(57)【要約】【課題】金属構造体を標識体として含有する、操作性がよくかつ高性能な標的物質検出材料、及び該材料を利用した検体中の標的物質の有無及び/或いは濃度を検出する標的物質検出方法を提供する。【解決手段】検体液中の標的物質を検出するための標的物質検出材料であって、金属構造体とポリマーマトリックスと標的物質捕捉体と捕捉体結合性物質とを少なくとも有し、前記ポリマーマトリックスが前記検体液に接触した際に膨潤する三次元架橋構造を有し、前記金属構造体が前記ポリマーマトリックスに保持されており、前記標的物質捕捉体および前記捕捉体結合性物質が前記ポリマーマトリックスの異なる部分に各々固定されており、前記標的物質捕捉体が前記捕捉体結合性物質を捕捉していることを特徴とする標的物質検出材料。【選択図】図１
2007316061.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の標的物質を検出するための標的物質検出材料であって、
金属構造体と、
ポリマーマトリックスと、
標的物質捕捉体と、
捕捉体結合性物質とを少なくとも有し、
前記ポリマーマトリックスが前記検体に接触した際に膨潤する三次元架橋構造を有し、
前記金属構造体が前記ポリマーマトリックスに保持されており、
前記標的物質捕捉体および前記捕捉体結合性物質が前記ポリマーマトリックスの異なる部分に各々固定されており、
前記標的物質捕捉体が前記捕捉体結合性物質を捕捉していることを特徴とする標的物質検出材料。
【請求項２】
前記標的物質捕捉体と前記捕捉体結合性物質との間の解離定数の大きさが、前記標的物質捕捉体と前記標的物質との間の解離定数の大きさ以上であることを特徴とする請求項１に記載の標的物質検出材料。
【請求項３】
検体中の標的物質を検出するための標的物質検出材料であって、
金属構造体と、
ポリマーマトリックスと、
第一の標的物質捕捉体と、
第二の標的物質捕捉体とを少なくとも有し、
前記ポリマーマトリックスが前記検体に接触した際に膨潤する三次元架橋構造を有し、
前記金属構造体が前記ポリマーマトリックスに保持されており、
前記第一の標的物質捕捉体および前記第二の標的物質捕捉体が前記ポリマーマトリックスの異なる部分に各々固定されており、
前記第一の標的物質捕捉体および前記第二の標的物質捕捉体が前記標的物質の異なる領域を捕捉することを特徴とする標的物質検出材料。
【請求項４】
前記金属構造体が前記ポリマーマトリックスに固定されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の標的物質検出材料。
【請求項５】
検体中の標的物質を検出する標的物質検出方法であって、
標的物質検出材料と前記標的物質を含む検体とを接触させて前記標的物質検出材料の体積を増大させる工程と、
前記標的物質検出材料の光学特性を検出する工程と、
を少なくとも有し、
前記標的物質検出材料として、
金属構造体と、ポリマーマトリックスと、標的物質捕捉体と、捕捉体結合性物質とを少なくとも有し、
前記ポリマーマトリックスが前記検体に接触した際に膨潤する三次元架橋構造を有し、
前記金属構造体が前記ポリマーマトリックスに保持されており、
前記標的物質捕捉体および前記捕捉体結合性物質が前記ポリマーマトリックスの異なる部分に各々固定されており、
前記標的物質捕捉体が前記捕捉体結合性物質を捕捉している、ものを用いることを特徴とする標的物質検出方法。
【請求項６】
前記標的物質検出材料として、前記標的物質捕捉体と前記捕捉体結合性物質との間の解離定数の大きさが、前記標的物質捕捉体と前記標的物質との間の解離定数の大きさ以上であるものを用いることを特徴とする請求項５に記載の標的物質検出方法。
【請求項７】
検体中の標的物質を検出するための標的物質検出方法であって、
標的物質検出材料に前記標的物質を含む検体を接触させて前記標的物質検出材料の体積を減少させる工程と、
前記標的物質検出材料の光学特性を検出する工程と、
を少なくとも有し、
前記標的物質検出材料として、
金属構造体と、ポリマーマトリックスと、第一の標的物質捕捉体と、第二の標的物質捕捉体とを少なくとも有し、
前記ポリマーマトリックスが前記検体に接触した際に膨潤する三次元架橋構造を有し、
前記金属構造体が前記ポリマーマトリックスに保持されており、
前記第一の標的物質捕捉体および前記第二の標的物質捕捉体が前記ポリマーマトリックスの異なる部分に各々固定されており、
前記第一の標的物質捕捉体および前記第二の標的物質捕捉体が前記標的物質の異なる領域を捕捉する、ものを用いることを特徴とする標的物質検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の標的物質を検出するための標的物質検出材料および標的物質検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、免疫検査、或いはイムノアッセイと呼ばれる、抗原−抗体反応を用いた検体中の標的物質の有無、及びその濃度を特異的に検出するための方法は、多くの検査に用いられている。そのような検出方法を用いる検査として、感染症のウイルスや細菌あるいは疾病マーカー分子を検出する体外診断、環境中の内分泌攪乱物質やダイオキシン等の有害物質を検出する環境検査、及び食品中のアレルゲン物質や細菌等を検出する食品検査等がある。
【０００３】
このような検査において、標的物質の有無あるいは濃度を、所謂「標識体」の有無あるいは濃度に置き換えて感度高く検出する方法が採用される場合が多く見られる。このような標識体には、間接的に検出される場合（間接標識体）と直接的に検出される場合（直接標識体）とがある。間接標識体は、酵素免疫（ＥＩＡ）法や化学発光免疫（ＣＬＩＡ）法、電気化学発光免疫（ＥＣＬＩＡ）法のように間接的、つまり標識体により変換される物質の有無或いは濃度を測定する場合に用いられるものである。直接標識体は、標識体が蛍光色素やラテックス標識である場合のように標識体そのものの有無或いは濃度を直接検出可能な標識体である。
【０００４】
また、「標識体」のもう１つの形態として、凝集標識体がある。凝集標識体とは、ラテックス定量法の着色ラテックスのように、標的物質の濃度が高くなるにつれてその凝集度合いが高くなり、その光学的性質の変化を読み取ることによって標的物質の有無あるいは濃度を検出するというような方法に用いられるものである。
【０００５】
上記の標識体の中では、直接標識体、凝集標識体において、近年直径が数ナノメートルから数百ナノメートルの金或いは銀の微粒子が用いられるようになってきた。
【０００６】
直径が数ナノメートルから数百ナノメートルの金或いは銀の微粒子は、局在表面プラズモン共鳴と呼ばれる光学効果により、通常４５０〜６５０ナノメートル付近の光を吸収する特性を有して可視領域で着色している。局在表面プラズモ共鳴による光の吸収では、微粒子同士の位置関係によりその強度や吸収波長が変化する事が知られている。また、これまで用いられてきた標識体に比べ、蛍光標識に対しては退色が無い事、ラテックスに比べては粒子径が小さく反応効率が高い等メリットが多いため、上記のような直接標識体あるいは凝集標識体として多くの場面で用いられてきている。
【０００７】
特許文献１には、抗体にコロイド金粒子を吸着させた抗体感作コロイド金を用いた検出方法が開示されている。この抗体感作コロイド金を用意し、被検抗原を含む抗原群に前記抗体感作コロイド金を反応させた後、洗浄して抗体感作コロイド金が固着した赤色の被検抗原を目視により検出する。
【０００８】
