(57)【要約】      （修正有）【課題】非小細胞肺癌、膵癌、胃癌などの癌組織に対して選択的に作用する癌治療薬に用いることのできる、副作用の少ないモノクローナル抗体を提供する。【解決手段】重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、それぞれ特定のアミノ酸配列を含むことを特徴とするモノクローナル抗体、前記抗体をコードするＤＮＡ、前記ＤＮＡを含む組換えベクター、前記ベクターを含む形質転換体、前記抗体を産生するハイブリドーマ、前記抗体を含む癌治療薬としての医薬組成物および診断試薬。【選択図】図３
2007252372.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変領域に配列番号７４、７６および７８のアミノ酸配列を含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項２】
重鎖可変領域に配列番号７２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
重鎖可変領域に配列番号１０４のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
軽鎖可変領域に配列番号８０、８２および８４のアミノ酸配列を含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項５】
軽鎖可変領域に配列番号７０のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項４に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
軽鎖可変領域に配列番号１０６のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項４に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
重鎖可変領域が、配列番号７４、７６および７８のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域が、配列番号８０、８２および８４の配列を含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項８】
重鎖可変領域が配列番号７２のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域が配列番号７０のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
重鎖可変領域が配列番号１０４のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域が配列番号１０６のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
ヒト抗体である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡ。
【請求項１２】
重鎖可変領域をコードする領域が、配列番号７３、７５および７７の塩基配列を含み、かつ軽鎖可変領域をコードする領域が、配列番号７９、８１および８３の塩基配列を含むことを特徴とする、請求項１１に記載のＤＮＡ。
【請求項１３】
重鎖可変領域をコードする領域が、配列番号７１の塩基配列を含み、かつ軽鎖可変領域をコードする領域が、配列番号６９の塩基配列を含むことを特徴とする、請求項１１または請求項１２に記載のＤＮＡ。
【請求項１４】
重鎖可変領域をコードする領域が、配列番号１０３の塩基配列を含み、かつ軽鎖可変領域をコードする領域が、配列番号１０５の塩基配列を含むことを特徴とする、請求項１１または請求項１２に記載のＤＮＡ。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項１７】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１８】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を含む医薬組成物。
【請求項１９】
癌治療薬である請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
癌治療薬が、非小細胞肺癌、膵癌、および胃癌からなる群より選ばれる、一または二以上の癌に対する癌治療薬である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
モノクローナル抗体を、毒素または抗癌剤を内包するリポソームの表面に担持させたことを特徴とする、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を含む診断試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療、診断に使用し得る新規なモノクローナル抗体、その抗体をコードするＤＮＡ、およびその抗体を産生するハイブリドーマ、並びに、その抗体を含む医薬組成物、診断試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の治療分野においては、充分な効果を示す治療薬のない固形癌に対して、特定の癌細胞を標的としたターゲティング療法の研究が従来よりなされてきた。かかるターゲティングには癌細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体が有効であるが、マウスモノクローナル抗体を用いると、免疫応答に起因するアナフィラキシーなどの副作用から、連続投与が難しい等の問題点があった（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００３】
そして、かかる問題点を解決するために、副作用の少ないモノクローナル抗体の取得が試みられてきた。遺伝子組み換えによって抗体の定常領域をヒト由来のものとするキメラ抗体作製技術や、超可変領域以外をヒト由来とするヒト化抗体作成技術などがあるが、副作用低減の観点からは完全ヒトモノクローナル抗体がより望ましいとされてきた。かかる完全ヒトモノクローナル抗体を得る方法としてヒト由来のリンパ球を用いたハイブリドーマ法（例えば、非特許文献２参照。）があるが、完全ヒトモノクローナル抗体の作製はマウスモノクローナル抗体の作製法と比較し、目的とする抗体を産生するヒトＢ細胞を効率的に得るための能動的免疫法が困難であること、抗体産生細胞を無限増殖化させる効率的方法が確立されていないことなどから、充分に腫瘍細胞に反応するヒトモノクローナル抗体の取得はごくわずかしか報告されておらず（例えば、特許文献１参照。）、依然として困難な状況にあった。
【０００４】
かかる状況下においても、徐々にではあるが、ヒト化抗体作製技術等を利用して、特定の癌細胞に対し、単独、又は抗癌剤との併用によって、殺傷効果や、増殖抑制効果を有するモノクローナル抗体の開発がなされてきており、最近では、抗Ｈｅｒ２ヒト化抗体の乳癌への適用（例えば、非特許文献３参照。）、抗ＥＧＦレセプター抗体（例えば、非特許文献４参照。）や抗ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）抗体（例えば、非特許文献５参照。）等を用いた治験が進められている。しかしながら、罹患者数の多い非小細胞肺癌や、特に難治性の癌種である膵癌等に対して特異的なターゲティング療法に用いることのできる抗体はいまだ存在せず、かかる癌種に対応するために、副作用が少なく、癌組織への特異性の高いモノクローナル抗体の取得が望まれていた。
