(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞を効率よく、かつダメージを与えずに基材に固定化することができる細胞固定化方法および装置、細胞固定化基板を提供する。【解決手段】基材２に当接した細胞４ａに、波長３３０〜４１０ｎｍの光を含む光１０を照射することによって細胞４ａを基材２に接着させる、細胞固定化方法、及びそのための基板、装置。更に、これらを用いて該細胞に対する薬剤の作用を検査する方法、及び複数種の細胞を付着性によって分別する方法。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を、基材表面に接着により固定化する方法であって、
前記細胞が前記基材表面に当接した状態で該細胞に光を照射することによって該細胞を前記基材に接着させ、
前記光は、波長３３０〜４１０ｎｍの光を含むことを特徴とする細胞固定化方法。
【請求項２】
前記波長範囲における前記光の照射エネルギーが１〜１００Ｊ／ｃｍ２であることを特徴とする請求項１に記載の細胞固定化方法。
【請求項３】
前記細胞への光の照射を、血清の存在下で行うことを特徴とする請求項１または２に記載の細胞固定化方法。
【請求項４】
前記基材は、少なくとも表面が非光応答性材料からなることを特徴とする請求項１〜３のうちいずれか１項に記載の細胞固定化方法。
【請求項５】
前記基材は、少なくとも表面がポリスチレンからなることを特徴とする請求項４に記載の細胞固定化方法。
【請求項６】
請求項１〜５のうちいずれか１項に記載の方法によって細胞が基材に固定化されたことを特徴とする細胞固定化基板。
【請求項７】
細胞を、基材表面に接着により固定化する装置であって、
前記基材の任意の領域に光を照射する照射手段を備え、該照射手段は、前記細胞が前記基材表面に当接した状態で該細胞に前記光を照射することによって該細胞を前記基材に接着可能とされ、前記光は、波長３３０〜４１０ｎｍの光を含むことを特徴とする細胞固定化装置。
【請求項８】
前記照射手段は、光源と、反射手段とを備え、該反射手段は、前記光源からの光を反射することによって該光を前記基材の任意の領域に照射できるようになっていることを特徴とする請求項７に記載の細胞固定化装置。
【請求項９】
請求項６に記載の細胞固定化基板を用いて、前記細胞に対する薬剤の作用を検査する方法であって、前記薬剤を前記細胞に接触させ、前記細胞に対する前記薬剤の作用を検出することを特徴とする検査方法。
【請求項１０】
複数種の細胞から一部の細胞を分別する方法であって、
前記複数種の細胞を基材表面に導き、これらのうち前記一部の細胞が前記基材表面に当接した状態で、該細胞に波長３３０〜４１０ｎｍの光を含む光を選択的に照射して該細胞を前記基材に接着させ、次いで該細胞以外の細胞を前記基材表面から除去することを特徴とする細胞の分別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞などの細胞に対する薬剤の影響を確認するなどの用途に使用される細胞固定化基板、その製造に適用可能な細胞固定化方法および装置、前記細胞固定化基板を用いた検査方法、細胞を分別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物細胞などの細胞を対象とする研究においては、特定の環境条件で細胞を培養し、その環境条件が細胞に与える影響を評価することが行われている。例えば、細胞に対する薬剤の影響を確認するための薬剤スクリーニングは、新薬の開発に欠くことができない技術である。
この種の技術では、基材に細胞を固定化した細胞固定化基板が用いられる（例えば特許文献１を参照）。
細胞を基材に固定化する技術としては、対象とする細胞と特異的に結合する抗体を介して細胞を基材に接着する手法や、有機化合物膜を介して基材に固定する手法がある（例えば特許文献２を参照）。
【特許文献１】特開２００５−４６１２１号公報
【特許文献２】特開平１０−１２３０３１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、従来技術では、細胞を基材に固定化するには、予め抗体を基材に付着させたり有機化合物膜を形成する必要があるため、細胞の固定化に手間がかかるという不都合がある。
また、細胞固定化基板を薬剤スクリーニングなどに用いる場合には、細胞が生理的に正常な状態にあることが要求されるため、固定化の際に細胞に生理的にダメージを与えないことが必要となる。
抗体や有機化合物膜を用いて細胞を接着する技術では、これら抗体や有機化合物膜が細胞の生理状態に影響を与えることを原因として、細胞に対する薬剤の作用を正確に測定するのが難しくなることがあった。
また、近年では、薬剤感受性の個人差を考慮に入れたテーラーメイド医療に対する関心が高まっており、細胞固定化基板の利用が検討されているが、テーラーメイド医療を一般に普及させるには低コスト化が不可欠である。このため、効率的な細胞固定化方法が要望されている。
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、その目的は以下のとおりである。
（１）細胞を効率よく、かつダメージを与えずに基材上に固定化することができる細胞固定化方法および装置、細胞固定化基板、検査方法、細胞を分別する方法を提供する。
