(57)【要約】【課題】本発明は、カバー部材と担体との間隔をコントロールすることにより、分析チップごとの検体溶液アプライ量のバラツキを改善し、これにより、検体と固定化された選択結合性物質との選択的な反応を効率良く且つ安定して行うことができる分析チップ及び分析方法を提供することを目的とする。【解決手段】担体と、前記担体の表面を覆い前記担体と接着されたカバー部材と、前記担体と前記カバー部材との間に介在しこれらを接着させる接着部材とからなり、担体とカバー部材と接着部材との間に空隙が形成されてなる分析チップであって、前記接着部材中にスペーサービーズが分散していることを特徴とする分析チップ及びこれを用いる分析方法。【選択図】  図２
2007304094.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体と、
前記担体の表面を覆い前記担体と接着されたカバー部材と、
前記担体と前記カバー部材との間に介在しこれらを接着させる接着部材とからなり、担体とカバー部材と接着部材との間に空隙が形成されてなる分析チップであって、
前記接着部材中にスペーサービーズが分散していることを特徴とする分析チップ。
【請求項２】
前記スペーサービーズの直径が、１μｍ〜１００μｍであることを特徴とする請求項１記載の分析チップ。
【請求項３】
前記接着部材が、シリコーン系ポリマー、オキシム系ポリマー、アクリル系ポリマー及びこれらの混合物からなる群より選択されるポリマーを含む樹脂組成物であることを特徴とする請求項１または２に記載の分析チップ。
【請求項４】
前記担体が、その表面であって前記空隙内に位置する領域上に固定化された選択結合性物質を有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分析チップ。
【請求項５】
前記担体が、その表面であって前記空隙内に位置する領域上に凹部を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分析チップ。
【請求項６】
前記凹部の内部に凸部を１つ以上有するものを有することを特徴とする、請求項５に記載の分析チップ。
【請求項７】
前記カバー部材が、前記担体に脱離可能に接着されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の分析チップ。
【請求項８】
前記空隙内に封入された微粒子をさらに含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の分析チップ。
【請求項９】
（Ａ）請求項１〜８のいずれか一項に記載の分析チップに被検物質をアプライする工程；
（Ｂ）前記被検物質を前記担体に選択的に結合させる工程；及び
（Ｃ）前記担体上に前記選択結合性物質を介して結合した前記被検物質量を測定する工程
を含むことを特徴とする、被検物質の分析方法。
【請求項１０】
前記分析チップが、前記担体の表面であって前記空隙内に位置する領域上に固定化された選択結合性物質を有し、前記工程（Ｂ）が、前記被検物質と前記選択結合性物質とを相互作用させ、前記被検物質を前記選択結合性物質を介して前記担体に結合させることを含む、請求項９に記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検物質と選択的に結合する物質（本明細書において「選択結合性物質」という。）を固定化した担体を備え、被検物質が含まれる溶液と選択結合性物質との反応による分析を行う際に用いうる分析チップ、並びに当該分析チップを用いた分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
各種生物の遺伝情報解析の研究が始められている。ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列、また遺伝子配列にコードされる蛋白質およびこれら蛋白質から二次的に作られる糖鎖に関する情報が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子、蛋白質、糖鎖などの高分子体の機能は、各種の方法で調べることができる。主なものとして、核酸は、ノーザンブロッティング、あるいはサザンブロッティングのような、各種の核酸／核酸間の相補性を利用して、各種遺伝子とその生体機能発現との関係を調べることができる。蛋白質は、ウエスタンブロッティングに代表される蛋白質／蛋白質間の反応を利用し蛋白質の機能および発現について調べることができる。
【０００３】
