(57)【要約】【課題】本発明は、転写因子結合物質及び転写因子の制御方法を提供し、これらを用いて、幹細胞を効率良く増幅する技術を提供することを目的とする。【解決手段】転写因子結合物質は、転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子の少なくとも１つの転写因子と結合能を有する転写因子結合物質であって、転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子の間の少なくとも１つの結合の阻害能を有する。２以上の転写因子には、ＨＯＸファミリータンパク質及びＰＢＸ１を含むことができる。転写因子結合物質は、核移行シグナルをもつペプチドであることができる。この転写因子結合物質を用いて、転写因子を制御することができる。また、この転写因子結合物質を用いて、幹細胞を増幅することもできる。幹細胞は、造血幹細胞であることができる。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子の少なくとも１つの転写因子と結合能を有する転写因子結合物質であって、
前記転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子の間の少なくとも１つの結合の阻害能を有する、転写因子結合物質。
【請求項２】
請求項１において、
前記転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子には、ＨＯＸファミリータンパク質が含まれる、転写因子結合物質。
【請求項３】
請求項１又は２において、
前記転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子には、ＰＢＸ１が含まれる、転写因子結合物質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項において、
前記転写因子結合物質は、ＨＯＸファミリータンパク質の標的遺伝子の発現を上昇及び／又は低下させる活性を有することを特徴とする、転写因子結合物質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項において、
前記転写因子結合物質は、少なくとも一部の幹細胞に多分化能を維持させたまま、前記幹細胞の自己複製能を亢進させる活性を有することを特徴とする、転写因子結合物質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項において、
前記転写因子結合物質は、幹細胞内において、核へ移行して機能することを特徴とする、転写因子結合物質。
【請求項７】
請求項５又は６において、
前記幹細胞は、哺乳類由来である、転写因子結合物質。
【請求項８】
請求項７において、
前記哺乳類は、ヒトである、転写因子結合物質。
【請求項９】
請求項５〜７のいずれか一項において、
前記幹細胞は、組織幹細胞又は胚性幹細胞である、転写因子結合物質。
【請求項１０】
請求項９において、
前記組織幹細胞は、造血幹細胞である、転写因子結合物質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項において、
前記転写因子結合物質は、ペプチドである、転写因子結合物質。
【請求項１２】
請求項１１において、
前記ペプチドは、ＰＢＸ１に結合することによって、ＰＢＸ１とＨＯＸファミリータンパク質の結合を阻害する活性を有することを特徴とする、転写因子結合物質。
【請求項１３】
請求項１１又は１２において、
前記ペプチドは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、転写因子結合物質。
【請求項１４】
請求項１１又は１２において、
前記ペプチドは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含みＰＢＸ１への結合能を有する、転写因子結合物質。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれか一項において、
前記ペプチドは、核移行シグナルを有する、転写因子結合物質。
【請求項１６】
請求項２、４、１２のいずれか一項において、
前記ＨＯＸファミリータンパク質は、ＨＯＸＢ４である、転写因子結合物質。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の転写因子結合物質を用いた、転写因子の制御方法。
【請求項１８】
転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子の少なくとも１つの転写因子と結合能を有する転写因子結合物質を、前記少なくとも１つの転写因子に作用させて、前記転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子の間の少なくとも１つの結合を阻害し、転写因子の活性を制御する、転写因子の制御方法。
【請求項１９】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の転写因子結合物質を含む、幹細胞。
【請求項２０】
請求項１９において、
前記幹細胞は、哺乳類由来である、幹細胞。
【請求項２１】
請求項２０において、
前記哺乳類は、ヒトである、幹細胞。
【請求項２２】
請求項１９〜２１のいずれか一項において、
前記幹細胞は、組織幹細胞又は胚性幹細胞である、幹細胞。
【請求項２３】
請求項２２において、
前記組織幹細胞は、造血幹細胞である、幹細胞。
【請求項２４】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の転写因子結合物質を用いた、幹細胞の増幅方法。
【請求項２５】
転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子の少なくとも１つの転写因子と結合能を有する転写因子結合物質を、前記少なくとも１つの転写因子に作用させて、前記転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子の間の少なくとも１つの結合を阻害し、転写因子の活性を制御することを含む、幹細胞の増幅方法。
【請求項２６】
請求項２４又は２５において、
前記幹細胞は、哺乳類由来である、幹細胞の増幅方法。
【請求項２７】
請求項２６において、
前記哺乳類は、ヒトである、幹細胞の増幅方法。
【請求項２８】
請求項２４〜２７のいずれか一項において、
前記幹細胞は、組織幹細胞又は胚性幹細胞である、幹細胞の増幅方法。
【請求項２９】
請求項２８において、
前記組織幹細胞は、造血幹細胞である、幹細胞の増幅方法。
【請求項３０】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の転写因子結合物質を含む、転写因子間結合阻害剤。
【請求項３１】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の転写因子結合物質を含む、組成物。
【請求項３２】
転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子の少なくとも１つの転写因子と結合能を有し、前記転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子の間の少なくとも１つの結合の阻害能を有するペプチドのアミノ酸配列をコードする領域を含む、ヌクレオチド鎖又はその相補鎖。
【請求項３３】
請求項３２において、
前記ヌクレオチド鎖又はその相補鎖は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする領域を含む、ヌクレオチド鎖又はその相補鎖。
【請求項３４】
請求項３２において、
前記ヌクレオチド鎖又はその相補鎖は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含みＰＢＸ１への結合能を有するペプチドをコードする領域を含む、ヌクレオチド鎖又はその相補鎖。
【請求項３５】
請求項３２〜３４のいずれか一項において、
前記ヌクレオチド鎖又はその相補鎖は、核移行シグナルをコードする領域を含む、ヌクレオチド鎖又はその相補鎖。
【請求項３６】
請求項３２〜３５のいずれか一項に記載のヌクレオチド鎖又はその相補鎖を含む、組換えベクター。
【請求項３７】
請求項３６に記載の組換えベクターで形質転換された、形質転換体。
【請求項３８】
請求項３２〜３５のいずれか一項に記載のヌクレオチド鎖又はその相補鎖を含む、組成物。
【請求項３９】
請求項３６に記載の組換えベクターを含む、組成物。
【請求項４０】
請求項３１、３８、３９のいずれか一項において、
前記組成物が、造血幹細胞の増殖促進剤である、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転写因子と結合能を有する転写因子結合物質、及び、その物質を用いた転写因子制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
造血幹細胞は、自己複製能と多分化能をあわせもつ血球細胞と定義され、骨髄、末梢血、臍帯血中などに存在する。
【０００３】
造血幹細胞の自己複製能や多分化能は、種々のサイトカインなどの外的因子、及び、転写因子などの内的因子により調節されている。外的因子であるサイトカインのシグナルは、造血幹細胞上に発現しているサイトカイン受容体を介して核に伝達され、内的因子である転写因子の動態を決定し、自己複製能と多分化能に関与する遺伝子の発現を調節していると考えられる。これまでに、造血幹細胞において重要な役割を担う転写因子の多くは、遺伝子変異により白血病などの悪性腫瘍形成にかかわることが明らかにされている。
