(57)【要約】      （修正有）【課題】発現用の有益な遺伝子で安定に形質転換したプロトプラストから再生した、植物の提供。【解決手段】ｐ３４ｃｄｃ２をコードする配列、サイクリン関連キナーゼ機能を有するｐ３４ｃｄｃ２様蛋白をコードする配列、およびｐ３４ｃｄｃ２もしくはｐ３４ｃｄｃ２様分子と相互作用し、ｐ３４ｃｄｃ２もしくはｐ３４ｃｄｃ２様分子のレベルを調節する調節要素よりなる群から選択される少なくとも１つで形質転換させたトランスジェニック植物または植物細胞であって、ここに、該調節要素は、ｐ１３ＳＵＣ１、サイクリン、ｃｄｃ２５、またはnim-1、wee-1およびmik-1遺伝子の産物よりなる群から選択されることを特徴とする該トランスジェニック植物または植物細胞。【選択図】図２
2007222171.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ３４ｃｄｃ２をコードする配列、サイクリン関連キナーゼ機能を有するｐ３４ｃｄｃ２様蛋白をコードする配列、およびｐ３４ｃｄｃ２もしくはｐ３４ｃｄｃ２様分子と相互作用し、ｐ３４ｃｄｃ２もしくはｐ３４ｃｄｃ２様分子のレベルを調節する調節要素よりなる群から選択される少なくとも１つで形質転換させたトランスジェニック植物または植物細胞であって、ここに、該調節要素は、ｐ１３ＳＵＣ１、サイクリン、ｃｄｃ２５、またはnim-1、wee-1およびmik-1遺伝子の産物よりなる群から選択されることを特徴とする該トランスジェニック植物または植物細胞。
【請求項２】
増強されたレベルのｐ３４ｃｄｃ２もしくはｐ３４ｃｄｃ２−様蛋白を発現する請求項１記載のトランスジェニック植物または植物細胞。
【請求項３】
単子葉植物である請求項１または２記載のトランスジェニック植物または植物細胞。
【請求項４】
双子葉植物である請求項１または２記載のトランスジェニック植物または植物細胞。
【請求項５】
該単子葉植物がトラデスカンティア（Tradescantia）、小麦、大麦、オート麦、トウモロコシまたは米である請求項３記載のトランスジェニック植物または植物細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、植物細胞成長の制御方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、細胞周期制御蛋白レベルを調節するか、あるいは植物細胞に作用する酵素レベルを変更することによりその活性を調節することによる植物細胞の増殖および分化の制御に指向される。
【背景技術】
【０００２】
植物体の形成は、分裂周期による新しい細胞の生成および特殊化した構造および代謝のそれらにおける発育を含む。特殊化には、穀類のごとき単子葉植物の細胞において特別な迅速性をもって減衰する分裂能の減少が伴う。
【０００３】
酵母では、ｃｄｃ２遺伝子機能が２つの主要制御点を通過する進行に必要であり、その時点で、細胞周期は細胞サイズおよび栄養が満たされるまで遅延させ得る（１；２）。これらの地点の制御は、ｃｄｃ２遺伝子産物のｐ３４ｃｄｃ２と刺激要素および抑制要素との相互作用によって行われる（３；４）。
【０００４】
発育の間の細胞分裂を制御するためのｐ３４ｃｄｃ２レベルの変化の可能な寄与はいずれの生物体においてもほとんど研究されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、再生植物における発現用の有益な遺伝子で安定に形質転換したプロトプラストから植物を再生させることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明では、今回、穀類植物の葉において、ｐ３４ｃｄｃ２の同族体が細胞の分裂および発育の制御に寄与することが判明した。この蛋白の発現および／または活性の調節により、細胞の増殖および分化の制御が可能となり、植物の再生および発育のごときプロセスは容易であろう。
【０００７】
従って、本発明の１の態様は、細胞分裂を修飾するかまたは制御するのに十分な時間および条件下で植物における細胞周期制御蛋白のレベルおよび／または触媒活性を調節することを特徴とする植物細胞成長を制御する方法である。
【０００８】
本発明のこの態様において、「植物細胞」とは、単一の細胞または細胞群あるいはカルスとして培養に存在するいずれの細胞も意味する。また、該細胞は培養において発育している植物におけるものであってもよく、あるいは天然で成長している植物におけるものであってもよい。植物細胞は天然に存在するもの、あるいは植物体から単離してもの、あるいは組換え、突然変異その他誘導化された植物細胞もしくは細胞群であってもよい。植物は双子葉植物または単子葉植物いずれでもよく、後者の場合、細胞周期遺伝子はさらにプロトプラスト細胞からの再生を助ける初期相で使用することもできる。分裂の回復を助けるこのさらなる技術は、小麦、大麦、オート麦、トウモロコシ、米その他の作物に適用する場合に特に価値がある。
【０００９】
単子葉植物については、本発明は二重の利益がある：（１）いずれかの有益遺伝子の導入後におけるより容易なプロトプラストからの再生作業；および（２）細胞周期遺伝子の植物遺伝子型への付加。双子葉植物については、すでに容易に再生可能であるので、利点（２）が特にあてはまる。
【００１０】
