(57)【要約】      （修正有）【課題】腫瘍抑制因子ｐ５３の不活性化に作用するｐ５３−ＭＤＭ２（オンコジーンタンパク質）複合体を免疫化学的に特徴付け、ｐ５３上のＭＤＭ２結合サイトの詳細を提供する。【解決手段】ＭＤＭ２との結合に寄与する、ｐ５３タンパク質の２８個のアミノ酸を超えず、且つ、アミノ酸配列ＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬを含む一部分か、これを保有する変異体かを含むポリペプチドの提供、及びこのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
医療的処理に用いるための化合物であって、
該化合物は、ｐ５３と、ＭＤＭ２との、または、アデノウイルスＥＩＢ ５８ｋＤタンパク質、ＴＡＴＡ ｂｏｘ結合タンパク質ＴＢＰ、及びＥ２Ｆファミリーの転写因子を含むｐ５３結合サイトを有するタンパク質との結合を阻害し、
該化合物は、２８個までのアミノ酸を有するペプチドを含み、
該ペプチドが配列ＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１）を含むｐ５３フラグメントであるか、または、配列ＦｘｘＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）、但しｘが任意のアミノ酸を表す、を保有するｐ５３フラグメントのペプチド変異体であり、
該ペプチドがＭＤＭ２に結合することができ、これによりｐ５３とＭＤＭ２との結合を阻害する化合物。
【請求項２】
前記ペプチドが、ｐ５３とＭＤＭ２との結合を防止することのできる、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
前記ペプチドが、配列ＴＦＳＤＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）を含むことを特徴とする請求項１または２記載の化合物。
【請求項４】
前記ペプチドが、配列ＦｘＥＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）、但しｘが任意のアミノ酸を表す、を含むことを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項５】
前記ＭＤＭ２タンパク質が、ヒトＭＤＭ２であることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
ヒトＭＤＭ２遺伝子の増幅を含む腫瘍細胞の成長の阻害のための医療的処置方法に用いられることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の化合物の有効量と、製薬的に許容されるキャリアまたは希釈剤とを組合せてなる製薬組成物。
【請求項８】
請求項１から６のいずれかに記載の化合物と異なる抗−腫瘍化学療法薬をさらに含む請求項７記載の組成物。
【請求項９】
オンコジーンタンパク質のｐ５３への結合を阻害する化合物の同定方法であって、
（ａ）２８個までのアミノ酸を有するペプチドであって、配列ＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１）を含むｐ５３フラグメントであるか、または、配列ＦｘｘＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）、但しｘが任意のアミノ酸を表す、を保有するｐ５３フラグメントのペプチド変異体であって、ＭＤＭ２に結合することができるペプチドを、
（ｂ）オンコジーンタンパク質またはその結合フラグメントに、
（ｃ）試験化合物の存在下で暴露し、
次いで、前記（ａ）と（ｂ）及び／または（ｃ）と（ｂ）との結合複合体を検出することを具備する方法。
【請求項１０】
前記オンコジーンタンパク質が、ＭＤＭ２またはヒトＭＤＭ２であることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記（ａ）及び（ｂ）の一方が固定化され、（ｃ）の存在下で固定化部位に存在する（ａ）及び（ｂ）の他方の存在を検出することを具備する請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
前記（ａ）及び（ｂ）の一方から選択される第１の化合物であって検出可能にラベルされた化合物の予め決定した量を、（ａ）及び（ｂ）の他方から選択される第２の化合物に結合し、 
前記（ｃ）を添加し、次いで、 
第２の化合物から遊離した第１の化合物、または、第２の化合物への結合を阻害された第１の化合物の量を検出することを特徴とする請求項９から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）が、配列ＦｘｘＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）を含む１２から２８個のアミノ酸を持つヒトｐ５３のフラグメントを含むことを特徴とする請求項９から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ハイスループットスクリーニングを提供するために用いられることを特徴とする請求項９から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物（ｃ）が、コンビナトリアル合成ペプチドライブラリーから得られたものである請求項９から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ヒトＭＤＭ２遺伝子の増幅を含む腫瘍細胞の成長を阻害するために使用するＤＮＡ分子であって、このＤＮＡ分子は、ｐ５３の２８個のアミノ酸を越えず、且つ、配列ＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１）を含む一部分か、または、配列ＦｘｘＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）、但しｘが任意のアミノ酸を表す、を保有するその変異体かを含むポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドはヒトＭＤＭ２と結合できることを特徴とするＤＮＡ分子。
【請求項１７】
ＭＤＭ２の存在を検出する方法であって、 
試験すべき試料に、２８個までのアミノ酸を有するペプチドであって、配列ＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１）を含むｐ５３フラグメントであるか、または、配列ＦｘｘＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）、但しｘが任意のアミノ酸を表す、を保有するｐ５３フラグメントのペプチド変異体であって、ＭＤＭ２に結合することができるペプチドを適用し、
ＭＤＭ２に特異的な抗体を用いて結合複合体の存在を検出することを具備する方法。
【請求項１８】
２８個までのアミノ酸を有するペプチドであって、配列ＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１）を含むｐ５３フラグメントであるか、または、配列ＦｘｘＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）、但しｘが任意のアミノ酸を表す、を保有するｐ５３フラグメントのペプチド変異体であって、ＭＤＭ２に結合することができるペプチド、及び、結合したＭＤＭ２の存在を検出することのできる少なくとも１つの抗体を具備することを特徴とするアッセイ用キット。
【請求項１９】
請求項１から６のいずれかに記載の化合物を含む、ヒトＭＤＭ２遺伝子の増幅を含む腫瘍細胞の成長の阻害のための医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガンの検出及び治療の領域に関する。より詳しくは、ｐ５３腫瘍抑制因子(tumour suppressor)の不活性化に関し、この抑制因子は、ヒトｐ５３タンパク質のアミノ酸１６−３０領域ＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬＰＥＮＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）によって表されるｐ５２の領域内のアミノ酸モチーフ(motif) を介するタンパク質の結合の結果生ずるものである。このようなタンパク質の例は、オンコジーン（腫瘍遺伝子）タンパク質ＭＤＭ２（ヒトＭＤＭ２）である。
【背景技術】
【０００２】
