(57)【要約】【課題】  βＧを特異的に測定するためのＡＬ試薬、及びそれを用いたβＧの特異的測定方法を提供すること。【解決手段】  カブトガニ血球抽出物の酵素反応を引き起こさない濃度以下しか(1→3)-β-D-グルカン又は／及びその類縁物質を含有しない、ポリミキシン又はその塩及びＡＬを含んでなる、(1→3)-β-D-グルカン測定用ＡＬ試薬及びキット、該ＡＬ試薬の調製方法、及び該ＡＬ試薬を用いて(1→3)-β-D-グルカンを特異的に測定する方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カブトガニ血球抽出物（以下、ＡＬと略記する。）の酵素反応を引き起こさない濃度以下しか(1→3)-β-D-グルカン又は／及びその類縁物質を含有しない、ポリミキシン又はその塩及びＡＬを含んでなる、(1→3)-β-D-グルカン測定用ＡＬ試薬。
【請求項２】
ポリミキシン又はその塩の濃度が０.２〜８０ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載のＡＬ試薬。
【請求項３】
ポリミキシン又はその塩が、正電荷を持った膜でポリミキシン又はその塩を処理して得られるものである、請求項１に記載のＡＬ試薬。
【請求項４】
(1→3)-β-D-グルカン又は／及びその類縁物質が(1→3)-β-D-グルカンである、請求項１に記載のＡＬ試薬。
【請求項５】
ポリミキシン又はその塩が、ポリミキシンＢ又はその塩である、請求項１に記載のＡＬ試薬。
【請求項６】
ポリミキシンＢの塩が、硫酸ポリミキシンＢである、請求項５に記載のＡＬ試薬。
【請求項７】
ＡＬに、ＡＬの酵素反応を引き起こさない濃度以下しか(1→3)-β-D-グルカン又は／及びその類縁物質を含有しないポリミキシン又はその塩を共存させることを特徴とする、(1→3)-β-D-グルカン測定用ＡＬ試薬の調製方法。
【請求項８】
(1→3)-β-D-グルカン測定用ＡＬ試薬に０.２〜８０ｍｇ／ｍＬのポリミキシン又はその塩を共存させる、請求項１に記載の調製方法。
【請求項９】
ＡＬの酵素反応を引き起こさない濃度以下しか(1→3)-β-D-グルカン又は／及びその類縁物質を含有しないポリミキシン又はその塩、及びＡＬを構成成分として含んでなる、(1→3)-β-D-グルカン測定用キット。
【請求項１０】
ＡＬの酵素反応を引き起こさない濃度以下しか(1→3)-β-D-グルカン又は／及びその類縁物質を含有しない、ポリミキシン又はその塩を含有するＡＬを構成成分として含んでなる試薬を含む、(1→3)-β-D-グルカン測定用キット。
【請求項１１】
エンドトキシンを含む試料を、ＡＬの酵素反応を引き起こさない濃度以下しか(1→3)-β-D-グルカン又は／及びその類縁物質を含有しない、ポリミキシン又はその塩を含有するＡＬ試薬と反応させ、その結果生ずる酵素活性化反応により活性化された酵素の活性を測定するか、又はその結果生ずるゲル化反応に基づく反応液の濁度の変化の程度やゲル化状態の程度を機器又は目視により測定することを特徴とする、(1→3)-β-D-グルカンを特異的に測定する方法。
【請求項１２】
エンドトキシンを含む試料を、ＡＬの酵素反応を引き起こさない濃度以下しか(1→3)-β-D-グルカン又は／及びその類縁物質を含有しないポリミキシン又はその塩の共存下にＡＬと反応させ、その結果生ずる酵素活性化反応により活性化された酵素の活性を測定するか、又はその結果生ずるゲル化反応に基づく反応液の濁度の変化の程度やゲル化状態の程度を機器又は目視により測定することを特徴とする、(1→3)-β-D-グルカンを特異的に測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カブトガニ血球成分と、（１→３）−β−Ｄ−グルカン（以下、「βＧ」と略記する場合がある。）とを反応させ、その反応を分析して行うβＧの特異的な測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
βＧは、酵母やカビの細胞壁の骨格構成物、多くの担子菌子実体（キノコ）の主要な多糖成分、血液透析に使用する膜等からの溶出成分等としてその存在が知られている物質である。βＧの生物活性はエンドトキシン（以下、ＥＴと略記する。）ほど明らかではないものの、これを測定することによって真菌症の早期診断や真菌による医療用具の汚染の検出を行うことができると考えられている。
【０００３】
一方、ＥＴは、グラム陰性菌の細胞壁外膜に存在するリポ多糖（Lipopolysaccharide 、ＬＰＳ）であり、強い発熱性物質として知られている。
【０００４】
βＧは、カブトガニの血球抽出物（Amebocyte Lysate、以下、ＡＬと略記する。）を含む溶液（以下、ＡＬ溶液と略記する。）と反応して酵素（プロテアーゼ等）の活性化反応やゲル化反応を生じる性質を有しており、医学、薬学、微生物学の分野ではこれを利用した、簡便で、安価なβＧ検出法として、例えば酵素（プロテアーゼ等）の活性化程度を比色法により測定することにより行う方法やゲル化反応を利用した所謂リムルステスト等（以下、これらを総称してリムルステスト等と略記する。）が、広く用いられている。
【０００５】
しかしながら、リムルステスト等に用いられるＡＬ試薬は、βＧのみならず、ＥＴとも反応するため（非特許文献１、非特許文献２）、これらを用いてβＧを測定しようとする場合は試料中のＥＴによって測定値に影響を受け、その特異性が損なわれるという問題があった。
【０００６】
このような問題点を解決するために、ＡＬ溶液を各種クロマトグラフィーにより処理してＡＬ溶液中に存在するＥＴと反応して酵素（プロテアーゼ等）の活性化反応やゲル化反応を生じさせる因子（ＥＴ感受性因子）を除去する方法（特許文献１、特許文献２、特許文献３）、ＥＴに対して親和性を持つペプチドをＡＬ溶液に添加してＥＴ感受性因子を不活化する方法（特許文献４）、ＥＴ感受性因子に対する抗体をＡＬ溶液に添加してＥＴ感受性因子を不活化する方法（特許文献５）等が報告されている。しかしながら、これらの方法は、いずれもＡＬ溶液自体に処理を施す方法であるため、通常の環境に広く存在するＥＴやβＧ等によって該処理中にＡＬ溶液が汚染される危険性が大きいという欠点を有している。
【０００７】
また、これらの方法は、このような汚染を回避するための無菌的設備や複雑な無菌的操作が必要であること、及び、ＥＴに対して親和性を持つペプチドやＥＴ感受性因子に対する抗体は入手が困難であり高価であること等からも明らかなように、経済的、技術的にも問題の多い方法である。
【０００８】
また、ＬＡＬとＥＴあるいはβＧとの反応で生成するコアギュリンペプチドCの濃度をELISAで測定することによって、試料中のＥＴ量あるいはβＧ量を定量する方法において、ジメチルスルホキシドとポリミキシンＢを添加したＬＡＬを試料と反応させた後、ELISAを行うと、ＥＴに対する反応性のみが阻害されることが報告されている（非特許文献３）
その他、ＡＬ溶液ではなく測定用試料を処理することによってＥＴを不活化させる方法として、試料を加熱処理する方法が報告されている（特許文献６）。この方法は、上記の方法の欠点を克服しているものの、ＥＴを充分に不活化するためには長い処理時間を必要とするという問題点を有しており、好ましい方法とは言い難い。
【０００９】
更に、ＥＴを含む試料に、ポリミキシンＢ等の、ＥＴと結合してＥＴの活性を抑制する性質を有するペプチド誘導体（又は蛋白質）と界面活性剤とを共存させ、加熱することにより、ＥＴの活性を抑制し、βＧを特異的に測定する方法も報告されている（特許文献７）。しかし、この方法では試料の前処理が必要であるため操作が煩雑であるという問題がある。
【００１０】
【特許文献１】特開昭59-27828号公報
【特許文献２】特開平2-138193号公報
【特許文献３】特開平4-76459 号公報
【特許文献４】特開平2-207098号公報
【特許文献５】特開平4-52558 号公報
【特許文献６】特開平2-141666号公報
【特許文献７】特許第3106839号公報
【非特許文献１】Kakinuma et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1981, vol.101, p.434-439
【非特許文献２】Morita et al., FEBS Lett., 1981, vol.129, p.318-321
【非特許文献３】Zhang et al., J. Clin. Microbiol., 1994, vol.32, No.6, p.1537-1541
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は上記した如き状況に鑑みなされたもので、βＧを特異的に測定するためのＡＬ試薬、及びそれを用いたβＧの特異的測定方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は上記課題を解決する目的でなされたものであり、以下の構成よりなる。
（１）ＡＬの酵素反応を引き起こさない濃度以下しかβＧ又は／及びその類縁物質を含有しない、ポリミキシン又はその塩及びＡＬを含んでなる、βＧ測定用ＡＬ試薬。
（２）ＡＬに、ＡＬの酵素反応を引き起こさない濃度以下しかβＧ又は／及びその類縁物質を含有しないポリミキシン又はその塩を共存させることを特徴とする、βＧ測定用ＡＬ試薬の調製方法。
（３）ＡＬの酵素反応を引き起こさない濃度以下しかβＧ又は／及びその類縁物質を含有しないポリミキシン又はその塩、及びＡＬを構成成分として含んでなる、βＧ測定用キット。
