(57)【要約】【課題】  アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、アミノアシルｔＲＮＡを用い、真核細胞中で、非天然型アミノ酸組み込み蛋白質を製造する方法の提供；かかるアミノアシルｔＲＮＡを真核細胞中で合成する方法の提供；ｔＲＮＡ、かかるｔＲＮＡの合成に用いる核酸の提供。【解決手段】  アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素と、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下で非天然型アミノ酸と結合可能なｔＲＮＡの核酸配列の５’末端に、真核生物由来ｔＲＮＡ核酸配列を結合させた配列を含む核酸と、非天然型アミノ酸と、所望の位置にナンセンス変異を受けた所望の蛋白質遺伝子と、を真核細胞中で発現させ、前記蛋白質のナンセンス変異の位置に前記非天然型アミノ酸を取り込ませて非天然型アミノ酸組み込み蛋白質を発現させることを特徴とする非天然型アミノ酸組み込み蛋白質の製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成対象となるｔＲＮＡの核酸配列の５’末端に真核生物由来ｔＲＮＡ核酸配列を結合させた配列を含む核酸を、真核細胞内において転写することを特徴とするｔＲＮＡ合成方法。
【請求項２】
前記合成対象となるｔＲＮＡが、非真核生物由来ｔＲＮＡである請求項１に記載のｔＲＮＡ合成方法。
【請求項３】
前記非真核生物由来ｔＲＮＡが、ピロリジン（ｐｙｒｒｏｌｙｓｉｎｅ）ｔＲＮＡである請求項２に記載のｔＲＮＡ合成方法。
【請求項４】
合成対象となるｔＲＮＡの核酸配列の３’末端に転写終結配列をさらに結合させた核酸を用いる請求項１〜３のいずれか１項に記載のｔＲＮＡ合成方法。
【請求項５】
真核細胞が動物細胞である請求項１〜４のいずれか１項に記載のｔＲＮＡ合成方法。
【請求項６】
動物細胞が哺乳動物細胞である請求項５に記載のｔＲＮＡ合成方法。
【請求項７】
真核生物由来ｔＲＮＡ核酸配列が、ヒトバリンｔＲＮＡ核酸配列である請求項１〜６のいずれか１項に記載のｔＲＮＡ合成方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のｔＲＮＡの合成方法に用いる核酸であって、ｔＲＮＡの核酸配列の５’末端に、真核生物由来ｔＲＮＡ核酸配列を結合させた配列からなる核酸。
【請求項９】
ｔＲＮＡに対応するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下、ｔＲＮＡの核酸配列の５’末端に真核生物由来ｔＲＮＡ核酸配列を結合させた配列を含む核酸を、真核細胞内において転写することを特徴とするアミノアシルｔＲＮＡ合成方法。
【請求項１０】
前記ｔＲＮＡが、非真核生物由来ｔＲＮＡである請求項９に記載のアミノアシルｔＲＮＡ合成方法。
【請求項１１】
前記非真核生物由来ｔＲＮＡが、ピロリジン（ｐｙｒｒｏｌｙｓｉｎｅ）ｔＲＮＡである請求項１０に記載のアミノアシルｔＲＮＡ合成方法。
【請求項１２】
合成対象となるｔＲＮＡの核酸配列の３’末端に転写終結配列をさらに結合させた核酸を用いる請求項９〜１１のいずれか１項に記載のアミノアシルｔＲＮＡ合成方法。
【請求項１３】
真核細胞が動物細胞である請求項９〜１２のいずれか１項に記載のアミノアシルｔＲＮＡ合成方法。
【請求項１４】
動物細胞が哺乳動物細胞である請求項１３に記載のアミノアシルｔＲＮＡ合成方法。
【請求項１５】
真核生物由来ｔＲＮＡ核酸配列が、ヒトバリンｔＲＮＡ核酸配列である請求項９〜１４のいずれか１項に記載のアミノアシルｔＲＮＡ合成方法。
【請求項１６】
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素と、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下で非天然型アミノ酸と結合可能なｔＲＮＡの核酸配列の５’末端に、真核生物由来ｔＲＮＡ核酸配列を結合させた配列を含む核酸と、非天然型アミノ酸と、所望の位置にナンセンス変異を受けた所望の蛋白質遺伝子と、を真核細胞中で発現させ、前記蛋白質のナンセンス変異の位置に前記非天然型アミノ酸を取り込ませて非天然型アミノ酸組み込み蛋白質を発現させることを特徴とする非天然型アミノ酸組み込み蛋白質の製造方法。
【請求項１７】
