(57)【要約】      （修正有）【課題】がん細胞の栄養飢餓耐性を阻害する物質をスクリーニングする方法と、正常細胞に対して栄養飢餓耐性を付与することのできる物質をスクリーニングする方法を提供する。【解決手段】栄養飢餓耐性を有する細胞を栄養飢餓培地で培養し、その培地に候補物質を添加し、栄養飢餓耐性細胞の生育を阻害する物質を、組織傷害用治療薬の有効成分として特定することを特徴とする薬剤成分のスクリーニング方法と、正常細胞を栄養飢餓培地で培養し、その培地に候補物質を添加し、細胞の生育を継続させる物質を臓器・組織保護薬の有効成分として特定することを特徴とする薬剤成分のスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
正常細胞を栄養飢餓培地で培養し、その培地に候補物質を添加し、細胞の生育を継続させる物質を臓器・組織保護薬の有効成分として特定することを特徴とする薬剤成分のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、薬剤成分のスクリーニング方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、がん治療薬等の組織傷害用治療薬の有効成分をスクリーニングする方法、および血流傷害等に対する臓器・組織保護薬の有効成分をスクリーニングする方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、がん治療薬として、がん細胞を死滅させる物質を有効成分とする薬剤が広く用いられてきた。しかしながら、このような細胞殺傷性の強い物質は必然的に副作用が極めて強く、長期の使用は不可能なものが多かった。また、最近開発されつつある血管新生阻害剤は、がん組織に特異的に作用するものとして期待されているが、血管新生が不十分ながん組織（例えば、膵臓がん等）には効果が期待できない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
血管新生能の乏しいがん組織の場合には、酸素、グルコース、その他の栄養物および成長因子などの代謝に必要な物質のがん細胞への供給が不十分であることが予想される。それにも拘わらず、がん細胞が増殖を継続するという事実は、がん細胞が栄養飢餓に対して耐性を獲得しているためであると考えられる。そこで、そのようながん細胞の栄養飢餓耐性能を阻害すれば、血管新生の乏しいがん組織中では、がん細胞は生存することは不可能となる。
【０００４】
この出願の発明は、以上のとおりの知見に基づいてなされたものであって、がん細胞の栄養飢餓耐性を阻害する物質を特定するための方法を提供することを第１の課題としている。
【０００５】
一方、正常細胞は栄養飢餓状態では急速に死滅する。しかしながら、正常細胞が栄養飢餓に対して耐性を獲得することができれば、例えば血流傷害等によって必要な栄養成分の供給が不十分となった場合にも、その臓器や組織は長期間に渡って生存することが可能となる。
【０００６】
この出願の第２の課題は、正常細胞に対して栄養飢餓耐性を付与することのできる物質を特定するためのスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この出願は、前記第１の課題を解決するための第１の発明として、栄養飢餓耐性を有する細胞を栄養飢餓培地で培養し、その培地に候補物質を添加し、栄養飢餓耐性細胞の生育を阻害する物質を、組織傷害用治療薬の有効成分として特定することを特徴とする薬剤成分のスクリーニング方法を提供する。
【０００８】
またこの出願は、前記第２の課題を解決するための第２の発明として、正常細胞を栄養飢餓培地で培養し、その培地に候補物質を添加し、細胞の生育を継続させる物質を臓器・組織保護薬の有効成分として特定することを特徴とする薬剤成分のスクリーニング方法を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
