(57)【要約】      （修正有）【課題】合成したタンパク質の構造変化及び該タンパク質の膜への付着や膜の目詰りを避けることができ、並びに簡便かつ大量合成を可能とする無細胞タンパク質合成方法の提供。【解決手段】（１）合成したタンパク質が捕捉された担体を含む無細胞タンパク質合成反応液を無細胞タンパク質合成系から回収し、該合成したタンパク質を該担体から分離する。その後、好適には、合成したタンパク質が捕捉された担体が回収された後の無細胞タンパク質合成反応液を無細胞タンパク質合成系にもどし、複数回タンパク質合成を行う。（２）合成したタンパク質が捕捉された担体のみを無細胞タンパク質合成反応液から回収し、該担体が回収された後の無細胞タンパク質合成反応液で複数回タンパク質合成を行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
無細胞タンパク質合成方法において、次の工程を含むタンパク質合成・回収一体型無細胞タンパク質合成方法：
１）無細胞タンパク質合成液を用いてタンパク質合成反応を行う工程、
２）合成されるタンパク質と特異的に結合できる担体を無細胞タンパク質合成反応液に添加し、合成反応により生成したタンパク質を該担体で捕捉する工程、
３）２）の工程の後、該担体を無細胞タンパク質合成系から回収する工程。
【請求項２】
上記１）のタンパク質合成反応を複数回行うことを特徴とする請求項１の方法。
【請求項３】
上記３）の回収において、合成したタンパク質を無細胞タンパク質合成中、複数回の無細胞タンパク質合成反応毎の合間、又は無細胞タンパク合成反応終了後に回収することを特徴とする請求項１又は２の方法。
【請求項４】
上記３）の回収において、合成したタンパク質を回収するために、合成したタンパク質が捕捉された担体を含む無細胞タンパク質合成反応液の一部又は全部を無細胞タンパク質合成系から回収することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１の方法。
【請求項５】
上記３）の回収において、合成したタンパク質を回収するために、担体のみを無細胞タンパク質合成系から回収することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１の方法。
【請求項６】
合成したタンパク質が捕捉された担体が回収された後の無細胞タンパク質合成反応液を、無細胞タンパク質合成系にもどすことを特徴とする請求項４の方法。
【請求項７】
無細胞タンパク質合成による副産物を無細胞タンパク質合成系外に除去する方法を含む請求項１〜６のいずれか１の方法。
【請求項８】
複数回のタンパク質合成反応のために、基質、エネルギー源及び／又は翻訳鋳型の無細胞タンパク質合成系内への補充が行われる請求項１〜７の何れか一に記載の方法。
【請求項９】
合成したタンパク質と特異的に結合できる担体が、以下のいずれか１から選ばれる請求項１〜８の何れか一に記載の方法。
１）合成したタンパク質を特異的に結合できる物質を固定したビーズ
２）合成したタンパク質を特異的に結合できる物質を固定した磁気ビーズ
３）合成したタンパク質を特異的に結合できるイオン交換樹脂
４）合成したタンパク質を特異的に結合できるアフィニティー樹脂
【請求項１０】
無細胞タンパク質合成液が、以下から選ばれる細胞抽出物由来である請求項１〜９の何れか一に記載の方法。
１）大腸菌、２）植物種子、３）ウサギ網状赤血球、４）昆虫細胞、５）哺乳動物細胞
【請求項１１】
請求項１〜１０いずれか１の無細胞タンパク質の合成方法に用いる試薬の少なくとも１を含む合成キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質合成・回収一体型無細胞タンパク質合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム計画の完了を間近に控えて、研究課題の中心は遺伝子構造解析から遺伝子機能解析へ急速に展開している。細胞内におけるタンパク質は、単独で機能しているのではない。それは、多種多様なタンパク質因子、核酸、低分子生理活性物質及び細胞膜成分等と協調して相互作用することによって機能が発現し、そして、それらの相互作用の総和として生物学的機能が営まれているものと考えられている。
ポストゲノム計画の中心課題の一つは、多種多様なタンパク質因子の複合体の構造と機能の関係を解析することである。ここから得られる成果は、構造生物学や生化学を含む基礎生物学などの研究、医学分野における遺伝子翻訳産物と病因との関係解明、そして医薬の開発における広い分野において極めて重要な知見を提供するものと期待されている。
タンパク質合成反応を生体外で行う方法として、細胞抽出液に翻訳鋳型、基質となるアミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、及びその他の有効因子を加えて試験管内でタンパク質を合成する、いわゆる無細胞タンパク質合成法等の研究が盛んに行われてきている（特許文献１〜５）。
この無細胞タンパク質合成系に用いるタンパク質合成用の細胞抽出液または生体組織抽出液は、大腸菌、コムギ胚芽、または家兎網状赤血球等を原料として調製される。無細胞タンパク質合成系は、"ペプチド合成速度"と"翻訳反応の正確性"の２点において、生細胞に匹敵する性能を保持している。そして、この系は複雑な化学反応工程や煩雑な細胞培養工程を必要としない。この利点を有するため、この系はその実用的なシステムの開発がなされてきた。しかしながら、一般的に、生物体の細胞から抽出した細胞抽出液は、そのタンパク質合成能が極めて不安定なためにタンパク質合成効率が低かった。さらに、保存中の細胞抽出液の品質低下も著しかった。そのため、無細胞タンパク質合成系によって得られる合成物の量は、放射性同位体標識等によって検出可能な程度の少量であった。その結果、この系は実用的なタンパク質の生産手段としては利用できなかった。
【０００３】
本発明者等は先に、従来の無細胞タンパク質合成系の欠点を解決する方法として、以下を提供した。
（１）無細胞タンパク質合成用細胞抽出物製剤および無細胞タンパク質合成方法（特許文献６）、（２）汎用性および高効率機能を備えた鋳型分子並びにこれを利用する無細胞タンパク質合成方法（特許文献７）、（３）拡散連続バッチ法（重層法と呼ぶことがある）（特許文献８）、（４）繰り返しバッチ法を発明している（特許文献９）。
【０００４】
上記合成法は、タンパク質合成反応継続時間が長いこと及び大量のタンパク質を一度に合成できる反面、合成したタンパク質が高密度状態で長時間にわたり合成系に存在する。よって、合成したタンパク質が凝集又は構造が変化することにより変性する問題がある。
これらの問題を解決するために、タンパク質合成過程中に合成したタンパク質を回収する合成方法が開示されている（特許文献１０、１１）。しかし、合成したタンパク質の回収方法は、合成したタンパク質を含む合成反応液ごと回収するものである。すなわち、合成系の合成反応液の減少によりタンパク質合成量の低下の問題があった。
さらに、タンパク質合成反応継続時間が長くなるにつれてタンパク質合成効率が減少するという問題があった。
【非特許文献１】Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１７，１２３−１４２
【特許文献１】特開平６−９８７９０
【特許文献２】特開平６−２２５７８３
【特許文献３】特開平７−１９４
【特許文献４】特開平９−２９１
【特許文献５】特開平７−１４７９９２
【特許文献６】ＷＯ００／６８４１２号号公報
【特許文献７】ＷＯ０１／２７２６０号公報
【特許文献８】ＷＯ０２／２４９３９号公報
【特許文献９】ＷＯ２００４／０９７０１４号公報
【特許文献１０】特開平４−２００３９０
