(57)【要約】【課題】  本発明は、本発明は、膵β細胞で構成的に発現され血液中に分泌されるレポーター遺伝子を作成し、トランスジーンとして種々のレシピエント細胞に導入して、膵β細胞を簡便に計測する方法を提供することを課題とする。【解決手段】  上記課題を解決する手段として、本発明はシグナル配列を含むヒトアルブミン遺伝子とヒトＣ−ペプチドとを融合させた人工レポーター遺伝子及び本レポーター遺伝子を組み込んだベクター、並びに本ベクターがコードする人工タンパク質を提供する。レシピエント細胞が分泌するこの人工タンパク質を計測することによって、膵β細胞量を推測することが可能となる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵β細胞特異的に、且つ構成的に発現され、調節を受けずに分泌されることを特徴とする人工タンパク質。
【請求項２】
ヒトアルブミン遺伝子のシグナル配列にヒトインスリン遺伝子のＣ−ペプチド又はルシフェラーゼを融合させた物質である請求項１に記載の人工タンパク質。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の人工タンパク質をコードしたレポーター遺伝子。
【請求項４】
膵β細胞特異的に発現するためのプロモーター配列を有することを特徴とする請求項３に記載のレポーター遺伝子。
【請求項５】
前記プロモーター配列がインスリンＩ遺伝子のプロモーター配列である請求項４に記載のレポーター遺伝子。
【請求項６】
種々の生理条件下でも、発現量が変化しないことを特徴とする請求項３乃至５のいずれかの項に記載のレポーター遺伝子。
【請求項７】
請求項３乃至６のいずれかの項に記載のレポーター遺伝子を組み込んだベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターがプラスミドまたはウイルスであることを特徴とするベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のウイルスがレトロウイルスであるベクター。
【請求項１０】
請求項７乃至９のいずれかの項に記載のベクターを用い、請求項３乃至６のいずれか１項に記載のレポーター遺伝子をゲノム内に組み込んだモデル動物であって、前記レポーター遺伝子がコードする人工タンパク質を、膵β細胞特異的にかつ構成的に発現することを可能とした、モデル動物。
【請求項１１】
請求項１又は２に記載の人工タンパク質を測定することを特徴とする膵β細胞量の計測方法。
【請求項１２】
膵β細胞特異的にかつ構成的に発現され、調節を受けずに分泌されることを特徴とする、人工タンパク質の発現量または血中濃度、及び前記タンパク質をコードしたレポーター遺伝子の発現量を計測することを特徴とする、膵β細胞量の定量法。
【請求項１３】
請求項１０又は１２に記載の膵β細胞量の定量法を用いた、膵β細胞を増加させる効果を持つ物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵臓に存在するβ細胞量の定量に関するものであり、詳しくは、膵β細胞で特異的にかつ構成的に発現され、調節を受けずに分泌されるレポータータンパク質を用い、その血中濃度等を測定することにより、生体内においてβ細胞量を定量的に推定するモデルを提供するものである。
【０００２】
本出願において「遺伝子」とは、ｍＲＮＡとして転写される配列に加え、その上流及び下流に位置し前記ｍＲＮＡの転写調節に関与している配列を含んだ塩基配列全体、と定義する。また本出願において、膵臓β細胞は、膵β細胞またはβ細胞と略す。
【背景技術】
【０００３】
膵臓β細胞の量的変化を計測することは、糖尿病の発症予知や発症後の経過観察に対して有用であるが、生体内における測定は非常に困難であり、その方法も限定されている（特許文献１，２、非特許文献１）。
【０００４】
インスリン分泌障害は、１型のみならず２型糖尿病の発症要因の一つとしても必須のものである。２型糖尿病では、インスリン抵抗性が同時に存在しうるが、インスリン分泌の亢進による代償が破綻してはじめて糖尿病を発症すると考えられる。
【０００５】
インスリン分泌障害には２つの要素が考えられる。すなわち、β細胞機能の質的障害と、β細胞量の不足である。１型糖尿病はβ細胞量の減少によって発症する。２型糖尿病においてはこれら２つの要素がどの程度の比率で関与するかは明らかでないが、β細胞の質的障害（ブドウ糖応答性の障害）に加え、代償的に肥大または過形成する能力の障害も含めたβ細胞量も発症に影響を持つことは疑いない。また、β細胞量は糖尿病発症後も１次的、２次的に減少することが知られている。
