(57)【要約】【課題】  カロテノイド類の生産ができる細菌を用いて、カロテノイド類中のアスタキサンチンなどの各カロテノイド化合物の生成割合を制御する方法および、特定比率のカロテノイド化合物を安定して生産する製造方法を提供する。【解決手段】  カロテノイド類を生産する微生物の培養によりアスタキサンチン、アドニキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノンおよびβ−カロテンからなる群より選ばれるいずれか一種または複数種を生産する方法において、培地中アンモニア濃度の調節によりカロテノイド類の生成割合を調節するカロテノイド類の製造方法を用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カロテノイド類を生産する微生物の培養によりアスタキサンチン、アドニキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノンおよびβ−カロテンからなる群より選ばれるいずれか一種または複数種を生産する方法において、培地中アンモニア濃度の調節によりカロテノイド類の生成割合を調節することを特徴とするカロテノイド類の製造方法。
【請求項２】
カロテノイド類を生産する微生物を、培地中のアンモニア濃度を０．８ｇ／Ｌ未満で培養し、得られる培養物からカロテノイド類を採取することでアスタキサンチン組成比が３０％以上のカロテノイド類を採取することを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
カロテノイド類を生産する微生物が、細菌であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
微生物が、パラコッカス属細菌であることを特徴とする請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
パラコッカス属細菌が、パラコッカス属細菌Ｎ−８１１０６株の変異株であることを特徴とする請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
パラコッカス属細菌が、Ｎ−８１１０６株に対し自然突然変異または変異原物質や紫外線等による人為的操作で誘発して得られる変異株であることを特徴とする請求項４に記載のカロテノイド類の製造方法。
【請求項７】
パラコッカス属細菌が、ＴＳＮ１８Ｅ７株（受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４６）であることを特徴とする請求項４に記載のカロテノイド類の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂溶性色素であるカロテノイド類、特にアスタキサンチンを製造する方法に関するものであり、アスタキサンチンは養殖サケ・マス・マダイの色揚げ剤や鶏卵の色調改善剤、健康補助食品、医薬品として有用な化合物である。
【背景技術】
【０００２】
アスタキサンチンはβ‐カロテンやリコペンなどで知られるカロテノイド色素の一種で、海藻やカニ、エビなど甲殻類、マダイ、サケ、マスなどの魚類、フラミンゴなどの鳥類、高等植物に至るまで、幅広く自然界に存在していることが知られている。近年、アスタキサンチンはサケやマス、マダイ等の養殖魚の色揚げ剤や鶏卵の色調改善剤として需要が増加しているだけでなく、ビタミンＡ前駆物質（プロビタミンＡ）効果、活性酸素に対する抗酸化活性が注目され、化粧品や健康補助食品としてにわかに脚光を浴びている。
【０００３】
これまでアスタキサンチンは化学合成品、天然物からの抽出品、微生物による醗酵生産品などが流通している。主に価格要因から化学合成品が養魚飼料市場をほぼ独占しているが、化学合成品は原料に臭素および塩素を含むハロゲン系化合物や重金属類を使用するため（例えば特許文献１参照）安全性の懸念から採卵鶏やブロイラー飼料への添加は認められていない。
【０００４】
天然物抽出品であるオキアミ抽出法は、含量が低く、採取、抽出、精製に多大な労力を要し、コスト高である。
【０００５】
醗酵生産法においても、酵母ではファフィア・ロドチーマ（Ｐｈａｆｆｉａ  ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）（例えば、非特許文献１参照）、藻類ではヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）（例えば、非特許文献２参照）が利用されているがどちらもコスト高である。ファフィア酵母は培養日数が長い、細胞壁の破壊が困難であるため抽出効率が低い、含量が少ないことが問題であり、ヘマトコッカス藻類は培養日数が長い、光を必要とするため立地条件や設備に制約がある、クロロフィルなどの夾雑物の除去が必要であることが問題となっている。
