(57)【要約】【課題】  細胞又は組織等の細胞試料や、コラーゲン膜等の生体適用膜等の生体適用材料中のエンドトキシンを測定するために用いられる、生体適用材料のエンドトキシン測定のための前処理方法、及び該試料中のエンドトキシン測定方法を提供すること。【解決手段】  生体適用材料を、０.１８規定以下の強アルカリ溶液中で処理することを特徴とする、エンドトキシン測定のための当該生体適用材料の前処理方法、及びこの方法により処理を行ったエンドトキシン測定用試料中のエンドトキシン測定方法、並びにこれらの方法に用いられるエンドトキシン測定のための生体適用材料の前処理用キット及びエンドトキシン測定用キット。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体適用材料を、０.１８規定以下の強アルカリ溶液中で処理することを特徴とする、エンドトキシン測定のための当該生体適用材料の前処理方法。
【請求項２】
生体適用材料が培養細胞である、請求項１に記載の前処理方法。
【請求項３】
生体適用材料が生体適用膜である、請求項１に記載の前処理方法。
【請求項４】
強アルカリが水酸化ナトリウムである、請求項１〜３の何れかに記載の前処理方法。
【請求項５】
強アルカリ溶液で処理した後、酸で中和する、請求項１〜４の何れかに記載の前処理方法。
【請求項６】
酸が塩酸である、請求項５に記載の前処理方法。
【請求項７】
生体適用材料を０.１８規定以下の強アルカリ溶液中で処理した後、酸で中和し、得られたものをエンドトキシン測定用試料として用いて、エンドトキシンを測定することを特徴とする、当該生体適用材料中のエンドトキシン測定方法。
【請求項８】
エンドトキシン測定用試料をカブトガニ血球抽出物（以下、ＡＬと略記する。）と反応させ、その結果生ずる酵素活性化反応により活性化された酵素の活性を測定するか、又はその結果生ずるゲル化反応に基づく反応液の濁度の変化の程度やゲル化状態の程度を機器又は目視により測定し、その測定結果に基づいてエンドトキシンの測定を行う、請求項７に記載の測定方法。
【請求項９】
強アルカリが水酸化ナトリウムで、酸が塩酸である、請求項７又は８に記載の測定方法。
【請求項１０】
強アルカリ溶液及び酸を構成成分として含み、該構成成分はエンドトキシンフリーである、エンドトキシン測定のための生体適用材料の前処理用キット。
【請求項１１】
強アルカリが水酸化ナトリウムで、酸が塩酸である、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
強アルカリ溶液、酸、及びＡＬを構成成分として含むキットであって、該構成成分はエンドトキシンフリーである、生体適用材料中のエンドトキシン測定用キット。
【請求項１３】
強アルカリが水酸化ナトリウムで、酸が塩酸である、請求項１２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞又は組織等の細胞試料，コラーゲン膜等の生体適用膜等の、生体適用材料中のエンドトキシンを、例えばエンドトキシンとカブトガニの血球抽出物（以下、ＡＬと略記する。）との反応により生ずる酵素（プロテアーゼ等）の活性化反応やゲル化反応に基づいて測定する方法等のエンドトキシン測定方法に適用するための、生体適用材料の前処理方法及びこの方法により得られた試料を用いた生体適用材料中のエンドトキシンの測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドトキシンは、主にグラム陰性菌の細胞壁外膜に存在するリポ多糖（Lipopolysaccharide、ＬＰＳ）の一種であり、強い発熱性物質（Pyrogen）として一般によく知られている物質である。
【０００３】
また、エンドトキシンは生体内に入ると発熱、ショックを惹起するため、とくに医療用具、医薬品などのエンドトキシン汚染は重要な管理事項となっており、その測定法は日本や米国の薬局方にも収載されている。
【０００４】
医薬品の場合、静脈内投与であれは被投与個体において５.０ＥＵ／ｋｇ以下となるように基準が設けられており、これを満たさない薬品、器具は医薬品又は医療用具として認められない。従って、医療（特に再生医療）の現場においても、その素材たる細胞，組織，コラーゲン膜等の生体適用膜等がエンドトキシンで汚染された場合、ごく微量でも重篤な結果を招くことがあり、これらのエンドトキシン汚染量は厳密に管理されなければならない。しかもこれらの素材は生体外で何等かの処理を受けるため、エンドトキシンに汚染される危険性が高い。そのため、これら細胞，組織又は生体適用膜等の生体適用材料中のエンドトキシン濃度を測定し、エンドトキシンによる汚染の程度を知ることは重要であった。
【０００５】
エンドトキシンの測定方法としては、エンドトキシンがＡＬと反応して酵素の活性化を起こしたり、ゲル化反応を生じさせたりする性質を利用した測定法が種々開発され、利用されている。
【０００６】
日本薬局方、米国薬局方（United States Pharmacopoeia、ＵＳＰ）及びヨーロッパ薬局方（European Pharmacopoeia、ＥＰ）において、エンドトキシンの測定はＡＬを用いる測定法（ＬＡＬ法）によることと規定されている。しかし、この測定法は水系に溶解したエンドトキシンの測定を予定したものであり、細胞，組織又は生体適用膜のような固形物を測定するには、これらに含まれるエンドトキシンを水系にて測定できるようにする必要があった。
【０００７】
例えば医療用具のうち、ゴム製手袋など一部の製品に関しては有機溶媒を用いてエンドトキシンを溶出させ、有機溶媒を蒸発させた後に水系へ再溶解させて測定する方法が行われている。しかし、この方法はエンドトキシンの回収率が悪く、かつ測定に時間を要するという問題がある。一方、再生医療に用いられる細胞，組織又は生体適用膜等は直接生体に使用されるという点からも、使用直前に速やかにエンドトキシンの測定が行われなくてはならないし、エンドトキシンの汚染を高感度に検出できなくてはならない。そのため、上記のような有機溶媒を用いてエンドトキシンを溶出させ、測定する方法を再生医療に用いられる上記した如き材料に適用することは好ましくない。
