(57)【要約】      （修正有）【課題】未分化な幹細胞を高率かつ選択的に心筋細胞へと分化誘導する方法の提供。【解決手段】胚性癌種細胞（ＥＣ細胞）における心筋細胞への分化誘導時に発現量が増加する遺伝子の探索を行うことで、幹細胞から心筋細胞への分化誘導を促進させる候補分子の特定を行った。その結果、胚性癌種細胞系における心筋分化誘導時に発現量が一時的に上昇する物質として、骨形成因子（ＢＭＰ−５）又は、Ｗｎｔシグナルの分泌性阻害因子（ｓＦＲＰ−５）を見出した。胚性癌種細胞系における心筋分化誘導開始から１０日以内に当該物質の作用下で幹細胞の培養を行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞から心筋細胞を分化誘導することにより心筋細胞を製造する方法であって、胚性癌種細胞系における心筋分化誘導開始から１０日以内に発現量が一時的に上昇する物質の作用下で幹細胞の培養を行うことを含む方法。
【請求項２】
上記物質がＢＭＰ−５またはＢＭＰ−５をコードする遺伝子である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記物質がｓＦＲＰ−５またはｓＦＲＰ−５をコードする遺伝子である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
幹細胞が胚性幹細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
幹細胞が胚性癌種細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
幹細胞が哺乳動物由来である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
幹細胞の培養において胚様体を形成する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
胚様体が形成されるまでの間、培地に白血病抑制因子を添加する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
胚様体形成後の幹細胞の培養が、培養容器上での平面培養によって行われる、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
幹細胞の培養において胚様体を形成する工程を含む、請求項２記載の方法。
【請求項１１】
胚様体形成期から１〜２日間ＢＭＰ−５を添加する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
胚様体形成期からＢＭＰ−５を０．２〜１．０ｎｇ／ｍｌの濃度で培地に添加する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法によって製造された心筋細胞を含有してなる、心疾患の治療剤。
【請求項１４】
胚性癌種細胞系における心筋分化誘導開始から１０日以内に発現量が一時的に上昇する物質を含む、心筋細胞の分化誘導剤。
【請求項１５】
上記物質がＢＭＰ−５またはＢＭＰ−５をコードする遺伝子である、請求項１４記載の分化誘導剤。
【請求項１６】
上記物質がｓＦＲＰ−５またはｓＦＲＰ−５をコードする遺伝子である、請求項１４記載の分化誘導剤。
【請求項１７】
ＢＭＰ−５、ｓＦＲＰ−５のうちの少なくとも何れかの発現または機能を抑制する物質を含む、心筋細胞への分化阻害剤。
【請求項１８】
発現または機能を抑制する物質が、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ誘導性核酸、ターゲティングベクター、及び抗体からなる群より選ばれる、請求項１７記載の分化阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋細胞の製造方法、該方法によって得られた心筋細胞、および、心筋細胞への分化を誘導する分化誘導剤などに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に心筋細胞は、出生前は自律拍動しながら活発に細胞分裂を行っているが、出生直後よりその分裂能を喪失し、また未分化な前駆細胞を持つこともないため、心筋梗塞や心筋炎等の各種ストレスに曝されることにより心筋細胞が死滅すると喪失した心筋細胞は補充されることがないとされている。その結果、残存心筋細胞は代償性肥大により心機能を保とうとする。しかし、各種ストレスが持続し、その許容範囲を超えてしまうと、さらなる心筋細胞の疲弊、死滅を誘発して心機能の低下（すなわち、心不全）を呈するようになる。
【０００３】
心不全の治療薬としては、従来、心筋の収縮力を増加させるジギタリス製剤やキサンチン製剤等の強心剤が使用されてきたが、これらの薬剤の長期投与は、心筋エネルギーの過剰消費のため、病態を悪化させることが知られている。また最近では、交感神経系やレニン−アンジオテンシン系の亢進による過剰な心臓負荷を軽減するβ遮断薬やＡＣＥ阻害薬による治療が主流になってきているが、これらは対症的治療法に過ぎず、傷害を受けた心組織そのものを回復させるものではない。これに対し、心臓移植は重症心不全に対する根本的な治療法であるが、臓器提供者の不足や医療倫理、患者の肉体的・経済的負担の重さ等の問題から本法を一般的な治療法として頻用することは困難である。
【０００４】
そのため、衰弱又は失われた心筋細胞を補充的に移植する方法が、心不全の治療に極めて有用であると考えられる。心筋細胞の移植を行うためには、心筋細胞を取得することが必要となる。そこで、心筋細胞を未分化な幹細胞から分化誘導し、これを移植用細胞として利用する方法が近年、特に注目されている。現在のところ、成体心組織中に心筋細胞を産生し得る前駆細胞もしくは幹細胞として明らかに同定できる細胞集団は見出されていないため、上記の方法を実施するためには、より未分化で多彩な分化能を有している多能性幹細胞の使用が考えられる。この多能性幹細胞としては、例えば胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）などが挙げられる。
【０００５】
しかし、ＥＳ細胞又はＥＧ細胞などから形成された胚様体（ＥＢ）からは、心筋細胞以外に血球系細胞、血管系細胞、神経系細胞、腸管系細胞、及び骨・軟骨細胞などの別種の細胞が混在して発生するため、多能性幹細胞に由来する心筋細胞を細胞移植治療などの目的のために使用する際の大きな問題となる。さらに、これらの分化した細胞の中で心筋細胞が占める割合は、全体の５〜２０％程度に過ぎず、心筋細胞への分化効率が低いことも問題となる。
【０００６】
別種の細胞が混在している中から、心筋細胞のみを選択的に選別する方法としては、ＥＳ細胞の遺伝子に人為的な装飾を加え、薬剤耐性もしくは異所性発現能を付与することにより、心筋細胞又はその前駆細胞としての形質を有する細胞を回収する方法が挙げられる。しかし、この方法では心筋細胞の純度は高くなるものの、最終的に得られる心筋細胞数は全細胞数の数パーセント程度に過ぎず、移植治療に必要な心筋細胞を得るのは容易なことではない。
【０００７】
そこで、ＥＳ細胞から心筋細胞を高率に分化誘導する方法として、ヒトＥＳ細胞を５−アザシチジンで処理する方法が報告されている（非特許文献１参照）。この方法によれば、ＥＢ中のトロポニンＩ陽性（心筋）細胞が１５％から４４％に増加することが報告されているが、それでも心筋細胞の占める割合がＥＢ中の５０％を越えることはない。
【０００８】
これ以外にも、ＥＳ細胞から心筋細胞をより高率に発生させる方法として、例えば、マウスＥＳ細胞では、レチノイン酸（非特許文献２参照）、アスコルビン酸（非特許文献３参照）、ＴＧＦβ、ＢＭＰ−２（非特許文献４参照）、ＢＭＰ−４（非特許文献５参照）、ＰＤＧＦ（非特許文献６参照）、又はＤｙｎｏｒｐｈｉｎ  Ｂ（非特許文献７参照）を添加したり、あるいは、細胞内の活性酸素種（ＲＯＳ）（非特許文献８参照）やＣａ２＋（非特許文献９参照）を増加させる処理を行ったりする方法が知られている。また、特許文献１には、マウスＥＳ細胞の培養において、ＢＭＰのシグナル伝達を抑制する物質を添加することによって、心筋細胞を選択的かつ高率に産生することができることが開示されている。しかし、これらの何れの方法を用いても、心筋細胞の産生効率は依然として満足できるほどは上昇しない。
【０００９】
また、上記以外にも、組織幹細胞（ＳＰ細胞、Ｓｃａ１＋細胞、ｉｓｌ１細胞など）をｉｎ  ｖｉｔｒｏでフィーダー細胞と共培養することによって心筋細胞の分化誘導を行う方法が知られている。例えば、非特許文献１０には、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）をフィーダーとして、ヒトＥＳ細胞から心筋分化を行ったことが記載されている。また、非特許文献１１には、マウスＥＳ細胞にＯＰ９をフィーダーとして用いた心筋分化系について記載されている。しかしながら、この方法でも心筋細胞の産生効率を満足できる程度に上昇させることはできない。
【００１０】
【特許文献１】国際公開第０５／０３３２９８号パンフレット
【非特許文献１】Ｃｈｕｎｈｕｉら、「サーキュレーション・リサーチ」（“Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．”）、９１：５０８．２００２
【非特許文献２】Ｗｏｂｕｓら、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・セルラー・カージオロジー」（“Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．”）、２９：１５２５、１９９７
【非特許文献３】Ｔａｋａｈａｓｈｉら、「サーキュレーション」（“Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ”）、１０７：１９１２、２００３
【非特許文献４】Ｂｅｈｆａｒら、「ＦＡＳＥＢジャーナル」（“ＦＡＳＥＢ  Ｊ．”）、１６：１５５８、２００２
【非特許文献５】Ｓｃｈｕｌｔｈｅｉｓｓ ら，「ジーンズ・アンド・ディベロプメント」（“Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．”），１１（４），４５１，１９９７
【非特許文献６】Ｓａｃｈｉｎｉｄｉｓら、「カージオバスキュラー・リサーチ」（“Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．”）、５８：２７８、２００３
【非特許文献７】Ｖｅｎｔｕｒａら、「サーキュレーション・リサーチ」（“Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．”）、９２：６２３、２００３
