(57)【要約】【課題】  樹皮、茶殻等の農林産廃棄物中にタンニンやカテキンとの複合体として多量に存在するガリック酸から、工業原料として価値の高いＰＤＣを高効率かつ低廉なコストの下に安定的に生産して市場に提供することで樹皮等の木質廃棄物や茶殻等のガリック酸を有する農林産廃棄物を新たなバイオマス資源として有効活用する。【解決手段】  特定のアミノ酸配列を有する4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸シクロラーゼ酵素活性を有するタンパク質、このタンパク質に関連してこれをコードし特定の塩基配列を有する遺伝子を提供して、遺伝子組み換え微生物の作用によりガリック酸からＰＤＣを安定的に高生産可能にして上記課題を解決しようとするものである。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２に記載されたアミノ酸配列、または配列番号２に記載されたアミノ酸配列から１もしくは複数の欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有して4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸シクロラーゼ酵素活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１記載の4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸シクロラーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有する請求項２記載の遺伝子。
【請求項４】
３，４−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子と請求項２又は３いずれか記載の遺伝子とを連結する制御遺伝子。
【請求項５】
４，５−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子と請求項２又は３いずれか記載の遺伝子とを連結する制御遺伝子。
【請求項６】
請求項２又は３記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項７】
請求項６のベクターにおいて、さらに、３，４−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子および請求項４記載の制御遺伝子を含むベクター。
【請求項８】
請求項６のベクターにおいて、さらに、４，５−ジオキシゲナーゼをコードするコードする遺伝子および請求項５記載の制御遺伝子を含むベクター。
【請求項９】
請求項７又は８いずれか記載のベクターの宿主細胞への導入により得られる形質転換体。
【請求項１０】
請求項２又は３記載の遺伝子および請求項４又は５記載の遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入することを特徴とする形質転換方法。
【請求項１１】
請求項９記載の形質転換体を培養して、得られる培養物から4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸シクロラーゼ酵素活性を有するタンパク質を採取することを特徴とするタンパク質製造方法。
【請求項１２】
３，４−ジオキシゲナーゼ又は４，５−ジオキシゲナーゼによりガリック酸のベンゼン環を開裂させ4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸に変換し、この4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸に請求項１記載の4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸シクロラーゼ酵素活性を有するタンパク質を作用させて２−ピロンー４，６−ジカルボン酸に変換させることを特徴とする２−ピロンー４，６−ジカルボン酸の製造方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の形質転換がなされた微生物を発酵槽中で培養し得られた培養物により、ガリック酸を4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸に変換し、この4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸をさらに２−ピロンー４，６−ジカルボン酸に変換させることを特徴とする２−ピロンー４，６−ジカルボン酸の製造方法。
【請求項１４】
