(57)【要約】【課題】  肝星細胞のアポトーシスに関連するタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびその発現を抑制するリボザイム【解決手段】  本願発明者らは、上記課題に鑑みて鋭意研究の結果、ランダム化リボザイムライブラリーによるジーンディスカバリーシステムを用いて、グリオトキシン誘導肝星細胞アポトーシスに関連するリボザイム配列を20クローン得た。実際に得られたクローンの一つであるRz.1配列をコードするプラスミドを導入することで、細胞はグリオトキシン誘導アポトーシスに抵抗性を獲得した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１〜２０のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号：１〜２０のいずれかに記載の塩基配列を含む、肝星細胞のアポトーシスに関連するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドによりコードされる、肝星細胞のアポトーシスに関連するタンパク質。
【請求項４】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載のベクターを保持する宿主細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞またはその培養上清から、産生させたタンパク質を回収する工程を含む、請求項３に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項７】
請求項１に記載のポリヌクレオチドの転写産物を切断するリボザイム。
【請求項８】
請求項７に記載のリボザイムを発現するベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のリボザイムがハンマーヘッド型リボザイムであるベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
肝星細胞のアポトーシスに関連する新規遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性肝疾患の進展に伴い臓器の線維化が進行し、病態の終末像として肝硬変に至る。肝硬変は肝癌の母地となり、とりわけウイルス性肝硬変からの発癌は極めて高率であり、我が国の肝癌成因の大半を占めている。高度の肝線維化が、肝癌発生の母地となることから肝線維化と肝癌発生機序の連繋が注目されているが、肝線維化には肝在住の星細胞が深く関わっていることが明らかとなっている。そのため、星細胞における線維化に関わる遺伝子発現を網羅的・系統的に探索し、機能相関を明らかにすることは慢性肝障害の進展を阻止し、肝がん予防に直接寄与することが可能である。しかしながら現在のところ、星細胞における線維化に関わる遺伝子発現を網羅的・系統的に探索し、機能相関を明らかにした例はない。inverse genomics的な手法により肝星細胞の細胞死にかかわる遺伝子群を明らかにし、責任遺伝子の肝星細胞特異的ノックダウンを介した活性化星細胞の細胞死による除去が可能となれば、慢性肝炎から肝硬変への進展防止および肝発癌予防の新しいアプローチにつながることが期待できる。
【０００３】
ハンマーヘッド型リボザイムは初め、植物ウイロイドを解析していて同定されたものである。RNA分子の特異的な切断を触媒し、相補的な基質RNAをシスおよびトランスに切断することができる。リボザイムによる（Rz-介在型）切断にとって重要な条件は、標的RNAの中にNUXトリプレットが存在することである（ここで、Nはどのリボヌクレオチドでもよく、XはA、U、またはCを表す）。リボザイムは、NUXトリプレットを含むRNAを切断できるため、治療薬となる可能性が相当高いと考えられている。また、真核細胞における目的遺伝子の機能解析にも用いられてきた。インビボでのリボザイムの利用を目指して多数の研究が行われており、さまざまな生物における遺伝子発現を抑制するためにリボザイムを利用する実験に成功したとの報告が多数ある。
【０００４】
今やヒトの全ゲノムに関する配列情報を利用することができるため、ヒトの機能的な遺伝子を同定して、それらの機能を明らかにすることが重要になった。それらの解明において、DNAマイクロアレイと酵母ツーハイブリッド系が広く利用されている。DNAマイクロアレイ技術は、さまざまな細胞内プロセスが起きる間に遺伝子発現レベルが変化することに基づいている。しかし、リン酸化のように、特定の遺伝子の発現レベルを変化させることなく表現型に変化をもたらすという質的変化を伴う機能的遺伝子を同定することは困難である。酵母ツーハイブリッド系は、インビボでの直接的なタンパク質間相互作用を検出し、また、その産物がcDNAライブラリーから得られた特定のタンパク質と相互作用する遺伝子を同定するための強力な方法を提供する。しかし、この方法には、予想される相互作用が必ずしも当該現象における役割を反映しておらず、しばしば、偽陽性の結果が生じるという限界がある。そこで、特定の現象に関与する重要遺伝子を迅速に同定するシステムの開発が必要とされていた。
また、以下の文献（非特許文献１〜１５参照）が報告されている。
【０００５】
【非特許文献１】Friedman SL. Molecular regulation of hepatic fibrosis, an integrated cellular response to tissue injury. J Biol Chem. 2000 Jan 28;275:2247-50.
【非特許文献２】Iredale JP, Benyon RC, Pickering J, McCullen M, Northrop M, Pawley S, Hovell C, Arthur MJ. Mechanisms of spontaneous resolution of rat liver fibrosis. Hepatic stellate cell apoptosis and reduced hepatic expression of metalloproteinase inhibitors. J Clin Invest. 1998 Aug 1;102:538-49.
【非特許文献３】Alcolado R, Arthur MJ, Iredale JP. Pathogenesis of liver fibrosis.Clin Sci (Lond). 1997 Feb;92:103-12. Review.
【非特許文献４】Pierce ML, Ruffner DE. Construction of a directed hammerhead ribozyme library: towards the identification of optimal target sites for antisense-mediated gene inhibition. Nucleic Acids Res. 1998; 26:5093-101.
