(57)【要約】  【課題】  マイクロ流体システムを用いた生体高分子の分析において、検出感度を低下させずに、且つ、反応時間を大幅に短縮させることが可能な分析方法、及び分析キットを提供する。  【解決手段】  マイクロ流体システムを用いたプレミックス反応系を用いた分析対象物質３の測定において、流路内に配置させるリガンドとレセプターの組の一方をビオチン６とし、第１結合物質１に結合させる、リガンドとレセプターの組の他方をアビジン及びストレプトアビジンから選ばれた多価物質２とした場合に、ステップワイズ反応系と比較して、検出感度を低下させることなく分析が行える。  【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析対象物質を含有する疑いのある試料中における分析対象物質の存在又は量を測定する方法であって、
（１）液相中において、次の試薬Ａ、試薬Ｂ及び試料を接触させることにより、アビジン又はストレプトアビジンが結合した第１結合物質と、分析対象物質と、標識物質で標識された、又は後で標識される第２結合物質からなる複合体を形成し：
ｉ) 分析対象物質に対して特異的結合性を有する第１結合物質に、アビジン及びストレプトアビジンから選ばれた多価分子が結合してなる試薬Ａ；
ii) 分析対象物質に対して特異的結合性を有する第２結合物質が、標識物質で標識された、又は後で標識される試薬Ｂ；
iii)  試料
（２）前記工程で反応した液相をマイクロチップの流路内に導入し、該マイクロチップは、幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−１ｍｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成されたものであり、該流路内の捕獲ゾーンにおいてビオチンが配置されるようにビオチンが支持体に固定化されており、
（３）液相中に生成した、多価分子が結合した第１結合物質、分析対象物質及び標識物質で標識された第２結合物質からなる複合体を、捕獲ゾーンにおいてビオチンと、アビジン又はストレプトアビジンの結合により支持体上に固定化し、
（４）固定化された複合体中の標識物質を検出することにより、分析対象物質の存在又は量を測定する方法。
【請求項２】
分析対象物質を含有する疑いのある試料中における分析対象物質の存在又は量を測定する方法であって、
（１）液相中において、次の試薬Ａ、試薬Ｂ及び試料を接触させ、
ｉ) 分析対象物質に対して特異的結合性を有する第１結合物質に、アビジン及びストレプトアビジンから選ばれた多価分子が結合してなる試薬Ａ；
ii) 該第１結合物質に対して、分析対象物質と競合的な結合性を有する物質が、標識物質で標識された、又は後で標識される試薬Ｂであって、該競合的な結合性を有する物質は、分析対象物質と同じ物質、及びアナログ物質から選ばれたものである試薬Ｂ；
iii)  試料
（２）前記工程で反応した液相をマイクロチップの流路内に導入し、該マイクロチップは、幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−１ｍｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成されたものであり、該流路内の捕獲ゾーンにおいてビオチンが配置されるようにビオチンが支持体に固定化されており、
（３）液相中に生成した、多価分子が結合した第１結合物質及び分析対象物質からなる複合体、及び多価分子が結合した第１結合物質及び標識物質で標識された分析対象物質と競合的な結合性を有する物質からなる複合体を、捕獲ゾーンにおいてビオチンと、アビジン又はストレプトアビジンの結合により支持体上に固定化し、
（４）固定化された複合体中の標識物質を検出することにより、分析対象物質の存在又は量を測定する方法。
【請求項３】
前記支持体はビーズであり、ビオチンが固定化されたビーズが捕獲ゾーンに配置されている請求項１又は２記載の分析対象物質の存在又は量を測定する方法。
【請求項４】
前記支持体はマイクロチップの流路壁面であり、ビオチンが固定化された流路壁面が捕獲ゾーンである請求項１又は２記載の分析対象物質の存在又は量を測定する方法。
【請求項５】
前記ビオチンがスペーサーを介して、支持体の表面に固定化されている請求項１又は２記載の分析対象物質の存在又は量を測定する方法。
【請求項６】
前記スペーサーがデオキシリボ核酸である請求項５記載の分析対象物質の存在又は量を測定する方法。
【請求項７】
次の試薬Ａ、試薬Ｂ及びマイクロチップを組み合わせてなる分析キットであって、試薬Ａと試薬Ｂは同一の系に含まれていても、或いは独立して存在してもよい分析キット：
ｉ) 分析対象物質に対して特異的結合性を有する第１結合物質に、アビジン及びストレプトアビジンから選ばれた多価分子が結合してなる試薬Ａ；
ii) 分析対象物質に対して特異的結合性を有する第２結合物質が、標識物質で標識された、又は後で標識される試薬Ｂ；
iii)幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−１ｍｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成され、該流路内において、表面にビオチンが固定化された支持体が存在する捕獲ゾーンを有するマイクロチップ。
【請求項８】
次の試薬Ａ、試薬Ｂ及びマイクロチップを組み合わせてなる分析キットであって、試薬Ａと試薬Ｂは同一の系に含まれていても、或いは独立して存在してもよい分析キット：
ｉ) 分析対象物質に対して特異的結合性を有する第１結合物質に、アビジン及びストレプトアビジンから選ばれた多価分子が結合してなる試薬Ａ；
ii) 該第１結合物質に対して、分析対象物質と競合的な結合性を有する物質が、標識物質で標識された、又は後で標識される試薬Ｂであって、該競合的な結合性を有する物質は、分析対象物質と同じ物質、及びアナログ物質から選ばれたものである試薬Ｂ；
iii)幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−１ｍｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成され、該流路内において、表面にビオチンが固定化された支持体が存在する捕獲ゾーンを有するマイクロチップ。
【請求項９】
前記表面にビオチンが固定化された支持体は、ビーズの表面にビオチンが固定化されたものである請求項７又は８記載の分析キット。
【請求項１０】
前記表面にビオチンが固定化された支持体は、マイクロチップの流路壁面にビオチンが固定化されたものである請求項７又は８記載の分析キット。
【請求項１１】
前記ビオチンがスペーサーを介して支持体に結合している請求項７又は８記載の分析キット。
【請求項１２】
前記スペーサーがデオキシリボ核酸である請求項１１記載の分析キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微小断面の流路を有するマイクロチップを用いた免疫測定において、短時間で高感度の検出を可能にする分析方法、及び分析キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体高分子の分析は、臨床検査において最も一般的に行われる。臨床検査においては、患者から採取した血液に含まれる抗原、抗体などの生体高分子を分析する方法が採られる。このような検査において、患者から５〜１０ｍＬの血液を採血後、検査室に検体が搬送され、そこに設置された大型の分析装置により分析が行われ、数日後に来院した患者に検査結果を基にした診断結果が通知される。こうした検査システムは検査結果がでるまでに数日を要し、検査にタイムラグが生じることにより、適切な治療が行えない場合があることから、緊急を要する検査には適していない。さらに、採血量が多いため特に乳幼児、高齢者に対する負担が大きいという問題があった。
【０００３】
近年、ＭｉｃｒｏＴＡＳ（Micro Total Analysys System 、マイクロ総合分析システム）といわれるマイクロ流体システム技術を用いた分析方法が考案され、生体高分子の分析などに応用されてきている。マイクロ流体システムでは、流路を小型化、マイクロ化することにより、単位体積あたりの反応表面積が増大するため、反応効率が上昇し、分析時間が大幅に短縮できる。さらに、反応空間が微小であるため、必要な検体量も大幅に減らすことができるなど多くの利点が注目されている。
【０００４】
マイクロ流体システムを用いて分析対象物質を検出するためには、流路内に分析対象物質を捕捉するための結合物質を配置させておく必要がある。検体中の抗原を測定することを目的とするサンドイッチ免疫測定法を例にとると、まず始めに、抗原を捕捉するための第１抗体を流路内に配置させておき、続いて抗原を含む検体を反応させ、続いて抗原のエピトープのうち、第１抗体とは異なるエピトープに結合する標識された、又は後で標識される第２抗体を反応させ、最終的に標識物質を適当な検出装置で検出することにより抗原の量を測定することが可能となる。
