(57)【要約】      （修正有）【課題】大腸癌のリンパ節転移の有無を予測するための方法及び当該方法に利用できる遺伝子セットの提供。【解決手段】下記（１）〜（４）の工程を含む、遺伝子セットの選択方法：（１）組織病理学的判定によりリンパ節転移の有無が明らかにされた患者の大腸癌原発巣組織における遺伝子発現情報を、リンパ節転移の有無を正分類率７５％以上で分類できる遺伝子群をそれぞれの解析方法において選定する工程（２）（１）で用いた解析方法で選定された遺伝子群から、何れの解析方法でも共通して選定された共通遺伝子を選択する工程、（３）前記遺伝子発現情報を解析することにより、任意の２以上の遺伝子の組合せの中から、リンパ節転移の有無の分類を指示し、交互作用を示す遺伝子の組合わせを選択する工程、及び（４）前記共通遺伝子及び前記遺伝子の組合わせを説明変数としてリンパ節転移の有無を応答としたロジスティック回帰モデルにおける変数選択を行う工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（４）の工程を含む、大腸癌リンパ節転移の有無を予測するための遺伝子セットの選択方法：
（１）組織病理学的判定によりリンパ節転移の有無が明らかにされた患者の大腸癌原発巣組織における遺伝子発現情報を、教師あり学習解析方法を少なくとも一つ含む、４以上の解析方法で解析することにより、リンパ節転移の有無を正分類率７５％以上で分類できる遺伝子群をそれぞれの解析方法において選定する工程、
（２）（１）で用いたそれぞれの解析方法で選定された遺伝子群から、何れの解析方法でも共通して選定された共通遺伝子を選択する工程、
（３）前記遺伝子発現情報を解析することにより、任意の２以上の遺伝子の組合せの中から、リンパ節転移の有無の分類を指示し、交互作用を示す遺伝子の組合わせを選択する工程、及び
（４）前記共通遺伝子及び前記遺伝子の組合わせを説明変数として、リンパ節転移の有無を応答としたロジスティック回帰モデルにおける変数選択を行う工程。
【請求項２】
（１）の解析方法が、（a）Support Vector Machine、（b）Principal Component Analysis Artificial Neural Networkの拡張法、（c）Hierarchical Cluster AnalysisとStepwise Logistic Discriminationの組合せ及び（d）Classification And Regression TreeとLogistic Discriminationの組合せよりなる群から選択されるものを少なくとも一つ含むものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（３）の解析方法が、（d）Classification And Regression TreeとLogistic Discriminationの組合せである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（４）の変数選択の方法が、ステップワイズの変数選択法である、請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれかに記載の方法により選択される、大腸癌リンパ節転移の有無を予測するための遺伝子セット。
【請求項６】
少なくともNM_003404（G1592）、NM_002128（G2645）、NM_052868（G3031）、NM_005034（G3177）、NM_001540（G3753）、NM_005722（G3826）、及びNM_015315（G4370）のデータベースのアクセス番号（シリアル番号）で表される遺伝子を含む、請求項５に記載の遺伝子セット。
【請求項７】
請求項５または６の何れかに記載の遺伝子セットを用いることを特徴とする大腸癌リンパ節転移の有無を予測するための方法。
【請求項８】
下記の判別式を用いることを特徴とする請求項７記載の方法：
Ｄ＝０.２３０７−２.７１３２×NM_003404（G1592）の発現量
＋８.９５０９×NM_052868（G3031）の発現量
＋８.７９７５×NM_005722（G3826）の発現量
−２.３０９８×NM_015315（G4370）の発現量
＋３.５１２６×NM_002128（G2645）の発現量×NM_005034（G3177）の発現量
−８.８２２６×NM_001540（G3753）の発現量×NM_005722（G3826）の発現量
（Ｄ＞０のときリンパ節転移あり、Ｄ≦０のときリンパ節転移なし、と判別する）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸癌のリンパ節転移の有無を予測するのに有用な遺伝子群、及びそれらの遺伝子発現情報の活用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸癌は先進国では特に発生率が高く、本邦でも年々増加の一途を辿っており、癌関連死の主要な原因のひとつとなっている。統計学的な報告（例えば、非特許文献１参照）によれば、大腸癌患者の３７％は転移がない主病巣に限局した癌であり、同じく３７％が所属リンパ節にのみ転移を認める局在的な癌であり、残りは遠隔転移を伴っているものなどであることが分かっている。
【０００３】
現在、臨床における大腸癌の悪性度分類として最も一般的に利用されているDukes分類においては、癌の大腸壁深達度と所属リンパ節への転移の程度などの病理学的な事項を指標としており、本分類と予後の相関に関しては疑う余地のないところとなっている。しかしながら、上記分類結果を大きく左右するリンパ節転移の有無の判定に関しては、切除された数多くのリンパ節組織のうちの一部を用いて作成された標本を顕微鏡下で観察するという古典的な組織病理学的手法に頼っているのが現状である。このような手法によりリンパ節転移陰性と判定された患者の２０〜４０％には後に転移が発見されるとの報告（例えば、非特許文献２参照）が示すように、従来のリンパ節転移判定法は必ずしも精度が十分とはいえなかった。
【０００４】
大腸癌は、多段階発癌の構造など分子生物学的な研究がもっともよく進んでいる癌の一つで、これまでＡＰＣ、Ｋ−ｒａｓ、ｐ５３、ＤＣＣなどの個々の遺伝子についての報告が多数みられる。しかし、これらの遺伝子のいずれかに注目するだけでは、大腸癌の個性を表現するには不十分であるため、近年はＤＮＡマイクロアレイなどを用いることにより一度に極めて多数の遺伝子の発現情報を得ることにより有用な新規知見を得る試みがなされ始めている。
【０００５】
