(57)【要約】【課題】液体燃料又は油を含有する液体と接触する環境において腐食した金属の腐食部位に存在する微生物の簡便な回収方法を提供する。【解決手段】金属の腐食部位に存在する、液体、付着物、錆、スラッジの少なくともいずれかを、微生物を取り除いた水に添加して懸濁した後、相分離してその水相を回収し、当該回収水をｐＨ７以上１０以下に調整して回収水中に存在する金属イオンを金属水酸化物として沈殿させ、上澄み液を孔径０．５μｍ以下の膜でろ過して、ろ膜上に金属の腐食に関わる微生物を回収する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体燃料又は油を含有する液体と接触する環境において腐食した金属の当該腐食に関わる微生物を回収する方法であって、前記金属の腐食部位に存在する、液体、付着物、錆、スラッジの少なくともいずれかを、微生物を取り除いた水に添加して懸濁した後、相分離してその水相を回収し、当該回収水をｐＨ７以上１０以下に調整して回収水中に存在する金属イオンを金属水酸化物として沈殿させ、上澄み液を孔径０．５μｍ以下の膜でろ過して、ろ膜上に金属の腐食に関わる微生物を回収することを特徴とする前記方法。
【請求項２】
前記回収した微生物を、更に、微生物を取り除いた水に添加した後、ｐＨ７以上１０以下に調整して該添加水に存在する金属イオンを金属水酸化物として沈殿させ、上澄み液を孔径０．５μｍ以下の膜でろ過して、ろ膜上に金属の腐食に関わる微生物を回収することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記液体燃料又は油が、石油、ガソリン、軽油、重油、アルコール、ディーゼルオイル、炭化水素、エーテルの少なくともいずれかであることを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記腐食部位を有する金属が、鉄、亜鉛、ニッケル、クロム、アルミニウム、銅、カドミウム、マンガンのうちのいずれか１種以上を含有する金属であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記金属の腐食が、液体燃料又は油を貯留するタンク若しくは容器、液体燃料を通液するパイプ、又は、前記タンク、容器、パイプにおける接合部又は溶接部、で生じる腐食であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法で回収した微生物から、ＤＮＡを抽出した後、当該ＤＮＡの特定領域を増幅し、得られたＤＮＡの塩基配列に基づいて微生物を同定することを特徴とする金属の腐食に関わる微生物の同定方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡの特定領域の増幅にＰＣＲを用いることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体燃料又は油、特に、原油、石油、ガソリン、軽油、重油、アルコール、ディーゼルオイル、炭化水素、エーテル等、を含有する液体に接触する環境で腐食した金属の、腐食に関わる微生物を回収する方法および同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
金属の腐食には微生物作用に起因するものがある。このような腐食は微生物腐食（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｙ  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ  Ｃｏｒｒｏｓｉｏｎ）と呼ばれる。例えば、アルミニウム合金製の航空機燃料タンクがクラドスポリウム・レジネーというカビにより腐食して燃料漏れを起こした事例や、油井環境での硫酸塩還元菌由来の硫化水素による鉄鋼の腐食などが知られている（以下の非特許文献１、２を参照のこと）。
【０００３】
金属の腐食面に接する水や油等の液体中や、付着物、錆、又はスラッジ内に存在する微生物を検出する方法としては、以下の二つが考えられる。一つは、培養によって微生物を単離して、その形態や生理的、生化学的性質を調べて金属の腐食面に接する水、付着物、錆、スラッジ、液体に存在する微生物を特定する方法である。もう一つは、金属の腐食面に接する水や油等の液体中や、付着物、錆、又はスラッジ内に存在する微生物のＤＮＡを抽出して、そのＤＮＡ配列を読み取り、ＤＮＡ配列のデータベースを参照することで、存在する微生物を特定化する方法である。
【０００４】
例えば培養に関して鉄酸化細菌を例にとると、従来から知られている鉄酸化細菌の培養や単離に用いる９Ｋ培地のように、調べたい微生物に対応した培養用の培地が確立されており、培養によって微生物の検出が広く行われている（以下の非特許文献３を参照のこと）。
【０００５】
