(57)【要約】      （修正有）【課題】簡便、安全、安価且つ短時間操作で線維芽細胞の除去を行うことができる線維芽細胞除去フィルター及び線維芽細胞除去方法を提供する。【解決手段】液体導入口と液体導出口を有する容器に線維芽細胞高親和性材料を収納した線維芽細胞除去フィルターを用いて線維芽細胞含有液を通す。さらに線維芽細胞除去フィルターの前記線維芽細胞高親和性材料が、少なくとも表面に線維芽細胞高親和性物質を有する水不溶性多孔質構造体である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体導入口と液体導出口を有する容器に線維芽細胞高親和性材料を収納した線維芽細胞除去フィルター。
【請求項２】
前記線維芽細胞高親和性材料が少なくとも表面に線維芽細胞高親和性物質を有する水不溶性多孔質構造体である請求項1の線維芽細胞除去フィルター。
【請求項３】
前記線維芽細胞高親和性物質が非動物由来物である請求項２に記載の線維芽細胞除去フィルター。
【請求項４】
線維芽細胞含有液を請求項１から３記載の何れかの線維芽細胞除去フィルターで濾過することを特徴とする線維芽細胞除去方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線維芽細胞含有液から線維芽細胞を除去するフィルターに関する。本発明による線維芽細胞除去フィルターは基礎科学実験用器具や臨床医学における医療器具として用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞を積極的に活用して、生体の臓器組織の病変および／または欠損を治療する、いわゆる再生医療が大変注目を集めており、世界各国で研究開発が盛んに行われている（たとえば非特許文献１）。通常、これらの細胞が存在する部位には、しばしば不要な夾雑細胞が混在しており、特に線維芽細胞はその最たるものである。
【０００３】
近年、線維芽細胞の除去に注目が集まり、例えば特許文献１には浮遊性培養法により繊維が細胞を分離・除去する方法が開示されている。同方法は細胞培養用フラスコにて１日間培養し、線維芽細胞を付着除去させるという煩雑で長時間を要するものであり、通常これらの細胞分離法はクリーンベンチ内で行われるものの、完全開放系の操作のため無菌性に難がありヒトへの臨床応用には安全上、問題を有する。
【０００４】
また、非特許文献２の102、103ページは細胞培養における線維芽細胞の除去法に関して多くの技術を網羅的に記述してあり、同文献によれば、線維芽細胞の除去法として以下の７法をあげている。「（１）植え込む時、基質への付着性の差を利用して選別（decantation）、（２）熱などによる物理的除去法、（３）酵素処理による除去、（４）Thimerosal処理による除去、（５）培地成分による除去、（６）DNA合成阻害剤の使用、（７）解糖阻害剤２−デオキシ−２−フルオログルコースまたはヨード酢酸の使用」。ここで、（１）は前述の特許文献１で説明したものと同じ方法であり、煩雑で長時間を要するとい問題点がある。（２）については、非特許文献２には、さらに以下の記載がある。「（２）の物理的な方法は顕微鏡下に観察しながら先の尖った針、あるいはパスツールピペットで取り除いてもよいし、また尖鋭な電気ゴテを培養器の外からあてて細胞を焼灼することも可能である」。この記述からみても非常に煩雑で、かつ無菌操作性に難があり、極微量の処理にしか適していないことは明らかである。（３）〜（７）は前述の（２）のような、完全手作業ではないので、処理量の点では改善されているとは思えるが、これらの薬剤は線維芽細胞だけでなく、非線維芽細胞にも悪影響を与えることが危惧され、さらに、これらの操作を行った後に洗浄操作が必要であり、やはり煩雑・長時間を要することには変わりない。
【０００５】
