(57)【要約】【課題】  試料が有限の高さを有する場合でも、励起光の焦点を最適な高さに合わせて正確な測定を行うことのできる蛍光検出装置を提供する。【解決手段】  検査チップ（３）からの反射光に基づいてフォーカス誤差信号を生成するフォーカス誤差検出手段（２５）と、集光された蛍光の光量検出を行う蛍光センサ（２０）と、フォーカス誤差検出手段（２５）と蛍光センサ（２０）からの各信号を入力としてレンズアクチュエータ（３０）の制御を行う制御回路（６４）とを備え、制御回路（６４）は、励起光の光軸を検査チップ（３）の試料位置と重ならせた状態で前記対物レンズを昇降させることで蛍光の検出量が最大となるときのフォーカス誤差信号のオフセット値を算出し、試料測定時にこのオフセット値を基準にしてフォーカス方向の駆動制御を行うように構成する。【選択図】        図２
2007316006.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の載せられた検査チップに励起光を照射してそこから発せられる蛍光を検出することで試料の検査を行う蛍光検出装置であって、
励起光を前記検査チップの測定箇所に集束させるとともに前記蛍光の集光を行う対物レンズと、
該対物レンズを少なくとも励起光の焦点方向に変位させるレンズアクチュエータと、
前記検査チップからの反射光を所定の光学部品を通過させて光センサで検出することで反射面に対する前記励起光の焦点のズレ量を表わすフォーカス誤差信号を出力するフォーカス誤差検出手段と、
前記対物レンズにより集光された蛍光の光量検出を行う蛍光センサと、
前記フォーカス誤差検出手段と前記蛍光センサからの各信号を入力として前記レンズアクチュエータの制御を行う制御回路とを備え、
前記制御回路は、
前記励起光の光軸を前記検査チップの試料位置と重ならせた状態で前記対物レンズを昇降させる第１ステップと、
該第１ステップにて前記蛍光の検出量が最大となるときの前記フォーカス誤差信号のオフセット値を算出する第２ステップと、
前記オフセット値を所定の記憶領域に設定する第３ステップとを行って、
試料測定時に前記オフセット値と前記フォーカス誤差信号の値とを比較しながらフォーカス方向の駆動制御を行うことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項２】
試料の載せられた検査チップに励起光を照射してそこから発せられる蛍光を検出することで試料の検査を行う蛍光検出装置であって、
励起光を前記検査チップの測定箇所に集束させるとともに前記蛍光の集光を行う対物レンズと、
該対物レンズを少なくとも励起光の焦点方向に変位させるレンズアクチュエータと、
前記検査チップからの反射光を所定の光学部品を通過させて光センサで検出することで反射面に対する前記励起光の焦点のズレ量を表わすフォーカス誤差信号を出力するフォーカス誤差検出手段と、
前記対物レンズにより集光された蛍光の光量検出を行う蛍光センサと、
前記フォーカス誤差検出手段と前記蛍光センサからの各信号を入力として前記レンズアクチュエータの制御を行う制御回路とを備え、
前記制御回路は、
前記励起光の光軸を前記検査チップの試料位置と重ならせた状態で前記対物レンズを昇降させることで、前記蛍光の検出量が最大となるときの前記フォーカス誤差信号のオフセット値を算出し、試料測定時にこのオフセット値を基準にしてフォーカス方向の駆動制御を行うことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項３】
前記制御回路は、
前記オフセット値を所定の記憶領域に設定するとともに、
試料測定時に前記所定の記憶領域に設定された前記オフセット値とフォーカス誤差信号の値とを比較しながらフォーカス方向の駆動制御を行うことを特徴とする請求項２記載の蛍光検出装置。
【請求項４】
前記制御回路は、
試料測定時、前記フォーカス誤差信号の値が前記オフセット値と一致するように前記対物レンズのフォーカス方向のサーボ制御を行うことを特徴とする請求項２又は３に記載の蛍光検出装置。
【請求項５】
前記制御回路は、
試料測定時、前記オフセット値に対応するフォーカス方向の位置を基準位置として、前記対物レンズが該基準位置から所定の変位動作をするようにフォーカス方向の駆動制御を行うことを特徴とする請求項２又は３に記載の蛍光検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、試料が付着された検査チップに励起光を照射して蛍光を検出することで試料の検査を行う蛍光検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