しかしながら、金属の腐食面に接する水や油等の液体中や、付着物、錆、又はスラッジ内に存在する微生物を同定することは容易ではない。なぜならば、金属の腐食面に接する水や油等の液体、付着物、錆、及びスラッジは、一般に複数種の金属イオンを高濃度に含んでおり、これらの金属イオンは微生物の培養に影響を与え、さらに微生物のＤＮＡ抽出とＤＮＡ配列の読み取りに著しい悪影響を及ぼすからである。
【０００６】
まず、金属の腐食面に接する水や油等の液体や、付着物、錆、又はスラッジから微生物を培養により検出する方法に関する問題点について述べる。
一般に、金属の存在状態で微生物を培養するために確立された培地を使用する場合、特定の金属を一定濃度含んだ条件での培養のみに限られるため、金属の腐食面に接する水や油等の液体や、付着物、錆、スラッジのように複数種の金属が存在し、それらの含有濃度が変動する条件で存在している微生物を検出することは困難である。更に、上記の鉄酸化細菌では、９Ｋ培地等が広く使用されるが、この培地に適した微生物のみが優先的に検出されてしまう危険性がある。
【０００７】
また、微生物が存在することは確認できても培養できないＶＮＣ（Ｖｉｓｉｂｌｅ  ｂｕｔ  Ｎｏｎｅ-ｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ）という現象が最近では広く認知されている（以下の非特許文献４を参照のこと）。培養可能な微生物は１割程度であり、残り９割は培養できないという報告もある（以下の非特許文献４を参照のこと）。
従って、金属の腐食面に接する水や油等の液体中や、付着物、錆、又はスラッジ内に存在する微生物は、さらに培養が困難であると考えられる。
【０００８】
上記培養によって微生物を単離するという従来技術に対して、ＤＮＡ配列に基づいて微生物を同定する方法は、培養によるバイアスを受けず、簡便かつ正確であり、きわめて優れている。したがって、ＤＮＡ配列に基づく微生物の検出方法が、微生物を利用する産業上においても主流になりつつある（以下の特許文献１を参照のこと）。
【０００９】
しかしながら、金属の腐食面に接する水や油等の液体中や、付着物、錆、又はスラッジ内に存在する微生物からＤＮＡを抽出しようとすると、先ずＤＮＡと金属の分離回収が困難である。
【００１０】
例えば、一般的なフェノール・クロロホルム抽出などでは、ＤＮＡの夾雑物からの分離精製はできるが、ＤＮＡと金属を分離回収することはできない。更に金属の腐食面に接する液体が石油、ガソリンのような油分である場合には、ＤＮＡの精製はより困難を伴う。
【００１１】
このような状況は、液体燃料の保管、貯留、輸送或いは運搬に用いられる燃料タンクにおける金属腐食に関わる微生物を解析しようとするとき、特に問題になる。
【特許文献１】特開２００２−１０１８８４
【非特許文献１】日本材料科学会編  先端材料シリーズ  微生物と材料  （裳華房）（２００１年）第１章  微生物による材料の被害と防護方法、
【非特許文献２】腐食防食協会編  エンジニアのための微生物腐食入門  （丸善）  （２００４年）  第２章  事例と対策）
【非特許文献３】極限環境微生物ハンドブック、  大島泰郎監修、  ｐ２２３−ｐ２３２）
【非特許文献４】水処理におけるVNC細菌群集、  染谷、  日本水環境学会・日本微生物生態学会合同シンポジウム講演資料集 (2002年11月）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述のように、金属の腐食部位に存在する液体、及び付着物、錆、スラッジに存在する金属腐食に関わる微生物を同定することは困難なことが多い。
このような微生物は、局所的な環境で複数種類の微生物が棲息する複合微生物系として棲息しており、微生物培養単離により微生物を同定することは困難な場合が多い。また、夾雑する金属イオンによって、例えばＰＣＲなど酵素反応が強く阻害を受けるため、ＤＮＡ配列を元に微生物同定することも困難であることが多いという大きな課題がある。何故ならば、ＤＮＡの抽出やＤＮＡ配列の読み取りに必要な酵素による反応、例えばＤＮＡの増幅に必要なＰＣＲなどに対して、金属イオンがこれらの反応を強く阻害するからである。
【００１３】
本発明者らも、金属の腐食部位に存在する液体及び付着物、錆、スラッジに対して、様々な生化学的な手法を使って、金属の腐食部位に存在する微生物を回収してそのＤＮＡを抽出して、ＰＣＲでＤＮＡを増幅することを試みたが、ほとんどの場合で良好な結果は得られなかった。
【００１４】
特に、液体がガソリンなど石油系の液体燃料である、燃料タンクなどの金属腐食に関わる微生物を解析しようとする際、特に困難であった。
更に近年では、ＣＯ2対策からトウモロコシ、サトウキビなどを原料に微生物処理によるエタノール発酵で作るエタノールを混入したガソリンの導入もブラジル、米国などですすめられている。エタノールは微生物影響によって酸化されやすく、生成する酢酸は嫌気性環境での微生物腐食の原因物質ともなりえる。この他にもヒマワリなどを原料とするバイオディーゼルオイルなども微生物の影響により変質して微生物腐食が発生する可能性も考えられる。
【００１５】
