(57)【要約】【課題】インバースＰＣＲ方法に用いる鋳型ＤＮＡ鎖の生産方法を提供する。【解決手段】標的ＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖、ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１残基のＬＮＡを有するオリゴヌクレオチドおよび４種のｄＮＴＰを少なくとも含む系において、上記ＤＮＡ鎖を鋳型とし、上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして、プライマー伸長反応をさせる工程、を包含することを特徴とする方法により、インバースＰＣＲ方法に用いる鋳型ＤＮＡ鎖を生産する。【選択図】図１
2007252373.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ＤＮＡ鎖、ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１残基のＬＮＡを有するオリゴヌクレオチドおよび４種のｄＮＴＰを少なくとも含む系において、上記標的ＤＮＡ鎖を鋳型とし、上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして、プライマー伸長反応をさせる工程を包含することを特徴とするインバースＰＣＲ方法に用いる鋳型ＤＮＡ鎖の生産方法。
【請求項２】
標的ＤＮＡ鎖が、環状ＤＮＡである請求項１に記載の生産方法。
【請求項３】
ＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼである請求項１または２に記載の生産方法。
【請求項４】
ＤＮＡポリメラーゼが、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼおよびＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される少なくとも１種である請求項１〜３のいずれか１項に記載の生産方法。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドが、６〜１２塩基長である請求項１〜４のいずれか１項に記載の生産方法。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドが、２〜４残基のＬＮＡを有するものである請求項１〜５のいずれか１項に記載の生産方法。
【請求項７】
標的ＤＮＡ鎖が、環境ＤＮＡから得られるものである請求項１〜６のいずれか１項に記載の生産方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の鋳型ＤＮＡ鎖の生産方法に用いるキットであって、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１残基のＬＮＡを有するオリゴヌクレオチドおよび４種のｄＮＴＰを少なくとも含むことを特徴とするキット。
【請求項９】
以下の工程（ａ）および（ｂ）を包含することを特徴とする試料中の標的ＤＮＡ配列を増幅する方法。
（ａ）標的ＤＮＡ配列を有する標的ＤＮＡ鎖、ＤＮＡポリメラーゼおよび少なくとも１残基のＬＮＡを有するオリゴヌクレオチドを少なくとも含む系において、上記標的ＤＮＡ鎖を鋳型とし、上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして、プライマー伸長反応をさせる工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られたプライマー伸長反応産物を鋳型として、インバースＰＣＲ方法により上記標的ＤＮＡ配列を増幅する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学の分野に関し、より詳しくはインバースＰＣＲ方法に用いる鋳型ＤＮＡ鎖の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有用な酵素や化合物を生態系から取得する場合、通常はまず、目的の酵素や化合物を産生する微生物の分離および培養を行う。しかし、生態系中の微生物群は、複雑に相互作用しており、分離および培養が困難な場合が多い。そこで、未知微生物を分離および培養することなく、未知微生物を含む土壌または海水などから直接ＤＮＡを回収し、当該環境試料中に含まれる生物のゲノムＤＮＡを網羅する環境ＤＮＡ（ｅＤＮＡ（Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ＤＮＡ）またはメタゲノムとも呼ばれる）を調製し、これから直接目的とする酵素などの遺伝子を取得する環境ＤＮＡの利用に関する技術が近年注目を集めている。
【０００３】
環境ＤＮＡなどの試料中に含まれるＤＮＡを利用する場合、まず目的とするＤＮＡ配列を増幅する必要があるが、このための方法としてはポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」と略す。例えば、特許文献１および２を参照のこと）を利用する方法が有用である。
ＰＣＲ方法については種々の改良が試みられており、ＰＣＲ方法に使用するプライマーは従来ＤＮＡのみから構成されていたが、近年では、相補鎖に対する熱安定性に優れたＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）残基を有するプライマーの使用が試みられている。ＬＮＡ残基を有するプライマーは、等温核酸増幅反応でのバックグラウンドシグナルを抑制するための方法において利用できることが開示されている（例えば、特許文献３を参照のこと）。
【０００４】
環境ＤＮＡなどの試料から有用な遺伝子などを取得する際に、既知のＤＮＡ配列の周辺領域の未知のＤＮＡ配列について、増幅が必要とされる場合がある。このような場合、ＰＣＲを用いる方法の中でも、既知のＤＮＡ配列領域から、当該領域に隣接する未知のＤＮＡ配列領域の方向に、伸長反応するように設計されたプライマーを用いて、未知のＤＮＡ配列を増幅するインバースＰＣＲ方法（例えば、非特許文献１を参照のこと）が特に有用である。
【０００５】
【特許文献１】米国特許第４，６８３，１９５号明細書
【特許文献２】米国特許第４，６８３，２０２号明細書
【特許文献３】特表２００４−５２６４３２号公報
【非特許文献１】「ＰＣＲテクノロジー」、Ｈｅｎｒｙ  Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編、加藤郁之進  監訳、宝酒造株式会社、１９９７年、１４７−１５５頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、インバースＰＣＲ方法は、選択的増幅の対象とするＤＮＡ配列（本発明中において、「標的ＤＮＡ配列」と略す）を増幅するために、鋳型として用いる標的ＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（「標的ＤＮＡ鎖」と略す）を、ＤＮＡ試料中に大量に必要とするという問題点を有している。
なお、本発明において「ＤＮＡ試料」というときは、インバースＰＣＲ方法または本発明のインバースＰＣＲ方法に用いる鋳型ＤＮＡ鎖の生産方法に用いる標的ＤＮＡ鎖を含む試料のことを意味するものとする。
【０００７】
前記の環境ＤＮＡは、環境中のさまざまな生物のゲノムＤＮＡを網羅する非常に有用な資源であるが、その中に含まれる標的ＤＮＡ鎖のコピー数はごくわずかであることが多い。このため、環境ＤＮＡにインバースＰＣＲ方法を適用し標的ＤＮＡ配列を増幅させることは非常に困難であり、環境ＤＮＡにインバースＰＣＲ方法を適用して未知遺伝子を取得する試みはほとんど行われていない。また、環境ＤＮＡ以外の試料をＤＮＡ試料として使用する場合においても、その中に含まれる標的ＤＮＡ鎖のコピー数に制限されずに、インバースＰＣＲ方法を適用して未知遺伝子などの標的ＤＮＡ配列を増幅することが望まれている。
【０００８】
