(57)【要約】      （修正有）【課題】ＥＳ細胞の分化能およびキメラ動物への寄与率を改善するための、あるいはＥＳ細胞の遺伝子発現を正常化するための、簡便かつ確実な方法、並びに分化能が改善されたＥＳ細胞、キメラ動物への寄与率が改善されたＥＳ細胞、および遺伝子発現が正常化されたＥＳ細胞の提供。【解決手段】ＥＳ細胞由来の核をレシピエント細胞に移植し；次いで、作出されたクローン胚からＥＳ細胞を再樹立することを特徴とする方法、および再樹立されたＥＳ細胞。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＳ細胞の分化能を改善する方法であって、ＥＳ細胞をドナー細胞として核移植を行い、作出したクローン胚からＥＳ細胞を再樹立することを特徴とする方法。
【請求項２】
ＥＳ細胞の分化能を改善する方法であって、請求項１記載の方法を数回繰り返すことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または２記載の方法により得られる、分化能が改善されたＥＳ細胞。
【請求項４】
ＥＳ細胞のキメラ動物への寄与率を改善する方法であって、ＥＳ細胞をドナー細胞として核移植を行い、作出したクローン胚からＥＳ細胞を再樹立することを特徴とする方法。
【請求項５】
ＥＳ細胞のキメラ動物への寄与率を改善する方法であって、請求項４記載の方法を数回繰り返すことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項４または５記載の方法により得られる、キメラ動物への寄与率が改善されたＥＳ細胞。
【請求項７】
ＥＳ細胞の遺伝子発現を正常化する方法であって、ＥＳ細胞をドナー細胞として核移植を行い、作出したクローン胚からＥＳ細胞を再樹立することを特徴とする方法。
【請求項８】
ＥＳ細胞の遺伝子発現を正常化する方法であって、請求項７記載の方法を数回繰り返すことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項７または８記載の方法により得られる、遺伝子発現が正常化されたＥＳ細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の能力の改善方法に関する。詳細には、ＥＳ細胞を核移植によって再樹立することにより、その分化能およびキメラ動物への寄与率を改善し、遺伝子発現を正常化する方法に関する。さらに本発明は、上記方法により得られる、分化能が改善されたＥＳ細胞、キメラ動物への寄与率が改善されたＥＳ細胞、および遺伝子発現が正常化されたＥＳ細胞にも関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子改変動物の作成においてＥＳ細胞は不可欠であるが、ＥＳ細胞は長期間の培養などが原因で分化能が低下し、生殖細胞へ寄与しなくなりやすいという欠点がある。これでは折角得られたＥＳ細胞を用いた研究の進捗が図れない。また、ＥＳ細胞から臓器を作り出す再生医療においてもＥＳ細胞の分化能の低下は深刻な問題となっている。
【０００３】
これまで、ＥＳ細胞の分化能を改善する試みは、培養条件の改善や分化能の高い細胞の選別によって行われてきたが、これらの方法は多くの時間や労力を要するうえに確実性も低いので、通常は、別のＥＳ細胞で代替するのが実情であった。しかし特定の代替できないＥＳ細胞の場合、実験を最初からやり直す必要があった。また、最近になって、本発明者らは、分化能の低いＥＳ細胞を使用するにあたり、キメラマウスの精巣からＥＳ細胞由来の精子を取り出す方法も案出している。しかしながら、これまでの方法は、ＥＳ細胞自身の分化能を改善するものではなかった。
【０００４】
さらにＥＳ細胞は長期間の培養などが原因でキメラ動物への寄与率が低下し、あるいは遺伝子発現が正常な状態でなくなる傾向がある。このような問題もまた研究の進捗の妨げとなり、再生医療においても深刻な問題となっている。
【０００５】
一方、核移植技術（非特許文献１〜４参照）はクローン動物の作成および体細胞由来ＥＳ細胞の作成に用いられていたが、ＥＳ細胞の分化能の改善をはじめとする上記問題を解決するために核移植技術が用いられたことはなかった。
【非特許文献１】Wilmut et al., Nature  1997; 385:810-813.