以前より、例えばＤＮＡ（デオキシリボ核酸）などの検体を試薬と反応させ、この試料に励起光を照射してそこから発せられる蛍光量を検出することで、検体の検査を行う蛍光検出装置がある。このような検査によれば、癌など遺伝子に起因すると考えられる病気の検査に威力を発揮すると考えられている。
【０００３】
本発明者らは、このような蛍光検出装置において、励起光を検査箇所に集束したりそこから発せられる蛍光の集光を行ったりする対物レンズを電磁力作用によりその焦点方向や水平方向に微小変位させて、フォーカス調整や検査位置のスキャンを行うようにした装置を開発している。
【０００４】
フォーカスの調整には、光ディスクのピックアップの技術を利用して、例えば、非点収差法やダブルナイフエッジ法等により反射光の検出信号からフォーカス誤差信号を生成し、このフォーカス誤差信号を用いてフォーカスサーボをかける構成を適用した。
【０００５】
また、本願発明に関連する従来技術として、次のような技術があった。例えば、特許文献１には、ＤＮＡアレイ読み取り装置においてＤＮＡディスクとレンズとの距離を求める方法として非点収差法やナイフエッジ法などを使用する技術が開示されている。また、特許文献２には、球面収差の検出補正のために、光束の焦点位置の検出に非点収差法やナイフエッジ法を組み合わせることが開示されている。また、特許文献３には、光ディスクドライブ装置において２組のフォーカスサーボ検出手段を設け、状況に応じてこれらを切り替えて使用する技術が開示されている。
【特許文献１】特開２００１−２３８６７４号公報
【特許文献２】特開２００５−３０２２５４号公報
【特許文献３】特開２０００−３２２７４８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
蛍光検出装置においては、試料は５μｍ〜２０μｍ程度の高さを有して検査チップに載せられる。従って、励起光の焦点は、検査チップの試料載置面ではなく、そこから少し試料の側へ変位した位置で合わせる必要がある。
【０００７】
しかしながら、光ディスクのピックアップ技術とは異なり、焦点を合わせたい位置においてレーザー光は反射しないため、従来の光ピックアップ技術をそのまま適用したのでは、最適なフォーカス制御が出来ないという問題があった。
【０００８】
この発明の目的は、試料が有限の高さを有する場合でも、励起光の焦点を最適な高さに合わせて正確な測定を行うことのできる蛍光検出装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上記目的を達成するため、試料の載せられた検査チップに励起光を照射してそこから発せられる蛍光を検出することで試料の検査を行う蛍光検出装置であって、励起光を前記検査チップの測定箇所に集束させるとともに前記蛍光の集光を行う対物レンズと、該対物レンズを少なくとも励起光の焦点方向に変位させるレンズアクチュエータと、前記検査チップからの反射光を所定の光学部品を通過させて光センサで検出することで反射面に対する前記励起光の焦点のズレ量を表わすフォーカス誤差信号を出力するフォーカス誤差検出手段と、前記対物レンズにより集光された蛍光の光量検出を行う蛍光センサと、前記フォーカス誤差検出手段と前記蛍光センサからの各信号を入力として前記レンズアクチュエータの制御を行う制御回路とを備え、前記制御回路は、前記励起光の光軸を前記検査チップの試料位置と重ならせた状態で前記対物レンズを昇降させることで、前記蛍光の検出量が最大となるときの前記フォーカス誤差信号のオフセット値を算出し、試料測定時にこのオフセット値を基準にしてフォーカス方向の駆動制御を行うようにしたものである。
【００１０】
このような手段によれば、試料が有限の高さを有する場合でもそれに合わせて励起光の焦点を最適な位置に調整することが出来る。
具体的には、前記制御回路は、前記オフセット値を所定の記憶領域に設定するとともに、試料測定時に前記所定の記憶領域に設定された前記オフセット値とフォーカス誤差信号の値とを比較しながらフォーカス方向の駆動制御を行うように構成すると良い。
【００１１】
このように構成することで、１つの検査チップに複数の試料スポットが形成されている場合に、１個のスポットに対してオフセット値の検出と設定を行うことで、他のスポットの測定に対してもこのオフセット値を使い回すことが出来る。それにより、全てのスポットについて測定を高速に行うことが出来る。
【００１２】
