(57)【要約】      （修正有）【課題】界面活性剤や合成高分子を使用することなく、生体適合性の高い材料を用いた安全性の高いナノ粒子を提供すること。【解決手段】ナノ粒子の形成中および／又は形成後に、トランスグルタミナーゼ等の酵素を用いて架橋処理することにより得られる、コラーゲン、ゼラチン等のタンパク質ナノ粒子と、その製法。該粒子には、リン脂質やアニオン性多糖を添加したり、化粧品、機能性食品等の活性成分を含有することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質ナノ粒子の形成中および／又は形成後に酵素架橋処理することにより得られる、タンパク質ナノ粒子。
【請求項２】
タンパク質の重量に対して、０.１〜１００重量％の架橋用酵素を添加して酵素架橋処理を行う、請求項１に記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項３】
架橋処理に用いる酵素がトランスグルタミナーゼである、請求項１又は２に記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項４】
酵素架橋処理を有機溶媒中で行う、請求項１から３の何れかに記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項５】
少なくとも１種の活性成分をさらに含む、請求項１から４の何れかに記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項６】
タンパク質の重量に対して、０.１〜１００重量％の活性成分を含有する、請求項５に記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項７】
活性成分が、化粧品用成分、機能性食品用成分、又は医薬品成分である、請求項５又は６に記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項８】
化粧品用成分が保湿剤、美白剤、育毛剤、ホルモン剤、又はアンチエイジング剤であり、機能性食品用成分がビタミン又は抗酸化剤であり、医薬品成分が制癌剤、抗アレルギー剤、抗血栓剤、免疫抑制剤、皮膚疾患治療薬、抗真菌薬、核酸医薬、又は抗炎症剤である、請求項７に記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項９】
平均粒子サイズが１０〜１０００ｎｍである、請求項１から８の何れかに記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項１０】
タンパク質が、リジン残基およびグルタミン残基を有するタンパク質である、請求項１から９の何れかに記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項１１】
タンパク質がコラーゲン、ゼラチン、アルブミン、カゼイン、トランスフェリン、グロブリン、フィブロイン、フィブリン、ラミニン、フィブロネクチン、又はビトロネクチンからなる群より選ばれる少なくとも一種である、請求項１から１０の何れかに記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項１２】
タンパク質の由来が、牛、豚、魚、および遺伝子組み換え体より選ばれる少なくとも一種である、請求項１から１１の何れかに記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項１３】
タンパク質が酸処理ゼラチンである、請求項１から１２の何れかに記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項１４】
タンパク質の重量に対して、０.１〜１００重量％のリン脂質が添加されている、請求項１から１３の何れかに記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項１５】
タンパク質の重量に対して、０．１〜１００重量％のカチオン性又はアニオン性多糖が添加されている、請求項１から１４の何れかに記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項１６】
タンパク質の重量に対して、０．１〜１００重量％のカチオン性タンパク質又はアニオン性タンパク質が添加されている、請求項１から１５の何れかに記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項１７】
請求項１から１６の何れかに記載のタンパク質ナノ粒子を含む、薬物送達剤。
【請求項１８】
経皮吸収剤、局所治療剤、経口治療剤、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、化粧品、機能性食品、又はサプリメントとして使用される、請求項１７に記載の薬物送達剤。
【請求項１９】
薬物送達剤に、添加物が含まれている、請求項１７又は１８に記載の薬物送達剤。
【請求項２０】
添加物が、保湿剤、柔軟剤、経皮吸収促進剤、無痛化剤、防腐剤、酸化防止剤、色素剤、増粘剤、香料、又はpH調整剤から選択される１種以上のものである、請求項１９に記載の薬物送達剤。
【請求項２１】
タンパク質ナノ粒子の形成中および／又は形成後に酵素架橋処理することを含む、タンパク質ナノ粒子の製造方法。
【請求項２２】
タンパク質ナノ粒子の形成中および／又は形成後に、有機溶媒中において酵素架橋処理することを含む、タンパク質ナノ粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素架橋したタンパク質ナノ粒子、その製造方法およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
