(57)【要約】      （修正有）【課題】  白血病芽球の濃縮又は分離に応用できる、白血病芽球を特異的に検出する試薬を提供すること。【解決手段】  以下のオリゴヌクレオチド対からなるWT1  mRNA検出プローブ：（１）5'-ggcggcgggggtggcg-3'及び5'-gatgaaggagtgaggcggc-3'（２）5'-gacagtgaaggcgctcaggc-3'及び5'-gtgaactggccggaaaagtg-3'（３）5'-gtggttggggaactgc-3'及び5'-gatcctcatgcttgaatg-3'（４）5'-ccatttcactgagctggag-3'及び5'-tggttgctctgcccttctgt-3'（５）5'-attgggctccgcagaggatg-3'及び5'-caccgtgcgtgtgtattctgt-3'（６）5'-ggtatggtttctcaccagtg-3'及び5'-acagtccttgaagtcacact-3'（７）5'-tacctgtatgagtcctggtg-3'及び5'-gaaggcttttcgcttgttt-3'。ここで、オリゴヌクレオチドの一方にはエネルギードナー蛍光色素が導入され、他方にはエネルギーアクセプター蛍光色素が導入されており、WT1  mRNAとのハイブリッドにおいて、２つの蛍光色素の距離は２〜２０塩基である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の蛍光色素が導入された5'-ggcggcgggggtggcg-3'で表される第１のオリゴヌクレオチドと、第２の蛍光色素が導入された5'-gatgaaggagtgaggcggc-3'で表される第２のオリゴヌクレオチドとからなり、
第１及び第２の蛍光色素のうち、一方がエネルギードナー蛍光色素であり、他方がエネルギーアクセプター蛍光色素であり、
第１及び第２のオリゴヌクレオチドとＷＴ１  ｍＲＮＡとのハイブリッドにおいて第１及び第２の蛍光色素が２〜２０塩基離れた位置に存在する、
ＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ。
【請求項２】
第１の蛍光色素が導入された5'-gacagtgaaggcgctcaggc-3'で表される第１のオリゴヌクレオチドと、第２の蛍光色素が導入された5'-gtgaactggccggaaaagtg-3'で表される第２のオリゴヌクレオチドとからなり、
第１及び第２の蛍光色素のうち、一方がエネルギードナー蛍光色素であり、他方がエネルギーアクセプター蛍光色素であり、
第１及び第２のオリゴヌクレオチドとＷＴ１  ｍＲＮＡとのハイブリッドにおいて第１及び第２の蛍光色素が２〜２０塩基離れた位置に存在する、
ＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ。
【請求項３】
第１の蛍光色素が導入された5'-gtggttggggaactgc-3'で表される第１のオリゴヌクレオチドと、第２の蛍光色素が導入された5'-gatcctcatgcttgaatg-3'で表される第２のオリゴヌクレオチドとからなり、
第１及び第２の蛍光色素のうち、一方がエネルギードナー蛍光色素であり、他方がエネルギーアクセプター蛍光色素であり、
第１及び第２のオリゴヌクレオチドとＷＴ１  ｍＲＮＡとのハイブリッドにおいて第１及び第２の蛍光色素が２〜２０塩基離れた位置に存在する、
ＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ。
【請求項４】
第１の蛍光色素が導入された5'-ccatttcactgagctggag-3'で表される第１のオリゴヌクレオチドと、第２の蛍光色素が導入された5'-tggttgctctgcccttctgt-3'で表される第２のオリゴヌクレオチドとからなり、
第１及び第２の蛍光色素のうち、一方がエネルギードナー蛍光色素であり、他方がエネルギーアクセプター蛍光色素であり、
第１及び第２のオリゴヌクレオチドとＷＴ１  ｍＲＮＡとのハイブリッドにおいて第１及び第２の蛍光色素が２〜２０塩基離れた位置に存在する、
ＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ。
【請求項５】
第１の蛍光色素が導入された5'-attgggctccgcagaggatg-3'で表される第１のオリゴヌクレオチドと、第２の蛍光色素が導入された5'-caccgtgcgtgtgtattctgt-3'で表される第２のオリゴヌクレオチドとからなり、
第１及び第２の蛍光色素のうち、一方がエネルギードナー蛍光色素であり、他方がエネルギーアクセプター蛍光色素であり、
第１及び第２のオリゴヌクレオチドとＷＴ１  ｍＲＮＡとのハイブリッドにおいて第１及び第２の蛍光色素が２〜２０塩基離れた位置に存在する、
ＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ。
【請求項６】
第１の蛍光色素が導入された5'-ggtatggtttctcaccagtg-3'で表される第１のオリゴヌクレオチドと、第２の蛍光色素が導入された5'-acagtccttgaagtcacact-3'で表される第２のオリゴヌクレオチドとからなり、
第１及び第２の蛍光色素のうち、一方がエネルギードナー蛍光色素であり、他方がエネルギーアクセプター蛍光色素であり、
第１及び第２のオリゴヌクレオチドとＷＴ１  ｍＲＮＡとのハイブリッドにおいて第１及び第２の蛍光色素が２〜２０塩基離れた位置に存在する、
ＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ。
【請求項７】
第１の蛍光色素が導入された5'-tacctgtatgagtcctggtg-3'で表される第１のオリゴヌクレオチドと、第２の蛍光色素が導入された5'-gaaggcttttcgcttgttt-3'で表される第２のオリゴヌクレオチドとからなり、
第１及び第２の蛍光色素のうち、一方がエネルギードナー蛍光色素であり、他方がエネルギーアクセプター蛍光色素であり、
第１及び第２のオリゴヌクレオチドとＷＴ１  ｍＲＮＡとのハイブリッドにおいて第１及び第２の蛍光色素が２〜２０塩基離れた位置に存在する、
ＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドから構成される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドがリボヌクレオチドから構成される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチドから構成される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドが２’−Ｏ−４’−Ｃ−架橋ヌクレオチドから構成される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ。
【請求項１２】
２’−Ｏ−４’−Ｃ−架橋ヌクレオチドが２’−Ｏ−４’−Ｃ−メチレン架橋ヌクレオチドである、請求項１１に記載のＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ。
【請求項１３】
２’−Ｏ−４’−Ｃ−架橋ヌクレオチドが２’−Ｏ−４’−Ｃ−エチレン架橋ヌクレオチドである、請求項１１に記載のＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ。
【請求項１４】
オリゴヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド及び２’−Ｏ−４’−Ｃ−架橋ヌクレオチドからなる群から選択される２種以上のヌクレオチドから構成されるキメラオリゴヌクレオチドである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ。
【請求項１５】
オリゴヌクレオチドがホスホロチオエート型ヌクレオチドである、請求項８〜１４のいずれか一項に記載のＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブからなる白血病芽球検出試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ及び白血病芽球検出試薬に関する。より詳細には、本発明は、ＷＴ１  ｍＲＮＡをＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）により検出することを利用して、白血病芽球を検出することに関する。
【背景技術】
【０００２】
白血病の診断・治療にとって、白血病芽球（癌化した白血球）のキメラ染色体の解析が重要である。正確な解析を行うためには検体中の白血病芽球の比率（白血球全体に占める割合）が高いことが望ましいが、通常、その比率は数パーセント程度であり、正確な解析を行うには不十分である。そこで、種々の方法により白血病芽球の濃縮が試みられているが、臨床現場の要求を満足する充分な方法は存在しない。
【０００３】
【特許文献１】特開２００１−２８６２８５号公報
【非特許文献１】Inoue K et al., Blood, vol. 84, pp.3071-3079 (1994).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
白血病芽球を白血球分画から濃縮又は分離する優れた方法が開発できれば、白血病をより正確に診断でき、より適切に治療できる。したがって、本発明の目的は、白血病芽球の濃縮又は分離に応用できる、白血病芽球を特異的に検出する試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
白血病芽球を特異的に検出するため、本発明者らはＷＴ１遺伝子に着目した。ＷＴ１遺伝子は、当初、小児の腎臓癌であるウィルムス腫瘍の原因遺伝子として見つかったが、その後、白血病芽球において高発現していることが分かっている（非特許文献１）。本発明者らは、ＷＴ１  ｍＲＮＡを発現している細胞を特異的に検出することで白血病芽球が検出でき、セルソーター等と組み合わせることにより白血病芽球を分離することができると考えた。
【０００６】
そして、ＷＴ１  ｍＲＮＡを発現している細胞を特異的に検出する方法として、ＦＲＥＴを利用した方法（特許文献１）を適用することとし、ＷＴ１  ｍＲＮＡを検出するためのＦＲＥＴプローブを開発した。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下のオリゴヌクレオチド対からなるＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ（ＦＲＥＴプローブ；一方はドナープローブで、他方はアクセプタープローブである）を提供する。
（１）5'-ggcggcgggggtggcg-3'及び5'-gatgaaggagtgaggcggc-3'。