【０００６】
この様に、β細胞量の変化は糖尿病発症の予知や発症後の経過観察に有用であるが、実際には、これまでのところ動物モデルにおいてさえその測定は極めて困難である。直接的には膵摘出標本での組織学的検査が可能ではあるが、生体に行うことは難しい。従って、生体では定常状態または各種刺激下（例えば、グルカゴン刺激）でのインスリン分泌量等からβ細胞量を推測することが、現時点で取り得る数少ない方法である（特許文献３）。
【特許文献１】特許３６３１７６４号  哺乳動物の膵細胞の分化状態を試験する新規な方法
【特許文献２】特表２００２−５３２０８８  肝臓細胞および膵臓細胞に共通の幹細胞／前駆細胞を同定するための動物モデル
【特許文献３】特開２００４−１５４１３６  β細胞機能不全改善薬の評価方法
【非特許文献１】Ｍｏｏｒｅ  Ａ，Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ  Ｓ，Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ  Ｒ．（２００１）  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０（１０）：２２３１−２２３６．
【非特許文献２】Ｔａｎｉｚａｗａ  Ｙ，Ｏｈｔａ  Ｙ，Ｎｏｍｉｙａｍａ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４２（７）：８８７−８９１．
【非特許文献３】Ｉｎｏｕｅ  Ｈ，Ｔａｎｉｚａｗａ  Ｙ，Ｗａｓｓｏｎ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０（２）：１４３−１４８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の現状に鑑み、本発明者らは、糖尿病の発症機構に着目して研究を進め、ＭＯＤＹ（ｍａｔｕｒｉｔｙ  ｏｎｓｅｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｏｕｎｇ）の幾つかのタイプが膵β細胞に発現する転写因子の異常により発症することから、それらの一部ではインスリン分泌障害が関係することを示した（非特許文献２）。また本発明者らは、膵臓ランゲルハンス島からβ細胞が選択的に消失し、インスリン依存状態の糖尿病を発症する「Ｗｏｌｆｒａｍ症候群」の原因遺伝子「ＷＦＳ１」を世界に先駆けて同定し、その病態モデルとなるＷＦＳ１ノックアウトマウスを作成し、糖尿病の発症機序について研究を進めてきている（非特許文献３）。
【０００８】
これらの研究過程で、本発明者らは、膵β細胞量の変化を簡便に測定できる系の必要性と有用性に着目した。ここで重要なのは、β細胞量を増加させることは糖尿病の治療や予防の一手段となりうるが、この様な作用を持つ薬物や成長因子などの開発、スクリーニングには、簡便なβ細胞量の評価法が必須であるということである。すなわち本発明は、膵β細胞で構成的に発現され血液中に分泌される人工レポーター遺伝子を作成し、トランスジーンとして種々のレシピエント細胞に導入して、膵β細胞を簡便に計測する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、膵β細胞で特異的にかつ構成的に発現され、調節を受けずに分泌されるレポータータンパク質（及びそれをコードする遺伝子）、および前記タンパク質を用い、その血中濃度等を測定することにより、生体内においてβ細胞量を定量的に推定するモデルを提供することを目的とする。
【００１０】
すなわち本発明の第１の態様は、膵β細胞で特異的に且つ構成的に発現され、調節を受けずに分泌することを特徴とする人工タンパク質を提供することにある。
【００１１】
本発明の第２の態様は、第１の発明に緒稀有人工タンパク質としてヒトアルブミン遺伝子のシグナル配列にヒトインスリン遺伝子のＣ−ペプチド又はルシフェラーゼを融合させた物質を提供するにある。
【００１２】
本発明の第３の態様は、上記第１の態様、第２の態様における膵β細胞で特異的にかつ構成的に発現され、調節を受けずに分泌される人工タンパク質をコードしたレポーター遺伝子を提供する。膵β細胞特異的に発現するためのプロモーター配列を有することを特徴とする、レポーター遺伝子を提供する。
