(57)【要約】【課題】高速な観察が可能な顕微鏡装置を提供する。【解決手段】（ａ）に示す回折格子５１は、板状体５２が、透明なガイド５４の中を、矢印方向にスライドするようになっており、移動方向に直角な方向を有する格子パターン５３ａと、移動方向に６０°傾いた方向を有する格子パターン５３ｂと、移動方向に−６０°傾いた方向を有する格子パターン５３ｃが形成されている。板状体５２をスライドさせることにより、格子パターン５３ａ、５３ｂ、５３ｃのうちの一つを選択して、回折格子として使用可能なようになっている。それにより、回折格子を、０°、１２０°、２４０°回転させたのと同じ効果が得られる。この格子パターンの選択のための位置合わせは、高精度を要しないので、回折格子を回転させる場合に比して、高速に格子パターンの選択が可能である。【選択図】  図７
2007199397.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光路中に置かれた回折格子の像を被観察物の表面に結像させて照明を行う照明光学系と、前記照明光学系により照明された前記被観察物の像を、前記回折格子上に中間像として結像させる結像光学系と、前記中間像の像を形成するリレー光学系とを備えた顕微鏡装置であって、前記回折格子は、格子パターンの方向が互いに異なる複数の回折格子が板状体に各々別個に形成されたものであり、前記板状体を連続的に移動させること、或は断続的に移動させることにより、前記照明光学系により照明される回折格子を順次変化させるともに、前記被観察物の表面に結像する前記回折格子の像の位相をも変化させることが可能とされていることを特徴とする顕微鏡装置。
【請求項２】
光路中に置かれた回折格子の像を被観察物の表面に結像させて照明を行う照明光学系と、前記照明光学系により照明された前記被観察物の像を、前記回折格子上に中間像として結像させる結像光学系と、前記中間像の像を形成するリレー光学系とを備えた顕微鏡装置であって、前記回折格子が、向きの異なる複数の格子パターンを重畳させて形成されていることを特徴とする顕微鏡装置。
ただし、前記回折格子を移動させる方向を基準にとり、任意の２つの格子パターンの格子の方向が前記基準方向となす角をそれぞれξm、ξn、それぞれの格子ピッチをＰm、Ｐnとするとき、
Ｐm／cos（ξm）＝Ｐn／cos（ξn）の関係が成り立たないものとする。
【請求項３】
少なくとも前記回折格子から前記被観察物に至る前記照明光学系を構成する光学素子と、前記被観察物から前記回折格子に至る前記結像光学系を構成する光学素子が共用されていることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
光路中に置かれた回折格子の像を被観察物の表面に結像させて照明を行う照明光学系と、前記照明光学系により照明された前記被観察の像を結像させる結像光学系とを備えた顕微鏡装置であって、前記回折格子は、格子パターンの方向が互いに異なる複数の回折格子が板状体に各々別個に形成されたものであり、前記板状体を連続的に移動させること、或は断続的に移動させることにより、前記照明光学系により照明される回折格子を順次変化させるともに、前記被観察物の表面に結像する前記回折格子の像の位相をも変化させることが可能とされていることを特徴とする顕微鏡装置。
【請求項５】
光路中に置かれた回折格子の像を被観察物の表面に結像させて照明を行う照明光学系と、前記照明光学系により照明された前記被観察の像を結像させる結像光学系とを備えた顕微鏡装置であって、前記回折格子が、向きの異なる複数の格子パターンを重畳させて形成されていることを特徴とする顕微鏡装置。
ただし、前記回折格子を移動させる方向を基準にとり、任意の２つの格子パターンの格子の方向が前記基準方向となす角をそれぞれξm、ξn、それぞれの格子ピッチをＰm、Ｐnとするとき、
Ｐm／cos（ξm）＝Ｐn／cos（ξn）の関係が成り立たないものとする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は顕微鏡装置、さらに詳しくは、超解像度を有する構造化照明顕微鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光学顕微鏡等の結像光学系による像形成においては、結像光学系固有の伝達関数が存在し、その伝達関数により結像される物体像の特性が制限される。さらに詳しくは、伝達する光学像のフーリエ成分（空間周波数成分）の内、その伝達関数によって定まる特定の空間周波数領域のみが伝達し、残りの空間周波数成分はカットされる。
【０００３】
例えば、一般の光学顕微鏡においては、対物レンズの開口数（ＮＡ）で定まるカットオフ周波数と呼ばれる空間周波数ｆcutoff、
ｆcutoff＝２ＮＡ／λ （ただし、λ：光の波長）
が存在し、入力した光学像のフーリエ成分の内、そのカットオフ周波数より高い空間周波数成分を結像させることはできない。
【０００４】