微粒子材料は、バイオテクノロジーにおいて幅広い利用が期待されている。特に近年、ナノテクノロジーの進展によって生み出されたナノ微粒子材料をバイオテクノロジーや医療に応用することが活発に検討され、研究成果も数多く報告されている。
【０００３】
薬剤送達システム（DDS）の分野では早くからナノ粒子への期待が強く、薬剤や遺伝子のキャリアーとしてナノ粒子が極めて有望である。中でも、高分子ミセルを用いた研究は盛んに行われているが、ほとんどの場合、AB型かABA型のブロックコポリマーがその構造の単純さから用いられている。高分子ミセルの特徴として、大きな薬物容量、高い水溶性、高い構造安定性、非蓄積性、小さな粒経（１００nm以下）、機能分離性がある。このことから、標的部位へのターゲティングや、疎水性薬物の可溶化を目的とした研究が行われている。
【０００４】
固形ガン局所の血管内皮の透過性は異常に亢進していると同時に、リンパ系による排出が抑制されているために、高分子は本質的にガン部位に選択的に蓄積しやすい性質がある。この性質はEPR効果（Enhanced Permeability and Retention effect）と呼ばれる（例えば、非特許文献１）。このEPR効果を示すためには、その大きさは５〜２００ｎｍが最適であり、その表面は親水的で荷電は中性か弱く負に帯電していることが求められる。高分子ミセルの大きさはこの範囲内であり、疎水的な薬物を封入した疎水性内核を親水性の外殻が取り囲んでいるので、表面物性は親水的であり、上記の条件を満たしているため、EPR効果の実現に適したキャリアーシステムである。
【０００５】
近年開発される活性の高い薬剤にはタキソールのように水に不溶なものがある。経口吸収が困難な抗ガン剤では血液中に投与することが望ましい。よって、有機溶媒や界面活性剤を用いて非水溶性の薬剤を水に可溶化するのであるが、用いる有機溶剤や界面活性剤の毒性は相当なレベルに及ぶ。また、この毒性によるショック様症状を抑えるために、ステロイドの前投与や、カテーテルによって心臓内に導いて投与することが求められるなど、入院が必要な治療形態となる。有機溶剤や低分子の界面活性剤に比べれば毒性が低いと考えられる両親媒性高分子を用いてそのミセル構造に薬物を封入して血液中に投与する研究が行われており、臨床試験も行われている（例えば、非特許文献２）。
【０００６】
一方、近年、化粧品においては、ナノテクノロジーをはじめ様々な新しい技術を取り入れることにより、機能性・使用性の向上、他社品との差別化が計られており、より明確な肌効果が求められるようになってきている。肌は一般的に、角質層がバリアーとして存在するために薬物の皮膚への浸透性が低い。肌効果を十分に発揮させるためには、有効成分の皮膚透過性の改善が不可欠である。また、皮膚に対して高い有効性を持っていても、保存安定性が悪かったり、皮膚に刺激を起こしやすかったりするために製剤化が困難な成分も多い。これらを解決すべく、経皮吸収性の改善および保存安定性の向上、皮膚刺激性の低減など目的とした、様々なカプセルの開発が進められている。現在、超微細乳化やリポソームなど各種素材が研究されている（例えば、非特許文献３）。しかし、乳化に用いられる界面活性剤は安全性に懸念があり、またイオンコンプレックスによる構造形成は共有結合に比べて安定性も劣る。
【０００７】
高分子材料を用いれば、保存安定性や生体内における粒子の安定性の点で、大きく改善されることが予想される。しかし、ほとんどの研究は乳化重合をはじめとする合成高分子を用いたものであり、低分子に比べれば毒性は軽減されるものの、ある程度の毒性は覚悟しなければならず、より安全なキャリアーが求められている。
【０００８】
天然高分子は合成高分子と同様に高い構造安定性を示しながら、合成高分子よりも格段に安全性が高く、DDSキャリアーとしての利点を兼ね備えている。しかし、合成高分子に比べて天然高分子キャリアーの困難な点は、粒子作製方法である。天然高分子の粒子作製方法としては、噴霧乾燥、凍結乾燥およびジェットミルが利用できるが、ほとんどの場合、粒子サイズはミクロンサイズであり、大きさの制御が困難である。
【０００９】
特許文献１では、高分子材料を用いたナノ粒子経皮吸収剤を提案しているが、これは界面活性剤を使用した乳化物であり、前述のように安全性および安定性に懸念がある。また、特許文献２には、球状タンパク質粒子が記載されているが、薬物を含有する組成物としての粒子サイズは１μｍ以上であり、沈殿剤による粒子形成のみで、共有結合によるタンパク質同士のネットワークがなく、保存安定性や生体内における粒子の安定性の点で問題がある。特許文献３では、高分子材料（合成高分子または天然高分子）から作られるナノ粒子の薬剤標的化システムを提案しているが、粒子作製方法として、１つ以上のモノマーおよび／またはオリゴマー前駆体を重合する工程を含んでいるため、高分子材料として天然高分子を用いたとしても、安全性に問題がある。また、特許文献４でも、スキンケア成分を含む架橋高分子ナノ粒子を提案しているが、モノマーもしくはマクロマー（重合性基を持つ合成高分子）の重合過程を含んでおり、安全性に懸念がある。非特許文献４では、ゼラチン水溶液に有機溶媒を添加して不溶化した粒子を、グルタルアルデヒドを用いて架橋しているが、グルタルアルデヒドは毒性の強い物質であり、残存した場合には安全性に問題がある。上記の通り、これまで知られている高分子ナノ粒子は、合成高分子は言うに及ばず、天然高分子であっても、粒子形成過程で、界面活性剤や重合性モノマー、化学架橋剤などを使用しており、安全性に懸念がある。
【００１０】
ところで、タンパク質の架橋は化学架橋が一般的であり、上述のグルタルアルデヒドのような架橋剤を添加する方法や、光反応性基を有するモノマー用いＵＶ照射する方法、パルス照射により局所的にラジカルを発生させ架橋する方法などが知られている。一方、生体高分子の特質を生かした方法として、トランスグルタミナーゼを利用して、グルタミン残基のアシル転位反応を触媒し分子間および分子内に架橋結合を形成する方法がある（例えば、特許文献５）。しかし、通常この方法はバルクもしくは含水した生体高分子中で行われるものであり、タンパクナノ粒子内での架橋結合の形成は知られていない。更に、有機溶媒中に分散したナノ粒子での架橋反応は知られていない。
