(57)【要約】      （修正有）【課題】線維症および／または肝硬変を含む肝線維性傷害の検出方法の提供。【解決手段】生体サンプルについて、６３の特定遺伝子、およびそのヒトオーソログから選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の差異的発現を分析することにより、少なくとも１つの遺伝子の差異的発現が肝線維症または肝硬変の存在を示す方法。さらに該６３遺伝子およびそのヒトオーソログによりコードされるタンパク質の差異的発現を分析することによって、肝線維症および／または肝硬変を検出するための核酸プローブまたは抗体を含むキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝線維症および／または肝硬変の検出方法であって、
患者から生体サンプルを得る工程、および
該サンプルについて配列番号１〜配列番号６３およびそのヒトオーソログから選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の差異的発現を分析する工程、
を含み、少なくとも１つの遺伝子の差異的発現が肝線維症および／または肝硬変の存在を示す方法。
【請求項２】
前記ヒトオーソログには、配列番号６４〜配列番号１２０から選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子が含まれる請求項１記載の方法。
【請求項３】
配列番号７〜配列番号２３と配列番号４２〜配列番号６３とそのヒトオーソログとから選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の増加した発現が、肝線維症および／または肝硬変の存在を示す請求項１記載の方法。
【請求項４】
配列番号６８〜配列番号８２および配列番号１００〜配列番号１２０から選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の増加した発現が、肝線維症および／または肝硬変の存在を示す請求項２記載の方法。
【請求項５】
配列番号１〜配列番号６と配列番号２４〜配列番号４１とそのヒトオーソログとから選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の減少した発現が、肝線維症および／または肝硬変の存在を示す請求項１記載の方法。
【請求項６】
配列番号６４〜配列番号６７および配列番号８３〜配列番号９９から選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の減少した発現が、肝線維症および／または肝硬変の存在を示す請求項２記載の方法。
【請求項７】
肝線維症および／または肝硬変の検出方法であって、
患者から生体サンプルを得る工程、および
該サンプルについて配列番号１から配列番号１２０を含む配列由来のタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の差異的発現を分析する工程、
を含み、少なくとも１つの遺伝子の該差異的発現が、肝線維症および／または肝硬変の存在を示す方法。
【請求項８】
前記差異的に発現される遺伝子が、がん、細胞周期および細胞形態学において機能する、配列番号９、配列番号６９、配列番号１２、配列番号７２、配列番号４、配列番号６５、配列番号１７、配列番号７６、配列番号７、配列番号６８、配列番号１９、配列番号７８、配列番号５、配列番号６６、配列番号２０、配列番号７９、配列番号２２、配列番号８１、配列番号２１および配列番号８０を含む配列から選択されるタンパク質をコードする請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記差異的に発現される遺伝子が脂質代謝、低分子生化学、臓器損傷および異常において機能する、配列番号１０、配列番号７０、配列番号３、配列番号６４、配列番号１４、配列番号７３、配列番号１５および配列番号７４を含む配列から選択されるタンパク質をコードする請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記差異的に発現される遺伝子が、血液病、内分泌系の発達と機能、および神経系の発達と機能において機能する配列番号１３を含むタンパク質をコードする請求項７記載の方法。
【請求項１１】
前記差異的に発現される遺伝子が、がん、細胞形態学、皮膚病および病変において機能する、配列番号８、配列番号４４、配列番号１０２、配列番号４５、配列番号１０３、配列番号４８、配列番号１０６、配列番号３１、配列番号９０、配列番号３５、配列番号９３、配列番号５０、配列番号１０８、配列番号５１、配列番号１０９、配列番号４０および配列番号９８を含む配列から選択されるタンパク質をコードする請求項７記載の方法。
【請求項１２】
前記差異的に発現される遺伝子が、脂質代謝、低分子生化学、分子輸送において機能する、配列番号２５、配列番号８４、配列番号４２、配列番号１００、配列番号２７、配列番号８６、配列番号４７、配列番号１０５、配列番号３６、配列番号９４、配列番号５３、配列番号１１１、配列番号３７、配列番号９５、配列番号３８、配列番号９６および配列番号１０７を含む配列から選択されるタンパク質をコードする請求項７記載の方法。
【請求項１３】
前記差異的に発現される遺伝子が、がん、細胞運動、細胞成長および増殖において機能する、配列番号５９、配列番号１１７、配列番号４６、配列番号１０４、配列番号３０、配列番号８９、配列番号５２、配列番号１１０、配列番号５８、配列番号１１６、配列番号５５、配列番号１１３、配列番号３９、配列番号９７、配列番号５６、配列番号１１４、配列番号５７および配列番号１１５を含む配列から選択されるタンパク質をコードする請求項７記載の方法。
【請求項１４】
配列番号７〜配列番号２３と配列番号４２〜配列番号６３とそのヒトオーソログとから選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の差異的発現を減少させる化合物を同定する方法であって、
配列番号７〜配列番号２３と配列番号４２〜配列番号６３とそのヒトオーソログとから選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を発現する細胞を提供する工程、
該細胞をテスト化合物に接触させる工程、ならびに
該少なくとも１つの遺伝子の該差異的発現が該テスト化合物の存在下で減少するか否かを判定する工程
を含み、該減少した差異的発現が、肝線維症および／または肝硬変を食い止めるまたは回復させる徴候である方法。
【請求項１５】
配列番号１〜配列番号６と配列番号２４〜配列番号４１とそのヒトオーソログとから選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の差異的発現を増加させる化合物を同定する方法であって、
配列番号１〜配列番号６と配列番号２４〜配列番号４１とそのヒトオーソログとから選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を発現する細胞を提供する工程、
該細胞をテスト化合物に接触させる工程、ならびに
該少なくとも１つの遺伝子の差異的発現が該テスト化合物の存在下で増加するか否かを判定する工程
を含み、該増加した差異的発現が、肝線維症および／または肝硬変を食い止めるまたは回復させる徴候である方法。
【請求項１６】
肝線維症および／または肝硬変の診断方法であって、
肝線維症および／または肝硬変でない第１の対象から第１の生体サンプルを得る工程、
肝線維症および／または肝硬変に罹患していることがわかっているまたは疑われる第２の対象から第２の生体サンプルを得る工程、ならびに
該第１および第２の生体サンプルにおける配列番号１から配列番号１２０より選択される少なくとも１つのタンパク質の量を測定する工程
を含み、該第１の対象由来の第１の生体サンプルに存在する該タンパク質の量と、該第２の対象由来の第２の生体サンプルに存在する該タンパク質の量との間の差異が、該第２の対象が肝線維症および／または肝硬変に罹患していることを示す方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのタンパク質の量がウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡによって測定される請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのタンパク質が、配列番号１から配列番号６３より選択されるものである請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのタンパク質が、配列番号６４から配列番号１２０より選択されるものである請求項１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本発明は、参照することにより全体として本明細書に明示的に組み込まれる２００６年１月２４日出願の米国仮特許出願第６０／７６１，９５９号に関連し、かつ、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づいて、その利益を主張する。
【０００２】
本明細書に記載するのは、多種のタンパク質の差異的発現（differential expression）に基づく肝線維症および／または肝硬変の検出方法、ならびに線維症および／または肝硬変を診断するためのキットである。
【背景技術】
【０００３】
肝線維症は、肝臓の構造を崩壊させ、肝機能を低下させる総肝コラーゲンおよびその他のマトリックスタンパク質の増加に特徴を有する連続的な疾患スペクトラムを意味する（１、２）。肝臓における線維化の進行は壊死性炎症性（necroinflammatory）変化への応答である。総体的に見て、肝線維化のプロセスはダイナミックな炎症および修復の１つであり、治癒する可能性を有している（３）。線維症は、患者の肝臓における瘢痕形成としてとらえられている。肝臓が不可逆的に損傷および瘢痕化した場合、その状態を肝硬変と呼ぶ。
【０００４】
肝線維症および／または肝硬変は肝細胞癌（ＨＣＣ）の主要危険因子である。例えばＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、肝臓毒、代謝異常およびアルコール依存症など多種の要因が、表現型を共通にする肝線維症および／または肝硬変の両方を引き起こす可能性があり（３〜７）、線維化の末期は肝硬変となる。しかし、どのタイプの遺伝子が関与しているか、あるいはそれらは肝臓の損傷と修復が起こったときにどう作用するのかは明らかではない。さらに、これらの危険因子によって生じる肝硬変は潜行的に進行することが多い。肝硬変末期の患者は、５年生存率が７５％である肝臓移植を受けない限り、１年以内に死亡し得る（３）。
【０００５】
過去の生化学研究によれば、３９個の既知の線維化または肝硬変マーカーがあると報告されているが（３、８、９）、いくつかのマーカーは侵襲的試料採取によって得られるものである。
【０００６】
さらなるマーカーについての研究が、定量的プロテオミクスに加え、さらにトランスクリプトームのマイクロアレイ解析に基づき進められている。マイクロアレイ技術は包括的遺伝子発現解析に広く用いられている。特に、遺伝子発現の大規模マイクロアレイ解析により、研究者たちは、数千の遺伝子の同時に生じる変化を分析し、かつ、有意なパターンを同定できるようになった（１０、１１）。これまで、差異的（differential）プロテオミクス研究において最も広く利用されてきた技術は、２次元ゲル電気泳動（２ＤＥ）と液体クロマトグラフィーベースの同位体コードアフィニティータギング（ＩＣＡＴ）技術であった（１２）。最近になって、ＩＣＡＴ技術の変形、ｉＴＲＡＱ（相対および絶対的定量のための同重体タグ（Isobaric tags））が取り入れられている。ＩＣＡＴおよびｉＴＲＡＱタギングの両方は、オンライン上での多数のマーカーの同定とそれらタンパク質の相対定量を可能とする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、肝線維症および／または肝硬変の検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、差異解析、例えばマイクロアレイｍＲＮＡ発現プロファイリングおよび定量的タンパク質プロファイリングを用い、肝線維症および／または肝硬変の診断と治療に潜在的に価値のある、さらなるユニークかつ識別可能なシグネチャー（signature）を発見するに至った。
