(57)【要約】【課題】従来のＤＮＡチップに比べ安価で簡単に製造でき、また分析時の取り扱いが簡便な、簡易型で、かつ高感度で検出できる遺伝子検出体及びそれを用いた検出方法を提供すること目的とする。また、保存が容易な遺伝子検出体を提供することを目的とする。【解決手段】プローブ核酸の少なくとも一部が固定されている含浸性基材からなる遺伝子検出対とするものである。また、プローブ核酸の少なくとも一部が固定されている含浸性基材に検体を添加する工程、ハイブリダイゼーション環境下に置く工程、含浸性基材を洗浄する工程、プローブ核酸と検体のハイブリダイゼーションの有無を判別する工程、を有する遺伝子検出方法とするものである。【選択図】図２
2007037506.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブ核酸の少なくとも一部が含浸性基材に固定されていることを特徴とする遺伝子検出体。
【請求項２】
前記含浸性基材が３次元網目構造を有し、前記プローブ核酸が含浸性基材内部の網目構造に結合していることを特徴とする請求項１記載の遺伝子検出体。
【請求項３】
前記含浸性基材が非水溶性であることを特徴とする請求項１又は２に記載の遺伝子検出体。
【請求項４】
前記含浸性基材が、紙、不織布、織布のいずれかであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子検出体。
【請求項５】
前記含浸性基材が、可撓性を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子検出体。
【請求項６】
前記含浸性基材が長尺状であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子検出体。
【請求項７】
前記含浸性基材に、ＤＮＡ分解酵素を阻害する酵素処理が施されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子検出体。
【請求項８】
少なくとも１層の被覆層を有することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の遺伝子検出体。
【請求項９】
前記被覆層が基材を挟んで上下に１層ずつあることを特徴とする請求項８記載の遺伝子検出体。
【請求項１０】
前記被覆層が、ＤＮＡ分解酵素を阻害する酵素を含有することを特徴とする請求項８または９に記載の遺伝子検出体。
【請求項１１】
前記被覆層の含浸性基材と接する側に、ＤＮＡ分解酵素を阻害する酵素処理が施されていることを特徴とする請求項８または９に記載の遺伝子検出体。
【請求項１２】
プローブ核酸の少なくとも一部が固定されている含浸性基材に検体を添加する工程、ハイブリダイゼーション環境下に置く工程、含浸性基材を洗浄する工程、プローブ核酸と検体のハイブリダイゼーションの有無を判別する工程、を有する遺伝子検出方法。
【請求項１３】
プローブ核酸の少なくとも一部が固定されている含浸性基材及び少なくとも１層の被覆層を有する遺伝子検出体の含浸性基材に検体を添加する工程、ハイブリダイゼーション環境下に置く工程、含浸性基材を洗浄する工程、プローブ核酸と検体のハイブリダイゼーションの有無を判別する工程、を有する遺伝子検出方法。
【請求項１４】
プローブ核酸の少なくとも一部が固定されている含浸性基材及び少なくとも１層の被覆層を有する遺伝子検出体の被覆層を剥離する工程、被覆層が剥離された含浸性基材に検体を添加する工程、ハイブリダイゼーション環境下に置く工程、含浸性基材を洗浄する工程、プローブ核酸と検体のハイブリダイゼーションの有無を判別する工程、を有する遺伝子検出方法。
【請求項１５】
前記含浸性基材が３次元網目構造を有し、前記プローブ核酸が含浸性基材内部の網目構造に結合していることを特徴とする請求項１２〜１４のいずれかに記載の遺伝子検出方法。
【請求項１６】
前記含浸性基材が非水溶性であることを特徴とする請求項１２〜１５のいずれかに記載の遺伝子検出方法。
【請求項１７】
前記含浸性基材が、紙、不織布、織布のいずれかであることを特徴とする請求項１２〜１６のいずれかに記載の遺伝子検出方法。
【請求項１８】
前記含浸性基材に、ＤＮＡ分解酵素を阻害する酵素処理が施されていることを特徴とする請求項１２〜１７のいずれかに記載の遺伝子検出方法。
【請求項１９】
前記検体が標識物質により標識されてなることを特徴とする請求項１２〜１８のいずれかに記載の遺伝子検出方法。
【請求項２０】
前記ハイブリダイゼーション環境下に置く工程の後に、二本鎖認識体を加える工程を有することを特徴とする請求項１２〜１８のいずれかに記載の遺伝子検出方法。
【請求項２１】
前記被覆層が基材を挟んで上下に１層ずつあり、かつ少なくとも１層の被覆層を剥離する工程を有することを特徴とする請求項１４〜１９のいずれかに記載の遺伝子検出方法。
【請求項２２】
前記被覆層が、ＤＮＡ分解酵素を阻害する酵素を含有することを特徴とする請求項１３〜２０のいずれかに記載の遺伝子検出方法。
【請求項２３】
前記被覆層の含浸性基材と接する側に、ＤＮＡ分解酵素を阻害する酵素処理が施されていることを特徴とする請求項１３〜２１のいずれかに記載の遺伝子検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液等の試料中に含まれる遺伝子の配列を決定するために用いる遺伝子検出対およびそれを用いた遺伝子検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血液等に含まれる遺伝子の配列を解析する手段として、ＤＮＡチップが知られており、多数の遺伝子を同時に解析することが可能であり、創薬分野などでの研究に用いられている。
ＤＮＡチップの原理は、塩基配列が相補的な核酸が水素結合により二重螺旋構造を形成するハイブリダイゼーション法を用いている。一般的なＤＮＡチップは、基板上に複数の塩基配列の異なるプローブ核酸を固定しておき、蛍光標識された核酸を含む試料を供給し、ハイブリダイズさせ、ハイブリダイズの有無を蛍光検出することにより、塩基配列を決定する。
【０００３】
ＤＮＡチップの代表例としては、アフィメトリックス型（フォトリソグラフィ型）（特許文献１参照）とスタンフォード型（スポッティング型）が挙げられる。
アフィメトリックス型はシリコン基板にフォトリソグラフィ法により、ＤＮＡプローブとして、塩基を合成していくものである。スタンフォード型はスライドガラス上に、予め合成しておいたＤＮＡ断片をＤＮＡプローブとしてスポッティングすることにより固定するものである。
しかし、どちらのチップも、製造コストが高く、分析時の取り扱いなどが煩雑であった。
【０００４】
従来のチップでは、スライドガラス上にあるＤＮＡプローブとその後加える血液などから抽出した核酸を含む試料とのハイブリダイゼーション反応により、塩基配列を決定する。
スライドガラス上のＤＮＡプローブは、基板から垂直に生えていること、すなわち林立した状態であることが好ましいが、実際は図１に示すように基板上に横たわる状態になる。この場合、隣り合うプローブ核酸と接触または重なり合う状態になり、その後のハイブリダイゼーション反応時に反応効率が落ち、結果検出感度が低下してしまう。特にプローブＤＮＡの数を増やし、高密度化を図った場合に顕著になる。
【０００５】
また、従来のチップでは、保管にある程度の場所が必要でまた、ホコリや湿度温度などの環境にも配慮が必要であった。
【０００６】
【特許文献１】特表平１１−５１２２９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明では、従来のＤＮＡチップに比べ安価で簡単に製造でき、また分析時の取り扱いが簡便な、簡易型で、かつ高感度で検出できる遺伝子検出体及びそれを用いた検出方法を提供すること目的とする。また、保存が容易な遺伝子検出体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
