(57)【要約】【課題】腸内細菌叢を顕著に改善する作用を有する食品およびその製造方法を提供すること【解決手段】抗ウェルシュ菌抗体を含有する乳清タンパクを添加してなり、前記抗体を１μｇ／ｇ以上含有する発酵乳製品等の食品で、添加される乳清タンパクを含有する部分の殺菌方法が、非加熱または乳清タンパクに含まれる抗ウェルシュ菌抗体が７０質量％以上残存する方法で行われる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳清タンパクを添加してなる、抗ウェルシュ菌抗体を１μｇ／ｇ以上含有することを特徴とする、腸内細菌叢改善効果を持つ食品。
【請求項２】
乳清タンパクが抗ウェルシュ菌抗体を含有する請求項１に記載の食品。
【請求項３】
食品が発酵乳製品である請求項１または２に記載の食品。
【請求項４】
乳清タンパクを添加する食品の製造方法において、添加される乳清タンパクを含有する部分については、非加熱または乳清タンパクに含まれる抗ウェルシュ菌抗体が７０質量％以上残存する方法で除菌あるいは殺菌した後添加することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の食品の製造方法。
【請求項５】
前記食品が発酵乳製品であって、常法により発酵させた発酵乳に、乳清タンパクを添加する請求項４に記載の食品の製造方法。
【請求項６】
発酵乳製品の製造方法において、発酵乳原料母液に乳清タンパクを添加し、前記母液中の抗ウェルシュ菌抗体が７０質量％以上残存する方法で除菌あるいは殺菌した後に、発酵微生物スターターを接種して発酵させることを特徴とする腸内細菌叢改善効果を持つ発酵乳製品の製造方法。
【請求項７】
前記発酵微生物スターターが乳酸菌である請求項６に記載の発酵乳製品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な機能を持つ食品およびその製造方法に関し、さらに詳しくは腸内細菌叢を顕著に改善させる作用を持つ食品およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトや動物の腸管内には各種の細菌が定着しており、腸内細菌叢を形成していることが知られている。このような細菌の中には宿主に対して有害な作用をもたらす悪玉菌と、宿主に対して有益な作用をもたらす善玉菌がある。そして、これらの細菌は共生または括抗関係を保っている。悪玉菌としては、アンモニア、硫化水素、アミン等の有害産物を生産し、これにより肝機能に過剰な負担をかけたり、発ガンに関連したりするもの等が挙げられ、具体的な菌種としては例えばウェルシュ菌等のクロストリジウム、腸球菌、連鎖球菌等が挙げられる。また、善玉菌としてはビフィズス菌、ラクトバチルス菌等が挙げられる。
【０００３】
腸内細菌叢の改善、すなわち、前記善玉菌の生育が活発で、菌数が増加することにより、宿主にもたらされる有益な効果として、下痢、便秘を中心とする消化器症状の改善、免疫賦活を介してのガン予防、感染抵抗力等の向上、有害微生物代謝産物及び有害酵素の抑制等、宿主が健康な生活を維持するために必要な、良好な腸内環境をもたらすことにつながる各種の効果が挙げられる。
【０００４】
特に、ビフィズス菌は高齢になると腸内での菌数が減少していくことが知られており、ビフィズス菌の菌数を増加させることが、良好な腸内環境の維持に特に重要である。
【０００５】
ビフィズス菌の菌数の増加を妨げているものに、ウェルシュ菌が挙げられる。ウェルシュ菌の菌数が減少すれば、ビフィズス菌の菌数の増加が期待できる。
【０００６】
ウェルシュ菌に対する抗体（抗ウェルシュ菌抗体）は、ウェルシュ菌の増殖を阻害すると考えられるが、これまでのところ、食品レベルで用いることのできる、安価で、供給の容易な該抗体は知られていない。
【０００７】
腸内細菌叢の改善の役割を担うものとして、プロバイオティクスとプレバイオティクスが挙げられる。プロバイオティクスとはFuller（1989）による定義では、「腸内細菌叢のバランスを改善することによって宿主の健康に好影響を与える生きた菌体」とされている。また、プレバイオティクスとは、「腸内に生息する善玉菌の増殖を助けたり、活性を高めることで腸内環境を改善し、宿主の健康に有利に作用する食品成分」と定義され、オリゴ糖等の難消化性物質やプロピオン酸菌による乳清発酵物等がこれに該当する。
さらに、プロバイオティクスとプレバイオティクスの両者の混合物シンバイオティクスという概念も提唱されている。
【０００８】
