(57)【要約】【課題】本発明は、マハタ親魚の良質卵確保手法として、LHRHa徐放性製剤を用いた成熟・排卵誘導後の人工授精タイミングにおいて、最適な時期に媒精を行うことで、受精率、ふ化率等の高い良質な受精卵を安定的かつ効率的に得る採卵方法を提供する。【解決手段】合成黄体形成ホルモン放出ホルモン（LHRHa：des-Gly10,[D-Ala6]-LHRH ethylamide）の徐放投与法として、コレステロールペレット固形製剤の埋め込み投与またはカカオバター油性製剤の注射投与を行い、LHRHaの投与量は20〜100μg/kg BWとし、マハタ親魚は人為的環境下で養殖した養成親魚を用い、その卵巣卵の卵径が420〜550μmの個体を使用し、ホルモン処理後の採卵は人工授精により行い、かつ人工授精のタイミングは、排卵直後に卵を採取し、直ちに媒精することにより、マハタ親魚から安定的かつ効率的に良質な受精卵を得ることを可能にした。【選択図】図6
2007252344.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成黄体形成ホルモン放出ホルモン（LHRHa：des-Gly10,[D-Ala6]-LHRH ethylamide）の徐放投与法を行い、LHRHaの投与量は20〜100μg/kg BWとし、マハタ親魚は人為的環境下で養殖した養成親魚を用い、その卵巣卵の卵径が420〜550μmの個体を使用し、ホルモン処理後の採卵は人工授精により行い、かつ人工授精のタイミングは、排卵直後に卵を採取し、直ちに媒精することにより、マハタ親魚から安定的かつ効率的に良質な受精卵を得ることを特徴としたLHRHa徐放性製剤を用いた成熟・排卵誘導後の人工授精タイミングに配慮したマハタ親魚の良質卵確保手法。
【請求項２】
合成黄体形成ホルモン放出ホルモン（LHRHa：des-Gly10,[D-Ala6]-LHRH ethylamide）の徐放投与法として、コレステロールペレット固形製剤の埋め込み投与またはカカオバター油性製剤の注射投与を行い、LHRHaの投与量は20〜100μg/kg BWとし、マハタ親魚は人為的環境下で養殖した養成親魚を用い、その卵巣卵の卵径が420〜550μmの個体を使用し、ホルモン処理後の採卵は人工授精により行い、かつ人工授精のタイミングは、排卵直後に卵を採取し、直ちに媒精することにより、マハタ親魚から安定的かつ効率的に良質な受精卵を得ることを特徴としたLHRHa徐放性製剤を用いた成熟・排卵誘導後の人工授精タイミングに配慮したマハタ親魚の良質卵確保手法。
【請求項３】
コレステロールペレット固形製剤を用いたLHRHaの埋め込み投与またはカカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導法において、排卵はLHRHa投与後36〜54時間に起こる請求項２記載のLHRHa徐放性製剤を用いた成熟・排卵誘導後の人工授精タイミングに配慮したマハタ親魚の良質卵確保手法。
【請求項４】
コレステロールペレット固形製剤を用いたLHRHaの埋め込み投与またはカカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導法において、LHRHa投与後の最適な人工授精のタイミングは、排卵後0〜6時間である請求項２記載のLHRHa徐放性製剤を用いた成熟・排卵誘導後の人工授精タイミングに配慮したマハタ親魚の良質卵確保手法。
【請求項５】
LHRHaコレステロールペレット固形製剤は、円柱状に成型したものである請求項２記載のLHRHa徐放性製剤を用いた成熟・排卵誘導後の人工授精タイミングに配慮したマハタ親魚の良質卵確保手法。
【請求項６】
LHRHaコレステロールペレット固形製剤は、1個あたりLHRHaを50〜400μg含むものである請求項２記載のLHRHa徐放性製剤を用いた成熟・排卵誘導後の人工授精タイミングに配慮したマハタ親魚の良質卵確保手法。
【請求項７】
LHRHaコレステロールペレット固形製剤は、マハタ親魚の筋肉内または腹腔内に埋め込むことを特徴とした請求項２記載のLHRHa徐放性製剤を用いた成熟・排卵誘導後の人工授精タイミングに配慮したマハタ親魚の良質卵確保手法。
【請求項８】
LHRHaカカオバター油性製剤は、LHRHaを50％エチルアルコールに溶解させ、カカオバターとLHRHa溶液との質量比が95：5 〜70：30のものである請求項２記載のLHRHa徐放性製剤を用いた成熟・排卵誘導後の人工授精タイミングに配慮したマハタ親魚の良質卵確保手法。
【請求項９】
LHRHaカカオバター油性製剤は、0.1 mlあたりLHRHaを50〜200μg含むものである請求項２記載のLHRHa徐放性製剤を用いた成熟・排卵誘導後の人工授精タイミングに配慮したマハタ親魚の良質卵確保手法。
【請求項１０】
LHRHaカカオバター油性製剤は、サンプル瓶等に収容後、-20℃以下で保存可能であり、再び使用する際には、湯煎等により溶解させることで使用可能である請求項２記載のLHRHa徐放性製剤を用いた成熟・排卵誘導後の人工授精タイミングに配慮したマハタ親魚の良質卵確保手法。
【請求項１１】
LHRHaカカオバター油性製剤は、マハタ親魚の筋肉内または腹腔内に注射投与することを特徴とした請求項２記載のLHRHa徐放性製剤を用いた成熟・排卵誘導後の人工授精タイミングに配慮したマハタ親魚の良質卵確保手法。
