(57)【要約】【課題】試料中の溶存酸素が分析結果に与える影響を適切に抑制する。【解決手段】充填剤を保持したカラムと、カラムに導入する試料を調製するための試料調製手段と、を備えた液体クロマトグラィ装置において、試料調製手段を、血球を含む試料における血球を多く含む層の上層部から調製用試料を採取するように構成した。好ましくは、試料調製手段は、赤血球を含む血液試料１３を、赤血球がリッチな血球層１３Ｂと赤血球がプアーな血漿層１３Ａとに分離させたときの血球層１３Ｂの上層部から調製用試料を採取し、かつ調整用試料を用いてカラムに導入する導入用試料を調製するように構成されている。【選択図】図５
2007240500.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
充填剤を保持したカラムと、
上記カラムに導入する導入用試料を調製するための試料調製手段と、
を備えており、
上記試料調製手段は、血球を含む試料における血球を多く含む層の上層部から上記調製用試料を採取するように構成されていることを特徴とする、液体クロマトグラィ装置。
【請求項２】
上記試料調製手段は、赤血球を含む血液試料を、赤血球がリッチな血球層と赤血球がプアーな血漿層とに分離させたときの上記血球層の上層部から調製用試料を採取し、かつ上記調整用試料を用いて上記導入用試料を調製するように構成されている、請求項１に記載の液体クロマトグラィ装置。
【請求項３】
上記試料調製手段は、上記血球層と上記血漿層との界面を検出するための検出手段と、
上記血球層の上層部から上記調製用試料を採取するための調製用試料サンプリングノズルと、を備えており、
上記調製用試料サンプリングノズルは、上記検出手段による検出結果に基づいて、上記血球層の上層部から上記調製用試料を採取するように動作させられる、請求項２に記載の液体クロマトグラフィ装置。
【請求項４】
上記試料調製手段は、上記血球層における上記部界面から距離が、上記血球層の厚みに対して５〜３０％の範囲にある領域から上記調製用試料を採取するように構成されている、請求項１ないし３のいずれかに記載の液体クロマトグラフィ装置。
【請求項５】
上記試料調製手段は、上記血球層における上記界面からの距離が０．５〜５．０ｍｍの範囲にある領域から上記調製用試料を採取するように構成されている、請求項１ないし３のいずれかに記載の液体クロマトグラフィ装置。
【請求項６】
血液試料中のグルコヘモグロビン濃度を測定するように構成されている、請求項１ないし５のいずれかに記載の液体クロマトグラフィ装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カラムに導入される試料中の溶存酸素の影響を低減することができる液体クロマトグラフィ装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液などの生体試料を用いて生体成分を分離分析する場合には、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を利用した高速液体クロマトグラフィ装置（ＨＰＬＣ装置）が広く用いられている（たとえば特許文献１，２参照）。一般的なＨＰＬＣ装置は、図８に示したように、生体成分を含んだ試料が、インジェクションバルブ９０を介して分析カラム９１に導入され、分析カラム９１の充填剤に生体成分が吸着させられる。その一方で、充填剤に吸着したに生体成分は、溶離液ボトル９２から送液ポンプ９３の動力によって分析カラム９１に送られた溶離液によって脱着させられる。分析カラム９１からの脱着液は、測光機構９４によって吸光度が連続的に測定され、これにより、生体成分の分離分析が行なわれる。
【０００３】
その一方で、分析カラム９１に導入する試料としては、たとえばグリコヘモグロビンを測定する場合には全血中の赤血球から調製されたものが使用される。試料の調製は、全血から血球成分を採取するとともに、希釈槽９５において赤血球を溶血させた後、この溶血液を蒸留水や希釈液によって希釈することにより行なわれている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−１３３４４５号公報
