(57)【要約】【課題】  本発明は、哺乳動物において、中枢神経の障害によって引き起こされる疾患の治療用に利用可能な細胞及び細胞製剤を提供することを目的とする。【解決手段】  上記課題の解決手段として、本発明は生きた個体から採取された鼻粘膜組織の培養によって得られる嗅覚鞘性細胞と線維芽細胞からなる細胞群と、嗅覚鞘性細胞を有効成分とし線維芽細胞を補助成分とする細胞製剤を提供する。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の鼻粘膜固有層から採取された組織に由来するか、または哺乳動物の鼻粘膜固有層から採取された細胞を培養して得られる、中枢神経の再生誘導能を有する細胞群。
【請求項２】
生きた哺乳動物から採取されたものであることを特徴とする、請求項１に記載の細胞群。
【請求項３】
嗅覚鞘性細胞と線維芽細胞とを含み、嗅覚鞘性細胞数と線維芽細胞数の比が２：８から７：３の間で存在する、請求項１または請求項２に記載の細胞群。
【請求項４】
（Ａ）鼻粘膜由来の粘膜組織から主として嗅覚鞘性細胞と線維芽細胞とを含む細胞群を分離する工程と、（Ｂ）前記分離された細胞群に神経成長因子を加えて培養する工程からなる、中枢神経の再生誘導能を有する細胞群の培養方法。
【請求項５】
神経成長因子がニューロトロフィン−３（Ｎｅｏｒｏｔｒｏｐｈｉｎ−３，ＮＴ−３）である、請求項４に記載の細胞培養法。
【請求項６】
請求項１から請求項３のうちいずれか１項に記載の細胞群を有効成分とする、哺乳動物の障害性中枢神経疾患における中枢神経細胞再生用の細胞製剤。
【請求項７】
請求項４または請求項５に記載の培養法により得られた細胞群を有効成分とする、請求項６に記載の細胞製剤。
【請求項８】
形状がシート状である、請求項６または請求項７に記載の細胞製剤。
【請求項９】
形状が線維芽細胞によって形成された第１層と、これに密着して嗅覚鞘性細胞よりなる第２層が重なりあって形成される積層シート状である、請求項８に記載の細胞製剤。
【請求項１０】
請求項９に記載の積層シートを折りたたむか、またはロール状にすることによって形成される、細胞製剤。
【請求項１１】
繊維芽細胞増殖因子と組み合わせて使用されることを特徴とする、請求項７から請求項１０のうちいずれか１項に記載の細胞製剤。
【請求項１２】
線維芽細胞増殖因子がＦＧＦ−２である、請求項１１に記載の細胞製剤。
【請求項１３】
対象動物が中型から大型の哺乳動物である、請求項７から請求項１２に記載の細胞製剤。
【請求項１４】
対象動物がイヌである、請求項１３に記載の細胞製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は中枢神経細胞の再生誘導に関するものであり、詳しくは、中枢神経障害性疾患において障害を受けた中枢神経細胞の再生誘導技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物における中枢神経障害性疾患は、例えば脊椎損傷による肢運動機能障害などの様に重篤な後遺症を残すのが常であり、辛うじて障害直後の薬剤投与が有効との報告もあるが基本的にはリハビリ療法に依存しているのが現状である。
【０００３】
この様な疾患に対する治療剤としては、例えばペプチド製剤、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素、ウロテンシンＩＩ受容体拮抗薬などがこれまでに開示されている（特許文献１−５）。しかし、投薬治療は軽微な損傷にのみ有効であるという問題があった。
【０００４】
近年、「再生医療」という新たな医療分野が開拓されつつあり、神経細胞の再生についても、羊膜上皮細胞、神経細胞再生誘導物質、胎児の神経組織から単離した神経細胞、神経系特異的活性化Ｔ細胞などを利用して障害を受けた中枢神経細胞を再生させるための試みがなされている（特許文献６−１２）。しかしながら、細胞移植に用いる幹細胞は対象となる動物の骨髄や脊髄から採取しなければならず、他家細胞を用いる場合には常に拒絶反応の問題があり、自家細胞を用いる場合にも手術の負担と危険性が大きいという問題があった。更に採取した細胞の培養も複雑でコストがかかるという問題があり、こうして行われる治療の結果についても運動機能障害が改善するなど具体的な成果には遠いのが現状であった。
【特許文献１】特開２００４−０１０５７４  神経再生因子