プロバイオティクスである微生物のうち、乳酸菌は古くから食品の発酵用に広く利用されていた。例えば、乳をチーズ、ヨーグルト等に加工するために、また、種々の漬物や発酵調味料などに良い味や香りを付けるためにも利用されてきた。これらの乳酸菌類は本来自然界に存在したもので、発酵の原料となる乳類、穀物類、果実類などの自然発酵に関与し、長い間食品として使用されてきた。
【０００９】
また、プロバイオティクスである微生物のうち、ビフィズス菌、特に人の腸管に由来するビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属の菌が、整腸作用、免疫賦活効果、感染防御効果等さまざまな生理効果を示すことが、近年、数多くの研究によって明らかになっており、乳製品の発酵用に使用されるほか、健康食品のサプリメントとして大きな市場を獲得している。
【００１０】
特許文献１においては、乳酸菌またはビフィズス菌と抗体を組み合わせることにより、優れた免疫賦活機能を奏する食品が提案されている。抗体の特異性については記載されていないが、免疫賦活機能を奏するということから、主にエンドトキシンやエンテロトキシンに対する抗体が機能していると考えられる。また、特許文献１には腸内細菌叢の変化については記載されていない。
【特許文献１】特開２００６−１４６５４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明においては、腸内細菌叢を顕著に改善する食品およびその製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは前記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、乳清タンパク中には抗ウェルシュ菌抗体が含まれていることを初めて見出し、産業上利用可能な抗ウェルシュ菌抗体を初めて獲得することができた。そして、乳清タンパクを食品に添加することで、抗ウェルシュ菌抗体を含有する食品を得、これが、腸内細菌叢を改善させることを見出し、本発明に到達した。食品を発酵乳とすると、発酵乳中の乳酸菌、ビフィズス菌との相乗作用から、腸内細菌叢をさらに顕著に改善させることを見出した。抗ウェルシュ菌抗体を含有する発酵乳製品は、発酵乳原料母液に乳清タンパクを添加し、抗ウェルシュ菌抗体が７０質量％以上残存する加熱条件で殺菌した後に発酵させるか、または発酵乳製品に乳清タンパクを添加して、容易に得られることも見出し、本発明に到達した。
【００１３】
すなわち、本発明は下記のとおりである。
１）乳清タンパクを添加してなる、抗ウェルシュ菌抗体を１μｇ／ｇ以上含有することを特徴とする、腸内細菌叢の改善効果を持つ食品、
２）乳清タンパクが抗ウェルシュ菌抗体を含有する請求項１に記載の食品、
３）食品が発酵乳製品である請求項１または２に記載の食品、
４）乳清タンパクを添加する食品の製造方法において、乳清タンパクを含有する部分については、非加熱または乳清タンパクに含まれる抗ウェルシュ菌抗体が７０質量％以上残存する方法で除菌あるいは殺菌した後添加することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の食品の製造方法、
５）前記食品が発酵乳製品であって、常法により発酵させた発酵乳に、乳清タンパクを添加する請求項４に記載の食品の製造方法、
６）発酵乳製品の製造方法において、発酵乳原料母液に乳清タンパクを添加し、前記母液中の抗ウェルシュ菌抗体が７０質量％以上残存する方法で除菌あるいは殺菌した後に、発酵微生物スターターを接種して発酵させることを特徴とする腸内細菌叢改善効果を持つ発酵乳製品の製造方法、および
７）前記発酵微生物スターターが乳酸菌である請求項６に記載の発酵乳製品の製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
請求項１記載の発明によれば、抗ウェルシュ菌抗体を１μｇ／ｇ以上含有することにより腸内細菌叢を改善させる機能を持つ食品を提供することができる。請求項２記載の発明によれば、乳清タンパクの含有する前記抗体が特に前記効果を奏することができる。請求項３記載の発明によれば、食品を発酵乳製品とすることで、発酵乳中の乳酸菌、ビフィズス菌と抗ウェルシュ菌抗体の相乗作用により腸内細菌叢の改善を期待することができる。請求項４記載の発明によれば、添加する乳清タンパクを含有する部分について、非加熱または抗ウェルシュ菌抗体が７０質量％以上残存する方法で除菌あるいは殺菌することにより、前記食品を容易に製造することができる。