(57)【要約】      （修正有）【課題】イヌ由来の胚性幹細胞、及びその生産方法の提供。また、イヌ由来の胚性幹細胞を未分化のまま長期間継代培養する方法の提供。【解決手段】イヌ由来の脱出胚盤胞期胚の内部細胞塊から、多分化能と自己複製能とを有する未分化細胞を分離することにより、胚性幹細胞を取得する。また、イヌ由来の胚性幹細胞のコロニーの細胞数を物理的手段により減じて培養することによって、イヌ由来の胚性幹細胞を未分化のまま長期間継代培養する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌの脱出胚盤胞期胚から得られる胚性幹細胞。
【請求項２】
上皮細胞、線維芽細胞、色素産生細胞、神経細胞、及び心筋細胞よりなる群から選択される少なくとも１種の細胞への分化能を有する、請求項１に記載の胚性幹細胞。
【請求項３】
アルカリホスファターゼ陽性、SSEA-1陽性、SSEA-4陰性、及びOct-4陽性を示す細胞である、請求項１又は２に記載の胚性幹細胞。
【請求項４】
下記工程を経て得られる、請求項１乃至３のいずれかに記載の胚性幹細胞：
(a)イヌ由来の脱出胚盤胞期胚を得る工程、及び
(b)脱出胚盤胞期胚の内部細胞塊から多分化能と自己複製能とを有する未分化細胞を選択することにより胚性幹細胞を得る工程。
【請求項５】
下記工程を有する、イヌ由来胚性幹細胞の生産方法：
(a)イヌ由来の脱出胚盤胞期胚を得る工程、及び
(b)脱出胚盤胞期胚の内部細胞塊から多分化能と自己複製能とを有する未分化細胞を選択することにより胚性幹細胞を得る工程。
【請求項６】
工程(a)が、交配後の雌イヌから脱出胚盤胞期胚を得る工程である、請求項５に記載の生産方法。
【請求項７】
工程(a)が、交配後１５〜１６日の雌イヌから脱出胚盤胞期胚を得る工程である、請求項６に記載の生産方法。
【請求項８】
イヌ由来の胚性幹細胞のコロニーを物理的に切り離すことにより、該コロニーの細胞数を減じて培養する工程を含む、イヌ由来の胚性幹細胞の継代培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イヌ由来の胚性幹細胞に関する。更に、本発明は、イヌ由来胚性幹細胞を生産する方法、及びイヌ由来胚性幹細胞を継代培養する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、イヌを飼育する人が増加しており、これに伴って、イヌを家族の一員として人間同様に飼うというコンパニオン・アニマル（伴侶動物）の考え方が定着してきており、イヌの疾病に対しても、人間と同等の高度な医療を施すことが望まれてきている。また、イヌについてのゲノムの解析が完了し、イヌはマウスよりもヒトに近い遺伝子を持っていることが明らかにされ、疾病研究、臨床応用、実験モデル等に有用であることが分かっている。
【０００３】
そのため、イヌの胚性幹細胞（以下、ＥＳ細胞ともいう）を樹立することができれば、細胞移植治療によるイヌの再生医療が実現でき、更には、遺伝子改変イヌを作成して遺伝病の解明や治療の研究が可能となり、ヒト再生医療の発展に寄与するものと考えられている。
【０００４】
従来、マウス、ウサギ、サル等に由来する胚性幹細胞の樹立に関しては、これらの動物の胚盤胞期胚から透明体を除去し、内部細胞塊を分離、培養することにより胚性幹細胞が取得できることが分かっている（例えば、特許文献１参照）。これら動物の胚性幹細胞の取得において、胚盤胞期胚から透明体の除去は、ヒアルロニダーゼ、プロナーゼ、酸性タイロード液等で処理することにより行われている。
【０００５】
しかしながら、イヌの場合、胚盤胞期胚の透明体が非常に頑丈であり、上記動物の場合と同様の方法で処理しても、透明体を十分に除去できないという問題点がある。また、イヌの胚盤胞期胚から透明体の除去は、細い針等で物理的に除去する方法でも可能であるが、この方法では実験者による高度の技術が必要であるため、汎用的に実施できるものではない。更に、イヌの胚盤胞期胚の内部細胞塊は小く、胚盤胞期胚から胚性幹細胞を分離する手法では、その分離効率が低くなるという欠点もある。
【０００６】