【０００５】
こうしたマイクロ流体システムを用いた免疫測定系は、Satoらによって実証されている(Analytical Chemistry 2001,73, 1213-1218（非特許文献１）、Lab on a Chip 2004, 4, 570-575（非特許文献２）、特開2001-4628 号公報（特許文献１）) 。彼らの報告では、ガラス製のマイクロチップの流路内に堰き止め構造を形成させ、捕捉抗体を結合させたポリスチレンビーズを堰き止め構造の上流側の流路内に充填し、堰き止めておく。続いて、分析対象物質である抗原を含む検体、及び、標識抗体を順次送液することにより、該ビーズ表面において抗原抗体複合体を形成させ、熱レンズ顕微鏡により抗原抗体複合体中の標識物質を検出することで免疫測定を実施している。非特許文献１においては、標識物質として金コロイドが使用されており、金コロイドを熱レンズ顕微鏡で直接検出することにより測定を行っている。一方、非特許文献２においては標識物質として西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を使用した酵素免疫測定法を採用しており、ＨＲＰの酵素活性により酸化されて発色した基質代謝物質を検出することで測定を行っている。後者は前者に比べ、熱レンズ顕微鏡による検出の際の焦点合わせが容易であると同時に、測定値の再現性が改善されている。
【０００６】
Satoらの方法を用いれば、反応時間、検出感度が従来法に比べて大幅に改善できると同時に、微量の検体量で測定ができる。しかし、この方法は反応効率を上げるために流路内に高密度にビーズを充填して反応表面積を大きくする必要があるので、送液の際の圧力が高くなり、正確な流速の維持、及び、ビーズ間の隙間での均一な送液の維持が困難であるという問題がある。
【０００７】
ビーズを用いずに捕捉抗体を流路内に配置させる方法として、流路壁面に抗体を直接固定化したマイクロチップを使用することが考えられる。Biosensors and Bioelectronics 19(2004)1193-1202 （非特許文献３）には、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製の基板に抗体を物理吸着により直接固定化し、その上に溝を形成させた基板を貼り合わせることで流路壁面に抗体が固定化されたマイクロチップを作製する方法が記載されている。ＰＤＭＳは吸着性のある材質であるために、他の基板との接合の際に接着剤等の薬剤を使用せずに常温で圧着させることができる利点がある。しかし、ＰＤＭＳは性状がゴム状であり、他の樹脂製基板に比べて形態保持性が不安定なために、厳密な検出精度が要求されるマイクロチップとしての製品化には不向きである。さらにこの方法はＰＤＭＳ以外の基板に応用することが困難である。
【０００８】
マイクロチップとしての製品化に適した基板の材質として、ガラス製の基板や、ポリスチレン、ポリオレフィンコポリマー、ポリメチルメタアクリレート（ＰＭＭＡ）などが挙げられるが、これらに代表される樹脂製の基板は、他の基板との接合の際に、熱により基板表面を溶解しながら基板相互を融着させる熱融着法や、有機溶剤を含む接着剤を用いて接着させる方法が一般的である。しかしながら、これらの方法により、予め基板に抗体等のタンパク質を固定化した後に基板の接着を行うと、熱融着による熱の影響、或いは接着剤に含まれる有機溶剤の影響により、予め固定化しているタンパク質が変性してしまい、測定に使用できなくなる問題がある。
【０００９】
このようなタンパク質の変性の問題を回避するために結合子を介して、流路壁面に抗体を間接的に固定化する方法が考案されている。Lab on a chip 2002,2,27-30（非特許文献４）に、結合子として磁性粒子を用いた系が記載されている。これによると、磁性粒子表面に抗体を固定化し、これを送液によりマイクロ流路内に設置した磁石上に移動させて該磁性粒子を固定化し、検体及び標識抗体を順次送液することにより磁性粒子表面で免疫複合体を形成させて電気化学的な検出を行っている。非特許文献４の方法でマウス由来イムノグロブリンＧ（マウス由来ＩｇＧ）の検出を行っているが、反応時間は短縮できるものの、検出感度は５０ｎｇ／ｍＬと報告されており、検出感度が低いという課題がある。
【００１０】
上述した非特許文献１−非特許文献４、及び特許文献１の方法は、反応空間を微小化することによって、反応効率を上げて反応時間を短縮させる方法、即ち、マイクロ流体システム技術を用いた分析方法（ＭｉｃｒｏＴＡＳ）である。
【００１１】
上記した方法とは別の観点から反応時間を短縮させる有効な手段として、反応系を多段ステップを経るステップワイズ反応系から単一ステップの反応系に近づけることが考えられる。単一ステップからなる測定系の例として、特許第２５０１９６０号（特許文献２）には、リガンド（Ｌ）を免疫学的に測定するための方法が記載されている。該文献には、ビオチン（Ｐ１）とアビジン（Ｐ２）のような特異的結合能を有する物質（Ｐ１、Ｐ２）を用いた例が代表的に示されている。該文献のこれらの物質を用いた例によると、
１．測定すべきリガンド（Ｌ）を、
２．少なくとも１個が標識を有するアビジンからなるアビジン分子２個（Ｐ２、標識−Ｐ２）、並びに、
３．アビジン（Ｐ２）に対して１価の結合能を有するビオチン（Ｐ１）と測定すべきリガンド（Ｌ）に対する結合部位Ｒ１の複合体（Ｐ１−Ｒ１）からなる受容体Ｒと、
４．反応させることにより複合体〔（標識−Ｐ２）−（Ｐ１−Ｒ１）−Ｌ−（Ｒ１−Ｐ１）−Ｐ２〕を生成させ、
５．該複合体中の標識を測定することを特徴とするリガンドの測定方法が示されている。即ち、特許文献２には、リガンド（Ｌ）、アビジン（Ｐ２）又は標識されたアビジン（標識−Ｐ２）、複合体（Ｐ１−Ｒ１）を同一の系において単一ステップで反応させることにより、複合体〔（標識−Ｐ２）−（Ｐ１−Ｒ１）−Ｌ−（Ｒ１−Ｐ１）−Ｐ２〕を形成させている。
【００１２】
しかしながら、特許文献２には、Ｐ１はＰ２に対して１価の結合能を有すること、好ましくはＰ１がビオチンであり、且つＰ２がアビジン又はストレプトアビジンである旨が記載されているが、Ｐ１がアビジン又はストレプトアビジンであり、且つＰ２がビオチンであることは示唆されていない。
【００１３】
特表２００２−５１７７２８号公報（特許文献３）には、分析対象物を検出する方法が記載されている。これによると、１）分析対象物質（検体）と、２）第１結合剤が結合した分析対象物に結合性をもつ特定結合剤と、３）第２結合剤を含有する支持体、を混合して反応させた後、第１結合剤及び第２結合剤の双方に結合性をもつ活性剤を添加することで、支持体上に分析対象物質を含む複合体を配置させることができる。ここで、第１結合剤と第２結合剤の例として、両者が共にビオチンであり、活性剤がアビジン又はストレプトアビジンであることが記載されている。この方法は活性剤を添加しなければならない点で反応ステップが多くなる欠点がある。
【００１４】
特開２０００−１８０４４９号公報（特許文献４）には、１）リガンドとレセプターの組の一方が結合された第１抗体（又は抗原）、２）測定されるべき抗原（又は抗体）、３）標識物質が結合された第２抗体（又は抗原）、を液相中で反応させ、該反応と同時か、或いは該反応後に、前記リガンドとレセプターの組の他方が固定化された担体を加え、免疫複合体を担体上に配置させる方法が記載されている。特許文献４の発明は、使用される第１抗体の量と担体の量が最適化されることを特徴としている。特許文献４において、リガンドとレセプターの実施例として、支持体上にアビジン又はストレプトアビジンを固定化し、ビオチン標識した第１結合物質を支持体上に結合する方法が示されている。しかし、この方法には以下に示すような欠点がある。
【００１５】
ビオチンは分子量約２２４Ｄａの低分子物質である。一方、第１結合物質が抗体である場合を例にとると、抗体の分子量は約１５００００Ｄａと巨大分子である。従って単純に抗体とビオチンを結合させただけではビオチンが抗体分子の中に埋もれてしまいその機能が妨げられる。そこで、一般的にビオチンと抗体の結合にあたっては、炭素鎖の連なったスペーサーを介して結合させることで、抗体の表面にビオチンがでるように工夫されている。しかし、このような手法で、ビオチン標識抗体と抗原で免疫複合体を形成させると、さらに巨大分子となった免疫複合体が原因の立体障害がより顕著となり、ビオチンの結合能はより一層抑制されてしまうため、免疫複合体の担体上への固相化に障害が生ずる。
【００１６】
以上の特許文献２−４には、液相中で予め試薬と分析対象物質を含む検体を混合するホモジニアス、又はこれに近い方法が報告されているが、これらの方法は、マイクロ流体システムで行うものではなく、また、行えることを示唆するものでもない。
【特許文献１】特開２００１−４６２８号公報
【特許文献２】特許第２５０１９６０号公報
【特許文献３】特表２００２−５１７７２８号公報
【特許文献４】特開２０００−１８０４４９号公報
【非特許文献１】Analytical Chemistry 2001,73,1213-1218 Sato et al.