（４）ＡＬの酵素反応を引き起こさない濃度以下しかβＧ又は／及びその類縁物質を含有しない、ポリミキシン又はその塩を含有するＡＬを構成成分として含んでなる試薬を含む、βＧ測定用キット。
（５）ＥＴを含む試料を、ＡＬの酵素反応を引き起こさない濃度以下しかβＧ又は／及びその類縁物質を含有しない、ポリミキシン又はその塩を含有するＡＬ試薬と反応させ、その結果生ずる酵素活性化反応により活性化された酵素の活性を測定するか、又はその結果生ずるゲル化反応に基づく反応液の濁度の変化の程度やゲル化状態の程度を機器又は目視により測定することを特徴とする、βＧを特異的に測定する方法。
（６）ＥＴを含む試料を、ＡＬの酵素反応を引き起こさない濃度以下しかβＧ又は／及びその類縁物質を含有しないポリミキシン又はその塩の共存下にＡＬと反応させ、その結果生ずる酵素活性化反応により活性化された酵素の活性を測定するか、又はその結果生ずるゲル化反応に基づく反応液の濁度の変化の程度やゲル化状態の程度を機器又は目視により測定することを特徴とする、βＧを特異的に測定する方法。
【００１３】
即ち、本発明者等は、ＡＬ溶液を用いたβＧの特異的測定法を見出すべく鋭意研究の途上、市販のポリミキシン又はその塩を、試料との反応系に共存するＥＴの活性を抑制し得るほどＡＬ試薬に共存させるとＡＬ試薬が活性化されてしまうが、高純度に精製したポリミキシン又はその塩をＡＬ試薬に共存させた場合には、このようなＡＬ試薬の活性化は起こらず、更にはこのＡＬ試薬をβＧとＥＴとを含有する試料と反応させた場合には、ＡＬはＥＴとは反応せず、βＧを特異的に測定することができることを見出した。そして更に研究を行った結果、市販されているポリミキシン又はその塩の多くは、それ自体βＧ又は／及びその類縁物質に汚染されていることを突き止め、更に鋭意研究の結果、ポリミキシン又はその塩を適宜精製処理することにより、ポリミキシン又はその塩をロスすることなく、効果的に共存するβＧ又は／及びその類縁物質を除去し得、ＡＬの酵素反応を引き起こさない濃度以下しかβＧ又は／及びその類縁物質を含有しないポリミキシン又はその塩を得ることができることを見出した。
【００１４】
そして、このポリミキシン又はその塩を予め共存させたＡＬ試薬を用いて試料中のβＧの測定を行えば、試料中に共存するＥＴの影響を受けることなく、βＧを特異的に測定することができることを見出し、本発明を完成した。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、新規なβＧ測定用ＡＬ試薬及びその調製方法、並びにこの方法によって調製されたβＧ測定用ＡＬ試薬を用いたβＧの特異的な測定方法を提供するものであり、このＡＬ試薬を用いてβＧの測定を行えば、従来のような試料の前処理を行わなくても試料中に存在するＥＴの影響を排除し得、βＧを特異的に測定できる、という効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明のβＧ測定用ＡＬ試薬としては、「ＡＬの酵素反応を引き起こさない濃度以下しかβＧ又は／及びその類縁物質を含有しないポリミキシン又はその塩及びＡＬを含んでなる、βＧ測定用ＡＬ試薬。」が挙げられる。
【００１７】
本発明に用いられるＡＬとしては、通常のβＧの測定に使用できるものであれば特に限定されることなく挙げることができるが、例えばリムルス属（Limulus）、タキプレウス属（Tachypleus）、あるいはカルシノスコピウス属（Carcinoscorpius）等に属するカブトガニの血球から得られた ライセート（lysate）であって、βＧとの反応により酵素（プロテアーゼ等活性化やゲル化反応が生じるものであればよく、特に限定されない。
【００１８】
また、例えばＡＣＣ（Associates of Cape Cod）社、ヘマケム社、ケンブレックス社（Cambrex Corp.）、チャールズリバー社（Charles River Laboratories）、生化学工業(株)、及び和光純薬工業(株)等から市販されているＡＬ溶液の凍結乾燥品をもとに調製したものも当然のことながら使用可能である。
【００１９】
本発明に係るβＧ又は／及びその類縁物質（以下、「βＧ類」と略記する場合がある）としては、βＧをその構成成分として含む多糖類であれば特に限定されることなく挙げることができるが、例えばＡＬの酵素反応を引き起こす性質のあるものが挙げられる。具体的には、例えば各種細菌類（例えば、Alcaligenes属，Agrobacterium属等）、酵母類（例えば、Saccharomyces属、Candida属、Cryptococcus属、Trichosporon属、Rhodotorula属等）カビ類（Aspergillus属、Mucor属、Penicillium属、Trichophyton属、Sporothrix属、Phialophora属等）、放線菌類（Actinomyces属、Nocardia属等）、キノコ類（例えば、シイタケ，スエヒロタケ，カワラタケ等）等の細胞壁等から得られる天然の多糖、具体的には例えばカードラン，パキマン，スクレロタン，レンチナン，シゾフィラン，コリオラン等、或は、藻類（例えば、褐藻，ユーグレナ，ケイ藻等）の貯蔵性多糖、具体的には例えばラミナラン，パラミロン等、或は又これらに常法、例えば大有機化学第19巻,第７版,70〜101頁,小竹無二雄監修,昭和42年５月10日,朝倉書店；A. E. Clarkeら, Phytochemistry, vol.1 ,175-188(1967)；T.Sasakiら,Europ.J.Cancer,vol.15,211-215(1967)等に記載された方法に準じて例えば硫酸基，カルボキシメチル基，カルボキシエチル基，メチル基，ヒドロキシエチル基，ヒドロキシプロピル基，スルホプロピル基等を導入して得られる誘導体等が挙げらる。
【００２０】
本発明に於いて用いられる「βＧの濃度」といった場合の濃度とは、和光純薬工業（株）から市販されているβ-グルカンテストワコー「β-グルカン標準品」を標準品として用い、試料を、ＡＬとしてリムルス属（Limulus）に属するカブトガニの血球から得られたライセート（lysate、特にＬＡＬと略記する。）であって、βＧとの反応により濁度が増加する性質を有するものを用いて測定して得られた値（濃度）を、意味する。
【００２１】
本発明に係るポリミキシン又はその塩（以下、「ポリミキシン類」と略記する。）のポリミシキンとしては、例えばポリミキシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｍ、Ｐ等が挙げられ、その由来は、例えばＢacillus polymyxa等が産生するものが挙げられるが、特に限定されない。また、単一の成分として精製されたものでも、これらの内のいくつかの混合物でも、また、塩の形になったものでも何れにてもよく、特に限定されない。ポリミキシンの塩としては、例えば硫酸塩が挙げられる。入手の容易さを考慮するとポリミキシンＢの硫酸塩が好ましい。
【００２２】
本発明に係るβＧ測定用ＡＬ試薬中の、本発明のポリミキシン類の濃度としては、試料と反応させた場合にＥＴの活性を充分に抑制し得る濃度であって且つ例えばβＧのＡＬ溶液に対する反応性を促進も阻害もしない濃度であれば特に限定されることなく選択できる。試料とＡＬ試薬とを１対１で混合して測定する場合、反応時のＥＴ濃度が１ｎｇ／ｍＬ程度であれば、βＧ測定用ＡＬ試薬中に４μｇ／ｍＬ程度のポリミキシンが含有されていれば、ＥＴによる影響を受けることなく、測定は可能である。しかし、臨床診断の分野に於いては数１０ｎｇ／ｍＬ程度の濃度のＥＴを含有している試料もある。また、βＧ測定法の種類によっても、その濃度は異なり、比濁時間分析法を行う場合には、エンドポイント合成基質法を行う場合よりも高濃度のポリミキシン類を加えることが望ましい。また、臨床診断の分野において、βＧを特異的に測定するためには、あらゆる試料中のＥＴ活性を十分抑制できる濃度のポリミキシン類を含有している必要がある。そこで、どのような測定法であっても、またどのような濃度のＥＴを含有する臨床試料を用いた場合であってもＥＴの活性を十分抑制し、βＧを特異的に測定できるための、本発明のポリミキシン類の濃度としては、βＧ測定用ＡＬ試薬中に０.０２〜８０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０.２〜８０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０.４〜２０ｍｇ／ｍＬ、更に好ましくは１〜４ｍｇ／ｍＬ程度である。
【００２３】
本発明に係るポリミキシン類は、測定に影響を与える量のβＧ類を含んでいてはならない。即ち、ＡＬの酵素反応を引き起こさない濃度以下しかβＧ類を含有しないものでなければならない（そのようなポリミキシン類を、以下「本発明のポリミキシン類」と記載する場合がある。）。
【００２４】
ＡＬは調製方法や測定方法によりβＧ類に対する感度が異なる。本発明では、ポリミキシン類に由来するβＧ類によりＡＬの酵素反応が引き起こされないようにすることが肝要である。そのため、ポリミキシン類中のβＧ類の濃度は、ポリミシキン類を必要濃度となるようにＡＬ溶液中に共存させた場合に、ＡＬ試薬中のβＧ類濃度が、最終的に許容される濃度（即ち、ＡＬ溶液の活性化を引き起こさない濃度）以下となるような濃度以下であることが要求される。ＡＬの酵素反応を引き起こさないβＧの濃度は、ＡＬのβＧ感度により異なるが、一般的なＡＬでは数ｐｇ/ｍＬ程度である。例えば、ＬＡＬを用いて測定する場合には、ＬＡＬ溶液中に（１→３）−β−Ｄ−グルカン濃度として１０ｐｇ／ｍＬ以下、好ましくは１ｐｇ／ｍＬ以下、より好ましくは約０.２ｐｇ／ｍＬ未満である。
