(57)【要約】【課題】甲状腺未分化癌などの癌に特徴的な挙動を示す遺伝子を同定して癌の検出方法を提供すること。【解決手段】検体における８番染色体ｐ１２領域の遺伝子の増幅を指標として当該検体の癌化を検出することを含む、癌の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体における８番染色体ｐ１２ゲノムＤＮＡ領域の遺伝子の増幅を指標として当該検体の癌化を検出することを含む、癌の検出方法。
【請求項２】
前記遺伝子が、ＦＵＴ１０遺伝子、ＬＯＣ８４５４９遺伝子、ＦＬＪ２３２６３遺伝子、ＲＮＦ１２２遺伝子、又はＮＡＴＡ１遺伝子のいずれかである、請求項１に記載の癌の検出方法。
【請求項３】
増幅の指標が、正常検体と比較して１．５倍以上である、請求項１又は２に記載の癌の検出方法。
【請求項４】
検体が甲状腺由来細胞である、請求項１から３の何れかに記載の癌の検出方法。
【請求項５】
癌が甲状腺未分化癌である、請求項１から４の何れかに記載の癌の検出方法。
【請求項６】
甲状腺細胞におけるＮＡＴＡ１遺伝子の増幅を指標として当該甲状腺細胞の癌化を検出することを含む、甲状腺癌の検出方法。
【請求項７】
遺伝子の増幅を、ＤＮＡチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、ＣＧＨ法、またはアレイＣＧＨ法のいずれかの方法を用いて検出する、請求項１から６の何れかに記載の癌の検出方法。
【請求項８】
ＦＵＴ１０遺伝子、ＬＯＣ８４５４９遺伝子、ＦＬＪ２３２６３遺伝子、ＲＮＦ１２２遺伝子、又はＮＡＴＡ１遺伝子から選択される遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを、インビトロで細胞に導入することを含む、細胞の増殖を抑制する方法。
【請求項９】
ＦＵＴ１０遺伝子、ＬＯＣ８４５４９遺伝子、ＦＬＪ２３２６３遺伝子、ＲＮＦ１２２遺伝子、又はＮＡＴＡ１遺伝子から選択される遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、細胞増殖抑制剤。
【請求項１０】
ＦＵＴ１０遺伝子、ＬＯＣ８４５４９遺伝子、ＦＬＪ２３２６３遺伝子、ＲＮＦ１２２遺伝子、又はＮＡＴＡ１遺伝子から選択される遺伝子を、インビトロで細胞に導入することを含む、細胞の増殖を活性化する方法。
【請求項１１】
ＦＵＴ１０遺伝子、ＬＯＣ８４５４９遺伝子、ＦＬＪ２３２６３遺伝子、ＲＮＦ１２２遺伝子、又はＮＡＴＡ１遺伝子から選択される遺伝子を含む、細胞増殖活性化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、甲状腺未分化癌などの癌を初期に診断するために、さらには甲状腺未分化癌などの癌の悪性度を調べるために、ヒト８番染色体ｐ１２領域のゲノム増幅を検出する方法に関する。また、本発明は、Ｎｏｖｅｌ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｔｈｙｒｏｉｄ Ａｎａｐｌａｓｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ 1 （ＮＡＴＡ１）遺伝子と甲状腺未分化癌との関係についての知見を用いた癌の増殖を抑制する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ  ｃａｎｃｅｒ）は濾胞細胞由来の乳頭癌、濾胞癌、未分化癌および傍濾胞細胞由来の髄様癌の４つの組織型に分類される。甲状腺癌の中でも、甲状腺未分化癌［Ａｎａｐｌａｓｔｉｃ  ｔｈｙｒｏｉｄ  ｃａｎｃｅｒ（ＡＴＣ）］は非常に増殖が早く、未分化癌の約８０％の人は、治療しても１年以内に死亡する（Ｐａｓｓｌｅｒ，Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｅｎｂｅｃｋｓ．Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．３８４，２８４−２９３，１９９９；Ｖｏｕｔｉｌａｉｎｅｎ，Ｐ．Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．２３，９７５−９７８，１９９９）。従って、甲状腺未分化癌の治療は困難であるので、未分化転化する以前の甲状腺分化癌に対する徹底的な治療が重要である。このため、甲状腺未分化癌の発生機構の理解および未分化転化する可能性の高い甲状腺分化癌症例の選別が必要となる。これまでの研究により、細胞は、細胞の分化と増殖の過程で、遺伝子の変化が連鎖的に起こり、その結果、癌化に至ると考えられている。しかし、どのような遺伝子の変化が、甲状腺未分化癌を誘導するのかは、未だ明らかではない。従って、甲状腺未分化癌の検出方法並びに甲状腺未分化癌の悪性度の検査方法は存在しない状況である。
【０００３】
【非特許文献１】Ｐａｓｓｌｅｒ，Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｅｎｂｅｃｋｓ．Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．３８４，２８４−２９３，１９９９
【非特許文献２】Ｖｏｕｔｉｌａｉｎｅｎ，Ｐ．Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．２３，９７５−９７８，１９９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
甲状腺細胞の癌化についての遺伝子レベルでのメカニズムが解明されれば、遺伝子レベルにおける甲状腺細胞の癌化の早期発見や甲状腺癌の悪性度の診断をおこなうことが可能となり、さらに、当該メカニズムに基づく薬剤の選別、開発や治療方法を確立することも可能となるはずである。具体的には、甲状腺未分化癌に特徴的な挙動を示す遺伝子を同定して、当該遺伝子を中心とした技術的検討をおこなうことにより、この課題を解決することができると考えられる。即ち、本発明は、甲状腺未分化癌などの癌に特徴的な挙動を示す遺伝子を同定して癌の検出方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ （ＣＧＨ）はゲノム上で多数の遺伝子増幅並びに欠失に伴う遺伝子異常を解析するためには、簡便で迅速であり、最良の方法である。そして、癌化並びに癌の悪性化に関与するゲノム上の遺伝子異常を解析するためにＣＧＨアレイに搭載する８００種類のＢＡＣ/ＰＡＣ  ＤＮＡを選別する（Ｔａｋａｄａ  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．９６，１００−１０５，２００５）ことにより、甲状腺細胞の癌化を活性化する癌遺伝子、すなわち、Ｎｏｖｅｌ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｔｈｙｒｏｉｄ Ａｎａｐｌａｓｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ 1 （ＮＡＴＡ１）遺伝子の同定に成功した。そして、ＮＡＴＡ１遺伝子の増幅、すなわち、ＮＡＴＡ１タンパク質の増加が甲状腺未分化癌細胞の増殖を顕著に促進すること、また、ＮＡＴＡ１遺伝子の転写産物を抑制すると甲状腺未分化癌細胞の増殖が著しく低下することを見出すことに成功し、本発明を完成した。
【０００６】
