(57)【要約】      （修正有）【課題】微生物の突然変異および当該突然変異体の選別、特に直接的かつ特異的な方法により代謝突然変異体を得る新しい方法の提供。【解決手段】二方向性マーカーをコードする核酸配列を含む核酸カセットであって、該核酸カセットはさらに該二方向性マーカーをコードする核酸配列に作動可能に連結された基本転写ユニットを含み、該二方向性マーカーは更に該基本転写ユニットに連結された誘導性エンハンサーまたはアクチベーター配列を含み、該エンハンサーまたはアクチベーター配列は、その誘導の際に二方向性マーカーをコードする核酸配列が発現されるように連結されていることと、該誘導性エンハンサーまたはアクチベーター配列は代謝の一部の活性に関連する遺伝子に由来することと、該誘導性エンハンサーまたはアクチベーター配列は代謝に関連する遺伝子に由来することを特徴とする核酸カセット、及びそれを利用した突然変異体の選別方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号９のｘｙｌＲのアミノ酸配列と、あるいは配列番号９のｘｙｌＲをコードする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも８０％の同一性を示す発現生成物をコードする核酸配列ｘｙｌＲ。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸配列であって、前記核酸配列が、配列番号９のｘｙｌＲのアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を示す発現生成物をコードする核酸配列。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸配列であって、前記核酸配列が、配列番号９のｘｙｌＲのアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を示す発現生成物をコードする核酸配列。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸配列であって、前記核酸配列が、配列番号９のｘｙｌＲのアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を示す発現生成物をコードする核酸配列。
【請求項５】
前記核酸配列が配列番号９の核酸配列である、請求項１〜４の何れか一項に記載の核酸配列。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸配列であって、該配列が、配列番号９のコード化核酸配列と比較して、該配列の一以上の部分における欠失および／または置換を含み；配列番号９と比較したとき、１〜１５のアミノ酸が欠失及び／又は置換され；及び、前記配列が亜鉛フィンガー結合領域をコードする配列及びＲＲＲＬＷＷをコードする配列を含むことを特徴とする核酸配列。
【請求項７】
特異的な最小ストリンジェンシィー条件下で、核酸配列番号９に由来するプライマーまたはプローブにハイブリダイズできる核酸配列であって、該プライマーまたはプローブが非亜鉛フィンガー結合領域に由来し、かつ該プライマーまたはプローブが、少なくとも２０ヌクレオチドの長さであり、ここにおいて、該最小ストリンジェンシィー条件が、６×ＳＳＣ、0.1％ ＳＤＳ、0.05％ ピロリン酸ナトリウム、５×Denhardt’s溶液及び20μｇ／ｍｌ 変性ニシン精子ＤＮＡでの、５６℃、１８〜２４時間のハイブリダイゼーション、続いて、５×ＳＳＣ、0.1％ ＳＤＳでの６８℃、３０分の２回の洗浄、及び、２×ＳＳＣ、0.1％ ＳＤＳでの、５６℃、３０分の２回の洗浄であることを特徴とする核酸配列。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸配列であって、該配列が、特異的な最小ストリンジェンシィー条件下において、配列番号９のコード化核酸配列にハイブリダイズでき、ここにおいて、該最小ストリンジェンシィー条件が、６×ＳＳＣ、0.1％ ＳＤＳ、0.05％ ピロリン酸ナトリウム、５×Denhardt’s溶液及び20μｇ／ｍｌ 変性ニシン精子ＤＮＡでの５６℃、１８〜２４時間のハイブリダイゼーション、続いて、５×ＳＳＣ、0.1％ ＳＤＳでの６８℃、３０分の２回の洗浄、及び、２×ＳＳＣ、0.1％ ＳＤＳでの５６℃、３０分の２回の洗浄であることを特徴とする核酸配列。
【請求項９】
請求項１〜６の何れか一項に記載の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列。
【請求項１０】
前記アミノ酸配列が、配列番号９によってコードされるアミノ酸配列である、請求項９に記載のアミノ酸配列。
【請求項１１】
同等発現生成物がＤＮＡ結合活性を有する、請求項９に記載のアミノ酸配列。
【請求項１２】
前記同等発現生成物がＤＮＡ結合活性を有する、請求項１０に記載のアミノ酸配列。
【請求項１３】
請求項１１に記載のアミノ酸配列であって、前記ＤＮＡ結合活性が、配列番号９によってコードされるアミノ酸配列による発現生成物が、前記標的遺伝子の核酸配列に結合するのと同程度又はそれ以上に、前記発現生成物が標的遺伝子の核酸配列に結合する程度であり、ここにおいて、前記標的遺伝子が、標的遺伝子ｘｌｎＡ、ｘｌｎＢ、ｘｌｎＣ、ｘｌｎＤ及びａｘｅＡから成る群から選択される、アミノ酸配列。
【請求項１４】
請求項９〜１３の何れか一項に記載のアミノ酸配列であって、前記配列が、配列番号９によってコードされるアミノ酸配列と比較して、該配列の一以上の部分において、欠失及び／又は置換を含み、配列番号９と比較したとき、１〜１５のアミノ酸が欠失及び／又は置換され；及び、前記配列が亜鉛フィンガー結合ドメイン及びＲＲＲＬＷＷモチーフを含む、アミノ酸配列。
【請求項１５】
請求項９〜１４の何れか一項に記載のアミノ酸配列であって、亜鉛フィンガー結合領域からアミノ酸配列の少なくともＣ末端側半分を含むアミノ酸配列。
【請求項１６】
請求項９〜１５の何れか一項に記載のアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が亜鉛フィンガー結合領域に対応する断片を含む、アミノ酸配列。
【請求項１７】
請求項９〜１６の何れか一項に記載のアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列が、ＲＲＲＬＷＷモチーフに対応するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列。
【請求項１８】
請求項９〜１７のいずれか一項に記載のアミノ酸配列であって、配列番号９における１１１０ないし１２６０位におけるヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列に対応する亜鉛フィンガー結合領域に突然変異が存在しない、アミノ酸配列。
【請求項１９】
請求項９〜１８のいずれか一項に記載のアミノ酸配列であって、配列番号９によってコードされるアミノ酸配列に存在するモチーフＲＲＲＬＷＷに対応するＲＲＲＬＷＷモチーフに突然変異が存在しない、アミノ酸配列。
【請求項２０】
レギュレーターをコードする配列の欠如、又は、該レギュレーターが発現されないか又はレギュレーターとして不活性であるような突然変異−いわゆるノックアウト突然変異ホスト細胞−を含む突然変異ホスト細胞であって、前記レギュレーターをコードする配列がｘｙｌＲをコードし、及び、該レギュレーターが請求項１〜６の何れか一項に記載の核酸配列によってコードされ、又は、該レギュレーターが請求項９〜１９の何れか一項に記載のアミノ酸配列を有する、突然変異ホスト細胞。
【請求項２１】
キシラン分解副活性を含まずに得ることができる、蛋白質またはペプチドをコードする配列をさらに含む、請求項２０に記載の突然変異ホスト細胞。
【請求項２２】
請求項２０または２１に記載のノックアウト突然変異体を培養し、その結果として蛋白質を得ることを特徴とする、キシラン分解副活性の無い蛋白質またはポリペプチドを生産する方法。
【請求項２３】
蛋白質またはペプチドを生産するための、組合せ核酸カセットの使用であって、前記組合せ核酸カセットが、
１）標的遺伝子プロモーター、ここにおいて該標的遺伝子は誘導性エンハンサー又は活性化配列の活性化レギュレーターの標的遺伝子である、
２）さらなるプロモーターに作動可能に連結されたレギュレーターをコードする核酸配列、
３）蛋白質又はペプチドをコードする配列、
を含み、
前記標的遺伝子プロモーターは、（３）のコード配列に作動可能に連結され、ここにおいて、該レギュレーターをコードする核酸配列は、キシランレギュレーターをコードし、ここにおいて、該レギュレーターをコードする核酸配列は、ｘｙｌＲをコードし、ここにおいて、該レギュレーターをコードする核酸配列は、請求項１〜８の何れかに記載の核酸配列であり、或いは、該レギュレーターは請求項９〜１９の何れかに記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする使用。
【請求項２４】
前記レギュレーターをコードする核酸配列に作動可能に連結されたさらなるプロモーターが、前記核酸配列に天然に付随するプロモーターである、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記標的遺伝子プロモーターが、標的遺伝子ｘｌｎＡ、ｘｌｎＢ、ｘｌｎＣ、ｘｌｎＤおよびａｘｅＡに付随するプロモーターから選択される、請求項２３又は２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記標的遺伝子プロモーターが、前記標的遺伝子ｘｌｎＤに付随するプロモーターである、請求項２３〜２５の何れか一項に記載の使用。
【請求項２７】
前記配列が、キシラン分解酵素、グルカナーゼ、α-グルクロニダーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、プロテアーゼ又はヘキソース酸化酵素のような酸化還元酵素をコードする、請求項２３〜２６の何れか一項に記載の使用。
【請求項２８】
請求項１〜８の何れか一項に記載の核酸配列の使用であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸配列によってコードされる誘導性エンハンサーまたはアクチベーター配列の活性化レギュレーターの標的遺伝子と正常に関連するプロモーターに作動可能に連結された標的遺伝子を含むホスト細胞において、該核酸配列を発現させることによって、標的遺伝子を過剰生産させるための使用であり、但し、該標的遺伝子および請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸配列が、該ホスト細胞に天然のものである場合、請求項１〜８のいずれか１項に記載の配列は野生型ホスト細胞と比較して複数コピーが存在することを特徴とする使用。
【請求項２９】
蛋白質またはペプチドを生産するためのホスト細胞の使用であって、前記ホスト細胞が、請求項２３〜２７の何れかで定義された組み合わせ核酸カセット及び／又は請求項２３〜２７のいずれかで定義された組み合わせ核酸カセットを含むベクターを含む、ホスト細胞の使用。
【請求項３０】
請求項２９に記載のホスト細胞の使用であって、前記ホスト細胞が、請求項２３で定義される組み合わせ核酸カセットの成分を含み、前記ホスト細胞が、天然の又は組換えＤＮＡ技術によるレギュレーターの標的遺伝子を含み、但し、該標的遺伝子及びレギュレーターが該ホスト細胞に天然に備わっている場合、該レギュレーターは複数コピー存在する、ホスト細胞の使用。
【請求項３１】
前記ホスト細胞が、請求項２３で定義されるレギュレーターをコードする核酸配列又は請求項１〜８の何れかに記載の核酸配列の複数コピーを含む、請求項２９に記載のホスト細胞の使用。
【請求項３２】
請求項２９〜３１の何れか一項に記載のホスト細胞の使用であって、前記レギュレーターが、請求項１〜８の何れか一項で定義された核酸、或いは、請求項９〜１９の何れかに記載のアミノ酸配列、および、請求項２６で定義された標的遺伝子プロモーターによってコードされ、該プロモーターは標的遺伝子ｘｌｎＤに付随するプロモーターである使用。
【請求項３３】
請求項２９〜３２の何れか一項に記載のホスト細胞の使用であって、前記ホスト細胞が微生物及び植物細胞を含む群から選択される使用。
【請求項３４】
請求項２９〜３３の何れか一項に記載のホスト細胞の使用であって、前記ホスト細胞が真菌細胞から選択される使用。
【請求項３５】
請求項２９〜３４の何れか一項に記載のホスト細胞の使用であって、前記ホスト細胞が、アスペルギルス（Aspergillus）属、トリコデルマ（Trichoderma）属、ペニシリウム（Penicillium）属およびフザリウム（Fusarium）属から選択される使用。
【請求項３６】
請求項２９〜２５の何れか一項に記載のホスト細胞であって、前記ホスト細胞が、アスペルギルス・ニゲール、アスペルギルス・トゥービゲンシス、アスペルギルス・アクレトゥス、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・オリザエ、アスペルギルス・ニドゥランス、アスペルギルス・フェティダス、アスペルギルス・テレウス、アスペルギルス・シドウィー、アスペルギルス・カワチー、アスペルギルス・カルボナリウムおよびアスペルギルス・ヤポニカスから選択される株である使用。
【請求項３７】
前記標的遺伝子がホスト細胞に内在性である、請求項２９〜３６の何れか一項に記載のホスト細胞の使用。
【請求項３８】
前記標的遺伝子が複数コピー存在する、請求項２９〜３７の何れか一項に記載のホスト細胞の使用。
【請求項３９】
請求項１〜８の何れか一項に記載の核酸配列の少なくとも一つのさらなるコピーを含む、形質転換されたホスト細胞。
【請求項４０】
微生物、植物細胞および真菌細胞を含む群から選択される請求項３９に記載のホスト細胞。
【請求項４１】
前記ホスト細胞が糸状真菌である、請求項４０に記載のホスト細胞。
【請求項４２】
前記ホスト細胞が、アスペルギルス属、トリコデルマ属、ペニシリウム属、およびFusarium属、サッカロミセス属、クルベロミセス属、およびラクトバチルス属から選択される、請求項４０に記載のホスト細胞。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は微生物の突然変異および突然変異体の選択の分野に属する。さらに詳しくは、本発明は、簡便で、直接的かつ特異的な方法で代謝突然変異体を得ることに向けられている。好ましい態様においては、より簡略な法の手続きのために、組み換えＤＮＡを含まない所望の突然変異体を得ることにより、ヒトが消費する産物またはヒトに適用する産物中へのその組込みを容易にすることもできる。本発明の方法は、ランダム突然変異および所望の代謝突然変異体の特異的選択を含む。該方法は適切には自動的に行うことができる。かかる突然変異体は、代謝活性の増大または減少いずれかを示し得る。該方法の特異性は適用する選択条件にある。得られた突然変異体は、代謝の所定の一部に関するその調節機能が突然変異されている。該選択条件に応じて、過剰発現を示すであろう抑制解除された突然変異体を単離でき、あるいは特定の代謝酵素活性が排除された突然変異体を見出すことができる。かくして、望ましくない代謝酵素活性を排除し、あるいは所望の代謝活性を増強することが可能となる。
【０００２】
本発明の方法は、産業において既に広く用いられている十分に特徴づけられた供給源に対して、適切に実施することができる。例えば、過剰発現突然変異体は、低コストで大量生産する酵素の主要な供給源として使用することができる。変異を誘発すべき最初の株は、効果的な蛋白質分泌、大規模生産プロセスの利用可能性、発酵液の後処理に関する経験、広範な遺伝学的知識および安全な微生物の使用に関する保証のごとき当業者に公知のいくつかの要素に依拠するであろう。
【０００３】
また、本発明のもう１つの態様において、今や、機能を調節する特異的代謝遺伝子を突きとめ同定することも可能となった。
【０００４】
現在まで、産業的に応用でき且つ自動化できた突然変異体の調製方法は、修正されるべきであった特徴、突然変異体の選択およびそれに続く分析を行うことなく突然変異体誘発を行う方法であった。選択を用いる別法は、通常、富化行程に、続いて増殖また非増殖に基づく選別を必要とした。このことは、多数の望ましくない突然変異体を最初に除去すべきことを意味した。また、現存する方法は不適切な表現型を有する非常に多数の突然変異体を生じ、かくして低選択性を示す。
【０００５】
数年前、Gist-Brocadesは、アスペルギルス・ニゲール（Aspergillus niger）のためのｐｌｕＧＢｕｇマーカー遺伝子を用いない技術を開発し、紹介した。G.SeltenによるＧＩＳＴ９４／６０ｐ５−７において、それを調節する遺伝子の高い発現レベルを達成するためのグルコアミラーゼ調節領域を含む、アスペルギルス・ニゲール(Aspergillus niger)のためのベクターについての説明がなされている。これは天然アスペルギルス・ニゲール（Aspergillus niger）によるグルコアミラーゼの本来的に高い発現に基づいて調節領域として選択された。組換えＤＮＡ技術を用いて、選択マーカーであるアスペルギルス（Aspergillus）ＡｍｄＳと同様に注目する遺伝子に該調節領域を適切に融合させ、A．ニゲール（A.niger）ホストへ発現カセットを導入した後、所望の形質転換体の選択を可能とした。次いで、該発現カセットの複数のコピーはランダムにA．ニゲール（A.niger）ゲノムに組込まれた。該論文に記載されたごとく、生産された酵素はフィターゼであった。ひき続いて、マーカーを含まない形質転換体の創生を達成できる。公知の系において、ａｍｄＳ遺伝子は二方向性に使用できるので、マーカーを含まない組換え株の創生は実際には２段階プロセスである。まず形質転換工程で、提供された発現カセットを有する最初の形質転換体を選択し、次いで第二の工程で、ａｍｄＳ遺伝子を再び喪失した最終の組換え株を逆選択する。ａｍｄＳ遺伝子はアセトアミドをアンモニウムおよびアセテートへ変換できる酵素をコードする。アセトアミドは形質転換工程で唯一のＮ源として用いられる。組換え工程において、例えば尿素のごとき第二の適当なＮ源と共に、フルオロアセトアミドを選択的Ｎ源として用いる。生成物フルオロアセテートは他の細胞に対して毒性であるので、その増殖は、発現カセット中のＤＮＡリピートにわたる内部組み換えによってａｍｄＳ遺伝子を喪失した細胞に限られるであろう。この公知の方法に伴う最大の問題は、その結果得られた系が組換え株であるという事実である。所望の特性は「外来」核酸の組込みによって導入されなければならず、これは法的認可に要する期間を遅延させる可能性があり、また時には法的認可を妨げることすらある。加えて、該方法は修正された代謝を有する株の確立には適していない。酵素カスケードおよび複数のフィードバックループの存在のため、特定遺伝子の単純な組込みは常には所望の結果につながるとは限らない。コードされた特定の生成物の過剰発現は別の生成物の付随した過剰発現によって補償され、あるいは下方調節されて、かくして、組み込まれた遺伝子の効果が無くなる可能性がある。それゆえＤＮＡの組込みは、所望の核酸の組込みは選択可能であるが所望の表現型が必ずしも付随して達成されないという試行錯誤の場合がしばしばであろう。さらに、マーカー遺伝子の喪失は時間を要する自然発生的なプロセスであり、該核酸カセットを含む全ての形質転換体に生じることを保証することはできない。
【０００６】