ｐ５３腫瘍抑制因子の非活性化は、ヒトの新形成においてしばしば見られることである。この不活性化は、ｐ５３遺伝子の突然変異よって、または、ＳＶ４０大型Ｔ及びＭＤＭ２等の抗原ウィルス性または細胞性オンコジーンタンパク質への結合を介して生ずる。野生種ｐ５３が腫瘍細胞の成長を抑制する機構は、未だほとんど解明されていないが、成長抑制の鍵となる特徴の１つが、ｐ５３の転写因子として作用する性質であることは明らかである（Farmer，G.，等,（1992）Nature，358，83-86; Funk，W.D.，等,（1992）Mol．Cell．Biol.，12，2866- 2871; Kern，S.E.，等,（1992）Science，256，827-830）。現在、成長抑制遺伝子を同定するための多くの研究がなされているが、この成長抑制遺伝子は、これらの遺伝子の近傍または内部の配列要素に結合するｐ５３によって調整される。このような遺伝子の多くが、既に同定されている。筋肉クレアチニンキナーゼ遺伝子（Weintraub，H.，等，（1991）Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，88，4570-4571; Zambetti，G.P. ，等,（1992）Genes Dev.，6，1143-1152）及びＧＬＮレトロウイルスエレメント（Zauberman，A.，等，Embo J.，12，2799-2808）のような場合には、これらの遺伝子が成長抑制において果たす役割が不明である。しかしながら、他の例、即ち、ｍｄｍ２（Barak，Y.，等,（1993）Embo J.，12，461-468; Wu，X.，等, （1993）Genes Dev.，7，1126-1132）、ＧＡＤＤ４５（Kastan，M.B.，等,（199 2）Cell，71，587-597）、及びＷＡＦ１またはＣＩＰ１（El-Beiry，W.S.，等, （1993）Cell，75，817-825; Harper，J.W.，等,（1993）Cell，75，805-816）では、細胞成長にそれらが関与していることが良く理解されている。
【０００３】
この明細書において、「ｍｄｍ２」はオンコジーンを示し、「ＭＤＭ２」はこの遺伝子の発現の結果得られるタンパク質を示すものとする。
【０００４】
オンコジーンとして知られるｍｄｍ２は、マウスのダブルミヌーテ(double minute)染色体に最初に見出された（Cahilly-Snyder，L.，等,（1987）Somatic Cell Mol．Genet．13，235-244）。続いて、そのタンパク生成物がｐ５３と複合体を形成することが見出されたが、それは、予め温度過敏性マウスのｐ５３遺伝子で形質変換されたラットの線維芽細胞系（クローン６）で観察された（Michalovitz，D.，等,（1990）Cell，62，671-680）。このラット細胞系は、３７℃で良好に成長したが、３２℃に下げるとＧ１停止を示し、これは、観察されたｐ５３コンホメーション及び活性における温度依存性スイッチと完全に一致した。しかし、ｐ５３−ＭＤＭ２複合体は、３２℃においてのみ豊富に観察され、この温度においてｐ５３は主に機能的または「野生種」形態をなしていた（Barak，Y.，等, （1992）Embo J.，11，2115-2121及びOren,，1992; Momand，J．等,（1992）Cell，69，1237-1245）。ラット細胞系を３２℃に移し、デノボ(de novo)タンパク質合成をブロックすることにより、ｍｄｍ２遺伝子によって「野生種」ｐ５３のみの発現が誘発されることが示され、これによってｐ５３転写活性から見た複合体の差別的豊富さが説明された（Barak，Y.，等,（1993）Embo J.，12，461-468 ）。この説明は、ｍｄｍ２遺伝子の最初のイントロン内の野生種ｐ５３のＤＮＡ結合サイトの同定によってさらに発展した（Wu，X.，等,（1993）Genes Dev.，7 ，1126-1132）。報告者は、このｐ５３のＤＮＡ結合サイトを採用することによって、野生種ｐ５３がＭＤＭ２とともに発現されるときに不活性化されると主張している。
【０００５】
このｐ５３の転写活性の阻害は、ｐ５３の活性化領域及び／またはＤＮＡ結合サイトをブロックするＭＤＭ２によっても起こりうる。従って、ＭＤＭ２の野生種ｐ５３の転写活性に対する阻害効果を介してｍｄｍ２発現が自己調整されることが提案された。このｐ５３−ｍｄｍ２自己調整フィードバック回路は、ｐ５３によって細胞成長が如何にして調整されるかの新たな洞察を提供した。第３のヒトの肉腫がｍｄｍ２遺伝子の増幅によるｐ５３調整された成長抑制に勝ると考えられている（Oliner，J.D.，等,（1992）Nature，358，80-83）。従って、ｐ５３とＭＤＭ２との相互作用は治療的目標の鍵となりうる。
【０００６】
ヒトＭＤＭ２タンパク質（従来は「ＨＤＭ２」とも呼ばれる）をエンコードするｃＤＮＡ配列が、ＷＯ９３／２０２３８から知られている。本出願は、ヒトＭＤＭ２タンパク質がヒトｐ５３と結合し、ＭＤＭ２とｐ５３との結合を阻害する分子がｐ５３のキレート形成を緩和することによって治療的であると示唆されたことを開示する。しかし、ｐ５３とＭＤＭ２との結合サイトは広範囲に渡り、ｐ５３のアミノ酸残基１３−４１が含まれ、並びにこのペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端からさらに９から３０残基も含まれることも示唆された。これは、結合を有意に阻害するためには、大型のポリペプチドまたは他の巨大分子が必要となることを示していると考えられる。
【特許文献１】ＷＯ９３／２０２３８
【非特許文献１】Farmer，G.，等,（1992）Nature，358，83-86
【非特許文献２】Funk，W.D.，等,（1992）Mol．Cell．Biol.，12，2866- 2871
【非特許文献３】Kern，S.E.，等,（1992）Science，256，827-830
【非特許文献４】Weintraub，H.，等，（1991）Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，88，4570-4571
【非特許文献５】Zambetti，G.P. ，等,（1992）Genes Dev.，6，1143-1152
【非特許文献６】Zauberman，A.，等，Embo J.，12，2799-2808
【非特許文献７】Barak，Y.，等,（1993）Embo J.，12，461-468
【非特許文献８】Wu，X.，等, （1993）Genes Dev.，7，1126-1132
【非特許文献９】Kastan，M.B.，等,（199 2）Cell，71，587-597
【非特許文献１０】El-Beiry，W.S.，等, （1993）Cell，75，817-825
【非特許文献１１】Harper，J.W.，等,（1993）Cell，75，805-816
【非特許文献１２】Cahilly-Snyder，L.，等,（1987）Somatic Cell Mol．Genet．13，235-244
【非特許文献１３】Michalovitz，D.，等,（1990）Cell，62，671-680
【非特許文献１４】Barak，Y.，等, （1992）Embo J.，11，2115-2121
【非特許文献１５】Oren,，1992; Momand，J．等,（1992）Cell，69，1237-1245
【非特許文献１６】Oliner，J.D.，等,（1992）Nature，358，80-83
【非特許文献１７】Thut-CJ，等，1995，Science，267，100-4
【非特許文献１８】Picksley及びLans,（1993）Bioasseys，15，10，689-690
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って本出願人は、ｐ５３−ＭＤＭ２複合体を免疫化学的に特徴付け、ｐ５３上のＭＤＭ２結合サイトを詳細に同定することを目指した。
【０００８】
驚くべきことに、ＭＤＭ２との結合には、ｐ５３内の比較的少数のアミノ酸しか含まれていないことが判明した。
【０００９】
この結合サイトの正確な同定は、ｐ５３とＭＤＭ２またはｐ５３結合サイトに類似したものを含むタンパク質との結合を分裂または阻害する分子を合理的に設計するために不可欠である。さらに、結合相互作用を分裂または阻害することのできる化合物を正確かつ迅速に同定することのできるスクリーニング方法の設計も可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本出願人は、ＭＤＭ２との結合に寄与するｐ５３タンパク質のサイトが、わずか６アミノ酸の短い配列であり、そのうちの３アミノ酸が臨界的であることを見出した。この配列は、ヒトではＴＦＳＤＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）（配列のアミノ酸１８−２３）、マウスではＴＦＳＧＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）であり、臨界的アミノ酸はＦ−−ＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）であることがわかった。ｐ５３のこの特定の領域における結合を分裂又は阻害することにより、ＭＤＭ２またはｐ５３結合サイトに類似したものを持つタンパク質との結合による有害な影響を回避することができる。ＭＤＭ２に類似したｐ５３結合サイトを持つタンパク質は、一般に、ヒトｐ５３タンパク質のアミノ酸１６−３０（ＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬＰＥＮＮ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）で表されるｐ５３の領域内のオンコジーンタンパク質を含む。