対物レンズの開口数は、対物レンズが観察物体Ｏより取り込める光の円錐の頂角の１／２のサイン関数に観察物体と対物レンズ前面の間の媒質の屈折率を掛け合わせたものであり、例えば空気中にある物体に対しては、開口数は１以上とならないので、カットオフ周波数は２／λ以上にはならない。したがって、空気中に置かれた光の波長の１／２より小さい周期を持つ微細構造は、一般の光学顕微鏡で解像できない。
【０００５】
ところが、観察物体と結像光学系の間に空間周波数を変調する手段を挿入することにより、結像光学系では伝達できない空間周波数領域の観察物体の空間周波数成分を結像に反映させることができる。ただし、その場合、結像光学系により結像された観察物体の像は変調を受けているので、その変調の回復（復調）手段を合わせて用いることにより、正しい観察物体像が形成できる。これを光学顕微鏡に適用した場合、従来のカットオフ周波数より高い空間周波数を持つ観察物体の微細構造を解像できるようになる。これを超解像と呼ぶ。
【０００６】
このような超解像を利用した顕微鏡装置は、生体標本などの被観察物を超解像観察するために使用されている。（特許文献１，２，非特許文献１，２など参照）。前述のように、この手法では、空間変調された照明光で被観察物の構造の空間周波数を変調し、解像限界を超える高い空間周波数の情報を顕微鏡光学系の結像に寄与させる。
【０００７】
但し、前述のように、超解像画像を観察するためには変調された被観察物の像（変調像）を復調する必要がある。復調の方法は大別して２種類あり、光学的な復調（非特許文献１，２参照）と、演算による復調（特許文献１，２参照）とがある。なお、光学的な復調は、回折格子などの空間変調素子を用いて変調像を再変調することによって実現する。
【特許文献１】特開平１１−２４２１８９号公報
【特許文献２】米国再発行特許発明第３８３０７号明細書
【非特許文献１】W.Lukosz,"Optical systems with resolving powers exceeding the clasical limit.II",Journal of the Optical Society of America,Vol.37,PP.932,1967
【非特許文献２】W.Lukosz and M.Marchand,Opt. Acta. 10,241,1963
【０００８】
この他、公知技術でないが、本願の発明者等は、照明光学系中に置かれた回折格子の像を、被観察物の表面に結像させて照明を行い、前記照明光により照明された前記被観察物の像を、結像光学系により前記回折格子状に中間像として結像させ、前記回折格子を通過した前記中間像を、リレー光学系により、撮像素子上に結像させる顕微鏡装置にであって、少なくとも前記回折格子から前記被観察物に至る前記照明光学系を構成する光学素子と、前記被観察物から前記回折格子に至る前記結像光学系を構成する光学素子が共用されている顕微鏡装置の発明を行い、特願２００５−２９９３２９号として特許出願している（先願発明という）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上述べた何れの方法においても、超解像が得られる方向は、回折格子の格子の長さ方向と直角な方向である。よって、２次元的な超解像を得ようとすると、回折格子の向きを変化させて、複数方向（通常は３方向）での撮像を行い、その結果を演算処理する必要がある。
【００１０】
このような方法を実現する手段として、最も一般的に用いられている方法は、回折格子を回転させて、それに対応する像の撮像を行う方法であり、先願発明においても、その実施の形態においてはこの方法を採用している。
【００１１】
しかしながら、回折格子を回転させて位置決めする方法では、位置決めに時間がかかるという問題点がある。特に生体観察に使用されるLive Cell等の観察には、高速での撮像が必要とされ、回折格子を回転させて位置決めする方法では、実用的でないという問題点がある。
【００１２】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたもので、高速な観察が可能な顕微鏡装置を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
光路中に置かれた回折格子の像を被観察物の表面に結像させて照明を行う照明光学系と、前記照明光学系により照明された前記被観察物の像を、前記回折格子上に中間像として結像させる結像光学系と、前記中間像の像を形成するリレー光学系とを備えた顕微鏡装置であって、前記回折格子は、格子パターンの方向が互いに異なる複数の回折格子が板状体に各々別個に形成されたものであり、前記板状体を連続的に移動させること、或は断続的に移動させることにより、前記照明光学系により照明される回折格子を順次変化させるともに、前記被観察物の表面に結像する前記回折格子の像の位相をも変化させることが可能とされていることを特徴とする顕微鏡装置である。
【００１４】
前記課題を解決するための第２の手段は、光路中に置かれた回折格子の像を被観察物の表面に結像させて照明を行う照明光学系と、前記照明光学系により照明された前記被観察物の像を、前記回折格子上に中間像として結像させる結像光学系と、前記中間像の像を形成するリレー光学系とを備えた顕微鏡装置であって、前記回折格子が、向きの異なる複数の格子パターンを重畳させて形成されていることを特徴とする顕微鏡装置である。