【００１３】
本発明の第４の態様は、第３の態様において膵β細胞特異的に発言するためのプロモーター配列を有するレポーター遺伝子を提供する。
【００１４】
本発明の第５の態様は、前記プロモーター配列がインスリンＩ遺伝子のプロモーター配列であるレポーター遺伝子を提供する。
【００１５】
本発明の第６の態様は、前記レポーター遺伝子により発現される人工タンパク質が、種々の生理条件下でも、発現量が変化しないことを特徴とするレポーター遺伝子を提供する。
【００１６】
本発明の第７の態様は、前記第３乃至第６の態様として示したレポーター遺伝子を組み込んだベクターを提供する。
【００１７】
本発明の第８の態様は、前記第７の態様において、ベクターとしてプラスミドまたはウイルスを用いられることを特徴とするベクターを提供する。
【００１８】
更に、本発明の第９の態様は、第８の態様におけるウイルスとしてレトロウイルスをベクターとすることを特徴とする発明である。
【００１９】
本発明の第１１の態様は、前記第７の態様乃至第９の態様のいずれかによるレポーター遺伝子をゲノム内に組み込んだモデル動物であって、前記レポーター遺伝子がコードする人工タンパク質を、膵β細胞で特異的にかつ構成的に発現することを可能としたモデル動物を提供する。
【００２０】
本発明の第１０の態様は、前記第１の態様又は第２の態様、すなわち膵β細胞で特異的にかつ構成的に発現され、調節を受けずに分泌されることを特徴とする、人工タンパク質を測定することを特徴とする膵β緒細胞量の計測である方法。
【００２１】
本発明の第１２の態様は、膵β細胞で特異的にかつ構成的に発現され、調節を受けずに分泌されることを特徴とする、人工タンパク質の発現量または血中濃度、及び前記タンパク質をコードしたレポーター遺伝子の発現量を計測することを特徴とする、膵β細胞量の定量法を提供する。
【００２２】
本発明の第１３の態様は、前記第１０の態様、又は第１２の態様における膵β細胞量の定量法を用いた、膵β細胞を増加させる効果を持つ物質のスクリーニング方法を提供する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明を利用した非侵襲的膵β細胞量定量法は、糖尿病発症、進展の病態の解明や発症予知のみならず、膵β細胞の減少を阻止する様な薬剤療法や再生医療の開発に寄与するものと期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下に本発明の実施の形態を詳述する。本発明の第1の態様は、膵β細胞で特異的に且つ構成的に発現され、調節を受けずに分泌されることを特徴とする人工タンパク質（レポーター分子）を提供する。本発明者らは、膵β細胞量の非侵襲的な計測を目的とし、膵β細胞で合成されるレポーター分子を用い、この濃度を測定することで、生体内において膵β細胞量が推定できるシステムを開発した。本発明のレポーター分子に必要とされる条件としては、（１）レポーター分子の発現が膵β細胞特異的である。（２）発現が構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）で、種々の条件下でも発現調節を受けない。（３）分子が構成的に血中に分泌される。（４）分泌されたレポーター分子は比較的安定で、且つ生理活性を持たない。（５）レポーター分子の血中濃度測定が容易である。の５点が挙げられる。
【００２５】
本発明の第２から第６の態様においては、膵β細胞で特異的にかつ構成的に発現され、調節を受けずに分泌されることを特徴とする、人工タンパク質をコードしたレポーター遺伝子が提供される。ここでいうレポーター遺伝子は、膵β細胞特異的に発現するためのプロモーター配列を有し、より詳しくは発現が構成的で、種々の生理条件下でも発現量が変化しない遺伝子であって、更に詳しくは膵β細胞を計測しようとする対象生物に由来しない遺伝子で、そのコードする遺伝子産物が生理活性を持たないレポーター遺伝子である。前記レポーター遺伝子を更に具体的に例示すれば、インスリンＩ遺伝子のプロモーター配列を有し、そのコードするタンパク質がアルブミン遺伝子のシグナル配列にヒトインスリン遺伝子のＣ−ペプチドを融合させ、更にＭｙｃタグを付加した人工タンパク質、またはアルブミン遺伝子のシグナル配列にルシフェラーゼを融合させ、更にＭｙｃタグを付加した人工タンパク質であるレポーター遺伝子である。本発明におけるプロモーターと人工タンパク質の組み合わせは、上述のレポーター遺伝子に必要とされる条件を満たしていればその種類に特に限定は無く、またその組み合わせが本発明を限定するものでは無い。
