(57)【要約】【課題】被験物質の可視光突然変異誘発能力の検定方法等を提供する。【解決手段】アミノ酸要求性変異微生物に被験物質を接触させ（第一工程）、第一工程で被験物質を接触させた微生物を、第一工程における接触開始後１２時間以内に可視光の照射下で培養し（第二工程）、第二工程で培養された微生物の全部若しくは一部を炭素源が添加され且つアミノ酸が不足した最少培地で培養し（第三工程）、第三工程で培養された微生物の増殖及び／又はDNA修復遺伝子産物発現の有無若しくはその程度を検査し（第四工程）、第四工程の検査結果によって被験物質の可視光突然変異誘発能力の有無又はその程度を評価し、被験物質の可視光突然変異誘発能力を検定する（第五工程）。該検定方法の陽性対照としての、プロフラビン、ベンゾ(a)ピレン、メチレンブルー、トルイジンブルーの使用等も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（１）〜（５）を有することを特徴とする可視光突然変異誘発能力の検定方法。
（１）アミノ酸要求性変異微生物に被験物質を接触させる第一工程、
（２）第一工程で被験物質を接触させた微生物を、第一工程における接触開始後１２時間以内に可視光の照射下で培養する第二工程、
（３）第二工程で培養された微生物の全部若しくは一部を、炭素源が添加され且つアミノ酸が不足した最少培地で培養する第三工程、
（４）第三工程で培養された微生物の増殖及び／又はDNA修復遺伝子産物発現の有無若しくはその程度を検査する第四工程、
（５）第四工程の検査結果によって被験物質の可視光突然変異誘発能力の有無又はその程度を評価し、被験物質の可視光突然変異誘発能力を検定する第五工程。
【請求項２】
可視光は、複数の波長においてエネルギー極大値を有する分光分布を有する可視光であることを特徴とする請求項１記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法。
【請求項３】
前記第五工程において、前記第四工程の検査結果と、対照のアミノ酸要求性変異微生物における突然変異発生の有無又はその程度の検査結果とを比較し、その差異に基づいて被験物質の可視光突然変異誘発能力の有無又はその程度を評価することを特徴とする請求項１又は２記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法。
【請求項４】
前記対照は、アミノ酸要求性変異微生物に既知の可視光突然変異誘発物質を接触させた陽性対照を含むことを特徴とする請求項３記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法。
【請求項５】
前記可視光突然変異誘発物質は、プロフラビン、ベンゾ(a)ピレン、メチレンブルー又はトルイジンブルーであることを特徴とする請求項４記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法。
【請求項６】
前記第二工程の後、培養された微生物に再び被験物質を接触させ、被験物質接触開始後１２時間以内に該微生物を可視光の照射下で再び培養する工程、を１回以上繰り返した後、第三工程に供することを特徴とする請求項１〜５のいずれかの請求項記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法。
【請求項７】
前記アミノ酸要求性変異微生物は、ヒスチジン要求性のサルモネラ菌又はトリプトファン要求性の大腸菌であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかの請求項記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法。
【請求項８】
可視光の照射強度が１００ルクス以上であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかの請求項記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法。
【請求項９】
第四工程が、さらに付加的に、第三工程で培養された微生物の生存有無若しくはその程度を検査する工程が追加されてなる工程であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかの請求項記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかの請求項記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法のための、陽性対照としてのプロフラビンの使用。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれかの請求項記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法のための、陽性対照としてのベンゾ(a)ピレンの使用。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれかの請求項記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法のための、陽性対照としてのメチレンブルーの使用。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれかの請求項記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法のための、陽性対照としてのトルイジンブルーの使用。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれかの請求項記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法に用いるための陽性対照試薬であって、プロフラビンを含有することを特徴とする陽性対照試薬。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれかの請求項記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法に用いるための陽性対照試薬であって、ベンゾ(a)ピレンを含有することを特徴とする陽性対照試薬。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれかの請求項記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法に用いるための陽性対照試薬であって、メチレンブルーを含有することを特徴とする陽性対照試薬。
【請求項１７】
請求項１〜９のいずれかの請求項記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法に用いるための陽性対照試薬であって、トルイジンブルーを含有することを特徴とする陽性対照試薬。
【請求項１８】
請求項１〜９のいずれかの請求項記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法によって、被験物質の可視光突然変異誘発能力を検定し、所望の可視光突然変異誘発能力を有する物質を選抜することを特徴とする可視光突然変異誘発物質の探索方法。
【請求項１９】
請求項１〜９のいずれかの請求項記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法によって、被験物質の可視光突然変異誘発能力を検定し、所望の可視光突然変異誘発能力を有さない物質を選抜することを特徴とする可視光突然変異非誘発物質の探索方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可視光突然変異誘発能力の検定方法及びその利用等に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の物質等による毒性又は副作用発現の表現型の一つとして、光突然変異誘発性が知られている。光突然変異誘発性は、紫外線突然変異誘発能力を有する物質が細胞に接触した後、太陽光を浴びることによって発現する毒性であり、太陽光の中の紫外線に起因することが知られている。