この出願の発明によって、がん細胞の栄養飢餓耐性を阻害する物質を特定するための方法が提供される。この方法によって特定された物質を用いることによって、血管新生の乏しいがん組織中のがん細胞を特異的に死滅させるがん治療薬の開発が可能となる。また、この出願の発明によって、正常細胞に対して栄養飢餓耐性を付与することのできる物質を特定するためのスクリーニング方法が提供される。この方法によって特定された物質を用いることによって、例えば血流傷害等による細胞死を予防するための臓器・組織保護剤の開発が可能となる。
【００１０】
以下、この出願の発明について実施形態を詳しく説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
第１の発明において、栄養飢餓培地とは、血清、グルコース、アミノ酸等の栄養成分の１以上を除去した動物細胞用培地（例えば、DMEM培地等）である。そして正常細胞は、血清、グルコースおよびアミノ酸を含まないDMEM培地で培養した場合、ほとんど全ての細胞が24時間以内に死滅する。従って、この第１発明の方法に用いる栄養飢餓耐性を有する細胞とは、そのような栄養飢餓培地で50%以上の細胞が24時間以上、好ましくは36時間以上にわたって生育可能な細胞である。具体的には、膵臓がん細胞株、胃癌細胞株、結腸がん細胞株等から、栄養飢餓耐性能を指標として適宜に選択して用いることができる。
【００１２】
第１発明の方法は、例えば、候補物質を栄養飢餓培地に添加し、この培地で栄養飢餓耐性細胞を24時間程度培養し、細胞の生存数を測定することによって行うことができる。コントロール（候補物質無添加）に比較して、生存細胞数を有意に減少させた物質を、組織傷害用治療薬（がん治療薬）の有効成分として特定することができる。なお、特定された物質が、栄養培地での培養細胞に対しては細胞障害性を示さないことを別途確認することは言うまでもない。
【００１３】
この出願の第２の発明は、正常細胞に対して栄養飢餓耐性能を付与することのできる物質を特定する方法である。使用する栄養飢餓培地は、前記第１発明で使用する培地と同様とすることができる。前記のとおり、正常細胞は栄養飢餓培養条件では24時間以内に死滅するので、候補物質を添加した際に、例えば50%以上の細胞が24時間以上生存するような物質を、臓器・組織保護薬の有効成分として特定することができる。
【００１４】
以下、参考例および実施例を示し、この出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
参考例１：栄養飢餓耐性を有する細胞株の確認
(1)  細胞株
胃癌細胞株（MKN28、MKN45、MKN74）、結腸癌細胞株（DLD-1、WiDr、SW-480）、膵臓癌細胞株（PANC-1、AsPC-1、PSN-1、KP-3、BxPC-3、MiaPaCa-2）、肝臓癌細胞株（HepG2、Hep3B、HLE、HuH-7）、発明者らがヒト結腸から樹立した正常ヒト結腸線維芽細胞（HF）を用いた。
【００１５】
(2)  栄養飢餓培養
DMEM培地またはRPMI1640培地にて細胞を培養した。細胞はすべて1.5 x 105個/ウエルで6穴プレートに蒔き、完全な新鮮培地で20時間インキュベートした。次いで細胞をリン酸緩衝液生理食塩水（PBS)にて洗浄し、栄養を除去した培地と交換することにより栄養飢餓培養とした。基本培地は、DMEMの組成に従って以下のように電解質とビタミンのみを含むように調製した；CaCl2(2H2O)、265mg/L；Fe(NO3)(9H2O)、0.1mg/L；KCl、400mg/L；MgSO4(7H2O)、200mg/L；NaCl、6400mg/L；NaHCO3、700mg/L；NaH2PO4、125mg/L；フェノールレッド、15mg/L；25mM HEPES緩衝液（pH7.4）およびMEMビタミン溶液（ギブコBRL社)。グルコースを補う場合は、1000mg/LでD-グルコースを加えた。200ｍMのL-グルタミン、MENアミノ酸溶液およびMEM非必須アミノ酸溶液（ギブコBRL社)はストック溶液として用い、100倍に希釈して添加した。ウシ胎児血清(シグマ社)は使用前に大過剰の0.9％NaClに対して3回透析した。栄養剥奪後の細胞の生存率は、トリパンブルー色素排除法によって計測した。