ところで、近年、抗体を用いたフィルターによりこれらの問題点を解決する方法が散見されるようになった。たとえば特許文献２では繊維で構成された不織布にカルボキシル基および親水性鎖を導入した担体に、幹細胞の膜表面の抗原に対する抗体を固定化してなる幹細胞分離材が開示されている。本技術は幹細胞しか開示されておらず、線維芽細胞の除去に関しては一切言及されていないが、幹細胞に対する抗体の代わりに線維芽細胞に関する抗体を用いて同様なフィルターを作成し、線維芽細胞を除去するという方法も理論的に考えられる。これにより操作が煩雑、長時間という問題点は解消されると思われるが、抗体を用いるという点で非常にコスト高であり、また抗体はしばしば異種動物のタンパク質であるため、安全性に問題が残る。さらに、本方式では線維芽細胞の抗体が必須であるが、線維芽細胞は多数の市販抗体が存在し容易に入手できる血液系細胞と異なり、確実に線維芽細胞と反応する抗体は存在していないと言って良い。
【０００６】
以上より、線維芽細胞の除去に関する簡便、安価、安全性の高い技術は現存しておらず、さらに、類縁既存技術の一部改変により線維芽細胞除去への展開をすることを行っても、未解決の問題や、新たな問題を生じることになり、線維芽細胞の画期的除去技術が待望されていた。
【特許文献１】特開２００３−２４５０６７号公報
【特許文献２】特開平８−３３７０８号公報
【非特許文献１】（株）シーエムシー出版、「再生医療工学の最先端」、２００２年
【非特許文献２】丸善（株）、「機能細胞の分離と培養」、１９８７年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、簡便、安全、安価且つ短時間操作で線維芽細胞の除去を行うことができる線維芽細胞除去フィルターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意検討を進めた。まず、従来の細胞生物学実験の常套手段である線維芽細胞と正確に反応する（特異性の高い）抗体を取得するという方法はとらずに、また、細胞培養皿やプレートといった細胞生物学実験で多用される平面要素を用いないことを前提として種々の条件を鋭意検討した結果、線維芽細胞をある特定のフィルターに通液するだけで吸着除去できるという驚くべき事実を発見し、本発明の完成に至ったものである。
【０００９】
すなわち本発明は、液体導入口と液体導出口を有する容器に線維芽細胞高親和性材料を収納した線維芽細胞除去フィルターであり、また本発明は前記線維芽細胞高親和性材料が少なくとも表面に線維芽細胞高親和性物質を有する水不溶性多孔質構造体である線維芽細胞除去フィルターであり、さらに本発明は前記線維芽細胞高親和性物質が非動物由来物である線維芽細胞除去フィルターである。さらにまた、本発明は線維芽細胞含有液を前記線維芽細胞除去フィルターで濾過することを特徴とする線維芽細胞除去方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の線維芽細胞除去フィルターにより、簡便、安全、安価、短時間操作で線維芽細胞の除去を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明について、以下、具体的に説明する。
本発明における線維芽細胞除去フィルターは線維芽細胞高親和性材料を液体導入口と液体導出口を有する容器に収納したものであるが、ここで、液体導入口と液体導出口とは、液体が導出入されれば、いかなる形状でもよく、単なるチューブ、スパイク、金属針、オス、メスルアー等が挙げられる。また、フィルターに通液される原料細胞液の保存や廃液や回収の目的のために、血液バッグ等の回路を直接接続したものでもよい。また、これらの液体導入口および液体導出口は、容器に、直接、存在していても、チューブを介して接続されていてもよい。液体導入口と液体導出口の位置は、液体導入口から細胞懸濁液が入り、濾材を経て液体導出口に至るものであれば、容器における位置は限定されない。
【００１２】
また、原料液中に存在する凝集塊（しばしば目詰まりの原因となる）を排除するために、いわゆるプレフィルターを容器内あるいは容器外に具備させておいても良いが、この場合、プレフィルターに分離回収が必要となる細胞が捕捉除去されてしまわないようにすることが重要である。
【００１３】
