(57)【要約】【課題】血清、血漿、尿、その他の生体由来試料中に含まれる微量蛋白質を精度よくかつ効率に検出、定量するための新規な解析法を提供する。【解決手段】蛋白質を含有する血清、血漿、尿、その他の生体由来試料に、蛋白質に親和性を有する任意の種類の塩基配列が明らかなポリヌクレオチドを添加し、ポリヌクレオチドと蛋白質を結合させた後に非結合ポリヌクレオチドと蛋白質−ポリヌクレオチドとを分離した後、蛋白質に結合したポリヌクレオチドを増幅し、ポリヌクレオチドを特定、  定量することにより、試料中の蛋白質を解析する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質含有試料に、蛋白質に親和性を有するポリヌクレオチドを少なくとも一種以上添加して、該ポリヌクレオチドと蛋白質とを結合せしめ、次いで非結合ポリヌクレオチドを分離除去した後、蛋白質に結合したポリヌクレオチドを検出及び／又は定量することを特徴とする、試料中の蛋白質の解析方法。
【請求項２】
蛋白質に結合したポリヌクレオチドからポリヌクレオチドを解離させるかあるいは解離させずに、該ポリヌクレオチドを増幅した後、電気泳動法により蛋白質に結合したポリヌクレオチドの定量を行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
蛋白質に結合したポリヌクレオチドからポリヌクレオチドを解離させるかあるいは解離させずに、定量ＰＣＲ法により蛋白質に結合したポリヌクレオチドを定量することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
蛋白質含有試料に、蛋白質に親和性を有するポリヌクレオチドを２種以上添加して、該ポリヌクレオチドと蛋白質とを結合せしめ、次いで非結合ポリヌクレオチドを分離除去した後、蛋白質に結合したポリヌクレオチドからポリヌクレオチドを解離させるかあるいは解離させずに、該ポリヌクレオチドを増幅した後、増幅されたポリヌクレオチドを、添加したポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを担持した核酸マイクロアレイにより解析することを特徴とする、試料中の蛋白質の解析方法。
【請求項５】
ポリヌクレオチドの増幅がＰＣＲ法によるものである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記ＰＣＲ法による増幅において、蛍光標識ヌクレオチドをポリメラ−ゼ反応溶液に含有せしめ、増幅ポリヌクレオチドを蛍光標識することを特徴とする、請求項３または５に記載の方法。
【請求項７】
蛋白質含有試料の種類に応じて、蛍光波長の異なる蛍光標識ヌクレオチドをポリメラ−ゼ反応溶液に含有せしめることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
蛋白質に結合したポリヌクレオチドと非結合ポリヌクレオチドを分離する手段が、蛋白質に結合したポリヌクレオチドを含有する溶液において、蛋白質を凝集させて該溶液から蛋白質−ポリヌクレオチド結合体を分離回収するか、あるいは蛋白質に対し結合活性表面を有する粒子又は膜を該溶液と接触させ、該粒子又は膜に蛋白質を結合させて、該溶液から蛋白質−ポリヌクレオチド結合体とを分離するか、あるいは非結合ポリヌクレオチドのみを通過させる膜を用いて洗浄除去する手段であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
蛋白質に親和性を有するポリヌクレオチドが、転写制御因子の、ゲノムにおける結合部位の塩基配列を有するポリヌクレオチド、あるいは該ポリヌクレオチドにおいて１乃至数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加された塩基配列を有し、かつ転写制御因子に対し結合活性を有するポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
転写制御因子の、ゲノムにおける結合部位の塩基配列を有するポリヌクレオチドが、メチル化シチジン−３−リン酸を含むポリメラ−ゼ反応溶液を使用してＰＣＲを行うか、あるいはＰＣＲ後に得られたポリヌクレオチド中のシトシン塩基に対しメチル化して得られたものであることを特徴とする、請求項９に記載の方法。  
【請求項１１】
蛋白質に親和性を有するポリヌクレオチドがヒストン、又はメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化を少なくとも１種以上受けたヒストン、若しくは転写因子複合体に親和性を有することを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
蛋白質含有試料が、生体由来試料であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法
【請求項１３】