【００２６】
本発明の第７から第９の態様においては、膵β細胞で特異的にかつ構成的に発現され、調節を受けずに分泌されることを特徴とする、人工タンパク質をコードしたレポーター遺伝子を組み込んだベクターが提供される。本発明におけるベクターは、詳しくは請求項２から請求項６のうちいずれか１項に記載のレポーター遺伝子を組み込んだベクターであり、より詳しくはプラスミドベクターまたはウイルスベクターのいずれかである。
【００２７】
本発明の第１０の態様においては、請求項７に記載のベクターを用い、請求項２から請求項６のいずれか１項に記載のレポーター遺伝子をゲノム内に組み込んだモデル動物であって、前記レポーター遺伝子がコードする人工タンパク質を、膵β細胞で特異的にかつ構成的に発現することを可能とした、モデル動物が提供される。このモデル動物の例としてはマウスが挙げられ、このマウスはゲノムＤＮＡ内に前記レポーター遺伝子を組み込んだものである。このマウスを他の糖尿病モデルマウスと交配させるなどにより、膵β細胞量の変化を追跡し糖尿病発症の病態解明に寄与することが期待される。
【００２８】
本発明の第１１、第１２の態様においては、膵β細胞で特異的にかつ構成的に発現され、調節を受けずに分泌される人工タンパク質（レポーター分子）の、発現量または血中濃度、及びレポーター遺伝子の発現量を計測することを特徴とする、膵β細胞量の定量法が提供される。実施例で述べるとおり、計測方法としては、例えば分泌されたタンパク質をＥＬＩＳＡ法等によって定量するなどの方法が考えられる。
【００２９】
本発明の第１３の態様においては、請求項１１または１２に記載の膵β細胞量の定量法を用いた、膵β細胞を増加させる効果を持つ物質のスクリーニング方法が提供される。前述の通り、１型糖尿病では膵β細胞が経時的に減少、消失するが、２型糖尿病においてもまたその発症及び進展には膵β細胞量の減少が関わることが明らかになってきており、これを抑えるかまたは膵β細胞を増加させる効果を持つ物質が利用可能となれば、１型糖尿病のみならず２型糖尿病の治療に大きく寄与できると期待される。その様な物質のスクリーニングのために、例えば候補物質の投与前後におけるレポーター遺伝子または遺伝子産物を定量する、本発明の膵β細胞量の定量法は利用可能である。
【実施例１】
【００３０】
以下に本発明の実施例を述べるが、本実施例は本発明を限定するものでは無い。
【００３１】
（レポーター遺伝子の作成と発現）  ヒトアルブミン遺伝子のｃＤＮＡ全長を、ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ細胞株ＨｅｐＧ２よりｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ−ＰＣＲ）法にて得た。また、ヒトＣ−ペプチドについては、合成オリゴヌクレオチドによりｃＤＮＡ作成を行った。これらのｃＤＮＡを用い、表1のプライマーを用いたＰＣＲ法により、合成遺伝子Ａｌｂ−ｈｃを作成した（図1）。また、発現された人工タンパク質の検出をより容易にするために、Ｍｙｃタグを挿入し、それぞれを発現するためのベクターを、プラスミドｐｃＤＮＡ３を基に構築した。作成した全てのＤＮＡについては、シークエンシングを行いその塩基配列を確認した。
【表１】
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【実施例２】
【００３２】
（細胞培養）  ＮＨＩ３Ｔ３線維芽細胞、Ｃｏｓ７細胞、ＨＥＫ２９３細胞及びＰｌａｔＥ細胞（東京大学医科学研究所・北村俊雄博士より供与）を、１０％（ｖ／ｖ）ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（２５ｍＭ  ｇｌｕｃｏｓｅ，５０ｍｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）を用いて３７℃，５％ＣＯ２下で培養した。マウスインスリノーマ細胞株であるＭＩＮ６は、１５％（ｖ／ｖ）ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍを含む前記Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（含５０μＭ  β−メルカプトエタノール）を用い、３７℃，５％ＣＯ２下で培養した。