(57)【要約】  【課題】    精子を凍結乾燥する場合に、精子を採取した後から凍結乾燥するまでの間にある程度の時間が確保できること、及び凍結乾燥した精子を用いて受精した後の胚盤胞発生率が80%を越えることを満足するような、哺乳類由来の細胞又は精子の凍結乾燥用溶液を提供する。  【解決手段】    EGTAトリス塩酸緩衝液（50mM NaCl、50mM EGTA、10mM Tris-HCl）（非特許文献２）を検討した結果、緩衝剤（Tris-HCl）の濃度を高くし、かつ浸透圧調整剤（NaCl）を加えないか又はその濃度を低くすることにより、上記課題を解決した。即ち、本発明は、抗−凝固剤１０〜１００ｍＭ、緩衝剤５０〜５００ｍＭ、及び浸透圧調整剤０〜１０ｍＭから成る哺乳類由来の細胞又は精子の凍結乾燥用溶液である。  【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗−凝固剤１０〜１００ｍＭ、緩衝剤５０〜５００ｍＭ、及び浸透圧調整剤０〜１０ｍＭから成る哺乳類由来の細胞又は精子の凍結乾燥用溶液。
【請求項２】
前記抗−凝固剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＤＣＴＡ）、又はエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）である請求項１に記載の溶液。
【請求項３】
前記緩衝剤が、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ又はリン酸バッファ液である請求項１又は２に記載の溶液。
【請求項４】
前記浸透圧調整剤が、塩又は糖類である請求項１〜３のいずれか一項に記載の溶液。
【請求項５】
前記浸透圧調整剤が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グルコース、ショ糖、又は糖類である請求項４に記載の溶液。
【請求項６】
哺乳類由来の細胞又は精子を請求項１〜５のいずれか一項に記載の溶液に懸濁し、これを０℃〜３７℃で一定時間保持した後に、凍結乾燥することから成る、哺乳類由来の精子の凍結乾燥方法。
【請求項７】
前記保持時間が、２５℃の場合には６時間〜７日、４℃の場合には２日〜７日である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の方法により凍結乾燥した非ヒト哺乳類由来の精子を用いて同じ非ヒト哺乳類の雌に受精させることから成る非ヒト哺乳類の受精方法。
【請求項９】
前記非ヒト哺乳類が、ウシ、マウス、ラット又はウサギである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の方法により受精させた雌の非ヒト哺乳類を出産させることから成る非ヒト哺乳類の製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、哺乳類由来の細胞や精子を凍結乾燥するための溶液に関する。
【背景技術】
【０００２】
1998年に哺乳動物（マウス）の凍結乾燥精子から初めて産仔が得られたことが報告されたが、このときに使用された凍結乾燥用溶液は、マウス受精卵培養用のCZB培地（カルシウム及びEDTAフリー）とDMEM培地（10%牛胎仔血清入り）であった（非特許文献１）。その3年後に本発明者らは、マウス凍結乾燥精子の染色体正常率が安定して高率となるための凍結乾燥用溶液として、EGTAトリス塩酸緩衝液を報告した（非特許文献２）。以来、このEGTAトリス塩酸緩衝液を用いた凍結乾燥精子又は乾燥精子に関する研究が世界中で報告されており（非特許文献３，４）、ウサギ（非特許文献５）やラット（非特許文献６）の凍結乾燥精子から産仔が得られている。
【０００３】
【非特許文献１】Nat. Biotechnol. 16:639-641 (1998)
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98:13501-13506 (2001)
【非特許文献３】Biol. Reprod. 68:1779-1786 (2002)
【非特許文献４】Biol. Reprod. 73:627-633 (2005)
