(57)【要約】【課題】カイコにおいて組換えタンパク質を大量にかつその生理活性を保持した形で効率よく生産するための手段を提供すること。【解決手段】カイコ絹糸腺特異的に発現するプロモーターの下流に、外来タンパク質をコードする遺伝子とフィブロンＨ鎖遺伝子との融合遺伝子を連結した発現カセットであって、前記外来タンパク質をコードする遺伝子とフィブロインＨ鎖遺伝子の間にタンパク分解酵素認識配列を有することを特徴とする、前記発現カセット、該発現カセットを染色体に組み込んだ遺伝子組換えカイコ、及び該遺伝子組換えカイコを用いてタンパク質を生産する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カイコ絹糸腺特異的に発現するプロモーターの下流に、外来タンパク質をコードする遺伝子とフィブロンＨ鎖遺伝子との融合遺伝子を連結した発現カセットであって、前記外来タンパク質をコードする遺伝子とフィブロインＨ鎖遺伝子の間にタンパク分解酵素認識配列を有することを特徴とする、前記発現カセット。
【請求項２】
外来タンパク質をコードする遺伝子が、フィブロインＨ鎖遺伝子の５’末端領域とフィブロインＨ鎖遺伝子の３’末端領域の間に融合している、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項３】
フィブロインＨ鎖遺伝子の５’末端領域が、フィブロインＨ鎖遺伝子の第１エキソン領域、第１イントロン領域、及び第２エキソン領域を含むことを特徴とする、請求項２に記載の発現カセット。
【請求項４】
フィブロンＨ鎖遺伝子の３’末端領域が、フィブロインＨ鎖Ｃ末端部分をコードする領域とフィブロンＨ鎖遺伝子のポリＡ領域を含むことを特徴とする、請求項２に記載の発現カセット。
【請求項５】
カイコ絹糸腺特異的に発現するプロモーターが、フィブロインＨ鎖遺伝子のプロモーターである、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項６】
外来タンパク質がサイトカインである、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項７】
サイトカインがインターフェロンである、請求項６に記載の発現カセット。
【請求項８】
インターフェロンが、ネコインターフェロン-ωである、請求項７に記載の発現カセット。
【請求項９】
請求項１〜８に記載の発現カセットを含む、外来遺伝子導入用ベクター。
【請求項１０】
トランスポソン由来のDNA配列を含む、請求項９に記載の外来遺伝子導入用ベクター。
【請求項１１】
請求項１〜８に記載の発現カセットが染色体に組み込まれ、絹糸腺または繭糸に外来タンパク質を産生する遺伝子組換えカイコ。
【請求項１２】
請求項１〜８に記載の発現カセットを染色体に組み込んだ遺伝子組換えカイコを作製し、得られた遺伝子組換えカイコの絹糸腺または繭糸を可溶化した後、タンパク分解酵素処理し、外来タンパク質を採取することを特徴とする、タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カイコを宿主とする組換えタンパク質の生産に用いる発現カセット、該発現カセットを染色体に組み込んだ遺伝子組換えカイコ、該遺伝子組換えカイコを用いてタンパク質を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子組換え技術による有用タンパク質の生産が精力的に行われ、得られた組換えタンパク質は、医薬、診断薬、食品、化成品製造など幅広い分野で利用されている。従来、組換えタンパク質は、多くの場合、外来タンパク質をコードする遺伝子（外来遺伝子）を、細菌、酵母、または動物細胞などに導入し、培地中でその細胞を増殖させた後、合成されたタンパク質を回収することによって生産されている。しかしながら、細菌または酵母では、翻訳後修飾に問題があり、組換えタンパク質を十分機能する形で合成できないことがある。また、動物細胞では、組換えタンパク質を機能する形で合成できることが多いが、一般的に細胞を増殖させるのが困難で産生量も低く経済的ではない。
【０００３】
一方、昆虫または昆虫細胞もまた組換えタンパク質生産の宿主として利用されている。昆虫または昆虫細胞を宿主とする系では、外来遺伝子を組み込んだバキュロウイルスを昆虫または昆虫細胞に感染させる方法が用いられており、組換えタンパク質を比較的安価に量産でき、しかも哺乳類に近いタンパク質の翻訳後修飾が得られることが知られている。これまで、昆虫または昆虫細胞を宿主とする系において、サイトカインなどの医薬品として有用な種々の生理活性タンパク質が生産されており、たとえば、ネコインターフェロン-ω、イヌインターフェロン−γのカイコにおける生産（特許文献１、特許文献２）、ヒトコラーゲンの昆虫細胞における生産（特許文献３）などが報告されている。
【０００４】
しかし、従来の昆虫または昆虫細胞を用いた組換えタンパク質の生産では、外来遺伝子の導入にウイルスを用いることから、その不活性化や封じ込めが必要であり、また、ウイルス接種が煩雑であるなどの問題がある。また、カイコ体液中には、大量の夾雑タンパク質が含まれており、そこに産生された組換えタンパク質を高純度に精製することは困難である。
【０００５】
