(57)【要約】【課題】  本発明は、光照射により微細構造に励起される局在プラズモン現象の増強電場をもって、蛍光励起現象もしくはリカップリング散乱光を引き起こし、発光をモニタリングすることで、信号増強効果が大きく、低濃度の被測定物質であっても正確に定性・定量することができ、且つ、小型で、製造が容易で安価な局在プラズモン増強センサシステムを提供する。【解決手段】  光学基材の一面に、高さが１００〜１００００ｎｍ、幅が２０〜１０００ｎｍ、アスペクト比が２〜１０である、多数の凸部が形成され、該凸部表面に厚さ４０〜１２０ｎｍの金属膜が積層され、該金属膜表面に誘電体層が積層され、該誘電体層表面に試料中の被測定物質と特異的に結合して特異的結合物を構成しうる特異的結合メンバーが固定されていることを特徴とする局在プラズモン増強センサ。【選択図】  図１
2007240361.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学基材の一面に、高さが１００〜１００００ｎｍ、幅が２０〜１０００ｎｍ、アスペクト比が２〜１０である、多数の凸部が形成され、該凸部表面に厚さ４０〜１２０ｎｍの金属膜が積層され、該金属膜表面に誘電体層が積層され、該誘電体層表面に試料中の被測定物質と特異的に結合して特異的結合物を構成しうる特異的結合メンバーが固定されていることを特徴とする局在プラズモン増強センサ。
【請求項２】
光学基材の一面に、高さが１００〜１００００ｎｍ、幅が２０〜１０００ｎｍ、アスペクト比が２〜１０である、多数の凸部が形成され、該凸部表面に厚さ４０〜１２０ｎｍの金属膜が積層され、該金属膜表面に誘電体層が積層され、該誘電体層表面に試料中の被測定物質と同等の標準物質が固定されていることを特徴とする局在プラズモン増強センサ。
【請求項３】
凸部が柱状凸部または錐状凸部または条状凸部または格子条状凸部であることを特徴とする請求項1 または２記載の局在プラズモン増強センサ。
【請求項４】
誘電体層が、酸化珪素膜、カチオン性とアニオン性の交互吸着性ポリマー膜、脂質ベシクル及び自己組織化分子膜よりなる群から選ばれた膜であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の局在プラズモン増強センサ。
【請求項５】
金属膜が金であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の局在プラズモン増強センサ。
【請求項６】
被測定物質を含む流体試料と蛍光標識又は光散乱標識が結合された第２の特異的結合メンバーとを同時もしくは逐次的に、請求項１〜５のいずれか１項記載の局在プラズモン増強センサの特異的結合メンバーまたは被測定物質と同等の標準物質が固定されている面に供給し、特異結合メンバーと結合する被測定物質または被測定物質と同等の標準物質を介して、蛍光標識又は光散乱標識が結合された第２の特異的結合メンバーを局在プラズモン増強センサ表面に固定した後、該局在プラズモン増強センサに光線を照射し、金属膜で変換されて生じる表面プラズモンポラリトンの電場中で励起される蛍光標識由来のプラズモン増強蛍光又は光散乱標識によって散乱されるプラズモンリカップリング散乱光を受光素子で測定することを特徴とする特異的結合物の局在プラズモン増強光学的測定方法。
【請求項７】
被測定物質が抗原であり、特異的結合メンバーと第２の特異的結合メンバーはそれに特異的に結合する抗体であることを特徴とする請求項６記載の特異的結合物の局在プラズモン増強光学的測定方法。
【請求項８】
蛍光標識が、蛍光を発生する化合物を含有する合成樹脂粒子であることを特徴とする請求項６又は７記載の特異的結合物の局在プラズモン増強光学的測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による局在電場増強効果を利用した局在プラズモン増強センサシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
