(57)【要約】【課題】  予め計数盤本体と上部プレートからなる空間が固定されていて、細胞計数従事者による組み立てが不要で、安価に大量に製造できる使い捨ての細胞計数盤を提供する。【解決手段】  細胞計数盤は、本体１０Ａと、本体１０Ａに取り付けられるカバープレート３０とからなる。本体１０Ａは、部分１１の上面よりも所定寸法だけ低位に位置する平面状のランド１２，１３と、ランド１２，１３に設けられた計数部１４，１５と、ランド１２，１３に近接して設けられるとともにカバープレート３０をランド１２，１３上に位置決めして固定するための４個の突部２０とを有する。カバープレート３０は、突部２０に対応する位置に形成された嵌合穴３２を有する。嵌合穴３２に突部２０を嵌合させることでカバープレート３０を本体１０Ａに取り付けたときに、ランド１２，１３の上面とカバープレート３０の下面との間に所定寸法（０．１ｍｍ）の空間４０が生じる。【選択図】      図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
本体と、この本体に取り付けられるカバープレートとからなり、
本体は、当該本体の上面よりも所定寸法だけ低位に位置する平面状のランドと、このランドに設けられた細胞計数用の計数部と、ランドに近接して設けられるとともにカバープレートをランド上に位置決めして固定するための少なくとも２個の突部とを有し、
カバープレートは、本体の突部に対応する位置に形成された嵌合穴を有し、
カバープレートの嵌合穴に本体の突部を嵌合させることでカバープレートを本体に取り付けたときに、本体のランド上面とカバープレート下面との間に前記所定寸法の空間が生じるようにしたことを特徴とする細胞計数盤。
【請求項２】
前記本体及びカバープレートは、合成樹脂からなることを特徴とする請求項１記載の細胞計数盤。
【請求項３】
前記本体の突部は、ランドを挟んで一方側に２個、他方側に２個配置されていることを特徴とする請求項１又は請求項２記載の細胞計数盤。
【請求項４】
前記本体の突部は、フック状の先端部を有する直方体形状であることを特徴とする請求項１、請求項２又は請求項３記載の細胞計数盤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学、薬学、農学、工学、理学等の生物学分野において、特に、細胞生物学、細胞生理学、生化学、分子生物学、血液学、免疫学、薬理学、植物学、微生物学等の研究や開発および、それらにかかわる産業分野において、細胞を計数するための計数盤に関するものである。さらに詳しくは、１回の使用で廃棄される使い捨てタイプの細胞計数盤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、血液中の細胞や、培養細胞や、酵素などで単離した細胞の数を数えるための簡便な方法として、細胞計数盤あるいは血球計算盤とよばれる器具が使われてきた。この細胞計数盤は、例えば図１１の斜視図に示したように、顕微鏡スライドグラスほどの大きさの計数盤本体７０と、カバーグラスほどの大きさのガラスプレート８０とからなる。
【０００３】
計数盤本体７０は、２つのランド７１，７１と、このランド７１，７１の間に位置する２つのランド７２，７３とを有する。ランド７２，７３の中央部には、それぞれ格子状にけがきされた計数部７５，７６が設けられている。計数部７５，７６は、後述するように細胞の計数を容易にする役目を果たす。ランド７１，７１とランド７２，７３は、高低差が約０．１ｍｍあり、ランド７２，７３の平面（上面）がランド７１，７１の平面（上面）よりも低くなっている。ランド７２，７３上には、ガラスプレート８０がランド７１，７１に密接するように取り付けられる。ガラスプレート８０は、通常は、このガラスプレート８０の周縁部を水で濡らすか、呼気で湿り気を与えてから、ガラスプレート８０を計数盤本体７０に載せて、指で強く押すことにより、水の表面張力によって、計数盤本体７０（ランド７１，７１）上に密着固定される。
【０００４】
ガラスプレート８０を計数盤本体７０に取り付けた状態での要部拡大断面図を図１２の（ａ）に示す。前記のようにランド７１，７１とランド７２，７３には高低差があるので、ランド７２（７３）の平面とガラスプレート８０の下面との間には、一定幅（寸法ｄ＝０．１ｍｍ）の空間９０が形成される。この空間９０に、希釈した血液や細胞けん濁液をピペットチップ等で注入すると、それらの液体は表面張力によって空間９０に充満する。
【０００５】