このように微生物腐食発生が懸念される液体燃料又は油として原油、石油、ガソリン、軽油、重油、アルコール、ディーゼルオイル、炭化水素、エーテルなどがある。
ここで液体燃料の炭化水素としては例えば液化メタンなど、液体燃料のエーテルとしてはジメチルエーテルなどがある。
【００１６】
そこで本発明は、液体燃料又は油を含有する液体と接触する環境において、腐食した金属の腐食部位に存在する微生物の簡便な回収方法を提供することを目的とする。
また、特に液体がガソリンなどの液体燃料を貯留するタンク若しくは容器、液体燃料を通液するパイプ、又は、前記タンク、容器、パイプにおける接合部又は溶接部、で生じる腐食に関わる微生物の回収方法を提供することを目的とする。
【００１７】
また、回収した腐食に関わる微生物を、ＰＣＲなどの酵素反応を阻害せずにＤＮＡ配列読み取りが可能なこれら金属の腐食に関わる微生物の同定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、液体燃料又は油、特に、原油、石油、ガソリン、軽油、重油、アルコール、ディーゼルオイル、炭化水素、エーテル等、を含有する液体と接触する環境で腐食した金属に関して、金属の腐食部位に存在する微生物は、特に、その腐食部位の液体、付着物、錆、又はスラッジ中に多く存在すると考え、更に、これらの腐食に関わる微生物をＤＮＡ配列に基づいて検出するには、腐食により発生した夾雑する金属から微生物を分離して回収することで、金属に阻害されずに微生物のＤＮＡ配列の読み取りに必要なＰＣＲ反応などの酵素反応を行うことができるだろうと考えた。
【００１９】
更に、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、前記環境の金属の腐食部位に存在する微生物は、腐食部位の存在物が水においてはその水中に存在し、油分においてはその中にエマルジョンとして存在する水の中に存在し、付着物や錆やスラッジにおいてはその中に含まれる少量の水の中に存在することを見出した。
【００２０】
そして、金属の腐食部位に存在する液体及び付着物、錆、若しくはスラッジを、例えば０．５μｍ孔径以下のろ膜を用いたろ過により微生物を取り除いた水に懸濁して、存在する微生物をその水相に移動させ、相分離によりその水相を回収して得られる水に対して、ｐＨを７以上１０以下にすることで水中に溶解している金属類を水酸化物沈澱として沈澱・除去して、上澄み液に残った微生物をろ膜でろ過することで、安価かつ簡便に金属から微生物を分離・回収する方法を発明するに至った。
【００２１】
なお、本発明では、相分離して水相を回収した後、ｐＨ調整して、金属類を水酸化物沈殿として沈殿させた後、上澄みを回収して、ろ過によってろ膜上に微生物を回収する。
この操作の順序を変えて、先にｐＨ調整して、金属類を水酸化物として沈殿させて、相分離した水相を回収して、ろ過してろ膜上に微生物を回収することでは目的を達成できない。なぜならば、この場合には、相分離により得られる水相に、油分や金属含有スラッジが多くのこってしまうため、ろ膜でろ過する際に目詰まりの原因になるほか、微生物もより多くの油分や金属含有スラッジと一緒に回収されることになるためである。
【００２２】
上記のように、ろ膜上に回収した微生物の一部は、培養することが可能である。しかしながら、前述のＶＮＣ（Ｖｉｓｉｂｌｅ  ｂｕｔ  Ｎｏｎｅ-Ｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ）の問題があり、培養により検出できる微生物はごく一部に限られる。そこで、本発明者らは、ろ膜上に回収した微生物に対してＤＮＡ抽出法の適用したところ、ＤＮＡを抽出した後、ＤＮＡ配列に基づいた検出によって、前述の処理によって回収した微生物の同定が可能であることを更に見出した。
【００２３】
本発明は、上記知見によりなし得たものであり、その要旨とするところは以下の通りである。
（１）液体燃料又は油を含有する液体と接触する環境において腐食した金属の当該腐食に関わる微生物を回収する方法であって、前記金属の腐食部位に存在する、液体、付着物、錆、スラッジの少なくともいずれかを、微生物を取り除いた水に添加して懸濁した後、相分離してその水相を回収し、当該回収水をｐＨ７以上１０以下に調整して回収水中に存在する金属イオンを金属水酸化物として沈殿させ、上澄み液を孔径０．５μｍ以下の膜でろ過して、ろ膜上に金属の腐食に関わる微生物を回収することを特徴とする前記方法。
【００２４】
（２）前記回収した微生物を、更に微生物を取り除いた水に添加した後、ｐＨ７以上１０以下に調整して該添加水に存在する金属イオンを金属水酸化物として沈殿させ、上澄み液を孔径０．５μｍ以下の膜でろ過してろ膜上に金属の腐食に関わる微生物を回収することを特徴とする前記（１）記載の方法。
【００２５】
（３）前記液体燃料又は油が、石油、ガソリン、軽油、重油、アルコール、ディーゼルオイル、炭化水素、エーテルの少なくともいずれかであることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の方法。
【００２６】