請求項１の発明は、プローブ核酸の少なくとも一部が含浸性基材に固定されていることを特徴とする遺伝子検出体である。
【０００９】
請求項２の発明は、前記含浸性基材が３次元網目構造を有し、前記プローブ核酸が含浸性基材内部の網目構造に結合していることを特徴とする請求項１記載の遺伝子検出体である。
【００１０】
請求項３の発明は、前記含浸性基材が非水溶性であることを特徴とする請求項１又は２に記載の遺伝子検出体である。
【００１１】
請求項４の発明は、前記含浸性基材が、紙、不織布、織布のいずれかであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子検出体である。
【００１２】
請求項５の発明は、前記含浸性基材が、可撓性を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子検出体である。
【００１３】
請求項６の発明は、前記含浸性基材が長尺状であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子検出体である。
【００１４】
請求項７の発明は、前記含浸性基材に、ＤＮＡ分解酵素を阻害する酵素処理が施されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子検出体である。
【００１５】
請求項８の発明は、少なくとも１層の被覆層を有することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の遺伝子検出体である。
【００１６】
請求項９の発明は、前記被覆層が基材を挟んで上下に１層ずつあることを特徴とする請求項８記載の遺伝子検出体である。
【００１７】
請求項１０の発明は、前記被覆層が、ＤＮＡ分解酵素を阻害する酵素を含有することを特徴とする請求項８または９に記載の遺伝子検出体である。
【００１８】
請求項１１の発明は、前記被覆層の含浸性基材と接する側に、ＤＮＡ分解酵素を阻害する酵素処理が施されていることを特徴とする請求項８または９に記載の遺伝子検出体である。
【００１９】
請求項１２の発明は、プローブ核酸の少なくとも一部が固定されている含浸性基材に検体を添加する工程、ハイブリダイゼーション環境下に置く工程、含浸性基材を洗浄する工程、プローブ核酸と検体のハイブリダイゼーションの有無を判別する工程、を有する遺伝子検出方法である。
【００２０】
請求項１３の発明は、プローブ核酸の少なくとも一部が固定されている含浸性基材及び少なくとも１層の被覆層を有する遺伝子検出体の含浸性基材に検体を添加する工程、ハイブリダイゼーション環境下に置く工程、含浸性基材を洗浄する工程、プローブ核酸と検体のハイブリダイゼーションの有無を判別する工程、を有する遺伝子検出方法である。
【００２１】
請求項１４の発明は、プローブ核酸の少なくとも一部が固定されている含浸性基材及び少なくとも１層の被覆層を有する遺伝子検出体の被覆層を剥離する工程、被覆層が剥離された含浸性基材に検体を添加する工程、ハイブリダイゼーション環境下に置く工程、含浸性基材を洗浄する工程、プローブ核酸と検体のハイブリダイゼーションの有無を判別する工程、を有する遺伝子検出方法である。
【００２２】
請求項１５の発明は、前記含浸性基材が３次元網目構造を有し、前記プローブ核酸が含浸性基材内部の網目構造に結合していることを特徴とする請求項１２〜１４のいずれかに記載の遺伝子検出方法である。
【００２３】
請求項１６の発明は、前記含浸性基材が非水溶性であることを特徴とする請求項１２〜１５のいずれかに記載の遺伝子検出方法である。
【００２４】
請求項１７の発明は、前記含浸性基材が、紙、不織布、織布のいずれかであることを特徴とする請求項１２〜１６のいずれかに記載の遺伝子検出方法である。
【００２５】
請求項１８の発明は、前記含浸性基材に、ＤＮＡ分解酵素を阻害する酵素処理が施されていることを特徴とする請求項１２〜１７のいずれかに記載の遺伝子検出方法である。
【００２６】
請求項１９の発明は、前記検体が標識物質により標識されてなることを特徴とする請求項１２〜１８のいずれかに記載の遺伝子検出方法である。
【００２７】
請求項２０の発明は、前記ハイブリダイゼーション環境下に置く工程の後に、二本鎖認識体を加える工程を有することを特徴とする請求項１２〜１８のいずれかに記載の遺伝子検出方法である。
【００２８】
請求項２１の発明は、前記被覆層が基材を挟んで上下に１層ずつあり、かつ少なくとも１層の被覆層を剥離する工程を有することを特徴とする請求項１４〜１９のいずれかに記載の遺伝子検出方法である。
【００２９】
請求項２２の発明は、前記被覆層が、ＤＮＡ分解酵素を阻害する酵素を含有することを特徴とする請求項１３〜２０のいずれかに記載の遺伝子検出方法である。
【００３０】
請求項２３の発明は、前記被覆層の含浸性基材と接する側に、ＤＮＡ分解酵素を阻害する酵素処理が施されていることを特徴とする請求項１３〜２１のいずれかに記載の遺伝子検出方法である。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によれば、安価で簡単な遺伝子検出体とすることができる。また、検出反応時の取り扱いも簡便で、かつ高感度な検出が可能である。
さらに、保存適性も優れ、長期間常温常湿下で保存した後も、高感度な検出ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明に用いる含浸性基材としては、特に限定するものではないが、基材としての強度がありプローブ核酸を固定できるものであれば良い。また、基材はハイブリダイゼーション後の洗浄時に、ハイブリダイゼーションした二本鎖核酸は固定されたままであるが、未反応の核酸を含む検体は洗い流せるような構造であると良い。
【００３３】
含浸性基材は、３次元網目構造を有する多孔質体又は繊維質体であることが好ましい。３次元網目構造であれば、プローブ核酸網目構造に結合させることにより、３次元的にプローブ核酸を配置することができ、プローブ核酸同士の接触や重なりを防ぐことができ、高効率なハイブリダイゼーション反応が可能で、高感度な検出が可能となる（図２参照）。
また、図１に示すような従来のガラスなどを基材としたチップに比べ、３次元的にプローブ核酸を配置できるので、単位面積あたりのプローブ核酸の数を増やすことができる。すなわち、反応点が増えるので、反応の有無の検出感度も向上する。
【００３４】
また、含浸性基材は、非水溶性であることが好ましい。ハイブリダイゼーション反応や洗浄は水系でおこなわれることが多い。非水溶性であれば、反応時、洗浄時の溶媒などで溶け出すことがなく、基材としての強度も保つことができる。
【００３５】
このようなものとして、例えば多孔体、紙、不織布、織布などを用いることができる。
紙、不織布、織布などは、繊維を様々な手法により絡ませ、或いは接着させることにより、３次元網目構造をとることができる。この、繊維としては、セルロースやその他の糖類、また、それらの誘導体などからなる天然繊維や半合成繊維、または、ナイロン、ポリエステル、アクリルなどからなる合成繊維が挙げられる。特に、基材の親水性、コスト面、取り扱いの簡便さ、焼却による廃棄が可能である点、燃焼エネルギーが低いなどの面を考慮すると、セルロースを主原料とした繊維、或いはセルロースの含まれる繊維が好ましい。
また、これらの繊維は、1種類あるいは複数の繊維を混抄しても構わない。
【００３６】
このようなものであれば、ＤＮＡ同士の接触があまりなく必要な量のプローブＤＮＡを形成することができる。また、基材としての適性があり、かつ未反応の検体ＤＮＡやインターカレーターを容易に除去することができる。
【００３７】