【特許文献１１】特開２００５−６６０３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、無細胞タンパク質合成方法において、合成したタンパク質の構造変化を避けることができ、タンパク質合成反応継続時間が長くなるにつれてタンパク質合成効率が減少することを避けることができ、並びに簡便かつ大量合成を可能とする無細胞タンパク質合成方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、合成したタンパク質の構造変化を避けるために、またタンパク質合成反応継続時間が長くなるにつれてタンパク質合成効率が減少する原因の１つとして合成したタンパク質の膜への付着があることより、合成したタンパク質を捕捉できる担体を無細胞タンパク質合成液に添加すること、合成反応工程中において、合成したタンパク質を回収するために、無細胞タンパク質合成反応液ごと回収することによる無細胞タンパク質合成反応液量の減少によりタンパク質合成量の低下に対して、合成したタンパク質が回収された後の無細胞タンパク質合成反応液を、無細胞タンパク質合成系にもどすことを検討した。
以上の検討により、以下の２つのメインのタンパク質合成・回収一体型無細胞タンパク質合成方法を構築した。
（１）合成したタンパク質が捕捉された担体を含む無細胞タンパク質合成反応液の一部又は全部を無細胞タンパク質合成系から回収し、該合成したタンパク質を該担体から分離する。その後、好適には、合成したタンパク質が捕捉された担体が回収された後の無細胞タンパク質合成反応液を無細胞タンパク質合成系にもどし、複数回タンパク質合成を行う（以後、Ａ方法と称する場合あり）。
（２）合成したタンパク質が捕捉された担体のみを無細胞タンパク質合成反応液から回収し、該担体が回収された後の無細胞タンパク質合成反応液で複数回タンパク質合成を行う（以後、Ｂ方法と称する場合あり）。
その結果、合成したタンパク質の構造変化を避けることができ、かつ合成したタンパク質の膜への付着や膜の目詰りを解消でき、さらにタンパク質を大量合成できる無細胞タンパク質合成方法を構築し、本発明を完成した。
【０００７】
つまり、本発明は以下からなる；
「１．無細胞タンパク質合成方法において、次の工程を含むタンパク質合成・回収一体型無細胞タンパク質合成方法：
１）無細胞タンパク質合成液を用いてタンパク質合成反応を行う工程、
２）合成されるタンパク質と特異的に結合できる担体を無細胞タンパク質合成反応液に添加し、合成反応により生成したタンパク質を該担体で捕捉する工程、
３）２）の工程の後、該担体を無細胞タンパク質合成系から回収する工程。
２．上記１）のタンパク質合成反応を複数回行うことを特徴とする前項１の方法。
３．上記３）の回収において、合成したタンパク質を無細胞タンパク質合成中、複数回の無細胞タンパク質合成反応毎の合間、又は無細胞タンパク合成反応終了後に回収することを特徴とする前項１又は２の方法。
４．上記３）の回収において、合成したタンパク質を回収するために、合成したタンパク質が捕捉された担体を含む無細胞タンパク質合成反応液の一部又は全部を無細胞タンパク質合成系から回収することを特徴とする、前項１〜３のいずれか１の方法。
５．上記３）の回収において、合成したタンパク質を回収するために、担体のみを無細胞タンパク質合成系から回収することを特徴とする前項１〜３のいずれか１の方法。
６．合成したタンパク質が捕捉された担体が回収された後の無細胞タンパク質合成反応液を、無細胞タンパク質合成系にもどすことを特徴とする前項４の方法。
７．無細胞タンパク質合成による副産物を無細胞タンパク質合成系外に除去する方法を含む前項１〜６のいずれか１の方法。
８．複数回のタンパク質合成反応のために、基質、エネルギー源及び／又は翻訳鋳型の無細胞タンパク質合成系内への補充が行われる前項１〜７の何れか一に記載の方法。
９．合成したタンパク質と特異的に結合できる担体が、以下のいずれか１から選ばれる前項１〜８の何れか一に記載の方法。
１）合成したタンパク質を特異的に結合できる物質を固定したビーズ
２）合成したタンパク質を特異的に結合できる物質を固定した磁気ビーズ
３）合成したタンパク質を特異的に結合できるイオン交換樹脂
４）合成したタンパク質を特異的に結合できるアフィニティー樹脂
１０．無細胞タンパク質合成液が、以下から選ばれる細胞抽出物由来である前項１〜９の何れか一に記載の方法。
１）大腸菌、２）植物種子、３）ウサギ網状赤血球、４）昆虫細胞、５）哺乳動物細胞
１１．前項１〜１０いずれか１の無細胞タンパク質の合成方法に用いる試薬の少なくとも１を含む合成キット。」
【発明の効果】
【０００８】
本発明の無細胞タンパク質合成方法は、従来にない、合成したタンパク質の構造変化を避けることができ、かつ合成したタンパク質の膜への付着や膜の目詰りを解消でき、並びに簡便かつ大量合成を可能とする無細胞タンパク質合成方法を構築した。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、mRNAを原料にする無細胞タンパク質合成系において、少なくとも以下の工程を含む、無細胞タンパク質合成方法である。
１）無細胞タンパク質合成液を用いてタンパク質合成反応を行う工程、
２）合成されるタンパク質と特異的に結合できる担体を無細胞タンパク質合成反応液に添加し、合成反応により生成したタンパク質を該担体で捕捉する工程、
３）２）の工程の後、該担体を無細胞タンパク質合成系から回収する工程。
つまり本発明は、合成反応工程中において、合成したタンパク質を担体で捕捉することによって、合成したタンパク質が変性することを防ぎ、合わせて合成したタンパク質の膜への付着や膜の目詰りを解消できることを大きな特徴とする合成法である。
なお、合成したタンパク質が捕捉された担体の回収時期は、合成反応工程中である。本発明の合成反応工程中とは、通常の１回の無細胞タンパク合成工程中（合成開始前も含む）だけではなく、無細胞タンパク質合成反応が停止した後に次の合成を再開される間、さらに２回目以降の合成工程中若しくは後並びに複数回の無細胞タンパク質合成反応毎の合間も含まれる。また、複数回とは、「２回以上」であることを意味する。
さらに、本発明の無細胞タンパク質合成方法は、従来既知の無細胞タンパク質合成方法であるバッチ法、透析法、重層法、繰り返しバッチ法、繰り返し供給バッチ法、繰り返し重層法でも適用可能である。
【００１０】
（１）Ａ方法
Ａ方法の概要は以下の通りである。
無細胞タンパク質合成法を行うことが可能な無細胞タンパク質合成系（反応槽）でバッチ法、透析法、重層法、繰り返しバッチ法、繰り返し供給バッチ法、繰り返し重層法でタンパク質合成を行う。そして、合成工程中に、合成したタンパク質が捕捉された担体を含む無細胞タンパク質合成反応液の一部又は全部を無細胞タンパク質合成系から回収する。続いて、合成したタンパク質が捕捉された担体から合成したタンパク質を分離する。なお、合成したタンパク質の分離方法は、合成したタンパク質の特性により異なるが、通常の緩衝液（例えば、高塩濃度条件）を用いる自体公知の方法で分離する。
そして、好適には、合成したタンパク質が捕捉された担体が回収された後の無細胞タンパク質合成反応液を無細胞タンパク質合成系にもどす。
ここで、無細胞タンパク質合成反応液とは、無細胞タンパク質合成液を用いてタンパク質合成反応により得られる反応液を意味する。さらに、好ましくは、タンパク質合成反応効率向上のために、反応液の濃度調整をして、基質、エネルギー源及び／又は翻訳鋳型の無細胞タンパク質合成系内への補充が行われる。
上記タンパク質合成方法では、加えて濃縮処理により副産物を無細胞タンパク質合成系外に除去する方法を含むことができる。
【００１１】
ここで、本発明の一態様としての繰り返しバッチ法では、合成液である反応相に供給液を一度に供給して合成反応に導く。続いて、反応液（反応相）の濃縮処理を行う。濃縮された反応液（反応相）は、供給液の供給により、反応液（反応相）の希釈処理を行う。この希釈処理で、mRNAを原料とする合成に必要とされる基質、エネルギー源、イオン類、緩衝液及び鋳型物質などの成分が補充される。この処理で、反応液（反応相）は元の反応至適濃度にもどされ、タンパク質合成が再活性化される。
そして、この希釈及び濃縮処理は、不連続に繰り返しおこなうことで、大量のタンパク質の合成を可能とする。
