(57)【要約】      （修正有）【課題】グルコースなどの還元糖とタンパク質との間の非酵素的糖化反応であるメイラード反応の後期段階で生成される化合物である終末糖化産物アドヴァンスド  グリケーション  エンド  プロダクツ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  Ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ：以下ＡＧＥと略す。）を特異的に結合する分子認識ポリマーならびにそれを用いた固相抽出方法、固相抽出キットを提供する。【解決手段】ポリマー合成用のモノマーとともに鋳型分子となる少なくとも一種のＡＧＥまたは、少なくとも一種のＡＧＥ構造類似体の存在下で重合を行い、得られたポリマーから鋳型分子を有利除去することで調製することを特色とするモレキュラーインプリント法により分子認識ポリマーを形成する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一種のＡＧＥに対する結合部位を提示する分子認識ポリマー。
【請求項２】
上記ＡＧＥがＮε−カルボキシルメチルリジンであることを特徴とする請求項１に記載の分子認識ポリマー
【請求項３】
合成される際にポリマー合成用のモノマーとともに鋳型分子となる少なくとも一種のＡＧＥ構造類似体の存在下で重合を行い、得られたポリマーから鋳型分子を遊離除去することで調製することを特色とするモレキュラーインプリント法により形成されたことを特徴とする請求項１または２に記載の分子認識ポリマー。
【請求項４】
上記ＡＧＥ構造類似体がＮε−カルボキシルメチルリジンであることを特徴とする請求項３に記載の分子認識ポリマー。
【請求項５】
上記ＡＧＥ構造類似体がＮα−Ｂｏｃカルボキシルリジンであることを特徴とする請求項３に記載の分子認識ポリマー。
【請求項６】
上記ＡＧＥ構造類似体がＮα−Ｂｏｃリジンであることを特徴とする請求項３に記載の分子認識ポリマー。
【請求項７】
少なくとも一種のポリマー合成用のモノマー及び少なくとも一種の架橋剤の存在下で重合させることにより製造された、請求項４から６のいずれか１項に記載の分子認識ポリマー。
【請求項８】
上記ポリマー合成用のモノマーが１−ビニルイミダゾールであることを特徴とする請求項７に記載の分子認識ポリマー。
【請求項９】
上記架橋剤がトリメタクリル酸トリメチロールプロパンであることを特徴とする請求項７または８に記載の分子認識ポリマー。
【請求項１０】
ラジカル開始剤として触媒及び／または紫外線の存在下、重合が実施された、請求項１から９のいずれか１項に記載の分子認識ポリマー。
【請求項１１】
ＡＧＥの固相抽出方法であり請求項１から１０のいずれかの１項に記載の分子認識ポリマーを用いることを特徴とするＡＧＥの固相抽出法
【請求項１２】
上記ＡＧＥがＮε−カルボキシルメチルリジンであることを特徴とする請求項１１に記載の選択的固相抽出方法。
【請求項１３】
請求項１から１０のいずれかの１項に記載の分子認識ポリマーをカラムに充填し、使用することを特徴とするＡＧＥ選択的固相抽出用キット。
【請求項１４】
上記ＡＧＥがＮε−カルボキシルメチルリジンであることを特徴とする請求項１３に記載のＡＧＥ選択的固相抽出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃａｔｅｄ  Ｅｎｄ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓを特異的に結合する分子認識ポリマーならびにそれを用いた固相抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】    終末糖化産物（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  Ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ：以下ＡＧＥと略す。）はグルコースなどの還元糖とタンパク質との間の非酵素的糖化反応であるメイラード反応の後期段階で生成される化合物の総称であり、糖化最終産物、後期糖化最終生成物とも呼ばれ、生体内に存在することが明らかとなっている。生体内においては、糖尿病などで慢性的に高血糖が続くと、循環血液中や組織で、ＡＧＥの生成が促進される。生体内のＡＧＥは、糖尿病、動脈硬化、老化等の様々な疾患の発病や進展に関わっていることが明らかになっている。糖尿病合併症との関連では、ＡＧＥは血管内皮細胞にある特異的なＡＧＥレセプター（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  Ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ：ＲＡＧＥと略す）に結合して糖尿病血管症の発症に寄与しているとの報告がある。アルツハイマー病では、ＡＧＥが老人斑と神経原線維変化に沈着していること、また、ＡＧＥ受容体の一つであるＲＡＧＥがアミロイドβ蛋白質による神経細胞毒性を媒介しうることなどの報告がある。【０００３】    一方、ＡＧＥは食品の加熱や調理過程の褐変反応として知られているメイラード反応からいくつかの可逆的な化学反応を経た後に不可逆的に高分子化して生成で生じることが知られており、味や風味に関わる現象として研究されてきた。加熱や調理過程を伴う食品、例えば牛乳やコーヒー豆、ベーカリー製品にもＡＧＥは含まれることが報告されており、日常口にする多くの食品中にＡＧＥが含まれている。食品中のＡＧＥは体内に吸収、蓄積されることが報告されており、食品中のＡＧＥと各種疾患との関連についての研究がされている。また、食品中のＡＧＥを定量することは、食品の安全性ならびに品質管理指標として注目されている。【０００４】  そのため、生体中や食品中のＡＧＥを感度良く、正確に定量することが求められている。【０００５】  従来、ＡＧＥの定量方法として、例えば高速液体クロマトグラフィーを利用したＷｅｎｉｎｇｅｒらの方法（Ｎｅｐｈｒｏｎ，１９９２，６２，８０−８３）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ−ＭＳ）を使用する方法（ＤＩＡＢＥＴＥＳ，１９９１，４０，１９０−１９６）、ＡＧＥに対するモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法による方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９１，２６６：７３２９−７３３２．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ，２００５，４３，５０３−５１１）がある。【０００６】  しかしながら、生体試料や食品試料に含まれるＡＧＥは微量でるために、試料中に含まれる夾雑物のＡＧＥ測定の感度と定量性への影響が問題とされてきた。【０００７】  そのため、試料中に含まれる蛋白質や脂質などの夾雑物を取り除く必要があるが、従来の方法ではいずれも操作が煩雑であったり、操作に時間がかかったりする欠点を有する。
