(57)【要約】【課題】従来の乳酸菌バクテリオシンに比べて、より実用性に優れた抗菌剤および該抗菌剤を効率よく得るための方法ならびに前記抗菌剤を用いた食品を提供すること。【解決手段】ｐＨ２からｐＨ１１まで安定して、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）に抗菌性を有する発酵生成物を産生するストレプトコッカス・ボービス（Streptococcus bovis）に属する乳酸菌、前記乳酸菌を培養して得られた発酵生成物を含有してなる抗菌剤および食品、ならびに前記酸菌を培養して得られた発酵生成物を食品に添加する工程を有する食品改質方法および食品の製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ２からｐＨ１１まで安定して、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）に抗菌性を有する発酵生成物を産生するストレプトコッカス・ボービス（Streptococcus bovis）に属する乳酸菌。
【請求項２】
１２１℃、２０分の熱処理した後にも、発酵生成物の抗菌性が２５％以上失活しない請求項１記載の乳酸菌。
【請求項３】
乳酸菌がストレプトコッカス・ボービスＪ２  ４０−２（Streptococcus bovis J2 40-2）（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０８４１）である請求項１または請求項２記載の乳酸菌。
【請求項４】
発酵生成物がＭＲＳ培地、ＴＹＬＧ培地および還元脱脂乳培地からなる群より選ばれる何れかの培地中で、乳酸菌を培養して得られることを特徴とする請求項１〜３何れかに記載の乳酸菌。
【請求項５】
請求項１〜４何れかに記載の乳酸菌を培養して得られた発酵生成物を含有してなる抗菌剤。
【請求項６】
請求項１〜４何れかに記載の乳酸菌を培養して得られた発酵生成物を含有してなる食品。
【請求項７】
請求項１〜４何れかに記載の乳酸菌を培養して得られた発酵生成物を食品に添加する工程を有する、食品改質方法。
【請求項８】
請求項１〜４何れかに記載の乳酸菌を培養してえられた発酵生成物を食品に添加する工程を有する、食品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）に強い抗菌性を有する新規乳酸菌およびその発酵生成物を含有する抗菌剤ならびに食品に関するものである。また、本発明は、前記発酵生成物を用いる食品改質方法および食品の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は食品の風味と保存性を高めるため、古くから意図的あるいは非意図的に乳酸発酵という過程をへて食品に用いられてきた。乳酸菌の産生する抗菌物質として乳酸などの有機酸、過酸化水素およびジアセチルなどの低分子化合物、または各種ペプチド、タンパク質などがある。中でも、近年注目されているポリペプチドである乳酸菌バクテリオシン（非特許文献１）の多くは次に示す特性をもつ。（1）耐熱性のペプチドである。（特許文献１）（2）酸性域で抗菌活性を発揮する。（特許文献２）（3）消化器系のタンパク分解酵素によって分解されるため、安全性が高いことが期待できる。
【特許文献１】特許第３４７６５１６号公報
【特許文献２】特許第２６３７８７９号公報
【非特許文献１】「バイオプリザベーション」森地敏樹編、幸書房、Ｐ７６（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
乳酸菌の産生するバクテリオシンには、安全な抗菌物質として食品加工分野での期待は高いが、中性域からアルカリ域ｐＨでの抗菌活性の低下、抗菌スペクトルの狭いこと、耐熱性などから実用的な乳酸菌バクテリオシンは少ない。したがって、本発明は、従来の乳酸菌バクテリオシンに比べて、より実用性に優れた抗菌剤および該抗菌剤を効率よく得るための方法ならびに前記抗菌剤を用いた食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、バングラデシュの伝統的な発酵乳より分離した乳酸菌を培養して得られた発酵生成物に、公知のバクテリオシンと比べて顕著に広い領域のｐＨに抗菌活性があり、しかも高い耐熱性があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
