(57)【要約】【課題】  アスタキサンチン生産能を有する微生物を用いるカロテノイドの製造過程において、培養初期から中期に菌体増殖に適した条件において菌体密度を上昇させると共に、培養後期にアスタキサンチン生産を促進する条件に培養液の溶存酸素濃度を調節して微生物を培養する方法を提供する。【解決の手段】  アスタキサンチン生産能を有する微生物を用い、前記微生物を含む培養液が入った発酵槽へ酸素を含むガスを供給しながら培養してカロテノイド類を製造する方法において、培養中期における培養液の溶存酸素濃度を０．１ｐｐｍ以下とする発酵法によるカロテノイド類の製造方法を用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスタキサンチン生産能を有する微生物を含む培養液が入った発酵槽へ酸素を含むガスを供給しながら培養してカロテノイド類を製造する方法において、培養中期における培養液の溶存酸素濃度を０．１ｐｐｍ以下とすることを特徴とする発酵法によるカロテノイド類の製造方法。
【請求項２】
培養中期における培養液中の溶存酸素濃度を０．１ｐｐｍ以下に維持しつつ前記醗酵槽への酸素供給量を上昇させて培養することを特徴とする請求項１記載の発酵法によるカロテノイド類の製造方法。
【請求項３】
醗酵槽への酸素供給量の上昇を、培養中期中に断続的に行うことを特徴とする請求項１または請求項２記載の発酵法によるカロテノイド類の製造方法。
【請求項４】
カロテノイド類が、アスタキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノンおよびβ−カロテンからなる群より選ばれるいずれか一種または複数種であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の発酵法によるカロテノイド類の製造方法。
【請求項５】
培養後期における培養液中の溶存酸素濃度が０．１ｐｐｍを超えるように醗酵槽へ酸素を含むガスを供給し、生成するカロテノイド類中のアスタキサンチンの存在比率を３０％以上にすることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の発酵法によるカロテノイド類の製造方法。
【請求項６】
微生物が、アスタキサンチン生産能を有する細菌であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の発酵法によるカロテノイド類の製造方法。
【請求項７】
細菌が、アスタキサンチン生産能を有するパラコッカス属細菌であることを特徴とする請求項６に記載の発酵法によるカロテノイド類の製造方法。
【請求項８】
パラコッカス属細菌が、Ｎ−８１１０６株の改変株であることを特徴とする請求項７に記載の発酵法によるカロテノイド類の製造方法。
【請求項９】
Ｎ−８１１０６株の改変株が、Ｎ−８１１０６株に対し自然突然変異または変異原物質や紫外線等による人為的操作で誘発して得られる変異株であることを特徴とする請求項８に記載の発酵法によるカロテノイド類の製造方法。
【請求項１０】
Ｎ−８１１０６株の改変株が、Ｎ−８１１０６株に対し遺伝子操作を施した組換え株であることを特徴とする請求項８または請求項９に記載の発酵法によるカロテノイド類の製造方法。
【請求項１１】
Ｎ−８１１０６株の改変株が、ＴＳＮ１８Ｅ７株（受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４６）、ＴＳＴＴ００１株（受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６７０）又はＴＳＴＴ００３１株（受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６８９）であることを特徴とする請求項９に記載の発酵法によるカロテノイド類の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂溶性色素であるカロテノイド類、特にアスタキサンチンを発酵法で製造する方法に関するものである。アスタキサンチンは養殖サケ・マス・マダイの色揚げ剤や鶏卵の色調改善剤、健康補助食品、医薬品として有用な化合物である。
【背景技術】
【０００２】
カロテノイドのうちアスタキサンチン（以下「Ａｘ」と略記する。）やβ−カロチン、リコペンなどのカロテノイドは、オキアミ、カニ、エビなどの甲殻類やマダイ、サケ、マスなどの魚類、フラミンゴなどの鳥類、藻類や微生物等に広く分布する天然の化合物である。近年はＡｘがサケやマス、マダイ等の養殖魚の色揚げ剤や鶏卵の色調改善剤として需要が増加している。またＡｘには抗酸化活性や抗癌活性などの様々な生理的作用が確認され、医薬品や健康補助食品としての利用も注目されている。
【０００３】
Ａｘの製造方法としては、化学合成法、天然物からの抽出法、微生物による発酵生産法などがあるが、現在は主に価格等の要因から化学合成法による製品が広く流通している。しかし、化学合成法では原料に臭素および塩素を含むハロゲン系化合物や重金属類を使用するため安全性に懸念があり（例えば、特許文献１参照）、消費者の自然、天然嗜好の上昇にともない天然物由来のＡｘへの要求が強くなっている。
【０００４】
天然物からの抽出法としてはオキアミ等からの抽出する方法があるが、これらは含量が低く、採取、抽出、精製などに多大な労力を要し、コスト的に問題があった。
【０００５】
微生物を利用した製法としては、酵母ではファフィア・ロドチーマ（Ｐｈａｆｆｉａ  ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）（例えば、非特許文献１参照）、藻類ではヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）（例えば、非特許文献２参照）の報告がある。しかしながらファフィア酵母は増殖速度が遅いため培養日数が長く、細胞壁が強固なために抽出効率が低く、含量が少ないためコスト高である。またヘマトコッカス藻類は増殖速度が非常に遅いために非常に培養日数が長く、光を必要とするため立地条件や設備などに制約がある他、クロロフィルなどの夾雑物の除去が必要になりコスト高である。
【０００６】
これらの問題を解決する方法として海洋性アグロバクテリウム属細菌Ｎ−８１１０６株（独立行政法人特許生物寄託センターへの受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０２３）の培養により得る方法が開示されている（例えば、特許文献２参照）。当該発明によれば、本海洋性細菌は増殖が速く、またその菌体を回収した後、アセトンなどの有機溶媒と菌体を混和・攪拌するだけで容易にＡｘを抽出できるという利点がある。なお、この微生物は後に１６ｓリボゾーマルＲＮＡ遺伝子の配列解析が行われた結果、パラコッカス属細菌と再同定された。海洋バイオテクノロジー研究所においてＭＢＩＣ０１１４３としても登録され、その諸性質に関する情報が提供されている（例えば、非特許文献６〜９参照）。また該微生物を用いて変異育種を行ない、Ａｘの生産能が向上したＴＳＵＧ１Ｃ１１株（独立行政法人特許生物寄託センターへの受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４１６）株の取得やＴＳＮ１８Ｅ７株（独立行政法人特許生物寄託センターへの受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４６）が報告されている（例えば、特許文献３参照）。
【０００７】
本微生物の培養方法として、フラスコ内の培養液量や振とう条件を変えることでカロテノイド成分が異なることが報告されている（例えば、非特許文献４参照）。これによれば、容器当りの培地仕込み量がカロテノイドの組成に影響し、培地を少量仕込んだ場合にはＡｘ合成の一段階前の前駆体であるアドニキサンチンが主に生産され、適量に仕込んだ場合にアスタキサンチンが生産されることが示された。この検討では培地の仕込み量以外の因子を一定として培養したため、二つの培養条件間の相違は体積当りの空気との接触面積であり、それに起因する溶存酸素濃度（ＤＯ）がカロテノイドの成分に影響するものと結論された。
【０００８】
またＦｒａｓｅｒらにより、β−カロテンからＡｘを合成する酵素の遺伝子、ｃｒｔＷおよびｃｒｔＺが見出され、さらに大腸菌にクローニングして製造された両酵素の性質が解析された（例えば、非特許文献５参照）。その結果によれば、これらはそれぞれβ−カロテンの３および３’位にケト基を導入する酵素、および４および４’位に水産基を導入する酵素である。この発見に基づき、Ａｘの生合成経路として１）β−カロテンにｃｒｔＺが優先して作用してβ−クリプトキサンチンを経てゼアキサンチンが第一に生産され、次いでｃｒｔＷが作用してアドニキサンチン（４−ケトゼアキサンチンとも称される）を経てＡｘが生産される経路と、２）ｃｒｔＷが優先して作用してエキネノンを経てカンタキサンチンが第一に生産され、次いでｃｒｔＺが作用してフェニコキサンチンを経てＡｘに至る経路の、二つの経路が存在することが提唱された。またゼアキサンチンにｃｒｔＷを作用させるとアドニキサンチンには速やかに変換されるが、最後の一段階の水酸化が十分に進まずアドニキサンチンが蓄積することが報告されている。一方、カンタキサンチンにｃｒｔＺを作用させると良好にＡｘが生産されることも報告されている。なお、以上のカロテノイドの生合成経路を図１に示した。