【０００４】
造血幹細胞のもつ自己複製能は、造血幹細胞移植という形で、血液悪性腫瘍などに対する移植療法に利用されるとともに、再生医療における有用性が期待されている。臍帯血中には、末梢血や骨髄中と比較して、より多くの造血幹細胞が含まれることが知られているが、成人を対象とした移植療法に用いるのに十分な量を得ることは困難である。そこで近年では、提供者から必要量の造血幹細胞を採取するのではなく、少量の造血幹細胞を採取して、体外で培養し、増幅する試みが行われてきた。従って、体外において、造血幹細胞を効率よく未分化のまま増殖させる技術の開発が必要とされている。
【０００５】
これまでに、外的因子及び内的因子を操作することにより、造血幹細胞を体外で増幅させる試みが精力的に行われてきた。外的因子操作法においては、造血幹細胞上に発現しているサイトカイン受容体の解析から、造血幹細胞の体外増幅に有用な種々のサイトカインの組み合わせが検討され、一定の見解が得られている。しかしながら、外的因子操作のみによる造血幹細胞増幅には明らかに限界があるのが実状である。そこで、近年は種々のサイトカインによって引き起こされる細胞内のシグナル伝達機構が注目され、そこで活躍する転写因子操作によるアプローチが進んできた。
【０００６】
ホメオボックス型転写因子ＨＯＸＢ４は、マウス、ヒト造血幹細胞における重要な自己複製因子として注目されており、転写因子を修飾して造血幹細胞を増幅する研究において、最も高い効率が報告されている。
【０００７】
ＨＯＸＢ４は、同じホメオボックス型転写因子ＰＢＸ１と複合体を形成して、種々の遺伝子発現を調節していることが知られている。
【０００８】
近年、ＰＢＸ１は、造血幹細胞の自己複製過程において、ＨＯＸＢ４の活性を負に制御していること、及び、骨髄球系への分化過程において、別のＨＯＸファミリータンパク質であるＨＯＸＡ１０の活性を正に制御していることが報告されている。さらに、ＨＯＸファミリータンパク質とＰＢＸ１との結合には、それぞれのホメオドメインだけでなく、ＨＯＸファミリータンパク質によく保存されたＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔモチーフが必須であることが、タンパク質結晶構造解析などから明らかにされている。
【０００９】
これまで、造血幹細胞の体外増幅における内的因子操作は、レトロウィルスやアデノウィルスなどのウィルスベクターを用いた遺伝子導入法が中心であった。しかし、ヒト造血幹細胞へは遺伝子導入効率が低いという問題点に加えて、ウィルスベクターを用いた遺伝子導入による白血病の発症が報告されるなど、染色体レベルの影響が不可避であると考えられる。これらの問題点を克服するために、近年、遺伝子産物であるタンパク質自体を細胞に直接導入する方法が試みられているが、発現させたタンパク質が活性を有する立体構造をとれない場合がありうるなどの問題点も多い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、転写因子結合物質及び転写因子の制御方法を提供し、さらに、これらを用いて、幹細胞を効率良く増幅する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段及び発明の効果】
【００１１】
１．転写因子結合物質
本発明の転写因子結合物質は、
転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子の少なくとも１つの転写因子と結合能を有する転写因子結合物質であって、
前記転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子の間の少なくとも１つの結合の阻害能を有する。
【００１２】
本発明によれば、転写因子の間の結合状態を変化させることによって、転写因子の活性を制御することができる。
【００１３】
本発明において、前記転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子に、ＨＯＸファミリータンパク質が含まれることが可能である。これによれば、ＨＯＸファミリータンパク質が含まれている転写に関わる複合体に含まれる転写因子の活性を、前記転写因子結合物質を用いて制御することができる。
【００１４】
本発明において、前記転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子に、ＰＢＸ１が含まれることが可能である。これによれば、ＰＢＸ１が含まれている転写に関わる複合体に含まれる転写因子の活性を、前記転写因子結合物質を用いて制御することができる。
【００１５】
また、前記転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子に、ＨＯＸファミリータンパク質及びＰＢＸ１が含まれ、両者が直接的に結合している場合は、ＨＯＸファミリータンパク質又はＰＢＸ１と結合能を有する転写因子結合物質であって、ＨＯＸファミリータンパク質とＰＢＸ１の間の結合の阻害能を有する転写因子結合物質によって、前記転写に関わる複合体に含まれる転写因子の活性を制御することができる。
【００１６】
本発明において、前記転写因子結合物質は、ＨＯＸファミリータンパク質の標的遺伝子の発現を上昇及び／又は低下させる活性を有することができる。これによれば、細胞の生理状態を変化させることができる。細胞の生理状態とは、例えば、細胞の自己複製状態である。
【００１７】
本発明において、前記転写因子結合物質は、少なくとも一部の幹細胞に多分化能を維持させたまま、前記幹細胞の自己複製能を亢進させる活性を有することができる。これによれば、幹細胞を、未分化の状態を維持させたまま増幅することができる。
【００１８】
本発明において、前記転写因子結合物質は、幹細胞内において、核へ移行して機能することができる。これによれば、前記転写因子結合物質が、核において転写因子と結合し、前記転写因子の間の少なくとも１つの結合を阻害することができる。
【００１９】
本発明において、前記幹細胞は、哺乳類由来であることができる。前記哺乳類は、ヒトであることができる。
【００２０】
また、本発明において、前記幹細胞は、組織幹細胞又は胚性幹細胞であることができる。前記組織幹細胞は、造血幹細胞であることができる。
【００２１】
本発明において、前記転写因子結合物質は、ペプチドであることができる。これによれば、転写因子結合物質として遺伝子を用い、ウィルスベクター等を用いて細胞に導入した場合と比較して、有利な導入効率を得ることができる。また、ペプチドは、一定の時間がたつと細胞内で分解され消失する化合物であるため、ペプチドを導入した細胞は、最終的に、無操作の細胞に極めて近い状態に至ることが可能であり、細胞に染色体レベルの影響を与えない。
【００２２】
本発明において、前記ペプチドは、ＰＢＸ１に結合することによって、ＰＢＸ１とＨＯＸファミリータンパク質の結合を阻害する活性を有することができる。これによれば、ＨＯＸファミリータンパク質は、ＰＢＸ１から受けていた制御から逃れることができ、ＨＯＸファミリータンパク質の活性が変化することができる。
【００２３】
本発明において、前記ペプチドは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むことができる。これによれば、前記ペプチドは、ＰＢＸ１のホメオドメインに直接結合することができる。
【００２４】
本発明において、前記ペプチドは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含みＰＢＸ１への結合能を有することができる。これによれば、前記ペプチドは、ＰＢＸ１のホメオドメインに直接結合することができる。
【００２５】
本発明において、前記ペプチドは、核移行シグナルを有することが可能である。これによれば、前記ペプチドを確実に核に導入することができる。
【００２６】
本発明において、前記ＨＯＸファミリータンパク質は、ＨＯＸＢ４であることができる。これによれば、ＨＯＸＢ４が含まれている転写に関わる複合体に含まれる転写因子の活性を、前記転写因子結合物質を用いて制御することができる。
【００２７】
２．転写因子の制御方法
本発明の転写因子の制御方法は、本発明に係る転写因子結合物質を用いた、転写因子の制御方法である。
【００２８】
すなわち、本発明に係る転写因子の制御方法は、転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子の少なくとも１つの転写因子と結合能を有する転写因子結合物質を、前記少なくとも１つの転写因子に作用させて、前記転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子の間の少なくとも１つの結合を阻害し、転写因子の活性を制御する。
【００２９】
本発明によれば、転写因子の活性を変化させることによって、標的遺伝子の発現を変化させることが可能である。
【００３０】
３．幹細胞及び幹細胞の増幅方法
本発明は、本発明に係る転写因子結合物質を含む、幹細胞である。
【００３１】
また、本発明は、本発明に係る転写因子結合物質を用いた、幹細胞の増幅方法である。
【００３２】
すなわち、本発明に係る幹細胞の増幅方法は、転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子の少なくとも１つの転写因子と結合能を有する転写因子結合物質を、前記少なくとも１つの転写因子に作用させて、前記転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子の間の少なくとも１つの結合を阻害し、転写因子の活性を制御することを含む。
