(57)【要約】【課題】粒子送達の分野において、物質を標的細胞に導入する、粒子媒介による送達方法およびその装置などの提供。【解決手段】長手方向軸および湾曲内部表面を有する一定長の管に粒子を堆積する方法であって、（ａ）蒸発可能液中の生物学的物質でコーティングされた粒子の、均一に分布する懸濁液を調製する工程と、（ｂ）  該管をその長手方向軸を中心に第１速度で回転させる工程と、（ｃ）  該管を該第１速度で回転させながら、該粒子の懸濁液を該管に導入する工程と、（ｄ）  該管を回転させて、該蒸発可能液から該粒子を遠心分離式に分離させ、該管の該内部表面上に該粒子を分散させる工程と、（ｅ）  該管が回転すると、ガスに該管を通過させ、該内部表面上に分散された該粒子を乾燥させる工程とを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
長手方向軸および湾曲内部表面を有する一定長の管に粒子を堆積する方法であって、該方法は、
（ａ）  蒸発可能液中の生物学的物質でコーティングされた粒子の、均一に分布する懸濁液を調製する工程と、
（ｂ）  該管をその長手方向軸を中心に第１速度で回転させる工程と、
（ｃ）  該管を該第１速度で回転させながら、該粒子の懸濁液を該管に導入する工程と、
（ｄ）  該管を回転させて、該蒸発可能液から該粒子を遠心分離式に分離させ、該管の該内部表面上に該粒子を分散させる工程と、
（ｅ）  該管が回転すると、ガスに該管を通過させ、該内部表面上に分散された該粒子を乾燥させる工程とを含む。
【請求項２】
前記工程（ｃ）は、前記懸濁液をシリンジに装填する工程と、前記管の端部に該シリンジを連結させる工程と、該シリンジから該管へ該懸濁液を伝達する工程とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ｂ）から前記工程（ｅ）は、前記管の前記長手方向軸が水平方向に配向された状態で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ｂ）において、前記管は、１分あたり約50から200の回転数の速度で回転させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（ｄ）において、前記第１速度よりも速い第２速度で前記管が回転させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第２速度は１分あたり約1700と2300の間の回転数である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（ｅ）において、前記管は、前記第１速度よりも速い速度で回転させられる、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記工程（ｅ）は、
前記管が回転すると、第１流速でガスに該管を通過させ、そこから前記蒸発可能液を除去する工程と、
該管が回転すると、第２流速でガスに該管を通過させ、該管の前記内部表面上に分散された前記粒子を乾燥させる工程とを含み、該第２流速は該第１流速よりも速い、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記第１流速でのガスの通過工程は、前記第２速度よりも遅い第３速度で前記管が回転している間に起こる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第３速度は、１分あたり約700と1300の間の回転数である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第２流速でのガスの通過工程は、前記第３速度よりも速い第４速度で前記管が回転している間に起こる、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記第４速度は、１分あたり約4000と6000の間の回転数である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ガスに前記管を通過させる前記工程は、
該管が回転すると、第１流速でガスに該管を通過させて、そこから前記蒸発可能液を除去する工程と、
該管が回転すると、前記第２流速でガスに該管を通過させて、該管の内部表面上に分散された粒子を乾燥させる工程とを含み、該第２流速は該第１流速よりも速い、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１流速は、１分あたり約2.5 ml と3.5 ml の間である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２流速は、１分あたり約500 ml と800 ml の間である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ガスは、空気および窒素からなるグループから選択される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子送達の分野に関するものである。より特定すると、本発明は、物質を標的細胞に導入する、粒子媒介による送達方法およびその装置に関連する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ここ10年間、生細胞および活組織への生物学的物質および薬学的物質、特に遺伝物質の粒子媒介による加速が、動植物バイオテクノロジーの分野における用途の重要なツールとして出現している。導入ＤＮＡの一過性発現および生殖系列組込は、微生物、植物、および動物において例証されてきた。
【０００３】
同テクノロジーの基礎が解明されるにつれて、注目は、連続的にかつ立て続けに迅速に生物学的物質を粒子媒介により送達できるようにする装置の開発へとますます移ってきている。このような装置は、種々のワクチン組成物と共に、人間または家畜の集団免疫化における用途について特に有益である。
【０００４】
