(57)【要約】      （修正有）【課題】  ＦＲＥＴ効率が高く、高い精度で予測できるＦＲＥＴプローブの設計方法を提供する。【解決手段】  ＦＲＥＴプローブのＲＮＡ上のハイブリダイゼーション領域を設定する方法：ｍｆｏｌｄにより塩基の長さがｎであるＲＮＡ配列のｉ番目（１≦ｉ≦ｎ）の塩基のＳＳ−ｃｏｕｎｔ値Ｓ（ｉ）を算出する；ＦＲＥＴプローブの長さＬ（２Ｌ＜ｎ）を決める；１≦ｉ≦ｎ−Ｌ＋１である全てのｉについて、ｉ番目の塩基からｉ＋Ｌ−１番目の塩基までのＳＳ−ｃｏｕｎｔ値Ｓ（ｉ）の平均値Ｍ（ｉ）を算出する；１≦ｉ≦ｎ−２Ｌ＋２である全てのｉについて、Ｆ（ｉ）＝Ｍ（ｉ＋Ｌ−１）−Ｍ（ｉ）を算出する；及びｃ≦ｉ≦ｃ＋Ｌ−１におけるＦ（ｉ）の最大値が正かつ最小値が負であり、かつ、Ｆ（ｃ）＜Ｆ（ｃ＋Ｌ−１）となるｃを算出し、ＲＮＡのｃ番目からｃ＋Ｌ−１番目の塩基領域をＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーション領域と設定することからなる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドナープローブとアクセプタープローブとからなる蛍光共鳴エネルギー移動プローブのＲＮＡ上のハイブリダイゼーション領域を設定する方法であって、
ｍｆｏｌｄにより塩基の長さがｎであるＲＮＡの塩基配列のｉ番目（１≦ｉ≦ｎ）の塩基のＳＳ−ｃｏｕｎｔ値Ｓ（ｉ）を算出する工程と、
蛍光共鳴エネルギー移動プローブの長さＬ（２Ｌ＜ｎ）を決める工程と、
１≦ｉ≦ｎ−Ｌ＋１であるすべてのｉについて、ｉ番目の塩基からｉ＋Ｌ−１番目の塩基までのＳＳ−ｃｏｕｎｔ値Ｓ（ｉ）の平均値Ｍ（ｉ）を算出する工程と、
１≦ｉ≦ｎ−２Ｌ＋２であるすべてのｉについて、Ｆ（ｉ）＝Ｍ（ｉ＋Ｌ−１）−Ｍ（ｉ）を算出する工程と、
ｃ≦ｉ≦ｃ＋Ｌ−１におけるＦ（ｉ）の最大値が正かつＦ（ｉ）の最小値が負であり、かつ、Ｆ（ｃ）＜Ｆ（ｃ＋Ｌ−１）となるｃを算出し、ＲＮＡのｃ番目からｃ＋Ｌ−１番目の塩基領域を蛍光共鳴エネルギー移動プローブのハイブリダイゼーション領域と設定する工程と、
を含む方法。
【請求項２】
２０≦Ｌ≦５０である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動プローブの設計方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用して、特定のｍＲＮＡが発現している細胞を生きたままの状態で選択的に分離する方法が提案されている（特許文献１）。この方法は、標的ｍＲＮＡにドナープローブとアクセプタープローブとが近接してハイブリダイズしている場合、ドナープローブに結合しているエネルギードナー蛍光色素の励起波長の光を照射すると、ＦＲＥＴが生じて、アクセプタープローブに結合しているエネルギーアクセプター蛍光色素からの蛍光が生じることを利用している。
【０００３】
ドナープローブとアクセプタープローブとからなるＦＲＥＴプローブを、標的ｍＲＮＡのどの領域でハイブリダイズさせるかによって、ＦＲＥＴの効率（エネルギーアクセプター蛍光色素の蛍光強度）は大きく異なる。ＦＲＥＴの効率が低い場合、目的とするｍＲＮＡを高感度に検出することができず、そのｍＲＮＡを発現した細胞を分離することができない。
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−２８６２８５号公報
