(57)【要約】【課題】優れた女性ホルモン物質分解能を有する新規の微生物を提供すること。【解決手段】女性ホルモン物質分解能を有する、スフィンゴモナダセア科に属し、受託番号FERM P-20833の細菌又はその変異株、及びこれらを用いて女性ホルモン物質を分解する方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
女性ホルモン物質分解能を有し、スフィンゴモナダセア（Sphingomonadaceae）科に属する、受託番号FERM P-20833の細菌又はその変異株。
【請求項２】
前記女性ホルモン物質が、17β-エストラジオール又はエストロンである、請求項１に記載の細菌又はその変異株。
【請求項３】
前記女性ホルモン物質を約15〜30℃の範囲の温度で分解する、請求項１又は２に記載の細菌又はその変異株。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の細菌又はその変異株を用いて女性ホルモン物質を分解することを含む、女性ホルモン物質の分解方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の細菌又はその変異株を、女性ホルモン物質に汚染された物質と接触させる工程を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記汚染された物質が、排水又は土壌である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかに記載の細菌又はその変異株を付着させた固体支持体を用いる、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、女性ホルモン物質分解能を有する細菌及びその利用に関し、更に詳細には、女性ホルモン物質分解能を有するスフィンゴモナダセア（Sphingomonadaceae）科に属する細菌、及びそれを用いた女性ホルモン物質の分解方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、人や野生生物の内分泌作用に悪影響を引き起こす可能性のある外因性内分泌撹乱物質、いわゆる環境ホルモンによる環境汚染が問題となっている。このうち、河川等における魚類の生殖異変の主原因は、下水処理場から排出される17β-エストラジオールなどの女性ホルモンである可能性が高いとされている。これらの物質の除去に微生物を用いる方法が検討されているが、エストロゲンの分解菌の報告は少ない。
【０００３】
報告されているエストロゲン分解菌のうち、グラム陰性菌に分類されるノボスフィンゴビウム属（Novosphingobium spp.）は、17β-エストラジオールを分解することができ、この細菌を用いた微生物浄化装置が商品化されている（非特許文献１、特許文献１）。微生物を用いた浄化装置は低コストであること、例えば菌体を固定化した浄化装置を下水処理場の排水口などで用いれば、環境への影響も問題にならないなどの利点がある。しかし、前記ノボスフィンゴビウム属の菌は、0.02％(w/v)の17β-エストラジオールをほぼ分解するのに20日程度かかり、0.1％の場合には50日が過ぎても、最初の添加量の10％以上が残存するため、分解力に問題がある。
【０００４】
また、他のエストロゲン分解菌として、グラム陽性菌のロドコッカス属のロドコッカス・ゾフィイ（Rhodococcus zophii）D-I7株（受託番号FERM P-18839）、ロドコッカス・イクイ（Rhodococcus equi）A-Y2株、D-Y4株、E-Y5株、及びグラム陰性菌のスフィンゴモナス・スピーシーズC-I2株（受託番号FERM P-18838）、D12株が報告されている（非特許文献２及び３、特許文献２）。これらの菌のうち、スフィンゴモナス属細菌は、例えば、17β-エストラジオール0.1μg/L、エストロン0.2μg/Lをそれぞれ添加した合成下水で８時間培養した場合に、合成下水中の17β-エストラジオールを83％、エストロンを66％分解し（特許文献２）、また17β-エストラジオール600μg/4mlを添加した培地で96時間培養した場合及びエストロン600μg/4mlを添加した培地で24時間培養した場合、培地中の17β-エストラジオールを97％、エストロンを95％分解した（非特許文献３）が、これ以上に優れた分解能を有する菌株、あるいは、通常外気温や下水温度の、細菌の通常培養温度である30℃より低い温度で良好な分解活性を示す菌株は、応用面で特に有利であると考えられる。