さらに具体的には、前記制御回路は、試料測定時、前記フォーカス誤差信号の値が前記オフセット値に留まるように前記対物レンズのフォーカス方向のサーボ制御を行うように構成する。或いは、前記オフセット値に対応するフォーカス方向の位置を基準位置として、前記対物レンズが該基準位置から所定の変位動作をするようにフォーカス方向の駆動制御を行う。
【００１３】
蛍光検出装置では、励起光を試料の中央に集束させた状態で測定を行ったり、或いは、試料に対して励起光の焦点を上下に揺動させて測定を行ったりするので、それぞれの場合に、前記オフセット値に対応する位置を基準位置といてフォーカス制御を行うことで、測定時の励起光の焦点位置や焦点位置の変位動作を最適なものにすることが出来る。
【発明の効果】
【００１４】
以上説明したように、本発明に従うと、検査チップ上で有限の高さを有する試料に対して励起光の焦点を最適な高さに合わせて正確な測定を行うことが出来るという効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。
図１は、本発明の実施の形態の蛍光検出装置１００の光学構成を示した斜視図、図２は蛍光検出装置１００の全体構成図である。図３には、この蛍光検出装置１００で測定対象となるＤＮＡがスポットされたＤＮＡチップの一部分を表わした平面図を示す。
【００１６】
この実施の形態の蛍光検出装置１００は、試薬と反応させたＤＮＡに励起光を照射してそこから発せられる蛍光を測定することで、検体であるＤＮＡが正常なものか或いは異常なものかを判別する装置である。また、この蛍光検出装置１００は、第１波長（例えば５３２ｎｍ）の励起光と第２波長（例えば６５８ｎｍ）の励起光とを別々に用いて、各励起光により発生される第１波長（例えば５７０ｎｍ）の蛍光と第２波長（例えば６７０ｎｍ）の蛍光とを検出することを可能とするものである。
【００１７】
図３に示すように、検査チップとしてのスライドガラス３には、試薬と反応させたＤＮＡ試料が縦横複数の配列状にスポットされ、これら各スポットＰ…に励起光の照射位置を順次移動させていくことで、全てのスポットＰ…について検体の検査が行えるようになっている。励起光の照射位置は、対物レンズ１６を水平方向（ＸＹ方向）に変位させたり或いはスライドガラス３を平行移動させたりして移動させる。
【００１８】
図１と図２に示すように、この蛍光検出装置１００の光学系は、第１波長の励起光を出力する第１発光器１１と、第１発光器１１の出射光を平行光にするコリメータレンズ１２と、第１発光器１１の出射光から第１波長以外の光を除去するエキサイタフィルタ１３と、第１波長域の光を反射させ第２波長域の光を透過させるフィルタミラー１４と、光の波長帯に応じて励起光は反射させ蛍光は透過させる２波長対応のダイクロイックミラー１５と、励起光をスライドガラス３の各スポットＰへ集束させるとともにそこから発せられる蛍光を受光する対物レンズ１６と、ダイクロイックミラー１５を透過した光から蛍光波長域以外の光を除去する２枚のエミッタフィルタ１７Ａ，１７Ｂと、これら２枚のエミッタフィルタ１７Ａ，１７Ｂの何れかを蛍光の光軸上に配置させるアクチュエータ１８と、蛍光の光量検出を行う光センサとしてのフォトマルチプライア２０と、第２波長の励起光を出力する第２発光器２１と、進行波と反射波とを分離する偏光ビームスプリッタ２２および１／４波長板２４と、第２発光器２１の出射光を平行光にするコリメータレンズ２３と、偏光ビームスプリッタ２２で分離された反射光を受光して励起光の焦点位置の変位量を検出するフォーカス誤差検出ユニット２５等を備えている。
【００１９】
また、この蛍光検出装置１００には、スライドガラス３を一定箇所に載置するステージ（図示略）と、対物レンズ１６を上下左右前後の３軸方向に電気的な作用により駆動するレンズアクチュエータ３０と、フォーカス誤差検出ユニット２５からの出力を演算してフォーカス誤差信号を生成する演算回路６１（図２参照）と、フォーカス誤差信号をデジタル化するデジタルサンプリング回路６２と、フォトマルチプライア２０の検出信号をデジタル化するデジタルサンプリング回路６３と、これらデジタル化されたフォーカス誤差信号や蛍光検出信号を入力してレンズアクチュエータ３０の駆動制御を行う制御回路６４等が設けられている。
【００２０】
上記の第１発光器１１は例えばＬＥＤ（発光ダイオード）が適用され、第２発光器２１は例えばレーザーダイオードが適用されている。第１発光器１１の出射光と第２発光器２１の出射光とは、フィルタミラー１４の作用によりほぼ同一の光軸に沿ってスライドガラス３の側へ向うようになっている。
