(57)【要約】【解決手段】不活性型α−アミラーゼ、２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドおよび必要により、マルトオリゴ糖またはその還元末端グルコースに非発色基が結合したマルトオリゴ糖および塩化ナトリウムを含有し、かつ、最終ｐＨが５．５〜６．５に保持されている体液中のカルシムイオン測定用試薬組成物および該試薬組成物を用いて、体液中のカルシウムイオンを測定する方法。【効果】α−アミラーゼ活性を利用するカルシウムイオンの測定方法において、体液中のカルシムイオンを低い値から高値まで幅広く、正確かつ簡便に測定できる測定方法ならびに該方法に使用する測定用試薬組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（１）〜（５）の構成をすべて含む、体液中のカルシウムイオン測定用試薬組成物。
（１）カルシウムイオンと結合していないα−アミラーゼ、
（２）０．１〜５０ｍＭの、２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド、
（３）１００〜２５０ｍＭの、マルトオリゴ糖またはその還元末端グルコースに非発色基が結合したマルトオリゴ糖、
（４）０．１〜１０ｍＭの、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−四酢酸４カリウム（ＢＡＰＴＡ）、および、
（５）塩化ナトリウム、
を含有し、かつ、
（６）最終ｐＨが５．５〜６．５に保持されている。
【請求項２】
請求項１に記載のカルシウムイオン測定用試薬組成物を作用させ、生成する発色性化合物を測定することを特徴とする体液中のカルシウムイオンの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は体液中のα−アミラーゼがカルシウムイオンによって活性化されることを利用した、体液中のカルシウムイオン測定用試薬組成物ならびに該試薬組成物を使用する測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床検査の分野では、血清または尿中のカルシウムイオン量の測定が頻繁に行われている。血清または尿中のカルシウムイオン量の測定は、各種病態の診断において有用な情報をもたらす。例えば、低カルシウム血症として、低タンパク血症、低リン血症、腎炎、ネフローゼ、ビタミンＤ欠乏症、副甲状腺機能低下症、クル病等の疾患、高カルシウム血症としては、骨腫瘍、アジソン病、肺気腫、副甲状腺機能亢進症、腎不全等の疾患の診断に用いることができる。
【０００３】
体液中のカルシウムイオン測定法としては、従来から（１）滴定法、（２）比色法、（３）原子吸光法、（４）炎光光度計法、（５）電極法、（６）酵素法などが知られている。しかしながら、従来のこれらの方法では、正確かつ簡便にカルシウム量を測定することができなかった。
【０００４】
上記（１）の滴定法は、シュウ酸塩やキレートを用いて、化学的に滴定する方法であるが、煩雑である、実施者により測定値に差異が出る、多量の試料を短時間に処理できないという欠点を有する。
また、上記（２）の比色法のうち、発色剤にｏ−ＣＰＣ（オルトクレゾールフタレインコンプラクソン）を用いる方法は、汎用の自動分析機に適用できる方法であるが、温度・時間により吸光度が変化する、マグネシウムイオンの影響を受ける等の欠点を有する。
さらに、上記（３）の原子吸光法は、試料を希釈することが必要である、手技に熟練を要する等の欠点を有する。
上記（４）の炎光光度計法も特異性・再現性に欠点を有する。
しかも、上記（５）の電極法は、ｐＨの影響を受ける、機器を一定の状態に維持することが煩雑である等の欠点を有する。
【０００５】
上記（６）の酵素法には、（ａ）ホスホリパーゼＤを利用する方法（特許文献１）、（ｂ）カルモジュリンを利用する方法（特許文献２）、（ｃ）α−アミラーゼを利用する方法（特許文献３）などがある。上記（ａ）の方法は基質を均一に調製することが困難であり、反応に時間がかかる欠点を有する。また、上記（ｂ）の方法は検体を希釈する（１００〜１０００倍）ことが必要である。
【特許文献１】特開昭６２−１９５２９７号公報
【特許文献２】特開昭６２−  ３６１９９号公報
【特許文献３】特開平  ２−２７６５９７号公報
【０００６】
さらに、基質として、２，４−ジクロロフェニル−β−Ｄ−マルトペンタオシド、４−ニトロフェノル−α−Ｄ−マルトトリオシドなどを使用する上記（ｃ）の方法では、他のイオンの影響も少なく、汎用の自動分析機に適用可能ではあるが、内因性のα−グルコシダーゼの影響を受ける、あるいは膵臓由来のＰ−アミラーゼと唾液由来のＳ−アミラーゼの基質に対する親和性が異なるため、基質濃度の至適化が困難である、また測定範囲が狭く、非常に低い値から高値まで幅広く、正確に測定することが困難であるという欠点があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、α−アミラーゼ活性を利用する方法において、体液中のカルシウムイオンを正確かつ簡便に測定できる測定方法ならびに該方法に使用する測定用試薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明は不活性型α−アミラーゼおよび非還元末端にβ−Ｄ−ガラクトピラノシル基を有し、還元末端に発色基を有するマルトシドを含むことを特徴とする体液中のカルシウムイオン測定用試薬組成物である。本発明の一実施態様は、不活性型α−アミラーゼおよび２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドを含むことを特徴とする体液中のカルシウムイオン測定用試薬組成物である。
【０００９】