【非特許文献５】Biol. Reprod. 70:1776-1781 (2004)
【非特許文献６】Zygote 13:79-85 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、従来の凍結乾燥用溶液を用いて精子を凍結乾燥した場合、受精後の胚盤胞発生率が80%を越えることはなく、良くても70%台であった。
また、従来の凍結乾燥用溶液を用いた場合、懸濁液のまま室温で放置すると精子に染色体異常が蓄積するため（Theriogenology 62:897-905 (2004)）、精子を採取した後すぐに凍結乾燥しなければならない。そのため、精子の採取から凍結乾燥までの間に、精子の運搬や凍結乾燥装置の準備などに十分な時間が取れないという問題がある。
従って、本発明は、細胞や精子を凍結乾燥する場合に、細胞や精子を採取した後から凍結乾燥するまでの間にある程度の時間が確保できること、及び凍結乾燥した精子を用いて受精した後の胚盤胞発生率が80%を越えることを満足するような、哺乳類由来の細胞又は精子の凍結乾燥用溶液を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、既に開発したEGTAトリス塩酸緩衝液（50mM NaCl、50mM EGTA及び10mM Tris-HCl）（非特許文献２）を検討した結果、緩衝剤（Tris-HCl）の濃度を高くし、かつ浸透圧調整剤（NaCl）を加えないか又はその濃度を低くすることによる改良によって、上記課題を解決することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、抗−凝固剤１０〜１００ｍＭ、緩衝剤５０〜５００ｍＭ、及び浸透圧調整剤０〜１０ｍＭから成る哺乳類由来の細胞又は精子の凍結乾燥用溶液である。
また、本発明は、哺乳類由来の細胞又は精子をこの凍結乾燥用溶液に懸濁し、これを0℃〜37℃で一定時間保持した後に、凍結乾燥することから成る、哺乳類由来の精子の凍結乾燥方法である。
また、本発明は、この方法により凍結乾燥した非ヒト哺乳類由来の精子を用いて同じ非ヒト哺乳類の雌に受精させることから成る非ヒト哺乳類の受精方法であり、更に、この方法により受精させた雌の非ヒト哺乳類を出産させることから成る非ヒト哺乳類の製法である。
【発明の効果】
【０００６】
細胞や精子を採取した後から凍結乾燥するまでの間にある程度の時間が確保できることや凍結乾燥精子の室温保存後の正常性が改善されたことは、細胞や精子の運搬や輸送の方法に自由度を与え、精子の運搬や輸送をより簡単に安心して行うことができる。
従来の凍結乾燥用溶液を用いて作製した凍結乾燥精子と比べ、本発明の凍結乾燥用溶液を用いて作製した凍結乾燥精子では、冷蔵及び室温保存サンプル共に染色体正常率、胚盤胞発生率及び胎仔発生率が著しく改善する。
本発明の凍結乾燥用溶液を用いて作製した凍結乾燥精子は、従来の凍結乾燥用溶液を用いて作製した凍結乾燥精子よりも有効期限が延長され、1年間室温保存した精子からも産仔が得られ、また1年間冷蔵した後の正常胎仔発生率に大きな減少はないものと推定される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の哺乳類由来の細胞又は精子の凍結乾燥用溶液の組成は、抗−凝固剤１０〜１００ｍＭ、好ましくは１０〜７０ｍＭ、緩衝剤５０〜５００ｍＭ、好ましくは５０〜２００ｍＭ、及び浸透圧調整剤０〜１０ｍＭ、好ましくは０ｍＭである。
「抗−凝固剤」としては、金属イオンと結合することにより血液凝固等を防ぐことができる有機化合物であればよく、金属２価陽イオンのキレート剤が好ましく用いられ、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＤＣＴＡ）、又はエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）、好ましくはＥＧＴＡが挙げられる。
「緩衝剤」としては、室温（２５℃）でｐＨが安定する溶液であればよく、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液又はリン酸緩衝生理的塩類溶液（ＰＢＳ）、好ましくはＴｒｉｓ−ＨＣｌが挙げられる。