【非特許文献１】Zuker M. et al., Algorithms and Thermodynamics for RNA SecondaryStructure Prediction: A Practical Guide in RNA Biochemistry and Biotechnology,J. Barciszewski and B.F.C. Clark, eds., NATO ASI Series, Kluwer AcademicPublishers (1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＦＲＥＴ効率の高いＦＲＥＴプローブを設計する方法（ハイブリダイゼーション領域を設計する方法）は考案されているものの、その予測精度は低く、ＦＲＥＴプローブの候補を複数合成しても、必ずしもすべてのＦＲＥＴプローブが充分なＦＲＥＴが生じるとは限らない。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、ＦＲＥＴ効率の高いＦＲＥＴプローブを高い精度で予測できる、ＦＲＥＴプローブの設計方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、ＲＮＡの高次構造予測の指標の一つであるＳＳ−ｃｏｕｎｔ値に着目し、ＳＳ−ｃｏｕｎｔ値の平均が所定の条件を満たす領域をＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーション領域とすれば、ＦＲＥＴ効率の高いＦＲＥＴプローブを高い精度で設計できることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、
ドナープローブとアクセプタープローブとからなるＦＲＥＴプローブのＲＮＡ上のハイブリダイゼーション領域を設定する方法であって、
ｍｆｏｌｄにより塩基の長さがｎであるＲＮＡの塩基配列のｉ番目（１≦ｉ≦ｎ）の塩基のＳＳ−ｃｏｕｎｔ値Ｓ（ｉ）を算出する工程と、
蛍光共鳴エネルギー移動プローブの長さＬ（２Ｌ＜ｎ）を決める工程と、
１≦ｉ≦ｎ−Ｌ＋１であるすべてのｉについて、ｉ番目の塩基からｉ＋Ｌ−１番目の塩基までのＳＳ−ｃｏｕｎｔ値Ｓ（ｉ）の平均値Ｍ（ｉ）を算出する工程と、
１≦ｉ≦ｎ−２Ｌ＋２であるすべてのｉについて、Ｆ（ｉ）＝Ｍ（ｉ＋Ｌ−１）−Ｍ（ｉ）を算出する工程と、
ｃ≦ｉ≦ｃ＋Ｌ−１におけるＦ（ｉ）の最大値が正かつＦ（ｉ）の最小値が負であり、かつ、Ｆ（ｃ）＜Ｆ（ｃ＋Ｌ−１）となるｃを算出し、ＲＮＡのｃ番目からｃ＋Ｌ−１番目の塩基領域をＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーション領域と設定する工程と、
を含む方法、を提供する。
【０００９】
ここで、Ｌは２０≦Ｌ≦５０という条件を満たすことが好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法によれば、ＦＲＥＴ効率の高くなるハイブリダイゼーション領域を高い精度で予測することができ、したがって、優れたＦＲＥＴプローブを設計することができる。
【００１１】
また、本発明の方法によれば、複数のＦＲＥＴプローブを設計することができ、設計された複数のＦＲＥＴプローブを組み合わせて同時に用いることにより、単独のＦＲＥＴプローブを用いるときよりも高感度に標的ｍＲＮＡを検出することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の方法は、以下の工程（１）〜（５）を含むことを特徴とする：
（１）ｍｆｏｌｄにより塩基の長さがｎであるＲＮＡの塩基配列のｉ番目（１≦ｉ≦ｎ）の塩基のＳＳ−ｃｏｕｎｔ値Ｓ（ｉ）を算出する工程；
（２）蛍光共鳴エネルギー移動プローブの長さＬ（２Ｌ＜ｎ）を決める工程；
（３）１≦ｉ≦ｎ−Ｌ＋１であるすべてのｉについて、ｉ番目の塩基からｉ＋Ｌ−１番目の塩基までのＳＳ−ｃｏｕｎｔ値Ｓ（ｉ）の平均値Ｍ（ｉ）を算出する工程；
（４）１≦ｉ≦ｎ−２Ｌ＋２であるすべてのｉについて、Ｆ（ｉ）＝Ｍ（ｉ＋Ｌ−１）−Ｍ（ｉ）を算出する工程；及び
（５）ｃ≦ｉ≦ｃ＋Ｌ−１におけるＦ（ｉ）の最大値が正かつＦ（ｉ）の最小値が負であり、かつ、Ｆ（ｃ）＜Ｆ（ｃ＋Ｌ−１）となるｃを算出し、ＲＮＡのｃ番目からｃ＋Ｌ−１番目の塩基領域をＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーション領域と設定する工程。