一方、計数盤本体７０の計数部７５，７６は、細い線で格子状にけがきされており、格子状の升目の幅は一定である。希釈した血液や細胞けん濁液をピペットチップ等で空間９０に注入し、表面張力によって該空間９０に充満させた後、顕微鏡等で観察すると、格子状の升目の部分に細胞が観察される。升目の正方形の面積部分は、その空間間隙が一定なので、一定の容積の直方体には、希釈した血液や細胞けん濁液の一定容積が存在することになる。例えば、計数部７５，７６の１ｍｍ幅の正方形部分内にＮ個の細胞が観察された場合を考える。上記空間９０の幅（ｄ）が０．１ｍｍの場合、１ｍｍ×１ｍｍ×０．１ｍｍの直方体の中にＮ個の細胞が存在することになる。１ｍｍ×１ｍｍ×０．１ｍｍ＝０．０００１ｍＬの容積なので、注入した細胞けん濁液の０．０００１ｍＬにＮ個の細胞が存在することになる。従って、注入した細胞けん濁液はＮ×１００００個／ｍＬの細胞密度を持つことが容易に計算できる。
【０００６】
注入前の細胞けん濁液に、トリパンブルー青色色素液を一定量加えた後に注入して顕微鏡観察すると、死んだ細胞は、細胞内にトリパンブルー青色色素液が浸入して、青黒く染まるのに対して、生きた細胞は細胞内への浸入を許さないので、青黒くは染まらない。この原理により、青黒く染まっている細胞と染まっていない細胞とを別々に数えることにより、細胞けん濁液の中の生きている細胞と死んでいる細胞とを別々に計数することも可能である。
【０００７】
このような細胞計数盤の材料は、従来からガラスを使用してきた。上記空間９０の正確な寸法の幅を維持するための研磨作業や、計数部７５，７６の正確な細線のけがき部を作るための精密な作業のため、細胞計数盤は高価なものとなっている。従って、使用後は細胞計数盤を洗浄して繰り返し使用している。ガラス製の高価な細胞計数盤は、しばしば床への落下により簡単に破損して使えなくなることがあり、これが欠点であった。細胞数を数えるための検体が多数ある時には、一つの検体を計数した後、計数盤本体７０とガラスプレート８０を水洗して、細胞とトリパンブルー青色色素液とを洗い流した後、水分を拭き取り、乾燥させ、計数盤本体７０とガラスプレート８０を再度密着させる操作が必要であった。トリパンブルー青色色素液中では、５分もすると、生きている細胞も死んでしまうため、数分以内に計測しなければならず、上記のような水洗操作をしていては、多数の検体を短時間に計数することは困難であった。しかも手間と時間が掛かるだけではなく、臨床サンプルの研究の場合には、感染性のバクテリアやウイルス等のバイオハザードの取り扱い上、細胞計数盤を使い捨てにすることが強く求められていた。
【０００８】
このような目的のために、プラスチック樹脂でできて、予め計数盤本体と上部プレートからなる空間が既に固定されていて、細胞計数従事者が組み立て不要の、使い捨ての細胞計数盤が求められていた。この目的のために、プラスチック樹脂で計数盤本体と上部プレートを作製し、計数盤本体と上部プレートを予め接着剤で固着したものが、いくつか製品として知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００９】
この特許文献１に記載された血球計数板は、図１２の（ｂ）に示すように、計算板本体１００と観察プレート１１０が接着剤１３０で固定され、接着剤１３０が一定幅の間隔１２０を形成するためのスペーサ（一定粒径の球状粒子１３１）を混入してなるものである。この血球計数板によると、１回のみの使用で廃棄する使い捨てタイプのものとして好適である。
【特許文献１】特開平１１−１６０３１０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、上記特許文献１記載の血球計数板では、観察プレート１１０を計算板本体１００（ランド１０１，１０２，１０３）上に正確に位置決めして接着剤１３０で固定する必要があるため、この接着剤１３０による接着は大変手間の掛かるものであり、観察プレート１１０とランド１０２（１０３）で形成される空間１２０の保持と品質管理のためには向いておらず、空間１２０の正確な保持には工夫が必要である。しかも、血球計数板ごとに接着剤１３０により接着しなければならず、コストが掛かる上に、大量生産には不向きである。
【００１１】
一般に、プラスチック樹脂でできて、予め計数盤本体と上部プレートからなる空間が既に固定されていて、細胞計数従事者が組み立て不要の、使い捨ての細胞計数盤は、安価に大量に製造することが、その目的から求められている。そのためにも、計数盤本体と上部プレートとの接着を、大変手間のかかり、空間の保持と品質管理に向いていない接着剤での接着による方法（特許文献１記載のような技術）ではなく、簡単に固着させて作製する方法が求められていた。
