(57)【要約】【課題】  真核生物のルビスコを原核生物中で発現させることを可能とする方法を提供する。【解決手段】  本発明によれば、真核生物のリブロース−１，５ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼを原核生物中で発現させる方法であって、藍藻のｒｂｃＸ遺伝子を真核生物のｒｂｃＬ遺伝子及び真核生物のｒｂｃＳ遺伝子と共に原核生物中で共発現させることを特徴とする方法が提供される。前記方法において好ましくは真核生物は高等植物又は真核藻類であり、原核生物は大腸菌又は藍藻である。本発明によれば、かかる方法に用いる遺伝子構築物又は遺伝子構築物のキット、及びこれらの遺伝子構築物又は遺伝子構築物のキットで形質転換された組換え原核生物も提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核生物のリブロース−１，５ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼを原核生物中で発現させる方法であって、藍藻のｒｂｃＸ遺伝子を真核生物のｒｂｃＬ遺伝子及び真核生物のｒｂｃＳ遺伝子と共に原核生物中で共発現させることを特徴とする方法。
【請求項２】
藍藻のｒｂｃＸ遺伝子が、配列番号１によって表されるＤＮＡからなるか、又は配列番号１によって表されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしかつ藍藻のｒｂｃＸ遺伝子の機能を有するＤＮＡからなることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
真核生物が高等植物又は真核藻類であり、原核生物が大腸菌又は藍藻であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
藍藻のｒｂｃＸ遺伝子、真核生物のｒｂｃＬ遺伝子及び真核生物のｒｂｃＳ遺伝子を含み、さらにこれらの遺伝子の発現を制御する制御配列を含むことを特徴とする遺伝子構築物。
【請求項５】
藍藻のｒｂｃＸ遺伝子が、配列番号１によって表されるＤＮＡからなるか、又は配列番号１によって表されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしかつ藍藻のｒｂｃＸ遺伝子の機能を有するＤＮＡからなることを特徴とする請求項４に記載の遺伝子構築物。
【請求項６】
真核生物が高等植物又は真核藻類であることを特徴とする請求項４又は５に記載の遺伝子構築物。
【請求項７】
以下のものを含むことを特徴とする遺伝子構築物のキット：
藍藻のｒｂｃＸ遺伝子及びこの遺伝子の発現を制御する制御配列を含む第一遺伝子構築物；及び
真核生物のｒｂｃＬ遺伝子及び真核生物のｒｂｃＳ遺伝子を含み、さらにこれらの遺伝子の発現を制御する制御配列を含む第二遺伝子構築物。
【請求項８】
藍藻のｒｂｃＸ遺伝子が、配列番号１によって表されるＤＮＡからなるか、又は配列番号１によって表されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしかつ藍藻のｒｂｃＸ遺伝子の機能を有するＤＮＡからなることを特徴とする請求項７に記載の遺伝子構築物のキット。
【請求項９】
真核生物が高等植物又は真核藻類であることを特徴とする請求項７又は８に記載の遺伝子構築物のキット。
【請求項１０】
請求項４〜６のいずれか一項に記載の遺伝子構築物又は請求項７〜９のいずれか一項に記載の遺伝子構築物のキットで形質転換されたことを特徴とする組換え原核生物。
【請求項１１】
原核生物が大腸菌又は藍藻であることを特徴とする請求項１０に記載の組換え原核生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリブロース−１，５ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ルビスコとも称される）を原核生物中で発現させる方法に関する。本発明はまた、かかる方法に用いる遺伝子構築物又は遺伝子構築物のキット、及びこれらの遺伝子構築物又は遺伝子構築物のキットで形質転換された組換え原核生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ルビスコは光合成を行う生物（高等植物や紅藻などの真核生物、藍藻などの原核生物）が有する酵素である。ルビスコは光合成の二酸化炭素固定反応のキー酵素であるため、作物などの高等植物（真核生物）のルビスコの二酸化炭素固定能を遺伝子工学やタンパク質工学により改良して光合成効率を向上させることは、作物などの収率の向上の観点から多くの関心を集めている。この改良のためには作物などの高等植物（真核生物）のルビスコや二酸化炭素固定能が元来優れている紅藻（真核生物）のルビスコを大腸菌などの原核生物中で発現させてルビスコを多量に得る必要がある。しかしながら、大腸菌などの原核生物中で真核生物のルビスコを発現させることは従来不可能であった。