即ち、本発明によれば、検体における８番染色体ｐ１２領域の遺伝子の増幅を指標として当該検体の癌化を検出することを含む、癌の検出方法が提供される。
【０００７】
好ましくは、前記遺伝子は、ＦＵＴ１０遺伝子、ＬＯＣ８４５４９遺伝子、ＦＬＪ２３２６３遺伝子、ＲＮＦ１２２遺伝子、又はＮＡＴＡ１遺伝子のいずれかである。
好ましくは、増幅の指標は、正常検体と比較して１．５倍以上である。
好ましくは、検体は甲状腺由来細胞である。
好ましくは、癌は甲状腺未分化癌である。
【０００８】
好ましくは、本発明の方法は、甲状腺細胞におけるＮＡＴＡ１遺伝子の増幅を指標として当該甲状腺細胞の癌化を検出することを含む甲状腺癌の検出方法である。
好ましくは、遺伝子の増幅を、ＤＮＡチップ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法、ＣＧＨ法、またはアレイＣＧＨ法のいずれかの方法を用いて検出する。
【０００９】
本発明の別の側面によれば、ＦＵＴ１０遺伝子、ＬＯＣ８４５４９遺伝子、ＦＬＪ２３２６３遺伝子、ＲＮＦ１２２遺伝子、又はＮＡＴＡ１遺伝子から選択される遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを、インビトロで細胞に導入することを含む、細胞の増殖を抑制する方法が提供される。
【００１０】
本発明のさらに別の側面によれば、ＦＵＴ１０遺伝子、ＬＯＣ８４５４９遺伝子、ＦＬＪ２３２６３遺伝子、ＲＮＦ１２２遺伝子、又はＮＡＴＡ１遺伝子から選択される遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、細胞増殖抑制剤が提供される。
【００１１】
本発明のさらに別の側面によれば、ＦＵＴ１０遺伝子、ＬＯＣ８４５４９遺伝子、ＦＬＪ２３２６３遺伝子、ＲＮＦ１２２遺伝子、又はＮＡＴＡ１遺伝子から選択される遺伝子を、インビトロで細胞に導入することを含む、細胞の増殖を活性化する方法が提供される。
【００１２】
本発明のさらに別の側面によれば、ＦＵＴ１０遺伝子、ＬＯＣ８４５４９遺伝子、ＦＬＪ２３２６３遺伝子、ＲＮＦ１２２遺伝子、又はＮＡＴＡ１遺伝子から選択される遺伝子を含む、細胞増殖活性化剤が提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、甲状腺細胞検体における癌種の分類、癌化の兆候、癌の進行度や悪性度を的確に把握することが可能となった。また、甲状腺未分化癌細胞において増幅するＮＡＴＡ１遺伝子の転写産物を阻害することにより、当該甲状腺未分化癌細胞の増殖を抑制することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
（１）癌の検出方法
本発明による癌の検出方法は、検体における８番染色体ｐ１２領域の遺伝子の増幅を指標として当該検体の癌化を検出することを特徴とする。
【００１５】
ヒトゲノムプロジェクトの成果により、ヒトＮＡＴＡ１遺伝子（別名：ＭＧＣ１１３６、ＭＧＣ２６２７、ＭＫＰ８、ＳＫＲＰ３、ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ２６などともいう）の転写産物は既に知られており（ＮＡＴＡ１、ＭＧＣ１１３６、ＭＧＣ２６２７、ＭＫＰ８、ＳＫＲＰ３、ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ２６：ＮＭ＿０２４０２５）、８ｐ１２染色体に存在する遺伝子である（Ｖａｓｕｄｅｖａｎ，Ｓ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３０，５１１−５１８，２００５）。ヒトＮＡＴＡ１遺伝子がコードするタンパク質は、ｄｕａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｄｏｍａｉｎを含み、脱リン酸化活性を有する。しかしながら、このヒトＮＡＴＡ１遺伝子が、ヒト甲状腺未分化癌発症に関わる重要な癌遺伝子であることは本発明以前においては知られていなかった。
【００１６】
同様に、８ｐ１２染色体に存在する遺伝子としては、ＦＵＴ１０遺伝子、ＬＯＣ８４５４９遺伝子、ＦＬＪ２３２６３遺伝子、及びＲＮＦ１２２遺伝子が知られている。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）のデータベースより、各遺伝子は、
ＦＵＴ１０遺伝子：ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  １０  （ａｌｐｈａ  （１，３）  ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ＮＭ＿０３２６６４（ＲＥＦＳＥＱ  ＩＤ）
ＬＯＣ８４５４９遺伝子：ＲＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １３  １、ＭＡＫ１６−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＲＢＭ１３  （ＲＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １３）  （ＮＮＰ７８）、ＮＭ＿０３２５０９（ＲＥＦＳＥＱ  ＩＤ）
ＦＬＪ２３２６３遺伝子：Ｃ８ＯＲＦ４１、ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ８  ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ  ４１、ＮＭ＿０２５１１５（ＲＥＦＳＥＱ  ＩＤ）
ＲＮＦ１２２遺伝子：ｒｉｎｇ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １２２、ＮＭ＿０２４７８７（ＲＥＦＳＥＱ  ＩＤ）
として登録されており、ヒトゲノム中にはＲＰ−１１クローンＩＤとして、７２２Ｅ２３、１０７Ｂ２に含まれる。（ＵＣＳＣゲノムブラウザ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＧａｔｅｗａｙ）にて閲覧可能）
【００１７】
上述したように、本発明の癌の検出方法の一例としては、甲状腺細胞におけるヒトＮＡＴＡ１遺伝子の増幅を検出することを特徴とする方法を挙げることができる。ヒトＮＡＴＡ１遺伝子の増幅を検出する対象となる甲状腺細胞は、検体提供者の生検組織細胞が好適である。この検体組織細胞は、健常人の甲状腺細胞か、甲状腺癌患者の当該癌組織であるかを問わないが、現実的には、検査等の結果、甲状腺に癌化が疑われる病変部が認められた場合の当該病変組織、または、甲状腺癌であることが確定しているが、その悪性度や進行度を判定する必要がある甲状腺癌の組織、等が主な対象となり得る。
【００１８】
本発明の検出方法により、「検査等の結果、甲状腺に癌化が疑われる病変部が認められた場合の当該病変組織」におけるヒトＮＡＴＡ１遺伝子の増幅が認められた場合には、当該病変組織は癌化に向かって進行しているか、あるいは既に癌化の状態であり、かつ、悪性度が高くなりつつあることが判明し、早急な本格的治療（手術等による病変部の除去、本格的な化学療法等）をおこなう必要性が示される。また、「甲状腺癌であることが確定しているが、その悪性度や進行度を判定する必要がある甲状腺癌の組織」におけるヒトＮＡＴＡ１遺伝子の増幅が認められた場合にも、当該癌組織の悪性度が高くなりつつあることが判明し、早急な本格的治療（手術等による病変部の除去、本格的な化学療法等）をおこなう必要性が示される。検体として採取された甲状腺細胞組織は、必要な処理、例えば、採取された組織からのＤＮＡあるいはＲＮＡの調製を行い、本検出方法をおこなう対象とすることができる。