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  本発明は、試料中に含まれるＡＧＥの簡易な抽出方法を提供すること、すなわちＡＧＥを選択的に結合する分子認識ポリマー、この分子認識ポリマーを用いた試料中からのＡＧＥの新規な抽出方法を提供することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】  本発明者らは、前記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、モレキュラーインプリント法により作成されたＡＧＥ認識ポリマーが試料中からのＡＧＥの抽出に有効であることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】  すなわち、本発明はＡＧＥに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーである。
【００１１】  また、本発明は［００１０］においてＮε−カルボキシルメチルリジンであることを特徴とする分子認識ポリマーである。
【００１２】  さらに本発明は合成される際にポリマー合成用のモノマーとともに鋳型分子となる少なくとも一種のＡＧＥまたは、少なくとも一種のＡＧＥ構造類似体の存在下で重合を行い、得られたポリマーから鋳型分子を有利除去することで調製することを特色とするモレキュラーインプリント法により形成されたことを特徴とする［００１０］または［００１１］に記載の分子認識ポリマーである。
【００１３】  また、本発明は［００１２］においてＡＧＥ構造類似体がＮε−カルボキシルメチルリジンであることを特徴とする分子認識ポリマーである。
【００１４】  また、本発明は［００１２］においてＡＧＥ構造類似体がＮα−Ｂｏｃカルボキシルリジンであることを特徴とする分子認識ポリマーである。
【００１５】  また、本発明は［００１２］においてＡＧＥ構造類似体がＮα−Ｂｏｃリジンであることを特徴とする分子認識ポリマーである。
【００１６】  さらに、本発明は［００１３］から［００１５］において、ポリマー合成用のモノマー及び架橋剤の存在下で重合させることにより製造された、分子認識ポリマーである。
【００１７】  また、本発明は［００１６］においてポリマー合成用のモノマーが１−ビニルイミダゾールであることを特徴とする分子認識ポリマーである。
【００１８】  また、本発明は［００１６］において架橋剤がトリメチロ−ルプロパントリメタクリル酸であることを特徴とする分子認識ポリマーである。
【００１９】  さらに、本発明は［００１０］から［００１８］においてラジカル開始剤として触媒及び／またはＵＶ光の存在下、重合が実施された分子認識ポリマーである。
【００２０】  さらに、本発明は、［００１０］から［００１９］記載の分子認識ポリマーを用いることを特徴とするＡＧＥの固相抽出法である。
【００２１】  また、本発明は［００２０］においてＡＧＥがＮε−カルボキシルメチルリジンであることを特徴とする選択的固相抽出用方法である。
【００２２】  さらに、本発明は、［００１０］から［００１９］記載の分子認識ポリマーをカラムに充填し、使用することを特徴とするＡＧＥ選択的固相抽出用キットである。
【００２２】  また、本発明は［００２２］においてＡＧＥがＮε−カルボキシルメチルリジンであることを特徴とするＡＧＥ選択的固相抽出用キットである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】  本発明の一実施形態ついて以下に詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定されるものではない。【００２４】  本発明で用いるＡＧＥとしては特に限定されず、例えばＮε−カルボキシルメチルリジン、ペントシジン、クロスリン、フルオロリンク、ピロピリジン、ピラリン等の化合物が挙げられる。【００２５】  例えば、Ｎε−カルボキシルメチルリジンは、グルコースとリジンから精製されるＡＧＥであり、現在までに報告されているＡＧＥの中でも最も研究が行われている。そのため、従来の一般的なＡＧＥの定量は、構造が明らかになっているＣＭＬの定量で代替されてきた。【００２６】  本発明にかかる分子認識ポリマーは、モレキュラーインプリンティング法により形成されたものである。ここで、モレキュラーインプリンティング法とは、ポリマーを合成する際、ポリマー合成用のモノマーに、鋳型分子を混入させて重合を行い、得られたポリマーから鋳型分子を遊離除去することにより、標的分子の鋳型をポリマー内にとる方法をいう。鋳型分子に特徴的な官能基があれば、そのような官能基と結合する官能基を提供するモノマー（機能性モノマー）を、ポリマー合成用のモノマーに混入させて重合を行なう。機能性モノマーを、ポリマー合成用のモノマーに混入させる方法は、非共有結合型と共有結合型とに大別される。非共有結合型インプリンティング法は、機能性モノマーと標的分子とをそのまま混入させ、水素結合や静電的相互作用などの非共有結合を利用して、重合反応液中に、標的分子と機能性モノマーとの複合体を生じさせる方法である。これに対して、共有結合型インプリンティング法は、あらかじめ機能性モノマーと標的分子とを共有結合で複合体とした後、この複合体をモノマーとして混入させる方法である。分子認識ポリマーを形成するために、機能性モノマーを、インプリントされる鋳型分子の存在下で架橋剤及び触媒としてラジカル生成剤で重合させる。【００２７】  なお、モレキュラーインプリンティング法において、鋳型分子の構造は、分子認識ポリマーに認識させる標的分子の構造と一致していることが好ましいが、標的分子の構造と類似していれば、両者の構造は異なっていてもよい。構造が類似していれば、得られる分子認識ポリマーは、鋳型分子と構造が類似する標的分子を選択的に認識することが可能となる。【００２７】  本発明においては、鋳型分子はＡＧＥまたはＡＧＥ構造類似化合物であり得る。