微生物における株の改良は様々なレベルで生物を修飾することにより達成できることが知られている。転写レベルでの遺伝子発現の改良は、ほとんどの場合、発現カセットの遺伝子量の増加と組み合わせて、注目する生成物をコードする高レベルのｍＲＮＡを生じさせる強力なプロモーターの使用により達成される。これは形成された生成物の増加につながり得るが、この戦略は原則的に不利な点を有する。プロモーターの複数コピーが存在するため、転写を駆動する転写レギュレーターの量は限られ、レギュレーターの標的遺伝子または複数の該遺伝子の発現が減少する結果となる。これはａｍｄＳ遺伝子の多数のコピーを有するアスペルギルス・ニドゥランス(Aspergillus nidulans)株の場合(KellyおよびHynes,1987:AndrianopoulosおよびHynes,1988)およびａｌｃＡプロモーターの制御下で異種遺伝子の複数コピーを有するＡ．トゥランス（A.nidulans）株の場合(Gwynneら,1987)に観察された。後者の場合において、ａｌｃＡ遺伝子の転写レギュレーターをコードするａｌｃＲ遺伝子の増加は、該発現カセットの発現を増加させる結果となった（Gwynneら,1987;Davies,1991)。アスペルギルス・ニドゥランス（Aspergillus nidulans）において判明した効果と類似して、アスペルギルス・ニゲール（Aspergillus niger）においては、転写を駆動する転写レギュレーターの制限に起因して、グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）プロモーターの使用において同様の制限が観察された(Verdoesら,1993;Verdoesら,1995;Verdoes,1994)。ｇｌａＡ調節遺伝子のクローニングは選択戦略の欠如によりこれまで導入を妨げられてきた。
【０００７】
アラビナーゼ遺伝子発現の場合において、アラビナーゼ遺伝子投与量の増加に際し、転写レギュレーターに対する明確な競合が見出されたが(Flipphiら,1994)、このことは、研究された３つの遺伝子のすべてに共通の転写レギュレーターの制限を反映している。
【０００８】
前記した技術水準の欠点に加え、ほとんどの調節蛋白質が細胞中に非常に低濃度でしか存在せず、どの物質が調節を担うのかの決定を困難にさせているという事実に起因して、レギュレーター遺伝子の単離および測定は今まで大変困難であった。さらに、一般的に、調節生成物は酵素ではなく、ＤＮＡ結合アッセイによってスクリーニングすることしかできず、その結果、同定および単離は困難で、且つ大変時間のかかるものとなっている。調節遺伝子をクローン化するためにこれまで使用されている戦略は、例えば次の通りである：
−相補性によるもの。しかしながら、これは利用可能な突然変異体を要する；
−調節蛋白質の精製によるもの。該蛋白質はＤＮＡ結合特性によって特徴付けするしかないので、これは非常に面倒である。これらの精製のいくつかはマトリックスとして結合ＤＮＡ断片を用いるアフィニティークロマトグラフィーを含む。このタイプの精製における欠点の一つは、しばしば断片に対して１を越えるタンパク質が特異的ならびに非特異的に結合するということである。
【０００９】
−遺伝子のクラスター形成に基づくもの。ここに該調節遺伝子は、その遺伝子生成物、例えばｐｒｎクラスター、ａｌｃクラスターなどによって調節される構造遺伝子とゲノム的にクラスターを形成する。
【発明の詳細な説明】
【００１０】
本発明者らは、今回、特定の望ましい酵素を過剰発現できる突然変異体微生物の法的認可に必要な時間を短縮するために使用できる系を達成した。該系は「外来」核酸の複数のランダムな挿入の問題、特に選択マーカー遺伝子の挿入の問題を克服する。それは、所望の特性を達成するために外来核酸ですら必要としない。その結果得られた突然変異体株は異種核酸を含まないであろう。さらに本発明の系は、特異的な代謝突然変異を可能とし、望ましくない表現型につながる大量の実験を回避する。
【００１１】
本発明は二方向性マーカーをコードする核酸配列を含む核酸カセットであって、該核酸カセットはさらに該二方向性マーカーをコードする核酸配列に作動可能に連結された基本転写ユニットを含むことと、該二方向性マーカーは更に、該基本転写ユニットに連結された誘導性エンハンサーまたはアクチベーター配列を含み、該エンハンサーまたはアクチベーター配列は、その誘導の際に二方向性マーカーをコードする核酸配列が発現されるように連結されていることと、該誘導性エンハンサーまたはアクチベーター配列は代謝の一部の活性に関連する遺伝子に由来することと、該誘導性エンハンサーまたはアクチベーター配列は代謝に関連する遺伝子に由来することを特徴とする核酸カセットを目的とする。
【００１２】
基本転写ユニットは転写がリンクされている遺伝子の転写に必要ないずれの要素をも具備している。それはエンハンサー配列を含むプロモーターあるいは含まないプロモーターも具備し得る。基本転写ユニットはホスト微生物において作動しなければならない。基本転写ユニットはそれがその転写のための二方向性マーカー遺伝子に作動可能に連結されるように位置しなければならない。適当な例は、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）、トリコデルマ（Trichoderma）、ペニシリウム（Penicillium）、フサリウム（Fusarium）、サッカロミセス（Saccaromyces）、クルベロミセス（Kluyveromyces）およびラクトバチルス（Lactobacillus）のごとき多数のホスト細胞でよく知られている。実施例において、アスペルギルス・ニゲール（Aspergillus niger）ｇｏｘＣ転写ユニットに由来する基本転写ユニットｔＧＯＸ(Whittingtonら1990)が本発明の実施可能な態様で示されている。
【００１３】
誘導性エンハンサーまたはアクチベーター配列は、好ましくは、通常、酵素カセットの調節に正常に関与し、または１以上のフィードバックループを伴う代謝の一部に関与する。さらなる態様において、本発明の核酸カセットは、炭素代謝に正常に関与する誘導性エンハンサーまたはアクチベーター配列を具備する。本発明の核酸カセットに使用される誘導性エンハンサーまたはアクチベーター配列の適当な例は、以下の核酸断片のいずれかに含まれる上流活性化配列（ＵＡＳ）である：
＋＋＋−各々アラビノフラノシダーゼＡ、アラビノフラノシダーゼＢおよびエンドアラビナーゼをコードするａｂｆＡ、ａｂｆＢおよびａｂｎＡ遺伝子のプロモーターに由来する断片、
−グルコアミラーゼをコードするｇｌａＡ遺伝子に由来する断片、
−ａｌｃＲおよびａｌｃＡプロモーター上のごときａｌｃＲ結合部位を有する断片、
−ＣＵＰＩ遺伝子に由来する断片、
−ＰＨＯ５遺伝子に由来する断片、
−ＧＡＬ１、ＧＡＬ７またはＧＡＬ１０遺伝子に由来する断片、
−ｘｌｎＡ遺伝子に由来する断片、
−ｐｇａＩＩ遺伝子に由来する断片。
【００１４】
例として、これらの断片は文献に記載されているごとく以下の生物から誘導されることができる：
−各々アスペルギルス・ニゲール（Aspergillus niger）のアラビノフラノシダーゼＡ、アラビノフラノシダーゼＢおよびエンドアラビナーゼをコードするａｂｆＡ、ａｂｆＢおよびａｂｎＡ遺伝子のプロモーターに由来する断片(Flipphi M.J.A.ら1994)、
−アスペルギルス・ニゲール（Aspergillus niger）のグルコアミラーゼをコードするｇｌａＡ遺伝子に由来する断片(Fowler T.ら1990)、
−アスペルギルス・ニドゥランス（Aspergillus nidulans）のａｌｃＲプロモーター上のａｌｃＲ結合部位を含有する断片(Felenbok B.ら1994),
−サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＣＵＰ１遺伝子に由来する断片(Hinnen A.ら1995)、
−サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＰＨＯ５遺伝子に由来する断片(Hinnen A.ら1995)、
−サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＧＡＬ１、ＧＡＬ７またはＧＡＬ１０遺伝子に由来する断片(Hinnen A.ら1995)、
−アスペルギルス・ニドゥランス（Aspergillus nidulans）のｘｌｎＡ、ｘｌｎＢ、ｘｌｎＣまたはｘｌｎＤ遺伝子に由来する断片、
−アスペルギルス・ニゲール（Aspergillus niger）のｘｌｎＢ、ｘｌｎＣまたはｘｌｎＤ遺伝子に由来する断片（本明細書の他所参照）、
−アスペルギルス・トゥービゲンシス（Aspergillus tubigensis）のｘｌｎＡまたはｘｌｎＤ遺伝子に由来する断片(de Graaffら1994)、
−アスペルギルス・ニゲール（Aspergillus niger）のｐｇａＩＩ遺伝子に由来する断片（本明細書の他所参照）。
【００１５】
実施例において、ｘｌｎＡのＵＡＳが本発明の実施可能な態様において示されている。
【００１６】
二方向性マーカーは当該分野で認められた用語である。それは使用した選択条件に基いて、発現の存在または不存在を示すために使用できる選択マーカーからなる。好ましい二方向性マーカーは、致死性または極度の増殖低下に基いて、選択性を付与する。別法として、二方向性マーカー遺伝子の発現また欠如に基づく異なるコロニーの着色も可能な態様である。公知の二方向性マーカーの適当な例は、ｆａｃＢ、ＮｉａＤ、ＡｍｄＳ、Ｃａｎ１、Ｕｒａ３、Ｕｒａ４およびＰｙｒＡ遺伝子よりなる群で見い出されるべきものである。これによって本発明者らはまた、ＰｙｒＡ相同体が文献中でＰｙｒＧ、Ｕｒａ３、Ｕｒａ４、Ｐｙｒ４およびＰｙｒ１と呼ばれていることも指摘する。これらの遺伝子は例えば、以下の生物において見出すことができる。アスペルギルス・ニドゥランス（Aspergillus nidulans）におけるｆａｃＢ遺伝子、アスペルギルス・ニゲール（Aspergillus niger）におけるＮｉａＤ遺伝子、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzaeにおけるＮｉａＤ遺伝子、アスペルギルス・ニドゥランス（Aspergillus nidulans）におけるＡｍｄＳ遺伝子、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）におけるＣａｎ１遺伝子、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）におけるＵｒａ３遺伝子、サッカロミセス・ポンベ（Saccharomyces pombe）におけるＵｒａ４遺伝子およびアスペルギルス（Aspergillus）、トリコデルマ（Trichoderma）、ペニシリウム（Penicillium）、フサリウム（Fusarium）、サッカロミセス（Saccharomyces）およびクルベロミセス（Kluyveromyces）におけるＰｙｒＡ遺伝子である。
【００１７】
ｆａｃＢ突然変異体、すなわち陰性表現型を用いた選択は、フルオロアセテート耐性に基いて起こり得る。ＦＡＣ  Ｂ＋、すなわち、陽性表現型についての選択は炭素源としてのアセテートに基いて起こり得る(Katz,M.E.およびHynes M.J.1989)。ｎｉａＤ突然変異体、すなわち、陰性表現型を用いた選択は、塩素酸塩耐性に基いて起こり得る。ＮＩＡ  Ｄ＋、すなわち、陽性表現型についての選択は、窒素源としての硝酸塩に基いて起こり得る(Unkles S.E.ら1989aおよび1989b）。ａｍｄＳ突然変異体、すなわち、陰性表現型を用いた選択は、フルオルアセトアミド耐性に基いて起こり得る。ＡＭＤ  Ｓ＋、すなわち、陽性表現型についての選択は、窒素源としてのアセトアミドに基いて起こり得る。ほとんどの真菌類はアセトアミダーセ機能をコードする遺伝子を有しないので、ＡＭＤ  Ｓはかかる真菌類についての優性マーカーである。それはとりわけ、アスペルギルス・ニゲール（Aspergillus niger)、アスペルギルス・ニゲール・バール・チュービゲネシス（Aspergillus niger var.tubigensis）、アスペルギルス・バール・アワモリ（Aspergillus var.awamori)、アスペルギルス・フェティダス（Aspergillus foetidus)、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・スブドウィー（Aspergillus svdowii)、アスペルギルス・ヤポニカス（Aspergillus japonicas)、アスペルギルス・アクレトゥス（Aspergillus aculeatus)、ペニシリウム属（Penicillum）、トリコデルマ属（Trichoderma）においてそれ自体用いられてきた(KellyおよびHynes1985、およびBaileyら1991)。ｃａｎ１突然変異体、すなわち、陰性表現型を用いた選択は、カナバニン耐性に基いて起こり得、ここにカナバニンはアルギニン類縁体である。ＣＡＮ  １＋、すなわち、陽性表現型についての選択は、アルギニンに基いて起こり得る(Ekwall K.1991)。オロチジン５’−Ｐ−デカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、ｐｙｒＡ、ｐｙｒＧまたはｕｒａ３として知られている。それは例えば、
アスパルギルス属（Aspergillus）、トリコデルマ属（Trichoderma）、ペニシリウム属（Penicillum）、フサリウム属（Fusarium）、サッカロミセス属（Saccharomyces）およびクリベロシセス属（Kluyveromyces）の種々の生物について見出されてきた。ｐｙｒＡ突然変異体、すなわち、陰性表現型を用いる選択はまた、ｐｙｒＧまたはｕｒａ３としても記載され、フルオロオロチニ酸耐性に基いて起こり得る。ＰＹＲ  Ａ＋およびその相同体、すなわち、陽性表現型についての選択は、ウリジンまたはウラシルの原栄養性に基いて成し得る。実施例において、アスペルギルス・ニゲール（Aspergillus niger)からのｐｒｙＡ(Wilsonら1988)が本発明の実施可能な態様で示されている。他の例も当業者に知られ、容易に文献中で見い出すことができる。用いられる選択マーカーは、突然変異させるホスト生物、および選択性、信頼性ならびになかでも使用される基質のコストのごとき他の二次的な考慮に依存する。
【００１８】
また、形質転換ベクターまたは発現ベクターに組み込まれた核酸カセットも、本発明の範囲に含まれる。また、形質転換法および選択法におけるかかる核酸カセットまたはベクターの適用も含まれる。特に、代謝の所定の部分に関与する酵素の過剰発現を呈する突然変異体を作出する方法、代謝の所定の部分に関与する酵素の発現の減少または阻害を呈する突然変異体を作出する方法、および代謝の所定の部分に関与する調節遺伝子を測定および単離する方法における適用である。
【００１９】
かくして、微生物の突然変異株の調製および選択する方法、該突然変異は、非変異誘発株と比較して代謝の所定の部分を増強し、該方法は、
−前記請求項のいずれか１項による核酸カセットをホストに導入し、
該ホストは該核酸カセットの導入に先立って二方向性マーカーの発現に関連する表現型を呈さず、
−得られた微生物を、該核酸カセットに含まれたエンハンサーまたはアクチベーター配列が正常に作動する条件下であって、二方向性マーカーが発現され、好ましくは該二方向マーカーの発現が増殖に連結された、および非発現が非増殖に連結された条件下で培養し、
−前記培養条件下で二方向性マーカー遺伝子の発現に対応する表現型を呈する形質転換体を選択し、
−選択された形質転換体に自体公知の方法で突然変異に付しし、
−得られた株を二方向性マーカーの発現に対応する表現型を持つ株に許容される条件下であって、二方向性マーカーの非発現の結果となる、該核酸カセットを含む非突然変異親における条件下、および代謝の所定の部分についての代謝可能な基質の存在下で培養し、
−突然変異誘発に続く培養工程から得られた、二方向性マーカー遺伝子の発現に対応する表現型を呈する株を、本発明の範囲内にある二方向性マーカーの非発現の結果となる核酸カセットを含む非突然変異親のための選択条件下で選択する
ことを含む。
【００２０】
この方法の適当な態様において、
−誘導性エンハンサーまたはアクチベーター配列は、遺伝子ｘｌｎＡに由来する上流活性化配列（ＵＡＳ）であり、
−代謝の所定の部分が、炭素代謝のキシラン分解部分であり、
−得られた微生物をエンハンサーまたはアクチベーター配列が正常に作動し、二方向性マーカーが発現する条件下で培養する培養工程が、ＵＡＳのインデューサーの存在下であってＵＡＳのリプレッサーおよび代謝可能な炭素源の不在下での培養を含み、
−二方向性マーカー遺伝子の発現に対応する表現型を呈する形質転換体の選択が前記した培養条件下で生じる
−選択された形質転換体の突然変異誘発後の培養工程が、二方向性マーカーの発現に対応する表現型を持つ株に許容される条件下であって、二方向性マーカーが非発現の結果となる核酸カセットを含む非突然変異親における条件下、すなわち、ＵＡＳのリプレッサーの存在下であって代謝可能な炭素源の存在下かつ所望によりＵＡＳのインデューサーの存在下でも起こり、
−二方向性マーカー遺伝子の発現に対応する表現型を呈する株の突然変異誘発に続く培養工程かリプレッサーから得られた株の選択が、二方向性マーカーの非発現の結果を導く核酸カセットを含む非突然変異親のための選択条件下で起こる。
【００２１】
この方法のさらなる態様において、
−該核酸カセットは、二方向マーカーｐｙｒＡをコードする核酸配列を含み、
−該ホストは、該核酸カセットの導入に先立って、二方向性マーカーの発現に関連するｐｙｒＡ＋表現型を呈さず、
−得られた微生物をエンハンサーまたはアクチベーター配列が正常に作動し、二方向性マーカーが発現される条件下で培養する培養工程が、エンハンサーまたはアクチベーターが正常に作動する条件下、すなわち、エンハンサーまたはアクチベーターのインデューサーの存在下であってエンハンサーまたはアクチベーターのリプレッサーの不存在下、かつ二方向性マーカーが発現される条件下で培養することを含み、
−二方向性マーカー遺伝子の発現に対応する表現型を呈する形質転換体の選択が前記培養条件下で起こり、
−選択された形質転換体の突然変異誘発後の培養工程が、二方向性マーカーの発現に対応する表現型を持つ株に許容される条件下であって、二方向性マーカーが非発現の結果となる核酸カセットを含む非突然変異親における条件下、すなわち、エンハンサーまたはアクチベーターのインデューサーの不在下、またはエンハンサーまたはアクチベーターのリプレッサーの存在下、かつ代謝の所定の部分についての代謝可能な基質の存在下で起こり、
−二方向性マーカー遺伝子の発現に対応する表現型を呈する株の突然変異誘発に続く培養工程から得られた株の選択が、二方向性マーカーの非発現の結果となる核酸カセットを含む非突然変異親につての選択条件下、すなわち、エンハンサーまたはアクチベーターのインデューサーの不在下、またはエンハンサーまたはアクチベーターのリプレッサーの存在下で起こる。
【００２２】
適当には前記の適した態様はさらに
−核酸カセットが二方向性マーカーｐｙｒＡをコードする核酸配列を含み、
−該ホストは該核酸カセットの導入に先立って二方向性マーカーの発現に関連するｐｙｒＡ＋表現型を呈さず、
−誘導性エンハンサーまたはアクチベーター配列が遺伝子ｘｌｎＡに由来するＵＡＳであり、
−得られた微生物がエンハンサーまたはアクチベーター配列が正常に作動し、二方向性マーカーが発現される条件下で培養される培養工程が、ＵＡＳが正常に作動する条件下、すなわち、キシロースまたはキシランのごときＵＡＳのインデューサーの存在下であって、ＵＡＳのリプレッサーの不存在下、すなわち、グルコースの不在下、および二方向性マーカーが発現される条件下での培養を含み、
