(57)【要約】      （修正有）【課題】  新規トランスポゼースおよびこれをコードする遺伝子を提供すること。【解決手段】  トランスポゾンｄＴｄｉｃ１を転移する活性を有するトランスポゼースが開示される。本発明のトランスポゼースは、カーネーション由来の特定のアミノ酸配列を有する。トランスポゾンｄＴｄｉｃ１は高い確率で遺伝子のコーディング領域に挿入される性質を有するため、本発明のトランスポゼース、またはこれをコードする遺伝子を含むベクターは、タギング法による遺伝子機能の研究ならびに植物の育種に有用である。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
【請求項２】
配列番号１に記載されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつトランスポゾンｄＴｄｉｃ１を転移する活性を有する蛋白質。
【請求項３】
請求項１または２に記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項４】
配列番号２に記載される塩基配列を有する、請求項３記載の遺伝子。
【請求項５】
請求項３または４に記載の遺伝子を含む、植物細胞中で複製可能なベクター。
【請求項６】
請求項１または２に記載の蛋白質を植物細胞に導入することにより、植物細胞の遺伝子上でトランスポゾンｄＴｄｉｃ１を転移させる方法。
【請求項７】
請求項５記載のベクターを植物細胞に導入することにより、植物細胞の遺伝子上でトランスポゾンｄＴｄｉｃ１を転移させる方法。
【請求項８】
請求項５記載のベクターとトランスポゾンｄＴｄｉｃ１とを含む、植物細胞の遺伝子操作用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は植物の育種技術に関する。より詳細には、本発明は、新規トランスポゼースおよびこれをコードする遺伝子、ならびにこれらを用いる植物遺伝子操作技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に遺伝子は染色体上の一定の座位に存在していて、染色体と行動をともにし、染色体の組換えや転座、欠失など染色体の構造的変異によって座位を変えることがあっても、遺伝子が単独で染色体から分離したり、他の染色体に移ることは考えられない。しかしＢ．ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋ（１９５１）は、トウモロコシの種子や植物体に含まれるアントシアニン遺伝子や、胚乳の黄色デンプンの遺伝子などの発現を変化させる制御遺伝子（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｅｌｅｍｅｎｔ）が、一つの染色体から他の染色体に移動していること、すなわち単独で染色体上を移動する遺伝子が存在することを明らかにした。
【０００３】
このような遺伝子は転移因子（動く遺伝子）といわれ、近年、植物をはじめ生物のゲノムのダイナミズムに関わり、進化に重要な役割を果たしているものとして注目されている。転移因子にはＤＮＡのままで転移するＤＮＡ型と、転移の中間体として生じたＲＮＡが逆転写酵素によりｃＤＮＡとなって転移するレトロ型に大別される。レトロ型は、さらに転移因子の構造上などの違いから、ウイルスポゾンと非ウイルスポゾンにわけられる。
【０００４】
ＤＮＡ型転移因子（以下トランスポゾンと称する）に関する研究は、分子生物学的手法が確立された１９８０年代以降から盛んに行われ、１９８３年にトウモロコシのＷｘ遺伝子座に挿入されていたＡｃ／Ｄｓが単離、塩基配列が決定され、生物から初めてトランスポゾンが見い出された。１９８４年にはキンギョソウからアントシアニン合成系遺伝子ｎｉｖｅａに挿入されていたＴａｍ１が単離、その塩基配列が決定されるなど、多くのトランスポゾンが様々な植物種から単離、同定された。現在も塩基配列を含めた構造解析などのトランスポゾンに関する研究が盛んに行なわれている。
【０００５】
トランスポゾンにはトランスポゾン内に活性のある転移酵素（トランスポゼース）遺伝子をもち、自ら転移ができる自律性因子と、核内に自律性因子が共存し、トランスポゼースがトランスに作用することによってはじめて転移できる非自律性因子が存在する。トランスポゾンには共通して、ターミナル・インバーテッド・リピート（ＴＩＲ）、サブターミナル・リピート（ＳTＲ）、さらに挿入の際に生じるターゲット・サイト・デュープリケーション（ＴＳＤ）と呼ばれる構造的配列が存在する。トランスポゼースはこれらの配列を認識、結合し、ＤＮＡ−蛋白結合体となり、トランスポゾンを切り出し、挿入させることが明らかとなっている。そのなかでもＡｃ／Ｄｓファミリーは  ＴＩＲにＣＡまたはＴＡの配列、８ｂｐのＴＳＤをもつ転移因子群である。しかしトランスポゾンの転移機構や、特に転移の頻度がどのように調節されているのか、また転移因子の役割などについては未だ解明されていない。
【０００６】