【０００５】
また、ロドコッカス属細菌には分解活性の高いものが多いが、グラム陽性菌であり、遺伝子操作がグラム陰性菌より難しいので、高い女性ホルモン物質分解能を有するグラム陰性菌があれば、遺伝子操作により菌の分解力を更に上げる等の可能性があり、より好ましいと考えられる。
【０００６】
【特許文献１】特開2005-254075号公報
【特許文献２】特開2004-65008号公報
【非特許文献１】Katsuhiko Fujii, Shintaro Kikuchi, Masataka Satomi, Noriko Ushio-Sata, and Naoki Morita. (2002) Degradation of 17β-Estradiol by a Gram-Negative Bacterium Isolated from Activated Sludge in a Sewage Treatment Plant in Tokyo, Japan. Applied and Environmental Microbiology, 68: 2057-2060
【非特許文献２】Takeshi Yoshimoto, Fumiko Nagai, Junji Fujimoto, Koichi Watanabe, Harumi Mizukoshi. (2004) Degradation of Estrogens by Rhodococcus zopfii and Rhodococcus equi. Isolates from Activated Sludge in Wastewater Treatment Plants. Applied and Environmental Microbiology, 70: 5283-5289
【非特許文献３】Yaping Chao, Futoshi Kurisu, Satoshi Saitoh and Osami Yagi. (2004) Degradation of 17β-Estradiol by Sphingomonas sp. Strain D12 Isolated from Soil. Journal of Environmental Biotechnology Vol. 3, No. 2: 89-94
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、グラム陰性菌のスフィンゴモナダセア科に属する、優れた女性ホルモン物質分解能を有する細菌を提供することである。
【０００８】
本発明の別の目的は、上記細菌を用いて、女性ホルモン物質を効率良く分解する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するため検討を行った結果、女性ホルモン物質分解能を有する、スフィンゴモナダセア科に属する新規の細菌を単離することに成功し、この細菌が、女性ホルモン物質を効率良く分解することを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
即ち、本発明は、要約すると、以下の特徴を有する。
本発明は、第一の態様において、女性ホルモン物質分解能を有し、スフィンゴモナダセア（Sphingomonadaceae）科に属する、受託番号FERM P-20833の細菌又はその変異株を提供する。
その実施形態において、前記女性ホルモン物質は、17β-エストラジオール又はエストロンである。
別の実施形態において、前記女性ホルモン物質を約15〜30℃の範囲の温度で分解する。
本発明は、第二の態様において、前記細菌又はその変異株を用いて女性ホルモン物質を分解することを含む、女性ホルモン物質の分解方法を提供する。
その実施形態において、前記細菌又はその変異株を、女性ホルモン物質に汚染された物質と接触させる工程を含む。
別の実施形態において、前記汚染された物質は、排水又は土壌である。
