(57)【要約】      （修正有）【課題】ユーカリ属植物を確実に識別する方法を提供する。【解決手段】以下の（ａ）及び（ｂ）のＤＮＡから選択される少なくとも１種のＤＮＡを検出することにより、ユーカリ属植物における個体を識別する方法：（ａ）特定の配列を有する２８の塩基配列の全部又は一部を含むＤＮＡ、（ｂ）上記２８の配列のいずれかの全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつユーカリ属植物のゲノムＤＮＡにおいて個体間で多型性を有するＤＮＡ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）及び（ｂ）のＤＮＡから選択される少なくとも１種のＤＮＡを検出することにより、ユーカリ属植物における個体を識別する方法：
（ａ）配列番号１〜２８のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１〜２８のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつユーカリ属植物のゲノムＤＮＡにおいて個体間で多型性を有するＤＮＡ。
【請求項２】
検出しようとするＤＮＡの全部又は一部を増幅しうるように設計されたオリゴヌクレオチドのセットをプライマーとして用いることによりＤＮＡを検出する請求項１記載の方法。
【請求項３】
配列番号２９〜８４のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列又は該塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるプライマーから選択される少なくとも１種のプライマーを用い、ユーカリ属植物のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅反応を行うことにより、ユーカリ属植物における個体を識別する方法。
【請求項４】
ユーカリ属植物が、ユーカリ・ダニアイ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｄｕｎｎｉｉ  Ｍａｉｄｅｎ．）、ユーカリ・グロブラス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｌｏｂｕｌｕｓ  Ｌａｂｉｌｌ．）、ユーカリ・カマルドレンシス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｃａｍａｌｄｕｌｅｎｓｉｓ  Ｄｅｈｎｈ．）およびユーカリ・ナイテンス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｎｉｔｅｎｓ  Ｍａｉｄｅｎ．）からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ：
（ａ）配列番号１〜２８のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１〜２８のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつユーカリ属植物のゲノムＤＮＡにおいて個体間で多型性を有するＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号２９〜８４のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列又は該塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるプライマー。
【請求項７】
請求項６記載のプライマーを含むユーカリ属植物個体識別用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ユーカリ属植物における新規ＤＮＡおよび、それらを利用したユーカリ属植物の個体識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ属）植物は主にオーストラリアやインドネシアなどの温帯から熱帯地域を原産とし、７００種以上が知られている。世界的に有用な産業造林樹種であり、成長量および材質の優れた品種開発のための育種が各国で進められている。
【０００３】
近年、早成樹林業では、世界的にクローン林業が指向されている。また、ＤＮＡ分子マーカーによる家系／クローン管理技術を組込んだ新育種システムが提唱されており、育種事業を効率的に進めるためには、確実で簡便な個体鑑定技術が不可欠となっている。
【０００４】
これまで個体の識別法としてはＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ）分析やマイクロサテライト分析を利用することが多かった（特許文献１及び２参照）。ＲＡＰＤ法は手順が簡便で、少量のＤＮＡでも分析できるという利点をもつ。しかし、再現性が悪く実験室間で結果が異なる場合があるという致命的欠点があり、必ずしも正確で確実な個体識別法とは言い難い。また、マイクロサテライトはＡＣやＴＣなど２〜６塩基の配列が数回〜数十回繰り返しているＤＮＡ領域で、ゲノムＤＮＡ中に散在し、その繰り返し数の違いによる変異性が非常に高いことが分かっている。このマイクロサテライトを利用して個体識別する方法も開発されているが、ＤＮＡシーケンサーを用いて分析する必要があるため、必ずしも簡便な個体識別法とは言い難い。
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−２９１４７５号公報