【００２５】
従って、本発明に係るポリミキシン類中のβＧ類の含有量としては、ポリミキシン類をβＧ測定用ＡＬ溶液中にポリミキシン類を上記した如き濃度となるように添加した場合のＡＬ溶液中のβＧの濃度が１０ｐｇ／ｍＬ以下、となる量である。従って、これを直鎖の（１→３）−β−Ｄ−グルカンであるカードランの濃度に換算すると、０.９ｎｇ／ｍＬ以下、であり好ましくは０.０９ｎｇ／ｍＬ以下、より好ましくは０.０１８ｎｇ／ｍＬ以下である。
【００２６】
従来より、試料中のβＧを特異的に測定するために、ポリミキシン類を試料に添加して、試料中のＥＴ活性を抑制して試料中のβＧを特異的に測定する方法が試みられてきたが、ポリミキシン類単独ではＥＴ活性を十分に抑制することができない、あるいは、そのバックグラウンド値を抑えることが出来なかった。本発明者等は鋭意研究の結果、使用するそのポリミキシン類自体が、βＧ類で汚染されている場合があり、これが、βＧを測定する際のバックグラウンド値上昇の原因であることも突き止めた。また、ポリミキシン類のβＧ類による汚染のために、ＥＴ活性を十分に抑制できる量のポリミキシン類を添加することができなかったことが、ポリミキシン類単独ではＥＴ活性を十分に抑制することが出来なかった原因であることも突き止めた。
【００２７】
そのため、本発明で用いられるポリミキシン類は、βＧ類含有量が上記した如き所要量以下のポリミキシン類、或は、所定濃度以下となるようにポリミキシン類からβＧ類を除去する前処理を行ったものである必要がある。
【００２８】
βＧ類を含有する溶液から、βＧ類を除去する方法としては、一般に例えばゼータポアメンブレン（キュノ（株）社商品名）等の正電荷を持った膜、ウルチポア（日本ポール社商品名）、ベイオダイン（日本ポール社商品名）等のナイロン６６製フィルター、例えばＰＴＦＥ膜（日東電工（株）製）等のポリテトラフルオロエチレンフィルター等を用いて処理する方法や、活性炭を用いて処理する方法が知られている。
【００２９】
本発明者等は、ポリミキシン類からβＧ類を除去する前処理を行う方法について鋭意研究の結果、特に正電荷を持った膜でポリミキシン類を含有する溶液を処理することにより、ポリミキシン類を含有する溶液からβＧ類を効果的に除去し、ＡＬの酵素反応を引き起こさない濃度以下しかβＧ類を含有しないポリミキシン類（「本発明のポリミキシン類」）を得ることに成功した。またこの方法によれば、当該溶液中のポリミキシン類のロスが少ないことを見出した。
【００３０】
ポリミキシン類からβＧ類を除去する為に用いられる正電荷を持った膜としては、ゼータ電位の吸着作用により、微粒子、ＥＴ等の除去を行うことができる、ナイロン６６製の膜等が挙げられる。実際には、例えばゼータポアメンブレン（キュノ株式会社商品名）、ウルチポア（日本ポール社商品名）、ベイオダイン（日本ポール社商品名）等のナイロン６６製フィルター等の市販品を用いればよい。正電荷を持った膜のポアサイズとしては特に限定されないが、例えば０.１〜２μmのものが挙げられる。
【００３１】
尚、当然のことながら、セルロース系の膜は、膜からβＧ様物質が溶出してくる危険性があるため、本目的に使用することはできない。
【００３２】
βＧ類の除去を正電荷を持った膜に通すことにより行う場合、例えば使用するポリミキシン類を適当な濃度（例えば０.１〜８Ｗ／Ｖ％程度）の溶液とした後、当該膜を支持体にセットし、濾過すればよい。尚、ポリミキシン類溶液は、目的濃度の溶液とした後に上記の条件で濾過処理してもよい。
【００３３】
正電荷を持った膜でポリミキシン類を含有する溶液を処理する際に用いられるポリミキシン類を含有する溶液の溶媒としては、ＥＴ及びβＧフリーであって、且つＡＬとβＧ類との反応を阻害も促進もしないものが望ましく、蒸留水（例えばＥＴ及びβＧフリーの注射用蒸留水）、緩衝液等が挙げられる。緩衝液を構成する緩衝剤としては、通常この分野で用いられるものは全て使用可能であり、具体的には、例えばリン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、トリス緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられ、その使用濃度は、通常この分野に於ける使用濃度範囲から適宜選択すればよい。
【００３４】
また、ポリミキシン類を含有する溶液を正電荷を持った膜で１回又は数回処理を行っても良い。また、その他上記した如き従来のフィルターを用いて処理する方法を適宜組み合わせるのは任意である。また、限外濾過等の方法を組み合わせて用いても良い。中でも、正電荷を持った膜でポリミキシン類を含有する溶液を処理した後、通常の限外濾過処理を行うことが望ましく、その後更に再度正電荷を持った膜で処理すればより効果的にポリミキシン類を含有する溶液からβＧ類を除去することが出来る。
【００３５】
ポリミキシン類中のβＧ類の含有量は、これをＡＬと共存させた場合にＡＬの酵素反応を引き起こさない濃度以下でなくてはならないが、当該方法でポリミキシン類を処理することにより、ポリミキシン類から、ポリミキシン類を殆どロスすることなく、βＧ類を効果的に除去することができる。
【００３６】
本発明のβＧ測定用ＡＬ試薬の調製方法としては、ＡＬに、本発明のポリミキシン又はその塩を共存させればよい。
【００３７】
ポリミキシン類をＡＬ又はその溶液に共存させて、本発明のβＧ測定用ＡＬ試薬を得る方法としては、ＡＬ又はその溶液に、上記した如きポリミキシン類を上記した如き濃度となるように、共存させておけば足りる。その具体的方法としては、最終的に該ポリミキシン類をＡＬ又はその溶液中に所定濃度となるように添加できる方法であれば特に限定されないが、例えば
（１）本発明のポリミキシン類を含む溶液でＡＬの凍結乾燥品を溶解する方法、
（２）本発明のポリミキシン類をＡＬ溶液に適当量添加、溶解する方法、
（３）本発明のポリミキシン類を含む溶液をＡＬ溶液に適当量添加する方法、等が挙げられる。
【００３８】
上記（１）及び（３）の方法において、βＧ測定用ＡＬ試薬を調製する際のポリミキシン類を含む溶液中のポリミキシン類の濃度としては、目的のβＧ測定用ＡＬ試薬を調製した際の最終濃度が前記した如き濃度となるような範囲であれば特に限定されない。
【００３９】
また、上記（２）及び（３）の方法に於いて、βＧ測定用ＡＬ試薬を調製する際のＡＬ溶液の濃度としては、目的のβＧ測定用ＡＬ試薬を調製した際の最終濃度が試料中のβＧ測定に用いるのに適した濃度となるような範囲であれば特に限定されない。
【００４０】
更に、後述する合成基質法でβＧの測定を行う場合、本発明のβＧ測定用ＡＬ試薬は、ＡＬ及び所定濃度のポリミキシン類の他に、更に合成基質を含有させたものとなる。
【００４１】
尚、本発明の調製方法に用いられるポリミキシン類を含む溶液及びＡＬ溶液を調製するための溶媒は、ＥＴ及びβＧフリーであって、且つＡＬとβＧとの反応を阻害も促進もしないことを確認したものが望ましい。例えば蒸留水（例えばβＧフリーの注射用蒸留水）、緩衝液等が挙げられる。緩衝液を構成する緩衝剤としては、通常この分野で用いられるものは全て使用可能であり、具体的には、例えばリン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、トリス緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられ、その使用濃度は、通常この分野に於ける使用濃度範囲から適宜選択すればよい。
【００４２】
上記の方法で得られた本発明のβＧ測定用ＡＬ試薬は、溶液状態のままでもよいが、一旦凍結乾燥して試薬の形態として保存し、その後蒸留水等のＥＴ及びβＧを含まない水で再溶解して、βＧの測定に使用することも当然可能である。
【００４３】
また、上記のβＧ測定用ＡＬ試薬あるいはこれを凍結乾燥処理したものの中には、βＧのリムルステスト法による測定を阻害又は促進しない範囲であれば例えば燐酸緩衝剤，グッド緩衝剤（Good's Buffers）等の緩衝剤や例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤等が含まれていても良いことは言うまでもない。
【００４４】
更に、βＧ測定用ＡＬ試薬あるいはこれを凍結乾燥処理したものの中には、反応促進剤、安定化剤、防腐剤、その他この分野で用いられているものは、共存する試薬等の安定性を阻害したり、βＧの測定を阻害又は促進しないものであれば目的の測定に於いて通常使用されるものを含有していても良い。またその濃度も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲で用いられればよい。
【００４５】
また、本発明のβＧ測定用キットとしては、
（ｉ）ＡＬの酵素反応を引き起こさない濃度以下しかβＧ類を含有しないポリミキシン類、及びＡＬを構成成分として含んでなるもの、又は
（ｉｉ）ＡＬの酵素反応を引き起こさない濃度以下しかβＧ類を含有しない、ポリミキシン類を含有するＡＬを構成成分として含んでなる試薬を含むもの、
が、挙げられる。
【００４６】
夫々の構成要素の好ましい態様、具体例については上で述べたとおりである。
【００４７】
本発明のβＧ測定方法を実施するには、例えば、以下の２つの方法が挙げられる。
【００４８】
（１）βＧを含む試料を、本発明のβＧ測定用ＡＬ試薬と反応させ、その結果生ずる酵素活性化反応により活性化された酵素の活性を測定するか、又はその結果生ずるゲル化反応に基づく反応液の濁度変化の程度やゲル化状態の程度を機器又は目視により測定することを特徴とする、βＧを特異的に測定する方法。