一方、カイコ染色体に外来遺伝子を導入する組換えタンパク質の製造技術の検討が行われている。例えば、核多核体病ウイルスの一種であるAutographa californica nucleopolyhedrovirus (AcNPV)のDNAを用いて、カイコフィブロインＬ鎖遺伝子にクラゲ緑色蛍光タンパク質遺伝子を付加した融合遺伝子を相同組換えによりカイコ染色体上に導入し、発現させる技術が報告されており（非特許文献１）、また、その技術を用いてヒトコラーゲン遺伝子を導入したカイコを作製し、該カイコによってヒトコラーゲンを製造した例がある（特許文献４）。また、最近、外来遺伝子を鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンであるpiggyBacを用いてカイコ染色体へ安定に導入し、その外来遺伝子がコードするタンパク質を発現させる方法が、クラゲ緑色蛍光タンパク質をモデルとして研究され、交配により子孫へと遺伝子が安定に伝わることも確認された（非特許文献２）。しかし、上記のAcNPVを用いる方法では、組換えタンパク質はフィブロインＬ鎖ポリペプチドと融合しているため、組換えタンパク質のみを回収できず、またその生理活性が低下するなどの問題がある。また、トランスポゾンpiggyBacを用いる方法では、組換えタンパク質の産生量が低く、かつ、カイコ全身に産生されるため、発現させた組換えタンパク質を高純度な形で回収するためには、高度な精製技術を必要とし、経済的に問題があった。
【０００６】
これまで、カイコにおける組換えタンパク質の製造では、発現量向上のための種々の試みが検討されている。例えば、外来遺伝子へのカイコ絹糸腺特異的に発現するプロモーターとトランスポゾン由来のDNA配列の付加 (特許文献５）、外来遺伝子へのフィブロインＨ鎖遺伝子由来の転写活性促進するポリヌクレオチドの付加（特許文献６）、外来遺伝子とフィブロインＨ鎖遺伝子との融合遺伝子を含む発現カセットの構築（特許文献７）などが報告されている。しかしながら、いずれの発現系において組換えタンパク質の発現量が十分でない、あるいは、組換えタンパク質の生理活性を維持しつつ回収できないなどの問題があった。
【０００７】
【特許文献１】特開平3-139276号公報
【特許文献２】特開平9-234085号公報
【特許文献３】特開平8-23979号公報
【特許文献４】特開2001-161214号公報
【特許文献５】特開2003-325188号公報
【特許文献６】特開2004-344123号公報
【特許文献７】特開2004-254681号公報
【非特許文献１】Genes Dev.,13,511-516,1999
【非特許文献２】Nature Biotechnology 18,81-84,2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明は、カイコにおいて組換えタンパク質を大量にかつその生理活性を保持した形で効率よく生産するための手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決すべく、外来タンパク質をコードする遺伝子とフィブロンＨ鎖遺伝子の融合遺伝子内にタンパク分解酵素認識配列を挿入した遺伝子を、カイコ絹糸腺に特異的な発現をもたらすプロモーターの下流に結合させた発現カセットを構築し、該発現カセットをトランスポゾン由来のDNA配列を利用してカイコ染色体に導入して遺伝子組換えカイコを作製したところ、該組換えカイコの絹糸腺または繭糸にタンパク分解酵素認識部位を有する融合タンパク質が大量に生産されることを見出した。そして、その絹糸腺または繭糸を可溶化してタンパク分解酵素処理を行ったところ、活性を維持したタンパク質を効率よく回収できることに成功した。本発明はかかる知見により完成されたものである。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
(1)  カイコ絹糸腺特異的に発現するプロモーターの下流に、外来タンパク質をコードする遺伝子とフィブロンＨ鎖遺伝子との融合遺伝子を連結した発現カセットであって、前記外来タンパク質をコードする遺伝子とフィブロインＨ鎖遺伝子の間にタンパク分解酵素認識配列を有することを特徴とする、前記発現カセット。
(2)  外来タンパク質をコードする遺伝子が、フィブロインＨ鎖遺伝子の５’末端領域とフィブロインＨ鎖遺伝子の３’末端領域の間に融合している、(1)に記載の発現カセット。
(3)  フィブロインＨ鎖遺伝子の５’末端領域が、フィブロインＨ鎖遺伝子の第１エキソン領域、第１イントロン領域、及び第２エキソン領域を含むことを特徴とする、(2)に記載の発現カセット。
(4)  フィブロンＨ鎖遺伝子の３’末端領域が、フィブロインＨ鎖Ｃ末端部分をコードする領域とフィブロンＨ鎖遺伝子のポリＡ領域を含むことを特徴とする、(2)に記載の発現カセット。
(5)  カイコ絹糸腺特異的に発現するプロモーターが、フィブロインＨ鎖遺伝子のプロモーターである、(1)に記載の発現カセット。
(6)  外来タンパク質がサイトカインである、(1)に記載の発現カセット。
(7)  サイトカインがインターフェロンである、(6)に記載の発現カセット。
(8)  インターフェロンが、ネコインターフェロン-ωである、(7)に記載の発現カセット。
(9)  (1)〜(8)に記載の発現カセットを含む、外来遺伝子導入用ベクター。
(10)  トランスポソン由来のDNA配列を含む、（9)に記載の外来遺伝子導入用ベクター。
(11)  (1)〜(8)に記載の発現カセットが染色体に組み込まれ、絹糸腺または繭糸に外来タンパク質を産生する遺伝子組換えカイコ。
(12)  (1)〜(8)に記載の発現カセットを染色体に組み込んだ遺伝子組換えカイコを作製し、得られた遺伝子組換えカイコの絹糸腺または繭糸を可溶化した後、タンパク分解酵素処理し、外来タンパク質を採取することを特徴とする、タンパク質の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、カイコを宿主として生産された組換えタンパク質を、大量の夾雑物を含まない絹糸腺または繭糸から活性を維持しつつ効率的に回収することが可能であり、煩雑な精製操作を要さない。また、バキュロウイルスのようなウイルスを使用しないことから、ウイルスの不活化が不要であり、簡便かつ安全に組換えタンパク質を生産できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