請求項５に記載の発明によれば常法により製造された発酵乳製品に本発明の効果を付与することができる。請求項６に記載の発明によれば、抗ウェルシュ菌抗体の残存量が多くて、前記効果に優れる発酵乳製品を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明において、食品としては乳清タンパクを添加することのできる全ての加工食品を挙げることができ、原料の由来や形態はいずれでもよい。例えば、ヨーグルトや乳酸菌飲料等の発酵乳製品、加工乳や乳飲料等、発酵乳以外の乳製品類；スポーツ飲料・栄養ドリンク・野菜や果汁飲料等の飲料類；錠菓、キャンディ、チョコレート、シリアル、チューインガム等の菓子類；アイスクリーム、プリン、ゼリー、ババロア等のデザート類；クリームチーズ、マヨネーズ、ピーナッツバター、コンデンスミルク等のスプレッド類；ココア、抹茶粉末、ふりかけ等の粉末食品類等が挙げられるが、これら以外でもよい。 
【００１６】
本発明において、前記食品に添加される乳清タンパクは通常の市販されているもの、すなわち、ホエータンパク濃縮物（ＷＰＣ）、ホエータンパク単離物（ＷＰＩ）、脱塩ホエー粉等が使用できるが、抗ウェルシュ菌抗体の含有量の高いものが好ましい。含有量が５０μｇ／ｇ以上であるとより好ましい。また、全抗体の含有量が高いことも好ましい。含有量が２０ｍｇ／ｇ以上であればより好ましい。乳清からの乳清タンパクの分離法については、各種の方法が採用されているが、ウルトラフィルタレーション法、マイクロフィルタレーション法、クロスフローマイクロフィルタレーション法、イオン交換法、その他いずれの方法によるものでも使用できる。
【００１７】
乳清タンパクの原料としての乳は牛、ヤギ、ヒツジ、馬、水牛等いずれの哺乳動物の乳でもよいが、多量の入手が容易な牛の乳由来の乳清タンパクが好ましい。また、その乳はワクチン接種を受けた哺乳動物から採取された乳でも、ワクチン接種を受けていない哺乳動物から採取された乳でもよい。
【００１８】
本発明において、発酵乳製品としては「乳および乳製品の成分規格等に関する省令」が定める発酵乳および乳酸菌飲料が挙げられる。
すなわち、発酵乳とは、乳等を乳酸菌または酵母で発酵させ、糊状または液状にしたもの、またはこれらを凍結したもので、無脂乳固形分８％以上であり、乳酸菌数または酵母菌数が１０7／ｍｌ以上含まれるものをいう。
乳酸菌飲料とは、乳等を乳酸菌または酵母で発酵させたものを加工し、または主要原料とした飲料で、無脂乳固形分３％以上８％未満のものについては、乳酸菌数または酵母菌数が１０7／ｍｌ以上含まれるものを（ただし、発酵後に加熱殺菌したものはこの限りでない）、無脂乳固形分３％未満のものについては、乳酸菌数または酵母菌数が１０6／ｍｌ以上含まれるものをいう。本発明においては、このほか、ビフィズス菌を接種して発酵させたものも含める。
【００１９】
本発明の腸内細菌叢を改善させる効果を持つ食品は、抗ウェルシュ菌抗体を１μｇ／ｇ以上含有する。１μｇ／ｇ以上含有することにより、人に摂取され、腸内でウェルシュ菌の増殖を抑制し、その結果、腸内細菌叢の顕著な改善が認められる。また、抗ウェルシュ菌抗体以外の抗体も、その摂取により、腸内で胆汁酸の分泌が促進され、胆汁酸に耐性のあるビフィズス菌の増殖が促進され、一方、胆汁酸に感受性のあるウェルシュ菌をはじめとしたクロストリジウム等の悪玉菌は菌数が減少すると考えられるので、全抗体量も多く含有していることが好ましい。抗体の胆汁酸分泌促進作用は便色改善（黄色みが増す）効果からも推定できる。抗ウエルシュ菌抗体量および全抗体量は後記実施例に記載する方法により測定される値である。
【００２０】
本発明の腸内細菌叢改善効果を有する食品は、前記した食品の通常の製造工程における任意の工程において、乳清タンパクを適宜添加することにより製造することができる。食品の製造工程において、食品を殺菌または除菌する必要がある場合、乳清タンパクを含有する部分については、非加熱あるいは抗ウェルシュ菌抗体が７０質量％以上残存する条件で行われる方法が採用される。かかる殺菌方法としては、例えば、７５℃以下での加熱殺菌や、電子線、ガンマ線、紫外線、高電圧パルス、振動磁場、閃光パルス、超音波、高圧処理等を用いた非加熱殺菌等が挙げられる。好ましくは、６３〜７５℃で１５秒〜３０分間の加熱殺菌である。
【００２１】