【０００９】
非特許文献４に酸素供給量が多い条件ではアドニキサンチンが蓄積され、酸素供給量が少ない条件では生合成経路２）の中間体群が蓄積することが示されていること、非特許文献５にアドニキサンチンからＡｘへの変換は進行しにくいことが示されていることを総合して、ｃｒｔＷは比較的酸素が少ない条件でも活性を発現するが、ｃｒｔＺは比較的酸素濃度が高い条件を要求することが推測されていた。また、ｃｒｔＺが優先的に作用する経路ではアドニキサンチンからＡｘへの工程が進行しにくいことから、ｃｒｔＷとｃｒｔＺが適切な比率で進行するような酸素濃度で培養を行うことがＡｘ生産には好ましいことが推測されていた。しかしながら、これらの報告には具体的な酸素濃度が示されておらず、工業的な応用に十分な情報はこれまで得られていなかった。
【００１０】
かかる問題の解決のため、Ｎ−８１１０６株やその変異株の培養において、特定のＤＯ及び酸化還元電位（ＯＲＰ）で培養する方法が開示されている（例えば、特許文献４参照）。当該文献によれば、Ｎ−８１１０６株やその変異株がアスタキサンチンを良好に生産する条件は培養液のＤＯが０．１ｐｐｍ以下であり、かつＯＲＰは−１５０ｍＶ付近である条件である。この文献によれば、より酸化的な条件においても還元的な条件においてもアスタキサンチンの収量が低下する。特に酸化的な条件においては、たとえＤＯが０．１ＰＰＭ以下であっても、ＯＲＰが−１００ｍＶとなった場合には生産が阻害される。さらにはＤＯが１ｐｐｍ（約１５％飽和に相当する）となった場合にはアスタキサンチンの収量は極端に低下し、アドニキサンチンが主に生産されることが開示されている。
【００１１】
通常の培養でＤＯの測定はＤＯ電極により行われるが、ＤＯ電極の測定感度は一般的に０．１ｐｐｍ以下にある。従って、かかる状況のもとではＤＯ電極を用いた酸素制御法では電極の感度の問題から制御が困難であり、そのための好的な指標としてＯＲＰが選択された。しかしながら当該発明では天然培地を用いて一定通気量・一定撹拌速度で培養した場合の平均的なＤＯや酸化還元電位が示されているにすぎなかった。天然培地を用いた条件で醗酵槽中の微生物の菌体の密度が低い場合にはＯＲＰ位は有効な指標となるが、合成培地を用いた場合には上記の方法では限界が存在した。すなわち、微生物の培養においては、微生物が増殖すると、培地中の栄養源が消費されるため培地組成も変化していき、ＤＯ以外の条件もＯＲＰに影響を及ぼすためである。ペプトンや酵母エキスを主体とする天然原料ではこのような影響を受けにくいため有効な方法であった。しかしながら原料価格などの経済的な理由や原料のロット間差を低減する必要が存在する場合は、無機塩を主体とした合成培地が一般的に利用される。合成培地ではＯＲＰが栄養源の消費に伴い大きく影響をうけるため、酸素供給量の調節に関する好適な指標の提供が求められていた。
【００１２】
他の細菌として、新属の細菌による例も報告されており、ＤＯ電極を用いた制御により目的のカロテノイドを得る方法が開示されている（例えば、特許文献５参照）。この文献に寄れば、Ａｘ生産に好的な条件は２０〜３０％飽和のＤＯで培養することであり、当該文献では４０％飽和を超えるＤＯではアドニキサンチンの割合が高くなり、０〜１０％ではフェニコキサンチン、カンタキサンチン、アドニルビンおよびβ−カロテンなどの生産割合が高くなることが記述されている。
【００１３】
しかしながらＤＯ電極による方法は先に述べたとおり０．１ｐｐｍ以上のＤＯで制御する場合には有効であるものの、０．１ｐｐｍ以下で制御を行なう場合には適用が困難である。また、本文献においても培養の初めから最後までのＤＯの制御目標値が示されているだけであり、実際の培養における溶存酸素濃度の変動パターンやそれが与える生産性への影響、特に微生物菌体の収量には全く触れられていなかった。
【００１４】
以上のようにＡｘ生産量を高める方法として様々な方法が報告されているが、何れの方法も当該微生物によるＡｘの工業生産においては問題点が存在していた。
【００１５】
また、いずれの文献においても、他のカロテノイドに比較してＡｘ生産割合を高める方法が示されているのみであり、微生物の増殖に好適な条件は示されていなかった。
【００１６】
当該発明の対象となる細菌のみならず、ファフィア酵母やヘマトコッカス藻などのカロテノイド生産性微生物はカロテノイドをその細胞内に蓄積する。従って微生物の培養によるカロテノイドの生産においては、生産の場となる微生物細胞を高収量で得ることが必要である。
【００１７】
また、微生物の培養により物質生産を行なう場合に、菌体増殖と目的物生産では好適な条件が異なる場合があることは良く知られたことである。特にＡｘは微生物菌体内に蓄積するので、Ａｘを高収量に得るためには菌体とＡｘの双方をバランスよく生産する必要があった。しかしながら、Ａｘの細菌による生産法においてはこの課題を解決する方法が全く知られていなかった。
【特許文献１】米国特許第４２８３５５９号明細書
【特許文献２】特許第３５７０７４１号公報
【特許文献３】特開２００５−５８２１６号公報
【特許文献４】特開２００５−８０６２５号公報
【特許文献５】特開２００１−３５２９９５号公報
【非特許文献１】Ａｎｄｒｅｗｓ，Ａ．Ｇ．ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１５，１００３，１９７６年
【非特許文献２】Ｒｅｎｓｔｏｒｍ，Ｂ．ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０，２５６１，１９８１年
【非特許文献３】Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８，１８４２，１９９４年
【非特許文献４】Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ａ．＆  Ｍｉｋｉ，Ｗ．、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，１２８，１３９，１９９５年
【非特許文献５】Ｆｒａｓｅｒ，Ｐ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，６１２８，１９９７年
【非特許文献６】海洋バイオテクノロジー研究所ホームページ、株式会社  海洋バイオテクノロジー研究所、ＭＢＩＣ（菌株コレクションデータベース）、［ｏｎｌｉｎｅ］、９ページ目の「ｃａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ」、「ｓｔｒａｉｎ  ｎａｍｅ」及び「１６ｓ」の項、  ［２００５年６月８日検索］、インターネット：＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｃｏｄ．ｍｂｉｏ．ｃｏ．ｊｐ／ｍｂｉｈｐ／ｊ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ＞
【非特許文献７】国立遺伝学研究所ホームページ、大学共同利用機関法人  情報・システム研究機構  国立遺伝学研究所  日本ＤＮＡデータバンク、”ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ”、［ｏｎｌｉｎｅ］、２００２年１０月８日、３ページ目の「ＯＲＩＧＩＮ」の項、［２００５年６月８日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ＞
【非特許文献８】米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈホームページ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、［ｏｎｌｉｎｅ］、２００２年１０月８日、４頁目の「Ｓｏｕｒｃｅ  ｏｒｉｇｉｎｅ」および「Ｆｅａｔｕｒｅｓ」の項、［２００５年１０月１８日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／＞