（２）細胞に対する薬剤の作用を検査するにあたって、正確な測定が可能となる細胞固定化方法および装置、細胞固定化基板、検査方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の構成は以下の通りである。
（１）細胞を、基材表面に接着により固定化する方法であって、前記細胞が前記基材表面に当接した状態で該細胞に光を照射することによって該細胞を前記基材に接着させ、前記光は、波長３３０〜４１０ｎｍの光を含むことを特徴とする細胞固定化方法。
（２）前記波長範囲における前記光の照射エネルギーが１〜１００Ｊ／ｃｍ２であることを特徴とする（１）に記載の細胞固定化方法。
（３）前記細胞への光の照射を、血清の存在下で行うことを特徴とする（１）または（２）に記載の細胞固定化方法。
（４）前記基材は、少なくとも表面が非光応答性材料からなることを特徴とする（１）〜（３）のうちいずれか１つに記載の細胞固定化方法。
（５）前記基材は、少なくとも表面がポリスチレンからなることを特徴とする（４）に記載の細胞固定化方法。
（６）（１）〜（５）のうちいずれか１つに記載の方法によって細胞が基材に固定化されたことを特徴とする細胞固定化基板。
（７）細胞を、基材表面に接着により固定化する装置であって、前記基材の任意の領域に光を照射する照射手段を備え、該照射手段は、前記細胞が前記基材表面に当接した状態で該細胞に前記光を照射することによって該細胞を前記基材に接着可能とされ、前記光は、波長３３０〜４１０ｎｍの光を含むことを特徴とする細胞固定化装置。
（８）前記照射手段は、光源と、反射手段とを備え、該反射手段は、前記光源からの光を反射することによって該光を前記基材の任意の領域に照射できるようになっていることを特徴とする（７）に記載の細胞固定化装置。
（９）（６）に記載の細胞固定化基板を用いて、前記細胞に対する薬剤の作用を検査する方法であって、前記薬剤を前記細胞に接触させ、前記細胞に対する前記薬剤の作用を検出することを特徴とする検査方法。
（１０）複数種の細胞から一部の細胞を分別する方法であって、前記複数種の細胞を基材表面に導き、これらのうち前記一部の細胞が前記基材表面に当接した状態で、該細胞に波長３３０〜４１０ｎｍの光を含む光を選択的に照射して該細胞を前記基材に接着させ、次いで該細胞以外の細胞を前記基材表面から除去することを特徴とする細胞の分別方法。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の細胞固定化方法では、波長３３０〜４１０ｎｍの光を含む光を照射することによって細胞を基材表面に接着させるので、細胞にダメージを与えずに、基材に十分に接着、固定化することができる。
従って、細胞に対する薬剤の作用を検査するにあたって正確な測定が可能となる。
また、抗体などの介在物を用いずに細胞を基材に接着することができるため、基材の前処理工程が必要ない。このため、作業工程を簡略化し、効率よく細胞を固定化できる。従って、細胞固定化基板の製造コストを低減できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
図１は、本発明の細胞固定化基板の一例である細胞アレイ１を示すものである。
ここに示す細胞アレイ１は、基材２に４つの流路３ａ〜３ｄが形成され、これら第１〜第４流路３ａ〜３ｄに、第１〜第４細胞４ａ〜４ｄが固定化されている。
基材２の構成材料は、特に限定されないが、合成樹脂、ガラス、金属、シリコンなどを挙げることができる。
合成樹脂として好適なものとしては、ポリスチレン系樹脂、シリコーン系樹脂（例えばポリジメチルシロキサン樹脂）、アクリル系樹脂（例えばポリメタクリル酸メチル樹脂）、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、エポキシ系樹脂を挙げることができる。
基材２は、少なくとも表面が前記構成材料からなるものであればよく、表層部分が前記材料からなり、それ以外の部分が他の材料で構成されていてもよい。
基材２は、照射光（後述）が透過可能な材料が好ましい。
なお、光によってその分子構造等が変化する材料を光応答性材料というが、基材２の構成材料としては、光応答性のない材料（非光応答性材料）を使用できる。非光応答性材料としては、前述の材料（合成樹脂、ガラス、金属、シリコンなど）を挙げることができる。
【０００７】
基材２は、表面処理によって接着性を高めることができる。表面処理方法としては、極性を持つ官能基（例えば−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨなど）を基材２の表面に形成可能な処理方法、例えばプラズマ処理、オゾン処理、コロナ放電処理、フレーム処理のうちいずれかが好ましい。
なかでも特に、プラズマ処理またはオゾン処理が施されたポリスチレンであるＴＣＰＳ（tissue culture polystyrene）の使用が好ましい。
基材２の表面には、細胞接着成分からなるコート層を設けてもよい。細胞接着成分としては、例えばフィブロネクチン、ヴィトロネクチン、ラミニンのうち１または２以上が使用できる。フィブロネクチン等からなるコート層の形成によって、基材２に対する細胞の接着強度を高めることができる。コート層によって細胞接着強度が高められるのは、細胞表面の膜タンパク（例えばインテグリン）の高次構造が光により変化し、コート層の成分（例えばフィブロネクチン）のリガンドに強固に結合するためであると推察することができる。
