(57)【要約】【課題】  ＮＥＤＬ１の発現を制御する経路を見出し、それを利用したＦＡＬＳの発症又は進行を抑える化合物のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】  以下の工程を備えるスクリーニング方法：被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件において細胞を培養する工程；培養したそれぞれの細胞における、ＨＩＦ−１αの発現量を測定する工程；及び被検化合物の存在下において培養した細胞におけるＨＩＦ−１αの発現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるＨＩＦ−１αの発現量よりも少ない場合に、当該被検化合物を家族性筋萎縮性側索硬化症の発症又は進行を抑える化合物であると判定する工程。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件において細胞を培養する工程と、
培養したそれぞれの細胞における、ＨＩＦ−１αの発現量を測定する工程と、
被検化合物の存在下において培養した細胞におけるＨＩＦ−１αの発現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるＨＩＦ−１αの発現量よりも少ない場合に、当該被検化合物を家族性筋萎縮性側索硬化症の発症又は進行を抑える化合物であると判定する工程と、
を備える、家族性筋萎縮性側索硬化症の発症又は進行を抑える化合物のスクリーニング方法。
【請求項２】
患者から採取した神経細胞における、ＨＩＦ−１αの発現量を測定する工程と、
ＨＩＦ−１αの発現量が多い患者を家族性筋萎縮性側索硬化症に罹患していると判定する工程と、
を備える、家族性筋萎縮性側索硬化症の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、家族性筋萎縮性側索硬化症の発症又は進行を抑える化合物のスクリーニング方法に関する。また、本発明は、家族性筋萎縮性側索硬化症の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；Amyotrophic Lateral Sclerosis）は神経難病の一つであり、脊髄の運動ニューロンの脱落により発症後数年で歩行困難となり、最後には死に至る悲惨な疾患である。ＡＬＳの原因はいまだ不明であり、予防・治療法もないのが現状である。１９９３年にポジショナルクローニングにより、常染色体優性遺伝の家族性ＡＬＳ（ＦＡＬＳ；Familial Amyotrophic Lateral Sclerosis）の約２０％がスーパーオキシドジスムターゼ−１（ＳＯＤ−１）の変異で発症することが報告された（非特許文献１）。ＳＯＤ−１は細胞質で活性酸素腫（ＲＯＳ；Reactive Oxygen Species）から過酸化水素への反応を触媒する酵素である。しかし、ＦＡＬＳにおいて、ＳＯＤ−１活性レベルと病状との間に相関が見出されないことから（非特許文献２）、変異ＳＯＤ−１の示すtoxic-gain-of-functionがＦＡＬＳの原因であろうと考えられ、原因解明が大きな注目を集めている。
【０００３】
ＦＡＬＳにおいてＳＯＤ−１活性レベルと病状との間に相関が認められないが、運動ニューロンにおいては、酸化還元系の以上のためにＲＯＳが過剰に産生されており、これがＦＡＬＳの発症に深く関与していることを示す報告がなされている（非特許文献３、４）。また、ＲＯＳの発生を抑制する抗酸化剤がＡＬＳの発症を遅延させる可能性も指摘されている（非特許文献５、６）。
【０００４】
ＦＡＬＳモデルマウスの脊髄中には、炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）やインターロイキン１（ＩＬ１）が発症前に多く含まれていることが報告されており、運動ニューロンの細胞死に炎症反応が関与していることが示唆されている（非特許文献７、８）。
【０００５】
最近、変異ＳＯＤ−１と結合し、ユビキチン化するＨＥＣＴ型Ｅ３リガーゼとしてＮＥＤＬ１が発見された（非特許文献９）。ＮＥＤＬ１は変異ＳＯＤ−１をユビキチン化しプロテアソームにおける分解を促進するが、野生型ＳＯＤ−１をユビキチン化しない。また、数種の異なる変異ＳＯＤ−１により発症したＦＡＬＳの重症度と、各々の変異ＳＯＤ−１とＮＥＤＬ１との結合の程度とが、正の相関を示した。以前から、変異ＳＯＤ−１は粗面小胞体上の親水性チャネル（translocon）の成分の一つであるtranslocon-associatedprotein-δ（ＴＲＡＰ−δ）と結合することが知られていたが、ＮＥＤＬ１もＴＲＡＰ−δと結合する。一方、ＮＥＤＬ１はＷｎｔシグナル伝達系の鍵分子であるDishevelled-1（ＤＶＬ１）とも結合し、ユビキチン化することが明らかになった。これらの結果から、ＮＥＤＬ１は変異ＳＯＤ、ＴＲＡＰ−δ、Ｄｖｌ１とユビキチン化複合体を形成し、この複合体が有する毒性のために運動ニューロンが死に至るのではないかと推測されている。
