(57)【要約】【課題】  カロテノイド生産性細菌Ｎ−８１１０６株の変異育種菌株であるＴＳＵＧ１Ｃ１１株又はＴＳＮ１８Ｅ７株より得られ、マダイに代表される魚類の色調を改善し、かつ表皮中に多量のカロテノイドを蓄積させうる剤、およびその製造方法を提供する。【解決手段】  カロテノイド生産性細菌Ｎ−８１１０６株の変異育種菌株であるＴＳＵＧ１Ｃ１１（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４１６）又はＴＳＮ１８Ｅ７（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４６）を培養し、当該培養液より回収される固形分からなる魚類の色調改善剤およびその製造方法を用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カロテノイド生産性細菌Ｎ−８１１０６株の変異育種菌株であるＴＳＵＧ１Ｃ１１（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４１６）又はＴＳＮ１８Ｅ７（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４６）を培養し、当該培養液より回収される固形分からなる魚類の色調改善剤。
【請求項２】
固形分が、アスタキサンチンを含むことを特徴とする請求項１記載の魚類の色調改善剤。
【請求項３】
固形分が、アスタキサンチン、アドニキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、ゼアキサンチン、β−カロテンおよびリコペンからなる群より選ばれる１又は２以上を含むことを特徴とする請求項１記載の魚類の色調改善剤。
【請求項４】
培養液より回収される固形分を乾燥してなる請求項１〜３のいずれかに記載の魚類の色調改善剤。
【請求項５】
カロテノイド生産性細菌Ｎ−８１１０６株の変異育種菌株であるＴＳＵＧ１Ｃ１１（受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４１６）又はＴＳＮ１８Ｅ７（受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４６）を、栄養培地とともに撹拌しながら培養した後、当該培養液より固形分を分離する魚類の色調改善剤の製造方法。
【請求項６】
固形分を分離した後、さらに当該固形分を乾燥することを特徴とする請求項５記載の魚類の色調改善剤の製造方法。
【請求項７】
固形分が、アスタキサンチンを含むことを特徴とする請求項５又は請求項６記載の魚類の色調改善剤の製造方法。
【請求項８】
固形分が、アスタキサンチン、アドニキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、ゼアキサンチン、β−カロテンおよびリコペンからなる群より選ばれる１又は２以上を含むことを特徴とする請求項５又は請求項６記載の魚類の色調改善剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の培養により得られる、脂溶性色素である天然アスタキサンチンを含有した固形分よりなる色調改善剤及びその製造方法に関するものである。アスタキサンチンは養殖サケ・マス・マダイの色揚げ剤や鶏卵の色調改善剤、健康補助食品、医薬品として有用な化合物である。
【背景技術】
【０００２】
β‐カロチンやリコペンなどに代表されるカロテノイド類の化合物のうち、アスタキサンチン（以下「Ａｘ」と略記する。）は、オキアミ、カニ、エビなどの甲殻類やマダイ、サケ、マスなどの魚類、フラミンゴなどの鳥類、藻類や微生物等に広く分布する天然の化合物である。近年はサケやマス、マダイ等の養殖魚の色揚げ剤や鶏卵の色調改善剤としてＡｘの需要が増加している。またＡｘには抗酸化活性や抗癌活性などの様々な生理的作用が確認され、医薬品や健康補助食品としての利用も注目されている。
【０００３】
Ａｘの製造方法としては、化学合成法、天然物からの抽出法、微生物による発酵生産法などがあるが、現在は主に価格等の要因から化学合成法による製品が広く流通している。しかし、化学合成法では原料に臭素および塩素を含むハロゲン系化合物や重金属類を使用するため安全性に懸念があり（例えば、特許文献１参照）、消費者の自然、天然志向にともない天然物由来のＡｘへの要求が強くなっている。
【０００４】
天然物からの抽出法としてはオキアミ等からの抽出法があるが、これらは含量が低く、採取、抽出、精製などに多大な労力を要し、コスト的に問題があった。