本発明において、食品が発酵乳製品においては、常法により、発酵させて得られた発酵乳に乳清タンパクを添加することも、また、乳清タンパクを発酵乳の原料母液に添加した後、発酵させることもできる。発酵乳に乳清タンパクを添加する場合において、添加する乳清タンパク部には、糖類を添加することもできる。糖類を添加すると、後の加熱殺菌工程での抗体の安定性を高めることができる。添加する糖類としては、後記する糖類を挙げることができる。また、通常の発酵乳を製造するときに用いる食品素材、食品添加物を添加することもできる。
【００２２】
添加する乳清タンパク部は、含まれる抗ウェルシュ菌抗体が７０質量％以上残存する方法で除菌または殺菌されることが必要であり、このような殺菌方法としては前記した７５℃以下での加熱殺菌や非加熱殺菌方法が挙げられる。好ましくは、６３〜７５℃で１５秒〜３０分間の加熱殺菌法である。
【００２３】
発酵乳への乳清タンパク部の添加方法については、制限はない。例えば、予め発酵乳に乳清タンパク部を添加して容器に充填してもよいし、また、発酵乳部と乳清タンパク部を容器に同時に充填してもよい。
【００２４】
一方、乳清タンパクを発酵乳の原料母液（以下、発酵母液ということがある）に添加した後、発酵させる方法においては、前記母液中の抗ウェルシュ菌抗体が７０質量％以上残存する方法で除菌または殺菌したのちに、発酵微生物スターターを接種して発酵させる。発酵母液としては、通常の発酵乳を製造するときに用いる原料を用いることができる。すなわち、生乳、全粉乳、脱脂粉乳、クリーム等の乳製品；アスパルテーム、ステビアなどの高甘味物質等の甘味料；次項に示すような糖類；クエン酸、リンゴ酸、乳酸などの酸味料；増粘多糖類、ポリデキストロース、ポリグルタミン酸等の安定剤；ビタミンＣ等のビタミン類；風味向上のための乳化香料及び水性香料等の着香料；カロチノイドやアントシアニン等の着色料；ポリフェノール等の抗酸化剤；その他、嗜好成分、機能性成分等から選ばれる数種を混合して得られる液またはそれらの水溶液が用いられる。
【００２５】
発酵母液に糖類を添加すると、後の加熱殺菌工程での抗体の安定性を高めることができる。添加する糖類としては、ブドウ糖、果糖等の単糖類、ショ糖、乳糖、マルトース等の二糖類、フラクトオリゴ糖、乳果オリゴ糖（ラクトスクロース）、ラクチュロース、イソマルトオリゴ糖、大豆オリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、大豆オリゴ糖、キシロオリゴ糖、ラフィノース、パラチノースオリゴ糖、ニゲロオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、トレハロース、カップリングシュガー、ペクチンオリゴ、シクロデキストリン等のオリゴ糖類、グリセリン、ソルビトール、マルチトール、エリスリトール、還元パラチノース、ラクチトール、マンニトール、キシリトール等の糖アルコール類等を用いることができる。糖類は単体ないしは複数種を混合して添加してもよいし、その他の原料乳および副原料中に元来含まれる糖類も乳清タンパク中の抗体の安定性に寄与する。
【００２６】
発酵母液中の糖濃度は、加熱殺菌時において２質量％以上とすると抗体の熱安定性が高まり、抗体の残存率も高くなるので、好ましい。糖類の濃度の上限は特になく、糖の溶解度の範囲であればよい。
【００２７】
発酵母液への乳清タンパクの添加方法に制限はない。また、添加順序も制限はない。例えば、生乳に糖類を添加した後に乳清タンパクを添加してもよいし、生乳に乳清タンパクを添加した後に糖類を添加してもよい。他の粉末原料を用いる場合、あらかじめ粉末原料と乳清タンパクを混合し、これを液体原料に加えると、乳清タンパクの溶解性がよくなるため好ましい。例えば、あらかじめ粉末状の糖類と乳清タンパクを混合し、これを生乳に添加する方法が挙げられる。
【００２８】
発酵乳の製造方法においては、一般に殺菌された発酵母液に発酵微生物スターターを接種し、発酵させるが、本発明において、乳清タンパクを添加した発酵母液の殺菌方法としては母液中の抗ウェルシュ菌抗体が７０質量％以上残存する条件で行われる方法が採用される。かかる殺菌方法としては、例えば、７５℃以下での加熱殺菌や、電子線、ガンマ線、紫外線、高電圧パルス、振動磁場、閃光パルス、超音波、高圧処理等を用いた非加熱殺菌等が挙げられる。好ましくは、６３〜７５℃で１５秒〜３０分間の加熱殺菌である。
【００２９】
乳清タンパクを添加した後、殺菌を行った発酵母液は、通常通り、乳酸菌、ビフィズス菌等の発酵微生物スターターを接種され、２０〜５０℃で８〜２４時間、発酵培養される。また、いわゆるケフィアヨーグルト等のように酵母を添加して複合発酵させることもできる。乳酸菌飲料においては、得られた発酵乳を通常の方法に従い加工して製造される。
【００３０】