「浸透圧調整剤」としては、細胞保存液の浸透圧を細胞質に対して等張または高張になるように調節する目的で加えられる水溶性物質であればよく、例えば、塩又は糖類であり、好ましくは塩である。塩は、好ましくは金属塩、より好ましくはアルカリ金属塩、より好ましくはハロゲン化アルカリ金属であり、例えば、塩化ナトリウムや塩化カリウムが挙げられる。糖類は、好ましくは単糖又はオリゴ糖、より好ましくは単糖又は二糖類であり、例えば、グルコース、スクロース、トレハロース等が挙げられる。
本発明の凍結乾燥用溶液は、上記成分のほか、更に抗酸化物質、例えば、ビタミンＥ、ジメチルスルホキシド、カテキン類等を含んでもよい。
【０００８】
このような凍結乾燥用溶液に、哺乳類由来の細胞又は精子を懸濁し、これを一定期間保持した後に、凍結乾燥する。
この期間はプレインキュベーションといい、後述の実施例でも明らかにされるが、本発明の凍結乾燥用溶液を用いる場合に必須な時間であり、その保持時間は温度によって異なる。例えば、２５℃の場合には６時間〜７日、好ましくは１日〜４日、４℃の場合には２日〜７日、好ましくは４日〜７日である。他の温度についてもこれらから類推できる。
また、この期間の温度は、０℃〜３７℃、好ましくは４℃〜２５℃であり、この範囲より高いと精子クロマチンが変質して精子ＤＮＡに傷害が生じやすくなり、この範囲より低いと凍結により精子細胞膜に機械的傷害が生じ、凍結乾燥後の精子の染色体正常率に影響を及ぼす場合がある。
凍結乾燥の条件は、液体窒素による予備凍結時間：１分間、真空度：２２×１０−３〜４２×１０−３ミリバール、真空時間：４時間〜１０時間、氷結トラップ内温度：−４４〜−５０℃である。
【０００９】
本発明の凍結乾燥用溶液は、哺乳類由来の細胞又は精子の保存に適している。このような哺乳類としては、ヒト、ウシ、マウス、ラット又はウサギが挙げられる。
凍結乾燥して保存できる期間は０〜３６５０日程度である。この期間後、凍結乾燥試料に０．０５〜０．１ｍｌの水を加えて細胞または精子を再懸濁する。その懸濁した細胞または精子を顕微操作により注入用ピペットで吸い取り、未受精卵に注入する。精子以外の細胞核を注入する場合や、精子に卵活性化能が失われている場合は、化学物質処理等により卵を人為的に活性化させる。活性化した卵は、２細胞期胚〜胚盤胞まで試験管内で発生させ、偽妊娠個体の卵管または子宮に移植される。
精子以外の細胞を凍結乾燥する場合、対象となる組織の細胞もしくは組織由来の初代培養細胞を、本発明の凍結乾燥用溶液に懸濁したものを使用する。
【００１０】
本発明の凍結乾燥用溶液及び凍結乾燥方法は、対象となる個体から精子が得られない場合などに、例えば、雌個体や無精子症の個体から凍結乾燥によりゲノム保存を行う場合などに、精子以外の細胞を冷凍乾燥する目的にも適している。
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【００１１】
0.5M EGTA（EGTA[ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetracetic acid]（シグマ社）を、水（シグマ社、Water for embryo transfer）に飽和NaOH溶液を添加しながら溶解し、pHを8.0に調整した。）、Tris-HCl（シグマ社、Trisma(R)-HCl, 1 M, pH 7.4）、NaCl（シグマ社、Sodium Chloride 5M solution）及び水（シグマ社、Water for embryo transfer）を用いて、表１に示す組成の各種溶液を作成した。
上記のように作成した各種溶液を1.2 ml 採取し、1.5 ml遠心チューブに加え、37℃にインキュベーションした。7〜12週齢の雄マウス（B6D2F1：BDF1）の精巣上体尾部の切除片を、それらの各種溶液の入ったチューブに１個ずつ加えた。更に10分間37℃でインキュベーションし、精子をスイムアップ又は分散させた後、上層から精子懸濁液1 mlを採取し、別のチューブに移した。スライドグラスに精子懸濁液を滴下し、回収された精子を観察した。回収できた精子数を4段階：Very good（多い、約50万個以上/ml）、Good（多少ある）、Poor（少ない）、Very poor（ほとんど確認できないがわずかにある）で評価した。