また、基材は、可撓性を有していることが好ましい。可撓性を有し、かつ後述するような長尺形状であれば、保存時にロール状で保存することが可能である。また、折り曲げ適性を有していることが好ましい。折り曲げ適性とは、折り曲げが可能でかつ広げて元の状態に戻すことができることを言う。折り曲げ適性があれば、折りたたんでの保存が可能である。
【００３８】
紙、不織布、織布などであれば可撓性を有しているので好ましい。基材に後述のある程度の支持性を有する被覆層を設ける場合、膜厚は０．０１〜２ｍｍの範囲内、好ましくは０．１〜０．２５ｍｍの範囲内であることが好ましい。０．２５ｍｍ以上、特に２ｍｍ以上であると可撓性が乏しくロール状または折りたたむことによる保存が困難になる。また０．０１ｍｍ以下であると基材を形成するのが困難なためないため好ましくない。特に０．１ｍｍ以上であれば、好適に３次元網目構造を形成することができる。
また、後述の被覆層を用いず、基材単体で用いる場合、膜厚は０．１〜２ｍｍの範囲内、好ましくは０．１〜０．２５ｍｍの範囲内であることが好ましい。０．２５ｍｍ以上、特に２ｍｍ以上であると可撓性が乏しくロール状または折りたたむことによる保存が困難になる。また０．１ｍｍ以下であると強度等の基材適性がないため好ましくない。
【００３９】
また、基材の含水率は、特に規定するものではないが、１〜５０％の範囲内、好ましくは３〜１５％の範囲内であることが良い。紙、不織布、織布などであれば、内部に水分を吸着し、ある程度一定に保つことができる。すなわち、含水率を上記範囲内で一定に保つことができる。なお、後述の阻害酵素を用いる場合、特に、基材の含水率を１〜５０％の範囲内、好ましくは３〜１５％の範囲内にすることがよい。阻害酵素の活性の効果が効率的に得られるからである。
【００４０】
前述の基材を構成する繊維の種類、繊維の長さや太さ、あるいはこれら繊維の組み合わせと混合割合など、また、繊維以外の接着剤やバインダー、添加剤などの有無、量や種類、または湿式法、乾式法など繊維をシート化する際の形成方法や接着方法および水素結合など繊維間結合の種類や大小を設計することにより、基材の吸湿性、吸水性、柔軟性、可撓性、厚み、密度などの性質を制御できる。
【００４１】
また、これらの基材の形状は限定するものではないが、長尺形状であってもよい。長尺形状であれば、ロール状に巻いて保存でき、使用するときに必要な分だけ切り取ることにより使用することができる。
【００４２】
プローブ核酸を基材に含浸固定させる方法は、予めある塩基配列を有するプローブ核酸を合成しておき、そして基材に固定する。
プローブ核酸を基材に固定させる方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
核酸は末端がリン酸イオンになっている。また、セルロースなどからなる基材は、表面などにヒドロキシル基、カルボキシル基などが存在し、ここに核酸の末端を作用させれば固定することができる。
例えば、基材に核酸を含む溶液を加え、アンモニア水などの存在下、５０〜７０℃程度、数時間反応させることにより、固定できる。
【００４３】
また、基材をカルボキシル化、ヒドロキシル化、アミノ化、スルホン化、アミド化、シアノ化、トリアジン化、ジアゾ化、シアノ化、アルデヒド化、酸アジド化、イオン化、ＮＨＳによる活性化等の処理をすることが好ましい。このようにすることで、基材へのプローブ核酸の固定が強固になる。
【００４４】
また、リンカーを介し、固定しても良い。具体的には、まず基材にリンカーを固定し、そのリンカー上に核酸を固定しても良い。リンカーとしては、基材に結合するような官能基と核酸の末端のリン酸イオンに結合する官能基を有するものを用いればよい。
【００４５】
また、核酸を固定する部分は含浸性基材の全面に設けても良いし、局部的に設けても良い。例えば、両端をあけて中心部だけに設けても良い。
また、長尺状の基材を用いる場合、核酸を固定する部分長手方向にストライプ状に設けても良い。また、複数のストライプ状の核酸固定部分を設けても良く、その際には各ストライプで固定する核酸の配列を変えても良い。
【００４６】
プローブ核酸は以下のようにして調整することができる。
リン酸トリエステル法、リン酸アミダイド法などでプローブ核酸を調整することができる。
【００４７】
検体は、以下のようにして調整することができる。
直接血液もしくは、市販の調製済みＤＮＡの検出したい部位を、Ｔ７プロモーター付きプライマーによってＰＣＲ反応により増幅する。Ｔ７付きｃＤＮＡから、ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡ合成を行い、得られたＲＮＡを検体とする。また、ここで検体によっては、フラグメンテーションをおこなって検体ＲＮＡを検出しやすい様に短い塩基配列ＲＮＡにして検出を行う事も可能である。
検体には、上記のＲＮＡと水、バッファーなどを含む検体溶液として用いることができる。
【００４８】
検体には予め標識しておくことができる。標識しておくことで、その標識の有無により核酸の検出ができる。
標識としては蛍光標識などが挙げられる。蛍光標識としては、テキサスレッド、Ｃｙ５、スルフォローダミン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）などが挙げられる。
また、検体に標識物質と結合する準標識物質を付けておき、後から標識物質をこの準標識物質に作用させても良い。例えば、予め検体にビオチンをつけておき、後から蛍光物質を結合しているアビジンを加え、ビオチンとアビジンの結合させることにより標識しても良い。
【００４９】
また、検出には、検体には予め標識しておくのではなく、二本鎖核酸に特異的に作用する二本鎖認識体としてインターカレーターを用いても良い。インターカレーターとしては、発蛍光性のものが好ましく用いられ、このようなものとしては、サイバーグリーン、エチジュウム、エチジュウムブロマイド、アクリジン、アミノアクリジン、アクリジンオレンジ、プロフラビン、エリブチシン、アクチノマイシンＤ、ドーノマイシン、マイトマイシンＣなどが挙げられる。また、これらインターカレーターに増感の目的で、ビオチン、トリニトロベンゼンスルホン酸、ジニトロベンゼンスルホン酸等のハプテン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコシアニン、ローダミン等の蛍光物質を結合させても良い。
【００５０】
本発明では被覆層を有していてもよい。被覆層を有することにより、外部からのゴミ、ホコリなどからの汚染を防ぐ、乾燥を防ぐ、拡散の劣化を防ぎ保存性を向上させる、ハンドリング性の向上、長尺状基材を用い巻き状態で保存する場合の上下の層からの汚染防止、などの効果がある。特に、外部からの核酸を分解するような酵素（以下分解酵素）から保護することができる。
【００５１】
被覆層としては、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）などのポリオレフィン類、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ＡＢＳ、ＡＳ、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、メチルペンテン系樹脂（ＴＰＸ（三井化学株式会社製））、シンジオクタチィックポリスチレン（ＳＰＳ）、ポリサルフォン（ＰＥＳ）、ポリフタルアミド（ＰＰＡ）、ポリフェニレンサルファイド（ＰＰＳ）、ポリアクリレート（ＰＡＲ）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、アルミ箔等が挙げられる。ここで、ポリオレフィン類の被腹膜は耐薬品性も優れ、耐熱性も強い。また、価格も手ごろであり、被覆層としては最も適している。
また、被覆層の膜厚は、被覆層としての機能、可撓性などの点から１μｍ〜１ｍｍの範囲内であることが好ましい。
【００５２】
被覆層は接着剤を用いて基材上に設けることができる。
