(57)【要約】【課題】ＶＥＧＦ受容体−１を細胞表面に発現し、ＶＥＧＦ受容体−１の活性化を適確かつ簡便に評価することが可能な細胞株、該細胞株を用いた前記ＶＥＧＦ受容体−１の機能制御物質の評価方法及びスクリーニング方法を提供する。【解決手段】ＶＥＧＦ受容体−１を細胞表面に発現し、かつ該ＶＥＧＦ受容体−１の活性化に応答した自己リン酸化能および細胞遊走能を有することを特徴とする培養血管内皮細胞株である。該細胞株に被験物質を添加し、該培養血管内皮細胞株のＶＥＧＦ受容体−１のリン酸化、及び該培養血管内皮細胞株の遊走のいずれかを検出する前記被験物質のＶＥＧＦ受容体−１の機能制御能の評価方法である。該評価方法を行う工程、及び該評価方法によりＶＥＧＦ受容体−１の機能促進能又は機能阻害能を有すると評価された前記被験物質を選択する工程、を含むことを特徴とするスクリーニング方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＥＧＦ受容体−１を細胞表面に発現し、かつ該ＶＥＧＦ受容体−１の活性化に応答した自己リン酸化能及び細胞遊走能を有することを特徴とする培養血管内皮細胞株。
【請求項２】
安定的な細胞増殖能を有する請求項１に記載の培養血管内皮細胞株。
【請求項３】
ＶＥＧＦ受容体−１を細胞表面に高発現する請求項１から２のいずれかに記載の培養血管内皮細胞株。
【請求項４】
ヒト良性血管腫に由来する請求項１から３のいずれかに記載の培養血管内皮細胞株。
【請求項５】
ＶＥＧＦ受容体−１をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターが導入された請求項１から４のいずれかに記載の培養血管内皮細胞株。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の培養血管内皮細胞株に被験物質を添加し、
該培養血管内皮細胞株の細胞表面に発現したＶＥＧＦ受容体−１の自己リン酸化、及び該培養血管内皮細胞株の遊走のいずれかを検出することにより、前記被験物質のＶＥＧＦ受容体−１の機能促進能を評価することを特徴とする評価方法。
【請求項７】
請求項１から５のいずれかに記載の培養血管内皮細胞株に、ＶＥＧＦ受容体−１の機能促進物質と被検物質とを添加し、
該培養血管内皮細胞株の細胞表面に発現したＶＥＧＦ受容体−１の自己リン酸化阻害、及び該培養血管内皮細胞株の遊走阻害のいずれかを検出することにより、前記被験物質のＶＥＧＦ受容体−１の機能阻害能を評価することを特徴とする評価方法。
【請求項８】
（Ａ）請求項６に記載の評価方法により、被験物質物質のＶＥＧＦ受容体−１の機能促進能を評価する工程、及び
（Ｂ）前記工程（Ａ）においてＶＥＧＦ受容体−１の機能促進能を有すると評価された前記被験物質を選択する工程、
を含むことを特徴とするＶＥＧＦ受容体−１の機能促進能を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項９】
（Ａ’）請求項７に記載の評価方法により、被験物質物質のＶＥＧＦ受容体−１の機能阻害能を評価する工程、及び
（Ｂ’）前記工程（Ａ’）においてＶＥＧＦ受容体−１の機能阻害能を有すると評価された前記被験物質を選択する工程、
を含むことを特徴とするＶＥＧＦ受容体−１の機能阻害能を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
（ａ）請求項８から９のいずれかに記載のスクリーニング方法を実施する工程、
（ｂ）前記工程（ａ）で同定された化合物を生成する工程、及び
（ｃ）前記工程（ｂ）で生成した化合物と、薬理学上許容される担体とを混合する工程
を含むことを特徴とする、ＶＥＧＦ受容体−１の機能を促進又は阻害する薬剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養血管内皮細胞株、並びにそれを用いた評価方法及びスクリーニング方法に関し、詳しくは、ＶＥＧＦ受容体−１を細胞表面に発現し、該ＶＥＧＦ受容体−１の活性化を適確かつ簡便に評価することが可能な細胞株、並びに該細胞株を用いたＶＥＧＦ受容体−１の機能促進能又は機能阻害能を有する物質の評価方法及びスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，血管内皮増殖因子）及びその受容体システムは、がんの増殖、転移、関節リウマチや乾癬などの炎症性疾患、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、動脈硬化症などのヒトの血管形成が関与する疾患の進展において、非常に重要な役割を持つことが近年の研究から明らかにされてきた(非特許文献１〜３参照)。
このため、ＶＥＧＦは、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞、閉塞性動脈硬化症などの虚血性疾患に対する血管再生医療における有用な血管新生用薬剤として期待されている。一方、ＶＥＧＦ拮抗阻害剤及びＶＥＧＦ受容体に対する阻害剤（アンタゴニスト）は、前記病的血管形成が関与する疾患の治療における有用な薬剤として期待されている。
【０００３】
ＶＥＧＦファミリーのなかでも、ＶＥＧＦ−Ａは血管構造と機能を決定するのに最も重要な役割を有する。該ＶＥＧＦ−Ａは、ＶＥＧＦ受容体−１（以下、「ＶＥＧＦＲ−１」又は「Ｆｌｔ−１」ということがある。非特許文献４及び５参照）、及びＶＥＧＦ受容体−２（以下、「ＶＥＧＦＲ−２」又は「ＫＤＲ」ということがある。非特許文献６参照）の２種類の受容体と結合してその作用を発揮する。
【０００４】
２種類のＶＥＧＦ受容体のうち、前記ＶＥＧＦ受容体−２は、病的血管新生に強く関わるが、炎症性疾患にはあまり強く関与しないのに対し、前記ＶＥＧＦ受容体−１は、病的血管新生には中等度に関与するが、炎症性疾患には強く関わるという特徴をもつことが知られている。
また前記ＶＥＧＦ受容体−１は、多くの血管内皮細胞や末梢血の単球及びマクロファージに細胞膜タンパク質として発現し、血管内皮細胞の生存や増殖に関与し、さらに単球やマクロファージの細胞遊走に関与することが知られている（非特許文献３参照）。
【０００５】
前記ＶＥＧＦ受容体−２は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）によく発現していることから、これを用いて解析することができ、さらに細胞内ドメインであるチロシンキナーゼドメインの活性が強いことから解析が容易である。
前記ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、前記ＶＥＧＦ受容体−２を相対的に強く発現しているため、ＶＥＧＦ受容体−１特異的な機能を観察するために用いることは困難である。
また、単球及びマクロファージは前記ＶＥＧＦ受容体−１の発現レベルが低いことに加え、用いる際には末梢血からその都度分離する必要があることなどから、前記ＶＥＧＦ受容体−１の解析への利用は困難である。
【０００６】
このように、前記ＶＥＧＦ受容体−１は、（１）その発現が一般的に低レベルであること、（２）細胞内ドメインであるチロシンキナーゼドメインの活性が前記ＶＥＧＦ受容体−２などと比べて弱いこと、及び（３）その生物学的活性やシグナル伝達を解析する適当な細胞や細胞株が存在しないこと、などの理由から解析が困難であった。
【０００７】
これに対し、前記ＶＥＧＦ受容体−１を発現する細胞株として、本発明者らは、ＶＥＧＦ受容体−１を発現させたＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞株（非特許文献７参照）を樹立した。しかしながら、該ＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞株は、導入したＶＥＧＦ受容体−１遺伝子を細胞内で発現させても、発現させたＶＥＧＦ受容体−１の多くが細胞内の顆粒に捕捉されてしまい、細胞表面にＶＥＧＦ受容体−１を高発現させることができなかった。また、何らの外的刺激なしに、内因性のＶＥＧＦによって細胞表面に発現させたＶＥＧＦ受容体−１が自己リン酸化してしまうため、これがＶＥＧＦ受容体−１の活性化の評価においてバックグラウンドとなってしまうという問題もあった。さらに、前記ＶＥＧＦ受容体−１とそのリガンドとの結合により誘起される細胞の遊走も認められないという問題もあった。