生体由来試料が、血液、血清、血漿、尿、唾液、涙、リンパ液、生体組織浸出液であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載の方法により得られた解析結果と、生体由来試料採取源の疾病及び／又は病態とを対比し、特異的な定量値を示す蛋白質を探索することを特徴とする、疾病及び／又は病態に対するバイオマ−カ−の探索方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多種多様な蛋白質を含有する血清、血漿、尿、その他の生体由来試料中に存在する蛋白質の解析方法、及びこの解析結果を利用した、疾病及び／又は病態を判定するために使用するバイオマ−カ−の探索法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清、血漿、尿、その他の生体由来試料中に含まれる多種多様な蛋白質は、病気や各種疾患・疾病のマ−カ−としての利用が期待されている。各種疾患・疾病と蛋白質マ−カ−の関係を解析するためには、蛋白質を含む試料を二次元電気泳動により分離し、質量分析計等により蛋白質の特定、定量を行うのが一般的である。また、特定疾患・疾病との関係が明らかにされた蛋白質を定量するためには、抗体蛋白質を利用したELISA法がよく利用されている。しかしながら、前者は二次元電気泳動という高度な技術を要する手法と、高価な質量分析計が必要となる。一方、ELISA法は、抗体蛋白質の作成が必要であることから、いったん確立すれば有効に利用できるが、網羅的な解析や複数の蛋白質を解析する場合には不向きである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
以上のように、生体由来試料中に含まれる多種多様な蛋白質の特性評価や定量には未だに簡易な方法が存在しないが、塩基配列が明らかなポリヌクレオチドを定量する手法としては、定量PCR 法等の優れた手法が既に開発されている。
一方、網羅的にＤＮＡやＲＮＡなどの核酸を解析する技術としては既にＤＮＡマイクロアレイ等が開発され、広く利用されている。
本発明の課題は、このような、既に開発されているこれら定量ＰＣＲ法、及びＤＮＡマイクロアレイ技術等の技術を有効に活用し、上記生体由来試料中のタンパク質の特定、その特性評価及び定量を極めて簡便に行い得る、蛋白質の新たな解析手段を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記課題を解決するため、本発明者等は鋭意研究を重ねた結果、蛋白質に対し親和性を有するポリヌクレオチドを蛋白質含有試料に添加し、試料中の蛋白質と結合したポリペプチドをＰＣＲ法等により増幅すれば、極めて少量のポリヌクレオチドの使用によっても、感度よく、しかも簡便に、蛋白質の特定あるいは定量が可能であることを見いだした。そして、さらに、上記蛋白質に親和性を有するポリヌクレオチドを複数種用いて上記と同様な操作を行い、増幅されたポリペプチドを、核酸マイクロアレイを用いて解析すれば、試料中の蛋白質の網羅的解析が可能であり、また、これら解析結果と疾病、疾患、病態との関連を明らかにすることにより、新たな疾病、疾患、病態を診断するための新たなバイオマ−カ−の発見にも貢献すると確信し、本発明を完成するに至ったものである。
【０００５】
すなわち本発明は以下に示すとおりである。
（１）蛋白質含有試料に、蛋白質に親和性を有するポリヌクレオチドを少なくとも一種以上添加して、該ポリヌクレオチドと蛋白質とを結合せしめ、次いで非結合ポリヌクレオチドを分離除去した後、蛋白質に結合したポリヌクレオチドを検出及び／又は定量することを特徴とする、試料中の蛋白質の解析方法。
（２）蛋白質に結合したポリヌクレオチドからポリヌクレオチドを解離させるかあるいは解離させずに、該ポリヌクレオチドを増幅した後、電気泳動法により蛋白質に結合したポリヌクレオチドの定量を行うことを特徴とする上記（１）に記載の方法。
（３）蛋白質に結合したポリヌクレオチドからポリヌクレオチドを解離させるかあるいは解離させずに、定量ＰＣＲ法により蛋白質に結合したポリヌクレオチドを定量することを特徴とする、上記（１）に記載の方法。
（４）蛋白質含有試料に、蛋白質に親和性を有するポリヌクレオチドを２種以上添加して、該ポリヌクレオチドと蛋白質とを結合せしめ、次いで非結合ポリヌクレオチドを分離除去した後、蛋白質に結合したポリヌクレオチドからポリヌクレオチドを解離させるかあるいは解離させずに、該ポリヌクレオチドを増幅した後、増幅されたポリヌクレオチドを、添加したポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを担持した核酸マイクロアレイにより、解析することを特徴とする、試料中の蛋白質の解析方法。
（５）ポリヌクレオチドの増幅がＰＣＲ法によるものである請求項４に記載の方法。
（６）上記ＰＣＲ法による増幅において、蛍光標識ヌクレオチドをポリメラ−ゼ反応溶液に含有せしめ、増幅ポリヌクレオチドを蛍光標識することを特徴とする、上記（３）または（５）に記載の方法。
（７）蛋白質含有試料の種類に応じて、蛍光波長の異なる蛍光標識ヌクレオチドをポリメラ−ゼ反応溶液に含有せしめることを特徴とする、上記（６）に記載の方法。