従って、本発明の目的は、ＤＮＡ試料中に含まれる標的ＤＮＡ鎖のコピー数が従来のインバースＰＣＲ方法により標的ＤＮＡ配列を増幅できる下限値よりも少ない場合であっても、インバースＰＣＲ方法により標的ＤＮＡ配列を増幅することを可能とするために、当該標的ＤＮＡ鎖から、インバースＰＣＲ方法に用いる標的ＤＮＡ配列を有する鋳型ＤＮＡ鎖の生産方法およびそれに用いるキットを提供することにある。また、当該生産方法により生産されたＤＮＡ鎖をインバースＰＣＲ方法に用いる鋳型ＤＮＡ鎖として使用し、標的ＤＮＡ配列を増幅させる方法もまた、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
具体的には、本発明は、以下に掲げるものである。すなわち、本発明は、標的ＤＮＡ鎖、ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１残基のＬＮＡを有するオリゴヌクレオチドおよび４種のｄＮＴＰを少なくとも含む系において、上記標的ＤＮＡ鎖を鋳型とし、該オリゴヌクレオチドをプライマーとして、プライマー伸長反応をさせる工程を包含することを特徴とするインバースＰＣＲ方法に用いる鋳型ＤＮＡ鎖の生産方法を提供する。
【００１０】
上記本発明の生産方法においては、前記標的ＤＮＡ鎖が、環状ＤＮＡであること；前記ＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換活性を有すること；前記オリゴヌクレオチドが、２〜４残基のＬＮＡを有し、６〜１２塩基長であること；および前記標的ＤＮＡ鎖が、環境ＤＮＡから得られるものであることが好ましい。さらに前記鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼまたはＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼであることが、特に好ましい。
【００１１】
また、本発明は、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１残基のＬＮＡを有するオリゴヌクレオチドおよび４種のｄＮＴＰを少なくとも含むことを特徴とする、前記本発明の生産方法に用いるキットを提供する。
また本発明は、（ａ）標的ＤＮＡ配列を有する標的ＤＮＡ鎖、ＤＮＡポリメラーゼおよび少なくとも１残基のＬＮＡを有するオリゴヌクレオチドを少なくとも含む系において、上記標的ＤＮＡ鎖を鋳型とし、上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして、プライマー伸長反応をさせる工程、および（ｂ）工程（ａ）で得られたプライマー伸長反応産物を鋳型として、インバースＰＣＲ方法により上記標的ＤＮＡ配列を増幅する工程を包含することを特徴とする、試料中の標的ＤＮＡ配列を増幅する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明者らは、ＤＮＡ試料中に含まれる標的ＤＮＡ鎖のコピー数が従来のインバースＰＣＲ方法により標的ＤＮＡ配列を増幅できる下限値よりも少ない場合であっても、インバースＰＣＲ方法により標的ＤＮＡ配列を増幅することを可能とする方法について鋭意検討を行った。その過程で本発明者らは、図１（ａ）に示す従来のインバースＰＣＲ方法のようにＤＮＡ試料中に含まれる標的ＤＮＡ鎖を、インバースＰＣＲ方法による増幅反応のための鋳型として直接用いるのではなく、図１（ｂ）に示すように、まず、第１の増幅工程でＤＮＡ試料中の標的ＤＮＡ鎖（第１の鋳型ＤＮＡ鎖）を増幅し、次いで第２の増幅工程でその増幅産物をインバースＰＣＲ方法に用いる鋳型ＤＮＡ鎖（第２の鋳型ＤＮＡ鎖）として使用することにより標的ＤＮＡ配列を増幅するという方法を想到するに至った。この方法を達成するため、使用するＤＮＡポリメラーゼやプライマー等について種々の検討を行った。
【００１３】
本発明者らは、まず、第１の増幅工程において使用するプライマー（第１のプライマー）について検討した。従来のＰＣＲ方法でプライマーとして用いられる２０〜４０塩基長のＤＮＡオリゴマーは、環状ＤＮＡを鋳型とし、鎖置換活性を持つポリメラーゼによる増幅を行う際のプライマーとして用いる場合、増幅効率はあまり高くないという報告がある。また、環状ＤＮＡを鋳型としＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼのような鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用して増幅する場合、通常６塩基長のＤＮＡからなるランダムオリゴマーがプライマーとして用いられるが、この６塩基長のＤＮＡオリゴマーは、鋳型ＤＮＡ鎖に対するアニーリング効率が極めて低いという問題点がある。
【００１４】
そこで、本発明者らは、第１のプライマーとして、少なくとも１残基のＬＮＡを有するオリゴヌクレオチドを使用して、インバースＰＣＲ方法に用いる鋳型ＤＮＡ鎖を生産し、次いで当該ＤＮＡ鎖をインバースＰＣＲ方法に用いる鋳型ＤＮＡ鎖として用いて標的ＤＮＡ配列を増幅する方法を開発し、本発明の完成に至った。
【００１５】
本発明の鋳型ＤＮＡ鎖の生産方法を用いれば、ＤＮＡ試料中の標的ＤＮＡ鎖のコピー数が、従来のインバースＰＣＲ方法により増幅できる下限値よりも少ない場合であっても、当該試料から、インバースＰＣＲ方法により標的ＤＮＡ鎖中の標的ＤＮＡ配列を増幅することが可能な、インバースＰＣＲ用の鋳型ＤＮＡ鎖を提供することができる。
また、本発明の応用として、環境ＤＮＡ中から未知の有用遺伝子を培養を介さずに直接取得することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
次に、好ましい実施の形態を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
なお、本発明において「標的ＤＮＡ配列」とは、特に明記されない限り、通常のＰＣＲ方法またはインバースＰＣＲ方法により選択的に増幅されるＤＮＡ配列のことを意味する。通常のＰＣＲ方法では、図２（ｂ）に示すように２つのプライマーで挟まれた領域が標的ＤＮＡ配列となるが、インバースＰＣＲ方法では、図２（ｃ）に示すように、既知の配列領域から未知の配列領域に向かって伸長するように設計したプライマーを使用するため、未知の配列領域を標的ＤＮＡ配列として増幅することができる。
【００１７】
また、本発明において「標的ＤＮＡ鎖」とは、上記したように標的ＤＮＡ配列を増幅するために鋳型として用いる、標的ＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖のことをいう。本発明において、本発明のインバースＰＣＲ方法に用いる鋳型ＤＮＡ鎖の生産方法に使用する標的ＤＮＡ鎖とインバースＰＣＲ方法に用いる鋳型ＤＮＡ鎖とを区別するために、前者を「第１の鋳型ＤＮＡ鎖」、後者を「第２の鋳型ＤＮＡ鎖」と呼ぶことがある。同様に、本発明の生産方法に用いるＤＮＡポリメラーゼおよびプライマーとインバースＰＣＲ方法に用いるＤＮＡポリメラーゼおよびプライマーとを区別するために、前者をそれぞれ「第１のＤＮＡポリメラーゼ」、「第１のプライマー」と呼ぶことがある（図１を参照のこと）。
また、本明細書中において「通常のＰＣＲ方法」という用語は、インバースＰＣＲ方法ではないＰＣＲ方法という意味で用いるものとする。
さらに、本明細書中において、標的ＤＮＡ鎖を「複製」するという場合、１つの標的ＤＮＡ鎖から１つの標的ＤＮＡ鎖を複製する場合だけでなく、標的ＤＮＡ鎖の塩基配列が複数つながったＤＮＡ鎖を得ることも含むものとする。
【００１８】
本発明の第１の増幅工程では、標的ＤＮＡ鎖を高い精度（正確さ）で複製することが必要である。このため、本発明の第１の増幅工程で用いる第１のプライマーとして、少なくとも１つのＬＮＡ残基を有するオリゴヌクレオチドを使用する。当該オリゴヌクレオチドは、同じ長さのＤＮＡのみからなるオリゴヌクレオチドよりも、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡに対する結合安定性に優れている。また、上記オリゴヌクレオチドは、相補鎖にミスマッチ塩基対が存在すると、Ｔｍ値が著しく低下する。すなわち、相補鎖に対する特異性が高く、誤った配列を増幅する危険性が少ないという利点を備えている。このため、ＤＮＡ試料中に含まれる標的ＤＮＡ鎖のコピー数が極めて少ない場合であっても、インバースＰＣＲ用の鋳型ＤＮＡ鎖を得ることができ、また、当該ＤＮＡ鎖を第２の鋳型ＤＮＡ鎖として用いて、インバースＰＣＲ方法により標的ＤＮＡ配列を増幅することができる。
