(57)【要約】【課題】  所定の基体上でのプライマー伸長反応による遺伝子の検出方法において、検出感度が高くかつ非特異的な検出が抑えられる方法を提供する。【解決手段】  リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基体に、（ａ）一部または全てのヌクレオチドがＬＮ）に置換されたＤＮＡ伸長用プライマー鎖を基体表面に固定化する工程、（ｂ）検出する着目遺伝子のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片、ヌクレオチドモノマー、及びＤＮＡ伸長用酵素を含む試料溶液を基体表面に接触させる工程、（ｃ）前記試料溶液中のＤＮＡ断片をまたはＲＮＡ断片を鋳型にして、基体表面に固定化されている前記ＤＮＡ伸長用プライマー鎖を伸長させる工程、を含む遺伝子の検出方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基体に、
（ａ）一部または全てのヌクレオチドがＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）に置換されたＤＮＡ伸長用プライマー鎖を基体表面に固定化する工程、  
（ｂ）検出する着目遺伝子のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片、ヌクレオチドモノマー、及びＤＮＡ伸長用酵素を含む試料溶液を基体表面に接触させる工程、
（ｃ）前記試料溶液中のＤＮＡ断片をまたはＲＮＡ断片を鋳型にして、基体表面に固定化されている前記ＤＮＡ伸長用プライマー鎖を伸長させる工程、を含むことを特徴とする遺伝子の検出方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡ伸長用プライマー鎖のＬＮＡ置換ヌクレオチドが、プライマー鎖の３’末端を含む位置に導入されていることを特徴とする請求項１記載の遺伝子の検出方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡ伸長用プライマー鎖が、前記着目遺伝子の特徴配列を含む塩基配列の一塩基を他の塩基に置き換えられていること特徴とする請求項１又は２記載の遺伝子の検出方法。
【請求項４】
前記一塩基の置き換えが、３’末端で行なわれることを特徴とする請求項３記載の遺伝子の検出方法。
【請求項５】
請求項１〜４いずれか記載に記載の遺伝子の検出方法において、
前記高分子物質の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルグリセロール基、ホスファチジルホスホリルグリセロール基のいずれかであることを特徴とする遺伝子の検出方法。
【請求項６】
請求項１〜５いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
前記ヌクレオチドモノマーのいずれかに標識がなされていることを特徴とする遺伝子の検出方法。
【請求項７】
請求項６記載の遺伝子の検出方法において、
標識が蛍光色素であることを特徴とする遺伝子の検出方法。
【請求項８】
請求項６記載の遺伝子の検出方法において、
更に（ｄ）ヌクレオチドモノマーの標識に酸化還元酵素を導入し、酸化又は還元反応により、発色する基質を加え、該基質を発色させる工程、
を含むことを特徴とする遺伝子の検出方法。
【請求項９】
請求項１〜８いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
前記ＤＮＡ鎖伸長用酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡリガーゼであることを特徴とする遺伝子の検出方法。
【請求項１０】
請求項１〜９いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
前記ＤＮＡ伸長用プライマー鎖が、前記電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位の部位で共有結合していることを特徴とする遺伝子の検出方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することを特徴とする遺伝子の検出方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
前記基体は、前記高分子物質に加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含むことを特徴とする遺伝子の検出方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
前記基体が、プラスチック材料からなることを特徴とする遺伝子の検出方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
前記（ｃ）の工程が、所定のヒートサイクルを加えることにより行われることを特徴と
する遺伝子の検出方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の遺伝子の検出方法において、
ヒートサイクル数が１以上であることを特徴とする遺伝子の検出方法。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の遺伝子の検出方法において、
前記ヒートサイクルが、熱変性温度での保持、アニール処理温度での保持、ＤＮＡ伸長温度での保持を含むことを特徴とする遺伝子の検出方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の遺伝子の検出方法において、
アニール処理温度とＤＮＡ伸長温度が同一温度であることを特徴とする遺伝子の検出方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７いずれか記載の遺伝子の検出方法に使用する遺伝子検出用担体であって、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基体に、一部または全てのヌクレオチドがＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）に置換されたＤＮＡ伸長用プライマー鎖が基体表面に固定化した遺伝子検出用担体。  
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基体表面にプライマーを固定化した遺伝子検出用担体を使用した遺伝子の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
非特許文献１には、所定のアミノ−シラン試薬を用いて修飾されたガラス基板の表面に、プライマーとなるＤＮＡ鎖を共有結合させたＤＮＡマイクロアレイにて固相ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）によるＤＮＡ増幅を行なう技術が開示されている。
【０００３】
また、非特許文献２には、ガラス基板の代わりにポリ（メチルメタクリレート）を用いて、表面にＤＮＡ断片を固定化させたＤＮＡマイクロアレイを用いて、所定のＤＮＡ鎖とのハイブリッド特性およびＰＣＲ様環境下における熱安定性が評価されており、新規のＰＣＲ技術に適用できるデバイスの可能性を示唆する記載がなされている。