（４）前記腐食部位を有する金属が、鉄、亜鉛、ニッケル、クロム、アルミニウム、銅、カドミウム、マンガンのうちいずれか１種以上を含有する金属であることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
【００２７】
（５）前記金属の腐食が、液体燃料を貯留するタンク若しくは容器、液体燃料を通液するパイプ、又は、前記タンク、容器、パイプにおける接合部又は溶接部、で生じる腐食であることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
【００２８】
（６）前記（１）〜（５）のいずれかに記載の微生物の回収方法で回収した微生物から、ＤＮＡを抽出した後、当該ＤＮＡの特定領域を増幅し、得られたＤＮＡの塩基配列に基づいて微生物を同定することを特徴とする金属の腐食に関わる微生物の同定方法。
【００２９】
（７）前記ＤＮＡの特定領域の増幅にＰＣＲを用いることを特徴とする前記（６）の方法。
【００３０】
なお、液体燃料又は油を含有する液体と接触する環境とは、例えばガソリンタンクなどの液体燃料タンクの内部や、原油貯蔵施設などの液体燃料の存在する環境を意味する。
また、本発明で言うところの微生物を取り除いた水とは、液体、付着物、錆、スラッジの少なくともいずれかを添加する前に、膜ろ過等で微生物を取り除いておいた水のことである。
【発明の効果】
【００３１】
本発明により、液体燃料又は油を含有する液体と接触する環境における金属の腐食部位に存在する金属の腐食に関わる微生物を、腐食により夾雑する金属から分離して回収して、微生物を同定することが可能になる。
特に、今まで困難であった、ガソリン、アルコールなどの液体燃料の金属タンクに存在する腐食に関わる微生物を回収し、同定することが可能となる。
これにより、従来、難しかった金属の腐食に関わる微生物を解明できるようになり、金属の腐食対策に進展をもたらすものと期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明では、液体燃料又は油を含有する液体と接触する環境において腐食した金属に対して、金属の腐食部位に存在する、液体、バイオフィルムなどの付着物、腐食により生成した錆、腐食生成物と液体などが混在することにより生成したスラッジの少なくともいずれかを、微生物を取り除いた水に添加することをまず行なう。
【００３３】
対象とする液体燃料又は油としては、水と比重が異なるものであれば、本発明を適用可能であるが、金属腐食に特に影響する、原油、石油、ガソリン、軽油、重油、アルコール、ディーゼルオイル、炭化水素、エーテル等の単独、又は、混合物を対象とすることがより好ましい。
【００３４】
液体燃料又は油を含有する液体とは、上記の液体燃料又は油の中に水を含有する液体である。例えば、液体燃料又は油に結露等で水分が混ざった液や、液体燃料や油の製造時に、精製度が低く水分が混ざっている液等がある。勿論、純度の高い液体燃料又は油も含まれる。
【００３５】
ここで、金属の腐食部位とは、文字通り金属が腐食している箇所及び腐食している箇所の周囲を意味する。例えば、ガソリンタンクの底板腐食では、底板腐食箇所周囲にあるガソリン等の液体燃料、錆、スラッジなどを意味する。原油、石油、ガソリン、軽油、重油、アルコール、ディーゼルオイル、炭化水素、エーテルを保持あるいは貯留するタンク、容器、パイプ、又は、これらの接合部あるいは溶接部などで、特に微生物腐食が起こりやすい。
【００３６】
次に、添加後の、微生物を取り除いた水と、液体、付着物、錆、スラッジの少なくともいずれかとの混合液を、攪拌して懸濁する。
その後、例えば静置あるいは遠心して相分離によりその水相を、ピペット等を用いて回収して得られる水（水相回収水と呼称する）に対して、そのｐＨを７以上１０以下に調整する。
【００３７】
尚、微生物を取り除いた水は、添加前に事前に作成したおく。作成方法としては、例えば孔径０．５μｍ未満のろ膜を用いてろ過するなどして行うことができる。微生物が取り除かれたことを確認する方法としては、例えば蛍光色素のＤＡＰＩ（4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール, ジヒドロクロライド）を用いて、微生物が存在する場合には蛍光染色された微生物が蛍光顕微鏡で観察されることより、微生物の存在の有無が判り、微生物が取り除かれたことを確認できる。
【００３８】
添加先の微生物を取り除いた水の量としては、相分離により水相が明確に形成され、かつピペット等を用いて水相を回収可能な量があればよい。
腐食部位に存在する液体、付着物、錆、又はスラッジに存在する微生物は、この微生物を取り除いた水に添加して懸濁後、相分離することにより水相に移行させることができる。例えば液体であるガソリン中にエマルジョンとして存在する水に生息する微生物は、ガソリンを、微生物を取り除いた水に添加して、懸濁後、相分離することにより水相に移行させることができる。
【００３９】