【特許文献２】特開２００２−３４５９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、ユーカリ属植物の個体を確実に識別する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは前記状況にかんがみ、より優れたユーカリ属植物の個体識別方法を見いだすべく鋭意研究を重ねた結果、ユーカリ属植物から新規ＤＮＡを取得することに成功し、さらに該新規ＤＮＡを利用することによりユーカリ属植物の個体を識別できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）以下の（ａ）及び（ｂ）のＤＮＡから選択される少なくとも１種のＤＮＡを検出することにより、ユーカリ属植物における個体を識別する方法：
（ａ）配列番号１〜２８のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１〜２８のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつユーカリ属植物のゲノムＤＮＡにおいて個体間で多型性を有するＤＮＡ。
（２）検出しようとするＤＮＡの全部又は一部を増幅しうるように設計されたオリゴヌクレオチドのセットをプライマーとして用いることによりＤＮＡを検出する（１）記載の方法。
（３）配列番号２９〜８４のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列又は該塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるプライマーから選択される少なくとも１種のプライマーを用い、ユーカリ属植物のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅反応を行うことにより、ユーカリ属植物における個体を識別する方法。
（４）ユーカリ属植物が、ユーカリ・ダニアイ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｄｕｎｎｉｉ  Ｍａｉｄｅｎ．）、ユーカリ・グロブラス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｌｏｂｕｌｕｓ  Ｌａｂｉｌｌ．）、ユーカリ・カマルドレンシス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｃａｍａｌｄｕｌｅｎｓｉｓ  Ｄｅｈｎｈ．）およびユーカリ・ナイテンス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｎｉｔｅｎｓ  Ｍａｉｄｅｎ．）からなる群から選択される、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ：
（ａ）配列番号１〜２８のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１〜２８のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつユーカリ属植物のゲノムＤＮＡにおいて個体間で多型性を有するＤＮＡ。
（６）配列番号２９〜８４のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列又は該塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるプライマー。
（７）（６）記載のプライマーを含むユーカリ属植物個体識別用キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、ＤＮＡを用いたより簡便で確実なユーカリ属植物の個体識別方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を具体的に説明する。
【００１１】
本発明者らは、試料となるユーカリ属植物からＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）法を用いてＤＮＡを抽出し、次ぎに該ゲノムＤＮＡに、例えばＧＧＧＣＧＧＴＴＴＡ（配列番号８５）、ＣＣＣＧＣＣＴＴＣＣ（配列番号８６）、ＡＴＣＧＧＧＴＣＣＧ（配列番号８７）、ＴＡＧＣＣＣＧＣＴＴ（配列番号８８）、ＡＧＴＡＧＡＣＧＧＧ（配列番号８９）、ＧＴＡＧＡＣＧＡＧＣ（配列番号９０）、ＧＧＡＡＡＣＣＴＣＴ（配列番号９１）、ＧＣＴＴＣＣＣＣＴＴ（配列番号９２）、ＡＴＣＣＴＧＴＴＣＧ（配列番号９３）、ＡＧＡＧＧＧＴＴＣＴ（配列番号９４）、ＡＴＧＴＧＴＴＧＣＧ（配列番号９５）、ＣＣＡＡＧＡＴＧＣＴ（配列番号９６）、ＧＣＡＡＧＴＣＡＣＴ（配列番号９７）、ＣＧＡＣＡＧＴＣＣＣ（配列番号９８）、ＴＧＣＡＧＴＣＧＡＡ（配列番号９９）、ＴＣＣＡＣＣＧＡＧＣ（配列番号１００）、ＧＴＴＣＣＣＧＡＧＴ（配列番号１０１）、ＡＡＡＣＡＧＣＣＣＧ（配列番号１０２）、ＡＣＡＧＧＧＡＡＣＧ（配列番号１０３）、ＡＴＡＣＧＧＣＧＴＣ（配列番号１０４）、ＧＧＴＧＧＴＴＴＣＣ（配列番号１０５）、ＣＡＣＡＡＣＧＧＧＴ（配列番号１０６）、ＣＴＣＴＣＧＴＧＣＧ（配列番号１０７）、ＣＴＣＡＣＡＴＧＣＣ（配列番号１０８）、ＣＣＣＧＴＡＴＧＴＣ（配列番号１０９）、ＣＣＧＡＣＣＧＧＡＡ（配列番号１１０）、ＣＣＡＧＣＧＴＡＴＴ（配列番号１１１）で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして作用させて、ＤＮＡを増幅させた。