【００１５】
ただし、前記回折格子を移動させる方向を基準にとり、任意の２つの格子パターンの格子の方向が前記基準方向となす角をそれぞれξm、ξn、それぞれの格子ピッチをＰm、Ｐnとするとき、
Ｐm／cos（ξm）＝Ｐn／cos（ξn）の関係が成り立たないものとする。
【００１６】
前記課題を解決するための第３の手段は、前記第１の手段又は第２の手段であって、少なくとも前記回折格子から前記被観察物に至る前記照明光学系を構成する光学素子と、前記被観察物から前記回折格子に至る前記結像光学系を構成する光学素子が共用されていることを特徴とするものである。
【００１７】
前記課題を解決するための第４の手段は、光路中に置かれた回折格子の像を被観察物の表面に結像させて照明を行う照明光学系と、前記照明光学系により照明された前記被観察の像を結像させる結像光学系とを備えた顕微鏡装置であって、前記回折格子は、格子パターンの方向が互いに異なる複数の回折格子が板状体に各々別個に形成されたものであり、前記板状体を連続的に移動させること、或は断続的に移動させることにより、前記照明光学系により照明される回折格子を順次変化させるともに、前記被観察物の表面に結像する前記回折格子の像の位相をも変化させることが可能とされていることを特徴とする顕微鏡装置である。
【００１８】
前記課題を解決するための第５の手段は、光路中に置かれた回折格子の像を被観察物の表面に結像させて照明を行う照明光学系と、前記照明光学系により照明された前記被観察の像を結像させる結像光学系とを備えた顕微鏡装置であって、前記回折格子が、向きの異なる複数の格子パターンを重畳させて形成されていることを特徴とする顕微鏡装置である。
【００１９】
ただし、前記回折格子を移動させる方向を基準にとり、任意の２つの格子パターンの格子の方向が前記基準方向となす角をそれぞれξm、ξn、それぞれの格子ピッチをＰm、Ｐnとするとき、
Ｐm／cos（ξm）＝Ｐn／cos（ξn）の関係が成り立たないものとする。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、高速な観察が可能な顕微鏡装置を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の実施の形態の例を説明するが、これらの実施の形態の主なものは、先願発明の実施の形態の改良であるので、まず、先願発明の実施の形態の例を説明する。図１は、先願発明の実施の形態である顕微鏡装置の概略構成図である。図１に示すとおり、顕微鏡装置には、光源１、コレクタレンズ２、レンズ３、励起フィルタ４、ダイクロイックミラー５、レンズ７、回折格子８、第２対物レンズ９、対物レンズ１０、蛍光色素で標識された標本（生体標本など）１１、バリアフィルタ６、レンズ１２、撮像装置（ＣＣＤカメラなど）２５、制御・演算装置（回路やコンピュータなど）４２、画像表示装置４３、アクチュエータ４０、回転ステージ４１が配置される。
【００２２】
このうち、光源１、コレクタレンズ２、レンズ３、励起フィルタ４、ダイクロイックミラー５、レンズ７、回折格子８、第２対物レンズ９、対物レンズ１０が照明光学系ＬＳ１を構成しており、対物レンズ１０、第２対物レンズ９、回折格子８、レンズ７、ダイクロイックミラー５、バリアフィルタ６、レンズ１２が観察光学系ＬＳ２を構成している。また、対物レンズ１０と第２対物レンズ９とが結像光学系ＬＳ２１を構成し、レンズ７とレンズ１２とがリレー光学系ＬＳ２２を構成している。照明光学系ＬＳ１と観察光学系ＬＳ２とは、対物レンズ１０からダイクロイックミラー５までの光路を共有している。
【００２３】
照明光学系ＬＳ１の光源１からの光は、コレクタレンズ２において平行光に変換され、レンズ３により瞳共役面３１に光源像を形成する。その光源像３１からの光は、励起フィルタ４によって波長選択されたのちダイクロイックミラー５によって偏向され、照明光学系ＬＳ１と観察光学系ＬＳ２との共通光路へ入り、レンズ７により標本１１の共役面２２上に集光する。共役面２２から射出した光は、その共役面２２に配置された回折格子８を介して第２対物レンズ９へ入射し、平行光に変換された後、対物レンズ１０を介して標本１１上に回折格子８の像２３を形成する（このとき、対物レンズ１０の後側焦点面に光源像３２が形成される。）。これによって標本１１上は、空間変調された照明光で照明（構造化照明）される。
【００２４】
ここで、回折格子８は、例えば、１次元の周期構造をもつ位相型又は振幅型の回折格子である。特に、振幅型の回折格子は波長特性が良いため、光源１に白色光源を使用できるので好ましい。光源１としては、白色光源の代わりに単一波長の光源を用いてもよいし、レーザ光源からの光を光ファイバで導き、その端面に形成される二次光源を光源１として用いてもよい。
【００２５】