【００１６】
(3)  結果
膵臓癌細胞株PANC-1は、グルコース飢餓に対して強い抵抗性を示した（図1A)。血清の存在に関わりなく、アミノ酸飢餓の方がグルコース飢餓よりも生存には重要であった。さらに、完全に栄養を欠乏させた条件下で48時間経過しても50％を越えるPANC-1細胞が生存していた（図1B)。腫瘍組織への血液供給が不充分な状態で、グルコースはグリコーゲンの貯蔵からの動員または糖新生によって供給される。アミノ酸自体は、それらがエネルギー源としても作用する酸化的代謝の基質としての役目も果す。アミノ酸は、血流のみならず、細胞自体または周囲の細胞または基質のタンパク質分解によっても供給される。従って、このような知見は、栄養飢餓耐性を持ったがん細胞は、エネルギー代謝を変化させることを示唆している。図1Aに見られるように、PANC-1細胞は血清が存在する場合、グルコースもアミノ酸も存在しない状態で長い期間生存している。この知見は、がん細胞がアミノ酸源としてタンパク質を利用し、それによってエネルギー源を得ているという仮説を支持している。
【００１７】
次に、栄養飢餓状態に対する耐性を調べるために、極度に栄養を剥奪した条件下における細胞の生存を、電解質とビタミンしか含まない培地で細胞を培養することにより調べた。正常なヒト線維芽細胞をこの条件で培養した場合、細胞は24時間以内に死滅した（図2A)。同様に４種のヒト肝臓癌細胞株（Hep3B、HepG2、HLEおよびHuH-7）のほとんどは36時間以内に死滅した。それに対して、６種の膵臓癌細胞株のうち４腫（PANC-1、AsPC-1、BxPC-3およびKP-3）は栄養飢餓状態で長い期間生存した(図2B)。相対的に感受性の高い細胞株（PSN-1およびMiaPaCa-2）でさえ、36時間後で30％を越える細胞が生存していた。
【００１８】
さらに、胃癌および結腸癌細胞株についても栄養飢餓耐性の有無を検討した（図2C)。分化の進んだ胃癌細胞株（MKN28およびMKN74）は正常線維芽細胞と同様に死滅したが、分化の遅れた胃癌細胞株（MKN45）は膵臓癌細胞株と同程度の耐性を示すことが確認された。３種の結腸癌細胞株（SW-480、WiDrおよびDLD-1）は比較的長く生存したが、分化の遅れたもののほうが耐性は優れていた。
参考例２：Akt（タンパクキナーゼB）タンパク質とそのリン酸化の検出
(1)  方法
栄養剥奪後0、12および24時間に細胞溶解物を得た。SDSを含むポリアクリルアミドゲル上でゲル電気泳動を行うことによりタンパク質を分離し、Akt抗体とAkt特異的リン酸化（Ser473）抗体（ニューイングランド・バイオラボ社）を用いたウエスタンブロットにより特異的なバンドを検出した。HRPを結合したヤギ抗ウサギIgG（サンタクルーズ・バイオテクノロジー社）を二次抗体として用い、増感化学発光（アマシャム社）を行った。
【００１９】
(2)  結果
膵臓癌細胞株の中にはAktが過剰発現しているものがあることが報告されている(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 3636-3641, 1996; Mol. Carcinog., 21: 81-86, 1998)ので、細胞の生存とAktの発現との関係を調べるために、ウエスタンブロット解析によりAktの発現を検討した。Aktの過剰発現は栄養飢餓耐性を示した４種の膵臓癌細胞株のうち3種で認められたが、肝臓癌細胞株でな認められなかった（図3)。さらに、６種の胃癌および結腸癌細胞株では、２種の耐性細胞株（MKN45およびSW-480）でAkt発現が見られた。また、Aktは過剰発現する７種のがん細胞株において、５細胞株は過度の栄養飢餓に対して耐性を示した。さらに、栄養剥奪後のPANC-1細胞株においてAkt特異的リン酸化抗体で免疫ブロットすることにより、Aktの活性化を調べた。グルコースの除去またはアミノ酸の除去、もしくは両方の除去によって2時間以内にAktはリン酸化された(図4左)。それに対して、血清を抜いた培地における栄養除去後では、構成的に弱いリン酸化は認められたものの、Aktはリン酸化されなかった。従って、Aktのリン酸化は必ずしも認容性とは相関しているわけではないことが確認された。
