(57)【要約】    【課題】簡便にヒトリンパ管から直接分離、培養できる高品質の内皮細胞であるヒトリンパ管由来細胞株、およびそれを用いたリンパ系疾患等の診断キットを提供する。    【解決手段】ヒトリンパ管由来細胞株は、摘出されたヒトリンパ管の内腔にコラゲナーゼ液を灌流することにより、剥離させて採取した内皮細胞である。前記内皮細胞が、前記採取の後、低酸素環境下で培養したものであってもよい。診断キットは、前記のヒトリンパ管由来細胞株が基材上に播種されたものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
摘出されたヒトリンパ管の内腔にコラゲナーゼ液を灌流することにより、剥離させて採取した内皮細胞であることを特徴とするヒトリンパ管由来細胞株。
【請求項２】
前記内皮細胞が、前記採取の後、低酸素環境下で培養したものであることを特徴とする請求項１に記載のヒトリンパ管由来細胞株。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の内皮細胞に、マイコプラズマ除去剤を添加して、マイコプラズマ陰転化した後、精製したものであることを特徴とするヒトリンパ管由来細胞株。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のヒトリンパ管由来細胞株が基材上に播種されていることを特徴とする診断キット。
【請求項５】
半透膜を有する前記基材上に、前記ヒトリンパ管由来細胞株が、播種されていることを特徴とする請求項４に記載の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リンパ系疾患の生物学的解析のためや、リンパ系疾患用の医薬品の開発のために用いられるヒトリンパ管由来細胞株、およびそれを用いたこの疾患の診断キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
リンパ系は、炎症、免疫、癌転移等に携わるリンパが流れる組織・器官である。リンパ系は、組織間隙のリンパ液を、毛細リンパ管、微小リンパ管、集合リンパ管、リンパ節、主幹リンパ管、胸管の順で血管系へ送るものである。
【０００３】
このリンパ管に由来する細胞株は、炎症発症・免疫不全・癌転移等のリンパ系疾患の生物学的解析の研究のためや、抗炎症剤・抗癌剤のような医薬品の開発の際のスクリーニングのために、重要なものである。
【０００４】
このような細胞株のうちヒトリンパ管由来細胞株として、リンパ管内腔壁で内皮細胞を有するが平滑筋を有しない毛細リンパ管に由来するものが、コスモバイオ社から市販されている。このヒト毛細リンパ管由来細胞株は、リンパ管に特異的な表面マーカーを用いて選択された細胞であるが、ヒトリンパ管から直接分離されたものではない。
【０００５】
一方、ヒトリンパ管、中でも特に重要な機能であるポンプ作用を発現し平滑筋細胞と内皮細胞とのいずれもが存在するヒト集合リンパ管に由来した細胞株は、分離、培養された例がない。
【０００６】
そこで従来は、特許文献１に記載されているようなラットのリンパ管からトリプシン消化酵素により分離し、培養した内皮細胞を用いて、リンパ系疾患についてin vitroでの解析研究や医薬品の開発をしなければならなかった。
【０００７】
このラットリンパ管由来内皮細胞は、単にトリプシン消化酵素により分離したものであるから平滑筋細胞も多量に含んでいるため、いずれかの細胞のみを用いるべきリンパ系疾患の生物学的解析の研究や医薬品の開発に向いていない。さらに、ラットとヒトとでは種差があるため、患者に対する高感度で正確なリンパ系疾患診断キット等への応用ができないという問題がある。
【０００８】
そのため、ヒトリンパ管から直接分離、培養された内皮細胞である細胞株が望まれていた。
【０００９】
【特許文献１】特開２００４−２４８５７７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、簡便にヒトリンパ管から効率よく直接分離、培養でき高品質であって内皮細胞であるヒトリンパ管由来細胞株、およびそれを用いたリンパ系疾患等の診断キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記の目的を達成するためになされた特許請求の範囲の請求項１に記載されたヒトリンパ管由来細胞株は、摘出されたヒトリンパ管の内腔にコラゲナーゼ液を灌流することにより、剥離させて採取した内皮細胞であることを特徴とする。