請求項１３において、製造過程終了後発酵槽中の培養液から菌体成分を沈殿除去させた後、pHを所定値に設定するとともに低温下に保持することにより２−ピロンー４，６−ジカルボン酸を沈殿分離するようにしたことを特徴とする２−ピロンー４，６−ジカルボン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、ガリック酸から２−ピロン−４，６−ジカルボン酸の生成に関与する4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸シクロラーゼ酵素活性を有するタンパク質、それをコードする遺伝子、その遺伝子等が導入された形質転換体、この形質転換体に前記遺伝子等を導入するベクターに関し、詳しくは4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸シクロラーゼ酵素活性を有するタンパク質をガリック酸から生成した4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸に作用させて２−ピロンー４，６−ジカルボン酸を安定的かつ効率的に工業生産するための製造技術に関するものである。
【発明の背景】
【０００２】
２−ピロンー４，６−ジカルボン酸（以下、ＰＤＣと略）は分子内にカルボキシル基と１つのラクトン骨格を有する化合物であるが、従来の石油化学的方法や有機合成では製造が困難な特異な化学的特徴を有している。この化合物を原料として精緻な物理化学的特性が要求される種々の高機能性プラスチックの生産が可能である。
【０００３】
ＰＤＣの製造については、従来天然芳香族高分子化合物であるリグニンの酸化分解で得られるバニリン酸、シリンガ酸から形質転換微生物細胞を用いてのＰＤＣ高生産が試みられている。  しかしながら、リグニンの酸化分解によるバニリン酸、シリンガ酸の収量はきわめて低く、したがってリグニンという木質原料の効率的利用を実現できないばかりかコスト上も問題がある。
【０００４】
一方、各種の植物体中には天然ポリフェノール類の１つであるガリック酸（没食子酸、3,4,5-Trihydroxy-bezoic acid）がタンニンやカテキンとの複合体として多量に存在しているが、その効果的な利用は実現していない。  すなわち、例えば茶葉、発酵茶葉中にもカテキンとの複合体として存在しており、その量は乾燥茶葉中の約１０％を占めるとされている。
この成分は茶を煎じることにより約３０％が可溶化して飲用されるが残りの７０％はそのまま廃棄されてしまうのが現状である。しかし、この残りの７０％からガリック酸を取り出すことは容易である。したがって、ガリック酸を有用物質に変換できれば、これまでガリック酸を多量に有しながら有効利用されていない植物系材を新たなバイオマス資源として利用することができる。しかしながら、これまでのところガリック酸から工業原料となりえるＰＤＣを安定的に高生産する技術は実現していない。
【０００５】
なお、本願発明に関連して次のような文献が開示されている。
【特許文献１】特開２００４−２５６７４７
【非特許文献１】「PDCヒドロラーゼ遺伝子のシーケンシングと発現」原田  利之（岐阜大学生命工学科丸山研究室１９９９年度卒論要旨）
【非特許文献２】「PDCヒドロラーゼ遺伝子のシーケンシングと発現」武宮 新二（岐阜大学生命工学科丸山研究室２０００年度卒論要旨）
【非特許文献３】「CHMSデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニングと大腸菌での発現」市川  晶貴（岐阜大学生命工学科丸山研究室２００３年度卒論要旨）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
樹皮、茶殻等の農林産廃棄物にタンニンやカテキンとの複合体として多量に存在するガリック酸から、工業原料として価値の高いＰＤＣを高効率かつ低廉なコストの下に安定的に生産して市場に提供することで樹皮等の木質廃棄物や茶殻等のガリック酸を有する農林産廃棄物を新たなバイオマス資源として有効活用する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
特定のアミノ酸配列を有する4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸シクロラーゼ酵素活性を有する新規タンパク質を提供して、ガリック酸からＰＤＣを安定的に高生産可能にして上記従来の課題を解決しようとするものである。
【０００８】
また、本願発明は  上記4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸シクロラーゼ酵素活性を有するタンパク質に関連してこれをコードし特定の塩基配列を有する遺伝子を提供して、遺伝子工学的にガリック酸からＰＤＣを安定的に高生産可能にして上記従来の課題を解決しようとするものである。
【０００９】
さらに、本願発明は、ガリック酸に作用して4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸を生成する３，４−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子と前記遺伝子とを連結する制御遺伝子を提供して遺伝子組み換え技術によるガリック酸からのＰＤＣ生産を容易にする。
【００１０】
上記制御遺伝子において、３，４−ジオキシゲナーゼに替えて４，５−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子となすことがある。
【００１１】