【０００６】
一方、細胞が低酸素条件に曝露されると、低酸素応答シグナル伝達経路の鍵分子であるhypoxia-inducible factor-1（ＨＩＦ−１）が誘導されることが知られている（非特許文献１０）ＨＩＦ−１は、ＨＩＦ−１αとＨＩＦ１−β／ＡＲＮＴ（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator）の２つのサブユニットで構成され、両サブユニットともにＰＡＳドメインを有するbasichelix-loop-helix（ｂＨＬＨ）型転写因子サブファミリーに属する（非特許文献１１）。ＨＩＦ−１α分子中には２ヶ所の転写活性化領域が存在する。ＨＩＦ−１αは、ｍＲＮＡレベルでは常に発現しているが、タンパク質は合成されるとすぐに分解されるため、通常は検出限界以下である。これに対して、ＨＩＦ−１βは恒常的に発現している。ＨＩＦ−１αの分解には、HIF prolyl hydroxylase（ＰＤＨ）が関与している。現在までに４つのＰＤＨ（ＰＤＨ１〜４）が発見されている。ＰＤＨはＨＩＦ−１αタンパク質中の４０２番目と５６４番目のプロリン残基を水酸化する。プロリン残基が水酸化されたＨＩＦ−１αは、von Hippel Lindauタンパク質（ｐＶＨＬ）、elonginB、elongin C、ＣＵＬ及びＲＢＸ１からなるＥ３−ユビキチンリガーゼ複合体によりユビキチン化され、２６Ｓプロテアソームで速やかに分解される。しかし、低酸素下では、酸素分子要求性のＰＤＨの活性が低下するためにＨＩＦ−１αが分解されなくなり、タンパク質として検出されるようになる。また、ＰＨＤを抑制する作用を有するデスフェリオキサミン（ＤＦＯ）に細胞を曝露すると、通常酸素下でもＨＩＦ−１αが検出されるようになる（非特許文献１２）。４０２番目と５６４番目のプロリンをアラニンに変換させたＨＩＦ−１α（ＨＩＦ−１αＰ４０２Ａ／Ｐ５６４Ａ）は、もはやＰＤＨにより水酸化されなくなるため分解されず、いわゆる構成的活性化変異体（constitutive active mutant）としての挙動を示す（非特許文献１３）。
【０００７】
ＨＩＦ−１αの安定化にＲＯＳが関与しているという報告がなされている。低酸素下では、ミトコンドリアにおけるＲＯＳの発生が増加し、これがＨＩＦ−１αの安定化に寄与することが見出された（非特許文献１４）。ミトコンドリア呼吸鎖の阻害剤の中で、ＲＯＳの産生を抑制する阻害剤を細胞に作用させると、ＨＩＦ−１活性が阻害され、逆にＲＯＳの産生を促進する阻害剤を細胞に作用させると、ＨＩＦ−１活性が通常酸素下でも増加した（非特許文献１４）。また、ミトコンドリアＤＮＡ欠損細胞では、低酸素下でもＨＩＦ−１の活性化は起こらなかった。さらに、過酸化水素の産生を増加させるＳＯＤを細胞で過剰発現させるとＨＩＦ−１が活性化された。これらの結果は、ＨＩＦ−１αの安定化にＲＯＳが関与していることを示している。
【０００８】
ＨＩＦ−１αはいくつかの増殖因子（例えばインスリン、インスリン様増殖因子１及び２、上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子２、血小板由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β１など）及び炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ１、ＴＮＦαなど）などにより、通常酸素下においても発現が誘導される（非特許文献１１、１５）。
【０００９】
これまでに、ＨＩＦ−１により転写が活性化される遺伝子が数多く見出されている。例えば、血管新生を促進する血管内皮増殖因子、赤血球産生を促進するエリスロポエチン、エネルギー代謝に関与する解糖系酵素（乳酸デヒドロゲナーゼやアルドラーゼＡなど）やグルコーストランスポーター１、アポトーシスを促進するＢＮＩＰ３などの遺伝子の転写が活性化される。これらの多くの遺伝子の中に、ＨＩＦ−１結合配列5'-(A/G)CGTG-3'が存在することが報告されている（非特許文献１１）。
【００１０】
上記のように、ＦＡＬＳの発症には、変異ＳＯＤ１、ＮＥＤＬ１、ＲＯＳ及び炎症性サイトカイン（ＩＬ１やＴＮＦαなど）が密接に関与していることが考えられる。しかし、ＦＡＬＳの発症には、これらの分子それぞれ単独では不十分であると考えられ、これらの物質を機能的に結びつける何らかの分子が存在することが予想される。
【００１１】
【非特許文献１】Rosen DR et al. Nature 364:59-62,1993
【非特許文献２】Wong PC et al. Neuron14:1105-1116, 1995
【非特許文献３】Liu D et al., FASEB J. 13: 2318-2328, 1999