古の時代より植物の観賞法として、その花卉が織り成す色と模様があった。この模様の中には花弁に条や斑といった易変性変異も含まれていおり、これらの多くはトランスポゾンによる体細胞変異であることが知られている。花弁の斑入りは、色素合成酵素をコードしている遺伝子にトランスポゾンが挿入することによつて生じる。つまり、トランスポゾンが挿入された遺伝子は機能しないため、それによって色素合成は出来なくなり、花色は正常とは異なるものになる。しかし、トランスポゾンが脱離すると、その遺伝子は正常な機能を回復し、再び色素合成を行なうようになる。正常な機能が回復した遺伝子を含む細胞が多ければ大きい斑が生じ、そのような細胞が少なければ、斑の大きさも小さくなる。様々な植物において花弁の斑入りといった模様を造り出すためにトランスポゾン（遺伝子）を用いた育種が行なわれるようになった。これまでの遺伝学的研究から、カーネーションは様々な色彩をもつ植物であると同時に、非常に高頻度で転移するトランスポゾンが存在し、しかもそのトランスポゾンが遺伝子を効率よく破壊していることが明らかにされている。しかしその分子生物学的実体は未解明のままであった。
【０００７】
本発明者らは、先に、カーネーションの花色に関与する遺伝子の発現を制御するトランスポゾンとして、トランスポゾンｄＴｄｉｃ１を同定した（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｌｏｇｙ，２００２，Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．５，５７８−５８５）。白地に紫色の条が見える花色を有するカーネーションの「ラプソディ（Ｒｈａｐｓｏｄｙ）」を材料として用い、ゲノム遺伝子の解析および花弁における遺伝子発現の分析を行ったところ、色素合成系遺伝子であるＤＦＲ遺伝子にＡｃ／Ｄｓ型のトランスポゾンが挿入されていることが見いだされた（図３）。さらに、このトランスポゾンｄＴｄｉｃ１の挿入によって色素合成系遺伝子が不活性化され、脱離することによって再活性化されること、このことにより斑入りなどの複雑な花色が生ずること、およびｄＴｄｉｃ１は遺伝子のエクソンに挿入して遺伝子破壊を引き起こすという、他のトランスポゾンにはない極めて珍しい特性をもっていることが明らかとなった。
【０００８】
しかし、このｄＴｄｉｃ１には、転移する際にトランスポゼースが結合するサブターミナル・リピート（ＳＲ）がいくつか存在するが、内部にトランスポゼースをコードするＯＲＦは見い出されなかった。すなわち、ｄＴｄｉｃ１は転移酵素を内部にコードしない非自律性因子であり、カーネーションゲノム内に存在する自律性因子からトランスポゼースがトランスに作用することによって、ｄＴｄｉｃ１が転移することがわかった。したがって、ｄＴｄｉｃ１を転移させることができるトランスポゼースを同定して、その機能を明らかにすることが求められていた。
【非特許文献１】Plant Cell Physilogy, 2002, Vol. 43, No. 5, 578-585
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、新規トランスポゼースおよびこれをコードする遺伝子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、トランスポゾンｄＴｄｉｃ１を転移する活性を有する新規トランスポゼースを同定し、Ｔｄｉｃと命名した。本発明は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有するトランスポゼースを提供する。本発明はまた、配列番号１に記載されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつトランスポゾンｄＴｄｉｃ１を転移する活性を有する蛋白質を提供する。
【００１１】
別の観点においては、本発明は、上述のトランスポゼースをコードする遺伝子を提供する。好ましくは、本発明の遺伝子は配列番号２に記載される塩基配列を有する。本発明はまた、上述のトランスポゼースをコードする遺伝子を含む、植物細胞中で複製可能なベクターを提供する。
【００１２】
さらに別の観点においては、本発明は、本発明のトランスポゼースを植物細胞に導入することにより、植物細胞の遺伝子上でトランスポゾンｄＴｄｉｃ１を転移させる方法を提供する。本発明はまた、本発明のトランスポゼースをコードする遺伝子を含むベクターを植物細胞に導入することにより、植物細胞の遺伝子上でトランスポゾンｄＴｄｉｃ１を転移させる方法を提供する。さらに、本発明は、本発明のトランスポゼースをコードする遺伝子を含むベクターとトランスポゾンｄＴｄｉｃ１とを含む、植物細胞の遺伝子操作用キットを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の新規トランスポゼースのアミノ酸配列は図１（配列番号１）に記載される。本発明のトランスポゼースは、トランスポゾンｄＴｄｉｃ１を転移する活性を有する。ここで、転移とは、遺伝子中にトランスポゾンを挿入させること、および挿入されているトランスポゾンを切り出すことの両方を含む。また、トランスポゾンｄＴｄｉｃ１とは、ターミナル・インバーテッド・リピートとして、5'-CAGGGTT-------AACCCTG-3'を有するＡｃ／Ｄｓ型トランスポゾンである。