（８）蛋白質に結合したポリヌクレオチドと非結合ポリヌクレオチドを分離する手段が、蛋白質に結合したポリヌクレオチドを含有する溶液において、蛋白質を凝集させて該溶液から蛋白質−ポリヌクレオチド結合体を分離回収するか、蛋白質に対し結合活性表面を有する粒子又は膜を該溶液と接触させ、該粒子又は膜に蛋白質を結合させて、該溶液から蛋白質−ポリヌクレオチド結合体とを分離するか、あるいは非結合ポリヌクレオチドのみを通過させる膜を用いて洗浄除去する手段であることを特徴とする、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）蛋白質に親和性を有するポリヌクレオチドが、転写制御因子の、ゲノムにおける結合部位の塩基配列を有するポリヌクレオチド、あるいは該ポリヌクレオチドにおいて１乃至数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加された塩基配列を有し、かつ転写制御因子に対し結合活性を有するポリヌクレオチドであることを特徴とする、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）転写制御因子の、ゲノムにおける結合部位の塩基配列を有するポリヌクレオチドが、メチル化シチジン−３−リン酸を含むポリメラ−ゼ反応溶液を使用してＰＣＲを行うか、あるいはＰＣＲ後に得られたポリヌクレオチド中のシトシン塩基に対しメチル化して得られたものであることを特徴とする、上記（８）に記載の方法。  
（１１）蛋白質に親和性を有するポリヌクレオチドがヒストン、又はメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化を少なくとも１種以上受けたヒストン、若しくは転写因子複合体に親和性を有することを特徴とする、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（１２）蛋白質含有試料が、生体由来試料であることを特徴とする、上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法
（１３）生体由来試料が、血液、血清、血漿、尿、唾液、涙、リンパ液、生体組織浸出液であることを特徴とする上記（１２）に記載の方法。
（１４）上記（１２）又は（１３）に記載の方法により得られた解析結果と、生体由来試料採取源の疾病及び／又は病態とを対比し、特異的な定量値を示す蛋白質を探索することを特徴とする、疾病及び／又は病態に対するバイオマ−カ−の探索方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明は、特性の評価や定量が容易でない生体試料中の多種多様な蛋白質を、定量精度が高い核酸の定量によって間接的に評価あるいは定量することを特徴とする。例えば、タンパク質の定量においては最新の機器を用いても１０８分子以上が必要となるが、ポリヌクレオチドの場合は、ＰＣＲ等の増幅法により、１０分子程度でも十分に定量が可能である。これに加え、本発明においてはＤＮＡマイクロアレイを利用することにより、試料中の多種多様な蛋白質の短時間で網羅的な解析、評価が可能であり、極めて効率的である。
したがって、本発明の手段は、血清、血漿、尿、その他の生体由来試料中に含まれる極微量の多様な蛋白質の検出、その特性評価あるいは定量において極めて有用であり、解析結果と疾病、疾患との関連を明らかにすることにより、医療診断に有効に利用しうる新たなバイオマ−カ−の取得にも大いに貢献するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下本発明を詳細に説明する。
本発明を詳細に説明する前に、特許請求の範囲を含む本明細書全体にわたって使用する用語について説明する。本発明に用いている用語は特別な定義がない場合、生物学、分子生物学、遺伝学、遺伝子工学等で一般的に出願時に使用されている用語と同じ意味である。
PCR 法とは、Polymerase Chain Reaction法のことであり、増幅DNAのセンス鎖、アンチセンス鎖に相補的なオリゴDNAプライマ−とDNA  ポリメラ−ゼを利用して、目的とするDNAを増幅するために利用される。温度を上げて目的DNA鎖を変性させた後温度を下げてプライマ−を結合させDNA伸長反応を行うという操作を繰り返すことにより、目的とするDNA鎖を指数関数的に増幅することができる。
【０００８】
クロマチン免疫沈降法とは、転写因子等の蛋白質がどの遺伝子の転写調節に係わっているのかを明らかにするため、まず、生きた細胞をformaldehydeで処理することにより、クロマチン近傍に存在する蛋白質とDNAの間ならびに蛋白質相互間をクロスリンクする。その後、細胞を溶解し、クロスリンクされたクロマチンを超音波処理により約500 bpのDNAサイズに裁断する。このようにして調整した可溶性クロマチンを、修飾（アセチル化、メチル化、リン酸化など）されたヒストン・転写因子・エピト−プ（タグ付きタンパク質の場合）などに対する抗体で免疫沈降させる。次に免疫沈降されたクロマチン分画を加熱処理しクロスリンクを外した後、DNAを精製し、このDNA分画の中に、自分が調べているDNA領域がどれだけ濃縮されているかをPCR法により定量する。
転写因子とは、DNAからRNAを合成する転写過程において、転写酵素であるRNAポリメラ−ゼ以外に必要とされるサイトカイン（生理活性をもつ低分子量のタンパク質）の総称で、合成の鋳型となるDNAの特異的塩基に結合して転写の調節を行う。
エンハンサ−とは、真核生物DNA上の塩基配列領域を区分する名称で、転写因子と結合することで遺伝子の発現を調節している。転写因子と結合することにより転写速度が大幅に増大（enhance）することから命名された。