【特許文献２】特開２０００−２７５２２９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、希釈槽９５からインジェクションバルブ９０への試料の供給は、希釈槽９５における試料の調整が完了した後、時間をおかずに直ぐに行なわれている。そのため、試料中の溶存酸素濃度が低いために、測定されるグリコヘモグロビン濃度が真値からずれたものとなることがある。これは、血液試料中のグリコヘモグロビン濃度を測定する場合には、グリコヘモグロビンがヘモグロビン総量におけるグリコヘモグロビンの割合として把握される一方で、試料中の酸素飽和度（溶存酸素濃度）は、調製対象となる血液が長期保存された場合や遠心分離により血漿と血球に分離された場合に変動しうるからである。すなわち、血液を長期保存した場合には、経時的に溶存酸素が消費されて酸素飽和度（溶存酸素濃度）が低くなる。一方、遠心分離した血液では、血球層における下層部分は、上層部分に比べて酸素飽和度（溶存酸素濃度）が低く、血球層における酸素飽和度（溶存酸素濃度）は、血球層の位置（深さ）によって異なったものとなる。そのため、血球層における上層部から採取した血球から試料を調製した場合と、下層部から採取した血球から試料を調製した場合では、試料中の酸素飽和度（溶存酸素濃度）が異なったものとなる。
【０００６】
このようにして酸素飽和度（溶存酸素濃度）が異なる場合には、ヘモグロビン中におけるオキシヘモグロビンとデオキシヘモグロビンとの比率が変動する。その一方で、血液試料を希釈して酸素が比較的多い状態で分析カラム９１に導入することから、測光機構９４においては、オキシヘモグロビンの最大吸収波長である４１５ｎｍを測定波長として使用している。そのため、酸素飽和度（溶存酸素濃度）の異なる試料を用いる場合には、オキシヘモグロビンとデオキシヘモグロビンとの比率が異なることとなるため、それらを同一の波長において測定する場合には正確な測定が困難となる。
【０００７】
本発明は、試料中の溶存酸素が分析結果に与える影響を適切に抑制することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明においては、充填剤を保持したカラムと、上記カラムに導入する導入用試料を調製するための試料調製手段と、を備えており、上記試料調製手段は、血球を含む試料における血球を多く含む層の上層部から上記調製用試料を採取するように構成されていることを特徴とする、液体クロマトグラィ装置が提供される。
【０００９】
試料調製手段は、たとえば赤血球を含む血液試料を、赤血球がリッチな血球層と赤血球がプアーな血漿層とに分離させたときの血球層の上層部から調製用試料を採取し、かつ調整用試料を用いて導入用試料を調製するように構成される。
【００１０】
試料調製手段は、たとえば血球層と血漿層との界面を検出するための検出手段と、血球層の上層部から調製用試料を採取するための調製用試料サンプリングノズルと、を備えたものとして構成される。この場合、調製用試料サンプリングノズルは、検出手段による検出結果に基づいて、血球層の上層部から調製用試料を採取するように動作させられる。
【００１１】
試料調製手段は、たとえば血球層における界面から距離が、血球層の厚みに対して５〜３０％の範囲にある領域、あるいは０．５〜５．０ｍｍの範囲にある領域から調製用試料を採取するように構成される。この場合の調整用試料の採取は、たとえば調製用試料サンプリングノズルを用いて行われる。
【００１２】
本発明の液体クロマトグラフィ装置は、たとえば血液試料中のグルコヘモグロビン濃度を測定するように構成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の具体的な例について、図１ないし図６を参照して説明する。
【００１４】
図１に示したＨＰＬＣ装置Ｘは、ラック１０に保持させた採血管１１をテーブル２０にセットして、全血中のグリコヘモグロビン濃度を自動で測定するように構成されたものである。このＨＰＬＣ装置Ｘは、複数の溶離液ボトル１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃ（図面上は３つ）、および装置本体２を備えている。
【００１５】
各溶離液ボトル１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃは、後述する分析カラム６０に供給すべき溶離液を保持したものであり、装置本体２におけるホルダ部２１に配置されている。溶離液としては、たとえばｐＨや塩濃度の異なるバッファが使用される。
【００１６】