即ち、本発明の第一はｐＨ２からｐＨ１１まで安定して、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）に抗菌性を有する発酵生成物を産生するストレプトコッカス・ボービス（Streptococcus bovis）に属する乳酸菌に関する。好ましい実施態様は、１２１℃、２０分の熱処理した後にも、前記発酵生成物の抗菌性が２５％以上失活しない乳酸菌に関する。より好ましくは前記乳酸菌がストレプトコッカス・ボービスＪ２ ４０−２（Streptococcus bovis J2 40-2）（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０８４１）である。更に好ましくは、発酵生成物がＭＲＳ培地、ＴＹＬＧ培地および還元脱脂乳培地からなる群より選ばれる何れかの培地中で、乳酸菌を培養して得られることを特徴とする。本発明の第二は、前記乳酸菌を培養して得られた発酵生成物を含有してなる抗菌剤に関する。本発明の第三は、前記乳酸菌を培養して得られた発酵生成物を含有してなる食品に関する。
また、本発明は、前記乳酸菌を培養して得られた発酵生成物を食品に添加する工程を有する、食品改質方法および食品の製造方法に関する。
【発明の効果】
【０００６】
低温で増殖し致命率の高い（３０％）リステリア症の原因菌であるリステリア・モノサイトゲネスに強い抗菌性を示す乳酸菌およびその発酵生成物を汚染報告が多い肉製品、乳製品に用いることにより食品添加物でない食中毒の防止の提供が可能になる。通常、バクテリオシンは食品酸性領域（ｐＨ６以下）で効果を発揮することが多いが、本発明の乳酸菌の発酵生成物は酸性領域だけでなく、中性域（ｐＨ７付近）からアルカリ域（ｐＨ１１）まで広い範囲で抗菌性を示すことから、多くの食品への利用することができ、それにより安全性に優れた食品の製造が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明につき、さらに詳細に説明する。本発明に関わる乳酸菌は、食中毒菌であるリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）に強い抗菌性を有する発酵生成物を産生し、その抗菌性がｐＨ２からｐＨ１１まで安定なものである。
【０００８】
本発明において発酵生成物とは、前記乳酸菌が生育している過程で生成されたリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）に対して抗菌性を示すものであればよく、例えば、前記乳酸菌の培養物、該培養物から菌体を分離した培養液、該培養液を噴霧乾燥などで乾固させた固形物、該固形物を水などの媒体に溶解させたものなどが挙げられる。
【０００９】
前記発酵生成物は、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）に対して選択的に高い抗菌活性を有するものであり、一方、他の菌について抗菌活性は極めて低いため、安全性に優れたものである。なお、前記発酵生成物の抗菌活性のスクリーニングは、松崎らの方法〔生物工学会誌，Vol.75,125-133（1977）〕に準じ、以下の試験菌に対して測定した。
【００１０】
試験菌：バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）IFO3205、エシェリシア・コリ（Escherichia coli）RB、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）VTU206、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）IAM1011
乳酸菌：エンテロコッカス・フェーカリス（Enterococcus faecalis）TH15、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）ATCC393、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）JCM1025
【００１１】
前記発酵生成物としては、耐熱性の観点から、１２１℃、２０分の熱処理した後にも、抗菌性が２５％以上失活しないものが好ましい。
【００１２】
