(57)【要約】【要  約】【課  題】従来より、酵母や乳酸菌等の菌種の同定は、菌を培地で培養し、菌の栄養要求性及び形態等で同定する培養法が採用されてきた。しかしながら、該培養法による菌種の同定は、培養環境等の外的要因による影響を受ける上、時間がかかるという欠点があった。また、菌種によっては、培養が困難であったり、死滅した菌では培養することができないという問題があった。【解決手段】一方で、近年の分子生物学の発展に伴い、ＤＮＡの塩基配列の違いから植物や細菌の種別を同定する方法が開発されてきており、本発明者は更に研究を重ねたところ、加熱処理を施した加工食品からＤＮＡを抽出してＤＮＡ溶液を増幅させたＰＣＲ産物を得て、さらに変性勾配ゲル電気泳動法を用いて塩基配列の異なるＤＮＡを分離することができることを見いだし、本発明の加工食品中の菌種の同定方法を提案することができた。【特許請求の範囲】
【請求項１】
加熱処理を施した加工食品からＤＮＡを抽出してＤＮＡ溶液を得る工程、
該ＤＮＡ溶液にＰＣＲ法を適用してＤＮＡを増幅させたＰＣＲ産物を得る工程、
該ＰＣＲ産物に変性勾配ゲル電気泳動法を適用して、該ＰＣＲ産物中の塩基配列が相違するＤＮＡ毎にＤＮＡを分離する工程、
該分離したＤＮＡ毎に、塩基配列を解読する工程、
該解読した塩基配列毎に菌種を同定する工程、
を備えることを特徴とする加工食品中の菌種の同定方法。
【請求項２】
前記変性勾配ゲル電気泳動法を適用するＰＣＲ産物中のＤＮＡ量を１２５ｎｇ／μｌ以上とすることを特徴とする請求項１に記載の加工食品中の菌種の同定方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡ溶液にＰＣＲ法を複数回適用してから変性勾配ゲル電気泳動法を適用することを特徴とする請求項１又は２に記載の加工食品中の菌種の同定方法。
【請求項４】
前記ＰＣＲ法により増幅するＤＮＡの部位がリボゾーマルＲＮＡ由来のＤＮＡであることを特徴とする請求項１、２又は３に記載の加工食品中の菌種の同定方法。
【請求項５】
前記分離したＤＮＡ毎に、ＤＮＡ量をＰＣＲ法により増幅させてから、塩基配列を解読することを特徴とする請求項１、２、３又は４に記載の加工食品中の菌種の同定方法。
【請求項６】
前記変性勾配ゲル電気泳動法が変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法であることを特徴とする請求項１、２、３、４又は５に記載の加工食品中の菌種の同定方法。
【請求項７】
前記菌が酵母及び／又は乳酸菌であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５又は６に記載の加工食品中の菌種の同定方法。
【請求項８】
前記加工食品を粉砕してからＤＮＡを抽出することを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６又は７に記載の加工食品中の菌種の同定方法。
【請求項９】
前記加工食品がベーカリー製品であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７又は８に記載の加工食品中の菌種の同定方法。
【請求項１０】
前記ベーカリー製品が食パン、フランスパン、ライ麦パン、サワーブレッド又は中華まんじゅうであることを特徴とする請求項９に記載の加工食品中の菌種の同定方法。
【請求項１１】
前記ベーカリー製品のクラム（内相）部分からＤＮＡを抽出することを特徴とする請求項９又は１０に記載の加工食品中の菌種の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、加熱処理を施した加工食品中のＤＮＡを解析して、該加工食品中の菌種を同定する方法に関し、更に詳しくは、加工食品中のＤＮＡを抽出して得たＤＮＡ溶液にポリメラーゼ連鎖反応法（以下、ＰＣＲ法という）を適用してＤＮＡを増幅させたＰＣＲ産物に変性勾配ゲル電気泳動法を適用することによって、塩基配列が相違するＤＮＡ毎に分離して解読することを特徴とする加工食品中の菌種の同定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より、酵母や乳酸菌等の菌種の同定は、菌を培地で培養し、菌の栄養要求性及び形態等で同定する培養法が採用されてきた。しかしながら、該培養法による菌種の同定は、培養環境等の外的要因による影響を受ける上、時間がかかるという欠点があった。
【０００３】
また、菌種によっては、培養が困難であったり、死滅した菌では培養することができないという問題があった。
【０００４】
一方で、近年の分子生物学の発展に伴い、ＤＮＡの塩基配列の違いから植物や細菌の種別を同定する方法が開発されてきている。
【０００５】
加工食品から植物遺伝子を検出する方法として、高温処理、高温磨砕処理、高圧処理または発酵処理のいずれかの処理を受けた植物性加工食品を、脱脂した後、ＤＮＡ粗画分を抽出し、次いでポリエチレングリコール沈殿法及び／又はポリアクリルアミドゲル電気泳動法によるＤＮＡ分画処理を行って調製した鋳型ＤＮＡを用いてＰＣＲ法により植物遺伝子を検出する技術があった（特許文献１）。