例えば、ＡＧＥの中でも最も研究が行われているＮε−カルボキシルメチルリジンに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーを得る場合は、標的分子のＮε−カルボキシルメチルリジンを鋳型分子とすることが好ましい。また、Ｎε−カルボキシルメチルリジンと構造が類似するＮα−Ｂｏｃカルボキシルリジン、Ｎα−Ｂｏｃリジンを鋳型分子とすることがあり得る。【００２８】  機能性モノマーはＡＧＥと相互作用し、吸着されるものであれば、その結合形式は特に限定されるものではなく、どのような結合形式であってもよい。かかる結合形式には、共有結合及び水素結合、静電的相互作用、イオン結合、疎水性相互作用、π−πスタッキング等の非共有結合が含まれる。【００２９】  典型的な機能性モノマーとしては、ビニルイミダ��ール誘導体（例えば、１−ビニルイミダゾール、（４）−５ビニルイミダゾール）、４−ビニルピリジン、一種のアクリル酸及びメタクリル酸、ビニル安息香酸、フェニルビニル誘導体（例えば、スチレン）またはメチレンもしくはビニル基を有する任意の分子、即ち、ＲＲ’Ｃ＝ＣＨ２（式中、Ｒは脂肪族または芳香族基であり、Ｒ’は脂肪族基、芳香族基またはＨである）で示される任意の分子である。１−ビニルイミダゾールは、好ましい機能性モノマーである。【００３０】  また、機能性モノマーは１種類に限定されず、さらに一種以上の機能性モノマーも、上記機能性モノマーと共重合させることができる。【００３１】  さらには、ＡＧＥと相互作用しないモノマー分子を上記機能性モノマーと共重合させることができる。モノマー分子は共重合させたポリマーマトリックスの剛性が、未改良ポリマーマトリックスと比較して改良されるように特異的に選択する。典型的なモノマー分子としてはメチルメタアクリレート、酢酸ビニル、ハロゲン化ビニル、アクリルアミドなどが挙げられる。【００３２】  また、典型的な機能性モノマー／鋳型分子のモル比は１から１０の間であり、本発明においては２から５の間が好ましい。【００３３】  また典型的な架橋剤は、メチレンまたはビニル基に属する少なくとも２個の二重結合を有する。架橋剤は、架橋してポリマーを生成するものであれば特に限定はしないが、トリアクリル酸トリメチロールプロパン、トリアクリル酸ペンタエリスリトール、ジアクリル酸エチレングリコール、ジアクリル酸１，４−ブタンジオール、ジアクリル酸１，６−ヘキサンジオール、ジメタクリル酸エチレングリコール、ジメタクリル酸１，４−ブタンジオール及びジメタクリル酸１，６−ヘキサンジオール等が挙げられ、好ましくは、ジメタクリル酸エチレングリコールなどの任意の分子である。トリメタアクリル酸トリメチロールプロパンは、好ましい架橋剤である。【００３４】  また、典型的な架橋剤／鋳型分子のモル比は５から５００の間であり、８０から１５０の間が好ましい。【００３５】  ラジカル生成剤は、ラジカルを生成しうるものであれば特に限定はしないが、過酸化ベンゾイル及びｔ−ＢｕＯＯＨ等の過酸化物並びにアゾビスジメチルバレロニトリル及びアゾビスイソブチロニトリル等のアゾ化合物などの任意の分子である。アゾ化合物が好ましく、アゾビスイソブチロニトリルが更に好ましい。【００３６】  ラジカル生成剤の使用量は、触媒量以上であれば特に限定はしないが、鋳型分子に対して０．１〜１．０当量、好ましくは、０．３〜０．５当量以上用いれば充分である。【００３７】  鋳型分子、機能性モノマー、架橋剤、ラジカル生成剤を溶解させる溶媒は、これらの化合物を溶解するものであれば特に限定はしないが、メタノールが好ましい。【００３８】  重合反応は、ラジカル生成剤が分解される条件であれば特に限定はしないが、４℃にて１２０，０００マイクロＪ／ｃｍ２となるように波長３６５ｎｍの紫外線を１時間から５時間し、その後４５℃で１０〜１５時間以上反応させるのが好ましい。【００４０】  得られた分子認識ポリマーは、すり潰し、ふるいにかけることにより所望の粒径を有するポリマー粒子にすることができる。得られた粒子状のポリマーをメタノール、酢酸又はメタノール−酢酸混合溶液等で洗浄することにより、鋳型分子を分子認識ポリマー内から除去することができる。【００４１】  本発明の分子認識ポリマーをカラムもしくはカートリッジに充填し、ＡＧＥとその他の夾雑物の含まれる試料インジェクションすることにより分子認識ポリマーに対する結合を調べた。【００４２】  本発明の分子認識ポリマーは、標的分子であるＡＧＥと選択的に結合することが示された。例えば、表１にしめすように、標的分子の類似化合物であるＮα−Ｂｏｃカルボキシルリジンを鋳型としてインプリントしたポリマーは標的分子のＮε−カルボキシルメチルリジンに対して結合能を有することが示された。同様に、類似化合物であるＮα−Ｂｏｃリジンを鋳型としてインプリントしたポリマーは標的分子のＮε−カルボキシルメチルリジンに対して選択的に結合することが示された。【００４３】  ＡＧＥ固相抽用キットの構成としては、本発明の分子認識ポリマーを充填したカラムまたはカートリッジのみでも使用できるが、これに洗浄溶媒、抽出溶媒を加えてもよい。【００４４】  本発明であるＡＧＥに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーは、ＡＧＥまたはＡＧＥ類似化合物を鋳型分子としてモレキュラーインプリント法により形成され、ＡＧＥを結合する。また、ＡＧＥを結合する分子認識ポリマーをカラムに充填することにより、試料中からＡＧＥを吸着できることから、蛋白質や脂質などの夾雑物を含む試料中からＡＧＥを簡易に抽出・濃縮できることは自明である。【００４５】  例えば、ＡＧＥの一種であるＮε−カルボキシルメチルリジンに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーは、類似化合物であるＮα−ＢｏｃカルボキシルリジンまたはＮα−Ｂｏｃリジンを鋳型分子としてモレキュラーインプリント法により形成され、Ｎε−カルボキシルメチルリジンを結合する。また、Ｎε−カルボキシルメチルリジンを結合する分子認識ポリマーをカラムに充填することにより、試料中からＮε−カルボキシルメチルリジンを吸着できることから、蛋白質や脂質などの夾雑物を含む試料中からＮε−カルボキシルメチルリジンを簡易に抽出・濃縮できることは自明である。
【実施例】
【００４６】  以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００４７】実施例１
Ｎα−Ｂｏｃカルボキシルリジンを鋳型分子としたＮε−カルボキシルメチルリジンに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーの合成