【００１１】
【非特許文献１】Y.Matsumura and H. Maeda, Cancer Res., 46, 6387(1986)
【非特許文献２】Y.Mizumura et al., Jap.J.Cancer Res., 93, 1237(2002)
【非特許文献３】西田  光広、フレグランスジャーナル、11月、17（2005）
【非特許文献４】C.Coester et al., J. Microencapsulation, 17, 189(2000)
【特許文献１】特開２００２−３０８７２８公報
【特許文献２】特表２００５−５００３０４号公報
【特許文献３】特表２００１−５０２７２１号公報
【特許文献４】特開２００４−２４４４２０公報
【特許文献５】特開昭６４−２７４７１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、界面活性剤や合成高分子を使用することなく、生体適合性の高い材料を用いた安全性の高いナノ粒子を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、合成化学架橋剤を使用することなく架橋した安全性の高いナノ粒子を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、タンパク質ナノ粒子の形成中および／又は形成後に酵素架橋処理することによってタンパク質ナノ粒子を作製できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【００１４】
即ち、本発明によれば、タンパク質ナノ粒子の形成中および／又は形成後に酵素架橋処理することにより得られる、タンパク質ナノ粒子が提供される。
【００１５】
好ましくは、タンパク質の重量に対して、０.１〜１００重量％の架橋用酵素を添加して酵素架橋処理を行う。
好ましくは、架橋処理に用いる酵素はトランスグルタミナーゼである。
好ましくは、酵素架橋処理を有機溶媒中で行う。
【００１６】
好ましくは、本発明のタンパク質ナノ粒子は、少なくとも１種以上の活性成分をさらに含む。
好ましくは、本発明のタンパク質ナノ粒子は、タンパク質の重量に対して、０.１〜１００重量％の活性成分を含有する。
【００１７】
好ましくは、活性成分は、化粧品用成分、機能性食品用成分、又は医薬品成分である。
好ましくは、化粧品用成分は保湿剤、美白剤、育毛剤、ホルモン剤、又はアンチエイジング剤であり、機能性食品用成分はビタミン又は抗酸化剤であり、医薬品成分は制癌剤、抗アレルギー剤、抗血栓剤、免疫抑制剤、皮膚疾患治療薬、抗真菌薬、核酸医薬、又は抗炎症剤である。
【００１８】
好ましくは、平均粒子サイズは１０〜１０００ｎｍである。
好ましくは、タンパク質は、リジン残基およびグルタミン残基を有するタンパク質である。
好ましくは、タンパク質はコラーゲン、ゼラチン、アルブミン、カゼイン、トランスフェリン、グロブリン、フィブロイン、フィブリン、ラミニン、フィブロネクチン、又はビトロネクチンからなる群より選ばれる少なくとも一種である。
また、タンパク質の由来は特に限定するものではなく、牛、豚、魚、および遺伝子組み換え体のいずれも用いることができる。
好ましくは、タンパク質は酸処理ゼラチンである。
【００１９】
好ましくは、タンパク質の重量に対して、０.１〜１００重量％のリン脂質が添加されている。
好ましくは、タンパク質の重量に対して、０．１〜１００重量％のカチオン性又はアニオン性多糖が添加されている。
好ましくは、タンパク質の重量に対して、０．１〜１００重量％のカチオン性タンパク質又はアニオン性タンパク質が添加されている。
【００２０】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明のタンパク質ナノ粒子を含む、薬物送達剤が提供される。
好ましくは、薬物送達剤が、経皮吸収剤、局所治療剤、経口治療剤、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、化粧品、機能性食品、又はサプリメントとして使用される。
好ましくは、薬物送達剤に添加物が含まれている。
好ましくは、添加物は、保湿剤、柔軟剤、経皮吸収促進剤、無痛化剤、防腐剤、酸化防止剤、色素剤、増粘剤、香料、又はpH調整剤から選択される１種以上のものである。
【００２１】
本発明のさらに別の側面によれば、タンパク質ナノ粒子の形成中および／又は形成後に酵素架橋処理することを含む、タンパク質ナノ粒子の製造方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、タンパク質ナノ粒子の形成中および／又は形成後に、有機溶媒中において酵素架橋処理することを含む、タンパク質ナノ粒子の製造方法が提供される。
【発明の効果】
【００２２】
本発明のタンパク質ナノ粒子においては、界面活性剤や合成高分子を使用することなく、生体適合性の高いタンパク質を用いているため、生体に対する安全性が高い。また、本発明のタンパク質ナノ粒子では、合成化学架橋剤を使用することなく、酵素によって架橋を形成しているため、生体に対する安全性が高い。特に、本発明で用いることができるトランスグルタミナーゼ（TG）は人の体の中にも存在するタンパクであり安全性が高い。また、微生物由来のTGは食品のタンパクの架橋に用いられているものでもあり、本発明のタンパク質ナノ粒子は、経口投与又は経皮用のDDS製剤として安全性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明の実施の形態についてさらに具体的に説明する。
本発明のタンパク質ナノ粒子は、タンパク質ナノ粒子の形成中および／又は形成後に酵素架橋処理することにより得られることを特徴とする。
【００２４】
