(57)【要約】      （修正有）【課題】移し替えによる汚染のおそれがなく、確実に細胞を採取できる細胞培養遠心分離管の提供。【解決手段】分離管２と、分離管２の上部開口部を封止する栓体１とを含み、栓体１には開口部が設けられ、この開口部を覆うように培養ガスの透過が可能な不織布が設けられ、また、分離管２の内壁面には、少なくとも一つの邪魔板５が設けられ、また、邪魔板５は、分離管２と一体成形されていることを特徴とする細胞培養遠心分離管。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離管と、前記分離管の上部開口部を封止する栓体とを含み、
前記栓体には開口部が設けられ、前記開口部を覆うように培養ガスの透過が可能な不織布が設けられていることを特徴とする細胞培養遠心分離管。
【請求項２】
前記分離管の内壁面には、少なくとも一つの邪魔板が設けられている請求項１に記載の細胞培養遠心分離管。
【請求項３】
前記邪魔板は、前記分離管と一体成形されている請求項１または２に記載の細胞培養遠心分離管。
【請求項４】
前記分離管の内部壁面はプラズマ処理されている請求項１ないし３のいずれかに記載の細胞培養遠心分離管。
【請求項５】
前記栓体と前記分離管は脱着可能である請求項１ないし４のいずれかに記載の細胞培養遠心分離管。
【請求項６】
前記分離管の底部には、少なくとも一つのねじれ板が設けられている請求項１ないし５のいずれかに記載の細胞培養遠心分離管。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養遠心分離管に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に細胞の培養操作は、細胞懸濁液の調製、培養ガス雰囲気下での細胞培養、培養容器内の培地交換、等の操作を経た後に、必要に応じて培養容器に分配する継代操作を繰り返す。
上記操作により必要とする細胞数まで増殖させた細胞を用いて、細胞の産出するバイオリアクターの回収、または増殖した細胞の医薬への利用、更に大腸菌、酵母、培養細胞などの生きた細胞を利用した蛋白質の合成等の目的に使用される。
【０００３】
上記培養操作において、シャーレ、フラスコ、ローラーボトル等の培養用容器と、遠沈管と呼ばれる遠心分離用容器が適宜使い分けられており、例えば、遠心分離用の容器を用いて所定の濃度の細胞懸濁液を調製した後に、培養用の容器に細胞懸濁液を移し替えて、培養に適した温度・培養ガス雰囲気下において培養操作を行う。
【０００４】
また、継代操作やバイオリアクターの回収、更に合成した蛋白質の回収の際には培養用の容器から遠心分離用の容器に移し替えて遠心分離操作を行う。
培養容器に必須な性能は主に培養ガス交換性であり、一方遠心分離管には遠心分離をおこなう為のチューブ形状および遠心強度が必要になる為、各々の容器を使い分けているが、それぞれの容器に移し替える際に発生する汚染への注意が作業上大きな労力となっている（例えば特許文献１）。
【０００５】
移し替えの作業は、一般的にクリーンベンチ内でピペットを用いて人の手で行っているが、訓練を受けた作業者がバクテリアやウイルスの混入、更には目的によってはエンドトキシン、ケラチン、ＤＮＡ分解酵素等の混入に対しても細心の注意を払い、時間を掛けて作業を行う必要がある。
そのため、移し替えの作業に時間が掛かる事により細胞がダメージを受け、採取できる細胞数が減少するという問題も発生することがあった。
また、細心の注意を払って作業を行ったとしても、場合によっては汚染を起こし、以降の操作に影響を与える事があった。  
【特許文献１】特開２０００−１５７２６１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、移し替えによる汚染のおそれがなく、確実に細胞を採取できる細胞培養遠心分離管を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の細胞培養遠心分離管は、分離管と、前記分離管の上部開口部を封止する栓体とを含み、前記栓体には開口部が設けられ、前記開口部を覆うように培養ガスの透過が可能な不織布が設けられていることを特徴とする。
【０００８】
本発明によれば、栓体開口部がありその開口部を覆うように不織布が設けられていることにより、培養容器に移し替えることなく細胞培養遠心分離管に細胞培養液などを入れたまま培養を行なうことができ、遠心分離管であるとともに培養管としての機能も有している。また、培養管から遠心分離管への移し替えがないので培養液への汚染を防ぐことができる。さらに、培養が終わったのちは、そのまま細胞を分離する遠心分離管として使うことが可能である。