近年、多数の遺伝子発現を一度に解析する手法として、ＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる新しい分析法が開発され、ＤＮＡのみならず蛋白質や糖鎖検出・定量にも応用されている。これらの方法の大きな特徴は、マイクロアレイ又はＤＮＡチップと呼ばれるガラスの平面基板片上に、多数のＤＮＡ断片や蛋白質、糖鎖が高密度に整列固定化されたものが用いられている点にあり、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子等を蛍光色素等で標識したサンプルを平面基板片上でハイブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）同士を結合させ、その箇所を高解像度検出装置（スキャナー）で高速に読み取る方法や、電気化学反応にもとづく電流値等の応答を検出する方法に応用され、サンプル中の遺伝子量の迅速な推定に貢献している。また、ＤＮＡチップの応用分野は、発現遺伝子の量を推定する遺伝子発現解析のみならず、遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰ）を検出する手段としても大きく期待されている。
【０００４】
ＤＮＡチップの使用時は、調製した検体溶液を、ＤＮＡチップ上の選択結合性物質が設けられた領域全体に広がるようにアプライすることが必要である。微量な検体溶液をＤＮＡチップの当該領域全体に広げるためには、予めＤＮＡチップ表面に平坦なカバーガラスをかけておき、横から毛細管現象により検体溶液を注入する方法がある。しかし、この方法では、カバーガラス表面の汚れ、混入したゴミ等が検体溶液の注入を妨げ、気泡が入ってしまうという問題があった。そこで、これらの課題を解決するためにＤＮＡチップとカバーガラスとの間に空隙形成部材を保持し、検体溶液を安定してアプライする工夫が、特許文献１に開示されている。
【０００５】
また、特許文献２では、検体ＤＮＡ溶液に微粒子を添加し、その微粒子の運動を利用して攪拌を行いながらハイブリダイゼーションを行う技術が開示されている。この技術では、ＤＮＡチップを回転することにより微粒子を動かし検体溶液を攪拌するので、その際に検体溶液及び微粒子を保持できるように閉じた空隙を形成することになる。そのように閉じた空隙に検体溶液等を密閉する手段として、特許文献２では、予め微粒子を検体ＤＮＡ溶液に添加しておいた微粒子分散溶液をＤＮＡチップにアプライして、カバーガラスを被せて、シール剤により密閉し、カバーガラス、ＤＮＡチップ及びシール剤により規定される密閉された空隙を形成することが開示されている。
【０００６】
しかしながら、これらのＤＮＡチップにおいては、空隙内に検体溶液をアプライする際、ＤＮＡチップにより空隙内に入る検体溶液量にバラツキが発生するといった問題があった。これは、チップ作製時に担体にカバー部材を接着させる工程において、接着部材の厚みにバラツキが生じ、これが原因で空隙内体積のバラツキが生じることに因る。この検体溶液量のバラツキが、ハイブリダイゼーション後のシグナル強度に影響を与えるため、ＤＮＡチップ間における測定データ再現性の低下という問題が生じていた。
また、同一ＤＮＡチップ内の各４辺の厚みにおいてもバラツキが発生し、カバー部材と担体との間隔が一定に保持されていないことから、攪拌子の運動がスムーズに行われないといった問題があった。
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００１／０４４８１４号パンフレット
【特許文献２】特許第３５５７４１９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、前記課題を解決するもので、その目的は、カバー部材と担体との間隔を厳密にコントロールすることにより、分析チップのカバー部材と担体との間隔を一定に保ち、これにより、分析チップ間の検体溶液アプライ量の差、すなわちバラツキを改善することができ、またハイブリダイゼーションを行う際に攪拌子が空隙内をスムーズに移動できるようにすることにより、検体と固定化された選択結合性物質との選択的な反応を効率良く且つ安定して行うことができる分析チップ及び分析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため、本発明によれば、下記のものが提供される：
〔１〕  担体と、
前記担体の表面を覆い前記担体と接着されたカバー部材と、
前記担体と前記カバー部材との間に介在しこれらを接着させる接着部材とからなり、担体とカバー部材と接着部材との間に空隙が形成されてなる分析チップであって、
前記接着部材中にスペーサービーズが分散していることを特徴とする分析チップ。
〔２〕  前記スペーサービーズの直径が、１μｍ〜１００μｍであることを特徴とする上記〔１〕記載の分析チップ。
〔３〕  前記接着部材が、シリコーン系ポリマー、オキシム系ポリマー、アクリル系ポリマー及びこれらの混合物からなる群より選択されるポリマーを含む樹脂組成物であることを特徴とする上記〔１〕または〔２〕に記載の分析チップ。
〔４〕  前記担体が、その表面であって前記空隙内に位置する領域上に固定化された選択結合性物質を有することを特徴とする、上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載の分析チップ。
〔５〕  前記担体が、その表面であって前記空隙内に位置する領域上に凹部を有することを特徴とする、上記〔１〕〜〔４〕のいずれか一項に記載の分析チップ。