なお、本発明のタンパク質ナノ粒子は、磁気応答性粒子は含まないものである。
【００２５】
本発明で用いるタンパク質の種類は特に限定されないが、リジン残基およびグルタミン残基を有するタンパクが好ましく、分子量１万から１００万程度のタンパク質を用いることが好ましい。タンパク質の由来は特に限定されないが、ヒト由来のタンパク質を用いることが好ましい。タンパク質として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。コラーゲン、ゼラチン、アルブミン、カゼイン、トランスフェリン、グロブリン、フィブロイン、フィブリン、ラミニン、フィブロネクチン、又はビトロネクチンからなる群より選ばれる少なくとも一種を使用することができる。また、タンパク質の由来は特に限定するものではなく、牛、豚、魚、および遺伝子組み換え体のいずれも用いることができる。遺伝子組み換えゼラチンとしては、例えばＥＵ1014176Ａ２号、米国特許6,992,172号に記載のものを用いることができるがこれらに限定されるものではない。その中で好ましいものは、酸処理ゼラチン、コラーゲン、アルブミンであり、最も好ましいものは酸処理ゼラチンである。
【００２６】
本発明に用いられるタンパク質は、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００２７】
本発明に用いられる酵素は、タンパクの架橋作用が知られているものであれば特に制限されず、その中で好ましいものはトランスグルタミナーゼである。
【００２８】
トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、遺伝子組み換え体を用いることができる。具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として発売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼ、ヒト由来リコンビナントトランスグルタミナーゼなどが挙げられる。
【００２９】
本発明に用いられる酵素の量は、タンパク質の種類に応じて適宜設定することが出来るが、標準的には、タンパク質の重量に対して、０.１〜１００重量％程度を添加することができ、好ましくは、１〜５０重量％程度を添加することができる。
【００３０】
酵素による架橋反応の時間は、タンパク質の種類、ナノ粒子サイズに応じて適宜設定することができるが、標準的には、１時間から７２時間反応することができ、好ましくは、２時間から２４時間反応することができる。
【００３１】
酵素による架橋反応の温度は、タンパク質の種類、ナノ粒子サイズに応じて適宜設定することができるが、標準的には、０℃から８０℃で反応することができ、好ましくは、２５℃から６０℃で反応することができる。
【００３２】
本発明に用いられる酵素を単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３３】
本発明のナノ粒子の平均粒子サイズは、通常は１〜１０００ｎｍであり、好ましくは１０〜１０００ｎｍであり、より好ましくは５０〜５００ｎｍであり、特に好ましくは１００〜５００ｎｍである。上記したようなナノオーダーのサイズを有することにより、本発明のナノ粒子は、毛細血管などの微細な部位にも到達することが可能になる。
【００３４】
本発明のタンパク質ナノ粒子は、好ましくは、少なくとも１種以上の活性成分を含むことができる。活性成分の量は特に限定されないが、一般的には、タンパク質の重量に対して、０.１〜１００重量％の活性成分を含有させることができる。
【００３５】
本発明において、活性成分はタンパク質ナノ粒子形成時に添加してもよいし、タンパク質ナノ粒子作成後に添加してもよい。
【００３６】
本発明に用いられる活性成分は、保湿剤、美白剤、育毛剤、ホルモン剤、アンチエイジング剤などの化粧品用成分、ビタミン、抗酸化剤などの機能性食品用成分、制癌剤、抗アレルギー剤、抗血栓剤、免疫抑制剤、皮膚疾患治療薬、抗真菌薬、核酸医薬、抗炎症剤などの医薬品成分である。
【００３７】
本発明に用いられる保湿剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。ヒアルロン酸、セラミド、リピジュア、イソフラボン、アミノ酸、コラーゲン、ムコ多糖、フコダイン、ラクトフェリン、ソルビトール、キチン・キトサン、リンゴ酸、グルクロン酸、プラセンタエキス、海藻エキス、ボタンピエキス、アマチャエキス、オトギリソウエキス、コレウスエキス、マサキ抽出物、コウカエキス、マイカイ花エキス、チョレイエキス、サンザシエキス、ローズマリーエキス、デュークエキス、カミツレエキス、オドリコソウエキス、レイシエキス、セイヨウノコギリソウエキス、アロエエキス、マロニエエキス、アスナロエキズ、ヒバマタエキス、オスモインエキス、オーツ麦エキス、チューベロースポリサッカライド、冬虫夏草エキス、大麦エキス、オレンジ抽出物、ジオウエキス、サンショウエキス、ヨクイニンエキスなどが挙げられる。
【００３８】
本発明に用いられる美白剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。ビタミンＣおよびその誘導体、アルブチン、ハイドロキノン、コウジ酸、ルシノール、エラグ酸、トラネキサム酸、グルタチオンなどが挙げられる。
【００３９】
本発明に用いられる育毛剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。アデノシン、セファランチン、グリチルレチン酸又はその誘導体、グリチルリチン酸又はその誘導体、イソプロピルメチルフェノール、パントテン酸、パンテノール、t-フラバノン、トコフェノール類又はその誘導体、ヒノキチオール、ペンタデカン酸又はその誘導体、カンゾウ抽出物、キンセイソウ抽出物、クジン抽出物、センブリ抽出物、トウガラシ抽出物、トウチャ抽出物、ニンジン抽出物、ホウコウエイ抽出物、ボタン抽出物、ミカン抽出物、血行促進剤（例えば、ニコチン酸、ニコチン酸ベンジル、ニコチン酸トコフェロール、ニコチン酸β-ブトキシエステル、ミノキシジル又はその類縁体、センブリ抽出物、γ-オキサゾール、アルコキシカルボニルピリジンN-オキシド、塩化カルプロニウム、及びアセチルコリン又はその誘導体など）、抗炎症剤、保湿剤などが挙げられる。