特許文献２及び特許文献３には、抗体感作金属コロイドを標識体とするイムノクロマト法或いは凝集比色法などの測定方法で用いる抗体感作金属コロイドを含む試薬溶液の安定性を高める方法が開示されている。イムノクロマト法では、抗体を感作した金属コロイドを抗原と反応させることにより形成された抗原・抗体−金属コロイド複合体を、抗体が固定化された判定紙（膜）上で泳動させる。判定紙上に固定化された抗体に複合体が捕捉され、その結果、生じた金属コロイドによる着色を判定することにより抗原の有無を調べる。凝集比色法では、溶液中で抗体感作金コロイドと抗原を反応させた際に金コロイドが凝集することによって生じる色調の変化を吸光度変化として捉え測定することにより、抗原の有無または量を調べる。これらの方法において用いられる金コロイド粒子を含む試薬溶液の安定性を高めることが測定精度の向上に寄与するとしている。
【０００９】
特許文献４には、測定感度が良好で、測定時間が短縮された、Ｂ／Ｆ分離を必要としない自動化に適したハプテンの測定法および、その測定法に基づく測定キットが開示されている。この検体中のハプテン量を測定する方法は、次の工程を含んでいる。まず、抗原を含む検体と、ハプテン結合蛋白質を含有する第１試薬とを混合し、この混合液に抗ハプテン抗体結合金コロイドを含有する第２試薬を添加して混合する。そしてハプテン結合蛋白質と抗ハプテン抗体結合金コロイドとの免疫反応凝集による吸光度変化を、５００ｎｍ〜５８０ｎｍで２回以上測定した吸光度より求める。または、５００ｎｍ〜５８０ｎｍを主波長および６２０ｎｍ〜８００ｎｍを副波長とする二波長で２回以上測定した吸光度より求める。
【００１０】
また、特許文献５には、金ナノ粒子が固定されたインプリントポリマーを用いた標的物質検出方法が記載されている。この検出方法では、インプリントポリマーが標的物質を捕捉することによって生じるインプリントポリマーの膨張率変化を利用して標的物質の検出を行う。インプリントポリマーの膨張率が変化すると、インプリントポリマーに固定されている金ナノ粒子間の距離が変化し、金ナノ粒子に由来するシグナルが変化する。このシグナルの変化を利用することで標的物質の検出を行うことができる。
【００１１】
特許文献１〜４では、前述の金或いは銀微粒子の特徴を生かした検査方法が記載されている。しかしながら、これらの方法では、金或いは銀微粒子の表面に標的物質捕捉体である抗体を固定して用いているため、条件によっては凝集や沈殿といった現象が起こりやすく、そのことが検査の再現性や精度に対し悪影響を及ぼす場合があった。
【００１２】
また、特許文献５に記載の検出方法では、標的物質を捕捉する際のインプリントポリマーの膨張率の変化が小さく、高感度な測定は困難であると考えられる。
【特許文献１】特開平１１−０３２７９１号公報
【特許文献２】特開平１１−１０１７９９号公報
【特許文献３】特開２０００−１４６９６７号公報
【特許文献４】特開２００４−３２５１９２号公報
【特許文献５】特開２００４−３４６１７７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
よって、本発明の目的は、上記問題点を鑑み、金や銀などの金属を含有する微粒子を標識体として用いた操作性がよくかつ高性能な標的物質検出材料を提供することにある。
【００１４】
また、本発明の他の目的は、本発明の標的物質検出材料を用いて標的物質を検出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、
検体中の標的物質を検出するための標的物質検出材料であって、
金属構造体と、
ポリマーマトリックスと、
標的物質捕捉体と、
捕捉体結合性物質とを少なくとも有し、
前記ポリマーマトリックスが前記検体に接触した際に膨潤する三次元架橋構造を有し、
前記金属構造体が前記ポリマーマトリックスに保持されており、
前記標的物質捕捉体および前記捕捉体結合性物質が前記ポリマーマトリックスの異なる部分に各々固定されており、
前記標的物質捕捉体が前記捕捉体結合性物質を捕捉していることを特徴とする標的物質検出材料である。
【００１６】
また、別の本発明は、
検体中の標的物質を検出するための標的物質検出材料であって、
金属構造体と、
ポリマーマトリックスと、
第一の標的物質捕捉体と、
第二の標的物質捕捉体とを少なくとも有し、
前記ポリマーマトリックスが前記検体に接触した際に膨潤する三次元架橋構造を有し、
前記金属構造体が前記ポリマーマトリックスに保持されており、
前記第一の標的物質捕捉体および前記第二の標的物質捕捉体が前記ポリマーマトリックスの異なる部分に各々固定されており、
前記第一の標的物質捕捉体および前記第二の標的物質捕捉体が前記標的物質の異なる領域を捕捉することを特徴とする標的物質検出材料である。
【００１７】
また、別の本発明は、
検体液中の標的物質を検出する標的物質検出方法であって、
標的物質検出材料と前記標的物質を含む検体とを接触させて前記標的物質検出材料の体積を増大させる工程と、
前記標的物質検出材料の光学特性を検出する工程と、
を少なくとも有し、
前記標的物質検出材料として、
金属構造体と、ポリマーマトリックスと、標的物質捕捉体と、捕捉体結合性物質とを少なくとも有し、
前記ポリマーマトリックスが前記検体に接触した際に膨潤する三次元架橋構造を有し、
前記金属構造体が前記ポリマーマトリックスに保持されており、
前記標的物質捕捉体および前記捕捉体結合性物質が前記ポリマーマトリックスの異なる部分に各々固定されており、
前記標的物質捕捉体が前記捕捉体結合性物質を捕捉している、ものを用いることを特徴とする標的物質検出方法である。
【００１８】
また、別の本発明は、
検体液中の標的物質を検出するための標的物質検出方法であって、
標的物質検出材料に前記標的物質を含む検体を接触させて前記標的物質検出材料の体積を減少させる工程と、
前記標的物質検出材料の光学特性を検出する工程と、
を少なくとも有し、
前記標的物質検出材料として、
金属構造体と、ポリマーマトリックスと、第一の標的物質捕捉体と、第二の標的物質捕捉体とを少なくとも有し、
前記ポリマーマトリックスが前記検体に接触した際に膨潤する三次元架橋構造を有し、
前記金属構造体が前記ポリマーマトリックスに保持されており、
前記第一の標的物質捕捉体および前記第二の標的物質捕捉体が前記ポリマーマトリックスの異なる部分に各々固定されており、
前記第一の標的物質捕捉体および前記第二の標的物質捕捉体が前記標的物質の異なる領域を捕捉する、ものを用いることを特徴とする標的物質検出方法である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の材料は、金属構造体を標識体として利用するものの、金属微粒子そのものに抗体のような標的物質捕捉分子を固定しない。したがって、金属構造体の利点を活かしつつ金属構造体の凝集を抑制して測定することが可能となる。また本発明の材料は、標的物質の有無及び／或いは濃度によって支持体の体積が大きく変化する構造である。よって、本発明の材料を用いると非常に簡便で且つ再現性の良い高性能な標的物質検出材料および標的物質検出方法を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明における標的物質検出材料は、検体中の標的物質を検出するための材料であり、金属構造体と、標的物質捕捉体と、該金属構造体および標的物質捕捉体を保持するポリマーマトリックスを少なくとも有する。該標的物質捕捉体が標的物質を捕捉することにより、前記ポリマーマトリックスの体積が変化する。このようなポリマーマトリックスの体積変化を金属構造体の光学特性の変化として測定し、標的物質の検出を行う。
【００２１】
本発明における第一の標的物質検出材料は、少なくとも、標的物質捕捉体と、該標的物質捕捉体と親和性を有する捕捉体結合性物質と、金属構造体と、ポリマーマトリックスからなる。
【００２２】
また、本発明における第二の標的物質検出材料は、標的物質検出材料と、第一の標的物質捕捉体と、第二の標的物質捕捉体と、金属構造体と、ポリマーマトリックスからなる。
【００２３】
