(57)【要約】【課題】生体分子と化合物との相互作用および変化の要因を簡便かつ短時間で精度よく検出する。【解決手段】（１）蛍光標識したタンパク質のみのサンプルと、蛍光標識したタンパク質と化合物とを混合したサンプルとを用意する。（２）温度、ｐＨ、塩濃度や界面活性剤濃度などの条件をサンプルごとに変えて反応実験を行う。（３）反応させた混合液についてＦＣＳ測定を行い、サンプル中の蛍光分子について、並進拡散係数と分子数と明るさとを求める。（４）ＦＣＳ測定で得られたデータを基に反応の有無および種類を判断する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光標識された生体分子と化合物とを混合するステップと、
混合後に、互いに異なる温度または酸性度または添加物濃度の状態におかれた複数の混合溶液について、蛍光解析法により前記混合溶液中の蛍光を発する分子の大きさまたは明るさまたは数を求めるステップと、
前記求められた大きさまたは明るさまたは数に基づいて、生体分子と化合物との相互作用と、生体分子自体の変化または生体分子と化合物との反応生成物の変化の有無と、前記有無の要因となる温度または酸性度または添加物濃度とを検出するステップと
を含むことを特徴とする生体分子と化合物との相互作用および変化の要因を検出する方法。
【請求項２】
前記蛍光解析法は、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）および蛍光相互相関分光法（ＦＣＣＳ）、蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）、蛍光偏光解析法（FIDA-polarization）、多項目蛍光強度分布解析法（ＦＩＭＤＡ）、共焦点蛍光寿命解析法（ｃＦＬＡ）、蛍光強度寿命分布解析法（ＦＩＬＤＡ）、共焦点時間分解蛍光違法性解析法（ｃＴＲＡ）のいずれかひとつであることを特徴とする請求項１に記載の生体分子と化合物との相互作用および変化の要因を検出する方法。
【請求項３】
前記化合物を含まず、かつ蛍光標識された前記生体分子を含む複数の溶液を前記互いに異なる温度または酸性度または添加物濃度の状態におき、前記複数の溶液について、蛍光解析法により前記溶液中の蛍光を発する分子の大きさまたは明るさまたは数を求めるステップをさらに含み、
前記検出するステップでは、前記複数の溶液について求められた大きさまたは明るさまたは数に基づいて、生体分子と化合物との反応生成物の変化の有無と、前記有無の要因となる温度または酸性度または添加物濃度とを検出することを特徴とする請求項１に記載の生体分子と化合物との相互作用および変化の要因を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体分子と化合物との相互作用および変化の要因を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特表２００２−５１４５７１号公報は、タンパク質の熱ほどけを測定することによって生体分子と化合物との相互作用を解析または検出することを記載している。
【０００３】
特開２００３−１５６４４４号公報は、タンパク質を蛍光スフィアに結合させ、スフィアの凝集を測定することによって、タンパク質の結合反応を検出することを記載している。
【０００４】
特開２００１−２０８７５４号公報は、タンパク質を親疎水性ブロックポリマーに結合させ、ポリマーの凝集を測定することによって、タンパク質の結合反応を検出することを記載している。
【０００５】
特表２０００−５１１６２９号公報は、生体分子と化合物をマイクロプレート内で加熱し、タンパク質の熱ほどけに伴う熱変性曲線を解析して、タンパク質と化合物との相互作用を検出することを記載している。
【０００６】
文献「pH-Dependent Aggregate Forms and Conformation of Alzheimer Amyloid b-Peptide (12-24)」（Abeほか、The Journal of Biochemistry, Vol.132, pp.863-874 (2002)）は、アルツハイマーアミロイドタンパクのｐＨ条件の違いによる凝集物の大きさを電子顕微鏡で測定、解析することを記載している。
【特許文献１】特表２００２−５１４５７１号公報
【特許文献２】特開２００３−１５６４４４号公報
【特許文献３】特開２００１−２０８７５４号公報
【特許文献４】特表２０００−５１１６２９号公報
【非特許文献１】「pH-Dependent Aggregate Forms and Conformation of Alzheimer Amyloid b-Peptide (12-24)」（Abeほか、The Journal of Biochemistry, Vol.132, pp.863-874 (2002)）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記従来技術は、タンパク質などの生体分子を固体に固定した上で、生体分子と化合物とを反応させ、生体分子が凝集したことを検出することで、生体分子と化合物との反応の有無や程度を検出している。従って、固体に固定できない生体分子や化学物質は凝集を検出することができない。また、タンパク質の凝集物の大きさの変化を電子顕微鏡で観察する場合には、観察対象の取り扱いが容易ではない。