【非特許文献２】Wakayama, T. et al. Science 292, 740-743 (2001)
【非特許文献３】Wakayama, T. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 14984-14989 (1999)
【非特許文献４】Wakayama, T. et al. Nature 394, 369-374 (1998)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＥＳ細胞の分化能を改善するための、簡便かつ確実な方法を提供することが、本発明の課題であった。さらに、ＥＳ細胞のキメラ動物への寄与率を改善、あるいはＥＳ細胞の遺伝子発現を正常化させるための、簡便かつ確実な方法を提供することも、本発明の課題であった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは鋭意研究を重ね、ＥＳ細胞をドナー細胞として核移植を行い、作出したクローン胚からＥＳ細胞を再樹立した結果、再樹立されたＥＳ細胞の分化能が改善されることを見出した。さらに本発明者らは、上記方法にて再樹立したＥＳ細胞のキメラ動物への寄与率が改善されること、遺伝子発現が正常化されることも見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は下記の方法を提供するものである：
（１）ＥＳ細胞の分化能を改善する方法であって、ＥＳ細胞をドナー細胞として核移植を行い、作出したクローン胚からＥＳ細胞を再樹立することを特徴とする方法；
（２）ＥＳ細胞の分化能を改善する方法であって、（１）記載の方法を数回繰り返すことを特徴とする方法；
（３）（１）または（２）記載の方法により得られる、分化能が改善されたＥＳ細胞；
（４）ＥＳ細胞のキメラ動物への寄与率を改善する方法であって、ＥＳ細胞をドナー細胞として核移植を行い、作出したクローン胚からＥＳ細胞を再樹立することを特徴とする方法；
（５）ＥＳ細胞のキメラ動物への寄与率を改善する方法であって、（４）記載の方法を数回繰り返すことを特徴とする方法；
（６）（４）または（５）記載の方法により得られる、キメラ動物への寄与率が改善されたＥＳ細胞；
（７）ＥＳ細胞の遺伝子発現を正常化する方法であって、ＥＳ細胞をドナー細胞として核移植を行い、作出したクローン胚からＥＳ細胞を再樹立することを特徴とする方法；
（８）ＥＳ細胞の遺伝子発現を正常化する方法であって、（７）記載の方法を数回繰り返すことを特徴とする方法；
（９）（７）または（８）記載の方法により得られる、遺伝子発現が正常化されたＥＳ細胞。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、分化能が低下したＥＳ細胞の分化能を、簡便かつ確実に改善することができる。さらに本発明によれば、ＥＳ細胞のキメラ動物への寄与率の改善、ならびにＥＳ細胞の遺伝子発現の正常化も、簡便かつ確実に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明に用いるＥＳ細胞はいかなるＥＳ細胞であってもよい。すなわち、いかなる動物に由来するものであってもよく、例えば、ほ乳類由来のものであってもよい。ほ乳類由来のＥＳ細胞としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモットのごとき齧歯類由来のもの、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の有蹄類由来のもの、イヌ、ネコ、ウサギなどの他のほ乳類由来のもの、ならびに、霊長類由来のものが挙げられる。また本発明に用いるＥＳ細胞の取得手段・経路も限定されない。ＥＳ細胞としては受精した初期胚から得られたものが一般的であるが、単為発生的あるいは雄性発生的に得られたものであってもよい。多くのＥＳ細胞株が商業的に入手可能であり、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６系とＣＢＡ系マウスとの交雑系マウスから樹立されたＥＳ細胞などがある。
【００１１】
これらのＥＳ細胞の分化能が何らかの原因で低下した場合、あるいは分化能が本来的に低い場合に、本発明の方法を適用することができる。