【０００３】
一方、本発明者らは最近、原核生物の一種である藍藻シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ.ＰＣＣ７００２ではｒｂｃＸという遺伝子がルビスコの発現に関与していることを見出している（非特許文献１）。ルビスコはラージサブユニット（Ｌ）及びスモールサブユニット（Ｓ）の二つのサブユニットからなるＬＳ複合体の八量体（Ｌ８Ｓ８）タンパク質である。シネココッカスｓｐ.ＰＣＣ７００２ではｒｂｃＸ遺伝子はｒｂｃＬ（ルビスコのラージサブユニット）遺伝子とｒｂｃＳ（ルビスコのスモールユニット）遺伝子の間のスペーサー領域に存在しており、ｒｂｃＬとｒｂｃＳの翻訳及びその後のＬ８Ｓ８ユニット形成を補助すると考えられている。しかしながら、ｒｂｃＸ遺伝子が他の生物、特に真核生物のルビスコの発現を補助することができるかどうかは今だ確認されていない。
【非特許文献１】Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，４５（１０）、１３９０、（２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明はかかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は真核生物のルビスコを原核生物中で発現させることを可能とすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らはかかる課題を解決するため、原核生物の一種である藍藻のｒｂｃＸ遺伝子の機能を鋭意研究した結果、藍藻のルビスコ遺伝子のオペロン構造中に存在するｒｂｃＸ遺伝子を真核生物のｒｂｃＬ遺伝子及び真核生物のｒｂｃＳ遺伝子と共発現させることにより、真核生物のルビスコを原核生物中で発現させることができることを見出し、遂に本発明を想到するに至った。
【０００６】
即ち、本発明によれば、真核生物のリブロース−１，５ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼを原核生物中で発現させる方法であって、藍藻のｒｂｃＸ遺伝子を真核生物のｒｂｃＬ遺伝子及び真核生物のｒｂｃＳ遺伝子と共に原核生物中で共発現させることを特徴とする方法が提供される。
【０００７】
また、本発明によれば、藍藻のｒｂｃＸ遺伝子、真核生物のｒｂｃＬ遺伝子及び真核生物のｒｂｃＳ遺伝子を含み、さらにこれらの遺伝子の発現を制御する制御配列を含むことを特徴とする遺伝子構築物が提供される。
また、本発明によれば、以下のものを含むことを特徴とする遺伝子構築物のキットが提供される：
藍藻のｒｂｃＸ遺伝子及びこの遺伝子の発現を制御する制御配列を含む第一遺伝子構築物；及び
真核生物のｒｂｃＬ遺伝子及び真核生物のｒｂｃＳ遺伝子を含み、さらにこれらの遺伝子の発現を制御する制御配列を含む第二遺伝子構築物。
さらに、本発明によれば、前記遺伝子構築物又は遺伝子構築物のキットで形質転換されたことを特徴とする組換え原核生物が提供される。
【０００８】
本発明の好ましい実施態様においては、藍藻のｒｂｃＸ遺伝子は配列番号１によって表されるＤＮＡからなるか、又は配列番号１によって表されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしかつ藍藻のｒｂｃＸ遺伝子の機能を有するＤＮＡからなり、ルビスコの由来する真核生物は高等植物又は真核藻類であり、発現ホストである原核生物は大腸菌又は藍藻である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の方法で発現対象とするルビスコは、そのｒｂｃＬ遺伝子及びｒｂｃＳ遺伝子が同定されている真核生物由来のルビスコであればいかなるものも発現対象とすることができるが、例えば高等植物や真核藻類である紅藻のルビスコを挙げることができる。