４℃で４〜７日間、精子懸濁液をインキュベーションした後、凍結乾燥(FD)した。
その後、４℃で１日〜３週間保存した後、卵細胞質内精子注入法（ICSI）により精子をマウス未受精卵に注入した。
ICSI終了後、分裂阻害剤であるビンブラスチン硫酸塩を加えたm-CZB培地に卵を移した。翌日、染色体標本を作製し、ギムザ染色後風乾した。
染色体の総本数が40本であり、かつ染色体の構造異常（染色分体型あるいは染色体型の切断又は交換等）が認められない受精卵を、正常な染色体構成をもつ受精卵とした。本実施例においては、染色体分析を行った受精卵のうち、正常な染色体構成をもつ受精卵の比率（％）を求め、染色体正常率とした。
【００１２】
結果を表１に示す。
【表１】
2007252270.tif 000002
【００１３】
EGTAが10 mMで、Tris-HCl (pH 7.4)の濃度が100mMである場合、凍結乾燥精子の試料はアンプルカット直後に粉砕し、そのほとんどが消失した。これは溶液が低浸透圧であるため細胞が膨化したためと考えられ、Tris-HCl (pH 7.4)の濃度は50 mM以上必要であると考えられる。
EGTAが50 mMで、Tris-HCl (pH 7.4)の濃度が50〜200mMの場合、凍結乾燥精子を注入した受精卵の染色体正常率は80%以上を示した。また、Tris-HCl (pH 7.4)の濃度が500 mMの場合には精子回収能が悪かった。
EGTAが100 mMの場合、精子回収能が悪く、Tris-HCl (pH 7.4)の濃度が 10 mMのとき、受精卵の染色体正常率は４割以下となった。精子回収能が悪い理由はEGTA の毒性によるものと考えられる。
50 mM EGTA+100 mM Tris-HCl (pH 7.4)にNaClを10〜50mMで加えた場合、充分に産仔は得られると思われるが、受精卵の染色体正常率は6〜7割と、NaClを加えないときと比べて低かった。特に、NaClが50 mMのときは精子回収能が悪かった。
【実施例２】
【００１４】
実施例１で用いた各成分を用いて下表に示す組成のストック原液（以下「m-ETBS」という。）を調製した。
【表２】
2007252270.tif 000003
【００１５】
m-ETBSにマウス（B6D2F1）の精子を懸濁して室温保存（25℃）又は冷蔵（4℃）した（「プレインキュベーション」という。）後に凍結乾燥し、2週間以内にマウス（B6D2F1）未受精卵に注入した。表３に、第一卵割中期における受精卵の染色体正常率を示す。
【表３】
2007252270.tif 000004
m-ETBSにマウス（B6D2F1）の精子を懸濁した直後に凍結乾燥すると、新鮮であるにもかかわらず精子注入後の受精卵の染色体正常率は低い値を示した（16%）。しかし、プレインキュベーションの時間に依存して、受精卵の染色体正常率は増加する。室温（25℃）では6時間以上、冷蔵では2日間以上のプレインキュベーションを行った後に凍結乾燥すると、受精卵の染色体（4℃）正常率が80%付近まで増加した。
なお、ここにデータは示さないが、室温（25℃）で4〜7日間プレインキュベーションした場合、凍結乾燥後の精子は卵活性化能を失った。従って、精子を卵に注入後、塩化ストロンチウム処理によって卵を人為的に活性化させる必要がある。冷蔵（4℃）でプレインキュベーションした場合は７日間以下であれば卵活性化能が残っていた。
【実施例３】
【００１６】
実施例２で作成したm-ETBSにマウス（B6D2F1）の精子をプレインキュベーション後（4℃、6日間）に凍結乾燥し、19日間冷蔵（4℃）したマウス精子をマウス（B6D2F1）未受精卵に注入した。移植した１３例のうち、着床数は１３であり、交配後14日の正常胎仔数は７であった。胎仔の様子を図１に示す。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の凍結乾燥用溶液を用いて凍結乾燥した精子を用いて受精した胎仔の様子を示す図である。（１）は１３個の初期胚が移植された妊娠１４日目のマウスの子宮、（２）はその子宮から得られた着床胚（正常胎仔及び吸収胚）を示す。
【図１】
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