(57)【要約】      （修正有）【課題】ハイスループットかつ効率的な機能解析及びスクリーニングを実現することができる、改変タンパク質の作製方法を提供する。【解決手段】（ａ）微生物を含有する試料から、微生物に由来するＤＮＡを調製し、（ｂ）同一種類の機能を有する第１〜第ｎの既知タンパク質の間で保存されているアミノ酸配列に基づいて縮重プライマーを作製し、（ｃ）前記微生物に由来するＤＮＡの存在下、ＰＣＲを行い、（ｄ）前記ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、前記ＤＮＡ断片にコードされるアミノ酸配列を確定し、（ｅ）既知タンパク質のアミノ酸配列との相同性を評価し、相同性を示すアミノ酸配列を有する既知タンパク質を見出し、（ｆ）前記工程（ｅ）で見出された既知タンパク質をコードするＤＮＡのうち前記相同性を示す領域を前記ＤＮＡ断片で置換して、改変ＤＮＡを作製し、（ｇ）前記改変ＤＮＡを発現させて、改変タンパク質を作製する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（ａ）〜（ｇ）を含む、改変タンパク質の作製方法。
（ａ）微生物を含有する試料から、前記微生物に由来するＤＮＡを調製する工程
（ｂ）同一種類の機能を有する第１〜第ｎの既知タンパク質の間で保存されているアミノ酸配列に基づいて縮重プライマーを作製する工程
（ｃ）前記微生物に由来するＤＮＡの存在下、前記縮重プライマーを用いてＰＣＲを行う工程
（ｄ）前記ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、前記ＤＮＡ断片にコードされるアミノ酸配列を確定する工程
（ｅ）前記ＤＮＡ断片にコードされるアミノ酸配列と既知タンパク質のアミノ酸配列との相同性を評価し、前記ＤＮＡ断片にコードされるアミノ酸配列と相同性を示すアミノ酸配列を有する既知タンパク質を見出す工程
（ｆ）前記工程（ｅ）で見出された既知タンパク質をコードするＤＮＡのうち前記相同性を示すアミノ酸配列をコードする領域を前記ＤＮＡ断片で置換して、改変ＤＮＡを作製する工程
（ｇ）前記改変ＤＮＡを発現させて、改変タンパク質を作製する工程
【請求項２】
下記工程（ａ）〜（ｈ）を含む、改変タンパク質ライブラリーの作製方法。
（ａ）微生物を含有する試料から、前記微生物に由来するＤＮＡを調製する工程
（ｂ）同一種類の機能を有する第１〜第ｎの既知タンパク質の間で保存されているアミノ酸配列に基づいて縮重プライマーを作製する工程
（ｃ）前記微生物に由来するＤＮＡの存在下、前記縮重プライマーを用いてＰＣＲを行う工程
（ｄ）前記ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、前記ＤＮＡ断片にコードされるアミノ酸配列を確定する工程
（ｅ）前記ＤＮＡ断片にコードされるアミノ酸配列と既知タンパク質のアミノ酸配列との相同性を評価し、前記ＤＮＡ断片にコードされるアミノ酸配列と相同性を示すアミノ酸配列を有する既知タンパク質を見出す工程
（ｆ）前記工程（ｅ）で見出された既知タンパク質をコードするＤＮＡのうち前記相同性を示すアミノ酸配列をコードする領域を前記ＤＮＡ断片で置換して、改変ＤＮＡを作製する工程
（ｇ）前記改変ＤＮＡを発現させて、改変タンパク質を作製する工程
（ｈ）微生物を含有する２種類以上の試料について前記工程（ａ）〜（ｇ）を行う工程
【請求項３】
下記工程（ａ）〜（ｉ）を含む、所定機能を有する改変タンパク質のスクリーニング方法。
（ａ）微生物を含有する試料から、前記微生物に由来するＤＮＡを調製する工程
（ｂ）同一種類の機能を有する第１〜第ｎの既知タンパク質の間で保存されているアミノ酸配列に基づいて縮重プライマーを作製する工程
（ｃ）前記微生物に由来するＤＮＡの存在下、前記縮重プライマーを用いてＰＣＲを行う工程
（ｄ）前記ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、前記ＤＮＡ断片にコードされるアミノ酸配列を確定する工程
（ｅ）前記ＤＮＡ断片にコードされるアミノ酸配列と既知タンパク質のアミノ酸配列との相同性を評価し、前記ＤＮＡ断片にコードされるアミノ酸配列と相同性を示すアミノ酸配列を有する既知タンパク質を見出す工程
（ｆ）前記工程（ｅ）で見出された既知タンパク質をコードするＤＮＡのうち前記相同性を示すアミノ酸配列をコードする領域を前記ＤＮＡ断片で置換して、改変ＤＮＡを作製する工程
（ｇ）前記改変ＤＮＡを発現させて、改変タンパク質を作製する工程
（ｈ）微生物を含有する２種類以上の試料について前記工程（ａ）〜（ｇ）を行う工程
（ｉ）前記改変タンパク質の機能を評価し、所定機能を有する改変タンパク質をスクリーニングする工程
【請求項４】
下記工程（ａ）〜（ｇ）及び（ｊ）を含む、微生物に由来するタンパク質の機能推定方法。
（ａ）微生物を含有する試料から、前記微生物に由来するＤＮＡを調製する工程
（ｂ）同一種類の機能を有する第１〜第ｎの既知タンパク質の間で保存されているアミノ酸配列に基づいて縮重プライマーを作製する工程
（ｃ）前記微生物に由来するＤＮＡの存在下、前記縮重プライマーを用いてＰＣＲを行う工程
（ｄ）前記ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、前記ＤＮＡ断片にコードされるアミノ酸配列を確定する工程
（ｅ）前記ＤＮＡ断片にコードされるアミノ酸配列と既知タンパク質のアミノ酸配列との相同性を評価し、前記ＤＮＡ断片にコードされるアミノ酸配列と相同性を示すアミノ酸配列を有する既知タンパク質を見出す工程
（ｆ）前記工程（ｅ）で見出された既知タンパク質をコードするＤＮＡのうち前記相同性を示すアミノ酸配列をコードする領域を前記ＤＮＡ断片で置換して、改変ＤＮＡを作製する工程
（ｇ）前記改変ＤＮＡを発現させて、改変タンパク質を作製する工程
（ｊ）前記改変タンパク質の機能を評価し、前記改変タンパク質の機能に基づいて、前記微生物に由来するタンパク質の機能を推定する工程
【請求項５】
前記工程（ｂ）で作製される縮重プライマーが、前記第１〜第ｎの既知タンパク質をコードするＤＮＡのうち、前記第１〜第ｎの既知タンパク質の機能ドメインをコードする領域を増幅できる請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記工程（ｅ）で見出される既知タンパク質が、前記第１〜第ｎの既知タンパク質と同一種類の機能を有する請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
前記微生物が培養不能又は培養条件が未知の微生物である請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変タンパク質の作製方法、改変タンパク質ライブラリーの作製方法及び改変タンパク質のスクリーニング方法に関する。また、本発明は、微生物に由来するタンパク質の機能推定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
優れた機能を有するタンパク質を取得する方法としては、（１）新規なタンパク質を同定し、その機能を解析する方法、（２）既存のタンパク質のアミノ酸配列にランダム変異を導入して改変タンパク質を作製し、その機能を解析する方法（例えば、特許文献１）がある。
【特許文献１】特開２００３−３０４８７０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記（１）の方法では、既存のタンパク質又は遺伝子の間で保存されているアミノ酸配列又は塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅断片をプローブとして新規なタンパク質をコードする遺伝子を取得する。しかしながら、新規なタンパク質の機能を評価するためには、それをコードする遺伝子の全長塩基配列を決定する必要があり、既存のタンパク質又は遺伝子の間で保存されているアミノ酸配列又は塩基配列以外の情報は未知であるので、新規なタンパク質をコードする遺伝子の全長塩基配列を決定するには多大な労力と時間を要する。また、上記（１）の方法を利用して微生物に由来するタンパク質又は遺伝子を同定する際、微生物に由来するゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ等を得るために微生物の分離培養が必要となる場合があるが、微生物が培養不能又は培養条件が未知である場合には対処の仕様がない。
【０００４】
一方、上記（２）の方法では、改変タンパク質を容易かつ迅速に作製することができるので、改変タンパク質のハイスループットな機能解析を行うことができる。しかしながら、既存のタンパク質のアミノ酸配列にランダム変異を導入した結果、かえって機能が低下してしまう場合が多い。
【０００５】
そこで、本発明は、機能の向上が期待できる改変タンパク質を容易かつ迅速に作製することにより、改変タンパク質のハイスループットかつ効率的な機能解析及びスクリーニングを実現することができる、改変タンパク質の作製方法、改変タンパク質ライブラリーの作製方法及び改変タンパク質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【０００６】