１．発現カセット
本発明の発現カセットは、カイコ染色体に導入した場合に外来タンパク質の発現を可能とするために必要なDNAのセットをいう。本発明の発現カセットは、カイコ絹糸腺特異的に発現するプロモーターと、その下流に、外来タンパク質をコードする遺伝子とフィブロンＨ鎖遺伝子との融合遺伝子とを含み、外来タンパク質をコードする遺伝子とフィブロンＨ鎖遺伝子の間にタンパク分解酵素認識配列を有する。
【００１３】
「外来タンパク質」としては、カイコにおいて発現し、その後、タンパク分解酵素処理により生理活性が保持されるタンパク質であれば特に限定はされないが、例えば、サイトカイン、ホルモン、抗原、抗体などが挙げられる。なかでも、免疫調節作用、抗ウイルス作用、血球細胞増殖作用、細胞間情報伝達作用など多様な機能を有する生理活性タンパク質として知られているサイトカインが好ましい。サイトカインには、インターフェロン（インターフェロン−α、β、γ、ω、τなど）、コロニー刺激因子[顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、単球コロニー刺激因子（M-CSF）、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)など]、エリスロポエチン（EPO）、トロンボポイエチン（TPO)、インターロイキン（インターロイキン-１，２，６，１０，１２など）などが挙げられ、その起源哺乳類（ヒト、ネコ、イヌなど）であれば特に限定されないが、好ましくは、ネコインターフェロン-ω(Biosci.Biotech.Biochem.,56,211-214,1992、GenBank データベース登録番号E04599)、ネコ顆粒球コロニー刺激因子（Gene,274,263-269,2001）、ヒトインターフェロン−βなどが挙げられる。
【００１４】
「カイコ絹糸腺特異的に発現するプロモーター」としては、例えば、フィブロインＨ鎖遺伝子のプロモーター（GenBank登録番号V00094の塩基番号255〜574番目、GenBank登録番号AF226688の塩基番号62118〜62437番目）、フィブロインＬ鎖遺伝子のプロモーター（Gene, 100:151-158:GenBank登録番号M76430）、セリシン遺伝子のプロモーター（GenBank登録番号AB007831の塩基番号599〜1656番目）などが挙げられるが、フィブロインＨ鎖遺伝子のプロモーターが好ましい。
【００１５】
また、本発明の発現カセットにおいて、上記の外来タンパク質をコードする遺伝子は、フィブロンＨ鎖遺伝子の５’末端領域とフィブロンＨ鎖遺伝子の３’末端領域の間に融合している。ここで、フィブロインＨ鎖遺伝子の５’末端領域は、外来タンパクをコードする遺伝子の転写活性を促進する作用を有する限り、特に限定はされないが、例えばフィブロインＨ鎖遺伝子の第１エキソン領域、第１イントロン領域、及び第２エキソン領域（GenBank登録番号AF226688の塩基番号62118〜63513番目）が好ましい。また、フィブロンＨ鎖遺伝子の３’末端領域は、産生された外来タンパク質をカイコ絹糸腺内に分泌させる作用を有する限り、特に限定はされないが、例えばフィブロインＨ鎖Ｃ末端部分をコードする領域とフィブロンＨ鎖遺伝子のポリＡ領域（GenBank登録番号AF226688の塩基番号79099〜79995番目）が好ましい。
【００１６】
本発明の発現カセットにおいて、発現制御領域、シグナル配列、ポリＡ配列は上記のフィブロインＨ鎖遺伝子の特定の領域に含まれるが、これらに限定されず、発現させる外来タンパクの種類に応じたものを適宜選択して用いてよい。
【００１７】
発現カセットに含まれる上記の遺伝子を取得する方法に特に制限はない。既知の遺伝子情報に基づき、PCR(polymerase chain reaction)法を用いて必要な遺伝子領域を増幅取得する方法、既知の遺伝子情報に基づきゲノムライブラリーやcDNAライブラリーより相同性を指標としてスクリーニングする方法などが挙げられる。
【００１８】
例えば、ネコインターフェロン-ω遺伝子は、E. coli(pFeIFN1)（微工研条寄第1633号）から抽出したプラスミドから切り出すことによって得ることができる。または、切り出したネコインターフェロン-ω遺伝子を、カイコのクローニングベクター（T.Horiuchiら、Agric.Biol.Chem.,51,1573-1580,1987)に連結して作製した組換えプラスミドとカイコ多核体病ウイルスDNAとを、カイコ樹立細胞にコトランスフェクションして作製したrBNV100から得ることも可能である。
【００１９】
本発明の発現カセットに含まれる各遺伝子は、それと同等の機能を有する限り、変異遺伝子も含まれる。変異遺伝子は、遺伝的多型性や変異剤などを用いた人為的変異処理による変異遺伝子のいずれであってもよい。遺伝的多型性とは遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものをいう。
【００２０】
また、「タンパク分解酵素認識配列」は、外来タンパク質をコードする遺伝子とフィブロインＨ鎖遺伝子の間に挿入され、その認識配列のタンパク分解酵素による分解（切断）によって、外来タンパク質の活性が阻害されない限り、特に限定されるものではない。