【非特許文献５】Kruger M, Beger C, Li QX, Welch PJ, Tritz R, Leavitt M, Barber JR, Wong-Staal F. Identification of eIF2Bgamma and eIF2gamma as cofactors of hepatitis C virus internal ribosome entry site-mediatedtranslation using a functional genomics approach. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 97:8566-71.
【非特許文献６】Beger C, Pierce LN, Kruger M, Marcusson EG, Robbins JM, Welcsh P, Welch PJ, Welte K, King MC, Barber JR, Wong-Staal F. Identification of Id4 as a regulator of BRCA1 expression by using a ribozyme-library-based inverse genomics approach. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001, 98:130-5.
【非特許文献７】Kawasaki H, Taira K. Identification of genes by hybrid ribozymes that couple cleavage activity with the unwinding activity of an endogenous RNA helicase. EMBO Rep. 2002 May;3:443-50.
【非特許文献８】Kawasaki H, Onuki R, Suyama E, Taira K. Identification of genes that function in the TNF-alpha-mediated apoptotic pathway using randomized hybrid ribozyme libraries. Nat Biotechnol. 2002 Apr;20:376-80.
【非特許文献９】Rhoades K, Wong-Staal F. Inverse Genomics as a powerful tool to identify novel targets for the treatment of neurodegenerative diseases. Mech Ageing Dev. 2003 Jan;124:125-32.
【非特許文献１０】Onuki R, Bando Y, Suyama E, Katayama T, Kawasaki H, Baba T, Tohyama M, Taira K. An RNA-dependent protein kinase is involved in tunicamycin-induced apoptosis and Alzheimer's disease. EMBO J. 2004 Feb 25;23:959-968.
【非特許文献１１】Kawasaki H, Tsunemi M, Iyo M, Oshima K, Minoshima H, Hamada A, Onuki R, Suyama E, Taira K. A functional gene discovery in cell differentiation by hybrid ribozyme and siRNA libraries.Nucleic Acids Res Suppl. 2002;:275-6.
【非特許文献１２】Takagi Y, Suyama E, Kawasaki H, Miyagishi M, Taira K. Mechanism of action of hammerhead ribozymes and their applications in vivo: rapid identification of functional genes in the post-genome era by novel hybrid ribozyme libraries. Biochem Soc Trans. 2002 Nov;30:1145-9.
【非特許文献１３】Suyama E, Kawasaki H, Kasaoka T, Taira K. Identification of genes responsible for cell migration by a library of randomized ribozymes. Cancer Res. 2003 Jan 1;63:119-24.
【非特許文献１４】Suyama E, Wadhwa R, Kaur K, Miyagishi M, Kaul SC, Kawasaki H, Taira K. Identification of metastasis-related genes in a mouse model using a library of randomized ribozymes. J Biol Chem. 2004 Sep 10;279:38083-6.
【非特許文献１５】Suyama E, Kawasaki H, Nakajima M, Taira K. Identification of genes involved in cell invasion by using a library of randomized hybrid ribozymes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 May 13;100 :5616-21.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、肝星細胞のアポトーシスに関与する新規遺伝子およびその発現を抑制するリボザイムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ランダム化された基質結合アームをもつRNAヘリカーゼと結合したリボザイムライブラリーを用いた本発明者らによって開発された簡便なシステムを利用し、肝星細胞のアポトーシスにおいて機能する遺伝子の単離を試みた。肝星細胞のアポトーシスに関しては、グリオトキシンを用いて検討を行った。グリオトキシンは真菌の代謝産物であり、胸腺細胞やリンパ球、マクロファージ、繊維芽細胞、そして肝星細胞にアポトーシスを誘導することが知られている。
【０００８】
