(57)【要約】      （修正有）【課題】唾液等の検体から、特定の５種類の歯周病菌を、インベーダー・アッセイ法を用いて、効率よく、かつ、確実に定量検出する手段を提供する。【解決手段】インベーダー・アッセイ法において、歯周病菌のうち、Porphyromonas gingivalisの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の７４８番目の塩基、Prevotellaintermediaの同遺伝子の１９１番目の塩基、Actinobacillusactinomycetemcomitansの同遺伝子の８４２番目の塩基、Bacteroides forsythusの同遺伝子の１５５番目の塩基、又は、Treponema denticolaの同遺伝子の１５５番目若しくは４２０番目の塩基をターゲット塩基として定量検出を行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のヌクレオチド鎖（１）〜（３）：
（１）検出対象となるターゲット塩基を有する鋳型ヌクレオチド鎖；
（２）鋳型ヌクレオチド鎖の当該ターゲット塩基と近接する塩基を有し、当該近接塩基から鋳型ヌクレオチド鎖の３’側に向かってハイブリダイズ可能な、第１の相補鎖；
（３）上記ターゲット塩基に対して相補的な塩基を有し、当該相補的塩基から鋳型ヌクレオチド鎖の５’側に向かってハイブリダイズ可能であり、３’側に向かってはハイブリダイズできない、第２の相補鎖；
をハイブリダイズさせて、上記の鋳型ヌクレオチド鎖（１）のターゲット塩基部分に部分的三重鎖構造を形成させ、次いで、当該三重鎖構造を形成した第２の相補鎖（３）の３’側を特異的に切断する制限酵素を作用させて、当該酵素反応により遊離した第２の相補鎖（３）のハイブリダイズしない側のヌクレオチド鎖を検出することにより、鋳型ヌクレオチド鎖（１）のターゲット塩基を検出する方法において、
Porphyromonas gingivalis（P.g.）、 Prevotella intermedia（P.i.）、Actinobacillus actinomycetemcomitans（A.a.）、Bacteroides forsythus（B.f.）、及び、Treponema denticola（T.d.）からなる群の歯周病菌から選ばれる１〜５種の、１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子を、上記の鋳型ヌクレオチド鎖（１）として、当該ヌクレオチド鎖における下記（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）P.g.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子（相補的両塩基配列を含む）の７４８番目の塩基；
（ｂ）P.i.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子（相補的両塩基配列を含む）の１９１番目の塩基；
（ｃ）A.a.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子（相補的両塩基配列を含む）の８４２番目の塩基；
（ｄ）B.f.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子（相補的両塩基配列を含む）の８４２番目の塩基；
（ｅ）T.d.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子（相補的両塩基配列を含む）の１５５番目の塩基又は４２０番目の塩基；
を上記ターゲット塩基として検出を行うことにより、これらの歯周病菌の定量検出を行うことを特徴とする、歯周病菌の検出方法。
【請求項２】
上記検出方法において下記（ａ）〜（ｅ）からなる群のうち、少なくとも１つの特徴を有する、請求項１記載の歯周病菌の検出方法。
（ａ）P.g.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の７４８番目の塩基がグアニンである。
（ｂ）P.i.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の１９１番目の塩基がグアニンである。
（ｃ）A.a.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の８４２番目の塩基がグアニンである。
（ｄ）B.f.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の８４２番目の塩基がチミンである。
（ｅ）T.d.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の１５５番目の塩基がチミンであり、同４２０番目の塩基がチミンである。
【請求項３】
上記検出方法において、遊離した、第２の相補鎖（３）のハイブリダイズしない側のヌクレオチド鎖（Ａ）の検出を、当該ヌクレオチド鎖（Ａ）、及び、プローブ（Ｂ）：
（Ｂ）：１本のヌクレオチド鎖が３’末端と５’末端を両端として、折れ曲がってハイブリダイズしてなり、かつ、３’末端側のヌクレオチド鎖の一部が一本鎖として突出してなる構造であり、（１）３’末端側の突出部分が、上記の遊離のヌクレオチド鎖とハイブリダイズ可能であり、かつ、当該突出部分の最も５’側の塩基に隣り合うさらに５’側の一塩基がターゲット塩基（Ｂ１）であり、（２）５’末端の近傍に蛍光色素（Ｂ２）が標識され、当該蛍光色素の３’側近傍に蛍光消光物質（Ｂ３）が標識されてなる、プローブ；
の共存により、プローブ（Ｂ）の３’末端側の突出部分の一部又は全部と、ヌクレオチド鎖（Ａ）とを、ヌクレオチド鎖（Ａ）の３’末端のターゲット塩基に対して相補的な塩基（Ａ１）とターゲット塩基（Ｂ１）を含めてハイブリダイズさせ、当該相補的塩基（Ａ１）、ターゲット塩基（Ｂ１）及びプローブ（Ｂ）の５’末端近傍の塩基、からなる部分的三重鎖構造を形成させて、当該三重鎖構造の３’側を特異的に切断する制限酵素の作用により、プローブ（Ｂ）の５’末端を、当該末端部分に標識した蛍光色素（Ｂ２）と共に、プローブ（Ｂ）から遊離させることにより、蛍光消光物質（Ｂ３）の消光作用から開放された蛍光色素（Ｂ２）の蛍光強度を指標として行うことを特徴とする、請求項１又は２記載の歯周病菌の検出方法。
【請求項４】
上記検出方法において、第１の相補鎖が、鋳型ヌクレオチド鎖（１）におけるターゲット塩基（当該塩基を含まない）から３’側に向かって少なくとも９塩基分の塩基配列からなるヌクレオチド鎖（相補的両塩基配列を含む）に対して相補的なヌクレオチド鎖を、鋳型ヌクレオチド鎖（１）のターゲット塩基と近接する塩基と連続して有し、かつ、当該第１の相補鎖の総塩基数が１０〜５０塩基であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の歯周病菌の検出方法。
【請求項５】
上記検出方法において、第１の相補鎖の塩基配列が下記（ａ）〜（ｅ）から選ばれる少なくとも１種類の特徴を有する、請求項４記載の歯周病菌の検出方法。
（ａ）P.g.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子（相補的両塩基配列を含む）の７４８番目の塩基をターゲット塩基として、P.g.の検出を行う場合の塩基配列が、配列番号６で表される塩基配列（相補的両塩基配列を含む）である。
（ｂ）P.i.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子（相補的両塩基配列を含む）の１９１番目の塩基をターゲット塩基として、P.i.の検出を行う場合の塩基配列が、配列番号７で表される塩基配列（相補的両塩基配列を含む）である。
（ｃ）A.a.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子（相補的両塩基配列を含む）の８４２番目の塩基をターゲット塩基として、A.a.の検出を行う場合の塩基配列が、配列番号８で表される塩基配列（相補的両塩基配列を含む）である。
（ｄ）B.f.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子（相補的両塩基配列を含む）の８４２番目の塩基をターゲット塩基として、B.f.の検出を行う場合の塩基配列が、配列番号９で表される塩基配列（相補的両塩基配列を含む）である。