【００１３】
まず、工程（１）では、ＦＲＥＴプローブで検出したいＲＮＡの塩基配列をｍｆｏｌｄに入力し、ＲＮＡの各塩基におけるＳＳ−ｃｏｕｎｔ値Ｓ（ｉ）を算出する。ｍｆｏｌｄとは、Ｚｕｃｋｅｒらによって開発されたＲＮＡの二次構造を予測するプログラムであり、ウェブ上で公開されており、ＲＮＡの塩基配列を入力することでＲＮＡの二次構造に関する様々なデータを入手することが可能である。ＳＳ−ｃｏｕｎｔ値とは、各塩基における相補鎖を形成しない場合の数を表し、この数値が高い塩基ほど高次構造の中で熱的に不安定である確率が高いといえる。
【００１４】
入力するＲＮＡの塩基配列は、検出したいＲＮＡの完全長の塩基配列であっても、一部の塩基配列であってもよい。入力するＲＮＡの塩基配列の長さｎは特に限定されないが、ｎの数値が小さすぎる場合にはＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーション領域を適切に設定できない可能性があるため、２００以上であることが好ましい。
【００１５】
次に、工程（２）では、ＦＲＥＴプローブの長さＬ（２Ｌ＜ｎ）を決定する。ＦＲＥＴプローブはエネルギードナー蛍光色素が結合したドナープローブとエネルギーアクセプター蛍光色素が結合したアクセプタープローブとで構成される。ドナープローブの５’末端付近にエネルギードナー蛍光色素が結合する一方、アクセプタープローブの３’末端付近にはエネルギーアクセプター蛍光色素が結合している。そのため、ドナープローブとアクセプタープローブが近接して標的ＲＮＡに結合すると、エネルギードナー蛍光色素とエネルギーアクセプター蛍光色素とが近接し、ＦＲＥＴが生じるようになる。
【００１６】
ここでＦＲＥＴプローブの長さＬとは、通常は、ドナープローブの長さ（塩基数）とアクセプタープローブの長さ（塩基数）の合計である。ただし、ドナープローブの５’末端とアクセプタープローブの３’末端とは、必ずしも隣り合っている必要はなく、１塩基以上離れた状態でドナープローブとアクセプタープローブは標的ＲＮＡにハイブリダイズしていてもよい。かかる場合には、ドナープローブの塩基数とアクセプタープローブの塩基数の合計に、両プローブが離れている塩基数を加えたものが、ＦＲＥＴプローブの長さＬに相当する。
【００１７】
ＦＲＥＴプローブの長さＬは特に限定されるものではないが、プローブ合成の容易さやハイブリダイズ条件の制御、ＦＲＥＴ効率などの観点から、２０以上５０以下であることが好ましく、３０以上４０以下であることが特に好ましい。ドナープローブの長さとアクセプタープローブの長さは、両プローブのＴｍ値がほぼ等しくなるように調整すればよい。
【００１８】
エネルギードナー蛍光色素とエネルギーアクセプター蛍光色素の距離は、２０塩基以内となるように、好ましくは２〜４塩基以内となるように、各プローブにおける各蛍光色素の位置を決めればよい。例えば、エネルギードナー蛍光色素をドナープローブの５’末端に配置し、エネルギーアクセプター蛍光色素をアクセプタープローブの３’末端から４塩基目に配置（両プローブ間が数塩基離れた状態で標的ＲＮＡにハイブリダイズする場合には、離れた塩基数だけ３’末端よりに配置）すればよい。
【００１９】
エネルギードナー蛍光色素は、直接又はヘキシルアミノ基などのリンカーを介して、塩基の代わりにヌクレオチドの糖に結合している。