【００１９】
本発明では、上述したように、甲状腺細胞におけるヒトＮＡＴＡ１遺伝子の増幅を検出することにより、当該細胞の癌化を特定することが可能である。
【００２０】
本発明では、検体における８番染色体ｐ１２領域の遺伝子の増幅を指標として検体の癌化を検出するが、検出される癌の種類は、８番染色体ｐ１２領域の遺伝子の増幅を示すものであれば特に限定されない。癌の具体例としては、例えば悪性黒色腫、悪性リンパ腫、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、尿管腫瘍、胆嚢癌、胆管癌、胆道癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、睾丸腫瘍、上顎癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、甲状腺癌、脳腫瘍、カポジ肉腫、血管腫、白血病、真性多血症、神経芽細胞腫、網膜芽腫、骨髄腫、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚癌、基底細胞癌、皮膚付属器癌、皮膚転移癌、皮膚黒色腫などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明では、上記の癌の中でも甲状腺未分化癌を検出することが特に好ましい。
【００２１】
本発明の方法において増幅の指標として使用される８番染色体ｐ１２領域の遺伝子としては、例えば、ＦＵＴ１０遺伝子、ＬＯＣ８４５４９遺伝子、ＦＬＪ２３２６３遺伝子、ＲＮＦ１２２遺伝子、及びＮＡＴＡ１遺伝子を挙げることができる。本発明の方法においては、上記のような遺伝子が、正常検体と比較して１．５倍以上、好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上、特に好ましくは５倍以上増幅されている場合には、癌化を示すものであると判断することができる。
【００２２】
ヒトＮＡＴＡ１遺伝子などの８番染色体ｐ１２領域の遺伝子の増幅の検出を直接的に行うための代表的な方法としては、ＣＧＨ（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法とＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法を挙げることができる。この態様の本検出方法は、ヒトＮＡＴＡ１遺伝子を有するＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ、ＹＡＣ（Ｙｅａｓｔ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ、ＰＡＣ（Ｐ１−ｄｒｉｖｅｄ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ（以下、ＢＡＣ ＤＮＡ等ともいう）を標識し、ＦＩＳＨをおこなうと、ヒトＮＡＴＡ１遺伝子の増幅部分を検出することができる。具体的に、ヒトＮＡＴＡ１遺伝子を有するＢＡＣ ＤＮＡとしては、ＲＰ１１−２Ｉ１３、ＲＰ１１−１４３Ｏ７、ＲＰ１１−１０８１Ｇ１８、ＲＰ１１−１０Ｄ７、ＲＰ１１−１０７Ｂ２、ＲＰ１１−５３９Ｐ２、ＲＰ１１−２Ｉ１３等を挙げることができる。
【００２３】
上記の態様の方法は、ゲノムＤＮＡ定着基盤を用いておこなうことが、好適であり、かつ、現実的である。
【００２４】
通常に得られるＢＡＣ ＤＮＡ等は、ゲノムＤＮＡ定着基盤を多数製造して実用化するには少量であるので、当該ＤＮＡを遺伝子増幅産物として得る必要がある（この遺伝子増幅行程を「無尽蔵化」ともいう）。無尽蔵化においては、まずＢＡＣ ＤＮＡ等を、４塩基認識酵素、例えば、ＲｓａＩ、ＤｐｎＩ、ＨａｅＩＩＩ等で消化した後、アダプターを加えてライゲーションをおこなう。アダプターは１０〜３０塩基、好適には１５〜２５塩基からなるオリゴヌクレオチドで、２本鎖は相補的配列を有し、アニーリング後、平滑末端を形成する側の３‘-末端のオリゴヌクレオチドをリン酸化する必要がある。次に、アダプターの一方のオリゴヌクレオチドと同一配列を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により増幅し、無尽蔵化することができる。一方、各ＢＡＣ ＤＮＡ等に特徴的な５０〜７０塩基のアミノ化オリゴヌクレオチドを検出用プローブとして用いることもできる。
【００２５】
このようにして無尽蔵化したＢＡＣ ＤＮＡ等を基盤上、好適には固体基盤上に定着させることにより、所望するＤＮＡ定着基盤を製造することができる。固体基盤としては、ガラス板が好ましい。ガラス等の固体基盤は、ポリ−Ｌ−リジン、アミノシラン、金・アルミニウム等の凝着により基盤をコートすることがより好ましい。
【００２６】
上記の無尽蔵化したＤＮＡを基盤上にスポットする濃度は、好ましくは１０ｐｇ/μｌ〜５μｇ/μｌ、より好ましくは１ｎｇ/μｌ〜２００ｎｇ/μｌである。スポットする量は好ましくは１ｎｌ〜１μｌ、より好ましくは１０ｎｌ〜１００ｎｌである。また、基盤に定着させる個々のスポットの大きさ及び形状は、特に限定されないが、例えば、大きさは直径０．０１〜１ｍｍであり得、上面から見た形状は円形〜楕円形であり得る。乾燥スポットの厚みは、特に制限はないが、１〜１００μｍである。さらに、スポットの個数は、特に制限はないが、使用する基盤あたり１０〜５０，０００個、より好ましくは１００〜５，０００個である。それぞれのＤＮＡはＳｉｎｇｕｌａｒからＱｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅの範囲でスポットするが、Ｄｕｐｌｉｃａｔｅ或るいはＴｒｉｐｌｉｃａｔｅにスポットすることが好ましい。
【００２７】
乾燥スポットの調整は、例えば、スポッターを用いて無尽蔵化したＢＡＣ ＤＮＡ等を基盤上にたらして、複数のスポットを形成した後、スポットを乾燥することにより製造することができる。スポッターとしてインクジェット式プリンター、ピンアレイ式プリンター、バブルジェット（登録商標）式プリンターが使用できるが、インクジェット式プリンターを使用することが望ましい。例えば、ＧＥＮＥＳＨＯＴ（日本ガイシ株式会社、名古屋）等を使用できる。
【００２８】
このようにして無尽蔵化したＢＡＣ ＤＮＡ等を基盤上、好適には固体基盤上に定着させることにより、所望するＤＮＡ定着基盤を製造することができる。
【００２９】
また、このヒトＮＡＴＡ１遺伝子の増幅を直接的に検出する手段の一つとしてサザンブロット法を挙げることができる。サザンブロット法は、検体から得られるゲノムDNAを分離して固定し、これと、ヒトＮＡＴＡ１遺伝子とのハイブリダイゼーションを検出することにより、検体中の当該遺伝子の存在を検出する方法である。
【００３０】