【特許文献２】特表２００５−５００３７５  神経組織の修復を促進するための材料および方法
【特許文献３】特表２００３−５２８１５１  神経変性疾患等の疾患の治療または予防のためのＣＲＦ受容体アゴニストの使用
【特許文献４】特表２００５−５０１８０１  フラクトピラノーススルファメートとエリスロポイエチンを含んで成る神経学的機能不全治療
【特許文献５】特表２００４−５０７２２４  ＮＲＧ−２核酸分子、ポリペプチド、ならびに診断および治療法
【特許文献６】特開２００６−００６２４９  羊膜由来細胞の培養方法及びその利用
【特許文献７】特表２００５−５２１４２７  神経細胞再生の刺激
【特許文献８】特開２００４−１６６８９３  中枢神経組織の再生方法
【特許文献９】特表２００５−５０４７１６  神経再生を促進し神経変性を防止するための修飾ＣＮＳ由来ペプチドを含む医薬組成物
【特許文献１０】特表２００４−５２８０４２  Ｔ細胞誘導性組織修復および再生
【特許文献１１】特開２００２−２８１９６２  脊髄におけるシナプス形成ニューロンを誘導する中枢神経系前駆細胞
【特許文献１２】特公平０７−０１７５１３  哺乳動物中枢神経系の再生誘発方法および組成物
【非特許文献１】Ｆｅｒｏｎ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｂｒａｉｎ  １２８：２９５１−２９６０．
【非特許文献２】Ｃｏｌｌａｚｏｓ−Ｃａｓｔｒｏ  ＪＥ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ−Ｓｐｉｎｅ  ３（４）：３０８−３１７．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の現状に鑑み、本発明は、中枢神経の障害によって引き起こされる疾患の治療用に利用可能な細胞及び細胞製剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的のため、本発明者は獣医臨床分野において研究を重ね、その治療法を模索してきた。その中で、近年マウスなどの動物実験において神経再生に良好な結果が認められつつある嗅覚鞘性細胞に着目した。
【０００７】
嗅覚鞘性細胞は嗅神経を鼻粘膜から嗅球まで取り囲んでいるグリア細胞である。脊髄損傷を負った患者さんの脊髄に、液体培養した嗅覚鞘性細胞を注入することによって神経細胞の再生が観察されるなど、ヒトにおいても良好な結果が報告されている（非特許文献１，２）。培養細胞溶液の脊髄への注射は細胞の定着などに課題もあり、本発明者は神経再生用のツールとして更に有効な細胞の調整法を検討して、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明の第１の態様は、哺乳動物の鼻粘膜固有層から採取された組織に由来するか、または哺乳動物の鼻粘膜固有層から採取された細胞を培養して得られる、中枢神経の再生誘導能を有する細胞群を提供する。
【０００９】
本発明の第２の態様は、生きた哺乳動物から採取されたものであることを特徴とする、請求項１に記載の細胞群を提供する。
【００１０】
本発明の第３の態様は、嗅覚鞘性細胞と線維芽細胞とを含み、嗅覚鞘性細胞数と線維芽細胞数が２：８から７：３の間の比で存在する、請求項１または請求項２に記載の細胞群を提供する。
【００１１】
本発明の第４の態様は、（Ａ）鼻粘膜由来の粘膜組織から主として嗅覚鞘性細胞と線維芽細胞とを含む細胞群を分離する工程と、（Ｂ）前記分離された細胞群に神経成長因子を加えて培養する工程からなる、中枢神経の再生誘導能を有する細胞群の培養方法を提供する。
【００１２】
本発明の第５の態様は、神経成長因子がニューロトロフィン−３（Ｎｅｏｒｏｔｒｏｐｈｉｎ−３，ＮＴ−３）である、請求項４に記載の細胞培養法を提供する。
【００１３】
本発明の第６の態様は、請求項１から請求項３のうちいずれか１項に記載の細胞群を有効成分とする、哺乳動物の障害性中枢神経疾患における中枢神経細胞再生用の細胞製剤を提供する。
【００１４】
本発明の第７の態様は、請求項４または請求項５に記載の培養法により得られた細胞群を有効成分とする、請求項６に記載の細胞製剤を提供する。
【００１５】
本発明の第８の態様は、形状がシート状である、請求項６または請求項７に記載の細胞製剤を提供する。
【００１６】