【０００８】
第１〜第４流路３ａ〜３ｄの断面形状は特に限定されず、例えば矩形、三角形、台形、円形、半円形、楕円形などとすることができる。図示例では、流路３ａ〜３ｄの平面視形状は直線状とされ、互いにほぼ平行に形成されている。
流路３ａ〜３ｄは、例えば、溝が形成された基体の上にカバー材を配置することなどによって形成された流通孔であることが好ましい。流路３ａ〜３ｄは閉鎖系の流路であることが好ましい。
【０００９】
図１に示すように、第１流路３ａ内面には、第１〜第４細胞４ａ〜４ｄが流路長さ方向に並んで固定化されている。第２〜第４流路３ｂ〜３ｄの内面にも、第１流路３ａと同様に、第１〜第４細胞４ａ〜４ｄが固定化されている。
【００１０】
次に、細胞アレイ１を製造する方法を説明する。
図７は、基材２に光を照射する装置の一例を示す構成図である。
この照射装置は、基材２を保持する保持台２１（保持手段）と、基材２の任意の領域に光１０を照射する照射手段２２と、基材２を観察可能な倒立型顕微鏡２３（観察手段）と、パソコンなどの制御手段２４を備えている。
照射手段２２は、光源（図示略）と、ＤＭＤ２５（デジタルマイクロミラーデバイス（Digital Micromirror Device））（反射手段）とを備えている。ＤＭＤ２５は複数のマイクロミラーに分割されている。各マイクロミラーは、制御手段２４からの信号により独立に角度を設定できるようにされ、光源からの光を反射することによって、前記信号に応じたパターンの光１０を基材２に照射できるようになっている。ＤＭＤ２５は、この構成によって、基材２の任意の領域に光１０を照射できる。例えば、基材２の表面の一部領域にのみ光１０を照射することもできるし、全領域に光１０を照射することもできる。
光源としては、汎用の紫外線ランプ等を用いることができる。
倒立型顕微鏡２３は、観察光２６によって基材２上の細胞を観察することができるようになっている。
【００１１】
図２に示すように、第１細胞４ａを含む培養液を、基材２の第１〜第４流路３ａ〜３ｄに導入する。
培養液としては、細胞４ａ〜４ｄの生理状態を良好にし得る細胞培養用培地を用いることができる。この培地としては、汎用のベース培地に血清を添加したものを例示できる。ベース培地としては、Ｄ’ＭＥＭ、ＨａｍＦ１２、ＨａｍＦ１０、ＲＰＭＩ１６４０などがある。これらは単独で使用してもよいし、これらのうち２以上を混合して使用してもよい。
血清としては、ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）、ＦＣＳ（Fetal Calf Serum）、ＮＣＳ（Newborn Calf serum）、ＣＳ（Calf Serum）、ＨＳ（Horse Serum）のうち１または２以上が使用できる。
また、培地としては、無血清培地、無タンパク質培地を使用することもできる。
本発明で使用できる細胞としては、動物由来（例えばヒト細胞）、植物由来、および微生物由来のものを挙げることができる。
【００１２】
次いで、図２および図３に示すように、前記照射装置を用いて、流路３ａ〜３ｄの一部に光１０を照射する。図示例では、流路３ａ〜３ｄに対し垂直な方向に沿う直線状の光１０を照射する。図示例では、光１０は、基材２の下方から照射され、下面（細胞４ａ〜４ｄがある面とは反対の面）側から流路３ａ〜３ｄの底部を透過して細胞４ａに達する。
【００１３】
流路３ａ〜３ｄに照射する光１０は、波長が短すぎると細胞４ａ〜４ｄの生理状態に悪影響が及び、波長が長すぎると細胞４ａ〜４ｄの接着が不十分となる。
このため、波長３３０〜４１０ｎｍの光を含む光１０を用いる。
波長が前記範囲である光は、細胞４ａ〜４ｄにダメージを与えずに、細胞４ａ〜４ｄを基材２に十分に接着することができる。また、光の照射によって細胞４ａ〜４ｄの細胞外マトリクスや膜タンパク質が悪影響を受けることはない。
なお、光１０には、前記範囲を外れる波長の光が含まれていてもよいが、前記範囲を下回る波長（３３０ｎｍ未満）の光は、細胞の生理状態に悪影響を及ぼすおそれがあるため、強度が低いことが望ましい。
【００１４】
光１０の照射エネルギーは、小さすぎると細胞４ａ〜４ｄの接着が不十分となり、大きすぎると細胞４ａ〜４ｄの生理状態に悪影響が及ぶため、前記波長範囲における光１０の照射エネルギーは、１〜１００Ｊ／ｃｍ２（好ましくは１〜７０Ｊ／ｃｍ２）が好適である。
照射エネルギーを前記範囲とすることによって、細胞４ａ〜４ｄにダメージを与えることなく、細胞４ａ〜４ｄを基材２に十分に接着することができる。
光１０の強度は、小さすぎると細胞４ａ〜４ｄの接着が不十分となり、大きすぎると細胞４ａ〜４ｄの生理状態に悪影響が及ぶため、０．０１〜１Ｗ／ｃｍ２が好ましい。
【００１５】
光１０が照射された部分の流路３ａ〜３ｄ（以下、第１照射部分６ａ〜６ｄという）では、流路３ａ〜３ｄ内面（底面）に当接した状態の細胞４ａ〜４ｄは、流路３ａ〜３ｄ内面に強く接着し固定化される。
細胞４ａ〜４ｄは、光１０の照射による基材２の温度変化がほとんどない場合でも、流路３ａ〜３ｄに強く接着する。
図４に示すように、洗浄液により流路３ａ〜３ｄを洗浄すると、未接着の第１細胞４ａが除去され、第１照射部分６ａ〜６ｄに接着された第１細胞４ａのみが流路３ａ〜３ｄに残る。洗浄液としては、例えばリン酸緩衝液が使用できる。
【００１６】
光１０の照射によって細胞４ａ〜４ｄが流路３ａ〜３ｄ内面に接着される機構は不明であるが、次の推測が可能である。