【非特許文献８】Ｓａｕｅｒら、「ＦＥＢＳレターズ」（“ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．”）、４７６：２１８、２０００
【非特許文献９】Ｌｉら、「ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー」（“Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．”）、１５８：１０３、２００２
【非特許文献１０】Ｍｕｍｍｅｒｙら，「サーキュレーション」      （“Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ”），１０７：２７３３，２００２
【非特許文献１１】Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら，「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ジ・ユナイテッド・オブ・アメリカ」（“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ”)，１００：４０１８，２００３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、未分化な幹細胞をより高率かつ選択的に心筋細胞へと分化誘導する方法を提供するとともに、この方法によって得られた心筋細胞の利用方法などを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記の目的を達成するために、胚性癌種細胞（ＥＣ細胞）における心筋細胞への分化誘導時に発現量が増加する遺伝子の探索を行うことで、幹細胞から心筋細胞への分化誘導を促進させる候補分子の特定を行った。その結果、胚性癌種細胞系における心筋分化誘導時に発現量が一時的に上昇する物質、具体的には、ＢＭＰ−５又はｓＦＲＰ−５が幹細胞から心筋細胞への分化誘導を顕著に促進することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち本発明は、以下の通りである。
〔１〕幹細胞から心筋細胞を分化誘導することにより心筋細胞を製造する方法であって、胚性癌種細胞系における心筋分化誘導開始から１０日以内に発現量が一時的に上昇する物質の作用下で幹細胞の培養を行うことを含む方法。
〔２〕上記物質がＢＭＰ−５またはＢＭＰ−５をコードする遺伝子である、上記〔１〕に記載の方法。
〔３〕上記物質がｓＦＲＰ−５またはｓＦＲＰ−５をコードする遺伝子である、上記〔１〕に記載の方法。
〔４〕幹細胞が胚性幹細胞である、上記〔１〕に記載の方法。
〔５〕幹細胞が胚性癌種細胞である、上記〔１〕に記載の方法。
〔６〕幹細胞が哺乳動物由来である、上記〔１〕に記載の方法。
〔７〕幹細胞の培養において胚様体を形成する工程を含む、上記〔１〕に記載の方法。
〔８〕胚様体が形成されるまでの間、培地に白血病抑制因子を添加する、上記〔７〕に記載の方法。
〔９〕胚様体形成後の幹細胞の培養が、培養容器上での平面培養によって行われる、上記〔７〕に記載の方法。
〔１０〕幹細胞の培養において胚様体を形成する工程を含む、上記〔２〕に記載の方法。
〔１１〕胚様体形成期から１〜２日間ＢＭＰ−５を添加する、上記〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕胚様体形成期からＢＭＰ−５を０．２〜１．０ｎｇ／ｍｌの濃度で培地に添加する、上記〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕上記〔１〕〜〔１２〕の何れかに記載の方法によって製造された心筋細胞を含有してなる、心疾患の治療剤。
〔１４〕胚性癌種細胞系における心筋分化誘導開始から１０日以内に発現量が一時的に上昇する物質を含む、心筋細胞の分化誘導剤。
〔１５〕上記物質がＢＭＰ−５またはＢＭＰ−５をコードする遺伝子である、上記〔１４〕に記載の分化誘導剤。
〔１６〕上記物質がｓＦＲＰ−５またはｓＦＲＰ−５をコードする遺伝子である、上記〔１４〕に記載の分化誘導剤。
〔１７〕ＢＭＰ−５、ｓＦＲＰ−５のうちの少なくとも何れかの発現または機能を抑制する物質を含む、心筋細胞への分化阻害剤。
〔１８〕発現または機能を抑制する物質が、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ誘導性核酸、ターゲティングベクター、及び抗体からなる群より選ばれる、上記〔１７〕に記載の分化阻害剤。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の心筋細胞の製造方法によれば、従来の分化誘導方法と比較して高率かつ選択的に心筋細胞を得ることができるという効果が得られる。なお、ここで、「高率」とは、心筋細胞に高い効率で分化することを意味し、「選択的」とは、心筋細胞以外の細胞にはなりにくいことを意味する。また本発明により得られる心筋細胞は、心疾患患者への細胞移植用に利用されるとともに、心疾患の治療剤として有用である。さらに、本発明の分化誘導剤によれば、高率かつ選択的に心筋細胞への分化を誘導することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の内容を詳細に説明する。
【００１６】
（１）心筋細胞の製造方法
本発明の心筋細胞の製造方法は、幹細胞から心筋細胞を分化誘導することにより心筋細胞を製造する方法であって、胚性癌種細胞系における心筋分化誘導開始から１０日以内に発現量が一時的に上昇する物質の作用下で幹細胞の培養を行うことを特徴とするものである。つまり、当該物質は、初期心筋分化に必須の因子であり、分化誘導開始から７日頃に発現し始めるＧＡＴＡ−４よりも早い時期、または、ＧＡＴＡ−４の発現量のピークと同時期に一時的に上昇するものである。なお、上記物質は、分化誘導開始から５〜７日目の間に一時的に発現量が上昇するものであることが好ましい。またあるいは、上記物質は、分化誘導開始から７〜１０日目の間に一時的に発現量が上昇するものであってもよい。
【００１７】
本明細書において、心筋細胞とは、将来、機能的な心筋細胞となり得る能力を有した心筋前駆細胞や、胎児型心筋細胞、成体型心筋細胞のすべての分化段階の細胞を含み、以下に記載する少なくとも一つ、好ましくは複数の方法により、少なくとも一つ、好ましくは複数のマーカーや基準が確認できる細胞と定義する。
【００１８】
心筋細胞に特異的な種々のマーカーの発現は、従来の生化学的又は免疫化学的手法により検出される。その方法は特に限定されないが、好ましくは、免疫化学的染色法や免疫電気泳動法などの免疫化学的手法が使用される。これらの方法では、心筋前駆細胞又は心筋細胞に結合するマーカー特異的ポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体を使用することができる。個々の特異的マーカーを標的とする抗体は市販されており、容易に入手することが可能である。心筋前駆細胞又は心筋細胞に特異的なマーカーとしては、例えば、ミオシン重鎖／軽鎖、α−ａｃｔｉｎ、トロポニンＩ、ＡＮＰ、ＧＡＴＡ−４、Ｎｋｘ２．５、ＭＥＦ−２ｃ等が挙げられる。
【００１９】
あるいは、心筋前駆細胞又は心筋細胞特異的マーカーの発現は、特にその手法は問わないが、逆転写酵素介在性ポリメーラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）やハイブリダイゼーション分析といった、任意のマーカータンパク質をコードするｍＲＮＡを増幅、検出、解析するための従来から頻用される分子生物学的手法により確認できる。心筋前駆細胞又は心筋細胞に特異的なマーカー（例えば、ミオシン重鎖／軽鎖、α−ａｃｔｉｎ、トロポニンＩ、ＡＮＰ、ＧＡＴＡ−４、Ｎｋｘ２．５、ＭＥＦ−２ｃ）タンパク質をコードする核酸配列は既知であり、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）のような公共データベースにおいて利用可能であり、プライマー又はプローブとして使用するために必要とされるマーカー特異的配列を容易に決定することができる。
【００２０】
さらに、幹細胞の心筋細胞への分化を確認するために、生理学的基準も追加的に使用される。すなわち、幹細胞由来の細胞が、自律拍動性を有することや、各種イオンチャネルを発現しており電気生理的刺激に反応し得ることなども、その有効な指標となる。
【００２１】
本発明の心筋細胞の製造に用いられる幹細胞としては、少なくとも試験管内培養下で心筋細胞様形質を有する細胞に分化し得る性質を有した未分化細胞であればよい。この幹細胞としては、適当な条件下において三胚葉（外胚葉、中胚葉、および内胚葉）全ての系譜の細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞が好ましい。
【００２２】
多能性幹細胞としては、既に培養細胞として広く使用されているマウス、サル、ヒト等の哺乳動物由来の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、成人型多能性幹細胞（ＭＡＰＣ）等を挙げることができる。マウス由来ＥＳ細胞の具体例としては、ＥＢ３細胞、Ｅ１４細胞、Ｄ３細胞、ＣＣＥ細胞、Ｒ１細胞、１２９ＳＶ細胞、Ｊ１細胞等が挙げられる。また、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞、ＭＡＰＣなどの作製、継代、保存については、従来公知の方法を用いて実施することができる。
【００２３】
なお、本発明の製造方法に使用される幹細胞は、少なくとも試験管内培養下で心筋細胞様形質を有する細胞に分化し得る性質を有した細胞であればよいため、必ずしも上記のような胚性幹細胞に限定されない。胚性幹細胞以外に使用可能な幹細胞としては、胎児、臍帯血、成体臓器や骨髄などの成体組織、および、血液などに由来するあらゆる体性幹細胞が挙げられる。さらに、上記幹細胞は、胚性癌種細胞（ＥＣ細胞）であってもよい。ＥＣ細胞とは、腫瘍中に含まれる胚様細胞（テラトカルシノーマ）のことを意味する。ＥＣ細胞は癌細胞ではあるが、未分化で分化全能性を有する胚細胞に類似した性質を有する。ＥＣ細胞の具体例としては、マウス由来のＰ１９．ＣＬ６（文献：再生医療、日本再生医療学会雑誌  Ｖｏｌ．４  Ｎｏ．３、メディカルレビュー社、２００５年、６１−６８頁参照）が挙げられる。本発明の心筋細胞の製造方法にＰ１９．ＣＬ６を用いれば、心筋細胞をより高率に生産することができる。
【００２４】