表面プラズモン共鳴は、金属表面の自由電子の粗密波である。従来より、表面プラズモンを励起する方法として、金属表面に電子線を照射する方法と光波を利用する方法が知られている。実用性の点から後者が有利であると言われており、光波を利用する方法としては、金属表面に回折格子を刻み、光とプラズモンを結合させる方法とエバネッセント波を利用する方法が提案されている。特に、エバネッセント波を利用する方法は、生化学や医療検査等の分野における固相表面における被測定物の吸着度合いの測定方法として実用的に活用されている。
【０００３】
例えば、回折格子を利用したＳＰＲセンサーとして、型に回折格子を形成するステップと、上記型の上記回折格子が形成された側の面に金属膜を積層するステップと、上記金属膜上に基板を積層するステップにより製造された、励起光の照射により上記回折格子において生じるエバネッセント波と上記金属膜の表面に生じる表面プラズモン波との共鳴現象を利用して試料の定量的及び／又は定性的な分析を行うためのＳＰＲ用分析素子が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
【特許文献１】特開２００２−３５７５３７号公報
【０００４】
ところで、金属の２次元表面に伝播型の表面プラズモンが存在する一方、金属微粒子には局在型の表面プラズモンが存在する。局在型のプラズモンが励起された際には、著しく増強された電場が誘起されることがよく知られている。Ａｕ微粒子を用いた場合には５２０ｎｍ近傍の光に対して強い吸収ピークが現われる。
【０００５】
局在表面プラズモンによる電場増強は、主に表面増強ラマン散乱に利用されてきた。その歴史は深く、１９７４年から１９８４年頃にかけて多くの報告がすでになされてきた。Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎらは、で、粗さの存在する金属表面上の吸着分子からのラマン散乱強度が大きく増強されていることを発見したと報告している（例えば、非特許文献１参照。）。この増強をもたらす要因の１つが、金属表面を伝播、あるいは表面の微細構造上に局在する表面プラズモンの励起であると考えられている。また、Ｏｔｔｏらは、で、金属のアイランド状薄膜や、平坦な金属表面においてもATR 配置により励起された表面プラズモンを用いることで、表面増強効果が得られることを報告している（例えば、非特許文献２参照。）。
【非特許文献１】M.Fleischmann, P.J.Hendra and A.J.McQuillan, Chem. Phys. Lett 26, 123, (1974).
【非特許文献２】A.Otto, in Light Scattering in Solids IV, Topics in Applied Physics, Vol.54 ed. M.Cardona and G.G ntherodt (Springer-Verlag, Berlin, 1984) pp.289-418.
【０００６】
このように、１９７０年代当時の研究において、表面増強の効果により、金属の存在しない場合と比較しておよそ１０４から１０６程度のラマン散乱の増強があると報告されており、その増強度を決定する最も大きな要因は表面プラズモンを生じる金属の表面構造であると指摘されている。
【０００７】
このような増強効果は、ラマン散乱のほか、光吸収（光透過）や蛍光、光散乱においても観測されることが期待できる。実際、光吸収（光透過）の例が報告されている。例えば、一表面に複数の微細孔が形成された層状の基体と、この基体の前記微細孔内に充填された金属微粒子と、この金属微粒子と概略その径以下の距離を置いた状態で、前記一表面において前記微細孔の周囲部分に形成された金属薄膜とからなる微細構造体を用いたセンサであって、前記微細構造体の前記金属微粒子および金属薄膜の部分に測定光を照射する手段と、前記金属微粒子および金属薄膜の部分を透過、あるいは該部分で反射した前記測定光の強度を検出する光検出手段とを備えてなるセンサ（例えば、特許文献２参照。）が報告されている。
【特許文献２】特開２００４−２３２０２７号公報
【０００８】