【００４０】
本発明に用いられるホルモン剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。エストラジオール、エチニルエストラジオール、エストロン、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロンなどが挙げられる。
【００４１】
本発明に用いられるアンチエイジング剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。レチノイン酸、レチノール、ビタミンＣおよびその誘導体、カイネチン、β-カロテン、アスタキサンチン、トレチノインなどが挙げられる。
【００４２】
本発明に用いられるビタミンとして具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。ビタミンＡおよびその誘導体、レチノイン酸、ビタミンＢ群（例えば、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミン１２、葉酸など）、ビタミンＣおよびその誘導体、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＦ、パントテン酸、ビタミンＨなどが挙げられる。
【００４３】
本発明に用いられる抗酸化剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。ビタミンＣおよびその誘導体、ビタミンＥ、カイネチン、α−リポ酸、コエンザイムＱ１０、ポリフェノール、ＳＯＤ、フィチン酸など。
【００４４】
本発明に用いられる制癌剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。フッ化ピリミジン系代謝拮抗薬（５-フルオロウラシル（5FU）やテガフール、ドキシフルリジン、カペシタビンなど）；抗生物質（マイトマイシン（MMC）やアドリアシン（DXR）など）；プリン代謝拮抗薬（メソトレキサートなどの葉酸代謝拮抗薬、メルカプトプリンなど）；ビタミンAの活性代謝物（ヒドロキシカルバミドなどの代謝拮抗薬、トレチノインやタミバロテンなど）；分子標的薬（ハーセプチンやメシル酸イマチニブなど）；白金製剤（ブリプラチンやランダ（CDDP）、パラプラチン（CBDC）、エルプラット（Oxa）、アクプラなど）；植物アルカロイド薬（トポテシンやカンプト（CPT）、タキソール（PTX）、タキソテール（DTX）、エトポシドなど）；アルキル化剤（ブスルファンやシクロホスファミド、イホマイドなど）；抗男性ホルモン薬（ビカルタミドやフルタミドなど）；女性ホルモン薬（ホスフェストロールや酢酸クロルマジノン、リン酸エストラムスチンなど）；LH-RH薬（リュープリンやゾラデックスなど）；抗エストロゲン薬（クエン酸タモキシフェンやクエン酸トレミフェンなど）；アロマターゼ阻害薬（塩酸ファドロゾールやアナストロゾール、エキセメスタンなど）；黄体ホルモン薬（酢酸メドロキシプロゲステロンなど）；BCGなどが挙げられるが、これに限定されない。
【００４５】
本発明に用いられる抗アレルギー剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。クロモグリク酸ナトリウムやトラニラストなどのメディエーター遊離抑制薬、フマル酸ケトチフェンや塩酸アゼラスチンなどのヒスタミンH1-措抗薬、塩酸オザグレルなどのトロンボキサン阻害薬、プランルカストなどのロイコトリエン拮抗薬、トシル酸スプラタストなどが挙げられる。
【００４６】
本発明に用いられる抗血栓剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。アスピリン、塩酸チクロピジン、シロスタゾール、ワルファリンカリウムなどが挙げられる。
【００４７】
本発明に用いられる免疫抑制剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。ラパマイシン、タクロリムス、シクロスポリン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、ミゾリビンなどが挙げられる。
【００４８】
本発明に用いられる皮膚疾患治療薬として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。アトピー性皮膚炎薬（例えば、酪酸ヒドロコルチゾン、酪酸クロベタゾン、プロピオン酸アルクロメタゾン、プロピオン酸クロベタゾール、ジプロピオン酸ベタメタゾン、ジフルプレドナートなどのステロイド薬、タクロリムスなどの免疫抑制薬、ブフェキサマク、ウフェナマート、イブプロフェンピコノール、ベンダザックなどの非ステロイド薬、酸化亜鉛、アズレン、ジフェンヒドラミン、クロタミトン、保湿剤など）、ニキビ薬（例えば、イオウ、サリチル酸、レゾルシン、チオキソロン、硫化セレン、ナジフロキサシン、硫酸ゲンタマイシン、塩酸テトラサイクリン、リン酸クリンダマイシン、レチノイン酸など）、湿疹薬などが挙げられる。
【００４９】
本発明に用いられる抗真菌薬として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。クロトリマゾール、ビホナゾール、硝酸ミコナゾール、硝酸エコナゾール、硝酸スルコナゾール、塩酸ネチコナゾール、塩酸クロコナゾール、ラノコナゾール、ケトコナゾール、ルリコナゾール、塩酸アモロルフィン、塩酸テルビナフィン、トルナフタートなどが挙げられる。
【００５０】