【００３３】
本発明によれば、幹細胞が前記転写因子結合物質を含むことによって、転写因子の活性が変化し、標的遺伝子の発現を変化させることができる。その結果、幹細胞の自己複製能が亢進し、幹細胞を増幅することができる。
【００３４】
本発明において、前記幹細胞は、哺乳類由来であることができる。前記哺乳類は、ヒトであることができる。
【００３５】
また、本発明において、前記幹細胞は、組織幹細胞又は胚性幹細胞であることができる。前記組織幹細胞は、造血幹細胞であることができる。
【００３６】
４．転写因子間結合阻害剤
本発明は、本発明に係る転写因子結合物質を含む、転写因子間結合阻害剤である。これによれば、転写因子の間の結合状態を変化させることによって、転写因子の活性を制御することができる。
【００３７】
５．組成物
本発明は、本発明に係る転写因子結合物質を含む、組成物である。これによれば、転写因子結合物質を、例えば、医薬組成物や実験試薬の態様で、医療や研究に用いることができる。
【００３８】
本発明において、前記組成物は、造血幹細胞の増殖促進剤であることができる。これによれば、転写因子の活性を制御することによって、少なくとも一部の造血幹細胞に多分化能を維持させたまま、造血幹細胞の自己複製能を亢進させることによって、造血幹細胞を増幅することができる。
【００３９】
６．ヌクレオチド又はその相補鎖
本発明のヌクレオチド鎖又はその相補鎖は、転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子の少なくとも１つの転写因子と結合能を有し、前記転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子の間の少なくとも１つの結合の阻害能を有するペプチドのアミノ酸配列をコードする領域を含む。
【００４０】
本発明によれば、本発明に係るペプチドを発現することができる。
【００４１】
本発明において、前記ヌクレオチド鎖又はその相補鎖は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする領域を含むことができる。これによれば、ＰＢＸ１のホメオドメインに直接結合するペプチドを発現することができる。
【００４２】
本発明において、前記ヌクレオチド鎖又はその相補鎖は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含みＰＢＸ１への結合能を有するペプチドをコードする領域を含むことができる。これによれば、ＰＢＸ１のホメオドメインに直接結合するペプチドを発現することができる。
【００４３】
本発明において、前記ヌクレオチド鎖又はその相補鎖は、核移行シグナルをコードする領域を含むことができる。これによれば、核移行シグナルを含むペプチドを発現することができ、前記ペプチドが確実に核に移行することができる。
【００４４】
本発明は、本発明に係るヌクレオチド鎖又はその相補鎖を含む、組換えベクターである。これによれば、目的細胞を形質転換し、形質転換体を得ることが可能である。
【００４５】
７．形質転換体
本発明は、本発明に係る組換えベクターで形質転換された、形質転換体である。これによれば、本発明に係る組換えベクターの増幅や、本発明に係るペプチドの発現が可能となる。また、前記形質転換体中で発現した本発明に係るペプチドが、転写因子の間の少なくとも１つの結合を阻害することによって、転写因子の活性を制御し、そのため標的遺伝子の発現が変化することによって自己複製能が亢進し、形質転換体自体が増幅することも可能である。
【００４６】
８．組成物
本発明は、本発明に係るヌクレオチド鎖又はその相補鎖を含む、組成物である。
【００４７】
また、本発明は、本発明に係る組換えベクターを含む、組成物である。
【００４８】
これらによれば、本発明に係るヌクレオチド鎖又はその相補鎖、あるいは組換えベクターを、例えば、医薬組成物や実験試薬の態様で、医療や研究に用いることができる。
【００４９】
本発明において、前記組成物は、造血幹細胞の増殖促進剤であることができる。これによれば、発現したペプチドが転写因子の活性を制御することによって、少なくとも一部の造血幹細胞に多分化能を維持させたまま、造血幹細胞の自己複製能を亢進させることによって、造血幹細胞を増幅することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
以下、本発明の最良の実施の形態を、図面を参照しながら説明する。本発明は、以下の実施形態に限定されず、本発明の要旨を超えない範囲で種々の変更が可能である。
【００５１】
１．転写因子結合物質
本実施の形態に係る転写因子結合物質は、転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子の少なくとも１つの転写因子と結合能を有する転写因子結合物質であって、この転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子の間の少なくとも１つの結合の阻害能を有する。
【００５２】
本実施の形態に係る転写因子結合物質によれば、転写因子の間の結合状態を変化させることによって、転写因子の活性を制御することができる。
【００５３】
本実施の形態において、転写因子とは、基本転写因子、転写開始因子、転写伸長因子、転写終結因子、転写調節因子などの、転写反応において必要とされるタンパク質を意味する。転写因子には、ＤＮＡに結合するものと、ＤＮＡには結合せず、因子間相互作用を介して機能するものとがあるが、本実施の形態における転写因子は、いずれであってもよい。
【００５４】
本実施の形態において、２以上の転写因子とは、２以上の同種の転写因子であっても、２以上の異種の転写因子であってもよい。
【００５５】
転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子は、例えば、ＨＯＸファミリータンパク質、又は、ＰＢＸ１を含むことが可能である。ＨＯＸファミリータンパク質を含んだ場合、このＨＯＸファミリータンパク質は、例えば、ＨＯＸＢ４であることができる。
【００５６】
転写因子結合物質は、例えば、ＨＯＸファミリータンパク質の標的遺伝子の発現を上昇及び／又は低下させる活性を有するもの、少なくとも一部の幹細胞に多分化能を維持させたまま、幹細胞の自己複製能を亢進させる活性を有するもの、又は、この両者の活性を有するものを挙げることができる。
【００５７】
ＨＯＸファミリータンパク質の標的遺伝子としては、例えば、ｃ−ｍｙｃ、ｐ２１ｗａｆ１／ｃｉｐ１、ｃｙｃｌｉｎＤ１を挙げることができる。
【００５８】
本実施の形態において、幹細胞は、哺乳類由来の幹細胞を用いることができる。また、哺乳類由来の幹細胞としては、例えば、ヒト由来の幹細胞を用いることができる。
【００５９】
また、本実施の形態において、幹細胞は、組織幹細胞又は胚性幹細胞を用いることができる。組織幹細胞としては、例えば、造血幹細胞を用いることができる。造血幹細胞の採取源としては、例えば、臍帯血、胎児肝臓、骨髄、胎児骨髄、又は末梢血があげられるが、造血幹細胞を含む組織であれば特に限定されない。また、本実施の形態において、造血幹細胞以外の組織幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞、神経幹細胞、血管幹細胞、肝幹細胞、又は膵幹細胞を用いることができる。
【００６０】
また、転写因子結合物質は、幹細胞内において、核へ移行して機能することが可能である。これによれば、前記転写因子結合物質が、核において転写因子と結合し、前記転写因子の間の少なくとも１つの結合を阻害することができる。転写因子結合物質を核へ移行させる手段としては、結果として転写因子結合物質を核に到達させうる手段であれば特に限定されないが、例えば、核へ移行する活性がある物質と転写因子結合物質を共有結合等を用いて結合させる方法や、転写因子結合物質を核へ移行する活性がある物質で包み込む方法などが挙げられる。
【００６１】
転写因子結合物質は、ペプチドを用いることができる。また、ペプチドは、核へ移行する手段として、例えば、核移行シグナルを有することが可能である。核移行シグナルとしては、ペプチドを核まで輸送するために働くアミノ酸配列であれば特に限定されず、例えば、複数個の塩基性アミノ酸のクラスターを１又は２以上含むアミノ酸配列が挙げられる。具体的には、例えば、ＳＶ４０のＴ抗原、Ｎｕｃｌｅｏｐｌａｓｍｉｎ、ＨｕｍａｎＲＢに見られるアミノ酸配列が挙げられる。ＳＶ４０のＴ抗原、Ｎｕｃｌｅｏｐｌａｓｍｉｎ、ＨｕｍａｎＲＢに見られる核移行シグナルを、それぞれ配列表の配列番号２、配列番号３、配列番号４に示す。
【００６２】
２．転写因子の制御方法
本実施の形態は、本実施の形態に係る転写因子結合物質を用いることによる、転写因子の制御方法である。転写因子の制御方法の具体的な態様としては、転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子の少なくとも１つの転写因子と結合能を有する転写因子結合物質を、この少なくとも１つの転写因子に作用させて、この転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子の間の少なくとも１つの結合を阻害し、転写因子の活性を制御する、転写因子の制御方法である。  これによれば、転写因子の活性を変化させることによって、標的遺伝子の発現を変化させることが可能である。
【００６３】
３．転写因子結合物質及び転写因子の制御方法の一例