【０００８】
また従来技術は、熱ほどけによるタンパク質の構造変化に注目して、蛍光標識つき化合物との反応を検出しているので、熱条件以外でのタンパク質の変化や熱ほどけを伴わないタンパク質と化合物との反応ついて検出できない。
【０００９】
また従来技術は、タンパク質の凝集物全体について蛍光測定を行っているので、分子レベルでのタンパク質と化合物との反応ついて検出できない。
【００１０】
本発明の目的は、生体分子と化合物との相互作用および変化の要因を簡便かつ短時間で精度よく検出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、生体分子と化合物との相互作用および変化の要因を検出する方法であり、蛍光標識された生体分子と化合物とを混合するステップと、混合後に、互いに異なる温度または酸性度または添加物濃度の状態におかれた複数の混合溶液について、蛍光解析法により前記混合溶液中の蛍光を発する分子の大きさまたは明るさまたは数を求めるステップと、前記求められた大きさまたは明るさまたは数に基づいて、生体分子と化合物との相互作用と、生体分子自体の変化または生体分子と化合物との反応生成物の変化の有無と、前記有無の要因となる温度または酸性度または添加物濃度とを検出するステップとを含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、生体分子と化合物との相互作用および変化の要因を簡便かつ短時間で精度よく検出する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。
【００１４】
本実施形態では、以下の手順で生体分子と化合物との反応の解析を行う。図１に手順の例を示す。生体分子としてタンパク質を扱う。
【００１５】
（１）生体分子および化合物の調整
次の２つの溶液を準備する。
【００１６】
（ｉ）蛍光標識したタンパク質を含むが、化合物を含まない溶液（サンプル１〜８）
（ｉｉ）蛍光標識したタンパク質と化合物とを混合した溶液（サンプル１１〜１８）
（２）生体分子と化合物との反応実験
準備した２つの溶液について反応実験を行う。実験の条件は反応の要因として予測できるものを予め決めておく。例えば、温度、ｐＨ、塩濃度や界面活性剤濃度などの添加物濃度が要因として考えられる場合は、これらの各要因をサンプルごとに変えて実験を行う。
【００１７】
（３）ＦＣＳ測定（蛍光相関分光法（fluorescence correlation spectroscopy）測定）
反応させた混合液をＦＣＳ測定用のガラスボトムプレート、例えばマイクロプレートに移し、ＦＣＳ測定を行う。
【００１８】
ＦＣＳ測定では、微小領域内の蛍光分子の揺らぎを測定し、求められた値に基づいて並進拡散時間(Diffusion Time)を求める。並進拡散時間の大小は分子の大きさの大小を示すので、反応の前後で並進拡散時間を比較することにより、分子の大きさの増加または減少がわかる。分子の大きさの増加は生体分子間の結合反応を、分子の大きさの減少は生体分子の分解反応を、分子の大きさの維持は生体分子に結合も分解もなかったことを示す。従って、蛍光標識されたタンパク質と化合物との反応の前後で、蛍光を発する分子の並進拡散時間の増加を検出した場合は、蛍光標識されたタンパク質と化合物との結合反応を検出したことになる。一方、タンパク質と化合物との反応生成物について並進拡散時間の減少を検出した場合は、これは反応生成物の分子の大きさの減少を示しているから、タンパク質と化合物とが分離したか、反応生成物のタンパク質部分が変性した反応を検出したことになる。
【００１９】
また、ＦＣＳ測定では微小領域内の蛍光分子について分子数と明るさも計測できる。蛍光標識されたタンパク質と化合物との反応の前後で、発光する分子の数の増加を検出した場合は、反応前に消光していたタンパク質が反応後に発光を始めたこと、すなわち、タンパク質と化合物との間で結合などの相互作用があったことを検出したことになる。一方、発光する分子の数の減少を検出した場合は、反応前に発光していたタンパク質が反応後に消光したこと、すなわち、タンパク質と化合物との反応生成物が分離してタンパク質が消光したこと、またはタンパク質の構造が崩れて消光したことを検出したことになる。明るさの変化の検出についても同様に、明るさの増加は相互作用を検出したことに、減少は反応生成物の分離またはタンパク質構造の崩れを検出したことにつながる。
【００２０】
上述した手順では、（３）で反応生成物の並進拡散時間を求めるために蛍光相関分光法（ＦＣＳ）を用いたが、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）の代わりに、蛍光相互相関分光法（ＦＣＣＳ(fluorescence cross correlation spectroscopy)）、蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ(Fluorescence Intensity Distribution Analysis)）、蛍光偏光解析法（FIDA-polarization）、多項目蛍光強度分布解析法（ＦＩＭＤＡ(Fluorescence Intensity Multiple Distribution Analysis)）、共焦点蛍光寿命解析法（ｃＦＬＡ(Confocal Fluorescence Lifetime Analysis)）、蛍光強度寿命分布解析法（ＦＩＬＤＡ(Fluorescence Intensity and Lifetime Distribution Analysis)）、共焦点時間分解蛍光違法性解析法（ｃＴＲＡ(Confocal version of Time-Resolved fluorescence Anisotropy)）のいずれかを用いてもよい。