【０００６】
しかし、該特許文献１に記載の技術は、ＰＣＲ法を適用する前に、煩雑なポリエチレングリコール沈澱法及び／又はポリアクリルアミドゲル電気泳動法によるＤＮＡ分画処理を必要とするものであった。また、該特許文献１に記載の技術は、植物性加工食品の原料として遺伝子組み換え植物が使用されたか否かを判別するのに用いられるものであって、目的とする遺伝子の存否のみを判断するものであった。
【０００７】
さらには、食品から細菌を分離し、該分離した細菌のＤＮＡ断片にＰＣＲ法を適用して増幅させ、増幅させたＤＮＡ断片に電気泳動法を適用して電気泳動像を得て、該電気泳動像に基づいて細菌を検出する技術があった（特許文献２）。
【０００８】
しかし、該前記特許文献２において試料とする食品は、非加熱又は加熱後に細菌を植菌した食品、即ち、細菌が加熱による損傷を受けていない食品であった。また、用いられるＰＣＲ法は、特殊なＳＳＣ−ＰＣＲ法で、多数のプライマーを合成するという非常に煩雑な作業を伴うものであった。
【特許文献１】特開２００１−１４９０８０号公報
【特許文献２】特開２００３−２５０５４１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、加熱処理が施された加工食品中の、加熱工程において損傷を受けたり、死滅した菌の種類を同定する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は係る課題を解決するために鋭意研究したところ、加熱処理を施した加工食品からＤＮＡを抽出してＤＮＡ溶液を得て、該ＤＮＡ溶液中のＤＮＡを増幅させたＰＣＲ産物を得て、さらに変性勾配ゲル電気泳動法を用いて塩基配列の異なるＤＮＡを分離することができることを見いだし、本発明の加工食品中の菌種の同定方法を提案することができた。
【００１１】
すなわち本発明の第一は、加熱処理を施した加工食品からＤＮＡを抽出してＤＮＡ溶液を得る工程、
該ＤＮＡ溶液にＰＣＲ法を適用してＤＮＡを増幅させたＰＣＲ産物を得る工程、
該ＰＣＲ産物に変性勾配ゲル電気泳動法を適用して、該ＰＣＲ産物中の塩基配列が相違するＤＮＡ毎にＤＮＡを分離する工程、
該分離したＤＮＡ毎に、塩基配列を解読する工程、
該解読した塩基配列毎に菌種を同定する工程、
を備えることを特徴とする加工食品中の菌種の同定方法である。
【００１２】
本発明の第二は、前記変性勾配ゲル電気泳動法を適用するＰＣＲ産物中のＤＮＡ量を１２５ｎｇ／μｌ以上とすることを特徴とする請求項１に記載の加工食品中の菌種の同定方法である。
【００１３】
本発明の第三は、前記ＤＮＡ溶液にＰＣＲ法を複数回適用してから変性勾配ゲル電気泳動法を適用することを特徴とする請求項１又は２に記載の加工食品中の菌種の同定方法である。
【００１４】
本発明の第四は、前記ＰＣＲ法により増幅するＤＮＡの部位がリボゾーマルＲＮＡ由来のＤＮＡであることを特徴とする請求項１、２又は３に記載の加工食品中の菌種の同定方法である。
【００１５】
本発明の第五は、前記分離したＤＮＡ毎に、ＤＮＡ量をＰＣＲ法により増幅させてから、塩基配列を解読することを特徴とする請求項１、２、３又は４に記載の加工食品中の菌種の同定方法である。
【００１６】
本発明の第六は、前記変性勾配ゲル電気泳動法が変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法であることを特徴とする請求項１、２、３、４又は５に記載の加工食品中の菌種の同定方法である。
【００１７】
本発明の第七は、前記菌が酵母及び／又は乳酸菌であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５又は６に記載の加工食品中の菌種の同定方法である。
【００１８】
本発明の第八は、前記加工食品を粉砕してからＤＮＡを抽出することを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６又は７に記載の加工食品中の菌種の同定方法である。
【００１９】
本発明の第九は、前記加工食品がベーカリー製品であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７又は８に記載の加工食品中の菌種の同定方法である。
【００２０】
本発明の第十は、前記ベーカリー製品が食パン、フランスパン、ライ麦パン、サワーブレッド又は中華まんじゅうであることを特徴とする請求項９に記載の加工食品中の菌種の同定方法である。
【００２１】
本発明の第十一は、前記ベーカリー製品のクラム（内相）部分からＤＮＡを抽出することを特徴とする請求項９又は１０に記載の加工食品中の菌種の同定方法である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の加工食品中の菌種の同定方法によって、加熱処理が施された加工食品中の加熱工程において損傷したり、死滅した菌の種類を同定することが可能となっている。