Alizadehらは、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫患者の末梢血から分取したＢリンパ球を試料としてＤＮＡマイクロアレイによる測定を行い、得られた遺伝子発現データの階層的クラスタリングを行うことにより、同病患者の末梢血Ｂリンパ球には、リンパ組織の胚中心に存在するＢ細胞に類似した遺伝子発現パターンを示す場合と、in vitroで活性化したＢ細胞に類似した遺伝子発現パターンを示す場合の２種類があることを見出した（非特許文献３）。両者の生存率をKaplan-Meierプロットで調べた結果、後者の発現パターンを示すＢ細胞を持つ患者は、前者の発現パターンを示すＢ細胞を持つ患者と比べて予後が悪いことが明らかとなった。加えて、従来からの病理学的診断に基づく予後予測に従うよりも、著者らの行った遺伝子発現情報のクラスタリングで得られた結果の方が予後との相関性が高かった。Alizadehらの研究結果は、遺伝子発現情報から臨床的に利用可能な有用な法則性を導き出せたという点で意義のあるものといえる。しかし、その法則が全く新たな臨床例についても適用できるかどうかについての検証はなされておらず、この論文の範囲でのみ成立する結果である可能性は否定できない。
【０００６】
Khanらは、組織学的には区別が難しい小円形青色細胞腫に属する４種類の癌が、人工ニューラルネットワークを利用した遺伝子発現情報の解析により正確に区別されることを報告した（非特許文献４）。この報告の中では、全体のデータから無作為に抜き出した一部のデータを用いて導き出した人工ニューラルネットワークモデルに対して、テストサンプルのデータを入力した場合にも、正確な判定結果が得られることが検証されている。したがって、ここで導き出された人工ニューラルネットワークモデルは、この論文内のデータの範囲に限定されるものではなく、小円形青色細胞腫に属する４種類の癌を区別するために一般的に適用可能なものであることが示唆される。しかしながら、人工ニューラルネットワークモデルで得られる判定結果は、数学的な根拠を明確に説明できないという点で一般には受け入れられにくい。
【０００７】
大腸癌の肝転移に関わる分子標的を同定することを目的としてＤＮＡマイクロアレイを用いて行われた最近の研究例としては、柳川らの報告（非特許文献５）がある。著者らは、公共の遺伝子データベースに登録されているヒトｃＤＮＡの塩基配列に基づいて設計したオリゴＤＮＡをプライマーとして用い、ヒトのｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、９,１２１種類の増幅ｃＤＮＡ断片を得た。次いで、これらのｃＤＮＡ断片をプローブとしてプリントしたＤＮＡマイクロアレイを使って、１０症例の大腸癌患者より分離した大腸癌原発巣及び大腸癌肝転移巣の遺伝子発現プロファイルを調べた。その結果、原発巣に対して肝転移巣で発現が上昇している４０種類の遺伝子と、原発巣に対して肝転移巣で発現が低下している７種類の遺伝子を明らかにし、大腸癌の肝転移に関わる可能性がある候補遺伝子セットを同定した。
【０００８】
大腸癌の肝転移に関与する遺伝子セットについては、ＤＮＡマイクロアレイ法により大腸癌原発巣組織に特異的に発現した遺伝子群の発現情報を遺伝子判別分析手法に基づく統計解析処理することにより、大腸癌の肝転移の予測に有効な遺伝子セットを同定する方法、当該方法によって同定された遺伝子セット及び大腸癌原発巣組織における当該遺伝子セットの発現情報を用いて大腸癌の肝転移を予測する方法が知られている（特許文献１）。当該遺伝子セット及び方法は、大腸癌の異時性肝転移の予測に有用な情報を提供するものであり、大腸癌で特異的に発現している重要な遺伝子を同定するための材料として好ましいものではあるが、大腸癌のリンパ節転移は肝転移とは病理学的にみて全く病態が異なるため、これら大腸癌の肝転移用の遺伝子セット及び方法をそのまま大腸癌のリンパ節転移に応用できるわけでは決してない。
【０００９】
また、大腸癌原発巣組織、大腸癌肝転移巣組織及び正常大腸粘膜組織を材料として作製したｃＤＮＡライブラリーから選択したプローブを用いてオリジナルのＤＮＡマイクロアレイを作製し、それを用いて大腸癌組織における遺伝子発現解析を行うことにより、大腸癌の発育・進展に関連すると考えられる候補遺伝子の同定が可能であることも示されている（非特許文献６）。
【００１０】
一方、大腸癌のリンパ節転移に関しては、上記のようにリンパ節転移の有無の判定が、切除された数多くのリンパ節組織のうちの一部を用いて作成された標本を顕微鏡下で観察するという古典的な組織病理学的手法に頼っているのが現状であり、このようなリンパ節転移判定法は精度が必ずしも十分とはいえない。また、大腸癌原発巣除去手術後に行われる術後補助療法により、リンパ節転移のあった患者の予後を改善できることも知られているが、術後補助療法は食欲不振・上腹部不快感・嘔気などの副作用を伴うこともあり、Quality of life（QOL）や医療費の観点からみて、患者個人の状態と病勢を考慮して必要・不必要を判断する必要がある。従って、より精度の高いリンパ節転移判定法が見出されれば、術後補助療法の選択に際して意志決定のための有用な指標として利用可能となり、最終的には適切な治療が受けられることにより患者の利益につながると考えられる。
【００１１】
【特許文献１】特開２００４−３３０８２
【非特許文献１】Troisi R.J.ら、1999, Cancer, vol. 85, p. 1670-1676
【非特許文献２】Cohen A.M.ら、1997, Curr Probl Surg., vol. 34, p. 601-676
【非特許文献３】Alizadehら、2000, Nature, vol. 403, p. 503-511
【非特許文献４】Khanら、2001, Nature Medicine, vol. 7, p. 673-679
【非特許文献５】柳川ら、2001, Neoplasia, vol. 3, No. 5, p.395-401
【非特許文献６】竹政ら、2001, Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 285, p. 1244-1249
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記のように、大腸癌のリンパ節転移の有無を判定する従来の方法は、大腸癌周辺の複数のリンパ節を切除し、これを顕微鏡下で観察するもので、判定結果の精度に問題があった。
【００１３】
したがって、本発明は、この点を改善するために、大腸癌原発巣組織の遺伝子発現プロファイルを調べることにより、大腸癌のリンパ節転移の有無を予測する方法を提供することを目的とする。本発明はまた、リンパ節への癌細胞の転移の有無を予測することを可能とならしめるために、大腸癌のリンパ節転移判定に利用可能な遺伝子セット及びそれらの発現情報に基づいてリンパ節転移の有無を判定するために利用可能な判別式を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、大腸癌原発巣組織、大腸癌肝転移巣組織及び正常大腸粘膜組織を材料として作製したｃＤＮＡライブラリーから選択したプローブを用いてオリジナルのＤＮＡマイクロアレイを作製し、当該ＤＮＡマイクロアレイを用いて得た大腸癌原発巣の遺伝子発現解析データの統計解析を通じて、リンパ節転移の有無を予測するのに利用可能な遺伝子セット、及びそれらの発現量に基づいて実際にリンパ節転移の有無を予測するために利用する判別式を見出すことに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は、以下の大腸癌のリンパ節転移の有無を予測するための遺伝子セットの選択方法を提供する。