また、本発明は、微生物に由来するタンパク質の機能を推定する際、タンパク質又はそれをコードするＤＮＡの全長配列を同定する必要がなく、また、微生物を分離培養する必要がない、微生物に由来するタンパク質の機能推定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を解決するために、本発明は、下記（１）〜（７）の改変タンパク質の作製方法、改変タンパク質ライブラリーの作製方法、改変タンパク質のスクリーニング方法及び微生物に由来するタンパク質の機能推定方法を提供する。
【０００８】
（１）下記工程（ａ）〜（ｇ）を含む、改変タンパク質の作製方法。
（ａ）微生物を含有する試料から、前記微生物に由来するＤＮＡを調製する工程
（ｂ）同一種類の機能を有する第１〜第ｎの既知タンパク質の間で保存されているアミノ酸配列に基づいて縮重プライマーを作製する工程
（ｃ）前記微生物に由来するＤＮＡの存在下、前記縮重プライマーを用いてＰＣＲを行う工程
（ｄ）前記ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、前記ＤＮＡ断片にコードされるアミノ酸配列を確定する工程
（ｅ）前記ＤＮＡ断片にコードされるアミノ酸配列と既知タンパク質のアミノ酸配列との相同性を評価し、前記ＤＮＡ断片にコードされるアミノ酸配列と相同性を示すアミノ酸配列を有する既知タンパク質を見出す工程
（ｆ）前記工程（ｅ）で見出された既知タンパク質をコードするＤＮＡのうち前記相同性を示すアミノ酸配列をコードする領域を前記ＤＮＡ断片で置換して、改変ＤＮＡを作製する工程
（ｇ）前記改変ＤＮＡを発現させて、改変タンパク質を作製する工程
【０００９】
（２）下記工程（ａ）〜（ｈ）を含む、改変タンパク質ライブラリーの作製方法。
（ａ）微生物を含有する試料から、前記微生物に由来するＤＮＡを調製する工程
（ｂ）同一種類の機能を有する第１〜第ｎの既知タンパク質の間で保存されているアミノ酸配列に基づいて縮重プライマーを作製する工程
（ｃ）前記微生物に由来するＤＮＡの存在下、前記縮重プライマーを用いてＰＣＲを行う工程
（ｄ）前記ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、前記ＤＮＡ断片にコードされるアミノ酸配列を確定する工程
（ｅ）前記ＤＮＡ断片にコードされるアミノ酸配列と既知タンパク質のアミノ酸配列との相同性を評価し、前記ＤＮＡ断片にコードされるアミノ酸配列と相同性を示すアミノ酸配列を有する既知タンパク質を見出す工程
（ｆ）前記工程（ｅ）で見出された既知タンパク質をコードするＤＮＡのうち前記相同性を示すアミノ酸配列をコードする領域を前記ＤＮＡ断片で置換して、改変ＤＮＡを作製する工程
（ｇ）前記改変ＤＮＡを発現させて、改変タンパク質を作製する工程
（ｈ）微生物を含有する２種類以上の試料について前記工程（ａ）〜（ｇ）を行う工程
【００１０】
（３）下記工程（ａ）〜（ｉ）を含む、所定機能を有する改変タンパク質のスクリーニング方法。
（ａ）微生物を含有する試料から、前記微生物に由来するＤＮＡを調製する工程
（ｂ）同一種類の機能を有する第１〜第ｎの既知タンパク質の間で保存されているアミノ酸配列に基づいて縮重プライマーを作製する工程
（ｃ）前記微生物に由来するＤＮＡの存在下、前記縮重プライマーを用いてＰＣＲを行う工程
（ｄ）前記ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、前記ＤＮＡ断片にコードされるアミノ酸配列を確定する工程
（ｅ）前記ＤＮＡ断片にコードされるアミノ酸配列と既知タンパク質のアミノ酸配列との相同性を評価し、前記ＤＮＡ断片にコードされるアミノ酸配列と相同性を示すアミノ酸配列を有する既知タンパク質を見出す工程
（ｆ）前記工程（ｅ）で見出された既知タンパク質をコードするＤＮＡのうち前記相同性を示すアミノ酸配列をコードする領域を前記ＤＮＡ断片で置換して、改変ＤＮＡを作製する工程
（ｇ）前記改変ＤＮＡを発現させて、改変タンパク質を作製する工程
（ｈ）微生物を含有する２種類以上の試料について前記工程（ａ）〜（ｇ）を行う工程
（ｉ）前記改変タンパク質の機能を評価し、所定機能を有する改変タンパク質をスクリーニングする工程
【００１１】
（４）下記工程（ａ）〜（ｇ）及び（ｊ）を含む、微生物に由来するタンパク質の機能推定方法。
（ａ）微生物を含有する試料から、前記微生物に由来するＤＮＡを調製する工程
（ｂ）同一種類の機能を有する第１〜第ｎの既知タンパク質の間で保存されているアミノ酸配列に基づいて縮重プライマーを作製する工程
（ｃ）前記微生物に由来するＤＮＡの存在下、前記縮重プライマーを用いてＰＣＲを行う工程
（ｄ）前記ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、前記ＤＮＡ断片にコードされるアミノ酸配列を確定する工程
（ｅ）前記ＤＮＡ断片にコードされるアミノ酸配列と既知タンパク質のアミノ酸配列との相同性を評価し、前記ＤＮＡ断片にコードされるアミノ酸配列と相同性を示すアミノ酸配列を有する既知タンパク質を見出す工程
（ｆ）前記工程（ｅ）で見出された既知タンパク質をコードするＤＮＡのうち前記相同性を示すアミノ酸配列をコードする領域を前記ＤＮＡ断片で置換して、改変ＤＮＡを作製する工程
（ｇ）前記改変ＤＮＡを発現させて、改変タンパク質を作製する工程
（ｊ）前記改変タンパク質の機能を評価し、前記改変タンパク質の機能に基づいて、前記微生物に由来するタンパク質の機能を推定する工程
【００１２】
（５）前記工程（ｂ）で作製される縮重プライマーが、前記第１〜第ｎの既知タンパク質をコードするＤＮＡのうち、前記第１〜第ｎの既知タンパク質の機能ドメインをコードする領域を増幅できる前記（４）記載の方法。
【００１３】
（６）前記工程（ｅ）で見出される既知タンパク質が、前記第１〜第ｎの既知タンパク質と同一種類の機能を有する前記（４）又は（５）記載の方法。
【００１４】
（７）前記微生物が培養不能又は培養条件が未知の微生物である前記（４）〜（６）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、機能の向上が期待できる改変タンパク質を容易かつ迅速に作製することにより、改変タンパク質のハイスループットかつ効率的な機能解析及びスクリーニングを実現することができる、改変タンパク質の作製方法、改変タンパク質ライブラリーの作製方法及び改変タンパク質のスクリーニング方法が提供される。
【００１６】
また、本発明によれば、微生物に由来するタンパク質の機能を推定する際、タンパク質又はそれをコードするＤＮＡの全長配列を同定する必要がなく、また、微生物を分離培養する必要がない、微生物に由来するタンパク質の機能推定方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の方法に含まれる工程について詳細に説明する。
工程（ａ）
工程（ａ）は、微生物を含有する試料から、前記微生物に由来するＤＮＡを調製する工程である。
【００１８】
試料の種類は、１種類又は２種類以上の微生物を含有する限り特に限定されるものではない。試料としては、例えば、各種環境から採取した土壌、水、泥、堆積物等の天然試料を使用することができる。天然試料を採取する環境は特に限定されるものではなく、様々な条件（例えば、常温、高温、低温等の様々な温度条件、中性、酸性、アルカリ性等の様々なｐＨ条件、常圧、高圧、低圧等の様々な圧力条件）下にある環境から天然試料を採取することができる。天然試料を採取する環境の具体例としては、温泉等の高温環境、酸性温泉等の酸性環境、アルカリ性温泉等のアルカリ環境、深海等の高圧環境等が挙げられる。
【００１９】
試料としては、２種類以上の微生物を含有する試料を使用することが好ましい。２種類以上の微生物を含有する試料を使用すると、工程（ｃ）においてＰＣＲ増幅断片が得られる可能性が高くなる。また、２種類以上のＰＣＲ増幅断片が得られる可能性も高くなり、１つの試料から多種類の改変タンパク質を作製することが可能となる。なお、２種類以上のＰＣＲ増幅断片は混合物として得られるが、工程（ｄ）において各ＰＣＲ増幅断片の塩基配列を決定することにより、各ＰＣＲ増幅断片の種類を区別することができる。
【００２０】
試料に含有される微生物の種類は特に限定されるものではなく、例えば、細菌、カビ類（糸状菌類）、担子菌類、酵母類、ウイルス等が挙げられる。
【００２１】
試料として、高温環境から採取した天然試料を使用する場合、試料には好熱菌が含有されると考えられる。「好熱菌」は、高温下に生育できる細菌の総称であり、通常５５℃以上で生育できる細菌を指す。好熱菌には、通常７５℃以上でも生育できる高度好熱菌、通常８５〜９０℃以上で生育できる超好熱菌、常温（通常３７℃）でも生育できる通性好熱菌、約４０℃以上でのみ生育できる絶対好熱菌等が含まれる。
【００２２】
試料に含有される微生物の種類（科、属、種等）は同定されていてもよいし同定されていなくてもよい。試料に含有される微生物の種類が同定されていない場合であっても、当該微生物の種類を同定する必要はない。
【００２３】
試料に含有される微生物は、培養不能又は培養条件が未知の微生物であってもよい。本発明は、試料に含有される微生物を分離培養する必要がないので、試料に含有される微生物が培養不能又は培養条件が未知である場合に特に有用である。
【００２４】