【非特許文献９】Ｃｈｏｉら、Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７，５１５，２００５年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の課題は、アスタキサンチン生産能を有する微生物を用いるカロテノイドの製造過程において、培養初期から中期に菌体増殖に適した条件において菌体密度を上昇させると共に、培養後期にアスタキサンチン生産を促進する条件に培養液の溶存酸素濃度を調節して微生物を培養する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、アスタキサンチン生産能を有する微生物を用いるカロテノイドの製造過程を詳細に解析した結果、増殖初期には培養液の溶存酸素濃度（以下、「溶存酸素濃度」を「ＤＯ」と略記することがある。）が高いほど比増殖速度が高いが、増殖中期においては培養液の溶存酸素濃度を０．１ｐｐｍ以下に保つことで比増殖速度の低下を抑制せしめうることを見出した。またこの際、単に培養液の溶存酸素濃度を０．１ｐｐｍ以下に保つだけでなく、醗酵槽内での微生物菌体量の増加にともなう酸素消費速度の上昇に合わせて培養槽への酸素供給量を上昇させることによりカロテノイド収量を向上せしめうることを見出した。
【００２０】
すなわち、当該微生物の培養において培養液のＤＯを０．１ｐｐｍを超えた濃度で培養すると初期には急速に増殖するが培養の早期に増殖が停止して菌体を高収量に得られず、その結果、菌体内に生産されるカロテノイド類も高収量に得られない。これに対して培養中期から培養液のＤＯを０．１ｐｐｍ以下に維持することで増殖の急激な低下が抑制されて菌体を高収量に得られ、その結果カロテノイド類も高収量で得られる。さらには醗酵槽内での微生物菌体量の増加にともなう呼吸速度の上昇に合わせて酸素供給量を上昇させていくことによりカロテノイド類のうちアスタキサンチンの生産が向上することを見出したのである。なお、０．１ｐｐｍは一般的に用いられる発酵槽用の溶存酸素電極の検出下限の値である。
【００２１】
また、培養中期の期間にＤＯを０．１ｐｐｍ以下に維持しつつ、供給ガスから培養液への酸素供給量を上昇させていくことで、リコペンからアスタキサンチンに至るアスタキサンチン生合成の中間体のカロテノイド類、例えばアスタキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノンおよびβ−カロテン等の生産量が、一定の酸素供給量で培養した場合に比べて向上することも見出した。さらに培養の後期において０．１ｐｐｍを超えるＤＯとすることでアスタキサンチンの生産量が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２２】
すなわち本発明は、アスタキサンチン生産能を有する微生物を含む培養液が入った発酵槽へ酸素を含むガスを供給しながら培養してカロテノイド類を製造する方法において、培養中期における培養液の溶存酸素濃度を０．１ｐｐｍ以下とする発酵法によるカロテノイド類の製造方法である。
【００２３】
また本発明は、培養中期における培養液中の溶存酸素濃度を０．１ｐｐｍ以下に維持しつつ前記醗酵槽への酸素供給量を上昇させて培養する発酵法によるカロテノイド類の製造方法である。
また本発明は、醗酵槽への酸素供給量の上昇が、培養中期中に断続的に行われる発酵法によるカロテノイド類の製造方法である。
【００２４】
また本発明は、カロテノイド類が、アスタキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノンおよびβ−カロテンからなる群より選ばれるいずれか一種または複数種からである発酵法によるカロテノイド類の製造方法である。
また本発明は、培養後期における培養液中の溶存酸素濃度が０．１ｐｐｍを超えるように醗酵槽へ酸素を含むガスを供給し、生成するカロテノイド類中のアスタキサンチンの存在比率を３０％以上にする発酵法によるカロテノイド類の製造方法である。
【００２５】
また本発明は、微生物が、アスタキサンチン生産能を有する細菌であり、さらには細菌が、アスタキサンチン生産能を有するパラコッカス属細菌である発酵法によるカロテノイド類の製造方法である。
【００２６】
また本発明は、パラコッカス属細菌が、Ｎ−８１１０６株の改変株である発酵法によるカロテノイド類の製造方法である。
【００２７】
また本発明は、Ｎ−８１１０６株の改変株が、Ｎ−８１１０６株に対し自然突然変異または変異原物質や紫外線等による人為的操作で誘発して得られる変異株である発酵法によるカロテノイド類の製造方法である。
【００２８】
また本発明は、Ｎ−８１１０６株の改変株が、Ｎ−８１１０６株に対し遺伝子操作を施した組換え株である発酵法によるカロテノイド類の製造方法である。
【００２９】
また本発明は、Ｎ−８１１０６株の改変株が、ＴＳＮ１８Ｅ７株（受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４６）、ＴＳＴＴ００１株（受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６７０）又はＴＳＴＴ００３１株（受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６８９）である発酵法によるカロテノイド類の製造方法である。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、以下の効果を奏することができる。
（１）本発明では培養中期の溶存酸素濃度を０．１ｐｐｍ以下に維持して培養することにより、菌体を高収量に得られ、その結果、菌体内に生産されるカロテノイドを高収量に得られる。
（２）さらに本発明では培養中期に溶存酸素濃度を０．１ｐｐｍ以下に維持しつつ、微生物の増殖に合わせて酸素供給量を上昇させていくことでカロテノイドをさらに高収量に得られる。
（３）また培養後期において溶存酸素濃度を０．１ｐｐｍを越える濃度とすることでアスタキサンチンを生産させることができる。アスタキサンチンは菌体細胞内に蓄積して生産されるが、本発明の培養中期の条件で大量に増殖した菌体細胞が、それぞれ大量のアスタキサンチンを溜め込むため、高い生産性を得ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下に本発明の詳細を説明する。
【００３２】
本発明に用いる微生物としては、アスタキサンチン等のカロテノイド類を生産する能力を有する微生物であれば特に限定はないが、この内でもカロテノイド類を生産する能力を有する細菌が好ましく、カロテノイド類を生産する能力を有するパラコッカス属細菌が特に好ましい。
【００３３】
このような細菌として、例えばＮ−８１１０６株やその変異株が挙げられる。Ｎ−８１１０６株は当初アグロバクテリウム・アウランティアカム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）ｓｐ．ｎｏｖ  Ｎ−８１１０６（独立行政法人特許生物寄託センターへの受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０２３）と同定されたが、その後１６Ｓ  ｒＲＮＡ（１６Ｓ  リボゾームＲＮＡ）遺伝子配列の分析結果を加えることで、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属に再同定された（非特許文献６〜９参照）。
【００３４】
また、その変異株として、ＴＳＮ１８Ｅ７株（独立行政法人特許生物寄託センターへの受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４６）やＴＳＴＴ００１株（独立行政法人特許生物寄託センターへの受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６７０）、ＴＳＴＴ００３１株（独立行政法人特許生物寄託センターへの受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６８９）が存在する。またこれらの遺伝子組換え体を用いることもできる。なお、本明細書中では変異株と遺伝子組換え体を総称して改変株と称する。
【００３５】
本発明に用いる培養液としては、カロテノイド類を生産する能力を有する微生物が増殖でき、カロテノイド類を生産しうるものであればいずれを使用してもよい。たとえば炭素源にはグルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、デンプン、乳糖、グリセロール、酢酸、またはこれらを主成分として含む天然物（例えば糖蜜）などが、窒素源にはコーンスティープリカー、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕等の天然成分や、アンモニア水、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等のアンモニア及び、アンモニア塩や、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン等のアミノ酸類が、無機塩にはリン酸２ナトリウム、リン酸１ナトリウム、リン酸２カリウム、リン酸１カリウム等のリン酸塩等が、金属イオンには硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、クエン酸鉄、塩化第一鉄、塩化第二鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、塩化マンガン、塩化銅などが、ビタミン源として酵母エキス、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシン、ビオチン、葉酸、コリン等が使用できる。