【０００９】
本発明は、患者から生体サンプルを得る工程、ならびに該サンプルについて、配列番号１〜配列番号６３およびそのヒトオーソログから選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の差異的発現を分析する工程を含み、少なくとも１つの遺伝子の差異的発現が、肝線維症および／または肝硬変の存在を示す、肝線維症および／または肝硬変を検出する方法を提供する。
【００１０】
また、前記生体サンプルについて上述したヒトオーソログの差異的発現を分析することにより、肝線維症および／または肝硬変を検出する方法をも提供し、該ヒトオーソログには、配列番号６４〜配列番号１２０より選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子が含まれる。
【００１１】
また、配列番号１〜配列番号６３およびそのヒトオーソログから選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の核酸分子にハイブリダイズする１つまたはそれ以上の核酸プローブと、肝線維症および／または肝硬変の検出に使用されることを表示する包装物（packaging）とを含む肝線維症および／または肝硬変を診断するためのキットも提供する。
【００１２】
さらに、１つまたはそれ以上の上述した核酸プローブを含み、前記ヒトオーソログが配列番号６４〜配列番号１２０より選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む、肝線維症を診断するためのキットをも提供する。
【００１３】
本発明はさらに、配列番号１〜配列番号６３およびそのヒトオーソログから選択される配列によってコードされる少なくとも１つのタンパク質に特異的に結合する１つまたはそれ以上の抗体と、肝線維症および／または肝硬変の検出に使用されることを表示する包装物とを含む肝線維症および／または肝硬変を診断するためのキットを提供する。
【００１４】
また、１つまたはそれ以上の上述した抗体を含み、前記ヒトオーソログが配列番号６４〜配列番号１２０より選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む、肝線維症および／または肝硬変の診断に用いるキットをも提供する。
【００１５】
本発明はまた、配列番号７〜配列番号２３と配列番号４２〜配列番号６３とそのヒトオーソログとより選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の差異的発現を減少させる化合物を同定する方法であって、少なくとも１つの上述した遺伝子を発現する細胞を提供する工程、細胞をテスト化合物に接触させる工程、および、少なくとも１つの遺伝子の差異的発現がテスト化合物の存在下で減少するか否かを判定する工程を含み、減少した差異的発現が、肝線維症および／または肝硬変を食い止める（halting）または回復させる（reversing）ことの徴候（indication）である方法をも提供する。
【００１６】
本発明はさらに、配列番号１〜配列番号６と配列番号２４〜配列番号４１とそのヒトオーソログとから選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の差異的発現を増加させる化合物を同定する方法であって、少なくとも１つの上述した遺伝子を発現する細胞を提供する工程、細胞をテスト化合物に接触させる工程、および、少なくとも１つの遺伝子の差異的発現がテスト化合物の存在下で増加するか否かを判定する工程を含み、増加した差異的発現が、肝線維症および／または肝硬変を食い止めるまたは回復させることの徴候である方法を提供する。
【００１７】
本発明のさらなる目的および長所は、以下の記載でも説明されるが、ある程度当該記載から明らかとなる、または本発明を実施することで知ることもできる。かかる本発明の目的および長所は、添付の特許請求の範囲において詳細に示した構成要素および組み合わせを用いることにより実現かつ達成される。
【００１８】
言うまでもなく、前述した概要および後述する詳細な説明はいずれも例示的かつ説明的なものに過ぎず、特許請求の範囲に記載された本発明を限定するものではない。
【００１９】
本明細書の一部であって本明細書を構成する添付の図面は、本発明のいくつかの実施形態を図解し、かつ、記載と共に本発明の原理を説明するのに用いられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
表１は、コントロールラットと比較した６週間にわたるジメチルニトロソアミン（ＤＭＮ）処理ラット血清の生化学分析結果である。
【００２１】
2007252366.tif 000002
【００２２】
表２は、遺伝子発現に有意な変化を示した遺伝子およびそのヒトオーソログのリストである。これら遺伝子はマイクロアレイ解析および定量的プロテオームの結果の組み合わせから選び出したものであって、その線維化との関連が公開文献には未開示のものである。
【００２３】
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【００２４】
表３は、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ（表３Ａ）およびｉＴＲＡＱプロテオーム（表３Ｂ）試験において発現に有意な変化を示したタンパク質の相互作用ネットワーク分析の結果である。本試験においてネットワークで同定され、肝傷害と関連することがまだ報告されていないタンパク質は太字で示した。
【００２５】
2007252366.tif 000009
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【００２６】
定義
本明細書において、「生体サンプル」という語は、対象の細胞、組織または器官から採取した任意の生体由来物質のことをいう。生体サンプルのソースは、診断される対象における特定の症状に応じて変えることができる。生体サンプルは採取後直ちに分析しても、あるいは保存してもよい。保存する場合、そのサンプルを適当な保存バッファーで平衡化して、４℃、−２０℃、−７０℃で保存してもよいし、または低温液体、例えば液体窒素もしくは液体ヘリウム中で保存してもかまわない。１実施形態において、生体サンプルは血液、血清または血漿からなる。別の実施形態において、生体サンプルは生検または組織サンプルからなる。本発明のさらなる実施形態では、生体サンプルは、羊水、乳汁、唾液、脳脊髄液、リンパ液、汗、粘液、滑液、涙液、またはその他の臨床材料もしくはサンプルからなる。
【００２７】
本明細書において、「患者」という語は、限定はされないが、ヒト、霊長類の動物、家畜哺乳動物、実験用哺乳動物などの哺乳動物ことについていう。
【００２８】
本明細書において、「差異的発現」という語は、正常な遺伝子発現と対比しての、ＲＮＡ／ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル、またはＲＮＡ／ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方における遺伝子発現、例えば、ＲＮＡ／ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル、またはＲＮＡ／ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方において増加したまたは減少した遺伝子発現のことをいう。
【００２９】
本明細書において、「遺伝子」および「タンパク質をコードする遺伝子」なる語は、タンパク質のコードまたは転写において機能的役割を有する任意の核酸配列またはその一部のことをいう。かかる遺伝子には、特定の配列番号の機能タンパク質のコーディングに関与するすべての核酸、または特定の配列番号のタンパク質のコーディングもしくは発現に関与する核酸の一部のみが含まれる。核酸配列には、エクソン、イントロン、開始もしくは終止領域、プロモーター配列、その他の調節配列、またはその遺伝子に特異な隣接領域（unique adjacent regions to the gene）内の遺伝的異常のみならず、正常な配列も含まれる。
【００３０】
本明細書において、「ヒトオーソログ」という語は、非ヒト遺伝子およびヒト遺伝子がヒトおよび非ヒトの最も近い共通の祖先における単一の先祖遺伝子から派生し、かつ同一の機能を有しているような対応するヒト遺伝子のことをいう。
【００３１】
本明細書において、「プローブ」という語は、塩基特異的な方式で核酸の相補鎖に結合するオリゴヌクレオチドであるハイブリダイゼーションプローブのことをいう。かかるプローブには、Nielsenら、1991,（１３）に記載されているようなペプチド核酸、ならびにその他の核酸アナログおよび核酸様物質（nucleic acid mimetic）が含まれる。参照として本明細書に組み込まれる米国特許第６，１５６，５０１号明細書を参照されたい。
【００３２】
本明細書において、「核酸」という語は、例えば組織サンプル中に存在する染色体、ミトコンドリア、ウイルスおよび／またはバクテリアの核酸のほか、合成核酸などの任意のＤＮＡまたはＲＮＡ／ｍＲＮＡのことをいう。「核酸」という語には二本鎖核酸分子の鎖のうちの一方または両方が包含され、かつ、インタクトな（intact）核酸分子の任意のフラグメントまたは部位が含まれる。
【００３３】
本明細書において、「包装物」という語は、通常、外部ラベルおよび容器に入った内部材料など包装する材料のことをいい、限定はされないが、キットの使用説明書が含まれる。
【００３４】
本明細書において、「抗体」という語は、免疫グロブリンまたはそのフラグメントもしくは誘導体のことをいい、かつ、生体外あるいは生体内のどちらで産出されたかにかかわらず、抗原結合サイトを含む任意のポリペプチドを包含する。この用語には、限定はされないが、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異的、多特異的、ヒト化、一本鎖、キメラ、合成、組み換え、ハイブリッド、変異およびグラフトされた抗体が含まれる。また「抗体」という語には、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂなどの抗体フラグメント、および抗原結合機能、つまり特定の抗原に結合する能力を保持しているその他の抗体フラグメントも含まれる。一般に、そのようなフラグメントには、抗原結合ドメイン、すなわち、抗体と抗原間の特異的結合に関与するアミノ酸を含む抗体分子の一部が含まれ得る。抗原結合ドメインは通常、抗体軽鎖可変領域（ＶL）および抗体重鎖可変領域（ＶH）を含むが、必ずしも両方を備えていなければならないということはない。例えば、いわゆるＦｄ抗体フラグメントはＶHドメインのみからなるが、インタクトな抗体の一部抗原結合機能を依然保持している。
【００３５】