本発明に用いられる核酸医薬として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。アンチセンス、リボザイム、siＲＮＡ、アプタマー、デコイ核酸などが挙げられる。
【００５１】
本発明に用いられる抗炎症剤として具体例を列挙するが、本発明においてこれらの化合物に限定されるものではない。アズレン、アラントイン、塩化リゾチーム、グアイアズレン、塩酸ジフェンヒドラミン、酢酸ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、グルタチオン、サポニン、サリチル酸メチル、メフェナム酸、フェニルブタゾン、インドメタシン、イブプロフェン及びケトプロフェンから選ばれる化合物並びにそれらの誘導体並びにそれらの塩、オウゴンエキス、カワラヨモギエキス、キキョウエキス、キョウニンエキス、クチナシエキス、クマザサ抽出液、ゲンチアナエキス、コンフリーエキス、シラカバエキス、ゼニアオイエキス、トウニンエキス、桃葉エキス並びにビワ葉エキスから選ばれる植物抽出物からえらばれるものなどが挙げられる。
【００５２】
本発明に用いられる活性成分は、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００５３】
本発明のタンパク質ナノ粒子は、特許文献特開平６−７９１６８号公報、又はC.Coester著、ジャーナル・ミクロカプスレーション、２０００年、１７巻、p.１８７−１９３に記載の方法に準じて作製することができるが、架橋方法としてグルタルアルデヒドの代わりに酵素を用いる。
【００５４】
また、本発明においては、酵素架橋処理を有機溶媒中で行うことが好ましい。ここで用いる有機溶媒としては、エタノール、イソプロパノール、アセトン、THFなどの水溶性有機溶媒が好ましい。
【００５５】
本発明に用いることができるリン脂質として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリンなどが挙げられる。
【００５６】
本発明に用いることができるアニオン性多糖とはカルボキシル基、硫酸基又はリン酸基等の酸性極性基を有する多糖類である。以下に具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデキストラン、アルギン酸、ペクチン、カラギーナン、フコイダン、アガロペクチン、ポルフィラン、カラヤガム、ジェランガム、キサンタンガム、ヒアルロン酸類等が挙げられる。
【００５７】
本発明に用いることができるカチオン性多糖とは、アミノ基等の塩基性極性基を有する多糖類である。以下に具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。キチン、キトサンなどのグルコサミンやガラクトサミンを構成単糖として含むものなどが挙げられる。
【００５８】
本発明に用いることができるアニオン性タンパク質とは等電点が生理的ｐＨよりも塩基性側にあるタンパク質およびリポタンパク質である。具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、リゾチーム、チトクロムＣ、リボヌクレアーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、α−キモトリプシンなどが挙げられる。
【００５９】
本発明に用いられるカチオンタンパク質とは等電点が生理的ｐＨよりも酸性側にあるタンパク質およびリポタンパク質である。具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。ポリリジン、ポリアルギニン、ヒストン、プロタミン、オバルブミンなどが挙げられる。
【００６０】
本発明のタンパク質ナノ粒子は、その中に活性成分を含むことができ、そのような活性成分を含むタンパク質ナノ粒子は、疾患部位に投与して用いることができる。即ち、本発明のタンパク質ナノ粒子は、薬物送達剤として有用である。
【００６１】
本発明のタンパク質ナノ粒子の投与方法として好ましいものは、経皮・経粘膜吸収、血管・体腔内・リンパへの注射が挙げられる。より好ましくは経皮・経粘膜吸収が挙げられる。
【００６２】
本発明においては、薬物送達剤の使用は特に限定することはないが、経皮吸収剤、局所治療剤、経口治療剤、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、化粧品、サプリメントなどが挙げられる。
【００６３】
本発明においては、薬物送達剤には添加物を含むことができる。添加物としては特に限定することはないが、保湿剤、柔軟剤、経皮吸収促進剤、無痛化剤、防腐剤、酸化防止剤、色素剤、増粘剤、香料、又はpH調整剤などが挙げられる。
【００６４】
本発明で用いることができる保湿剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。カンテン、ジグリセリン、ジステアリルジモニウムヘクトライト、ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、へキシレングリコール、ヨクイニンエキス、ワセリン、尿素、ヒアルロン酸、セラミド、リピジュア、イソフラボン、アミノ酸、コラーゲン、ムコ多糖、フコダイン、ラクトフェリン、ソルビトール、キチン・キトサン、リンゴ酸、グルクロン酸、プラセンタエキス、海藻エキス、ボタンピエキス、アマチャエキス、オトギリソウエキス、コレウスエキス、マサキ抽出物、コウカエキス、マイカイ花エキス、チョレイエキス、サンザシエキス、ローズマリーエキス、デュークエキス、カミツレエキス、オドリコソウエキス、レイシエキス、セイヨウノコギリソウエキス、アロエエキス、マロニエエキス、アスナロエキズ、ヒバマタエキス、オスモインエキス、オーツ麦エキス、チューベロースポリサッカライド、冬虫夏草エキス、大麦エキス、オレンジ抽出物、ジオウエキス、サンショウエキス、ヨクイニンエキスなどが挙げられる。