【００３６】
培養温度およびｐＨは上記菌株が生育する条件でよく、たとえば１０〜４０℃、ｐＨ６〜８とするのが好ましい。
【００３７】
本発明では、カロテノイド類を生産する能力を有する微生物を上記の培地で培養する。培養にあたり、培養前期では酸素を含有する培地中でまず増殖させ、次いで培養中期において培養液のＤＯを０．１ｐｐｍ以下に維持して培養する。これにより増殖速度の低下が抑制され、０．１ｐｐｍ以上で培養した場合に比べて微生物菌体を高収量に得ることができ、その結果、カロテノイド類を高収量に得ることができる。また、培養に用いる微生物（菌）の増殖による菌体量の増加に合わせて酸素供給量を増加させる。このことによりカロテノイドをさらに高収量に得ることができる。さらに培養後期において単位培養液あたりの微生物の存在量（菌体密度）が十分に上昇した段階で培養液のＤＯを、０．１ｐｐｍを超えるように上昇させることにより、菌体と総カロテノイドの生産量は上述の操作のみを行った場合に比べて若干低下するが、Ａｘを高収量に生産することができる。
【００３８】
なお、本明細書中における培養前期とは培養を開始より任意の酸素供給条件下で微生物を増殖させ、微生物が最も活発に増殖している期間を称する。培養前期と培養中期の境界は培養条件等により大きく影響されるために、物理化学的な計測値に基づいて一義的に決定することは困難であり、そのため実験の試行錯誤により経験的に設定されるが、簡易に前期の終了を知る方法として、一定の酸素供給量で培養を行い、微生物の増殖に伴う酸素消費速度の増加によりＤＯを減少させ、培養液中のＤＯが０．１ｐｐｍ以下に達した時期を上げることができる。
【００３９】
培養中期とは培養前期の終了から、微生物菌体が十分に生育するまでの期間をいう。この期間も培養条件や菌株の種類により変動するので、実験の試行錯誤により経験的に設定されることが好ましいが、一つの指標として、予め上記に記載培地で溶存酸素濃度を０．１ｐｐｍ以下に保って培養を行い到達しうる最大の菌体密度を求めておき、同じ条件で再度培養を行って菌体密度が最大値の５０〜９８％程度の菌体収量に到達する期間、好ましくは６０〜９５％に到達するまでの任意の時点までを培養後期とすることができる。
【００４０】
その後、培養に用いた微生物（菌体）は徐々に増殖を停止し、さらに溶菌していくが、菌の増殖や溶菌とは関わりなく、カロテノイド類、特にアスタキサンチンの生産量が最大値を超えるまでの期間を培養後期と称する。
【００４１】
またこの際、培養中期においては培養液中の溶存酸素濃度（ＤＯ）が０．１ｐｐｍ以下に保たれていることを確認するため酸素濃度を測定するが、その測定法には特に制限はなく、培養液に直接設置あるいはその一部を採取して溶存酸素電極を用いて測定する方法や、培養液の一部を採取して亜硫酸ナトリウムによる滴定法等を用いることができる。
【００４２】
培養中期において培養液中のＤＯを０．１ｐｐｍ以下の範囲を保ちつつ、酸素供給量を上昇させていくことが好ましいが、酸素供給量を上昇する方法は、培地の撹拌速度を上げる方法、供給ガスの通気量を上げる方法、通気ガスの酸素分圧を上げる方法など、いずれの方法を用いてもよい。
【００４３】
酸素供給量は、酸素移動容量係数（ｋＬａと略記される。容量係数とも称される。単位：ｈ−１、）や気相から液相への酸素移動速度（Ｏｘｙｇｅｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｒａｔｅ、以下「ＯＴＲ」と略記する。酸素吸収速度、Ｏｘｙｇｅｎ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｒａｔｅとも称される。単位：ｍｍｏｌ／Ｌ・ｍｉｎ）を指標として設定されることが好ましい。ｋＬａやＯＴＲは上記の様々な酸素供給量の調節法を用いる場合や異なる培養装置を用いる場合において共通の制御の指標となる。これらは培養装置や培地の成分によって決まる物理量なので、実際の培養に使用する培地と実際に使用する培養装置を用いて予め測定しておく。なお、ｋＬａとＯＴＲの間には次式（１）の関係があり（例えば、山根恒夫、「生物反応工学（第３版）」、産業図書、２００２年４月１０日、ｐ．２４１−２６０、および、Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ＆Ａ．Ｗｈｉｔａｋｅｒ、石崎文彬訳、「発酵工学の基礎、実験室から工場まで」、学会出版センター、１９８８年９月１日、ｐ１７２−１８９を参照）、互換性があるため、どちらかを任意に用いることができる。
【００４４】
ＯＴＲ＝ｋＬａ（［ＤＯ］＊−［ＤＯ］）          （１）
【００４５】
式（１）中、［ＤＯ］＊は気相中の酸素分圧と平行な培養液中の溶存酸素であり（単位：ｍｍｏｌ／Ｌ）、［ＤＯ］は実際の溶存酸素濃度である（単位：ｍｍｏｌ／Ｌ）。
【００４６】
ｋＬａの測定方法に特に限定はなく、亜硫酸ナトリウム酸化法、ＤＯ電極法、直説法、反応吸収法、排気ガス分析法などいずれの方法を用いることができる。特に排気ガス分析法では実際の培養を行いながら、かつ培養に影響が少なく測定できるため好ましく用いることができる。また、培養系のｋＬａと通気撹拌効果の関係を検討する方法として最も簡単な方法であるという特徴を有する。この方法ではＯＴＲはＷａｎｇらの計算式により算出される。すなわち次式（２）に示す通りである。
【００４７】
【数１】
2007244222.tif 000002
【００４８】
式（２）中、Ｑは通気量（単位：Ｌ／ｈ）、Ｐは圧力（単位：ａｔｍ）、Ｔは気体温度（単位：Ｋ（絶対温度））、ｙは気体中の酸素のモル分率（単位：無単位）、ＶＬは培養液量（単位：Ｌ（リットル））である。また、ＱｉＰｉｙｉ／Ｔｉに示される「ｉ」は発酵槽の入り口における値を意味し、ＱＯＰＯｙＯ／ＴＯに示される「Ｏ」は発酵槽の出口における値を意味する。７．３２×１０５は６０ｍｉｎ／ｈ、１ｍｏｌ／２２．４Ｌ、２７３Ｋ／１ａｔｍの換算係数である。
【００４９】
実験室レベルの培養（容量が数ｍｌから数十リットルの培養）では、Ｑ、Ｐ、Ｔの入口と出口の差は事実上無視できる差であるため、ＯＴＲは入口と出口での酸素のモル分率差により一義的に決めることができる。
【００５０】
以下にｋＬａとＯＴＲを撹拌速度により調節する場合の測定法の一例を説明する。まず、一定通気量のもと、所定の速度で撹拌しつつ培養を行い、排気ガス中の酸素分圧を測定してＯＴＲを計算する。次いで撹拌速度を変更すると、それに伴い排気ガス中の酸素分圧が変化するので、そのときの酸素分圧よりその撹拌速度でのＯＴＲを測定する。この操作を繰り返して撹拌速度とＯＴＲの関係を解析する。
【００５１】
ｋＬａは式（２）に従って測定したＯＴＲより、上記式（１）に従って計算する。このとき、溶存酸素濃度はＤＯ電極を用いて測定するが、測定の精度を高めるためには［ＤＯ］＊−［ＤＯ］の値が大きい状態であることが好ましく、例えば、培養系の溶存酸素が微生物に消費されつくした状態、すなわち［ＤＯ］＝０の状態で測定されることが好ましい。
【００５２】
なお、上記のように測定した撹拌速度とｋＬａの関係は指数関数で近似することができる。すなわち下式（３）の関係で表せる。
【００５３】
ｋＬａ＝α×ｅｘｐ（ｒ×β）      （３）
【００５４】
式（３）中、ｋＬａとは酸素移動容量係数（単位：ｈ−１）を意味する。ｒは撹拌速度（単位：ｒｐｍ）、αおよびβは、上記のｒとｋＬａの測定値から最小二乗法による計算で求められる定数（単位：任意単位）である。
【００５５】
実際の培養において、目的のｋＬａを得るために必要な回転速度は式（３）から求めることができる。酸素供給量を撹拌速度以外の因子により調節したい場合、例えば通気量や供給ガス中の酸素ガス分圧により調節する場合には、上記の撹拌速度を目的の因子に置き換えて実験を行えばよい。なお、上記の方法は実験室レベルの培養（容量が数ｍｌから数十リットルの培養）において有効な方法であり、さらに大きな培養では、培養系内の物質の濃度分布、圧力分布等の要因が影響するために、様々な補正が必要である（例えば、Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ＆Ａ．Ｗｈｉｔａｋｅｒ、石崎文彬訳、「発酵工学の基礎、実験室から工場まで」、学会出版センター、１９８８年９月１日、ｐ１７２−１８９を参照）。
【００５６】
本発明における培養中期での酸素供給量を上昇させる幅については、溶存酸素が０．１ｐｐｍを超えない範囲であれば任意に設定できるが、好ましくはｋＬａとして１〜３０、より好ましくは５〜１０程度に上昇させる。その状態で１分から１時間、好ましくは５〜３０分程度の間、ＤＯ計の指示値、および排ガス分析計の酸素ガス濃度の指示値を観察する。この間にＤＯ計の指示値が０．１ｐｐｍ未満にあることを確認する。また酸素ガス濃度の指示値はｋＬａの上昇により、当初安定していた値から減少しはじめ、やがて一定の値で安定したことを確認する。両者が確認できた後にｋＬａを同様に上昇させる操作を、ＤＯ計の指示値が０．１ｐｐｍを超えるまで繰り返す。ＤＯ計の指示値が０．１ｐｐｍを超えた場合は直ちにｋＬａを上昇する直前の値に設定し、培養を継続する。
