とする、（１）記載の植物活着安定剤。
（５）上記植物がツツジ科、ラン科、イネ科、サトイモ科、ナス科、マメ科、ウコギ科、キク科、シソ科、ツバキ科、アカザ科、アブラナ科、ウリ科、ショウガ科、スイレン科、セリ科、タデ科、バラ科、ユリ科、ヒルガオ科、アヤメ科、イワタバコ科、キンポウゲ科、キョウチクトウ科、ケシ科、コショウ科、ゴマノハグサ科、サクラソウ科、スミレ科、シュウカイドウ科、ツユクサ科、ツリフネソウ科、ナデシコ科、パイナップル科、フウロソウ科、ベンケイソウ科、リンドウ科、ヤシ科、ユキノシタ科、アオイ科、スギ科、トウダイグサ科、ニシキギ科、ノウゼンカズラ科、ヒノキ科、マツ科、ミズキ科及びモクセイ科に属する植物から成る群より選択される植物であることを特徴とする、（１）記載の植物活着安定剤。
（６）（１）〜（５）のいずれか１記載の植物活着安定剤を土壌に施用する工程と、前記土壌において植物を生育する工程とを含む、植物の活着を促進する方法。
（７）（１）〜（５）のいずれか１記載の植物活着安定剤を、湿度70％以下及び温度25℃〜40℃の条件下で保存することを特徴とする、植物活着安定剤の保存方法。
（８）セラミックスを放線菌懸濁液に浸漬する工程と、前記放線菌を前記セラミックス上で増殖させる工程とを含む植物活着安定剤の製造方法。
（９）上記放線菌が植物の根伸長、種子の発根、苗の発根又は苗の活着を促進する機能を有するものであることを特徴とする、（８）記載の植物活着安定剤の製造方法。
（１０）上記放線菌がストレプトミセス属(Streptomyces)又はミクロバイスポラ属(Microbispora)に属する放線菌であることを特徴とする、（８）記載の植物活着安定剤の製造方法。
（１１）上記放線菌が受託番号NITE P-169で特定される微生物であることを特徴とする、（８）記載の植物活着安定剤の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、放線菌の活性により植物の種子の発根又は苗の発根及び/若しくは活着を安定的且つ効率的に促進する植物活着安定剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る植物活着安定剤は、セラミックスに定着した放線菌を含有するものである。ここで、活着とは、植物が発根して、養分を吸収する状態を意味する。本発明に係る植物活着安定剤は、植物の種子の発根又は苗の発根及び/若しくは活着の促進効果を有する。
【００１５】
本発明において使用されるセラミックスとしては、例えば、FFC（商標）セラミックス（有限会社アトムジャパン製）等の市販されているものを使用することができる。例えば、ビーズ状のFFCセラミックス（直径0.5〜1.2cm）(以下、これを「FFCセラミックビーズ」と略記する)は古代の海底堆積物が隆起した地層の堆積岩を粉砕し、その粉末を水で練って直径0.5〜1.2cmの球形に成型し、200〜850℃で焼成したものである。
【００１６】
一方、本発明において使用される放線菌は、植物の根伸長、種子の発根、苗の発根又は苗の活着を促進する機能を有するものであれば、いずれの属、種に属する放線菌であってもよく、例えば、ストレプトミセス属(Streptomyces)、ミクロバイスポラ属(Microbispora)、ノカルジア属(Nocardia)、ミクロモノスポラ属(Micromonospora)、アクチノマジュラ属(Actinomadura)、ストレプトスポランジウム属(Streptosporangium)、アクチノプラネス属(Actinoplanes)及びサーモモノスポラ属(Termomonospora)に属する放線菌が挙げられる。特にストレプトミセス属又はミクロバイスポラ属に属する放線菌が好ましい。
【００１７】
さらに、例えば、以下のようにして本発明に使用できる植物内生放線菌を分離、純化することができる。
【００１８】
野外に生育する草本・木本植物が放線菌の分離源として用いられる。例えば、本発明に用いられる放線菌は、植物体から以下の方法で分離できる（特許文献１及び２）。すなわち、野外生育している植物体の器官（例えば、根、茎、葉、花）の一部を切り取り、その表面を水道水等で洗浄した後、次亜塩素酸ナトリウム、次いでエタノール（例えば、70％エタノール）に浸漬して表面殺菌する。表面殺菌後、この植物試料断片を十分水洗した後、風乾し、固形の放線菌分離用培地上に置床し、25〜40℃で10〜60日間培養する。放線菌分離用培地としては、例えばIMA-2培地（グルコース50g、可溶性デンプン5.0g、肉エキス1.0g、NZ-カゼイン2.0g、食塩2.0g、炭酸カルシウム1.0g、寒天15.0g、蒸留水1L）を用いる。また、必要に応じて、放線菌分離用培地に抗細菌剤や抗カビ剤を添加してもよい。
【００１９】