【０００３】
物質が有する紫外線によって突然変異が誘発される能力（紫外線突然変異誘発能力）を評価する方法としては、例えば、アミノ酸要求性微生物等の微生物を用いるインビトロの方法が知られている。インビトロの方法としては、被験物質をアミノ酸要求性微生物に接触させて紫外線を照射させた後、当該微生物を当該微生物が本来生育できない培地で培養し、当該培養の終了時点における微生物の増殖及び／又はDNA修復遺伝子産物発現の有無若しくはその程度を検査することにより、被験物質の突然変異誘発能力の有無又はその程度を評価する方法（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３参照）が実施されている。
【０００４】
一方、紫外線ではなく可視光によって活性化される物質が見つかってきており、注目を集めている。可視光によって活性化される物質には、紫外線と同様に、可視光によって突然変異が誘発される能力（可視光突然変異誘発能力）を有する物質（可視光突然変異誘発物質）が存在すると考えられ、物質が有する可視光突然変異誘発能力を正しく評価し、検定する方法等が求められている。そのような検定方法等があれば、被験物質の可視光突然変異誘発能力を効率的に検定でき、その検定結果を用いて新規の可視光突然変異誘発物質又は可視光突然変異誘発能力を有さない物質（可視光突然変異非誘発物質）を簡便に探索することが可能となる。
【０００５】
【特許文献１】特開平７−１９０９３６号公報
【特許文献２】特開２０００−１８９１６２号公報
【特許文献３】特開２００３−２７４９９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、物質が有する可視光突然変異誘発能力を正しく評価する方法は確立しておらず、効率的に可視光突然変異誘発能力の検定を行なうことができない。さらに、可視光突然変異誘発能力の検定に陽性対照として使用できる可視光突然変異誘発物質も今までに殆んど知られていない。同様に、所望の新規可視光突然変異誘発物質又は所望の新規可視光突然変異非誘発物質を選抜する方法も確立しておらず、簡便に可視光突然変異誘発物質を探索することができない。
【０００７】
本発明の目的は、物質が有する可視光突然変異誘発能力を検定する方法を提供し、同時に、該検定方法に用いることができる陽性対照物質、及び、該検定方法に用いることができる陽性対照試薬、該検定方法を用いる可視光突然変異誘発物質の探索方法、該検定方法を用いる可視光突然変異非誘発物質の探索方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、物質が有する可視光突然変異誘発能力を効率的に検定する方法を開発すべく、アミノ酸要求性変異微生物を用いた可視光突然変異誘発能力の評価系を構築することを試みた。その結果、被験物質を接触させたアミノ酸要求性変異微生物を、被験物質接触開始後１２時間以内に可視光の照射下で培養し、その突然変異発生を検査することにより、被験物質の可視光突然変異誘発能力を効率的に検定することができることを見出した。さらに、該検定方法に陽性対照として用いることができる可視光突然変異誘発物質を見出した。さらに、該検定方法を用いて所望の可視光突然変異誘発物質又は可視光突然変異非誘発物質を簡便に探索できることを見出し、本発明を完成した。即ち、本発明の要旨は以下の通りである。
【０００９】
請求項１記載の発明（以下、本発明検定方法と記すこともある。）は、下記工程（１）〜（５）を有することを特徴とする可視光突然変異誘発能力の検定方法である。
（１）アミノ酸要求性変異微生物に被験物質を接触させる第一工程、
（２）第一工程で被験物質を接触させた微生物を、第一工程における接触開始後１２時間以内に可視光の照射下で培養する第二工程、
（３）第二工程で培養された微生物の全部若しくは一部を、炭素源が添加され且つアミノ酸が不足した最少培地で培養する第三工程、
（４）第三工程で培養された微生物の増殖及び／又はDNA修復遺伝子産物発現の有無若しくはその程度を検査する第四工程、
（５）第四工程の検査結果によって被験物質の可視光突然変異誘発能力の有無又はその程度を評価し、被験物質の可視光突然変異誘発能力を検定する第五工程。
【００１０】
本発明は可視光突然変異誘発能力の検定方法にかかり、アミノ酸要求性変異微生物に被験物質を接触させ（第一工程）、第一工程で被験物質を接触させた微生物を、第一工程における接触開始後１２時間以内に可視光の照射下で培養し（第二工程）、第二工程で培養された微生物の全部若しくは一部を、炭素源が添加され且つアミノ酸が不足した最少培地で培養し（第三工程）、第三工程で培養された微生物の増殖及び／又はDNA修復遺伝子産物発現の有無若しくはその程度を検査し（第四工程）、第四工程の検査結果によって被験物質の可視光突然変異誘発能力の有無又はその程度を評価し、被験物質の可視光突然変異誘発能力を検定する（第五工程）。本発明の可視光突然変異誘発能力の検定方法によれば、被験物質の可視光突然変異誘発能力の検定を効率的に行なうことができる。
【００１１】
請求項２記載の発明は、可視光は、複数の波長においてエネルギー極大値を有する分光分布を有する可視光であることを特徴とする請求項１記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法である。
【００１２】
本発明の可視光突然変異誘発能力の検定方法では、複数の波長においてエネルギー極大を有する分光分布を有する可視光を用いる。かかる構成により、より正確かつ効率的に被験物質の可視光突然変異誘発能力を検定することができる。
【００１３】
請求項３記載の発明は、前記第五工程において、前記第四工程の検査結果と、対照のアミノ酸要求性変異微生物における突然変異発生の有無又はその程度の検査結果とを比較し、その差異に基づいて被験物質の可視光突然変異誘発能力の有無又はその程度を評価することを特徴とする請求項１又は２記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法である。
【００１４】
本発明の可視光突然変異誘発能力の検定方法では、対照のアミノ酸要求性変異微生物を設定し、被験物質を接触させたアミノ酸要求性変異微生物における突然変異発生の検査結果と、対照のアミノ酸要求性変異微生物における突然変異発生の検査結果とを比較し、その差異に基づいて被験物質の可視光突然変異誘発能力の有無又はその程度を評価する。かかる構成により、より正確かつ効率的に被験物質の可視光突然変異誘発能力を検定することができる。尚、対照としては、例えば、陰性対照及び陽性対照の両方が適用可能である。
【００１５】
請求項４記載の発明は、アミノ酸要求性変異微生物に既知の可視光突然変異誘発物質を接触させた陽性対照を含むことを特徴とする請求項３記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法である。
【００１６】
本発明の可視光突然変異誘発能力の検定方法では、アミノ酸要求性変異微生物に既知の可視光突然変異誘発物質を接触させた陽性対照を用いる。かかる構成により、より正確かつ効率的に被験物質の可視光突然変異誘発能力を検定することができる。さらに、陽性対照の可視光突然変異誘発物質が有する可視光突然変異誘発能力との比較で、被験物質の可視光突然変異誘発能力を定量的に評価し、検定することもできる。
【００１７】
請求項５記載の発明は、前記可視光突然変異誘発物質は、プロフラビン、ベンゾ(a)ピレン、メチレンブルー又はトルイジンブルーであることを特徴とする請求項４記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法である。
【００１８】