図１に、本発明における第一の標的物質検出材料の代表的な概略図を示す。第一の標的物質検出材料は、標的物質捕捉体２と、捕捉体結合性物質３と、金属構造体４と、ポリマーマトリックスとを少なくとも有している。標的物質捕捉体２と捕捉体結合性物質３はポリマーマトリックスの異なる部分に各々固定されている。より具体的には、標的物質捕捉体２は、ポリマーマトリックス１を構成する高分子鎖のうちの高分子鎖Ａ（図中の１ａ）に固定されており、捕捉体結合性物質３はポリマーマトリックス１を構成する高分子鎖のうちの高分子鎖Ｂ（図中の１ｂ）に固定されている。
【００２４】
標的物質検出材料に供する検体は、試料に標的物質が存在する場合には、標的物質を溶解または懸濁した状態で含有する液体（以下、検体液ともいう）を少なくとも含むように試料から調製される。検体は好ましくは、検体液のみからなる。検体液は好ましくは、標的物質が溶解した溶液（以下、検体溶液ともいう）である。以下では検体として検体溶液を供する場合を挙げて説明するが、用いることができる検体を検体溶液に限定することを意図するものではなく、標的物質が懸濁された検体液などを検体として用いることができることは言うまでもない。
【００２５】
ポリマーマトリックス１は、高分子鎖の三次元架橋構造（網目構造）を有しており、高分子鎖同士の架橋部分が少ないため、溶液中においては、三次元架橋構造内部に溶媒を保持して膨潤する。ここで、膨潤とは、ポリマーマトリックスが三次元架橋構造内部に溶媒を吸収して保持し、かつポリマーマトリックス内部の高分子鎖が溶媒に溶解することなく広がることで溶液のみからなる液相とポリマーマトリックスとの境界が識別可能に保たれている状態をいう。膨潤したポリマーマトリックスは十分な量の溶媒を保持するため、溶液中の標的物質がポリマーマトリックス内部に浸透することが可能となる。
【００２６】
また、ポリマーマトリックス１のうちの高分子鎖Ａに固定された標的物質捕捉体２は、ポリマーマトリックス１のうちの高分子鎖Ｂに固定された捕捉体結合性物質３を捕捉して、可逆的に結合している。すなわち、標的物質捕捉体２と捕捉体結合性物質３は、複合体（以降、標的物質捕捉体２−捕捉体結合性物質３複合体と記載する場合がある）を形成している。このような結合により、ポリマーマトリックス１は、標的物質捕捉体２と捕捉体結合性物質３との複合体が形成されない状態と比較して相対的に収縮した状態で保持されている。以下、前記複合体が形成されている状態を擬似的な架橋が形成された状態と呼び、複合体が形成されていない状態を擬似的な架橋が形成されていない状態と呼ぶ場合がある。なお、標的物質捕捉体２に固定されている高分子鎖Ａと、捕捉体結合性物質３が固定されている高分子鎖Ｂは異なる高分子鎖であることが好ましいが、同一の高分子鎖であっても良い。同一の高分子鎖に固定されている標的物質捕捉体と捕捉体結合性物質との間で擬似的な架橋を形成する場合は、高分子鎖のうち、標的物質捕捉体２によって捕捉体結合性物質３が捕捉されていない状態では、標的物質捕捉体２が固定されている部分と捕捉体結合性物質３が固定されている部分とが、標的物質捕捉体２の長さと捕捉体結合性物質３の長さをあわせた距離よりも離れて存在する。そして、標的物質捕捉体２によって捕捉体結合性物質３が捕捉されることによって、これらが固定されている部分の距離が短くなった状態となり、好ましくは標的物質捕捉体２と捕捉体結合性物質３の長さを合計した距離以下に近づいた状態となる。同一高分子鎖内の標的物質捕捉体２と捕捉体結合性物質３とが結合体を形成するようにポリマーマトリックスを設計する場合は、高分子鎖のうち標的物質捕捉体２が固定された部分と捕捉体結合性物質３が固定された部分との間に屈曲点を有する高分子鎖を用いることが好適である。
【００２７】
金属構造体４は、ポリマーマトリックス１に保持されている。金属構造体４は、ポリマーマトリックス１が形成する三次元架橋構造の内部の空間に包括されていても良いし、高分子鎖に固定されていても良い。なお、ここで、「金属構造体４がポリマーマトリックス１に包括されている」とは、金属構造体４がポリマーマトリックス１の三次元架橋構造の表面もしくは内部に存在し、金属構造体４がポリマーマトリックス１から流出しない状態とする。
【００２８】
次に、標的物質５を含む検体を第一の標的物質検出材料に接触させた際の変化の様子を図２に示す。
【００２９】
標的物質５を含む検体を第一の標的物質検出材料に接触させると、捕捉体結合性物質３との特異的な結合によって複合体を形成していた標的物質捕捉体２が、捕捉性結合性物質３の捕捉を解消し、標的物質を捕捉する。すなわち、標的物質捕捉体２が捕捉体結合性物質３との結合を解除し、標的物質５と結合するようになる。その結果、標的物質捕捉体２と捕捉体結合性物質３との結合によって擬似的に架橋されていた高分子鎖Ａと高分子鎖Ｂとの結合が解かれ、ポリマーマトリックス１は相対的に収縮した状態から膨張した状態へと大きく変化する。すなわち、標的物質がない状態と比較して、標的物質が存在する場合、標的物質検出材料の体積が増大する。ここで標的物質検出材料の体積が増大するとは、いいかえると、標的物質検出材料のポリマーマトリックスを構成する高分子鎖の密度が低下し、高分子鎖がより広がることを示す。これにより、ポリマーマトリックス１中に保持されている複数の金属構造体４間の距離が広がり、金属構造体の相対的な位置関係が変化する。また、ポリマーマトリックスを構成する高分子鎖の密度の変化が標的物質検出材料の屈折率の変化を生じさせる。
【００３０】
このように、第一の標的物質検出材料では、標的物質が存在することによるポリマーマトリックスの体積の膨張が生じ、それによる金属構造体の特性の変化によって標的物質の有無および濃度を検出する。
【００３１】
次に、図３に本発明における第二の標的物質検出材料の代表的な概略図を示す。第二の標的物質検出材料は、第一の標的物質捕捉体６と、第二の標的物質捕捉体７と、金属構造体４と、ポリマーマトリックスとを少なくとも有している。また、第一の標的物質捕捉体６と第二の標的物質捕捉体７はポリマーマトリックスの異なる部分に各々固定されている。なお、ポリマーマトリックス１および金属構造体４は、本発明における第一の標的物質検出材料のポリマーマトリックスおよび金属構造体と同様のものとする。
【００３２】
本発明における第二の標的物質検出材料の例についてより具体的に説明する。ポリマーマトリックス１を構成する高分子鎖のうち、高分子鎖Ｃ（図中の１ｃ）に第一の標的物質捕捉体６が固定され、高分子鎖Ｄ（図中の１ｄ）に第二の標的物質捕捉体７が固定されている。ポリマーマトリックス１を構成する高分子鎖Ｃに固定されている第一標的物質捕捉体６と高分子鎖Ｄに固定されている第二の標的物質捕捉体７は、標的物質５の別の領域を各々認識して捕捉（結合）するよう別の領域を捕捉する捕捉部位を有している（詳細は後述する）。なお、ここでの高分子鎖−標的物質捕捉体間の「固定」は共有結合によってなされていることが好ましい。
【００３３】
また、ポリマーマトリックスを形成する高分子鎖のうち、標的物質捕捉体２に固定されている高分子鎖Ｃと、捕捉体結合性物質３が固定されている高分子鎖Ｄは異なる高分子鎖であることが好ましいが、同一の高分子鎖であっても良い。同一の高分子鎖である場合は、第一の標的物質検出材料と同様、第一の標的物質捕捉体６と標的物質５と第二の標的物質捕捉体７とで複合体（以下、第一の標的物質捕捉体６−標的物質５−第二の標的物質捕捉体７と記載する場合がある）を形成するよう、高分子鎖のうち第一の標的物質捕捉体６が固定された部分と第二の標的物質捕捉体７が固定された部分との間に屈曲点を有する。
【００３４】
次に、標的物質を含む検体を第二の標的物質検出材料に接触させた際の変化の様子を図４に示す。
【００３５】
