(57)【要約】      （修正有）【課題】抜去歯が本来有している性能を損なうことなく、抜去歯の粉砕品を提供できる手段および方法を提供する。歯槽骨の再生等に適した、新たな性質を付与した抜去歯の粉砕品に由来する、新たな材料を提供する。【解決手段】抜去歯を粉砕機で粉砕して抜去歯粉砕品を得ることを含む、抜去歯粉砕品の調製方法。前記粉砕機は、密閉可能な粉砕室及びこの粉砕室内に回転自在の粉砕刃を有し、抜去歯を生理食塩氷片とともに、上記粉砕機により粉砕する。この方法により得られた抜去歯粉砕品を酸処理により脱灰して脱灰粉体を得る抜去歯由来の脱灰粉体の調製方法。この方法で得られた脱灰粉体の表面にアパタイトを被覆して、脱灰粉体とアパタイトとの複合体を調製する方法。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抜去歯を粉砕機で粉砕して抜去歯粉砕品を得ることを含む、抜去歯粉砕品の調製方法であって、
前記粉砕機は、密閉可能な粉砕室及びこの粉砕室内に回転自在の粉砕刃を有し、
抜去歯を生理食塩氷片とともに、上記粉砕機により粉砕する
ことを特徴とする前記方法。
【請求項２】
前記粉砕室の少なくとも内壁および粉砕刃は、ジルコニアからなる請求項1に記載の方法。
【請求項３】
粉砕刃の回転数を10,000〜15,000rpmの範囲とする請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
生理食塩氷片は、1つの体積が0.5〜8cm3の範囲である請求項1〜3のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
1回の粉砕において1本の抜去歯を粉砕する請求項1〜4のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
1本の抜去歯に対して、総量が10〜40cm3の範囲となる量の生理食塩氷片を用いる請求項1〜5のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
抜去歯粉砕品の粒度が0.1〜2.0mmの範囲になるように、粉砕時間を選択する請求項1〜6のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
抜去歯をそのまま粉砕することで、エナメル質と象牙質の混合物である抜去歯粉砕品を得る、請求項1〜7のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
抜去歯の表面を削除した後に粉砕することで、象牙質である抜去歯粉砕品を得る、請求項1〜7のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項1〜9のいずれか１項に記載の方法により得られた抜去歯粉砕品を酸処理により脱灰して脱灰粉体を得ることを含む、抜去歯由来の脱灰粉体の調製方法。
【請求項１１】
酸処理は、強酸水溶液を用いて行う請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
酸処理は、上記粉砕機を用いて行う請求項10または11に記載の方法。
【請求項１３】
脱灰粉体は、コラーゲンおよび骨形成タンパク質を含む請求項10〜12のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項10〜13のいずれか１項に記載の方法で得られた脱灰粉体の表面にアパタイトを被覆して、脱灰粉体とアパタイトとの複合体を調製する方法であって、
アパタイトの被覆は、抜去歯を生理食塩氷片とともに粉砕し、抜去歯粉砕品を濾別して得た濾液のpHをアパタイトが析出する条件に調整し、次いで析出したアパタイトを含む溶液と脱灰粉体を混合し、アパタイトが析出する条件に液のpHを調整するか、または析出したアパタイトを分離し、分離したアパタイトと脱灰粉体を混合し、アパタイトが高分散かつ複合化する条件に混合物のpHを調整することで行う、前記方法。
【請求項１５】
アパタイトの被覆は、上記粉砕機を用いて行う請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
密閉可能な粉砕室と、この粉砕室内に回転自在の粉砕刃を有し、かつ粉砕室の少なくとも内壁および粉砕刃は、ジルコニアからなることを特徴とする抜去歯を粉砕するための粉砕機。
【請求項１７】
粉砕刃は、10,000〜15,000rpmの範囲の回転数で回転可能である請求項16に記載の粉砕機。