ホメオボックス型転写因子ＨＯＸＢ４は、造血幹細胞の自己複製因子として機能することが知られている。また、同じホメオボックス型転写因子ＰＢＸ１は、造血幹細胞の自己複製過程において、ＨＯＸＢ４と直接結合して複合体を形成し、ＨＯＸＢ４の活性を負に制御していることが報告されている（Ｋｒｏｓｌ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１８：５６１，２００３）。さらに、ＨＯＸファミリータンパク質とＰＢＸ１との結合には、それぞれのホメオドメインに加えて、ＨＯＸファミリータンパク質によく保存されたＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔモチーフが必須であることが知られている（Ｐａｓｓｎｅｒ，ＪＭ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９７：７１４，１９９９）（図１）。
【００６４】
そこで、本実施の形態に係る転写因子結合物質は、例えば、ＰＢＸ１に結合することによって、ＰＢＸ１とＨＯＸファミリータンパク質の結合を阻害するペプチドを用いることができる。このペプチドとしては、例えば、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチドを挙げることができる（以下、このペプチドを「ペプチド１」と記す。）。ペプチド１は、核移行シグナルを有することが好ましい。核移行シグナルを有することによって、ペプチド１を確実に核に導入することができる。
【００６５】
また、本実施の形態に係る転写因子結合物質として、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含みＰＢＸ１への結合能を有するペプチドを用いることもできる（以下、このペプチドを「ペプチド２」と記す。）。これによれば、ペプチド２のアミノ酸配列が、ペプチド1のアミノ酸配列と相違するものであっても、ペプチド１の本質的な機能に影響を与えない相違であれば、ペプチド１と実質的に同等なものとみなすことができ、ペプチド２はＰＢＸ１に結合して機能することができる。さらに、ペプチド２が、例えば、ペプチド１よりも、ＰＢＸ１に対して高い結合能力を有する場合には、このペプチド２は、ＰＢＸ１とＨＯＸファミリータンパク質の結合を、より効果的に阻害する活性を有することができる。
【００６６】
本実施の形態に係る転写因子結合物質として、例えばペプチド１を用いた場合は、以下に示すような態様で、ＨＯＸＢ４の活性を制御することができる。ペプチド１を、例えば造血幹細胞に導入することによって、ペプチド１は、ＰＢＸ１のＨＯＸＢ４結合部位を、ＨＯＸＢ４と競合的に奪い合い、ペプチド１がＰＢＸ１に結合することによって、ＰＢＸ１とＨＯＸＢ４の結合を阻害する（図２）。その結果、ＨＯＸＢ４は、ＰＢＸ１から受けていた制御から逃れることができ、ＨＯＸＢ４の活性が変化する。従って、ＨＯＸＢ４標的遺伝子の発現が上昇及び／又は低下する。
【００６７】
ペプチドの合成は、ペプチドの化学合成に通常用いられている方法又は装置を用いて行うことができ、例えば、固相法や液相法を用いることができる。合成されたペプチドは、例えば、ＨＰＬＣにより精製される。ペプチドの純度は、例えば、ＨＰＬＣ及びアミノ酸分析によって確認される。
【００６８】
細胞へのペプチドの導入方法としては、ペプチドの持つ機能を保持したまま細胞内へ到達させうる方法であれば特に限定されないが、例えば、リポソームを利用した細胞内デリバリーシステムを用いることができる。リポソームはリン脂質二重膜でできていることから、例えば、膜融合を引き起こす活性をもつ物質を用いることによって、リポソームと細胞膜を融合させることが可能である。従って、ペプチドをリポソーム内部に封入し、リポソームを細胞膜と直接融合させることによって、内部に封入したペプチドを細胞内に導入することが可能である。また、リポソームをエンドサイトーシス（食作用）によって細胞に取り込んだ後にエンドソームと融合させて、内部に封入したペプチドを細胞内に導入することも可能である。
【００６９】
本実施の形態における転写因子阻害物質によってＰＢＸ１との結合が阻害されうるＨＯＸファミリータンパク質としては、例えば、ＨＯＸＡ、ＨＯＸＢ、ＨＯＸＣ又はＨＯＸＤファミリーに属するタンパク質が挙げられる。
【００７０】
４．幹細胞の増幅方法
本実施の形態は、本実施の形態に係る転写因子結合物質を用いることによる、幹細胞の増幅方法である。幹細胞の増幅方法の具体的な態様としては、転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子の少なくとも１つの転写因子と結合能を有する転写因子結合物質を、この少なくとも１つの転写因子に作用させて、この転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子の間の少なくとも１つの結合を阻害し、転写因子の活性を制御することを含む、幹細胞の増幅方法である。
【００７１】
これによれば、前記転写因子結合物質が、転写因子の間の結合を阻害することによって、転写因子の活性が変化し、標的遺伝子の発現を変化させることができる。その結果、幹細胞の自己複製能が亢進し、幹細胞を増幅することができる。
【００７２】
５．幹細胞の増幅方法の具体例
ＨＯＸＢ４は、造血幹細胞において自己複製因子として機能することが知られている（Ｓａｕｖａｇｅａｕ，Ｇ．，Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．，９：１７５３，１９９５）。
【００７３】
そこで、本実施の形態に係る転写因子結合物質として、例えばペプチド１を用いた場合は、以下に示すような態様で、造血幹細胞を増幅することができる。ペプチド１を造血幹細胞に導入することによって、ペプチド１はＰＢＸ１に結合し、ＰＢＸ１とＨＯＸＢ４の結合を阻害する。その結果、ＨＯＸＢ４の活性が変化し、ＨＯＸＢ４標的遺伝子の発現が上昇及び／又は低下する。ＨＯＸＢ４標的遺伝子は、例えば、細胞周期制御因子である。これによって、ペプチド１は、少なくとも一部の造血幹細胞に多分化能を維持させたまま、造血幹細胞の自己複製能を亢進させることによって、造血幹細胞を増幅することができる。
【００７４】
造血幹細胞の培養に用いる培地としては、造血幹細胞の生存、増殖が害されない限り特に限定されないが、例えば、血清添加培地としてＭＥＭ−α（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）、無血清培地としてＱＢＳＦ−６０（ＱＵＡＬＩＴＹ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ社）を挙げることができる。
【００７５】
本実施の形態に係る転写因子結合物質を用いて造血幹細胞をより効果的に増幅させるために、培地に種々の生理活性物質を添加することが可能である。生理活性物質は、造血幹細胞の生存、増殖が害されない限り特に限定されないが、例えば、サイトカインや造血因子、増殖因子を添加することができる。サイトカインとしては、例えば、ＩＬ−６（インターロイキン−６）、ｓＩＬ−６Ｒ（可溶性インターロイキン−６レセプター）、ＩＬ−３（インターロイキン−３）を挙げることができる。造血因子としては、例えば、ＳＣＦ（幹細胞成長因子）、ＦＬ（ｆｌｋ２／ｆｌｔ３リガンド）、ＴＰＯ（トロンボポエチン）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子）を挙げることができる。増殖因子としては、例えば、インスリンを挙げることができる。
【００７６】
６．幹細胞
本実施の形態は、本実施の形態に係る転写因子結合物質を含む、幹細胞である。この幹細胞は、本実施の形態に係る転写因子結合物質を含むことによって、転写因子の活性が制御されている状態におかれることができる。本実施の形態に係る転写因子結合物質を含む幹細胞としては、例えば、ペプチド１を含む造血幹細胞である。ペプチド１を含む造血幹細胞は、少なくとも一部の造血幹細胞が多分化能を維持したまま、自己複製能が亢進しているため、造血幹細胞の数を増幅することができる。
【００７７】
増幅された造血幹細胞は、従来の骨髄移植、末梢血移植、臍帯血移植に代わる血液細胞移植用の移植片として用いることができる。従来の移植片においては、含有幹細胞の絶対数が不足しており、成人を対象とした移植療法に用いるのに十分な量を得ることは困難であった。そこで、本実施の形態に係る造血幹細胞の増幅方法を用いることによって、造血幹細胞を効率よく未分化のまま増幅して、移植療法に用いることができる。また、本実施の形態に係る転写因子結合物質を含む造血幹細胞を、再生医療に応用することも可能である。
【００７８】
７．用途
本実施の形態に係る転写因子結合物質は、様々な用途に用いることが可能である。例えば、本実施の形態に係る転写因子結合物質を含む、転写因子間結合阻害剤である。これによれば、転写因子の間の結合状態を変化させることによって、転写因子の活性を制御することができる。この作用を利用して、例えば、転写因子の制御機構を解明することができる。
【００７９】
また、本実施の形態は、本実施の形態に係る転写因子阻害物質を含む、組成物である。この組成物は、例えば、医薬組成物、実験試薬であることができる。
【００８０】
また、この組成物の好適な例としては、例えば、造血幹細胞の増殖促進剤である。これによれば、転写因子の活性を制御することによって、少なくとも一部の造血幹細胞に多分化能を維持させたまま、造血幹細胞の自己複製能を亢進させることによって、造血幹細胞を増幅することができる。
【００８１】
８．本実施の形態に係るペプチドの利点
