(57)【要約】【課題】少量の液体でも枯渇することを防止する。【解決手段】側面と底面との間に内周に沿って、内側に向かって凸である段差部を有する容器である。上記段差部の高さと、上記段差部により囲まれる底面の面積とから算出される容量が１００〜２００μｌであることが好ましい。また、上記段差部の高さは１〜２mmであることが好ましい。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
側面と底面との間に内周に沿って、内側に向かって凸である段差部を有する容器。
【請求項２】
上記段差部の高さと、上記段差部により囲まれる底面の面積とから算出される容量が１００〜２００μｌであることを特徴とする請求項１記載の容器。
【請求項３】
上記段差部の高さは１〜２mmであることを特徴とする請求項１記載の容器。
【請求項４】
上記底面には、生体関連物質が固定化されていることを特徴とする請求項１記載の容器。
【請求項５】
上記底面には、生体関連物質を固定化した基材を載置することができることを特徴とする請求項１記載の容器。
【請求項６】
請求項１乃至５いずれか一項記載の容器を複数並列してなるプレート。
【請求項７】
マイクロタイタープレートの寸法に合致する支持部材に複数並列して載置することができる請求項６記載のプレート。
【請求項８】
請求項１乃至５いずれか一項記載の容器の内部に溶液を注入し、
当該溶液を上記生体関連物質固定化基材又は底面に固定化された生体関連物質に接触させる溶液処理方法。
【請求項９】
上記容液は１００〜２００μｌであることを特徴とする請求項８記載の溶液処理方法。
【請求項１０】
上記溶液は所定の生体関連物質に特異的に結合しうる被検物質を含有することを特徴とする請求項８記載の溶液処理方法。
【請求項１１】
上記溶液は洗浄液であることを特徴とする請求項８記載の溶液処理方法。
【請求項１２】
上記容器内部の溶液を攪拌することを特徴とする請求項８記載の溶液処理方法。
【請求項１３】
上記溶液は核酸増幅用溶液であり、上記容器内部で核酸増幅反応を行うことを特徴とする請求項８記載の溶液処理方法。
【請求項１４】
上記核酸増幅反応の後、上記容器内でハイブリダイゼーション反応を行うことを特徴とする請求項１３記載の溶液処理方法。
【請求項１５】
上記生体関連物質は核酸プローブであり、当該核酸プローブを用いたソリッドフェイス核酸増幅反応を行うことを特徴とする請求項８記載の溶液処理方法。
【請求項１６】
上記溶液は核酸、抗原及びタンパク質から選ばれる少なくとも１種を含む溶液であることを特徴とする請求項８記載の溶液処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体を注入することができる容器、及び当該容器内に液体を注入して内部でDNAチップ等に液体を接触させる液体処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、遺伝子解析等の手段のひとつとしてDNAチップが用いられている。DNAチップとは、多数のcDNA断片や合成オリゴヌクレオチドを固相表面に整列・固定させたものであって、生化学的、分子生物学的、遺伝子工学的研究あるいは医療検査等で一度に多数の微量試料を処理し、その結果を分光学的に迅速・簡便にできるものとして、近年注目されている。
【０００３】
DNAチップを用いた分析には、被検物質を含む溶液をDNAチップに接触させる工程が含まれる。従来の方法ではスライドガラス状のDNAチップ上にカバーガラスを載せ、その隙間に溶液を注入させた後、乾燥防止のため密封した加湿容器に入れてハイブリダイゼーション反応させていた。また、複数の試料の反応を同時に行えるウェルプレート型DNAチップを用いた分析方法も知られている。ウェルプレート型DNAチップでは、各DNAチップに対応するウェル内に溶液を入れ、蓋をしてハイブリダイゼーション反応させる。
【０００４】
また、DNAチップを用いた分析方法には、上記ハイブリダイゼーション反応の工程の後DNAチップの表面を洗浄する工程が含まれる。スライドガラス型のDNAチップを使用する場合には、DNAチップ全体を洗浄液の入った容器に入れて洗浄する。一方、ウェルプレート型DNAチップでは洗浄液をウェル内に注入して洗浄を行う。
【０００５】
このように、ウェルプレート型のDNAチップ等の生体関連物質固定化基板を用いた分析方法においては、所定の液体と当該基板とを接触させる工程が含まれている。この工程を実施する際には基板の底面全体に亘って液体を接触させることが必要である。このためには容器の側面に対する表面張力を考慮した量の溶液を注入しなければならない。液量が少ないと容器の底面の中央付近において液体が枯渇する虞がある。特に底面積が広い場合溶液の枯渇の可能性が高くなり、少量の溶液での反応を行うことができず、多量の溶液が必要となり、必要な試薬量の増加から来るコスト増加や、測定対象物質濃度の低下による測定感度の低下などの問題が発生する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、上述したような実状に鑑み、少量の液体でも枯渇することを防止できる容器及び当該容器を用いた液体処理方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述した目的を達成した本発明は以下を包含する。