前述のレポーター遺伝子をリポフェクション法（ＦｕＧｅｎｅ，Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｔｓｔｉｃｓ，ＣＨ）によりＣｏｓ７及びＨＥＫ２９３細胞、ＰｌａｔＥ細胞に導入し、人工タンパク質Ａｌｂ−ｈｃの発現を、抗Ｍｙｃ抗体を用いてＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ法により確認した。トランスフェクションのコントロールとして、ｐｃＤＮＡ３−ＧＦＰを使用した。実験は、トランスフェクションから４８時間後の細胞を用いて行った。
【実施例３】
【００３３】
（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ａｓｓａｙ）  細胞培養液をＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ（ＫＲＢ）−ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｅｒ（１２０ｍＭ  ＮａＣｌ，４．７ｍＭ  ＫＣｌ，１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４，１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，２ｍＭ  ＣａＣｌ２，ｐＨ７．４）に置き換え４時間培養を行った後、培養上清を一部回収した。Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で細胞を１回洗浄し、Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．５％  ＮＰ４０，２５０ｍＭ  ＮａＣｌ，３ｍＭ  ＥＧＴＡ，３ｍＭ  ＥＤＴＡ，１．０％  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）を加えて細胞溶解液を作成した。細胞溶解液のタンパク質量をＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ，ＵＳＡ）を用いて測定した。上清及び細胞溶解液にＳａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを加え加熱処理した後、１２％アクリルアミドゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、泳動後のゲルからＨｙｂｏｎｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）にタンパク質を転写した。メンブレンを５％  Ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ  ｉｎ  ０．１％  ＴＢＳ−Ｔ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）でブロッキングした。１次抗体として抗Ｍｙｃ抗体を、２次抗体として抗マウスＩｇ抗体を用い、ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）により検出した。
【実施例４】
【００３４】
（レトロウィルスによる遺伝子発現）  融合遺伝子Ａｌｂ−ｈｃを、レトロウィルスベクターであるｐＭＸｓ（東京大学医科学研究所・北村俊雄博士より供与）へ組み込んだ。これをパッケージング細胞ＰｌａｔＥにリポフェクション法（ＦｕＧｅｎｅ）を用いて導入し、４８時間後、ウィルスを含む細胞上清を回収した。７０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｔとなったＮＩＨ  ３Ｔ３  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔをレトロウィルス液で１２時間培養した。感染４８時間後よりｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ（２μｇ／ｍｌ）を行い、安定発現細胞株を作製した。ＭＩＮ６細胞に対しても、同様の方法でレトロウィルスを用いた。但し、遺伝子の導入効率を上げるために初回感染から４８時間後に２回目の感染を行った。２回目の感染から４８時間後にｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ（１μｇ／ｍｌ）を行い、安定発現細胞株を作製した。
