(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞を長期間冷凍保存することができ、且つ細胞の分譲を受けた者が解凍後に、さらに他の者にこの細胞を提供する場合は、この細胞を実質的に再培養することが困難であり、不特定多数の人にこの細胞を分譲できないようにするための細胞保存液、及びこれを用いた細胞保存方法を提供する。【解決手段】細胞を保存するための保存液であって、凍害防御剤としてのジメチルスルホキシドと、ｐＨ調製緩衝剤とを含有し、ｐＨが２．５以上６未満である細胞保存液である。細胞保存液中のジメチルスルホキシドの濃度は、１〜５０体積％とすることが望ましい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を保存するための保存液であって、
凍害防御剤を含有し、ｐＨが２．５以上６未満である細胞保存液。
【請求項２】
前記凍害防御剤が、ジメチルスルホキシドである請求項１に記載の細胞保存液。
【請求項３】
前記細胞保存液中のジメチルスルホキシドの濃度が１〜５０体積％である、請求項２に記載の細胞保存液。
【請求項４】
ｐＨを調整するための緩衝剤を含有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞保存液。
【請求項５】
前記緩衝剤が、グリシン−塩酸緩衝剤である、請求項４に記載の細胞保存液。
【請求項６】
ｐＨが２．５以上６未満であり、且つ凍害防御剤が存在する条件下で細胞を冷凍保存する細胞保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を保存するために用いる細胞保存液及び細胞保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の長期保存は、一般的には、細胞に液状の保存用媒体を添加し凍結保存させることにより行われる。液状の保存用媒体としては、特許文献１記載の細胞保存液が知られている。この細胞保存液は、細胞中の核酸を劣化させずに細胞を長期間冷凍保存し、解凍後に細胞を培養するためのものであり、５体積％以上２０体積％以下のジメチルスルホキシドを含有する。
【特許文献１】特開２００４−２５４５９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
理化学研究所バイオリソースセンターや微生物寄託センター等の細胞バンクから分譲された細胞を特許文献１記載の細胞保存液で保存することにより、分譲を受けた者は用時まで細胞を安定に保存することができる。しかしながら、細胞の分譲を受けた者がさらに他の者（第三者）にこの細胞を提供する場合は、第三者がこの細胞を実質的に培養できないような状態で提供することが求められる。第三者に提供された細胞が培養可能な状態であると、細胞バンクの関知しないところで第三者が細胞を培養し、不特定多数の人にこの細胞を分譲する危険性があるからである。
特許文献１の細胞保存液は上述したように解凍後の再培養を目的としたものであるため、第三者に提供する際の細胞保存用媒体としては好ましくない。従って、解凍後の細胞培養が困難であり、且つ細胞を長期間保存することのできる細胞保存液及び細胞保存方法の開発が望まれている。
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、細胞を長期間冷凍保存することができ、且つ解凍後に再培養することが困難である細胞保存液及びこれを用いた細胞保存方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は上記目的を達成するために次の技術的手段を講じた。
本発明の細胞保存液は、細胞を保存するための保存液であって、
凍害防御剤を含有し、ｐＨが２．５以上６未満である細胞保存液であることを特徴としている。
この細胞保存液によれば、その中に含まれる凍害防御剤の作用により、凍結や融解の際に細胞膜が破壊されにくく、細胞の形態を保ったままの状態で細胞を長期間冷凍保存することが可能となる。また、ｐＨが２．５以上６未満であるので、核酸の保存安定性を高めることができ、また細胞を解凍した後に培養しても増殖しにくい状態にすることができる。