【００２１】
例えば、タンパク分解酵素認識配列としては、PreScission ProteaseTM（アマシャムバ
イオサイエンス社製）の認識配列L（ロイシン）E（グルタミン酸）V（バリン）L（ロイシン）F（フェニルアラニン）Q（グルタミン）G（グリシン）P（プロリン）、トロンビンの認識配列L（ロイシン）V（バリン）P（プロリン）R（アルギニン）G（グリシン）S（セリン）、Factor Xaの認識配列I（イソロイシン）E（グルタミン酸）G（グリシン）R（アルギニン）、エンテロキナーゼの認識配列D（アスパラギン酸）D（アスパラギン酸）D（アスパラギン酸）D（アスパラギン酸）K（リジン）S（セリン）などが挙げられる。
【００２２】
２．外来遺伝子導入用ベクター
本発明の「外来遺伝子導入用ベクター」は、上記の発現カセットを含み、該発現カセットをカイコ染色体に導入できるものであれば特に限定はされず、ウイルスベクター、トランスポゾン由来のDNA配列を含んだベクター、または染色体には組み込まれないプラスミドベクターなどを用いることができる。
【００２３】
トランスポゾンとしては、例えば、鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンであるpiggyBac（Nature Biotechnology 18,81-84,2000)、ショウジョウバエ由来のトランスポゾンであるmariner（Third International workshop on transgenesis of invertebrate organisms,p37-38,1999）、Minos（Insect Mol.Biol.9,277-281,2000）などが挙げられるが、piggyBacが好ましい。トランスポゾン由来のDNA配列とは、例えば、piggyBac由来のDNA配列である、TTAA配列を含む一対の末端逆位反復配列をいい、ベクター内において上記発現カセットを挟んでその両側に挿入する。
【００２４】
また、外来遺伝子導入用ベクターには、必要に応じて、遺伝子組換えカイコのスクリーニングを容易にすることが可能するため蛍光タンパク遺伝子などのマーカー遺伝子を挿入してもよい。例えば、適切なプロモーター下流に結合された緑色蛍光タンパク質(GFP）の遺伝子を、上記の１対のトランスポゾン由来のDNA配列間の適切な部位に導入すればよい。ここで用いるプロモーターとしては、カイコ細胞内で有効に働くプロモーターであれば特に限定はされないが、たとえばショウジョウバエの熱ショックタンパク質遺伝子のプロモーター、カイコアクチン遺伝子のプロモーター（Nature Biotechnology 18,81-84,2000）、ショウジョウバエの視神経で発現することが知られている3xP3プロモーターなどが挙げられるが、カイコアクチン遺伝子のプロモーター（Nature Biotechnology 18,81-84,2000）または3xP3プロモーターが好ましい。
【００２５】
３．遺伝子組換えカイコ
上記の発現カセットのカイコ染色体への導入方法としては、遺伝子が安定に染色体に組み込まれ、発現し、交配により子孫にも安定に遺伝子が伝わるような遺伝子導入方法であれば特に制限はされず、例えば、上記の発現カセットを含むベクターをカイコガ(Bombyx mori)の卵にマイクロインジェクションする方法、遺伝子銃を用いる方法などを用いることができる。
【００２６】
また、上記の発現カセットを含むベクターが、トランスポゾン由来のDNA配列を含むベクターである場合は、トランスポザーゼ遺伝子を含むヘルパープラスミド（Nature Biotechnology 18, 81-84, 2000）を同時にカイコ卵にマイクロインジェクションする。このようなベクターとしては、例えばTrichoplusia ni cell line TN-368、Autographa californica NPV(AcNPV)、Galleria mellonea NPV(GmMNPV)由来のpiggyBacを含むベクター、好ましくはTrichoplusia ni cell line TN-368由来PiggyBacの一部を持つプラスミドpHA3PIG、pPIGA3GFP(Nature biotechnology 18,81-84,2000)などを用いることができる。
【００２７】
上記のようにして染色体に遺伝子を導入したカイコは、通常の条件で催青し、孵化した幼虫を５令まで飼育し成虫を得る（G0世代）。得られたG0成虫の雌雄を交配して卵を得、これらの卵を催青し孵化させる。次に得られた幼虫、好ましくは１〜２令のカイコ(G1世代)の中から目的とする遺伝子組換えカイコを選抜する。遺伝子組換えカイコの選抜は、は、例えば、上記のG1世代カイコ幼虫の組織の一部からDNAを取り出し、外来遺伝子を基に設計したプライマーを用いてPCRによって増幅することによって行うことができる。あるいは、外来遺伝子導入用ベクター内にGFPなどのマーカー遺伝子を挿入した場合は、上記のG1世代カイコ幼虫の中から緑色蛍光を発する個体を選抜することによってより簡便に行うことができる。
【００２８】
外来遺伝子は、マイクロインジェクションされたカイコ卵から孵化し、成長した遺伝子組換えカイコの生殖細胞へ導入される。こうして得られた遺伝子組換えカイコの子孫は、その染色体上に外来遺伝子を安定に保持することが可能である。本発明で得られる遺伝子組換えカイコは、通常のカイコと同様な方法で、継代維持可能である。すなわち、卵を通常の条件で催青し、孵化した蟻蚕を人工飼料等へ掃立てし、通常のカイコと同様な条件で飼育することで５令カイコまで飼育できる。
【００２９】