【請求項１２】
LHRHaカカオバター油性製剤は、マハタ親魚の筋肉内または腹腔内に注射投与された後、マハタ親魚の産卵期成熟水温の17〜23℃で凝固し、LHRHaを長期間持続的に溶出させる徐放性製剤となることを特徴とした請求項２記載のLHRHa徐放性製剤を用いた成熟・排卵誘導後の人工授精タイミングに配慮したマハタ親魚の良質卵確保手法。
【請求項１３】
LHRHaカカオバター油性製剤の注射投与に使用する針は、目詰まりを防止するために18〜21Gの比較的針穴が大きいものを使用する請求項２記載のLHRHa徐放性製剤を用いた成熟・排卵誘導後の人工授精タイミングに配慮したマハタ親魚の良質卵確保手法。
【請求項１４】
LHRHaコレステロールペレット固形製剤およびLHRHaカカオバター油性製剤のマハタ親魚への投与回数は1回である請求項２記載のLHRHa徐放性製剤を用いた成熟・排卵誘導後の人工授精タイミングに配慮したマハタ親魚の良質卵確保手法。
【請求項１５】
マハタ親魚は、当該産卵期において、自然環境下で未だ排卵していない個体を用いる請求項２記載のLHRHa徐放性製剤を用いた成熟・排卵誘導後の人工授精タイミングに配慮したマハタ親魚の良質卵確保手法。
【請求項１６】
マハタ親魚は、成熟・排卵誘導が可能な5歳魚以上かつ体重2 kg以上の個体を用いる請求項２記載のLHRHa徐放性製剤を用いた成熟・排卵誘導後の人工授精タイミングに配慮したマハタ親魚の良質卵確保手法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マハタ親魚からの人工授精によるホルモン処理採卵において、安定的かつ効率的に受精率の高い良質な受精卵を得ることを目的としたLHRHa徐放性製剤を用いた成熟・排卵誘導後の人工授精タイミングに配慮した良質卵確保手法に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでのマハタを対象にした人工授精によるホルモン処理採卵では、個々の親魚の成熟状態に関わらず、ホルモン処理から概ね48時間経過後に腹部の触診を行い、排卵が確認された親魚については卵を搾出し、人工授精を行っていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、ホルモン処理による成熟・排卵誘導後の人工授精のタイミングをすべての個体で48時間後に設定した場合、親魚の排卵の有無や得られた卵の卵質は様々であり、安定的かつ効率的に良質な受精卵を得ることは困難であった。
【０００４】
このように、人工授精により得られた卵の受精率、ふ化率等の卵質が不安定な原因の一つに、排卵された卵の媒精適期を逃している可能性が考えられる。
【０００５】
一般に、人為的環境下において同一の親魚養成を行っている親魚群においても、それらの個体間での成熟状態は様々である。成熟が十分に進んでいて卵巣卵の卵径が大きく成長している親魚もいれば、まだ、未熟な親魚も存在する。ブリでは、ホルモン処理による成熟・排卵誘導が可能である親魚を選定するために、カニューラチューブにより卵巣卵を採取し、卵径や成熟状況を調査する。ブリでは、親魚の卵径に基づき、ホルモン処理から排卵するまでの時間が個体毎に予測可能となっている。マハタにおいても、カニューラチューブにより卵巣卵を採取し、卵径を計測することで、成熟・排卵誘導が可能な親魚の選定と当該個体の排卵時間が予測できる可能性がある。個体毎の排卵時間の予測が、受精率、ふ化率等の高い良質卵の確保に重要な役割を果たすと考えられる。
【０００６】
また、トラフグやブリ等では、人工授精により得られた卵の受精率が排卵してから経過時間と密接な関係があり、排卵された卵がそのまま長時間卵巣腔内に滞留すると、卵は過熟現象を起こし、受精率、ふ化率等の卵質が低下することが確認されている。マハタにおいても、これまで良質な受精卵を得ることが困難であった原因の一つとして、人工授精のタイミングが不適切であり、すでに過熟となった卵に媒精していた可能性がある。
【０００７】
そこで、本発明は、マハタ親魚の良質卵確保手法として、LHRHa徐放性製剤を用いた成熟・排卵誘導後の人工授精タイミングにおいて、最適な時期に媒精を行うことで、受精率、ふ化率等の高い良質な受精卵を安定的かつ効率的に得る採卵方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、発明者らは、LHRHa徐放性製剤を用いてマハタ親魚の成熟・排卵を誘導し、その排卵状況および人工授精における排卵後経過時間と卵質との関係を各種試験により、明らかとした結果、本発明のLHRHa徐放性製剤を用いた成熟・排卵誘導後の人工授精タイミングに配慮したマハタ親魚の良質卵確保手法を見出すに至った。
【０００９】
請求項１の発明は、合成黄体形成ホルモン放出ホルモン（LHRHa：des-Gly10,[D-Ala6]-LHRH ethylamide）の徐放投与法を行い、LHRHaの投与量は20〜100μg/kg BWとし、マハタ親魚は人為的環境下で養殖した養成親魚を用い、その卵巣卵の卵径が420〜550μmの個体を使用し、ホルモン処理後の採卵は人工授精により行い、かつ人工授精のタイミングは、排卵直後に卵を採取し、直ちに媒精することにより、マハタ親魚から安定的かつ効率的に良質な受精卵を得ることを特徴する。