【００１４】
本発明のトランスポゼースは、トランスポゾンｄＴｄｉｃ１を転移する活性を有する限り、配列番号１に記載されるアミノ酸配列において１もしくはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有していてもよい。このようなアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を作製する方法は当該技術分野においてよく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，第２版，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載される部位特異的塩基配列置換を利用することができる。このような変異体は、好ましくは、上述のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは９０％またはそれ以上、より好ましくは９５％またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００１５】
本発明のトランスポゼースは、植物細胞の遺伝子にトランスポゾンｄＴｄｉｃ１を挿入し、およびトランスポゾンｄＴｄｉｃ１が挿入されている遺伝子からこれを切り出す活性を有するため、トランスポゾンｄＴｄｉｃ１を利用して植物の遺伝子を操作するための有用なツールとして用いることができる。
【００１６】
本発明はまた、本発明のトランスポゼースをコードする遺伝子を提供する。好ましくは、トランスポゼースをコードする遺伝子は図２（配列番号２）に記載される塩基配列を有する。本発明のトランスポゼースをコードする遺伝子は、植物細胞中で複製可能なベクター中に組み込んで、植物細胞中に導入して植物細胞を形質転換することにより、植物の遺伝子を操作するための有用なツールとして用いることができる。（なお図2（配列番号２）に記載される塩基配列においては１４７５番目から１５６９番目までがイントロンとなっていることが核ゲノム配列から確認されており、図2（配列番号２）に記載される塩基配列は不完全なスプライシングのためイントロンが除去されていない。）本発明において、植物細胞の形質転換に用いられるベクターは、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はないが、挿入遺伝子を過剰発現させることが可能なベクターであることが好ましい。好ましくは、ベクターは、導入された細胞内でＤＮＡが転写され、トランスポゼースが適切に発現されるような様式で配列された、プロモーター領域、開始コドン、終止コドンおよびターミネーター領域等を含む。例えば、植物細胞内で恒常的に遺伝子を発現させるためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクターや、外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることもできる。例えば、バイナリーベクターｐＢＩ  １０１（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら１９８７）などこれらの改変ベクターを使用することができる。
【００１７】
また、上記「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
【００１８】
植物細胞へのベクターの導入には、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法など、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。
【００１９】
形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。例えば、高等植物において形質転換植物体を作出する手法については、組織からプロトプラストを単離し、最適培養密度に調整した後に、植物ホルモンを添加したＭＳ培地でカルスを誘導し、これを脱分化させることによって植物体を再生させる方法など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００２０】
ゲノム内に本発明のトランスポゼースをコードする遺伝子が導入された形質転換植物体がいったん得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることができる。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなど）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。