【０００５】
微生物を利用した製法としては、酵母ではファフィア・ロドチーマ（Ｐｈａｆｆｉａ  ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）（例えば、非特許文献１参照）、藻類ではヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）（例えば、非特許文献２参照）の報告がある。しかしながらファフィア酵母は増殖速度が遅いため培養日数が長く、細胞壁が強固なために抽出効率が低く、含量が少ないためコスト高である。またヘマトコッカス藻類は増殖速度が非常に遅いために培養日数が長く、光を必要とするため立地条件や設備などに制約がある他、クロロフィルなどの夾雑物の除去が必要になりコスト高である。
【０００６】
これらの問題を解決する方法として海洋性アグロバクテリウム属細菌Ｎ−８１１０６株（受託番号ＦＥＲＭ−１２７８２）の培養により得る方法が開示されている（例えば、特許文献２参照）。当該発明によれば、藻類や酵母に比べて細菌は増殖が速く、また細胞壁が脆弱であり、藻類と異なりクロロフィルなどのカロテノイド以外の色素を含まず、酵母のように副生成物の多糖類を生産しないという利点がある。当該発明によればＡｘを含有した菌体が迅速に得られ、さらに菌体を回収した後、アセトンなどの有機溶媒と菌体を混和・攪拌するだけで容易にＡｘを抽出できるという利点がある。なお、この微生物は後に１６ＳリボゾーマルＲＮＡ遺伝子の配列解析が行われた結果、パラコッカス属細菌と再同定された。海洋バイオテクノロジー研究所においてＭＢＩＣ０１１４３としても管理され、その諸性質に関する情報の概略は国立遺伝学研究所日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）や米国ＮＩＨのデーターベース（ＮＣＢＩ）に公開されている（例えば、非特許文献３、４、５参照）。また該微生物を用いて変異育種を行ない、Ａｘの生産能が向上したＴＳＵＧ１Ｃ１１株（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターへ寄託された、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４１６）やＴＳＮ１８Ｅ７株（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターへ寄託された、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４６）の取得例が報告されている（例えば、特許文献３参照）。
【０００７】
上記Ｎ−８１１０６株は細胞中にＡｘを主なカロテノイドとして蓄積するが、その他にβ−カロテン、エキネノン、β−クリプトキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、カンタキサンチン、３’−ヒドロキシエキネノン、シス−アドニキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチンなどの多様なカロテノイドを蓄積し、これらの生成比率は培養条件により変化することも知られている（例えば、非特許文献６参照）。
【０００８】
当該微生物のＡｘの生合成経路は三澤らにより解明されている（例えば、非特許文献７参照）。彼らはβ−カロテンからＡｘを合成する酵素の遺伝子であるｃｒｔＷおよびｃｒｔＺを見出し、大腸菌にクローニングして製造した両酵素の性質を解析した。その結果によれば、これらはそれぞれβ−カロテンの３および３’位にケト基を導入する酵素、および４および４’位に水酸基を導入する酵素である。この発見に基づき、Ａｘの生合成経路として、１）β−カロテンにｃｒｔＺが優先して作用してβ−クリプトキサンチンを経てゼアキサンチンが第一に生産され、次いでｃｒｔＷが作用してアドニキサンチン（４−ケトゼアキサンチンとも称される）を経てＡｘが生産される経路と、２）ｃｒｔＷが優先して作用してエキネノンを経てカンタキサンチンが第一に生産され、次いでｃｒｔＺが作用してフェニコキサンチンを経てＡｘに至る経路の、二つの経路が存在することが解明された。
【０００９】