【００４９】
（２）βＧを含む試料を、ＡＬの酵素反応を引き起こさない濃度以下しかβＧ類を含有しないポリミキシン類（「本発明のポリミキシン類」）の共存下にＡＬと反応させ、その結果生ずる酵素活性化反応により活性化された酵素の活性を測定するか、又はその結果生ずるゲル化反応に基づく反応液の濁度の変化の程度やゲル化状態の程度を機器又は目視により測定することを特徴とする、βＧを特異的に測定する方法。
【００５０】
上記（１）の方法を実施するには、本発明のβＧ測定用ＡＬ試薬を用いる以外は、自体公知の例えばＡＬを用いるＬＡＬ法等により、通常の測定条件（例えば反応時間、測定時の温度、測定波長等）、測定操作で測定を行えばよい。
【００５１】
また、上記（１）の方法において、βＧを含む試料を、本発明のβＧ測定用ＡＬ試薬と反応させる方法としては、例えば本発明のβＧ測定用ＡＬ試薬溶液（本発明のポリミキシン類を所定濃度含有するＡＬ溶液）を当該試料と反応させる方法、例えばβＧ測定用ＡＬ試薬（本発明のポリミキシン類を所定濃度含有するＡＬ溶液）を一旦凍結乾燥し、再度溶解して、当該試料と反応させる方法が挙げられる。
【００５２】
上記（２）の方法は、βＧを含む試料とＡＬとを反応させる際に、ＡＬの酵素反応を引き起こさない濃度以下しかβＧ類を含有しないポリミキシン類（「本発明のポリミキシン類」）が、所定濃度存在していれば良いというものである。具体的には、例えばβＧを含む試料と、ＡＬ又はＡＬ溶液と、本発明のポリミキシン類又はその溶液を混合し、その後、上記（１）の方法と同様の、自体公知のＡＬを用いるＬＡＬ法等によりβＧの測定を実施する方法等が挙げられる。
【００５３】
上記（２）の方法で用いられるＡＬの具体例は、前記したとおりである。
【００５４】
βＧ測定用ＡＬ試薬を、βＧを含有する試料と反応させた際のポリミキシン類の反応液中の濃度としては、０.０１〜４０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０.１〜４０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０.２〜１０ｍｇ／ｍＬ、更に好ましくは０.５〜２ｍｇ／ｍＬである。
【００５５】
自体公知のＡＬを用いるＬＡＬ法としては、例えば試料を本発明のβＧ測定用ＡＬ試薬と反応させ、その結果生ずる酵素活性化反応により活性化された酵素の活性を測定するか、又はその結果生ずるゲル化反応に基づく反応液の、濁度の変化の程度やゲル化状態の程度を機器又は目視により測定し、その測定結果に基づいてＥＴの測定を行う、いわゆるＬＡＬ法等の常法が挙げられる。
【００５６】
通常良く用いられる手法としては、例えば、ＦＤＡガイドライン（Guidelines on Validation of the Limulus Amoebocyte Lysate Test as an End-Product Endotoxin Test for Human and Animal Parenteral Drugs, Biologics and Medical Devices, Food and Drug Adm. (1987)）に記載されている合成基質法、比濁時間分析法、ゲル化転倒法等が挙げられる。
【００５７】
即ち、合成基質法はＡＬの活性化に伴って活性化される酵素（例えばプロテアーゼ等）の活性を、合成基質を用いて測定する方法（Nakamura, S. et al., J. Biochem., 81, 1567-1569 (1977)）であり、比濁時間分析法は、例えばトキシノメーターＭＴ−５５００、トキシノメーターＥＴ−２０１（和光純薬工業(株)製）、トキシノメーターＭＴ−２５１（和光純薬工業(株)製）、ＬＡＬ−５０００［ＡＣＣ（Associates of Cape Cod社製］、マイクロプレートリーダーTmax（モレキュラーデバイス社製）等の専用装置を用い、βＧとＡＬとを混合した後、透過光量がある一定の割合だけ変化するまでの時間（ゲル化時間）を測定することによる方法（Oishi, H. et al., J. Parenter. Sci. Techn. 39, 194-200 (1985)）であり、ゲル化転倒法はＡＬの活性化によって形成されるゲルの生成の有無を目視によって判定する方法（Cooper, J. F. et al., J. Lab. clin. Med., 78, 138-148 (1971)）である。また、凝固に伴って生ずる濁度を測定する比濁法（Bondar, R. J. L. et al., Biomedical Applications of the Horseshoe Crab (ed. Cohan, E.), 435-451, Alan R. Liss, Inc. New York (1979)）も挙げられる。
【００５８】
また、βＧとＡＬとを混合して反応を開始させ、その結果生じるゲル化反応に基づく吸光度変化量が一定の値に到達するまでに要する時間（到達時間）を求め、この値を、到達時間とＥＴ濃度との関係を表す検量線に当てはめることにより行ってもよい。
【００５９】
本発明に係るβＧの測定方法を更に具体的に述べれば例えば以下の如くである。
【００６０】
ａ)合成基質法
試料と本発明のβＧ測定用ＡＬ試薬とを、これらを混合した結果活性化される酵素の作用によりその一部が切断されて発色物質を遊離するような基質（合成基質）の存在下で混合した後、２５〜４０℃保温下に所定時間反応させる。その後、反応液に反応停止液（例えば塩酸溶液、酢酸溶液等）を添加して反応を停止させ、得られた最終溶液の所定の吸光度（或は蛍光強度）を適当な測定機器（例えば分光光度計、マイクロプレートリーダー、蛍光光度計等）を使用して測定する。得られた測定値を、濃度既知のβＧ溶液を使用して予め作成しておいたβＧ濃度と該測定値との関係を表す検量線に当てはめ、試料中のβＧ濃度を求める。
【００６１】
ｂ)比濁時間分析法
先ず、本発明のβＧ測定用ＡＬ試薬と、βＧを含有する試料とを混合し、該混合液に光を照射する。次いで、適当な測定機器（例えば分光光度計、マイクロプレートリーダー等）を使用して該混合液についての例えば透過率の変化、吸光度の変化、透過光量比Ｒtの変動、透過光量比Ｒtの対数値の変動等の光学的変化が、光照射開始後に所定の値に到達するまでに要する時間（ゲル化時間、Ｔｇ）を測定する。得られた当該時間を、濃度既知のβＧ溶液を使用して予め作成しておいたゲル化時間とβＧ濃度との関係を表す検量線に当てはめ、試料中のβＧ濃度を求める。
【００６２】
ｃ)ゲル化転倒法
１０×７５ｍｍの試験管中で、試料と本発明のβＧ測定用ＡＬ試薬とを混合した後、２５〜４０℃保温下に６０分間反応させる。その後、これを１８０℃転倒させ、ゲルの形成の有無を目視によって判定する。
【００６３】
また、ＬＡＬ法によるＥＴ測定用の市販されたキットを用いて測定を行っても良い。
【００６４】
また、ＬＡＬ法の手法は、通常用いられる方法であれば特に限定されることなく使用可能である。
【００６５】
これら自体公知の測定法に於いて用いられるその他の試薬類としては、例えば３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ドーパ），合成基質等の測定する酵素の基質、共役酵素、補酵素等、要すれば、緩衝剤、発色剤、例えば２価の金属イオン（Ｃａ2+、Ｍｇ2+等）等の賦活剤、安定化剤、界面活性剤等、目的とする酵素活性の測定法として自体公知の方法に於いて使用される試薬類等が挙げられる。
【００６６】
これら自体公知の測定法に於ける反応ｐＨとしては、測定方法や測定する酵素の種類等によって異なるが、通常ｐＨ４〜１１、好ましくはｐＨ６〜９である。また、この反応ｐＨを維持するため緩衝剤を使用しても良く、緩衝剤としては反応に影響を与えないものであれば、種類，使用濃度ともに特に制限されず、例えばリン酸塩，ホウ酸塩，酢酸塩，トリス緩衝剤，グッドの緩衝剤等が挙げられる。
【００６７】
また、反応温度及び反応時間については、反応が進行する温度，時間であれば特に制限されず、反応温度としては、通常０〜５０℃、好ましくは４〜３０℃、反応時間としては、通常１秒〜２０時間、好ましくは１０秒〜２時間の範囲から適宜選択される。
【００６８】
本発明に係る試料としては、例えば血漿、血清、尿、リンパ、髄液、胸水、腹水等の臨床検体、医薬品、医療用具、食品等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６９】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００７０】
実施例１．硫酸ポリミキシンB溶液のβ-グルカン除去−１
〔各試薬の調製〕
（１）ポリミキシンＢ（以下、「ＰｘＢ」と略記する。）水溶液
硫酸ポリミキシンＢ(和光純薬工業(株)製、生化学用試薬)を、エンドトキシンフリーの注射用蒸留水(大塚製薬(株)製)に溶解させたものを調製し、１Ｗ／Ｖ％ ＰｘＢ水溶液２００ｍＬを得た。
（２）βＧ標準液
カードラン（和光純薬工業（株）製）１０ｍｇを０.１Ｎ水酸化ナトリウム溶液１０ｍＬに溶解したものをβＧ原液とした。使用にあたっては、該βＧ原液を注射用蒸留水で希釈して、βＧ標準液とした。
尚、使用したカードランは、ＬＡＬを用いた測定によって、カードラン１ｎｇ＝(１→３)−β−Ｄ−グルカン１１ｐｇに相当することを確認した。
（３）ＡＬ溶液
ＡＬの凍結乾燥品（カブトガニ血球抽出物ＨＳ−Ｊ、和光純薬工業(株)販売、ゲル化感度：０.０３ＥＵ／ｍＬ、５.２ｍＬ用）を注射用蒸留水５.２ｍＬで溶解したものを調製し、ＡＬ溶液とした。
【００７１】
〔ＡＬ試薬の調製〕