更に、胚性幹細胞の樹立と共に、胚性幹細胞を継代培養する技術の確立が不可欠であるが、通常の細胞継代培養の方法で胚性幹細胞を継代培養すると、胚性幹細胞が次第に分化してしまい、未分化の状態で長期間継代培養できないという問題点がある。
【０００７】
このような従来技術を背景として、イヌ由来の胚性幹細胞の樹立、及びイヌ由来の胚性幹細胞を未分化のまま継代培養する技術の開発が望まれている。
【特許文献１】特開２００２−１５９２８９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、イヌ由来の胚性幹細胞、及びその生産方法を提供することを目的とする。更に、本発明は、イヌ由来の胚性幹細胞を未分化のまま長期間継代培養する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、イヌ由来の脱出胚盤胞期胚の内部細胞塊から胚性幹細胞を効率よく取得できることを見出した。更に、イヌ由来の胚性幹細胞のコロニーの細胞数を物理的手段により減じて培養することによって、イヌ由来の胚性幹細胞を未分化のまま長期間継代培養できることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて、更に改良を重ねることにより完成したものである。
【００１０】
即ち、本発明は、下記に掲げるイヌ由来の胚性幹細胞及びその生産方法である：
項１．  イヌの脱出胚盤胞期胚から得られる胚性幹細胞。
項２．  上皮細胞、線維芽細胞、色素産生細胞、神経細胞、及び心筋細胞よりなる群から選択される少なくとも１種の細胞への分化能を有する、項１に記載の胚性幹細胞。
項３．  アルカリホスファターゼ陽性、SSEA-1陽性、SSEA-4陰性、及びOct-4陽性を示す細胞である、項１又は２に記載の胚性幹細胞。
項４．  下記工程を経て得られる、項１乃至３のいずれかに記載の胚性幹細胞：
(a)イヌ由来の脱出胚盤胞期胚を得る工程、及び
(b)脱出胚盤胞期胚の内部細胞塊から多分化能と自己複製能とを有する未分化細胞を選択することにより胚性幹細胞を得る工程。
項５．  前記工程(b)が、脱出胚盤胞期胚の内部細胞塊を培地に入れてフィーダー細胞と共培養して、培養液中に形成された多分化能と自己複製能とを有する未分化細胞のコロニーを選択し分離する工程である、項４に記載の胚性幹細胞。
項６．  下記工程を有する、イヌ由来胚性幹細胞の生産方法：
(a)イヌ由来の脱出胚盤胞期胚を得る工程、及び
(b)脱出胚盤胞期胚の内部細胞塊から多分化能と自己複製能とを有する未分化細胞を選択することにより胚性幹細胞を得る工程。
項７．  工程(a)が、交配後の雌イヌから脱出胚盤胞期胚を得る工程である、項６に記載の生産方法。
項８．  工程(a)が、交配後１５〜１６日の雌イヌから脱出胚盤胞期胚を得る工程である、項７に記載の生産方法。
項９．  前記工程(b)が、脱出胚盤胞期胚の内部細胞塊を培地に入れてフィーダー細胞と共培養して、培養液中に形成された多分化能と自己複製能とを有する未分化細胞のコロニーを選択し分離することにより胚性幹細胞を得る工程である、項７に記載の生産方法。
【００１１】
更に、本発明は、下記に掲げるイヌ由来の胚性幹細胞を継代培養する方法である：
項１０．  イヌ由来の胚性幹細胞のコロニーを物理的に切り離すことにより、該コロニーの細胞数を減じて培養する工程を含む、イヌ由来の胚性幹細胞の継代培養方法。
【００１２】
Ｉ．イヌ由来の胚性幹細胞及びその生産方法
本発明の胚性幹細胞は、イヌ由来の細胞であり、脱出胚盤胞期胚から得られる、多分化能と自己複製能を有する未分化細胞である。
【００１３】
本発明の胚性幹細胞の起源となるイヌは、その種別については、特に制限されず、例えば、ビーグル犬、ラブラドル・リトリバー、マルチーズ、ヨークシャーテリア、チワワ等が挙げられる。これらの中で、特にビーグル犬は、実験動物としてのデーターベースが豊富で持続的に供給されている、産子数が比較的多く胚の採取に都合がよい、中型（体重：９〜１３ｋｇ）のため外科的手術が容易である、性質が温厚で取り扱いが容易である等の利点があり、本発明において好適に使用することができる。
【００１４】
脱出胚盤胞期胚とは、胚盤胞期胚が透明体から脱出した状態のものであり、通常、交配後約１５〜１６日の雌イヌの子宮内の卵子は、脱出胚盤胞期胚の状態である。この脱出胚盤胞期胚の内部細胞塊から得られ多分化能と自己複製能とを有する未分化細胞が、本発明の胚性幹細胞である。