また、ノーザンブロット法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によりヒトＮＡＴＡ１遺伝子の増幅を検出してもよい。ノーザンブロット法は、検体から得られるｍＲＮＡを分離して固定し、これとヒトＮＡＴＡ１遺伝子とのハイブリダイゼーションを検出することにより、検体中の当該遺伝子のｍＲＮＡの存在を検出する方法である。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法は、逆転写反応とポリメラーゼ連鎖反応による目的遺伝子の増幅を経時的（リアルタイム）に測定する方法であり、増幅率に基づいて鋳型となるｍＲＮＡの定量を行なうことができる。この定量は蛍光色素を用いて行われ、二種類の方法がある。即ち、二重鎖DNAに特異的に挿入（インターカレート）して蛍光を発する色素 (例えば、SYBR green) を用いる方法と、増幅するDNA配列に特異的なオリゴヌクレオチドに蛍光色素を結合させたプローブを用いる方法が知られている。
【００３１】
（２）細胞の増殖抑制方法、及び細胞増殖抑制剤
本発明によれば、ＦＵＴ１０遺伝子、ＬＯＣ８４５４９遺伝子、ＦＬＪ２３２６３遺伝子、ＲＮＦ１２２遺伝子、又はＮＡＴＡ１遺伝子から選択される遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを、インビトロで癌細胞に導入することを含む細胞の増殖を抑制する方法、並びに上記ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む細胞増殖抑制剤が提供される。
【００３２】
ｓｉＲＮＡは、約２０塩基（例えば、約２１〜２３塩基）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡであり、このようなｓｉＲＮＡ は、細胞に発現させることにより、そのｓｉＲＮＡ の標的となる遺伝子（本発明においては、ＦＵＴ１０遺伝子、ＬＯＣ８４５４９遺伝子、ＦＬＪ２３２６３遺伝子、ＲＮＦ１２２遺伝子、又はＮＡＴＡ１遺伝子）の発現を抑制することができる。
【００３３】
本発明において用いられるｓｉＲＮＡ は、ＲＮＡｉを引き起こすことができる限り、どのような形態のものでもよい。ここで、「ｓｉＲＮＡ 」とは、ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖ＲＮＡをいい、通常、５'−リン酸、３'−ＯＨの構造を有しており、３'末端は約２塩基突出している。このｓｉＲＮＡ に特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡ と同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡ の中央部でｍＲＮＡを切断する。
【００３４】
ｓｉＲＮＡ の配列と、標的として切断するｍＲＮＡの配列とは１００％一致することが好ましい。しかし、ｓｉＲＮＡ の中央から外れた位置の塩基が一致していない場合については、ＲＮＡｉによる切断活性は部分的には残存することが多いので、必ずしも１００％一致していなくてもよい。
【００３５】
ｓｉＲＮＡの塩基配列と、発現を抑制すべきＦＵＴ１０遺伝子、ＬＯＣ８４５４９遺伝子、ＦＬＪ２３２６３遺伝子、ＲＮＦ１２２遺伝子、又はＮＡＴＡ１遺伝子の塩基配列との間で相同性のある領域は、当該遺伝子の翻訳開始領域を含まないことが好ましい。翻訳開始領域には種々の転写因子や翻訳因子が結合することが予想されるため、ｓｉＲＮＡ が効果的にｍＲＮＡに結合することができず、効果が低減することが予測されるからである。従って、相同性を有する配列は、当該遺伝子の翻訳開始領域から２０塩基離れていることが好ましく、より好ましくは当該遺伝子の翻訳開始領域から７０塩基離れている。相同性を有する配列としては、例えば、当該遺伝子の３'末端付近の配列でもよい。
【００３６】
本発明の別の態様によれば、ＲＮＡｉにより標的遺伝子の発現を抑制することができる因子として、３'末端に突出部を有する短いヘアピン構造から成るｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）を使用することができる。ｓｈＲＮＡとは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子のことを言う。そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡ と同様にＲＮＡｉを引き起こすことができる。上記の通りｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ と同様にＲＮＡｉを引き起こすことから、本発明において有効に用いることができる。
【００３７】
ｓｈＲＮＡは好ましくは、３'突出末端を有している。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは約１０ヌクレオチド以上であり、より好ましくは約２０ヌクレオチド以上である。ここで、３'突出末端は、好ましくはＤＮＡであり、より好ましくは少なくとも２ヌクレオチド以上のＤＮＡであり、さらに好ましくは２〜４ヌクレオチドのＤＮＡである。
【００３８】
上記の通り、本発明では、ＲＮＡｉによりＦＵＴ１０遺伝子、ＬＯＣ８４５４９遺伝子、ＦＬＪ２３２６３遺伝子、ＲＮＦ１２２遺伝子、又はＮＡＴＡ１遺伝子の発現を抑制することができる因子として、ｓｉＲＮＡ またはｓｈＲＮＡを使用することができる。ｓｉＲＮＡの長所としては、（１）細胞内に導入してもＲＮＡ自体は正常細胞の染色体内に組み込まれないので、子孫に伝わる変異を起こすような治療ではなく、安全性が高いこと、及び（２）短鎖二本鎖ＲＮＡは化学合成が比較的容易であり二本鎖にするとより安定であること、などが挙げられる。また、ｓｈＲＮＡの長所としては、遺伝子発現を長期間抑制することによって治療を行う場合、細胞内でｓｈＲＮＡを転写するようなベクターを作製して細胞内に導入することができることなどが挙げられる。
【００３９】
本発明で用いるＲＮＡｉによりＦＵＴ１０遺伝子、ＬＯＣ８４５４９遺伝子、ＦＬＪ２３２６３遺伝子、ＲＮＦ１２２遺伝子、又はＮＡＴＡ１遺伝子の発現を抑制することができるｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、人工的に化学合成してもよいし、センス鎖およびアンチセンス鎖のＤＮＡ配列を逆向きに連結したヘアピン構造のＤＮＡをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによってインビトロでＲＮＡを合成することによって作製することもできる。インビトロで合成する場合は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡを合成することができる。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、ＲＮＡｉが引き起こされ、標的遺伝子の発現が抑制される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法、又は各種のトランスフェクション試薬（例えば、oligofectamine、Lipofectamineおよびlipofectionなど）を用いてそのようなＲＮＡを細胞内に導入することができる。
【００４０】
