(57)【要約】【課題】  ウシの脂肪交雑形成能力を遺伝子型解析により判定するウシの脂肪交雑形成能力の予測、遺伝子型判定方法およびそれに使用するキットを提供する。【解決手段】  ウシのＥＤＧ１遺伝子の＋１６６ｂｐおよび＋３６９８ｂｐの少なくとも一方におけるＳＮＰタイプを判定することを特徴とするウシの脂肪交雑形成能力の予測、遺伝子型判定方法および試料中のウシのＥＤＧ１遺伝子の＋１６６ｂｐを含む領域の配列を増幅するプライマーと制限酵素ＢａｌＩまたはＭｓｃＩ、および＋３６９８ｂｐを含む領域の配列を増幅するプライマーと制限酵素ＥｃｏＴ１４Ｉの少なくとも一方からなることを特徴とする上記方法によるウシの脂肪交雑形成能力の予測、遺伝子型判定用ＲＣＲ−ＲＦＬＰキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるウシのＥＤＧ１遺伝子であって、＋１６６ｂｐがＧＧホモ型で＋３６９８ｂｐがＡＡホモ型、＋１６６ｂｐがＡＡホモ型で＋３６９８ｂｐがＧＧホモ型、または＋１６６ｂｐがＧＡヘテロ型で＋３６９８ｂｐがＡＧヘテロ型であるウシの脂肪交雑形成能力に関与する遺伝子多型。
【請求項２】
ウシのＥＤＧ１遺伝子の＋１６６ｂｐおよび＋３６９８ｂｐの少なくとも一方における一塩基多型（ＳＮＰ）タイプを判定することを特徴とするウシの脂肪交雑形成能力の予測、遺伝子型判定方法。
【請求項３】
ＳＮＰタイプの判定を制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析により、＋１６６ｂｐについては、ＢａｌＩまたはＭｓｃＩを、＋３６９８ｂｐについてはＥｃｏＴ１４Ｉを用いて行う請求項２記載の方法。
【請求項４】
ウシのＥＤＧ１遺伝子の＋１６６ｂｐを含む領域の配列を増幅するプライマー、＋３６９８ｂｐを含む領域の配列を増幅するプライマー、ならびに制限酵素ＢａｌＩ、ＭｓｃＩおよびＥｃｏＴ１４Ｉから選ばれる試薬の少なくとも１つを含む請求項２記載の方法によるウシの脂肪交雑形成能力の予測、遺伝子型判定用キット。
【請求項５】
試料中のウシのＥＤＧ１遺伝子の＋１６６ｂｐを含む領域の配列を増幅するプライマーと制限酵素ＢａｌＩまたはＭｓｃＩ、および＋３６９８ｂｐを含む領域の配列を増幅するプライマーと制限酵素ＥｃｏＴ１４１の少なくとも一方からなるＰＣＲ−ＲＦＬＰキットである請求項４記載のキット。
【請求項６】
＋１６６ｂｐを含む領域が、ＥＤＧ１遺伝子の第１エキソンまたはその一部、＋３６９８ｂｐを含む領域がＥＤＧ１遺伝子の第２エキソンまたはその一部である請求項４または５記載のキット。
【請求項７】
プライマーが、配列番号２と配列番号３に示す配列からなるプライマー、配列番号４と配列番号５に示す配列からなるプライマーの少なくとも一方である請求項４または５記載のキット。
【請求項８】
ウシのＥＤＧ１遺伝子の＋１６６ｂｐを含む領域の配列増幅用のプライマー。
【請求項９】
＋１６６ｂｐを含む領域が、ＥＤＧ１遺伝子の第１エキソンまたはその一部である請求項８記載のプライマー。
【請求項１０】
配列番号２および配列番号３に示す配列からなる請求項８記載のプライマー。
【請求項１１】
ウシのＥＤＧ１遺伝子の＋３６９８ｂｐを含む領域の配列増幅用のプライマー。
【請求項１２】
＋３６９８ｂｐを含む領域が、ＥＤＧ１遺伝子の第２エキソンまたはその一部である請求項１１記載のプライマー。
【請求項１３】
配列番号４および配列番号５に示す配列からなる請求項１１記載のプライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウシ脂肪交雑形成能力の遺伝子診断、さらに詳しくは、ウシ脂肪交雑形成能力の関与する遺伝子、その遺伝子型を判定し、ウシの脂肪交雑形成能力を予測する方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
「霜降り」や「サシ」と称されるウシの脂肪交雑は牛肉の肉質を評価、判定する上で重要な因子であり、脂肪交雑形成能力の高い個体とそうでない個体をウシの肥育の早期に判別し、それらの能力に合った肥育計画を立てることができれば、肉用牛の生産において非常に望ましい。さらに、その能力を早期に判定できれば、世代間隔を短縮することができ、育種改良に多大の貢献をする。