【請求項１８】
粉砕以外の抜去歯粉砕品の処理にも利用できる請求項16または17に記載の粉砕機。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抜去歯粉砕品の調製方法、抜去歯由来の脱灰粉体の調製方法、脱灰粉体とアパタイトとの複合体を調製する方法および粉砕機に関する。本発明の方法で得られる抜去歯由来の脱灰粉体や脱灰粉体とアパタイトとの複合体は、高度先進医療に応用できる。
【背景技術】
【０００２】
歯の治療法にて、歯槽骨の再生が必要な患者は約２００万人を数え、安全・簡便な治療法の普及が強く望まれている。しかし、現在の治療法では患者の骨盤から骨を採取しそれを埋め込む方法及び最近開発中である患者の骨髄細胞を採取・培養して利用する方法があるが、いずれも患者の安全面・コスト面等で問題がある。
【０００３】
歯はエナメル質（歯の表層部）、象牙質、歯髄、セメント質、歯根膜で構成され、大部分の領域はエナメル質と象牙質で占められている。エナメル質の組成はアパタイト（リン酸カルシウム）９５％、水５％であり、象牙質の組成はアパタイト７０％、コラーゲン２０％、水１０％である。この象牙質には、骨誘導を促進するための有用な蛋白質等が微量含まれていることが知られている。
【０００４】
そこで、本発明者らは、患者本人の不要になった歯(抜去歯)を再生利用することを考え、その一例として、粉砕し、その顆粒状粉砕品を埋め込み、歯槽骨を再生する方法を開発した。本発明者らは、抜去歯を市販の手動装置を用いて粉砕し、塩酸脱灰・洗浄した試料をラットまたはヌ−ドマウス背部皮下部に埋め込み、骨誘導・軟骨誘導されることを報告してきた。（1）佐藤大介，村田勝，佐々木智也，赤澤敏之，有末眞，ヒト脱灰象牙質/リコンビナントヒトBMP-2複合インプラントによる骨誘導，日口腔インプラント誌，15,403-411 (2002).(非特許文献1)、(2）村田勝，佐藤大介，赤澤敏之，平敏夫，佐々木智也，有末眞，ヌードマウスにおけるヒト脱灰象牙質顆粒の骨・軟骨誘導，Journal of Hard Tissue Biology, 11(3),110-114 (2003).(非特許文献2)）さらに、本発明者らは、この方法を用いて、既に８例の治療実績を持つ。また、最近、抜去歯を凍結保存しておき(例えば、歯の銀行)、後日、移植すること(遅延移植治療)も実施されている。しかし、これまでに抜去歯を再生利用することはほとんど行われておらず、抜去歯を再生利用可能な状態にする方法すら、まだ確立されていない。
【０００５】
特開平９−３０８６４０号公報(特許文献１)には、抜去歯の歯根部の少なくとも一部を型取りして人工歯根を製作するために使用することが開示されている。しかるに、抜去歯自体を再生利用することは記載されていない。
【非特許文献１】佐藤大介, 村田勝，佐々木智也，赤澤敏之，有末眞，ヒト脱灰象牙質/リコンビナントヒトBMP-2複合インプラントによる骨誘導，日口腔インプラント誌，15,403-411 (2002)
【非特許文献２】村田勝，佐藤大介，赤澤敏之，平敏夫，佐々木智也，有末眞，ヌードマウスにおけるヒト脱灰象牙質顆粒の骨・軟骨誘導，Journal of Hard Tissue Biology, 11(3),110-114 (2003).
【特許文献１】特開平９−３０８６４０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、上記のように、抜去歯を粉砕し、その顆粒状粉砕品を埋め込み、歯槽骨を再生する方法を開発した。しかし、抜去歯の粉砕は、乳鉢を用いてマニュアルで行っており、この方法をより一般化するためには、埋め込みに適した粒径を有する粉体を、抜去歯が本来有している化学成分や石灰化促進能のような性能を損なうことなく提供できる手段や方法が必要である。
【０００７】
さらに、抜去歯の単なる粉砕ではなく、歯槽骨の再生等に適した、骨形成細胞の活性化のような新たな性質を付与した抜去歯の粉砕品に由来する、新たな材料の提供も望まれている。
【０００８】
そこで本発明の第1の目的は、抜去歯が本来有している性能を損なうことなく、抜去歯の粉砕品を提供できる手段および方法を提供することにある。
【０００９】
さらに本発明の第2の目的は、歯槽骨の再生等に適した、新たな性質を付与した抜去歯の粉砕品に由来する、新たな材料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記互いを解決するための本発明は以下のとおりである。