【００１２】
ヒト集合リンパ管由来内皮細胞株を分離する際に用いるコラゲナーゼ液は、コラゲナーゼII液（Worthingron社製；品番S2B5456）が挙げられる。それの濃度は０．０１〜０．１％が好ましく、０．０５％が特に好ましい。ヒト集合リンパ管内腔を灌流する速度は、コラゲナーゼII液の場合、少なくともコラゲナーゼIIの酵素作用が発現できさえすれば如何なる速度でもよく、灌流を一旦停止させて内皮細胞を剥離させることも可能であるし、灌流をしたまま内皮細胞を剥離させていくことも可能である。コラゲナーゼII液の組成はコラゲナーゼIIが前述の濃度で含有されていれば特に限定されるものではない。
【００１３】
請求項２に記載されたヒトリンパ管由来細胞株は、前記内皮細胞が、前記採取の後、低酸素環境下で培養したものであることを特徴とする。
【００１４】
このヒトリンパ管は、ヒト集合リンパ管であることが好ましい。中でもヒト腋窩リンパ節輸入リンパ管であるとなお好ましい。
【００１５】
この低酸素環境下は、酸素濃度が１〜１０％であることが好ましく、３〜７％であることが一層好ましく、５％であることが特に好ましい。ヒト生体内のリンパ液中の酸素濃度が血液中の酸素濃度に比べ格段に低いことから、このような低酸素環境下での培養条件は、ヒトリンパ管由来細胞株の培養に最適なものであると考えられる。
【００１６】
請求項３に記載されたヒトリンパ管由来細胞株は、請求項１又は２に記載の内皮細胞に、マイコプラズマ除去剤を添加して、マイコプラズマ陰転化した後、精製したものであることを特徴とする。
【００１７】
このマイコプラズマ除去は、いかなる継代目に行ってもよいが、好ましくは２〜５継代目、特に好ましいのは２継代目である。マイコプラズマの除去には、例えば培養細胞用マイコプラズマ除去剤であるMynox (Minerva biolabs社製；商品名)15倍希釈液やMC-210（大日本製薬株式会社製；商品名）が用いられるが、特に限定されるものではない。少なくともマイコプラズマの除去が可能であれば如何なる方法や物質を用いてもよく、マイコプラズマ除去剤の濃度も特に限定されるものではなく、複数の手法を併用してもよい。
【００１８】
マイコプラズマ除去の前に、マイコプラズマ感染の有無を計測してもよく、マイコプラズマ除去の前であればいかなる継代目に計測してもよいが、好ましくは２〜５継代目、特に好ましいのは２継代目である。マイコプラズマ感染の有無の計測は、マイコプラズマ感染測定キットMycoplasma Plus PCR Primer Set (Stratagene社製；商品名)を使用してもよいが、少なくともマイコプラズマ感染の有無が計測出来さえすれば如何なる方法や物質を用いても良く、複数の手法を併用してもよい。
【００１９】
請求項４に記載された診断キットは、請求項１〜２のいずれかに記載のヒトリンパ管由来細胞株が基材上に播種されていることを特徴とする。
【００２０】
請求項５に記載された診断キットは、半透膜を有する前記基材上に、前記ヒトリンパ管由来細胞株が、播種されていることを特徴とする。
【００２１】
この診断キットは、少なくともヒトリンパ管由来細胞株である内皮細胞株が生育できさえすれば、如何なる培養用プレート、培養用スライドガラス、半透膜を用いてもよく、その形状や、培養表面の修飾状態などは、如何なるものであってもかまわない。診断キットに用いる培養液は少なくとも該細胞株が増殖できる培養液であれば如何なる成分組成であってもよいが、血管内皮細胞用培地であるＥＧＭ−２（三光純薬社製）が特に好ましく、hFGFやVEGFやR3-IGF-1やhEGFやVFGF-CやVEGF-DやPDGF-BBといったサイトカイン、アスコルビン酸などの各種ビタミン、hydrocortisoneといったステロイド、血清など如何なる添加物が含まれていてもよい。また、細胞数は播種基材の面積によるが、１×１０４〜１×１０５個／平方センチメートルであることが好ましい。
【００２２】
これらの細胞株は、現在市販されているHUVEC(human umbilical vein endothelial cells: Takara #CC-2517)やヒト皮下組織から採取したHMVEC（human microvascular endothelial cells：Takara #CC-2505)と同様に、単一細胞由来ではなく、可能継代数も１０継代程度という性質を有する。
【００２３】