【００１１】
この発見は、最近、転写装置の２つの部材、即ちＴＡＦＩＩ４０及びＴＡＦＩＩ６０が、それらをｐ５３に結合させるため及びｐ５３の転写活性を仲介するために、Ｌｅｕ−２２及びＴｒｐ−２３を必要とするという報告によって強化された（Thut-CJ，等，1995，Science，267，100-4）。
【００１２】
ｐ５３の同じ２つのアミノ酸は、上記したようにＭＤＭ２の結合ばかりでなく、Ａｄ Ｅｌｂにも臨界的であることから、ＭＤＭ２及びＥｌｂが、ｐ５３に結合し、ｐ５３の転写活性をブロックするように作用するという仮説が強化される。
【００１３】
従って、本発明は、ｐ５３とＭＤＭ２または類似のｐ５３結合サイトを有するオンコジーンタンパク質との結合を阻害する方法を提供するが、この方法は、ｐ５３とＭＤＭ２との結合を分裂または阻害することのできる２８までのアミノ酸を持つペプチド、またはそれらに類似した機能を持つペプチドから選択された化合物の有効量を投与することからなる。
【００１４】
このような方法には、例えば、４から１０アミノ酸、好ましくは５から１０アミノ酸という小さなペプチド、及びそれらの類似したペプチドが特に好ましいと思われる。特に興味深いペプチドは、結合に臨界的であることがわかったｐ５３のフラグメントと一致するものである。そのようなペプチドは、ＷＯ９３／２０２３８で同定されたように、ヒトｐ５３の配列内のアミノ酸１８−２３のうちの少なくとも数個を含むｐ５３タンパク質のフラグメント、またはそれらに類似したペプチドを含む。好ましくは、これらのペプチドは、より良い膜透過を達成するために、環状、直線状、または誘導体のものである。
【００１５】
このタイプの新規なペプチドまたはペプチド類似物(analogues)は、本発明のさらなる態様を構成する。
【００１６】
従って、好ましいペブチドは、ＴＦＳＤＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）等の配列ＦｘｘＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）またはその一部を含む。ここで、「ｘ」は、任意のアミノ酸を表す。特別な実施態様では、配列中のアスパラギン酸残基がグルタミン酸残基に置換され、ＦｘＥＬＷという配列になっている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）、例えば、ＴＦＳＥＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）。
【００１７】
結合を阻害できる他の化合物は、ｐ５３ペプチドの前記の領域の三次元構造に近づけるように設計(modelled)された有機化合物である。従って、本発明の他の実施態様では、ヒトｐ５３のアミノ酸１９−２３に現れるようなＦ−−ＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）によって表されるアミノ酸の三次元構造に類似するように設計され、ヒトＭＤＭ２に結合する有機化合物である。特に、この有機化合物は、ヒトｐ５３のアミノ酸１８−２３の領域に現れるような、ＴＦＳＤＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）の配列の三次元構造に類似するように設計してもよい。
【００１８】
好ましいオンコジーンタンパク質はＭＤＭ２であるが、ＭＤＭ２の結合サイトに類似したｐ５３結合サイトを含む他のオンコジーンタンパク質に対するｐ５３の結合の分裂も、本発明の範囲に含まれる。そのような他のオンコジーンの例は、アデノウイルスＥＩＢ ５８ｋＤタンパク質、ＴＡＴＡ ｂｏｘ結合タンパク質ＴＢＰ、及びＥ２Ｆ科の転写因子である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
ここで用いる「ペプチド類似物」という表現は、問題のペプチドと同様の、特にｐ５３とＭＤＭ２との結合を阻害する機能的活性を有するペプチド変異体または有機化合物を意味する。このような類似体の例は、ＴＦＳＤＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）の配列、特に、ヒトｐ５３に現れるようなＦ−−ＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）アミノ酸の配列によって表されるアミノ酸の三次元構造に類似するように設計され、ヒトＭＤＭ２に結合する有機化合物である。
【００２０】
好ましい設計技術は、この分野において知られている。これは、分子の機能的相互作用を研究し、これらの相互作用を再現するように配列された機能性基を含有する化合物を設計するといった、いわゆる「ミメティックス(mimetics)」と呼ばれる設計を含む。
【００２１】
周知の製薬的活性化合物に対するミメティックスの設計は、「先行(lead)」化合物に基づく薬剤の開発で知られた方法である。これは、活性化合物の合成が困難または高価である場合、あるいは特定の投与方法に不適切である場合などに適している。例えば、ペプチドは、消化管においてプロテアーゼによって即座に消化されてしまうので、経口用組成物には適しない活性剤である。一般に、ミメティック設計、合成、及び試験は、目的とする特性のために多量の分子をランダムにスクリーニングすることを避ける。
【００２２】
与えられた目的とする特性を有する化合物からミメティックを設計するのに共通して用いられる工程がある。第１に、目的とする特性を決定するのに臨界的及び／または重要な、化合物の特定部分を決定する。ペプチドの場合、これは、ペプチドのアミノ酸残基を系統的に変化させることにより、例えば、各残基ごとに置換することによって行うことができる。化合物の活性領域を構成するこれらの部分または残基は、その「ファーマコフォア(pharmacophore)」として知られている。
【００２３】
ファーマコフォアが見出されれば、例えば、スペクトル技術、Ｘ線回折データ、及びＮＭＲといった源からのデータを使用して、その物理的性質、例えば、立体化学、結合、大きさ、及び／または電荷に従ってその構造が設計される。コンピュータ解析、類似性マッピング（原子間の結合ではなく、ファーマコフォアの電荷及び／または容積のモデル化）、及び他の技術を、この設計方法に用いても良い。
【００２４】
この方法の変形では、リガンドの三次元構造及びその結合相手が設計される。これは、リガンド及び／または結合相手が結合コンホメーションを変化させる場合に特に有効であり、これを考慮したモデルがミメティックの設計になる。
【００２５】
次いで、ファーマコフォアに類似した化学基(chemical group)をグラフトすることのできるテンプレート分子が選択される。テンプレート分子、及びそれにグラフとされる化学基は、その類似物の合成が容易になり、製薬的に許容され、インビボで分解されず、先行化合物の生物学的活性を維持するように選択されている。この方法で見出された類似物は、目的とする特性を有するか否か、どの程度発揮するかを見るためにスクリーニングされる。さらに、最適化や修飾を行い、インビボまたは臨床試験用の１つまたは複数の最終的類似物に到達することができる。
【００２６】
上述の方法で有用な化合物を同定するために、化合物のＭＤＭ２／ｐ５３相互作用の阻害についてスクリーニングしてもよい。好ましくは、スクリーニング方法は、ＭＤＭ２及びｐ５３のようなオンコジーンタンパク質の結合サイトを含有または発現するペプチド間の結合を阻害する化合物に関する観察に基づき、ここで与えられた前記結合サイトに関する情報に基づく。このような方法は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び酵素結合イムノアブソーバントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）等のこの分野で広く知られた免疫検定法技術を含む。特に好ましい技術は、ｐ５３またはオンコジーンのいずれかであるまたは発現するペプチド又は試薬の一方であるまたは発現するペプチド又は試薬を、試験すべき化合物と、ｐ５３またはオンコジーンタンパク質のいずれかであるまたは発現するペプチド又は試薬の他方に露出する競合アッセイ(competitive assay)技術である。そこで、結合した複合体の存在が検出される。これは、前記ペプチドまたは試薬の一方を、例えば金または他の可視ラベルでラベルする、あるいは、ラベルした抗体または抗体の配列であって、その一方が従来の方法でラベルされたものを投与することによって行なってもよい。例えば、ＭＤＭ２及びｐ５３に対する好ましい抗体をここに記す。好ましくは、ｐ５３またはオンコジーンタンパク質を発現するペプチドまたは試薬の１つを支持体に固定化する。