[1]抜去歯を粉砕機で粉砕して抜去歯粉砕品を得ることを含む、抜去歯粉砕品の調製方法であって、前記粉砕機は、密閉可能な粉砕室及びこの粉砕室内に回転自在の粉砕刃を有し、抜去歯を生理食塩氷片とともに、上記粉砕機により粉砕することを特徴とする前記方法。
[2]前記粉砕室の少なくとも内壁および粉砕刃は、ジルコニアからなる[1]に記載の方法。
[3]粉砕刃の回転数を10,000〜15,000rpmの範囲とする[1]または[2]に記載の方法。
[4]生理食塩氷片は、1つの体積が0.5〜8cm3の範囲である[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5]1回の粉砕において1本の抜去歯を粉砕する[1]〜[4]のいずれかに記載の方法。
[6]1本の抜去歯に対して、総量が10〜40cm3の範囲となる量の生理食塩氷片を用いる[1]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[7]抜去歯粉砕品の粒度が0.1〜2.0mmの範囲になるように、粉砕時間を選択する[1]〜[6]のいずれかに記載の方法。
[8]抜去歯をそのまま粉砕することで、エナメル質と象牙質の混合物である抜去歯粉砕品を得る、[1]〜[7]のいずれかに記載の方法。
[9]抜去歯の表面を削除した後に粉砕することで、象牙質である抜去歯粉砕品を得る、[1]〜[7]のいずれかに記載の方法。
[10][1]〜[9]のいずれかに記載の方法により得られた抜去歯粉砕品を酸処理により脱灰して脱灰粉体を得ることを含む、抜去歯由来の脱灰粉体の調製方法。
[11]酸処理は、強酸水溶液を用いて行う[10]に記載の方法。
[12]酸処理は、上記粉砕機を用いて行う[10]または[11]に記載の方法。
[13]脱灰粉体は、コラーゲンおよび骨形成タンパク質を含む[10]〜[12]のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、種々の歯科治療に利用できる抜去歯粉砕品を容易に調製することができ、かつこの抜去歯粉砕品から、抜去歯由来の脱灰粉体および脱灰粉体とアパタイトとの複合体を調製することもできる。さらに本発明によれば、抜去歯粉砕品、脱灰粉体および脱灰粉体とアパタイトとの複合体の調製に利用できる粉砕機を提供することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
[抜去歯粉砕品の調製方法]
本発明の抜去歯粉砕品の調製方法は、抜去歯を粉砕機で粉砕して抜去歯粉砕品を得ることを含む。この調製方法では、粉砕機として、密閉可能な粉砕室及びこの粉砕室内に回転自在の粉砕刃を有する粉砕機を用い、かつ抜去歯を生理食塩氷片とともに、上記粉砕機により粉砕することを特徴とする。
【００１３】
[粉砕機]
まず、本発明で使用する粉砕機について説明する。
本発明で使用する粉砕機は、密閉可能な粉砕室及びこの粉砕室内に回転自在の粉砕刃を有する。そして、粉砕室の少なくとも内壁および粉砕刃は、ジルコニア(ZrO2)からなることが好ましい。粉砕室の少なくとも内壁および粉砕刃が、ZrO2からなることで、粉砕に際して、万一、内壁あるいは粉砕刃の摩耗粉が抜去歯粉砕品に混入しても、ZrO2は、生体安定性に優れ生体材料にも応用されており、医学的に問題ない材料だからである。さらに、ZrO2は、耐熱性、耐摩耗性、化学的耐久性に優れているため、熱殺菌や滅菌、強酸・強塩基処理が可能であるという利点もある。
【００１４】
粉砕機の具体例について説明する。粉砕容器は、例えば、円筒形状容器（例えば、直径7.2cm、高さ5.6cm）にZrO2焼結体を加工が困難な部分にZrO2溶射膜を適用して粉砕室とする。この容器には、粉砕室を密閉可能にするため、蓋が設けられ、蓋は、ZrO2製であるか、または、容器の内側になる側にZrO2溶射膜を適用したものであることができる。容器内には、回転自在の粉砕刃が設けられ、粉砕刃は、ZrO2製とする。粉砕刃の形状は、例えば、肉厚長方形(60×15.5×8.5mm)、薄長方形(64×12.3×6.3mm)、または肉厚菱形(60×15.5×9mm）などであることができる。粉砕刃は、例えば、容器の底から延存し、他端が回転用のモーター等の駆動手段と連結している回転軸の一端に固定される。
【００１５】