一方、前記ＶＥＧＦ受容体−１を発現する細胞株として、ＶＥＧＦ受容体−１を発現させたブタ動脈内皮細胞株も報告されている（非特許文献８参照）。この細胞株には、前記ＶＥＧＦ受容体−１を発現させたＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞株と比較して、内因性のＶＥＧＦの発現が少ないという利点が存在する。しかしながら、細胞表面に発現させたＶＥＧＦ受容体−１の自己リン酸化能が低く、さらには、前記ＶＥＧＦ受容体−１を発現させた発現ＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞株と同様に、ＶＥＧＦ受容体−１に依存した細胞遊走が認められないという問題がなお存在している。
このように、ＶＥＧＦ受容体−１を発現させた上記２つの細胞のいずれも、ＶＥＧＦ受容体−１を介したシグナル伝達の解析やＶＥＧＦ受容体−１の機能を評価する細胞としては、決して満足のいくものではなかった。
【０００８】
前記ＶＥＧＦ受容体−１の活性化を適確かつ簡便に評価することが可能な細胞株が得られれば、ＶＥＧＦ及び前記ＶＥＧＦ受容体−１の新たな生物学的機能の研究のみならず、上記種々の疾患に対する医薬として有用なＶＥＧＦ受容体−１の機能を制御する化合物の探索を効率的に行うことも可能となる。
しかしながら、いまだ、そのような細胞株が提供されていないのが現状である。
【０００９】
【非特許文献１】Ferrara, N. and Davis-Smith, T., EndocrineRev., 18:4 (1997)
【非特許文献２】Carmeliet, P. et al., Nature Medicine,7:575 (2001)
【非特許文献３】Shibuya, M. et al., Curr. Topics Microbiol.Immunol., 237:59 (1999)
【非特許文献４】Shibuya, M. et al., Oncogene, 5:519（1990）
【非特許文献５】DeVries, C. et al., Science, 255:989（1992）
【非特許文献６】Terman, B.I. et al., Bichem. Biophys. Res.Commun.,187:1579（1992）
【非特許文献７】Sawano, A. et al., Cell Growth Diff., 7:213(1996)
【非特許文献８】Waltenberger, J. et al., J. Biol. Chem.,269:26988 (1994)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は従来における前記問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、ＶＥＧＦ受容体−１の活性化を適確かつ簡便に評価することが可能な細胞株を提供することを目的とする。
より詳しくは、本発明は、前記ＶＥＧＦ受容体−１を細胞表面に発現し、かつ、発現したＶＥＧＦ受容体−１の活性化に応答した自己リン酸化能および細胞遊走能を示す細胞株、並びに、該細胞株を用いた、前記ＶＥＧＦ受容体−１の機能制御物質の評価方法およびスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、外科治療により切除されたヒト良性腫瘍の血管内皮様細胞から樹立した内皮様細胞株に対して、ＶＥＧＦ受容体−１遺伝子を導入して得た新規細胞株「AG1−G1−Flt-1細胞株」が、ＶＥＧＦ受容体−１を細胞表面に発現し、前記ＶＥＧＦ受容体−１の活性化に応答して、顕著に自己リン酸化と遊走反応を示すことを見出した。また、該細胞株が、安定的に増殖し、細胞内で発現させたＶＥＧＦ受容体―１が高率で細胞表面に移行し、しかも、内因性ＶＥＧＦが実質的に発現していないため、ＶＥＧＦ受容体―１の活性化を検出する際に自己リン酸化のバックグラウンドが少ないという、さらなる利点を有することをも見出した。そして、本発明者らは、このような「AG1−G1−Flt-1細胞株」の優れた特性から、該細胞株が、前記ＶＥＧＦ受容体−１の機能制御物質の評価やスクリーニングにおいて極めて有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明は、本発明者による前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  ＶＥＧＦ受容体−１を細胞表面に発現し、かつ該ＶＥＧＦ受容体−１の活性化に応答した自己リン酸化能および細胞遊走能を有することを特徴とする培養血管内皮細胞株である。
＜２＞  安定的な細胞増殖能を有する＜１＞に記載の培養血管内皮細胞株である。
＜３＞  ＶＥＧＦ受容体−１を細胞表面に高発現する前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の培養血管内皮細胞株である。
＜４＞  ヒト良性血管腫に由来する前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の培養血管内皮細胞株である。
＜５＞  ＶＥＧＦ受容体−１をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターが導入された前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の培養血管内皮細胞株である。
＜６＞  ＶＥＧＦ受容体−１をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１で表される前記＜５＞に記載の培養血管内皮細胞株である。
＜７＞  ＳＶ４０のラージＴ抗原をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターが導入された前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の培養血管内皮細胞株である。
＜８＞  AG1−G1−Flt-1細胞株（生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センター、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７８９）である前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の培養血管内皮細胞株である。
＜９＞  前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の培養血管内皮細胞株に被験物質を添加し、
該培養血管内皮細胞株の細胞表面に発現したＶＥＧＦ受容体−１の自己リン酸化、及び該培養血管内皮細胞株の遊走のいずれかを検出することにより、前記被験物質のＶＥＧＦ受容体−１の機能促進能を評価することを特徴とする評価方法である。
＜１０＞  前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の培養血管内皮細胞株に、ＶＥＧＦ受容体−１の機能促進物質と被検物質とを添加し、
該培養血管内皮細胞株の細胞表面に発現したＶＥＧＦ受容体−１の自己リン酸化阻害、及び該培養血管内皮細胞株の遊走阻害のいずれかを検出することにより、前記被験物質のＶＥＧＦ受容体−１の機能阻害能を評価することを特徴とする評価方法である。
＜１１＞  ＶＥＧＦ受容体−１の機能促進物質が、ＶＥＧＦ、ＰＩＧＦのいずれかである前記＜１０＞に記載の評価方法である。