本発明のＡ方法では、上記のいずれかの工程中に、合成したタンパク質と特異的に結合できる担体を無細胞タンパク質合成反応液に添加することにより、合成したタンパク質を担体に捕捉させる工程を導入し、さらに、該担体を含む無細胞タンパク質合成反応液の一部又は全部を回収する工程を導入する。続いて、好適には、合成したタンパク質が捕捉された担体が回収された後の無細胞タンパク質合成反応液を反応相にもどす。好ましくは、担体は濃縮処理後の無細胞タンパク質合成反応系から回収する。
【００１２】
本発明の一態様としての繰り返し供給バッチ法では、合成液である反応相に供給液を連続又は不連続に供給して合成反応に導き、合成速度の略低下前後、合成反応の略停止前後、又はそれらの途上に、供給液の供給を停止する。続いて、反応液（反応相）の濃縮処理を行う。濃縮された反応液（反応相）は、供給液の連続又は不連続の供給により、反応液（反応相）の希釈処理を行う。この希釈処理で、mRNAを原料とする合成に必要とされる基質、エネルギー源、イオン類、緩衝液及び鋳型物質などの成分が補充される。この処理で、反応液（反応相）は元の反応至適濃度にもどされ、タンパク質合成が再活性化される。
そして、この希釈及び濃縮処理は、不連続に繰り返しおこなうことで、大量のタンパク質の合成を可能とする。
本発明のＡ方法では、上記のいずれかの工程中に、合成したタンパク質と特異的に結合できる担体を無細胞タンパク質合成反応液に添加することにより、合成したタンパク質を担体に捕捉させる工程を導入し、さらに、該担体を含む無細胞タンパク質合成反応液の一部又は全部を回収する工程を導入する。続いて、好適には、合成したタンパク質が捕捉された担体が回収された後の無細胞タンパク質合成反応液を反応相にもどす。好ましくは、担体は濃縮処理後の無細胞タンパク質合成反応系から回収する。
【００１３】
本発明の一態様としての繰り返し重層法では、mRNAを原料にする無細胞タンパク質合成系において重層法の反応速度の高い合成反応初期相の特性を最大限に利用し、その方法は、合成速度の略低下前後又は合成反応の略停止前後、又はそれらの途上に、供給相と反応相の混合処理を行う。続いて、濃縮処理を行う。濃縮後、続いて供給相の重層が施される。
この重層処理で、mRNAを原料とする合成に必要とされる基質、エネルギー源、イオン類、緩衝液などの成分が補充され、タンパク質合成が再活性化される。
そして、この混合、濃縮、重層処理は、不連続に繰り返し行うことで、大量のタンパク質を合成可能とする。
本発明のＡ方法では、上記のいずれかの工程中に、合成したタンパク質と特異的に結合できる担体を無細胞タンパク質合成反応液に添加することにより、合成したタンパク質を担体に捕捉させる工程を導入し、さらに、該担体を含む無細胞タンパク質合成反応液の一部又は全部を回収する工程を導入する。続いて、好適には、合成したタンパク質が捕捉された担体が回収された後の無細胞タンパク質合成反応液を反応相にもどす。好ましくは、担体は濃縮処理後の無細胞タンパク質合成反応系から回収する。
【００１４】
なお、無細胞タンパク質合成反応の効率を上げるために、上記無細胞タンパク質合成反応液又は上記供給相と反応相の混合液に、必要に応じて希釈操作を加えることができる。希釈操作は、濃縮処理の前後を問わず行うことができる。なお、希釈操作とは、緩衝液等を反応相に添加する操作を意味する。なお、緩衝液には、基質、エネルギー源、翻訳鋳型を含むこともできる。
【００１５】
また、本発明の濃縮処理は、自体公知の限外ろ過膜を含む限外ろ過装置を利用することができる。好適には、ビバフローシステムのビバフロー50又はビバフロー200（ザルトリウス社製）を使用することができる。
ビバフローシステムに使用する限外ろ過膜の分画分子量は、担体が通過不能であれば良く、分画分子量が5000〜100000MWCOのものを用いることができるが、好ましくは 5000〜10000MWCOが用いられる。または、膜の穴径としては5nm〜200nmのものを用いることができる。
【００１６】
Ａ方法の構成は以下の通りである。
無細胞タンパク質合成を行うことが可能な反応容器である無細胞タンパク質合成系１（１）、合成したタンパク質と特異的に結合できる担体を含む無細胞タンパク質合成反応液の一部又は全部を回収するために無細胞タンパク質合成系外部に連結している流路２（２）、無細胞タンパク質合成反応液を送液するための送液ポンプ３（３）、流路２の末端に連結しており取り外し可能な担体回収容器４（４）、合成したタンパク質が捕捉された担体が回収された後の無細胞タンパク質合成反応液を無細胞タンパク質合成系にもどすための流路５（５）、無細胞タンパク質合成反応液の流れを止めるための弁６（６）が少なくとも有する（図１参照）。
【００１７】
Ａ方法を利用する無細胞タンパク質の合成方法は以下の通りである。
自体公知の無細胞タンパク質合成を無細胞タンパク質合成系１で行う。合成工程前又は合成工程中に、合成したタンパク質と特異的に結合できる担体を無細胞タンパク質合成系１（１）に添加する。無細胞タンパク質合成反応液をよく攪拌して、合成したタンパク質を該担体に結合させる。次に、反応系内の合成したタンパク質が捕捉された担体を含む無細胞タンパク質合成反応液の一部又は全部を流路２を通じて回収する。続いて、流路２を通じて回収された"合成したタンパク質が捕捉された担体を含む無細胞タンパク質合成反応液"は、担体回収容器４に通される。これにより、合成したタンパク質が捕捉された担体は、担体回収容器内の膜等により担体回収容器内に回収されるが、無細胞タンパク質合成反応液は膜等を通過して、流路５を通して無細胞タンパク質合成系１にもどされる。
次に、各流路の弁６を閉めた後、流路２、流路５と連結している担体回収容器４を、流路から離す。自体公知の溶出液を担体回収容器４に流すことで、合成したタンパク質を溶出（分離）する。そして、担体回収容器４を洗浄液で数回洗浄した後に、流路２、流路５と連結させる。続いて、上記工程を複数回繰り返す。なお、担体回収容器４を離した状態であっても、弁６が閉めてある限り、タンパク質合成を行うことができる。当然に、流路２と流路５の役割をお互いに変えることができる。
本発明では、好適には、合成したタンパク質が捕捉された担体を含む無細胞タンパク質合成反応液の担体回収容器の通過速度を考慮して、無細胞タンパク質合成反応液の送液速度を設定・制御可能な装置を設置することもできる。
【００１８】
また、本発明のＡ方法では、上記のような流路、送液ポンプを有さなくても、実験者が、ピペッター等を用いて合成したタンパク質が捕捉された担体を含む無細胞タンパク質合成反応液を無細胞タンパク質合成系から回収し、各種の回収方法により合成したタンパク質が捕捉された担体を回収する。さらに、合成したタンパク質が捕捉された担体が回収された後の無細胞タンパク質合成反応液を無細胞タンパク質合成系にもどすこともできる。
また、実験者が、ピペッター等を用いて無細胞タンパク質合成反応液を合成したタンパク質が捕捉された担体を含む無細胞タンパク質合成系から回収する場合には、スピンカラムに合成したタンパク質が捕捉された担体を含む無細胞タンパク質合成反応液を添加し、遠心分離後に、上澄液（合成したタンパク質が捕捉された担体を含んでいない）である無細胞タンパク質合成反応液を無細胞タンパク質合成系にもどすこともできる。しかしながら、合成したタンパク質を回収することができる方法であれば、特に限定されない。
【００１９】
合成したタンパク質と特異的に結合できる担体とは、合成したタンパク質を特異的に結合できる物質が固定化されている。該物質の例として、合成したタンパク質が抗原であれば抗体であり、リガンドであれば受容体である。
なお、合成したタンパク質を適当なタグ・マーカーで修飾しておけば、（例えば、ストレプトアビジン、ヒスチジンタグ、GST、マルトース結合タンパク質等）、この修飾物質と特異的に結合しうる物質（例えば、ビオチン、2価金属イオン、グルタチオン、マルトース等）を使って合成したタンパク質を担体に捕捉させることが可能である。
他の合成タンパク質と担体の例は、以下の通りである。