本明細書において、「特異的に結合」またはこれに同種の語は、２つの分子が、生理条件下で比較的安定である複合体（例えば安定な抗原／抗体複合体）を形成するということを意味する。この用語はまた、例えば、多くの分子において見出されるような、抗原結合ドメインが特定のエピトープに特異であるという場合にも適用される。よって、抗体は多数のタンパク質と、その各々に存在するエピトープに結合する場合に、特異的に結合し得る。特異的な結合は、たいていの場合、低から中程度の容量における高親和性を含む選択的相互作用に特徴を有する。非特異的な結合とは通常は低い選択的相互作用のことであり、かつ、中から高程度の容量における低親和性を備え得る。一般に結合は、その親和性が少なくとも１０5Ｍ-1、１０6Ｍ-1、１０7Ｍ-1または１０8Ｍ-1である場合に、特異的であると見みなされる。必要であれば、結合条件を変えることにより、特異的な結合に実質上影響を及ぼさずして非特異的結合を減らすこともできる。かかる条件は当該分野では既知であり、当業者は普段よく使う技術を用いて適当な条件を選択することができる。該条件は通常、抗体の濃度、溶液のイオン強度、温度、結合時間、無関係な分子の濃度（例えば血清アルブミンまたはミルクカゼインのようなブロッキング剤）などについて定められる。Morganら、“The Matrix Effects on Kinetic Rate Constants of Antibody-Antigen Interactions Reflect Solvent Viscosity,”J. Immunol. Meth. 217:51:60（1998）、およびZhuangら、“Measurement of Association Rate Constant of Antibody -Antigen Interactions in Solution Based on Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,”J. Biosci. Bioeng. 92（4）:330-336（2001）を参照されたい。
【００３６】
本明細書において、「タンパク質」という語は、任意のアミノ酸長の高分子フォームのものをいい、それには、天然または合成アミノ酸ならびにコードされたおよびコードされていないアミノ酸、環状、二環式、デプシ環状（depsicyclic）のペプチド、デプシペプチド、ポリペプチド、またはデプシ二環式（depsibicyclic）ペプチドバックボーン、一本鎖タンパク質さらに多量体タンパク質、そしてさらにインタクトなタンパク質分子の任意のフラグメントまたは部位が含まれる。
【００３７】
本明細書において、「化合物」という語は、任意の比率および任意の構造の１つ以上の化学成分を含んでいる物質のことをいい、限定はされないが、環状、二環式、分岐または直鎖のものが含まれる。化合物は有機または無機の化合物であってよい。また化合物は、１つ以上の化学成分、１つ以上の薬草／植物成分もしくは薬草／植物抽出物、または化学成分と薬草／植物成分もしくは抽出物との両方を含む組成物のことをもいう。
【００３８】
実施形態
慢性肝疾患は、アジアにおいてよく見られる致死となり得る疾患である。通常、肝細胞癌（ＨＣＣ）の発生の前に、線維症末期に生じる肝硬変が先行する。肝硬変と線維症の両方には同一のタンパク質が発現する。線維症および／または肝硬変の診断に役立つ肝線維症のマーカーを同定するために、肝線維症期間中におけるこれらタンパク質の遺伝子発現の変化を分析する。本研究は肝線維症モデルの確立から開始する。Jezequel A.M.ら（１４）に記載されているように、非遺伝毒性の肝臓毒、ジメチルニトロソアミン（ＤＭＮ）を用い、ヒト肝傷害の研究に用いられる既知のモデルである（１５）ラット壊死性炎症（necroinflammatory）および肝線維症を誘発する。６週間にわたる時間経過を通し、組織病理学、生化学および定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析によってラットモデル系における肝線維症の発生が確認された。
【００３９】
マイクロアレイとｉＴＲＡＱ定量的プロテオミクス技術を用いた。ｉＴＲＡＱ技術は、複数のタンパク質の同時同定、そしてもちろんそれらタンパク質の相対定量を可能にする。アプライドバイオシステム社のｉＴＲＡＱ試薬は、４種の同重体試薬のマルチプレックスなセットである。かかる４種の試薬はアミンに特異であり、ペプチドを標識する。標識されたペプチドは質量において同一であり、よって単一のＭＳモードにおいても同一である。これらは、最大４種類の異なるサンプルの同時定量を可能とする強力な診断用の低質量ＭＳ／ＭＳシグネチャーイオンを生じる。定量は、量の多い４種類のプロダクトイオンつまり、４種類の可能性のあるタグのうち１つからそれぞれ切断された１１４、１１５、１１６および１１７ダルトンのプロダクトイオンの差異によって行う。すべてのペプチドにタグが付加されているため、プロテオームのカバレッジが広がり、かつ、１つのタンパク質につき複数のペプチドを解析することにより、それら同定されたものの信頼度が向上する（１６）。ｉＴＲＡＱ技術のマルチサンプル能力は、それぞれ異なる肝臓の状態のタンパク質発現プロファイルを同時に比較する手段を提供する。
【００４０】
本研究に採用したモデルはヒト肝臓研究用モデルに非常に類似しているため、本研究の成果はヒトの臨床に応用され得る。本研究では、強力な非遺伝毒性の肝臓毒であるＤＭＮを用いて肝線維症をシミュレートした（１７、１８）。上述したようにＤＭＮが急激に肝傷害を引き起こすということは実証されており、かつ、ヒト線維症形成の研究に有用であるということも実験的に証明されている（１４、１５、１９）。また、表１を参照されたいが、コントロールラットと対比して、本研究で確立したラット肝線維症モデルにて発現に有意な差異を示した血清マーカーは、ヒト肝線維症の血清マーカー、例えば、アルブミン、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）、総ビリルビン、アルカリホスファターゼ（ＡＫＰ）、酸ホスファターゼ（ＡＣＰ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、コレステロール（ＣＨＯＬ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、グロブリン、プロトロンビン時間（ＰＴ）および血小板（ＰＬＴ）の１３個の血清マーカーと同じであった。したがって、本研究により同定されたこれらマーカーは、ヒトの肝線維症および／または肝硬変を診断するのに利用することができる。
【００４１】
検出方法
本研究では、肝線維性傷害のバイオマーカーとしてほぼ９７個の遺伝子を同定した。ＰｕｂＭｅｄ文献検索の結果により、マイクロアレイおよびプロテオミクスの方法を用い本研究で同定した発現差異のある遺伝子のほぼ３０％が、線維症または肝硬変に関連していることが判明した。残りの７０％はどの文献にも未だ報告されていない。マイクロアレイおよび定量的プロテオミクス技術から得た全情報を組み合わせることによって、それらすべてがＤＭＮ処理群とＤＭＮ未処理群の間で発現に有意な変化を示したがこれまでにいかなる文献にも肝線維症または肝硬変との関連が報告されたことのない６３個の遺伝子を選び出した（表２）。ＤＭＮ処理ラットにおけるこれら６３個の遺伝子は、正常な遺伝子発現と比較した場合に、ＲＮＡ／ｍＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベルで遺伝子発現に差異を有している。いくつかの遺伝子は上方制御され、一方、他の遺伝子は下方制御されている。それら６３個のラット遺伝子を、ＥｎｓＥＭＢＬおよびＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅデータベースにおけるオーソログアサーション（ortholog assertion）に基づいて、そのヒトオーソログ遺伝子に変換した（表２配列番号１〜配列番号１２０）。
【００４２】
よって、本発明は、本明細書に記載する肝傷害に関する差異的遺伝子発現研究をベースにした肝線維性傷害を検出する方法を提供する。当該検出方法において、タンパク質をコードする遺伝子の差異的発現には、全長タンパク質をコードする全長遺伝子、またはタンパク質の一部をコードする遺伝子の一部の差異的発現が含まれる。
【００４３】
したがって、本発明は、患者から生体サンプルを得る工程、ならびに、該サンプルについて、配列番号１から配列番号６３およびそのヒトオーソログより選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の差異的発現を分析する工程を含み、少なくとも１つの遺伝子の差異的発現が肝線維症および／または肝硬変の存在を示す、肝線維症および／または肝硬変を検出する方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、該サンプルについて、配列番号６４から配列番号１２０を含むヒトオーソログより選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の差異的発現を分析することにより、肝線維症および／または肝硬変を検出する方法を提供する。
【００４４】
本研究で同定されたタンパク質のヒトオーソログは、http://www.ensembl.org/Rattus_norvegicus/ 上のＥｎｓｅｍｂｌデータベースと共にhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=homologene上のＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ  ＮＣＢＩデータベースにある遺伝子／タンパク質を利用する検索から導き出すことができる。
【００４５】
本発明の実施において、差異的遺伝子発現は、転写解析または定量的プロテオーム解析、例えばマイクロアレイ、Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ、ＩＣＡＴおよびｉＴＲＡＱ、または当業者に知られたその他任意の適当な方法によって分析することができる。
【００４６】
別の実施形態において、本発明は、配列番号７〜配列番号２３と配列番号４２〜配列番号６３とそのヒトオーソログとから選択されるタンパク質をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の上方制御または増加した発現を分析することに関し、該増加した発現は肝線維症および／または肝硬変の存在を示す。さらに別の実施形態において、本発明は、配列番号６８〜配列番号８２および配列番号１００〜配列番号１２０を含むヒトオーソログから選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の増加した発現を分析することに関する。
【００４７】
また本発明は、別の実施形態において、配列番号１〜配列番号６と配列番号２４〜配列番号４１とそのヒトオーソログとから選択されるタンパク質をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の下方制御または減少した発現を分析することに関し、該減少した発現は、肝線維症および／または肝硬変の存在を示す。さらに別の実施形態において、本発明は、配列番号６４〜配列番号６７および配列番号８３〜配列番号９９を含むヒトオーソログから選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の減少した発現を分析することに関する。
【００４８】
本発明はまた機能グループによる遺伝子のクラスタリングも提供する。よって本発明は、肝線維症および／または肝硬変を検出する方法であって、生体サンプルについて、配列番号９、配列番号６９、配列番号１２、配列番号７２、配列番号４、配列番号６５、配列番号１７、配列番号７６、配列番号７、配列番号６８、配列番号１９、配列番号７８、配列番号５、配列番号６６、配列番号２０、配列番号７９、配列番号２２、配列番号８１、配列番号２１および配列番号８０を含む配列から選択される、がん、細胞周期および細胞形態学において機能するタンパク質と、配列番号１０、配列番号７０、配列番号３、配列番号６４、配列番号１４、配列番号７３、配列番号１５および配列番号７４を含む配列から選択される、脂質代謝、低分子生化学（small molecule biochemistry）、臓器（organismal）損傷および異常（abnormalities）において機能するタンパク質と、血液病、内分泌系の発達と機能、神経系の発達と機能において機能する配列番号１３を含むタンパク質と、配列番号８、配列番号４４、配列番号１０２、配列番号４５、配列番号１０３、配列番号４８、配列番号１０６、配列番号３１、配列番号９０、配列番号３５、配列番号９３、配列番号５０、配列番号１０８、配列番号５１、配列番号１０９、配列番号４０および配列番号９８を含む配列から選択される、がん、細胞形態学、皮膚病および病変において機能するタンパク質と、配列番号２５、配列番号８４、配列番号４２、配列番号１００、配列番号２７、配列番号８６、配列番号４７、配列番号１０５、配列番号３６、配列番号９４、配列番号１６、配列番号７５、配列番号５３、配列番号１１１、配列番号３７、配列番号９５、配列番号３８、配列番号９６および配列番号１０７を含む配列から選択される、脂質代謝、低分子生化学、および分子輸送において機能するタンパク質と、配列番号５９、配列番号１１７、配列番号４６、配列番号１０４、配列番号３０、配列番号８９、配列番号５２、配列番号１１０、配列番号５８、配列番号１１６、配列番号５５、配列番号１１３、配列番号３９、配列番号９７、配列番号５６、配列番号１１４、配列番号５７および配列番号１１５を含む配列から選択される、がん、細胞運動、細胞成長および増殖において機能するタンパク質とをコードする少なくとも１つの遺伝子の差異的発現を分析する工程を含む方法を提供する。