第二の標的物質検出材料に、標的物質５を含む溶液を接触させると、第一の標的物質捕捉体６および第二の標的物質捕捉体７が同一の標的物質５の異なる領域を認識して捕捉し、第一の標的物質捕捉体６−標的物質５−第二の標的物質捕捉体７の複合体１６を形成する。すなわち、第一の標的物質捕捉体６と第二の標的物質捕捉体７とで標的物質５を挟み込んで（サンドイッチ方式で）標的物質５を捕捉する。その結果、第一の標的物質捕捉体６が固定化されている高分子鎖Ｃと第二の標的物質捕捉体７が固定されている高分子鎖Ｄとの間に擬似的な架橋が生じることとなり、第二の標的物質検出材料は相対的に膨張した状態から収縮した状態へと変化する。ここで標的物質検出材料の体積が収縮するとは、いいかえると、標的物質検出材料のポリマーマトリックスを構成する高分子鎖の密度が高くなり、高分子鎖の広がりが狭くなることを指す。その結果、ポリマーマトリックス中に保持されている複数の金属構造体４の相対的な位置関係が変化する。また、ポリマーマトリックスを構成する高分子鎖の密度の変化が標的物質検出材料の屈折率の変化を生じさせる。
【００３６】
このように、第二の標的物質検出材料では、標的物質が存在することによるポリマーマトリックスの体積の減少が生じ、それによる金属構造体の特性の変化によって標的物質の有無および濃度を検出する。
【００３７】
なお、第一の標的物質捕捉体６と第二の標的物質捕捉体７とで標的物質５を捕捉する際は、第一の標的物質捕捉体６が捕捉した標的物質５を更に第二の標的物質捕捉体７が捕捉しても良いし、第二の標的物質捕捉体７が捕捉した標的物質５を更に第一の標的物質捕捉体６が捕捉しても良い。また、第一の標的物質捕捉体６と第二の標的物質捕捉体７が同時に標的物質５を捕捉しても良い。
【００３８】
なお、「相対的に膨張した状態」と「相対的に収縮した状態」における「相対的に」とは標的物質が存在しない場合と存在する場合とを比較することによるものである。
【００３９】
背景技術で述べたように、直径数ナノメートルから数百ナノメートルの金や銀といった金属の微粒子のような金属構造体は、局在表面プラズモン共鳴（以下ＬＳＰＲと記載する場合もある）と呼ばれる光学効果により、可視から近赤外領域における特定の波長の光を吸収する。そして、ＬＳＰＲにより吸収される光の波長は、金属構造体同士の間隔により変化する事が知られている。一方で、上記図２及び４で示すポリマーマトリックスの収縮または膨張は、金属構造体等を含むポリマーマトリックスと検体との接触条件を一定にすれば、検体中の標的物質の濃度に比例すると考えられる。
【００４０】
ここで、接触条件を一定にするとは、撹拌や適度な加熱により、ポリマーマトリックスの三次元架橋構造の内部まで標的物質が十分にかつ均一に到達した状態に保つことである。よって、第一の標的物質検出材料のようなポリマーマトリックスの収縮または第二の標的物質検出材料のようなポリマーマトリックスの膨張による金属構造体同士の間隔の変化を、検体接触前後の標的物質検出材料の吸収スペクトルの変化として測定することができる。このような吸収スペクトルの変化を測定することにより、前記検体中の標的物質の濃度が検出できることになる。
【００４１】
更に、検体接触前後の金属構造体の吸収波長の変化を引き起こすもう１つの要因としては、標的物質の有無、或いはその濃度により、前記材料の膨張あるいは収縮が生じた際の標的物質検出材料そのものの屈折率の変化がある。ＬＳＰＲでは、金属構造体周辺の屈折率の変化によって、得られる吸収スペクトルが変化する事が知られている。そのため、結果的に、本方法により標的物質の有無、或いは濃度に応じた前記材料の膨張、収縮によって生じる屈折率の変化を、金属構造体のＬＳＰＲに基づく吸収波長の変化として計測する事で、標的物質の有無、或いは濃度を検出する事が可能となる。
【００４２】
よって、本発明にかかる標的物質検出材料は、前述したように、（１）金属構造体同士の間隔の変化、及び（２）金属構造体周辺の屈折率の変化、の少なくとも一方により、標的物質の有無、或いは濃度を検出することができる。いずれの影響が大きいかは、前記標的物質検出材料中に存在する金属構造体の分布する密度、即ち初期状態（検体と接触させる前の状態）における金属構造体の位置関係に依存する。金属構造体の分布密度が高く、各金属構造体の局在プラズモンに由来する有効電磁場の及ぶ範囲が隣接する金属構造体の電磁場の範囲と重なる部分が生じる金属構造体同士が十分に近い距離にある場合は、（１）の金属構造体同士の間隔の変化による影響が大きい。一方、金属構造体の密度が低く、前記有効電磁場の及ぶ範囲の重なる部分が生じない程、金属構造体同士が十分に離れている場合には（２）金属構造体周辺の屈折率の変化による影響が大きい。尚、後に示す実施例では、前者、即ち（１）金属構造体同士の間隔の変化による影響が大きい場合を記載している。（１）の金属構造体間の間隔の変化により検出する場合は、初期状態での金属構造体間の距離が金属構造体の径（ロッド形状の場合は長径）と同じ程度の間隔を有して金属構造体が保持されるポリマーマトリックスを好適に用いることができる。
【００４３】
このような検出を行う場合、検体との接触による標的物質検出材料の体積変化から標的物質以外のものの影響による標的物質検出材料の体積変化を差し引くことが好ましい。そのような場合、検体の緩衝溶液、より好ましくは検体の標的物質以外を含む溶液と標的物質検出材料を接触させた際の光学特性のシグナルをコントロールとして差し引くことができる。
【００４４】
なお、コントロールとしての標的物質検出材料は、検体と接触させる前の標的物質検出材料が好ましいが、検体と接触させる標的物質検出材料とは別に対照用材料として用意しても良い。
【００４５】
また、標的物質の濃度を検出する場合は、あらかじめ、既知である複数の標的物質の濃度の標準検体を用いて、スペクトルの変化と標的物質の濃度の関係を取得しておき、この関係をもとに検量線を求め、スペクトル変化と濃度の関数を求めておくことができる。この関数を用いて、実際の計測時には、スペクトル変化をもとに濃度が未知の標的物質の濃度を求めることができる。なお、ここでのスペクトルの変化は、強度の最大値を有する波長の変化（スペクトルピークの変化）を用いてもよいし、スペクトルのピークの半値幅等のピーク形状の変化を用いてもよい。さらには、１つあるいは、複数の波長での光の強度の変化を用いても構わない。
【００４６】
次に、これら標的物質および標的物質検出材料を構成する要素（ポリマーマトリックス、金属構造体、捕捉体結合性物質、標的物質捕捉体）について詳細に説明する。
【００４７】
＜ポリマーマトリックス＞
ポリマーマトリックス１は、高分子鎖の三次元架橋構造（網目構造）をなしており、標的物質捕捉体および金属構造体を包括し、これらの支持体としての機能を有している。また、ポリマーマトリックス１は、ポリマーマトリックスを構成する高分子鎖同士の架橋部分が少ないため、内部に溶媒を保持することができ、かつ、高分子鎖の表面に固定された物質同士の特異的相互作用による擬似的な架橋構造が形成されることによって体積が変化するほどの柔軟性を有する。
【００４８】
このようなポリマーマトリックス１としては、前記性質を有し、標的物質捕捉体と標的物質（或いは捕捉体結合性物質）との結合反応に悪影響を及ぼさない物質であればいかなる物質も用いることが可能である。
【００４９】
ポリマーマトリックス１が保持する溶媒は親水性であっても疎水性であっても良い。また、ポリマーマトリックス１は、金属構造体の光学的特性を評価するための波長域の透過性が適度に必要である。したがって、架橋部分が均質に存在することが好ましい。また、ポリマーマトリックス１は前記標的物質捕捉体、捕捉体結合性物質、及び金属構造体を固定するための官能基を側鎖に有することが好ましい。なお、これらの標的物質および捕捉体結合性物質が有する基と反応させる官能基を高分子鎖に形成する場合、モノマーを重合する段階で前記官能基を有するモノマーを混入するなどにより前記官能基を有する高分子鎖を重合して形成しても良いし、モノマーを重合し高分子鎖を形成した後に前記高分子鎖に化学的な修飾を行うことによって前記官能基を形成しても良い。