〔６〕  前記凹部の内部に凸部を１つ以上有するものを有することを特徴とする、上記〔５〕に記載の分析チップ。
〔７〕  前記カバー部材が、前記担体に脱離可能に接着されていることを特徴とする上記〔１〕〜〔６〕のいずれか一項に記載の分析チップ。
〔８〕  前記空隙内に封入された微粒子をさらに含むことを特徴とする〔１〕〜〔７〕のいずれか一項に記載の分析チップ。
〔９〕  （Ａ）〔１〕〜〔８〕のいずれか一項に記載の分析チップに被検物質をアプライする工程；
（Ｂ）前記被検物質を前記担体に選択的に結合させる工程；及び
（Ｃ）前記担体上に前記選択結合性物質を介して結合した前記被検物質量を測定する工程
を含むことを特徴とする、被検物質の分析方法。
〔１０〕  前記分析チップが、前記担体の表面であって前記空隙内に位置する領域上に固定化された選択結合性物質を有し、前記工程（Ｂ）が、前記被検物質と前記選択結合性物質とを相互作用させ、前記被検物質を前記選択結合性物質を介して前記担体に結合させることを含む、上記〔９〕に記載の分析方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の分析チップ及び分析方法によれば、分析チップごとの接着部材の厚みが一定でカバー部材と担体との間隔が一定となるので、アプライする検体溶液量も一定になる。従って、分析チップごとの測定値のバラツキを顕著に低減することができ、検体と固定化された選択結合性物質との選択的な反応を安定して行うことができる。特に微量検体溶液による反応においても適用可能となり、より高精度な結果を得ることができるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の分析チップは、担体と、担体の表面を覆い担体と接着されたカバー部材と、前記担体と前記カバー部材との間に介在しこれらを接着させる接着部材とを備える。
【００１２】
本発明の分析チップとは、被検物質を含む溶液を当該チップにアプライし、被検物質の存在の有無や、被検物質の量や、被検物質の性状等を測定するために用いるチップをいう。具体的には、担体表面に固定化された選択結合性物質と検体との反応により、検体の量や、検体の有無を測定するバイオチップが挙げられる。より具体的には、核酸を担体表面に固定化したＤＮＡチップ、抗体に代表されるタンパク質を担体表面に固定化したタンパク質チップ、糖鎖を担体表面に固定化した糖鎖チップ、及び担体表面に細胞を固定化した細胞チップ等が挙げられる。選択結合性物質及びその固定化の態様については後述する。
【００１３】
前記担体としては、特に限定はなく、表面が平滑なものを用いることもできるし、表面に凹部を有するものを用いることもできる。前記カバー部材は、前記担体の表面の少なくとも一面の一部を覆い、担体と、カバー部材との間に空隙を有するよう接着されることができる。
そして、担体は、好ましくはその表面であって前記空隙内に位置する領域上に固定化された選択結合性物質を有する。即ち、好ましくは、前記選択結合性物質が固定化された領域が、当該空隙内に存在するように、前記カバー部材は前記担体に接着される。前記カバー部材は、前記空隙が形成される限りにおいて、どのような態様で接着されてもよいが、好ましくは、両面テープ、樹脂組成物等の接着部材を介して接着される。担体の形状、前記選択結合性物質、その固定化の態様、空隙の形状、接着の態様等の具体例については後に詳述する。
【００１４】
図１は、本発明の分析チップの概略的な態様の例を示す斜視図であり、図２は図１の分析チップを矢印Ａ１に沿った面で切断した断面図である。図１及び図２に示す例においては、担体２が、接着部材３を介してカバー部材１で覆われ、凹部Ｒ１を含む空隙５を形成しており、空隙５は、本発明において必要に応じて設けることのできる複数の貫通孔４を介して外部と連通する他は、外部と連通しない閉じた空間となっている。
【００１５】
本発明の分析チップにおいては、スペーサービーズが接着部材中に分散していることを特徴とする。このようにすることにより、接着の際の加重の程度に関わらず接着部材の厚さが一定に保たれるので、空隙の高さ、すなわち容積が制御され、空隙に注入される溶液の量を一定に保つことができる。
【００１６】
スペーサービーズの形状及び大きさは、スペーサーとしての機能を果たす観点から球形で、かつほぼ一定であることが最も好ましい。ここで、ほぼ一定の形状及び大きさであるとは、ビーズの形状及び大きさに誤差がほとんどなく、好ましくはまったく同じであることを意味する。更に、スペーサービーズは、直径が１μｍ〜１００μｍ、さらには５μｍ〜８０μｍの間であることが好ましい。
【００１７】
接着部材の厚さがスペーサービーズの直径と同一またはそれより僅かに大きい程度となるので、所望とする接着部材の厚さに合わせてスペーサービーズの直径を選択することができる。具体的には、例えば上記の１μｍ〜１００μｍの範囲で任意に選択することができる。
【００１８】
スペーサービーズは、接着部材中に分散させることが好ましい。ここで、分散とは凝集がほとんどなく均一に位置させることを意味する。