別の実施形態において、前記細菌又はその変異株を付着させた固体支持体を用いる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の細菌は、スフィンゴモナダセア科に属する新規の細菌であり、女性ホルモン物質を効率良く分解することができ、比較的低温の条件下でも優れた分解能を有する。また、この細菌を用いて、排水や土壌中の女性ホルモン物質を分解し、環境を改善することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明において、分解処理の対象となる女性ホルモン物質は、天然あるいは合成女性ホルモン物質であり、例えばエストロゲンである。エストロゲンはステロイド骨格を持つホルモンで、例えば17β-エストラジオール、エストロン、エストリオール（以上天然エストロゲン）、エチニルエストラジオール（合成エストロゲン）等を含み、哺乳類では卵胞や乳腺の発育を促す。17β-エストラジオールは、天然エストロゲンの中で生理活性が最も高い。エストロンは、17β-エストラジオールの1/2〜1/5程度の活性を有するとの報告があるが、河川水では17β-エストラジオールの約5〜20倍の濃度のエストロンが検出されており、環境ホルモン汚染において17β-エストラジオール同様、無視できない状況となっている。
【００１３】
本発明の細菌は、土壌サンプルなどに存在する細菌を、女性ホルモン物質を用いてスクリーニングすることにより得られる。スクリーニングの具体例としては、以下の手順を示すことができる。まず、土壌サンプル（例えば、活性汚泥、池などの底土、畑土壌、庭土、下水道の汚泥）を、女性ホルモン物質を添加した土壌液体培地に加え、菌の培養を行う。培地組成は、例えば、土壌エキス（土壌と水をオートクレーブ処理した上清）、酵母抽出物、リン酸アンモニウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウムなどを含む。培養条件は、菌が生育可能な温度であればよく、例えば約15〜30℃であり、振とう培養が好ましい。菌の生育による白濁が観察されたサンプルを、女性ホルモン物質を添加した寒天培地に塗布し、培養する。寒天培地は女性ホルモン物質を含んでいるために白濁しており、女性ホルモン物質が細菌により分解されるとその部分が透明になる。生育したコロニーの周辺に女性ホルモン物質の分解による透明部分が生じている菌株を選択する。この株を、再び適切な培地で培養し、女性ホルモン物質の分解が確認された株を純化する。
【００１４】
純化した菌株の女性ホルモン物質の分解活性は、例えば、以下のように測定できる。
菌株を、女性ホルモン物質を添加した液体培地に植菌し、振とう培養を行う。例えば、数時間おきに、培養液を適量（例えば500μl）採取し、メタノールを添加して、遠心し、上清を直接、HPLCを用いて分析する。検出されたピークの大きさから、培養液中の女性ホルモン物質の残存量を求めることにより、菌株の女性ホルモン物質分解活性を測定することができる。
【００１５】
女性ホルモン物質を分解する菌株の同定は、定法に従い、形態学的・生理性状学的性質に関する試験と16S rDNA解析を用いて行う。
【００１６】
形態学的・生理性状学的性質に関する試験は、対象の細菌を例えばLB寒天培地で約30℃で48時間、好気培養し、例えば市販のグラム染色キット（例：フェイバーG「ニッスイ」（日水製薬、東京）、細菌同定キット（例：細菌同定キットAPI20 E、bioMerieux、France）などを用い、NCIMB（National Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria）の試験方法及び既報の方法（参照文献：BARROW, (G.I.) and FELTHAM, (R.K.A.): Cowan and Steel’s Manual for the Identification of Medical Bacteria. 3rdedition. 1993, Cambridge University Press、及び坂崎利一・吉崎悦郎・三木寛二、新細菌培地学講座・下（第二版）1998、近大出版、東京）に従って行う。
【００１７】
16S rDNA解析は、対象の細菌を、DNA抽出・精製し、次に16S rDNA増幅・精製し、DNAを回収、更に増幅・精製し、16S rDNA部分塩基配列解析を行い、データベース検索し、データベースとの比較から菌の分類を推定する。
【００１８】
前記スクリーニング及び菌株の同定により得られた細菌は、実施例で詳述するように、スフィンゴモナダセア科の細菌であり（2-1-17株と命名）、産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(茨城県つくば市東１−１−１つくばセンター中央第６)に平成18年（2006年）3月7日付で受託番号FERM P-20833で寄託された。以下に、2-1-17株の菌学的性質を示す。
【００１９】
【表１】