しかしながら、上記のごとき局在プラズモン現象を光吸収（透過光）でモニターするセンサーでは依然として、信号増強効果が小さく、微量の被測定物質を測定するには不充分であり、より大きな信号増強がおこりうる表面プラズモン共鳴センサーの開発が要望されていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、上記欠点に鑑み、光照射により微細構造に励起される局在プラズモン現象の増強電場をもって、蛍光励起現象もしくはリカップリング散乱光を引き起こし、発光をモニタリングすることで、信号増強効果が大きく、低濃度の被測定物質であっても正確に定性・定量することができ、且つ、小型で、製造が容易で安価な局在プラズモン増強センサシステムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
請求項１記載の局在プラズモン増強センサは、光学基材の一面に、高さが１００〜１００００ｎｍ、幅が２０〜１０００ｎｍ、アスペクト比が２〜１０である、多数の凸部が形成され、該凸部表面に厚さ４０〜１２０ｎｍの金属膜が積層され、該金属膜表面に誘電体層が積層され、該誘電体層表面に試料中の被測定物質と特異的に結合して特異的結合物を構成しうる特異的結合メンバーが固定されていることを特徴とする。
【００１１】
請求項２記載の局在プラズモン増強センサは、光学基材の一面に、高さが１００〜１００００ｎｍ、幅が２０〜１０００ｎｍ、アスペクト比が２〜１０である、多数の凸部が形成され、該凸部表面に厚さ４０〜１２０ｎｍの金属膜が積層され、該金属膜表面に誘電体層が積層され、該誘電体層表面に試料中の被測定物質と同等の標準物質が固定されていることを特徴とする局在プラズモン増強センサである。
【００１２】
光学基材の一面に設けられた高さが１００〜１００００ｎｍ、幅が２０〜１０００ｎｍ、アスペクト比が２〜１０の微細構造が照射される光の波長以下の構造物であるため、光学基材は明確な全反射角を示すことなく、光学基材を透過してきた光はほぼ無反射で金属膜上の表面電子粗密波と相互作用し、金属膜微細構造に強く局在した増強電場を生じるとともに、唯一の周波数レベルにエネルギーが集中し、強い増強電場が形成される。
【００１３】
これに対比して、平面や回折格子のような照射される光の波長よりも大きな構造をもつ光学基材上の金属膜への光照射では、二次散乱光、三次散乱光、四次散乱光といったものが観測され、プラズモンの周波数は、多数のレベルに分散される。
【００１４】
形成された増強電場中に標識物質として蛍光分子を置くと、蛍光分子は電場直接励起により電子励起され、強い蛍光を発する。これは、光吸収による励起とそれに続く蛍光ではなく、増強電場による励起による蛍光である。前者は、照射光強度に対する発光強度の比率が吸光度を上限とするのに対し、後者では吸光度が上限ではない。
【００１５】
従って、このような微細構造による配置を表面プラズモン共鳴現象に利用することにより、蛍光分子を強く発光させることができる。
【００１６】
また、標識として微粒子を用いると、散乱光の波長が変調され、表面プラズモンの二次散乱光、三次散乱光、四次散乱光が無い波長帯で散乱光を発するため、ノイズ・信号比レベルをあげることができる。光散乱を生じる具体的な粒子パラメータは該当分野の既知のレイリーおよびミーの光散乱理論に基づいている。
【００１７】
なお、照射光の波長以上の構造体、例えば回折格子のような構造体では、二次回折光、三次回折光等や二次反射光、三次反射光の影響が出てしまい、照射光の波長以下の構造体の場合とは異なる光学現象となる。
【００１８】
本発明において、金属膜上に設けられた誘電体膜は、表面プラズモン共鳴を増長する効果と、金膜からの距離を適切に確保する働きがある。金膜からの距離を適切に確保する必要性は、表面プラズモンポラリトンが、金表面から離れるに従い急峻に減衰する一方、金表面に近すぎると、金表面とのエネルギー移動により蛍光消光をおこすことによる。誘電体膜の厚さは、２０〜１００ｎｍが望ましい。
【００１９】
図１は、請求項１記載の局在プラズモン増強センサの一例を示す断面図であり、図２は凸部表面の拡大説明図である。