【００１０】
請求項２の発明は、合成黄体形成ホルモン放出ホルモン（LHRHa：des-Gly10,[D-Ala6]-LHRH ethylamide）の徐放投与法として、コレステロールペレット固形製剤の埋め込み投与またはカカオバター油性製剤の注射投与を行い、LHRHaの投与量は20〜100μg/kg BWとし、マハタ親魚は人為的環境下で養殖した養成親魚を用い、その卵巣卵の卵径が420〜550μmの個体を使用し、ホルモン処理後の採卵は人工授精により行い、かつ人工授精のタイミングは、排卵直後に卵を採取し、直ちに媒精することにより、マハタ親魚から安定的かつ効率的に良質な受精卵を得ることを特徴する。
【００１１】
請求項３の発明は、請求項２において、コレステロールペレット固形製剤を用いたLHRHaの埋め込み投与またはカカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導法において、排卵はLHRHa投与後36〜54時間に起こることを特徴とする。
【００１２】
請求項４の発明は、請求項２において、コレステロールペレット固形製剤を用いたLHRHaの埋め込み投与またはカカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導法において、LHRHa投与後の最適な人工授精のタイミングは、排卵後0〜6時間であることを特徴とする。
【００１３】
請求項５の発明は、請求項２において、LHRHaコレステロールペレット固形製剤は、円柱状に成型したものである。
【００１４】
請求項６の発明は、請求項２において、LHRHaコレステロールペレット固形製剤は、1個あたりLHRHaを50〜400μg含むものである。
【００１５】
請求項７の発明は、請求項２において、LHRHaコレステロールペレット固形製剤は、マハタ親魚の筋肉内または腹腔内に埋め込むことを特徴とする。
【００１６】
請求項８の発明は、請求項２において、LHRHaカカオバター油性製剤は、LHRHaを50％エチルアルコールに溶解させ、カカオバターとLHRHa溶液との質量比が95：5 〜70：30のものである。
【００１７】
請求項９の発明は、請求項２において、LHRHaカカオバター油性製剤は、0.1 mlあたりLHRHaを50〜200μg含むものである。
【００１８】
請求項１０の発明は、請求項２において、LHRHaカカオバター油性製剤は、サンプル瓶等に収容後、-20℃以下で保存可能であり、再び使用する際には、湯煎等により溶解させることで使用可能である。
【００１９】
請求項１１の発明は、請求項２において、LHRHaカカオバター油性製剤は、マハタ親魚の筋肉内または腹腔内に注射投与することを特徴とする。
【００２０】
請求項１２の発明は、請求項２において、LHRHaカカオバター油性製剤は、マハタ親魚の筋肉内または腹腔内に注射投与された後、マハタ親魚の産卵期成熟水温の17〜23℃で凝固し、LHRHaを長期間持続的に溶出させる徐放性製剤となることを特徴とする。
【００２１】
請求項１３の発明は、請求項２において、LHRHaカカオバター油性製剤の注射投与に使用する針は、目詰まりを防止するために18〜21Gの比較的針穴が大きいものを使用する。
【００２２】
請求項１４の発明は、請求項２において、LHRHaコレステロールペレット固形製剤およびLHRHaカカオバター油性製剤のマハタ親魚への投与回数は1回である。
【００２３】
請求項１５の発明は、請求項２において、マハタ親魚は、当該産卵期において、自然環境下で未だ排卵していない個体を用いる。
【００２４】
請求項１６の発明は、請求項２において、マハタ親魚は、成熟・排卵誘導が可能な5歳魚以上かつ魚体重2 kg以上の個体を用いる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明のLHRHa徐放性製剤を用いた成熟・排卵誘導後の人工授精タイミングに配慮したマハタ親魚の良質卵確保手法によれば、これまで受精率、ふ化率等の高い受精卵の確保が困難であったマハタにおいて、種苗生産用の良質な受精卵を安定的かつ効率的に確保できるという有利な効果を奏する。
【００２６】
また、本発明のLHRHa徐放性製剤を用いた成熟・排卵誘導後の人工授精タイミングに配慮したマハタ親魚の良質卵確保手法によれば、安定的に種苗生産用の受精卵の確保が可能となることから、ふ化から稚魚にかけて生産を行う仔稚魚飼育において、より計画的かつ安定的な生産を可能にするという有利な効果を奏する。
【００２７】
また、本発明のLHRHa徐放性製剤を用いた成熟・排卵誘導後の人工授精タイミングに配慮したマハタ親魚の良質卵確保手法によれば、マハタ親魚からの再現性の高い採卵が可能となることから、高額なマハタ親魚の効率的な利用，使用親魚数の低減およびそれに伴う経費の削減が図れるという有利な効果を奏する。
【００２８】