【０００６】
海洋細菌であるアグロバクテリウム・アウランティカムを用いたカロテノイド合成は横山らの報告がある（例えば、非特許文献３参照）。細菌は藻類や酵母に比べて一般的に増殖が速く、また細胞壁が脆弱であり、藻類とことなりクロロフィルなどのカロテノイド以外の色素を含まず、酵母のように副生成物の多糖類を生産しないという利点があるためである。当該発明によればアスタキサンチンを含有した菌体が迅速に得られ、さらに菌体を回収した後、アセトンなどの有機溶媒と菌体を混和・攪拌するだけで容易にアスタキサンチンを抽出できるという利点がある。なお、この微生物は後に１６ＳリボゾーマルＲＮＡ遺伝子の配列解析等の分類のための分析が進められた結果、パラコッカス属細菌と再同定された。海洋バイオテクノロジー研究所においてＭＢＩＣ０１１４３としても公開され（例えば非特許文献４参照）、その諸性質に関する情報の概略は国立遺伝学研究所日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ、例えば非特許文献５参照）や米国ＮＩＨのデーターベース（ＮＣＢＩ、例えば非特許文献６参照）に公開されている。
【０００７】
彼らは液量や振とう条件を変えることでカロテノイド成分がことなることが見出している（例えば、非特許文献７参照）。我々は前述の問題点を解決するため当該細菌に注目した。
【０００８】
当該細菌を用いて醗酵槽を用いて工業的なカロテノイド種の生産を行う場合、醗酵温度、ｐＨ、酸素濃度、栄養源の濃度管理が必要と考えられる。
【０００９】
たとえば横山らはカロテノイドの種の生産比率は醗酵培地の酸素濃度によって変動すると推定している。当該文献では培養中の酸素供給量を変えることにより、アスタキサンチンだけでなく、β−カロテン、エキネノン、β−クリプトキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、カンタキサンチン、３’−ヒドロキシエキネノン、ゼアキサンチン、アドニルビン（フェニコキサンチンとも称される）、アドニキサンチン、ｃｉｓ−アドニキサンチン等の多様なカロテノイドが異なる比率で生産された知見に基づく。彼らはこの知見に基づき、β−カロテンからアスタキサンチンに至る生合成経路を推測した。これは細菌のもつケト化酵素と水酸化酵素の酵素活性が培養諸条件により変わることが原因と考えられる。
【００１０】
なお、Ｆｒａｓｅｒらにより（例えば、非特許文献８参照）、当該細菌からβ−カロテンからアスタキサンチンを合成する酵素の遺伝子、ｃｒｔＷおよびｃｒｔＺが見出され、さらに大腸菌にクローニングして製造された両酵素の性質が解析された。その結果によれば、これらはそれぞれβ−カロテンの３および３’位にケト基を導入する酵素、および４および４’位に水産基を導入する酵素である。この発見に基づき、アスタキサンチンの生合成経路として主に二つの経路があることが提唱された。すなわち、まずリコペンから環化酵素の働きによりβ−カロテンが生成され、次いで経路が分岐して、１）β−カロテンにｃｒｔＺが優先して作用してβ−クリプトキサンチンを経てゼアキサンチンが第一に生産され、次いでｃｒｔＷが作用してアドニキサンチン（４−ケトゼアキサンチンとも称される）を経てアスタキサンチンが生産される経路と、２）ｃｒｔＷが優先して作用してエキネノンを経てカンタキサンチンが第一に生産され、次いでｃｒｔＺが作用してフェニコキサンチンを経てアスタキサンチンに至る経路の、二つの経路の存在である。またゼアキサンチンにｃｒｔＷを作用させるとアドニキサンチンには速やかに変換されるが、最後の一段階の水酸化が十分に進まずアドニキサンチンが蓄積することが報告されている。一方、カンタキサンチンにｃｒｔＺを作用させると良好にアスタキサンチンが生産されることも報告されている。なお本明細書では、これらをリコペンからアスタキサンチンに至るアスタキサンチン生合成経路上に存在するカロテノイドと称し、これらの混合物またはこれらの混合物を含有する物をカロテノイド組成物と称する。
【００１１】
また、別の細菌による培養法において酸素濃度制御によりカロテノイド種の生産量が制御された例もある（例えば、特許文献２参照）。しかしながらアンモニア濃度でカロテノイド生産比率を制御した例は見られない。
【００１２】
アンモニアは微生物の培養において窒素源として一般的に利用される。微生物菌体を構成する主要元素は主に炭素、窒素、水素、酸素であるが、その炭素及び生育のためのエネルギーの供給源となる培地成分を炭素源、窒素の供給源となるものを窒素源と称する。このうち炭素源の濃度が高濃度であると微生物の生育や目的物生産を阻害することは知られており、流加培養と呼ばれる方法で低濃度に維持される。流加培養とは栄養源が微生物に消費された量を補給しながら培養する方法である。このとき培地の様々な指標に連動して流加が行われる。
【００１３】