前記ｔＲＮＡが、非真核生物由来である請求項１６に記載の非天然型アミノ酸組み込み蛋白質の製造方法。
【請求項１８】
前記非真核生物由来ｔＲＮＡが、ピロリジン（ｐｙｒｒｏｌｙｓｉｎｅ）ｔＲＮＡである請求項１７に記載の非天然型アミノ酸組み込み蛋白質の製造方法。
【請求項１９】
前記ｔＲＮＡの核酸配列の３’末端に転写終結配列をさらに結合させた核酸を用いる請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の非天然型アミノ酸組み込み蛋白質の製造方法。
【請求項２０】
真核細胞が動物細胞である請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の非天然型アミノ酸組み込み蛋白質の製造方法。
【請求項２１】
動物細胞が哺乳動物細胞である請求項２０に記載の非天然型アミノ酸組み込み蛋白質の製造方法。
【請求項２２】
真核生物由来ｔＲＮＡ核酸配列が、ヒトバリンｔＲＮＡ核酸配列である請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の非天然型アミノ酸組み込み蛋白質の製造方法。
【請求項２３】
非天然型アミノ酸がリジン誘導体である請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の非天然型アミノ酸組み込み蛋白質の製造方法。
【請求項２４】
リジン誘導体が、ピロリジン（ｐｙｒｒｏｌｙｓｉｎｅ）、Ｎε−ｔ−ブトキシカルボニルリジン（Ｎε−Ｂｏｃ−リジン）、Ｎε−アセチルリジン、Ｎε−トリメチルリジン、Ｎε−２−メチルアミノ−ベンゾイルリジン（Ｎｍａ−リジン）からなる群より選ばれる１種である請求項２３に記載の非天然型アミノ酸組み込み蛋白質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｔＲＮＡ合成方法、核酸、アミノアシルｔＲＮＡ合成方法及び非天然型アミノ酸組み込み蛋白質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質中の所望の位置のアミノ酸残基を、通常の蛋白質合成に関わる２０種類以外のアミノ酸（非天然型アミノ酸）で置換した、非天然型アミノ酸組み込み蛋白質（以下、「アロ蛋白質」という）は、蛋白質の機能・構造解析のための有効な手段となり得る。リジン誘導体の中には、アセチルリジン、メチルリジン等のように、翻訳後修飾により合成されるアミノ酸がある。それらは、特にヒストンにおける遺伝子発現調節に関わることで有名であるが、その他多くの蛋白質の転写活性化調節、蛋白質−蛋白質相互作用調節、ユビキチン化の抑制／促進に関わることが知られている。このようなリジン誘導体が、真核生物に部位特異的に導入できれば、リジンのアセチル化、メチル化等について多くの知見が得られると期待される。
【０００３】
ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素（ＰｙｌＲＳ）は、メタン生成古細菌（Methanosarcina属）から発見された新しいアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）である。その対応するｔＲＮＡ（ピロリジン（ｐｙｒｒｏｌｙｓｉｎｅ）ｔＲＮＡ）は、サプレッサーｔＲＮＡであり、異常に小さいＤループを有する等特異な二次構造を有する。最近、ＰｙｌＲＳとピロリジンｔＲＮＡが、大腸菌内で、内在性のａａＲＳ及びｔＲＮＡとは相互作用をせず（直交性）、ピロリジンをアンバー・コドン特異的に蛋白質に導入し得ることが見出された（非特許文献１）。また、野生型ＰｙｌＲＳが、大腸菌内でＮε−Ｂｏｃ−Ｌ−リジン等の非天然型アミノ酸をピロリジンｔＲＮＡに結合させ得ることを見出した（非特許文献１）。
【非特許文献１】Ｓ．Ｋ．Ｂｌｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４３１，  ３３３−３３５（２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、ＰｙｌＲＳとピロリジン（ｐｙｒｒｏｌｙｓｉｎｅ）ｔＲＮＡが、真核生物、特に動物細胞において直交性を有し、これらを遺伝暗号の拡張に用いることができるか否か明らかになっていなかった。
【０００５】