【００２３】
このため加熱処理を施した加工食品として、パン、ドーナツ、パイ、中華まんじゅう等のベーカリー製品の中で、特に、乳酸菌等の醗酵種を用いて製品の特徴付けがされることのある食パン、フランスパン、ライ麦パン、サワーブレッド及び中華まんじゅうで用いられた菌種を同定することによって、菌の種類による加工食品に与える影響を解析することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明における加熱処理を施した加工食品とは、焼成、蒸成、油揚その他の加熱工程を経て製造された加工食品である。本発明では、特に限定されるものではないが、例えば、パン、ドーナツ、パイ、中華まんじゅう等のベーカリー製品が望ましい。特に、乳酸菌等の醗酵種を用いて製品の特徴付けがされることのある食パン、フランスパン、ライ麦パン、サワーブレッド及び中華まんじゅうであることがより望ましい。
【００２５】
また、本発明において、加熱処理を施した加工食品として、ベーカリー製品を採用する場合には、該ベーカリー製品のクラム（内相）部分を試料として用いることが望ましい。これは、ベーカリー製品のクラム部分は、クラスト（外相）部分と比較して加熱によるＤＮＡの損傷が少ないため、クラム部分からＤＮＡを抽出した方が、より純度の高いＤＮＡ溶液が得られ、より有効に菌種の同定を行うことができるようになるからである。
【００２６】
また、前記加工食品は、粉砕してから試料として用いることが望ましく、本発明における菌は、酵母及び／又は乳酸菌であることが望ましい。
【００２７】
本発明では、まず、加熱処理を施した加工食品から、該加工食品中の菌のＤＮＡを抽出してＤＮＡ溶液を得る。
【００２８】
本発明において、ＤＮＡの抽出は、ＤＮＡ抽出の基本的な手法とされているＣＴＡＢ法、ＳＤＳ−フェノール法、プロテアーゼＫ法、その他を用いることができるし、また、市販化されているＤＮＡ抽出用キットを用いることもできる。
【００２９】
ＣＴＡＢ法を採用する場合には、例えば、以下の通り行うことができる。
【００３０】
まず、試料とする加工食品にＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）抽出液を加え、攪拌して、保温した後、遠心分離してその上清を得る。次に、該上清にＰＣＩ（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール）溶液を加え、振とうして、遠心分離してその上層を得る。
【００３１】
次に、該上層にイソプロピルアルコールを加え、混和した後、遠心分離してその沈澱物を乾燥する。該乾燥させた沈澱物にＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）とリボヌクレアーゼAを加え、保温した後、ＣＴＡＢ抽出液を加え、さらにＣＩＡ（クロロホルム：イソアミルアルコール）を加えて、混和した後、遠心分離してその上層を得る。該上層にイソプロピルアルコールを加えて混和し、遠心分離してその沈澱物を乾燥する。該乾燥させた沈澱物に滅菌水を加え、ＤＮＡを溶解してＤＮＡ溶液を得ることにより行うことができる。 
【００３２】
次に、前記ＤＮＡ溶液中のＤＮＡをＰＣＲ法により増幅させてＰＣＲ産物を得る。
【００３３】
ここで、ＰＣＲ法を適用する前に、ＤＮＡ溶液中のＤＮＡ量を測定してからＰＣＲ法を適用することが望ましい。該ＤＮＡ量の測定は、例えば、分光光度計を用いて、２６０ｎｍにおける吸光度からＤＮＡ量を測定したり、ゲル電気泳動装置を用いて、電気泳動を行い、電気泳動後のゲルを染色して紫外線照射等によりゲルが分布する部分を可視化して該可視化した部分（バンド）と、同時に電気泳動させた予めＤＮＡ量が明らかであるＤＮＡ分子量マーカー（ラダーマーカー）のバンドとの濃淡の比較に基づいて前記可視化したバンド中のＤＮＡ量を算出することにより行なうこともできる。
【００３４】
なお、ここでの「ゲル電気泳動」は、例えば、ＤＮＡを電気泳動させてＤＮＡの長さの相違によりＤＮＡを分離するアガロースゲル電気泳動やポリアクリルアミドゲル電気泳動を採用することができる。
【００３５】
ＤＮＡ溶液中のＤＮＡ量は、好ましくは１０〜１００ｎｇ／μｌの範囲内となるように調製することが望ましい。ＤＮＡ量が少な過ぎる場合には、その後のＰＣＲによるＤＮＡの増幅に悪影響を及ぼすおそれがある。従って、このような場合には、改めて、加工食品からＤＮＡを抽出し直して前記好ましい範囲のＤＮＡ量とすることが望ましく、さらには、試料の量を最初のＤＮＡ抽出に用いた量よりも多くして、改めて、ＤＮＡ抽出をし直して前記好ましい範囲のＤＮＡ量とすることがより望ましい。
【００３６】
また、ＤＮＡ量が前記好ましい範囲よりも多い場合には、ＤＮＡ溶液を適宜蒸留水で希釈して、前記好ましい範囲内のＤＮＡ量とすることが望ましい。
【００３７】