１．下記（１）〜（４）の工程を含む、大腸癌リンパ節転移の有無を予測するための遺伝子セットの選択方法：
（１）組織病理学的判定によりリンパ節転移の有無が明らかにされた患者の大腸癌原発巣組織における遺伝子発現情報を、教師あり学習解析方法を少なくとも一つ含む、４以上の解析方法で解析することにより、リンパ節転移の有無を正分類率７５％以上で分類できる遺伝子群をそれぞれの解析方法において選定する工程、
（２）（１）で用いたそれぞれの解析方法で選定された遺伝子群から、何れの解析方法でも共通して選定された共通遺伝子を選択する工程、
（３）前記遺伝子発現情報を解析することにより、任意の２以上の遺伝子の組合せの中から、リンパ節転移の有無の分類を指示し、交互作用を示す遺伝子の組合わせを選択する工程、及び
（４）前記共通遺伝子及び前記遺伝子の組合わせを説明変数として、リンパ節転移の有無を応答としたロジスティック回帰モデルにおける変数選択を行う工程；
２．（１）の解析方法が、（a）Support Vector Machine、（b）Principal Component Analysis Artificial Neural Networkの拡張法、（c）Hierarchical Cluster AnalysisとStepwise Logistic Discriminationの組合せ及び（d）Classification And Regression TreeとLogistic Discriminationの組合せよりなる群から選択されるものを少なくとも一つ含むものである、上記１．に記載の方法；
３．（３）の解析方法が、（d）Classification And Regression TreeとLogistic Discriminationの組合せである、上記１．または２．に記載の方法；
４．（４）の変数選択の方法が、ステップワイズの変数選択法である、上記１．ないし３．のいずれかに記載の方法。
【００１６】
本発明はまた、以下の大腸癌リンパ節転移の有無を予測するための遺伝子セットを提供する。
５．上記１．ないし４．のいずれかの方法により選択される、大腸癌リンパ節転移の有無を予測するための遺伝子セット；
６．少なくともNM_003404（G1592）、NM_002128（G2645）、NM_052868（G3031）、NM_005034（G3177）、NM_001540（G3753）、NM_005722（G3826）、及びNM_015315（G4370）のデータベースのアクセス番号（シリアル番号）で表される遺伝子を含む、上記５．に記載の遺伝子セット。
【００１７】
本発明はさらに、以下の、上記選択された遺伝子セットを用いた大腸癌のリンパ節転移の有無を予測する方法をも提供する。
７．上記５．または６．の何れかに記載の遺伝子セットを用いることを特徴とする大腸癌リンパ節転移の有無を予測するための方法；
８．下記の判別式を用いることを特徴とする上記７．記載の方法：
Ｄ＝０.２３０７−２.７１３２×NM_003404（G1592）の発現量
＋８.９５０９×NM_052868（G3031）の発現量
＋８.７９７５×NM_005722（G3826）の発現量
−２.３０９８×NM_015315（G4370）の発現量
＋３.５１２６×NM_002128（G2645）の発現量×NM_005034（G3177）の発現量
−８.８２２６×NM_001540（G3753）の発現量×NM_005722（G3826）の発現量
（Ｄ＞０のときリンパ節転移あり、Ｄ≦０のときリンパ節転移なし、と判別する）。
【００１８】
本発明において用いる遺伝子群の解析方法としては、以下のものが挙げられる：
１．Hierarchical Cluster Analysis  クラスター分析
２．Logistic Discrimination（変数選択法を含む）  ロジスティック解析
３．Classification And Regression Tree  カート
４．Principal Component Analysis Artificial Neural Network（拡張法を含む）  ピーシーエー／主成分分析
５．Projection Pursuit for supervised classification  プロジェクションパーシュート／射影追跡
６．Support Vector Machine  サポートベクターマシン／エスブイエム
７．Self Organizing Map  エスオーエム
８．AdaBoost  アダブースト
９．これらの手法を２つ以上組み合わせた遺伝子の選択の工程。
【００１９】
本発明において用いる遺伝子発現情報の解析方法としては、ロジスティク解析（Logistic Discrimination）が挙げられる。
【００２０】
本発明において用いる変数選択の方法としては、以下のものが挙げられる：
１．ステップワイズ（逐次増減法；stepwise）
２．前進選択法（forward）
３．後退選択法（backward）
【発明の効果】
【００２１】
本発明では、大腸癌患者が大腸癌原発巣切除手術を受ける時点で、大腸癌細胞が周辺のリンパ節に転移している可能性が高いか否かを判定するために有用な一連の遺伝子セット、ならびにそれらの遺伝子発現情報に基づいてリンパ節転移の有無を予測するための判別式が提供される。本発明の方法に従えば、大腸癌原発巣組織の当該遺伝子セットの遺伝子発現情報をロジスティック回帰式で解析することにより、良好なリンパ節転移判定成績を得ることができる。したがって、大腸癌原発巣切除手術の時点において、リンパ節への癌細胞の転移の有無を予測することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の方法は、大腸癌原発巣切除手術の時点におけるリンパ節転移の有無を予測するうえで有効な遺伝子セット、及び当該遺伝子セットの発現量に基づいて実際にリンパ節転移の有無を予測するための判別式によって特徴付けられる。
【００２３】
リンパ節転移の有無を予測するうえで有用な遺伝子セットは、多サンプルの大腸癌原発巣組織について遺伝子発現を網羅的に調べ、その中から判定に利用可能な遺伝子のセットを選出することにより得られる。このような網羅的な遺伝子発現解析の方法としては、マイクロアレイをはじめとして、Northern解析、ATAC−PCR法（Katoら、Nuc. Acids Res., vol. 25, p. 4694−4696, 1997）やTaq Man PCR法（Applied Biosystems社）に代表されるリアルタイムPCR法、SAGE（Velculescuら、Science, vol. 270,p. 484−487, 1995）等々様々な方法が利用可能である。