また、構造化照明の輝度分布（回折格子８の像２３の輝度分布）を正弦波状にするために、回折格子８で生じる次数２以上の余分な回折成分を除去することが望ましい。例えば、回折格子８が位相型である場合は、余分な回折成分が生じやすいので、回折格子８よりも後段の適当な箇所（例えば対物レンズ１０の瞳面）で除去するとよい。或いは、回折格子８の濃度分布を予め正弦波状にしておけば、余分な回折成分の発生を抑え、光量の損失を抑えることができる。
【００２６】
さて、構造化照明された光を励起光として標本１１上では蛍光が発生する。このときに対物レンズ１０側から見た標本１１の構造は、構造化照明により変調されている。変調された構造には、モアレ縞が生じている。このモアレ縞は、標本１１が有する微細構造と構造化照明のパターンとが成すモアレ縞であり、標本１１の微細構造が、構造化照明の空間周波数の分だけ低い空間周波数帯域に変換されている。よって、解像限界を超える高い空間周波数の構造の光までもが、対物レンズ１０によって捉えられることになる。
【００２７】
対物レンズ１０によって捉えられた蛍光は、対物レンズ１０及び第２対物レンズ９からなる結像光学系ＬＳ２１により、共役面２２上に標本１１の変調像を形成する。その変調像は、その共役面２２に配置された回折格子８によって再変調される。このようにして生じた再変調像では、空間周波数を変化させた標本１１の構造が、元の空間周波数に戻される。この再変調像に、標本１１の復調像が含まれている。
【００２８】
但し、この再変調像には、復調像にとって不要な回折成分が含まれている。不要な回折成分とは、標本１１から射出された０次回折光に対し回折格子８で生じた±１次回折成分、標本１１から射出された−１次回折光に対する０次回折成分、標本１１から射出された＋１次回折光に対する０次回折成分である。これらの不要な回折成分を再変調像から除去するためには、回折格子８を１周期分若しくはＮ周期分（Ｎは自然数）動かして平均化すればよい。
【００２９】
再変調像からの蛍光は、レンズ７を介してダイクロイックミラー５を透過した後、観察光学系ＬＳ２の単独光路へ入り、バリアフィルタ６を透過したのち、レンズ１２を介して再変調像の拡大像２４を形成する。つまり、回折格子８で再変調された再変調像は、レンズ７及びレンズ１２からなるリレー光学系ＬＳ２２によって、拡大像２４へとリレーされる。この拡大像２４は、撮像装置２５によって撮像され、再変調像の画像データが生成される。なお、撮像装置２５で撮像する場合、回折格子８を１周期若しくはＮ周期（Ｎは自然数）動かしている間、再変調像を蓄積することによって平均化すれば、復調像の画像データを得ることができる。
【００３０】
この画像データは、標本１１を構造化照明によって超解像観察するための情報を含む。その画像データは、制御・演算装置４２によって取り込まれ、演算が施されてから、画像表示装置４３へと送出される。 
以上、本顕微鏡装置は、標本１１の共役面２２から標本１１までの光路を照明光学系ＬＳ１と観察光学系ＬＳ２とで完全に共通光路にすると共に、その共役面２２に回折格子８を配置している。本顕微鏡装置ではこの回折格子８により、標本１１の微細構造の変調を図る。そして、変調された標本１１の微細構造は、この位置に配置された回折格子８により、自動的に再変調される。
【００３１】
なお、回折格子８は、アクチュエータ４０によって格子線に直交する方向Ｄｂへ移動可能である。この移動により、構造化照明の位相が変化する。制御・演算装置４２がアクチュエータ４０及び撮像装置２５を制御し、１フレーム分の画像データを蓄積している間にその位相を１周期分若しくはＮ周期分（Ｎは自然数）だけ変化させることで、その画像データから、構造化照明のパターンと、再変調時に生じた不要な回折成分とを消去する。
【００３２】
また、回折格子８は、回転ステージ４１によってアクチュエータ４０と共に光軸の周りを回転可能である。この回転により、構造化照明の方向が変化する。制御・演算装置４２が回転ステージ４１及び撮像装置２５を制御し、構造化照明の方向を複数方向に変化させる度に画像データを取得すれば、複数方向に亘り超解像観察するための情報を得ることができる。これにより、標本１１の二次元の超解像観察が可能となる。
【００３３】
また、以上の動作に必要なプログラムは、例えばＣＤ−ＲＯＭなどの記録媒体やインターネットを介して制御・演算装置４２に予めインストールされている。
【００３４】
次に、本顕微鏡装置のリレー光学系ＬＳ２２に必要な条件を説明する。
【００３５】
図２は、本顕微鏡装置における観察光学系ＬＳ２の標本１１からレンズ７までの結像光束の開口数を説明する図である。なお、図２では、光束の広がりの変化をわかりやすくするために、回折格子８の像２３と標本１１とをずらして描き、標本１１の共役面２２と回折格子８とをずらして描いている。
【００３６】
図２に示すとおり、標本１１の高い空間周波数の構造で発生した蛍光ＬＡは射出角度が大きいため、通常は破線のとおり進行して対物レンズ１０の瞳径内に入射することができない。しかし、その蛍光ＬＡは回折格子８の像２３（つまり構造化照明）により変調されるので、その射出角度が低周波数側（つまり小角度）に変化したものは、実線のとおり進行して対物レンズ１０の瞳径内に入射することが可能になる。