本発明において、ＰＣＲは常法により行うことができる。具体的には、例えば、前記ＤＮＡ溶液、ｄＮＴＰ（デオキシヌクレオチド）、緩衝液、プライマー対、ＤＮＡポリメラーゼ及び水の混合液をチューブに入れて、該チューブをＰＣＲ反応装置に設置して、熱変性、アニーリング及び伸張（重合）反応を繰り返し行う。
【００３８】
ここで、ＰＣＲにより増幅させるＤＮＡの部位は、リボゾーマルＲＮＡ由来のＤＮＡであることが望ましい。例えば、菌が乳酸菌である場合には、１６ｓリボゾーマルＲＮＡ由来のＤＮＡ、また、酵母である場合には、１８ｓリボゾーマルＲＮＡ由来のＤＮＡであることが望ましい。
【００３９】
リボゾーマルＲＮＡ由来のＤＮＡの塩基配列は、菌種毎の変異に富んだ領域（菌種毎に特徴的な配列）を備えているため、菌種に特異なリボゾーマルＲＮＡ由来のＤＮＡの塩基配列をＰＣＲにより増幅させることにより、菌種の同定がより有効に行うことができるようになる。
【００４０】
また、一方で、リボゾーマルＲＮＡ由来のＤＮＡは、保存性の高い領域（菌種にかかわらず共通の配列）をも備えているため、ＰＣＲで用いるプライマーの設定をより有効に行うことができるようになる。
【００４１】
ＰＣＲに用いるプライマーは、ＰＣＲによる増幅の標的とするＤＮＡに応じて適宜該ＤＮＡに特異なプライマーを選択して使用する。具体的には、例えば、乳酸菌１６ｓリボゾーマルＲＮＡ由来のＤＮＡを標的とする場合には、以下に示すプライマー対を用いることが望ましい。
【００４２】
５´―ＡＧＣ  ＡＧＴ  ＡＧＧ  ＧＡＡ  ＴＣＴ  ＴＣＣ  Ａ−３´
５´―ＧＣクランプ―ＡＴＴ  ＴＣＡ  ＣＣＧ  ＣＴＡ  ＣＡＣ  ＡＴＧ−３´
【００４３】
この場合、ＧＣクランプとは、ＧＣに富んだ配列のことであり、例えば、以下に示す配列が使用可能である。
【００４４】
CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG
【００４５】
また、温度プログラムは、用いるプライマー対に応じて適宜設定することができる。具体的には、例えば、上記プライマー対を用いる場合には、９４℃で３分間保持した後、９４℃で１分間（熱変性）、６１℃で１分間（アニーリング）及び７２℃で３分間（伸張（重合）反応）を１サイクルとして、これを３５サイクル行った後、７２℃で７分間保持する温度プログラムを採用することが望ましい。得られたＰＣＲ産物を保管する場合には、４℃で保管することが望ましい。
【００４６】
ＰＣＲ産物は精製することが望ましい。後述するように、複数回のＰＣＲを適用する場合には、ＰＣＲを適用した毎にＰＣＲ産物を精製するのが望ましい。こうすることにより、より有効に菌種の同定を行うことができるようになる。ここでのＰＣＲ産物の精製方法は、特に限定されるものではなく、例えば、エタノール沈澱法等により行なうこともできるし、市販されているＰＣＲ産物精製用キットを用いて精製することも可能であり、望ましい。
【００４７】
次に、前記ＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物中のＤＮＡ量を測定することが望ましい。ここでのＤＮＡ量測定は、前記ＤＮＡ抽出後のＤＮＡ溶液のＤＮＡ量測定と同様にして行うことができる。
【００４８】
本発明では、ＤＮＡが加熱工程により損傷を受けて、ＰＣＲにより増幅させても十分なＤＮＡ量が得られないおそれがあり、その後の変性勾配ゲル電気泳動により、ＤＮＡを検出できなくなるおそれがあるため、前記ＰＣＲ産物中のＤＮＡ量が１２５ｎｇ／μｌ以上となるようにすることが望ましい。ＰＣＲ産物中のＤＮＡ量が１２５ｎｇ／μｌよりも少ない場合には、さらに１回又は複数回ＰＣＲを行って、ＤＮＡ量を１２５ｎｇ／μｌ以上としてから変性勾配ゲル電気泳動することが望ましい。２回目以降のＰＣＲ条件は、最初のそれと同様の条件を採用できるし、条件を変えて行うこともできる。
【００４９】
次に、前記ＰＣＲ産物を変性勾配ゲル電気泳動法に供して、前記ＰＣＲ産物中の塩基配列が相違するＤＮＡ毎にＤＮＡを分離する。変性勾配電気泳動法は、変性剤の濃度勾配や温度勾配を利用して、ＤＮＡの塩基配列の相違によりＤＮＡを分離する手法である。変性勾配ゲル電気泳動法は、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）、温度勾配ゲル電気泳動法（ＴＧＧＥ）等の方法により行うことができる。以下では、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法を用いる場合について説明する。
【００５０】
変性剤濃度勾配ゲル電気泳動は、例えば、変性剤として尿素とホルムアミドの混合物を用い、該変性剤の濃度勾配を３５％から５０％としたポリアクリルアミドゲル上で、前記ＰＣＲ産物を一定温度（例えば、６０℃）で、６０Ｖで１３時間定電圧で電気泳動を行うことが望ましい。これにより、該ゲル上の前記ＰＣＲ産物に含まれる２本鎖ＤＮＡは、該ゲルの変性濃度に応じて部分解離しながら、該ゲル上を泳動する。該解離度は、塩基配列に依存しており、そして、該解離度により該ゲル上での部分解離したＤＮＡの移動度が異なるため、該移動度の相違を検出することにより、塩基配列の異なるＤＮＡ毎にＤＮＡを分離することができる。