鋳型分子として１．６ｘ１０−５ｍｏｌ（５ｍｇ）のＮα−Ｂｏｃカルボキシルリジン、機機能性モノマーとして６．６ｘ１０−５ｍｏｌ（６．１７４ｍｇ）の１−ビニルイミダゾール  、架橋剤として１．６ｘ１０−３ｍｏｌ（０．５５ｇ）のトリアクリル酸トリメチロールプロパン、ラジカル生成剤として４．９ｘ１０−５ｍｏｌ（８．０９ｍｇ）の２，２−アゾビスイソブチロニトリルを０．５７Ｍｌのメタノールに溶解して混合した。ポリマーの重合はアルゴンガスを２分間パージすることで、溶存酸素を取り除き４℃にて３６５ｎｍの紫外線を１２０，０００μＪ／ｃｍ２で２時間照射した後、４５℃で一晩インキュベートして重合を行い、Ｎα−Ｂｏｃカルボキシルリジンインプリントポリマーを合成した。作成したポリマーは粒子径を揃えるため、ポリマーを乳鉢に入れ破砕し、これをふるいにかけ、３８μｍ以下の粒子を収集した。その後細かすぎる粒子を取り除くため、アセトンを用いてデカンテーションを３０分間、３回行った。このようにして粒子径が１０−３８μｍのポリマー粒子を収集した。このようにして調製した分子認識ポリマーは１０％酢酸を含むメタノール３０ｍｌを添加し攪拌しながら３０分処理し、鋳型であるＮα−Ｂｏｃカルボキシルリジンをポリマーから除去した。さらに４５℃で乾燥した。また、コントロールポリマー（以下、ＮＩＰ（ｎｏｎ）と略す。）は上記と同じポリマーの合成方法において鋳型分子であるＮα−Ｂｏｃカルボキシルリジンを加えないで合成したポリマーである。【００４８】実施例２
Ｎα−Ｂｏｃリジンを鋳型分子としたＮε−カルボキシルメチルリジンに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーの合成
鋳型分子として１．６ｘ１０−５ｍｏｌ（４．０５ｍｇ）のＮα−Ｂｏｃリジン、機機能性モノマーとして６．６ｘ１０−５ｍｏｌ（６．１７４ｍｇ）の１−ビニルイミダゾール  、架橋剤として１．６ｘ１０−３ｍｏｌ（０．５５ｇ）のトリアクリル酸トリメチロールプロパン、ラジカル生成剤として４．９ｘ１０−５ｍｏｌ（８．０９ｍｇ）の２，２−アゾビスイソブチロニトリルを０．５７Ｍｌのメタノールに溶解して混合した。その後、［００４７］に従ってＮε−カルボキシルメチルリジンに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーを作成した。【００４９】実施例３
Ｎε−カルボキシルメチルリジンに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーのカラムへの充填
［００４７］または［００４８］において作製したＮε−カルボキシルメチルリジンに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーをメタノールに懸濁し、ステンレスカラム（３３ｍｍ×２．１ｍｍ  ｉ．ｄ．）に詰めた。体積比がメタノール：酢酸＝９：１の溶液を流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで２時間流した。このカラムを分子認識ポリマー充填カラムとして使用した。【００５０】実施例４
Ｎε−カルボキシルメチルリジンに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーの評価実験
［００４８］において作成した分子認識ポリマー充填カラムを用いて、分子認識ポリマーの評価を行った。分子認識ポリマー充填カラムに対して、１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／ＰＯ４緩衝液または、メタノールと１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／ＰＯ４緩衝液（ｐＨ２．６）を１対１で混合したものを溶媒として流速０．１ｍｌ／分で運転し、紫外吸収２３５ｎｍを記録した。また、試料は１ｍｇ／ｍｌに調製し、測定毎に２０μｌインジェクションした。分子認識ポリマーに結合しない標準物質としてメタノールを用いた。試料のカラムへの保持時間からキャパシティーファクター（以下ｋと略す。）を算出した。ｋ値は以下の式から求めた。
ｋ＝（ｔＲ−ｔ０）／ｔ０
ここで、ｔＲは試料の保持時間、ｔ０は標準物質（メタノール）の保持時間を示す。【００５１】実施例５
Ｎε−カルボキシルメチルリジンに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーのカルボキシルメチルリジンに対する結合
Ｎε−カルボキシルメチルリジンに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーの評価実験で得られたＮε−カルボキシルメチルリジンをインジェクションしたときのクロマトグラムを図１に示す。Ｎα−ＢｏｃカルボキシルリジンまたはＮα−Ｂｏｃリジンを鋳型分子とした分子認識ポリマーはメタノールに由来する非吸着ピークとＮε−カルボキシルメチルリジンに由来する吸着ピークの非吸着ピークと分離が見られた。このことから、Ｎε−カルボキシルメチルリジンに結合していることが結合していることは明らかである。Ｎε−カルボキシルメチルリジンに対するキャパシティーファクターｋ値はＮα−Ｂｏｃカルボキシルリジンを鋳型分子とした分子認識ポリマー（以下ＭＩＰ（Ｂｏｃ−ＣＭＬ）と略す。）においては２．７５であった。また、Ｎα−Ｂｏｃリジンを鋳型分子とした分子認識ポリマー（以下ＭＩＰ（Ｂｏｃ−Ｌｙｓ）と略す。）においては２．５８であった。このことから、ＭＩＰ（Ｂｏｃ−ＣＭＬ）またはＭＩＰ（Ｂｏｃ−Ｌｙｓ）はＮε−カルボキシルメチルリジンに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーであることが明らかである。【００５２】実施例５
Ｎε−カルボキシルメチルリジンに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーの夾雑物に対する結合
夾雑物として、Ｌ−リジン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グリシン、フロシンを用いてＮε−カルボキシルメチルリジンに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーの評価を行った。各試料は１ｍｇ／ｍｌに調製し、測定毎に２０μｌインジェクションした。ＭＩＰ（Ｂｏｃ−ＣＭＬ）を充填したカラムを用いて各試料をインジェクションしたときに得られるに対するクロマトグラムを図２、ＭＩＰ（Ｂｏｃ−Ｌｙｓ）を充填したカラムを用いて各試料をインジェクションしたときに得られるに対するクロマトグラムを図３に記す。また、キャパシティーファクターｋ値を表１に記す。Ｌ−リジン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グリシン、フロシンに対しては吸着をほとんど示さなかった。このことから、本発明の分子認識ポリマーはＮε−カルボキシルメチルリジンを特異的に結合し、夾雑物として試料中に含まれる可能性のあるアミノ酸、特にＬ−リジン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グリシンならびにＡＧＥ化合物であるフロシンは結合しないことが示された。このことから、ＭＩＰ（Ｂｏｃ−ＣＭＬ）またはＭＩＰ（Ｂｏｃ−Ｌｙｓ）はＮε−カルボキシルメチルリジンに対して特異的な結合部位を持つことが明らかである。【００５３】