【０００８】
その他、界面活性剤で細胞又は組織等を処理してこれらを可溶化させる方法も考えられたが、エンドトキシン測定時に界面活性剤が存在すると、エンドトキシンのミセル化障害を引き起こし、正確なエンドトキシンの測定が行えないという問題がある。
【０００９】
また、再生医療の分野で用いられるコラーゲン膜等の生体適用膜中のエンドトキシンを測定するためには、これらをエンドトキシンフリーの蒸留水中に浸漬し、ボルテックスミキサー等を用いて攪拌して、エンドトキシンを抽出し、そのようにして得られたものを試料とするという方法が行われているが、この方法では、必ずしも十分エンドトキシンを抽出しているとは言い難い。
【００１０】
以上のように、これら医療用具についてはエンドトキシンに関してバリデーション（validation）が確立されていないのが現状である。そのため、細胞、組織又は生体適用膜等の生体適用材料中に含まれるエンドトキシンを水系にて測定するための新たな前処理方法の確立が希求されていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、細胞又は組織等の細胞試料や、コラーゲン膜等の生体適用膜等の生体適用材料中のエンドトキシンを測定するために用いられる、生体適用材料のエンドトキシン測定のための前処理方法、及び該試料中のエンドトキシン測定方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は上記課題を解決する目的でなされたものであり、以下の構成よりなる。
（１）生体適用材料を、０.１８規定以下の強アルカリ溶液中で処理することを特徴とする、エンドトキシン測定のための当該生体適用材料の前処理方法。
（２）生体適用材料を０.１８規定以下の強アルカリ溶液中で処理した後、酸で中和し、得られたものをエンドトキシン測定用試料として用いて、エンドトキシンを測定することを特徴とする、当該生体適用材料中のエンドトキシン測定方法。
（３）強アルカリ溶液及び酸を構成成分として含み、該構成成分はエンドトキシンフリーである、エンドトキシン測定のための生体適用材料の前処理用キット。
（４）強アルカリ溶液、酸、及びＡＬを構成成分として含むキットであって、該構成成分はエンドトキシンフリーである、生体適用材料中のエンドトキシン測定用キット。
【００１３】
エンドトキシンに汚染された細胞，組織，生体適用膜等の生体適用材料中のエンドトキシン含量を測定するには、まず生体適用材料を溶解し、含有されたエンドトキシンがＬＡＬ測定の系にて反応する状態にする必要がある。本発明者等は上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、生体適用材料を強アルカリ溶液にて溶解し、それを酸で中和したものをエンドトキシン測定用試料として用いることにより、エンドトキシンの回収率が薬事法で希求される水準となり、且つ簡易に測定する事が可能となることを見出し、本発明を完成させるに到った。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の前処理方法により生体適用材料を前処理することにより得られる試料をエンドトキシンの測定に付した場合には、高い回収率で、エンドトキシンの測定を速やかに行うことができる。
【００１５】
また、例えば細胞試料を洗浄して得られた洗浄液について、エンドトキシンの測定を行った場合にはエンドトキシンが検出できず、エンドトキシン汚染が認められないと判定された細胞試料について、本発明の前処理方法により得られる試料を用いてエンドトキシンの測定を行ったところ、エンドトキシンが検出される場合があり、洗浄液では検出できなかった細胞内エンドトキシン汚染を検出することができる。
【００１６】
更に、薬事法では生体に投与される医薬品又は医療用具はすべてエンドトキシンの測定がなされることを求めており、またその生体投与における基準値が明記されている。例えば、静脈内投与される場合は被投与個体の体重当たり５.０ＥＵ／ｋｇ未満と規定されている。しかし、現在まで細胞又は組織内のエンドトキシンの測定法が確立されていなかったこともあり、再生医療に用いる医療用具は一つとして認可されていないのが実状である。本発明によって確立された生体適用材料のための前処理方法及び測定法は、再生医療における医療用具のvalidationに有効なものであり、再生医療における障害の１つを克服するものである。即ち細胞又は組織内のエンドトキシン、更にはコラーゲン膜等の生体適用膜のエンドトキシンを高回収率で速やかに測定する方法を確立したのであり、本技術開発により、再生医療領域の大きな壁の一つであった、生体適用材料中のエンドトキシンのvalidationが可能となり、また今後の再生医療の裾野を拡げ、再生医療用具の実業家・産業化に向けて大きな進歩となり、更には新たな産業の創出を導く礎となるのである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の生体適用材料の、エンドトキシン測定のための前処理方法としては、「生体適用材料を、０.１８規定以下の強アルカリ溶液中で処理する方法」が挙げられる。
【００１８】
本発明に係る生体適用材料としては、例えば再生医療等の医療分野で用いられるもの、例えば細胞試料や生体適用膜等が挙げられる。
【００１９】
細胞試料としては、細胞又は組織等が挙げられ、その具体例としては、例えば再生医療に用いられる、例えば線維芽細胞（fibroblast），体性幹細胞等の細胞、骨軟骨，乳房等の組織が挙げられる。また、前記した組織から分離された細胞やその培養細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３等の樹立化された細胞株等も挙げられる。