【００１９】
スペーサービーズの材料は特に限定されず、接着部材中に分散可能でスペーサーとして機能するものを選択して用いることができる。例えば、シリカゲル（例えば、スペーサーシリカ）、セラミック（例えばイットリウム部分安定化ジルコニア）、ガラス、金属（例えば金、白金、ステンレス）、プラスチック等が挙げられ、なかでも安価であるシリカゲルや、耐熱性や強度に優れており、サイズ選択幅が広いという点で、プラスチックが好ましい。プラスチックとしては、例えばナイロン樹脂、ポリスチレン樹脂、アクリル樹脂等が挙げられ、なかでもアクリル樹脂が好ましい。スペーサービーズの硬さは、担体やカバー部材の硬さと同等又はそれよりも小さいものの方が、担体やカバー部材の損傷を防ぐ観点から好ましい。
【００２０】
スペーサービーズの含有量も特に限定されないが、少なすぎるとスペーサーとしての機能が十分に発揮されず、また多すぎても接着力の低下を引き起こす可能性がある観点から定めることができる。スペーサービーズの含有量は、接着部材に対し、０．０５容量％〜０．５容量％であることが好ましい。
【００２１】
スペーサービーズは、接着部材をカバー部材の表面に塗布する前に予め分散させておくことができる。スペーサービーズを接着部材中に添加して、適度に攪拌することで分散させ、これをそのままカバー部材の担体への接着に用いることができる。
【００２２】
カバー部材と担体基板との接着は、例えば、上記のようにしてスペーサービーズを分散させた接着部材を、ディスペンサー用いて担体基板上に塗布し、その上にカバー部材を被せて荷重を掛け、静置して乾燥させることで行うことができる。接着時の荷重は１０〜１００ｇ重程度が好ましく選択される。また、常温で静置することも可能であるが、適度な加温状態で静置すること、例えば４２℃のオーブン内で２時間程度静置することで、簡便に乾燥させることができる。
【００２３】
接着部材は、カバー部材を担体に脱離可能に接着することができ、上記のスペーサービーズを分散可能な素材から適宜選択することができる。また、カバー部材と担体が損傷されることなく脱離することが可能である態様が好ましい。このような素材としては、例えば、樹脂組成物等を挙げることができる。当該樹脂組成物としては、アクリル系ポリマー、シリコーン系ポリマー、オキシム系ポリマー、及びこれらの混合物からなる群より選択されるポリマーを含む樹脂組成物等を用いることができる。
【００２４】
特に、接着部材としてシリコーン系のエラストマーを用いると、密閉性が良好であり、しかも、容易に脱離が可能な状態でカバーを接着することができる。このようなエラストマーとしては、具体的には、シルガード（シルガードはダウコーニング社の登録商標）や、信越化学工業社製の二液型ＲＴＶゴム（型取り用）を挙げることができる。
【００２５】
一方、本発明の分析チップの担体の形状は特に限定されず、図２の例のように平面状のものを利用することができるほか、図３の例のように表面に凹部を有するものを用いることもできる。表面に凹部を有する担体において、凹部の位置は、担体、カバー部材、及び接着部材により三方向を囲まれた空間内とすることが好ましい。
また、図４及び図５の例のように、表面に凹部を有する担体においては、凹部内に複数の凸部が設けられたものを用いることができる。このような担体を用いる場合には、接着部材の厚みを制御することにより、凸部の上面とカバー部材との間の距離を一定に保つことができ、反応領域におけるビーズの移動がスムーズに行われる。これにより凸部上面に結合させた選択結合性物質と被検物質との反応を効率よく進めることができるので好ましい。
【００２６】
本発明の分析チップにおいて、カバー部材は、担体に、脱離可能に接着されていることが好ましい。担体がＤＮＡチップの場合、通常、ＤＮＡチップを専用スキャナーで読み取ることが必要である。その時、カバー部材が接着された状態では、専用スキャナーにセットすることが難しく、セットされたとしてもスキャン操作を実施するとカバー部材とスキャナーの光学系部品が接触し、故障の原因となることがある。また、カバー部材を介しての読み取りが可能であっても、読み取り値が不正確となりうる。そのため、読み取りの工程においてカバー部材を取り外せるよう、カバー部材が脱離可能であることが好ましい。
【００２７】
上記カバー部材の形状は、前記基材の表面の少なくとも一面の一部を覆い、基材と、カバー部材との間に空隙を有するよう接着されうる形状を適宜選択することができる。例えば、図４に示すように平面状であっても良いし、図５に示すように接着部材部分を突出させて、カバー部材と担体の間に形成される空隙を大きく取る構造であっても良い。カバー部材の脱離の際の基材損傷を回避する観点から、その外周部分において、基材に近い部分より基材に遠い部分において突出した部分を有する構造、すなわちオーバーハング構造が設けられたものであってもよい。
【００２８】