【非特許文献２】Lab on a Chip 2004,4,570-575
【非特許文献３】Biosensors and Bioelectronics 19(2004)1193-1202
【非特許文献４】Lab on a chip 2002,2,27-30
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
マイクロ流体システムを利用した分析方法は、反応空間が微小であるため、物質の拡散速度が大幅に速くなることで反応効率が上昇し、反応時間の大幅な短縮ができる。さらに、熱レンズ顕微鏡等の、微小空間の高感度測定が可能な検出器と組み合わせることで、高い検出感度を実現できる。しかし、これまでのマイクロ流体システムを利用した分析方法に関する報告では、完全なステップワイズ反応系であるため、各ステップの反応時間が短縮されても、トータルの時間は各ステップの反応時間をたした時間となり、ステップ数が多い分だけ反応時間が延びてしまう問題がある。
【００１８】
これを解決する手段として、反応系を単一ステップの系に近づけることが考えられる。具体的には、分析対象物質に対して結合能を有する第１結合物質、分析対象物質、及び標識物質で標識された、又は後で標識されることになっている分析対象物質に対して結合能を有する第２結合物質、或いは、第１結合物質に対して分析対象物質と同等の結合能を有する物質（例えば、アナログ物質、或いは分析対象物質と同一の物質）であって、標識物質で標識された、又は後で標識されることになっている物質を、液相中で予め混合して反応を行わせることが考えられる。続いて該混合液を流路内に送液することで、流路内に、第１結合物質、分析対象物質、及び、第２結合物質からなる複合体、或いは、第１結合物質と分析対象物質からなる複合体及び／又は第１結合物質とアナログ物質からなる複合体を配置させた後、標識物質を検出することで分析対象物質の量を測定する（以下プレミックス反応系と呼ぶ）ことが考えられる。この際、該複合体を流路内に配置させるために、リガンドとレセプターの組の一方を流路内に配置させておき、リガンドとレセプターの組の他方を結合させた第１結合物質を用いることで、リガンドとレセプターの結合を介して流路内に複合体を配置させることができる。
【００１９】
しかし、プレミックス反応系では液相中で形成された複合体が巨大分子であるために、第１結合物質に結合させたリガンドとレセプターの組の一方が複合体分子の中に隠れてしまう可能性が高くなる。このような立体障害が起きると、流路内に配置されたレセプターとリガンドの組となる各成分同士が結合しにくくなり、結果として、ステップワイズ反応系と比べて感度が低下してしまう問題点があった。
【００２０】
さらに、ステップワイズ反応系では、流路内に第１結合物質を十分量固相化することが可能であるが、プレミックス反応系では、液相中の第１結合物質の量が多いと、第１結合物質全体の中に占める分析対象物質と結合した第１結合物質の割合が低下してしまうため、結果として、流路内に固定化される第１結合物質の中で、複合体を形成しているものの割合が低下するため、感度が低下してしまう。逆に第１結合物質の量を少なくすると、反応速度論的に、流路内への第１結合物質の結合効率が低下してしまうという問題があった。この現象に影響を与える要因として、リガンドとレセプターの結合様式、結合強度が大きく関係してくることが考えられるため、リガンドとレセプターの組合わせの選択は非常に重要であり、これらの選択は検討課題である。
【００２１】
本発明の目的は、マイクロ流体システムを用いた生体高分子の分析において、検出感度を低下させずに、且つ、反応時間を大幅に短縮させることが可能な分析方法、及び分析キットを提供することである。
【００２２】
本明細書において、ステップワイズ反応系とは、試薬と試料を１回以上のＢ／Ｆ分離を介して順次反応させ、さらにＢ／Ｆ分離を行った後に標識物質の検出を行う系を意味する。ここでの反応は、一部の試薬同士、又は一部の試薬と試料が予め混合されていてもよい。
【００２３】
本明細書において、プレミックス反応系とは、試薬と試料をＢ／Ｆ分離を介さずに反応させた後、Ｂ／Ｆ分離を行ってから標識物質の検出を行う系を意味する。従って、プレミックス反応系はステップワイズ反応系よりも反応ステップ数が少ない系である。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
上記した目的を達成するために本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、前記したマイクロ流体システムを用いたプレミックス反応系を用いた測定において、流路内に配置させるリガンドとレセプターの組の一方をビオチンとし、第１結合物質に結合させる、リガンドとレセプターの組の他方をアビジン又はストレプトアビジンとした場合に、ステップワイズ反応系と比較したときに、検出感度を低下させることなく分析が行えることを見出し、分析時間の大幅な短縮を実現した。
【００２５】
即ち、本発明の分析対象物質を含有する疑いのある試料中における分析対象物質の存在又は量を測定する１番目の分析方法は、サンドイッチ法によるものであり、
（１）液相中において、次の試薬Ａ、試薬Ｂ及び試料を接触させることにより、アビジン又はストレプトアビジンが結合した第１結合物質と、分析対象物質と、標識物質で標識された、又は後で標識される第２結合物質からなる複合体を形成し：
ｉ) 分析対象物質に対して特異的結合性を有する第１結合物質に、アビジン及びストレプトアビジンから選ばれた多価分子が結合してなる試薬Ａ；
ii) 分析対象物質に対して特異的結合性を有する第２結合物質が、標識物質で標識された、又は後で標識される試薬Ｂ；
iii)  試料
（２）前記工程で反応した液相をマイクロチップの流路内に導入し、該マイクロチップは、幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−１ｍｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成されたものであり、該流路内の捕獲ゾーンにおいてビオチンが配置されるようにビオチンが支持体に固定化されており、
（３）液相中に生成した、多価分子が結合した第１結合物質、分析対象物質及び標識物質で標識された第２結合物質からなる複合体を、捕獲ゾーンにおいてビオチンと、アビジン又はストレプトアビジンの結合により支持体上に固定化し、
（４）固定化された複合体中の標識物質を検出することにより、分析対象物質の存在又は量を測定することを特徴とする。
【００２６】
また、本発明の分析対象物質を含有する疑いのある試料中における分析対象物質の存在又は量を測定する２番目の分析方法は、競合法によるものであり、
（１）液相中において、次の試薬Ａ、試薬Ｂ及び試料を接触させ、
ｉ) 分析対象物質に対して特異的結合性を有する第１結合物質に、アビジン及びストレプトアビジンから選ばれた多価分子が結合してなる試薬Ａ；
ii) 該第１結合物質に対して、分析対象物質と競合的な結合性を有する物質が、標識物質で標識された、又は後で標識される試薬Ｂであって、該競合的な結合性を有する物質は、分析対象物質と同じ物質、及びアナログ物質から選ばれたものである試薬Ｂ；
iii)  試料
（２）前記工程で反応した液相をマイクロチップの流路内に導入し、該マイクロチップは、幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−１ｍｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成されたものであり、該流路内の捕獲ゾーンにおいてビオチンが配置されるようにビオチンが支持体に固定化されており、
（３）液相中に生成した、多価分子が結合した第１結合物質及び分析対象物質からなる複合体、並びに、多価分子が結合した第１結合物質及び標識物質で標識された分析対象物質と競合的な結合性を有する物質からなる複合体を、捕獲ゾーンにおいてビオチンと、アビジン又はストレプトアビジンの結合により支持体上に固定化し、
（４）固定化された複合体中の標識物質を検出することにより、分析対象物質の存在又は量を測定することを特徴とする。
【００２７】
本発明の分析対象物質の存在又は量を測定する各方法は、前記した効果に加えて、さらに予測しえない効果として、バックグラウンドの低減が実現され、高い再現性が得られる効果をもたらす。さらに、本発明の方法は、マイクロチップの流路内にビオチンを配置させる手段として、ビオチン標識オリゴヌクレオチドを流路内の少なくとも一部又は全部の壁面に固定化する方法を使用することができるため、周知のＤＮＡ固定化方法を用いて高密度にビオチンを固定化することができると同時に、熱や有機溶剤に対して比較的安定なビオチン標識オリゴヌクレオチドが使用できるため、マイクロチップ作製時の熱融着や接着剤等の影響を考慮する必要が無い点で有利である。
【００２８】