上記したｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、細胞増殖抑制剤として有用である。本発明の細胞増殖抑制剤の投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）、患部への直接投与などが挙げられる。本発明の薬剤は、医薬組成物として使用する場合、必要に応じて薬学的に許容可能な添加剤を配合することができる。  薬学的に許容可能な添加剤の具体例としては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、キャリア、賦形剤および／または薬学的アジュバントなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
本発明の薬剤の製剤形態は特に限定されないが、例えば、液剤、注射剤、徐放剤などが挙げられる。本発明の薬剤を上記製剤として処方するために使用される溶媒としては、水性または非水性のいずれでもよい。
【００４２】
さらに、本発明の細胞増殖抑制剤の有効成分であるｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターの形態で投与することができる。非ウイルスベクター形態の場合、リポソームを用いて核酸分子を導入する方法（リポソーム法、ＨＶＪ−リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクション法、リポフェクトアミン法など）、マイクロインジェクション法、遺伝子銃（Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ）でキャリア（金属粒子）とともに核酸分子を細胞に移入する方法などを利用することができる。ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡをウイルスベクターを用いて生体に投与する場合は、組換えアデノウイルス、レトロウイルスなどのウイルスベクターを利用することができる。無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０などのＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを発現するＤＮＡを導入し、細胞または組織にこの組換えウイルスを感染させることにより、細胞または組織内に遺伝子を導入することができる。
【００４３】
本発明の細胞増殖抑制剤の投与量は、使用目的、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、又は有効成分であるｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの種類などを考慮して、当業者が決定することができる。ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの投与量は特に限定されないが、例えば、約０．１ｎｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約１ｎｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日である。ＲＮＡｉは、一般に投与後１〜３日間効果が見られる。したがって、毎日〜３日に１回の頻度で投与することが好ましい。発現ベクターを用いる場合、１週間に１回程度投与することも可能である。
【００４４】
本発明では、アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞増殖抑制剤として使用することもできる。本発明で用いるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＦＵＴ１０遺伝子、ＬＯＣ８４５４９遺伝子、ＦＬＪ２３２６３遺伝子、ＲＮＦ１２２遺伝子、又はＮＡＴＡ１遺伝子のＤＮＡ配列中の連続する５から１００の塩基配列に対して相補的な、またはハイブリダイズするヌクレオチドであって、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれであっても良く、また機能に支障がない限りにおいて修飾されたものであってもよい。本明細書で言う「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドがすべて相補的であるもののみならず、ＤＮＡ又はｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとが安定にハイブリダイズできる限り、多少のミスマッチが存在してもよい。
【００４５】
なお、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾されていてもよい。適当な修飾を施すことにより、当該アンチセンスオリゴヌクレオチドは生体内で分解されにくくなり、より安定してITIIαを阻害できるようになる。このような修飾されたオリゴヌクレオチドとしては、Ｓ−オリゴ型（ホスフォロチオエート型）、Ｃ−５チアゾール型、Ｄ−オリゴ型（フォスフォジエステル型）、Ｍ−オリゴ型（メチルフォスフォネイト型）、ペプチド核酸型、リン酸ジエステル結合型、Ｃ−５プロピニルピリミジン型、２−Ｏ−プロピルリボース、２'−メトキシエトキシリボース型等の修飾型のアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、リン酸基を構成する酸素原子の少なくとも一部がイオウ原子に置換、修飾されているものでもよい。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性、水溶性、ＲＮＡへの親和性に特に優れている。リン酸基を構成する酸素原子の少なくとも一部がイオウ原子に置換、修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、Ｓ−オリゴ型等のオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００４６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基数は、５０以下であることが好ましく、２５以下であることがより好ましい。塩基数があまりに多くなると、オリゴヌクレオチドの合成の手間とコストが増大し、また、収率も低下する。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基数は５以上であり、９以上であることが好ましい。塩基数が４以下の場合には、標的遺伝子に対する特異性が低下して好ましくないためである。
【００４７】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（又はその誘導体）は常法によって合成することができ、例えば、市販のＤＮＡ合成装置（例えばＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製など）によって容易に合成することができる。合成法はホスホロアミダイトを用いた固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法などで得ることができる。
【００４８】