前記のような発酵生成物を産生し得る乳酸菌の一例として、バングラデシュの伝統的な発酵乳（ダヒ（Ｄａｈｉ））より分離した乳酸菌が挙げられ、特に抗菌活性が高い乳酸菌としてストレプトコッカス・ボービスＪ２ ４０−２（Streptococcus bovis J2 40-2）を独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託申請し、「ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０８４１」（受領日：平成１８年３月１３日）の番号が付与されている。これらの乳酸菌が前記のような特異的な抗菌活性を有することは本件発明者らが初めて見出した事柄である。
【００１３】
前記ストレプトコッカス・ボービスＪ２ ４０−２（Streptococcus bovis J2 40-2）は、表１に示す性質を有しており、１６ＳｒＤＮＡ部分塩基配列の相同性解析の結果、ストレプトコッカス・ボービス（Streptococcus bovis）に近縁な乳酸菌であった（相同性９９．８％）。
【００１４】
【表１】
2007244324.tif 000002
【００１５】
また、本発明の乳酸菌を培養する培地としては、乳酸菌の増殖力が高いという点から、表２に示す組成を有するMRS液体培地,TYLG培地または還元脱脂乳培地からなる群から選ばれる培地が好ましい。
【００１６】
【表２】
2007244324.tif 000003
【００１７】
本発明に用いる発酵生成物は、前記MRS液体培地、TYLG培地または還元脱脂乳培地中において本発明の乳酸菌を至適生育温度（３７℃）で２４時間培養して得られるものが好ましい。中でも、得られた培養物から菌体をろ過、遠心分離などで取り除いたものが好適に用いられる。
【００１８】
以上のようにして得られる乳酸菌の発酵生成物は、抗菌剤として食品などに好適に用いられる。
したがって、本発明は、本発明の乳酸菌を培養して得られた発酵生成物を含有してなる抗菌剤、および前記乳酸菌を培養して得られた発酵生成物を含有してなる食品に関する。
【００１９】
前記抗菌剤中の発酵生成物の含有量としては、前記抗菌性が発現されるのであれば特に限定はなく、発酵生成物そのものを用いてもよい。
また、前記発酵生成物の抗菌性を阻害しないのであれば、前記抗菌剤中には公知の他の成分を配合していてもよく、このような他の成分の種類や含有量についても特に限定はない。
【００２０】
また、本発明において食品には、ヒトが摂取する食品（例えば、畜肉食品、チーズなどの乳製品）に加えて、非ヒトの哺乳動物（例えば、ネコ、イヌ、トリ、マウス、ネズミ、ウマ、ウシ、ブタなどのペットや家畜動物）用の餌、飼料なども含まれる。
食品中における発酵生成物の含有量としては、一概に限定できないが、例えば、固形分換算で３〜１５ｇ／ｋｇであればよい。
【００２１】
前記のようにして得られた食品は、保存期間が長くても、リステリア・モノサイトゲネスの増殖が顕著に抑えられるため、酸味などの風味の劣化を低減させることができる。
したがって、本発明は、
〔１〕  本発明の乳酸菌を培養して得られた発酵生成物を食品に添加する工程を有する、食品改質方法、
〔２〕  本発明の乳酸菌を培養して得られた発酵生成物を食品に添加する工程を有する、食品の製造方法
に関する。
【実施例】
【００２２】
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお、実施例において「部」や「％」は重量基準である。
【００２３】
（実施例１）乳酸菌の抗菌活性スクリーニング
乳酸菌（ストレプトコッカス・ボービスＪ２  ４０−２（Streptococcus bovis J2 40-2）（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０８４１））をMRSまたはTYLG液体培地で継代して十分活性化させ、前記液体培地に１％接種し至適生育温度で２４時間培養した。培養液を４℃で１００００ｇ、２０分間遠心分離し、菌体を沈殿させ、その上清を５Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ６．０に調整しフィルターを通してサンプル培養上清液とした。次にＭＲＳ，ＴＹＬＧ培地で十分活性化させた被検菌１％加えた標準寒天培地（食品汚染菌）、ＢＣＰ加プレートカウント寒天培地（乳酸菌）を作成し、松崎らの方法、即ちアガー・ウエル・ディフージョン法により阻止円の大きさによって抗菌活性を測定した。その結果を表３に示す。
【００２４】
【表３】
2007244324.tif 000004
【００２５】
表１の結果より、ストレプトコッカス・ボービス（Streptococcus bovis）Ｊ２  ４０−２株は食中毒菌のリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）に強い抗菌活性を示し、その他の有用乳酸菌であるラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）など類縁種に抗菌活性は示さなかった。