本発明の方法は、前記した試薬Ａ、試薬Ｂ及び検体をマイクロ流体システムを用いたプレミックス反応により接触させ、得られた複合体を、複合体中のアビジンまたはストレプトアビジンと、流路内の支持体上に固定化されたビオチンとの結合により固定化している。該アビジンまたはストレプトアビジンと、ビオチンの結合力は、一般的な抗原抗体反応よりも強固なほぼ不可逆的な結合である点で安定して測定が行える点で有利である。さらに、アビジンまたはストレプトアビジンは、ビオチンに対して特異的な４価の結合能を有するため、アビジンまたはストレプトアビジンを結合する第１結合物質は、１分子に４価のビオチン結合能を付与できる点で、複合体中に４価の結合能を導入できるため、リガンドとレセプターの衝突頻度を上昇させることができ、複合体を固相化するのに有利であり、高い検出感度を達成できる。
【００２９】
ところで、アビジン又はストレプトアビジンはタンパク質であるため、熱や有機溶媒に暴露されると失活してしまう。そのため、アビジン又はストレプトアビジンを固定化した基板を準備し、溝を形成させた基板と熱融着や接着剤によって張り合わせて流路壁面にアビジン又はストレプトアビジンが固定化されたマイクロチップを調製することはできない。従って、第１結合物質にビオチンを修飾し、流路内にアビジン又はストレプトアビジンを配置しておく方法は、プレミックス反応系をマイクロ流体システムで実現させることを考えたときには不向きである。
【００３０】
これに対して、本発明では、マイクロ流体システムを用いたプレミックス反応系による分析において、流路内に安定な物質であるビオチンを配置させ、アビジン又はストレプトアビジンを結合させた第１結合物質を介して、複合体を流路内に固定化する方法を採用することにより、プレミックス反応系をマイクロ流体システムで、感度を低下させることなく高感度で、しかも短時間に分析をするを可能にしている。
【００３１】
アビジンは分子量約６８０００Ｄａ、ストレプトアビジンは分子量約６００００Ｄａであり、ビオチンに比べて分子量が約３００倍と大きい分、本発明のように抗体等の第１結合物質とアビジンまたはストレプトアビジンを結合しても、ビオチンとの結合能が立体障害により抑制されることがないか、あっても結合能の低下は微少と考えられる。さらに、アビジン又はストレプトアビジン１分子はビオチン４分子に対して結合できるため、複合体中にアビジン又はストレプトアビジンが１分子存在するだけでビオチンに対する結合能を有するものが４分子結合しているのと同じ効果がある。従って、固定化されたビオチンへの衝突頻度が増す点において、１：１の結合能を有するリガンドとレセプターの組を用いるより有利である。
【００３２】
ビオチンは非常に安定な低分子物質であり、ビオチンを固定化した基板を準備し、該基板と溝を形成させた基板とを熱融着や接着剤を用いて張り合わせることにより、アビジン又はストレプトアビジンに対する結合能を失わない状態の、流路壁面にビオチンが固定化されたマイクロチップを調製することができる。
【００３３】
本発明において、アビジン又はストレプトアビジンを挙げているが、中和アビジンのようなアビジンの修飾形態も、本発明では使用可能である。本発明で使用可能なアビジンの修飾形態は、ビオチン結合能を維持した状態で改変を加えたアビジン又はストレプトアビジンの修飾形態である。
【００３４】
本発明のさらに有利な点は、ＤＮＡチップに使用されるＤＮＡの高密度固定化方法を応用できる点である。ＤＮＡチップは、分析対象物質としてのＤＮＡやＲＮＡに代表される核酸を検出するためのチップであり、当業者においては周知の技術である。分析対象となる核酸と相補的な配列をもつＤＮＡ溶液を、ガラスや樹脂製の基板上にスポットし、該基板上に高密度にＤＮＡを固定化することで作製する。ここで、容易に合成が可能で、国内外を問わず入手可能なビオチンで標識したオリゴヌクレオチドをＤＮＡチップの作製方法に沿って基板上にスポットすることで、基板上に高密度にビオチン標識オリゴヌクレオチドを固定化することができる。この基板と、溝を形成させた基板とを熱融着等の方法により張り合わせることで、流路壁面にビオチンが高密度に固定化されたマイクロチップを作製することができる。さらに、基板とビオチンの間にオリゴヌクレオチドが存在し、これがスペーサーの役割を果たすことで、アビジン又はストレプトアビジンが結合した複合体とビオチンの結合の際の立体障害をより一層解消する。さらにこの方法は、分析対象物質が核酸である場合には当該核酸と相補的なビオチン標識核酸を固定しておくことで、ＤＮＡチップとしての利用と、核酸以外の分析対象物質の検出とを同一のマイクロチップで行うことも可能になる。
【００３５】
本発明の方法には次の分析キットが使用される。
前記１番目の方法に用いられる本発明の分析キットは、サンドイッチ法に用いるものであり、次の試薬Ａ、試薬Ｂ及びマイクロチップを組み合わせてなる分析キットである。：
ｉ) 分析対象物質に対して特異的結合性を有する第１結合物質に、アビジン及びストレプトアビジンから選ばれた多価分子が結合してなる試薬Ａ；
ii) 分析対象物質に対して特異的結合性を有する第２結合物質が、標識物質で標識された、又は後で標識される試薬Ｂ；
iii)幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−１ｍｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成され、該流路内において、表面にビオチンが固定化された支持体が配置されてなる捕獲ゾーンを有するマイクロチップ。
【００３６】
本発明の１番目の分析キットにおいて、試薬とマイクロチップは別体であっても、一体であってもよい。別体とは独立して存在することを意味する。一体とは同一の系に接触して存在することを意味する。本発明の１番目の分析キットにおいて、試薬Ａと試薬Ｂは同一の系に含まれていても、独立して存在してもよい。本明細書に記載の分析キットにおいて、「試薬Ａと試薬Ｂが同一の系に含まれている」とは、試薬Ａと試薬Ｂが均一に混ざり合った状態のことを意味し、「試薬Ａと試薬Ｂが独立して存在する」とは試薬Ａと試薬Ｂが別体となって、分離した状態であることをいう。試薬Ａと試薬Ｂは液状であっても、乾燥状態でも良い。
【００３７】
本発明の２番目の方法に用いられる本発明の分析キットは、競合法に用いるものであり、次の試薬Ａ、試薬Ｂ及びマイクロチップを組み合わせてなる分析キットである。：
ｉ) 分析対象物質に対して特異的結合性を有する第１結合物質に、アビジン及びストレプトアビジンから選ばれた多価分子が結合してなる試薬Ａ；
ii) 該第１結合物質に対して、分析対象物質と競合的な結合性を有する物質が、標識物質で標識された、又は後で標識される試薬Ｂであって、該競合的な結合性を有する物質は、分析対象物質と同じ物質、及びアナログ物質から選ばれたものである試薬Ｂ；
iii)幅１μｍ−５ｍｍ、深さ１μｍ−１ｍｍの断面の溝を有する第１部材と、該溝を覆うことができる第２部材とを接合することにより液体が通過できる流路が形成され、該流路内において、表面にビオチンが固定化された支持体が配置されてなる捕獲ゾーンを有するマイクロチップ。
【００３８】
本発明の２番目の分析キットにおいて、試薬とマイクロチップは別体であっても、一体であってもよい。本発明の２番目の分析キットにおいて、試薬Ａと試薬Ｂは同一の系に含まれていても、独立して存在してもよい。
【発明の効果】
【００３９】
本発明によれば、マイクロ流体システムにおいて反応ステップ数の少ないプレミックス反応系を実現させることにより、マイクロ流体システムでのステップワイズ反応系に比べて、反応時間の大幅な短縮を行うことが可能となる。
【００４０】
従来、プレミックス反応系ではステップワイズ反応系のような感度を達成することができないという問題があったが、本発明によれば、マイクロチップの流路内に配置された支持体にビオチンを固定化し、複合体中の試薬Ａにおけるアビジン及びストレプトアビジンから選ばれた多価分子が、ビオチンと結合することにより、複合体を捕捉しているので、プレミックス反応系でもステップワイズ反応系のような感度を達成することができる。
【００４１】
本発明によれば、マイクロチップの流路内に配置された支持体に、熱及び有機溶剤に対して比較的安定なビオチンを固定化しているので、マイクロチップを製造するときの第１部材と第２部材の接合時においてビオチンが失活することなく、複合体に対する捕捉力の安定したマイクロチップを製造することができる。
【００４２】
本発明によれば、アビジン又はストレプトアビジンから選ばれた多価分子で標識された第１結合物質を用いることで予想外の効果としてバックグラウンドシグナルの低減ができる。
【００４３】
該予想外の効果としてアビジン又はストレプトアビジンで標識された第１結合物質によるバックグラウンドの低減化について、その原因は実証されていないが、恐らく以下のように考えることができる。その原因について、第１結合物質を第１抗体とし、第２結合物質を第２抗体とし、分析対象物質を抗原としたサンドイッチ免疫測定系を例にして、次に詳細に説明する。