また、本発明の心筋細胞の製造に用いられる幹細胞は、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）、霊長類（例えば、サル、ヒト）等の哺乳動物由来であることが好ましい。そして、本発明の製造方法によって得られた心筋細胞を心臓への細胞移植に用いる場合には、該心臓が由来する動物種と同種の動物由来の幹細胞を用いることが好ましい。
【００２５】
本発明において、胚性癌種細胞（ＥＣ細胞）とは、腫瘍中に含まれる胚様細胞（テラトカルシノーマ）であって、癌細胞ではあるが、未分化で分化全能性を有するもののことをいう。ＥＣ細胞の具体例としては、上述したマウス由来のＰ１９．ＣＬ６などが挙げられる。
【００２６】
本発明の心筋細胞の製造方法に用いる物質は、このＥＣ細胞において、例えばＤＭＳＯを添加するなどして心筋細胞への分化を誘導した場合に、誘導開始から１０日以内にその発現量が一時的に上昇するものである。ここで、「一時的」とは、誘導開始から一旦その発現量が上昇した後低下することを意味する。
【００２７】
また、本発明の製造方法において、「胚性癌種細胞系における心筋分化誘導開始から１０日以内に発現量が一時的に上昇する物質の作用下で幹細胞の培養を行う」とは、幹細胞に対して一時的に上記物質を作用させた状態で培養することを意味する。
【００２８】
本発明の製造方法において用いられる上記の物質は、ＢＭＰ−５またはＢＭＰ−５をコードする遺伝子、あるいは、ｓＦＲＰ−５またはｓＦＲＰ−５をコードする遺伝子であることが好ましい。ＢＭＰ−５は、骨形成因子（ＢＭＰ）ファミリーに含まれる分子の一つであり、中胚葉形成・軟骨形成・肢芽形成に関わることが知られている。また、ｓＦＲＰ−５は、Ｗｎｔシグナルの分泌性阻害因子の一つであり、網膜の光受容細胞の極性を決定することが知られている。なお、本明細書において、単に「ＢＭＰ−５」、「ｓＦＲＰ−５」と記載するときはＢＭＰ−タンパク質、ｓＦＲＰ−５タンパク質をそれぞれ意味するものとする。また、本明細書において、「ＢＭＰ−５（をコードする）遺伝子」、「ｓＦＲＰ−５（をコードする）遺伝子」と記載するときは、ＢＭＰ−５タンパク質をコードする遺伝子、ｓＦＲＰ−５タンパク質をコードする遺伝子をそれぞれ意味するものとする。
【００２９】
本発明において幹細胞に作用させる上記の物質がＢＭＰ−５またはｓＦＲＰ−５である場合、ＢＭＰ−５またはｓＦＲＰ−５の作用下での幹細胞の培養は、結果的に、ＢＭＰ−５またはｓＦＲＰ−５を含む培地中で幹細胞又は幹細胞から派生した細胞（例えば、ＥＢなど）を培養することとなる限り特に限定されない。従って、培養開始時に、ＢＭＰ−５またはｓＦＲＰ−５が培地中に存在していなくとも構わない。
【００３０】
一方、本発明において幹細胞に作用させる上記の物質がＢＭＰ−５遺伝子またはｓＦＲＰ−５遺伝子である場合、ＢＭＰ−５遺伝子またはｓＦＲＰ−５遺伝子の作用下での幹細胞の培養は、幹細胞又は幹細胞から派生した細胞（例えば、ＥＢなど）に当該遺伝子を発現可能な状態で導入して培養するものであれば、培養のどの段階で遺伝子を導入するかは特に限定されない。このような培養法として具体的には、ＢＭＰ−５遺伝子発現ベクターまたはｓＦＲＰ−５遺伝子発現ベクターを導入した幹細胞の培養、ＢＭＰ−５発現細胞またはｓＦＲＰ−５発現細胞と幹細胞との共培養などが挙げられる。
【００３１】
培地にＢＭＰ−５またはｓＦＲＰ−５を添加する方法としては、特に限定されないが、生体組織から抽出、精製したＢＭＰ−５またはｓＦＲＰ−５を培地に添加する方法が挙げられる。なお、ＢＭＰ−５またはｓＦＲＰ−５は生体組織から抽出、精製したものだけでなく、合成により得られたもの、遺伝子組み換え技術により作製されたもの、市販されているものなども使用可能である。なお、ＢＭＰ−５は、例えばＲ＆Ｄ  Ｉｎｃ．より入手可能である。
【００３２】
本発明の製造方法において使用されるＢＭＰ−５又はｓＦＲＰ−５は、分化誘導を行う幹細胞が由来する種と同種の動物由来のものが好ましい。例えば、幹細胞としてマウス由来のＥＳ細胞又はＥＣ細胞を使用して分化誘導を行う場合には、マウス由来のＢＭＰ−５又はｓＦＲＰ−５の作用下で培養を行うことが好ましい。
【００３３】
マウス由来のＢＭＰ−５として具体的には、ＮＣＢＩデータベースにアクセッション番号ＮＰ＿０３１５８１として登録されているアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。マウス由来のｓＦＲＰ−５として具体的には、ＮＣＢＩデータベースにアクセッション番号ＮＰ＿０６１２５０として登録されているアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。また、ヒト由来のＢＭＰ−５として具体的には、ＮＣＢＩデータベースにアクセッション番号ＮＰ＿０６６５５１として登録されているアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。さらに、ヒト由来のｓＦＲＰ−５として具体的には、ＮＣＢＩデータベースにアクセッション番号ＮＰ＿００３００６として登録されているアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。
【００３４】
また、上記ＢＭＰ−５には、上記したタンパク質のアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列で表わされるタンパク質であり、かつ、心筋細胞への分化誘導を促進させるＢＭＰ−５関連タンパク質も含まれるものとする。
【００３５】
また、上記ｓＦＲＰ−５には、上記したタンパク質のアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列で表わされるタンパク質であり、かつ、心筋細胞への分化誘導を促進させるｓＦＲＰ−５関連タンパク質も含まれるものとする。
【００３６】
また、本発明の製造方法に使用される物質が、ＢＭＰ−５をコードする遺伝子またはｓＦＲＰ−５をコードする遺伝子である場合、これらの遺伝子は、いかなる方法で得られるものであってもよい。例えば、ｍＲＮＡから調製される相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノミックライブラリーから調製されるゲノミックＤＮＡ、化学的に合成されるＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により増幅させて得られるＤＮＡ及びこれらの方法を適当に組み合わせて構築されるＤＮＡ等が含まれる。
【００３７】
本発明の製造方法に使用されるこれらの遺伝子は、分化誘導を行う幹細胞が由来する種と同種の動物由来のものが好ましい。例えば、幹細胞としてマウス由来のＥＳ細胞又はＥＣ細胞を使用して分化誘導を行う場合には、マウス由来のＢＭＰ−５又はｓＦＲＰ−５をコードする遺伝子を用いることが好ましい。
【００３８】
マウス由来のＢＭＰ−５をコードする遺伝子として具体的には、ＮＣＢＩデータベースにアクセッション番号ＮＭ＿００７５５５として登録されている塩基配列から実質的になるＤＮＡを挙げることができる。マウス由来のｓＦＲＰ−５をコードする遺伝子として具体的には、ＮＣＢＩデータベースにアクセッション番号ＮＭ＿０１８７８０として登録されている塩基配列から実質的になるＤＮＡを挙げることができる。また、ヒト由来のＢＭＰ−５をコードする遺伝子として具体的には、ＮＣＢＩデータベースにアクセッション番号ＮＭ＿０２１０７３として登録されている塩基配列から実質的になるＤＮＡを挙げることができる。さらに、ヒト由来のｓＦＲＰ−５をコードする遺伝子として具体的には、ＮＣＢＩデータベースにアクセッション番号ＮＭ＿００３０１５として登録されている塩基配列から実質的になるＤＮＡを挙げることができる。
【００３９】
ここで、「実質的になるＤＮＡ」とは、上記特定の塩基配列からなるＤＮＡに加えて、ストリンジェントな条件（本発明では、塩基配列において約６０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上の相同性を有するＤＮＡがハイブリダイズし得る条件をいい、ストリンジェンシーはハイブリダイズ反応や洗浄の際の温度、塩濃度等を適宜変化させることにより調節することができる）において、上記の特定塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズし得る塩基配列からなるＤＮＡを意味する。
【００４０】
本発明の製造方法に使用する物質が遺伝子である場合、該遺伝子は発現可能な状態で幹細胞に導入されることが好ましい。すなわち、上記遺伝子は、適当な発現ベクターに組み込まれた状態で幹細胞に導入されることが好ましい。当該発現ベクターは、分化誘導対象となる例えば哺乳動物由来の幹細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されていなければならない。使用されるプロモーターは、幹細胞で機能し得るものであれば特に制限されず、例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター、並びにβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーターなどが挙げられる。これらのうち、ＰＧＫ遺伝子プロモーターを使用することが好ましい。
【００４１】
発現ベクターとしては、プラスミドまたはウイルスベクターが使用可能であるが、ヒト等の哺乳動物由来の幹細胞に使用する場合に好適なベクターとしては、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。
【００４２】
上記の遺伝子が組み込まれた発現ベクターを用いて幹細胞から心筋細胞への分化誘導を行う場合、当該発現ベクターは、自体公知の方法、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション法、リポソーム、陽イオン性脂質等の脂質を使用する方法を用いて幹細胞へ導入すればよい。また、これ以外の方法として、上記遺伝子発現ベクターをフィーダー細胞へ導入し、その導入細胞を共培養細胞として用いる方法、または、その導入細胞の培養上清などの細胞生産物を用いる方法なども利用できる。
【００４３】
後述の実施例に示すように、ＢＭＰ−５またはｓＦＲＰ−５をコードする遺伝子が組み込まれた発現ベクターをＥＣ細胞などの幹細胞へ導入すれば、該ＥＣ細胞を心筋細胞へ効率的に分化誘導することができる。特に、ＢＭＰ−５を導入したＥＣ細胞（Ｐ１９．ＣＬ６）は、ＤＭＳＯ非添加で心筋マーカー（α−ＭＨＣ）の発現が活性化される。
【００４４】
