(57)【要約】【課題】EHECおよびレジオネラ属菌を含む病原細菌の型別検査方法として、テキストデータとして蓄積できる塩基配列の多型による型別検査方法を提供する。【解決手段】病原細菌の型別を検査する方法。前記病原細菌の遺伝子中に存在する互いに相同性が高い複数の塩基配列領域に含まれる一塩基多型を同定し、得られた一塩基多型情報に基づいて遺伝子型別を決定する。前記病原細菌は、腸管出血性大腸菌であり、前記相同性が高い塩基配列領域は前記大腸菌のプロファージゲノム配列中に存在する。前記病原細菌は、ジオネラ属菌である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原細菌の型別を検査する方法であって、
前記病原細菌の遺伝子中に存在する互いに相同性が高い複数の塩基配列領域に含まれる一塩基多型を同定し、
得られた一塩基多型情報に基づいて遺伝子型別を決定する、前記方法。
【請求項２】
前記相同性が高い複数の塩基配列領域は、細菌ゲノム上に存在するDNA配列であり、細菌集団内で適度な多型を有する塩基配列領域、あるいは機能しているプロファージ中の領域、インサーションシーケンスまたはトランスポゾンに含まれる塩基配列領域から選ばれる請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記一塩基多型の同定は、前記相同性が高い塩基配列領域中の塩基配列であって、塩基数が1000bp以下であり、1〜10個の一塩基多型が含まれ、一塩基多型以外の塩基配列は同一である一塩基多型同定配列について行う、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記一塩基多型の同定を、前記一塩基多型同定配列を増幅し得るプライマーを用いたサイクルシーケンス法または転写シーケンス法により行う請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記一塩基多型同定配列中のプライマーがハイブリダイズする配列が、サイクルシーケンス法または転写シーケンス法用のプライマーの塩基配列と100%の相同性を有するように、プライマーを設計する請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記相同性が高い塩基配列領域は、前記病原細菌の遺伝子中に2つ以上存在する塩基配列領域から選択する請求項1〜5のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記病原細菌が腸管出血性大腸菌であり、前記相同性が高い塩基配列領域は前記大腸菌のプロファージゲノム配列中に存在する請求項1〜6のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記腸管出血性大腸菌が、ベロ毒素産生に関わる大腸菌である請求項7に記載の方法。
【請求項９】
大腸菌が、大腸菌O157または大腸菌O26である請求項7または8に記載の方法。
【請求項１０】
前記プロファージゲノム配列がVTプロファージゲノム配列である請求項7〜9のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記大腸菌における一塩基多型同定配列が、配列表の配列番号1〜4のいずれかの塩基配列を有する領域にある請求項7〜10のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記病原細菌がレジオネラ属菌であり、前記相同性が高い塩基配列領域は、前記レジオネラ属菌のゲノム配列中に存在する請求項1〜5のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記レジオネラ属菌における一塩基多型同定配列が、配列表の配列番号23、26、27、29、30、31、34、および35のいずれかに記載の塩基配列を有する領域にある請求項12に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病原細菌、腸管出血性大腸菌およびレジオネラ属菌を型別する方法に関する。特に本発明は、MLST(Multilocus Sequence Typing)を用いた腸管出血性大腸菌の型別検査方法およびレジオネラ属菌の型別検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腸管出血性大腸菌の検査方法
腸管出血性大腸菌（Enterohemorrhagic E.coli; EHEC）は、1982年にアメリカのオレゴン州およびミシガン州で発生したハンバーガーを原因とする出血性大腸炎患者の下痢便から血清型O157:H7の大腸菌が分離され、広く知られるようになった。この大腸菌は、ベロ細胞に対する細胞毒性を有する毒素（ベロ毒素と呼ばれる）を産生する。このベロ毒素が、志賀赤痢菌が産生する志賀毒素に対する抗体で中和されることがわかり、志賀様毒素あるいは志賀毒素とも呼ばれ、さらに腸管出血性大腸菌は、ベロ毒素産生大腸菌（Verotoxin-producing E.coli; VTEC）あるいは志賀様毒素産生大腸菌（Shiga-like toxin producing E.coli; SLTEC）、あるいは志賀毒素産生大腸菌（Shiga toxin-producing E.coli; STEC）とも呼ばれる場合がある。
【０００３】
O157を代表とするEHECは、平成8年8月に伝染病予防法による指定伝染病扱いとなった。さらに、平成14年4月からは、新しい感染症法による三類感染症扱いとなり、診断した医師は届出する義務を負い、家族あるいは関係者の喫食調査、検便等の行政的な対応処置が行われ、更なる感染の拡大を防止するための処置がとられる。この行政的な対応時には、しばしば徹底的な細菌検査が行われる。医療機関から分離された患者由来分離株や関係者の検便から分離された分離株については、その感染源特定のために同一の株がどうか特定することが必要となる。以下、その検査方法を記述する。
【０００４】
患者糞便から菌を分離する場合は、特定の血清型大腸菌（例えばO157）が検出されるかどうか。また、EHECの病原因子であるベロ毒素遺伝子stx1あるいはstx2をPCRあるいはハイブリダイゼーションによって検出する。あるいは、ベロ毒素（VT1とVT2、あるいはStx1とStx2と表現するが以後、VT1およびVT2という表現を用いることにする）の産生を逆受身ラテックス凝集反応によって確認する。さらに、患者便中のO157膜抗原（LPS；リポポリサッカライド）やベロ毒素（VT1とVT2）を、金コロイド標識抗体を用いた免疫濾紙法で検出する方法も利用することができる。ここで示したO157のLPSに対する抗体あるいはベロ毒素（VT1とVT2）に対する抗体を感作した金コロイド標識を用いた検出キットは既に市販されている。従って、このような検出キットを使用することによって、簡単に腸管出血性大腸菌の有無を調べることが可能となっている。
【０００５】
しかし、公衆衛生上は、腸管出血性大腸菌だけではなく、サルモネラ、腸炎ビブリオ、赤痢等の腸管感染症（食中毒を含む）の大規模化あるいは散在的集団発生（diffuse outbreak）即ち、一見散発事例の多発に見えるが、実は同じ感染源により起こっている集団事例が大きな問題となっている。近年の食糧流通の国際化あるいは国内流通量が増加するなかこのような事件の大規模化のリスクは常に存在しており、その危険性は年々増加していると言っても過言ではない。この感染の拡大を未然に防ぐためには、迅速な感染源の究明および除去が不可欠となる。そのためには、１）患者情報、食品等の情報をもとにした食中毒・感染症の疫学的解析と、２）その情報を科学的に裏付けするための菌学的解析結果の二面からの総合判断が重要となる。２）の菌学的解析方法としては、パルスフィールド電気泳動（pulsed-field gel electrophoresis; PFGE）が行なわれてきており、感染症の集団発生及びdiffuse outbreakを迅速に検知し、その感染の拡大を防ぐことに貢献している。またこの広域腸管感染症は、しばしば汚染輸入食品を原因とする場合があり、海外からの輸入食品の増加している現在、その危険性は高くなることはあっても減少することはないであろう。従って、今後、それらに迅速に対応するためには、日本だけでなく、国際的なネットワークの構築が重要であり、国際的に使用できる菌学的な解析方法のプロトコールと技術の精度管理およびデータベースの作成が不可欠である。このような観点から、現在頻繁に用いられているPFGE法は、その結果を画像として蓄積するため、研究室間のデータの互換性に欠け、データベース化にはまだまだ問題があることが指摘されている。
【０００６】
これまで説明してきたEHECのPFGEの目的は、本菌を原因とする感染症の伝播様式を解明することであり、そのための分子疫学的解析(molecular epidemiology)法の一種である。そのほかの分子疫学的方法は勿論開発され続けているが、多くの理由からPFGEの有効性が認められており、現在では分子疫学的解析法の標準的な解析法（デファクトスタンダード）として確立している。勿論、EHECだけでなく、その他の病原細菌の分子疫学的解析法としても有効性が認められていることは言うまでもない。しかしながら、PFGEは、一般的に電気泳動後、制限酵素処理された細菌染色体DNAの断片の大きさに依存したパターンを所謂「指紋(fingerprint)」と表現するため、同一ゲル中で比較した場合問題はないが、同一の試料でも泳動装置や泳動ゲルが異なると、同一パターンが再現できないことがしばしば起こる。この再現性を良くするためには、標準化された作業手順の構築が必要である。しかしながら、どんなに注意深く実験を行っても完全に満足する再現性を得ることは極めて難しいことがよく知られている。従って、このような欠点を克服する新しい解析方法の開発が望まれているが、未だ満足する方法は報告されていない。
【０００７】
ここでさらに細菌の分子疫学的解析の意味を詳細に説明する。ヒトに病気を引き起こす細菌は、日和見感染原因菌を含めると1,000種類にも及ぶという。この病気の原因になっている細菌を同定することは、その治療には勿論、感染力の強いものであればさらにその病気の拡大を防止する目的からも非常に重要である。従って、原因菌の検査の目的は、大局的には、治療と拡大防止の２点から考える必要があり、その基本は、細菌の分類と同定である。前者については、細菌の様々な性質を利用して、その細菌の属、種レベルあるいは亜種レベルで同定する。例えば、赤痢菌と大腸菌の鑑別には、特別な培地中での特定の栄養素の資化能力、運動性、細菌表面の膜抗原の型別によって通常行われる。しかし、これらの表現形質の疫学的価値はそれほど高くはなく、伝播様式を推定することは不可能である。疫学的価値の高い形質を探る方法として注目を集めだしたのは、遺伝子型別法である。細菌のDNAには、細菌自身の染色体DNAと細菌の生育には直接関与しないエピゾームとして知られるプラスミドやファージDNAがあり、これらが遺伝子型別法の対象となる特徴を備えている場合がある。このなかで、染色体外遺伝因子であるプラスミドやファージは細菌の培養条件や長い間に脱落すると、例えばプラスミドに薬剤耐性遺伝子が存在している場合、プラスミドの脱落は菌の薬剤耐性能力を失うという結果となる。従って、一般にはプラスミドやファージ遺伝子を対象にした解析は、安定性に欠く方法であると言われている。しかし、たとえ染色体DNAであっても増殖過程で変異した状態で、蓄積する可能性は否定できないため、現在、完全な解析方法はないと言っても過言ではない。しかし、公衆衛生上重要な細菌については、しばしばこの遺伝子型別の需要は少なくないのが現状である。ここで伝播様式を推定するような疫学的解析を目的とした解析法に求められる遺伝子多型解析の条件となる要件としては、(1)適度な多型性を示し、(2)その多型の頻度を示すデータがある程度揃っていること（データベース化されている等）、(3)通常の検査中やヒトへの数回の感染で変異がはいりにくいことなどがあげられる。これらの条件が揃った型別法は、アウトブレイクなのかどうか、あるいは感染ルートや感染源の特定を推定する材料となり得るが、さらに、行政的には迅速な結果を要求されているのが現実である。
【０００８】
さらに、病原微生物による院内感染が問題となっている。特に細菌による病棟内アウトブレイクは重要な問題である。医療の現場で様々な抗生物質の使用による耐性菌の出現や、高齢化により免疫力が低下し、日和見感染を起こしやすい患者が増加していることから、これまであまりヒトへの病原性は知られていなかった弱毒菌による院内感染のリスクが高まっている。従って、病院内感染が疑われる場合、それが流行感染（epidemic）なのか慢性感染(endemic)なのかを判定することが、感染症管理上、極めて重要となっている。MRSA（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）、VRE（バンコマイシン耐性腸球菌）や緑膿菌に関して、アウトブレイクを疑った時に、これまで分子疫学的解析から有効な情報が得られており、非常に有効な解析方法となっている。
【０００９】
以上のような現状から感染症の分子疫学的解析というと、従来は、生物の進化の観点に基づく系統発生的研究の意味合いが強かったが、現在では、「感染症原因菌の遺伝子レベルでの感染源調査」の意味として定着しつつある。
【００１０】
分子疫学的解析法として、デファクトスタンダードとして定着しているPFGEは、先進国で問題となっている腸管出血性大腸菌を原因とする感染症の感染源調査に非常に威力を発揮し、感染源ルートの特定に利用されている。しかし、コスト的な問題、データの蓄積性の問題等を考えると、PFGEは必ずしも完璧な解析法ではなく、現在、PCR産物のダイレクトシークエンス法やDNAマイクロアレイ法など今後期待される解析方法であるが、未だ研究開発段階であり実用化されているとは言いがたいのが現状である。
【００１１】