【００２０】
生体適用膜としては、例えば再生医療の分野で一般に用いられるアルギン酸膜、コラーゲン膜、ヒアルロン酸膜等の生体適用膜等が挙げられる。
【００２１】
また、その他の生体適用材料として、ヒアルロン酸溶液等も挙げられる。
【００２２】
これら生体適用膜や、ヒアルロン酸溶液等の生体適用材料は、医療用品又は医療用具として医家向けに販売されているものの他、使用目的に合うように特別に製造されたものを用いても良い。
【００２３】
これらの生体適用材料は、エンドトキシンフリーの生理食塩水等の等張液、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ），グッド緩衝液等の等張緩衝液（以下、これらを総称して「等張液」と呼ぶ場合がある。）等で洗浄した後、蒸留水や、上記したような等張液に再懸濁してから、本発明の前処理方法に付すことが望ましい。
【００２４】
本発明の前処理方法に用いられる強アルカリとしては、生体適用材料を破壊・溶解することができるものであれば特に限定されないが、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等が好ましいものとして挙げられる。
【００２５】
また、その使用濃度としては、細胞試料の種類やその濃度等によって異なり、必ずしも一定ではないが、生体適用材料を破壊、溶解できる濃度であればよい。また生体適用材料がエンドトキシンの測定に影響を及ぼすプロテアーゼやプロテアーゼインヒビター等を含有するものである場合には、これらを失活させることができる濃度であることが好ましい。但し、生体適用材料中に含まれるエンドトキシンを失活させる程、高濃度であってはならない。
【００２６】
そのような条件を満たす強アルカリの濃度としては、例えば生体適用材料が細胞試料等である場合には、処理する時の終濃度として、例えば処理する生体適用材料の蛋白質濃度０.１ｍｇ（総量）に対して０.１規定〜０.１８規定、好ましくは０.１３規定〜０.１８規定程度が挙げられる。
【００２７】
また、生体適用材料が生体適用膜等である場合には、生体適用材料０.１ｍｇに対して０.１規定〜０.１８規定、好ましくは０.１３規定〜０.１８規定程度が挙げられる。
【００２８】
また、これらのような濃度の強アルカリ溶液の使用量としては、処理する生体適用材料の蛋白質濃度０.１ｍｇ（総量）又は生体適用材料０.１ｍｇに対して０.２〜１ｍＬ、好ましくは０.２〜０.８ｍＬ程度である。
【００２９】
生体適用材料を強アルカリ溶液中で処理する方法としては、強アルカリが上記した如き所定濃度となるように生体適用材料中に添加、混合すれば足りる。
【００３０】
強アルカリ溶液を生体適用材料に所定濃度となるように添加する方法としては、生体適用材料に強アルカリを、最終的に所定濃度となるように添加できる方法であれば特に限定されないが、例えば(1)強アルカリを含む溶液を生体適用材料又はその懸濁液に適当量添加する方法、(2)強アルカリを含む溶液の適当量を予め適当な試料採取用試験管に分注しておき、それに生体適用材料又はその懸濁液を添加する方法、(3)所定濃度となるように、強アルカリを生体適用材料の懸濁液に添加する方法、(4)強アルカリを含む溶液を、所定濃度となるように生体適用材料又はそのペレットに加える方法等が挙げられる。
【００３１】
中でも、強アルカリ溶液中で処理する生体適用材料はＰＢＳ等の等張緩衝液や、生理食塩水等の等張液に懸濁したものを用いるのが好ましい。そして、操作の簡便性等も考慮すると、上記(1)の方法が、より好ましい方法として挙げられる。
【００３２】
強アルカリ溶液による生体適用材料の希釈倍率としては、特に限定されないが、希釈倍率が低すぎると、強アルカリの作用により生じた生体適用材料の溶解物のために液の粘性が上がったり、該液中に沈殿が生じたりする等の問題が生じるし、希釈倍率が高すぎるとエンドトキシンを適切に検出し得なくなる等の問題が生じる場合があるので、生体適用材料を含む溶液１容量に対して通常１〜１００倍容量、好ましくは１〜１０倍容量、より好ましくは２〜３倍容量程度が挙げられる。
【００３３】
強アルカリによる処理時間としては、生体適用材料の固形物（細胞膜、生体適用膜等）が破壊・溶解し、また試料中にセリンプロテアーゼやセリンプロテアーゼインヒビター等が存在する場合には、これらを失活させることができる程度の時間であれば良く、特に限定されないが、通常３０秒〜１０分間、好ましくは５０秒〜５分間程度が挙げられる。
【００３４】
以上のように、強アルカリ溶液で生体適用材料を処理することによって、生体適用材料を破壊・溶解して水系に溶解した状態にすれば、これを試料として用いて、続いてＬＡＬ測定法に付すことが可能となる。
【００３５】
尚、本発明の前処理方法により生体適用材料を前処理して得られたエンドトキシン測定用試料を、ＡＬ溶液を用いたエンドトキシン測定方法に付すためには、強アルカリで処理した生体適用材料を、更に酸で処理してアルカリを中和しておくことが望ましい。
【００３６】
そのために用いられる酸としては、強アルカリで処理した生体適用材料溶液を中和することができるものであればよいが、例えば塩酸、酢酸等が挙げられる。
【００３７】
その方法としては、強アルカリで処理した生体適用材料溶液に、酸を必要量添加すればよい。
【００３８】
また、その必要量とは、強アルカリで処理した生体適用材料溶液を中和できる量であればよい。例えば、用いた強アルカリと同濃度に調製された酸溶液を、強アルカリ溶液と同量加えればよい。その処理時間は、強アルカリで処理した生体適用材料溶液が、酸で中和されるのに必要な時間であればよい。
【００３９】
尚、本発明の前処理方法に用いられる強アルカリ溶液、酸溶液等は、当然のことながら測定に影響を与える量のエンドトキシンを含んでいてはならない。そのためには、例えばエンドトキシンフリーの蒸留水等を用いて希釈したものであって、エンドトキシンフリーであり、且つＬＡＬとエンドトキシンとの反応を促進又は阻害しないことを確認したものが望ましい。