本発明において、幹細胞から心筋細胞を製造するために行う細胞の培養法としては、心筋細胞の分化誘導に適した方法であれば、特に限定されることなく利用することができる。具体的な培養法としては、例えば幹細胞としてＥＳ細胞又はＥＣ細胞を用いる場合、胚様体（ＥＢ）形成法（平面培養法、浮遊凝集培養法、懸濁（ｈａｎｇｉｎｇ  ｄｒｏｐ）培養法など）、フィーダー細胞との共培養法、旋回培養法、軟寒天培養法、マイクロキャリア培養法などを挙げることができる。また、本発明の心筋細胞の製造方法では、これらの培養法を順次組み合わせ、工程ごとに異なる培養法を採用してもよい。
【００４５】
胚様体形成法とは、培養プレートから剥離したＥＳ細胞を含む細胞液を培養皿にスポットし、この細胞滴が下になるように上蓋の向きを返して培養する方法のことをいう。
より具体的には、胚様体形成法は、ＥＳ細胞を培養プレートから０．２５%トリプシン−ＥＤＴＡを用いて剥離し、α−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳを含む）に懸濁をした後、３×１０４細胞／ｍｌの細胞濃度に調製し、この調製した細胞液を１５μｌずつ培養皿の上蓋にスポットし（６０〜７０個）、懸濁した細胞滴が下になるように上蓋の向きを返して、培養プレートの下皿に載せて３７℃、５％二酸化炭素通気下で１〜２日培養することによって行うことができる。
【００４６】
幹細胞の培養に用いられる培地は、幹細胞の分化に適切である限り特に限定されず適宜選択されるが、例えば、最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、Ｆ１２培地またはＲＰＭＩ１６４０培地、あるいはそれらの混合培地を基本培地として含むものなどである。ＢＭＰ−５またはｓＦＲＰ−５以外の培地への添加剤としては、例えば、各種アミノ酸、各種無機塩、各種ビタミン、各種抗生物質、緩衝剤などが挙げられる。培養条件もまた適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０℃〜約４０℃である。培地は、血清を含んでも含まなくてもよいが、未同定成分の混入の防止、感染リスクの軽減などの観点から、無血清培地が好ましい。
【００４７】
以下に、本発明の製造方法において、培地にＢＭＰ−５を添加して幹細胞の培養を行う方法について具体的に説明する。本発明では、幹細胞を一時的にＢＭＰ−５の作用下で培養すればよく、少なくとも培養のある一定の段階においてＢＭＰ−５を含む培地中で幹細胞の培養を行えばよい。
【００４８】
本発明の実施において、幹細胞の培養を行う場合、２つの段階に大きく分けることができる。すなわち、胚様体（ＥＢ）を形成する前と後である。以下、その前段階（すなわち、胚様体が形成されるまでの間）を前処理期、後段階を分化誘導期と呼ぶ。また、分化誘導期のうち、特にその初期の段階でＥＢが形成される段階をＥＢ形成期と呼ぶ。
【００４９】
この前処理期においては、幹細胞を未分化状態に維持するために、該幹細胞の動物種に応じて通常用いられる条件下で培養することが好ましい。例えば、幹細胞がマウス由来のＥＳ細胞の場合には、培地中に１００〜１００００Ｕ／ｍｌ、好ましくは５００〜２０００Ｕ／ｍｌ濃度の白血病抑制因子（ＬＩＦ）を添加することが好ましい。前処理期の培地中にＬＩＦが含まれる場合には、前処理期からＥＢ形成期への移行は、培地中に含まれるＬＩＦを除去することによって行うことができる。前処理期の期間としては、特に限定はされないが、１〜５日間程度であればよく、３日間が好ましい。
【００５０】
前処理期において、ＢＭＰ−５は培地に添加しないことが好ましい。これによって、後述の実施例にも示されるように、より効率よく心筋細胞を製造することができる。
【００５１】
前処理期の後、培地からＬＩＦを除去することで分化誘導を開始することができる。分化誘導を開始する際の培地（分化培地）としては、１０％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ（製造元：インビトロジェン株式会社  Ｂａｓｅ  Ｃａｔ．  Ｎｏ．：１２５７１）等を用いることが好ましい。このような培地に、幹細胞を播種することによって分化誘導が始まり、ＥＢが形成される。
【００５２】
分化誘導開始から１〜２日経過してＥＢが形成された後（つまり、ＥＢ形成期の後）、該ＥＢは培養プレート（培養容器）上に調製された平面培地上に播種し、平面培養されることが好ましい。これによれば、ＥＢにより形成された三胚葉（外・中・内胚葉）の中胚葉から心筋前駆細胞が形成されるという効果が得られる。なお、ＥＢ形成時の懸濁液中の細胞密度は、３００細胞／滴以上であることが好ましく、４５０細胞／滴程度であることがより好ましい。また、この平面培養では、培養プレートに播種後５〜２０日間、好ましくは７〜１５日間、３７℃で５％の二酸化炭素を通気した条件下で培養する。
【００５３】
また、分化誘導期においては、ＥＢ形成期から１〜２日間ＢＭＰ−５を添加することが好ましく、ＥＢ形成期から１日間ＢＭＰ−５を添加することがより好ましい。さらに、ＢＭＰ−５は、培地に対して０．２〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加することが好ましく、０．２〜１．０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加することがより好ましい。
【００５４】
上記のような製造方法でＥＳ細胞の培養を行なえば、分化誘導開始から約１０日経過後において、培養されたＥＢのうち自律拍動性を有する心筋細胞を９０％以上の高い割合で得ることができる。
【００５５】
なお、本発明の心筋細胞の製造方法は、上記したような胚様体形成後に平面培養を行う方法に限定されることなく、他の培養方法でも実施することができる。他の培養方法としては、浮遊凝集培養法、フィーダー細胞との共培養法などを挙げることができる。但し、共培養法では、ＥＳ細胞以外の細胞（例えば、フィーダー細胞、線維芽細胞）は心筋細胞には分化せず、結果として最終分化した心筋細胞の純度を下げることになること、および、フィーダー細胞を適切な条件下に維持するために一定の技術を要することなどから、平面培養を採用することが好ましい。平面培養を採用することによって、作成した各胚様体の自律拍動頻度を定量しやすいという効果、および、発現する心筋マーカーの遺伝子発現量やタンパク量を個々に定量化できるという効果も得られる。
【００５６】
浮遊凝集培養法の場合、単一細胞状態（酵素消化等を施すことで細胞同士の接着がない個々の細胞が液相中で分散した状態）とした幹細胞を、好ましくは、培地に２．０×１０４細胞／ｍｌ〜１．６×１０５細胞／ｍｌ、より好ましくは４．０×１０４〜１．０×１０５細胞／ｍｌの細胞密度になるように懸濁し、培養プレートに播種後、５〜１５日間、好ましくは８〜１２日間、３７℃で５％の二酸化炭素を通気した条件下で培養する方法を挙げることができる。この場合のＢＭＰ−５の添加濃度および添加期間も、平面培養する場合に好ましい添加濃度および添加期間を採用することが好ましい。
【００５７】
また、フィーダー細胞との共培養法を用いる場合、フィーダー細胞としては、特に限定はされないが、好ましくは間葉系細胞の性質を有した細胞、さらに好ましくはＳＴ２細胞、ＯＰ９細胞、ＰＡ６細胞などの骨髄ストローマ細胞様の形質を有する細胞が挙げられる。これらのフィーダー細胞を高密度培養後、マイトマイシンＣ処理、または放射線照射などの方法により、フィーダー化し、その上に１細胞／ｍｌ〜１×１０６細胞／ｍｌ、好ましくは１００細胞／ｍｌ〜１×１０５細胞／ｍｌ、より好ましくは１×１０３細胞／ｍｌ〜１×１０４細胞／ｍｌの細胞密度になるように培地中に懸濁した単一細胞状態の幹細胞を播種後、４〜３０日間、好ましくは６〜１５日間、３７℃で５％の二酸化炭素を通気した条件下にて培養することができる。この場合のＢＭＰ−５の添加濃度および添加期間も、平面培養する場合に好ましい添加濃度および添加期間を採用することが好ましい。
【００５８】
上述したような本発明の心筋細胞の製造方法によれば、従来の分化誘導方法と比較して高率かつ選択的に心筋細胞を得ることができるという効果が得られる。そのため、本発明にかかる方法によって得られた心筋細胞は、心疾患患者に対する移植用細胞として有用であり、心不全、心筋梗塞などの心疾患の治療に有効である。
【００５９】
（２）本発明の分化誘導方法によって得られる心筋細胞
本発明の心筋細胞は、上述の本発明の製造方法によって製造されたものである。ここで、心筋細胞には、将来機能的な心筋細胞となり得る能力を有した心筋前駆細胞や、胎児型心筋細胞、成体型心筋細胞のすべての分化段階の細胞を含むものとする。そして、上述した少なくとも一つ、好ましくは複数の方法により、少なくとも一つ、好ましくは複数のマーカーや基準が確認できる細胞を心筋細胞と定義する。
【００６０】
さらに、幹細胞の心筋細胞への分化を確認するために、生理学的基準も追加的に使用される。すなわち、幹細胞由来の細胞が、自律拍動性を有することや、各種イオンチャネルを発現しており電気生理的刺激に反応し得ることなども、その有効な指標となる。なお、本発明の製造方法によれば、培養されたＥＢのうち自律拍動性を有する心筋細胞を５０％以上の高い割合で得ることができる。
【００６１】
また、本発明の方法によって製造された心筋細胞は、高率かつ選択的に製造されたものであるため、下記（３）に示すように心疾患の治療薬等として有効利用することができる。
【００６２】
（３）本発明の心筋細胞の用途
続いて、本発明にかかる方法によって製造された心筋細胞の用途について説明する。本発明の方法によって製造された心筋細胞は、心疾患状態にある心臓を治療するために利用することができる。ここで、心疾患としては、心筋梗塞、虚血性心疾患、うっ血性心不全、肥大型心筋症、拡張型心筋症、心筋炎、慢性心不全などが挙げられる。
【００６３】
本発明の心筋細胞を心疾患の治療に用いる場合、その投与方法としては、開胸し注射器を用いて直接心臓に注入する方法、心臓の一部を外科的に切開して移植する方法、さらにはカテーテルを用いて経血管的に移植する方法などが挙げられるが、特にこれに限定されることはない。本発明の心筋細胞を、疾患を有する心臓組織に補充的に注入又は移植することによって、心機能の改善を促すことができる。
【００６４】
また、本発明の方法によって製造された心筋細胞は、心疾患状態にある心臓への細胞移植にも用いることができる。この場合の移植方法としては、上記したような心臓の一部を外科的に切開して移植する方法、さらにはカテーテルを用いて経血管的に移植する方法、心電位をマッピングしながら心腔内から移植する方法などを採用することができる。
【００６５】