前記カバー部材は、前記空隙に連通する１つ以上の貫通孔を有することが好ましい。図１〜図４に示す分析チップの使用においては、検体溶液を貫通孔４の任意の１箇所以上よりアプライし、空隙５に充填する。その後、貫通孔４を封止部材で塞ぐことで、検体溶液を簡便に密閉保持することができる。その結果、検体と、担体の領域Ｒ１に固定化された選択結合性物質との反応を、安定して行うことができる。貫通孔を有す貫通孔の数は、１つ以上であれば良いが、被検物質が含まれる溶液の充填が容易となる観点から、複数、特に３〜６個とすることが好ましい。なお、後述するように、空隙が、互いに連通しない複数の空間に分かれている場合は、各空間あたりに複数個、特に３〜６個の貫通孔を有することが好ましい。貫通孔の孔径は必要に応じて適宜設定可能であるが、複数の貫通孔を設ける場合、そのうちの一部をアプライ口とし、その他の貫通孔を空気の抜け口として機能させる場合、検体溶液のアプライの容易さ及び該溶液の密閉保持性の点から、アプライ口のみをアプライに必要な広い孔径、例えば直径０．０１から２．０ｍｍの範囲内とし、その他の貫通孔をより狭い孔径、例えば０．０１〜１．０ｍｍとすることができる。
【００２９】
貫通孔の少なくとも１つは、貫通孔の封止を容易かつ確実に行う観点から、上端に径の広い部分、いわゆる液面駐止用チャンバーを備えるものとすることが好ましい。液面駐止用チャンバーの形状は、円柱形、角柱形、円錐形、角錐形、半球形等の任意の形状を適宜選択とすることができ、特に製造の容易さ及び検体溶液の上昇抑制効果の高さ等の観点からは、円柱形が好ましい。
【００３０】
貫通孔の孔径サイズは検体溶液のアプライを容易に行うとともに、アプライ後封止前の検体溶液の蒸発などをより効果的に抑制する観点から定めることができる。例えば、図６及び図７に示す縦断面形状の円筒形の貫通孔４及び液面駐止用チャンバー４Ａとの組み合わせの場合を例に挙げると、貫通孔４の孔径サイズ（直径）は、０．０１から２．０ｍｍが好ましく、０．３から１．０ｍｍがより好ましい。
一方、液面駐止用チャンバー４Ａの孔径サイズ（直径）については、十分な液面駐止効果を得る観点から定めることができ、通常１．０ｍｍ以上、好ましくは１．０ｍｍ以上１０ｍｍ以下とすることができる。また、液面駐止用チャンバー４Ａの深さは、特に限定されないが、０．１〜５ｍｍの範囲内とすることができる。
【００３１】
本発明の分析チップでは担体、カバー部材及び接着部材を含む構造により規定される空隙内に封入された撹拌子をさらに含んでいても良い。当該撹拌子を含むことにより、検体溶液をアプライした後に分析チップを揺動、回転等させることで、空隙内で撹拌子を運動させ、検体溶液の十分な撹拌を達成し、より精密な分析を行うことができる。
【００３２】
前記撹拌子の形状は、特に限定されず、球状の形状以外に、多角形、円筒形などの任意の形状とすることができる。また、撹拌子のサイズも特に限定されないが、例えば球状の微粒子の場合、０．１〜４００μｍ、好ましくは０．１〜３００μｍの範囲とすることができ、また、円筒形の微粒子の場合、長さ５０〜３００００μｍ、底面直径１０〜４００μｍ、好ましくは１０〜３００μｍの範囲とすることができる。前記撹拌子の材質も、特に限定されないが、ガラス、セラミック（例えばイットリウム部分安定化ジルコニア）、金属（例えば金、白金、ステンレス）、プラスチック（例えばナイロン樹脂、ポリスチレン樹脂、アクリル樹脂）等を用いることができる。
【００３３】
本発明の分析チップは、撹拌子を、予め封入した態様であることが好ましいが、これには限定されず、撹拌子が封入されていない態様であってもよい。この場合、撹拌子を使用せず分析を行ってもよく、検体溶液に撹拌子を混入させて検体溶液のアプライと同時に空隙内に撹拌子を充填してもよく、または検体溶液のアプライの前又は後に、貫通孔を介して撹拌子を別途充填してもよい。
【００３４】
本発明の分析チップは、担体、カバー部材及び接着部材を含む構造により規定される空隙を有するが、当該空隙は、１つの空間でもよく、複数の仕切られた空間であってもよい。複数の仕切られた空間は、例えば図６に示すような仕切り構造により設けることができる。図６に示す例においては、カバー部材の凸部１Ａ及び担体２が接着部材３Ａを介して接着することにより、複数の仕切られた空間５を設けている。複数の仕切られた空間を設ける別の例として、例えば図７に示すような仕切り構造を設けることもできる。図７に示す例においては、担体の凸部２Ｂ及びカバー部材１が接着部材３Ｂを介して接着することにより、複数の仕切られた空間５を設けている。また、さらに別の例として、図８に示すように、担体及びカバー部材に特に仕切り構造を設けるための凸部を設けず、接着部材３Ａのみで空隙を仕切り、複数の仕切られた空間を設けることもできる。これらの例においては、空間５は、互いに連通せず、それぞれが別々に、１以上の貫通孔４及び液面駐止用チャンバー４Ａを有することになる。このように、複数の仕切られた空間を設けることによって、１枚の分析チップに複数種の検体溶液をアプライすることが可能となり、従って複数種の検体を同時に１枚の分析チップで測定することができる。
【００３５】