【００２７】
従って、本発明は、ヒトＭＤＭ２とヒトｐ５３との結合を阻害する化合物を同定する方法をさらに提供する。この方法は、第１のペブチド分子を固定化し、試験すべき化合物及び第２のペプチドを添加し、固定化サイトにおける結合した第２のペプチドの存在を検出することからなり、第１のペプチドまたは第２のペプチドの一方が、ＭＤＭ２またはＭＤＭ２の結合サイトに類似したｐ５３結合サイトを持つオンコジーンタンパク質または前記結合サイトを含むそのフラグメントであり、他方が、アミノ酸残基ＦｘｘＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）を含む５から２８のアミノ酸を持つヒトｐ５３のフラグメントまたはそのペプチド類似物である。
【００２８】
結合を検出するイムノアッセイを、以下に例示する。
【００２９】
アミノ酸１６−２５からなるｐ５３のＭＤＭ２結合サイトを含むビオチニル化した(biotinylated)ペプチド（または、例えばＴＦＳＤＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）を含む上記の小さなペプチド）をストレプトアビディン被覆したＥＬＩＳＡプレートに固定化した。これらのＥＬＩＳＡプレートに、試験化合物の存在下または不存在下で、組み換えＭＤＭ２タンパク質を添加した。次いで、これを４℃で２時間インキュベートした。結合したＭＤＭ２を、標準的なＥＬＩＳＡ方法によって検出した。これらの試薬の阻害又は刺激効果は、試験化合物を含まない対照用ウェル(well)を参照して決定した。実験のさらなる詳細は、以下に記述され、結合アッセイは図７に示される。
【００３０】
本発明は、定量的アッセイを含む。例えば、ヒトＭＤＭ２のヒトｐ５３への結合を阻害する化合物を同定する方法が提供され、この方法は、予め決められた量の検出可能なラベルされた第１のペプチド分子を第２のペプチドに結合させ、試験すべき化合物を添加し、第２のペプチドへの結合から置換(displace)または妨害(prevent)された第１のペプチドの量を決定することからなり、第１のペプチドまたは第２のペプチドの一方が、ＭＤＭ２またはＭＤＭ２の結合サイトに類似したｐ５３結合サイトを持つペプチドであり、他方が、をＷＯ９３／２０２３８に示されたように、ヒトｐ５３の配列の１８−２３アミノ酸残基を含む６から２８のアミノ酸を持つヒトｐ５３のフラグメントまたはそのペプチド類似物である。
【００３１】
上記で特徴づけられたようなＭＤＭ２結合サイトを含むｐ５３のフラグメントまたはそのペプチド類似物を含むアッセイは、本発明のさらなる部分を構成する。このアッセイは、キットとして調製され、これも本発明の一部を構成する。このアッセイの特に好適な形態は、生物学的試料中のオンコジーンタンパク質レベルの試験で採用されるものである。そのようなキットは、結合試薬としてｐ５３のフラグメントまたはそのペプチド類似物を具備するとともに、ＭＤＭ２等のオンコジーンタンパク質に特異的な抗体を具備する。さもなくば、結合複合体を検出することのできる抗体をキットに具備してもよい。
【００３２】
これは、診断において、白血病または肉腫やグリア芽腫といった固体カロイノーマス(solid caroinomas)の場合における血液試料中のオンコジーン即ちＭＤＭ２レベルの測定に用いることができる。
【００３３】
好ましくは、上記のアッセイ方法において、オンコジーンタンパク質はヒトＭＤＭ２及び配列ＴＦＳＤＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）を含む１２から２８のアミノ酸を持つヒトｐ５３のフラグメントである。
【００３４】
この方法は、例えば、９６−ウェルで実施することにより、高いスルー・プット・スクリーン(throughput screen)に容易に用いることができる。このような条件下で、自動化スクリーニング技術を適用できることは、この分野で容易に理解される。種々の起源からの化合物が、多量にスクリーニングできる。化合物の一つの可能な起源は、入手可能な合成的組合せ(synthetic combinatorial)のペプチドライブラリである。
【００３５】
このスクリーニング方法で同定された化合物の腫瘍の治療における使用は、本発明のさらなる態様を構成する。 
【００３６】
ガンや他の悪性疾患などの状況の治療方法が、本発明の化合物を投与することによって構成される。
【００３７】
従って、本発明は、ヒトＭＤＭ２遺伝子の増幅を含む腫瘍細胞の成長を阻害する方法も提供し、この方法は、ｐ５３とＭＤＭ２との結合を阻害できる化合物の有効量を投与することからなり、この化合物は、ｐ５３とＭＤＭ２との結合を分裂又は阻害できる２８までのアミノ酸を有するペプチド、あるいはそのペプチド類似物からなる群から選択される。
【００３８】
好ましくは、上記の治療方法において、化合物はヒトｐ５３の領域と一致し、例えば、ＴＦＳＤＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）等の配列Ｆ−−ＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）を含む６から２８アミノ酸を持つペプチドである。
【００３９】
さもなくば、この方法で用いられる化合物は、配列ＴＦＳＤＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）と、ＭＤＭ２上の同じサイトに結合する有機化合物などのペプチド類似物である。
【００４０】
これらの応用を用いるために、化合物は、製薬的に許容されるキャリアとの組成物の形態で適用するのが好ましい。これらは、固体キャリアでも液体キャリアでもよく、この分野で理解される経口または経腸投与に適した組成物であってよい。組成物の投与量は患者、特別な状況、及び選択した特定の化合物の性質に依存する。例えば、化合物がペプチドフラグメントである場合、０．１から１０ｍｇ／ｋｇが有効である。
【００４１】
ｍｄｍ２発現が、フィードバックループにおいて、ＭＤＭ２タンパク質の野生種ｐ５３の転写活性に対する阻害効果を介して自己調整的であることが示唆されている（Picksley及びLans,（1993）Bioasseys，15，10，689-690）。本発明によるｐ５３とＭＤＭ２との結合の阻害は、ｐ５３−ＭＤＭ２自己調整ループに影響する。ｐ５３のゲノムの防御という役割が与えられると、そのような効果を持つ化合物は、他の治療薬の活性を増進する。
【００４２】
従って、本発明のさらなる態様は、本発明の化合物の相乗的量と、他の抗ガン薬との組合せを含む製薬組成物である。
【００４３】
ＭＤＭ２−結合、ｐ５３誘導ペプチド、またはそれらの多重コピーをエンコードするＤＮＡも、腫瘍細胞に対して、ペプチドの投与の形態のように投与することができる。従って、本発明は、ヒトＭＤＭ２遺伝子の増幅を含む腫瘍細胞の成長を阻害する方法を提供し、この方法は、前記腫瘍細胞にｐ５３の一部分またはその変異体を含むポリペプチドを発現するＤＮＡ分子を適用することからなり、前記一部分はｐ５３の１８−２３アミノ酸を含み、前記ポリペプチドはヒトＭＤＭ２と結合できる。
【００４４】
このＤＮＡは、典型的には、ＭＤＭ２結合ペプチドの発現を達成するように正当に配置された発現に必要なＤＮＡ要素を有するレトロウイルス、ＤＮＡウイルス、またはプラスミド−ベクター等の発現構造体である。ＤＮＡは、中でも、リポソームにカプセル化して、あるいはこの分野で細胞に有効に取り込まれることが知られたような任意の形態で投与することができる。
【００４５】
結合サイトを詳細に同定することにより、本出願人は、このサイトを特異的に標的とする小さな治療用化合物を開発した。これは、小さな分子は細胞内に透過しやすく、治療的に活性なので有利である。さらに、この結果として、診断方法が、より正確かつ単純な分子を用いて行える。
【００４６】
本発明を、添付した図面を参照してさらに詳細に説明する。図１Ａ−１Ｂは、クローン６細胞から得られたＭＤＭ２、ｐ５３、及びＭＤＭ２ｐ５３複合体の免疫沈降のウェスタン・ブロットを示す。
【００４７】
図２Ａ−２Ｂは、３２℃で２４時間（Ａ）または引き続き３７℃で成長させたクローン６細胞におけるＭＤＭ２、ｐ５３、及びＭＤＭ２−ｐ５３複合体のレベルを決定するための２−サイトイムノアッセイの結果を示すグラフである。
【００４８】