【００４４】
第１抗体と、第２抗体は、分析対象物質である抗原に対して特異的結合能を持つ抗体である。しかし、疎水結合、分子間力結合といった微弱な結合力により第２抗体が第1 抗体に対して非特異的に結合してしまうことによるバックグラウンドシグナルが少なからず認められる。この非特異的な結合は、抗体の抗原結合部位とは異なる部位の相互作用によっても引き起こされると考えられる。本発明において、第１抗体は高分子であるアビジン又はストレプトアビジンと結合されているため、第２抗体との非特異的な結合をしている第１抗体の部位がアビジン又はストレプトアビジンによりマスクされることが原因であるか、或いは、第１抗体にアビジン又はストレプトアビジンが結合されているため、このような複合体からなる試薬Ａは全体として疎水性の性質が低減化するため、試薬Ｂの疎水性部分が試薬Ａに非特異的に結合することが抑制されるものと推測される。バックグラウンドシグナルの低減は、バックグラウンドシグナルの安定化に繋がるため、再現性及び感度の上昇に寄与する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
図１は、サンドイッチ法による本発明の分析方法の原理の１例を表す図である。図１ａは、液相中で試薬Ａ、試薬Ｂ及び分析対象物質を接触させるために予め混合した状態の液相を表す。即ち、第１結合物質１にアビジン及びストレプトアビジンから選ばれた多価分子２が結合してなる試薬Ａと、分析対象物質３と、第２結合物質４が標識物質５で標識されてなる試薬Ｂの３者を液相中で予め混合した状態を表す。図１ｂは、前記した混合により反応した液相をマイクロチップの流路に送液して、該流路内の捕獲ゾーンにおいて、ビオチン６と、アビジン又はストレプトアビジンから選ばれた多価分子２との結合により、支持体７上に、多価分子２−第１結合物質１−分析対象物質３−第２結合物質４−標識物質５からなる複合体が固定化された状態を表す。
【００４６】
図２は、競合法による本発明の分析方法の原理の１例を表す図である。図２ａは、液相中で、試薬Ａ、分析対象物質、及び試薬Ｂを接触させるために予め混合した状態を表す。即ち、第１結合物質１にアビジン及びストレプトアビジンから選ばれた多価分子２が結合してなる試薬Ａ（即ち、第１結合物質１−多価分子２）、分析対象物質３、並びに、第１結合物質１に対して、分析対象物質３と競合的な結合性を有するアナログ物質８が標識物質５で標識されてなる試薬Ｂ（即ち、アナログ物質８−標識物５）を、液相中で予め混合した状態を表す。又は、第１結合物質１にアビジン及びストレプトアビジンから選ばれた多価分子２が結合してなる試薬Ａ（即ち、第１結合物質１−多価分子２）、分析対象物質３、並びに、分析対象物質３と同一の物質９が標識物質５で標識されてなる試薬Ｂ（即ち、分析対象物質３と同一の物質９−標識物質５）を液相中で予め混合した状態を表す。図２ｂは、前記した混合により反応した液相をマイクロチップの流路に送液して、該流路内の捕獲ゾーンにおいて、ビオチン６と、アビジン又はストレプトアビジンから選ばれた多価分子２との結合により、支持体７上に、多価分子２−第１結合物質１−分析対象物質３からなる複合体、及び／又は、多価分子２−第１結合物質１−アナログ物質８−標識物質５からなる複合体が固定化された状態を表す。或いは、支持体７上に、多価分子２−第１結合物質１−分析対象物質３からなる複合体、及び／又は、多価分子２−第１結合物質１−分析対象物質３と同一の物質９−標識物質５からなる複合体が固定化された状態を表す。
【００４７】
本発明における「分析対象物質」は、生物学的物質が好適である。生物学的物質としては、抗原、抗体、糖鎖、タンパク質、ペプチド、脂質、糖タンパク質、レクチン、レセプター、リガンド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ホルモン、その他、生体中の物質と特異的に結合することができる物質であり、その物質の分子量に依存しないものが挙げられる。
【００４８】
本発明における「第１結合物質」及び「第２結合物質」は、分析対象物質に対して特異的な結合能を有するものであり、両者は分析対象物質に対して非競合的な結合能を有する。
【００４９】
分析対象物質と結合物質の組み合わせとして、抗原と抗体、抗体と抗原、糖鎖とレクチン、レクチンと糖鎖、リガンドとレセプター、レセプターとリガンド、ＤＮＡとＤＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡ、ＲＮＡとＲＮＡ  などが挙げられるが、これは例示に過ぎず、組み合わせを限定するものではない。ここで、使用する結合物質は分析対象物質との結合に関与しない部分を取り除くなどの人工的な改変を加えたものも含まれる。例えば、結合物質が抗体の場合には、未改変の抗体の他、Ｆｃ部分を取り除いたＦ（ａｂ’）2 やＦａｂ’も使用できる。
【００５０】
分析対象物質が抗原である場合には、第１結合物質及び第２結合物質は、各々結合するエピトープが異なるモノクローナル抗体、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体、複数のポリクローナル抗体であってもよく、抗原が複数のサブユニットからなる場合や、ウイルス抗原の場合には、同一のモノクローナル抗体であってもよい。
【００５１】
本発明における標識物質として、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ等の酵素、金コロイド、磁性粒子、蛍光物質、発光物質、核酸、放射性物質などが挙げられる。
【００５２】
本発明において、「第２結合物質が後で標識される」は、複合体形成時に同時に第２結合物質が標識物質で標識されること、あるいは、複合体形成後であって、標識物質の検出前迄に、複合体中の第２結合物質が標識物質で標識されることを意味する。例えば、第２結合物質としてマウス由来ＩｇＧを用いた場合に、複合体が流路内に配置された後、標識された抗マウスＩｇＧ抗体を反応させることで第２結合物質を間接的に標識することができる。また、抗マウスＩｇＧ抗体を混合液中に添加することで、複合体形成と同時に第２結合物質を標識することもできる。
【００５３】
本発明において、「アナログ物質が後で標識される」は、複合体形成時に同時にアナログ物質が標識物質で標識されること、あるいは、複合体形成後であって、標識物質の検出前迄に、複合体中のアナログ物質が標識物質で標識されることを意味する。
【００５４】
本発明におけるマイクロチップの素材としては、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサンの略語）、ＰＭＭＡ、環状ポリオレフィンコポリマー、ポリスチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、シリコン、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂等の樹脂、ガラス、あるいは、これらの部材の表面に、ダイアモンドもしくはダイアモンドライクカーボン、グラファイト、アルデヒド基、アミノ基、アルボジイミド、マレイミド基、ポリ−L −リジン、スクシンイミド基、デキストランなどで表面が修飾されたものを用いることができるが、これらは例示列挙であり、素材を限定するものではない。
【００５５】
本発明における支持体の素材としては、上記したマイクロチップの素材を使用できるが、これらは例示列挙であり、素材を限定するものではない。
【００５６】
本発明において、マイクロチップの流路内にビオチンを配置させる方法として、大きく分けて次の２つの方法をとることができる。
【００５７】
一つめの方法は、支持体としての担体表面にビオチンを固定化し、該担体を流路内に配置させることで、流路内にビオチンを配置させる。担体の流路内への配置は、非特許文献１に記載された方法で実現できる。即ち、流路内に担体は通過できないが、溶液類は通過できる大きさの堰き止め構造を作製し、該流路の入り口から担体を送り込むことで、堰き止め構造より入り口側に担体を配置させることができる。該担体は流路内のうち、流路の入り口から堰き止め構造までの間の全ての空間に配置されていても良いし、流路の入り口から堰き止め構造までの間の一部に配置されていても良い。このような担体の形態にはビーズが挙げられる。担体表面へのビオチンの結合は、直接的な結合でも、スペーサーを介した間接的な結合であってもよい。
【００５８】
二つめの方法は、支持体としての流路壁面にビオチンを固定化する方法である。流路壁面へのビオチンの結合は、直接的な結合でも、スペーサーを介した間接的な結合でもよい。
【００５９】