また、本発明のLHRHa徐放性製剤を用いた成熟・排卵誘導後の人工授精タイミングに配慮したマハタ親魚の良質卵確保手法によれば、良質な受精卵を安定的かつ効率的に得ることができるとともに、その後の仔稚魚飼育も計画的かつ安定的な生産が可能となることから、それに伴うマハタ人工種苗の大量生産が実現し、養殖生産用のマハタ種苗を切望している魚類養殖業の発展が期待されるという有利な効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明のマハタ親魚の良質卵確保手法では、その成熟・排卵誘導法として、LHRHaの徐放投与を可能にするコレステロールペレット固形製剤の埋め込み投与またはカカオバター油性製剤の注射投与を行う。
【００３０】
まず、LHRHaコレステロールペレット固形製剤の埋め込み投与による成熟・排卵誘導法について説明する。
【００３１】
LHRHaコレステロールペレット固形製剤の作製方法は、LHRHaを50％エチルアルコールに溶解した後、その溶液をコレステロールパウダーに添加し、ガラス棒等でペースト状になるまで混合させ、全体を均一化させる。
【００３２】
ペースト状になったLHRHaコレステロールを真空デシケーター等に収容し、十分に乾燥させる。
【００３３】
乾燥させたLHRHaコレステロールパウダーに湯煎等で溶解したカカオバターを添加、混合し、全体を均一化させる。
【００３４】
バインダーの役目をするカカオバターが添加されたLHRHaコレステロールパウダーは、30mgずつ秤量し、ペレット作製器の穴内に入れ、その後ステンレス棒等で圧縮し、ペレット状にする。
【００３５】
完成したLHRHaコレステロールペレット固形製剤は、直ちに使用することも可能だが、-20℃以下の冷凍庫にて保存しておくことも可能である。
【００３６】
LHRHaコレステロールペレット固形製剤の大きさや形状は、種々のものが考えられるが、特に2×6mm程度の円柱状に成型したものが良い。LHRHaコレステロールペレットは、マハタ親魚の体内に埋め込むことになるが、ペレットのサイズが大きすぎると親魚に多大なストレスを与えることとなる。形状は、円柱状にすると、ペレット投与器に装填しやすく、取り扱いも容易で作業性も向上し、作業時間も短縮化できる。
【００３７】
また、LHRHaコレステロールペレット固形製剤の1個あたりのLHRHa含有量は、マハタ親魚に使用する場合、50〜400μg が考えられるが、その中でも100〜200μgが良い。仮にLHRHaのマハタ親魚への投与量を50μg/kg BWとすると、親魚の体重が6 kgの場合はLHRHaが300μg必要となる。ペレット1個あたりのLHRHa含有量が100μgの場合は3個、200μgの場合は1.5個埋め込むこととなる。また、仮に、ペレット1個あたりのLHRHa含有量を10μgと少なくした場合には、埋め込み個数が30個となり、親魚へのストレスが大きくなる。逆に、ペレット1個あたりのLHRHa含有量を600μgと多くした場合には、埋め込み個数が0.5個となり、固形製剤の取り扱いや埋め込み作業が困難となる。もちろん、LHRHaがペレットから溶出する条件も極端に変わり、期待した徐放量、徐放期間が実現しない可能性がある。
【００３８】
LHRHaコレステロールペレット固形製剤の埋め込み投与には、内径2mm、外径3mmのPFAチューブと外径2mmのステンレス丸棒で作製したペレット投与器を使用すると良い。
【００３９】
ペレット投与器には、事前にペレットを1個入り、1.5個入り、2個入りと準備しておくことが可能で、マハタ親魚の魚体重により、臨機応変にペレットの必要個数に応じて投与することが可能となる。例えば、マハタ親魚へのLHRHa投与量を50μg/kg BWとすると、親魚の体重が6 kgの場合は、LHRHaが300μg必要となる。ペレット1個あたりのLHRHa含有量が200μgの場合はペレットを1.5個装填したペレット投与器を使用し、埋め込めば良い。また、別の親魚の体重が4 kgの場合は、LHRHaが200μg必要となり、ペレットを1個装填したペレット投与器を使用し、埋め込めばよい。事前に各種個数のペレット投与器を準備しておくことで、迅速なLHRHaの埋め込み投与が可能となり、マハタ親魚へ与えるストレスも最小限に抑えることができる。
【００４０】
LHRHaコレステロールペレット固形製剤の埋め込み投与部分は、マハタ親魚の筋肉内および腹腔内が考えられるが、特に背筋部の肉厚な部分に皮下1〜2cm程度の深さで実施するのが良い。
【００４１】
LHRHaコレステロールペレット固形製剤の埋め込み投与の際は、まず、マハタ親魚を麻酔後、埋め込み投与予定部分にメスで5mm程度の切れ込みを入れ、ペレット投与器を挿入する。ペレット投与器先端が皮下2cm程度に達したら、ペレット投与器のステンレス棒を押し込み、ペレットを筋肉内に埋め込む。その後、ペレット投与器は速やかに引き抜く。
【００４２】
LHRHaコレステロールペレット固形製剤は、腹腔内にも埋め込み投与可能だが、作業に熟練を要し、作業者が未熟な場合は、内臓等を傷つける可能性がある。したがって、よりマハタ親魚へのストレスを軽減し、迅速に埋め込み投与作業を行うためには、その投与部分は、魚体背筋部の肉厚な部分が適していると考えられる。
【００４３】
LHRHaコレステロールペレット固形製剤のマハタ親魚への埋め込み回数は1回で十分である。コレステロールペレットからLHRHaが高いレベルで溶出し続ける期間は、概ね5日間であるが、マハタ親魚がLHRHaの埋め込み投与により排卵するまでの時間は42〜48時間であるので、1回の埋め込み投与で十分だと考えられる。仮に、1回の埋め込み投与で親魚の排卵が行われなかった場合は、親魚の成熟状態が未熟であった可能性が高い。