本発明で得られる遺伝子組換えカイコは、通常のカイコと同様に蛹化し、繭を作ることができる。蛹の段階で雌雄を区別し、発蛾したのち雌雄を交尾させ、翌日採卵する。卵は通常のカイコ卵と同様に保存することが可能である。本発明の遺伝子組換えカイコは、こうした飼育を繰り返すことで継代することが可能であり、また、大量に増やすことが可能である。
【００３０】
本発明の遺伝子組換えカイコとは、外来タンパクをコードする遺伝子（外来遺伝子）が染色体に導入されたカイコのことであり、そのカイコ染色体DNAを常法に従って制限酵素処理したのち、常法に従って標識された導入した外来遺伝子をプローブとしてサザンブロッティングを行う時、ポジティブなシグナルを与えるカイコのことである。外来遺伝子が導入される染色体上の遺伝子座位は、カイコの発生、分化、成長を阻害しない部位であれば、特に制限はない。
【００３１】
４．タンパク質の製造方法
上記で得られた本発明の遺伝子組換えカイコは、その絹糸腺または繭糸に外来タンパク質を産生する。この遺伝子組換えカイコの絹糸腺または繭糸に産生された外来タンパク質をその活性を保持した状態で回収するには、まず絹糸腺または繭糸を可溶化し、その後、前記のタンパク分解酵素認識配列に特異的なタンパク分解酵素にて処理する。
【００３２】
絹糸腺または繭糸からの外来タンパク質の抽出に使用する溶媒については特に制限はないが、その活性を保持した状態で回収するためには水系溶媒が好ましい。抽出に使用する水系溶媒は、タンパク質の抽出を促進させるために適切な溶質を含有してもよい。そのような溶質としては、例えば、リン酸などの無機酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸などの有機酸や、食塩、尿素、塩酸グアニジン、塩化カルシウムなどの塩類、エタノール、メタノール、アセトニトリル、アセトンなどの極性有機溶媒などが挙げられる。また、溶媒のpHも特に限定はなく、目的とする外来タンパク質を失活させないpHであればよい。
【００３３】
抽出されたタンパク質を、単離・精製するための方法に特に限定はなく、通常のタンパク質の精製方法を用いることができる。例えば、目的とする外来タンパク質が本来有する機能を指標としながら、シリカゲル担体、イオン交換性担体、ゲル濾過担体、キレート性担体、色素担持担体等を用いたクロマトグラフィーや、限外濾過、ゲル濾過、透析、塩析等による脱塩、濃縮を組み合わせることによって精製し単離することができる。
【００３４】
例えば、本発明の発現カセットを導入した遺伝子組換えカイコにおいて、外来タンパク質がネコインターフェロン-ωである場合は、その遺伝子組換えカイコの絹糸腺を、20mMリン酸緩衝液（pH7.0）をホモジナイズして得られる可溶性画分をタンパク分解酵素処理することによって回収することができる。さらに、得られた可溶性画分を、例えばブルーセファロース担体に吸着させ、洗浄後、塩類を含む緩衝液で溶出することにより、ネコインターフェロン-ωの純度を上げることができる。
【００３５】
上記のようにして製造された組換えタンパク質は、従来の他の方法で製造されたタンパク質と同様に、医薬用途や各種の測定・診断用途に用いることができる。この場合、各種添加剤を加えた混合物として使用してもよい。また組換えタンパク質を発現したカイコの組織や繭糸は、そのままで、あるいは加工して、医療用または衣料用の繊維として用いることができる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３７】
（参考例）  抗ウイルス活性測定法
本発明の遺伝子組換えカイコにおいて生産されたインターフェロン（ネコインターフェロン-ω）の生理活性は、抗ウイルス活性を測定することによって評価した。抗ウイルス活性は、ウイルスとしてVesicular Stomatitis Virus(VSV)を用い、感受性細胞としてネコFc9細胞（J.K.Yamamotoら；Vet.Immunol.and Immunopathol.,11,1-19,1986）を用いてCPE法により以下のようにして測定した。
【００３８】
96穴マイクロプレート上でコンフルエントになるまで37℃で培養した感受性細胞に、サンプル（実施例で製造した組換えネコインターフェロン-ω）の希釈液を上端の行に加え、下端に向かって２倍ずつ段階希釈した。37℃で20〜24時間培養した後、VSVを加えさらに37℃で16〜20時間培養した。生存してマイクロプレート上に付着している感受性細胞を、20％ホルマリンを含むクリスタルバイオレット染色液で染色し、クリスタルバイオレットの量を570nmにおける吸光度を測定することによって求めた。同様にしてスタンダードについても上記と同様の操作を行い、570nmにおける吸光度を測定し、上記のサンプルの吸光度と比較することによって抗ウイルス活性を求めた。なお、スタンダードとしては、インターキャット（東レ（株）製）を細胞培養用培地で400 U/mlに調整したものを用いた。
【００３９】
（実施例１）遺伝子の調製
フィブロインＨ鎖遺伝子のプロモーター・第１エキソン領域・第１イントロン領域・第２エキソン領域（GenBank登録番号AF226688の塩基番号62118〜63513番目：以下「HP領域」）は、カイコゲノムDNAを鋳型とし、下記のプライマー１[GenBank登録番号AF226688の62118〜62157番目にHindIIIサイト及びAscIサイト（下線部）を付加]とプライマー２[GenBank登録番号AF226688の63474〜63513番目にBamHIサイト（下線部）を付加]を用いたPCRにより取得した。
プライマー１（配列番号１）：taaaagcttGGCGCGCCgggagaaagcatgaagtaagttctttaaatattacaaaaa 