エネルギードナー蛍光色素はＦＲＥＴに通常用いられるエネルギードナー蛍光色素が利用できるが、例えば、以下の蛍光色素が挙げられる：４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−８−プロピオン酸（4,4-difluoro-1,3,5,7-tetramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-8-propionicacid）およびその誘導体（これらはBodipy493/503シリーズとしてモレキュラープローブス社から入手可能）；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（５−イソチオシアネートおよび６−イソチオシアネートの混合物であってもよい）（tetramethylrhodamine-5-(and-6)-isothiocyanate）およびその誘導体（これらはTRITCシリーズとしてモレキュラープローブス社から入手可能）；及び４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸（4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionicacid）およびその誘導体（これらはBodipy FLシリーズとしてモレキュラープローブス社から入手可能）等が挙げられる。
【００２０】
エネルギーアクセプター蛍光色素も、直接又はヘキシルアミノ基などのリンカーを介して、塩基の代わりにヌクレオチドの糖に結合している。エネルギーアクセプター蛍光色素はＦＲＥＴに通常用いられるエネルギーアクセプター蛍光色素が利用できるが、例えば、以下の蛍光色素が挙げられる：１，１’−ビス（ε−カルボキシペンチル）−３，３，３’，３’−テトラメチルインドジカルボシアニン−５，５’−二スルホン酸  カリウム塩（1,1'-bis(ε-carboxypentyl)-3,3,3',3'-tetramethylindodicarbocyanine-5,5'-disulfonatepotassium salt）およびその誘導体（これらはCy5シリーズとしてアマシャムバイオサイエンス社から入手可能）；１，１’−ビス（ε−カルボキシペンチル）−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン−５，５’−二スルホン酸  カリウム塩（1,1'-bis(ε-carboxypentyl)-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine-5,5'-disulfonatepotassium salt)およびその誘導体（これらはCy3シリーズとしてアマシャムバイオサイエンス社から入手可能）；Ｘ−ローダミンイソチオシアネート（５−イソチオシアネートおよび６−イソチオシアネートの混合物であってもよい）（X-rhodamine-5-(and-6)-isothiocyanate）およびその誘導体（これらはXRITCシリーズとしてモレキュラープローブス社から入手可能）；６−（（（４，４−ジフロロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−イル）スチリロキシ）アセチル）アミノヘキサン酸（6-(((4,4-difluoro-5-(2-thienyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-yl)styryloxy)acetyl)aminohexanoicacid）およびその誘導体（これらはBodipy630/650シリーズとしてモレキュラープローブス社から入手可能）；６−（（（４，４−ジフロロ−５−（２−ピローリル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−イル）スチリロキシ）アセチル）アミノヘキサン酸（6-(((4,4-difluoro-5-(2-pyrrolyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-yl)styryloxy)acetyl)aminohexanoicacid）およびその誘導体（これらはBodipy650/665シリーズとしてモレキュラープローブス社から入手可能）等が挙げられる。
【００２１】