【００４４】
コレステロールペレット固形製剤を用いたLHRHaの埋め込み投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導において、マハタ親魚へのLHRHa投与量は、20〜100μg/kg BWが考えられるが、その中でも50μg/kg BWで、安定的かつ効率的に成熟・排卵が誘導でき、良質な受精卵が得られる。平成13,14年5〜6月の産卵期には、合計59個体のマハタ親魚を用い、LHRHa投与量を50μg/kg BWとしたLHRHaコレステロールペレット固形製剤の埋め込み投与により、44個体で成熟・排卵を誘導でき、合計3,573万粒の浮上卵を得た。マハタ親魚1個体から得られた浮上卵量は81.2万粒で、平均受精率も80％以上と良質な受精卵を得ることができた。
【００４５】
採卵に使用する親魚は、天然由来および養殖由来が考えられるが、安定的かつ効率的に良質な受精卵を得たい場合は、人為的環境下で養殖した養成親魚を使用する方が良い。
【００４６】
自然界に生息するマハタの親魚は貴重で、生息数も少ない。また、産卵期に漁獲できたとしても、その卵巣卵の成熟状態は様々であり、かつ漁獲によるスレやストレス等の悪影響により、それらの個体から良質な受精卵を得ることは非常に困難である。
【００４７】
一方、養殖された養成親魚は、人為的環境下に慣れ、人のハンドリングにも慣れていることから、卵巣卵の成熟状態も個体間で同調性が高く、ある程度のストレスにも強い。これらのことから、養成親魚を使用した方が、採卵用として適した個体を多数確保でき、良質な受精卵を得ることができる。
【００４８】
コレステロールペレット固形製剤を用いたLHRHaの埋め込み投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導において、LHRHaの埋め込み投与時の親魚は、卵巣卵の卵径が420〜550μmの個体で排卵誘導が可能だが、その中でも卵巣卵の卵径が460〜520μmの個体を使用する方が良い。
【００４９】
卵巣卵の卵径が420μm未満の個体は、LHRHaの埋め込み投与で成熟・排卵が誘導されない未熟な個体で、また420〜460μmの個体は、まだすべての卵がホルモンに対する感受性を持っていないため、成熟・排卵卵数が少ない個体である。
【００５０】
一方、卵巣卵の卵径が550μm以上の個体は、卵巣卵の中に退行卵や排卵卵が多く見られることから、良質な受精卵を得ることが期待できない個体で、また520〜550μmの個体は、卵巣卵の中に退行卵や排卵卵が一部見られ、卵質が悪くなりつつある個体である。これらのことから、採卵に使用する親魚は卵巣卵の卵径が460〜520μmの個体を選定して用いることが望ましい。
【００５１】
マハタ親魚は、人為的環境下において、自然に成熟が進み、6月の産卵後期になると、卵巣卵の一部が排卵した状態となる。このような産卵後期に見られる一部排卵個体では、仮にLHRHaの埋め込み投与を行ったとしても、得られる卵の卵質が安定しない。安定的かつ効率的に良質な受精卵を得たい場合には、当該産卵期において、産卵前期の自然環境下で未だ排卵していない個体を選定して用いることが望ましい。
【００５２】
マハタ親魚の年齢と体重は、雌個体の卵巣が発達する5歳以上、魚体重は2kg以上が良い。その中でも、個体間の成熟が同調し、卵量も多く確保することができる7〜10歳かつ4〜6 kgの個体を選定して用いることが望ましい。
【００５３】
また、コレステロールペレット固形製剤を用いたLHRHaの埋め込み投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導において、LHRHaの埋め込み投与後の採卵は人工授精により行う必要がある。マハタ親魚は、人為的環境下では産卵行動を行わず、仮に雌個体が放卵した場合にも卵は受精しない。水槽内において、完全に自然環境を再現できれば、自然産卵を誘発させることも不可能ではないかもしれないが、現在の親魚養成技術では困難である。これらのことから、マハタ親魚から受精卵を得る場合は、各種ホルモン処理技術を駆使して、人工授精により採卵を行う必要がある。
【００５４】
次に、LHRHaカカオバター油性製剤の注射投与による成熟・排卵誘導法について説明する。
【００５５】
LHRHaカカオバター油性製剤の作製方法は、まず、LHRHaを50％エチルアルコールに溶解させる。
【００５６】
また、カカオバターは、サンプル瓶等の容器に入れ、湯煎（約60℃）により溶解させる。
【００５７】
溶解したカカオバターは40℃程度に冷ました後、すでに作製していたLHRHa溶液と混合、攪拌し、均一化させる。
【００５８】
完成したLHRHaカカオバター油性製剤は、直ちに使用することも可能だが、-20℃以下の冷凍庫にて保存しておくことも可能である。冷凍保管しておいたLHRHaカカオバター油性製剤は、湯煎等により再び溶解させることで使用可能であり、冷凍前と同等の成熟・排卵誘導効果を示す。
【００５９】