プロフラビン（Proflavine、化学名：2,8-diaminoacridine、化学式：C13H11N3、CAS：1811-28-5）はアクリジン骨格を持つ多環芳香族化合物である。また、ベンゾ（ａ）ピレン（Benzo(a)pyrene、化学名：3,4-Benzpyrene、化学式：C20H12）は５個のベンゼン環を持つ多環芳香族炭化水素である。また、メチレンブルー（Methylene Blue、化学式：C16H18ClN3S・3H2O、2C16H18ClN3S・ZnCl2・H2O）はフェノチアジン骨格を持つ多環化合物である。また、トルイジンブルー（Toluidine Blue、化学式：C15H18ClN3S、CAS：92-31-9）はフェノチアジン骨格を持つ多環化合物である。プロフラビンとベンゾ(a)ピレンとメチレンブルーとトルイジンブルーとが可視光突然変異誘発能力を有することは、本発明者らによって初めて明らかにされた。そして、本発明の可視光突然変異誘発能力の検定方法では、プロフラビン、ベンゾ(a)ピレン、メチレンブルー又はトルイジンブルーを、陽性対照のアミノ酸要求性変異微生物に接触させる。かかる構成により、プロフラビン、ベンゾ(a)ピレン、メチレンブルー又はトルイジンブルーが有する可視光突然変異誘発能力との比較で、被験物質の可視光突然変異誘発能力を定量的に評価し、検定することもできる。
【００１９】
請求項６記載の発明は、前記第二工程の後、培養された微生物に再び被験物質を接触させ、被験物質接触開始後１２時間以内に該微生物を可視光の照射下で再び培養する工程、を１回以上繰り返した後、第三工程に供することを特徴とする請求項１〜５のいずれかの請求項記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法である。
【００２０】
本発明の可視光突然変異誘発能力の検定方法においては、第二工程の後（第三工程の前）に、「培養された微生物に再び被験物質を接触させ、被験物質接触開始後１２時間以内に該微生物を可視光の照射下で再び培養する工程」を１回以上繰り返した後、第三工程に供する。即ち、本発明の可視光突然変異誘発能力の検定方法では、被験物質をアミノ酸要求性変異微生物に反復接触させる。かかる構成により、高感度に被験物質の可視光突然変異誘発能力を検定することができる。
【００２１】
請求項７記載の発明は、前記アミノ酸要求性変異微生物は、ヒスチジン要求性のサルモネラ菌又はトリプトファン要求性の大腸菌であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかの請求項記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法である。
【００２２】
かかる構成により、アミノ酸要求性変異微生物の取り扱いが容易となり、より簡便に被験物質の可視光突然変異誘発能力を検定することができる。
【００２３】
請求項８記載の発明は、可視光の照射強度が１００ルクス以上であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかの請求項記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法である。
【００２４】
かかる構成により、より確実に被験物質の可視光突然変異誘発能力を発現させることができ、可視光突然変異誘発能力の検定が容易となる。
【００２５】
請求項９記載の発明は、第四工程が、さらに付加的に、第三工程で培養された微生物の生存有無若しくはその程度を検査する工程が追加されてなる工程であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかの請求項記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法である。
【００２６】
かかる構成により、被験物質が有する、第三工程で培養された微生物に対する毒性の有無若しくはその程度を確認することができ、より高い精度での被験物質の可視光突然変異誘発能力の検定が可能となる。
【００２７】
請求項１０記載の発明は、請求項１〜９のいずれかの請求項記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法のための、陽性対照としてのプロフラビンの使用である。
【００２８】
また請求項１１記載の発明は、請求項１〜９のいずれかの請求項記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法のための、陽性対照としてのベンゾ(a)ピレンの使用である。
【００２９】
また請求項１２記載の発明は、請求項１〜９のいずれかの請求項記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法のための、陽性対照としてのメチレンブルーの使用である。
【００３０】
また請求項１３記載の発明は、請求項１〜９のいずれかの請求項記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法のための、陽性対照としてのトルイジンブルーの使用である。
【００３１】
本発明は、可視光突然変異誘発能力の検定方法のための、陽性対照としてのプロフラビンの使用、ベンゾ(a)ピレンの使用、メチレンブルーの使用又はトルイジンブルーの使用にかかるものである。本発明によれば、プロフラビン、ベンゾ(a)ピレン、メチレンブルー又はトルイジンブルーが有する可視光突然変異誘発能力との比較で、被験物質の可視光突然変異誘発能力を定量的に評価し、検定することもできる。
【００３２】
請求項１４記載の発明は、請求項１〜９のいずれかの請求項記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法に用いるための陽性対照試薬であって、プロフラビンを含有することを特徴とする陽性対照試薬である。
【００３３】
また請求項１５記載の発明は、請求項１〜９のいずれかの請求項記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法に用いるための陽性対照試薬であって、ベンゾ(a)ピレンを含有することを特徴とする陽性対照試薬である。
【００３４】
また請求項１６記載の発明は、請求項１〜９のいずれかの請求項記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法に用いるための陽性対照試薬であって、メチレンブルーを含有することを特徴とする陽性対照試薬である。
【００３５】
また請求項１７記載の発明は、請求項１〜９のいずれかの請求項記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法に用いるための陽性対照試薬であって、トルイジンブルーを含有することを特徴とする陽性対照試薬である。
【００３６】
本発明は陽性対照試薬にかかり、プロフラビン、ベンゾ(a)ピレン、メチレンブルー又はトルイジンブルーを含有することを特徴とし、本発明の可視光突然変異誘発能力の検定方法に陽性対照試薬として使用される。本発明の陽性対照試薬を用いれば、本発明の可視光突然変異誘発能力の検定における陽性対照の実験を簡便に行なうことができる。
【００３７】
請求項１８記載の発明は、請求項１〜９のいずれかの請求項記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法によって、被験物質の可視光突然変異誘発能力を検定し、所望の可視光突然変異誘発能力を有する物質を選抜することを特徴とする可視光突然変異誘発物質の探索方法である。
【００３８】
本発明は可視光突然変異誘発物質の探索方法にかかり、上記された可視光突然変異誘発能力の検定方法によって、被験物質の可視光突然変異誘発能力を検定し、所望の可視光突然変異誘発能力を有する物質を選抜することを特徴とする。かかる構成により、所望の可視光突然変異誘発物質を簡便に探索することができる。
【００３９】
請求項１９記載の発明は、請求項１〜９のいずれかの請求項記載の可視光突然変異誘発能力の検定方法によって、被験物質の可視光突然変異誘発能力を検定し、所望の可視光突然変異誘発能力を有さない物質を選抜することを特徴とする可視光突然変異非誘発物質の探索方法である。
【００４０】
本発明は可視光突然変異非誘発物質の探索方法にかかり、上記された可視光突然変異誘発能力の検定方法によって、被験物質の可視光突然変異誘発能力を検定し、所望の可視光突然変異誘発能力を有さない物質を選抜することを特徴とする。かかる構成により、所望の可視光突然変異非誘発物質を簡便に探索することができる。