＜１２＞  （Ａ）前記＜９＞に記載の評価方法により、被験物質物質のＶＥＧＦ受容体−１の機能促進能を評価する工程、及び
（Ｂ）前記工程（Ａ）においてＶＥＧＦ受容体−１の機能促進能を有すると評価された前記被験物質を選択する工程、
を含むことを特徴とするＶＥＧＦ受容体−１の機能促進能を有する物質のスクリーニング方法である。
＜１３＞  （Ａ’）前記＜１０＞から＜１１＞のいずれかに記載の評価方法により、被験物質物質のＶＥＧＦ受容体−１の機能阻害能を評価する工程、及び
（Ｂ’）前記工程（Ａ’）においてＶＥＧＦ受容体−１の機能阻害能を有すると評価された前記被験物質を選択する工程、
を含むことを特徴とするＶＥＧＦ受容体−１の機能阻害能を有する物質のスクリーニング方法である。
＜１４＞  （ａ）前記＜１２＞に記載のスクリーニング方法を実施する工程、
（ｂ）前記工程（ａ）で同定された化合物を生成する工程、及び
（ｃ）前記工程（ｂ）で生成した化合物と、薬理学上許容される担体とを混合する工程
を含むことを特徴とするＶＥＧＦ受容体−１の機能を促進する薬剤の製造方法である。
＜１５＞  薬剤が、血管新生促進用薬剤である前記＜１４＞に記載の薬剤の製造方法である。
＜１６＞  （ａ’）前記＜１３＞に記載のスクリーニング方法を実施する工程、
（ｂ’）前記工程（ａ’）で同定された化合物を生成する工程、及び
（ｃ’）前記工程（ｂ’）で生成した化合物と、薬理学上許容される担体とを混合する工程
を含むことを特徴とするＶＥＧＦ受容体−１の機能を阻害する薬剤の製造方法である。
＜１７＞  薬剤が、血管新生抑制用薬剤である前記＜１６＞に記載の薬剤の製造方法である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、ＶＥＧＦ受容体−１の活性化を適確かつ簡便に評価することが可能な細胞株が提供された。これにより、ＶＥＧＦ及び前記ＶＥＧＦ受容体−１の新たな生物学的機能の研究のみならず、上記種々の疾患に対する医薬として有用なＶＥＧＦ受容体−１の機能を制御する化合物の探索を効率的に行うことが可能となった。
本発明は、ＶＥＧＦ受容体−１の機能に関連した疾患のための薬剤（例えば、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞、閉塞性動脈硬化症などの虚血性疾患に対する血管再生医療における血管新生用薬剤や病的血管形成を抑制するための薬剤）の開発に大きく貢献するものと考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
［１］  培養血管内皮細胞株
本発明の培養血管内皮細胞株は、ＶＥＧＦ受容体−１（Ｆｌｔ−１）を細胞表面に発現し、かつＶＥＧＦ受容体−１の活性化に応答した自己リン酸化能及び細胞遊走能を有する細胞であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。その由来する細胞としては、ヒト由来の細胞であることが好ましく、例えば、ヒト良性血管腫に由来する細胞であることが好ましい。
ここで「自己リン酸化」とは、前記培養血管内皮細胞株の細胞表面に発現したＶＥＧＦ受容体−１が、その活性化に応答して自己をリン酸化する能力を意味する。
また、「細胞遊走能」とは、前記培養血管内皮細胞株がＶＥＧＦ受容体−１の機能促進物質に向かって運動する能力を意味する。
【００１５】
前記非特許文献８に記載された前記ＶＥＧＦ受容体−１を発現させたブタ動脈内皮細胞株は、細胞表面に発現させたＶＥＧＦ受容体−１の自己リン酸化能が低い。これに対し、本発明の培養血管内皮細胞株は、細胞表面に発現させたＶＥＧＦ受容体−１の高い自己リン酸化能を有する（実施例１の結果である図１参照のこと）。
また、前記ＶＥＧＦ受容体−１を発現させたブタ動脈内皮細胞株、及び前記ＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞株は、ともにＶＥＧＦ受容体−１の活性化に応答した細胞遊走能が認められないが、本発明の培養血管内皮細胞株は、ＶＥＧＦ受容体−１の活性化に応答した細胞遊走能が顕著に認められる。
従って、本発明の培養血管内皮細胞株は、ＶＥＧＦ受容体−１の活性化を検出し、評価する上で、極めて適した細胞である。
【００１６】
本発明の培養血管内皮細胞株は、その好ましい態様として、安定的な増殖能を有する細胞株である。ここで、「安定的な増殖能を有する」とは、３０世代以上の継代培養を行うことができること、すなわち、３０世代以上の継代培養の後にも増殖能を保持していることを意味する。本発明の培養血管内皮細胞株としては、５０世代以上（例えば、６０世代以上、７０世代以上、８０世代以上、９０世代以上、１００世代以上）の継代培養の後にも増殖能を保持していることがより好ましい。
【００１７】
なお、本発明の前記培養血管内皮細胞株を樹立するために用いられる「血管内皮細胞」としては、血管内皮細胞に特異的な分子マーカーの発現がみられ、かつ、ＶＥＧＦ受容体−１を細胞表面に発現させることにより、その活性化に応答した自己リン酸化能及び遊走能を検出可能な細胞株を作出することが可能である限り、リンパ管内皮細胞等の血管内皮細胞の類縁細胞（血管内皮様細胞）も含む。
前記血管内皮細胞に特異的な活性及び分子マーカーとしては、例えば、酸化ＬＤＬの取り込み活性、ＣＤ３１の発現、及びＶＥ−カドヘリンの発現などが挙げられる。
【００１８】
前記培養血管内皮細胞株は、他の好ましい態様として、ＶＥＧＦ受容体−１を細胞表面に高発現する細胞株である。ここで、「高発現」とは、１細胞あたり少なくとも７,０００分子（７,０００分子／細胞）発現していることを意味する。本発明の培養血管内皮細胞株としては、８,０００分子／細胞  以上（例えば、９，０００分子／細胞  以上、１０，０００分子／細胞  以上）であることがより好ましい。
前記ＶＥＧＦ受容体−１の細胞表面における発現量は、例えば、前記ＶＥＧＦ受容体−１に対する抗体を用いたウェスタンブロット法、及びＶＥＧＦ受容体−１特異的リガンドＰｌＧＦ結合活性の測定等の方法により検出することができる。
【００１９】
なお、ＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞株は、ＶＥＧＦ受容体−１遺伝子を細胞内で発現させても、発現させたＶＥＧＦ受容体−１の多くが細胞内の顆粒に捕捉されてしまい、細胞表面においてＶＥＧＦ受容体−１を高発現させることができない。これに対し、本発明の培養血管内皮細胞株は、その多くが細胞表面に移行するため（実施例１の結果である図１Ｂ参照のこと）、ＶＥＧＦ受容体−１の活性化を適確に評価することが可能である。
【００２０】
前記培養血管内皮細胞株は、さらに他の好ましい態様として、内因性のＶＥＧＦを実質的に発現しない（あるいは発現が低い）細胞株である。内因性のＶＥＧＦを発現すると、何らの人為的な外的刺激なしに、細胞表面に発現させたＶＥＧＦ受容体−１が自己リン酸化してしまうため、これが人為的な外的刺激による自己リン酸化の検出の際のバックグラウンドとなってしまう。実際、ＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞株は、内因性のＶＥＧＦの発現により、自己リン酸化能を適確に検出することが困難である。従って、ＶＥＧＦ受容体−１の活性化を適確に評価するためには、前記培養血管内皮細胞株のように、内因性のＶＥＧＦを実質的に発現しない（あるいは発現が低い）細胞株であることが好ましい。
【００２１】
前記培養血管内皮細胞株としては、例えば、ＶＥＧＦ受容体−１をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターが導入された形質転換体である培養血管内皮細胞株が挙げられる。
前記ＶＥＧＦ受容体−１をコードするヌクレオチド配列としては、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｘ５１６０２に登録された配列のうち、前記ＶＥＧＦ受容体−１のアミノ末端からカルボキシル末端を少なくとも含む配列であることが好ましい。具体的には、少なくとも配列番号１（２５０番目から４２６６番目の塩基）で表される配列を含むことが好ましく、配列番号２（１番目から４２６６番目の塩基）で表される配列がより好ましい。