したがって、本発明は、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、アミノアシルｔＲＮＡを用い、真核細胞中で、非天然型アミノ酸組み込み蛋白質を製造する方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、かかるアミノアシルｔＲＮＡを真核細胞中で合成する方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、ｔＲＮＡを真核細胞中で合成する方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、かかるｔＲＮＡを真核細胞中で合成するための核酸を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究した結果、プロモーターに着目した。一般に、真核細胞内でのｔＲＮＡの発現は、ｔＲＮＡコーディング配列内の２つの内部プロモーターを必要とし、そのコンセンサス配列は、ボックスＡ、ボックスＢとして知られている。例えば、バチルス  ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）のサプレッサーチロシンｔＲＮＡは、原核生物由来であるが、そのサプレッサーチロシンｔＲＮＡ配列内には、ボックスＡとボックスＢが存在しているため（M.Sprinzlら、Nucleic Acids Research 17, 1-172(1989)）、なんら改変を加えなくても動物細胞内で発現させることができる。このため、ボックスＡとボックスＢを有しない原核生物を用いる場合、これにボックスＡとボックスＢを導入することが必要であると考えられる。
【０００７】
しかしながら、上記したように、メタン生成古細菌由来のピロリジンｔＲＮＡのＤループは、数塩基が欠損した異常に小さいものであり、これにボックスＡとボックスＢを導入すると、機能が失われてしまうため、ボックスＡとボックスＢを導入したピロリジンｔＲＮＡを用いても、リジン誘導体を組み込んだアロ蛋白質を合成することはできなかった。そこで、本発明者らは、さらに検討した結果、真核生物のｔＲＮＡをプロモーターとしてピロリジンｔＲＮＡの５’末端側に結合させれば、メタン生成古細菌由来のピロリジンｔＲＮＡを、動物細胞中で効果的に発現させることができることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、合成対象となるｔＲＮＡの核酸配列の５’末端に真核生物由来ｔＲＮＡ核酸配列を結合させた配列を含む核酸を、真核細胞内において転写することを特徴とするｔＲＮＡ合成方法を提供するものである。
また、本発明は、かかるｔＲＮＡの合成方法に用いる核酸であって、ｔＲＮＡの核酸配列の５’末端に、真核生物由来ｔＲＮＡ核酸配列を結合させた配列からなる核酸を提供するものである。
また、本発明は、ｔＲＮＡに対応するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下、ｔＲＮＡの核酸配列の５’末端に真核生物由来ｔＲＮＡ核酸配列を結合させた配列を含む核酸を、真核細胞内において転写することを特徴とするアミノアシルｔＲＮＡ合成方法を提供するものである。
また、本発明は、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素と、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の存在下で非天然型アミノ酸と結合可能なｔＲＮＡの核酸配列の５’末端に、真核生物由来ｔＲＮＡ核酸配列を結合させた配列を含む核酸と、非天然型アミノ酸と、所望の位置にナンセンス変異を受けた所望の蛋白質遺伝子と、を真核細胞中で発現させ、前記蛋白質のナンセンス変異の位置に前記非天然型アミノ酸を取り込ませて非天然型アミノ酸組み込み蛋白質を発現させることを特徴とする非天然型アミノ酸組み込み蛋白質の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の製造方法を用いれば、ｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡを、真核細胞中で効果的に発現させることができ、ボックスＡ、ポックスＢを有さないｔＲＮＡを真核細胞中で発現させることが可能である。