【００１０】
本発明の方法で発現ホストとする原核生物は発現目的によって適宜選択すればよい。例えば遺伝子工学やタンパク質工学によりルビスコを改良するためのルビスコの多量生産を目的とする場合は、大腸菌などの増殖能力が高い原核生物を選択すればよい。また、実際に改良した高機能ルビスコを品種改良対象の植物に導入する前段階としての発現確認を目的とする場合は、光合成能を有する原核生物でありかつ遺伝子導入が容易な藍藻を選択して藍藻での正常な発現を確認すればよい。
【００１１】
本発明の方法で用いるｒｂｃＸ遺伝子は藍藻のルビスコオペロン中、ｒｂｃＬ遺伝子とｒｂｃＳ遺伝子の間のスペーサー領域に存在する遺伝子であり、藍藻のｒｂｃＬとｒｂｃＳの翻訳及びその後のＬ８Ｓ８ユニット形成を補助する遺伝子である。ｒｂｃＸ遺伝子を持つ藍藻としては、例えばシネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、アナベナ（Ａｎａｂｅｎａ）属、アナシスティス（Ａｎａｃｙｓｔｉｓ）属、アファニゾメノン（Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ）属、ノストック（Ｎｏｓｔｏｃ）属、ミクロシスティス（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）属、プランクトスリックス（Ｐｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｘ）属、及びチコネマ（Ｔｙｃｈｏｎｅｍａ）属の藍藻がある。好ましくは、本発明の方法で用いるｒｂｃＸ遺伝子はシネココッカスｓｐ.ＰＣＣ７００２株のｒｂｃＸ遺伝子である。そのＤＮＡ配列を配列表の配列番号１に示す。また、配列番号１のいわゆる均等の範囲に含まれる遺伝子、つまり配列番号１によって表されるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしかつ藍藻のｒｂｃＸ遺伝子の機能を有するＤＮＡも本発明で好適に用いることができる。
【００１２】
配列番号１のいわゆる均等の範囲に含まれる配列は、データベースを用いた配列検索、又は配列番号１の塩基配列もしくはその一部をプローブとするコロニーもしくはプラークハイブリダイゼーションにより得ることができる。なお、本明細書において用いる用語「ストリンジェントな条件」は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えばある塩基配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡのみが特異的にハイブリダイズする条件であることができる。ストリンジェントな条件はハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、温度等を調節することにより作り出すことができる。
【００１３】
ハイブリダイゼーションの手順としては、先ず目的の遺伝子源から得たＤＮＡ（染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡ）のライブラリーを作製する。そのライブラリーをプレート上で培養し、生育したコロニー等をニトロセルロース等の膜に移し取り、変性処理によりＤＮＡを膜に固定する。この膜を３２Ｐ等で標識したプローブ（配列番号１の塩基配列又はその一部）を含む溶液中で保温し、膜上のＤＮＡとプローブとの間でハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下、例えば６×ＳＳＣ、１％  ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツを含む溶液中で６５℃で２０時間行う。ハイブリダイゼーション後、非特異的に吸着したプローブを洗い流し、オートラジオグラフィー等によりプローブとハイブリッド形成したクローンを同定する。この操作をハイブリッド形成したクローンが単一になるまで繰り返す。こうして得られたクローンの中には目的の遺伝子が挿入されている。得られた遺伝子が藍藻のｒｂｃＸ遺伝子の機能を有するかどうかは、例えば得られた遺伝子を藍藻のｒｂｃＬ遺伝子及びｒｂｃＳ遺伝子と共に大腸菌に導入し、形質転換体中のＬ８Ｓ８ユニットの発現をウェスタンブロッティング等により測定することにより確認することができる。