また、最近、感染症の原因菌の分子疫学的解析法として、塩基配列の多型を利用したMultilocus Sequence Typing (MLST)が開発されている[Maiden,M.C.J., et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 95:3140(1998)(非特許文献1)]。この方法は、７つのハウスキーピング遺伝子（生物が生きるために最低限必要な遺伝子のこと）をターゲットとして、塩基配列を決定し、その配列多型の組合せに基づいて、ある細菌集団の微視的な系統関係を明らかにすることを可能とする。しかし、この方法は、大腸菌や腸炎ビブリオなどの細菌については、あまり有効性は高くないとされている。この種の細菌では、ハウスキーピング遺伝子由来の多型、腸管出血性大腸菌O157に関してはほとんどない[Anna,C., et al. J.Clin.Microbiol., 41:675(2003)(非特許文献2)]、また腸炎ビブリオに関しても世界的な流行株のMLST解析の結果からも同一であり、ほとんど多型は見られなかった[Chowdhury,N.R., et.al. J.Clin.Microbiol., 42:1280(2004)(非特許文献3)]。一方では、病原細菌であるナイセリア菌（Neisseria;髄膜炎の原因菌）や食中毒菌として知られるカンピロバクター（Campylobacter）では、MLSTの有効性が高いことが知られている[ナイセリア菌の場合は、特にMaiden,M.C.J., Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 95:3140(1998)(非特許文献4); カンピロバクターの場合は、Dingle,K.E., et al. J.Clin.Microbiol., 39:14(2001)(非特許文献5)に詳しい]。従って、ハウスキーピング遺伝子を対象としたMLST法は、細菌種によって、その有効性が異なることを意味していると思われる。
【００１２】
レジオネラ属菌の検査方法
レジオネラは、呼吸器感染症であるレジオネラ症の原因菌のグラム陰性桿菌に分類される細菌である。近年、その発症が給水・給湯設備、空調設備などに関係することや、この菌が冷却塔や一般の環境水中に生息していることが広く知られるようになった。さらに、わが国において高齢化の進行や社会環境が大きく変化するなかで、レジオネラ症の発生率はこれまで以上に高くなる可能性があり、その防止を図ることは公衆衛生上極めて重要となっている。また、レジオネラ属菌は主に呼吸器系に侵入し、マクロファージの貪食作用で取り込まれるが、マクロファージの殺菌作用から逃れ、逆に細胞内で増殖することによって症状が現れると考えられている呼吸器系の感染症である。本来、環境中の原生生物（アメーバやテトラヒメナなどの繊毛虫など）を宿主として増殖するライフスタイルを持っているが、近年、24時間循環風呂や温泉やスパ施設の増加に伴い、全国的にレジオネラ症と思われる肺炎が増加しつつある。従って、EHECのようにヒトからヒトへと感染するようなことは少ないものの、入浴施設を感染源とした大規模な感染症の発生の可能性も指摘されており、決して軽視できるものではなく、感染源特定の要望が強い感染症である。従って、レジオネラについても多くの型別法が開発されており、感染源特定のための疫学的な利用が検討されている。しかし、レジオネラ属の検査は、人工寒天培地上での生育が遅く時間のかかる検査となる。通常は、10日ほど、検査には必要である。従って、迅速な検査法あるいは遺伝子型別法の要望は強い。
【００１３】
ここでレジオネラの検査方法について概説する。レジオネラ属菌の検査についての具体的な方法については、環境水中については、厚生省生活衛生局企画課監修「新版  レジオネラ症防止指針」（財団法人  ビル管理教育センター）がある。また、レジオネラ症疑い患者検体からの検査方法については、「病原体検出マニュアル」（地方衛生研究所全国協議会・国立感染症研究所編、平成15年）に詳しく記載されていることを申し添える。
【００１４】
両マニュアルに記載されている方法は、基本的に同様なので、ここでは環境水中のレジオネラ属菌の検査方法について概説する。検水中のレジオネラ属菌の検出限界を最低10CFU/100ml（CFU: Colony Forming Unit）とするため、検水は最低でも100mLまたはそれ以上必要である。また、レジオネラ属菌数が102CFU/100mL未満と推定されるときは検水を濃縮する。濃縮方法は、(1)冷却遠心濃縮法、(2)ろ過濃縮法、(3)フィルター貼付法がある。(1)冷却遠心濃縮法の場合は、検水200mLを滅菌遠心管に入れ、15〜25℃、5000〜7000 rpm、30分間遠心する。上清を捨て、2mLの滅菌蒸留水でよく洗い、沈渣を懸濁する（100倍濃縮）。そして、この懸濁液を50℃20分間加熱する。その加熱液を、レジオネラ属菌の選択培地であるWYOα寒天培地（栄研化学）あるいはGVPC寒天培地（日本ビオメリュー）に100μL接種し、均一に塗布する。接種後のシャーレは裏返しにして密封容器に入れ、36±1℃で培養する。通常培養5日目にはレジオネラ集落数を算定できるまでコロニーが検出されるが10日程度まで観察する。培養5日目にレジオネラ属菌と思われる集落を数え、使用した検水中のレジオネラ属菌と思われる菌数を希釈度および接種菌量から概数として求める。しかし、この段階ではレジオネラ属菌以外の菌である可能性も否定できないので、シャーレ上に形成した集落を釣菌し、BCYEα寒天培地およびL-システインを含まない平板培地あるいは血液寒天培地（羊血液寒天培地M58：栄研化学）に画線し培養する。レジオネラ属菌はその生育にL-システインを必要とし、L-システイン不含培地に生育したものはレジオネラ属菌を否定する。培養１〜２日後に、BCYEα寒天培地にのみ生育したグラム陰性桿菌をレジオネラ属菌と推定し、最初の菌数の概数値を修正する。このように検水中にレジオネラ属菌が生存するかどうか、さらにどの程度生存しているのかという結果は、試験を開始してから、少なくとも7〜10日必要である。レジオネラ症患者を診断した医者は、診断から一週間以内に届出することになっている。レジオネラ症は、公衆浴場等の不特定多数の人が利用する施設がその感染の原因になっている可能性が高いので、レジオネラ症患者の発生届出が行なわれた場合、その原因が公衆浴場等であった場合、その利用した不特定多数に広がる危険性があり、公衆衛生上、それを防止するために聞取り調査等の調査が公的機関（保健所等）により行なわれる。そして、この調査の結果、疑われる施設が存在した場合は、その施設のレジオネラ属菌の分離作業が先に述べた検査方法により行われる。また、レジオネラ症に罹患した患者からレジオネラ属菌の分離作業が行なわれる。そして、環境および患者からレジオネラ属菌が分離された場合、その分離菌の性質を調べ、その性質が同一の場合、通常、その施設が原因施設として断定される。
【００１５】
このとき実施される型別法として、PFGEが現在の標準的な遺伝子型別方法となっており、その検査は、主に公的試験研究施設で行なわれている。先に述べたとおり、PFGEはその結果が出るまで、5日〜7日程度必要であり、レジオネラ属菌の場合、分離培養から換算すると2週間以上は必要であり、公衆衛生上のこの感染症のコントロールという点では、非常に時間がかかるということ、およびPFGE法は画像診断という点で、データベース化しにくく、過去に流行した分離株との遺伝的な関係を調べるには、さらに時間と検査担当者の知識が必要であるという点で改善の要望が強い。また、分離菌株の血清型を市販のレジオネラ抗血清で型別するという血清型別も可能である。レジオネラは、血清群としてLegionella pneumophilaにおいては、15群に分けられており、さらにL.bozemanii, L.micdadei, L.dumoffii, L.gormanii, L.longbeachaeの血清も既に市販されている（デンカ生研）。しかし、この血清群型別は、レジオネラ症の患者から分離される血清型の約８０％は血清群１であるため、感染源を特定するといった疫学調査にはほとんど利用できない状況である。現在、社会的な環境が大きく変化している中で、旧来の銭湯形式の公衆浴場は減るなかで、温泉を利用した施設、ジャグジーやサウナ等を併せた公衆浴場が各地に建設され、また大型化するなかで、適切な衛生管理がなされない場合、レジオネラ症が大発生する可能性は高くなっている。従って、公衆衛生上、公共施設での衛生管理の徹底は当然として、検査方法の迅速化と正確な型別のできる方法の要望は強い。
【００１６】
以上のような状況のなかで、レジオネラの遺伝子型別法として、塩基配列多型を利用した方法が開発されている[Ko,K.S., et al. J.Bacteriol., 184:2123(2002)(非特許文献6); Gaia,V., et a. J.Clin.Microbiol., 43:2047(2005)(非特許文献7)]。いわゆる、MLST法は、前述したように、ハウスキーピング遺伝子を対象として７遺伝子を対象として解析される[非特許文献1]。レジオネラの場合も、ハウスキーピング遺伝子や、病原性に関する遺伝子を対象として配列多型解析の対象とされているが、その解析の解像度は疫学的な解析のためには低いことが報告されている[Aurell,H., Appl.Environ.Microbiol., 71:282(2005)(非特許文献8); Amemura-Maekawa,J., et al. Microbiol.Immunol., 49:1027(2005)(非特許文献9)]。
【非特許文献１】Maiden,M.C.J., et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 95:3140-3145 (1998)
【非特許文献２】Anna,C., et al. J.Clin.Microbiol., 41:675(2003)
【非特許文献３】Chowdhury,N.R., et.al. J.Clin.Microbiol., 42:1280(2004)
【非特許文献４】Maiden,M.C.J., Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 95:3140(1998)
【非特許文献５】Dingle,K.E., et al. J.Clin.Microbiol., 39:14(2001)
【非特許文献６】Ko,K.S., et al. J.Bacteriol., 184:2123(2002);
【非特許文献７】Gaia,V., et a. J.Clin.Microbiol., 43:2047(2005)
【非特許文献８】Aurell,H., Appl.Environ.Microbiol., 71:282(2005)
【非特許文献９】Amemura-Maekawa,J., et al. Microbiol.Immunol., 49:1027(2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
しかし、上記MLST法は、固有の分離株の塩基配列による違いにより分離株を特定するものであるから、そのデータは、別な表現を用いれば、デジタルデータとして蓄積することが容易であり、アナログデータとして位置づけられるPFGEの画像データと比べるとその利便性は非常に優れているのは自明である。
【００１８】
したがって、EHECおよびレジオネラ属菌を含む病原細菌の型別検査方法として、このテキストデータとして蓄積できる塩基配列の多型による型別検査方法が利用できれば、その分子疫学的な有用性は計り知れず、そのような方法の開発が望まれている。
【００１９】
そこで本発明の目的は、EHECおよびレジオネラ属菌を含む病原細菌の型別検査方法として、テキストデータとして蓄積できる塩基配列の多型による型別検査方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
塩基配列の多型を利用した理想的な型別法は、分離株ゲノムの全塩基配列を解析し比較することであろう。しかし、細菌ゲノムプロジェクトの進展が目覚しいものがあるとしても、分子疫学的な解析を目的にした場合、膨大なコストと解析能力が必要となり、将来にわたっても現実的ではない。
【００２１】
この目的のためにもっとも有力な方法は、MLST法であろう[非特許文献4]。この方法は、もともとは７つのハウスキーピング遺伝子（生物が生きるために最低限必要な遺伝子のこと）をターゲットとして、塩基配列を決定し、その配列の違い、即ち多型を検出し、その多型の型（Sequence type）の組合せに基づいて、ある細菌集団の微視的な系統関係を明らかにしようとするものである。この方法を分子疫学的手法に使用する場合は、細菌集団内にある程度の配列多型が存在する必要がある。
【００２２】
病原細菌であるナイセリア菌（Neisseria;髄膜炎の原因菌）や食中毒菌として知られるカンピロバクター（Campylobacter）では、MLSTの有効性が高いことが知られている[ナイセリア菌の場合は、特にMaiden,M.C.J., et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 95:3140(1998); カンピロバクターの場合は、Dingle,K.E., et al. J.Clin.Microbiol., 39:14(2001)に詳しい]。しかし、腸管出血性大腸菌O157に関してはほとんどない[Noller,A.C., et al. J.Clin.Microbiol., 41:675(2003)]と報告されており、また腸炎ビブリオに関しても世界的な流行株のMLST解析の結果からもほとんど多型は見られなかったという報告がされている[Chowdhury,N.R., et.al.  J.Clin.Microbiol., 42:1280(2004)]。従って、ハウスキーピング遺伝子を対象としたMLST法は、菌種によりその有用性が異なることが予想される。この理由について考察すると、先に述べたナイセリア菌については、ゲノム解析が終了している3つの菌株の報告されているゲノムサイズは、220万塩基対前後、カンピロバクターに関しては、2つの株のゲノム配列が報告されているが、170万塩基対ほどである。これに対して、大腸菌やサルモネラといった細菌については、400万〜600万塩基対と、ナイセリア菌やカンピロバクターの２〜３倍ほどサイズが大きく、これによりオープンリーディングフレーム（蛋白質をコードしていると思われる遺伝子のこと）の数も２〜３倍多い。そして、ゲノムサイズの大きな大腸菌やサルモネラには、ゲノムDNAの損傷やDNAポリメラーゼの取り込みミスの校正機構に関わる遺伝子が複数存在するが、ナイセリア菌やカンピロバクターにはこのような遺伝子が少ないことが報告されており、大腸菌やサルモネラでは、ハウスキーピング遺伝子の多型が、ナイセリア菌やカンピロバクターよりも蓄積しにくいものと考えられる。