【０００９】
プロモ−タ−とは、mＲＮＡ合成（ＤＮＡからＲＮＡを合成する段階；転写）の開始に関与するＤＮＡ上の特定領域の短い塩基配列で、ここにＲＮＡポリメラ−ゼ（ＲＮＡを合成する酵素）が結合し、転写が開始される。
ポリヌクレオチド（核酸）は、DNAとRNAがあり、五炭糖、リン酸および塩基から成るヌクレオチドの重合体であり、五炭糖にはＤ−リボ−スとデオキシ−Ｄ−リボ−スの２種があり、リボ核酸（RNA）にはＤ−リボ−ス、デオキシリボ核酸（DNA）にはデオキシ−Ｄ−リボ−スが含まれる。塩基はアデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、ウラシル(U)、チミン(T)の5つがあるが、RNAでは A、 G、C、U、DNAではA、G、C、Tが含まれる。
蛍光標識プロ−ブとは、核酸の特定塩基配列に相補的な塩基配列を持つ合成オリゴDNAに蛍光標識したものであり、特定塩基配列の検出に用いられる。
【００１０】
本発明の解析法は、蛋白質含有試料に、蛋白質に親和性を有するポリヌクレオチドを少なくとも一種以上添加して、蛋白質に結合したポリヌクレオチドを検出及び／又は定量することにより、試料中の蛋白質を間接的に検出、特定、定量するものである。
本発明における解析対象の蛋白質含有試料は、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ブタ等の哺乳動物の血液、血清、血漿、尿、唾液、涙、リンパ液、生体組織浸出液等の生体由来試料を含むが、特にこれに限定されず、植物由来のものであっても解析対象となりうる。
本発明においては、これら蛋白質含有試料を直接あるいは適宜希釈し、この試料に、蛋白質との結合活性を有すると推定されるポリヌクレオチド（塩基数は５０−１０００程度、より好適には１００−３００程度）を１種類あるいは複数種類添加する。一定時間、一定温度で放置し、試料中の蛋白質と上記ポリヌクレオチドを結合させた後、蛋白質−ポリヌクレオチド結合体から、蛋白質と結合していない遊離ポリヌクレオチドを分離除去する。
次に、蛋白質−ポリヌクレオチド結合体から、ポリヌクレオチドを分離するかあるいは分離しないで直接、上記添加したポリヌクレオチドに特異的なプライマ−を使用して、増幅する。
増幅されたポリヌクレオチドは、例えば、電気泳動法により泳動させ、泳動バンドを核酸特異的色素で染色した後、バンドの濃淡からそのポリヌクレオチドを定量することができ、また、バンドの泳動距離から蛋白質と結合したポリヌクレオチドを検出、特定できる。この電気泳動法は、１種類の蛋白質含有試料に、複数のポリヌクレオチドを添加し、混合状態のままＰＣＲ法等により増幅し、同時に検出する場合に有効である。
一方、上記増幅過程を、そのまま定量ＰＣＲ法、特にリアルタイムモニタリング定量ＰＣＲ法による蛋白質結合ポリヌクレオチドの定量過程とすることにより、より簡便、かつ効率的に該ポリヌクレオチドを検出、定量できる。
【００１１】
リアルタイムモニタリング定量ＰＣＲ法はそれ自体周知の方法であり、ＰＣＲによる増幅過程をリアルタイムでモニタリングしながら、増幅が観察されるＰＣＲサイクル数と、既知濃度の試料から作成される検量線に基づいて、もとのポリヌクレオチド量を求めるものである。このポリヌクレオチドの量は該ポリヌクレオチドが結合した蛋白質の量に比例するから、これにより間接的に試料中の蛋白質の量を測定することが可能となる。
本発明においては、上記蛋白質試料に添加したポリヌクレオチドに特異的なプライマ−を利用して蛋白質に結合したポリヌクレオチドのみをＰＣＲ増幅し、増幅産物が検出されるサイクル数と予め既知濃度の試料を用いて作成される検量線から、元の蛋白質−ポリヌクレオチド結合体中のポリヌクレオチドを定量する。
このように、増幅手法としてはPCR 法が一般的に利用されるが、LAMP、ICAN、NASBA、TRC法（詳細は省略）等の他の遺伝子増幅手法も利用可能である。
リアルタイムモニタリング定量PCR 法等のポリヌクレオチド増幅検出手法を使用する場合において、ポリヌクレオチドの定量は、より具体的には、ポリヌクレオチドの増幅過程を各種の蛍光標識プロ−ブ等を利用することによりモニタリングし、予め添加した既知濃度（コピ−数）の試料と、増幅が観察できるサイクル数との関係から検量線を作成し、未知試料の増幅が観察されるサイクル数を求め、検量線との比較により定量するものである。
【００１２】
増幅過程をモニタリングするための蛍光標識プロ−ブとしては、既に蛍光消光プロ−ブ（J−Bio21社、日本）、TaqMan−Probe (Applied Bioscience社、米国)、ハイブリプロ−ブ（Roche Diagnostics、ドイツ）、モレキュラ−ビ−コン（PHRI、米国）等が市販されており、いずれも利用することができる。また、LAMP法では、目的ポリヌクレオチドの増幅を濁度の増加でモニタリングすることができる。
また、このようなリアルタイムモニタリング定量PCR 法等においても、異なる蛍光波長を有する異なるプロ−ブを利用することにより、複数のポリヌクレオチドを同時に定量することができる。