【発明の効果】
【００４１】
本発明の可視光突然変異誘発能力の検定方法によれば、被験物質の可視光突然変異誘発能力の検定を効率的に行なうことができる。さらに、本発明では、該検定方法に陽性対照として用いることができる可視光突然変異誘発物質を提供することができる。
【００４２】
本発明の可視光突然変異誘発物質の探索方法によれば、所望の可視光突然変異誘発物質又は可視光突然変異非誘発物質の探索を簡便に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
以下、本発明を実施するための最良の形態について詳細に説明する。
【００４４】
本発明の可視光突然変異誘発能力の検定方法は、下記工程（１）〜（５）、
（１）アミノ酸要求性変異微生物に被験物質を接触させる第一工程、
（２）第一工程で被験物質を接触させたアミノ酸要求性変異微生物を、第一工程における接触開始後１２時間以内に可視光の照射下で培養する第二工程、
（３）第二工程で培養された微生物の全部若しくは一部を、炭素源が添加され且つアミノ酸が不足した最少培地で培養する第三工程、
（４）第三工程で培養された微生物の増殖及び／又はDNA修復遺伝子産物発現の有無若しくはその程度を検査する第四工程、
（５）第四工程の検査結果によって被験物質の可視光突然変異誘発能力の有無又はその程度を評価し、被験物質の可視光突然変異誘発能力を検定する第五工程、
を有する。
【００４５】
本発明の可視光突然変異誘発能力の検定方法に使用される被験物質としては特に限定はなく、全ての化学物質が対象となるが、例えば、化粧品、医薬品、食品等に適用される化学物質が被験物質として使用される。
【００４６】
本発明の可視光突然変異誘発能力の検定方法で使用されるアミノ酸要求性変異微生物は、アミノ酸代謝に関わる遺伝子に突然変異を起こした細菌等の微生物であって、微生物を用いる通常の復帰突然変異試験等でのハンドリングが可能である限り特に制限はない。好ましい実施形態では、培養が容易なヒスチジン要求性のサルモネラ菌（具体的には例えば、TA1535株、TA100株、TA1537株、TA98株、TA102株）又はトリプトファン要求性の大腸菌（具体的には例えば、WP2uvrA株）が用いられる。因みに、これらのアミノ酸要求性変異微生物は、当該分野において通常使用される微生物であり、例えば、独立行政法人製品評価技術基盤機構等の公的機関からも購入するもできる。
尚、上記の復帰突然変異試験の原理は、アミノ酸代謝に関わる遺伝子に突然変異を起こしたアミノ酸要求性変異微生物（AA-）に対して被験物質の処理等を施すことにより、当該微生物が分裂増殖する過程でアミノ酸代謝に関わる遺伝子が正常に戻る、復帰突然変異が当該微生物に生じると、当該復帰突然変異を起こした微生物（AA+）は、アミノ酸が不足した最少培地でも当該アミノ酸を自己生産し増殖を続けること（具体的に例えば、コロニーを形成すること）が可能になる現象を利用するものである。そして試験結果として、被験物質で処理した群の復帰突然変異微生物の数（具体的に例えば、被験物質で処理した群での計測されたコロニー数）が、陰性対照群の数（具体的に例えば、陰性対照群での計測されたコロニー数）に比較して統計学上（具体的には例えば、約２倍程度以上）有意に増加し、さらにまた被験物質の用量依存性が認められる場合には、被験物質は可視光突然変異誘発能力を有すると評価し、被験物質の可視光突然変異誘発能力を検定することができる。
【００４７】
上記第一工程では、アミノ酸要求性変異微生物に被験物質を接触させる。当該接触系は、固体培養系であってもよいし、液体培養系であってもよいが、好ましくは液体培養系を挙げることができる。
【００４８】
アミノ酸要求性変異微生物と被験物質との接触時間として、例えば、５分間以上を、好ましくは２０分間以上１４日間以内、より好ましくは２０分間以上４８時間以内等を挙げることができる。当該接触系における保温温度としては、例えば、１５℃〜４２℃程度を、好ましくは３５℃〜４２℃程度、より好ましくは３５℃〜３７℃程度、特に好ましくは３７℃程度等を挙げることができる。
【００４９】
アミノ酸要求性変異微生物に接触させる被験物質の濃度及び適用量については、特に限定はなく、被験物質の種類、予想される被験物質の可視光突然変異誘発能力、第二工程での培養時間、第二工程での可視光照射時間等によって適宜決定すればよい。例えば、１ｎｇ／プレート〜１０ｍｇ／プレート程度で、好ましくは１００ｍｇ／プレート〜５ｍｇ／プレート程度等を挙げることができる。
【００５０】
上記第一工程における接触系内でのアミノ酸要求性変異微生物の密度としては、例えば、固体培養系の場合には、1×103cell／cm2〜1×108cell／cm2程度で、好ましくは1×105cell／cm2〜1×107cell／cm2程度等を挙げることができ、また液体培養系の場合には、1×103cell／ｍＬ〜1×109cell／ｍＬ程度で、好ましくは1×105cell／ｍＬ〜1×108cell／ｍＬ程度等を挙げることができる。
【００５１】
尚、化学物質の変異原性試験においては、最終的にはヒトのDNAに突然変異を誘発する可能性を予測することが必要であるが、化学物質によっては、生体内で種々の酵素によって代謝を受けた後、変異原性を示すものが多く知られている。そのため、例えば、Ames試験でもラットの肝臓の抽出物を加えて、試験管内で代謝を行なった後に試験に用いられることもある。このことは一般的には「代謝活性化」と呼ばれており、「代謝活性化」を行う試験を「代謝活性化法」といい、「代謝活性化」を行わない試験を「直接法」といい、通常はこれらの２つの処理を同時に行い、これらの結果を総合して変異原性の有無について判定される。本発明においても前記同様に２つの処理を同時に行い、これらの結果を総合して被験物質の可視光突然変異誘発能力の有無又はその程度を評価し、被験物質の可視光突然変異誘発能力を検定してもよい。
【００５２】
上記第一工程での具体的な代表的な例では、被験物質を、水または有機溶媒で溶解又は懸濁して、５段階の濃度の試験液を調製する。調製された試験液に予め培養しておいたアミノ酸要求性変異微生物の菌液と緩衝液とを加え、当該混合物を３７℃で２０分間放置する（直接法）。一方、代謝活性化法では、緩衝液の代わりにラットの肝臓の抽出物に補酵素を加えたもの（Ｓ９混液）を混ぜて、３７℃で２０分間反応させる（代謝活性化法）。  
【００５３】
上記第二工程では、第一工程で被験物質を接触させたアミノ酸要求性変異微生物を、第一工程における接触開始後１２時間以内に可視光の照射下で培養する。そして、被験物質が可視光突然変異誘発能力を有する場合には、本工程でその可視光突然変異誘発能力を発現させることができる。このとき、可視光を吸収する色素を含まない培養液を使用することが好ましい。
当該可視光照射のための培養系は、固体培養系であってもよいし、液体培養系であってもよいが、好ましくは固体培養系を挙げることができる。
【００５４】
好ましい実施形態では、第一工程における接触開始後２時間以内、より好ましくは１時間以内、特に好ましくは実質的に直後（具体的には例えば、３０分間以内）に可視光の照射下で培養する。ちなみに、第一工程における接触開始後から第二工程における可視光の照射開始前までの期間において、第一工程で被験物質を接触させたアミノ酸要求性変異微生物は、例えば、１５℃〜４２℃程度を、好ましくは３５℃〜４２℃程度、より好ましくは３５℃〜３７℃程度、特に好ましくは３７℃程度等の培養温度下でかつ可視光の非照射下で培養しておけばよい。また第一工程における被験物質のアミノ酸要求性変異微生物に対する１２時間以内の接触の後、当該微生物を洗浄・培地交換してから第二工程における可視光の照射に供することによって、細胞外にある被験物質の影響を排除し、第一工程において細胞内にとりこまれた被験物質の作用のみを評価することもできる。
【００５５】
好ましい実施形態では、「可視光」は、複数の波長においてエネルギー極大値を有する分光分布を有する可視光である。このような可視光の代表例としては、家庭用一般蛍光灯が発する光等を挙げることができる。即ち、青色領域（４００ｎｍ付近）、緑色領域（５５０ｎｍ付近）及び桃色領域（６５０ｎｍ付近）においてエネルギー極大値を有する可視光等が挙げられる。
【００５６】