【非特許文献４】Said Ahmed M et al., J Neurol Sci. 176: 88-94, 2000
【非特許文献５】Jung C et al., Neurosci Lett. 304:157-160, 2001
【非特許文献６】Di Matteo V and Esposito E., Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. 2:95-107, 2003
【非特許文献７】Hensley K et al., J Neurochem. 82: 365-374, 2002
【非特許文献８】Yoshihara T et al., J Neurochem. 80: 158-167, 2002
【非特許文献９】Miyazaki K et al., J Biol Chem. 279: 11327-11335, 2004
【非特許文献１０】Wang GL and Semenza GL. J.Biol Chem. 268: 21513-21518, 1993
【非特許文献１１】Zagorska A and Dulak J. Acta Biochim. Pol. 51: 563-585, 2004
【非特許文献１２】Wang GL and Semenza GL.Blood 82: 3610-3615, 1993
【非特許文献１３】Yu F et al. Proc Natl Acad Sci USA. 98:9630-9635, 2001
【非特許文献１４】Chandel NS et al. Proc Natl Acad Sci USA. 95:11715-11720, 1998
【非特許文献１５】T Hell-B et al.,Blood 94:1561-1567,1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ＮＥＤＬ１の発現を制御する経路を見出すことができれば、ＦＡＬＳの治療・予防薬の開発につながる可能性がある。したがって、本発明の目的の一つは、ＮＥＤＬ１の発現を制御する経路を見出すことである。また、本発明の別の目的は、ＦＡＬＳの発症又は進行を抑える化合物のスクリーニング方法を提供することである。さらに、本発明の別の目的は、ＦＡＬＳの診断方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、ヒト神経芽腫におけるＨＩＦ−１の標的遺伝子を探索する目的で、低酸素で発現の変化する遺伝子をＤＮＡチップ（神経芽腫由来の約１１，０００個の遺伝子を搭載）を用いて検討したところ、驚いたことにＮＥＤＬ１遺伝子の発現が増加することを見出した。さらにＲＴ−ＰＣＲ法などを用いた実験結果から、ＮＥＤＬ１の発現がＨＩＦ−１の下流で制御されていることを見出した。そして、以上の知見から、本発明者らは本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件において細胞を培養する工程と、培養したそれぞれの細胞における、ＨＩＦ−１αの発現量を測定する工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞におけるＨＩＦ−１αの発現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるＨＩＦ−１αの発現量よりも少ない場合に、当該被検化合物をＦＡＬＳの発症又は進行を抑える化合物であると判定する工程と、を備えるＦＡＬＳの発症又は進行を抑える化合物のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法は、ＮＥＤＬ１の発現がＨＩＦ−１の下流で制御されているというメカニズムに基づくものである。このスクリーニング方法により、今までとは作用機序が異なるＦＡＬＳの発症又は進行を抑える化合物を得ることが可能である。かかる化合物は、ＦＡＬＳの治療・予防薬に応用することが可能である。
【００１５】
また、本発明は、患者から採取した神経細胞における、ＨＩＦ−１αの発現量を測定する工程と、ＨＩＦ−１αの発現量が多い患者をＦＡＬＳに罹患していると判定する工程と、を備えるＦＡＬＳの診断方法を提供する。この診断方法は、ＮＥＤＬ１の発現がＨＩＦ−１の下流で制御されているというメカニズムに基づくものである。今までとは異なる判断基準でＦＡＬＳの診断を下すことが可能である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のスクリーニング方法によれば、今までとは作用機序が異なるＦＡＬＳの発症又は進行を抑える化合物を得ることが可能である。また、本発明のＦＡＬＳの診断方法によれば、今までとは異なる判断基準によりＦＡＬＳの診断を下せ、ＦＡＬＳの初期段階の診断に利用できる可能性がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００１８】