このヒトリンパ管由来内皮細胞株は、平成１８年１月１８日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１−１−１）で受領され、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７６８が付されたものである。
【発明の効果】
【００２４】
本発明のヒトリンパ管由来細胞株は、ヒトリンパ管から、簡便な灌流工程を経て内皮細胞を、高品質で採取したもので、また効率よく確実に培養できるものである。
【００２５】
このような樹立されたヒトリンパ管由来細胞株は、ヒトリンパ管に由来しているから動物種差を考慮することなく、患者のリンパ系疾患の生物学的解析の研究、薬物輸送剤のような医薬品の開発、診断キットの製造に使用できるものである。
【００２６】
この細胞株やそれが播種された診断キットは、癌細胞の粘着・接着性、リンパ管内皮細胞への薬剤の透過性機能等について、生物学的特性、物理学的特性、化学的特性の差によるin vitro の定量的な評価をしたり、炎症時のアルブミン透過性変化、癌のリンパ管浸潤、癌のリンパ節転移等のメカニズムを解明したりするのに有用である。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明の実施例を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２８】
ヒトリンパ管由来細胞株の一例として、ヒト集合リンパ管から分離、培養したヒト集合リンパ管由来内皮細胞株について順次説明する。
【００２９】
以下のようにしてヒト集合リンパ管由来内皮細胞株を分離した。
【００３０】
信州大学医学部乳腺外科内での乳癌患者の乳腺内分泌外科手術によるセンチネルリンパ節生検症例のうち、その手術前に同意が得られた患者から、手術時に摘出された周囲組織が付着したままヒト腋窩リンパ節輸入リンパ管であるヒト集合リンパ管の提供を受けた。
【００３１】
ヒト集合リンパ管由来の細胞以外の混入を避けるため、実体顕微鏡下で、このリンパ管外周の脂肪、毛細血管などの組織を剥離した。灌流、洗浄、細胞採取を行うために細いポリエチレンチューブを、ヒト集合リンパ管内腔に挿入して留置した。この内腔を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ溶液）で灌流して洗浄した。この内腔に、０．０５％のコラゲナーゼII液（Worthington社製；品番S2B5456）を充填した。それを３７℃の培養器内で内皮細胞の剥離が認められる時間、主に１０分間静置した。
【００３２】
培地および培地添加物として、血管内皮細胞用増殖培地ブレットキットＥＧＭ−２（三光純薬社；品番ＣＣ−３１６２）５００ｍｌ、および牛胎児血清（Fetal Bovine Serum：ＦＢＳ）（Japan Bioserum社製；品番S1560）４０ｍｌを用いる。
【００３３】
ヒト集合リンパ管内腔を１０％ＦＢＳ添加ＥＧＭ−２の１ｍｌで灌流し、この内腔に剥離した内皮細胞を回収した。この内皮細胞の回収液をチューブに入れ、２０００r.p.m.で５分間遠心し、内皮細胞成分を採取した。これによりヒト集合リンパ管由来内皮細胞株が分離できた。
【００３４】
ヒトリンパ管由来内皮細胞株を以下のようにして培養した。
【００３５】
細胞の接着を向上させるためＩ型コラーゲン（新田ゼラチン社製；品番I-P）を塗布した３５ｍｍ細胞培養用プレートに、採取したうちの１×１０５個の内皮細胞を播種し、培地として１．５ｍｌの１０％ＦＢＳ添加ＥＧＭ−２を入れて、３７℃で、５％酸素、５％二酸化炭素および９０％窒素の低酸素環境下で培養した。ダブリングタイムは、約４８時間であった。コンフルエントになったらそれを、ＰＢＳ溶液で洗浄し、０．２５％トリプシン液により３７℃で３分間処理した後、細胞を回収して２０００r.p.m.で５分間遠心し、Ｉ型コラーゲンを塗布した３〜４枚の新しい３５ｍｍ細胞培養用プレートに播種した。またコンフルエントになったら適宜継代培養を施行した。
【００３６】
これらの細胞は、患者由来の細胞のためか初代継続代時すでにマイコプラズマ感染を認める症例もあるため、２継代目にまずマイコプラズマ感染測定キットMycoplasma Plus PCR Primer Set (Stratagene社製；商品名)を用いて感染の有無を計測した。計測の結果、マイコプラズマ陽性である場合には、培養細胞用マイコプラズマ除去剤であるMynox (Minerva biolabs社製；商品名)15倍希釈液およびMC-210（大日本製薬株式会社製；商品名）0.5μg/mlの単独もしくは併用方法にてマイコプラズマ除去を行った。