（ｅ）T.d.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子（相補的両塩基配列を含む）の１５５番目の塩基又は４２０番目の塩基をターゲット塩基として、T.d.の検出を行う場合の塩基配列が、１５５番目の塩基においては配列番号１０で表される塩基配列（相補的両塩基配列を含む）であり、４２０番目の塩基においては配列番号１１で表される塩基配列（相補的両塩基配列を含む）である。
【請求項６】
上記検出方法において、第２の相補鎖の鋳型ヌクレオチド鎖（１）とハイブリダイズさせる部分の配列が、鋳型ヌクレオチド鎖（１）におけるターゲット塩基（当該塩基を含む）から５’側に向かって少なくとも１０塩基分の塩基配列からなるヌクレオチド鎖（相補的両塩基配列を含む）に対して相補的なヌクレオチド鎖であり、かつ、当該第２の相補鎖のハイブリダイズ部分の総塩基数が１０〜３０塩基であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の歯周病菌の検出方法。
【請求項７】
上記検出方法において、第２の相補鎖の鋳型ヌクレオチド鎖（１）とハイブリダイズさせる部分の塩基配列が、下記（ａ）〜（ｅ）から選ばれる少なくとも１種類の特徴を有する、請求項６記載の歯周病菌の検出方法。
（ａ）P.g.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子（相補的両塩基配列を含む）の７４８番目の塩基をターゲット塩基として、P.g.の検出を行う場合の塩基配列が、配列番号１２で表される塩基配列（相補的両塩基配列を含む）である。
（ｂ）P.i.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子（相補的両塩基配列を含む）の１９１番目の塩基をターゲット塩基として、P.i.の検出を行う場合の塩基配列が、配列番号１３で表される塩基配列（相補的両塩基配列を含む）である。
（ｃ）A.a.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子（相補的両塩基配列を含む）の８４２番目の塩基をターゲット塩基として、A.a.の検出を行う場合の第１の相補鎖が、配列番号１４で表される塩基配列（相補的両塩基配列を含む）である。
（ｄ）B.f.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子（相補的両塩基配列を含む）の８４２番目の塩基をターゲット塩基として、B.f.の検出を行う場合の第１の相補鎖が、配列番号１５で表される塩基配列（相補的両塩基配列を含む）である。
（ｅ）T.d.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子（相補的両塩基配列を含む）の１５５番目の塩基又は４２０番目の塩基をターゲット塩基として、T.d.の検出を行う場合の第１の相補鎖が、１５５番目の塩基においては配列番号１６で表される塩基配列（相補的両塩基配列を含む）であり、４２０番目の塩基においては配列番号１７で表される塩基配列（相補的両塩基配列を含む）である。
【請求項８】
上記検出方法において、検体中の全菌体数を、下記のヌクレオチド鎖（１）〜（３）：
（１）検出対象となるターゲット塩基を有する鋳型ヌクレオチド鎖；
（２）鋳型ヌクレオチド鎖の当該ターゲット塩基と近接する塩基を有し、当該近接塩基から鋳型ヌクレオチド鎖の３’側に向かってハイブリダイズ可能な、第１の相補鎖；
（３）上記ターゲット塩基に対して相補的な塩基を有し、当該相補的塩基から鋳型ヌクレオチド鎖の５’側に向かってハイブリダイズ可能であり、３’側に向かってはハイブリダイズできない、第２の相補鎖；
をハイブリダイズさせて、上記の鋳型ヌクレオチド鎖（１）のターゲット塩基部分に部分的三重鎖構造を形成させ、次いで、当該三重鎖構造を形成した第２の相補鎖（３）の３’側を特異的に切断する制限酵素を作用させて、当該酵素反応により遊離した第２の相補鎖（３）のハイブリダイズしない側のヌクレオチド鎖を検出することにより、鋳型ヌクレオチド鎖（１）のターゲット塩基を検出する方法にて定量検出して、当該全菌体数における歯周病菌の菌体数の割合を算出する場合に、当該検出方法にて検出するターゲット塩基を、A.a.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の１３８２番目、P.gの同１３８４番目、P.i.の同１３５０番目、B.f.の同１３４１番目、及び、T.d.の同１３５３番目の塩基（相補的な塩基を択一的に含む）とし、かつ、これらの異なる歯周病菌のターゲット塩基を共通に検出することができる第１の相補鎖と第２の相補鎖を選択して、上記の方法を行うことを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の歯周病菌の検出方法。
【請求項９】
前記検出方法において、鋳型ヌクレオチド鎖（１）を提供する検体が、唾液検体又はプラーク検体であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の歯周病菌の検出方法。
【請求項１０】
請求項１記載の歯周病菌の検出方法を行うためのキットであって、下記（１）の特徴を有し、かつ、下記（２）及び（３）に示す第１の相補鎖と第２の相補鎖を含有することを特徴とする、歯周病菌検出用キット。
（１）ターゲット塩基が、下記の塩基である。
（ａ）P.g.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の７４８番目のグアニンである；
（ｂ）P.i.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の１９１番目のグアニンである；
（ｃ）A.a.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の８４２番目のグアニンである；
（ｄ）B.f.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の８４２番目のチミンである；
（ｅ）T.d.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の１５５番目のチミン又は４２０番目のチミンである；
（２）第１の相補鎖が、第１の相補鎖が、ターゲット塩基（当該塩基を含まない）から３’側に向かって少なくとも９塩基分の塩基配列からなるヌクレオチド鎖に対して相補的なヌクレオチド鎖を、ターゲット塩基と近接する塩基と連続して有し、かつ、当該第１の相補鎖の総塩基数は１０〜５０塩基である。
（３）第２の相補鎖の、鋳型ヌクレオチド鎖とハイブリダイズさせる部分の配列が、ターゲット塩基（当該塩基を含む）から５’側に向かって少なくとも１０塩基分の塩基配列からなるヌクレオチド鎖に対して相補的なヌクレオチド鎖であり、かつ、当該第２の相補鎖のハイブリダイズ部分の総塩基数は１０〜３０塩基である。
【請求項１１】
前記キットにおいて、さらに、検体中の全菌体数を、定量検出を行うことを目的とした、ターゲット塩基を、A.a.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の１３８２番目、P.gの同１３８４番目、P.i.の同１３５０番目、B.f.の同１３４１番目、及び、T.d.の同１３５３番目の塩基（相補的な塩基を択一的に含む）とし、かつ、これらの異なる歯周病菌のターゲット塩基を共通に検出することができる第１の相補鎖と第２の相補鎖を含有することを特徴とする、請求項１０記載の歯周病菌検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の細菌の検出方法に関する発明である。具体的には、本発明は、特定の歯周病菌を、インベーダー・アッセイ法を用いて定量検出することを目的とする発明である。
【背景技術】
【０００２】
歯周疾患は、歯肉炎の段階であれば、正しい歯磨きや、歯石の除去により改善することが知られている。歯周疾患は、歯−歯周組織への細菌叢の定着と増殖により、歯肉縁下ポケットにおいて進行する疾患であることが知られている。歯周疾患は、進行してもほとんど痛みがなく、気付かないうちに進行することが多いが、放置しておくと最終的には歯が抜け落ちることにもなりかねない。
【０００３】
特に、近年の日本においては、食生活の欧米化が進み、比較的柔らかな食品を好む傾向や、精神的なストレスの増加等により、歯周疾患に罹患する度合いが高まっている。
【０００４】