微生物に由来するＤＮＡは、ゲノムＤＮＡであってもよいしｃＤＮＡであってもよい。微生物に由来するゲノムＤＮＡは、常法に従って微生物から抽出することができる。微生物に由来するｃＤＮＡは、常法に従って微生物から抽出されたｍＲＮＡを逆転写することにより調製することができる。微生物から抽出されたゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡには、通常、微生物が有する全てのゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡが含まれるが、微生物が有する一部のゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのみが含まれていてもよい。
【００２５】
工程（ｂ）
工程（ｂ）は、同一種類の機能を有する第１〜第ｎの既知タンパク質の間で保存されているアミノ酸配列に基づいて縮重プライマーを作製する工程である。
【００２６】
第１〜第ｎの既知タンパク質は、アミノ酸配列、由来生物種、機能等が既知の天然型タンパク質である。
【００２７】
第１〜第ｎの既知タンパク質が有する同一種類の機能は特に限定されるものではないが、例えば、耐熱性、ＤＮＡポリメラーゼ活性、キチナーゼ活性、アラニンデヒドロゲナーゼ活性、Ｄ−２−デオキシリボース−５−フォスフェートアルドラーゼ活性、ヌクレアーゼ活性、ヘリカーゼ活性等が挙げられる。第１〜第ｎの既知タンパク質が有する機能のうち、１種類の機能が同一であってもよいし、２種類以上の機能が同一であってもよい。
【００２８】
第１〜第ｎの既知タンパク質が由来する生物種は特に限定されるものではないが、微生物であることが好ましく、試料に含有される微生物と近縁の微生物であることがさらに好ましい。試料に含有される微生物と、第１〜第ｎの既知タンパク質が由来する生物種とが近縁である場合、工程（ｃ）においてＰＣＲ増幅断片が得られる可能性が高くなる。試料に含有される微生物が未同定であっても、試料に含有される微生物と近縁の生物種に由来するタンパク質を第１〜第ｎの既知タンパク質として選択することができる。例えば、高温環境から採取された天然試料を使用する場合、当該天然試料には好熱菌が含有されると考えられるので、好熱菌に由来するタンパク質を第１〜第ｎの既知タンパク質として選択することができる。
【００２９】
縮重プライマーは、第１〜第ｎの既知タンパク質の間で保存されているアミノ酸配列に基づいて作製することができる。すなわち、第１〜第ｎの既知タンパク質のアミノ酸配列をアライメントして保存領域（相同領域）を同定し、保存領域のアミノ酸配列に基づいて縮重プライマーの塩基配列を決定し、化学合成等の常法に従って縮重プライマーを作製することができる。
【００３０】
縮重プライマーには、第１〜第ｎの既知タンパク質をコードする２本鎖ＤＮＡのうち、センス鎖にハイブリダイズできるプライマー及びアンチセンス鎖にハイブリダイズできるプライマーが含まれ、各プライマーはそれぞれ異なる保存領域のアミノ酸配列に基づいて作製することができる。
【００３１】
微生物に由来するＤＮＡの存在下、第１〜第ｎの既知タンパク質の間で保存されているアミノ酸配列に基づいて作製した縮重プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、微生物に由来するＤＮＡのうち、第１〜第ｎの既知タンパク質と同一種類の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部が増幅されると考えられる。
【００３２】
例えば、Bacillus subtilis、Bacillus caldotenax、Thermus aquaticus、Themus thermophilus、Escherichia coli等の微生物に由来するファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼには、図２及び図３に示すように、ＤＰＮＬＱＮＩＰ、ＱＶＨＤＥＬＸ（ＸはＩ、Ｖ又はＬを表す）等のアミノ酸配列が保存されており、ＤＰＮＬＱＮＩＰに基づいて5'- gaycchaacytscaraayathcc -3'で表される縮重プライマーを、ＱＶＨＤＥＬＸに基づいて5'- kassakytcrtcgtgnacytg -3'で表される縮重プライマーを作製することができる。そして、任意の微生物（例えば、Bacillus caldotenax，Bacillus caldolyticus，Escherichia coli，Bacillus subtilis，Lactobacillus bulgaricus，Lactobacillus homohiochii，Lactobacillus heterohiochii，Thermus aquaticus，Themus thermophilus，Sulfolobus solfataricus）に由来するＤＮＡの存在下、上記縮重プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ＰＣＲ増幅断片を得ることができる。こうして得られたＰＣＲ増幅断片は、ファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを鋳型として増幅したＤＮＡ断片（ファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡの一部）であると考えられる。
【００３３】
例えば、Serratia marcescens、Bacillus circurans、Stenotrophomonas maltophilia、Janthinobacterium lividum、Thermococcus kodakaraensis、Clostridium thermocellum、Bacillus licheniformis等の微生物に由来するキチナーゼには、図１０に示すように、ＴＨＩＮＹＡＦ、ＩＳＶＧＧＷＴ、ＤＩＤＷＥＹＰ、ＩＮＶＭＴＹＤ、ＧＬＧＧＡＭＦＷＥ等のアミノ酸配列が保存されており、ＴＨＩＮＹＡＦに基づいて5'- acncayathaaytaygcntt -3'で表される縮重プライマーを、ＩＳＶＧＧＷＴに基づいて5'- athwsigtiggnggntggac -3'で表される縮重プライマーを、ＤＩＤＷＥＹＰに基づいて5'- gayathgaytgggartaycc -3'で表される縮重プライマーを、ＩＮＶＭＴＹＤに基づいて5'- athaaygtnatgacntayga -3'で表される縮重プライマーを、ＧＬＧＧＡＭＦＷＥに基づいて5'- tcccadatcatiacnccncciarncc -3'で表される縮重プライマーを作製することができる。そして、任意の微生物に由来するＤＮＡの存在下、上記縮重プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ＰＣＲ増幅断片を得ることができる。こうして得られたＰＣＲ増幅断片は、キチナーゼをコードするＤＮＡを鋳型として増幅したＤＮＡ断片（キチナーゼをコードするＤＮＡの一部）であると考えられる。
【００３４】
例えば、Bacillus属、Carnobacterium属、Synechocystis属、Phormidium属、Vibrio属、Shewanella属、Mycobacterium属等の微生物に由来するアラニンデヒドロゲナーゼ（AlaDH）には、図１１に示すように、ＦＴＹＬＨＬＡ、ＤＶＡＩＤＱＧ等のアミノ酸配列が保存されており、ＦＴＹＬＨＬＡに基づいて5'- ttyacitwyyticayytigc -3'で表される縮重プライマーを、ＤＶＡＩＤＱＧに基づいて5'- ccytgrtcdatigciayrtc -3'で表される縮重プライマーを作製することができる。そして、任意の微生物に由来するＤＮＡの存在下、上記縮重プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ＰＣＲ増幅断片を得ることができる。こうして得られたＰＣＲ増幅断片は、アラニンデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを鋳型として増幅したＤＮＡ断片（アラニンデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡの一部）であると考えられる。
【００３５】
例えば、Bacillus subtilis、Oceanobacillus iheyensis、Escherichia coli、Thermotoga maritima、Aquifex aeolicus等に由来するＤ−２−デオキシリボース−５−フォスフェートアルドラーゼ（D-2-deoxyribose-5-phosphate aldolase：DERA）は、図１２に示すように、ＶＩＧＦＰＬＧ、ＶＫＡＳＧＧＶ等のアミノ酸配列が保存されており、ＶＩＧＦＰＬＧに基づいて5'- gtnathggittycciytigg -3'で表される縮重プライマーを、ＶＫＡＳＧＧＶに基づいて5'- ayiccicciswngcyttnac -3'で表される縮重プライマーを作製することができる。そして、任意の微生物に由来するＤＮＡの存在下、上記縮重プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ＰＣＲ増幅断片を得ることができる。こうして得られたＰＣＲ増幅断片は、Ｄ−２−デオキシリボース−５−フォスフェートアルドラーゼをコードするＤＮＡを鋳型として増幅したＤＮＡ断片（Ｄ−２−デオキシリボース−５−フォスフェートアルドラーゼをコードするＤＮＡの一部）であると考えられる。