【００２２】
前記ＶＥＧＦ受容体−１をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、例えば、該ＶＥＧＦ受容体−１をコードするヌクレオチド配列を、ヒト胎盤組織より作成したｃＤＮＡライブラリー(例えば、タカラバイオ社製、ＴａＫａＲａ  Ｃｏｄｅ  ９５１１)からの分子クローニング、及び同組織ＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ法による分子クローニングなどにより調製し、得られた配列を、ＣＭＶプロモーター付加発現ベクター、ｐＣｒｕｚ−ＴＭ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎベクター、ｐＢＣＭＧＳｎｅｏベクター等に公知の方法により挿入して調製することができる。
なお、該ＶＥＧＦ受容体−１をコードするヌクレオチド配列を調製するためのプライマーとしては、前記ＧｅｎＢａｎｋ  Ｘ５１６０２に登録された配列中、タンパク質をコードしない５’領域及び３’領域から適宜選択することができ、例えば、配列番号３（１番目から２０番目の塩基）、配列番号４（１１１番目から１３０番目の塩基）、配列番号５（４２８１番目から４３００番目の塩基）、及び配列番号６（４３０１番目から４３２０番目の塩基）で表される配列などが挙げられる。
【００２３】
前記ＶＥＧＦ受容体−１をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、培養血管内皮細胞株（例えば、ヒト良性血管腫に由来する細胞）に導入する方法としては、特に制限はなく、公知の方法から適宜選択することができ、例えば、リポソーム法、マイクロインジェクション法、電気パルス法、リン酸カルシウム法、及びポリブレン法などが挙げられる。
【００２４】
前記培養血管内皮細胞株の増殖能は、例えば、不死化遺伝子等の導入により付与されてもよく、前記不死化遺伝子としては、ＳＶ４０ラージＴ−抗原遺伝子、ｃ−ｍｙｃ遺伝子、パピローマウイルス由来Ｅ１Ａ遺伝子等が挙げられる。
具体的には、ＳＶ４０のラージＴ抗原をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターが導入されたことによって、高い増殖能が付与された前記培養血管内皮細胞株であることが好ましい。
【００２５】
前記ＳＶ４０のラージＴ抗原をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターの構築方法としては、特に制限はなく、公知の方法から適宜選択することができ、例えば、Kim, D.W. et al. Gene, 91, 217-223, 1990に記載のｐＥＦ３２１−Ｔベクターの調製方法などが挙げられる。
【００２６】
前記ＳＶ４０のラージＴ抗原をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、培養血管内皮細胞株（例えば、ヒト良性血管腫に由来する細胞）に導入する方法としては、特に制限はなく、公知の方法から適宜選択することができ、例えば、リポソーム法、マイクロインジェクション法、電気パルス法、リン酸カルシウム法、及びポリブレン法などが挙げられる。
【００２７】
前記培養血管内皮細胞株の培養液としては、例えば、１０％ウシ胎児血清（Fetal  Bovine  Serum：ＦＢＳ、JRH  Biosciences社製）、及び４０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＦ−１２  Nutrient  Mixture（Ham）（Invitrogen社製）培養液が好ましく、培養条件としては、例えば、５％ＣＯ２存在下、３７℃で行うことが好ましい。
【００２８】
本発明の培養血管内皮細胞株としては、例えば、AG1−G1−Flt-1細胞株（生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センター、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７８９）が好ましい。AG1−G1−Flt-1細胞株は、ヒト良性血管腫に由来する細胞に、ＶＥＧＦ受容体−１をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター、及びＳＶ４０のラージＴ抗原をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターが導入され、ＶＥＧＦ受容体−１を安定に発現し、３０世代の継代培養培養後にも増殖能を有し、かつ遊走能を有する培養血管内皮細胞株である。
【００２９】
本発明の培養血管内皮細胞株は、ＶＥＧＦ受容体−１の活性化を適確かつ簡便に評価することが可能であるため、ＶＥＧＦ受容体−１の機能制御物質、具体的には、前記ＶＥＧＦ受容体−１に対するリガンド（アゴニスト及びアンタゴニスト）、並びにＶＥＧＦ受容体−１を介するシグナル伝達を促進する物質、及びＶＥＧＦ受容体−１を介するシグナル伝達を阻害する物質の評価およびスクリーニングに好適である。
ＶＥＧＦ受容体−１の機能制御物質の評価およびスクリーニングは、下記の通り行うことができる。
【００３０】
[２]  評価方法
本発明の被験物質によるＶＥＧＦ受容体−１の機能制御能を評価する方法には、(1)前記被験物質の前記ＶＥＧＦ受容体−１の機能促進能を評価する方法、及び(2)前記被験物質の前記ＶＥＧＦ受容体−１の機能阻害能を評価する方法が含まれる。
前記被験物質の前記ＶＥＧＦ受容体−１の機能促進能を評価する方法は、前記培養血管内皮細胞株に前記被験物質を添加し、該培養血管内皮細胞株のＶＥＧＦ受容体−１の自己リン酸化、及び該培養血管内皮細胞株の遊走のいずれかを検出することにより行われる。
【００３１】
本方法においては、前記培養血管内皮細胞株に対して、低濃度のＶＥＧＦ受容体−１の機能促進物質と共に、前記被験物質を添加し、前記被験物質が、前記機能促進物質による前記ＶＥＧＦ受容体−１の機能促進能を、さらに高めるか否かを評価してもよい。
一方、前記被験物質の前記ＶＥＧＦ受容体−１の機能阻害能を評価する方法は、前記培養血管内皮細胞株にＶＥＧＦ受容体−１の機能促進物質と被検物質とを添加し、該培養血管内皮細胞株のＶＥＧＦ受容体−１の自己リン酸化阻害、及び該培養血管内皮細胞株の遊走阻害のいずれかを検出することにより行われる。
【００３２】
ここで「ＶＥＧＦ受容体−１の機能」とは、その活性化により、自己リン酸化し、細胞内シグナル伝達を通じて、細胞の遊走を生じさせる機能を意味する。
【００３３】
前記「被験物質」としては特に制限はなく、ＶＥＧＦ受容体−１の機能制御能を評価したい所望の物質、例えば、低分子化合物、タンパク質、ペプチド、核酸、糖質、脂質、細胞抽出液、細胞培養上清などを用いることができる。
【００３４】
また、前記「ＶＥＧＦ受容体−１の機能促進物質」としては、ＶＥＧＦ受容体−１を活性化しうるものであれば特に制限はないが、例えば、前記ＶＥＧＦ受容体−１に対する公知のアゴニスト（ＶＥＧＦ、ＰＩＧＦ等）を好適に用いることができる。
【００３５】
本発明の培養血管内皮細胞株は、ＶＥＧＦ受容体−１の活性化に応答した優れたＶＥＧＦ受容体−１の自己リン酸化能および遊走能を有することから、以下に示す通り、これらを指標にＶＥＧＦ受容体−１の機能制御能を評価することができる。
【００３６】
（１）ＶＥＧＦ受容体−１の自己リン酸化による評価
前記ＶＥＧＦ受容体−１の自己リン酸化による評価方法としては、前記培養血管内皮細胞株に被験物質を添加して、前記培養血管内皮細胞株における前記ＶＥＧＦ受容体−１の自己リン酸化を検出可能な方法であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、抗リン酸化抗体を用いたＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法、及び免疫蛍光顕微鏡検査法等が挙げられる。