【００４０】
ところで、本発明の前処理方法により得られたエンドトキシン測定用試料を、該試料中のエンドトキシン濃度を測定すべくＡＬを用いる所謂ＬＡＬ法に付した場合には、測定に何ら支障を生じず、正確な測定値が得られることが望ましい。しかし、ＬＡＬ法は、塩の影響も受けるため、本発明の前処理方法で、細胞試料に例えば水酸化ナトリウム溶液と塩酸溶液を加えて中和することにより生じる塩の量がある程度以上になると、ＬＡＬ法に影響を及ぼす可能性が否定できない。
【００４１】
従って、本発明の前処理方法により得られたエンドトキシン測定用料をそのままＬＡＬ法に付すためには、中和で生じる塩の濃度がＬＡＬ法に影響を及ばさない程度になるように、予め前処理に用いる強アルカリ及び酸の濃度を調整しておくか、あるいは前処理後のエンドトキシン測定用試料をエンドトキシンフリーの溶液で希釈して、中和で生じる塩の濃度を、ＬＡＬ法に影響を及ぼさない程度の濃度にしておく必要がある。ＬＡＬ法による測定に阻害を引き起こす塩濃度は約０.２４ｍｏｌ／Ｌ以上である。
【００４２】
また、このようにして調製されたエンドトキシン測定用試料のｐＨが、エンドトキシン測定の至適ｐＨではない場合には、ＨＥＰＥＳ，ＭＯＰＳ等のグッド緩衝剤等を適宜添加して、エンドトキシン測定に好適なｐＨに調製することが好ましい。
【００４３】
本発明に係るエンドトキシン測定用試料の前処理方法を具体的に説明するために、細胞試料を用いた一実施態様を以下に述べる。
【００４４】
先ず、例えば線維芽細胞（fibroblast）等の細胞試料をエンドトキシンフリーの溶液（等張液）で洗浄した後、蛋白質量が０.１ｍｇ protein／１００μＬとなるように蒸留水あるいはＰＢＳ等に懸濁させる。次いで例えば０.２規定の水酸化ナトリウム溶液を、細胞懸濁液の２倍容量加えて３０秒〜１分間分間攪拌し、細胞材料を破壊・溶解させる。次いで、水酸化ナトリウム溶液と同規定（この場合０.２規定）の塩酸を、水酸化ナトリウム溶液と同容量加えて、中和させる。以上の場合、細胞材料を処理する時の水酸化ナトリウムの終濃度は約０.１３３規定である。
【００４５】
本発明のエンドトキシン測定方法を実施するには、本発明の前処理方法により生体適用材料を前処理する以外は、自体公知の例えばＡＬを用いるＬＡＬ法等により、通常の測定条件（例えば反応時間、測定時の温度、測定波長等）、測定操作で測定を行えばよい。
【００４６】
また、ＬＡＬ法によるエンドトキシン測定用の市販されたキットを用いて測定を行っても良い。
【００４７】
本発明の前処理方法により処理したエンドトキシン測定用試料中のエンドトキシン量を、ＬＡＬ法を用いて測定する場合に用いられるＡＬとしては、通常のエンドトキシンの測定に使用できるものであれば特に限定されることなく挙げることができるが、例えばリムルス属（Limulus）、タキプレウス属（Tachypleus）或いはカルシノスコピウス属（Carcinoscorpius）に属するカブトガニの血球から抽出されたもので、エンドトキシンとの反応により酵素（プロテアーゼ等）の活性化やゲル化反応が生じるものであればよく、特に限定されない。
【００４８】
また、例えばＡＣＣ（Associates of Cape Cod）社、ヘマケム社、ウィタカーバイオプロダクト社（WhittakerBioproducts, Inc.）、エンドセイフ社（Endosafe, Inc.）、生化学工業(株)、帝国臓器(株)、及び和光純薬工業(株)等から市販されているＡＬ溶液の凍結乾燥品をもとに調製したものも当然のことながら使用可能である。
【００４９】
また、ＬＡＬ法の手法は、通常用いられる方法であれば特に限定されることなく使用可能である。
【００５０】
生体適用材料を本発明の前処理方法により処理して得られるエンドトキシン測定用試料中のエンドトキシンを測定するに当たっては、例えば試料をＡＬと反応させ、その結果生ずる酵素活性化反応により活性化された酵素の活性を測定するか、又はその結果生ずるゲル化反応に基づく反応液の、濁度の変化の程度やゲル化状態の程度を機器又は目視により測定し、その測定結果に基づいてエンドトキシンの測定を行う、いわゆるＬＡＬ法等の常法で行えばよい。
【００５１】
通常良く用いられる手法としては、例えば、ＦＤＡガイドライン（Guidelines on Validation of the Limulus Amoebocyte Lysate Test as an End-Product Endotoxin Test for Human and Animal Parenteral Drugs, Biologics and Medical Devices, Food and Drug Adm. (1987)）に記載されている合成基質法、比濁時間分析法、ゲル化転倒法等が挙げられる。
【００５２】
即ち、合成基質法はＡＬが活性化したときに現れるプロテアーゼ活性を、合成基質を用いて測定する方法であり、比濁時間分析法は、例えばトキシノメーターＭＴ−５５００、トキシノメーターＥＴ−２０１（和光純薬工業(株)製）、トキシノメーターＭＴ−２５１（和光純薬工業(株)製）、ＬＡＬ−５０００［ＡＣＣ（ASSOCIATES OF CAPE COD）社製］等の専用装置を用い、エンドトキシンとＬＡＬとを混合した後、透過光量がある一定の割合だけ変化するまでの時間（ゲル化時間）を測定することによる方法であり、ゲル化転倒法はＬＡＬの活性化によって形成されるゲルを目視によって判定する方法である。
【００５３】
また、エンドトキシンとＬＡＬとを混合して反応を開始させ、その結果生じるゲル化反応に基づく吸光度変化量が一定の値に到達するまでに要する時間（到達時間）を求め、この値を、到達時間とエンドトキシン濃度との関係を表す検量線に当てはめることにより行ってもよい。
【００５４】
本発明に係るエンドトキシンの測定方法を更に具体的に述べれば例えば以下の如くである。
【００５５】
ａ)合成基質法