【００３７】
この蛍光ＬＡは、結像光学系ＬＳ２１によって共役面２２上に結像した後、回折格子８において再変調される。再変調された蛍光ＬＡ’の射出角度は、高周波側（つまり大角度）に戻されている。
【００３８】
このような蛍光ＬＡ’を含む結像光束を導光するためには、リレー光学系ＬＳ２２の物体側開口数ＮＡ’を、予め大きく設定しておく必要がある。
【００３９】
特に、構造化照明の空間周波数（つまり回折格子８の格子周波数）が高いほど、その結像光束の開き角は大きくなるので、リレー光学系ＬＳ２２の物体側開口数ＮＡ’も大きくする必要がある。
【００４０】
但し、一般に、構造化照明による超解像効果は、対物レンズ１０の解像限界の２倍程度である。なぜなら、照明光学系ＬＳ１によって標本１１上に投影される構造化照明の空間周波数は、対物レンズ１０の解像限界が上限だからである。したがって、リレー光学系ＬＳ２２の物体側開口数ＮＡ’は、或る程度大きければ十分である。
【００４１】
次に、制御・演算装置４２の制御に関する動作を説明する。図３は、本顕微鏡装置における観察光学系ＬＳ２の標本１１からレンズ７までの結像光束の開口数を説明する図である。図３に示すとおり、制御・演算装置４２は、再変調像の画像データを取得するに当たり、撮像装置２５の露光開始（ステップＳ１１）から露光終了（ステップＳ１３）までの期間に、構造化照明の位相を１周期分だけ変化させる（ステップＳ１２）。
【００４２】
このようにして取得された画像データは、構造化照明の位相変化中における再変調像の時間積分であり、構造化照明の輝度分布は正弦波状なので、この画像データからは、構造化照明のパターンは消去される。また、この画像データからは、再変調時に生じた不要な回折成分も消去される。よって、この画像データは、復調像を表す。
【００４３】
さらに、制御・演算装置４２は、構造化照明の方向を変化させてから（ステップＳ１５）、再びステップＳ１１〜Ｓ１３の処理を行い、構造化照明のパターンの消去された別の復調像の画像データを取得する。
【００４４】
そして、以上のステップＳ１１〜Ｓ１３における復調像の画像データの取得処理は、構造化照明の方向が予め決められた全方向に設定されるまで（ステップＳ１４ＹＥＳとなるまで）繰り返され、構造化照明のパターンの消去された復調像の画像データが、設定された方向の数だけ取得される。
【００４５】
例えば、制御・演算装置４２は、ステップＳ１１〜Ｓ１３の処理を、構造化照明の方向が０°，１２０°，２４０°の３方向に設定されるまで繰り返し、構造化照明のパターンの消去された３つの復調像の画像データＩ1，Ｉ2，Ｉ3を取得する。これらの復調像の画
像データＩ1，Ｉ2，Ｉ3の間では、超解像の方向が１２０°ずつ異なる。
【００４６】
次に、制御・演算装置４２の演算に関する動作を説明する。
【００４７】
図４は、制御・演算装置４２の演算に関する動作フローチャートである。ここでは、超解像の方向が１２０°ずつ異なる３つの復調像の画像データＩ1，Ｉ2，Ｉ3を取得した場
合の演算を説明する。
【００４８】
先ず、制御・演算装置４２は、３つの復調像の画像データＩ1，Ｉ2，Ｉ3の各々をフー
リエ変換し、波数空間で表現された３つの復調像の画像データＩk1，Ｉk2，Ｉk3を得る（ステップＳ２１）。これら復調像の画像データＩk1，Ｉk2，Ｉk3を図５（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）に示した。
【００４９】
なお、図５（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）において符号Ｉk±1は、変調された状態で（±１次回折光として）結像光学系ＬＳ２１によって伝達された成分（±１次変調成分）を示し、符号Ｉk0は、変調されない状態で（０次回折光として）結像光学系ＬＳ２１によって伝達された成分（０次変調成分）を示す。また、符号Ｄｂは、超解像の方向（構造化照明の方 
向）を示し、符号Ｋは、構造化照明の空間周波数を示す。
【００５０】
続いて、制御・演算装置４２は、３つの復調像の画像データＩk1，Ｉk2，Ｉk3を、図６に示すとおり波数空間上で合成し、１つの合成画像データＩkを得る（ステップＳ２２）。３つの復調像の画像データＩk1，Ｉk2，Ｉk3は、互いのデータ範囲を重複させている（共通の空間周波数成分を含んでいる）ので、制御・演算装置４２は、合成に当たり、重複したデータについてはそれらの平均値をとり、その平均値を合成画像データＩkのデータとする。この平均によって、合成画像データＩkの低周波数成分の寄与が大きくなりすぎるのを抑えることで、高周波数成分の相対的な寄与が小さくなるのを防ぐことができる。
【００５１】
続いて、制御・演算装置４２は、合成画像データＩkを逆フーリエ変換し、実空間で表現された画像データＩを得る。この画像データＩは、１２０°ずつ異なる３方向に亘る標本１１の超解像画像を表現する（ステップＳ２３）。制御・演算装置４２は、この画像データＩを画像表示装置４３へ送出し、超解像画像を表示する。