粉砕刃は、抜去歯粉砕品の調製に際しては、回転数を10,000〜15,000rpmの範囲とすることが望まれるので、この回転数での回転を可能にするモーター等の駆動手段を用いる。また、粉砕機は、抜去歯粉砕品の調製以外に、洗浄や脱灰処理にも用いられることから、回転数を1,000〜10,000rpmの範囲とすることも可能であるモーター等の駆動手段を用いることが好ましい。
【００１６】
本発明の抜去歯粉砕品の調製方法では、上記粉砕機を用い、かつ抜去歯を生理食塩氷片とともに、上記粉砕機により粉砕する。抜去歯は、所望の粒度、例えば、0.1〜2.0mmの範囲の粒度に粉砕することが、粉砕品を歯周病等による骨欠損部、歯の移植やインプラント植立のための骨増生等の治療に利用するという観点からは好ましい。さらに、上記粒度になるように抜去歯を短時間粉砕するには、粉砕刃の回転数を10,000〜15,000rpmの範囲とすることが好ましい。但し、このような高速で粉砕刃を回転すると、粉砕中の抜去歯の温度が高くなる。抜去歯の象牙質粉砕品には、骨形成蛋白質（ＢＭＰ）等の骨誘導物質、ホスホホリン等の石灰化促進物質が含まれており、粉砕に際して、これらの生理活性物質が熱により変質することは、粉砕品を上記治療に利用するという観点からは、回避するのが好ましい。そこで、本発明では、抜去歯を生理食塩氷片とともに粉砕する。
【００１７】
生理食塩氷片は、所望の粒度の粉砕品を得ると言う観点から、1つの体積が0.5〜8cm3の範囲であることが好ましい。さらに、同様の観点から、1回の粉砕において1本の抜去歯を粉砕し、かつ1本の抜去歯に対して、総量が10〜40cm3の範囲となる量の生理食塩氷片を用いることが好ましい。また、生理食塩氷片の形状は、所望の粒度の粉砕品を得ると言う観点から、方形よりは、球形または球形に近いことが好ましく、方形の生理食塩氷片の場合、一定時間室温等に放置して、角部が解けて丸みを帯びたものであることが好ましい。当初から球形または球形に近い生理食塩氷片を作成し、利用することも勿論できる。
【００１８】
抜去歯粉砕品の粒度は、上記のように0.1〜2.0mmの範囲になるように、粉砕時間を適当に選択することができる。
【００１９】
抜去歯は、抜去後、必要により洗浄した後、そのまま上記粉砕に供することができる。この場合、エナメル質と象牙質の混合物である抜去歯粉砕品が得られる。あるいは、抜去歯は、抜去後、必要により洗浄した後、その表面の一部または全部を削除(例えば、研削)した後に粉砕することもでき、その場合には、象牙質である抜去歯粉砕品が得られる。したがって、抜去歯粉砕品の使用に応じて適宜、抜去歯表面の削除の有無を選択できる。
【００２０】
粉砕終了後、粉砕品は、液から分離し、必要により、洗浄および／または乾燥する。粉砕品の液からの分離は、例えば、粉砕スラリーの吸引濾過、超純水を用いた洗浄、室温での乾燥工程により行うことができる。尚、粉砕終了には、生理食塩氷片はほとんど溶解しているか、一部がシャーベット状に残る場合もあるがこの場合には、室温で多量の超純水を用いて洗浄することにより、生理食塩氷を完全に除去できる。上記洗浄および／または乾燥した粉砕品は、そのまま、治療に使用することもできるが、使用時まで保存(例えば、−１９６℃〜２０℃)しておくこともできる。
【００２１】
[抜去歯由来の脱灰粉体の調製方法]
本発明は、抜去歯由来の脱灰粉体の調製方法を包含し、この調製方法は、上記本発明の方法により得られた抜去歯粉砕品を酸処理により脱灰して脱灰粉体を得ることを含む。酸処理には、例えば、強酸水溶液を用いることができ、強酸水溶液としては、例えば、硝酸水溶液または塩酸水溶液を用いることができる。硝酸水溶液、塩酸水溶液の濃度は、抜去歯由来のアパタイト成分を完全または部分溶解するのに必要な添加量を考慮して適宜決定できる。例えば、市販の硝酸または塩酸試薬を超純水で５〜１０倍希釈し、１０〜２０％硝酸または塩酸水溶液の範囲とする。
【００２２】
酸処理は、例えば、抜去歯粉砕品0.1g当たり、上記酸水溶液10〜50mlを用いて行うことができる。酸処理は、室温で例えば、1〜10時間行うことができる。また、酸処理は、必要により、冷却しながら行うこともできる。酸処理の条件(酸濃度、温度、時間、酸水溶液との比率等)は、酸処理により脱灰して得られる脱灰粉体の組成物および物性を考慮して適宜決定できる。
【００２３】
酸処理は、上記粉砕機を用いて行うことができる。上記粉砕機は、内壁および粉砕刃がジルコニア製であるため、上記酸水溶液に対する高い耐久生を有する。上記粉砕機を用いて行う場合、粉砕刃の回転数は、例えば、1,000〜5,000rpmの範囲にすることが適当である。酸水溶液での処理後は、脱灰粉体を酸水溶液から分離し、さらに必要により、洗浄および／または乾燥する。得られた脱灰粉体は、そのまま、治療に使用することもできるが、使用時まで保存(例えば、−１９６℃〜２０℃)しておくこともできる。