また、本願発明は、上記の各遺伝子を含むベクターを提供してＤＮＡ組み換えによるガリック酸からのＰＤＣ生産に資する。
【００１２】
さらに、本願発明は上記ベクターの宿主細胞への導入により得られる形質転換体および形質転換方法を提供して組換え微生物の産生する酵素により安定的かつ高収率の下にガリック酸からのＰＤＣ生産を可能にする。
【００１３】
本願発明はまた、上記形質転換体を培養してなる4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸シクロラーゼ酵素活性を有するタンパク質の製造方法を提供して、安定的かつ高収率の下にガリック酸からのＰＤＣ生産を可能にする。
【００１４】
そして、本願発明はガリック酸に３，４−ジオキシゲナーゼもしくは４，５−ジオキシゲナーゼを作用させて4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸を生成し、この4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸に4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸シクロラーゼ酵素活性を有するタンパク質を作用させて２−ピロンー４，６−ジカルボン酸を安定的に高生産する技術、すなわち、以下の工程を要旨とする２−ピロンー４，６−ジカルボン酸製造技術を実現して上記従来の課題を解決する。
１：4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸シクロラーゼ（chmc）遺伝子の単離
２：上記ｃｈｍｃ遺伝子の塩基配列及びその配列から推定されるアミノ酸配列の決定
３：ｃｈｍｃ遺伝子と4,5-ジオキシゲナーゼ（3,4-ジオキシゲナーゼでも可）の連結プラスミドpＢchmcligABの作成
４：広宿主域プラスミドへｃｈｍｃ及びligA,ligB連結遺伝子を挿入することによる広宿主域プラスミドpKchmcligABの作成
５：Pseudomonas 属細菌へpKchmcligABプラスミドの導入
６：形質転換細胞を用いたガリック酸からの2-ピロンー4,6-ジカルボン酸の生産
７：生産した2-ピロンー4,6-ジカルボン酸の発酵液からの単離
【発明の効果】
【００１５】
本願発明にあっては、以上述べた構成作用により次のような効果を奏する。すなわち、樹皮、茶殻等の農林産廃棄物にタンニンやカテキンとの複合体として多量に存在するガリック酸から、工業原料として価値の高いＰＤＣを遺伝子組み換え技術により高効率かつ低廉なコストの下に安定的に生産して市場に提供することが可能となり、樹皮等の木質廃棄物や茶殻等のガリック酸を有する農林産廃棄物の新たなバイオマス資源としての有効活用に資するところが大きい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明に係る酵素活性を有するタンパク質は、ガリック酸もしくはプロトカテキュ酸などから4,5-ジオキシゲナーゼもしくは3,4-ジオキシゲナーゼにより生産される4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸を2-ピロン-4,6-ジカルボン酸に変換するものである。すなわち4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸シクロラーゼ酵素活性を有するタンパク質である。
【００１７】
上記のタンパク質（酵素）を得るには、各請求項に記載のコードする遺伝子を取得する必要がある。具体的には本発明におけるガリック酸から2-ピロン-4,6-ジカルボン酸（以下PDCと略すことがある）を生産するためには4,5-ジオキシゲナーゼもしくは3,4-ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子と4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸シクロラーゼをコードする遺伝子（以下chmc遺伝子と略すことがある）が必要である。
これらのうち、4,5-ジオキシゲナーゼおよび3,4-ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子は公知でありすでに遺伝子も取得されている。
【００１８】
4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸シクロラーゼをコードする遺伝子（chmc遺伝子）
は、例えば組み換えDNA技術を利用して次のように取得することが出来る。
すなわちDNA供与体として4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸シクロラーゼを生産する能力を有する微生物を用い、該微生物からゲノムDNAを抽出し、制限酵素などにより切断しDNA断片を作成する。
他方、ファージ、プラスミド等のベクターDNAを制限酵素等を用いて、ゲノム断片が挿入可能な制限酵素末端を作成する。これらゲノムDNA断片と直鎖上にしたベクターDNAをDNAリガーゼを用いて結合させ組み換えベクターを得る。