【０００４】
特許文献１には、ハイドロゲル層を有する固体支持体表面にプローブを固定化させ、所定のＤＮＡ鎖を鋳型としてプローブ伸長反応を行い遺伝子の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）検出する方法が記載されているが、実際には特異性およびシグナル量が低いという問題があった。
【０００５】
また一方で、特許文献２には、二環式ヌクレオチド誘導体であるＬＮＡを含んでいるヌクレオチドは、相補的な配列のＤＮＡ及びＲＮＡとの結合の特異的が高いことを記載されている。
【非特許文献１】Adessi，Celine  et  al．“Solid  Phase  DNA  amplification：Characterisation  of  primer  attachment  and   amplification  mechanisms”，Nucleic  Acids  Research，2000，Vol．20，No.20，e87
【非特許文献２】Fixe，F.  et  al．“Functionalization  of  poly（methyl  methacrylate）（PMMA）  as  a  substrate  for  DNA  microarrays”，Nucleic  Acids  Research，2004，January  12，Vol.32  No.１，ｅ9
【特許文献１】特表２００４−５３２０２６号公報
【特許文献２】特開２００２−５４０１１８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者等は、非特許文献１および２に代表されているＤＮＡマイクロアレイを用いてＤＮＡ鎖伸長反応を行ったところ、プライマーと試料中遺伝子断片との親和性、特異性に問題があることを見出し、表面に所定の高分子物質を配した基体を用いることと、一部のヌクレオチドをＬＮＡに置換したプライマーを用いることでこの問題を解決して本発明の完成に至った。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
即ち本発明は、
（１）リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基体に、
（ａ）一部または全てのヌクレオチドがＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）に置換されたＤＮＡ伸長用プライマー鎖を基体表面に固定化する工程、  
（ｂ）検出する着目遺伝子のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片、ヌクレオチドモノマー、及びＤＮＡ伸長用酵素を含む試料溶液を基体表面に接触させる工程、
（ｃ）前記試料溶液中のＤＮＡ断片をまたはＲＮＡ断片を鋳型にして、基体表面に固定化されている前記ＤＮＡ伸長用プライマー鎖を伸長させる工程、を含むことを特徴とする遺伝子の検出方法、
（２）前記ＤＮＡ伸長用プライマー鎖のＬＮＡ置換ヌクレオチドが、プライマー鎖の３’末端を含む位置に導入されていることを特徴とする（１）記載の遺伝子の検出方法、
（３）前記ＤＮＡ伸長用プライマー鎖が、前記着目遺伝子の特徴配列を含む塩基配列の一塩基を他の塩基に置き換えられていること特徴とする（１）又は（２）記載の遺伝子の検出方法、
（４）前記一塩基の置き換えが、３’末端で行なわれることを特徴とする（３）記載の遺伝子の検出方法、
（５）（１）〜（４）いずれか記載に記載の遺伝子の検出方法において、
前記高分子物質の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルグリセロール基、ホスファチジルホスホリルグリセロール基のいずれかであることを特徴とする遺伝子の検出方法、
（６）（１）〜（５）いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
前記ヌクレオチドモノマーのいずれかに標識がなされていることを特徴とする遺伝子の検出方法、
（７）（６）記載の遺伝子の検出方法において、
標識が蛍光色素であることを特徴とする遺伝子の検出方法、
（８）（６）記載の遺伝子の検出方法において、
更に（ｄ）ヌクレオチドモノマーの標識に酸化還元酵素を導入し、酸化又は還元反応により、発色する基質を加え、該基質を発色させる工程、
を含むことを特徴とする遺伝子の検出方法、
（９）（１）〜（８）いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
前記ＤＮＡ鎖伸長用酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡリガーゼであることを特徴とする遺伝子の検出方法、
（１０）（１）〜（９）いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
前記ＤＮＡ伸長用プライマー鎖が、前記電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位の部位で共有結合していることを特徴とする遺伝子の検出方法、
（１１）（１）〜（１０）いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することを特徴とする遺伝子の検出方法、
（１２）（１）〜（１１）いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
前記基体は、前記高分子物質に加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含むことを特徴とする遺伝子の検出方法、
（１３）（１）〜（１２）いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
前記基体が、プラスチック材料からなることを特徴とする遺伝子の検出方法、
（１４）（１）〜（１３）いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
前記（ｃ）の工程が、所定のヒートサイクルを加えることにより行われることを特徴と
する遺伝子の検出方法、
（１５）（１４）記載の遺伝子の検出方法において、
ヒートサイクル数が１以上であることを特徴とする遺伝子の検出方法、
（１６）（１４）または（１５）に記載の遺伝子の検出方法において、
前記ヒートサイクルが、熱変性温度での保持、アニール処理温度での保持、ＤＮＡ伸長温度での保持を含むことを特徴とする遺伝子の検出方法、
（１７）（１６）に記載の遺伝子の検出方法において、
アニール処理温度とＤＮＡ伸長温度が同一温度であることを特徴とする遺伝子の検出方法、
（１８）（１）〜（１７）いずれか記載の遺伝子の検出方法に使用する遺伝子検出用担体であって、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基体に、一部または全てのヌクレオチドがＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）に置換されたＤＮＡ伸長用プライマー鎖が基体表面に固定化した遺伝子検出用担体、  