前記ビオチンの各配置方法において、ビオチンと支持体との間接的な結合に用いるスペーサーとして、核酸、核酸の中で好ましくは数塩基〜数十塩基程度のオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、磁性粒子、炭素鎖（途中、ＯＨ基、ＣＯＯ基、ＮＨ2 基、ＮＨ基などで置換、あるいは修飾されたものを含む）、ポリエチレングリコール（骨格中一部が、ＯＨ基、ＣＯＯ基、ＮＨ2 基、ＮＨ基などで置換、あるいは修飾されたものを含む）、糖鎖、ペプチド、タンパク質等が挙げられる。
【００６０】
本発明における、サンドイッチアッセイの形態の例を以下に示す。はじめに、アビジン又はストレプトアビジンと結合した第１結合物質、分析対象物質を含む試料、及び標識物質で標識された又は後で標識される第２結合物質は液相中で反応が進行する。この反応方法として、
１）  マイクロチップとは別の反応槽を準備し、その中で、溶液状のアビジン又はストレプトアビジンが結合した第１結合物質、分析対象物質、及び第２結合物質を混合して反応を進行させる方法、又は、
２）  マイクロチップとは別の反応槽の中に、アビジン又はストレプトアビジンが結合した第１結合物質、及び標識物質で標識された又は後で標識される第２結合物質を乾燥状態で置いておく。続いて、分析対象物質を含む液体状の試料を添加して、試料液中にアビジン又はストレプトアビジンが結合した第１結合物質と、標識物質で標識された又は後で標識される第２結合物質を溶かし込みながら液相反応を進行させる方法、又は、
３）  マイクロチップにおけるビオチンが配置された流路と連結された流路内に反応槽を形成させておき、該反応槽の中に、アビジン又はストレプトアビジンが結合した第１結合物質、及び標識物質で標識された又はあとで標識される第２結合物質を乾燥状態で置いておく。その後、分析対象物質を含む試料液を該反応槽に満たして、試料液中にアビジン又はストレプトアビジンが結合した第１結合物質と、標識物質で標識された又は後で標識される第２結合物質を溶かし込みながら液相反応を進行させる方法、
などが挙げられる。
【００６１】
続いて、ビオチンが配置された流路に上記した混合液を送液することで、流路内にアビジン−ビオチン又はストレプトアビジン−ビオチンの結合を介して、第１結合物質−分析対象物質−第２結合物質からなる複合体を配置させる。続いて、複合体中の第２結合物質に結合されている標識物質を検出することで分析対象物質の存在又は量を分析することができる。
【００６２】
上記した方法の他にも、
４）  マイクロチップにおけるビオチンが配置された流路と連結された流路、又はマイクロチップ外のチューブ等であって、ビオチンが配置された流路から分岐したものの中に、アビジン又はストレプトアビジンが結合した第１結合物質、分析対象物質を含む試料、標識物質で標識された第２結合物質を溶液の状態で、それぞれ独立して満たす。続いて、各溶液を同時に送液することで、各試薬をビオチンが配置された流路内で混合しながら、そこで形成された複合体を流路内に配置させる。続いて、複合体中の第２結合物質に結合されている標識物質を検出することで分析対象物質の量を測定することもできる。
【００６３】
ここで、ビオチンが配置された流路内に複合体を配置させるために、混合液を流路内に送液するが、必ずしも送液し続ける必要は無く、流路に混合液が満たされた状態で送液を止め、一定時間インキュベーションする方法でも良い。送液方法としては溶液を流路入り口から押し出すこともできるし、流路入り口に混合液を接触させ、流路内を陰圧にして吸引により溶液を流路内に呼び込む方法でも良い。また、毛細管現象によって流路内に溶液を満たす方法も使用できる。即ち、流路内に配置させたビオチンに混合液を接触させることができるいかなる方法も用いることができる。
【００６４】
本発明はサンドイッチアッセイに限らず、競合アッセイにも利用できる。即ち、アビジンが結合した第１結合物質、分析対象物質を含む試料、分析対象物質と競合的に第１結合物質に結合する標識された又は後で標識されるアナログ物質を液相中で反応させる。該競合アッセイにおいて、前記アナログ物質の代わりに、分析対象物質と同じ物質を用いても、同様に競合アッセイを行ううことができる。競合アッセイとてし、例えば、次の１）−４）の４個の反応方法が挙げられる。これらの反応方法においても、アナログ物質に代えて、分析対象物質と同じ物質を用いることができる。
【００６５】
１）  マイクロチップとは別の反応槽を準備し、その中で、溶液状のアビジン又はストレプトアビジンが結合した第１結合物質、分析対象物質、及び標識物質で標識された又は後で標識されるアナログ物質を混合して反応を進行させる方法、又は
２）  マイクロチップとは別の反応槽の中に、アビジン又はストレプトアビジンが結合した第１結合物質及び標識された又は後で標識されるアナログ物質を乾燥状態で置いておく。続いて、分析対象物質を含む液体状の試料を添加して、試料液中にアビジン又はストレプトアビジンが結合した第１結合物質と、標識物質で標識された又は後で標識されるアナログ物質を溶かし込みながら液相反応を進行させる方法、又は、
３）  マイクロチップにおけるビオチンが配置された流路と連結された流路内に反応槽を形成させておき、該反応槽の中に、アビジン又はストレプトアビジンが結合した第１結合物質、及び標識された又は後で標識されるアナログ物質を乾燥状態で置いておく。その後、分析対象物質を含む試料液を該反応槽に満たして、試料液中にアビジン又はストレプトアビジンが結合した第１結合物質と、標識された又は後で標識されるアナログ物質を溶かし込みながら液相反応を進行させる方法、
などが挙げられる。
【００６６】
続いて、ビオチンが配置された流路に上記した混合液を送液することで、流路内にアビジン−ビオチン又はストレプトアビジン−ビオチンの結合を介して、第１結合物質−分析対象物質、及び／又は、第１結合物質−アナログ物質からなる複合体を配置させる。続いて、複合体中のアナログ物質の標識物質を検出することで分析対象物質の量を分析することができる。
【００６７】
上記した方法の他にも、
４）  マイクロチップにおけるビオチンが配置された流路と連結された流路、又はマイクロチップ外のチューブ等であって、ビオチンが配置された流路から分岐したものの中に、アビジン又はストレプトアビジンが結合した第１結合物質、分析対象物質を含む試料、標識物質で標識されたアナログ物質を溶液の状態で、それぞれ独立して満たす。続いて、各溶液を同時に送液することで、各試薬をビオチンが配置された流路内で混合しながら、そこで形成された複合体を流路内に配置させる。続いて、複合体中のアナログ物質に結合している標識物質を検出することで分析対象物質の量を測定することもできる。
【実施例】
【００６８】
〔実施例１〕
ステップワイズ反応系とプレミックス反応系でのシグナルの違い
（１）  第１抗体へのストレプトアビジンの導入
ｉ) 第１抗体のＦａｂ’化
Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に対するマウスモノクローナル抗体（「第１抗体」と呼ぶ）（商品名：MONOCLONAL ANTI HBsAg, ASCITES PURIFIED, CLONE23-02 、SCANTIBODIES Laboratory, Inc. ）を、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）に溶解し、第１抗体量の５％の量になるように、ペプシン（ロシュ社製）を加え、３７℃でインキュベーションした。続いて、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いてゲルろ過カラムクロマトグラフィーによりペプシン消化物とＦ（ａｂ’）2 を分離し、Ｆ（ａｂ’）2 分画を限外ろ過により濃縮した。
【００６９】
前記工程で調製したＦ（ａｂ’）2 の溶液に、最終濃度が１０ｍＭとなるようにシスチアミン塩酸塩（和光純薬株式会社製）を添加し、３７℃でインキュベーションした。続いて５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いてゲルろ過カラムクロマトグラフィーによりシスチアミン塩酸塩とＦａｂ’を分離し、第１抗体由来のＦａｂ’を調製した。
【００７０】
ii) ストレプトアビジンへのマレイミド基の導入
リン酸緩衝液（pH7.0 ）にストレプトアビジン（Sigma-aldorich社製）を１ｍｇ／ｍＬになるように溶解し、６６ｎｍｏｌのＮ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）−スクシンイミド（商品名：ＥＭＣＳ、同仁化学研究所製、発売元：和光純薬株式会社）を１００μＬのＤＭＦに溶解したものと混合して、３７℃で1 時間インキュベーションした。続いて、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いたゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより遊離のＮ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）−スクシンイミドを除去した。マレイミド基導入ストレプトアビジンを限外ろ過濃縮した。