【００３７】
前記抗リン酸化抗体としては、前記ＶＥＧＦ受容体−１の自己リン酸化状態を検出可能な抗体であれば、特に制限なく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＰＹ２０抗リン酸化抗体(ICN  Biochemicals（Costa  Mesa,CA）製)、４Ｇ１０抗リン酸化抗体などが挙げられる。
前記抗リン酸化抗体は、標識されていてもよく、また該抗リン酸化抗体に対する標識された２次抗体とともに用いてもよい。標識を検出することにより、前記ＶＥＧＦ受容体−１の自己リン酸化の状態を目視で明確に評価することができる。
【００３８】
前記被験物質の添加により、前記ＶＥＧＦ受容体−１の自己リン酸化が検出されたとき、前記被験物質は、ＶＥＧＦ受容体−１の機能促進物質であると評価することができる。
また、前記ＶＥＧＦ受容体−１の自己リン酸化による評価方法において、前記ＶＥＧＦ受容体−１の機能促進物質と被検物質とを添加し、自己リン酸化がみられないとき、前記被験物質は、ＶＥＧＦ受容体−１の機能阻害物質であると評価することができる。
【００３９】
（２）培養血管内皮細胞株の遊走反応による評価
前記培養血管内皮細胞株の遊走反応による評価方法としては、前記培養血管内皮細胞株に被検物質を添加して、前記培養血管内皮細胞株の遊走反応を検出可能な方法であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
ここで、遊走反応とは、前記培養血管内皮細胞株がＶＥＧＦ受容体−１の機能促進物質に向かって運動する反応をいう。
【００４０】
前記培養血管内皮細胞株の遊走反応を検出する方法としては、例えば、フィルターを介した一対のチャンバーからなる装置を用い、一方のチャンバーに単独で又はＶＥＧＦやＰｌＧＦと共に被検物質を添加し、他方のチャンバーからフィルターを通過し、遊走して移動したことにより増減した前記培養血管内皮細胞の数を測定する方法や、単独で又はＶＥＧＦやＰｌＧＦと共に被検物質の濃度勾配を作成し、高濃度領域へ向かって遊走して移動した前記培養血管内皮細胞の数を測定する方法などが挙げられる。
前記培養血管内皮細胞株の遊走反応を検出する装置としては、適宜作製したものであってもよく、市販品であってもよい。市販品としては、例えば、BD  BioCoat  Angiogenesis  System-Endothelial  Cell  Migration  ２４ウェルプレート（BD  Biosciences社製）等が好適に挙げられる。
【００４１】
前記被験物質の添加により、前記培養血管内皮細胞株の遊走反応が検出されたとき、前記被験物質は、ＶＥＧＦ受容体−１の機能促進物質であると評価することができる。
また、前記培養血管内皮細胞株の遊走反応の評価において、前記ＶＥＧＦ受容体−１の機能促進物質と被検物質とを添加し、遊走反応がみられないとき、前記被験物質は、ＶＥＧＦ受容体−１の機能阻害物質であると評価することができる。
【００４２】
前記遊走反応による評価としては、例えば、フィルターを介した一対のチャンバーからなる装置を用いた場合において、被検物質を添加したチャンバーに対し、遊走により流入してきた細胞数が、測定開始から１２〜２４時間後において、被検物質を添加していない場合に比べて統計的に有意な増加を示すとき、例えば被検物質を添加していない場合に比べて１．５倍以上であるとき、前記被検物質がアゴニストであると特定する方法が挙げられる。
前記チャンバー内の細胞数は、細胞を蛍光標識し、蛍光プレートリーダー等を用いて測定した蛍光強度によっても評価することができる。
前記遊走反応の測定条件としては、３７℃、５％ＣＯ２存在下であることが好ましい。
【００４３】
[３]  スクリーニング方法
本発明のＶＥＧＦ受容体−１の機能制御物質のスクリーニング方法には、(1)前記ＶＥＧＦ受容体−１の機能促進能を有する物質のスクリーニング方法、及び(2)前記ＶＥＧＦ受容体−１の機能阻害能を有する物質のスクリーニング方法が含まれる。
前記スクリーニング方法は、本発明の培養血管内皮細胞株を用い、複数の被験物質につき、前記評価方法で示したＶＥＧＦ受容体−１の機能制御能を評価し、被験物質の中から、ＶＥＧＦ受容体−１の機能制御能を有する物質を選択する工程を含む。更に必要に応じて適宜選択されたその他の工程を含んでもよい。 
【００４４】
前記ＶＥＧＦ受容体−１の機能促進能を有する物質のスクリーニング方法は、（Ａ）前記被験物質物質のＶＥＧＦ受容体−１の機能促進能を評価する工程、及び（Ｂ）前記工程（Ａ）においてＶＥＧＦ受容体−１の機能促進能を有すると評価された前記被験物質を選択する工程を含み、更に必要に応じて適宜選択されたその他の工程を含む。
【００４５】
一方、前記ＶＥＧＦ受容体−１の機能阻害能を有する物質のスクリーニング方法は、（Ａ’）前記被験物質物質のＶＥＧＦ受容体−１の機能阻害能を評価する工程、及び（Ｂ’）前記工程（Ａ’）においてＶＥＧＦ受容体−１の機能阻害能を有すると評価された前記被験物質を選択する工程を含み、更に必要に応じて適宜選択されたその他の工程を含む。
【００４６】
前記ＶＥＧＦ受容体−１の機能促進能を有する物質のスクリーニング方法により同定された、前記ＶＥＧＦ受容体−１の機能促進能を有する物質には、前記ＶＥＧＦ受容体−１のアゴニスト、及びＶＥＧＦ受容体−１を介するシグナル伝達を促進する物質が含まれる。これら物質は、例えば、血管新生を促進する活性を持つことが考えられるため、例えば、虚血性疾患の治療剤、創傷の治療剤、腎不全などの組織機能不全症の治療剤、及びアルツハイマーなどの神経疾患の治療剤等として利用することができる。
【００４７】
また、前記ＶＥＧＦ受容体−１の機能阻害能を有する物質のスクリーニング方法により同定された、前記ＶＥＧＦ受容体−１の機能阻害能を有する物質には、前記ＶＥＧＦ受容体−１のアンタゴニスト、及びＶＥＧＦ受容体−１を介するシグナル伝達を阻害する物質が含まれる。これら物質は、例えば、病的血管新生を抑制する活性を持つことが考えられるため、、例えば、関節リウマチによる関節炎、乾癬、自己免疫疾患等の炎症性疾患の治療剤、並びにがんの増殖や転移（特に肺特異的転移）を抑制するがん治療剤、動脈硬化症の予防剤・治療剤等として利用することができる。
【００４８】
[４]  薬剤の製造方法
本発明のＶＥＧＦ受容体−１の機能を促進又は阻害する薬剤の製造方法は、前記ＶＥＧＦ受容体−１の機能制御物質のスクリーニング方法を実施する工程、該スクリーニング方法により同定された化合物を生成する工程、及び生成した化合物と薬理学上許容される担体とを混合する工程を含み、更に、必要に応じて適宜選択されたその他の工程を含む。
【００４９】
前記薬剤の製造方法が（ａ）ＶＥＧＦ受容体−１の機能促進能を有する物質のスクリーニング方法を実施する工程、（ｂ）前記工程（ａ）で同定された化合物を生成する工程、及び（ｃ）前記工程（ｂ）で生成した化合物と、薬理学上許容される担体とを混合する工程からなる場合、製造された薬剤は、例えば、血管新生促進用薬剤として好適に用いることができる。
一方、前記薬剤の製造方法が、（ａ）ＶＥＧＦ受容体−１の機能阻害能を有する物質のスクリーニング方法を実施する工程、（ｂ）前記工程（ａ）で同定された化合物を生成する工程、及び（ｃ）前記工程（ｂ）で生成した化合物と、薬理学上許容される担体とを混合する工程からなる場合、製造された薬剤は、例えば、血管新生抑制用薬剤や炎症性疾患治療用薬剤として好適に用いることができる。
【００５０】
前記本発明のスクリーニング方法により同定された化合物は、その構造や由来などに応じて、化学合成や精製などの手法により、適宜、生成することができる。
前記生成した化合物と混合する薬学的に許容される担体としては、特に制限はなく、例えば、生成した化合物を各種の剤型として用いる場合に、その剤型に応じて適宜選択することができる。