【００３６】
なお、上記縮重プライマーの塩基配列において、「i」はイノシンを、「w」はa又はtを、「y」はt又はcを、「s」はc又はgを、「k」はg又はtを、「r」はa又はgを、「h」はa又はt又はcを、「n」はa又はg又はc又はtを、「d」はa又はt又はgを表す。
【００３７】
縮重プライマーは、通常１５〜３０塩基、好ましくは２０〜２５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、常法に従って化学合成することができる。縮重プライマーには、制限酵素認識配列、タグ配列、蛍光色素、ラジオアイソトープ等の標識を付加することができる。
【００３８】
縮重プライマーは、第１〜第ｎの既知タンパク質をコードするＤＮＡのうち、第１〜第ｎの既知タンパク質の機能ドメインをコードする領域を増幅できるように作製することが好ましい。ここで、「機能ドメイン」とは、第１〜第ｎの既知タンパク質が有する同一種類の機能に関与するドメインを意味する（例えば、第１〜第ｎの既知タンパク質が有する同一種類の機能がＤＮＡポリメラーゼ活性である場合、ＤＮＡポリメラーゼ活性に関与するドメインを意味する）。縮重プライマーが、第１〜第ｎの既知タンパク質の機能ドメインをコードする領域を増幅できる場合、微生物に由来するＤＮＡのうち、第１〜第ｎの既知タンパク質と同一種類の機能を有するタンパク質の機能ドメインをコードする領域を増幅することができると考えられ、このようなＰＣＲ増幅断片を利用して改変タンパク質を作製することにより、改変タンパク質の機能が向上する可能性が高くなるとともに、改変タンパク質の機能が微生物に由来するタンパク質の機能を反映する可能性が高くなる。
【００３９】
工程（ｃ）
工程（ｃ）は、前記微生物に由来するＤＮＡの存在下、前記縮重プライマーを用いてＰＣＲを行う工程である。
【００４０】
微生物に由来するＤＮＡの存在下、縮重プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、微生物に由来するＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅断片を得ることができる。ＰＣＲは常法に従って行うことができ、ＰＣＲ増幅断片は、ポリアクリルアミド電気泳動等の常法に従って精製することができる。
【００４１】
工程（ｄ）
工程（ｄ）は、前記ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、前記ＤＮＡ断片にコードされるアミノ酸配列を確定する工程である。
【００４２】
ＰＣＲ増幅断片の塩基配列は、マキサム−ギルバートの化学修飾法、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の常法に従って決定することができる。塩基配列解析の際には、例えば、市販の塩基配列分析装置を使用することができる。
【００４３】
ＰＣＲ増幅断片は、塩基配列解析の前に、常法に従ってクローニングしてもよい。例えば、ＰＣＲ増幅断片を適当なクローニングベクターに組み込んで組換えベクターを作製し、当該組換えベクターを用いて大腸菌等の宿主細胞を形質転換し、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性を指標として形質転換体を選択することにより、ＰＣＲ増幅断片をクローニングすることができる。クローニングベクターは、宿主細胞中で自立複製できるものであればよく、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター等を使用することができる。宿主細胞としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）等を使用することができる。
【００４４】
決定された塩基配列には誤差が含まれる場合があるので、決定された塩基配列を修正して誤差を取り除いた後、塩基配列にコードされるアミノ酸配列を確定することが好ましい。
【００４５】
工程（ｅ）
工程（ｅ）は、前記ＤＮＡ断片にコードされるアミノ酸配列と既知タンパク質のアミノ酸配列との相同性を評価し、前記ＤＮＡ断片にコードされるアミノ酸配列と相同性を示すアミノ酸配列を有する既知タンパク質を見出す工程である。
【００４６】
相同性評価の対象となる既知タンパク質は、アミノ酸配列、由来生物種、機能等が既知の天然型タンパク質であり、その種類は特に限定されるものではない。      
【００４７】
相同性評価の対象となる既知タンパク質が有する機能は特に限定されるものではなく、第１〜第ｎの既知タンパク質と同一種類の機能であってもよいし、第１〜第ｎの既知タンパク質と異なる種類の機能であってもよいが、第１〜第ｎの既知タンパク質と同一種類の機能であることが好ましい。
【００４８】
相同性の評価は、既存のデータベース等を利用して行うことができる。
相同性の評価により、ＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列が新規であるか否かを判別することができる。工程（ｆ）及び（ｇ）は、ＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列が既知である場合に行ってもよいが、ＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列が新規である場合に行うことが好ましい。
【００４９】
相同性の評価により、既知タンパク質が、ＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列と相同性を示すアミノ酸配列を有するか否かを判定することができる。
相同性を示す領域は、ＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列と通常５０％以上、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上の相同性を示す領域である。
【００５０】
工程（ｆ）
工程（ｆ）は、前記工程（ｅ）で見出された既知タンパク質をコードするＤＮＡのうち前記相同性を示すアミノ酸配列をコードする領域を前記ＤＮＡ断片で置換して、改変ＤＮＡを作製する工程である。
【００５１】
改変ＤＮＡは、工程（ｅ）で見出された既知タンパク質をコードするＤＮＡを制限酵素で処理して、ＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列と相同性を示すアミノ酸配列をコードする領域を除去し、この部分にＰＣＲ増幅断片を連結することにより作製することができる。ＰＣＲ増幅断片は、トリプレット（コドン）の読みとり枠がずれないように（すなわちフレームシフトが生じないように）連結する。
【００５２】
改変ＤＮＡは、工程（ｅ）で見出された既知タンパク質のアミノ酸配列のうち、ＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列と相同性を示すアミノ酸配列が、ＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列で置換された改変タンパク質をコードする。ＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列は自然界に存在するアミノ酸配列であり、自然淘汰されたものであるので、そのアミノ酸配列は何らかの意義を有しているものと考えられる。したがって、ＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列と相同性を示すアミノ酸配列が、ＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列で置換された改変タンパク質は、既存のタンパク質のアミノ酸配列をランダムに変異させた改変タンパク質よりも、機能の向上を期待することができる。
【００５３】
改変ＤＮＡは、改変タンパク質をコードするオープンリーディングフレームとその３'末端側に位置する終止コドンとを含む。改変ＤＮＡは、オープンリーディングフレームの５'末端及び／又は３'末端に非翻訳領域（ＵＴＲ）を含んでいてもよい。また、改変ＤＮＡは、改変タンパク質が融合タンパク質として発現されるように、他のタンパク質又はペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含んでいてもよい。
【００５４】
工程（ｇ）
工程（ｇ）は、前記改変ＤＮＡを発現させて、改変タンパク質を作製する工程である。
【００５５】
改変タンパク質は、例えば、次のようにして作製することができる。