ＡＬ溶液が１２.５Ｖ／Ｖ％、t-ブチルオキシカルボニル-Thr-Gly-Arg-p-ニトロアニリン（Ｂoc-Thr-Gly-Arg-pNA）が０.４ｍＭ 、ＭｇＳＯ４が１００ｍＭとなるように、１００ｍＭのTris-HCl pH８.０に溶解させたものを調製し、ＡＬ試薬とした。
【００７２】
〔濾過用材料〕
（１）ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオリド）膜
マイレクスＶＶ(ミリポア社製、シリンジ加圧式フィルターユニット、孔径０.１μｍ、φ３３ｍｍ、フィルター材質・ＰＶＤＦ、γ線滅菌済)。
（２）限外濾過膜
バイオマックス１０（Ｂｉｏｍａｘ１０、ミリポア社商品名、ＰＢＧＣ限外濾過ディスク、ＮＭＷＬ10,000 、φ４７ｍｍ、フィルター材質・ポリエーテルスルホン）。
（３）正電荷を持った膜
ゼータポア膜(ゼータポアディスク、キュノ(株)商品名、孔径０.６５μｍ、φ４７ｍｍ)。
【００７３】
〔ＰｘＢ水溶液の粗精製〕
１Ｗ／Ｖ％ ＰｘＢ水溶液２００ｍＬをマイレクスVVで加圧濾過し濾液を得た。得られた濾液をバイオマックス１０で加圧下に限外濾過した。得られた濾液を更にゼータポア膜で吸引濾過した。各濾過処理毎に得られた濾液を２ｍＬずつサンプリングし、各濾液中のＰｘＢ濃度の測定とβＧ濃度の測定を行った。
【００７４】
〔ＰｘＢ濃度の測定〕
分光光度計ＵＶｍｉｎｉ−１２４０（（株）島津製作所製）を用い、各濾液の２５６ｎｍにおける吸光度を測定した。
１Ｗ／Ｖ％ ＰｘＢ水溶液中のＰｘＢ濃度を１０ｍｇ／ｍＬとして、該水溶液を用いて２５６ｎｍの吸光度を測定して得られた値をもとに、サンプリングした各濾液中のＰｘＢ濃度を算出した。
【００７５】
〔βＧ濃度の測定〕
各濾液中のβＧ濃度を、下記の方法によるエンドポイント合成基質法で測定した。
まず、マイクロプレート（Costar 3595、コーニング社製）に濾液５０μＬを添加後、ＡＬ試薬を５０μＬ添加した。３７℃で３０min反応させた後、０.０４％ ＮａＮＯ２（０.９Ｍ HCl）５０μＬ、０.３Ｗ／Ｖ％ アミド硫酸アンモニウム溶液５０μＬ、０.０７Ｗ／Ｖ％ N-１-ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩５０μＬを加えて混合した。
その後、スペクトラマックス２５０（モレキュラーデバイス社製）を用い、５４５ｎｍ−６３０ｎｍでの吸光度を測定した。
更に、βＧ標準液を用いて濃度既知のβＧ溶液を調製し、これを用いて同様の測定を行い、βＧ濃度と吸光度との関係を表す検量線を作成した。この検量線に基づいて、得られた各濾液中のβＧの濃度を算出した。
【００７６】
〔結果〕
１Ｗ／Ｖ％ ＰＸＢ水溶液及び各濾液中の、ＰｘＢ濃度測定結果とβＧ濃度測定結果を表１に示す。
尚、βＧ濃度は、ＰｘＢ １ｇ当たりのβＧ含量で示す。
【００７７】
【表１】
2007240397.tif 000002
【００７８】
表１の結果から明らかな如く、０.１μｍＰＶＤＦ膜による濾過処理では、ＰｘＢ中に混入するβＧ類をわずかしか除去することが出来なかった。NMWL 10,000の限外濾過膜による濾過処理でも、ＰｘＢ中のβＧ類をわずかしか除去することは出来なかった。
【００７９】
一方、０.６５μｍゼータポア膜（正電荷を持った膜）で濾過処理を行った場合には、ＰｘＢ中のβＧ濃度は1/100以下に低下している。即ち、孔径０.１μｍのＰＶＤＦ膜、NMWL 10,000の限外濾過膜での濾過処理後に、孔径０.６５μｍという大孔径のゼータポア膜で濾過処理を行ったにもかかわらず、ＰｘＢ中のβＧ類は効率的に除去されていることが判る。一方、溶液中のＰｘＢ濃度はゼータポア膜による濾過処理によっても全く変化していないことから、ＰｘＢのゼータポア膜への吸着も無いことが判る。
【００８０】
以上のことから、正電荷を持った膜での処理はβＧ類除去に有効であることは明らかである。
【００８１】
実施例２．ＰｘＢ溶液中のβ-グルカン除去−２
〔試薬の調製〕
（１）ＰｘＢ水溶液
硫酸ポリミキシンＢ(Ｂ社製、日本薬局方硫酸ポリミキシンＢ)を、エンドトキシンフリーの注射用蒸留水(大塚製薬(株)製)に溶解させたものを調製し、１Ｗ／Ｖ％ ＰｘＢ水溶液２００ｍＬを得た。
（２）βＧ標準液
実施例１で使用したものと同じ。
（３）ＡＬ溶液
実施例１で使用したものと同じ。
【００８２】
〔ＡＬ試薬の調製〕
実施例１と同じ方法で、ＡＬ試薬を調製した。
【００８３】
〔濾過用材料〕
（１）活性炭
クロマトグラフ用（和光純薬工業（株）製）。
（２）正電荷を持った膜
ゼータポア膜(ゼータポアディスク、キュノ(株)商品名、孔径０.２μｍ、φ４７ｍｍ)。
（３）限外濾過膜
バイオマックス５（Ｂｉｏｍａｘ５、ミリポア社商品名、PBCC限外濾過ディスク、5,000 ＮＭＷＬ、φ４７ｍｍ、フィルター材質・ポリエーテルスルホン）。
【００８４】
〔ＰｘＢ水溶液の粗精製〕
活性炭２ｇを５００ｍＬ容三角フラスコに入れ、２６０℃で３時間乾熱滅菌した。次いで１Ｗ／Ｖ％ＰｘＢ水溶液２００ｍＬを添加し、一晩攪拌した。遠心分離(３,０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ)を行い、上清を回収して活性炭を除去した。得られた上清をゼータポア膜で吸引濾過した後、濾液を更にバイオマックス５で加圧下に限外濾過した。各濾過処理毎に得られた濾液を２ｍＬずつサンプリングし、実施例１と同様の操作で、各濾液中のＰｘＢ濃度の測定とβＧ濃度の測定を行った。
【００８５】
〔ＰｘＢ濃度の測定〕
実施例１と同様の操作法で行った。
【００８６】
〔βＧ濃度の測定〕
実施例１と同様の操作法で行った。
【００８７】
〔結果〕
１Ｗ／Ｖ％ ＰＸＢ水溶液及び各濾液中の、ＰｘＢ濃度測定結果とβＧ濃度測定結果を表２に示す。
尚、βＧ濃度は、ＰｘＢ １ｇ当たりのβＧ含量で示す。
【００８８】
【表２】
2007240397.tif 000003
【００８９】
表２の結果から明らかな如く、実施例１とは異なるメーカーのＰｘＢ製品についてβＧ類の汚染を調べた結果、やはりβＧ類で汚染されていることが判る。
【００９０】
また、従来の活性炭を用いてＰｘＢ水溶液を処理する方法では、ＰｘＢが活性炭へ吸着してしまうので、ＰｘＢのロスが大きいことが判る。更に活性炭処理により溶液中のβＧ濃度は低下するものの、除去は不十分であった。
【００９１】
一方、ゼータポア膜（正電荷を持った膜）及び限外濾過膜で濾過処理を行った場合には、ＰｘＢの膜への吸着が殆どなく、濾過処理によるＰｘＢのロスが殆どないことが判った。
【００９２】
更に、正電荷を持った膜と限外濾過膜による濾過処理を組み合わせることで、活性炭処理では除去できなかった、ＰｘＢ水溶液中のβＧ類をほとんど完全に除去することが可能であることが判る。
【００９３】
実施例３．ＡＬとβＧ、あるいはＡＬとＥＴとの反応に対するＰｘＢの影響（エンドポイント合成基質法）
〔試薬の調製〕
（１）ＰｘＢ水溶液
実施例２で使用したものと同じ。
（２）ＰｘＢ試液
実施例２の、各処理段階でサンプリングした、活性炭処理して得られた上清又は濾液を使用した。
（３）βＧ試料
カードラン（和光純薬工業（株）製）１０ｍｇを０.１Ｎ水酸化ナトリウム溶液１０ｍＬに溶解したものをβＧ原液とした。これを、注射用蒸留水で希釈し、１１ｐｇ／ｍＬのβＧ試料を調製した。
（４）エンドトキシン試料（以下「ＥＴ試料」と記載する。）
Escherichia coli 0111:B4由来の精製リポポリサッカライド(和光純薬工業(株)製)を、注射用蒸留水で溶解希釈し、２ｎｇ／ｍＬのＥＴ試料を調製した。
（５）ＡＬ溶液
実施例１で使用したものと同じ。
【００９４】
〔ＡＬ試薬の調製〕
ＡＬ溶液が１２.５Ｖ／Ｖ％、Ｂoc-Thr-Gly-Arg-pNAが０.４ｍＭ 、ＭｇＳＯ４が１００ｍＭとなるように、そしてＰｘＢ水溶液、ＰｘＢ試液又は注射用蒸留水を、ＰｘＢ濃度が４００ｎｇ／ｍＬ〜１.２ｍｇ／ｍＬ又は０となるように１００ｍＭのTris-HCl pH８.０に溶解させたものを調製し、ＡＬ試薬とした。
【００９５】
〔βＧ及びＥＴに対するＡＬ試薬の反応性試験〕
βＧ及びＥＴに対するＰｘＢを含有するＡＬ試薬の反応性を、下記の方法によるエンドポイント合成基質法で測定した。
【００９６】
まず、マイクロプレート（Costar 3595、コーニング社製）に１１ｐｇ／ｍＬのβＧ試料あるいは２ｎｇ／ｍＬのＥＴ試料５０μＬを添加した後、ＡＬ試薬５０μＬを添加した。３７℃で３０min反応させた後、０.０４％ ＮａＮＯ２（０.９Ｍ HCl）５０μＬ、０.３Ｗ／Ｖ％ アミド硫酸アンモニウム５０μＬ、０.０７Ｗ／Ｖ％ N-１-ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩５０μＬを加えて混合した。
【００９７】
１１ｐｇ／ｍＬのβＧ試料を添加した場合の、ＡＬ試薬との反応時のβＧの終濃度は５.５ｐｇ／ｍＬ である。また、２ｎｇ／ｍＬのＥＴ試料を添加した場合の、ＡＬ試薬との反応時のＥＴの終濃度は１ｎｇ／ｍＬ ＥＴである。
【００９８】
その後、スペクトラマックス２５０（モレキュラーデバイス社製）を用い、各溶液の５４５nm−６３０nmでの吸光度を測定した。
【００９９】
対照として、βＧ試料又はＥＴ試料の代わりに、ＥＴおよびβＧフリーの注射用蒸留水を用いて、同様に操作し、エンドポイント合成基質法により５４５ｎｍ−６３０ｎｍでの吸光度を測定した、
【０１００】
〔結果〕