【００５１】
前記剤型としては、特に制限はなく、投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）及び吸入散剤などが挙げられる。
【００５２】
前記経口固形剤としては、例えば、有効成分たる化合物に賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
【００５３】
前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。
前記添加剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられ、前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられ、前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられ、前記着色剤としては、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられ、前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
【００５４】
前記経口液剤としては、例えば、有効成分たる化合物に、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
【００５５】
ここで、前記添加剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられ、緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられ、安定剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。
【００５６】
前記注射剤としては、例えば、有効成分たる化合物に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤などを添加し、常法により皮下、筋肉内及び静脈内用注射剤を製造することができる。
【００５７】
ここで、前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
また、前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
【００５８】
本発明の薬剤の製造方法により製造された前記薬剤は、上記の通り、剤型に応じて経口又は非経口で投与することができ、その投与量は、医師により、疾患の種類、患者の年齢、体重、症状、遺伝的背景等を考慮して、適宜決定される。
【実施例】
【００５９】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこの実施例に何ら限定されるものではない。なお、細胞の培養はすべて３７℃、５％ＣＯ２存在下にて行った。
【００６０】
（実施例１）
前記培養血管内皮細胞株として、下記の方法により作製した培養血管内皮細胞であるAG1−G1−Flt-1細胞株を用い、被検物質としてＶＥＧＦ−Ａ、及びＳＵ５４１６（ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤）を添加して、ＶＥＧＦ受容体−１のリン酸化を評価した。
【００６１】
（Ｉ）AG1−G1−Flt-1細胞株の作製
（１）ＡＧ１−Ｇ１細胞株の樹立
ヒト成人から外科手術により切除された良性血管腫組織を細切し、コラゲナーゼ処理して単一細胞（以下、「良性血管腫細胞」という）とした。
前記良性血管腫細胞に、ＳＶ４０のラージＴ抗原発現ベクタープラスミドＤＮＡをリン酸カルシウム法により導入した。前記ＳＶ４０のラージＴ抗原発現ベクタープラスミドＤＮＡは、Kim, D.W. et al. Gene, 91, 217-223, 1990に記載のｐＥＦ３２１−Ｔベクターと同様にして調製した。
前記良性血管腫細胞のうち、２４〜４８時間の間で細胞数の倍加がみられた増殖能が高い細胞株を採取し、これを「ＡＧ１細胞株」と名付けた。さらに、前記ＡＧ１細胞株のなかから単一細胞クローンを検索し、３０世代以上の継代培養を行った後も増殖能を保持している安定した増殖能を有する細胞株クローン「ＡＧ１−Ｇ１細胞株」を樹立した。
【００６２】
（２）AG1−G1−Flt-1細胞株の樹立
前記ＡＧ１−Ｇ１細胞株は、１０％ウシ胎児血清（Fetal  Bovine  Serum、ＦＢＳ）（JRH  Biosciences社製）、及び４０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＦ−１２  Nutrient  Mixture（Ham）（Invitrogen社製）培養液中で２４〜４８時間培養し、その後、下記の方法により調製したＶＥＧＦ受容体−１発現用プラスミドベクターｐＢＣＭＧＳ−Ｎｅｏ−Ｆｌｔ-１と、ｐＢＣＭＧＳ−ＮｅｏプラスミドベクターＤＮＡを、EffecteneＴＭ  Transfection  Reagent（QIAGEN社製）を用いてそれぞれトランスフェクションした形質転換細胞を得た。
【００６３】
＜ｐＢＣＭＧＳ−Ｎｅｏ−Ｆｌｔ−１の調製＞
ヒトＦｌｔ−１ｃＤＮＡ（配列番号２）を、ｐＢＣＭＧＳ−Ｎｅｏプラスミドベクター（Karasuyama,H.et  al.J.Exp.Med.,172,969-972,1990）の制限酵素ＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ部位に、Seetharam,L.et  al.Oncogene,10,135-147,1995に記載の方法と同様にしてＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。
【００６４】
＜ｐＢＣＭＧＳ−Ｎｅｏの調製＞
前記ｐＢＣＭＧＳ−Ｎｅｏプラスミドベクターを、Karasuyama, H. et al. J. Exp. Med., 172, 969-972,(1990)に記載の方法と同様にして調製した。
【００６５】
次いで２００μｇ／ｍＬ  Geneticin  G418を含む前記Ｆ−１２  Nutrient  Mixture培養液にて培養し、薬剤耐性クローンを選択した。ｐＢＣＭＧＳ−Ｎｅｏプラスミドベクターを導入して得た細胞を、「AG1−G1−Neo細胞株」とした。
ｐＢＣＭＧＳ−Ｎｅｏ−Ｆｌｔ-１を導入して得た形質転換細胞から、ＶＥＧＦ受容体−１（Ｆｌｔ−１）の細胞表面における発現が高い細胞株を以下に説明するウェスタンブロット法によりスクリーニングし、ＶＥＧＦ受容体−１高発現細胞株を単離し、これを「AG1−G1−Flt-1細胞株」とした。
なお、ここで、「ＶＥＧＦ受容体−１高発現細胞株」とは、ウェスタンブロット法により観察されるＦｌｔ−１バンドの濃淡を同条件で評価した場合、細胞１個あたり約７，０００分子のＦｌｔ−１を細胞表面に発現するＮＩＨ３Ｔ３−Ｆｌｔ−１細胞株よりも、細胞表面に発現するＦｌｔ−１バンドが濃く観察される細胞株をいう。
【００６６】
＜ウェスタンブロット法＞
前記薬剤耐性クローンを、HNTG緩衝液（50mM  HEPES、150mM  NaCl、1%  Triton  X-100、10%  glycerol）、1.5mM  MgCl2、1mM  EGTA、1mM  PMSF、1mg/ml  aprotiinin  and  leupeptin、50mM  sodium  fluoride、10mM  sodium  pyrophosphate、5mM  EDTA、及び2mM  sodium  orthovanadateを含む溶液に溶解して、細胞溶解液を得た。
