(57)【要約】【課題】酸化還元酵素を含む電極系と酸化酵素を含まない電極系の２組の電極系を同一空間内に配置して、直流的な電位を印加する方法では、電極反応を短時間で検出できない場合などは、検体液中に酸化還元酵素や電子受容体などが浸出し、両電極系間で相互干渉が生じ、検出精度を低下させる。  また、２組の電極系を同一センサの同一平面空間に配置すると電極占有面積が大きくなり、センサ設計の自由度が低下するという問題があった。【解決手段】本発明における濃度測定装置の構成では、酸化還元酵素を含む電極系と酸化酵素を含まない電極系の参照極が両電極共通で測定時の電位制御は、任意時間で切り替わり両電極系は同時に電位制御されることがない。  したがって、電極占有面積を小さくすることができ、２電極系間の相互干渉も生じることもなく、小型で安定した高精度な濃度測定装置を実現することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体である任意の水溶液に含まれる検出対象とする物質を電気化学的に計測することによって、前記物質の濃度を定量する濃度測定装置であって、絶縁性基板と該絶縁性基板に形成した第１の作用極と第１の対極と第２の作用極と第２の対極と参照極とで構成される電気化学的計測手段と、該電気化学的計測手段の電位を一定にする電位制御手段と、前記電気化学的計測手段で計測した結果を検出する信号検出手段と該信号検出手段の結果から検出対象とする物質の濃度を算出する濃度算出手段とを有する濃度測定装置。
【請求項２】
前記電気化学的計測手段は、前記第１の作用極に設けた活性な酵素を含む反応層を有し、前記第２の作用極に設けた活性な酵素を含まない補正層とを有することを特徴とする請求項１に記載の濃度測定装置。
【請求項３】
前記電気化学的計測手段は、前記第１の作用極と前記第１の対極とに設けた活性な酵素を含む反応層を有し、前記第２の作用極と前記第２の対極とに設けた活性な酵素を含まない補正層とを有することを特徴とする請求項１に記載の濃度測定装置。
【請求項４】
前記電位制御手段は、前記第1の作用極と前記第1の対極と前記参照極とで構成される電極系と、前記第２の作用極と前記第２の対極と前記参照極とで構成される電極系に対して交互に一定の電位に制御することを特徴とする請求項１、請求項２または請求項３に記載の濃度測定装置。
【請求項５】
前記信号検出手段は、前記第1の作用極と前記第1の対極と前記参照極とで構成される電極系と、前記第２の作用極と前記第２の対極と前記参照極とで構成される電極系に対して、電位制御時間内において電極反応で得られる電流値を検出することを特徴とする請求項１、請求項２、請求項３または請求項４に記載の濃度測定装置。
【請求項６】
前記信号検出手段は、前記第1の作用極と前記第1の対極と前記参照極とで構成される電極系と、前記第２の作用極と前記第２の対極と前記参照極とで構成される電極系に対して、電位制御時間内において電極反応で得られる平均電流値を検出することを特徴とする請求項１、請求項２、請求項３または請求項４に記載の濃度測定装置。
【請求項７】
前記濃度算出手段は、前記信号検出手段によって、前記第1の作用極と前記第1の対極と前記参照極とで構成される電極系と、前記第２の作用極と前記第２の対極と前記参照極とで構成される電極系で各々検出した前記電流値または前記平均電流値の差分を求めることを特徴とする請求項５または請求項６に記載の濃度測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液などの生体試料中或いは、水溶液中に含まれる特定の成分濃度を測定するための濃度測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体試料中或いは、水溶液中に含まれる特定の成分濃度を求める手法として、一般に電気化学的手法が用いられる。
電気化学的手法とは、化学物質の特性変化を化学反応の変化量から直接、電気量に変換して測定するもので簡便、高感度、リアルタイム検出など優れた特徴を有している。