上記少なくとも１残基のＬＮＡを有するオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの製造受託会社（例えば、グライナー・ジャパン社、東京都）に製造を委託して入手することができる。
【００１９】
標的ＤＮＡ鎖が図３に示すような環状ＤＮＡ鎖である場合、通常のＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応は、環状ＤＮＡ鎖を１周した時点で終了する。しかし、鎖置換活性を持つＤＮＡポリメラーゼを使用すると、当該ポリメラーゼは、合成された鎖を置換しながらローリングサークル型増幅と呼ばれる態様で伸長反応を進めるため、図４（ａ）に示すように、標的ＤＮＡ鎖が直列に多数つながったＤＮＡ鎖を得ることができる。この直鎖状の反応産物は、図４（ｂ）に示すようにプライマー伸長反応の起点を複数有しているため、そこからもプライマー伸長反応が起こり（ブランチング）、標的ＤＮＡ配列を多数有する、本発明のインバースＰＣＲ方法に用いる鋳型ＤＮＡ鎖を得ることができる。
【００２０】
本発明に使用される第１のＤＮＡポリメラーゼは特に制限されず、市販のＤＮＡポリメラーゼを好適に使用することができるが、本発明においては、上記の理由から、環状ＤＮＡである標的ＤＮＡ鎖と組合わせて、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを第１のＤＮＡポリメラーゼとして使用することが好ましい。
【００２１】
本発明において、第１のＤＮＡポリメラーゼとして鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用する場合、当該ＤＮＡポリメラーゼとしてＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼまたはＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼのいずれかを使用することが好ましい。特に、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼはプライマー伸長反応の際のエラー率が低く（例えば、Ｅｓｔｅｂａｎ  Ｊ．Ａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８、２７１９−２７２６頁、１９９３年を参照のこと）、３’−５’エキソヌクレアーゼのプルーフリーディング活性を備えていることから（例えば、Ｂｌａｎｃｏ  Ｌ．およびＳａｌａｓ  Ｍ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１３、１２３９−１２４９頁、１９８５年を参照のこと）、本発明で使用する第１のＤＮＡポリメラーゼとしてもっとも好ましい。
【００２２】
プライマー伸長反応には、上記した標的ＤＮＡ鎖、プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼのほかに、４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）が必要である。当該プライマー伸長反応の系には、必要に応じて、ＢＳＡおよび／または塩化マグネシウムなどを含む緩衝液を使用することができる。このような緩衝液は、当業者に公知である。
【００２３】
ＤＮＡポリメラーゼを用いて、プライマー伸長反応を行う場合、まず、二本鎖の鋳型ＤＮＡ鎖を変性して、１本鎖ＤＮＡにする必要がある。ＤＮＡ鎖の変性は、物理的方法、化学的方法または酵素を用いる方法などの種々の方法によって行うことができるが、加熱による熱変性または溶液をアルカリ性とするアルカリ処理が好ましい。
第１の鋳型ＤＮＡ鎖を熱変性させる場合、第１のＤＮＡポリメラーゼは、当該熱変性条件により酵素活性を失わないものであれば熱変性の前に試料中に加えてよい。しかし、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼのように鋳型ＤＮＡ鎖の熱変性温度で不活性化するＤＮＡポリメラーゼを用いる場合には、当該ＤＮＡポリメラーゼは熱変性の後に試料中に加える必要がある。このような場合、サーマルサイクラー装置を用いて鋳型ＤＮＡ鎖を熱変性させた後、当該溶液を所望の温度に冷却し、この溶液にＤＮＡポリメラーゼを添加する。このような方法は当業者に公知である。
【００２４】
プライマー伸長反応は、通常、使用するＤＮＡポリメラーゼの酵素活性発現に適した条件にて行われる。また、反応条件の好適化のための種々の条件が当業者に知られており、本発明においても、そのような条件を適用することができる。ＤＮＡポリメラーゼとしてＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを使用する場合、プライマー伸長反応は通常３０℃にて８〜１６時間行い、その後６５℃に加熱してＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを失活させるが、これらの条件に限定されない。
【００２５】
本発明において第１のプライマーとして使用する、少なくとも１残基のＬＮＡを有するオリゴヌクレオチドの好ましい塩基長は、相補的なＤＮＡ鎖との結合の安定性にも左右されるが、６〜１２塩基長であることが好ましい。５塩基長以下の場合は相補鎖ＤＮＡとの結合力が弱すぎ、また、１３塩基より長い場合は相補鎖ＤＮＡとの結合力が強すぎて、プライマーとして適切ではなくなるためである。より好ましい塩基長は７〜１０塩基長であり、もっとも好ましくは８塩基長である。
【００２６】
上記第１のプライマーにおいて、ＬＮＡ残基の数は特に制限されないが、ＬＮＡ残基のみから構成されるものよりも、ＬＮＡ以外のＤＮＡ等を含むものの方がＰＣＲにおける増幅効率が高い傾向があり好ましい。好ましいＬＮＡ残基の数は、オリゴヌクレオチドの塩基長にもよるが１〜６であり、より好ましくは２〜４である。また、同数のＬＮＡ残基を有する場合、ＬＮＡ残基が３’側にあるものよりも、５’側にあるほうがＰＣＲにおける増幅効率が高くなり好ましい。ＰＣＲにおける増幅効率の点から、ＬＮＡ残基の塩基はアデニンまたはチミンであることが好ましく、チミンであることが最も好ましい。
【００２７】
本発明に使用するＤＮＡ試料の由来は特に限定されない。例えば、大腸菌、酵母、放線菌、ウイルスまたはプラスミドなどの当業者に周知の試料を、ＤＮＡ試料として使用することができる。また、従来は培養を介さずに利用することが困難だった土壌、海水または廃水などに由来する環境ＤＮＡも、本発明におけるＤＮＡ試料として好適に用いることができる。環境ＤＮＡをＤＮＡ試料として使用する場合、標的ＤＮＡ鎖を本発明の使用に適する環状ＤＮＡ鎖とするために、下記の前処理に供してから本発明に用いることが好ましい。
【００２８】
環境ＤＮＡを本発明においてＤＮＡ試料として好適に使用するための前処理工程は、（１）制限酵素処理工程および（２）セルフライゲーション反応（自己環状化反応）工程からなる。前処理工程の模式図を、図５に示す。
【００２９】
（１）制限酵素処理工程
まず、標的ＤＮＡ鎖を本発明に好適に使用できる塩基長とするために、ＤＮＡ試料を制限酵素で処理する。この処理に用いる制限酵素は、配列特異的な切断を行うクラスＩＩの制限酵素が好ましい。ＤＮＡの切断面が、平滑末端となる制限酵素を用いてもよいが、付着末端を与える制限酵素を用いることがより好ましい。
【００３０】
図２（ａ）に制限酵素処理前の標的ＤＮＡ鎖の模式図を示す。制限酵素処理によって生成したＤＮＡ断片のうち増幅対象とするＤＮＡ配列を含むものが標的ＤＮＡ鎖となる。上記したように、標的ＤＮＡ配列は、インバースＰＣＲ方法で用いるプライマーの設計に応じて任意に設定し得るが、図２（ａ）に示されるように、既知の配列領域に隣接する未知の配列領域をインバースＰＣＲ方法によって増幅する場合、インバースＰＣＲ方法に用いるプライマー（第２のプライマー）は、図２（ｃ）に示すように、既知の配列領域から未知の配列領域に向かって伸長するように設計したものを使用し、図中に示した部分が標的ＤＮＡ配列となる。