上記第二工程では、被験物質の「可視光照射下での接触時間」を調節することができる。即ち、培養時間及び可視光の照射時間を適宜設定することにより、所望の「可視光照射下での接触時間」を実現することができる。尚、可視光の照射は連続的又は間欠的に行なうことができる。可視光の照射を連続的に行なう場合には、培養時間が「可視光照射下での接触時間」に相当する。例えば、連続的な可視光照射の下で、１時間、１２時間、２４時間又は４８時間培養することにより、１時間、１２時間、２４時間又は４８時間の「可視光照射下での接触時間」を実現することができる。一方、可視光の照射を間欠的に行なう場合には、可視光の照射時間が「可視光照射下での接触時間」に相当する。例えば、２４時間の培養期間中、最初の１２時間を可視光下で培養し、残りの１２時間を可視光を遮断した状態で培養することにより、１２時間の「可視光照射下での接触時間」を実現することができる。
そして、本工程における「可視光照射下での接触時間」は、例えば、５分間以上を採用することができ、好ましくは１時間以上、より好ましくは２時間以上、特に好ましくは２４時間以上である。また、アミノ酸要求性変異微生物の培養温度としては、例えば、１５℃〜４２℃程度を、好ましくは３５℃〜４２℃程度、より好ましくは３５℃〜３７℃程度、特に好ましくは３７℃程度等を挙げることができる。
【００５７】
尚、勿論、本発明検定方法における好ましい実施形態では、上記第一工程（即ち、薬剤との接触）と上記第二工程（即ち、可視光照射下での培養）とが同時に進行しながら実施してもよい。
【００５８】
好ましい実施形態では、上記第二工程の後、培養された微生物に再び被験物質を接触させ、被験物質接触開始後１２時間以内に該微生物を可視光の照射下で再び培養する工程、を１回以上繰り返した後、第三工程に供してもよい。即ち、本実施形態では被験物質を反復接触させる。例えば、アミノ酸要求性変異微生物に被験物質を接触させる場合には、接触時間の進行は、当該微生物を洗浄・培地交換して被験物質を除去することにより止めることができるので、被験物質の「接触」と「洗浄・培地交換」とを繰り返すことにより、被験物質を蓄積させずに反復接触を行なうことができる。具体例を挙げると、第二工程で可視光の照射下で２４時間培養した時点で、微生物を洗浄・培地交換して被験物質を除去する。その後ただちに微生物に被験物質を接触させ、可視光の照射下で再び２４時間培養する（第１サイクル）。可視光の照射下での培養２４時間経過時に、微生物を洗浄・培地交換して被験物質を除去する。その後ただちに微生物に被験物質を接触させ、可視光の照射下で再び２４時間培養する（第２サイクル）。このサイクルを所望の回数だけ繰り返すことにより、反復接触を行なうことができる。一方、「洗浄・培地交換」を行なわずに被験物質を蓄積させながら反復接触させる方法も採用可能である。
【００５９】
好ましい実施形態では、可視光の照射強度が１００ルクス以上であり、より好ましくは５００〜１００００ルクスの範囲であり、特に好ましくは１０００〜６０００ルクスの範囲である。１００ルクス以上の照射強度とすることにより、より確実に被験物質の可視光突然変異誘発能力を発現させることができる。
【００６０】
上記第二工程での具体的な代表的な例では、上記第一工程後、第一工程で得られた混合物を寒天培地上に播種する。アミノ酸要求性変異微生物が播種された寒天培地に可視光を照射しながら３７℃で２時間放置する。
【００６１】
上記第三工程では、第二工程で培養された微生物の全部若しくは一部を、炭素源が添加され且つアミノ酸が不足した最少培地で培養する。
当該培養系は、固体培養系であってもよいし、液体培養系であってもよいが、好ましくは固体培養系を挙げることができる。
上記第三工程では、第二工程で培養された微生物の全部若しくは一部を回収し、回収された微生物を、炭素源が添加され且つアミノ酸が不足した最少培地で培養するような回収工程が存在していてもよい。
【００６２】
上記第三工程での具体的な代表的な例のうち、第二工程で培養された微生物の一部が固体培養系である場合には、上記第二工程後、第二工程で培養された微生物を、例えば、最少グルコース寒天平板培地（組成：グルコース２０ｇ、寒天１５ｇ、Vogel-Bonner培地(×10)１００ｍＬ、蒸留水９００ｍＬ）等の炭素源と極少量のアミノ酸とが添加された最少培地で３７℃で２日間培養する。尚、ここで「極少量のアミノ酸」とは、微生物に生じた突然変異を固定するために数回程度の細胞分裂が必須であり、当該細胞分裂を為すのに必要となる量のアミノ酸を意味する。
【００６３】
上記第四工程では、第三工程で培養された微生物の増殖及び／又はDNA修復遺伝子産物発現の有無若しくはその程度を検査する。
【００６４】
上記第四工程での具体的な代表的な例では、第三工程で培養された微生物の増殖の有無若しくはその程度は、例えば、第三工程での培養系が液体培養系である場合には、第三工程で培養された微生物の増殖の有無若しくはその程度を、肉眼、顕微鏡及び／若しくは実体顕微鏡（40〜60倍）を用いて、発生した復帰突然変異細胞数等をカウントしたり、或いはＡＴＰ測定法でのルミノメーターを用いて、発光試薬に基づく発光量を測定したり、或いはＭＴＴ測定法によって生細胞量を測定すること等により、検査すればよい。また第三工程での培養系が固体培養系である場合には、第三工程で培養された微生物の増殖の有無若しくはその程度を、肉眼、顕微鏡及び／若しくは実体顕微鏡（40〜60倍）を用いて、発生した復帰突然変異コロニーの数をカウントすること等により、検査すればよい。
【００６５】
また第三工程で培養された微生物のDNA修復遺伝子産物発現の有無若しくはその程度は、例えば、ＤＮＡ傷害を検出するようなｕｍｕ試験法等の通常の方法を用いて突然変異発生の有無又はその程度を検査すればよい。
【００６６】
上記第五工程では、第四工程の検査結果によって被験物質の可視光突然変異誘発能力の有無又はその程度を評価し、被験物質の可視光突然変異誘発能力を検定する。被験物質の可視光突然変異誘発能力の有無又はその程度を評価する際、対照を設定せずに第四工程の検査結果の絶対値で評価してもよいし、対照を設定し、その検査結果との比較で評価してもよい。
即ち、上記のように、陰性対照を用いる場合には、被験物質における復帰突然変異発生の有無又はその程度（具体的には例えば、被験物質で処理した群の復帰突然変異微生物の数（具体的に例えば、被験物質で処理した群での計測されたコロニー数）の検査結果と、陰性対照における復帰突然変異発生の有無又はその程度（具体的には例えば、陰性対照群での計測されたコロニー数）の検査結果とを比較する。そして、陰性対照よりも復帰突然変異発生の有無又はその程度が統計学上（具体的には例えば、約２倍程度以上）有意に高い被験物質を選抜すればよい。さらにまた、被験物質の用量依存性が認められる場合には、被験物質は可視光突然変異誘発能力を有するとより精密に評価でき、被験物質の可視光突然変異誘発能力をより正確に検定することが可能となる。
【００６７】
好ましい実施形態では、上記第四工程の検査結果と、対照のアミノ酸要求性変異微生物における突然変異発生の有無又はその程度の検査結果とを比較し、その差異に基づいて被験物質の可視光突然変異誘発能力の有無又はその程度を評価する。ここで、「対照」には陰性対照及び陽性対照の両方が設定可能である。陰性対照の例としては、可視光を照射せずに培養するアミノ酸要求性変異微生物群、照射強度が弱い可視光の照射下で培養するアミノ酸要求性変異微生物群、可視光突然変異誘発能力を有さないことが予め分かっている物質（例えば、溶媒のみ）を接触させるアミノ酸要求性変異微生物群、等が挙げられる。このような陰性対照を用いる場合には、以下のような検定が可能となる。即ち、被験物質における突然変異発生の有無又はその程度の検査結果と、陰性対照における突然変異発生の有無又はその程度の検査結果とを比較する。そして、被験物質における突然変異発生の有無又はその程度の方が高い場合には、当該被験物質は可視光突然変異誘発能力を有すると評価し、検定することもできる。
【００６８】