−二方向性マーカー遺伝子の発現に対応する表現型を呈する形質転換体の選択が、前記培養条件下で起こり、
−選択された形質転換体の突然変異誘発後の培養工程が、二方向性マーカーの発現に対応する表現型を持つ株に許容される条件下であって、二方向性マーカーが非発現の結果となる核酸カセットを含む非突然変異親における条件下、すなわち、キシロースまたはキシランのごときＵＡＳのインデューサーの不在下、またはＵＡＳのリプレッサーの存在下、すなわち、グルコースの存在下、および代謝可能な炭素源の存在下で起こり、
−二方向性マーカー遺伝子の発現に対応する表現型を呈する株の突然変異誘発に続く培養工程から得られた株の選択が、二方向性マーカーが非発現の結果となる核酸カセットを含む非突然変異親についての選択条件下、すなわち、キシロースまたはキシランのごときＵＡＳのインデューサーの不存在下、またはＵＡＳのリプレッサーの存在下、すなわち、グルコースの存在下で起こる
によって特徴付けられる。
【００２３】
さらに、微生物の非組み換え突然変異株を調製および選択する方法、非突然変異株と比較して代謝の所定の部分を増強する該突然変異は、本発明の好ましい範囲内である。この方法は、先の段落に記載したごとく、本発明の方法の工程を実施し、続いて、導入された核酸カセットの核酸を自体公知の方法で交差させることよりなる。
【００２４】
従前に示したごとく微生物の突然変異株を調製および選択する方法、該突然変異は非突然変異誘発株と比較して、炭素代謝の所定の部分を阻害し、該方法は、
−前記したごとく本発明の核酸カセットをホストに導入し、
該ホストは、核酸カセットの導入に先立って二方向性マーカーの発現に関連する表現型を呈さず、該ホストは代謝の所定の部分を特徴付けるタイプの低下したまたは阻害された活性を呈し、
−得られた微生物を、核酸カセットのエンハンサーまたはアクチベーター配列が正常に作動し、核酸カセットの二方向性マーカーの非発現が、得られた微生物の増殖および検出の結果となり、該二方向性マーカーの発現が好ましくは致死的であるかるいは強力に増殖を阻害する条件下で培養し、
−前記培養条件の下で、二方向性マーカー遺伝子の発現に対応する表現型を呈する形質転換体を選択し、
−選択された形質転換体に自体公知の方法で突然変異誘発に付し、
−突然変異誘発から得られた株を二方向性マーカーの非発現に対応する表現型を持つ株の増殖に許容される条件下であって、代謝可能な基質の存在下、かつ核酸カセットを含むまたは含まないいずれかの非突然変異ホストと比較して、代謝の所定の部分の低下したまたは阻害された活性を示す条件下で培養し、
−代謝の所定の部分の低下したまたは阻害された活性に対応する表現型を示す、突然変異誘発に続く培養工程から得られた株を、それに対する活性が低下または阻害されるべき、代謝の部分についての基質として働く基質上での増殖に基づく清澄ゾーンの減少のごとき、核酸カセットを含むまたは含まない非突然変異ホストと比較して、代謝の所定の部分の低下したまたは阻害された活性を示す選択条件下で選択すること
からなる。
【００２５】
かかる方法のさらなる態様において
−誘導性エンハンサーまたはアクチベーター配列は、遺伝子ｘｌｎＡに由来する上流活性化配列（ＵＡＳ）であり、
−代謝の所定の部分は、炭素代謝のキシラン分解部分であり、
−得られた微生物が、エンハンサーまたはアクチベーター配列が正常に作動し、二方向性マーカーが発現される条件下で培養される培養工程が、核酸カセットのＵＡＳのリプレッサーの不在下、代謝可能な炭素源の存在下、およびまた好ましくはＵＡＳのインデューサーの存在下での培養を含み、
−二方向性マーカー遺伝子の発現に対応する表現型を呈する形質転換体の選択が、前記培養条件下で起こり、
−選択された形質転換体の突然変異誘発後の培養工程が、二方向性マーカーの非発現に対応する表現型を持つ株の増殖および検出に許容される条件下、二方向性マーカーの発現に対応する表現型を持つ株の増殖および検出に許容されない条件下、すなわち、ウリジンおよびフルオロオロチン酸の存在下であって、炭素代謝の所定の部分の活性の結果となる核酸カセットを含む非突然変異親についての条件下、すなわち、ＵＡＳのインデューサーおよび代謝可能な炭素源の存在下、およびＵＡＳのリプレッサーの不在下、例えばソルビトール、またはインデューサー様キシランもしくはＤ−キシロースと組み合わせた別の非抑制炭素源の存在下で起こり、
−突然変異誘発に続く培養から得られた、炭素代謝の所定の部分の低下したまたは阻害された活性に対応する表現型を呈する株の選択が、キシラン上での増殖に際しての清澄ゾーンの減少のごとき、核酸カセットを含むまたは含まないいずれかの非突然変異体ホストに比較して、炭素代謝の所定の部分の低下したまたは阻害された活性を示す選択条件下で起こる。
【００２６】
先の段落による方法の例が提供され、ここに、
−該核酸カセットは二方向性マーカーｐｙｒＡをコードする核酸配列を含み、
−該ホストは該核酸カセットの導入に先立って二方向性マーカーの発現と関連するＰＹＲＡ＋を表現型を呈さず、
−得られた微生物が、エンハンサーまたはアクチベーター配列が正常に作動し、二方向性マーカーｐｙｒＡが発現される条件下で、培養される培養工程は、エンハンサーまたはアクチベーターのインデューサーの存在下であって、エンハンサーまたはアクチベーターのリプレッサーの不在下、および二方向性マーカーｐｙｒＡが発現される条件下での培養を含み、
−二方向性マーカー遺伝子ｐｙｒＡの発現に対応する表現型を呈する形質転換体の選択は、前記培養条件下で起こり、
−選択された形質転換体の突然変異誘発後の培養工程は、二方向性マーカーの非発現に対応する表現型、すなわちＰＹＲＡ−表現型を持つ株の増殖および検出に許容される条件下、ＰＹＲＡ＋表現型を持つ株の増殖および検出に許容されない条件下、かかる表現型は、二方向性マーカーの発現、すなわちウリジンおよびフルオロオロチン酸の存在を含むかかる条件に対応し、および代謝の所定の部分の活性結果となる核酸カセットを含む非突然変異親についての条件下、すなわちエンハンサーまたはアクチベーターのインデューサーおよび代謝可能な基質の存在下であって、アクチベーターまたはエンハンサーのリプレッサー、またはインデューサーと組み合わせた別の非抑制基質の不在下で起こる。
【００２７】
好ましい態様において、２段落前による本方法はさらに、
−該核酸カセットが二方向性マーカーｐｙｒＡをコードする核酸配列を含み、
−該ホストは該核酸カセットの導入に先立って二方向性マーカーの発現に関連したＰＹＲＡ＋表現型を呈さず、
−誘導性エンハンサーまたはアクチベーター配列は遺伝子ｘｌｎＡに由来するＵＡＳであり、
−得られた微生物が−エンハンサーまたはアクチベーター配列が正常に作動し、二方向性マーカーｐｙｒＡが発現される条件下で培養される培養工程が、ＵＡＳが正常に作動する条件下、すなわち、キシロースまたはキシランのごときＵＡＳのインデューサーの存在下であって、ＵＡＳのリプレッサーの不在下、すなわち、グルコースの不在下および二方向性マーカーｐｙｒＡが発現する条件下での培養を含み、
−二方向性マーカー遺伝子ｐｙｒＡの発現に対応する表現型を呈する形質転換体の選択が、前記培養条件下で起こり、
−選択された形質転換体の突然変異誘発後の培養工程が、二方向性マーカーの非発現に対応する表現型、すなわちｐｙｒＡ−表現型を持つ株の増殖および検出に許容される条件下、ＰＹＲＡ＋表現型を持つ株の増殖および検出に許容されない条件下で、かかる表現型は、二方向性マーカーの発現型、すなわちウリジンおよびフルオロオロチン酸の存在を含むかかる条件に対応し、および炭素代謝の所定の部分の活性となる該核酸カセットを含む非突然変異親についての条件下、すなわち、ＵＡＳのインデューサーおよび代謝可能な炭素源の存在下、およびＵＡＳのリプレッサーの不存在下、例えばソルビトールまたは、インデューサー様キシランもしくはＤ−キシロースと組み合わせた別の非抑制炭素源の存在下で起こり、
−突然変異誘発に続く培養工程から得られた、炭素代謝の所定の部分の低下したまたは阻害された活性に対応する表現型を呈する株の選択は、キシラン上での増殖に際しての清澄ゾーン減少のごとき、核酸カセットを含むまたは含まないいずれかの非突然変異誘発ホストと比較して、炭素代謝の所定の部分の低下したまたは阻害された活性を示す選択条件下で起こる
方法である。
【００２８】
前記した方法は該核酸カセットの導入に先立って特徴づけられたホストで有利に実施され、それは少なくとも二方向性マーカーをコードする核酸配列の一部に一致する核酸を含み、該一致は該核酸カセットに含まれる核酸をコードする二方向性マーカーの染色体において相同種組換えさせるに十分な程度である。この態様は、予め決定された位置での該核酸カセットの組込みを確実にする。
【００２９】
さらに好ましい態様において、該核酸カセットは、このままではマーカー陰性表現型およびマーカー陽性表現型数の低下を検出する際に不正確な結果となるので、突然変異に誘発工程が該二方向性マーカーを不活化しないことを保証するために複数コピーにて組込まれるであろう。
【００３０】
本発明の好ましい態様において、核酸カセットは代謝の所定の部分に関与する酵素の過剰発現を呈する突然変異体を作出する方法、代謝の所定の部分に関与する酵素の低下したまたは阻害された発現を呈する突然変異体を作出する方法、および代謝の所定の部分に含まれる調節遺伝子を同定および単離する方法で使用できるように構築された。特に、本発明者らは、炭素代謝における突然変異体のために使用されるごとき系を例示する。実施例において改変されたキシラン分解特性を有する突然変異体、ならびにアラビノース溶菌およびペクチン分解経路における突然変異体につながるアラビナーゼおよびポリガラクチュロナーゼ突然変異体が記載される。実施例において、突然変異させる株としてアスペルギルス属（Aspergillus）が用いられているが、他のいずれの産業的に許容される微生物でも十分である。かかる微生物の例は、サッカロミセス属（Saccaromyces）、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccaromyces cerevisiae）、サッカロミセス・ポンベ（Saccaromyces pombe）、アスペルギルス属（Aspergillus）、例えばアスペルギルス・ニドゥランス（Aspergillus nidulans）、トリコデルマ属（Trichoderma）、ペニシリウム属（Penicillium）、フサリウム属（Fusarium）、クリベロミセス属（Kluvyeromyces）およびレクトバチルス属（Lectobacillus）である。他の例は当業者において自明であり、また多くは本明細書の他所で記載されている。今回、代謝の所定の部分についての過剰発現または発現を無効にする株が作出できた。また、本発明者らは、誘導性エンハンサーまたはアクチベーター配列の活性化レギュレーターの同一特性および核酸配列を決定できた。特に、かかる活性化レギュレーターが代謝に関与する場合、より具体的には、かかる活性化レギュレーターが酵素カスケードまたはフィードバックループまたは複数フィードバックループを有する代謝の部分に関与する場合である。ひき続いて、かかる調節遺伝子の核酸配列を、標的遺伝子の発現を増強するために使用できる。該標的遺伝子とは、調節遺伝子によって調節される遺伝子である。好ましい態様において、かかる標的遺伝子は調節遺伝子の発現生成物に対する結合部位を有するであろう。通常、発現カセットにおいて、レギュレーターの標的遺伝子に関連したプロモーターを該調節遺伝子と組み合わせ、該プロモーターを発現させる同種または異種蛋白質またはペプチドをコードする同種または異種配列に作動可能なように連結して、同種のおよび異種の蛋白質またはペプチドの発現にすら極めて有用な発現カセットとすることができる。レギュレーターをコードする遺伝子は、その天然プロモーターまたは選択したホスト細胞において発現可能ないずれの他のプロモーターの制御下にあり得る。該プロモーターは構成的または誘導性であり、どんなものでも特定の作出工程には最も望ましい。かかるカセットからなるベクターまたはプラスミドがそうであるように、かかる組合せ発現カセットは、本発明の範囲内にある。発現の程度はレギュレーターの存在量が非常に少なくとももはや制限されず、かくして発現させるべき遺伝子の発現の程度は、同一のプロモーターであるが調節遺伝子の付加的存在を持たないプロモーターの制御の下で遺伝子が発現する相当するホスト細胞よりもず��と高くなる。かかる増加した発現は、好ましくは通常、影響されるべき代謝経路の部分の成分を含む生物の細胞において達成される。適当なホスト細胞は糸状菌細胞である。レギュレーターの標的遺伝子を含むホスト細胞において、現に前記したタイプの組合せ発現カセットの組込みは、標的遺伝子の発現の増加、すなわちもし複数標的遺伝子が存在するならば、標的遺伝子の発現の増加につながり得る。好ましくは、該標的遺伝子はホスト細胞にとって内因性であろう。該組合せ発現カセットを含むホスト細胞は、本発明の範囲内にある。
【００３１】
実施例において、キシラン分解経路のｘｙｌＲのレギュレーターの核酸配列ｘｌｎＲが提供されている。このレギュレーターに対する標的遺伝子は、遺伝子ｘｌｎＡ、ｘｌｎＢ、ｘｌｎＣおよびｘｌｎＤならびにａｘｅＡを含むことが判明した。キシラナーゼＡ発現における増加が例示され、これはｘｙｌＲレギュレーターの標的遺伝子に対するｘｙｌＲ作用の一般的な適用性を示すために役立ち得る。多数の配列が当該技術水準で公知であり、それは前記したｘｌｎＡ、Ｂ、ＣおよびＤ遺伝子およびａｘｅＡ遺伝子を含み、かかる情報は当業者ならば容易に入手でき、これらは本明細書の一部であるとみなされる。ｘｌｎＲ核酸と組み合わせて用いられる好ましい注目するプロモーターは、ｘｌｎＡ、ｘｌｎＢ、ｘｌｎｃおよびｘｌｎＤから選択できる。また、ａｘｅＡプロモーターの使用は、本発明の適切な態様をなす。該プロモーターは当業者にとって当該技術水準で公知であり、本明細書の一部とみなされる。該ｘｌｎＡプロモーターはGraaffら1994に記載されている。該ｘｌｎＢプロモーターはKinoshitaら1995によって記載されている。該ｘｌｎＤプロモーターはＥＰ９５２０１７０７．７に記載され、本明細書の配列番号８の配列において配列リストに含まれている。該プロモーター配列は、公知の配列を基にして容易に合成すること、また自体公知の標準法でそれらを含む生物またはベクターから誘導することのいずれかが可能である。プロモーター、エンハンサーまたはレギュレーターなる語は本来用いられ、プロモーター、エンハンサーまはたレギュレーターを含む断片は、かかる実施性が損なわれない限り使用可能である。本発明の構築体では、単なる関連配列の組み込みは必ずしも必要とせず、いずれの隣接する干渉配列も存在しない。本発明によって包含される発現生成物ｘｙｌＲをコードする核酸配列ｘｌｎＲばかりではなく、同等発現生成物および突然変異体発現生成物ならびに本発明の核酸配列自身の発現生成物をコードする配列がある。ｘｙｌＲすなわち本明細書に記載した配列（＝ｘｌｎＲ）をコードするｘｙｌＲのいずれの適用も突然変異体およびかかる突然変異体をコードする核酸配列に対し適用可能であり、それは必要な変更を加えて一部とみなされる。
【００３２】
本発明の核酸配列およびカセットの発現のために用いられるのに適した真菌類細胞の例は、アスペルギルス・ニゲール（Aspergillus niger）、アスペルギルス・トゥービゲンシス（Aspergillus tubiegensis）、アスペルギルス・アクレトゥス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ニドゥランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・カルボナリウム（Aspergillus carbonarium）、アスペルギルス・フェティダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、アスペルギルス・シドウィー（Aspergillus sydowii）、アスペルギルス・カワチー（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・ヤポニカス（Aspergillus japonicus）のごときアスペルギルス属およびトリコデルマ属、ペニシリウム属ならびにフザリウム属の種である。また植物細胞のごとき他の細胞も実施可能なホスト細胞であり、また本明細書の他所で別のホスト細胞についても記載されている。
【００３３】
本発明の発現カセットを用いた発現のための、また本発明の核酸配列との組み合わせにおいて特に興味深い遺伝子は、酵素をコードする遺伝子である。発現のための適した遺伝子は、キシラナーゼ、グルカナーゼ、ヘキソースオキシダーゼのごとき酸化還元酵素、α−グルクロニダーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、フェルラ酸エステラーゼおよびプロテアーゼをコードする遺伝子である。これらは所望の発現生成物例を限定するものではない。前記した遺伝子を含む多くの配列が当該分野で公知であり、かかる情報は当業者ならば容易に入手でき、これらも本明細書の一部とみなされる。該遺伝子は文献またはデータベースにおいて公知の配列を基にして容易に合成するか、または自体に公知の標準法にてそれらを含む生物またはベクターから誘導するかのいずれかが可能であり、それは当業者ならばさらなる説明を必要とせずに容易に利用できる知見であると考えられる。
【００３４】
配列番号９に従うｘｙｌＲのアミノ酸配列と８０％−１００％の一致を示す発現生成物、または配列番号９（９４８のヌクレオチド由来）のｘｌｎＲの核酸配列によりコードされたごとき発現生成物は、本発明のキシラナーゼレギュレーター（ｘｙｌＲ）の同等発現生成物であるとみなされ、従って本発明の範囲内にある。該同等発現生成物は、ＤＮＡ結合活性を有するはずである。好ましくは、該発現生成物は標的遺伝子の核酸と結合するはずなので、かかるＤＮＡ結合活性は、該発現生成物が配列番号９で提供されたアミノ酸配列に結合するのと同等またはそれ以上になる。結合活性を決定するために好ましい標的遺伝子は、ｘｙｌＡ、ｘｙｌＢ、ｘｙｌＣおよびｘｙｎＤをコードする遺伝子、すなわち、ｘｌｎＡ、ｘｌｎＢ、ｘｌｎＣおよびｘｌｎＤ遺伝子である。
【００３５】