エネルギードナー蛍光色素としてはBodipy 493/503を用いることが好ましく、エネルギーアクセプター蛍光色素としてはCy5又はXRITCを用いることが好ましい。
【００２２】
以上説明したＦＲＥＴプローブを設計するために、ＦＲＥＴプローブの長さＬを決定するのが、工程（２）である。
【００２３】
次に、工程（３）では、ＦＲＥＴプローブの長さＬにわたるＳＳ−ｃｏｕｎｔ値の平均値Ｍ（ｉ）を算出する。ＳＳ−ｃｏｕｎｔ値は１塩基ごとのデータであるため、それ自体から何ら有効な情報を得ることはできない。例えば図１に示すように、ＳＳ−ｃｏｕｎｔ値は離散的かつ何ら意味をなさない数値を示し、このデータに基づいてＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーション領域を設定することは不可能である。しかし、ＦＲＥＴプローブの長さＬで平均をとることにより、ＳＳ−ｃｏｕｎｔ値をＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーション領域の設定に有効に利用できることを本発明者らは見出した。例えば、図２に示すように、平均値Ｍ（ｉ）ではＳＳ−ｃｏｕｎｔ値の傾向を把握することが可能となり、ハイブリダイゼーション領域の設定に活用することが可能となる。
【００２４】
次に、工程（４）では、平均値Ｍ（ｉ）をよりハイブリダイゼーション領域の設定に利用し易くするための処理を行う。この処理により、次の工程（５）での判別が容易となる。
【００２５】
最後に、工程（５）では、ｃ≦ｉ≦ｃ＋Ｌ−１におけるＦ（ｉ）の最大値が正かつＦ（ｉ）の最小値が負であり、かつ、Ｆ（ｃ）＜Ｆ（ｃ＋Ｌ−１）となるｃを算出し、ＲＮＡのｃ番目からｃ＋Ｌ−１番目の塩基領域をＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーション領域と設定する。このような条件を満たす領域でＦＲＥＴプローブをハイブリダイゼーションさせると、ＦＲＥＴの効率が高くなる。
【実施例】
【００２６】
実施例１：ヒトＷＴ１  ｍＲＮＡに対するＦＲＥＴプローブ
【００２７】
（ｍｆｏｌｄによる計算）
ヒトＷＴ１  ｍＲＮＡ（GenBank受入番号：NM_024426）の塩基配列のうち、開始コドンのアデニン塩基から数えて１３５０の塩基長の配列データ（配列番号１）をｍｆｏｌｄに入力し、３７℃の条件におけるＳＳ−ｃｏｎｕｔ値を計算した。得られた結果を図１に示す。図１から分かるように、ＳＳ−ｃｏｎｕｔ値自体は離散的な数値をとり、このままでは何ら有力な情報を得ることができない。
【００２８】
そこで、ＦＲＥＴプローブの長さを４０に設定し、４０塩基にわたるＳＳ−ｃｏｕｎｔ値の平均値Ｍ（ｉ）を計算した。さらに、処理をしやすくするため、４０塩基離れた位置のＳＳ−ｃｏｕｎｔ値の平均値との差Ｆ（ｉ）を計算した。図２にＭ（ｉ）とＦ（ｉ）を示す。
【００２９】
（ＦＲＥＴプローブの合成）
図２から６つの領域を選んで、実際にＦＲＥＴプローブを合成した。合成したＦＲＥＴプローブを表１に示す。
【００３０】
【表１】
2007037465.tif 000002
【００３１】
表１に記載した配列を有するドナープローブを特許文献１に記載の方法に準じて合成した。より詳細には、以下の通りである。2.5mgのNHSS(N-Hydroxysulfosuccinimidesodium salt)を30μLの滅菌水に溶かした溶液と、5mgのEDAC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)を50μLの滅菌水に溶かした溶液と1mgのBodipy493/503プロピオン酸を50μLのDMFに溶かした溶液を混合し、室温で30分間反応させた。
【００３２】