また、本発明は、体液中のカルシウムイオンに、不活性型α−アミラーゼおよび非還元末端にβ−Ｄ−ガラクトピラノシル基を有し、還元末端に発色基を有するマルトシドを含むカルシウムイオン測定用試薬組成物を作用させ、生成する発色性化合物を測定することを特徴とする体液中のカルシウムイオンの測定方法である。本発明の一実施態様は体液中のカルシウムイオンに不活性型α−アミラーゼおよび２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドを含むカルシウム測定用試薬組成物を作用させ、生成する２−クロロ−４−ニトロフェノールを測定することを特徴とする体液中のカルシウムイオンの測定方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明では、体液中のカルシウムイオンを低い値から高値まで幅広く、正確に測定できる。また、α−グルコシダーゼの存在の有無に係わらす、カルシウムイオンを正確に測定することができる。さらに本発明では基質濃度の至適化が容易である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明に用いる体液とは、血清、唾液、膵液などの各種体液を意味する。また、α−アミラーゼとは、微生物、植物または動物のいずれの起源のものも用いることができるが、好適には動物起源のものであり、例えばブタ膵由来のα−アミラーゼが例示される。しかしながら、本発明に用いるα−アミラーゼは脱塩されて、不活性型であることが必要である。不活性型α−アミラーゼは、体液中のカルシウムイオンを得て、活性型α−アミラーゼとなり、α−アミラーゼ基質と反応する。
脱塩方法としては、透析、限外濾過、イオン交換、カラム除去などの方法がある。α−アミラーゼが脱塩されて不活性型でないと、ブランク反応が大きくなるため、体液中のカルシウムイオン測定において、正確性、精密性に欠けることとなる。不活性型α−アミラーゼの使用量は、試薬組成物中、好ましくは１〜１０００Ｕ／ｍｌである。
【００１２】
本発明に用いるα−アミラーゼ基質は、非還元末端にβ−Ｄ−ガラクトピラノシル基を有し、還元末端に発色基を有するマルトシドであり、β−Ｄ−ガラクトピラノシル基は非還元末端グルコースの４位および／または６位に結合するものである。発色基としては、ｐ−ニトロフェニル、２−クロロ−４−ニトロフェニルなどの基が挙げられる。その結合様式は、α−型、β−型があるが、本発明においては、α−型が好ましい。その一例として、２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドがある。該化合物の製造法は特開平８−６７６９１号公報、特開平  ８−６７６９２号公報などに記載される。
【００１３】
本発明では上記基質の他に、必要により、マルトオリゴ糖またはその還元末端グルコースに非発色基が結合したマルトオリゴ糖を使用する。
マルトオリゴ糖としては、例えばマルトース、マルトペンタース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオースなどのグルコース数が２〜７のマルトオリゴ糖が挙げられる。還元末端グルコースに非発色基が結合したマルトオリゴ糖としては、例えば２，４−ジクロロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド、２，４−ジクロロフェニル（αまたはβ）−Ｄ−マルトペンタオシド、２，４−ジクロロフェニル−（αまたはβ）−Ｄ−マルトヘプタオシドなどが挙げられる。
【００１４】
本発明の基質の１つである２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドは、従来の基質である２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−マルトペンタオシドに比べて、追随酵素不要であり、また、４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシドと比較して、α−アミラーゼによる糖転移反応が生じないという利点を有する。
さらに本発明の上記基質は内因性のα−グルコシダーゼの影響を受けない、Ｐ−アミラーゼ、Ｓ−アミラーゼの該基質に対する親和性がほぼ同等であるため、基質濃度の至適化が容易であるという利点も有する。
該基質の濃度は、試薬組成物中、０．１〜５０ｍＭで好適に用いられる。
【００１５】
本発明では試薬組成物の最終ｐＨを５．５〜６．５に保持することによって、α−アミラーゼの糖分解反応速度そのものを制御し、測定範囲を広げることが可能となる。ｐＨが５．５未満あるいは６．５以上の場合は、カルシウムイオンに対する広範囲の定量性を得ることができない。
試薬最終ｐＨを５．５〜６．５に保持する方法は公知の方法であれば、何ら限定されるものではないが、一般的には緩衝剤が用いられる。用いる緩衝剤としては、例えばグッド緩衝剤、トリス緩衝剤、リン酸緩衝剤が挙げられる。緩衝剤は１０〜５００ｍＭの濃度で好適に用いられる。
【００１６】
さらに、本発明の測定試薬組成物には、マルトオリゴ糖またはその還元末端グルコースに非発色基が結合したマルトオリゴ糖から選ばれる基質を１００〜２５０ｍＭ含有させ、α−アミラーゼのこれらの基質に対する糖分解反応を競合させることによっても、カルシウムイオンに対する広範囲の定量性を得ることが可能となる。
【００１７】
また、カルシウムキレート剤を用いてα−アミラーゼとカルシウムイオンの結合反応を制御することによってもカルシウムイオンに対する広範囲の定量性を得ることが可能となる。カルシウムキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩（ＥＤＴＡなど）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−四酢酸４カリウム（ＢＡＰＴＡ）などが挙げられ、特に１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−四酢酸４カリウム（ＢＡＰＴＡ）が好ましい。カルシウムキレート剤の濃度は、０．１〜１０ｍＭで、好適に用いられる。