【００５０】
ポリマーマトリックス１はミクロスフェアを形成するように製造されてもよく、その場合は、高分子鎖を形成する各モノマー前駆体をキャピラリー中に封入し、キャピラリー内で重合させることができる。
【００５１】
標的物質が水性媒体（親水性溶媒）に存在し、標的物質と標的物質捕捉体との結合反応も水性媒体中で行われる場合は、ポリマーマトリックス１には高分子ハイドロゲル（ヒドロゲルと称される場合もあるが、同様のものを指すものとする）を用いることが好ましい。ここで、本発明において、高分子ハイドロゲルとは、親水性の高分子鎖が絡み合った網目構造（三次元架橋構造）を有し、水溶液中で水分を含んである一定体積までに膨潤するものである。ゲル中の水分子は高分子鎖との相互作用の強さの違いから、いくつかの状態（結合水、束縛水、自由水）に分類されている。一般的に、DSC（示差走査熱量測定）測定やTG-DTA（示差熱−熱重量分析）測定から換算されるゲル中の自由水の重量％が３０−５０％以上をハイドロゲルと呼ばれている（R. M. Hodge et al., Polymer, 37, 1371 (1996)、W. -Z. Zhang et al., J. Membrane Sci., 42, 303 (1989).）。本発明に用いる高分子ハイドロゲルとしては、水溶液中で膨潤した状態の高分子ハイドロゲルに占める水分量の重量％が８０％以上であり、好ましくは９０％以上であるものを好適に使用することができる。このような高分子ハイドロゲルは、重合前の全モノマーに対して架橋剤３％以下の重量比で混入して形成されたものであることが好ましい。一方で、高分子ハイドロゲルが過度に水分を保持する構造であると、架橋されていない高分子鎖の領域が移動しやすくなり、その結果、高分子金属構造体間の距離が一定に保たれなくなる。高分子ハイドロゲルは、金属構造体間の距離を検出に影響がない程度に一定に保つという支持体としての構造的な安定性を保持できる程度に膨潤することが好ましく、膨潤時の水分量が９５重量％以下となるような高分子ハイドロゲルを好適に用いることができる。また、９５重量％を超える水分量を保持するものであっても、上記の支持体としての機能を有していれば問題なく用いることができる。なお、各高分子鎖同士の架橋の度合いが、前記標的物質との接触による高分子ハイドロゲルの膨張／収縮の程度を決めることになるので、検体や検出時の条件により適度な架橋密度で設計する。
【００５２】
本発明にかかるハイドロゲルとしては親水性を有するものを好適に用いることができる。本発明において、「ハイドロゲルが親水性を有する」とは当該ハイドロゲルを十分量の水溶液と接触させた場合、ハイドロゲルが、水を吸収し、次いで水和を受け、コロイド状に懸濁、あるいは場合により、ゲルの表面領域の少なくとも一部が溶解（半溶解）することができる程度の性質を有することとする。
【００５３】
このような高分子ハイドロゲルを構成する高分子鎖の例としては、例えば、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリアクリルアミド及びそれらの誘導体を含む高分子などが挙げられる。また、前記条件を満たすことができれば、ポリアミノ酸やポリビニルアルコール等、通常「高分子ハイドロゲル」として用いられている他の高分子も用いることが可能であり、それらのアロイ、共重合体も利用可能である。
【００５４】
これらの高分子鎖を含む高分子ハイドロゲルを得る方法としては、上記高分子鎖のモノマーと二以上の二重結合を有する架橋性モノマーとを共重合する方法、上記高分子鎖に水酸基またはアミノ基を導入した共重合体にエピクロルヒドリンまたはグルタールアルデヒドなどの多官能性化合物を反応させて架橋させる方法、高分子鎖のモノマーを自己架橋させる方法、あるいは光や放射線の照射により架橋させる方法などが挙げられる。本発明の高分子ハイドロゲルの合成には、架橋の密度および架橋構造を調整しやすいところから、架橋性モノマーを共重合する方法が好適に用いることができる。架橋性モノマーとしては、N,N'‐メチレンビスアクリルアミド、N,N'‐ジアリルアクリルアミド、N,N'‐ジアクリロイルイミドなどを用いることができるが、これらに限定されない。架橋性モノマーは全モノマーに対して、０．１  〜５  重量％、より好ましくは、０．５  〜  ３重量％で使用することが好ましい。
【００５５】
なお、ポリマーマトリックスの収縮あるいは膨張は、光学顕微鏡などによって確認することができる。
【００５６】
＜金属構造体＞
本発明で用いる金属構造体には、プラズモン共鳴現象による光吸収領域を有する金属であれば如何なる金属を用いて形成することも可能である。プラズモン共鳴現象による光吸収領域を有する金属の例としては、金、銀、銅、アルミニウム、およびそれらを含む合金より選択される金属が挙げられる。これらのうち、プラズモン共鳴現象の特性や加工のしやすさから、金あるいは銀を用いることが好ましい。特に、塩を含む水溶液中での反応の場合には劣化が起こりにくい金を用いることが好ましい。なお、本明細書において、金属構造体を金属含有構造体と記載する場合もある。
【００５７】
また、金属構造体は複数の層の積層構造で構成されていても良い。このような積層構造とする場合、最表面の層がプラズモン共鳴現象による光吸収領域を有する金属を含む層であれば、その他の層はプラズモン共鳴現象による光吸収領域を有さない材料で構成されていても良い。プラズモン共鳴現象による光吸収領域を有さない材料は、金属であっても良いし、高分子材料や無機材料などの誘電体であっても良い。このような例としては、プラズモン共鳴の性能を向上させるためにポリスチレン系ポリマーやシリカ材料の周りに金の薄膜をコーティングした所謂誘電体−金属コアシェル構造体などが挙げられる。
【００５８】
金属構造体の形状は球状でも角錐状でも針状でもよく、またそれらが歪んだ構造、非対称な構造等でもよく、形状は問わない。金属構造体は、可視領域から近赤外領域（吸収波長が４５０ｎｍ以上１５００ｎｍ以下の領域）にてプラズモン共鳴現象を生じさせる大きさである必要があるため、球状である場合には、直径が５ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることが望ましい。また形状がロッド状の場合はロッドの長径が２０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることが望ましく、突起状構造体（ある大きさのクラスタを有する構造体の表面の一部あるいは全部に前記クラスタよりも小さいクラスタを有する構造体が存在する構造体）では５ｎｍ以上５００ｎｍ以下のコア構造体に１ｎｍ以上５０ｎｍ以下の突起構造体を有した構造であることが望ましい。
【００５９】
金属構造体は、ポリマーマトリックス１に保持されていれば、ポリマーマトリックス１を構成する高分子鎖の三次元架橋構造の間隙に物理的に（非共有結合的に）包埋されていても良いし、高分子鎖が有する主鎖または側鎖に何らかの分子を介してあるいは直接共有結合的に固定されていても良い。また、高分子鎖への吸着によって固定されていても良い。
【００６０】
また、金属構造体が高分子鎖に固定されている場合、第一の実施形態においては、金属構造体が複数存在し、ある金属構造体が固定されている部分と別の金属構造体が固定されている部分の間に、標的物質捕捉体もしくは捕捉体結合性物質が固定されている部分が存在することが好ましい。これは、金属構造体が固定されている部分の間に、標的物質捕捉体もしくは捕捉体結合性物質が固定されている部分が存在し、標的物質捕捉体と捕捉体結合性物質との結合体が形成されている場合、前記標的物質捕捉体による前記捕捉体結合性物質の捕捉が解消されることによって、金属構造体同士の距離を大きく変えることができるからである。また、第二の実施形態においては、金属構造体が複数存在し、ある金属構造体が固定されている部分と別の金属構造体が固定されている部分の間に、第一の標的物質捕捉体もしくは第二の標的物質捕捉体が固定されている部分が存在することが好ましい。このような構成とすることによって、第一の実施形態と同様、第二の実施形態においても、金属構造体同士の距離を大きく変えることができる。