プライマー２（配列番号２）：
ataggatccgacatcactcccaaaatagtcctcatcaaaatcattgatg
【００４０】
フィブロインＨ鎖Ｃ末端部分コード領域・フィブロインＨ鎖遺伝子のポリＡ領域（GenBank登録番号AF226688の塩基番号79099〜79995番目：以下「CA領域」）は、カイコゲノムDNAを鋳型とし、下記のプライマー３[GenBank登録番号AF226688の79099〜79149番目にBamHIサイト（下線部）を付加]とプライマー４[GenBank登録番号AF226688の79955〜79995番目にKpnIサイト及びAscIサイト（下線部）を付加]を用いたPCRにより取得した。
プライマー３（配列番号３）：
taaggatcccgcagttacgactattctcgtcgtaacgtccgcaaaaactgtggaattcct 
プライマー４（配列番号４）：
attaggtaccGGCGCGCCacgacgtagacgtatagccatcggggatcaaagcatacagg 
【００４１】
ネコインターフェロン-ω遺伝子（GenBank登録番号S62636の塩基番号9〜590番目：以下「IFN領域」）の両端に、PreScission Proteaseの認識配列を付加した領域（以下「pIFNp領域」）は、ネコインターフェロン-ω遺伝子をコードするバキュロウイルスrBNV100を鋳型とし、下記のプライマー５[GenBank登録番号S62636の9〜54番目にBamHIサイト（下線部）及びPreScission Protease認識配列（四角囲み）を付加]とプライマー６[GenBank登録番号S62636の545〜590番目にBamHIサイト(下線部)及びPreScission Protease認識配列(四角囲み)を付加）を用いてPCRにより取得した。なお、プライマー５とプライマー６に付加したPreScission Protease認識配列（ctggaagttctgttccaggggccc）は、アマシャムバイオサイエンス（株）製のPreScission Proteaseの認識部位となるアミノ酸配列（Leu-Gln-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro）に対応する塩基配列である。
【００４２】
【化１】
2007222106.tif 000002
【００４３】
なお、上記のバキュロウイルスrBNV100は、E．coli（pFeIFN）（微工研条寄第1633号）から抽出したプラスミドからFeIFNの遺伝子を切り出して、カイコのクローニングベクター（T．Horiuchiら、Agric．Biol．Chem., 51，1573-1580，1987)に連結して作製した組換えプラスミドとカイコ多核体病ウイルスDNAとを、カイコ樹立細胞にコトランスフェクションして作製した。
【００４４】
PCRはKODplus（東洋紡（株）製）を用いて添付のプロトコールに従って行った。
PCR反応液組成を下記表１に、PCR反応条件を下記表２にそれぞれ示す。PCR反応はBiorad社のDNAサーマルサイクラーを用いて行った。
【００４５】
[表１]
（PCR反応液組成）
鋳型：カイコゲノムDNAの場合は100ng、rBNV100ウイルスゲノムの場合は10ng
各プライマー：50pmol
添付の10×PCRバッファー：10μl
1mM MgCl2
0.2mM dNTPs
2単位KODplus  DNA polymerase            
全量100μl
【００４６】
[表２]
（PCR反応条件）
DNAの変性条件：94℃、15秒
プライマーのアニーリング条件：55℃、30秒
伸長条件：68℃、30秒〜300秒           
上記反応を１サイクルとして３０サイクル
【００４７】
各PCR反応産物を1％アガロースゲルにて電気泳動し、それぞれHP領域では1.4kbp、CA領域では0.9kbp、IFN領域では0.9kbpのDNA断片を常法に従って抽出、精製した。これらのDNA断片をポリヌクレオチドキナーゼ（タカラバイオ（株）製）によってリン酸化した後、HincIIで切断し、脱リン酸化処理したpUC19ベクターにタカラバイオ（株）のDNA Ligation Kit Ver.2を用いて16℃で終夜反応を行って連結した。得られた各pUCベクターを用いて常法に従って大腸菌を形質転換した。形質転換体にPCR断片が挿入されていることは、得られたコロニーを前述と同じ条件でPCRすることにより確認した。また、プラスミドをシーケンスすることによって、それに含まれるPCR断片がそれぞれの遺伝子であることを確認した。
【００４８】
（実施例２）ネコインターフェロン-ω遺伝子導入用ベクターの作製
（１）発現カセットの構築
実施例１で調製した、PreScission Protease切断サイトを両端に付加したネコインターフェロン-ω遺伝子を有するプラスミド（pUC-pIFNp）をSalIとHindIIIにより切断し、この切断部位にフィブロインＨ鎖遺伝子のプロモーター・第１エキソン領域・第１イントロン領域・第２エキソン領域を有するプラスミド（pUC-HP）からSalIとHindIIIにより切り出した1.4kbp断片（HP領域）を挿入した。さらにこれをBamHIにより切断し、この切断部位にフィブロインＨ鎖Ｃ末端部分コード領域・フィブロインＨ鎖遺伝子のポリＡ領域を有するプラスミド（pUC-CA）からBamHIにより切り出した0.9kbp断片（CA領域）を挿入した。挿入遺伝子の方向性に関しては、シーケンス解析によってCA領域が正しい方向で挿入されているかどうかを確認した。これらの操作で得られたHP・pIFNp・CA遺伝子を有するプラスミド（pUC-HP-pIFNp-CA）をAscIで切断し、約3.2kbp断片（HP-pIFNp-CA）を切り出し、タカラバイオ（株）T4 DNA Polymeraseにより両末端を平滑化した。ここで得られた発現カセット：HP-pIFNp-CAは、フィブロインＨ鎖遺伝子のプロモーター・第１エキソン領域・第１イントロン領域・第２エキソン領域/PreScission Protease認識配列／ネコインターフェロン-ω／PreScission Protease認識配列/フィブロインＨ鎖Ｃ末端領域・フィブロインＨ鎖ポリＡ領域を含む。