装置本体２は、上述のテーブル２０およびホルダ部２１の他に、筐体３の内部に収容された、脱気ユニット４、試料調製ユニット５、分析ユニット６、および測光ユニット７を有している。
【００１７】
テーブル２０は、所定部位にセットされたラック１０を移動させることにより、ラック１０に保持させた採血管１１を、後述する試料調製ユニット５におけるノズル５１により採取可能な位置に移動させるように構成されている。
【００１８】
筐体３には、操作パネル３０および表示パネル３１が設けられている。操作パネル３０は、複数の操作ボタン３２が設けられたものであり、操作ボタン３２を操作することにより、各種の動作（分析動作や印字動作など）を行わせるための信号を生成させ、あるいは各種の設定（分析条件の設定や被験者のＩＤ入力など）を行うことができる。表示パネル３１は、分析結果やエラーである旨を表示するとともに、設定時における操作手順や操作状況などを表示するためのものである。
【００１９】
図２に示したように、脱気ユニット４は、分析ユニット６（分析カラム６０）に溶離液を供給する前に、溶離液から溶存気体を除去するためのものであり、配管８０Ａ，８０Ｂ，８０Ｃを介して溶離液ボトル１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃに、配管８１Ａ，８１Ｂ，８１Ｃを介して分析ユニット６のマニホールド６１に連結されている。
【００２０】
試料調製ユニット５は、採血管１１から採取した血球成分から、分析カラム６０に導入する試料を調製するためのものである。この試料調製ユニット５は、界面検出機構５０、ノズル５１、調製液タンク５２および希釈槽５３を有している。
【００２１】
図３ないし図５に示したように、界面検出機構５０は、採血管１１の血液試料１３における血漿層１３Ａと血球層１３Ｂとの界面１３Ｃを光学的手法により検出するためのものであり、透過型のフォトセンサとして構成されている。この界面検出機構５０は、Ｕ字ホルダ５４に対して、互いに対面した状態で光照射部５５および受光部５６を配置したものである。採血管１１は、テーブル２０において、ラック１０に保持された状態で光照射部５５と受光部５６との間の空間を横切るように移動させられる。
【００２２】
光照射部５５は、採血管１１における上下方向の一定範囲に光を照射可能なものであり、たとえば赤血球での光吸収の大きな波長範囲（５００〜５７０ｎｍ）にピーク波長を有する光を照射可能な線状光源が用いられている。光照射部５５としては、たとえば点状光源を上下方向に走査可能に構成したものを採用することもできる。一方、受光部５６は、採血管１１を透過した光を受光するためのものであり、採血管１１における上下方向の一定範囲において受光可能とされている。このような受光部５６としては、たとえばラインセンサあるいはエリアセンサを使用することができる。
【００２３】
もちろん、界面検出機構５０としては、たとえば採血管１１の表面において反射した光を検出する反射型のフォトセンサを有するものであってもよく、また光学的手法に限らず、たとえばノズル５１を採血管１１に挿入したときの挿入抵抗の変化により、あるいは電気抵抗の変化により血漿層１３Ａと血球層１３Ｂとの界面１３Ｃを検出するように構成してもよい。
【００２４】
図２および図５に示したように、ノズル５１は、採血管１１の血液試料１３をはじめとする各種の液体を採取するためのものであり、液体の吸引・吐出が可能であるとともに、上下方向および水平方向に移動可能とされている。このノズル５１の動作は、図外の制御手段によって制御されており、採血管１１から血液試料１３を採取する場合には、界面検出機構５０において検出された界面１３Ｃを基準として、その界面１３Ｃよりも若干下方において、血球層１３Ｂから血球成分を採取するように動作させられる。
【００２５】
図２に示した調製液タンク５２は、血液試料１３をもとに、分析カラム６０に導入する導入用試料を調製するための調製液を保持したものである。この調製液タンク５２には、調製液として、赤血球の溶血させるための溶血剤を含む希釈液などが保持されている。希釈液としては、酸素飽和度の高いもの、たとえば酸素飽和度が８５％以上のものを使用するのが好ましい。調製液タンク５２からの調製液の採取には、ノズル５１が使用される。
【００２６】
なお、調製液タンク５２には、希釈液として溶血剤を含むものが保持されているが、調製液タンク５２に溶血剤を含まない希釈液と溶血剤とを個別に保持させてもよい。