【００４９】
診断キット
本発明はまた、上述した遺伝子および／またはタンパク質をベースとする診断キットをも提供する。１実施形態において、配列番号１〜配列番号６３およびそのヒトオーソログから選択されるタンパク質マーカーをコードする少なくとも１つの遺伝子の核酸分子にハイブリダイズする１つまたはそれ以上の核酸プローブと、肝線維症の検出に使用されることを表示する包装物と、を含む肝線維症および／または肝硬変を診断するためのキットがある。該キットは、これら遺伝子の差異的発現、例えば上方制御または下方制御を検出することができ、該差異的発現は肝線維症および／または肝硬変を示唆する。別の実施形態において、本発明は、配列番号１〜配列番号６３およびそのヒトオーソログから選択されるタンパク質マーカーをコードする少なくとも１つの遺伝子の核酸分子にハイブリダイズする核酸プローブを含む線維症および／または肝硬変を診断するキットをも提供する。該遺伝子の差異的発現は線維症および／または肝硬変を示唆する。別の実施形態において、該診断キットは、肝線維症および／または肝硬変を診断するために、配列番号６４〜配列番号１２０から選択されるタンパク質を含むヒトオーソログをコードする少なくとも１つの遺伝子の核酸分子にハイブリダイズする１つまたはそれ以上の核酸プローブを含む。
【００５０】
前記キットは、当業者に知られた手法によって提供することができる。例として、検出を容易にするため、限定はされないが放射標識または蛍光標識など当業者に知られた標識法を用いてプローブを標識することができる。プローブは、二本鎖核酸分子の一方または両方の鎖であり、かつインタクトな核酸分子の任意のフラグメントまたは部位を含む核酸分子にハイブリダイズすることができる。
【００５１】
核酸ハイブリダイゼーションは、当業者には容易に理解され得るように、塩濃度、温度または有機溶剤、さらに塩基組成、相補鎖の長さ、およびハイブリダイズする核酸間のヌクレオチド塩基のミスマッチ数などのような条件の影響を受ける。ストリンジェントな条件は、当該分野で周知である手法により決定することのできる、核酸の長さと塩基組成によって決まる。一般に、ストリンジェンシーは、例えばハイブリダイゼーションおよび洗浄時の温度と塩濃度を操作することにより変えるまたは制御することができる。例として、高温および低塩濃度の組み合わせはストリンジェンシーを高める。かような条件は当業者には知られており、かつ、例えばStrauss, W.M.“Hybridization With Radioactive Probes,”in Current Protocols in Molecular Biology 6.3.1-6.3.6,（John Wiley & Sons, N.Y. 2000）中に見出すことができる。当該技術に示されている水性および非水条件の両方を用いることができる。
【００５２】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、５０℃またはそれ以上における、０．１×ＳＳＣ（１５ｍＭ塩化ナトリウム／１．５ｍＭクエン酸ナトリウム）中でのハイブリダイゼーションである。もう１つのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、５０％ホルムアミド、１×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％（ｗ／ｖ）硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡ中にて４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中で洗浄するというものである。高度にストリンジェントな条件には、例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは３．０Ｍ  ＮａＣｌおよび０．３Ｍクエン酸ナトリウムを含む）、１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中にて６５℃で約８時間（またはそれ以上）水性（aqueous）ハイブリダイゼーション（例えばホルムアミドを含まない）を行ってから、６５℃にて０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回またはそれ以上洗浄するというものなどが含まれる。
【００５３】
中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、核酸が、これに対して少なくとも約６０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、または約９０％をこえる同一性を有する相補的核酸に結合できるようにする条件である。ハイブリダイゼーションのストレンジェンシーは一般に、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度を低くすること、ハイブリダイゼーションバッファーにホルムアミドを添加すること、または洗浄バッファーの塩濃度を高めること、を単独でまたは組み合わせて行うことにより低減される。中程度のストリンジェント条件には、例えば、６×ＳＳＣ、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中にて６５℃で約８時間（またはそれ以上）水性（aqueous）ハイブリダイゼーション（例えばホルムアミドを含まない）を行ってから、室温下２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳで１回またはそれ以上洗浄するというものが含まれる。中程度のストリンジェンシー下でのその他のハイブリダイゼーションの例には、６×ＳＳＣ、５×デンハート試薬、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、および、任意で１００μｇ／ｍの超音波破砕されたサケまたはニシン精子ＤＮＡ中にて約４２℃でハイブリダイゼーションを行ってから、２×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中にて６５℃で洗浄するというものなどがある。その他の置換および可能性は、当業者には容易に理解され得るはずであり、本発明の範囲内において均等であると見なされる。
【００５４】
また、別の実施形態において、本発明は、配列番号１〜配列番号６３およびそのヒトオーソログから選択される配列でコードされる少なくとも１つのタンパク質に特異的に結合する１つまたはそれ以上の抗体を含み、肝線維症および／または肝硬変の検出に使用されることを表示する包装物をさらに含む肝線維症および／または肝硬変を診断するためのキットを提供する。他の実施形態において、該キットは、配列番号６４〜配列番号１２０から選択される配列でコードされる少なくとも１つのヒトオーソログタンパク質に特異的に結合する１つまたはそれ以上の抗体を含み、肝線維症および／または肝硬変の検出に使用されることを表示する包装物をさらに含む。それら遺伝子の差異的発現は線維症および／または肝硬変の存在を示す。
【００５５】
タンパク質に特異な抗体は、当業者に知られるモノクローナルまたはポリクローナル技術によって得ることができる。抗体は、例としてCurrent Protocols in Immunology（２０）に記載されている手法を用い、35Ｓ、14Ｃ、125Ｉ、3Ｈおよび131Ｉのような放射性同位体で標識してもよい。その放射能はシンチレーション計数によって測定することができる。また抗体は、例えば、希土類キレート（ユーロピウムキレート）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ローダミン、フルオレセイン、ダンシル、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ、ウンベリフェロン、フィコクリテリン（phycocrytherin）、フィコシアニン、もしくはＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＯＲＡＮＧＥ（登録商標）およびＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）のような市販のフルオロフォア、ならびに／または上述のうち任意の１つもしくはそれ以上の誘導体で蛍光標識することもできる。蛍光標識は、例えば上述のCurrent Protocols in Immunologyに開示された手法を用いて抗体にコンジュゲートできる。
【００５６】
差異的タンパク質発現は、ウェスタンブロッティングまたは酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）のような当該分野では知られた、よく用いられている方法により、抗体を利用して分析することができる。ウェスタンブロッティングは、当該分野で知られている標準法にしたがい、目的の生体サンプルから得たタンパク質をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）でサイズと電磁電荷（electromagnetic charge）により分ける電気泳動ステップから開始する。例えば、Sambrookら、3 Molecular Cloning: A Laboratory Manual A8.40-A8.45（2001）（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質電気泳動の各種試薬および方法が記載してある）を参照されたい。次いで、ゲルの内容物を、同じく当該分野において知られる標準法により、ニトロセルロース、ナイロン、ＰＶＤＦ、あるいは固定およびウェスタンブロッティングに適したその他の膜またはフィルターに転写する。転写は、浸漬、セミドライブロッティングまたは当該分野で知られたその他の類似する方法で行うことができる。続いて、ウェスタンブロッティングを含むいくつかのハイブリダイゼーション、洗浄および染色ステップにて目的のタンパク質が損失するのを防ぐため、そのフィルターまたは膜を固定する。固定は、加熱、紫外光による架橋またはその他の当該分野で知られた類似の方法により達成される。例えばSambrookら、3 Molecular Cloning: A Laboratory Manual A8.52-A8.55（免疫ブロッティングと抗原／抗体複合体の検出に用いられる各種試薬および方法が記載してある）を参照されたい。
【００５７】
固定されたフィルターまたは膜上の非特異的抗体結合サイトを、例えば０．５％（ｗ／ｖ）低脂肪粉乳または５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のようなブロッキング剤を含有したバッファー溶液（例えばリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）または同種のもの）でブロックする。ブロッキング後、そのフィルターまたは膜に対して一次抗体インキュベーションを行う。一次抗体インキュベーションが終わったら、そのフィルターまたは膜を洗浄し、発色（chromogenic）、蛍光または化学発光手段で標識された二次抗体を用いて抗体−抗原複合体の存在を検出する。次いで、比色分析（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼおよびＴＭＢを用いる）で、または、オートラジオグラフィー（例えばアルカリホスファターゼ）により抗体−抗原複合体を検出する。比色分析で、または、化学発光により検出する場合、蛍光の色の量はルミノメーター、分光光度計、またはその他類似の計器を用いて測定することができる。オートラジオグラフィーで検出する場合、結合した抗体の量を、デントシメーターまたは類似の計器を用い、感光させたＸ線フィルムにより測定することができる。例えばSambrookら、3 Molecular Cloning: A Laboratory Manual A8.52-A8.55を参照されたい。