また、本発明の製造方法を用いれば、野生型のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を用いて、特に真核生物に存在するＮε−アセチルリジン、Ｎε−トリメチルリジン、蛍光基を有するＮε−２−メチルアミノ−ベンゾイルリジン等のリジン誘導体が導入されたアロ蛋白質を合成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（非天然型アミノ酸）
本発明に用いられる非天然型アミノ酸としては、特にリジン誘導体であることが好ましい。リジン誘導体は、非天然型のアミノ酸であり、ε位の窒素原子に結合した水素原子が他の原子又は原子団に置換されたものが好ましい。例えば、ピロリジン（ｐｙｒｒｏｌｙｓｉｎｅ）、Ｎε−ｔ−ブトキシカルボニルリジン（Ｎε−Ｂｏｃ−リジン）、Ｎε−アセチルリジン、Ｎε−トリメチルリジン、Ｎε−２−メチルアミノ−ベンゾイルリジン（Ｎｍａ−リジン）が挙げられる。特に、真核生物に存在する修飾リジンであるメチルリジン、アセチルリジンを部位特異的に蛋白質に導入することにより、リジンのアセチル化、メチル化について多くの知見が得られる可能性がある。また、これらのリジン誘導体が導入されたアロ蛋白質は、蛋白質機能・構造解析の材料として有用であり、創薬のターゲットともなる可能性がある。
【００１１】
（アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素）
本発明で用いられるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素は、非天然型アミノ酸を認識し、かつアミノアシルｔＲＮＡを特異的に認識して、該非天然型アミノ酸が結合したサプレッサーｔＲＮＡを生成させることができるｔＲＮＡ合成酵素である。
このうち、アミノ酸としてリジン誘導体を認識し、かつｔＲＮＡとして併用するピロリジンｔＲＮＡを特異的に認識して、該リジン誘導体が結合したサプレッサーｔＲＮＡを生成させることができるメタン生成古細菌由来のＰｙｌＲＳが好ましい。メタン生成古細菌としては、メタノサルシーナ・マゼイ（M.mazei）が好ましい。
【００１２】
ＰｙｌＲＳは、真核細胞、好ましくは動物細胞、特に好ましくは哺乳動物細胞中で発現させる。ＰｙｌＲＳを哺乳動物細胞中で発現させるためには、例えばメタノサルシーナ・マゼイ由来の野生型遺伝子に、Ｎ末端領域にＦＬＡＧタグ等が付加するようにしたＤＮＡ配列をＰＣＲ法を用いて増幅し、これを市販のｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０７（Cytotechnology,3,133(1990)）、ｐＡＧＥ１０３[J.Biochem.101,1307(1987)]などのＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに組み込んで構築したプラスミドを、哺乳動物細胞に導入すればよい。
細胞へのベクターの導入方法としては、例えば、電気穿孔法（Nucleic,Acids Res.15,1311-1326(1987)）、リン酸カルシウム法（Mol.Cell Biol. 7,2745-2752(1987)）、リポフェクション法（Cell 7,1025-1037(1994);Lamb,Nature Genetics 5,22-30(1993)）などが挙げられる。
【００１３】
（ｔＲＮＡ）
上記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素と組み合わせて使用されるｔＲＮＡは、サプレッサーｔＲＮＡとして機能するためのナンセンスコドンに相補的なアンチコドン及び立体構造を保持しており、かつ真核細胞、好ましくは動物細胞、特に好ましくは哺乳動物細胞中で発現する。アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素がＰｙｌＲＳである場合、対応するピロリジンｔＲＮＡは、サプレッサーｔＲＮＡとして機能するためのナンセンスコドンに相補的なアンチコドン及び立体構造を保持しており、かつ真核細胞中で発現する、非真核細胞由来のｔＲＮＡである。すなわち、通常の２０種類のアミノ酸に割り当てられたコドンではないナンセンスコドンに割り当てられ、かつ、上記リジン誘導体に特異的なＰｙｌＲＳにのみ認識され、宿主の通常のａａＲＳには認識されない（直交性）、という要件を備え、かつ動物細胞中で発現するサプレッサーｔＲＮＡである。
ここで、ナンセンスコドンとしては、ＵＡＧ（アンバー）、ＵＡＡ（オーカー）、ＵＧＡ（オパール）が挙げられるが、ＵＡＧ（アンバー）コドンを用いることが好ましい。
【００１４】