歯周疾患の対策としては、正しい歯磨きや、定期検診によるプラークコントロール、食生活の改善等の予防行為が挙げられるが、現実的には、進行しつつある歯周疾患をいかに的確に発見し、その症状に適した治療を行うかが非常に重要なポイントとなっている。
【０００５】
歯周疾患の診断法としては、例えば、レントゲン検査、プラーク付着検査、歯肉縁下ポケット測定検査等が挙げられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
歯周疾患は、歯周病菌による感染症であり、特に、重度慢性歯周炎や侵襲性歯周炎では、本来口腔内には存在しない、特定の歯周病菌が多く存在し、細菌検査により、当該歯周病菌を定量検出することにより、治療ターゲットを明確にした原因除去療法を行うことができると考えられている。
【０００７】
しかしながら、例えば、歯肉縁下の細菌叢には２５０種以上の細菌が存在することが知られており、この中から、歯周病菌を特定して定量検出することは困難である。
【０００８】
本発明では、このような状況を鑑み、多くの種類の細菌を含み得る、唾液等の検体から、歯周疾患の原因菌として知られている、Porphyromonas gingivalis（P.g.）、 Prevotella intermedia（P.i.）、Actinobacillus actinomycetemcomitans（A.a.）、Bacteroides forsythus（B.f.）、及び、Treponema denticola（T.d.）を、効率よく、かつ、確実に定量検出する手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記の課題の解決のために、歯周病菌の定量検出をインベーダー・アッセイ法、すなわち、下記のヌクレオチド鎖（１）〜（３）：
【００１０】
（１）検出対象となるターゲット塩基を有する鋳型ヌクレオチド鎖；
【００１１】
（２）鋳型ヌクレオチド鎖の当該ターゲット塩基と近接する塩基を有し、当該近接塩基から鋳型ヌクレオチド鎖の３’側に向かってハイブリダイズ可能な、第１の相補鎖；
【００１２】
（３）上記ターゲット塩基に対して相補的な塩基を有し、当該相補的塩基から鋳型ヌクレオチド鎖の５’側に向かってハイブリダイズ可能であり、３’側に向かってはハイブリダイズできない、第２の相補鎖；
をハイブリダイズさせて、上記の鋳型ヌクレオチド鎖（１）のターゲット塩基部分に部分的三重鎖構造を形成させ、次いで、当該三重鎖構造を形成した第２の相補鎖（３）の３’側を特異的に切断する制限酵素を作用させて、当該酵素反応により遊離した第２の相補鎖（３）のハイブリダイズしない側のヌクレオチド鎖を検出することにより、鋳型ヌクレオチド鎖（１）のターゲット塩基を検出する方法（以下、特に断らない限り、この検出方法をインベーダー・アッセイ法という）、にて行うことを目指して、特定の検出対象塩基、上記第１の相補鎖、第２の相補鎖等について検討を行い、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明は、インベーダー・アッセイ法において、Porphyromonas gingivalis（P.g.）、Prevotella intermedia（P.i.）、Actinobacillus actinomycetemcomitans（A.a.）、Bacteroides forsythus（B.f.）、及び、Treponema denticola（T.d.）からなる群の歯周病菌から選ばれる１〜５種の、１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子を、上記の鋳型ヌクレオチド鎖（１）として、当該ヌクレオチド鎖における下記（ａ）〜（ｅ）：
【００１４】
（ａ）P.g.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子（相補的両塩基配列を含む）の７４８番目の塩基；
（ｂ）P.i.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子（相補的両塩基配列を含む）の１９１番目の塩基；
（ｃ）A.a.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子（相補的両塩基配列を含む）の８４２番目の塩基；
（ｄ）B.f.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子（相補的両塩基配列を含む）の８４２番目の塩基；
（ｅ）T.d.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子（相補的両塩基配列を含む）の１５５番目の塩基又は４２０番目の塩基；
を上記ターゲット塩基として検出を行うことにより、これらの歯周病菌の定量検出を行うことを特徴とする、歯周病菌の検出方法（以下、本検出方法ともいう）を提供する発明である。
【００１５】
本発明において「相補的」とは、ある塩基配列の核酸に対してストリージェントな条件下（５６〜６８℃、５０mM以上のナトリウムイオンの存在下）でハイブリダイズが可能な程度の相補性を有する塩基配列のことを意味する。また、「相補的両塩基配列」とは、＋鎖に対する−鎖の関係を有する相補的塩基配列、及び/又は、−鎖に対する＋鎖の関係を有する相補的塩基配列の双方を含む塩基配列という意味である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、唾液等の検体における特定の歯周病菌を、効率よく、かつ、精度良く定量検出する手段が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
［インベーダー・アッセイ法］  
図１は、インベーダー・アッセイ法［Third Wave Technologies社（米国）］のあらましを示した図面である。
【００１８】
図１において、鋳型ヌクレオチド鎖（検出対象遺伝子）１１に対して、第１の相補鎖１２をハイブリダイズさせる。
【００１９】
第１の相補鎖１２は、鋳型ヌクレオチド鎖１１における、検出対象塩基［本図では、Ｔ（チミン）］に相補的な塩基［本図では、Ａ（アデニン）］が３’末端に位置する鋳型ヌクレオチド鎖１１に対して相補的なヌクレオチド鎖である（この例では、第１の相補鎖１２の３’末端の塩基は、検出対象塩基に対して相補的であるが、たとえ当該塩基が相補的でなくても、当該塩基が、検出対象塩基と、以下に述べる第２の相補鎖との会合反応に干渉することにより、部分的三重鎖構造が形成され得る）。
【００２０】
次いで、この鋳型ヌクレオチド鎖１１と第１の相補鎖１２との部分的２本鎖に対して、さらに第２の相補鎖１３をハイブリダイズさせる。
【００２１】
第２の相補鎖１３は、鋳型ヌクレオチド鎖１１に対して相補的な「相補的部分」１３１が３’側にあり、これと連続して、検出要素が設けられた、鋳型ヌクレオチド鎖１３に対してハイブリダイズしない検出用部分１３２が５’側にある、複合的なヌクレオチド鎖であり、相補的部分１３１の最も５’側の塩基は、検出対象塩基（Ｔ）に対して相補的な塩基（Ａ）となっている。
【００２２】
この第２のハイブリダイズ反応によって、鋳型ヌクレオチド鎖１１の検出対象塩基部分（Ｔ）は、第１の相補鎖１２の３’末端塩基と、第２の相補鎖の相補的部分１３１の最も５’側の塩基（Ａ）との、部分的三重鎖構造が形成されることとなる。
【００２３】
次いで、この部分的三重鎖構造を、その３’側で特異的に切断する活性を有するヌクレアーゼ１４を作用させて、このヌクレアーゼにより切断された、第２の相補鎖１３の検出用部分１３２’［３’末端が、検出対象塩基（Ｔ）に対して相補的な塩基（Ａ）となっている］を検出することにより、鋳型ヌクレオチド鎖１１が検出対象遺伝子であることを明らかにすることができる。
【００２４】
本図においては、５’末端近傍に蛍光色素１５１と、その３’末端の近傍に蛍光消光物質（クエンチャー）１５２を標識したヘアピン型プローブ（ヌクレオチド鎖）１５を、上記のハイブリダイズ系と共存させることにより、上記の検出対象遺伝子を検出することが可能である。
【００２５】
なお、本発明において、ヘアピン型プローブは、「１本のヌクレオチド鎖が３’末端と５’末端を両端として、折れ曲がってハイブリダイズしてなり、かつ、３’末端側のヌクレオチド鎖の一部が一本鎖として突出してなる構造であり、（１）３’末端側の突出部分が、上記の遊離のヌクレオチド鎖とハイブリダイズ可能であり、かつ、当該突出部分の最も５’側の塩基に隣り合うさらに５’側の一塩基がターゲット塩基であり、（２）５’末端の近傍に蛍光色素が標識され、当該蛍光色素の３’側近傍に蛍光消光物質が標識されてなる、プローブ」として規定される。