電気化学的手法で得られる値は、電位、電流、時間あるいはこれらの相関関係であり、これらの測定結果の値を利用して目的物質を定量することができる。
これは、電極反応によって反応する物質量は電流量に比例し、反応物が違っても、同一電流量の電気分解によって電極に析出する物質の質量は各々の化学当量に比例する、というファラデーの法則に基づいている。
【０００３】
電気化学的手法では、作用極と対極とからなる２電極間の電位が一定になるように制御して、水溶液と各電極間で起こる酸化還元電流の時間的変化を求めることが行われる。
上記の２電極式では、２電極間への電圧印加で起こる拡散によって２電極間の電位は常に変化しており、実際に印加される作用極の電位は判らない。
そこで、参照極を加えた３電極式も一般的に用いられている。
３電極式では、ポテンショスタットと呼ばれる制御方法で、参照極と作用極間の電位が拡散の時間的変化に対しても常に一定になるように作用極と対極間の電位を制御するものである。
【０００４】
図６は、従来技術における電気化学的計測手段であり、作用極と対極と参照極とからなる３電極式によるポテンショスタットの構成を示す概略図である。
１０が第１の作用極、１１が第１の対極、３０が参照極、１３が第１の増幅器、１４が第２の増幅器、１５が差動増幅器、１６は電流検出抵抗、１７は検出電位、１８は設定電位である。
図６に示すように、参照極３０と第１の作用極１０間の電位の差分、この場合は、第１の作用極１０を接地しているので、第１の作用極１０に対する参照極３０の変化分を差動増幅器１５で検出し、検出電位１７を出力する。
そして、設定電位１８と検出電位１７との差分を検出量補正値として第１の対極１１に帰還させて、常に参照極３０と第１の作用極１０間の電位が設定した電位になるように第１の対極１１の電位を制御している。
【０００５】
近年では、これら電気化学的手法と酵素のもつ特異性を利用して試料中の目的とする物質の濃度を検出する電気化学センサが多数開発されている。
その一例として、グルコースの定量方法について説明する。
【０００６】
代表的なグルコースの定量方法として、グルコースオキシダーゼ（以下、ＧＯＤと記載する。）を用いる方法について説明する。
酸化酵素であるグルコースオキシダーゼは、酸素の存在環境においてグルコースを酸化反応させ、グルコン酸と過酸化水素を生成させる。
この酵素反応は、試料中の酸素を消費して過酸化水素が生成されるので、酸素消費量を検出することができる電極を用いる、或いは過酸化水素の生成量を検出する電極を用いることによって、グルコースの定量が可能となる。
過酸化水素を電気化学的に検出するには、基準電位に対して０．７Ｖの電位が必要であるが、血液中のグルコースを測定する場合は、生体内に存在する他の物質、例えばアスコルビン酸、尿酸、ビリルビンなども検出してしまうため、現在では、酵素反応系に電子受容体を共存させ、検出目的以外の妨害物質を電極反応させない電位まで低下させるなどのセンサも開発されている。
【０００７】
しかし、選択した電子受容体と生体内に存在する妨害物質が直接反応する場合では、その反応が電極反応とは無関係である。
その結果、この電極反応とは無関係で生じた値が電極反応で生じた結果に加算されるため検出結果に誤差を与え検出精度を低下させる。
そこで、基質に反応する酸化還元酵素を含む電極系と酸化還元酵素を含まない電極系との２つの電極系を同一センサ内に配置して直流的な電圧を同時に２つの電極系に印加して電位制御し測定を行い、２つの電極系で得られた検出値の差分を求めることによって、妨害物質の影響を除去する方法が考案されている。
【０００８】
その一例として、酸化還元酵素を含む電極系にはカルボキシメチルセルロース（以下、ＣＭＣと記載する。）にグルコース酸化酵素であるＧＯＤを混合したものを配置して、酸化還元酵素を含まない電極系にはＣＭＣのみを配置した電気化学センサがある。
同一空間に配置した２組の電極系で得られた検出電流の差分を求めることでアスコルビン酸の影響を除去できることが特許文献１に記載されている。