【００１２】
本発明の方法において、先ず、ＥＳ細胞をドナー細胞として核移植を行う。ＥＳ細胞の核移植の方法は当該分野において公知であり、例えば、Ｇ１期あるいはＧ２／Ｍ期のＥＳ細胞を未受精卵と電気融合する方法、ＥＳ細胞の核を直接未受精卵に注入する方法、あるいは未受精卵を活性化した直後に核を移植する方法などが知られている。特に、ＥＳ細胞核の導入には体細胞核移植法（ＳＣＮＴ法）（Wakayama, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 96, 14984-14989 (1999); Wakayama, T. et al. Nature 394, 369-374 (1998)）が好ましく用いられる。核移植は通常、顕微鏡下でマニピュレーターを用いて行う。
【００１３】
核移植のレシピエントとして使用される細胞としては、一般的には除核した未受精卵母細胞が用いられるが、除核した他の細胞、例えば、除核したＥＳ細胞、除核したＥＧ細胞、除核した胚細胞などであってもよい。除核した卵母細胞をレシピエントとして用いる場合には、中期ＩＩ段階のものが好ましく用いられる。レシピエント細胞の除核方法も種々の方法が公知であり、例えば、核をピペットに吸引する方法、透明帯にスリットを入れ、卵子を押すことでスリットから核を吐き出させる方法、遠心処理やデメコルチン（Demecortine）などの薬品処理によって核を卵子から分離する方法などが知られている。除核および核移植は、通常、顕微鏡下でマニピュレーターを用いて行う。その際、ピエゾドライブを併用すると作業効率が向上するので好ましい。
【００１４】
本発明において核移植して得られたクローン胚からのＥＳ細胞の再樹立法も公知のものを用いることができる。一般的には、核移植により得られた胚を培養してクローン化胚盤胞を得て、その内部細胞塊を分離してフィーダー細胞上で培養することにより、ＥＳ細胞を再樹立することができる。また、胚盤胞を直接フィーダー細胞上で培養することによりＥＳ細胞を再樹立してもよい。本発明の方法におけるＥＳ細胞の再樹立に使用する培地組成や培養条件は、当業者が適宜選択できるものである。
【００１５】
本発明の方法を複数回繰り返して行ってもよい。すなわち、本発明の方法により再樹立されたＥＳ細胞から核を得て、これをレシピエント細胞に移植し、得られたクローン胚からＥＳ細胞を再樹立する。かかる操作を複数回繰り返す。本発明の方法を繰り返し適用しても元のＥＳ細胞の特徴は失われにくく、細胞の性質の変化も起こりにくい。繰り返し回数には特に制限はないが、操作に要する時間や労力を考慮すると数回が適当であり、１〜３回でも十分な効果が得られる。ここで、数回とは１回ないし９回程度を意味する。本発明の方法を繰り返すことにより、ＥＳ細胞の分化能がさらに改善される。また、本発明の方法を適用すると、ＥＳ細胞のキメラマウスへの寄与率も改善される。本発明の方法を繰り返すことにより、ＥＳ細胞の遺伝子発現も正常化される。
【００１６】
本発明の方法によりＥＳ細胞の分化能が改善されるが、それは核移植されたＥＳ細胞核が再プログラムされることにより、例えば、ＤＮＡのメチル化等の異常が抑えられて、遺伝子発現が正常化されることにより、分化能が改善され、あるいはキメラ動物を作成した場合に寄与率が改善されると考えられる。このことから、本発明の方法を用いると、ＥＳ細胞の分化能の改善、キメラ動物への寄与率の改善のみならず、ＥＳ細胞の生存率、細胞分裂能、増殖能なども回復あるいは改善されうると考えられる。
【００１７】
さらに本発明は、上で説明した本発明の方法を用いて得られる、分化能が改善されたＥＳ細胞、キメラ動物への寄与率が改善されたＥＳ細胞、および遺伝子発現が正常化されたＥＳ細胞も提供する。これらのＥＳ細胞においては、生存率、細胞分裂能、増殖能なども回復あるいは改善されうる。したがって、かかるＥＳ細胞を用いることにより、研究の進捗や再生医療の進歩を図ることができる。
【００１８】
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的かつ詳細に説明するが、実施例はあくまでも例示説明であり、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００１９】
Ａ．材料および実験方法
単為発生胚の作成