また、ｘｌｎＲ遺伝子発現生成物ｘｙｌＲの突然変異体および少なくとも同程度の標的結合活性を維持している配列番号９に従う核酸配列ｘｌｎＲコードも請求される。同等発現生成物の定義内にあるとみなされる突然変異体は、配列番号９に従うアミノ酸配列に比してアミノ酸変化を有する特定の突然変異体を含む。かかる同等体はそれらをコードする核酸配列なので、本発明の適した態様とみなされる。１−１５個のアミノ酸置換を有する突然変異体が適切であり、例えば、１−５個のアミノ酸置換もまた同等発現生成物を形成する本発明の特に適した態様をなすとみなされる。特定のアミノ酸の同種の他のアミノ酸での置換はそのペプチド活性に顕著な影響を及ぼさないということは、当業者にとって一般的な知見である。水治療法(hydropathy)の側面を基礎として、当業者はその置換が実施可能であることを認識しているであろう。例えば、疎水性アミノ酸の他の疎水性アミノ酸による置換および、疎水性アミノ酸の他の親水性アミノ酸による置換は、本発明の適した実施例である発現生成物が結果として生じるであろう。かかる置換は同等なる語の下に、本発明の範囲によって包含されるとみなされる。配列番号９に従う核酸配列コードにおける点突然変異の結果、本発明の範囲内にある核酸配列が生じると考えられる。かかる点突然変異の結果、アミノ酸レベルでのサイレント突然変異または前記したごとき置換突然変異体が生じ得る。また置換突然変異も本発明によって包含され、ここで置換はいずれのタイプについても可能である。好ましくは突然変異体の一致は配列番号９に従うアミノ酸配列に比し８５−１００％であり、より好ましくは９０−１００％であり、最も好ましくは９５−１００％である。配列番号９に従うアミノ酸配列と８０−１００％の一致を示す、すでに前記で請求したアミノ酸配列は、同等なる語により包含されるので、アミノ酸配列の２０％まで欠失および／または置換が、好ましくは１５％より少ない、より好ましくは１０％より少ない、最も好ましくは５％より少ない本発明のアミノ酸配列が含有される。かかる突然変異体は１以上のアミノ酸配列部分において欠失および／または置換を含む。しかしながら、かかる欠失および／または置換突然変異体は、亜鉛フィンガー結合部位に対応するアミノ酸配列およびＲＲＲＬＷＷモチーフに対応するアミノ酸配列を含むであろう。１−５個のアミノ酸欠失突然変異体は本発明の範囲内にあるとみなされる。５個より多いアミノ酸欠失および／または５個より多い置換および／または点突然変異を有する欠失突然変異もＤＮＡ結合活性を維持し得る。好ましくは、かかるより多数の欠失および／または置換および／または点突然変異は、該アミノ酸配列のおよび該核酸配列のコードに対応する部分のＮ末端半分において生じる。調節および活性化に関わると考えられる最も重要な領域は、亜鉛フィンガー結合領域由来の該アミノ酸配列のＣ末端半分に存在し、欠失突然変異体それ自体は好ましくは、少なくともこのアミノ酸配列部分を含む。好ましくは、ヌクレオチド１１１０ないし１２６０位のヌクレオチド由来の配列番号９でコードされたものに対応する亜鉛フィンガー結合領域に突然変異が存在しないことであろう。もし突然変異が存在する場合は、好ましくは、それは亜鉛に配位する６個のシステイン間のスペーシングを含むべきではなく、最も好ましくは、いずれの突然変異も６個のシステインそれ自身のいずれをも含むべきではない。さらに好ましくは、配列番号９に従うアミノ酸配列に存在するＲＲＲＬＷＷモチーフに突然変異が存在しないことである。欠失はアミノ酸配列の１以上の断片で起こってもよい。しかしながら、かかる欠失突然変異体は亜鉛フィンガー結合領域に対応するアミノ酸配列およびＲＲＲＬＷＷモチーフに対応するアミノ酸配列を含む。１−１５個のアミノ酸の欠失、好ましくは１−１０個のアミノ酸の欠失、最も好ましくは１−５個のアミノ酸の欠失は、同等性を保証する適当した態様である。
【００３６】
同等核酸配列の態様は、配列番号９に従うｘｙｌＲのごとき、または配列番号９に従うｘｌｎＲの核酸配列によってコードされるごとき同一のアミノ酸配列を有する発現生成物コードする核酸配列である。配列番号９に従うｘｙｌＲのアミノ酸配列と８０−１００％の一致を示す発現生成物をコードする核酸配列、または配列番号９に従うｘｙｌＲをコードする核酸配列によってコードされたごとき核酸配列もまた、ｘｌｎＲの同等核酸配列であるとみなされ、これも本発明の範囲内にある。本発明の同等核酸配列のもう一つの態様は、核酸配列番号９から誘導されたプライマーまたはプローブに対して実施例で定義したごとき特異的最小ストリンジェンシィー条件の下でハイブリッド形成可能な核酸配列であり、該プライマーまたはプローブは非亜鉛フィンガー結合領域から誘導され、該プライマーまたはプローブは少なくとも２０個のヌクレオチドの長さを有している。一般的にプローブおよびプライマーに適した長さは２０−６０個のヌクレオチドの間であり、好ましくは２５−６０個である。好ましくは、プローブまたはプライマーは、該Ｚｉｎｃフィンガー結合領域由来の配列番号９に従う半分をコードするＣ−末端から誘導される。本発明の核酸配列の好ましい態様は、核酸配列番号９に対する実施例で例示された、少なくともストリンジェントの特異的条件の下でハイブリッド形成が可能であろう。同等核酸配列は、例えば、前記したごとき核酸配列番号９に基づくプライマーを用いるＰＣＲによって他の生物から誘導できよう。また、現に定義したごとき同等核酸配列の発現生成物も本発明の範囲内にあるとみなされる。逆にまた、本発明の同等アミノ酸配列をコードする核酸配列も同等核酸配列なる語の範囲内であるとみなされる。特に、同等核酸配列および糸状菌および植物から誘導可能なかかる配列の発現生成物は、本発明の好ましい態様である。好ましくは、同等核酸配列は１１１０ないし１２６０位からのヌクレオチド由来の配列番号９でコードされたものに対応する亜鉛フィンガー結合領域をコードする核酸配列を含むであろう。好ましい態様において、該同等核酸配列は亜鉛に配位する６個のシステインをコードするはずである。さらなる態様において、システイン間のスペーシングが配列番号９に従うそれに対応するはずである。
【００３７】
また、前記した同等核酸配列および発現生成物の種々の態様の特性の組み合わせからなる態様も本発明の範囲内にある。また、該亜鉛フィンガー結合ドメインにおける突然変異を有する突然変異体も、ＤＮＡ結合の増加を示し得るので請求される。また、ＤＮＡ結合の減少を示す突然変異体も、本発明の範囲内にあるとみなされる。かかる突然変異体は該Ｚｉｎｃフィンガー結合ドメインに突然変異を有するかもしれない。特に、配列番号９にて提供されたアミノ酸配列の突然変異体を請求する。
【００３８】
また、少なくとも１５個のヌクレオチドの配列番号９に従う核酸配列の断片も、本発明の範囲内にある。かかる断片は同等配列を検出および単離するためにプローブまたはプライマーとして使用できる。特に、２個以上のかかる断片の組み合わせが、かかる同等配列を検出するおよび／または単離するためのキットにおいて有用であり得る。好ましくは、断片は配列番号９に従うアミノ酸配列のＣ末端半分から誘導されよう。適したキットの態様において、一つの断片は該亜鉛フィンガードメインを形成する核酸配列の一部からなるのではない。実施例において、プライマーとして使用される断片の適した組み合わせを例示した。これらのプライマーとともに実施例に例示したごとき、ＰＣＲを介して得られたいずれの配列も、本発明の範囲内にあるとみなされる。実施例で用いられたハイブリッド形成条件は、選択のために必要な最小ストリンジェンシィーを提供する。さらなるストリンジェンシィー条件は、配列番号９で得られた配列の相同性を高めるために、Sambrookらによって記載されたストリンジェントハイブリッド形成条件のごときを適用できる。一般的により低い塩濃度はよりストリンジェントな条件を意味する。また、完全配列の標的遺伝子結合活性を示すポリペプチドである、またはそれをコードする配列番号９に従う配列断片はいずれも、ハイブリッド形成および／または突然変異および／または完全配列に対する遺伝的コードの同義性の点で、前記に定義されたごときに定義された同等性をもって同等核酸配列またはそのアミノ酸配列であるとして、本発明の範囲内に含まれる。
【００３９】
また、前記したごときｘｙｌＲまたはその同等配列をコードする核酸配列を含むベクターまたはプラスミドも、かかる配列を含むベクターまたはプラスミドおよびかかる付加的配列を含むホスト細胞をなすので、本発明の範囲内にある。配列番号９またはその同等体の核酸配列をコードする少なくとも一つの付加的コピーを運ぶ微生物または植物細胞のごとき、形質転換されたホスト細胞は、本発明の範囲内にある。好ましくは、種々の態様は体系づけられ、該配列はベクター、プラスミドまたはホスト細胞で発現可能である。該調節遺伝子は完全な配列番号９または単にその配列コードをホスト細胞で作動可能な別のプロモーターと組み合わせて含み得る。ホスト細胞の適切な例は、本明細書の他所で提供した。配列番号９に従う配列コードを組み込み得る種々のホスト細胞のための適切で作動可能なプロモーターは当業者には明らかであろう。特に、本明細書に明確に記載したホスト細胞に対する構成的プロモーターまたは誘導可能なプロモーターは公知であり、過度の負担無く本発明の研究に利用できる。
【００４０】
同種または異種蛋白質あるいはペプチドの生産のための工程が提供され、該工程はホスト細胞において同種蛋白質またはペプチドをコードする核酸配列の発現からなり、該ホスト細胞はさらにｘｌｎＲまたはそれもまた発現されるその同等体のごとき調節遺伝子をコードする核酸配列の付加的コピーからなる。現に記載したごとき工程は、好ましくは、組合せ核酸発現カセットを用いて実施され、これは第一のプロモーターに作動可能なように連結された調節遺伝子を含み、該カセットはさらに第二のプロモーターを含み、該第二のプロモーターは通常該レギュレーターの標的遺伝子と関連づけられ、該標的遺伝子プロモーターは発現する同種または異種蛋白質あるいはペプチドですらコードする核酸配列に作動可能なように連結される。第一のプロモーターは該調節遺伝子と本質的に関連づけられたプロモーターであり得るが、またホスト細胞において作動可能なように選択されたプロモーターであってもよい。発現の程度は、レギュレーターが非常に少量しか存在しなくとももはや制限されず、かくして発現すべき遺伝子の発現の程度は、調節遺伝子の付加的な存在を持たずに遺伝子が発現するホスト細胞に比して、ずっと高くなる。かかる発現の増加は、好ましくは、通常、影響する代謝経路の部分の成分を含む生物の細胞において達成される。適したホスト細胞は植物細胞または微生物である。適切には、該微生物は真菌類であり得、特にそれは糸状菌であり得る。適したホスト細胞の例は、本明細書の他所に与えられ、これも本明細書の一部とみなされてよい。レギュレーターの標的遺伝子を含むホスト細胞において、現に前記した種の組み合わせ発現カセットの組み込みは、標的遺伝子の発現の増加すなわち、複数標的遺伝子が存在すれば、標的遺伝子の発現の増加につながる。好ましくは、該標的遺伝子は該レギュレーターに本来備わっている。好ましくは、かかる標的遺伝子は該ホスト細胞にとって内因性である。実施例において、キシラン分解経路ｘｌｎＲのレギュレーターの核酸配列を提供した。このレギュレーターについて本来備わっている標的遺伝子は、遺伝子ｘｌｎＡ、ｘｌｎＢ、ｘｌｎＣおよびｘｌｎＤならびにａｘｅＡを含むことが判明し、これらの遺伝子それ自身は好ましくは標的遺伝子である。他の標的も存在し、それも標的遺伝子なる語に含められるとみなされる。本発明のホスト細胞についての種々の態様が、本請求に包含される。もし調節配列および標的遺伝子の双方が該ホスト細胞に本来存在していれば、該調節配列は複数コピー中に存在することになる。かかる微生物は自然の微生物に比して、該標的遺伝子プロモーターによって調節された遺伝子を過剰に発現するであろう。
【００４１】
今、キシラナーゼレギュレーターについての配列が知られているので、キシラナーゼレギュレーターをノックアウトできるようになった。ひとたびノックアウトされるべき遺伝子の核酸配列が公知となれば、ノックアウトホスト細胞の作出は標準的な技術となる。この方法はBerkaら(1990)およびＥＰ９５２０１７０７．７の実施例１１（これは、そのコピーが本文書を提出する際に含まれ、その実施例自身も実施例として本明細書にコピーされた、同時係属欧州特許出願である。）において記載された方法に類似して実施できる。かかるノックアウトはキシラン分解活性をなくし得たホスト細胞を与える。ｘｌｎＲ遺伝子のノックアウトのためにキシラン分解活性をなくしたホスト細胞は、キシラン分解活性が無いことを選択する同種または異種発現生成物を生産するために使用できる。ノックアウトされたｘｌｎＲ遺伝子を有するホスト細胞は、本発明の範囲内にある。かかるホスト細胞は好ましくは、植物細胞または糸状菌である。かかる糸状菌は好ましくは、Aspergillusである。多くの適したホスト細胞における実施例は、本明細書の他所で提供された。
【００４２】
本発明の選択および突然変異誘発法用いて到達し得る調節遺伝子における突然変異を有するホスト細胞は、該調節遺伝子の正常な活性を持つコピーで補足を受け得る。かかる補足された株は次いで、該レギュレーターによって調節されるいずれの標的遺伝子の産物も発現するであろう。これらの標的遺伝子産物は、補足を受けないレギュレーター陰性突然変異体の場合においては存在しないであろう。両株からそれ自身公知の方法で得られた蛋白質バンドを比較すれば、いずれの標的遺伝子が該レギュレーターによって調節されるかが明らかになるであろうし、ひとたびその発現生成物が同定されれば、次いで、自体公知の方法でそれに対応する新規標的遺伝子が同定できる。この方法において、既に知られているもの以外の他の標的遺伝子を、即時の実施例においてキシラナーゼレギュレーターｘｙｌＲに対して見いだすことができる。
【実施例】
【００４３】
実施例１：プラスミドの構築
実施例１．１：選択プラスミドｐＩＭ１３０の構築
選択プラスミドｐＩＭＩ３０は図１に示したごとくに構築した。ＰＣＲ１にて、オリゴヌクレオチド１（配列番号：１）
５’ＣＡＣＡＡＴＧＣＡＴＣＣＣＣＴＴＴＡＴＣＣＧＣＣＴＧＣＣＧＴ−３’（式１）
およびオリゴヌクレオチドＡ（配列番号：２）
５’−ＣＡＡＴＴＧＣＧＡＣＴＴＧＧＡＧＧＡＣＡＴＧＡＴＧＧＧＣＡＧＡＴＧＡＧＧＧ−３’（式２）
を用いて、プラスミドｐＩＭ１２０(de Graaffら、1994)から断片を生じさせた。オリゴヌクレオチド１はAspergillus tubigensis  ｘｌｎＡプロモーター(de Graaffら、1994)から誘導し、６００−６１９位（配列番号：５）にＮｓｉＩ部位を含む１０個のヌクレオチドを付加した。オリゴヌクレオチドＡの３’末端は、転写開始部位（７０８−７２３位）（配列番号：６）の直前で終わる、Aspergillus niger  ｇｏｘＣ転写ユニット(Whittingtonら、1990)から誘導し、一方５’末端は、転写開始部位で始まる（３４１ないし３５９、配列番号：７）A.niger  ｐｙｒＡ遺伝子の暗号領域から誘導した(Wilsonら、1988)。
【００４４】
断片Ａは、最終容量１００μｌ中に１０μｌ＊反応緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％ゼラチン）、１．２５ｍＭの４種のデオキシヌクレオチド三リン酸各々１６μｌ、プラスミドｐＩＭ１２０  ＤＮＡ１ｎｇ、オリゴヌクレオチド１およびＡ各々１μｇを含むＰＣＲによって生じさせた。この反応混合液を混合し、１μｌのＴＡＱポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）（Life Technologies)を添加した。該ＤＮＡを９２℃３分間のインキュベーション、次いで９２℃１分、４８℃１分、７２℃１分の２５サイクルによって変性させた。２５サイクル後、混合液を７２℃で５分間インキュベートした。アガロース電気泳動による該反応生成物の分析は、約２５０ｂｐの断片を明らかにし、これは該遺伝子の配列を基に推定されたサイズに一致する。
【００４５】
ＰＣＲ２にて、オリゴヌクレオチド２（配列番号：３）
５’−ＡＧＡＧＡＧＧＡＴＡＴＣＧＡＴＧＴＧＧＧ−３’（式３）
およびオリゴヌクレオチドＢ（配列番号：４）
５’−ＣＣＣＴＣＡＴＣＴＧＣＣＣＡＴＣＡＴＧＴＣＣＴＣＣＡＡＧＴＣＧＣＡＡＴＴＧ−３’（式４）
を用いて、プラスミドｐＧＷ６３５(Goosenら、1987)から断片を生じさせた。オリゴヌクレオチドＢの５’末端は、A.niger  ｇｏｘＣ基本転写ユニット（７０８−７２３位、配列番号：６）（Whittingtonら、1990）から誘導し、一方、３’末端は転写開始部位で始まるA.niger  ｐｙｒＡ遺伝子の暗号領域から誘導した。オリゴヌクレオチド２はｐｙｒＡ暗号領域（３３９−３５９位、配列番号：７）から誘導し、６０２位（配列番号：７）にてＥｃｏＲＶ制限部位をつないだ。
【００４６】
断片Ｂは、この場合においては反応混合液にオリゴヌクレオチド２およびＢを各々１μｇ、ならびにプラスミドｐＧＷ６３５ＤＮＡ１ｎｇを含んだ以外は、断片Ａと同一の方法で生じさせた。アガロース電気泳動による反応生成物の分析は、約２５０ｂｐの断片を明らかにし、これはｐｙｒＡ遺伝子の配列を基に推定されたサイズに一致する。
【００４７】
電気泳動後、断片ＡおよびＢをアガロースゲルから単離した。該断片をアガロースゲルから切り取り、その後ＩＳＣＯカップを用いた電気溶出によりアガロース片からそれらを回収した。このカップの大および小容器双方に透析膜を設置し、該カップを０．００５×ＴＡＥ（１０００ｍｌにつき５０×ＴＡＥ緩衝液：２４２．０ｇトリズマベース（Sigma）、７．１ｍｌ氷酢酸、１００ｍｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）で満たし、カップの大容器中にアガロース片を置いた。次いで、１＊ＴＡＥを含む陽極チャンバーに大容器、１＊ＴＡＥ／３Ｍ  ＮａＡｃを含んだ陰極に小容器として、カップを電気溶出装置に置いた。断片を１００Ｖで１時間電気溶出した。この期間の後、カップを電気溶出装置から取り出し、大容器から緩衝液を除去し、他方、小容器からは緩衝液は上部からのみ除去した。ＤＮＡ断片を含む残りの緩衝液（２００μｌ）をカップ中で蒸留水に対し３０分間透析した。最終的にＤＮＡは、０．１容量の３Ｍ  ＮａＡｃ、ｐＨ５．６および２容量の冷（−２０℃）エタノールの添加により沈殿させた。ＤＮＡを４℃にて１４，０００×ｇで３０分間の遠心分離（エッペンドルフ遠心機）によって集めた。上清を除去した後、ＤＮＡペレットをSavant Speedvac真空遠心機を用いて乾燥させた。ＤＮＡを１０μｌのＴＥ緩衝液（ＴＥ：１０ｍＭトリス／ＨＣｌ  ｐＨ７．２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）に溶解させ、標準として既知濃度のラムダＤＮＡおよびＤＮＡ検出のためのエチジウムブロマイド染色を用いて、該濃縮液をアガロースゲル電気泳動によって同定した。
【００４８】
断片ＡおよびＢは、この場合においては反応混合液にオリゴヌクレオチド１および２を各々１μｇ、ならびに断片ＡおよびＢを各々およそ５０μｇ含んだ以外は、ＰＣＲ１と同一であるＰＣＲ３にて融合させた。アガロースゲル電気泳動による反応生成物の分析は、約５００ｂｐの断片を明らかにし、これは該遺伝子の配列を基に推定されたサイズに一致する。
【００４９】
得られた断片Ｃを記載したごときにアガロースゲルから単離し、次いで制限酵素ＮｓｉＩおよびＥｃｏＲＶを用いて消化した。ＤＮＡを次の溶液からなる反応混合液中で３７℃にて３時間消化させた；５μｌ（≒０．５μｇ）ＤＮＡ溶液；２μｌのおよそ１０×反応緩衝液(Life Technologies)；１０Ｕ反応酵素(Life Technologies)および滅菌蒸留水で最終容量２０μｌにする。消化後、ＤＡＮ断片をアガロースゲル電気泳動によって分析し、次いで記載したごときにゲルから単離した。
【００５０】
ｐＩＭ１３０の最終構築体に対し、５μｇのプラスミドｐＧＷ６３５を、最終容量５００μｌ中５０Ｕの制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩを用いて、記載したごとくに消化した。生成物の分離後、２．２ｋｂ  ＥｃｏＲＶ／ＸｂａＩ断片（断片Ｄ）を電気溶出によってアガロースゲルから単離した。同様に１μｇベクターｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）(Promega)を制限酵素ＮｉｓＩ／ＸｂａＩを用いた消化により調製し、消化後これを電気泳動にかけ、電気溶出によりアガロースゲルから単離した。
【００５１】