このような抗体として特許文献２に癌組織への特異性の高いモノクローナル抗体が開示されていたが、さらなる抗体の取得が望まれていた。
【０００５】
【特許文献１】特許第３２３６６６７号公報
【特許文献２】特開２００５−０４０１２６号公報
【非特許文献１】Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. vol.86, p4220, 1989
【非特許文献２】Cancer Res. vol.45, p263, 1985
【非特許文献３】Oncology vol．63 Suppl 1，pp25−32, 2002
【非特許文献４】Semin Oncol. vol.29, No.5 Suppl 14, pp18-30, 2002
【非特許文献５】Semin Oncol. vol.29, No.6 Suppl 16, pp10-14, 2002
【非特許文献６】Mol Cell Biol. 1987, vol. 7, No. 11, p3908-15
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は癌、特に非小細胞肺癌、膵癌または胃癌の診断、治療に有用であり、かつ、副作用の少ないモノクローナル抗体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、癌組織に対するターゲティング療法に用いるためのモノクローナル抗体を提供すべく鋭意検討した結果、ＨＬＣ−１、ＰＡＮＣ−１、ＨＴ２９およびＭＫＮ４５等の癌細胞を特異的に認識する新規なヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製し、本抗体を用いることによりターゲティング療法に有用な癌治療薬が得られることを見いだして、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）重鎖可変領域に配列番号７４、７６および７８のアミノ酸配列を含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
（２）重鎖可変領域に配列番号７２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、（１）のモノクローナル抗体。
（３）重鎖可変領域に配列番号１０４のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、（１）のモノクローナル抗体。
（４）軽鎖可変領域に配列番号８０、８２および８４のアミノ酸配列を含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
（５）軽鎖可変領域に配列番号７０のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、（４）のモノクローナル抗体。
（６）軽鎖可変領域に配列番号１０６のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、（４）のモノクローナル抗体。
（７）重鎖可変領域が、配列番号７４、７６および７８のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域が、配列番号８０、８２および８４の配列を含むことを特徴とするモノクローナル抗体。
（８）重鎖可変領域が配列番号７２のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域が配列番号７０のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、（７）のモノクローナル抗体。
（９）重鎖可変領域が配列番号１０４のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域が配列番号１０６のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、（７）のモノクローナル抗体。
（１０）ヒト抗体である、（１）〜（９）のいずれかのモノクローナル抗体。
（１１）（１）〜（１０）のいずれかのモノクローナル抗体をコードするＤＮＡ。
（１２）重鎖可変領域をコードする領域が、配列番号７３、７５および７７の塩基配列を含み、かつ軽鎖可変領域をコードする領域が、配列番号７９、８１および８３の塩基配列を含むことを特徴とする、（１１）のＤＮＡ。
（１３）重鎖可変領域をコードする領域が、配列番号７１の塩基配列を含み、かつ軽鎖可変領域をコードする領域が、配列番号６９の塩基配列を含むことを特徴とする、（１１）または（１２）のＤＮＡ。
（１４）重鎖可変領域をコードする領域が、配列番号１０３の塩基配列を含み、かつ軽鎖可変領域をコードする領域が、配列番号１０５の塩基配列を含むことを特徴とする、（１１）または（１２）のＤＮＡ。
（１５）（１１）〜（１４）のいずれかのＤＮＡを含む組換えベクター。
（１６）（１５）の組換えベクターを含む形質転換体。
（１７）（１）〜（１０）のいずれかのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
（１８）（１）〜（１０）のいずれかのモノクローナル抗体を含む医薬組成物。
（１９）癌治療薬である（１８）の医薬組成物。
（２０）癌治療薬が、非小細胞肺癌、膵癌、および胃癌からなる群より選ばれる、一または二以上の癌に対する癌治療薬である（１９）の医薬組成物。
（２１）モノクローナル抗体を、毒素または抗癌剤を内包するリポソームの表面に担持させたことを特徴とする、（１８）〜（２０）のいずれかの医薬組成物。
（２２）（１）〜（１０）のいずれかのモノクローナル抗体を含む診断試薬。
【発明の効果】
【０００９】
本発明で得られたモノクローナル抗体を用いることにより、非小細胞肺癌、膵癌または胃癌等を選択的に攻撃する癌治療薬を提供することができる。さらに、本発明のヒトモノクローナル抗体を用いた場合、副作用が少なく連続投与可能な癌治療薬を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明のモノクローナル抗体
本発明のモノクローナル抗体は癌細胞特異的抗原を特異的に認識するモノクローナル抗体である。本発明のモノクローナル抗体として具体的には、重鎖可変領域に配列番号７４、７６および７８のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域に配列番号８０、８２および８４のアミノ酸配列を含むものが挙げられる。ここで、配列番号７６のアミノ酸配列において、２番目のアミノ酸はＩｌｅであってもＴｈｒであってもよい。また、同じく配列番号７６のアミノ酸配列において１６番目のアミノ酸はＬｙｓであってもＡｓｎであってもよい。すなわち、重鎖可変領域としては（２Ｉｌｅ、１６Ｌｙｓ）、（２Ｉｌｅ、１６Ａｓｎ）、（２Ｔｈｒ、１６Ｌｙｓ）、（２Ｔｈｒ、１６Ａｓｎ）の計４種類の配列が挙げられる。