【００２４】
本発明の好ましい態様では、ＤＮＡマイクロアレイを用いた、特開２００４−３３０８２に記載の方法に従って行われる。より具体的には、インフォームドコンセントを経て収集された、原発巣除去手術時の組織病理的観察でリンパ節への転移が認められた患者由来の大腸癌原発巣組織６３例と、リンパ節転移が認められなかった患者由来の原発巣組織８７例の合計１５０例の組織について上記ＤＮＡマイクロアレイを用いて遺伝子発現データを取得した。比較対照としては、４０症例分の大腸癌原発巣組織周辺の正常大腸粘膜組織から得られた遺伝子発現データを用いた。
【００２５】
上記の遺伝子発現データは、癌組織から抽出した全ＲＮＡを材料として調製した蛍光標識ｃＤＮＡを、ＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズさせ、ＤＮＡマイクロアレイ上のプローブにハイブリダイズした蛍光標識ｃＤＮＡの発する蛍光シグナルを専用のスキャナで検出・定量化することにより取得される。より具体的な手順を以下に記した。
【００２６】
大腸癌組織あるいは正常大腸粘膜組織からの全ＲＮＡ抽出は、TRIzol試薬（GIBCO BRL社）、ISOGEN（ニッポンジーン社）などの試薬を用い、各試薬の添付文書に記載された方法に従って行うことができる。このようにして調製した全ＲＮＡは、そのまま下記の標識ｃＤＮＡの調製に使用することができる。また、例えば、mRNA Purification Kit（Amersham BioSciences社）などの市販のキットにより、添付の方法に従って、該全ＲＮＡからポリアデニン付加ＲＮＡ（以下、「ｍＲＮＡ」と称することもある）を精製して以下の標識ｃＤＮＡの調製に使用することもできる。
【００２７】
Ｃｙ３標識した大腸癌原発巣組織由来のｃＤＮＡ（以下、「Ｃｙ３ｃＤＮＡ」と称することもある）は、上記の全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ、オリゴｄＴプライマー、ｄＮＴＰ及びＣｙ３標識ｄＵＴＰを含む混合液に逆転写酵素を加えた後、３７〜４５℃で１〜３時間、好ましくは、４２℃で１時間加温することにより調製される。比較対照として使用されるＣｙ５標識した正常大腸粘膜由来のｃＤＮＡ（以下、「Ｃｙ５ｃＤＮＡ」と称することもある）の調製も、正常大腸粘膜組織の全ＲＮＡを用いて同様の方法により行われる。こうして得られたＣｙ３ｃＤＮＡ及びＣｙ５ｃＤＮＡは、それぞれ変性溶液中で６５〜７０℃で１０〜２０分間、好ましくは、７０℃で１０分間加熱処理し、中和後、等量混合される（以下、この混合液を「Ｃｙ５・Ｃｙ３ｃＤＮＡ」を称することもある）。変性溶液として、５０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０.５Ｎ ＮａＯＨ又は１Ｎ ＮａＯＨなどを用いることができるが、５０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０.５Ｎ ＮａＯＨを使用するのが好ましい。Ｃｙ５・Ｃｙ３ｃＤＮＡの精製は、例えばMicrocon-30（Amicon社）などの市販キットを用い、添付の方法に従って行われる。
【００２８】
Ｃｙ５・Ｃｙ３ｃＤＮＡとＤＮＡマイクロアレイにプリントされたプローブとのハイブリダイゼーションは、以下のようにして行われる。先ず、プローブを熱変性させるためにＤＮＡマイクロアレイを加熱処理し、これに１００℃で２分間加熱処理したＣｙ５・Ｃｙ３ｃＤＮＡ含有ハイブリダイゼーション液を滴下し、カバーガラスで覆った後、ＤＮＡマイクロアレイを密閉容器に入れ、ハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション条件としては、ハイブリダイゼーション液がホルムアミドを含む場合には、４２℃で１２時間以上のハイブリダイゼーションが行われ、ホルムアミドを含まない場合には約６８℃で１２時間以上のハイブリダイゼーションが行われる。ハイブリダイゼーションの終了後、例えばScan Array 4000（GSI Lumonics社）などの機器によりＣｙ３とＣｙ５の蛍光をスキャンし、蛍光パターンを画像データとして得る。続いて、これらの画像データを、例えばQuantarrayソフトウェア（GSI Lumonics社）などのマイクロアレイデータ専用解析ソフトを用いて解析することにより、全プローブについてのＣｙ３とＣｙ５の蛍光強度をテキスト形式の数値データとして得ることができる。
【００２９】
本発明の好ましい態様では上記ＤＮＡマイクロアレイを使用したが、その代わりにハイブリダイゼーションのために有効な鎖長を持つ合成ＤＮＡを用いても同様の結果を得ることができる。例えば、本発明で開示された遺伝子名あるいは配列情報に基づいて、その一部の配列からなる約２０ヌクレオチド以上の長さを持つ合成ＤＮＡをプローブとして、ガラス基盤などに固定化したものを使用することも可能である。
【００３０】
一般的に、蛍光強度の低いデータはバックグラウンドの影響を大きく受けているので、例えば蛍光強度が強い方から３，０００データポイントだけを残すなどの方法により、蛍光強度の低いプローブのデータは棄却され欠損値として扱われる。続いて、スキャンの際に起こりうるＣｙ３とＣｙ５の検出感度調整のずれを補正して標準化するための操作が行われる。すなわち、各プローブについてのＣｙ３とＣｙ５の蛍光強度値の比であるＣｙ３／Ｃｙ５を算出し、底が２の対数値（以下、「ｌｏｇ（Ｃｙ３／Ｃｙ５）」と記載する）に変換し、各プローブについてのｌｏｇ（Ｃｙ３／Ｃｙ５）値から、全ｌｏｇ（Ｃｙ３／Ｃｙ５）値の中央値（median）を差し引くことにより標準化ｌｏｇ（Ｃｙ３／Ｃｙ５）値を得ることができる。該標準化ｌｏｇ（Ｃｙ３／Ｃｙ５）値は、各遺伝子の発現量として用いることができる。
【００３１】
このようにして得られた全症例についての標準化された数値データ（以下、「標準化数値データ」と記載することがある）は、一旦統合され、欠損値を多く含むプローブのデータを以降の解析対象から外す目的で次の選択操作が行われる。すなわち、マイクロアレイで解析した全１５０症例のうちの８５％以上にあたる１２８例以上でデータが取得できているプローブのデータのみが選択される。これにより、欠損値を１５％以下しか含まないプローブのデータだけを選択することができる。さらに、個人的な遺伝子背景因子の除外を目的として次の選択操作が加えられる。すなわち、各プローブについて、１５０例の大腸癌原発巣のデータ内での分散値と１２例の正常大腸粘膜についてのデータ内での分散値を算出し、前者が後者の１.１倍を超ているプローブのデータのみが選択される。
【００３２】