まず、改変ＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入して組換えベクターを作製し、組換えベクターを適当な宿主細胞に導入して改変タンパク質を生産できる形質転換体を作製する。次いで、形質転換体を培養する。改変タンパク質が形質転換体の細胞内に蓄積される場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に細胞を破砕して、改変タンパク質を抽出する。改変タンパク質が形質転換体の細胞外に分泌される場合には、培養上清をそのまま使用するか、遠心分離等により培養上清から細胞又は菌体を除去する。こうして、改変タンパク質を作製することができる。
【００５６】
組換えベクターにおいて、改変ＤＮＡは、その機能が発揮されるように組み込まれていることが必要であり、組換えベクターは、プロモーターの他、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子）、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を含有することができる。
【００５７】
発現ベクターの種類は、宿主細胞において自立複製が可能なものであれば特に限定されるものではなく、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。プラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えば、pRSET、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、pUB110、pTP5）、酵母由来のプラスミド（例えば、YEp13、YEp24、YCp50）が挙げられ、ファージベクターとしては、例えば、λファージ（例えば、Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP）が挙げられ、ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスが挙げられる。
【００５８】
宿主細胞の種類は、改変ＤＮＡを発現できる限り特に限定されるものではなく、例えば、原核細胞、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等が挙げられる。
【００５９】
組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００６０】
形質転換体の培養は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
改変タンパク質は、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、ゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法等により精製することができる。
【００６１】
工程（ｈ）
工程（ｈ）は、微生物を含有する２種類以上の試料について前記工程（ａ）〜（ｇ）を行う工程である。
【００６２】
２種類以上の試料について工程（ａ）〜（ｇ）を行うことにより、２種類以上の改変タンパク質の集合物である改変タンパク質ライブラリーを作製することができる。
２種類以上の試料としては、例えば、温度、ｐＨ等が異なる環境から採取された土壌、水、泥、堆積物等の天然試料を使用することができる。
【００６３】
工程（ｉ）
工程（ｉ）は、前記改変タンパク質の機能を評価し、所定機能を有する改変タンパク質をスクリーニングする工程である。
【００６４】
改変タンパク質の機能は、常法に従って解析することができる。改変タンパク質の機能解析は、少なくとも改変前の既知タンパク質が有する機能について行うが、それ以外の機能について行ってもよい。
スクリーニングする改変タンパク質が有する所定機能は特に限定されるものではなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００６５】
工程（ｊ）
工程（ｊ）は、前記改変タンパク質の機能を評価し、前記改変タンパク質の機能に基づいて、前記微生物に由来するタンパク質の機能を推定する工程である。
【００６６】
改変タンパク質は、微生物に由来するタンパク質の一部（ＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列）を有しているので、改変タンパク質の機能は、微生物に由来するタンパク質の機能を反映している可能性がある。タンパク質の機能には機能ドメインが関与すると考えられるので、改変タンパク質が有する微生物に由来するタンパク質の一部（ＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列）が、第１〜第ｎの既知タンパク質と同一種類の機能を有するタンパク質の機能ドメインである場合、改変タンパク質の機能は、微生物に由来するタンパク質の機能を反映している可能性が高い。また、改変タンパク質が有する微生物に由来するタンパク質の一部（ＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列）は、第１〜第ｎの既知タンパク質と同一種類の機能を有するタンパク質の一部であると考えられるので、工程（ｅ）で見出される既知タンパク質（微生物に由来するタンパク質の一部が組み込まれるタンパク質）が、第１〜第ｎの既知タンパク質と同一種類の機能を有する場合、改変タンパク質の機能は、微生物に由来するタンパク質の機能を反映している可能性が高い。
【実施例】
【００６７】
〔実施例１〕高温環境土壌に含まれる微生物に由来するゲノムＤＮＡの獲得
（１）高温環境土壌の採取
ＤＮＡポリメラーゼを有効に利用するためには、ＰＣＲ等に使用できるような耐熱性を有することが重要であると考えられる。そして、耐熱性酵素を得るためには、高温環境から試料を取得することが最も効率的である。そこで、高温環境として性質（ｐＨ）の異なる温泉地帯を選択した。一つは強酸性を示す九州鹿児島霧島温泉地域で、もう一つは中性に近いｐＨを示す宮城県鬼首温泉地域及び秋田県大噴湯温泉地域である。
【００６８】
温泉地域内の特定の領域には、マッドポット（泥が煮立っているような穴）が天然の状態（人手の入らない状態）で幾つも存在している。これらの地点から、採取地点ごとに、温度、ｐＨ等のデータとともに採取試料の色、水分量等の状態を映像等により記録した。各地点からは、十分量のＤＮＡが回収できるように、１００ｇ程度の土壌、泥又は堆積物を採取した。
【００６９】
（２）高温環境土壌からのゲノムＤＮＡの抽出
採取された土壌１ｇを滅菌したエッペンドルフチューブに分取した後、土壌に含まれる微生物に由来するゲノムＤＮＡを抽出した。土壌からのゲノムＤＮＡの抽出は、土壌からのＤＮＡ抽出キットであるUltra CleanTM Soil DNA Purification kit(MO Bio社製，カタログNo.12800-50，フナコシカタログNo.LM128000)を用いて行った。操作は本キットに添付されている操作手順書に従った。
【００７０】
実際に抽出したＤＮＡ溶液の１／５０量である２μＬを分取し、１８μＬのＴＡＥ緩衝液（０．０４Ｍ Ｔｒｉｓ，０．０２Ｍ 酢酸，０．００１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））及び２μＬの電気泳動用濃縮染色液（０．２５％ブロモフェノールブルー，０．２５％キシレンシアノール，３０％グリセロール）を加え、０．８％アガロースゲル電気泳動で確認した。
【００７１】
その結果、図１に示すように、量の多少は有るが、幾つかの地点からは１０キロ塩基対以上の長さのゲノムＤＮＡが回収されていることが確認できた。なお、図１中、「Ｍ」は分子量マーカーを表し、レーン１〜３８は異なる地点に関する結果を表す。この結果から、高温環境土壌中には、十分量のゲノムＤＮＡを抽出できる量の微生物が存在することが確認できた。
【００７２】
〔実施例２〕ファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼ特異的プライマーを用いたＰＣＲ
（１）ファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼ特異的プライマーの設計
複数の微生物（Bacillus subtilis、Bacillus caldotenax、Thermus aquaticus、Themus thermophilus、Escherichia coli）に由来するファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列のアライメント結果を図２及び図３に示す。なお、図３は図２の続きである。
【００７３】
図２及び図３中、四角で囲んだ２つの領域（ＤＰＮＬＱＮＩＰ及びＱＶＨＤＥＬＸ（ＸはＩ、Ｖ又はＬを表す））は、複数の微生物間で相同性が高いアミノ酸配列である。このアミノ酸配列は、その他の微生物が有するファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼにおいても保存されていると推測される。
【００７４】
そこで、上記アミノ酸配列に基づいて、表１に示す２種類（５'プライマー（配列番号１）及び３'プライマー（配列番号２））の縮重プライマーを設計した（Takashi Uemori, Yoshizumi Ishino, Kayo Fujita, Kiyozo Asada and Ikunoshin Kato “Cloning of the DNA Polymerase Gene of Bacillus caldotenax and Characterization of the Gene Product” (1993) J. Biocem., 113, 401-410.）。