結果を図１〜図４に夫々示す。図１は、濾過処理する前の１Ｗ／Ｖ％ＰｘＢ水溶液、図２は１Ｗ／Ｖ％ＰｘＢ水溶液を活性炭処理して得られた上清（ＰｘＢ溶液）、図３はその上清を更にゼータポア膜で吸引濾過して得られた濾液（ＰｘＢ溶液）、図４はその濾液を更にバイオマックス５で加圧下に限外濾過して得られた濾液（ＰｘＢ溶液）を夫々ＰｘＢ試液として用いて得られた結果を夫々示す。
【０１０１】
また、図１〜図４に於いて、−●−はβＧ試料、−▲−はＥＴ試料を用いた場合の結果を夫々示す。また、−◆−は、注射用蒸留水を用いた場合（対照）の結果を示す。
【０１０２】
尚、図１〜図４の横軸のＰｘＢ濃度は、ＡＬ試薬とＥＴ試料、βＧ試料又は対照（注射用蒸留水）とを反応させた際の反応液中のＰｘＢ濃度を示している。従って、使用したＡＬ試薬中のＰｘＢの濃度は、横軸のＰｘＢ濃度の二倍の濃度である。
【０１０３】
図１の結果から明らかなように、何も処理をしていない（濾過処理する前の）ＰｘＢ水溶液を用いて調製したＡＬ試薬をＥＴ試料と反応させた場合（反応時のＥＴ含有量は１ｎｇ／ｍＬ）には、反応時のＰｘＢの濃度が２μｇ（２×１０−６ｇ）/ｍＬの場合に吸光度がほとんど測定されなかったことから、反応時のＥＴ濃度が１ｎｇ／ｍＬ程度であれば、この濃度のＰｘＢが存在するとＡＬとＥＴとの反応が抑制された。
【０１０４】
しかし、さらにＡＬ試薬中のＰｘＢの添加量を増すに従い（反応時のＰｘＢ濃度が増すに従い）、再び吸光度が上昇している。また、対照（注射用蒸留水）とＡＬ試薬との反応性を試験した場合にも、吸光度が上昇しており（−◆−）、ＥＴもβＧも含有しない試料とＡＬ試薬を反応させたにもかかわらず、ＡＬ試薬が反応してしまっていることから、ＰｘＢの濃度が上がるに連れ、測定のバックグラウンドが上昇してしまっていることがわかる(図１)。
【０１０５】
これらの原因は、ＰｘＢ水溶液中にはβＧ類が共存しており、ＡＬ試薬中のＰｘＢの濃度が増すに従い、ＰｘＢ中のβＧ類の濃度も上昇し、そのβＧ類が、ＡＬと反応したためであると考えられる。例えば、表２より、１Ｗ／Ｖ％ ＰｘＢ水溶液中のβＧ濃度は70,000ｐｇ/ｇ ＰｘＢである。すると、AL試薬中のＰｘＢ濃度が４μｇ[反応時のＰｘＢ濃度が２μg（２×１０−６ｇ）/ｍＬ]の場合、ＡＬ試薬中のＰｘＢ溶液由来のβＧの量は０.２８ｐｇ／ｍＬ（反応時は０.１４ｐｇ/ｍＬ）であり、今回使用したＡＬ試薬であれば、この程度の濃度であれば反応していないが、ＡＬ試薬中のＰｘＢ濃度が１２μｇ／ｍＬ（反応時は６μｇ／ｍＬ）の場合、即ちＡＬ試薬中のＰｘＢ溶液由来のβＧ濃度が０.８４ｐｇ／ｍＬ（反応時は０.４２ｐｇ／ｍＬ）では、ＡＬ試薬との反応が起こっており、偽陽性と判定される可能性があることが判る。
【０１０６】
例えば臨床診断に用いられる試料には、数１０ｎｇ／ｍＬ程度の濃度のＥＴを含有しているものもある。そのような、どのくらいの量のＥＴを含有しているのか不明な臨床試料であっても、含有するＥＴ活性を十分に抑制するためには、より高濃度のＰｘＢをＡＬ試薬中に共存させておくことが望ましい。そのためには、ＡＬ試薬中にＰｘＢを少なくとも２００μｇ／ｍＬ以上（反応時には１００μｇ／ｍＬ以上）、好ましくは４００μｇ／ｍＬ以上（反応時には２００μｇ／ｍＬ以上）含有させておくことが望ましい。しかし、図１から明らかな如く、何も処理していないＰｘＢ水溶液を用いて、ＰｘＢを４００μｇ／ｍＬ含有させたＡＬ試薬を調製し、そのＡＬ試薬とＥＴとの反応性を試験したところ（図１、−▲−）（反応時のＰｘＢ濃度は２００μｇ（２×１０−４ｇ）／ｍＬ）、ＥＴの活性を抑えることが出来なかった。またβＧを含有する試料について測定した場合にも（図１、−●−）、吸光度が上昇してしまっていることが判る。即ち、βＧ類の除去処理を行っていない４００μｇ／ｍＬのＰｘＢを含有するＡＬ試薬を用いた場合、特異的に試料中のβＧを測定することが困難になることが判る。
【０１０７】
一方、図１〜図４を比較すると、活性炭処理、次いでゼータポア膜濾過処理、更に限外濾過処理を加えたＰｘＢ溶液を用いて調製したＡＬ試薬を用いた場合、高濃度のＰｘＢをＡＬ試薬に加えた場合でも、ＡＬとＥＴ、及びＡＬと対照（注射用蒸留水）との反応性上昇が処理段階毎に徐々に抑制されることがわかる。これは、ＰｘＢ水溶液に順次処理を加えていくに従い、ＰｘＢ中に共存していたβＧ類が効果的に除去されていったため、この処理液を用いて調製したＡＬ試薬中に共存するβＧ類の量が結果的に減少し、測定のバックグラウンド値の上昇が抑制されたためであるであると考えられる。
【０１０８】
特に、図４より明らかな如く、活性炭処理→ゼータポア膜濾過→限外濾過の全ての処理を行ったＰｘＢ溶液を用いて調製したＡＬ試薬と、ＥＴとの反応性を試験した結果、ＡＬ試薬中のＰｘＢ濃度が２ｍｇ／ｍＬ[反応時のＰｘＢ濃度が１ｍｇ（１×１０−3ｇ）/ｍＬ]以上になっても、ＥＴの活性を抑えることができ、且つバックグラウンドの上昇も見られない。表２より、限外濾過処理濾液中のβＧ濃度は＜５５ｐｇ／g ＰｘＢなので、ＡＬ試薬中のＰｘＢ濃度が４００μg／ｍＬ[反応時のＰｘＢ濃度が２００μg（２×１０−4ｇ）／ｍＬ]の場合、ＰｘＢ溶液由来のβＧの量は＜０.０２２ｐｇ/ｍＬ（反応時は＜０.０１１ｐｇ／ｍＬ）、更にAL試薬中のＰｘＢ濃度が２ｍｇ／ｍＬ[反応時のＰｘＢ濃度が１ｍｇ（１×１０−3ｇ）/ｍＬ]の場合、ＰｘＢ溶液由来のβＧの量は＜０.１１ｐｇ／ｍＬ（反応時は＜０.０５５ｐｇ／ｍＬ）である。即ち、活性炭処理→ゼータポア膜濾過→限外濾過の全ての処理を行ったＰｘＢ溶液を用いて、ＰｘＢを含有するＡＬ試薬を調製した場合には、ＰｘＢ溶液由来のβＧ類の量が少ないために、２ｍｇ／ｍＬという、高濃度のＰｘＢをALに共存させることができることが推察される。
【０１０９】
また、活性炭処理→ゼータポア膜濾過→限外濾過の全ての処理を行ったＰｘＢ溶液を用いて調製したＡＬ試薬について、注射用蒸留水との反応性（試薬盲検値）を試験した結果（図４、−◆−）、ＡＬ試薬中のＰｘＢ濃度が２ｍｇ／ｍＬの高濃度になっても（測定時のＰｘＢ濃度は１ｍｇ／ｍＬ）、吸光度ほとんど０であり、測定のバックグラウンド値の上昇を十分抑制することができた。すなわち、ＰｘＢを予め精製処理することで、高濃度のＰｘＢを添加しても、ＰｘＢ溶液中のβＧ類によってＡＬが活性化される危険性がなくなることが判る。
【０１１０】
また、図１から明らかな如く、何も処理していないＰｘＢ水溶液を用いて調製したＡＬ試薬は、試薬中のＰｘＢの濃度を上げていくに従い、βＧとの反応性も上昇してしまった（図１、−●−）。これは、ＡＬ試薬中に含有するβＧ類の濃度が上昇したために、見かけ上βＧとＡＬ試薬との反応性が上昇したためであり、このＡＬ試薬を用いた場合には、βＧ濃度を高精度に測定することが困難であることが示唆される。しかし、ＰｘＢ水溶液を順次精製処理したものを用いて調製したＡＬ試薬は、そのＰｘＢ水溶液の処理段階を経るに従い、ＥＴとの反応性だけでなく、βＧの濃度に無関係な反応性上昇が抑制されていくことが判る。特に図４の場合には、βＧを含有する試料とＡＬ試薬との反応性を試験した結果（図４、−●−）、ＡＬ中のＰｘＢ濃度が高くなっても吸光度が一定となったことから、ＡＬとβＧとの反応性はＰｘＢ濃度により影響を受けないことが判る。
【０１１１】
以上の結果から、βＧを含まないＰｘＢをＡＬに共存させることにより、測定対象の試料中に共存するＥＴ活性のみを抑制し、βＧを特異的に測定することができるようになることがわかる。
【０１１２】
実施例４．βＧ汚染を除去したＰｘＢを用いて調製したＡＬ試薬の、ＥＴ及びβＧに対する反応性試験（エンドポイント合成基質法）
〔試薬の調製〕
（１）ＰｘＢ試液
実施例２で得られた限外濾過処理濾液（活性炭処理→ゼータポア膜濾過→限外濾過処理を行ったもの。）を使用した。
（２）βＧ試料
カードラン（和光純薬工業（株）製）１０ｍｇを０.１Ｎ水酸化ナトリウム溶液１０ｍＬに溶解したものをβＧ原液とした。これを注射用蒸留水で希釈し、０.００９２ｐｇ／ｍＬ〜９２ｐｇ／ｍＬのβＧ試料を調製した。
（３）ＥＴ試料
Escherichia coli 0111:B4由来の精製リポポリサッカライド(和光純薬工業(株)製)を、注射用蒸留水で溶解希釈し、０.０６ｐｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬのＥＴ試料を調製した。
（４）ＡＬ溶液
実施例１で使用したものと同じ。
【０１１３】
〔本発明のＡＬ試薬の調製〕
ＡＬ溶液が１２.５Ｖ／Ｖ％、Ｂoc-Thr-Gly-Arg-pNAが０.４ｍＭ 、ＭｇＳＯ４が１００ｍＭ、及びＰｘＢ試液を用いてＰｘＢ濃度が２ｍｇ／ｍＬとなるように１００ｍMのTris-HCl pH８.０に溶解させたものを調製し、２ｍｇ／ｍＬのＰｘＢを含有する本発明のＡＬ試薬を得た。表２より、限外濾過処理濾液中のβＧ濃度は＜５５ｐｇ／ｇＰｘＢなので、このＡＬ試薬中のβＧ濃度は、＜０.１１ｐｇ／ｍＬである。
【０１１４】
〔ＰｘＢを含有しないＡＬ試薬の調製〕
ＰｘＢ試液の代わりに注射用蒸留水を用いた以外は、本発明のＡＬ試薬と同じ試薬を用いて、ＰｘＢを含有しないＡＬ試薬を調製した。
【０１１５】
〔βＧ及びＥＴに対するＡＬ試薬の反応性試験〕
βＧ及びＥＴに対するＰｘＢを含有するＡＬ試薬の反応性を、下記の方法によるエンドポイント合成基質法で測定した。
【０１１６】
まず、マイクロプレート（Costar 3595、コーニング社製）にβＧ試料、ＥＴ試料、あるいは注射用蒸留水（対照）５０μＬを添加した後、本発明のＡＬ試薬５０μＬを添加し、３７℃で３０min反応させた。この際の反応液中のＰｘＢ濃度は１ｍｇ／ｍｌである。反応時間経過後、０.０４％ ＮａＮＯ２（０.９Ｍ HCl）５０μＬ、０.３Ｗ／Ｖ％ アミド硫酸アンモニウム５０μＬ、０.０７Ｗ／Ｖ％ N-１-ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩５０μＬを加えて混合した。