これら一連の選択操作により、２,１２１種類のプローブの標準化された数値データが以降の解析対象として選択される。このようにして選択される標準化数値データに含まれる欠損値の存在は、後の統計解析において不都合を生じるため、何らかの方法で補完される必要がある。
【００３３】
補完の方法としては様々なものが適用可能であるが、例えば、補完する欠損値を含む症例についての全データの平均値に、その欠損値を含む遺伝子の全症例についてのデータの平均値を加えた値から、全症例についての全遺伝子のデータの平均値を引いた値をもって補完する方法がある。他にはTroyanskayaらの報告（Bioinformatics, vol. 17, p. 520−525, 2001）において３種類の補完方法、すなわち、K−Nearest Neighbors (KNN) method、Singular Value Decomposition (SVD) based method及びrow average methodによる補完の例が示されている。これらのうちのいずれかの方法を適用することにより、全ての欠損値を補完することが可能である。
【００３４】
かくして準備される欠損値が補完された標準化数値データ（以下、「標準化遺伝子発現データ」と称することもある）は、バックグラウンドの影響を受けておらず、Ｃｙ３とＣｙ５の検出感度の違いによる誤差を含まず、また欠損値も含まず、かつ、正常大腸粘膜との比較における大腸癌原発巣の遺伝子発現の変動幅が個人差に起因する遺伝子発現の変動幅を超えている遺伝子の発現情報を有しており、以後の統計解析の信頼性を確保することができるものである。
【００３５】
ＤＮＡマイクロアレイの測定で得られる大量の遺伝子発現データを統計学的手法により処理し、目的に叶う遺伝子セットを導き出す方法については、確立された一般的なものはなく、研究者の相当な鋭意工夫を必要とするのが現実である。本発明においては、まず４つの異なるアプローチで解析を行い、それらの各々について、リンパ節転移の有無の予測に利用可能な遺伝子群が同定される。
【００３６】
本発明で行った４つのアプローチは、
（a）Support Vector Machine（SVM）（Hastieら、The Elements of Statistical Learning-Data Mining, Inference, and Prediction, Springer, 2001）、
（b）Principal Component Analysis/artificial Neural Network（PCA/aNN）（Khanら、Nature Medicine, vol. 7, p. 673−679, 2001）の拡張法、
（c）Hierarchical Cluster Analysis（HCA） ＋ Stepwise Logistic Discrimination及び
（d）Classification And Regression Tree（CART）（Breimanら、Classification and Regression Trees, Wadswarth, 1983） ＋ Logistic Discrimination
である。遺伝子群の同定に際しては、統計学的な信頼性を担保する目的で、全データを予測用遺伝子同定用と評価用の２群に分けて解析を行う。より具体的に述べると、１５０例のデータを、リンパ節転移ありの４２例とリンパ節転移なしの５７例から成る９９例と、リンパ節転移ありの２１症例とリンパ節転移なしの３０例から成る５１例、の２群に分け、前者の９９例分のデータをリンパ節転移の有無を予測するための遺伝子の同定と判別式の確立に使用し、その判別式で後者の５１例分のデータを判別することにより、判別式の評価を行う。以降の記載においては、予測用遺伝子の同定及び判別式の確立に使用される前者の９９例分のデータを「トレーニング用データ」と表現し、判別式の評価に使用する後者の５１例分のデータを「テスト用データ」と表現することがある。
【００３７】
上記４つのアプローチのうちの（ａ）、（ｃ）及び（ｄ）の３つに関しては、上記のデータの２分割を、分割時の標本変動を考慮して、ランダムに１００回行って解析することにより、１００通りの判定用遺伝子群を同定したうえで、同定された回数が多かった遺伝子を採用する。
【００３８】
一方、上記（ｂ）のアプローチに関しては、膨大な計算量を考慮して最初の２分割についてのみ実施する。ただし、トレーニング用の９９例分のデータを２対１の割合で１２５０回ランダムに２分割し、それを用いて主成分分析とニューラルネットワークの学習を反復する。学習後、リンパ節転移の有無を識別する感度に基づき遺伝子をランキングし，遺伝子を絞り込む。２１２１個の遺伝子から開始し、以降１５３６個、７６８個、３８４個、１９２個、９６個、４８個、２４個の絞り込み個数のそれぞれで学習を進める。
【００３９】
以上の解析を行うことにより、各遺伝子セットに含まれる遺伝子の個数と、確立された判別式を用いたテスト用データの正分類率（判別式での判別結果と組織病理学的検査の結果が一致した症例数／テスト用データ数×１００（％））の平均値として、（ａ）については遺伝子数が１４４個で正分類率は８０.２％（標準偏差は５.６％）、（ｂ）については遺伝子数が１９２個で正分類率は（９０.２％）、（ｃ）については遺伝子数が１３３個で正分類率は７８.６％（標準偏差は６.２％）及び（ｄ）については遺伝子数が１３８個で正分類率は８６.３％（標準偏差：４.５％）が得られる。このとき、１６種類の遺伝子が、各アプローチで選択された遺伝子セットに共通して含まれる。
【００４０】
次いで、正分類率を落とさないようにしつつ、予測に使用する遺伝子の数を絞り込むために、まず対象とする遺伝子を上記の１６遺伝子とし、これら１６遺伝子各々の寄与（以下、「主効果」と記載する）に加えて、２遺伝子の交互作用も加味した統計解析を行う。これにより、個別の遺伝子による主効果だけでなく、遺伝子間の交互作用を含めたより広い範囲で判別ルールを探索することとなり、高い判別性能を維持できることが期待される。
【００４１】
交互作用探索のために、上記解析で用いた１００通りのトレーニング用データのそれぞれで、リンパ節転移の有無を応答とするＣＡＲＴ解析を再度行う。このＣＡＲＴ解析では、FreeのソフトウェアRのrpartを用いた。その際、操作パラメータは全てデフォルトの値を用いた。この解析により、データの分割を指示する変数として登場する遺伝子の個数として、１回の解析あたり３個から５個が得られる。
【００４２】
登場する遺伝子が例えば３個の場合、とり得る遺伝子のペアは３通りあるため、それら全てのペアを交互作用として捉える。同様にして、遺伝子が４個の場合は６組、５個の場合は１０組の各ペアを交互作用として捉える。そして、できる限り多くの候補をカバーするため１００通りの解析のうち１２回以上現れた１８組の遺伝子ペアを交互作用の候補として選択する。
【００４３】