しかしながら、特許文献２や特許文献３には当該細菌が色揚げに利用できることを示唆しているものの、実際に色揚げを行った例は示されていなかった。細菌により得られたカロテノイドによる色揚げの例としては、フラボバクテリウム属細菌Ｎ−８１１０６株より抽出精製された４−ケトゼアキサンチンを用いてワキンを飼育した例が知られている（例えば、特許文献４参照）。この例においては精製した４−ケトゼアキサンチンのアセトン溶液を市販の飼料に噴霧した後に乾燥した飼料を用いて飼育することにより、視認により赤色の良好なワキンが得られることが述べられているのみであり、当該細菌そのものを用いた場合の効果については全く述べられていなかった。また色揚げ機能の評価も目視により非投与群との比較をおこなったのみであり、客観的かつ定量的な色揚げ効果は知られていなかった。
【００１０】
またその他の細菌によるものとして土壌細菌であるＥ−３９６またはＡ−５８１−１株を培養し、遠心分離により得られた菌体をスプレードライヤーにより乾燥して得た乾燥菌体を用いて白色レグホンおよびマダイを飼育した例が知られている（例えば特許文献５参照）。しかしながら、本報告においても色揚げ機能の評価は、白色レグホンの飼育により得られた鶏卵の卵黄、表皮や肉の色調、または飼育したマダイの体表の色調を目視により非投与群と比較したのみであり、客観的かつ定量的な色揚げ効果は知られていなかった。また、本報告において示された細菌はＥ−３９６、Ａ−５８１−１株およびＥ−３９６株をＮ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ’−ｎｉｔｏｒｏ−Ｎ−ｎｉｔｏｒｓｏｇｕｒａｎｉｄｉｎｅで処理して得られたアスタキサンチンを生産せずカンタキサンチンを生産する菌（カンタキサンチン生産変異株）を用いた例が開示されるのみであり、その他の細菌の菌体を用いた場合の例は全く知られていなかった。
【００１１】
【特許文献１】米国特許第４２８３５５９号明細書
【特許文献２】特許第３５７０７４１号公報
【特許文献３】特開２００５−０５８２１６号公報
【特許文献４】特願平０４−２６３９２９号公報
【特許文献５】特許第３２７８５７４号公報
【非特許文献１】Ａ．Ｇ．Ａｎｄｒｅｗｅｓら，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１５，１００３，１９７６年
【非特許文献２】Ｂ．Ｒｅｎｓｔｒｏｍら，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０，２５６１，１９８１年
【非特許文献３】インターネット（海洋バイオテクノロジー研究所ホームページ）、株式会社  海洋バイオテクノロジー研究所、ＭＢＩＣ（菌株コレクションデータベース）、［ｏｎｌｉｎｅ］、掲載年月日不明、９ページ目の「ｃａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ」、「ｓｔｒａｉｎ  ｎａｍｅ」及び「１６ｓ」の項、  ［平成１７年６月８日検索］、インターネット：＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｃｏｄ．ｍｂｉｏ．ｃｏ．ｊｐ／ｍｂｉｈｐ／ｊ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ＞
【非特許文献４】インターネット（国立遺伝学研究所ホームページ）大学共同利用機関法人  情報・システム研究機構  国立遺伝学研究所  日本ＤＮＡデータバンク、”ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ”、［ｏｎｌｉｎｅ］、２００２年１０月８日、３ページ目の「ＯＲＩＧＩＮ」の項、［平成１７年６月８日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ＞
【非特許文献５】インターネット（米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈホームページ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、［ｏｎｌｉｎｅ］、２００２年１０月８日、４頁目の「Ｓｏｕｒｃｅ  ｏｒｉｇｉｎｅ」および「Ｆｅａｔｕｒｅｓ」の項、［２００５年１０月１８日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／＞
【非特許文献６】Ａ．Ｙｏｋｏｙａｍａ  ＆  Ｗ．Ｍｉｋｉ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｏｒｉｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２８，１３９，１９９５年