これまでの造血幹細胞の増幅方法において、内的因子を操作するのに用いられていた手段は、レトロウィルスなどのウィルスベクターを用いた遺伝子導入法が中心であった。しかし、レトロウィルスは分裂細胞にしか感染しないため、自己複製頻度が低いヒトのような大型動物の造血幹細胞については、マウスと比較してはるかに遺伝子導入効率が低かった。さらに、ヒトのレトロウィルス受容体であるアンホトロピック受容体は、げっ歯類に特異的なエコトロピック受容体に比べてはるかに発現が少なく、これもヒトの造血幹細胞の遺伝子導入効率が低い原因の一つとなっていた。
【００８２】
これに対して、本実施の形態に係る転写因子結合物質としてペプチドを用いれば、遺伝子導入が細胞の分裂状態に左右されることがない等の理由から、レトロウィルスを用いたときと比べて有利な導入効率を得ることができる。
【００８３】
また、レトロウィルスを用いて遺伝子を導入した場合は、遺伝子が造血幹細胞のゲノムに組み込まれる。このことは、造血幹細胞にいったん遺伝子を導入すれば、理論的には、その遺伝子は将来にわたって全血液細胞で発現可能であり、安定な発現が期待できるという利点がある。しかし、この方法では、導入した遺伝子がゲノムへランダムに組み込まれてしまうため、例えば近傍の癌遺伝子を活性化してしまうことによって、癌化を引き起こす可能性がある。実際に、２００２年、フランスにおいて、レトロウィルスベクターを用いた遺伝子治療を受けた患者が白血病を発症したことが報告されており、その原因は、投与した遺伝子が、造血幹細胞の増殖に関与する遺伝子の近傍に逆向きに挿入されて、増殖能が異常に活性化されたためだったことが明らかにされている。
【００８４】
一方、アデノウィルスを用いて遺伝子を導入した場合は、レトロウィルスと比較して、様々な細胞に効率よく遺伝子を導入することができ、非分裂細胞にも遺伝子導入が可能である。また、導入された遺伝子はゲノムに組み込まれず、体内で複製されないため、遺伝子の発現は一過性であり、導入した遺伝子の分だけの効果を生じる。しかし、導入した細胞にはウィルス遺伝子の大半が残っているため、細胞毒性を示したり、免疫反応が生じて反復投与ができなくなるなどの副作用が生じる。
【００８５】
これに対して、本実施の形態に係る転写因子結合物質としてのペプチドは、導入した細胞に染色体レベルの影響を与えない。また、ペプチドは一定の時間がたつと細胞内で分解され消失する化合物であるため、ペプチドを導入した細胞は、最終的に、無操作の細胞に極めて近い状態に至ると考えられる。さらに、リポソームを用いたペプチドの導入法は、ウィルスを用いた遺伝子導入法と比べて簡便である。
【００８６】
また、近年では、遺伝子産物であるタンパク質自体を、直接細胞に導入する方法が試みられている。しかし、用いるタンパク質発現系によって、発現したタンパク質が活性を有する立体構造をとれない場合や、翻訳後修飾がヒトと異なる場合が生じる可能性がある。
【００８７】
これに対して、本実施の形態に係る転写因子結合物質として、遺伝子産物であるタンパク質よりもはるかに低分子量であるペプチドを用いることができる。ペプチドは、合成が困難な配列でなく、一定の長さまでであれば、化学合成が可能であり、前述のような、タンパク質自体を発現させる場合に生じる問題点を考慮する必要性が低い。
【００８８】
以上に示すように、本実施の形態に係る転写因子結合物質としてペプチドを用いた場合には、様々な利点が認められる。
【００８９】
９．ヌクレオチド又はその相補鎖
本実施の形態に係るヌクレオチド鎖又はその相補鎖は、転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子の少なくとも１つの転写因子と結合能を有し、この転写に関わる複合体を形成しうる２以上の転写因子の間の少なくとも１つの結合の阻害能を有するペプチドのアミノ酸配列をコードする領域を含む。
【００９０】
このヌクレオチド鎖又はその相補鎖は、例えば、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする領域を含むことができる。
【００９１】
または、このヌクレオチド鎖又はその相補鎖は、前記ヌクレオチド鎖又はその相補鎖は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含みＰＢＸ１への結合能を有するペプチドをコードする領域を含むこともできる。
【００９２】
さらに、これらのヌクレオチド鎖又はその相補鎖は、核移行シグナルを含むペプチドのアミノ酸配列をコードする領域を含むこともできる。
【００９３】
本実施の形態に係るヌクレオチド鎖又はその相補鎖は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
【００９４】
また、本実施の形態は、本実施の形態に係るヌクレオチド鎖又はその相補鎖を含む、組換えベクターである。この組換えベクターは、例えば、プラスミドベクター、ウィルスベクター等である。
【００９５】
１０．形質転換体
本実施の形態は、本実施の形態に係る組換えベクターで細胞を形質転換することによって得られた形質転換体である。
【００９６】
形質転換する細胞としては、外来の核酸を導入しうる細胞であれば特に限定されず、原核細胞でも真核細胞でもよい。原核細胞では、例えば、大腸菌を用いることができる。この場合、形質転換の方法としては、細胞に核酸を導入しうる方法であれば特に限定されないが、例えば、当業者に公知の、ヒートショック法、エレクトロポレーション法等を用いることができる。真核細胞を用いた場合は、例えば、造血幹細胞を用いることができる。この場合、形質転換の方法としては、細胞に核酸を導入しうる方法であれば特に限定されないが、例えば、当業者に公知の、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、アデノウィルスベクター法、レトロウィルスベクター法、アデノ随伴ウィルス(ＡＡＶ)ベクター法等を用いることができる。
【００９７】
１１．用途
本実施の形態に係るヌクレオチド鎖又はその相補鎖、あるいは組換えベクターは、様々な用途に用いることが可能である。例えば、本実施の形態に係るヌクレオチド鎖又はその相補鎖、あるいは組換えベクターを含む、組成物である。この組成物は、例えば、医薬組成物、実験試薬であることができる。
【００９８】
また、この組成物の好適な例としては、例えば、造血幹細胞の増殖促進剤である。これによれば、転写因子の活性を制御することによって、少なくとも一部の造血幹細胞に多分化能を維持させたまま、造血幹細胞の自己複製能を亢進させることによって、造血幹細胞を増幅することができる。
【実施例１】
【００９９】
以下、本発明を実験例に基づき具体的に説明するが、本発明は本実施例に限定されない。
【０１００】
（実験例１）ペプチドｄｅｃＨＯＸ、ＮＣの合成
（１）ペプチドｄｅｃＨＯＸ、ＮＣの設計、合成
配列番号５、配列番号６に示すアミノ酸配列をもつペプチドを合成し、それぞれｄｅｃＨＯＸ、ＮＣと命名した。どちらのペプチドもＳＶ４０型核移行シグナル配列、及び、それに続くリンカー配列を有しており（Ｆａｎａｒａ，Ｐ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：２１２１８，２０００，Ｈｏｄｅｌ，ＭＲ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：１３１７，２００１）、また、ペプチドｄｅｃＨＯＸはＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔモチーフを有しているが、ペプチドＮＣは有していない（図３）。ペプチドＮＣは、ネガティブコントロールとして作製した。
【０１０１】
（２）ペプチドｄｅｃＨＯＸ、ＮＣの性状測定
合成したペプチドｄｅｃＨＯＸを、ペプチドカルキュレーター（Ｓｉｇｍａ社）を用いて性状測定した。その結果、ペプチドｄｅｃＨＯＸは、２７アミノ酸からなり、特性値は、分子量３０９３．６Ｄａ、酸性度３．７０％、塩基性度３３．３３％、中性度１４．８１％、疎水性度４８．１５％、等電点１１．６０であった。
【０１０２】
（３）ペプチドｄｅｃＨＯＸ、ＮＣの保存
合成したそれぞれのペプチドを、注射用蒸留水によって１０μｇ／μｌ、１μｇ／μｌに希釈し、−８０℃にて遮光保存した。
【０１０３】
（実験例２）ＧＳＴ融合タンパク質の合成
（１）ＧＳＴ融合タンパク質発現ベクターの構築
ｐＣＳ２ベクターに挿入されたＰＢＸ１を鋳型として（以下、このプラスミドを「ｐＣＳ２／ＰＢＸ１」と示す。Ｄｒ．Ｆｅａｔｈｅｒｓｔｏｎｅ（ＭｃＧｉｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ）より分与）、Ｐｆｕ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＰＢＸ１全長（ＦＬ，１２４−１４１６）、ホメオドメイン（ＨＤ，８１９−１０１１）、Ｃ末欠損（ｄｅｌＣ，１２４−８１９）を含むＰＣＲ断片を得た。用いたプライマーは、ＦＬについては配列表の配列番号７と配列番号８、ＨＤについては配列表の配列番号９と配列番号１０、ｄｅｌＣについては配列表の配列番号１１と配列番号１２に示すオリゴヌクレオチドを用いた。
【０１０４】
得られたＰＣＲ断片を、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化し、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩサイトにサブクローニングし、得られたプラスミドをそれぞれ、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１／ＰＢＸ１  ＦＬ、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１／ＰＢＸ１  ＨＤ、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１／ＰＢＸ１  ｄｅｌＣと名づけた。