該組み換えベクターを宿主細胞に移入し、目的の組み換えベクターを保持する形質転換細胞を選択し、該形質転換細胞より目的の組み換えベクターを分離することにより製造される。
【００１９】
上記手法に加えさらに、既にchmc遺伝子の全配列もしくは一部配列が明らかになっている場合は、公知のPCR法による方法でも取得することが可能である。
該遺伝子の分離のDNA供与体としては、4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸を2-ピロン-4,6-ジカルボン酸に変換する4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸シクロラーゼを生産する能力を有する微生物であれば特に制限されない。
【００２０】
該微生物からのゲノムDNAの抽出は、該微生物の培養菌体を集菌し、例えばプロテアーゼＫにて菌体を溶菌した後、フェノール抽出による除タンパク質処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコールによるゲノムDNAの沈殿、遠心分離などの方法を適宜組み合わせて行うのが好ましい。分離されたゲノムDNAを断片化するには、例えば該ゲノムDNAの制限酵素の消化により行われる。
【００２１】
ベクターとしては、宿主微生物内で自立的に増殖しうるファージ又はプラスミドから組み換えベクターを目的として構築されたものを用いるのが好ましい。プラスミドとしては、例えば大腸菌を宿主とするpUC18、pUC19、pUC118、pUC119、ブルースクリプト、pKT230MC等が好ましい。これらのベクターは、例えば制限酵素を用いてDNA断片が挿入可能な制限酵素末端を作成し、必要に応じてその末端を脱リン酸処理した後に用いられる。ゲノムDNA断片とベクターDNA断片の結合は、公知のDNAリガーゼ、例えばT4DNAリガーゼ等を用いて行うのが好ましい。
【００２２】
得られた組み換えベクターを導入させる宿主微生物としては、該組み換えベクターは安定的に且つ自立的に複製可能で、かつ外来遺伝子の性質が安定的に発現するものであれば良いが、例えば大腸菌やPseudomonas
putidaを用いることが出来る。宿主微生物に組み換えベクターを移入する方法としては、例えば接合法、エレクトロポレーション法、コンピテントセル法等の何れの方法も用いることが出来る。
【００２３】
形質転換体の選択は、例えば形質転換体のDNA組み換えにより獲得する薬剤耐性を指標にすることが出来る。これらの形質転換体の中から目的の組み換えベクターを含有する形質転換体の選択は、例えば遺伝子の部分的なDNA断片をプローブとして用いたコロニーハイブリダイゼーション法により行うのが好ましい。このプローブの標識としては例えば放射性同位元素、ジゴキシゲニン、酵素等の何れも用いることが出来る。
【００２４】
このようにして選択された形質転換細胞から組み換えベクターを抽出するには、常法により抽出すれば良く、例えばアルカリ溶菌法(Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Molecular Cloning Second Edition (1989))を用いることが出来る。
抽出される組み換えベクターは、必要に応じて再びDNA技術を利用して組みかえることが出来る。得られる組み換えベクターから、本発明遺伝子に含まれる4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸シクロラーゼをコードする遺伝子(chmc遺伝子)を切り出すには制限酵素等を用いることが出来る。
【００２５】
このようにして得られる、本発明遺伝子に含まれる4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸
シクロラーゼをコードする遺伝子の塩基配列は、例えばダイデオキシ法で解読し、決定することが出来る。
配列表の配列番号１に、4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸シクロラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を、また、配列表の配列番号２に4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸シクロラーゼ酵素活性を有するタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００２６】
このようにして得られた4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸シクロラーゼをコードする遺伝子(chmc)と既に得られている4,5-ジオキシゲナーゼ（ligA及びligB）を制限酵素によって切り出し、設計した遺伝子配置に基づきDNAリガーゼで連結して3種類の酵素遺伝子を含む制限酵素切断DNA断片を相互に連結する。これによりガリック酸から2-ピロン-4,6-ジカルボン酸を速やかに大量に発酵生産する多段階反応プロセスの制御遺伝子を作成することが出来る。
【００２７】