である。
【０００８】
本発明に係る遺伝子の検出方法は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基体に、一部のヌクレオチドがＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）に置換されたＤＮＡ伸長用プライマー鎖を基体表面に固定化し、検出する着目遺伝子のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を鋳型にして、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系、およびヌクレオチドモノマーを含む試料が導入された液相系を、好ましくはＤＮＡ鎖を熱変性する温度（以下、「熱変性処理温度」という）まで引き上げ、前記反応系の温度をアニール処理する温度（以下、「アニール処理温度」という）まで下げ、ＤＮＡ伸長温度を保つことにより、基体上に固定化されたＤＮＡ鎖の伸長反応を行い、かつ全処理を同一の液相系で行なうことを特徴としている。
【０００９】
基体に固定化させるＤＮＡ鎖の一部または全てのヌクレオチドをＬＮＡに置き換えることにより、特異性が高く、高精度の遺伝子が行なえる。
【００１０】
また、従来ではアニール処理した後で伸長反応の前に、二本鎖を組まなかったＤＮＡ断片を除くための洗浄処理が必要であったが、基体上に非特異的に吸着するＤＮＡ断片がないこと、およびＤＮＡ鎖伸長にかかる酵素反応が有効機能すると考えられ、伸長反応の前に基体の洗浄処理が不要になる。
【００１１】
このＤＮＡ鎖伸長方法において、基体の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルグリセロール基、ホスファチジルホスホリルグリセロール基のいずれかにすることができる。
このように、基体の表面にリン脂質と同様の環境を設けることで、基体表面で起こるＤＮＡ鎖伸長反応が細胞内と同等の環境下で行うことが可能になり、酵素反応効率が高く、ＤＮＡ鎖伸長を、よりマイルドな条件でより高効率に行うことが可能になる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、特異性が高く、高精度に遺伝子の検出が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
ここで使用される基体の表面には、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質が存在するようになっている。
【００１４】
このリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを有する高分子物質は、ＤＮＡ鎖の非特異的吸着を抑制する性質とＤＮＡ鎖を固定化する性質とを併せ持つポリマーである。特に、第一単位に含まれるリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基は鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第二単位に含まれるカルボン酸誘導基はプライマーを化学的に固定化する役割を果たす。すなわち、プライマーは、この高分子物質からなるコーティング層のカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、当該基体の表面に固定化される。
【００１５】
第一の単位は、たとえば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルキルホスホリルコリン基；
２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン基および１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルコキシアルキルホスホリルコリン基；
アリルホスホリルコリン基、ブテニルホスホリルコリン基、ヘキセニルホスホリルコリン基、オクテニルホスホリルコリン基、およびデセニルホスホリルコリン基等のアルケニルホスホリルコリン基；
等の基を有し、ホスホリルコリン基がこれらの基中に含まれている構成とすることができる。
【００１６】
また、これらの基のうち、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを有する構成とすることにより、基体表面における鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着をより一層確実に抑制することができる。
【００１７】
なお、ここでは基本骨格として下記式（ａ）に示すホスホリルコリン基である例を挙げたが、このホスホリルコリンを下記式（ｂ）のホスホリルエタノールアミン基、下記式（ｃ）のホスホリルイノシトール基、下記式（ｄ）のホスホリルセリン基、下記式（ｅ）のホスホリルグリセロール基、下記式（ｆ）に示したホスファチジルホスホリルグリセロール基などのリン酸基に置き換えてもよい（以下についても同様）。
【００１８】
【化１】
2007222010.tif 000002
【００１９】
カルボン酸誘導体は、カルボン酸のカルボキシル基が活性化されたものであり、Ｃ＝Ｏを介して脱離基を有するカルボン酸である。カルボン酸誘導体は、具体的には、アルコキシル基よりも電子求引性の高い基がカルボニル基に結合して求核反応が活性化された化合物である。カルボン酸誘導基は、アミノ基、チオール基、水酸基等に対する反応性を有する化合物である。
【００２０】
カルボン酸誘導体として、さらに具体的には、カルボン酸であるアクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸などのカルボキシル基が、酸無水物、酸ハロゲン化物、活性エステル、活性化アミドに変換された化合物が挙げられる。カルボン酸誘導基は、こうした化合物に由来する活性化された基であり、たとえば、ｐ−ニトロフェニル基やＮ−ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基；
―Ｃｌ、−Ｆ等のハロゲン；
等の基を有することができる。
【００２１】
また、カルボン酸誘導基は、下記式（１）に示される基とすることができる。
【００２２】
【化２】
2007222010.tif 000003
（ただし、上記式（１）において、Ａは水酸基を除く脱離基である。）
【００２３】
上記式（１）に示される一価の基は、たとえば下記式（ｐ）または式（ｑ）から選択されるいずれかの基とすることができる。
【００２４】
【化３】
2007222010.tif 000004
【００２５】
（ただし、上記式（ｐ）および式（ｑ）において、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式（ｐ）において、Ｒ1はＣとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式（ｑ）において、Ｒ2はＮとともに環を形成する二価の基であってもよい。）