上記６種類の配列は、重鎖および軽鎖の可変領域の中で「超可変領域」と呼ばれる領域の配列である。抗体は重鎖と軽鎖からなり、さらに、それぞれの鎖は定常領域と可変領域からなる。可変領域にはさらに超可変領域が存在し、かかる領域が免疫グロブリンの抗体としての特異性、抗原決定基と抗体の結合親和性を決定している。したがって、本発明の抗体は、超可変領域に上記それぞれの配列を含むものであるが、かかる超可変領域以外の領域は他の抗体由来であっても構わない。ここで、他の抗体とはヒト以外の生物由来の抗体も含むが、副作用低減の観点からはヒト由来のものが好ましい。
本発明において特に好適なモノクローナル抗体としては、重鎖可変領域に配列番号７２のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域に配列番号７０のアミノ酸配列を含む抗体が挙げられる。ここで、配列番号７２の配列において、５１番目のアミノ酸はＩｌｅ、Ｔｈｒのいずれであってもよく、６５番目のアミノ酸はＬｙｓ、Ａｓｎいずれであってもよい。
なお、癌細胞特異的抗原を認識するという抗体の特異性が損なわれない限り、本発明の抗体の可変領域の配列は、上記配列番号７２（重鎖）、７０（軽鎖）の配列において、一または数個のアミノ酸の置換、欠失、または付加が導入された配列であってもよい。ここで、数個とは好ましくは、２〜５個、より好ましくは、２個または３個、特に好ましくは、２個を意味する。このような置換、欠失、付加は超可変領域に導入されてもよいが、可変領域の超可変領域以外の領域に導入されることが好ましい。
【００１１】
本発明において、モノクローナル抗体とは、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体のフラグメント、Ｆ（ａｂ'）2化抗体、Ｆ（ａｂ'）化抗体、短鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）およびミニボディ（Ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）を含むものとする。定常領域を含む場合においては、重鎖および軽鎖の定常領域のアミノ酸配列は、Nucleic Acids Research vol.14, p1779, 1986、The Journal of Biological Chemistry vol.257, p1516, 1982 およびCell vol.22, p197, 1980 に記載のものが好ましい。定常領域及び可変領域を含む本発明の抗体としては、例えば、配列番号１０４（重鎖）、又は配列番号１０６（軽鎖）のアミノ酸配列を有する抗体を挙げることができる。
【００１２】
本発明のモノクローナル抗体は、例えば、本抗体を産生するハイブリドーマをウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培養液等を用いて培養するか、または、配列番号７１および６９の塩基配列を有する可変領域をコードするＤＮＡに、重鎖および軽鎖の定常領域をコードするＤＮＡをそれぞれ連結した遺伝子（例えば、配列番号１０３（重鎖）又は１０５（軽鎖）の遺伝子）をＰＣＲ法、または、化学合成により合成し、従来法により、その遺伝子の発現を可能とする公知の発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等）に組み込んでＣＨＯ細胞（チャイニーズハイスター卵巣細胞）や大腸菌等の宿主中で発現させることによって抗体を産生し、これらの培養液から、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム等を用いて抗体を精製することによって得ることができる。
【００１３】
＜２＞本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡであるが、例として、重鎖可変領域をコードする領域が、配列番号７４、７６、および７８のアミノ酸配列をコードする配列をそれぞれ含み、かつ、軽鎖可変領域をコードする領域が配列番号８０、８２、および８４のアミノ酸配列をコードする配列をそれぞれ含むＤＮＡが挙げられる。その中でも、重鎖可変領域をコードする領域が配列番号７３、７５および７７の塩基配列をそれぞれ含み、かつ軽鎖可変領域をコードする領域が、配列番号７９、８１および８３の塩基配列をそれぞれ含むＤＮＡが好ましい。ここで、配列番号７５の配列は、５番目の塩基がｔであってもｃであってもよい。また、同じく配列番号７５の配列は、４８番目の塩基がｇであってもｔであってもよい。
これらの配列のＤＮＡによってコードされる超可変領域が、抗体の特異性を決定する領域であるため、他の領域をコードする配列は他の抗体由来の配列であってもよい。ここで、他の抗体とはヒト以外の生物由来の抗体も含むが、副作用低減の観点からはヒト由来のものが好ましい。
本発明において特に好適なＤＮＡは、重鎖可変領域をコードする領域が配列番号７２のアミノ酸配列をコードする配列を含み、かつ、軽鎖可変領域をコードする領域が配列番号７０のアミノ酸配列をコードする配列を含むＤＮＡである。その中でも特に好ましいＤＮＡは、重鎖可変領域をコードする配列が配列番号７１の塩基配列を含み、かつ、軽鎖可変領域をコードする領域が、配列番号６９の塩基配列を含むＤＮＡである。ここで、配列番号７１の配列において、１５２番目はｔであってもｃであってもよい。また同じく配列番号７１の配列において、１９５番目はｇであってもｔであってもよい。
なお、本発明のＤＮＡは、癌細胞特異的抗原を認識するモノクローナル抗体をコードする限り、上記配列番号７１の塩基配列及び配列番号６９の塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件としては、例えば、サザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
本発明のＤＮＡは重鎖と軽鎖の定常領域と可変領域の全てをコードするものであってもよいが、重鎖と軽鎖の可変領域のみをコードするものであってもよい。定常領域と可変領域の全てをコードする場合における重鎖および軽鎖の定常領域の塩基配列は、Nucleic Acids Research vol.14, p1779, 1986、 The Journal of Biological Chemistry vol.257, p1516, 1982 および Cell vol.22, p197, 1980 に記載のものが好ましい。定常領域及び可変領域をコードする本発明のDNAとしては、例えば、配列番号１０３（重鎖）、配列番号１０５（軽鎖）の塩基配列を有するDNAを挙げることができる。
本発明のＤＮＡは例えば、以下の方法によって得ることができる。まず、本発明のハイブリドーマ等の細胞から、市販のＲＮＡ抽出キットを用いて全ＲＮＡを調製し、ランダムプライマー等を用い、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成する。次いで、既知のヒト抗体重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子の可変領域において、それぞれ保存されている配列のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲ法によって、抗体をコードするｃＤＮＡを増幅させる。定常領域をコードする配列については、既知の配列をＰＣＲ法で増幅することによって