接着剤としては、核酸や反応系に影響を与えないものであればなんでも良く、このようなものとして、塩酢ビ系接着剤、ポリエステル系、エポキシ系、アクリル系、塩ビ系などの接着剤が挙げられる。
また、被覆層がヒートシール性のものであれば、ヒートシールすることもできる。通常ヒートシール性の樹脂の融点は２００℃前後のものが多く、ヒートシールする際には融点以上の温度をかけるため、基材としては、２００℃前後の温度への耐性と溶融した樹脂がある程度入り込めるだけの多孔性が必要である。前記列挙した基材のうち、ポリオレフィン系の被覆層がヒートシール性のものである。また、オレフィン系の被覆層の上にヒートシールした際に熱伝導を良くするために、ＰＥＴ、アルミなどを接着剤等でラミネートしても良い。また、ガラス転移温度・融点温度が高い（ＰＣ・ＴＰＸなど）も超音波融着によってシールすることも可能である。
また、接着部、ヒートシール部は、特に限定するものではないが、プローブ核酸の設けていないところに施すことが好ましく、例えば、基材と被覆層の端部を接合するなどが挙げられる。
【００５３】
また、被覆層が例えばＰＶＡのような、溶剤可溶性のものであれば、基材上にコーティングすることにより設けることもできる。
なお、コーティング方法としては、公知の技術を用いることができ、例えばバーコート法、ダイコート法、スピンコート法、グラビアコート法、マイクログラビアコート法などが挙げられるが、これに限るものではない。
【００５４】
また、被覆層として、ある程度の強度、厚みのあるものを用いれば、基材を支持することができ、支持体として用いることができる。
【００５５】
また、被覆層は基材を挟んで上下に１層ずつ設けることができる。このようにすることで、前述のような汚染、乾燥などを防ぐことができ、またハンドリング性も良いものとなる。基材と被覆層の積層法は、前述と同じ方法で行うことができる。
また、このような構造にする場合、被覆層を少し核酸を固定した紙基材より大きくしておき、紙基材を被覆層で挟み、端部を接着剤を用いて接着またはヒートシールしても良い。このようにすれば、さらに汚染、乾燥などを防ぐことができ、またハンドリング性も良いものとなる。
また、片方の被覆層は、支持体を兼ねることができる。
【００５６】
また、本発明の遺伝子検出体には核酸を分解するような酵素（分解酵素）を阻害する酵素（以下阻害酵素）を有することが好ましい。
本発明では、簡便に取り扱える遺伝子検出体を想定しており、例えば、リトマス試験紙のように手軽に使用しようとすると、使用時に遺伝子検出体が手に触れたり外気に曝されたりする。人の手には遺伝子を分解する分解酵素が付着していることが多くこのような分解酵素が遺伝子検出体に付着すると、固定されている核酸が分解されてしまう。また外部に曝されれば他の要因で分解酵素が遺伝子検出体に付着することもある。分解酵素はデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）といい、ＤＮａｓｅＩ、ＤＮａｓｅＩＩ、ＤＮａｓｅＩＩＩなど、様々なものがある。本発明では、被覆層が分解酵素を阻害する酵素を有することで、上記問題点を解決できる。
【００５７】
前述のデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）は、酵素であり、タンパク質である。阻害酵素としては、このタンパク質である分解酵素を失活させるものであれば良く、例えばタンパク質を分解できる、プロテアーゼ（タンパク質分解酵素）を用いることができる。プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素であり、Ｎ末端又はその近傍、Ｃ末端のペプチド結合に作用するエキソペプチターゼとタンパク質内部のペプチド結合に作用するエンドペプチターゼがある。ここでは、エキソペプチターゼを用いることが好ましく、エキソペプチターゼとしては、活性中心のアミノ酸の種類によりセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼがある。中でもトリプシン、キモトリプシン、トロンビン、ブラスミン、エラスターゼなどのセリンプロテアーゼを好ましく用いることができる。
【００５８】
具体的には、基材自体に阻害酵素を含有させる方法、基材上または被覆層の基材と接する側に阻害酵素を含むコーティング溶液で阻害酵素コーティング層を設ける方法、被覆層自体に阻害酵素を混入する方法を用いることができる。
【００５９】
基材自体に阻害酵素を含有させる方法としては、阻害酵素と溶剤を含む溶液に浸漬する方法（ディッピング法）かスポイト等で滴下する方法、霧吹き器により吹き付ける方法などを用いることができる。ディッピング法であれば、簡単に阻害酵素を含有させることができるので好ましい。
溶剤としては、阻害酵素に影響を与えないものであれば特に限定はしないが、リン酸バッファー溶液などを用いることができる。
また、阻害酵素と溶剤を含む溶液の濃度は特に限定はしないが、１重量％程度であればよい。
【００６０】
基材上または被覆層の基材と接する側に阻害酵素を含むコーティング溶液で阻害酵素コーティング層を設ける方法としては、阻害酵素と溶剤を含む溶液を用いて、バーコート法、ダイコート法、スピンコート法、グラビアコート法、マイクログラビアコート法など公知のコーティング法により形成する方法を用いることができる。
溶剤や濃度は前述の場合と同様である。
【００６１】
また、被覆層がコーティングにより設ける場合は、予めコーティング液のなかに阻害酵素を含有させ、コーティングすることにより、被覆層の中に前述のような阻害酵素を含有させることができる。
【００６２】
また、被覆層を１層しか設けない場合、被覆層を設けない側に阻害酵素処理を行うことができる。具体的には前述のような阻害酵素を含むコーティング層でコーティングすることができる。コーティング層としては阻害酵素を含む溶液を用いてコーティングすればよい。
【００６３】
図３〜１０に本発明の遺伝子検出体の具体的な構成の一例を示す。
図３は、セルロース系繊維からなる３次元網目構造を有する含浸性基材中または含浸性基材上にプローブ核酸を結合させてなるものである。
図４は図３の構成において、さらに上面と下面に被覆層を有するものである。なおこの場合、下面の被覆層は支持層を兼ねていても良い。
図５は、図３の構成において、さらに上面に被覆層を有するものである。
図６は、図３の構成において、さらに下面に被覆層を有するものである。なおこの場合、被覆層は支持層を兼ねていても良い。
図７は、図４の構成において、被覆層と基材の間にそれぞれ阻害酵素を含むコーティング処理層を設けたものである。
図８は、図６の構成において、被覆層と基材の間に阻害酵素を含むコーティング処理層を設け、かつ上面にも阻害酵素を含むコーティング処理層を設けたものである。
図９は、図３の構成において、阻害酵素処理を施した基材を用いたものである。
図１０は、図５の構成において、阻害酵素処理を施した基材を用いたものである。
【００６４】
（検出法）
次に本発明の遺伝子検出体を用いた遺伝子検出法について説明する。
図１１を例に説明する。ここでは、ハイブリダイゼーションをした後にインターカレーターを用いて、蛍光標識する方法を用いた方法で説明する。
まず、セルロース系繊維からなる３次元網目構造を有する含浸性基材中または含浸性基材上にプローブ核酸を結合させてなる遺伝子検出体を用意し（図１１（ａ））、これに調整した検体溶液とハイブリダイゼーション調整液を含むハイブリダイゼーション溶液を加える（図１１（ｂ））。
加える方法としては、特に限定するものではなく、例えばスポイト等のようなもので遺伝子検出体に滴下する方法などを用いることができる。
【００６５】
ハイブリダイゼーション溶液は、検体溶液とハイブリダイゼーション調製液からなる。
検体溶液としては、ｃＲＮＡなどを含む溶液、例えば、ｃＲＮＡと水、バッファーを含む溶液を用いることができる。