（１）側面と底面との間に内周に沿って、内側に向かって凸である段差部を有する容器。
【０００８】
（２）上記段差部の高さと、上記段差部により囲まれる底面の面積とから算出される容量が１００〜２００μｌであることを特徴とする（１）記載の容器。
【０００９】
（３）上記段差部の高さは１〜２mmであることを特徴とする（１）記載の容器。
（４）上記底面には、生体関連物質が固定化されていることを特徴とする（１）記載の容器。
【００１０】
（５）上記底面には、生体関連物質を固定化した基材を載置することができることを特徴とする（１）記載の容器。
【００１１】
（６）上記（１）乃至（５）いずれかに記載の容器を複数並列してなるプレート。
（７）マイクロタイタープレートの寸法に合致する支持部材に複数並列して載置することができる（６）記載のプレート。
【００１２】
（８）上記（１）乃至（５）いずれかに記載の容器の内部に液体を注入し、当該液体を上記生体関連物質固定化基材又は底面に固定化された生体関連物質に接触させる液体処理方法。
【００１３】
（９）上記容液は１００〜２００μｌであることを特徴とする（８）記載の液体処理方法。
【００１４】
（１０）上記液体は所定の生体関連物質に特異的に結合しうる被検物質を含有することを特徴とする（８）記載の液体処理方法。
【００１５】
（１１）上記液体は洗浄液であることを特徴とする（８）記載の液体処理方法。
（１２）上記容器内部の液体を攪拌することを特徴とする（８）記載の液体処理方法。
【００１６】
（１３）上記液体は核酸増幅用溶液であり、上記容器内部で核酸増幅反応を行うことを特徴とする（８）記載の液体処理方法。
【００１７】
（１４）上記核酸増幅反応の後、上記容器内でハイブリダイゼーション反応を行うことを特徴とする（１３）記載の液体処理方法。
【００１８】
（１５）上記生体関連物質は核酸プローブであり、当該核酸プローブを用いたソリッドフェイス核酸増幅反応を行うことを特徴とする（８）記載の液体処理方法。
【００１９】
（１６）上記液体は核酸、抗原及びタンパク質から選ばれる少なくとも１種を含む溶液であることを特徴とする（８）記載の液体処理方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、少量の液体を枯渇することなく、底面或いは基材に固定化された生体関連物質に対して十分に接触させることができる容器を提供することができる。また、本発明によれば、少量の液体を枯渇することなく、底面或いは基材に固定化された生体関連物質に対して十分に接触させることができる複数の容器を備えるプレートを提供することができる。さらに、本発明によれば、少量の液体を枯渇することなく、底面或いは基材に固定化された生体関連物質に対して十分に接触させることができる液体処理方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明をより詳細に説明する。
図１及び図２に示すように、本発明に係る容器１は、側面２と底面３との間に内周に沿って、内側に向かって凸である段差部４を有している。なお、容器１は、図１及び図２に示すように複数個併設してもよいが、単独で構成してもよい。なお、本明細書において、複数の容器１を有する部材をプレート５と称する。すなわち、本発明を適用したプレート５は、複数の容器１を有している。また、プレート５は、方向性を示すマーク６を有している。
【００２２】
段差部４の高さは、容器１に注入する液体の量により規定される。すなわち、容器１に注入する液体量が１００〜２００μlである場合、段差部４の高さと、段差部４により囲まれる底面３の面積とから算出される容量が１００〜２００μｌとなるように、段差部４の高さを規定する。例えば、段差部４により囲まれる底面３の面積が約２００mm2である場合には、段差部４の高さを、例えば１〜２mm程度とする。ここで、段差部の高さとは、底面３から段差部４の上面までの距離を意味する。
【００２３】
図１及び２に示した容器１において、段座部４は側面２及び底面３とともに一体的に形成されている。しかしながら、段差部４は、図３に示すように、側面２及び底面３とは異なる部材として形成されても良い。
【００２４】
容器１において、底面３には生体関連物質が固定化されていても良い。生体関連物質を底面３に固定化した容器１は、所定の物質を検出するためのチップとして使用することができる。また、容器１は、底面３に生体関連物質を固定化せず、生体関連物質を基材に固定化した生体関連物質固定化基材を底面３に載置して使用することもできる。
【００２５】