これらの解析法から、反応後の核酸塩基の大きさ、数、明るさに関連するデータを求める。これらのデータから、反応前後での核酸塩基の大きさの変化、数の変化、明るさの変化を得ることができる。例えば、ＦＣＳ測定の結果では、反応の前後で核酸塩基の大きさに顕著な差はないが、1分子あたりの蛍光の明るさに変化がある場合には、蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）を行うことによって、反応の有無を知ることができる。
【００２１】
（４）データ処理
（実験１：温度）
実験１では、タンパク質と化合物との相互作用に温度が影響するか検出する。
【００２２】
サンプル１〜８は化合物を含まない、タンパク質だけを含む溶液である。１１〜１８は、タンパク質と化合物との混合夜液である。中性（ｐＨ．７）環境下で温度の違いによるタンパク質の変化を検出するためにこれらのサンプルごとに温度条件を変えて実験し、実験後に各サンプルをＦＣＳ測定した。ＦＣＳ測定で得られたサンプル中の蛍光分子についての並進拡散係数と分子数と明るさデータを基に、反応の有無および種類を判断した。サンプル１〜８の実験条件とＦＣＳ測定結果と反応の判断とを表１に、サンプル１１〜１８の実験条件とＦＣＳ測定結果と反応の判断とを表２に示す。
【表１】
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【００２３】
【表２】
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【００２４】
サンプル１〜８のＦＣＳ測定結果は、４８℃以上で並進拡散係数が小さくなって、タンパク質の分子の大きさが小さくなることを示しており、また、蛍光を発する分子の数が減り、蛍光を発する分子の蛍光の明るさも減少することを示している。これは熱ほどけによってタンパク質の立体構造が崩れたためと考えられる。
【００２５】
サンプル１１〜１８のＦＣＳ測定結果は、４２℃以上で進拡散係数が大きくなって、分子の大きさが大きくなることを示しており、また、蛍光を発する分子の蛍光の明るさが増加することを示している。これはタンパク質と化合物とが結合したためと考えられる。４８℃以上で並進拡散係数が小さくなって、蛍光を発する分子の数が減り、蛍光を発する分子の蛍光の明るさも減少することを示している。従って、タンパク質と化合物との反応生成物は、４８℃以上でタンパク質の熱ほどけの影響を受けることがわかる。
【００２６】
（実験２：ｐＨ）
実験２では、タンパク質と化合物との相互作用にｐＨが影響するか検出する。
【００２７】
サンプル２１〜２８は化合物を含まない、タンパク質だけを含む溶液である。３１〜３８は、タンパク質と化合物との混合夜液である。弱アルカリ（ｐＨ．１０）環境下で温度の違いによるタンパク質の変化を検出するためにこれらのサンプルごとに温度条件を変えて実験し、実験後に各サンプルをＦＣＳ測定した。実験１と同様に、ＦＣＳ測定で得られたデータを基に、サンプル中の蛍光分子について、並進拡散係数と分子数と明るさとを求め、これらから反応の有無および種類を判断した。サンプル２１〜２８の実験条件とＦＣＳ測定結果と反応の判断とを表３に、サンプル３１〜３８の実験条件とＦＣＳ測定結果と反応の判断とを表４に示す。
【表３】
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【００２８】
【表４】
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【００２９】
サンプル２１〜２８のＦＣＳ測定結果は、４６℃以上で並進拡散係数が小さくなって、タンパク質の分子の大きさが小さくなることを示しており、また、蛍光を発する分子の数が減り、蛍光を発する分子の蛍光の明るさも減少することを示している。これは、熱ほどけによってタンパク質の立体構造が崩れたためと考えられる。
【００３０】
サンプル３１〜３８のＦＣＳ測定結果は、４２℃以上で進拡散係数が大きくなって、分子の大きさが大きくなることを示しており、また、蛍光を発する分子の蛍光の明るさが増加することを示している。これはタンパク質と化合物とが結合したためと考えられる。４６℃以上で並進拡散係数が小さくなって、蛍光を発する分子の数が減り、蛍光を発する分子の蛍光の明るさも減少することを示している。従って、タンパク質と化合物との反応生成物は、４６℃以上でタンパク質の熱ほどけの影響を受けることがわかる。
【００３１】
また、実験１の結果と比較して、実験２の弱アルカリ環境下（ｐＨ．１０）では、中性環境下の場合よりも低い温度で熱ほどけが起こるが、タンパク質と化合物との結合反応は、中性環境下と同じ温度で起こることがわかる。従って、タンパク質熱ほどけはアルカリ環境下で促進され、タンパク質と化合物との反応生成物もアルカリ環境下で熱ほどけが促進されるが、タンパク質と化合物との相互作用の開始温度は、アルカリの影響を受けないことがわかる。