（ＦＡＬＳの発症又は進行を抑える化合物のスクリーニング方法）
本発明のＦＡＬＳの発症又は進行を抑える化合物のスクリーニング方法は、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件において細胞を培養する工程と、培養したそれぞれの細胞における、ＨＩＦ−１αの発現量を測定する工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞におけるＨＩＦ−１αの発現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるＨＩＦ−１αの発現量よりも少ない場合に、当該被検化合物をＦＡＬＳの発症又は進行を抑える化合物であると判定する工程と、を備える。
【００１９】
本スクリーニング方法に用いる細胞は、ＨＩＦ−１αを発現する細胞であれば特に限定されず、例えば、ヒト神経芽腫のＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）Ｃ細胞が挙げられる。この細胞を被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下で培養する。
【００２０】
次に、培養したそれぞれの細胞におけるＨＩＦ−１αの発現量を測定する。ここで、ＨＩＦ−１αの発現量とは、ＨＩＦ−１α  ｍＲＮＡ及び／又はＨＩＦ−１α  タンパク質の発現量を指す。ＨＩＦ−１αの発現量の測定は、当業者にとって公知の方法で行うことができる。例えば、ｍＲＮＡの測定は、ノーザンブロッティング、定量的又は半定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイなどで行うことができる。また、タンパク質の測定は、ウエスタンブロットなどで行うことができる。
【００２１】
測定の結果、被検化合物の存在下において培養した細胞におけるＨＩＦ−１αの発現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるＨＩＦ−１αの発現量よりも少ない場合に、当該被検化合物をＦＡＬＳの発症又は進行を抑える化合物であると判定できる。
【００２２】
（ＦＡＬＳの診断方法）
本発明のＦＡＬＳの診断方法は、患者から採取した神経細胞における、ＨＩＦ−１αの発現量を測定する工程と、ＨＩＦ−１αの発現量が多い患者をＦＡＬＳに罹患していると判定する工程と、を備える。
【００２３】
当業者にとって公知の方法に従い、患者から神経細胞を採取する。次に、上述のＨＩＦ−１αの発現量の測定方法により、ＨＩＦ−１αの発現量を測定し、発現量に応じてＦＡＬＳか否かを判定する。例えば、健常者から採取した神経細胞におけるＨＩＦ−１αの発現量を基準値として、患者のＨＩＦ−１αの発現量が基準値の所定倍数上回っている場合に、その患者をＦＡＫＳであると判定できる。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２５】
（ＨＩＦ−１α発現ベクターの作製）
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（−）にクローニングされたヒトＨＩＦ−１α  ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿００１５３０）は、Ｇａｓｓｍａｎｎ博士から入手した。このプラスミドからＨＩＦ−１α  ｃＤＮＡをＥｃｏＲＶとＮｏｔＩを用いて切り出し、アガロースゲルで電気泳動した後、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。これをｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社）のＥｃｏＲＶ／ＮｏｔＩ部位にサブクローニングし、プラスミドｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ−１αを作製した。
【００２６】
４０２番目及び５６４番目のプロリン（Ｐ）をアラニン（Ａ）に変換したＨＩＦ−１αＰ４０２Ａ／Ｐ５６４Ａを以下の方法で作製した。まず、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社）と変異導入用プライマー5'-CTTGGAGATGTTAGCTGCCTATATCCCAATGGATGA-3'（配列番号１）及び5'-TCATCCATTGGGATATAGGCAGCTAACATCTCCAAG-3'（配列番号２）を用いて、製造業者の使用説明書に従ってｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ−１αの５６４番目のプロリンをアラニンに変換したｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ−１αＰ５６４Ａを作製した。次に、ｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ−１αＰ５６４Ａの４０２番目のプロリンをアラニンに変換したｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ−１αＰ４０２Ａ／Ｐ５６４Ａを、変異導入用プライマー5'-CTTTGCTGGCCGCAGCCGCTGGAG-3'（配列番号３）及び5'-CTCCAGCGGCTGCGGCCAGCAAAG-3'（配列番号４）を用いて同様の方法で作製した。