本発明においてアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞増殖抑制剤として使用する場合には、一般的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドと製剤用添加物（担体、賦形剤など）とを含む医薬組成物の形態で提供される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトを含む哺乳動物に医薬として投与することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与経路は特に限定されず、経口投与または非経口投与（例えば、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔などへの粘膜投与、または吸入投与など）の何れでもよい。
【００４９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの製剤形態は特に限定されず、経口投与のための製剤としては例えば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤などが挙げられ、非経口投与のための製剤としては例えば、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、経粘膜吸収剤、経皮吸収剤、点鼻剤、点耳剤などが挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬剤の形態、使用すべき製剤用添加物、製剤の製造方法などは、いずれも当業者が適宜選択可能である。
【００５０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与量は、患者の性別、年齢または体重、症状の重症度、予防または治療といった投与目的、あるいは他の合併症状の有無などを総合的に考慮して適宜選択することができる。投与量は、一般的には、０．１μｇ／ｋｇ体重／日〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは０．１μｇ／ｋｇ体重／日〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。
【００５１】
（３）細胞増殖の活性化方法、及び細胞増殖活性化剤
本発明によればさらに、ＦＵＴ１０遺伝子、ＬＯＣ８４５４９遺伝子、ＦＬＪ２３２６３遺伝子、ＲＮＦ１２２遺伝子、又はＮＡＴＡ１遺伝子から選択される遺伝子を、インビトロで細胞に導入することを含む、細胞の増殖を活性化する方法、並びに上記遺伝子を含む細胞増殖活性化剤が提供される。
【００５２】
ＦＵＴ１０遺伝子、ＬＯＣ８４５４９遺伝子、ＦＬＪ２３２６３遺伝子、ＲＮＦ１２２遺伝子、又はＮＡＴＡ１遺伝子から選択される遺伝子は、ベクターに組み込んだ組換えベクターの形態で用いることができる。ベクターとしてはウイルスベクター又は動物細胞発現用ベクター、好ましくはウイルスベクターが用いられる。ウイルスベクターとしてはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。動物細胞発現用ベクターとしては例えばｐＣＸＮ２（Ｇｅｎｅ，  １０８，  １９３−２００，１９９１）、ＰＡＧＥ２０７（特開平６−４６８４１号公報）又はその改変体などを用いることができる。
【００５３】
上記組換えベクターは適当な宿主に導入して形質転換し、得られた形質転換体を培養することによって生産することができる。組換えベクターがウイルスベクターの場合、これを導入する宿主としてはウイルス生産能を有する動物細胞が用いられ、例えば、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞などが挙げられる。レトロウイルスベクターの宿主としては、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、ＭＬＶなどが、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターの宿主としては、ヒト胎児腎臓由来の２９３細胞などが用いられる。ウイルスベクターの動物細胞への導入はリン酸カルシウム法などで行うことができる。また、組換えベクターが動物細胞発現用ベクターの場合、これを導入する宿主としては大腸菌Ｋ１２株、ＨＢ１０１株、ＤＨ５α株などを使用でき、大腸菌の形質転換は当業者に公知である。
【００５４】
得られた形質転換体はそれぞれに適した培地、培養条件により培養する。例えば、大腸菌の形質転換体の培養は、生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他を含有するｐＨ５〜８程度の液体培地を用いて行うことができる。培養は通常１５〜４３℃で約８〜２４時間程度行う。この場合、目的とする組み換えベクターは、培養終了後、通常のＤＮＡ単離精製法により得ることができる。
【００５５】
また、動物細胞の形質転換体の培養は、例えば約５〜２０％のウシ胎児血清を含む１９９培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地などの培地を用いて行うことができる。培地のｐＨは約６〜８が好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１８〜６０時間行う。この場合、目的とする組み換えベクターは、それを含有するウイルス粒子が培養上清中に放出されるので、ウイルス粒子の濃縮、精製を塩化セシウム遠心法、ポリエチレングリコール沈澱法、フィルター濃縮法などにより得ることができる。
【００５６】
本発明の細胞増殖活性化剤は、有効成分である上記遺伝子を遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合することにより製造することができる。また、上記遺伝子をウイルスベクターに組み込んだ場合は、組換えベクターを含有するウイルス粒子を調製し、これを遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合する。
【００５７】
上記基剤としては、通常注射剤に用いる基剤を使用することができ、例えば、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物などの塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコースなどの溶液、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液などが挙げられる。あるいはまた、当業者に既知の常法に従って、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、植物油、界面活性剤などの助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製することもできる。これらの注射剤は、粉末化、凍結乾燥などの操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。
【００５８】
本発明の細胞増殖活性化剤の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内などの全身投与でもよいし、局所注射又は経口投与などの局所投与を行ってもよい。さらに、細胞増殖活性化剤の投与にあたっては、カテーテル技術、遺伝子導入技術、又は外科的手術などと組み合わせた投与形態をとることもできる。
【００５９】
本発明の細胞増殖活性化剤の投与量は、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日当たり組み換え遺伝子の重量として１μｇ／ｋｇ体重から１０００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。