また、増幅されるポリヌクレオチドの蛍光標識法としては、過剰量の蛍光標識したヌクレオチドを基質としてＰＣＲのポリメラ−ゼ反応溶液に含有させる方法も挙げられる。これによれば、ＰＣＲの進行に伴い、上記蛍光標識ヌクレオチドは、増幅されるポリヌクレオチドの構成ヌクレオチドとして取り込まれ、これにより増幅したポリヌクレオチドが蛍光標識されるが、これによる蛍光強度変化はそのポリヌクレオチド増幅量を反映する。この方法においても、蛋白質含有試料に添加するポリヌクレオチドの種類に応じて、蛍光標識ヌクレオチドの蛍光色素を変えることにより、複数のポリヌクレオチドを同時に定量することができる。このような、蛍光色素としては、FAM, TAMRA, Cy5, Cy3, Texas Red, Rox, BodyP−Fl等ポリヌクレオチドに修飾可能な蛍光色素であれば任意に使用することができる。また、SYBR−Green等のインタ−カレ−タ（二重鎖ポリヌクレオチドと結合して蛍光を発するようになる色素）を利用することによっても増幅されるポリヌクレオチドのモニタリングが可能となる。さらに、本発明においては放射性同位元素を用いて標識を行ってもよい。
【００１３】
一方、本発明においては、上記のようにして増幅されたポリヌクレオチドを、蛋白質含有試料に添加したポリヌクレオチとハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを担持した核酸マイクロアレイによって解析してもよい。このような核酸マイクロアレイに担持するポリヌクレオチドは、蛋白質含有試料に添加する各ポリヌクレオチドの塩基配列とそれぞれ相補の塩基配列を有し、その種類等に応じ基板上に整列配置される。
このようなマイクロアレイを使用する手法は、蛋白質に親和性を有するポリヌクレオチドを多種類用い、例えば、生体試料中の多種多様な蛋白質の網羅的な解析を効率的に行う上で好適である。すなわち、この手法によれば、一度の測定で試料中の多種の蛋白質を検出、特定及び定量することが可能となり、また、２種以上の異なる生体試料（例えば疾患・疾病試料と正常試料）中の蛋白質を比較解析・評価することも同時にできる。これにより、より有効かつ迅速に疾患・疾病と関連する蛋白質を特定でき、またその変動を明らかにすることが可能となる。
【００１４】
また、この核酸アレイを使用する解析法においては、上記した蛍光標識法を適用でき、測定されるマイクロアレイ上の蛍光スポットの位置および蛍光強度は、蛋白質と結合したポリヌクレオチドの種類及び量を反映する。したがって、この蛍光スポットの位置及び蛍光強度が明らかになれば、各試料中の蛋白質を検出、特定及び定量することができる。
一方、例えば、複数種の異なる生体試料の比較解析・評価に当たっては、蛋白質に結合した核酸を増幅する過程で、それぞれ蛍光波長の異なる複数の蛍光標識ヌクレオチドを使用して増幅し、それぞれの試料の増幅ポリヌクレオチドを蛍光標識し、核酸マイクロアレイに競合的にハイブリダイズさせ、その蛍光波長と蛍光強度から解析することが有効である。蛍光波長と蛍光強度の解析から、疾病・疾患試料で蛍光シグナルが高くなるマイクロアレイ上のスポット、あるいは逆にシグナルが低くなるスポットを特定することができる。上記したように、このマイクロアレイ上のスポットの位置及び蛍光強度により、蛋白質に結合したポリヌクレオチドを特定でき、またその量を知ることができ、これは試料中の蛋白質の種類及び量を反映するから、上記蛍光スポットのパタ−ンにより、疾病・病態に応じて発現あるいは発現抑制される蛋白質の網羅的な解析を行うことができる。この結果、ある疾病、病態とこの蛍光スポットのパタ−ンが関連付けられる場合においては、上記パタ−ン自体あるいはこれにより特定された蛋白質は、これら疾病、病態診断の有力なバイオマ−カ−になりうる。
【００１５】
このように、核酸マイクロアレイを使用する解析法はバイオマ−カ−の探索法に最適な方法ではあるが、上記した電気泳動法、あるいは上記ポリヌクレオチドの増幅過程を蛋白質に結合するポリヌクレオチドの定量過程とする方法であっても、順次、種々の生体由来試料について解析し、疾病あるいは病態と、蛋白質に結合するポリヌクレオチドの種類及びその量との関係を解明していくことにより、バイオマ−カ−を探索することができる。
【００１６】
本発明において使用する、生体試料中の蛋白質に親和性を有するポリヌクレオチドとしては、例えば、転写制御因子（蛋白質）等が認識（結合）するゲノム上の遺伝子配列部位の塩基配列、特に機能遺伝子配列の上流に位置するプロモ−タ−や、プロモ−タ−とは離れた部位に位置するエンハンサ−等の遺伝子発現制御領域の塩基配列を使用することが有効である。生体内ではこれらの塩基配列上には特定の蛋白質が結合し、機能遺伝子発現の制御が行われている。したがって、このような塩基配列部位と結合する蛋白質は遺伝子発現制御に重要な役割を果たしている可能性が高い。
【００１７】
このようなポリヌクレオチドとしては、あらゆる機能遺伝子のプロモ−タ−やエンハンサ−の塩基配列が利用できるが、特に特定の疾病・病態と関連がある機能遺伝子のプロモ−タ−やエンハンサ−の塩基配列を利用することが望ましい。例えば、糖尿病との関連ではグルコ−スの分解や新生に係わる酵素遺伝子の制御部位、癌との関連では、各種の癌遺伝子や癌抑制遺伝子、例えば、erbB2, APC, EGFR, TGF−β, KIT, PDGFR, RET, p53等の制御部位が挙げられる。いずれにしても、疾病・病態との関連が明らかにされた機能遺伝子の制御部位の塩基配列を利用することが望ましい。