本発明の第９の態様は、形状が線維芽細胞によって形成された第１層と、これに密着して嗅覚鞘性細胞よりなる第２層が重なりあって形成される積層シート状である、請求項８に記載の細胞製剤を提供する。
【００１７】
本発明の第１０の態様は、請求項９に記載の積層シートを折りたたむか、またはロール状にすることによって形成される、細胞製剤を提供する。
【００１８】
本発明の第１１の態様は、繊維芽細胞増殖因子と組み合わせて使用されることを特徴とする、請求項６から請求項１０のうちいずれか１項に記載の細胞製剤を提供する。
【００１９】
本発明の第１２の態様は、線維芽細胞増殖因子がＦＧＦ−２である、請求項１１に記載の細胞製剤を提供する。
【００２０】
本発明の第１３の態様は、対象動物が中型から大型の哺乳動物である、請求項６から請求項１２に記載の細胞製剤を提供する。
【００２１】
本発明の第１４の態様は、対象動物がイヌである、請求項１３に記載の細胞製剤を提供する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明を利用することにより、例えば脊椎損傷による運動機能麻痺などの中枢神経障害性疾患に対して、中枢神経細胞の再生やその機能の実質的回復が期待できる。この様な治療は、例えばヒトにおける神経傷害性疾患などにとっても極めて有効であると期待される。また本発明で用いる細胞は外鼻孔を通じて鼻粘膜から採取できるため、脳の嗅球から細胞を採取するのに比べて危険性が極めて低いという利点も併せ持っている。また本発明の細胞培養法は比較的簡単かつ安価であって、短期間での培養が可能のため迅速に利用することができ、更に拒否反応のない自家移植も可能となる。本発明において、形状をシート状細胞製剤とすることによって、これまでに知られている細胞懸濁液の脊髄注入に比べても、ねらった場所に的確に嗅覚鞘性細胞を定着させることが可能となり、これもまた大きな効果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下に本発明の詳細な実施形態を述べる。本発明の第１から第３の態様は、哺乳動物の鼻粘膜から採取された組織に由来するか、または鼻粘膜から採取された細胞を培養して得られる、中枢神経の再生誘導能を有する細胞群が提供される。これらの細胞群は、好ましくは対象となる生きた哺乳動物から採取されるものであり、実体は再生誘導能を持つ嗅覚鞘性細胞とシート状構造などの形成に関与する線維芽細胞を含む細胞群である。両細胞数の比率は、好ましくは２：８から７：３の間であり、特に４：６から６：４の間である。再生誘導能を持つのは嗅覚鞘性細胞であるが、鼻粘膜組織には線維芽細胞が多く含まれており、通常用いられる培養液では大体その比が３：７程度となる。もちろんこのままの細胞群を使っても再生の効果は期待できるが、実施例に示すように培養液に補助成分として神経成長因子を加えることにより、嗅覚鞘性細胞の比率を上げることができ、より高い効果が期待できる。マウスやラットの様な小動物では、鼻孔を通じて生きたまま細胞を採取することは技術的に非常に困難であるが、イヌなどの動物では麻酔により眠らせた生体から鼻粘膜細胞を採取することが可能である。このことは、飼い主にとっては家族同然の存在であるペットが事故などで中枢神経障害性疾患に陥った際、これを回復させることも可能になると期待できる。
【００２４】
本発明の実施例ではイヌを用いて嗅覚鞘性細胞と線維芽細胞とを培養したが、同じ哺乳動物であるヒトにも本発明は適用可能である。
【００２５】
本発明の第４及び第５の態様においては、上記態様の細胞群を培養するための方法が提示される。培養方法は（Ａ）鼻粘膜由来の粘膜組織（採取後、必要に応じて不要な組織や成分、或いは雑菌等を除去する処理を行う）から主として嗅覚鞘性細胞と線維芽細胞とを含む細胞群を分離する工程と、（Ｂ）前記分離された細胞群に神経成長因子を加えて培養する工程からなり、神経成長因子の効果としては嗅覚鞘性細胞の増殖促進と線維芽細胞の増殖抑制の両方の効果である。粘膜組織は嗅覚鞘性細胞と線維芽細胞を含んでいるが、両者を分別するのは技術的に困難であり、また後述するとおり線維芽細胞もシート形成などに役割を果たすと考えられることから、両者の共培養が現実的であり好ましい。
【００２６】