上記制限酵素の選択に当たっては、増幅対象とするＤＮＡ配列が標的ＤＮＡ鎖に含まれるようにするために、予備実験が必要となることがある。
【００３１】
（２）セルフライゲーション反応工程
本発明において環状の標的ＤＮＡ鎖を用いる場合、上記制限処理工程（１）で得た標的ＤＮＡ鎖にＤＮＡリガーゼを作用させ、セルフライゲーションを反応させることにより、図３に示すような環状の標的ＤＮＡ鎖を得ることができる。
当該セルフライゲーション反応工程後の試料中には、図５に示すように、様々な大きさの環状および直鎖状のＤＮＡ鎖が存在する。
【００３２】
本発明のインバースＰＣＲ方法に用いる鋳型ＤＮＡ鎖の生産方法により得られた反応溶液中には、標的ＤＮＡ配列を有する様々な長さのＤＮＡ鎖が含まれるが、標的ＤＮＡ配列を有するものであれば第２の鋳型ＤＮＡ鎖として使用することができ、ＤＮＡ鎖の長さによっては制限されない。当該産物は、必要に応じて当業者に周知のＤＮＡの精製方法による精製後、インバースＰＣＲ方法に用いる鋳型ＤＮＡ鎖として使用することができる。
【００３３】
インバースＰＣＲ方法の条件は、市販の成書を参考にすることができる（例えば、「ＰＣＲテクノロジー」、Ｈｅｎｒｙ  Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編、加藤郁之進  監訳、宝酒造株式会社、１９９７年、１４７−１５５頁を参照のこと）。
【実施例】
【００３４】
以下に実施例および比較例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３５】
［実施例１］
＜前処理工程＞
以下の手順により、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０（λ）（以下λ−リソゲン（ｌｙｓｏｇｅｎ）と呼ぶ）の抽出ＤＮＡ溶液を調製した。
λ−リソゲンをＬＢ培地１００ｍｌ中（トリプトン１ｇ、酵母エキス０．５ｇ、ＮａＣｌ  １ｇ、ｐＨ７．２）で一晩培養し、この培養液を遠心分離（４，０００×ｇ、１０分）することによりλ−リソゲンを回収した。回収したλ−リソゲンを９．５ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に懸濁し、次いで０．５ｍｌの１０％ＳＤＳ溶液および５０μｌのプロテイナーゼＫ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃にて１時間インキュベートした。その後１．８ｍｌのＮａＣｌ溶液（５Ｍ）および１０ｍｌの０．５Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．０）飽和フェノールを加え、この溶液を振盪機にて４５分間振盪した。振盪後の溶液を遠心分離（３，３００×ｇ、１０分）し、上層のＤＮＡ溶液を新たなチューブに移した。このＤＮＡ溶液に等量のイソプロパノールを加え、ＤＮＡを沈殿させλ−リソゲンのゲノムＤＮＡを回収した。
得られたλ−リソゲンのゲノムＤＮＡは、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）−１００（ミリポア社）を用いて精製した。
【００３６】
上記の手順により得た、λ−リソゲンの抽出ＤＮＡに制限酵素ＨｉｎｄIIIを５０ユニット加え、３７℃にて５時間制限酵素反応を行った（反応溶液は５０μｌで、１０ｍＭ  トリス塩酸、１０ｍＭ  塩化マグネシウム、１ｍＭ  ジチオトレイトール、５０ｍＭ  塩化ナトリウムを含む、ｐＨ７．５）。反応後、溶液を７０℃にて１５分間保ち制限酵素を失活させた。次いで反応後の溶液を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）−１００（ミリポア社）に加え、これを遠心分離することにより試料中のＤＮＡを精製した。
【００３７】
次に、精製したＤＮＡをＴＥ緩衝液に溶解し２０μｌとし、この溶液にＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ）（タカラバイオ社）を２０μｌ加え、１６℃にて一晩保ち、セルフライゲーション反応をさせた。反応終了後、溶液をＭｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）−１００に加え、上記と同様にして反応産物を精製した。
【００３８】
次いで、ＤＮＡ定量用キット（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ｑｕａｎｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）を用いて、精製後の試料中のＤＮＡの濃度を算出した。当該ＤＮＡ濃度および以下の式１を用いて、試料中のλ−リソゲンのゲノムＤＮＡのコピー数を求めた。
［式１］
ゲノムＤＮＡのコピー数＝溶液中の抽出ＤＮＡの質量［ｇ］×６×１０23÷ゲノムＤＮＡの分子量
上記の式１中、ゲノムＤＮＡの分子量は、４×１０6×３３０×２を用いた。λ−リソゲンはゲノムＤＮＡ１コピーあたりλＤＮＡ領域を１コピー有し、本実施例ではλＤＮＡ領域の一部からなる約７ｋｂｐの環状ＤＮＡ鎖を標的ＤＮＡ鎖として用いたため、式１にて求めたゲノムＤＮＡのコピー数はλＤＮＡ領域のコピー数および標的ＤＮＡ鎖のコピー数と等しい。
【００３９】
＜第１の増幅工程＞
標的ＤＮＡ鎖に対するプライマーとして、ＬＮＡモノマーのみからなる８塩基長のオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。当該プライマーは以下の配列、
配列番号１：５’−ｃｇａａｔｃａｇ−３’
を有する。当該プライマーの製造は、グライナー・ジャパン社（東京都）に委託した。当該プライマーのＴｍは、６０℃である（インターネット上のサイト、ｈｔｔｐ：／／ｌｎａ−ｔｍ．ｃｏｍにて計算した）。
【００４０】
前記のＤＮＡ精製物中の標的ＤＮＡ鎖を第１の鋳型ＤＮＡ鎖として、下記の条件にてプライマー伸長反応に供した。ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いた。当該ＤＮＡポリメラーゼに添付の緩衝液（２５℃におけるｐＨ７．５、いずれも終濃度として５０ｍＭ  トリス塩酸、１０ｍＭ  塩化マグネシウム、１０ｍＭ  硫酸アンモニウムおよび４ｍＭ  ジチオトレイトールを含む）を用いて、標的ＤＮＡ鎖を１０2コピー、１０3コピー、１０4コピー、１０5コピー、１０6コピーおよび１０7コピー含む６種の溶液を調製した。これらの溶液に、上記のＬＮＡプライマーを終濃度２．５μＭとなるように加え、滅菌蒸留水を加え１０μｌにメスアップした。次いで、これらの溶液を、サーマルサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）、ロシュ  ダイアグノスティックス社）を用いて９５℃にて３分間加熱し、ＤＮＡ鎖を熱変性させた。その後、当該溶液を１分間に１℃の割合で徐冷し、３０℃になった時点でそれぞれの溶液にリアクションミックス（上記の緩衝液中にＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ１０ユニット、４種のｄＮＴＰ（終濃度各０．２ｍＭ）、ＢＳＡ（終濃度０．２ｍｇ／ｍｌ））を１０μｌ添加した。リアクションミックスを添加後、各溶液を３０℃にて１６時間保ち、プライマー伸長反応をさせた。反応終了後、反応産物を６５℃にて１０分間加熱し、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを失活させた。当該反応産物をＭｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）−１００にて精製し、第２の増幅工程に使用するまで４℃にて保管した。
【００４１】
＜第２の増幅工程＞
上記の精製後の試料の全量をインバースＰＣＲ方法の鋳型として用いて、標的ＤＮＡ配列の増幅を行った。第２の増幅工程に用いる反応溶液は、上記反応産物の全量に、ＤＮＡポリメラーゼとしてＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（５ユニット／μｌ；タカラバイオ社）０．５μｌ、２×ＧＣ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｉ（タカラバイオ株式会社）  ２５μｌ、ｄＮＴＰ混合物（４種のｄＮＴＰを２．５ｍＭずつ含む）８μｌならびに配列番号２および３のプライマー（終濃度０．２μＭ）を添加し、滅菌蒸留水で５０μｌにメスアップすることにより調製した。