また、このほか、ヒストン蛋白質、又はメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化を少なくとも１種以上受けたヒストン蛋白質、若しくは転写因子複合体に親和性を有するポリヌクレオチド等も使用できる。
【００１８】
これらヒストンは、真核生物におけるゲノムの立体的な収納、格納に重要な役割を果たしているとともに、転写制御にも深く関連している。ヒストン蛋白質は、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化等を受けることにより、転写制御に関わるゲノム上の塩基配列部位や転写制御関連蛋白質との親和性が変化し、転写制御に大きな影響を及ぼしている。従って、転写制御に関わる遺伝子配列部位は、ヒストン蛋白質の各種修飾（メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化等）の程度によってとその親和性に大きな差が生じることが想定される。すなわち、疾病あるいは病態によってはヒストン修飾に変化が生じていることも考えられることから、その変化をヒストン蛋白質と親和性を有する転写制御関連塩基配列との親和性に基づいて評価することが可能となる。同様に、転写因子は複合体を形成することによって、転写制御関連塩基配列との親和性に差が生じることから、これらの修飾蛋白質や蛋白質複合体に親和性を有する塩基配列を上記ポリヌクレオチドとして利用することができる。
【００１９】
本発明で使用する、上記蛋白質に親和性を有するポリヌクレオチドは、例えば、ゲノム情報から発現制御領域等を特定し化学合成することもできるが、目的とする生物のゲノムから、制限酵素で切り出したり、各種の増幅手法で増幅して得られたものを使用することができる。
転写制御因子等の蛋白質が結合するポリヌクレオチドとしては、ゲノム遺伝子の目的配列をPCR 等により増幅して得られたポリヌクレオチドを利用するのが、最も容易である。一方、目的配列をPCR 等により増幅すると、転写制御部位のＣｐＧボックスのシトシンがメチル化されている場合、増幅産物のメチル化が消失し、蛋白質との結合特性に変化が生じることが想定される。したがって、メチル化シトシンを含むポリヌクレオチドが必要な場合には、メチル化シトシンモノマ−を利用してPCR法等により増幅して得られたポリヌクレオチドを使用したり、増幅産物のシトシン塩基を増幅後にメチル化して得られたポリヌクレオチドを使用することも、特定蛋白質との結合を強固にしたり、バイオマ−カ−として利用したりする場合に有効である。
【００２０】
また、使用するポリヌクレオチドは、例えば、転写制御因子等の蛋白質の結合部位の塩基配列を有するポリヌクレオチドのみではなく、このようなポリヌクレオチドにおいて１乃至数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加された塩基配列であっても、転写制御因子等の蛋白質に対し結合活性を有するポリヌクレオチドであればよい。使用するポリヌクレオチドとして、化学合成あるいは分子進化工学的な手法によって部分的な塩基置換等を行い、特定蛋白質との結合特性を更に改良することも有効である。本発明において添加するポリヌクレオチドと結合する蛋白質は、必ずしも１対１対応するものではなく場合によっては複数であったり、非特異的に結合する場合もある。しかしながら、疾病等との関連が明確であれば特に限定するものではない。
【００２１】
本発明において、蛋白質と結合したポリヌクレオチドの定量において、蛋白質−ポリヌクレオチド結合体から、蛋白質と結合しなかった遊離の添加ポリヌクレオチドを分離する場合においては、蛋白質−ポリヌクレオチド結合体含有溶液において、蛋白質を凝集させることにより該溶液から蛋白質−ポリヌクレオチド結合体を分離するかあるいは、蛋白質と吸着乃至結合する活性を導入した表面を有する粒子、膜等を上記蛋白質−ポリヌクレオチド結合体含有溶液と接触させ、該粒子あるいは膜にタンパク質を吸着乃至結合させることにより、蛋白質−ポリヌクレオチド結合体を担持した粒子あるいは膜を非結合ポリヌクレオチドを含有する溶液から分離するか、あるいは低分子の非結合ポリヌクレオチドのみを通過させる膜を用いて洗浄除去する方法が有効である。なお、本明細書において、「結合」とは「吸着」も包含する。
また、予め試料中の蛋白質を粒子や膜等の固体表面に吸着させておき、その後にポリヌクレオチドを結合させ、非結合ポリヌクレオチドを洗浄した後で蛋白質−ポリヌクレオチド結合体を遊離させ回収した後、定量することも可能である。
【００２２】
このような、粒子あるいは膜としては、例えば、磁性微粒子、各種プラスチック粒子、アガロ−ス、アクリルアミドゲル粒子表面を蛋白質に親和性を有する処理剤で処理したもの、あるいは、ニトロセルロ−ス、酢酸セルロ−ス、ナイロン濾過膜等の各種膜表面を上記処理剤で処理したもの等が挙げられる。
また、非結合ポリヌクレオチドのみを通過させる膜としては、各種分子量分画が可能なニトロセルロ−ス、酢酸セルロ−ス、ナイロン濾過膜等、蛋白質が結合した高分子量の蛋白質ポリヌクレオチド複合体と、非結合ポリヌクレオチドの分子量の差を利用して分画可能な、各種市販の濾過膜が挙げられる。