得ることができる。ＤＮＡの塩基配列は、配列決定用プラスミドに組み込むなどして、常法により決定することができる。なお、可変領域又はその一部の配列を化学合成し、定常領域を含む配列に結合することによっても本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを得ることができる。
本発明はまた、本発明のＤＮＡを含む組換えベクター及び該組換えベクターを含む形質転換体を提供する。組換えベクターとしては、大腸菌（Echerichia coli）のような原核細胞において発現可能なベクター（例えば、pBR322、pUC119又はこれらの派生物）であってもよいが、真核細胞において発現可能なベクターが好ましく、哺乳動物由来の細胞において発現可能なベクターがより好ましい。哺乳動物由来の細胞において発現可能なベクターとしては、例えば、pcDNA3.1（Invitrogen社製）のようなプラスミドベクター、pDON-AI DNA（宝バイオ社製）などのウイルスベクターを挙げることができる。本発明の組換えベクターを導入する形質転換体は、大腸菌のような原核細胞であってもよいが、真核細胞が好ましく、哺乳動物由来の細胞がより好ましい。哺乳動物由来の細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）などを挙げることができる。
【００１４】
＜３＞本発明のハイブリドーマ
本発明のハイブリドーマは、上述したようなモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマである。本発明のハイブリドーマとしては、後述の実施例に示すハイブリドーマ０２０６３０−１８−１株および０２０６３０−１８−１−１Ｆ８−１株などを挙げることができる。本発明のハイブリドーマは以下の方法によって得ることができる。まず、Ａ．Ｉｍａｍらの方法（Cancer Research vol.45,263 1985）に準じて、胃癌患者から摘出された癌所属リンパ節からリンパ球を単離し、リンパ球を含む細胞をポリエチレングリコールを用いてマウスミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを得る。次に、得られたハイブリドーマの上清を用いてエンザイムイムノアッセイを行い、パラホルムアルデヒド固定した各種癌細胞株に対して陽性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択し、さらに該ハイブリドーマを限界希釈によりクローニングする。
【００１５】
＜４＞本発明の医薬組成物
本発明の医薬組成物は、本発明のモノクローナル抗体を医薬上許容されうる担体とともに含んでなるものである。医薬上許容されうる担体の例としては、既知の生理学的に許容され得るバッファー（例えばリン酸バッファー）のような可溶性キャリアー、またはラテックスビーズのような固体状態のキャリアーが挙げられる。
【００１６】
本発明の医薬組成物は癌、特に非小細胞肺癌、膵癌または胃癌の治療薬として好適に用いられる。また、本発明の医薬組成物はモノクローナル抗体自身の細胞殺傷効果や増殖抑制効果を利用するものであってもよいし、アドリアマイシンなどの抗癌剤に本発明のモノクローナル抗体を結合させて抗癌剤を癌組織にターゲティングさせるものであってもよい。
【００１７】
本発明において特に好適な医薬組成物は、毒素や抗癌剤等を含んだリポソームに本発明の抗体を結合させたものである。抗体を担持するリポソームは、二重の脂質層からなるものであるが、該脂質層が多重層になったもの、あるいは一層のものいずれも使用することができる。リポソームの構成成分としては、フォスファチジルコリン、コレステロール、フォスファチジルエタノールアミン、さらに電荷をあたえる物質としてのフォスファチジン酸等が用いられる。構成成分の使用割合として、たとえば、フォスファチジルコリン１ｍｏｌに対しコレステロールは０．３〜１ｍｏｌ、好ましくは０．４〜０．６ｍｏｌ、フォスファチジルエタノールアミンは０．０１〜０．２ｍｏｌ好ましくは０．０２〜０．１ｍｏｌ、フォスファチジン酸は０〜０．４ｍｏｌ好ましくは０〜０．１５ｍｏｌの組成比を用いることができる。
【００１８】
リポソームの製造方法には公知の方法を用いることができる。たとえば、溶媒を除去した脂質混合物をホモジナイザー等で乳化し、凍結融解後、マルチラメラリポソームを得て、さらに適当な粒径に調整するために超音波処理、高速ホモジナイズ、あるいは均一ポアを持つメンブランで加圧ろ過する方法（Biochimica et Biophysica Acta vol. 812, p55,1985）を用いることによって製造できる。リポソームのサイズは３０ｎｍから２００ｎｍが好ましい。
【００１９】
リポソームに内封させる薬剤としては、アドリアマイシン、ダウノマイシン、マイトマイシン、シスプラチン、ビンクリスチン、エピルビシン、メトトレキセート、５Ｆｕ（５−フルオロウラシル）、アクラシノマイシン等の抗癌剤、リシンＡ、ジフテリアトキシン等の毒素、アンチセンスＲＮＡ等を用いることができる。薬剤は、脂質を薬剤水溶液で水和することでリポソームに封入することができる。またアドリアマイシン、ダウノマイシン、エピルビシンについては、ｐＨ勾配を利用したリモートローディング法（Cancer Res. vol.49, p5922, 1989）を用いて封入することもできる。
【００２０】
リポソーム表面上にモノクローナル抗体を結合させる方法としては、精製抗体に疎水性の物質をつけることでリポソームに挿入させる方法、ホスファチジルエタノールアミンと抗体をグルタールで架橋させる方法等もあるが、好適には、抗体をチオール化した後、マレイミド基を導入した脂質を含むリポソームを作製して抗癌剤または毒素を封入し、両者を反応させることによってリポソームの表面に抗体を結合させる方法を用いることができる。また、アミノ基との反応部位、および、チオール基または潜在的チオール基部分を有する水溶性高分子誘導体も好適に用いることができる（特開平１１−１５２２３４号）。一方、残存マレイミド基にチオール化したポリアルキレングリコール部分を含む化合物等を反応させることによって、リポソームの表面修飾を行うことも可能である。
【００２１】
抗体へのチオール基の付与は、抗体のアミノ基に対し、タンパク質のチオール化に通常用いられるＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）や、イミノチオラン、メルカプトアルキルイミデート等の化合物を用いて行う方法、または抗体の内在性ジチオール基を還元してチオール基とする方法が用いられるが、内在性チオール基を用いる方法が活性維持の点からより好ましい。また、抗体は、ペプシン等の酵素でＦ（ａｂ'）2化し、さらにジチオスレイトール（ＤＴＴ）等で還元し、Ｆ（ａｂ'）化して新たに生ずる１〜３個のチオール基をリポソームとの結合反応に供することもできる。マレイミド基含有リポソームとチオール化抗体の結合は中性の緩衝液（ｐＨ６．５−７．５）中、２〜１６時間反応させることで達成できる。
【００２２】