本発明では、配列番号１に示す遺伝子配列をその一部にもつDNA断片を保持する形質
転換プラスミドpBchmcのXbaI siteへpUCligABのXbaI処理によって得られるligA,ligB遺伝子配列を保持するDNA断片を公知のDNAリガーゼを用い挿入した大腸菌発現プラスミドpBchmcligABを作成する（図1参照）。
【００２８】
図１に示す大腸菌組み換えプラスミドpBchmcligABから、制限酵素ApaLI消化後切断末端を公知のKlenow fragment等を用いて平滑化し、更に制限酵素KpnI消化により得られるLacプロモーター配列、chmc、ligA及びligBを含むDNA断片を、Pseudomonas
putidaにて維持可能な広宿主域プラスミドpKT230MCの制限酵素EcoRI消化後切断末端を公知のKlenow fragment等を用いて平滑化し、更に制限酵素KpnI消化により得られるDNA断片に、公知のDNAリガーゼにより結合させることにより、図２に示すような新たな広宿主域プラスミドpKchmcligABを作成する。
【００２９】
広宿主域プラスミドpKchmcligABはエレクトロポレーション法やコンピテントセル法及び接合伝達法等を用いてPseudomonas putida等に導入されると、その形質転換細胞でLacプロモーター下流に存在する遺伝子から4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸シクロラーゼと4,5-ジオキシゲナーゼが強力且つ安定に生産される。
【００３０】
様々な宿主域を持つガリック酸から2-ピロンー4,6-ジカルボン酸を生産する組み換えプラスミドpKchmcligAB（図2）は、βラクタマーゼ遺伝子プロモーター及びLacプロモーター下流にガリック酸から2-ピロンー4,6-ジカルボン酸を発酵生産するための多段反応プロセスを構成する酵素をコードした遺伝子配列を含み、Pseudomonas属細菌をはじめとして広い宿主域を持つ。エレクトロポレーション法やコンピテントセル法及び接合伝達法等を用いて当該組み換えプラスミドを導入された形質転換細胞において、4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸シクロラーゼと4,5-ジオキシゲナーゼを同調的に発現して、ガリック酸から2-ピロンー4,6-ジカルボン酸を生産することが出来るが、2-ピロンー4,6-ジカルボン酸の高生産のためには、ガリック酸を細胞内に取り込むことが出来るがガリック酸を分解することの出来ない微生物を宿主とした形質転換体を用いる必要がある。なお、ガリック酸を細胞内に取り込むことが出来るがガリック酸を分解することの出来ない微生物として、後述の実施例で示すようにPseudomonas
putida PpY1100を用いることができる。
【００３１】
4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸シクロラーゼと4,5-ジオキシゲナーゼ遺伝子を持つ形質転換細胞（以下PDC生産細胞と略すことがある）を用いたガリック酸からの2-ピロンー4,6-ジカルボン酸生産には、例えばジャーファーメンターシステムを用いるのが好ましい。  PDC生産細胞は生育に必要な成分を含む培地にて培養し、十分に生育したところでガリック酸の添加を開始し、ガリック酸から2-ピロンー4,6-ジカルボン酸が生産されることによる培養液の酸性化をアルカリ水溶液例えば5M
NaOH溶液などを添加することにより、中和しながら2-ピロンー4,6-ジカルボン酸の発酵生産を行う。この場合培養液成分は微生物の発育に最適なものであれば限定されないが、例えば公知のＬＢ培地などを用いるのが好ましい。
【００３２】
発酵終了後は、発酵液に例えば塩酸などを添加して酸性にし、反応を停止させ、更に塩酸などを添加しpH1.0程度に調整した後、減圧濃縮もしくは低温で保存することにより2-ピロンー4,6-ジカルボン酸を沈殿物として回収することが出来る。この時、培養液中に存在する様々な栄養成分等は沈殿しないため、非常に高純度な2-ピロンー4,6-ジカルボン酸として回収することが可能となる。
【実施例】
【００３３】
図面参照の下に本願発明に係る１実施例を説明する。
まず、以下により4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸シクロラーゼをコードする遺伝子chmcを取得した。
すなわち、Sphingomonas paucimobilis SYK-6株のゲノムライブラリーから4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸シクロラーゼをコードする遺伝子chmcを単離した。そのＤＮＡ配列は配列表の配列番号１に示される。  そして、この遺伝子から生産される4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸シクロラーゼにより4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸は速やかに2-ピロンー4,6-ジカルボン酸へと変換される。
【００３４】