次に判別式の確立のために、１５０例のデータを用いて、１６遺伝子の主効果と１８通りの交互作用を説明変数とし、リンパ節転移の有無を応答としたロジスティック回帰モデルにおいてステップワイズの変数選択を行う。その際、回帰係数の有意性検定のｐ値を、変数の組入れ基準（０.０５未満）及び除外基準（０.０５超）として用いる。これにより、６個の変数、すなわち、G1592、G3031、G3826、G4370、G2645とG3177の交互作用、G3753とG3826の交互作用が選択される。そして、リンパ節転移の有無を予測するための判別式は、
Ｄ＝０.２３０７−２.７１３２×「Ｇ１５９２の発現量」
＋８.９５０９×「Ｇ３０３１の発現量」
＋８.７９７５×「Ｇ３８２６の発現量」
−２.３０９８×「Ｇ４３７０の発現量」
＋３.５１２６×「Ｇ２６４５の発現量」×「Ｇ３１７７の発現量」
−８.８２２６×「Ｇ３７５３の発現量」×「Ｇ３８２６の発現量」
と推定され、Ｄ＞０のときリンパ節転移あり、Ｄ≦０のときリンパ節転移なし、とする判別ルールが導かれる。この判別式に登場した７個の遺伝子、すなわちG1592、G2645、G3031、G3177、G3753、G3826、G4370をリンパ節転移の有無の識別に寄与する遺伝子のセットとして選択する。それらの遺伝子名を表１に記した。
【００４４】
最後に、選択した遺伝子セットによるリンパ節転移の判別性能がＬＯＯ法により評価される。すなわち、１サンプルを除いた残りの１４９サンプルのデータを用いて、上記の６個の変数を含むロジスティック判別式を推定し、それによって除いたサンプルを判別する操作を、１５０サンプルのそれぞれで実施する。これにより、表２に示すように、選択した遺伝子のセットによる正分類率は８８.７％（感度：７７.８％、特異度：９６.６％）と推定される。以上のように、本発明においては、大腸癌のリンパ節転移の有無を高い精度で予測するのに必要な遺伝子セットを明らかにすることができる。
【００４５】
以下に本発明を実施例により詳細に説明するが、これら実施例によって本発明は何ら制約を受けることはない。なお、実施例において使用した試薬類は特にことわりのない限り、ナカライテスク株式会社より購入したものを使用した。
【実施例１】
【００４６】
（１）大腸癌組織試料からの全ＲＮＡ調製
ＤＮＡマイクロアレイを用いた、大腸癌における遺伝子発現解析を行うための試料としては、インフォームドコンセントを経て収集された、大腸癌手術時に切除された大腸癌原発巣組織１５０例を用いた。その内訳は、原発巣除去手術時の組織病理学的な観察でリンパ節転移が認められた患者に由来する６３例（以下、「リンパ節転移陽性症例」と記載する）と、リンパ節転移が認められなかった患者に由来する８７例（以下、「リンパ節転移陰性症例」と記載する）である。これらの大腸癌組織試料からTRIzol試薬（GIBCO BRL社より購入）を用いて全ＲＮＡを抽出した。抽出手順は基本的に上記試薬に添付のマニュアルに従った。この他に、４０例分の正常大腸粘膜部分由来の全ＲＮＡを抽出し、それらを混合して、全ての実験を通して使用する標準正常大腸粘膜全ＲＮＡとした。これらのＲＮＡサンプルの濃度は、定法通りに分光光度計を用いて測定した波長２６０ｎｍでの吸光度に基づいて算出した。
【００４７】
（２）蛍光ラベルターゲットの調製
ＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズさせる蛍光ラベルターゲットは以下の手順で作製した。まず、２５μｇの大腸癌部試料由来全ＲＮＡ（以下、「大腸癌ＲＮＡ」と記す）と２５μｇの標準正常大腸粘膜全ＲＮＡ（以下、「標準大腸粘膜ＲＮＡ」と記す）を別々のチューブに入れ、それぞれに２μｇの１８ヌクレオチドから成るオリゴｄＴプライマーを加え、滅菌蒸留水にて容量を１４μＬとし、７０℃で１０分間加熱した後、直ちに氷上に移して急冷した。その後、それぞれのチューブに、６μＬの５×First Strand Buffer、３μＬの０.１Ｍ ＤＴＴ、１.５μＬの２０×ｄＮＴＰmix（１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及び６ｍＭのｄＴＴＰの混合物）及び０.５μＬのＲＮＡguardを添加した。
【００４８】
さらに、大腸癌ＲＮＡを入れた方のチューブに蛍光色素Ｃｙ３でラベルされたｄＵＴＰ（以下、「Ｃｙ３−ｄＵＴＰ」と記す；濃度１ｍＭ）を３μＬ、標準大腸粘膜ＲＮＡを入れた方のチューブにＣｙ５でラベルされたｄＵＴＰ（以下、「Ｃｙ５−ｄＵＴＰ」と記す；濃度１ｍＭ）を３μＬ加えて、４２℃にて２分間保温した。その後、逆転写酵素であるSuperscriptIIを各チューブに２μＬ加えて、４２℃にてさらに１時間保温することによりラベル反応を行った。この反応により、大腸癌ＲＮＡと標準大腸粘膜ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡ合成が起こる際に、それぞれＣｙ３−ｄＵＴＰとＣｙ５−ｄＵＴＰが取り込まれることにより、それぞれＣｙ３とＣｙ５で蛍光ラベルされた大腸癌ラベルターゲットと標準大腸粘膜ラベルターゲットが生成する。
【００４９】
この反応で使用した５×First Strand Buffer、０.１Ｍ ＤＴＴ及びSuperscriptIIは、いずれもGIBCO BRL社より購入した。また、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、Ｃｙ５−ｄＵＴＰ及びＣｙ３−ｄＵＴＰ、そしてＲＮＡguardはいずれもAmersham Biosciences社より購入した。反応後は、各チューブに５μＬの変性溶液（０.５Ｎ ＮａＯＨ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加して７０℃で１０分間加熱した後、７.５μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）を加えることにより中和した。これらの処理を行った段階で、大腸癌ラベルターゲットと標準大腸粘膜ラベルターゲットを混合し、ここに１０μｇのヒトＣＯＴ−１ ＤＮＡ（GIBCO BRL社より購入）を添加した。この混合液にＴＥバッファーを加えて５００μＬに調整し、Microcon−30（Amicon社より購入）を用いて精製・濃縮することにより、未反応のＣｙ５−ｄＵＴＰ及びＣｙ３−ｄＵＴＰなどを除去した。精製・濃縮の手順はMicrocon−30に添付のマニュアルに従った。最終的には、全容量が５μＬとなるまで濃縮し、これをＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズさせるラベルターゲットとした。
【００５０】
（３）ＤＮＡマイクロアレイの前処理
ＤＮＡマイクロアレイをマスキング溶液（３ｇの無水コハク酸、１９０ｍＬのＮ−メチル−２−ピロリドン及び２１ｍＬの０.２Ｍホウ酸ナトリウムの混合液）に５分間浸すことによりマスキングを行った後、９５℃の蒸留水に３分間浸すことにより、マイクロアレイ上にプリントされているｃＤＮＡを熱変性させた。その後直ちに９５％以上のエタノールに１分間浸して脱水し風乾させた。