これは、原油、石油、ガソリン、軽油、重油、アルコール、ディーゼルオイル、炭化水素、エーテルの少なくとも一成分を含有する液体を使用する環境で腐食した金属の腐食に関わる微生物は、殆どが上記液中においてエマルジョン等の形で水相に生息していると考えられるためである。
【００４０】
この微生物を取り除いた水は、０．５μｍ孔径以下、より好ましくは０．２μｍ以下の孔径のろ膜によりろ過した無菌水を用いることが望ましい。ろ膜の孔径の下限は特に規定しないが、水をろ過できるものであれば使用可能である。一般に市販されているろ膜で構わない。
【００４１】
水相回収水をｐＨ７以上１０以下に調整することにより、このｐＨ域で、鉄、亜鉛、ニッケル、クロム、アルミニウム、銅、カドミウム、マンガン等が水酸化物を形成して沈澱する。より詳細には、ｐＨ７以上８以下では鉄、アルミニウム、クロムが、ｐＨ８以上９以下では銅、亜鉛が、ｐＨ９以上１０以下ではニッケル、カドミウム、マンガンが、それぞれ水酸化物を形成して沈澱する。
【００４２】
鉄鋼の腐食を例に取ると、腐食部位に存在する液体、及び付着物、錆、スラッジのｐＨは酸性を示すことが多い。これは、腐食により溶出した２価イオンが錆を生成する際、例えば、下記の反応により、酸性化するからである。
Ｆｅ2+  ＋  ２Ｈ2Ｏ  →  Ｆｅ（ＯＨ）2  ＋  ２Ｈ+
【００４３】
したがって、腐食面に接する水、あるいは付着物、錆、スラッジ、液体に存在する水は酸性を示すことが多くなるため、ｐＨ７以上１０以下に調整するためには、一般にアルカリを添加することになる。
【００４４】
金属水酸化物が沈殿し始めるｐＨは、原則的に金属の溶解度積によって決定されるものの、実際には、共存するイオンの影響を受け、溶解度積の大きな金属でも比較的低いｐＨで共沈することがある。例えば３価鉄は、比較的低いｐＨで水酸化第二鉄として除去されるが、このとき、溶存していたカドミウム、クロムが共沈する現象が知られている。したがって、金属の腐食部位に存在する液体、及び付着物、錆、スラッジを微生物を取り除いた水に添加して懸濁後、相分離によりその水相を回収して得られる水を、ｐＨ７以上１０以下に調整することで金属イオンを効率的に沈澱除去することができる。ｐＨ７は、これら金属イオンの水酸化物の沈澱を効果的に生じさせる下限のｐＨであり、ｐＨ１０は、このｐＨを超えると、金属種によっては錯イオン化して再溶解する可能性があることと、これより高いｐＨに調整すると、アルカリ添加量が増え、コスト的に不利である。尚、続けてＤＮＡ抽出やＤＮＡの解析を行う際に再度のｐＨ調整を行う必要が生じることを考慮すると、ｐＨ７以上８．５以下にｐＨを調整することがより好ましい。
【００４５】
添加するアルカリとしては、微生物からのＤＮＡ抽出、ＤＮＡ配列の読み取りに必要な酵素反応を阻害するものでなければ特に限定はないが、コストの観点から消石灰（Ｃａ（ＯＨ）2）や水酸化ナトリウムが好ましい。
次に、前記工程によって発生した金属水酸化物と微生物を分離し、さらに微生物を回収する方法について説明する。
【００４６】
金属の腐食部位に存在する液体、及び付着物、錆、スラッジを微生物を取り除いた水に添加して懸濁後、相分離によりその水相を回収して得られる水を、ｐＨを７以上１０以下に調整すると金属水酸化物が生じて懸濁するが、通常、生じた金属水酸化物は、１時間程度静置することによって沈澱し、付着物、錆、スラッジの不溶成分も金属水酸化物の沈澱に伴って共沈させることができる。勿論、静置時間は、１時間よりも短時間あるいは長時間であっても、金属水酸化物の沈殿が良好に進行する程度静置すればよく、特に限定されるものではない。また、遠心器やデカンタを用いて短時間に金属水酸化物を沈殿させることも可能である。この場合、あまり強い遠心をかけると、微生物も沈降してしまい、上澄み液から微生物を回収できなくなるので注意を要する。例えば、３０００ｒｐｍで１０分間程度の遠心分離で金属水酸化物を沈殿させ、上澄み液に微生物を残存させることが可能であるが、勿論、遠心分離条件も前記条件のみに限定されるものではない。
【００４７】
前記操作後、沈澱した金属水酸化物等の不溶成分をとらないように注意して、上澄み液をピペット等で回収する。しかし、金属水酸化物が上澄み液に若干混入して回収されたことが目視により確認された場合は、回収した上澄み液を再度、上述の方法で静置あるいは遠心分離して金属水酸化物を沈殿させて、上澄み液を再度回収することが望ましい。
【００４８】
次に、回収した上澄み液をろ膜でろ過することにより、ろ膜上に微生物を回収する。微生物を回収するろ膜の孔径は、微生物の大きさよりも小さな径が好ましく、具体的には０．５μｍ以下が好ましい。微生物には０．５μｍ以下の大きさのものも多く存在するため、より確実に回収するためには孔径０．２μｍ以下が特に好ましい。ろ膜の孔径の下限は特に規定しないが、水をろ過できるものであれば使用可能である。
【００４９】
以上の操作により、金属の腐食に関わる微生物をろ膜上に回収できる。