容器の材質は、成形性および滅菌性に優れ、細胞毒性が低いという点で好ましいものを例示すると、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン、塩化ビニル等の合成高分子、ヒドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン、アルミニウム等の金属があげられるが、これらに限定されるものではない。
【００１４】
本発明でいう線維芽細胞高親和性材料とは少なくとも表面に線維芽細胞に高い親和性を有する物質を有する水不溶性多孔質構造体を指す。ここで、線維芽細胞高親和性物質とは線維芽細胞に親和性を有する物質であればいかなるものも利用できるが、安全性、価格の面からは動物由来の物質では無いことが好ましく、また、人工物の中では本発明者らは陽性荷電を有する合成高分子材料が特に好ましいことを見出している。
【００１５】
これらは以下が例示される。陽性荷電を有する化学種あるいは官能基としては、第１級アミノ基、第２級アミノ基、第３級アミノ基、第４級アンモニウム塩基、ピリジル基、イミダゾリル基、第４級ホスホニウム塩基、金属イオンなどを使用できるがこれに限定されない。陽性荷電の強さを考慮すると第３級アミノ基、第４級アンモニウム塩、第４級ホスホニウム塩が望ましく、更にはコーティングのしやすさを考慮すると第３級アミノ基、第４級アンモニウム塩を含有する単独重合体または共重合体が望ましい。
【００１６】
基材表面に第３級アミノ基、第４級アンモニウム塩を固定する方法としては、該化学種または官能基を含む低分子化合物や高分子化合物を、吸着、イオン結合、配位結合、共有結合、グラフト重合、コーティング及び基材成形時にブレンドするなどの方法により固定することが可能であり、より望ましくは、第３級アミノ基、第４級アンモニウム塩を含有する単独重合体または共重合体を塗布することが好適である。また表面改質により直接に化学反応で基材表面に第３級アミノ基、第４級アンモニウム塩を導入することも本発明には好適である。
【００１７】
本発明ではこれら線維芽細胞親和性物質が水不溶性多孔質構造体の少なくとも表面に存在せしめ線維芽細胞親和性材料とするが、ここで、水不溶性多孔質構造体の材質としては入手しやすさや安定性、安全性の観点からは以下に示す材料が好ましいが、これらに限定されるものではない。ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン等の合成高分子、アガロース、セルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸塩等の天然高分子、ヒドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン、アルミニム等の金属。
【００１８】
また、多孔質構造体とはメッシュ、織布、不織布、繊維塊（短繊維、長繊維）、スポンジ状構造体、粒子集合体等があげられ、これらをそのまま、あるいは積層体、袋状、３次元成型体（ブロック状）等の形態にして前記容器に収納して線維芽細胞除去フィルターとする。
【００１９】
また、本発明では前記線維芽細胞高親和性物質が少なくとも表面に存在しているものを線維芽細胞高親和性材料としている。これは、当該線維芽細胞高親和性物質そのもので線維芽細胞高親和性材料（水不溶性多孔質構造体）を作成しなくても、当該物質が少なくとも表面（細胞と接触する）に有していれば良いことを指している。この場合、当該物質を何らかの方法で水不溶性多孔質構造体に被覆することになるが、その被覆方法としてはコーティング、各種グラフト処理などがあげられ、適宜選択する。
【００２０】