【００７５】
【表１】
2007159401.tif 000002
【００７６】
なお、「y」はt又はcを、「s」はc又はgを、「k」はg又はtを、「r」はa又はgを、「h」はa又はt又はcを、「n」はa又はg又はc又はtを表す。
【００７７】
（２）ファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼ特異的プライマーを用いたＰＣＲ
１０種類の微生物（Bacillus caldotenax，Bacillus caldolyticus，Escherichia coli，Bacillus subtilis，Lactobacillus bulgaricus，Lactobacillus homohiochii，Lactobacillus heterohiochii，Thermus aquaticus，Themus thermophilus，Sulfolobus solfataricus）から抽出したゲノムＤＮＡ ０．５ｎｇの存在下、上記縮重プライマー１００ｐｍｏｌを用いて、５０μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰ及び５ユニット ＴＡＫＡＲＡ Ｅｘ Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を含む溶液中でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、７２℃で２分間からなる温度サイクルを３０サイクル行った。
【００７８】
その結果、図４に示すように、１０種全ての微生物において、ファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼに由来すると推定されるＰＣＲ増幅断片が得られた。なお、図４中、「Ｍ」は分子量マーカーを表し、レーン２はBacillus caldotenax、レーン３はBacillus caldolyticus、レーン４はEscherichia coli、レーン５はBacillus subtilis、レーン６はLactobacillus bulgaricus、レーン７はLactobacillus homohiochii、レーン８はLactobacillus heterohiochii、レーン９はThermus aquaticus、レーン１０はThemus thermophilus、レーン１１はSulfolobus solfataricusに関する結果である。
この結果から、上記縮重プライマーは、任意の微生物に由来するファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に対するプライマーとして使用できることが明らかになった。
【００７９】
次に、霧島温泉地域、鬼首温泉地域等の高温環境土壌より回収されたゲノムＤＮＡの全回収量の１／５０（１μＬ）の存在下、上記縮重プライマー１００ｐｍｏｌを用いて、５０μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３)、５０ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰ及び５ユニット ＴＡＫＡＲＡ ＥＸ Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を含む溶液中でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０サイクル行った。
【００８０】
その結果、図５に示すように、幾つかの地点から回収したゲノムＤＮＡを鋳型とした場合、ファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼに由来すると推定されるＤＮＡ断片が増幅された。ＤＮＡ断片の長さが予測とほぼ一致していた場合に、ＤＮＡ断片がファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼに由来するＤＮＡ断片であると推定した。なお、図５中、「Ｍ」は分子量マーカーを表し、レーン１〜２９は異なる地点に関する結果を表す。
【００８１】
（３）増幅断片のクローニング
ＰＣＲ終了後の反応液に等量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を加えた後、水溶液と等量の水飽和フェノール／クロロフォルム液を加えてよく攪拌し、７０℃で１０分間加温した後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上層水溶液画分を注意して分取した。分取した水溶液画分を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１００（ミリポア社製）に加え、２５００ｒｐｍで１５分間遠心した。再度、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５)及び１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を２００μＬ加え、２，５００ｒｐｍで１５分間遠心した。以上の操作により、未反応プライマー、ヌクレオチド、塩等を除去した。
【００８２】
ＰＣＲ増幅断片 約０．０５μｇと、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５)及び１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液に溶解したｐＧＥＭ Ｔ−ベクター（Promega社製） ０．１μｇと、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５)／１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液８μＬとを混合した後、ライゲーションキット・バージョン２（タカラバイオ社製）１０μＬを加えて１６℃で３０分間保温することにより、ＰＣＲ増幅断片をプラスミドＤＮＡにライゲートさせた。ＰＣＲ増幅断片がライゲートされたプラスミドＤＮＡ １μＬを、氷中で溶解したカルシウム処理済大腸菌ＤＨ１０Ｂ ５０μＬに加え、氷上で２０分間静置し、４２℃で２分間加温した後、９５０μＬの液体ＬＢ培地（１Ｌあたり１０ｇトリプトン、５ｇ酵母抽出液、５ｇ塩化ナトリウム及び１ｇグルコースを含む）を加え、３７℃で６０分間震盪培養した。震盪培養終了後の培養物１５０μＬを、１００μｇ／ｍＬ アンピシリンを含むＬＢ寒天培地上に植菌し、一晩３７℃で培養を行った。
【００８３】
（４）ＰＣＲ増幅断片の塩基配列の解読
寒天培地上に増幅した大腸菌のコロニーを１００μｇ／ｍＬ アンピシリン約２ｍＬを含むＬＢ培地に植菌し、一晩３７℃で震盪培養した。増殖した菌体を１０，０００ｒｐｍで１０分間の遠心で集菌し、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN社製，カタログNo.27104）を用いてプラスミドＤＮＡを回収した。回収されたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、塩基配列解読用プライマー（Ｍ１３プライマー Ｍ４及びＴプロモータープライマー）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲには、ダイターミネーターサイクルシーケンシングキット（ABI社製）を使用し、塩基配列の解読には、ABI社製3700自動塩基配列検出装置を使用した。
【００８４】
（５）ＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列の確定
決定されたＰＣＲ増幅断片の塩基配列は機械的な誤差を含む場合があるので、塩基配列を人手によって修正して機械的な誤差を除いた後、塩基配列にコードされるアミノ酸配列を決定した。公共のタンパク質データベースを使用して相同性検索を行い、ＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列と、既知のファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼ（Thermus aquaticus由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ））のアミノ酸配列と比較を行った。
【００８５】
その結果、図６に示すように、ＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列には、ファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼの機能ドメインのアミノ酸配列が含まれていることが確認された。