【００２７】
（細胞培養）
ヒト神経芽腫ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）Ｃ細胞は、１０％熱処理済みウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。低酸素下培養は、細胞をナプコ自動Ｏ２／ＣＯ２細胞培養装置（和研薬株式会社）中に入れ、２％酸素濃度下で行った。ＤＦＯ（シグマ社）処理は、細胞を２５０μＭのＤＦＯに２４時間さらすことにより行った。
【００２８】
（遺伝子導入）
細胞への遺伝子導入は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン社）を用いて、以下の手順で行った。遺伝子導入時に約７０％の密度になるように細胞を直径６ｃｍの培養シャーレ（＃３００２；ファルコン社）に播き、３７℃で一晩培養した。４μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００をポリスチレンチューブ（＃２０５８；ファルコン社）中の１００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（インビトロジェン社）に加え、室温で５分静置した。これに、１００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地に溶解した２．５μｇのプラスミドＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ−１α又はｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ−１αＰ４０２Ａ／Ｐ５６４Ａ）を加え、室温で１５分間静置し、ＤＮＡ−リポソーム複合体を形成させた。細胞の培地を３ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地に交換し、そこにＤＮＡ−リポソーム複合体を培養シャーレ全面にいきわたるように添加した。３７℃で５時間培養した後、０．６ｍＬのＦＢＳと２．４ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を添加した。翌日に、培地を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に交換し、さらに４８時間培養した。
【００２９】
（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ））
ＴＲＩＺＯＬ試薬（インビトロジェン社）を用いて、製造業者の使用説明書に従って、未処理、低酸素処理、ＤＦＯ処理した細胞及び遺伝子導入細胞から全ＲＮＡを調製した。ＲＴ−ＰＣＲは以下の手順で行った。調製した全ＲＮＡ（１μｇ／２．５μＬ）を７５℃で５分間インキュベートし、その後、氷上で５分間静置した。０．５μＬのＲＮａｓｅ阻害剤（４０ユニット／μＬ；東洋紡社）０．５μＬのＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（２００ユニット／μＬ；インビトロジェン社）、１μＬの５０×ｄＮＴＰｓ（各２ｍＭ）、０．５μＬのオリゴ（ｄＴ）プライマー（０．５ｍｇ／ｍＬ；インビトロジェン社）、２μＬの５×ファーストストランド緩衝液（インビトロジェン社）及び１μＬの０．１Ｍジチオスレイトールの混合液に、用意したＲＮＡを加え、室温で１０分間、３７℃で４５分間、９５℃で３０分間インキュベートし、ｃＤＮＡを作製した。作製したｃＤＮＡを鋳型にして、下記のＰＣＲ条件とプライマーを用いて、ＮＥＤＬ１及びβ−アクチン遺伝子のｃＤＮＡ断片を増幅した。１μＬのｃＤＮＡ、２μＬの５×緩衝液、０．５μＬのｄＮＴＰｓ（各２ｍＭ）、０．０５μＬのＧｏＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５ユニット／ｍＬ；プロメガ社）及び０．５μＬずつのセンス及びアンチセンスプライマー（１０μＭ）を混合し、水を加えて全量を１０μＬにした。ＰＣＲはＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＴ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（アプライドバイオシステムズ社）を用いて行った。ＰＣＲの条件は、まず、９５℃で２分間熱変性を行った後、熱変性（９５℃、１５秒）、アニーリング（６０℃、１５秒）及び伸長（７２℃、２０秒）のサイクルを３２〜３５回行い、７２℃で６分間インキュベートした後、１０℃に冷却した。用いたプライマーの塩基配列は次の通りである。