その目的のために、動力として圧縮ガスを用いて、生物学的物質でコーティングされた粒子を加速する機器が開発されている。生物学的物質は、球状を呈し得る、金またはプラチナのようなキャリア物質の小さく密な粒子の表面に堆積される。コーティングされたキャリア粒子は、次いで、剛性管またはカートリッジの内側曲面上にコーティングされる。コーティングされた管またはカートリッジは機器内に装填され、バレルと整列させられる。好適なソース(source)から放出されると、圧縮ガスはコーティングされた管およびバレルを通過し、バレルはキャリア粒子を捕獲し、それらを標的表面に向けて加速する。
【０００５】
従って、生物学的サンプルを保有する粒子で管の内部を均一にコーティングし、無数の管の上に同一の均一なコーティングを生成することは有益である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によって以下が提供される：
（１）  一定長の管の内部に粒子を堆積させる装置であって、該装置は、
長手の管ボアが形成された管ローラーであって、該ボアは第１端部および第２端部を有し、かつ、そこに一定長の管を着脱自在に挿入するような寸法にされる、管ローラーと、
該管ボアの主軸を中心として該管ローラーを回転させる手段と、
入り口を有するチャンバを備え、関連ソースから該チャンバにガスを導入するためのガス送達手段であって、該チャンバは、該管ローラーの一部が貫通延在する開口を更に有し、該開口は、該管ボアの該第２端部と該チャンバとの間に流体連絡を設ける、ガス送達手段と、
該管ボアの該第１端部に隣接して配置される支持手段であって、該支持手段は、該管ボアに挿入される一定長の管の端部と、該長さの管の内部に堆積される粒子の関連ソースとの間にシール可能な係合を設ける、支持手段とを備える、装置。
（２）  前記管ローラーを支持する一方で、前記その回転運動を許容するベアリング台座を更に備える、項目１に記載の装置。
（３）  前記管ローラーを回転させる手段が可変速度回転子を備える、項目１に記載の装置。
（４）  前記可変速度回転子は、可変速度制御デバイスにより駆動されるモーターを備える、項目３に記載の装置。
（５）  前記チャンバ入り口に接続される第１バルブを更に備え、該第１バルブは、前記関連ソースから該チャンバへと、第１ガス送達路を経由するガスの通過を制御する、項目１に記載の装置。
（６）  前記チャンバ入り口に接続される第２バルブを更に備え、該第２バルブは、前記関連ソースから該チャンバへと、第２ガス送達路を経由するガスの通過を制御する、項目５に記載の装置。
（７）  前記第１バルブを通る前記ガスの流量を制御する、第１ガス流量調節器を更に備える、項目５に記載の装置。
（８）  前記第１バルブを通る前記ガスの流量を制御する、第１ガス流量調節器と、第２バルブを通るガスの流量を制御する、第２ガス流量調節器とを更に備える、項目６に記載の装置。
（９）  前記第１ガス流量調節器は、第１流速で前記第１バルブを通るガス流量を制限し、前記第２ガス流量調節器は、第２流速で前記第２バルブを通るガス流量を制限する、項目８に記載の装置。
（10）  ガスが前記チャンバから出られるようにする流路を提供するチャンバ出口を更に備える、項目１に記載の装置。
（11）  前記チャンバ出口に接続される第３バルブを更に備え、該第３バルブは前記チャンバから排気手段へのガスの通過を制御する、項目10に記載の装置。
（12）  ガスが前記チャンバから出られるようにする流路を提供するチャンバ出口を更に備える、項目６に記載の装置。
（13）  前記チャンバ出口に接続される第３バルブを更に備え、該第３バルブは、該チャンバから排気手段へのガスの通過を制御する、項目12に記載の装置。
（14）  前記管ローラーを回転させる手段は可変速度回転子を備え、該可変速度回転子は、可変速度制御デバイスにより駆動されるモータの操作的組み合わせにより編成される、項目13に記載の装置。
（15）  前記第１バルブ、第２バルブ、および第３バルブがソレノイドバルブである、項目14に記載の装置。
（16）  前記可変速度制御デバイスならびに前記第１バルブ、第２バルブ、および第３バルブは、該バルブおよび該可変速度制御デバイスの作動を制御するプログラマブルコントローラと操作的に接続され、それにより、該装置の自動操作を提供する、項目15に記載の装置。
（17）  前記プログラマブルコントローラの動作を制御するマイクロプロセッサを更に備える、項目16に記載の装置。
（18）  長手方向軸および湾曲内部表面を有する一定長の管に粒子を堆積する方法であって、該方法は、
（ａ）  蒸発可能液中の生物学的物質でコーティングされた粒子の、均一に分布する懸濁液を調製する工程と、
（ｂ）  該管をその長手方向軸を中心に第１速度で回転させる工程と、
（ｃ）  該管を該第１速度で回転させながら、該粒子の懸濁液を該管に導入する工程と、
（ｄ）  該管を回転させて、該蒸発可能液から該粒子を遠心分離式に分離させ、該管の該内部表面上に該粒子を分散させる工程と、
（ｅ）  該管が回転すると、ガスに該管を通過させ、該内部表面上に分散された該粒子を乾燥させる工程とを含む。
（19）  前記工程（ｃ）は、前記懸濁液をシリンジに装填する工程と、前記管の端部に該シリンジを連結させる工程と、該シリンジから該管へ該懸濁液を伝達する工程とを含む、項目18に記載の方法。
（20）  前記工程（ｂ）から前記工程（ｅ）は、前記管の前記長手方向軸が水平方向に配向された状態で実施される、項目18に記載の方法。
（21）  前記工程（ｂ）において、前記管は、１分あたり約50から200の回転数の速度で回転させられる、項目18に記載の方法。
（22）  前記工程（ｄ）において、前記第１速度よりも速い第２速度で前記管が回転させられる、項目18に記載の方法。
（23）  前記第２速度は１分あたり約1700と2300の間の回転数である、項目22に記載の方法。
（24）  前記工程（ｅ）において、前記管は、前記第１速度よりも速い速度で回転させられる、項目22に記載の方法。
（25）  前記工程（ｅ）は、