【０１１７】
その後、スペクトラマックス２５０（モレキュラーデバイス社製）を用い、５４５nm−６３０nmでの吸光度を測定した。
【０１１８】
別に、本発明のＡＬ試薬の代わりにＰｘＢを含有しないＡＬ試薬を用いて同様にβＧ試料、ＥＴ試料に対する反応性試験を行った。
【０１１９】
[結果]
結果を図５及び図６に示す。図５はＡＬ試薬のＥＴに対する反応性（ＥＴ感受性）、図６はＡＬ試薬のβＧに対する反応性（βＧ感受性）を試験した結果である。また、図５及び図６に於いて、−●−は１ｍｇ／ｍＬのＰｘＢ共存下（２ｍｇ／ｍＬのＰｘＢを含む本発明のＡＬ試薬を用いた場合）、−◆−はＰｘＢ非共存下（ＰｘＢを含有しないＡＬ試薬を用いた場合）の結果を夫々示す。
【０１２０】
尚、図５及び図６の横軸のＥＴ濃度及びβＧ濃度は、ＡＬ試薬との反応時の反応液中のＥＴ濃度及びβＧ濃度を夫々示す。
【０１２１】
図５より明らかな如く、ＰｘＢ非共存下（−◆−）ではＡＬはＥＴに対し、ＥＴの濃度依存的に反応する。これに対し、１ｍｇ／ｍＬのＰｘＢ共存下（２ｍｇ／ｍＬのＰｘＢを含有する本発明のＡＬ試薬を用いた場合（−●−）は１００ｎｇ（１０−７ｇ／ｍＬ）の濃度のＥＴが存在しても、ＥＴとは全く反応していない。
【０１２２】
一方、図６から明らかな如く、ＰｘＢが共存するか否かにかかわらず、ＡＬのβＧに対する反応性（感受性）は同等になっており、本発明に係るＰｘＢはＡＬとβＧとの反応に影響を与えないことが判る。
【０１２３】
以上のことから、本発明のＡＬ試薬を用いて、エンドポイント合成基質法によるβＧの測定を行えば、試料中のＥＴ活性を抑制して、βＧを特異的に測定することができることが判る。
【０１２４】
また、本発明の方法で処理したポリミキシンをＡＬ試薬中に含有させた場合には、２ｍｇ／ｍＬという高濃度のＰｘＢを含有させることができるので、あらゆる濃度のＥＴを含有する臨床試料について、十分にＥＴ活性を抑制することができるような、βＧに特異的なＡＬ試薬を提供することができることが判る。
【０１２５】
実施例５．βＧ汚染を除去したＰｘＢを用いて調製したＡＬ試薬の、ＥＴ及びβＧに対する反応性試験（比濁時間分析法）
〔試薬の調製〕
（１）ＰｘＢ試液
実施例２で得られた限外濾過処理濾液（活性炭処理→ゼータポア膜濾過→限外濾過処理を行ったもの）を用いた。
（２）βＧ試料
実施例１で使用したものと同じβＧ原液を、注射用蒸留水で希釈し、０.０９２ｐｇ／ｍＬ〜２７５０ｐｇ／ｍＬのβＧ試料を調製した。
（３）ＥＴ試料
実施例３で使用したものと同じＥＴ試料を、注射用蒸留水で希釈し、０.２ｐｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬのＥＴ試料を調製した。
（４）ＡＬ溶液
実施例１で使用したものと同じ。
【０１２６】
〔本発明のＡＬ試薬の調製〕
ＡＬの凍結乾燥品（カブトガニ血球抽出物ＨＳ−Ｊ、和光純薬工業(株)販売、ゲル化感度：０.０３ ＥＵ／ｍＬ、５.２ｍＬ用）を２ｍｇ／ｍＬのＰｘＢ溶液５.２ｍＬで溶解し２ｍｇ／ｍＬのＰｘＢを含有する本発明のＡＬ試薬を得た。表２より、限外濾過処理濾液中のβＧ濃度は＜５５ｐｇ／ｍＬなので、このＡＬ試薬中のβＧ濃度は、＜０.１１ｐｇ／ｍＬである。
【０１２７】
〔ＰｘＢを含有しないＡＬ試薬の調製〕
ＡＬの凍結乾燥品（カブトガニ血球抽出物ＨＳ−Ｊ、和光純薬工業(株)販売、ゲル化感度：０.０３ ＥＵ／ｍＬ、５.２ｍＬ用）を注射用蒸留水５.２ｍＬで溶解し、ＰｘＢを含有しないＡＬ試薬を得た。
【０１２８】
〔βＧ試料及びＥＴ試料に対するＡＬ試薬の反応性試験〕
βＧ及びＥＴに対するＰｘＢを含有するＡＬ試薬の反応性を、下記の方法による比濁時間分析法で測定した。
【０１２９】
まず、反応用試験管に本発明のＡＬ試薬１００μＬを添加した。次いで、ＥＴ試料、βＧ試料、あるいは注射用蒸留水（対照） １００μＬを添加した。直ちにトキシノメーターＥＴ３０１にセットし比濁時間分析を行った。尚、分析時の反応液中のＰｘＢ濃度は、１ｍｇ／ｍＬである。
【０１３０】
別に、本発明のＡＬ試薬の代わりにＰｘＢを含まないＡＬ試薬を用いて同様に比濁時間分析を行った。
【０１３１】
[結果]
結果を図７及び図８に示す。
図７はＡＬ試薬のＥＴに対する反応性（ＥＴ感受性）、図８はＡＬ試薬のβＧに対する反応性（βＧ感受性）を試験した結果である。図７及び図８に於いて、−●−は１ｍｇ／ｍＬのＰｘＢ共存下（２ｍｇ／ｍＬのＰｘＢを含有する本発明のＡＬ試薬を用いた場合）、−◆−はＰｘＢ非共存下（ＰｘＢを含有しないＡＬ試薬を用いた場合）の結果を夫々示す。
【０１３２】
尚、図７及び図８の横軸のＥＴ濃度及びβＧ濃度は、ＡＬ試薬との反応時の反応液中のＥＴ濃度及びβＧ濃度を夫々示す。
また、比濁時間分析法では、比濁時間が短い方が、ＡＬの反応が起きていることを示す。
【０１３３】
図７より明らかな如く、ＰｘＢ非共存下（−◆−）では、ＡＬはＥＴに対し、ＥＴ濃度１ｐｇ（１×１０−１２ｇ）／ｍＬ以上で、ＥＴの濃度依存的に反応する。これに対し、１ｍｇ／ｍＬのＰｘＢ共存下（２ｍｇ／ｍＬのＰｘＢを含む本発明のＡＬ試薬を用いた場合、−●−）では、ＥＴ濃度３０ｎｇ（３×１０−８ｇ）／ｍＬ以上でしか反応していない。すなわち、ＰｘＢを含有する本発明のＡＬ試薬のＥＴに対する反応性は、ＰｘＢを含有しないＡＬ試薬のＥＴに対する反応性のおよそ１／３００００である。
【０１３４】
一方、図８から明らかな如く、ＰｘＢが共存するか否かにかかわらず、ＡＬのβＧに対する反応性（感受性）は同等であり、ＰｘＢは比濁時間分析法によるＡＬとβＧとの反応に影響を与えないことが判る。
【０１３５】
以上のことから、本発明のＡＬ試薬を用いて、比濁時間分析法によるβＧの測定を行えば、試料中のＥＴ活性を抑制して、βＧを特異的に測定することができることが判る。
【０１３６】
比較例１．βＧ汚染を除去していないＰｘＢを用いて調製したＡＬ試薬の、ＥＴ及びβＧに対する反応性試験１（エンドポイント合成基質法）
〔試薬の調製〕
（１）ＰｘＢ試液
実施例１で得られたＰＶＤＦ膜濾過処理濾液（βＧ類汚染が除去されていない）を使用した。
（２）βＧ試料
カードラン（和光純薬工業（株）製）１０ｍｇを０.１Ｎ水酸化ナトリウム溶液１０ｍＬに溶解したものをβＧ原液とした。これを注射用蒸留水で希釈し、０.００９２ｐｇ／ｍＬ〜９２ｐｇ／ｍＬのβＧ試料を調製した。
（３）ＥＴ試料
Escherichia coli 0111:B4由来の精製リポポリサッカライド(和光純薬工業(株)製)を、注射用蒸留水で溶解希釈し、０.０６ｐｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬのＥＴ試料を調製した。
（４）ＡＬ溶液
実施例１で使用したものと同じ。
【０１３７】
〔ＰｘＢを含有するＡＬ試薬の調製〕
ＡＬ溶液が１２.５Ｖ／Ｖ％、Ｂoc-Thr-Gly-Arg-pNAが０.４ｍＭ 、ＭｇＳＯ４が１００ｍＭ、及びＰｘＢ試液を用いてＰｘＢ濃度が６μｇ／ｍＬとなるように溶解させた１００ｍMのTris-HCl pH８.０を調製し、ＰｘＢを含有するＡＬ試薬を得た。表１より、ＰＶＤＦ膜濾過処理濾液中のβＧ濃度は５３,９００ｐｇ／ｇ ＰｘＢなので、このＡＬ試薬中のβＧ濃度は０.３２３４ｐｇ／ｍＬである。
【０１３８】
〔ＰｘＢを含有しないＡＬ試薬の調製〕
ＰｘＢ試液の代わりに注射用蒸留水を用いた以外は、本発明のＡＬ試薬と同じ試薬を用いて、ＰｘＢを含有しないＡＬ試薬を調製した。
【０１３９】
〔βＧ及びＥＴに対するＡＬ試薬の反応性試験〕
βＧ及びＥＴに対するＰｘＢを含有するＡＬ試薬の反応性を、下記の方法によるエンドポイント合成基質法で測定した。
【０１４０】
まず、マイクロプレート（Costar 3595、コーニング社製）にβＧ試料、ＥＴ試料、あるいは注射用蒸留水（対照）５０μＬを添加した後、ＰｘＢを含有するＡＬ試薬５０μＬを添加し、３７℃で３０min反応させた。この際の反応液中のＰｘＢ濃度は３μｇ／ｍＬである。反応時間経過後、０.０４％ ＮａＮＯ２（０.９Ｍ HCl）５０μＬ、０.３Ｗ／Ｖ％ アミド硫酸アンモニウム溶液５０μＬ、０.０７Ｗ／Ｖ％ N-１-ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩５０μＬを加えて混合した。
【０１４１】
その後、スペクトラマックス２５０（モレキュラーデバイス社製）を用い、５４５ｎｍ−６３０ｎｍでの吸光度を測定した。
【０１４２】
別に、ＰｘＢを含有するＡＬ試薬の代わりにＰｘＢを含有しないＡＬ試薬を用いて、同様にβＧ試料、ＥＴ試料に対する反応性試験を行った。
【０１４３】
〔結果〕
結果を図９及び図１０に示す。図９はＡＬ試薬のＥＴに対する反応性（ＥＴ感受性）、図１０はＡＬ試薬のβＧに対する反応性（βＧ感受性）を試験した結果である。また、図９及び図１０に於いて、−●−は３μｇ／ｍＬのＰｘＢ共存下（６μｇ／ｍＬのＰｘＢを含有するＡＬ試薬を用いた場合）、−◆−はＰｘＢ非共存下（ＰｘＢを含有しないＡＬ試薬を用いた場合）で試験を行った結果を夫々示す。
【０１４４】
尚、図９及び図１０の横軸のＥＴ濃度及びβＧ濃度は、ＡＬ試薬との反応時の反応液中のＥＴ濃度及びβＧ濃度を夫々示す。
【０１４５】