好ましくは、細胞周期制御蛋白はその誘導体、同族体および機能的アナログを含めたｐ３４ｃｄｃ２である。この蛋白は制御されるべき植物細胞に同種、すなわち該細胞において天然に存在するものであるか、あるいは該細胞に対して異種、すなわち該蛋白またはその遺伝子配列が同植物起源でない源からの当該細胞に導入され得るものである。例えば、制御蛋白はもう１つの植物からのものであってよく、あるいはもう１つの酵母細胞のごとき真核生物からものであってもよい。該ｐ３４ｃｄｃ２蛋白またはｐ３４ｃｄｃ２様分子は、分子のハイブリッドであってもよく、および／または、ハイブリッド遺伝子配列によってコードされるものでもよい。本明細書中で用いる「ｐ３４ｃｄｃ２またはｐ３４ｃｄｃ２様分子」なる語の使用は同種または異種誘導体、同族体および機能的アナログすべてを含む。本発明は、他の細胞周期制御蛋白まで及び、それらはｐ３４ｃｄｃ２と同様に機能し、あるいはｐ３４ｃｄｃ２活性を制御するので、そのような用語使用とする。かかる蛋白は、ｐ３４ｃｄｃ２とは別にあるいはそれと一緒に、ｐ１３ＳＵＣｌ、サイクリン（cyclin)、ｃｄｃ２５、およびnim-1、wee-1およびmik-1の産物またはその組合せを包含する。
【００１１】
ｐ３４ｃｄｃ２の「誘導体」とは、誘導体化前に天然に存在する分子における配列と比較して、少なくとも１個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有するいずれの蛋白分子も意味する。加えて、該用語は組換えもしくは合成分子および単一もしくは複数のアミノ酸の置換、欠失および／または付加あるいは炭水化物またはリピド部位のごとき関連分子のいずれかの置換、欠失および／または付加を担う分子をいう。
【００１２】
便宜には、ｐ３４ｃｄｃ２のレベルはｃｄｃ２遺伝子プロモーター（またはその同等物）を操作することによって遺伝子レベルで制御できる。例えば、異なるプロモーターを挿入することができ、それは発育段階で調節でき、あるいはいくつかの他の手段によって調節できる。異なるプロモーターの使用は、促進された発現および／または大いに制御された発現の機会を与え得る。別法として、適当な制御下にある同種または異種ｃｄｃ２遺伝子の多重コピーを挿入して発現レベルを増加させることができる。また、ｃｄｃ２遺伝子の発現を助力し、あるいは調節する制御遺伝子または遺伝子部位を操作することが可能であろう。当業者ならば、抑制的遺伝子の発現を減少させるアンチセンス剤またはルボザイム剤の使用のごとき同種および／または異種ｃｄｃ２遺伝子のin vivoにての発現を制御する種々の手段、ならびにそのようなすべての手段が本発明の範囲内に入ることを直ちに認識するであろう。例えば、ｐ３４ｃｄｃ２のごとき細胞周期蛋白は細胞周期蛋白に対して作用する酵素の活性レベルで制御することができる。
【００１３】
また、ｐ３４ｃｄｃ２レベルは蛋白レベルで制御することもできる。かかる制御はin vitroでの細胞の成長に対しより多く適用されるが、本発明は、必ずしもそのように限定されるものではない。本発明のこの態様において、例えば、細胞周期制御蛋白を培養に添加し、エレクトロポレーションのごとき種々の手法によって細胞に浸透させることができる。適当な形態への蛋白の精製は記載されている（１２）。量としては、細胞成長を調節するのに十分な時間および条件下にて使用される。
【００１４】
植物成長を制御する方法に関し、これは、初期の種子発育中におけるとか分裂組織におけるごとく適当な部位および時期に発現できるプロモーターの制御下にて植物ゲノムへの細胞周期遺伝子の安定な組み込みを含み得る。これは、アグロバクテリウムの使用のごとき形質転換の常法によって双子葉植物作物行うことができる。また、それは、胚形成カルス由来の細胞に遺伝子を導入し、続いて再生させるためのバイオリスティック（biolistic)マイロプロジェクタイル衝撃のごとき公表された方法を用いて単子葉植物で行うこともできる。
【００１５】
本発明のもう１つの態様は、長期懸濁培養を行う必要をなくすることによって、形質転換できる単子葉植物の数およびいずれの単子葉植物も形質転換できる容易性を増加させるために細胞周期遺伝子を用いることである。
【００１６】
関連する植物細胞に応じ、細胞膜は処理されたものである必要があれ、および／または、蛋白自身が標的細胞への侵入を容易にするために誘導体化されている必要がある。別法として、周期制御蛋白の活性の阻害剤、拮抗剤または作動剤を用いることもできる。さらに、かかる手法の組合せを用いることもできる。１つの特別の態様において、ｐ３４ｃｄｃ２をオーキシンと組み合わせて使用することもできる。
【００１７】
従って、本発明においては、ｐ３４ｃｄｃ２の量は植物組織における細胞分裂につき限定的であることが判明した。特殊化された機能の発育につき分裂の停止が必要な場合、これは、この鍵細胞周期制御蛋白の低レベルへの減少によって決定する。細胞分裂を回復できる組織においては、この蛋白を分裂に先立って誘導する（１２）。さらに、本発明者らは、植物ｐ３４ｃｄｃ２は、酵母ｐ３４ｃｄｃ２の活性を制御する役割を果す分裂酵母からの調節サブユニットｐ１３ＳＵＣｌと相互作用することを見い出した。ｐ１３ＳＵＣｌの植物同族体が今回見い出された。ｐ１３ＳＵＣｌの機能は分裂酵母における有糸分裂の完成に必要である。植物ｐ３４ｃｄｃ２蛋白が１つの調節サブユニットと関連するという事実は、酵母で遺伝子的に同定されている他の調節相互作用が植物で作動できこと、および酵母からまず採取された調節遺伝子を植物細胞分裂を制御するのに使用し得ることを意味する。従って、本発明はｐ３４ｃｄｃ２レベルの制御に向けられるのみならず、間接的にｐ３４ｃｄｃ２活性の調節となるｐ１３ＳＵＣｌ、wee-1、mik-1、nim-1およびｃｄｃ２５のごとき調節要素の制御まで拡大される。