【００２４】
上記脱灰により得られる脱灰粉体は、コラーゲンおよび骨形成タンパク質を含む。但し、粉砕品の原料である抜去歯が、表面の一部または全部を除去したものであるか、除去しないものであるかによって、脱灰粉体の組成は、以下のように異なる。完全脱灰象牙質の場合は、コラーゲン９５％、水５％であり、部分脱灰象牙質の場合は、アパタイト０〜７０％、コラーゲン２０〜９５％、水５〜１０％である。
【００２５】
本発明の方法により得られる脱灰粉体は、歯周病等による骨欠損部、歯の移植やインプラント植立のための骨増生等の治療に用いることができる。
【００２６】
[脱灰粉体とアパタイトとの複合体調製方法]
本発明は、脱灰粉体とアパタイトとの複合体を調製する方法を包含する。この方法は、上記本発明の方法で得られた脱灰粉体の表面にアパタイトを被覆、複合化することを包含する。アパタイトの被覆状態及び被覆量により、治療箇所における材料の生体吸収速度、骨誘導能を制御することができる。
【００２７】
アパタイトの被覆には、抜去歯を生理食塩氷片とともに粉砕し、抜去歯粉砕品を濾別して得た濾液を用いる。この濾液は、前記抜去歯粉砕品の調整に際して、粉砕後、粉砕品から分離した液をそのまま利用できる。この濾液中には、アパタイトの原料となる、カルシウムおよびリン酸が含まれている。
【００２８】
まずは、上記濾液のpHをアパタイトが析出する条件に調整する。アパタイトが析出する条件とは、例えば、pHが７〜８の範囲である。濾液のpHは、通常、酸性側であるので、pHの調整は、例えば、アンモニア水溶液等のアルカリ水溶液を添加することにより行うことができる。
【００２９】
次いで析出したアパタイトを含む溶液と脱灰粉体を、脱灰粉体中に含まれる蛋白質の変成が生じないpH条件（pH8以下）で混合する。アパタイトを含む溶液と脱灰粉体との混合割合は、治療箇所のニーズに適合した生体吸収速度を考慮して、例えば、アパタイト０〜５０％の範囲とすることが適当である。
【００３０】
アパタイトを含む溶液と脱灰粉体を混合した後に、アパタイトが熟成する条件に液のpHをさらに調整することで、脱灰粉体にアパタイトを分散、複合化することができる。pHの調整は、上記と同様に例えば、アンモニア水溶液等のアルカリ水溶液を添加することにより行うことができる。また、ここでのアパタイトが熟成する条件は、上記と同一である。
【００３１】
あるいは、最初のpH調整において、pH９〜１１でアパタイトを析出させた後、濾過、洗浄、分離したアパタイトと脱灰粉体を混合し、その後に、アパタイトが熟成する条件に混合物のpHを調整することで、脱灰粉体にアパタイトを分散、複合化することもできる。この場合のpHの調整は、上記と同様に例えば、アンモニア水溶液等のアルカリ水溶液を添加することが行うことができる。また、ここでのアパタイトが熟成する条件は、pH７〜８である。
【００３２】
上記アパタイト被覆、複合化は、室温で行うことができるが、必要により、冷却しながら行うこともできる。また、上記アパタイト被覆、複合化は、上記粉砕機を用いて行うことができる。上記粉砕機を用いて行う場合、粉砕刃の回転数は、例えば、500〜3,000rpmの範囲にすることが適当である。
【００３３】
上記アパタイト被覆、複合化した脱灰粉を、生体環境下に近い疑似体液（ＳＢＦ: Simulated Body fluid)に浸漬し、その浸漬時間を適宜選定することにより、疑似体液由来のイオンを含むHAp固溶体の結晶成長を制御し、繭やウニ状の多孔性表面を構築することができる。以上のように、ＳＢＦへの浸漬によって作製される材料は、表面性質の設計・制御が可能な生体材料である。
【００３４】
本発明の抜去歯粉砕品、抜去歯由来の脱灰粉体、および脱灰粉体とアパタイトとの複合体は、歯周病等の歯科治療の際の移植材料等に利用することができる。また、このような抜去歯粉砕品、抜去歯由来の脱灰粉体、および脱灰粉体とアパタイトとの複合体は、単独で移植材料として使用する以外に、症例に応じて患者自身の歯髄組織を加えて移植することもできる。歯髄は硬組織形成細胞で構成されており、組織内に骨を誘導する骨形成タンパク質（BMP)が存在するので、歯髄組織を抜去歯粉砕品等に加えると骨形成を、抜去歯粉砕品等単独よりも促進することができる。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