【０００９】
また、前記分離管の内壁面には、少なくとも一つの邪魔板が設けられている構成としてもよい。これにより、液を撹拌するときに効率のよい撹拌が可能となる。さらに、振とう機を用いて、培養液を振とう培養するとき、邪魔板により液内に乱流を発生させることが可能となり効率の良い培養を行なうことができる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、移し替えによる汚染のおそれがなく、確実に細胞を採取できる細胞培養遠心分離管を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。なお、すべての図面において、共通する構成要素には同一符号を付し、以下の説明において詳細な説明を適宜省略する。      
【００１２】
本実施形態に係る細胞培養遠心分離管は、図１に示すように、分離管（２）と、分離管（２）の上部開口部を封止する栓体（１）とを含み（図１）、  栓体（１）には開口部（７）が設けられ（図２（ａ））、開口部（７）を覆うように培養ガスの透過が可能な不織布（４）が設けられている（図２（ａ））。ここで、図２（ａ）は、図１におけるＡＡ’断面図、図２（ｂ）は、図１におけるＢＢ’断面図である。
【００１３】
栓体（１）に設けた不織布（４）の目的は、培養ガスの交換を行いながら、かつウィルスやバクテリア等の混入を防ぐ事にある。そのために、不織布（４）の透気度はＪＩＳＰ８１１７に基づく透気度が１秒／１００ｃｃ以上、５００秒／１００ｃｃ以下であることが好ましい。また製造後の品質保持を考慮する場合は、不織布（４）のバクテリアバリア性（ＡＳＴＭ  Ｆ１６０８−９５）が３年以上のものを用いることが好ましい。不織布（４）の材質は特に限定するものではなく、セルロース系材料の他に、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエーテルスルホン、ナイロン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン等から選択する事が出来る。これらの中で、放射線滅菌に対する安定性、更に耐水性、耐薬品性を考慮するとポリエチレン製の不織布（４）が特に好ましい。
【００１４】
また不織布（４）の厚みは、前記透気度を満たしていれば特に限定するものではないが、５０μｍ以上、５００μｍ以下の範囲であれば取り扱い性に優れ、かつ充分な強度を得ることが出来るため好ましい。培養ガスの透過が可能な不織布（４）の面積は、実質的に不織布（４）を透過したガスが培地中に細胞の培養に必要充分な量が供給される大きさであれば良く、培地１ｍｌあたり０．００１ｃｍ２以上有していると安定した培養ができるため好ましく、培地１ｍｌあたり０．００４ｃｍ２以上、０．０７ｃｍ２以下であれば、更に充分なガス透過性が得られ安定した培養が可能となる上に、培養時の振とうの際栓体（１）に飛散した培地が不織布（４）に接触する危険を低減出来るためさらに好ましい。
【００１５】
栓体（１）と不織布（４）の接合方法については隙間無く且つ培養期間中外れる事のない強度で接合されている必要があり、挟み込み、または熱・超音波・高周波等の溶着を利用する事ができる。
その中でも超音波・高周波による溶着手段が確実性および強度の点において好ましい。  栓体（１）の材質は特に限定するものではないが、強度や成形性、取り扱い性、価格、耐放射線（滅菌）性などの点において樹脂製が好ましく、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリスチレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ポリカーボネート樹脂等を選択することが出来る。栓体（１）にポリエチレン樹脂を用い、ポリエチレン製の不織布（４）を用いる事で溶着による接合をおこなった場合、特に接合部分の確実性および強度に優れるため、特に好ましい。
【００１６】
また細胞懸濁液の添加や、培地を交換する為に栓体（１）と分離管（２）が任意に勘合または着脱可能であることが好ましく、ネジ機構（６）による接合が、分離管（２）と栓体（１）を締めた際の確実性の点において特に好ましい（図３）。
【００１７】
本実施形態の細胞培養遠心分離管の内壁面には、少なくとも一つの邪魔板（５）が設けられていることが好ましい（図１、図２（ｂ））。これは、細胞培養遠心分離管を用いて培養をおこなう場合、インキュベーター等の培養器の中で本発明の細胞培養遠心分離管を振とう機に設置して振とうさせながら培養をおこなう。