回収した微生物はそのまま、以下に示すＤＮＡ抽出に使用することができる。また、さらに金属等の夾雑が心配される場合には、ろ膜上に回収した微生物を再度、微生物を取り除いた水に添加して懸濁後、この水を、ｐＨ７以上１０以下に調整して金属イオンを金属水酸化物とした後、該金属水酸化物を沈殿させ、さらに、上澄み液を孔径０．５μｍ以下の膜でろ過して金属の腐食部位に存在する液体、及び付着物、錆、スラッジに存在する金属の腐食に関わる微生物をろ膜上に分離して回収することを繰り返すことで、より金属の夾雑がなく微生物を回収することも可能である。
【００５０】
次に、本発明に係わる回収した微生物のＤＮＡを抽出してＤＮＡ配列に基づいて微生物を同定する方法について説明する。
前記操作によりろ膜上に回収した微生物は、必要に応じて、適当な洗浄液を用いて、混在する油や金属含有スラッジなどの不純物を取り除くことも可能である。洗浄液としては、例えば、分子生物学実験で一般的に使用されるＴＥ緩衝液（エチレンジアミン四酢酸を含むトリス−塩酸緩衝液）などを用いることができる。勿論、ＴＥ緩衝液以外のものでも、後述のＤＮＡ抽出やＰＣＲ反応などの酵素反応を阻害するものでなければ特に限定はない。
【００５１】
ろ膜上に回収した微生物からＤＮＡを抽出する方法としては、分子生物学実験で一般的に用いられるＤＮＡ抽出方法を用いることが可能である。例えば、塩化ベンジルを用いる方法、ガラスビーズを用いる方法、フェノールを用いる方法、酵素を用いる方法などが挙げられる。このうち、塩化ベンジルを用いるＤＮＡ抽出法が抽出効率が高いため、特に好ましいが、この方法に限定されるものではない。
【００５２】
ＤＮＡ抽出後、ＤＮＡの特定領域を増幅する方法について説明する。ここでＤＮＡの特定領域とは微生物の体内から抽出されたＤＮＡの中で、微生物種の比較検討が可能なＤＮＡの領域を意味する。例えば１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子の一部などがある。ＤＮＡの特定領域の増幅方法は、簡便で一般化されており、確実に増幅できることからＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）が好ましい。ＰＣＲによりＤＮＡを増幅した後、得られた増幅されたＤＮＡを、例えば変性剤濃度勾配電気泳動ＤＧＧＥ（Ｄｅｎａｔｕｒｅｄ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、あるいは温度勾配電気泳動ＴＧＧＥ（Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）などの方法で電気泳動して、ＤＮＡを蛍光色素で染色することにより、各微生物から抽出した異なる微生物配列を持つＤＮＡを分離したバンドとして得る。
前記各ＤＮＡバンドからＤＮＡ配列を読み取ることが可能であるため、各ＤＮＡバンドに対応する微生物をＤＮＡ配列のデータベースを参照することで同定できる。
【実施例】
【００５３】
実施例１
底板部に腐食が起こった鉄製石油燃料タンクの腐食部位に存在する、石油と結露により発生した水、および腐食生成物である鉄錆からなる混合物を１００ｇ採取した。この採取物を２Ｌのビーカーに入れ、これに０．２μｍ孔径のろ膜でろ過した微生物を含まない水１Ｌを加えて、採取物を滅菌処理した撹拌棒で攪拌し十分懸濁させた。１時間静置することにより、鉄錆は下層に沈澱し、石油油分は上層に分かれ、中間に水相が相分離した。
【００５４】
この水相をピペットを用いて注意深く７５０ｍＬ回収した。このように水相を回収することにより得られた水に対して、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加して、そのｐＨをｐＨ７．５に調整した。ｐＨ調製直後は赤褐色の懸濁状態であったが、室温（２０℃）で１時間静置したところ、赤褐色の懸濁物質は沈降して上澄み液は無色透明となった。
【００５５】
次に、この相分離された上澄み液をピペットで回収した後、孔径０．２μｍのろ膜でろ過し、ろ膜上にトラップされた回収物を１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ９．０）、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、１０ｍＭ塩化ナトリウムからなる溶液で洗浄し、回収物から不純物を取り除いて微生物を回収した。続いて、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、１０ｍＭ塩化ナトリウムからなる溶液で洗浄し、続いて塩化ベンジルを用いてＤＮＡを抽出した。さらにエタノール沈澱によってＤＮＡを濃縮した。この濃縮したＤＮＡを鋳型として、それぞれ表１に記載のプライマーを使用してＰＣＲを実施した。
【００５６】
表１  PCRプライマー
プライマー 塩基配列
フォワードプライマー：        5’-GCクランプ-GCAAGTCTGGTGCCAGCAGCC-3’
リバースプライマー：          5’-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3’