また、本発明は、本発明の心筋細胞を有効成分として含有する心疾患の治療剤についても提供する。ここで、心疾患の治療剤の範疇には、機能の損なわれた心筋の再生剤をも含むものとする。本発明の心疾患の治療剤は、本発明の方法によって得られた心筋細胞を高純度（好ましくは、８０〜１００％）に含有するものであれば、その形状は特に限定されないが、細胞を培地などの水性担体に浮遊させたもの、細胞を生体分解性基質などの支持体に包埋したもの、あるいは単層又は多層の心筋細胞シート（Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９０：ｅ４０，２００２）に加工したものなど、あらゆる形状のものを採用することができる。
【００６６】
（４）分化誘導剤
本発明の分化誘導剤は、胚性癌種細胞系における心筋分化誘導開始から１０日以内に発現量が一時的に上昇する物質を含み、心筋細胞への分化誘導を促進させるものである。胚性癌種細胞（ＥＣ細胞）とは、腫瘍中に含まれる胚様細胞（テラトカルシノーマ）であって、癌細胞ではあるが、未分化で分化全能性を有するもののことをいう。ＥＣ細胞の具体例としては、上述したマウス由来のＰ１９．ＣＬ６、Ｐ１９．ＣＬ６などが挙げられる。
【００６７】
本発明の分化誘導剤に含まれる物質は、このＥＣ細胞において、例えばＤＭＳＯを添加するなどして心筋細胞への分化を誘導した場合に、誘導開始から１０日以内にその発現量が一時的に上昇するものである。つまり、当該物質は、初期心筋分化に必須の因子であり、分化誘導開始から７日頃に発現し始めるＧＡＴＡ−４よりも早い時期、または、ＧＡＴＡ−４の発現量のピークと同時期に一時的に上昇するものである。なお、上記物質は、分化誘導開始から５〜７日目の間に一時的に発現量が上昇するものであることが好ましい。またあるいは、上記物質は、分化誘導開始から７〜１０日目の間に一時的に発現量が上昇するものであってもよい。ここで、「一時的」とは、誘導開始から一旦その発現量が上昇した後低下することを意味する。
【００６８】
本発明の分化誘導剤に含まれる物質は、ＢＭＰ−５またはＢＭＰ−５をコードする遺伝子、あるいは、ｓＦＲＰ−５またはｓＦＲＰ−５をコードする遺伝子であることが好ましい。
【００６９】
本発明の分化誘導剤に含まれるＢＭＰ−５又はｓＦＲＰ−５は、分化誘導を行う幹細胞が由来する種と同種の動物由来のものが好ましい。例えば、幹細胞としてマウス由来のＥＳ細胞又はＥＣ細胞を使用して分化誘導を行う場合には、マウス由来のＢＭＰ−５又はｓＦＲＰ−５を含む分化誘導剤を用いることが好ましい。
【００７０】
マウス由来のＢＭＰ−５、マウス由来のｓＦＲＰ−５、ヒト由来のＢＭＰ−５、ヒト由来のｓＦＲＰ−５として具体的には、上述の「（１）心筋細胞の製造方法」において説明したものをそれぞれ挙げることができる。
【００７１】
また、上記ＢＭＰ−５には、上記したタンパク質のアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列で表わされるタンパク質であり、かつ、心筋細胞への分化誘導を促進させるＢＭＰ−５関連タンパク質も含まれるものとする。
【００７２】
また、上記ｓＦＲＰ−５には、上記したタンパク質のアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列で表わされるタンパク質であり、かつ、心筋細胞への分化誘導を促進させるｓＦＲＰ−５関連タンパク質も含まれるものとする。
【００７３】
ＢＭＰ−５およびｓＦＲＰ−５は、自体公知の方法により調製することができる。
【００７４】
また、本発明の分化誘導剤に含まれる物質は、ＢＭＰ−５をコードする遺伝子またはｓＦＲＰ−５をコードする遺伝子であってもよい。これらの遺伝子は、いかなる方法で得られるものであってもよい。
【００７５】
本発明の分化誘導剤に含まれるこれらの遺伝子は、分化誘導を行う幹細胞が由来する種と同種の動物由来のものが好ましい。例えば、幹細胞としてマウス由来のＥＳ細胞又はＥＣ細胞を使用して分化誘導を行う場合には、マウス由来のＢＭＰ−５又はｓＦＲＰ−５をコードする遺伝子を含む分化誘導剤を用いることが好ましい。
【００７６】
マウス由来のＢＭＰ−５をコードする遺伝子、マウス由来のｓＦＲＰ−５をコードする遺伝子、ヒト由来のＢＭＰ−５をコードする遺伝子、ヒト由来のｓＦＲＰ−５をコードする遺伝子として具体的には、上述の「（１）心筋細胞の製造方法」において説明したものをそれぞれ挙げることができる。
【００７７】
ここで、「実質的になるＤＮＡ」とは、上記特定の塩基配列からなるＤＮＡに加えて、ストリンジェントな条件において、上記の特定塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズし得る塩基配列からなるＤＮＡを意味する。
【００７８】
本発明の分化誘導剤に含まれる物質が遺伝子である場合、該遺伝子は発現可能な状態で剤中に含まれることが好ましい。すなわち、上記遺伝子は、適当な発現ベクターに組み込まれた状態で分化誘導剤に含まれることが好ましい。当該発現ベクターは、分化誘導対象となる例えば哺乳動物由来の幹細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されていなければならない。使用されるプロモーターは、幹細胞で機能し得るものであれば特に制限されず、例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター、並びにβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーターなどが挙げられる。
【００７９】
発現ベクターとしては、プラスミドまたはウイルスベクターが使用可能であるが、ヒト等の哺乳動物由来の幹細胞に使用する場合に好適なベクターとしては、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。
【００８０】
なお、本発明の分化誘導剤には、ＢＭＰ−５、ｓＦＲＰ−５、またはこれらの何れかのタンパク質をコードする遺伝子の他に、心筋細胞への分化を促進する他の因子、あるいは、任意の担体が含まれていてもよい。この他の因子としては、心筋細胞への分化促進因子として従来から知られている、Ｎｏｇｇｉｎ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４などが挙げられる。また、ＢＭＰ−５、ｓＦＲＰ−５、及びこれらの何れかのタンパク質をコードする遺伝子を適宜組み合わせて分化誘導剤に含有してもよい。
【００８１】
なお、分化誘導剤が他の因子および担体を含む場合には、当該剤の有効成分である上述の物質の含有量は、心筋細胞への分化誘導促進機能を発揮できる量であれば特に限定はされない。例えば、当該物質がＢＭＰ−５である場合には、培地へ添加した際の濃度が０．２〜５０ｎｇ／ｍｌとなることが好ましく、０．２〜１．０ｎｇ／ｍｌとなることがより好ましい。
【００８２】
本発明の分化誘導剤を用いて幹細胞から心筋細胞への分化誘導を行う方法については、上述の「（１）心筋細胞の製造方法」において説明した方法を適用することができる。具体的には、本発明の分化誘導剤を添加した培地における幹細胞の培養、本発明の分化誘導剤を導入した幹細胞の培養、本発明の分化誘導剤を作用させたフィーダー細胞と幹細胞との共培養などによって、幹細胞から心筋細胞への分化誘導を行うことができる。
【００８３】
本発明の分化誘導剤を用いて幹細胞の培養を行えば、従来の分化誘導促進物質を添加した場合と比較して、より高い割合で拍動性を有する心筋細胞を得ることができる。つまり、本発明の分化誘導剤によれば、高率かつ選択的に心筋細胞への分化を誘導することができる。
【００８４】
（５）心筋細胞への分化阻害剤
本発明の心筋細胞への分化阻害剤は、ＢＭＰ−５、ｓＦＲＰ−５のうちの少なくとも何れかの発現または機能を抑制する物質（以下、該物質を抑制物質と呼ぶ）を含むものである。
【００８５】
抑制物質は、ＢＭＰ−５またはｓＦＲＰ−５の発現を抑制する物質（以下、該物質を発現抑制物質と呼ぶ）であり得る。発現抑制物質は、ＢＭＰ−５またはｓＦＲＰ−５の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾、局在化及び蛋白質フォールディング等の、いかなる段階で作用するものであってもよい。
【００８６】
発現抑制物質の例は、ＢＭＰ−５またはｓＦＲＰ−５をコードする遺伝子の転写産物、詳細にはｍＲＮＡもしくは初期転写産物に対するアンチセンス核酸である。アンチセンス核酸とは、標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）を発現する細胞の生理的条件下で該標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）とハイブリダイズし得る塩基配列からなり、且つハイブリダイズした状態で該標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）にコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得る核酸をいう。アンチセンス核酸の種類はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。さらに、アンチセンス核酸は、ＢＭＰ−５またはｓＦＲＰ−５をコードする遺伝子の転写産物とハイブリダイズして翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡと結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ｍＲＮＡへの転写を阻害し得るものであってもよい。
【００８７】
発現抑制物質のさらに別の例は、ＲＮＡｉ誘導性核酸である。ＲＮＡｉ誘導性核酸とは、細胞内に導入されることにより、ＲＮＡｉ効果を誘導し得る核酸をいい、好ましくはＲＮＡである。ＲＮＡｉ効果とは、ｍＲＮＡと同一のヌクレオチド配列（又はその部分配列）を含む２本鎖構造のＲＮＡが、当該ｍＲＮＡの発現を抑制する現象をいう。ＲＮＡｉ効果を得るには、例えば、少なくとも２０以上の連続する標的ｍＲＮＡと同一のヌクレオチド配列（又はその部分配列）を有する２本鎖構造のＲＮＡを用いることが好ましい。２本鎖構造は、異なるストランドで構成されていてもよいし、一つのＲＮＡのステムループ構造によって与えられる２本鎖であってもよい。ＲＮＡｉ誘導性核酸としては、たとえばｓｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどが挙げられる。
【００８８】