【００２７】
希釈槽５３は、血液試料１３中の赤血球の溶血および血液試料１３の希釈を行って導入用試料を調製する場であるとともに、導入用試料を大気に接触させて導入用試料における酸素飽和度（溶存酸素濃度）を高めるためのものである。この希釈槽５３は、後述する分析ユニット６におけるインジェクションバルブ６３に配管８３を介して接続されており、希釈槽５３において調製された導入用試料がインジェクションバルブ６３を介して分析カラム６０に導入できるように構成されている。希釈槽５３はまた、導入用試料を大気に接触させるために上部が開放されている。
【００２８】
図２に示したように、分析ユニット６は、分析カラム６０の充填剤に対する生体成分の吸着・脱着をコントロールし、各種の生体成分を測光ユニット７に供するためのものであり、図外の温調機構により温度コントロールされている。分析ユニット６における設定温度は、たとえば４０℃程度とされる。分析カラム６０は、試料中のヘモグロビンを選択的に吸着させるための充填剤を保持させたものである。充填剤としては、たとえばメタクリル酸アクリル共重合体が使用される。
【００２９】
分析ユニット６は、分析カラム６０の他に、マニホールド６１、送液ポンプ６２、およびインジェクションバルブ６３を有している。
【００３０】
マニホールド６１は、複数の溶離液ボトル１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃのうちの特定の溶離液ボトル１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃから、インジェクションバルブ６３に選択的に溶離液を供給させるためのものである。このマニホールド６１は、配管８１Ａ，８１Ｂ，８１Ｃを介して脱気ユニット４に接続され、配管８４を介してインジェクションバルブ６３に接続されている。
【００３１】
送液ポンプ６２は、溶離液をインジェクションバルブ６３に移動させるための動力を付与するためのものであり、配管８４の途中に設けられている。送液ポンプ６２は、たとえば溶離液の流量が１．０〜２．０ｍｌ／ｍｉｎとなるように動作させられる。
【００３２】
インジェクションバルブ６３は、一定量の導入用試料を採取するとともに、その導入用試料を分析カラム６０に導入可能とするものであり、複数の導入ポートおよび排出ポート（図示略）を備えている。このインジェクションバルブ６３には、インジェクションループ６４が接続されている。このインジェクションループ６４は、一定量（たとえば数μＬ）の液体を保持可能なものであり、インジェクションバルブ６３を適宜切り替えることにより、インジェクションループ６４が希釈槽５３と連通して希釈槽５３からインジェクションループ６４に導入用試料が供給される状態、インジェクションループ６４が配管８５を介して分析カラム６０と連通してインジェクションループ６４から導入用試料が分析カラム６０に導入される状態、あるいはインジェクションループ６４に図外の洗浄槽から洗浄液が供給される状態を選択することができる。このようなインジェクションバルブ６３としては、たとえば六方バルブを使用することができる。
【００３３】
図６に示したように、測光ユニット７は、分析カラム６０からの脱着液に含まれるヘモグロビンを光学的に検出するためのものであり、測光セル７０、光源７１、ビームスプリッタ７２、測定用受光系７３および参照用受光系７４を有している。
【００３４】
測光セル７０は、測光エリアを規定するためのものである。この測光セル７０は、導入流路７０Ａ、測光流路７０Ｂおよび排出流路７０Ｃを有しており、これらの流路７０Ａ，７０Ｂ，７０Ｃが一連に連通している。導入流路７０Ａは、分析カラム６０（図２参照）からの脱離液を測光流路７０Ｂに導入するためのものであり、分析カラム６０に配管８６を介して接続されている。測光流路７０Ｂは、測光対象となる脱離液を流通させ、かつ脱離液を測光するための場を提供するものであり、直線状に形成されている。この測光流路７０Ｂは、両端が開放しているとともに、両端部が透明カバー７５により塞がれている。排出流路７０Ｃは、測光流路７０Ｂの脱離液を排出するためのものであり、配管８７を介して廃液槽８８に接続されている（図２参照）。
【００３５】