なお、図６中、「Ｔａｑ」はＴａｑＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を表し、「No.1」、「No.2」及び「No.3」は、異なる地点から回収されたゲノムＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列を表し、それぞれＴａｑＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列と90％、57％及び52％の相同性を示す。また、「No.1」、「No.2」及び「No.3」に関するアミノ酸配列は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼと異なるアミノ酸配列のみを示す。
【００８６】
また、表２に示すように、異なる地点（ａ〜ｇ）から回収されたゲノムＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列は、それぞれ異なる微生物に由来するファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列と相同性を示したことから、数多くの未知ファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼが高温環境中に存在することが確認できた。
【００８７】
【表２】
2007159401.tif 000003
【００８８】
〔実施例３〕改変ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを有するプラスミドの構築
（１）制限酵素部位を導入するためのプライマーの設計
実施例２で得られたＰＣＲ増幅断片は、ＤＮＡポリメラーゼ活性の中心を担う領域をカバーするものであるから、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列のうち、ＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列と相同性を示す領域が、ＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列で置換された改変ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼとは異なるＤＮＡポリメラーゼ活性を示すと考えられ、向上したＤＮＡポリメラーゼ活性を示す可能性がある。また、改変ＤＮＡポリメラーゼの機能は、高温土壌中に存在する未知ファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼの機能を反映していると考えられる。
【００８９】
そこで、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡのうち、ＰＣＲ増幅断片で置換される領域の外側に制限酵素部位（BlpI部位及びBglII部位）を導入するために、表３に示す２種類のプライマーＡ（配列番号３）及びプライマーＢ（配列番号４）を設計した。プライマーＡ及びＢは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列に影響することなく、新たな制限酵素部位を導入できるように設計されている。
【００９０】
一方、ＰＣＲ増幅断片の外側に制限酵素部位（BlpI部位及びBglII部位）を導入するために、表３に示す２種類のプライマーＣ（配列番号５）及びプライマーＤ（配列番号６）を設計した。プライマーＣ及びＤは、ＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列に影響することなく、新たな制限酵素部位を導入できるように設計されている。
【００９１】
【表３】
2007159401.tif 000004
【００９２】
なお、表３中、一重下線部分は新たに導入されたBlpI部位を表し、二重下線部分は新たに導入されたBglII部位を表す。
【００９３】
（２）制限酵素部位導入プライマーを用いたＰＣＲ
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを含むｐＴＡＱ９ベクター（Ishino Y, Ueno T, Miyagi M, Uemori T, Imamura M, Tsunasawa S, Kato I.“Overproduction of Thermus aquaticus DNA polymerase and its structural analysis by ion-spray mass spectrometry” (1994) J Biochem (Tokyo), 116(5), 1019-24）１０ｎｇの存在下、プライマーＡ及びＢ ２ｐｍｏｌを用いて、５０μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰ及び２．５ユニット PfuUltra ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社製）を含む溶液中でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９５℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０サイクル行った。
【００９４】
次に、実施例２で得られたプラスミドクローン１０ｎｇの存在下、プライマーＣ及びＤ ２ｐｍｏｌを用いて、５０μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰ及び２．５ユニット PfuUltra ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社製）を含む溶液中でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９５℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の温度サイクルを３０サイクル行った。
【００９５】
（３）ＰＣＲ増幅断片の制限酵素処理
ＰＣＲ増幅断片を制限酵素BlpI及びBglIIで切断した。すなわち、各ＰＣＲ増幅反応液５０μＬに１０倍濃縮制限酵素用緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ８．２)、１００ｍＭ ＭｇＣｌ2、６００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ）５μＬ、滅菌蒸留水４２μＬ及び制限酵素BlpI ３μＬを加えて、十分に混合した後、３７℃で３時間保温した。次に、５Ｍ ＮａＣｌ溶液を４μＬ及び制限酵素BglII ３μＬを加えて、十分に混合した後、６０℃で３時間保温した。保温終了後、１０μＬの１０ｍＭ ＥＤＴＡ及び２％ＳＤＳ液を加えて、反応を止めた。
０．８％アガロースゲル電気泳動により切断された各ＤＮＡ断片を分離した後、QUIAGEN社製 QuiaQuickTipを用いて各ＤＮＡ断片を回収・精製した。
【００９６】
（４）制限酵素処理されたＤＮＡ断片のライゲーション
回収・精製された各ＤＮＡ断片０．５μｇ（１μＬ）を氷上で混合し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液３μＬ加え、さらにタカラバイオ社製 Takara Ligation Kit version2を５μＬ加えて、よく混合した後、１６℃で１時間保温した。
【００９７】
（５）大腸菌への導入
ライゲーション反応液のうち１μＬをカルシウム処理済大腸菌DH10B菌体液２０μＬと氷上で混合し、２０分間静置し、４２℃で２分間の熱処理後、ＬＢ液体培地９８０μＬを加え、３７℃で５０分間震盪培養を行った。次いで、１００μＬを分取し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含む寒天ＬＢ培地上に均一に植菌した後、一晩３７℃で保温した。
【００９８】
（６）組み換えの確認
寒天培地上に植菌された大腸菌のうち、プラスミドＤＮＡを有するもののみが寒天培地上で増殖しコロニーを形成した。形成されたコロニーのうち、無作為に１０個を選択し、２ｍＬのＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で一晩震盪培養した後、QIAGEN社製 QIAprep Spin Miniprep Kit（カタログNo.27104）を用いてプラスミドＤＮＡを回収した。回収したプラスミドＤＮＡをBlpI及びBglIIで処理し、BlpI／BglII断片を切り出した。その結果、図７に示すように、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを含むｐＴＡＱ９ベクターにＰＣＲ増幅断片が組み込まれていること、すなわち、改変ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを有するｐＴＡＱ９ベクターを構築できたことが確認された。なお、図７中、「Ｍ」はマーカーを表し、レーン１〜３は、それぞれ異なる地点から回収されたゲノムＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ増幅断片が組み込まれたｐＴＡＱ９ベクターに関する結果を示す。
【００９９】
〔実施例４〕改変ＤＮＡポリメラーゼの発現及び機能解析
（１）ベクターの発現用大腸菌への導入