LHRHaカカオバター油性製剤は、カカオバターとLHRHaエチルアルコール溶液との質量比が95:5〜70:30のものが考えられるが、その中でも魚体内へ投与後の固形化状況を考慮すると、質量比は90:10が良い。あまりにもLHRHaエチルアルコール溶液の質量比が大きいと魚体内での固形化に時間を要し、予想外のLHRHaの溶出量を示すことが考えられる。
【００６０】
また、LHRHaカカオバター油性製剤の0.1 mlあたりのLHRHa含有量は、マハタ親魚に使用する場合、50〜200μg が考えられるが、その中でも50〜100μgが良い。仮にLHRHaのマハタ親魚への投与量を50μg/kg BWとすると、親魚の体重が6 kgの場合はLHRHaが300μg必要となる。カカオバター0.1 mlあたりのLHRHa含有量が50μgの場合は0.6 ml、100μgの場合は0.3 ml注射投与することとなる。また、仮に、カカオバター0.1 mlあたりのLHRHa含有量を10μgと少なくした場合には、LHRHaカカオバターの注射投与量が3 mlとなり、親魚へのストレスが大きくなる。逆に、カカオバター0.1 mlあたりのLHRHa含有量を600μgと多くした場合には、注射投与量が0.05 mlとなり、油性製剤の取り扱いや正確な注射投与作業が困難となる。もちろん、LHRHaがカカオバター油性製剤から溶出する条件も極端に変わり、期待した徐放量、徐放期間が実現しない可能性がある。
【００６１】
LHRHaカカオバター油性製剤の注射投与には、比較的針穴が大きい18〜21Gの注射針と1〜5 mlのシリンジを使用した注射投与器を使用すると良い。LHRHaカカオバター油性製剤は、17〜23℃で凝固するので速やかに注射投与を行うためには、比較的針穴が大きい注射針を用いないと投与作業中にカカオバターが針穴内で凝固し、投与できなくなる。
【００６２】
LHRHaカカオバター油性製剤の注射投与部分は、マハタ親魚の筋肉内および腹腔内が考えられるが、特に背筋部の肉厚な部分に皮下1〜2cm程度の深さで実施するのが良い。
【００６３】
LHRHaカカオバター油性製剤は、腹腔内にも注射投与可能だが、内臓等を傷つける可能性がある。したがって、よりマハタ親魚へのストレスを軽減し、迅速に注射投与を行うためには、その投与部分は、魚体背筋部の肉厚な部分が適していると考えられる。
【００６４】
LHRHaカカオバター油性製剤の注射投与の際は、まず、マハタ親魚を麻酔後、注射投与を行うが、シリンジ内のカカオバター油性製剤は粘性が高く、筋肉内に浸透しにくいため、魚体の注射部からもれないように注意する。カカオバター油性製剤の注入はゆっくり行い、予定量を注射後は必要であれば指等で抑え、カカオバター油性製剤の逆流を防ぎながら速やかに注射器を引き抜く。
【００６５】
LHRHaカカオバター油性製剤は、注射投与後、マハタ親魚の産卵期成熟水温の17〜23℃で凝固し、魚体内部でLHRHaを長時間持続的に溶出させる徐放性製剤となる。
【００６６】
LHRHaカカオバター油性製剤のマハタ親魚への注射投与回数は1回で十分である。カカオバターが固形化後、LHRHaが高いレベルで溶出し続ける期間は、概ね5日間であるが、マハタ親魚がLHRHaの注射投与により排卵するまでの時間は42〜48時間であるので、1回の注射投与で十分だと考えられる。仮に、1回の注射投与で親魚の排卵が行われなかった場合は、親魚の成熟状態が未熟であった可能性が高い。
【００６７】
カカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導において、マハタ親魚へのLHRHa投与量は、20〜100μg/kg BWが考えられるが、その中でも50μg/kg BWで、安定的かつ効率的に成熟・排卵が誘導でき、良質な受精卵が得られる。
【００６８】
採卵に使用する親魚は、天然由来および養殖由来が考えられるが、安定的かつ効率的に良質な受精卵を得たい場合は、人為的環境下で養殖した養成親魚を使用する方が良い。
【００６９】
自然界に生息するマハタの親魚は貴重で、生息数も少ない。また、産卵期に漁獲できたとしても、その卵巣卵の成熟状態は様々であり、かつ漁獲によるスレやストレス等の悪影響により、それらの個体から良質な受精卵を得ることは非常に困難である。
【００７０】
一方、養殖された養成親魚は、人為的環境下に慣れ、人のハンドリングにも慣れていることから、卵巣卵の成熟状態も個体間で同調性が高く、ある程度のストレスにも強い。これらのことから、養成親魚を使用した方が、採卵用として適した個体を多数確保でき、良質な受精卵を得ることができる。
【００７１】
カカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導において、LHRHaの注射投与時の親魚は、卵巣卵の卵径が420〜550μmの個体で排卵誘導が可能だが、その中でも卵巣卵の卵径が460〜520μmの個体を使用する方が良い。
【００７２】
卵巣卵の卵径が420μm未満の個体は、LHRHaの注射投与で成熟・排卵が誘導されない未熟な個体で、また420〜460μmの個体は、まだすべての卵がホルモンに対する感受性を持っていないため、成熟・排卵卵数が少ない個体である。
【００７３】
一方、卵巣卵の卵径が550μm以上の個体は、卵巣卵の中に退行卵や排卵卵が多く見られることから、良質な受精卵を得ることが期待できない個体で、また520〜550μmの個体は、卵巣卵の中に退行卵や排卵卵が一部見られ、卵質が悪くなりつつある個体である。これらのことから、採卵に使用する親魚は卵巣卵の卵径が460〜520μmの個体を選定して用いることが望ましい。