【０１０５】
（２）ＧＳＴ融合タンパク質の発現
ｐＧＥＸ−５Ｘ−１及び、（１）で得られたそれぞれのプラスミドを、大腸菌（ＪＭ１０９）にトランスフォーメーションし、当業者に公知の方法を用いて培養し、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＰＢＸ１  ＦＬ、ＧＳＴ−ＰＢＸ１  ＨＤ、ＧＳＴ−ＰＢＸ１  ｄｅｌＣを発現させた（図４）。
【０１０６】
（３）ＧＳＴ融合タンパク質の精製
（２）で得られたそれぞれのＧＳＴ融合タンパク質を、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎＴＭ
ＧＳＴ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用い、付属のプロトコールに従って精製した。それぞれのＧＳＴ融合タンパク質が精製されたことを、１２％アクリルアミドゲルにて泳動後、ＣＢＢ染色することによって確認した（図５）。
【０１０７】
（４）ＧＳＴ融合タンパク質の保存
（３）において精製したＧＳＴ融合タンパク質のそれぞれの濃度を、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社）を用い、付属のプロトコールにしたがって定量した。それに基づいてそれぞれのＧＳＴ融合タンパク質を２０μｇ／ｍｌに希釈し、−８０℃にて保存した。
【０１０８】
（実験例３）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、ＧＳＴ融合タンパク質に対するペプチドｄｅｃＨＯＸの結合の解析
ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｊ（ＢＩＡＣＯＲＥ社）を用いて、実験例１で合成したペプチドｄｅｃＨＯＸと、実験例２で合成したＧＳＴ融合タンパク質の結合を検討した。
【０１０９】
（１）ペプチドｄｅｃＨＯＸのセンサー表面への固定化
アミンカップリングキット（ＢＩＡＣＯＲＥ社）を用いて、付属のプロトコールに従い、ペプチドｄｅｃＨＯＸをセンサーチップＣＭ５（ＢＩＡＣＯＲＥ社）表面に固定化した。固定量を示すＲｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｕｎｉｔｓ（ＲＵ）は１３２３ＲＵ（約１．３ｎｇ／ｍｍ２）であった。
【０１１０】
（２）ペプチドｄｅｃＨＯＸとＧＳＴ融合タンパク質の相互作用測定
ＨＢＳ−ＥＰバッファーで、実験例２で合成したＧＳＴ、ＧＳＴ−ＰＢＸ１  ＦＬ、ＧＳＴ−ＰＢＸ１  ＨＤ、ＧＳＴ−ＰＢＸ１  ｄｅｌＣを希釈し、２μｇ／１００μｌのアナライト溶液とした。このアナライト溶液を、付属のマニュアルに従って添加して結合・解離反応を測定し、ＢＩＡ  ｖｉｅｗｅｒ（ＢＩＡＣＯＲＥ社）によって解析した。
【０１１１】
（３）結果
解析の結果、図６に示すように、ペプチドｄｅｃＨＯＸは、ＧＳＴ−ＰＢＸ１  ＦＬ、ＧＳＴ−ＰＢＸ１  ＨＤと結合するが、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＰＢＸ１  ｄｅｌＣとは結合しないことがわかった。従って、ペプチドｄｅｃＨＯＸは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＰＢＸ１のホメオドメインと結合することが確認された。
【０１１２】
（実験例４）ＩＧＦＢＰ−１（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ
ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）プロモーターを用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるペプチドｄｅｃＨＯＸの作用の検討
ＩＧＦＢＰ−１プロモーター上に存在するＨＯＸＢ４結合領域を、タンデムにつないだ人工プロモーターを用いて、２９３Ｔ細胞にてルシフェラーゼアッセイを行い、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるペプチドｄｅｃＨＯＸの作用を検討した。
【０１１３】
（１）レポータープラスミドの構築
ＨＯＸＢ４は、ＩＧＦＢＰ−１プロモーターの特定の領域に結合し、ＩＧＦＢＰ−１の転写を活性化することが知られている（Ｇａｏ，Ｊ．，ＤＮＡ
Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２１：８１９，２００２）。ＩＧＦＢＰ−１プロモーター上に存在する２ヶ所のＨＯＸＢ４結合領域１、２の配列を、それぞれ配列表の配列番号１３、配列番号１４に示す。ＨＯＸＢ４結合領域１、２を、それぞれ３つタンデムにつないだ人工プロモーターを作製し、この人工プロモーターをｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のルシフェラーゼ遺伝子の上流に挿入して、レポータープラスミドを作製した。これらのプラスミドをそれぞれ、３×ＨＢ４（−３１６）−Ｌｕｃ、３×ＨＢ４（−７２）−Ｌｕｃと命名した（図７（ａ）（ｂ））。
【０１１４】
（２）２９３Ｔ細胞への遺伝子導入及びペプチドｄｅｃＨＯＸ導入
（ａ）遺伝子導入
２９３Ｔ細胞への遺伝子導入は、当業者に公知のリン酸カルシウム法を用いて行った。エフェクタープラスミドとして、ｐｃＤＮＡ３／ＨＯＸＢ４（ＨＯＸＢ４（ＧｅｎＢａｎｋ，Ａｃｃｓｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ０２４０１５）をｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩサイトに挿入したプラスミド。ＨＯＸＢ４はＤｒ．Ｋ．Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ（Ｔｅｒｒｙ  Ｆｏｘ  Ｌａｂ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ）より分与。）を４μｇ／ｓａｍｐｌｅ、及びｐＣＳ２／ＰＢＸ１（実験例２）を８μｇ／ｓａｍｐｌｅ用いた。内部標準プラスミドは、ｐＲＬ−ＣＭＶ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を１０ｎｇ／ｓａｍｐｌｅ用いた。レポータープラスミドは、１μｇ／ｓａｍｐｌｅ用いた。
【０１１５】
（ｂ）ペプチドｄｅｃＨＯＸ導入
２９３Ｔ細胞へのペプチドｄｅｃＨＯＸ導入は、Ｐｒｏｆｅｃｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ社）を用い、付属のプロトコールに従って行った。ペプチドｄｅｃＨＯＸは、５μｇ／ｓａｍｐｌｅ用いた。
【０１１６】
（ｃ）実験計画
図８（ａ）（ｂ）に示す実験計画に従って、２９３Ｔ細胞に、遺伝子及びペプチドｄｅｃＨＯＸを導入した。細胞は、１×１０５／６ｃｍ  ｄｉｓｈの細胞密度でプレーティングした。ペプチドｄｅｃＨＯＸの導入を組み合わせた場合は、ペプチドｄｅｃＨＯＸを導入してから１２時間後に遺伝子を導入した。
【０１１７】
（３）ルシフェラーゼアッセイ
遺伝子導入から１．５日後に細胞を回収し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ
Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）とＬｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いてルシフェラーゼ活性を測定し、ＳＯＦＴｍａｘ  ＰＲＯ  Ｆｏｒ  Ｌｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）にて解析した。
【０１１８】
（４）結果
解析の結果、図９に示すように、３×ＨＢ４（−３１６）プロモーター及び、３×ＨＢ４（−７２）プロモーターの活性は、ＨＯＸＢ４の導入により、どちらも約８倍に上昇するが、ＰＢＸ１を共発現させることにより、この活性化はほぼ完全に抑制された。さらに、ペプチドｄｅｃＨＯＸをあらかじめ導入しておいた場合は、ＰＢＸ１によるＨＯＸＢ４の活性化阻害作用は、ペプチドｄｅｃＨＯＸの用量依存的に解除されることが確認された。従って、ペプチドｄｅｃＨＯＸは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＰＢＸ１と結合し、ＰＢＸ１のＨＯＸＢ４に対する抑制作用を解除すると考えられた。
【０１１９】
（実験例５）ｃ−ｍｙｃプロモーターを用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるペプチドｄｅｃＨＯＸの作用の検討
ｃ−ｍｙｃプロモーターを用いて、２９３Ｔ細胞にてルシフェラーゼアッセイを行い、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるペプチドｄｅｃＨＯＸの作用を検討した。
【０１２０】
（１）レポータープラスミドの構築
ｃ−ｍｙｃのプロモーター領域を含む−１１６０から＋１４０の領域を、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のルシフェラーゼ遺伝子の上流に挿入して、レポータープラスミドを作製した。このプラスミドをｃ−ｍｙｃ−Ｌｕｃと命名した（図１０）。
【０１２１】
（２）２９３Ｔ細胞への遺伝子導入及びペプチドｄｅｃＨＯＸ導入
実験例４と同様の方法を用いて行った。
【０１２２】
（３）ルシフェラーゼアッセイ
実験例４と同様の方法を用いて行った。
【０１２３】
（４）結果