【表１】
2007240509.tif 000002
【発明の効果】
【００５４】  本発明であるモレキュラーインプリント法により作成されたＡＧＥに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーを用いることで、試料中からＡＧＥを選択的に結合することができる。この分子認識ポリマーを充填したカラムまたはカートリッジを使用することで、アミノ酸、蛋白質や脂質などの夾雑物を含む試料中からＡＧＥの簡易な抽出・濃縮が可能となった。
【図１】
2007240509.tif 000003
【図２】
2007240509.tif 000004
【図３】
2007240509.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成18年6月8日(2006.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃａｔｅｄ  Ｅｎｄ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓを特異的に結合する分子認識ポリマーならびにそれを用いた固相抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
終末糖化産物（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  Ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ：以下ＡＧＥと略す。）はグルコースなどの還元糖とタンパク質との間の非酵素的糖化反応であるメイラード反応の後期段階で生成される化合物の総称であり、糖化最終産物、後期糖化最終生成物とも呼ばれ、生体内に存在することが明らかとなっている。生体内においては、糖尿病などで慢性的に高血糖が続くと、循環血液中や組織で、ＡＧＥの生成が促進される。生体内のＡＧＥは、糖尿病、動脈硬化、老化等の様々な疾患の発病や進展に関わっていることが明らかになっている。糖尿病合併症との関連では、ＡＧＥは血管内皮細胞にある特異的なＡＧＥ レセプター（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ：ＲＡＧＥと略す）に結合して糖尿病血管症の発症に寄与しているとの報告がある。アルツハイマー病では、ＡＧＥが老人斑と神経原線維変化に沈着していること、また、ＡＧＥ 受容体の一つである ＲＡＧＥがアミロイドβ蛋白質による神経細胞毒性を媒介しうることなどの報告がある。
【０００３】
一方、ＡＧＥは食品の加熱や調理過程の褐変反応として知られているメイラード反応からいくつかの可逆的な化学反応を経た後に不可逆的に高分子化して生成で生じることが知られており、味や風味に関わる現象として研究されてきた。加熱や調理過程を伴う食品、例えば牛乳やコーヒー豆、ベーカリー製品にもＡＧＥは含まれることが報告されており、日常口にする多くの食品中にＡＧＥが含まれている。食品中のＡＧＥは体内に吸収、蓄積されることが報告されており、食品中のＡＧＥと各種疾患との関連についての研究がされている。また、食品中のＡＧＥを定量することは、食品の安全性ならびに品質管理指標として注目されている。
【０００４】
そのため、生体中や食品中のＡＧＥを感度良く、正確に定量することが求められている。
【０００５】
従来、ＡＧＥの定量方法として、例えば高速液体クロマトグラフィーを利用したＷｅｎｉｎｇｅｒらの方法（Ｎｅｐｈｒｏｎ，１９９２，６２，８０−８３）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ−ＭＳ）を使用する方法（ＤＩＡＢＥＴＥＳ，１９９１，４０，１９０−１９６）、ＡＧＥに対するモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法による方法（J. Biol. Chem. ，１９９１，266: 7329-7332、Clin Chem Lab Med ，２００５，４３，５０３５１１）がある。
【０００６】
しかしながら、生体試料や食品試料に含まれるＡＧＥは微量でるために、試料中に含まれる夾雑物のＡＧＥ測定の感度と定量性への影響が問題とされてきた。
【０００７】
そのため、試料中に含まれる蛋白質や脂質などの夾雑物を取り除く必要があるが、従来の方法ではいずれも操作が煩雑であったり、操作に時間がかかったりする欠点を有する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、試料中に含まれるＡＧＥの簡易な抽出方法を提供すること、すなわちＡＧＥを選択的に結合する分子認識ポリマー、この分子認識ポリマーを用いた試料中からのＡＧＥの新規な抽出方法を提供することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、モレキュラーインプリント法により作成されたＡＧＥ認識ポリマーが試料中からのＡＧＥの抽出に有効であることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明はＡＧＥに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーである。
【００１１】
また、本発明は、００１０においてＮε―カルボキシルメチルリジンであることを特徴とする分子認識ポリマーである。
【００１２】
さらに本発明は合成される際にポリマー合成用のモノマーとともに鋳型分子となる少なくとも一種のＡＧＥまたは、少なくとも一種のＡＧＥ構造類似体の存在下で重合を行い、得られたポリマーから鋳型分子を有利除去することで調製することを特色とするモレキュラーインプリント法により形成されたことを特徴とする、００１０または００１１に記載の分子認識ポリマーである。
【００１３】