【特許文献１】特許第２５０２６６５号公報  （第２頁）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このように、検出目的とする物質に対する酸化還元酵素を含む電極系と酸化還元酵素を含まない電極系との２組の電極系を用いて目的とする物質以外の妨害物質を除去し、検出精度を高める方法がある。
しかし、近年糖尿病患者に対して普及している簡易血糖計に代表されるように、使い捨て型のセンサでは電極を配置する面積に制限がある。
さらに、センサ内の同一空間に検出目的とする物質に対する酸化還元酵素を含む電極系と酸化還元酵素を含まない電極系を配置して、同時に直流的な電圧を印加して電位制御し測定を行うと両方の電極系で検出される電流値が異なるため両電極間で相互干渉が起こる。
電極反応が遅く短時間で検出ができない場合は、特に相互干渉が顕著に起こり、両電極で測定した検出電流に誤差を生じさせる原因になる。
例えば、両電極系に同時に電圧を印加し電位制御すると、検体試料中への酸化還元酵素の浸出、電子受容体を含む場合は電子受容体の浸出などが助長され、両者の電極反応に影響を与え検出値に誤差を与えるという問題がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、本発明の濃度測定装置は次のような構成を採用する。
【００１１】
本発明の濃度測定装置は、検体である任意の水溶液に含まれる検出対象とする物質を電気化学的に計測することによって、物質の濃度を定量する濃度測定装置であって、絶縁性基板と絶縁性基板に形成した第１の作用極と第１の対極と第２の作用極と第２の対極と参照極とで構成される電気化学的計測手段と、電気化学的計測手段の電位を一定にする電位制御手段と、電気化学的計測手段で計測した結果を検出する信号検出手段と信号検出手段の結果から検出対象とする物質の濃度を算出する濃度算出手段とを有することを特徴とする。
【００１２】
電気化学的計測手段は、第１の作用極に設けた活性な酵素を含む反応層を有し、第２の作用極に設けた活性な酵素を含まない補正層とを有することが好ましい。
【００１３】
電気化学的計測手段は、第１の作用極と第１の対極とに設けた活性な酵素を含む反応層を有し、第２の作用極と第２の対極とに設けた活性な酵素を含まない補正層とを有することが好ましい。
【００１４】
電位制御手段は、第１の作用極と第１の対極と参照極とで構成される電極系と、第２の作用極と第２の対極と参照極とで構成される電極系に対して交互に一定の電位に制御することが好ましい。
【００１５】
信号検出手段は、第１の作用極と第１の対極と参照極とで構成される電極系と、第２の作用極と第２の対極と参照極とで構成される電極系に対して、電位制御時間内において電極反応で得られる電流値を検出することが好ましい。
【００１６】
信号検出手段は、第１の作用極と第１の対極と参照極とで構成される電極系と、第２の作用極と第２の対極と参照極とで構成される電極系に対して、電位制御時間内において電極反応で得られる平均電流値を検出することが好ましい。
【００１７】
濃度算出手段は、信号検出手段によって、第１の作用極と第１の対極と参照極とで構成される電極系と、第２の作用極と第２の対極と参照極とで構成される電極系で各々検出した電流値または平均電流値の差分を求めるめることが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の濃度測定装置は、絶縁性基板と絶縁性基板に形成した第１の作用極と第１の対極と第２の作用極と第２の対極と参照極で構成される電気化学的計測手段と、電気化学的計測手段の電位を一定にする電位制御手段と、電気化学的計測手段で計測した結果を検出する信号検出手段と信号検出手段の結果から検出対象とする物質の濃度を算出する濃度算出手段とを有するものである。
本発明の構成によれば、酸化還元酵素を含む反応層が形成された電極系と酸化還元酵素を含まない補正層が形成された電極系との基準電極である参照極を共通電極として使用するため、センサの電極占有面積を小さく抑えることができる。
さらに、反応層と補正層への電位制御は、任意時間で切り替えるため検出時において両電極系間で相互干渉が生じにくく、電極反応速度の遅い反応系においても高精度な検出を可能とする。