【００５２】
以上、本顕微鏡装置では、図１に示したとおり標本１１からの光が回折格子８で再変調され、さらに回折格子８を動かして平均化して不要な回折成分を除去することによって復調像を得ている。したがって、復調演算をしない分だけ復調像の画像データは高速に得られる。
【００５３】
しかも、変調と再変調とに同一の回折格子８の同一の領域が用いられるので、仮にその回折格子８に形状誤差や配置誤差があったとしても、変調のパターンと再変調のパターンとを同一にすることができる。したがって、回折格子８の形状誤差や配置誤差は、復調像の画像データに対しノイズを殆ど与えない。このことは、構造化照明の位相を変化させたときや、構造化照明の方向を変化させたときにも同様に当てはまる。したがって、本顕微鏡装置では超解像画像が高精度に得られる。
【００５４】
また、本顕微鏡装置では、標本１１の共役面２２に回折格子８を配置する都合上、その共役面２に形成された再変調像をリレーしてから撮像装置２５で撮像する必要がある。しかし、本顕微鏡装置のリレー光学系ＬＳ２２は、超解像に必要な情報を確実に取得することができる。
【００５５】
また、本顕微鏡装置では、複数の画像データを合成する際に（図４ステップＳ２２）、それら画像データが共通して有する空間周波数成分を平均化するので、高周波数成分の減衰の少ない良好な超解像画像を得ることができる。
【００５６】
以下、本発明の実施の形態の例を３例説明するが、これらの実施の形態の基本的な構成は、図１に示した先願発明の実施の形態とほとんど同じであり、回折格子とその駆動機構の構成が異なるだけであるので、図１と同じ部分にには同じ符号を付してその説明を省略する。
【００５７】
図７に、本発明の実施の形態で使用する回折格子の概要を示す。図７（ａ）に示す回折格子５１は、板状体５２が、透明なガイド５４の中を、矢印方向にスライドするようになっており、移動方向に直角な方向を有する格子パターン５３ａと、移動方向に６０°傾いた方向を有する格子パターン５３ｂと、移動方向に−６０°傾いた方向を有する格子パターン５３ｃが形成されている。板状体５２をスライドさせることにより、格子パターン５３ａ、５３ｂ、５３ｃのうちの一つを選択して、回折格子として使用可能なようになっている。それにより、図１において、回折格子８を、０°、１２０°、２４０°回転させたのと同じ効果が得られる。この格子パターンの選択のための位置合わせは、高精度を要しないので、図１に示すような、回折格子８を回転させる場合に比して、高速に格子パターンの選択が可能である。また、板状体５２を、各格子パターン位置で停止させないで、連続的に往復運動させながら画像データを取得することもできる。
【００５８】
なお、位相の１周期分、又はＮ周期分の積分のための格子パターンの駆動も、板状体５２を矢印の方向に移動させることによって行うことができる。このとき、格子パターン５３ｂ、５３ｃにおいては、格子パターンのピッチをＰとすると、Ｐ／cos（60°）＝２Ｐを一周期と考えて行わなければならないのは言うまでもない。
【００５９】
図７（ｂ）に示す回折格子５５においては、円形板状体５６内の同心円上の場所に、格子パターン５３ａ、５３ｂ、５３ｃが形成されている。これらの格子パターンは全体として矩形をしているが、その矩形の中心と円形板状体５６の中心を結ぶ線に対する格子の方向のなす角度は、格子パターン５３ａで、０°、格子パターン５３ｂで６０°、格子パターン５３ｃで−６０°となっている。
【００６０】
円形板状体５６を、その中心の周りに回転させることにより、格子パターン５３ａ、５３ｂ、５３ｃのうちの一つを選択して、回折格子として使用可能なようになっている。それにより、図１において、回折格子８を、０°、１２０°、２４０°回転させたのと同じ効果が得られる。この格子パターンの選択のための位置合わせは、高精度を要しないので、図１に示すような、回折格子８を回転させる場合に比して、高速に格子パターンの選択が可能である。また、円形板状体５６を、各格子パターン位置で停止させないで、連続的に回転運動させながら画像データを取得することもできる。
【００６１】
なお、位相の１周期分、又はＮ周期分の積分のための格子パターンの駆動も、円形板状体５６を、その中心の周りに回転させることによって行うことができる。このとき、格子パターン５３ｂ、５３ｃにおいては、格子パターンのピッチをＰとすると、Ｐ／cos（60°）＝２Ｐを一周期と考えて行わなければならないのは言うまでもない。
【００６２】
厳密に言うと、格子パターンの移動が円周上で行われるので、格子パターンを直線に沿って移動させた場合と異なり、誤差が発生する。しかし、格子パターンの大きさに比して、円形板状体５６の半径を十分おおきくとっておけば、この回転運動を、実質的に直線運動と見なすことができる。実用上は、格子パターンの矩形のうち、円形板状体５６の半径方向の長さをｈ、円形板状体５６の中心から、格子パターンの矩形の中心までの距離をＲとすると、ｈ／Ｒ≦0.01としておけば、問題は生じない。
【００６３】