ＤＮＡの増幅はＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ）法により行った（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｊ．Ｇ．，  Ｋｕｂｅｌｉｋ，  Ａ．Ｒ．，  Ｌｉｖａｋ，  Ｋ．Ｊ．，  Ｒａｆａｌｓｋｉ，  Ｊ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｔｉｎｇｅｙ，  Ｓ．Ｖ．，  （１９９０）  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ａｒｂｉｔａｒｙ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ａｒｅ  ｕｓｅｆｕｌ  ａｓ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒ．  Ｎｕｃｌ．  Ａｓｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １８：６５３１−６５３５）。そして、このようにして得られた増幅ＤＮＡについて、アガロースゲル電気泳動を用い増幅ＤＮＡを分離し、その後、ユーカリ属植物個体間で多型性を有する増幅ＤＮＡに対してクローニングを行い、該ＤＮＡの塩基配列を決定した。
【００１２】
その結果、ユーカリ属植物個体間で多型性を有するＤＮＡとして、配列番号１〜２８のいずれかで表される塩基配列を含む２８種のＤＮＡを特定した。従って、本発明は、配列番号１〜２８のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部を含むＤＮＡ、ならびに配列番号１〜２８のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつユーカリ属植物の個体間で多型性を有するＤＮＡから選択される少なくとも１種のＤＮＡを検出することにより、ユーカリ属植物における個体を識別する方法に関する。
【００１３】
本発明の方法によって個体を識別できる植物は、ユーカリ属植物であれば特に制限されない。本発明は、ユーカリ・ダニアイ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｄｕｎｎｉｉ  Ｍａｉｄｅｎ）、ユーカリ・グロブラス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｌｏｂｕｌｕｓ  Ｌａｂｉｌｌ）、ユーカリ・カマルドレンシス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｃａｍａｌｄｕｌｅｎｓｉｓ  Ｄｅｈｎｈ）およびユーカリ・ナイテンス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｎｉｔｅｎｓ  Ｍａｉｄｅｎ）における個体の識別に特に好適に用いられる。
【００１４】
識別に使用するＤＮＡ種の数は識別しようとする個体数に基づいて、設定することができる。例えば５種類のＤＮＡ種を使用することにより、最大２５＝３２個体の識別が可能となる。すなわち対象とするユーカリ属植物のゲノムＤＮＡにおいて、上記の多型性を有するＤＮＡを検出することにより、個体を識別することができる。
【００１５】
本発明において個体を識別するとは、遺伝的に異なる２個体以上の植物体を区別することを意味する。
【００１６】
配列番号１〜２８のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部を含むＤＮＡ、及び配列番号１〜２８のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつユーカリ属植物の個体間で多型性を有するＤＮＡの塩基長は、個体間の多型を識別できる長さであれば特に制限されないが、通常、５０〜２０００塩基、好ましくは１００〜１０００塩基、より好ましくは２００〜７００塩基である。
【００１７】
本明細書において、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、すなわち、各遺伝子に対し高い相同性（相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、このような条件は、０．５〜１ＭのＮａＣｌ存在下４２〜６８℃で、又は５０％ホルムアミド存在下４２℃で、又は水溶液中６５〜６８℃で、ハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液を用いて室温〜６８℃でフィルターを洗浄することにより達成できる。
【００１８】
ここで、塩基配列の一部とは、各塩基配列の一部分の塩基配列であって、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせるのに十分な塩基配列の長さを有するものであり、例えば、各塩基配列において連続する少なくとも５０塩基、好ましくは少なくとも１００塩基、より好ましくは少なくとも２００塩基の配列である。
【００１９】