【００４２】
上記プライマーは、フォワードプライマーとして以下の配列
配列番号２：５’−ＣＣＧＧＴＡＣＴＧＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＴＡＴＧＧ−３’
を持ち、リバースプライマーとして以下の配列
配列番号３：５’−ＧＧＧＴＴＴＡＴＴＴＣＴＧＧＴＧＣＧＴＴＴＣＧＴＴＧＧ−３’
を持つものを使用した。プライマーＤＮＡ鎖の合成は、シグマアルドリッチジャパン社に委託した。上記のプライマーを使用する場合、インバースＰＣＲ方法により増幅される標的ＤＮＡ配列の長さは４，８９８ｂｐである。
【００４３】
上記反応溶液をサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて以下のインバースＰＣＲ反応に供した。
（１）熱変性工程：９４℃、６０秒間
（２）熱変性工程：９４℃、１０秒間
（３）アニーリングおよび伸長工程：６８℃、１８０秒間
（４）最終伸長工程：７２℃、１０分間
（１）の熱反応工程の後、工程（２）および（３）を３０サイクル繰り返し、最後に（４）の最終伸長工程を行い、反応を終了した。
【００４４】
＜増幅確認試験＞
インバースＰＣＲ方法による増幅反応後の溶液を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）−１００（ミリポア社）に加え、前記第１の増幅工程と同様の手順で、試料中のＤＮＡを精製した。λＤＮＡ領域の増幅を確認するために、精製後の試料をＴＥ緩衝液で１０倍に希釈し、当該希釈溶液１μｌをＤＮＡ７５００  ＬａｂＣｈｉｐキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてアガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ゲル上の標的ＤＮＡ配列に該当するバンドの有無を検出装置（２１００バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）をデフォルト設定で使用した。）および目視により判定した。その結果、標的ＤＮＡ鎖のコピー数が１０3以上であった試料においては、インバースＰＣＲ方法による増幅後に標的ＤＮＡ配列のバンドを確認することができた。このアガロースゲル電気泳動の結果を図６に示す（なお、上記キットおよび検出装置を用いて１，５００〜７，５００ｂｐの試料を泳動する場合、サイズ決定誤差は最大で±２０％となることがある）。左端のＭと記したレーンには分子量マーカーを流し、左から２番目のレーンから右側に向かって、それぞれ、標的ＤＮＡ鎖を１０2コピー、１０3コピー、１０4コピーおよび１０5コピー含む試料から調製したインバースＰＣＲ産物を電気泳動した。また、検出装置でバンドが確認された試料を○、検出装置ではバンドを確認できなかったが目視ではバンドを確認できたものを△、検出装置および目視ともにバンドが確認できなかった試料を×として、バンドの判定結果を比較例１、２、３および４の結果とともに表１に示す。
【００４５】
［比較例１］
＜前処理工程＞
実施例１と同様の手順および条件を用いて、λ−リソゲンの抽出ＤＮＡをＨｉｎｄIII処理し、当該処理後の試料をＭｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）−１００を用いて精製した後、セルフライゲーション反応をさせ、次いでセルフライゲーション反応後の産物を精製した。溶液中のゲノムＤＮＡのコピー数は、上記の式１により、実施例１と同様に計算した。
【００４６】
＜第１の増幅工程＞
前記の実施例１と同様に、λＤＮＡ領域の一部からなる約７ｋｂｐの環状ＤＮＡ鎖を標的ＤＮＡ鎖として、ＤＮＡモノマーのみからなる２６塩基長のオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。当該プライマーは、以下の配列、
配列番号４：５’−ＧＡＡＣＣＧＣＧＡＡＣＧＡＡＴＣＡＧＣＡＡＣＴＣＡＡ−３’
を有する。当該プライマーの製造は、シグマアルドリッチジャパン社に委託した。当該プライマーのＴｍは、７０℃である（インターネット上のサイト、ｈｔｔｐ：／／ｌｎａ−ｔｍ．ｃｏｍにて計算した）。
【００４７】
実施例１と同様の手順および条件を用いて、標的ＤＮＡ鎖を１０2コピー、１０3コピー、１０4コピー、１０5コピー、１０6コピーおよび１０7コピー含む６種の溶液を調製し、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）によるプライマー伸長反応を行った。反応終了後、反応産物を６５℃にて１０分間加熱しＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを失活させた。当該反応産物をＭｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）−１００にて精製し、インバースＰＣＲ方法による増幅に使用するまで、４℃にて保管した。
【００４８】
＜第２の増幅工程＞
上記の反応産物の全量を第２の鋳型ＤＮＡ鎖とし、実施例１で使用したものと同じ配列番号２および３のプライマーを使用して、実施例１と同様の手順および条件を用いてインバースＰＣＲ方法により標的ＤＮＡ配列の増幅を行った。
【００４９】
＜増幅確認試験＞
インバースＰＣＲ方法による増幅反応後の溶液をＭｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）−１００（ミリポア社）に加え、試料中のＤＮＡを精製した。実施例１と同様に、精製後の試料をＴＥ緩衝液にて１０倍希釈し、当該希釈溶液１μｌをＤＮＡ７５００  ＬａｂＣｈｉｐキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてアガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ゲル上の標的ＤＮＡ配列に該当するバンドの有無を検出装置（２１００バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）をデフォルト設定で使用した）および目視により判定した。その結果、標的ＤＮＡ鎖のコピー数が１０6以上であった試料においては、インバースＰＣＲ方法による増幅後に標的ＤＮＡ配列のバンドを確認することができた。１０5であった試料では検出装置ではバンドの存在は確認されなかったが、目視ではバンドの存在が確認された。１０4以下であった試料では、目視および検出装置のいずれによってもバンドの存在は確認されなかった。
【００５０】
［比較例２］
＜前処理工程＞
実施例１と同様に、λ−リソゲンの抽出ＤＮＡをＨｉｎｄIII処理し、当該処理後の試料をＭｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）−１００を用いて精製した後、セルフライゲーション反応をさせ、次いでセルフライゲーション反応後の産物を精製した。溶液中のゲノムＤＮＡのコピー数は、上記の式１により、実施例１と同様に計算した。
【００５１】
＜第１の増幅工程＞
前記の実施例１と同様に、λＤＮＡ領域の一部のみからなる約７ｋｂｐの環状ＤＮＡ鎖を標的ＤＮＡ鎖として、ＤＮＡモノマーのみからなる８塩基長のオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。当該プライマーは、以下の配列、
配列番号５：５’−ＣＧＡＡＴＣＡＧ−３’
を有する。なお、該配列は、実施例１で使用した配列番号１に示されるＬＮＡプライマーと同一の塩基配列を有し、比較例１で使用した配列番号４に示されるＤＮＡプライマーの一部である。当該オリゴヌクレオチドの製造は、シグマアルドリッチジャパン社に委託した。当該プライマーのＴｍは、２５℃である（インターネット上のサイト、ｈｔｔｐ：／／ｌｎａ−ｔｍ．ｃｏｍにて計算した）。
【００５２】