本態様における神経成長因子とは、例えばアドレナリン、ドーパミン、ノルアドレナリン、セロトニン、脳由来神経発育因子（Ｂｒａｉｎ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）、塩基性線維芽細胞成長因子、カルジオトロフィン、毛様体発育因子（Ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）、グリア細胞由来神経発育因子（Ｇｌｉａｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）、白血病阻害因子（Ｌｅｕｋｅｍａｎｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、β−神経成長因子、７Ｓ−神経成長因子、２．５Ｓ−神経成長因子、ＢＤＮＦ、Ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ−１、ＦＧＦ、ＧＤＮＦ、Ｋ２５２ｂなどであって、特に好ましくはニューロトロフィン−３である。
【００２７】
これら神経成長因子の多くは哺乳動物に共通して存在するものであり、ヒト神経成長因子を利用してヒト鼻粘膜組織を培養し、中枢神経細胞の再生能を有する細胞群を効率的に培養することもまた可能である。
【００２８】
本発明の第６から第１４の態様においては、第４、第５の態様に記載の培養法によって培養された第１から第３の態様に記載の細胞群を有効成分とする、哺乳動物の障害性中枢神経疾患における中枢神経細胞再生用の細胞製剤が提示される。細胞製剤の形状は、好ましくはシート状物であって、更に好ましくは線維芽細胞によって形成された第１層に嗅覚鞘性細胞が形成する第２層が重なった積層シート状であり、これを患部に貼り付けるためのシートとするか、またはこれを折りたたんで層状物とし、或いはこれを巻いてロール状とする。この様にすることによって、患部が微少な領域である場合にも本発明の細胞製剤が適用可能となる。下記実施例で述べる通り、本発明により提供される細胞製剤においては、線維芽細胞が密に並んで形成される層と嗅覚鞘性細胞がゆるやかに結合して形成される層とが積層された構造を特徴として有している。これは、損傷を受けた中枢神経細胞に嗅覚鞘性細胞を接触させて作用させつつ、外部を線維芽細胞層で覆って保護するという全く新しい形態の細胞製剤を提供可能とするものであり、液体培地に懸濁させた鞘性細胞を脊髄などに注入する方法での課題であった「患部への確実な定着と保護」という問題を解決可能にすると期待されるものである。シートを層状物やロール状にした場合、嗅覚鞘性細胞の何層かは線維芽細胞の層に織り込まれる形になるが、例えば嗅覚鞘性細胞から神経の再生に必要な因子が外液に分泌されている場合などにおいて、単位面積当たりの嗅覚鞘性細胞数を増やすことにより、本発明の効果を更に高めることができると期待される。
【００２９】
また本態様の細胞製剤は、線維芽細胞増殖因子と組み合わせて使用することによりその効果を高めることが可能である。少なくとも２２種類は知られている線維芽細胞成長因子（ＦＧＦｓ）のどれでも効果は期待できるが、より好ましいのはＦＧＦ−２である。下記実施例に示すとおり、ＦＧＦ−２をラット脊髄損傷モデルにおける本発明の細胞製剤（細胞シート）移植部位に作用させることで、その効果を実際に高めることができた。神経細胞再生能の本体が嗅覚鞘性細胞であることは認識されつつあるが、夾雑物であると考えられている線維芽細胞の増殖因子を加えることでこの効果が高められるという事実はこれまでに予測されなかった点であり、この効果もまた本発明に含まれるものである。
【００３０】
本発明の提供する細胞製剤をヒトに適用すれば、拒否反応のない安全な中枢神経の再生治療が可能になると期待される。またヒトにおいても、上述の神経増殖因子の効果は同様にあると期待され、これも本発明の技術範囲に含まれるものである。
【００３１】
本発明の細胞製剤としての態様は、基本的に生きた哺乳動物から採取した細胞を製剤として調整し、その動物に戻して中枢神経の再生を試みるものである。従って、ラットなどの小動物への適用は技術的に困難であり、対象となる動物は中型の哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、サル、ヒツジ、ブタなどから、大型の哺乳動物、例えばウマ、ウシ、ゾウなどが好ましい。動物の種類は本発明を限定するものではなく、より本質的には治療が必要となる動物、すなわちペットや動物園の動物など獣医師が治療に携わる動物であって、鼻粘膜組織を採取できるサイズの動物である。その中でもイヌについては、本発明者によって鞘性細胞の一次培養が可能であることが実証され、ペットとして飼われる動物の大きな部分を占めていることからも、本発明の対象動物として好ましいものである。