培地上に置いた植物試料断片から伸長した放線菌の菌糸を、新たに調製した固形放線菌分離用培地(例えば、IMA-2培地)に移植し、培養して菌糸コロニーを形成させる。コロニー形成後、コロニーの一部を切り取り、新たに調製した固形放線菌分離用培地(例えば、IMA-2培地)の表面に載せたメンブレンフィルター（孔径0.2μm）上に移植する。メンブレンフィルター上に移植したコロニーを30℃で7日間程度培養し、メンブレンフィルターの下に伸長した放線菌の菌糸を、新たに調製した固形又は液体の放線菌分離用培地(例えば、IMA-2培地)に移植し、菌糸を伸長させることによって、当該放線菌を選択的に純化できる。
【００２０】
なお、分離、純化された放線菌の胞子は、例えば、滅菌したグリセロール液(例えば、10％グリセロール＋10％ジメチルスルホキシド等）中に懸濁し、胞子懸濁液として凍結保存できる。
【００２１】
以上のようにして分離、純化された又は既知の放線菌が、例えば、放線菌自体又は放線菌由来の代謝産物が植物の根伸長に与える効果が陰性対照と比較して有意に(例えば、1.2〜1.3倍以上)促進するものである場合には、本発明で使用できる放線菌であると判定することができる。なお、根伸長としては、例えば、植物の主根長、根部乾燥重、側根数、不定根数等に基づいて判断することができる。あるいは、根の生長が促されると地上部の生長も促進されるため、分離、純化された又は既知の放線菌が植物に与える効果として、茎の長さ及び太さ並びに葉面積及び葉数の増加によって、本発明において使用できる放線菌か否かを判定することができる。
【００２２】
以上のようにして、具体的に本発明者等によって分離、純化した放線菌のうち、本発明において使用できるものとして、例えば、野外生育のシャクナゲから分離されたストレプトミセス属に属するMBR-52株(ストレプトミセス属の1菌種(Streptomyces sp.))を挙げることができる。MBR-52株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(NPMD)(千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8  NITEバイオテクノロジー本部  特許微生物寄託センター)に平成18年1月27日付で寄託されており、その受託番号は、NITE P-169である。
【００２３】
MBR-52株はコロニー形状、走査電子顕微鏡による胞子形態の観察、糖利用性等、菌体内糖、菌体細胞壁のアミノ酸組成、16S rDNAの塩基配列の解析などにより、ストレプトミセス属に属する微生物であると同定した。
【００２４】
本発明において使用する放線菌は、例えば、次のようにして大量培養することができる。例えば、ストレプトミセス属に属する放線菌の場合には、胞子懸濁液を、例えば、IMA-2液体培地、A-3M液体培地(グルコース5.0g、グリセリン20.0g、可溶性デンプン20.0g、Pharmamedia 15.0g、酵母エキス3.0g、Dianin HP-20 1.0g、蒸留水1L)又はその他の放線菌培養用液体培地に接種し、25〜30℃で1日間程度振盪培養又は静置培養する。この場合、胞子懸濁液は、凍結保存されていたものを用いることができる。必要に応じて、新たに調製したこれらの培地に、さらに放線菌を移植して菌体量を増やしてもよい。
【００２５】
以上に説明したセラミックスと放線菌を用いて、本発明に係る植物活着安定剤を製造することができる。まず、セラミックスを放線菌懸濁液に浸漬する。セラミックスに対する放線菌の量は、3〜6 cfu/ml、好ましくは3〜4 cfu/mlとすることができる。浸漬後、放線菌に応じて適宜選択することができるが、例えば、15〜40℃(好ましくは28〜32℃)で、1〜5日間(好ましくは1〜2日間)培養し、放線菌をセラミックス表面上で増殖させ、定着させる。ここで、定着とは、放線菌がセラミックス表面で菌糸体を伸長させ、胞子を形成することを意味する。なお、培養の際には、セラミックス表面上に放線菌が定着した後、セラミックスを取り出し、洗浄し、再度培養してもよい。
【００２６】
以下に、例えば、セラミックスとしてFFCセラミックビーズ及び放線菌としてMBR-52株を用いた場合の本発明に係る植物活着安定剤の製造方法を具体的に説明する。
【００２７】
まず、オートクレーブ滅菌したFFCセラミックビーズ50〜100g程度を、100〜200mLのガラスフラスコ中のIMA-2液体培地で培養したMBR-52株の菌体懸濁液に浸漬し、25〜40℃程度で静置培養する。次いで、静置培養開始後7〜10日目に、クリーンベンチ内でFFCセラミックビーズを無菌的に取り出し、その表面を滅菌水で軽くすすぐ。クリーンベンチ内で表面が乾くまでFFCセラミックビーズを風乾する。風乾後のFFCセラミックビーズを、例えば、オートクレーブ滅菌したガラスビーカー又はプラスチック箱に入れ、オートクレーブ滅菌したアルミフォイルでガラスビーカー又はプラスチック箱に蓋をし、25〜40℃の恒温器で培養する。約3日毎にガラスビーカー又はプラスチック箱を振動させて、それぞれのFFCセラミックビーズの表面において万遍なく放線菌菌体が増殖するようにする。3〜10日間程度で、放線菌はそれぞれFFCセラミックビーズの表面を覆うように増殖する。このようにして、MBR-52株が表面上に定着したFFCセラミックビーズを本発明に係る植物活着安定剤として使用することができる。