【００１８】
本発明は植物の再生で特に有用である。例えば、小麦葉の成熟細胞から、ＤＮＡの導入に非常に適する健全なプロトプラストが得られるがそれは、植物へ再生するのが非常に困難である。今回、これらの細胞は低レベルのｐ３４ｃｄｃ２を有し、これらのレベルを増加できないことが判明した。これは、単子葉植物と双子葉植物の間の組織の基本的な相違であろう。後者の群において、成長は先端で起こり、傷をつけると新しい組織を回復できる新しい分裂組織が生成される。しかしながら、単子葉植物では、末端分裂組織はなく、成長は基部分裂組織の継続的分裂による。傷をつけた結果、局在分裂組織は生じない。従って、ｐ３４ｃｄｃ２のレベルを上昇させることによって、単一細胞または細胞群の植物へのｐ３４ｃｄｃ２再生を容易とできる。
【００１９】
特別の適用は、細胞が従前に懸濁培養で長期増殖を受けていない場合における、その分裂を促進するための形質転換単子葉植物プロトプラストにおける分裂活性の影響である。この目的で、分裂に対する影響は、一過性のものであれば足り、非組込型遺伝的形質転換、または蛋白の導入が適当であろう。この使用は単子葉植物へのいずれかの有益遺伝子の導入を容易にするであろう。
【００２０】
細胞のプロトプラスト化後における分裂の回復を容易にするための細胞周期蛋白またはそれをコードする遺伝子配列の使用は、ゲノムに安定に組み込まれるべき遺伝子の単子葉植物への導入を可能とする。導入された遺伝子は、成長のための温度範囲の増大、病気耐性、水利用、穀類サイズおよび悪条件下における成長を改良するものを含む。
【００２１】
後者に関しては、また、本発明は、植物がその成長を修飾するのに十分な時間および条件下で植物において分裂できる１またはそれを超える植物細胞において細胞周期蛋白のレベルを調節することを特徴とする１またはそれを超える環境条件の存在下で植物成長挙動を修飾する方法に関する。。好ましくは、該植物は小麦、大麦、オート麦、トウモロコシ、米または同様の作物のごとき単子葉植物であり、細胞周期蛋白はｐ３４ｃｄｃ２またはｐ３４ｃｄｃ２様分子である。「環境条件」なる語は、高温または低温下での成長、病気への暴露および水もしくは他の栄養物の過剰または不足のごとき条件を含めるようその最も広義で使用する。
【００２２】
穀類サイズおよび成長に関し、安定な組込のために導入される遺伝子は細胞周期制御遺伝子を包含する。この場合、分裂を促進する遺伝子を、全部プロセスの間に２つの方法で用いることができる：１．分裂を再開するために、プロトプラスト化の後の分裂の回復期の間に、コードする蛋白の遺伝子の一過性発現、またはその蛋白の導入を用いる；２．再生後の植物で分裂活性を修飾するために、さらに、Ａｃのごとき転移性要素およびｎｅｏのごとき選択可能マーカーも含有するＤＮＡに導入された細胞周期遺伝子を安定に組み込み、また、それを用いる。安定に組み込まれた細胞分裂遺伝子は選択した組織または環境条件下で細胞分裂特性を改良するであろう。
【００２３】
さらに、穀物への根粒の誘導の困難性の一部は必要な局在化細胞分裂を誘導できないという可能性がある。本発明では、例えば、ｐ３４ｃｄｃ２遺伝子のさらなるコピーを酵母からおよび／または植物から穀物へ導入できる。ｐ３４ｃｄｃ２の高レベルは酵母でテストした場合に細胞分裂に対して抑制的でなかったので、導入された遺伝子は構成的プロモーターの制御下にあり得る。誘導可能なプロモーターも使用することができ、それは、ｐ３４ｃｄｃ２の基礎レベルを上昇させることから予測されない困難性があれば、形質転換細胞の再生の間のみ誘導できる。ｐ３４ｃｄｃ２の基礎レベルが上昇した、あるいはリゾビウムの感染の時点でレベルが上昇する植物は窒素固定用根粒を形成できるであろう。
【００２４】
しかしながら、植物細胞増殖を抑制する必要があるかも知れない。例えば、冬季の雨に続いて有限量の水を利用できる場合がしばしばそうであり、作物成長の価値ある部分が発育してしまう前に水源を消費しないように植物成長を抑制するのは有利である。冬季の雨の後に播種した小麦は、土壌水が消費される前に実を結ばなくてはならない。野菜植物の成長および特に水の蒸散は抑制されなければならない。蒸散を減少させる化学薬剤は引き続いての成長に逆の副作用を有することが判明した。本発明は、ｐ３４ｃｄｃ２の発現または活性の減少により毒性副作用なくして成長減少を達成できることを提案する。ｐ３４ｃｄｃ２の発現または活性の減少は前記したごとき多数の方法で達成できる。かかる方法の１つにおいて、ｐ３４ｃｄｃ２の活性を抑制する優性作用用量依存性遺伝子を用いることができる。これらは分裂酵母のwee-1およびmil-1遺伝子である。その制御された発現は水源を考慮するために作物の成長を調節するのに使用される。これには、矮化品種を創製するためには構成的に、あるいは水が限定的になる恐れがあれば誘導剤の適用によって矮化を誘導できるよう誘導的にwee-1および／またはmik-1を導入する必要がある。
【００２５】
また、本発明は、植物成長の制御の他の領域で有用である。例えば、植物器官の最終サイズが発育の臨界的段階における細胞数によって決定されるというのがしばしばその場合である。これは、穀類、豆類およびリンゴのごとき多くの重要な作物に適用される。本発明は収穫を増加させるためにこの段階で細胞分裂を刺激するのに使用できる。
【００２６】
さらに、被覆を形成する草冠成長の刺激は植物が休眠している間の土壌からの蒸発による水の喪失を減少でき、それにより、春に成長が回復した場合により多くの水が利用できる。これは、特に、秋蒔小麦に適用される。