【００２６】
ヘアピン型プローブ１５の３’側の一本鎖部分は、第２の相補鎖１３の検出用部分１３２に対して相補的に設計されており、かつ、かかる一本鎖部分の最も５’側の塩基に隣り合う、さらに５’側の一塩基は、検出対象塩基（Ｔ）となっている。そして、検出用部分１３２’が、ヘアピン型プローブ１５の一本鎖部分とハイブリダイズすると、検出用部分１３２’の３’末端の塩基（Ａ）が、ヘアピン型プローブ１５の二本鎖部分の先端において、再び、部分的三重鎖構造を形成する。これに対し、ヌクレアーゼ１４が再び作用して、ヘアピン型プローブ１５における、蛍光色素１５１と蛍光消光物質１５２の間のヌクレオチド鎖が切断されることにより、蛍光色素１５１が遊離し、蛍光消光物質１５２による蛍光消光反応から開放されて、本来の蛍光が検出可能な状態になる。この蛍光を検出することにより、鋳型ヌクレオチド１１が検出対象遺伝子であることを明らかにすることができる。
【００２７】
これに対して、鋳型ヌクレオチド１１の検出対象塩基に相当する塩基が、検出対象塩基以外の他の塩基［例えば、Ｇ（グアニン）］である場合、上記と同様の反応系においては、少なくとも検出用部分１３２の３’末端塩基（Ａ）は、当該他の塩基とは相補的ではない。よって、上記のような部分的三重鎖構造は形成されないので、検出用部分１３２は、ヌクレアーゼ１４によって第２の相補鎖から切断されず、遊離の検出用部分１３２’は系内に現れないこととなる。よって、ヘアピン型プローブ１５も、蛍光色素１５１と蛍光消光物質１５２が近接した状態が保たれ、実質的な蛍光は認められない。この場合は、鋳型ヌクレオチド１１は、検出対象遺伝子ではないことが明らかとなる。
【００２８】
このようにして、インベーダー法を用いて、検出対象遺伝子の特定を行うことができる。
【００２９】
なお、ここには、ヘアピン型プローブを用いた検出方法を例示したが、これ以外にも、例えば、検出用部分１３２に蛍光標識やアイソトープ標識等の標識を行って、この標識をカウントすることにより、検出対象遺伝子の検出を行うことができる。
【００３０】
インベーダー法による、検出対象遺伝子の定量は、概ね下記の原理により行うことができる。
【００３１】
上記の部分的三重鎖構造を形成させる段階の反応（一次反応）は、
［Ａ］＝α１×［Ｔ］×ｔ
（式中、［  ］は系中の濃度を示し、Ａは遊離の検出用部分１３２’（フラップ）の量を示し、α１は一次反応で部分的三重鎖構造にて開裂する割合を示し、Ｔは検体遺伝子量を示し、ｔは反応経過時間を示す）にて表される。
【００３２】
ここで、上記式を時間ｔで微分して、系中のフラップ量の時間当たりの変化率を求めると、
ｄ［Ａ］／ｔ＝α１×［Ｔ］
にて表される。
【００３３】
次に、フラップ１３２’が、ヘアピン型プローブ１５に部分的三重鎖構造を形成するように相補鎖結合が行われることにより、蛍光色素１５１と蛍光消光物質１５２の間のヌクレオチド鎖が開裂し、遊離の蛍光色素部分が系中に遊離する反応（二次反応）は、
［Ｓ］＝α２×［Ａ］×ｔ＋β１×［Ｘ］×ｔ
（式中、Ｓは二次反応産物量（遊離の蛍光色素１５１による蛍光量により表される）を示し、α２は二次反応で部分的三重鎖構造にて開裂する割合を示し、ｔは反応経過時間を示し、β１は非特異で開裂する割合を示し、Ｘは非特異産物量を示す）にて表される。
【００３４】
これを、上記と同様に時間ｔで微分して、二次反応産物量の変化率を求めると、
ｄ［Ｓ］／ｔ＝α２×［Ａ］＋β１×［Ｘ］
にて表される。
【００３５】
系中では、一次反応と二次反応は、巨視的には並行して進行するので、
ｄ［Ｓ］／ｔ＝α２×［Ａ］＋β１×［Ｘ］
ｄ［Ｓ］／ｔ＝α２×α１×［Ｔ］×ｔ＋β１×［Ｘ］
ｄ［Ｓ］／ｔ＝α１α２［Ｔ］ｔ＋β１［Ｘ］
にて表される。これを、ｔで積分すると、
［Ｓ］＝１／２α１α２［Ｔ］ｔ２＋β１［Ｘ］ｔ
【００３６】
ここで、β１［Ｘ］ｔは、検体遺伝子量にかかわらず一定とみなすことができるので、
二次反応産物量を示す蛍光量Ｓは、
［Ｓ］＝Ａｔ２＋Ｂ（式中、ＡとＢは定数）
にて表される。
【００３７】
よって、所望する検出対象遺伝子の定量値は、蛍光値をＹ、反応時間をＸとした場合に、
Ｙ＝ＡＸ２＋Ｂ（２次方程式）のＡとして表される。
【００３８】
以上のインベーダー・アッセイ法による定量過程については、文献においてすでに報告されている（Jeff et al,PNAS,vol.97,8272-8277,2000）。
【００３９】
［本検出方法］
本発明の定量検出（以下、特に断らない限り、「検出」という）の対象となる歯周病菌は、上述したとおり、Porphyromonas gingivalis（P.g.）、 Prevotella intermedia（P.i.）、Actinobacillus actinomycetemcomitans（A.a.）、Bacteroides forsythus（B.f.）、及び、Treponema denticola（T.d.）である。本検出方法において、検出を行うターゲットを含む遺伝子は、各歯周病菌の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子（以下、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子ともいう）である。P.g.の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は、配列番号１と図２にて示す通りであり、P.i.の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は、配列番号２と図２にて示す通りであり、A.a. の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は、配列番号３と図２にて示す通りであり、B.f. の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は、配列番号４と図２にて示す通りであり、T.d. の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は、配列番号５と図２にて示す通りである。
【００４０】
本検出方法を適用すべき検体は、歯周病菌を検出すべきすべてのものが対象となる。通常は、唾液検体又はプラーク検体であるが、重篤な歯周疾患の原因菌を特定するために、血清、血漿等の血液検体や尿検体も用い得る。
【００４１】
これらの検体からの遺伝子の調製方法は、常法に従って行うことができる。概ね、用いる検体、すなわち、唾液やペーパーポイント上のプラーク等を、ＳＤＳ法、フェノール法、エタノール法等の常法や、自動ＤＮＡ抽出機により、検体中のＤＮＡを抽出することにより行うことができる。このようにして得られる核酸試料（検体由来のＤＮＡ）を、上述したインベーダー・アッセイ法を、ターゲット塩基、第１の相補鎖、第２の相補鎖を定めて行うことにより、所望する歯周病菌の定量検出を行うことができる。なお、検出指標は特に限定されないが、上述したヘアピン型プローブが好適である。
【００４２】
（ターゲット塩基）
これらの歯周病菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子において、本検出方法のターゲット塩基となる塩基は、
（ａ）P.g.の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（相補的両塩基配列を含む）の７４８番目の塩基、具体的には、グアニン又はシトシンである。
（ｂ）P.i.の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（相補的両塩基配列を含む）の１９１番目の塩基、具体的には、グアニン又はシトシンである。
（ｃ）A.a.の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（相補的両塩基配列を含む）の８４２番目の塩基、具体的には、グアニン又はシトシンである。
（ｄ）B.f.の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（相補的両塩基配列を含む）の８４２番目の塩基、具体的には、チミン又はアデニンである。
（ｅ）T.d.の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（相補的両塩基配列を含む）の１５５番目の塩基、具体的には、チミン又はアデニン、あるいは、４２０番目の塩基、具体的には、チミン又はアデニンである。