【００２３】
以上のような理由から、EHECの塩基配列の多型解析による型別を目的とした場合、ハウスキーピング遺伝子を対象としたMLSTでは、公衆衛生上必要な疫学調査を目的とした場合、適していないと考えられる。従って、EHECを対象とした、分子疫学調査目的とする塩基配列多型を利用した型別法を行うためには、遺伝子型別を可能とする遺伝子領域を用いればよいと考えられる。
【００２４】
そこで本発明者は、鋭意研究を行いEHECの塩基配列の多型解析を可能とする新しい遺伝子領域を探索し、分子疫学的調査にも使用可能であることをこれまで、標準的なEHECの型別法として用いられているPFGEと比較して、ほぼ同等の結果が得られる方法の開発に成功し、かつ、この手法がEHEC以外の病原細菌についても適用可能であることを見いだして、本発明を完成した。
【００２５】
本発明は以下のとおりである。
[1]病原細菌の型別を検査する方法であって、
前記病原細菌の遺伝子中に存在する互いに相同性が高い複数の塩基配列領域に含まれる一塩基多型を同定し、
得られた一塩基多型情報に基づいて遺伝子型別を決定する、前記方法。
[2]前記相同性が高い複数の塩基配列領域は、細菌ゲノム上に存在するDNA配列であり、細菌集団内で適度な多型を有する塩基配列領域、あるいは機能しているプロファージ中の領域、インサーションシーケンスまたはトランスポゾンに含まれる塩基配列領域から選ばれる[1]に記載の方法。
[3]前記一塩基多型の同定は、前記相同性が高い塩基配列領域中の塩基配列であって、塩基数が1000bp以下であり、1〜10個の一塩基多型が含まれ、一塩基多型以外の塩基配列は同一である一塩基多型同定配列について行う、[1]または[2]に記載の方法。
[4]前記一塩基多型の同定を、前記一塩基多型同定配列を増幅し得るプライマーを用いたサイクルシーケンス法または転写シーケンス法により行う[3]に記載の方法。
[5]前記一塩基多型同定配列中のプライマーがハイブリダイズする配列が、サイクルシーケンス法または転写シーケンス法用のプライマーの塩基配列と100%の相同性を有するように、プライマーを設計する[4]に記載の方法。
[6]前記相同性が高い塩基配列領域は、前記病原細菌の遺伝子中に2つ以上存在する塩基配列領域から選択する[1]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[7]前記病原細菌が腸管出血性大腸菌であり、前記相同性が高い塩基配列領域は前記大腸菌のプロファージゲノム配列中に存在する[1]〜[6]のいずれかに記載の方法。
[8]前記腸管出血性大腸菌が、ベロ毒素産生に関わる大腸菌である[7]に記載の方法。
[9]大腸菌が、大腸菌O157または大腸菌O26である[7]または[8]に記載の方法。
[10]前記プロファージゲノム配列がVTプロファージゲノム配列である[7]〜[9]のいずれかに記載の方法。
[11]前記大腸菌における一塩基多型同定配列が、配列表の配列番号1〜4のいずれかの塩基配列を有する領域にある[7]〜[10]のいずれかに記載の方法。
[12]前記病原細菌がレジオネラ属菌であり、前記相同性が高い塩基配列領域は前記レジオネラ属菌のゲノム配列中に存在する[1]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[13]前記レジオネラ属菌における一塩基多型同定配列が、配列表の配列番号23、26、27、29、30、31、34、および35のいずれかの塩基配列を有する領域にある[12]に記載の方法。
【発明の効果】
【００２６】
最近の塩基配列決定技術の進展は目覚しいものがあり、特に多本架キャピラリーシーケンサーと検出感度の高い蛍光色素の開発により、同時に複数サンプルの塩基配列の決定を行うことが出来るようになった。この進展により、ヒトゲノム解析が完成したことは記憶に新しい出来事である。そして、現在、われわれは、鋳型調製から、塩基配列決定まで迅速に行うことが可能となっている。
従って、このような塩基配列決定技術の進展、即ち、塩基配列決定用試薬の進展（サイクルシークエンス法あるいは転写シークエンス法のいずれかを使用する）、さらにシーケンサーの普及により、分離株ごとの塩基配列多型を利用した型別方法は、今後、さらに利用しやすくなってくるであろう。そして、将来的には、臨床検査分野での普及も考えられる。
【００２７】
このような背景のなかで、本発明は、特に先進国と言われている国で問題となっているEHEC感染症の伝播ルートの解析、EHECの伝播中の進化の様子を解析することを容易し、本感染症の制御に役立つものと考えられる。したがって、このような情報は、将来的に本感染症の予防にも応用可能であると考えられ、公衆衛生上の貢献だけでなく、検査試薬の供給、解析サービス、情報の還元等、産業上にも大きく貢献すると考えられる。
【００２８】
さらに本発明によれば、解像度の高い塩基配列の多型による型別検査方法を提供することができ、レジオネラ属菌について、迅速な検査法を提供し、公衆衛生上の貢献は大きい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明は、病原細菌の型別を検査する方法である。この方法は、前記病原細菌の遺伝子中に存在する互いに相同性が高い複数の塩基配列領域に含まれる一塩基多型を同定し、得られた一塩基多型情報に基づいて遺伝子型別を決定することを含む。
【００３０】
本発明の方法では、互いに相同性が高い複数の塩基配列領域を有する病原細菌であれば、型別し得る。そのような病原細菌としては、腸管出血性大腸菌、Ａ群溶血性連鎖球菌、メシチリン耐性黄色ブドウ球菌、サルモネラ、結核菌、レジオネラ属菌等を挙げることができる。勿論本発明は、ここに細菌種を挙げたがこれに限定されるものではない。
【００３１】
前記相同性が高い複数の塩基配列領域は、例えば、機能しているプロファージ中の領域、インサーションシーケンス（ＩＳ）またはトランスポゾン（Ｔｎ）に含まれる塩基配列領域から選ばれる。機能しているプロファージの例としては、大腸菌のラムダファージ様配列を挙げることができる。大腸菌のゲノム解析の結果から、プロファージ配列が多数見つかっている。このラムダファージ様プロファージは、例えばＳＯＳ誘導を介してファージ粒子形成が可能なプロファージが知られている。特にＥＨＥＣから、例えばＳＯＳ誘導剤として、ＤＮＡ損傷性の抗生物質であるマイトマイシンＣで処理することによって、VT遺伝子を含んだファージ［Shiga-toxin converting phageと呼ばれる；Sato T, et al. J Bacteriol., 185:3966(2003)］が形成される。このことよりファージ粒子を形成するための遺伝子の配列はある程度保存されている可能性が高いと考えれる。従って、ラムダ様配列を示すプロファージを複数コピー持っている大腸菌ゲノム中には、相同性の高い複数の塩基配列領域が存在すると考えられる。また同じようにプロファージが多数存在している病原細菌として、Ａ群溶血性連鎖球菌を挙げることができる［Ferretti,JJ., et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 98:4658(2001)］。
【００３２】
インサーションシーケンスの領域の例としては、例えば、腸管出血性大腸菌であれば、IS629やIS1203、サルモネラ属であればAS1230, IS1351等、結核菌であればIS1239やIS1562を挙げることができる。
【００３３】
またトランスポゾンの領域の例としては、トランスポゾン機能領域の末端部分に存在するインサーションシークエンスユニットを挙げることができる。
【００３４】
ここで述べた、機能しているプロファージ、インサーションシーケンス（ＩＳ）またはトランスポゾン（Ｔｎ）の塩基配列はいずれも公的な塩基配列データベースから簡単に入手可能である。例えば、http://www.ddbj.nig.ac.jp/  を挙げることが出来る。
【００３５】
上記のような、機能しているプロファージ中の領域、インサーションシーケンスまたはトランスポゾンに含まれる塩基配列領域から、相同性が高い複数の塩基配列領域を選択するには、例えば、以下のような方法を用いることができる。
現在、細菌ゲノム配列の解析が進んでおり、同種の細菌においても複数の株のゲノム配列が報告されるようになっている。従って、しばしばその配列中にプロファージ、インサーションシーケンスまたはトランスポゾンが見つかっている。従って、相同性の高い複数の塩基配列領域を選択するためには、多数の株から報告されている相同性の高い領域をデータベース中から抽出し、多型が存在するかどうか、あるいはPCRのためのプライマーが設計可能な領域が存在するかどうかを検討する。
【００３６】
後述する大腸菌の例では、相同性が高い塩基配列領域は、機能しているプロファージ中の領域であるプロファージ領域からを選択した。この点について、さらに後述する。
【００３７】
前記一塩基多型の同定は、前記相同性が高い塩基配列領域中に存在する塩基配列であって、塩基数が1000bp以下であり、1〜10個の一塩基多型が含まれ、一塩基多型以外の塩基配列は同一である一塩基多型同定配列について行うことができる。
さらに、この一塩基多型の同定は、前記一塩基多型同定配列を増幅し得るプライマーを用いたサイクルシーケンス法または転写シーケンス法により行うことができる。さらに、サイクルシーケンス法または転写シーケンス法による場合、一塩基多型同定配列のプライマーがハイブリダイズする配列が、サイクルシーケンス法または転写シーケンス法用のプライマーの塩基配列と100%の相同性を有するように、プライマーを設計する。プライマーの設計について、以下に説明する。
【００３８】
多数の分離株を用いたMLSTを行う場合のプライマーの設計方法
設計ポリシー
臨床あるいは環境分離株からゲノムDNAを抽出し、本発明の方法(MLST解析)のための鋳型とする場合、ゲノム配列あるいは遺伝子構成の多様性を示す複数の遺伝子座で示す必要がある。従って、プライマーの設計は充分吟味する必要がある。この注意を怠ると途中でプライマーが使用できなくなる可能性が生ずる。また、PCRに続いて、これを鋳型として塩基配列決定を行う場合は、PCRの効率等を考慮すると増幅サイズを長くする必要はなく、500〜1000塩基程度が増幅サイズとして適当である。
【００３９】
設計方法
1.プライマーのアニーリング部位の絞込み
A)ターゲット遺伝子あるいは領域は、遺伝子機能に重要な領域があるか、塩基置換が蓄積しやすい（特に蛋白質コード領域のコドンの第3番目の塩基は変化しやすい傾向にある）領域かを見極める必要がある。
B)ターゲット領域を大まかに決定する（蛋白質をコードしているか、500〜1000塩基程度の増幅が可能かどうか）。必要であればMegaBlastプログラム等を利用する。
2.ターゲット領域の配列を用いて、DDBJのWebサービスのひとつBlastサーチを行う。
A)結果から、相同性の高い遺伝子がどの程度、データベース中にあるのか注意する。そのうち、相同性の高いものについて、ACCESSION No.を参考にダウンロードする。
3.ダウンロードした配列の相同性解析
A)ダウンロードした配列は、遺伝子解析ソフト中にある相同配列を並列に並べるソフトを利用して、多重並列配列として表示する。例えば、ソフトとしてはMEGA３という塩基配列の系統関係を解析するアプリケーションソフトウェアを利用するとよい。この解析によって、相同性の高い領域あるいは低い領域を見極める。
4.プライマーの設計
A)MLST解析を行う場合、複数のプライマー対を用いて同時にPCR反応を行うことになる。従って、使用するプライマーは、Tm値等揃える必要がある。このためには、プライマー設計用のアプリケーションソフトで、検索条件を対照の遺伝子すべてにたいして常に同一とする。この条件に基づいて出てきた配列が、先の多重並行配列結果の相同性の高い領域にアニールする配列があるかどうかを調べる。その場合、増幅サイズが500〜1000塩基対になるように使用するプライマーの組み合わせが可能かどうか注意する。この段階では、出来るだけ複数の組み合わせができるように複数の配列を選択する。
B)このように選択したプライマーの配列を再度、DDBJのWebサービスのBlastサーチを行う。この結果を見て、例えば、解析対象の細菌ゲノムの他の遺伝子にヒットしていないか等、PCRに使用する鋳型の形状（純粋分離菌のゲノムを使用する、あるいは様々な細菌が混在するような鋳型等）を考慮して、PCR時のノイズになる可能性を確認し、ノイズになりそうな配列は排除する。
5.プライマーの確認
A)実際に、上記の検討を経たプライマー配列は、予算の許す限り、複数合成を依頼する。そして、実際の鋳型を用いてPCRを行い、増幅度を調べる。必要であれば、PCRのサイクル条件等を検討し、特異性が高く、増幅効率のよいPCRサイクルを見つける。
【００４０】
上記説明は、主に、サイクルシーケンス法用のプライマーについてであるが、転写シーケンス法用のプライマーについてもほぼ同様にしてプライマー設計することができる。ただし、サイクルシーケンス法用のプライマーの場合は、PCR用に設計したプライマーの5'末端側に転写シークエンスを行う際に必要な対応するRNAポリメラーゼに特異的に機能するプロモーター配列を付加する。これにより、RNAポリメラーゼによる転写シークエンスを行うことが可能になる。RNAポリメラーゼに特異的に機能するプロモーター配列の例は後述する。
【００４１】
本発明の病原細菌の型別を検査する方法は、特に、病原性大腸菌を対象とする場合に有効であり、病原性大腸菌として、腸管出血性大腸菌を挙げることができる。さらに、腸管出血性大腸菌は、ベロ毒素産生に関わる大腸菌である大腸菌O157または大腸菌O26であることができる。しかし、この二つの血清型の腸管出血性大腸菌に限定するものではない。ベロ毒素産生に関わる大腸菌は、すべて本方法の対象になると考えられる。
【００４２】
病原細菌が腸管出血性大腸菌である場合、前記相同性が高い塩基配列領域として、前記大腸菌のプロファージゲノム配列中に存在する領域を用い、プロファージゲノム配列としては、例えば、VTプロファージゲノム配列を挙げることができる。さらに、大腸菌における一塩基多型同定配列は、VTプロファージゲノム配列に含まれる、配列表の配列番号1〜4のいずれかの塩基配列を有する領域であることができる。