【００６５】
本発明で用いることができる柔軟剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。グリセリン、ミネラルオイル、エモリエント成分（例えば、イソステアリン酸イソプロピル、イソステアリン酸ポリグリセリル、イソノナン酸イソトリデシル、イソノナン酸オクチル、オレイン酸、オレイン酸グリセリル、カカオ脂、コレステロール、混合脂肪酸トリグリセリド、コハク酸ジオクチル、酢酸ステアリン酸スクロース、シクロペンタシロキサン、ジステアリン酸スクロース、パルミチン酸オクチル、ヒドロキシステアリン酸オクチル、ベヘン酸アラキル、ポリベヘン酸スクロース、ポリメチルシルセスキオキサン、ミリスチルアルコール、ミリスチン酸セチル、ミリスチン酸ミリスチル、ラウリン酸ヘキシルなど）が挙げられる。
【００６６】
本発明で用いることができる経皮吸収促進剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。エタノール、ミリスチン酸イソプロピル、クエン酸、スクワラン、オレイン酸、メントール、N-メチル-2-ピロリドン、アジピン酸ジエチル、アジピン酸ジイソプロピル、セバシン酸ジエチル、セバシン酸ジイソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、オレイン酸イソプロピル、オレイン酸オクチルドデシル、イソステアリルアルコール、2-オクチルドデカノール、尿素、植物油、動物油が挙げられる。
【００６７】
本発明で用いることができる無痛化剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。ベンジルアルコール、塩酸プロカイン、塩酸キシロカイン、 クロロブタノールなどが挙げられる。
【００６８】
本発明で用いることができる防腐剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。安息香酸、安息香酸ナトリウム、パラベン、エチルパラベン、メチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸ナトリウム、ソルビン酸、デヒドロ酢酸ナトリウム、過酸化水素、ギ酸、ギ酸エチル、ジ亜塩素酸ナトリウム、プロピオン酸、プロピオン酸ナトリウム、プロピオン酸カルシウム、ペクチン分解物、ポリリジン、フェノール、イソプロピルメチルフェノール、オルトフェニルフェノール、フェノキシエタノール、レゾルシン、チモール、チラム、ティートリー油が挙げられる。
【００６９】
本発明で用いることができる酸化防止剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。ビタミンＣおよびその誘導体、ビタミンＥ、カイネチン、ポリフェノール、ＳＯＤ、フィチン酸、ＢＨＴ、ＢＨＡ、没食子酸プロピル、フラーレン、クエン酸などが挙げられる。
【００７０】
本発明で用いることができる色素剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。オキアミ色素、オレンジ色素、カカオ色素、カオリン、カルミン類、グンジョウ、コチニール色素、酸化クロム、酸化鉄、二酸化チタン、タール色素、クロロフィルなどが挙げられる。
【００７１】
本発明で用いることができる増粘剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。クインスシード、カラギーナン、アラビアガム、カラヤガム、キサンタンガム、ジェランガム、タマリンドガム、ローカストビーンガム、トラガントガム、ペクチン、デンプン、シクロデキストリン、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００７２】
本発明で用いることができる香料として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。ジャコウ、アカシア油、アニス油、イランイラン油、シナモン油、ジャスミン油、スウィートオレンジ油、スペアミント油、ゼラニウム油、タイム油、ネロリ油、ハッカ油、ヒノキ油、フェンネル油、ペパーミント油、ベルガモット油、ライム油、ラベンダー油、レモン油、レモングラス油、ローズ油、ローズウッド油、アニスアルデヒド、ゲラニオール、シトラール、シベトン、ムスコン、リモネン、バニリンなどが挙げられる。
【００７３】
本発明で用いることができるpH調整剤として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、リン酸、コハク酸が挙げられる。
【００７４】
本発明のタンパク質ナノ粒子の投与量は、活性成分の種類及び使用量、患者の体重、疾患の状態などに応じて適宜設定することができるが、一般的には、１回の投与につき、１０μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ程度を投与することができ、好ましくは、２０μｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ程度を投与することができる。また、経皮・経粘膜で使用する場合は、１μｇ〜５０ｍｇ／ｃｍ2程度を投与することができ、好ましくは２．５μｇ〜１０ｍｇ／ｃｍ2程度を投与することができる。
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７５】
実施例１
酸処理ゼラチンを２０ｍｇ、ダイキトサンを２ｍｇ、トランスグルタミナーゼ製剤（味の素（株）製アクティバTG-S）を１０ｍｇ、下記構造を有する活性物質モデルを０．４mg、イオン交換水を１．７９ｍL混合する。前記溶液１mLを、外設４０℃、８００rpmの攪拌条件で、マイクロシリンジを用いて、エタノール１０ｍL中に注入した。得られた分散液を外設５５℃で５時間静置することで、架橋された酸処理ゼラチンナノ粒子が得られた。上記粒子の平均粒経は、光散乱光度計（大塚電子（株）製ＤＬＳ−７０００）を用い測定したところ、８５nmであった。