【００５８】
ウェスタンブロッティングに用いられる二次抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルのどちらであっても、従来の手法を用いてリガンド（例えばビオチン）または検出可能なマーカー（例えば蛍光基もしくは酵素）で標識することができる。適した標識には、フルオロフォア、発色団、電子密度の高い試薬（例えば銀または金）、酵素、および特異的な結合パートナーを有するリガンドが含まれる。西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのような酵素は主にその活性により検出される。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼは、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を分光光度計による定量が可能な青色色素に変える能力によって検出され得る。その他の適したリガンドおよび／または検出可能なマーカーには、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧおよびプロテインＡ、ならびに当該分野で知られている多数のさらなる受容体−リガンドの組などがある。その他の置換物および可能性のある物は、当業者には容易に理解され得るはずであり、本発明の範囲内において均等であると見なされる。
【００５９】
ＥＬＩＳＡは、標的抗原または複数の標的抗原をマイクロタイタープレートのウェルに吸着させる抗原吸着ステップから始める。例えば、http://www.kpl.com/docs/techdocs/chapters%201%20-%204.pdf（最も最近のアクセスは２００７年１月１２日）において閲覧可能なKierkegaard & Perry Laboratories, Inc., Technical Guide for ELISA 9-13（2003）を参照されたい。最もよく用いられる抗体の吸着バッファーは、５０ｍＭカーボネート・ｐＨ＝９．６、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ・ｐＨ＝８．５、および１０ｍＭ  ＰＢＳ・ｐＨ＝７．２である。これらのバッファーは、多くのタンパク質に対して効果的に作用する。標的抗原がマイクロタイタープレートの表面に容易に吸着しない場合は、その表面にタンパク質が共有結合されるようさまざまな化学的手段によって表面が修飾または誘導体化されたプレートが、広く商業的供給業者から入手できる。時間と温度は、吸着されるタンパク質の量に影響する最も重要な要素である。
【００６０】
マイクロタイタープレートのウェルに目的の抗原または複数の目的の抗原を塗布したら、非特異的抗体の結合をブロックすると共に偽陽性の結果を最小限に抑えるため、ブロッキングバッファーで洗浄する。例えば、上記文献の１３および１４（マイクロタイタープレートのブロッキングに用いる方法と試薬について論じている）を参照されたい。よく使用されるブロッキング剤は、例えばＢＳＡ（通常１％から５％（ｗ／ｖ）の濃度でＰＢＳ、ｐＨ＝７．０中に使用される）、脱脂粉乳、カゼイン（脱脂粉乳の主タンパク質成分）もしくはカゼイネート（水酸化ナトリウムによる部分消化で生じるカゼインのより溶解性の高いもの）、正常血清（通常１％から５％（ｖ／ｖ）の濃度で使用される）、およびゼラチン（通常１％から５％（ｗ／ｖ）の濃度で使用される）のようなタンパク質溶液、または、例えばＴｗｅｅｎ−２０（登録商標）およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）のような非イオン性界面活性剤である。
【００６１】
洗浄剤は、特異的抗原−抗体相互作用の検出能力に影響を与え得る各種反応成分間の低親和性相互作用を阻止する能力により選択する。例えば上記文献の１４および１５（マイクロタイタープレートの洗浄に用いられる方法と試薬について論じている）を参照されたい。洗浄溶液は一般に、抗原とその同種抗体の変性を阻止するため、かつ、酵素活性を保つために、生理的バッファーを含んでいる。例えば中性ｐＨのＰＢＳ、トリス生理食塩水またはイミダゾール緩衝生理食塩などのバッファーが広く用いられている。通常は、特定のアッセイに用いられる検出の方法を基に具体的なバッファーが選ばれる。反応成分間の低親和性、非特異的相互作用を阻止するため、洗浄バッファーにも例えばＴｗｅｅｎ−２０（登録商標）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）またはこれらの同種の非イオン性界面活性剤が０．０１％から０．０５％（ｖ／ｖ）の濃度で含まれていなければならない。
【００６２】
ブロッキングステップ後、マイクロタイタープレートのウェルを洗浄する。続いて、吸着された抗原に対し一次抗体インキュベートを行い、その後再度洗浄する。次に、発色（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼおよびＴＭＢ）、蛍光または化学発光（例えばアルカリホスファターゼ）手段で標識された二次抗体を用い、抗体／抗原複合体を検出する。例えば上記文献の１５〜２１（抗体の調製および使用、さらによく用いられる検出分子について論じている）を参照されたい。色または蛍光の量はルミノメーター、分光光度計またはその他類似の計器によって測定することができる。よく用いられる標準ＥＬＩＳＡプロトコールの変法は多くあり、競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、それからその他にも数多くある。当業者は、検出すべき抗原、分析に用いる抗原および／または一次抗体のソース、ならびにその他任意の関連する実験パラメータに応じ、使用に適したプロトコールを選択することができる。これらおよびその他多くの置換物は、当業者には容易に理解され得るはずであり、本発明の範囲内において均等物であると見なされる。
【００６３】
スクリーニングの方法
また、配列番号７〜配列番号２３と配列番号４２〜配列番号６３とそのヒトオーソログとから選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の差異的発現を減少させ得る化合物を同定する方法についても記載する。該方法はこれら遺伝子のうちの少なくとも１つを発現する細胞を提供し、該細胞をテスト化合物に接触させてテスト化合物の存在下で差異的発現が減少するか否かを判定するもので、該差異的発現は、肝線維症および／または肝硬変を食い止めるまたは回復させることの徴候となる。同方法は、配列番号１〜配列番号６と配列番号２４〜配列番号４１とそのヒトオーソログとから選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の差異的発現を増加させ得る化合物を同定することもできる。
【００６４】
本発明のその他の実施形態は、詳細な説明の検討および本明細書に開示された本発明の実施を通して当業者には明らかとなるであろう。詳細な説明と実施例は単なる例として見なされることを意図しており、本発明の実際の範囲および精神は以下の特許請求の範囲によって示される。
【００６５】
定義されない限り、本明細書で用いるすべての技術および科学用語の意味は、本発明が属する分野の当業者によって普通に解される意味である。さらに当業者は、本明細書に記載されたものと類似するまたは均等な任意の方法および構成要素もまた、本発明を実施または試験するために使用可能であるということを理解できるはずである。また、本明細書において言及したすべての刊行物は参照することにより組み入れられる。
【００６６】
値の範囲に関し、本発明は、文言に明確に指定しない限り、上限と下限、および当該範囲の上限と下限の間の、上限と下限の少なくとも１０分の１の単位までの中間の各値を包含する。さらに本発明は、その他任意の指定された中間の値をも含める。
【００６７】
加えて、本明細書および特許請求の範囲において用いられる、成分、反応条件、純度のパーセント、ポリペプチド、およびポリヌクレオチドの長さなどの量を表すすべての数は、指定しない限り、「約」という語で修飾される。したがって、本明細書および特許請求の範囲において記載する数値パラメータは、本発明の所望の特性に応じて変わり得る近似値である。最低でも、かつ、クレームの範囲についての均等論の適用を制限しようとする試みとしてではなく、各数値パラメータは少なくとも、通常の四捨五入法を適用し、報告される有効桁の数を考慮に入れて理解されなければならない。とはいうものの、特定の実施例で記載されている数値は可能な限り正確に報告している。しかしながら、あらゆる数値は、その実測の標準偏差からの一定の誤差を本来的に含んでいるものである。
【００６８】
文言に明確に示さない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる単数形の「１つの」、「または」および「該」には複数の指示対象が含まれ、かつ複数の指示対象には単数形が含まれる。したがって、例えば「目的のポリペプチド」という言い方には複数のかかるポリペプチドが含まれ、「該薬剤」という言い方には１つまたはそれ以上の薬剤および当業者に知られるその均等物への言及が含まれ、「（複数の）核酸分子」という言い方には１つまたはそれ以上の核酸分子への言及が含まれ、さらに、「（複数の）抗体」という言い方には１つまたはそれ以上の抗体への言及が含まれる、などである。
【００６９】
以下の実施例は本発明をさらに説明するものである。これらは本発明を説明するに過ぎず、かつ、本発明の特定の実施形態の各種の有利な特徴を開示するものである。下記する実施例を本発明を限定するものと解するべきではない。
【００７０】
実施例
本発明の実施には、表示しない限り、当該分野の通常の技術レベル内にある差異的遺伝子発現、差異的プロテオーム発現、および組織病理学の研究に用いられる従来の手法を採用する。
【００７１】
以下の実施例は、動物モデルを使用しての肝線維症における異なるタンパク質発現の研究を説明するものである。
【００７２】
実施例１：ラット肝線維症モデルの確立
ＤＭＮを使用することによりラット肝線維症モデルを作製した。ＤＭＮは肝臓を特異的に標的とする強力な肝臓毒であり、肝線維症を引き起こし得る。ＤＭＮ処理により生じる組織病理学的変化は、線維症の主要タンパク質でありかつ肝硬変の進行にとって重要なコラーゲンの急速な沈着を伴う。ラットにおけるＤＭＮ誘発肝傷害は、例えば門脈圧亢進症腹水など多くの特徴のほか、さらにその他たくさんの組織病理学的および生化学的異常を呈する。これまでの研究により、ラットのＤＭＮ誘発肝傷害はヒト肝線維症および／または肝硬変に生じる諸変化を反映するということ、ならびに、それがヒト肝線維症および／または肝硬変の研究に適した動物モデルであるということが示されている（１５）。ＤＭＮ誘発肝線維症モデルは、Jezequel A.Mら（１４）に記述されているとおりに扱った。実験には体重３００から３５０グラムの雄Ｓｐｒａｇｕｅ-Ｄａｗｌｅｙラット（Slc：SD;日本SLC、静岡、日本）を用いた。６週間にわたる経時実験を通して肝線維症を誘発するため、最初の連続する３週間の間、投与量６．７ｍｇ／Ｋｇ体重で腹腔内注射により生理食塩水中に溶解したＤＭＮ（シグマ、セントルイス、ＭＯ）を１週に３日連続してラットに与えた。注射の時点は図１の逆三角形に示されるとおりである。注射は、投与量を１００ｍｇ／ｋｇ／日とするような別の実験に用いられるよりもはるかに低い投与量とした。より高い投与量はラット肝臓に毒性を生じさせる可能性がある（２１、２２）。
【００７３】