【実施例】
【００２０】
実施例１：栄養飢餓耐性細胞の生育阻害剤のスクリーニング例
(1)  方法
LY294002、ワートマニン（カルビオケム社)およびトログリタゾン（三共製薬社）をジメチルスルホキシドに溶解した。LY294002、ワートマニン、ヒトインスリン(和光化学、東京）およびトログリタゾンはそれぞれ最終濃度50μM、100 nM、5μg/mlおよび20μMで加えた。ジメチルスルホキシドの最終濃度は0.1％であり、それは細胞の生存とAktのリン酸化に影響しなかった。10％FCSを含むDMEMを基本培地で10倍に希釈し、栄養分の低い培地を作った。栄養分の低い培地で24時間培養後、トリパンブルー色素排除法によって細胞の生存率を数えた。
【００２１】
(2)  結果
実施例１の結果から、がん細胞ではアミノ酸が効果的に利用されていることが確認されたため、糖新生またはアミノ酸の酸化的代謝が根本的な生化学メカニズムであると想定した。インスリンはこれらの代謝事象を抑制することが知られている。従って、インスリンおよびインスリン増感剤であるトログリタゾン(J. Hypertens., 14: 1325-1330, 1996)を用いてエネルギー代謝変化の阻害を試験した。栄養飢餓培地（10％に希釈したDMEM）で24時間培養した場合、5μg/mlのインスリンは細胞の生存率とに影響を与えなかった（図5)。しかしながら、トログリタゾンは有意に細胞の生存率を低下させた。また、参考例２に示したように、栄養飢餓耐性とAktの活性化は密接に関係していたので、PI3の阻害剤であるワートマニンおよびLY294002(13-15)の影響を調べた。栄養飢餓状態において100nMのワートマニンは細胞の生存に影響しなかったが、50μMのLY294002は細胞の生存を顕著に低下させた。このような効果にどの栄養分が関わっているのかを調べるために、各栄養分を基礎培地に加えて細胞の生存率を調べた。興味深いことに、結果は、２つの化合物の細胞生存阻害には別々の条件が必要であることを示していた。トログリタゾンは、グルコースと血清の両方を除いた条件下での生存を阻害し(図6A)、一方、50μMのLY294002はグルコースおよび/または血清の存在に関わらず、アミノ酸を除いた条件下での細胞の生存を阻害した(図6B)。
【００２２】
次に、トログリタゾンおよびLY294002が、栄養剥奪に対するAkt活性化に影響を与えるかどうかを調べた。20μMのトログリタゾンは、生存を妨げるのに用いたものと同じ条件下でグルコースと血清の両方を除いた場合、Aktのリン酸化を阻害した（図4真ん中)。栄養剥奪を伴わない培地中のAktのリン酸化はLY294002により弱められたが、完全には阻害されなかった(図4右)。アミノ酸が存在しない場合、Aktのリン酸化におけるLY294002の影響はさらに顕著なものだった。それに対して、グルコース除去は、Aktリン酸化を抑制しなかった。このような知見は、Aktの活性化は細胞死が起きるのに必要であるけれども充分ではないことを示唆している。
実施例２：細胞に栄養飢餓耐性を付与する物質のスクリーニング例
(1)  方法
AMPキナーゼ活性化剤であるAICAR（５アミノイミダゾール-4-カルボキサマイド-1βD-リボフラノサイド：シグマ社）を水に溶解した（最終濃度500μM）。細胞は、栄養欠乏に対して感受性のHepG2ヒト肝臓がん細胞株を用いた。栄養飢餓培地としては、グルコースを除去したDMEM培地を用いた。２４時間ごとに生存細胞数をトリパンブルー法により計測した。