流路３ａ〜３ｄに当接する細胞４ａ〜４ｄは細胞外マトリクスを分泌する。光１０の照射によって細胞外マトリクスは分子構造が変化することによりその性質が変わり、細胞４ａ〜４ｄを流路３ａ〜３ｄ内面に強く接着させる。
【００１７】
次いで、図５に示すように、流路３ａ〜３ｄの一部であり第１照射部分６ａ〜６ｄとは異なる位置（第２照射部分７ａ〜７ｄ）に光１０を照射するとともに、第２細胞４ｂを含む培養液を流路３ａ〜３ｄに流す。図示例では、第２照射部分７ａ〜７ｄは第１照射部分６ａ〜６ｄよりも薬剤流れ方向（後述）の上流側である。
これによって、第２細胞４ｂを第２照射部分７ａ〜７ｄに接着させ固定化させる。
図６に示すように、洗浄によって、第２照射部分７ａ〜７ｄに接着された第２細胞４ｂのみが流路３ａ〜３ｄに残る。
【００１８】
次いで、流路３ａ〜３ｄの一部であり照射部分６ａ〜６ｄ、７ａ〜７ｄとは異なる位置（図示例では照射部分７ａ〜７ｄよりもやや上流側。以下、第３照射部分８ａ〜８ｄという。図１参照）に光１０を照射するとともに、第３細胞４ｃを含む培養液を流路３ａ〜３ｄに流し、第３細胞４ｃを第３照射部分８ａ〜８ｄに接着させ固定化させる。
【００１９】
次いで、流路３ａ〜３ｄの一部であり照射部分６ａ〜６ｄ、７ａ〜７ｄ、８ａ〜８ｄとは異なる位置（図示例では照射部分８ａ〜８ｄよりもやや上流側。以下、第４照射部分９ａ〜９ｄという。図１参照）に光１０を照射するとともに、第４細胞４ｄを含む培養液を流路３ａ〜３ｄに流し、第４細胞４ｄを第４照射部分９ａ〜９ｄに接着させ固定化させる。
第１〜第４細胞４ａ〜４ｄは、互いに異なる細胞であってよい。
以上の操作によって、４つの流路３ａ〜３ｄに、いずれも細胞４ａ〜４ｄが接着された細胞アレイ１が得られる（図１を参照）。
光１０の照射は細胞４ａ〜４ｄに生理的なダメージを与えることはなく、照射後の細胞４ａ〜４ｄは、正常な状態が維持される。光１０の照射後の細胞４ａ〜４ｄの生存率（バイアビリティ）は、照射前に対し、例えば９０％以上となる。
【００２０】
次に、細胞アレイ１を用いて、細胞４ａ〜４ｄに対する薬剤の作用を検査する方法の一例を説明する。
図８に示すように、第１〜第４薬剤含有液１１ａ〜１１ｄを、それぞれ流路３ａ〜３ｄに流す。薬剤含有液１１ａ〜１１ｄは、互いに異なる薬剤を含む液が好ましい。
これによって、第１〜第４薬剤含有液１１ａ〜１１ｄは、いずれも第１〜第４細胞４ａ〜４ｄに接触することになるため、４種の薬剤と４種の細胞のすべての組み合わせである１６通りのアッセイを同時に行うことができる。
【００２１】
次いで、図９に示すように、薬剤含有液１１ａ〜１１ｄと細胞４ａ〜４ｄとの反応を、検出手段１２を用いて検出する。
検出方法は特に限定されないが、例えば、蛍光色素や放射性物質で標識した薬剤含有液１１ａ〜１１ｄを使用し、これらが細胞４ａ〜４ｄに取り込まれた量を、蛍光等の強度により検出する方法が採用できる。
このほか、細胞４ａ〜４ｄにＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）遺伝子を導入し、産生したＧＦＰ量を蛍光強度に基づいて検出する方法；エステラーゼなどの酵素活性に基づいて蛍光を発する標識を用い、蛍光強度によって細胞の生存率（バイアビリティ）を検出する方法：細胞が産生した生理活性物質を抗体染色することにより細胞の生理活性を検出する方法なども採用できる。
【００２２】
上記細胞固定化方法では、波長３３０〜４１０ｎｍの光を含む光１０を照射することによって細胞４ａ〜４ｄを流路３ａ〜３ｄ内面に接着させるので、細胞４ａ〜４ｄに生理的なダメージを与えずに、基材２に十分に接着、固定化することができる。
従って、細胞４ａ〜４ｄに対する薬剤の作用を検査するにあたって正確な測定が可能となる。
また、抗体や有機化合物膜などの介在物を用いずに細胞４ａ〜４ｄを基材２に接着することができるため、基材２の前処理工程が必要ない。このため、作業工程を簡略化し、効率よく細胞４ａ〜４を固定化できる。従って、細胞アレイ１の製造コストを低減できる。
【００２３】
また、抗体などの介在物を用いる場合には、この介在物が細胞４ａ〜４ｄの生理状態に何らかの影響を与えるおそれがあるが、上記細胞固定化方法では、細胞４ａ〜４ｄは介在物なしで基材２に接着されるため、細胞４ａ〜４ｄの生理状態に悪影響が及ぶことがない。
従って、細胞４ａ〜４ｄに対する薬剤の作用を検査するにあたって正確な測定が可能となる。
さらには、細胞４ａ〜４ｄを、直接、基材２に接着するので、作業工程数を少なくできることから、コンタミネーションが起こりにくい。
【００２４】
細胞アレイ１を用いる検査方法では、複数の流路３ａ〜３ｄに複数種類の細胞４ａ〜４ｄを保持させることによって、細胞４ａ〜４ｄと薬剤含有液１１ａ〜１１ｄの全ての組み合わせに関するアッセイを同時に行うことができる。このため、多種類のアッセイを効率よく行うことができ、多種類の薬剤含有液１１ａ〜１１ｄの作用を、容易かつ低コストで調べることができる。
従って、ユーザーの細胞４ａ〜４ｄを用いて細胞アレイ１を作製することによって、ユーザー個人の特性に応じた対応が可能となる。例えば、医療において、患者個人の特性（例えば薬剤感受性）に応じた治療が可能となる。
【００２５】
また、従来技術では、細胞をマイクロアレイチップ上に配置する操作は、開放系でスポッティングにより行われることが多く、コンタミネーションを防止するのが難しいが、細胞アレイ１を用いる方法では、一連の操作を、すべて閉鎖系の流路３ａ〜３ｄ内で行うことができる。