発現抑制物質の他の例は、ターゲティングベクターである。本発明で用いられるターゲティングベクターは、ＢＭＰ−５またはｓＦＲＰ−５をコードする遺伝子の相同組換えを誘導し得るＢＭＰ−５またはｓＦＲＰ−５をコードする遺伝子に相同な第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチド、並びに選択マーカーを含む。第一及び第二のポリヌクレオチドは、ＢＭＰ−５またはｓＦＲＰ−５をコードする遺伝子を含むゲノムＤＮＡに対して、相同組換えを生じるのに十分な程度の配列同一性および長さを有するポリヌクレオチドである。第一及び第二のポリヌクレオチドは、ＢＭＰ−５またはｓＦＲＰ−５をコードする遺伝子を含むゲノムＤＮＡにおいて、第一及び第二のポリヌクレオチドに対して相同な２つの領域の間に存在するゲノムＤＮＡ部分領域が欠失すると、当該遺伝子の機能的欠損がもたらされるように選択される。選択マーカーとしては、ポジティブ選択マーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）、ネガティブ選択マーカー（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子）などが挙げられる。ターゲティングベクターは、ポジティブ選択マーカー、ネガティブ選択マーカーのいずれか一方、又は両方を含むことができる。
【００８９】
抑制物質の他の例としては、ＢＭＰ−５またはｓＦＲＰ−５の機能を抑制する物質が挙げられる。ＢＭＰ−５またはｓＦＲＰ−５の機能を抑制する物質としては、ＢＭＰ−５またはｓＦＲＰ−５の作用を妨げ得る物質である限り特に限定されないが、ＢＭＰ−５またはｓＦＲＰ−５に対する抗体、ＢＭＰ−５またはｓＦＲＰ−５のドミナントネガティブ変異体、これらをコードする核酸を含む発現ベクターが例示される。
【００９０】
本発明の分化阻害剤は、上記の抑制物質に加え、任意の担体、例えば試薬上許容され得る担体を含むことができる。本発明の分化阻害剤は、幹細胞から心筋細胞への分化を阻害するため、心筋細胞への分化のメカニズムを解明するための研究用試薬等として利用することができる。
【実施例】
【００９１】
以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００９２】
〔実施例１−１〕
Ｐ１９．ＣＬ６細胞をα−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳを含む）培地で１０ｃｍプレートにて付着培養を行い、剥離（０．０５％  Ｔｒｙｐｓｉｎｅ−１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３分間）・播種（４０倍希釈）を繰り返し継代培養した。３回目の継代培養後、細胞を剥離し、１×１０４細胞／ｍｌ濃度で２ｍｌのα−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１％ＤＭＳＯを含む）培地中にて１４日間、培地交換を一日毎に行い分化誘導培養を行った。
【００９３】
図１および図３に示した各日数で培養液を除き、細胞を１ｍｌ  ＰＢＳで２回洗浄後、１．５ｍｌチューブに移し、２５００回転、１分間の遠心操作で細胞を回収した。回収した細胞に１ｍｌ  Ｔｒｉｚｏｌを加え細胞を破砕し、ＲＮＡを６０％イソプロパノールで精製した。精製した全ＲＮＡ２５ｇをＤＮａｓｅＩ酵素で３７℃、１５分間処理しゲノムＤＮＡを除去した後、逆転写酵素Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴを用いて、ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを用いて定量ＲＴ−ＰＣＲを行い、ＧＡＴＡ−４、ＢＭＰ−５の発現量を定量した。具体的には、合成したｃＤＮＡの５０分の１量にＳｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ  １２．５μｌ（ＡＢＩ）と２μＭプライマー混合液２．５μｌを混合して、ＰＲＩＳＭ７０００（ＡＢＩ）を用いて定量ＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。
【００９４】
使用したプライマーは以下の通りである。
ＧＡＴＡ−４；５’側  GGAAGACACCCCAATCTCGAT（配列番号１）、
３’側  GGCCCCACAATTGACACACT（配列番号２）
ＢＭＰ−５；５’側  GGAGCGGCTGGGTTCAA（配列番号３）、
３’側  AAAACTGGAGTGAACGTGATTGTC（配列番号４）
ｓＦＲＰ−５；５’側  TGTGCCCAGTGTGAGATGGA（配列番号５）
３’側  GCGCATCTTGACCACAAAGTC（配列番号６）
各遺伝子発現量は、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ(プライマー；５’側  GGAGCGAGACCCCACTAACA（配列番号７）、３’側  GCCTTCTCCATGGTGGTGAA（配列番号８）)の発現量で基準化した。
【００９５】
結果を図１および図３に示す。図１（ａ）および（ｂ）に示すように、心筋分化細胞Ｐ１９．ＣＬ６を分化誘導剤ＤＭＳＯで分化誘導し、ＢＭＰ−５の経時的発現を定量解析したところ、初期心筋分化に必須なＧＡＴＡ−４の発現が生じ始める（Ｄａｙ７）よりも早い段階（Ｄａｙ５〜７）に一過的に上昇する発現パターンが確認された。また、図３（ａ）および（ｂ）に示すように、心筋分化細胞Ｐ１９．ＣＬ６を分化誘導剤ＤＭＳＯで分化誘導し、ｓＦＲＰ−５の経時的発現を定量解析したところ、初期心筋分化に必須なＧＡＴＡ−４の発現開始からピークになる（Ｄａｙ７〜１０）と同時期に発現が活性化された。
【００９６】
〔実施例１−２〕
マウスＵ６プロモーターの下流にＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイトを、ＭＬＵＶレトロウイルスベクターに導入したＤＮＡ断片を挿入したｓｉＲＮＡベクターを構築し、ＢＭＰ−５およびｓＦＲＰ−５のｓｉＲＮＡを発現させるために、次に示す合成オリゴマーを二重鎖にして上述の制限酵素サイトにクローニングした。
【００９７】
ＢＭＰ−５  ｓｉＲＮＡ−１
５’側  GATCCTTTATGCTGGATCTCTACAATTTCAAGAGAATTGTAGAGATCCAGCATAAAGTTTTTT（配列番号９）
３’側  AGCTAAAAAACTTTATGCTGGATCTCTACAATtctcttgaaATTGTAGAGATCCAGCATAAAG（配列番号１０）
ＢＭＰ−５  ｓｉＲＮＡ−２
５’側  GATCGCTGTGCTCCAACCAAACTAAttcaagagaTTAGTTTGGTTGGAGCACAGCTTTTTT（配列番号１１）
３’側  AGCTAAAAAAGCTGTGCTCCAACCAAACTAAtctcttgaaTTAGTTTGGTTGGAGCACAGC（配列番号１２）
ｓＦＲＰ−５  ｓｉＲＮＡ
５’側  GATCGCTGTGCTCCAACCAAACTAAttcaagagaTTAGTTTGGTTGGAGCACAGCTTTTTT（配列番号１３）
３’側  AGCTAAAAAACAAGAAGCTGGTCCTGCATATTCTCTTGAAATATGCAGGACCAGCTTCTTG（配列番号１４）
【００９８】
ｓｉＲＮＡ発現レトロウイルスを作成するため、２９３Ｔ細胞を３．５×１０５細胞／ｍｌで６穴プレートに播種して、３７℃、５％二酸化炭素通気下で培養した。２４時間後、ｓｉＲＮＡレトロウイルスベクターＤＮＡ２μｇ、Ｇａｇ／Ｐｏｌ  ＤＮＡ０．５μｇ、ＶＳＶ−Ｇ  ＤＮＡ０．５μｇを１００μｌ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、１０μｌ  ＦｕＧｅｎｅ６混合液に加えて、２９３Ｔ細胞に遺伝子導入した。２４時間後、培養上清を除き、１ｍｌ  α−ＭＥＭ（１０％  ＦＢＳ）を加え、２４時間培養してレトロウイルスを産生させた。レトロウイルスを含む細胞上清にα−ＭＥＭ（１０％  ＦＢＳ）１ｍｌと４ｍｇ／ｍｌ  ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ  ２μｌを混合し、０．４５μｍフィルターを通したウイルス液を１×１０４細胞／ｍｌで播種したＰ１９．ＣＬ６細胞に加え２４時間、３７℃、５％二酸化炭素通気下でウイルス感染させた。
【００９９】
感染後、ウイルス液を除き、２μｇ／ｍｌ  ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むα−ＭＥＭ（１０％  ＦＢＳ）２ｍｌ選択培地で４日間培養して、ｓｉＲＮＡレトロウイルスが感染したＰ１９．ＣＬ６細胞を選択した。薬剤選択後、直ちにｓｉＲＮＡ発現Ｐ１９．ＣＬ６細胞を１％ＤＭＳＯで分化誘導を行った。ｓｉＲＮＡ発現Ｐ１９．ＣＬ６細胞のＤＭＳＯ添加による分化誘導、並びに、定量ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現解析は実施例１−１と同様の方法で行った。定量ＲＴ−ＰＣＲに用いた各遺伝子プライマー配列は次の通りである。
【０１００】
Ｎｋｘ２．５
５’側  CGGGCGGATAAAAAAGAGCT（配列番号１５）
３’側  CCATCCGTCTCGGCTTTGT（配列番号１６）
α−ＭＨＣ
５’側  GCTGACAGATCGGGAGAATCAG（配列番号１７）
３’側  GCTGGCAAAGTACTGGATGACA（配列番号１８）
α−ａｃｔｉｎ
５’側  GTCTCTGTATGCTTCTGGAAGA（配列番号１９）
３’側  CTCATAGATGGGAACATTATGAGTT（配列番号２０）
【０１０１】
単離したＢＭＰ−５遺伝子が心筋分化に対してどの様な効果を有するかを明らかにするために、遺伝子活性を抑制するｓｉＲＮＡを発現するレトロウイルスベクターを構築し、ＢＭＰ−５またはｓＦＲＰ−５のｓｉＲＮＡ  レトロウイルスベクターをＰ１９．ＣＬ６細胞に導入した。その結果、図２（ａ）に示すように、ＢＭＰ−５  ｓｉＲＮＡ−２を発現するＰ１９．ＣＬ６細胞は、ＤＭＳＯ分化誘導時にＢＭＰ−５の８３％の活性を失っていた。このＰ１９．ＣＬ６細胞を分化誘導すると、心筋分化マーカー遺伝子（ＧＡＴＡ−４（図２（ｂ）参照）、Ｎｋｘ２．５（図２（ｃ）参照）、α−ＭＨＣ（図２（ｄ）参照）、α−ａｃｔｉｎ（図２（ｅ）参照））の発現が著しく抑制され、ＢＭＰ−５が各心筋遺伝子の発現を制御していることが確認できた。
【０１０２】
また、図４（ａ）に示すように、ｓＦＲＰ−５  ｓｉＲＮＡを発現するＰ１９．ＣＬ６細胞は、ＤＭＳＯ分化誘導時にｓＦＲＰ−５の９４％の活性を失っていた。ｓＦＲＰ−５が発現低下したＰ１９．ＣＬ６細胞を分化誘導すると、心筋分化マーカー遺伝子（ＧＡＴＡ−４（図４（ｂ）参照）、Ｎｋｘ２．５（図４（ｃ）参照）、α−ＭＨＣ（図４（ｄ）参照）、α−ａｃｔｉｎ（図４（ｅ）参照））発現の５０〜６０％が抑制された。これにより、ｓＦＲＰ−５が各心筋遺伝子の発現を制御していることが明らかになった。