【００２６】
上記式（ｐ）に示される基として、たとえば下記式（ｒ）、（ｓ）、および（ｗ）に示される基が挙げられる。また、上記式（ｑ）に示される基として、たとえば下記式（ｕ）に示される基が挙げられる。
【００２７】
上記式（１）に示される基は、たとえば下記式（ｒ）、式（ｓ）等に示される酸無水物由来の基；
下記式（ｔ）に示される酸ハロゲン化物由来の基；
下記式（ｕ）、式（ｗ）に示される活性エステル由来の基；または
下記式（ｖ）に示される活性化アミド由来の基とすることができる。
【化４】
2007222010.tif 000005
【００２８】
カルボン酸誘導基のうち、活性エステル基は、穏やかな条件における反応性に優れるため、好ましく用いられる。穏やかな条件としては、たとえば中性またはアルカリ性の条件、具体的にはｐＨ７．０以上１０．０以下、さらに具体的にはｐＨ７．６以上９．０以下、さらにまた具体的にはｐＨ８．０とすることができる。
【００２９】
また、本明細書において規定するところの「活性エステル基」は、その定義について厳密な規定はなされていないが、慣用の技術表現としては、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。なお、ペプチド合成の分野においては、泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇道典著、「ペプチド合成の基礎と実験」、１９８５年発行、丸善、に記載されているように、活性エステル法はアミノ酸またはペプチドのＣ末端を活性化する方法の一つとして用いられている。
【００３０】
実際的には、エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基、水酸基等の基に対する反応性を有する。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。
【００３１】
ここでは、高分子物質中の活性化カルボン酸誘導体基が活性エステル基である場合を例に、説明する。活性エステル基としては、たとえばｐ−ニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド基等が挙げられるが、たとえばｐ−ニトロフェニル基が好ましく用いられる。
【００３２】
表面にプライマーが固定化される基体の場合、第一単位と第二単位のさらに具体的な構成の組み合わせとして、たとえば、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有し、活性エステル基がｐ−ニトロフェニル基である構成とすることができる。
【００３３】
また、本実施形態の基体のコーティング層に使用される高分子物質は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基およびカルボン酸誘導基以外に他の基を含んでもよい。また、高分子物質は共重合体とすることができる。具体的には、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体であることが好ましい。こうすることにより、高分子物質を適度に疎水化し、この高分子物質の基体表面への吸着性をさらに好適に確保することができる。
【００３４】
具体的には、高分子物質を、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート（ＮＰＭＡ）基を有する第二単量体と、ブチルメタリレート（ＢＭＡ）基を有する第三単量体との共重合体とすることができる。これらの共重合体であるｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｃｏ−ＮＰＭＡ）（ＰＭＢＮ）は、模式的に下記一般式（２）で示される。
【００３５】
【化５】
2007222010.tif 000006
【００３６】
ただし、上記一般式（２）において、ａ、ｂ、およびｃは、それぞれ独立して、正の整数である。また、上記一般式（２）において、第一〜第三単量体がブロック共重合していてもよいし、これらの単量体がランダムに共重合していてもよい。
【００３７】
上記一般式（２）で示される共重合体は、高分子物質の適度な疎水化と、鋳型ＤＮＡ断片の非特異吸着を抑制する性質と、プライマーを固定化する性質とのバランスとに、より一層優れた構成である。このため、このような共重合体を用いることにより、基体表面をより一層確実に高分子物質で被覆するとともに、高分子物質がコーティングされた基体上への鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制しつつ、プライマーをさらに確実に共有結合により固定化して基体上に導入することができる。
【００３８】
なお、上記一般式（２）で示される共重合体は、ＭＰＣ、ＢＭＡ、およびＮＰＭＡの各単量体を混合し、ラジカル重合等の公知の重合方法により得ることができる。上記一般式（２）で示される共重合体をラジカル重合により作製する場合、たとえば、Ａｒ等の不活性ガス雰囲気にて、３０℃以上９０℃以下の温度条件で溶液重合を行うことができる。
【００３９】
溶液重合に使用される溶媒は適宜選択されるが、たとえば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコールや、ジエチルエーテル等のエーテル、クロロホルム等の有機溶媒を単独でまたは複数混合して用いることができる。具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒とすることができる。
【００４０】
また、ラジカル重合反応に使用されるラジカル重合開始剤としては、通常使用されるものを用いることができる。たとえば、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、アゾビスバレロニトリル等のアゾ系開始剤；
過酸化ラウロイル、過酸化ベンゾイル、ｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート等の油溶性の有機過酸化物；
などが用いられる。
【００４１】
さらに具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒およびＡＩＢＮを用い、Ａｒ中、６０℃にて２〜６時間程度重合を行うことができる。
【００４２】
なお、本実施形態では、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有する例を説明したが、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質を第一の高分子物質とし、これに加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位とブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含んでいてもよい。
【００４３】