前記の実施例１と同様の手順および条件を用いて、標的ＤＮＡ鎖を１０2コピー、１０3コピー、１０4コピー、１０5コピー、１０6コピーおよび１０7コピー含む６種の溶液を調製し、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）によるプライマー伸長反応を行った。反応終了後、反応産物を６５℃にて１０分間加熱しＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを失活させた。当該反応産物をＭｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）−１００にて精製し、インバースＰＣＲ方法による増幅に使用するまで、４℃にて保管した。
【００５３】
＜第２の増幅工程＞
上記の反応産物の全量を第２の鋳型ＤＮＡ鎖とし、実施例１で使用したものと同じ配列番号２および３のプライマーを使用して、実施例１と同様の手順および条件を用いてインバースＰＣＲ方法により標的ＤＮＡ配列の増幅を行った。
【００５４】
＜増幅確認試験＞
インバースＰＣＲ方法による増幅反応後の溶液をＭｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）−１００（ミリポア社）に加え、試料中のＤＮＡを精製した。実施例１と同様に、精製後の試料をＴＥ緩衝液にて１０倍希釈し、当該希釈溶液１μｌをＤＮＡ７５００  ＬａｂＣｈｉｐキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてアガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ゲル上の標的ＤＮＡ配列に該当するバンドの有無を検出装置（２１００バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）をデフォルト設定で使用した）および目視により判定した。その結果、標的ＤＮＡ鎖のコピー数が、１０6以上であった試料においては、インバースＰＣＲ方法による増幅後に標的ＤＮＡ配列のバンドを確認することができた。１０5であった試料では検出装置ではバンドの存在は確認されなかったが、目視ではバンドの存在が確認された。１０4以下であった試料では、目視および検出装置のいずれによっても、バンドの存在は確認されなかった。このアガロースゲル電気泳動の結果を、図７に示す。左端のレーンには分子量マーカーを流し、左から２番目のレーンから右側に向かって、それぞれ標的ＤＮＡ鎖を１０7コピー、１０6コピー、１０5コピー、１０4コピー、１０3コピーおよび１０2コピー含む試料から調製したインバースＰＣＲ産物を電気泳動した。
【００５５】
［比較例３］
＜前処理工程＞
実施例１と同様に、λ−リソゲンの抽出ＤＮＡをＨｉｎｄIII処理し、当該処理後の試料をＭｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）−１００を用いて精製した後、セルフライゲーション反応をさせ、次いでセルフライゲーション反応後の産物を精製した。溶液中のゲノムＤＮＡのコピー数は、上記の式１により、実施例１と同様に計算した。
【００５６】
＜第２の増幅工程＞
実施例１と同様にＴａｋａｒａ  ＬＡ  Ｔａｑ（登録商標）  ｗｉｔｈ  ＧＣ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社）を使用して、配列番号２および３のプライマーを終濃度０．２μＭ、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（５ユニット／μｌ）０．５μｌ、２×ＧＣ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｉ  ２５μｌおよびｄＮＴＰ混合物（４種のｄＮＴＰを２．５ｍＭずつ含む）８μｌならびに上記精製後の標的ＤＮＡ鎖を１０2コピー、１０3コピー、１０4コピー、１０5コピー、１０6コピーまたは１０7コピー含む６種の溶液（いずれも５０μｌ）を調製し、実施例１と同様の手順および条件を用いてインバースＰＣＲ方法により標的ＤＮＡ配列の増幅を行った。
【００５７】
＜増幅確認試験＞
インバースＰＣＲ方法による増幅反応後の溶液をＭｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）−１００（ミリポア社）に加え、試料中のＤＮＡを精製した。実施例１と同様に、精製後の試料をＴＥ緩衝液にて１０倍希釈し、当該希釈溶液１μｌをＤＮＡ７５００  ＬａｂＣｈｉｐキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてアガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ゲル上の標的ＤＮＡ配列に該当するバンドの有無を検出装置（２１００バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）をデフォルト設定で使用した）および目視により判定した。その結果、標的ＤＮＡ鎖のコピー数が、１０7であった試料においては、インバースＰＣＲ方法による増幅後に標的ＤＮＡ配列のバンドを確認することができた。１０6であった試料では検出装置ではバンドの存在は確認されなかったが、目視ではバンドの存在が確認された。１０5以下であった試料では、目視および検出装置のいずれによっても、バンドの存在は確認されなかった。
【００５８】
［比較例４］
通常のＰＣＲ方法において、標的ＤＮＡ配列を増幅するために必要なＤＮＡ試料中に含まれる標的ＤＮＡ鎖のコピー数について知見を得るために、配列番号６および７で示されるプライマーを使用して、通常のＰＣＲ方法による標的ＤＮＡ配列の増幅実験を行った。なお、本比較例４の標的ＤＮＡ配列と、実施例１および比較例１〜３のインバースＰＣＲ方法における標的ＤＮＡ配列とは異なるものとなる。上記のプライマーを使用して、通常のＰＣＲ方法により増幅される標的ＤＮＡ配列の長さは７６２ｂｐである。
配列番号６：５’−ＣＴＧＧＡＡＴＣＧＡＴＧＧＴＧＴＣＴＣＣＧＧＴＧＴＧＡ−３’
配列番号７：５’−ＣＧＧＣＡＴＣＣＣＡＣＴＧＡＧＣＡＧＡＣＧＴＧＡＧ−３’
【００５９】
＜前処理工程＞
実施例１と同様に、λ−リソゲンの抽出ＤＮＡをＨｉｎｄIII処理し、当該処理後の試料をＭｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）−１００を用いて精製した。溶液中のゲノムＤＮＡのコピー数を、上記の式１により、実施例１と同様に計算した。
【００６０】
＜通常のＰＣＲ方法による増幅工程＞
上記ＨｉｎｄIII処理により得られたλＤＮＡ領域の一部からなる約７ｋｂｐの直鎖状ＤＮＡを標的ＤＮＡ鎖とし、配列番号６および７のプライマーを使用して、通常のＰＣＲ方法により、標的ＤＮＡ配列の増幅を行った。反応溶液として、上記標的ＤＮＡ鎖を１０2コピー、１０3コピー、１０4コピー、１０5コピー、１０6コピーおよび１０7コピー含む６種の溶液を調製した。各反応溶液は、標的ＤＮＡ鎖のほかに、ＤＮＡポリメラーゼとしてＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（５ユニット／μｌ；タカラバイオ社）０．５μｌ、２×ＧＣ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｉ（タカラバイオ株式会社）２５μｌ、ｄＮＴＰ混合物（４種のｄＮＴＰを２．５ｍＭずつ含む）８μｌならびに配列番号６および７のプライマー（終濃度０．２μＭ）を含み、滅菌蒸留水で５０μｌにメスアップすることにより調製した。
【００６１】
上記反応溶液をサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて以下のＰＣＲ反応に供した。
（１）熱変性工程：９４℃、６０秒間
（２）熱変性工程：９４℃、１０秒間
（３）アニーリングおよび伸長工程：６８℃、１８０秒間
（４）最終伸長工程：７２℃、１０分間
（１）の熱反応工程の後、工程（２）および（３）を３０サイクル繰り返し、最後に（４）の最終伸長工程を行い、反応を終了した。
【００６２】
＜増幅確認試験＞