【００６１】
金属構造体が金を含む場合は、高分子鎖の一部分にチオール基或いはアミノ基を保持させ、金−チオール基、或いは金−アミノ基の結合力によって高分子鎖に金属構造体を固定することが好ましい。
【００６２】
＜標的物質、捕捉体結合性物質、標的物質捕捉体＞
次に、標的物質、捕捉体結合性物質、標的物質捕捉体について説明する。
【００６３】
まず、捕捉体結合性物質（捕捉分子結合性物質）について、図１および図２を用いて説明する。
【００６４】
前述したように、第一の標的物質検出材料が有する捕捉体結合性物質３は、ポリマーマトリックス１の高分子鎖Ｂ（１ｂ）に固定されており、高分子鎖Ａ（１ａ）に固定された標的物質捕捉体２と後述する特異的な親和力（結合力）により可逆的な結合を形成している（図１）。このような状態で標的物質５と接触させることにより、捕捉体結合性物質３と標的物質捕捉体２との結合が解除され、標的物質５と標的物質捕捉体２との結合が形成される。よって、前記捕捉体結合性物質３は、標的物質捕捉体２が捕捉体結合性物質３と標的物質５とを交換してこの標的物質５を捕捉可能なように、標的物質捕捉体２により捕捉される物質である。ここで、特異的な結合とは、後述するような生体物質相互作用などの特定の物質同士における固有の結合を示す。
【００６５】
このような現象を生じせしめるための捕捉体結合性物質３としては、標的物質捕捉体２に対する特異的な結合力は有するものの、ポリマーマトリックス１に固定された状態での捕捉体結合性物質３と標的物質捕捉体２との親和性が、ポリマーマトリックス１に固定された状態での標的物質捕捉体２と標的物質５との親和性より低いものから選択されることが好ましい。このような条件を満たすためには、ポリマーマトリックス１に固定されていない状態での捕捉体結合性物質３と標的物質捕捉体２との間の解離定数（以下Ｋｄと記載する場合がある）が標的物質５と標的物質捕捉体２との間の解離定数より大きいことが好ましい。より好ましくは、捕捉体結合性物質３と標的物質捕捉体２との間の解離定数が、標的物質５と標的物質捕捉体２との間の解離定数の１０倍以上であることである。なお、標的物質捕捉体２とポリマーマトリックス１に固定されていない捕捉体結合性物質３の解離定数が、標的物質捕捉体２と標的物質５との解離定数より小さいもしくは同じであっても、前述の条件を満たす場合がある。これは、捕捉体結合性物質３は、ポリマーマトリックス１に固定されることによって、標的物質捕捉体２との解離定数が大きくなると考えられるからである。したがって、同じ解離定数を有する捕捉体結合性物質として、標的物質と全く同一の分子を用いることもできる（後の実施例で記述）。
【００６６】
このような捕捉体結合性物質３は、標的物質を構造的、化学的に変形、変異、修飾したものであり、かつ標的物質捕捉体２との親和性を前述した条件で有するものであることが好ましい。捕捉体結合性物質の例としては、対象分子（標的物質）が核酸の場合、捕捉体結合性物質として１〜数塩基のミスマッチ配列を有する標的物質類似体などが挙げられる。
【００６７】
以上をまとめると、捕捉体結合性物質３としては、標的物質捕捉体２とのＫｄの値が、標的物質５と標的物質捕捉体２との間のＫｄの値以上である分子を好適に用いることができる。さらに、標的物質捕捉体２とのＫｄの値が標的物質５と標的物質捕捉体２との間のＫｄの値以下の分子を捕捉体結合性物質３として用いても、高分子鎖に固定された際の標的物質捕捉体２との親和性が標的物質５と標的物質捕捉体２との親和性より低くなる場合には問題なく用いることができる。
【００６８】
次に標的物質捕捉体および標的物質について図２および図４を用いて述べる。
【００６９】
本発明の第一の標的物質検出材料における標的物質捕捉体２は、標的物質５および捕捉性結合物質３と前述した関係を有するものであれば良い。
【００７０】
本発明の第二の標的物質検出材料における第一の標的物質捕捉体６と第二の標的物質捕捉体７は標的物質５における別の領域を各々認識して捕捉するよう別の領域を捕捉する捕捉部位を有している。
【００７１】
また、第一の標的物質捕捉体６および第二の標的物質捕捉体７が同一の捕捉部位を有し、該捕捉部位が標的物質５のうちの複数の領域を捕捉できる場合も「第一の標的物質捕捉体６と第二の標的物質捕捉体７は標的物質５における別の領域を各々認識して捕捉するよう別の領域を捕捉する捕捉部位を有している」という概念に含まれるものとする。このような場合、標的物質５が有する複数の領域のうちの特定の領域を第一の標的物質捕捉体６が捕捉し、前記複数の領域のうち第一の標的物質６が捕捉した領域以外の領域のいずれかを第二の標的物質捕捉体が捕捉する場合などがある。したがって、第一の標的物質捕捉体と第二の標的物質捕捉体は、標的物質５の複数の領域を捕捉することができれば、同一のものであっても構わない。
【００７２】
標的物質と標的物質捕捉体の関係は、抗原−抗体の関係、ＤＮＡあるいはＲＮＡ−ＤＮＡあるいはＲＮＡの関係（ハイブリダイゼーション）、リガンド−レセプターの関係、転写因子のようなＤＮＡあるいはＲＮＡ−タンパク質との関係、酵素−基質の関係、糖鎖化合物−タンパク質の関係（レクチン等）等が挙げられるが、特異的に結合を有する関係であれば特に制限されるものではない。したがって、標的物質および標的物質捕捉体は前述の関係を満たすものである。なお、標的物質−標的物質捕捉体の関係がα−βと示す場合には、αとβとの組み合わせを示しているものとして、標的物質がαであり、標的物質捕捉体βである場合と、標的物質がβであり、標的物質捕捉体がαである場合の両方を示すものとする。
【００７３】
標的物質、第一の標的物質捕捉体、および第二の標的物質捕捉体が核酸である場合の第一の標的物質捕捉体６、第二の標的物質捕捉体７、標的物質５の三者の反応例を図６に示す。核酸（DNAあるいはRNA）である標的物質５は、標的物質５が有する配列のうちの第一の相補的配列領域において高分子鎖Ｅ（図中の１ｅ）に固定されている第一の標的物質捕捉体６である核酸と結合し、標的物質５が有する配列のうち第一の相補的配列領域２０とは異なる第二の相補的配列領域２１において高分子鎖Ｆ（図中の１ｆ）第二の標的物質捕捉体７が結合し相補的に結合する。なお、このような場合、第一の標的物質捕捉体と第二の標的物質捕捉体の核酸配列が相互に重なり合わない配列を有しているように設計、合成して用いることが好ましい。
【００７４】
なお、標的物質が抗原であり、標的物質捕捉体が抗体である場合には、第一の標的物質捕捉体および第二の標的物質捕捉体はELISA法等で用いられている捕捉抗体と標識抗体のペアなどを用いることができ、通常のELISAキット等で市販されている各抗体を用いることができる。
【００７５】
また、標的物質および標的物質捕捉体の組み合わせが抗原−抗体である場合、抗原としては、例えば、細菌のような生物細胞から、ウイルス、タンパク質（いわゆる疾病マーカーと呼ばれるものも含まれる）、遺伝子断片、ペプチド、さらには内分泌攪乱物質（環境ホルモン）、ダイオキシン、ＰＣＢといった低分子化合物まで広範囲のものを用いることができる。
【００７６】