【００５１】
（４）ラベルターゲットとＤＮＡマイクロアレイとのハイブリダイゼーション
前述のようにして調製したラベルターゲット溶液５μＬに対して、２.５μＬの１０ｍｇ／ｍＬのポリアデニン（Roche社より購入）、０.５μＬの１０％ＳＤＳ溶液、３μＬの２０×ＰＭ溶液（０.４％ＢＳＡと１％ＳＤＳの混合液）、１５μＬのホルムアミド、３μＬの２０×ＳＳＣ（３Ｍ塩化ナトリウム、０.３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７.０）及び滅菌蒸留水１μＬを添加し、１００℃で２分間加熱した後、暗所にて約３０分間室温で静置した。その後、前項に記載の方法で前処理したＤＮＡマイクロアレイのｃＤＮＡがプリントされている部分に滴下し、２４×４０ミリメートルのカバーガラス（マツナミガラス工業より購入）で覆い、マイクロアレイを密閉容器に入れ、その容器ごと４２℃のインキュベーターに約１６時間入れておくことにより、ラベルターゲットをマイクロアレイ上のｃＤＮＡにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの後、マイクロアレイを０.１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣに浸して１０分間洗浄し、次に、０.１％ＳＤＳを含む０.１×ＳＳＣに浸して１０分間洗浄した。さらに、０.１×ＳＳＣに浸して５分間の洗浄を２回行った後、滴を切って暗所で風乾させた。
【００５２】
（５）マイクロアレイのスキャンとデータ解析
洗浄後風乾させたマイクロアレイを、マイクロアレイ専用共焦点レーザースキャナであるScanArray 4000（GSI Lumonics社製）を使ってＣｙ３とＣｙ５の蛍光を独立にスキャンすることにより、マイクロアレイ上の各プローブにハイブリダイズした大腸癌ターゲットと標準大腸ターゲットに由来するＣｙ３とＣｙ５の蛍光パターンを１６のビットＴｉｆｆ形式のスキャン画像データとして得た。続いて、それらの画像データをマイクロアレイデータ専用解析ソフトであるQuantArrayソフトウェア（GSI Lumonics社製）を用いて解析することにより、全プローブについてのＣｙ３とＣｙ５の蛍光強度をテキスト形式の数値データとして得た。バックグラウンドの補正のために、ｃＤＮＡがプリントされていない部分の蛍光強度値を、各プローブについての蛍光強度値から差し引いた。また、蛍光強度値が低い部分は実験誤差の影響を大きく受けるため、蛍光強度値が高い方から約３０００のデータポイントを残して他のデータは棄却した。各プローブについてのＣｙ３とＣｙ５の蛍光強度値の比、すなわちＣｙ３／Ｃｙ５を算出し、底が２の対数値（以下、「ｌｏｇ（Ｃｙ３／Ｃｙ５）」と記載する）に変換した。スキャンの際に起こりうるＣｙ３とＣｙ５の検出感度調整のずれを補正して標準化するために、各プローブについてのｌｏｇ（Ｃｙ３／Ｃｙ５）値から、全ｌｏｇ（Ｃｙ３／Ｃｙ５）値の中央値（median）を差し引くことにより標準化ｌｏｇ（Ｃｙ３／Ｃｙ５）値を得た。
【００５３】
以上の操作により、標準大腸粘膜ＲＮＡを基準としたときの、リンパ節転移ありの症例６３例分及びリンパ節転移なしの症例８７例分の大腸癌原発巣の相対的発現強度を対数化し、標準化した数値データを得ることができた。また、同様の操作によって、標準大腸粘膜ＲＮＡを基準としたときの、正常大腸粘膜サンプル１２例分の数値データも得た。これらの数値データのうち、解析した１５０症例の大腸癌原発巣のうちの８５％にあたる１２８症例以上についてデータが取得できており、かつ、１５０症例の大腸癌原発巣のデータ内での分散値（variance）が、１２例の正常大腸粘膜についてのデータ内での分散値の１．１倍を超えていた合計２,１２１種類のプローブについてのデータのみを以降の統計解析に使用した。
【００５４】
これらの２,１２１プローブのデータの中には、症例によっては発現量が低く、カットオフ値を下回ったために棄却されたものも含まれており、それらのデータは欠損値となっている。このような欠損値は合計で８,８１６個存在していた。全データ数は１５０×２,１２１＝３１８,１５０個であることから、欠損値の含有率は約２.８％である。これらの欠損値の存在は、後の統計解析において不都合を生じるため、k-Nearest Neighbor法を用いて、それらを補完した。具体的には、１５０症例×２,１２１プローブのデータ行列において、欠損値となっていた発現量を、サンプル間距離でその遺伝子に最も近い８個の遺伝子の発現量の平均値で推定した。具体的には、１５０症例×２,１２１プローブのデータ行列において、ペアにした全てのサンプル間の距離を計算した。そして、欠損値のあるサンプルと最も距離の近かった８個のサンプルで補完すべき遺伝子発現量の平均値を求め、それを欠損値の補完値として用いた。ここに、欠損値のあるサンプルと最も距離の近いサンプルの個数は、個数を順次増加させroot mean square（RMS）が最小となる個数で定義した。このようにして欠損値を補完して得られた全数値データを以降、標準化遺伝子発現データと記載する。
【実施例２】
【００５５】
標準化遺伝子発現データの統計解析によるリンパ節転移予測のための高判別能遺伝子セットの決定
本実施例においては、ＤＮＡマイクロアレイにプリントしたプローブを指して遺伝子と呼称することがある。
最初の試みとして、判定用遺伝子セットの同定のために次の４つのアプローチを適用した。すなわち、（a）Support Vector Machine（SVM）（Hastieら、The Elements of Statistical Learning-Data Mining, Inference, and Prediction, Springer, 2001）、（b）Principal Component Analysis/artificial Neural Network（PCA/aNN）（Khanら、Nature Medicine, vol. 7, p. 673−679, 2001）の拡張法、（c）Hierarchical Cluster Analysis（HCA） ＋ Stepwise Logistic Discrimination及び（d）Classification And Regression Tree（CART）（Breimanら、Classification and Regression Trees, Wadswarth, 1983） ＋ Logistic Discrimination、の４通りの手法を用いた。
【００５６】