【００４３】
以下、腸管出血性大腸菌の型別を例に、さらに本発明を詳細に説明する。
【００４４】
大腸菌は脊椎動物の腸管常在菌であり、そのほとんどは非病原菌か易感染宿主においてのみ病原性を発揮する日和見感染菌であるが、しかし、病原性大腸菌と呼ばれる一部の菌株がヒトに病原性を発揮する。病原性大腸菌は腸管外感染症を起こすものと腸管感染症を起こすもの（下痢原性大腸菌とも呼ばれる）に大きく分かれる。さらに下痢原性大腸菌は、産生する毒素の種類や細胞への付着様式の違いによって少なくとも5種類の病原型に分類されており、それぞれ異なった病態と疫学パターンを示す。このうち、最近、日本を含む先進諸国で問題になっているのがEHECである。特に1996年に大阪・堺市で発生した集団感染の際に多くの患者から分離されたO157:H7株（大阪大学微生物病研究所附属エマージング感染症研究センター微生物株保存室・保存株番号RIMD0509952、O157:H7 Sakaiまたは堺株と呼ばれている）は有名で、非常に少ない菌量で感染が成立することから極めて高い感染性を持ち、さらに溶血性尿毒症症候群（HUS）や脳症といった重篤な合併症を数％の頻度で引き起こすため、その集団感染の迅速な検知および疫学的解析が必要であった。それ以後も、毎年各地で多数の散発例や小規模な集団感染（同一の汚染食材の流通によって広域に被害が発生する"diffuse outbreak"も発生している。従って、公衆衛生上、EHEC感染症拡大を防止するために、行政的な処置を的確におこなうことが求められており、そのための手段として、遺伝子型別による感染源調査が行われている。
【００４５】
一方ではEHECの社会的な重要性から、本菌のゲノム解析が、2つの研究グループでおこなわれた。 [Hayashi,T., et al. DNA Res., 8:11-22(2001)；Perna,N.T., et al. Nature, 409: 529(2001)]。また、これらのゲノム配列はそれぞれ、産業上の利用価値の高さから特許申請されている[特開2002-355074；United States Patent 6,365,723]。特に前者の研究グループの配列データは、品質の高い完全なゲノム配列であるとされている。しかしながら後者の配列には、当初、ギャップを残した不完全なものであった。従って、本発明者らは、以後、前者の配列データを主に使用して様々な検討を行った。
【００４６】
このHayashiらによって報告されたO157:H7堺株のゲノムサイズは、5,498,450bpの環状DNAであり、2つのプラスミドを含んでいた。この配列の決定によって、非病原性大腸菌（K-12と呼ばれる実験室株）のゲノム配列と比較することによって、EHEC感染症の病態に直接関係する病原性関連遺伝子が特定されることが期待され、実際に検討された[Hayashi,T., et al. DNA Res., 8:11-22(2001)；未来開拓学術研究推進（ミレニアム関連）事業  微生物のゲノム配列解析による病原性と有用遺伝子システム解明  平成12〜14年度  研究成果報告書]。これによると、O157とK-12のゲノム配列の比較の結果、O157の染色体はK-12（4.6 Mb）よりも859Kbも大きかった。また、全長で4.1Mbにおよぶ領域は両株間で非常によく保存されており、この領域は98%以上の相同性でアラインメント可能であった。この4.1 Mbの領域内にはゲノムの再編成はみられず、各遺伝子は同じ順序で存在した。両株は最も遠い系統遺伝学的関係にある大腸菌グループに属するため、この4.1 Mb領域は大部分の菌株保存されている大腸菌染色体基本骨格であると予想された。しかし、このゲノム基本骨格には様々なサイズのDNA断片が至るところに挿入されていた。これらのDNA断片は各々の菌株に特異的であり、これらは菌株特異的ループと定義された。O157特異的ループ（S-loop）の総計は約1.4 Mb、K-12特異的ループ(K-loop)の場合も約0.5 Mbであった。このループにおいて20bp以上のものは、O157で296、K-12で326であった。菌株特異的領域の多くは共通領域の塩基組成と大きく異なり、外来性DNAであることが示唆された。そして、大きなループのほとんどがプロファージあるいはプロファージ様エレメントであった。
【００４７】
さらに詳しく述べると、O157のこの大量の外来性遺伝子獲得には、ISエレメントやバクテリオファージなどの可動性遺伝子が大きな役割を果たしていると予想された。ISエレメントは全部で24種類、合計で96コピー存在している。その中で最も多いのがIS629であり、構造的に機能していると思われるコピーだけでも17個存在する。そして、O157特異的な配列のほとんどはプロファージないしはプロファージ様エレメントである。明らかにファージと判定できるものだけでも18種類が存在し、O157特異配列の約半分を占める。さらにプロファージエレメントも6種類存在する。それらを加えるとO157特異配列の約3分の2がファージまたはファージ様エレメントということになる。そして、この18個のファージのうち、13は互いに非常に良く似たラムダ様ファージであり、ほとんど同一の塩基配列をもつ領域も存在する。EHECの大きな特徴である毒素遺伝子であるstx1及びstx2もファージゲノム中に含まれるが、これらのファージゲノム中には、stx以外の様々な病原性関連遺伝子などが存在し、病原菌O157の進化を考える上で重要である。ひとつの菌株にこれほど良く似たファージが集積し、しかもある程度安定に保持されており、このメカニズムに関しては大変興味深い。そして、このように集積したファージゲノムが、大腸菌がさまざまな動物宿主に対して、病原性を進化させる多様性のメカニズムの原動力であることが明らかになってきた。このO157：H7堺株のゲノム配列はWWWサイトで閲覧と様々な検索が可能である[http://genome.gen-info.osaka-u.ac.jp/bacteria/o157/]。
【００４８】
そこで本発明者は、このO157に特異的に存在するプロファージゲノム配列中の遺伝子領域をターゲットとしたMLST法の開発を目的として、遺伝子配列の多型解析に基づいた型別法を可能とするプロファージゲノム配列中のターゲットとする領域を探索した。
【００４９】
さらに詳細に記述すると、EHECの本来の定義は、VT1またはVT2を産生し、attaching and effacing(A/E) lesionと呼ばれる特殊な形態変化を引き起こし腸管上皮に粘着し、溶血毒素などがコードされている90Kb程度の大型プラスミドを保有する大腸菌であり、血性の下痢と激しい腹痛を主症状とする出血性大腸炎の原因となる大腸菌である。そして、このようなEHECには複数のラムダ様ファージが溶原化していると思われる。従って、ラムダ様ファージゲノム上の配列の多型を利用できないかと本発明者は考えた。複数のラムダ様ファージが大腸菌ゲノム中に溶原化していることが知られているが、ラムダプロファージは、SOS機能に関係する遺伝子の発現によって、プロファージの遺伝子が誘導され、ファージ粒子の形成、通常は宿主大腸菌の溶菌によって放出されると考えられる。EHEC O157菌体中に複数のラムダ様ファージが溶原化しているということは、多重感染の結果と考えられるが、このような複数のファージには少なからず多型が存在するはずであり、この多型が型別に利用できるはずである。また、ラムダ様ファージということで極めて類似した配列を持っているはずであり、ターゲット遺伝子によっては、共通のプライマー対を用いることで複数の部位のファージゲノム上の配列を同時に増幅することになり、一対のプライマーを用いるだけで多数の部位の、しかも多型も含んだ配列と一緒に増幅することができると考えられる。このような増幅産物を鋳型として、塩基配列決定を行ったとき、多型を示す部位は、複数の塩基が検出されると考えられる。そして、大腸菌の株が異なれば、溶原化しているファージの組み合わせが異なり、この多型部位も異なる可能性が予想される。従って、このような多型が同一であれば、それは同一の株であることが予想され、分子疫学的目的、特に感染源の追跡調査にも利用できると考えられる。
【００５０】
プロファージ遺伝子上の多型解析に利用できる領域の探索は、先ずEHECの大きな特徴のひとつであるベロ毒素産生性にかかわるプロファージゲノムから検討するのは理にかなっていると思われる。このベロ毒素は、VT1およびVT2の二つが知られており、いずれの毒素遺伝子（stx1とstx2）もこのプロファージゲノム中に存在しており、それぞれVT1プロファージあるいはVT2プロファージと呼ばれる。そして、この毒素遺伝子の発現は、プロファージ遺伝子の調節機構を利用して発現し、たとえば毒素産生性大腸菌分離株のベロ毒素の発現は、DNA損傷性抗生物質であるマイトマイシンCで処理する、すなわちSOS誘導が起こるとその産生量が増大し、さらにファージ増殖能を持っているプロファージであれば、ベロ毒素遺伝子も含めてファージ粒子となる。そして、このVT1及びVT2プロファージの配列は簡単に入手することができる。従って、本発明者は、VT１プロファージゲノム[Yokoyama,K., et al. Gene, 258:127-139(2000)；]及びVT2プロファージゲノムの配列[Makino,E., et al. Genes Genet.Syst., 74:227-239(1999)]を入手し、MEGA BLASTというゲノムサイズで配列を比較する時に用いられるアプリケーションプログラムを用い、共通領域を選択した（表２）。このようにして得られた領域は、公的データベース中の配列とBLAST検索を行い、相同性の高い配列を選択し、複数の配列を並列に並べて、さらに相同性の高い領域と低い領域を特定した。前者の領域すなわち相同性の高い領域を用いて、この領域中に遺伝子増幅用（たとえばPCR）のプライマーを設計することによって、複数のファージゲノム上の領域を対象として遺伝子増幅を可能とすると予想される。また、後者の配列には、複数の多型が存在すると予想され、分離株の遺伝子型別を可能とすると期待される。
【００５１】
以上のような解析の結果、VT1及びVT2プロファージ配列中から、５つの相同性の高い領域を選び、それぞれ領域I、II、III、IV及びVとした（図１、２）。この領域に存在するファージ遺伝子の機能については、領域I：Tail fiber protein、領域II：IS629、領域III：Antirepressor protein / Endolysin / host cell lysis、領域IV：Hypothetical protein、領域V：Five hypothetical protein / N6-adenine methylaseであることが示されている（Accession No.AP000400 and AP000422）。これらの領域は、VT1及びVT2プロファージゲノムの比較から得られたものであるが、宿主であるO157では、ラムダ様プロファージは  複数コピー存在することが報告されているが、今回選んだ領域I〜Vを改めて、宿主である大腸菌O157のゲノム配列中から検索したところ、領域I、II、III、IV及びVと相同性が高い領域のコピー数は、それぞれ、20、７、18、17及び15コピーであった（表６）。そして、この領域から、PCR時の増幅効率及び塩基配列決定効率を考慮して、PCR増幅のサイズを1,000塩基対以下で、PCRを可能とする遺伝子増幅用プライマーを複数、設計し、実際に塩基配列多型による型別が可能か検討を行った。
【００５２】
今回、合成したプライマーの名前と配列は表３に、及びこのプライマーの対象とする遺伝子に関する情報は図２に示している。このプライマー対を用いて、EHEC分離株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、増幅産物を確認した。これらの産物の塩基配列を明らかにするため、PCRに用いた同じプライマーを使用した。このようにして得られた塩基配列データは、さらに塩基配列データアッセンブルソフトウェアを用いて、多型が存在するかどうか、あるいは多型を示す部位（複数塩基が検出される）はどこなのかを確認し、互いに比較可能な領域の配列をトリミングして保存した。
【００５３】
その結果の代表的なデータを図４に示す。これによると領域Iについては、多型が激しくほとんど配列解析が不可能であった。しかしながら、領域II〜Vについて塩基配列には、適度な多型が存在し、多型解析が可能であることが予想された。そこで、領域II〜Vについて、多型を示す2つ以上の塩基が検出された部位について、通常のベースコールのアプリケーションプログラムでは、2つのピークがたとえば同じ程度の強度であれば、不特定塩基として、たとえばプリン（R）あるいはピリミジン（Y）と表示される。あるいはどちらかの塩基が、例えば別な塩基の2分の１程度であれば、高いほうのベースが読まれることになるだろう。従って、今回の目的のためには、二つの塩基のピークが同じであれば不特定塩基のRやYとしてベースコールされるが、どちらかが他の1/2の強度で検出された場合は、ピークの高いほうがベースコールされる。しかしながら、今回の目的のためには、このような部位が多型部位の候補として最も可能性が高いため、不特定塩基のベールコールを与えることが必要である。即ち、ある部位でＡとＧが検出された場合、その強度が同じあるいはどちらかが他方の１／２の強度であっても、Ｒ（プリン）を与えた。このような多型を示す部位は、プロファージ中の該遺伝子増幅物中にＡおよびＧの増幅物が存在し、これは、複数あるプロファージ遺伝子のうち多型がそのEHEC中、少なくとも型として２種類存在することを示していると考えられる。そして、このような多型を示すたくさんの座位を比較し、すべての多型部位で同一であれば、その比較した菌株はほとんど同一株由来であると判断することができるだろう。
【００５４】
