(57)【要約】      （修正有）【課題】代謝産物である水酸化されたセラミドの定量によらずに、セラミドを生成する水酸化酵素の発現等の情報から、がんの診断をし得る新たな方法を提供する。【解決手段】被検体に含まれる、セラミド-C4-水酸化酵素の遺伝子を検出することを含む、乳がん、卵巣がんおよび／または大腸がんの診断の方法。被検体に含まれる、セラミドーアルファー水酸化酵素の遺伝子を検出することを含む、肺がんおよび／または小腸がんの診断の方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体に含まれる、セラミド-C4-水酸化酵素の遺伝子を検出することを含む、乳がん、卵巣がんおよび／または大腸がんの診断の方法。
【請求項２】
被検体に含まれる、セラミドーアルファー水酸化酵素の遺伝子を検出することを含む、肺がんおよび／または小腸がんの診断の方法。
【請求項３】
前記被検体が、被験者から採取した組織、血液、または糞便であり、かつ前記遺伝子の検出をRT-PCRにより行う、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記被検体が、被験者から採取した組織、血液、または糞便であり、かつ前記遺伝子の検出を、DNAチップを用いて行う、請求項1または2に記載の方法。
【請求項５】
前記被検体が、被験者から採取した組織、血液、または糞便であり、かつ前記遺伝子の検出を、エンザイム・イムノアッセイ法(ELISA)で行う、請求項1または2に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はがんの診断方法に関する。特に本発明は、セラミド-C4-水酸化酵素の遺伝子またはセラミドーアルファー水酸化酵素の遺伝子を利用したがんの診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スフィンゴ脂質、セラミドは、スフィンゴイド塩基に長鎖脂肪鎖がアシル結合しており、スフィンゴイド塩基や脂肪鎖の違いによりいくつにも分類され、それぞれのセラミドが個々の機能を持っていることが期待されている。セラミドや、その代謝産物の量的変化が細胞の増殖に影響を与えることは知られているが、その質的変化によってもたらされる細胞の増殖における影響には、あまり目が向けられていない。
【０００３】
これまでに積み重ねられた種々のがん組織におけるセラミドの分析データは、ある種のがん組織で脂肪酸のアルファ位に水酸基を持つセラミドや、スフィンゴイド塩基の４位に水酸基を持つ水酸化されたセラミドの含量が正常組織に比較して癌組織において有意に増加していることを示している(J.B.C., 1971, 246, 1192-(非特許文献1))。しかし、これらのセラミドを生成する酵素は、動物細胞において存在そのものが不明であったため、代謝産物である水酸化されたセラミドの定量だけで議論されている。
【非特許文献１】J.B.C., 1971, 246, 1192-他
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、代謝産物である水酸化されたセラミドの定量によらずに、がんの診断をし得る新たな方法を提供することにある。
【０００５】
特に本発明の目的は、セラミドを生成する水酸化酵素の発現等の情報から、がんの診断をし得る新たな方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、被検体に含まれる、セラミド-C4-水酸化酵素の遺伝子を検出することを含む、乳がん、卵巣がんおよび／または大腸がんの診断の方法に関する。
さらに本発明は、被検体に含まれる、セラミドーアルファー水酸化酵素の遺伝子を検出することを含む、肺がんおよび／または小腸がんの診断の方法に関する。
【０００７】
上記本発明の方法においては、被検体が、被験者から採取した組織、血液、または糞便であり、かつ前記遺伝子の検出をRT-PCRにより行うか、または被検体が、被験者から採取した組織、血液、または糞便であり、かつ前記遺伝子の検出を、DNAチップを用いて行うことができる。さらに、被検体が、被験者から採取した組織、血液、または糞便であり、かつ前記遺伝子の検出を、エンザイム・イムノアッセイ法(ELISA)で行うこともできる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、乳がん、卵巣がんおよび／または大腸がんの診断、並びに肺がんおよび／または小腸がんの診断を、容易かつ確実に行うことができる。本発明によれば、将来的には抗がん剤感受性の差なども含めて、オーダーメイド治療のための治療情報の提供を行うこともできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の第１の態様は、被検体に含まれる、セラミド-C4-水酸化酵素の遺伝子を検出することを含む、乳がん、卵巣がんおよび／または大腸がんの診断の方法である。