従って、コンタミネーションを防ぎ、無菌環境下で正確なアッセイが可能である。
【００２６】
上記検査方法では、各流路３ａ〜３ｄに、互いに異なる細胞４ａ〜４ｄを接着させたが、本発明では、複数の流路のうち少なくとも１つにおいて、この流路に配置された複数の細胞のうち２以上が互いに異なっていればよい。
また、上記検査方法では、流路３ａ〜３ｄにそれぞれ異なる薬剤含有液１１ａ〜１１ｄを流したが、本発明では、流路のうち少なくとも２つに、それぞれ互いに異なる薬剤含有液を流せばよい。
【００２７】
次に、本発明の細胞分別方法の一例を説明する。
図１０に示すように、培養ディッシュ、培養キュベットなどの基材３２を用意する。基材３２の構成材料としては、上記基材２に使用可能な材料として挙げたものを使用できる。
基材３２表面に、複数種の異なる細胞３４ａ〜３４ｃを含有する細胞３４を播種、培養する。細胞３４ａ〜３４ｃは、基材３２表面で増殖する。
これに、例えば、蛍光色素等で標識したポリクローナル又はモノクローナル抗体を加え、細胞３４ａ〜３４ｃと結合させる。これにより、分別しようとする細胞の位置情報が検出可能となる。
【００２８】
次いで、細胞３４ａ〜３４ｃの位置情報３５ａ〜３５ｃを、図７に示す照射装置の制御手段２４に取り込み、位置情報３５ａ〜３５ｃに基づいて、目的とする細胞にのみ上述の光１０を照射する。
光１０が照射された細胞は基材３２に固定化されるため、光１０を照射していない細胞を洗浄などにより基材３２から回収することによって、細胞３４ａ〜３４ｃを分別回収することができる。例えば、細胞３４ａを回収する場合には、他の細胞３４ｂ、３４ｃにのみ光１０を照射してこれらを基材３２に固定化した後、洗浄により細胞３４ａのみを回収することができる。
【００２９】
なお、本発明においては、蛍光標識抗体を用いる手法のみでなく、種々の標識法を採用できる。例えば、ルシフェラーゼ等の発光系酵素の遺伝子を細胞に導入する方法等が挙げられる。また、形態の違う細胞の分別においては、標識を行わなくとも顕微鏡観察下で目的とする細胞にのみ光照射して、この細胞のみを分別して回収することができる。
【００３０】
本発明によれば、基材上で培養した細胞から所望のものを選択して固定化し、パターニングすることができる。すなわち、予め細胞接着物質をパターンに従って担持させた培養基材を用いる従来のパターニングとは大きく異なり、固定化するべき細胞を、培養後に選択できる。
細胞は光照射後も正常な状態を維持するため、上記方法は、所定の性質を有する細胞、例えば生理活性物質の産生能が高い細胞や、遺伝子導入操作後に安定導入が認められた細胞を純化し、引き続き培養して増殖させるといった操作に適用できる。
【００３１】
次に、本発明の細胞分別方法の応用例を説明する。以下の説明においては、既出の構成には同一符号を付してその説明を省略する。
細胞を純粋培養する際には、雑菌の混入を防ぐ必要があるが、雑菌が混入した場合には次のようにして除去することができる。
図１１に示すように、特定細胞４４を基材３２表面で培養する。他の細胞４５ａ、４５ｂが基材３２に混入した場合には、前記蛍光標識法などを用いて得られた特定細胞４４の位置情報４４ａを図７に示す照射装置の制御手段２４に取り込み、位置情報４４ａに基づいて、特定細胞４４にのみ光１０を照射して基材３２に固定化した後、洗浄などにより前記混入細胞４５ａ、４５ｂを基材３２から剥離させ、除去することができる。
なお、特定細胞４４と混入細胞４５ａ、４５ｂとを目視にて識別できる場合には、標識をしなくても、顕微鏡による観察によって光１０の照射パターンを定めることができる。
【００３２】
光による細胞の接着作用は、時間の経過とともに弱くなる場合がある。例えば光の照射により基材に接着した細胞が、光の照射終了後、所定時間放置することにより、再び剥離可能となることがある。このため、雑菌除去などの目的でいったん基材に接着させた細胞を、上記分別方法により分別回収することができる。
【００３３】
図１２は、細胞の増殖領域のパターニングを行う方法を示す工程図である。
第１細胞４６を基材３２表面に全体に増殖させ、パターン４７に基いて第１領域４８に光１０を照射し、第１領域４８に位置する第１細胞４６を基材３２に固定化し、それ以外の領域（第２領域４９）にある第１細胞４６を洗浄などにより除去する。図示例では、第１領域４８は互いにほぼ平行な複数の帯状に形成されている。
第１細胞４６が除去された第２領域４９に第２細胞５０を増殖させることによって、第１細胞４６が存在する第１領域４８と、第２細胞５０が存在する第２領域４９とは、所定方向（図中左右方向）に交互に配置される。
このような細胞の増殖領域のパターニングは、細胞どうしの情報伝達を解析したり、複数種の細胞の共存下で産生される生理活性物質を生産したりする際に有効である。
【００３４】
図１３は、細胞の分別に使用可能な装置の一例を示すものである。
ここに示す細胞分別装置は、細胞が接着可能な基材を有する細胞培養手段、該細胞培養手段に培地を供給する手段、前記基材に光を照射する手段、基材上の細胞の位置を検出する手段、光照射により剥離された細胞を分別する手段を有し、さらに必要に応じて洗浄液供給手段が付加されて構成されたものである。
【００３５】
以下、この細胞分別装置の構成を詳しく説明する。