生体適用材料を本発明の前処理方法で処理して得られるエンドトキシン測定用試料と、ＡＬとを、これらを混合した結果活性化される酵素の作用によりその一部が切断されて発色物質を遊離するような基質（合成基質）の存在下で混合した後、２５〜４０℃保温下に所定時間反応させる。その後、反応液に反応停止液（例えば塩酸溶液、酢酸溶液等）を添加して反応を停止させ、得られた最終溶液の所定の吸光度（或は蛍光強度）を適当な測定機器（例えば分光光度計、マイクロプレートリーダー、蛍光光度計等）を使用して測定する。
吸光度が測定できた場合には、その生体適用材料はエンドトキシンを含んでいると判断される。
【００５６】
また、生体適用材料中のエンドトキシン濃度を定量するには、得られた測定値を、濃度既知のエンドトキシン溶液を使用して予め作成しておいたエンドトキシン濃度と該測定値との関係を表す検量線に当てはめ、試料中のエンドトキシン濃度を求める。
【００５７】
ｂ)比濁時間分析法
生体適用材料を本発明の前処理方法で処理して得られるエンドトキシン測定用試料と、ＡＬとを混合した後、２５〜４０℃保温下で該混合液の透過光量の変化を適当な測定機器（例えば分光光度計、マイクロプレートリーダー等）を使用して測定し、透過光量がある一定の割合だけ変化するまでの時間（ゲル化時間、Ｔｇ）を求める。
透過光量の変化が測定できた場合には、その生体適用材料はエンドトキシンを含んでいると判断される。
【００５８】
また、生体適用材料中のエンドトキシン濃度を定量するには、測定によって得られたゲル化時間を、濃度既知のエンドトキシン溶液を使用して予め作成しておいたゲル化時間とエンドトキシン濃度との関係を表す検量線に当てはめ、試料中のエンドトキシン濃度を求める。
【００５９】
ｃ)ゲル化転倒法
１０×７５ｍｍの試験管中で、生体適用材料を本発明の前処理方法で処理することにより得られるエンドトキシン測定用試料とＡＬとを混合した後、２５〜４０℃保温下に６０分間反応させる。その後、これを１８０℃転倒させ、ゲルの形成の有無を判定する。
【００６０】
本発明の前処理用キットは、強アルカリ溶液及び酸を構成成分として含み、該構成成分はエンドトキシンフリーであることを特徴とするものである。夫々の構成要素の好ましい態様、具体例については上で述べたとおりである。
【００６１】
また、本発明の生体適用材料中のエンドトキシン測定用キットは、上記した如き方法によりエンドトキシンを定量する際に用いられるもので、強アルカリ溶液、酸、及びＡＬを構成成分として含むキットであって、該構成成分はエンドトキシンフリーであることを特徴とするものである。夫々の構成要素の好ましい態様、具体例については上で述べたとおりである。
【００６２】
以下に実施例、参考例等により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例等により何等限定されるものではない。
【実施例】
【００６３】
以下の実施例等において用いられる蒸留水は、すべてエンドトキシンフリーであることを確認したものである。また、使用する器具等は、予めオートクレーブ処理等を行って、エンドトキシンフリーとしたものである。
【００６４】
実験例１．エンドトキシン測定に及ぼす塩濃度の検討
［試薬］
・エンドトキシン溶液
E.coli 0111:B4 LPS（Difco社製）を秤取し、蒸留水で溶解して２５ＥＵ（エンドトキシン単位）／ｍＬのエンドトキシン溶液を調製した。
・塩化ナトリウム溶液
蒸留水に塩化ナトリウムを溶解して、０.１２５、０.２５、０.３、０.６２５、０.７５、１.０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム溶液を調製した。
【００６５】
［エンドトキシン測定用試料の調製］
エンドトキシン溶液１００μＬに、各濃度の塩化ナトリウム溶液４００μＬを添加し、攪拌して、エンドトキシン測定用試料とした（エンドトキシン濃度は５ＥＵ／ｍＬ）。
【００６６】
［エンドトキシン濃度の測定］
上記で得られたエンドトキシン測定用試料中のエンドトキシン濃度を、エンドトキシン測定用キットである市販のエンドトキシン−シングルテストワコー（和光純薬工業(株)製）を用い、当該キットのパンフレットに記載の操作法に従い、比濁時間分析法の常法に従って以下のようにエンドトキシンの測定を行った。
【００６７】
すなわち、エンドトキシン測定用試料２００μｌを、キットのリムルス試薬（凍結乾燥品。カブトガニ血球抽出物(ＡＬ)を含有する。）に添加し、ボルテックスミキサーにより数秒間攪拌した後、３７℃保温下に、トキシノメーターＭＴ−５５００（和光純薬工業(株)製）を用いて、上記混合液の透過光量が、測定開始から５％減少するまでの時間（以下、Ｔｇと略記する。）を測定した。別に、蒸留水と濃度既知のエンドトキシン溶液（塩化ナトリウムは含まない）を用いて同様の測定を行い、エンドトキシン濃度とＴｇとの関係を表す検量線を作成した。この検量線に基づいて、試料中のエンドトキシンの濃度を算出した。
また、比較として塩化ナトリウム溶液の代わりに蒸留水を用いて同様に前処理及びエンドトキシンの測定を行った。
【００６８】
尚、このキットを用いた測定では、測定に用いられた試料２００μｌは殆ど希釈されない。よって、０.１２５、０.２５、０.３、０.６２５、０.７５、１.０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム溶液を添加した各試料中の、エンドトキシン測定時の終塩濃度は、夫々０.１、０.２、０.２４、０.５、０.６、０.８ｍｏｌ／Ｌである。
【００６９】
［結果］
得られた結果を図１に示す。図１の横軸は、エンドトキシン測定時の終塩濃度を示す。
測定時のエンドトキシン量は５ＥＵ／ｍＬなので、得られた測定結果が２.５〜１０ＥＵ／ｍＬの範囲にある場合、日本薬局方で規定された、ＬＡＬ反応が阻害されていないと判断されるエンドトキシンの回収率である５０〜２００％ということになり、エンドトキシン測定の許容範囲内となる。