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2-1-17株はLB培地等の栄養培地で培養した際に、菌体が非常に強い黄色を呈する（図１）。無機培地の場合も時間が経つと黄色を呈する。LB培地上でのコロニーは光沢のある黄色で円形、厚みがあり半球状に近い。液体培養の場合、培養条件によっては初期に凝集が観察される場合があるが、定常期に達する前に凝集は無くなる。
【００２０】
2-1-17株の16S rDNA配列を配列番号１に示す。
2-1-17株の前記16S rDNA分析による分子系統樹を図２に示す。
【００２１】
前記スフィンゴモナス属C-I2株及びD12株と本発明の菌株（2-1-17株）を、菌学的性質から比較すると、C-I2株は運動性があるものも含まれた（特許文献２）のに対し、2-1-17株は運動性（鞭毛の着生状態）が無かった（表１）。また、D12株はβ-ガラクトシダーゼ活性は無く、コロニーの色は半透明白色であった（非特許文献３）のに対し、2-1-17株はβ-ガラクトシダーゼ活性があり（表１）、コロニーの色は強い黄色であった（図１）。
【００２２】
C-I2株及びD12株と、2-1-17株を、分子系統樹から比較すると、C-I2株及びD12株は、スフィンゴモナス・ウイッチ（Sphingomonas wittichii）AB021492及びスフィンゴモナス・スピーシーズ（Sphingomonas sp.）A175とクラスターを形成した（特許文献２、非特許文献３）のに対し、2-1-17株はスフィンゴモナス・ウイッチAB021492及びスフィンゴモナス・スピーシーズA175とクラスターを形成しておらず、系統的に異なる菌株と考えられた（図２）。
【００２３】
C-I2株及びD12株と、2-1-17株を、女性ホルモン分解能から比較すると、C-I2株は、17β-エストラジオール0.1μg/L、エストロン0.2μg/Lをそれぞれ添加した合成下水で８時間培養した場合に、合成下水中の17β-エストラジオールを83％、エストロンを66％分解し（特許文献２）、またD12株は、17β-エストラジオール600μg/4mlを添加した培地で９６時間培養した場合及びエストロン600μg/4mlを添加した培地で24時間培養した場合、培地中の17β-エストラジオールを97％、エストロンを95％分解した（非特許文献３、本実験の前培養条件は不明）のに対し、2-1-17株は、LB培地で前培養を行って菌体を洗浄し、D12株の場合と同程度の濃度（CFUで2-1-17株約2×107(cells/ml)、D12株約8×107(cells/ml)）の菌体をエストロン1g/Lを添加した培地で24時間培養した場合、培地中のエストロンの90%以上を分解し、36時間にはほぼすべて分解した（図５）。1/2LB+C培地に1g/L の17β-エストラジオールを添加した場合には、28℃では2日間で、20℃では3日間で添加した17β-エストラジオールをほぼ分解した。
【００２４】
従って、スフィンゴモナダセア科細菌2-1-17株は、エストロゲン資化能を有する新規な株である。
【００２５】
また、本菌株は、約15〜30℃の範囲の温度でエストロゲンを分解することが確認されたことから、実際の下水等の温度である約17〜24℃前後の比較的低温条件下でも優れたエストロゲン資化能を有する（図６A）。
【００２６】
本菌株は、栄養培地上で保存してもエストロゲン資化能は安定である。更に、大腸菌などと同じく、遺伝子操作のツールが多いグラム陰性菌であることから、女性ホルモン物質分解能の強化、分解基質の拡大などの遺伝子操作が、グラム陽性菌の場合より容易に行える。
【００２７】
また、2-1-17株の変異株も本発明に含まれる。ここで変異株とは、自然変異若しくは人為的変異（変異原物質処理、トランスポゾン、遺伝子変換、遺伝子組換えなど）で変異を生じさせて得られる、かつ遺伝子型に変化が生じた細菌を意味し、2-1-17株と同等の女性ホルモン分解能を有する細菌である。変異原には、物理的、化学的なものがあり、物理的変異原として、電離放射線（X線、γ線、α線、β線、陽子線、中性子線など）、紫外線がよく知られている。化学的変異原として、ニトロソ化合物（例えばニトロソアミン、ニトロソグアニジン）、塩基類似化合物(例えばブロモデオキシウリジン)、アルキル化剤（例えばN-エチル-N-ニトロソウレア、エタンスルホン酸メチル）、多環式炭化水素（例えばベンゾ[a]ピレン、ニトロピレン）、DNAインターカレーター（例えば臭化エチジウム）、DNA架橋剤（シスプラチン、マイトマイシンC）、活性酸素などが知られている。変異原物質処理は、例えば電離放射線は照射、化学的変異原は接触で行われる。