【実施例１】
【００３２】
以下に本発明の実施例を述べるが、本発明は実施例にのみ限定されるものではない。
（イヌ嗅粘膜からの嗅覚鞘性細胞の採取）  嗅粘膜内嗅覚鞘性細胞は、２頭のビーグル犬の幼犬（３歳牡）と３頭の成犬（５歳牡）からバイオプシー鉗子を用いた手術により採取した。マッピングのため、２つの生体組織（鼻甲介と鼻中隔）をそれぞれの個体から採取した。動物個体は０．０２ｍｇ／ｋｇのＭｅｄｅｔｏｍｉｄｉｎｅ（ＤｏｍｉｔｏｒＴＭ，Ｏｒｉｏｎ，Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ）と０．３ｍｇ／ｋｇのＭｉｔａｚｏｒａｍ（ＤｏｒｍｉｃｕｍＴＭ，Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で麻酔し、Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅで麻酔を維持した。手術前には抗生物質（０．１ｍｌ／ｋｇ  ペニシリン／ストレプトマイシン，ＩＭ，Ｍｙｃｉｌｌｉｎ  ＳｏｌＴＭ，Ｍｅｉｊｉｓｅｉｋａ，Ｔｏｋｙｏ）を投与し、手術を行った。
【実施例２】
【００３３】
（イヌ嗅粘膜組織中の鞘性細胞の免疫染色）  採取した鼻組織は４％パラホルムアルデヒドで２４時間固定し、３０％ショ糖溶液で４８時間置換した。これらの組織を凍結し、低温保持装置上で８μｍの厚さの切片を作りシランでコートしたスライドグラス上に乗せた。スライドグラスをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３回洗浄し（室温）し、組織の内在性ペルオキシダーゼ活性を消すために０．３％過酸化水素水（ｉｎ  ｍｅｔｈａｎｏｌ）で１０分処理した。スライドグラスを３回ＰＢＳで洗浄し、ブロッキング溶液（抗Ｌ−ＮＧＦＲ（ｐ７５）抗体用として、１０％Ｇｏａｔ  ｓｅｒｕｍ  ｉｎ  ＰＢＳ，抗ＧＦＡＰ抗体用として、１０％ＢＳＡｉｎＰＢＳ）中で１時間、室温にてインキュベートした。１次抗体として、抗ｐ７５（Ｌ−ＮＧＦＲ）モノクローナル抗体（１：２００，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ；抗マウスＩｇＧ１）及び抗ＧＦＡＰポリクローナル抗体（１：１０００，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ；抗ウサギ血清）を用いた。ｐ７５及びＧＦＡＰは、ヒト、マウス、ラットなどで嗅覚鞘性細胞に存在することが知られており、本実施例においても嗅覚鞘性細胞のマーカーとした。抗体は前述のブロッキング溶液で希釈し、４℃、ｏｖｅｒｎｉｇｈｔでインキュベートした。ネガティブコントロールとして、１次抗体抜きの一連の処理を合わせて行った。抗体処理後スライドグラスをＰＢＳで３回洗浄し、Ｈｏｒｓｅ  Ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）による検出をＥＮＶＩＳＩＯＮ＋キット（ＤＡＣＯ，ＣＡ）で行った。スライドグラスを２次抗体で１時間、室温にて処理し、ＰＢＳで３回洗浄して観察用とした。対比染色としては、ヘマトキシリン染色を行った。
【実施例３】
【００３４】
（イヌ嗅覚鞘性細胞の培養）  ビーグル犬の成犬を上述の麻酔法で麻酔し、バイオプシー鉗子を用いて嗅粘膜組織を採取した。採取後すぐに組織を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを加えた氷冷Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ／ＨＡＭ  Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ，Ｊａｐａｎ；以下ＤＭＥＭ／ＨＡＭ  Ｆ１２と略す）に浸漬し、その後２．４ｕｎｉｔ／ｍｌのＤｉｓｐａｓｅ  ＩＩ  溶液（Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で３７℃、４５分間処理した。