【００２６】
（実施例２）抗菌活性に及ぼすｐＨの影響
ストレプトコッカス・ボービス（Streptococcus bovis）Ｊ２  ４０−２株の培養上清のｐＨを２〜１３まで変化させ、それぞれを発酵生成物として用い、被検菌に対する抗菌活性を実施例１記載の方法で測定した。比較として、特許第２６３７８７９号記載のバクテリオシン、ナイシンを用いた。その結果を表４に示す。
【００２７】
【表４】
2007244324.tif 000005
【００２８】
抗菌活性の安定割合を次式により算出した。
ｐＨの調整後の抗菌活性／ｐＨの調整を行わない抗菌活性×１００（％）
【００２９】
表４の結果より、ナイシンがｐＨ４で２０％失活し、ｐＨ８以上で８０％以上失活したのに対し、ストレプトコッカス・ボービス（Streptococcus bovis）Ｊ２  ４０−２株の培養上清は、ｐＨ８で１００％抗菌活性を保ち、ｐＨ１０で１０％の失活、ｐH１１でも３０％程度しか失活せず、ナイシンとは顕著に異なる抗菌性を示すことがわかる。また、前記培養上清は、広いｐＨ領域でも高い活性を示すことから、ナイシンと比べて、実用上、優位な結果を示した。
【００３０】
（実施例３）抗菌活性に及ぼす熱処理とｐＨの影響
実施例２で得られた培養上清のｐＨを未調整（４．３）、ｐＨ６または８に調整し、それぞれを７０，９０，１１０，１２０℃、２０分間熱処理し後の抗菌活性を熱処理を行わないものに対する割合（％）を測定、算出した。その結果を表５に示す。
【００３１】
【表５】
2007244324.tif 000006
【００３２】
表５の結果より、ｐＨ未調整の場合では、１２１℃、２０分間の熱処理で２５％失活した。ｐＨ６に調整した場合では１１０℃、２０分間で３０％失活し、ｐＨ８に調整した場合では９０℃、２０分間で２５％失活であった。これらの結果から、発酵生成物を食品に配合し熱処理を実施してもまたは粉末化等のため加熱しても抗菌活性が維持されることを確認した。
【００３３】
（実施例４）各培地から得られた発酵生成物の抗菌活性
表３に示した各培地にストレプトコッカス・ボービス（Streptococcus bovis）を１％接種して２４時間培養し、培養液から菌体を除去したものを発酵生成物として用い、その抗菌活性を測定した。その結果を表６に示す。
【００３４】
【表６】
2007244324.tif 000007
【００３５】
表６の結果より、抗菌活性は３種いずれの培地由来の発酵生成物でも見られたが、ＭＲＳ培地由来のものが最も高く、発酵生成物の培地として最も適していた。
【００３６】
（実施例５）抗菌剤および畜肉製品での抗菌活性
実施例４において得られたＭＲＳ培地から調製した発酵生成物にデキストリン１０％添加し、加熱乾燥噴霧（条件：送風温度１６０℃、品温８５℃）し発酵粉末を調製した。発酵粉末または市販抗菌剤として酢酸製剤を添加したピックル液の配合組成（％）を表７に示す。以下、得られたピックル液を用いたハムの調製例を示す。
【００３７】
豚肉２００ｇにピックル液６０ｍｌを打ち込み５℃、３日間漬け込みを行った。発酵粉末、酢酸製剤は肉に対し各々１％添加となるよう調整した。熟成後、通常のハムの製法に従い調製後、被検菌〔リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）〕を１０3個／ｇとなるよう添加しひき肉状態にし包装した。各試験水準の試料を３０℃で保存し生菌数を測定した。
測定結果を表８に示す。
【００３８】
【表７】
2007244324.tif 000008
【００３９】
【表８】
2007244324.tif 000009
【００４０】
表７、８の結果より、被検菌であるリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）の増殖に対し、発酵粉末は酢酸製剤と同等の抑制効果が得られ、風味は酢酸の酸味も感じられず良好なものであった。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明の乳酸菌から得られる発酵生成物は、抗菌剤として、ヒトが摂取する食品（例えば、畜肉食品、チーズなどの乳製品）に加えて、非ヒトの哺乳動物（例えば、ネコ、イヌ、トリ、マウス、ネズミ、ウマ、ウシ、ブタなどのペットや家畜動物）用の餌、飼料などの食品に好適に使用することができる。