本発明において、発酵微生物スターターの１つとして使用される乳酸菌は、ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属するラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス（Lb.delbrueckii subsp.bulgaricus）、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ラクティス（Lb.delbrueckii subsp.lactis）、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・デルブルッキー（Lb.delbrueckii subsp.delbrueckii）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lb.acidophilus）、ラクトバチルス・カゼイ（Lb.casei）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lb.reuteri）、ラクトバチルス・ブレビス（Lb.brevis）、ラクトバチルス・ガッセリ（Lb.gasseri）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Lb.johnsonii）、ラクトバチルス・アラビノサス（Lb.arabinosus）、ラクトバチルス・ヘルベチカス（Lb.helveticus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）属のストレプトコッカス・サーモフィルス（Stc.thermophilus）、ラクトコッカス（Lactococcus）属のラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lc.lactis subsp.lactis）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス（Lc.lactis subsp.cremoris）、ラクトコッカス・プランタラム（Lc.plantarum）、ラクトコッカス・ラフィノラクティス（Lc.raffinolactis）、ペディオコッカス（Pediococcus）属のペディオコッカス・ハロフィルス（P.halophilus）、ペディオコッカス・ペントサシウス（P.pentosaceus）、ロイコノストック（Leuconostoc）属のロイコノストック・メセンテロイデス（Leu.mesenteroides）、ロイコノストック・ラクティス（Leu.lactis）、エンテロコッカス（Enterococcus）属のエンテロコッカス・フェカーリス（Ec.faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Ec.faecium）、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）属の乳酸菌等を挙げることができるが、他の乳酸菌も利用できる。
【００３１】
ビフィズス菌としては、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属のビフィドバクテリウム・ビフィダム（B.bifidum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B.longum）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B.infantis）、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（B.adolescentis）、ビフィドバクテリウム・カテヌラツム（B.catenulatum）等を挙げることができるが、他のビフィズス菌も利用できる。これらの乳酸菌およびビフィズス菌は２種以上を添加してもよい。
【実施例】
【００３２】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。実施例中、抗ウェルシュ菌抗体量の測定および全抗体量の測定は次の方法によった。また、実施例中、組成、糖濃度および抗体含量の％は質量％である。
【００３３】
（抗ウェルシュ菌抗体量の測定法）
抗ＬＰＳ（大腸菌Ｏ−１１１由来）抗体を精製し、ＥＬＩＳＡ法により、この抗体と大腸菌Ｏ−１１１の抗原用菌体から検量線を作成した。この検量線から、ウェルシュ菌の抗原用菌体を用いて、試料（乳清タンパク、ヨーグルト等）中の抗ウェルシュ菌抗体量を、求めた。以下、順に記述する。