また、本発明は００１２においてＡＧＥ構造類似体がＮε―カルボキシルメチルリジンであることを特徴とする分子認識ポリマーである。
【００１４】
また、本発明は００１２においてＡＧＥ構造類似体がＮα−Ｂｏｃカルボキシルリジンであることを特徴とする分子認識ポリマーである。
【００１５】
また、本発明は００１２においてＡＧＥ構造類似体がＮα−Ｂｏｃリジンであることを特徴とする分子認識ポリマーである。
【００１６】
さらに、本発明は００１３から００１５において、ポリマー合成用のモノマー及び架橋剤の存在下で重合させることにより製造された、分子認識ポリマーである。
【００１７】
また、本発明は００１６においてポリマー合成用のモノマーが１−ビニルイミダゾールであることを特徴とする分子認識ポリマーである。
【００１８】
また、本発明は００１６において架橋剤がトリメチロ-ルプロパントリメタクリル酸であることを特徴とする分子認識ポリマーである。
【００１９】
さらに、本発明は００１０から００１８においてラジカル開始剤として触媒及び／またはＵＶ光の存在下、重合が実施された分子認識ポリマーである。
【００２０】
さらに、本発明は、００１０から００１９記載の分子認識ポリマーを用いることを特徴とするＡＧＥの固相抽出法である。
【００２１】
また、本発明は００２０においてＡＧＥがＮε―カルボキシルメチルリジンであることを特徴とする選択的固相抽出用方法である。
【００２２】
さらに、本発明は、００１０から００１９記載の分子認識ポリマーをカラムに充填し、使用することを特徴とするＡＧＥ選択的固相抽出用キットである。
【００２３】
また、本発明は００２２においてＡＧＥがＮε―カルボキシルメチルリジンであることを特徴とするＡＧＥ選択的固相抽出用キットである。
【発明の効果】
【００２４】
本発明であるモレキュラーインプリント法により作成されたＡＧＥに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーを用いることで、試料中からＡＧＥを選択的に結合することができる。この分子認識ポリマーを充填したカラムまたはカートリッジを使用することで、アミノ酸、蛋白質や脂質などの夾雑物を含む試料中からＡＧＥの簡易な抽出・濃縮が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明の一実施形態ついて以下に詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定されるものではない。
【００２６】
本発明で用いるＡＧＥとしては特に限定されず、例えばＮε―カルボキシルメチルリジン、ペントシジン、クロスリン、フルオロリンク、ピロピリジン、ピラリン等の化合物が挙げられる。
【００２７】
例えば、Ｎε―カルボキシルメチルリジンは、グルコースとリジンから精製されるＡＧＥであり、現在までに報告されているＡＧＥの中でも最も研究が行われている。そのため、従来の一般的なＡＧＥの定量は、構造が明らかになっているＣＭＬの定量で代替されてきた。
【００２８】
本発明にかかる分子認識ポリマーは、モレキュラーインプリンティング法により形成されたものである。ここで、モレキュラーインプリンティング法とは、ポリマーを合成する際、ポリマー合成用のモノマーに、鋳型分子を混入させて重合を行い、得られたポリマーから鋳型分子を遊離除去することにより、標的分子の鋳型をポリマー内にとる方法をいう。鋳型分子に特徴的な官能基があれば、そのような官能基と結合する官能基を提供するモノマー（機能性モノマー）を、ポリマー合成用のモノマーに混入させて重合を行なう。機能性モノマーを、ポリマー合成用のモノマーに混入させる方法は、非共有結合型と共有結合型とに大別される。非共有結合型インプリンティング法は、機能性モノマーと標的分子とをそのまま混入させ、水素結合や静電的相互作用などの非共有結合を利用して、重合反応液中に、標的分子と機能性モノマーとの複合体を生じさせる方法である。これに対して、共有結合型インプリンティング法は、あらかじめ機能性モノマーと標的分子とを共有結合で複合体とした後、この複合体をモノマーとして混入させる方法である。分子認識ポリマーを形成するために、機能性モノマーを、インプリントされる鋳型分子の存在下で架橋剤及び触媒としてラジカル生成剤で重合させる。
【００２９】
なお、モレキュラーインプリンティング法において、鋳型分子の構造は、分子認識ポリマーに認識させる標的分子の構造と一致していることが好ましいが、標的分子の構造と類似していれば、両者の構造は異なっていてもよい。構造が類似していれば、得られる分子認識ポリマーは、鋳型分子と構造が類似する標的分子を選択的に認識することが可能となる。
【００３０】
本発明においては、鋳型分子はＡＧＥまたはＡＧＥ構造類似化合物であり得る。例えば、ＡＧＥの中でも最も研究が行われているＮε―カルボキシルメチルリジンに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーを得る場合は、標的分子のＮε―カルボキシルメチルリジンを鋳型分子とすることが好ましい。また、Ｎε―カルボキシルメチルリジンと構造が類似するＮα−Ｂｏｃカルボキシルリジン、Ｎα−Ｂｏｃリジンを鋳型分子とすることがあり得る。
【００３１】
機能性モノマーはＡＧＥと相互作用し、吸着されるものであれば、その結合形式は特に限定されるものではなく、どのような結合形式であってもよい。かかる結合形式には、共有結合及び水素結合、静電的相互作用、イオン結合、疎水性相互作用、π-πスタッキング等の非共有結合が含まれる。
【００３２】
典型的な機能性モノマーとしては、ビニルイミダゾール誘導体（例えば、1−ビニルイミダゾール、（４）−５ビニルイミダゾール）、４−ビニルピリジン、一種のアクリル酸及びメタクリル酸、ビニル安息香酸、フェニルビニル誘導体（例えば、スチレン）またはメチレンもしくはビニル基を有する任意の分子、即ち、ＲＲ’Ｃ＝ＣＨ２（式中、Ｒは脂肪族または芳香族基であり、Ｒ’は脂肪族基、芳香族基またはＨである）で示される任意の分子である。1−ビニルイミダゾールは、好ましい機能性モノマーである。
【００３３】
また、機能性モノマーは１種類に限定されず、さらに一種以上の機能性モノマーも、上記機能性モノマーと共重合させることができる。
【００３４】
さらには、ＡＧＥと相互作用しないモノマー分子を上記機能性モノマーと共重合させることができる。モノマー分子は共重合させたポリマーマトリックスの剛性が、未改良ポリマーマトリックスと比較して改良されるように特異的に選択する。典型的なモノマー分子としてはメチルメタアクリレート、酢酸ビニル、ハロゲン化ビニル、アクリルアミドなどが挙げられる。
【００３５】