【００２７】
さらに、農夫により表面下方で利用可能なことが知られている水を植物が利用できるように土壌の根貫入を促進するのが望ましい。また、農夫が将来の水供給を提案する場合は、水が限定されるときには苗条成長を遅延させないことが望ましい。植物における制御は、水ストレスの最初の検出時において、かつ、これが収穫を制限するかも知れない農業的状況において、成長の保存的制限を生じる。本発明は、分裂活性を刺激し、ｐ３４ｃｄｃ２に影響を与えることによって作用する優性作用用量依存性遺伝子のコピーを導入するのに使用できる。２つの候補遺伝子はnim-1およびcdc２５である。他の戦略は、活性の抑制的調節に応答しないｃｄｃ２の突然変異体のコピーを導入することである。２つの突然変異体は
cdc2-1wおよびcdc2-3wである。すべての３種の遺伝子については、発育の適当な段階で誘導すれば発現は最も効果的であろう。１つの可能性はニトレートレダクターゼプロモーターを使用することであり、希薄ニトレート含有栄養の適用によってその発現を誘導する。
【００２８】
また、この栄養は誘導されたさらなる成長を有利に支持するであろう。他の誘導剤を利用することができ、すべて本発明に含まれる。
【００２９】
双子葉植物および単子葉植物を共に含めた作物植物の経済的に価値ある部分において成長および発育を促進するために細胞周期制御遺伝子を使用することができる。この第２の分類群において、その再生性を改善するための細胞周期制御遺伝子もしくは蛋白のさらなる一過性使用は有利であるが、胚形成カルスのバイオリスティック(biollistic)形質転換も遺伝子の導入についての可能な経路であろう。
【００３０】
経済的に価値ある組織の最終収穫に細胞数が影響する場合は、発育の数段階で細胞分裂挙動に影響を与えるために細胞周期制御遺伝子を使用できる。特別の例は穀粒における胚乳発育の多核段階における多数繰返核分裂である。
【００３１】
また、本発明は、単子葉植物におけるｐ３４ｃｄｃ２またはｐ３４ｃｄｃ２様分子のごとき人工的に制御された細胞周期蛋白を担うトランスジェニック植物もしくは植物細胞に指向され、かかる植物は小麦、大麦、オート麦、トウモロコシ、米または他の作物を含む。かかる人工的制御は高構成もしくは誘導プロモーター、多重遺伝子反復および他の同様な手法および技術を含む。
【００３２】
単子葉植物の再生に関しては、単子葉プロトプラストにつき好ましい１の具体例は、例えば、ＤＮＡの２の調製を用いるエレクトロポレーションによって、再生植物における発現用の有益遺伝子（例えば、菌類または害虫に対する耐性または凍結耐性用遺伝子、および分裂挙動を修飾する遺伝子）で安定に形質転換されることである。１のものは、少なくともｐ３４ｃｄｃ２様分子をコードする遺伝子を担い、恐らく、要すれば、さらに、構成的に発現される３５Ｓまたはその複合ｐＥＭＵのごときプロモーターの制御下にあって、かつ組込を刺激するトランスポゾン要素およびＤＮＡのこの種の残存性を強化する選択マーカーを欠くサイクリンをコードする遺伝子を担うものである。このＤＮＡは分裂の数回の繰返を促進し、（プロトプラスト化の後に起こるごとく、単子葉植物の単一の細胞ではそうではないが、単子葉植物からの分裂する細胞の組織ではそうであるごとく）分裂が継続するミクロカルスに導くのに十分なくらい長く存在するであろう。同時に導入すべき他のＤＮＡは選択可能マーカー、および再生植物に安定に導入され発現される新しく望ましい特性を付与する遺伝子に隣接するＡｃ遺伝子を含有するものである。安定な形質転換のための遺伝子は、病気および害虫耐性用の遺伝子を包含するが、前記したごとき分裂挙動を改善するための遺伝子も包含できる。単子葉植物の場合、それは葉分裂組織特異的プロモーターの胚乳の制御下で発現されるであろう。
【００３３】
ミクロカルスは、オーキシンホルモン（２,４−Ｄ）を含有する固体培地に形質転換細胞を平板培養させることによって生きた状態で得られる。次いで、ミクロカルスを（例えば、カナマイシン型の抗生物質を含有する）選択培地に移して、非形質転換細胞を殺す。生き残るクローンを、オーキシン型ホルモン（２,４-Ｄ  ＮＡＡ）ならびにサイトカイン型ホルモン（カイネチン、ＢＡＰ）および苗条と根の再生のためのＡＢＡを含有する培地に移し、次いで、暫時寒気にあてて強くし、育種のために地面に植える。この手法は、トウモロコシおよび恐らくは米のいくつかの株に適用される別の手法よりも優れた２つの利点を有する。別の手法では、懸濁培養にて、（胚形成カルスに由来する）細胞の集塊を衝撃し、次いで、新しい遺伝情報を摂取した細胞を殺すことを試みる。なぜなら、それは、カナマイシンまたは関連抗生物質に対する耐性を欠くものであり、その耐性は安定に組み込まれるべき遺伝子を担うＤＮＡと一緒に導入されるからである。新しいＤＮＡを有しない各集塊におけるすべての細胞を殺すのは困難であるので、キメラ植物が生じる。しかしながら、概説した手法では、個々のプロトプラストとして十分分散され、かくして、キメラは回避される。第２の利点は、プロトプラストが、サテライトＤＮＡへではなくて、核ゲノムへの真性で安定な組込の高い機会を与え、従って、新しい特性を各世代に伝達できる真性育種作物の発育を容易とすることである。
【発明の効果】
【００３４】
再生植物における発現用の有益な遺伝子で安定に形質転換したプロトプラストから植物が再生される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
以下の図面および実施例を参照し、本発明をさらに詳しく説明する。
【００３６】