前記管が回転すると、第１流速でガスに該管を通過させ、そこから前記蒸発可能液を除去する工程と、
該管が回転すると、第２流速でガスに該管を通過させ、該管の前記内部表面上に分散された前記粒子を乾燥させる工程とを含み、該第２流速は該第１流速よりも速い、項目22に記載の方法。
（26）  前記第１流速でのガスの通過工程は、前記第２速度よりも遅い第３速度で前記管が回転している間に起こる、項目25に記載の方法。
（27）  前記第３速度は、１分あたり約700と1300の間の回転数である、項目26に記載の方法。
（28）  第２流速でのガスの通過工程は、前記第３速度よりも速い第４速度で前記管が回転している間に起こる、項目26に記載の方法。
（29）  前記第４速度は、１分あたり約4000と6000の間の回転数である、項目28に記載の方法。
（30）  ガスに前記管を通過させる前記工程は、
該管が回転すると、第１流速でガスに該管を通過させて、そこから前記蒸発可能液を除去する工程と、
該管が回転すると、前記第２流速でガスに該管を通過させて、該管の内部表面上に分散された粒子を乾燥させる工程とを含み、該第２流速は該第１流速よりも速い、項目18に記載の方法。
（31）  前記第１流速は、１分あたり約2.5  ml  と3.5  ml  の間である、項目30に記載の方法。
（32）  前記第２流速は、１分あたり約500  ml  と800  ml  の間である、項目30に記載の方法。
（33）  前記ガスは、空気および窒素からなるグループから選択される、項目18に記載の方法。
発明の要旨
本発明の一般的な目的は、ガス駆動式粒子加速機器における用途を目的として、大量の粒子カートリッジを形成する方法およびその装置を提供することである。本発明の更なる目的は、カートリッジを粒子で均一にコーティングするかかる方法および装置を提供することである。
【０００７】
一実施態様において、装置は一定長の管の内部に粒子を堆積させるために提供される。装置は、長手の管ボア(tubing  bore)が形成された管ローラーを備え、その場合、前記ボアは第１端部および第２端部を有し、一定長の管を着脱自在に挿入するのに適する寸法にされる。管ボアの主軸の周りで管ローラーを回転させる手段も提供され、関連ソースからチャンバ内へとガスを導入する入り口を有するチャンバを備えるガス送達手段と、管ローラーの一部が貫通延在する開口とが設けられる。開口は、管ボアの第２端部とチャンバとの間に流体連絡を提供する。支持手段は管ボアの第１端部に隣接して配置され、その場合、支持手段は、管ボア内に挿入された一定長の管の端部と、この一定長の管の内部に堆積されるべき粒子の関連ソースとの間に、シール可能係合を提供する。
【０００８】
別な実施態様において、一方法は、長手方向軸および湾曲内部表面を有する、一定長の管に粒子を堆積するために提供される。この方法は、
ａ）  蒸発可能な液体中の生物学的物質でコーティングされた粒子の、均一に分散された懸濁液を調製する工程と、
ｂ）  管をその長手方向軸の周りで第１速度で回転させる工程と、
ｃ）  前記管を第１速度で回転させながら、粒子懸濁液を管に導入する工程と、
ｄ）  管を回転させて、蒸発可能な液体から粒子を遠心分離で分離し、かつ、粒子を管の内部表面上に分散させる、工程と、
ｅ）  管が回転している時にガスを管に通過させ、内部表面上に分散された粒子を乾燥させる、工程とを含む。
【０００９】
多数の実質的に同一のサンプルカートリッジが一回の実施で調製され得ることが、本発明の利点である。この遠心分離法は、先行技術と比較して、極めて均一な管を製造し、かつ、プロセスの自動化をもたらす。
【００１０】
本発明の上記および他の目的、特徴、および利点は、添付の図面に鑑みて読まれれば、以下の明細書から明瞭となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明を詳細に記載する前に、本発明は勿論のこと変更可能なものとして、特定の粒子送達装置、または、特定のキャリア粒子に限定されないものと、理解されるべきである。開示されたサンプル方法および装置の異なる実施態様は、当該分野における特殊な必要性に適合するようにされ得ることもまた理解される。本明細書中で使用される用語法は、本発明の特定の実施態様を記載することのみを目的としており、限定することは意図されていないこともまた理解されるべきである。
【００１２】
前述後述いずれにしても、本明細書中に引用されるあらゆる刊行物、特許、および特許出願はその全体が、本明細書中に参考として援用される。
【００１３】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形は「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容が明確に別途規定しない限り、複数の対象をも含むことに、留意されねばならない。従って、例えば、「粒子（a    particle）」についての言及は２個以上の粒子の混合物についての言及を含み、「治療剤（a  therapeutic  agent)」についての言及は１種以上のこのような薬剤を包含し、「ベアリング台座（a  bearing  mount）」は１つ以上のこのような台座を含み、以下同様である。
【００１４】
Ａ．  定義
別途規定がない限り、本明細書中で使用される技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術の当業者により通常解釈されるのと同一の意味を有する。以下の用語は、下記のとおり定義されることが意図されている。
【００１５】
本明細書中で使用された場合、「治療剤（therapeutic  agent）」という用語は、生物（人間または人間以外の動物）に投与されると、局地的、部分的、および／または全身的作用により薬理学的、免疫学的、および／または生理学的効果を誘発する物の化合部または合成物を意図する。それゆえ、この語は、薬物、ワクチン、および生物薬剤と従来からみなされてきた化合物または化学物質を包含し、その例として、タンパク質、ペプチド、ホルモン、核酸、遺伝子構築物などのような分子を含む。このような治療剤は障害を阻止するために予防的に、および／または進行中の疾患の処置のために使用され得る。