上記したように、真核細胞でのｔＲＮＡの発現は、ｔＲＮＡコーディング配列内の２つの内部プロモーターを必要とし、そのコンセンサス配列は、ボックスＡ、ボックスＢとして知られている。
ピロリジンｔＲＮＡのクローバー型構造を図１に示す。図１において、左側のループ（Ｄループ）中、○は塩基の欠損を示す。このように、ピロリジンｔＲＮＡは、Ｄループ中３塩基が欠損しており、他のｔＲＮＡのＤループに比べて異常に小さい。動物細胞中でピロリジンｔＲＮＡを発現させるために、ピロリジンｔＲＮＡにボックスＡ、ボックスＢ配列を導入しても、ピロリジンｔＲＮＡのＤループが異常に小さいため、構造が大きく変化してしまい、このためサプレッサー活性を保持することができなかった。
【００１５】
（ｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡの合成）
本発明のアミノアシルｔＲＮＡの合成方法は、野生型のｔＲＮＡの５’末端に真核生物由来のｔＲＮＡを結合させ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の存在する真核細胞内、好ましくは動物細胞内、特に好ましくは哺乳動物細胞内で転写させる。このとき、ｔＲＮＡの３’末端に転写終結配列を結合させることが好ましい。より具体的には、まず、メタノサルシーナ・マゼイ由来の野生型ピロリジンｔＲＮＡの５’末端に真核生物由来のｔＲＮＡを結合させ、また３’末端に転写終結配列をそれぞれ結合させた配列をＤＮＡプライマーから合成し、例えばｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社製）等に組み込んで構築したプラスミドを、動物細胞に導入して発現させた後、動物細胞内で転写してプロセッシングすることにより得られる。このとき、野生型ピロリジンｔＲＮＡの５’末端と真核生物由来のｔＲＮＡとは、リンカーを介して結合させることが好ましい。リンカーとしては、特に制限はなく、例えば、ＢｇｌＩＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ等によって切断されるものが挙げられる。５’末端に結合するｔＲＮＡは、真核生物由来であるが、真核生物としては、特に制限はなく、例えば動物、植物、昆虫等が挙げられる。このうち、ヒト由来のｔＲＮＡが好ましい。ｔＲＮＡが結合するアミノ酸も、通常の２０種類の天然型アミノ酸であれば特に制限はない。このうち、バリンが好ましい。
【００１６】
本発明のｔＲＮＡの合成方法は、合成対象となるｔＲＮＡの５’末端に真核生物由来のｔＲＮＡを結合させ、真核細胞内で転写させる。合成対象となるｔＲＮＡは、特に限定されず、すべてのｔＲＮＡを指すが、例えば、真核生物由来ｔＲＮＡ（真核生物ミトコンドリアｔＲＮＡを含む）、原核生物由来ｔＲＮＡ等が挙げられる。好ましくは真正細菌、古細菌等の原核生物由来ｔＲＮＡであり、さらに好ましくはピロリジン（ｐｙｒｒｏｌｙｓｉｎｅ）ｔＲＮＡである。また３’末端に転写終結配列を結合させることが好ましい。真核細胞は、動物細胞、特に哺乳動物細胞であることが好ましい。真核生物由来のｔＲＮＡは、例えば動物、植物、昆虫等由来のものであり、このうち、ヒト由来のｔＲＮＡが好ましい。ｔＲＮＡが結合するアミノ酸としては、通常の２０種類の天然型アミノ酸であれば特に制限はない。このうち、バリンが好ましい。
【００１７】
（非天然型アミノ酸を組み込ませるための蛋白質）
本発明で非天然型アミノ酸を組み込ませる蛋白質の種類は、限定されるものではなく、発現可能ないかなる蛋白質でもよく、異種の組換え蛋白質でもよい。例えば、蛋白質の種類として、いわゆるシグナル伝達関連蛋白質、受容体、増殖因子、細胞周期関連因子、転写因子、翻訳因子、輸送関連蛋白質、分泌蛋白質、細胞骨格関連蛋白質、酵素、シャペロン又は癌、糖尿病若しくは遺伝病等を含む疾患関連蛋白質などが挙げられる。
【００１８】
本発明において、非天然型アミノ酸、特にリジン誘導体を組み込ませる位置にナンセンスコドン（サプレッサーｔＲＮＡがアンバーサプレッサーのときはアンバーコドン）を導入することが必要であり、これによりこのナンセンスコドン（アンバーコドン）部位に、特異的に非天然型アミノ酸、特にリジン誘導体を組み込むことができる。
【００１９】