ハイブリダイゼーション調製液としては、ＳＳＰＥ（ＮａＣｌ  ４．２ｋｇ、１Ｍ  リン酸ナトリウム（ｐＨ  ７．７）  ４Ｌ、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ０．８Ｍ、超純水、精製水またはＤｎａｓｅ  Ｒｎａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒで２０Ｌとした水溶液）、Ｄｅｉｏｎａｉｚｅｄ  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、水、Ｓｐｅｒｋ  ＤＮＡ、１％  ＳＤＳなどを含む溶液が一般的である。
具体的には、１２倍希釈のＳＳＰＥ（７５μｌ）、Ｄｅｉｏｎａｉｚｅｄ  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（３７．５μｌ）、水（１９．５μｌ）、Ｓｐｅｒｋ  ＤＮＡ（１．５μｌ）、１％  ＳＤＳ（７．５μｌ）含む溶液に、ｃＲＮＡを含む検体溶液（７．５μｌ）を加えたものをハイブリダイゼーション溶液として用いることができる。
【００６６】
次にこの遺伝子検出体をハイブリダイゼーション条件下に置く（図９（ｃ））。ハイブリダイゼーション条件としては、一般的には温度は４５〜６５℃の範囲内、時間は２〜１２時間の範囲内でインキュベートを行う。
なお、ハイブリダイゼーション反応を行う前に約９５℃で数分間インキュベートし、冷却を行う。
【００６７】
次に洗浄工程で、未反応の検体を除去する。洗浄の条件としては、基材に固定されているプローブ核酸が流出しないことと、ハイブリダイゼーションした二本鎖核酸が分離しないことが重要である。
洗浄液としては、特に限定するものではなく、公知のものを用いることができる。
例えば、ＳＳＰＥ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ（ＮａＣｌ  １６０ｇ、ＫＣｌ  ４ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  ７２．６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ４．８ｇ、超純水１．６Ｌに溶かした水溶液）を用いることができる。また、この場合、洗浄液は必要に応じて、超純水で薄めて濃度調製を行うことができる。
【００６８】
洗浄条件としては、特に限定するものではなく、公知のものを用いることができる。
例えば、前記洗浄液を用いる場合、６倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０溶液をハイブリダイゼーション温度に保っておいたものを用意し、６倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０溶液中（２０ｍＬ以上４５〜６５℃）に５分間振盪洗浄する。
次に洗浄溶液を１度捨て、３倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ溶液中室温で５分間振盪洗浄する。次に０．５倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ溶液中室温にて５分間振盪洗浄する。２倍希釈ＰＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０溶液中室温にて１５分間振盪洗浄を行う。
【００６９】
未反応の検体を除去した後、発蛍光性のインターカレーターを加えてハイブリダイゼーションをしたプローブ核酸と検体の二本鎖核酸に特異的に結合させた後、洗浄を行い余剰のインターカレーターを除去した後、蛍光により検出する（図１１（ｄ、ｅ））。
【００７０】
蛍光検出は公知の手法を用いることができ、一般的には紫外線を照射することにより蛍光物質を励起させ、蛍光を発生させ、この蛍光を検出器を用いて検出することにより行われる。
【００７１】
以上のような工程により、検体の核酸がどのような配列を有しているかを分析することができる。
ここでは、ハイブリダイゼーション反応を行った後に二本鎖認識体としてインターカレーターを加える方法で説明したが、インターカレーターを用いず、予め検体に蛍光などの標識を付けておいたものを用いても良い。
【００７２】
また、被覆層を有する場合は、検体を加える前に、被覆層を剥がす工程を入れても良い（図１２（ａ，ｂ））。
また、被覆層が基材を挟んで上下にある場合は、片方だけ剥がして用いても良い。
【００７３】
また、本発明の遺伝子検出体は、長尺状であれば、ロール状で保存することができる。この場合、プローブ核酸を乾燥させておけば、高温高湿などの極端な環境でなければ、通常の室内で保存することができる。また、被覆層を有していれば、ほこりやごみなどの外部からの汚染の影響を受けないものとなる。さらに、被覆層が阻害酵素を有すれば分解酵素からの影響を受けなくても良いものとなる。
【００７４】
具体的には、図１３で示すようなか形で保存することができる。図１３では、幅２ｃｍの長尺状紙基材に径０．５ｍｍのプローブ核酸スポットが、１ｃｍ間隔で配置されてなり、一方の面に基材と同形状の被覆層を有してなる遺伝子検出体がロール状で保存してなる。
また、図中１３で示すようにミシン目等を入れることにより、切り離しをし易くしてもよい。
【００７５】
また、図１４に示すように、折りたたむことによって保存しても良い。具体的には、前述の幅２ｃｍの長尺状紙基材に径０．５ｍｍのプローブ核酸スポットが、１ｃｍ間隔で配置されてなり、一方の面に基材と同形状の被覆層を有してなる遺伝子検出体を折りたたむことによって保存することができる。
また、図中１４で示すようにミシン目等を入れることにより、切り離しをし易くしてもよい。
【実施例】
【００７６】
以下、実施例を用い詳細に説明する。
（プローブ核酸溶液の調整）
後述の検体と相補的な配列を有するプローブ核酸１として、固相トリエステル法により、３５ｍｅｒ（配列：ＣＡＣＣＧＴＡＡＴＴＡＣＴＧＴＧＡＧＣＣＡＴＣＡＴＧＡＣＧＣＣＧＡＴＧ）のプローブ核酸溶液を調整した。調製方法は、ウリジンの２’、３’ジオールをメチルオルトアセテートで保護し、５’水酸基を２シアノエチルｐ−クロロフェニルホスクロデートでリン酸化し、次いで酢酸で２’、３’アセテートの混合物を得る。これに３’側末端のヌクレオチドをＴＰＳＴｅ存在化縮合させた。次いでリン酸保護基をはずしセルロースを縮合させると担体のついた出発物質を得た。この出発物から５’ＤＭＴｒ基を脱保護しダイマーを縮合し鎖を延長していく事によりオリゴマーを得る事ができる。
また、後述の検体と相補的でない配列を有するプローブ核酸２（配列：ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＴＴＡＡＧＧＧＴＴＴＡＡＡＡＴＴＴＧＧＧＧＴＴ）を同様の方法で調整した。
【００７７】
（検体溶液の調整）
前述のプローブ核酸１と相補的な配列を有する市販の核酸（和光純薬工業  ＤＮＡ  Ｅ．  ＣＯＬＩ  Ｗ８８５０、配列：ＵＴＵＵＣＡＴＴＡＡＴＵＡＣＡＣＴＣＵＵＴＡＵＴＡＣＴＵＣＵＵＣＴＡＣ）を用意し、必要部分をＰＣＲ反応または、大腸菌を培養してプラスミドを取り出して増幅し、調整した。
調製方法はテンプレートＤＮＡ１００ｎｇ、Ｅｘ  ｔａｑ  ０．２５μｌ、ｄＮＴＰ  ４μｌ、１０×ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、Ｆ−Ｐｒｉｍｅｒ／Ｒ−Ｐｒｉｍｅｒ  を各２．５μｌ、ＭｇＣｌ２  ４μｌ、ｄＨ２Ｏ  ３０．７５μｌを加え全体で５０μｌにしてサーマルサイクラーによってＰＣＲ反応を行った。
サーマルサイクラー条件は、９４℃  ５ｍｉｎ→３０  ｃｙｃｌｅ（９４℃  ３０ｓｅｃ→５５℃  ３０ｓｅｃ→７２℃  ４０ｓｅｃ  ）→７２℃×１５→４℃で反応を行った。