【００７６】
【化１】
2007224012.tif 000002
【００７７】
実施例２
アルブミンを２０ｍｇ、コンドロイチン硫酸−Ｃを２ｍｇ、トランスグルタミナーゼ製剤（味の素（株）製アクティバTG-S）を１０ｍｇ、アドリアマイシンを０．４mg、イオン交換水を１．７９ｍL混合する。前記溶液１mLを、外設４０℃、８００rpmの攪拌条件で、マイクロシリンジを用いて、エタノール１０ｍL中に注入した。得られた分散液を外設５５℃で５時間静置することで、架橋されたアルブミンナノ粒子が得られた。上記粒子の平均粒経は、光散乱光度計（大塚電子（株）製ＤＬＳ−７０００）を用い測定したところ、３０nmであった。
【００７８】
実施例３
酸処理ゼラチンを２０ｍｇ、トランスグルタミナーゼ製剤（味の素（株）製アクティバTG-S）を１０ｍｇ、アルブチン０．４mg、イオン交換水を１．７９ｍL混合する。前記溶液１mLを、外設４０℃、８００rpmの攪拌条件で、マイクロシリンジを用いて、レシチン２ｍｇを溶かしたエタノール１０ｍL中に注入した。得られた分散液を外設５５℃で５時間静置することで、架橋された酸処理ゼラチンナノ粒子が得られた。上記粒子の平均粒経は、光散乱光度計（大塚電子（株）製ＤＬＳ−７０００）を用い測定したところ、９０nmであった。
【００７９】
実施例４
アクアコラーゲンRを２０ｍｇ、デキストラン硫酸２ｍｇ、トランスグルタミナーゼ製剤（味の素（株）製アクティバTG-S）を１０ｍｇ、アドリアマイシンを０．４mg、イオン交換水を１．７９ｍL混合する。前記溶液１mLを、外設４０℃、８００rpmの攪拌条件で、マイクロシリンジを用いて、エタノール１０ｍL中に注入した。得られた分散液を外設５５℃で５時間静置することで、架橋されたアクアコラーゲンナノ粒子が得られた。上記粒子の平均粒経は、光散乱光度計（大塚電子（株）製ＤＬＳ−７０００）を用い測定したところ、１１０nmであった。
【００８０】
実施例５
５％のゼラチン水溶液２５ｍLに、アセトン２５ｍLをゆっくり加え、沈殿させる。上澄みを捨て、沈殿を再度水に溶かし、ポリリジン２mg、活性物質モデル０．４mg、トランスグルタミナーゼ製剤（味の素（株）製アクティバTG-S）１０mgを加えた後、pHを２．５にして不溶化する。得られた分散液を外設５５℃で５時間静置することで、架橋された酸処理ゼラチンナノ粒子が得られた。
【００８１】
実施例６
酸処理ゼラチン１００ｍｇをイオン交換水１０ｍLに加温しながら溶かし、塩酸を加えてｐHを２．５に調整した後、トランスグルタミナーゼ製剤（味の素（株）製アクティバTG-S）を５０ｍｇ、アルブチン０．４mｇを加える。攪拌下、この溶液にアセトン１６ｍLを滴下し、エタノール２３０ｍLで希釈したところ、酸処理ゼラチンナノ粒子が得られた。上記粒子の平均粒経は、光散乱光度計（大塚電子（株）製ＤＬＳ−７０００）を用い測定したところ、９０nmであった。ｐＨ７のリン酸バッファーを１０ｍL滴下した後、外設５５℃で５時間架橋処理を行った。
【００８２】
実施例７
酸処理ゼラチンを１０ｍｇ、トランスグルタミナーゼ製剤（味の素（株）製アクティバTG-S）を５ｍｇ、イオン交換水を１ｍL混合する。前記溶液１mLを、外設４０℃、８００rpmの攪拌条件で、マイクロシリンジを用いて、エタノール１０ｍL中に注入した。得られた分散液を外設５５℃で５時間静置することで、架橋された酸処理ゼラチンナノ粒子が得られた。上記粒子のSEM写真を撮影した（図１）。
【００８３】
実施例８
酸処理ゼラチンを１０ｍｇ、コンドロイチン硫酸−Ｃを１ｍｇ、トランスグルタミナーゼ製剤（味の素（株）製アクティバTG-S）を５ｍｇ、アドリアマイシン（和光純薬工業（株）製ドキソルビシン塩酸塩）を０．４mg、イオン交換水を１ｍL混合する。前記溶液１mLを、外設４０℃、８００rpmの攪拌条件で、マイクロシリンジを用いて、エタノール１０ｍL中に注入した。得られた分散液を外設５５℃で５時間静置することで、架橋されたゼラチンナノ粒子が得られた。上記粒子の平均粒経は、光散乱光度計（大塚電子（株）製ＤＬＳ−７０００）を用い測定したところ、７０nmであった。このナノ粒子分散液を遠心分離し、上澄のエタノールを捨て、生理食塩水を加えてアドリアマイシン濃度が200μｇ／ｍLになるように再分散させた。アドリアマイシン量は吸収スペクトル（Abs.480nm）から算出した。再分散後の平均粒径を、光散乱光度計（大塚電子（株）製ＤＬＳ−７０００）を用い測定したところ、１７４nmであった。水溶媒中でも前記光散乱光度計による粒子サイズ測定が可能であることから、粒子中での酵素架橋反応が進行し、架橋により水不溶化したゼラチンナノ粒子を作製できたことが裏付けられる。
【００８４】
実施例９
ＨｅｐＧ２細胞を２０×１０^３ cells/wellの濃度で１００μLづつ播種したマイクロプレートに、２μｇ／ｍL、５μｇ／ｍLの濃度に調整したアドリアマイシン水溶液および実施例８で作製したアドリアマイシンを内包したゼラチンナノ粒子を添加する。７２ｈ培養後、２回培地を洗う。セルカウンティングキット-８（（株）同仁化学研究所製）を１０μLずつ添加し、２．５時間呈色反応を行い、吸光度を測定した（図２）。ナノ粒子に封入することによりアドリアマイシンの毒性が軽減された。
【００８５】
実施例１０
上記実施例の酸処理ゼラチンに代えて遺伝子組み換えゼラチン（100ｋＤ、フィブロジェン社製）を使用しても同様に良好な結果が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、本発明のゼラチンナノ粒子を撮影した結果を示す。
【図２】図２は、アドリアマイシン水溶液およびアドリアマイシン内包ゼラチンナノ粒子の細胞毒性試験の結果を示す。
【図１】
2007224012.tif 000003
【図２】
2007224012.tif 000004