【００７０】
図１の結果から明らかな如く、エンドトキシン測定時の塩化ナトリウムの濃度（終塩濃度）が０.２ｍｏｌ／Ｌまでは、エンドトキシンの回収率が５０〜１００％（許容範囲内）であったが、塩化ナトリウムの終塩濃度が０.２４ｍｏｌ／Ｌ以上になると、エンドトキシンの回収率は著しく低下し、塩がエンドトキシンの測定に影響を及ぼしたことが判る。
以上のことから、エンドトキシン測定に影響を及ばさない塩濃度の上限は０.２４ｍｏｌ／Ｌ未満であることが判った。
【００７１】
実験例２．試料の前処理に用いる水酸化ナトリウムの濃度の検討
［試薬］
・エンドトキシン溶液：実験例１と同じもの（２５ＥＵ）を使用した。
・水酸化ナトリウム溶液
蒸留水に水酸化ナトリウムを溶解して、０.１５、０.２０，０.２５、０.３０、０.６２５、０.７５、１.０規定の水酸化ナトリウム溶液を調製した。
・塩酸溶液
蒸留水を用いて、０.１５、０.２０、０.２５、０.３０、０.６２５、０.７５、１.０規定の塩酸溶液を調製した。
【００７２】
［試料の前処理］
エンドトキシン溶液１００μＬに、各濃度の水酸化ナトリウム溶液２００μＬを添加し、１分間攪拌した。次いで添加した水酸化ナトリウム溶液と同規定の塩酸溶液を２００μＬ添加し、更に１分間攪拌した。これをエンドトキシン測定用試料とした（エンドトキシン濃度は５ＥＵ／ｍＬ）
尚、０.１５、０.２０、０.２５、０.３０、０.６２５、０.７５、１.０規定の水酸化ナトリウム溶液をエンドトキシン溶液に添加した前処理時の水酸化ナトリウムの終濃度は、夫々約０.１０、０.１３３、０.１６７、０.２０、０.４１７、０.５０、０.６６７規定である。
【００７３】
［エンドトキシン濃度の測定］
上記で得られたエンドトキシン測定用試料を希釈せずに用い、実験例１と同じキット及び機器を用いて、実験例１と同様の操作法により各試料中のエンドトキシン濃度を求めた。
また、比較として水酸化ナトリウム溶液の代わりに蒸留水を用いて同様に前処理及びエンドトキシンの測定を行った。
【００７４】
尚、前処理で０.１５、０.２０，０.２５、０.３０、０.６２５、０.７５、１.０規定の水酸化ナトリウム溶液を添加した各試料中の、エンドトキシン測定時の終塩濃度は、夫々約０.０６、０.０８、０.１０、０.１２、０.２５、０.３０、０.４０ｍｏｌ／Ｌである。
【００７５】
［結果］
得られた結果を図２に示す。図２の横軸は、試料の前処理時に添加した、水酸化ナトリウムの濃度を示す。
測定時のエンドトキシン量は５ＥＵ／ｍＬなので、得られた測定結果が２.５〜１０ＥＵ／ｍＬの範囲にある場合、日本薬局方で規定された、ＬＡＬ反応が阻害されていないと判断されるエンドトキシンの回収率である５０〜２００％ということになり、エンドトキシン測定の許容範囲内となる。
【００７６】
図２の結果から明らかな如く、添加した水酸化ナトリウム溶液の濃度が０.２５規定（エンドトキシン溶液に添加した前処理時の終濃度は０.１６７規定）までは、エンドトキシンの回収率が５０〜１２０％（許容範囲内）であったが、添加した水酸化ナトリウム溶液の濃度が０．３０規定以上になると、エンドトキシンの回収率は著しく低下し、水酸化ナトリウムがエンドトキシンの測定に影響を及ぼしたことが判る。
【００７７】
尚、添加した水酸化ナトリウムの濃度が０.３０規定の場合の、エンドトキシン測定時の終塩濃度は０.１２ｍｏｌ／Ｌであるので、実験例１の結果を考慮すると、実験例２のこの結果は、エンドトキシンとＡＬとの反応が、塩の影響を受けた為であるとは考えられない。
以上のことから、本発明の前処理を行った後、得られた試料を希釈せずにそのままエンドトキシン測定に供するためには、前処理時にエンドトキシン溶液に添加する水酸化ナトリウム溶液の濃度は０.３０規定未満（エンドトキシン溶液に添加した前処理時の終濃度は０.２規定未満）であることが判った。
【００７８】
実験例３.前処理法に及ぼす共存物質の影響
［試薬］
・エンドトキシン溶液
溶解液として（１）蒸留水、（２）ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Gibco社製）又は、（３）１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）及び抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン及びペニシリン）を含有するＤＭＥＭを用い、E.coli 0111:B4 LPS（Difco社製）を夫々の溶解液に溶解して、２５ＥＵ（エンドトキシン単位）／ｍＬのエンドトキシン溶液を調製した。
・水酸化ナトリウム溶液
蒸留水に水酸化ナトリウムを溶解して、０.２規定の水酸化ナトリウム溶液を調製した。
・塩酸溶液
蒸留水を用いて、０.２規定の塩酸溶液を調製した。
【００７９】
［試料の前処理］
エンドトキシンを各溶解液に溶解したエンドトキシン溶液夫々１００μＬに、水酸化ナトリウム溶液２００μＬを添加し、１分間攪拌した。次いで、塩酸溶液を２００μＬ添加し、更に１分間攪拌した。これをエンドトキシン測定用試料とした（エンドトキシン濃度は５ＥＵ／ｍＬ）。
尚、０.２規定の水酸化ナトリウム溶液をエンドトキシン溶液に添加した前処理時の、水酸化ナトリウムの終濃度は約０.１３３規定である。
【００８０】
［エンドトキシン濃度の測定］
上記で得られたエンドトキシン測定用試料を用い、また実験例１と同じキット及び機器を用いて、実験例１と同様の操作法により各試料中のエンドトキシン濃度を測定した。
尚、エンドトキシン測定時の終塩濃度は約０.０８ｍｏｌ／Ｌである。
【００８１】
［結果］
得られた結果を図３に示す。図３に於いて、（１）は溶解液として蒸留水を用いた場合、（２）は溶解液としてＤＭＥＭを用いた場合、（３）は溶解液として１０％ＦＣＳ及び抗生物質を含有するＤＭＥＭを用いた場合の結果を夫々示す。
【００８２】