【００２３】
(2)  結果
結果は図７に示したとおりである。HepG2細胞は、グルコースを除去した栄養飢餓培地では48時間以内に約80%の細胞が死滅したが、500μMのAICARを添加した場合には、72時間後でもほぼ100%の細胞が生存していた。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】PSNC-1細胞株における細胞の生存に対する各栄養剥奪の影響を調べた結果である。1.5 x 105個/ウエルの密度で細胞を6穴プレートに蒔き、完全に新鮮な培地で20時間インキュベートした。リン酸緩衝液生理食塩水で細胞を洗浄し、栄養因子を含まない培地に変更した。培地から各栄養物を剥奪し、電解質とビタミンしか含まない基本培地にDMEMのレシピに従って1mg/mlのグルコース、アミノ酸溶液、または透析した10％ウシ胎児血清を加えることにより培地を調製した。（A)血清の存在下、（B)非存在下における細胞の生存結果である。飢餓状態を開始する時点の細胞数を100％とした。
【図２】極度な栄養飢餓状態における細胞の生存を試験した結果である。図1で説明したように細胞を調製した。リン酸緩衝液生理食塩水で細胞を洗浄し、栄養因子および血清を含まない培地に変更した。（A）肝癌および正常線維芽細胞、（B)膵臓癌、（C）胃癌および結腸癌の結果である。各ポイントは2回実験のデータの平均である。飢餓状態を開始する時点のウエル当たりの細胞数を100％とした。
【図３】Akt発現のウエスタンブロット分析の結果である。各20μｇの細胞溶解物を各ウエルに入れ、12％SDS−PAGEにて分画した。Akt抗体（ニューイングランド・バイオラボ社）を用いてウエスタンブロット分析を行った。胃、結腸、肝臓、膵臓の各細胞株および線維芽細胞を以下のように左から右に示す。胃癌；MKN25、MKN74、MKN45、結腸癌；DLD-1、WiDr6、SW-480、膵臓癌；PANC-1、AsPC-1、PSN-1、KP-3、BxPC-3、MiaPaCa-2、肝臓癌；HepG2、Hep3B、HLE、HuH-7、正常線維芽細胞；HF。
【図４】PANC-1細胞におけるAktのリン酸化およびAktのリン酸化に対するトログリタゾンとLY294002の影響を調べた結果である。栄養飢餓状態にしてから2、12、24時間後に細胞溶解物を回収した。各20μｇの細胞溶解物試料を各ウエルに入れ、12％SDS-PAGEで分画した。Aktのリン酸化は、Akt特異的（セリン473）リン酸化抗体（ニューイングランド・バイオラボ社）によるウエスタンブロット分析を用いて調べた。
【図５】栄養分の低い培地におけるPANC-1細胞の生存に対するインスリン（5(g/ml）、トログリタゾン（20μM）、ワートマニン（100nM)およびLY294002（50μM）の影響を調べた結果である。10％FCSを含むDMEMを基本培地で希釈することにより10％希釈DMEMを調製した。栄養分の低い培地で24時間培養した後、トリパンブルー色素排除法により3回実験で細胞の生存を数えた。飢餓状態開始時の細胞数を100％とした。
【図６】トログリタゾンとLY294002の栄養剥奪と毒性を調べた結果である。（A)トログリタゾン（20μM）とLY294002（50μM）を培地に加え、栄養剥奪後12時間と24時間にそれぞれ細胞の生存率を数えた。生存数は図５の説明と同様にして調べた。
【図７】グルコース欠乏培地におけるHepG2細胞の生存に対するAICARの影響を調べた結果である。黒丸はAICARを500μM添加した培地での生存細胞数、黒四角はコントロールの生存細胞数である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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