【００２１】
また、本発明の形質転換植物体やその子孫あるいはクローンから切り花を生産することも可能である。本発明は、このような切り花もまた提供するものである。切り花とは、一般的には枝や茎のついたまま切りとった花を指すが、本発明における切り花には、枝や茎のついていない花も含む。
【００２２】
本発明のトランスポゼースをコードする遺伝子は、好ましくは、トランスポゾンｄＴｄｉｃ１とともに植物細胞中に導入する。トランスポゼースがトランスに作用して、トランスポゾンｄＴｄｉｃ１が植物細胞中の遺伝子に挿入され、このことによりその遺伝子の機能を破壊または変更することができる。あるいは、既にトランスポゾンｄＴｄｉｃ１を有する植物細胞に本発明のトランスポゼースをコードする遺伝子を導入してもよい。
【００２３】
一般に、トランスポゾンは、その挿入によって遺伝子破壊を生じさせるために、遺伝子の発現を抑制・失活するのに有用である。これを利用した遺伝子解析法がトランスポゾン・タギングである。トランスポゾンを遺伝子導入ベクターに結合して、これを内在性の転移因子による変異体が見い出されていないような植物に遺伝子導入し、この外部から導入したトランスポゾンを転移させて未知遺伝子内に挿入させる。次に、トランスポゾンをプローブとしてこの未知遺伝子を単離・同定することができる。このようなトランスポゾンを用いたタギング法によって、植物においてこれまでに様々な有用遺伝子がクローニングされてきた。また、遺伝子破壊することによって機能を調べる機能喪失（ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）の手法として、トランスポゾンを用いたタギング法は最も有効な方法である。
【００２４】
特に、トランスポゾンｄＴｄｉｃ１は、高い確率で遺伝子のコーディング領域に挿入される性質を有するため、本発明のトランスポゼースを用いて、タギング法による遺伝子機能の研究を効率よく行うことが可能である。さらに、トランスポゾンｄＴｄｉｃ１は、特定の遺伝子中に挿入されたときに，その遺伝子の発現を完全に消失させない性質を有する。このことから、これまでの方法では単離することが不可能であった、生育に直接関与する遺伝子など、不活性化されると致死に至るような遺伝子の単離にも有用である。
【００２５】
また、実施例２に示されるように、様々な花色を示すカーネーションからＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行なった結果、本発明のトランスポゼースはカーネーション花弁において特異的に発現していることが認められた（図４）。このことから、本発明のトランスポゼースは、花形成および色素合成関与遺伝子のタギングに特に適している。
【００２６】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
トランスポゼースＴｄｉｃのクローニング
カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）の栽培品種の、赤花をつける「シンフォーニーローズ（Ｓｙｍｐｈｏｎｙ  Ｒｏｓｅ）」および複色花「ラプソディー（Ｒｈａｐｓｏｄｙ）」、「９８２３５２−２８」を千葉県、長野県の農場で栽培し、適宜、４つの発育段階の花弁および葉、茎、根に分離した。組織を秤量し、液体窒素中で凍結して、−８０℃で保存した。
【００２８】
全ＤＮＡは、ＣＴＡＢ−ＣｓＣｌ超遠心法を用いて、上記品種である「ラプソディー（Ｒｈａｐｓｏｄｙ）」および「９８２３５２−２８」の葉より調製し、ＰＣＲのテンプレートとして使用した。ＰＣＲ増幅には、先にカーネーションから見い出されたトランスポゾンｄＴｄｉｃ１の配列（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｌｏｇｙ，２００２，Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．５，５７８−５８５）をもとに設計した。
リバースプライマー：
5'-CAGGGGTTTTAAATATCGGTATCG-3'
および
5'-CCGTCGGCCAGGGTTCAAAATCTCGGCCGAGTTGACTCGT-3'；
フオワードプライマー：
5'-AATGTTACAGGTAACCGAGATG-3'
および
5'-CACATATATCGACCCAACCGAGAT-3'
【００２９】