一方、DNA/RNAシンセサイザー（PerkinElmer社製モデル394又はPerceptive Biosystems社製モデル8909）を用いて、βシアノエチルアミダイト法により、表１に記載の塩基配列のうちxを除いた塩基配列を有するオリゴDNAを合成した。合成したオリゴDNAの5'末端に、６−（トリフルオロアセチルアミノ）ヘキシル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホロアミダイトを用いてヘキシルアミノ基を導入し、凍結乾燥した。これを200μLの0.5M Na2HCO3/NaH2CO3緩衝液（pH9.3）に溶解した。
【００３３】
これらを混合し、遮光条件下で一晩反応させた。反応液をゲル濾過して未反応の色素を除去した後、CAPCELL PACK18（資生堂社製、カラムサイズは6mm内径×250mm全長）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（流速：1mL/分、カラム温度：40℃、移動相組成：5mM triethylammonium acetateを含む5%アセトニトリル水溶液（Ａ）及び5mM triethylammonium acetateを含む40%アセトニトリル水溶液（Ｂ）、濃度勾配：30-80%Ｂ（0-20分））により、260nmと493nmに吸収をもつ画分を分取し、凍結乾燥した。
【００３４】
次に、表１に記載したアクセプタープローブを特許文献１に記載の方法に準じて合成した。より詳細には、以下の通りである。１チューブ分のCy5色素（Amersham社製, Fluorolink Cat. No. PA25001）を100μLの滅菌水に溶解した。
【００３５】
一方、Uni-Link AminoModifier (Clontech社製)を用いて表１に記載の塩基配列中yに相当する部分にヘキシルアミノ基を導入したオリゴDNAを合成し、凍結乾燥した。これを200μLの Na2HCO3/NaH2CO3緩衝液（0.5M、pH9.3）に溶解した。
【００３６】
これらを混合し、遮光条件下で一晩反応させた。反応液をゲル濾過して未反応の色素を除去した後、CAPCELL PACK18を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（流速：1mL/分、カラム温度：40℃、移動相組成：5mM triethylammonium acetateを含む5%アセトニトリル水溶液（Ａ）及び5mM triethylammonium acetateを含む40%アセトニトリル水溶液（Ｂ）、濃度勾配：15-60%Ｂ（0-20分））により、260nmに吸収をもつ画分を分取した。得られた画分の吸収スペクトルを220-700nmの範囲で測定し、650-700nmにおけるCy5の吸収極大を確認後、得られた画分を凍結乾燥した。
【００３７】
（WT1 mRNAの調製）
ヒトWT1のcDNAを含むプラスミドDNA（pUCWT1；理化学研究所バイオリソースセンターから購入）を制限酵素EcoRI及びHincIIで切断し、WT1 cDNA断片を得た。WT1 cDNA断片を、RNA合成用ベクターpBluescriptII KS+のEcoRI/HincIIによる消化部位に、T7プロモーター下流に断片が位置するように、ライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて結合させた。得られた組換えプラスミドを大腸菌JM109株のコンピテントセル（タカラバイオ社製）に導入し、得られた形質転換体を培養し組換えプラスミドを複製した。
【００３８】
複製したプラスミドをHincIIにより直鎖状にした後、ProteinaseK（タカラバイオ社製）及びフェノール・クロロホルムで処理し、変性、除タンパクを行った。このように精製した遺伝子断片を鋳型として、インビトロ転写キット（Megascript T7 Kits：Ambion社）を用いてRNAを合成した。RNA溶液にDNaseI（タカラバイオ社製）を加えてプラスミドDNAを消化した後、等量の塩化リチウム溶液と2倍量のエタノールを加えてRNAを沈殿させ、70%エタノールで洗浄した後、乾燥した。RNaseを含有しない蒸留水にRNAを溶解させて、以下の実験に用いた。