これらカルシウムイオンに対する広範囲の定量性を得る方法としては、(1) 試薬ｐＨの調節、(2) マルトオリゴ糖の添加、(3) カルシウムキレート剤の添加の３つの方法を単独あるいは組み合わせて用いることができる。
【００１８】
さらに、本発明の測定用試薬組成物には、アルカリ金属のハロゲン化物、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウムなどを３〜３００ｍＭの濃度で添加することが好ましい。また、必要に応じて、防腐剤、界面活性剤等をカルシウムの定量性に影響を及ぼさない範囲で使用することもできる。防腐剤としてはカルシウムを含有しないものであれば、特に限定されないが、好適にはアジ化ナトリウム、抗生物質等が用いられる。界面活性剤としては非イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤などを単独であるいは組み合わせて使用することができる。
【００１９】
本発明では、体液中のカルシウムイオンに不活性型α−アミラーゼおよび非還元末端にβ−Ｄ−ガラクトピラノシル基を有し、還元末端に発色基を有するマルトシド、例えば２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドを含むカルシウム測定用試薬組成物を作用させ、生成する２−クロロ−４−ニトロフェノールを吸光度測定する。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例でもって本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１
下記組成の試薬溶液０．３ｍｌに、カルシウム濃度０〜３０ｍｇ／ｄｌ相当の酢酸カルシウム水溶液０．０２ｍｌを添加し、３７℃で１０分間反応させ、４００ｎｍの吸光度の１分間あたり増加速度を求めた。
試薬：ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）              ５０ｍＭ
ブタ膵α−アミラーゼ（予め透析したもの）    ４０Ｕ／ｍｌ
２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−
ガラクトピラノシル−α−マルトシド            ２ｍＭ
塩化ナトリウム                                ５ｍＭ
トリトンＸ−１００                        ０．１％
１，２−ビス（Ｏ−アミノフェノキシ）−
エタン−４酢酸４カリウム（ＢＡＰＴＡ）    ０．５ｍＭ
得られた検量線を図１に示す。
【００２１】
実施例２
下記組成の試薬溶液０．３ｍｌに、カルシウム濃度０〜５０ｍｇ／ｄｌ相当の酢酸カルシウム水溶液０．０２ｍｌを添加し、３７℃で１０分間反応させ、４００ｎｍの吸光度の１分間あたり増加速度を求めた。
試薬：ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）              ５０ｍＭ
ブタ膵α−アミラーゼ（予め透析したもの）    ４０Ｕ／ｍｌ
２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−
ガラクトピラノシル−α−マルトシド          ２ｍＭ
塩化ナトリウム                                ５ｍＭ
トリトンＸ−１００                        ０．１％
マルトース                                １５０ｍＭ
１，２−ビス（Ｏ−アミノフェノキシ）−    
エタン−４酢酸４カリウム（ＢＡＰＴＡ）    ０．５ｍＭ
得られた検量線を図２に示す。
【００２２】
比較例１
下記組成の試薬溶液０．３ｍｌに、カルシウム濃度０〜５０ｍｇ／ｄｌ相当の酢酸カルシウム水溶液０．０２ｍｌを添加し、３７℃で１０分間反応させ、４００ｎｍの吸光度の１分間あたり増加速度を求めた。
試薬：ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）              ５０ｍＭ
ブタ膵α−アミラーゼ                                ４０Ｕ／ｍｌ
α−グルコシダーゼ（東洋紡績製  ＡＧＨ−２１１）    ４０Ｕ／ｍｌ
β−グルコシダーゼ（東洋紡績製  ＢＧＨ−１０１）    １００Ｕ／ｍｌ
２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−マルトペンタオシド      ２ｍＭ
塩化ナトリウム                                ５ｍＭ
トリトンＸ−１００                          ０．１％
１，２−ビス（Ｏ−アミノフェノキシ）エタン−４酢酸４カリウム（ＢＡＰＴＡ）    ０．５ｍＭ
得られた検量線を図２に示す。図２中、●印は本発明の試薬を用いた場合を示し、○印は比較例の試薬を用いた場合を示す。
図２から明らかなように、２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドを基質とする本発明では、５０ｍｇ／ｄｌまで検量線が直線性を示したのに対し、２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−マルトペンタオシドを基質とする比較例では、検量線が約１５ｍｇ／ｄｌまでしか直線性は認められなかった。
【００２３】
実施例３
試薬１（比較例）：
ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）              ５０ｍＭ