また、電位制御時間内における電極反応で得られる電流値或いは、平均電流値から反応層と補正層で検出した差分値を求めることによって、検出対象とする物質以外の妨害物質によるバックグラウンド電流を除去することができる。
このように本発明の構成によれば、センサ内での電極占有面積を抑えることができ、反応層と補正層間での相互干渉を抑制し、水溶液中に存在する検出対象とする物質の濃度を高精度に検出することができるという効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、図面を用いて本発明の実施形態における濃度測定装置の構成について説明する。
図１は、本発明の濃度測定装置の構成を示した概略図である。
１は電気化学的計測手段、２は電位制御手段、３は信号検出手段、４は濃度算出手段である。
電気化学的計測手段１は、第１の作用極１０、第１の対極１１、第２の作用極２０、第２の対極２１、参照極３０から構成されている電気化学センサである。
【００２０】
電気化学的計測手段１を構成する各電極は、例えばポリエチレンテレフタレート（Ｐｏｌｙ  Ｅｔｈｙ−ｌｅｎｅ  Ｔｅｒｅｐｈｔａｌａｔｅ：ＰＥＴ  以下、ＰＥＴと記述する）にスクリーン印刷技術によって印刷された導電性インクで形成されている。
ここでは、第１の作用極１０と第２の作用極２０はカーボン微粒子とバインダと溶剤とからなるカーボンペーストを主原料とする導電性インクで印刷され、印刷後、約１００℃で３０分程度の加熱工程を経て溶剤を揮発させ形成した電極であり、第１の対極１１と第２の対極２１と参照極３０は銀と塩化銀が任意割合で混合された微粒子とバインダと溶剤とからなる銀／塩化銀ペーストを主原料とする導電性インクで印刷され、印刷後は、カーボンインクと同様に加熱工程を経て溶剤を揮発させ形成した電極である。
【００２１】
第1の作用極１０には酸化還元酵素を含む反応層を形成し、第２の作用極２０には酸化還元酵素を含まない補正層を形成する。
そして、参照極３０を基準電位として第１の作用極１０での電極反応の結果生じる電流を第１の対極１１で計測し、参照極３０を基準電位として第２の作用極２０での電極反応の結果生じる電流を第２の対極２１で計測する。
これら５つの電極が対象となる水溶液で浸漬するようにする。
【００２２】
電位制御手段２では、参照極３０に対して第１の作用極１０の電位が設定電位になるように第１の作用極１０と第１の対極１１間の電位を制御するように動作する。
また、参照極３０に対して第２の作用極２０の電位が設定電位になるように第２の作用極２０と第２の対極２１間の電位も制御する。
第１の作用極１０と第１の対極１１と参照極３０で構成される電極系と第２の作用極２０と第２の対極２１と参照極３０で構成される電極系の２つの電極系は、任意時間で電位制御を切り替えるようにしてあり、片方の電極系が電位制御されているときは、もう片方の電極系には電位制御はなく、電極表面と水溶液との間で発生する自然電位と呼ばれる電位差が生じるだけである。
このように、２つの電極系は任意時間で交互に電位制御される。
【００２３】
信号検出手段３は、任意時間で電位制御を切り替え、２つの電極系で電位制御時間内において電極反応で得られる電流値或いは、平均電流値を求めるものである。
【００２４】
濃度算出手段４では、信号検出手段３によって求めた２つの電極系で電位制御時間内において電極反応で得られる電流値或いは、平均電流値の差分を計算して、あらかじめ求めておいた検出対象とする物質の検量線にしたがって測定対象とした水溶液中の特定物質の濃度を算出する。
実際の濃度表示は、例えば液晶表示器などを使って濃度算出手段４で計算した値を表示させればよい。
【実施例】
【００２５】
次に、本発明の実施例について具体的に説明する。
図２は、本発明の濃度測定装置における電気化学的計測手段１と電位制御手段２を具体的に示した図である。
ここで示す図は、酸化還元酵素を含む電極系と酸化還元酵素を含まない電極系と両電極系共通の参照極からなる３電極式によるポテンショスタットの構成を示す概略図である。