図１は、ＥＧＶ抗体でプローブすることによる小麦葉の細胞分裂領域からの蛋白のウェスタンブロットでｐ３４ｃｄｃ２同族体の検出を示す写真である。抗体溶液を分け、添加なしで（Ｏ）、２０ｎＭ  ＥＧＶペプチドＥＧＶＰＳＴＡＩＲＥＩＳＬＬＫＥを添加して（Ｖ）、または第１３位および第１４位に置換を有する改変ペプチドＥＧＴＰＳＴＡＩＲＥＩＳＬＭＫＥの２００ｎＭを添加して（Ｔ）プレインキュベートした。マーカーの位置およびサイズは右側に示す。
【００３７】
図２は、前記条件下における８日間の発芽の後に採取した小麦の９０ｍｍ長実生葉において、（Ａ）分析用に採取した葉セグメントおよび（Ｂ）分裂の有糸分裂期の細胞の出現率の分布を示すグラフである。葉基部から０および２０ｍｍ間とこの上部で、１０ｍｍ間隔で隣接して４ｍｍ長セグメントを採取した。図中に試料番号を入れたのは、各セグメントの中心を示す。有糸分裂指標は、４：１エタノール／酢酸で固定し、アセトカルミンで染色した試料で決定した。分裂組織領域における分裂の高出現率は、分裂周期のこの短時間の期間における細胞の検出によって示される。
【００３８】
図３は、図２Ａに示したごとく切断した葉セグメントで検出された、ｐ３４ｃｄｃ２同族体レベルにおける細胞分化の間の変化を示す写真である。蛋白５０μｇを含有する試料をＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースに移し、PonceauＳで染色し、次いで、ｐ３４ｃｄｃ２をアフィニティー精製したＥＧＶ抗体でプローブし、１２５Ｉ−標識抗−ウサギＩｇＧＦ(ａｂ')２を用いて検出した。
【００３９】
図４は葉細胞発育の間のｐ３４ｃｄｃ２同族体および合計蛋白の量の変化のグラフである。（Ａ）蛋白の５０μｇ試料におけるｐ３４ｃｄｃ２蛋白のレベル、（Ｂ）細胞における合計蛋白の濃度（１グラムの組織新鮮塊当たりの合計蛋白）、（Ｃ）細胞当たりの平均合計蛋白含量、（Ｄ）細胞当たりのｐ３４ｃｄｃ２同族体の量。図１におけるごとく作成した抽出物における合計蛋白は、オボアルブミン標準を用い、８０倍希釈の後に、染料結合によって見積もった。細胞当たりの蛋白は、Ｂに示した蛋白濃度に、細胞数と同一条件下（５）にて本実験で作成した新鮮な塊との初期測定から得られ、かつこれらの試料で細胞の大きさの測定から確認した平均細胞新鮮塊を乗ずることによって計算した。ウェスタンブロットでのｐ３４ｃｄｃ２同族体の定量はＥＧＶ抗体でプローブすることによって行い、第２抗体をヨウ素化した。完全なセットの試料をニトロセルロースの単一のパネルにて処理したので、直接的比較が可能である。
【００４０】
図５は生トラデスカンティア（Tradescantia）雄しべ毛細胞における有糸分裂核へのｐ１３ＳＵＣｌ蛋白の局在化を示す写真である。
【００４１】
該ｐ１３ＳＵＣｌ蛋白は共有結合蛍光基（ＦＬＵＯＳ）の励起によって直接検出された。１００ｍＭ  ＫＣｌ中の０.５ｍｇ／ｍｌ蛋白を含有する細胞容量の１％と同等の容量のマイクロインジェクションによって該蛋白を導入した。該蛋白は分裂酵母suc1遺伝子によってコードされ、イー・コリで過剰発現され、蛍光標識前に均質精製された標品ｐ１３ＳＵＣｌであった。
【００４２】
分裂酵母でｐ１３ＳＵＣｌの有糸分裂活性の制御に必要なｐ１３ＳＵＣｌ蛋白は、有糸分裂の前期に入るに従い核に濃縮されるのが観察された。鮮やかな核が細胞の上部の１／３を占めるのが観察され、暗色染色体がｐ１３ＳＵＣｌ蛍光のバックグラウンドに対して観察された。
【００４３】
図６はツィンニア（Zinnia)根先端細胞にｐ３４ｃｄｃ２様蛋白が存在することを示す写真である。
【００４４】
ｐ３４ｃｄｃ２に関連するすべての細胞周期制御蛋白で完全に保存されているペプチドＥＧＶＰＳＴＡＩＲＥＩＳＬＬＫＥに対して生起したアフィニティー精製ポリクローナル抗体を用いて蛋白を検出した。
【００４５】
プレ前期バンド(ＰＰＢ)でのｐ３４ｃｄｃ２様蛋白の濃度を検出した(矢印)。
【００４６】
図７は、再生可能および再生不能ニコチアナ・プルンバギニフォリア（Nicotiana plumbaginifolia)細胞の懸濁培養における同調的細胞分裂の間のｐ３４ｃｄｃ２様蛋白（PSTAIR蛋白)のレベルを示すグラフである。該再生可能細胞系は固体培地へ移した際に完全な植物を再生させることができ、該再生不能細胞は懸濁培養における長期増殖の間にこの能力を喪失した。２の細胞系を平行で増殖させ、各々からの蛋白試料を共電気泳動に付し、同一のウェスタンブロットでｐ３４ｃｄｃ２様蛋白のレベルを見積もった。
【００４７】
各時点で採取した試料の対において、左側のは再生不能細胞系に由来する。
Ｓ期に細胞を揃えるアフィジコリン（aphidicolin)ブロックからの放出の後、間隔を置いて、各培養をサンプリングし、無阻害剤培地へ移して同調細胞分裂が得られた。再生不能細胞系は再生可能細胞系の５倍のｐ３４ｃｄｃ２様蛋白の構成的レベルを有していた。
【００４８】
同調分裂が両培養で起こっている場合、１５〜２３時間の間におけるプレ前期バンド頻度の測定は、再生可能細胞系における４００細胞のうち５９が隔膜形成体を有し、６３が隔膜形成体および将来の横断壁の位置を決定するプレ前期バンド（ＰＰＢ）を有することを示した。対照的に、２９２隔膜形成体の検出は分裂する細胞がサンプリングされていることを示したが、再生不能細胞系からの２０００細胞の大量の試料は、ＰＰＢの不存在を示した。ＰＰＢの欠如は、懸濁培養の間の変性変化が分裂の面、従って、新しい細胞が形成される方向を決定する機構を排除したことを示す。かかる方向はカルスではなく細胞への成長に必要であり、その不存在はこの培養に再生性が無いことを説明する。本発明の鍵となる特徴は、形質転換細胞におけるｐ３４ｃｄｃ２活性の制御された一過的上昇の利点を診断することである。これは、プロトプラスト化後に分裂の回復能を得るための懸濁培養における細胞の長期前増殖の必要性を回避するであろう。懸濁培養間におけるｐ３４ｃｄｃ２のランダムな上昇は予測できず、通常、制御されない分裂および植物再生能力の喪失に至りかねない。