【００１４】
本発明の方法では藍藻のｒｂｃＸ遺伝子は発現対象の真核生物のｒｂｃＬ（ルビスコのラージサブユニット）遺伝子及びｒｂｃＳ（ルビスコのスモールサブユニット）遺伝子と共に原核生物中で共発現される。藍藻のｒｂｃＸ遺伝子の共発現により、原核生物中での真核生物のｒｂｃＬとｒｂｃＳの翻訳及びその後のＬ８Ｓ８ユニット形成が可能になる。
【００１５】
原核生物である藍藻のｒｂｃＬ遺伝子、ｒｂｃＳ遺伝子と真核生物のｒｂｃＬ遺伝子、ｒｂｃＳ遺伝子の塩基配列の相同性はいずれもかなり低い（本願実施例で用いた紅藻のｒｂｃＬ遺伝子、ｒｂｃＳ遺伝子の場合、それぞれ５６％及び５９％にすぎない）。また、ｒｂｃＸ遺伝子は真核生物には本来存在しない（真核生物ではｒｂｃＬ遺伝子は葉緑体ＤＮＡに、ｒｂｘＳ遺伝子はゲノムＤＮＡにそれぞれ別にコードされており、原核生物のようなｒｂｃＸ遺伝子を介したオペロン構造をとっていない）。これらの事実を考慮すると、藍藻のｒｂｃＸ遺伝子が真核生物ルビスコの発現に有用であることは極めて意外であり、予想外のことである。
【００１６】
藍藻のｒｂｃＸ遺伝子と真核生物のｒｂｃＬ遺伝子及びｒｂｃＳ遺伝子の原核生物中での共発現は、具体的にはこれらの遺伝子を含む遺伝子構築物を作成し、この遺伝子構築物で発現ホスト原核生物を形質転換することにより組換え原核生物を作成しておき、この組換え原核生物を増殖に好適な条件下で培養することにより実行することができる。これらの手順は当業者には周知であるので、ここではこれ以上説明しない。
【００１７】
本発明の方法に用いる遺伝子構築物上の藍藻のｒｂｃＸ遺伝子、真核生物のｒｂｃＬ遺伝子及びｒｂｃＳ遺伝子の配置は特に限定されず、これらの三つの遺伝子を一つの遺伝子構築物上に配置してもよいし、藍藻のｒｂｃＸ遺伝子を一つの（第一）遺伝子構築物上に、真核生物のｒｂｃＬ遺伝子及びｒｂｃＳ遺伝子を別の（第二）遺伝子構築物上に配置して第一遺伝子構築物及び第二遺伝子構築物を含む遺伝子構築物のキットとしてもよい。これらの遺伝子構築物は、配置された遺伝子の発現を制御する制御配列（プロモーターやターミネーター）も含む。制御配列としては普遍的なプロモーターやターミネーターを用いることができるが、ｒｂｃＸ遺伝子が由来する藍藻のルビスコオペロンのプロモーターやターミネーターも用いることができる。特に、ターミネーターについてはｒｂｃＸ遺伝子が由来する藍藻のルビスコオペロンのターミネーターを用いることにより真核生物のルビスコの発現が促進されることが明らかになっている（データは示さず）。
【００１８】
本発明によれば、従来不可能であった真核生物のルビスコの原核生物中での発現が可能になるので、例えばホスト原核生物として大腸菌を用いることにより真核生物のルビスコの遺伝子工学的・タンパク質工学的改良のために真核生物のルビスコを容易に多量に得ることができる。また、実際に改良した高機能ルビスコを品種改良対象の植物に導入する際には、ホスト原核生物として藍藻（光合成能を有する生物であり、かつ遺伝子導入が容易である）を用いて改良高機能ルビスコの藍藻での正常な発現を事前に確認することにより、最終目的である植物への改良高機能ルビスコの導入の成功率を上げることができる。さらに、改良高機能ルビスコを発現する藍藻自体を改良高機能ルビスコの二酸化炭素固定能を調査・スクリーニングするために用いることもできる。
【実施例】
【００１９】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、実施例の記載は純粋に発明の理解のためのみに挙げるものであり、本発明はこれによって何ら限定されるものではない。
【００２０】
実施例１
（１）紅藻ガルディエリア  パルティタ（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｐａｒｔｉｔａ）のリブロース−１，５ビスホスフェート  カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ルビスコ）遺伝子（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎアクセッション番号ＡＢ０１８００８）のラージサブユニット（ｒｂｃＬ）とスモールサブユニット（ｒｂｃＳ）部分、および藍藻のシネココッカスＰＣＣ７００２株のｒｂｃＸ遺伝子（配列番号１）をＰＣＲで増幅し、図１に示すような紅藻のｒｂｃＬ（Ｇ.