GCクランプ:                   CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG
【００５７】
このプライマーを用いることにより、大腸菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子の５０６番目の塩基と９０７番目の塩基に挟まれたＤＮＡの領域に対応する真正細菌のＤＮＡを増幅することができる。ＤＮＡを増幅する酵素であるＤＮＡポリメラーゼとして、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  ＵＳＡ）を用いた。ＰＣＲ装置はＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  ＵＳＡ）を用いた。ＰＣＲ条件は、９４℃で７分間の後に、９６℃で３０秒、アニール温度６５〜５５℃で６０秒、７２℃で９０秒を２０サイクル繰り返した（ただし、２サイクル毎にアニール温度が１℃ずつ下がるようにした）後に、９４℃で３０秒、５５℃で６０秒、７２℃で９０秒を１５サイクルの後、７２℃で１０分間として、４℃でＤＮＡ解析に供するまで保存した。
【００５８】
このＰＣＲにより得られた、増幅されたＤＮＡ産物を２質量％アガロースで電気泳動したところ、４００ｂｐ付近にＤＮＡのバンドが確認でき、微生物の回収が行えたことを確認できた。
【００５９】
そこで、上記ＰＣＲにより得られた、増幅されたＤＮＡ産物をＤＧＧＥ（変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法）で解析した。ＤＧＧＥの装置には、Ｄｃｏｄｅ（ＢＩＯ  ＲＡＤ，  ＵＳＡ）を用いた。変性剤として尿素とホルムアミドを用い、変性剤の濃度には、３０〜６０質量％の濃度勾配を付けた。また、ポリアクリルアミドの濃度についても、５〜１０質量％の濃度勾配をつけた。電圧１３０Ｖを印加して７時間電気泳動した。泳動後のゲルはＳｙｂｅｒ  Ｇｒｅｅｎ（ＴＡＫＡＲＡ）で染色して、染色されたＤＮＡのバンドを紫外線（３１０ｎｍ）照射下で、ＣＣＤカメラで撮影した。
【００６０】
ＤＧＧＥによる微生物の検出結果を図１に示す。さらに、図１において各微生物に対応する各ＤＮＡのバンドを切り出して、そのＤＮＡ配列を読み取った。読み取ったＤＮＡ配列をデータベースでホモロジー検索することで、存在する微生物を同定することができた。鉄酸化細菌であるチオバシラス・フェロオキシダンス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）とＤＮＡ配列が１００％一致したので、本鉄酸化細菌の存在が確認された。この鉄酸化細菌は２価鉄イオンを腐食性の３価鉄イオンに酸化する働きを持つので、微生物腐食に関わる微生物を同定することができた。
【００６１】
なお、ろ膜の孔径を０．３μｍ、０．５μｍ、０．６μｍと大きくして、その他は上記と同条件で試験したところ、０．３μｍ、０．５μｍの場合は、０．２μｍの場合と同様に微生物腐食に関わる微生物を同定することができたが、０．６μｍの場合は、微生物がろ膜を通過してしまったため、ＰＣＲ後にＤＮＡ産物を回収することができなかった。
また、ｐＨを６．５、９．５、１０．５と変えて上記と同条件の試験を実施したところ、ｐＨが９．５の場合は、７．５の場合と同様に微生物腐食に関わる微生物を同定することができたが、ｐＨが６．５の場合は、金属が水酸化物として沈殿せず、ろ液中にＦｅ2+等の金属イオンが残留したため、ＰＣＲが阻害され、ＤＮＡ産物を回収することができなかった。また、ｐＨが１０．５の場合は、金属の錯イオンが形成され、ろ液中に当該錯イオンが残留したため、ＰＣＲが阻害され、ＤＮＡ産物を回収することができなかった。
【００６２】
実施例２
底板部に腐食が起こった鉄製ディーゼル油用燃料タンクの腐食部位に存在する、ディーゼル油と結露により発生した水、および腐食生成物である鉄錆からなる混合物を５０ｇ採取した。この採取物を２Ｌのビーカーに入れ、これに０．２μｍ孔径のろ膜でろ過した微生物を含まない水１Ｌを加えて、採取物を十分懸濁させた。１時間静置することにより、鉄錆は下層に沈澱し、石油油分は上層に分かれ、中間に水相が相分離した。この水相をピペットを用いて注意深く７５０ｍＬ回収した。このように水相を回収することにより得られた水に対して、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加して、そのｐＨをｐＨ７．５に調整した。ｐＨ調製直後は赤褐色の懸濁状態であったが、室温（２０℃）で１時間静置したところ、赤褐色の懸濁物質は沈降して上澄み液は無色透明となった。
【００６３】