【００５１】
具体的には、例えば、前記変性勾配ゲル電気泳動後のゲルを染色して、ＵＶトランスイルミネーター等による紫外線照射等により、泳動したＤＮＡがゲル中に分布する部分（バンド）を可視化した電気泳動像を得る。該染色は、特に限定されるものではないが、電気泳動後のゲルの染色に一般的に用いられる、エチジウムブロマイド、その他により行うことができる。そして、前記電気泳動像は、必要に応じ、ＣＣＤカメラ等で撮影して電気泳動像の写真を得て、さらには、該写真をスキャナでコンピュータに取り込んでもよい。
【００５２】
本発明では、ＤＮＡの塩基配列の解読・決定の前に、好ましくは、前記ゲル中のＤＮＡをＰＣＲにより増幅させることが望ましい。この場合、前記バンドに対応する部分毎にゲルを、例えば、ピペット、ガラス棒、爪楊枝等で採取して、前記採取したゲル毎に、該ゲルをＰＣＲ法に供してもよいし、または、該ゲル毎にＤＮＡを抽出、例えば、該ゲルに蒸留水を加えて攪拌後、遠心分離することにより得られた上清をＤＮＡ溶液として、該ＤＮＡ溶液にＰＣＲ法を適用してもよい。
【００５３】
この場合のＰＣＲの条件は、例えば、上述したＰＣＲの条件と同じ条件を採用することが望ましいが、別の条件を採用することもできる。そして、ここで得られたＰＣＲ産物をそれぞれ精製することが望ましい。ここでの精製は、上述したＰＣＲ産物の精製と同様に行うことができる。即ち、ＰＣＲ産物の精製の常法を用いることができ、市販されているＤＮＡ精製キットを用いてＤＮＡを精製することができる。
【００５４】
次に、前記分離した、好ましくは分離してＰＣＲにより増幅した、より好ましくは分離・抽出してＰＣＲにより増幅した、さらにより好ましくは分離・抽出してＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物を精製したＤＮＡ毎に塩基配列を解読して決定する。
【００５５】
該ＤＮＡの塩基配列の解読及び決定は、常法であるサンガー法やマクサム−ギルバート法等を採用することができ、特に限定されるものではない。
【００５６】
本発明では、簡便性及び感度の良好性からサンガー法を採用することが望ましい。サンガー法のうち、ｄｄＮＴＰ（ジデオキシヌクレオチド）を蛍光標識して行なうダイターミネータ法を採用した場合の一例を示すと、例えば、まず、前記分離した、好ましくは分離してＰＣＲにより増幅した、より好ましくは分離・抽出してＰＣＲにより増幅した、さらにより好ましくは分離・抽出してＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物を精製したＤＮＡと、緩衝液、プライマー（５´―ＡＧＣ  ＡＧＴ  ＡＧＧ  ＧＡＡ  ＴＣＴ  ＴＣＣ  Ａ−３´）、ＤＮＡポリメラーゼ及び水の混合液（マスターミックス）を作成して、４つのチューブに分注する。
【００５７】
次に、蛍光基質を含有するｄｄＮＴＰ（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ）を、前記４つのチューブに、１つのチューブにつき１種類ずつ加え、それぞれのチューブをＰＣＲ反応装置に設置して、例えば、９５℃で２分間保持した後、９５℃で３０秒間（熱変性）、５０℃で３０秒間（アニーリング）及び７２℃で４５秒間伸張（重合）反応を１サイクルとして、これを３０サイクル行った後、７２℃で５分間保持する温度プラグラムによりＰＣＲを行う。得られたＰＣＲ産物中の未反応ｄｄＮＴＰを除去してから、ＰＣＲ産物を９５℃で３分間熱変性させ、氷上に載置する。
【００５８】
ここで得られたＰＣＲ産物は、それぞれｄｄＡＴＰで終結するポリヌクレオチド鎖ＤＮＡ、ｄｄＣＴＰで終結するポリヌクレオチド鎖ＤＮＡ、ｄｄＧＴＰで終結するポリヌクレオチド鎖ＤＮＡ及びｄｄＴＴＰで終結するポリヌクレオチド鎖ＤＮＡのみを含有し、さらに、それぞれのＰＣＲ産物中のポリヌクレオチド鎖は、様々な長さのものが混在する。
【００５９】
次に、シーケンサーにより、それぞれのＰＣＲ産物を電気泳動する。前述したように、前記ＰＣＲ産物中には、様々長さの異なるポリヌクレオチド鎖を有するＤＮＡが存在することから、これらを電気泳動した場合には、ポリヌクレオチド鎖の短いＤＮＡ程遠くまで移動することとなる。そして、電気泳動後のゲルを染色して紫外線等で照射すると、蛍光基質により、ＤＮＡが分布する部分が発色してバンドを形成するので、該バンドを遠くまで移動した順（ポリヌクレオチド鎖の短い順）に塩基を読んでいくことで塩基配列を解読する。
【００６０】
上述のように解読した塩基配列を、例えば、インターネットによる塩基配列のデータベースに基づく相同性検索やコンピュータによる相同性解析等の手法により、菌種を同定する。
【実施例１】
【００６１】