プラスミドｐＩＭ１３０を下記の連結反応によって構築した：１００ｎｇ  ｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）ＮｉｓＩ／ＸｂａＩ断片を５０ｎｇ断片Ｃおよび５０ｎｇ断片Ｄおよび４μｌ５＊連結反応緩衝液（成分；５００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６；１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ  ＡＴＰ；１０ｍＭジチオスレイトール；２５％ＰＥＧ−６０００）および１μｌ（１．２Ｕ／μｌ）のＴ４ＤＮＡリガーゼ(Life Technologies)を最終容量２０μｌ中にこの混合液を添加した。１４℃１６時間のインキュベーション後、該混合液を滅菌水で１００μｌに希釈した。該希釈混合液１０μｌを、Sambrookら、1989によって記載されたごときに調製し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）  ＤＨ５ａ感応細胞を形質転換するために使用した。
【００５２】
得られた２つのコロニーをアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（１０００ｍｌ当たりのＬＢ培地：１０ｇトリプチカーゼペプトン（ＢＢＬ）、５ｇ酵母抽出物（ＢＢＬ）、１０ｇＮａＣｌ、０．５ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５）中で一晩増殖させた。培養物からプラスミドＤＮＡをManiatisら(1982)によって記載されたごときアルカリ溶菌法によって単離し、これを所望のプラスミドｐＩＭ１３０をかくまうクローンを選択するための制限酵素分析に用いた。１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で増殖させたｐＩＭ１３０を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）  ＤＨ５ａ培養物５００ｍｌから大スケールでプラスミドＤＮＡを単離した(Maniatisら、1982)。該プラスミドをＣｓＣｌ遠心分離により精製し、フェノール溶菌させ、エタノール沈殿させおよび４００μｌＴＥに溶解させた。収量はおよそ５００μｇであった。
【００５３】
実施例１．２：プラスミドｐＩＭ１３５の構築
プラスミドｐＩＭ１２０から、ｐｙｒＡ暗号領域および末端領域に融合させたｇｏｘＣ基本転写ユニットを含む二次プラスミドを構築した。ＰＣＲ４にて、ＮｓｉＩ部位を含む１０個のヌクレオチドを付加したｇｏｘＣ基本転写ユニット（６４０−６６０位、配列番号：６）から誘導したオリゴヌクレオチド３、
５’−ＣＡＣＡＡＴＧＣＡＴＣＧＴＡＴＡＡＧＴＡＡＣＣＴＣＧＴＴＣＧ−３’（式５）
およびオリゴヌクレオチド２（式３）を用いて、プラスミドｐＩＭ１２０から断片を生じさせた。生じた断片をゲルから単離し、ＮｓｉＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、プラスミドｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）にてｐＧＷ６３５の２．２ｋｂ  ＥｃｏＲＶ／ＸｂａＩ断片とともにクローン化し、これを実施例１．１に記載したごときにＸｂａＩ／ＮｓｉＩで消化して、結果としてプラスミドｐＩＭ１３５を得た。
【００５４】
該プラスミドｐＩＭ１３５は、いずれの所望の誘導可能なエンハンサーまたはアクチベーター配列、代謝を含む遺伝子のＵＡＳも有する、本発明のベクターを調製するための構築伝達体として使用できる。ｐＩＭ１３５は二方向性マーカー遺伝子（ｐｙｒＡ）に作動可能なように連結された基本転写ユニット（ｔＧＯＸ）を含む。
【００５５】
実施例２：プラスミドｐＩＭ１３０を用いたA.nigerの形質転換
Aspergillus最小培地（ＭＭ）（１リットル当たり含量：６．０ｇ  ＮａＮＯ３、１．５ｇ  ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇ  ＫＣｌ、示されたごとき炭素源、ｐＨ６．０および１ｍｌのＶｉｓｈｎｉａｃ溶液（１リットル当たり含量１０ｇ  ＥＤＴＡ、４．４ｇ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．０ｇ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．３２ｇＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．３２ｇ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．２２ｇ（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、１．４７ｇ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１．０ｇ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｐＨ４．０）からなる培地２５０ｍｌに２％グルコース、０．５％酵母抽出物、０．２％カザミノ酸（ビタミンフリー）、１０ｍＭ  Ｌ−アルギニン、１０μＭニコチンアミド、１０ｍＭウリジンを添加し、株ＮＷ２０５（ｃｓｐＡ１、ｐｙｒＡ６、ｎｉｃＡ１、ａｒｇＢ１３）１×１０６胞子／ｍｌとともにインキュベートし、オービタルＮｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋシェーカーにて２５０ｒｐｍ、３０℃で１６−１８時間菌糸体を増殖させた。該菌糸体をブフナー漏斗および穏やかな吸引を用いてミラクロス（ナイロンガーゼ）上で収穫し、ＳＰ６（ＳＰ６：０．８％ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ−リン酸緩衝液ｐＨ６．０）で数回洗浄した。１５０ｍｇのノボザイム２３４を２０ｍｌ  ＳＭＣ（ＳＭＣ：１．３３Ｍソルビトール、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２、２０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ５．８）に溶解し、そこへ１ｇ（湿潤重量）の菌糸体を加え注意深く懸濁させた。この懸濁液を３０℃で１−２時間緩やかに振とうしながらインキュベートし、３０分毎に菌糸を注意深く再懸濁させ、プロトプラストを計数するためのヘマチトメーターを用いてプロトプラスト形成をモニターするため試料を採取した。十分なプロトプラストが存在した時（１×１０８以上）、これらを注意深く再懸濁させ滅菌ガラスウールプラグ上での濾過により菌糸残渣を除去した。該プロトプラストをベンチ遠心機で４℃３０００ｒｐｍにて１０分間の遠心分離によって集め、５ｍｌのＳＴＣ（ＳＴＣ：１．３３Ｍソルビトール、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５）中に注意深く再懸濁した。この洗浄工程を２回繰り返し、該プロトプラストを最終的にＳＴＣに１×１０８／ｍｌの密度で再懸濁させた。
【００５６】
形質転換は、１μｇのｐＩＭ１３０ＤＮＡ（１０−２０μｌＴＥ中に溶解）を５０μのＰＥＧ緩衝液（ＰＥＧ緩衝液：２５％ＰＥＧ−６０００、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ  ｐＨ７．２）とともに２００μｌのプロトプラスト懸濁液に添加しすることにより実施し、ピペッティングにより数回上下させて穏やかに混合し、室温で２０分間インキュベートした。この後、２ｍｌのＰＥＧ緩衝液を添加し、該溶液を穏やかに混合し、室温でさらに５分間インキュベートし、次いで４ｍｌのＳＴＣを添加してボルテックスミキサーで穏やかに混合した。また、５μｇ  ｐＩＭ１３０ならびに、１および５μｇのプラスミドｐＧＷ６３５ＤＮＡを用いてこれを行った。陰性対照としては、２０μｌのＴＥを該プロトプラストに添加した。
【００５７】
次いで、この懸濁液の一部１ｍｌを４ｍｌの浸透圧を安定化させた上層寒天に添加し、炭素源として１００ｍＭＤ−グルコースまたは１００ｍＭＤ−キシロースのいずれかを有するＭＭＳを含むプレートに注いだ（上層寒天で穏やかに回し入れてプレートを被覆する）。これらの培地は（ＭＭＳ）は０．８Ｍ  ＫＣｌを用いてまたは１．３３Ｍソルビトールを用いることによって浸透圧を安定化させた。
【００５８】
再分化のパーセンテージを決定するために、該プロトプラストの連続希釈を形質転換の前（未処理のプロトプラストは氷上で維持された）、および形質転換後（陰性対照から得られた）に調製した。１００μｌの１０−３、１０−４、１０−５および１０−６希釈を１０ｍＭウリジンを添加したＭＭＳプレートに２づつ(duplicate)にて平板培養した。
【００５９】
そこで菌類がプラスミドｐＧＷ６３５を用いて形質転換された陽性対照については、すべてのプレートでコロニーが見られた。しかしながら、ＫＣｌで安定化させた培地での形質転換頻度は（１−１０形質転換体／μｇプラスミドＤＮＡ）、ソルビトールで安定化させた培地（１００−１０００形質転換体／μｇプラスミドＤＮＡ）よりもずっと低かった。このことは後者の培地で再分化頻度が非常に高かったことにより、これはＫＣｌで安定化させた培地における２−５％に比して、約９０％であった。
【００６０】
プラスミドｐＩＭ３０を用いた形質転換の場合は、炭素源としてＤ−キシロースを含む培地では形質転換体は見られたが、Ｄ−グルコースを含む培地では見られなかった。ソルビトールで安定化させた培地での頻度は約１００／μｇプラスミドＤＮＡであったが、ＫＣｌで安定化させた培地での頻度は１／μｇＤＮＡより低かった。
【００６１】
実施例３  形質転換体の分析
１００ｍＭ  Ｄ−グルコース、１００ｍＭ  Ｄ−グルコース／１％オートスペルト・キシラン（Sigma #X0627)および１％オートスペルト・キシランを含有するＭＭ上で平板培養することによって、  実施例２で得られたｐＩＭ１３０からの形質転換体を分析した。選択した形質転換体をこれらの培地にレプリカ平板培養し、３０℃でインキュベートした。形質転換体の約７５％はキシラン含有培地上で増殖しており、他方、Ｄ−グルコースを含有する培地上では増殖は見出されなかった。コロニーの残りの２５％は全ての３つのテストした培地上で増殖した。
【００６２】
予測された表現型（キシラン含有培地上の増殖、Ｄ−グルコース含有培地上の非増殖）を有する５つの形質転換体の選択は、サザン分析によって行った。実質的にGraaffら, 1988によって記載されているごとく植物ＲＮＡを単離するのに使用される修飾手法によって菌類ＤＮＡを単離した。培養基中で一晩増殖させた菌糸体を収穫し、冷生理食塩水で洗浄し、液体窒素中で凍結し、−８０℃で貯蔵した。マクイロディスメンブレーター（Braun）を用いて０.５ｇの凍結菌糸体を破壊することによって単離した。得られた菌糸体粉末を新たに調製した抽出緩衝液で抽出した。抽出緩衝液を以下のごとくに調製した：１ｍｌトリ−イソプロピルナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）（２０ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌのｐ−アミノサリチル酸（ＰＡＳ）（１２０ｍｇ／ｍｌ）と徹底的に混合し、０.５ｍｌ  ５×ＲＮＢ緩衝液を添加した（５×ＲＮＢは１リットル（ｐＨ８．５）中に１２１.１０ｇトリス、７３.０４ｇ  ＮａＣｌおよび９５.１０ｇ  ＥＧＴＡを含有した）。１.５ｍｌフェノールの添加の後に、抽出緩衝液を５５℃で１０分間平衡化させた。次いで、暖かい緩衝液を菌糸体粉末に添加し、ボルテックスミキサーを用いて懸濁液を徹底的に１分間混合した。１ｍｌのクロロホルムの添加後、懸濁液を１分間再混合した。ソルボール(Sorvall)高速遠心機を用いる１０４×ｇでの１０分間の遠心の後、水相を等容量のフェノール／クロロホルム（１：１）でもう１回抽出し、次いで、クロロホルムで２回抽出した。以下の手法を用い、ＤＮＡを水相から単離した：ＤＮＡを室温にて２容量のエタノールで水相から直ちに沈殿させ、続いて、１０４×ｇにて１０分間、Sorvall高速遠心機を用いる遠心によって収集し、ＤＮＡを蒸留した滅菌水に再溶解させ、それを再度エタノールで沈殿させることによって洗浄し、ＲＮＡｓｅＡ（２０ｇμｇ／ｍｌ）を最終溶液に添加することによってＲＮＡを除去した。
【００６３】
野生型としてのＡ．ニゲール（A. niger)Ｎ４０２（ｃｓｐＡ１）および前記した５種のｐＩＭ１３０形質転換体から単離した高分子量ＤＮＡ（１−２μｇ）を製造業者の指示に従ってＨｐａＩ（Life Technologies)で消化した。得られた断片をアガロースゲル電気泳動によって分離し、Maniatisら(1982)によって記載された高結合(Ｈｉｇｈ−ｂｏｎｄ)Ｎ膜に移した。Ａ．ニゲール（A. niger)ｐｙｒＡ遺伝子をプローブとして含有する、Sambrookら(1989)によって記載されているごとくに調製した、３２Ｐ−標識した３.８ｋｂ  ＸｂａＩ断片を用いるハイブリダイゼーションを以下の手法に従って行った（Sambrookら; ６８℃における３−５時間の６×ＳＳＣ（１０００ｍｌ当たり２０×ＳＳＣ：１７５.３ｇ  ＮａＣｌ、１０７.１ｇクエン酸ナトリウム・５.５Ｈ２Ｏ、ｐＨ７.０）、０.１％ＳＤＳ、０.０５ピロリン酸ナトリウム、５＊デンハート溶液（５００ｍｌ当たり１００×デンハート溶液：１０ｇＦｉｃｏｌｌ−４００、１０ｇポリビニルピロリドン、１０ｇウシ血清アルブミン（ＰｅｎｔａｘフラクションＶ）および２０μｇ／ｍｌ変性ニシン精子ＤＮＡ）中でのプレハイブリダイゼーションおよび６８℃における１５−１８時間の変性放射性標識プローブを含有する同一緩衝液中でのハイブリダイゼーション、続いての６８℃における３×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中での２回の洗浄、および６８℃における０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中での２回の洗浄。膜をサランラップで被覆し、コニカ製Ｘ−線フィルムおよび正規増感スクリーンを備えたコダックＸ−オステック(Omatic)カセットを用い、−７０℃で一晩オートラジオグラフィーに付した。
【００６４】
その結果、１０ｋｂのハイブリダイジングバンドがＮ４０２レーンで見出され、他方、このバンドは形質転換体ＮＷ２０５：：１３０＃１およびＭＷ２０５：：１３０＃２およびＭＷ２０５：：１３０＃３では失われる。形質転換体ＮＷ２０５：：１３０＃１およびＭＷ２０５：：１３０＃３においては、１５ｋｂハイブリダイジング断片が見出され、他方、ＭＷ２０５：：１３０＃２では、２０ｋｂバンドが見出される。これらの結果は、各々、相同ｐｙｒＡ遺伝子座における単一および二重コピー組込みに対応する。形質転換体ＭＷ２０５：：１３０＃４およびＭＷ２０５：：１３０＃５においては、該プラスミドが非相同遺伝子座に取り込まれた。形質転換体ＮＷ２０５：：１３０＃２を突然変異誘発につき選択した。
【００６５】
ｐＩＭ１３０のＵＡＳ断片はＵＡＳの刺激活性を呈するための陽性レギュレーターに必要な結合部位を含む。かくして、ｐＩＭ１３０を含むホスト細胞におけるｘｌｎＲの阻害の結果、ｐＩＭ１３０に存在するに方向マーカーの陰性発現となった。ｘｌｎＲの発現はキシランまたはキシロースによって誘導される。かくして、かかる基質の存在の結果、もしホストがｘｌｎＲを保有するならば、ｐＩＭ１３０の二方向マーカーの発現となる。
【００６６】
ｐＩＭ１３０のＵＡＳ断片は、アスペルギルス・ニゲール（Aspergillus niger)ｘｌｎＡ遺伝子の天然ＵＡＳに存在するｃｒｅＡの阻害活性に必要な部位を含まない。かくして、グルコースの存在は、Ａ．ニゲールをＣＲＥ  Ａ＊とし、引き続いて、ｘｌｎＡのＵＡＳおよびｘｌｎＤおよびａｘｅＡのごときキシラン分解酵素をコードする遺伝子を阻害し、また、前記したキシラン分解酵素をコードする遺伝子のＵＡＳのアクチベーターをコードするｘｌｎＲ遺伝子を阻害する、すなわち、ｐＩＭ１３０の陰性発現の結果となるキシラン分解酵素発現を抑制する。
【００６７】
実施例４：突然変異体の選択
実施例４．１：抑制された突然変異体の選択
ＮＷ２０５：：１３０＃２の胞子を５ｍｌ  ＳＴ（ＳＴ：０.８％  ＮａＣｌ、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中で収穫し、高周波数で振盪し、菌糸体デブリスを滅菌ガラスウールプラグ上の濾過によって除去した。ベンチ遠心機にての室温における３０００ｒｐｍでの１０分間の遠心によって胞子を収集し、５ｍｌ生理食塩水に再懸濁させた。この洗浄工程を２回反復し、胞子を最終的に１ｍｌ当たり１＊１０７の密度にて生理食塩水に再懸濁させた。１０ｍｌの胞子懸濁液をガラスペトリ皿に分散させ、ＵＶを用いて１８エルグ／ｍｍ２／分の線量で２分間照射した。突然変異誘発の後、１０５および１０６胞子を、３％Ｄ−グルコースを含有するＭＭ＋１０ｍＭ  Ｌ−アルギニン＋１０μＭニコチンアミド上、および３％Ｄ−グルコース／３％オートスペント・キシラン（Sigma #X0627)を含有するプレートで平板培養した（各１０プレート）。
【００６８】
４−７日後に、その形態に基づいて、３つのクラス：大きくて胞子形成されたコロニー、中程度のサイズのよく胞子形成されたコロニーおよび小さくて貧弱な胞子形成のコロニーに分けることができる、プレート当たり５−１０突然変異体コロニー（接種した１０６胞子）が見出された。これらの突然変異体から２０をランダムに選択し、選択された突然変異体を、異なる炭素源または基質を含有する培地でテストした。突然変異体コロニーは、Ｄ−グルコース、Ｄ−グルコース／キシランおよびキシランを含有する培地で成長できることが判明し、一方、親株のＮＷ２０５：：１３０＃２のみは、炭素源としてキシランを含む培地で成長することが出来た。加えて、これらの突然変異体を異なる色原体基質：４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−シキロシド（β−キシロシダーゼ、エンドキシラナーゼ）（Sigma #M7008)、４−メチルウンベリフェリルアセテート（アセチル−キシランエステラーゼ）(Sigma #M0883)、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｌ−アラビノフラノシド（アラビノフラノシダーゼ）（Sigma #M9519)上で、およびレマゾールブリリアントブルー修飾キシラン（エンド−キシラナーゼ）（Sigma #M5019)上でテストした。メチルウンベリフェル誘導体は、Ｄ−グルコース、Ｄ−グルコース／キシランおよびキシランを含有する培地最終濃度に１ｍＭで添加し、他方、ＲＢＢ−キシランをＤ−グルコース／キシランおよびキシランを含有する培地に最終濃度１ｍｇ／ｍｌで添加した。テストした全てのこれらの基質につき、Ｄ−グルコース含有培地上での増殖後の突然変異体で酵素活性が見出され、他方、親株ＮＷ２０５：：ｐＩＭ１３０＃２で発現は見出されなかった。キシランを含有する培地で、ＮＷ２０５：：ｐＩＭ１３０と比較してこれらの酵素の増大した発現が見出された。テストした突然変異体のうち、突然変異体５Ｂは最高レベルの発現を有していた。この場合において、選択は、キシラノリシスの阻害剤、すなわちグルコースとして正常に活性な基質で起こった。発現が抑制の不存在下で起こり得るかを確認するために、キシラン分解遺伝子ｘｙｌａｎのインデューサーも含ませた。かかる対照テストは、好ましくは、本発明の方法に含まれる。突然変異体は明らかに抑制を示した。
【００６９】