ＤＮＡ混合物１μｌとプライマー２ｐｍｏｌを含むＬＡ−ＰＣＲ混合物（１０μｌ）を、供給者の推奨に従って調製した。混合物は９２℃にて１分間インキュベートし、その後０．５ユニットのＴａＫａＲａＬＡ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを加えた。ＰＣＲは４０回の増幅サイクルを実施した（９２℃にて３０秒；５５℃にて４５秒；７２℃にて１分）。増幅した断片をｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔＳＫ中にクローニングして、Ａｌｏｋａ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ｍｏｄｅｌ  ４０００ＬとともにＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅサイクルシークエンシングキット（ｕｓｂ）を使用して配列決定を行った。
【００３０】
このようにして得られたＴｄｉｃの遺伝子配列をもとにＴｄｉｃ  ｃＤＮＡのクローニングを行なった。全ＲＮＡは、改良グアニジニウムチオシアネート−ＣｓＣｌ超心法を用いて、上記２品種の第二段階の閉じた蕾の花弁（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏらの図５Ａ、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１７：３２５−３２９，２０００）より調製した。ポリ（Ａ）+ＲＮＡは、ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、日本）を用いて、供給者によるマニュアルに記載されているように全ＲＮＡから調製した。第一鎖ｃＤＮＡは、第一鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｔａｋａｒａ）を用いて、上記品種の花弁から調製したポリ（Ａ）+ＲＮＡにより合成し、ＰＣＲのテンプレートとして使用した。全長ｃＤＮＡは、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（登録商標）Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、オランダ）を用いて調製した。Ｔｄｉｃの遺伝子配列データに基づいて、以下のフオワードおよびリバースプライマーを作成した。
リバースプライマー：
5'-AGTCTCTAGGAGTAAGTTGGTCACTAT-3'
および
5'-TGGTCGATGAAATGTGAAGTCACGACCA-3'；
フオワードプライマー：
5'-TATCTATTGTTGATCACTTTGGT-3'
および
5'-GATTGGATGCAGTCCACATATCCG-3'
【００３１】
ｃＤＮＡ混合物１μｌとプライマー４ｐｍｏｌを含むＬＡ−ＰＣＲ混合物（１０μｌ）を、供給者の推奨に従って調製した。混合物は９２℃にて１分間インキュベートし、その後０．５ユニットのＴａＫａＲａＬＡ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを加えた。ＰＣＲは４０回の増幅サイクルを実施した（９２℃にて３０秒；５５℃にて４５秒；７２℃にて１分）。増幅した断片を上記と同様に塩基配列の解析を行なった。
【実施例２】
【００３２】
トランスポゼースＴｄｉｃの発現分析
様々な花色を示すカーネーション数種から、実施例１と同様にして全ＲＮＡを調製し、１μｇのポリ（Ａ）+ＲＮＡから第一鎖ｃＤＮＡを合成した。これをテンプレートとして使用して、ＲＴ−ＰＣＲ解析によりトランスポゼースＴｄｉｃの発現分析を行った。
【００３３】
このｃＤＮＡ混合物１μｌとプライマー４ｐｍｏｌを含むＬＡ−ＰＣＲ混合物（１０μｌ）を、供給者の推奨に従って調製した。混合物は９４℃にて１分間インキュベートし、その後０．５ユニットのＴａＫａＲａＬＡ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを加えた。ＰＣＲは２０回の増幅サイクルを実施した（９２℃にて３０秒；５３℃にて４５秒；７２℃にて１分）。プライマーとしては以下に示す配列のプライマーを用いた：
5'- AGTCTCTAGGAGTAAGTTGGTCACTAT-3'
5' -GAATATGAGCACTACATCTCATATGCAT-3'
【００３４】
結果を図４に示す。トランスポゼースＴｄｉｃは、カーネーション花弁において特異的に発現しており、葉では発現していないこと、および、花弁における発現量はカーネーションの種類によって異なることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１はトランスポゼースＴｄｉｃのアミノ酸配列を示す。
【図２】図２はトランスポゼースＴｄｉｃをコードする遺伝子の塩基配列を示す。
【図３】図３はトランスポゾンｄＴｄｉｃ１の構造を示す。
【図４】図４はトランスポゼースＴｄｉｃの発現分析を示す。
【図１】
2007037407.tif 000002
【図２】
2007037407.tif 000003
【図３】
2007037407.tif 000004
【図４】
2007037407.tif 000005
【配列表】
2007037407000001.app