【００３９】
（蛍光スペクトル変化の測定）
ドナープローブとアクセプタープローブが近接してハイブリダイゼーションすることに伴うFRETによる蛍光スペクトルの変化を測定した。ドナープローブ及びアクセプタープローブを終濃度1μMとなるように150μLの1xSSC（150mM塩化ナトリウム、17mMクエン酸ナトリウム、pH7.0）溶液に加え、室温で15分放置した後、四面透過の石英製のキュベットに注入し、蛍光分光光度計（F4500；日立製作所製）により励起波長488nm、蛍光波長500-750nmの範囲で蛍光スペクトルを測定した。次に、この溶液にWT1 mRNAを200pmol添加し、30分放置した後、室温における蛍光スペクトルを測定して、ハイブリダイゼーションに伴う蛍光スペクトルの変化を観察した。
【００４０】
図３は、FRETプローブ単独存在下及びWT1mRNA（200pmol）との共存下における、515nmの蛍光強度に対する670nmの蛍光強度の比（I670nm/I515nm）を表すグラフである。図３から分かるように、連続する４０塩基の領域において、その領域内のＦ（ｉ）の最大値が正かつＦ（ｉ）の最小値が負であり、かつ、５’末端のＦ（ｉ）が３’末端のＦ（ｉ）よりも小さいという条件を満たしている場合（プローブWT1Ex1、WT1Ex2、WT1Ex5、WT1Ex6及びWT1KTS+）、高い効率のＦＲＥＴが観測された。一方、上記条件を満たさない場合（プローブWT1Ex1+）、ＦＲＥＴは観測されなかった。
【００４１】
実施例２：ヒトＩＬ２  ｍＲＮＡに対するＦＲＥＴプローブ
既に公表した、ヒトＩＬ−２  ｍＲＮＡのＦＲＥＴプローブによる検出の実験結果と、本発明の方法により設定されるハイブリダイゼーション領域との比較を試みた。公表した実験結果は、Ishibashi K. et al., Anal. Chem., vol. 75, pp. 2715-2723 (2003) 及びそれに対応する特許出願（特許文献１）を用いた。ヒトＩＬ−２  ｍＲＮＡ検出用の様々なＦＲＥＴプローブ（エネルギーアクセプター蛍光色素としてXRITCを用いている）を用いたときの蛍光強度比（I606nm/I515nm）を図４に示す。プローブ名は、ヒトＩＬ−２  ｍＲＮＡのヌクレオチドの位置（開始コドンのアデニンを１とする）に対応している。ＦＲＥＴプローブの長さは３０である。
【００４２】
ヒトＩＬ２  ｍＲＮＡの塩基配列の一部（配列番号２）をｍｆｏｌｄに入力し、３７℃の条件におけるＳＳ−ｃｏｎｕｔ値を計算した。ＦＲＥＴプローブの長さを３０として、３０塩基にわたるＳＳ−ｃｏｕｎｔ値の平均値Ｍ（ｉ）を計算し、さらに、３０塩基離れた位置のＳＳ−ｃｏｕｎｔ値の平均値との差Ｆ（ｉ）を計算した。図５にＭ（ｉ）とＦ（ｉ）を示す。
【００４３】
図４及び図５から分かるように、高いＦＲＥＴ効率を示すプローブ287-316及び342-371は、本発明の方法で規定する条件に合致し、他方、ＦＲＥＴが生じていないプローブ198-227は、本発明の方法で規定する条件を満たしていない。
【００４４】
実施例３：ヒトＩＬ４  ｍＲＮＡに対するＦＲＥＴプローブ
ヒトＩＬ−４  ｍＲＮＡについても、実施例２と同様に、既出の実験結果と、本発明の方法により設定されるハイブリダイゼーション領域との比較を行った。実験結果を引用した文献は、実施例２と同じである。ヒトＩＬ−４  ｍＲＮＡ検出用の様々なＦＲＥＴプローブを用いたときの蛍光強度比（I670nm/I515nm）を図６に示す。プローブ名は、ヒトＩＬ−４  ｍＲＮＡのヌクレオチドの位置（開始コドンのアデニンを１とする）に対応している。ＦＲＥＴプローブの長さは３０である。
【００４５】