【００２０】
図中１は、光学基材であり、光学基材１の一面に多数の凸部１０、１０・・が形成されている。光学基材１を構成する材料は、光透過性の優れたものが好ましく、例えば、ガラス、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート等が挙げられる。
【００２１】
凸部１０は、光学基材１に照射された光線が金属膜により効率よく照射され、より大きな表面プラズモン共鳴が発生するように、高さは１００〜１００００ｎｍ、幅は２０〜１０００ｎｍで、アスペクト比（高さ／幅）が２〜１０であり、その形状は円柱状、角柱状、円錐、三角錐、四角錐等の角錐状、条状凸部、波条状凸部、図３に示したような格子条状凸部等が好ましい。
【００２２】
凸部１０の先端や基部は、なだらかであってもよいし、円錐台形状、角錐台形状であってもよい。更に、凸部１０は連続して形成されていてもよいし、一定間隔をあけて形成されていてもよい。
【００２３】
凸部１０には、光学基材１とは異なる誘電率を有する金属膜２が積層されている。金属膜２としては、金、銀、銅、アルミニウム等が使用可能であるが、メッキの容易さ、安定性という点で、金が好適に使用される。
【００２４】
金属膜２の厚さは、光学基材１と金属膜２の間で表面プラズモン共鳴が発生する必要があるので、４０〜６０ｎｍが好ましい。
【００２５】
図４は請求項１記載の局在プラズモン増強センサの表面を拡大した模式図である。請求項１記載の局在プラズモン増強センサにおいては、金属膜２には、誘電体層３が積層され、更に該誘電体層表面に、試料中の被測定物質と特異的に結合して特異的結合物を構成しうる特異的結合メンバー４が固定されている。
【００２６】
上記特異的結合メンバー４は、測定すべき被測定物質により異なるが、例えば、酵素、微生物、抗原、抗体、抗体断片、レクチン、レセプター、イオノフォア、プロトンポンプ、生体膜、人工生体素子、ＤＮＡの分子、ＲＮＡの分子、タンパク質、ペプチド、糖鎖、糖タンパク質、メタロプロティンよりなる群から選ばれた1 種もしくはこれらの混合物等が挙げられる。
【００２７】
上記誘電体層３としては、誘電体よりなる層であれば特に限定されないが、酸化珪素膜、カチオン性とアニオン性の交互吸着性ポリマー膜、脂質ベシクル及び自己組織化分子膜よりなる群から選ばれた膜が好ましい。自己組織化分子膜としては、シリコンカップリング剤の自己組織化二重層が好適に用いられる。
【００２８】
図５は請求項２記載の局在プラズモン増強センサの表面を拡大した模式図である。請求項２記載の局在プラズモン増強センサにおいては、金属膜上に誘電体層３が積層され、更に該誘電体層表面に、試料中の被測定物質と同等の標準物質５が固定されている。
【００２９】
ここで、被測定物質と同等の標準物質とは、被測定物質と全く同じ物質であってもよいし、被測定物質と特異的に結合する特異結合メンバと結合しうる部分構造であってもよい。また、被測定物質を包含する構造や被測定物質とハプテンとを化学結合させたものであってもよい。
【００３０】
請求項６記載の特異的結合物の局在プラズモン増強光学的測定方法は、被測定物質を含む流体試料と蛍光標識又は光散乱標識が結合された第２の特異的結合メンバーとを同時もしくは逐次的に、請求項１〜５のいずれか１項に記載の局在プラズモン増強センサの特異的結合メンバーまたは被測定物質と同等の標準物質が固定されている面に供給し、共有結合メンバーと結合する被測定物質または被測定物質と同等の標準物質を介して、蛍光標識又は光散乱標識が結合された第２の特異的結合メンバーを局在プラズモン増強センサ表面に固定した後、該局在プラズモン増強センサに光線を照射し、金属膜で変換されて生じる表面プラズモンポラリトンの電場中で励起される蛍光標識由来の蛍光又は光散乱標識によって散乱されるプラズモンリカップリング散乱光を受光素子で測定することを特徴とする。
【００３１】