【００２１】
フォーカス誤差検出ユニット２５は、内部にフォーカス誤差検出用の光学部品２５Ａと光センサ２５Ｂとが組み込まれて一体化されたものであり、第２発光器２１からのレーザ光の反射ビームにより励起光の焦点位置のズレ検出を行うものである。上記の第１発光器１１とコリメータレンズ１２、並びに、第２発光器２１とコリメータレンズ２３は、製造時に精度よく位置調整がなされ、第２発光器２１の励起光の焦点が合えば、第１発光器１１の励起光の焦点も同一の高さに合うようになっている。
【００２２】
なお、この実施の形態では、フォーカス誤差検出ユニット２５として、例えば、共焦点法によりフォーカス誤差を検出するもの、ダブルナイフエッジ法によりフォーカス誤差を検出するもの、非点収差法によりフォーカス誤差を検出するものの３種類が用意され、これら複数種類のユニットの中から１つを選択して装着可能な構成にされている。このように選択可能にすることで、適宜フォーカス誤差の検出方式を切り替えて、測定の状況に応じて素早い焦点合わせを行うことが可能となる。
【００２３】
図４には、レンズアクチュエータ３０の詳細な斜視図を示す。
レンズアクチュエータ３０は、対物レンズ１６を保持する直方体形状のレンズホルダ３１と、このレンズホルダ３１を上下四方から可動な状態に支持する８本のワイヤ３２…と、ワイヤ３２…の基部でワイヤ３２…の振動を緩衝するゲル材が注入されたゲルボックス３３…と、レンズホルダ３１の全側面に沿って横方向に巻回される第１コイル３５と、レンズホルダ３１の側面に固着された偏平型の第２コイル３６，３６…と、これらレンズホルダ３１の４つの側面にそれぞれ対向配置される４つの磁石３８…と、レンズホルダ３１の隣接する２つの側面の上部に貼着されたスケールテープ４１，４１と、これらスケールテープ４１，４１に対向する位置で機枠に固定される反射型光センサ４２，４２等を備えている。
【００２４】
レンズホルダ３１は、その中央に上下に貫通した導光孔が形成され、この導光孔の上部に対物レンズ１６が嵌合されている。
【００２５】
８本のワイヤ３２…は、弾性を有する金属製の線状バネであり、各ワイヤ３２が横方向にしなることでレンズホルダ３１がＸ方向やＹ方向に変位し、また、各ワイヤ３２…が上下方向にしなることでレンズホルダ３１がＺ方向に変位するようになっている。
【００２６】
スケールテープ４１，４１と反射型光センサ４２は、レンズホルダ３１のＸ−Ｙ方向の変位量を検出するためのリニアエンコーダ装置である。
【００２７】
このような構成により、ワイヤ３２…を介して第１コイル３５や第２コイル３６，３６…に電流を流すことで、対物レンズがＸＹＺの３軸方向にそれぞれ独立的に微少量の駆動が可能になっている。
【００２８】
次に、上記構成の蛍光検出装置１００の動作について説明する。
図５には、スライドガラス３上のＤＮＡスポットＰに励起光が照射される状態を表わした概略図を、図６には、フォーカス調整処理の過程で制御回路に入力される蛍光検出信号とフォーカス誤差信号の波形図を示す。
【００２９】
測定を開始するには、先ず、試料がスポットされたスライドガラス３をステージに載置して装置に測定開始の指令を与える。図５に示すように、スライドガラス３は例えばその下面側にＤＮＡスポットＰ…が来るように載置される。
【００３０】
測定開始の指令があると、先ず、制御回路６４はレンズアクチュエータ３０に駆動信号を出力して、対物レンズ１６をＸ−Ｙ方向に移動させて励起光の光軸を或るＤＮＡスポットＰに合わせる。このＸＹ方向の位置合わせは、例えば、１つのＤＮＡスポットＰの位置が予め決められた位置に来るようにしておくことで実現できる。次いで、対物レンズ１６をＺ方向に変位させて励起光の焦点をＤＮＡスポットＰの下方から上方まで通過させる。
【００３１】
このとき、制御回路６４に入力される蛍光検出信号およびフォーカス誤差信号は、図６に示すように変化する。すなわち、蛍光検出信号は励起光の焦点がＤＮＡスポットＰの内部にあるときにピークとなり、フォーカス誤差信号は励起光の焦点がスライドガラス３の表面から前後１０μｍ程度のところで信号が現われ、焦点が表面にあったところでほぼ信号強度がゼロとなる。また、焦点が反射面より手前にあるときと奥側にあるときとで信号の正負が逆になる。
【００３２】
このような蛍光検出信号とフォーカス誤差信号を入力しながら、制御回路６４は、蛍光検出信号がピークとなるときのフォーカス誤差信号の値をオフセット値Ｉｏｆｓとして算出し、例えば制御回路６４内の設定レジスタに登録する。
【００３３】