【００７１】
iii)  ストレプトアビジンが結合したＦａｂ’の調製
前記工程ｉ) で調製したＦａｂ’と前記工程ii) で調製したマレイミド基導入ストレプトアビジンを混合し、３７℃で１時間インキュベーションした後、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いたゲルろ過カラムクロマトグラフィーを行い、ストレプトアビジンとＦａｂ’が結合した分子量に当たるピークフラクションを集めて限外ろ過濃縮したものを、ストレプトアビジン導入第１抗体（略語：ＳＡ導入第１抗体）溶液とした。
【００７２】
（２）  第２抗体のＨＲＰ標識
ｉ) 第２抗体のＦａｂ’化
Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に対するマウスモノクローナル抗体で第１抗体とは異なるエピトープに反応する抗体（「第２抗体」と呼ぶ）（商品名：抗ＨＢｓ抗体  Hyb-824 、株式会社特殊免疫研究所）を、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）に溶解し、第２抗体量の５％の量になるようにペプシン（ロシュ社製）を加え、３７℃でインキュベーションした。続いて、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いてゲルろ過カラムクロマトグラフィーによりペプシン消化物とＦ（ａｂ’）2 を分離し、Ｆ（ａｂ’）2 分画を限外ろ過により濃縮した。
【００７３】
調製したＦ（ａｂ’）2 の溶液に、最終濃度が１０ｍＭとなるようにシスチアミン塩酸塩（和光純薬株式会社製）を添加し、３７℃でインキュベーションした。続いて５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いてゲルろ過カラムクロマトグラフィーによりシスチアミン塩酸塩とＦａｂ’を分離し、第２抗体由来のＦａｂ’を調製した。
【００７４】
ii) ＨＲＰへのマレイミド基の導入
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にＨＲＰ（ロシュ社製）を１ｍｇ／ｍＬになるように溶解し、１２５０ｎｍｏｌのＮ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）−スクシンイミド（商品名：ＥＭＣＳ、同仁化学研究所製、発売元：和光純薬株式会社）を１００μＬのＤＭＦに溶解したものと混合して、３７℃で1 時間インキュベーションした。続いて、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いたゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより遊離のＮ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）−スクシンイミドを除去した。マレイミド基導入ＨＲＰを限外ろ過濃縮した。
【００７５】
iii)  ＨＲＰ標識Ｆａｂ’の調製
前記ｉ) の工程で調製したＦａｂ’と前記ii) の工程で調製したマレイミド基導入ＨＲＰを混合し、３７℃で１時間インキュベーションした後、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いたゲルろ過カラムクロマトグラフィーを行い、ＨＲＰとＦａｂ’が結合した分子量に当たるピークフラクションを集めて限外ろ過濃縮したものを、ＨＲＰ標識第２抗体溶液とした。
【００７６】
（３）  流路内にビオチンを固定化したマイクロチップの調製
ジーンスライド（商品名、株式会社日本パーカーライジング製）にビオチン標識オリゴヌクレオチドを固定化し、該固定化基板上に溝を形成させたＰＤＭＳを圧着することで流路を形成させたマイクロチップを作製した。即ち、5 ’末端をアミノ基で修飾し、3 ’末端をビオチンで修飾した、５’−ＡＴＡＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧＴＴＡＧＣＡＡ−３’の配列からなるオリゴヌクレオチド（Sigma genosys 社製）を、２５μＭの濃度になるようにSolution６（溶液名、株式会社日本パーカーライジング製のジーンスライド購入時に添付されてくる溶液で、ジーンスライドにＤＮＡを固定化するための専用溶液）に溶解し、ジーンスライド（商品名、株式会社日本パーカーライジング製）上に添付されたプロトコールにしたがって固定化した。続いて、幅１．５ｍｍ、深さ２０μｍの溝を形成させたＰＤＭＳを、該溝がＤＮＡの固定化された領域の上を覆うように圧着させることで、ビオチンが流路壁面に固定化されたマイクロチップを調製した。
【００７７】
（４）  マイクロ流体システムを用いたＢ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の検出−ステップワイズ反応系
ビオチンが固定化された流路に、ＰＢＳで２倍希釈したブロックエース（商品名、雪印乳業株式会社製、販売元：大日本製薬株式会社）を送液して流路壁面をブロッキングした。続いて、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で５０μｇ／ｍＬに調製したＳＡ導入第１抗体を流路内に送液し、流路内のビオチンをＳＡ導入第１抗体で飽和させた後、ＰＢＳ（−）を送液することで流路内を洗浄した。ここに、ＨＢｓＡｇとＨＲＰ標識抗体を１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）中で混合した溶液（混合液中のＨＲＰ標識抗体濃度は１μｇ／ｍＬとした）を送液して、流路内にビオチンを介してＳＡ導入第１抗体−ＨＢｓＡｇ−ＨＲＰ標識第２抗体からなる複合体を固定化し、ＰＢＳ（−）を送液して流路内を洗浄した。ここで、複合体の検出は複合体中のＨＲＰ活性を測定することで実施した。即ち、ＨＲＰの基質溶液であるＳＡＴＢｌｕｅ（同仁化学研究所社製）を流路に送液しながら、複合体が固定化された領域の下流で、ＨＲＰにより酸化されて発色したＳＡＴＢｌｕｅ溶液を熱レンズ顕微鏡により検出した。Ｂｌａｎｋと５ｎｇ／ｍＬのＨＢｓＡｇを測定した結果を縦軸に熱レンズ信号強度（単位：電圧）をとって表したグラフを図３に示す。
【００７８】
（５）  マイクロ流体システムを用いたＢ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の検出−プレミックス反応系
ビオチンが固定化された流路に、ＰＢＳで２倍希釈したブロックエース（商品名、雪印乳業株式会社製、販売元：大日本製薬株式会社）を送液して流路壁面をブロッキングした。続いて、ＳＡ導入第１抗体、ＨＢｓＡｇ、及びＨＲＰ標識抗体を１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）中で混合した溶液（混合液中のＳＡ導入第１抗体濃度は０．５μｇ／ｍＬとし、ＨＲＰ標識抗体濃度は１μｇ／ｍＬとした）を送液して、流路内にビオチンを介して、ＳＡ導入第１抗体−ＨＢｓＡｇ−ＨＲＰ標識第２抗体、からなる複合体を固定化し、ＰＢＳ（−）を送液して流路内を洗浄した。ここで、複合体の検出は複合体中のＨＲＰ活性を測定することで実施した。即ち、ＨＲＰの基質溶液であるＳＡＴＢｌｕｅ（同仁化学研究所社製）を流路に送液しながら、複合体が固定化された領域の下流で、ＨＲＰにより酸化されて発色したＳＡＴＢｌｕｅ溶液を熱レンズ顕微鏡により検出した。Ｂｌａｎｋと５ｎｇ／ｍＬのＨＢｓＡｇを測定した結果を縦軸に熱レンズ信号強度（単位：電圧）をとって表したグラフを図４に示す。
【００７９】
図３と図４を比較すると、Ｂｌａｎｋのシグナルと５ｎｇ／ｍＬのＨＢｓＡｇを反応させたときのシグナルは共に同じレベルである。即ち、ＳＡ導入第１抗体を用いたプレミックス反応系ではステップワイズ反応系に比べて感度の低下は認められず、シグナルが維持できることが示された。
【００８０】
〔比較例１〕
ＤＮＡ導入第１抗体を用いたときのステップワイズ反応系とプレミックス反応系のシグナルの比較、及びＳＡ導入第１抗体を用いたときにバックグラウンドシグナルが低減できることの実証
（１）オリゴヌクレオチド導入第１抗体の調製
第１抗体に導入するオリゴヌクレオチドの配列は5 ’末端をアミノ基で修飾した、5 ’−ＴＴＧＣＴＡＡＣＣＣＡＧＡＡＣＡＣＴＡＴ−３’を用いた。Ｏｋｕらの方法（Ｊ
Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００１  Ｄｅｃ  １；２５８（１−２）：７３−８4.）に従って、ＤＮＡ導入第１抗体の調製を行った。
【００８１】
（２）流路内にオリゴヌクレオチドを固定化したマイクロチップの調製