また、本発明の分析チップは、一枚の担体あたり一枚のカバー部材を有していてもよく、二枚以上のカバー部材を有していてもよい。具体的には、図９及び図１０に示す通り、一枚の担体２上に、複数のカバー部材１を有することができる。複数のカバー部材１のそれぞれは、それぞれ別の接着部材３Ｃを介して担体２上に設けることができる。好ましくは、複数のカバー部材１のそれぞれが、担体２との間に空隙５を有し、且つ各空隙に連通する１つ以上の貫通孔を有することができ、そして、各カバー部材１がそれぞれ別の、選択結合性物質が固定化された領域Ｒ１を有することができる。このような態様をとることによって、上記複数の仕切られた空間を有する態様と同様に、複数種の検体を同時に１枚の分析チップで測定する等の効果を得ることができる。さらに、このような態様をとることにより、それぞれの領域Ｒ１についてカバー部材を独立して脱離させることができるので、例えば一つの領域Ｒ１について分析を行った後に他の領域Ｒ１を用いて分析を行うといった、独立した使用を行いうる。
【００３６】
本発明の分析チップを構成するカバーの材料としては、特に限定されるものではないが、検体溶液をアプライした際に、溶液の様子を観察可能とするために、透明な材料が好ましい。そのような材質としては、ガラス又はプラスチックが挙げられる。特に、貫通孔や液面駐止チャンバー等の構造を容易に作製可能という点から、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート等の透明樹脂を好ましく用いることができる。カバーの作製方法も特に限定されるものではなく、切削加工や射出成型法による加工が可能である。大量生産が可能という観点から、射出成型法を好ましく用いることができる。
【００３７】
本発明の分析チップを構成する担体は、その少なくとも一面の一部、好ましくは凹部の一部に選択結合性物質が固定化された領域を有するものとすることが好ましい。前述のように、表面に凹部を有し、その内部に凸部を１つ以上有する担体の場合には、凸部上面に選択結合性物質が固定化されることが好ましい。このような構造を取ることにより、検出の際、非特異的に吸着した検体を検出することがないので、ノイズが小さく、結果的によりＳ／Ｎが良好な結果を得ることができる。ノイズが小さくなる具体的な理由は、以下の通りである。すなわち、凸部上面に選択結合性物質を固定化した担体をスキャナーと呼ばれる装置を用いてスキャンすると、凹凸部の凸部上面にレーザー光の焦点が合っているため、凹部では、レーザー光がぼやけ、凹部に非特異的に吸着した検体の望まざる蛍光（ノイズ）を検出しがたいという効果があるためである。
【００３８】
凹部に設けられる凸部の高さに関しては、それぞれの凸部の上面の高さが略同一であることが好ましい。ここで、高さが略同一とは、多少高さの違う凸部の表面に選択結合性物質を固定化し、これと蛍光標識した検体とを反応させ、そして、スキャナーでスキャンした際、その信号レベルの強度差が問題とならない高さをいう。具体的に高さが略同一とは、高さの差が５０μｍ以下であることをいう。高さの差は３０μｍ以下であることがより好ましく、高さが同一であればなお好ましい。なお、本願でいう同一の高さとは、生産等で発生するばらつきによる誤差も含むものとする。最も高い凸部上面の高さと、最も低い凸部上面の高さの差が５０μｍより大きいと、高さのずれた凸部上面でのレーザー光がぼやけてしまい、この凸部上面に固定化された選択結合性物質と反応した検体からのシグナル強度が弱くなる場合があるため好ましくない。
【００３９】
凹部において、表面上方からみた際の凸部の配置は、列状であっても良いしランダム状であっても良い。但し、凹部にマイクロロッド状の撹拌子を保持する場合には、列状、特に、一定の方向に等間隔或いは任意の間隔にて凸部が配置されてなることが好ましい。また、凸部分の上面は、実質的に平坦であることが好ましい。ここで凸部上面が実質的に平坦とは、２０μｍ以上の凹凸がないことを意味する。
【００４０】
本発明の分析チップは、さらに好ましくは、担体の凹部が設けられる表面の凹部以外の部分には平坦部が設けられていることが好ましい。この場合、平坦部に接着地点が位置することになる。担体表面の凹部内に凸部を設ける場合、凸部の上面の高さと平坦部分の高さは、略同一であることが好ましい。すなわち、平坦部の高さと凸部上面の高さの差は、５０μｍ以下であることが好ましい。凸部上面の高さと平坦部の高さの差が５０μｍを超えると、検出できる蛍光強度が弱くなる場合があるため好ましくない。平坦部の高さと凸部上面の高さの差は、より好ましくは３０μｍ以下であり、最も好ましくは、平坦部の高さと凸部の高さは同一である。
【００４１】