さらに好ましい実施形態では、前記対照は、アミノ酸要求性変異微生物に既知の可視光突然変異誘発物質を接触させた陽性対照を含む。陽性対照の例としては、可視光突然変異誘発能力を有することが予め分かっている基準物質を接触させて、可視光の照射下で培養するアミノ酸要求性変異微生物群が挙げられる。このような陽性対照を用いる場合には、以下のような検定が可能となる。即ち、被験物質における突然変異発生の有無又はその程度の検査結果と、陽性対照における突然変異発生の有無又はその程度の検査結果とを比較する。そして、被験物質における突然変異発生の有無又はその程度の方が高い場合には、当該被験物質は陽性対照で用いた基準物質よりも高い可視光突然変異誘発能力を有すると評価し、検定することもできる。さらに、当該基準物質の各濃度又は各適用量において同様に評価し、検定することにより、当該被験物質の可視光突然変異誘発能力を定量的に評価し、検定することができる。この際、陽性対照と上記の陰性対照とを併用して設定してもよい。また、陽性対照における突然変異発生の有無又はその程度が陰性対照におけるそれよりも高いことをもって、可視光の照射が正しく行われ、試験が成立したことを示すこともできる。
【００６９】
さらに好ましい実施形態では、プロフラビン、ベンゾ(a)ピレン、メチレンブルー又はトルイジンブルーを基準物質として陽性対照に用いる。プロフラビンとベンゾ(a)ピレンとメチレンブルーとトルイジンブルーとが可視光突然変異誘発能力を有することは、本発明者らによって初めて明らかにされた。
【００７０】
本発明の可視光突然変異誘発能力の検定方法のための、プロフラビンの陽性対照としての使用も、本発明の１つである。また、本発明の可視光突然変異誘発能力の検定方法のための、ベンゾ(a)ピレンの陽性対照としての使用も、本発明の１つである。また、本発明の可視光突然変異誘発能力の検定方法のための、メチレンブルーの陽性対照としての使用も、本発明の１つである。さらに、本発明の可視光突然変異誘発能力の検定方法のための、トルイジンブルーの陽性対照としての使用も、本発明の１つである。
【００７１】
本発明の陽性対照試薬の１つの様相は、本発明の可視光突然変異誘発能力の検定方法に用いるための陽性対照試薬であって、プロフラビンを含有する。また、本発明の陽性対照試薬の他の様相は、本発明の可視光突然変異誘発能力の検定方法に用いるための陽性対照試薬であって、ベンゾ(a)ピレンを含有する。また、本発明の陽性対照試薬の他の様相は、本発明の可視光突然変異誘発能力の検定方法に用いるための陽性対照試薬であって、メチレンブルーを含有する。また、本発明の陽性対照試薬の他の様相は、本発明の可視光突然変異誘発能力の検定方法に用いるための陽性対照試薬であって、トルイジンブルーを含有する。
試薬の形状としては、プロフラビン、ベンゾ(a)ピレン、メチレンブルー、トルイジンブルーをそのまま用いてもよいし、溶媒に溶かして溶液状としてもよい。さらに、適宜の基剤に含有又は分散させた形状でもよい。
【００７２】
本発明の可視光突然変異誘発物質の探索方法は、本発明の可視光突然変異誘発能力の検定方法によって、被験物質の可視光突然変異誘発能力を検定し、所望の可視光突然変異誘発能力を有する物質を選抜するものである。本発明の可視光突然変異誘発物質の探索方法においても、上記した本発明の可視光突然変異誘発能力の検定方法と同様の実施形態をとることができる。
即ち、上記のように、陰性対照を用いる場合には、被験物質における復帰突然変異発生の有無又はその程度（具体的には例えば、被験物質で処理した群の復帰突然変異微生物の数（具体的に例えば、被験物質で処理した群での計測されたコロニー数）の検査結果と、陰性対照における復帰突然変異発生の有無又はその程度（具体的には例えば、陰性対照群での計測されたコロニー数）の検査結果とを比較する。そして、陰性対照よりも復帰突然変異発生の有無又はその程度が統計学上（具体的には例えば、約２倍程度以上）有意に高い被験物質を選抜すればよい。さらにまた、被験物質の用量依存性が認められる場合には、被験物質は可視光突然変異誘発能力を有するとより精密に評価でき、被験物質の可視光突然変異誘発能力を検定することが可能となり、所望の可視光突然変異誘発能力を有する物質をより正確に選抜することができる。
【００７３】
一方、プロフラビン、ベンゾ(a)ピレン、メチレンブルー、トルイジンブルー等の陽性対照が用いられる場合には、被験物質における突然変異発生の有無又はその程度の検査結果と、陽性対照における突然変異発生の有無又はその程度の検査結果とを比較する。そして、陽性対照よりも突然変異発生の有無又はその程度が統計学上（具体的には例えば、約２倍程度以上）有意に高い被験物質を選抜するか、又は、何らかの突然変異を有する微生物の割合が同じであるときの濃度が、陽性対照の濃度よりも低い被験物質を選抜することにより、陽性対照で用いられた基準物質よりも高い可視光突然変異誘発能力を有する物質を選抜することができる。また、陽性対照が用いられる場合には、突然変異発生の有無又はその程度を定量的に評価し、検定することもできる。具体的には、プロフラビン、ベンゾ(a)ピレン、メチレンブルー、トルイジンブルー等の基準物質の各濃度又は各適用量において、被験物質に対して同様に評価し、検定することにより、被験物質の可視光突然変異誘発能力を定量的に評価し、検定することができる、そして、所望の可視光突然変異誘発能力をする物質を選抜する。
【００７４】
本発明の可視光突然変異非誘発物質の探索方法は、本発明の可視光突然変異誘発能力の検定方法によって、被験物質の可視光突然変異誘発能力を検定し、所望の可視光突然変異誘発能力を有さない物質を選抜するものである。本発明の可視光突然変異非誘発物質の探索方法においても、上記した本発明の可視光突然変異誘発能力の検定方法と同様の実施形態をとることができる。
尚、探索の対象となる被験物質は、所望の可視光突然変異誘発能力を有さない物質であれば何でもよく、例えば、低分子化合物、蛋白質、ペプチド等が挙げられる。
【００７５】
本発明の可視光突然変異誘発能力の検定方法に基づくシステム工程を有する装置によれば、被験物質の可視光突然変異誘発能力の検定をより効率的に行なうことができ、所望の可視光突然変異誘発物質又は可視光突然変異非誘発物質をより簡便に探索することもできる。また、本発明の可視光突然変異誘発能力の検定方法によって得られた可視光突然変異性に関する毒性情報を電子情報記録媒体に記録することにより、毒性情報を包含する有用な電子情報記録媒体を作製することができる。
【実施例】
【００７６】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７７】
実施例１  （可視光突然変異誘発能力の検定及び可視光突然変異誘発物質の探索で用いられる可視光の照射時間の設定）
ヒスチジン要求性サルモネラ菌TA100株、TA1535株、TA98株、TA1537株及びTA102株、並びに、トリプトファン要求性大腸菌WP2uvrA株を使用した。アミノ酸要求性、紫外線感受性、膜変異rfa特性、薬剤耐性因子の有無等の特性検査を行い、各々の菌株が特性を保持していることが予め確認されている凍結保存菌液を融解し、得られた菌液０．１ｍＬを３００ｍＬ容三角フラスコに入ったニュートリエントブロス培地６０ｍＬに加え、これを３７℃で１０時間振盪培養（前培養）した。前培養後の培養液中の菌密度は１×１０9個／ｍＬ以上であった。
【００７８】
尚、ニュートリエントブロス培地としては、下記の組成のものが用いられた。
＜ニュートリエントブロス培地の組成（精製水１０００ｍＬ当たり）＞
・ニュートリエントブロス（Bacto Nutrient Broth、Difco Laboratories）  ８ｇ
・塩化ナトリウム(和光純薬工業)  ５ｇ
このようにして、以下の試験に用いられる菌懸濁液を調製した。
【００７９】
次に、滅菌水０．１ｍＬずつが分注された小試験管に、１００ｍＭナトリウム−リン酸緩衝液０．５ｍＬと上記で調製された菌懸濁液０．１ｍＬとを添加した後、これに下記のように調製されたトップアガー溶液２．０ｍＬを加えた。得られた混合物を下記の組成からなる最少グルコース寒天培地（プレート）の上に広げた。
最少グルコース寒天培地としては、バイタルメディアＡＭＴ-Ｓ培地（極東製薬工業）が使用された。
＜プレートの組成（１Ｌ当たり）＞
・硫酸マグネシウム・７水塩  0.2g
・クエン酸・１水塩  2.0g
・リン酸二カリウム・無水塩  10.0g