醗酵培地のｐＨを指標とする自動流加としては山根がグルコース、コーンスティープリカー、脱脂大豆粉末、酵母エキス無機塩を流加する方法を紹介している（例えば、非特許文献９参照）。
【００１４】
アンモニアでｐＨをコントロールする例としてはＰ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙら（例えば、非特許文献１０参照）の方法が知られている。
【００１５】
しかしながらアンモニアの濃度と微生物の増殖や物質生産との係わり合いは一般的には知られておらず、当該文献においてもアンモニアの具体的濃度や二次代謝産物の生産に関する言及は見当たらない。
【００１６】
【特許文献１】米国特許第４２８３５５９号明細書
【特許文献２】特開２００１−３５２９９５号公報
【非特許文献１】Ａｎｄｒｅｗｅｓ，Ａ．Ｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １５，  １００３，  １９７６年
【非特許文献２】Ｒｅｎｓｔｒｏｍ，Ｂ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２０，  ２５６１，  １９８１年
【非特許文献３】Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ａ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ５８，  １８４２，  １９９４年
【非特許文献４】インターネット（海洋バイオテクノロジー研究所ホームページ）、株式会社  海洋バイオテクノロジー研究所、ＭＢＩＣ（菌株コレクションデータベース）、［ｏｎｌｉｎｅ］、掲載年月日不明、９ページ目の「ｃａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ」、「ｓｔｒａｉｎ  ｎａｍｅ」及び「１６ｓ」の項、  ［平成１７年６月８日検索］、インターネット：＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｃｏｄ．ｍｂｉｏ．ｃｏ．ｊｐ／ｍｂｉｈｐ／ｊ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ＞
【非特許文献５】インターネット（国立遺伝学研究所ホームページ）大学共同利用機関法人  情報・システム研究機構  国立遺伝学研究所  日本ＤＮＡデータバンク、”ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ”、［ｏｎｌｉｎｅ］、２００２年１０月８日、３ページ目の「ＯＲＩＧＩＮ」の項、［平成１７年６月８日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ＞
【非特許文献６】インターネット（米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈホームページ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、［ｏｎｌｉｎｅ］、２００２年１０月８日、４頁目の「Ｓｏｕｒｃｅ  ｏｒｉｇｉｎｅ」および「Ｆｅａｔｕｒｅｓ」の項、［２００５年１０月１８日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／＞
【非特許文献７】Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ａ  ＆  Ｍｉｋｉ，Ｗ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ，  １２８，  １３９，  １９９５年
【非特許文献８】Ｆｒａｓｅｒ，Ｐ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，６１２８，１９９７年
【非特許文献９】山根恒夫、「生物反応工学」、生物反応工学産業図書、ｐ．２２１，  １９８０年
【非特許文献１０】Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ，  Ａ．  Ｗｈｉｔａｋｅｒ、「発酵工学の基礎」，学会出版センター、ｐｐ１６０−１６１  １９８８年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
パラコッカス属細菌を用いた醗酵生産では複数のカロテノイド化合物、すなわち先述するアスタキサンチン合成系路上のカロテノイド類、特にアスタキサンチン、アドニキサンチン，カンタキサンチン、エキネノン、β−カロテンを同時に生成し、しかもそれらの生成割合が培養毎に変動し、安定した比率で色素を生成させることが困難であった。このため、生成した色素混合物を動物飼料等に色調改善剤として使用する際の色調効果にばらつきを生じ，商業的生産に対する障害となっていた。従って一定の比率のカロテノイド化合物を安定して生産する製造方法が求められていた。