なお、上記第一の高分子物質の第一単位と上記第二の高分子物質の第一単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。また、上記第一の高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を含むとき、この第一の高分子物質の第三単位と上記第二の高分子物質の第三単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。
【００４４】
このような第二の高分子物質は、鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制するポリマーとして用いられる。このようなポリマーとしては、たとえばホスホリルコリン基が３０モル％、ブチルメタクリレート基が７０モル％の割合で含まれているものであるＭＰＣポリマー（日本油脂社製）を用いることができる。
【００４５】
なお、高分子物質が上記第一の高分子物質、第二の高分子物質からなる場合、これらの高分子物質が混合されている構成とすることができる。各々の高分子物質のポリマーは、たとえばエタノール溶液に溶解できるため、それぞれのポリマー溶液を混合することにより容易に混合ポリマーを得ることができる。
【００４６】
以上のような高分子物質からなるコーティング層を表面に含む基体は、所定の形状に加工された基体の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に基体を浸漬し、乾燥してもよい。
【００４７】
また、基体として、プラスチック材料を用いた場合には、形状やサイズの変更に対する柔軟性が確保される上に、ガラス基板のものに比べて安価で提供することができるという観点から好ましい。このようなプラスチック材料としては、表面処理の容易性および量産性の観点から、熱可塑性樹脂を用いることができる。
【００４８】
熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものを用いることができる。蛍光発生量の少ない樹脂を用いることにより、ＤＮＡ鎖の検出反応におけるバックグランドを低下させることができるため、検出感度をさらに向上させることができる。蛍光発生量の少ない熱可塑性樹脂としては、たとえば、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン；
環状ポリオレフィン；
含フッ素樹脂；
等を用いることができる。上記樹脂の中でも、飽和環状ポリオレフィンは、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、透明性および成形性に特に優れるため、光学的な分析に好適であり、基体の材料として好ましく用いられる。
【００４９】
ここで、飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体を指す。前者の例としては、たとえばノルボルネン、ジシクロペンタジエン、テトラシクロドデセンに代表されるノルボルネン系モノマー、及び、これらのアルキル置換体を開環重合して得られる重合体を水素添加して製造される飽和重合体である。後者の共重合体はエチレンやプロピレン、イソプロピレン、１−ブテン、３−メチル−１−ブテン、１−ペンテン、３−メチル−１−ペンテン、１−ヘキセン、１−オクテン等のα−オレフィンと環状オレフィン系モノマーのランダム共重合体を水素添加することにより製造される飽和重合体である。共重合体では、エチレンとの共重合体が最も好ましい。これらの樹脂は単独で用いてもよく、2種類またはそれ以上の共重合体あるいは混合物であってもよい。また、環状オレフィン構造を有する単量体が開環重合して得られる飽和環状ポリオレフィンだけでなく、環状オレフィン構造を有する単量体の付加重合により得られる飽和環状ポリオレフィンを用いることもできる。
【００５０】
以上のような高分子物質を表面に含むプラスチック材料からなる基体は、所定の形状に加工された基体の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に基体を浸漬し、乾燥してもよい。
【００５１】
なお、基体の材料をプラスチックとした場合、形状は板状には限られず、たとえばフィルム状やシート状であってもよい。具体的には、基体を可とう性のプラスチックフィルムとすることもできる。また、基体は、一つの部材から構成されていてもよいし、複数の部材から構成されていてもよい。
【００５２】
プライマー鎖の設計については、ＧＣ含量、塩基長、Ｔｍ、３’末端の塩基配列など重要なパラメータがあるため、通常は専用のプライマー設計ソフトたとえばＯＬＩＧＯ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（タカラバイオ社製）などを用いて設計を行なうことが好ましい。前記記載のパラメータはどれも重要であるが、伸長反応にとくに影響を及ぼすのは３’末端の塩基配列である。伸長反応では、プライマー鎖は検体ＤＮＡ断片を鋳型として、３’末端を起点として伸長するために、プライマー鎖の３’末端の塩基配列はとくに重要である。
【００５３】
プライマー鎖の３’末端の塩基配列と鋳型となるＤＮＡ断片の相補的な結合力が十分でない場合、非特異的にプライマー鎖と鋳型ＤＮＡ断片が結合して伸長反応が起こることが予想される。この場合、結果として非特異的なシグナル検出が起こることとなり、遺伝子検出の精度が落ちることとなる。以上の理由により、プライマー鎖と鋳型ＤＮＡ断片とがより相補特異的に結合するような工夫をすることにより、遺伝子検出の精度が向上することとなる。
【００５４】
ＤＮＡ−ＤＮＡあるいは、ＤＮＡ−ＲＮＡの相補的結合力を向上させる方法として、ＤＮＡのヌクレオチドをＬＮＡに置換する方法がある。ＬＮＡとは、リボヌクレオチドの２’部位の酸素原子と４’部位の炭素原子がメチレンを介して結合している２つの環状構造を持つヌクレオチドであり、ＤＮＡと比べて分子構造が安定化するために、相補的なヌクレオチドとの結合力が増す一方で、相補的でないヌクレオチドとの結合力は低下する特徴がある。
【００５５】
本実施形態では、プライマー鎖の一部または全部のヌクレオチドをＬＮＡに置換したＤＮＡ伸長用プライマー鎖を用いる。全部のヌクレオチドをＬＮＡに置換しても良いが、伸長反応に強く影響するプライマー鎖３’末端のヌクレオチドのみをＬＮＡ置換しても良い。
【００５６】
前記の理由により、ＤＮＡと比較してＬＮＡは１塩基のミスマッチでも容易に検出できる。そのため、ＬＮＡは単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）解析に有効である。
【００５７】
本発明の遺伝子の検出方法によりＳＮＰを検出する場合には、プライマー鎖の末端にＳＮＰ位置を設定する。ＳＮＰ位置にＬＮＡを設定することにより、ＤＮＡの場合と比較してより検出感度の高いＳＮＰ解析が可能となる。
【００５８】
次に、基体の表面へのプライマー鎖の固定化方法について説明する。
例えば、（ｉ）基体上の高分子物質に含まれる複数の活性エステル基のうち、少なくとも一部の活性エステル基とプライマー鎖とを反応させて共有結合を形成させることにより、基体表面でプライマー鎖を固定化し、続いて（ｉｉ）プライマー鎖を固定化した以外の基体表面の活性エステル基を不活性化する、すなわち残りの活性エステル基を不活性化することにより、プライマー鎖を基体の表面に固定することができる。以下、それぞれの工程について説明する。