ガリック酸からPDCを生産するための遺伝子構造の構築
Sphingomonas paucimobilis SYK-6株のゲノムライブラリーから単離したchmsをpBluescriptのマルチクローニングサイトに連結したpBchmcを作成した（図１参照）。4,5-ジオキシゲナーゼ酵素をコードするligA,
ligBをマルチクローニングサイト上に保持したプラスミドpUCligAB から制限酵素XbaI 消化により得られるligA-ligB 断片をpBchmc のXbaI
サイトに挿入し、pBchmcligABを作成した（図1参照）。
【００３５】
次いで、図２に示すように、pBchmcligAB を制限酵素ApaLI消化し、切断部位をKlenow Fragment(TAKARA co.LTD)により平滑化し、更に制限酵素KpnI消化により、Lac
promotorを含むchmc-ligA-ligB断片を得た。
さらに、高範囲宿主ベクターpKT230MCを制限酵素EcoRIにより消化し、Klenow Fragmentによる切断部位の平滑化後、制限酵素KpnIにより切断した遺伝子断片とLac
promotorを含むchmc-ligA-ligB断片をligase(TOYOBO)によりligationし、pKchmcligABを得た（図2）。得られたpKchmcligABは大腸菌DH5α株に導入し、さらに三親接合伝達法によりpKchmcligAB
をPseudomonas putida PpY1100株に導入した。得られた菌体をPseudomonas putida PpY1100
(pKchmcligAB)株と名付けた。
【００３６】
Pseudomonas putida PpY1100 (pKchmcligAB)株を用いたガリック酸からのPDC生産
Pseudomonas putida PpY1100 (pKchmcligAB)株を、200mlのLB液体培地（25mg/Ｌのカナマイシンを含む)に接種し28℃で１６時間培養し前培養菌体懸濁液とした。
8LのLB液体培地および消泡剤（Antiform A )3mlを10L容量のジャーファーメンター（発酵槽）を用いて調製し、そこに培養したPseudomonas
putida PpY1100 (pKchmcligAB)株の前培養菌体懸濁液200mlを混合し、28℃、500rpm/minの通気攪拌下、OD660＝13~14まで培養した（10時間?１2時間）。なお、この培養に伴う増殖曲線を図３に示した。
【００３７】
10L容量のジャーファーメンター（発酵槽）を用いた培養で、OD660＝13~14に達した時点で、発酵槽から500mlの培養液を三角フラスコに抜き取り、氷上で保存した（氷冷菌体懸濁液）。OD660＝13~14に達した発酵槽の培養液に、基質であるガリック酸80gを含む
0.1N のNAOH溶液（pH8~9） 500mlを、ペリスタポンプを用いて５時間かけて添加した。反応の進行に伴う２?ピロンー４，６?ジカルボン酸の生成により、培養液のpH
が低下する。それを防ぐためpHセンサーに連結したペリスタポンプで0.1N のNaOH溶液を添加して培養液のpHを維持した。
【００３８】
反応の進行はThin Layer Chromatography (TLC)によって確認した。ガリック酸添加開始から24時間後、先に調製した氷冷菌体懸濁液500mlを発酵槽の培養液に加えて１２時間培養を続けた。反応終了後、発酵槽の培地をプラスチック容器（バケツ）に移し塩酸を加えてpH3として反応を停止させた。
次いで、培養液から遠心分離(6000rpm, 20℃)により菌体成分を沈殿除去し、得られた上清に塩酸を加える事によりpH1.0に低下させ低温で保存する事により２?ピロンー４，６?ジカルボン酸を沈殿として分離した。生成した２?ピロンー４，６?ジカルボン酸は約６５gに達し、添加した基質比９０％程度の収率で生産されたことになる。
【００３９】
製造した２?ピロンー４，６?ジカルボン酸を活性炭処理等によりさらに純度を上げた精製物を分析した。すなわち、上記実施例により生産した２?ピロンー４，６?ジカルボン酸（PDC）を1H-NMRおよび13C-NMRにより分析した。この結果、図４に示すように生産された物質が確かに２?ピロンー４，６?ジカルボン酸（PDC）であり、かつ非常に高純度であることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】大腸菌組み換えプラスミドpBchmcligABの生産過程の模式図である。
【図２】4,5-ジオキシゲナーゼ（ligAB）遺伝子とchmc遺伝子を機能させるための制御遺伝子を含むベクター作成過程を示す模式図である。
【図３】実施例に係る培養におけるPseudomonas putida PpY1100 (pKchmcligAB)株の増殖状況を示すグラフである。
【図４】実施例に係る製造方法により生産した２−ピロンー４，６−ジカルボン酸を活性炭処理等によりさらに純度を上げた精製物のＮMRスペクトルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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