【００３４】
（抗ＬＰＳ抗体の精製）
牛の初乳より得られた乳清から、５０％飽和硫安の沈殿画分を得、ＰＢＳに溶解、透析した。透析内液の遠心上清をＬＰＳアフィニティカラムに流した。ＰＢＳで洗浄後、０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．７）で溶出させた。抗体分画は２８０ｎｍの紫外部吸収で集め、抗体分画をプロテインＧセファロース４ファーストフロー（アマシャムバイオサイエンス）５ｍｌを用いて、吸着洗浄溶出により精製した。ＬＰＳカラムアフィニティとプロテインＧカラムアフィニティを２回繰り返し、精製した抗体標品を標準品とした。抗体タンパク質濃度は２８０ｎｍにおける１％溶液の紫外部吸収を１４として算出した。
【００３５】
（抗原用菌体の調製）
大腸菌Ｏ−１１１およびウェルシュ菌をブレインハートインヒュージョン（ＢＨＩ）スラント培地で前培養後、ＢＨＩプレート５枚に塗抹し、大腸菌Ｏ-１１１は好気的、ウェルシュ菌は嫌気的に、３７℃で培養した。菌が増殖したところで、菌体をＰＢＳで回収し、沸騰水中で60分間加熱して、菌を死滅させた。遠心して上清を除去し、菌体ペレットを再度ＰＢＳに縣濁することを３回繰り返して、菌体を洗浄し、その後、６６０ｎｍの吸光度が１０となるように容量を調整し、抗原用菌体とした。
【００３６】
（ＥＬＩＳＡ法による定量）
大腸菌Ｏ−１１１の抗原用菌体をＥＬＩＳＡプレートにコートし、牛血清アルブミンでブロッキングした後、上記で精製した抗ＬＰＳ抗体を濃度を０〜４０ｎｇ／ｍｌに調整して、添加した。洗浄後、ＨＲＰ標識抗牛ＩｇＧ抗体（コスモバイオ製）を結合させ、ｏ−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ社）を基質として発色させ、４９０ｎｍの吸光度を測定して、検量線を求めた。
一方、ウェルシュ菌の抗原用菌体をＥＬＩＳＡプレートにコートし、同様にブロッキングした後、ＰＢＳに溶解し適宜濃度を調整した試料を添加した。洗浄後、同様に発色させ、４９０ｎｍの吸光度を測定し、上記検量線を用いて、その測定値から抗ウェルシュ菌抗体量を求めた。
【００３７】
（全抗体量の測定法）
試料を１００ｍｇ取り、５０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解し、２時間以上撹拌してから、その１０ｍｌ以上を０．４５μｍメンブランフィルターでろ過した。一方、プロテインＧカラム（Amersham、HiTrap Protein G HP 1ml）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化し、前記メンブランフィルターでろ過した試料１０ｍｌをカラムに流し、同緩衝液（ｐＨ６．８）で洗浄後、１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．７）で抗体を溶出させた。
【００３８】
溶出液の２８０ｎｍの吸光度を測定し、抗体濃度１％のときの吸光度を１４として試料中の抗体濃度を換算し、試料中に含まれる抗体量を計算した。
【００３９】
（乳酸菌数の測定法）
ＢＣＰ加プレートカウント寒天培地（栄研化学（株））を滅菌し、シャーレに分注して、平板とする。希釈した試料をコンラージ棒で塗布し、３７℃、７２時間培養を行い、算定した。
【００４０】
（ビフィズス菌数の測定法）
ＢＬ寒天培地「ニッスイ」（日水製薬（株））を滅菌後、５０℃まで冷却し、ＢＳ培地用添加液（プロピオン酸ナトリウム３０％、塩化リチウム６％、硫酸パロモマイシン０．１％、硫酸ネオマイシン０．１％）を５％、ウマ脱繊維血液を５％添加し、シャーレに分注して、平板とした。希釈した試料をコンラージ棒で塗布し、３７℃、２０時間嫌気培養を行い、算定した。
【００４１】
（ウェルシュ菌数の測定法）
カナマイシン含有ＣＷ寒天基礎培地「ニッスイ」（日水製薬（株））を滅菌し、シャーレに分注して、平板とする。希釈した試料をコンラージ棒で塗布し、３７℃、２０時間嫌気培養を行い、算定した。
【００４２】
［参考例１］（乳清タンパク中の抗ウェルシュ菌抗体量および全抗体含量の測定）
前記測定法に従い、市販の乳清タンパク中の抗ウェルシュ菌抗体量および全抗体含量を測定したところ、ミラクテール８０（森永乳業（株）製）は５０μｇ／ｇおよび２８．８ｍｇ／ｇ、乳清タンパクＬＮ２３（（株）アオテアロア製）は１４２μｇ／ｇおよび１２１ｍｇ／ｇであった。