本発明の癌治療薬の製剤化には、公知の方法つまり、脱水法（特表平２−５０２３４８号公報）、安定化剤を加え液剤として用いる方法、凍結乾燥法（特開昭６４−９９３１号公報）等の製剤化法を用いることができる。本発明の癌治療薬は、血管内投与法や、腹腔内等、局所投与法で用いることができ、その投与量は、リポソームに含有された薬剤によって、それぞれ最適な量とすることができる。アドリアマイシン封入体を例に取れば投与量はアドリアマイシン量として５０ｍｇ／ｋｇ以下、好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ以下、より好ましくは５ｍｇ／ｋｇ以下で用いることができる。
【００２３】
＜５＞本発明の診断試薬
本発明の診断試薬としては、本発明の抗体の癌細胞特異性を利用する診断試薬が挙げられるが、具体的には、本発明の抗体、二次抗体および検出基質等からなる癌の診断試薬が挙げられる。
【００２４】
実施例
以下、実施例により本発明についてより詳細に説明するが、その要旨を越えない限り以下に限定されるものではない。
【００２５】
（１）癌患者癌所属リンパ節由来リンパ球とマウスミエローマとの細胞融合によるハイブリドーマの作製
（１）−１．リンパ球の調製
培養液Ａ（ＲＰＭＩ１６４０またはｅ−ＲＤＦ＋５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン硫酸塩）に１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を添加した培養液Ｂを満たしたシャーレ中、金属メッシュ上で胃癌患者から摘出した癌所属リンパ節からリンパ球を分散させた。この細胞懸濁液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、４．８×１０7個の癌所属リンパ節由来リンパ球を得た。
【００２６】
（１）−２．細胞融合
癌所属リンパ節由来リンパ球は、ポリエチレングリコール１５００（ロシュダイアグノスティックス）を用いて、マウスミエローマ細胞（リンパ球とほぼ同数）と常法（CancerResearch vol.45, 263, 1985）に従い融合させた。融合させた細胞は、培養液Ｂに細胞数が５×１０5／ｍｌの密度になるよう懸濁し、１００μｌずつ９６ウェル−プレートに播種し、３７℃のＣＯ2インキュベーター中で培養を開始した。二日目に１０μＭヒポキサンチン、０．０４μＭアミノプテリン、１．６μＭチミジンを添加した培養液Ｂ（ＨＡＴ添加培養液）を各ウェルに１００μｌずつ添加し、ハイブリドーマのコロニーが出現するまで培養を行った。その結果、ハイブリドーマのコロニーが、２３ウェル中に確認された。
【００２７】
（２）ヒトモノクローナル抗体の癌細胞株への反応性の検討
（２）−１．癌細胞株と維持
出現したハイブリドーマの培養上清を用いて、固定胃癌細胞株ＭＫＮ４５（癌と化学療法，vol．5，p89，1978、免疫生物研究所から入手）に対する反応性を測定し、目的のハイブリドーマを選択した。癌細胞株は、培養液Ｃ（Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２＋５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン硫酸塩）に５％ＦＣＳを添加した培養液Ｄで、３７℃、５％ＣＯ2の条件で維持、増殖させた。
【００２８】
（２）−２．癌細胞株に対する反応性の測定
上記癌細胞株は、９６ウェル−プレートで３日から４日間、一層になるまで培養を行い、上清を除去後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）（ＰＢＳ）で１回洗浄した後、２％パラホルムアルデヒド固定（室温、２０分）を行った。ＰＢＳで５回洗浄した後、５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）含有ＰＢＳ溶液を１５０μｌ／ウェルずつ入れ、ブロッキングを行った。このプレートをＰＢＳで５回洗浄し、５０μｌのハイブリドーマ培養上清を加えて３７℃、１時間半、反応させた。次に、ＰＢＳで５回洗浄し、５０μｌのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合させたヒト抗体に対するヤギ抗体（１０００培希釈、カペル社）を加え、３７℃、１時間の反応を行った。次に、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％含んだＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）でプレートを洗浄し、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（５．２％）とＨ2Ｏ2（０．０１５％）を含有したりん酸クエン酸緩衝液を５０μｌ／ウェルずつ加え、室温で発色が確認できるまで反応させた後、４９０ｎｍにおける吸光度をマイクロフォトメーター（日本インターメッド）によって測定した。反応性が確認できたウェルから限界希釈によってクローニングを行い、ハイブリドーマ株０２０６３０−１８−１を得た。以下、この株から得られるモノクローナル抗体を０２０６３０−１８−１抗体と呼ぶ。さらにクローニングを繰り返し、ハイブリドーマ株０２０６３０−１８−１−１Ｆ８−１を得た。以下、この株から得られるモノクローナル抗体を１Ｆ８抗体と呼ぶ。
【００２９】
（３）モノクローナル抗体０２０６３０−１８−１および１Ｆ８の精製と標識化
（３）−１．ハイブリドーマ０２０６３０−１８−１および０２０６３０−１８−１−１Ｆ８−１の培養とモノクローナル抗体０２０６３０−１８−１および１Ｆ８の精製
まず、ウシ胎児血清をプロテインＡ−ガラスビーズカラム（プロセップＡ）（ｂｉｏ  ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ）に素通りさせてプロセップＡに吸着する物質を除去した血清を作製し、この血清を４〜１０％添加した培養液Ａを用いてハイブリドーマ０２０６３０−１８−１または０２０６３０−１８−１−１Ｆ８−１を培養した。次に、ハイブリドーマ０２０６３０−１８−１またはハイブリドーマ０２０６３０−１８−１−１Ｆ８−１を培養した培養液をプロセップＡにかけることにより、プロセップＡ吸着ポリペプチドを吸着させ、その後溶出させることによって、プロセップＡ吸着ポリペプチドを精製した。このプロセップＡ吸着ポリペプチドを以後、０２０６３０−１８−１抗体または１Ｆ８抗体として用いた。上記の血清を培養に用いることによって、血清由来の抗体等、プロセップＡに吸着する物質の混入がない精製０２０６３０−１８−１抗体または１Ｆ８抗体が得られたと考えられた。なお、図には示していないが、０２０６３０−１８−１抗体および１Ｆ８抗体は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で純粋なＩｇＧであることが確認された。
【００３０】
（３）−２．０２０６３０−１８−１抗体または１Ｆ８抗体のビオチン標識
プロセップＡで精製した０２０６３０−１８−１抗体または１Ｆ８抗体をビオチニレーションリージェント（アマシャムファルマシアバイオテック）を用いて説明書に従いビオチン標識させた後、ゲルろ過法によって標識抗体と遊離のビオチンを分離した。
【００３１】
（４）各種組織切片に対する反応性の検討
（４）−１．各種組織切片の調製