ｒｂｃＬ）のみを持つもの、紅藻のｒｂｃＬ（Ｇ.ｒｂｃＬ）と藍藻のｒｂｓＸ（Ｓ.ｒｂｃＸ）を持つもの、及び紅藻のｒｂｃＬ（Ｇ.ｒｂｃＬ）、ｒｂｃＳ（Ｇ.ｒｂｃＳ）と藍藻のｒｂｃＸ（Ｓ.ｒｂｃＸ）を持つものの三種類のルビスコ遺伝子構築物を作成した。構築物の５’上流にはシネココッカスＰＣＣ７００２株のｒｂｃ遺伝子プロモーター領域を、３’下流にはターミネーター領域を結合した。これらの構築物をシアノバクテリア用シャトルベクターｐＡＱＪ４（文献Ｍｉｙａｓａｋａ，Ｈ．，Ｎａｋａｎｏ，Ｈ．，Ａｋｉｙａｍａ，Ｈ．，Ｋａｎａｉ，Ｓ．ａｎｄ  Ｈｉｒａｎｏ，Ｍ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＨＡ（ｐｏｌｙ  ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ）ｂｙ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｍａｒｉｎｅ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ．Ｓｔｕｄ．Ｓｕｒｆ．Ｓｃｉ．Ｃａｔａｌ．，１１４，２３７−２４２，（１９９８））に導入して、図１に示すような三種類のプラスミドＤＮＡ  ｐＲｂｃＧＬ，ｐＲｂｃＧＬＳＸおよびｐＲｂｃＧＬＳＸＧＳを作成した。
【００２１】
（２）次に、（１）で作成した３種のプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌での発現を検討した。作成したプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌（ＪＭ１０９株）を形質転換し、ＬＢ／Ａｍｐ培地で６時間培養後ＯＤ６００を測定し、集菌した後ＰＢＳ緩衝液に懸濁して菌体数を合わせた。懸濁液を電気泳動用サンプル緩衝液と１：１に混合し、４−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。一方、タンパク質を抽出する際は菌体を超音波破砕し、遠心により上清画分と沈殿画分に分離して調製した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法でタンパク質濃度を測定した後、タンパク質量を合わせて４−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。
【００２２】
（３）その結果を図２に示す。図２から明らかな通り、紅藻のｒｂｃＬのみを持つ発現プラスミドｐＲｂｃＧＬで形質転換された大腸菌では紅藻のｒｂｃＬの発現を検出できなかった（レーン１）。これに対し、紅藻のｒｂｃＬに加えて藍藻のｒｂｃＸを持つ発現プラスミドｐＲｂｃＧＬＳＸ、及び紅藻のｒｂｃＬ，ｒｂｃＳに加えて藍藻のｒｂｃＸを持つ発現プラスミドｐＲｂｃＧＬＳＸＧＳで形質転換された大腸菌では、紅藻のｒｂｃＬおよびｒｂｃＳの発現量が大幅に上昇した（レーン２およびレーン３）。以上の結果から藍藻のｒｂｃＸ遺伝子は藍藻のルビスコのみならず、真核生物である紅藻のルビスコタンパク質のｒｂｃＬとｒｂｃＳの翻訳にも重要な役割を果たすことが明らかになった。
【００２３】
実施例２
（１）実施例１と同様に、紅藻ガルディエリア  パルティタ（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｐａｒｔｉｔａ）のリブロース−１，５ビスホスフェート  カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ルビスコ）遺伝子（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎアクセッション番号ＡＢ０１８００８）のラージサブユニット（ｒｂｃＬ）とスモールサブユニット（ｒｂｃＳ）部分、および藍藻のシネココッカスＰＣＣ７００２株のｒｂｃＸ遺伝子をＰＣＲで増幅し、図３に示すような紅藻のｒｂｃＬ（Ｇ.ｒｂｃＬ）とｒｂｃＳ（Ｇ.ｒｂｃＳ）のみを持ち藍藻のｒｂｓＸ（Ｓ.ｒｂｃＸ）を持たないもの、及び紅藻のｒｂｃＬ（Ｇ.ｒｂｃＬ）、ｒｂｃＳ（Ｇ.ｒｂｃＳ）と藍藻のｒｂｃＸ（Ｓ.ｒｂｃＸ）を持つものの二種類のルビスコ遺伝子構築物を作成した。