光源７１は、測光流路７０Ｂを流通する脱離液に光を照射するためのものである。この光源７１は、光軸Ｌが測光流路７０Ｂの中心を通過するように、測光流路７０Ｂの端面７０Ｂａ（透明カバー７５）に対面した状態で配置されている。光源７１としては、オキシヘモグロビンの最大吸収波長である４１５ｎｍおよび参照波長である５００ｎｍの光を含んだ波長範囲の光を出射可能なもの、たとえばハロゲンランプが使用されている。もちろん、光源７１としては、ハロゲンランプ以外のもの、たとえば１または複数のＬＥＤ素子を備えたものを使用することもできる。
【００３６】
ビームスプリッタ７２は、光源７１から出射された光のうち、測光流路７０Ｂを透過した光を分割して測定用受光系７３および参照用受光系７４に入射させるためのものであり、光軸Ｌ上において、４５度傾斜した状態で配置されている。ビームスプリッタ７２としては、ハーフミラーなどの公知の種々のものを使用することができる。
【００３７】
測定用受光系７３は、ビームスプリッタ７２を透過した光のうち、オキシヘモグロビンの最大吸収波長である４１５ｎｍの光を選択的に受光するものであり、光軸Ｌ上に配置されている。この測定用受光系７３は、４１５ｎｍの光を選択的に透過させる干渉フィルタ７３Ａと、干渉フィルタ７３Ａを透過した光を受光するための受光素子７３Ｂと、を備えている。受光素子７３Ｂとしては、フォトダイオードを使用することができる。
【００３８】
参照用受光系７４は、ビームスプリッタ７２において反射して光路が変えられた光のうち、参照波長である５００ｎｍの光を選択的に受光するものである。この測定用受光系７４は、５００ｎｍの光を選択的に透過させる干渉フィルタ７４Ａと、干渉フィルタ７４Ａを透過した光を受光するための受光素子７４Ｂと、を備えている。受光素子７４Ｂとしては、フォトダイオードを使用することができる。
【００３９】
次に、ＨＰＬＣ装置Ｘの動作について説明する。
【００４０】
ＨＰＬＣ装置Ｘを用いてグリコヘモグロビンを測定する場合には、まず血液試料１３が入った採血管１１をラック１０に保持させた状態で、ラック１０をテーブル２０の所定の部位にセットする。採血管１１の血液試料１３は、予め血漿層と血球層に分離させられる。このような分離は、遠心分離機を用いて、あるいは血球成分を自然沈降させることにより行なうことができる。
【００４１】
血漿層１３Ａと血球層１３Ｂとの分離は、ＨＰＬＣ装置Ｘに遠心分離機を組み込んでＨＰＬＣ装置Ｘにおいて行なうようにしてもよく、また、テーブル２０に採血管１１をセットした状態で一定時間静置することにより行ってもよい。
【００４２】
ＨＰＬＣ装置Ｘにおいては、測定開始の指示が確認された場合には、テーブル２０においてラック１０を移動させ、目的とする採血管１１から血液試料１３を採取する。測定開始の指示は、使用者がＨＰＬＣ装置Ｘの所定の操作ボタン３２を操作することにより行なわれる。
【００４３】
採血管１１からの血液試料１３の採取は、界面検出機構５０において血漿層１３Ａと血球層１３Ｂとの界面１３Ｃを検出した後、その界面１３Ｃから一定距離Ｄだけ下方に離れた領域において行なわれる。より具体的には、界面検出機構５０では、光照射部５５から採血管１１に対して光を照射するとともに、採血管１１を透過した光が受光部５６において受光される。ここで、光照射部５５として赤血球での光吸収の大きな波長範囲にピーク波長を有する光を照射した場合には、血漿層１３Ａに比べて、血球層１３Ｂでの光吸収がより大きくなる。そのため、界面検出機構５０においては、光吸収が著しく変化する部分を受光部５６での受光量に基づいて検出することにより、血漿層１３Ａと血球層１３Ｂとの間の界面１３Ｃを検出することができる。
【００４４】
界面検出機構５０において界面１３Ｃの検出が終了した場合には、界面検出機構５０での検出結果に基づいてノズル５１を動作させることにより、血球層１３Ｂの上層部から血液試料１３が採取される。この場合、ノズル５１は、血漿層１３Ａと血球層１３Ｂとの間の界面１３Ｃから距離Ｄが、たとえば血球層１３Ｂの厚みに対して５〜３０％の範囲にある領域、あるいは距離Ｄが０．５〜５．０ｍｍの範囲にある領域に先端が位置させられ、この状態において吸引動作を行なうことにより採血管１１から血液試料１３を採取するように動作させられる。
【００４５】