その際、分離管（２）内部に設けた邪魔板（５）により分離管（２）内部の培養液が効率的に攪拌されることで、不織布（４）を透過した培養ガスによる培養液中のガス交換がおこなわれると同時に、容器内の培養液の成分を均一にすることが出来る点も本発明の重要な特長の一つである。
更に、懸濁培養等、細胞が浮遊した状態で培養をおこなう場合には、細胞自体も培養液中に均一に分散するため安定した培養が可能となる。邪魔板（５）の形状は特に限定するものではないが、ピペット操作や遠心した細胞の回収操作を妨げない形状であることが好ましく、分離管（２）および分離管底部（３）に沿った形状のものや（図３、図４）、分離管底部（３）中央部に突起状にねじれ板（８）（図５（ａ），（ｂ））を設ける事もできる。さらに、邪魔板（５）を分離管底部（３）から、放射状に複数枚設けることでさらに攪拌効率を高める事も可能である（図７）。
また、分離管（２）の中央部と分離管底部（３）の複数の箇所の壁面に邪魔板（５）を設ける事で、撹拌効率をさらに高めること可能である（図６）。
【００１８】
分離管（２）の材質は特に限定するものではないが、栓体（１）同様の理由に加えて、接着細胞用の表面処理が容易な点において樹脂製が好ましく、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリスチレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ポリカーボネート樹脂、ＴＰＸ樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂等を選択することが出来る。
透明性と遠心強度を考慮すると、ポリプロピレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリスチレン樹脂が特に好ましい。
また、プラズマ処理やコロナ処理により容器内壁面に親水性を付与する事で、接着性の細胞培養にも好適に使用することが出来る。
【００１９】
分離管（２）の形状は特に限定するものではないが、チューブ形状が遠心分離効率の点で好ましく、更に底面がコニカル（円錐）またはラウンド（半球）形状であればより効率的に遠心分離した細胞を容器の一箇所に集める事が出来るため特に好ましい。
分離管（２）の容量は培養のスケールに応じて任意に選択する事が出来るが、１０ｍｌ以上、２５０ｍｌ以下の範囲であれば取り扱い性が特に優れるため好ましい。
１０ｍｌ以上、１００ｍｌ以下の範囲であれば既存の一般的な遠心分離機および振とう機に適合させる事が容易であるため特に好ましい。
【００２０】
また、邪魔板（５）は、分離管（２）と一体成形されていることが好ましい。これにより、分離管を形成する際同一工程で可能となるためより効率よく安価に細胞培養遠心分離管を提供することが可能となる。
【００２１】
本発明の細胞培養遠心分離管は滅菌されている事が好ましく、滅菌の方法としてはオートクレーブ、乾熱滅菌、ガス滅菌、放射線滅菌、等を使用することが出来る。
細胞に影響を与える残留ガスの問題がなく、大量処理が可能な点において放射線滅菌が好ましい。
【００２２】
本願発明を用いて培養可能な細胞は特に限定されるものではなく、一般的な癌化細胞の他に、蛋白質合成を目的とした大腸菌等の菌類や酵母、又は再生医療や抗体医療を目的とした生体細胞にも有効に使用することが出来る。
特に、今後大きな進展が期待されるヒト細胞を利用した再生医療や抗体医薬の分野においては、汚染の防止と作業の効率化が重要な課題であり、本願発明の細胞培養遠心分離管を有効に用いる事が出来る。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を実施例および比較例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２４】
（実施例１）
樹脂材料としてポリプロピレン樹脂（住友ノーブレン社製、ＷＰ７０８）を用いて射出成形により図１に示す形状の分離管（２）と一体に邪魔板（５）を有する容量５０ｍｌのチューブを成形した。
チューブの形状は、高さ１１５ｍｍ、外径３０ｍｍ、容量５０ｍｌのＶ底で、邪魔板（５）の形状は長さ５０ｍｍ×高さ５ｍｍであった。
更に、樹脂材料としてポリエチレン樹脂（日本ポリオレフィン社製、ＫＭ５９０Ｌ）を用いて射出成形により図１に示す形状の栓体（１）を成形した。
栓体（１）の形状は、高さ１５ｍｍ、外径３５ｍｍ、で中央部に直径１０ｍｍの開口部（７）を有していた。
栓体（１）の前記開口部（７）に不織布（旭・デュポン社製、タイベック  １０５９Ｂ、厚み１７０μｍ、透気度２２秒／１００ｃｃ）を超音波溶着で接合し、培養ガスの透過が可能な不織布（４）の面積が０．７９ｃｍ２（３０ｍｌの培地を添加した場合、１ｍｌあたり０．０２６ｃｍ２）である栓体（１）を得た。