さらにこのような多型部位を含む配列をテキストデータとして蓄積しておけば、複数の配列の系統関係を現在では、簡単にしかも、極めて高い解像度で明らかにすることができる。蓄積対象の配列がたとえば比較対象の領域の総計が数千塩基程度に及んだ場合を考えると、そのなかで多型を示す部位が５０箇所程度存在すれば、５０箇所の組み合わせは非常に膨大となる。即ちDNAの塩基を一文字で表示するIUPAC single letter codesによれば、A,G,C,T,R,Y,M,K,S,W,H,B,V,D,Nの15種類考えられるので、これが正確に解析できれば、あるいは検出できれば、この型別能力は極めて高いと予想される。ここでこの一文字表示された塩基の意味は以下のとおりである。IUPAC single letter codes の定義によれば、A=アデニン, G=グアニン, C=シトシン, T=チミン, R=プリン, Y=ピリミジン, M=A or C, K=G or T, S=C or G, W=A or T, H=A or C or T, B=C or G or T, V=A or C or G, D=A or G or T, N=A or C or G or Tである。しかし、本発明者らが今回作成しているデータベース中のこの一文字表示された塩基の意味は、IUPACの定義の「or」ではなく「and」である。即ちR=A and G, Y=C and T, M=A and C, K=G and T, S=C and G, W=A and T, H=A and C and T, B=C and G and T, V=A and C and G, D=A and G and T, N=A and C and G and T がここでは適切である。これまでの塩基配列決定技術およびその配列の解析に使われているコンピューターのソフトウェアはすべてIUPACの定義に準拠している。従って、今後、本発明者が発明した型別方法では、特にその系統関係を正確に解析するためには新しい塩基配列の処理プログラムの開発が望まれる。しかし、このようなプログラムの改良は容易に行うことが出来ることは、現在の技術水準からすれば容易に想像できる。本発明者は、今回発明した型別法を狭義にはprophage-directed multilocus sequence typing (pMLST)と呼んでおり、また広義にはprophage-directed multilocus and overlap sequence typing (pMLOST)と呼べるものであり、これまでのMLSTと区別している。
【００５５】
そこで、本発明者は、現在の系統解析用のソフトウェアは本発明の目的を必ずしも正確に反映するものではないが、本発明から得られる塩基配列データを現在のソフトウェアを用いて解析し、この解析した結果を評価するため従来の遺伝子型別法であるPFGEと比較した。そのためにある地域で短期間に発生したEHEC感染症事例の臨床分離株のpMLSTを実施し、系統解析を試みた（図６）。また、同時に各分離株のPFGEを実施し、同じくその泳動像から系統解析を試みた（図７）。これによると少なくともPFGEの結果と今回の結果はほぼ相関するものの異なる結果も得られた。さらにpMLSTはPFGEよりも解像度が高いことが示された。
【００５６】
さらにこの二つの方法を詳しく比較する。以上のように現在よく用いられているPFGEによる結果と今回の発明であるpMLSTの結果は、ほぼ同じ結果を示すが、一部については、異なる結果が示された。また、9つの分離株はそれぞれ３つの地域から分離されたもので、その概要は表１に示した。これによると、pMLSTの解析から、３つの遺伝子型が検出された。また、PFGEも３つの遺伝子型が示されたが、この遺伝子型の相関はなかった。特出すべきは、EC2510は、EC2508, ED2513, EC2509, EC2511及びEC2514と同じ遺伝子型（この場合は塩基配列多型）がほぼ同一であったが、PFGEの結果は、EC2510とその他の株とは異なっていた。また、pMLSTの結果から、EC2512株が若干異なっていることが判明した。この株は、PFGE解析においては違いが他の株と見出せなかったことから、pMLSTはPFGEよりもその解像度が高いと予想される。
【００５７】
【表１】
2007252371.tif 000002
【００５８】
しかしながら、これらの違いについては、詳細は不明である。PFGE解析は、細菌ゲノム中に存在する制限酵素処理によって出てくるフラグメントのアガロース中の移動度に応じて検出するものであり、また、pMLSTは、特定の遺伝子配列中の塩基配列の多型を検出するものであり、その原理はまったく異なる。EHECを代表とする大腸菌を含めた細菌は、複数の可動遺伝子因子が含まれていることがよく知られている。今回の発明の対象であるプロファージもそのうちの一つである。また、その他、トランスポゾン、プラスミド、インサーション・シークエンス（IS）などが知られており、今回、解析したEHECにもISが含まれていることが知られている。従って、ある集団中にこのような可動遺伝因子が動いた可能性があるものと思われる。その遺伝子因子がゲノム中の他の座に動いたことによって、PFGEのパターンの一部に変化が見られたと判断することが一番理解しやすい。しかし、プロファージ遺伝子の配列については、このようなある集団内の解析を行うような時間軸では、それほど変化はないことは容易に想像できることから、PFGEで異なる結果であっても、同一集団のクローンでないという結論はできないし、逆にPFGEのパターンが同一でも遺伝的に同一ではないという報告もある[Davis,M.A., et al. J.Clin.Microbiol., 41:1843(2003)]。また、Tenoverら[Tenover,F.C., et al. J.Clin.Microbiol., 33:2233(1995)]は、多型性の確認されている制限酵素と細菌種の組み合わせで、バンドの変化がなければ同一のクローン、２〜３バンドの違いまでは極めて関連のある菌種であり、流行株の一部の可能性がありと判断できるとしている。今回のpMLSTは、塩基配列がほぼ一致したことからその意味で同一集団であることが強く示唆された。従って、PFGEよりも解像度に優れた方法であると考えられ、分子系統解析の有力な方法となりうると考えられる。
【００５９】
また、本発明を行うにあたり、塩基配列決定法は、耐熱性DNAポリメラーゼを使用したサイクルシークエンス(CS)法を用いて行なった。しかし、本発明は、この塩基配列決定法に限定するものではない。たとえば、RNAポリメラーゼを用いた転写シークエンス(TS)法[Sasaki,N., et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 95:3455(1998)]も用いることができる。ただし、異なる方法を用いるときには、ダイターミネーターの取り込み効率が異なることも充分考えられ、結果として出力される多型部位のピークの高さは使用する塩基配列決定方法に依存する可能性があるので注意が必要であろう。しかし、転写シークエンス法は、鋳型の増幅後の精製工程を省略することが出来るため、塩基配列決定までの時間を短縮することが可能である（図３）。従って、迅速診断すなわち迅速に分子疫学的情報を提供することが可能になる。
【００６０】
本発明において、EHECの型別を行う場合、一塩基多型同定配列は、配列表の配列番号1〜4のいずれかの塩基配列を有する領域であることが好ましい。配列表の配列番号1〜4のいずれかの塩基配列を有する領域は、それぞれ、VT1及びVT2プロファージ配列中の領域II、III、IV及びVに相当する。
【００６１】
さらに、上記配列表の配列番号1〜4のいずれかの塩基配列を有する領域において、一塩基多型の同定をサイクルシーケンス法により行う場合、プライマーとしては、後述の表３に示す配列番号7〜19のいずれかの塩基配列を有するDNAからフォワードプライマーとリバースプライマーを選択して用いることが適当である。より具体的には、配列番号1の塩基配列を有する領域において、一塩基多型の同定をサイクルシーケンス法により行う場合には、後述の表３に示す配列番号7〜9のいずれかの塩基配列を有するDNAからフォワードプライマーとリバースプライマーを選択して用いる。配列番号2の塩基配列を有する領域において、一塩基多型の同定をサイクルシーケンス法により行う場合には、後述の表３に示す配列番号10〜13のいずれかの塩基配列を有するDNAからフォワードプライマーとリバースプライマーを選択して用いる。配列番号3の塩基配列を有する領域において、一塩基多型の同定をサイクルシーケンス法により行う場合には、後述の表３に示す配列番号14〜15のいずれかの塩基配列を有するDNAからフォワードプライマーとリバースプライマーを選択して用いる。配列番号4の塩基配列を有する領域において、一塩基多型の同定をサイクルシーケンス法により行う場合には、後述の表３に示す配列番号16〜19のいずれかの塩基配列を有するDNAからフォワードプライマーとリバースプライマーを選択して用いる。
【００６２】
また、上記配列表の配列番号1〜4のいずれかの塩基配列を有する領域において、一塩基多型の同定を転写シーケンス法により行う場合も、プライマーとしては、後述の表３に示す配列番号7〜19のDNAの5'-末端に転写シーケンス用のRNAポリメラーゼのプロモーター配列を付加したDNAからフォワードプライマーとリバースプライマーを選択して用いることが適当である。但し、前述のように、サイクルシーケンス法用のプライマーの場合は、PCR用に設計したプライマーの5'末端側に転写シークエンスを行う際に必要な対応するRNAポリメラーゼに特異的に機能するプロモーター配列を付加する。推奨されているT7 RNAポリメラーゼおよびT3 RNAポリメラーゼのプロモーター配列は以下のとおりである。
T3 RNAポリメラーゼ:5'-CTAATTAACCCTCACTAAAGGG-3'(配列番号21)
T7 RNAポリメラーゼ:5'-CTAATACGACTCACTATAGGG-3'(配列番号22)
この配列をPCRのプライマーの5'-末に付加すれば、転写シーケンス法の鋳型になる。実施例4に、RNAポリメラーゼに特異的に機能するプロモーター配列を含むプライマーの例が配列番号20として記載されている。
【００６３】
ここではこれまでEHECプロファージを用いた塩基配列多型解析による分子疫学的方法に限定して説明してきたが、もちろん、本発明はEHECだけに限定されるものではない。先にも述べたが、ファージだけでなく細菌のプラスミドやトランスポゾンといった可動性の遺伝子因子は、最近のゲノム解析から、細菌の進化に大きな役割を果たしていることが解ってきた。特に病原細菌の宿主への感染と宿主の感染防御の関連の中でバクテリオファージ、特に溶原化可能なファージの役割が注目されている[Brussow,H., et al. Microbiol.Mol.Biol.Rev., 68:560(2004)]。従って、このような状況のなかで本発明で述べているプロファージ遺伝子領域をターゲットにしたMLSTへの応用は、プロファージを持っている細菌に応用することができることは自明であり、その応用範囲はEHECにとどまらない。たとえば、Streptococcus pyogenes、Staphylococcus aureusやSalmonella entericaにもプロファージゲノムが複数存在することが報告されている[Canchaya,C., et al. Microbiol.Mol.Biol.Rev., 67:238(2003)]。
【００６４】
細菌ゲノム中に複数コピー存在するプロファージゲノムの配列多型を検出し、複数の分離株の遺伝的な関係を調べることがEHECで可能となった。その標的遺伝子あるいは配列あるいは領域の探索には、プロファージゲノム配列の全体を比較し、その中から配列多型が存在すると思われる配列（あるいは遺伝子座）を推定し、実際に多数の分離株から配列を調べ、分離株の遺伝学的あるいは疫学的な関係を知るための解像度を持ったこの方法は、その他の細菌の遺伝的な関係を調べるための実施可能で有用な方法、あるいはプロセスを提供すると考えられる。EHECの型別を解析する場合、トランスポゾンのような可動因子の配列多型を結果的に利用したが、汎用性のある型別法の構築法を提供する発明である。一方で、病原細菌のゲノム解析の結果から、例えばウエルシュ菌の場合、可動因子が必ずしも病原性の進化に寄与していないことが報告されている[Shimizu,T., et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 99:996(2002)]。そこで、以下に、本発明が他の細菌の型別法として応用可能であることを記載する。
【００６５】
近年、細菌ゲノム解析は様々な細菌種まで及びさらに同一病原体においても、複数の株からゲノム配列が報告されるようになっており、プロファージよりも大きな細菌ゲノム配列レベルで比較することが可能となった。この比較により、細菌の型別に利用出来るような多型を有する配列が存在するかどうか、また、その配列を用いて配列多型による遺伝子型別ができるかどうかの検討を行なった。その結果、感染源の特定等の分子疫学的手法開発の要望が強い、レジオネラについて、遺伝子型別ができることを確認した。
【００６６】
先の塩基配列の多型を利用した遺伝子型別法は、その迅速性とデータベース化が容易である点で非常に魅力的な方法であることは間違いない。その理由としては、比較したい分離株の遺伝的な関係を直接的に評価できること、塩基配列データは、簡単に比較可能でありデータベース化しやすいことが挙げられる。
【００６７】
一方で、レジオネラのゲノム配列は既に報告されており、Legionella pneumophila subsp. pneumophila Philadelphia 1 [Chien,M., et al. Science, 305:1966 (2004)]、L.pneumophila Paris and  L.pneumophila Lens [Cazale,C., et al. Nature Genetics, 36:1165(2004)]の3つについては、公的な塩基配列データベースから誰でもダウンロードして利用することが出来る（例えば、DDBJのホームページ http:www/nig.co.jp/………）。ゲノム解析の対象となったレジオネラであるL.pneumophila subsp. Philadelphia 1とL.pneumophila strain Lensは、集団発生の原因菌であり、L.pneumophila strain Parisは散発的に発生した臨床分離株であり、いずれも血清型別は、１群である。先にも述べたように臨床株のほとんどは、血清群1型であり、その割合は約80％である。PFGEのように分離株の遺伝子型別を行う方法の原理は、制限酵素処理後、ゲノムDNAを電気泳動により大きさの順に並べ、そのパターンを固有の遺伝子型として扱うことを特徴とする。したがって、原理的には遺伝的な関係にこだわらずに実施できる。しかし、塩基配列多型による型別は、塩基配列多型が多いとプライマーの設計によってはPCRの増幅が出来ない等の問題も懸念される。しかし、レジオネラ症から分離されるレジオネラ属菌のほとんどが血清型別１群であることから、既に報告されているゲノム配列が解析されたレジオネラの血清群もすべて１群であり、発明者は、これらの配列を比較し、疫学的解析目的で利用できる多型を示すゲノム上の領域を探すことを試み、先に説明したEHECのプロファージ配列を用いて、疫学的調査に用いることが出来る配列を決定した手法が、細菌のゲノムのレベルで適応できるかどうか検討した。