上記増幅反応後の溶液をＭｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）−１００（ミリポア社）に加え、試料中のＤＮＡを精製した。実施例１と同様に、精製後の試料をＴＥ緩衝液にて１０倍希釈し、当該希釈溶液１μｌをＤＮＡ７５００  ＬａｂＣｈｉｐキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてアガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ゲル上の標的ＤＮＡ配列に該当するバンドの有無を検出装置（２１００バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）をデフォルト設定で使用した）および目視により判定した。その結果、標的ＤＮＡ鎖のコピー数が、１０3以上であった試料では目視および検出装置の両方で、バンドの存在を確認することができた。
【００６３】
2007252373.tif 000003
【００６４】
上記の結果より、ＤＮＡ試料中の標的ＤＮＡ鎖のコピー数が従来のインバースＰＣＲ方法（比較例３）では標的ＤＮＡ配列を増幅できないほど少数であっても、当該ＤＮＡ試料から本発明の生産方法により生産したＤＮＡ鎖を第２の鋳型ＤＮＡ鎖としてインバースＰＣＲ方法に用いることにより、標的ＤＮＡ配列を増幅できることが理解される。
また、上記の結果より、第１の増幅工程によりインバースＰＣＲ方法に使用する鋳型ＤＮＡ鎖を生産し、次いで当該ＤＮＡ鎖をインバースＰＣＲ方法の鋳型ＤＮＡ鎖として使用する場合であっても、第１のプライマーとして少なくとも１残基のＬＮＡを有するプライマーを使用（実施例１）することにより、ＤＮＡのみからなるプライマーを第１のプライマーとして使用（比較例１および２）する場合と比べて、当該方法により標的ＤＮＡ配列を増幅できるＤＮＡ試料中に含まれる標的ＤＮＡ鎖の数の下限値が、１００分の１以下となることが示された。
【００６５】
本発明の方法により標的ＤＮＡ配列を増幅するために必要なＤＮＡ試料中の標的ＤＮＡ鎖のコピー数の下限値は、比較例４に示された通常のＰＣＲ方法の下限値と同程度であり、本発明の方法により、標的ＤＮＡ鎖を通常のＰＣＲ方法で増幅可能な下限値程度しか含んでいないＤＮＡ試料についても、インバースＰＣＲ方法を適用して標的ＤＮＡ配列を増幅できることが理解される。
【００６６】
［実施例２］
＜キシラナーゼ遺伝子および塩基配列情報の取得＞
西表島で１０個のタカサゴシロアリ（Ｎａｓｕｔｉｔｅｒｍｅｓ  ｔａｋａｓａｇｏｅｎｓｉｓ）の巣を採取し、それぞれの巣のタカサゴシロアリ（約１００匹分）から腸管を分離、回収し、土壌ＤＮＡ抽出キットＩＳＯＩＬ（株式会社ニッポンジーン）を用いて付属のマニュアルに従いＤＮＡを抽出した。また、２種類のウマの虫垂（北海道畜産公社道央事業所より入手）から上述のキットを用いてＤＮＡを抽出した。得られた１２種のＤＮＡのうち、それぞれ１．５μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社）を用いて、３７℃にて５時間処理した。その後、当該溶液を７０℃にて１５分間保ち、制限酵素を失活させ、次いで、当該溶液を、ＭｏｎｔａｇｅＰＣＲ５０（ミリポア社）に加え、これを遠心分離することにより試料中のＤＮＡを精製した。
【００６７】
キシラナーゼが属する糖質加水分解酵素ファミリー１０に特異的な配列に対するプライマー（配列番号８および９）を用いて、上記ＩＳＯＩＬを用いて抽出したウマの虫垂由来のＤＮＡを通常のＰＣＲ方法による増幅反応に供した。得られた増幅産物をＭｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）−１００を用いて精製し、当業者に周知の方法により、クローニングおよび塩基配列解析を行った。
配列番号８（フォワードプライマー）：５’−ＣＡＴＡＣＫＴＴＫＧＴＴＴＧＧＣＡ−３’
配列番号９（リバースプライマー）：５’−ＴＭＧＴＴＫＡＣＭＡＣＲＴＣＣＣＡ−３’
なお、上記配列中、ＫはＧまたはＴを意味し、ＭはＡまたはＣを意味し、ＲはＧまたはＡを意味する。
【００６８】
塩基配列解析の結果、得られた産物は、配列番号１０の塩基配列を持つことが分かった。
配列番号１０：５’−ＣＡＴＡＣＧＴＴＴＧＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＴＣＡＴＧＧＣＴＧＡＣＴＧＣＣＧＧＣＡＧＴＡＡＡＡＣＡＧＡＡＧＴＣＣＴＴＧＧＣＡＡＴＣＴＧＧＡＡＡＡＡＴＡＴＧＴＴＡＣＣＧＡＴＧＴＴＡＣＡＡＣＴＣＡＴＴＴＴＡＧＧＧＧＧＡＡＡＣＴＴＡＴＴＴＣＣＴＧＧＧＡＴＧＴＡＧＴＣＡＡＣＧＡ−３’
配列番号１０の塩基配列を周知のデータベースにより照合した結果、既知の遺伝子の塩基配列との相同性などから、当該配列はキシラナーゼの一部であると同定された。
【００６９】
＜前処理工程＞
前記精製後の１２種のＤＮＡをＴＥ緩衝液に溶解しそれぞれ４０μｌとし、このうちの５μｌにＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ）（タカラバイオ社）を２０μｌ加え、１６℃にて一晩保ち、セルフライゲーション反応をさせた。反応終了後、溶液をＭｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）−１００に加え、前記と同様にして反応産物を精製し、精製後のＤＮＡ溶液にＴＥ緩衝液を加え２５μｌとし、第１の増幅工程に使用するまで４℃にて保管した。
【００７０】
＜第１の増幅工程＞
上記ＤＮＡ試料からキシラナーゼ遺伝子全長を取得するために、上記前処理工程で得た環状ＤＮＡ鎖のうち、キシラナーゼ遺伝子全長を有する環状ＤＮＡ鎖を標的ＤＮＡ鎖として、本発明の生産方法により、インバースＰＣＲ方法に用いる鋳型ＤＮＡ鎖の生産を行った。
第１のプライマーとして、上記配列番号１０の一部と同じ塩基配列を持ち、２個のＬＮＡ残基を有する８塩基長のオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。当該プライマーは、以下の配列、
配列番号１１：５’−ＧｔＴｔＧＧＣＡ−３’
を有する。上記配列中、ＬＮＡ残基を小文字で示す。当該プライマーの製造は、グライナー・ジャパン社（東京都）に委託した。
【００７１】
前記精製後のＤＮＡ溶液３．７μｌに、配列番号１１のプライマー３２ｐｍｏｌおよびＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）に添付の緩衝液（２５℃におけるｐＨ７．５）を所定量添加し、滅菌蒸留水を加え１０μｌにメスアップした。なお、当該溶液は、いずれも終濃度として５０ｍＭ  トリス塩酸、１０ｍＭ  塩化マグネシウム、１０ｍＭ  硫酸アンモニウムおよび４ｍＭ  ジチオトレイトールを含む。
【００７２】
次いで、この溶液を、サーマルサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）、ロシュ  ダイアグノスティックス社）を用いて９５℃にて３分間加熱し、ＤＮＡ鎖を熱変性させた。その後、当該溶液を１分間に１℃の割合で徐冷し、３０℃になった時点でリアクションミックス（上記の緩衝液中にＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ１０ユニット、４種のｄＮＴＰ（終濃度各０．２ｍＭ）、ＢＳＡ（終濃度０．２ｍｇ／ｍｌ）を含む。）を１０μｌ添加した。リアクションミックスを添加後、溶液を３０℃にて１６時間保ち、プライマー伸長反応をさせた。反応終了後、反応産物を６５℃にて１０分間保ち、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを失活させた。当該反応産物をＭｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）−１００にて精製し、第２の増幅工程に使用するまで４℃にて保管した。
【００７３】
＜第２の増幅工程＞
上記の精製後の試料をインバースＰＣＲ方法の鋳型として用いて、第２の増幅工程で前記配列番号１０の塩基配列を一部に有するキシラナーゼ遺伝子の増幅を試みた。第２の増幅工程で使用する第２のプライマーは、配列番号１０の塩基配列に基づき、フォワードプライマーとして以下の配列