【００７４】
マハタ親魚は、人為的環境下において、自然に成熟が進み、6月の産卵後期になると、卵巣卵の一部が排卵した状態となる。このような産卵後期に見られる一部排卵個体では、仮にLHRHaの注射投与を行ったとしても、得られる卵の卵質が安定しない。安定的かつ効率的に良質な受精卵を得たい場合には、当該産卵期において、産卵前期の自然環境下で未だ排卵していない個体を選定して用いることが望ましい。
【００７５】
マハタ親魚の年齢と体重は、雌個体の卵巣が発達する5歳以上、魚体重は2 kg以上が良い。その中でも、個体間の成熟が同調し、卵量も多く確保することができる7〜10歳かつ4〜6 kgの個体を選定して用いることが望ましい。
【００７６】
また、カカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導において、LHRHaの注射投与後の採卵は人工授精により行う必要がある。マハタ親魚は、人為的環境下では産卵行動を行わず、仮に雌個体が放卵した場合にも卵は受精しない。水槽内において、完全に自然環境を再現できれば、自然産卵を誘発させることも不可能ではないかもしれないが、現在の親魚養成技術では困難である。これらのことから、マハタ親魚から受精卵を得る場合は、各種ホルモン処理技術を駆使して、人工授精により採卵を行う必要がある。
【００７７】
本発明のマハタ親魚の良質卵確保手法では、LHRHaコレステロールペレット固形製剤の埋め込み投与またはLHRHaカカオバター油性製剤の注射投与により成熟・排卵誘導を行い、人工授精のタイミングは、排卵直後に卵を採取し、直ちに媒精することで、安定的かつ効率的に良質な受精卵を得ることができる。
【００７８】
マハタにおいて、ホルモン処理により得られた卵の卵質は、排卵後の時間の経過とともに低下することが当研究グループの試験研究により明らかとなったことから、ホルモン処理による成熟・排卵誘導後は、親魚の排卵状況を適切な時期に確認し、排卵後は速やかに人工授精を行う必要がある。
【００７９】
さらに、マハタは他の魚種と比較して、排卵後から時間の経過とともに進行する卵質の低下が急速であることから、良質な受精卵を安定的かつ効率的に得るためには、特に本技術が重要となる。
【００８０】
コレステロールペレット固形製剤を用いたLHRHaの埋め込み投与またはカカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導法において、卵巣卵の卵径が420〜550μmの親魚は、LHRHa投与後36〜54時間に排卵が起こるが、その中でもLHRHa投与後42時間に集中する。
【００８１】
コレステロールペレット固形製剤を用いたLHRHaの埋め込み投与またはカカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導法において、LHRHa投与後の最適な人工授精のタイミングは、排卵後0〜6時間であるが、その中でも排卵直後に人工授精を行った方が、より受精率、ふ化率等の卵質が高い受精卵を得ることができる。
【００８２】
したがって、マハタ親魚から良質な受精卵を安定的かつ効率的に確保するためには、LHRHa徐放性製剤投与から42時間経過後に人工授精を行う採卵作業スケジュールを計画すればよい。
【００８３】
つまり、LHRHa徐放性製剤のマハタ親魚への投与作業を16:00に実施するとともに、翌々日の10:00に親魚の腹部の触診と排卵の確認を行い、排卵が確認された親魚については直ちに人工授精を行えばよい。
【００８４】
このように、LHRHa徐放性製剤を用いた成熟・排卵誘導後の人工授精タイミングに配慮することで、ホルモン処理採卵技術の高度化が図られ、安定的かつ効率的にマハタ親魚から良質卵を確保することが可能となる。
【実施例】
【００８５】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は、下記実施例に限定して解釈される意図ではない。
【００８６】
実施例１
マハタ養成親魚を用いた人工授精による採卵における受精率の向上を目的として、LHRHa投与により成熟・排卵を誘導した親魚を用いて、排卵後の経過時間と受精率との関係を調べ、人工授精を行う際の媒精適期の検討を行った。
【００８７】
養成雌親魚11尾に対して、合成黄体形成ホルモン放出ホルモン（LHRHa：des-Gly10,[D-Ala6]-LHRH ethylamide）のコレステロールペレット固形製剤の埋め込み投与を行い、成熟・排卵を誘導した。LHRHaの投与量は50 μg/kg BWとした。LHRHa投与時にカニューラチューブにより卵巣卵を採取し、卵径を測定した結果、供試魚の卵巣卵の卵径は457〜516μmであった。なお、LHRHa徐放性製剤の投与は、実施例１ではコレステロールペレット固形製剤の埋め込み投与で行ったが、これに代えてカカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与でも実施例１の内容に差異は生じない。このため、カカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与による実施例は省略した。