図３Ａ−３Ｃは、モノクローナル抗体４Ｂ２を用いたＥＬＩＳＡアッセイによって決定したペプチドライブラリーに対するＭＤＭ２の結合の結果を示すグラフである。ヒト及びマウスｐ５３のライブラリーを、昆虫細胞抽出物単独（ＳＦ９）及びＭＤＭ２を発現する昆虫細胞抽出物（ＳＦ９ Ｍｕｓ ＭＤＭ２）でチャレンジした。ヒトｐ５３のＮ−末端から中間領域のペプチド番号３−５０の結果を３Ａに示し、ヒトｐ５３アミノ酸配列の残りとマウスｐ５３のＮ−末端配列の結果を３Ｂに示す。３Ｃは、検出用抗体４Ｂ２の特異性を証明するためのＢに由来する特定のペプチドを用いた対照実験の結果を示す。
【００４９】
図４は、ＭＤＭ２が結合するペプチド配列の同定、及び、ヒト及びマウスｐ５３上の一致したＭＤＭ２結合サイトの決定である。
【００５０】
図５Ａ−５Ｃは、各々、ＭＤＭ２、抗体ＤＯ−１、及び抗体Ｂｐ５３−１９結合のために必要な鍵となる残基を示す。
【００５１】
図６は、ＭＤＭ２と、ｐ５３のアミノ酸配列１８−２３に基づく一連のペプチドとの間の結合のレベルを示す。
【００５２】
そして、 図７は、本発明のイムノアッセイ法を例示する。
【００５３】
ＭＤＭ２タンパク質とｐ５３タンパク質との間の相互作用の最初に現れるのものは、マウスｐ５３の温度過敏性突然変異形態を発現したラット細胞系、クローン６に対する処置から見られた（Barak及びOren，1992，Michalovitz，D.，等, （1990）Cell 62,671-680；Momand，J.，等,（1992）Cell，69，1237-1245）。ＭＤＭ２は、３２℃でｐ５３と複合体の形成が容易に観察されるが、細胞が３７ ℃で成長したときには検出できる程度であった。
【００５４】
３２℃および３７℃でのクローン６細胞系におけるｐ５３−ＭＤＭ２複合体の形成を、定量的方法で再試験した。その結果、低温度でのＭＤＭ２レベルがかなり上昇しており、ＭＤＭ２が検出できる程度の温度である３７℃におけるレベルの約１０−３０倍であることが確認された。従って、ｐ５３−ＭＤＭ２複合体は、３２℃では容易に観察されるが３７℃では見られない。ｐ５３のレベルも２つの異なる温度で変化した。しかし、ｐ５３のレベルは、ＭＤＭ２の挙動とは反対に、３７℃において、３２℃のレベルの約５倍に上昇した。従って、ｐ５３とＭＤＭ２のレベルの相違は、異なる説明を有すると思われる。ＭＤＭ２の場合、他のグループが、３２℃でのＭＤＭ２の増加が、ｐ５３の推定された転写活性形態へのコンホメーション変化によるＭＤＭ２の転写の増加によるものであることが確立されている（Barak，Y.，等,（1993）Embo J.，12，461-468; Wu，X.，等,（199 3）Genes Dev.，7，1126-1132）。ｐ５３の発現に野生種ｐ５３が必要とされるとしても、同じ説明はｐ５３には当てはまらず（Deffie，A.，等，G.（1993）Mo l．Cel l．Biol.，13，3415-3423）、おそらく３７℃におけるｐ５３の突然変異コンホメーションの半減期の増加によって説明されるであろう（Gannon，J.V.，等,（1991）Nature，349，802-806）。これ以降に示すデータは、ＥＬＩＳＡによるｐ５３−ＭＤＭ２複合体の直接観察と、Ｂｐ５３−１９エピトープのロスの間接的推論を組み合わせた免疫沈降との両方を用いたが、ｐ５３分子のほとんど全てが、３２℃においてＣ６細胞の過剰なＭＤＭ２タンパク質と複合体形成することが示唆された。これは、この温度におけるこれらの細胞で見られるｐ５３に強く依存した転写応答とは一致せず、インビボにおいてＭＤＭ２に対する複合体形成がｐ５３を完全に不活性化できないか、少量の「フリーな」ｐ５３が極めて活性であるかのいずれかを示唆する。ｐ５３とＭＤＭ２との複合体は、個々の細胞レベルにおいて、おそらく細胞サイクルに依存した応答として、細胞中で機能的なｐ５３を放出するように調製されるのかもしれない。
【００５５】
本発明は、最小のＭＤＭ２結合サイトが、ＴＦＳＤ／ＧＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２及び３）であるという同定に基づいている。このサイトは、他のグループによって、ｐ５３のＭＤＭ２結合領域、特にａａ１−４１及び１３−５７（Oliner, J.D.，等,（1993）Nature，362，857-860）、ａａ１−５２（Chen，J.，等,（1993）Mol．Cell．Biol.，13，4107-14）及びａａ１−１５９（Brown，D.R .，等,（1993）Mol．Cell．Biol.，13，6849-57）である広範な場所にあると報告されている。特に、オリナー(Oliner)及び共同研究者によって一般化されたｐ５３のａａ１３−４１を有する構造は、３つのハイブリッド系においてＭＤＭ２の結合に十分ではなく、我々の観察とも異なる。この相違は、本発明のデータがフランキング配列がＭＤＭ２結合にわずかながら寄与することを示しているように、ａａ１８−２３のＴＦＳＤ／ＧＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２及び３）に隣接したフュージョン(fusion)タンパク質配列が極めて類似していることによって説明される。ＴＦＳＤ／ＧＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２及び３）配列は、転写活性領域ａａ２０−４２に極めて近接しており（Unger，T.，等，Embo J.，11，1383-139 0）、他者が示したように、このサイトへのＭＤＭ２の結合は、ｐ５３の転写活性を阻害する（Oliner，J.D.，等,（1993）Nature，362，857-860）。ｐ５３上のＭＤＭ２結合サイトの置換分析は、ＴＦＳＤ／ＧＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２及び３）が、ＭＤＭ２がｐ５３に結合するのに必要な鍵となる領域であることを同定したが、このサイトにフランキングする他の残基も、ＭＤＭ２結合に僅かながら寄与するけれども、ＴＦＳＤ／ＧＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２及び３）配列が、転写活性に影響することなく複合体形成を阻害する試薬としての最小の標的であること（そのための鍵となる残基が判明していなかったこと）は明らかである。最初の２つの残基ＴＦはコンサーブドボックスＩ(conserved box I)の一部であり、後者ＳＤ／ＧＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８及び９）はその外側であるが、アフリカツメガエルからヒトまでに保持されたｐ５３の領域の一部である。
【００５６】
ＭＤＭ２のｐ５３に対する対応する結合サイトは、ａａ１−１２１、１９−１０２（Chen，J.，等,（1993）Mol．Cell．Biol.，13，4107-14）、ａａ１０２−２９４または２４９−４９１、また、１−２２１（Brown，D.R .，等,（1993）Mol．Cell．Biol.，13，6849-57）であると種々に報告されている。特に、ヒトＭＤＭ２のＮ−末端領域に対するモノクローナル抗体である３Ｇ５（ａａ５９−８９のマップ）も、ＭＤＭ２は免疫沈降させるが、ｐ５３（Chen，J.，等,（1993）Hol．Cell．Biol.，13，4107-14）、抗体Ｂｐ−１９を用いた我々の発見の類似物観察をともに免疫沈降させない。
【００５７】
ＭＤＭ２のｐ５３への結合は、網膜芽腫タンパク質ｐ１０７、シクリンＡ及びｐ１３０を含むタンパク質の範囲についてのアデノウイルスＥ１Ａ及びヒト乳頭腫ウイルスＥ７を同定するための小さなペプチドを用いた類似の研究に明らかに平行している（Dyson，N.，等,（1992a）J．Virol.，66，4606-4611）。ｐ５３上のＭＤＭ２結合サイトは、Ｅ１Ａ及びＥ７の場合のような２ドメインではなく単一ドメインであることがわかった。ｐ５３上のＭＤｍ２結合サイトは、タンパク質の高い免疫原エピトープと正確に重複し、独立に単離されたｐ５３に対する多くのモノクローナル抗体がこのサイトを認識し、これに対する抗体は、ガン患者の血清中に存在する（schlichtholtz，B.，等,（1993）Cancer Res.，52，638 0-6384）。これは、露出され、かつ決定された構造を有することを示唆している。これらの抗体の相補的決定領域のアミノ酸配列がＭＤＭ２のｐ５３結合サイトと相同性を示すことは可能である。高レベルのＭＤＭ２が存在するところでのｐ５３レベルを試験するために用いられる抗−ｐ５３抗体は、注意深く選択しなければならないことも示唆された。セリン２０にＤＮＡ依存性キナーゼサイトがあり（Less-Miller，S.P.，等,（1990）Mol．Cell．Biol.，10，6472-6481）、セリン６、９、及び１５に他のリン酸化サイトがあるので（Samad，A.，等,（1986） Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，83，897-901; Heek，D.W.，等,（1988）Mol． Cell．Biol.，8，461-465; Meek及びEckbardt，1988）、ＭＤＭ２のこのサイトへの結合はリン酸化によって調整される。