このような事情に鑑み、ウシの脂肪交雑形成能力を遺伝子型解析により判定すべく、従来から、ウシの脂肪交雑形成に関与する原因遺伝子の探索、同定が試みられている。例えば、特許文献１ではウシの脂肪細胞分化のマスターキーといわれているウシＰＰＡＲγ遺伝子の１つであるウシＰＰＡＲγ２の変異体が開示されている。
また、本発明者らは、先に、ウシの脂肪交雑形成に影響する遺伝子を特定することを目的として、系統的に脂肪交雑形成能力の異なることが判明しているウシ群間で、脂肪交雑形成が始まる前後８〜１４ヶ月齢の時期に発現するｍＲＮＡ量を調べ、配列既知の５つの候補遺伝子を選抜した（平成１７年３月２７日〜２９日開催の日本畜産学会第１０４回大会にて発表）。その後、これらの遺伝子のゲノム配列を決定し、いくつかの遺伝子において一塩基多型（ＳＮＰ）が存在することを見出した（平成１７年９月１１日、１２日開催の日本動物遺伝育種学会第６回大会にてポスター発表）。
しかしながら、これまで、実際にウシの脂肪交雑形成能力の予測、遺伝子型判定に用いることのできる、原因遺伝子のＳＮＰは知られていない。
【特許文献１】特開２００１−８６８８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の主な目的は、ウシの脂肪交雑形成能力を遺伝子型解析により判別するウシの脂肪交雑形成能力の予測、遺伝子型判定方法およびそれに使用するキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、この度、上記の本発明者らが見出したＳＮＰが存在するいくつかの遺伝子のうち、血管伸長に関連すると推測されるウシＥＤＧ１遺伝子の正確なＳＮＰ部位を特定し、それがＳＮＰタイプにより特定の制限酵素で切断可能な場合と不可能な場合があり、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析でタイプ分けできること、当該ＳＮＰタイプとウシ個体の脂肪交雑形成能力に統計的に有意な相関関係があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）配列番号１で示されるウシのＥＤＧ１遺伝子であって、＋１６６ｂｐがＧＧホモ型で＋３６９８ｂｐがＡＡホモ型、＋１６６ｂｐがＡＡホモ型で＋３６９８ｂｐがＧＧホモ型、または＋１６６ｂｐがＧＡヘテロ型で＋３６９８ｂｐがＡＧヘテロ型であるウシの脂肪交雑形成能力に関与する遺伝子多型、
（２）ウシのＥＤＧ１遺伝子の＋１６６ｂｐおよび＋３６９８ｂｐの少なくとも一方における一塩基多型（ＳＮＰ）タイプを判定することを特徴とするウシの脂肪交雑形成能力の予測、遺伝子型判定方法、
（３）ＳＮＰタイプの判定を制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析により、＋１６６ｂｐについては、ＢａｌＩまたはＭｓｃＩを、＋３６９８ｂｐについてはＥｃｏＴ１４Ｉを用いて行う上記（２）記載の方法、
（４）ウシのＥＤＧ１遺伝子の＋１６６ｂｐを含む領域の配列を増幅するプライマー、＋３６９８ｂｐを含む領域の配列を増幅するプライマー、ならびに制限酵素ＢａｌＩ、ＭｓｃＩおよびＥｃｏＴ１４Ｉから選ばれる試薬の少なくとも１つを含む上記（２）記載の方法によるウシの脂肪交雑形成能力の予測、遺伝子型判定用キット、
（５）試料中のウシのＥＤＧ１遺伝子の＋１６６ｂｐを含む領域の配列を増幅するプライマーと制限酵素ＢａｌＩまたはＭｓｃＩ、および＋３６９８ｂｐを含む領域の配列を増幅するプライマーと制限酵素ＥｃｏＴ１４１の少なくとも一方からなるＰＣＲ−ＲＦＬＰキットである上記（４）記載のキット、
（６）＋１６６ｂｐを含む領域が、ＥＤＧ１遺伝子の第１エキソンまたはその一部、＋３６９８ｂｐを含む領域がＥＤＧ１遺伝子の第２エキソンまたはその一部である上記（４）または（５）記載のキット、
（７）プライマーが、配列番号２と配列番号３に示す配列からなるプライマー、配列番号４と配列番号５に示す配列からなるプライマーの少なくとも一方である上記（４）または（５）記載のキット、
（８）ウシのＥＤＧ１遺伝子の＋１６６ｂｐを含む領域の配列増幅用のプライマー、
（９）＋１６６ｂｐを含む領域が、ＥＤＧ１遺伝子の第１エキソンまたはその一部である上記（８）記載のプライマー、
（１０）配列番号２および配列番号３に示す配列からなる上記（８）記載のプライマー、
（１１）ウシのＥＤＧ１遺伝子の＋３６９８ｂｐを含む領域の配列増幅用のプライマー、