図７（ｃ）に示す回折格子５７においては、円筒板状体５８に、格子パターン５３ａ、５３ｂ、５３ｃが形成されている。これらの格子パターンは全体として矩形をしているが、円筒板状体５８の中心線と格子の方向のなす角度は、格子パターン５３ａで、０°、格子パターン５３ｂで６０°、格子パターン５３ｃで−６０°となっている。
【００６４】
円筒板状体５８を、その中心の周りに回転させることにより、格子パターン５３ａ、５３ｂ、５３ｃのうちの一つを選択して、回折格子として使用可能なようになっている。それにより、図１において、回折格子８を、０°、１２０°、２４０°回転させたのと同じ効果が得られる。この格子パターンの選択のための位置合わせは、高精度を要しないので、図１に示すような、回折格子８を回転させる場合に比して、高速に格子パターンの選択が可能である。また、円筒板状体５８を、各格子パターン位置で停止させないで、連続的に回転運動させながら画像データを取得することもできる。
【００６５】
なお、位相の１周期分、又はＮ周期分の積分のための格子パターンの駆動も、円形板状体５６を、その中心の周りに回転させることによって行うことができる。このとき、格子パターン５３ｂ、５３ｃにおいては、格子パターンのピッチをＰとすると、Ｐ／cos（60°）＝２Ｐを一周期と考えて行わなければならないのは言うまでもない。
【００６６】
厳密に言うと、格子パターンが円筒上に形成されているため、その像には、像面湾曲が発生する。しかし、円筒の半径を十分大きくとるか、像面湾曲補正光学系を付加することにより、この像面湾曲を実際上問題とならない程度にすることができる。
【００６７】
図８は、図７（ａ）に示す回折格子５１を、顕微鏡装置に取り付けた様子を示す図である。図１と異なり回転ステージは設けられておらず、回折格子５１は、リニアモータ等の駆動装置６１により、矢印の方向に駆動される。これにより、各格子パターンは、光軸上で、標本１１と光学的に共役な位置に来るようになっている。制御・演算装置４２は、駆動装置６１を介して回折格子５１を駆動して、所望の格子パターンを選択すると共に、当該格子パターンを所定周期移動させてその積分値をとることにより平均を求める。
【００６８】
格子を連続駆動させる場合には、その駆動と撮像装置とを同期させ、各格子パターン像が顕微鏡視野を覆った時点から、格子が整数周期移動した時点まで撮像を行うことで、複数方向の空間変調像を別々に得ることができる。その他の作用は図１に示したものと同じであるので、その説明を省略する。
【００６９】
図９は、図７（ｂ）に示す円形（円盤状）の回折格子５５を、顕微鏡装置に取り付けた様子を示す図である。回折格子５５は、モータ６２により回転されるようになっており、回転した際、各格子パターンが、光軸上で、標本１１と光学的に共役な位置に来るようになっている。制御・演算装置４２は、モータ６２を駆動して、所望の格子パターンを選択すると共に、当該格子パターンを所定周期移動させてその積分値をとることにより平均を求める。その他の作用は図１に示したものと同じであるので、その説明を省略する。
【００７０】
図１０は、図７（ｃ）に示す円筒状の回折格子５７を、顕微鏡装置に取り付けた様子を示す図である。回折格子５７は、ドラム回転装置６３により回転されるようになっており、回転した際、各格子パターンが、光軸上で、標本１１と光学的に共役な位置に来るようになっている。制御・演算装置４２は、ドラム回転装置６３を駆動して、所望の格子パターンを選択すると共に、当該格子パターンを所定周期移動させてその積分値をとることにより平均を求める。
【００７１】
なお、回折格子５７と光学系の干渉を避けるため、折り曲げミラー６４が設けられており、この折り曲げミラー６４により、光路が９０°折り曲げられている。よって、実際の光学系においては、図１０において折り曲げミラー６４より上部にある部分は、その上部が紙面の手前側となるようになっているが、図示の都合上、光路が折り曲げられていないものとして、同一平面に作図を行っている。また、回折格子５７の格子パターン面が光軸に垂直でないことに起因する像面湾曲を補正するために、補正光学系６５が設けられている。その他の作用は図１に示したものと同じであるので、その説明を省略する。
【００７２】
以上の実施の形態においては、１つの回折格子上に複数の格子パターンを形成し、それらを適宜選択して使用していたが、１つの回折格子上に異なる格子パターンを重畳して形成し、それらを一度に使用するようにしてもよい。このような回折格子の例を、図１１に示す。回折格子５９上には、格子パターン５３ｄが設けられているが、この格子パターンは、その格子の方向が６０°ずつ異なる３つの格子パターンを重畳させたものである。ただし、前記回折格子を移動させる方向を基準に取り、任意の２つの格子パターンの格子の方向が前記基準方向となす角をそれぞれξm、ξn、それぞれの格子ピッチをそれぞれＰm、Ｐnとするとき、Ｐm／cos（ξm）＝Ｐn／cos（ξn）の関係が成り立たないように、格子パターンのピッチと角度を選ぶ必要がある。例えば、格子ピッチをすべて等しくし、前記回折格子を移動させる方向と各格子の方向とがなす角を、それぞれ、−４５°、１５°、７５°とするとこのような条件を満たし、かつ、各格子の方向が６０°ずつ異なるようにすることができる。