遺伝子群の同定に際しては、統計学的な信頼性を担保する目的で、全データを判定用遺伝子同定用と評価用の２群に分けて解析を行った。より具体的に述べると、１５０例のデータを、リンパ節転移ありの４２例とリンパ節転移なしの５７例から成る９９例と、リンパ節転移ありの２１症例とリンパ節転移なしの３０例から成る５１例、の２群に分け、前者の９９例分のデータをリンパ節転移の有無を判定するための遺伝子の同定と判別式の確立に使用し、その判別式で後者の５１例分のデータを判別することにより、遺伝子の同定と判別式の評価を行った。以降の記載においては、前者の９９例分のデータのように判定用遺伝子の同定及び判別式の確立に使用されるデータを「トレーニング用データ」と表現し、後者の５１例分のデータのように判別式の評価に使用するデータを「テスト用データ」と表現することがある。
【００５７】
上記４つのアプローチのうちの（ａ）、（ｃ）及び（ｄ）の３つに関しては、上記のデータの２分割をランダムに１００回行って解析することにより、１００通りの判定用遺伝子群を同定したうえで、同定された回数が多かった遺伝子を採用した。一方、上記（ｂ）のアプローチに関しては、最初の２分割についてのみ実施した。ただし、トレーニング用の９９例分のデータを２対１の割合で１２５０回ランダムに２分割し、それを用いて主成分分析とニューラルネットワークの学習を反復した。学習後、リンパ節転移の有無を識別する感度に基づき遺伝子をランキングし、遺伝子を絞り込んだ。２１２１個の遺伝子から開始し、以降１５３６個、７６８個、３８４個、１９２個、９６個、４８個、２４個の絞り込み個数のそれぞれで学習を進めた。
【００５８】
以上の検討の結果、各アプローチごとに判別用遺伝子セットと判別式を確立することができた。各遺伝子セットに含まれる遺伝子の個数と、確立された判別式を用いたテスト用データの正分類率（判別式での判別結果と組織病理学的検査の結果が一致した症例数／テスト用データ数×１００（％））の平均値は、（ａ）については遺伝子数が１４４個で正分類率は８０.２％（標準偏差は５.６％）、（ｂ）については遺伝子数が１９２個で正分類率は（９０.２％）、（ｃ）については遺伝子数が１３３個で正分類率は７８.６％（標準偏差は６.２％）及び（ｄ）については遺伝子数が１３８個で正分類率は８６.３％（標準偏差：４.５％）であった。また、各アプローチで選択された遺伝子セットに共通して含まれていた遺伝子が１６種類あった。
【００５９】
上記のように、４つの異なるアプローチのそれぞれで、８０％を超える高い正分類率を達成することができた。しかしながら、判別に使用する遺伝子の数はどのアプローチでも１００種類を超えており、実際にアッセイ法として実用化するためには多すぎると考えた。
【００６０】
そこで、正分類率を落とさないようにしつつ、判定に使用する遺伝子の数を絞り込んで新たな判別ルールを確立することを考えた。そのために、まず対象とする遺伝子を上記の各アプローチで選択された遺伝子セットに共通して含まれていた１６遺伝子とした。次に、これら１６遺伝子各々の寄与（以下、「主効果」と記載する）に加えて、２遺伝子の交互作用も加味することに工夫した。個別の遺伝子による主効果だけでなく、遺伝子間の交互作用を含めたより広い範囲で判別ルールを探索することで、高い判別性能を維持できることを期待した。
【００６１】
交互作用探索のために、前述の解析で用いた１００通りのトレーニング用データのそれぞれで、リンパ節転移の有無を応答とするＣＡＲＴ解析を再度行った。その結果、データの分割を指示する変数として登場した遺伝子の個数は、１回の解析あたり３個から５個であった。登場した遺伝子が例えば３個の場合、とり得る遺伝子のペアは３通りあるため、それら全てのペアを交互作用として捉えた。同様にして、遺伝子が４個の場合は６組、５個の場合は１０組の各ペアを交互作用として捉えた。そして、１００通りの解析のうち、１２回以上現れた１８組の遺伝子ペアを交互作用の候補として選択した。
【００６２】
次に判別式の確立のために、１５０例のデータを用いて、１６遺伝子の主効果と１８通りの交互作用を説明変数とし、リンパ節転移の有無を応答としたロジスティック回帰モデルにおいてステップワイズの変数選択を行った。その際、回帰係数の有意性検定のｐ値を、変数の組入れ基準（０.０５未満）及び除外基準（０.０５超）として用いた。その結果、６個の変数、すなわち、G1592、G3031、G3826、G4370、G2645とG3177の交互作用、G3753とG3826の交互作用が選択された。G1592、G3031、G3826、G4370、G2645、G3177及びG3753とは、本発明で使用したColonoChip上の各プローブ（遺伝子）に付与したシリアル番号である。そして、リンパ節転移の有無を判定するための判別式は、
Ｄ＝０.２３０７−２.７１３２×Ｇ１５９２の発現量
＋８.９５０９×Ｇ３０３１の発現量
＋８.７９７５×Ｇ３８２６の発現量
−２.３０９８×Ｇ４３７０の発現量
＋３.５１２６×Ｇ２６４５の発現量×Ｇ３１７７の発現量
−８.８２２６×Ｇ３７５３の発現量×Ｇ３８２６の発現量
と推定され、Ｄ＞０のときリンパ節転移あり、Ｄ≦０のときリンパ節転移なし、とする判別ルールが導かれた。
【００６３】
この判別式に登場した７個の遺伝子、すなわちG1592、G2645、G3031、G3177、G3753、G3826、及びG4370をリンパ節転移の有無の識別に寄与する遺伝子のセットとして選択した。それらの遺伝子名を表１に記した。表１中には上記の各遺伝子のＲｅｆＳｅｑデータベースにおけるアクセス番号も併記した。RefSeqデータベースにはNational Center for Biotechnology Information（NCBI）のWeb site（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/index.html）からアクセスすることができる。
【００６４】
【表１】
2007037421.tif 000002
【００６５】
最後に、選択した遺伝子セットによるリンパ節転移の判定性能をＬＯＯ法により評価した。すなわち、１サンプルを除いた残りの１４９サンプルのデータを用いて、上記の６個の変数を含むロジスティック判別式を推定し、それによって除いたサンプルを判別する操作を、１５０サンプルのそれぞれで実施した。その結果を表２に示した。表２から、選択した遺伝子のセットによる正分類率は８８.７％（感度：７７.８％、特異度：９６.６％）と推定された。
【００６６】
【表２】
2007037421.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明により可能となるリンパ節転移の判定によって、症例に応じたよりよい治療方針の選択が可能であり、また医療経済効果も期待できる。例えば、リンパ節転移の可能性の高い症例に対しては積極的な治療を施行することによって予後の改善が期待できるし、一方、リンパ節転移の可能性の低い症例に対しては、術後補助療法は軽度のものにすることができ、患者の肉体的・経済的負担を軽くすることができる。
【００６８】
さらに、本発明で開示される遺伝子セットに含まれる個々の遺伝子は、リンパ節転移の原因として機能するものである可能性も推察されるため、これらの遺伝子及びその発現産物を標的とする薬剤を開発し、リンパ節転移を直接抑制できるようにすることも期待できる。