得られた細胞溶解液をSosium  Dodecyl  Sulfate（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Polyacrylamide  Gel  Electrophoresis、ＰＡＧＥ）で分離し、Polyvinylidene  Fluoride（ＰＶＤＦ）膜にトランスファーした。このＰＶＤＦ膜を２％Bovine  Serum  Albumin（ＢＳＡ）（生化学工業社製）を含むＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ）でブロッキングを行い、該ＰＢＳＴで洗浄した後、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで希釈した抗Ｆｌｔ−１ウサギ抗体（１次抗体）と反応させた。
一次抗体と反応させた後、ＰＢＳＴで洗浄し、Horseradish  Peroxidase（ＨＲＰ）標識した抗マウス（Amersham  Biosciences）二次抗体を０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳＴで希釈して添加し、室温で１時間反応させた。
その後、ＰＢＳＴで洗浄し、ＥＣＬ  Western  blotting  detection  reagents（Amersham  Biosciences社製）の化学発光検出試薬を使用して二次抗体を発光させ、FUJI  MEDICAL  X-RAY  FILM（富士写真フイルム社製）に感光させ、ＶＥＧＦ受容体−１の検出を行った。
なお、前記二次抗体は、抗ウサギ抗体であってもよく、また前記化学発光検出試薬としては、Western  Blotting  Luminol  Reagent（Santa  Cruz  Biotechnology社製）、及びWestern  LightingＴＭ  Chemiluminescence  Reagenct  Plus（PerkinElmer  Life  Science社製）等のその他の市販品を用いることもできる。
【００６７】
（II）自己リン酸化の評価
前記AG1−G1−Flt-1細胞株、及び比較対象としてＶＥＧＦ受容体−１発現ベクターを導入していないAG1−G1−Neo細胞株に対し、被検物質としてＶＥＧＦ−Ａ、及びＳＵ５４１６（ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤）を添加し、ＶＥＧＦ受容体−１のリン酸化検出のために抗リン酸化チロシンモノクローナル抗体を用いた以外は前記AG1−G1−Flt-1細胞株のスクリーニングと同様にしてウェスタンブロット法によりＶＥＧＦ受容体−１の自己リン酸化を評価した。
結果を図１Ａに示す。
【００６８】
前記ＶＥＧＦ受容体−１のリン酸化の検出には、前記抗リン酸化チロシンモノクローナル抗体（ＰＹ２０、BD  Bioscience社製）を使用した。
なお、ＶＥＧＦ受容体−１（Ｆｌｔ−１）の検出には、Ｆｌｔ−１のアミノ末端を認識する抗ヒトＦｌｔ−１（＃２）ポリクローナル抗体（Ｆｌｔ−１アミノ末端領域に対するウサギ抗体）を使用し、コントロールとしてのＰＬＣγの検出には、抗ＰＬＣ-γ1（１２４９）ポリクローナル抗体(Santa  Cruz  Biotechnology社製)を使用した。
【００６９】
図１Ａの結果から、本発明の培養血管内皮細胞株であるAG1−G1−Flt-1細胞株は、ＶＥＧＦ受容体−１（Ｆｌｔ−１）を細胞表面に高発現しているため、自己リン酸化の有無を検出可能な細胞株として、スクリーニングに有用であることがわかった。
【００７０】
（III）細胞表面における発現の評価
前記前記AG1−G1−Flt-1細胞株、及び比較対象としてＶＥＧＦ受容体−１発現ベクターを導入していないAG1−G1−Neo細胞株、及びＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞株について、細胞内に存在するＶＥＧＦ受容体−１（Ｆｌｔ−１）タンパク量と、細胞表面に発現したＶＥＧＦ受容体−１（Ｆｌｔ−１）タンパク量とを、ウェスタンブロット法により比較した。結果を図１Ｂに示す。
【００７１】
図１Ｂの結果から、本発明の培養血管内皮細胞株であるAG1−G1−Flt-1細胞株は、ＶＥＧＦ受容体−１遺伝子を細胞内で発現させても、発現させたＶＥＧＦ受容体−１の多くが細胞内の顆粒に捕捉されてしまうＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞株とは異なり、発現させたＶＥＧＦ受容体−１が細胞表面に移行されていることがわかった。
【００７２】
（実施例２）
実施例１で作製したAG1−G1−Flt-1細胞株、及び比較対象としてAG1-G1-Neo細胞株を用い、下記の方法により細胞遊走反応を評価した。
【００７３】
＜細胞遊走（Cell  Migration）アッセイ＞
前記AG1−G1−Neo細胞株、及び前記AG1−G1−Flt-1細胞株の細胞遊走アッセイにはBD  BioCoat  Angiogenesis  System-Endothelial  Cell  Migration  ２４ウェルプレート（BD  Biosciences社製）を使用した。
１０％の血清を含む培養液で細胞を懸濁し、０．２５ｍＬの細胞懸濁液をトップチャンバーへ入れ、ボトムチャンバーには被検物質としてＶＥＧＦを１００ｎｇ／ｍＬ含んだ１０％血清を含むＦ１２培養液０．７５ｍＬを注ぎ入れた。
その後３７℃、５％ＣＯ２存在下で２１〜２３時間インキュベートした。インキュベート後はボトムチャンバーのＶＥＧＦを含んだ培養液を取り除き、N,N’-[[3’,6’-bis(acetyloxy)3-oxospiro[isobenzofuran-1(3H),9’-[9H]xanthene]-4’,5’-diyl]bis(methyllene)]bis[N-[2-[(acetyloxy)methyloxy]-2-oxoethyl]-,bis[(acetyloxy)methyll]ester（Calcein、AM）（Molexular  Probes）を４μg／ｍＬの濃度で含むHank’s  Balanced  Salt  Solution（HBSS）をボトムチャンバーに注ぎ入れ、３７℃、５％ＣＯ２下で９０分間インキュベートし、蛍光顕微鏡で遊走した細胞を観察し、分析した。
遊走した細胞の定量は１ウェルあたりランダムに５視野を抽出し強拡大(ｘ４０)で鏡検した後、細胞数のカウント或いはイメージ分析ソフトAdobe  Photoshop（登録商標）により行った。
蛍光顕微鏡により視野内の細胞を観察した結果を図２Ａに、解析結果を図２Ｂに示す。
【００７４】
（実施例３）
実施例１で作製したAG1−G1−Flt-1細胞株について、被検物質としてのＶＥＧＦの濃度を５０ｎｇ／ｍＬ、及び１００ｎｇ／ｍＬとしてボトムチャンバーに添加した以外は実施例２と同様にして細胞遊走反応を評価した。
蛍光顕微鏡により視野内の細胞を観察した結果を図３Ａに、解析結果を図３Ｂに示す。
【００７５】
図２Ａ、図２Ｂ、図３Ａ、及び図３Ｂの結果から、アゴニストを含むボトムチャンバーの細胞数は、アゴニストを添加していない場合に比べ２倍以上であり、前記AG1−G1−Flt-1細胞がアゴニストを含むチャンバーへ遊走したことが示された。このことから、本発明の培養血管内皮細胞株であるAG1−G1−Flt-1細胞株は、ＶＥＧＦ受容体−１の公知のアゴニストであるＶＥＧＦによって細胞遊走能を示すことが明らかになり、ＶＥＧＦ受容体−１のアゴニストのスクリーニングに有用であることがわかった。
【００７６】
（実施例４）
実施例１で作製したAG1−G1−Flt-1細胞株、及び比較対象としてAG1-G1-Neo細胞株を用い、被検物質としてＶＥＧＦ受容体−１のリガンドであるＰＩＧＦを１００ｎｇ／ｍＬボトムチャンバーに添加した以外は実施例２と同様にして細胞遊走反応を評価した。
蛍光顕微鏡により視野内の細胞を観察した結果を図４Ａに、解析結果を図４Ｂに示す。
【００７７】
図４Ａ、及び図４Ｂの結果から、本発明の培養血管内皮細胞株であるAG1−G1−Flt-1細胞株は、ＶＥＧＦ受容体−１の公知のアゴニストであるＰＩＧＦによっても細胞遊走能を示すことが明らかになり、ＶＥＧＦ受容体−１のアゴニストのスクリーニングに有用であることがわかった。