【００７３】
このような条件の下で、格子ピッチをＰとするとき、回折格子をＰ／cos(-45°)移動させて、その間の出力の積分をとれば、格子の方向が−４５°の格子パターンについての、１周期分の平均値を求めることができ、Ｐ／cos(15°)移動させて、その間の出力の積分をとれば、格子の方向が１５°の格子パターンについての、１周期分の平均値を求めることができ、Ｐ／cos(75°)移動させて、その間の出力の積分をとれば、格子の方向が７５°の格子パターンについての、１周期分の平均値を求めることができる。このようにして、１つの回折格子を、一方向に移動させることにより、１５°方向、１３５°方向、２５５°方向の超解像を行うことができる。
【００７４】
さらに、全ての格子方向について、事実上整数周期となる距離だけ格子を移動させながら撮像を行うことで、すべての方向について超解像となる単一の画像を得ることもできる。この場合には、図４に示した画像の合成は不要である。
【００７５】
図１２は、図１１に示す回折格子５９を、顕微鏡装置に取り付けた様子を示す図である。図１２は、図１とほとんど同じであり、回折格子５９の回折パターン５３ｄが、光軸上で、標本１１と光学的に共役な位置に来るようになっている。制御・演算装置４２は、駆動装置６１を介して回折格子５９を駆動して、格子パターンを所定周期移動させてその積分値をとることにより平均を求める。その他の作用は図１に示したものと同じであるので、その説明を省略する。
【００７６】
以上の実施の形態は、回折格子と共役な位置に標本を置き、照明光学系により回折格子の像を標本上に形成すると共に、標本の像を同じ回折格子上に形成することによって像の復調を行う方式の顕微鏡装置に関するものであった。しかしながら、本発明は、特許文献１に記載されるような、回折格子と共役な位置に標本を置き、照明光学系により回折格子の像を標本上に作製すると共に、標本の像を撮像し、計算によって像の復調を行う方式の顕微鏡装置にも適用できる。
【００７７】
例えば、特許文献１の図１５には、その実施の形態の例が示されているが、この図における回折格子を、以上の実施の形態で述べた回折格子で置き換えることにより、回折格子を回転させる必要が無くなり、本発明と同様の作用効果を奏することができる。このような光学系の概要については、特許文献１を参照することによって理解することができるので、その説明を省略する。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】先願発明の実施の形態である顕微鏡装置の概略構成図である。
【図２】先願発明の実施の形態である顕微鏡装置における観察光学系ＬＳ２の標本１１からレンズ７までの結像光束の開口数を説明する図である。
【図３】先願発明の実施の形態である顕微鏡装置における観察光学系ＬＳ２の標本１１からレンズ７までの結像光束の開口数を説明する図である。
【図４】先願発明の実施の形態中の、制御・演算装置４２の演算に関する動作フローチャートである。
【図５】図４中のステップＳ２１を説明する図である。
【図６】図４中のステップＳ２２を説明する図である。
【図７】本発明の実施の形態で使用する回折格子の概要を示す図である。
【図８】図７（ａ）に示す回折格子５１を、顕微鏡装置に取り付けた様子を示す図である。
【図９】図７（ｂ）に示す回折格子５５を、顕微鏡装置に取り付けた様子を示す図である。
【図１０】図７（ｃ）に示す回折格子５７を、顕微鏡装置に取り付けた様子を示す図である。
【図１１】１つの回折格子上に異なる格子パターンを重畳して形成した回折格子の例を示す図である。
【図１２】図１１に示す回折格子を、顕微鏡装置に取り付けた様子を示す図である。
【符号の説明】
【００７９】
１…光源、２…コレクタレンズ、３…レンズ、４…励起フィルタ、５…ダイクロイックミラー、６…バリアフィルタ、７…レンズ、８…回折格子、９…第２対物レンズ、１０…対物レンズ、１１…標本、１２…レンズ、２２…共役面、２３…回折格子８の像、２４…拡大像、２５…撮像装置、３１…光源像（瞳共役面）、３２…光源像、３３…瞳共役面、４０…アクチュエータ、４１…回転ステージ、４２…制御・演算装置、４３…画像表示装置、５１…回折格子、５２…板状体、５３ａ，５３ｂ、５３ｃ、５３ｄ…格子パターン、５４…ガイド、５５…回折格子、５６…円形板状体、５７…回折格子、５８…円筒板状体、５９…回折格子、ＬＳ１…照明光学系、ＬＳ２…観察光学系、ＬＳ２１…結像光学系、ＬＳ２２…リレー光学系
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2007199397.tif 000011
【図１０】
2007199397.tif 000012
【図１１】
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【図１２】
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