【００１２】
この発明は、そのような実情に鑑みてなされたものであって、予め計数盤本体と上部プレートからなる空間が既に固定されていて、細胞計数従事者が組み立てが不要であり、しかも安価に大量に製造することができる使い捨ての細胞計数盤を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成するために、本発明の細胞計数盤は、本体と、この本体に取り付けられるカバープレートとからなり、本体は、当該本体の上面よりも所定寸法だけ低位に位置する平面状のランドと、このランドに設けられた細胞計数用の計数部と、ランドに近接して設けられるとともにカバープレートをランド上に位置決めして固定するための少なくとも２個の突部とを有し、カバープレートは、本体の突部に対応する位置に形成された嵌合穴を有し、カバープレートの嵌合穴に本体の突部を嵌合させることでカバープレートを本体に取り付けたときに、本体のランド上面とカバープレート下面との間に前記所定寸法の空間が生じるようにしたことを特徴とする。
【００１４】
この細胞計数盤において、本体及びカバープレートは合成樹脂からなることが好ましい。合成樹脂としては、例えばスチレン系のポリスチレン樹脂、ＡＳ（アクリロニトリル／スチレン）樹脂、アクリル系のポリメタクリル酸樹脂、アクリルニトリル樹脂、オレフィン系のポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ビニル系のポリ塩化ビニル、ポリカーボネート樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリアリレート樹脂、或いはこれらの混合樹脂などを用いてもいい。これらの樹脂成分に、必要に応じて剛性、濡れ性ほかの特性を変化させる成分を含ませてもいい。水への親和性の弱い樹脂の場合には、細胞計数部への細胞けん濁液の注入を容易にするために、コロナ放電処置などの導電処理で表面加工をして、濡れ性、荷電性等の表面特性を変えればいい。
【００１５】
また、本体及びカバープレートの製造コスト、本体へのカバープレートの取付のし易さや正確な位置決め等の組立作業性を考慮すると、本体の突部は、ランドを挟んで一方側に２個、他方側に２個配置されていることが好ましい。
【００１６】
更に、本体の突部は、フック状の先端部を有する直方体形状であることが、取付のし易さや加工性等から好ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の細胞計数盤は、以上説明したように構成されるので、次の効果を有する。
（１）カバープレートの嵌合穴に本体の突部を嵌合させるだけで、カバープレートを本体に取り付けることができ、組立が容易である。
（２）カバープレートを本体に取り付けるだけで、本体のランド上面とカバープレート下面との間に所定寸法の空間が形成されるので、空間の寸法精度を確保するのに手間隙が掛からない。
（３）上記（１）、（２）より、非常に安価に大量生産することができる。
（４）上記（３）やバイオハザード等の観点から使い捨てに適している。
（５）カバープレートの嵌合穴に本体の突部を嵌合させた簡易な構造により、至便性に優れている。
（６）請求項２の構成とすることで、上記（１）〜（５）の効果がより顕著になる。
（７）請求項３の構成とすることで、本体に対するカバープレートの取り付けを、コストを余り掛けないでより確実に行うことが可能となる。
（８）請求項４の構成とすることで、本体に対するカバープレートの取り付けを、より簡素な構造で実現できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を実施の形態に基づいて説明する。
【００１９】
その一実施形態に係る細胞計数盤における本体の平面図を図１の（ａ）に、その一部破断正面図を図１の（ｂ）に、図１の（ａ）の線Ａ−Ａにおける断面図を図２の（ａ）に、（ａ）の円形部分の拡大図を図２の（ｂ）に示す。
【００２０】
本体１０Ａは、合成樹脂（例えばポリスチレン）からなる長方形状のもので、長手方向の中央部に２つの平面状のランド１２，１３が設けられている。このランド１２，１３は、その他の部分１１の上面よりも所定寸法（約０．１ｍｍ）だけ低位に位置し、部分１１とランド１２，１３との間には高低差がある。また、ランド１２，１３には、それぞれ細胞を計数するための計数部１４，１５が設けられ、この計数部１４，１５は、前記の通り、例えば細い線で格子状にけがきされており、格子状の升目の幅は一定である。ランド１２，１３の周囲には、余分の液体をオーバーフローさせるためと、ランド１２，１３で異なる試料液体を使用する場合に双方の試料液体が混合しないようにするための平面視Ｈ字状の溝（網目状部分）１７が形成されている。なお、部分１１の斜線領域及び溝１７はシボ加工が施されている。