蛋白質に部位特異的に変異を導入する方法としては、周知の方法を用いることができ、特に限定されないが、Gene 152,271-275(1995)、Methods Enzymol.100,468-500(1983)、Nucleic Acids Res.12,9441-9456(1984)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488-492(1985)、「細胞工学別冊「新細胞工学実験プロトコール」、秀潤社、２４１−２４８頁（１９９３）」に記載の方法、または「QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit」（ストラタジーン社製）を利用する方法などに準じて、適宜実施することができる。
本発明は動物細胞内で発現させることができるので、これまで、大腸菌や無細胞蛋白質系では、発現しない、あるいは発現量が低い、または活性型となるための翻訳後の修飾を受けることができないような蛋白質へ、非天然型アミノ酸を取りこませることができる。このような蛋白質としては、当業者には種々のものが知られているが、例えば、ヒトＥＧＦＲ等のチロシンキナーゼ型レセプターの細胞外ドメイン（Cell,110,775-787(2002)）、ヒトGroucho/TLE1蛋白質（Structure 10,751-761(2002)）、ラット筋肉特異的キナーゼ（Structure 10.1187-1196(2002)）などについて、アロ蛋白質を合成することができるが、これらに限定されるものではない。
また、本発明の方法においては、動物細胞内でアロ蛋白質を発現させるので、糖鎖と結合した糖蛋白質に非天然型アミノ酸、特にリジン誘導体を組みこませることもできる。特に、無細胞蛋白質系における糖鎖付加のパターンが、本来のパターンと異なるようなタイプの糖蛋白質の場合には、本発明の動物細胞内での系は、目的の（本来の）パターンの糖鎖が付加されたアロ蛋白質を得るための有効な手段と考えられる。
【００２０】
非天然型アミノ酸、特にリジン誘導体を組み込ませるための蛋白質は、例えば所望の蛋白質の所望のアミノ酸の位置に対応するコドンを、ナンセンスコドンに置換し、さらにＣ末端に所望のタグを付加するように構築した配列を有する遺伝子を、例えばｐｃＤＮＡ４／ＴＯ等のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトに組み込んでプラスミドを構築し、これを動物細胞に導入して発現させることができる。
【００２１】
（宿主）
本発明に用いられる、宿主の動物細胞としては、遺伝子組換え系が確立されている、哺乳類細胞が好ましい。有用な哺乳動物宿主細胞系の実例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）とＣＯＳ細胞を含む。より特有な例は、ＳＶ４０によって形質転換したサル腎臓ＣＶ１系(ＣＯＳ-７,ATCC CRL 1651)；ヒト胚腎臓系(２９３又は懸濁培養での増殖用にサブクローンした２９３細胞、J.Gen Virol.,36:59(1977))；チャイニーズハムスター卵巣細胞/-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980))；マウスセルトーリ細胞(ＴＭ４，Biol.Reprod.,23:243-251(1980))；ヒト肺細胞(Ｗ１３８，ATCC CCL 75)；ヒト肝臓細胞(Hep G2, HB 8065)；及びマウス乳癌(MMT 060562, ATCC CCL51)を含む。これらの宿主は、各々発現系が確立されており、適切な宿主細胞の選択は、当業者の技術範囲内である。
これらは、例えば、Molecular Cloning 第３版、 Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)などに記載された方法に準じて行なうことができる。
【００２２】
上記３種類のプラスミドを、動物細胞に組み込んで発現させることにより、目的とするリジン誘導体が組み込まれたアロ蛋白質を発現させることができる。
すなわち、（Ａ）アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、特にＰｙｌＲＳを動物細胞内で発現させる発現ベクターと、（Ｂ）上記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、特にＰｙｌＲＳの存在下で、非天然型アミノ酸、特にリジン誘導体と結合可能なメタノサルシーナ・マゼイ由来のピロリジンｔＲＮＡを、上記動物細胞内で発現させる発現ベクターと、（Ｃ）所望の位置にナンセンス変異を受けた所望の蛋白質を発現させる発現ベクターと、非天然型アミノ酸、特にリジン誘導体と、を有する動物細胞を、その動物細胞の増殖に適した培地（例えば、ＣＨＯ細胞の場合、Opti-MEM I (Gibco BRL社)など）で、適当な条件でインキュベートする。例えば、ＣＨＯ細胞の場合は、３７℃程度の温度で、２４時間程度、インキュベートする。