カルモデュリン結合ペプチド融合タンパク質−カルモデュリン結合担体、セルロース結合ドメイン融合タンパク質−セルロース結合担体、キチン結合ドメイン融合タンパク質−キチン結合担体、マルトース結合タンパク質融合タンパク質−アミロース又は架橋したアミロースを結合した担体、FLAGタグ融合タンパク質−FLAGタグに対する抗体を結合した担体なども用いることができる。また、プロティンＡ融合タンパク質、プロティンＧ融合タンパク質をタグとして、これに特異的に結合する免疫グロブリンＦｃフラグメントを結合した担体を用いることもできる。
また、担体の性質は、特に限定されず、合成したタンパク質に負の影響を与えない各種のビーズ、好適にはアガロースビーズ、磁気ビーズ、磁気アガロースビーズが使用できる。
なお、本発明の無細胞タンパク質合成方法で使用できる担体としての市販品のビーズは以下の通りである。なお、当然に本発明の無細胞タンパク質合成方法で使用可能な担体は限定されない。
H1786 HIS-SelectR HC Nickel Magnetic Beads （Sigma社製）
G1919  Glutathione High Capacity Magnetic Agarose Beads（Sigma社製）
His  MagTM Agarose Beads（MERCK社製）
GST  MagTM Agarose Beads （MERCK社製）
TALONTM Magnetic Beads（Clontech社製）
MagneHisTM Ni-Particles （Promega 社製）
MagneGSTTM Particles （Promega 社製）
Promega Streptavidin MagneSphereR Paramagnetic Particles（Promega社製）
また、無細胞タンパク質合成系からの担体の回収方法の一例としては、担体の中に磁石を導入した磁気ビーズを利用すれば、無細胞タンパク質合成系内部での回収だけでなく、無細胞タンパク質合成系外部から磁石の力で担体を無細胞タンパク質合成系外に取り出すことができる。そして、回収した担体を、合成したタンパク質を溶出するための溶液に浸けて、該担体からタンパク質を分離させる。
さらに、合成したタンパク質を結合する部位と他の物質に結合する部位の両方を供えた担体を利用すれば、担体にタンパク質を結合させた後で他の物質を固着させたカラム等を使って担体を回収することができる。
また、上記のように実験者による磁石操作を行わずとも、以下の無細胞タンパク質合成方法を用いることにより容易に担体を回収することができる。
【００２０】
（２）Ｂ方法
従来公知のバッチ法、透析法、重層法、繰り返しバッチ法、繰り返し供給バッチ法及び繰り返し重層法でタンパク質合成を行う。そして、合成開始前又は合成工程中に、合成したタンパク質と特異的に結合できる担体を無細胞タンパク質合成反応液に添加する。そして、該担体を回収した後、合成したタンパク質が捕捉された担体が回収された無細胞タンパク質合成反応液で複数回のタンパク質合成を行う。好ましくは、タンパク質合成反応効率向上のために、基質、エネルギー源及び／又は翻訳鋳型の無細胞タンパク質合成系内への補充が行われる。
上記タンパク質合成方法では、加えて副産物を無細胞タンパク質合成系外に除去する方法を含むことができる。
【００２１】
Ｂ方法の構成は以下の通りである。
第１反応槽８（８）、第２反応槽９（９）、第１反応槽と第２反応槽を連結するための流路１０（１０）、無細胞タンパク質合成反応液を送るための送液ポンプ１１（１１）、第１反応槽と第２反応槽間の無細胞タンパク質合成反応液の流れを止めるための弁１２（１２）、流路１０の両端に担体を通過不可能とする膜１３（１３）を少なくとも有する。好適には、流路１０には、無細胞タンパク質合成反応液を回収するための排出口１４（１４）を有する（図２参照）。
【００２２】
Ｂ方法を利用する無細胞タンパク質の合成方法は以下の通りである。
まず、第１反応槽（第２反応槽を最初に選択することもできる）で無細胞タンパク質合成を行う。合成工程前又は合成工程中に、合成したタンパク質と特異的に結合できる担体を第１反応槽（第２反応槽）に添加する。無細胞タンパク質合成反応液をよく攪拌して、合成したタンパク質を該担体に結合させる。その後、弁１２を開放して、無細胞タンパク質合成反応液を第２反応槽（第１反応槽）に送る。ここで、膜１３の存在により、該担体は第２反応槽（第１反応槽）に移ることはできない。次に、合成したタンパク質が捕捉された担体を空の第１反応槽（第２反応槽）から回収し、一方、送られてきた無細胞タンパク質合成反応液を用いて第２反応槽（第１反応槽）でタンパク質合成を行う。そして、上記工程を繰り返すことにより、第１反応槽、第２反応槽で、交互に複数回タンパク質合成を行う。
さらに、無細胞タンパク質合成反応液の一部又は全部を排出口１４から回収することもできる。
【００２３】
ビバフローシステムを用いたタンパク質合成・回収一体型無細胞タンパク質合成方法
本発明の好ましいタンパク質合成・回収一体型無細胞タンパク質合成方法では、限外濃縮器としてザルトリウス社製のビバフローシステムを用いる。限外濃縮器としてビバフローシステムを利用すること及び合成したタンパク質と特異的に結合できる担体を無細胞タンパク質合成反応液に添加することで、合成したタンパク質は膜への付着や膜の目詰りがほとんどなく、高効率で合成したタンパク質を無細胞タンパク質合成系から回収することができる。
以下、図３を用いて本発明のビバフローシステムを用いたタンパク質合成・回収一体型無細胞タンパク質合成方法を説明する。
反応槽１５（１５）内において、合成したタンパク質と特異的に結合できる担体を、合成するタンパク質mRNAを含む無細胞タンパク質合成液に添加し、無細胞タンパク質合成反応を行う。
さらに、無細胞タンパク質合成工程中に、反応槽１５内の無細胞タンパク質合成液を、流路１６（１６）、流路１７（１７）、流路１８（１８）、ビバフロー１９（１９）、流路２０（２０）を通して、ポンプ２１（２１）で引き、約1/2量の無細胞タンパク質合成液とする（濃縮操作）。なお、ビバフロー１９で濃縮された後の溶液は、溶液回収装置２２（２２）に貯められる。次に、供給液２３（２３）を、流路２４（２４）、流路１７、流路１８、ビバフロー１９、流路２５（２５）を通して、ポンプ２１により反応槽１５内に供給して、約元量の無細胞タンパク質合成液とする（希釈操作）。さらに、希釈操作工程と濃縮操作工程を複数回繰り返す。なお、希釈操作工程と濃縮操作工程は、どちらの工程を先にしても良い。
また、供給液２３を無細胞タンパク質合成反応液に供給する場合には、ビバフロー１９を介することが好ましい。しかしながら、供給液２３は、流路２４、流路１６を通して、反応槽１５内に供給しても良い。なお、このような供給液の流れは、送液切替バブル２６（２６）により切り替えることができる。
さらに、合成したタンパク質を捕捉した担体を反応槽１５から回収する。また、担体回収装置４を各流路（流路２０を除く）、ビバフロー１９、ポンプ２１、送液切替バブル２６に設置することによっても合成したタンパク質を捕捉した担体を回収することができる。
【００２４】
上記いずれの方法でも、合成したタンパク質と特異的に結合できる担体である磁気ビーズを用いて合成タンパク質を回収する方法は特に好ましい。該方法は、操作性が簡便であり、特にろ過吸引等のための遠心操作が必要としないために、反応液に圧力をかける必要がない。これにより、反応液の環境変化が起こらないために合成タンパク質の不溶化を防ぐことができる。また、ろ過吸引等の操作とは異なり、無細胞タンパク質合成反応液中の合成濃度が低い状態であっても合成タンパク質を回収することができるので、合成タンパク質の不溶化が進行する前に回収できる。さらに、合成工程と同時に回収操作も行えるので、合成時間を伸ばして、合成反応の繰り返し回数を抑えることができる。
以上により、特に不溶化するタンパク質に用いるのに好適である。
【００２５】
（１）転写鋳型の作製工程