各時点において２から７匹のラットをＤＭＮあるいはコントロールとしてのＤＭＮを含まない等量の生理食塩水のいずれかで処理した（２６匹のＤＭＮ処理ラットおよび２４匹のコントロールラット）。１１、１８、２５、３２、３９および４６日目にそれぞれラットを評価し、犠牲死させた（犠牲死の時点は図１Ａの三角形に示されるとおり）。これら三角形の時点は１から６の週で示した（図１Ａ）。
【００７４】
ラット肝線維症モデルの確立を確認するために、Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ、血清分析および組織病理学的分析を用いた。
【００７５】
ＤＭＮ誘発肝傷害の組織病理学的試験
犠牲死させた後直ちに肝臓組織を摘出し組織病理学的試験に用いた。次いで、固定した肝臓サンプルを処理してパラフィン包埋した。５マイクロメーター（５μｍ）の切片を作り、ヘマトキシリンおよびエオシン染色（壊死性炎症（necroinflammatory）と脂肪変化を評価するため）、ならびにシリウスレッド／ファストグリーンのコラーゲン染色（線維化を評価するため）を行った（２３）。脂肪変化は存在（＋）または非存在（−）で分類した。
【００７６】
ＤＭＮ誘発肝傷害により生じた表現型の変化が図２Ａに示されている。図２Ａにおいて、ＤＭＮ誘発ラット肝線維症の典型的な表現型を、４つの組織病理学的特徴（壊死、炎症、線維化および脂肪変化）を次のようにスコアリングすることによって特徴付けた。壊死のスコアはＮ０からＮ３とし（１番目のパネル）、炎症のスコアはＩ０からＩ３とした。肝線維化度を観察するためのスコアリングシステムは、肝炎活性指数（ＨＡＩ）（２９、３０）のスコアリングシステムに修正を加えたものとした。線維化を４スコア：正常（Ｆ０）、門脈域の線維性拡大（Ｆ１）、線維性架橋形成（Ｆ２）、および高頻度な（frequent）局所結節形成を伴う線維性架橋形成（Ｆ３）に分けた。脂肪変化は存在（＋）または非存在（−）でそれぞれ評価した（最下のパネル）。脂肪変化の画像は倍率２００倍で示しているが、その他は倍率１００倍で示している（図２Ａ）。
【００７７】
図２Ｂは、ラットモデルの組織病理学的スコアの要約を示すものである。結果は時間経過にしたがって並べた。壊死性炎症スコアは壊死と炎症のスコアの和であり、範囲はＡ０からＡ６までである。壊死性炎症変化を３グレード、Ａ０＝なし、Ａ（１〜３）＝軽度およびＡ（４〜６）＝中程度の壊死性炎症、に分けた。線維化の変化は２グレード、Ｆ（０〜１）＝正常から門脈域の線維性拡大、Ｆ（２〜３）＝線維性架橋形成から高頻度の結節形成を伴う線維性架橋形成、に分けた。脂肪変化は存在（＋）または非存在（−）で示した。ラットの数をカウントし、各時点における各組織病理学的レベルの百分率を計算するために用いた。
【００７８】
図２Ｂに示されるように、最初の２週間において、ＤＭＮ処理ラットの７５％がなし（Ｆ０）または低度の線維化（Ｆ１）を示した。３から４週目には、ＤＭＮ処理ラットのほぼ９０％が高度の線維化、つまり線維性架橋形成（Ｆ２）から高頻度の局所結節形成を伴う線維性架橋形成（Ｆ３）を示した。最後の２週間において、ＤＭＮ処理ラットの７８％にＦ２およびＦ３が依然存在していた。脂肪変化は少数の処理ラット（３．７％）にしか存在していなかった。これに対し、コントロール群には異常な病理学的パターンが全くなかった。さらに、ＤＭＮ処理および正常ラットの腎臓または脾臓に明らかな異常は見られなかった（データに示していない）。同時に、ＤＭＮ誘発肝傷害進行の詳細な壊死性炎症および線維化スコアリングシステムは、肝傷害進行の初期（１〜４週目）に急激な壊死と炎症が生じた後、３から６週目に線維化形成が生じるということを示す。ＤＭＮ処理の３週間後、胆管増殖、小葉中心性壊死、線維性架橋および中心静脈周辺の線維化と共に、ラット肝臓にコラーゲン線維の沈着が観察された。
【００７９】
定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ）
確立された動物モデルについてさらなる情報を得るため、Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲを用いて、脂肪細胞の形質転換を促進し得る肝線維症のエフェクター細胞中の最も強力な既知の線維成長誘導因子（２４〜２７）、形質転換成長因子−β１（Ｔｇｆβ１）の遺伝子発現プロファイルを評価した。同じ総ＲＮＡサンプルをマイクロアレイとＱ−ＲＴ−ＰＣＲの両方の解析に用いた。ＲＮＡの調製および解析は、アフィメトリック社（Affymetric）（サンタクララ、ＣＡ、米国）の使用説明書にしたがって行った。各サンプル対しそれぞれ３回繰り返しの方式（triplicate）でＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを行い、平均値を用いて発現レベルを計算した。目的の遺伝子の定量を標準化するため、各サンプルからの１８Ｓ  リボソームＲＮＡ（１８Ｓ  ｒＲＮＡ）を同一のプレート上で目的の遺伝子と共に定量した。Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲの結果は、コントロールラットにおいてよりも、ＤＭＮ処理ラットの肝臓においてより高いレベルのＴｇｆβ１のｍＲＮＡ発現が観察されたことを示した（図１Ｂ）。この変化は、Jezequel A.Mら、（１４）に記載されている観察結果と一致していた。つまり、これらの試験はＤＭＮ誘発ラット肝線維症モデルを支持する。
【００８０】
ＤＭＮ誘発肝線維症ラットモデル実験の血清生化学データの解析
全５０匹の各ラットの血清に対し肝傷害に関する各種生化学検査を行った。死体解剖時に動物から集めた血液サンプルを用い、血清濃度またはアルブミン、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）、総ビリルビン、アルカリホスファターゼ（ＡＫＰ）、酸ホスファターゼ（ＡＣＰ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、コレステロール（ＣＨＯＬ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、グロブリン、プロトロンビン時間（ＰＴ）および血小板（ＰＬＴ）の活性をＨｉｔａｃｈｉ７４７とＡＣＬ３０００臨床化学アナライザーシステム（MYCO、レントン、ワシントン）で測定した。ＤＭＮ処理サンプルとコントロールを比較したところ、１３の血清マーカーが有意な差異を示し、ＤＭＮ処理群が肝傷害に罹患したことが確認された。ＤＭＮ処理群の生化学的データは、多くの血清マーカーに変化があったということ、および、そのタンパク質発現レベルまたは身体的反応がヒト肝傷害の表現型に類似する、ということを示す（１、２）。これらの実験で同定された１３の血清マーカーは、ヒト肝線維症の血清マーカーと同じである。
【００８１】
実施例２：ＤＭＮ誘発肝線維症期間中の遺伝子発現プロファイルの構築
マイクロアレイ解析
マイクロアレイ解析に用いる総ＲＮＡの質をＳｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｐｌｕｓ（モレキュラーデバイス、サニーベール、ＣＡ、米国）を用いて判定すると、Ａ260／Ａ280比は１．９から２．１の範囲であった。ハイブリダイゼーションのプロトコールおよび試薬、洗浄ならびに染色はアフィメトリック社の使用説明書（http://www.affymetrix.com/support/technical/manuals.affx）にしたがった。アフィメトリック社製Ｒａｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ３４Ａ  Ａｒｒａｙへのハイブリダイゼーションの前に、その質を確認するため、標識されたｃＲＮＡをアフィメトリック社製ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｔｅｓｔ３  Ａｒｒａｙにハイブリダイズした。
【００８２】
データ解析とクラスター化アルゴリズム
アフィメトリック社が開発したＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＣＯＳ）を用い、マイクロアレイイメージを、強度情報を含むテキストファイルに変換した。続いて、そのマイクロアレイデータセットをＧｅｎｅｓｐｒｉｎｇ（登録商標）７．２ソフトウェア（シリコンジェネティクス、レッドウッドシティー、ＣＡ、米国）により解析した。
【００８３】
遺伝子発現プロファイリング
６週間にわたる経時実験を通して１２匹のコントロール動物と１２匹のＤＭＮ処理ラットの肝臓組織を選び出し（各時点にそれぞれ２匹のラット）、マイクロアレイ実験を行った。そのマイクロアレイデータを何らかの統計的分析にかける前に、再現性を評価した。すべての遺伝子チップから、遺伝子を、それらがアフィメトリックのパーフェクトマッチ（ＰＭ）／ミスマッチ（ＭＭ）アルゴリズムにより有（present）コールと指定された場合に、有として選び出した（２８）。解析した８７９９のプローブセットのうち、チップ上の２３８５個の転写産物の全体的な発現パターンが有と判定された（Ｐ＜０．０５）。サンプル内（intra-sample）の変動がコントロール群とＤＭＮ処理群間の差異を分かりにくくしていないということを証明するため、そしてさらに、有意であると認められる倍率の変化（fold-change）を決定するため、２４のコントロールのデータセット間で発現プロファイルの比較を行った。マイクロアレイ上に提示された２３８５個の転写産物の発現レベルの散布グラフを互いに比較した。マイクロアレイ解析における実験用チップ間の関係を直線回帰により分析した。全体的に見て統計的な差異はなく、２倍以上離れたのは転写産物の３．２％であった。時間経過の変動を詳しく調べるため、コントロールの第１週から第６週の間におけるこれら２３８５のプローブセットの信頼できる信号を計算した。同様に統計的な差異はなく、２倍以上離れたのは転写産物の４．６％であった。これとは対照的に、コントロール群とＤＭＮ処理群との間には有意な散布（significant scatter）が見出され、２倍以上離れたのは転写産物の２８．７％であった。
【００８４】
偽陽性の可能性を最小限に抑えるための第１のステップとして、マイクロアレイデータから独立した２つのクラスターを作ると共に、発現に差異があるものを同定することにより、すべての転写産物をフィルターにかけた。より詳細に解析するため、第１のクラスターにて前述した２３８５個の転写産物を作成した。コントロール群とＤＭＮ処理群を比較すると、これらのうち２６８個が、１．５倍またはそれ以上高いあるいは低い差で差異的に発現した転写産物であった。「検出フラグ」抽出（２４）を用いる第２の方法では、ＤＭＮ処理群において２３個の転写産物が「有」と判定されたが、コントロール群ではされなかった。反対に、全ＤＭＮ処理群において「無」と判定された転写産物はたった１つだけあり、コントロール群では「有」と判定された。
【００８５】
全体として見ると、ＤＭＮ処理群とコントロール群を比較したとき、上方制御された１３７個と下方制御された１１９個の遺伝子を含む２５６個の遺伝子を表す２９２個の転写産物が発現差のある遺伝子発現パターンを示した。階層的クラスター解析により、図３Ａに示されるような、２４サンプルにわたるこれら２９２個の転写産物の遺伝子発現パターンのデンドログラムを作成した。行（row）は個々の転写産物を示し、カラムは経時サンプルを示す。各セルの色は、その平均発現レベルと対比した、対応する組織の発現レベルを反映している。スケールは、全サンプルについて平均レベルに対して蛍光ラジオ０．２５から４に拡張する。
【００８６】
定量リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ）
マイクロアレイデータの妥当性を検証するため、メタロプロテイナーゼ１の組織阻害因子（Ｔｉｍｐ１）、メタロプロテイナーゼ２の組織阻害因子（Ｔｉｍｐ２）、マトリックスメタロプロテイナーゼ３（Ｍｍｐ３）およびガンマグルタミントランスペプチターゼ（Ｇｇｔｐ）についてＱ−ＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。検証のためにこれらの遺伝子を選んだのは、これら遺伝子が当ＧｅｎｅＣｈｉｐ試験およびこれまでの研究の両方で出現したためである。