１０が第１の作用極、１１が第１の対極、２０が第２の作用極、２１が第２の対極、３０が参照極、１３が第１の増幅器、１４が第２の増幅器、１５が差動増幅器、１６は電流検出抵抗、１７は検出電位、１８は設定電位、５１はリレー回路、５２はリレー制御信号である。
【００２６】
図２に示すように、第１の作用極１０と第２の作用極２０は、リレー制御信号５２によ
って、リレー回路５１のオンオフを制御する。
例えば、ノーマリーオンのリレー回路５１を使用する場合、リレー回路５１にハイレベルの信号が入力されるまでは第１の作用極１０に接続されており、ハイレベルの信号が入力されると第１の作用極１０を切断し、第２の作用極２０を接続する。
リレー制御信号５２のパルス幅を変更することによって、各電極系への電位制御時間を決定することができる。
【００２７】
全体の動作としては、リレー制御信号５２からの信号がローレベルの時、リレー回路５１はノーマリーオンの状態で、第１の作用極１０が接続される状態になる。
この場合、参照極３０と第１の作用極１０間に設定した電位の差分、本実施例では作用極を接地しているので、第１の作用極１０に対する参照極３０の変化分を差動増幅器１５で検出電位１７として検出する。
次にリレー制御信号５２からの信号がハイレベルの時、リレー回路５１は第１の作用極１０との接続を切断し、第２の作用極２０に接続するように動作する。
この場合、参照極３０と第２の作用極２０間に設定した電位の差分、本実施例では第１の作用極同様に第２の作用極２０もまた接地しているので、第２の作用極２０に対する参照極３０の変化分を差動増幅器１５で検出電位１７として検出する。
そして、設定電位１８と検出電位１７との差分を検出量補正値として第１の対極１１或いは第２の対極２１に帰還させて、常に参照極３０と第１の作用極１０或いは、第２の作用極２０間の電位が設定した電位になるように第１の対極１１或いは第２の対極２１の電位を制御している。
【００２８】
このように、リレー制御信号５２によってリレー回路５１を制御して、第１の作用極１０と第２の作用極２０は任意時間で電位制御が切り替えられ、２つの電極系は交互に一定の電位に制御する構成になっている。
電位制御時間は、リレー制御信号５２のパルス幅を変更することによって設定することができる。
【００２９】
電気化学的計測手段１を構成する各電極は、厚さ５００μｍの絶縁性基板であるＰＥＴ基板上に、第１の作用極１０と第１の対極１１と第２の作用極と第２の対極と参照極３０の電極とからなる領域をスクリーン印刷技術で印刷したセンサを用いる。
第１の作用極１０と第２の作用極２０は、カーボン微粒子とバインダと溶剤とからなるカーボンペーストの導電性インクで、第１の対極１１と第２の対極２１と参照極３０は、銀と塩化銀の微粒子が任意割合で配合された銀／塩化銀ペーストの導電性インクを第１の作用極１０と第２の作用極２０と同様にスクリーン印刷技術で印刷したものである。
各々の電極は、ＰＥＴ板の表面に厚さ２００μｍの銀箔を貼り合せ、規定の形状にパターニングしたものを配線材として用いて配線抵抗を減少させている。
【００３０】
各電極上部は、被測定水溶液の量を規定するためスペーサを用いて容積を決定する。
スペーサは、厚さ１５０μｍ程度の両面テープを用いる。
この両面テープは、テープ両面に粘着剤が塗布されたものである。
このスペーサ上にはさらにＰＥＴ板で蓋をして、水溶液の充填空間を規定する。
水溶液は、このセンサの吸入口から毛細管現象によって吸引し、規定量の水溶液を各電極上に充填し、電気化学的計測手段１の電極が浸潤するようにする。
【００３１】
酸化還元酵素を含む第１の作用極１０である反応層は、純水希釈した１％ＣＭＣに糖化アミノ酸を酸化する酵素であるフルクトシルアミンオキシダーゼ（Ｆｒｕｃｔｏｓｙｌａｍｉｎｅ  ｏｘｉｄａｓｅ  以下、ＦＡＯＤと記述する）と、電子受容体であるメトキシＰＭＳ（１−Ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ  以下、ｍＰＭＳと記述する）を混合し、第１の作用極１０に滴下した後
、室温で３０分間送風乾燥した。