【０１０３】
〔実施例２〕
レンチウイルスベクターに、ＰＧＫプロモーターとその下流にＢＭＰ−５完全長ｃＤＮＡを導入した過剰発現ベクターを構築した。レンチウイルスを作成するため、２９３Ｔ細胞を３．５×１０５細胞／ｍｌで６穴プレートに播種して、３７℃、１０％二酸化炭素通気下で培養した。２４時間後、レンチベクターＤＮＡ  ２．１μｇ、Ｇａｇ／Ｐｏｌ  ＤＮＡ  １．５μｇ、ＶＳＶ−Ｇ  ＤＮＡ  ０．９μｇ、ＲＥＶ  ＤＮＡ  ０．６μｇをＯｐｔｉ−ＭＥＭ  １００μｌ、ＦｕＧｅｎｅ６  １０μｌ混合液に加えて、２４時間、３７℃、３％二酸化炭素通気下の培養で２９３Ｔ細胞に遺伝子導入した。
【０１０４】
培養上清を除き、α−ＭＥＭ（１０％  ＦＢＳ）１ｍｌを加え、４８時間、３７℃、１０％二酸化炭素通気下で培養してレンチウイルスを産生させた。レンチウイルスを含む細胞上清にα−ＭＥＭ（１０％  ＦＢＳ）１ｍｌと４ｍｇ／ｍｌ  ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ  ２μｌを混合し、０．４５μｍフィルターを通したウイルス液を１×１０４細胞／ｍｌで播種したＰ１９．ＣＬ６細胞に加え、２４時間、３７℃、５％二酸化炭素通気下でウイルス感染させた。
【０１０５】
感染後、ウイルス液を除き、１μｇ／ｍｌ  ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むα−ＭＥＭ（１０％  ＦＢＳ）２ｍｌ選択培地で４日間培養して、レンチウイルスが感染したＰ１９．ＣＬ６細胞を選択した。樹立したＢＭＰ−５過剰発現Ｐ１９．ＣＬ６細胞をＤＭＳＯ非添加α−ＭＥＭ（１０％  ＦＢＳ）２ｍｌで培養し、形態変化を光学顕微鏡で観察、さらに、心筋構造タンパク質の細胞免疫染色法にて心筋分化を調べた。
【０１０６】
細胞免疫染色を実施するために、細胞をＰＢＳ  １ｍｌで２回洗浄後、２％パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ  １ｍｌで２０分間固定した後、ＰＢＳ洗浄を３回行い、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００−ＰＢＳで１５分間、抗体透過処理を行った。そして、３％  ＢＳＡ−ＰＢＳで３０分間、非特異的抗体吸着を抑制した後、マウス抗α−ＭＨＣ抗体（２００倍希釈：ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ）で１時間、一次抗体反応を行った。ＰＢＳ洗浄を３回行った後、Ａｌｅｘａ５４６−抗マウスＩｇＧ抗体（５００倍希釈：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）で１時間、二次抗体反応を行い、過剰の抗体をＰＢＳで洗浄した。細胞の核染色はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（１０００倍希釈）−ＰＢＳで１０分間反応後、ＰＢＳ洗浄を３回行った。抗体反応後の蛍光シグナルは蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ７１）を用いて行った。
【０１０７】
図５（ａ）には、ＢＭＰ−５過剰発現Ｐ１９．ＣＬ６細胞を光学顕微鏡にて観察した結果を示す。この図から、ＢＭＰ−５過剰発現Ｐ１９．ＣＫ６細胞は分化誘導剤ＤＭＳＯ非存在下で細胞質及び核が肥大化し、心筋様細胞と類似した形態を示したことがわかる。これらの細胞が心筋細胞であることを確かめるために、ＢＭＰ−５過剰発現Ｐ１９．ＣＫ６細胞について、心筋構造タンパク質α−ＭＨＣ抗体を用いて免疫染色を行った。その結果を図５（ｂ）に示す。この図に示すように、ＢＭＰ−５過剰発現細胞では、α−ＭＨＣが発現していることがわかった。この結果から、ＢＭＰ−５は心筋分化に必須な構造タンパク質の発現誘導を促進する遺伝子であることが明らかになった。
【０１０８】
〔実施例３〕
マウスＥＳ細胞ＥＢ５をＧ−ＭＥＭ（１０％ＫＤＲ、１０００Ｕ／ｍｌ  ＬＩＦ、５０μｇ／ｍｌ  Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎｅを含む）培地で０．１％ｇｅｌａｔｉｎ処理した１０ｃｍプレートにて未分化付着培養を行い、剥離（０．２５％  Ｔｒｙｐｓｉｎｅ−１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５分間）・播種（１０倍希釈）を繰り返し継代培養した。
【０１０９】
２回目の継代培養後、細胞を剥離し、０．１％ｇｅｌａｔｉｎ処理した６穴プレートにてＧ−ＭＥＭ（１０％ＫＤＲ、１０００Ｕ／ｍｌ  ＬＩＦ、５０μｇ／ｍｌ  Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎｅを含む）培地２ｍｌで２日間未分化培養した。その後、細胞を再び剥離し、１５ｍｌチューブに細胞液を移し、８００ｇ、４分間遠心操作を行い、α−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳを含む）培地に懸濁した。剥離した細胞を３×１０４細胞／ｍｌ細胞濃度に調整し、細胞液を１５μｌずつ培養皿の上蓋にスポットし（６０〜７０個）、懸濁した細胞滴が下になるように上蓋の向きを返して、培養プレートの下皿に載せて３７℃、５％二酸化炭素通気下で１日間、胚様体形成培養を行った。０．１％ｇｅｌａｔｉｎ処理した９６穴プレートの各ウェルにα−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳを含む）１００μｌを入れて、１ｍｌチップで各胚様体を１個ずつ移し、α−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳを含む）培地交換を一日毎に行い付着培養にて分化誘導培養を１５日間行った。
【０１１０】
ＢＭＰ−５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）の添加時期の検討は、次の６条件で行った。即ち、（１）未分化培養２日間のみに添加、（２）未分化状培養２日間と胚様体形成期１日間、（３）未分化状培養２日間と胚様体形成期１日間とそれに続くＥＢ付着培養１日間、（４）胚様体形成期１日間のみ、（５）胚様体形成期１日間とＥＢ付着培養１日間、（６）胚様体形成期１日間とＥＢ付着培養２日間、である。図６には、上記６条件での分化誘導培養の工程を模式的に示す。なお、図中では、上記（１）〜（６）の各条件を丸付き数字で示している。
【０１１１】
ＢＭＰ−５によるＥＳ細胞分化誘導に及ぼす濃度効果は、上記のＥＳ分化系に濃度０．２、１、１０、５０、５００ｎｇ／ｍｌで細胞培養液に添加して行った。対照実験としてＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、及びＮｏｇｇｉｎ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）を投与した。ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４の投与時期は、ＢＭＰ−５と同様に胚様体形成期の懸滴培養１日間である。Ｎｏｇｇｉｎは未分化培養時の２日間と胚様体形成時の１日間に１５０ｎｇ／ｍｌで投与した。
【０１１２】
そして、これらの各条件で培養を行った細胞培養液について、拍動性ＥＢの出現効率、心筋マーカーのタンパク量、心筋マーカーの遺伝子発現量の測定を行った。
【０１１３】
拍動性ＥＢの出現効率は、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、及びＮｏｇｇｉｎ処理と未処理ＥＢ、各々４８個の自立拍動を光学顕微鏡下で経時的(付着培養後７〜１３日)に観察し、全ＥＢ数に対する拍動性ＥＢ数の割合として算出した。
【０１１４】
心筋マーカーｃａｒｄｉａｃ  ｔｏｌｏｐｏｎｉｎ（ｃＴｎＴ）タンパク量は実施例２に記述した蛍光抗体による免疫染色法を行った後、蛍光強度を蛍光プレートリーダー（ＤＴＸ８８０）で測定し、ＥＢ８個の蛍光強度の平均値とした。ｃＴｎＴの免疫染色法には一次抗体にマウス抗ｃＴｎＴ抗体（２００倍希釈：ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ）、二次抗体にＡｌｅｘａ−４８８抗マウスＩｇＧ抗体（５００倍希釈：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）を用いた。
【０１１５】
心筋マーカー遺伝子の発現解析は、図１１に示した日数でＥＢ（ｎ＝８）をＰＢＳで２回洗浄後、剥離したＥＢを４個ずつ１．５ｍｌチューブに回収し、ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。抽出した全ＲＮＡ２００〜４００ｎｇとＥｘｓｃｒｉｐｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてｃＤＮＡ合成を行った後、遺伝子発現量解析のためｃＤＮＡの１０分の１量と２μＭプライマー混合液２μｌ、Ｐｏｗｅｒ  Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ（ＡＢＩ）１０μｌを混和し、反応液２０μｌで定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。定量ＲＴ−ＰＣＲに用いたｃＴｎＴプライマーは次の通りである。
【０１１６】
ｃＴｎＴ
５’側  TCCCTCAAAGACAGGATCGAA（配列番号２１）
３’側  GCGGTTCTGCCTTTCCTTCT（配列番号２２）
【０１１７】
図７Ａ（ａ）〜（ｃ）及び図７Ｂ（ｄ）〜（ｆ）には、ＥＳ心筋分化系に対してＢＭＰ−５（１００ｎｇ／ｍｌ）を上記（１）〜（６）の各条件で添加し、自律（自立）拍動率（ｎ＝４８）を付着培養後９〜１３日の間で調べた結果を順に示す。なお、図７Ａおよび図７Ｂでは、ＢＭＰ−５処理を実線で、ＢＭＰ−５未処理を破線で、Ｎｏｇｇｉｎ処理を一点鎖線で示す。この図に示すように、ＢＭＰ−５処理をした場合、いずれの条件でもＢＭＰ−５未処理のコントロールより自立拍動率が上昇した。
【０１１８】
添加条件（１）〜（３）では１３日目で８０％の自立拍動率を示し、添加条件（５）では１３日目で８０％以上の自立拍動率を示し、添加条件（４）では１３日目で９０％以上の自立拍動率を示した。この結果から、添加条件としては、添加条件（４）でＥＳ細胞を処理することが最も望ましいことが明らかになった。また、分化促進剤Ｎｏｇｇｉｎで効果が認められる添加条件（２）におけるＢＭＰ−５の投与効果は、Ｎｏｇｇｉｎと同等かそれ以上であり、ＢＭＰ−５添加条件（４）での拍動促進効果は、Ｎｏｇｇｉｎによる効率を上回っていることが確認できた。