各種癌細胞株（肺癌細胞株：ＨＬＣ−１（癌 vol.67, No.4, pp483-492, 1976、慶應義塾大学医学部、鈴木氏より入手）、Ａ５４９、ＰＣ−３、ＰＣ−９（いずれも免疫生物研究所）、膵癌細胞株：ＳＵＩＴ２（国立病院九州ガンセンター、井口氏より入手）、ＨＰＡＣ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−２１１９）、ＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１４６９）およびＰＫ８（東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターより入手）、胃癌細胞株：ＭＫＮ４５、ＭＫＮ７４、ＨＳＣ−３（いずれも免疫生物研究所）、大腸癌細胞株：ＨＴ２９（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ３８）、ＤＬＤ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ２２１）、ＬｏＶｏ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ２２９）、ＣｏＬｏ２０５（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ２２２）は、それぞれ培養液Ｄで３７℃、５％ＣＯ2の条件で増殖させ、それぞれ約１×１０6〜１×１０7個の細胞をヌードマウス（日本クレア）の皮下に移植し、腫瘍を形成させた。形成した腫瘍を摘出し、常法に従ってホルマリン溶液で固定し、パラフィンに包埋させて切片をそれぞれ作製した。
【００３２】
（４）−２．各種組織切片に対する反応性の検出
作製した各種組織切片を常法に従い脱パラフィン処理し、ブロッキング操作を行った後に、実施例（３）−２．に記載のビオチン標識した０２０６３０−１８−１抗体を反応させた。検出には、ＤＡＫＯ  Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  Ｓｉｇｎａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｉｏｎ（ＣＳＡ）  Ｓｙｓｔｅｍ(ＤＡＫＯ)を用い、その反応性は、ジアミノベンチジンの赤褐色の染色として検出された。さらに上記免疫染色を行った組織切片は、組織像を確認するためにヘマトキシリンによって組織中の細胞の核を青染させた。
０２０６３０−１８−１抗体の各種癌組織切片に対する染色像を図１に示した。０２０６３０−１８−１抗体は、いずれの腫瘍組織切片においても、癌細胞に明確な反応性が認められた。特に癌細胞の核が強く染色された。一方、組織切片中のヌードマウス由来非癌細胞に対しては反応性は認められなかった。
また、図１には示していないが、コントロールとして、ヒト血清から０２０６３０−１８−１抗体と同様にプロセップＡカラムを用いて精製したヒト抗体を用いた染色も、上記
と同様の手順で行った。このコントロール抗体は、上記各組織切片に対して特異的な反応性を示さなかった。
【００３３】
（５）１Ｆ８抗体の生癌細胞表面への結合活性
肺癌患者から手術によって摘出された新鮮な肺癌組織、肺非癌部組織のそれぞれの小塊をカミソリ刃によって細かくほぐし、培養液Ｄ中に懸濁させ、メッシュを通すことによって組織由来の生細胞を調製した。この生細胞をヒト血清（０．０５％アジ化ナトリウム含有）に懸濁し、実施例（３）−２に記載のビオチン標識した１Ｆ８抗体を５０μｇ／ｍｌの濃度となるよう細胞溶液に添加し、全量として〜１００μｌ（細胞数は１０5〜１０6）に調製した。氷冷下、６０分間反応させた。遠心（２０００ｒｐｍ、５分間）を行って上清の抗体含有溶液を除去した後、２０ｎＭ−ＱｄｏｔＴＭ５６５ストレプトアビジン標識（Ｑｕａｎｔｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）溶液（０．０５％アジ化ナトリウム含有）を加えて室温、３０分間反応を行い、本溶液を除去してＰＢＳ（０．０５％アジ化ナトリウム含有）を添加し、共焦点蛍光顕微鏡（ＣＳＵ１０、横河電機株式会社製）での観察を行った。各生細胞表面に対する１Ｆ８抗体の結合活性を図２に示した。１Ｆ８抗体は、肺癌組織由来生細胞表面に結合活性を示した（図２−Ａ）が、非癌部組織由来の生細胞に対しては結合活性を示さなかった（図２−Ｂ）。また、図２には示していないが、コントロールとして用いたヒト抗体は、いずれの細胞に対しても結合活性を示さなかった。
【００３４】
（６）癌細胞株への作用の検討
（６）−１．癌細胞株および血管内皮細胞と維持
ヒト癌細胞株として肺癌株ＨＬＣ−１、胃癌株ＭＫＮ４５および膵癌株ＰＡＮＣ−１を用いた。これらの癌細胞株は、培養液Ｄで３７℃、５％ＣＯ2の条件で維持、増殖させた。
【００３５】
（６）−２． 癌細胞株に対する増殖抑制効果の検討
肺癌細胞株ＨＬＣ−１、胃癌細胞株ＭＫＮ４５および膵癌細胞株ＰＡＮＣ−１を、それぞれ１０％ヒト血清を含有した培養液Ｃで希釈し、ウェル中の細胞数が１．５ｘ１０3／１００μｌ／ウェル、１Ｆ８抗体の濃度が１００μｇ／ｍｌから等倍希釈となるよう調整した。３７℃、５％ＣＯ2の環境で培養し、１日置きに３回、培養上清を上記と同様の条件となるよう交換し、６日目にＭＴＴアッセイ（Ｊ.Immunol.Methods vol.70， p257, 1984）によって生癌細胞数の比較を行った。
結果を図３に示した。抗体を添加しなかったコントロール条件での細胞数を１００％として抑制効果を示した。１Ｆ８抗体を添加することによって、いずれの癌細胞株に対しても濃度依存的に細胞の増殖が抑制されていることが確認された。特に、肺癌細胞株ＨＬＣ−１では強い増殖抑制活性が確認された。また、図には示していないが、比較として用いたヒト抗体では、同様の濃度の添加による癌細胞株の増殖抑制効果は認められなかった。
【００３６】
（７）ヒトモノクローナル抗体１Ｆ８遺伝子の取得と塩基配列の決定
１Ｆ８抗体産生ハイブリドーマからＲＮｅａｓｙ  Ｐｒｏｔｅｃｔ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて全ＲＮＡを調製した。逆転写反応は、ランダム６ｍｅｒをプライマーとして、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて行い、ｃＤＮＡを合成した。
ＰＣＲ増幅用プライマーとしては、既知の抗体配列（J Mol Biol. Vol.222, pp581-597, 1991）に基づいて、重鎖可変領域の増幅用には、ヒト抗体重鎖可変領域のフレーム１で保存されているＮ末側アミノ酸配列（配列番号２、４、６、８、１０および１２）にそれぞれ対応するＰＣＲプライマーＶＨ１（配列番号１）、ＶＨ２（配列番号３）、ＶＨ３（配列番号５）、ＶＨ４（配列番号７）、ＶＨ５（配列番号９）、ＶＨ６（配列番号１１）の等量混合物を５'側に、ヒト抗体重鎖可変領域のフレーム４で保存されているＣ末側ア
ミノ酸配列（配列番号１４、１６、１８および２０）にそれぞれ対応するＰＣＲプライマーＪＨ１（配列番号１３）、ＪＨ２（配列番号１５）、ＪＨ３（配列番号１７）、ＪＨ４（配列番号１９）の等量混合物を３'側に用いた。
κ鎖可変領域の増幅用プライマーには、ヒト抗体κ鎖可変領域のフレーム１で保存されているＮ末側アミノ酸配列（配列番号２２、２４、２６、２８、３０および３２）にそれぞれ対応するＰＣＲプライマーＶＫ１（配列番号２１）、ＶＫ２（配列番号２３）、ＶＫ３（配列番号２５）、ＶＫ４（配列番号２７）、ＶＫ５（配列番号２９）、ＶＫ６（配列番号３１）の等量混合物を５'側に、ヒト抗体κ鎖可変領域のフレーム４で保存されているＣ末側アミノ酸配列（配列番号３４、３６、３８、４０および４２）にそれぞれ対応するＰＣＲプライマーＪＫ１（配列番号３３）、ＪＫ２（配列番号３５）、ＪＫ３（配列番号３７）、ＪＫ４（配列番号３９）、ＪＫ５（配列番号４１）の等量混合物を３'側に用いた。