【００２８】
なお、本発明に係る植物活着安定剤には、セラミックスに定着した放線菌以外に、例えば、放線菌の増殖を長期間維持するための培養液等の養分を含有することができる。
【００２９】
以上のように製造した本発明に係る植物活着安定剤は、例えば、紙製の袋若しくは箱又はプラスチック製の袋若しくは箱などに乾燥剤（例えば、シリカゲルなど）と共に入れておくと、湿度70％以下（好ましくは60％以下、特に好ましくは50％以下）及び温度5℃〜40℃(好ましくは25℃〜40℃、特に好ましくは25℃〜30℃)の条件下で、少なくとも6ヶ月間保存することができる。
【００３０】
一方、本発明に係る植物活着安定剤を植物が生育する土壌に施用することで、植物の活着を促進することができる。対象となる植物としては、例えば、ツツジ科、ラン科、イネ科、サトイモ科、ナス科、マメ科、ウコギ科、キク科、シソ科、ツバキ科、アカザ科、アブラナ科、ウリ科、ショウガ科、スイレン科、セリ科、タデ科、バラ科、ユリ科、ヒルガオ科、アヤメ科、イワタバコ科、キンポウゲ科、キョウチクトウ科、ケシ科、コショウ科、ゴマノハグサ科、サクラソウ科、スミレ科、シュウカイドウ科、ツユクサ科、ツリフネソウ科、ナデシコ科、パイナップル科、フウロソウ科、ベンケイソウ科、リンドウ科、ヤシ科、ユキノシタ科、アオイ科、スギ科、トウダイグサ科、ニシキギ科、ノウゼンカズラ科、ヒノキ科、マツ科、ミズキ科及びモクセイ科に属する植物が挙げられる。特に、例えば、シャクナゲやカルミア等のツツジ科に属する植物が好ましい。
【００３１】
本発明に係る植物活着安定剤は、例えば、育苗用セルトレイ、育苗用プラスチック鉢、育苗床の土壌に混和して施用することができる。混和する土壌の種類は特に限定されるものではなく、また通常栽培に用いる堆肥、化学肥料と併用できる。例えば、育苗用セルトレイにおいて使用する場合、例えば1セル（約25cc）の土壌に、本発明に係る植物活着安定剤として有用放線菌を定着させた直径約5〜10mmのFFCセラミックビーズを1個混和する。土壌に混和する本発明に係る植物活着安定剤の量は、使用する育苗用プラスチック鉢や育苗床の土壌の容量によって適宜増減させることができる。本発明に係る植物活着安定剤を混和した土壌において植物を生育させることで、植物の活着が促進される。例えば、本発明に係る植物活着安定剤を含有する土壌における植物の活着が、本発明に係る植物活着安定剤を含有しない土壌における植物の活着と比較して有意に(例えば、1.5〜2倍以上)促進するものである場合には、本発明に係る植物活着安定剤が有用であると判定することができる。なお、植物の活着は、例えば、植物の主根長、根部乾燥重量、側根数、不定根数等の根伸長により判定してもよい。あるいは、萎凋苗の発生減少、並びに茎長、葉数及び葉面積の増加、苗の乾燥耐性などによって、植物の活着を判定することができる。
【００３２】
以上に説明した本発明に係る植物活着安定剤によれば、環境を汚染することなく、放線菌の活性により植物の種子の発根又は苗の発根及び/若しくは活着を安定的に促進することができる。本発明に係る植物活着安定剤は、例えば、草本・木本植物の組織培養苗、幼苗、移植苗、移植苗木の活着を促進する微生物資材又は植物生産に活用される農業用資材として有用である。また、本発明に係る植物活着安定剤は、苗の発根を促進するので、従来用いられてきた植物ホルモン処理による苗の発根よりも時間を短縮することができる(例えば、1/2の時間に短縮)。過湿状態で発根を促す組織培養苗や幼苗の発根に本発明に係る植物活着安定剤を使用することで、生育障害を軽減できる。さらに、本発明に係る植物活着安定剤の製造では、従来、担体と微生物との付着や微生物の活性を保持するために使用されてきた界面活性剤や補助剤を使用する必要はない。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３４】
〔実施例１〕放線菌の分離及び純化
野外に生育するシャクナゲの根の一部を切り取り、その表面を水道水等で洗浄した後、次亜塩素酸ナトリウム、次いで、エタノール(例えば、70％エタノール）に浸漬して表面殺菌した。表面殺菌後、この植物試料断片を十分水洗した後、風乾し、固形放線菌分離用培地上に置床し、25〜40℃で10〜60日間培養した。放線菌分離用培地として、IMA-2培地(グルコース5.0g、可溶性デンプン5.0g、肉エキス1.0g、NZ-カゼイン2.0g、食塩2.0g、炭酸カルシウム1.0g、寒天15.0g、蒸留水1L）を用いた。
【００３５】
次いで、培地上に置いた植物試料断片から伸長した放線菌の菌糸を、新たに調製した固形IMA-2培地に移植し、培養して菌糸コロニーを形成させた。コロニー形成後、コロニーの一部を切り取り、新たに調製した固形IMA-2培地の表面に載せたメンブレンフィルター（孔径0.2μm）上に移植した。メンブレンフィルター上に移植したコロニーを30℃で7日間程度培養し、メンブレンフィルターの下に伸長した放線菌の菌糸を、新たに調製した固形IMA-2培地に移植し、菌糸を伸長させることによって、当該放線菌を選択的に純化した。