【００４９】
（２）遺伝子導入用ベクターの構築
一方、遺伝子導入用プラスミドには、Trichoplusia ni（イラクサキンウワバ）由来のトランスポゾンの末端逆位反復配列を含む、pigA3GFP（Nature Biotechnology 18, 81-84, 2000)を利用した。pigA3GFPは、米国特許第218185号に開示されるプラスミドp3E1.2よりトランスポザーゼ（transposase）をコードする領域を取り除き、その部分にA3プロモーター（GenBank登録番号U49854の塩基番号1764〜2595番目）及びpEGFP-N1ベクター（Clontech社製）由来の緑色蛍光タンパク質（GFP）及びSV40由来ポリＡ付加配列（GenBank登録番号U55762の塩基番号659〜2578番目）を挿入したベクターであり、このベクターは独立行政法人農業生物資源研究所より分与可能である。
【００５０】
前記の平滑末端化した約3.2kbp断片（HP-pIFNp-CA）を、予めA3プロモーターの上流側にあるXhoI部位を平滑化し、脱リン酸化処理したpigA3GFPに連結し、pBAC-HP-pIFNp-CAを得た。得られたプラスミドは、QIAGEN Plasmid Maxi Kitを用い、添付のプロトコールに従って精製した。
【００５１】
図１に、上記で得られたネコインターフェロン-ω発現カセット（HP-pIFNp-CA）の構造、ならびにネコインターフェロン-ω遺伝子導入用ベクター（pBAC-HP-pIFNp-CA）の構築手順を示す。
【００５２】
(実施例３) 遺伝子組換えカイコの作製
実施例２で構築したベクター（pBAC-HP-pIFNp-CA)とピギーバックトランスポザーゼタンパク質を生産するDNA（pHA3PIG）を各200μg/ml含んだ0.5mMリン酸バッファー(pH7.0)/5mMKCl溶液を調製し、3〜20nlを産卵後４時間以内のカイコ卵500個に対してマイクロインジェクションした。上記のpHA3PIG（Nature biotechnology 18,81-84,2000 農業生物資源研究所より分与可能）は、ピギーバックトランスポゾンの一方の逆位反復配列と5’フランキング領域、トランスポザーゼ遺伝子のリーダー配列を欠いており、その代わりにカイコアクチン遺伝子の5’フランキング領域とリーダー配列が組み込まれている。pHA3PIGはアクチンプロモーターの働きによりピギーバックトランスポザーゼタンパク質を作る機能を持つが、ピギーバックトランスポゾンの一方の逆位反復配列が欠損しているため自身のDNAは転移しない。
【００５３】
マイクロインジェクション後、カイコ卵より孵化した幼虫を飼育し、得られた成虫（G0）を群内で掛け合わせて得られた次世代（G1）をGFPの蛍光を指標として、目的遺伝子が染色体へ導入された遺伝子組換えカイコをスクリーニングした。
【００５４】
（実施例４） ウエスタン解析による絹糸腺組織中のネコインターフェロン-ωの発現解析
実施例３で得られた遺伝子組換えカイコの後部絹糸腺組織を回収し、絹糸腺組織中のネコインターフェロン-ωの発現を以下のようにしてウエスタン解析により調べた。
【００５５】
GFPにより目的遺伝子の導入が確認されたカイコの後部絹糸腺を100mMリン酸ナトリウムバッファー(pH7.0)中でホモジナイズした後、遠心分離して上清を回収し、回収した上清にPreScission Protease（アマシャムバイオサイエンス社製）を加え、４℃にて一晩反応させた。得られたサンプルについて、ECL PlusTM Western blotting Kit （アマシャムファルマシア社製）を用い、添付のプロトコールに従って以下のようにしてネコインターフェロン-ωの検出を行った。
【００５６】
まず、ブロッティングしたメンブレンをブロッキング溶液（5%スキムミルク/0.1%Tween20/PBS）中で4℃にて終夜ブロッキングした。メンブレンをTPBS(0.1%Tween20/PBS)で２回洗浄し、TPBSで1000倍希釈した抗ネコインターフェロン抗体で室温1時間処理した。メンブレンをTPBSで２回洗浄し、更にTPBSで5分間3回洗浄した。その後TPBSで10000倍希釈した後、HRP標識抗ラビットIgG抗体で室温にて1時間処理した。メンブレンをTPBSで２回洗浄し、更にTPBSで5分間3回洗浄した後、ECL PlusTM Western blotting Detection System（アマシャムファルマシア社製）の検出試薬（溶液A＋溶液B）を加えた。発光をHyperfilmTMECLTMに露光、現像した。シグナルの比較には、BIORAD社製モレキュラーイメージャーFXProを用いた。その結果を図２に示す（レーン１：コントロール（インターキャット（東レ社製））、レーン２：遺伝子組換えカイコ絹糸腺のネコインターフェロン-ω、レーン３：遺伝子組換えカイコ絹糸腺のプロテアーゼ認識部位を有するネコインターフェロン-ω、レーン４：３をプロテアーゼ処理したネコインターフェロン-ω）。
【００５７】