粉砕機
図1に示すジルコニア（ZrO2）製容器およびZrO2製粉砕刃（肉厚長方形60×15.5×8.5mm、肉薄長方形64×12.3×6.3mm、肉厚菱形60×15.5×9mm）と粉砕容器（直径7.2cm、高さ5.6cm）を用いた、図2に示す粉砕機(歯用リサイクルユニット)を用いた。ZrO2製容器はZrO2焼結体を加工が困難な部分にZrO2溶射膜を適用した。
【００３６】
実施例1
[抜去歯粉砕条件の検討]
ZrO2製容器に、抜去歯の発熱防止と洗浄を目的とした所定の大きさ（10×10×10mm、15×15×15mm、20×20×20mm）の生理食塩氷を入れ、３種のZrO2製粉砕刃（肉厚長方形、肉薄長方形、肉厚菱形）を用いて、11,900〜12,000rpm、１分間の条件で抜去歯1個を高速粉砕した。すべての場合で、生理食塩氷の残存がみられ、容器内温度０℃が保持され、様々な粒度の粉砕品が得られた。その生理食塩氷は、粉砕品が容器内壁の上部にまとわりつかないように、−80℃で1日間静置、室温で約5分間放置し、立方体の角が丸くなり融け始めた氷を用いた。抜去歯粉砕品の粒度は、ZrO2製粉砕刃の種類に関係なく同様であり、生理食塩氷のサイズと充填量により依存して変化した。生理食塩氷のサイズが増加するに伴い、粉砕品の粒度が粗くなる傾向がみられた。
【００３７】
実施例2
[抜去歯粉砕品の調製]
実施例1の検討結果を踏まえて、以下の条件で抜去歯粉砕品を調製した。ZrO2製容器に、10×10×10mmの生理食塩氷20個、さらに抜去歯1個を入れ、肉厚菱形ZrO2製粉砕刃を用いて11,900〜12,000rpm, 1分間の条件で高速粉砕を行った。生理食塩氷を含んだ粉砕スラリーを濾過し歯肉等の不純物を除去した後、超純水100cm3で洗浄、室温で24時間乾燥することにより、歯槽骨の再生に理想的な粒度0.5〜1mmの粉砕試料エネメル質・象牙質の混合粉体）が得られた。図4に粉砕前の抜去歯、図5に粉砕品の写真を示す。
【００３８】
実施例3
[抜去歯粉砕試料の脱灰処理工程]
ZrO2製容器に実施例2で得たエナメル質・象牙質の混合粉体0.3g、2%-HClまたはHNO3水溶液30cm3を添加し、3,000rpm, 3時間、ZrO2製粉砕刃を用いて攪拌脱灰することにより、ミネラル成分が完全に溶解除去された脱灰粉が得られた。HCl水溶液を用いて得られた脱灰粉の写真を図6に示す。HNO3水溶液を用いて得られた脱灰粉の写真を図7に示す。
【００３９】
得られた脱灰粉の電子線微小部分析(EPMA)では、酸処理時間の増加に伴い、CaとP濃度が減少し、約3時間でCaとPがほぼ検出されないことから、脱灰反応がほぼ完結することが分かる(図8)。
【００４０】
ZrO2製容器内温度36℃を超えないようにするため、容器外壁を冷却したり、酸水溶液充填量の調整により冷却必要空間を確保する操作を施すことが好ましい。脱灰工程で容器温度が上昇した場合は、コラーゲンの変性と骨形成蛋白質（BMP）活性の低下がみられる。
【００４１】
脱灰スラリーを濾過し、超純水100〜150cm3で洗浄し、室温で24時間乾燥することにより、自家歯由来BMP含有コラーゲン(Teeth-Originated Collagen with Bone Morphogenetic Protein: TOC-BMP)粉末が0.17g得られた。
【００４２】
実施例4
[抜去・表面切削歯の粉砕・洗浄・脱灰処理]
実施例2および3と同様の条件で、出発試料として、抜去・表面切削歯を用いた場合には、抜去歯表面近傍のエナメル質が除去されているため、上記と同様な粉砕・洗浄・脱灰工程(図9)により、象牙質由来BMP含有コラーゲン(Dentin-Originated Collagen with Bone Morphogenetic Protein: DOC-BMP)が0.11g得られた。
【００４３】
実施例5
[抜去歯由来アパタイト/コラーゲン複合材料の作製技術(1)]
TOC/AC-BMP (No.1)の作製 (HApの結晶成長を伴うコラーゲンとの複合化)
実施例3における抜去歯粉砕試料の脱灰処理工程時のa)生理食塩氷を含んだ粉砕スラリー(Ap)の濾液とb)TOC-BMP粉末を用いる。ZrO2製容器にApの濾液を入れ、10%-NH3水, 3cm3を室温で滴下し約pH8.5に調製後、1,000 rpm, 4時間攪拌することにより、アパタイト(HAp)を再析出させた。そのHApスラリーに、TOC-BMP粉末を添加し、室温、約pH8.0、1,000rpm, 4時間攪拌混合することにより、TOC-BMP表面上にHAp結晶を分散・複合化した。それを濾過、超純水10,000cm3で洗浄、室温で24時間乾燥することにより、TOC-BMPとHApの複合材料 (TOC/AC-BMP (No.1))が0.52g得られた。得られたTOC/AC-BMP(No.1)の写真(微細構造)を図11に示す。