【００３６】
なお、分離、純化された放線菌の胞子は、滅菌したグリセロール液（例えば、10％グリセロール）中に懸濁し、胞子懸濁液として凍結保存した。
このようにして、得られた菌株を、MBR-52株と呼ぶ。
【００３７】
〔実施例２〕MBR-52株の分類学的性質
分離菌株MBR-52株のコロニー形状、走査電子顕微鏡による胞子形態の観察、糖利用性等、菌体内糖、菌体細胞壁のアミノ酸組成及び16S rDNAの塩基配列の解析を以下のようにして行った。
【００３８】
(1)  コロニー形状及び糖利用性等の検討
IMA-2固形培地上で30℃で2週間培養したMBR-52株を、International Streptomyces Project(以下、「ISP」という)培地No.2〜5の固形培地に移植し、30℃で3〜4週間培養した。培地上のコロニー性状を肉眼判定した。結果を表１に示す。なお、ISP培地No.2はイースト・麦芽寒天培地、ISP培地No.3はオートミール寒天培地、ISP培地No.4はスターチ・無機塩寒天培地、ISP培地No.5はグリセリン・アスパラギン寒天培地である。また、表１におけるカラー番号は、新色名事典（財団法人  日本色彩研究所編集、日本色研事業株式会社発行）第4版（1998年）に基づくものである。
【００３９】
【表１】
2007210981.tif 000002
【００４０】
表１に示すように、いずれのISP培地においても、MBR-52株の基生菌糸はよく増殖し、成熟時には青味がかったベージュ色〜灰色の胞子を多数形成した。基生菌糸コロニーの色及びコロニー裏面の色は培地によって異なっていた。
【００４１】
また、IMA-2固形培地上で30℃で2週間培養したMBR-52株を、ISP培地No.6及び7の固形培地に移植し、30℃で3〜4週間培養した。コロニー周辺に拡散するメラニン色素の有無を肉眼判定した。結果を表２に示す。なお、ISP培地No.6はペプトン・イースト・鉄寒天培地であり、ISP培地No.7はチロシン寒天培地である。
【００４２】
【表２】
2007210981.tif 000003
【００４３】
表２に示すように、ISP培地No.6上ではメラニン様色素は認められたが、ISP培地No.7では認められなかった。
【００４４】
さらに、IMA-2固形培地上で30℃で2週間培養したMBR-52株を、各種単糖を添加したISP培地No.9の固形培地（対照区には無添加）に移植し、30℃で3〜4週間培養した。培地上のコロニーの伸長度を肉眼判定し、MBR-52株による各糖の利用性を検討した。結果を表３に示す。結果は、糖無添加の対照区のものと比較したコロニー伸長度(「+」、「++」はコロニー伸長の活発さを示す)である。なお、ISP培地No.9は、プリドハム・ゴトリーブ寒天培地である。
【００４５】
【表３】
2007210981.tif 000004
【００４６】
いずれの糖も含有しないISP培地No.9上では、基生菌糸はわずかに伸長するのみであったが、表３に示すように、D-グルコースを添加したISP培地No.9上では、基生菌糸は活発に伸長した。D-グルコースを添加した培地上よりも、イノシトール、D-キシロース又はシュークロースを添加したISP培地No.9上で基生菌糸はより活発に伸長した。他の糖を加えた培地では、このような効果は認められなかった。
【００４７】
(2)  走査電子顕微鏡による胞子形態の観察
凍結保存していたMBR-52株を無菌水に懸濁した。50μlの当該菌体懸濁液を100mlのISP培地No.3の固体培地の表面に塗布し、30℃で1週間培養した。培養後、コロニー小片を寒天培地ごと切り取り、密封容器の中で四酸化オスミウムによって蒸気固定した。試料を液体窒素中で凍結した後、凍結乾燥機中で一晩乾燥した。試料に金蒸着を施し、走査電子顕微鏡でMBR-52株の胞子形態を観察した。結果を図１に示す。図１は、MBR-52株の胞子鎖の走査電子顕微鏡像を示す。図１において、スケールバーは3μmである。
【００４８】
図１に示したように、気中菌糸は滑らかな表面をもち、幅0.5〜0.7μmであり、所々から胞子柄が分岐して、やや湾曲した胞子鎖を形成していた。胞子は俵型で、平均の大きさは0.6〜1.2μmであった。
【００４９】
(3)  菌体内糖の解析
1mlの1N硫酸を、50mgのMBR-52株凍結菌体に加え、密封したガラス管の中で15分間120℃で加熱した。加熱後、その液の上清を遠心分離によって集め、水酸化バリウムでpH5.5に調整した。再び、遠心分離器で上清を集め、少量のエタノールを加えてロータリーエバポレーターで乾固した。乾固試料を300μlの蒸留水に溶解して、標準糖試料液とともに、薄層クロマトグラフィーで展開した。薄層の展開には、n-ブタノール:蒸留水:ピリジン:トルエン＝10:6:6:1の溶媒を用いた。アニリンフタレートを噴霧して、スポットを発色させた。
その結果、MBR-52株は、ガラクトースが菌体内の主要糖であることが明らかとなった。
【００５０】