（２）5'-gacagtgaaggcgctcaggc-3'及び5'-gtgaactggccggaaaagtg-3'。
（３）5'-gtggttggggaactgc-3'及び5'-gatcctcatgcttgaatg-3'。
（４）5'-ccatttcactgagctggag-3'及び5'-tggttgctctgcccttctgt-3'。
（５）5'-attgggctccgcagaggatg-3'及び5'-caccgtgcgtgtgtattctgt-3'。
（６）5'-ggtatggtttctcaccagtg-3'及び5'-acagtccttgaagtcacact-3'。
（７）5'-tacctgtatgagtcctggtg-3'及び5'-gaaggcttttcgcttgttt-3'。
ここで、オリゴヌクレオチド対のうち一方のオリゴヌクレオチドはエネルギードナー蛍光色素が導入され（ドナープローブ）、他方のオリゴヌクレオチドはエネルギーアクセプター蛍光色素が導入されている（アクセプタープローブ）。また、オリゴヌクレオチド対とＷＴ１  ｍＲＮＡとのハイブリッドにおいて、エネルギードナー蛍光色素とエネルギーアクセプター蛍光色素は２〜２０塩基離れた位置に存在する。
【０００８】
上記（１）〜（７）のＦＲＥＴプローブは、高い効率でＷＴ１  ｍＲＮＡにハイブリダイズするため、ＷＴ１  ｍＲＮＡを高感度に検出できる。
【０００９】
また、上記（１）〜（７）のＦＲＥＴプローブは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド及び２’−Ｏ−４’−Ｃ−架橋ヌクレオチド（２’−Ｏ−４’−Ｃ−メチレン架橋ヌクレオチド、２’−Ｏ−４’−Ｃ−エチレン架橋ヌクレオチドなど）から選択されるいずれかのヌクレオチド、またはこれらのヌクレオチドの任意の組合せからなる２種以上のヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドである。また、オリゴヌクレオチドは、通常のホスホジエステル型ではなく、ホスホロチオエート型であってもよい。
【００１０】
また、本発明は、上記ＦＲＥＴプローブからなる白血病芽球検出試薬を提供する。白血病芽球はＷＴ１を高発現しているため、上記ＦＲＥＴプローブを用いてＷＴ１  ｍＲＮＡが高発現していることが確認できた細胞を白血病芽球であると同定することができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブは、ＷＴ１  ｍＲＮＡを特異的かつ高感度に検出することができ、それにより、白血病芽球を検出することができる。したがって、本発明の白血病芽球検出試薬を利用して、白血病芽球を特異的に分離することができ、白血病の診断・治療に応用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブは、表１に示した塩基配列を有し、それぞれ１分子の蛍光色素で標識された１対のオリゴヌクレオチド（ＦＲＥＴプローブ対）からなる。
【００１３】
【表１】
2007037463.tif 000002
【００１４】
表１中、a, t, g, cはそれぞれ、アデニン、チミン、グアニン、シトシンのヌクレオチド塩基を表す（ただし、tは適宜u（ウラシル）と読み替えるものとする）。位置は、ＷＴ１  ｍＲＮＡの開始コドンのアデニンの位置を１としたときのＷＴ１  ｍＲＮＡにおける相対的な位置を表す。
【００１５】
蛍光色素の導入位置は、ドナープローブ、アクセプタープローブ及びＷＴ１  ｍＲＮＡの３者により形成されるハイブリッドにおいて、エネルギードナー蛍光色素からエネルギーアクセプター蛍光色素に有意の効率でＦＲＥＴが生じるように決定する。ハイブリッド上において２つの蛍光色素の距離が２〜２０塩基であるときにこのような条件を満足することが、先行技術文献において明らかである（Tsuji et al., Biophys. J., vol. 78, pp.3260-3274 (2000) 及び Tsuji et al., Biophys. J., vol. 81,pp.501-515 (2001) 等）。また、蛍光色素の導入位置は、５’末端、３’末端及び鎖内のいずれでもよい（Tsuji et al., Biophys. J., vol. 78, pp.3260-3274 (2000) 及び Tsuji et al., Biophys. J., vol. 81,pp.501-515 (2001) 等）。高い効率でＦＲＥＴを生じさせるためには、２つの蛍光色素の距離は、２〜４塩基であることが好ましい。
【００１６】
エネルギードナー蛍光色素は、直接又はヘキシルアミノ基などのリンカーを介して結合している。エネルギードナー蛍光色素はＦＲＥＴに通常用いられるエネルギードナー蛍光色素が利用できるが、例えば、以下の蛍光色素が挙げられる：４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−８−プロピオン酸（4,4-difluoro-1,3,5,7-tetramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-8-propionicacid）及びその誘導体（これらはBodipy493/503シリーズとしてモレキュラープローブス社から入手可能）；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（５−イソチオシアネート及び６−イソチオシアネートの混合物であってもよい）（tetramethylrhodamine-5-(and-6)-isothiocyanate）及びその誘導体（これらはTRITCシリーズとしてモレキュラープローブス社から入手可能）；４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸（4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionicacid）及びその誘導体（これらはBodipy FLシリーズとしてモレキュラープローブス社から入手可能）；Alexa Fluor 488などのAlexa Fluorシリーズ（モレキュラープローブス社から入手可能）等が挙げられる。