【００５７】
この操作は培養中期の間に１回以上の回数、１時間から数十時間の間隔おいて、好ましくは２０〜５０時間程度の間隔をおいて行うことができる。この操作を行わない場合にも微生物菌体やカロテノイドは高収量に得られるが、これを行うことでカロテノイド収量がさらに高収量に得られる。
【００５８】
培養後期にＤＯを上昇させる方法にも特に限定はなく、上記と同様に、通気撹拌培養条件下で撹拌速度を上げる方法、供給ガスの酸素分圧を上げる方法、供給ガスの流量を上げる方法などが例としてあげられる。この操作により、カロテノイド類のうちでアスタキサンチンの生産量が選択的に上昇していき、全カロテノイド中の３０％以上をしめるカロテノイド混合物が得られる。酸素供給量の上昇の目安は、微生物の呼吸活性が低下してＤＯが上昇を始める程度のものである。酸素供給量の上昇が不十分で一度ＤＯが上昇しても再び低下を始める様な場合は十分にアスタキサンチンが生産されないだけでなく、カロテノイドの収量も低下するので好ましくない。
【００５９】
本発明におけるカロテノイドの定量方法は、菌体または培養液から安定に効率よく抽出し定量できれば特に限定はなく、例えば抽出溶媒としてメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジクロロメタン、クロロフォルム、ジメチルフォルムアミド、ジメチルスルフォキシド、酢酸エチル等が用いられる。抽出されたカロテノイドの定量には、各種カロテノイドが分離され、定量性に優れる高速液体クロマトグラフィーにより行うことが好ましいが、比色定量などで行うこともできる。
【００６０】
カロテノイドの回収方法にも特に限定はないが、菌体を回収してそのまま、或いは乾燥して使用することができるし、定量の方法として述べたものと同様の方法で抽出して使用することもできる。抽出液をそのまま用いることも可能であり、さらに精製して使用することもできる。またこれらの菌体、抽出物或いは精製物を、それぞれ単独で用いることもでき、これらを任意の割合で混合して用いることもでき、また他の任意の物質と混合して用いることもできる。
【００６１】
（実施例）
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお本発明は、これらの実施例のみに限定されるものではなく、発明の要旨を逸脱しない範囲で、任意に変更が可能であることは言うまでもない。
【００６２】
カロテノイドの定量法
カロテノイドの定量は以下の方法で行った。すなわち、培養終了後培養液１００μｌを１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブに回収し、トミーＣＲ−１５型遠心分離器（トミー精工株式会社製）で１５０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離を行ない沈澱した菌体を得た。この菌体を２０μｌの純水に懸濁し、次いで２００〜１０００μｌのジメチルフォルムアミドを加えて振盪し、さらにアセトン２００〜１０００μｌを加えてアスタキサンチンの抽出を行なった。抽出残渣をトミーＣＲ−１５型遠心分離器で１５０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離を行なって除去した後、ＴＳＫ  ｇｅｌ−ＯＤＳ８０ＴＭカラム（東ソー株式会社製）を用いた高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと略記する）でカロテノイドの定量を行なった。移動相にはＡ溶媒として水／メタノール（５／９５）の混合溶媒を、Ｂ溶媒としてテトラヒドロフラン／メタノール（４０／６０）の混合溶媒を用いた。検出は４７０ｎｍの吸光度の測定によった。典型的なＨＰＬＣのパターンを図２に示した。
【００６３】
（実施例１）  ＴＳＮ１８Ｅ７株の培養によるアスタキサンチン含量の高いカロテノイド類の製造
表１に示した組成の培地３００ｍｌを５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに入れ１２１℃、２０分間で滅菌後、Ｎ−８１１０６株の変異株の一つであるＴＳＮ１８Ｅ７株（独立行政法人特許生物寄託センターへの受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４６）を植菌し、２５℃で１日間、毎分１００回転の振とう速度で前々培養を行なった。次いで表２に示した組成の培地１００ｍｌを５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに入れ１２１℃、２０分間で滅菌し、上記培養液５ｍｌを植菌して２５℃で約１８時間、毎分１００回転の振とう速度で前培養した。さらに、表３に示す組成の培地約２．３Ｌを５Ｌの発酵槽に入れ、１２１℃、２０分間で滅菌後、得られた上記培養液９０ｍｌと金属塩を添加し本培養を開始した。培養温度は２２℃、ｐＨは７．０〜７．４とした。培養時ｐＨは微生物の増殖に伴って低下するので１０％アンモニア水の添加によりｐＨを調節した。また本操作により培養液中のアンモニア濃度は０．５ｇ／Ｌ以下に維持された。また１ＶＶＭで空気を通気し、ｋＬａが９０（ｈ−１）となる撹拌速度で撹拌することで酸素供給を行った。培養装置には千代田製作所社のＴＦＬ−３を使用したが、本装置を用いて上記の通気量とした場合には３９０ｒｐｍがその撹拌速度に相当した。また排ガス分析装置はエイブル社のＤＥＸ−２５６２を使用した。
【００６４】
【表１】
2007244222.tif 000003
【００６５】
【表２】
2007244222.tif 000004
【００６６】
【表３】
2007244222.tif 000005
【００６７】
培養開始より約２０時間後、ＤＯがほぼ０．１ｐｐｍとなった時点で回転速度を徐々に上昇させたところ、ｋＬａが１２０ｈ−１（４２０ｒｐｍ）を越えた時点で、ＤＯが上昇し始めたので、直ちにｋＬａを１２０ｈ−１にもどして培養を継続した。またほぼ同時期（培養開始後約２０時間）に培養液中のグルコースが菌の消費より５ｇ／Ｌに低下したので、５００ｇ／Ｌのグルコースの流加を開始し、グルコース濃度を０〜５ｇ／Ｌの範囲内に維持した。
【００６８】
さらに約４８時間目より撹拌速度を徐々に上昇させたところ、ｋＬａが１５０ｈ−１（４６０ｒｐｍ）となった時点でＤＯが上昇し始めたので、直ちにｋＬａを１５０ｈ−１に戻してさらに培養を継続した。
【００６９】
以上の様に培養を繰り返したところ、約８０時間目に予め求めた最大菌体収量（ＯＢ６６０ｎｍ＝１８０；単位、任意単位、５４ｇ／Ｌの菌体に相当、後述する実施例３における菌体収量）の６１％に達したため（ＯＢ６６０ｎｍ＝１１０；単位、任意単位）、以降を培養後期とすることとしてｋＬａを１６０ｈ−１（４７０ｒｐｍ）までに上昇させた。その結果、約９０時間目から溶存酸素の濃度が徐々に上昇をはじめ、１００時間目には５０％飽和付近（約４ｐｐｍ）まで上昇した。
【００７０】
Ａｘの生産量は約８０時間目において９０ｍｇ／Ｌ以下だったが、酸素供給量を向上させたことにより、１００時間目には約５００ｍｇ／Ｌにまで向上した。また、菌体収量の指標となる培養液の６６０ｎｍの濁度は１１０から１４０に上昇した。
【００７１】
その後さらにｋＬａを２３０ｈ−１（５１０ｒｐｍ）まで上昇させ、溶存酸素を飽和濃度に近づけたが、既に菌の活性は低下しており、Ａｘの生産は若干上昇した程度に留まった。菌の生育とカロテノイド生産のパターンを図３に、酸素供給量の制御の結果を図４に、それぞれ示した。
【００７２】
最終的なＡｘ生産量は５３０ｍｇ／Ｌであり、この他にアドニキサンチンが９７ｍｇ／Ｌ、フェニコキサンチンが１０８ｍｇ／Ｌ、カンタキサンチンが９３ｍｇ／Ｌ、エキネノンが２３ｍｇ／Ｌ、生成していた。以上の菌体収量及びカロテノイド生産量を表４に示した。またこれらの他にもβ−カロテンなどと推定される複数種のカロテノイドが観察されたが、微量であったため同定・定量しなかった。以上のことより本菌株では、培養液の濁度が１００に到達した段階で酸素供給量を呼吸速度以上に上昇させＤＯを向上させることで、Ａｘを効率よく生産させられることが判明した。
【００７３】
【表４】
2007244222.tif 000006
【００７４】
（実施例２）ＴＳＮ１８Ｅ７株の培養によるカロテノイド類の製造
培養開始後、約２０時間後よりｋＬａを徐々に上昇させ１２０（ｈ−１）に設定したが、それ以降はｋＬａを上昇させず、１２０（ｈ−１）のｋＬａを維持して培養したことを除き、実施例１と同様の操作による培養を１５０時間おこなった。菌の生育とカロテノイド生産のパターンを図５に、酸素供給量の制御の結果を図６に、それぞれ示した。
【００７５】
溶存酸素は培養中期には０．１ｐｐｍ以下に維持されたが、１４０時間後以降、菌の呼吸活性の低下により溶存酸素濃度が徐々に上昇し、２０％飽和（約１６ｐｐｍに相当する）付近となった。
【００７６】