【０１１９】
続いて、添加条件（４）で最も心筋分化効率が促進されるＢＭＰ−５の濃度を決定した。その結果を図８Ａおよび図８Ｂに示す。図８Ａ（ａ）〜（ｃ）及び図８Ｂ（ｄ）〜（ｆ）には、ＢＭＰ−５の添加濃度を０．２ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌとし、付着培養後７〜１１日間、自律（自立）拍動率（ｎ＝４８）を調べた結果を順に示す。なお、図８Ａおよび図８Ｂでは、ＢＭＰ−５処理を実線で、ＢＭＰ−５未処理を破線で示す。
【０１２０】
図８Ａおよび図８Ｂに示すように、０．２〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲内のいずれの濃度においても、付着培養後１１日目において、ＢＭＰ−５未処理の自立拍動率よりも有意な促進効果が認められた。これらの濃度の中でも、０．２〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度条件において、８０％以上拍動率が促進されることが確認された。さらに、０．２〜１ｎｇ／ｍｌの濃度条件においては、付着培養後７〜１１日目すべてにおいて促進効果が認められ、かつ、１１日目で９０％以上の増強効果を有することが明らかになった。この結果から、ＢＭＰ−５の添加濃度は、０．２〜５０ｎｇ／ｍｌが好ましく、０．２〜１ｎｇ／ｍｌがより好ましいことがわかる。
【０１２１】
続いて、０．２〜５００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−５の投与による分化促進効果を、ｃａｒｄｉａｃ  Ｔｒｏｐｏｎｉｎ（ｃＴｎＴ）タンパク質量を定量化して調べた。その結果を図９に示す。図９に示すように、０．２〜１ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−５処理をした１０日目のＥＢはＢＭＰ−５未処理（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べてｃＴｎＴタンパク量が２〜２．５倍亢進していることが確認できた。１０〜５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−５処理でも有意な促進効果が認められた。
【０１２２】
続いて、ＢＭＰ−５の促進効果と既知の心筋分化因子（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、Ｎｏｇｇｉｎ）のそれとを比較検討した。０．２ｎｇ／ｍｌ及び１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、及びＢＭＰ−５と、１５０ｎｇ／ｍｌのＮｏｇｇｉｎの促進効率を、処理後４日目〜１３日目にｃＴｎＴ抗体で蛍光免疫染色して調べた結果を図１０Ａ、図１０Ｂに示す。また、０．２ｎｇ／ｍｌ及び１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、又はＢＭＰ−５、あるいは、１５０ｎｇ／ｍｌのＮｏｇｇｉｎで処理後、４〜１３日目にｃＴｎＴタンパク質を定量化（ｎ＝８）した結果を図１１に示す。
【０１２３】
ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５の投与時期は、上述の添加条件（４）にて、また、Ｎｏｇｇｉｎは添加条件（２）にて行った。各因子の投与後７日目でｃＴｎＴの発現が認められるのは、０．２ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ−５と１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４処理ＥＢ群であり、投与後１３日目でＥＢ細胞の５０％以上がｃＴｎＴポジティブの心筋細胞に分化していた。１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ−５ではＢＭＰ−５未処理と同程度の分化能しか示さなかった。同様の促進効果がｃＴｎＴタンパク質の定量解析でも認められ、０．２ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ−５の投与後１３日目でＢＭＰ−５未処理に比べてｃＴｎＴタンパク量が４倍亢進し、そのタンパク量は１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４と同程度であったことから、ＢＭＰ−５は既知の分化促進因子よりも低濃度で優れた分化誘導活性を有していることが明らかになった。
【０１２４】
また、上記と同濃度でのＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５の分化促進効果を、心筋マーカー遺伝子発現量の定量ＲＴ−ＰＣＲから解析した。０．２ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ群を添加条件（４）にてＥＢに投与して、７日目の各心筋マーカー遺伝子（ＧＡＴＡ−４、ｃＴｎＴ、α−ＭＨＣ）の発現量を調べた結果を図１２（ａ）〜（ｃ）にそれぞれ示す。０．２ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ−５処理によって、ＢＭＰ−５未処理に比べてＧＡＴＡ−４遺伝子量で１．５倍、ｃＴｎＴ遺伝子量で８倍、α−ＭＨＣ遺伝子量で５倍促進効果が認められた。同濃度のＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４に対して、ＢＭＰ−５は各遺伝子発現の促進効果が有意に高いことが明らかになった。また、１５０ｎｇ／ｍｌ  ＮｏｇｇｉｎによるｃＴｎＴ、α−ＭＨＣ発現促進率よりもＢＭＰ−５の促進効果が高いことが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
上述したように、本発明の心筋細胞の製造方法によれば、従来の分化誘導方法と比較して高率かつ選択的に心筋細胞を得ることができる。そして、本発明により得られる心筋細胞は、心疾患患者への細胞移植用に利用されるとともに、心疾患の治療剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】図１は、Ｐ１９．ＣＬ６心筋分化誘導時におけるＢＭＰ−５の発現変化を示すグラフである（図１（ａ））。なお、比較のためにＧＡＴＡ−４の発現変化も併せて示す（図１（ｂ））。
【図２】図２（ａ）は、ＢＭＰ−５  ｓｉＲＮＡによるＢＭＰ−５の発現量の変化を示すグラフであり、図２（ｂ）〜（ｅ）は、ＢＭＰ−５  ｓｉＲＮＡによる各心筋分化マーカーの発現変化を示すグラフである。
【図３】図３は、Ｐ１９．ＣＬ６心筋分化誘導時におけるｓＦＲＰ−５の発現変化を示すグラフである（図３（ａ））。なお、比較のためにＧＡＴＡ−４の発現変化も併せて示す（図３（ｂ））。
【図４】図４（ａ）は、ｓＦＲＰ−５  ｓｉＲＮＡによるｓＦＲＰ−５の発現量変化を示すグラフであり、図４（ｂ）〜（ｅ）は、ｓＦＲＰ−５  ｓｉＲＮＡによる各心筋分化マーカーの発現変化を示すグラフである。
【図５】図５（ａ）は、ＢＭＰ−５過剰発現Ｐ１９．ＣＬ６細胞を光学顕微鏡にて観察した結果を示す図である。図５（ｂ）は、ＢＭＰ−５過剰発現Ｐ１９．ＣＫ６細胞を、心筋構造タンパク質α−ＭＨＣ抗体を用いて免疫染色した結果を示す図である。
【図６】図６は、実施例３において行った分化誘導培養の工程を模式的に示す図である。
【図７Ａ】図７Ａ（ａ）〜（ｃ）は、ＥＳ心筋分化系に対してＢＭＰ−５を図６に示す（１）〜（３）の各条件で添加し、自律（自立）拍動率を付着培養後９〜１３日の間で調べた結果をそれぞれ示す図である。
【図７Ｂ】図７Ｂ（ｄ）〜（ｆ）は、ＥＳ心筋分化系に対してＢＭＰ−５を図６に示す（４）〜（６）の各条件で添加し、自律（自立）拍動率を付着培養後９〜１３日の間で調べた結果をそれぞれ示す図である。
【図８Ａ】図８Ａ（ａ）〜（ｃ）は、ＢＭＰ−５の添加濃度を０．２ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌとした場合の心筋分化効率を調べた結果をそれぞれ示す図である。
【図８Ｂ】図８Ｂ（ｄ）〜（ｆ）は、ＢＭＰ−５の添加濃度を５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌとした場合の心筋分化効率を調べた結果をそれぞれ示す図である。
【図９】図９は、０．２〜５００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−５の投与による分化促進効果を、ｃＴｎＴタンパク質量を定量化して調べた結果を示す図である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、０．２ｎｇ／ｍｌ及び１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、及びＢＭＰ−５と、１５０ｎｇ／ｍｌのＮｏｇｇｉｎの促進効率を、処理後４日目又は７日目にｃＴｎＴ抗体で蛍光免疫染色して調べた結果を示す図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、０．２ｎｇ／ｍｌ及び１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、及びＢＭＰ−５と、１５０ｎｇ／ｍｌのＮｏｇｇｉｎの促進効率を、処理後１０日目又は１３日目にｃＴｎＴ抗体で蛍光免疫染色して調べた結果を示す図である。
【図１１】図１１は、０．２ｎｇ／ｍｌ及び１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、又はＢＭＰ−５、あるいは、１５０ｎｇ／ｍｌのＮｏｇｇｉｎで処理後、４〜１３日目にｃＴｎＴタンパク質を定量化した結果を示す図である。
【図１２】図１２（ａ）〜（ｃ）は、０．２ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ群を図６に示す添加条件（４）にてＥＢに投与して、７日目の各心筋マーカー遺伝子（ＧＡＴＡ−４、ｃＴｎＴ、α−ＭＨＣ）の発現量を調べた結果をそれぞれ示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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