【００１７】
エネルギーアクセプター蛍光色素も、直接又はヘキシルアミノ基などのリンカーを介して結合している。エネルギーアクセプター蛍光色素はＦＲＥＴに通常用いられるエネルギーアクセプター蛍光色素が利用できるが、例えば、以下の蛍光色素が挙げられる：１，１’−ビス（ε−カルボキシペンチル）−３，３，３’，３’−テトラメチルインドジカルボシアニン−５，５’−二スルホン酸  カリウム塩（1,1'-bis(ε-carboxypentyl)-3,3,3',3'-tetramethylindodicarbocyanine-5,5'-disulfonatepotassium salt）及びその誘導体（これらはCy5シリーズとしてアマシャムバイオサイエンス社から入手可能）；１，１’−ビス（ε−カルボキシペンチル）−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン−５，５’−二スルホン酸  カリウム塩（1,1'-bis(ε-carboxypentyl)-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine-5,5'-disulfonatepotassium salt)及びその誘導体（これらはCy3シリーズとしてアマシャムバイオサイエンス社から入手可能）；Ｘ−ローダミンイソチオシアネート（５−イソチオシアネート及び６−イソチオシアネートの混合物であってもよい）（X-rhodamine-5-(and-6)-isothiocyanate）及びその誘導体（これらはXRITCシリーズとしてモレキュラープローブス社から入手可能）；６−（（（４，４−ジフロロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−イル）スチリロキシ）アセチル）アミノヘキサン酸（6-(((4,4-difluoro-5-(2-thienyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-yl)styryloxy)acetyl)aminohexanoicacid）及びその誘導体（これらはBodipy630/650シリーズとしてモレキュラープローブス社から入手可能）；６−（（（４，４−ジフロロ−５−（２−ピローリル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−イル）スチリロキシ）アセチル）アミノヘキサン酸（6-(((4,4-difluoro-5-(2-pyrrolyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-yl)styryloxy)acetyl)aminohexanoicacid）及びその誘導体（これらはBodipy650/665シリーズとしてモレキュラープローブス社から入手可能）；Alexa Fluor 647などのAlexa Fluorシリーズ（モレキュラープローブス社から入手可能）等が挙げられる。
【００１８】
本発明においては、エネルギードナー蛍光色素としてはBodipy 493/503又はAlexa Fluor488を用いることが好ましく、エネルギーアクセプター蛍光色素としてはCy5又はAlexa Fluor 647を用いることが好ましい。
【００１９】
上記のＦＲＥＴプローブは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド及び２’−Ｏ−４’−Ｃ−架橋ヌクレオチド（２’−Ｏ−４’−Ｃ−メチレン架橋ヌクレオチド、２’−Ｏ−４’−Ｃ−エチレン架橋ヌクレオチドなど）からなる群から選択されるいずれかのヌクレオチド、またはこれらのヌクレオチドの任意の組合せからなる２種以上のヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドである。
【００２０】
デオキシリボヌクレオチドから構成されるプローブはＤＮＡプローブであり、リボヌクレオチドから構成されるプローブはＲＮＡプローブである。
【００２１】
２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチドは、リボヌクレオチドのリボース２’位のヒドロキシル基がメチル化されており、そのオリゴヌクレオチドから構成されるプローブは、ＤＮＡプローブやＲＮＡプローブに比べてヌクレアーゼに対する安定性等が向上している。
【００２２】
２’−Ｏ−４’−Ｃ−架橋ヌクレオチドは、リボヌクレオチドのリボースの２’−Ｏと４’−Ｃとがアルキレン鎖（メチレン、エチレンなど）で架橋されているヌクレオチドであり、Locked Nucleic Acid (LNA)とも呼ばれる。架橋によってリボース環のフレキシビリティが制限され、それにより、ハイブリダイゼーション能が向上し（Ｔｍ値の増加）、ヌクレアーゼに対する安定性も向上している。