センサ表面に特異的結合メンバーが固定されている場合には、図６のような状態が形成され、センサ表面に被測定物質と同等の標準物質が固定されている場合には、図７のような状態が形成される。説明中、蛍光標識と表記するものは、光散乱標識と読み替えていただいてかまわない。図中、６は被測定物質であり、７は第２の特異的結合メンバーであり、８は蛍光標識（または光散乱標識）である。
【００３２】
図８は請求項６記載の測定方法の光学的配置を説明する図である。光照射装置９から入射光線９１をセル９４の光学基材１の下側から照射すると、入射光線９１の電磁場は、凸部１０上の金属膜上の表面プラズモンポラリトンと共鳴する。この際、凸部の微細構造が入射光線の波長以下の構造であるため、入射光線は、凸部１０と金属膜２との界面において殆ど反射されることなく、２次光、３次光の影響なく、強い増強電場を誘起させる。
【００３３】
表面プラズモン共鳴が誘起された入射光線９１は、第２の特異的結合メンバー４に結合された蛍光標識又は光散乱標識に照射され、蛍光又は光散乱光線が測定光線９２として出射されてくる。従って、出射してきた測定光線９２を受光素子９３で受光し測定分析することにより、被測定物質を定性的または定量的に測定することができる。
【００３４】
光照射装置としては、ＬＥＤ、レーザー、ハロゲンランプ、ナトリウムランプ等が用いられ、望ましくは、プラズモン共鳴に関与しない帯域の光は、光学フィルターで除かれる。また、レンズや光ファイバー、プリズム、回折格子等の光学素子が組み合わされていてよい。
【００３５】
受光素子としては、蛍光もしくは散乱光に対して感度をもつ光感応性の素子であれば何でもよく、例えばフォトダイオードまたはフォトダイオード・アレイ、光電増倍管、銀塩カメラ、ビデオ・カメラ、ＣＭＯＳカメラ、ＣＣＤデバイスの如き光検出器、あるいは人間の肉眼によって検出される。
【００３６】
局在プラズモン増強電場により励起された蛍光もしくは散乱光が、暗い背景上に明るく見えるように照明するのが望ましく、そのため、入射光線と測定光線の光軸は必ずしも一直線である必要はない。照明システムとしては、一般に入手できる暗視野照明が用いられる。すなわち、拡大レンズの下からの直接的な照明に波長選択フィルターを組み合わせた暗視野照明システム、受光センサの前に設置されたレンズの集光束外から光軸をずらして照明する暗視野照明システム、光学フィルターキューブを用いる落射暗視野照明システム、光導波路またはプリズム等の全反射系によるエバネッセント光で照明する暗視野照明システム、偏光と偏光フィルターを併用する暗視野照明システムなどが好適に用いられる。
【００３７】
上記蛍光標識は、光線の照射を受けた際に光線を変換することにより蛍光を発生する物質であり、例えば、光線の照射を受けた際に蛍光を発生する化合物、この蛍光を発生する化合物を含有する合成樹脂粒子等が挙げられる。
【００３８】
上記蛍光を発生する化合物としては、表面プラズモンポラリトンによる増強電場で励起できる蛍光物質であればよく、それらは、表面プラズモンリカップリング散乱光で励起できる蛍光物でもある。例えば、TexasRed、BODIPY、Alexa Fluor 568 、Alexa Fluor 594 、5-carboxynapthofluorescein、5-ROX (carboxy-X-rhodamine) 、7-aminoactinomycin D (7-AAD)、Acid Fuchsin、Calcium Crimson 、Cy3.5 、Feulgen (Pararosaniline)、Nile Red、Rhodamine B 、Rhodamine Red Dye 、SpectrumRed 、Thiazine Red R  等が好適に用いられる。
【００３９】
上記蛍光を発生する化合物を含有する合成樹脂粒子は、蛍光強度をみかけ上強くするので好ましい。
【００４０】
上記蛍光を発生する化合物を合成樹脂粒子に含有させる方法は従来公知の任意の方法が採用されてよく、例えば、蛍光を発生する化合物の存在下で重合性モノマーを乳化重合、懸濁重合等の重合方法で重合する方法が挙げられる。
【００４１】