【００３７】
マイコプラズマが陰転した後も、適時（２継代毎程度）マイコプラズマ感染状況を上記感染測定キットにて確認し、マイコプラズマ陰性の細胞株を樹立した。
【００３８】
（ヒトリンパ管由来内皮細胞株の増殖能評価）
酸素５％という低酸素環境下と酸素２０％という通常の酸素環境下とでそれぞれ９６時間かけてこのヒトリンパ管由来内皮細胞株を培養した場合に、顕微鏡でそれぞれの１視野の細胞数を数えることにより、酸素濃度毎の内皮細胞株の増殖能の相違を検討した。その結果、通常の酸素環境下での内皮細胞株の培養よりも低酸素環境下での内皮細胞株の培養の方が、一層優れた増殖能を示していた。
【００３９】
（ヒトリンパ管由来内皮細胞株の保存）
ヒトリンパ管由来内皮細胞株の保存条件は、０．２５％トリプシン液で内皮細胞株を回収し、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および９０％ＦＢＳからなる凍結保存液を用いて細胞懸濁液を調製した後、凍結チューブに入れ、バイセルを用いて段階的に冷却し、最終的に液体窒素内で保存するというものである。その融解条件および融解時培養条件は、凍結チューブを３７℃の恒温槽で融解させ、２０００r.p.m.で５分間遠心して内皮細胞株を回収し、細胞培養液として１０％ＦＢＳ添加ＥＧＭ−２を用いて細胞懸濁液を調製し、前記の内皮細胞株の培養の条件と同様にして培養するというものである。
【００４０】
次に、ヒトリンパ管由来内皮細胞株の生物学的特性について調べた結果を示す。
【００４１】
（ヒトリンパ管由来内皮細胞株の生物学的特性）
Ａ．  ＣＤ３１（platelet endothelial cell adhesion molecule：ＰＥＣＡＭ）による免疫染色観察
培養系に移行したヒト集合リンパ管由来内皮細胞株をスライドガラス上に播種した。培養を継続し、コンフルエントになったところで、これを１０％ホルマリンにて固定した。０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）添加ＰＢＳ溶液にてブロッキングした後、一次抗体として内皮細胞のマーカーであるＣＤ３１（Santa Cruz社製；品番sc-8306）を１：１００に０．１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ溶液で希釈して加え、４℃で一晩静置した。その一次抗体をＰＢＳ溶液で洗浄した後に、この一次抗体に見合う二次抗体として色素で蛍光標識してあるgoat anti-rabbit IgG-FITC（Santa Cruz社製；品番sc-2012）を０．１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ溶液で１：１００に希釈して加え、室温で１時間静置した。その二次抗体をＰＢＳ溶液で洗浄した後、Mobi GLOW Mounting Medium（Mo Bi Tec社；品番MGM01）に封入して蛍光顕微鏡で観察したところ、この内皮細胞株は、緑の蛍光色を示し、ＣＤ３１に対して陽性であることが確認された。
【００４２】
Ｂ．  ＶＥＧＦ−Ｒ３（vascular endothelial growth factor receptor 3）による免疫染色観察
培養系に移行したヒト集合リンパ管由来内皮細胞株をスライドガラス上に播種した。培養を継続し、コンフルエントになったところで、これを１０％ホルマリンにて固定した。０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）添加ＰＢＳ溶液にてブロッキングした後、一次抗体としてリンパ管内皮細胞の特異的なマーカーであるＶＥＧＦ−Ｒ３（Santa Cruz社製；品番sc-637）を１：１００に０．１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ溶液で希釈して加え、４℃で一晩静置した。その一次抗体をＰＢＳ溶液で洗浄した後に、この一次抗体に見合う二次抗体として蛍光標識してあるgoat anti-rabbit IgG-FITC（Santa Cruz社製；品番sc-2012）を０．１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ溶液で１：１００に希釈して加え、室温で１時間静置した。その二次抗体をＰＢＳ溶液で洗浄した後、Mobi GLOW Mounting Medium（Mo Bi Tec社；品番MGM01）に封入し、蛍光顕微鏡で観察したところ、この内皮細胞株は、緑の蛍光色を示し、ＶＥＧＦ−Ｒ３に対して陽性であることが確認された。