【実施例５】
【００３５】
（ヒトＣ−ペプチドＥＬＩＳＡキットによるレポーター分子の測定）  Ｃｏｓ７、２９３細胞及びＮＩＨ  ３Ｔ３  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔに融合遺伝子Ａｌｂ−ｈｃをトランスフェクションし、４８時間後に実験を行った。Ｍｅｄｉｕｍを吸引、Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  （ＫＲＢ−ＨＥＰＥＳ）  ｂｕｆｆｅｒ（１２０ｍＭ  ＮａＣｌ，４．７ｍＭ  ＫＣｌ，１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４，１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，２ｍＭ  ＣａＣｌ２，ｐＨ７．４）で細胞を２回洗浄、ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１％  ＮＰ４０，２５０ｍＭ  ＮａＣｌ，３ｍＭ  ＥＧＴＡ，３ｍＭ  ＥＤＴＡ，１．０％  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）を加え細胞溶解液を作製した。培養上清及び細胞溶解液を用いてＥＬＩＳＡ法（ヒトＣ−ペプチドＥＬＩＳＡキット，ＬＩＮＣＯ，ＵＳＡ）にてＣ−ペプチド濃度を測定した。融合タンパク質を発現した安定細胞株３Ｔ３  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔにおいては、６ｃｍ  ｄｉｓｈに蒔き、８０％  ｃｏｎｆｌｕｅｎｔとなった状態で上記と同様に行った。
【実施例６】
【００３６】
（Ｃｏｓ７，ＨＥＫ２９３細胞での融合タンパク質の発現）  まず、３つの異なる位置にＭｙｃ−ｔａｇを付加した融合タンパク質Ａｌｂ−ｈｃを発現させるためのベクターを、ｐｃＤＮＡ３を用いて作製した（図２）。これら発現ベクターをＣｏｓ７細胞に導入し、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ法にて融合タンパク質の発現を確認した。３０−３３ｋＤａにバンドが確認できたが、Ｃ−ペプチド部分の両端にｍｙｃ−ｔａｇを付加したＡｌｂ−ｈｃ（Ｃ：ｍｙｃ−ｃｐｅｐ−ｍｙｃ，Ｃ：ｍｃｍ）の検出が良好であり、以後これを実験に用いた（図３）。
【００３７】
（Ｃｏｓ７細胞での融合タンパク質の分泌）  融合タンパク質Ａｌｂ−ｈｃを発現した細胞からＡｌｂ−ｈｃが分泌されているかどうか検討するため、ＫＲＢ−ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒで４時間培養し、上清の一部を用いてＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ法を行った（図４）。上清中にも、細胞溶解液中において検出されたバンドと同じサイズのバンドが検出された。Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ法の結果は、融合タンパク質Ａｌｂ−ｈｃが細胞から分泌されていることを示している。
【００３８】
Ａｌｂ−ｈｃが既存の方法で測定可能かどうかを検討するために、ヒトＣ−ペプチド特異的抗体を用いたＥＬＩＳＡ法による検出を行った。細胞上清を用いて融合タンパク質の測定をヒトＣ−ペプチドＥＬＩＳＡアッセイキットにより試みた結果、培養液中のＣ−ペプチドは検出・測定可能であった。Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ法での結果と同様、Ａｌｂ−ｈｃ（Ｃ：ｍｃｍ）でより高い値を示した（図５）。更にＣｏｓ７細胞以外の細胞でも同様に発現分泌されるかどうかを確認するため、ＨＥＫ２９３細胞にＡｌｂ−ｈｃ：ｍｃｍを発現させ同様の実験を行った。ＨＥＫ２９３細胞においても培養上清中にＡｌｂ−ｈｃが分泌され、Ｃｏｓ７細胞と同等の濃度のヒトＣ−ペプチドが確認された（図６）。