【００１５】
本発明の胚性幹細胞は、上皮細胞、線維芽細胞、色素産生細胞、神経細胞、及び心筋細胞等の機能性細胞の内の１種又は２種以上の細胞に分化する能力を有している。本発明の胚性幹細胞として、好ましくは、少なくとも上皮細胞、線維芽細胞、色素産生細胞、神経細胞、及び心筋細胞に分化する能力を有するものである。本発明の胚性幹細胞の上記各種細胞への分化は、通常の胚性幹細胞の分化方法に従って行うことができる。当該分化方法として、具体的には、(i)胚性幹細胞から胚様体を形成させる工程、及び(ii)胚様体から機能性細胞に分化させる工程を含む方法が例示される。
【００１６】
胚性幹細胞から胚様体を形成させるには、例えば、イヌ胚性幹細胞のコロニーを、必要に応じて物理的に切り離す処理を行い、外径１００〜３００μm程度の細胞塊に調整した後、これをＬＩＦ（白血病抑制因子）無添加の培地を入れた滅菌シャーレ中で３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気の条件下で、２〜３日間浮遊培養するとよい。
【００１７】
また、胚様体から機能性細胞に分化させるには、例えば、ゼラチンコートした細胞培養用のディッシュを用いて、ＬＩＦ無添加の培地で、浮遊培養で形成した胚様体を３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気の条件下で培養を行うとよい。このような条件で培養を行うことによって、培養を始めた翌日には、胚様体がディッシュに接着し、さらに培養を続けることによって、分化が始まる。
【００１８】
なお、本発明において、ＬＩＦ無添加の培地としては、具体的には、２０重量％のウシ胎子血清、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、２ｍＭのL-グルタミン、及び１重量％の非必須アミノ酸を含むDMEM/F12培地が例示される。また、当該培地には、１００IU/ｍｌ程度のペニシリンや１００μｇ/ｍｌ程度のストレプトマイシンが含まれていてもよい。
【００１９】
また、本発明の胚性幹細胞において、細胞表面マーカーは、アルカリホスファターゼ陽性、SSEA-1陽性、SSEA-4陰性、及びOct-4陽性を示す。
【００２０】
また、本発明の胚性幹細胞は、細胞質が少なく相対的に核の占める割合が多く、核小体が顕著であるという特徴を示すと共に、そのコロニーの形態がマウスES細胞に比べて扁平で、ヒトやサルよりも盛り上がっているという特徴が認められる。
【００２１】
本発明の胚性幹細胞は、(a)イヌ由来の脱出胚盤胞期胚を得る工程、及び(b)脱出胚盤胞期胚の内部細胞塊から多分化能と自己複製能とを有する未分化細胞を選択することにより胚性幹細胞を得る工程、を経て取得することができる。以下、本発明の胚性幹細胞の生産方法について、工程毎に説明する。
【００２２】
工程(a)
まず、イヌ由来の脱出胚盤胞期胚を取得する。イヌ由来の脱出胚盤胞期胚を形成させる方法として、具体的には、雌イヌの子宮内で脱出胚盤胞期胚を形成させる方法（以下、「子宮内形成法」という）が挙げられる。
【００２３】
子宮内形成法は、具体的には、次のようにして行われる。まず、雌イヌの発情周期（無発情期、発情前期、発情期、発情休止期）について、外陰部の腫大、膣スメア検査、雄イヌの許容行動の確認等により把握しておき、発情期の初日に妊孕能がある雄イヌと自然交配させる。また、必要に応じて、最初の交配の日（発情期の初日）から２日おきに１〜２回交配させてもよい。このようにして、雌イヌの子宮内に受精卵を形成させる。なお、雄イヌと交配させる代わりに、イヌの精子を子宮内に注入させても良い。最初に交配した日から１５〜１６日後に、子宮内で脱出胚盤胞期胚が形成されており、これを回収することによってイヌ由来の脱出胚盤胞期胚を得ることができる。子宮内から胚盤胞期胚の回収は、例えば、子宮灌流や子宮摘出等の公知の方法により行うことができる。
【００２４】