中期ＩＩ紡錘体の核体を１２９／Ｓｖ卵母細胞から取り、Ｃ５７ＢＬ／６−ＧＦＰ  Ｔｇマウスの卵母細胞の卵黄周囲に挿入した。次いで、交流電流（２０Ｖ／ｃｍ，２ＭＨｚ，２ｓ）および直流電流（１３０Ｖ／ｃｍ，１０μｓ）にて電気融合させた。ＳｒＣｌ２にて単為発生的に活性化させ、２つのさらなる極体を産生する再構築された卵子をＣＺＢ培地にて４日間培養して胚盤胞にまで成長させた。
【００２０】
核移植およびＥＳ細胞の誘導
ＳＣＮＴ法（Wakayama, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 96, 14984-14989 (1999); Wakayama, T. et al. Nature 394, 369-374 (1998)）にて核移植を行った。具体的には、最初に卵子の透明帯をピエゾで切り、そのまま同じピペットで卵子の核を吸い取る。次にピペットをドナー細胞のサイズに合わせて変え、ピペット内へドナー細胞の膜を壊して核を吸い込む。このときもピエゾを作用させると、容易にドナー細胞の細胞膜が破ける。そして除核した卵子へ、同様にピエゾで透明帯と細胞膜を破ってドナー核を注入する。核移植された卵子は、そのまま３０分から数時間培養したあと、塩化ストロンチウムで活性化する。このとき卵子内の核は、数時間待った影響で凝縮し分裂中期のようになっている。このままでは卵子を活性化したとき、その染色体の一部が偽第２極体として放出されてしまう。そこでその偽第２極体の放出を押さえるために、サイトカラシンも同時に加える。活性化後、２〜３個の偽前核が出来、そのまま培養すると受精卵のように核の融合が起こり、発生が継続される。活性化した卵子は４日間体外培養した。胚盤胞段階に達したクローン胚を用いて、文献（Wakayama et al., Science 292;740-743, 2001）に記載の方法にて核移植ＥＳ細胞株を樹立した。ＥＳ細胞の誘導には、産生タイロード（ＡＴ）溶液を用いて透明帯を取り、０．１ｍｇ／ｍＬの副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ，フラグメント１−２４）を添加したＥＳ細胞培地（Wakayama, S. et al. J Reprod Dev 51, 765-772 (2005)）中のマウス胚フィーダー細胞上に胚盤胞を外植した（Ogawa, K. et al. Genes Cells 9, 471-477 (2004)記載の方法参照）。樹立されたすべての核移植ＥＳ細胞株について、アルカリ性ホスファターゼ活性（生殖細胞マーカー）および胚様体形成能（全能性の証拠）に関して試験した。
【００２１】
胚盤胞注入およびＦＡＣＳ分析
文献（Wakayama, T. et al. Science 292, 740-743 (2001); Wakayama, S. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 29-33 (2005)）に記載の方法にて胚盤胞注入を行った。ＦＡＣＳａｒｉａセルソーター（ベクトンデッキンソン  Biosciences製）を用いてキメラマウスに対するＥＳ細胞の寄与率を分析した。交接後１８．５日目および１９．５日目のキメラ胚を切り出し、トリプシン処理した細胞を血清含有培地に添加し、８００ｒｐｍの遠心分離にて集めた。集めた細胞を培地に再懸濁し、ＧＦＰ陽性および陰性細胞数をＦＡＣＳａｒｉａセルソーターにて計数した。各細胞タイプ（陽性および陰性）を別個のチューブに集めた。７−ＡＤＤ染色により生存していない細胞を除去した。
【００２２】
インビトロ分化
文献（Watanabe, K. et al. Nat Neurosci 8, 288-296 (2005); Nishikawa, S. I. et al. Development 125, 1747-1757 (1988)）に記載の方法にて神経細胞および中胚葉へのＥＳ細胞の分化を誘導した。神経細胞の分化には、細胞を神経マーカーにて染色し、コロニー数を計数した。中胚葉細胞分化は、ＦＡＣＳａｒｉａにより細胞をソーティングすることにより分析した。
【００２３】
Ｂ．実験結果
単為発生ＥＳ（ｐＥＳ）細胞株の樹立