細胞内におけるリボザイムの有効な使用は、標的部位への送達性によって大きく制約されてきたため、従来のリボザイムライブラリーの有効性は低かった。この問題を克服するため、内在性RNAヘリカーゼと相互作用することができるRNAモチーフ［ポリAテール］をリボザイムに付けることによって、ヘリケースが付着したハイブリッドリボザイムが、mRNAの二次構造や三次構造とは関係なく、mRNAの内側にある部位を攻撃できるようになる。具体的な処理方法は以下の原理に基づくものである。リボザイムライブラリーを導入して細胞の表現型に変化があれば、活性のあるリボザイムクローンの配列を決定することによって表現型を変化させた遺伝子を同定することができる。グリオトキシンによってもたらされる肝星細胞のアポトーシスの場合に、リボザイムライブラリーを肝星細胞株であるHSC-T6に導入したところ、グリオトキシン誘導型アポトーシスに完全抵抗性のある生存クローンが出現した。発明者らは、本方法を用いて、アポトーシスに関連する遺伝子の断片ＤＮＡを多数単離することに成功した。該ＤＮＡは、肝星細胞のグリオトキシン誘導型アポトーシスに関与する遺伝子の部分ＤＮＡであるものと考えられる。当業者においては、該ＤＮＡ断片をプローブ等として使用することにより、肝星細胞のアポトーシスに関与する遺伝子の完全長cDNAを容易に取得することができる。
【０００９】
本発明は、肝星細胞のアポトーシスに関与する遺伝子に関し、より具体的には、
〔１〕  配列番号：１〜２０のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
〔２〕  配列番号：１〜２０のいずれかに記載の塩基配列を含む、肝星細胞のアポトーシスに関連するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
〔３〕  〔２〕に記載のポリヌクレオチドによりコードされる、肝星細胞のアポトーシスに関連するタンパク質、
〔４〕  〔１〕または〔２〕に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
〔５〕  〔１〕または〔２〕に記載のポリヌクレオチドまたは〔４〕に記載のベクターを保持する宿主細胞、
〔６〕  〔５〕に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞またはその培養上清から、産生させたタンパク質を回収する工程を含む、〔３〕に記載のタンパク質の製造方法、
〔７〕  〔１〕に記載のポリヌクレオチドの転写産物を切断するリボザイム、
〔８〕  〔７〕に記載のリボザイムを発現するベクター、
〔９〕  〔８〕に記載のリボザイムがハンマーヘッド型リボザイムであるベクター、
を、提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本願発明者らは、ランダム化リボザイムライブラリーによるジーンディスカバリーシステムを用いて、グリオトキシン誘導肝星細胞アポトーシスに関連するリボザイム配列を20クローン得た。実際に得られたクローンの一つであるRz.1配列をコードするプラスミドを導入することで、細胞はグリオトキシン誘導アポトーシスに抵抗性を獲得することが示された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本明細書において用いられる「ポリヌクレオチド」とは、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドであって、複数の塩基または塩基対からなる重合体を意味する。ポリヌクレオチドには、一本鎖型および二本鎖型のDNAを含む。ポリヌクレオチドは、天然に存在する状態から修飾されていないもの、および修飾されているものの双方を含む意である。修飾された塩基としては、例えば、トリチル化された塩基およびイノシンのような特殊な塩基がある。
【００１２】
本明細書において用いられる「タンパク質」は、複数のアミノ酸からなる重合体を意味する。従って、オリゴペプチドおよびポリペプチドもまた、タンパク質の概念に含まれる。タンパク質は、天然に存在する状態から修飾されていないもの、および修飾されているものの双方を含む意である。修飾としては、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸の転移RNA媒介付加、ユビキチン化などが含まれる。
【００１３】
本発明者らにより、肝星細胞のアポトーシスに関連するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの部分断片ポリヌクレオチドが提供された。本発明の上記ポリヌクレオチドの配列を、配列番号：１〜２０で示す。なお、配列番号：１〜２０に記載された配列に相補的な配列もまた、本発明のポリヌクレオチドに含まれる。
【００１４】
本発明者らにより提供された上記ポリヌクレオチドは、肝星細胞のアポトーシスに関連する遺伝子の部分配列であるが、当業者においては、配列番号：１〜２０のいずれかに記載のポリヌクレオチドの配列情報を基に、肝星細胞のアポトーシスに関連する遺伝子の全長cDNAを単離することは、容易に行うことが可能である。即ち、例えば、配列番号：１〜２０のいずれかに記載の配列をプローブとして各種細胞から調製したcDNAライブラリーなどをハイブリダイゼーションによってスクリーニングする方法や、配列番号：１〜２０のいずれかに記載の配列をプライマーとして用い、各種cDNAライブラリーなどのDNAを鋳型として、プライマーに特異的なサイズの増幅産物が得られることを指標としてライブラリーをスクリーニングする方法により、該cDNAの全長を取得することができる。また、配列番号：１〜２０のいずれかに記載の配列をプライマーとして用い、各種細胞から調製されたmRNAを一本鎖cDNAに変換し、末端にオリゴマーを付加してからPCRを行うRACE法（Frohman, M. A. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8992, 1988）によって肝星細胞のアポトーシスに関連する遺伝子の全長cDNAを取得することも可能である。
【００１５】
本発明のポリヌクレオチドを、ハイブリダイゼーションのためのプローブとして使用する場合には、通常、標識したものが用いられる。標識としては、例えば、DNAポリメラーゼIを用いるニックトランスレーションによる標識、ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識、クレノーフラグメントによるフィルイン末端標識（Berger SL, Kimmel AR. (1987) Guide to Molecular Cloning Techniques, Method in Enzymology, Academic Press; Hames BD, Higgins SJ (1985) Genes Probes: A Practical Approach. IRL Press; Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press）、RNAポリメラーゼを用いる転写による標識（Melton DA, Krieg,PA, Rebagkiati MR, Maniatis T, Zinn K, Green MR. (1984) Nucleic Acid Res., 12,7035-7056）、放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドをDNAに取り込ませる方法（Kricka LJ. (1992) Nonisotopic DNA Probing Techniques. Academic Press）等が挙げられる。