子宮灌流法により子宮内から胚盤胞期胚を回収するには、具体的には以下の方法に従って行うことができる。まず、麻酔下で開腹手術をし、子宮角の基部を1ｃｍ程度一部切開して、バルーンカテーテルを挿入する。次いで、21Gの注射針を付けた５〜１０ｍｌの注射筒を用いて、37℃の灌流液（例えばペニシリン（100 IU/ml）及びストレプトマイシン（100μg/ml）を含むPBS(Phosphate buffered saline)溶液）を子宮角の先端から注入し、バルーンカテーテルから回収した灌流後の液を顕微鏡で調べることによって、胚を確認し回収する。
【００２５】
また、子宮摘出法により子宮内から胚盤胞期胚を回収するには、具体的には以下の方法に従って行うことができる。まず、麻酔下で開腹手術をし、一般的な手法によって子宮および卵巣を摘出する。摘出した子宮は、21Gの注射針を付けた５〜１０ｍｌの注射筒を用いて、上記の子宮灌流法と同様の組成の灌流液を子宮角の先端から注入し、灌流後の液を顕微鏡で調べることによって、胚を確認し回収する。
【００２６】
斯くして得られたイヌ由来の脱出胚盤胞期胚は、以下の工程(b)に供される。
【００２７】
工程(b)
次いで、脱出胚盤胞期胚の内部細胞塊から多分化能と自己複製能とを有する未分化細胞を選択することにより胚性幹細胞を取得する。
【００２８】
脱出胚盤胞期胚の内部細胞塊は、脱出胚盤胞期胚から物理的分離処理を行うことにより得ることができる。具体的には、先端が尖ったガラスキャピラリーや注射針（31G程度）を使用して、脱出胚盤胞期胚から内部細胞塊を分離することができる。
【００２９】
このようにして得られる脱出胚盤胞期胚の内部細胞塊を培地に入れてフィーダー細胞と共培養することにより、多分化能と自己複製能とを有する未分化細胞（即ち、本発明の胚性幹細胞）のコロニーが形成される。即ち、培地に添加された内部細胞塊中の胚性幹細胞は、該内部細胞塊の周辺を押し広げるように増殖していき、島状のコロニー（細胞塊）を形成する。このように形成されたコロニーを選択し単離することによってイヌ由来胚性幹細胞を取得することができる。
【００３０】
ここで、胚性幹細胞のコロニー形成の為に使用される培地としては、該胚性幹細胞が増殖可能なものである限り、特に制限されないが、好適な培地として、DMEM/F12培地（シグマ社製）に、マウス白血病抑制因子（ＬＩＦ；leukemia inhibitory factor）が１０００IU/mlの濃度で添加されている培地が例示される。また、胚性幹細胞のコロニー形成の為に使用される培地は、必要に応じて、牛胎子血清（FBS）；ストレプトマイシン、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質；各種アミノ酸；２−メルカプトエタノール等を含有していてもよい。
【００３１】
また、胚性幹細胞のコロニー形成のための培養に使用されるフィーダー細胞の好適な例としては、マウス由来の胎子線維芽細胞が挙げられる。
【００３２】
胚性幹細胞のコロニー形成のための培養は、通常３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気の条件下で、２〜５日後に形成が始まり、さらに数日間このような条件下で培養することにより外径５００〜１０００μｍ程度の胚性幹細胞のコロニーが形成されるので、これを分離することによって本発明の胚性幹細胞が取得できる。
【００３３】
なお、本工程において、多分化能と自己複製能とを有する未分化細胞（即ち、本発明の胚性幹細胞）により形成されたコロニーの選択は、コロニーを形成する細胞の形態上の特徴に基づいて未分化細胞のコロニーであるか否かを識別し、更に必要に応じてアルカリホスファターゼ、SSEA-1、SSEA-4、及びOct-4等のマーカーの発現を確認することにより行うことができる。
【００３４】
ＩＩ．イヌ由来胚性幹細胞の継代培養方法
通常の動物細胞の継代培養では、コラゲナーゼやトリプシン等のプロテアーゼで処理することによりコロニーの細胞数を減じることが行われているが、イヌ由来胚性幹細胞を上記プロテアーゼで処理すると、分化が誘導されて、未分化の状態を保持することが困難になる。
【００３５】
本発明の継代培養方法では、イヌ由来胚性幹細胞のコロニーの細胞数を物理的手段により減じて培養することを特徴とするものであり、イヌ由来胚性幹細胞を未分化の状態で長期に亘って保持させることが可能になる。