この細胞分別装置は、細胞が接着可能な基材５２を有する細胞培養キュベット５１（細胞培養手段）、該キュベット５１に培地を供給する培地リザーバ５３（培地供給手段）、該キュベット５１の基材５２に上述の光１０を照射するプロジェクタ５４（照射手段）、細胞の位置を検出し該位置情報信号を制御手段５７に送出するカラーＣＣＤカメラ５５（細胞位置検出手段）、複数の回収容器５６ａが切り替え可能に設けられた分別回収手段５６、これら各手段の動作を制御する制御手段５７とを備えている。
この装置には、必要に応じて細胞培養キュベット５１に洗浄液を供給するための洗浄液供給手段（図示せず）が設けられていてもよい。
【００３６】
細胞培養キュベット５１は、底部が基材５２で構成された容器であり、外部から基材５２に光１０を照射することができ、基材５２表面の細胞を観察できる。
細胞培養キュベット５１は、基材５２を有する本体部５１ａと、本体部５１ａに培地を導入する導入経路５１ｂと、培地を導出する導出経路５１ｃとを有する。経路５１ｂ、５１ｃには、弁などの開閉手段５８が設けられている。基材５２の構成材料としては、上記基材２に使用可能な材料として挙げたものを使用できる。
プロジェクタ５４は、制御手段５７からの信号に応じたパターンの光を照射する照射手段であり、基材５２表面の任意の領域を照射できるようになっている。
プロジェクタ５４は、光源（図示略）と、前記光源からの光の照射領域を前記パターンに変換する光学変換部（図示略）とを有する。光学変換部としては、ＤＭＤ、透過型液晶パネルなどが使用できる。
【００３７】
制御手段５７は、細胞の位置情報の取り込み、それに基づくプロジェクタ５４からの光照射の設定、細胞培養キュベット５１への培地または洗浄液の供給および停止を制御するものが望ましい。
カラーＣＣＤカメラ５５は、個々の細胞あるいは細胞群を識別するに十分な解像度、光学倍率、感度を備えるものを使用することが好ましい。また、細胞種を識別するために複数の抗体担持蛍光色素を用いる場合には、色を識別できることが望ましい。
なお、上記説明では、細胞培養キュベットで細胞を播種し、培養させるプロセスについて説明したが、本発明においては、細胞を単にキュベットに導入しこれを分別回収するというプロセスにも適用できる。このプロセスは、例えば複数種の細胞を含む組織等において、各細胞種を分別回収するために有効である。
【００３８】
以下、上記細胞分別装置の動作の一例について説明する。
開閉手段５８の開閉により、培地リザーバ５３から細胞培養キュベット５１に培地を供給し、細胞を播種し培養する。
この際、目的とする細胞は予め蛍光標識されているかあるいは培養後蛍光抗体を用いて標識してもよい。細胞培養キュベット５１における基材５２上の細胞の位置はカラーＣＣＤカメラ５５で検出され、その位置情報信号は制御手段５７に入力される。
これにより蛍光標識により分別する目的細胞を識別し、プロジェクタ５４によって該目的細胞以外の細胞に光１０を照射する。照射位置の設定は、制御手段５７による自動制御でもよいし、細胞を観察しつつ手動操作により行ってもよい。
光１０が照射された細胞は基材５２に接着するが、光１０が照射されなかった細胞は、基材５２から剥離可能となるため、培養キュベット５１に培地または洗浄液を供給することにより選択的に基材５２から除去され、分別回収手段５６の回収容器５６ａに回収される。
分別回収手段５６は、複数の回収容器５６ａが切り替え可能に設けられているので、分別された各細胞を異なる回収容器５６ａに回収するのが容易である。
【実施例】
【００３９】
（実施例１）
表面をプラズマ処理したポリスチレン（ＴＣＰＳ）からなるプレート状の基材（９６穴（ウェル））を用意し、それぞれのウェルに動物細胞を平均１００個播種し２３時間培養した。その後、図７に示す照射装置を用いて、いくつかの波長条件、エネルギー条件で光をウェルの底面側から照射した。細胞としては、ＣＨＯ−Ｋ１を使用した。
１ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝液を用いて表面を洗浄し、残った細胞の量を目視にて確認することによって、光照射によって誘起された細胞接着性の良否を判定した。表１および表２に細胞接着性の程度を、照射されない細胞を除去するのに必要十分な一定の洗浄操作を行った後の残存率８０％以上（◎）、５０％以上８０％未満（○）、２０％以上５０％未満（△）、および２０％未満（×）のいずれかで示す。
細胞の増殖性は、光照射から３日後に冷凍処理を施し、細胞個数に比例した強度の蛍光を発するＣｙＱＵＡＵＴを添加し、その蛍光強度をプレートリーダーで測定し、非照射サンプルと比較することで判定した。表１および表２に、増殖性の程度を、非照射の参照条件に対し９０％以上（○）、５０％以上９０％未満（△）、および５０％未満（×）のいずれかで示す。
【００４０】
【表１】
2007244378.tif 000003
【００４１】
【表２】
2007244378.tif 000004
【００４２】
表１に示すように、波長３１３ｎｍの光を用いた試験例１では、ほとんどの細胞が死滅したことを示す結果が得られた。
波長３３４ｎｍの光を用いた試験例２では、基材表面への細胞接着を観察できた。細胞の死滅は見られなかったが、増殖性に若干の影響が認められた。
波長３６５ｎｍの光を用いた試験例３では、増殖性に影響することなく細胞接着性が高くなった。
試験例１〜３の結果より、試験例２の場合より波長が短くなると、細胞接着性を高くできる強度の光照射によって、細胞のダメージが大きくなると考えることができる。