【００２３】
また、上記オリゴヌクレオチドは、通常のホスホジエステル型ではなく、ホスホロチオエート型であってもよく、そのようなオリゴヌクレオチドをＳ−オリゴという。オリゴヌクレオチドは、通常、ホスホジエステル結合を介してリボース同士が結合しているが、その結合がホスホロチオエート基に置き換わったＳ−オリゴは、ヌクレアーゼに対する安定性が向上している。デオキシリボヌクレオチドやリボヌクレオチドがホスホロチオエート基で結合したオリゴヌクレオチドのみならず、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチドや２’−Ｏ−４’−Ｃ−架橋ヌクレオチドがホスホロチオエート基で結合したオリゴヌクレオチドも、ＦＲＥＴプローブとして機能し得る。
【００２４】
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、公知の方法（例えば、ホスホロアミダイト法、βシアノエチルアミダイト法、ホスホロチオエート法）に従って合成することが可能である。目的とするオリゴヌクレオチドの種類に応じて、必要な試薬（ホスホロアミダイト試薬等）を使い分けることができ、そのような試薬は市販されている。
【００２５】
以上、本発明のＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブについて説明してきたが、ＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブを用いた白血病芽球の検出方法について以下で説明する。
【００２６】
まず、本発明のＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブを生細胞（白血球）に導入する。導入方法は公知の方法、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法などが適用可能である。また、ストレプトリシンＯなどの細菌毒素で膜穿孔処理する方法も適用できる。
【００２７】
細胞内にＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブを導入した後は、ドナープローブ及びアクセプタープローブをＷＴ１  ｍＲＮＡにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば、白血病芽球検出試薬を導入した細胞を室温において数分間インキュベーションすればよい。
【００２８】
ストレプトリシンＯなどで膜穿孔処理をした場合、ハイブリダイゼーション後に膜の再封入（血清を含む培地で数分間インキュベーションする）を行うことが好ましい。
【００２９】
次にドナープローブ及びアクセプタープローブとＷＴ１  ｍＲＮＡとのハイブリッドが存在する細胞を検出する。ドナープローブに結合している蛍光色素の励起光を細胞に照射し、ＦＲＥＴに基づくアクセプタープローブに結合している蛍光色素からの蛍光を観測することで、白血病芽球が検出できる。
【００３０】
励起光の照射によって、ｍＲＮＡとハイブリダイズしているドナープローブのエネルギードナー蛍光色素も、ｍＲＮＡとハイブリダイズしていないドナープローブのエネルギードナー蛍光色素も同時に励起されるが、ドナープローブに近接してアクセプタープローブがハイブリダイズしている場合にのみＦＲＥＴが生じ、このときはアクセプタープローブのエネルギーアクセプター蛍光色素から蛍光が生じる。すなわち、エネルギーアクセプター蛍光色素からの蛍光の観察は、ドナープローブとアクセプタープローブが近接していることを意味し、生細胞中にＷＴ１  ｍＲＮＡが発現していることがわかる。
【００３１】
このようにして検出されたＷＴ１  ｍＲＮＡを発現している生細胞が選択的に分離される。分離方法に関しては特に制限はないが、セルソーター（Fluorescence Activated Cell Sorter、ＦＡＣＳ）を用いて、ＷＴ１  ｍＲＮＡを発現している生細胞を検出するとともに、選択的に分離することが好ましい。
【００３２】
セルソーターは、フローサイトメーターと細胞分取装置とを備えたものであり、特定物質を蛍光標識プローブで染色した個々の細胞に、細い流路の途中でレーザー光を照射することにより、散乱光（前方散乱光や側方散乱光）や蛍光のシグナル情報を個々の細胞ごとに測定し、その結果を、例えば度数分布（ドットプロット）として表示する機能を有しており、特定のシグナル情報を発する細胞にゲートをかけ所望の細胞を分取することができる。以上のような方法はフローサイトメトリーと呼ばれている。
【００３３】
例えば以下に述べる方法を適用して、ＷＴ１  ｍＲＮＡを発現している生細胞を分離することができる。すなわち、セルソーターにより個々の生細胞における、エネルギードナー蛍光色素（例えば、Bodipy 493/503）を励起するレーザーを照射したときの同蛍光色素の相対的蛍光強度、及びＦＲＥＴに基づくエネルギーアクセプター蛍光色素（例えば、Ｃｙ５）の相対的蛍光強度のシグナル情報を得て、例えば、前者を横軸、後者を縦軸としてドットプロットを行い、後者が高い値をとる細胞群を選択し、Ｒ２として領域指定する。さらに、測定対象の生細胞の細胞サイズに基づく前方散乱光と、生細胞の内部構造の複雑さに基づく側方散乱光のシグナル情報を得て、例えば、前者を横軸、後者を縦軸としてドットプロットを行い、測定対象の生細胞を表わしていると考えられる細胞群を選択し、Ｒ１として領域指定する。そして、Ｒ１及びＲ２の両選択条件を満たす（Ｒ１かつＲ２に属する）生細胞のみを分取できるようにセルソーターをセッティングすることにより、ＷＴ１  ｍＲＮＡが発現している細胞のみを選択的に分離することができる。