【００３６】
コロニーの細胞数を物理的手段により減じるとは、プロテアーゼや薬剤を使用することなく、コロニーを物理的に切り離すことにより、該コロニーの細胞数を減じることを意味するものである。その具体的態様としては、顕微鏡下で先端が尖ったガラスキャピラリー、又は３１Ｇの注射針等を使用してコロニーを切断して小さくする方法が例示される。
【００３７】
本発明の継代培養方法では、外径５００〜１０００μｍ程度に増殖したコロニーを対象として、これを１００〜２００μｍ、好ましくは２００μｍ程度の細胞塊に物理的に切り離すことが望ましい。これよりも著しく小さい細胞塊にすると、継代後のコロニー形成率が極端に低下する傾向がみられる。
【００３８】
また、本発明の継代培養方法では、培養液中で２又はそれ以上のコロニーが成長によって接着することがないようなタイミングで継代培養していくことが望ましい。
【００３９】
本発明の継代培養方法において使用される培地は、イヌ由来胚性幹細胞が生育可能であることを限度として特に制限されないが、例えば、DMEM/F12培地、DMEM培地等をベースとして使用した培地が挙げられる。
【００４０】
また、本発明の継代培養方法において、その細胞培養は、フィーダー細胞の存在下で行われる。ここで使用されるフィーダー細胞の好適な例としては、マウス由来の胎子線維芽細胞が挙げられる。
【００４１】
本発明の継代培養方法において、上記のように細胞数を物理的手段により減じたコロニーを通常３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気の条件下で、通常３〜１０日間培養することにより、コロニーが５００〜１０００μｍ程度に増殖させることができる。このように増殖したコロニーに対して、再度同条件でコロニーの細胞数を減じて培養を繰り返すことにより、未分化の状態を保持したままイヌ由来胚性幹細胞を植え継ぐことが可能になる。
【発明の効果】
【００４２】
本発明の胚性幹細胞は、イヌ由来の脱出胚盤胞期胚から得られ、簡便で効率よく取得することができるものであり、イヌの再生医療への応用や、遺伝子改変イヌの作製及びそれを利用した遺伝病の解明や治療の研究に有用である。
【００４３】
また、本発明の継代培養方法によれば、イヌ由来胚性幹細胞を未分化のまま長期間継代培養できるので、イヌ由来胚性幹細胞の応用上の不都合が解消され、その実用性を高めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
以下に、実施例等に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【００４５】
実施例１
(1)脱出胚盤胞期胚の取得
外陰部の腫大、膣スメア検査、雄イヌの許容行動の確認により、正常な発情周期を有していることを確認した雌ビーグル犬（１〜６歳、計１０頭）に対して、発情期の初日に妊孕能が確認されている雄イヌと自然交配させた。交配１５又は１６日後に、各雌イヌの子宮から灌流法により脱出胚盤胞期胚を取得した。具体的には、灌流法による脱出胚盤胞期胚の取得は、次のようにして行った：雌イヌを麻酔下で開腹手術して子宮角の基部を１ｃｍ程度一部切開して、バルーンカテーテルを挿入した。一方、２１Ｇの注射針を付けた注射筒を用いて、３７℃のペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳ（Phosphate buffered saline）溶液を子宮角の先端から注入し、バルーンカテーテルから胚を回収した。回収した胚はＭ２培地（シグマ社製）に入れ、顕微鏡下で脱出胚盤胞期胚の選別を行った。最終的に、１０頭のイヌから、２８個の脱出胚盤胞期胚が取得できた。得られた脱出胚盤胞期胚の顕微鏡写真の一例を図１に示す。
【００４６】
(2)胚性幹細胞の取得