【００２８】
以上説明した本発明の細菌又はその変異株は、例えば排水中や土壌中の女性ホルモン物質を分解するのに使用することができる。例えば、本発明の細菌又はその変異株を、活性汚泥、池などの底土、畑土壌、庭土、下水道の汚泥水に接触させることにより、女性ホルモン物質を分解することができる。また、細菌を固体支持体に付着、生育させて使用してもよい。
【００２９】
固体支持体としては、本発明の細菌又はその変異株を固定化することができるものであれば、どのようなものでもよい。例えば、合成及び天然ポリマー（例えばポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリアクリルアミドゲル、κ-カラギーナン、アルギン酸カルシウム、ゲランガム、アガロース、セルロース、デキストラン）、プレポリマー（例えば光架橋性樹脂プレポリマー、ウレタンプレポリマー）、ガラス、活性炭、木材、シリカゲル、軽石、セラミック等の担体を挙げることができる。
【００３０】
本発明の細菌又はその変異株を固体支持体に固定化する方法として、担体結合法（例えば共有結合法、イオン結合法、物理的吸着法、生化学的特異結合法）、架橋法、包括法（例えば格子型、マイクロカプセル型）、架橋法と包括法、担体結合法と包括法、担体結合法と架橋法を組合わせた複合法などが挙げられる。
【００３１】
固体支持体に付着させた細菌又はその変異株を、例えば、バイオリアクター装置に使用することができ、具体的には、固定膜式リアクター、沈漬式固体膜リアクター、カラム充填式バイオリアクター、その他の装置に使用できる。
【００３２】
固体支持体を使用せず、細菌を水中などで増殖させ、直接女性ホルモン物質を接触させて分解する場合は、例えば浮遊式増殖リアクターが使用できる。
【００３３】
排水や土壌を処理する温度及びpHは、本発明の細菌又はその変異株が増殖でき、女性ホルモン物質分解能を発揮する条件であればよく、例えば約15〜30℃、pH約6〜8が好ましい。
【００３４】
以下、実施例について本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３５】
女性ホルモン物質分解菌の単離
庭土、池の汚泥水、「小平ふれあい下水道館」の汚泥水、理化学研究所の池汚泥水、熊本の土壌、理化学研究所研究室保存土壌の土壌サンプルを、1mg/mlの17β-エストラジオールを添加した土壌エキス培地（組成は後記参照）に加えて振とう培養を行った。培養温度は20℃と28℃に設定し、培養温度20℃での一次集積培養は50ml/300ml flaskで15日間培養後、その5％量の培養液を二次集積培養液に摂取し、更に７日間培養した。同様に、培養温度28℃では、一次集積培養は100ml/500ml flaskで10日間培養後、その5％量の培養液を二次集積培養液に摂取し、更に７日間培養した。
【００３６】
[土壌エキス培地の組成]
土壌エキス          20%
（土壌１＋水３をオートクレーブ処理した上清）
Yeast Extract      0.05%
(NH4)2HPO4          0.12%
KCl                0.1%
NaCl               0.2%
MgSO4・7H2O         0.03%
pH7.1
【実施例２】
【００３７】
女性ホルモン物質分解菌コロニーの単離
菌の生育による白濁が観察されたサンプルについて、適当に希釈して0.5mg/mlの17β-エストラジオールを添加した1/2LB+C液体培地に塗布し、20℃又は28℃で培養した（LB培地とC培地の組成は後記参照。1/2LB+C液体培地は、LB培地とC培地を1:1の割合で配合した培地である）。この寒天培地は、添加した17β-エストラジオールにより白濁しており、17β-エストラジオールが分解されるとその部分が透明になる。寒天培地に菌が生育してコロニーを形成した後、コロニーの周辺に17β-エストラジオールの分解による透明部分が生じている菌株を選択した。その株を再び1/2LB+C液体培地で培養し、17β-エストラジオールの分解が確認された株を純化した。
【００３８】
[LB培地の組成]
ポリペプトン 10g；NaCl 5g；酵母エキス5g；pH 7.0(NaOHで調整)／１Ｌ蒸留水
[C培地の組成]