本実施例では電極に局在させた状態で、ＦＡＯＤが３ｍＵｎｉｔ、ｍＰＭＳが６ｎｍｏｌになるように設定した。
【００３２】
酸化還元酵素を含まない第２の作用極２０である補正層は、純水希釈した１％ＣＭＣに電子受容体であるｍＰＭＳを混合し、第２の作用極２０に滴下した後、同様に室温で３０分間送風乾燥した。
ここで、第１の作用極１０である反応層を形成した時と同様にｍＰＭＳは電極に局在した状態で６ｎｍｏｌとした。
【００３３】
測定直前まで温度や湿度などの環境的影響を低減するために、室温低湿度環境で保管し、測定前に取り出し使用した。
試料とした水溶液は、血清に検出対象とする物質として任意濃度のフルクトシルバリン（Ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ  ｖａｌｉｎ  以下、ＦＶと記述する。）を添加したものを用いた。
ＦＶは、赤血球に存在するヘモグロビンのβ鎖末端のバリンのアミノ基にグルコースが選択的に結合したものである。
一般的には、糖化ヘモグロビンに代表される糖化タンパク質の状態では分子量が大きいため、直接酸化して検出可能な酵素はまだ発見されていない。
そのため、タンパク質分解酵素を用いて分子量の小さい糖化アミノ酸の形態にする。
【００３４】
試料とした水溶液は、電気化学的計測手段１を構成する２つの電極系を浸潤してから３分後に、電位印加を開始した。
設定電位は参照極３０に対して＋２５ｍＶとし、第１の作用極１０と第２の作用極２０の電位制御切替は５秒、リレー制御信号５２の設定周波数としては１００ｍＨｚとした。
【００３５】
次に、本発明の構成を用いてＦＶ濃度の検出について説明する。
本発明の構成を用いて、血清８０％に５００μＭの濃度のＦＶを添加した水溶液が、電気化学的計測手段１を構成する第1の作用極１０と第1の対極１１と第２の作用極２０と第２の対極２１と参照極３０を浸漬させる。
水溶液が各電極を浸漬した状態から、３分経過後に参照極３０に対して＋２５ｍＶを印加した場合の反応電流を測定した。
浸潤してからの待ち時間は、ＣＭＣの膨潤の安定性、検出対象とする物質と酵素との安定した反応を得るために必要な時間である。
図３は、酸化還元酵素を含む反応層と酸化還元酵素を含まない補正層に対して電位制御を切り替えて同時に反応電流を測定した結果を示したものである。
横軸は電位制御経過時間、縦軸は反応層に対する検出電流６１と補正層に対する検出電流６２を示している。
電位制御切替時のチャタリングと瞬間的な充電電流が認められるが、反応層に対する検出電流６１と補正層に対する検出電流６２に示すように異なる電流曲線が５秒毎に測定されていることが判る。
【００３６】
同様にして、血清８０％に対してＦＶ濃度を変えた水溶液を用いて、反応層と補正層に対する反応電流を測定した結果、補正層に対する検出電流は、ＦＶ濃度に依存することなくバックグラウンド電流を測定していることが判った。
【００３７】
図３に示す黒塗りの丸印は、信号検出手段３により求めた反応層に対して電位制御時間内において電極反応で得られる最低電流値を示し、白抜きの丸印は、同様に補正層に対して電位制御時間内において電極反応で得られる最低電流値を示している。
電位が印加されると、電極表面近傍での電気二重層容量に起因する充放電電流が流れが
、その後、電極反応が進んで電極表面近傍での電子授受が低下して電流が減少していく。
その変化途中でもう片方の電極系への電位制御が切り替わり、電極反応が停止する。  電位制御時間内において電極反応で得られる電流値は、電極反応経過を示していることになるので、その値は検出対象とする物質の濃度に依存する。
電位制御時間内において電極反応で得られる電流は、どの時点での電流もその時間における電極反応を示すことになるが、ここでは電位制御時間内における最低電流値とした。
電位制御時間が短いと、電気二重層容量の電流が合成されているため検出精度を低下させることになる。
このように電位制御切替の設定時間は、任意に決定することができるが、十分な電極反応を生じさせるために適正な時間を設定する。
電極反応速度は使用する酸化還元酵素や電子受容体の種類、濃度などによって変わり得るが、今回使用したＦＡＯＤとｍＰＭＳの組み合わせでは電位制御切替時間は５秒程度で測定誤差が小さくなり最適であった。