【００４３】
（第１の相補鎖）
本検出方法において、上記のターゲット塩基を検出するために、上記例のごとき第１の相補鎖を用いることが必要である。当該第１の相補鎖は、上記ターゲット塩基（当該塩基を含まない）から、検出対象遺伝子の３’側に向かって少なくとも９塩基分の塩基配列からなるヌクレオチド鎖（相補的両塩基配列を含む）に対して相補的なヌクレオチド鎖を、検出対象遺伝子のターゲット塩基と近接する塩基と連続して有し、かつ、当該第１の相補鎖の総塩基数は１０〜５０塩基程度が好適であり、特に好適には２０〜４５塩基程度である。
【００４４】
第１の相補鎖として、具体的には、下記のヌクレオチド鎖を例示することができる。下記のヌクレオチド鎖において、５’末端のＮ（Ｇ又はＣ又はＡ又はＴ等のあらゆる核酸塩基が選択可能であることを示す）が、上記の「ターゲット塩基と近接する塩基」である。
【００４５】
（ａ）P.g.の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（相補的両塩基配列を含む）に対して、配列番号６で表される塩基配列（相補的両塩基配列を含む）が挙げられる。
５’−CCCACGCCTTCGTGCTTCAGTGTCAGTN−３’（配列番号６）
【００４６】
（ｂ）P.i.の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（相補的両塩基配列を含む）に対して、配列番号７で表される塩基配列（相補的両塩基配列を含む）が挙げられる。
５’−CAACAAGCTAATCAGACGCATCCCCATCCTCCACN−３’（配列番号７）
【００４７】
（ｃ）A.a.の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（相補的両塩基配列を含む）に対して、配列番号８で表される塩基配列（相補的両塩基配列を含む）が挙げられる。
５’−GTCGATTTATCACGTTAGCTTCGGGCACCAGGGN−３’（配列番号８）
【００４８】
（ｄ）B.f.の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（相補的両塩基配列を含む）に対して、配列番号９で表される塩基配列（相補的両塩基配列を含む）が挙げられる。
５’−CCCAGGTGGATTACTTAACGCTTTCGCTGTAGAGCTTACN−３’（配列番号９）
【００４９】
（ｅ）T.d.の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（相補的両塩基配列を含む）に対して、配列番号１０（当該遺伝子の１５５番目の塩基がターゲット塩基の場合）、又は、配列番号１１（当該遺伝子の４２０番目の塩基がターゲット塩基の場合）で表される塩基配列（相補的両塩基配列を含む）が挙げられる。
５’−CGGAGCCGTAGCTCCTTTCCTCATTTACCTTTN−３’（配列番号１０）
５’−CATGACTACCGTCATCAAAGAAGCATTCCCTCTTCTTCTTN−３’（配列番号１１）
【００５０】
（第２の相補鎖）
本検出方法において、上記のターゲット塩基を検出するために、上記例のごとき第１の相補鎖と共に、第２の相補鎖を用いることが必要である。当該第２の相補鎖は、検出対象遺伝子に対して非相補的（ハイブリダイズしない）な５’側のヌクレオチド鎖（上記例の「検出用部分１３２」に相当する）と、相補的（ターゲット塩基に対して相補的な塩基を含み、検出対象遺伝子とハイブリダイズする）な３’側のヌクレオチド鎖（上記例の「相補的部分１３１」に相当する）からなる、複合ヌクレオチド鎖である。当該第２のヌクレオチド鎖の相補的なハイブリダイズ部分の総塩基数は１０〜３０塩基程度が好適であり、特に好適には１２〜２５塩基程度である。非相補的なヌクレオチド鎖は、任意のものを用いることができるが、好適には７〜３０塩基程度、特に好適には１０〜２０塩基程度のヌクレオチド鎖が挙げられる。
【００５１】
第２の相補鎖として、具体的には、下記のヌクレオチド鎖を例示することができる。下記例にて、Ｘは非相補的なヌクレオチド鎖部分を表す。
【００５２】
（ａ）P.g.の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（相補的両塩基配列を含む）に対して、配列番号１２で表される塩基配列（相補的両塩基配列を含む）が挙げられる。
５’−ＸCGCAGTATGGCAAGC−３’（配列番号１２：ただし、ヌクレオチド鎖Ｘを除く）
【００５３】
（ｂ）P.i.の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（相補的両塩基配列を含む）に対して、配列番号１３で表される塩基配列（相補的両塩基配列を含む）が挙げられる。
５’−CGATGAATCTTTGGTCCA−３’（配列番号１３）
【００５４】
（ｃ）A.a.の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（相補的両塩基配列を含む）に対して、配列番号１４で表される塩基配列（相補的両塩基配列を含む）が挙げられる。
５’−ＸCTAAACCCCAATCCCCA−３’（配列番号１４：ただし、ヌクレオチド鎖Ｘを除く）
【００５５】
（ｄ）B.f.の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（相補的両塩基配列を含む）に対して、配列番号１５で表される塩基配列（相補的両塩基配列を含む）が挙げられる。
５’−ＸACTATATCGCAAACTCCTAG−３’（配列番号１５：ただし、ヌクレオチド鎖Ｘを除く）
【００５６】
（ｅ）T.d.の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子（相補的両塩基配列を含む）に対して、配列番号１６（当該遺伝子の１５５番目の塩基がターゲット塩基の場合）、又は、配列番号１７（当該遺伝子の４２０番目の塩基がターゲット塩基の場合）で表される塩基配列（相補的両塩基配列を含む）が挙げられる。
【００５７】
５’−ATGTAAATGAGCACATTCG−３’（配列番号１６）
５’−ＸATTCTTCATCTGCAAAAGAATT−３’（配列番号１７：ただし、ヌクレオチド鎖Ｘを除く）
【００５８】
（総口腔細菌数）
本検出方法においては、検体中の全菌体数を算出して、その中での特定の歯周病菌の比率を求めることにより、さらに正確に被験者の歯周疾患の状態を把握することが可能である。すなわち、特に、唾液を検体として用いる場合には、唾液の採取方法によって、唾液内に含まれる細菌濃度が異なってくる傾向が認められる。例えば、自然に口腔内に分泌されている唾液と、ガム等を噛ませて分泌量を促進させて得た唾液とを比較すると、後者の唾液の方が、唾液量当たりの菌体数が少ないことが通常である。そのため、歯周病菌の数を定量するには、まず、唾液から抽出した核酸に基づいて全菌体数を測定し、その唾液検体における口腔細菌の単位容積当たりの菌体数を確認した上で、歯周病菌についての測定を行い、口腔細菌全体の菌体数に占める歯周病菌の菌体数の割合を求めることで、唾液検体の採取方法等に影響なく、歯周病菌の定量検出を行うことが可能である。検体中の全菌体数の算出の方法は常法に従うが、本検出方法と同様に、インベーダー・アッセイ法を用いる態様を好適な方法として例示することができる。
【００５９】
この場合、インベーダー・アッセイ法にて検出するターゲット塩基を、A.a.の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の１３８２番目、P.gの同１３８４番目、P.i.の同１３５０番目、B.f.の同１３４１番目、及び、T.d.の同１３５３番目の塩基（相補的な塩基、具体的には、グアニン又はシトシンである、を択一的に含む）とし、かつ、これらの異なる歯周病菌のターゲット塩基を共通に検出することができる第１の相補鎖と第２の相補鎖を選択して、インベーダー・アッセイ法を行い、上述の要領で定量検出を行うことにより、所望する口腔細菌の菌体数を算出することができる。
【００６０】
この場合、例えば、第１の相補鎖を、
５’−TGACGGGCGGTGTGTACAAGGCN−３’（配列番号１８）として、かつ、
第２の相補鎖を、
５’−ＸCCGGGAACGTATTCACC−３’（配列番号１９：ただし、ヌクレオチド鎖Ｘを除く）