【００１８】
本発明はこのような実状に鑑みなされたものであり、その目的は、カロテノイド類の生産ができる細菌を用いて、カロテノイド類中のアスタキサンチンなどの各カロテノイド化合物の生成割合を制御する方法を提供するものであり、また本発明は、特定比率のカロテノイド化合物を安定して生産する製造方法を提供することにもその目的がある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく種々検討した結果、アンモニア濃度を制御することによりカロテノイド化合物の生成割合を制御できることを見出した。
【００２０】
すなわち培養液へのアンモニア供給をｐＨに連動して濃度制御すると、０〜０．８ｇ／Ｌ以下のアンモニア濃度で制御するとアスタキサンチン組成比の高いカロテノイドが生産され、０．８ｇ／Ｌ以上でフェニコキサンチン、カンタキサンチン、およびエキネノン組成比の高いカロテノイドが生産されることを見出し、本発明に到達した。
【００２１】
すなわち本発明は、カロテノイド生産菌を、０．８ｇ／Ｌを境にアンモニア濃度を制御しながら培養することによりカロテノイド種を作り分け、特に０．８ｇ／Ｌ未満で培養することによりアスタキサンチン含量の高いカロテノイド混合物を生産させ、その菌体または又は培養液から目的とするカロテノイドを回収することを特徴とするカロテノイドの製造法である。ここで、培地中のアンモニア濃度を０．８ｇ／Ｌ未満で培養する際、アンモニアの消費速度と供給速度が一致する場合はアンモニア濃度が０ｇ／Ｌとなることがある。
【００２２】
従って本発明は、カロテノイド類を生産する微生物の培養によるリコペンからアスタキサンチンに至るアスタキサンチン生合成経路上に存在するカロテノイド類の製造法において、培地中アンモニア濃度の調節によりカロテノイド類の生成割合を調節するカロテノイド類の製造方法である。
【００２３】
また本発明は、カロテノイド類を生産する微生物を、培地中のアンモニア濃度を０．８ｇ／Ｌ未満で培養し、得られる培養物からカロテノイド類を採取することでアスタキサンチン組成比が３０％以上のカロテノイド類を採取するカロテノイド類の製造方法である。
【００２４】
また本発明は、カロテノイド類を生産する微生物が、細菌であり、さらにパラコッカス属細菌であり、特にパラコッカス属細菌Ｎ−８１１０６株の変異株であるカロテノイド類の製造方法である。
【００２５】
また本発明は、カロテノイド類を生産する微生物が、Ｎ−８１１０６株に対し自然突然変異または変異原物質や紫外線等による人為的操作で誘発して得られる変異株であるカロテノイド類の製造方法である。
【００２６】
本発明に用いる細菌としてはカロテノイド生産性のものであれば特に限定はないが、例えばパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属細菌を用いることができ、中でもＮ−８１１０６（独立行政法人特許生物寄託センターへの受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０２３）やその改変株が好ましく用いられる。この微生物は当初、アグロバクテリウム・アウランティアカム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ  ｓｐ．  ｎｏｖと同定・報告されたが（非特許文献７）、後に１６ＳリボゾーマルＲＮＡ遺伝子の配列解析が行われた結果、パラコッカス属細菌と再同定された。海洋バイオテクノロジー研究所においてＭＢＩＣ０１１４３としても登録され、その諸性質に関する情報の概略は国立遺伝学研究所日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）や米国ＮＩＨのデーターベース（ＮＣＢＩ）より入手することができる。変異株として例えばＴＳＮ１８Ｅ７株（独立行政法人特許生物寄託センターへの受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４６）の様な変異株（例えば、特開２００５−５８２１６号公報参照）を挙げることができる。
【００２７】