【００２３】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
Ｇｒｂ２は、細胞内で、上皮成長因子受容体と相互作用する、細胞の癌化に関わるタンパク質である。本実施例では、ヒトＧｒｂ２の１１１位にリジン誘導体を組み込む実験を行った。
【００２５】
（ＰｙｌＲＳ発現プラスミドの構築）
メタノサルシーナ・マゼイ由来の野生型ＰｙｌＲＳ遺伝子に、Ｎ末端領域にＦＬＡＧタグが付加するようにしたＤＮＡ配列（配列番号１）を、ＰＣＲ法を用いて増幅した。これを、ｐｃＤＮＡ３．１のＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに組み込んで、プラスミドを構築した。
（ピロリジンｔＲＮＡ発現プラスミドの構築）
メタノサルシーナ・マゼイ由来の野生型ピロリジンｔＲＮＡの５’末端に、リンカー（配列番号２）を介してヒトバリンｔＲＮＡを結合させ、また３’末端に、転写終結配列をそれぞれ結合させた配列（配列番号３）をＤＮＡプライマーから合成した。これを、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯに組み込んで、プラスミドを構築した。
（リジン誘導体を組み込む蛋白質を発現させるプラスミドの構築）
ヒトのｇｒｂ２の１１１位のロイシンコドンを、Quick Change site-directed mutagenesis kit（ストラタジーン社）を用いて、アンバーコドンに変換した（ｇｒｂ２（Ａｍ１１１））。次いで、Ｃ末端にＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）が付加するように構築した遺伝子（配列番号４）を、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトに組み込み、サプレッション検出用のプラスミドとした。
【００２６】
（遺伝子の細胞への導入とサプレッション反応）
上記３種類のプラスミドを２．０ｍＬ培養スケール６-wellプレートで培養されたチャイニーズハムスター卵巣細胞 (ＣＨＯ細胞、継代時の培養液はDMEM/F-12 (Gibco), 10% FBS (ICN), 1/100 penicillin-streptomycin (Gibco) を使用)) の１ウェルあたりに０．５μｇずつ、様々な組み合わせで (結果参照)，９０％コンフルエント時に形質導入を行った． 形質導入は，Lipofectamine 2000 (Invitrogen) を用いる方法をとり，そのマニュアルに沿って行った．形質導入時は培養液としてOpti-MEM (Gibco) を使用した．
形質導入を行った細胞培養液を、１ｍＭ  Ｂｏｃ−リジン (Bachem) が存在するか、又は存在しないDMEM/F-12 (Gibco) で置換し，１μｇ／ｍＬテトラサイクリンの添加により発現誘導し，２０時間ほどＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で培養を続けた。
【００２７】
（検出）
細胞培養液を除き、緩衝液で洗浄後、細胞を溶解させ、蛋白質を回収した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行い、分子量で蛋白質を分離した後，メンブレンにエレクトロブロット (100V，1時間) を行った．抗体はANTI-FLAG M2 (Sigma) を一次抗体，Mouse IgG Horseradish Peroxidase-Linked whole antibody from sheep (Amersham) を二次抗体として用いた．検出試薬は，ECL Western Blotting Detection Reagent (Amersham) を用いた．測定は冷却CCDカメラLAS1000 plus (富士フィルム) を用いて行った．
【００２８】
（結果）