【００１６】
より特定すると、用語「治療剤」とは、主要な治療領域全体における使用のための化合物または組成物を含み、その例を以下に列挙するがそれらに限定されない：抗生物質および抗ウイルス剤のような抗感染薬、鎮痛剤および鎮痛剤併用、局部麻酔剤および全身麻酔剤、食欲減退剤、抗関節炎剤、抗喘息剤、抗痙攣剤、抗鬱剤、抗ヒスタミン剤、抗炎症剤、制吐剤、抗腫瘍剤、止痒剤、抗精神病剤、解熱剤、鎮痙剤、心臓血管製剤（カルシウムチャネル遮断剤、ベータ遮断薬、ベータ作用薬、不整脈治療剤など）、降圧剤、利尿剤、血管拡張剤、中枢神経系刺激剤、咳製剤および風邪製剤、抗鬱血剤、診断薬、ホルモン、骨成長刺激剤および骨再吸収抑止剤、免疫抑制剤、筋肉弛緩剤、精神刺激剤、鎮静剤、精神安定剤、タンパク質、ペプチドおよびそれらのフラグメント（天然に存在する、化学合成、または組換え産生）、ならびに核酸分子（ポリマー形態の２つ以上のヌクレオチド、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）またはデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）のいずれかで、２本鎖分子および１本鎖分子の両方、遺伝子構築物、発現ベクター、アンチセンス分子などを含む）。
【００１７】
治療剤の粒子は、単独であれ他の薬物または薬剤との組み合わせであれ、代表的に薬学的組成物として調製され、これはビヒクル、および／または賦形剤のような１つ以上の添加物質を含み得る。「ビヒクル」および「賦形剤」とは一般に、毒性がなく、そして有害な様式で組成物のうちの他の成分と相互作用しない、実質的に不活性な材料のことをいう。これらの物質は、特定の薬学的組成物における個体の量を増大させるために使用される。適切なキャリアの具体例として、水、シリコン、ゼラチン、ワックス、および類似材料が挙げられる。通常使用される「賦形剤」の具体例としては、薬学的等級のブドウ糖、スクロース、ラクトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストラン、デンプン、スターチ、セルロース、リン酸ナトリウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、クエン酸、酒石酸、グリシン、高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびそれらの組み合わせが挙げられる。さらに、薬学的組成物中に荷電脂質および／または界面活性剤を含むのが所望され得る。このような物質は、安定剤、抗酸化剤、として使用され得るか、または投与の部位での局部的刺激の可能性を減じるために使用され得る。好適な荷電脂質は、制限することなく、ホスファチジルコリン（レシチン）などを含む。界面活性剤は代表的に、非イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、または両性界面活性剤である。好適な洗浄剤の具体例としては、例えば、Tergitol（登録商標）界面活性剤およびTriton（登録商標）界面活性剤（Union  Carbide  Chemicals  and  Plastics  Danbury  CT）、例えばTWEEN（登録商標）界面活性剤のようなポリオキシエチレンソルビタン（Atlas  Chemical  Industries  Wilmington  DE）、Brijのようなポリオキシエチレンエーテル、ラウリル硫酸やその塩（ＳＤＳ）のような薬学的に受容可能な脂肪酸エステル、および類似物質が挙げられる。
【００１８】
Ｂ．堆積装置
本発明は、ガス駆動式粒子加速機器において使用するためのサンプルカートリッジを大量生産するための再現可能方法を提供する。特に、小さく密なキャリア粒子は、サンプルカートリッジの凹状内部表面上に可逆的に（reversibly）コーティングされる。キャリア粒子はそれら自体、治療剤（例えば、遺伝子材料または蛋白質のような生物学的物質）で可逆的にコーティングされる。粒子加速および送達の間は、キャリア粒子を通過するガス流はキャリア粒子をサンプルカートリッジの内側表面から放出し、粒子を標的の細胞、組織、または生物に搬送する。
【００１９】
送達の反復性については、各サンプルカートリッジから送達される粒子量が確認可能で、比較的一定で、少なくとも統計的に許容範囲内（例えば、実験的に決定された平均数の約±10％の範囲内）にあることが重要である。各サンプルカートリッジ間の粒子分布は実質的に一定に保たれ、従って、サンプル対サンプルの再現可能性を最大限にすることもまた重要である。
【００２０】
ここで図１を参照すると、好適な装置10が例示され、これは本明細書中に記載された堆積手順において使用可能である。装置10は管ローラー12を備えるが、これは、参照番号16および18に描かれる２個以上の台座により、一般に水平方向に配向される基部14に回転自在に搭載される。基部14はどのような寸法および形状でもよく、本発明を実施するにあたりコーティングされる管の長さと少なくとも同じ長さであるべきである。基部14は、管ローラーの水平位置決め処理を容易にするための水平測量手段と水準器を含み得る。台座16および18は基部14に装着されるか、またはその一部であり、参照番号19で示されるベアリング台座を備え、これらが管ローラー12と係合し、かつ、管ローラー12を装置におけるその水平方向位置で維持する。ベアリング台座19は、管ローラー12がその主軸の周りを最小限の摩擦で正確に回転するのを許容する限り、任意の適切な型（例えば、ローラー型、ボール型、またはニードル型など）のものであり得る。台座16および18は、管ローラー12とその向かい合う端部で回転自在に係合するのが好ましい。管ローラー12の長さに依存して、追加の台座は、必要に応じて終端位置にある台座16と台座18の間に設けられて、コーティングプロセスの期間中に採用される比較的高回転速度での管ローラー中での過剰な振動を阻止し得る。