【非特許文献７】Ｆｒａｓｅｒ  Ｐ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，６１２８，１９９７年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、海洋細菌アグロバクテリウム属細菌Ｎ−８１１０６株の変異株であるＴＳＵＧ１Ｃ１１株又はＴＳＮ１８Ｅ７株より得られ、マダイに代表される魚類の色調を改善し、かつ表皮中に多量のカロテノイドを蓄積させうる剤、およびその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは鋭意検討の結果、上記海洋細菌Ｎ−８１１０６株の変異株であるＴＳＵＧ１Ｃ１１株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４１６）又はＴＳＮ１８Ｅ７株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４６）を培養し、培養液から固形分を回収し、これを乾燥することにより得られた乾燥物を得、これを各種飼料原料と混合してマダイを飼育することにより、同じ飼料原料を用いるものの当該乾燥物を混合しなかった場合と比較すると、有意に体表の赤色が強く、かつ表皮中のカロテノイド含量の高いマダイが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち本発明は、カロテノイド生産性細菌Ｎ−８１１０６株の変異育種菌株であるＴＳＵＧ１Ｃ１１（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４１６）又はＴＳＮ１８Ｅ７（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４６）を培養し、当該培養液より回収される固形分からなる魚類の色調改善剤。
【００１５】
また本発明は、カロテノイド生産性細菌Ｎ−８１１０６株の変異育種菌株であるＴＳＵＧ１Ｃ１１（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４１６）又はＴＳＮ１８Ｅ７（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４６）を、栄養培地とともに撹拌しながら培養した後、当該培養液より固形分を分離する魚類の色調改善剤の製造方法である。
【００１６】
本発明に用いる細菌株ＴＳＵＧ１Ｃ１１株やＴＳＮ１８Ｅ７株の性質については前記特許第３５７０７４１号公報および前記特開２００５−０５８２１６号公報に記載されている。
【００１７】
本発明の色調改善剤は、前記カロテノイド生産性細菌Ｎ−８１１０６株の変異育種菌株であるＴＳＵＧ１Ｃ１１又はＴＳＮ１８Ｅ７を培養し、当該培養液より回収される固形分からなるが、この固形分中にはアスタキサンチンを含むものであることが好ましく、また、アスタキサンチン以外にも、アドニキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、ゼアキサンチン、β−カロテン、リコペンの内の１又は２以上を含むものであることが好ましい。このようなカロテノイド色素を魚類の色調を改善することで本発明の目的を達しうるからである。
【００１８】
上記のように本発明の色調改善剤はその主成分として、アスタキサンチン、アドニキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、ゼアキサンチン、β−カロテン、およびリコペン等のカロテノイドを含有する。そして、これらの色調改善剤中の含有量は、色調改善剤を製造する際の細菌の培養条件により大きく変化するが、カロテノイドの総含量として、色調改善剤（乾燥物）の粉体あたり、０．５〜１．５重量％を含有させればよい。
【００１９】
また、個々のカロテノイドの色調改善剤中の存在比も培養条件により大きく変化し、アスタキサンチンを０．１〜１重量％、アドニキサンチンを０．０５〜１重量％、フェニコキサンチンを０．１〜１重量％、カンタキサンチンを０．１〜１重量％、エキネノンを０．０５〜１重量％、β−カロテンを０．０５〜１重量％の間の含量で、それぞれ含有させるとよい。
【００２０】