上記重合性モノマーとしては、例えば、スチレン、α−メチルスチレン、ｏ−ビニルトルエン、ｍ−ビニルトルエン、ｐ−ビニルトルエン等の芳香族ビニル化合物；メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ｎ−プロピル（メタ）アクリレート、ｉ−プロピル（メタ）アクリレート、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート等のアクリレート類；（メタ）アクリロニトリル、シアン化ビニリデン等のシアン化ビニル化合物；塩化ビニル、塩化ビニリデン、フッ化ビニル、フッ化ビニリデン、テトラフルオロエチレン等のハロゲン化ビニル化合物；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステルなどが挙げられる。
【００４２】
上記重合性モノマーは、これらの重合性モノマーを重合する際に一般に共重合されている単官能性モノマーや多官能性モノマーが共重合されてよく、単官能性モノマーとしては、例えば、（メタ）アクリル酸、無水マレイン酸、グリシジルアクリレート等が挙げられ、多官能性モノマーとしては、例えば、ジビニルベンゼン、（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【００４３】
上記合成樹脂粒子中の蛍光を発生する化合物の含有量は、少なくなると蛍光の発生量が少なくなり測定感度が低下し、多くなると蛍光を発生する化合物を溶解しているのと同様になるので、合成樹脂粒子中５〜８０重量％が好ましく、より好ましくは１５〜６０重量％である。
【００４４】
上記合成樹脂粒子は大きさはなるべく小さいのが好ましく、１０μｍ以下が好ましく、より好ましくは２０ｎｍ〜５００ｎｍであり、更に好ましくは３０ｎｍ〜２００ｎｍである。
【００４５】
このような粒子径の小さい合成樹脂粒子を合成するには、重合性モノマーの微小液滴を作製し重合すればよく、例えば、重合性モノマーと乳化剤、分散剤、重合開始剤等の必要成分との混合液をホモジナイザー、マイクロミキサー、マイクロチャンネル等に供給して微小液滴を作製し常法に従って重合すればよい。
【００４６】
上記光散乱標識は、光線の照射を受けた際に光線を散乱しうる化合物又は微粒子であり、例えば、金，銀など金属のコロイド微粒子凝集体、ＣｄＳ、ＣｄＳｅなどのカルコゲナイト微粒子、Ｓｉ量子ドット、ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリ（メタ）アクリル樹脂などのポリマー微粒子、シリカゲル、アルミナ、酸化チタンなどの無機酸化物微粒子、これらの２種以上の組合せによるコアシェル微粒子等が挙げられる。又、上記ポリマー微粒子及び無機酸化物微粒子は、染色されていてもよいし、蛍光分子や金属ナノ粒子が分散されていてもよい。
【００４７】
上記光散乱標識粒子の大きさは、特に限定されるものではないが、一般に１０ｎｍ〜１０μｍであり、好ましくは５０ｎｍ〜５００ｎｍであり、更に好ましくは７０〜２００ｎｍである。
【００４８】
上記第２の特異的結合メンバーは、測定すべき被測定物質に特異的に結合しうるものであり、特異的結合メンバーと第２の特異的結合メンバーの間に被測定物質をサンドイッチすることができるものである。
【００４９】
従って、第２の特異的結合メンバーとしては、被測定物質及び特異的結合メンバーに対応して異なるが、例えば、酵素、微生物、抗原、抗体、抗体断片、レクチン、レセプター、イオノフォア、プロトンポンプ、生体膜、人工生体素子、ＤＮＡの分子、ＲＮＡの分子、タンパク質、ペプチド、糖鎖、糖タンパク質、メタロプロティンよりなる群から選ばれた1 種もしくはこれらの混合物等が挙げられる。
【００５０】
従って、免疫測定方法の場合には、被測定物質が抗体又は抗原であり、特異的結合メンバーと第２の特異的結合メンバーとしては、それに特異的に反応する抗原又は抗体が使用される。
【００５１】
本発明は、顕微鏡スライド、マイクロアレイチップ、マイクロタイター・プレート、フローセル、試験管、キュベット、キャピラリーシステム、マイクロチャネルデバイス、その他のプラスチック容器の形態と共に使用される。
【発明の効果】
【００５２】