【００１６】
本発明は、配列番号：１〜２０のいずれかに記載の塩基配列を含む、肝星細胞のアポトーシスに関連するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。該ポリヌクレオチドには、配列番号：１〜２０のいずれかに記載の配列情報を基に単離し得る、肝星細胞のアポトーシスに関連する遺伝子の全長cDNAが含まれる。
【００１７】
さらに本発明には、配列番号：１〜２０のいずれかに記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドが含まれる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、通常「1xSSC、0.1% SDS、37℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「0.5xSSC、0.1% SDS、42℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「0.2xSSC、0.1% SDS、65℃」程度の条件である。このようにハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するDNAの単離を期待しうる。但し、上記SSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００１８】
本発明のポリヌクレオチドは、上記肝星細胞のアポトーシスに関連するタンパク質の発現を抑制するためのアンチセンスポリヌクレオチド（アンチセンスDNA/RNA； 例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスRNA、siRNA（あるいは、RNAi活性を有するRNAをコードするDNA）、および該RNAをコードするDNA）、またはリボザイムを構成するポリヌクレオチド（あるいは、リボザイム活性を有するRNAをコードするDNA）として利用することができる。
【００１９】
アンチセンスポリヌクレオチドが標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ(Ａ)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する(平島および井上「新生化学実験講座2 核酸IV 遺伝子の複製と発現」,日本生化学会編,東京化学同人,pp.319-347,1993)。
【００２０】
本発明で用いられるアンチセンスポリヌクレオチドは、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むポリヌクレオチドも、本発明で利用されるアンチセンスポリヌクレオチドに含まれる。使用されるアンチセンスポリヌクレオチドは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。アンチセンスポリヌクレオチドの配列は、標的遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相補性を有する。
【００２１】
該アンチセンスポリヌクレオチドは、例えば、本発明のポリヌクレオチド（例えば、配列番号：１を基に単離される肝星細胞のアポトーシスに関連するタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列）の配列情報を基にホスホロチオネート法（Stein, 1988 Physicochemical properties of phosphorothioate oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Res 16, 3209-21 (1988)）などにより調製することが可能である。
【００２２】
RNAiは、標的遺伝子のmRNAと相同な配列からなるセンスRNAとこれと相補的な配列からなるアンチセンスRNAとからなる二本鎖RNA（以下、「dsRNA」と略称する）を細胞等に導入することにより、標的遺伝子mRNAの破壊を誘導し、標的遺伝子の発現を抑制し得る現象である。このようにRNAiは、標的遺伝子の発現を抑制し得ることから、従来の煩雑で効率の低い相同組換えによる遺伝子破壊方法に代わる簡易な遺伝子ノックアウト方法として注目を集めている。上記RNAiは、当初、線虫において発見されたが（Fire, A. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811, (1998)）、現在では、線虫のみならず、植物、線形動物、ショウジョウバエ、原生動物などの種々の生物において観察されている（Fire, A. RNA-triggered gene silencing. Trends Genet. 15, 358-363 (1999)、Sharp, P. A. RNA interference 2001. Genes Dev. 15, 485-490 (2001)、Hammond, S. M., Caudy, A. A. & Hannon, G. J. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nature Rev. Genet. 2, 110-1119 (2001)、Zamore, P. D. RNA interference: listening to the sound of silence. Nat Struct Biol. 8, 746-750 (2001)）。これら生物では、実際に外来よりdsRNAを導入することにより標的遺伝子の発現が抑制されることが確認され、さらにはノックアウト個体を創生する方法としも利用されつつある。
【００２３】
インビトロにおいて、dsRNAは、ショウジョウバエの初期胚の溶解物または培養ショウジョウバエS2細胞の抽出物における切断に関してmRNAを標的とすることが知られている（Tuschl T., et al., Genes Dev. 13: 3191-3197, 1999; Hammond S. M., et al., Nature 404: 293-296, 2000; Zamore P., et al., Cell 101: 25-33, 2000）。インビトロでのRNAiの反応はATP（Zamore P., et al., Cell 101: 25-33, 2000）を必要とする。