【００５８】
以下の実施例は、本発明の種々の態様を 例示するために提供するが、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００５９】
これらの実施例では、以下の材料及び方法を用いた。
【００６０】
（材料及び方法）
（細胞培養） 
クローン６細胞（Michalovitz等，1990）を、１０％ＦＣＳを添加したダルベッコの修正イーグル媒質(Dulbecco's Modified Eagle Medium)（ＤＭＥＭ）中で、２３または３７℃のいずれかで成長させた。スポドドプテラ・フルギペルダ(Spododoptera frugiperda)細胞系であるＳＦ９を、５％ＦＣＳとグルタミンを添加したエクセル４００媒質（J.R．H．Biosciences，Sera-Lab．UK）中で、２７ ℃で成長させた。
【００６１】
（昆虫細胞中でのＭＤＭ２の発現）
マウスｍｄｍ２遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応によって、マウス・プロスタート(mouse prostate)細胞系(Le等，1992)から得て、スポドドプテラ・フルギペルダ発現ベクターｐＶＬ１３９３に、標準的なＤＮＡ及びバキュロウイルス発現技術を用いてクローン化した。発現クローンは、抗−ＭＤＭ２抗体によって認識された９０−９５ｋＤａタンパク質の生成物によって同定した。  
【００６２】
（抗体）
ｐ５３タンパク質は、ポリクローナル血清ＣＭ１（Midgley，C.A.，等,（1992 ）J．Cell．Sci.，101，183-189）、またはモノクローナル抗体ＰＡｂ４２１（Harlow, E.，等,（1981）J．Virol.，39，861-869）、及びＢｐ５３−１９（Bartek，J.，等,（1993）J．Pathol.，169，27-34）を用いて検出した。ＭＤＭ２は、ラビット抗−ＭＤＭ２ポリクローナル血清（Barak，Y.，等,（1993）Embo J.，1 2，461-468）、またはモノクローナル抗体４Ｂ（Chen，等，1993）及びＳＭＰ１４（未だ報告されていない我々が調製した抗体であり、ａａ１５４から１６７までのヒトＭＤＭ２の（Oliner，J.D.，等,（1992）Nature，358，80-83）一部を含むＣＳＲＰＳＴＳＳＲＲＲＡＩＳＥ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０）に対する抗体であって、最初のシステインはＭＤＭ２の一部ではなく余分なカップリングオプションを提供する）を用いて検出した。ＳＶ４０大型Ｔ抗原に対して調製された（Harlow，E.，等,（1981）J．Virol.，39，861-869）抗体ＰＡｂ４１９は、免疫沈降法の無関係対照として用いた。  
【００６３】
（免疫沈降法）
細胞は、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリドを含む氷冷したＮＥＴバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ ｐＨ８．０、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＮＰ４０）中、４℃で３０分間ライス(lyse)した。レフリジェレーテド・エェペンドルフ(refridgerated Eppendorf)遠心分離器内で、１４，０００ｒｐｍで遠心分離することにより、細胞抽出液からデブリス(Debris)を取り除いた。免疫沈降法は、実質的に既に記述されている通りであり（Gannon，J.V．等,（1990）Embo J.，9，1595-1602）、細胞抽出液の前−吸収と、続く抗体タンパク質複合体の単離の両方に、１μｇの精製したマウスのモノクローナル抗体、及び、プロテインＧセファロース・ビーズ（Pharmacia）を用いた。  
【００６４】
（ｐ５３ペプチドライブラリーのスクリーニング）
全ヒトｐ５３タンパク質及びマウスｐ５３タンパク質の一部のＮ−末端領域のペプチドライブラリーを、キロン・ミモトープ(Chiron Mimotope)Ｐ／Ｌ（ビクトリア、オーストラリア）から得た。このライブラリーは、セリン−グリシン−セリン−グリシン（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２０）という付加的ペプチドスペーサ領域を介してビオチンに結合した１５ｍｅｒのペプチドの形態であり、各ペプチドは一次配列における前のペプチドと５アミノ酸が重複する。ＥＬＩＳＡプレートは、各ウェル毎に、５μｇ／ｍｌストレプトアビディン（Vector Labs）の１００μｌで被覆し、３７℃で一昼夜インキュベートし、次いで、２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸バッファー食塩水（ＰＢＳ）を用いて、室温で１時間ブロックした。ストックしたビオチニル化ペプチドは、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで５μｇ／ｍｌに希釈し、各５０μｌを設定したウェルにプレートし、次いで、室温で１時間インキュベートした。このプレートを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで４回洗浄した後、細胞抽出液（各ウェルに、５０μｌの１−４ｍｇ／ｍｌ）または精製したタンパク質を加えた。プレートを４℃で２−３時間インキュベートした後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで４回洗浄して未結合のタンパク質を取り除いた。細胞抽出液の場合、結合したタンパク質は、標準的なＥＬＩＳＡアッセイのように、適当な第１の抗体１−３μｇ／ｍｌに続いて、抗−マウス・ワサビダイコン・ペルオキシダーゼ複合体(conjugate)及び３’３’４’４’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質で検出した（Harlow，E.，等,（1988）抗体：実験室マニュアル(Antibody: laboratory manual)，New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press and Lane，1988）。  
【００６５】
ｐ５３、ＭＤＭ２、及びそれらの複合体のレベルは、上述の抗体を用いた２サイト・イムノアッセイで決定した。マウスモノクローナル抗体は、精製した抗体の３０μｇ／ｍｌ溶液の５０μｌを入れたファルコン・ミクロタイター・ディッシュ・ウェル(Falcon microtiter dish wells)を４℃で一昼夜インキュベートすることにより固相で使用した。プレートは、ＰＢＳ中の２％ウシ血清アルブミンを用い、室温で２時間ブロックし、ＰＢＳで洗浄した。細胞抽出液は、免疫沈降法で述べたように調製し、無菌的に２倍に希釈した後、各ウェルに５０μｌを添加して４℃で２時間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ中の０．１％ＮＰ−４０で洗浄し、検出用ポリクローナル抗血清を１／１０００希釈で添加した。プレートは、ＰＢＳ中の０．１％ＮＰ−４０で再度洗浄し、ペルオキシダーゼ複合体抗−ラビットＩｇ血清（ＤＡＫＯ）の１／１０００希釈物を５０μｌ、２時間添加し、次いで、ＴＭＢ反応で可視化させた。  
【００６６】
（実施例１：ＭＤＭ２、ｐ５３およびＭＤＭ２−ｐ５３複合体の免疫沈降）
ラット細胞系クローン６が、熱に敏感なマウスｐ５３の変異体を発現するという観察を、ｐ５３モノクローナル抗体のパネルを用いて確認した。ウエスタンブロットにより、３２℃で２４時間（図１Ａ）もしくは連続的に３７℃（図１Ｂ）で生育させたクローン６細胞のＭＤＭ２、ｐ５３およびＭＤＭ２−ｐ５３複合体の免疫沈降物を得た。これらの免疫沈降物は、１μｇの精製された抗体、すなわち、レーン１と４はＰＡｂ４２１；レーン２と５はＢｐ５３−１９；並びにレーン３と６は４Ｂ２を用いて得られた。ＭＤＭ２は、ＳＭＰ１４抗体上清とウサギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体とを用いて、レーン１、２および３で検出し、ｐ５３は、２００倍に希釈したＤＭ−１とブタ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体とを用いてレーン４、５および６で検出した。不適切な抗体であるＰＡｂ４１９は、３２℃もしくは３７℃で調製された細胞抽出物からＭＤＭ２とｐ５３のどちらも沈殿させなかった（データは示さず）。マーカーの分子量は、ｋＤａで与えられている。  
【００６７】