ＮＥＤＬ１  センスプライマー：5'-CCAGGGAACCAAAGCATAGA-3'（配列番号５）
アンチセンスプライマー：5'-GTGGATGCGGATGTAGTGCG-3'（配列番号６）
β−アクチン  センスプライマー：5'-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3'（配列番号７）
アンチセンスプライマー：5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3'（配列番号８）
増幅したＰＣＲ産物を、エチジウムブロミドを含む１％アガロースゲルで電気泳動した後、ＵＶイルミネーター中でＤＮＡバンドを観察した。
【００３０】
（実施例１）
正常酸素下及び低酸素下（２％酸素）で２４時間培養したＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）Ｃ細胞から調製した全ＲＮＡを用いて、発現の変化している遺伝子をＤＮＡチップを用いて解析したところ、ＮＥＤＬ１遺伝子の発現が増加していた（データは示さない）。
【００３１】
次に、２％酸素濃度下で、０、３、６、１２及び２４時間培養したＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）Ｃ細胞から全ＲＮＡを調製し、ＮＥＤＬ１  ｍＲＮＡの発現を半定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて検討したところ、低酸素に応答してＮＥＤＬ１  ｍＲＮＡの発現が増加することが確認された（図１）。また、１％酸素の条件やＤＦＯ処理によっても、ＮＥＤＬ１  ｍＲＮＡの発現が増加した（図２）。
【００３２】
ＮＥＤＬ１  ｍＲＮＡの発現亢進がＨＩＦ−１を介するものかどうかを検討するため、細胞に野生型又は構成的活性化型ＨＩＦ−１αを発現するベクターであるｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ１−α又はｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ１−αＰ４０２Ａ／Ｐ５６４Ａを遺伝子導入した後にＮＥＤＬ１遺伝子の発現を調べた。その結果、ｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ１−αＰ４０２Ａ／Ｐ５６４Ａを導入した細胞において、明らかなＮＥＤＬ１  ｍＲＮＡの発現亢進が認められた（図３）。ｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ−１αを導入した細胞では発現亢進が認められなかったが、これは、野生型ＨＩＦ−１αが分解されるためだと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明のスクリーニング方法によれば、今までとは作用機序が異なるＦＡＬＳの発症又は進行を抑える化合物を得ることが可能である。また、本発明のＦＡＬＳの診断方法によれば、今までとは異なる判断基準によりＦＡＬＳの診断を下せ、ＦＡＬＳの初期段階の診断に利用できる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】低酸素下（２％酸素）で培養したＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）Ｃ細胞におけるＮＥＤＬ１  ｍＲＮＡの発現量を表す図である。
【図２】様々な条件下で培養したＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）Ｃ細胞におけるＮＥＤＬ１  ｍＲＮＡの発現量を表す図である。
【図３】野生型及び構成的活性化型のＨＩＦ−１αを発現させたときのＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）Ｃ細胞におけるＮＥＤＬ１  ｍＲＮＡの発現量を表す図である。
【図４】ＨＩＦ−１及びＮＥＤＬ１との関係を表す、本発明の概略図である。
【図１】
2007043990.tif 000002
【図２】
2007043990.tif 000003
【図３】
2007043990.tif 000004
【図４】
2007043990.tif 000005
【配列表】
2007043990000001.app