【００２４】
合成RNA二本鎖による最近の研究により、それぞれのsiRNA二本鎖が標的RNAを切断することが証明された（Elbashir S. M. et al., Genes Dev. 15: 188-200, 2001）。siRNA二本鎖内の2ヌクレオチドまたは3ヌクレオチドの突出3'末端が、効率的な標的切断にとって必要であることが明らかになった（Elbashir S. M. et al., Genes Dev. 15: 188-200, 2001）。そのような3'突出末端は、RNアーゼIII切断反応の産物に特徴的であり、培養ショウジョウバエS2細胞において、dsRNAのsiRNAへの切断は、ダイサーとして知られる多数のドメインRNアーゼIII酵素を必要とする（Bernstein E. et al., Nature 409: 363-366, 2001）。その後、siRNAは、ショウジョウバエにおいて同定され、RISCと呼ばれる多成分ヌクレアーゼと会合し、mRNAの配列特異的分解に関してこの酵素を誘導するものと考えられる（Hammond S. M., et al., Nature 404: 293-296, 2000; Bernstein E. et al., Nature 409: 363-366, 2001; Hammond S. M. et al., Science 293: 1146-1150, 2001）。
【００２５】
RNAiは標的遺伝子を不活化する方法を提供し、このように、C. エレガンス（C. elegans）、ショウジョウバエおよび植物における遺伝子機能を研究するための強力なツールを提供する。遺伝子発現の特異的阻害はまた、動物および植物におけるdsRNAの安定な発現および誘導型発現によって得ることができる（Kennerdell and Carthew Nature Biotechnol. 18: 896-898, 2000; Tavernarakis N. et al., Nature Genetics 24: 180-183, 2000; Hammond S. M. et al., Nature Reviews Genetics 2: 110-119, 2001）。マウス胚癌EC細胞および胚幹（ES）細胞では、dsRNAによる遺伝子の不活化は成功したが（Billy E. et al., PNAS 98: 14428-14433, 2001; Paddison P. J. et al., PNAS 99: 1443-1448, 2002）、培養哺乳類細胞における長いdsRNAによるRNAiの誘発は一般的にあまり成功していない。これらの失敗は、長いdsRNA（＞30塩基対）（Stark G. R. et al., Annu. Rev. Biochem. 67: 227-264, 1998）によって活性化されるインターフェロン（IFN）防御経路の一部を形成する２つの潜在型酵素の作用によって、容易に説明される。その一つは、2'-5'-オリゴアデニレート（2-5A）シンターゼであり、これはdsRNAによって活性化されて、RNアーゼLと呼ばれる配列非特異的RNアーゼの活性化にとって必要である2-5Aの合成を増加させる（Silverman R. H. in Ribonucleases: Structures and Functions, eds. D'Alessio, G. and Riordan J. F. (Academic, New York) pp.515-551）。もう一つは、蛋白質キナーゼPKRであり、その活性型は翻訳因子真核細胞開始因子（eIF2）をリン酸化して、蛋白質合成の全般的な阻害と細胞死に至る（Clemens M. J. and Elia A., J. Interferon Cytokine Res. 17: 503-524, 1997）。
【００２６】
最近、21ヌクレオチドのsiRNA二本鎖がいくつかの哺乳類細胞において内因性遺伝子の発現を特異的に抑制することが報告された（Elbashir S. M. et al., Nature 411: 494-498, 2001）。この場合、21ヌクレオチドsiRNA二本鎖は、IFN防御システムから逃れることができる。この知見は、RNAiまたはRNAi関連システムが哺乳類に存在することを示唆した。実際に、rde-1、mut-7およびダイサーのようなRNAi関連蛋白質の哺乳類相同体がいくつか同定されている（Tabara H. et al., Cell 99: 123-132, 1999; Ketting R. F. et al., Cell 99: 133-141, 1999; Bernstein E. et al., Nature 409: 363-366, 2001）。
【００２７】
このようなsiRNAをより簡便に利用することを目的としてsiRNA発現ベクターが開発された。siRNAを発現させるプロモーターとしては、Pol III系のH1、U6、tRNAが一般的に用いられている。H1およびU6に関しては、ヘアピン構造部分の長さが21塩基であるsiRNAが最も高い遺伝子発現抑制を示すことが知られているが、tRNAに関してはヘアピン構造部分の長さが29塩基付近である場合に高い遺伝子発現抑制を示すことが示されている。内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リボザイムをコードするポリヌクレオチドを利用して行うことも可能である。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループIイントロン型や、RNasePに含まれるM1RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある(小泉誠および大塚栄子, (1990) 蛋白質核酸酵素,35:2191)。
【００２８】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15のC15の3'側を切断するが、活性にはU14が９位のAと塩基対を形成することが重要とされ、15位の塩基はCの他にAまたはUでも切断されることが示されている(M.Koizumiら,(1988) FEBS Lett.228:225)。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のRNA配列と相補的になるように設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することが可能である(M.Koizumiら,(1988) FEBS Lett. 239:285、小泉誠および大塚栄子,(1990) 蛋白質核酸酵素,35:2191、M.Koizumiら, (1989) Nucleic Acids Res. 17:7059)。本発明においては、配列番号：１〜２０に記載された配列の転写産物(mRNAの一部)は、リボザイムの標的となる配列であることから、該配列を標的配列として認識するリボザイムを、当業者においては、容易に構築することが可能である。このようにして構築されたリボザイムは、本発明における肝星細胞のアポトーシスに関連するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写産物を切断するものと考えられる。これらのリボザイムも本発明に含まれる。本発明のリボザイムは、例えば、肝星細胞アポトーシスのメカニズムを解析するためのツールとして大いに有用である。