【実施例】
【００３４】
（FRETプローブの合成）
【００３５】
【表２】
2007037463.tif 000003
【００３６】
ここでは、ドナープローブ、アクセプタープローブ及びＷＴ１  ｍＲＮＡの３者により形成されるハイブリッドにおいて、蛍光色素間の距離は４塩基であるが、蛍光色素間の距離は４塩基に限定されるものではない。また、ドナープローブにおけるエネルギードナー蛍光色素の導入位置を５’末端とし、アクセプタープローブにおけるエネルギーアクセプター蛍光色素を３’末端から３又は４塩基の鎖内としているが、導入位置はこれらに限定されるものではない。また、３者のハイブリッドは、ドナープローブの５’末端がアクセプタープローブの３’末端と隣り合うようにして形成されているが、この形態に限定されず、アクセプタープローブの５’末端がドナープローブの３’末端と隣り合うようにして形成されていてもよい。すなわち、例えば、上記表２において、xをCy5などのエネルギーアクセプター蛍光色素とし、yをBodipy 493/503などのエネルギードナー蛍光色素としてもよい。
【００３７】
表２に記載した配列を有するドナープローブを特許文献１に記載の方法に準じて合成した。より詳細には、以下の通りである。2.5mgのNHSS(N-Hydroxysulfosuccinimidesodium salt)を30μLの滅菌水に溶かした溶液と、5mgのEDAC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)を50μLの滅菌水に溶かした溶液と1mgのBodipy493/503プロピオン酸を50μLのDMFに溶かした溶液を混合し、室温で30分間反応させた。
【００３８】
一方、DNA/RNAシンセサイザー（PerkinElmer社製モデル394又はPerceptive Biosystems社製モデル8909）を用いて、βシアノエチルアミダイト法により、表２に記載の塩基配列のうちxを除いた塩基配列を有するオリゴDNAを合成した。合成したオリゴDNAの5'末端に、６−（トリフルオロアセチルアミノ）ヘキシル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホロアミダイトを用いてヘキシルアミノ基を導入し、凍結乾燥した。これを200μLの0.5M Na2HCO3/NaH2CO3緩衝液（pH9.3）に溶解した。
【００３９】
これらを混合し、遮光条件下で一晩反応させた。反応液をゲル濾過して未反応の色素を除去した後、CAPCELL PACK18（資生堂社製、カラムサイズは6mm内径×250mm全長）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（流速：1mL/分、カラム温度：40℃、移動相組成：5mM triethylammonium acetateを含む5%アセトニトリル水溶液（Ａ）及び5mM triethylammonium acetateを含む40%アセトニトリル水溶液（Ｂ）、濃度勾配：30-80%Ｂ（0-20分））により、260nmと493nmに吸収をもつ画分を分取し、凍結乾燥した。
【００４０】
次に、表２に記載したアクセプタープローブを特許文献１に記載の方法に準じて合成した。より詳細には、以下の通りである。１チューブ分のCy5色素（Amersham社製, Fluorolink Cat. No. PA25001）を100μLの滅菌水に溶解した。
【００４１】
一方、Uni-Link AminoModifier (Clontech社製)を用いて表２に記載の塩基配列中yに相当する部分にヘキシルアミノ基を導入したオリゴDNAを合成し、凍結乾燥した。これを200μLの Na2HCO3/NaH2CO3緩衝液（0.5M、pH9.3）に溶解した。
【００４２】
これらを混合し、遮光条件下で一晩反応させた。反応液をゲル濾過して未反応の色素を除去した後、CAPCELL PACK18を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（流速：1mL/分、カラム温度：40℃、移動相組成：5mM triethylammonium acetateを含む5%アセトニトリル水溶液（Ａ）及び5mM triethylammonium acetateを含む40%アセトニトリル水溶液（Ｂ）、濃度勾配：15-60%Ｂ（0-20分））により、260nmに吸収をもつ画分を分取した。得られた画分の吸収スペクトルを220-700nmの範囲で測定し、650-700nmにおけるCy5の吸収極大を確認後、得られた画分を凍結乾燥した。
【００４３】
（WT1 mRNAの調製）
ヒトWT1のcDNAを含むプラスミドDNA（pUCWT1；理化学研究所バイオリソースセンターから購入）を制限酵素EcoRI及びHincIIで切断し、WT1 cDNA断片を得た。WT1 cDNA断片を、RNA合成用ベクターpBluescriptII KS+のEcoRI/HincIIによる消化部位に、T7プロモーター下流に断片が位置するように、ライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて結合させた。得られた組換えプラスミドを大腸菌JM109株のコンピテントセル（タカラバイオ社製）に導入し、得られた形質転換体を培養し組換えプラスミドを複製した。