前記凍害防御剤は、ジメチルスルホキシドであることが好ましい。
前記細胞保存液中のジメチルスルホキシドの濃度が１〜５０体積％であることが好ましい。
前記細胞保存液は、ｐＨを調整するための緩衝剤を含有することが好ましい。
前記緩衝剤が、グリシン−塩酸緩衝剤であることが好ましい。
【０００５】
また、本発明の細胞保存方法は、ｐＨが２．５以上６未満であり、且つ凍害防御剤が存在する条件下で細胞を冷凍保存する細胞保存方法であることを特徴としている。
凍害防御剤の存在下で細胞を保存することにより、凍結や融解の際に細胞膜が破壊されにくく、細胞の形態を保ったままの状態で細胞を長期間冷凍保存することが可能となる。また、ｐＨを２．５以上６未満とすることで、細胞に含まれる核酸を安定的に保存することができる。また、この細胞保存液を用いて細胞を冷凍保存すると、解凍した後に培養しても増殖しにくい状態にすることができる。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、細胞を長期間冷凍保存することができ、且つ解凍後に再培養することが困難である細胞保存液及びこれを用いた細胞保存方法を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の細胞保存液は、凍害防御剤を含有し、ｐＨは２．５以上６未満に調整されている。凍害防御剤の作用により、凍結や融解の際に細胞膜が破壊されにくく、細胞の形態を保ったままの状態で細胞を長期間冷凍保存することが可能となる。
凍害防御剤としては、上記のような作用を有する化学物質であれば特に限定されないが、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセリン、エチレングリコール、プロリン、サッカロース、ソルビトール、ポリビニルピロリドン、デキストランなどが挙げられ、これらを単独又は組み合わせて用いることができる。この中で、ＤＭＳＯが、最も代表的な凍害防御剤であって、動物や陸上植物の細胞をはじめ、さまざまな細胞の凍結保存に使われていることから、好ましく用いられる。ＤＭＳＯとしては、一般的に知られている市販のものを用いることができる。細胞保存液中のＤＭＳＯの濃度は、通常１〜５０体積％であり、好ましくは１０〜３０体積％である。濃度が１体積％未満では凍害防御の作用が弱く、また反対に５０体積％を超えても効果は変わらないからである。
細胞保存液は酸性の液体である。細胞保存液のｐＨは２．５以上６未満であり、好ましくは２．５〜５．５、より好ましくは３〜４である。ｐＨをこの範囲にすることにより、細胞に含まれる核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）を安定的に保存することができる。
またこの細胞保存液を用いて細胞を凍結保存すると、解凍した後に保存後の細胞を培養しても増殖しにくい状態にすることができる。解凍後の増殖が起こりにくい理由は不明であるが、細胞が酸性液中で保存されることにより、細胞の増殖に関連するタンパク質が失活する等の要因が考えられる。
細胞保存液の溶媒は特に限定されず、ＤＭＳＯが溶解するものであれば何れも用いることができ、精製水、ＴＥバッファーなどが例示される。
【０００８】
細胞保存液は、ｐＨを調整するための緩衝剤を含有することが好ましい。緩衝剤は、ｐＨを２．５以上６未満に調整できるものであればその種類は特に限定されない。緩衝剤として、例えば、グリシン−塩酸緩衝剤、グッド緩衝剤、リン酸カルシウムなどが挙げられ、好ましくはグリシン−塩酸緩衝剤である。
【０００９】
この細胞保存液に細胞を添加し凍結させると、半永久的に細胞を保存することができる。凍結の際は、徐々に凝固点まで温度を下げてもよいし、液体窒素等を用いて急速に凍結してもよい。また、融解の際は室温下で静置するなど、徐々に融解してもよいし、加熱するなどして急速に融解してもよい。
【００１０】
保存対象となる細胞の種類は特に限定されない。本発明の細胞保存液を用いると、例えば真核細胞や原核細胞などの長期保存を行うことができる。また、保存する細胞は細胞保存液中に分散されていることが好ましいが、多細胞生物から採取した組織などの細胞塊をそのまま保存することも可能である。
【００１１】