【００４３】
Ｃ．  ＬＹＶＥ−１（lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1）による免疫染色観察
一次抗体としてリンパ管内皮細胞の特異的な別のマーカーであるＬＹＶＥ−１（Santa Cruz社製；品番sc-19316）を用い、二次抗体として蛍光標識であるdonkey anti-goat IgG-FITC（Santa Cruz社製；品番sc-2024）を用いたこと以外は、ＶＥＧＦ−Ｒ３による免疫染色と同様に観察したところ、この内皮細胞株は、緑の蛍光色を示し、ＬＹＶＥ−１に対して陽性であることが確認された。
【００４４】
これらのＣＤ３１、ＶＥＧＦ−Ｒ３およびＬＹＶＥ−１の免疫染色の観察の結果から明らかなように、リンパ管由来内皮細胞株は培養系に移行させても、ＣＤ３１、ＶＥＧＦ−Ｒ３およびＬＹＶＥ−１の発現が認められ、内皮細胞の生物学的特性が維持されていた。したがって、リンパ管由来内皮細胞株の分離・培養が樹立できたと確認された。
【００４５】
Ｄ．  細胞骨格蛋白Ｆ−ａｃｔｉｎによる染色観察
培養系に移行したヒト集合リンパ管由来内皮細胞株をスライドガラス上に播種した。培養を継続し、コンフルエントになったところで、刺激因子として腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）（SIGMA社製；品番T-0157）の１０ｎｇ／ｍｌ、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）（Pepro Tech社製；品番200-01B）の１ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌのそれぞれを３％ＦＢＳ添加ＥＢＭ−２（三光純薬社；品番CC-3156）にて溶解して細胞上に付加し、２時間３７℃で培養した。これを、３．７％ホルマリンにて固定した。これをＰＢＳ溶液にて洗浄し、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（SIGMA社製；品番X-100）添加ＰＢＳ溶液内で５分間静置した。ＰＢＳ溶液にて洗浄し、ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ−ＦＩＴＣ  抗体（SIGMA社製；品番P-5282）を０．１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ溶液で１：５００に希釈して加え、室温で２時間静置した。ＰＢＳ溶液にて洗浄した後、Mobi GLOW Mounting Mediumに封入した。また、刺激因子を用いないこと以外は同様にしてネガティブコントロールを調製した。これらを蛍光顕微鏡で観察し比較したところ、刺激因子がないネガティブコントロールは不明瞭な緑の蛍光色を示しＦ−ａｃｔｉｎの発現が少なかったのに対し、ＴＮＦ−αやＩＬ−１βで刺激されたものは明瞭な緑の蛍光色を示しＦ−ａｃｔｉｎの発現の増加が確認された。
【００４６】
このＦ−ａｃｔｉｎによる染色の観察の結果から明らかなように、ヒト集合リンパ管由来内皮細胞株は、炎症性サイトカインによってこの内皮細胞株の骨格変化がおこり、炎症時に発生する浮腫が誘発されるものである。したがって、この内皮細胞株は、サイトカインによる骨格変化を抑制する抗炎症剤のような医薬品のスクリーニングに有用であることが示された。またリンパ系疾患の患者からリンパ球を含む末梢血を採取しそのリンパ球の接着能を評価したり、また患者から生検、採取した癌細胞の転移能を定量的に評価したりするためにも有用であることが示された。
【００４７】
さらにこのヒト集合リンパ管由来内皮細胞株は、癌細胞との接着性を有することを利用して、細胞質染色用蛍光色素ＣＦＳＥで蛍光標識したメラノーマ細胞のリンパ節への灌流をｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察するのに用いることもできる。また制癌剤をヒト集合リンパ管由来内皮細胞株に吸着もしくは修飾もしくは細胞内に取り込ませて、癌細胞を有するリンパ節にこの制癌剤を選択的に到達させるドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）に用いることもできる。