２つの先を尖らせたガラスキャピラリーを用いて、顕微鏡下で、Ｍ２培地中で、上記(1)で得られた脱出胚盤胞期胚から内部細胞塊を分離した。得られた内部細胞塊は、500 μlの液体培地［DMEM/F12培地（シグマ社製）；20重量％のウシ胎子血清、0.1 mMの２−メルカプトエタノール、2 mMのL-グルタミン、1000 IU/mlのLIF（ケミコンインターナショナル社製）、100 IU/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、１重量％の非必須アミノ酸（インビトロゲン社製）含有］（以下、「ＥＳ用培地」と表記する）、及び不活性化したマウス胎子線維芽細胞をフィーダー細胞として含む４穴プレート（Nalge Nunc International社製）に入れて、３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気の条件下で２〜５日間培養した。その結果、図２のＡ及びＢに示すように、他の生物種の胚性幹細胞と同様の形態を示す胚性幹細胞のコロニーが１９個確認された。
【００４７】
(3)未分化マーカーの検出
上記(2)で得られた胚性幹細胞について、未分化マーカー（アルカリホスファターゼ、SSEA-1、SSEA-4、及びOct-4）の検出を下記の方法に従って行った。
＜アルカリホスファターゼの検出＞
上記(2)で得られた胚性幹細胞を４重量％パラフォルムアルデヒド含有PBSで１０分間固定化した。固定化後の細胞をPBSで３回洗浄し、次いで、細胞を25 mM Tris-maleate［pH 9.5； 0.4 mg/ml αナフチルリン酸ナトリウム、8 mM MgCl2、1mg/ml Fast Red TR含有］中で室温で３０分間インキュベートした。その結果、上記で得られた胚性幹細胞は、赤色に染色され、アルカリホスファターゼ陽性を示すことが確認された（図３のＡ参照）。
＜SSEA-1、SSEA-4及びOct-4の検出＞
上記(2)で得られた胚性幹細胞を４重量％パラフォルムアルデヒド含有PBSで１０分間固定化した。次いで、固定化後の細胞に対して、SSEA-1、SSEA-4及びOct-4のぞれぞれに特異的に結合するモノクローナル抗体を用いて通常の免疫学的手法に従って、SSEA-1、SSEA-4及びOct-4の発現の有無について確認した。
【００４８】
その結果、上記で得られた胚性幹細胞は、SSEA-1及びOct-4は陽性を示すが、SSEA-4は陰性を示すことが確認された（図３のＢ及びＣ参照）。
【００４９】
(4)胚様体の形成
上記(2)で得られた胚性幹細胞を、DMEM/F12培地（シグマ社製）［20重量％のウシ胎子血清、0.1 mMの２−メルカプトエタノール、2 mMのL-グルタミン、100 IU/mlのペニシリン、100 μg/mlのストレプトマイシン、１重量％の非必須アミノ酸（インビトロゲン社製）含有］中で、３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気の条件下で２〜４日間浮遊培養したところ、胚様体の形成が認められた（図４のＡ参照）。更に、同条件で培養を２週間引続き行ったところ、胞状の胚様体の形成が認められた（図４のＢ参照）。
【００５０】
(5)分化能の確認
上記(4)で得られた胚様体を、ゼラチンコートしたディッシュを用いて、上記(4)と同様の培地で３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気の条件下で７〜４０日間培養を行ったところ、上皮細胞（図５のＡ参照）、線維芽細胞（図５のＢ参照）、色素産生細胞（図５のＣ参照）、神経細胞（図５のＤ及びＥ参照）、及び心筋細胞（図５のＦ参照）に分化することが確認された。なお、分化した心筋細胞では、律動的な拍動が観察された。
【００５１】
比較例１
外陰部の腫大、膣スメア検査、雄イヌの許容行動の確認により、正常な発情周期を有していることを確認した雌ビーグル犬（１〜６歳、計３頭）に対して、発情期の初日に妊孕能が確認されている雄イヌと自然交配させた。交配１２日後に、上記実施例の(1)と同様の方法で各雌イヌの子宮から灌流法により桑実胚を取得した。最終的に、雌ビーグル３頭から１３個の桑実胚が回収できた。
【００５２】
次いで、得られた桑実胚を顕微鏡下で観察しながら、２つの先を尖らせたガラスキャピラリーを用いて、内部にある細胞を傷つけないように注意して、桑実胚から透明帯を切除した。その後、２つの先を尖らせたガラスキャピラリーを用いて、顕微鏡下で、Ｍ２培地中で、透明帯を切除した桑実胚から胚細胞（割球ともいう）を分離した。斯くして得られた胚細胞を、上記実施例１の(2)と同様の条件で培養を行った。その結果、１３個の桑実胚から１つも胚性幹細胞のコロニーを得ることはできなかった。