【００５９】
上記工程（ｉ）において、鋳型ＤＮＡ断片とアニールするプライマー鎖を基体上に固定化する際には、プライマー鎖を溶解または分散した液体を点着する方法が好ましい。高分子物質に含まれる活性エステル基の一部がプライマー鎖と反応して、プライマー鎖の間で共有結合が形成される。
【００６０】
このプライマー鎖を溶解または分散した液体は、例えば中性からアルカリ性、例えばｐＨが７．６以上とすることができる。
【００６１】
また、点着後、基体表面に固定化されなかったプライマー鎖を除去するため、純水や緩衝液で洗浄してもよい。
【００６２】
また、上記工程（ｉｉ）に示したように、洗浄後はプライマー鎖を固定化した以外のプラスチック基体表面の活性エステルの不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行う。
【００６３】
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを用いることができる。
【００６４】
一級アミノ基を有する化合物としては、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５-アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを用いることができる。これらのうち、アミノエタノール、グリシンを用いることが好ましい。
【００６５】
また、基体に固定化するプライマー鎖には、活性エステル基との反応性を高めるため、アミノ基を導入しておくことが好ましい。アミノ基は活性エステル基との反応性に優れるため、アミノ基が導入されたプライマー鎖を用いることにより、効率よくかつ強固に基体の表面上にプライマー鎖を固定化することができる。アミノ基の導入位置はプライマー鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端に導入されていることが、相補的な鋳型ＤＮＡ断片とのアニーリングをより一層効率よく行うことができるという観点からは、好ましい。
【００６６】
以上により、プライマー鎖が固定化されたＤＮＡマイクロアレイが得られる。
【００６７】
上記のように作製されたＤＮＡマイクロアレイ表面に、固定化されたプライマー鎖にアニールさせる検出する着目遺伝子の鋳型ＤＮＡ断片または鋳型ＲＮＡ断片、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系、及びヌクレオチドモノマーを含む試料が導入される。
【００６８】
この導入された試料からなる反応系としては、ＤＮＡ鎖伸長用酵素系は、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼのいずれかを用い、ヌクレオチドモノマー（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰなど）を含有するバッファーを用いることができる。
【００６９】
バッファー中には、少なくとも２ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは２ｍｍｏｌ／Ｌ〜６ｍｍｏｌ／Ｌのマグネシウムイオンを含むことにより、遺伝子の検出感度が向上する。
【００７０】
また、ＤＮＡポリメラーゼの中でも、特に耐熱性細菌に由来するＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼなどを用いることもできる。
【００７１】
また、これらヌクレオチドモノマーの少なくとも一種をラベルしておくことができる。例えば、ｄＴＴＰの塩基の３位を蛍光ラベルしたＣｙ３−ｄＵＴＰをヌクレオチドモノマーとして用いることで、鋳型ＤＮＡ断片のアデニン（Ａ）に対応する伸長（プライマー）側の位置にＣｙ３−ｄＵＴＰが挿入される。これにより、伸長反応が生じたプライマーから形成されるＤＮＡ断片がＣｙ３−ｄＵＴＰで蛍光染色されて、このＤＮＡ断片の検出を行うことができるようになる。
【００７２】
なお、他のヌクレオチドモノマーをラベルしてもよく、また複数の種類のヌクレオチドモノマーをラベルしてもよい。また、ラベル方法も蛍光体の導入の他に、光吸収体の導入の方法、放射線ラベルの方法（P32-ATP、P32-ｄATP）、酵素標識などの非放射性ラベルの方法などによってもＤＮＡ鎖を検出することができる。
【００７３】
この酵素標識の方法においては、ビオチン（biotin）化またはジゴキシゲニン（ＤＩＧ：ステロイド系天然物）を結合した核酸（例えば、biotin-dUTP、DIG-dUTP）を使用してプライマーを伸張させた後、蛍光標識化したり、アルカリフォスファターゼまたはアルカリフォスファターゼ処理しニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）液中で数時間反応させることによってＤＮＡを検出することができる。
【００７４】
試料が導入された反応系の温度を、ＤＮＡ鎖の熱変性温度（melting temperature：Ｔｍ）以上、例えば９０℃〜９５℃まで上昇させる。この熱変性処理により、自己相補鎖などで見られる折れたたみ構造を有する鋳型ＤＮＡ断片やプライマーが直鎖状の一本鎖になる。
【００７５】
続いて、反応系の温度をプライマーと鋳型ＤＮＡ断片とがアニールする温度（アニール温度）、例えば４℃〜７２℃、好ましくは５０℃〜７２℃まで下降させる。このアニール処理により、鋳型ＤＮＡ断片の一部と相補的な配列を有するプライマー鎖と、この鋳型ＤＮＡ断片とが二本鎖になる。この反応系に対して、洗浄処理を行わずにそのままＤＮＡ伸長反応に進める。また、アニールさせる工程で、熱変性温度以上から例えば４℃〜室温まで急冷させる工程を経た後、アニールする温度まで昇温させても良い。
【００７６】
ここで、従来では、アニール処理した後で伸長反応の前に、二本鎖を組まなかったＤＮＡ断片を除くため、の洗浄処理が必要であったが、本実施形態では、基体上に非特異的に吸着するＤＮＡ断片がないため、および基体表面環境がＤＮＡ鎖伸長にかかる酵素反応に適しているため基体の洗浄処理が不要になる。このようにして、試料導入からＤＮＡ鎖の伸長反応までを同一の液相系、すなわち反応系をそのまま用いることができる。
【００７７】
ＤＮＡ伸長では、アニール処理を行った反応系の温度を、更に一定温度に保つように制御することが好ましい。
【００７８】
ここでは、鋳型ＤＮＡ断片に対して耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いた例を示したが、ＤＮＡ鎖を鋳型として新たなＤＮＡ鎖を合成する酵素であれば特に限定はされない。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ（大腸細菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ断片など）、α型ＤＮＡポリメラーゼ（ピロコッカス・フリオサス由来ＤＮＡポリメラーゼ、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ）及び非α非ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ（国際公開第９７／２４４４４号パンフレット記載のＤＮＡポリメラーゼ）等が挙げられる。