【００３２】
従って、サンプル中のタンパク質と化合物と相互作用をしていると見られるとき、本実施形態で説明したようにＦＣＳ測定を行い、ＦＣＳ測定結果を解析することにより、それが本来の相互作用のみから成っているのか、本来の相互作用に加えて他の要因によるタンパク質や反応生成物の変化を伴っているのか、本来の相互作用はなくて他の要因のみによってタンパク質が変性しているだけなのかを知ることができる。その他の要因とは、熱ほどけによる構造のゆるみや熱による凝集などの熱条件によるもの、および、ｐＨや添加物の影響による構造変化など熱条件以外の条件によるもので、それぞれタンパク質や反応生成物を変化させるものである。
【００３３】
他の要因を特定する場合、タンパク質のみのサンプル、および、タンパク質と化合物を混合したサンプルを用いて、化合物温度、ｐＨ、添加物など、要因として考えられるものを変数にして反応実験を行い、ＦＣＳ測定を行う。ＦＣＳ測定結果として蛍光を発する分子についての並進拡散係数（分子の大きさ）、分子数、蛍光の明るさを求める。これらの結果から、表５に示す反応とＦＣＳ測定結果との関係を基に、相互作用および他の要因によるタンパク質や反応生成物の変化を判断する。このようにして、タンパク質や反応生成物の変化を分子レベルで検出することができ、変化の要因を特定することができる。
【表５】
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【００３４】
本実施形態によれば、タンパク質と化合物との反応の有無、反応の程度および反応の種類を精度良く検出することができる。また反応の要因を特定することができる。
【００３５】
また、各溶液の混合と、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）または蛍光相互相関分光法（ＦＣＣＳ(fluorescence cross correlation spectroscopy)）、蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ(Fluorescence Intensity Distribution Analysis)）、蛍光偏光解析法（FIDA-polarization）、多項目蛍光強度分布解析法（ＦＩＭＤＡ(Fluorescence Intensity Multiple Distribution Analysis)）、共焦点蛍光寿命解析法（ｃＦＬＡ(Confocal Fluorescence Lifetime Analysis)）、蛍光強度寿命分布解析法（ＦＩＬＤＡ(Fluorescence Intensity and Lifetime Distribution Analysis)）、共焦点時間分解蛍光違法性解析法（ｃＴＲＡ(Confocal version of Time-Resolved fluorescence Anisotropy)）の利用により、浮遊系における反応生成物の大きさの変化、明るさの変化、数の変化をｎＭオーダーという非常に良い感度で検出することができる。
【００３６】
また、放射の測定、表面プラズモンの測定または核磁気共鳴の測定、支持体への固定などの煩雑な操作を行わずに、検出結果を簡便に短時間で得ることができる。また、固体支持体を用いないので、固定できないタンパク質や化合物でも反応と解析ができる。
【００３７】
蛍光標識した生体分子と化合物とを混合した溶液の場合、各混合溶液は互いに異なる温度または酸性度または添加物濃度などの条件で反応し、反応の結果が各混合溶液中の蛍光を発する分子の大きさまたは明るさまたは数に反映される。求められた分子の大きさまたは明るさまたは数から、混合溶液中での生体分子と化合物との相互作用と、生体分子自体の変化または生体分子と化合物との反応生成物の変化とが検出でき、反応の要因となった条件を特定することができる。
【００３８】
溶液が蛍光標識された生体分子を含むが化合物を含まない場合、溶液中の生体分子は化合物の影響を受けずに、温度または酸性度または添加物濃度などの条件で反応し、反応の結果が各溶液中の蛍光を発する分子の大きさまたは明るさまたは数に反映される。求められた分子の大きさまたは明るさまたは数から、生体分子自体の変化が特定され、混合溶液中での生体分子と化合物との相互作用と、生体分子自体の変化または生体分子と化合物との反応生成物の変化とが精度良く検出でき、反応の要因となった条件を精度良く特定することができる。
【００３９】
また、本実施形態では、生体分子であるタンパク質に蛍光標識を付けたが、化合物に蛍光標識を付けて反応実験を行ってもよい。
【００４０】
また、本発明は、自動分注機、プレートスタッカーを用いれば、大量のサンプルのスクリーニング作業にも応用できる。
【００４１】
これまで、図面を参照しながら本発明の実施形態を述べたが、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本実施様態における生体分子と化合物との反応の解析手順の例を示している。
【図１】
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