測定時のエンドトキシン量は５ＥＵ／ｍＬなので、得られた測定結果が２.５〜１０ＥＵ／ｍＬの範囲にある場合、日本薬局方で規定された、ＬＡＬ反応が阻害されていないと判断されるエンドトキシンの回収率である５０〜２００％ということになり、エンドトキシン測定の許容範囲内となる。
【００８３】
図３の結果から明らかな如く、培地(DMEM)を含有するエンドトキシン測定用試料(2)、培地(DMEM)，血清及び抗生物質を含有するエンドトキシン測定用試料(3)の何れを用いても、エンドトキシンの回収率は１００％又はそれ以上（許容範囲内）であった。
以上のことから、本発明の前処理方法によりこれらの共存物質を含有する試料を前処理した後、エンドトキシン測定に付しても、これらの成分がエンドトキシン測定に及ぼす影響はないことが判った。
【００８４】
実施例１.前処理法に及ぼす細胞残渣の影響の検討
エンドトキシンに汚染されていないことが判っている細胞を用いて、本発明の前処理を行い、細胞残渣がエンドトキシン測定に及ぼす影響を検討した。
［試薬］
・水酸化ナトリウム溶液
蒸留水に水酸化ナトリウムを溶解して、０.１、０.２、０.５、１.０規定の水酸化ナトリウム溶液を調製した。
・塩酸溶液
蒸留水を用いて、０.１、０.２、０.５、１.０規定の塩酸溶液を調製した。
【００８５】
［試料の調製］
エンドトキシンに汚染されていないことを確認した健常ヒト皮膚由来線維芽細胞をＰＢＳで洗浄した後、蒸留水に再懸濁した（０.１ｇ protein／ｍＬ）。
【００８６】
［試料の前処理］
試料１００μＬ（０.１ｍｇ protein）に各濃度の水酸化ナトリウム溶液２００μＬを添加し、１分間攪拌して細胞を溶解させた。次いで、添加した水酸化ナトリウム溶液と同規定の塩酸溶液２００μＬを添加し、更に１分間攪拌した。これをエンドトキシン測定用試料とした。
【００８７】
尚、０.１、０.２、０.５、１.０規定の水酸化ナトリウム溶液をエンドトキシン溶液に添加した前処理時の水酸化ナトリウムの終濃度は、夫々約０.０６７、０.１３３、０.３３３、０.６６７規定である。
【００８８】
[エンドトキシン濃度の測定]
上記で得られたエンドトキシン測定用試料を用い、また実験例１と同じキット及び機器を用いて、実験例１と同様の操作法により各試料中のエンドトキシン濃度を測定した。
また、比較として細胞試料及び水酸化ナトリウム溶液の代わりに蒸留水を用いて同様に前処理及びエンドトキシンの測定を行った。
【００８９】
尚、前処理で０.１、０.２、０.５、１.０規定の水酸化ナトリウム溶液を添加した各試料中の、エンドトキシン測定時の終塩濃度は、夫々約０.０４、０.０８、０.２０、０.４０ｍｏｌ／Ｌである。
【００９０】
［結果］
得られた結果を図４に示す。
実施例１で細胞試料として用いた細胞は、エンドトキシンに汚染されていないことを確認したものである。従って、これを用いて調製されたエンドトキシン測定用試料はエンドトキシンが測定できないはずである。
【００９１】
図４の結果から明らかな如く、０.１mg protein／１００μＬの細胞が存在する細胞試料を、０.１規定の水酸化ナトリウムを添加して前処理した場合（前処理時の水酸化ナトリウムの終濃度は約０．０６７規定）には、エンドトキシンが測定された。これは水酸化ナトリウムの濃度が低かったために、細胞が十分に溶解されず、その細胞残渣がエンドトキシン測定に影響を及ぼし、バックグラウンドが高くなってしまったためと考えられる。
【００９２】
一方、０.２規定又は０.５規定の水酸化ナトリウムを添加して前処理した場合（前処理時の水酸化ナトリウムの終濃度は、夫々約０.１３３規定、約０.３３規定）には、バックグラウンドが殆ど検出されなかった。以上の結果を実験例２で得られた結果と考え合わせると、０.１mg proteinの細胞試料を前処理するために用いられる水酸化ナトリウムの前処理時の至適終濃度は０.１規定〜０.１８規定付近、好ましくは０.１３規定〜０.１８規定程度であることが判った。
【００９３】
実施例２．細胞増殖に及ぼすエンドトキシン汚染の影響
［試薬］
・水酸化ナトリウム溶液
蒸留水に水酸化ナトリウムを溶解して、０.２規定の水酸化ナトリウム溶液を調製した。
・塩酸溶液
蒸留水を用いて、０.２規定の塩酸溶液を調製した。
【００９４】
［細胞の培養］
エンドトキシンフリーの１０％ＦＣＳ及び抗生物質を含有するＤＭＢＭに、１０ＥＵ／ｍＬとなるようにエンドトキシン[ＣＳＥ：Control Standard Endotoxin]を添加した培地を調製した。エンドトキシンに汚染されていないことを確認した健常ヒト由来線維芽細胞（ヒト24才女性、前腕皮膚由来）をＰＢＳで洗浄した後、この培地に播き、培養した。
細胞の数が、夫々１.０５０，１.２００、１.３３３，１.６６６倍になったときに培養した細胞を所定量採取し、以下の方法で、細胞中のエンドトキシンの濃度を測定した。
【００９５】
［試料の前処理］
所定量採取した培地中の細胞を回収した後、ＰＢＳで洗浄して、０.１ｍｇ protein／１００μＬ以上になるように、蒸留水に再懸濁した。この細胞懸濁液１００μＬに、水酸化ナトリウム溶液２００μＬを添加し、１分間攪拌した。次いで塩酸溶液２００μＬを添加し、更に１分間攪拌した。これをエンドトキシン測定用試料とした。
以上の操作において、０.２規定の水酸化ナトリウム溶液を細胞懸濁液に添加した前処理時の水酸化ナトリウムの終濃度は、約０.１３３規定である。
【００９６】
［エンドトキシン濃度の測定］
上記で得られたエンドトキシン測定用試料を用い、また実験例１と同じキット及び機器を用いて、実験例１と同様の操作法により各試料中のエンドトキシン濃度を測定した。
尚、エンドトキシン測定時の終塩濃度は、約０.０８ｍｏｌ／Ｌである。
【００９７】
［結果］
得られた結果を図５に示す。
図５の結果から明らかな如く、細胞が増殖すると細胞中のエンドトキシンの濃度（ＥＵ／ｍｇ cell protein）も増加したことから、エンドトキシンが培地中に含まれている場合、細胞が増殖する際にエンドトキシンが取り込まれていくことがわかる。