【００４４】
実施例6
[抜去歯由来アパタイト/コラーゲン複合材料の作製技術(2)]
DOC/AC-BMP (No.1)の作製 (HApの結晶成長を伴うコラ−ゲンとの複合化)
実施例4における抜去・表面切削歯を用いた場合では、脱灰処理工程時のa)Ap濾液とb)DOC-BMP粉末を用いる。実施例5と同様な工程によりDOC-BMPとHApの複合材料(DOC/AC-BMP(No.1))が0.50g得られた。図12にDOC/AC-BMP (No.1)の作製方法のスキームを示す。また、図13に得られたDOC/AC-BMP (No.1)の写真(微細構造)を示す。
【００４５】
実施例7
[抜去歯由来アパタイト/コラーゲン複合材料の作製技術(3)]
TOC/AC-BMP (No.2)の作製 (HApゲルとコラーゲンの複合化)
実施例3の抜去歯粉砕試料の脱灰処理工程時のa)Apの濾液とb)TOC-BMP粉末を用いる。Ap濾液を室温、1,000rpmで攪拌しながら、200cm3の10%-NH3水を1時間で滴下しpH10.5に調製後、3時間攪拌熟成することにより、アパタイト(HAp)を再析出させた。それを濾過、超純水18,000cm3で洗浄することにより、pH7.5以下のHApゲルを調製した。HApゲルスラリー50cm3にTOC-BMP粉末を添加し、室温、200rpm, 1時間攪拌混合することにより、TOC-BMP表面上にHAp結晶を分散・複合化した。それを室温で24時間乾燥することにより、TOC/AC-BMP (No.2)が0.45g得られた。図14にTOC/AC-BMP (No.2)の作製方法のスキームを示す。また、図15に得られたDOC/AC-BMP (No.2)の写真(微細構造)を示す。
【００４６】
実施例8
[抜去歯由来アパタイト/コラーゲン複合材料の作製技術(4)]
DOC/AC-BMP (No.2)の作製 (HApゲルとコラーゲンの複合化)
実施例4の抜去・表面切削歯を用いた場合では、脱灰処理工程時のa)Ap濾液とb)DOC-BMP粉末を用いる。実施例7と同様な工程により、DOC/AC-BMP (No.2)が0.44g得られた。図16にDOC/AC-BMP (No.2)の作製方法のスキームを示す。
【００４７】
実施例9
[抜去歯由来アパタイト/コラーゲン複合材料の作製技術(5)]
TOC/AC-BMP (No.3)の作製 (疑似体液中でHAp微結晶の表面修飾)
生体模倣環境下でHAp微結晶を析出させるために、疑似体液(SBF)を調製した。1000cm3のポリエチレンビーカーに約700cm3の超純粋水とスターラを入れた。これを恒温槽に入れ、攪拌しながら36.5℃に保ち、NaCl, NaHCO3, KCl, K2HPO4・3H2O, MgCl2・6H2O, 1M-HCl,CaCl2, Na2SO4, (CH2OH)3CNH2試薬を順に加えた。その溶液に1M-HClを徐々に滴下し、pH7.40に調節した。メスシリンダー内で、超純水を添加し、全量を1000cm3とし、ポリエチレン製瓶に入れ、5〜10℃で冷蔵保存した。図17に疑似体液の調製方法のスキームと条件(表)を示す。
【００４８】
実施例3の抜去歯粉砕試料の脱灰処理工程時のa)Apの濾液とb)TOC-BMP粉末を用いる。Ap濾液を室温、1,000rpmで攪拌しながら、200cm3の10%-NH3水を1時間で滴下しpH10.5 に調製後、3時間攪拌熟成することにより、アパタイト(HAp)を再析出させた。それを濾過、超純水18,000cm3で洗浄することにより、pH7.5以下のHApゲルを調製した。HApゲルスラリー50cm3にTOC-BMP粉末を添加し、室温、200rpm, 1時間攪拌混合することにより、TOC-BMP表面上にHAp結晶を分散・複合化したTOC/AC-BMPゲルが得られた。それを36.5℃、pH7.40で100cm3のSBFに7日間浸漬、濾過、乾燥することにより、bone-like apatiteを析出させたTOC/AC-BMP (No.3)が0.48g得られた。図18にTOC/AC-BMP (No.3)の作製方法のスキームを示す。
【００４９】
実施例10
[抜去歯由来アパタイト/コラーゲン複合材料の作製技術(6)]