なお、上記のフォーカス誤差信号は、フォーカス誤差検出ユニット２５として非点収差法のユニットを用いたときのものであり、適用するユニットによってフォーカス誤差信号の現われる反射面からの距離や信号波形は変化する。例えば、ダブルナイフエッジ法のユニットを用いれば、励起光の焦点がスライドガラス３の反射面から前後５０μｍ程度離れたところからフォーカス誤差信号が現われる。従って、ＤＮＡスポットＰがもう少し高いものであればダブルナイフエッジ法のユニットを用いるなど、適宜、フォーカス誤差検出ユニットを選定することで、蛍光検出が最大となるフォーカス誤差信号のオフセット値を得ることが出来る。
【００３４】
但し、このフォーカス調整処理では、フォーカス誤差信号により焦点がスライドガラス３表面の手前側にあるか奥側にあるかを認識できる必要があるため、前後の認識ができない共焦点法のユニットは使用できない。
【００３５】
オフセット値Ｉｏｆｓを設定したら、次に、スライドガラス３上の複数のＤＮＡスポットＰ，Ｐ…に対する蛍光測定の処理に移行する。蛍光測定の処理が開始されたら、制御回路６４は、上記のオフセット値Ｉｏｆｓにフォーカス誤差信号が留まるようにフォーカスサーボを掛ける。そして、このフォーカスサーボを継続しながら、レンズアクチュエータ３０のＸＹ方向の駆動制御を行って励起光の焦点を複数のＤＮＡスポットＰ，Ｐ…を通過させるようにスキャンさせていく。これにより、複数のＤＮＡスポットＰ，Ｐ…に対して、順次、最適な高さに焦点がくるように励起光が照射され、それにより各ＤＮＡスポットＰ，Ｐ…から発せられる蛍光がフォトマルチプライア２０に入射されてその光量が検出される。
【００３６】
このようにして得られた蛍光検出値は、各ＤＮＡスポットＰ，Ｐ…に対して励起光の焦点が一定の高さ位置に合わされたときの値を含むため、この値により各スポットＰ，Ｐ…内の試料に対して正確な定性分析を行うことが出来る。
【００３７】
以上のように、この実施の形態の蛍光検出装置１００によれば、試料が有限の高さを有する場合でもそれに合わせて励起光の焦点を最適な高さに調整することができ、それにより正確な試料の分析を行うことが出来るという効果が得られる。
【００３８】
なお、本発明は、上記実施の形態に限られるものではなく、様々な変更が可能である。例えば、上記実施の形態では、複数のＤＮＡスポットの測定の際に励起光の高さが一定に維持されるようにフォーカスサーボを掛けた例を示したが、本発明のフォーカス方向の駆動制御は、これに限られず、例えば、オフセット値に対応する焦点の高さを中心に焦点位置を上下に揺動させるなど、オフセット値に対応する焦点高さを基準にして行われる種々の駆動制御が含まれる。
【００３９】
その他、励起光の波長、蛍光の波長、試料（検体）の種類、検査チップにおける試料の固定方法、測定手順など、実施の形態で具体的に記した細部等は、発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明の実施の形態の蛍光検出装置の光学構成を示した斜視図である。
【図２】実施の形態の蛍光検出装置の全体構成図である。
【図３】測定対象となるＤＮＡがスポットされたＤＮＡチップの一部分を示した平面図である。
【図４】レンズアクチュエータの詳細を示す斜視図である。
【図５】スライドガラス上のＤＮＡスポットに励起光を照射する状態を表わした概略図である。
【図６】制御回路に入力される蛍光検出信号とフォーカス誤差信号の波形図を示す。
【符号の説明】
【００４１】
３    スライドガラス
１１    第１発光器
１２    コリメータレンズ
１３    エキサイタフィルタ
１４    フィルタミラー
１５    ダイクロイックミラー
１６    対物レンズ
１７Ａ，１７Ｂ  エミッタフィルタ
１８    アクチュエータ
２０    フォトマルチプライア
２１    第２発光器
２２    偏光ビームスプリッタ
２３    コリメータレンズ
２４    １／４波長板
２５    フォーカス誤差検出ユニット
３０    レンズアクチュエータ
６１    演算回路
６２，６３  デジタルサンプリング回路
６４    制御回路
１００  蛍光検出装置
Ｉｏｆｓ  オフセット値
【図１】
2007316006.tif 000003
【図２】
2007316006.tif 000004
【図３】
2007316006.tif 000005
【図４】
2007316006.tif 000006
【図５】
2007316006.tif 000007
【図６】
2007316006.tif 000008