λ鎖可変領域の増幅用プライマーには、ヒト抗体λ鎖可変領域のフレーム１で保存されているＮ末側アミノ酸配列（配列番号４４、４６、４８、５０、５２，５４および５６）にそれぞれ対応するＰＣＲプライマーＶＬ１（配列番号４３）、ＶＬ２（配列番号４５）、ＶＬ３（配列番号４７）、ＶＬ４（配列番号４９）、ＶＬ５（配列番号５１）、ＶＬ６（配列番号５３）、ＶＬ７（配列番号５５）の等量混合物を５'末端に、ヒト抗体λ鎖可変領域のフレーム４で保存されているＣ末側アミノ酸配列（配列番号５８、６０および６２）にそれぞれ対応するＰＣＲプライマーＪＬ１（配列番号５７）、ＪＬ２（配列番号５９）、ＪＬ３（配列番号６１）の等量混合物を３'末端に用いた。
ＰＣＲ反応は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ
２４００を用い、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて説明書に従って行った。その結果、軽鎖については、λ鎖用プライマーによるＰＣＲで増幅され、κ鎖用プライマーでは増幅されなかったため、ハイブリドーマより産生される抗体の軽鎖はλ鎖であることがわかった。
増幅された重鎖、軽鎖各々の可変領域ＤＮＡ断片は、ＭｉｎｉＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。次に、ＴＯＰＯ
ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ(インビトロジェン社)を用いて、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯと上記の精製ＰＣＲ産物とを連結させ、大腸菌のトランスフォーメーションを行った。生じたコロニーをピックアップし、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ(ＱＩＡＧＥＮ社)を用いてプラスミドを精製し、ＥｃｏＲＩで３７℃３０分間消化して、２%アガロース電気泳動で目的ＤＮＡ断片が組み込まれていることを確認した。
塩基配列は、目的のＤＮＡ断片が組み込まれた複数のコロニーについて、Ｍ１３プライマーを用いて、ＣＥＱ  ２０００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ）により解析した。その結果、重鎖の解析からは１Ｆ８−Ｈ−Ａ（配列番号６３）、１Ｆ８−Ｈ−Ｂ（配列番号６５）、１Ｆ８−Ｈ−Ｃ（配列番号６７）、の３種類の配列が得られた。λ鎖の解析からは、１Ｆ８−Ｌ（配列番号６９）の配列が得られた。これらの塩基配列、および対応するアミノ酸配列（重鎖：配列番号６４、６６、６８、λ鎖：配列番号７０）を比較することによって、重鎖および軽鎖それぞれについて、可変領域の塩基配列（重鎖：配列番号７１、軽鎖：配列番号６９）およびアミノ酸配列（重鎖：配列番号７２、軽鎖：配列番号７０）を決定した。
超可変領域（ＣＤＲ）とフレームワークの境目はＫａｂａｔらの文献（Sequences of Proteins of Immunological Interest, fifth edition National Institutes of Health, Bethesda, MD  1991年）を参考にして決定した。その結果、重鎖のＣＤＲはＨＣＤＲ１（塩基配列：配列番号７３、アミノ酸配列：配列番号７４）、ＨＣＤＲ２（塩基配列：配列番号７５、アミノ酸配列：配列番号７６）およびＨＣＤＲ３（塩基配列：配列番号７７、アミノ酸配列：配列番号７８）、軽鎖のＣＤＲはＬＣＤＲ１（塩基配列：配列番号７９、アミノ酸配列：配列番号８０）、ＬＣＤＲ２（塩基配列：配列番号８１、アミノ酸配列：配列番号８２）およびＬＣＤＲ３（塩基配列：配列番号８３、アミノ酸配列：配列番号８４）と決定することができた。
【００３７】
（８）γ−１Ｆ８．（組換え１Ｆ８抗体）の作製
（８−１）ｃＤＮＡの作製および１Ｆ８可変領域断片の取得
全ＲＮＡ（実施例（７）に記載）からのｃＤＮＡの調製およびＰＣＲ反応は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２４００を用い、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて説明書に従って行った。重鎖のｃＤＮＡを調製するためのプライマーには、キットに付属のｒａｎｄｏｍ  ６ｍｅｒを用いた。
重鎖およびλ鎖の可変領域の増幅には、発現プラスミドと連結するための制限酵素サイトを導入したプライマーを用いた。重鎖可変領域の増幅には、５’末端側にＡｆｌIIサイトを含むＰ１（配列番号８９）、３’末端側にＮｈｅIサイトを含むＰ２（配列番号９０）を用いた。λ鎖可変領域の増幅には、５’末端側にＢｓｒＧIサイトを含むＰ３（配列番号９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７の等量混合物）、３’末端側にＡｖｒIIサイトを含むＰ４（配列番号９８、９９、１００の等量混合物）を用いた。
増幅された重鎖、λ鎖各々の可変領域ＤＮＡ断片は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。次に、発現ベクターと連結するため、ＤＮＡ断片を制限酵素で消化した。重鎖ＤＮＡ断片はＡｆｌIIおよびＮｈｅIで３７℃、２時間消化した。λ鎖ＤＮＡ断片はＢｓｒＧIおよびＡｖｒIIで３７℃、２時間消化した。消化したＤＮＡ断片は１．５％アガロース電気泳動し、目的のＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。
【００３８】
（８−２）発現プラスミドの切断およびプラスミド断片の取得
１Ｆ８のヒトＩｇＧ１型組換え抗体を発現させるため、重鎖発現用プラスミドとして重鎖定常領域の配列とｄｈｆｒ遺伝子の配列を含むｐＥＸ−Ｇ１―ｓｉｇ―ｄｈｆｒ‘’、λ鎖発現用プラスミドとしてλ鎖定常領域の配列を含むｐＥＸ−ｌａｍｂｄａ−ｓｉｇを用いた。ｐＥＸ−Ｇ１―ｓｉｇ―ｄｈｆｒ‘’はＡｆｌIIおよびＳｐｅIで３７℃、２時間消化した。ｐＥＸ−ｌａｍｂｄａ−ｓｉｇはＢｓｒＧIおよびＡｖｒIIで２時間消化した。消化した断片は０．８％アガロース電気泳動し、目的の断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。
【００３９】
（８−３）１Ｆ８可変領域の発現プラスミドへの連結
上記の方法により得られた１Ｆ８の重鎖可変領域を含むＤＮＡ断片と切断した発現プラスミドｐＥＸ−Ｇ１―ｓｉｇ―ｄｈｆｒ‘’は、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、説明書に従って連結させ、大腸菌ＤＨ５α−Ｔ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を説明書に従い形質転換した。生じたコロニーをピックアップし、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。重鎖塩基配列を含むプラスミドはＨｉｎｄIIIとＮｈｅIとで３７℃、１．５時間消化し、１％アガロース電気泳動を行い所望のプラスミドｐＥＸ−１Ｆ８−Ｈを得た。  得られたプラスミドは、５’末端側にＰ５（配列番号１０１）、３’末端側にＰ６（配列番号１０２）を用いて塩基配列を確認した。１Ｆ８組換え抗体の重鎖構造遺伝子の塩基配列を配列番号１０３に示す。