ヒトＩＬ４  ｍＲＮＡの塩基配列の一部（配列番号３）をｍｆｏｌｄに入力し、３７℃の条件におけるＳＳ−ｃｏｎｕｔ値を計算した。ＦＲＥＴプローブの長さを３０として、３０塩基にわたるＳＳ−ｃｏｕｎｔ値の平均値Ｍ（ｉ）を計算し、さらに、３０塩基離れた位置のＳＳ−ｃｏｕｎｔ値の平均値との差Ｆ（ｉ）を計算した。図７にＭ（ｉ）とＦ（ｉ）を示す。
【００４６】
図６及び図７から分かるように、高いＦＲＥＴ効率を示すプローブ178-207及び265-294は、本発明の方法で規定する条件に合致し、他方、ＦＲＥＴが生じていないプローブ77-99、119-148及び326-355は、本発明の方法で規定する条件を満たしていない。
【００４７】
実施例４：複数のＦＲＥＴプローブを使用したヒトＷＴ１  ｍＲＮＡの検出
WT1Ex1プローブのみを用いた場合と、WT1Ex1プローブ、WT1Ex2プローブ、WT1Ex6プローブ及びWT1KTS+プローブの４種類のプローブの混合物を用いた場合とで、ヒトWT1 mRNAの増加に伴うFRETの蛍光強度変化を比較した。
【００４８】
ドナープローブ及びアクセプタープローブを120pmolずつ含むWT1Ex1プローブ溶液を調製し、各FRETプローブに関してドナープローブ及びアクセプタープローブを30pmolずつ含む混合プローブの溶液を調製した。各溶液に、WT1 mRNAを32pmol添加し、37℃で30分間インキュベーションした後に、蛍光分光光度計により励起波長488nm、蛍光波長500-750nmの範囲で蛍光スペクトルを測定した。さらに32pmolずつ96pmolまでWT1 mRNAを添加していき各添加量における蛍光スペクトルを測定した。
【００４９】
図８は、WT1 mRNAの様々な添加量における、WT1Ex1プローブ及び混合プローブを用いた場合の蛍光強度比（I670nm/I515nm）を表すグラフである。WT1 mRNAの添加量によらず、混合プローブを用いたときの方がWT1Ex1プローブ単独のときに比べて、強いFRETが観測された。特に、WT1 mRNAの添加量が少ないほど、FRETの強度差は顕著であった。
【００５０】
この結果から、本発明のFRETプローブの設計方法により設計される複数のFRETプローブを組み合わせて同時に使用することにより、標的mRNAを高感度に検出できることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、ヒトＷＴ１  ｍＲＮＡの各塩基に対するＳＳ−ｃｏｎｕｔ値を表すグラフである。
【図２】図２は、ヒトＷＴ１  ｍＲＮＡのＭ（ｉ）及びＦ（ｉ）を表すグラフである。
【図３】図３は、ヒトＷＴ１  ｍＲＮＡ検出用の様々なＦＲＥＴプローブを用いたときの蛍光強度比（I670nm/I515nm）を表すグラフである。
【図４】図４は、ヒトＩＬ２  ｍＲＮＡ検出用の様々なＦＲＥＴプローブを用いたときの蛍光強度比（I606nm/I515nm）を表すグラフである。
【図５】図５は、ヒトＩＬ２  ｍＲＮＡのＭ（ｉ）及びＦ（ｉ）を表すグラフである。
【図６】図６は、ヒトＩＬ４  ｍＲＮＡ検出用の様々なＦＲＥＴプローブを用いたときの蛍光強度比（I670nm/I515nm）を表すグラフである。
【図７】図７は、ヒトＩＬ４  ｍＲＮＡのＭ（ｉ）及びＦ（ｉ）を表すグラフである。
【図８】図８は、ヒトＷＴ１  ｍＲＮＡの様々な添加量における、WT1Ex1プローブ及び混合プローブを用いた場合の蛍光強度比（I670nm/I515nm）を表すグラフである。
【図１】
2007037465.tif 000003
【図２】
2007037465.tif 000004
【図３】
2007037465.tif 000005
【図４】
2007037465.tif 000006
【図５】
2007037465.tif 000007
【図６】
2007037465.tif 000008
【図７】
2007037465.tif 000009
【図８】
2007037465.tif 000010
【配列表】
2007037465000001.app