本発明に用いる培養液としては、カロテノイド生産菌が増殖しカロテノイドを生産し得るものであればいずれを使用してもよく、例えば炭素源には廃糖蜜、グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、デンプン、乳糖、グリセロール、酢酸、窒素源にはコーンスティープリカー、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕等の天然成分やグルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン等のアミノ酸が、無機塩にはリン酸１ナトリウム、リン酸２ナトリウム、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム等のリン酸塩や塩化ナトリウムなどが、金属イオンには、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、塩化第一鉄、塩化第二鉄、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム、硫酸カルシウムなどが、ビタミン類として酵母エキスやビオチン、ニコチン酸、値アミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシン等が利用できる。
【００２８】
本発明では、カロテノイド生産菌を０．８ｇ／Ｌ未満のアンモニアが存在する培養液で培養することによりフェニコキサンチン、カンタキサンチンおよびエキネノンの蓄積を抑制し、アスタキサンチンの生産量を増加させることが出来る。培養液のアンモニア濃度の測定法に特に限定はなく、ネスラー試薬を用いる方法やグルタミン酸脱水素酵素によるＮＡＤＨの酸化により測定する方法などが用いられるが、アンモニア電極を用いる方法は簡便であり好ましく用いられる。例えば堀場製アンモニア電極（５００２Ａ形）を用いてアンモニア濃度を測定することができる。
【００２９】
培養初期のアンモニア濃度が０．８ｇ／Ｌ以上のときはｐＨを水酸化ナトリウム水溶液で調節し、アンモニア濃度が０．８ｇ／Ｌ未満となるとｐＨに連動してアンモニアを培地へ流加すればよい。
【００３０】
それ以外の培養条件に関しては、カロテノイド生産菌が増殖し、カロテノイドを生産し得るものであれば特に限定はないが、例えば培養温度は１５〜４０℃が好ましく、ｐＨは６〜９が好ましく、培養時間は２４〜１６８時間が好ましい。
【００３１】
なお、効率的にカロテノイドを製造するには、培養の初期にはアンモニア濃度が上述のものより高い濃度で培養し菌体を増加させ、その後上述の範囲のアンモニア濃度の培養液で培養することが好ましい。また、本発明においてはアンモニア濃度の測定値が０であっても、アンモニアの供給速度と微生物による消費速度が一致している場合は培養を良好に行うことができる。アンモニアの供給速度が不足した場合は微生物の代謝状態に変調をきたし、培養液ｐＨの上昇、溶存酸素濃度の上昇、排気ガス中の酸素濃度の上昇や炭酸ガス濃度の減少などとして現れるので、容易に見分けることが可能である。この様な場合にはアンモニアや硫安などのアンモニウム塩を添加して、本発明の濃度範囲に再設定することで良好に培養を継続することができる。
【００３２】
本発明におけるカロテノイドの定量方法は、菌体または培養液から安定に効率よく抽出し定量できれば特に限定はなく、例えば抽出溶媒としてメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジクロロメタン、クロロフォルム、ジメチルフォルムアミド、ジメチルスルフォキシド、酢酸エチル等が用いられる。抽出されたカロテノイドの定量には、各種カロテノイドが分離され、定量性に優れる高速液体クロマトグラフィーにより行うことが好ましいが、比色定量などで行うこともできる。
【００３３】
カロテノイドの回収方法にも特に限定はないが、菌体を回収してそのまま、或いは乾燥して使用することができるし、定量の方法として述べたものと同様の方法で抽出して使用することもできる。抽出液をそのまま用いることも可能であり、さらに精製して使用することもできる。またこれらの菌体、抽出物或いは精製物を、それぞれ単独で用いることもでき、これらを任意の割合で混合して用いることもでき、また他の任意の物質と混合して用いることもできる。
【００３４】
本発明で製造されるカロテノイドとしては、例えばアスタキサンチン、アドニキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、β―カロテン等があげられる。特にこれらの混合物の製造においてアスタキサンチン含量が高い混合物を、安定に生産することが本法により可能となる。
【発明の効果】
【００３５】
本発明によれば、培養液のアンモニア濃度を制御することにより、アスタキサンチン等のカロテノイド化合物の生成割合を制御し、組成比の安定したカロテノイドを生産することが可能になる。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお本発明は、これらの実施例のみに限定されるものではなく、発明の要旨を逸脱しない範囲で、任意に変更が可能であることは言うまでもない。
【００３７】
（カロテノイドの定量法）