加熱処理が施された加工食品として、市販されているパン・ド・カンパーニュ（フランスパンの一種）４種類を試料（試料１〜４）として用いて、以下に示すように本発明により各試料中の乳酸菌種を同定した。
〔試料〕
【００６２】
パン・ド・カンパーニュのクラム部分を家庭用ミキサーで粉砕して試料とした。
〔ＤＮＡ抽出〕
【００６３】
前記試料から、ＤＮＡ抽出用キット「ＩＳＯＰＬＡＮＴ２」（ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ社製）を用いて、以下に示す通り、ＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ溶液を得た。
【００６４】
２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを終濃度０．５％となるように緩衝液に加えた溶液１ｍｌに、前記試料２００ｍｇを加えて混合し、１４ｋ×ｇ、４℃の条件で１０分間遠心分離して、沈殿物を得る。
【００６５】
２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを終濃度１％となるように「ＳｏｌｕｔｉｏｎＩ」に加えた溶液３００μｌと前記沈殿物とを１〜２秒間混合・攪拌する。
【００６６】
前記混合・攪拌物に１％ＮａＢＨ?溶液を３０μｌ加えて混合し、さらに、「ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩ」を１５０μｌ加えて、１０秒間攪拌した後、５０℃で１０分間静置した。
【００６７】
静置した後の溶液に、「ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩＩ−Ａ」を１００μｌ及び「ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩＩ−Ｂ」を１２０μｌを加えて、１〜２秒間攪拌した後、氷上に１０分間静置し、さらにその後、１４ｋ×ｇ、４℃の条件で１０分間遠心分離して、遠心分離後の水相を得る。
【００６８】
該水相に２倍量エタノールを混合し、６ｋ×ｇ、室温の条件で５分間遠心分離して、沈殿物を得る。該沈殿物に７０％エタノールを混合し、６ｋ×ｇ、室温の条件で１分間遠心分離し、得られた沈殿物を乾燥させた後、ｐＨ８．０のＴＥを加えて、ＤＮＡ溶液を得た。
分光光度計（Beckman社製）を用いて、２６０ｎｍにおける吸光度から該ＤＮＡ溶液中のＤＮＡ量を測定した。いずれのＤＮＡ溶液も、ＤＮＡ量は１０〜１００ｎｇ／μｌの範囲内であった。
〔ＰＣＲ〕
【００６９】
前記ＤＮＡ溶液中の１６ｓリボゾーマルＲＮＡ由来のＤＮＡを増幅の標的として、ＰＣＲ反応装置「サーマルサイクラー」（ＢＩＯ―ＲＡＤ社製）を用いて以下の条件にてＰＣＲ法を適用した。
〔反応液〕
【００７０】
反応液は総量２５μｌとし、５０ｎｇ DNA、DNAポリメラーゼとして「ＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ」(ＴａＫａＲａ社製)０．１μＬを使用し、また、緩衝液及びｄＮＴＰは「ＥｘＴａｑ」に付属の「ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ」と「ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ」を使用した。また、各プライマー溶液は最終濃度が２．５μＭとなるように反応液に加えた。
〔プライマー対〕
【００７１】
５´―ＡＧＣ  ＡＧＴ  ＡＧＧ  ＧＡＡ  ＴＣＴ  ＴＣＣ  Ａ−３´
５´―ＧＣクランプ―ＡＴＴ  ＴＣＡ  ＣＣＧ  ＣＴＡ  ＣＡＣ  ＡＴＧ−３´
【００７２】
〔ＧＣクランプ〕
【００７３】
CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG
〔温度プログラム〕
【００７４】
【表１】
2007222105.tif 000002
【００７５】
〔精製〕
【００７６】
前記ＰＣＲにより得たＰＣＲ産物をＤＮＡ精製キット（「ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」ＱＩＡＧＥＮ社製）により以下のように精製した。
【００７７】
前記ＰＣＲ産物２０μｌに５倍量の「バッファーＰＢ」を加え十分混合した後、１３，０００ｒｐｍで６０秒間遠心分離して、上清を除去する。次いで、「バッファーＰＥ」を７５０μｌ加えて、１３，０００ｒｐｍで６０秒間遠心分離して、上清を除去する。次いで、３０μｌの蒸留水を加えて、６０秒間そのまま保持した後、１３，０００ｒｐｍで６０秒間遠心分離して、精製したＰＣＲ産物を得た。
〔ＰＣＲ〕
【００７８】
前記精製したＰＣＲ産物を前記ＰＣＲと同様の条件にてＰＣＲ（２回目）を適用した。該２回目のＰＣＲ産物を前記ＰＣＲ産物の精製と同様に精製した。該精製した２回目のＰＣＲ産物中のＤＮＡ量を、分光光度計（Beckman社製)を用いて２６０ｎｍにおける吸光度から測定したところ、いずれも１２５ｎｇ／μｌ以上であった。