本明細書において「転写鋳型」とは、インビトロ転写反応の鋳型分子として使用し得るＤＮＡをいい、適当なプロモーター配列の下流に目的タンパク質をコードする塩基配列を少なくとも有する。適当なプロモーター配列とは、転写反応において使用されるＲＮＡポリメラーゼが認識し得るプロモーター配列をいい、例えば、SP6プロモーター、T7プロモーター等が挙げられる。目的タンパク質をコードするＤＮＡはいかなるものであってもよい。
転写鋳型は、プロモーター配列と目的タンパク質をコードする塩基配列との間に翻訳効率を制御する活性を有する塩基配列を有することが好ましく、例えば、タバコモザイクウイルス由来のΩ配列などのＲＮＡウイルス由来の5'非翻訳領域、及び/又はコザック配列等を用いることができる。さらに、転写鋳型は、目的タンパク質をコードする塩基配列の下流に転写ターミネーション領域等を含む3'非翻訳領域を含むことが好ましい。3'非翻訳領域としては、終止コドンより下流の約1.0〜約3.0キロベース程度が好ましく用いられる。これらの3'非翻訳領域は必ずしも目的タンパク質をコードする遺伝子本来のそれである必要はない。
本発明の方法の好ましい実施態様の一つとして、目的タンパク質をコードする転写鋳型をPCR法によって増幅・合成したDNA鋳型を精製することなくそのまま転写鋳型とすることである。
尚、非特異的増幅により生じる短鎖ＤＮＡ（結果として目的産物の収量低下及び低分子翻訳産物ノイズを生じる）の生成を防ぐために、国際公開第ＷＯ０２／１８５８６号に記載のプロモーター分断型プライマーを用いることもできる。
上記のようにして得られる転写鋳型ＤＮＡはクロロホルム抽出やアルコール沈殿により精製した後に転写反応に供してもよいが、本発明のタンパク質合成方法では、ＰＣＲ反応後の合成液をそのまま転写鋳型溶液として使用することが可能である。転写鋳型の作製において、鋳型DNAをプラスミドに導入しないので、一旦プラスミドを大量調製して、これを制限酵素処理して転写鋳型を得る方法と比較して、工程を格段に省略でき、少ない工程数で短時間での転写鋳型の大量合成が可能となる。すなわち、目的タンパク質をコードするDNAを組み込んだプラスミドを調製する工程を必要としないので、プラスミド精製のための超遠心に要する時間を短縮することができる。また、プラスミドから転写鋳型を切り出すための制限酵素処理、及び制限酵素等を除去するためのフェノール処理、クロロホルム処理、転写鋳型の精製のためのアルコール沈殿、転写鋳型であるＤＮＡの沈殿を溶解する工程を省略することができるので、フェノール／クロロホルムの残存による転写反応の阻害や、多工程の精製操作による転写鋳型のロスがない。また、反応に要するステップ数を少なくすることができるので使用するチップ数なども少なくて済むというさらなる利点を有する。
【００２６】
（２）転写反応工程
転写鋳型を、転写鋳型中のプロモーターに適合するRNAポリメラーゼやRNA合成用の基質（4種類のリボヌクレオシド三リン酸）等の転写反応に必要な成分を含む溶液（転写反応溶液ともいう）と混合し、これを約20〜約60℃、好ましくは約30〜約42℃で、約30分〜約16時間、より好ましくは約2〜5時間インキュベートして転写反応をおこなう。
また、好ましい実施態様の一つとして、自体公知の方法を用いて調製された目的タンパク質をコードする転写鋳型ＤＮＡ又は（１）に記載のPCR法によって増幅・合成したDNA鋳型を精製することなくそのまま転写鋳型として調製された目的タンパク質をコードする転写鋳型ＤＮＡから、インビトロ転写反応により翻訳鋳型であるｍＲＮＡを生成させるものである。転写反応は、反応系（例えば、96穴タイタープレートなどの市販の容器）に提供された転写鋳型を含む溶液（未精製mRNAを含む転写溶液）、好ましくはＰＣＲ反応液と、転写鋳型中のプロモーターに適合するＲＮＡポリメラーゼ（例えば、SP6  RNAポリメラーゼなど）やＲＮＡ合成用の基質（4種類のリボヌクレオシド3リン酸）等の転写反応に必要な成分を含む溶液（「転写反応用溶液」ともいう）とを混合した後、約20℃〜約60℃、好ましくは約30℃〜約42℃で約30分間〜約16時間、好ましくは約2時間〜約5時間該混合液をインキュベートすることにより行われる。
なお、本発明の実施例で使用した翻訳鋳型となるmRNAは、GFP遺伝子DNA（Chiu, W. &#8211;L.,et al., Curr. Biol. 6, 325-330 (1996)）が挿入されたpEU-GFPベクター（Sawasaki, T. et al.,PNAS, 99 (23), 14652-7（2002））を基に、Ω配列部分をＷＯ０３／０５６００９号公報に記載の配列番号136の塩基配列に置き換えた環状プラスミドDNAを鋳型として、SP6 RNApolymerase（Promega社製）を用いて転写を行った。
【００２７】
以下の翻訳反応工程に供するため、未精製mRNAを含む転写溶液又は精製mRNAをタンパク質合成用細胞抽出液に直接添加する。ここで用いられるタンパク質合成用細胞抽出液としては、翻訳鋳型を翻訳して該鋳型にコードされるタンパク質を生成させ得るものであれば如何なるものであってもよいが、具体的には、大腸菌、植物種子の胚芽、ウサギ網状赤血球、昆虫細胞、哺乳動物細胞（ヒト由来細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞が挙げられるが、限定されない）等の細胞抽出液等が用いられる。これらは市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には、大腸菌抽出液の場合、Pratt, J. M. et al., Transcription and Translation, Hames, 179-209, B. D. & Higgins, S. J., eds), IRL Press, Oxford (1984)に記載の方法等に準じて調製することもできる。
市販のタンパク質合成用細胞抽出液としては、大腸菌由来では、E.coli S30 extract system（Promega社製）やRTS 500 Rapid Translation System（Roche社製）に添付のもの等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来ではRabbit Reticulocyte Lysate Sytem（Promega社製）に添付のもの等、昆虫細胞由来では、TransdirectTM insect cell（株式会社  島津製作所）等、更にコムギ胚芽由来ではPROTEIOSTM（TOYOBO社製）に添付のもの等が挙げられる。このうち、植物種子の胚芽抽出液の系を用いることが好ましく、植物種子としては、コムギ、オオムギ、イネ、コーン等のイネ科の植物、及びホウレンソウ等の種子が好ましく、特にコムギ種子胚芽抽出液を用いたものが好適である。さらに胚芽の胚乳成分および低分子のタンパク質合成阻害剤物質が実質的に除去されたコムギ種子胚芽抽出液抽出液がより好適である。これらは従来のコムギ種子胚芽抽出液と比較して、抽出液中のタンパク質合成阻害に関与する成分及び物質が低減されているからである。
【００２８】
本発明の最良の細胞抽出液は、コムギ胚芽由来の抽出液であり、さらに混入する胚乳成分や胚芽組織細胞中のタンパク質合成阻害をもたらすグルコースなどの代謝物質が実質的に除去された抽出液であるので、これを例にとって原料の調製方法を以下説明する。
【００２９】
通常、胚芽の部分は非常に小さいので胚芽を効率的に取得するためには胚芽以外の部分をできるだけ除去しておくことが好ましい。通常、まずコムギ種子に機械的な力を加えることにより、胚芽、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む混合物を得、該混合物から、粗胚芽画分（胚芽を主成分とし、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む混合物）を得る。種子に加える力は、種子から胚芽を分離することができる程度の強さであればよい。具体的には、公知の粉砕装置を用いて、種子を粉砕することにより、胚芽、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む混合物を得る。