図９より明らかな如く、ＰｘＢ非共存下（−◆−）ではＡＬはＥＴに対し、ＥＴの濃度依存的に反応する。これに対し、３μｇ／ｍＬのＰｘＢ共存下（−●−）ではＡＬとＥＴとの反応はＰｘＢ非共存下の場合と比べると抑制されてはいるものの、ＥＴの濃度が１ｎｇ（１×１０−９ｇ）／ｍＬになるとＡＬはＥＴと反応していることが判る。このことから、ＰＶＤＦ膜で濾過処理したＰｘＢ試液を用いて調製したＡＬ試薬を用いてＥとの反応性を試験した場合、３μｇ／ｍＬのＰｘＢ共存下では（反応時のＰｘＢ溶液由来のβＧ濃度は０.１６１７ｐｇ/ｍＬ）、ＰｘＢの添加量が不十分で、ＡＬとＥＴとの反応が十分に抑制されないことは明らかである。また、ＰｘＢ共存下の場合（−●−）、０.３ｎｇ（３×１０−１０ｇ）／ｍＬ以下のＥＴ濃度域では、ＰｘＢ存在下における吸光度が、ＰｘＢ非存在下の場合と比べて高くなっていることが判る。また、ＥＴ濃度が０の場合でも、ＰｘＢ ３μｇ／ｍＬ共存下では、ＰｘＢ非共存下に比較して吸光度が高くなっている。これは、ＰｘＢ中に混在するβＧ類がＡＬと反応したことによるものと考えられ、バックグラウンド値が高くなっていることを示している。
【０１４６】
また、図１０から明らかな如く、βＧ濃度が０.１ｐｇ（１０−１ｐｇ）／ｍＬより低くなると、βＧ濃度と吸光度との関係に直線性がなくなり、このような低濃度のβＧの定量が困難であることが判る。
【０１４７】
以上のことから明らかな如く、ＰｘＢ中に混在するβＧ類の除去が十分でないＰｘＢをＡＬ試薬に６μｇ／ｍＬ共存させると（反応時のＰｘＢは３μｇ／ｍＬ）、ＰｘＢ溶液由来のβＧ類が測定に影響を与え、０.１ｐｇ（１０−１ｐｇ）／ｍＬ以下のβＧの測定は不可能となる。また、３μｇ／ｍＬのＰｘＢ共存下では、２×１０−１０ｇ／ｍＬのＥＴ活性でさえ抑制することはできない。これらのことを勘案すれば、βＧ類の除去が十分でないＰｘＢを用いた場合、活性を十分に抑制できる量のＰｘＢをＡＬ試薬に共存させることができない。その当然の結果として、このようなＡＬ試薬を用いた場合には、ＡＬとＥＴとの反応を十分に抑制することができず、βＧ特異的な測定は行い得ないことが判る。
【０１４８】
比較例２．βＧ汚染を除去していないＰｘＢを用いて調製したＡＬ試薬の、ＥＴ及びβＧに対する反応性試験２（エンドポイント合成基質法）
〔試薬の調製〕
（１）ＰｘＢ試液
実施例１で得られたＰＶＤＦ膜濾過処理濾液（βＧ類汚染が除去されていない）を使用した。
（２）βＧ試料
カードラン（和光純薬工業（株）製）１０ｍｇを0.１Ｎ水酸化ナトリウム溶液１０ｍＬに溶解したものをβＧ原液とした。これを注射用蒸留水で希釈し、０.００９２ｐｇ／ｍＬ〜９２ｐｇ／ｍＬのβＧ試料を調製した。
（３）ＥＴ試料
Escherichia coli 0111:B4由来の精製リポポリサッカライド(和光純薬工業(株)製)を、注射用蒸留水で溶解希釈し、０.２ｐｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬのＥＴ試料を調製した。
（４）ＡＬ溶液
実施例１で使用したものと同じ。
【０１４９】
〔ＰｘＢを含有するＡＬ試薬の調製〕
ＡＬ溶液が１２.５Ｖ／Ｖ％、Ｂoc-Thr-Gly-Arg-pNAが０.４ｍＭ 、ＭｇＳＯ４が１００ｍＭ、及びＰｘＢ試液を用いてＰｘＢ濃度が２００μｇ／ｍＬとなるように溶解させた１００ｍMのTris-HCl pH８.０を調製し、２００μｇ／ｍＬのＰｘＢを含有するＡＬ試薬を得た。表１より、ＰＶＤＦ膜濾過処理濾液中のβＧ濃度は５３,９００ｐｇ／ｇＰｘＢなので、このＡＬ試薬中のβＧ濃度は、１０.７８ｐｇ／ｍＬである。
【０１５０】
〔ＰｘＢを含有しないＡＬ試薬の調製〕
ＰｘＢ試液の代わりに注射用蒸留水を用いた以外は、本発明のＡＬ試薬と同じ試薬を用いて、ＰｘＢを含有しないＡＬ試薬を調製した。
【０１５１】
〔βＧ及びＥＴに対するＡＬ試薬の反応性試験〕
βＧ及びＥＴに対するＰｘＢを含有するＡＬ試薬の反応性を、下記の方法によるエンドポイント合成基質法で測定した。
【０１５２】
まず、マイクロプレート（Costar 3595、コーニング社製）にβＧ試料、ＥＴ試料、あるいは注射用蒸留水（対照）５０μＬを添加した後、ＰｘＢを含有するＡＬ試薬５０μＬを添加し、３７℃で３０min反応させた。この際の反応液中のＰｘＢ濃度は１００μｇ／ｍＬである。反応時間経過後、０.０４％ ＮａＮＯ２（０.９Ｍ HCl）５０μＬ、０.３Ｗ／Ｖ％ アミド硫酸アンモニウム５０μＬ、０.０７Ｗ／Ｖ％ N-１-ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩５０μＬを加えて混合した。
【０１５３】
その後、スペクトラマックス２５０（モレキュラーデバイス社製）を用い、５４５ｎｍ−６３０ｎｍでの吸光度を測定した。
【０１５４】
別に、ＰｘＢを含有するＡＬ試薬の代わりに、ＰｘＢを含有しないＡＬ試薬を用いて同様にβＧ試料、ＥＴ試料に対する反応性試験を行った。
【０１５５】
〔結果〕
結果を図１１及び図１２に示す。図１１はＡＬ試薬のＥＴに対する反応性（ＥＴ感受性）、図１２はＡＬ試薬のβＧに対する反応性（βＧ感受性）を試験した結果である。図１１及び図１２に於いて、−●−は１００μｇ／ｍＬのＰｘＢ共存下（２００μｇ／ｍＬのＰｘＢを含有するＡＬ試薬を用いた場合）、−◆−はＰｘＢ非共存下（ＰｘＢを含有しないＡＬ試薬を用いた場合）で試験を行った結果を夫々示す。
【０１５６】
尚、図１１及び図１２の横軸のＥＴ濃度及びβＧ濃度は、ＡＬ試薬との反応時の反応液中のＥＴ濃度及びβＧ濃度を夫々示す。
【０１５７】
図１１より明らかな如く、ＰｘＢ非共存下（−◆−）ではＡＬはＥＴと、ＥＴの濃度依存的に反応する。  これに対し、１００μｇ／ｍＬのＰｘＢ共存下（−●−）では、ＥＴ濃度に関係なくＡＬは反応していることがわかる。
【０１５８】
また、図１２からも明らかなように、ＰｘＢ存在下（−●−）ではβＧが存在しなくても（βＧの濃度が０ｐｇ／ｍＬの場合でも）ＡＬが反応している。
【０１５９】
上で述べたように、ＥＴ濃度が様々な各種試料について行われる臨床診断のために用いることのできる、βＧ測定用のＡＬ試薬を調製するためには、少なくとも２００μｇ／ｍＬのＰｘＢをＡＬに共存させておくことが望ましい。しかしながら、ＰｘＢ中に混在するβＧ類の除去が十分でない場合には、ＰｘＢ中のβＧ類がＡＬと反応してしまうため、ＡＬを用いたβＧ測定を実施し得ないことは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】実施例３において得られた、濾過処理する前の１Ｗ／Ｖ％ＰｘＢ水溶液を用いて調製したＡＬ試薬の、ＥＴ及びβＧに対する反応性を試験した結果を示す。
【図２】実施例３において得られた、１Ｗ／Ｖ％ＰｘＢ水溶液を活性炭処理して得られた上清（ＰｘＢ溶液）を用いて調製したＡＬ試薬の、ＥＴ及びβＧに対する反応性を試験した結果を示す。
【図３】実施例３において得られた、活性炭処理して得られた上清を、更にゼータポア膜を用いて吸引濾過して得られた濾液（ＰｘＢ溶液）を用いて調製したＡＬ試薬の、ＥＴ及びβＧに対する反応性を試験した結果を示す。
【図４】実施例３において得られた、ゼータポア膜を用いて吸引濾過して得られた濾液を更にバイオマックス５で加圧下に限外濾過して得られた濾液を用いて調製したＡＬ試薬の、ＥＴ及びβＧに対する反応性を試験した結果を示す。
【図５】実施例４において得られた、ＰｘＢ水溶液の限外濾過処理濾液を用いて調製したＡＬ試薬の、ＥＴに対する反応性を試験した結果を示す。
【図６】実施例４において得られた、ＰｘＢ水溶液の限外濾過処理濾液を用いて調製したＡＬ試薬の、βＧに対する反応性を試験した結果を示す。
【図７】実施例５において得られた、ＰｘＢ水溶液の限外濾過処理濾液を用いて調製したＡＬ試薬の、ＥＴに対する反応性を試験した結果を示す。
【図８】実施例５において得られた、ＰｘＢ水溶液の限外濾過処理濾液を用いて調製したＡＬ試薬の、βＧに対する反応性を試験した結果を示す。
【図９】比較例１において得られた、ＰＶＤＦ膜濾過諸理路液（ＰｘＢ溶液）を用いて調製したＡＬ試薬の、ＥＴに対する反応性を試験した結果を示す。
【図１０】比較例１において得られた、ＰＶＤＦ膜濾過諸理路液（ＰｘＢ溶液）を用いて調製したＡＬ試薬の、βＧに対する反応性を試験した結果を示す。
【図１１】比較例２において得られた、ＰＶＤＦ膜濾過処理濾液（ＰｘＢ溶液）を用いて調製したＡＬ試薬の、ＥＴに対する反応性を試験した結果を示す。
【図１２】比較例２において得られた、ＰＶＤＦ膜濾過処理濾液（ＰｘＢ溶液）を用いて調製したＡＬ試薬の、βＧに対する反応性を試験した結果を示す。
【符号の説明】
【０１６１】
図１〜図４において、−●−はβＧ試料、−▲−はＥＴ試料、−◆−は注射用蒸留水を用いた場合（対照）の結果を夫々示す。
【０１６２】
図５及び図６において、−●−は１ｍｇ／ｍＬのＰｘＢ共存下（２ｍｇ／ｍＬのＰｘＢを含有する本発明のＡＬ試薬を用いた場合）、−◆−は、ＰｘＢ非共存下（ＰｘＢを含有しないＡＬ試薬を用いた場合）の結果を夫々示す。
【０１６３】
図７及び図８において、−●−は１ｍｇ／ｍＬのＰｘＢ共存下（２ｍｇ／ｍＬのＰｘＢを含有するＡＬ試薬を用いた場合）、−◆−はＰｘＢ非共存下（ＰｘＢを含有しないＡＬ試薬を用いた場合）の結果を夫々示す。
【０１６４】
図９及び図１０において、−●−は３μｇ／ｍＬのＰｘＢ共存下（６μｇ／ｍＬのＰｘＢを含有するＡＬ試薬を用いた場合）、−◆−はＰｘＢ非共存下（ＰｘＢを含有しないＡＬ試薬を用いた場合）の結果を夫々示す。
【０１６５】
図１１及び図１２において、−●−は１００μｇ／ｍＬのＰｘＢ共存下（２００μｇ／ｍＬのＰｘＢを含有するＡＬ試薬を用いた場合）、−◆−はＰｘＢ非共存下（ＰｘＢを含有しないＡＬ試薬を用いた場合）の結果を夫々示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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