培養終了後の培養液の６６０ｎｍの濁度は２００（単位；任意単位。菌体密度６０ｇ／Ｌに相当）に達した。この培養によりＡｘは３００ｍｇ／Ｌが生産されたに過ぎなかった。その他のカロテノイドとしてアドニキサンチン４６ｍｇ／Ｌ、フェニコキサンチン３３０ｍｇ／Ｌ、カンタキサンチン２２０ｍｇ／Ｌ、エキネノン２６０ｍｇ／Ｌが生産された。以上の菌体収量及びカロテノイド生産量を表４に示した。
【００７７】
以上の事から培養中期に溶存酸素０．１ｐｐｍに維持したまま、酸素供給量を上昇することで、実施例３と同等の菌体収量が得られ、また実施例３よりも高収量にカロテノイドが得られることが判明した。
【００７８】
（実施例３）ＴＳＮ１８Ｅ７株の培養によるカロテノイドの製造
培養開始より終了までの期間を通してｋＬａを９０（ｈ−１）に維持して培養したことを除き、実施例１と同様の操作による培養を１２０時間おこなった。培養中期から終了までの溶存酸素濃度は０．１ｐｐｍ以下に維持された。菌の生育とカロテノイド生産のパターンを図７に、酸素供給量の制御の結果を図８に、それぞれ示した。
【００７９】
培養終了後の培養液の６６０ｎｍの濁度は１８０（単位；任意単位）に達した。この培養液の１００ｍｌを遠心分離して菌体を回収し、凍結乾燥を行った後に回収された固形分（菌体）の重量を測定することにより、６６０ｎｍの濁度が１８０の培養液中の菌体密度は５４ｇ／Ｌであることが判明した。また、本結果よりＴＳＮ１８Ｅ７株を表３の培地を用いて溶存酸素濃度０．１ｐｐｍ以下で培養した場合の最大菌体収量は５４ｇ／Ｌと特定された。
【００８０】
この培養によりＡｘは１８０ｍｇ／Ｌが生産されたに過ぎなかった。その他のカロテノイドとしてアドニキサンチン４０ｍｇ／Ｌ、フェニコキサンチン１４５ｍｇ／Ｌ、カンタキサンチン９７ｍｇ／Ｌ、エキネノン１３５ｍｇ／Ｌ、およびβ−カロテン  １５ｍｇ／Ｌが生産された。以上の菌体収量及びカロテノイド生産量を表４に示した。以上の事から培養中期の溶存酸素濃度を０．１ｐｐｍ以下とすることで、比較例１に示す０．１ｐｐｍを越える濃度で培養した場合に比べて菌体収量およびカロテノイドともに高収量に得られることが判明した。
【００８１】
（比較例１）ＴＳＮ１８Ｅ７株の培養における０．１ｐｐｍを超えるＤＯの影響
実施例１と同様に培養を開始したが、２０時間後にＤＯが０．１ｐｐｍ付近となった後、ＤＯを２％飽和（約０．１６ｐｐｍ）で維持するように、溶存酸素電極指示値からの撹拌速度のフィードバック制御を行った。
【００８２】
この結果、増殖阻害が生じ、培養開始後４５時間、６６０ｎｍの濁度が６０に達した段階で増殖が停止した。この時点におけるＡｘ生産量は６．２ｍｇ／Ｌに過ぎなかった。その後、ＤＯを２％飽和で維持したまま、さらに５５時間まで培養を継続したがＡｘ収量は１８ｍｇ／Ｌまで向上したに過ぎなかった。菌の生育とカロテノイド生産のパターンを図９に、酸素供給量の制御の結果を図１０に、それぞれ示した。
【００８３】
その他のカロテノイドとしてもアドニキサンチン８ｍｇ／Ｌ、フェニコキサンチン２７ｍｇ／Ｌ、カンタキサンチン２４ｍｇ／Ｌ、エキネノン８８ｍｇ／Ｌ、β−カロテン３４ｍｇ／Ｌが生産された。以上の菌体収量及びカロテノイド生産量を表４に示した。β−カロテンが実施例１〜３より高い値となったことを除き、カロテノイド収量は全体的に実施例１〜３より低収量にしか得られなかった。
【００８４】
以上の結果より、培養中期の溶存酸素濃度を０．１ｐｐｍを越える濃度とした場合、実施例１に比較して菌体が十分に向上せず、Ａｘを初めとするカロテノイド類も実施例１と比較して低収率にしか得られないことが判明した。
【００８５】
（実施例４）  ゲラニルゲラニル２リン酸合成遺伝子発現ベクターの作製
定法に従いパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．Ｎ−８１１０６株のゲノムＤＮＡを調製した。次いで、ゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素遺伝子（ｃｒｔＥ）領域をＰＣＲで増幅した。増幅に用いるプライマーは配列番号１と配列番号２の組み合わせである。増幅される領域は約１．２  ｋｂａｓｅであり、この増幅ＤＮＡをＰｃｒｔＥ１ｃｒｔＥとした。塩基配列を配列番号３に示す。増幅ＤＮＡの作製は、先ず、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下ＰＣＲと略記する）で行い、テンプレートとなる調製ゲノムＤＮＡ  １．０  μＬに、水１６．５  μＬ、２×Ｈｉｇｈ  ＧＣ緩衝液（タカラバイオ社製）を２５  μＬをそれぞれ添加し、９４℃で１０  分間加熱した。氷冷後、ｄＮＴＰ  ５  μＬ、配列番号１  の１０  ｐｍｏｌ／μＬのフォワードプライマー  ２．０  μＬ、配列番号２の  １０  ｐｍｏｌ／μＬのリバースプライマー２．０  μＬを添加し、最後にｅｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ  （タカラバイオ社製）０．５  μＬを加えた。反応は９４℃、３０秒のステップ、次いで６０℃、３０秒の第２のステップ、最後に７２℃、２分の第３ステップを３０サイクル行い、最後に７２℃、７  分間反応させた。増幅された断片をアガロース電気泳動で確認し、抽出精製（キアゲン社製ＱＩＡｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）した。さらに、制限酵素Ｘｂａ  Ｉおよび  ＳａｃＩによって消化し、プラスミドベクターへの挿入末端を揃えた。
【００８６】
次いで、インサートが挿入されるプラスミドベクターであるｐＢＢＲ１ＭＣＳ２を制限酵素ＢｔｓＩ  およびＢｓｕ３６Ｉにより消化し不要なＤＮＡ鎖を脱落させた。フェノールクロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行い精製した。さらに、同ベクター上に制限酵素ＳａｃＩとＸｂａＩのサイト設計・導入するため、配列番号４および配列番号５に記載の一本鎖オリゴヌクレオチドをアニールさせ、制限酵素ＢｔｓＩ  およびＢｓｕ３６Ｉで消化したｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ２３７５１）由来の精製ＤＮＡ断片にライゲーションし、二本鎖が挿入されたベクターを取得した。これをｐＢＢＲ１ＭＣＳ２ｏｌｉｇｏとした。次いでｐＢＢＲ１ＭＣＳ２ｏｌｉｇｏを制限酵素ＳａｃＩおよびＸｂａＩにより消化し、インサート挿入末端を揃えた。この断片に、先に調製したＰｃｒｔＥｃｒｔＥをＸｂａＩ及びＳａｃＩで消化して得た断片をライゲーションし、５０  μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地により大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。任意のコロニーをピックアップし、培養後、プラスミド調製を行い、設計通りのコンストラクトであることを電気泳動により確認した。これをｐＢＢＲ１ＭＣＳ２ＰｃｒｔＥ１ｃｒｔＥとした。
【００８７】
（実施例５）  組換え株１の作製：ゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素のパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属細菌への導入
ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２ＰｃｒｔＥ１ｃｒｔＥをヒートショック法により大腸菌Ｓ１７−１株導入し、その上で大腸菌Ｓ１７−１株による接合伝達によりパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．の変異株を形質転換した。接合伝達は５０  μｇ／ｍｌのカナマイシン、１０  μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地により形質転換法により行った。カナマイシン耐性を獲得した任意の形質転換株を同ＬＢ培地で培養し（３７℃、１８時間）、プラスミド抽出キット（キアゲン社製）を用いてプラスミド抽出を行い、プラスミドが導入されたかどうか確認した。
【００８８】
次いで、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２ＰｃｒｔＥ１ｃｒｔＥプラスミドベクターを保持する大腸菌Ｓ１７−１株を５０  μｇ／ｍｌのカナマイシン、１０  μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＬＢ培地で培養し（３７℃）、対数増殖期の菌体を含む培養液を得た。濁度（ＯＤ６６０  ｎｍ）を測定し、０．１になるように同培地で希釈した。並行して、パラコッカス属細菌ＴＳＴＴ００１株も表１に示す培地で培養（２５℃）し、対数増殖期の菌体を含む培養液を得た。同様に濁度を測定し、１．０になるように同培地で希釈した。これらの溶液をそれぞれ１．０  ｍｌずつ５ｍｌ容のシリンジにとり、シリンジ内の溶液をメンブランホルダー（アドバンテック社製）に装着されたメンブレン上に集菌した。集菌後、メンブレンをホルダーから外し、同寒天培地上にのせ（菌体側を上向き）、接合伝達を行わせるための培養を行った（２５℃、４時間）。培養後、メンブレンを１．０  ｍｌの同培地に入れ、激しく攪拌することにより接合伝達完了体をメンブレンフィルターから分離した。この溶液を同培地で適当な濃度になるように希釈し、５０  μｇ／ｍｌのカナマイシン、１５μｇ／ｍｌのアミカシン（シグマ社製）を含む同寒天培地にスプレッドし、２５℃にて培養した。アミカシンの添加は大腸菌の増殖を抑えるために行った。