生産された活性レベルの比較のために、Ａ．ニゲールＮ４０２および突然変異体５Ｂを共に炭素源として１.５％粗製小麦アラビノ−キシランを含有するＭＭ上で培養した。試料を２４、４２、７２および９６時間に採取し、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、エンド−キシラナーゼおよびβ−キシロシダーゼの活性を測定した。結果（図２Ａ、Ｂ、Ｃ）は、全ての３種の酵素に対する突然変異体株につき活性の増大を示した。α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼおよびエンド−キシラナーゼ活性は最も強く増加した。
【００７０】
実施例４．２：非発現突然変異体の選択
株ＮＷ２０５：：１３０＃２の胞子を収穫し、実施例４．１に記載したごとくに突然変異させ、引き続いて、１０ｍＭウリジン、１０ｍＭＬ−アルギニンおよび０.８ｍｇ／ｍｌの５−フルオロオロチン酸（Sigma #F5013)を含有するＭＭ上で平板培養した。これらのプレートを３０℃で４−７日間インキュベートした。ＰＹＲ−表現型を有する６４の増殖コロニーを、１％キシラン＋１０ｍＭウリジン＋１０ｍＭＬ−アルギニン＋１０μＭニコチンアミドを含有するＭＭ上で平板培養することによってキシリナーゼ発現につき分析した。テストしたこれらの６４の突然変異体のうち、１０はキシラン含有プレート上で清澄ゾーンの減少を与え、潜在的キシラナーゼレベルの低下を有した。これらの突然変異体の表現型を、ウリジンの存在および不在下で、Ｄ−グルコース、Ｄ−グルコース／キシランおよびキシランを含有する培地上で確認した。全ての１０の突然変異体はウリジンを含まない培地では増殖しなかった。
【００７１】
さらなる分析のため、これらの突然変異体を、５０ｍＭフラクトース＋１０ｍＭウリジン＋１０ｍＭ  Ｌ−アルギニン＋１０μＭニコチンアミドを含有するＭＭ上にて、３０℃で１８時間前培養し、しかる後、菌糸体を収穫し、１ｇの湿潤菌糸体を、１％キシランを含有するＭＭおよび１０ｍＭ  Ｄ−キシロース＋１０ｍＭウリジン＋１０ｍＭ  Ｌ−アルギニン＋１０μＭニコチンアミドを含有するＭＭに移した。３０℃における５.５時間のインキュベーションの後、菌糸体および培養濾液を収穫した。培養濾液を１ｍＭ  ＮａＰｉｐＨ５.６に対して透析し、しかる後、キシラナーゼ（Baileyら, (1991))を測定し、β−キシロシダーゼ活性を測定した（表１）。キシラナーゼならびにβ−キシロシダーゼ発現レベルが共にこれらの選択した突然変異体では強く減少することが判明した。
【表１】
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【００７２】
実施例５  非発現突然変異体の相補性
５．１  Ａ．ニゲール・ゲノミックプラスミドライブラリーの構築
プラスミドライブラリーの構築のために、最終容量１００μｌ中の３.５Ｕ  Ｓａｕ３Ａ（Life-Technologies)を用い、製造業者の指示に従って、実施例３に記載したごとくに単離した、Ａ．ニゲールＮＭ１２８（ｃｓｐＡ１、ｎｉｃＡ１、ｐｙｒＡ６、ｇｏｘＣ１７）のゲノムＤＮＡ１０μｇを３７℃で３０分間部分的に消化した。アガロースゲル電気泳動による断片の分離の後、６.７ｋｂないし９.４ｋｂのサイズ範囲の断片を、低融点アガロースゲルから切断し、Sambrookら (1989)が記載したごとくに単離した。合計６つの消化物から４μｇの断片を最終濃度１００ｎｇ／μｌにて単離した。得られた断片６００ｎｇを製造業者の指示に従って１００ｎｇのＢａｍＨＩ消化のｐＵＣ１８（Pharmacia #27526201)中で連結した。連結後、４μｇの得られた連結混合物を用いて、製造業者の指示に従って、１００μｌの大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＨ５α混在能力の充分な(Ｍａｘ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ)細胞（Life Technologies)を形質転換させた。６つの引き続いての形質転換実験の結果、約５＊１０４コロニーが得られた。これらのコロニーの再懸濁および１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＴＹ培地（１００ｍｌ当たりの培地：１６ｇ上級ペプトン(select peptone)１４０（Life Technologies）、１０ｇのＮａＣｌおよび１０ｇの酵母エキス）中での３７℃での３時間の培養の後、プラスミドＤＮＡを単離し、ＣｓＣｌ遠心によって精製した。
【００７３】
５．２  非発現突然変異体の相補性
非発現突然変異体の相補性のため、選択した３種の突然変異体、ＮＷ２０５：：１３０Ａｃ１−４、ＮＷ２０５：：１３０  Ａｃ１−１５およびＮＷ２０５：：１３０Ａｃ４−４につきこれらの株のプロトプラストを調製し、実施例２に記載したごとくに形質転換させた。これらの形質転換実験においては、１０８プロトプラストを用い、これを実施例５．１に記載したＡ．ニゲールプラスミドライブラリーの２０μｇ  ＤＮＡと組み合わせ、また自律複製プラスミドｐＨＥＬＰ１（GemsおよびClutterbuck, 1993)の１０μｇＤＮＡと合わせたプラスミドライブラリーの１０μｇと組み合わせ、また自律複製プラスミドｐＨＥＬＰ１の１０μｇＤＮＡと合わせたプラスミドライブラリーの２０μｇＤＮＡとを組み合わせた。陽性対照として、２μｇのｐＧＷ６３５を用いた。形質転換手法の後、１０μＭニコチンアミドおよび１０ｍＭ  Ｌ−アルギニンを補足した炭素源としての５０ｍＭ  Ｄ−キシロースを含有する１.３３Ｍソルビトールで安定化させたＭＭ上で混合物を平板培養した。約４日後、コロニーが陽性対照プレートに出現し、これを計数し、他方、６日後に相補性プレートからコロニーを拾うことができた。
【００７４】
１％オートスペルトキシラン、１ｍＭ  ４−メチルウンベルフェリル−β−Ｄ−キシロシド、１０μＭニコチンアミドおよび１０ｍＭ  Ｌ−アルギニンを含有する培地上で平板培養することによって、得られた形質転換体コロニーを分析した。３０℃での６−７時間のインキュベーションの後に、ｘｘ蛍光コロニーを検出した。２−３日後、これらのコロニーのまわりのキシランの清澄化が出現した。
【００７５】
実施例６：Ａ．ニゲールｘｌｎＲ遺伝子のクローニング
実施例６．１：  Ａ．ニゲールｘｌｎＲ遺伝子の単離
Ａ．ニゲールｘｌｎＲ遺伝子を得られた形質転換体から単離し、実施例５．２に記載したごとくに選択した。ＮＷ２０５：：１３０  Ａｃ１−４、ＮＷ２０５：：１３０  Ａｃ１−１５およびＮＷ２０５：：１３０  Ａｃ４−４から得られた１３の形質転換体から、全ＤＮＡを、Graffら, 1988によって記載されているごとくに単離した。Ｃ源としての１.５％粗製小麦アラビノ−キシラン上でのｐｙｒＡおよびキシラン分解発現のための選択（すなわち、誘導）条件下で菌糸体を培養した後、遊離複製プラスミドをＮｕｃｌｅｏｂｏｎｄ  ＡＸ１００カラム（Machery & Nagel)を用いて単離した。４００μｌの滅菌水中に溶解させた２００μｇの全ＤＮＡを２ｍｌのＳ１緩衝液（５０μＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８.０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００μｇ  ＲＮａｓｅＡ）、２ｍｌのＳ２（２００ｍＭ  ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）と混合し、続いて、室温でインキュベートし、２ｍｌのＳ３（２.６０Ｍ  ＫＡｃ、ｐＨ５．２）と混合し、続いて氷上で５分間インキュベートした。１５,０００ｇにおける３０分間の懸濁液の清澄化の後、全て「プラスミドおよびコスミドの精製のための実験手法」（５．３修飾アルカリ性／ＳＤＳ溶解）についての製造業者の指示に従って、プラスミドの吸着、洗浄、溶出および沈殿を行った。１５０μｌの滅菌水に溶解させた２０μｌの得られたプラスミドＤＮＡを大腸菌(E.Coli)ＤＨ５α形質転換で用いた。（Sambrookら, 1989)。各プラスミド調製物から得られた１２の大腸菌(E.Coli)のコロニーを、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２５０ｍｌ  ＬＢ培地中、３７℃で９−１２時間培養し、しかる後、Sambrooko, 1989によって沸騰溶解プロトコルにつき記載されている１.５ｍｌ培養で、ミニプレププラスミドＤＮＡ単離を行い、遠心によって細胞をペレット化し、−２０℃で貯蔵した。アガロース電気泳動によるＨｉｎｄＩＩＩ消化後におけるこれらのＤＮＡ調製物の分析により、３つのクラスのプラスミド：ｐＨＥＬＰタイプのプラスミド、ゲノミックライブラリータイプのプラスミドおよび大きい複合体タイプのプラスミドが明らかとされた。後者のタイプのプラスミドを含有するコロニーから、修飾されたアルカリ性／ＳＤＳ溶解（Macherey-Nagel)についての製造業者の指示に従ってヌクレオボンド(Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ)ＡＸ１００カラムを用いる大規模プラスミド単離を、２５０ｍｌの培養の凍結ペレットで行った。この結果、各々、２つのプラスミドタイプＡおよびＢ、相補体ＡおよびＢが単離された。これらの両プラスミドをＳａｌＩ、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、アガロース電気泳動の後、変性放射性標識ｐＨＥＬＰ１、プラスミドＡおよびプラスミドＢを用いるサザン分析によって、断片を三連で分析した。これは、両プラスミドＡおよびＢは、ｐＨＥＬＰ部分以外に、同一のゲノム領域を有することを示した。ベクターおよびＡＭＡ１配列を示す、ｐＨＥＬＰプラスミドを用いて見出されたハイダリダイゼーションシグナルおよびプラスミドＡおよびＢシグナルの間の差異に基づき、プラスミドＡおよびＢ双方とハイブリダイズするが、ｐＨＥＬＰ１とハイブリダイズしない断片を同定し、サブクローンした。プラスミドＢの４ｋｂ  ＥｃｏＲＩ断片および６.５ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ断��、およびプラスミドＡの３ｋｂ  ＰｓｔＩ断片はプラスミドＡおよびＢ双方とハイブリダイズすることが判明し、ｐＧＥＭ７／ＥｃｏＲＩ、ｐＧＥＭ７／ＨｉｎｄＩＩＩおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＰｓｔＩにサブクローニングし、その結果、各々、プラスミドｐＮＰ１、２および３が得られた。増殖および精製の後、これらのプラスミドを、実施例５．２に記載した突然変異体ＮＷ２０５：：１３０  Ａｃ４−４を用いる相補性実験で使用した。これらの実験において、ｐＨＥＬＰ１を用いることなく突然変異体を直接形質転換した。これらの実験において、６.５ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片を含有するプラスミドｐＮＰ２は、突然変異の相補性を生起した。ｐＮＰ２−由来のプラスミドのさらなるサブクローニングおよび形質転換により、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローンされた５ｋｂ  ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片が明らかとなり、プラスミドｐＮＰ８が得られ、株ＮＷ２０５：：１３０  Ａｃ４−４相補鎖が生起した。
【００７６】
実施例６．２：
Ａ．ニゲールｘｌｎＲ遺伝子のサブクローニング
ｘｌｎＲ遺伝子のサブクローニングのために、Harmsenら, 1990によって記載されているごとくに構築したＡ．ニゲールのゲノミックライブラリーを、プローブとしてｐＮＰ１の４ｋｂ  ＥｃｏＲＩ断片を用いることによって、ｘｌｎＲ領域を含有するファージにつきスクリーニングした。平板培養細菌として大腸菌(E.Coli)ＬＥ３９２を用い、記載されているごとく（Maniatisら, 1982)５つの８５−ｍｍ直径ＮＺＹＣＭ（１.５％寒天）プレート上、０.７％アガロースを含有するＮＺＹＣＭ頂部−アガロース中で、プレート当たり３×１０３ｐｆｕを平板培養した。３７℃におけるプレートの一晩のインキュベーションの後、二連の各プレートをManiatisら(1982)に記載されているようにＨｙｂｏｎｄＮ＋フィルター（Amersham)上で作成した。３×ＳＳＣ中でフィルターを湿らせた後、該フィルターを３×ＳＳＣ中、室温にて６０分間洗浄した。Sambrookら, 1989によって記載されているごとくに調製した３２Ｐ-標識４ｋｂ  ＥｃｏＲＩ断片を用いるハイブリダイゼーションを以下の手法（Sambrookら，1989)に従って行った：６８℃における３−５時間の６×ＳＳＣ（１０００ｍｌ当たり２０×ＳＳＣ：１７５.３ｇ  ＮａＣｌ、１０７.１ｇクエン酸ナトリウム・５.５Ｈ２Ｏ、ｐＨ７.０）、０.１％ＳＤＳ、０.０５％ピロリン酸ナトリウム、５＊デンハートの溶液（５００ｍｌ当たり１００×デンハート溶液：１０ｇのＦｉｃｏｌｌ−４００、１０ｇのポリビニルピロリドン、１０ｇ胎児ウシ血清アルブミン（ペンタックスフラクションＶ）および２０μｇ／ｍｌ変性ニシン精子ＤＮＡ中でのプレハイブリダイゼーションおよび６８℃における１５−１８時間の変性放射性標識プローブを含有する同一緩衝液中でのハイブリダイゼーション、続いての６８℃における２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中での２回の洗浄、および６８℃における０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中での２回の洗浄。膜をサランラップで被覆し、コニカＸ−線フィルムおよび正規増感スクリーンを備えたコダックＸ−Omaticカセットを用い、−７０℃で一晩オートラジオグラフィーに付した。
【００７７】
このスクリーニングの結果、約１２の陽性ファージが得られ、そのうち８つを精製した。パスツールピペットを用いて各陽性プラークをプレートから拾い、Maniatisら(1982)により記載されているごとく、ファージを、２０μｌクロロホルムを含有する１ｍｌのＳＭ緩衝液にて寒天栓から溶出させた。得られたファージを、５０−１００プラグの単離ファージを含有するプレートからのフィルターレプリカを用いて前記した手法を反復することによって精製した。
【００７８】
精製の後、ＮＺＹＣＭ培地上で５×１０３ファージを平板培養することによってファージを増殖させた。３７℃での一晩のインキュベーションの後、密集プラークが得られ、それから、５ｍｌ  ＳＭ緩衝液を添加することによってファージを溶出させ、間欠的に振盪しつつ、４℃で２時間プレートを保存した。ピペットを用いる上清の収集の後、４℃にて４０００×ｇで１０分間遠心することによって細菌を溶液から除去した。上清に０.３％クロロホルムを添加し、ｐｆｕの数を決定した。これらのファージストック（Ａ−Ｒ／Ｈ−Ｒ）はほぼ１０９ｐｆｕ／ｍｌを含有する。
【００７９】
Sambrookら（1989)により記載されているごとくに単離した５種のファージ、Ａ−Ｒ、Ｂ−Ｒ、Ｃ−Ｒ、Ｅ−Ｒ、Ｆ−ＲからのＤＮＡをサザン分析によって分析した。以下の溶液：５μｌ（〜１μｇ）ＤＮＡ溶液；２μｌの適当な１０×反応緩衝液（Life Technologies)；１０Ｕ制限酵素（Life  Technologies)および滅菌蒸留水よりなる反応混合物中でＤＮＡを３７℃で５時間消化して最終容量２０μｌを得た。試料を６５℃で１０分間インキュベートし、１＊ＴＡＥ緩衝液にての０.６％アガロースゲル上に負荷する前に氷上で迅速に冷却した。ＤＮＡ断片を２５Ｖにて１５−１８時間の電気泳動によって分離した。
【００８０】
電気泳動の後、ＤＮＡを移し、バキュジーン(VacuGene)ＸＬ指示マニュアル（２５−２６頁）に記載されているごとくにナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ，Amersham)にアルカリ性真空ブロッティング（VacuGene XL, Pharmacia LKB)によって変性し、引き続いて、プレハイブリダイズさせ、前記したハイブリダイゼーション条件にてプラスミドｐＮＰ８の変性放射性標識５ｋｂ  ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩを用いてハイブリダイズさせた。正規増感スクリーンを用い、−７０℃で１８時間コダックXAR-5 Ｘ−線フィルムに暴露することによってハイブリダイゼーションパターンを得た。全ての５つのクローンにおいて、同一ゲノム領域に由来する断片が見出され、それにつき制限パターンが作成された。
【００８１】
制限地図に基づき、５ｋｂ  ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片をサブクローニングのために選択した。１００ｎｇのpBluescript  ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ消化ベクターを２５０ｎｇのファージＢ−Ｒの５ｋｂ  ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ  ＤＮＡと混合し、４μｌの５＊連結緩衝液（組成；５００ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.６；１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ  ＡＲＰ；１０ｍＭ  ジチオスレイトール；２５％ＰＥＧ−６０００）、および１μｌ（１.２Ｕ／μｌ）Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Life Technologies）を最終容量２０μｌにてこの混合物に添加した。１４℃で１６時間のインキュベーション後、混合物を滅菌水１００μｌに希釈した。１０μｌの希釈混合物を用いて、Sambrookら (1989)によって記載されているごとくに調製した大腸菌(E.Coli)ＤＨ５α能力細胞を形質転換させた。得られたコロニーのうち６つを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ培地（１０００ｍｌ当たりＬＢ培地：１０ｇトリプティカーゼペプトン（ＢＲＬ）、５ｇ酵母エキス（ＢＲＬ）、１０ｇ  ＮａＣｌ、０.５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ７.５）中で一晩培養した。該培養より、Maniatisら (1982)によって記載された沸騰溶解方法によって、プラスミドＤＮＡを単離し、これを制限分析で用いて所望のプラスミドｐＩＭ２３０を保有するクローンを選択した。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ培地中で培養したｐＩＭ２３０を含有する５００ｍｌの培養大腸菌(E.Coki)ＤＨ５αから大規模にプラスミドＤＮＡを単離した（Maniatisら, 1982)。ＣｓＣｌ遠心によってプラスミドを精製し、エタノール沈殿させ、４００μｌのＴＥに溶解させた。収率はほぼ５００μｇであった。ｐＩＭ２３０を含有する大腸菌(E.Coli)を、１９９６年６月に、ブダペスト条約の条件下で、ＣＢＳ６７８.９６の受託番号にてＣＢＳに寄託した。
【００８２】
実施例６.３
Ａ．ニーガーｘｌｎＲ  ｃＤＮＡのサブクローニング