とすることにより、検体由来のＤＮＡに対してインベーダー・アッセイ法を行うことにより、口腔細菌数を求めることができる。
【００６１】
［検出用キット］
本発明においては、本検出方法を行うための、上記特定の５種の歯周病菌の検出用キット（以下、本検出用キットともいう）も提供される。
【００６２】
本検出用キットには、本検出方法におけるインベーダー・アッセイ法を行うために用いる、上述のごとく規定される第１の相補鎖と第２の相補鎖が、キットの構成要素として含まれる。すなわち、ターゲット塩基が、上述した「ターゲット塩基」の項に示すものであり、第１の相補鎖が、上述した「第１の相補鎖」の項に示すものであり、第２の相補鎖が、上述した「第２の相補鎖」の項に示すものとして、本検出用キットにて含有される。
また、好適には、本検出用キットには、上述したヘアピン型プローブに代表される検出手段、及び、部分的三重鎖構造の３’側を特異的に切断する活性を有する制限酵素を含有させることができる。
【００６３】
さらに、インベーダー・アッセイ法を行うために用いる、バッファーや、試験用のチューブやプレートを含有させることもできる。
また、検体における全菌体数を算出することを目的としたインベーダー・アッセイ法を行うための、第１の相補鎖と第２の相補鎖をキットの構成要素として加えることも好適である。
【実施例】
【００６４】
以下、本発明の実施例を開示する。ただし、本実施例により、本発明の範囲が限定されるものではない。
【００６５】
［歯周病菌の検出］
（１）検出対象
検出対象は、前述したとおり、歯周病菌のうち、Porphyromonas gingivalis（P.g.）、 Prevotella intermedia（P.i.）、Actinobacillus actinomycetemcomitans（A.a.）、Bacteroides forsythus（B.f.）、及び、Treponema denticola（T.d.）である。
【００６６】
（２）検出方法
インベーダー・アッセイ法による検出は、下記のように行った。
試薬（反応bufferおよびcleavase XI等）は、third wave technologies社から供給されているInvader core reagent kit（プローブとして、上述したヘアピン型プローブを用いている）を使用した。96ウェルプレートにcleavase XI FRET mix 3.5μl、Cleavase XI Enzyme/MgCl2 solution 1.0μlと100μΜ FRET probe 0.105μl、10μM invader oligo 0.105μl、10mM MOPS buffer 2.79μl、D.W. 2.5μl を加え、さらに、Sample（標準試薬および検体由来のDNA溶液）5.0μlを加えて、63℃あるいは65℃で4時間反応させ、120秒ごとに蛍光値を測定した。反応チューブから経時的に得られた蛍光値の増幅率を、文献（Jeff et al,PNAS,vol.97,8272-8277,2000）に基づいて2次曲線化した。この曲線の傾きを各反応チューブの測定値として、標準試薬の測定値から検量線を求め、被験サンプルの測定値から標的遺伝子の定量値を算出した。
【００６７】
（３）口腔内の全菌体数
上述したように、被験者の口腔内における全菌体数を把握することは、特に、唾液検体を用いる場合には、歯周疾患における正確な評価を行う上で重要な要素である。本実施例では、サンプル中の全菌体数を、インベーダー・アッセイ法におけるターゲット塩基を、A.a.の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の１３８２番目、P.gの同１３８４番目、P.i.の同１３５０番目、B.f.の同１３４１番目、及び、T.d.の同１３５３番目の塩基（具体的には、シトシン：図２を参照のこと）、として算出した。本実施例では、この全体菌数をインベーダー・アッセイ法にて用いる第１の相補鎖を、
５’−TGACGGGCGGTGTGTACAAGGCA−３’（配列番号２０）として、かつ、
第２の相補鎖を、
５’−CGCGCCGAGGCCGGGAACGTATTCACC−３’（配列番号２１）として、上記（２）の要領にて、インベーダー・アッセイ法による検出を行った。
（この相補鎖の組を用いると、図２における５種類の歯周病菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の下線部分１の領域において、インベーダー・アッセイ法によるハイブリダイズ反応が行われ、ターゲット塩基１１の検出が行われる。）
【００６８】
本実施例における測定値は、歯周病菌数／総口腔細菌数×１００＝口腔細菌全体に対する歯周病菌の割合（％）として算出した。
【００６９】
（４）特定の歯周病菌の検出
（ａ）Porphyromonas gingivalis（P.g.）の検出
P.g.菌の16S rRNA遺伝子配列(Gene bank accetion number :X73964、配列番号１、図２) における、３９０、４２４、４２８、４３３、５２８、５６７、５８７、６２２、６２６、６６６、７１１、８０４、８１６、９７３、９８０、１０７７番目の塩基を、Cleavase酵素（部分的三重鎖構造の３’側を特異的に切断する制限酵素）が切断点として認識するターゲット塩基として、16通りの第１の相補鎖と第２の相補鎖の組を設計し、これらを用いて検出感度及び特異性の検討を行った。定量用の標準試薬として、P.g.菌株（ATCC33277）からDNAを精製し、16S rRNA遺伝子配列全域をPCR増幅後、プラスミド（pCRII-TOPO：インビトロジェン社）に組み込み、このプラスミドを検出感度試験に使用した。プラスミドは、１０の３乗〜１０の７乗コピー/測定チューブに調製し、標準試薬とした。検出感度試験では、上記の１６通りのインベーダー・アッセイ法の相補鎖の組のうち、３９０、４２４、４２８、５８７、６６６、７１１、８１６番目の塩基をターゲット塩基とした場合に、１０の３乗〜１０の７乗コピー/測定チューブの測定レンジが得られた。この７通りの相補鎖の組について、特異性試験を行った。特異性試験のための試料としては唾液を選択した。ＤＮＡについては唾液200μlから自動核酸抽出機MagNA Pure LC (Roche)、及び、DNA Isolation kit I (Roche)を用いて、溶出液１００μｌに抽出し、９５℃で５分間処理した後、５μlを測定に使用した。P.g.菌の16S rRNA遺伝子の６１５〜６８２番目の塩基を遺伝子増幅領域としたReal-time PCR法で、陽性又は陰性となったＤＮＡサンプルそれぞれ10例を、上記７通りの相補鎖の組を用いたインベーダー・アッセイ法にて測定した結果、Real-time PCR法における結果との相違が認められなかった相補鎖の組は、下記の７１１番目の塩基（グアニン）をターゲット塩基とした組：
【００７０】
第１の相補鎖：５’−CCCACGCCTTCGTGCTTCAGTGTCAGTT−３’（配列番号２２）
第２の相補鎖：５’−CGCGCCGAGGCGCAGTATGGCAAGC−３’（配列番号２３）
（この相補鎖の組を用いると、図２におけるＰ．ｇ．菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の下線部分２の領域において、インベーダー・アッセイ法によるハイブリダイズ反応が行われ、ターゲット塩基２１の検出が行われる。）
【００７１】
のみであった。さらにこの相補鎖の組を用いたインベーダー・アッセイ法による検出を、６４例のreal-time PCR法による陽性サンプルにおける、real-time PCR法との定量値の比較検討を行ったところ、累乗回帰で係数が０．９１０９と良好な相関が得られた。
また、この７１１番目の塩基をターゲット塩基とした相補鎖の組を用いた、インベーダー・アッセイ法による検出を、培養プレートで分離培養したP.g.、P.i.、B.f.、A.a.、T.d.、Neisseria subflava、Neisseria sicca、Streptococcus mutans、Streptococcus sobrinus、Streptococcus salivarius、Streptococcus mitis、Streptococcus anguinosus、Streptococcus gordanii、Streptococcus sanguisの菌株から抽出したDNA100ngを測定した結果、P.g.菌のみを特異的に検出可能であることが判明した。なお、本検出方法にて陽性となったＰ．ｇ．菌の全口腔菌体数における割合は、０．００７〜０．１７７％であった。