驚くべきことに、抗体の一つであるＢｐ５３−１９は、２４時間３２℃で生育させたグローンＣ６細胞からｐ５３を免疫沈降しなかったが、連続して３７℃で生育させた細胞からｐ５３を効率的に沈降させ（図１Ａトラック５と図１Ｂトラック５を比較）、一方、ＰＡｂ４２１は、両方の温度でｐ５３を沈降させた（図１Ａトラック４と１Ｂトラック４）ことがわかった。そこで、Ｂｐ５３−１９が、ｐ５３と共にＭＤＭ２を共免疫沈降（co-immunoprecipitate）するのか否かを調べるために調査を行った。図１Ａと１Ｂの免疫沈降ウェスタンデータから、Ｂｐ５３−１９が、３２℃もしくは３７℃で生育されたいずれの細胞抽出物からも、ＭＤＭ２を共免疫沈降させないことは明らかである（図１ＡとＢのトラック２）。しかしながら、ＰＡｂ４２１等の他のｐ５３抗体は、３２℃でｐ５３と共にＭＤＭ２を共免疫沈降させても、３７℃では共免疫沈降させない（図１ＡおよびＢのトラック１）。逆に、４Ｂ２、図１、およびＳＭＰ１４（データ示さず）等のＭＤＭ２に対する抗体は、３２℃でｐ５３を共沈降させるが、３７℃では共沈降させない（図１ＡとＢのトラック６）。８０ｋＤａよりわずかに小さい４Ｂ２（およびＳＭＰ１４）によって認識された二つのバンドは、ラットＭＤＭ２が切断された形態であり、全長は、９０ｋＤａの明らかに相対的な分子量でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を移動する。ＭＤＭ２の多型はしばしば観察される（Chen，J.，et a l．(1993)．Mol．Cell Biol.，13，4107-14）。
【００６８】
（実施例２：ＭＤＭ２、ｐ５３およびＭＤＭ２−ｐ５３複合体のレベルを決定するための２サイト・イムノアッセイ（two-site immunoassay））
２４時間３２℃（図２Ａ）もしくは連続的に３７℃（図２Ｂ）で生育されたクローン６細胞のＭＤＭ２、ｐ５３およびＭＤＭ２−ｐ５３複合体のレベルを決定するために２サイト・イムノアッセイを行った。図２Ａでは、被覆抗体は、図の説明で述べたような以下の精製抗体、４Ｂ２、４２１およびＢｐ５３−１９の一つであり、ウサギ抗−ｐ５３血清ＣＭ１またはウサギ抗ＭＤＭ２血清でプローブされ、ブタの抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体複合体と基質としてＴＭＢを用いて検出した。３７℃では、ＭＤＭ２−ｐ５３複合体は、抗体のどんな組み合わせでも検出できなかった。  
【００６９】
３２℃および３７℃におけるＭＤＭ２、ｐ５３およびＭＤＭ２−ｐ５３複合体のレベルの２サイト・イムノアッセイは、実施例１の免疫沈降の結果と一致する。図２Ａのデータから判る顕著な特徴は、ｐ５３とｐ５３−ＭＤＭ２複合体のレベルが非常に類似しており、全てではないがほとんどのｐ５３が、３２℃においてＭＤＭ２と複合体を形成していることを示唆している。抗体の別の組み合わせが、ｐ５３−ＭＤＭ２複合体を検出できることから、Ｂｐ５３−１９が３２℃でｐ５３−ＭＤＭ２複合体を検出できないことに再度注意すべきである。
【００７０】
３２℃および３７℃における２サイト・イムノアッセイの比較から、ＭＤＭ２タンパク質のレベルはずっと低く、ようやく検出できる程度あるので、３７℃でＭＤＭ２がなぜ免疫沈降しないのか明らかである。ＭＤＭ２−ｐ５３複合体は、３７℃で調製された細胞抽出物の２サイト・イムノアッセイによって全く検出されなかった。図２Ｂを参照。図２Ｂでは、４Ｂ２（捕獲抗体）とＣＭ１（検出抗体）との抗体の組み合わせに対するデータが示されている（類似した抗体ＰＡｂ４２１またはＢｐ５３−１９とウサギ抗ＭＤＭ２ポリクローナルは複合体を検出しなかった）。３７℃におけるＭＤＭ２の低減したレベル、すなわち３２℃のレベルの１０％未満は、３２℃のレベルと比較して約５倍に上昇したｐ５３の状況と対照的である。
【００７１】
３２℃ではｐ５３とＭＤＭ２を共に共沈降することができるが、３７℃では共沈降できない、ＰＡｂ４２１と４Ｂ２の能力の説明は、二つの温度におけるＭＤＭ２レベルの差異と一致し、また、ｍｄｍ２の発現が３２℃で優先的に存在するｐ５３の“野生型”形態に依存するという公表された観察とも一致する。
【００７２】
Ｂｐ５３−１９がＭＤＭ２を共免疫沈降できず、また、３２℃でｐ５３−ＭＤＭ２複合体を検出できないことは、二つの理由から予期しないものである。第一に、捕獲抗体ＰＡｂ４２１と４Ｂ２に検出されるようなｐ５３との複合体を形成し得る過剰のＭＤＭ２タンパクがあることが、２サイト・アッセイにより示唆されている。第二に、３７℃における２サイト・イムノアッセイにより、Ｂｐ５３−１９が、ＰＡｂ４２１とほぼ同じ効率で細胞抽出物中のｐ５３を認識することが示唆されている。この観察に対する最も単純な解釈は、Ｂｐ５３−１９が、ｐ５３上のＭＤＭ２が結合するのと同じ領域を認識するということである。
【００７３】
（実施例３：ＭＤＭ２−ｐ５３結合サイトの同定）
Ｂｐ５３−１９とＭＤＭ２は、ｐ５３アミノ酸終末端と相互作用することが以前に示されていた（Stephenら，調製の原稿(manuscript inpreparation); Oliner，J.D.ら(1993)．Nature，362，857-860）。ヒトｐ５３タンパク質の完全なペプチドライブラリーおよびマウスｐ５３タンパク質の部分的なペプチドライブラリーを、ＭＤＭ２が結合する領域を同定するために利用した。ヒトｐ５３配列は、ペプチド番号３から始まってペプチド７９で終わり、各ペプチドは１５アミノ酸からなり、最後の５つのアミノ酸は、次のペプチドに存在している。マウスｐ５３配列は、部分的であって、アミノ酸１−９２からのＮ末端配列からなり、５アミノ酸によって先のペプチドと次のペプチドとが互いに重複している。
【００７４】
これらのライブラリーは、ｐ５３一次アミノ酸配列の１５アミノ酸長の断片から構成され、５アミノ酸で連続的に重複し、４アミノ酸の長さのスペーサーを介してそれぞれビオチン取り付けられている。ストレプトアビジン被覆ＥＬＩＳＡプレート上にビオチニル化ペプチドを固定化することによって、もしｐ５３上のＭＤＭ２結合サイトが１５アミノ酸以下の範囲に含まれるのであれば、ｐ５３上のＭＤＭ２結合サイトを素早く同定することができる。ＭＤＭ２を含む抽出物を、ペプチドライブラリーを結合したＥＬＩＳＡプレートに加え、モノクローナル抗体４Ｂ２と標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用いて、結合したＭＤＭ２タンパク質を検出した。ｐ５３ライブラリーに挑むにあたって、いくつかの出所の組換えＭＤＭ２タンパク質を用いた。これらは、E.coliで発現されたヒトおよびマウスのＭＤＭ２および昆虫細胞で発現されたマウスＭＤＭ２の、精製されていない抽出物および部分的に精製された調製物を含んでおり、全ての形態が、ｐ５３ライブラリーの同じペプチドを同定した。昆虫細胞で発現されたマウスＭＤＭ２を用いた結果は、図３ＡおよびＢに示されている。ペプチドライブラリーを、昆虫細胞抽出物のみ、ＳＦ９、並びにマウスＭＤＭ２を発現する昆虫細胞抽出物、ＳＦ９ Ｍｕｓ ＭＤＭ２でチャレンジした。ＭＤＭ２のペプチドへの結合を、モノクローナル抗体４Ｂ２を用いたＥＬＩＳＡアッセイによって決定し、ウサギ抗マウスＩｇが結合した西洋ワサビペルオキシダーゼとＴＭＢ基質とを用いて、結合した抗体を検出した。図３Ｃには、図３Ｂで用いられているが、検出抗体４Ｂ２の特異性の確認を、抽出物の存在するもしくは存在しない条件下で行った、ペプチド５９、７１、８３および９５を用いた対照実験から得られた結果が示されている。結果は、マウスＭＤＭ２を発現するものではなく、昆虫細胞のみの抽出物を読むＥＬＩＳＡと並んで提示される。その特異性は注目すべきものであり、ＭＤＭ２とｐ５３誘導ペプチドとの間の強力な相互作用を示唆している。図３Ｃに示された対照から、ＭＤＭ２を発現する抽出物が存在する場合にのみ、結合が観察されること、並びに、結合がペプチドのみを認識する抗体によるのではないことが判る。さらに、同じ結果が、一次検出抗体としてＳＭＰ１４を用いた場合にも得られた（データ示さず）。
【００７５】
ＭＤＭ２に結合する４つのペプチドが、図４に示されている。ペプチド５および６は、ヒトｐ５３のＮ終末の部位を同定するが、ペプチド８３および８４は、マウスｐ５３のＮ終末の対応する領域を同定する。共通に、これらの４つのペプチドは、ｐ５３における共通配列ＭＤＭ２結合部位を、−ＱＥＴＦＳＤ／ＧＬＷＫＬ−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１と１２）と同定し、アスパラギン酸からグリシンがヒトとマウス配列との間で違う唯一のアミノ酸である。ＭＤＭ２の結合に係るペプチドは、ｐ５３抗体ＤＯ−１およびＢｐ５３−１９によっても認識される（Stephenら，印刷中の原稿(manuscript inpreparation)）。
【００７６】