【００２９】
また本発明は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を提供する。該タンパク質は、肝星細胞アポトーシスに関連するタンパク質である。本発明のタンパク質は任意の適当な方法で製造することができる。このようなタンパク質には、単離された天然に存在するタンパク質、組換え的に生産されたタンパク質、合成的に製造されたタンパク質、またはこれらの方法の組み合わせにより製造されたタンパク質が含まれる。このようなタンパク質の製造のための手段は当業界でよく理解されている。組み換え的なタンパク質は、例えば、本発明のポリヌクレオチドを挿入したベクターを適当な宿主細胞に導入し、形質転換体内で発現したタンパク質を精製することにより調製することが可能である。一方、天然由来のタンパク質は、例えば、タンパク質に対する抗体を結合したアフィニティーカラムを利用して調製することができる (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons Section 16.1-16.19)。任意のタンパク質についての抗体の作製は、当業者においては周知の方法により行うことができる。アフィニティー精製に用いる抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。また、インビトロトランスレーションなどにより本発明のタンパク質を調製することも可能である。
【００３０】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含有するベクター、本発明のポリヌクレオチドまたは該ベクターを保持する宿主細胞、および該宿主細胞を利用した本発明のポリペプチドの生産方法を提供する。
【００３１】
本発明のベクターとしては、挿入したDNAを安定に保持するものであれば特に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターとしてはpBluescriptベクター(Stratagene社製）などが好ましい。本発明のポリペプチドを生産する目的においてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でポリペプチドを発現するベクターであれば特に制限されないが、例えば、試験管内発現であればpBESTベクター（プロメガ社製）、大腸菌であればpETベクター（Invitrogen社製）、培養細胞であればpME18S-FL3ベクター（GenBank Accession No. AB009864）、生物個体であればpME18Sベクター（Mol Cell Biol. 8:466-472(1988)）などが好ましい。ベクターへの本発明のDNAの挿入は、常法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 11.4-11.11）。
【００３２】
本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々の宿主細胞が用いられる。ポリペプチドを発現させるための細胞としては、例えば、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵母、アスペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフィラS2、スポドプテラSF9）、動物細胞（例：CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes メラノーマ細胞）および植物細胞を例示することができる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9）、リポフェクタミン法（GIBCO-BRL社製）、マイクロインジェクション法などの公知の方法で行うことが可能である。
【００３３】
宿主細胞において発現したタンパク質を小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、または細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のタンパク質に組み込むことができる。これらのシグナルは目的のタンパク質に対して内因性であっても、異種シグナルであってもよい。
【００３４】
本発明のタンパク質の回収は、本発明のポリペプチドが培地に分泌される場合は、培地を回収する。本発明のタンパク質が細胞内に産生される場合は、その細胞をまず溶解し、その後にタンパク質を回収する。
【００３５】
組換え細胞培養物から本発明のタンパク質を回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法を用いることができる。
【００３６】
本発明のリボザイムは、そのまま細胞内に導入し、細胞内で機能させることもできるが、効率的な発現阻害を行うために、上記リボザイムを発現ベクターに保持させることが好ましい。本発明のリボザイムを発現するベクターもまた、本発明に含まれる。ここで用いることができる「ベクター」は、導入したい細胞などに対応して選択することができる。例えば、哺乳動物細胞では、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、EBウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、フォーミーウイルスベクターなどのウイルスベクターやカチオニックリポソーム、リガンドDNA複合体、ジーンガンなどの非ウイルスベクターなどが挙げられるが（Niitsu Y. et al., Molecular Medicine 35: 1385-1395 (1998)）、これらに限定されるものではない。
【００３７】
ベクターには、必要に応じて、ベクターが導入された細胞を選択し得る選択マーカーなどをさらに保持させることができる。選択マーカーとしては、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子のような薬剤耐性マーカー、ガラクトシダーゼなどの酵素活性を指標に選択し得るマーカー、あるいは、GFPなどの蛍光発光などを指標に選択し得るマーカーなどが挙げられる。また、EGFレセプター、B7-2などの表面抗原を指標に選択し得る選択マーカーなども用いてもよいこのように選択マーカーを用いることにより、該ベクターが導入された細胞、すなわち、本発明のベクターが導入された細胞のみを選択することが可能となる。また、ベクターを用いることにより、細胞内での保持時間を高め、またベクターによってはレトロウイルスベクターなどのように染色体へのインテグレーションを誘導するため、本発明のリボザイムの安定的な供給を行うことが可能となる。