図２に示すように、レーン４において、プロテアーゼ処理によって遺伝子組換えカイコ絹糸腺のプロテアーゼ認識部位を有するネコインターフェロン-ω（レーン３）を示すバンドが、本来のネコインターフェロン-ωの分子量に対応するバンドに変化しており、活性型として回収されていることが確認できた。このことは、後述する実施例５で示す抗ウイルス活性の違いからも確認された。以上の結果から、本発明の発現カセットを導入した遺伝子組換えカイコ絹糸腺から外来タンパク質を回収し、プロテアーゼ処理することによって、本来のタンパク質と同程度の分子量のタンパク質を得ることが可能であり、しかも、外来タンパク質が酵素活性等を備えたタンパク質である場合には、本来のタンパク質に近い活性が得られることがわかった。なお、レーン１のコントロールであるネコインターフェロン標品と遺伝子組み換えカイコ絹糸腺のネコインターフェロン−ωの分子量の違いは糖鎖修飾の違いによるものと考えられた。
【００５８】
（実施例５）遺伝子組換えカイコ絹糸腺組織に産生されたネコインターフェロン-ωの抗ウイルス活性
ネコインターフェロン-ωは抗ウイルス活性を持つことから、その力価よりネコインターフェロン-ωの存在を知ることができる。実施例３で得られた遺伝子組換えカイコ（G1）を野生カイコと交配して得られた世代（G2）のうち、ネコインターフェロン-ω遺伝子の導入が確認されたカイコの５齢幼虫の後部絹糸腺を摘出し、それを20mMリン酸ナトリウムバッファー(pH7.0)でホモジナイズした（タンパク質濃度：2.69mg/ml）。この絹糸腺溶解液にPreScission Protease（アマシャム バイオサイエンス社製）を加え、４℃にて一晩反応させた。このプロテアーゼ処理後の絹糸腺溶解液について、前記参考例の手法に従って抗ウイルス活性測定を行い、プロテアーゼ未処理の絹糸腺溶解液のそれと比較した。結果を下記表３に示す。プロテアーゼ処理を行った絹糸腺溶解液は、プロテアーゼ未処理の絹糸腺溶解液に比較して高い抗ウイルス活性を示した。
【００５９】
[表３]
2007222106.tif 000003
【００６０】
（実施例６） ウエスタン解析によるカイコ繭糸中のネコインターフェロン-ωの発現解析
実施例３で得られた遺伝子組換えカイコの繭糸へのネコインターフェロン-ωの分泌を以下のようにしてウエスタン解析により調べた。
GFPにより目的遺伝子の導入が確認されたカイコの繭糸を各10mg量り採り、60%LiSCN4mlを加え攪拌後、室温にて終夜静置し、繭糸を溶解した。この繭糸溶解液を8M尿素/2%SDS/5% 2-メルカプトエタノールにて10倍希釈したものに、PreScission Protease（アマシャム バイオサイエンス社製）を加え、４℃にて一晩反応させた。得られたサンプルについて、ECL PlusTM Western blotting Kit （アマシャムファルマシア社製）を用い、添付のプロトコールに従って、実施例４と同様にしてネコインターフェロン-ωの検出を行った。その結果を図３に示す（レーン１：コントロール（インターキャット（東レ社製））、レーン２：遺伝子組換えカイコ繭糸のプロテアーゼ認識部位を有するネコインターフェロン-ω、レーン３：２をプロテアーゼ処理したネコインターフェロン-ω）。
【００６１】
図３に示すように、レーン３の殆どの融合タンパク質がプロテアーゼ処理で切断されていることが確認された。ここで、標品のネコインターフェロン-ωと分子量が若干異なるのは、糖鎖付加の違いによるものと考えられた。以上から、タンパク質分解酵素認識配列を付加した本発明の発現カセットを導入した遺伝子組換えカイコの繭から外来タンパク質を抽出することにより、本来のタンパク質とほぼ同様の分子量を有するタンパク質を獲得することができることが確認された。
【００６２】
（実施例７）遺伝子組換えカイコ絹糸中に産生されたネコインターフェロン-ωの抗ウイルス活性
実施例６で得られたプロテアーゼ処理後の繭糸溶解液について、前記参考例の手法に従って抗ウイルス活性測定を行い、プロテアーゼ未処理の繭糸溶解液のそれと比較した。結果を下記表４に示す。プロテアーゼ処理を行った繭糸溶解液は、プロテアーゼ未処理の繭糸溶解液に比較して高い抗ウイルス活性を示した。
【００６３】
[表４]
2007222106.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１はネコインターフェロン-ω発現カセットの構造、ならびにネコインターフェロン-ω遺伝子導入用ベクターの構築手順を示す図である。
【図２】図２は絹糸腺に発現した組換えネコインターフェロン-ωをプロテアーゼ処理しネコインターフェロン抗体でウエスタン解析した図である（レーン１：コントロール（インターキャット（東レ社製））、レーン２：遺伝子組換えカイコ絹糸腺のネコインターフェロン-ω、レーン３：遺伝子組換えカイコ絹糸腺のプロテアーゼ認識部位を有するネコインターフェロン-ω、レーン４：３をプロテアーゼ処理したネコインターフェロン-ω）。
【図３】図３は繭糸に発現した組換えネコインターフェロン-ωをプロテアーゼ処理しネコインターフェロン抗体でウエスタン解析した図である（レーン１：コントロール（インターキャット（東レ社製））、レーン２：遺伝子組換えカイコ繭糸のプロテアーゼ認識部位を有するネコインターフェロン-ω、レーン３：２をプロテアーゼ処理したネコインターフェロン-ω）
【図１】
2007222106.tif 000005
【図２】
2007222106.tif 000006
【図３】
2007222106.tif 000007
【配列表】
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