（１２）＋３６９８ｂｐを含む領域が、ＥＤＧ１遺伝子の第２エキソンまたはその一部である上記（１１）記載のプライマー、および
（１３）配列番号４および配列番号５に示す配列からなる上記（１１）記載のプライマーを提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
以下の実施例に示すごとく、本発明の方法により、黒毛和種種雄牛６３頭について相関解析を行った結果、ＥＤＧ１遺伝子第１エキソン内の＋１６６ｂｐにおける遺伝子型間の変動が５％有意水準に近かった。また、脂肪交雑の育種価上位２０頭と下位２０頭との間で、遺伝子頻度に危険率１％水準以下で有意な差が認められ、Ｇ対立遺伝子頻度は上位群で高く、脂肪交雑形成に対してＧ対立遺伝子がプラスに働いていることが分かった。さらに、優良種雄牛を父に持つ種雄牛４頭（遺伝子型はいずれもＧＡヘテロ型）の半きょうだい肥育牛２８３頭の育種価について、遺伝子型を母数効果、種雄牛を変量効果とするモデルで分散分析を行ったところ、危険率５％以下でこの遺伝子多型が脂肪交雑形成能力に関与し、Ｇ対立遺伝子が脂肪交雑に対してプラスの効果をもっていることが示された。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
配列表の配列番号１にウシのＥＤＧ１遺伝子のゲノム配列を示す。配列番号１中、第２８２塩基のｒ（ＧまたはＡ）が第１エキソン内の＋１６６ｂｐに該当し、第３８１４塩基のｒ（ＡまたはＧ）が＋３６９８ｂｐに該当する。第１１７塩基から第４２７塩基までが第１エキソンに該当し、第２０５４塩基から第４７７２塩基までが第２エキソンに該当する。
本発明者らによって見出されたウシの脂肪交雑形成能力に関与するＳＮＰは、配列番号配列１において、＋１６６ｂｐがＧＧホモ型で＋３６９８ｂｐがＡＡホモ型、＋１６６ｂｐがＡＡホモ型で＋３６９８ｂｐがＧＧホモ型、または＋１６６ｂｐおよび＋３６９８ｂｐが共にＧＡヘテロ型のウシＥＤＧ１遺伝子多型である。
【０００８】
本発明の方法は、ウシ個体から採取した検体から抽出した試料ＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、ＥＤＧ１遺伝子の＋１６６ｂｐおよび＋３６９８ｂｐの少なくとも一方におけるＳＮＰタイプを＋１６６ｂｐについては、ＢａｌＩまたはＭｓｃＩを、＋３６９８ｂｐについてはＥｃｏＴ１４Ｉを用いて行うＲＦＬＰ分析により判定するものである。
検体としては、血液、精液等の生物体の一部を使用でき、これらから、常法により試料ＤＮＡを抽出して判定を行う。
【０００９】
ＰＣＲは公知の方法に従って行うことができる。
ＰＣＲに使用するプライマーは、ＥＤＧ１遺伝子の＋１６６ｂｐを含む領域、例えば、ＥＤＧ１遺伝子の第１エキソンまたはその一部、＋３６９８ｂｐを含む領域、例えば、ＥＤＧ１遺伝子の第２エキソンまたはその一部を増幅するための配列を適宜設計すればよい。
例えば、＋１６６ｂｐを含む領域を増幅するセンスプライマーとして配列番号２、アンチセンスプライマーとして配列番号３で示す配列が挙げられる。また、＋３６９８ｂｐを含む領域を増幅するセンスプライマーとして配列番号４、アンチセンスプライマーとして配列番号５で示す配列が挙げられる。
【００１０】
また、ＲＦＬＰ分析も公知の方法に従って行うことができる。
＋１６６ｂｐにおけるＳＮＰのＡ対立遺伝子は制限酵素ＢａｌＩまたはＭｓｃＩで切断されるが、Ｇ対立遺伝子は切断されない。＋３６９８ｂｐにおけるＳＮＰのＧ対立遺伝子は制限酵素ＥｃｏＴ１４Ｉで切断されるが、Ａ対立遺伝子は切断されない。これにより、電気泳動で切断の有無を調べることによりＳＮＰタイプが判定できる。
本発明においては、＋１６６ｂｐおよび＋３６９８ｂｐの両方におけるＳＮＰタイプを判定してもよいが、両方のＳＮＰタイプは非常に強く連鎖しており、どちらか一方のＳＮＰタイプの判定で足りる。
【００１１】
本発明のキットは、ウシのＥＤＧ１遺伝子の＋１６６ｂｐを含む領域の配列を増幅するプライマー、＋３６９８ｂｐを含む領域の配列を増幅するプライマー、ならびに制限酵素ＢａｌＩ、ＭｓｃＩおよびＥｃｏＴ１４Ｉから選ばれる試薬の少なくとも１つを含む。好ましくは、ウシのＥＤＧ１遺伝子の＋１６６ｂｐを含む領域の配列を増幅するプライマーと制限酵素ＢａｌＩまたはＭｓｃＩ、および＋３６９８ｂｐの配列を増幅するプライマーと制限酵素ＥｃｏＴ１４Ｉの少なくとも一方からなるＰＣＲ−ＲＦＬＰキットとする。当該キットにはこれ以外に検体からのゲノムＤＮＡの抽出試薬や、必要な器具、判定用の説明書等が含まれていてもよい。