【実施例】
【００６０】
実施例１：甲状腺未分化癌細胞でのヒト８ｐ１２領域の増幅
甲状腺未分化癌での新規な遺伝子増幅を検出するために、１４種類の甲状腺未分化癌細胞から調製したゲノムＤＮＡを用いて、ＭＧＣ Ｃａｎｃｅｒ Ａｒｒａｙ−８００のＣＧＨアレイを使用したＣＧＨアレイ解析をおこなった。
【００６１】
なお、対象として男性の健常人ゲノムＤＮＡを使用しＣｙ５で標識した。被検ＤＮＡとして上記甲状腺未分化癌細胞から調製したゲノムＤＮＡを使用しＣｙ３で標識した。具体的には、ＤｐｎＩＩ消化したゲノムＤＮＡ（０．５μｇ）を、各々０．６ｍＭ ｄＡＴＰ、０．６ｍＭ ｄＴＴＰ、０．６ｍＭ ｄＧＴＰ、０．３ｍＭ ｄＣＴＰ及び０．３ｍＭＣｙ３−ｄＣＴＰ（甲状腺未分化癌細胞）或るいは０．３ｍＭＣｙ５−ｄＣＴＰ（正常細胞）存在下で、ＢｉｏＰｒｉｍｅ Ａｒｒａｙ ＣＧＨ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により標識した。Ｃｙ３及びＣｙ５標識ｄＣＴＰはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社より入手した。両標識ゲノムＤＮＡをＣｏｔ−１ ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）存在下でエタノールを加えて沈殿させ、１２０μｌのハイブリダイゼーション混合液（５０％ホルムアミド、１０％Ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ、２ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ：１５０ｍＭ ＮａＣｌ/１５ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ）、４％ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ、ｐＨ７．０）に溶解した。３７℃で３０分間インキュベーション後、ハイブリダイゼーションチャンバーにセットしたＣＧＨアレイ上に加え、３７℃で３ｒｐｍ（ｒｏｕｎｄ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ）のスピードで振とうしながら４８−７２時間インキュベーションをおこなった。その後、ＣＧＨアレイを５０％ホルムアミド/２ｘＳＳＣ（ｐＨ７．０）溶液中で５０℃にて１５分間洗浄し、次に２ｘＳＳＣ/０．１％ＳＤＳ中で５０℃にて１５分間洗浄した。風乾した後、ＣＧＨアレイをＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂスキャナー（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてＣｙ３及びＣｙ５に由来する蛍光をモニタリングした。得られた結果をＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ４．１イメージングソフトウエア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて解析した。Ｃｙ３に由来する蛍光強度の平均とＣｙ５に由来する蛍光強度の平均を同じ値に調整し、Ｃｙ３/Ｃｙ５のＲａｔｉｏを求めた。ゲノムに異常がない場合にはＲａｔｉｏ値は１（ｌｏｇ２Ｒａｔｉｏ＝０）である。Ｒａｔｉｏ値が１．３２以上（ｌｏｇ２Ｒａｔｉｏで０．４以上）の時にゲノムの増幅があり、４以上の時に顕著な増幅が認められると判定した。Ｒａｔｉｏ値が０．７５以下（ｌｏｇ２Ｒａｔｉｏで−０．４以下）の時にゲノムのヘテロ接合体欠失の可能性、０．２５以下（ｌｏｇ２Ｒａｔｉｏで−２以下）の時にホモ接合体欠失の可能性が極めて大きいと判定した。
【００６２】
その結果、６クローン/遺伝子に増幅（ｌｏｇ２Ｒａｔｉｏ＞２）が認められた（表１）。そのうちの５クローン/遺伝子（ＭＥＴ、ＭＹＣ、ＰＶＴ１、ＹＡＰ１、ＣＩＡＰ１）については、様々なヒトの癌において既に報告がなされていた。しかし、甲状腺未分化癌（８３０５Ｃ）細胞においては、染色体８ｐ１２に存在するＰＡＣクローン、ＲＰ１−２５Ｄ１０、が増幅していることがわかった。このときのｌｏｇ２  Ｒａｔｉｏは３．２であった（図１Ａ：被検細胞として８３０５ＣのゲノムＤＮＡを用いて、実施例に示したＣＧＨアレイ上でＣＧＨ解析をおこなったときの代表的なアレイイメージである。染色体８ｐ１２におけるコピー数の増幅は明確なシグナルで示される。）。
【００６３】
【表１】
2007252243.tif 000002
【００６４】
また、甲状腺未分化癌細胞（８３０５Ｃ、８５０５Ｃ、ＫＴＡ１、ＫＴＡ２、ＨＴＣ/Ｃ３）を用いて、ＲＰ１−２５Ｄ１０の近くに位置するＢＡＣクローン（ＲＰ１１−２５８Ｍ１５）をプローブにしてＦＩＳＨ法をおこない、８３０５Ｃ細胞において８ｐ１２領域の増幅を確認した結果を図１Ｂに示す。また、８ｐ１２領域に位置するＢＡＣクローンとＦＩＳＨ法によるコピー数の増幅の相関関係を図１Ｃに示す。
【００６５】
実施例２：甲状腺未分化癌細胞でのヒトＮＡＴＡ１遺伝子の増幅
甲状腺未分化癌細胞で、実際にどのような遺伝子が増幅しているのかを特定するため、ＦＩＳＨ法でコピー数の増幅が多かったゲノム領域からヒトゲノムデータベース（ｈｔｔｐ://ｇｅｎｏｍｅ.ｕｃｓｃ.ｅｄｕ/）を用いて解析、候補遺伝子を特定し、実際に甲状腺未分化癌細胞から抽出したＴｏｔａｌ ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法にて候補遺伝子の発現量を検出した。
【００６６】
ヒトゲノムデータベースからの解析の結果、増幅が多かったゲノム領域から、ＦＵＴ１０、ＬＯＣ８４５４９、ＦＬＪ２３２６３、ＲＮＦ１２２、ＮＡＴＡ１（ＭＧＣ１１３６）遺伝子の５つの候補遺伝子を確認した（図１Ｃ）。そして、１４種類の甲状腺未分化癌細胞から抽出したＴｏｔａｌ ＲＮＡを用いて、５つの候補遺伝子の発現解析をおこなった結果、特に８３０５Ｃ細胞株でＮＡＴＡ１（ＭＧＣ１１３６）遺伝子が過剰発現していることがわかった（図１Ｄ）。
【００６７】
実施例３：ヒトＮＡＴＡ１遺伝子の発現による甲状腺未分化癌細胞の増殖