【００３８】
図４は、濃度算出手段４により信号検出手段３によって求めた反応層と補正層に対して電位制御時間内において電極反応で得られた最低電流値の差分を求めた図である。
横軸は電位制御経過時間、縦軸は反応層と補正層に対して電位制御時間内において電極反応で得られた最低電流値の差分を示している。
具体的には、図３に示した黒塗りの丸印と白抜きの丸印の差分値をＦＶ濃度を変えてプロットしたものである。
点７１はＦＶ濃度０μＭ、点７２はＦＶ濃度２００μＭ、点７３はＦＶ濃度５００μＭ、点７４はＦＶ濃度８００μＭである。
ＦＶ濃度０μＭで検出電流はほぼ０を示し、ＦＶ濃度が増加すると検出電流も増加する。
【００３９】
図５は、検出対象とする物質であるＦＶ濃度に対して電位制御６０秒後における反応層と補正層に対して電位制御時間内において電極反応で得られた最低電流値の差分をプロットしたものである。
ＦＶ濃度に対して原点を通り、線形性を示していることが判る。
【００４０】
酸化還元酵素を含む第１の作用極１０である反応層における酵素反応は、検出対象とする物質であるＦＶがＣＭＣに包含された糖化アミノ酸の酸化酵素であるＦＡＯＤによって酸化され、酸化されたＦＶは同様にＣＭＣに包含された電子受容体であるｍＰＭＳを還元する。
参照極３０に対する第１の作用極１０の電位がｍＰＭＳの酸化電位よりも高く、電流経路が存在すれば、第１の作用極１０の表面近傍に局在化されたｍＰＭＳの還元体は、第１の作用極１０表面で２電子を放出して酸化され、酸化体に変わり、放出された電子により第１の対極１１である電流経路を電流として流れる。
ｍＰＭＳの酸化体は、再度ＦＡＯＤによって酸化されたＦＶを還元するというサイクルを形成する。
ＦＶは一度ＦＡＯＤによって酸化されると消失し、時間経過とともにＦＶ濃度は減少していく。このように、ｍＰＭＳの還元体は、ＦＶ濃度に応じて決まり、時間経過とともにＦＶ濃度が低下していく。
【００４１】
一方、酸化還元酵素を含まない第２の作用極２０である補正層では、ＣＭＣに電子受容体であるｍＰＭＳのみが包含されておりＦＶが存在してもｍＰＭＳの還元体は増加しない。
しかし、ｍＰＭＳは濃度によって異なるが、酸化体と還元体が任意の割合で存在する。
この割合は、精製、調合などの段階でｍＰＭＳ自身が安定するように決定するため、電極作製毎に異なることになる。
さらに、生体試料中に存在するアスコルビン酸、尿酸、ビリルビンなど直接ｍＰＭＳと反応しｍＰＭＳの還元体を増加させることが想定できる。
【００４２】
本実施例では、第１の作用極１０の反応層と第２の作用極２０の補正層で同じ製造工程を通したｍＰＭＳを同一濃度でＣＭＣに包含しているため、ｍＰＭＳ自身の還元体量と妨害物質によるｍＰＭＳと直接反応で増加する還元体量を第１の作用極１０側の反応層と第２の作用極２０側の補正層との差分を求めることによって補正することができる。
【００４３】
しかも、第１の作用極１０側の反応層と第２の作用極２０側の補正層への電位制御は、任意時間で切替るため片方の電極系が電位制御されていれば、もう片方の電極系は電位制御されず、作用極表面と水溶液との間で生じる自然電位が発生しているだけである。
そのため、２つの電極系で異なる電流を測定する場合でも相互干渉が生じにくく、各々の電極系における電極反応による電流を精度よく検出することができる。
【００４４】
その後、濃度算出手段４では、反応層と補正層に対する検出電流の差分を求めた後、予め検出対象とする物質に対して求めておいた検量線に従って未知の物質の濃度を求め、求めた結果を液晶表示素子などに表示させればよい。
【００４５】
次に、信号検出手段３として別の方法を用いた場合について説明する。
センサ構成、測定方法は、前述と同様である。
本実施例では、信号検出手段３として第１の作用極１０の反応層と第２の作用極２０の補正層に対して、電位制御時間内においてサンプリングされた測定値の平均値を求めるものである。
【００４６】
例えば、サンプリング時間を２０ｍｓとした場合５秒の電位印加時間の間に２５点の測定点を得ることができる。