【００４９】
図８は、アッセイ前に１４日間２,４−Ｄを含有する固体培地へ移した後測定した、実生小麦葉セグメントにおけるｐ３４ｃｄｃ２様蛋白のレベルを示すグラフである。
【００５０】
無菌的に成長させた実生からの葉をセグメント化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって蛋白を分画し、前記したごとくにアフィニティー精製抗体によってｐ３４ｃｄｃ２様蛋白を見積もった（１１）。
【００５１】
分裂組織細胞分裂領域よりなる葉の基部から採取した組織における細胞を、
２,４−Ｄによって刺激してｐ３４ｃｄｃ２様蛋白の合成を継続させ、分裂を継続させた。葉の他の箇所からの細胞は分化してしまっており、２,４−Ｄに対しては反応せず、ｐ３４ｃｄｃ２様蛋白を合成せず、分裂しなかった。これらの成熟細胞はプロトプラスト化で生き残り、細胞壁を再生できる。それは、一過性発現についての細胞周期遺伝子の導入によって細胞分裂を回復するよう刺激できれば、形質転換に適するであろう。
【００５２】
図９Ａは、発芽後１、２、４および１１日にてのニンジン子葉から抽出した蛋白のウェスタンブロットにおけるｐ３４ｃｄｃ２様蛋白の検出を示す例示的なグラフである。図９Ｂは、発芽後種々の日の子葉におけるｐ３４ｃｄｃ２様蛋白の相対量を示す例示的なグラフである。子葉および発育の段階は各サンプリング時間にて描写的に示されている。相対的ユニットは文献１２に記載されている。
【実施例】
【００５３】
実施例１ 材料および方法
植物
植物は本実験では先の実験で記載したごとくに正確に成長させた(１０)。
蛋白抽出、電気泳動およびブロッティング
液体窒素中で破砕し、洗剤Tween２０ならびにプロテアーゼおよびフォスファターゼの阻害剤を含有するＲＩＰＡ緩衝液と０℃で激しく混合することによって蛋白を抽出した（６）。蛋白５０μｇを含有する試料を１０−１５％グラジエントゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。該蛋白をニトロセルロースに移し、マウスｐ３４ｃｄｃ２融合蛋白に対する抗体のアフィニティー精製（８）後に、先に記した（６；７）抗−ＥＧＶＰＳＴＡＩＲＥＩＳＬＬＫＥ抗体（ＥＧＢ抗体）でプローブした。ｐ３４ｃｄｃ２を含まない対照の精製は反応抗体を与えなかった。結合抗体は前記したごとく（６）アルカリ性フォスファターゼで検出するか、あるいは２４時間オートラジオグラフィー暴露を使用する０.５ｍＣｉ／ｌにおける１２５Ｉ−標識抗−ウサギＩｇＧＦ(ａｂ')２（アメルスハム(Amersham)、ＩＭ１３４０）で検出した。
【００５４】
ｐ３４ｃｄｃ２同族体の定量
ｐ３４ｃｄｃ２同族体はＥＧＶ抗体およびヨウ素化第２抗体でプローブすることによってウェスタンブロットで定量した。完全な試料セットをニトロセルロースの単一パネル上で加工し、従って、直接比較可能である。オートラジオグラフィーを用いてｐ３４バンドを位置付けし、次いで、それを放射能活性計数のために切断し、各トラックで測定した低バックグランドで修正した（図３Ｂ参照）。
【００５５】
実施例２  植物細胞における細胞周期制御蛋白の検出
ｐ３４ｃｄｃ２同族体の検出
図１は、酵母とヒトの間ではｐ３４ｃｄｃ２で完全に保存されているが他の蛋白キナーゼにおいては保存されていないＥＧＶＰＳＴＡＩＲＥＩＳＬＬＫＥ配列（ＥＧＶペプチド）に対して生起した抗体を用いて、小麦葉の細胞分裂領域からの抽出物中にｐ３４ｃｄｃ２の同族体が検出されたことを示す。哺乳動物ｐ３４ｃｄｃ２に結合させることによるアフィニティー精製の後、該抗体は分子量３４×１０３の小麦蛋白を認識した。認識は保存されたＥＧＶペプチド領域に対し特異的であった。というのは、それは２０ｎＭ  ＥＧＶペプチドとの競合によって見積もったからである（図１）。ｃｄｃ２と同様性を有するが細胞分裂には影響しない、ＰＨ０８５遺伝子によってコードされる相同ペプチド（９）は競合せず、これは、ＥＧＶ抗体は、細胞周期機能に特異的である最大の完全保存領域内のコンフィギュレーションを認識したことを示す。
【００５６】
葉における分布
実生葉（図２Ａ）の基部から先端にかけてセグメントを採取し、細胞分裂はより低い１２ｍｍにおいてのみ検出され（図２Ｂ）、これは、核ＤＮＡへのチミジンの取り込みの領域と一致する。分化の間の蛋白の量の変化(図３Ａ)は、基部から２８ｍｍを超えるところのRUBISCOの分子量５５×１０３サブユニットの出現によって説明され、これはクロロプラスト数の増加および光合成の開始と相関する。ｐ３４ｃｄｃ２同族体の電気泳動移動度は、いずれの富蛋白のそれとも合致せず、他の蛋白のそれに対するそのレベルは活性な細胞分裂の領域を外れるとシャープに減衰した(図３Ｂ)。図４Ａで定量化される相対レベルでのこの減衰は、分化する細胞がサイズ、蛋白濃度（図４Ｂ）および、従って合計蛋白含量（図４Ｃ）を増加させるに伴う他の蛋白の蓄積のためである。細胞当たりのｐ３４ｃｄｃ２同族体の量（図４Ｄ）は、どれくらいの数の細胞が図３Ｂおよび４Ａでプローブされた蛋白を生成したかを記す細胞当たりの蛋白含量を用いることによって求めた。分化の間にｐ３４ｃｄｃ２の有意な正味の分解は起こらず、その蓄積の停止によって９４％相対減衰が計算された一方、他の蛋白の大々的な合成が分化の間に起こる。