・リン酸一アンモニウム  1.92g
・水酸化ナトリウム  0.66g
・ブドウ糖  20.0g
・寒天末（大洋寒天、清水食品）  15.0g
【００８０】
＜トップアガー溶液の調製＞
サルモネラ菌用のトップアガー溶液は、６００ｍＬの精製水に対し、寒天末（和光純薬工業）３．６ｇ、塩化ナトリウム３．０ｇの割合で混合し、得られた混合物を高圧蒸気滅菌した後、当該混合物の容量１０に対して１の割合で滅菌済みの０．５ｍＭ Ｌ-ヒスチジン−０．５ｍＭ Ｄ-ビオチン溶液を加えることにより調製された。大腸菌用のトップアガー溶液は、６００ｍＬの精製水に対し、寒天末３．６ｇ、塩化ナトリウム３．０ｇの割合で混合し、得られた混合物を高圧蒸気滅菌した後、当該混合物の容量１０に対して１の割合で滅菌済みの０．５ｍＭ Ｌ-トリプトファン溶液を加えることにより調製された。
【００８１】
このようにして調製されたプレートに含まれた状態のアミノ酸要求性変異微生物を、培養温度３６．０〜３８．０℃の条件で、白色蛍光灯由来の１０００ルクス若しくは６０００ルクスの可視光の照射下で０（非照射）〜４８時間培養した後、引き続き暗所で４８〜０時間培養し、合わせて４８時間培養した。
【００８２】
培養終了後、突然変異誘発により生じたプレート上の復帰変異コロニー数を、自動コロニーカウンター（システムサイエンス）及び肉眼を用いて計数した。尚、自動コロニーカウンターが用いられた場合の計数値には、プレート面積による補正処理がなされた。また同時に菌の生存（生育）阻害の有無若しくはその程度については肉眼及び実体顕微鏡（40〜60倍）を用いて観察した。その結果を表１に示した。
【００８３】
表１から明らかなように、非照射で培養した群に対し、１０００ルクス又は６０００ルクスの可視光の照射下で培養した両群とも、照射時間が長くなるにつれて復帰変異コロニー数が増加した。これにより１０００ルクス及び６０００ルクスの可視光自体にも突然変異誘発能力があることが明らかになった。
【００８４】
このことから、可視光自体が突然変異を誘発させる照射条件下での、可視光突然変異誘発能力の検定を行なえば、陰性対照値が高値となるため検定感度の低下を招くことが判明した。従って、より正確な可視光突然変異誘発能力の検定を実施するには、照度毎及びアミノ酸要求性変異微生物の菌株毎に適切な照射時間を設定することが必要であることが好ましい。
【００８５】
さらに、照度毎及びアミノ酸要求性変異微生物の菌株毎に、復帰変異コロニー数と照射時間との関係を検討すると、非照射で培養した群と同程度の復帰変異コロニー数しか生じさせない照射時間が、菌株毎に設定されることが判明した。具体的には、１０００ルクスの可視光の照射下でTA100株、TA1535株又はTA102株を培養した群における場合には２時間、１０００ルクスの可視光の照射下でTA98株、TA1537株又はWP2uvrA株を培養した群における場合には２４時間、６０００ルクスの可視光の照射下でTA100株、TA1535株、TA102株、TA98株、TA1537株及びWP2uvrA株を培養した群における場合には２時間の照射時間であれば、陰性対照群の復帰変異コロニー数に影響を与えないことが明らかとなった。
【００８６】
これらは、照度毎及びアミノ酸要求性変異微生物の菌株毎に適切な照射時間を設定することが可能であり、本発明者らが初めて見出した知見である。
以上より、被験物質の単回接触、可視光突然変異誘発能力の検定及び可視光突然変異誘発物質の探索において、より正確な可視光突然変異誘発能力の検定を実施するには、可視光の照度及び／又はアミノ酸要求性変異微生物の菌株に応じた適切な可視光の照射時間を設定することが好ましい。
【００８７】
【表１】
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【００８８】
実施例２  （可視光突然変異誘発能力の検定及び可視光突然変異誘発物質の探索：その１）
プロフラビン（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）をジメチルスルホキシドに溶解し、０．７５、０．５及び０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度からなる被験物質溶液を調製した。
【００８９】
ヒスチジン要求性サルモネラ菌TA100株及びTA98株、並びに、トリプトファン要求性大腸菌WP2uvrA株を使用した。アミノ酸要求性、紫外線感受性、膜変異rfa特性、薬剤耐性因子の有無等の特性検査を行い、各々の菌株が特性を保持していることが予め確認されている凍結保存菌液を融解し、得られた菌液０．１ｍＬを３００ｍＬ容三角フラスコに入ったニュートリエントブロス培地６０ｍＬに加え、これを３７℃で１０時間振盪培養（前培養）した。前培養後の培養液中の菌密度は１×１０9個／ｍＬ以上であった。
【００９０】
尚、ニュートリエントブロス培地としては、下記の組成のものが用いられた。
＜ニュートリエントブロス培地の組成（精製水１０００ｍＬ当たり）＞
・ニュートリエントブロス（Bacto Nutrient Broth、Difco Laboratories）  ８ｇ
・塩化ナトリウム(和光純薬工業)  ５ｇ
このようにして、以下の試験に用いられる菌懸濁液を調製した。
【００９１】
次に、上記で調製された被験物質溶液０．１ｍＬずつが分注された小試験管に、１００ｍＭナトリウム−リン酸緩衝液０．５ｍＬと上記で調製された菌懸濁液０．１ｍＬとを添加した後、これに下記のように調製されたトップアガー溶液２．０ｍＬを加えた。得られた混合物を下記の組成からなる最少グルコース寒天培地（プレート）の上に広げた。このようにしてアミノ酸要求性変異微生物に被験物質を接触させた。
最少グルコース寒天培地としては、バイタルメディアＡＭＴ-Ｓ培地（極東製薬工業）が使用された。
＜プレートの組成（１Ｌ当たり）＞
・硫酸マグネシウム・７水塩  0.2g
・クエン酸・１水塩  2.0g
・リン酸二カリウム・無水塩  10.0g
・リン酸一アンモニウム  1.92g
・水酸化ナトリウム  0.66g
・ブドウ糖  20.0g
・寒天末（大洋寒天、清水食品）  15.0g
【００９２】
＜トップアガー溶液の調製＞
TA100株及びTA98株用のトップアガー溶液は、６００ｍＬの精製水に対し、寒天末（和光純薬工業）３．６ｇ、塩化ナトリウム３．０ｇの割合で混合し、得られた混合物を高圧蒸気滅菌した後、当該混合物の容量１０に対して１の割合で滅菌済みの０．５ｍＭ Ｌ-ヒスチジン−０．５ｍＭ Ｄ-ビオチン溶液を加えることにより調製された。WP2uvrA株用のトップアガー溶液は、６００ｍＬの精製水に対し、寒天末３．６ｇ、塩化ナトリウム３．０ｇの割合で混合し、得られた混合物を高圧蒸気滅菌した後、当該混合物の容量１０に対して１の割合で滅菌済みの０．５ｍＭ Ｌ-トリプトファン溶液を加えることにより調製された。
【００９３】
このようにして調製されたプレートに被験物質と接触しながら含まれた状態のアミノ酸要求性変異微生物を、培養温度３６．０〜３８．０℃の条件で、白色蛍光灯由来の１０００ルクスの可視光の照射下で、TA100株の場合には２時間引き続き暗所で４６時間、TA98株及びWP2uvrA株の場合には２４時間引き続き暗所で２４時間、各々合わせて４８時間培養した。一方、陰性対照として、被験物質溶液の代わりに、ジメチルスルホキシドのみを用いて且つ可視光の非照射下で培養した群、及び、ジメチルスルホキシドのみを用いて且つ可視光の照射下で培養した群を設定した。
【００９４】
培養終了後、突然変異誘発により生じたプレート上の復帰変異コロニー数を、自動コロニーカウンター（システムサイエンス）及び肉眼を用いて計数した。尚、自動コロニーカウンターが用いられた場合の計数値には、プレート面積による補正処理がなされた。また同時に菌の生存（生育）阻害の有無若しくはその程度については肉眼及び実体顕微鏡（40〜60倍）を用いて観察した。その結果を表２及び表３に示した。
【００９５】
表２から明らかなように、１０００ルクスの可視光の照射下で培養した群において、プロフラビン処理群の陰性対照群（即ち、溶媒対照群）に対する復帰変異コロニー数の増加率が約３倍以上であり、且つ、その増加には用量依存性が認められた。従って、プロフラビンには可視光突然変異誘発能力が存在することが明らかになった。