【００４３】
［実施例１〜３、比較例１］
実施例１として、下記表１に示す配合（数値は質量比）で乳清タンパクと牛乳を混合し、６３℃で３０分間加熱殺菌して加工乳とした。実施例２、３および比較例１として、下記表１に示す配合で３種類の発酵母液を作り、６３℃で３０分間加熱殺菌し、その母液１ｋｇに前培養スターター（ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ビフィドバクテリウム・ロンガムを混合）を５０ｇ加え、３７℃で１５時間発酵させてヨーグルトを得た。実施例１において得られた加工乳１ｇ中には１．８μｇの抗ウェルシュ菌抗体、１．１ｍｇの全抗体が含まれていた。実施例２において得られたヨーグルト１ｇ中には１．７μｇの抗ウェルシュ菌抗体、１．０ｍｇの全抗体と８×１０9の乳酸菌、６×１０7のビフィズス菌が含まれていた。実施例３で得られたヨーグルト１ｇ中には５．４μｇの抗ウェルシュ菌抗体、４．５ｍｇの全抗体と９×１０9の乳酸菌、２×１０8のビフィズス菌が含まれていた。比較例１のヨーグルト１ｇ中には７×１０9の乳酸菌が含まれており、抗体は検出されなかった。
【００４４】
（表１）
実施例１  実施例２  実施例３  比較例１
牛乳（１３０℃３秒殺菌）            96        96        96       100
ミラクテール８０                     4         4         -        -
乳清タンパクＬＮ２３                 -         -         4        -    
乳酸菌発酵の有無                    無        有        有        有   
【００４５】
［実施例４］（腸内ビフィズス菌数の変化）
被験者４名に、実施例１の加工乳、実施例２、３および比較例１で得られたヨーグルト、を表２に示したような順序で２週間ずつ（計８週間）、それぞれ１日１００ｇを、毎朝食後に飲用してもらった。各２週間のうち、後半の１週間について糞便を採取した。なお、試験開始前の１週間も糞便を採取した。これらの糞便中のビフィズス菌数とウェルシュ菌数を上記の方法で測定し、各試験区の値を平均した。これらの測定結果を図１のグラフに示す。
【００４６】
（表２）
飲用順序                        
被験者Ａ  比較例１→実施例１→実施例２→実施例３
被験者Ｂ  実施例１→比較例１→実施例２→実施例３
被験者Ｃ  実施例１→実施例２→比較例１→実施例３
被験者Ｄ  実施例１→実施例２→実施例３→比較例１
【００４７】
図１に示すとおり、善玉菌であるビフィズス菌は、試験開始前は１０の９乗台であり、比較例１のヨーグルトを摂取してもほとんど増加しなかったが、実施例１の加工乳を摂取することで菌数は増加した。さらに実施例２、３のヨーグルトを摂取することで、菌数が１０の１１乗まで約１００倍に大きく増加した。一方、悪玉菌であるウェルシュ菌は、比較例１のヨーグルトを摂取してもほとんど減少しなかったのに対し、実施例１の加工乳を摂取することで、大きく減少した。実施例２、３のヨーグルトを摂取することでさらに減少した。これらのことから、実施例１の加工乳を摂取する、すなわち、抗ウェルシュ菌抗体を摂取することで、腸内細菌叢が大きく改善されることがわかった。さらに、実施例２、３のヨーグルトを摂取する、すなわち、抗ウェルシュ菌抗体と乳酸菌を同時に摂取することで相乗効果が見られ、腸内細菌叢が劇的に改善されていることが示された。
【００４８】
［実施例５］
牛乳（１３０℃３秒殺菌）１ｋｇに前培養した乳酸菌(Lactobacillus acidophilus)スターターを５０ｇ加え、３７℃で１５時間発酵させてヨーグルトを得た。一方、乳清タンパクＬＮ２３を１５質量％となるように脱イオン水に溶解し、６３℃で３０分間加熱殺菌後冷却したものを作り、乳清タンパク溶液を得た。無菌容器に無菌的にヨーグルト１１４ｇと乳清タンパク溶液８ｇを混合、充填した。実施例５において得られたヨーグルト１ｇ中には１．０μｇの抗ウェルシュ菌抗体、０．７ｍｇの全抗体と６×１０9の乳酸菌が含まれていた。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】実施例１〜３、比較例１で測定した糞便中のビフィズス菌数およびウェルシュ菌数を示すグラフである。
【図１】
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