波長４０５ｎｍの光を用いた試験例４、５のうち、照射エネルギーを７０Ｊ／ｃｍ２とした試験例４では、細胞増殖性に影響が見られなかったことから細胞のダメージが小さかったと考えられるが、細胞接着性は若干低い結果が得られた。照射エネルギーを試験例４より大きくした試験例５では、細胞接着性は高くなったが、増殖性に若干の影響が認められた。
このことから、波長が試験例４、５の場合を大きく上回ると、細胞増殖性に顕著な影響が現れない強度の範囲で十分な細胞接着性は得られにくいと考えることができる。
波長４３６ｎｍの光を用いた試験例６では、細胞接着性は不十分であった。
以上より、細胞の増殖性に悪影響を与えることなく十分な細胞接着性を得るには、波長３３０〜４１０ｎｍの光の照射が適当であることがわかる。
【００４３】
表２に示すように、照射エネルギーが０．６Ｊ／ｃｍ２である試験例７では細胞の接着が不十分となり、照射エネルギーが１２０Ｊ／ｃｍ２である試験例１２では、増殖性が劣る結果となった。
【００４４】
光の照射エネルギーが細胞増殖性に及ぼす影響を、次のようにして調べた。
基材表面でＣＨＯ−Ｋ１細胞を培養し、所定のパターンをなす光を照射した後、１ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝液で基材表面を洗浄した。光の波長は３６５ｎｍとした。
図１４は、光照射後の細胞数の経時変化を示すグラフである。縦軸は細胞数を示し、横軸は光照射後の経過時間を示す。光の照射エネルギーは３０Ｊ／ｃｍ２および１２０Ｊ／ｃｍ２とした。比較のため、光照射を行わなかった場合の試験結果を合わせて示す（０Ｊ／ｃｍ２）。
照射エネルギーが３０Ｊ／ｃｍ２である場合は光照射を行わなかった場合と同様の増殖性が得られたが、照射エネルギーが１２０Ｊ／ｃｍ２である場合は増殖性に劣る結果となった。
【００４５】
図１４および表２より、光の照射エネルギーを１〜１００Ｊ／ｃｍ２（好ましくは１〜７０Ｊ／ｃｍ２）とすることによって、増殖性に影響を与えることなく細胞接着性を高めることができたことがわかる。
【００４６】
（実施例２）
細胞アレイ６１を次のようにして作製した（図１５および図１６を参照）。
表面をプラズマ処理したポリスチレン（ＴＣＰＳ）からなり、直径２００μｍの５箇所の円形領域６６を除いて、細胞接着を阻害するシリコン樹脂で被覆された基材６２を用意した。流路６３は、幅６００μｍ、深さ２００μｍの断面矩形に形成した。
赤い蛍光を発するＣＭＴＰＸで染色したＭＤＣＫ細胞を含む培養液を流路６３内に導入し、５時間３０分培養した。
次いで、図７に示す照射装置を用いて、光を流路６３の一部に照射することによって、５箇所の円形領域６６のうち２箇所（第１照射部分６４）に第１細胞であるＭＤＣＫ細胞６５を接着させ固定化し、それ以外の、固定化されない細胞を洗浄によって除去した。
図１５は、第１細胞（ＭＤＣＫ細胞６５）を第１照射部分６４に固定化した後における流路６３の蛍光顕微鏡写真である。
２時間培養後、緑色の蛍光を発するＣＭＦＤＡで染色したＣＨＯ細胞６８を含む培養液を流路６３内に導入し、５時間３０分培養した。
そして再び図７に示す照射装置を用いて、光を流路の一部に照射することによって、残りの３箇所の円形領域６６（第２照射部分６７）に第２細胞であるＣＨＯ細胞６８を接着させ固定化、それ以外の細胞を洗浄によって除去した。
図１６は、第２細胞（ＣＨＯ細胞６８）を第２照射部分６７に固定化した後における流路６３の蛍光顕微鏡写真である。ＭＤＣＫ細胞６５およびＣＨＯ細胞６８は、同一流路６３内のそれぞれ異なる位置に固定化されたことがわかる。
ＭＤＣＫ細胞６５およびＣＨＯ細胞６８を固定化するために用いた光の波長は３６５ｎｍ、強度は０．０２６Ｗ／ｃｍ２、照射時間は１５０秒間とした（照射エネルギー３．９Ｊ／ｃｍ２）。
【００４７】
（実施例３）
表面をプラズマ処理したポリスチレン（ＴＣＰＳ）からなる基材７２を用意し、その表面にＭＤＣＫ細胞７３を一様に播種し、４時間培養した。図７に示す照射装置を用いて、この基材に、「ＡＩＳＴ」という文字をなす領域７４および長方形の領域７５に光を照射した。光の波長は３６５ｎｍ、強度は０．０８Ｗ／ｃｍ２、照射時間は１０分間とした（照射エネルギー４８Ｊ／ｃｍ２）。
図１７は、１ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝液を用いて洗浄した後の基材７２表面の写真である。光照射を行った領域７４、７５にのみ、細胞７３が固定化されたことがわかる。
【００４８】
（実施例４）
フィブロネクチンがコートされたポリスチレン製基材（Ｎｏ．３５４４５７，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を一様に播種し、２４時間培養した。図７に示す照射装置を用いて、所定のパターンをなす光を照射した。光の波長は３６５ｎｍ、照射エネルギーは１８Ｊ／ｃｍ２とした。
１ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝液に１０分間作用させた後、このリン酸緩衝液を用いて、実施例３に準じて基材表面を洗浄した。
図１８は、洗浄後の基材表面の写真である。光照射を行った領域には細胞が固定化され、非照射領域では細胞がほぼ完全に除去され、コントラストが非常に高いパターンが得られたことがわかる。
【００４９】
（実施例５）