【００１０】
セラミド-C4-水酸化酵素は、スフィンゴイド塩基の４位に導入する酵素であり、その発現は、皮膚、小腸などに高く組織特異性が高い。セラミド-C4-水酸化酵素の遺伝子配列は配列番号1に示す。
【００１１】
本発明の第2の態様は、被検体に含まれる、セラミドーアルファー水酸化酵素の遺伝子を検出することを含む、肺がんおよび／または小腸がんの診断の方法である。セラミドーアルファー水酸化酵素は、脂肪酸鎖のアルファー位に水酸基を導入する酵素であり、脳に最も特異的発現が高く、皮膚にも発現が見られる。セラミドーアルファー水酸化酵素の遺伝子の遺伝子配列は配列番号2に示す。
【００１２】
前記被検体は、例えば、被験者から採取した組織、血液または糞便であり、かつ前記遺伝子の検出を、例えば、RT-PCRまたはDNAチップ等を用いて行うことができる。あるいは前記遺伝子の検出をエンザイム・イムノアッセイ法(ELISA)で行うこともできる。但し、これらの方法に限定される意図ではない。
【００１３】
本発明の方法の診断対象となる「被験者」は、ヒトを含む任意の哺乳動物であり得るが、ヒトが最も好適な被験者である。
【００１４】
本発明の第１の態様では、セラミド-C4-水酸化酵素の遺伝子を検出し、第２の態様では、セラミドーアルファー水酸化酵素の遺伝子を検出する。この検出には、これら遺伝子と相補的な配列を有するDNAをプライマーとして用いるRT-PCRまたは、プロープとして用いるDNAチップ等により実施できる。RT-PCR用のプライマーとして用いるDNAの配列は、本発明の第１の態様であればセラミド-C4-水酸化酵素の遺伝子を特異的に増幅し得る配列を有するように設計する。また、第２の態様であれは、セラミドーアルファー水酸化酵素の遺伝子を特異的に増幅し得る配列を有するように設計する。DNAチップのプロープとして用いるDNAは、本発明の第１の態様であればセラミド-C4-水酸化酵素の遺伝子と特異的にハイブリダイズするように設計する。また、第２の態様であれは、セラミドーアルファー水酸化酵素の遺伝子と特異的にハイブリダイズするように設計する。
【００１５】
(1)セラミド-C4-水酸化酵素の遺伝子増幅用プライマー
プライマーの設計はゲノムのバックを除去するため、可能であればイントロンを挟んで設計することが望ましい。
プライマーの例を以下に示す。但し、これはあくまでも一例であって、これに限定される意図ではない。
Forward primer; 5-ATGGGCAACAGCGCGAGCCGC -3'(配列番号7),
Reverse primer; 5-GGGTGTCGAGAAGAACCAGC-3'(配列番号8)
【００１６】
(2)セラミドーアルファー水酸化酵素の遺伝子増幅用プライマー
プライマーの例を以下に示す。但し、これはあくまでも一例であって、これに限定される意図ではない。
Forward primer; 5-CAAGGACCTGGTGGACTGGC -3' (配列番号9),
Reverse primer; 5-GTCTTAGAGAGGCCCTCAATG-3' (配列番号10)
【００１７】
(1)セラミド-C4-水酸化酵素のDNAチップ用プローブ
セラミド-C4-水酸化酵素のDNAチップ用プローブの例を以下に示す。但し、これはあくまでも一例であって、これに限定される意図ではない。
チップに固定するプローブ作成例（各70 mer）
human DES2-1;
5'-TGAAGGTGCTCTGGGATTTTGTGTTTGAGGACTCCCTGGGGCCCTATGCCAGGGTGAAGCGGGTGTACA -3' (配列番号11) （69mer）
【００１８】
(2)セラミドーアルファー水酸化酵素のDNAチップ用プローブ
セラミドーアルファー水酸化酵素のDNAチップ用プローブの例を以下に示す。（各70mer）但し、これはあくまでも一例であって、これに限定される意図ではない。
human FA2H-1;
5'-CTGGGCTACGTCCTCTATGACATGACCCATTACTACCTGCACTTTGGCTCGCCGCACAAGGGCTCCTACC -3' (配列番号12)
human FA2H-2;
5'-GGAGCCTCATCGAGTACCTCATCCACCGCTTCCTGTTCCACATGAAGCCCCCCAGCGACAGCTATTACCT -3' (配列番号13)
human FA2H-3;
5'-GAACGAGCCTGTAGCCCTTGAGGAAACTCAGAAGACAGATCCTGCTATGGAACCACGGTTCAAAGTGGTG -3' (配列番号14)
【００１９】
遺伝子の検出をエンザイム・イムノアッセイ法(ELISA)で行う場合、以下のようにして行うことができる。本発明の第１の態様では、セラミド-C4-水酸化酵素に対する特異抗体を用いて検出し、第２の態様では、セラミドーアルファー水酸化酵素に対する特異抗体を用いて検出する。抗体は、他の蛋白との相同性の低いC末領域をターゲットにした特異抗体が望ましい。検出は酵素標識２次抗体を用いる間接法、もしくはサンドイッチ法が現実的である。例としてはペルオキシダーゼ標識の２次抗体が利用できる。使用する抗体の力価により、適時、使用濃度等、条件検討をおこなう。