DOC/AC-BMP (No.3)の作製 (疑似体液中でHAp微結晶の表面修飾)
実施例4の抜去・表面切削歯を用いた場合では、脱灰処理工程時のa)Ap濾液とb)DOC-BMP粉末を用いる。実施例9と同様な工程により、DOC/AC-BMP (No.3)が0.47g得られた。図19にDOC/AC-BMP (No.3)の作製方法のスキームを示す。
【００５０】
実施例11
1.  実験動物と飼育
実験動物は、雄性、4週齢のヌードマウス(体重:約30g)を使用した。1週間の検疫期間をおき、全身的に異常のないことを確認した後、以下の実験に用いた。
【００５１】
2.  ヒト脱灰象牙質の調製
実施例3で調製した脱灰象牙質顆粒(TOC-BMP粉末)は70mgずつに分別し、改良シリンジ(1mlツベルクリン用注射シリンジ改良)内に入れ、埋植直前に生理食塩水100μｌをTOC-BMP粉末に滴下含浸させた。
【００５２】
3.  皮下埋植
全身麻酔下で背部両側に１カ所ずつ、計２カ所に約10mmの皮下切開を加え、皮下結合組織を鈍的に剥離してポケットを形成した。埋植物は切開創付近に後戻りしないよう切開創から10mm距離をとって埋植し、切開創復位後ナイロン糸で1針縫合し、術後の感染予防のため抗生剤軟膏を塗布して終了した。
【００５３】
4.  組織学的観察
埋植2、4週後に屠殺し、埋植物を一塊として摘出した。試料は、10%中性緩衝ホルマリン液に24時間浸漬固定した。10%蟻酸-クエン酸溶液で3日間脱灰した後、パラフィン包埋して厚さ4μmの連続切片を作製した。ヘマトキシリン−エオジン(hematoxylin-eosin:H-E)染色を施し、光学顕微鏡で組織学的に観察した。
【００５４】
結果
組織学的観察(２週後)結果を図19に示す。埋入物は薄い線維性膜で被包化されDDMは緻密構造を呈し、多数の象牙細管が観察された。炎症性細胞浸潤は極めて軽度であった。
【００５５】
組織学的観察(4週後)結果を図20に示す。TOC-BMP顆粒表面に骨誘導が確認された。TOC-BMP表層の一部に多核巨細胞による吸収窩がみられたが、TOC-BMPは全体的に残存していた。TOC-BMPが感染したり、排除されることはなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明は、歯周病等の歯科治療に有用な歯科材料である抜去歯粉砕品等の各種素材を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ジルコニア製容器およびジルコニア製粉砕刃の写真。
【図２】粉砕機(歯用リサイクルユニット)の写真。
【図３】実施例2におけるTOC-BMPの作製方法を示すスキーム。
【図４】実施例2に用いた粉砕前の抜去歯の写真を示す。
【図５】実施例2で得られた粉砕品の写真を示す。
【図６】実施例3においてHCl水溶液を用いて得られた脱灰粉の写真を示す。
【図７】実施例3においてHNO3水溶液を用いて得られた脱灰粉の写真を示す。
【図８】実施例3において得られた脱灰粉の電子線微小部分析(EPMA)結果。
【図９】実施例4におけるDOC-BMPの作製方法を示すスキーム。
【図１０】実施例5におけるTOC/AC-BMP(No.1)の作製方法を示すスキーム。
【図１１】実施例5で得られたTOC/AC-BMP(No.1)の微細構造を示す写真。
【図１２】実施例6におけるDOC/AC-BMP(No.1)の作製方法を示すスキーム。
【図１３】実施例6で得られたDOC/AC-BMP(No.1)の微細構造を示す写真。
【図１４】実施例7におけるTOC/AC-BMP(No.2)の作製方法のスキームを示す。
【図１５】実施例7で得られたTOC/AC-BMP(No.2)の微細構造を示す写真。
【図１６】実施例8におけるDOC/AC-BMP(No.2)の作製方法のスキームを示す。
【図１７】実施例9における疑似体液の調製方法のスキームと条件(表)を示す。
【図１８】実施例9におけるTOC/AC-BMP(No.3)の作製方法のスキームを示す。
【図１９】実施例10における図18にDOC/AC-BMP (No.3)の作製方法のスキームを示す。
【図２０】実施例11において得られた組織学的観察(2週後)結果。
【図２１】実施例11において得られた組織学的観察(4週後)結果。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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