【００２３】
一方、この定量において、回収された蛋白質−ポリヌクレオチド結合体からポリヌクレオチドを解離するには、温度を５０℃以上１００℃以下、望ましくは６０℃以上、８０℃以下、あるいは塩濃度で１モルから５モル、通常２−４モル、あるいは温度と塩濃度の組み合わせで最適な条件を求めることが望ましい。
また、血清や血漿中には疾病や疾患に関連しないと思われる蛋白質として、アルブミンやグロブリンが高濃度に含有されることから、このような蛋白質は、予め市販の除去剤で除去しておくことも効果的である。
【００２４】
なお、本発明と良く似た方法として、クロマチン免疫沈降法（ChIP）がある。これは、機能未知の転写制御蛋白質の機能を明らかにするため、予め機能未知の蛋白質を取得し、この蛋白質に対する抗体を作成し、本抗体を表面に担持させたビ−ズ等を利用し、生体試料中から機能未知の蛋白質と結合したゲノム上の塩基配列部位であるポリヌクレオチドを分取した上で塩基配列を解析し、塩基配列情報から未知機能蛋白質の機能を推定する方法である。したがって、既に明らかにされている塩基配列情報を利用し、PCR増幅あるいは化学合成等によって得られたポリヌクレオチドを生体試料に添加し、本ポリヌクレオチドが何らかの要因で試料中の蛋白質に結合したものを定量することにより、試料中の蛋白質の評価に利用することを目的とする本手法とは、目的、原理ともに異なる。
【００２５】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。但し本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
ポリヌクレオチド結合性蛋白質を、結合したポリヌクレオチドを利用し間接的に定量可能かどうかを確認する実験を行った。本実施例では、ポリヌクレオチドの特定塩基配列に結合することが明らかになっているAP−1 (activator protein−1)蛋白質を用いた。AP−1は、Junファミリ−、Fos ファミリ−、ATFファミリ−、またはMAFファミリ−からなる二量体（ダイマ−）により構成され、AP−1結合部位に結合して転写を促進する転写因子である。AP−1/c−Junは「ＴＧＡＣＴＣＡ」という特定の塩基配列に結合し遺伝子の転写を誘導することが知られている。そこで、この塩基配列を含むポリヌクレオチド（合成ＤＮＡ）及びヒトAP−1/c−Jun (promega社、米国)を用いて本手法を検証した。配列番号１と２に記載の塩基配列を有するDNAを合成し（シグマアルドリッチジャパン社、日本）、それぞれを等量混合して２本鎖DNAを調製した。調製した2本鎖DNAを濃度10 nMになるようAP−1/c−Jun溶液（0−10 nM:AP−1/c−Jun、50 mM:Tris−HCl (pH 7.5)、70 mM:KCl、1 mM:EDTA、0.2 mg/ml:BSA、4%:グリセリン）に混合し、全量100μＬにて37℃、1時間インキュベ−トした。
【００２７】
市販の蛋白質吸着チップ (ProteinChip Array C573−00、サイファ−ジェン・バイオシステムズ社)に吸着させ非吸着ポリヌクレオチドを洗浄後、吸着ポリヌクレオチドを４モルのNaClで遊離させた。アミコンＹＭ−２００フィルタ−（ミリポア社、米国）で濃縮・脱塩後、配列番号３、４に示したPCRプライマ−及び配列番号５で示した増幅モニタリング用蛍光消光プロ−ブ−Ｇ（J−Bio21社、日本）で目的ポリヌクレオチドを定量した。ここで、使用した蛍光消光プロ−ブはその5’末端に蛍光色素(TAMRA)を標識し、3’末端をリン酸化した。またTm値を上げるため、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）にLNA(Locked Nucleic Acid)を修飾したものを用いた。定量的PCR反応条件は以下の通りである。
・１× Titanium Taq DNA ポリメラ−ゼ
・１× Titanium Taq付属バッファ−
・200μＭ dNTPs
・300 nM 配列番号３
・1000 nM 配列番号４
・100 nM 配列番号５
・鋳型核酸溶液
【００２８】
解析にはライトサイクラ−システム（Roche社）を用いた。95℃で2分間変性後、95℃ 5秒、55℃ 10秒、72℃、12秒を1サイクルとして45サイクル反応させた。各サイクルの520
nm における95℃、55℃の蛍光強度値を測定した。検量線は配列番号1,2を鋳型に配列番号3，4でPCRして得られたＤＮＡ断片（ポリヌクレオチド）を既定のコピ−数(１〜１０８)に調製したものを用いて作成した。
測定結果を図１に示した。添加ポリヌクレオチドは一定量とし、添加蛋白質濃度を変化させたところ、吸着洗浄後に定量されたポリヌクレオチド量は添加蛋白質濃度と比例関係にあることが明らかとなった。この結果から、本発明の基本的な原理の有効性が確認できた。
【実施例２】
【００２９】
上記実施例における蛋白質とポリヌクレオチドの結合が特異的なものかどうかを検討するために、実施例１で使用した配列番号１、２に対応する塩基配列として、その内の２塩基を変異させた「ＴＧＡＣＴＴＧ」を有する配列番号６、７に記載の合成ＤＮＡを用いて、実施例１と同様の実験を行った。その結果、図２に示すように、ポリヌクレオチド定量値はほとんど変化しなかった。このように、本手法は特定の核酸に強い親和性を有する蛋白質のみを特異的に検出可能であることが明らかになった。