【００５３】
参考例１
外陰部の腫大、膣スメア検査、雄イヌの許容行動の確認により、正常な発情周期を有していることを確認した雌ビーグル犬（１〜６歳、計９頭）に対して、発情期の初日に妊孕能が確認されている雄イヌと自然交配させた。交配１４日後に、上記実施例の(1)と同様の方法で各雌イヌの子宮から灌流法により胚盤胞期胚を取得した。最終的に、雌ビーグル９頭から３９個の胚盤胞期胚が回収できた。
【００５４】
次いで、得られた胚盤胞期胚を顕微鏡下で観察しながら、２つの先を尖らせたガラスキャピラリーを用いて、内部細胞塊を傷つけないように注意して、胚盤胞期胚から透明帯を切除した。その後、２つの先を尖らせたガラスキャピラリーを用いて、顕微鏡下で、Ｍ２培地中で、透明帯を切除した胚盤胞期胚から内部細胞塊を分離した。この内部細胞塊は、脱出胚盤胞期胚由来のものに比べて、小さいため分かりにくく、この内部細胞塊の分離作業は極めて困難であった。斯くして得られた内部細胞塊を、上記実施例１の(2)と同様の条件で培養を行った。その結果、最終的に３９個の胚盤胞期胚から胚性幹細胞のコロニーを１０個得ることができた。
【００５５】
実施例２
顕微鏡下で、上記実施例１で得られた外径５００〜１０００μｍの初代コロニー（１７細胞株）をフィーダー細胞から分離し、それぞれＥＳ用培地が入ったディッシュに移した。次いで、この初代コロニーを顕微鏡下で、２つの先の尖ったガラスキャピラリーを用いて物理的に切り離し、１００〜２００μｍ程度の細胞塊に分離させた。得られた細胞塊を、再度、ＥＳ用培地及び不活性化したマウス胎子線維芽細胞をフィーダー細胞として含むディッシュに入れて、３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気の条件下で培養を行った。培養後再度コロニーが５００〜１０００μｍになった時点（培養４〜８日後）で、再度、上記と同様の方法で継代を繰り返し行い、最終的に、８回の継代培養を行った（実施例２）。また、顕微鏡観察によって、各継代毎に培養液中のコロニーが未分化の状態を保持しているか否かについての確認を行った。
【００５６】
一方、比較として、５００〜１０００μｍのコロニー（１２細胞株）に対して、コラゲナーゼ処理（例えば、０．１重量％コラゲナーゼを用いて３７℃、３〜５分間の処理）を行うことによって、１００〜２００μｍ程度の細胞塊に分離させること以外は、上記と同条件で継代培養を行い、コロニーが未分化の状態を観察した（比較例２）。
【００５７】
各継代毎に培養液中のコロニーが未分化の状態を観察した結果を表１に示す。コラゲナーゼ処理を行い継代培養した比較例３では、３代目までに全てのコロニーが分化し、胚性幹細胞が消滅していたが、物理的手段によりコロニーの細胞数を減じて継代培養した実施例２では、２つの細胞株で８代目まで未分化の状態を保持できることが確認された。
【００５８】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】実施例１において、イヌから得られた脱出胚盤胞期胚の顕微鏡写真を示す。
【図２】Ａ（弱拡大）及びＢ（強拡大）はいずれも、実施例１において得られたイヌ由来の胚性幹細胞のコロニーの顕微鏡写真を示す。
【図３】実施例１で得られたイヌ由来の胚性幹細胞の表面マーカーを検出した結果を示す。Ａはアルカリホスファターゼ陽性であること；ＢはSSEA-1陽性であること；及びＣはOct-4陽性であることを示す顕微鏡写真である。
【図４】実施例１において、イヌ由来の胚性幹細胞から形成された胚様体（Ａ図）及び胞状の胚様体（Ｂ図）の顕微鏡写真を示す。
【図５】実施例１において、イヌ由来の胚性幹細胞から分化した上皮細胞（Ａ図）、線維芽細胞（Ｂ図）、色素産生細胞（Ｃ図）、神経細胞（Ｄ及びＥ図）、及び心筋細胞（Ｆ図）の顕微鏡写真を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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