【００７２】
（ｂ）Prevotella intermedia（P.i.）の検出
P.i.菌の16S rRNA遺伝子配列(Gene bank accetion number :X73964、配列番号２、図２) における、１３８，１８０，１９１，４１３，４２３，４３３，５５２番目の塩基を、Cleavase酵素（部分的三重鎖構造の３’側を特異的に切断する制限酵素）が切断点として認識するターゲット塩基として、７通りの第１の相補鎖と第２の相補鎖の組を設計し、これらを用いて検出感度及び特異性の検討を行った。定量用の標準試薬として、P.i.菌株（ATCC49046）からDNAを精製し、16S rRNA遺伝子配列全域をPCR増幅後、プラスミド（pCRII-TOPO：インビトロジェン社）に組み込み、このプラスミドを検出感度試験に使用した。プラスミドは、１０の３乗〜１０の７乗コピー/測定チューブに調製し、標準試薬とした。検出感度試験では、上記の７通りのインベーダー・アッセイ法の相補鎖の組のうち、１８０、１９１、４２３番目の塩基をターゲット塩基とした場合に、１０の３乗〜１０の７乗コピー/測定チューブの測定レンジが得られた。この３通りの相補鎖の組について、特異性試験を行った。特異性試験のための試料としては唾液を選択した。ＤＮＡについては唾液200μlから自動核酸抽出機MagNA Pure LC (Roche)、及び、DNA Isolation kit I (Roche)を用いて、溶出液１００μｌに抽出し、９５℃で５分間処理した後、５μlを測定に使用した。P.i.菌の16S rRNA遺伝子の91〜191番目の塩基を遺伝子増幅領域としたReal-time PCR法で、陽性又は陰性となったＤＮＡサンプルそれぞれ10例を、上記７通りの相補鎖の組を用いたインベーダー・アッセイ法にて測定した結果、Real-time PCR法における結果との相違が認められなかった相補鎖の組は、１９１番目の塩基（グアニン）をターゲット塩基とした組：
【００７３】
第１の相補鎖：５’−CAACAAGCTAATCAGACGCATCCCCATCCTCCACA−３’（配列番号２４）
第２の相補鎖：５’−CGCGCCGAGGCGATGAATCTTTCGTCCA−３’（配列番号２５）
（この相補鎖の組を用いると、図２におけるＰ．ｉ．菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の下線部分３の領域において、インベーダー・アッセイ法によるハイブリダイズ反応が行われ、ターゲット塩基３１の検出が行われる。）
【００７４】
のみであった。さらにこの相補鎖の組を用いたインベーダー・アッセイ法による検出を、６４例のreal-time PCR法による陽性サンプルにおける、real-time PCR法との定量値の比較検討を行ったところ、累乗回帰で係数が０．９６２３と良好な相関が得られた。
【００７５】
また、この１９１番目の塩基をターゲット塩基とした相補鎖の組を用いた、インベーダー・アッセイ法による検出を、培養プレートで分離培養したP.g.、P.i.、B.f.、A.a.、T.d.、Neisseria subflava、Neisseria sicca、Streptococcus mutans、Streptococcus sobrinus、Streptococcus salivarius、Streptococcus mitis、Streptococcus anguinosus、Streptococcus gordanii、Streptococcus sanguisの菌株から抽出したDNA100ngを測定した結果、P.i.菌のみを特異的に検出可能であることが判明した。なお、本検出方法にて陽性となったＰ．ｉ．菌の全口腔菌体数における割合は、０．０１１〜１．０９０％であった。
【００７６】
（ｃ）Actinobacillus actinomycetemcomitans（A.a.）の検出
A.a.菌の16S rRNA遺伝子配列(Gene bank accetion number :M75037、配列番号３、図２) における、１５１、１５３、１８６、３１５、３３８、４５１、４６７、５８６、５８８、５９０、５９２、５９４、５９７、６０８、６５９、７４４、８３７、８４２、８５３番目の塩基を、Cleavase酵素（部分的三重鎖構造の３’側を特異的に切断する制限酵素）が切断点として認識するターゲット塩基として、２０通りの第１の相補鎖と第２の相補鎖の組を設計し、これらを用いて検出感度及び特異性の検討を行った。定量用の標準試薬として、A.a.菌株（ATCC43718）からDNAを精製し、16S rRNA遺伝子配列全域をPCR増幅後、プラスミド（pCRII-TOPO：インビトロジェン社）に組み込み、このプラスミドを検出感度試験に使用した。プラスミドは、１０の３乗〜１０の７乗コピー/測定チューブに調製し、標準試薬とした。検出感度試験では、上記の２０通りのインベーダー・アッセイ法の相補鎖の組のうち、１５１、１５３、１８６、３１５、４５１、４６７、５８６、８３７、８４２、８５３番目の塩基をターゲット塩基とした場合に、１０の３乗〜１０の７乗コピー/測定チューブの測定レンジが得られた。この１０通りの相補鎖の組について、特異性試験を行った。特異性試験のための試料としては唾液を選択した。ＤＮＡについては唾液200μlから自動核酸抽出機MagNA Pure LC (Roche)、及び、DNA Isolation kit I (Roche)を用いて、溶出液１００μｌに抽出し、９５℃で５分間処理した後、５μlを測定に使用した。A.a.菌の16S rRNA遺伝子の465〜609番目の塩基を遺伝子増幅領域としたReal-time PCR法で、陽性又は陰性となったＤＮＡサンプルそれぞれ10例を、上記１０通りの相補鎖の組を用いたインベーダー・アッセイ法にて測定した結果、Real-time PCR法における結果との相違が認められなかった相補鎖の組は、８４２番目の塩基（グアニン）をターゲット塩基とした組：
【００７７】
第１の相補鎖：５’−GTCGATTTATCACGTTAGCTTCGGGCACCAGGGT−３’（配列番号２６）
第２の相補鎖：５’−CGCGCCGAGGCTAAACCCCAATCCCCA−３’（配列番号２７）
（この相補鎖の組を用いると、図２におけるA.a.菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の下線部分４の領域において、インベーダー・アッセイ法によるハイブリダイズ反応が行われ、ターゲット塩基４１の検出が行われる。）
【００７８】
のみであった。さらにこの相補鎖の組を用いたインベーダー・アッセイ法による検出を、４０例のreal-time PCR法による陽性サンプルにおける、real-time PCR法との定量値の比較検討を行ったところ、累乗回帰で係数が０．８０１３と良好な相関が得られた。
【００７９】
また、この８４２番目の塩基をターゲット塩基とした相補鎖の組を用いた、インベーダー・アッセイ法による検出を、培養プレートで分離培養したP.g.、P.i.、B.f.、A.a.、T.d.、Neisseria subflava、Neisseria sicca、Streptococcus mutans、Streptococcus sobrinus、Streptococcus salivarius、Streptococcus mitis、Streptococcus anguinosus、Streptococcus gordanii、Streptococcus sanguisの菌株から抽出したDNA100ngを測定した結果、A.a.菌のみを特異的に検出可能であることが判明した。なお、本検出方法にて陽性となったA.a.菌の全口腔菌体数における割合は、０．００５〜０．０３２％であった。
【００８０】
（ｄ）Bacteroides forsythus（B.f.）の検出