【実施例３】
【００３０】
AP−1/c−Jun対応するプロモ−タ−領域のポリヌクレオチドの結合がどの程度特異的であるかをさらに確認するため、ヒト血清を１００倍希釈した溶液に、実施例１で調製したプロモ−タ−領域の塩基配列（配列番号１，２）を有するポリヌクレオチド及びAP−1/c−Junをそれぞれ最終濃度10  nM、0−10 mM添加し、吸着ポリヌクレオチドの定量を試みた。その結果、図３に示すように、ヒト血清を加えない場合（図１参照）と比較して吸着ポリヌクレオチドの定量値が増加する傾向を示したが、吸着ポリヌクレオチドの定量値はAP−1/c−Junの添加量に比例して増加した。このように、血清のような多岐にわたる蛋白質が高濃度で含まれる試料においても、特定蛋白質濃度を対応する特異的ポリヌクレオチドを介して定量可能であることが明らかとなった。
【実施例４】
【００３１】
AP−1/c−Jun以外の蛋白質にも有効であるかどうかを検討するために、代表的なDNA結合タンパク質のひとつであるNF-κBについて、同様に検討を行った。また、DNA-タンパク質複合体と遊離のDNAを分ける手法として新たに表面が疎水性のMagnetic Beadsを用いた方法についても検討を行った。使用した塩基配列は両末端にNF-κBの結合サイトを有し、中間はAP−1/c−Junの結合定量部位の配列をもっているため、蛋白質結合ポリヌクレオチドの定量には実施例１と同様の方法が適用できる。配列番号８と９に記載の塩基配列を有するDNAを合成し（シグマアルドリッチジャパン社、日本）、それぞれを等量混合して２本鎖DNAを調製した。表面が疎水性のMagnetic Beads として，DYNAL社のDynabeads RPC Proteinを用いた。
【００３２】
反応液の組成(12.5uL)は，10mM Tris-HCl(pH7.5), 50mM NaCl, 0.5mM EDTA, 0.5mM DTT, 3mM MgCl2, 0.05mg/mL poly(dI-dC), 10% Glycerol, 0.5mg/ml BSA, 0.05% NP-40とし，NF-κBの濃度は0, 25, 58, 138, 275pMにふった。37℃にて10分間インキュベートした後，ポリヌクレオチド (Protein binding site：2つ)を終濃度25pM（=1.5×10^7 copies/μL）になるように添加した(最終的な反応液量は15.0ul)。37℃にて20分間インキュベートした後，Dynabeads処理を施し，回収したDNAをQProbe-PCRに供試した。Real-time装置としてライトサイクラ−システム（Roche社）を使用した。測定結果を図4に示した。添加ポリヌクレオチドは一定量とし、添加蛋白質濃度を変化させたところ、吸着洗浄後に定量されたポリヌクレオチド量は添加蛋白質濃度と比例関係にあることが明らかとなった。この結果から、複数の異なる蛋白質とポリヌクレオチドの組み合わせでも本発明の基本的な原理の有効性が確認できた。
なお、上記実施例１〜４において使用したプラ−マ−、蛍光プロ−ブにおける塩基配列は以下のとおりである。
【００３３】
配列番号 (5’ − 3‘)
1;accccaaagtggtgactcatcactatcatgctataaaatagaagatgcttgccctg
2;cagggcaagcatcttctattttatagcatgatagtgatgagtcaccactttggggt
3;accccaaagtggtga
4;cagggcaagcatctt
5;cactatcatgctataaaatag
6;accccaaagtggtgacttgtcactatcatgctataaaatagaagatgcttgccctg
7;cagggcaagcatcttctattttatagcatgatagtgacaagtcaccactttggggt 
8;agttgaggggactttcccaggcaccccaaagtggtgacttgtcactatcatgctataaaatagaagatgcttgccctgggaaggagttgaggggactttcccaggc
9;gcctgggaaagtcccctcaactccttcccagggcaagcatcttctattttatagcatgatagtgacaagtcaccactttggggtgcctgggaaagtcccctcaact
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】AP−1/c−Jun蛋白質添加量と対応する核酸の定量値との関係を示すグラフである。
【図２】AP−1/c−Jun蛋白質添加量と変異導入核酸の定量値との関係を示すグラフである。
【図３】血清存在下におけるAP−1/c−Jun蛋白質添加量と対応する核酸の定量値との関係を示すグラフである。
【図４】NF-κB蛋白質添加量と対応する核酸の定量値との関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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