各塩基配列の一部としては、例えば、配列番号１で表される塩基配列の２０６〜８６６位の配列、配列番号２で表される塩基配列の１１０〜８１７位の配列、配列番号３で表される塩基配列の１７２〜４８５位の配列、配列番号４で表される塩基配列の６２〜５８４位の配列、配列番号５で表される塩基配列の１８〜５８４位の配列、配列番号６で表される塩基配列の２１〜３３３位の配列、配列番号７で表される塩基配列の１５５〜７１５位の配列、配列番号８で表される塩基配列の７４〜４４６位の配列、配列番号９で表される塩基配列の９８〜６６０位の配列、配列番号１０で表される塩基配列の８〜６６４位の配列、配列番号１１で表される塩基配列の１０〜３６４位の配列、配列番号１２で表される塩基配列の８２〜６９８位の配列、配列番号１３で表される塩基配列の１〜４９３位の配列、配列番号１４で表される塩基配列の１５０〜３８８位の配列、配列番号１５で表される塩基配列の２７４〜５３２位の配列、配列番号１６で表される塩基配列の１５〜５７０位の配列、配列番号１７で表される塩基配列の２６６〜７４６位の配列、配列番号１８で表される塩基配列の１１〜３３７位の配列、配列番号１９で表される塩基配列の６〜６９７位の配列、配列番号２０で表される塩基配列の８６〜６９１位の配列、配列番号２１で表される塩基配列の２７０〜１０３１位の配列、配列番号２２で表される塩基配列の１０９〜６４７位の配列、配列番号２３で表される塩基配列の６８〜２２３位の配列、配列番号２４で表される塩基配列の１５６〜６４０位の配列、配列番号２５で表される塩基配列の２３４〜８２６位の配列、配列番号２６で表される塩基配列の１３１〜８０５位の配列、配列番号２７で表される塩基配列の１５８〜３６３位の配列、配列番号２８で表される塩基配列の１１〜３０８位の配列が挙げられる。
【００２０】
対象とするユーカリ属植物由来の試料における本発明のＤＮＡの検出は、当技術分野で通常用いられる方法によって実施できる。本発明においては、上記の配列番号１〜２８のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部を含むＤＮＡ、ならびに配列番号１〜２８のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつユーカリ属植物のゲノムＤＮＡにおいて個体間で多型性を有するＤＮＡのうち、検出しようとするＤＮＡの全部又は一部を増幅しうるように設計されたオリゴヌクレオチドのセットをプライマーとして用いることにより検出を行うのが好ましい。
【００２１】
特定のＤＮＡの全部又は一部を増幅しうるプライマーの設計は、当技術分野において通常用いられる方法によって実施できる。プライマーの長さは、通常１０塩基以上、好ましくは１１〜４５塩基、より好ましくは２０〜３０塩基である。また、プライマーの設計の際には、プライマーの融解温度（Ｔｍ）を確認することが好ましい。Ｔｍとは、任意の核酸鎖の５０％がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度を意味し、鋳型ＤＮＡ又はＲＮＡとプライマーとが二本鎖を形成してアニーリングするためには、アニーリングの温度を最適化する必要がある。一方、この温度を下げすぎると非特異的な反応が起こるため、温度は可能な限り高いことが望ましい。従って、設計しようとするプライマーのＴｍは、増幅反応を行う上で重要な因子である。Ｔｍの確認には、公知のプライマー設計用ソフトウエアを利用することができ、本発明で利用可能なソフトウエアとしては、例えばＡｍｐｌｉｆｙなどが挙げられる。またＴｍの確認は、ソフトウエアを使わず、自ら計算することによっても行うことができる。その場合には、最近接塩基対法（Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  Ｍｅｔｈｏｄ）、Ｗａｌｌａｎｃｅ法、ＧＣ％法等に基づく計算式を利用することができる。本発明では、平均Ｔｍが約４５〜５５℃であることが好ましい。
【００２２】
プライマーとして特異的なアニーリング又はハイブリダイズが可能な条件としては、その他にもＧＣ含量などがあり、そのような条件は当業者に周知である。また、プライマーは、設計時に鋳型として使用する配列に対し相同的な場合と相補的な場合があり、一般にフォワードプライマーの場合は鋳型配列に対し相同配列となり、リバースプライマーの場合は鋳型配列に対し相補配列となることに留意してプライマーを設計する必要がある。このようなプライマーの設計は当業者には周知である。
【００２３】
本発明においては、ＳＣＡＲ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）プライマーを用いるのが好ましい。ＳＣＡＲプライマーの設計方法は当業者に周知であり、例えば、Ｐａｒａｎ，  Ｉ．  ａｎｄ  Ｒ．Ｗ．Ｍｉｃｈｅｌｍｏｒｅ．  （１９９３）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｅｌｉａｂｌｅ  ＰＣＲ−ｍａｒｋｅｒｓ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｄｏｗｎｙ  ｍｉｌｄｅｗ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｌｅｔｔｕｃｅ．  Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．８５ｆ：９８５−９９３に記載されている。
【００２４】
本発明においては、さらに以下のプライマーセット１〜２８からなる群から選択される少なくとも１種のプライマーセットを用いるのが好ましい。
【００２５】
配列番号１〜２８のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部を含むＤＮＡ又は配列番号１〜２８のいずれかで表される塩基配列の全部又は一部からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつユーカリ属植物のゲノムＤＮＡにおいて個体間で多型性を有するＤＮＡを増幅しうるプライマーセットとして、それぞれ、以下のプライマーセット１〜２８が挙げられる。