(NH4)2SO4 5.0g；K2HPO4 5.87g；KH2PO4 2.93g；MgSO4・7H2O (x100) 10ml；NaCl 2g；酵母エキス0.2g；10g/L CaCl2 溶液1ml (最終10mg/L)；10g/L FeSO4 溶液1ml (最終 10mg/L)；微量元素溶液 (x100) 20μl；pH7.0(NaOHで調整)／１L 蒸留水；MgSO4・7H2O(×100): MgSO4・7H2O 30g/L；微量元素溶液(x100) : MoO3 0.1g、ZnSO4・5H2O 0.7g、 CuSO4・5H2O 0.05g、H3BO3 0.1g、MnSO4・5H2O 0.1g、CoCl2・6H2O 0.1g／１L 蒸留水
【実施例３】
【００３９】
女性ホルモン物質分解菌株の活性測定
純化したそれぞれの菌株を、プレートから直接、1mg/mlの17β-エストラジオールを添加した1/2LB+C液体培地に植菌し、20℃及び28℃で振とう培養を行った。24時間おきに培養液の500μlをとり、メタノール1000μlを添加して遠心、上清を直接HPLCを用いて分析した。検出されたピークの大きさから、17β-エストラジオールの残存量を求めた（図３及び図４）。
【００４０】
[HPLC分析条件]
装置：Waters 2690 HPLC
カラム：Inertsil ODS-3 (4.6×250 mm)
展開溶剤：20％溶液A＋80％溶液Bから65％溶液A＋35％溶液Bのグラジエント10分；３分の保持；20％溶液Aへ２分間で変化;15分から最初の状態20％溶液A＋80％溶液Bに戻る。
溶液A(CH3CN:CH3OH:TFA=95:5:0.05)
溶液B(H2O:CH3OH:TFA=95:5:0.05)
温度：40℃
流速：１ml/分
【００４１】
分析した18の菌株のうち、良好な17β-エストラジオール分解能を示した、10株について、更に検討を行った。
【実施例４】
【００４２】
菌株の同定
定法に従い、前記10株の16S rDNAの塩基配列を決定し、BLASTを用いた細菌基準株データベースに対する相同性検索を行った。
【００４３】
ほとんどがロドコッカス属の細菌であったが、2-1-17株（図３及び４のES2-Lot2-1-17）は、スフィンゴモナス（Sphingomonas）やスフィンゴビウム（Sphingobium）に近縁であると考えられた。通常のデータベースを用いた解析では属の決定が困難であったため、専門の菌株同定機関による詳細な解析を行った。2-1-17株の16S rDNA配列に類似の配列をデータベース中で検索した結果、細菌基準株データベースを対象にした検索では最大で95.6%の相同性しか示さず（表２）、国際塩基配列データベースを対象にした場合でも種が明らかとなっている株に対しては、種の同定が可能な相同性（97%以上）は示されなかった（表３）。細菌基準株の16S rDNA配列を用いた系統樹を作成した結果（図２、系統樹に用いた基準株表４）、2-1-17株の16S rDNAは、スフィンゴモナスの16S rDNAが形成するクラスターとスフィンゴビウムのクラスターの中間に単独で系統枝を形成した（図２）。ブートストラップ値から、この系統枝の安定性はやや低いと思われるものの、スフィンゴモナスの基準種であるSphingomonas paucimobilisを中心とするスフィンゴモナスと、スフィンゴビウムの基準種であるSphingobium yanoikuyaeを中心とするスフィンゴモナスの16S rDNAは、属レベルのクラスターを形成していると考えられることから、2-1-17株の16S rDNAの位置は、既知のスフィンゴモナスやスフィンゴビウムとは系統的に異なる可能性が高いことを示唆するものと考えられた。これら解析結果から、2-1-17株の種レベル、および属レベルにおける帰属分類群の推定は困難と考えられ、新属、新種を形成する可能性もあると推測された。以上の結果から、2-1-17株は、スフィンゴモナスやスフィンゴビウムを含むスフィンゴモナダセア（Sphingomonadaceae）科に帰属する菌株とするのが妥当と考えられた。
【００４４】
【表２】
2007252332.tif 000005
【００４５】
【表３】
2007252332.tif 000006
【００４６】
【表４】
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【実施例５】
【００４７】
2-1-17株のエストロンへの生育とエストロン残存量の測定