【００２１】
管ローラー12は、金属、プラスティック、木など、任意の実質的に剛性の耐性のある材料から形成され得る。図１に描かれる実施態様においては、管ローラー12は円筒型である。これに加えて、管ローラー12は回転の軸に沿って、コーティングされるべき１片の管の実質的に全長を受容しかつ固着するのに十分な長さを有する。
【００２２】
搭載した管ローラー12は、その主軸と同軸の回転軸を有し、回転軸と同軸の長手の管ボア20を有する。管ボア20は、その内部に受容された一定長の管21が管ローラー12と同一回転軸を共有するように、かつ、それが管ボアの第１端部で開口部22を通って管ローラー内へと延びるように、位置決めされる。管ボア20は、多様な管型を収納するように、長さ、幅、および深さの寸法が決められ、一般には円筒型であるのが好ましい。管21の管ボア20内への挿入を容易にするために、管ボアの開口部22はボア20自体よりも広くされ得、ボア20から外方向に広がるのが好ましい。管ボア20の第２開口部25はキャップを被せられる。管ボア20は装置10の回転軸27に沿って延びる。
【００２３】
管ボアのキャップを被せた第２端部はガス送達台座24を貫通し、管ローラー12をその回転軸の周りに（すなわち、長手の管ボアの主軸の周りに）回転させるための手段26と係合する。回転手段26は、任意の方法（例えば、電気エネルギーまたは機械エネルギーを用いて）で駆動されて、管ローラー12の直接回転または間接回転を実施し得る。しかし、約50RPM（１分間あたりの回転数）と6000RPMの間の多様な一定速度で、少なくとも約２分間、回転軸の周りに管ローラー12を回転させるのに十分な動力を回転手段が供与しなければならない。ローラーの軸の回転が過度に抑制されない限り、回転手段26は管ローラー12の任意の部分に接続され得る。一構成において、回転手段26のシャフト28は取り付け具30を介して管ボアのキャップを被せた第２端部25に直接装着される。シャフト28に直接装着し得る、適切な回転手段26は、Barnant  Mixer  Series  20  モーターのような電気作動型ギアモーターであり、これは、参照番号32で示される、関連する（associated）可変速度モーター制御を利用して遠隔制御され得る。回転手段26は、基部14に装着される必要はないが、しかし、装置の作動中の安定性の向上を提供するためには装着され得る。
【００２４】
上述のように、管ローラー12の一部は、図１および図２に示されるように、ガス送達台座24を貫通する。ガス送達台座は、管ボア20内にガスを導入するためのガス送達手段を提供する。より特定すると、管ローラー12はガス送達台座24の開口を通って延び、耐久性のある低摩擦材料から形成された１対のブッシング34により開口内部でシール可能に支持される。ブッシング34は開口の開口部をシールし、従って、ガス送達台座内部にチャンバ36を規定するのを助ける。あるいは、シールベアリングがブッシング34の代わりに利用できるが、本発明の方法で使用される回転速度でシールベアリングが回転できることを条件とする。入り口通路38がガス送達台座34に設けられる。入り口通路38は、例えばガス導管40を介して、関連ソースからチャンバ36内にガス流を導入するのを可能にする。横断開口42は管ローラー12を通って延び、チャンバ36と管ボア20との間に流体連絡を設け、それにより、チャンバからのガスが管ボアに入るのを許容する。チャンバ36は管ローラー12のまわりに完全に延び、その結果、ガス導管40とチャンバ36との間の連絡が一定に維持され得る一方で、管ローラーが回転手段26により軸27のまわりに回転できる。従って、ガス送達台座24は、乾燥ガスがガスの関連外部ソースからボア20の第２端部内へ適切に制御された流速で連続して中断せずに送達されるのを可能にする。
【００２５】
装置10内へのガスの制御送達に備えて、ガス導管40は１個以上のガスバルブに接続可能である。図１の装置において、３つの電気作動式ソレノイドバルブ44、45、および46がガス導管40に接続され、装置内への多様な流速のガス送達に備える。第１バルブ44の入り口側は第１の流量調節器48に連結され、これはガスがそこを通って第１の固定流速で、例えば、約2.5  ml/分から3.5  ml/分で流れるのを可能にする。同様に、第２バルブ45の入り口側は第２の流量調節器50に連結され、これは、ガスがそこを通って第２の固定流速で、例えば約500  ml/分と800  ml/分の間で流れるのを可能にする。２つの流量調節器は供給ホース49を経由して、空気または窒素のような圧縮乾燥ガスのソースに接続される。示されるように、第１バルブ／調節器の組み合わせはチャンバ36への第１のガス送達路を設け、第２バルブ／調節器の組み合わせはチャンバへの第２のガス送達路を設ける。第３バルブ46はチャンバ36のための出口として使用され、ガス導管40を大気排気ポート47に接続する。
【００２６】
堆積装置10の構成要素の運転は手動制御され得るが、市販のプログラマブルコントローラ52により統制されるのが好ましい。プログラマブルコントローラ52はその出力端が速度制御デバイス32および３つのソレノイドバルブ44〜46に接続される。プログラマブルコントローラ52の入力端は３つの押しボタン式スイッチ53、54、および55に接続され、それらボタンにより、技師は装填、回転、および制止の運転モードをそれぞれ指定し得る。本明細書を読んだ当業者によって理解されるように、マイクロプロセッサユニットは、プログラマブルコントローラの動作に指示を与えるために使用され得、堆積装置10の十分に自動化された運転が可能となる。例えば、回転サイクル時間、回転速度、および乾燥ガス流速の適切な設定はマイクロプロセッサに入力でき、次いでマイクロプロセッサが全堆積手順にわたって制御器52の動作を制御する。あるいは、マイクロプロセッサは堆積装置10の半自動運転を可能にし、例えばその場合、堆積手順の１サイクルまたは複数サイクルがマイクロプロセッサの制御下で行われる一方、他の運転のパラメータは手動で制御される。