本発明でいう線維芽細胞含有液とは少なくとも線維芽細胞を含む液体のことであり、線維芽細胞以外に含有する細胞は何らかの用途に用いる細胞であり線維芽細胞の混入が問題となる細胞で、たとえば、以下の細胞を含む液体があげられるがこれらに限定されるものではない。白血球、赤血球、顆粒球、好中球、好塩基球、好酸球、骨髄球、赤芽球、リンパ球、Ｔリンパ球、ヘルパーＴリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、サプレッサーＴリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、破骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、造血幹／前駆細胞（以下、造血幹細胞と略す）、軟骨芽細胞、間葉系幹／前駆細胞（stroma stem cellまたはmesenchymal stem cell）、巨核球、血小板、脂肪細胞、肝実質細胞、肝非実質細胞、内皮細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、内分泌細胞、外分泌細胞、膵β細胞、膵α細胞、膵δ細胞、膵ＰＰ細胞、腎メサンギウム細胞、腎尿細管細胞、腎糸球体細胞、神経細胞、成人幹細胞（ＳＰ細胞、MAPCなど）、ＥＳ細胞、各種腫瘍細胞などがあげられる。
【００２１】
また、単一の細胞だけでなく、細胞の集合体、たとえば内分泌細胞の集合体である膵島も含まれる。
【００２２】
陽性荷電を有するとは、有機溶媒の含有量が５０％未満の水溶液、および湿度10%RHから100%RHの通常大気中において、動物細胞が生存できるｐHすなわちｐHが5−10、より望ましくはｐHが6.5−8.5の範囲において重合体の荷電が陽性である状態をいう。該水溶液中には塩化ナトリウムなどの無機塩類が存在していてもかまわない。
【００２３】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
（陽性荷電を有する重合体の調整）
ジメチルアミノエチルメタクリレート:DMAEMA (0.63g、4mmol)と２ヒドロキシプロピルメタクリレート：HPMA(5.19g、36mmol)をエタノール20ｇに溶解し、アゾビスイソブチロニトリル：AIBN(33mg、0.20mmol)を添加し氷冷下溶解させながら、容器内をアルゴン置換した。容器を密栓後70℃で８時間反応した。反応液を多量のｎ−ヘキサンに加え生じた沈殿を減圧下乾燥し、第３級アミノ基含有共重合体を得た（以下、重合体１と表記）6.41gを得た。共重合の組成はNMRにより確認し、DEMAEMA：HPMA=11：89であった。
【００２５】
ジメチルアミノエチルメタクリレート：DMAEMA (2.08g、13mmol)とメチルメタクリレート：MMA(3.08g、31mmol)をエタノール２０ｇに溶解し、アゾビスイソブチロニトリル：AIBN(36mg、0.22mmol)を添加し氷冷下溶解させながら、容器内をアルゴン置換した。容器を密栓後70℃で８時間反応した。反応液を多量のｎ−ヘキサンに加え生じた沈殿を減圧下乾燥し、第３級アミノ基含有共重合体を得た（以下重合体２と表記）4.58gを得た。共重合の組成はNMRにより確認し、DEMAEMA：MMA=30：70であった。
【実施例２】
【００２６】
（線維芽細胞高親和性材料の作製）
ポリエチレンテレフタレート製不織布E01050（旭化成せんい社製）を、実施例１で作製した重合体１または重合体２の2wt%DMF溶液に浸せきし、余分なコーティング液をローラーにより絞りとり、50℃で減圧乾燥した。これにより線維芽細胞高親和性材料である、表面に重合体１（重合体１含有不織布と表記）または重合体２（重合体２含有不織布と表記）を含有する不織布を作製した。
【００２７】
（線維芽細胞除去フィルターの作製）
上述のようにして作製した線維芽細胞高親和性材料を直径8.5mmに打ち抜き、2.5ｍｌのシリンジ筒(テルモ社製)に8枚重ねて充填することによって、液体導入口と液体導出口を有する容器内に線維芽細胞高親和性材料を収納した。以上の操作によって線維芽細胞除去フィルターを作製した。
【実施例３】
【００２８】
（線維芽細胞除去実験）