すなわち、細胞又は組織がエンドトキシンで汚染されているか否かを調べるに当たっては、細胞又は組織それ自体について調べる必要があることがわかる。
従って、本発明の前処理法によって細胞試料を破壊・溶解した後、エンドトキシンを測定することが、特に再生医療の分野においては極めて有効であることがわかる。
【００９８】
実施例３．本発明の方法による生体適用膜のエンドトキシン汚染の測定
【００９９】
［試薬］
・水酸化ナトリウム溶液
蒸留水に水酸化ナトリウムを溶解して、０.２規定の水酸化ナトリウム溶液を調製した。
・塩酸溶液
蒸留水を用いて、０.２規定の塩酸溶液を調製した。
【０１００】
［生体適用膜］
下記の、医家向け商品を用いた。
・アルゴダームＴＭ（アルギン酸塩被覆剤、(株)メディコン製）
・テルダーミスＴＭコラーゲン単層タイプ（テルモ(株)製）
・テルダーミスＴＭシリコン膜付タイプ（テルモ(株)製）
・テルプラグＴＭ（コラーゲン製品、テルモ(株)製）
・スポンジ状アルギン酸創傷被覆剤((株)クラレ)
・ヒアルロン酸膜（Life Core社製）
【０１０１】
[生体適用膜の前処理]
ＰＢＳ ４００μＬに、各生体適用膜（０.１ｍｇ／４００μＬ以下）を浸漬した。これに水酸化ナトリウム溶液８００μＬを添加し、１分間攪拌して試料を溶解させた。次いで、塩酸溶液８００μＬを添加して更に１分間攪拌し、更に、１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７.４）８０μＬを添加して平衡化した。これをエンドトキシン測定用試料とした。
【０１０２】
尚、０.２規定の水酸化ナトリウム溶液を試料に添加した前処理時の水酸化ナトリウムの終濃度は、約０.１３３規定である。
【０１０３】
［エンドトキシン濃度の測定］
上記で得られたエンドトキシン測定用細胞試料を用い、また実験例１と同じキット及び機器を用いて、実験例１と同様の操作法により、各エンドトキシン測定用試料中のエンドトキシン濃度を測定した。得られた結果から、生体適用膜１g中のエンドトキシン濃度を求めた。
尚、エンドトキシン測定時の塩濃度は、約０.０８ｍｏｌ／Ｌである。
[結果]  結果を表１に示す。
【０１０４】
比較例１．従来法による生体適用膜のエンドトキシン汚染の測定
［試薬及び試料］  実施例３と同じものを用いた。
［試料の前処理］
ＰＢＳ ４００μＬに、各試料（０.１ｍｇ／４００μＬ）を浸漬した後、３０秒間ボルテックスミキサーにかけた。これをエンドトキシン測定用試料とした。
【０１０５】
［エンドトキシン濃度の測定］
上記で得られたエンドトキシン測定用細胞試料を用い、また実験例１と同じキット及び機器を用いて、実験例１と同様の操作法により、各試料中のエンドトキシン濃度を測定した。得られた結果から、生体適用膜１g中のエンドトキシン濃度を求めた。
【０１０６】
[結果]  結果を表１に併せて示す。
【０１０７】
【表１】
2007064895.tif 000002
【０１０８】
表１の結果から明らかな如く、本発明の方法によれば、従来法よりも約１０〜１００倍のはるかに高感度で、生体適用膜のエンドトキシン汚染を検出できることが判った。
【産業状の利用可能性】
【０１０９】
本発明の前処理方法により生体適用材料を前処理することにより得られる試料をエンドトキシンの測定に付した場合には、高い回収率で、エンドトキシンの測定を速やかに行うことができる。また、従来の、細胞試料を洗浄して得られた洗浄液についてエンドトキシンの測定を行う方法では検出できなかった細胞内エンドトキシン汚染を検出することができる。
【０１１０】
更に、本発明によって確立された生体適用材料のための前処理方法及び測定法は、再生医療における医療用具のvalidationに有効なものであり、再生医療における障害の１つを克服するものである。即ち細胞又は組織内のエンドトキシン、更にはコラーゲン膜等の生体適用膜のエンドトキシンを高回収率で速やかに測定する方法を確立したのであり、本技術開発により、再生医療領域の大きな壁の一つであった、生体適用材料中のエンドトキシンのvalidationが可能となり、また今後の再生医療の裾野を拡げ、再生医療用具の実業家・産業化に向けて大きな進歩となり、更には新たな産業の創出を導く礎となる。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】実験例１において得られた、各終濃度の塩の存在下に、エンドトキシン濃度の測定を行った結果を示す。
【図２】実験例２において得られた、各種濃度の水酸化ナトリウム溶液を用いてエンドトキシン溶液を前処理し、得られたエンドトキシン測定用試料中のエンドトキシン濃度の測定を行った結果を示す。
【図３】実験例３において得られた、各種溶解液で希釈したエンドトキシン溶液を本発明の前処理方法で処理し、得られたエンドトキシン測定試料中のエンドトキシン濃度の測定を行った結果を示し、（１）は溶解液として蒸留水を用いた場合、（２）は溶解液としてダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた場合、（３）は溶解液として１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）及び抗生物質を含有するＤＭＥＭを用いた場合の結果を夫々示す。
【図４】実施例１において得られた、各種濃度の水酸化ナトリウム溶液を用いて本発明の前処理方法で前処理した細胞試料について、エンドトキシン濃度の測定を行った結果を示す。
【図５】実施例２において得られた、エンドトキシンを含有する培養液で健常ヒト由来線維芽細胞を培養し、一定数にまで増殖した細胞中のエンドトキシン濃度を測定した結果を示す。
【図１】
2007064895.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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