種子の粉砕は、通常公知の粉砕装置を用いて行うことができるが、被粉砕物に対して衝撃力を加えるタイプの粉砕装置、例えばピンミル、ハンマーミルを用いることが好ましい。粉砕の程度は、使用する種子胚芽の大きさに応じて適宜選択すればよいが、例えばコムギの場合は、通常、最大長さ4ｍｍ以下、好ましくは最大長さ2ｍｍ以下の大きさに粉砕する。また、粉砕は乾式で行うのが好ましい。
次いで、得られた種子粉砕物から、通常公知の分級装置、例えば、篩を用いて粗胚芽画分を取得する。例えば、コムギの場合、通常、メッシュサイズ0.5ｍｍ〜2.0ｍｍ、好ましくは0.7ｍｍ〜1.4ｍｍの粗胚芽画分を取得する。さらに、必要に応じて、得られた粗胚芽画分に含まれる種皮、胚乳、ゴミ等を風力、静電気力を利用して除去してもよい。
また、胚芽と種皮、胚乳の比重の違いを利用する方法、例えば重液選別により、粗胚芽画分を得ることもできる。より多くの胚芽を含有する粗胚芽画分を得るために、上記の方法を複数組み合わせてもよい。さらに、得られた粗胚芽画分から、例えば目視や色彩選別機等を用いて胚芽を選別する。
【００３０】
このようにして得られた胚芽画分は、胚乳成分が付着している場合があるため、通常胚芽純化のために更に洗浄処理することが好ましい。洗浄処理としては、通常10℃以下、好ましくは4℃以下に冷却した水または水溶液もしくは界面活性剤を含有する水溶液に胚芽画分を分散・懸濁させ、洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄することが好ましい。また、通常10℃以下、好ましくは4℃以下で、界面活性剤を含有する水溶液に胚芽画分を分散・懸濁させて、洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄することがより好ましい。界面活性剤としては、非イオン性のものが好ましく、非イオン性界面活性剤であるかぎりは、広く利用ができる。具体的には、例えば、好適なものとして、ポリオキシエチレン誘導体であるブリッジ（Ｂｒｉｊ）、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）P40、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）等が例示される。なかでも、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）P40が最適である。これらの非イオン性界面活性剤は、胚乳成分の除去に十分且つ胚芽成分のタンパク質合成活性に悪影響を及ぼさない濃度で使用され得るが、例えば0.5％の濃度で使用することができる。水または水溶液による洗浄処理及び界面活性剤による洗浄処理は、どちらか一方でもよいし、両方実施してもよい。また、これらの洗浄処理は、超音波処理との組み合わせで実施してもよい。
【００３１】
本発明においては、上記のように種子粉砕物から選別し、洗浄して得られた発芽能を有する胚芽を好ましくは抽出溶媒の存在下に細分化した後、得られた胚芽抽出液を分離し、更に精製することにより無細胞タンパク質合成用抽出液を得る。
【００３２】
抽出溶媒としては、緩衝液、カリウムイオン、マグネシウムイオンおよび／またはチオール基の酸化防止剤を含む水溶液を用いることができる。また、必要に応じて、カルシウムイオン、Ｌ型アミノ酸等をさらに添加してもよい。例えば、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ'−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、Ｌ型アミノ酸および／またはジチオスレイトールを含む溶液や、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎらの方法を一部改変した溶液（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、塩化カルシウム、Ｌ型アミノ酸および／またはジチオスレイトールを含む溶液）を抽出溶媒として使用することができる。抽出溶媒中の各成分の組成・濃度はそれ自体既知であり、無細胞タンパク質合成用の細胞抽出液の製造に用いられるものを採用すればよい。
必要量の抽出溶媒を胚芽に加え、抽出溶媒の存在下に胚芽を細分化する。抽出溶媒の量は、洗浄前の胚芽1ｇに対して、通常0.1ミリリットル以上、好ましくは0.5ミリリットル以上、より好ましくは1ミリリットル以上である。抽出溶媒量の上限は特に限定されないが、通常、洗浄前の胚芽1ｇに対して、10ミリリットル以下、好ましくは5ミリリットル以下である。また、細分化しようとする胚芽は従来のように凍結させたものを用いてもよいが、凍結させていないものを用いるのがより好ましい。
【００３３】
細分化の方法としては、摩砕、圧砕等、従来公知の粉砕方法を採用することができるが、本発明者が開発した衝撃または切断により胚芽を細分化する方法（ＷＯ  ０３/０６４６７１）が好ましい。ここで、「衝撃または切断により細分化する」とは、植物胚芽の細胞核、ミトコンドリア、葉緑体等の細胞小器官（オルガネラ）、細胞膜や細胞壁等の破壊を、従来の摩砕または圧砕と比べて最小限に止めうる条件で植物胚芽を破壊することを意味する。
細分化する際に用いることのできる装置や方法は、上記条件を満たすものであれば特に限定されないが、例えば、ワーリングブレンダーのような高速回転する刃状物を有する装置を用いることが好ましい。刃状物の回転数は、通常1000ｒｐｍ以上、好ましくは5000ｒｐｍ以上であり、また、通常30000ｒｐｍ以下、好ましくは25000ｒｐｍ以下である。刃状物の回転時間は、通常5秒以上、好ましくは10秒以上である。回転時間の上限は特に限定されないが、通常10分以下、好ましくは5分以下である。細分化する際の温度は、好ましくは10℃以下で操作が可能な範囲内、特に好ましくは4℃程度が適当である。
このような衝撃または切断による胚芽の細分化では、胚芽の細胞核や細胞壁は全て破壊されず、少なくともその一部は破壊されることなく残る。即ち、胚芽の細胞核等の細胞小器官、細胞膜や細胞壁が必要以上に破壊されることがないため、それらに含まれるＤＮＡや脂質等の不純物の混入が少なく、細胞質に局在するタンパク質合成に必要なＲＮＡやリボソーム等を高純度で効率的に胚芽から抽出することができる。
このような衝撃または切断による細分化においては、細分化した後に抽出溶媒を添加することもできるが、抽出溶媒の存在下に行うことがより好ましい。
このような方法によれば、従来の胚芽を粉砕する工程と、粉砕された胚芽に抽出溶媒を加えて胚芽抽出液を得る工程とを同時に一つの工程として行うことができるため効率的にコムギ胚芽抽出液を得ることができる。上記の方法を、以下「ブレンダー法」と称することがある。
【００３４】
次いで、胚芽抽出液について2〜4万Ｇ、好ましくは2.5〜3.5万Ｇ、さらに好ましくは3万Ｇの遠心分離を行い、遠心上清を取得する。この際、沈殿助剤として無機担体をいれておくことは沈殿物と上清との分離のためにより好ましい。この沈殿物中には、グリコシダーゼなどの酵素とカルシウムの複合体が含まれている。グリコシダーゼをあらかじめ除いておくことは、澱粉からグルコースの生成を最小限に抑えることに役立つ。好適な無機担体としては、ベントナイト、活性炭素、シリカゲル、海砂等が例示される。この無機担体の導入により、沈殿物が上清へ混入することをほぼ完全に防ぐことが出来る。沈殿助剤を遠心時に加えない場合は、沈殿物の上部に不溶性スラリーが存在し、これが混入したＳ-３０画分から調製した抽出液のタンパク質合成活性は低くなる。そこで、遠心後の遠心管からのＳ-３０画分の回収に当たっては混入を避けるために細心の注意が必要となる。