【００２７】
Ｃ．  粒子調製法
キャリア粒子（治療剤でコーティングされた）を一定長の管の内側表面上に堆積する処理は、図３のフローチャートに描かれている。このプロセスの第１工程は、治療剤でキャリア粒子をコーティングすることを含む。
【００２８】
治療剤（またはそこから誘導された薬学的調製物）は、当該技術で公知の多様な技術を用いて、キャリア粒子上にコーティングされ得る。標的に向かって短距離にわたり容易に加速され得る粒子を提供するためには高密度材料が好ましく、ここでコーティングされた粒子は、それらが送達されるべき細胞に関してなお十分に寸法が小さい。数ミクロンの平均直径を有するキャリア粒子は、このような細胞を過度に傷つけることなく、生きた細胞に容易に入り得ることが分かっている。
【００２９】
生物学的物質を有する、小さい高密度粒子をコーティングする方法も公知である。しかし、任意のこのような方法がコーティング粒子を調製するために使用され得、ＤＮＡを金粒子上にコーティングする好ましい方法が本明細書中に記載される。当業者は以下の説明から、許容差の限度内で、１粒子あたりの生物学的物質の量および１サンプルカートリッジあたりの粒子数を決定する重要性を理解する。許容差レベルは所望量の約±30％であり、約±20％が好ましく、約±10％がより好ましい。
【００３０】
金粒子はＤＮＡでコーティングするのに好ましい。本明細書中での「ビーズ」または「粒子」への言及は、無制限に、適切な寸法および密度の球状粒子およびアモルファス粒子の両方を含むことが意図される。ＤＮＡは、粒子上にコーティングするのに好ましい生物学的物質である。しかし、ＲＮＡやタンパク性材料のような（これらに限定されないが）他の物質も、以下の技術を用いて、粒子上にコーティングし得る。この点について、他の生物学的物質を堆積する条件、または金でない粒子を用いる条件は、当該分野で理解される方法で論述される方法とは異なり得る。
【００３１】
粒子調製方法に関して続けるが、金粒子の所望量は遠心分離管内に設置される。使用される金の量は、所望の１回の送達あたりの粒子数を、準備中のサンプルカートリッジの数、例えば１片の管21から製造されるカートリッジの数で、乗算することにより大ざっぱに決定し得る。受容可能な量は、より高くまたはより低くなり得るが、１回の送達あたりの粒子の好適な量は、典型的には１回の送達あたりの金粒子数が約0.25から0.50mgのオーダーである。定常実験により粒子送達量の限界を確認できるが、この限界を下回ると、伝達が受容可能な程度に高くなる（遺伝子発現レベルまたは処置に対する生物学的反応のような、どのような確認し得る方法によってでも）一方で、標的組織に対する外傷は最小限になる。動物標的組織における最小限の外傷は、標的領域の僅かな赤色変化のみをもって例証される。
【００３２】
ＤＮＡコーティングされた粒子を調製する一代表的方法は、以下のとおりである。少量（100から300ml）の0.1Mスペルミジンが遠心分離管に添加され、非凝集粒子の懸濁は、十分な長さの時間、一般に数秒間、管内容物を超音波処理することにより形成される。
【００３３】
次に、ＤＮＡ自体の保全性(integrity)または安定性に影響のない緩衝液中に懸濁される適量のＤＮＡが粒子／スペルミジン懸濁液に添加され、受容可能なＤＮＡ装着率（loading  rate）を達成する。ＤＮＡ、スペルミジン、および金粒子は撹拌（vortexing）により混合される。ＤＮＡ装着率は１粒子あたりのＤＮＡの平均密度であり、大量個体群（bulk  population）（例えば、１mgの粒子あたりのμｇ単位のＤＮＡ）について表現される。金粒子に関する好ましい有効ＤＮＡ装着率は、１mgの金粒子あたり約0.1から5.0μｇのＤＮＡの範囲に及ぶ。１mgの金につき10.0μｇを超過するＤＮＡは好ましくなく、金粒子を凝集させる結果となり得るからである。しかし、１mgの金につき0.001μｇ以下のＤＮＡは、いくつかの発現ベクターから顕著な発現を達成するのに適切である。
【００３４】
最も均一なコーティング結果を得るためには、ＤＮＡ量はスペルミジン量を超過すべきではなく、より少ない量が採用され得る。したがって、最初に金粒子に添加されるＤＮＡ濃度かスペルミジン量のいずれかを調節することが必要であり得る。
【００３５】
次いで、緩やかな撹拌（vortexing）の間に、塩化カルシウム（CaCl２）が混合物に添加される。ＤＮＡコーティングされた金粒子の沈殿を生じるように、十分な量のCaCl２が添加される。2.5MのCaCl２が添加される場合、好適な量は先に添加されるスペルミジンの量に等しい。混合物は室温で少なくとも５分間または10分間で沈殿するようにできる。１mgの金粒子あたり1.0μｇＤＮＡまたはこれより高いＤＮＡ装着率では、沈殿はCaCl２が添加された直後にはっきり確認できるようにすべきである。
【００３６】
沈殿後、管は短時間（10秒から15秒）遠心分離処理され、コーティングされた金粒子にペレット化（pellet）する。上澄みは除去および廃棄され、ペレットは好適な溶剤を用いて（例えば、エタノール）、事実上全ての水がコーティングされた粒子調製物から除去されてしまうまで、数回洗浄される。各溶剤洗浄の間に、調製物は回転させられ、上澄みが廃棄される。最終ペレットのコーティングされた粒子は、既知の量のＤＮＡおよび金の両方を含有し、100％エタノールが好ましいが、コーティングされた粒子をサンプルカートリッジに接合させるのに十分な、わずかな一過性粘着効果を提供する適量の添加剤を任意で含有する、蒸発可能な液体中で再懸濁させられる。かかる好適な粘着剤の一例が、ポリビニル・ピロリドン（ＰＶＰ）である。蒸発可能液中の所要粘着剤量は、後に続く粒子加速処理中にサンプルカートリッジが晒されるガス圧と、使用される管の種類とに依存する。約100から150psiの範囲にあるガス圧での送達作動については、粘着剤は必要ではない。約150psiから300psiでの作動については、１mlの粒子調製物について0.001から0.01mgのＰＶＰが適切である。１mlあたり0.01から0.05mgのＰＶＰは、約300から500psiまたはそれより高いレベルの範囲の圧力での作動について好適である。約500から800psiの作動圧では、１mlあたり0.3mgのＰＶＰが好適な粘着効果を提供する。