構築物の５’上流にはシネココッカスＰＣＣ７００２株のｒｂｃ遺伝子プロモーター領域を、３’下流にはターミネーター領域を結合した。これらの構築物をシアノバクテリア用シャトルベクターｐＡＱＪ４（文献Ｍｉｙａｓａｋａ，  Ｈ．，Ｎａｋａｎｏ，Ｈ．，Ａｋｉｙａｍａ，Ｈ．，Ｋａｎａｉ，Ｓ．ａｎｄ  Ｈｉｒａｎｏ，Ｍ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＨＡ（ｐｏｌｙ  ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ）ｂｙ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｍａｒｉｎｅ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ．Ｓｔｕｄ．Ｓｕｒｆ．Ｓｃｉ．Ｃａｔａｌ．，１１４，２３７−２４２，（１９９８））に導入して、図３に示すような二種類のプラスミドｐＲｂｃＧＬＧＳおよびｐＲｂｃＧＬＳＸＧＳを作成した。これらのプラスミドで大腸菌（ＪＭ１０９株）を形質転換して以下の発現実験に用いた。
【００２４】
（２）藍藻のｒｂｃＸ遺伝子が紅藻のルビスコのＬ８Ｓ８ユニット形成に及ぼす影響を調べるために、抗Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｒｂｃ抗体（Ｌ８Ｓ８ユニットに対する抗体）を用いたウエスタンブロッティングを行った。（１）で作成した組換え大腸菌をＬＢ／アンピシリン培地で６時間培養後、菌体数を合わせてＰＢＳ緩衝液に懸濁して、超音波破砕によりタンパク質を抽出した。不溶性画分を遠心により除き、上清画分の可溶性タンパク質を同量アプライして４−１２％  Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動の後、タンパク質をゲルからＰＶＤＦメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に１００  Ｖで１時間トランスファーし、メンブレンをブロッキングバッファーに浸して４℃で一晩浸とうした後、１次抗体（抗Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｒｂｃ抗体）、２次抗体（抗ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ−ＨＲＰ）を順次加えて各１時間反応させた。
【００２５】
（３）図４にウエスタンブロティングの結果を示す。図４から明らかな通り、藍藻のｒｂｃＸ遺伝子が紅藻のｒｂｃＬ遺伝子及びｒｂｃＳ遺伝子と共発現することにより、明らかに紅藻のルビスコのＬ８Ｓ８ユニットの量が増加した（レーン２）。このことから藍藻のｒｂｃＸ遺伝子が真核生物である紅藻のルビスコタンパク質のＬ８Ｓ８ユニット形成を促進することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明の方法によれば真核生物のルビスコを原核生物中で発現させることができるので、大腸菌を用いた真核生物のルビスコの多量生産や、藍藻を用いた真核生物の改良ルビスコの発現確認、スクリーニング等に広く応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施例１で作成した三種類のプラスミドＤＮＡの構成を示す。
【図２】図１のプラスミドＤＮＡで形質転換した大腸菌培養物のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図３】実施例２で作成した二種類のプラスミドＤＮＡの構成を示す。
【図４】図２のプラスミドＤＮＡで形質転換した大腸菌培養物のウェスタンブロッティングの結果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００２８】
配列番号１はシネココッカスＰＣＣ７００２株のｒｂｃＸ遺伝子の塩基配列であり、配列番号２はシネココッカスＰＣＣ７００２株のｒｂｃＸ遺伝子のアミノ酸配列である。
【図１】
2007037474.tif 000002
【図２】
2007037474.tif 000003
【図３】
2007037474.tif 000004
【図４】
2007037474.tif 000005
【配列表】
2007037474000001.app