ＭＤＭ２との相互作用に係るｐ５３上のキー配列を同定するために、共通結合部位配列−ＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬ−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）の形態を、配列の各位置をアラニンに置換し、ＭＤＭ２を発現する昆虫細胞抽出物に由来するＭＤＭ２の結合にどんな影響を及ぼすか調べることによって調節した。この実験は、抗体ＤＯ−１とＢｐ５３−１９の結合に対する影響を調べることによって行われた。結果は図５に示されている。アミノ酸配列は述べるとおりである。Ａでは配列ＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬＰＥＮＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）は、図３のペプチド６の配列を示し、ＳＰＤＤＩＥＱＷＦＴＥＤＰＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）は、不適当なペプチド対照である。形式的に、上記ペプチドの最初のセリン残基共通配列をビオチンにカップリングするためのスペーサーの一部であり、セリンは共通ｐ５３配列に先行するので、この残基もアラニンで置換した。ＭＤＭ２結合に関して、共通結合部位における全てのアラニン置換が、ＥＬＩＳＡによって測定した結合レベルを減少するが、置換によって未置換の共通配列の１５％未満までＭＤＭ２結合の量を減少するので、キー配列はＴＦＳＤＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）であると思われる。興味深いことに、より高いレベルのＭＤＭ２の結合が、結合部位の定義を再確認するｐ５３ペプチドライブラリーのペアチド６（ＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬＰＥＮＮ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）より短い共通配列ペプチドに観察される。共通配列に結合するモノクローナル抗体ＤＯ−１の場合には、キー残基は、ＥＴＦＳＤＬＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）であり、ＤとＫは最も重要である。ＤＯ−１エピトープに対するアスパラギン酸残基の重要性は、ＤＯ−１がマウスｐ５３ではなくヒトｐ５３のみを認識するというレポートと一致しており、違いはアスパラギン酸からグリシンに変わっただけである。この差は、ＤＯ−１結合に重大な影響を与えるが、タンパク質またはペプチドとＭＤＭ２の相互作用にひどくは影響しない。しかしながら、この位置でアスパラギン酸の代わりにアラニンを置換することによって、全ての３つのタンパク質リガンドの結合が遮断される。この位置のグリシンもしくはアスパラギン酸からアラニンを区別するＭＤＭ２の能力は、結合部位のこの領域における極性環境が相互作用にとって重要であることを暗示しているのかもしれない。また、ＤＯ−１のエピトープがＦＳＤＬＷＫＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）であること（Stephen ら，印刷中の原稿）が、ファージ・ディスプレイ・ライブラリーから確立されており、キー残基に対する我々の観察と一致している。抗体Ｂｐ５３−１９に関して、アラニン置換シリーズは、キー残基がＦ−ＤＬＷ−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）であると同定し、この後ろの３つの残基が最も重要であり、これはＭＤＭ２が共通配列結合部位に結合するのに必要なものと類似している。驚くことではないが、後から添加した場合に、ビオチニル化されたペプチドＳＱＥＴＥＳＤＬＷＫＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）に対する抗体Ｂｐ５３−１９の予備結合が、ペプチドに対するＭＤＭ２の結合を遮断したことが判った（データ示さず）。
【００７７】
（実施例４：ｐ５３−ＭＤＭ２結合サイトのさらなる特徴付け）
２つの１８０ｍｌ2組織培養フラスコ中のＳＦ９細胞からのＭｕｓ ＭＤＭ２を発現するバキュロウイルスで感染させた昆虫細胞を用いた以外は実施例３の方法を繰り返した。抽出液は、約３ｍｉｌｓのリシシ(lysisi)バッファー中で調製し、１３ｍｇ／ｍｌの濃縮した上澄み液を与えた。  
【００７８】
前記のように、ＭＤＭ２結合サイトは、ｐ５３誘導ペプチド、ＳＱＥＴＦＳＤＬＷＬ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１８）のアラニン置換によって決定し、結果を図６に示した。さらに、他の維持された置換基を試験し（例えば、同一の機能の高度に維持されたタンパク質に共通してみられるもの）、結果を図６に示した。高いタンパク質濃度（１−４ｍｇ／ｍｌではなく１３ｍｇ／ｍｌ）では、アラニン置換実験により、グルタミン酸（ＥＴＦＳＤＬＷ）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１９）に加えて、同じ６つのアミノ酸（”ＴＦＳＤＬＷ”）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）が重要であることが示された。しかし、このデータは、これらが、両方のアラニン置換、及び維持された置換基の全てではないならばいくつかに非寛容であるので、最も臨界的な残基がＦ−−ＬＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）であることを確立する。
【００７９】
さらなる興味深い観察は、グルタミン酸に対するアスパラギン酸残基の置換がＭＤＭ２の結合を促進するという事実に関し、そのような残基が本発明の治療的ペプチドに有効に含まれていても良いことを示している。これは、この方法がＭＤＭ２への向上した結合性を有する試薬の発見を導くことができることを例証している。
【００８０】
[参考文献]
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【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１Ａ】図１Ａは、クローン６細胞から得られたＭＤＭ２、ｐ５３、及びＭＤＭ２ｐ５３複合体の免疫沈降のウェスタン・ブロットを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、クローン６細胞から得られたＭＤＭ２、ｐ５３、及びＭＤＭ２ｐ５３複合体の免疫沈降のウェスタン・ブロットを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、３２℃で２４時間で成長させたクローン６細胞におけるＭＤＭ２、ｐ５３、及びＭＤＭ２−ｐ５３複合体のレベルを決定するための２−サイトイムノアッセイの結果を示すグラフである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、３２℃で２４時間に続き３７℃で成長させたクローン６細胞におけるＭＤＭ２、ｐ５３、及びＭＤＭ２−ｐ５３複合体のレベルを決定するための２−サイトイムノアッセイの結果を示すグラフである。
【図３Ａ】図３は、モノクローナル抗体４Ｂ２を用いたＥＬＩＳＡアッセイによって決定したペプチドライブラリーに対するＭＤＭ２の結合の結果を示すグラフである。ヒト及びマウスｐ５３のライブラリーを、昆虫細胞抽出物単独（ＳＦ９）及びＭＤＭ２を発現する昆虫細胞抽出物（ＳＦ９ Ｍｕｓ ＭＤＭ２）でチャレンジした。ヒトｐ５３のＮ−末端から中間領域のペプチド番号３−５０の結果を図３Ａに示す。
【図３Ｂ】ヒトｐ５３アミノ酸配列の残りとマウスｐ５３のＮ−末端配列の結果を図３Ｂに示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、検出用抗体４Ｂ２の特異性を証明するためのＢに由来する特定のペプチドを用いた対照実験の結果を示す。
【図４】図４は、ＭＤＭ２が結合するペプチド配列の同定、及び、ヒト及びマウスｐ５３上の一致したＭＤｍ２結合サイトの決定である。
【図５Ａ】図５Ａは、ＭＤＭ２結合のために必要な鍵となる残基を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、抗体ＤＯ−１結合のために必要な鍵となる残基を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、抗体Ｂｐ５３−１９結合のために必要な鍵となる残基を示す。
【図６】図６は、ＭＤＭ２と、ｐ５３のアミノ酸配列１８−２３に基づく一連のペプチドとの間の結合のレベルを示す。
【図７】図７は、本発明のイムノアッセイ法を例示する。
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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