プライマーセット１：配列番号２９で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３０で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット２：配列番号３１で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３２で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット３：配列番号３３で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３４で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット４：配列番号３５で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３６で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット５：配列番号３７で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３８で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット６：配列番号３９で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４０で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット７：配列番号４１で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４２で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット８：配列番号４３で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４４で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット９：配列番号４５で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４６で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット１０：配列番号４７で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４８で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット１１：配列番号４９で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５０で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット１２：配列番号５１で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５２で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット１３：配列番号５３で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５４で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット１４：配列番号５５で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５６で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット１５：配列番号５７で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５８で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット１６：配列番号５９で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号６０で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット１７：配列番号６１で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号６２で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット１８：配列番号６３で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号６４で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット１９：配列番号６５で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号６６で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット２０：配列番号６７で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号６８で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット２１：配列番号６９で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号７０で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット２２：配列番号７１で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号７２で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット２３：配列番号７３で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号７４で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット２４：配列番号７５で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号７６で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット２５：配列番号７７で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号７８で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット２６：配列番号７９で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号８０で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット２７：配列番号８１で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号８２で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
プライマーセット２８：配列番号８３で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号８４で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセット。
【００２６】
上記プライマーセットにおいて、各塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列又は該塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるプライマーもまた上記プライマーセットに包含される。
【００２７】
ここで「一部」とは、各塩基配列のうち、通常１０塩基以上、好ましくは１５〜４５塩基、より好ましくは２０〜３０塩基、さらに好ましくは２２〜２９塩基の連続する塩基配列を意味する。上述したプライマーに付加配列が付加されたものも本発明の範囲内に包含される。各塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列は、通常５０〜２０００塩基、好ましくは１００〜１０００塩基、より好ましくは２００〜７００塩基である。
【００２８】
本発明はまた、本発明のプライマーを含むユーカリ属植物個体識別用キットに関する。本識別用キットは、さらに、反応液を構成するバッファー、ｄＮＴＰ混合物、酵素類（逆転写酵素、ＲＮａｓｅＨなど）、校正用の標準試料などを含んでもよい。
【００２９】
次にユーカリ属植物のゲノムＤＮＡにおいて多型性を有するＤＮＡを検出する方法について以下に述べる。試料は、ユーカリ属植物に由来するものであれば特に限定されず、例えば、葉、茎、根、樹皮、木材などが挙げられ、新鮮な葉を使用するのが好ましい。
【００３０】
通常、これらの試料から、被検核酸を調製する。被検核酸は、核酸であればＤＮＡ又はＲＮＡのいずれでもよい。ＤＮＡ又はＲＮＡは、当技術分野で周知の方法を適宜使用して抽出することができる。例えば、ＤＮＡを抽出する場合には、フェノール抽出及びエタノール沈殿を行う方法、臭化セチルトリメチルアンモニウムを用いる方法、ガラスビーズを用いる方法などを利用することができる。またＲＮＡを抽出する場合には、グアニジン−塩化セシウム超遠心法、ホットフェノール法、又はチオシアン酸グアジニウム−フェノール−クロロホルム（ＡＧＰＣ）法などを利用することができる。以上のように調製した試料又は被検核酸を用いて、以下に示す増幅反応を行う。
【００３１】
本発明の識別方法は、上記プライマーを用いて被検核酸を鋳型とした増幅反応を行い、その個体間で特異的な増幅反応を検出することにより実施できる。
【００３２】
増幅手法としては、特に限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の原理を利用した公知の方法を挙げることができる。例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ＡＭＰｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）法、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等を挙げることができる。増幅は、増幅産物が検出可能なレベルになるまで行う。
【００３３】
例えば、ＰＣＲ法は、被検核酸であるＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼにより、一対のプライマー間の塩基配列を合成するものである。ＰＣＲ法によれば、変性、アニーリング及び合成からなるサイクルを繰り返すことによって、増幅断片を指数関数的に増幅させることができる。ＰＣＲの最適条件は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００３４】