本発明の分析チップの構成要素として好ましく用いうる担体の具体例を図１１及び図１２に例示する。図１１及び図１２に示す例において、選択結合性物質が固定化された領域Ｒ１は、複数の凸部６を含む凹部により構成されており、その周りに平坦部８が設けられている。凸部６の上面には、選択結合性物質（例えば核酸）が固定化されている。この平坦部を使って、容易にスキャナーの励起光等の測定用の光線の焦点を凸部の上面に合わせることが可能となる。より具体的に説明すると、スキャナーが担体の表面に励起光の焦点を合わせる際には図１３に示すように、バネ１３で付勢して治具１４に担体２を突き当て、この治具の突き当て面１５の高さにレーザー光１２が合焦するようレンズ１１等により予め焦点を調整しておくことが多い。本発明の分析チップの担体の平坦部を治具の面１５に突き当てることにより、容易に担体の凸部上面にスキャナーのレーザー光の焦点を合わせることが可能となる。なお、図１３の例においては、担体２は、選択結合性物質が固定化された面が下側になるよう固定されている。
【００４２】
本発明の分析チップの担体において、凹部内の選択結合性物質が固定化される凸部とは、データとして必要な選択結合性物質（例えば核酸）が固定化された部分をいうが、担体はその他に、何も固定化していない凸部や、ただ単にダミーの選択結合性物質を固定化した部分を有していてもよい。
【００４３】
本発明の分析チップの担体が、選択結合性物質が固定化された凸部を有する場合、当該凸部の上面の面積は略同一であることが好ましい。凸部の上面の面積が略同一であることにより、多種の選択結合性物質が固定化される部分の面積を同一にできるので、後の解析に有利である。ここで、凸部の上部の面積が略同一とは、凸部の中で最も大きい上面面積を、最も小さい上面面積で割った値が１．２以下であることを言う。
【００４４】
選択結合性物質が固定化された凸部の上面の面積は、特に限定されるものではないが、選択結合性物質の量を少なくすることができる点とハンドリングの容易さの点から、１ｍｍ2以下、１０μｍ2以上が好ましい。
【００４５】
本発明で好ましく用いられる担体の凹部における凸部の高さ、即ち凸部上面と凹部底面との高さの差は、１０μｍ以上、５００μｍ以下が好ましく、５０μｍ以上、３００μｍ以下が特に好ましい。凸部の高さが１０μｍより低いと、スポット以外の部分の非特異的に吸着した検体試料を検出してしまうことがあり、結果的にＳ／Ｎが悪くなることがあるため好ましくない。また、凸部の高さが５００μｍより高いと、凸部が折れて破損しやすいなどの問題が生じる場合があり好ましくない。
【００４６】
本発明の分析チップにおける、担体、カバー部材、接着部材及び微粒子の関係の好ましい例を、図１４を参照して説明する。図１４に示した例では、ＤＮＡ等の選択結合性物質９は、担体２の凸部上面６上に固定化されている。そして、撹拌子（この場合は球状のビーズ）７は、担体２の凹部の空隙内に載置されている。選択結合性物質９及び撹拌子７は、検体ＤＮＡ（被検物質）が含まれる検体溶液（図示せず）に触れることになる。検体溶液は、担体２、接着部材３及びカバー部材１により規定される空隙内で保持されることになる。図１４の例においては、担体の凸部上面６とカバー部材１との間隔の最短距離が、撹拌子７の直径未満となっている。それにより、撹拌子が凸部上面６に接触できなくなり、凸部上面６上の選択結合性物質９を傷つけることを防ぐことができる。撹拌子が、例えば楕円形等の非球状の形状である場合は、凸部上面と容器との最短距離が撹拌子の最小径未満であれば、同様に凸部上面６と撹拌子との接触を防ぎ、選択結合性物質９の損傷を防ぐことが可能となる。
【００４７】
本発明の分析チップの担体の材質は、特に限定されないが、ガラス、セラミック、シリコンなどの無機材料、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、シリコーンゴム等のポリマーなどを挙げることができる。この中でも、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）エラストマー、ガラス及びシリコンを特に好ましく用いることができる。また、上記材料に加え、担体を黒色にして光学的測定のＳ／Ｎ比を高めるため、カーボンブラック等の添加剤を配合することができる。
【００４８】
担体は、材質がポリマー等の場合、射出成形法、ホットエンボス法、鋳型内で重合させる方法等により成型することができる。また材質がガラスやセラミック等の無機物の場合、サンドブラスト法、シリコンの場合は公知の半導体プロセスなどで成型することができる。
【００４９】
成型した担体は、選択結合性物質をその表面に固定化するのに先立ち、必要に応じて各種の表面処理を施すことができる。かかる表面処理としては、具体的には例えば特開２００４−２６４２８９号公報に記載されるものなどを挙げることができる。
【００５０】
担体の表面に固定化する選択結合性物質としては、被検物質と直接的又は間接的に、選択的に結合し得る各種の物質を用いることができ、代表的な例として、核酸、タンパク質、糖類及び他の抗原性化合物を挙げることができる。核酸は、ＤＮＡやＲＮＡでもＰＮＡでもよい。特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう「選択結合性物質」に該当する。また、タンパク質としては、抗体及びＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ'）2フラグメントのような、抗体の抗原結合性断片、並びに種々の抗原を挙げることができる。抗体やその抗原結合性断片は、対応する抗原と選択的に結合し、抗原は対応する抗体と選択的に結合するので、「選択結合性物質」に該当する。糖類としては、多糖類が好ましく、種々の抗原を挙げることができる。また、タンパク質や糖類以外の抗原性を有する物質を固定化することもできる。「選択結合性物質」として、特に好ましいものは、核酸、抗体及び抗原である。本発明に用いる選択結合性物質は、市販のものでもよく、また、生細胞などから得られたものでもよい。また、選択結合性物質として、担体の表面に細胞を固定化してもよい。