本発明の局在プラズモン増強センサシステムの構成は上述の通りであり、光学基材の一面に形成されている微細凸部に金属膜が積層されており、微細構造が照射される光の波長以下の構造物であるため、光学基材は明確な全反射角を示すことなく、光学基材を透過してきた光はほぼ無反射で金属膜上の表面電子粗密波と相互作用し、金属膜微細構造に強く局在した増強電場を生じるとともに、二次回折光、三次回折光等や二次反射光、三次反射光の影響がなく、唯一の周波数レベルにエネルギーが集中し、強い増強電場が形成される。
【００５３】
形成された増強電場中に蛍光分子が固定される結果として、電場直接励起により蛍光分子が電子励起され、強い蛍光を発する。もしくは、形成された増強電場中に光散乱体が固定される結果として、Ｓ／Ｎの高い散乱光が生じる。このため、低濃度の被測定物質であっても正確に定性・定量することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
（実施例１）
基部の直径が２００ｎｍアスペクト比２．５の略円錐のアレイをアクリルプレートに２００μｍｔ×１ｍｍの範囲にインプリントしたものを作成し、該プレートに厚さ約５０ｎｍの金蒸着後、表面を２ｍＭシスタミンエタノール溶液で処理してアミノ化し、5 ％グルタルアルデヒド水溶液で処理した。このプレートをＢＳＡに共有結合させたアドリアマイシンの０．１ｍｇ/ ｍＬ  ＰＢＳ緩衝溶液に２４時間浸漬し、さらに、ＢＳＡのＰＢＳ溶液でブロッキングして局在プラズモン増強センサを作成した。
【００５５】
（比較例１）
アクリルプレートに微細構造をインプリントすることなく、実施例１で行ったと同様にして表面処理を施して表面プラズモン共鳴センサを作成した。
【００５６】
メトトレキサートを検体として、メトトレキサートに対するモノクローナル抗体にＢＯＤＩＰＹ標識したものを用い、受光素子として光照射装置に緑黄色ＬＥＤ（東芝ＴＬＧＥ２３ＴＰ；波長５７６ｎｍ）を中心波長５６２ｎｍ，バンド幅４０ｎｍのバンドパスフィルターと共に用い、受光素子には、６０１ｎｍ〜８００ｎｍで９０％以上透過するダイクロイックフィルターと中心波長６２４ｎｍバンド幅４０ｎｍのバンドパスフィルターと１倍マクロレンズを介してフレーム蓄積可能なＣＣＤカメラを用い、斜照明とし、それぞれに最も感度が高い入射角で、表１に示した検体濃度を変えて競合法における両者の検出可否を比較し、検出できたものを○、できないものを×で表１に示した。
【表１】
2007240361.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】請求項１記載の局在プラズモン増強センサの一例を示す断面図である。
【図２】請求項１記載の局在プラズモン増強センサの一例を示す鳥瞰図である。
【図３】請求項１記載の局在プラズモン増強センサの一例を示す鳥瞰図である。
【図４】請求項１記載の局在プラズモン増強センサの表面を拡大した模式図である。
【図５】請求項２記載の局在プラズモン増強センサの表面を拡大した模式図である。
【図６】特異結合メンバーと結合する被測定物質を介して、蛍光標識又は光散乱標識が結合された第２の特異的結合メンバーが局在プラズモン増強センサに固定された状態を示す説明図である。
【図７】標準物質を介して、蛍光標識又は光散乱標識が結合された第２の特異的結合メンバーが、局在プラズモン増強センサに固定された状態を示す説明図である
【図８】請求項６記載の測定方法の光学的配置を説明する図である。
【符号の説明】
【００５８】
１    光学基材
２    金属膜
３    誘電体層
４    特異的結合メンバー
５    標準物質
６    被測定物質
７    第２の特異的結合メンバー
８    蛍光標識（または光散乱標識）
９    光照射装置
９１  入射光線
９２  測定光線
９３  受光素子
９４  セル
１０  凸部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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