甲状腺未分化細胞の癌化における、ヒトＮＡＴＡ１遺伝子の役割を明らかにするため、本遺伝子発現を過剰にしたときに、甲状腺未分化癌胞株の増殖が活性化されるかどうか検討した。まず、ヒトＮＡＴＡ１遺伝子のｍｙｃタグを発現するプラスミド（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３Ｂ−ＮＡＴＡ１）を構築した。本プラスミドは、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅したヒトＮＡＴＡ１遺伝子ｃＤＮＡをｐＣＭＶ−Ｔａｇ３発現ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にｍｙｃエピトープと翻訳フレームが合うように挿入して作製した。対象として、ヒトＮＡＴＡ１遺伝子を挿入しない空ベクター（ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３Ｂ−ｍｏｃｋ）を使用した。これらの発現ベクターをトランスフェクション試薬であるＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）と混合し、ＫＴＡ１、ＫＴＡ３、ＴＴＡ１細胞にトランスフェクションした。３週間後にネオマイシン系薬剤であるＧ４１８存在下で増殖する細胞を７０％エタノールで固定し、クリスタルバイオレットで染色することにより、コロニー数をカウントした。その結果、ヒトＮＡＴＡ１遺伝子を発現するベクターをトランスフェクションした細胞は、顕著にコロニー数が増幅した（（図２Ａ：ＮＡＴＡ１の発現ベクターｐＣＭＶ−Ｔａｇ３Ｂ−ＮＡＴＡ１及び空ベクターｐＣＭＶ−Ｔａｇ３Ｂ−ｍｏｃｋを用いて、ＫＴＡ１、ＫＴＡ３、ＴＴＡ１細胞にトランスフェクションした。ヒトＮＡＴＡ１遺伝子が導入されることにより、形成されるコロニー数は激増した。（Ｂ）：ＫＴＡ１、ＫＴＡ３、ＴＴＡ１細胞で生成したコロニー数の定量の結果を示している。上記図２Ａの実験で形成されたコロニー数をカウントしその結果を棒グラフで示した。２ｍｍより大きいコロニーをカウントし、３回の実験結果を平均値±SEで表示した。）。この結果は明らかにヒトＮＡＴＡ１遺伝子発現が、甲状腺未分化癌の増殖を活性化することを示しており、癌遺伝子として機能していると推定される。
【００６８】
実施例４：ヒトＮＡＴＡ１遺伝子の不活性化による甲状腺未分化癌細胞の増殖抑制
実施例３の結果から、今度は、ＮＡＴＡ１遺伝子発現を抑制することで、甲状腺未分化癌細胞の増殖が抑制されるかどうか検討した。まず、ヒトＮＡＴＡ１遺伝子のｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を合成した。ＮＡＴＡ１遺伝子のｓｉＲＮＡはＤｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社により合成した。その標的配列は、ＣＡＴＣＣＴＴＴＣＣＴＣＡＡＴＧＴＣＴ（配列番号１）（塩基配列５１３−５３１；ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＢ１５８２８８）とし、二本鎖ＲＮＡとした。このｓｉＲＮＡをトランスフェクション試薬であるＯｐｔｉｆｅｃｔ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ＮＡＴＡ１遺伝子が強く発現している８３０５Ｃ、８５０５Ｃ、ＨＴＣ/Ｃ３細胞（図１Ｄ）にトランスフェクションした。４８時間後、ＲＴ−ＰＣＲ解析によりＮＡＴＡ１特異的ｓｉＲＮＡは、コントロールｓｉＲＮＡと比較して、３種の細胞株で内在性のＮＡＴＡ１遺伝子の発現を減少させたことが明らかとなった（図２Ｅ）。そして、ＮＡＴＡ１特異的ｓｉＲＮＡは細胞の増殖を抑制することも明らかである（図２Ｆ）。また、トランスフェクション後７２時間の８３０５Ｃ、８５０５Ｃ細胞の細胞数をカウントした結果でも増殖を抑制していることが明らかである（図２Ｇ）。また、細胞をトリパンブルーで染色し、細胞の生死を確認した結果、ＮＡＴＡ１特異的ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞は、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞と比較して細胞死を起こしている割合が多いことが明らかになった（図２Ｈ）。これらの結果は明らかにヒトＮＡＴＡ１遺伝子の発現を抑制することで、甲状腺未分化癌細胞の増殖を抑制でき癌抑制剤として機能することを示している。
【配列表フリーテキスト】
【００６９】
SEQUENCE LISTING
<110>  Fuji Photo Film Co.
<120>  A method for detecting cancer and a cancer-suppressing agent
<130>  A61196A
<160>  1
<210>  1
<211>  19
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  1
catcctttcc tcaatgtct                  19
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、甲状腺未分化癌細胞株におけるＮＡＴＡ１の増幅と過剰な発現を示す。Ａ：甲状腺未分化癌細胞（８３０５Ｃ）染色体全体のＣＧＨアレイイメージ（上図）と遺伝子変化（下図）を示す。ヒト８ｐ１２領域におけるＰＡＣクローンＲＰ１−２５Ｄ１０のコピー数の増幅は明らかな緑のシグナルで確認できる（ｌｏｇ２  ｒａｔｉｏ＝３．２，赤矢印）Ｂ：ＢＡＣ  ＲＰ１１−２５８Ｍ１５をプローブとして用いたＦＩＳＨイメージ、８３０５Ｃ細胞株の中期染色体にハイブリダイズさせた。Ｃ：左側、甲状腺未分化癌細胞におけて増幅した８ｐ１２領域をカバーしている地図。ＦＩＳＨに用いたＢＡＣは、縦棒で示す。全てのマーカーと転写産物はゲノムデータベース（ｈｔｔｐ://ｇｅｎｏｍｅ.ｕｃｓｃ.ｅｄｕ/）と一致している。中心は、ＦＩＳＨによるＤＮＡコピー数解析の結果をまとめた。水平軸（上）は、各ＢＡＣプローブによる決定したＦＩＳＨシグナルの数を示す；シグナルの数は、２０で切り捨てた。右側、４つ細胞種の増幅位置を３種の異なる癌で増幅が見られる８ｐ１１−１２領域に決定した。全体線、８ｐ１１−１２領域の増幅は乳癌；甲状腺未分化癌の線は本研究で８ｐ１２；乳癌の線、Ｇａｒｃｉａ，Ｍ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  ２４，５２３５−５２４５，２００５により８ｐ１２に報告；肺癌の線、Ｔｏｎｏｎ，Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０２，９６２５−９６３５，２００５により８ｐ１２に報告．Ｄ：ＲＴ−ＰＣＲからの１４種の甲状腺未分化癌細胞株における８ｐ１２領域に存在する５つの転写産物のｍＲＮＡ発現量決定。ＭＧＣ１１３６（ＮＡＴＡ１）とＲＮＦ１２２の発現量はそれらのコピー数と相関関係にある。コピー数はＢＡＣ  ＲＰ１１−１０７Ｂ２をプローブとして用いたＦＩＳＨ実験により決定した。
【図２】図２は、甲状腺未分化癌細胞の増殖でのＮＡＴＡ１の影響を示す。Ａ：ＮＡＴＡ１遺伝子が低発現であるＫＴＡ１、ＫＴＡ３、ＴＴＡ１細胞のコロニーフォーメーションアッセイ。トランスフェクション後２週間とその結果生じた薬剤耐性コロニー選択をおこなった。ＮＡＴＡ１発現ベクターの導入はは空ベクターより多くのコロニーを生産した。Ｂ：コロニー形成の定量解析。＞２ｍｍコロニーをカウントした、そしてその結果は３回の別々の実験の平均値として表した。Ｃ：ＮＡＴＡ１遺伝子の発現が強い８３０５Ｃ、８５０５Ｃ、ＨＴＣ／Ｃ３細胞でのＮＡＴＡ１特異的ｓｉＲＮＡによるＮＡＴＡ１  ｍＲＮＡ発現の抑制。ＲＴ−ＰＣＲはトランスフェクション後４８時間でおこなった。Ｄ：細胞増殖試験による、８３０５Ｃ、８５０５Ｃ、ＨＴＣ／Ｃ３細胞の増殖におけるＮＡＴＡ１特異的ｓｉＲＮＡの効果。Ｅ：トランスフェクション７２時間後の生存している８３０５Ｃと８５０５Ｃ細胞の数でのＮＡＴＡ１特異的ｓｉＲＮＡの効果。Ｆ：トランスフェクション７２時間後の死滅している８３０５Ｃと８５０５Ｃ細胞の数でのＮＡＴＡ１特異的ｓｉＲＮＡの効果、トリパンブルー染色法を用いて直接細胞を計測した。
【図１】
2007252243.tif 000003
【図２】
2007252243.tif 000004