コムギ胚芽抽出液は、ゲルろ過等によりさらに精製することができる。ゲルろ過は、例えば予め適当な溶液で平衡化しておいたゲルろ過装置を用いて行うことができる。ゲルろ過溶液中の各成分の組成・濃度はそれ自体既知であり、無細胞タンパク合成用の細胞胚芽抽出液の製造に用いられるもの（例えば、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、ジチオスレイトールまたはＬ型アミノ酸を含む溶媒）を採用すればよい。
このようにして得られた胚芽細胞抽出物は、ＲＮａｓｅ活性及びホスファターゼ活性が極めて低減されたものである。
【００３５】
ゲルろ過後の胚芽抽出物含有液には、微生物あるいは糸状菌（カビ）などの胞子が混入していることがあるためこれら微生物などを排除しておくことが好ましい。特に長期（1日以上）の無細胞タンパク質合成反応中に微生物の繁殖が見られることがあるので、これを阻止することは重要である。微生物の排除方法は特に限定されないが、ろ過滅菌フィルターを用いるのが好ましい。フィルターのポアサイズとしては、混入の可能性のある微生物が除去可能なものであれば特に制限はないが、通常0.1〜1マイクロメーター、好ましくは0.2〜0.5マイクロメーターが適当である。ちなみに、枯草菌の胞子のサイズは0.5μｍｘ1μｍであることから、0.20マイクロメーターのフィルター（例えばＳａｒｔｏｒｉｕｓ製のＭｉｎｉｓａｒｔＴＭ等）を用いるのが胞子の除去にも有効である。ろ過に際して、まずポアサイズの大きめのフィルターでろ過し、次に混入の可能性のある微生物が除去可能であるポアサイズのフィルターを用いてろ過するのが好ましい。
【００３６】
このようにして得られた細胞抽出液は、原料であるコムギ自身が含有または保持するタンパク質合成機能を抑制する物質（各種RNA、翻訳タンパク質因子やリボソーム等に作用してその機能を抑制する物質。例えば各種リボヌクレアーゼ、各種プロテアーゼ、トリチン、チオニン等）が、ほぼ完全に取り除かれている。すなわち、これらの阻害物質が局在する胚乳がほぼ完全に取り除かれ純化されている。胚乳の除去の程度は、コムギ胚芽抽出液中に夾雑するトリチンの活性、すなわちリボソームを脱アデニン化する活性をモニターすることにより評価できる。リボソームが実質的に脱アデニン化されていなければ、胚芽抽出液中に夾雑する胚乳由来成分がない、すなわち胚乳がほぼ完全に取り除かれ純化されていると判断される。リボソームが実質的に脱アデニン化されていない程度とは、リボソームの脱アデニン化率が7％以下、好ましくは1％以下になっていることをいう。
【００３７】
このような胚芽抽出液を原料にして、さらに「胚芽組織細胞内因性の解糖系などの代謝経路や翻訳反応制御機構の排除」のために糖、リン酸化糖、糖のリン酸化酵素、糖分解酵素等を低減した無細胞タンパク質合成用の細胞抽出液調製のための処理を行うこともできる。処理工程の概要は以下である。得られた細胞抽出液、あるいはこの抽出液について、ゲルろ過による溶液の交換あるいは必要成分の添加などにより翻訳反応液としたものを、分子量10ｋＤａカットで分子量分画し、低分子画分を排除する。あるいは、分子量10ｋＤａ以上の物質を分子量分画し、回収することも可能である。この分画処理は複数回行い、特に分子量10ｋＤａ以下の物質を実質的に除去することが好ましい。複数回の具体的回数としては、1〜10回、好ましくは2〜9回、さらに好ましくは3〜8回、最も好ましいくは4〜7回である。このように調製された細胞抽出液は、実質的に糖、リン酸化糖が10mM以下、好ましくは6mM以下まで低減されている（260nmにおける吸光度200 OD/mlの抽出液中のグルコース濃度として）。かくして得られたグルコース濃度が低減された抽出液は、従来にない高い無細胞タンパク質合成能を保有する。
【００３８】
（３）翻訳反応工程
上記のようにして得られる転写溶液を直接添加したタンパク質合成用細胞抽出液に、基質となるアミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、ATP再生系、核酸分解酵素阻害剤、tRNA、還元剤、ポリエチレングリコール、3'，5'−cAMP、葉酸塩、抗菌剤等の、翻訳反応に必要もしくは好適な成分を含有する溶液（「翻訳反応用溶液」ともいう）を添加して、翻訳反応に適した温度で適当な時間インキュベートすることにより翻訳反応を行うことができる。基質となるアミノ酸は、通常、タンパク質を構成する20種類の天然アミノ酸であるが、目的に応じてそのアナログや異性体を用いることもできる。また、エネルギー源としては、ＡＴＰ及び／又はＧＴＰが挙げられる。各種イオンとしては、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、酢酸アンモニウム等の酢酸塩、グルタミン酸塩等が挙げられる。緩衝液としては、Hepes−KOH、Tris−酢酸等が用いられる。またＡＴＰ再生系としては、ホスホエノールピルベートとピルビン酸キナーゼの組み合わせ、またはクレアチンリン酸（クレアチンホスフェート）とクレアチンキナーゼの組み合わせ等が挙げられる。核酸分解酵素阻害剤としては、リボヌクレアーゼインヒビターや、ヌクレアーゼインヒビター等が挙げられる。このうち、リボヌクレアーゼインヒビターの具体例としては、ヒト胎盤由来のRNase inhibitor（TOYOBO社製等）等が用いられる。ｔＲＮＡは、Moniter, R., et al., Biochim. Biophys. Acta., 43, 1 (1960)等に記載の方法により取得することができ、あるいは市販のものを用いることもできる。還元剤としては、ジチオスレイトール等が挙げられる。抗菌剤としては、アジ化ナトリウム、アンピシリン等が挙げられる。これらの添加量は、無細胞タンパク質合成において通常使用され得る範囲で適宜選択することができる。
【００３９】
本発明のタンパク質合成・回収一体型無細胞タンパク質合成方法を利用する無細胞タンパク質合成装置は、上記方法の一連の工程を自動で実行可能である。この方法を自動で実行するためには、駆動源（モータ、空圧・油圧機器、その他の動作制御可能なアクチュエータ等）及びコンピュータ制御による制御回路、シーケンス制御回路等により、動作のオン・オフ、動作の程度、動作スピード、動作間隔が調節される。また、信号転送用ドライバー、動作確認用センサー、動作制御用スイッチ、タイマー等は適宜所望により装備可能である。
【００４０】
ここで「自動で実行可能」とは、一連の工程中に、実験者が無細胞タンパク質合成系に直接的に手動の操作を加えないことを意味する。従って、各工程を実行させるに際し、用いられる本発明の自動合成装置に設けられた所定の操作ボタンやスイッチなどの操作を実験者が手動で行うことは、本発明における「自動」の要件を損なうものではない。
【００４１】
さらに、本発明の範囲は、上記方法を利用する無細胞タンパク質の合成方法に用いられる試薬の少なくとも１を含む合成キットも含まれる。
加えて、本発明の範囲は、上記方法において、無細胞タンパク質合成方法として使うコムギ胚芽抽出物の用途も含まれる。
【００４２】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００４３】
グルタチオン磁気ビーズを用いたタンパク質合成・回収一体型無細胞タンパク質合成方法
まず、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成反応においての翻訳鋳型となるｍＲＮＡの合成を行うために、発明者である遠藤が構築した汎用性のあるプラスミドｐＥＵ１（ＷＯ０１／２７２６０号公報）を利用した。目的のタンパク質をコードする遺伝子としてはN端にGSTタグ塩基配列を持つオワンクラゲのグリーン蛍光タンパク質（GST-GFP）遺伝子（ｇｆｐ遺伝子）を用い、上記プラスミドに常法に従って挿入した。
得られたプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで切断して直鎖型とし、これを転写鋳型として常法によりｍＲＮＡを合成した。合成したｍＲＮＡは、5′末端にＣＡＰをもたず、非翻訳配列として5′末端にＡＭＶ−Ω配列を、3′末端にプラスミド由来の500塩基を有している。なお、ＡＭＶ−Ω配列とは、アルファルファモザイクウイルスｍＲＮＡ（ＡＭＶ−ｍＲＮＡ）の5′末端リーダー構造とタバコモザイクウイルスｍＲＮＡ（ＴＭＶ−ｍＲＮＡ）の5′末端Ω配列とを直列に結合した塩基配列をいう（ＷＯ０１／２７２６０号公報）。