【００７９】
ＤＮＡポリメラーゼの代わりに、ＤＮＡリガーゼを用いてもＤＮＡ鎖伸長反応を行うことができるため、ＤＮＡ鎖増幅を行うことが可能である。
【００８０】
このＤＮＡ鎖増幅のためには、基体上の一定の区画内に複数のスポットを設けておき、各スポットにプライマーＤＮＡ鎖を固定化しておき、マイクロアレイを形成しておくことが好ましい。
【００８１】
また、基体の表面に固定化させるＤＮＡ伸長用プライマーＤＮＡ鎖の長さを検出対象に応じて任意に決定することができ、例えば５〜５０塩基とすることができる。
【００８２】
ＤＮＡ伸長反応の後に、反応液を除去して、ＤＮＡマイクロアレイを、例えば０．１ｗｔ％のＴＷＥＥＮ２０溶液を用いて洗浄して、終了する。
【００８３】
以下に、本実施形態となる遺伝子の検出方法の流れについて記載する。
【００８４】
基体表面へ固定化するプライマーの選択は、検出対象の遺伝子に特異的な配列をもとに設計する、プライマー鎖の長さは、２０〜３０塩基がＤＮＡの伸長反応のし易さから好適である。
【００８５】
設計されたプライマー鎖の５’末端にアミノ修飾がなされ、基体表面の活性エステル基と反応し基体上への強固に固定化される。
【００８６】
本発明を用いた、遺伝子の検出方法の例を記載する。ただし本記載例に限定したものではない。
【００８７】
まず、採取したヒトの血液等からＤＮＡを抽出する。抽出する方法として、市販のＤＮＡ抽出キットを使用することがあげられる。
【００８８】
次に、抽出されたＤＮＡを断片化する。抽出されたＤＮＡ鎖は長いため断片化の工程が必要になる。断片化すなわち切り出しの方法の一つにＰＣＲがあげられる。遺伝子特異配列を含む部分を増幅するように、プライマー設計を行い、ＰＣＲにより増幅することにより、ＤＮＡ鎖の一部の切り出しを行なう、切り出されるＤＮＡ鎖の長さが、１００〜１０００塩基程度になるように、プライマーの設計をおこなう。
【００８９】
ＤＮＡ鎖の断片化は、ＰＣＲの他に超音波による破砕も可能である。しかし、破砕条件については、ＤＮＡ鎖が細断片化されない注意を要する。また、制限酵素による断片化も
可能である。
【００９０】
ＤＮＡ鎖断片化の後、プライマー鎖が固定された基体上で、ＤＮＡ伸長反応を行う。
【００９１】
断片化されたＤＮＡ鎖、ＤＮＡ伸長酵素、ヌクレオチドモノマーを含む溶液を、プライマーＤＮＡ鎖が固定された基体上に供給し、必要に応じてカバーガラスをかけ、密閉容器中に納め、所定のヒートサイクルにより加熱を行いＤＮＡ鎖の伸長反応を行う。
【００９２】
ヌクレオチドモノマーの何れかに、Ｃｙ３などの蛍光色素を標識しておけば、蛍光スキャナーによりスポットの確認が可能である。
【００９３】
あるいは、ヌクレオチドモノマーの何れかに、ビオチンを標識しておき、ＤＮＡ伸長反応の後、アルカリフォスファターゼを標識したアビジンを反応させることにより、伸長したＤＮＡにアルカリフォスファターゼを標識した後、ＢＣＩＰ/ＮＴＢなどの発色試薬を作用させることにより、ＤＮＡが伸長したスポットの可視化が可能となる。可視化された
スポットは、目での認識が可能である他、デジカメやＯＡスキャナーで画像を認識し、画像処理ソフトなどを使って、スポットの強度の解析も可能となる。
【実施例】
【００９４】
以下、実施例を記載する。
【００９５】
（実験例１）
以下の手法にて、遺伝子に特異的なＤＮＡ配列よりなるＬＮＡ化したプライマー鎖およびＬＮＡ化しないプライマー鎖を、本実施形態に対応するプラスチック基体の表面に固定化して、各プライマー固定化基体上でＤＮＡ鎖伸長反応を行って、プライマーのＤＮＡ鎖伸長反応を検出し、遺伝子の検出能の評価を行った。このとき、ＬＮＡ化したヌクレオチドの位置は、プライマー鎖の３’末端の１箇所とした。本実施例では、遺伝子として大腸菌、黄色ブドウ球菌、サルモネラ菌および緑膿菌２３ＳリボゾームＤＮＡを使用した。
【００９６】
（プラスチック基板の製造）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物（ＭＦＲ（Melt flow rate）：２１ｇ/１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度１２３℃）を用い、射出成形によりスライドガラス形状の基板を得た。基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体（各基は、モル％で２５：７４：１）の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入して、プラスチック基板を得た。
【００９７】
（プライマー固定）
５’末端がアミノ基で修飾された、各菌２３ＳリボゾームＤＮＡ配列特異なオリゴＤＮＡ鎖を０．２５Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．０）を用いて溶解し、１０μＭのオリゴＤＮＡ溶液を調製した。このとき、３’末端をＬＮＡ化したオリゴＤＮＡ鎖とＬＮＡ化しないオリゴＤＮＡ鎖の両者を調整した。これら溶液をスポッタ（日立ソフトウェアーエンジニアリング製Marks-I）を用い、１００μｍ径クロスカットピンでプラスチック基板の表面上にスポットした。オリゴＤＮＡをスポットした基板を、８０℃で一時間加熱して、オリゴＤＮＡ（プライマー）を固定化させた。
スポットおよび固定化させた大腸菌検出用プライマーの鎖配列を下記に示す。
黄色ブドウ球菌：agtaggataggcgaagcgtgcgatt        ＳＡ
agtaggataggcgaagcgtgcgatt        ＳＡ−ＬＮＡ
大腸菌：        ctgatatgtaggtgaagcgacttgctcg     ＥＣＯ
ctgatatgtaggtgaagcgacttgctcg      ＥＣＯ−ＬＮＡ
緑濃菌：        gttaatcgacgcagggttagtcggtt        ＰＡ
gttaatcgacgcagggttagtcggtt        ＰＡ―ＬＮＡ
サルモネラ菌：  tgtgtgttccaggtaaatccggttc        ＳＡＬ
tgtgtgttccaggtaaatccggttc        ＳＡＬ−ＬＮＡ
ポジティブコントロール：gacagccaggatgttggcttagaagcagc    ＰＯＳ
【００９８】
（菌の培養）
以下に掲げる菌株の培養を行った。
使用した菌株名
黄色ブドウ球菌：Staphylococcus aureus ATCC 25923
大腸菌：Escherichia coli ATCC 25922
緑膿菌：Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
サルモネラ菌：
Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC 14028
Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis IID 604
寒天培地を用い、37℃、一昼夜(14-18時間)行なった。培地はインスタント培地である"普通ブイヨン栄研"を用い、液体培地は" 普通ブイヨン栄研"の指示量を脱塩水に溶かし、寒天培地はそれに1.6%の寒天を加え、それぞれオートクレーブ後、使用した。