ｘｌｎＲ遺伝子の亜鉛フィンガー領域の一部のｃＤＮＡクローンを得るために、ＺＡＰＴＭ−ｃＤＮＡ合成キット（Stratagene)に記載された方法と同様に、１４７６−１４９６位で開始するオリゴヌクレオチド（配列番号９）にて、３０時間キシラン上で培養したＡ．ニーガーＮ４０２野生型株からの１μｇのポリＡ＊＋ＲＮＡで逆転写酵素および第２ストランド合成反応を行った。第２ストランド反応のアリコット（１／５０）を、順次９５℃、５８℃および７２℃の６０分、続いて７２℃の５分のインキュベーションの３５サイクルにてのプライマーＲＯ２６およびＲＯ２５（配列番号９の９４６−９７０位な由来する）を用いるＰＣＲで鋳型として使用した。５００ｂｐの得られた断片をｐＧＥＮ−Ｔベクター（Promega)にサブクローンし、配列決定した。
【００８３】
実施例７：
ｘｌｎＲ遺伝子の一次構造
実施例７.１
ｘｌｎＲ遺伝子の配列分析
配列決定反応において特異的オリゴヌクレオチドのプライマーとしての使用と組み合わせ、ｐＮＰ８およびｐＩＭ２３０双方からの断片をサブクローニングすることによって、Ａ．ニゲールｘｌｎＲ遺伝子、そのプロモーター／調節領域、該遺伝子の構造部分および終止領域の配列を決定した。
【００８４】
ヌクレオチド配列分析のため、制限断片を単離し、次いで、適当な制限酵素で消化したｐＥＭＢＬ、ｐＵＣ、pBluescript、ｐＧＥＭ  ＤＮＡベクターにクローン化した。ファルマシアALFエクスプレス自動シーケンサーおよびサーモシークエンス(Thermosequenase)配列決定キット（Amersham)を用い、ジデオキシヌクレオチド鎖停止手法（Sangerら, 1997)によって、ヌクレオチド配列を決定した。遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの場合には、ファルマシアCy5内部標識キットを、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ配列決定キット（Pharmacia）と組み合わせて用いた。反応および電気泳動は、製造業者の指示に従って行った。コンピューター解析はＰＣ／ＧＥＮＥプログラム（Inteligenetics)を用いて行った。決定された配列を配列番号９に示す。
【００８５】
実施例７．２
ｘｌｎＲ遺伝子の記載
ｘｌｎＲ構造遺伝子を含む配列番号９で与えられる配列には、９４７ヌクレオチド長の上流領域が先行する。上流非コード領域においては、ＣＴ−リッチ配列が見出されるが、ＴＡＴＡＡボックスは見いだされない。ｘｌｎＲ遺伝子の構造部分は９４８位から３６９０位までの範囲であり、２つのイントロンによって中断される。１１７４位から１２３７位のイントロンは、実施例６．２に記載されたｐＩＭ２３０中のゲノム断片および実施例６．３に記載されたｃＤＮＡの一部を配列決定することによって確認した。第２のイントロンは３４９６位から３５４９位までに示される。第２イントロン配列は、スプライス連結および投げ縄(lariat)配列のための、通常は菌類に見出される、保存されたイントロン配列に続く。
【００８６】
ｘｌｎＲ遺伝子は長さが８７５のアミノ酸の一部をコードする。誘導されたポリペプチドは、亜鉛に配位する典型的な６つのシステインと共に、１１１０位から１２６０位のヌクレオチドによってコードされる典型的なＮ−末端亜鉛二核クラスタードメインを含有する。この領域においては、ここに引用して本明細書の一部とみなすKraulisら(1992)の図１にリストされたごとく、他の菌類調節蛋白質とのさらに多数の類似点が示される。
【００８７】
典型的なＲＲＲＬＷＷモチーフが２６２３位ないし２６４９位に見出され、このモチーフは、Suarezら (1995)によって記載された多数の二核亜鉛クラスター調節蛋白質中にわずかに変形されて見出される。
【００８８】
実施例７．３
Ａ．ニゲール突然変異体におけるｘｌｎＲの配列分析
実施例４．２に記載されたキシラン分解システムを発現しないＡ．ニゲール突然変異体の場合において、突然変異がｘｌｎＲに位置するか否かを判断するために、これらの突然変異体のｘｌｎＲ遺伝子の配列を決定した。このため、５.５ｋｂ  ＢａｍＨＩ  ｘｌｎＲを含有する断片に富んだライブラリーを、ＮＷ２０５：：１３０Ａｃ突然変異体の各々を作成した。このｘｌｎＲに富んだライブラリーの構築のため、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎＤＩＩＩ、ＸｈｏＩ、ＳｓｔＩおよびＫｐｎＩ消化のゲノムＤＮＡの５.５ｋｂ断片を各株から単離した。これらの断片をＢａｍＨＩ消化した脱リン酸化ｐＵＣ１８ベクター（Ready-To-GOＴＭ  ｐＵＣ１８  ＢａｍＨＩ／ＢＡＰ＋リガーゼ、Pharmacia)と混合し、連結した。連結混合物を用いて、大腸菌(E.Coli)ＤＨ５α（MAX Efficiency DH5αＴＭ能力細胞、Gibco-BRL)を、Ａｍｐ耐性につき、製造業者のプロトコルに従って形質転換し、その結果、５＊１０２−１０３コロニーの一次ライブラリーを得た。マスタープレート上で一次ライブラリーを再平板培養した後、これらのＡ．ニゲールｘｌｎＲ富化ライブラリーを、プローブとしてのｐＩＭ２３０の変性放射性標識ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩインサートを使用して、標準的なプロトコル（Sambrookら, 1989)に従って、コロニーフィルターハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。
【００８９】
各突然変異株につき、陽性コロニーを爪楊枝でマスタープレートから拾い、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する５ｍｌのＬＢ培地中、３７℃で１５−１８時間培養し、しかる後、Sambrookら(1989)によって沸騰溶解のために記載されているごとくにミニプレププラスミドＤＮＡ単離を行った。アガロース電気泳動によるこれらのＤＮＡ調製の分析およびｘｌｎＲ特異的パターンと消化パターンとの比較により、正しい５.５ｋｂ  ＢａｍＨＩ  ｘｌｎＲ断片を含有するコロニーが明らかとされた。実施例７．２に記載された配列決定反応においてプライマーとして特異的ｘｌｎＲオリゴヌクレオチドを使用して、Ａ．ニゲール突然変異体の配列を決定した。突然変異体ＮＷ２０５：：１３０Ａｃ１−１５については、単一塩基対置換が３４７９位に決定され、その結果、配列番号９の８２３位のロイシンがセリンに変化した。突然変異体ＮＷ２０６：：１３０  Ａｃ２−５については、単一塩基対置換が３６５５位に決定され、その結果、配列番号９の８６４位のチロシンがアスパラギン酸に変化した。これらの突然変異は両突然変異体をｘｌｎＲ突然変異体として同定する。
【００９０】
実施例８
Ａ．ニゲールにおけるｘｌｎＲの発現
キシラン分解系を発現しないＡ．ニゲールの相補性
全ての非発現突然変異体における相補性において、形質転換頻度についての対照としてのプロトプラストおよびｐＧＷ６３５とｐＩＭ２３０の相補性をテストするためのｐＩＭ２３０とを組み合わせることによって、実施例４に記載した全ての１０のＮＷ２０５：：１３０  Ａｃ突然変異体を、本明細書の実施例２に記載したごとくに形質転換した。
【００９１】
得られた形質転換体コロニーをキシラン分解活性につき分析し、Ｃ源として１％オートスペルトキシランを含有する適当な培地でそれらを平板培養することによってそれらの親突然変異体と比較し、２−３日後に親突然変異体株ではなく形質転換体コロニーの回りの清澄化が１０全てにつき出現し、それにより、キシラン活性の回復を示した。
【００９２】
実施例９
Ａ．ニゲールキシラン系の発現に対するｘｌｎＲ遺伝子用量の効果
増大したキシラン分解発現についての株改良に対するｘｌｎＲ遺伝子の潜在的使用を実験するために、プラスミドｐＩＭ２３０を保有する１９μｇのｘｌｎＲおよびエイ・ニドゥランス（A. nidulans)  ａｒｇＢ遺伝子（Johnstoneら, 1985)を有するプラスミドｐＩＭ６５０の２μｇを用いて、本明細書の実施例２に記載したごとくに、β−キシシダーゼをコードするエイ・ニゲールｘｌｎＤ遺伝子の複数コピー（約６）を保有する株Ｎ９０２：：２００−１８を共トランスフェクション実験においてアルギニン原栄養可体に形質転換した。得られた形質転換体を、１％オートスペルトキシランを含有するＭＭプレート上にて、増大したエンド−キシリナーゼ発現につきスクリーニングした。最速かつ最大ハロー形成を有する４つのコロニーを選択して、ｘｌｎＲコピー数を決定した。このために、これらの形質転換体および受容体株のＤＮＡを単離し、系列希釈をハイボンド(Ｈｙｂｏｎｄ)Ｎ膜にスポットした。ｘｌｎＲ遺伝子の暗号配列にわたる放射性標識４.５ｋｂ  ＳｍａＩ／ＸｂａＩ断片を用い、ハイブリダイゼーション後に見出されたシグナルからコピー数を見積もった。受容体株に対する比較に基づいて、ｘｌｎＲコピー数はＮ９０２：：２００−１８−Ｒ１４では８と、Ｎ９０２：：２００−１８−Ｒ１６では３２と判断された。両方のこれらの形質転換体につき、株を液状培養にて培養した後に、ｘｌｎＲの増大した遺伝子投与量の効果をノーザン分析によって分析した。これは、１％フラクトース中での１８時間のプレ培養の後に、炭素源としての２％オートスペルトキシランへの導入実験で行った。菌糸体試料を導入より８および２４時間後に採取し、それから、製造業者の指示に従い、ＴｒｉＺｏｌ（Life technologies)を用いて全ＲＮＡを単離し、ノーザンブロット分析（Sambrookら, 1989)によって分析した。キシラナーゼＢ発現レベルは、Ａ．ニゲールｘｌｎＢ（Kinoshitaら, 1995)の放射性標識１ｋｂ  ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ断片を用いるハイブリダイゼーション後に検出して、受容体株と比較して、これらの形質転換体において強く増加した。
【００９３】
増大したエンド-キシリナーゼ発現についての株改良のためのｘｌｎＲ遺伝子の潜在的使用をさらに実験するために、エイ・ニゲールを以下のスキームに従って、本明細書の実施例２に記載されたごとくに形質転換した；１．ｐＧＷ６３５（ｐｙｒＡ）（陽性対照）、２．ｐＤＢ−Ｘ（ＸＡ）、３．ｐＤＢ−Ｘ（ＸＡ）＋ｐＩＮＭ２３０）および４．ｐＧＷ６３５＋ｐＩＭ２３０。プラスミドｐＤＢ−Ｘ（ＸＡ）は、ベクターｐＥＭＢＬ１８中のＡ．トゥービゲンシス（A. tubigensis)からのＡ．ニゲールｐｙｒＡ遺伝子およびエイ・ニゲール・キシリナーゼＡ遺伝子を共に含有する。形質転換体は使用した全ての条件につき得られ、エンド−キシリナーゼを過剰発現する株を、オートスペルトキシリナーゼ上でのプレートスクリーニングにおいてハローサイズによって選択した（各群からの２０形質転換体をテストした）。
【００９４】
各群から１の形質転換体を選択し、活性アッセイのために増殖させた。株をフラクトースを含有する培地で１８時間プレ増殖させ、しかる後、菌糸体（５０ｍｌ中、２.５ｇ湿潤重量）を１.４％粗製アラビノキシランを含有する培地に移した。全ての培養は振盪フラスコ中で行った。インキュベーションは３０℃で４０時間行い、キシリナーゼＡレベルをＨＰＬＣ分析によって測定し、他方、β−キシロシダーゼおよびエンド−キシリナーゼ活性は双方につき測定した。１.５ｍｌ／分にてソース(ＳＯＵＲＣＥ)１５Ｑ．ＨＲ５／５−カラムで流す標準的ファルマシア-LKB HPLC装置（Uppsala, スウェーデン)でクロマトグラフィーを行った。緩衝液Ａ＝２０ｍＭトリス−緩衝液、ｐＨ７.５および緩衝液Ｂ＝１Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス−緩衝液、ｐＨ７.５。３０分にわたる０−５０％緩衝液Ｂからのグラジエント。２８０ｎｍにおける検出、ファルマシア-LKB ＵＶ−ＭＩＩ、０.１−０.２の吸光度範囲、図３参照。１００μｌ培養培地を１０００μｌ  ２０ｍＭトリス−緩衝液、ｐＨ７.５で希釈し、１０００μｌ希釈試料をカラムに適用した。次いで、キシラナーゼＡがほぼ３０％Ｂ−緩衝液にて溶出するピークで観察された。形質転換体の各群から、ＨＰＬＣ分析における最高キシラナーゼＡ活性／ピークを示すものを図３に示す。エンド−キシラナーゼ活性は、Megazyme, Warriewood, オーストラリアからのアズリン-染色架橋小麦アラビノキシラン(Xylazyme錠剤）の放出を測定することによって測定した。キシラナーゼ活性は、０.１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ３.４中、４０℃にて１００ＸＵ／グラム（キシラナーゼ−ユニット）の内部標準酵素と比較することによって計算した。同一の４種の形質転換体をｐＨにて水不溶性アラビノキシランでアッセイし、キシラナーゼＡのみがエオンドキシラナーゼ活性に寄与し、この分析の結果を表２に与える。
【表２】
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【００９５】
図３および表２に示す結果から、予測されるキシラナーゼＡをコードする遺伝子での形質転換は、キシラナーゼＡ酵素活性において大きな増加を与えることが明らかである。より驚くべきことに、アクチベーター遺伝子ｘｌｎＲを用いる形質転換後においても、キシラナーゼＡのレベルの大きな増加も見い出される。これは、未形質転換親におけるアクチベーターＸＹＬ  Ｒ（＝ｘｌｎｒ遺伝子産物）のレベルにおける制限を示す。従って、ｐＤＢ−Ｋ（ＸＡ）マルチコピー形質転換体において、トランス作用レギュレーターの量はより制限されていると予測される。これは、ｐＤＢ−Ｋ（ＸＡ）マルチコピー形質転換体の２倍高いキシラナーゼＡレベルを有する、ｐＤＢ−Ｋ（ＸＡ）／ｐＩＭ２３０形質転換体についての結果によって確認される。
【００９６】
実施例１０：ｘｌｎＲ遺伝子についての糸状菌のスクリーニング
ｘｌｎＲ遺伝子の４.５ｋｂ  ＳｍａＩ／ＸｂａＩ断片をプローブとして用いる、異種ハイブリダイゼーションによってｘｌｎＲカウンターパートを他の菌類を単離することが可能か否かを分析するために、ＤＮＡを以下の株から単離した：Ａ．ニゲールＮ９０２（ａｒｇＢ１５、ｃｓｐＡ１、ｆｗｎＡ１、ｍｅｔＢ１０、ｐｙｒＡ５）、Ａ．ドゥービゲンシスＮＷ１８４（ｃｓｐＡ１、ｆｗｎＡ１、ｐｙｒＡ２２）、ＦＧＳＣ１８７からのＡ．ニデュランス（A. nidulans)ＷＧ０９６（ｐａｂａＡ１、ｙＡ２）、ＣＢＳ１０１.４３のＡ．アクレアトゥス（A. aculeatus)ＮＷ２４０（ｐｙｒＡ３）、ＣＢＳ１１５.８０からのＡ．アクレアトゥスＮＷ２１７（ｆｗｎＡ１、ｃｓｐＡ１、ｐｙｒＡ４、ｌｙｓＡ１）、ＣＢＳ１１５.５２からのＡ．フェティダス（A. foetidus)(ａｗａｍｏｒｉ）ＮＷ１８３（ｃｓｐＡ１、ｆｗｎＡ１、ｐｙｒＡ１３、ｌｙｓＡ１）、Ａ．ジャポニカス（A. japonicus)ＣＢＳ１１４.５１およびトリコデルマ・レエセイ（Trichoderma reesei)ＱＭ９４１４。１−２μｇのＤＮＡをＢａｍＨＩまたはＸｈｏＩで消化し、引き続いて、実施例３に記載したごとくにサザン分析によって分析した。使用したハイブリダイゼーション条件は：５６℃における１８−２４時間の６×ＳＳＣ（１０００ｍｌ当たりの２０×ＳＳＣ：１７５.３ｇ  ＮａＣｌ、１０７.１ｇクエン酸ナトリウム・５.５Ｈ２Ｏ、ｐＨ７.０）、０.１％ＳＤＳ、０.０５％ピロリン酸ナトリウム、５＊デンハート溶液（５００ｍｌ当たり１００×デンハート溶液：１０ｇＦｉｃｏｌｌ−４００、１０ｇのポリビニルピロリドン、１０ｇウシ血清アルブミン（ＰｅｎｔａｘフラクションＶ）および２０μｇ／ｍｌ変性ニシン精子ＤＮＡ中でのハイブリダイゼーション、続いての６８℃における５×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳにおける２回の３０分間の洗浄および５６℃における２×ＳＳＣ、０.１％ＳＳＣにおける２回の３０分間の洗浄であった。ハイブリダイゼーションの後、膜をサランラップで被覆し、コニカＸ−線フィルムおよび正規増感スクリーンを備えたコダックＸ−Omaticカセットを用い、−７０℃で一晩オートラジオグラフィーに付した。
【００９７】
その結果、ハイブリダイズする断片が分析した全ての菌類で見出され、非常に強いハイブリダイゼーションシグナルがＡ．ニゲール、Ａ．チュービゲンシス、Ａ．フェティダスで見出され、他方、調査した他の株でははっきりしたハイブリダイゼーションシグナルが見出された。
【００９８】
実施例１１：他のプロモーター断片を用いる選択系の適用
Ａ．ニゲールａｂｆＡ遺伝子（Flipphiら, 1994)およびＡ．ニゲールａｂｆＢ遺伝子（Flipphiら，1993)からのプロモーター断片を含有するプラスミドを構築した。ａｂｆＡプロモーター断片を含有する構築体については、ｐＩＭ９００（Flipphiら, 1994)からの１.４ｋｂ  ＸｈｏＩ／ＰｓｔＩ断片を、実施例１に記載したごとくにＳａｌＩ／ＰｓｔＩ消化ｐＡｌｔｅｒ（Promega)に連結した。Ａｌｔｅｒｅｄ  ＳｉｔｅｓＩＩイン・ビトロ突然変異誘発系（Promega)を用い、ＸｈｏＩ制限部位を翻訳開始部位に対して−８３位から−８８位に創製した（Flipphiら, 1994)。得られたプラスミドから、９５３ｂｐ  ＳｓｔＩ／ＸｈｏＩ断片を単離した。この断片およびｐＩＭ１３０からの１.５ｋｂ  ＸｈｏＩ断片を、ＳｓｔＩ／ＸｈｏＩで消化したpBluescript(Stratagene)に連結した。１.５ＸｈｏＩ断片の正しい向きを含有するプラスミドを、ＢｇｌＩＩを用いる消化によって同定した。得られたプラスミドはｐＡＰ８である。
【００９９】
同様に、ａｂｆＢプロモーターからの９１０ｂｐ  ＰｓｔＩ断片をｐＩＭ９９１（Flipphiら，1993)から単離し、ＰｓｔＩ消化のｐＥＭＢＬ１９に連結した。ＳａｌＩを用いて得られたプラスミドを消化し、プラスミドｐＩＭ１３０からの１.５ｋｂ  ＸｈｏＩ断片と連結した。正しい向きの両断片を含有するプラスミドを、ＢａｍＨＩを用いる消化によって同定した。得られたプラスミドはｐＩＭ１３２である。
【０１００】
１４５０  ｂｐ  ＸｂａＩ／ＸｈｏＩ断片をベクターｐＡｌｔｅｒにクローニングすることによって、Ａ．ニゲールｐｇａＩＩからの断片を含有する第３のプラスミドを構築した。改変部位(altered sites)ＩＩイン・ビトロ突然変異誘発系（Promega)を用い、翻訳開始部位に対して−１０７ないし−１１２位にＸｈｏＩ制限部位を創製した（Bussinkら, 1991)。得られたプラスミドから、１.２ｋｂ  ＸｂａＩ／ＸｈｏＩ断片を単離した。この断片およびｐＩＭ１３０からの１.５ｋｂ  ＸｈｏＩ断片を、ＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化したpBluescript（Stratagene)に連結した。１.５ＸｈｏＩ断片の正しい向きを含有するプラスミドを、ＨｉｎＤＩＩＩを用いる消化によって同定した。得られたプラスミドはｐＩＩＰ７である。同一ｐｇａＩＩ遺伝子から、２２３ｂｐ  ＨｉｎＤＩＩＩ／ＰｓｔＩ断片（Bussinkら，1992)を単離し、消化したｐＥＭＢＬ１９のＨｉｎＤＩＩＩ／ＰｓｔＩに連結した。得られたプラスミドをＳａｌＩを用いて消化し、プラスミドｐＩＭ１３０からの１.５ｋｂ  ＸｈｏＩ断片と連結した。正しい向きの両断片を含有するプラスミドを、ｉｎｄＩＩＩを用いる消化によって同定した。得られたプラスミドはｐＨＰＩＩである。
【０１０１】
ｐｇａＩＩ断片を保有するプラスミドの場合に、ａｂｆプロモーター断片（プラスミドＡＰ８およびｐＩＭ１３２）および１％ポリガラクツロン酸（ＵＳＢ Chemicals)を有する構築体を用いる形質転換実験でインデューサーとして１０ｍＭ  Ｌ−アラビトールを用い、実施例２に記載した形質転換によって、全ての４種のプラスミドをＡ．ニゲールＮＷ２１９に導入した。プラスミドＡＰ８およびｐＩＭ１３２については、形質転換体が高頻度で見出され、プラスミドｐＩＩＰ７およびｐＨＰＩＩを含有するｐｇａＩＩプロモーター断片を用いる形質転換実験では、５および７の形質転換のみが各々見出された。