【００６８】
既に報告されているレジオネラのゲノム配列のうち、米国とフランスの研究グループから報告されていたレジオネラ症流行株であるL.pneumophila subsp. Philadelphia 1（Accession No.=GIB00207CH01)とL.pneumophila strain Lens (Accession No.=GIB00214CH01)を、MegaBlastプログラムを用いて比較した。この比較の条件として、比較する最低の塩基長を500塩基対以上、相同性90%以上とした。その結果、79箇所の領域が選択された。この79の領域のうち、更にrRNA遺伝子やtRNAに関係した領域を除外、さらにBlastサーチの結果のスコアと対象領域の長さの比が1.5から1.9に該当する36箇所の領域に絞り込んだ（後述の表7参照）。この36箇所の領域長は654〜3846塩基対に及んでいる。この36箇所の領域は、少なくとも今回比較した２つのゲノム配列の中で配列多型が存在し、しかも疫学的な解析に利用できる候補を含んでいると推定し選択されたものである。これを確かめるためにこの３６箇所の領域について、プライマーの設計を試みた。
【００６９】
このプライマー設計には、最終的には塩基配列を決定することを考慮して、増幅長400塩基以上、800塩基対以下として、プライマー効率等を考慮して、プライマーの条件として、Tm値は65℃±2℃（AあるいはTの塩基対は２℃、GあるいはCの塩基対は４℃として計算）、塩基配列の中に2つ以上の同一塩基の連続はないこと、プライマー長は20±2塩基長とし、対象とした２つのレジオネラの配列を並べて、考慮したプライマーが両ゲノム上多型を示していない領域に一致するものを最終的に選択することとした。その結果、15の領域から16箇所をターゲット配列としたPCR用のプライマーを設計した。このプライマーの配列は、後述の表8に示した。
【００７０】
増幅物にはアルファベットをつけ、AからPとした。次にこれらプライマーの評価を行なった。この評価には、8つのレジオネラ分離株（血清１群5株、血清群5群１株、血清群6群１株、最後にL.bozemanii１株）を用いてPCRを行なった。その結果を後述の表9に示す。これによると、これらのプライマーはL.bozemaniiにはほとんど反応しないことが判明した。また、プライマー対AおよびCは、L.pneumophilaの一部で増幅しないことが判明した。
【００７１】
次に増幅したPCR断片の塩基配列を決定し、最終的にある程度の多型を示し、疫学的な調査に有用と思われる8つの領域（B、E、F、H、I、J、MおよびN)を選択した（各領域のゲノム上の相対的な位置関係は、図9に示す）。これらの配列には配列型（Sequence Type, ST)として管理し、研究室保存株であるLG1（臨床分離株、L.pneumophila  血清型１群）の各領域の配列型を１（ST1)と定義し、例えば、領域B,E,F,H,I J,M,Nの配列型として、1,1,1,1,1,1,1,1と表すことができる。そしてこのST1と異なる配列が解析した分離株から見つかった時には、2,3,・・・・と算用数字を順番に付与することとした。そして、様々な分離株（臨床分離株、環境分離株）の解析を行い、これまで臨床分離株と同一の配列型を示す環境分離株を得ることができた。
【００７２】
また、領域Nについては、しばしば１２番目の塩基がCとTの重なりを示した（図10参照）。このことは、この部位でCとTの塩基が重なりY（ピリミジン）と表記される分離株は、この対象領域は、少なくともゲノム中に２コピー存在することを示していると思われる。従って、レジオネラの場合は、EHECと異なり、塩基の重なりはほとんどないが、レジオネラの領域Nの125番目のこの部位も有用な識別マーカーとなると考えられる。
【００７３】
本発明は、病原細菌として、レジオネラ属菌についても型別を検査することができ、レジオネラ属菌の相同性が高い塩基配列領域はレジオネラ属菌のゲノム配列中に存在する。具体手には、レジオネラ属菌における一塩基多型同定配列は、8つの領域（B、E、F、H、I、J、MおよびN)(配列表の配列番号23、26、27、29、30、31、34、および35)のいずれかの塩基配列を有する領域にある。
【００７４】
以上、レジオネラのMLSTは完成した。このMLSTは、L.pneumophilaに特化し、臨床株のほとんどをカバーし、環境株（特に公衆浴場から分離された環境分離株）の多型データベースを構築することにより、遺伝的に関連のある分離株をこれまでよりも迅速に診断することを可能とし、例えば公衆衛生上の対応を迅速に行なうことを可能にする。また、複数のゲノム配列が報告されていれば、本発明により、細菌ゲノム全体を比較することにより疫学的に有用な多型領域（あるいは遺伝子座、あるいは遺伝子等）を選択することが出来ることを示した。また、先に述べた複数コピー存在する遺伝子を対象とする場合、有用な識別マーカーを提供する。それはEHECの場合、可動遺伝子としてのファージ遺伝子等であったが、細菌ゲノム中の検査あるいは研究の目的に合った多型を示す遺伝子領域の選択を可能とする。また、他コピー存在する遺伝子もこの対象になり、例えば多重遺伝子族（共通の祖先遺伝子をもつ複数の遺伝子群のひとつ）も有用な個体識別マーカーと使用できると予想される。例えば、結核菌のPE-PGRS（glycine-rich protein family genes）と呼ばれる遺伝子は有用であろうことは容易に推定できる。
【００７５】
本発明は、解析したい細菌に応じて、塩基配列多型を利用したMLSTを実施するための方法を提供する。この方法は、公衆衛生分野だけでなく、より正確な細菌の遺伝学的関係を知ることができるため、病原細菌の進化等を調べる分野でも有用である。
【実施例】
【００７６】
以下本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。但し、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００７７】
［実施例１］
EHEC プロファージ配列中の保存領域の特定とPCR用プライマーの設計
EHEC O157 Sakai株のゲノム配列[Hayashi,T., et al. DNA Res., 8:11(2001); ACCESSION No. GIB00048CH01; 5,498,450 bp]は、DDBJ Webページから入手した。VT1遺伝子を持っているプロファージ（VT1プロファージ）は、Accession No.AP000400、VT2遺伝子を持っているプロファージ（VT2プロファージ）は、Accession No.AP000422として入手した。この二つのVT遺伝子を含むプロファージ配列中の相同性の高い領域の検索は、国立遺伝学研究所で開発されたゲノム配列を効率的に解析するソウトウェアG-InforBIO V1.21-J4（平成18年1月現在、http://lilium.genes.nig.ac.jp/inforbio から自由にダウンロード可能）中のMEGABLST V2.2.6を用いて、解析した。その結果の詳細は、図１及び表２に示した。
【００７８】
【表２】
2007252371.tif 000003
【００７９】
表２には、90%以上の相同性の高い領域として13箇所検出され、また、その相同性は、最小105塩基から、最大で2221塩基の領域で、93.91〜99.85%であった。ここで、PCRのためのプライマーの設計を可能とし、さらにある程度の塩基配列決定領域を確保するために、500塩基以下で95％以上の相同性を持つ領域に絞った。そこでこれらの領域の遺伝子を高い確率でPCRにより増幅を可能とするためのプライマーのアニーリングする部位を探索するために、さらに相同性の高い領域を特定するために、VT1配列中の各領域に相当する配列を用いて、DDBJのWebサイトよりBLASTサーチを行い、公開されているデータベース中からEHECのベロ毒素ファージ関連配列を検索し、さらにそれらの配列を分子進化解析アプリケーションソフトであるMEGA3([Kumar,S., et al. Breifings In Bioinfomatics, 5:150(2004)；本プログラムは、http://www.megasoftware.netより無料でダウンロード可能である]。その結果、最終的に領域IからVの５つの領域に絞り（図１）、プライマーの設計を行った。さらに具体的には、このプライマーの設計にあたり、先に行った各領域のBLASTサーチを行い、相同性の高い順から少なくとも5つ以上の配列の相同領域を並列に並べ、少なくともすべての遺伝子に対して、プライマーがアニールする領域を選択した。プライマーの検索は、例えばSequence Assistant Ver 1.5.3 (http://www2s.biglobe.ne.jp/~harura/から無料でダウンロード可能である) に含まれているプライマー検索プログラムを用いて行うことが可能である。その際、使用するプライマー配列の検索条件は以下の通りとした。
【００８０】
プライマーの長さ：18〜22塩基であること
プライマーの3'-末端の条件：3'-末端の2塩基は、GかCであること
Tm（計算値）：63〜67℃
さらに、同じ塩基が2塩基以上連続しないこと、およびプライマー内の配列で２次構造を形成する確率を示す相補スコア(complementarity score)が３以下とした。
そして、今回設計したプライマー名、配列は表３に示し、ターゲット遺伝子内のアニーリングする位置については図２に示した。
【００８１】
【表３】
2007252371.tif 000004
【００８２】
［実施例２］
プロファージ遺伝子をターゲットとしたPCR用プライマーの評価
表３に示したプライマーの評価は以下のように行った。
また、腸管出血性大腸菌の分離株として使用した株は表４に示した。使用した株のうち、表中のSakaiは、堺株であり、ゲノム配列が報告されている株である。また、ECが付加された４桁の番号で示された大腸菌株は、すべて本発明者らの所属する研究室に保存されている臨床由来のEHECである。この分離株からゲノムDNAは以下のように調製した。純化された株は、TSA培地（Trypticase Soy Agar, BBL社製）上で３７℃一晩培養し、生育した菌体は、直径約２mmの白金耳でマッチ棒の頭の半分程度を目安に掻きとり、100〜200μLのTE（pH8.8）に懸濁する。この菌懸濁液に等量のキレックス-100（バイオラド社製）の10%懸濁液（W/V, TE pH8.8）を加えて、軽く混ぜ、56℃30分、続いて100℃8分間処理する。この間、時々チューブを反転させ、混合操作を行った。この熱処理後、チューブを室温まで冷やし、13,000rpm × 3分間遠心操作を行い、遠心後、沈殿物を取らないように上清を最初に菌懸濁液に作製に使用したTE量に相当する量をピペットで丁寧に採取し、新しいプラスチックチューブに移し、これをEHECゲノムDNA溶液とし、使用まで−２０℃で凍結して保管した。
【００８３】
【表４】
2007252371.tif 000005
【００８４】
EHECゲノムDNAを鋳型としたPCRは、各プライマーの組み合わせに基づき以下のように行った（図２）。PCRの条件は、EHEC分離株ゲノムDNA溶液10倍希釈液 ４μL、フォワードプライマー及びリバースプライマー（濃度１μM）を各1.5μL、100mM dNTP混合液を1.6μL、Taq DNAポリメラーゼ（宝酒造あるいはニッポンジーン）１単位、反応体積２０μLとして、94℃で90秒後、94℃30秒→50℃ 60秒→72度60秒のサイクルを30回、最後に72℃で60秒のサイクルプログラムで行った。得られた反応産物の一部（10分の１量）を２％アガロース電気泳動で増幅DNAの確認を行い、確認後、残りの反応物をQIAquick PCR purification kit (キアゲン社製)を用いて精製し、最終的にキットに添付されている溶出液（EB）５０μLを用いて溶出し、塩基配列決定のための鋳型とした。
【００８５】
表５には、各プライマーの組み合わせに基づいてPCRを行ったときの結果を示した。各領域番号の下の小文字のアルファベットa〜iは、今回のPCRで増幅したPCR産物の名称、その下の数字は、プライマーの番号（表３中の配列番号と一致する）であり、フォワードプライマー(F)/リバースプライマー(R)であることを示しており、表３中に各プライマー名にFあるいはRと明記した。また、表５中、NDは未実施のもの、また、＋の後の数字は、アガロース電気泳動で増幅産物を確認したときに明確に分子量の異なるPCR産物が検出されたことを示し、その数を示している。その結果、EHECであるEC2187では、領域VのPCR産物のｇが増幅に失敗しているが、ｈとｉに関しては、明らかに分子量の異なる複数の産物が検出され、明らかに本分離株に関しては、領域Vの遺伝子領域内で遺伝子の再構成が起こっていることが示唆される。しかしながら、O157以外の血清型を持つEHECについては、すべての増幅については確認していないものの、おおむね、今回作成したプライマーはかなりの確率でPCR産物が得られることが判明した。
【００８６】
【表５】
2007252371.tif 000006
【００８７】