〔変性勾配ゲル電気泳動〕
【００７９】
前記２回目のＰＣＲ産物を「Ｄコードシステム」（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）により、以下の条件にて、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動に供して、ＤＮＡを塩基配列の相違するＤＮＡ毎に分離した。
【００８０】
８％ポリアクリルアミドゲル
変性剤：７Ｍ尿素、４０％ホルムアミド
変性剤濃度勾配：３５％〜５０％
６０Ｖ、１３時間定電圧
【００８１】
前記変性剤濃度勾配ゲル電気泳動後のゲルを発色用試薬（「ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎn Ｉ」ＴａＫａＲａ社製）で染色した後、トランスイルミネーターで紫外線照射して分離したＤＮＡが分布する部分を発色させて可視化したバンドを有する電気泳動像を得た。
〔ＤＮＡ抽出〕
【００８２】
前記バンド毎に、バンドに対応する部分のゲルをガラス棒により採取して、チューブに入れ、これに、蒸留水を加えて、攪拌・遠心分離して得られた上清をＤＮＡ溶液とした。
〔ＰＣＲ〕
【００８３】
前記ゲルから抽出したＤＮＡ溶液毎に前記ＰＣＲと同様の条件にてＰＣＲ（３回目）を適用した。
〔ＤＮＡ精製〕
【００８４】
前記３回目のＰＣＲ産物をＤＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）により、上記精製と同様の条件にて精製した。
〔ダイターミネータ法〕
【００８５】
前記精製した３回目のＰＣＲ産物から、ダイターミネータ法により、塩基配列を決定した。
〔マスターミックス組成（２７μｌ）〕
【００８６】
精製した３回目のＰＣＲ産物  １μｌ
プライマー（５´―ＡＧＣ  ＡＧＴ  ＡＧＧ  ＧＡＡ  ＴＣＴ  ＴＣＣ  Ａ−３´）３μｌ
バッファー  ２μｌ
ＤＮＡポリメラーゼ（「ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ」Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）  ２μｌ
蒸留水    １９μｌ
【００８７】
４つのチューブを用意し、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔの４種のｄｄＮＴＰ（「ＩＲＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍｉｘ」Ａｌｏｋａ社製）を１つのチューブにつき、１種類を２μｌ入れる。該４つチューブに、前記組成のマスターミックスをそれぞれ６．５μｌずつ入れた。
〔ＰＣＲ〕
【００８８】
前記４つのチューブをＰＣＲ反応装置にセットして、以下の温度プログラムにより、ＰＣＲ法を適用した。
〔温度プログラム〕
【００８９】
【表２】
2007222105.tif 000003
【００９０】
〔未反応ｄｄＮＴＰの除去〕
【００９１】
ここで得られた４種類のＰＣＲ産物をそれぞれ以下の方法にて精製して、未反応のｄｄＮＴＰを除去した。
【００９２】
ＰＣＲ産物（８．５μｌ）に３ＭＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）を１μｌ、リニアポリアクリルアミド（「ビビッドバイオレット」ＣＨＩＭＥＲｘ社製）を１μｌ加え、さらに、１００％エタノールを２０μｌを加え混合して、室温で５分間放置した。
【００９３】
次に、これを１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去した。
【００９４】
さらに、７０％エタノールを２００μｌ加え、混合した後、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、沈澱物を乾燥させた。
【００９５】
乾燥させた沈殿物に蒸留水３μｌを加えて攪拌した後、反応停止液（Ａｌｏｋａ社製）を１．５μｌ添加して、９５℃で３分間熱変性させ、氷上に置いた。
〔電気泳動〕
【００９６】
前記未反応ｄｄＮＴＰ液を除去したＰＣＲ産物をそれぞれ１μｌずつシーケンサー（「ＤＮＡシーケンシングシステム」Ａｌｏｋａ社製）により電気泳動させて、得られた電気泳動像からシーケンサーにより、それぞれ塩基配列を解読して決定した。
〔電気泳動条件〕
【００９７】
電圧  ２０００Ｖ
電流  ２５ｍＡ
電力  ５０ｗ
温度  ４５℃
時間  ９時間
〔相同性検索〕
【００９８】
前記決定した塩基配列に基づき、それぞれＢＬＡＳＴ（「Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ」）により、相同性検索を行い、それぞれの塩基配列から菌種を同定した。
〔結果〕
【００９９】