【００２０】
上記遺伝子を検出するためには、まず、被験者から、遺伝子を含有する試料を採取する。遺伝子を含有する試料としては、採取した組織、細胞、体液を含む任意の試料がなり得る。好ましい試料は、細胞、組織、血液が含まれる。
【００２１】
遺伝子を検出する場合、被験者から試料を採取した後、通常は、該試料から核酸を抽出する操作を行う。生体成分から核酸を抽出する方法としては、例えばフェノール抽出、エタノール沈殿の他、任意の抽出方法を使用し得る。mRNAを抽出する場合には、オリゴdTカラムにかけてもよい。
【００２２】
核酸の量が少ないときには、必要に応じて、核酸を増幅する操作を行ってもよい。増幅操作は、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)等のポリメラーゼ連鎖反応(以下PCRと略記する)によって行い得る。
【００２３】
必要に応じて、抽出操作及び／又は増幅操作を行った後には、核酸を検出する。            
【００２４】
また、多種類の試料を同時に定量する場合には、DNAチップやDNAマイクロアレイを用いることが好ましい。
【００２５】
本発明の方法によって、がんを診断する。
本発明の第１の態様では、セラミド-C4-水酸化酵素の遺伝子を検出することにより、乳がん、卵巣がんおよび／または大腸がんの診断ができる。本酵素の発現を確認することにより、乳がん、卵巣がんおよび／または大腸がんの悪性度、転移能や抗がん剤感受性に対する情報が得られ、がん診断及び治療に有用な情報を提供しうる。オーダーメイド治療に向けた診断法として期待できる。
【００２６】
発明の第2の態様では、セラミドーアルファー水酸化酵素の遺伝子を検出することにより、肺がんおよび／または小腸がんの診断ができる。本酵素の発現を確認することにより、肺がんおよび／または小腸がんの悪性度、転移能や抗がん剤感受性に対する情報が得られ、がん診断及び治療に有用な情報を提供しうる。オーダーメイド治療に向けた診断法として期待できる。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
【００２８】
実施例１；癌プロファイリングアレイによる、セラミド水酸化酵素のmRNAの癌組織における発現上昇の検討
【００２９】
ターゲットとなるがんの種類を明らかにするために、まずcancer profiling array I and II (Immunocytometry Systems, BD Biosciences, San Jose, CA)を用いた転写レベルでの発現調節について検討した。このフィルターには、ヒトがん組織および正常部位の組織から抽出した同一患者組織のmRNAをテンプレートにしたcDNA(2μg)が並べてスポットされている。
【００３０】
DES2, FA2HのmRNAを検出するためにプローブを以下のようにして作成した。human DES2 (NM_206918) のオープン・リーディング・フレーム(ORF)(配列番号2)のC末を含む500bpを(5'-AAGCTGCTCTGGCTGGTGCTG-3'(配列番号3)および5'-tcgcagaatcttttgcctg-3'(配列番号4))をプローブとしてpGEM-FA2HプラスミドからPCRで増幅させた。全長では非特異が出やすいため、部分長で行った。N末とC末で確認して、同じように特異性があることをノーザンで確認して、問題がないことが判っている配列を使用した。
【００３１】
h FA2Hについてもオープン・リーディング・フレーム(ORF) (配列番号1)の中央500bpを(5'-CAAGGACCTGGTGGACTGGC-3'(配列番号5)および5'-CTGCATGCACAAGTAGAAGAC-3' (配列番号6))のプライマーセットを用いPCRで増幅させた。PCRの条件は以下のとおりである。
【００３２】
増幅させた断片を1%アガロース電気泳動により分離し，ゲルから精製し，Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2 (TaKaRa) を用いて ランダムプライミング法により[α-32P]dCTP (3000 Ci/mmol; PerkinElmer・Lifesciences) で標識した。メンブレンはExpressHyb buffer (Clontech) で30分間 68℃でプレインキュベートしたのち，2.0X10E7 CPM分の標識プローブを混和したExpressHyb buffer (Clontech) に移し68 ℃でO/Nインキュベートした。Wash Solution I (2 x SSC，0.05% SDS) を用い68℃で3回洗浄後，さらにWash Solution II (0.2 x SSC，0.5% SDS) を用いて68℃で1回洗浄した。検出にはIPプレートを用いた。