【００９６】
さらに表２と表３との対比から明らかなように、照射下で培養した群におけるプロフラビン処理群の陰性対照群（即ち、溶媒対照群）に対する復帰変異コロニー数の増加率が、非照射下で培養した群におけるプロフラビン処理群の陰性対照群（即ち、溶媒対照群）に対する復帰変異コロニー数の増加率よりも約２倍以上高くなることが判明した。従って、可視光照射による可視光突然変異誘発能力の増強が明らかとなった。
【００９７】
これらは、プロフラビンが可視光突然変異誘発能力を有することを示しており、本発明者らが初めて見出した知見である。
以上より、本実施例の手順（単回接触、１０００ルクス照射）によって被験物質の可視光突然変異誘発能力を検定でき、かつ、被験物質の中から可視光突然変異誘発物質を探索できることが示された。
さらに、プロフラビンが、本発明検定方法の陽性対照として使用できることも示された。
【００９８】
【表２】
2007222090.tif 000003
【００９９】
【表３】
2007222090.tif 000004
【０１００】
実施例３  （可視光突然変異誘発能力の検定及び可視光突然変異誘発物質の探索：その２）
プロフラビン（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）をジメチルスルホキシドに溶解し、０．０２、０．０５、０．１、０．２及び０．５／ｍＬの濃度からなる被験物質溶液を調製した。ベンゾ(a)ピレン（和光純薬工業）をジメチルスルホキシドに溶解し、０．１、０．３及び１ｍｇ／ｍＬの濃度からなる被験物質溶液を調製した。メチレンブルー（関東化学）を水に溶解し、０．０１、０．０３及び０．１ｍｇ／ｍＬの濃度からなる被験物質溶液を調製した。トルイジンブルー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｏｒｉｃｈ）を水に溶解し、０．０１２５、０．０２５及び０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度からなる被験物質溶液を調製した。
【０１０１】
ヒスチジン要求性サルモネラ菌TA102株、TA1535株、TA1537株及びTA100株を使用した。アミノ酸要求性、紫外線感受性、膜変異rfa特性、薬剤耐性因子の有無等の特性検査を行い、各々の菌株が特性を保持していることが予め確認されている凍結保存菌液を融解し、得られた菌液０．１ｍＬを３００ｍＬ容三角フラスコに入ったニュートリエントブロス培地６０ｍＬに加え、これを３７℃で１０時間振盪培養（前培養）した。前培養後の培養液中の菌密度は１×１０9個／ｍＬ以上であった。
【０１０２】
尚、ニュートリエントブロス培地としては、下記の組成のものが用いられた。
＜ニュートリエントブロス培地の組成（精製水１０００ｍＬ当たり）＞
・ニュートリエントブロス（Bacto Nutrient Broth、Difco Laboratories）  ８ｇ
・塩化ナトリウム(和光純薬工業)  ５ｇ
このようにして、以下の試験に用いられる菌懸濁液を調製した。
【０１０３】
次に、上記で調製された被験物質溶液０．１ｍＬずつが分注された小試験管に、１００ｍＭナトリウム−リン酸緩衝液０．５ｍＬと上記で調製された菌懸濁液０．１ｍＬとを添加した後、これに下記のように調製されたトップアガー溶液２．０ｍＬを加えた。得られた混合物を下記の組成からなる最少グルコース寒天培地（プレート）の上に広げた。このようにしてアミノ酸要求性変異微生物に被験物質を接触させた。
最少グルコース寒天培地としては、バイタルメディアＡＭＴ-Ｓ培地（極東製薬工業）が使用された。
＜プレートの組成（１Ｌ当たり）＞
・硫酸マグネシウム・７水塩  0.2g
・クエン酸・１水塩  2.0g
・リン酸二カリウム・無水塩  10.0g
・リン酸一アンモニウム  1.92g
・水酸化ナトリウム  0.66g
・ブドウ糖  20.0g
・寒天末（大洋寒天、清水食品）  15.0g
【０１０４】
＜トップアガー溶液の調製＞
TA100株及びTA98株用のトップアガー溶液は、６００ｍＬの精製水に対し、寒天末（和光純薬工業）３．６ｇ、塩化ナトリウム３．０ｇの割合で混合し、得られた混合物を高圧蒸気滅菌した後、当該混合物の容量１０に対して１の割合で滅菌済みの０．５ｍＭ Ｌ-ヒスチジン−０．５ｍＭ Ｄ-ビオチン溶液を加えることにより調製された。
【０１０５】
このようにして調製されたプレートに被験物質と接触しながら含まれた状態のアミノ酸要求性変異微生物を、培養温度３６．０〜３８．０℃の条件で、白色蛍光灯由来の６０００ルクスの可視光の照射下で、いずれの菌株の場合でも、２時間引き続き暗所で４６時間、合わせて４８時間培養した。一方、陰性対照として、被験物質溶液の代わりに、ジメチルスルホキシドのみを用いて且つ可視光の非照射下で培養した群、及び、ジメチルスルホキシドのみ若しくは滅菌水のみを用いて且つ可視光の照射下で培養した群を設定した。
【０１０６】
培養終了後、突然変異誘発により生じたプレート上の復帰変異コロニー数を、自動コロニーカウンター（システムサイエンス）及び肉眼を用いて計数した。尚、自動コロニーカウンターが用いられた場合の計数値には、プレート面積による補正処理がなされた。また同時に菌の生存（生育）阻害の有無若しくはその程度については肉眼及び実体顕微鏡（40〜60倍）を用いて観察した。その結果を表４及び表５に示した。
【０１０７】
表４から明らかなように、６０００ルクスの可視光の照射下で培養した群において、プロフラビン処理群及びベンゾ(a)ピレン処理群の陰性対照群（即ち、溶媒対照群）に対する復帰変異コロニー数の増加率が約２倍以上であり、且つ、その増加には用量依存性が認められた。従って、プロフラビン及びベンゾ(a)ピレンには可視光突然変異誘発能力が存在することが明らかになった。また、メチレンブルー処理群及びトルイジンブルー処理群の陰性対照群（即ち、溶媒対照群）に対する復帰変異コロニー数の増加率が約２倍以上であり、且つ、その増加には用量依存性が認められた。従って、プロフラビン及びベンゾ(a)ピレンには可視光突然変異誘発能力が存在することが明らかになった。
【０１０８】
さらに表４と表５との対比から明らかなように、照射下で培養した群におけるプロフラビン処理群及びベンゾ(a)ピレン処理群の陰性対照群（即ち、溶媒対照群）に対する復帰変異コロニー数の増加率が、非照射下で培養した群におけるプロフラビン処理群及びベンゾ(a)ピレン処理群の陰性対照群（即ち、溶媒対照群）に対する復帰変異コロニー数の増加率よりも約２倍以上高くなることが判明した。従って、可視光照射による可視光突然変異誘発能力の増強が明らかとなった。また、照射下で培養した群におけるメチレンブルー処理群及びトルイジンブルー処理群の陰性対照群（即ち、溶媒対照群）に対する復帰変異コロニー数の増加率が、非照射下で培養した群におけるメチレンブルー処理群及びトルイジンブルー処理群の陰性対照群（即ち、溶媒対照群）に対する復帰変異コロニー数の増加率よりも約２倍程度高くなることが判明した。従って、可視光照射による可視光突然変異誘発能力の増強が明らかとなった。
【０１０９】
これらは、プロフラビン、ベンゾ(a)ピレン、メチレンブルー及びトルイジンブルーが可視光突然変異誘発能力を有することを示しており、本発明者らが初めて見出した知見である。
以上より、本実施例の手順（単回接触、６０００ルクス照射）によって被験物質の可視光突然変異誘発能力を検定でき、かつ、被験物質の中から可視光突然変異誘発物質を探索できることが示された。
さらに、プロフラビン、ベンゾ(a)ピレン、メチレンブルー及びトルイジンブルーが、本発明検定方法の陽性対照として使用できることも示された。
【０１１０】
【表４】
2007222090.tif 000005
【０１１１】
【表５】
2007222090.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明の可視光突然変異誘発能力の検定方法によれば、被験物質の可視光突然変異誘発能力の検定を効率的に行なうことができる。さらに、本発明では、該検定方法に陽性対照として用いることができる可視光突然変異誘発物質を提供することができる。