【００７８】
（実施例５）
実施例１で作製したAG1−G1−Flt-1細胞株を用い、（１）被検物質としてＶＥＧＦ１００ｎｇ／ｍＬ、（２）ＶＥＧＦ１００ｎｇ／ｍＬ及び０．５％ＤＭＳＯ、（３）ＶＥＧＦ１００ｎｇ／ｍＬ及び５μＭ  ＳＵ５４１６を、それぞれボトムチャンバーに添加した以外は実施例２と同様にして細胞遊走反応を評価した。解析結果を図５に示す。
なお、ＳＵ５４１６は、ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤（Mendel, D.B. et al., Anticancer Drug Des., 15, 29-41,(2000)）である。
【００７９】
図５の結果から、本発明の培養血管内皮細胞株であるAG1−G1−Flt-1細胞株の遊走反応は、ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤ＳＵ５４１６の添加により抑制されることがわかった。このことから、ＶＥＧＦ受容体−１のアンタゴニストのスクリーニングにも有用であることがわかった。また、溶媒として使用されるＤＭＳＯによって遊走反応は影響を受けないことがわかった。
【００８０】
（参考例）
実施例１で作製したAG1−G1−Flt-1細胞株、及び比較対象としてAG1-G1-Neo細胞株を用い、被検物質としてＶＥＧＦ受容体−１のアゴニストによる増殖反応を下記の方法により評価した。
【００８１】
＜増殖アッセイ＞
前記AG1−G1−Neo細胞株及び前記AG1−G1−Flt-1細胞株それぞれについて、コラーゲンＩコートされた96ウェルプレート（住友ベークライト）に播き、培養液を約６時間後に100ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦを含む１０％血清含有Ｆ１２培養液に置換し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて２４時間、及び７２時間の条件でそれぞれ培養を行った。
細胞数はCellTiter  96（登録商標）  Aqueous  One  Solution  Cell  Proliferation  Assay（Promega社製）を用い、吸光度を測定することにより評価した。ＶＥＧＦによる増殖アッセイの結果を図６Ａ及び図６Ｂに、ＰｌＧＦによる増殖アッセイの結果を図７Ａ及び図７Ｂにそれぞれ示す。
【００８２】
図６Ａ及びＢ、並びに図７Ａ及びＢの結果から、本発明の培養血管内皮細胞株は、増殖能を有するが、ＶＥＧＦ受容体−１のアゴニストの刺激に依存した増殖はみられないことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明の培養血管内皮細胞株は、ＶＥＧＦ受容体−１（Ｆｌｔ−１）を細胞表面に発現し、かつ該ＶＥＧＦ受容体−１の活性化に応答した自己リン酸化能および細胞遊走能を有する細胞であるため、前記ＶＥＧＦ受容体−１の機能制御物質、具体的には、前記ＶＥＧＦ受容体−１に対するリガンド（アゴニスト及びアンタゴニスト）、並びにＶＥＧＦ受容体−１を介するシグナル伝達を促進する物質、及びＶＥＧＦ受容体−１を介するシグナル伝達を阻害する物質の評価方法及びスクリーニング方法に好適である。
本方法により同定される前記ＶＥＧＦ受容体−１の機能制御物質は、前記ＶＥＧＦ受容体−１が関与することが明らかにされている疾患、具体的には、がん転移、炎症性疾患、虚血性疾患等に対する治療剤や予防剤等として好適である。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１Ａ】図１Ａは、実施例１において、AG1−G1−Flt-1細胞株、及びAG1−G1−Neo細胞に対し、ＶＥＧＦ−Ａを添加したとき（図中、「ＶＥＧＦ」）、ＳＵ５４１６を添加したとき（図中、「ＳＵ５４１６」）、及び無添加（図中、「（−）」）について、それぞれＶＥＧＦ受容体−１のリン酸化（図中、「Ｐ−Ｆｌｔ１」）、及びＶＥＧＦ受容体−１タンパクの発現（図中、「Ｆｌｔ−１」）をウェスタンブロット法により評価した結果の写真である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、実施例１において、AG1−G1−Flt-1細胞株、及びAG1−G1−Neo細胞、及びNIH3T3-Flt-1細胞株について、それぞれＶＥＧＦ受容体−１タンパクの発現量（図中、「Ｆｌｔ-１」）をウェスタンブロット法により評価した結果の写真である。AG1−G1−Flt-1細胞株のFlt-1タンパク発現量（図中、「Ｆｌｔ-１」）は、細胞１個あたり約7,000分子のFlt-1を発現するNIH3T3-Flt-1細胞株よりも明らかに高い。図中、「（細胞内Flt-1）」のバンドは、細胞内に存在するFlt-1タンパクを示す。細胞内Flt-1タンパクは受容体としての機能をもたない。
【図２Ａ】図２Ａは、実施例２において、AG1−G1−Flt-1細胞株、及びAG1−G1−Neo細胞に対し、ＶＥＧＦ−Ａを添加したときの細胞遊走反応を蛍光顕微鏡にて観察した結果を示す写真である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、実施例２において、AG1−G1−Flt-1細胞株、及びAG1−G1−Neo細胞に対し、ＶＥＧＦ−Ａを添加したときの細胞遊走反応を、蛍光量の測定により解析した結果を示すグラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、実施例３において、AG1−G1−Flt-1細胞株に対し、ＶＥＧＦ−Ａを異なる濃度（無添加、５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ）で添加したときの細胞遊走反応を蛍光顕微鏡にて観察した結果を示す写真である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、実施例３において、AG1−G1−Flt-1細胞株に対し、ＶＥＧＦ−Ａを異なる濃度で添加したときの細胞遊走反応を、遊走した細胞数の測定により解析した結果を示すグラフである。
【図４Ａ】図４Ａは、実施例４において、AG1−G1−Flt-1細胞株、及びAG1−G1−Neo細胞に対し、ＰＩＧＦを添加したときの細胞遊走反応を蛍光顕微鏡にて観察した結果を示す写真である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、実施例４において、AG1−G1−Flt-1細胞株、及びAG1−G1−Neo細胞に対し、ＰＩＧＦを添加したときの細胞遊走反応解析した結果を示すグラフである。
【図５】図５は、実施例５において、AG1−G1−Flt-1細胞株に対し、ＶＥＧＦ単独、ＶＥＧＦ及びＤＭＳＯの組合せ、ＶＥＧＦ及びＳＵ５４１６の組合せによる細胞遊走反応を解析した結果を示すグラフである。
【図６Ａ】図６Ａは、参考例においてAG1−G1−Flt-1細胞株のＶＥＧＦによる２４時間後の細胞増殖を調べた結果を示すグラフである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、参考例においてAG1−G1−Flt-1細胞株のＶＥＧＦによる７２時間後の細胞増殖を調べた結果を示すグラフである。
【図７Ａ】図７Ａは、参考例においてAG1−G1−Flt-1細胞株のＰＩＧＦによる２４時間後の細胞増殖を調べた結果を示すグラフである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、参考例においてAG1−G1−Flt-1細胞株のＰＩＧＦによる７２時間後の細胞増殖を調べた結果を示すグラフである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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