カロテノイドの定量法は逆送カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにて測定し、以下の操作手順で行った。すなわち培養液１ｍＬを遠心分離して菌体を回収し、２０μＬの純水を加えチューブミキサーにて１０分間懸濁させる。ついで５００μＬのジメチルホルムアミド、５００μＬのアセトンを加えてチューブミキサーで１時間攪拌後、１４０００回転５分間遠心分離を行い、上清を回収し、一部を高速液体クロマトグラフィー（ＴＳＫ−ｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名）、東ソー（株）製を使用）にて生成したカロテノイドを定量した。なお、アスタキサンチンの分離はＡ溶媒として純水とメチルアルコールの５対９５の混合溶媒、Ｂ溶媒としてメチルアルコールとテトラヒドロフランの７対３の混合溶媒を用い、１ｍＬ／ｍｉｎの流速でＡ溶媒を５分間カラムに通過させた後、同じ流速でＡからＢへ５分間の直線濃度勾配を行ない、さらにＢ溶媒を５分間通過させることによった。アスタキサンチンの定量は４７０ｎｍの吸光度により行ない、既知濃度のアスタキサンチン試薬（シグマ社製）の溶液との吸光度の比較により行なった。
【００３８】
実施例１
アスタキサンチン組成比の高いカロテノイド組成物の製造法
表１に示す培地３００ｍＬ入りの５００ｍｌ容バッフル付き三角フラスコに表２のストック液をいれ、次いでＴＳＮ１８Ｅ７株（独立行政法人特許生物寄託センターへの受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４６）を植菌し、２５℃、１００ｒｐｍで１日間振盪培養を行なった培養液を前々培養液とした。表３に示した組成の培地１００ｍｌを５００ｍｌ容の三角フラスコにいれ１２１℃、２０分間で滅菌後、表４のストック液をいれ前々培養液３ｍｌを植菌し、前培養液とした。
【００３９】
表５に示した培地  を５Ｌ容醗酵槽にいれ１２１℃、２０分間滅菌後、あらかじめ滅菌しておいた表６の栄養源と１５０ｍＬの前培養液を植菌した。
【００４０】
培養条件は温度２２℃、攪拌数３００回転、ｐＨ７．０〜７．２、通気は空気にて１ＶＶＭで制御し、１２０時間培養した。ｐＨの調整には培養８時間後までは２Ｍ−水酸化ナトリウム水溶液を使用し、その後ｐＨに連動して１４％アンモニアを培地へ供給した。グルコースはＹＳＩ社製グルコースセンサー（２７００ＳＥＬＥＣＴ）を用いて測定し、５０％グルコース水溶液を適宜追加した。
【００４１】
培養終了後のカロテノイド含量を表９にアンモニアの時間推移を図１に示す。生産されたカロテノイドのうち、アスタキサンチンは５８％であり、その他にアドニキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、およびエキネノンが検出された。すなわち、アンモニアを０．８ｇ／Ｌ未満で制御するとアスタキサンチンの生成割合を高めることができた。
【００４２】
【表１】
2007244205.tif 000002
【００４３】
【表２】
2007244205.tif 000003
【００４４】
【表３】
2007244205.tif 000004
【００４５】
【表４】
2007244205.tif 000005
【００４６】
【表５】
2007244205.tif 000006
【００４７】
【表６】
2007244205.tif 000007
比較例１
アスタキサンチン組成比の低いカロテノイド組成物の製造法
前培養液は実施例１と同様に作成した。表７に示した培地を５Ｌ容醗酵槽にいれ１２１℃、２０分間滅菌後、あらかじめ滅菌しておいた表８の栄養源と１５０ｍＬの前培養液を植菌した。培養条件はアンモニア濃度を１ｇ／Ｌとしたことを除き、実施例１と同様とし１４０時間培養した。
【００４８】
培養終了後のカロテノイド含量を表９にアンモニアの時間推移を図１に示す。アンモニアは約２０時間目付近に一時的に０．７ｇ／Ｌ付近にまで低下したが、４０時間目より修正して０．８ｇ／Ｌ以上とした。その結果、アスタキサンチン生産量は全カロテノイドの約２０％にまで低下し、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノンの生成割合が６７％に高まった。
【００４９】
【表７】
2007244205.tif 000008
【００５０】
【表８】
2007244205.tif 000009
【００５１】
【表９】
2007244205.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】本発明による培養においての培養時間と生成するアンモニア濃度の推移を示す図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は培養時間（単位は時間）を示し、Ｙ軸（縦軸）は生成するアンモニア濃度（単位はｇ／Ｌ）であり、●は実施例１を、□は比較例１を、それぞれ表す。
【図１】
2007244205.tif 000011