またＲＴ−ＰＣＲ法では、まず、被検核酸であるＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素反応によりｃＤＮＡを作製し、その後、作製したｃＤＮＡを鋳型として一対のプライマーを用いてＰＣＲ法を行うものである。
【００３５】
なお、増幅手法として競合ＰＣＲ法やリアルタイムＰＣＲ法等の定量的ＰＣＲ法などを採用することにより、定量的な検出が可能となる。例えば競合ＰＣＲ法は、同じプライマーを用いて、定量の内部標準となる競合的鋳型から得られる増幅産物と被検核酸から得られる増幅産物との量を比較することにより、被検核酸に含まれる検出対象を定量することができる。また、検出の特異性を高めるために、２組以上のプライマーを用いて２回以上増幅反応を行ってもよく、そのような増幅手法はｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法として当技術分野で公知である。
【００３６】
本発明の識別方法においては、上記プライマーを用いて特異的な増幅反応が起こる条件下で増幅反応を行う限り、その増幅手法は特に限定されない。また、特異的な増幅反応が起こるような条件は、当業者であれば適宜設定することができる。
【００３７】
上記増幅反応後に特異的な増幅反応が起こったか否かを検出するには、増幅反応により得られる増幅産物を特異的に認識することができる公知の手段を用いることができる。例えば、アガロースゲル電気泳動法等を利用して、特定のサイズの増幅断片が増幅されているか否かを確認することにより、特異的な増幅反応を検出することができる。
【００３８】
増幅産物のサイズは設計したプライマー間の塩基配列に基づいて推測することが可能である。あるいは、増幅反応の過程で取り込まれるｄＮＴＰに、放射性同位体、蛍光物質、発光物質などの標識体を作用させ、この標識体を検出することができる。放射性同位体としては、３２Ｐ、１２９Ｉ、３５Ｓなどを用いることができる。また蛍光物質としては、例えば、フルオレセン（ＦＩＴＣ）、スルホローダミン（ＴＲ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）などを用いることができる。また発光物質としてはルシフェリンなどを用いることができる。
【００３９】
これら標識体の種類や標識体の導入方法等に関しては、特に制限されることはなく、従来公知の各種手段を用いることができる。例えば標識体の導入方法としては、放射性同位体を用いるランダムプライム法が挙げられる。
【００４０】
標識したｄＮＴＰを取り込んだ増幅産物を観察する方法としては、上述した標識体を検出するための当技術分野で公知の方法であればいずれの方法でもよい。例えば、標識体として放射性同位体を用いた場合には、放射活性を、例えば液体シンチレーションカウンター、γ−カウンターなどにより計測することができる。また標識体として蛍光を用いた場合には、その蛍光を蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダーなどを用いて検出することができる。
【実施例】
【００４１】
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例によってなんら制限されるものではない。
【００４２】
＜材料＞
ユーカリ・ダニアイ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｄｕｎｎｉｉ  Ｍａｉｄｅｎ．）１６個体、ユーカリ・グロブラス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｌｏｂｕｌｕｓ  Ｌａｂｉｌｌ．）８個体、ユーカリ・カマルドレンシス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｃａｍａｌｄｕｌｅｎｓｉｓ  Ｄｅｈｎｈ．）４個体、ユーカリ・ナイテンス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｎｉｔｅｎｓ  Ｍａｉｄｅｎ．）３個体を使用した。
【００４３】
＜ユーカリ属植物の全ＤＮＡの単離＞
全ＤＮＡは白石らの方法（白石  進・渡辺敦史（１９９５）ｒｂｃ  Ｌ遺伝子多型を利用したアカマツとクロマツの葉緑体ゲノム識別．日林誌  ７７：４２９−４３６）に従って抽出を行った。得られたＤＮＡはＴＥ緩衝液に溶解した。
【００４４】
＜ユーカリ属植物多型的ＤＮＡの取得＞
得られたユーカリ属植物のゲノムＤＮＡを鋳型としてＲＡＰＤ分析を行った。ＲＡＰＤ分析はゲノムＤＮＡ１０ｎｇ、プライマー５’−ＣＣＡＧＣＧＴＡＴＴ−３’（配列番号８５）終濃度１μＭ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ社製）０．１ユニット、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ各２００μＭを加えた増幅用緩衝液２０μｌ中で行った。ＰＣＲサイクルはサーマルサイクラー（ＭＰ、宝酒造社製）中で、鋳型ＤＮＡを９５℃で５分間変性させ、変性：９５℃で１分間、アニーリング：３６℃で３０秒間、伸長反応：７２℃で１分間を１サイクルとして４５回繰り返した後、さらに７２℃で５分間伸長反応を行った。
【００４５】