顕微鏡下で２６Ｇ針を用い、嗅粘膜から嗅上皮を取り除き、嗅粘膜固有層を単離した。固有層を切り分け、８ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＨ溶液（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）中で３７℃、１０分間処理した。細胞がばらばらになった後、１０％ＦＣＳと１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／ＨＡＭ  Ｆ１２培養液中に移して酵素反応を停止させた。同培養液に細胞を再懸濁し、Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓでコートしたプレートに蒔いた。鞘性細胞の精製を目的として、血清を含む培養液を取り除き、５０ｎｇ／ｍｌのＮｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ−３（ＮＴ−３；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，ＵＫ）を含むＤＭＥＭ／ＨＡＭ  Ｆ１２培養液でも細胞を培養した。
【実施例４】
【００３５】
（培養鞘性細胞の免疫染色）  培養した前述の細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、抗ｐ７５モノクローナル抗体と抗ＧＦＡＰポリクローナル抗体で免疫染色を行った。免疫染色の方法については実施例２の方法に準じた。血清を含む培地とＮＴ−３を含む培地とで、鞘性細胞の増殖に違いがあるかどうかを確認するために、培養５日後に細胞を分け、片方はＦＣＳ培養を続け、もう片方はにＦＣＳ培養液をＮＴ−３添加無血清培養液に置換した。観察は培養開始から５，７，９日後に行い、各々のプレート上の５つの場所において細胞数をカウントした。抗ｐ７５抗体で認識される細胞、抗ＧＦＡＰ抗体で認識される細胞、両方で認識される（両陽性）細胞、どちらでも認識されない（両陰性）細胞のそれぞれについて、全細胞に対する割合を算出した。一連のくり返しは３回行った。
【実施例５】
【００３６】
（統計的解析）  嗅覚鞘性細胞の細胞数（割合）について、ＮＴ−３含有培養液とＦＣＳとで分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって比較した。両者の比較のために、平均値±標準誤差を算出した。
【実施例６】
【００３７】
（イヌ鼻粘膜組織内における嗅覚鞘性細胞の免疫染色）  図１に、組織免疫染色の結果を示す。幼犬（成犬も同様の結果を示した）の鼻甲介と鼻中隔組織において、軸索を取り囲む鞘性細胞が抗ｐ７５抗体と抗ＧＦＡＰ抗体によって認識された。反対に嗅上皮細胞は、これらの抗体で認識されなかった。イヌにおいても、嗅覚鞘性細胞が鼻粘膜固有層に存在し、粘膜組織は生きた個体から容易に採取できることが本発明者によって明らかとなった。
【実施例７】
【００３８】
（培養されたイヌ嗅覚鞘性細胞）培養開始後４８時間で、培養液中には２種類の細胞が観察された（図２）。一つは紡錘型／結節形成型の細胞であり、もう片方は扁平な形態を取る細胞であった。扁平な細胞は、紡錘型細胞の下に細胞層を形成した。紡錘型／結節形成型細胞はｐ７５、ＧＦＡＰともに陽性であり、細胞層形成細胞は両方に陰性であった。これらの事実から、紡錘型／結節形成型細胞は嗅覚鞘性細胞、扁平な細胞層形成細胞は線維芽細胞であると考えられた。図３にその結果を示す。ＦＣＳ培養においては、嗅覚鞘性細胞は増加するが線維芽細胞も増加し、９日後における嗅覚鞘性細胞の割合は３６％であった。一方５日後にＮＴ−３を添加した系では、嗅覚鞘性細胞数の増加とともに線維芽細胞の増殖抑制が見られ、９日後における嗅覚鞘性細胞の割合は６０．４％まで高まっていた（表１）。両培養液の結果（陽性／陰性細胞数の比）は、統計的に優位な差であった（ｐ＜０．０５）。この事は、ＮＴ−３添加によって嗅覚鞘性細胞が増殖するとともに線維芽細胞が減少する事を示しており、２種類の細胞が混在する組織からの培養において、ＮＴ−３の添加により必要な嗅覚鞘性細胞を選択的に増殖させられる事が明らかとなった。
【表１】