上記のチューブと栓体（１）を組み合わせた状態で、γ線１０ｋＧｙで滅菌したものを実施例１とした。
【００２５】
（実施例２）
樹脂材料としてポリスチレン樹脂（ＰＳジャパン社製  ＨＦ７７）用いて射出成形でチューブ分離管（２）を成形した後、５分間の酸素プラズマ処理を行い表面にぬれ性を付与した以外は実施例１と同一の条件で作製したものを実施例２とした
【００２６】
（比較例１）
樹脂材料としてポリプロピレン樹脂（住友ノーブレン社製、ＷＰ７０８）を用いて射出成形により実施例１で示したチューブから邪魔板（５）を取り去った形のチューブを成形した。
チューブの形状は、高さ１１５ｍｍ、外径３０ｍｍ、容量５０ｍｌのＶ底で、邪魔板（５）を有していない形状である。
更に、樹脂材料としてポリエチレン樹脂（日本ポリオレフィン社製、ＫＭ５９０Ｌ）を用いて射出成形により実施例１に示した形状の栓体（１）から開口部（７）をなくした形の栓体（１）を成形した。
栓体（１）の形状は、高さ１５ｍｍ、外径３５ｍｍ、で中央部には開口部（７）を有していない形状である。
上記のチューブと栓体（１）を組み合わせた状態で、γ線１０ｋＧｙで滅菌したものを比較例１とした。
【００２７】
（比較例２）
実施例１と同一の邪魔板（５）を有する形状のチューブに、比較例１と同一の開口部（７）を有しない栓体を組み合わせた状態で、γ線１０ｋＧｙで滅菌したものを比較例２とした。
【００２８】
試験例
肝芽細胞腫ヘパブラストーマ（ＨｅｐＧ２）細胞を、ウシ胎児血清１０％を添加したダルベッコ改変イーグル培地で１×１０４ｃｅｌｌ／ｍｌに調整し、実施例１、実施例２、比較例１、比較例２で製造した遠心分離管にそれぞれ３０ｍｌづつ分注し、それぞれの栓体（１）を閉めた後に３７℃湿度９９％の炭酸ガスインキュベーター内で、振とう機（東京理科機械製  ＭＵＬＴＩ  ＳＨＡＫＥＲ  ＭＭＳ）を用いて１７０ｒｐｍで振とうさせた状態で６日間培養を行った。尚、６日間の培養の間、培地交換は２回行った。
培養終了後インキュベーターから取り出したそれぞれの遠心分離管を１０００ｒｐｍ、５分間で遠心を行った後に遠心分離管の中の細胞を全て回収し、細胞数を測定した。その結果を表１に示す。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
表１から明らかなように、実施例１、実施例２で製造した本発明の細胞培養遠心分離管は良好な細胞増殖性を示した。
また、培養後の細胞の状態は実施例１では、培地中に幾つもの細胞凝集塊が分散した状態で増殖しており、培養用の表面処理を施した実施例２においては培地中の凝集塊に加えて、チューブ壁面に細胞が敷石状に接着、重層した状態で増殖していた。
一方比較例においては殆どの細胞が死滅しており、栓体（１）の不織布（４）でガス交換が行われていた比較例２においては生存細胞が確認されたが、培地中のガス交換が充分に行われなかった為、増殖しなかったものと考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明は、細胞培養操作と遠心分離操作を行う際の容器の移し替えが不要な細胞培養遠心分離管に関するものであり、汚染の危険が無く、細胞懸濁液の調製、培養容器内の培地交換、継代操作、更にはバイオリアクターの回収等の操作を安全かつ迅速に行うことが出来ることから、一般的な細胞培養研究用途及び、蛋白質合成を目的とした大腸菌等の菌類や酵母、又は再生医療や抗体医療を目的とした生体細胞の培養、更にヒト細胞を利用した再生医療や抗体医薬の分野において有効に使用することが出来る。
【符号の説明】
【００３２】
１  栓体
２  分離管
３  分離管底部
４  不織布
５  邪魔板
６  ネジ
７  開口部
８  ねじれ板    
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明の培養時の状態を示す細胞培養遠心分離管の斜視図である。
【図２】栓体の開口部と分離管の邪魔板を示す断面図である。
【図３】分離管のネジ機構を示す斜視図である。
【図４】邪魔板の他の実施形態を示す斜視図である。
【図５】邪魔板の他の実施形態を示す斜視図である。
【図６】邪魔板の他の実施形態を示す斜視図である。
【図７】邪魔板の他の実施形態を示す斜視図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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