近親交配による近交退化あるいはＦ２バックグラウンドによる遺伝学的バランス不良を回避するのみならず、ｐＥＳ細胞中にＧＦＰマーカーを導入して、クローニング成功率を向上させるＦ１遺伝学的バックグラウンドを生じさせるために、Ｃ５７ＢＬ／６−ＧＦＰ  Ｔｇ（Okabe, M. et al. FEBS Lett. 407, 313-319 (1997)）および１２９／Ｓｖ雌性マウスに由来する雌性生殖的に再構築された卵子からｐＥＳ細胞株を樹立した（Wakayama and Yanagimachi Biol Reprod, 59, 100-104(1998); Wakayama et al., Science 292, 740-743 (2001)）。単為発生的に活性化された胚を胚盤胞に成長させ、胚盤胞をＥＳ細胞樹立培地（Ogawa, K. et al. Genes Cells 9, 471-477 (2004)）に撒いた。約１ヶ月後、胚盤胞から４つのＥＳ細胞株（６７％）が樹立された。これらをＰＧ１−１〜ＰＧ１−４と命名した。
【００２４】
ｐＥＳ細胞の核移植
上記のごとく新たに樹立されたｐＥＳ細胞の核を、除核したＢ６Ｄ２Ｆ１卵母細胞中にＳＣＮＴ法により移植した。得られたクローン化胚盤胞を、新たなＥＳ細胞の誘導に使用した（Wakayama, T. et al. Science 292, 740-743 (2001)）。その結果、合計１８の第２世代の核移植ｐＥＳ（ＮＴ−ｐＥＳ）細胞株（８２％）が得られた。これらをＰＧ２−１〜ＰＧ２−１８と命名した。このプロセスを繰り返して、第２世代のＮＴ−ｐＥＳ細胞核由来のクローン化胚盤胞から、９つの第３世代のＮＴ−ｐＥＳ細胞株（８２％）を得た。これらをＰＧ３−１〜ＰＧ３−９と命名した。ｐＥＳ細胞株およびＮＴ−ｐＥＳ細胞株の樹立結果を表１に示す。
【表１】
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【００２５】
樹立されたｐＥＳ細胞株細胞株およびＮＴ−ｐＥＳ細胞株の性質
樹立されたすべてのｐＥＳ細胞株およびＮＴ−ｐＥＳ細胞株はアルカリ性ホスファターゼ活性、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−１（ＥＳ細胞マーカー）が陽性であり、ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４が陰性であった。さらにこれらの細胞株は胚様体（分化全能性の証拠）を形成した。
【００２６】
５つの細胞株（ＰＧ１−１、ＰＧ２−１、ＰＧ３−１〜ＰＧ３−３）に関して、ギムザ染色およびＳＫＹ−ＦＩＳＨペインティングにより核型を調べたところ、第３世代においてさえも正常な核型が維持されていることがわかった（細胞の５７〜６７％）。顕微鏡観察によってもｐＥＳ細胞とＮＴ−ｐＥＳ細胞との間に相違は認められなかった。
【００２７】
ｐＥＳ細胞株およびＮＴ−ｐＥＳ細胞株のインビボにおける分化能、ならびにキメラマウスにおける寄与率
ＩＣＲまたはＢ６Ｄ２Ｆ２胚盤胞の胚盤腔への細胞注入により得られたキメラマウスにおけるｐＥＳ細胞株およびＮＴ−ｐＥＳ細胞株の分化能を調べた。交接１９．５日後にキメラ子孫マウスを集め、蛍光顕微鏡下でＧＦＰ発現を調べることにより、ｐＥＳ細胞株およびＮＴ−ｐＥＳ細胞株の寄与率を検討した。キメラマウスの出生率は、本発明の方法を繰り返すにつれ増加した（４８％から７８％、表２）。この実験において、ｐＥＳ細胞の寄与率は非常に低く、皮膚においてＧＦＰを高発現するマウスはたった２匹（１８％）しか生まれなかった。それらは翌日に母親に食殺された。ＮＴ−ｐＥＳ細胞株を用いた場合、ＧＦＰ発現により調べたところ、細胞株によらず６０％以上のキメラマウスが高い寄与を示した。
【表２】
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＊生後まもなく食殺されたので、正確には評価できなかった。
＊＊生まれた翌日に食殺されたものを含む。
＊＊＊寄与は、高い（皮膚の大部分においてＧＦＰが発現）あるいは低い（低発現または部分的発現）で評価した。
【００２８】
ｐＥＳ細胞株およびＮＴ−ｐＥＳ細胞株のインビボにおける分化能