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１２】
ＥＤＧ１のＰＣＲ−ＲＦＬＰによる遺伝子型判定
（１）試料の採取
種雄牛については血液あるいは精液を採取、肥育牛については食肉市場で屠殺された個体から脂肪組織を採取して用いた。これらの検体から常法によりゲノムＤＮＡを抽出した。
血液からの抽出にはReadyAmpTM Genomic DNA Purification System(Promega)を、精液および脂肪組織からの抽出にはWizard SV Genomic DNA Purification System(Promega)を用いた。
（２）ＤＮＡの増幅
下記プライマーを使用し、下記反応液を、９４．０℃で２分間の加熱１サイクルと、９４．０℃で３０秒、５０．０℃で３０秒、ついで７２．０℃で１分の加熱を３５サイクル繰り返してＤＮＡを増幅した。
ＰＣＲ用プライマー配列
＋１６６ｂｐ
GAAGACCTCCGGCCGCGAT（配列番号２）
GTCTCAGCTGCACAGATCC（配列番号３）
＋３６９８ｂｐ
GTGCACTTCTGCTTCCCTAG（配列番号４）
TGCAGCCTACCTGCTAC（配列番号５）
反応液
ゲノムDNA溶液              3.0μl
5×Go taq buffer（Promega）4.0μl
dNTP mix（各2.5mM）        2.0μl
プライマーミックス
（各20μM）                1.0μl
Go taq（5U/μl）（Promega） 0.1μl
水                          9.9μl
全量                       20.0μl
（３）制限酵素処理
下記反応液を３７℃で１時間インキュベーションして制限酵素処理した後、制限酵素処理反応液７．５μｌを１％アガロースゲルで１００Ｖ、３０分間電気泳動した。図１に＋１６６ｂｐについての電気泳動パターンの例を示す。図中の各レーンはつぎのとおりである。
１：マーカー
２、５：ＧＡ型
３：ＡＡ型
４、６：ＧＧ型
反応液
＋１６６ｂｐ（Ｇ／Ａ）
PCR反応液                  4.00μl
BSA（1mg/ml）              1.00μl
TA buffer（TOYOBO）        1.00μl
MscI（8U/μl）（TOYOBO） 0.25μl
水                         3.75μl
全量                         10.00μl
＋３６９８ｂｐ（Ａ／Ｇ）
PCR反応液                    4.00μl
10×H buffer（TAKARA）       1.00μl
EcoT14I（10U/μl）（TAKARA）0.50μl
水                           4.50μl
全量                           10.00μl
【実施例２】
【００１３】
統計解析
各種のウシ個体について、実施例１と同様にしてＳＮＰタイプを判定し、分散分析により脂肪交雑形成能力との相関関係を統計的に調べた。
分散分析には最小二乗分散分析法を用いて、計算はＳＡＳのＧＬＭプロシジャを用いた。独立性検定にはFisherの直接検定またはχ２検定を用いて、計算にはＦＲＥＱプロシジャを用いた。
（１）大分県産種雄牛「糸福」および後代種雄牛を用いた相関解析
検出されたＳＮＰと脂肪交雑との相関解析を行う予備的な解析として、脂肪交雑に関する育種価が得られている大分県種雄牛「糸福」とその後代種雄牛１７頭の合計１８頭についてＳＮＰ遺伝子型と脂肪交雑との間の相関解析を行った。
結果を表１に示す。
【表１】
2007252271.tif 000002
２つＳＮＰは非常に強く連鎖してハプロタイプを構成していた。
【００１４】
＋１６６ｂｐにおける遺伝子型ごとの育種価の平均値を比較した結果を表２に示す。
【表２】
2007252271.tif 000003
統計的に有意な差は見られなかったが、頭数を増やすことで有意性がますことが期待された。
【００１５】
（２）大分県産種雄牛６３頭を用いた相関解析