【００３８】
本発明の好ましい態様においては、本発明のリボザイムまたは該リボザイムを発現するベクターを、細胞へ導入することにより、該細胞における遺伝子の発現を抑制することができる。従って本発明は、標的遺伝子の発現が抑制された細胞を生産する方法であって、本発明のリボザイムまたは該リボザイムを発現するベクターを細胞に導入する工程、および前記ベクターが導入された細胞を選択する工程、を含む生産方法を提供する。さらに本発明は、本発明のリボザイムまたは該リボザイムを発現するベクターを保持する細胞を提供する。本発明の上記細胞は、特に限定されず、遺伝子の発現を抑制したい所望の細胞を使用することができる。
【００３９】
また、本発明のリボザイムまたは該リボザイムを発現するベクターの上記細胞への導入方法は、当業者においては、細胞の種類により適宜選択することができる。例えば、哺乳動物細胞への導入では、リン酸カルシウム法(Virology, Vol.52, p.456 (1973))、エレクトロポーレーション法(Nucleic Acids Res., Vol.15, p.1311 (1987)) 、リポフェクション法(J. Clin. Biochem. Nutr., Vol.7, p.175 (198 9))、ウィルスにより感染導入方法(Sci.Am., p.34, March (19 94)) 、ジーンガンなどから選択することがる。
【００４０】
本発明のリボザイムまたは該リボザイムを発現するベクターが導入された細胞を選択する方法としては、本発明のリボザイムまたは該リボザイムを発現するベクターに特異的なDNA配列をプローブあるいはプライマーとしてハイブリダイゼーション、PCR法等の公知の手法により選択することもできるが、選択マーカーを備えたベクターに本発明のリボザイムが保持されている場合には、その選択マーカーによる表現型を指標に選択することができる。
【００４１】
上記のように本発明のリボザイムまたは該リボザイムを発現するベクターが導入された細胞は、標的遺伝子の発現が抑制されたノックダウン細胞となる。ここで「ノックダウン細胞」には、標的遺伝子の発現が完全に抑制された細胞と、標的遺伝子の発現が完全には抑制されていないが低減されている細胞とが含まれる。従来、このような細胞は、標的遺伝子をあるいはその制御領域を欠損・改変させることにより創生されていたが、本発明を用いることにより、染色体上の標的遺伝子を改変することなく、単に本発明のリボザイムまたは該リボザイムを発現するベクターを導入し、導入された細胞を選択するという簡易な方法により標的遺伝子の発現が抑制された細胞を作ることができる。このように創生されたノックダウン細胞は、標的遺伝子の機能解析のための研究材料として、また疾患原因遺伝子を標的遺伝子として発現が抑制されている細胞では疾患モデル細胞などとして利用することが可能となる。また、生殖細胞に本発明のリボザイムまたは該リボザイムを発現するベクターを導入し、この本システムを保持した生殖細胞より生物個体を発生させることにより、標的遺伝子ノックダウン動物、疾患モデル動物などを創生することも可能となる。本発明には、本発明によって生産される上記ノックダウン細胞も含まれる。
【００４２】
また本発明は、本発明のリボザイムまたは該リボザイムを発現するベクターを含有する組成物に関する。本発明により所望の標的遺伝子の発現を抑制し得るため、本発明により疾患の原因となる遺伝子発現を抑制することにより、該疾患の治療または予防効果が期待できる。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００４４】
[実施例１]  肝星細胞のアポトーシスに関する遺伝子の同定
（１）実験材料および方法
（ａ）ランダム化ハンマーヘッド型リボザイムライブラリーの構築
ランダム化基質結合アームとpol III終結配列をもつリボザイム配列をコードするオリゴヌクレオチドを化学的に合成し、PCRによって、二本鎖配列に変換させた。Csp45IおよびKpnIで制限酵素消化した後、断片をpUC-dt8のtRNAプロモーターの下流にクローニングした。ポリ(A)を結合したRz発現ベクターを作製するために、60ヌクレオチドからなるポリ(A)配列を、リボザイム配列とpol III終結配列の間に挿入した。
【００４５】
（ｂ）グリオトキシンによる肝星細胞のアポトーシス誘導
24ウェルマルチプレートに5.0×104/wellの濃度でヒト肝星細胞由来のHSC-T6細胞を蒔き、37℃で36時間培養した。グリオトキシンを1.5μMの濃度で培養液に添加し、さらに0-24時間培養した。種々の培養時間（0,5,8,12,24時間）後、細胞をFITC標識annexin-Vとpropidium iodideによる二重染色を行い、アポトーシス・ネクローシス細胞をFACSにて定量的に評価した。その結果、グリオトキシン処理24時間後にはほとんどの細胞が死滅していることが確認された。
【００４６】
（ｃ）電気穿孔法によるHSC-T6細胞に対する遺伝子の導入
星細胞への遺伝子導入の至適条件を検討するためにレポーター遺伝子であるGFP発現プラスミド（EGFP-N2 Vector, CLONTECH）を電気穿孔法にてトラスフェクションし、その発現を蛍光顕微鏡、およびFACSで評価した。電気穿孔法によるHSC-T6細胞に対するEGFP-N2の導入効率はDNA 4μg / 4.0x106 cells, voltage 130V, P-length 15 ms, 75Ω, 1700μFの条件下で最も高率で29.8±3.3％ であった。リボザイムライブラリーがトランスフェクションされなかった細胞に関してはグリオトキシンによるセレクションで細胞死にいたるため、上記の導入効率で十分と考えられた。
【００４７】
（２）肝星細胞のアポトーシスに関する遺伝子の網羅的スクリーニング