【０１０２】
プラスミドｐＡＢ８およびｐＩＭ１３２（ａｂｆプロモーター断片）を用いる形質転換実験から得られた形質転換体を、１０ｍＭ  Ｌ−アラビノース／５０ｍＭソルビトール、１０ｍＭ  Ｌ−アラビトール／５０ｍＭ  Ｄ−グルコースおよび５０ｍＭ  Ｄ−グルコースを含有するＭＭを用い、実施例３に記載したごとくに表現型により分析した。予測された表現型：１０ｍＭ  Ｌ−アラビトール／５０ｍＭソルビトールでの増殖、１０ｍＭ  Ｌ−アラビトール／５０ｍＭ  Ｄ−グルコースおよび５０ｍＭ  Ｄ−グルコースでの非増殖が、プラスミドｐＡＰ８から得られた２９の形質転換体からの１０で、およびプラスミドｐＩＭ１３２から得られた３０の形質転換体のうちの１３で見出された。プラスミドｐＩＩ７およびｐＨＰＩＩから得られた形質転換体を、１％ポリガラクツロン酸、１％ポリガラクツロン酸／５０ｍＭ  Ｄ−グルコースおよび５０ｍＭ  Ｄ−グルコースを含有するＭＭでテストした。しかしながら、形質転換体の両クラスは、予測された表現型を示さず、全ての形質転換体は全ての３つの培地で増殖できた。これは、これらの形質転換体がｐｙｒＡ遺伝子座における二重交差に由来することを示唆する。
【０１０３】
プラスミドを含有するｐｇａＩＩプロモーター断片についての結果に基づき、本発明者らは、誘導を改良することによって形質転換頻度を改良し得るか否かをテストした。本発明者らは、ポリガラクツロナーゼに対するモノマーインデューサーが利用できず、かくして、ポリマーは分解されてインデューサーを放出して発現を与える必要があるので、インデューサーの欠如のため形質転換は多かれ少なかれ失敗したと推定した。本発明者らは、少量のウリジンを用いる培地の補充がこの問題を克服し得るか否かをテストした。このため、各々、０、０.００１、０.００５、０.０１、０.１、１、５および１０ｍＭの増大させる量のウリジンと組み合わせた、ａｂｆＢの誘導を与える、１％オートスペルトキシランを含有する培地で、ＮＷ２１９および形質転換体ＮＷ２１９：：ｐＩＭ１３２＃３０をテストした。本実験では、受容体株ＮＷ２１９は０.０１ｍＭ未満のウリジンを含有する培地では増殖せず、他方、ＮＷ２１９：：ｐＩＭ１３２＃３０形質転換体株は使用したすべての条件下で増殖した。しかしながら、胞子形成の程度およびコロニー形態は変化し、野生型様胞子形成を与える最低のウリジン濃度は０.０１ｍＭウリジン程度である。
【０１０４】
これらの結果に基づき、１％レモンペクチン（エステル化の程度４５％）（Copenhagem Pectin factory)を含有する実施例２に記載したＭＭＳおよび、各々、ウリジン補充０.０１ｍＭおよび０.００５ｍＭの対する条件を用いて、プラスミドｐＩＩＰ７およびｐＨＰＩＩを用いるＡ．ニゲールＮＷ２１９形質転換を反復した。この結果、判明した増大する数の形質転換体が得られた。前記した１％レモンペクチン、１％レモンペクチン／５０ｍＭ  Ｄ−グルコースおよび５０ｍＭ  Ｄ−グルコースを含有するこれらの形質転換体をテストし、それにつき予測される表現型は、各々、増殖、非増殖および非増殖である。３０の形質転換体のうちｐＩＩＰ７の得られた形質転換体１０につき、および３０の形質転換体のうちｐＨＰＩＩ形質転換体９つにつき、予測された表現型が見出された。
【０１０５】
予測される表現型を示す形質転換体の選択は、サザン分析によって分析した。ＤＮＡを単離し、実施例３におけるごとくに分析した。プラスミドｐＡＰ８を含有するａｂｆＡプロモーター断片から得られた形質転換体については、ＣｌａＩを用いて、ｐＩＭ１３２（ａｂｆＢ）由来形質転換体についてはＣｌａＩを用い、およびｐｇａＩＩプラスミドｐＩＩＰ７およびｐＨＰＩＩに由来する形質転換体についてはＣｌａＩを用いてＤＮＡを消化した。以下の放射性断片：ｐｙｒＡ遺伝子の３.８ｋｂ  ＸｂａＩおよび１.２ｋｂ  ＣｌａＩ断片を用いるハイブリダイゼーション後に得られたオートラジオグラフィーに基づき、見積もられたコピー数に基づいて形質転換体を選択した。以下の形質転換体を選択した；ＡＰ８／１６（ａｂｆＡ）、ＮＷ２１９：：１３２＃８（２コピー）およびＮＷ２１９：：１３２＃３０（３−４コピー）（ａｂｆＢ）、ＮＷ２１９：：ｐＩＩＰ７＃３（２コピー）およびＮＷ２１９：：ｐＨＰＩＩ＃９（２コピー）（ｐｇａＩＩ）。
【０１０６】
選択した形質転換体を実施例４に記載したごとくに突然変異誘発に付した。アラビノフラノシダーゼ抑制突然変異体はＭＭ＋５０ｍＭ  Ｄ−グルコースおよびＭＭ＋１０ｍＭ  Ｌ−アラビトール／５０ｍＭ  Ｄ−グルコースで選択し、他方、ポリガラクツロナーゼ抑制突然変異体はＭＭ＋５０ｍＭ  Ｄ−グルコースおよびＭＭ＋１％レモンペクチン／５０ｍＭ  Ｄ−グルコースで選択した。４−７日後に、プレート当たり５−１０の突然変異体コロニーが見出され、これは、その形態に基づき、３つのクラス：大きくて十分胞子形成するコロニー、中程度のサイズで十分胞子形成するコロニーおよび小さくて貧弱な胞子形成コロニーに分けられる。これらの突然変異体のうちの２０のランダム選択をなし、選択した突然変異体を、異なる炭素源または基質を含有する培地でテストした。アラビノフラノシダーゼ突然変異体コロニーは、Ｄ−グルコース、Ｄ−グルコース／Ｌ−アラビトールおよびＬ−アラビトールを含有する培地で増殖でき、他方、親株は炭素源としてＬ−アラビトールを含有する培地でのみ増殖できることが判明した。同様に、ポリガラクツロナーゼ突然変異体はＭＭ＋５０ｍＭ  Ｄ−グルコース、ＭＭ＋１％レモンペクチン／５０ｍＭ  Ｄ−グルコース、およびＭＭ＋１％レモンペクチンでも増殖できた。加えて、アラビノフラノシダーゼ突然変異体（各々の２０）を、実施例４に記載されているごとくに色原体基質メチルウンベリフェリル−α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼでテストした。親株は基質の蛍光によって検出してＤ−グルコース／Ｌ−アラビトールを含有する培地のいずれのアラビノフラノシダーゼ発現も示さなかったが、突然変異体は種々のレベルの発現を示し、最高レベルはＤ−グルコース培地で選択された突然変異体で見出された。
【０１０７】
ポリガラクツロナーゼ突然変異体はＭＭ＋１％レモンペクチン／５０ｍＭグルコースでテストし、プレートの接種から２および３日後に、RiedおよびCollmer(1985)によって記載されているごとく染色することによって、ポリガラクツロナーゼ活性を可視化した。この場合、親株については、小さいハロー(halo)が見出され、他方、突然変異体では、増大したハロー形成についての種々の程度が検出された。
【０１０８】
実施例４に従い、ＦＯＡを含有する培地で非発現突然変異体も選択された。この株については、この株については、ＮＷ２１９：１３２＃３０（ａｂｆＢ）を突然変異させ、ＭＭ＋１０ｍＭ  Ｌ−アラビトール＋１ｍｇ／ｍｌ  ＦＯＡ＋１０ｍＭウリジンで平板培養した。７−１０日後、突然変異体を選択し、１０ｍＭ  Ｌ−アラビトール／５０ｍＭソルビトール、１０ｍＭウリジンを含有し、エンド−アラビナン発現の検出のための０.５％ＡＺＣＬ−アラビナン（Megazyme, Dydney、オーストラリア）を含有する頂部寒天を有するＭＭ上で平板培養した。テストした３０の形質転換体のうち２つ、１３２／３０  Ｆ１２およびＦ２６は、エンド−アラビナン活性の不存在の指標である、基質からの色素の放出ができなかった。１０ｍＭ  Ｌ−アラビトールおよび１０ｍＭウリジンを含有する液状ＭＭにおけるこれらの形質転換体の培養および培養濾液中でのアラビノフラノシダーゼ活性の測定に際して、少なくとも４倍の活性の減少が見出された。
【０１０９】
株ＮＷ２１９：：ｐＩＩＰ７＃３を突然変異させ、１％レモンペクチン／５０ｍＭソルビトール、１０ｍＭウリジンおよび１ｍｇ／ｍｌ  ＦＯＡを含有するＭＭで平板培養した。６−１０日間のプレートのインキュベーションの後、突然変異体を拾い、前記したごとくにポリガラクツロナーゼ活性につきスクリーニングした。選択した６５の突然変異体のうち、３つの突然変異体がポリガラクツロナーゼ活性染色の後に低下したハロー形成を有することが見出され、ポリガラクツロナーゼ発現の減少を示した。
【０１１０】
本明細書を出願する際にそのコピーを含ませ、その実施例も本明細書にコピーした同時係属欧州特許出願であるＥＰ  ９５２０１７０７.７の実施例７、８および１１
ＥＰ  ９５２０１７０７.７の実施例７
プラスミドｐＩＭ２００を用いるA.ニゲールの形質転換
２％グルコース、０.５％酵母エキス、０.２％カザミノ酸（無ビタミン）、２ｍＭロイシン、１０μＭニコチンアミド、１０ｍＭウリジンを補足したＭＭよりなる２５０ｍｌの培養基に、株ＮＷ１５５（ｃｓｐＡ１、ａｒｇＢ１３、ｐｙｒＡ６、ｎｉｃＡ１、ｌｅｕＡ１、ｐｒｔＦ２８）（ＮＥ２２８由来、Van den Homberghら, 1995)１ｍｌ当たり１＊１０６胞子を接種し、オービタルNew Brunswick振盪機中、３０℃および２５０ｒｐｍにて１６−１８時間増殖させた。Buchner漏斗および温和な吸引を用い、菌糸体をMyracloth (ナイロンゲージ）上に収穫し、ＳＰ６（ＳＰ６：０.８％  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６.０）で数回洗浄した。１５０ｍｇのNovozyme２３４を、１ｇ（湿潤重量）の菌糸体を添加し、注意深く再懸濁した２０ｍｌのＳＭＣ（ＳＭＣ：１.３３Ｍソルビトール、５０ｍＭＣａＣｌ２、２０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ５.８）に溶解させた。この懸濁液を３０℃にて１−２時間温和に振盪しつつインキュベートし、各３０分毎に菌糸体を注意深く再懸濁し、試料を採取して、血球計を用いてプロトプラスト形成をモニターし、プロトプラストを計数した。十分なプロトプラストが存在すれば（１＊１０８を超える）、これらを注意深く再懸濁し、菌糸体デブリスを滅菌ガラスウール栓での濾過によって除去した。ベンチ遠心機にて、３０００ｒｐｍおよび４℃における１０分間の遠心によってプロトプラストを収集し、上清を除去し、ペレットを注意深く５ｍｌのＳＴＣ（ＳＴＣ：１.３３Ｍソルビトール、５０ｍＭ  ＣａＣｌ・、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７.５）に再懸濁させた。この洗浄工程を２回反復し、プロトプラストを最終的に１ｍｌ当たり１＊１０８の密度にてＳＴＣに再懸濁させた。
【０１１１】
Ａ．ニゲール遺伝子（１０−２０μｌ  ＴＥに溶解）を含有する２０μｇのｐＩＭ２００  ＤＮＡおよび５μｇのｐＧＷ６３５を５０μｌのＰＥＧ緩衝液（ＰＥＧ緩衝液：２５％ＰＥＧ−６０００、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ  ｐＨ７.２）と共に２００μｌのプロトプラスト懸濁液に添加することによって形質転換を行い、ピペットで数回吸い上げたり降ろしたりすることによって温和に混合し、室温で２０分間インキュベートした。この期間の後、２ｍｌ  ＰＥＧを添加し、撹拌ミキサーで緩慢に混合して、室温で５分間インキュベートし、次に４ｍｌのＳＴＣを添加して、緩やかにボルテックスミキサーで混合した。次いで、この懸濁液の１ｍｌ分を、４ｍｌの０.９５Ｍスクロースで浸透圧的に安定化させた頂部寒天に添加し、浸透圧的に安定化させたプレート上に注いだ。対照として、ｐＧＷ６３５を用い、Ａ．ニゲールも形質転換した。
【０１１２】
ＥＰ  ９５２０１７０７.７の実施例８：形質転換体の分析
１％オートスペルトキシランおよび１ｍＭ  ４−メトルウンベリフェリル−β−Ｄ−キシロシドを含有するＭＭ上で平板培養することによって、実施例７で得られたｐＩＭ２００からの形質転換体を表現型により分析した。テストした２６の形質転換体のうち、５つは増大した蛍光を有した。参照としてのＰＹＲ＋と共にこれらの形質転換体を、１％オートスペルトキシランを含有するＭＭ上で２０、２７および４２時間増殖させ、しかる後、ＰＮＰ−Ｘに向かうβ−キシロシダーゼ活性を測定した。結果を表Ｃにまとめる。
【０１１３】
増大したレベルのβ−キシロシダーゼ活性が５つの選択した形質転換体全てで見い出され、最高レベルは野生型活性の３０倍を超えていた。これらの結果は、ＥＰ  ９５２０１７０７.７の実施例３に記載したごとくに調製した抗β−キシロシダーゼ抗体を用いるウェスタンブロット分析、および供給業者の指示によるＢｉｏ−ＲａｄイムノブロットＧＡＲ−ＡＰアッセイによって確認した。
【表Ｃ】
2007244387.tif 000005
ＥＰ  ９５２０１７０７.７の実施例１１：Ａ．ニゲールｘｌｎＲ遺伝子の破壊
実施例１１．１：破壊プラスミドｐＩＭ２０３およびｐＩＭ２０４の構築
ＰＣＲによりｘｌｎＤ遺伝子の内部断片を生じさせることによって、遺伝子破壊プラスミドｐＩＭ２０３およびｐＩＭ２０４を構築した。ｘｌｎＲ配列（配列番号８）に由来するオリゴヌクレオチドを用い、断片を生じさせた。キシロース００１は、１１５７位ないし１１７６位に由来し、キシロース００４は３１４７位ないし３１６４位に由来した。最終容量１００μｌ中の１０μｌの１０＊反応緩衝液（１００ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.３、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０.０１％ゼラチン）、１６μｌの１.２５ｍＭの各４種のデオキシヌクレオチド三リン酸、１ｎｇのプラスミドｐＩＭ２００  ＤＮＡおよび１μｇの各オリゴヌクレオチドを含有するＰＣＲによって断片を生じさせた。この反応混合物を混合し、１μｌのＴＡＱポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）（Life Technologies)を添加した。９２℃における３分間のインキュベーションによってＤＮＡを変性させ、続いて１分間の９２℃、１.５分間の５２℃および１.５分間の７２℃の２５サイクルを行った。これらの２５サイクルの後、混合物を７２℃で５分間インキュベートした。アガロース電気泳動による反応生成物の分析により、約２０００ｂｐの断片が明らかとなり、これは遺伝子の配列に基づくと、予測されるサイズに対応する。得られた断片をベクターｐＧＥＭ−Ｔ（Promega)にサブクローニングし、プラスミドｐＩＭ２０２が得られた。プラスミドｐＩＭ２０３は、Ａ．ニジュランスａｒｇＢ遺伝子（Upshallら，1986)を含有するｐＩＬＪ１６のＳｍａＩ／ＰｓｔＩ断片（Johnstoneら, 1985)を、ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ消化のｐＩＭ２０２ベクターに連結することによって構築した。プラスミドｐＩＭ２０４は、Ａ．トゥービゲネシスのｘｌｎＡプロモーターのＵＡＳの制御下にあるｐｙｒＡ遺伝子を含有するｐＩＭ１３０のＮｓｉ１／Ｘｂａ１断片（本明細書、Ｅｐ  ９５２０２３４６.３）を、ＳｐｅＩ／Ｎｓｉ１消化のｐＩＭ２０２ベクターに連結することによって構築した。
【０１１４】
実施例１１.２：Ａ．ニゲールにおけるｘｌｎＤ遺伝子の破壊
形質転換における選択マーカーとして、同時係属ＥＰ出願の実施例１１.１に記載されたごとき、ｘｌｎＤ内部断片ならびにａｒｇＢ遺伝子（ｐＩＭ２０３）またはｐｙｒＡ遺伝子（ｐＩＭ２０４）を含有するプラスミドを用いて、Ａ．ニゲールｘｌｎＤ遺伝子を破壊した。このために、各々、アルギニンまたはウリジン原栄養体につき選択するプラスミドｐＩＭ２０３およびｐＩＭ２０４を用い、Ａ．ニゲールＮ９０２（ａｒｇＢ１５、ｃｓｐＡ１、ｆｗｎＡ１、ｍｅｔＢ１０、ｐｙｒＡ５）を、本明細書の実施例２に記載したごとくに形質転換した。得られた形質転換体を、同時係属ＥＰ出願の実施例８に記載したごとくに、１％キシランプレート上のメチルウンベリフェリル−β−Ｄ−キシロシドに対する活性につきスクリーニングした。形質転換体の両群について、２０をスクリーニングした。これらの形質転換体のうち、各群の１つは２４時間の増殖の後にＭＵＸ活性のひどく低下したレベルを有した。同時係属出願の実施例３に記載したごとき、選択した形質転換体のサザン分析は、ｐＩＭ２０３形質転換体につき、同種ｘｌｎＤ遺伝子座における複数のコピー取込みを示した。ｐＩＭ２０４形質転換体の場合において、ｘｌｎＤ遺伝子座における単一の同種取込みが起こった。これらの形質転換体の、同時係属ＥＰ出願の実施例８に記載したごとき、ＰＮＰ−Ｘ活性についての分析は、β−キシロシダーゼ活性における少なくとも１００倍の減少であることを明らかとした。
【０１１５】
実施例１１.３：Ａ．ニゲールのキシラン分解系の発現におけるｘｌｎＤ遺伝子座の過剰発現および不活化の効果
キシラン分解スペクトルの発現におけるｘｌｎＤ発現の効果を測定するために、Ａ．ニゲールＮ９０２、Ｎ９０２における２つのｘｌｎＤ複数のコピー−形質転換体ならびにｘｌｎＤ遺伝子破壊株を液体培地中で培養した。これは、１８時間の１％フルクトース中の予備培養の後に、炭素源としての２％オートスペルトキシランまたは３％Ｄ−キシロースへの導入実験で行った。ベータ−キシロシダーゼ活性は、培養濾液におけるＰＮＰ−Ｘ活性として決定した。両Ｃ源に関し、両（ｐＩＭ２０３およびｐＩＮ２０４）不活化形質転換体に対するＰＮＰ−Ｘ活性のほとんどの不存在に対するｐＩＭ２００形質転換体につきはっきりした過剰発現がスクリーニングできた。ｘｌｎＤ遺伝子破壊形質転換体はエンド−キシラナーゼ発現の最初の低下したレベルを示し、しかしながら、これは最終的に１６時間後には時間内に増大し、Ａ．ニゲール野生型と比較して増大した活性レベルとなった。かくして、β−キシロシダーゼの無いキシラナーゼ調製が得られた。
【０１１６】
培養濾液は、Dinex系およびパルスド・アンペロメトリック（Pilsed Amperometric)検出を用い、ＨＰＬＣ分析によって引き続いて分析した。このために、１ｍｌの培養濾液を収穫後に直ちに沸騰させて、キシラン分解酵素を不活化し、しかる後、試料を１０分間遠心した（４℃における１４,０００ｒｐｍ、Eppendorf遠心機)。得られた上清をビデスト(bidest)中に５倍希釈し、２０μｌをディオネックスカルノパック(Dionex  CarboPac)１００カラムを用いるＨＰＬＣによって分析した。分析は、野生型および過剰発現形質転換体においては、初期段階でのみ、キシロースオリゴマーが培養濾液で、破壊突然変異体キシロビオースで検出でき、小エクステント(lesser extent)キシロトリオースが培養濾液で蓄積し、かくして、キシロオリゴマーのための源、特にキシロビオースおよびキシロトリオースが得られた。
【参考文献】
【０１１７】
2007244387.tif 000006
2007244387.tif 000007
2007244387.tif 000008
2007244387.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】プラスミドｐＩＭＩ３０の構築の概要図。
【図２】活性の測定結果。
【図３】ＨＰＬＣ分析における結果を示す図。
【図１】
2007244387.tif 000010
【図２】
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【図３】
2007244387.tif 000012
【配列表】
2007244387000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月27日(2007.7.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007244387000001.app