溶出したDNA溶液を鋳型として、PCRに使用した同じプライマーを用いてシークエンス反応を行った。シークエンス反応は、BigDyeR Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitのプロトコールに準拠して行ったが、DyeMixの使用量は、5×Sequencing Buffer(アプライド・バイオシステム社製)を用いて8倍希釈して使用した。サイクル反応後、反応物は、DyeExTM 2.0 Spin Kit(キアゲン社製)にて精製し、ABI3100 Genetic Analyzerを用いた解析のための直接の試料とした。この試料は、本装置のインストラクションマニュアルに従って操作し、キャピラリー電気泳動を開始した。泳動終了後、本装置内にあるDNA Sequence Analysis Version 5.1を用いて、塩基配列のベースコールを行った。この解析データは、更に塩基配列データアッセンブルソフトウェアSequencher v4.2 (MiraiBio.Inc.製、宝酒造取扱)により、塩基配列を評価、加工した。
【００８８】
その結果を図４と表６に示した。領域I（図中Iと表示、以下、II〜Vに同じ）は、20の鋳型（表５のPCR産物"a"）の塩基配列を決定したが、図４のIに示したようにすべての結果において、ABI3100 Genetic Analyzerから出力される波形が乱れており、正確なベースコールができなかった。しかし、領域IIからVまでの領域については、ベースコールは正常に行われていた。また、図４のIIからVに示したように一部の部位で複数の塩基が波形として見られた。これらはABI3100 Genetic Analyzerに付属しているベースコールプログラムであるDNA Sequence Analysis Version 5.1においては、波形の高い塩基がベースコールされてしまうが、実は多型部位であると予想される。例えば、図４のIIIにおいて、ここでは、６クローンの配列の一部を比較しているが、このうち５クローンについては、Gとベースコールされているが、ひとつのクローンは、AとGの波形が共に検出されており、この部位に関しては、Rという多型が検出されたことになる。ここで、このAとGと二つ波形が検出されるのは、試薬あるいは装置の不具合によるものではなく、実際に検査した大腸菌のなかに少なくともこの部位に関してAとGの塩基である領域IIIが少なくとも２種類存在することを示している。このような解析を行い、例えば領域IIについては、正確にベースコールされた502塩基に限定して、今回解析できた7つのクローンについて見ると55の多型部位が発見された。同じような解析をIII〜Vまで行い、多型部位を探したところ、表６に示したように領域III、IV及びVにおいて、それぞれ、13、26および8つの多型部位が検出された。
【００８９】
【表６】
2007252371.tif 000007
【００９０】
従って、今回、設計したプロファージゲノムを対象としたPCR用プライマーを用いたPCRによって、様々なEHECクローンのPCRが可能であり、また、そのPCR産物を用いた塩基配列を決定し、多型解析に使用できる遺伝子を特定することができた。
【００９１】
［実施例３］
プロファージ遺伝子をターゲットとしたMLSTとPFGEによる系統解析結果の比較
実施例２の結果から、このような配列の多型を実際にEHEC感染症事件にプロファージMLSTとして使用できるかどうかをPFGEと比較した。
【００９２】
今回解析したEHEC感染症事件は、ある地域の3か所で散発的であるが、ほぼ同時期に発生したもので、９つの分離株を用いその分離株の概要は表１に示した。この９株については、実施例２に示した方法でゲノムDNAを精製したものをPCRの鋳型として用いた。また、今回、MLSTの鋳型として使用したのは、領域II、III、IV及びVのPCR産物それぞれ、b, d, f, g及びiとした（図２及び表５を参照）。また、塩基配列解析は、PCR産物b, d, f及びgを鋳型としたとき、使用プライマーは、おのおのフォワード、リバース、フォワード、リバース及びフォワード側を用いた５ヶ所とした。実際には実施例２で示した方法と同じ方法で行い、得られた塩基配列データは、系統解析を行うために、フォワード側のプライマーを用いて得られた配列を１、リバース側は２として、おのおのｂ１、ｄ２、ｆ１、ｇ２及びi１とした。そこで得られた配列を統合し、全体で2449塩基長の配列を作成した。このように作成した配列の一部を示したのが、図５であり、この図ではEC2508, EC2510, EC2512及びEC2516を比較したものを示している。この統合配列はMEGA3を用いて９株について系統樹を作成し、その系統関係を調べた。その結果は、図６に示した。また、この9株につき、PFGE解析を行い、PFGE解析結果について系統解析を行った。具体的な方法は、国立感染症研究所で推奨されている方法に従って行った。その詳細は以下の通りである。
【００９３】
純粋に分離された菌をTSA寒天平板に接種し、37℃で一晩培養し、精製水1mLに、菌体をO.D.(610nm)で0.5から0.6とし、菌懸濁液とする。この菌懸濁液200μLに予め溶解し、50℃とした1%アガロース（SeaKem Gold Agarose）を等量加え、よく混合する。この混合液をサンプルプラグキャスター（バイオラド社製、厚さ0.7mm）に流し込み、室温で15分置くことによってアガロースを固化させた。固化した寒天片（一般にこれはプラグと呼んでいる）を取り出し、蓋付プラスチックチューブ（〜15mL容量）に入れて、1mL のLysis buffer [1mg/mL プロテアーゼＫ（和光純薬社製）、1% N-Lauryl sarcosine, 0.5M EDTA, pH 8.0]を加え、蓋をして、50℃で一晩ゆっくり振盪した。処理が終了したプラグは、4×4mmの大きさに切り、残りは同じbufferに戻し、冷蔵にて保存した。4×4mmの大きさのプラグ片は、300μLの4mM Pefabloc SC buffer [Pefabloc SC（ロシュ社製）を10mM Tris-Cl, 1mM EDTA, pH 8.0に溶解したもの]に移し、50℃、40分間の洗浄操作を2回繰り返した。さらに300μLのTE buffer (pH 8.0)中で、氷上にて20分間平衡化した。TE bufferを捨て、制限酵素XbaI（ニッポンジーン社製）の反応緩衝液200μLとし、氷上にて20分間平衡化する。この後、緩衝液を捨て、新しい制限酵素XbaIの反応緩衝液100μL、制限酵素XbaIを30単位加えて、37℃にて一晩反応した。反応後、緩衝液を、200μLの0.5×TBE bufferに置換え、室温に置いた。そして、このプラグを電気泳動用ゲルにセットする。方法は、例えば成書（「感染対策のための分子疫学入門−パルスフィールドゲル電気泳動法を中心に」満田年宏著、メディカ出版）にある方法に従って、0.5×TBE bufferにて1%アガロース（SeaKem Gold Agarose）としプラグを泳動用アガロースにセットした。完全にアガロースが固化したことを確認後、CHEF-DRIII（バイオラド社製）にセットし、泳動バッファーとして0.5×TBE buffer を使用し、6V/cm、2.2-54.2s,  12時間の条件で泳動を開始した。泳動終了後、ゲルを0.3μg/mL濃度の臭化エチジウム溶液300mLで、30分間染色する。その後、精製水で20分振盪しながら脱色した。このアガロースゲルを短波長のUVを発するトランスイルミネーター上に置き、ポラロイドカメラで写真撮影し、泳動像を記録した。このPFGEの泳動像は、スキャナーで取り込み、Fingerprinting II(バイオラド社製)を用いて、系統解析を行った。その結果は、図７に示す。
【００９４】
以上の実験結果を簡単にまとめると、図６のプロファージMLST解析からは、3種類の配列多型が検出され、それぞれグループ分けすると、（EC2516とEC2517）、（EC2808, EC2509, EC2510,EC2511, EC2513及びEC2514）及び（EC2512）である。pMLSTの結果から、9つの分離株中、EC2512が単独多型を示していた。これとは別に、図７には同じクローンのPFGEの解析結果を示したが、その結果に若干の違いがあった。すなわち、3種類の遺伝子型が検出されたもののそのグループ分けは、（EC2516とEC2517）、（EC2808, EC2509, EC2511, EC2512, EC2513及びEC2514）及び（EC2510）である。このEC2510は、明らかにPFGEパターンは今回、解析した9つの分離株の中では単独パターンであった。
【００９５】
［実施例４］
プロファージ遺伝子をターゲットとした塩基配列決定法：サイクルシークエンス法と転写シークエンス法の比較
プロファージMLSTによる結果は、迅速な方法であれば、危機管理に使用することが可能である。迅速性を追求する場合、増幅産物を直接、塩基配列決定の鋳型として用いることが出来る転写シークエンス法は魅力的である。従って、塩基配列決定法として、サイクルシークエンス法と転写シークエンス法を比較した。
【００９６】
腸管出血性大腸菌の分離株としてはEC2489株を用いた。本菌は、臨床株由来で血清型はO157:H7で、Stx2のみ産生する毒素型を示した。本菌の純粋分離株はTSA培地上、37℃で一晩培養し、生育した菌体は、直径2mmの白金時で1/2エーゼほど掻きとり、100μLのTE緩衝液（Tris-Cl, pH 8.8）に懸濁した。懸濁後、等量のキレックス-100の10%懸濁液を加えて、軽く混ぜ、56℃30分、続いて100℃8分間処理した。この間、チューブは時々反転させることによって、混合した。この熱処理後、チューブを室温まで冷やし、13,000rpm×3分間の遠心操作を行った。遠心後、沈殿物を取らないように上清を100μL分取し、新しいチューブに移して、ゲノムDNA溶液として使用するまで−20℃で保管した。
【００９７】
サイクルシークエンス法で塩基配列を決定するためには、表３に示したプライマーを用いてPCRを行い塩基配列決定のための鋳型を調製した。プロファージMLSTのためには、複数の遺伝子に関して同時に行うことになるが、ここでは領域IIIをターゲットとした実施例を紹介する。
【００９８】
PCRは、ゲノムDNA溶液 ２μL、プライマー配列番号10及び11の組み合わせ（詳細な配列は表３を参照）で各1.5μL(濃度１μM）、100mM dNTP混合液を1.6μL、Taq DNAポリメラーゼ（宝酒造あるいはニッポンジーン）１単位、反応体積２０μLとして、94℃で90秒後、94℃30秒→50℃ 60秒→72度60秒のサイクルを30回、最後に72℃で60秒のサイクルプログラムで行った。得られた反応産物の一部（10分の１量）を２％アガロース電気泳動で増幅DNAの確認を行い、確認後、残りの反応物をQIAquick PCR purification kit (キアゲン社製)を用いて精製し、最終的にキットに添付されている溶出液（EB）５０μLを用いて溶出し、塩基配列決定のための鋳型とした。
【００９９】
溶出したDNA溶液を鋳型として、PCRに使用した同じプライマーを用いてシークエンス反応を行った。シークエンス反応は、PCR反応に使用したプライマーのひとつである配列番号11を2μL、鋳型DNA溶液４μLを用いて、BigDyeR Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitのプロトコールに準拠して行ったが、キットに添付されているDyeMixの使用量は、5×Sequencing Buffer(アプライド・バイオシステム社製)を用いて8倍希釈して使用した。サイクル反応後、反応物は、DyeExTM 2.0 Spin Kit(キアゲン社製)にて精製し、ABI3100 Genetic Analyzerを用いた解析のための直接の試料とした。この試料は、本装置のインストラクションマニュアルに従って操作し、電気泳動を開始した。泳動終了後、本装置内にあるDNA Sequence Analysis Version 5.1を用いて、塩基配列のベースコールを行った。この解析データは、更に塩基配列データアッセンブルソフトウェアSequencher v4.2 (MiraiBio.Inc.製、宝酒造取扱)により、塩基配列を評価、加工した。
【０１００】
転写シークエンスを行う場合には、PCRを行うときに、一方のプライマーとして転写反応に利用するRNAポリメラーゼの種類に対応したプロモーター配列を、5'-末端に付加したプライマーを用いた。そこで、領域IIIを増幅するプライマーのひとつである配列番号11の配列の5'-末端にT7 RNAポリメラーゼのプロモーター配列を付加したプライマー (5'-CTAATACGACTCACTATAGGGAGAACATCGTCGCACTCTTCC-3')(配列番号20)を作成した。転写シークエンス法を行うためのプライマーの設計方法に関しては、CUGA Sequencing Kit for ABI PRISM 310 Genetic Analyzer（ニッポン ジーンテク社製）に添付されているユーザーズマニュアルに記載されている。配列番号10のプライマーと配列番号20のプライマーを用いたPCRは、先の配列番号10のプライマーと配列番号11を用いたときのPCRの条件は同一で行った。PCR後、反応物の一部（10分の１量程度）を２％アガロース電気泳動で増幅DNAの確認を行ったところ、ほぼ単一の約600塩基対程度の大きさを示す単一の増幅物が得られた。
【０１０１】
この増幅産物のうち、4μLを直接、転写シークエンス反応のための鋳型として使用した。転写シークエンス法は、CUGA7 Sequencing Kit for ABI PRISIM 310 Genetic Analyzerを用いて、反応は、添付のユーザーズマニュアルに準拠して行い、反応体積は20μLで行った。反応後、反応溶液に0.1M EDTA.2Naを25μL加え、充分混合した後、エタノールを55μL加えて、再び充分混合し、遮光下、室温にて15分間放置した。その後、室温、16,000×g、15分間、遠心し、上清を捨て、70%エタノールを250μL加えて、室温、16,000×g、5分間、遠心した。上清を出来る限り除き、沈殿物を乾燥させ、TSR（アプライド・バイオシステム社製）20μLを加えて、充分に溶解した。この溶液を、ABI PRISIM 310 Genetic Analyzerで解析するためのサンプルとした。
【０１０２】
ABI PRISIM 310 Genetic Analyzerの操作は、装置に付属の操作ガイドおよびCUGA Sequencing Kit for ABI PRISIM 310 Genetic Analyzerに添付されているユーザーズマニュアルに従って行った。泳動後、Sequencing Analysisを起動させて、ベースコールを行った。