(4)  菌体細胞壁アミノ酸組成の解析
1mlの6N塩酸を、50mgのMBR-52株凍結菌体に加え、密封したガラス管の中で一晩100℃で加熱した。加熱後、この混液を45℃で完全に乾燥させた。さらに2mlの蒸留水を加えて再び乾燥させた。乾燥試料を0.2mlの蒸留水に溶かし、標準試料液のジアミノピメリン酸及びグリシンとともに、薄層クロマトグラフィーで展開した。薄層の展開には、蒸留水:6N塩酸:ピリジン＝80:264:10の溶媒を用いた。ニンヒドリンを噴霧し、120℃で加熱してスポットを発色させた。結果を図２に示す。図２は、MBR-52株の細胞壁アミノ酸組成を示す薄層クロマトグラフィーである。図２において、「A2pm」はジアミノピメリン酸標準試料、「MBR-52」はMBR-52株試料、「Glysine」はグリシン標準試料を示す。矢印で示す「LL type A2pm」はLL型ジアミノピメリン酸の位置を示す。同様に、矢印で示す「Meso type A2pm」及び「Glysine」は、それぞれメソ型ジアミノピメリン酸、グリシンの位置を示す。
図２に示すように、MBR-52株の細胞壁は、LL型ジアミノピメリン酸及びグリシンを含有することが明らかとなった。
【００５１】
(5)  16S rDNAの塩基配列解析
IMA-2培地で30℃で10日間培養したMBR-52株菌体からDNAを抽出した。PCRを用いて、抽出したDNAを鋳型として16S rDNAを増幅して、DNAシーケンサーで塩基配列を解析した。次いで、得られた16S rDNA の塩基配列に基づいて、BLASTによりDNA塩基配列データベースと比較してホモロジー検索と系統解析を行った。ホモロジー検索の結果を表４に示す。表４において、各菌種の16S rDNA塩基配列に対するアクセッション番号は、GenBankに登録された番号である。また、相同性値は、BLASTを用いてDNA塩基配列データベース(GenBank/DDBJ/EMBL)に基づいて計算された。
【００５２】
【表４】
2007210981.tif 000005
【００５３】
ホモロジー検索の結果、MBR-52株と相同性が高い菌種の上位20位までは全てストレプトミセス属(Streptomyces)が占めていた。表４には、相同性が高いトップ5位までの菌種とそれらの相同性値(％)を示してある。表４に示すように、MBR-52株はストレプトミセス・シスコウカシカス（S. ciscaucasicus）と99.6％の最も高い相同性を示したが、本菌種と生理的に異なる系統の可能性が否定できないため、MBR-52株はストレプトミセス属の1菌種(Streptomyces sp.)と位置づけることが適切と判断された。
以上の結果より、MBR-52株は、ストレプトミセス属に属するものと同定した。
【００５４】
〔実施例３〕MBR-52株の根伸長促進効果
キュウリ種子の生育に対するMBR-52株の根伸長促進効果の検定法と検定結果を本実施例において説明する。
【００５５】
(1)  キュウリ種子に対する放線菌株の根伸長促進効果検定法
実施例１において、分離、純化し、且つ凍結保存したMBR-52株の胞子懸濁液を、それぞれ抗生物質抽出用培地A-3M培地（グルコース5.0g、グリセリン20.0g、可溶性デンプン20.0g、Pharmamedia 15.0g、酵母エキス3.0g、Dianin HP-20 1.0g、蒸留水1L）に移植し、3日間30℃で振盪前培養した。この培養液1mLを新たに調製したA-3M培地に入れ、さらに6日間同条件で本培養した。
【００５６】
MBR-52株の代謝産物を抽出するために、本培養後の培養液と同量のアセトンを該培養液に加え、30℃で24時間振盪培養した。
【００５７】
振盪培養後、振盪培養液を遠心分離し、上清を回収した。回収した上清をロータリーエバポレーターに供し、アセトンを揮発させた後、代謝産物抽出液を回収した。さらに、ミリポアフィルター（孔径0.2μm）を用いて、代謝産物抽出液を濾過滅菌し、濾液を放線菌代謝産物液とした。
【００５８】
一方、キュウリ種子を、1％次亜塩素酸ナトリウムで表面殺菌し、滅菌水で十分洗浄した。滅菌ペトリ皿に滅菌水を含ませた滅菌濾紙を置き、その上に滅菌キュウリ種子を置いて、28℃で2日間暗黒で催芽させた。
【００５９】
次いで、オートクレーブ滅菌したガラス管（10cm長、2.5cm口径）に滅菌濾紙を2枚入れ、上述の放線菌代謝産物液の10、100、1000倍希釈液を1ml入れた。さらに、これらのガラス管に、上述の催芽キュウリ種子を入れ、オートクレーブ滅菌したアルミフォイルで蓋をして、28℃、暗黒下で7日間培養した。
【００６０】
(2)  キュウリ種子に対する放線菌株の根伸長促進効果の検定結果
上記(1)のようにして培養したキュウリ種子において生育した根の主根長及び根部(地下部)乾燥重を測定した。結果を表５に示す。なお、対照区は、放線菌代謝産物液非存在下で培養したものである。一方、陰性対照(表５では「A-3M培地」)は、A-3M培地の10、100、1000倍希釈液を添加し、同様に培養したものである。
【００６１】
【表５】