反応終了後、Ｑｉａｇｅｎ  Ｋｉｔ（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を用いてカラムに通して精製を行い濃度測定を行ったところ、ｃＤＮＡ濃度は１２７ｎｇ／μｌであった。
次にｃＤＮＡからプローブと相補的なｃＲＮＡ合成を行った。１μｇ分のｃＤＮＡを計りとり、水溶液を乾燥させた。そこに、ｄＨ２Ｏ  ７．７５μｌ、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルアミダイドを各１．３４μｌ、１０×ｂｕｆｆｅｒ  ２μｌ、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ  ２μｌを加えて全体で２０μｌとして６時間、３７℃でインキュベーションを行った。
反応終了後、ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔに通して精製を行いｃＲＮＡ濃度を測定したところ、１７９３．５３ｎｇ／ｕｌであった。精製したｃＲＮＡを８μｇ分計りとり、乾燥させてＤｎａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒ  ６．４μｌに溶かし、Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  １．６μｌを加えて９５℃、２０分で検体を検出しやすいようにＦｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎを行ったものを検体溶液とした。
【００７８】
（ハイブリダイゼーション溶液の調整）
１２倍希釈のＳＳＰＥ（７５μｌ）、Ｄｅｉｏｎａｉｚｅｄ  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（３７．５μｌ）、水（１９．５μｌ）、Ｓｐｅｒｋ  ＤＮＡ（１．５μｌ）、１％  ＳＤＳ（７．５μｌ）含む溶液に、ｃＲＮＡを含む検体溶液（７．５μｌ）を加えたものをハイブリダイゼーション溶液として用いた。
【００７９】
＜実施例１＞
基材として、１０×２０ｍｍに切断した紙材（ＡＤＶＡＮＴＥＣ製  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｐａｐｅｒ５１Ｂ）を用いた。
この基材上に予め調整しておいたプローブ核酸溶液３０μｌ及びアンモニア水を加え、６０℃、２時間反応させることによりプローブ核酸１を固定し、遺伝子検出体を得た。
【００８０】
次に、予め調整しておいた検体溶液とハイブリダイゼーション調整液を含むハイブリダイゼーション溶液を８μｌを加え、ハイブリダイゼーション条件下（４５℃  １８０分）に置いた。
【００８１】
次に、洗浄を行い、未反応の検体溶液を除去した。洗浄方法は以下の通りである。６倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ溶液を用意し４５℃に保っておく。６倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ溶液２０ｍｌ中で揺らしながら洗浄を行う。次に３倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ溶液中室温で５分間洗浄する。次に０．５倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ溶液中室温で５分間洗浄する。最後に、２倍希釈ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ溶液中、室温にて３０分洗浄を行った。
【００８２】
次にインターカレーター標識として、ｓｙｂｅｒ  ｇｒｅｅｎ溶液（インビトロジェン社製  Ｓ−７５６３）４μｌを１０μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ  ８．０）溶液に加え、常温で３０分インキュベーションを行った。その後、５０ｍｌのＴＥ溶液で３０分常温で洗浄を行い、未反応の標識溶液を除去した。
【００８３】
この２つの遺伝子検出体について、ＵＶランプ（ＳＡＮ−ＥＩ  ＴＥＣＨ社製、出力２００Ｗ）を用い、蛍光試験を行ったところ、検体と相補的な配列であるプローブ核酸１を有する遺伝子検出体は蛍光を発したが、相補的でない配列であるプローブ核酸２を有する遺伝子検出体は、蛍光を発しなかった。
【００８４】
＜実施例２＞
基材として、１０×２０ｍｍに切断した紙材（ＡＤＶＡＮＴＥＣ製  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｐａｐｅｒ５１Ｂ）を用いた。
この基材上に予め調整しておいたプローブ核酸溶液３０μｌ及びアンモニア水を加え、６０℃、２時間反応させることによりプローブ核酸１を固定した。
【００８５】
この上に被覆層として、１２×２２ｍｍ（ポリエチレンテレフタラート  ３０μｍ）を用い、接着剤としてポリエステル系接着剤（東洋モートン株式会社  ＡＤ−Ｘ１７−３）を介して貼り合わせることにより本発明の遺伝子検出体を得た。
また、同様の方法でプローブ核酸２を固定した遺伝子検出体を得、２つの遺伝子検出体を用意した。
【００８６】
次にこれらの遺伝子検出体の被覆層を剥離し、予め調整しておいた検体溶液とハイブリダイゼーション調整液を含むハイブリダイゼーション溶液を８μｌを加え、ハイブリダイゼーション条件下（４５℃  １８０分）に置いた。
【００８７】
次に、洗浄を行い、未反応の検体溶液を除去した。洗浄方法は以下の通りである。６倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ溶液を用意し４５℃に保っておく。６倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ溶液２０ｍｌ中で揺らしながら洗浄を行う。次に３倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ溶液中室温で５分間洗浄する。次に０．５倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ溶液中室温で５分間洗浄する。最後に、２倍希釈ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ溶液中、室温にて３０分洗浄を行った。
【００８８】
次にインターカレーター標識として、ｓｙｂｅｒ  ｇｒｅｅｎ溶液（インビトロジェン社製  Ｓ−７５６３）４μｌを１０μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ  ８．０）溶液に加え、常温で３０分インキュベーションを行った。その後、５０ｍｌのＴＥ溶液で３０分常温で洗浄を行い、未反応の標識溶液を除去した。
【００８９】
この２つの遺伝子検出体について、ＵＶランプ（ＳＡＮ−ＥＩ  ＴＥＣＨ社製、出力２００Ｗ）を用い、蛍光試験を行ったところ、検体と相補的な配列であるプローブ核酸１を有する遺伝子検出体は蛍光を発したが、相補的でない配列であるプローブ核酸２を有する遺伝子検出体は、蛍光を発しなかった。
【００９０】
＜実施例３＞
基材として、１０×２０ｍｍに切断した紙材（ＡＤＶＡＮＴＥＣ製  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｐａｐｅｒ５１Ｂ）を用いた。
この基材上に予め調整しておいたプローブ核酸溶液３０μｌ及びアンモニア水を加え、６０℃、２時間反応させることによりプローブ核酸１を固定した。
【００９１】
この上に被覆層として、１２×２２ｍｍ（ポリエチレンテレフタラート  ３０μｍ）を用い、接着剤としてポリエステル系接着剤（東洋モートン株式会社  ＡＤ−Ｘ１７−３）を介して貼り合わせることにより本発明の遺伝子検出体を得た。