【００５７】
実施例３  ｐ３４ｃｄｃ２およびＰ１３ＳＵＣｌ間の相互作用
ｐ３４ｃｄｃ２の細胞周期制御蛋白様と考えられる植物蛋白は、酵母ｐ３４ｃｄｃ２蛋白と機能的に非常によく似ている。この重要性は、ｐ３４ｃｄｃ２の細胞分裂制御機能および植物蛋白の同様性につき、酵母における決定的な遺伝的証拠があることであり、従って、同様の分裂制御機能がそれらに存在する可能性を支持する。
【００５８】
かかる証拠は以下のことを含む：
ａ）３４ｋＤａの同一サイズを有し、抗体によって認識されるアミノ酸配列
ＥＧＶＰＳＴＡＩＲＥＩＳＬＬＫＥ（PSTAIR）を含有する植物ｐ３４ｃｄｃ２様蛋白もまた、標品酵母ｐ３４ｃｄｃ２に結合する酵母ｐ１３ＳＵＳｌサブユニットに結合する。該結合植物蛋白はカルシウムまたは環状ＡＭＰを要しないＨ１ヒストンに向けられたプロテインキナーゼ活性を有し、これらの点で、標品酵母ｐ３４ｃｄｃ２と同一である。
【００５９】
ｂ）植物は、分裂酵母からの蛋白と同一サイズであって酵母ｐ１３ＳＵＣｌに対する抗体によって認識されるｐ１３ＳＵＣｌの同族体を含有する。点（ａ）および（ｂ）は、一緒に、植物ｐ３４ｃｄｃ２は酵母酵素と同様に調節蛋白との相互作用につき同一の能力を保持することを示す。ｐ１３ＳＵＣｌは酵母において成長に必要であり、有糸分裂における後期の完了に必要である。ｐ１３ＳＵＣｌと相同な植物蛋白の存在および標品ｐ１３ＳＵＣｌへの植物ｐ３４ｃｄｃ２様蛋白の結合の意味するところは、植物ｐ３４ｃｄｃ２は、本発明者らが我々の特許で提案したごとく酵母でまず特徴付けられたネットワークの他の蛋白との相互作用によって調節されるということである。
【００６０】
これらの結果はジョン（John)ら（１１）によって開示されており、ここに参照のために挙げる。
【００６１】
実施例４
本実施例は(ｉ)ｐ３４ｃｄｃ２と相互作用する蛋白の細胞内の位置および(ii)可能な標的蛋白に対するｐ３４ｃｄｃ２の細胞内位置は植物細胞周期におけるｐ３４ｃｄｃ２の機能と一致するか否かの実験に指向される。
【００６２】
ａ）分裂酵母の１３ｋＤ蛋白ｐ１３ＳＵＣｌをイー・コリ(E. coli)で過剰発現させ、均質に精製し、蛍光染料５（６）−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで共有結合的に標識し、活性に分裂していた生トラデスカンティア（Tradescantia)雄しべ毛細胞に０.５ｍｇ／ｍｌにて微量注射した。該蛋白は有糸分裂前期の核で濃縮され（図５）、これは、ｐ３４ｃｄｃ２は植物における有糸分裂で機能し、ｐ１３ＳＵＣｌのごとき調節サブユニットとの協同によって調節されるという提案と合致する。
【００６３】
ｂ）ｐ３４ｃｄｃ２様蛋白の位置は、分裂植物細胞における抗体結合および免疫蛍光顕微鏡によって決定した。該蛋白は細胞質および核に位置するが、初期の有糸分裂では、微小管のプレ前記バンド（ＰＰＢ）と呼ばれる細胞骨格構造である分裂の配位の主要決定要素に局在するようになる（図６参照）。該ＰＰＢは新しい（娘）細胞を分離する横断壁の配位の部位をマークし、それ故、成長が起こる方向を決定する。調節可能なｐ３４ｃｄｃ２レベルおよびＰＰＢ形成能は共に培養細胞から植物を再生する能力において鍵となる要素である。導入された遺伝情報を作物の改良で利用する場合、かかる再生が必要である。ｐ３４ｃｄｃ２レベルおよびＰＰＢ成形能という二重の要件は、共に、培養細胞から植物を再生させる能力において鍵となる要素である。導入された遺伝情報を作物の改良で利用する場合、かかる再生が必要である。ｐ３４ｃｄｃ２調節およびＰＰＢ形成という二重の要件は２つの要素の共局在によって強調される。
【００６４】
関連系列の調査は、他の界におけるｐ３４ｃｄｃ２機能に必要な他の蛋白が植物に存在するか否かを確立することを追及してきた。ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて細胞周期制御遺伝子と相同な植物遺伝子の領域を増幅させた。小麦においては、ｐ３４ｃｄｃ２様蛋白および、Ｇ１期でｐ３４ｃｄｃ２と複合体化するサイクリンのＧクラス様蛋白をコードできる遺伝情報が検出されており、細胞周期のＧ１期でその機能を活性化させることが示唆された。Ｇ１サイクリン遺伝子のこの部分の存在およびプローブとしてＰＣＲ増幅断片を用いて単子葉植物サイクリンをクローン化するのにそれを使用する能力は重要である。というのは、単子葉植物細胞は共通に細胞周期のＧ１期を妨げ、適当なサイクリンは分裂を刺激するのを助力するからである。
【００６５】
植物細胞の懸濁培養で起こる再生能の喪失の分子的基礎を直接調べるためにもう１つのアプローチを試みた。
【００６６】
懸濁液中における植物細胞の長期培養は、新鮮な培地での反復希釈および非天然条件下でより迅速に分裂する細胞の暫時の優勢化を含む。本発明者らは、ニコチニア・プルムバギニフォリア(Nicotiana plumbaginifolia)の懸濁培養で、培養を希釈する毎に不可避的に起こるより迅速な分裂細胞についての継続選択の結果、ｐ３４ｃｄｃ２レベルが増加し、プレ前記バンドが喪失したことを観察した（図７に詳細を説明する）。
【００６７】