【００８８】
図１に本試験におけるマハタ親魚の最適な人工授精タイミングを検討するための実験スケジュールを示す。親魚はLHRHa投与後12、18、24、30、36、42、48、54時間目に麻酔した後、腹部の触診により排卵の有無を調べた。排卵時間の確認は、供試魚の腹部を圧迫し排卵された卵が生殖口から流出するか否かで行い、排卵卵が流出し始めた時間を排卵直後とした。排卵が確認された個体については、同一個体から排卵直後（0時間と設定）以降、６時間毎にそれぞれ卵を2,000粒前後搾出し、精液を添加して、乾導法により人工授精を行った。
【００８９】
人工授精により得られた卵（約2,000粒）は洗卵を行った後、浮上卵と沈下卵に分離し、浮上卵率（浮上卵数／総卵数）を算出した。受精率は、人工授精４時間後の卵発生が16〜32細胞期（水温20℃）に、浮上卵約100粒のうち発生が進んでいる個体の割合で算出した。ふ化率は、別途浮上卵約200粒を20℃のインキュベーター内の1L容器に収容し、収容卵のうちふ化した個体の割合で算出した。
【００９０】
図２にマハタ親魚のLHRHa投与後の排卵状況を示す。LHRHa投与後、最も早く排卵が確認できた時間は、36時間経過後であり11個体中1個体で排卵が確認された。その後、42時間後では8個体、48時間後では1個体、54時間後では1個体で排卵が確認された。このように、マハタ親魚ではLHRHa投与から42時間後に排卵が集中することが確認された。
【００９１】
図３にマハタ親魚のLHRHa投与後の卵径の変化を示す。排卵はLHRHa投与から42時間後に11個体中8個体で集中しており、その場合の卵径は30〜42時間にかけて急激な増大が認められた。
【００９２】
図４に個体別にモニタ−した排卵後経過時間と受精率との関係を示す。各個体の排卵直後の受精率は平均88.2％（74.3〜100％）と非常に高く、６時間後においても平均68.0％と高い値を示した。しかし、その後、受精率は排卵後経過時間に伴い急激に低下し、排卵後12時間目には28.9％、18時間目には12.3％となった。供試魚すべての個体で、排卵後経過時間に伴い受精率が低下するという現象が確認された。
【００９３】
図５に個体別にモニタ−した排卵後経過時間とふ化率との関係を示す。各個体の排卵直後の卵から調査したふ化率は、平均68.2％（29.5〜98.2％）と非常に高い値を示した。しかし、その後、ふ化率は排卵後経過時間に伴い急激に低下し、排卵後12時間目には0.9％となった。これらの結果から、排卵直後の卵でないと高いふ化率は望めないことが確認された。
【００９４】
図６に11個体の平均浮上卵率、平均受精率および平均ふ化率の変化を示した。浮上卵率、受精率、ふ化率ともに排卵直後が高く、その後は時間の経過とともに低下した。特に、ふ化率は12時間目で急激に低下し、0.9％の値を示した。このことから、排卵から6時間以内に人工授精を行わないと良質な受精卵を確保できないことが明らかとなった。
【００９５】
以上の結果から、マハタの人工授精卵の受精率は、卵が排卵されてからの経過時間、即ち、卵巣腔内滞留時間に依存していることが明らかとなった。即ち、排卵後６時間以内に媒精を行った場合、平均68.0％以上の高い受精率を示したが、その後受精率は急速に低下し、排卵後24時間を経過すると10％以下となった。浮上卵率、ふ化率においても同様で、それらの値は排卵直後が最も高く、その後時間の経過に伴って低下した。実際の種苗生産現場で人工授精を行う際、得られる卵の浮上卵率、受精率およびふ化率を考慮すると、排卵直後に人工授精を行うことが望ましく、遅くとも６時間以内には行う必要があることが判明した。
【００９６】
このことから、事業としてマハタの人工授精を行う場合、いかに排卵時刻を予測し、速やかに受精させることが、良質卵を効率的に得るための決め手となる。マハタは、LHRHa投与後42時間目に大部分の個体で排卵が集中していたことから、その時間に排卵の確認作業を行い、排卵が確認された個体では、速やかに人工授精を実施することにより、高い受精率、ふ化率を示す良質な受精卵を安定的に確保できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明は、マハタ親魚からの採卵技術の高度化および本種の人工種苗の安定生産を可能とし、水産業における増養殖分野（養殖業および栽培漁業）において、貢献度が極めて高い。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】マハタ親魚の最適な人工授精タイミングを検討するための実験スケジュールを示す図である。
【図２】マハタ親魚のLHRHa投与後の排卵状況を示す図である。
【図３】マハタ親魚のLHRHa投与後の卵径の変化を示す図である。
【図４】マハタ親魚の排卵後経過時間と受精率との関係を示す図である。
【図５】マハタ親魚の排卵後経過時間とふ化率との関係を示す図である。
【図６】マハタ親魚の人工授精における排卵後経過時間と卵質（浮上卵率、受精率、ふ化率）との関係を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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