細胞を保存する際の温度としては、細胞保存液が凍結する温度であれば特に限定されないが、−４℃以下であることが好ましく、−２０℃以下であることがより好ましい。
【００１２】
さらに、本発明の細胞保存方法は、ｐＨが２．５以上６未満であり、且つ凍害防御剤が存在する条件下で細胞を冷凍保存する細胞保存方法である。この細胞保存方法によれば、凍害防御剤の作用により、凍結や融解の際に細胞膜が破壊されにくく、細胞の形態を保ったままの状態で細胞を長期間冷凍保存することが可能となる。また、ｐＨ２．５以上６未満の条件下で保存することにより、細胞中の核酸を安定的に保存することができる。またこの細胞保存方法により保存された細胞は、解凍した後に培養しても増殖しにくい状態となっている。
【実施例】
【００１３】
以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。
（実施例１）
細胞保存液の細胞保存安定性におけるｐＨ依存性を検討した。
細胞保存液として、ｐＨを２、３、３．５、４、６及び８に調整した６種類の細胞保存液を用いた。ｐＨが２、３、３．５及び４である細胞保存液は、２０％  ＤＭＳＯ及びグリシン（２００ｍＭ）−塩酸を含み、塩酸の量でｐＨを調整した。ｐＨが６及び８である細胞保存液は、２０％  ＤＭＳＯ及びＴｒｉｓ（２００ｍＭ）−塩酸を含み、塩酸の量でｐＨを調整した。
ヒト肺癌由来の培養細胞（ＬＣ−２／ａｄ細胞）（５×１０５ｃｅｌｌｓ）を各ｐＨの細胞保存液（−２０℃）で１日冷凍保存した。解凍した後、遠心して細胞を沈降させ、細胞保存液を除去した。ここに２００μｌのホモジナイズ試薬（シスメックス（株）製）を加えて破砕し、１０倍希釈して測定用試料を調製した。ＧＤ−１００（シスメックス（株）製）を用いてこの測定用試料とサイトケラチン試薬（シスメックス（株）製）とを混合し、試料中のサイトケラチン１９（ＣＫ１９）ｍＲＮＡを定量した。定量結果を図１に示す。
図１より、ｐＨ３以上６未満の細胞保存液で細胞を保存した場合に、多くのコピー数のｍＲＮＡが検出された。即ち、ｐＨ３以上６未満の細胞保存液中では、細胞のＲＮＡの安定性が良好であることがわかった。
得られた図１のグラフのデータから、細胞保存液のｐＨと細胞に含まれるＲＮＡの保存安定性には相関関係があることが確認された。これによると、ｐＨ２．５〜５．５の細胞保存液を用いると細胞中のＲＮＡを安定的に保存でき、ｐＨ３〜４の細胞保存液を用いると最も安定的にＲＮＡを保存できることがわかった。
【００１４】
（実施例２）
次に、ｐＨ３．５の細胞保存液を用いて細胞保存安定性を検討した。この細胞保存液は、上述のように２０％  ＤＭＳＯ及びグリシン（２００ｍＭ）−塩酸を含み、塩酸の量でｐＨを３．５に調整したものである。
ＬＣ−２／ａｄ細胞（０．８×１０５ｃｅｌｌｓ／ｔｕｂｅ）を、１ｍｌの細胞保存液（ｐＨ３．５、−２０℃）に懸濁し、凍結保存した。これを０、１５、４８、５６、８３又は１０５日間保存した後、１２００ｒｐｍで遠心して細胞保存液を除去した。ここに２００μｌのホモジナイズ試薬（シスメックス（株）製）を加え、２２Ｇシリンジ、３０ストローク、氷上で細胞を破砕し、−８０℃で一時保存した。その後、この細胞破砕液を２００倍希釈（４×１０３ｃｅｌｌｓ／ｔｅｓｔ）して測定用試料を調製し、実施例１と同様にしてＣＫ１９ｍＲＮＡを定量した。同様の実験を３回繰り返し（ｎ＝３）、その平均値を図２のグラフ（◆）に示した。
ポジティブコントロールとして、ＬＣ−２／ａｄ細胞（０．８×１０５ｃｅｌｌｓ／ｔｕｂｅ）を−８０℃で凍結細胞ペレットに保存したものを用い、実施例１と同様に処理してＣＫ１９ｍＲＮＡ量を測定した。同様の実験を２回繰り返し（ｎ＝２）、その平均値を図２のグラフ（■）に示した。
図２より、本発明の細胞保存液を用いて細胞を保存した場合、少なくとも−２０℃で１０５日間保存しても、−８０℃で保存した細胞（ポジティブコントロール）と同程度にＲＮＡを保存できることがわかった。
【００１５】
（実施例３）
次に、本発明の細胞保存液で凍結保存した細胞が解凍後培養せず、細胞形態を保持しているかどうかを確認した。