2007210981.tif 000006
【００６２】
表５に示すように、野外生育のシャクナゲから分離した放線菌ストレプトミセス属のMBR-52株がキュウリ種子の根の生長を促進することが明らかになった。
【００６３】
〔実施例４〕MBR-52株のシャクナゲの組織培養苗への定着
本実施例では、MBR-52株をシャクナゲの組織培養苗に定着させ、同苗の不定根数に及ぼす影響を検討した。
(1)  シャクナゲの組織培養苗におけるストレプトミセス属MBR-52株の定着の検定法
組織培養増殖培地で3週間育成したシャクナゲ組織培養苗（無根)(品種サキガケ及びブーケ）を検定に用いた。
【００６４】
凍結保存していたMBR-52株の胞子懸濁液0.5mLを、オートクレーブ滅菌した200mLのGYブロス(グルコース10g、酵母エキス10g、イオン交換水1L）に添加し、30℃で12時間振盪培養した。次いで、シャクナゲ組織培養苗が生育しているフラスコ内の増殖培地の表面に、約2mLの得られたMBR-52株培養液を塗布し、10日間25℃で培養した。
【００６５】
培養土（容量比 ピートモス:バーミキュライト:パーライト:サチュライト=67:16:16:1）20gとイオン交換水100mLとを入れたプラスチック製プラントボックス(6.5cm×6.5cm×10cm)をオートクレーブ滅菌した後、クリーンベンチ内で15個のプラントボックスに、上記のように培養した品種サキガケの組織培養苗を5株移植した。一方、別の15個のプラントボックスに上記のように培養した品種ブーケの組織培養苗を移植した。また、MBR-52株無処理のフラスコから別の15個のプラントボックスにシャクナゲ組織培養苗を移植した区を対照区とした。プラントボックス内が高湿になることを避けるために、プラントボックスの蓋に直径6mmの孔を5個開け、フィルター（商品名ミリシール、ミリポア社製）を貼り、空気を流通させるとともに空中微生物の混入防止を図った。4000ルクスの照明付き（照射時間 12時間/日）の人工気象器(25℃)の中に、それぞれのプラントボックスを入れ、苗を培養した。
【００６６】
培養開始後1週間目に、クリーンベンチ内でそれぞれのプラントボックスから苗を3本抜き取り、無菌的に各苗を二分節毎の小片及び地下部相当部に切り分けた。これらの小片を、IMA-2固形培地(グルコース5.0g、可溶性デンプン5.0g、肉エキス1.0g、NZ-カゼイン2.0g、食塩2.0g、炭酸カルシウム1.0g、寒天15.0g、蒸留水1L）上に置き、30℃で1週間培養し、苗小片から伸長したMBR-52株の菌糸の有無を実体顕微鏡で確認した。
【００６７】
(2)  シャクナゲの組織培養苗におけるストレプトミセス属MBR-52株の定着の検定結果
上記(1)のように、苗小片から伸長したMBR-52株の菌糸の有無を観察することで、菌糸伸長が見られた苗小片数を計数した。結果を表６に示す。
【００６８】
【表６】
2007210981.tif 000007
【００６９】
表６に示すように、品種サキガケでは、地下部相当部並びに地際から上第一及び第二分節からの再分離率は100％であり、地際から上第三分節からは93％であった。一方、品種ブーケでは、地下部相当部並びに地際から上第一及び第二分節からの再分離率は100％であり、地際から上第三分節からは86％であった。いずれの品種でも、地際部から上部にMBR-52株が定着していることが示された。
【００７０】
(3)  MBR-52株がシャクナゲの組織培養苗の不定根数に及ぼす影響
上記(1)と同様の方法で、MBR-52株をフラスコ内で接種したシャクナゲ組織培養苗(無根)(品種サキガケ及びブーケ)を、プラントボックスで培養した。培養開始後1週間毎に各区のプラントボックスから15株の苗をクリーンベンチ内で抜き取り、実体顕微鏡で組織培養苗から生じた不定根を数えた。結果を図３及び表７に示す。図３は、MBR-52株を接種したシャクナゲ（品種サキガケ及びブーケ）組織培養苗の不定根伸長状況（滅菌プラスチックボックス内の滅菌土壌に移植）を示す。図３において、Ａ〜Ｄは、下記の各組織培養苗の写真を示す。Ａ：品種サキガケ(MBR-52株無接種)、Ｂ：品種サキガケ(MBR-52株接種)、Ｃ：品種ブーケ(MBR-52株無接種)、Ｄ：品種ブーケ(MBR-52株接種)、Ａ及びＢ：移植後3週間、Ｃ及びＤ：移植後5週間。
【００７１】
【表７】
2007210981.tif 000008
【００７２】
図３及び表７に示すように、MBR-52株無接種の土壌に移植した品種サキガケにおいて移植後3週間目までの平均不定根数は1本以下であったが、MBR-52株接種の土壌に移植した同品種の苗からの平均不定根数は移植後2週間目で1.1本、3週間目には2.7本となった。5週間目には接種、無接種土壌に関わらず、平均不定根数は4〜5本となった。
【００７３】
一方、品種ブーケは品種サキガケよりも約2週間不定根の発生が遅かった。MBR-52株無接種の土壌に移植した苗からの平均不定根数は移植後4週間目で0.6本、5週間目で1.7本であったが、MBR-52株接種の土壌に移植した同品種の苗からの平均不定根数は移植後4及び5週間目でそれぞれ1.9本及び3.4本となった。