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明のレポーター遺伝子、人工タンパク質及びベクターを利用し、トランスジェニックマウスを作製することにより、ヒトＣ−ペプチドをマウスで発現させ、これによってマウス膵β細胞量を推定する事が可能になると考えられる。またこうして得られたマウスを他の糖尿病モデルマウスと交配させる事により、膵β細胞量変化を追うことで糖尿病発症の病態解明に寄与すると考えられる。また本発明は、膵β細胞の減少を防止し、その再生や増殖を促進する糖尿病治療薬のスクリーニングにも応用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明に係るヒトアルブミンとヒトＣ−ペプチドの融合遺伝子の構成を示す。ヒトプレアルブミンのアミノ酸１−２０４をコードする領域と、ヒトプロインスリンのアミノ酸３１−６５をコードする領域を融合させた。
【図２】融合遺伝子Ａｌｂ−ｈｃの構造を示す。ヒトアルブミンシグナル配列（矢印）を含むドメインとヒトＣ−ペプチドドメインを融合させた。ＡはＣ−ペプチドのＣ末端側にｍｙｃ−ｔａｇを付加（ｃｍ）、ＢはＣ−ペプチドのＮ末端側に（ｍｃ）、ＣはＮ，Ｃ両末端にｍｙｃ−ｔａｇを付加（ｍｃｍ）している。
【図３】Ｃｏｓ７細胞での融合タンパク質の発現を示す。発現ベクターをトランスフェクション後４８時間で回収した細胞溶解液を１２％アクリルアミドゲルにて泳動し抗Ｍｙｃ抗体を用いてＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。Ａ：ｃｍ，Ｂ：ｍｃ，Ｃ：ｍｃｍ．
【図４】Ｃｏｓ７細胞におけるＡｌｂ−ｈｃの分泌を確認した。発現ベクターをトランスフェクションした細胞の培養上清を１２％アクリルアミドゲルにて泳動し、抗Ｍｙｃ抗体を用いてＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。トランスフェクション細胞において、抗Ｍｙｃ抗体が認識する３５ｋＤａのバンドが検出された。
【図５】Ｃｏｓ７細胞の培養上清に分泌された融合タンパク質のＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。Ａｌｂ−ｈｃを発現する３つのコンストラクトをトランスフェクションしたＣｏｓ７培養上清を、ヒトＣ−ペプチドＥＬＩＳＡキットで測定した。単位はヒトＣ−ペプチドとしての濃度で表記した。トランスフェクション細胞において、Ｃ−ペプチドが検出された。
【図６】ＨＥＫ２９３細胞上清への、Ａｌｂ−ｈｃの分泌を示す。ＨＥＫ２９３細胞、Ｃｏｓ７細胞にＡｌｂ−ｈｃ（ｍｃｍ）を発現させ、培養上清中のＡｌｂ−ｈｃをヒトＣ−ペプチドＥＬＩＳＡキットで測定した。単位はヒトＣ−ペプチドとしての濃度で表した。Ｃｏｓ７細胞と同様、ＨＥＫ２９３細胞においてもＣ−ペプチドが検出された。ＧＦＰを発現するコントロールベクターをトランスフェクションした細胞の培養上清でのＣ−ペプチド値は、測定のバックグラウンドである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年4月26日(2006.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
（レポーター遺伝子の作成と発現）  ヒトアルブミン遺伝子のｃＤＮＡ全長を、Ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ細胞株ＨｅｐＧ２よりＲｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ−ＰＣＲ）法にて得た。また、ヒトのＣ−ペプチドについては、合成オリゴヌクレオチドによりｃＤＮＡ作成を行った。これらのｃＤＮＡを用い、表１（配列番号７−１０）のプライマーを用いたＰＣＲ法により、合成遺伝子Ａｌｂ−ｈｃを作成した（図１）。また、発現された人工タンパク質の検出をより容易にするために、Ｍｙｃタグを挿入し、それぞれを発現するためのベクターを、プラスミドｐｃＤＮＡ３を基に構築した（配列番号１−３）。作成した全てのＤＮＡについては、シークエンシングを行いその塩基配列を確認した。
【表１】
2007037434.tif 000010
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007037434000001.app