成熟穀物葉細胞で調べた細胞分裂の抑制は鍵細胞分裂蛋白ｐ３４ｃｄｃ２を誘導できないことによる。２,４−Ｄを含有する培地で無菌的に培養する場合、組織は活性に分裂する（分裂組織）領域から採取したにも拘わらず、細胞は分裂を支持できるレベルでｐ３４ｃｄｃ２様蛋白を保持し（図９参照）、一方、低レベルのｐ３４ｃｄｃ２様蛋白と共に成熟細胞を含有する葉の他の箇所から採取した組織はｐ３４ｃｄｃ２のレベルを上昇させることができず（図８参照）、また、細胞分裂を開始させることができなかった。細胞分裂を容易に継続する分裂組織は形質転換源としては不適当である。なぜならば、それは細胞壁を再生せず、また、遺伝物質の導入後に細胞分裂を回復できないプロトプラストを生じるからである。成熟細胞は細胞壁を再生できるが、長期懸濁培養に付されたものでない場合、成熟細胞における分裂の主要抑制はｐ３４ｃｄｃ２蛋白の低レベルのその保持である。
【００６８】
文献
１．ナース・ピイおよびビセット・ワイ（Nurse,P. and Bisset,Y.)、ネイチャー（Nature)２９２：５５８−５６０、１９８１
２．ナース・ピイおよびファンテス・ピイ（Nurse,P. and Fantes,P.)、ザ・セル・サイクル（The Cell Cycle)、８５−９８、１９８１
３．ラッセル・ピイおよびナース・ピイ（Russell,P. and Nurse P.)、セル
（Cell)、４９：５６９−５７６、１９８７
４．モレノ・エス、ナース・ピイおよびラッセル・ピイ（Moreno,S.,Nurse,P.and Rissell,P.)、ネイチャー（Nature)３４４：５４９−５５２、１９９０
５．ウェルニッケ・ダブリューおよびミルコビィッツ・エル（Wernicke,W.and Milkovits，L.)、フィジオロジア・プル（Physiologia Pl.)６９  ２３−２８、１９８７ｂ
６．ジョン・ピイ・シイ・エル、セク・エフ・ジェイおよびリー・ジイ・エム（John,P.C.L.,Sek,F.J. and Lee,G.M.)プラント・セル(Plant Cell)１：１１８５−１１９３、１９８９
【００６９】
７．リー・エム・ジイおよびナース・ピイ（Lee,M.G. and Nurse,P.)、ネイチャー（Nature)３２７：３１−３５、１９８７
８．スニダー・エム、エレッジ・エス、スウェーツェル・デイ、ヤング・アール・エイおよびデイビス・アール・ダブリュー(Snyder,M.,Elledge,S.,Sweetser,D.,Young,D.,Young,R.A. and Davis,R.W.)、メス・エンザイム（Meth.Enzym.)１５４：１０７−１２８、１９８７
９．トー・イー・エイ、タナカ・ケイ、ウエソノ・ワイおよびウイックナー・アール・ビイ（Toh-E.,A.,Tanaka,K.,Uesono,Y. and Wickner,R.B.)、サッカロミセス・セレビシエ・モレク・ジェン・ジェネト（Saccharomyces Cerevisiae
Molec.Gen.Genet.)２１４：１６２−１６４、１９８８
１０．ウィルニッケ・ダブリューおよびミルコヴィッツ・エル（Wernicke,W. and Milkovits,L.)、フィジオロジア・プル（Physiologia Pl.)６９：１６−２２、１９８７
１１．ジョン・ピイ・シイ・エル、セク・エフ・ジェイおよびハイレス・ジェイ（John,P.C.L.,Sek,F.J. and Hayles,J.)、プロトプラズマ（J.Protolasma)
１６１：７０−７４、１９９１
１２．コルスト・ジェイ・アール、セク・エフ・ジェイおよびジョン・ピイ・シイ・エル（Corst.J.R.,F.J. and John,P.C.L.)、プランタ（Planta)１８５：３０４−３１０、１９９１
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、ＥＧＶ抗体でプローブすることによる小麦葉の細胞分裂領域からの蛋白のウェスタンブロットでｐ３４ｃｄｃ２同族体の検出を示す写真である。
【図２】前記条件下における８日間の発芽の後に採取した小麦の９０ｍｍ長実生葉において、（Ａ）分析用に採取した葉セグメントおよび（Ｂ）分裂の有糸分裂期の細胞の出現率の分布を示すグラフである。
【図３】図２Ａに示したごとく切断した葉セグメントで検出された、（Ａ）染色可能蛋白および（Ｂ）ｐ３４ｃｄｃ２同族体レベルの、細胞分化の間における変化を示す写真である。
【図４】図４は葉細胞発育の間のｐ３４ｃｄｃ２同族体および合計蛋白の量の変化のグラフである。
【図５】図５は生トラデスカンティア（Tradescantia）雄しべ毛細胞における有糸分裂核へのｐ１３ＳＵＣｌ蛋白の局在化を示す写真である。
【図６】図６はツィンニア（Zinnia)根先端細胞にｐ３４ｃｄｃ２様蛋白が存在することを示す写真である。
【図７】図７は、再生可能および再生不能ニコチアナ・プルンバギニフォリア（Nicotiana plumbaginifolia)細胞の懸濁培養における同調的細胞分裂の間のｐ３４ｃｄｃ２様蛋白（PSTAIR蛋白)のレベルを示すグラフである。
【図８】図８は、アッセイ前に１４日間２,４−Ｄを含有する固体培地へ移した後測定した、実生小麦葉セグメントにおけるｐ３４ｃｄｃ２様蛋白のレベルを示すグラフである。
【図９】図９は、発芽後のニンジン子葉から抽出した蛋白のウェスタンブロットにおけるｐ３４ｃｄｃ２様蛋白の検出および相対量を示す例示的なグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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