【００７４】
以上のように、いずれの品種を用いても、MBR-52株接種土壌では組織培養苗からの不定根の発生時期が早まることが確認された。
【００７５】
〔実施例５〕本発明に係る植物活着安定剤の製造
MBR-52株菌体の担体として、FFC(商標)セラミックビーズ(直径0.5〜1.2cm)(有限会社アトムジャパン製)を用いた。
【００７６】
一方、凍結保存してあるストレプトミセス属MBR-52株の胞子懸濁液を、100〜200mLのガラスフラスコ中のIMA-2液体培地に接種し、25〜30℃で約1日間振盪培養し、大量の菌体培養液(菌体懸濁液)を得た。
【００７７】
得られたMBR-52株の菌体懸濁液に、オートクレーブ滅菌したFFCセラミックビーズ50〜100g程度を浸漬し、25〜40℃程度で7〜10日間静置培養した。クリーンベンチ内でFFCセラミックビーズを無菌的に取り出し、その表面を滅菌水で軽くすすいだ。次いで、クリーンベンチ内で表面が乾くまでFFCセラミックビーズを風乾した。
【００７８】
風乾後のFFCセラミックビーズを、オートクレーブ滅菌したガラスビーカー又はプラスチック箱に入れ、オートクレーブ滅菌したアルミフォイルでガラスビーカー又はプラスチック箱に蓋をし、25〜40℃の恒温器で培養した。約3日毎にガラスビーカー又はプラスチック箱を振動させて、それぞれのFFCセラミックビーズの表面において万遍なく放線菌菌体が増殖するようにした。
【００７９】
図４は、上記のようにしてFFCセラミックビーズ表面上に増殖させたMBR-52株菌体の増殖状況を示す。図４において、Ａ〜Ｄは下記の各写真を示す。Ａ：FFCセラミックビーズ表面上で増殖するMBR-52株(白色菌体)、Ｂ：FFCセラミックビーズ表面上のMBR-52株の白色コロニー(実体顕微鏡像)、Ｃ：FFCセラミックビーズの表面を伸長するMBR-52株の菌糸(走査電子顕微鏡像）、Ｄ：FFCセラミックビーズ表面のMBR-52株の菌糸から形成された胞子(走査電子顕微鏡像）。
【００８０】
図４に示すように、3〜10日程度でMBR-52株はそれぞれFFCセラミックビーズの表面を覆うように増殖した。
【００８１】
〔実施例６〕本発明に係る植物活着安定剤の保存
本実施例では、実施例５で製造したMBR-52株を表面上で増殖させ、且つ定着させたFFCセラミックビーズ(本発明に係る植物活着安定剤)を異なる温度条件下で保存し、一定期間毎に、当該FFCセラミックビーズ上の放線菌の生存を、以下の方法で確認した。
【００８２】
実施例５で製造したMBR-52株を表面上に定着させたFFCセラミックビーズを、オートクレーブ滅菌アルミフォイルで蓋をしたガラスビーカー又はプラスチック箱に入れ、25℃、5℃、-20℃でそれぞれ保存した。一定期間毎に、当該FFCセラミックビーズの一部をクリーンベンチの中で取り出し、新たに用意したペトリ皿中のIMA-2寒天培地上に置床した。このペトリ皿を25〜40℃の恒温器内に保ち、7〜180日間程度培養した。当該FFCセラミックビーズからMBR-52株の菌糸が培地上に伸長した場合には、当該FFCセラミックビーズ上でMBR-52株が生存していると判定した。すなわち、当該FFCセラミックビーズからMBR-52株の菌糸が培地上に伸長した場合には、MBR-52株が当該FFCセラミックビーズから再分離されたと判定した。FFCセラミックビーズの保存条件/保存期間に対するMBR-52株の再分離率の変化を検討した結果を表８に示す。
【００８３】
【表８】
2007210981.tif 000009
【００８４】
表８に示すように、25℃で保存したFFCセラミックビーズからのMBR-52株の再分離率は、保存開始7〜180日の間100％であった。5℃で保存した同上ビーズからの再分離率は、保存開始7日目では67％であったが、14〜180日の間では100％であった。7日目の再分離率が25℃のそれよりやや低い理由は、低温のためにFFCセラミックビーズ上におけるMBR-52株の増殖がやや遅くなるためと考えられた。
【００８５】
一方、-20℃で保存したFFCセラミックビーズからのMBR-52株の再分離率は保存開始7〜180日の間25〜42％であった。このことは、凍結状態ではMBR-52株は増殖できず、定着処理の間にFFCセラミックビーズに付着した菌体がそのまま生存していることを示している。これらの再分離率は、FFCセラミックビーズに付着していた菌体が再分離培地で増殖してきた率を示すと考えられた。
【００８６】
〔実施例７〕カルミア組織培養苗の発根に及ぼす本発明に係る植物活着安定剤の効果検定
ツツジ科植物のカルミア(Kalmia latifolia L.)の組織培養苗は、発根しにくい培養苗であり、フラスコ内の組織培養用の増殖・植込培地中では発根しない。このフラスコからセルトレイ内の土壌に移植した当該組織培養苗は、高温高湿の馴化用ビニールトンネルに置くと2〜3ヶ月で発根し、ポット移植苗に生育する。本実施例では、このように発根しにくいカルミア組織培養苗を用いて、本発明に係る植物活着安定剤が発根に及ぼす効果を検定した。