各試料から検出された乳酸菌１６ｓリボゾーマルＲＮＡ由来のＤＮＡの塩基配列と９９％以上の相同性を有する乳酸菌種を以下の表３に示す。
【表３】
2007222105.tif 000004
【０１００】
パン・ド・カンパーニュは、田舎風のフランスパンとも言われ、一般的に、全粒粉やライ麦等を原料の一部として含み、これらに特有の穀物臭をマスキングするために、乳酸菌等の醗酵種を用いた製パン法が採用されることが多い。前記結果により、同定された菌種は、いずれも乳酸菌で、パン用乳酸菌醗酵種に利用される菌種であることから、試料１乃至４は、いずれも乳酸菌醗酵種を用いて製造されたものと推測された。また、それぞれ試料は異なる風味を有するものであったが、これは上記結果のように乳酸菌種の相違、乳酸菌の組合せの相違による影響が大きいものと推測された。
【実施例２】
【０１０１】
加熱処理が施された加工食品として、市販されているバゲット（フランスパンの一種）６種類を試料（試料５〜１０）として用いて、実施例１と同様にして、各試料中の乳酸菌種を同定した。
【０１０２】
なお、試料８及び試料９については、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法適用前の２回目のＰＣＲ産物中のＤＮＡ量は、１２５ｎｇ／μｌを大きく下回っていた。いずれも２回のＰＣＲによってもＤＮＡ量の増幅が認められなかったことから、さらにＰＣＲ法を適用することなく、他の試料と同様に、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法を適用した。
〔結果〕
【０１０３】
【表４】
2007222105.tif 000005
【０１０４】
試料８及び９からは乳酸菌が検出されなかった。バゲットに関しては、製造者が製品を特徴付けるために、乳酸菌醗酵種を使用する場合と、敢えて使用しない場合とがあると考えられ、試料５、６、７及び１０に関しては前者、試料８及び９に関しては後者の場合であると推測された。
【実施例３】
【０１０５】
〔初種の調製〕
【０１０６】
以下の表５に示す配合からなる原料を混合し、該混合物を２７℃で２７時間醗酵させて初種の種起こしをする。
【０１０７】
【表５】
2007222105.tif 000006
【０１０８】
〔継ぎ種の調製〕
【０１０９】
該初種の一部を元種として、以下の表６に示す配合からなる原料を混合し、該混合物を２７℃で２４時間醗酵させて継ぎ種を調製する。
【０１１０】
【表６】
2007222105.tif 000007
【０１１１】
該継ぎ種の一部を元種として、以下の表７に示す配合からなる原料を混合し、該混合物を２７℃で２４時間、定期的に攪拌しながら、醗酵させて継ぎ種２を調製する。
【０１１２】
【表７】
2007222105.tif 000008
【０１１３】
該継ぎ種２の一部を元種として、以下の表８に示す配合からなる原料を混合し、該混合物を２７℃で１２時間、定期的に攪拌しながら、醗酵させて継ぎ種３を調製して、１０℃で１２時間保存する。
【０１１４】
【表８】
2007222105.tif 000009
【０１１５】
〔醗酵種の調製〕      
該保存後の継ぎ種３の一部を元種として、以下の表９に示す配合からなる原料を混合し、該混合物を２７℃で８時間醗酵させて継ぎ種４を調整して、１０℃で保存する。これを何回も繰り返して醗酵種とする。
【０１１６】
【表９】
2007222105.tif 000010
【０１１７】
〔パンの作成〕
前記醗酵種を使用して、以下の表１０に示す配合と表１１に示す工程によりパリジャン（フランスパンの一種）を製造する。
【０１１８】
【表１０】
2007222105.tif 000011
【０１１９】
【表１１】
2007222105.tif 000012
【０１２０】
前記醗酵種並びに実施例３−１及び実施例３−２のパリジャンを試料として用いて、前記実施例１と同様にして、各試料中の乳酸菌種を同定した。（但し、醗酵種については、粉砕せずに、そのまま試料としてＤＮＡを抽出した。）  
〔結果〕
【０１２１】
前記醗酵種、実施例３−１及び実施例３−２から同定された乳酸菌種は、いずれもL.sanfranciscensisであった。
【０１２２】
加熱工程を経る前の前記醗酵種には、優勢種としてL.sanfranciscensisが存在し、該醗酵種を用いて加熱処理を施して作成されたパンからもL.sanfranciscensisが同定されたことから、本発明により、加熱処理を施した加工食品から加熱処理前に存在した菌種を同定することができることが確認できた。
【手続補正書】
【提出日】平成18年2月27日(2006.2.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
前記混合・攪拌物に１％ＮａＢＨ４溶液を３０μｌ加えて混合し、さらに、「ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩ」を１５０μｌ加えて、１０秒間攪拌した後、５０℃で１０分間静置した。