【００８７】
Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲにより測定したところ、ＤＭＮ処理サンプルにおいてＴｉｍｐ１（図３Ｂ）、Ｔｉｍｐ２、Ｍｍｐ３、Ｇｇｔｐ（データは示していない）およびＴｇｆβ１（図１Ｂにおいて先に示した）が上昇していた。これら５つの遺伝子のＱ−ＲＴ−ＰＣＲ解析結果は、これら個々のマーカーを分析する過去の報告（８、９）と一致していた。
【００８８】
さらに、マイクロアレイデータとＱ−ＲＴ−ＰＣＲ結果の間で倍率の変化（fold change）に基づく高い一致性が観察された。図３Ｂに示されるように、Ｔｉｍｐ１の発現は、マイクロアレイおよびＱ−ＲＴ−ＰＣＲ実験の両方で、ＤＭＮ処理ラットにおいて２０倍をこえ上昇していた。各サンプルにつきＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを３回繰り返しの方式で実施し、平均値を発現レベルの計算に用いた（四角形で示してある）。Ｔｉｍｐ１転写産物の定量を標準化するために、図右側の対数目盛りに示されるように、各サンプルからの１８Ｓ  ｒＲＮＡを同一のプレート上で目的遺伝子として定量した。２つのＴｉｍｐ１転写産物、ｒｃ_ＡＩ１６９３２７_ａｔとｒｃ_ＡＩ１６９３２７_ｇ_ａｔ（丸と三角形でそれぞれ示す）の発現レベルを、図左側の目盛りに示される全遺伝子発現レベルの平均値との比較で示した。Ｔｉｍｐ１の発現パターンはＱ−ＲＴ−ＰＣＲ結果とＧｅｎｅＣｈｉｐ解析間で高い相関性があり（ピアソンの相関係数はそれぞれ０．７９と０．９２であった）（図３Ｂ）、その遺伝子発現結果が、より詳細な解析を行った場合に信頼できるものであるということを示している。
【００８９】
線維症候補遺伝子
壊死性炎症および線維化がラットモデルにおける肝硬変の進行に重要な役割を果たすということはすでに示されている（８、２３、２４、２９、３０）。組織病理学的な表現型に関与する因子を明らかにするため、図２Ｂにおいて先に述べた壊死性炎症（Ａ０〜Ａ６）および線維化（Ｆ０〜Ｆ３）の組織病理学的スコアを用いた組織病理学的評価により、すべてのラットサンプルを分類した。線維化スコアでは２つのサブグループ（Ｆ（０〜１）とＦ（２〜３））の変動をベースとしたため、線維化関連遺伝子解析にはスチューデントのｔ検定による統計的分析を用いた。０．０５未満のＰ値を統計学的に有意であると見なした。
【００９０】
本発明者らは、スチューデントのｔ検定を用い、コントロールラットに比べ、ＤＭＮ誘発ラットでの発現が１．５倍またはそれ以上高いあるいは低い２５６個の遺伝子を解析した。線維化のＦ（０〜１）からＦ（２〜３）レベルの間にある合計６２個の差異的に発現した遺伝子（３２個は上方制御、３０個は下方制御）を特定し、線維化スコアの２つのサブグループの変動のみを用い、５％の有意水準で評価した。Ｔｉｍｐ１、ＣＤ６３およびアネキシンＡ１（Ａｎｘａ１）を含む３つの遺伝子が肝線維化期間において類似する遺伝子発現パターンを示し、過去の研究と一致していた（３１〜３４）。
【００９１】
Ｔｉｍｐ１は周知の線維症マーカーであり、肝線維症の進行に重要な役割を果たすことが証明されている。肝傷害の後期において、肝星細胞（ＨＳＣ）は、正常な肝臓マトリクスを分解する能力を有するマトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の組み合わせを発現し、同時に肝線維化中に蓄積する線維状コラーゲンの分解を阻害する。Ｔｉｍｐ１の発現の増加は、間質コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１／ＭＭＰ−１３）による線維状肝臓コラーゲン分解のより広範な阻害をもたらす（３５）。図３Ｂに示されるように、Ｔｉｍｐ１の発現はマイクロアレイ中のＤＭＮ処理ラットにおいて２０倍をこえて上昇する。
【００９２】
先に観察された線維症遺伝子シグネチャーの１つである膜貫通タンパク質、ＣＤ６３もまた、ＤＭＮ処理後に上方制御されていた。慢性障害の後、ＨＳＣは活性化する、または筋線維芽細胞様細胞に分化し、収縮性、炎症性および線維形成性を獲得する。活性化したＨＳＣは、組織修復の部位に移動して蓄積し、線維化進行中に大量の細胞外マトリクスタンパク質を分泌する。活性化したＨＳＣは、肝臓損傷時における主要なコラーゲン産生細胞（コラーゲンは細胞外マトリクスタンパク質である）および肝線維症の開始物質であることが確認されている（７）。ＣＤ６３の阻害が、損傷を受けた肝臓の新規な診断マーカーとなり得ることはすでに実証されている。
【００９３】
アルコール性肝臓疾患（ＡＬＤ）研究において、アネクシンＡ１（Ａｎｘａ１）は肝損傷後に高度に発現する（３４）。アルコールに起因する肝傷害は炎症を経て生じる。ＡＬＤの進行には、継続的な肝損傷、線維化、および肝再生不全が含まれる。Ａｎｘａ１が線維症の進行に関与し得ることはすでに示唆がされている。
【００９４】
上述した３つの遺伝子について本研究が過去の研究と一致するという事実は、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ解析が、発生機序が未知である肝傷害と修復時の分子事象をモニターするための強力なアプローチであるということを示す。また、本研究において同定されたシグネチャー遺伝子は、低スコアと高スコアの組織病理群の間ではっきりと区別された。同時に、これら遺伝子は線維症形成に関与すると見られ、線維化検出の有力なマーカーである。
【００９５】
実施例３：ＤＭＮ誘発肝線維症期間におけるタンパク質発現プロファイル
肝線維症で差異的に発現するタンパク質を同定するためにｉＴＲＡＱタギングを用いた実験を行った。
【００９６】
同重体タギング法（Isobaric Tagging Method）：サンプル調製と試薬標識
６匹のコントロールラットおよび６匹のＤＭＮ処理ラットの肝組織を用い、２回繰り返しの方式（duplicate）でｉＴＲＡＱ標識実験を行った。肝組織を液体窒素中で凍結させてから、液体窒素で予冷しておいた乳鉢と乳棒を用い粉砕して粉末にした。次に、液体窒素を蒸発させ、粉末となった組織を分離してチューブに移し、−８０℃で保存した。２０倍量（volume）（ｗ／ｖ）の溶解バッファー（２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ含有２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．６）を、粉末となった組織に加え、室温で１時間インキュベートした。サンプルを１２０００ｒｐｍで１０分遠心分離機にかけ、その上清を取り、６倍量（volume）の冷アセトンをサンプルのチューブに加えることによってアセトン沈殿を行った。沈殿が形成されるまでチューブを−２０℃でインキュベートした。アセトンの上清を除去した（decanting）後、０．１％ＳＤＳおよび６Ｍ尿素を含む溶解バッファー（ｉＴＲＡＱ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｋｉｔ、アプライドバイオシステム、フォスターシティー、ＣＡ、米国のものを用いた）中に沈殿物を再懸濁させた。
【００９７】
Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ピアス（PIERCE）、ロックフォールド（Rockford）、ＩＬ、米国）を用いて総タンパク質含有量を測定した。２００μｇのタンパク質を取り、等量（ｗ／ｖ）の０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ含有溶出バッファーで希釈した。ｉＴＲＡＱプロトコール（アプライドバイオシステム、フォスターシティー、ＣＡ、米国）に記述されているように、タンパク質を還元し、システインをブロックした。４倍量の溶出バッファーを各チューブに加え、２０μｇのトリプシンで３７℃１６時間インキュベートした。コントロールラットおよびＤＭＮ処理ラットの肝組織から抽出したトリプシンペプチドを、実験の各時点においてｉＴＲＡＱ１１４および１１５でそれぞれ標識した。
【００９８】
ペプチドの分離および解析
異なる同重体タグを有するペプチドをプールし、１０ｍＭリン酸と混合する（２５％（ｖ／ｖ）アセトニトリルおよび７５％のＨ2Ｏ中）ことにより酸性化して全量４．０ｍＬとし、強陽イオン交換（ＳＣＸ）クロマトグラフィーを行った。その結果得られたサンプルを、５ミクロン３００Åビーズが充填された２．１ｍｍ×２００ｍｍポリスルフォエチルＡカラム（ポリＬＣ、コロンビア、ＭＤ、米国）を用いた液体クロマトグラフィーシステム（Ettan、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス、ウーメオ（Umea）、スウェーデン）に流速０．０８ｍＬ／分で注入した。分析カラムの上流に同材質のガードカラムを取り付けた。バッファーには、バッファーＡとして１０ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、２５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、ｐＨ３．０を、バッファーＢとして１０ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、１Ｍ  ＫＣｌ、２５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、ｐＨ３．０を用いた。溶出のグラジエントを、バッファーＢ１６ｍＬで０から４０％、次いでバッファーＢの別の４ｍＬで１００％まで直線的に変化させた。合計３０の画分を回収し、高速真空遠心（speed vacuuming centrifugation）により乾燥させた。すべての画分をｐｅｐＣｌｅａｎ（登録商標）Ｃ−１８スピンカラム（ピアス、ロックフォールド、ＩＬ、米国）で脱塩した。各ＳＣＸ画分の脱塩されたペプチドを高速真空遠心により乾燥させてから、ｎａｎｏＬＣハイブリッド質量分析計で分析した。ｎａｎｏＬＣシステムはＬＣ  Ｐａｃｋｉｎｇｓ社（アムステルダム、オランダ）製のもので、ＡＰＩ  ＱＳＴＡＲ  ＰｕｌｓａｒハイブリッドＱｑＴＯＦ質量分析計（アプライドバイオシステム／ＭＤＳ  シエックス（Sciex）、フォスターシティー、ＣＡ、米国）に接続させた。ペプチドの分離は、逆相Ｃ18カラム（直径７５μｍ×長さ１５ｃｍ、３μｍ粒子）を用い、５〜５０％バッファーＡ４５分間、および５０〜９５％バッファーＢ１０分間、流速０．２μｌ／分の２段階リニアグラジエント（バッファーＡ：２％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、０．１％（ｗ／ｖ）ギ酸；バッファーＢ：８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、０．１％（ｗ／ｖ）ギ酸）により行った。ＭＳおよびタンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）のｍ／ｚ走査範囲はそれぞれ４００〜１２００および７５〜１５００Ｄａとした。ＭＳ／ＭＳ質量スペクトルを１０ｍｍ  Ｉ．Ｄ．溶融シリカチップを用い、連続フローモードで分析した。ＭＳ／ＭＳスペクトルをＰｒｏＱＵＡＮＴ２．０（アプライドバイオシステム／ＭＤＳ  シエックス、フォスターシティー、ＣＡ、米国）によりＮＣＢＩのｒａｔ．ｆａｓｔａデータベースと対比させて分析した。ペプチド同定の精度の許容範囲はそれぞれＭＳで０．５Ｄａ、ＭＳ／ＭＳで０．５Ｄａとした。信頼度についてカットオフの設定は９５とし、スコアについては２０とした。ペプチドの相対定量を、ピーク下面積の比を用い、ＭＳ／ＭＳ走査により行った。同定された構成ペプチドを平均することにより、タンパク質の相対定量を達成した。
【００９９】