電位制御時間内において、電位切替以前の５点の測定点をとると、もう一方の電極系への電位制御切り替わり１秒前からの電流値をサンプリングする。
前述したように、電位制御時間内での電流値変化は電極反応を反映しているので、本実施例のように１秒間における測定値を検出してその平均値を取ればその時間内での平均電極反応を求めていることになる。
このように電極反応の平均値を得ることで、雑音に影響されない検出が可能となる。
同様にして、濃度算出手段によって第１の作用極１０の反応層と第２の作用極２０の補正層に対して、電位切替前１秒間の平均値の差分を求めた結果、ＦＶに対する濃度依存性は線形性を示した。
【００４７】
本実施例では、第１の作用極１０を反応層、第２の作用極２０を補正層としたが、第１の作用極１０と第１の対極１１を反応層、第２の作用極２０と第２の対極を補正層とした場合においても同様な効果が得られる。
【００４８】
さらに本実施例では、ＰＥＴ材にスクリーン印刷で作製したセンサにおいて、作用極にカーボンペースト、対極と参照極に銀と塩化銀が任意割合で混合されたペーストを用いた例を説明したが、センサの電極に用いる材料が変わっても本発明が有効であることは言うまでもない。
また、酵素と電子受容体の種類を変えた場合においても本発明が有効であることは明白である。
【００４９】
従来は、生体試料中に存在するグルコースなどの濃度を電気化学センサで検出する場合、酸化還元酵素を含む電極系と酸化酵素を含まない電極系の２組の電極系を同一空間内に配置して、直流的な電位を印加して両電極系で検出した検出値の差分を求めて、アスコル
ビン酸などの妨害物質の影響を補正していた。
しかし、電極反応速度が遅く電極反応を短時間で検出できない場合などは、検体である水溶液中に酸化還元酵素や電子受容体などが浸出し、両電極系間で相互干渉が生じ、検出精度を低下させる。
また、２組の電極系を同一センサの同一平面空間に配置すると電極占有面積が大きくなり、センサ設計の自由度が低下する。
これに対して、本発明における濃度測定装置の構成では、酸化還元酵素を含む電極系と酸化酵素を含まない電極系の基準電極となる参照極が両電極共通となっており、測定時の電位制御は、任意時間で切り替わり両電極系は同時に電位制御されることがない。
さらに、信号の検出は電極反応を反映する電流変化の値を得ることから、電位切替で得られた検出信号の差分を求めれば目的とする基質濃度を反映する値が得られる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明によれば、電極占有面積を小さくすることができ、２つの電極系への電位制御を任意時間で切り替え同時に電位が印加されない。
その結果、２電極系間の相互干渉も生じることもなく、小型で安定した高精度な濃度測定装置を実現することができ、本発明を用いることの効果は非常に高い。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明の濃度測定装置を示す概略図である。
【図２】本発明の濃度測定装置における電気化学的計測手段及び電位制御手段を示す            図である。
【図３】本発明の濃度測定装置における測定結果を示す図である。
【図４】本発明の濃度測定装置における測定結果を示す図である。
【図５】本発明の濃度測定装置における測定結果を示す図である。
【図６】従来の濃度測定装置に使われる電気化学的計測手段を示す概略図である。
【符号の説明】
【００５２】
１    電気化学的計測手段
２    電位制御手段
３    信号検出手段
４    濃度算出手段
１０  第１の作用極
１１  第１の対極
２０  第２の作用極
２１  第２の対極
３０  参照極
１３  第１の増幅器
１４  第２の増幅器
１５  差動増幅器
１６  電流検出抵抗
１７  検出電位
１８  設定電位
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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