【００３７】
コーティングされた粒子を再懸濁させるための総量を決定する際には、ある種の処置がとられるべきである。この量は、１回の送達あたりの生物学的物質の所望量、現実のＤＮＡ装着率、最終サンプルカートリッジ中の所望粒子密度、および管の長さあたりの内部容積で決まる。当業者ならばまた、１回の送達あたりのＤＮＡの好ましい量、および１回の送達あたりの粒子量は、標的の性質、粒子がコーティテングされる密度、および伝達の所望成果（例えば、一過性の発現、または安定な組み込み）によって変動することを認識する。それゆえ、粒子が管内部に装填される濃度を含む、上述の変数の各々は、それらに応じて調整されるべきである。
【００３８】
所望の粒子装着率、粒子密度、および管の単位長さあたりの容積容量を決定した後、コーティングされた粒子を再懸濁させるための蒸発可能液の総体積は容易に決定できる。好適なサンプルカートリッジの長さは、17.78  cm  の長さあたり約0.6  ml  と2.0  ml  の間の内部容量を有する管について、約12.7  mm  の長さであることが分かっている。この特定内部容量を有する管については、単純計算により以下の結果が提示される。すなわち、0.5  mg  の金が12.7  mm  のサンプルカートリッジで所望される場合は、粒子は１ml  につき7.0  mg  の金の濃度で調製される。同様に、12.7  mm  カートリッジ中の0.25  mg  サンプルについては、１  ml  あたり3.5  mg  濃度が適切である。これ以外の粒子密度を達成する濃度は、同じ方法で算出される。
【００３９】
コーティングされた粒子を蒸発可能液内に完全に移動させるために、ペレットは、数回の部分的移動工程のうちに、格納管に移動されることが推奨される。例えば、コーティングされた粒子は少量（500  ml）の液体中で再懸濁され、撹拌(vortex)され、短期間（２秒から３秒）超音波処理され、次いで、清浄な管に移動されればよい。ポリプロピレンの培養管のように、生物学的物質がくっつかない材料から管が形成されることが推奨される。コーティングされた粒子が全て管に移動されるまで、これらの少量の移動が繰り返され得る。所望されるならば、懸濁したコーティングされた粒子を含有する管はParafilmでシールされ、-20℃で数ヶ月間保存され得る。コーティングされた粒子が完全に移動されると、サンプルカートリッジの準備を開始できる。先に保存された管は室温まで暖められ、その後、後述の管コーティング法における使用のために開封される。
【００４０】
カートリッジ装填プロセス
サンプルカートリッジを準備するために、凹状の弧状内側表面を有する、一定長の好適な管が、蒸発可能液内に分散されたコーティングされた粒子の均一な懸濁液で充満される。内側凹状表面上にコートされた粒子が視覚的に観察できるように、管は透明または半透明であるのが好ましい。使用される管は全て、選択された乾燥ガス（窒素が好ましい）との反応に対して不活性であるべきであり、粒子送達プロセスの終わりまで、機械的安定性を維持するのに十分な耐性を備えているべきである。Tefzel（登録商標）管（1/8インチ外径  ×  3/32インチ内径）は、本発明を実施するにあたって使用するための、好適な管基材であることが分かっている。17.78  cm  長さのこの特定寸法の管は、約0.8  ml  の内部容量を有する。
【００４１】
図１を再び参照すると、堆積装置がオフ状態にされると、一定長の管21は開口部22を通して管ボア20内に挿入され得、その結果、管はボアの表面に緊密に係合し、２個の構成要素が共に回転する。管21の一部は、ボア20の開口部22から突出した状態に留まる。開口部から延びる管の量は、管が、チャンバ36内へのガス流を阻止し得る過度な深さまで管ローラー12内部に挿入されないように選択される。次いで、着脱自在支持体60が、管21の露出端部に隣接して基部14に固着される。支持体60は、管の露出端部を受容する滑りベアリング62を備える。滑りベアリング62は、管の端部と支持体60との間の流体密封シールを提供する態様で、管21の外側表面に係合する一方で、支持体内部で静止状態に留まる滑りベアリングの内部で、管が回転できるようにする。
【００４２】
上述のような方法で調製されたコーティングされた粒子の懸濁液は、均一な分布を達成するように、撹拌(vortex)され、超音波処理される。次いで、１回装填分のコーティングされた粒子懸濁液が、図１に描かれるバレルシリンジ64のような好適な送達手段に引き込まれる。本明細書を読めば理解されるように、どのような好適な粒子ソースでも使用できるが、バレルシリンジは或る体積の粒子懸濁液の好都合な測定分送達を提供する。シリンジ64は弾性結合部を有し、図１に示されるように、滑りベアリング62の露出端部上に適合される。この方法で、支持体60は、管の長さの内部に堆積されるべき粒子の送達を目的として、管21の露出端部とシリンジ64との間にシール可能係合を提供する。
【００４３】
充填したシリンジ64が滑りベアリング62に装着されると、技師は「装填」スイッチ53を押す。このスイッチの作動により、プログラマブルコントローラ52はベントバルブ(vent  valve)50を開放させ、速度制御手段32に指示を与えて、例えば50  rpm  から200  rpmの第１速度で管ローラー12および管21を回転させ始める回転手段26を活動状態にする。次に、技師がシリンジ64のプランジャーを押して、コーティングされた粒子をシリンジから管21へ強制的に送り込む。シリンジからの粒子懸濁液の送達と同時に管を回転させることにより、粒子が水平方向に配置された管21の底部に向かうのを阻止する。これに加えて、ベントバルブ50を介して管の対向する端部を通気させることにより、コーティングされた粒子の導入期間中に圧力が管内部に累加されるのを防ぐ。
【００４４】