電気穿孔法を用いてHSC-T6細胞にランダム化ハンマーヘッド型リボザイムライブラリーを導入し、36時間後にグリオトキシン（1.5μM）を添加した。24時間後に生存細胞のみをセレクションし、培養した後に細胞よりDNAを回収し、得られたDNAをテンプレートとしてPCRにて増幅した。(primers: forward M13-47 5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’（配列番号：２１）, reverse M13-RV 5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’（配列番号：２２）; 96.0℃/10sec-68.0℃/20sec- 94.0℃/10sec -60.0℃/20sec - 72.0℃/10sec x 25 cycles)PCRプロダクトを制限酵素（EcoRI,SphI）で処理した後に電気泳動によりインサート部分のみを回収し、pUC-19プラスミドベクターにライゲーションした後にE.coli (DH5αCompetent Cells)にトランスフォーメーションを行い、セカンドスクリーニング用のリボザイムライブラリーを作成した。擬陽性のリボザイムクローンを減らすために再びHSC-T6細胞にそのリボザイムライブラリーのトランスフェクションを行い、グリオトキシンによるスクリーニングを前回と同様の条件で行い、24時間後に生存細胞のみを培養。この操作を再度繰り返し、スクリーニングを３回まで行った。図３に実施したスクリーニングの概念図を示す。図４には３回目のスクリーニングで得られたリボザイムライブラリーによるアポトーシス抑制効果を示す。アポトーシスが誘導される細胞数の減少が観察されることから、本スクリーニング系が良好に機能していることが示唆された。
【００４８】
（３）アポトーシス関連遺伝子配列の同定
グリオトキシンによる３回目のスクリーニングまでを実施した後にリボザイムの標的遺伝子発現抑制効果によりアポトーシス誘導を回避したと考えられる生存細胞からDNAプラスミドを回収し、E. coliへのトランスフォーメーションを行い、E.coliのコロニーからリボザイム搭載プラスミド20クローンを単離した。回収したプラスミドをApplied Biosystemsシークエンサーにて解析し、リボザイム塩基配列およびをリボザイムの基質認識部位の配列を決定した。（sequence primer: M13-21 5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’（配列番号：２３）, cycling条件：96.0℃/30sec - 96.0℃/10sec  - 50.0℃/5sec - 60.0℃/240sec × 25 cycles）
（表１）
グリオトキシン誘導星細胞アポトーシスに関わる遺伝子の各リボザイムによる基質認識部位配列
Rz.1: 5’-ATCCTGAACACAGTCTTG-3’    （配列番号：１）
Rz.2: 5’-ACTTGAGAAAACAGTTGAT-3’   （配列番号：２）
Rz.3: 5’-AAACAAGATACCAACACG-3’    （配列番号：３）
Rz.4: 5’-ACCGGAGTATACCAATTCAA-3’  （配列番号：４）
Rz.5: 5’-CGCGCTTTTCACAGAATAA-3’   （配列番号：５）
Rz.6: 5’-GTCACACTGAACTGTGTCC-3’   （配列番号：６）
Rz.7: 5’-GGGTTCCTCCACGACTCAA-3’   （配列番号：７）
Rz.8: 5’-CAGGGAGTACAAGTG-3’       （配列番号：８）
Rz.9: 5’-GAATAACAAACTCG-3’        （配列番号：９）
Rz.10: 5’-GCGAGGGTNACAGGACTA-3’   （配列番号：１０）
Rz.11: 5’-CTAGGCATCACATAGGAG-3’   （配列番号：１１）
Rz.12: 5’-AAGCGATACACACAGCAGA-3’  （配列番号：１２）
Rz.13: 5’-AAGCGATACACACAGCAGA-3’  （配列番号：１３）
Rz.14: 5’-CACCGCGGGAAACGCACGAA-3’ （配列番号：１４）
Rz.15: 5’-GACTACAGTCACTATTAAG-3’  （配列番号：１５）
Rz.16: 5’-AATATGACTTACCTGTGGGC-3’ （配列番号：１６）
Rz.17: 5’-AGTGGACACTACGCAAGAT-3’  （配列番号：１７）
Rz.18: 5’-CTAGCCAGAATGTGTTTC-3’   （配列番号：１８）
Rz.19: 5’-CGAGTTTTCACTGCGATT-3’   （配列番号：１９）
Rz.20: 5’-GTCAGGGAGAACAAGTGGA-3’  （配列番号：２０）
【００４９】
上記の表１は、グリオトキシン誘導星細胞アポトーシスに関わる遺伝子の各リボザイムによる基質認識部位配列を示した表である。この認識配列を含むmRNAがリボザイムの切断標的と考えられる。
【００５０】
（４）Rz.1導入によるグリオトキシン誘導星細胞アポトーシス抑制の検証
Rz.1をライゲーションしたプラスミドを電気穿孔法にてHSC-T6細胞に導入(DNA 4μg / 4.0x106 cells, voltage 130V, P-length  15 ms, 75Ω,1700 μF.)し、24ウェルプレートで36時間培養した後にグリオトキシン(1.5μM)を添加した。グリオトキシン添加24時間後に細胞をトリプシン処理にて回収しannexin Vとpropidium iodideによる二重染色を行い、Rz.1リボザイムによるアポトーシスの抑制効果をFACSにて解析した。図５にはRz.1によるアポトーシス抑制効果を示す。アポトーシスが誘導される細胞数の減少が観察されることから、本スクリーニング系が良好に機能し、アポトーシス抑制効果を示すリボザイムクローンが選択されていることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】グリオトキシンによる肝星細胞のアポトーシス誘導を確認した図である。1.5μMのグリオトキシン処理24時間後にはほとんどの細胞が死滅していることが確認された。
【図２】電気穿孔法によるHSC-T6細胞に対する遺伝子の導入効率を確認した図である。導入効率は最も高率で29.8±3.3％ であったが、リボザイムライブラリーがトランスフェクションされなかった細胞に関してはグリオトキシンによるセレクションで細胞死にいたるため、スクリーニングは十分可能であると考えられた。
【図３】肝星細胞のアポトーシスに関する遺伝子の網羅的スクリーニングの概念図である。
【図４】３回目のスクリーニングで得られたリボザイムライブラリーによるアポトーシス抑制効果を示した図である。アポトーシスが誘導される細胞数の減少が観察されることから、本スクリーニング系が良好に機能していることが示唆された。
【図５】Rz.1によるアポトーシス抑制効果を示した図である。アポトーシスが誘導される細胞数の減少が観察されることから、本スクリーニング系が良好に機能し、アポトーシス抑制効果を示すリボザイムクローンが選択されていることが確認された。
【図１】
2007037508.tif 000002
【図４】
2007037508.tif 000003
【図５】
2007037508.tif 000004
【図２】
2007037508.tif 000005
【図３】
2007037508.tif 000006
【配列表】
2007037508000001.app