また、典型的な機能性モノマー／鋳型分子のモル比は１から１０の間であり、本発明においては２から５の間が好ましい。
【００３６】
また典型的な架橋剤は、メチレンまたはビニル基に属する少なくとも２個の二重結合を有する。架橋剤は、架橋してポリマーを生成するものであれば特に限定はしないが、トリアクリル酸トリメチロールプロパン、トリアクリル酸ペンタエリスリトール、ジアクリル酸エチレングリコール、ジアクリル酸１，４−ブタンジオール、ジアクリル酸１，６−ヘキサンジオール、ジメタクリル酸エチレングリコール、ジメタクリル酸１，４−ブタンジオール及びジメタクリル酸１，６−ヘキサンジオール等が挙げられ、好ましくは、ジメタクリル酸エチレングリコールなどの任意の分子である。トリメタアクリル酸トリメチロールプロパンは、好ましい架橋剤である。
【００３７】
また、典型的な架橋剤／鋳型分子のモル比は５から５００の間であり、８０から１５０の間が好ましい。
【００３８】
ラジカル生成剤は、ラジカルを生成しうるものであれば特に限定はしないが、過酸化ベンゾイル及びｔ−ＢｕＯＯＨ等の過酸化物並びにアゾビスジメチルバレロニトリル及びアゾビスイソブチロニトリル等のアゾ化合物などの任意の分子である。アゾ化合物が好ましく、アゾビスイソブチロニトリルが更に好ましい。
【００３９】
ラジカル生成剤の使用量は、触媒量以上であれば特に限定はしないが、鋳型分子に対して０．１〜１．０当量、好ましくは、０．３〜０．５当量以上用いれば充分である。
【００４０】
鋳型分子、機能性モノマー、架橋剤、ラジカル生成剤を溶解させる溶媒は、これらの化合物を溶解するものであれば特に限定はしないが、メタノールが好ましい。
【００４１】
重合反応は、ラジカル生成剤が分解される条件であれば特に限定はしないが、４℃にて１２０，０００マイクロＪ／ｃｍ２となるように波長３６５ｎｍの紫外線を１時間から５時間し、その後４５℃で１０〜１５時間以上反応させるのが好ましい。
【００４２】
得られた分子認識ポリマーは、すり潰し、ふるいにかけることにより所望の粒径を有するポリマー粒子にすることができる。得られた粒子状のポリマーをメタノール、酢酸又はメタノール−酢酸混合溶液等で洗浄することにより、鋳型分子を分子認識ポリマー内から除去することができる。
【００４３】
本発明の分子認識ポリマーをカラムもしくはカートリッジに充填し、ＡＧＥとその他の夾雑物の含まれる試料インジェクションすることにより分子認識ポリマーに対する結合を調べた。
【００４４】
本発明の分子認識ポリマーは、標的分子であるＡＧＥと選択的に結合することが示された。例えば、表１にしめすように、標的分子の類似化合物であるＮα−Ｂｏｃカルボキシルリジンを鋳型としてインプリントしたポリマーは標的分子のＮε―カルボキシルメチルリジンに対して結合能を有することが示された。同様に、類似化合物であるＮα−Ｂｏｃリジンを鋳型としてインプリントしたポリマーは標的分子のＮε―カルボキシルメチルリジンに対して選択的に結合することが示された。
【００４５】
ＡＧＥ固相抽用キットの構成としては、本発明の分子認識ポリマーを充填したカラムまたはカートリッジのみでも使用できるが、これに洗浄溶媒、抽出溶媒を加えてもよい。
【００４６】
本発明であるＡＧＥに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーは、ＡＧＥまたはＡＧＥ類似化合物を鋳型分子としてモレキュラーインプリント法により形成され、ＡＧＥを結合する。また、ＡＧＥを結合する分子認識ポリマーをカラムに充填することにより、試料中からＡＧＥを吸着できることから、蛋白質や脂質などの夾雑物を含む試料中からＡＧＥを簡易に抽出・濃縮できることは自明である。
【００４７】
例えば、ＡＧＥの一種であるＮε―カルボキシルメチルリジンに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーは、類似化合物であるＮα−ＢｏｃカルボキシルリジンまたはＮα−Ｂｏｃリジンを鋳型分子としてモレキュラーインプリント法により形成され、Ｎε―カルボキシルメチルリジンを結合する。また、Ｎε―カルボキシルメチルリジンを結合する分子認識ポリマーをカラムに充填することにより、試料中からＮε―カルボキシルメチルリジンを吸着できることから、蛋白質や脂質などの夾雑物を含む試料中からＮε―カルボキシルメチルリジンを簡易に抽出・濃縮できることは自明である。
【００４８】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４９】
Ｎα−Ｂｏｃカルボキシルリジンを鋳型分子としたＮε―カルボキシルメチルリジンに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーの合成。
鋳型分子として１．６ｘ１０−５ｍｏｌ（５ｍｇ）のＮα−Ｂｏｃカルボキシルリジン、機機能性モノマーとして６．６ｘ１０−５ｍｏｌ（６．１７４ｍｇ）の１−ビニルイミダゾール  、架橋剤として１．６ｘ１０−３ｍｏｌ（０．５５ｇ）のトリアクリル酸トリメチロールプロパン、ラジカル生成剤として４．９ｘ１０−５ｍｏｌ（８．０９ｍｇ）の２，２−アゾビスイソブチロニトリルを ０．５７Ｍｌのメタノールに溶解して混合した。ポリマーの重合はアルゴンガスを２分間パージすることで、溶存酸素を取り除き４℃にて３６５ｎｍの紫外線を１２０，０００μＪ／ｃｍ２で２時間照射した後、４５℃で一晩インキュベートして重合を行い、Ｎα−Ｂｏｃカルボキシルリジンインプリントポリマーを合成した。作成したポリマーは粒子径を揃えるため、ポリマーを乳鉢に入れ破砕し、これをふるいにかけ、３８μｍ以下の粒子を収集した。その後細かすぎる粒子を取り除くため、アセトンを用いてデカンテーションを30分間、３回行った。このようにして粒子径が１０−３８μｍのポリマー粒子を収集した。このようにして調製した分子認識ポリマーは１０％酢酸を含むメタノール30 mlを添加し攪拌しながら３０分処理し、鋳型であるＮα−Ｂｏｃカルボキシルリジンをポリマーから除去した。さらに４５℃で乾燥した。また、コントロールポリマー（以下、ＮＩＰ（ｎｏｎ）と略す。）は上記と同じポリマーの合成方法において鋳型分子であるＮα−Ｂｏｃカルボキシルリジンを加えないで合成したポリマーである。
【実施例２】
【００５０】
Ｎα−Ｂｏｃリジンを鋳型分子としたＮε―カルボキシルメチルリジンに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーの合成。