上記方法およびｉＴＲＡＱプロテオーム研究から得られた結果の妥当性を確認するため、ｉＴＲＡＱ実験において質量分析により定量されたビメンチンの発現変化を、抗ビメンチン抗体を用いたウェスタンブロットで得られたものと比較した。コントロールラットおよびＤＭＮ誘発ラットの肝臓から、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．６でタンパク質を抽出した。１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、タンパク質をポリビニリデンジフルオライド膜に転写し、次いで、免疫染色をマウス抗ビメンチンモノクローナル抗体（ケミコン（Chemicon）、テメクラ（Temecula）、ＣＡ、米国）で１時間、引き続き西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ラットＩｇＧでさらに１時間行った。増強化学発光（enhanced chemiluminescence）システム（ＥＣＬ、パーキン−エルマー  ライフィサイエンス、ウェルズリー、ＭＡ、米国）を用いて、免疫反応性バンドを検出した。図４に示されているように、ウェスタンブロットで観察された結果は、質量分析により測定された傾向と一致していた。
【０１００】
結果
信頼度の閾値（confidence threshold）を９５％に設定した場合に、同定された識別できるペプチドの数は６２４〜１５９１の範囲にあった。有意数のこれらペプチドについては、２回以上の確認を行った。各実験において３５１個を超える特異なタンパク質（unique protein）が同定された。コントロールラットと対比して、Ｆ２およびＦ３の線維化スコアを有するＤＭＮ処理ラット肝組織のタンパク質発現において、３９個のタンパク質が有意なかつ整合性のある差異（１．５倍以上）を示した。これら３９個のタンパク質のうちのいくつかは、フィブリノゲンおよびフィブロネクチンなど、線維化形成に関連してすでに報告されていたものであった。
【０１０１】
本研究においてフィブリノゲンはＤＭＮ誘発ラットにて上方制御されていることが見出された。これは、モデルＣＣｌ4誘発ラットの肝傷害におけるフィブリノゲン遺伝子発現の結果と一致している。また、ＣＣｌ4誘発ラットの肝傷害は、短期間の肝傷害と肝臓の線維成長の間に、フィブリノゲンのｍＲＮＡレベルの増加およびフィブリノゲン／フィブリン沈着をも示した。このことは、フィブリノゲンが短期間の肝傷害と肝線維化において「凝固の様な過程（clotting-like process）」に関与することを示唆し得る（３６）。フィブロネクチンは２本のポリペプチド鎖からなる。それはコラーゲン、フィブリンおよびヘパリンの細胞への接着を媒介するものであり、故にこれら構造の細胞への付着を促すことで血栓の組織および創傷治癒にかかわっている。フィブロネクチンならびにＩ型およびIII型コラーゲンは、肝硬変の状態の特性としてＣＣｌ4誘発肝硬変ラットモデルに使用されている（３７）。
【０１０２】
さらに、グリシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（Ｇｎｍｔ）、アルドラーゼＡ（Ａｌｄｏａ）、ミオシン軽鎖ポリペプチド６（Ｍｙｌ６）および細胞質γアクチン（Ａｃｔγ）が、ＲＮＡ発現マイクロアレイとプロテオーム研究の両方において、差異的発現を示すものであるとして確認されている。
【０１０３】
実施例４：ネットワーク解析
線維症肝において差異的に発現する遺伝子をさらに絞り込むため、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）ソフトウェア（インジェニュイティーシステム、マウンテンビュー、ＣＡ、米国）を用いてネットワーク解析を実行した。マイクロアレイとｉＴＲＡＱプロテーオーム解析により同定された遺伝子に対し相互作用ネットワーク分析を行った。遺伝子のアクセッション番号をＩＰＡソフトウェアに取り込んだ。これらネットワークにより、文献において既知である相互作用をベースに、遺伝子産物間の機能的関係が示された。そして、ＩＰＡツールで、既知の生物学的経路にこれらネットワークを関連付けた。マイクロアレイ試験で同定された６２個の遺伝子のうち、４２個の遺伝子が３つのグループ、つまり、１）がん、細胞形態学および皮膚病と病変；２）脂質代謝、低分子生化学、分子輸送；ならびに３）がん、細胞運動、細胞成長と増殖に関連する遺伝子ネットワークに分類された。表３Ａを参照されたい。プロテオーム試験において同定された３９個のうち２２個のタンパク質が、１）がん、細胞周期および細胞形態学；２）脂質代謝、低分子生化学、臓器損傷および異常；ならびに３）血液病、内分泌系の発達と機能、神経系の発達と機能に関連する別の３つのネットワークに分類された。図３Ｂを参照されたい。表３Ａおよび３Ｂには、ネットワークのタンパク質の機能および構成要素がリストしてある。本研究で同定された遺伝子には下線を引いた。該下線を引いた遺伝子の、肝傷害との関係が報告されていないものは太字で示している。
【０１０４】
実施例５：ＤＭＮ誘発肝線維症ラットモデルにおいて同定されたバイオマーカーのヒトサンプルを用いた臨床評価
ＤＭＮ誘発肝線維症ラットモデルで同定されたバイオマーカーがヒトの肝線維症または肝硬変の診断に使用可能であるということを裏付けるため、ウェスタンブロット解析によりヒト血清中の酵素であるカルボニックアンヒドラーゼＩ（表２参照、配列番号１１および７１）の発現を調べた。健常志願者とＢ型肝炎関連肝硬変に罹患した患者とから採取した血清サンプル（各患者からそれぞれ８μｌ）を、先ずＰｒｏｔｅｏＰｒｅｐ（登録商標）２０  Ｐｌａｓｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（シグマ−アルドリッチ、セントルイス、ＭＯ、米国）を用い、含有量の高い上位２０種の血清タンパク質を除去するべく処理した。除去後、低含有量の血清タンパク質を５倍量（volume）の冷アセトンを用い−２０℃で２時間沈殿させた。次いで、タンパク質／アセトン混合物を１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけた。そのタンパク質沈殿物を再懸濁し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動することにより分離してから、０．４５μｍのポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（ミリポア、ビルリカ、ＭＡ、米国）に転写した。５％（ｗ／ｖ）脱脂乳でブロッキングした後、その膜をＴＢＳＴバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）で洗浄し、カルボニックアンヒドラーゼＩに特異なヤギポリクローナル抗体（アブケム（Abcam）、ケンブリッジ、英国）で１時間インキュベートした。その膜をＴＢＳＴバッファーで再度洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートロバ抗ヤギＩｇＧ（ジャクソン  イムノリサーチ  ラボラトリー、ＰＡ、米国）で免疫染色した。その免疫反応のバンドを増強化学発光システム（ＥＣＬ、パーキン−エルマー  ライフィサイエンス、ウェルズリー、ＭＡ、米国）を用いて視覚化した。ウェスタンブロットは、肝硬変患者から採取したいくつかの血清サンプルのカルボニックアンヒドラーゼＩ濃度が、肝硬変を罹っていない健常者から採取したサンプルよりも高いことをはっきりと示している。この結果は、肝線維症および／または肝硬変のラットモデルにおいて同定されたマーカーが、ヒトの肝線維症および／または肝硬変にも関与するということを裏付ける。
【０１０５】
本明細書で言及した刊行物は、単にその開示が本出願の出願日より前であったために提示したまでである。本明細書のいかなる記載も、本発明が先行発明の理由によりかかる刊行物に先行し得ないことを認めるものであると解釈されるべきではない。また、提示した発行日は実際の発行日とは異なっている可能性があり、所定の機関による確認を必要とするかもしれない。
【０１０６】
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【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１Ａ】ラットに線維症を誘発するためのＤＭＮ処理の概略説明図である。各ラットに、連続３週間、週に３度ＤＭＮを注射（逆三角形で示す）、あるいはコントロールとして生理食塩水を注射した。毎週ラットを評価し、犠牲死させた（三角形で示す。１１日目に開始し、これを第１週とし、第６週まで）。生化学分析のために血液サンプルを採取し（表１に要約）、肝臓を摘出して重さを量った。次いで、肝臓を、組織病理学試験用にホルムアルデヒドに固定、あるいはマイクロアレイおよびｉＴＲＡＱプロテオーム試験用にＲＮＡとタンパク質を単離するのに用いた。
【図１Ｂ】最も強力な既知の線維成長誘導因子、Ｔｇｆβ１（形質転換成長因子−β１）の、ＤＭＮ処理ラットにおける定量リアルタイムＰＣＲ（Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ）結果であり、Ｔｇｆβ１発現のレベルがより高くなっている。
【図２Ａ】ＤＭＮ処理ラットから採取した肝組織の組織病理学的実験の結果を示している。該ラット肝組織の典型的な表現型を、次の４つの組織病理学的特徴をスコアリングすることにより明らかとした。壊死のスコアをＮ０からＮ３（１番目の列）、炎症のスコアをＩ０からＩ３（２番目の列）、線維化のスコアをＦ０からＦ３（３番目の列）とし、最終列の脂肪変化のスコアは存在または非存在（＋と−）とした。
【図２Ｂ】ラットモデルの組織病理学的スコアの要約である。結果は時間経過に沿って並べてある。壊死性炎症変化は３グレード：Ａ０＝なし、Ａ（１〜３）＝軽度およびＡ（４〜６）＝中程度の壊死性炎症、に分けられている。線維化変化は２グレード：Ｆ（０〜１）＝正常から門脈域の線維性拡大、Ｆ（２〜３）＝線維性架橋形成から高頻度な結節形成を伴う線維性架橋形成、に分けられている。脂肪変化は存在または非存在（＋／−）で示される。ラットの数をカウントし、各時点の各組織病理学的レベルにおけるラットの百分率を計算するのに用いた。
【図３Ａ】ラットにおけるＤＭＮ誘発線維症モデルから得られた２５６個の遺伝子パターンの発現のデンドログラムを示す。
【図３Ｂ】Ｔｉｍｐ１（メタロプロテイナーゼ１の組織阻害因子）発現のＱ−ＲＴ−ＰＣＲ結果とマイクロアレイデータ間での比較を示しており、両方の結果の間の高い一致性が示されている。Ｔｉｍｐ１のＱ−ＲＴ−ＰＣＲ分析では、発現レベル（四角形で示す）は、全遺伝子発現の平均と比較され、図右側の対数目盛りによって測定される。２つのＴｉｍｐ１転写産物、ｒｃ_ＡＩ１６９３２７_ａｔとｒｃ_ＡＩ１６９３２７_ｇ_ａｔ（丸と三角形でそれぞれ示す）の発現レベルは、全遺伝子発現レベルの平均と比較され、図左側に示される目盛りにより測定される。
【図４Ａ】ｉＴＲＡＱプロテオミクスにより測定された２、４および６週目におけるＤＭＮ処理ラットおよびコントロールラットのビメンチン発現の比率を示す。ラットがＤＭＮ処理されている場合に、その肝臓におけるビメンチン発現は２．４から３．４倍増加した。
【図４Ｂ】ＤＭＮ誘発ビメンチン発現のウェスタンブロット解析の結果を示す。観察された結果は、ｉＴＲＡＱプロテオーム実験における質量分析により測定された傾向と一致している。
【図５】健常志願者とＢ型肝炎関連肝硬変の患者より採取したヒト血清中のカルボニックアンヒドラーゼＩ発現を比較するウェスタンブロット解析の結果を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図２Ａ】
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【図３Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【誤訳訂正書】
【提出日】平成19年3月20日(2007.3.20)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】配列表
【訂正方法】追加
【訂正の内容】
【配列表】
2007252366000001.app
【外国語明細書】
2007252366000001.pdf
2007252366000002.pdf
2007252366000003.pdf
2007252366000004.pdf