例えば後記の実施例中、実施例１に示す条件で培養して得た粉体は、アスタキサンチンを０．３３重量％、アドニキサンチンを０．１６重量％、フェニコキサンチンを０．２０重量％、カンタキサンチンを０．１８重量％、エキネノンを０．２０重量％、β−カロテンを０．１３重量％含有する。その他の成分として細菌の菌体を構成する蛋白質、脂質、炭水化物等が主成分として含まれる他、１〜３％の粗灰分を含有する。また乾燥の条件により大きく変化するが１０％未満の水分を含有する。
【００２１】
これらの細菌の培養方法に特に限定はないが、振とう培養や通気撹拌培養等の好気的な条件が好ましく、培養時間としては２４時間〜２００時間程度、培養温度としては１０〜４０℃付近が好ましく、ｐＨは６〜８が好ましい。
【００２２】
用いられる栄養培地としては、細菌が増殖しカロテノイドを生産しうるものであればいずれを使用してもよく、炭素源には廃糖蜜、グルコース、フルトース、マルトース、ショ糖、デンプン、乳糖、グリセロール、酢酸などが、窒素源にはコーンスチープリカー、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕等の天然成分や、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩、又はアンモニア水や、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン等のアミノ酸類が、無機塩にはリン酸１ナトリウム、リン酸２ナトリウム、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム等のリン酸塩や塩化ナトリウムなどが、金属イオンには塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、塩化第一鉄、塩化第二鉄、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化銅、硫酸マンガン、塩化マンガンなどが、ビタミン類としては酵母エキスやビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシン等が使用できる。
【００２３】
培養後、培養液から固形分を分離して回収するが、分離・回収の方法に限定はなく、遠心分離法やろ過法等の一般的な方法を適用できる。この際、固形分が回収できる条件であれば、その条件に特に限定は無いが、カロテノイドは熱安定性が低いため低温であることが好ましく、しかし溶液が凍結する温度では固形分の回収が不可能になるため、凍結しない温度であることが好ましい。その様な温度として、−５℃〜１００℃の温度領域が上げられるが、より好ましくは０〜８０℃である。
【００２４】
得られた固形分はそのまま用いることもでき、また通常の方法で乾燥して用いることもできる。乾燥方法にも特に限定はなく、凍結乾燥法、噴霧乾燥法、真空乾燥法等の通常の方法が用いられる。この際の条件は、カロテノイドがほとんど分解しない条件であれば特に限定は無く、その様な条件は乾燥方法ごとに異なるため、適用する方法に従って、随時実験的に設定される。例えば噴霧乾燥においては、入口温度１２０℃、出口温度６０℃で噴霧乾燥を行うことにより、約９０％の回収率で目的物が回収された。
【００２５】
このようにして得られた固形分は単独で用いることもできるが、より好ましくは様々な飼料の原料と混合して魚類に与えられる。飼料原料と混合する場合、原料の配合比は魚の成長に良好なものであれば特に限定はなく、フィッシュミール、大豆ミール、小麦粉、デンプン、大豆油、肝油などの原料と８０℃を越えない温度で混合される。
【００２６】
対象となる魚類については特に限定はなく、マダイやハナダイ等の体表が赤色を呈する魚類や、ブリ、カンパチ、ヒラマサの様なカロテノイドに由来する黄色を体表に呈するもの、またサケやマス類の様な肉質にカロテノイドを蓄積して赤色を呈するものに特に好ましく用いられる。
【００２７】
魚類への投与法については特に限定はなく、魚類が良好に成育する条件下において、過剰投与などによる生育環境の汚染が生じない任意の範囲で自由に使用することができる。
【００２８】
魚体中のカロテノイドの蓄積量の評価方法に特に限定はないが、解剖して表皮や筋肉組織などを採取し、それらを抽出した後に、比色法や、ＨＰＬＣなどクロマトグラフィー等の既存の方法で定量すればよい。例えば抽出溶媒としてメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジクロロメタン、クロロフォルム、ジメチルフォルムアミド、ジメチルスルフォキシド、酢酸エチル等が用いられる。
【００２９】