【００４４】
複製したプラスミドをHincIIにより直鎖状にした後、ProteinaseK（タカラバイオ社製）及びフェノール・クロロホルムで処理し、変性、除タンパクを行った。このように精製した遺伝子断片を鋳型として、インビトロ転写キット（Megascript T7 Kits：Ambion社）を用いてRNAを合成した。RNA溶液にDNaseI（タカラバイオ社製）を加えてプラスミドDNAを消化した後、等量の塩化リチウム溶液と2倍量のエタノールを加えてRNAを沈殿させ、70%エタノールで洗浄した後、乾燥した。RNaseを含有しない蒸留水にRNAを溶解させて、以下の実験に用いた。
【００４５】
（蛍光スペクトル変化の測定）
ドナープローブとアクセプタープローブが近接してハイブリダイゼーションすることに伴うFRETによる蛍光スペクトルの変化を測定した。ドナープローブ及びアクセプタープローブを終濃度1μMとなるように150μLの1xSSC（150mM塩化ナトリウム、17mMクエン酸ナトリウム、pH7.0）溶液に加え、室温で15分放置した後、四面透過の石英製のキュベットに注入し、蛍光分光光度計（F4500；日立製作所製）により励起波長488nm、蛍光波長500-750nmの範囲で蛍光スペクトルを測定した。次に、この溶液にWT1 mRNAを50pmol添加し、30分放置した後、室温における蛍光スペクトルを測定して、ハイブリダイゼーションに伴う蛍光スペクトルの変化を観察した。蛍光スペクトルを測定した後、さらにWT1 mRNAを50pmol添加し、再度、蛍光スペクトルを測定した。WT1 mRNAの量が200pmolになるまで、同様の操作を繰り返し、蛍光スペクトルを測定した。
【００４６】
表２に列挙したプローブの蛍光スペクトルの変化を図１〜８に示す。WT1Ex1cプローブを用いた場合（図３）には蛍光スペクトルの変化が認められなかったが、それ以外のプローブを用いた場合（図１〜２及び４〜８）には蛍光スペクトルの変化が認められた。表３に、FRETプローブ単独存在下及びWT1mRNA（200pmol）との共存下における、515nmの蛍光強度に対する670nmの蛍光強度の比（I670nm/I515nm）をまとめた。
【００４７】
【表３】
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【００４８】
（細胞内へのFRETプローブの導入方法の検討）
生細胞内へのFRETプローブの導入方法として、ストレプトリシンＯ（SLO）による膜穿孔及び血清培地による再封入を利用した。SLO処理は、Giles RV etal., Nucleosides & Nucleotides, vol. 16, 1155-1163 (1997)に記載の方法を参考にした。
【００４９】
FRETプローブを導入するための条件検索として、まずは、FITC-Dextran（分子量9300；シグマ社製）を用いて、SLO法の導入効率及び細胞毒性を検討した。
【００５０】
0.05% BSA（ウシ血清アルブミン；シグマ社製）を含む25mLのPBS（リン酸緩衝食塩水）に、25000 UnitのSLO（シグマ社製）を溶解し、1000 Unit/mLのSLO溶液を調製した。膜穿孔処理の前に、終濃度5mMのDTT（ジチオスレイトール）を添加し、37℃で2時間放置した。
【００５１】
恒常的にWT1を発現していると報告されているK562培養細胞株（ヒューマンサイエンス振興財団研究資源バンクから入手；JCRB0019）を10% FBS（ウシ胎児血清）及び1% Glu（グルタミン酸）を含むRPMI-1640培地（いずれもインビトロジェン社製）で培養し、細胞を遠心操作（800g、5分、室温；以下の遠心操作は同一条件）で回収し、RPMI-1640培地（血清非含有）で懸濁し、再び遠心し、血清成分を除去した。細胞をRPMI-1640培地に懸濁し、遠心管１本あたり4x 106個の細胞を含むように分注した。遠心操作後に上清を捨て、沈降してペレット状の細胞塊を、FITC-Dextran（終濃度10μM）を含むRPMI-1640培地200μLに懸濁した。
【００５２】
この200μLの細胞懸濁液に、最終的なユニット数が0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14Unit/106 cellとなるようにSLO溶液を添加し、37℃で10分間インキュベーションを行った。インキュベーション終了後、細胞懸濁液に、1mLの10% FBS及び1% Gluを含むRPMI-1640培地を添加して37℃で30分間インキュベーションし、さらにPI（PropidiumIodide；シグマ社製）を加えて氷温で10分間インキュベーションした。PIはインターカレーターとして核内のDNAを染色する試薬である。PIは通常、細胞膜を透過できないため、SLOによって穿たれた細胞膜が血清培地の添加によって再封入されたかを確認するために用いている。
【００５３】