配列番号１２：５’−ＴＣＴＧＧＡＡＡＡＡＴＡＴＧＴＴＡＣＣＧＡＴＧＴＴ−３’
を持ち、リバースプライマーとして以下の配列
配列番号１３：５’−ＣＣＡＡＧＧＡＣＴＴＣＴＧＴＴＴＴＡＣＴＧＣＣ−３’
を持つものを使用した。プライマーＤＮＡ鎖の合成は、シグマアルドリッチジャパン社に委託した。
【００７４】
第２の増幅工程に用いる反応溶液は、上記精製後の反応産物にＴＥ緩衝液を加え２５μｌにメスアップし、このうちの１μｌに、ＤＮＡポリメラーゼとしてＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（５ユニット／μｌ；タカラバイオ社）０．５μｌ、２×ＧＣ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｉ（タカラバイオ株式会社）２５μｌ、ｄＮＴＰ混合物（４種のｄＮＴＰを２．５ｍＭずつ含む）８μｌならびに配列番号１２および１３のプライマーを各２０ｐｍｏｌ添加し、滅菌蒸留水で５０μｌにメスアップすることにより調製した。
【００７５】
上記反応溶液をサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて以下のインバースＰＣＲ反応に供した。
（１）熱変性工程：９４℃、６０秒間
（２）熱変性工程：９４℃、３０秒間
（３）アニーリングおよび伸長工程：６８℃、１０分間
（４）最終伸長工程：７２℃、１０分間
（１）の熱反応工程の後、工程（２）および（３）を４０サイクル繰り返し、最後に（４）の最終伸長工程を行い、反応を終了した。
【００７６】
＜増幅確認試験＞
インバースＰＣＲ方法による増幅反応後の溶液を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）−１００（ミリポア社）に加え、前記と同様の手順で、試料中のＤＮＡを精製した。キシラナーゼ遺伝子の増幅を確認するために、精製後の試料をＴＥ緩衝液で１０倍に希釈し、当該希釈溶液１μｌをＤＮＡ７５００  ＬａｂＣｈｉｐキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてアガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ゲル上の標的ＤＮＡ配列に該当するバンドの有無を検出装置（２１００バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社））および目視により判定した。このアガロースゲル電気泳動の結果を図８に示す。左端のＬと記したレーンには分子量マーカーを流し、レーン１〜１０には上記シロアリ由来の増幅産物を、レーン１１および１２には、ウマ由来の増幅産物を電気泳動した。この結果、全１２試料中１１試料について数キロ塩基長の増幅産物を確認できた。なお、各レーン中、最上部と最下部（約５０ｂｐ）のラインは、それぞれアッパーマーカーおよびローアーマーカーのラインである。
【００７７】
また、ウマ由来のＤＮＡ試料から得た上記増幅産物について、当業者に周知の方法によりクローニングおよび塩基配列解析を行った結果、１２０３塩基長の新規なキシラナーゼ遺伝子の全長を取得することができた。
また、当該遺伝子をプラスミドｐＱＥ３０−ＵＡ（キアゲン社）に組み込み、当該プラスミドを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎ  Ｍ１５／ｐＲＥＰ４（キアゲン社））を形質転換した。当該大腸菌を周知の方法により培養し、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｆａｓｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｋｉｔ（キアゲン社）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより菌体抽出物を分離、精製し、精製物をキシランに作用させ、遊離した還元糖を周知の方法で定量することにより、当該精製物がキシラナーゼ活性を有することを確認した。
【００７８】
［実施例３］
＜前処理工程＞
実施例２と同様にして、第１の増幅工程に使用する１２種のＤＮＡ試料を調製した。
【００７９】
＜第１の増幅工程＞
プライマーとして、実施例２で使用した配列番号１１のプライマーと同じ塩基配列を持ち、ＬＮＡ残基のみからなる８塩基長のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１４）を使用したこと以外は実施例２と同様に第１の増幅工程を行い、インバースＰＣＲ方法に用いる鋳型ＤＮＡ鎖を調製した。
配列番号１４：５’−ｇｔｔｔｇｇｃａ−３’
上記配列中、ＬＮＡ残基を小文字で示す。当該プライマーの製造は、グライナー・ジャパン社（東京都）に委託した。
【００８０】
＜第２の増幅工程＞
上記の精製後の試料をインバースＰＣＲ方法の鋳型として用いて、実施例２と同様にして、インバースＰＣＲ方法によりキシラナーゼ遺伝子の増幅を試みた。
【００８１】
＜増幅確認試験＞
インバースＰＣＲ方法による増幅反応後の溶液を、実施例２と同様にしてアガロースゲル電気泳動に供した。このアガロースゲル電気泳動の結果を図９に示す。左端のＬと記したレーンには分子量マーカーを流し、レーン１〜１０には上記シロアリ由来の増幅産物を、レーン１１および１２には、ウマ由来の増幅産物を電気泳動した。この結果、得られた増幅産物は、ほとんどが非特異的増幅産物であった。
【００８２】
実施例２および実施例３の結果から、ＬＮＡ残基のみからなるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて第１の増幅工程を行い、次いでインバースＰＣＲ方法により第２の増幅工程を行って標的ＤＮＡ配列を取得できない場合であっても、第１の増幅工程においてＤＮＡおよびＬＮＡから構成されるキメラプライマーを使用することにより、標的ＤＮＡ配列を取得し得ることが明らかにされた。この結果は、ＬＮＡのみから構成されるプライマーよりも、ＤＮＡおよびＬＮＡから構成されるキメラプライマーのほうが、第１のプライマーとしてより優れていることを示唆するものである。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明により、標的ＤＮＡ配列を増幅するためのインバースＰＣＲ方法に用いる鋳型ＤＮＡ鎖の生産方法が提供される。本発明の生産方法によれば、ＤＮＡ試料中に含まれる標的ＤＮＡ配列を有する標的ＤＮＡ鎖が、従来のインバースＰＣＲ方法では増幅できないほど微量であっても、インバースＰＣＲ方法により上記標的ＤＮＡ配列を増幅することができる、インバースＰＣＲ方法に用いる鋳型ＤＮＡ鎖を提供である。また、当該生産方法を実施するために有用なキットを提供することも、本発明の範疇にある。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】従来のインバースＰＣＲ方法と本発明の方法とを比較する模式図である。
【図２】標的ＤＮＡ鎖と標的ＤＮＡ配列の関係を示す模式図である。
【図３】本発明に使用する環状の標的ＤＮＡ鎖の一例を示す模式図である。
【図４】本発明により得られるインバースＰＣＲ方法に用いる鋳型ＤＮＡ鎖の一例を示す模式図である。
【図５】環境ＤＮＡを本発明に適用するための前処理工程を示す模式図である。
【図６】本発明の生産方法で生産した鋳型ＤＮＡ鎖を用いてインバースＰＣＲ方法による増幅を行い、増幅産物を電気泳動したアガロースゲルの写真である。
【図７】比較例２に記載した方法で生産した鋳型ＤＮＡ鎖を用いてインバースＰＣＲ方法による増幅を行い、増幅産物を電気泳動したアガロースゲルの写真である。
【図８】配列番号１１のＤＮＡ／ＬＮＡキメラオリゴヌクレオチドを第１のプライマーとして使用し、第２の増幅工程で得られた産物を電気泳動したアガロースゲルの写真である。
【図９】配列番号１４のＬＮＡのみからなるオリゴヌクレオチドを第１のプライマーとして使用し、第２の増幅工程で得られた産物を電気泳動したアガロースゲルの写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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