比色法の場合は抽出液から、遠心分離やろ過などの方法で不溶性物質を除去した後、アスタキサンチン等の赤色カロテノイドの定量として４８０ｎｍの吸光度、そしてゼアキサンチン等の黄色カロテノイドの定量として４６０ｎｍの吸光度を測定することが好ましい。
【００３０】
ＨＰＬＣによる場合は比色法の場合と同様に試料を調整した後、逆相法や順相法など既存の方法で行うことができる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によれば、カロテノイド生産性海洋細菌Ｎ−８１１０６株の育種によって得られた菌株であるＴＳＵＧ１Ｃ１１株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４１６）又はＴＳＮ１８Ｅ７株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４６）を培養し、その培養液より固形分を回収することで、魚類の色調改善効果に優れた色調改善剤が得られる。
【００３２】
当該色調改善剤を用いて魚類を飼育することでカロテノイドを高含量に含んだ魚体を得ることができる。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお本発明は、これらの実施例のみに限定されるものではなく、発明の要旨を逸脱しない範囲で、任意に変更が可能であることは言うまでもない。
【００３４】
ＨＰＬＣによるカロテノイドの定量法
（カロテノイドの抽出と定量法）
適量な培養液を１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブを用いて、１５，０００回転、５分間遠心分離を行ない菌体を得た。この菌体に２０μｌの純水に懸濁し、次いで２４０μｌのジメチルホルムアミドおよび２４０μｌのアセトンを加え約１時間振とうし、カロテノイドを抽出した。この抽出液を１５，０００回転、５分間遠心分離により残渣を除去後、ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴＭカラム（東ソー社製）を用いた高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと略記する）でアスタキサンチンを定量した。なおＡｘの分離はＡ液として純水とメチルアルコールの５対９５の混合溶媒、Ｂ液としてメチルアルコールとテトラヒドロフランの７対３の混合溶媒を用い、１ｍｌ／ｍｉｎの流速でＡ液を５分間カラムに通過させた後、同じ流速Ａ液からＢ液へ５分間の直線濃度勾配を行ない、さらにＢ液を５分間通過させることにより行なった。Ａｘ濃度は４７０ｎｍの吸光度をモニターし、既知濃度のＡｘ試薬（シグマ製）で作成した検量線より濃度を算出した。
（比色によるカロテノイドの定量法）
比色による定量を行う場合は、試料よりアセトンおよびジエチルエーテルでカロテノイドを抽出した後、遠心分離により不溶物を除去したのち、ベンゼンで希釈して吸光度を測定した。この際、赤色カロテノイドは４８０ｎｍを測定し、分子吸光係数として１９００（単位：ｇ／１００ｍｌ）を用いて定量した。また、黄色カロテノイドは４６０ｎｍを測定し、分子吸光係数には２５００（単位：ｇ／１００ｍｌ）を用いて定量した。分光光度計には株式会社島津製作所製ＵＶ−２６０型分光光度計を用いた。カロテノイド濃度の算出は下式（１）により計算した。
【００３５】
Ｃ＝  Ａ×Ｄ×１００００／Ｅ１％１ｃｍ×Ｗ      （１）
式（１）中、Ｃは試料のカロテノイド含量（単位：μｇ／ｇ）、Ａは抽出液の４８０ｎｍまたは４６０の吸光度（単位：任意単位）、Ｄは希釈液容量（単位：ｍｌ）、Ｅ１％１ｃｍは分子吸光係数（単位：ｇ／１００ｍｌ）、Ｗは抽出に用いた試料の重量（単位：ｇ）である。
【００３６】
（実施例１）
菌体の調製
表１に示した組成の培地３００ｍｌを５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに入れ１２１℃、２０分間で滅菌後、Ｎ−８１１０６株の変異株の一つであるＴＳＮ１８Ｅ５株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７４６）を植菌し、２５℃で１日間、毎分１００回転の振とう速度で前々培養を行なった。
【００３７】
次いで表２に示した組成の培地１００ｍｌを５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに入れ１２１℃、２０分間で滅菌し、上記培養液５ｍｌを植菌して２５℃で約１８時間、毎分１００回転の振とう速度で前培養した。