第１抗体に導入されたオリゴヌクレオチドと相補的な配列をもつオリゴヌクレオチドをジーンスライド（商品名、株式会社日本パーカーライジング製）上に固定化し、該固定化基板上に溝を形成させたＰＤＭＳを圧着することで流路を形成させたマイクロチップを作製した。即ち、5 ’末端をアミノ基で修飾した、５’−ＡＴＡＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧＴＴＡＧＣＡＡ−３’なる配列からなるオリゴヌクレオチド（Sigma genosys 社製）を、２５μＭの濃度になるようにＳｏｌｕｔｉｏｎ６（ジーンスライド購入時に添付されてくる溶液で、ジーンスライドにＤＮＡを固定化するのに適したＤＮＡ溶解用の溶液）に溶解し、ジーンスライド（商品名、株式会社日本パーカーライジング製）上に、添付されたプロトコールにしたがって固定化した。続いて、幅１．５ｍｍ、深さ２０μｍの溝を形成させたＰＤＭＳを該溝が、ＤＮＡが固定化された領域の上にかぶるように圧着させることで、オリゴヌクレオチドが流路壁面に固定化されたマイクロチップを調製した。
【００８２】
（３）マイクロ流体システムにおいて、ＤＮＡ導入抗体を用いたときのステップワイズ反応系におけるＨＢｓＡｇの検出
第１抗体に導入されたオリゴヌクレオチドと相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドが固定化された流路に、ＰＢＳで２倍希釈したブロックエース（商品名、雪印乳業株式会社製、販売元：大日本製薬株式会社）を送液して流路壁面をブロッキングした。続いて、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で５０μｇ／ｍＬに調製したＤＮＡ導入第１抗体を流路内に送液し、流路内のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ導入第１抗体との結合で飽和させた後、ＰＢＳ（−）を送液することで流路内を洗浄した。ここに、ＨＢｓＡｇとＨＲＰ標識抗体を１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）中で混合した溶液（混合液中のＨＲＰ標識抗体濃度は１μｇ／ｍＬとした）を送液して、流路内にＤＮＡのハイブリダイゼーションを介してＤＮＡ導入第１抗体−ＨＢｓＡｇ−ＨＲＰ標識第２抗体からなる複合体を固定化し、ＰＢＳ（−）を送液して流路内を洗浄した。ここで、複合体の検出は複合体中のＨＲＰ活性を測定することで実施した。即ち、ＨＲＰの基質溶液であるＳＡＴＢｌｕｅ（同仁化学研究所社製）を流路に送液しながら、複合体が固定化された領域の下流で、ＨＲＰにより酸化されて発色したＳＡＴＢｌｕｅ溶液を熱レンズ顕微鏡により検出した。Ｂｌａｎｋと５ｎｇ／ｍＬのＨＢｓＡｇを測定した結果を縦軸に熱レンズ信号強度（単位：電圧）をとって表したグラフを図５に示す。
【００８３】
（４）マイクロ流体システムにおいて、ＤＮＡ導入抗体を用いたときのプレミックス反応系におけるＨＢｓＡｇの検出
第１抗体に導入されたオリゴヌクレオチドと相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドが固定化された流路に、ＰＢＳ（−）で２倍希釈したブロックエース（商品名、雪印乳業株式会社製、販売元：大日本製薬株式会社）を送液して流路壁面をブロッキングした。続いて、ＤＮＡ導入第１抗体、ＨＢｓＡｇ、及びＨＲＰ標識抗体を１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）中で混合した溶液（混合液中のＤＮＡ導入第１抗体濃度は０．５μｇ／ｍＬとし、ＨＲＰ標識抗体濃度は１μｇ／ｍＬとした）を送液して、流路内にＤＮＡのハイブリダイゼーション反応を介して、ＤＮＡ導入第１抗体−ＨＢｓＡｇ−ＨＲＰ標識第２抗体、からなる複合体を固定化し、ＰＢＳ（−）を送液して流路内を洗浄した。ここで、複合体の検出は複合体中のＨＲＰ活性を測定することで実施した。即ち、ＨＲＰの基質溶液であるＳＡＴＢｌｕｅ（同仁化学研究所社製）を流路に送液しながら、複合体が固定化された領域の下流で、ＨＲＰにより酸化されて発色したＳＡＴＢｌｕｅ溶液を熱レンズ顕微鏡により検出した。Ｂｌａｎｋと５ｎｇ／ｍＬのＨＢｓＡｇを測定した結果を縦軸に熱レンズ信号強度（単位：電圧）をとって表したグラフを図６に示す。図５のグラフと図６のグラフを比較すると、ステップワイズ反応系に比べ、プレミックス反応系ではシグナルが大きく低下してしまうことが分かる。図５のグラフと前記実施例１の図３を比較すると、Ｂｌａｎｋのシグナル（Ｂ）と５ｎｇ／ｍＬのＨＢｓＡｇを反応させたときのシグナルのシグナル（Ｓ）比（Ｓ／Ｂ）が図３では大きい。即ち、ＳＡ導入第１抗体を用いることでバックグラウンドシグナルが低減され、その結果Ｓ／Ｂが大きくなり、感度が上昇することが示された。
【００８４】
〔実施例２及び比較例２〕
ＳＡ導入第１抗体を用いたプレミックス反応系と、比較のためのＤＮＡ導入抗体を用いたプレミックス反応系におけるＨＢｓＡｇの検出感度の比較
前記実施例１の（５）、及び、前記比較例１の（４）に示した方法によりＨＢｓＡｇ濃度を０，０．１，０．５，２．５ｎｇ／ｍＬとしたときのシグナルを測定した。測定した結果を横軸に濃度、縦軸に熱レンズ信号強度（単位：電圧）をとったグラフにして、本発明のＳＡ導入第１抗体を用いたプレミックス反応系については図７に、比較のためのＤＮＡ導入抗体を用いたプレミックス反応系については図８に示す。図７、図８を比較すれば分かるように、ＳＡ導入抗体を用いたプレミックス反応系では０．１ｎｇ／ｍＬの検出が確認でき、短い反応時間で、高感度検出が実現できることが実証された。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明の分析方法及び分析キットは、微小断面の流路を有するマイクロチップを用いたマイクロ流体システムによるプレミックス反応系において、短時間で高感度の検出を可能にする。本発明の分析方法及び分析キットは臨床検査における生体高分子の分析に有用である。
【００８６】
本明細書において、本発明の分析方法及び分析キットは、主として微小断面の流路を有するマイクロチップを用いたマイクロ流体システムによるプレミックス反応系について説明されているが、該プレミックス反応系はマイクロ流体システムのみならず、イムノクロマトへの応用も可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】サンドイッチ法による本発明の分析方法の原理の１例を表す図である。
【図２】競合法による本発明の分析方法の原理の１例を表す図である。
【図３】マイクロ流体システムを用いたサンドイッチ免疫測定系において、ＳＡ導入抗体を用いたステップワイズ反応系で、Ｂｌａｎｋと５ｎｇ／ｍＬのＨＢｓＡｇを測定した結果を縦軸に熱レンズ信号強度（単位：電圧）をとって表したグラフである。
【図４】マイクロ流体システムを用いたサンドイッチ免疫測定系において、ＳＡ導入抗体を用いたプレミックス反応系で、Ｂｌａｎｋと５ｎｇ／ｍＬのＨＢｓＡｇを測定した結果を縦軸に熱レンズ信号強度（単位：電圧）をとって表したグラフである。
【図５】マイクロ流体システムを用いたサンドイッチ免疫測定系において、ＤＮＡ導入抗体を用いたステップワイズ反応系で、Ｂｌａｎｋと５ｎｇ／ｍＬのＨＢｓＡｇを測定した結果を縦軸に熱レンズ信号強度（単位：電圧）をとって表したグラフである。
【図６】マイクロ流体システムを用いたサンドイッチ免疫測定系において、ＤＮＡ導入抗体を用いたプレミックス反応系で、Ｂｌａｎｋと５ｎｇ／ｍＬのＨＢｓＡｇを測定した結果を縦軸に熱レンズ信号強度（単位：電圧）をとって表したグラフである。
【図７】ＳＡ導入第１抗体を用いたプレミックス反応系におけるＨＢｓＡｇの検出感度を、横軸に濃度、縦軸に熱レンズ信号強度（単位：電圧）をとって表したグラフである。
【図８】ＤＮＡ導入抗体を用いたプレミックス反応系におけるＨＢｓＡｇの検出感度を、横軸に濃度、縦軸に熱レンズ信号強度（単位：電圧）をとって表したグラフである。
【符号の説明】
【００８８】
１    第１結合物質
２    多価分子
３    分析対象物質
４    第２結合物質
５    標識物質
６    ビオチン
７    支持体
８    アナログ物質
９    分析対象物質と同一の物質
【図１】
2007085779.tif 000003
【図２】
2007085779.tif 000004
【図３】
2007085779.tif 000005
【図４】
2007085779.tif 000006
【図５】
2007085779.tif 000007
【図６】
2007085779.tif 000008
【図７】
2007085779.tif 000009
【図８】
2007085779.tif 000010
【配列表】
2007085779000001.app