また、抗体としては、所謂イムノグロブリンフォールド構造を有する領域を含んでいれば如何なる分子も用いる事が可能である。通常はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ等の抗体本体及びその複合体が用いられるが断片であるＦａｂ’２、Ｆａｂ、Ｆｖ、さらにはＶＨ、ＶＬ単独でも用いる事が可能である。また、これらを遺伝子工学的にペプチドリンカーで一本鎖としたｓｃＦｖやＤｉａｂｏｄｙ、Ｔｒｉａｂｏｄｙ、Ｔｅｔｒａｂｏｄｙ等の抗体断片複合体も用いる事が可能である。
【００７７】
また、これら標的物質捕捉体および捕捉体結合性物質の高分子鎖への固定は、例えば、共有結合、イオン結合、吸着などによってなされるが、これらの成分が良好に固定又は担持されれば方法はこれらに限らない。
【００７８】
結合により固定する方式としては、例えば、高分子鎖にサクシンイミド骨格を有する官能基を形成し、前記サクシンイミド骨格を有する官能基と標的物質捕捉体および捕捉体結合性物質のアミノ基と反応させる方法が挙げられる。また、ポリマーゲル分子鎖にマレイミド骨格を有する官能基を形成させ、標的物質捕捉体および捕捉体結合性物質のチオール基と反応させる方法等が挙げられる。ここで、標的物質捕捉体および捕捉体結合性物質が有するアミノ基およびチオール基は分子中に元来有していても、化学的に修飾したものでもどちらでも良い。
【００７９】
さらにより精緻に高分子鎖内の標的物質捕捉体および捕捉体結合性物質の固定の頻度を調整するためには次のような方法が用いることができる。まず、標的物質捕捉体および捕捉体結合性物質をハイドロゲルを形成する高分子鎖のモノマー前駆体で修飾する。その後、モノマー前駆体修飾標的物質捕捉体およびモノマー前駆体修飾捕捉体結合性物質を直接重合する方法である。本法では、モノマー前駆体修飾標的物質捕捉体およびモノマー前駆体修飾捕捉体結合性物質と通常のモノマー前駆体の仕込み比を調整することにより、標的物質捕捉体、捕捉体結合性物質の高分子鎖内の固定の頻度を調整することが可能となる。
【００８０】
標的物質の濃度が同じであれば、標的物質捕捉体および捕捉体結合性物質の高分子鎖における固定の頻度が多いほど、第一の標的物質検出材料においては、標的物質捕捉体と捕捉体結合物質との擬似的な架橋の形成の頻度はより多くなる。第二の標的物質検出材料においては、第一の標的物質捕捉体−標的物質−第二の標的物質捕捉体の複合体による擬似的な架橋の形成の頻度がより多くなる。その結果、ポリマーマトリックスの体積の膨張／収縮の変化は大きくなる。第一の標的物質検出材料においては、擬似的な架橋の形成の頻度が多いほど、標的物質が存在する溶液中でポリマーマトリックスの膨張率は大きくなる。第一の標的物質検出材料において、標的物質捕捉体および捕捉体結合性物質の夫々の固定量はともに、全モノマーに対し、好ましくは０．１  〜１０  重量％、より好ましくは０．５  〜５  重量％である。また、第二の標的物質検出材料においては、擬似的な架橋の形成の頻度が多いほど、標的物質が存在する溶液中でポリマーマトリックスの収縮率は大きくなる。第二の標的物質検出材料において、第一の標的物質捕捉体および第二の標的物質捕捉体の夫々の固定量はともに、全モノマーに対し、好ましくは０．１  〜１０  重量％、より好ましくは０．５〜５  重量％である。
【００８１】
また、前記標的物質検出材料を用いて標的物質検出キットおよび標的物質検出素子を作製することもできる。これら標的物質検出キットおよび標的物質検出素子について、図５を用いて説明する。
【００８２】
前記標的物質検出材料を用いた標的物質検出キットは、検体中の標的物質の有無及び／或いは濃度を検出するためのキットであって、前記第一或いは第二の標的物質検出材料８と、前記標的物質検出材料に前記標的物質を含む検体を接触させるための容器１０と、を含む。
【００８３】
また、前記標的物質検出材料を用いた標的物質検出素子は、検体中の標的物質の有無及び／或いは濃度を検出するための素子であって、本発明の第一或いは第二の標的物質検出材料８と、前記検体を導入する領域であり、前記標的物質検出材料に前記標的物質を含む検体を接触させるための領域である検体接触容器１０と、前記標的物質検出材料の光学特性を測定するための当該波長光透過領域１７および１８と、を含むことを特徴とする標的物質検出用素子である。ここで、波長光透過領域１７は入射光１４と交わる検体接触容器１０の面のうち光源に近い面の光が透過する領域であり、波長光透過領域１８は検体接触容器１０の面のうち前記面と対向する面における光が透過する領域のことである。
【００８４】
前記標的物質検出材料８を含む溶液９は、検体を標的物質検出材料８に接触させるための領域を含む容器（検体接触容器）１０に格納される。その後、前記検体接触容器１０に標的物質の有無あるいは濃度を検出したい検体１１を外部より導入する。
【００８５】
そして、検体接触容器１０内部の検体１１および標的物質検出材料８を含む溶液９に対して、光源１２から光透過領域１７を透過した入射光１４を入射させ、前記溶液を透過した透過光１５を検出器１３にて検出する。図５では、標的物質検出材料の格納容器と接触容器は同一の容器として記載したが、標的物質検出材料の格納容器は別に用意されていても良い。また、図５では透過光１５を検出する構成としているため、１７および１８は波長光透過領域なっているが、１７を透過領域とし、１７が存在する面を反射面として前記波長光透過領域１８を反射領域とすることもできる。このような場合、検出器１３と光源１２とが検体接触容器１０から見て同一方向にあって、反射光を検出する構成となる。
【実施例】
【００８６】
以下、実施例を用いてさらに詳細に本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではなく、材料、組成条件、反応条件等、同様な機能、効果を有する検出用材料、検出用キット、および検出用素子が得られる範囲で自由に変えることができる。
【００８７】
（実施例１）
第一の標的物質検出材料の例
実施例１および実施例２では、標的物質及び捕捉体結合性物質として牛血清アルブミン（以降ＢＳＡと記載する場合もある）、標的物質捕捉体としてヤギ抗ＢＳＡイムノグロブリンＧモノクローナル抗体（以降抗ＢＳＡ−ＧＩｇＧと記載する場合もある）を用いる。
【００８８】
＜捕捉体結合性物質及び標的物質捕捉体−モノマー前駆体の合成及び精製＞
本合成及び精製は、Appl.Biochem.Biotech.,15, 11-24(1987)及びNature,399,766- 769 (1999) 記載の方法に従って行う。即ち;N-succinimidylacrylate（以降ＮＳＡと記載する場合もある）０．４ｍｇを、標的物質捕捉体である１００ｍｇの抗ＢＳＡ−ＧＩｇＧを含むリン酸バッファー（２０ｍＭ，ｐＨ７．４）に加え、３６℃で１時間反応させる。その後、ゲルろ過により精製を行う。捕捉体結合性物質であるＢＳＡにおいても、ＮＳＡとのモル量比を合わせて同様の合成、精製を行い、それぞれの工程から抗ＢＳＡ−ＧＩｇＧ−モノマー前駆体およびＢＳＡ−モノマー前駆体を得る。
【００８９】
＜捕捉体結合性物質或いは標的物質捕捉体固定高分子鎖の重合・合成＞
次に、５７０ｍｇの抗ＢＳＡ−ＧＩｇＧ−モノマー前駆体にａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（以降ＡＡｍ
と記載する場合もある）を３０ｍｇ加え、更に０．０１ｍＬのammonium persulphate（以降ＡＰＳと記載する場合もある）水溶液（１００ｍＭ）及び０．０１ｍＬのN,N,N',N'-tetramethylethylenediamide（以降ＴＥＭＥＤと記載する場合もある）（０．８Ｍ）を加えて、２５℃で３時間反応させ、分子量２００，０００程度の抗ＢＳＡ−ＧＩｇＧ固定高分子鎖を得る。捕捉体結合性物質であるＢＳＡにおいても、ＢＳＡ−モノマー前駆体、ＡＡｍおよび各試薬のモル量比を、抗ＢＳＡ−ＧＩｇＧ−モノマー高分子鎖の重合でのモル量比に合わせて同様の重合反応を行い、ＢＳＡ固定高分子鎖を得る。