異なる改変ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを有する２種類のｐＴＡＱ９ベクターを、外来タンパク質の発現効率が高い大腸菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL（Stratagene社製）に形質転換した。
大腸菌BL21-CodonPlus(DE3)-RILのコンピテント細胞を融解して、２本のファルコンチューブに０．１ｍＬずつ移した。その中に、２種類のｐＴＡＱ９ベクター１０ｎｇに相当する溶液を別々に加え、氷中に３０分間放置した後、４２℃のヒートショックを３０秒間行い、そこにＳＯＣ培地０．９ｍＬを加え、３７℃で１時間振とう培養した。その後、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上に適量まき、３７℃で一晩培養し、形質転換体大腸菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL/ST0452-1を得た。
【０１００】
（２）改変ＤＮＡポリメラーゼの発現
寒天培地上に現れた形質転換体を、アンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬ中、３７℃で一晩培養した後、ＩＰＴＧ（Isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside）を１ｍＭになるように加え、さらに３０℃で５時間培養した。培養後、遠心分離（６，０００ｒｐｍで２０分間）により集菌を行った。
集菌した菌体を７５℃で３０分間加熱処理した後、２倍量の５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１錠のプロテアーゼ阻害剤（Complete EDTA-free, Roche社製)、０．５ｍｇのＤＮａｓｅ ＲＱ１（プロメガ社製）を加え、懸濁した。得られた懸濁液を超音波破砕し、３７℃で１０分間保温した後、遠心分離（１１，０００ｒｐｍで２０分間)により上清を得た。この上清に終濃度０．２Ｍとなるように硫酸アンモニウムを加えた後、１,８０００×ｇで１０分間遠心し、上清を得た。この上清をHiTrapフェニールHPカラムで処理した後、HiTrapヘパリンHPカラムで処理し、粗ＤＮＡポリメラーゼ画分とした。
【０１０１】
粗ＤＮＡポリメラーゼ画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）染色した結果を図８に示す。図８中、「Ｍ」は分子量マーカーを表し、「ｐＴＡＱ９」は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを含むｐＴＡＱ９ベクターを発現させて得られた粗ＤＮＡポリメラーゼ画分に関する結果を表し、レーン１及び２は、改変ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを有するｐＴＡＱ９ベクターを発現させて得られた粗ＤＮＡポリメラーゼ画分に関する結果を表す。図８に示すように、粗ＤＮＡポリメラーゼ画分はほぼ均一なタンパク質評品であった。
【０１０２】
（３）改変ＤＮＡポリメラーゼの機能解析
改変ＤＮＡポリメラーゼが耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するか否かを、本酵素を用いてＰＣＲを行うことにより確認した。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び２００μＭ ｄＮＴＰを含む緩衝液５０μＬに、ｐＥＴ３２プラスミドＤＮＡ １ｎｇ、該プラスミドＤＮＡに特異的なＴ７プロモータープライマー及びＴ７ターミネータープライマー各１０ｐｍｏｌ（いずれもNovagen社製）、並びに粗ＤＮＡポリメラーゼ液１μＬを混合し、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で１分間の温度サイクルを３０サイクル行った。また、コントロールとして、市販のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（TaKaRa Taq）を用いて同様の条件でＰＣＲを行った。その結果、図９に示すように、予定していたＤＮＡ領域の増幅が確認された。この結果から、改変ＤＮＡポリメラーゼが耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有することが確認された。なお、図９中、「Ｍ」は分子量マーカーを表し、レーン１は、市販のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（コントロール）を用いて得られたＰＣＲ増幅断片の電気泳動結果を示し、レーン２は改変ＤＮＡポリメラーゼを用いて得られたＰＣＲ増幅断片の電気泳動結果を示す。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】高温環境土壌から抽出したゲノムＤＮＡの電気泳動結果を示す図である。
【図２】複数の微生物（Bacillus subtilis、Bacillus caldotenax、Thermus aquaticus、Themus thermophilus、Escherichia coli）に由来するファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列のアライメント結果を示す図である。
【図３】複数の微生物（Bacillus subtilis、Bacillus caldotenax、Thermus aquaticus、Themus thermophilus、Escherichia coli）に由来するファミリーＡ型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列のアライメント結果を示す図（図２の続き）である。
【図４】複数の微生物（Bacillus caldotenax，Bacillus caldolyticus，Escherichia coli，Bacillus subtilis，Lactobacillus bulgaricus，Lactobacillus homohiochii，Lactobacillus heterohiochii，Thermus aquaticus，Themus thermophilus，Sulfolobus solfataricus）から抽出したゲノムＤＮＡの存在下、縮重プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより得られたＰＣＲ増幅断片の電気泳動結果を示す図である。
【図５】高温環境土壌から回収したゲノムＤＮＡの存在下、縮重プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより得られたＰＣＲ増幅断片の電気泳動結果を示す図である。
【図６】高温環境土壌から回収したゲノムＤＮＡの存在下、縮重プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより得られたＰＣＲ増幅断片にコードされるアミノ酸配列を示す図である。
【図７】プラスミドＤＮＡから切り出したBlpI／BglII断片の電気泳動結果を示す図である。
【図８】粗ＤＮＡポリメラーゼ画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）染色した結果を示す図である。
【図９】改変ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲにより得られたＰＣＲ増幅断片の電気泳動結果を示す図である。
【図１０】複数の微生物（Serratia marcescens、Bacillus circurans、Stenotrophomonas maltophilia、Janthinobacterium lividum、Thermococcus kodakaraensis、Clostridium thermocellum、Bacillus licheniformis）に由来するキチナーゼのアミノ酸配列のアライメント結果を示す図である。
【図１１】複数の微生物（Bacillus属、Carnobacterium属、Synechocystis属、Phormidium属、Vibrio属、Shewanella属、Mycobacterium属）に由来するアラニンデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列のアライメント結果を示す図である。
【図１２】複数の微生物（Bacillus subtilis、Oceanobacillus iheyensis、Escherichia coli、Thermotoga maritima、Aquifex aeolicus）に由来するＤ−２−デオキシリボース−５−フォスフェートアルドラーゼのアミノ酸配列のアライメント結果を示す図である。
【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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