複数の容器１を有するプレート５は、マイクロタイタープレートの寸法に合致する支持部材に複数並列して載置することができる形状及び寸法とすることが好ましい。例えば、図１及び２に示す容器を用いた時には、図４に示すように、６枚のプレート５を並列して支持部材７に載置することによって、マイクロタイタープレートの規格と一致することとなる。
【００２６】
本発明において「生体関連物質」とは、核酸、タンパク質、糖類及び他の抗原性化合物を挙げることができる。ここで核酸とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びＰＮＡを含む意味である。また、核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。ここでタンパク質としては、抗体、Fabフラグメント及びF(ab')2フラグメントのような抗体の抗原結合性断片、並びに種々の抗原を挙げることができる。ここで糖類としては、多糖類が好ましく、種々の抗原を挙げることができる。また、「生体関連物質」には、タンパク質や糖類以外の抗原性を有する物質も含まれる。生体関連物質は、市販のものでもよく、また、生細胞などから得られたものでもよい。
【００２７】
「生体関連物質」として、核酸を使用する場合には長さが１０塩基から１００塩基までのオリゴ核酸を使用することが好ましい。オリゴ核酸は、DNA合成装置により容易に人工的に合成することができる。また、オリゴ核酸の末端にはアミノ基修飾等を施しても良い。オリゴ核酸の末端にアミノ基修飾を行うことによって、基材表面への固定化が容易となる。また、オリゴ核酸の長さを２０〜１００塩基とすることによって、検出対象の核酸分子とオリゴ核酸とのハイブリダイゼーションの安定性を保持することができる。
【００２８】
本発明において「基材」とは、上述の生体関連物質を固定化した平板状の基材或いは容器１における底面３を意味する。基材は、ガラス、樹脂、シリコン、セラミック、カーボン或いは金属から作製することができる。樹脂としては、例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂及びメラミン樹脂等を使用することができる。カーボンとしては、グラファイト、ダイヤモンド、アモルファスカーボン及びカーボンナノチューブ等を使用することができる。金属としては、例えば、鉄、ステンレス、アルミニウム、チタン、金、銀、銅、ニッケル、クロム、タングステン、モリブデン等を使用することができる。
【００２９】
なお、基板は、無色透明であっても良いが、生体関連物質と被検物質との相互作用を測定する蛍光、発色、発光などの測定手法や使用する装置に応じて、透明（蛍光、発色用）、黒色（蛍光用）、白色（発色、発光用）など選択可能である。
【００３０】
基材の厚さは、特に限定されないが、通常０．１ｍｍ〜２０ｍｍ程度であるが、好ましくは０．１ｍｍ〜２０ｍｍ程度である。基材の両主面或いは一主面に如何なる表面処理を施したものであっても良い。表面処理としては、特に限定されず、以下を例示することができる。例えば、基材の表面処理としては、例えば、アルカリ、酸などで対象の表面を処理する方法、温中で超音波処理する方法、酸素プラズマを照射する方法、アルゴンプラズマを照射する方法、放射線を照射する方法を挙げられ、これらの方法を単独或いは適宜組み合わせて使用することができる。
【００３１】
また、生体関連物質を基材に固定化する方法は、特に限定されず、公知の方法を適宜使用することができる。例えば、生体関連物質として核酸を使用する場合、核酸の一末端に官能基を導入し、当該官能基を基材表面と化学的に結合させる。すなわち、当該官能基を介して核酸を基材に固定化することができる。さらに、基材の一主面をビオチン若しくはアビチン修飾し、生体関連物質である核酸の一末端をアビチン若しくはビオチン修飾して、アビチン・ビオチン相互作用を解して核酸を基材の一主面に固定化することができる。さらにまた、基材の一主面をエチレンジアミン等のリンカーと反応させて、さらにこのリンカーと核酸とを反応させ固定化することもできる。
【００３２】
一方、生体関連物質を固定化した基材は、生体関連物質を固定した後、適当な処理を施したものであっても良い。例えば、熱処理、アルカリ処理、界面活性剤処理などを行うことにより、固定された生体関連物質を変性させることもできる。
【００３３】
以上のように構成された生体関連物質を固定化した基材は、生体関連物質に対する被検物質の相互作用を検出する際に、当該生体関連物質が固定化された基材の一主面に被検物質を含有する溶液が供給される。すなわち、被検物質を含有する溶液を容器１内部に注入する。当該溶液と基板との接触状態を所定の時間（核酸同士のハイブリダイゼーションの場合には例えば１２〜２４時間）維持した後、生体関連物質と相互作用しなかった被検物質を基板の一主面から除去する。その後、場合によっては洗浄液を容器１に注入し、所定の時間洗浄する。スキャナー等によって被検物質に結合した標識物質を検出することによって、生体関連物質と被検物質との相互作用を検出することができる。
【００３４】