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【実施例８】
【００３９】
（ラット鼻粘膜の採取及び移植片からの嗅覚鞘性細胞の調製）  ラットを材料に、脊髄損傷モデルを用いた嗅覚鞘性細胞の移植を行った。ラットの様な小動物では、生きた個体から嗅粘膜を採取することは技術的に非常に困難である。そこでラット個体を安楽死させ、下顎、上歯、口蓋、鼻甲介を手術により切除し、鼻中隔を採取した。培養液中に浸して鼻中隔から嗅粘膜を剥離し、Ｄｉｓｐａｓｅ処理を行った。処理後顕微鏡下において嗅粘膜を嗅上皮と嗅粘膜固有層に分離し、固有層を移植片とした。組織処理の詳細は実施例１に準じた。
【実施例９】
【００４０】
（ラット脊髄損傷モデルにおける嗅覚鞘性細胞の移植）  上述の移植片を、脊髄損傷モデルラットに移植した。脊髄損傷モデルラットは、麻酔下で椎弓切除後にＴ９−１０の脊髄を切断し、１−２ｍｍの間隙を作製した。移植効果の評価には、ＢＢＢ  Ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅを用いた。移植を行わなかった対照群において、スコアは１０週間の期間中０．５以下であったが、嗅覚鞘性細胞を移植した群では１週目の０．０５からスコアが徐々に上昇し、７週目には１．１０を認めた。また４週目には、８０％のラットで深部痛覚が回復した。更に、対照群では後肢機能の改善が全く見られなかったのに対して、移植群では後肢を動かす程度にまで機能の改善が見られた。
【実施例１０】
【００４１】
（嗅覚鞘性細胞の移植に対するＦＧＦ−２の効果）  前述の移植群において、効果を高めるために線維芽細胞成長因子の影響を検討した。線維芽細胞成長因子としてはＦＧＦ−２を用い、移植部位に添加した。ＢＢＢ  Ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅは早期から上昇し、５週目には１．６を認めた。スコアは１０週までこのレベルで維持された。対照群にＦＧＦ−２のみを作用させたものについては、スコアが１０週間で０．５以下と上昇が見られず、後肢機能の改善も見られなかった。この結果から、ＦＧＦ−２は単独では脊髄損傷の改善効果を持たないが、嗅覚鞘性細胞と線維芽細胞からなる移植片と同時に作用させることによって、脊髄損傷の回復効果を高めるという新たな事実が示された。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明は、中枢神経損傷疾患というきわめて重大な疾患に対してその再生療法への道を拓くものであり、細胞製剤などの開発と製造に利用可能である。また同時に、ペットが家族同然の存在となっている現状において、獣医師が中枢神経損傷疾患のペットを適切に治療するための有効な手段を提供するものであり、「ペット医療産業」の分野にも応用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】イヌ（幼犬）から採取した鼻中隔（Ａ，Ｂ）、鼻甲介（Ｃ、Ｄ）の免疫染色像を示す。抗ｐ７５抗体（Ａ，Ｃ）、抗ＧＦＡＰ抗体（Ｂ，Ｄ）のいずれを用いた場合でも、軸索を取り囲む細胞が認識され、これらの細胞が嗅覚鞘性細胞であることを示した。ＡＸ：Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｎｅｒｖｅ  ａｘｏｎ，ＥＰＩ：Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．
【図２】培養したイヌ鼻粘膜組織由来の細胞で観察された２種類の細胞を示す。（Ａ）は紡錘型／結節形成型の形態を示し、（Ｂ）は扁平な形態で細胞層を形成した。
【図３】培養したイヌ鼻粘膜組織由来の細胞を抗ＧＦＡＰ抗体（Ａ，Ｂ，Ｃ）、抗ｐ７５抗体（Ｃ，Ｄ，Ｅ：Ｃは２重染色）で免疫染色した。紡錘型／結節形成型の細胞は軸糸を伸ばして緩やかに結合した層を形成し、両方の抗体で認識されたが、扁平な細胞は密に結合した層を形成してどちらの抗体とも反応しなかった。このことから、紡錘型／結節形成型の細胞は嗅覚鞘性細胞、扁平な細胞は、線維芽細胞であると判定された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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