【００４８】
次に、ヒトリンパ管由来内皮細胞株が播種された診断キットの一例について説明する。
【００４９】
（内皮細胞株播種診断キットの作製およびそれを用いた評価）
前記のようにして分離、培養されたリンパ管由来内皮細胞株を、直径３５ｍｍ細胞培養用プレートに播種し、リンパ管由来内皮細胞株が生育可能な培地で培養し、コンフルエントになるまで培養し、内皮細胞株播種診断キットを作製した。
【００５０】
それを用いて、リンパ管由来内皮細胞株とヒト胃癌細胞との接着性について以下のようにして評価した。リンパ管由来内皮細胞株をＩＬ−１βの１ｎｇ／ｍｌで５時間刺激した。これに、アセチルグルコースアミンα（ＧｌｃＮＡｃα）発現株であるヒト胃癌細胞株ＡＧＳ（大日本製薬社製；品番09-1739）をトリプシンで剥離した後に培養液で希釈して細胞懸濁液を作成し、各プレートに５×１０５個を加え、３０分静置した。それを顕微鏡で観察した。一方、対照群として、リンパ管由来内皮細胞株をＩＬ−１βで刺激せずにＧｌｃＮＡｃα発現株および非発現株であるヒト胃癌細胞株を用いて同様に調製したものを、顕微鏡で観察した。その結果、炎症系サイトカインであるＩＬ−１β刺激でリンパ管内皮細胞と胃癌細胞の接着が亢進することが観察され、胃癌で高頻度に発現する糖鎖であるＧｌｃＮＡｃαは、ヒトリンパ管由来内皮細胞株との接着に関与していることが分った。これにより、胃癌細胞の接着抑制評価をすることができ、胃癌の転移能、特にリンパ節への転移能を診断することができる。
【００５１】
（別な内皮細胞株播種診断キットの作製およびそれを用いた評価）
先ず、前記のようにして分離、培養されたヒトリンパ管由来内皮細胞株を調製した。次いで、市販の血管内皮細胞用透過性評価キットin vitro  Vascular Permeability Assay Kit（CHEMICON社製：商品名）の２層チャンバー上室に形成された半透膜上へコラーゲンを塗布し、その上層に、血管内皮細胞を播種する代わりにヒト由来リンパ管内皮細胞株を２．０×１０５個ずつ播種した。一方そのキットのプレートウェルを形成する２層チャンバー下室に細胞増殖培地（１０％ＦＢＳ添加ＥＧＭ−２）を投与した。細胞が単層でコンフルエントなるまで、４８時間培養器内で培養し、別な態様の内皮細胞株播種診断キットを作製した。
【００５２】
それを用いて、リンパ管由来内皮細胞株透過性について、以下のようにして評価した。リンパ管由来内皮細胞株を、細胞刺激因子として１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αで一晩刺激した。内皮細胞株播種診断キットの２層チャンバー上室へ、透過性物質として血管内皮細胞透過性評価キットに添付のＦＩＴＣ−デキストランを加え、上室から下室へのそれの透過性を測定した。その相対蛍光ユニット（Relative Fluorescence Units：ＲＦＵｓ）は、約１３００ＲＦＵｓであった。ＴＮＦ−αで刺激しなかったこと以外は同様にした対照での相対蛍光ユニットは約３００ＲＦＵｓであった。その結果、ヒトリンパ管由来内皮細胞株をＴＮＦ−αで刺激することにより、ＦＩＴＣ−デキストランの透過性が亢進することが確認された。
【００５３】
また、透過性物質として４ＫＤａ、１２ＫＤａ、７７ＫＤａなどのように分子サイズが異なるＦＩＴＣ−デキストラン、およびＦＩＴＣでラベルされ７７ＫＤａのデキストランとほぼ同じ分子サイズのアルブミンについても、同様にして透過性を測定した。その結果、透過性は、デキストランの分子サイズに依存し、また、ほぼ同じ分子サイズのデキストランとアルブミンとで相違する性質にも依存していることが分かった。このようにして、ヒトリンパ管由来内皮細胞株による透過性評価をすることができ、透過性を制御するメカニズムや内皮機能の研究、内皮細胞の薬剤の透過の影響の診断をすることができる。なお、細胞刺激因子としてＴＮＦ−αを用いた例を示したが、ＩＬ−１βを用いても同様に透過性を測定できる。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明のヒトリンパ管由来細胞株は、リンパ系の疾患の病態研究や医薬品開発の際のスクリーニングのツールとして用いられるものである。またこの細胞株を播種したキットは、サイトカインにより炎症を抑制するような抗炎症剤や抗癌剤の有効性の確認、患者の癌転移能評価や浮腫誘発評価や末梢血のリンパ球の接着能評価などリンパ系の疾患の臨床での診断のために用いられる。