【００８９】
培養３日目に現れるコロニーをピックアップし、５０  μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＯＥＧ培地で培養（２５℃）しプラスミドを抽出した。プラスミド抽出は大腸菌ＪＭ１０９株と同様にキアゲン社のプラスミド抽出キットを利用して行った。この抽出溶液を０．９％のアガロースによる電気泳動を行ったところ、大腸菌Ｓ１７−１株に保持させたｐＢＢＲ１ＭＣＳ２ＰｃｒｔＥ１ｃｒｔＥと同一であり、大腸菌からパラコッカス属細菌へのプラスミド転移が成功したことがわかった。
【００９０】
（実施例６）組換え株１の培養におけるアスタキサンチン含量の高いカロテノイド類の製造
以下の点を除き、実施例１と同様に培養を開始した。すなわち、１）実施例４−２で作製した菌株を使用したこと、２）初期ｋＬａを７５（ｈ−１）としたこと、３）醗酵槽に入れる培地を表５に示すものとしたこと、および３）流加用のグルコース溶液に１５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを添加したことである。
【００９１】
【表５】
2007244222.tif 000007
【００９２】
培養開始後、８０時間目まで実施例１と同様の操作で培養を行ったところ、培養液の濁度は約２５０に到達していた（菌体密度６３ｇ／Ｌに相当。最大菌体収量の８６％、最大菌体密度；７３ｇ／Ｌ、実施例７に示した）。Ａｘは６４ｍｇ／Ｌが生産された。菌の生育とカロテノイド生産のパターンを図１１に、酸素供給量の制御の結果を図１２に、それぞれ示した。
【００９３】
この時点より以降を培養後期としてｋＬａを２６０（ｈ−１）に上昇した。この操作により、それまで０．１ｐｐｍ以下に保たれていたＤＯは４０％飽和（約４ｐｐｍ）まで上昇した。この状態で１２０時間まで培養を行ったところ、培養液の濁度は２９０まで上昇し、Ａｘ収量は４５０ｍｇ／Ｌまで上昇した。その他のカロテノイドとしてアドニキサンチン１７４ｍｇ／Ｌ、フェニコキサンチン１０１ｍｇ／Ｌ、カンタキサンチン１４８ｍｇ／Ｌ、エキネノン１０３ｍｇ／Ｌ、β−カロテン１０３ｍｇ／Ｌが生産された。以上の菌体生産量とカロテノイド生産量を表４にまとめた。
【００９４】
（実施例７）  組換え株の培養におけるカロテノイド類の製造
実施例６と同様に培養をおこなったが、初期ｋＬａを１３５（ｈ−１）としたことと、８０時間目に溶存酸素を上昇させる操作を行わないことの２点を変更し、１２０時間までＤＯを０．１ｐｐｍ以下に維持して培養を行った。培養終了後の６６０ｎｍの培養液の濁度は２９０だった。この培養液の１００ｍｌを遠心分離して菌体を回収し、凍結乾燥を行った後に回収された固形分（菌体）の重量を測定することにより、６６０ｎｍの濁度が２９０の培養液中の菌体密度は７３ｇ／Ｌだった。すなわち本結果よりＴＳＴＴ００１株の組換え株を表５の培地を用いて溶存酸素濃度０．１ｐｐｍ以下で培養した場合の最大菌体密度は７３ｇ／Ｌと特定された。
【００９５】
菌の生育とカロテノイド生産のパターンを図１３に、酸素供給量の制御の結果を図１４に、それぞれ示した。
【００９６】
この培養におけるＡｘの収量は４００ｍｇ／Ｌであり、溶存酸素濃度を０．１ｐｐｍ以上に上昇させる操作を行わなかったため、実施例６に比較して低い値となったが、アドニキサンチン４８ｍｇ／Ｌ、フェニコキサンチン５６０ｍｇ／Ｌ、カンタキサンチン５３０ｍｇ／Ｌ、エキネノン３０ｍｇ／Ｌ、β−カロテン３００ｍｇ／Ｌが生産され、Ａｘ以外のカロテノイドは多量に生産された。以上の菌体生産量とカロテノイド生産量を表４にまとめた。
【００９７】
（比較例２）  組換え株の培養によるアスタキサンチン含量の高いカロテノイド類の製造において培養後期の酸素供給量増加が十分ではない場合
実施例６と同様に培養を実施したが、８０時間目のｋＬａを１６０（ｈ−１）とした。この操作で溶存酸素は一時的に２０％飽和（１６ｐｐｍ）にまで上昇したが、次第に減少して９０時間後に０．１ｐｐｍ以下となった。その後再びＤＯは上昇をはじめ、最終的に８０％飽和に達した。
【００９８】
菌の生育とカロテノイド生産のパターンを図１５に、酸素供給量の制御の結果を図１６に、それぞれ示した。
【００９９】
培養液の濁度は１２０時間後に３１０まで達したが、得られたアスタキサンチンの量は２８０ｍｇ／Ｌに過ぎなかった。その他のカロテノイドとしてアドニキサンチン４５ｍｇ／Ｌ、フェニコキサンチン３３４ｍｇ／Ｌ、カンタキサンチン３０５ｍｇ／Ｌ、エキネノン２１６ｍｇ／Ｌ、β−カロテン２１ｍｇ／Ｌが生産された。以上の菌体生産量とカロテノイド生産量を表４にまとめた。
培養後期での酸素供給量の増加が不十分である場合には、実施例４と比較してアスタキサンチンの収量が低下するだけでなく、実施例７に比較してカロテノイド収量が低下することが確認された。
【０１００】
（実施例８）  ゲラニルゲラニル２リン酸合成遺伝子とカロテノイド合成遺伝子群を組み合わせたプラスミドベクターの作製
実施例４に記載のｐＢＢＲ１ＭＣＳ２ＰｃｒｔＥ１ｃｒｔＥを制限酵素ＸｂａＩで消化した。切断末端をＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）により滑化し、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。次いで、三澤らの方法（Ｍｉｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７７、６５７５−６５８４、参照）に従ってプラスミドベクターｐＵＣＣＲＴを作製した。このプラスミドベクターを制限酵素ＢａｍＨ  Ｉで消化しカロテノイド合成遺伝子群（ｃｒｔＷ，  Ｚ，  Ｙ，  Ｉ，  Ｂ）を含むＤＮＡ断片を調製した。塩基配列を配列番号６に示す。このＤＮＡ断片を平滑化処理後、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。これを先に調製したｐＢＢＲ１ＭＣＳ２ＰｃｒｔＥ１ｃｒｔＥに挿入・ライゲーションし、５０  μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地により大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。任意のコロニーをピックアップし、培養後、プラスミド調製を行い、設計通りのコンストラクトであることを電気泳動により確認した。このコンストラクトをｐＢＢＲ１ＭＣＳ２ＰｃｒｔＥ１ｃｒｔＥＣＲＴとした。
【０１０１】
（実施例９）  組換え株２の作製：ゲラニルゲラニル２リン酸合成遺伝子とカロテノイド合成遺伝子群を組み合わせたプラスミドベクターの発現
ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２ＰｃｒｔＥ１ｃｒｔＥＣＲＴを実施例５と同様に大腸菌Ｓ１７−１株導入し、接合伝達によりパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．ＴＳＴＴ００１株を形質転換した。実施例４−２と同様に形質転換されたＴＳＴＴ００１株からプラスミドを抽出したところ、導入したｐＢＢＲ１ＭＣＳ２ＰｃｒｔＥ１ｃｒｔＥＣＲＴと同一であることを確認した。
【０１０２】
（実施例１０）  組換え菌２によるアスタキサンチンの製造
実施例９で作製した組換え株を、実施例６と同様の手法で培養を行った。菌の生育とカロテノイド生産のパターンを図１７に、酸素供給量の制御の結果を図１８に、それぞれ示した。
【０１０３】
この培養により１０１５ｍｇ／ＬのＡｘが生産された。その他にアドニキサンチン１５７ｍｇ／Ｌ、フェニコキサンチン３９ｍｇ／Ｌ及びカンタキサンチン４２ｍｇ／Ｌの生産が観察された。最終的な培養液の濁度は３４０だった。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明により、発酵法でカロテノイドを高収量に得られるので、極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】アスタキサンチンの生合成経路を示す説明図である。