インビトロにおけるｐＥＳ細胞株およびＮＴ−ｐＥＳ細胞株の神経細胞および中胚葉細胞への分化能を調べた。抗−ネスチン、抗−ＴｕＪ、および抗−ＴＨ抗体を、神経細胞のそれぞれ初期、中期、および終期分化マーカーとして使用した（Watanabe, K. et al. Nat Neurosci 8, 288-296 (2005)）。すべてのコロニー中の陽性コロニーの数とパーセンテージを計算した。分化開始から７日目のｐＥＳ細胞株およびＮＴ−ｐＥＳ細胞株の初期の分化は受精ＥＳ細胞のそれと同様であった（図１ａ）。しかしながら、分化開始から７日目および１０日目のｐＥＳ細胞株およびＮＴ−ｐＥＳ細胞株の分化は、対照ＥＳ細胞よりも程度が低かった（図１ｂ）。分化開始から７日目の終期分化も対照ＥＳ細胞よりも程度が低かったが、さらに３日後にはＮＴ−ｐＥＳ細胞の分化はｐＥＳ細胞よりも有意に増加した（ＰＧ１：２３．４％、ＰＧ２：５３．５％、ＰＧ３：５４．８％、図１ｃ）。ＴｕＪ陽性コロニー中のＴＨ陽性細胞のコロニー数をカウントしたところ、ＮＴ−ｐＥＳ細胞のＴＨ陽性割合は対照ＥＳ細胞のそれとほとんど同じであった（図１ｄ）。次に、ＰＤＧＦＲ−ａおよびＦＬＫ１／ＫＤＲを中胚葉マーカーとして用いて（Nishikawa, S. I. et al. Development 125, 1747-1757 (1998)）、分化開始から４日目にＦＡＣＳにより分化割合を調べた（図２）。その結果、中胚葉への分化割合は、ｐＥＳ細胞よりもＮＴ−ｐＥＳ細胞において増加しており、ＮＴ−ｐＥＳ細胞の分化能が改善されていた。
【００２９】
以上の結果より、単為発生ＥＳ細胞はインビボおよびインビトロにおいてＥＳ細胞よりも低い分化能を有するが、本発明の方法により、すなわち核移植およびＮＴ−ｐＥＳ細胞の樹立により、その分化能を改善しうることが示された。
【００３０】
Ｕ２ａｆ１−ｒｓ１プロモーター領域のＤＮＡメチル化
ＨｐａＩＩ消化を用いるサザンブロットにより、上で得られたｐＥＳ細胞株およびＮＴ−ｐＥＳ細胞株のＵ２ａｆ１−ｒｓ１プロモーター領域のＤＮＡメチル化を調べた。結果を図３に示す。この領域は母性アリール上で高メチル化されるので、対照ＥＳ細胞（Ｅ１４ＴＧ２ａ細胞）では２本のバンド（母性アリール由来の未消化バンドおよび父性アリール由来の消化バンド）が検出された。ｐＥＳ細胞では１本のバンド（母性アリール由来未消化バンド）が検出された。しかしながら、すべてのＮＴ−ｐＥＳ細胞株では２本のバンドが検出され、本発明の方法による核移植で父性アリールが脱メチル化されたことが示唆された。
【００３１】
まとめ
本発明の方法により、ＥＳ細胞の分化能を改善することができた。この分化能の改善は１回の核移植でも確認された。本発明の方法を繰り返して適用することにより、分化能をさらに改善することができた。本発明の方法により、ＥＳ細胞のキメラマウスへの寄与率も改善された。また、繰り返して本発明の方法を適用しても、細胞の性質に著しい変化はみられなかった。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明は、ＥＳ細胞を用いる各種の研究分野において利用可能であり、再生医療の分野においても利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、インビトロにおけるｐＥＳ細胞株（ＰＧ１）およびＮＴ−ｐＥＳ細胞株（ＰＧ２、ＰＧ３）の神経細胞および中胚葉細胞への分化能を示す図である。抗−ネスチン、抗−ＴｕＪ、および抗−ＴＨ抗体を、神経細胞のそれぞれ初期、中期、および終期分化マーカーとして使用した。すべてのコロニー中の陽性コロニーの数とパーセンテージを計算した。（ａ）は抗−ネスチン抗体陽性コロニーの割合、（ｂ）は抗−ＴｕＪ抗体陽性コロニーの割合、（ｃ）は抗−ＴＨ抗体陽性コロニーの割合、（ｄ）は抗−ＴｕＪ抗体陽性かつ抗−ＴＨ抗体陽性コロニーの割合を示す。対照ＥＳ細胞は１２９Ｂ６細胞（当研究室において作出）であった。
【図２】図２は、対照細胞（Ｅ１４ＴＧ２ａ（西川研究室(理研CDB）より分与））、ｐＥＳ細胞（ＰＧ１−１）およびＮＴ−ｐＥＳ細胞（ＰＧ３−１）の分化割合をＦＡＣＳにより調べた結果を示す図である。
【図３】図３は、ＨｐａＩＩ消化を用いるサザンブロットにより、上で得られたｐＥＳ細胞株およびＮＴ−ｐＥＳ細胞株のＵ２ａｆ１−ｒｓ１プロモーター領域のＤＮＡメチル化を調べた結果示すサザンブロットである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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