【００２１】
この本体１０Ａは、その特徴として、後記カバープレート３０をランド１２，１３上に位置決めして固定するための４個の直方体形状の突部２０が、部分１１においてランド１２，１３に近接して、ランド１２，１３を挟んで一方側に２個、他方側に２個配置されている。突部２０は、図２に詳細に示すように、四角形の穴２１の下方から上方に起立状に突出しており、その先端部２０ａはフック状になっている。この突部２０は適度の弾性を有している。
【００２２】
同細胞計数盤におけるカバープレートの平面図を図３の（ａ）に、その正面図を図３の（ｂ）に、図３の（ａ）の線Ｂ−Ｂにおける断面図を図４に示す。
【００２３】
カバープレート３０は、合成樹脂（例えばポリスチレン）からなる矩形状のもので、本体１０Ａのランド１２，１３に対応する位置に切欠部３１を有するとともに、本体１０Ａの４個の突部２０に対応する位置に４つの四角形状の嵌合穴３２が形成されている。
【００２４】
本体１０Ａにカバープレート３０を取り付けた状態の同細胞計数盤の平面図を図５の（ａ）に、その一部破断正面図を図５の（ｂ）に、図５の（ａ）の線Ｃ−Ｃにおける断面図を図６に示す。
【００２５】
本体１０Ａへのカバープレート３０の取り付けは、本体１０Ａの突部２０をカバープレート３０の嵌合穴３２に嵌合させるだけでよい。このとき、突部２０の適度の弾性により嵌合穴３２に突部２０を挿入するのは容易であり、挿入後は突部２０のフック状の先端部２０ａが嵌合穴３２の縁に弾性的に係合するため、カバープレート３０が位置ずれを起こすことなく本体１０Ａに確実に固定される。
【００２６】
この取付状態では、本体１０Ａの部分１１の上面とカバープレート３０の下面とが密接し、本体１０Ａのランド１２，１３の上面とカバープレート３０の下面との間に所定寸法（０．１ｍｍ）の空間４０が形成される〔図５の（ｂ）〕。この細胞計数盤で、細胞計数を行うには、カバープレート３０の切欠部３１から出現しているランド１２，１３の部分から空間４０に向けて、希釈した血液や細胞けん濁液をピペットチップ等で注入すればよい。
【００２７】
この細胞計数盤によると、カバープレート３０の嵌合穴３２に本体１０Ａの突部２０を嵌合させるだけで、カバープレート３０を本体１０Ａに取り付けることができ、組立が容易である。しかも、カバープレート３０を本体１０Ａに取り付けるだけで、本体１０Ａのランド１２，１３の上面とカバープレート３０の下面との間に所定寸法の空間４０が形成されるので、空間４０の寸法精度を確保するのに手間隙が掛からない。これらにより、この細胞計数盤は、非常に安価に大量生産することができる。また、廉価な大量生産が可能なことやバイオハザード等の観点から使い捨てに適しているだけでなく、カバープレート３０の嵌合穴３２に本体１０Ａの突部２０を嵌合させた簡易な構造により、至便性に優れている。
【００２８】
この細胞計数盤は、本体１０Ａ及びカバープレート３０が共に合成樹脂からなるため、高精度な成型用の金型を用意しておけば、本体とカバープレートを組み立てた後の空間４０の寸法精度の良い高品質な細胞計数盤を非常に安価に大量生産することが可能となる。
【００２９】
なお、上記実施形態の細胞計数盤は本の一例であり、種々の変更が可能である。例えば、上記細胞計数盤における本体１０Ａの突部２０の個数は４個であるが、図７の（ａ）に示す本体１０Ｂでは６個の突部２０が設けられ、図７の（ｂ）に示す本体１０Ｃでは２個の突部２０が対角線状に設けられ、図８に示す本体１０Ｄでは２個の突部２０が正対状に設けられている。図７の（ｂ）及び図８のように突部２０は最低限２個あれば、カバープレート３０が本体１０に位置ずれすることなく確実に固定される。勿論、本体１０（Ｂ〜Ｄ）の突部２０の位置と個数に合わせてカバープレート３０の嵌合穴３２の位置と個数を設定する。
【００３０】
また、上記細胞計数盤における本体１０Ａの突部２０は直方体形状であるが、図９に示す本体１０Ｅでは、突部２５は円柱形状であり、その先端部２５ａは球形を呈している。これに応じて、図示しないが、カバープレート３０の嵌合穴は円形に形成される。この場合、円形の嵌合穴に突部２５の球形の先端部２５ａを嵌入することで、カバープレート３０が本体１０Ｅに取り付けられる。
【００３１】