図２に、ウェスタンブロットによるＧｒｂ２（１１１ａｍｂ）のサプレッションの検出結果を示す。左端の１レーンは、Ｇｒｂ２全長のバンドの位置を示すための対照である。野生型Ｇｒｂ２のＣ末端にはＦＬＡＧタグが付加されており、Ｃ末端まで合成された場合にＧｒｂ２の矢印の部分にバンドが検出される。２〜４レーンは、ＰｙｌＲＳ、ピロリジンｔＲＮＡ、Ｎε−Ｂｏｃ−リジンのいずれかがない場合である。これらの場合、Ｇｒｂ２の全長が合成されていない。一方、レーン５は、ＰｙｌＲＳ、ピロリジンｔＲＮＡ及びＮε−Ｂｏｃ−リジンのすべてが細胞内に導入された場合であり、Ｇｒｂ２の全長が合成されている。このことから、Ｇｒｂ２の１１１位に導入したアンバーコドンに、ＰｙｌＲＳ及びピロリジンｔＲＮＡによって、Ｎε−Ｂｏｃ−リジンが導入されたことがわかる。
【００２９】
（参考例１）
図３は、大腸菌内で、ＰｙｌＲＳ、ピロリジンｔＲＮＡの存在下でＮε−Ｂｏｃ−リジンがペプチドに取り込まれたことを示すマススペクトルデータである。図中、分子量（ＭＷ）が１３２７．６７のピークは、配列がＮＳＹＳＰＩＬＧＹＷＫであるペプチドを示している。分子量が１３９２．７６のピークは、左から１１番目のチロシンがＮε−Ｂｏｃ−リジンに置換された（＊で示す）ペプチドを示している。
【００３０】
（比較例１）
実施例１において、ピロリジンｔＲＮＡ発現プラスミドの構築方法を用いず、メタノサルシーナ・マゼイ由来の野生型ピロリジンｔＲＮＡにボックスＡ、ボックスＢを導入したものを用いた以外は、実施例１と同様にプラスミドの構築、遺伝子の導入を行い、サプレッション反応の検出を行った。ボックスＡ、ボックスＢを導入したピロリジンｔＲＮＡのクローバー型構造を図４に示す。ボックスＡ、ボックスＢは、常法に従って導入した。
【００３１】
（結果）
図５に、ウェスタンブロットによるＧｒｂ２（１１１ａｍｂ）のサプレッションの検出結果を示す。左端の１レーンは、Ｇｒｂ２全長のバンドの位置を示すための対照である。２〜４レーンは、ＰｙｌＲＳ、ピロリジンｔＲＮＡ、Ｎε−Ｂｏｃ−リジンのいずれかがない場合である。これらの場合、Ｇｒｂ２の全長が合成されていない。一方、レーン５は、ＰｙｌＲＳ、ピロリジンｔＲＮＡ及びＮε−Ｂｏｃ−リジンのすべてが細胞内に導入された場合であるが、Ｇｒｂ２の全長が合成されていない。このことから、ピロリジンｔＲＮＡにボックスＡ、ボックスＢを導入しても、ピロリジンｔＲＮＡが発現せず、このためＧｒｂ２の１１１位にＮε−Ｂｏｃ−リジンが導入されなかったことがわかる。
【００３２】
（参考例２）
図６は、試験管内で、精製ＰｙｌＲＳ、精製ピロリジンｔＲＮＡの存在下で、各リジン誘導体がピロリジンｔＲＮＡに結合するか否かを検討したものである。バンドが上にシフトしたものがピロリジンｔＲＮＡに結合したことを示す。ＢｏｃはＮε−Ｂｏｃ−リジン、ＡｃはＮε−アセチルリジン、Ａｒｇはアルギニンを示す。図６では、Ｎε−Ｂｏｃ−リジンは８ｍＭであり、このときピロリジンｔＲＮＡに結合しているが、Ｎε−Ｂｏｃ−リジンが１ｍＭ以下でも、ＰｙｌＲＳがＮε−Ｂｏｃ−リジンをピロリジンｔＲＮＡに結合させることができることが確認されている。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明は、リジン誘導体を導入してアロ蛋白質を合成することに有効に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ピロリジンｔＲＮＡのクローバー型構造を示す。
【図２】実施例１において、ウェスタンブロットによるＧｒｂ２（１１１ａｍｂ）のサプレッションの検出結果を示す。
【図３】大腸菌内で、ＰｙｌＲＳ、ピロリジンｔＲＮＡの存在下でＮε−Ｂｏｃ−リジンがペプチドに取り込まれたことを示すマススペクトルデータである。
【図４】ボックスＡ、ボックスＢを導入したピロリジンｔＲＮＡのクローバー型構造を示す。
【図５】比較例１において、ウェスタンブロットによるＧｒｂ２（１１１ａｍｂ）のサプレッションの検出結果を示す。
【図６】試験管内で、精製ＰｙｌＲＳ、精製ピロリジンｔＲＮＡの存在下で、各リジン誘導体がピロリジンｔＲＮＡに結合するか否かを検討したものである。
【図１】
2007037445.tif 000002
【図２】
2007037445.tif 000003
【図３】
2007037445.tif 000004
【図４】
2007037445.tif 000005
【図５】
2007037445.tif 000006
【図６】
2007037445.tif 000007
【配列表】
2007037445000001.app