解析の結果、図１１に示すように、ｃ−ｍｙｃプロモーターの活性は、ＨＯＸＢ４の導入により、約３倍に上昇するが、ＰＢＸ１を共発現させることにより、この活性化は完全に抑制された。さらに、ペプチドｄｅｃＨＯＸをあらかじめ導入しておいた場合は、ＰＢＸ１によるＨＯＸＢ４の活性化阻害作用は、ペプチドｄｅｃＨＯＸの用量依存的に解除されることが確認された。従って、ペプチドｄｅｃＨＯＸは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＰＢＸ１と結合し、ＰＢＸ１のＨＯＸＢ４に対する抑制作用を解除すると考えられた。
【０１２４】
（実験例６）ＣＤ３４陽性造血幹細胞における、ペプチドｄｅｃＨＯＸの導入効率の検討
（１）臍帯血の処理
ヒト臍帯血より赤血球を除去する処理を行った。まず、ヒト臍帯血を、臍帯血＋ＡＣＤ＋α−ＭＥＭ：ＨＥＳ＝３：１になるように希釈し、ＤＮａｓｅを最終濃度２０μｇ／ｍｌになるように加えた。室温で約３０分間静置して赤血球をチューブの１／３以下に沈降させた後、上清を新しい５０ｍｌチューブに分注した。赤血球の沈降が遅いものは、室温にて５０Ｇで５分間遠心し、沈降させた。分注液に、総量の１／３〜１／２になるようにα−ＭＥＭを添加して混和した後、１０℃にて４００Ｇで１０分間遠心した。遠心後のサンプルから上清を取り除き、α−ＭＥＭを２０ｍｌ添加して混和し、さらに１０℃にて４００Ｇで１０分間遠心した。上清を取り除いたサンプルに、細胞数１０８あたり３００μｌのＭａｃｓ  ｂｕｆｆｅｒ(ＰＢＳ、０．５％アルブミン、ＥＤＴＡ)を加えて、細胞を浮遊させた。さらに、細胞数１０８あたり１００μｌのＦｃ  Ｂｌｏｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔを加えて、遮光し、４℃にて１０分間放置した。その後、ＣＤ３４  Ｍｉｃｒｏ  Ｂｅａｄｓを細胞数１０８あたり１００μｌ加えて、遮光し、４℃にて３０分間混和した。次にＭａｃｓ
Ｂｕｆｆｅｒを４０ｍｌ添加して混和し、セルストレイナーを通してデブリスを除去し、４℃にて１２００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を除去した後、Ｍａｃｓ Ｂｕｆｆｅｒを２ｍｌ添加し、混和した。
【０１２５】
（２）ＣＤ３４陽性造血幹細胞の分離
（１）のサンプルから、磁気ビーズ法を用いてＣＤ３４陽性造血幹細胞を分離した。分離は、ａｕｔｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を用い、プログラムはＰＯＳＳＥＬ  Ｄ２で行った。分離後のＣＤ３４陽性率は約９５％、生細胞率は約９０％だった。
【０１２６】
（３）ペプチドｄｅｃＨＯＸ、ＮＣの導入
配列番号５、配列番号６に示すアミノ酸配列を持ち、Ｎ末端がフルオレセイン色素で蛍光標識されたペプチドｄｅｃＨＯＸ、ＮＣを、実験例１と同様にして合成した（図１２）。これらのペプチドそれぞれを、Ｐｒｏｆｅｃｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ社）を用い、付属のプロトコールに従って、（２）で得られたＣＤ３４陽性造血幹細胞に導入した。ペプチドは１×１０５細胞あたり５μｇを用い、トランスフェクション後ｖｉａｂｉｌｉｔｙが８０−９０％になったところで、サイトカイン添加無血清培地Ａに懸濁した。なお、サイトカイン添加無血清培地Ａは、ＱＢＳＦ−６０培地にＳＣＦ  １００ｎｇ／ｍｌ、ＦＬ  １００ｎｇ／ｍｌ、ＴＰＯ  １０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ  １００ｎｇ／ｍｌが添加された培地である。（ＱＢＳＦ−６０：ＱＵＡＬＩＴＹ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ社、ＳＣＦ：ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、ＦＬ：Ｇｅｎｚｙｍｅ社、ＴＰＯ：ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、ＩＬ−６：ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、ｓＩＬ−６Ｒ：ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）。
【０１２７】
（４）ペプチドｄｅｃＨＯＸ、ＮＣの導入効率の検討
細胞内の蛍光強度を、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて解析することによって、ＣＤ３４陽性造血幹細胞における、ペプチドｄｅｃＨＯＸ、ＮＣの導入効率を検討した。検討は、図１３の上に示す日軸における２日目に行った。
【０１２８】
（５）結果
解析の結果、図１４に示すように、ＣＤ３４陽性造血幹細胞において、ペプチドｄｅｃＨＯＸの導入効率は約７０％であることがわかった。
【０１２９】
（実験例７）ＣＤ３４陽性造血幹細胞における、ペプチドｄｅｃＨＯＸの半減期の検討
（１）ペプチドｄｅｃＨＯＸ導入細胞の分離
実験例６の（１）、（２）、（３）に示す方法を用いて、ヒト臍帯血からＣＤ３４陽性造血幹細胞を分離し、Ｎ末端を蛍光標識したペプチドｄｅｃＨＯＸを導入した。トランスフェクション翌日に、ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて、蛍光標識された細胞をソーティングした。
【０１３０】
（２）ペプチドｄｅｃＨＯＸの半減期の検討
細胞内の蛍光強度を、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて解析することによって、ＣＤ３４陽性造血幹細胞における、ペプチドｄｅｃＨＯＸの半減期を検討した。検討は、図１３の下に示す日軸における１、３、７日目に行った。
【０１３１】
（３）結果
図１５に示す結果から、ＣＤ３４陽性造血幹細胞において、ペプチドｄｅｃＨＯＸの半減期は約７２時間であると推定された。
【０１３２】
（実験例８）サイトカイン（ＳＣＦ、ＦＬ、ＴＰＯ、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ）添加無血清培地において、ペプチドｄｅｃＨＯＸが含まれるＣＤ３４陽性造血幹細胞の増殖能及び表面形質の検討
（１）ペプチドｄｅｃＨＯＸ、ＮＣ導入細胞の分離
実験例６の（１）、（２）、（３）に示す方法を用いて、ヒト臍帯血からＣＤ３４陽性造血幹細胞を分離し、Ｎ末端を蛍光標識したペプチドｄｅｃＨＯＸ、ＮＣを導入した。トランスフェクション翌日に、ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて、蛍光標識された細胞をソーティングした。
【０１３３】
（２）増殖能及び表面形質の検討
（１）で得られた細胞を、１×１０４／ｗｅｌｌ  ｏｆ  ９６  ｗｅｌｌの濃度で
プレーティングし、実験例６に示すサイトカイン添加無血清培地Ａにて、７日間培養した（図１３の下に示す日軸）。生細胞数の測定はトリパンブルー染色によって行い、表面形質の検討は、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて行った。
【０１３４】
（３）結果
結果を図１６及び表１に示す。図１６の上の２直線は、生細胞の総数の変化を示しており、斜線で示した下の２直線は、ＣＤ３４陽性造血幹細胞数の変化を示している。この結果より、ペプチドｄｅｃＨＯＸは、培養後の生細胞数に、ほとんど影響を与えなかった。一方、ペプチドｄｅｃＨＯＸの導入によって、ＣＤ３４陽性造血幹細胞の割合が、ペプチドＮＣを導入した場合と比較して約２倍維持されていた。この結果から、ペプチドｄｅｃＨＯＸは、ＣＤ３４陽性造血幹細胞において未分化な状態を維持する働きがあると推測された。
【０１３５】
【表１】
2007037401.tif 000003
【０１３６】
（実験例９）サイトカイン（ＳＣＦ、ＦＬ、ＴＰＯ、ＩＬ−３）添加無血清培地において、ペプチドｄｅｃＨＯＸが含まれるＣＤ３４陽性造血幹細胞の増殖能及び表面形質の検討
【０１３７】
（１）ペプチドｄｅｃＨＯＸ、ＮＣ導入細胞の分離
実験例６の（１）、（２）、（３）に示す方法を用いて、ヒト臍帯血からＣＤ３４陽性造血幹細胞を分離し、Ｎ末端を蛍光標識したペプチドｄｅｃＨＯＸ、ＮＣを導入した。トランスフェクション後に懸濁する培地は、サイトカイン添加無血清培地Ｂを用いた。サイトカイン添加無血清培地Ｂは、ＱＢＳＦ−６０培地にＳＣＦ  １００ｎｇ／ｍｌ、ＦＬ  １００ｎｇ／ｍｌ、ＴＰＯ  １０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−３  ２０ｎｇ／ｍｌが添加された培地である（ＱＢＳＦ−６０：ＱＵＡＬＩＴＹ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ社、ＳＣＦ：ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、ＦＬ：Ｇｅｎｚｙｍｅ社、ＴＰＯ：ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、ＩＬ−３：ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）（Ｑｉｕ，Ｌ．，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，８：６０９，１９９９）。トランスフェクション翌日に、ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて、蛍光標識された細胞をソーティングした。