ここで、遠心分離などにより血球成分を採血管１１の底部に分離した場合には、血球層１３Ｂの上層部は、下層部に比べて酸素飽和度（溶存酸素濃度）が高くなり、また血液試料１３を静置しておいた場合にも、気相からの距離が小さい血球層１３Ｂの上層部は、下層部に比べて酸素飽和度（溶存酸素濃度）が高くなる。そのため、界面検出機構５０における界面１３Ｃの検出結果に基づいてノズル５１の動作を制御し、血球層１３Ｂにおける上層部から血液試料１３を採取するようにすれば、酸素飽和度（溶存酸素濃度）が高い血液試料１３を採取することができる。また、界面１３Ｃからの距離Ｄが先の領域にある部分から血液試料１３を採取する場合には、血球層１３Ｂの上層部から血液試料１３を確実に採取することができる。
【００４６】
ノズル５１によって採取された血液試料１３は、ノズル５１を動作させることによって希釈槽５３に供給される。希釈槽５３にはさらに、調製液タンク５２から希釈液が供給され、ノズル５１を利用したピペッティング操作によって希釈槽５３内の液体を混合することによって導入用試料が調製される。なお、溶血剤を含まない希釈液と溶血剤とを併用する場合には、希釈槽５３に対して希釈液および溶血液を同時的に供給して血液試料１３の希釈および血液試料１３の血球の溶血を同時的に行なってもよいし、それらを時間をおいて個別に供給し、血液試料１３の希釈および血液試料１３の血球の溶血を別工程として行なってもよい。
【００４７】
希釈槽５３において調製された導入用試料は、希釈槽５３において大気と一定時間接触させた後、インジェクションループ６４に供給され、インジェクションループ６４において保持される。
【００４８】
導入用試料を一定時間大気と接触させた場合には、導入用試料の溶存酸素濃度が増加させられる。このようにして導入用試料の酸素飽和度を増加させた場合には、インジェクションループ６４ひいては分析カラム６０に対して溶存酸素濃度の大きな導入用試料を供給することができる。すなわち、導入用試料に含まれるヘモグロビンにおいて、オキシヘモグロビンの割合が大きなものとすることができる。
【００４９】
ここで、導入用試料と大気との接触時間（大気開放時間）は、たとえば１〜２分とされる。これは、大気開放時間が短すぎる場合には導入用試料に対して十分な量の酸素を溶存させることができない一方で、大気開放時間が長すぎる場合には導入用試料調製後からインジェクションループ６４へ導入用試料を導入するまでの時間が大きくなって測定時間が長くなってしまうからである。
【００５０】
また、希釈液として酸素飽和度（溶存酸素濃度）の高いもの、たとえば酸素飽和度が８５％以上のものを使用する場合には、必ずしも希釈後の導入用試料を大気開放する必要はない。すなわち、酸素飽和度（溶存酸素濃度）の高い希釈液を用いる場合には、希釈槽５３として閉鎖されたものを用いる場合であっても一定時間（たとえば１分以上）放置することにより、希釈後の導入用試料の酸素飽和度（溶存酸素濃度）を高めることができ、ヘモグロビン中のオキシヘモグロビンの割合を大きなものとすることができる。
【００５１】
ＨＰＬＣ装置Ｘにおいてはさらに、測定開始の指示が確認された場合には、インジェクションバルブ６３に対して溶離液が供給される。溶離液は、送液ポンプ６２の動力により、溶離液ボトル１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃから脱気ユニット４、マニホールド６１を介してインジェクションバルブ６３に供給され、また複数の溶離液ボトル１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃのうちのいずれの溶離液ボトル１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃの溶離液を供給するかは、マニホールド６１を制御することによって選択される。
【００５２】
インジェクションバルブ６３に供給された溶離液は、配管８５を介して分析カラム６０に供給される。その一方で、インジェクションバルブ６３の切替操作を行うことにより、インジェクションループ６４の導入用試料が溶離液とともに分析カラム６０に導入される。導入用試料の導入開始から一定時間経過した場合には、インジェクションバルブ６３の切替操作を行うことにより、分析カラム６０に対して引き続き溶離液を供給するとともに、インジェクションループ６４の洗浄を行なう。一方、インジェクションループ６４の洗浄と同時的に、先に説明したのと同様にして、先とは異なる採血管１１の血液試料１３から導入用試料を調製し、インジェクションループ６４の洗浄後においては、再び導入用試料をインジェクションループ６４に導入する。このような導入用試料の調製、導入、洗浄は、インジェクションバルブ６３を適宜切り替えつつ、測定対象となる採血管１１（血液試料１３）の数に応じて繰り返し行なわれる。