【００８７】
(1)  カルミア組織培養苗の育成
カルミア組織培養苗を育成する目的で、まずカルミアの新梢を採取し、エタノール、次亜塩素酸ナトリウムに浸漬することにより表面を殺菌した。次いで、クリーンベンチ内で、この新梢を先端から約1cmに切り取り、外植体として表９に示すカルミア増殖用培地に植え付けた。
【００８８】
1〜2ヶ月間、人工光照射下（約4000〜5000ルクス、12時間/日）、25℃の培養室で無菌的に上述した外植体を培養することにより、外植体から数本のシュートを形成させた。さらに1〜2ヶ月間培養を続けることにより、茎、葉をもった幼植物が形成された。次いで、形成した幼植物をクリーンベンチ内で容器から取り出し、それぞれの幼植物を無菌的に分け、新鮮なカルミア増殖用培地(表９)に植え付け、さらに人工光照射下（約4000〜5000ルクス、12時間/日）、25℃の培養室で無菌的に培養することによって、増殖用の幼植物を得た。この幼植物を分割して継代培養することによって目的数量の幼植物を得ることができた。
【００８９】
次いで、カルミア増殖用培地で得られた幼植物を、セルトレイに移植可能な組織培養苗に育成するために、表９に示すホルモンフリーで活性炭を添加したカルミア植込培地に植え付けた。この幼植物は人工光照射下(約4000〜5000ルクス、12時間/日）、25℃の培養室で無菌的に培養することによって、2〜3ヵ月後にはフラスコからセルトレイに移植可能な大きさの組織培養苗に生育した。
【００９０】
【表９】
2007210981.tif 000010
【００９１】
(2)  本発明に係る植物活着安定剤を含む組織培養苗移植用土壌の準備
未滅菌の育苗用培養土（容量比 ピートモス:バーミキュライト:パーライト:サチュライト=67:16:16:1）を、セルトレイの1セル(約25cm3)を満たすように入れた。次いで、室温保存していた実施例５で製造したMBR-52株を表面上に定着させたFFCセラミックビーズ（直径3〜10mm）(本発明に係る植物活着安定剤)を各セルの培養土に1個ずつ埋め込んだ。これを植物活着安定剤処理区とした。なお、セラミックス無処理区には、実施例５で製造したMBR-52株を表面上に定着させたFFCセラミックビーズも放線菌未処理FFCセラミックビーズも埋め込まなかった。また、比較のために、MBR-52株及び他の放線菌を全く定着させていないFFCセラミックビーズを各セルに1個ずつ埋め込んだセラミックス試験区を設け、FFCセラミックビーズ自身の発根促進効果も検定した。
【００９２】
(3)  本発明に係る植物活着安定剤を含む移植用土壌へのカルミア組織培養苗の移植
上記(1)のように育成したフラスコ内のカルミア組織培養苗を、フラスコから取り出した後に乾燥を避けるために、水中で1本ずつ分離した。次いで、上記(2)の育苗用培養土を入れたセルトレイの各セルに当該組織培養苗を1本ずつピンセットで挿し込んで移植した。これらのセルトレイを、ガラス温室内の密閉したビニールトンネルに入れ、自動ミストで水分を補給した。10〜15日間隔で適量の液肥を与え、2ヶ月間育苗した。
【００９３】
組織培養苗移植2ヶ月後の各区の組織培養苗からの根部伸長状況を図５に、また、各区の根部の乾燥重量を表１０に示す。図５において、Ａ〜Ｃは下記の各区の写真を示す。Ａ：セラミックス無処理区、Ｂ：セラミックス試験区、Ｃ：植物活着安定剤処理区。
【００９４】
【表１０】
2007210981.tif 000011
【００９５】
図５に示すように、セラミックス無処理の土壌で2ヶ月育成した区(セラミックス無処理区)と比較してセラミックス処理した土壌(セラミックス試験区)で育成した苗からは長い根が多数発生し、また植物活着安定剤を処理した土壌(植物活着安定剤処理区)では、さらに長い根が多数発生した。表１０に示すように、セラミックス無処理区の60本苗の根部乾燥重を1とすると、セラミックス試験区は約2倍、植物活着安定剤処理区では約3倍となっていた。これらの結果から、セラミックス自体を土壌に処理してもカルミア組織培養苗からの根の生長は促進されるが、植物活着安定剤を土壌処理するとさらに根の生長が促進されることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１は、MBR-52株の胞子鎖の走査電子顕微鏡像を示す。
【図２】図２は、MBR-52株の細胞壁アミノ酸組成を示す薄層クロマトグラフィーを示す。
【図３】図３は、MBR-52株を接種したシャクナゲ（品種サキガケ及びブーケ）組織培養苗の不定根伸長状況を示す。
【図４】図４は、FFCセラミックビーズ表面上に増殖させたMBR-52株菌体の増殖状況を示す。
【図５】図５は、カルミア組織培養苗移植2ヶ月後の各区の組織培養苗からの根部伸長状況を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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