NIH-3T3(ATCC：CRL-1658；マウス株化線維芽細胞)、HEPES-NaOH(20mM)(Sigma社製)、ペニシリン−ストレプトマイシン（米国、GIBCO-BRL社製）、および10%のFBS(GIBCO-BRL社製)を含むDMEM培地(pH7.4)(GIBCO  BRL社製11995-065)で継代培養した。実験時は組織培養用dish上の両細胞を、生理的リン酸緩衝食塩液pH=7.4 (以下PBS(−)と記載)で洗浄後、37℃に保温した0.05%トリプシン−0.53mM  EDTA-4Na液（以下：トリプシン液と記載；GIBCO-BRL社製）を添加し、タンパク分解酵素であるトリプシン消化条件を(2,min；37℃)処理した。その後、血清(FBS)含有培地を添加することによって、トリプシンの作用を止め、さらにピペットによる水流(以下ピペッティングと記載)で組織培養用dish底面の細胞を剥離し回収した。
【００２９】
実施例２で作製した線維芽細胞除去フィルターに、線維芽細胞であるNIH-3T3細胞を10%FBS入りDMEM培地に懸濁した細胞懸濁液(5×10E5 cells/ml) 2.5mlずつを自然落下により通液し、そのフィルター通過液を回収した。このフィルターに要した時間は1分未満であり、重力による落下という簡便な方法且つ短時間で処理することが可能であった。
フィルター通過前後の細胞数をCyQUANT（モレキュラープローブ社）により、説明書に従って算出した。これをもとに算出した細胞の除去率は、重合体１含有不織布を充填した線維芽細胞除去フィルターで82.8%であり、重合体２含有不織布を充填した線維芽細胞除去フィルターで97.9%であった。また、比較の為に、重合体１や重合体２をコーティングしていない不織布（未コート不織布と表記）で同様の実験を行ったものでは、36.2%であった。このように本発明の線維芽細胞除去フィルターにより、線維芽細胞であるNIH-3T3細胞を効果的に除去出来ることが明らかとなった。
【実施例４】
【００３０】
（非線維芽細胞除去実験）
RINr細胞(ラット膵島腫瘍由来株化インスリノーマ細胞；参考文献：Proceedings National Academy of Science, USA 77(6) p3519-3523)は、HEPES-NaOH(20mM)(Sigma社製)、ペニシリン−ストレプトマイシン（GIBCO-BRL社製）、および5%のFBS(GIBCO-BRL社製)を含むRPMI1640培地(pH7.4)(SIGMA社製R-8758)で継代培養した。実験時は組織培養用dish上の細胞をPBS(−)で洗浄後、37℃に保温したトリプシン液で２分間処理後、血清(FBS)含有培地を添加することによって、トリプシンの作用を止め、ピペッティングを行い組織培養用dish底面の細胞を剥離し回収した。
【００３１】
実施例２で作製した線維芽細胞除去フィルターに、RINr細胞を10%FBS入りDMEM培地に懸濁した細胞懸濁液(5×10E5 cells/ml) 2.5mlずつを自然落下により通液し、そのフィルター通過液を回収した以外は実施例３と全く同様に操作を行った。
これをもとに算出した細胞の除去率は、重合体１含有不織布を充填した線維芽細胞除去フィルターで24.9%であり、重合体２含有不織布を充填した線維芽細胞除去フィルターで30.9%であった。また、比較の為に、重合体１や重合体２をコーティングしていない不織布（未コート不織布と表記）で同様の実験を行ったものでは、26.1%であった。このように本発明の線維芽細胞除去フィルターでは、線維芽細胞ではない細胞であるRINr細胞を実質的に除去しないことが明らかとなった。
【実施例５】
【００３２】
実施例２で重合体１や重合体２の代わりに重合体３としてポリアリルアミン塩酸塩（平均分子量約７万、Aldrich社製）を用いる他は実施例２、３、４と同様の操作を行った。重合体３含有不織布を充填した線維芽細胞除去フィルターによる線維芽細胞除去率は７３．７％であり、非線維芽細胞除去率は３２．８％であった。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明による線維芽細胞除去フィルターは基礎科学における実験用器具や臨床医学に用いられ、分離された細胞（線維芽細胞が除去された細胞）はそのまま、または必要に応じて、さらなる分離精製（洗浄を含む）、培養、活性化、増幅、遺伝子導入、凍結保存等の処理が施された後、生体への移植や細胞生物学や免疫学等の基礎科学実験に用いられる。