【００５３】
一方、分析カラム６０においては、導入用試料が導入されることにより、充填剤にグリコヘモグロビンが吸着する。充填剤にグリコヘモグロビンを吸着させた後においては、マニホールド６１によって、分析カラム６０に供給する溶離液の種類を適宜切り替え、充填剤に吸着したグリコヘモグロビンを脱着させる。
【００５４】
分析カラム６０から排出されるグリコヘモグロビンを含む脱着液は、配管８６を介して測光ユニット７の測光セル７０に供給される。測光セル７０に対しては、配管８６および導入流路７０Ａを介して脱着液が導入され、この脱着液は測光流路７０Ｂおよび排出流路７０Ｃを通過した後に、配管８７を介して廃液槽８８に導かれる。
【００５５】
測光ユニット７においては、脱離液が測光流路７０Ｂを通過する際に、光源７１によって脱離液に対して連続的に光が照射される。その一方で、測光流路７０Ｂを透過した光は、ビームスプリッタ７２において分割された後、測定用受光系７３および参照用受光系７４において受光される。測定用受光系７３では、干渉フィルタ７３Ａを透過したオキシヘモグロビンの最大吸収波長である４１５ｎｍの光が受光素子７３Ｂにおいて選択的に受光される。一方、参照用受光系７４では、干渉フィルタ７４Ａを透過した参照波長である５００ｎｍの光が受光素子７４Ｂにおいて選択的に受光される。
【００５６】
受光素子７３Ａ，７４Ａでの受光結果は、図外の演算回路に出力され、この演算回路においてヘモグロビンのクロマトグラム、グリコヘモグロビンの濃度（ヘモグロビン総量におけるグリコヘモグロビンの割合）が演算される。演算回路での演算結果は、表示パネル３１に表示され、また自動的あるいは使用者のボタン操作によってプリントアウトされる。
【００５７】
このようなＨＰＬＣ装置Ｘでは、分析カラム６０に導入するための導入用試料における酸素飽和度（溶存酸素濃度）は、血球層１３Ｂの上部から採取した血液試料１３に基づいて調製されるとともに、調製後においては、分析カラム６０に導入する前に、希釈槽５３において導入用試料の酸素飽和度（溶存酸素濃度）高められている。そのため、分析カラム６０に導入される導入用試料は、各回の測定毎に高い酸素飽和度（溶存酸素濃度）において画一化されるため、導入用試料におけるオキシヘモグロビンとデオキシヘモグロビンの比率を一定化して分析カラム６０に供給することが可能となる。その結果、測光ユニット７に対しては、導入用試料ごとのオキシヘモグロビンとデオキシヘモグロビンとの比率のバラツキが抑制され、このバラツキに起因する測定結果のバラツキを抑制することが可能となる。
【００５８】
本発明は、上述した実施の形態には限定されず、種々に変更可である。たとえば、希釈槽５３において調製された導入用試料の酸素飽和度（溶存酸素濃度）を高めるための手段としては、たとえば図７に示したように希釈槽５３の導入用試料を、酸素リッチなガス、あるいは空気によりバブリングするバブリング機構５４を採用することもできる。
【００５９】
また、血液試料からの血球成分の採取は、必ずしも血漿層と血球層とを分離して行なう必要はなく、血漿と血球が混合した状態で行なってもよい。このような血液試料を用いて導入用試料を調製する場合には、血液試料の液面より若干下方（血液試料の上層部）、たとえば０．５〜５．０ｍｍの範囲にある領域において血液を採取することで、酸素飽和度（溶存酸素濃度）の高い調整用試料を確保するようにしてもよい。
【００６０】
本発明はさらに、血液中のグリコヘモグロビン濃度を測定するためのＨＰＬＣ装置に限らず、血液以外の検体を用いる場合、グリコヘモグロビン濃度以外の成分を測定する場合、あるいはＨＰＬＣ装置以外の液体クロマトグラフィ装置についても適用することができる。
【実施例】
【００６１】
（参考例）
本参考例においては、全血を遠心分離したときの血球層における上層部と下層部とでのグリコヘモグロビンの測定値について検討した。
【００６２】
全血の遠心分離は、Φ１３．２×７８ｍｍである採血管(「ＶＰＤＫ０５２」テルモ株式会社製)に２ｍｌの全血を保持させた状態において、遠心分離装置(「ＣＦ７Ｄ２形」日立工機株式会社製)を用いて、１８５０Ｇで１０分間行なった。
【００６３】