また、同様の方法でプローブ核酸２を固定した遺伝子検出体を得、２つの遺伝子検出体を用意した。
【００９２】
予め調整しておいた検体溶液とハイブリダイゼーション調整液を含むハイブリダイゼーション溶液を８μｌを加え、ハイブリダイゼーション条件下（４５℃  １８０分）に置いた。
【００９３】
次に、洗浄を行い、未反応の検体溶液を除去した。洗浄方法は以下の通りである。６倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ溶液を用意し４５℃に保っておく。６倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ溶液２０ｍｌ中で揺らしながら洗浄を行う。次に３倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ溶液中室温で５分間洗浄する。次に０．５倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ溶液中室温で５分間洗浄する。最後に、２倍希釈ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ溶液中、室温にて３０分洗浄を行った。
【００９４】
次にインターカレーター標識として、ｓｙｂｅｒ  ｇｒｅｅｎ溶液（インビトロジェン社製  Ｓ−７５６３）４μｌを１０μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ  ８．０）溶液に加え、常温で３０分インキュベーションを行った。その後、５０ｍｌのＴＥ溶液で３０分常温で洗浄を行い、未反応の標識溶液を除去した。
【００９５】
この２つの遺伝子検出体について、ＵＶランプ（ＳＡＮ−ＥＩ  ＴＥＣＨ社製、出力２００Ｗ）を用い、蛍光試験を行ったところ、検体と相補的な配列であるプローブ核酸１を有する遺伝子検出体は蛍光を発したが、相補的でない配列であるプローブ核酸２を有する遺伝子検出体は、蛍光を発しなかった。
【００９６】
＜実施例４＞
基材として、１０×２０ｍｍに切断した紙材（ＡＤＶＡＮＴＥＣ製  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｐａｐｅｒ５１Ｂ）を用いた。
この基材上に予め調整しておいたプローブ核酸溶液３０μｌ及びアンモニア水を加え、６０℃、２時間反応させることによりプローブ核酸１を固定した。
【００９７】
この上にヒートシール性の被覆層として、１２×２２ｍｍ（ポリプロピレン・ノバテックＰＰ  厚さ３０μｍ）を用い、加熱圧着（１６０℃、２０ｓｅｃ）することにより貼り合わせ、本発明の遺伝子検出体を得た。
また、同様の方法でプローブ核酸２を固定した遺伝子検出体を得、２つの遺伝子検出体を用意した。
【００９８】
次にこの遺伝子検出体の被覆層を剥離し、予め調整しておいた検体溶液とハイブリダイゼーション調整液を含むハイブリダイゼーション溶液を８μｌを加え、ハイブリダイゼーション条件下（４５℃  １８０分）に置いた。
【００９９】
次に、洗浄を行い、未反応の検体溶液を除去した。洗浄方法は以下の通りである。６倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ溶液を用意し４５℃に保っておく。６倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ溶液２０ｍｌ中で揺らしながら洗浄を行う。次に３倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ溶液中室温で５分間洗浄する。次に０．５倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ溶液中室温で５分間洗浄する。最後に、２倍希釈ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ溶液中、室温にて３０分洗浄を行った。
【０１００】
次にインターカレーター標識として、ｓｙｂｅｒ  ｇｒｅｅｎ溶液（インビトロジェン社製  Ｓ−７５６３）４μｌを１０μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ  ８．０）溶液に加え、常温で３０分インキュベーションを行った。その後、５０ｍｌのＴＥ溶液で３０分常温で洗浄を行い、未反応の標識溶液を除去した。
【０１０１】
この２つの遺伝子検出体について、ＵＶランプ（ＳＡＮ−ＥＩ  ＴＥＣＨ社製、出力２００Ｗ）を用い、蛍光試験を行ったところ、検体と相補的な配列であるプローブ核酸１を有する遺伝子検出体は蛍光を発したが、相補的でない配列であるプローブ核酸２を有する遺伝子検出体は、蛍光を発しなかった。
【０１０２】
＜実施例５＞
基材として、１０×２０ｍｍに切断した紙材（ＡＤＶＡＮＴＥＣ製  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｐａｐｅｒ５１Ｂ）を用いた。
この基材上に予め調整しておいたプローブ核酸溶液３０μｌ及びアンモニア水を加え、６０℃、２時間反応させることによりプローブ核酸１を固定した。
【０１０３】
この上にヒートシール性の被覆層と  して、１２×２２ｍｍ（ポリプロピレン・ノバテックＰＰ  厚さ３０μｍ）を用い、加熱圧着（１６０℃、２０ｓｅｃ）することにより貼り合わせ、本発明の遺伝子検出体を得た。
また、同様の方法でプローブ核酸２を固定した遺伝子検出体を得、２つの遺伝子検出体を用意した。
【０１０４】
予め調整しておいた検体溶液とハイブリダイゼーション調整液を含むハイブリダイゼーション溶液を８μｌを加え、ハイブリダイゼーション条件下（４５℃  １８０分）に置いた。
【０１０５】
次に、洗浄を行い、未反応の検体溶液を除去した。洗浄方法は以下の通りである。６倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ溶液を用意し４５℃に保っておく。６倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ溶液２０ｍｌ中で揺らしながら洗浄を行う。次に３倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ溶液中室温で５分間洗浄する。次に０．５倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ溶液中室温で５分間洗浄する。最後に、２倍希釈ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ溶液中、室温にて３０分洗浄を行った。
【０１０６】
次にインターカレーター標識として、ｓｙｂｅｒ  ｇｒｅｅｎ溶液（インビトロジェン社製  Ｓ−７５６３）４μｌを１０μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ  ８．０）溶液に加え、常温で３０分インキュベーションを行った。その後、５０ｍｌのＴＥ溶液で３０分常温で洗浄を行い、未反応の標識溶液を除去した。
【０１０７】
この２つの遺伝子検出体について、ＵＶランプ（ＳＡＮ−ＥＩ  ＴＥＣＨ社製、出力２００Ｗ）を用い、蛍光試験を行ったところ、検体と相補的な配列であるプローブ核酸１を有する遺伝子検出体は蛍光を発したが、相補的でない配列であるプローブ核酸２を有する遺伝子検出体は、蛍光を発しなかった。
【０１０８】
＜実施例６＞
基材として、１０×５００ｍｍの長尺状紙材（ＡＤＶＡＮＴＥＣ製  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｐａｐｅｒ５１Ｂ）を用いた。