鋳型分子として１．６ｘ１０−５ｍｏｌ（４．０５ｍｇ）のＮα−Ｂｏｃリジン、機機能性モノマーとして６．６ｘ１０−５ｍｏｌ（６．１７４ｍｇ）の１−ビニルイミダゾール  、架橋剤として１．６ｘ１０−３ｍｏｌ（０．５５ｇ）のトリアクリル酸トリメチロールプロパン、ラジカル生成剤として４．９ｘ１０−５ｍｏｌ（８．０９ｍｇ）の２，２−アゾビスイソブチロニトリルを ０．５７Ｍｌのメタノールに溶解して混合した。その後、００４７に従ってＮε―カルボキシルメチルリジンに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーを作成した。
【実施例３】
【００５１】
Ｎε―カルボキシルメチルリジンに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーのカラムへの充填。
００４７または００４８において作製したＮε―カルボキシルメチルリジンに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーをメタノールに懸濁し、ステンレスカラム（３３ ｍｍ×２．１ｍｍ  ｉ．ｄ．)に詰めた。体積比がメタノール：酢酸＝９：１の溶液を流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで２時間流した。このカラムを分子認識ポリマー充填カラムとして使用した。
【実施例４】
【００５２】
Ｎε―カルボキシルメチルリジンに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーの評価実験。
００４８において作成した分子認識ポリマー充填カラムを用いて、分子認識ポリマーの評価を行った。分子認識ポリマー充填カラムに対して、１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４／ＰＯ４ 緩衝液または、メタノールと１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４／ＰＯ４ 緩衝液（ｐＨ２．６）を１対１で混合したものを溶媒として流速０．１ｍｌ／分で運転し、紫外吸収２３５ｎｍを記録した。また、試料は1 ｍｇ／ｍｌに調製し、測定毎に20 μｌインジェクションした。分子認識ポリマーに結合しない標準物質としてメタノールを用いた。試料のカラムへの保持時間からキャパシティーファクター（以下ｋと略す。）を算出した。ｋ値は以下の式から求めた。
ｋ＝（ｔＲ−ｔ０）／ｔ０
ここで、ｔＲは試料の保持時間、ｔ０は標準物質（メタノール）の保持時間を示す。
【実施例５】
【００５３】
Ｎε―カルボキシルメチルリジンに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーのカルボキシルメチルリジンに対する結合
Ｎε―カルボキシルメチルリジンに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーの評価実験で得られたＮε―カルボキシルメチルリジンをインジェクションしたときのクロマトグラムを図１に示す。Ｎα−ＢｏｃカルボキシルリジンまたはＮα−Ｂｏｃリジンを鋳型分子とした分子認識ポリマーはメタノールに由来する非吸着ピークとＮε―カルボキシルメチルリジンに由来する吸着ピークの非吸着ピークと分離が見られた。このことから、Ｎε―カルボキシルメチルリジンに結合していることが結合していることは明らかである。Ｎε―カルボキシルメチルリジンに対するキャパシティーファクターｋ値はＮα−Ｂｏｃカルボキシルリジンを鋳型分子とした分子認識ポリマー（以下ＭＩＰ（Ｂｏｃ−ＣＭＬ）と略す。）においては２．７５であった。また、Ｎα−Ｂｏｃリジンを鋳型分子とした分子認識ポリマー（以下ＭＩＰ（Ｂｏｃ−Ｌｙｓ）と略す。）においては２．５８であった。このことから、ＭＩＰ（Ｂｏｃ−ＣＭＬ）またはＭＩＰ（Ｂｏｃ−Ｌｙｓ）はＮε―カルボキシルメチルリジンに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーであることが明らかである。
【実施例６】
【００５４】
Ｎε―カルボキシルメチルリジンに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーの夾雑物に対する結合
夾雑物として、L-リジン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、L-グリシン、フロシンを用いてＮε―カルボキシルメチルリジンに対する結合部位を提示する分子認識ポリマーの評価を行った。各試料は1 ｍｇ／ｍｌに調製し、測定毎に20 μｌインジェクションした。ＭＩＰ（Ｂｏｃ−ＣＭＬ）を充填したカラムを用いて各試料をインジェクションしたときに得られるに対するクロマトグラムを図２、ＭＩＰ（Ｂｏｃ−Ｌｙｓ）を充填したカラムを用いて各試料をインジェクションしたときに得られるに対するクロマトグラムを図３に記す。また、キャパシティーファクターｋ値を表１に記す。L-リジン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、L-グリシン、フロシンに対しては吸着をほとんど示さなかった。このことから、本発明の分子認識ポリマーはＮε―カルボキシルメチルリジンを特異的に結合し、夾雑物として試料中に含まれる可能性のあるアミノ酸、特にL-リジン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、L-グリシンならびにＡＧＥ化合物であるフロシンは結合しないことが示された。このことから、ＭＩＰ（Ｂｏｃ−ＣＭＬ）またはＭＩＰ（Ｂｏｃ−Ｌｙｓ）はＮε―カルボキシルメチルリジンに対して特異的な結合部位を持つことが明らかである。
【００５５】
表１は、分子認識ポリマーを充填したカラムを用いて各試料をインジェクションしたときに得られるキャパシティーファクター（ｋ）である。
【００５６】
【表１】
2007240509.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】分子認識ポリマーを充填したカラムを用いて各試料をインジェクションしたときに得られるＮε―カルボキシルメチルリジンに対するクロマトグラム
【図２】ＭＩＰ（Ｂｏｃ−ＣＭＬ）を充填したカラムを用いて各試料をインジェクションしたときに得られるクロマトグラム
【図３】ＭＩＰ（Ｂｏｃ−Ｌｙｓ）を充填したカラムを用いて各試料をインジェクションしたときに得られるクロマトグラム
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2007240509.tif 000007
【図２】
2007240509.tif 000008
【図３】
2007240509.tif 000009