血球層における上層部からの血球成分の採取は、血漿層と血球層との界面を目視により確認し、その界面から２ｍｍ下方位置において行なった。一方、血球層における下層部からの血球成分の採取は、採血管の底にノズルを押し付けた状態で行なった。
【００６４】
グリコヘモグロビンは、グリコヘモグロビン測定装置（「ＡＤＡＭＳ  Ａ１ｃ  ＨＡ−８１６０」；アークレイ株式会社製）を用いて行なった。溶離液としては、商品名「６１Ａ」、「６１Ｂ」および「６１Ｃ」（アークレイ株式会社製）を用い、溶離液は、流量が１．７ｍｌ／ｍｉｎとなるようにして供給した。血球層における上層部と下層部とでのグリコヘモグロビンの測定値については、下記表１に示した。表１においては、６種類の試料についてのグリコヘモグロビンの測定結果を示してある。
【００６５】
【表１】
2007240500.tif 000003
【００６６】
表１から分かるように、血球層における上層部と下層部とでのグリコヘモグロビン濃度は、血球層の下層部ほど大きくなる傾向があるとともに、両者の間には測定値に比較的に大きな隔たりがある。すなわち、血球層における血球成分を採取する位置によって測定値が変動することが伺える。これは、血球層における上層部から採取した血球成分により調製した試料と、下層部から採取した血球成分により調製した試料とでは、酸素飽和度（溶存酸素量）が異なるために測定値が異なっているものと考えられる。
【００６７】
また、本発明者らの実験によれば、カラムからの脱離液中のヘモグロビンの回収率は、脱離時間が長くなるにつれて小さくなる傾向があるとともに、酸素飽和度が高い（溶存酸素量が大きい）場合に比べて、酸素飽和度が低い（溶存酸素量が小さい）場合のほうが、回収率の低下割合が大きくなる。この実験結果からすれば、酸素飽和度が低い（溶存酸素量が小さい）場合には、回収されるヘモグロビン中の大部分を占めるＨｂＡ０の回収率が、グリコヘモグロビン（ＨｂＡｌｃ）の回収率に比べてより小さくなるため、酸素飽和度が高い（溶存酸素量が大きい）場合に比べて測定値が高値化するものと考えられる。
【００６８】
（実施例）
本実施例では、グリコヘモグロビン測定装置（「ＡＤＡＭＳ  Ａ１ｃ  ＨＡ−８１６０」；アークレイ株式会社製）に対して、先に説明した界面検出機構５０を組み込むとともに、検出される界面１３Ｃからの距離が２ｍｍ下方位置において血球成分を採取するようにノズル５１の動作を制御するように改良した装置（図５参照）を用いて全血中のグリコヘモグロビン濃度を測定した。溶離液の種類、流量については参考例と同様な条件とし、参考例と同様な６種類の試料についてグリコヘモグロビンを測定した。測定結果については、下記表２において、参考例での血球層の上層部から血液を採取した場合にとともに示した。
【００６９】
【表２】
2007240500.tif 000004
【００７０】
表２から分かるように、界面検出機構によって界面を検出するとともに、その検出結果に応じてノズルの動作を制御した場合には、血球層の上層部から目視により血球成分を採取した場合と略同様な結果が得られた。すなわち、改良装置では、酸素飽和度の高い（溶存酸素量の大きい）血球層の上層部から確実に血球成分を採取でき、また測定値が高値化することを抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】本発明に係るＨＰＬＣ装置の一例を示す全体斜視図である。
【図２】図１に示したＨＰＬＣ装置の概略構成図である。
【図３】図１に示したＨＰＬＣ装置の界面検出機構を説明するための斜視図である。
【図４】図３のIV−IV線に沿う断面図である。
【図５】試料採取方法を説明するための断面図および要部拡大図である。
【図６】図１に示したＨＰＬＣ装置における測光ユニットを説明するための断面図である。
【図７】本発明に係るＨＰＬＣ装置におけるバブリング機構を示す模式図である。
【図８】従来のＨＰＬＣ装置（高速液体クロマトグラフィ装置）の一例を示す概略構成図である。
【符号の説明】
【００７２】
Ｘ  ＨＰＬＣ装置
１３  血液試料
１３Ａ  血漿層
１３Ｂ  血球層
１３Ｃ  界面
５  試料調製ユニット
５０  界面検出機構
５１  ノズル
７  測光ユニット（検出機構）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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