【０１３８】
（２）増殖能及び表面形質の検討
（１）で得られた細胞を、１×１０４／ｗｅｌｌ  ｏｆ  ９６  ｗｅｌｌの濃度でプレーティングし、サイトカイン添加無血清培地Ｂにて、７日間培養した（図１３の下に示す日軸）。生細胞数の測定はトリパンブルー染色によって行い、表面形質の検討は、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて行った。
【０１３９】
（３）結果
結果を図１７及び表２に示す。図１７の上の２直線は、生細胞の総数の変化を示しており、斜線で示した下の２直線は、ＣＤ３４陽性造血幹細胞数の変化を示している。この結果より、ペプチドｄｅｃＨＯＸは、培養後の生細胞数に、ほとんど影響を与えなかった。一方、ペプチドｄｅｃＨＯＸの導入によって、ＣＤ３４陽性造血幹細胞の割合が、ペプチドＮＣを導入した場合と比較して約１．７倍維持されていた。この結果から、ペプチドｄｅｃＨＯＸは、ＣＤ３４陽性造血幹細胞において未分化な状態を維持する働きがあると推測された。
【０１４０】
【表２】
2007037401.tif 000004
【０１４１】
（実験例１０）サイトカイン（ＳＣＦ、ＦＬ、ＴＰＯ、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ）添加無血清培地において、ペプチドｄｅｃＨＯＸが、ＣＤ３４陽性造血幹細胞のコロニー形成能に及ぼす効果の検討
（１）ペプチドｄｅｃＨＯＸ、ＮＣ導入細胞の分離及び培養
実験例６の（１）、（２）、（３）に示す方法を用いて、ヒト臍帯血からＣＤ３４陽性造血幹細胞を分離し、Ｎ末端を蛍光標識したペプチドｄｅｃＨＯＸ、ＮＣを導入した。トランスフェクション翌日に、ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて、蛍光標識された細胞をソーティングし、実験例６に示すサイトカイン添加無血清培地Ａを用いて培養した。
【０１４２】
（２）コロニーアッセイ
（１）で得られた細胞のコロニー形成能を、当業者に公知のコロニーアッセイ法を用いて検討した。培地はＭｅｔｈｏｃｕｌｔ  ＧＦ４４３４（ＳｔｅｍＣｅｌｌ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社)を用い、細胞数は３５ｍｍペトリディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ社、♯１００８）あたり１×１０３を用いた。ソーティングから７日目にプレーティングし、さらに１０日後にコロニー数を測定した。
【０１４３】
（３）結果
結果を図１８及び表３に示す。ＣＦＵ−Ｅ／ＢＦＵ−Ｅは赤芽球前駆細胞、ＣＦＵ−ＧＭは顆粒球・単球系前駆細胞、ＣＦＵ−Ｍｉｘは混合コロニー形成細胞を示す。ペプチドｄｅｃＨＯＸの導入によって、Ｍｉｘコロニーが、ペプチドＮＣを導入した場合と比較して約２倍形成された。この結果から、ペプチドｄｅｃＨＯＸが導入されたＣＤ３４陽性造血幹細胞は、未分化な性質を維持していたことが確認された。
【０１４４】
【表３】
2007037401.tif 000005
【０１４５】
（実験例１１）サイトカイン（ＳＣＦ、ＦＬ、ＴＰＯ、ＩＬ−３）添加無血清培地において、ペプチドｄｅｃＨＯＸが、ＣＤ３４陽性造血幹細胞のコロニー形成能に及ぼす効果の検討
（１）ペプチドｄｅｃＨＯＸ、ＮＣ導入細胞の分離及び培養
実験例６の（１）、（２）、（３）に示す方法を用いて、ヒト臍帯血からＣＤ３４陽性造血幹細胞を分離し、Ｎ末端を蛍光標識したペプチドｄｅｃＨＯＸ、ＮＣを導入した。トランスフェクション後に懸濁する培地は、実験例９に示したサイトカイン添加無血清培地Ｂを用いた。トランスフェクション翌日に、ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて、蛍光標識された細胞をソーティングし、サイトカイン添加無血清培地Ｂを用いて培養した。
【０１４６】
（２）コロニーアッセイ
（１）で得られた細胞のコロニー形成能を、当業者に公知のコロニーアッセイ法を用いて検討した。培地はＭｅｔｈｏｃｕｌｔ  ＧＦ４４３４（ＳｔｅｍＣｅｌｌ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社)を用い、細胞数は３５ｍｍペトリディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ社、♯１００８）あたり１×１０３を用いた。ソーティングから７日目にプレーティングし、さらに１０日後にコロニー数を測定した。
【０１４７】
（３）結果
結果を図１９及び表４に示す。ＣＦＵ−Ｅ／ＢＦＵ−Ｅは赤芽球前駆細胞、ＣＦＵ−ＧＭは顆粒球・単球系前駆細胞、ＣＦＵ−Ｍｉｘは混合コロニー形成細胞を示す。ペプチドｄｅｃＨＯＸの導入によって、Ｍｉｘコロニーが、ペプチドＮＣを導入した場合と比較して約２倍形成された。この結果から、ペプチドｄｅｃＨＯＸが導入されたＣＤ３４陽性造血幹細胞は、未分化な性質を維持していたことが確認された。
【０１４８】
【表４】
2007037401.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】ＨＯＸＢ４及びＰＢＸ１の構造を示す模式図である。
【図２】ペプチド１による、ＰＢＸ１とＨＯＸＢ４の結合の阻害を模式的に示した図である。
【図３】ペプチドｄｅｃＨＯＸ、ＮＣを示す図である。
【図４】ＧＳＴ融合タンパク質の構造を模式的に示した図である。
【図５】ＧＳＴ融合タンパク質の発現を示す図である。それぞれのＧＳＴ融合タンパク質について、左のレーンは精製前、右のレーンは精製後のタンパク質である。
【図６】ＢＩＡＣＯＲＥによる、ＧＳＴ融合タンパク質に対するペプチドｄｅｃＨＯＸの結合の解析を示す図である。
【図７】（ａ）ＩＧＦＢＰ−１プロモーター上に存在する２ヶ所のＨＯＸＢ４結合領域を示した図である。（ｂ）３×ＨＢ４（−３１６）−Ｌｕｃ、３×ＨＢ４（−７２）−Ｌｕｃプラスミドの人工プロモーター部位及びルシフェラーゼ遺伝子を模式的に示した図である。
【図８】ルシフェラーゼアッセイにおける実験計画を示す図である。（ａ）ペプチドｄｅｃＨＯＸの導入を組み合わせない場合の実験計画を示す図である。（ｂ）ペプチドｄｅｃＨＯＸの導入を組み合わせる場合の実験計画を示す図である。
【図９】３×ＨＢ４（−３１６）−Ｌｕｃ、３×ＨＢ４（−７２）−Ｌｕｃを用いた、ルシフェラーゼアッセイによるペプチドｄｅｃＨＯＸの作用の検討を示す図である。
【図１０】ｃ−ｍｙｃ−Ｌｕｃプラスミドのプロモーター部位及びルシフェラーゼ遺伝子を模式的に示した図である。
【図１１】ｃ−ｍｙｃ−Ｌｕｃを用いた、ルシフェラーゼアッセイによるペプチドｄｅｃＨＯＸの作用の検討を示す図である。
【図１２】Ｎ末端を、フルオレセイン色素を用いて蛍光標識したペプチドｄｅｃＨＯＸ、ＮＣを示す図である。
【図１３】ペプチドｄｅｃＨＯＸが、ＣＤ３４陽性造血幹細胞に及ぼす効果の検討における実験計画を示す図である。
【図１４】ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒを用いた、ペプチドの導入効率の検討を示す図である。
【図１５】ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒを用いた、ペプチドｄｅｃＨＯＸの半減期の検討を示す図である。
【図１６】サイトカイン（ＳＣＦ、ＦＬ、ＴＰＯ、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ）添加無血清培地における、ペプチドｄｅｃＨＯＸが含まれるＣＤ３４陽性造血幹細胞の増殖能及び表面形質の検討を示す図である。
【図１７】サイトカイン（ＳＣＦ、ＦＬ、ＴＰＯ、ＩＬ−３）添加無血清培地における、ペプチドｄｅｃＨＯＸが含まれるＣＤ３４陽性造血幹細胞の増殖能及び表面形質の検討を示す図である。
【図１８】サイトカイン（ＳＣＦ、ＦＬ、ＴＰＯ、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ）添加無血清培地において、ペプチドｄｅｃＨＯＸがＣＤ３４陽性造血幹細胞のコロニー形成能に及ぼす効果を示す図である。
【図１９】サイトカイン（ＳＣＦ、ＦＬ、ＴＰＯ、ＩＬ−３）添加無血清培地において、ペプチドｄｅｃＨＯＸがＣＤ３４陽性造血幹細胞のコロニー形成能に及ぼす効果を示す図である。
【図１】
2007037401.tif 000007
【図２】
2007037401.tif 000008
【図３】
2007037401.tif 000009
【図４】
2007037401.tif 000010
【図５】
2007037401.tif 000011
【図６】
2007037401.tif 000012
【図７】
2007037401.tif 000013
【図８】
2007037401.tif 000014
【図９】
2007037401.tif 000015
【図１０】
2007037401.tif 000016
【図１１】
2007037401.tif 000017
【図１２】
2007037401.tif 000018
【図１３】
2007037401.tif 000019
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2007037401.tif 000022
【図１７】
2007037401.tif 000023
【図１８】
2007037401.tif 000024
【図１９】
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【配列表】
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