実施例４に準じて、基材表面にＣＨＯ−Ｋ１細胞からなる直線状のパターンを形成した。基材表面の写真を図１９（ａ）に示す。この細胞を引き続き２４時間培養した後の基材表面の写真を図１９（ｂ）に示す。
この図より、光照射を経た細胞が、その後も十分なバイアビリティを維持し、照射域を超えて増殖したことがわかる。
【００５０】
（実施例６）
実施例４に準じて、基材表面にＣＨＯ−Ｋ１細胞を培養し、所定のパターンをなす光を照射し、その直後に１ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて、基板表面を洗浄（洗浄時のＰＢＳ流速：２ｍ／ｓ）することによって、所定のパターンを形成した（図２０の符号８１）。
前記パターンをなす細胞を、引き続いて８時間培養した後、上記洗浄条件（洗浄時のＰＢＳ流速：２ｍ／ｓ）で基板表面を洗浄した。その結果、ほとんどの細胞が基材表面から除去された。図２０の符号８２は洗浄後の基材表面を示すものである。
この結果は、光照射による細胞の接着強度が時間経過とともに弱まったことを示す。
このことから、細胞の接着および剥離を容易に操作できることがわかる。
【００５１】
（実施例７）
ＨｅＬａ細胞を用いること以外は実施例５と同様にして、直線状のパターンを形成した。基材表面の写真を図２１に示す。光の波長は３６５ｎｍ、照射エネルギーは３．５Ｊ／ｃｍ２とした。
【００５２】
（実施例８）
ＨｅｐＧ２細胞を用いること以外は実施例５と同様にして、直線状のパターンを形成した。基材表面の写真を図２２に示す。光の波長は３６５ｎｍ、照射エネルギーは３．０Ｊ／ｃｍ２とした。
【００５３】
（実施例９）
ＭＤＣＫ細胞を用いること以外は実施例５と同様にして、細胞が除去された部分が「Ｓ」という文字をなすようなパターンを形成した。基材表面の写真を図２３に示す。光の波長は３６５ｎｍ、照射エネルギーは２４Ｊ／ｃｍ２とした。
【００５４】
実施例７〜９の結果より、本発明が複数種類の細胞に適用可能であったことがわかる。
【００５５】
（実施例１０）
次に示すように、２種類の細胞を用いてパターンを形成した。
実施例４に準じて、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いて培養基材上にハニカム状のパターンを形成した。基材表面の写真を図２４に示す。
次いで、同様にして、前記パターンを構成する６角形の中央に、それぞれドット状にＨｅＬａ細胞を接着させた。基材表面の写真を図２５に示す。
このように、既に細胞が接着された基材に、光照射によって所定のパターンの細胞を追加できた。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明の細胞固定化基板の一例を示す構成図である。
【図２】図１に示す細胞固定化基板の製造方法を示す工程図である。
【図３】図１に示す細胞固定化基板の製造において、細胞が基材に接着することを説明する説明図である。
【図４】図２に続く工程図である。
【図５】前図に続く工程図である。
【図６】前図に続く工程図である。
【図７】本発明の細胞固定化方法に使用可能な細胞固定化装置の一例である。
【図８】図１に示す細胞固定化基板を使用する方法の一例を示す説明図である。
【図９】図１に示す細胞固定化基板を用いて、細胞と薬剤との反応を検出する方法を示す説明図である。
【図１０】本発明の細胞分別方法の一例を示す説明図である。
【図１１】本発明の細胞分別方法の他の例を示す説明図である。
【図１２】本発明の細胞分別方法の他の例を示す説明図である。
【図１３】本発明の細胞分別方法に使用可能な装置の一例を示す構成図である。
【図１４】実施例において、光の照射エネルギーが細胞増殖性に及ぼす影響に関する試験結果を示すグラフである。
【図１５】実施例において、光照射によって細胞を所定の位置に固定化した流路の写真である。
【図１６】実施例において、前図に続く同様の工程によって別種の細胞を所定の位置に固定化した流路の写真である。
【図１７】実施例において、光の照射により細胞を固定化した基材表面の写真である。
【図１８】実施例において、光の照射により細胞を固定化した基材表面の写真である。
【図１９】実施例において、光の照射により細胞を固定化した基材表面の写真である。
【図２０】実施例において、光の照射により細胞を固定化した基材表面の写真である。
【図２１】実施例において、光の照射により細胞を固定化した基材表面の写真である。
【図２２】実施例において、光の照射により細胞を固定化した基材表面の写真である。
【図２３】実施例において、光の照射により細胞を固定化した基材表面の写真である。
【図２４】実施例において、光の照射により細胞を固定化した基材表面の写真である。
【図２５】実施例において、光の照射により細胞を固定化した基材表面の写真である。
【符号の説明】
【００５７】
１…細胞アレイ（細胞固定化基板）、２、３２、５２…基材、３ａ〜３ｄ…第１〜第４流路、４ａ〜４ｄ、３４、３４ａ〜３４ｃ、４４、４６．５０…細胞、６ａ〜６ｄ、７ａ〜７ｄ、８ａ〜８ｄ、９ａ〜９ｄ…照射部分、１１ａ〜１１ｄ…第１〜第４薬剤含有液、１２…検出手段、２２…照射手段、２５…ＤＭＤ（反射手段）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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