【００９０】
＜捕捉体結合性物質及び標的物質捕捉体固定高分子ハイドロゲルの合成＞
上記のようにして得られるＢＳＡ固定高分子鎖（２．５ｍｇ）と、ＡＡｍを８５ｍｇと、N,N'-methylenebisacrylamide（以降ＭＢＡＡと記載する場合もある）（ＡＡｍに対し０．１重量％）とを、上記のようにして得られる抗ＢＳＡ−ＧＩｇＧ固定高分子鎖（ＢＳＡ固定高分子鎖と等モル）及び直径４０ｎｍの金コロイド微粒子を含む、６００ｍｇのリン酸バッファーに溶解させ、０．０１ｍＬのＡＰＳ水溶液（１００ｍＭ）と０．０１ｍＬのＴＥＭＥＤ水溶液（０．８Ｍ）を加えるとすぐにガラスキャピラリ中に導入し、２５℃、３時間架橋反応を行う。反応終了後、得られるハイドロゲルをリン酸バッファー中に浸漬する。
【００９１】
また、対照としてのポリアクリルアミドのみのハイドロゲルも、捕捉体結合性物質及び標的物質捕捉体が存在しないように、これらを加えない以外は同様の方法で合成することができる。
【００９２】
（実施例２）
実施例１の標的物質検出材料を用いた標的物質検出方法の一例
実施例１で得られる捕捉体結合性物質及び標的物質捕捉体を固定させた高分子ハイドロゲル−リン酸バッファー水溶液５００μＬを石英光学セルに入れ、可視−近赤外分光光度計で予め吸収スペクトルを得る。また、対照としてポリアクリルアミドのみのハイドロゲル分散液も同様に吸収スペクトルを得る。これらのセルに、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬの濃度のＢＳＡ含有リン酸バッファー５０μＬを順に加え、各添加より２時間後の吸収スペクトルを得る。その結果、対照としてポリアクリルアミドのみのハイドロゲル分散液の吸収スペクトルはほとんど変化がないのに対し、捕捉体結合性物質及び標的物質捕捉体固定高分子ハイドロゲル分散液の吸収スペクトルは、最大吸収波長がＢＳＡ溶液を加えるにしたがって長波長側にシフトする。
【００９３】
（実施例３）
第二の標的物質検出材料の例
実施例３および実施例４では、標的物質としてＢＳＡを用い、第一の標的物質捕捉体としてヤギ抗ＢＳＡイムノグロブリンＧモノクローナル抗体（以降抗ＢＳＡ−ＧＩｇＧと記載する場合もある）を、第二の標的物質捕捉体としてウサギ抗ＢＳＡイムノグロブリンＧモノクローナル抗体（以降抗ＢＳＡ−ＲＩｇＧと記載する場合もある）を用いる。
【００９４】
＜第一の標的物質捕捉体及び第二の標的物質捕捉体固定高分子ハイドロゲルの合成＞
実施例１のＢＳＡを抗ＢＳＡ−ＲＩｇＧに変更する以外は実施例１と同様の手法により、第一の標的物質捕捉体及び第二の標的物質捕捉体を固定させた高分子ハイドロゲルを得る。
【００９５】
（実施例４）
実施例３の標的物質検出材料を用いた標的物質検出方法の一例
実施例３で得られる第一の標的物質捕捉体及び第二の標的物質捕捉体を固定させた高分子ハイドロゲル−リン酸バッファー水溶液およびポリアクリルアミドのみの高分子ハイドロゲル分散液を用い、実施例２と同様にして標的物質であるＢＳＡの検出を行う。
【００９６】
その結果、対照としてポリアクリルアミドのみのハイドロゲル分散液の吸収スペクトルはほとんど変化がないのに対し、捕捉体結合性物質及び標的物質捕捉体固定高分子ハイドロゲル分散液の吸収スペクトルは、最大吸収波長がＢＳＡ溶液を加えるにしたがって短波長側にシフトする。
【００９７】
（実施例５）
第一の標的物質検出材料の別の例
実施例５では、第一の標的物質検出材料の実施例１とは別の例として、金コロイドが高分子鎖に固定された標的物質検出材料の例を示す。
【００９８】
まず、溶液１の調製として、反応容器にglycidylmethacrylate（以降ＧＭＡと記載する場合もある）０．５ｇとアセトン７ｇを秤量した後、窒素バブリングによって反応容器内及び溶液内の酸素を窒素に置換する。
【００９９】
また、溶液２の調製として、重合開始剤として2、2’-azobis(2-methylpropanenitrile)（以降ＡＩＢＮと記載する場合もある）０．０５ｇをアセトン３ｇに溶解させ、窒素バブリングによって溶液内の酸素を窒素に置換する。
【０１００】
次に、溶液１を６０℃に恒温し、攪拌下、溶液２をシリンジにて反応容器に投入し重合を開始する。重合一時間後、反応容器内に空気（酸素）を投入して重合を停止させる。精製は、重合終了後のポリマー溶液を大過剰のメタノールに滴下して、再沈殿する。
【０１０１】
上記操作により得られたＰｏｌｙＧＭＡの分子量をＧＰＣにて測定する。数平均分子量（Ｍｎ）＝１５０００程度、Ｍｗ（重量平均分子量）／Ｍｎ＝３程度のＰｏｌｙＧＭＡを得る。
【０１０２】
得られたＰｏｌｙＧＭＡのグリシジル基を以下のようにして末端をアミノ基に変換する。
まず、ＰｏｌｙＧＭＡ  ０．０２ｇをアセトン１０ｍＬに溶解させる。別途、ＰｏｌｙＧＭＡ  ０．０２ｇに含まれるモノマーユニットに対し、モル換算で２０倍量のアミノエタンチオールを蒸留水に溶解させ、１Ｎ  ＮａＯＨ水溶液あるいは１Ｎ  ＨＣｌ水溶液を用いてｐＨを９．０に調製し、全量で７０ｍＬとする。
【０１０３】
更に、これらの溶液を混合し、攪拌下、室温にて２４時間反応する。反応後、反応液を蒸留水中で透析→精製することにより、アミノ化ＰｏｌｙＧＭＡポリマーを得る。
【０１０４】
次に、実施例１で行ったハイドロゲルの合成手法と同様の操作において、アクリルアミドのかわりに、上記のアミノ化ＰｏｌｙＧＭＡポリマーをアクリルアミドの場合と同量（重量比）加えて、BSA固定高分子鎖、抗ＢＳＡ−ＧＩｇＧ固定高分子鎖を含み、アミノ化ＰｏｌｙＧＭＡポリマーのアミノ末端に金コロイド粒子が固定されたハイドロゲル材料を得る。
【０１０５】
（実施例６）
実施例５の第一の標的物質検出材料を用いた標的物質検出方法の例
ハイドロゲル材料を、実施例５で得られるハイドロゲル材料にする以外は、実施例２と同様の方法にて、標的物質であるＢＳＡの検出を行う。その結果、対照としてポリアクリルアミドのみのハイドロゲル分散液の吸収スペクトルはほとんど変化がないのに対し、捕捉体結合性物質及び標的物質捕捉体固定高分子ハイドロゲル分散液の吸収スペクトルは、最大吸収波長がＢＳＡ溶液を加えるにしたがって長波長側にシフトする。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】本発明における第一の標的物質検出材料を示す模式図である。
【図２】本発明における第一の標的物質検出材料が標的物質と接触した際の変化の様子を示す模式図である。
【図３】本発明における第二の標的物質検出材料を示す模式図である。
【図４】本発明における第二の標的物質検出材料が標的物質と接触した際の変化の様子を示す模式図である。
【図５】標的物質検出材料を含むキット、素子の模式図である。
【図６】本発明における第二の標的物質検出材料が標的物質と接触した際の変化の様子を示す模式図である。
【符号の説明】
【０１０７】
１  高分子ハイドロゲル
１ａ  高分子鎖Ａ
１ｂ  高分子鎖Ｂ
１ｃ  高分子鎖Ｃ
１ｄ  高分子鎖Ｄ
１ｅ  高分子鎖Ｅ
１ｆ  高分子鎖Ｆ
２  標的物質捕捉分子
３  捕捉分子結合性物質
４  金属構造体
５  標的物質
６  第一の標的物質捕捉分子
７  第二の標的物質捕捉分子
８  標的物質検出材料
９  材料水溶液
１０  検体接触容器
１１  検体
１２  光源
１３  検出器
１４  入射光
１５  透過光
１６  第一の標的物質捕捉体と標的物質と第二の標的物質捕捉体との複合体
１７  波長光透過領域
１８  波長光透過領域
２０  第一の相補的配列領域
２１  第二の相補的配列領域
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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