【００３８】
さらに、表３に示す組成の培地約１．４Ｌを３Ｌの発酵槽に入れ、１２１℃、２０分間で滅菌後、得られた上記培養液９０ｍｌと金属塩を添加し本培養を開始した。培養装置は千代田製作所社のＴＦＬ−３を使用し、排ガス分析装置はエイブル社のＤＥＸ−２５６２を使用した。培養温度は２２℃、ｐＨは７．０〜７．４とした。培養時のｐＨ調整はアルカリに２Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を、酸には２Ｎの塩酸水溶液を用いて制御した。また通気は１．５Ｌ／ｍｉｎの速度で空気を供給し、毎分４００回転の回転速度で撹拌した。
【００３９】
約１１６時間培養を行ったのち、遠心分離により湿菌体を回収した。さらに得られた湿菌体を東京理科機器製凍結乾燥機ＦＥ−８１型を用いて、トラップ温度、約−８０℃、試料周辺の温度、室温、真空度、約６０Ｔｏｒｒにおいて乾燥菌体を回収した。同様の培養を１１回行って、約２１０ｇの凍結乾燥菌体を得た。
【００４０】
この粉体の一部を採取し、アセトンでカロテノイドを抽出した後、ＨＰＬＣで定量したところ、本乾燥菌体は単位重量当り０．３３ｗｔ％のアスタキサンチンを含有していた。また本菌体は０．０３ｗｔ％のアスタキサンチン、０．１６ｗｔ％のアドニキサンチン、０．２０ｗｔ％のフェニコキサンチン、０．１８ｗｔ％のカンタキサンチン、０．２０ｗｔ％のエキネノン及び０．１３ｗｔ％のβ−カロテンを含有した。
【００４１】
以上のカロテノイドの組成比は表４にまとめた。なお、表４中、Ａは「アスタキサンチン」を、Ｂは「アドニキサンチン」を、Ｃは「フェニコキサンチン」を、Ｄは「カンタキサンチン」を、Ｅは「エキネノン」を、Ｆは「β−カロテン」を、ｎ．ｄ．は「検出されず」を示す。
【００４２】
【表１】
2007244206.tif 000002
【００４３】
【表２】
2007244206.tif 000003
【００４４】
【表３】
2007244206.tif 000004
【００４５】
【表４】
2007244206.tif 000005
（実施例２）
耐熱性の分析
実施例１の乾燥菌体を遮光条件下、８０℃で一日加熱した後、実施例１と同様にカロテノイドを抽出して定量した。その結果を表４に示すが、加熱を行わなかった場合に対する４０％付近にまで低下していた。すなわち８０℃での加熱処理により、カロテノイドの有効濃度が著しく低下することが判明した。
【００４６】
（実施例３）
マダイの色揚げ試験
表５に示す飼料原料を室温で混合、ペレットとした後に凍結乾燥し、−２０℃で凍結保存した。体重９１．５＋／−１．５ｇ（平均重量９１．５ｇ、標準偏差１．５ｇ）のマダイを１群１６匹で２系列、６０Ｌ水槽において１週間の予備飼育した後、上記の飼料を用いて１２週間飼育した。飼育は，人工海水を用いた閉鎖循環システムで行い，飼育水温は１８〜２４℃で，各水槽への注水量は０．５ｍｌ／ｍｉｎであった。給餌は１日３回（１０：００、１３：００、及び１８：００）、マダイがほぼ飽食するまで行った。飼育期間終了後、体表の色を観察したところ、良好な赤色を呈していた。
【００４７】
さらに魚体を解剖して、表皮、肝臓及び筋肉組織をそれぞれ回収し、各組織をホモジナイズしたのちにカロテノイドをアセトンおよびジエチルエーテルで抽出し、さらにベンゼンにより所定の吸光度が０．１〜０．５の範囲内になるように希釈して吸光度を測定した。
【００４８】
その結果を表６に示す。赤色カロテノイド及び黄色カロテノイド共に表皮中に選択的に蓄積していることが判明した。さらに表皮中のカロテノイドをＨＰＬＣで分析した結果を表７に示した。カロテノイドのなかでも，アスタキサンチンおよびβ‐カロテンの蓄積が顕著であった。
【００４９】
【表５】
2007244206.tif 000006
【００５０】
【表６】
2007244206.tif 000007
【００５１】
【表７】
2007244206.tif 000008
（比較例１）
色揚げ試験（ブランク）
表５に示す組成のうち、乾燥菌体を添加せず、セルロースを５．４０ｇとした飼料を用いた他、実施例２と同様にマダイを飼育した。飼育期間終了後、体色を観察したところ、マダイに特有の赤色は示さなかった。各組織中のカロテノイドの定量を行った結果を表６および表７に示したが（表７中、ｎｄは「検出されず」を示す。）、実施例２のような表皮へのカロテノイドの蓄積は観察されなかった。すなわち本発明の乾燥菌体を主要成分とする色調改善剤を用いることで、マダイの赤い体色と表皮へのカロテノイドの蓄積が生じることが判明した。