材料として脂肪交雑に関する育種価が得られている大分県の黒毛和種種雄牛６３頭を用いて、ＥＤＧ１の＋１６６ｂｐにおけるＳＮＰと脂肪交雑との相関解析を行った。
結果を表３および表４に示す。
【表３】
2007252271.tif 000004
【表４】
2007252271.tif 000005
【００１６】
分散分析の結果、５％水準で有意な差は認められなかったが、Ｐ値が０．０５９８と有意水準に近い値を示しており脂肪交雑との関連を示唆する結果であった。
そこで、６３頭を育種価の高い順に並べ上位群と下位群で２０頭ずつ選抜し、群間での遺伝子型頻度および遺伝子頻度の差について検定した。
結果を表５および表６に示す。
【表５】
2007252271.tif 000006
【表６】
2007252271.tif 000007
脂肪交雑能力の異なる群間での頻度の差を検定した結果、遺伝子型頻度で５％水準、遺伝子頻度では１％水準で有意な差が認められた。上位群でＧ対立遺伝子頻度が高く、脂肪交雑形成に対してＧ対立遺伝子がプラスに働いていることが示された。
ただし、今回用いた６３頭の種雄牛は色々な系統に属しており、集団の構造化やＥＤＧ１以外の遺伝子の関与が考えられるので、特定の種雄牛の後代肥育牛を用いて、さらに頭数を増やした相関解析を行う必要があると考えられた。
【００１７】
（３）「糸福」の後代種雄牛の半きょうだい肥育牛２８３頭を用いた相関解析
表７に示す遺伝子型がＧＡヘテロである大分県産種雄牛４頭（Ｇ２５６６、Ｇ２８８０、Ｇ３０３４、Ｇ３１３４）の後代肥育牛２８３頭を用いて、上記と同様の解析を行った。ここでは脂肪交雑と同じく脂肪蓄積に関連する形質である皮下脂肪厚についても相関解析を行った。
結果を表８に示す。
【表７】
2007252271.tif 000008
【表８】
2007252271.tif 000009
【００１８】
脂肪交雑と皮下脂肪厚の育種価について、種雄牛の変量効果を含むモデルでＳＡＳのＧＬＭプロシジャを用いた分散分析を行った。以下に数学モデルを示す。
［数１］
ｙ＝μ＋ｇ＋ｓ＋ｅ
式中、ｙ：育種価、μ：集団平均、ｇ：遺伝子型の母数効果、ｓ：種雄牛の変量効果、
ｅ：残差
結果を表９に示す。
【表９】
2007252271.tif 000010
表９に示すごとく、脂肪交雑の育種価については遺伝子型の効果が５％水準で有意であった。また、遺伝子型の最小二乗平均値間で比較したところ、ＧＧ型とＡＡ型との間では５％水準で有意な差が認められた（表１０）。一方、皮下脂肪厚では、遺伝子型に有意な効果は認められなかった。
【表１０】
2007252271.tif 000011
以上の結果から、ＥＤＧ１のＳＮＰは脂肪交雑と相関があり、＋１６６ｂｐにおけるＳＮＰのＧ対立遺伝子が脂肪交雑形成に対してプラスに働いていることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００１９】
以上記載したごとく、本明細書に開示する遺伝子型を判定することにより、肥育牛の早期段階において脂肪交雑能力の高い個体とそうでない個体を判別し、それらの能力に合った肥育計画を立てることができると考えられる。脂肪交雑は肥育牛の価格を決める重要な因子であり、肉用牛産業に多大な貢献ができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例１におけるＰＣＲ−ＲＦＬＰの一例を示す電気泳動パターン。
【配列表フリーテキスト】
【００２１】
配列番号２：Designed oligonucleotide primer for amplifying bovine EDG1 gene
region containing +166bp
配列番号3:Designed oligonucleotide primer for amplifying bovine EDG1 gene
region containing +166bp
配列番号4:Designed oligonucleotide primer for amplifying bovine EDG1 gene
region containing +3698bp
配列番号5:Designed oligonucleotide primer for amplifying bovine EDG1 gene
region containing +3698bp
【図１】
2007252271.tif 000012
【配列表】
2007252271000001.app