本発明において被検物質としては、生体関連物質に対して選択的に相互作用する物質であれば特に限定されず、生体関連物質の種類に応じてあらゆる物質を含む意味である。具体的には、DNA、RNA及びPNA等の核酸、抗原や抗体等のタンパク質、糖鎖、その他の高分子化合物、及び低分子化合物を挙げることができる。さらに、被検物質としては、例えば、測定すべき核酸、例えば、病原菌やウイルス等の遺伝子や、遺伝病の原因遺伝子等並びにその一部分、抗原性を有する各種生体成分、病原菌やウイルス等に対する抗体等を挙げることができる。また、これらの被検物質を含む溶液としては、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、各種組織液等の体液や、各種飲食物並びにそれらの希釈物等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、被検物質として核酸を対象とする場合には、血液や細胞から常法により抽出した核酸を標識してもよいし、該核酸を鋳型として、PCR等の核酸増幅法によって増幅したものであってもよい。後者の場合には、測定感度を大幅に向上させることが可能である。
【００３５】
核酸増幅産物を被検物質とする場合には、蛍光物質等で標識したヌクレオチド三リン酸の存在下で増幅を行うことにより、増幅後の核酸を標識することが可能である。また、被検物質が抗原又は抗体の場合には、被検物質である抗原や抗体を常法により直接標識してもよいし、被検物質である抗原又は抗体を生体関連物質と結合させた後、生体関連物質を固定化した基材を洗浄し、該抗原又は抗体と抗原抗体反応する標識した抗体又は抗原を反応させ、当該基材に結合した標識を測定することもできる。
【００３６】
生体関連物質と被検物質とを相互作用させる工程は、従来と全く同様に行うことができる。反応温度及び時間は、ハイブリダイズさせる核酸の鎖長や、免疫反応に関与する抗原及び／又は抗体の種類等に応じて適宜選択されるが、核酸のハイブリダイゼーションの場合、通常、５０℃〜７０℃程度で１分間〜十数時間、免疫反応の場合には、通常、室温〜４０℃程度で１分間〜数時間程度である。
【００３７】
また、このとき容器内部の溶液を攪拌することで、生体関連物質と被検物質との相互作用反応の効率を向上させることができる。容器内部の溶液を攪拌する手法としては、特に限定されないが、例えば、シェーカー等の攪拌手段を適宜使用することができる。
【００３８】
なお、本発明に係る容器を使用することによって、容器内部でPCR法などの核酸増幅反応を行うことができる。この場合には、容器内部に注入する液体としては、DNAポリメラーゼ、塩基及び緩衝液等を含む核酸増幅用溶液を使用する。また、容器の底面に、生体関連物質として核酸プローブを固定した場合には、いわゆるソリッドフェイスPCRを行うこともできる。容器内部で核酸増幅反応を行う場合には、核酸増幅反応の後、当該容器内でハイブリダイゼーション反応を行うことも可能である。
【００３９】
以上のように、生体関連物質を固定化した基材に対して、被検物質を含有する溶液や洗浄液等の液体試料を接触させる場合には、容器１内に当該液体試料を注入する。本発明においては、図５（ａ）に模式的に示すように、注入された液体試料が段差部４により底面３を完全に覆うことができる。これに対して、従来の容器においては、図５（ｂ）に模式的に示すように、注入された液体試料は、表面張力によって側面近傍と比較して底面中央近傍において液体の高さが低くなる。図５（ｂ）に示す溶液を使用した場合には、底面中央近傍において液体試料の接触が不十分になる虞や底面中央近傍において液体試料が枯渇する虞が生じる。また、この不都合を回避するためには、過剰量の液体試料が必要となり、経済的に不利である。
【００４０】
これに対して、図５（ａ）に示すように、本発明に係る容器１を使用した場合には、このような不都合を確実に回避することができ、少量の液量であっても液体試料を十分に接触させることができ、且つ、底面３中央近傍における液体試料の枯渇を回避することができる。したがって、本発明に係る容器１を使用した場合には、液体試料が少量であっても上記問題が生じず、経済的に有利な実験系を構築することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本発明を適用した容器を有するプレートの上面図である。
【図２】本発明を適用した容器を有するプレートの断面図である。
【図３】本発明を適用した他の容器を有するプレートの断面図である。
【図４】複数のプレートを載置した状態を示す上面図である。
【図５】（ａ）本発明を適用した容器に液体試料を注入した状態を模式的に示す要部断面図であり、（ｂ）従来の容器に液体試料を注入した状態を模式的に示す要部断面図である。
【符号の説明】
【００４２】
１…容器、２…側面、３…底面、４…段差部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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