【図２】ＨＰＬＣによるカロテノイドの分析の典型的なパターンを示す説明図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は溶出時間（単位は分）を示し、Ｙ軸（縦軸左側）は４７０ｎｍにおける吸光度（単位は任意）を示し、ピーク番号の内、１はアスタキサンチン、２はアドニキサンチン、３はフェニコキサンチン、４はカンタキサンチン、５はエキネノン、６はβ−カロテンに帰属する。
【図３】ＴＳＮ１８Ｅ７株の増殖とカロテノイドの生産のパターンを示す説明図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は培養時間（単位は時間）を示し、Ｙ軸（縦軸左側）はアスタキサンチンの生産濃度（単位はｍｇ／Ｌ）、Ｙ軸（縦軸右側）は６６０ｎｍにおける濁度（単位は任意）を示し、白丸（○）は培養液の６６０ｎｍの濁度の値を、黒丸（●）はアスタキサンチンの生産濃度の値を、▲は総カロテノイド（アスタキサンチン、アドニキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、及びβ−カロテンの和）をそれぞれ表す。
【図４】培養時の溶存酸素濃度、ｋＬａの推移を示す説明図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は培養時間（単位は時間）を示し、Ｙ軸（縦軸左側）はｋＬａ（単位はｈ−１）、Ｙ軸（縦軸右側）は溶存酸素濃度（単位は％飽和）を示す。
【図５】ＴＳＮ１８Ｅ７株の増殖とカロテノイドの生産のパターンを示す説明図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は培養時間（単位は時間）を示し、Ｙ軸（縦軸左側）はアスタキサンチンの生産濃度（単位はｍｇ／Ｌ）、Ｙ軸（縦軸右側）は６６０ｎｍにおける濁度（単位は任意）を示し、白丸（○）は培養液の６６０ｎｍの濁度の値を、黒丸（●）はアスタキサンチンの生産濃度の値を、▲は総カロテノイド（アスタキサンチン、アドニキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、及びβ−カロテンの和）をそれぞれ表す。
【図６】培養時の溶存酸素濃度、ｋＬａの推移を示す説明図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は培養時間（単位は時間）を示し、Ｙ軸（縦軸左側）はｋＬａ（単位はｈ−１）、Ｙ軸（縦軸右側）は溶存酸素濃度（単位は％飽和）を示す。
【図７】ＴＳＮ１８Ｅ７株の増殖とカロテノイドの生産のパターンを示す説明図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は培養時間（単位は時間）を示し、Ｙ軸（縦軸左側）はアスタキサンチンの生産濃度（単位はｍｇ／Ｌ）、Ｙ軸（縦軸右側）は６６０ｎｍにおける濁度（単位は任意）を示し、白丸（○）は培養液の６６０ｎｍの濁度の値を、黒丸（●）はアスタキサンチンの生産濃度の値を、▲は総カロテノイド（アスタキサンチン、アドニキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、及びβ−カロテンの和）をそれぞれ表す。
【図８】培養時の溶存酸素濃度、ｋＬａの推移を示す説明図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は培養時間（単位は時間）を示し、Ｙ軸（縦軸左側）はｋＬａ（単位はｈ−１）、Ｙ軸（縦軸右側）は溶存酸素濃度（単位は％飽和）を示す。
【図９】ＴＳＮ１８Ｅ７株の増殖とカロテノイドの生産のパターンを示す説明図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は培養時間（単位は時間）を示し、Ｙ軸（縦軸左側）はアスタキサンチンの生産濃度（単位はｍｇ／Ｌ）、Ｙ軸（縦軸右側）は６６０ｎｍにおける濁度（単位は任意）を示し、白丸（○）は培養液の６６０ｎｍの濁度の値を、黒丸（●）はアスタキサンチンの生産濃度の値を、▲は総カロテノイド（アスタキサンチン、アドニキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、及びβ−カロテンの和）をそれぞれ表す。
【図１０】培養時の溶存酸素濃度、ｋＬａの推移を示す説明図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は培養時間（単位は時間）を示し、Ｙ軸（縦軸左側）はｋＬａ（単位はｈ−１）、Ｙ軸（縦軸右側）は溶存酸素濃度（単位は％飽和）を示す。
【図１１】ＴＳＴＴ００１株にＮ−８１１０６株由来のｃｒｔＥ遺伝子を導入した組換え株の増殖とカロテノイドの生産のパターンを示す説明図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は培養時間（単位は時間）を示し、Ｙ軸（縦軸左側）はアスタキサンチンの生産濃度（単位はｍｇ／Ｌ）、Ｙ軸（縦軸右側）は６６０ｎｍにおける濁度（単位は任意）を示し、白丸（○）は培養液の６６０ｎｍの濁度の値を、黒丸（●）はアスタキサンチンの生産濃度の値を、▲は総カロテノイド（アスタキサンチン、アドニキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、及びβ−カロテンの和）をそれぞれ表す。
【図１２】培養時の溶存酸素濃度、ｋＬａの推移を示す説明図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は培養時間（単位は時間）を示し、Ｙ軸（縦軸左側）はｋＬａ（単位はｈ−１）、Ｙ軸（縦軸右側）は溶存酸素濃度（単位は％飽和）を示す。
【図１３】ＴＳＴＴ００１株にＮ−８１１０６株由来のｃｒｔＥ遺伝子を導入した組換え株の増殖とカロテノイドの生産のパターンを示す説明図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は培養時間（単位は時間）を示し、Ｙ軸（縦軸左側）はアスタキサンチンの生産濃度（単位はｍｇ／Ｌ）、Ｙ軸（縦軸右側）は６６０ｎｍにおける濁度（単位は任意）を示し、白丸（○）は培養液の６６０ｎｍの濁度の値を、黒丸（●）はアスタキサンチンの生産濃度の値を、▲は総カロテノイド（アスタキサンチン、アドニキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、及びβ−カロテンの和）をそれぞれ表す。
【図１４】培養時の溶存酸素濃度、ｋＬａの推移を示す説明図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は培養時間（単位は時間）を示し、Ｙ軸（縦軸左側）はｋＬａ（単位はｈ−１）、Ｙ軸（縦軸右側）は溶存酸素濃度（単位は％飽和）を示す。
【図１５】ＴＳＴＴ００１株にＮ−８１１０６株由来のｃｒｔＥ遺伝子を導入した組換え株の増殖とカロテノイドの生産のパターンを示す説明図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は培養時間（単位は時間）を示し、Ｙ軸（縦軸左側）はアスタキサンチンの生産濃度（単位はｍｇ／Ｌ）、Ｙ軸（縦軸右側）は６６０ｎｍにおける濁度（単位は任意）を示し、白丸（○）は培養液の６６０ｎｍの濁度の値を、黒丸（●）はアスタキサンチンの生産濃度の値を、▲は総カロテノイド（アスタキサンチン、アドニキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、及びβ−カロテンの和）をそれぞれ表す。
【図１６】培養時の溶存酸素濃度、ｋＬａの推移を示す説明図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は培養時間（単位は時間）を示し、Ｙ軸（縦軸左側）はｋＬａ（単位はｈ−１）、Ｙ軸（縦軸右側）は溶存酸素濃度（単位は％飽和）を示す。
【図１７】ＴＳＴＴ００１株にＮ−８１１０６株由来のｃｒｔＥとカロテノイド遺伝子群を導入した組換え株の増殖とカロテノイドの生産のパターンを示す説明図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は培養時間（単位は時間）を示し、Ｙ軸（縦軸左側）はアスタキサンチンの生産濃度（単位はｍｇ／Ｌ）、Ｙ軸（縦軸右側）は６６０ｎｍにおける濁度（単位は任意）を示し、白丸（○）は培養液の６６０ｎｍの濁度の値を、黒丸（●）はアスタキサンチンの生産濃度の値を、▲は総カロテノイド（アスタキサンチン、アドニキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、及びβ−カロテンの和）をそれぞれ表す。
【図１８】培養時の溶存酸素濃度、ｋＬａの推移を示す説明図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は培養時間（単位は時間）を示し、Ｙ軸（縦軸左側）はｋＬａ（単位はｈ−１）、Ｙ軸（縦軸右側）は溶存酸素濃度（単位は％飽和）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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