この基材上に予め調整しておいたプローブ核酸溶液３０μｌを加え及びアンモニア水を加え、６０℃、２時間反応させることによりプローブ核酸１を固定した。
【０１０９】
次に、予め調製しておいた阻害酵素溶液と（プロテイナーゼ（アマシャム株式会社製）を１ｗｔ％含むリン酸バッファー液）にプローブ核酸１を固定した基材をディッピングし、乾燥し、遺伝子検出体を得た。た。その後、ロール状にまるめ、室温２５℃、湿度５５％の環境下で１ヶ月放置した。
また、同様の方法でプローブ核酸２を固定した遺伝子検出体を得、２つの遺伝子検出体を用意した。
【０１１０】
次に、ロール状の遺伝子検出体を２０ｍｍ切り取り、保存しておいた予め調整しておいた検体溶液とハイブリダイゼーション調整液を含むハイブリダイゼーション溶液を８μｌを加え、ハイブリダイゼーション条件下（４５℃  １８０分）に置いた。
【０１１１】
次に、洗浄を行い、未反応の検体溶液を除去した。洗浄方法は以下の通りである。６倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ溶液を用意し４５℃に保っておく。６倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ溶液２０ｍｌ中で揺らしながら洗浄を行う。次に３倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ溶液中室温で５分間洗浄する。次に０．５倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ溶液中室温で５分間洗浄する。最後に、２倍希釈ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ溶液中、室温にて３０分洗浄を行った。
【０１１２】
次にインターカレーター標識として、ｓｙｂｅｒ  ｇｒｅｅｎ溶液（インビトロジェン社製  Ｓ−７５６３）４μｌを１０μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ  ８．０）溶液に加え、常温で３０分インキュベーションを行った。その後、５０ｍｌのＴＥ溶液で３０分常温で洗浄を行い、未反応の標識溶液を除去した。
【０１１３】
この２つの遺伝子検出体について、ＵＶランプ（ＳＡＮ−ＥＩ  ＴＥＣＨ社製、出力２００Ｗ）を用い、蛍光試験を行った。遺伝子検出体を１ヶ月放置したが、検体と相補的な配列であるプローブ核酸１を有する遺伝子検出体は蛍光を発したが、相補的でない配列であるプローブ核酸２を有する検体を加えた遺伝子検出体は、蛍光を発しなかった。従ってプローブ核酸が分解していなかったことが確認された。
【０１１４】
＜実施例７＞
基材として、１０×５００ｍｍに切断した紙材（ＡＤＶＡＮＴＥＣ製  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｐａｐｅｒ５１Ｂ）を用いた。
この基材上に予め調整しておいたプローブ核酸溶液３０μｌ及びアンモニア水を加え、６０℃、２時間反応させることによりプローブ核酸１を固定した。
【０１１５】
この上に被覆層として、１２×５０２ｍｍ（ポリエチレンテレフタラート  ３０μｍ）を用い、接着剤としてポリエステル系接着剤（東洋モートン株式会社  ＡＤ−Ｘ１７−３）を介して貼り合わせた
【０１１６】
次に、予め調製しておいた阻害酵素溶液と（プロテイナーゼ（アマシャム株式会社製）を１ｗｔ％含むリン酸バッファー液）にプローブ核酸１を固定した基材をディッピングし、乾燥し、遺伝子検出体を得た。た。その後、ロール状にまるめ、室温２５℃、湿度５５％の環境下で１ヶ月放置した。
また、同様の方法でプローブ核酸２を固定した遺伝子検出体を得、２つの遺伝子検出体を用意した。
【０１１７】
次に  次に、ロール状の遺伝子検出体を２０ｍｍ切り取り、被覆層を剥離し、予め調整しておいた検体溶液とハイブリダイゼーション調整液を含むハイブリダイゼーション溶液を８μｌを加え、ハイブリダイゼーション条件下（４５℃  １８０分）に置いた。
【０１１８】
次に、洗浄を行い、未反応の検体溶液を除去した。洗浄方法は以下の通りである。６倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ溶液を用意し４５℃に保っておく。６倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ溶液２０ｍｌ中で揺らしながら洗浄を行う。次に３倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ溶液中室温で５分間洗浄する。次に０．５倍希釈ＳＳＰＥ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ溶液中室温で５分間洗浄する。最後に、２倍希釈ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ溶液中、室温にて３０分洗浄を行った。
【０１１９】
次にインターカレーター標識として、ｓｙｂｅｒ  ｇｒｅｅｎ溶液（インビトロジェン社製  Ｓ−７５６３）４μｌを１０μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ  ８．０）溶液に加え、常温で３０分インキュベーションを行った。その後、５０ｍｌのＴＥ溶液で３０分常温で洗浄を行い、未反応の標識溶液を除去した。
【０１２０】
この２つの遺伝子検出体について、ＵＶランプ（ＳＡＮ−ＥＩ  ＴＥＣＨ社製、出力２００Ｗ）を用い、蛍光試験を行った。遺伝子検出体を１ヶ月放置したが、検体と相補的な配列であるプローブ核酸１を有する遺伝子検出体は蛍光を発したが、相補的でない配列であるプローブ核酸２を有する検体を加えた遺伝子検出体は、蛍光を発しなかった。従ってプローブ核酸が分解していなかったことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】従来のＤＮＡチップを示す断面概略図である。
【図２】本発明の遺伝子検出体を示す断面概略図である。
【図３】本発明の遺伝子検出体を示す断面概略図である。
【図４】本発明の遺伝子検出体の具体的な態様の一例を示す断面概略図である。
【図５】本発明の遺伝子検出体の具体的な態様の一例を示す断面概略図である。
【図６】本発明の遺伝子検出体の具体的な態様の一例を示す断面概略図である。
【図７】本発明の遺伝子検出体の具体的な態様の一例を示す断面概略図である。
【図８】本発明の遺伝子検出体の具体的な態様の一例を示す断面概略図である。
【図９】本発明の遺伝子検出体の具体的な態様の一例を示す断面概略図である。
【図１０】本発明の遺伝子検出体の具体的な態様の一例を示す断面概略図である。
【図１１】本発明の遺伝子検出体を用いた遺伝子の検出の一例を説明する説明図である。
【図１２】本発明の遺伝子検出体の被覆層を剥がす工程を示す断面概略図である。
【図１３】本発明の遺伝子検出体の形態の一例を示す概略図である。
【図１４】本発明の遺伝子検出体の形態の一例を示す概略図である。
【符号の説明】
【０１２２】
１      遺伝子検出体（ＤＮＡチップ）
２      ガラス基材
３      プローブ核酸
４      含浸性基材
４’    阻害酵素処理が施されている含浸性基材
５      ３次元網目構造を構成する要素（繊維等）
６      被覆層
６’    支持層兼被覆層
７      阻害酵素コーティング層
８      阻害酵素コーティング層
９      検体ＤＮＡ
１０    ハイブリダイゼーションした核酸
１１    インターカレーター
１１’  インターカレーター（蛍光発光中）
１２    ミシン目
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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