【００３３】
hDES2(NM_206918)の結果を図1および2に示す。図1に示すように、乳がん(lane 2)、卵巣がん(lane 4)、大腸がん(lane 6)といった特定のがんにおいて、がん組織特異的に強いスポットが得られた。検体数をあげるため、同一条件で別フィルターの検討も行ったが、同一の傾向が得られた(図2)。これらのスポットが非特異的な結合によるものでないことは、同時に行ったノーザンブロッティングの結果から明らかである(データは示さず)。これまでの結果は、hDES2が効率よく特定のがん細胞を検出しうることを示している。特に乳がんにおいては正常組織における発現ががん組織を上回るような逆転現象は見出されなかった（60検体中）。また、一部の症例はhDES2が癌の悪性度を検出する指標となりうる可能性を示している(図2)。また、human DES2には水酸化活性を持たない相同性の高いファミリーhuman DES1が存在するが、こちらはがん組織特異的な発現上昇を示さないことから、hDES2のmRNAのがん組織に対する発現の高さが、改めて示された(図3)。
【００３４】
hFA2Hについての結果は図4と5に示す。図4に示すように、肺(lane 9 and 10)及び小腸(lane 13 and 14)において、有為な結果を得た。プローブの特異性はノーザンブロッティングの結果からも示された。（図5）
【００３５】
実施例2；real time (RT)-PCRによる、セラミド水酸化酵素のmRNAの癌組織における発現上昇の検討
【００３６】
RT-PCRは検出感度が高く検体の量が少なくてすむため、実際の臨床検査に有効である。TaqMan (Applied biochems)のシステムを用い、RT-PCRによる検出法の確立を行った。逆転写反応には1st Strand cDNA Synthesis kit for RT-PCR (AMV)を使用した。totalRNA(2.5μg分) xμl、10×Reaction Buffer  5μl、25mM MgCl2  10μl、Deoxynucleotide Mix  5μl、Random Primer  5μl、RNase Free Water  (23.2-x)μl、65℃  5min  インキュベート後、RNase Inhibiitor 1μlとAMV Reverse Transcriptase 0.8μlを加え室温  10min、42℃  60minで反応、95℃  5minで反応停止する。
【００３７】
Taq ManによるReal Time PCR (n=3)の組成は2×Taq Man Universal Master Mix  80μl、Forward primer (10pmol/μl) 14.4μl、Reverse primer (10pmol/μl) 14.4μl、Taq Man Probe (5pmol/μl) 8μl、DDW 27.2μlを加、反応液144μlとcDNAサンプル(50ng/μl) 16μlをいれmix各tubeに50μlずつ分注した。Control としてハウスキーピング遺伝子であるRPLP0を用いた。
Human FA2H
Forward primer; 5-AGACAGATCCTGCTATGGAACCA -3' (配列番号15)
Reverse primer; 5-CCAGTCCACCAGGTCCTTGT-3' (配列番号16)
Taq Man Probe; 5-TTCAAAGTGGTGGATTGG-3' (配列番号17)
【００３８】
この手法により、アレイにおいて、検出が難しかったhFA2Hについても高感度で検出することが可能であった(図6)。組織検体からだけではなく血液検体からの検出も可能である。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明は、がんの診断分野に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】実施例1において得られた癌プロファイリングアレイにおけるhDES2(NM_206918)の発現検討結果。
【図２】実施例1において得られた癌プロファイリングアレイにおけるhDES2(NM_206918)の発現検討結果。
【図３】実施例1において得られた癌プロファイリングアレイにおけるhuman DES1の発現検討結果。
【図４】実施例1において得られた癌プロファイリングアレイにおけるhFA2Hの発現検討結果。
【図５】実施例1において得られた癌プロファイリングアレイにおけるhFA2Hの発現検討結果。
【図６】実施例２において得られたreal time (RT)-PCRによる、セラミド水酸化酵素のmRNAの癌組織における発現上昇の検討結果。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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