インキュベーション後に細胞懸濁液を遠心し、上清を捨て、PBSに懸濁し、遠心洗浄した。沈降した細胞塊を1mLのPBSに懸濁し、蛍光顕微鏡観察による細胞群の透過像及び蛍光像からSLOによる膜穿孔処理及び再封入の過程における細胞損傷の有無を確認した。また、同時にFACS（FACSCalibur；Becton Dickinson社製）により、細胞のサイズ（FSC-Height：前方散乱光）、内部構造の複雑さ（SSC-Height：側方散乱光）、細胞に取り込まれたFITC-Dextranの量（蛍光強度FL1として）及び再封入が不完全な細胞数（PIの蛍光強度FL3として）を測定した。
【００５４】
図９は蛍光顕微鏡観察の結果を示し、図１０はFACSの測定結果を示す。これらの結果から、膜穿孔処理によるFRETプローブの導入効率が最も高く、かつ、不完全な再封入が生じ難いSLOの至適濃度は、10Unit/106 cellと考えられた。
【００５５】
次に、血清培地中のインキュベーションによる再封入の条件（温度及び時間）を検討した。2 x 106個のK562細胞を含む40μLのPBSに終濃度10 Unit/106cellのSLO及び終濃度10μMのFITC-Dextranを添加して37℃で10分間インキュベーションした。インキュベーション終了後、細胞懸濁液に、1mLの10% FBS及び1% Gluを含むRPMI-1640培地を添加して、37℃又は氷温にてインキュベーションを行った。培地の添加後10、20、30、40及び60分後に、PIを加えて氷温で10分間インキュベーションした。
【００５６】
図１１に、各条件におけるFITC-Dextran及びPIが取り込まれた細胞の割合を示した。図１１から明らかなように、再封入を37℃、氷温のいずれの条件で行っても、再封入の効果に大きな違いは見られなかった。また、処理時間についても、10分〜60分の間で大きな違いは認められなかった。
【００５７】
（K562細胞へのFRETプローブの導入及びFRETシグナルによる細胞の分離）
K562細胞を遠心操作により回収し、RPMI-1640培地で懸濁した後、遠心管１本あたり2 x 106 cellのK562細胞が含まれるように細胞懸濁液を分注し、遠心を行った。沈降したペレット状の細胞塊に100μMのドナープローブ（終濃度25μM）を10μLと100μMのアクセプタープローブ（終濃度25μM）を10μLとSLO溶液（1000 Unit/mL）を20μLとを加えて懸濁し（合計40μL）、37℃で10分間インキュベーションした。1mLの10% FBS及び1% Gluを含むRPMI-1640培地を添加して、氷温で10分間インキュベーションを行った。遠心操作後にPBSで１回洗浄し、遠心した。1mLのPBSに懸濁した後、FACSで解析を行った。
【００５８】
FRETプローブとして、蛍光スペクトルが著しく変化したWT1Ex1bプローブ及び全く蛍光スペクトルが変化しなかったWT1Ex1cプローブを用いた。FACSの解析結果を図１２に示す。WT1Ex1bプローブを導入した細胞ではFRETによるアクセプタープローブの蛍光の増加が観察され、一方、WT1Ex1cプローブを導入した細胞ではFRETによる蛍光の増加は観察されなかった。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、WT1Ex1aプローブを用いたときの蛍光スペクトル変化を表すグラフである。
【図２】図２は、WT1Ex1bプローブを用いたときの蛍光スペクトル変化を表すグラフである。
【図３】図３は、WT1Ex1cプローブを用いたときの蛍光スペクトル変化を表すグラフである。
【図４】図４は、WT1Ex2プローブを用いたときの蛍光スペクトル変化を表すグラフである。
【図５】図５は、WT1Ex5プローブを用いたときの蛍光スペクトル変化を表すグラフである。
【図６】図６は、WT1Ex6プローブを用いたときの蛍光スペクトル変化を表すグラフである。
【図７】図７は、WT1Ex8プローブを用いたときの蛍光スペクトル変化を表すグラフである。
【図８】図８は、WT1KTSプローブを用いたときの蛍光スペクトル変化を表すグラフである。
【図９】図９は、膜穿孔処理及び再封入処理後のK562細胞の蛍光顕微鏡観察の結果を表す図である。図中の数字は、SLOのユニット数（Unit/106cell）を表す。
【図１０】図１０は、膜穿孔処理及び再封入処理後のK562細胞のFACS解析の結果を表すグラフである。白抜き三角は、FL1(+)かつFL3(-)の細胞に相当し、FITC-Dextranが導入され、PIで染色されない細胞を表す。すなわち、細胞にプローブが導入され、かつ再封入に成功している細胞を表す。黒三角は、FL1(-)かつFL3(-)の細胞に相当し、FITC-Dextranが導入されず、PIで染色されない細胞を表す。すなわち、細胞が膜穿孔されていない未処理の細胞を表す。黒丸は、FL1(-)かつFL3(+)の細胞に相当し、FITC-Dextranが導入されず、PIで染色される細胞を表す。すなわち、細胞が再封入できずに細胞膜が破損した死細胞を表す。白抜き四角は、FL1(+)かつFL3(+)の細胞に相当するが、再封入に失敗した死細胞と考えられる。
【図１１】図１１は、様々な再封入条件における、FITC-Dextran及びPIが取り込まれた細胞の割合を示すグラフである。
【図１２】図１２は、WT1Ex1bプローブ及びWT1Ex1cプローブを導入した細胞のFACSの解析結果を表す図である。（ａ）プローブ未添加（ｂ）WT1Ex1bプローブ添加（ｃ）WT1Ex1cプローブ添加。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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