一方、１Ｆ８のλ鎖可変領域を含むＤＮＡ断片と切断した発現プラスミドｐＫＳ−ｌａｍｂｄａ−ｓｉｇは、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、説明書に従って連結させ、大腸菌ＤＨ５α−Ｔ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換した。生じたコロニーをピックアップし、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。λ鎖塩基配列を含むプラスミドはＢｓｒＧIおよびＡｖｒIIで３７℃、２時間消化し、１％アガロース電気泳動を行い所望のプラスミドｐＥＸ−１Ｆ８−Ｌを得た。得られたプラスミドは、５’末端側にＰ５を用いて塩基配列を確認した。１Ｆ８組換え抗体のλ鎖構造遺伝子の塩基配列を配列番
号１０５に示す。
【００４０】
（８−３）１Ｆ８  重鎖と１Ｆ８  λ鎖を含むプラスミドの連結
１Ｆ８の重鎖とλ鎖をひとつのプラスミドに連結するため、上記で得られたプラスミドを制限酵素で消化した。ｐＥＸ−１Ｆ８−ＨはＮｈｅIで３７℃、１．５時間消化し、ｐＥＸ−１Ｆ８−ＬはＮｈｅＩおよびＳｐｅＩで３７℃、１．５時間消化した。得られた断片はＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。各々の断片をＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて説明書に従い連結させ、大腸菌ＤＨ５α−Ｔ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換した。生じたコロニーをピックアップし、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。得られたプラスミドをＮｈｅIで３７℃、１時間消化し、１．５％アガロース電気泳動を行って目的のサイズのプラスミドを選択した。さらにそれらについて、ＨｉｎｄIIIで３７℃、１時間消化し、１．５％アガロース電気泳動を行ってプラスミドチェックし、所望のプラスミドｐＥＸ−１Ｆ８−ＨＬを得た。
【００４１】
（８−４）γ−１Ｆ８生産組換体の作製
γ−１Ｆ８生産組換体作製のための細胞株として、無血清培地で培養可能なＣＨＯ（ＤＧ３２５）細胞株を用いた。ＣＨＯ（ＤＧ３２５）をＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ（ＧＩＢＣＯ）にて１ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した。２μｇのプラスミドｐＥＸ−１Ｆ８−ＨＬ  ＤＮＡと６μｌのＦｕＧＥＮＥ  ６（Ｒｏｃｈｅ）を混合し、説明書に従ってＣＨＯ（ＤＧ３２５）にトランスフェクションした。トランスフェクションして５．５時間後にＥＸ―ＣＥＬＬ３２５−ＰＦ（ニチレイ）を添加した。２日間培養後、Ｇ４１８（Ｐｒｏｍｅｇａ）４００μｇ／ｍｌおよびメトトレキセート（Ｓｉｇｍａ）０、もしくは２５ｎＭを選択試薬として培地に添加して培養し、クローニングを経た後、γ−１Ｆ８を生産する細胞株を得た。
【００４２】
（８−５）ＥＬＩＳＡ  Ａｓｓａｙを用いた抗体生産株のスクリーニング
抗体生産細胞のスクリーニングは、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により行った。まず、ヤギ抗ヒトイムノグロブリン抗体（ＣＡＰＰＥＬ）を５０μｇ／ｍｌにＰＢＳで希釈し、９６ウェル−プレート（ＦＡＬＣＯＮ）に５０μｌ／ｗｅｌｌずつ添加し、３７℃で２時間処理した。ＰＢＳで５回洗浄した後、５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）含有ＰＢＳ溶液を１５０μｌ／ウェルずつ入れ、ブロッキングを行った。このプレートをＰＢＳで５回洗浄し、５０μｌの組換体培養上清を加えて３７℃、２時間、反応させた。次に、ＰＢＳで５回洗浄し、５０μｌのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合させたヒト抗体に対するヤギ抗体（１０００培希釈、カペル社）を加え、３７℃、１時間の反応を行った。次に、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％含んだＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）でプレートを洗浄し、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（５．２％）とＨ2Ｏ2（０．０１５％）を含有したりん酸クエン酸緩衝液を５０μｌ／ウェルずつ加え、室温で発色が確認できるまで反応させた後、１Ｎ−Ｈ2ＳＯ4を５０μｌ／ｗｅｌｌを添加して反応を停止させ、４９０ｎｍにおける吸光度をマイクロフォトメーター（日本インターメッド）によって測定し、生産量の高い細胞株を選別した。
【００４３】
（８−６）γ−１Ｆ８の精製
Ｇ４１８（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加したプロセップＡ処理血清４％含有培養液Ａを用いて、上記で得られたγ−１Ｆ８生産細胞株を培養し、γ−１Ｆ８を含む培養液を得た。次に、その培養液をプロセップＡにかけることにより、γ−１Ｆ８を吸着させ、その後溶出させることによってγ−１Ｆ８を精製した。なお、図には示していないが、γ−１Ｆ８は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純粋なＩｇＧであることが確認された。
【００４４】
（８−７）γ−１Ｆ８の癌細胞に対する結合活性の確認
（８−６）記載の精製γ−１Ｆ８について、（２−２）記載の方法と同様の方法によって固定したＨＬＣ−１細胞に対する結合活性を確認した。それぞれの濃度の抗体を固定癌細胞と３７℃、１時間反応させた。プレートをＰＢＳで洗浄し、ＨＲＰを結合したヒト抗体に対するヤギ抗体（１０００倍希釈、カペル）を加え、さらに３７℃、１時間の反応を行った。γ−１Ｆ８の反応性を検出した結果、γ−１Ｆ８は濃度依存的にＨＬＣ−１細胞に対して結合活性を示すことが確認された（図４）。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】０２０６３０−１８−１抗体の各種癌組織切片に対する反応性を示す図（写真）。
【図２】１Ｆ８抗体の肺癌生細胞表面（Ａ）および肺正常生細胞表面（Ｂ）に対する結合活性を示す図（写真）。
【図３】１Ｆ８抗体の培養癌細胞株ＨＬＣ−１、ＰＡＮＣ−１およびＭＫＮ４５に対する増殖抑制効果を示すグラフ図。
【図４】γ−１Ｆ８抗体の固定癌細胞表面に対する結合活性を示すグラフ図。
【図１】
2007252372.tif 000003
【図２】
2007252372.tif 000004
【図３】
2007252372.tif 000005
【図４】
2007252372.tif 000006
【配列表】
2007252372000001.app