コーティングされた粒子が管21に伝達された後は、シリンジ64は滑りベアリング62から除去される。次に、技師は「回転」スイッチ54を押し、同スイッチにより、プログラマブルコントローラ52がベントバルブ50の閉鎖を指示するとともに、速度制御32が管ローラーの回転速度を第２速度まで、例えば、約1700  rpm  から2300  rpm  まで増大させるが、2000  rpm  が好ましい。管は少なくとも約15秒間、第２速度で回転し、懸濁液から管21の凹状弧状内側表面に対して粒子を遠心力で強制移動させ、その上に均一な層を形成する。
【００４５】
層が形成された後、定着した粒子は、まず管から上澄みを排除することにより、乾燥させられる。これは、空気または窒素ガスのような乾燥ガスを管の一方端部内に導入することにより、容易に達成される。この時点で、プログラマブルコントローラ52は約700  rpm  と  1300  rpm  の間まで管の回転速度を自動的に低減するが、1000  rpm  が好ましい。同時に、第１ガスバルブ44は制御器52により開放され、供給ホース49からの圧縮ガスを、第１ガス流量調節器48の設定により決定されるように、１分間あたり約2.5  ml  から3.5  ml  の流速で、チャンバ36を介して管ローラー12に流入させる。このガス流は、分離された上澄みを管21から滑りベアリング62を通して吹き戻す。上記条件下の動作は約55秒間継続し、この時間は上澄みを排除するのに十分であり、その時点から後は、第１ガスバルブ44は閉鎖される。
【００４６】
最終的に、定着した粒子は、管21から残留蒸発可能液を除去することにより乾燥させられる。これを達成するために、プログラマブルコントローラ52は約4000  rpm  と6000  rpm  の間まで回転速度を増大させるが、5000  rpm  が好ましい。これにより、蒸発可能液から粒子を分離させるのに十分な遠心力の増大が引き起こされる。従って、第２バルブ45は制御器52により作動させられ、第２ガス流量調節器48の設定により定められたとおりに、１分間あたり約500  ml  から800  ml  で管ローラー12にガスを流入させる。この増大したガス流は懸濁液から液体を蒸発させ、管21の凹状弧状内側表面に固着された、コーティングされた粒子の均一な分布を残す。最終乾燥工程は、およそ２分間、または、粒子が完全に乾燥するまで継続する。乾燥サイクルが終了した後は、プログラマブルコントローラ52は第２ガスバルブ45を閉鎖し、速度制御32に指示して、回転手段26を停止させる。次に、コーティングされた管21が堆積装置10から除去され得る。
【００４７】
管がサンプルカートリッジとしての使用のために適切な長さへと切断される前に、粒子分布にむらがある管の端部をいずれも除去することが必要である。管内の粒子の分布は、実際の送達条件下でガス駆動式粒子加速デバイスを使用する際に操作的に検査され得る。後述の検査条件は適切であるが、調製されたサンプルカートリッジの粒子送達プロファイルを決定および比較するための他の検査も容易に考案され得る。
【００４８】
所望の長さの検査カートリッジは、管の向かい合った端部から除去される。各検査カートリッジからの粒子は、約400  psi  のガス圧下で、管の凹状内側表面から送達され、表面凝縮されずに、60  ml  のペトリ皿中の最小残留水（３％）寒天に向けられる。各プレートから、およそ１  cm  の切片が標的寒天の中心を貫いて切り取られ、顕微鏡スライド上に載置される。サンプルが比較された時に、比較可能な厚さの各切片を検査することは重要である。
【００４９】
各切片は、粒子送達深さおよび粒子数を得るために顕微鏡で分析される。粒子は、10ｘ接眼鏡がマイクロメータを装備した顕微鏡を用いて、容易に観察され得る。寒天の頂部表面では、粒子は最も密で、寒天の切片の深さが増大するにつれてそれに沿って密度が減少する。高中低の各レベルの粒子密度の領域は各切片ごとに記入される。接眼鏡マイクロメータは、粒子の最深透過度に概ね等しい深さで、ゼロに調整される。寒天表面でのマイクロメータ値は、粒子深さである。400  psi  での最小残留水寒天への送達後の典型的な粒子深さは、0.95  μｍアモルファス金粒子が使用された場合、約100  μｍから120  μｍであり、１  μｍから３  μｍの金の球状粒子またはビーズが使用された場合、約260  μｍから300  μｍである。
【００５０】
粒子深さおよび密度が類似している場合は、両端の間の管セクションから得られるカートリッジは使用を容認できる。しかし、２つの端部が互いに著しく異なる場合、または、標準コーティングパラメータとは著しく異なる場合は、追加分の複数対の向かい合った端部サンプルが、両端部が比較可能かつ受容可能な結果を生むまで、検査されるべきである。両端部から比較可能な結果が得られた場合、外科手術用メスおよびルーラー、または他のタイプの切断装置を用いて、管の残余の長さが適切な長さの細片へと切断される。次に、サンプルカートリッジは、２ヶ月までの間、パラフィルムで密封され、ラベルを貼った小瓶に入れて、乾燥剤と共に４℃で格納され得る。
【００５１】
このように、一定長の管の内部に粒子を堆積するための新規な方法および装置が解説されてきた。本発明の好ましい実施態様はある程度詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲により規定されるように、本発明の精神および範囲から逸脱すること無く、明確な変更が行われ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、本発明に従って構築される装置の、切断図である。
【図２】図２は、図１の線２−２に沿って破断された断面図である。
【図３】図３は、管状サンプルカートリッジ内部にコーティングされた粒子を堆積させる処理プロセスにおける一連の工程を示す、フローチャートである。
【図１】
2007222176.tif 000002
【図２】
2007222176.tif 000003
【図３】
2007222176.tif 000004