次に、該ＰＣＲ反応液からＰＣＲ産物を分離させるために、１．５％アガロースゲルによる電気泳動を行った。ＰＣＲ反応液９μｌとローディングバッファー１μｌを混合した後、１．５％アガロースゲルで、１００Ｖにて１時間電気泳動を行った。泳動終了後、該アガロースゲルを０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドを含むＴＡＥバッファー溶液に約３０分浸積し、アガロースゲル内のＤＮＡを染色した。その後、暗所で紫外線を照射し、ゲル中のＤＮＡバンドを検出した。
【００４６】
複数増幅されるＤＮＡバンドの内、ユーカリ属植物個体間で多型的なバンドが１０３８ｂｐに観察された。このバンドをゲルごとカッターで切りだし、市販の精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、使用法に従い、ＤＮＡを回収、精製した。次にＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、使用法に従い、該ＰＣＲ産物をクローニングし、ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社製のキャピラリーシーケンサーＣＥＱ８０００を用いて目的のＤＮＡ配列を決定し、配列番号１で表されるＤＮＡを得た。
【００４７】
同様にＲＡＰＤ分析において配列番号８６〜１１１のプライマーを用いることによって、２７本の多型的なＤＮＡバンドを検出した。さらに同様に該ＤＮＡバンドの塩基配列を決定し、配列番号２〜２８で表されるＤＮＡを得た。
【００４８】
得られたＤＮＡ（配列番号１〜２８）を基に、該ＤＮＡの一部をＰＣＲ増幅可能なプライマーを設計し、配列番号２９〜８４で表されるオリゴヌクレオチドプライマーを得た。
【００４９】
＜配列番号１で表されるＤＮＡを利用したユーカリ属植物の個体識別＞
配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡの一部を増幅するようなオリゴヌクレオチドＡＧＴＴＡＧＧＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＴＡＡＡＧＧ（配列番号２９）とＴＡＧＡＡＧＣＡＡＡＡＣＧＣＣＣＡＣＣＡＡＣＣ（配列番号３０）（プライマーセット１）をプライマーとして用いるＰＣＲ法により、ユーカリ属植物３１個体の個体識別を行った。
【００５０】
＜ＤＮＡ増幅＞
ＰＣＲ反応は全ＤＮＡ１０ｎｇ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ各２００μＭ（最終濃度）、Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ社製）０．５ユニットおよび添付の増幅反応用緩衝液２０μｌ中で行った。ＰＣＲサイクルは９５℃で２分間変性させた後、変性：９５℃で３０秒間、アニーリング：６５℃で３０秒間、伸長反応：７２℃で９０秒間のサイクルを３０回行った後、７２℃で５分間伸長反応を行った。
【００５１】
次に該ＰＣＲ反応液からＰＣＲ産物を分離させるために、１．５％アガロースゲルによる電気泳動を行った。ＰＣＲ反応液９μｌとローディングバッファー１μｌを混合した後、１．５％アガロースゲルで、１００Ｖにて１時間電気泳動を行った。泳動終了後、該アガロースゲルを０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドを含むＴＡＥバッファー溶液に約３０分浸積し、アガロースゲル内のＤＮＡを染色した。その後、暗所で紫外線を照射し、ゲル中のＤＮＡバンドを検出した。結果を図１に示す。
【００５２】
図１に示すように、ＤＮＡバンドが検出される個体と検出されない個体を識別することができた。
【００５３】
図１はオリゴヌクレオチドセット番号１をプライマーとしてＰＣＲを行った後のアガロース電気泳動パターンの一部である。図中、Ｍは電気泳動マーカーを示す。
【００５４】
同様に配列番号２〜２８で表される塩基配列からなるＤＮＡの一部を増幅するようなオリゴヌクレオチド（それぞれ、配列番号２９〜８４、プライマーセット２〜２８）をプライマーとして用いるＰＣＲ法により、ユーカリ属植物３１個体の個体識別を行った。
【００５５】
以下の表１〜３に、供試した３１個体についてプライマーセット１〜２８で表されるオリゴヌクレオチドのセット（配列番号２９〜８４）をプライマーとして用いるＰＣＲにおけるＤＮＡ増幅の有無を記した。供試した３１個体はそれぞれ異なるＤＮＡ増幅のパターンを示した。
【００５６】
【表１】
2007037501.tif 000002
【００５７】
【表２】
2007037501.tif 000003
【００５８】
【表３】
2007037501.tif 000004
【００５９】
上記、表１〜３は、供試した３１個体について、プライマーセット１〜２８であらわされるオリゴヌクレオチド（配列番号２９〜８４）をプライマーとして用いるＰＣＲにおけるＤＮＡ増幅の有無を示したものである。ＤＮＡ増幅が認められた場合は「１」、認められなかった場合は「０」で、表記している。
【００６０】
これらの結果より、配列番号１〜２８で表される塩基配列からなるＤＮＡの一部を増幅するようなオリゴヌクレオチド（配列番号２９〜８４、プライマーセット１〜２８）をプライマーとして用いたＰＣＲによる分析結果を複数比較して用いることによって、ユーカリ属植物の個体識別が可能であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】供試した３１個体についてプライマーセット１（配列番号２９および３０）をプライマーとして用い、ＰＣＲを行った後のアガロース電気泳動のパターンの一部を示す。
【図１】
2007037501.tif 000005
【配列表】
2007037501000001.app