【０１０３】
以上のようにサイクルシークエンス法及び転写シークエンス法で得られたデータは、Sequencher v4.2にて、比較した。その結果を図８に示した。この結果から、サイクルシークエンス法および転写シークエンス法において解析された配列データは同一であり、塩基配列決定のための反応として、いずれの試薬も今回のプロファージMLST法に使用できることが判明した。
さらに、転写シークエンス法は、PCR後の増幅産物の精製操作が必要ないことから、省力化に貢献する方法であり、本発明技術をさらに迅速に行うことを可能にすると思われる。
本発明によるEHECの遺伝子型別法である、PFGE、サイクルシークエンス法を用いたpMLST及び転写シークエンス反応を用いた作業工程と時間に関して比較したものを図３に示した。
【０１０４】
［実施例５］
レジオネラ属菌を対象としたMLSTを行うためのターゲット領域の設定、プライマー配列の設計と評価
【０１０５】
塩基配列多型を疫学的解析手法として利用するために必要なターゲット部位を探索し、新しいMSLTをレジオネラで利用することを目的として、DDBJのホームページのなかのGenome Information Broker （http://gib.genes.nig.ac.jp/）から、Legionella pneumophila subsp. pneumophila Philadelphia 1（以下、Lpn.Philadelphiaと略記）、L.pneumophila Paris（Lpn.Paris）及びL.pneumophila Lens（Lpn.Lens）の３つのゲノム配列を得た。これらの配列は誰でも利用することが出来る。
【０１０６】
この3つのゲノム配列の中から、特に流行株であるLpn.PhiladelphiaとLpn.Lensについて、MegaBlastプログラムを用いて比較し、その一部はLpn.Parisの配列と比較して確認した。MegaBlastは、国立遺伝学研究所から得ることができるB-InfoBio Version 1.84を利用して行なった[BMC Bioinformatics, 7:368(2006)]。MegaBlastを行なうときの条件として、比較する最低の塩基長を500塩基対以上、相同性90%以上とした。その結果、79箇所の領域が選択された。この79の領域のうち、更にrRNA遺伝子やtRNAに関係した領域を除外、さらにBlastサーチの結果のスコアとその対象領域の長さの比が1.5から1.9に該当する36箇所の領域に絞り込んだ（表7）。ここでBlastサーチによるスコアとその対象領域の長さの比は、全く一致した配列の場合は、塩基配列のGC含量やギャップの有無によってその値は異なるが、２に近い値を示しており、表７に示した遺伝子領域は、比較に使用したLpn.PhiladelphiaとLpn.Lensのゲノム領域の中で「適度な多型を示し、分離株の遺伝子型別」を可能とする遺伝子領域であり、少なくとも本菌の型別を可能とする領域を含む可能性が高い配列を含んでいると考えられる。
【０１０７】
【表７】
2007252371.tif 000008
【０１０８】
この36箇所の領域長は654〜3846塩基対に及んだ。次にこの36箇所の配列のすべてにおいて、Lpn.PhiladelphiaとLpn.Lensで比較し、Tm値は65℃±2℃（AあるいはTの塩基対は２℃、GあるいはCの塩基対は４℃として計算）、塩基配列の中に2つ以上の同一塩基の連続はないこと、プライマー長は20±2塩基長の条件で検索した（Sequence Assistant Version 1.5.3を利用）。PCRを行なう場合、センス鎖側とアンチセンス鎖側の一対の組み合わせが必要であるので、プライマーの中から、増幅サイズとして、増幅長400塩基以上、800塩基対以下に設定できるプライマーの組み合わせになるように選択したところ、最終的に16組のプライマー対について設計することが出来た（表8）。
【０１０９】
【表８】
2007252371.tif 000009
【０１１０】
これらのプライマーは、すべて報告されているゲノム配列から設計されたものであり、実際のサンプルで利用できるかどうかの確認、さらに、実際に多型が存在し、疫学的な目的に利用できるかどうかの確認を、以下のように行った。研究室保存株のうち、血清群１を5株（レジオネラ保存株番号LG1、LG2、LG3、LG6、LG7)、血清群５を１株（LG11）、血清群６を１株（LG12)を用いた。これらはすべてL.pneumophilaである。そして、最後にL.bozemaniiを１株（LG14)のゲノムDNAを精製し、プライマーの機能確認の鋳型として利用した。
【０１１１】
PCRは、レジオネラゲノムDNAを1μL、フォワードプライマー(１μM)及びリバースプライマー(１μM)を各2.0μL、2.5mM dNTP混合液  2μL、Taq DNA ポリメラーゼ（宝酒造あるいはニッポンジーン）１単位、反応体積20μLとし、94℃90秒後、94℃30秒→50℃60秒→72℃60秒を30回、最後に72℃で60秒を加えて行い、得られた反応産物の一部（5μL)を２％アガロース電気泳動で増幅DNAの確認を行なった。その結果を表9に示す。表中、「＋」は、PCR産物が検出されたもの、「-」はPCR産物が検出されなかったことを示す。
【０１１２】
【表９】
2007252371.tif 000010
【０１１３】
その結果、LG14(L.bozemanii)を鋳型にした場合、PCRで増幅したのはNおよびPのみであり、残りは増幅しなかった。またL.pneumophilaを対象にした場合は、AおよびCで一部増幅に失敗したプライマーがあったが、残りのプライマーはPCR産物をほぼ予想通りの大きさで検出された(表9)。
【０１１４】
次に、増幅産物の塩基配列を決定し、多型が存在するかどうか調べた。増幅産物は、QIAquick PCR purification kit (キアゲン社)を用い精製した。精製されたPCR産物は、PCRに用いたプライマーをそのまま塩基配列決定のためのプライマーとして用いた。シークエンス反応は、BigDYER Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitのプロトコールに準拠して行なったが、DyeMixの使用量は、5xSequencing Buffer (アプライド・バイオシステム社)を用いて8倍希釈して使用した。サイクルシークエンス反応後、反応物は、DyeExTM  2.0 Spin Kit (キアゲン社)あるいはSephadexG-50を用いたゲル濾過を行い精製した。精製された反応物は、ABI 3100 Genetic Analyzerを用いた解析のための直接の試料とした。この試料は、本装置のインストラクションマニュアルに従って操作し、キャピラリー電気泳動を行なった。泳動終了後、本装置に添付されているDNA Sequence Analysis Version 5.1を用いて、塩基配列のベースコールを行なった。このデータは、更に塩基配列データアッセンブルソフトウェアSequencher v4.2 (Miraibio.Inc. 製、宝酒造取扱)により、塩基配列を評価、MLSTのデータベースを構築するための加工（塩基配列のトリミング等）を行なった。
【０１１５】
ここで、保存株LG1のすべての領域の塩基配列を配列型（Sequence type, ST)を１とした（図11）。また、この配列と１塩基でも異なる配列が別な分離株で発見された場合、解析された順番に2,3,4・・・・という具合に算用数字で割り当て、すべてのデータを塩基配列の標準的な保存形式であるFasta形式で保存し、データベース化した。このようなデータベースは、細菌のゲノムを比較するソフトウェアであるG-InfoBioプログラム中に含まれるBlastプログラムを用いて、解析された遺伝子領域の配列のSTを調べることができる。この場合、100%配列が同じであれば、そのSTの番号を記載し、100%一致する配列がない場合には、新しいSTとして登録し、データベースをその都度、更新した。表8で示したPCRのプライマーのうち、AとCを除いたプライマー対に関して、塩基配列を決定し、STを付与した。その結果は表10に示す。
【０１１６】
【表１０】
2007252371.tif 000011
【０１１７】
ここで、ABI 3100 Genetic Analyzerは一度に16サンプルを泳動することが可能であること、これまで様々なMLSTの解析対象になった配列の数は通常7つであること等を考慮すると非常に、今回のレジオネラのMLST解析の対象とする遺伝子座を8つに絞ることとし、最終的に、PCR産物であるB,E,F,H,I,J,M,Nとすることに決定し、この８つの遺伝子座のゲノム上の相対的な位置は図9に示した。ここで、このMLSTの解析が疫学的な情報とどの程度合致しており、実際に本発明が疫学的な遺伝子型別方法として利用できるかどうか評価した。その結果を表11に示した。
【０１１８】
【表１１】
2007252371.tif 000012
【０１１９】
その結果は、患者から分離された臨床分離株および聞取り調査の結果、利用したとされる公衆浴場施設とその施設から分離されたレジオネラのMLSTのタイプを比較した。その結果、患者Bについては、患者が利用したとされる浴場施設から分離された株と一致する株（備考欄に○で表記）が見られ、これらはPFGEの結果と一致しており、本法が疫学的な目的にも充分利用できることが判明した。この調査に用いた臨床株および風呂の浴用水から分離された株の遺伝子型は、複数存在することがわかる。患者Aおよび患者Cと一致する株は今回なかったが、浴用水からさらに分離株数を増やすことで、一致する株が存在した可能性があることが伺える。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
本発明の方法は、種々の病原細菌の遺伝子型別法として非常に有効であり、食品および衛生分野において非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】VT1及びVT2プロファージゲノム配列のメガブラスト検索の結果を示す。
【図２】プロファージ遺伝子を対象としたMLSTのためのターゲット領域とPCRを示す。領域I〜Vのプロファージゲノム中の位置については、EHEC O157:H7 Sakai株中のVT1プロファージゲノム中の位置として図示する。矢印の数字は表３の配列番号と一致する。また、このプライマーを使用したPCRによって増幅する産物a〜iのサイズも図示した。
【図３】各種遺伝子型別法の作業工程の比較を示す。PFGE, pulsed-field gel electrophoresis; pMLST, prophage-directed multilocus sequence typing; CS, Cycle Sequencing; TS, Transcriptional Sequencing
【図４−１】プロファージ遺伝子を目的としたPCR産物の塩基配列の一部の解析例を示す。
【図４−２】プロファージ遺伝子を目的としたPCR産物の塩基配列の一部の解析例を示す。
【図４−３】プロファージ遺伝子を目的としたPCR産物の塩基配列の一部の解析例を示す。
【図４−４】プロファージ遺伝子を目的としたPCR産物の塩基配列の一部の解析例を示す。
【図５−１】pMLST評価のために使用したEHEC感染症事件で分離された大腸菌のpMLSTの実際の解析データを示す。
【図５−２】pMLST評価のために使用したEHEC感染症事件で分離された大腸菌のpMLSTの実際の解析データを示す。
【図６】pMLST評価のために使用したEHEC感染症事件で分離された大腸菌分離９株の系統解析結果を示す。領域II〜Vから、5箇所を対象にしたPCRを行い、決定された塩基配列の統合した配列（2,448塩基対）につき、MEGA3（ペンシルバニア州立大学の根井博士によって開発された、分子進化解析プログラム）により系統樹を作成した。この系統樹の株番号の右側に各分離株のPFGEのパターンを示した。
【図７】pMLST評価のために使用したEHEC感染症事件で分離された大腸菌分離９株のPFGE画像による系統解析結果を示す。
【図８】サイクルシークエンス法及び転写シークエンス法によるpMLST解析結果の比較を示す。
【図９】実施例5で決定した８つの遺伝子座B,E,F,H,I,J,M,Nのゲノム上の相対的な位置を示す。
【図１０】領域Nにおける１２番目の塩基がCとTの重なりを示すことを示す塩基配列決定結果を示す。
【図１１−１】レジオネラ分離株LG1から得られた配列を示す。この株から得られた各遺伝子座の配列型を１と定義した。また、それらの配列をFasta形式で示している。実際のデータベースでは、この形式のテキストデータとして保管される。
【図１１−２】レジオネラ分離株LG1から得られた配列を示す。この株から得られた各遺伝子座の配列型を１と定義した。また、それらの配列をFasta形式で示している。実際のデータベースでは、この形式のテキストデータとして保管される。
【図１１−３】レジオネラ分離株LG1から得られた配列を示す。この株から得られた各遺伝子座の配列型を１と定義した。また、それらの配列をFasta形式で示している。実際のデータベースでは、この形式のテキストデータとして保管される。
【図１】
2007252371.tif 000013
【図２】
2007252371.tif 000014
【図３】
2007252371.tif 000015
【図４−１】
2007252371.tif 000016
【図４−２】
2007252371.tif 000017
【図４−３】
2007252371.tif 000018
【図４−４】
2007252371.tif 000019
【図５−１】
2007252371.tif 000020
【図５−２】
2007252371.tif 000021
【図６】
2007252371.tif 000022
【図７】
2007252371.tif 000023
【図８】
2007252371.tif 000024
【図９】
2007252371.tif 000025
【図１０】
2007252371.tif 000026
【図１１−１】
2007252371.tif 000027
【図１１−２】
2007252371.tif 000028
【図１１−３】
2007252371.tif 000029
【配列表】
2007252371000001.app