ＬＣ−２／ａｄ細胞（１×１０５ｃｅｌｌｓ）を、１）実施例２と同じ細胞保存液（ｐＨ３．５）、２）十慈フィールド（株）製セルバンカー（商品名）、３）培地（（ＨａｍＦ１２：ＲＰＭＩ１６４０＝１：１）、１０％  ＦＢＳ、及び２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含む）で５日間保存した（いずれも−２０℃）。全量を７５ｃｍ２のフラスコにて培地（（ＨａｍＦ１２：ＲＰＭＩ１６４０＝１：１）、１０％  ＦＢＳ、及び２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含む）で培養した。培養開始１日後及び４日後に顕微鏡で観察して写真撮影を行った。その後、培地を交換し、１３日目に再度顕微鏡で観察して写真撮影を行った。図３にそれぞれの培養開始後１日目、４日目、及び１３日目の顕微鏡観察像を示し、図４に培地及び細胞保存液中で保存した細胞の１３日目の拡大画像を示す。
図３から、セルバンカーで保存した細胞は、解凍後の培養により、１３日目には細胞がプレートに接着して増殖していることが確認されたが、培地及び細胞保存液で保存した細胞は、１３日目にも増殖していなかった。
また、図４から、培地で保存した細胞は、細胞膜が壊れたものが多かったが、細胞保存液で保存した細胞は、細胞膜が損傷せずに細胞の形態が保たれた状態であった。
以上より、本実施例の細胞保存液で細胞を凍結保存すると、解凍した後に実質的に再培養できず、且つ細胞の形態を保ったまま保存されることが確認された。
【００１６】
（実施例４）
細胞保存液で凍結保存した細胞を解凍し、培養するか否かを確認した。
ＬＣ−２／ａｄ細胞を、実施例２と同じ細胞保存液（ｐＨ３．５、−２０℃）に５日間−２０℃で冷凍保存した。解凍後、遠心して細胞保存液を除去し、ＬＣ−２／ａｄ細胞を回収した。この細胞を計測し、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（９６ウェルプレート）及び５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（２４ウェルプレート）となるよう各ウェルに解凍後の細胞を収容し、培養を開始した。１〜１３日間培養し、各ウェル内の細胞を回収して細胞計数板にて計数した（９６ウェルプレートに関してはｎ＝３、２４ウェルプレートに関してはｎ＝２で計数した）。
対照として、冷凍保存していないＬＣ−２／ａｄ細胞を用い、上記と同様に培養した。但し、ここでは培養は１〜８日間だけ行った。これらの結果を図５及び図６に示す。図５及び図６において、■は本実施例の細胞保存液を用いた際の実験結果を示し、◆は対照実験結果である。図５は、９６ウェルプレートにおける結果であり、図６は２４ウェルプレートにおける結果である。
図５及び図６より、冷凍保存していない細胞は培養により増殖したが、本実施例の細胞保存液で凍結保存した細胞は、解凍後に培養しても、１３日間ほとんど増殖しないことがわかった。
【００１７】
（実施例５）
さらに、細胞保存液を用いて５日間−２０℃で凍結保存したＬＣ−２／ａｄ細胞を解凍後にＤＮＡ染色色素であるヘキスト３３３４２により染色した。また、培養フラスコで培養したＬＣ−２／ａｄ細胞を、凍結保存せずにトリプシン処理を行い、フラスコから剥離し、これをポジティブコントロールとして用いた。これらの位相差像及び蛍光像を図７に示す。
図７から、ポジティブコントロールと同様に細胞保存液で保存した細胞もＤＮＡが染色されていることから、本発明の細胞保存液を用いると、ＤＮＡを劣化させずに細胞を保存できることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の細胞保存液へのｐＨの影響を示すグラフである。
【図２】実施例２の細胞保存安定性の実験結果を示すグラフである。
【図３】実施例３の細胞保存後の細胞再培養実験の結果を示す顕微鏡画像である。
【図４】図３の１３日目の細胞の拡大顕微鏡画像である。
【図５】実施例４の９６ウェルプレートにおける結果を示すグラフである。
【図６】実施例４の２４ウェルプレートにおける結果を示すグラフである。
【図７】細胞保存液で保存した細胞及び正常細胞の位相差像及び蛍光像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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