B.f.菌の16S rRNA遺伝子配列(Gene bank accetion number : X73962、配列番号４、図２) における、８１、９５、１００、２０２、４１８、４２３、６７０、７００、７０２、７０４、７０６、７０８、７１０、７１９、７２１、８０３、８１１番目の塩基を、Cleavase酵素（部分的三重鎖構造の３’側を特異的に切断する制限酵素）が切断点として認識するターゲット塩基として、１８通りの第１の相補鎖と第２の相補鎖の組を設計し、これらを用いて検出感度及び特異性の検討を行った。定量用の標準試薬として、B.f.菌株（ATCC43037）からDNAを精製し、16S rRNA遺伝子配列全域をPCR増幅後、プラスミド（pCRII-TOPO：インビトロジェン社）に組み込み、このプラスミドを検出感度試験に使用した。プラスミドは、１０の３乗〜１０の７乗コピー/測定チューブに調製し、標準試薬とした。検出感度試験では、上記の２０通りのインベーダー・アッセイ法の相補鎖の組のうち、８１、４１８、４２３、７００、７０４、７０６、７０８、７１０、７２１、８０３番目の塩基をターゲット塩基とした場合に、１０の３乗〜１０の７乗コピー/測定チューブの測定レンジが得られた。この１０通りの相補鎖の組について、特異性試験を行った。特異性試験のための試料としては唾液を選択した。ＤＮＡについては唾液200μlから自動核酸抽出機MagNA Pure LC (Roche)、及び、DNA Isolation kit I (Roche)を用いて、溶出液１００μｌに抽出し、９５℃で５分間処理した後、５μlを測定に使用した。B.f.菌の16S rRNA遺伝子の５６３〜７２４番目の塩基を遺伝子増幅領域としたReal-time PCR法で、陽性又は陰性となったＤＮＡサンプルそれぞれ10例を、上記１０通りの相補鎖の組を用いたインベーダー・アッセイ法にて測定した結果、Real-time PCR法における結果との相違が認められなかった相補鎖の組は、８０３番目の塩基（チミン）をターゲット塩基とした組：
【００８１】
第１の相補鎖：５’−CCCAGGTGGATTACTTAACGCTTTCGCTGTAGAGCTTACT−３’（配列番号２８）
第２の相補鎖：５’−CGCGCCGAGGACTATATCGCAAACTCCTAG−３’（配列番号２９）
（この相補鎖の組を用いると、図２におけるB.f.菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の下線部分５の領域において、インベーダー・アッセイ法によるハイブリダイズ反応が行われ、ターゲット塩基５１の検出が行われる。）
【００８２】
のみであった。さらにこの相補鎖の組を用いたインベーダー・アッセイ法による検出を、４０例のreal-time PCR法による陽性サンプルにおける、real-time PCR法との定量値の比較検討を行ったところ、累乗回帰で係数が０．８０１３と良好な相関が得られた。
【００８３】
また、この８０３番目の塩基をターゲット塩基とした相補鎖の組を用いた、インベーダー・アッセイ法による検出を、培養プレートで分離培養したP.g.、P.i.、B.f.、A.a.、T.d.、Neisseria subflava、Neisseria sicca、Streptococcus mutans、Streptococcus sobrinus、Streptococcus salivarius、Streptococcus mitis、Streptococcus anguinosus、Streptococcus gordanii、Streptococcus sanguisの菌株から抽出したDNA100ngを測定した結果、B.f.菌のみを特異的に検出可能であることが判明した。なお、本検出方法にて陽性となったB.f.菌の全口腔菌体数における割合は、０．０１１〜１．８１５％であった。
【００８４】
（ｅ）Treponema denticola(T.d.)の検出
T.d.菌の16S rRNA遺伝子配列(Gene bank accetion number : D85438、配列番号５、図２) における、１５１、１５５、４２０、４２４番目の塩基を、Cleavase酵素（部分的三重鎖構造の３’側を特異的に切断する制限酵素）が切断点として認識するターゲット塩基として、４通りの第１の相補鎖と第２の相補鎖の組を設計し、これらを用いて検出感度及び特異性の検討を行った。定量用の標準試薬として、T.d.菌株（ATCC35404）からDNAを精製し、16S rRNA遺伝子配列全域をPCR増幅後、プラスミド（pCRII-TOPO：インビトロジェン社）に組み込み、このプラスミドを検出感度試験に使用した。プラスミドは、１０の３乗〜１０の７乗コピー/測定チューブに調製し、標準試薬とした。検出感度試験では、上記の２０通りのインベーダー・アッセイ法の相補鎖の組のうち、１５５、４２０番目の塩基をターゲット塩基とした場合に、１０の３乗〜１０の７乗コピー/測定チューブの測定レンジが得られた。この２通りの相補鎖の組について、特異性試験を行った。特異性試験のための試料としては唾液を選択した。ＤＮＡについては唾液200μlから自動核酸抽出機MagNA Pure LC (Roche)、及び、DNA Isolation kit I (Roche)を用いて、溶出液１００μｌに抽出し、９５℃で５分間処理した後、５μlを測定に使用した。T.d.菌の16S rRNA遺伝子の333〜445番目の塩基を遺伝子増幅領域としたReal-time PCR法で、陽性又は陰性となったＤＮＡサンプルそれぞれ10例を、上記２通りの相補鎖の組を用いたインベーダー・アッセイ法にて測定した結果、Real-time PCR法における結果との相違が認められなかった相補鎖の組は、１５５，４２０番目の塩基（共にチミン）をターゲット塩基とした組：
（１５５番目の塩基をターゲット塩基とする場合）
【００８５】
第１の相補鎖：５’−CGGAGCCGTAGCTCCTTTCCTCATTTACCTTTT−３’（配列番号３０）
第２の相補鎖：５’−CGCGCCGAGGATGTAAATGAGCACATTCG−３’（配列番号３１）
（この相補鎖の組を用いると、図２におけるT.d.菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の下線部分６の領域において、インベーダー・アッセイ法によるハイブリダイズ反応が行われ、ターゲット塩基６１の検出が行われる。）
【００８６】
（４２０番目の塩基をターゲット塩基とする場合）
第１の相補鎖：５’−CATGACTACCGTCATCAAAGAAGCATTCCCTCTTCTTCTTT−３’（配列番号３２）
第２の相補鎖：５’−CGCGCCGAGGATTCTTCATCTGCAAAAGAATT−３’（配列番号３３）
（この相補鎖の組を用いると、図２におけるT.d.菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の下線部分７の領域において、インベーダー・アッセイ法によるハイブリダイズ反応が行われ、ターゲット塩基７１の検出が行われる。）
【００８７】
双方であった。さらにこれら２種類の相補鎖の組を用いたインベーダー・アッセイ法による検出を、６４例のreal-time PCR法による陽性サンプルにおける、real-time PCR法との定量値の比較検討を行ったところ、１５５番目の塩基をターゲット塩基とした相補鎖の組においては、累乗回帰で係数が０．４７５７、４２０番目の塩基をターゲット塩基とした相補鎖の組においては、同０．９５７３であった。
【００８８】
また、この１５５番目と４２０番目の塩基をターゲット塩基とした相補鎖の組を用いた、インベーダー・アッセイ法による検出を、培養プレートで分離培養したP.g.、P.i.、B.f.、A.a.、T.d.、Neisseria subflava、Neisseria sicca、Streptococcus mutans、Streptococcus sobrinus、Streptococcus salivarius、Streptococcus mitis、Streptococcus anguinosus、Streptococcus gordanii、Streptococcus sanguisの菌株から抽出したDNA100ngを測定した結果、T.d.菌のみを特異的に検出可能であることが判明した。なお、本検出方法にて陽性となったT.d.菌の全口腔菌体数における割合は、１５５番目の塩基をターゲット塩基とした場合は０．００５〜０．４５０％、４２０番目の塩基をターゲット塩基とした場合は０．００７〜０．５０７％であった。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】インベーダー・アッセイ法のあらましを示した図面である。
【図２】歯周病菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列と、本発明の実施例で用いられた検出対象領域の位置関係を示した図面である。
【図１】
2007244349.tif 000002
【図２】
2007244349.tif 000003
【配列表】
2007244349000001.app