次に、コムギ胚芽抽出物を全容量の48％容（濃度は、200Ａ260ｎｍ  ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）含む、次のような終濃度の組成〔1,000ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  リボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＮＡｓｉｎ）（ＴＡＫＡＲＡ社製）、30ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ7.6）、95ｍＭ  酢酸カリウム、2.65ｍＭ  酢酸マグネシウム、2.85ｍＭ  ジチオスレイトール、0.5ｍｇ／ｍｌ  クレアチンキナーゼ、1.2ｍＭ  アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、0.25ｍＭ  グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、16ｍＭ  クレアチンリン酸、0.380ｍＭ  スペルミジン、20種類のＬ型アミノ酸（各0.3ｍＭ）、0.05％  ＮＰ−４０、600μｇ／ｍｌ  ｍＲＮＡ〕からなる無細胞タンパク質合成液を調製した。
この無細胞タンパク質合成液を、口径7ｍｍ、5ｍｍ、および3ｍｍの反応容器（それぞれ、マイクロタイタープレート、1.5ｍＬ容量の試験管、および0.2ｍＬ容量の試験管）に加え、その上に5倍容量の供給溶液〔30ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ7.6）、95ｍＭ  酢酸カリウム、2.65ｍＭ  酢酸マグネシウム、2.85ｍＭ  ジチオスレイトール、1.2ｍＭ  ＡＴＰ、0.25ｍＭ  ＧＴＰ、16ｍＭ  クレアチンリン酸、0.380ｍＭ  スペルミジンおよび20種類のＬ型アミノ酸（0.3ｍＭ）〕を添加し、静置条件下26℃で反応させた。
上記合成反応の停止した無細胞タンパク質合成反応液に、あらかじめ基質やエネルギー源、例えばアミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰ、タンパク質合成反応に必要なその他のイオン類や緩衝液を含む供給溶液で平衡化しておいたグルタチオン磁気ビーズを加え静かに攪拌した。次いで、無細胞タンパク質合成反応液を同様の処理を施したセファデックスＧ−２５カラムを用いてゲルろ過した後、さらに26℃でタンパク質合成を行った。
上記合成反応を８回繰り返した後に、磁気ビーズを磁石の磁力を利用して無細胞タンパク質合成反応液から回収した。回収された磁気ビーズを洗浄液（30ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ7.6）、95ｍＭ  酢酸カリウム、2.65ｍＭ  酢酸マグネシウムからなる）で3回洗浄した後、溶出液を用いて溶出した。この溶出液を、SDS-PAGEにて分析して、GST-GFPタンパク質の存在を確認した。
【実施例２】
【００４４】
Ni-キレート磁気ビーズを用いたタンパク質合成・回収一体型無細胞タンパク質合成方法
GSTタグの代わりに、Hisタグを用いて、実施例１の方法と同様にHis-GFPタンパク質を合成した。
実施例１の方法と同様に無細胞タンパク質合成を行った。次に、あらかじめ基質やエネルギー源、例えばアミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰ、タンパク質合成反応に必要なその他のイオン類や緩衝液を含む供給溶液で平衡化しておいたNi-キレート磁気ビーズを加え静かに攪拌した。次いで、無細胞タンパク質合成反応液を同様の処理を施したセファデックスＧ−２５カラムを用いてゲルろ過した後、さらに26℃でタンパク質合成を行った。
上記合成反応を８回繰り返した後に、磁気ビーズを磁石の磁力を利用して無細胞タンパク質合成反応液から回収した。回収された磁気ビーズを洗浄液（30ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ7.6）、95ｍＭ  酢酸カリウム、2.65ｍＭ  酢酸マグネシウムからなる）で３回洗浄した後、溶出液を用いて溶出した。この溶出液を、SDS-PAGEにて分析して、His-GFPタンパク質の存在を確認した。
【実施例３】
【００４５】
ビバフローシステムを用いたタンパク質合成・回収一体型無細胞タンパク質合成方法
実施例１の方法と同様にGST-GFPタンパク質mRNA及び無細胞タンパク質合成液を調製した。
200μlのMagne GSTTM Particles、5.5mlの供給液〔30ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ7.6）、95ｍＭ  酢酸カリウム、2.65ｍＭ  酢酸マグネシウム、2.85ｍＭ  ジチオスレイトール、1.2ｍＭ  ＡＴＰ、0.25ｍＭ  ＧＴＰ、16ｍＭ  クレアチンリン酸、0.380ｍＭ  スペルミジンおよび20種類のＬ型アミノ酸（0.3ｍＭ）〕を、250μlのGST-GFPタンパク質mRNAを含む無細胞タンパク質合成液0.5mlに添加した。その後、20℃で無細胞タンパク質合成を行った。無細胞タンパク質合成工程中の1時間毎に、反応槽中の無細胞タンパク質合成液を、ビバフロー50（分画分子量：10000MWCO）を通して、ポンプで引き、約1/2量の無細胞タンパク質合成液とした。次に、供給液を、ビバフロー50を通して、反応槽中の無細胞タンパク質合成液に添加し、約元量の無細胞タンパク質合成液とした。
上記合成反応を８回繰り返した後に、磁気ビーズを磁石の磁力を利用して無細胞タンパク質合成反応液から回収した。回収された磁気ビーズを洗浄液（30ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ7.6）、95ｍＭ  酢酸カリウム、2.65ｍＭ  酢酸マグネシウムからなる）で３回洗浄した後、溶出液を用いて溶出した。この溶出液を、SDS-PAGEにて分析して、GST-GFPタンパク質の存在を確認した。なお、合成したタンパク質量は、バンド染色強度から、最初の無細胞タンパク質合成液1ml当たり1.2mgとなった。
以上により、合成したタンパク質は膜への付着や膜の目詰りがほとんどなく、高効率で無細胞タンパク質合成系から回収することができる。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明の無細胞タンパク質合成方法は、従来にない、合成したタンパク質の構造変化を避けることができ、かつ合成したタンパク質の膜への付着や膜の目詰りを解消でき、並びに簡便かつ大量合成を可能とする無細胞タンパク質合成方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、本発明のＡ方法の概要図
【図２】図２は、本発明のＢ方法の概要図
【図３】図３は、本発明のビバフローシステムを用いたタンパク質合成・回収一体型無細胞タンパク質合成方法の概要図
【符号の説明】
【００４８】
１：無細胞タンパク質合成系１
２：流路２
３：送液ポンプ３
４：担体回収容器４
５：流路５
６：弁６
８：第１反応槽８
９：第２反応槽９
１０：流路１０
１１：送液ポンプ１１
１２：弁１２
１３：膜１３
１４：排出口１４
１５：反応槽１５
１６：流路１６
１７：流路１７
１８：流路１８
１９：ビバフロー１９
２０：流路２０
２１：送液ポンプ２１
２２：溶液回収装置２２
２３：供給液２３
２４：流路２４
２５：流路２５
２６：送液切替バブル２６
【図１】
2007195545.tif 000002
【図２】
2007195545.tif 000003
【図３】
2007195545.tif 000004