2-1-17株をLB培地で一晩培養し、菌体を集菌、滅菌蒸留水で2回洗浄した後、適当な量の滅菌蒸留水に菌体を懸濁してOD600を測定した。OD600が10となるように菌懸濁液を調製し、エストロンを終濃度1mg/mlになるように添加した10mlのC培地に菌懸濁液100μlを植菌し、30℃、100 shake/minで培養した。培養開始から12時間おき、及び培養開始18時間に培養液を適当に希釈してLB培地に塗布し、生菌数を測定した。同時に500μlの培養液をサンプリングして1000μlのメタノールを添加して混合、遠心し、上清をHPLCを用いて分析してピークの大きさからエストロンの残存量を求めた。その結果、前培養を栄養培地で行っているにもかかわらず、24時間でエストロンの9割近くが分解され、36時間ではほとんどが分解されて生育も定常に達した（図５）。
【実施例６】
【００４８】
低温での2-1-17株のエストロゲン分解
通常、下水の温度の平均は17℃から24℃とされている。この温度付近で良好にエストロゲンを分解すれば、保温などの必要が無く、より簡便で安価なエストロゲンの処理が可能と考えられる。そこで、17℃、20℃、24℃、28℃の温度における、2-1-17株の17β-エストラジオールの分解性を調べた。
【００４９】
2-1-17株をLB培地で一晩培養し、菌体を集菌、滅菌蒸留水で2回洗浄した後、適当な量の滅菌蒸留水に菌体を懸濁してOD600を測定した。OD600が10となるように菌懸濁液を調製し、17β-エストラジオールを終濃度1mg/mlになるように添加した10mlのC培地に、菌懸濁液100μlを植菌し、各々の温度において150 rpmで培養した。24時間おきに400μlの培養液をサンプリングして800μlのメタノールを添加して混合、遠心し、上清をHPLCを用いて分析し、極大吸収(280nm)のピークの高さを標品の高さと比較して17β-エストラジオールの残存量を求めた。HPLC分析は、分析時間の短縮のため、以下の条件で行った。
【００５０】
[HPLC分析条件]
装置：Waters 2690 HPLC
カラム：Inertsil ODS-3 (4.6×250 mm)
展開溶剤：60％溶液A＋40％溶液B一定、8分
溶液A(CH3CN:CH3OH:TFA=95:5:0.05)
溶液B(H2O:CH3OH:TFA=95:5:0.05)
温度：40℃
流速：１ml/分
【００５１】
比較のために、ロドコッカス属細菌の2株（B5株、A8株）についても同様の分解試験を行った（B5株、A8株は実施例１、２と同様の手法で異なる時期に単離された菌株であり、図３、４の分解試験のグラフには含まれていない）。
【００５２】
2-1-17株は、ロドコッカス属のエストロゲン分解菌の中でも分解活性の高いB5株に近い、良好な17β-エストラジオールの分解が認められた。特に、温度が20℃以下の場合に、B5株とほぼ同じ分解を示した（図６）。28℃ではB5株よりやや活性が低い事を考えると、本菌株は、低温での17β-エストラジオールの分解に優れていると言える。A8株は28℃での分解活性は2-1-17株に近いが、低温では顕著に分解活性が低下した。
【００５３】
本実験も前培養が栄養培地で、17β-エストラジオールが添加されてからエストロゲン分解酵素が誘導されていると考えられ、また、生菌数の測定実験と同じ、最初の菌体添加量が少ない条件で行っていることから、前培養にもエストロゲンを加える、あるいは添加する菌体量を増加させるなどにより、より迅速な分解が可能と考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明の細菌は、バイオレメディエーションに利用することができる。また、本発明の細菌はグラム陰性菌であることから、遺伝子操作により、女性ホルモン物質分解能の向上、分解基質の拡大等を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】2-1-17株のコロニーである。
【図２】2-1-17株の16S rDNAに基づく系統樹である。
【図３】各菌株における17β-エストラジオール分解の経時的変化を示す。
【図４】各菌株における17β-エストラジオール分解の経時的変化を示す。
【図５】2-1-17株におけるエストロン分解の経時的変化と生育曲線を示す。
【図６】各菌株における各温度条件下での17β-エストラジオール分解の経時的変化を示す。A：2-1-17株、B:ロドコッカス属B5株、C:ロドコッカス属A8株。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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