次に、培養細胞と赤血球細胞で、プラスチックからなる上記細胞計数盤を使った実験例の一つを示す。チャイニーズハムスター卵細胞（ＣＨＯ細胞）をＤＭＥＭ／Ｆ−１２倍地で培養後、ＰＢＳ溶液（リン酸緩衝０．１５Ｍ生理食塩水）で洗い、０．２５％トリプシンＥＤＴＡ酵素溶液で細胞を剥がして、遊離細胞とした。１５００ｒｐｍ、５分の遠心で細胞を落とした後、１０％血清入りのＤＭＥＭ培地に上記細胞をけん濁した。この細胞けん濁液とトリパンブルー染色液を等量混合後に、細胞導入部（上記細胞計数盤では空間４０）に注入して、位相差倒立顕微鏡で観察した。細胞数を実際に計測した結果を図１０の（ａ）に示した。
【００３２】
図１０の（ａ）において、“ガラス”はBurker-Turkタイプの従来のガラス製血球計算盤を用いた計数結果、“プラスチック”は上記細胞計数盤を用いた計数結果、“パーティクル”は細胞計数装置（パーティクルカウンター）（ベックマンコールター社製Ｚ１カウンター）を用いた計数結果をそれぞれ示す。但し、パーティクルカウンターでの計測以外のものは、計数をトリパンブルー染色後に行った。また、Ｎ＝４−６の平均値を黒棒で、平均値の標準誤差をバーで示した。この（ａ）より明らかなように、上記細胞計数盤は、従来品と同等の計数結果を示している。
【００３３】
次に、ヒトの末梢血の赤血球細胞の計測を行った。ヘパリンの入ったＰＢＳ溶液に採血で得た末梢血を一滴滴下して、さらにＰＢＳ溶液で希釈後、細胞注入部（上記細胞計数盤では空間４０）に注入した。同様に、ガラス製の血球計算盤でも計測し、その計数結果を図１０の（ｂ）、（ｃ）に示した。
【００３４】
図１０の（ｂ）、（ｃ）において、“ガラス”はBurker-Turkタイプの従来のガラス製血球計算盤を用いた計数結果、“プラスチック”は上記細胞計数盤を用いた計数結果をそれぞれ示す。但し、（ｂ）での計測は非染色で行い、（ｃ）での計測はトリパンブルー染色後に行った。また、（ｂ）、（ｃ）のいずれも、Ｎ＝４−６の平均値を黒棒で、平均値の標準誤差をバーで示した。この（ｂ）、（ｃ）より明らかなように、上記細胞計数盤は、従来品と同等の計数結果を示している。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】一実施形態に係る細胞計数盤における本体の平面図（ａ）、及びその一部破断正面図（ｂ）である。
【図２】図１の（ａ）の線Ａ−Ａにおける断面図（ａ）、及び（ａ）の円形部分の拡大図（ｂ）である。
【図３】同細胞計数盤におけるカバープレートの平面図（ａ）、及びその正面図（ｂ）である。
【図４】図３の（ａ）の線Ｂ−Ｂにおける断面図である。
【図５】同細胞計数盤において、本体にカバープレートを取り付けた状態の平面図（ａ）、及びその一部破断正面図（ｂ）である。
【図６】図５の（ａ）の線Ｃ−Ｃにおける断面図である。
【図７】別実施形態に係る細胞計数盤における本体の平面図（ａ）、及び更に別実施形態に係る細胞計数盤における本体の平面図（ｂ）である。
【図８】更に別実施形態に係る細胞計数盤における本体の平面図である。
【図９】更に別実施形態に係る細胞計数盤における本体の平面図（ａ）、及びその突部の拡大断面図（ｂ）である。
【図１０】実施形態に係る細胞計数盤を用いて細胞計数を行った結果と従来法での結果とを比較する図であり、培養ＣＨＯ−Ｋ１細胞での細胞計数結果の比較を示す図（ａ）、及びヒト末梢血赤血球での細胞計数結果の比較を示す図（ｂ）、（ｃ）である。
【図１１】従来例に係る細胞計数盤の分解斜視図である。
【図１２】従来例に係る細胞計数盤の要部拡大断面図（ａ）、及び別の従来例に係る細胞計数盤の要部拡大断面図（ｂ）である。
【符号の説明】
【００３６】
１０（Ａ〜Ｅ）    本体
１２，１３        ランド
１４，１５        計数部
１７              溝
２０，２５        突部
２０ａ，２５ａ    先端部
３０              カバープレート
３２              嵌合穴
４０              空間
【図１】
2007303958.tif 000003
【図２】
2007303958.tif 000004
【図３】
2007303958.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2007303958.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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