ブタ膵α−アミラーゼ（予め透析したもの）    ４０Ｕ／ｍｌ
２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−
マルトトリオシド                              ２ｍＭ
塩化ナトリウム                                ５ｍＭ
トリトンＸ−１００                            ０．１％
マルトース                                １５０ｍＭ
１，２−ビス（Ｏ−アミノフェノキシ）−
エタン−４酢酸４カリウム（ＢＡＰＴＡ）    ０．５ｍＭ
試薬２（本発明）：
ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）              ５０ｍＭ
ブタ膵α−アミラーゼ（予め透析したもの）    ４０Ｕ／ｍｌ
２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−
ガラクトピラノシル−α−マルトシド            ２ｍＭ
塩化ナトリウム                                ５ｍＭ
トリトンＸ−１００                        ０．１％
マルトース                                １５０ｍＭ
１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）
エタン−４酢酸４カリウム（ＢＡＰＴＡ）    ０．５ｍＭ
【００２４】
上記組成で得られた試薬を実施例２と同様にして測定を行った。測定試料を以下に示す。
１．生理食塩水
２．管理用血清
３．管理用血清＋１００ＩＵ／ｌ    α−グルコシダーゼ
測定結果を表１に示す。表１から明らかなように、２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドを使用する場合、試料へのα−グルコシダーゼ添加の有無で測定値に影響は認められなかったが、２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−マルトトリオシドを使用する比較例では、α−グルコシダーゼの添加によって測定値の上昇が認められた。
【００２５】
【表１】
2007252392.tif 000002
【００２６】
実施例４
（比較例）
試薬：ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）              ５０ｍＭ
ブタ膵α−アミラーゼ（予め透析したもの）    ４０Ｕ／ｍｌ
２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−
ガラクトピラノシル−α−マルトシド            ２ｍＭ
塩化ナトリウム                                ５ｍＭ
トリトンＸ−１００                        ０．１％
マルトース                                １５０ｍＭ
１，２−ビス（Ｏ−アミノフェノキシ）−
エタン−４酢酸４カリウム（ＢＡＰＴＡ）    ０．５ｍＭ
【００２７】
（本発明）
試薬：ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）              ５０ｍＭ
ブタ膵α−アミラーゼ（予め透析したもの）    ４０Ｕ／ｍｌ
２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−
ガラクトピラノシル−α−マルトシド            ２ｍＭ
塩化ナトリウム                                ５ｍＭ
トリトンＸ−１００                        ０．１％
マルトース                                １５０ｍＭ
１，２−ビス（Ｏ−アミノフェノキシ）−
エタン−４酢酸４カリウム（ＢＡＰＴＡ）    ０．５ｍＭ
上記組成で得られた試薬を実施例１と同様にして測定を行った。
得られた検量線を図３および図４に示す。
図３および図４から明らかなように、ｐＨ６．０の緩衝液を使用する本発明では、３０ｍｇ／ｄｌまで検量線が直線性を示したのに対し、ｐＨ７．０の緩衝液を使用する比較例では、検量線が約１０ｍｇ／ｄｌまでしか直線性は認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明では、体液中のカルシウムイオンを低い値から高値まで幅広く、正確に測定できる。また、α−グルコシダーゼの存在の有無に係わらす、カルシウムイオンを正確に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明のカルシウムイオン測定用試薬組成物（マルトースを含まない）を使用して、カルシウムイオンを測定した検量線を示す。
【図２】本発明のカルシウムイオン測定用試薬組成物（マルトースを含む）および比較例のカルシウムイオン測定用試薬組成物を使用して、カルシウムイオンを測定した検量線を示す。
【図３】ｐＨ６．０である緩衝液を使用する本発明のカルシウムイオン測定用試薬組成物を使用して、カルシウムイオンを測定した検量線を示す。
【図４】ｐＨが７．０である緩衝液を使用するカルシウムイオン測定用試薬組成物を使用して、カルシウムイオンを測定した検量線を示す。
【図１】
2007252392.tif 000003
【図２】
2007252392.tif 000004
【図３】
2007252392.tif 000005
【図４】
2007252392.tif 000006