【００９９】
（２３ＳリボゾームＤＮＡの抽出）
上記菌培養における１つのコロニーを、２００μｌのＰＢＳ（−）中に分散させ、ＤＮＡ抽出キット（Invitrogen）を用い、３μｌのＤＮＡ抽出液を得た。
（ＰＣＲによる２３ＳリボゾームＤＮＡ鎖増幅反応）
２３ＳリボゾームＤＮＡのユニバーサルプライマーを用い、ＰＣＲ反応により２３ＳリボゾームＤＮＡの増幅をおこなった。
ＰＣＲによる増幅に使用プライマーの配列を下記に示す。
プライマー配列：
センス  ：５‘−gacagccaggatgttggcttagaagcagc
アンチセンス：下記を同量混合したものを用いた。
５‘−ggaatttcgctaccttaggaccgttatagttacg
５‘−ggaatttcgctaccttaggatggttatagttacc
２５μＬ中に上記プライマー各々を１２．５pmol、２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、０．５ＵのＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製Ex Taq）をＰＣＲバッファー中に溶解させ、
サーマルサイクラーにより、熱変性９５℃１分、アニーリング７５℃２分、ＤＮＡ鎖の伸長反応７２℃５分のヒートサイクルで、１０サイクル行い、ＰＣＲ産物を得た。
【０１００】
（基板上でのＤＮＡの伸長反応）
ＰＣＲバッファー（タカラバイオ株式会社製10X EX Taq Buffer (Mg2+ free)）２５μＬ中に２μｌの上記ＰＣＲ産物、１００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、Ｃｙ３標識ｄＵＴＰ、０．５ＵのＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製Ex Taq）、２ｍｍｏｌ／Ｌのマグネシウムイオン（塩化マグネシウム）を溶解させ試料溶液とし、以降の実施例に使用した。
【０１０１】
試料溶液を９５℃で５分熱変性させた後、基板上に分注し、６５℃で６０分静置させＤＮＡ鎖伸長反応を行った。
【０１０２】
ＤＮＡ伸長反応の後、基板を０．１ｗｔ％のＳＤＳ溶液を用いて洗浄して、終了した。
スライド用スキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙパーキンエルマー社製）によりスポットの蛍光強度を測定した。
各々の菌から抽出したＤＮＡ溶液について、基板上に固定した上記プライマー各々のスポットの蛍光強度について比較をおこなった。
【０１０３】
（実験例２）
実施例１に記載の試料溶液中に溶解させるマグネシウムイオン濃度を４ｍｍｏｌ／Ｌとして、その他の工程は実施例１と同様に行った。
【０１０４】
（実施例３）
実施例１に記載の試料溶液中に溶解させるマグネシウムイオン濃度を６ｍｍｏｌ／Ｌとして、その他の工程は実施例１と同様に行った。
【０１０５】
実施例１〜３におけるスポットの蛍光強度の比較を表１〜表３に示す。
【０１０６】
【表１】
2007222010.tif 000007
【０１０７】
【表２】
2007222010.tif 000008
【０１０８】
【表３】
2007222010.tif 000009
【０１０９】
ＬＮＡ化したプライマー鎖で遺伝子を検出した場合には、ＬＮＡ化していないプライマー鎖で検出した場合と比較して、検出シグナル量が大きい、非特異的なシグナル検出が起こりにくい結果となった。
【手続補正書】
【提出日】平成18年10月10日(2006.10.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
（プライマー固定）
５’末端がアミノ基で修飾された、各菌２３ＳリボゾームＤＮＡ配列特異なオリゴＤＮＡ鎖を０．２５Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．０）を用いて溶解し、１０μＭのオリゴＤＮＡ溶液を調製した。このとき、３’末端をＬＮＡ化したオリゴＤＮＡ鎖とＬＮＡ化しないオリゴＤＮＡ鎖の両者を調整した。これら溶液をスポッタ（日立ソフトウェアーエンジニアリング製Marks-I）を用い、１００μｍ径クロスカットピンでプラスチック基板の表面上にスポットした。オリゴＤＮＡをスポットした基板を、８０℃で一時間加熱して、オリゴＤＮＡ（プライマー）を固定化させた。
スポットおよび固定化させた大腸菌検出用プライマーの鎖配列を下記に示す。
黄色ブドウ球菌：agtaggataggcgaagcgtgcgatt（配列番号１）    ＳＡ
agtaggataggcgaagcgtgcgatt（配列番号１）    ＳＡ−ＬＮＡ
大腸菌：        ctgatatgtaggtgaagcgacttgctcg（配列番号２）     ＥＣＯ
ctgatatgtaggtgaagcgacttgctcg（配列番号２）      ＥＣＯ−ＬＮＡ
緑濃菌：        gttaatcgacgcagggttagtcggtt（配列番号３）    ＰＡ
gttaatcgacgcagggttagtcggtt（配列番号３）    ＰＡ―ＬＮＡ
サルモネラ菌：  tgtgtgttccaggtaaatccggttc（配列番号４）      ＳＡＬ
tgtgtgttccaggtaaatccggttc（配列番号４）        ＳＡＬ−ＬＮＡ
ポジティブコントロール：gacagccaggatgttggcttagaagcagc（配列番号５）  ＰＯＳ
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
（２３ＳリボゾームＤＮＡの抽出）
上記菌培養における１つのコロニーを、２００μｌのＰＢＳ（−）中に分散させ、ＤＮＡ抽出キット（Invitrogen）を用い、３μｌのＤＮＡ抽出液を得た。
（ＰＣＲによる２３ＳリボゾームＤＮＡ鎖増幅反応）
２３ＳリボゾームＤＮＡのユニバーサルプライマーを用い、ＰＣＲ反応により２３ＳリボゾームＤＮＡの増幅をおこなった。
ＰＣＲによる増幅に使用プライマーの配列を下記に示す。
プライマー配列：
センス  ：５‘−gacagccaggatgttggcttagaagcagc（配列番号５）
アンチセンス：下記を同量混合したものを用いた。
５‘−ggaatttcgctaccttaggaccgttatagttacg（配列番号６）
５‘−ggaatttcgctaccttaggatggttatagttacc（配列番号７）
２５μＬ中に上記プライマー各々を１２．５pmol、２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、０．５ＵのＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製Ex Taq）をＰＣＲバッファー中に溶解させ、
サーマルサイクラーにより、熱変性９５℃１分、アニーリング７５℃２分、ＤＮＡ鎖の伸長反応７２℃５分のヒートサイクルで、１０サイクル行い、ＰＣＲ産物を得た。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007222010000001.app