次に、この相分離された上澄み液をピペットで回収した後、孔径０．２μｍのろ膜でろ過し、ろ膜上にトラップされた回収物を１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ９．０）、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、１０ｍＭ塩化ナトリウムからなる溶液で洗浄し、回収物から不純物を取り除いて微生物を回収した。続いて、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、１０ｍＭ塩化ナトリウムからなる溶液で洗浄し、続いて塩化ベンジルを用いてＤＮＡを抽出した。さらにエタノール沈澱によってＤＮＡを濃縮した。この濃縮したＤＮＡを鋳型としてそれぞれ表１に記載のプライマーを使用してＰＣＲを実施した。
【００６４】
このプライマーを用いることにより、大腸菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子の５０６番目の塩基と９０７番目の塩基に挟まれたＤＮＡの領域に対応する真正細菌のＤＮＡを増幅することができる。ＤＮＡを増幅する酵素であるＤＮＡポリメラーゼとして、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  ＵＳＡ）を用いた。ＰＣＲ装置はＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  ＵＳＡ）を用いた。ＰＣＲ条件は、９４℃で７分間の後に、９６℃で３０秒、アニール温度６５〜５５℃で６０秒、７２℃で９０秒を２０サイクル繰り返した（ただし、２サイクル毎にアニール温度が１℃ずつ下がるようにした）後に、９４℃で３０秒、５５℃で６０秒、７２℃で９０秒を１５サイクルの後、７２℃で１０分間として、４℃でＤＮＡ解析に供するまで保存した。
【００６５】
このＰＣＲにより得られた、増幅されたＤＮＡ産物を２質量％アガロースで電気泳動したところ、４００ｂｐ付近にＤＮＡのバンドが確認でき、微生物の回収が行えたことを確認できた。
【００６６】
そこで、上記ＰＣＲにより得られた、増幅されたＤＮＡ産物をＤＧＧＥ（変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法）で解析した。ＤＧＧＥの装置には、Ｄｃｏｄｅ（ＢＩＯ  ＲＡＤ，  ＵＳＡ）を用いた。変性剤として尿素とホルムアミドを用い、変性剤の濃度には、３０〜６０質量％の濃度勾配を付けた。また、ポリアクリルアミドの濃度についても、５〜１０質量％の濃度勾配をつけた。電圧１３０Ｖを印加して７時間電気泳動した。泳動後のゲルはＳｙｂｅｒ  Ｇｒｅｅｎ（ＴＡＫＡＲＡ）で染色して、染色されたＤＮＡのバンドを紫外線（３１０ｎｍ）照射下で、ＣＣＤカメラで撮影した。
【００６７】
ＤＧＧＥによる微生物の検出結果を図２に示す。さらに、図２において各微生物に対応する各ＤＮＡのバンドを切り出して、そのＤＮＡ配列を読み取った。読み取ったＤＮＡ配列をデータベースでホモロジー検索することで、存在する微生物を同定することができた。ＤＧＧＥで検出された十数本のＤＮＡバンドのうち一本は、硫酸塩還元菌であるディスルフォビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）とＤＮＡ配列が１００％一致した。本硫酸塩還元菌の存在が確認された。この硫酸塩還元菌は腐食性の硫化水素を発生する働きを持つので、微生物腐食に関わる微生物を同定することができた。
【００６８】
なお、ろ膜の孔径を０．３μｍ、０．５μｍ、０．６μｍと大きくして、その他は上記と同条件で試験したところ、０．３μｍ、０．５μｍの場合は、０．２μｍの場合と同様に微生物腐食に関わる微生物を同定することができたが、０．６μｍの場合は、微生物がろ膜を通過してしまったため、ＰＣＲ後にＤＮＡ産物を回収することができなかった。
【００６９】
また、ｐＨを６．５、９．５、１０．５と変えて上記と同条件の試験を実施したところ、ｐＨが９．５の場合は、７．５の場合と同様に微生物腐食に関わる微生物を同定することができたが、ｐＨが６．５の場合は、金属が水酸化物として沈殿せず、ろ液中にＦｅ2+等の金属イオンが残留したため、ＰＣＲが阻害され、ＤＮＡ産物を回収することができなかった。また、ｐＨが１０．５の場合は、金属の錯イオンが形成され、ろ液中に当該錯イオンが残留したため、ＰＣＲが阻害され、ＤＮＡ産物を回収することができなかった。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】本発明に関わるＤＧＧＥによる微生物（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）の検出結果（ＤＮＡバンド）を示す図面に代わる写真である。
【図２】本発明に関わるＤＧＧＥによる微生物（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．）の検出結果（ＤＮＡバンド）を示す図面に代わる写真である。
【図１】
2007244290.tif 000002
【図２】
2007244290.tif 000003
【配列表】
2007244290000001.app