【００５１】
生細胞からのＤＮＡ又はＲＮＡの調製は、公知の方法、例えばＤＮＡの抽出については、Blinらの方法（Blin et al.，Nucleic Acids Res．3：2303（1976））等により、また、ＲＮＡの抽出については、Favaloroらの方法（Favaloro et al.，Methods Enzymol．65：718（1980））等により行うことができる。固定化する核酸としては、更に、鎖状若しくは環状のプラスミドＤＮＡや染色体ＤＮＡ、これらを制限酵素により若しくは化学的に切断したＤＮＡ断片、試験管内で酵素等により合成されたＤＮＡ、又は化学合成したオリゴヌクレオチド等を用いることもできる。
【００５２】
本発明の分析チップを用いた分析方法に供せられる被検物質としては、分析すべき核酸、例えば、病原菌やウイルス等の遺伝子や、遺伝病の原因遺伝子等並びにその一部分、抗原性を有する各種生体成分、病原菌やウイルス等に対する抗体等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、これらの被検物質を含む検体としては、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、各種組織液等の体液や、各種飲食物並びにそれらの希釈物等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、被検物質となる核酸は、血液や細胞から常法により抽出した核酸を標識してもよいし、該核酸を鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって増幅したものであってもよい。後者の場合には、測定感度を大幅に向上させることが可能である。核酸増幅産物を被検物質とする場合には、蛍光物質等で標識したヌクレオシド三リン酸の存在下で増幅を行うことにより、増幅核酸を標識することが可能である。また、被検物質が抗原又は抗体の場合には、被検物質である抗原や抗体を常法により直接標識してもよいし、被検物質である抗原又は抗体を選択結合性物質と結合させた後、担体を洗浄し、該抗原又は抗体と抗原抗体反応する標識した抗体又は抗原を反応させ、担体に結合した標識を測定することもできる。
【００５３】
本発明の被検物質の分析方法は、（Ａ）前記本発明の分析チップに被検物質をアプライする工程；（Ｂ）前記被検物質を前記担体に選択的に結合させる工程；及び（Ｃ）前記担体上に前記選択結合性物質を介して結合した前記被検物質量を測定する工程を含む。
【００５４】
前記工程（Ａ）は、必要に応じ上述のような標識、増幅等を施した被検物質を水溶液や適当な緩衝液等の溶液とし、ピペット等の通常の器具で担体の凹部に注入することにより行うことができる。特に、前記分析チップとして貫通孔を備えるカバー部材を備えるものを用いる場合には、注入を貫通孔より行うことができる。
【００５５】
貫通孔を備えるカバー部材を備える分析チップを用いる場合には、貫通孔に被検物質を注入した後、貫通孔の一部又は全て、好ましくは全てを封止する態様で封止部材を貼付することにより封止することが望ましい。前記封止部材としては、例えばカプトン（商標、ポリイミドフィルム、東レ・デュポン社製）、ポリエステル、セロハン、又は塩化ビニル製の粘着テープ等の可とう性のテープを好ましく挙げることができるが、これに限らず、非可とう性の板状の接着可能な任意の部材を用いることもでき、非定型のシーリング剤を用いることもできるが、液面駐止用チャンバーによる本発明の効果をより良好に得るという観点からは、可とう性のテープ及び板状の部材が好ましく、操作の簡便性などの観点から、可とう性のテープがさらに好ましい。
【００５６】
封止部材としてテープ又は板状の部材を用いる場合、その使用枚数は任意である。具体的には、カバー部材上の全ての貫通孔を一枚の封止部材で封止してもよく、複数の封止部材を用いてそれぞれで複数の貫通孔の一部を封止してもよい。また、前記の通り一枚の担体上に複数のカバー部材が設けられている場合、カバー部材のそれぞれに別々の封止部材を用いてもよく、複数のカバー部材上の貫通孔をまとめて一枚の封止部材で封止してもよい。通常は、一枚のカバー部材あたり一枚の封止部材を用いることが、簡便且つ確実な封止を達成しうることから好ましい。
【００５７】
封止の具体例を、再び図１４を参照して説明する。図１４の例では、検体溶液（図示せず）を貫通孔４よりアプライした後、可とう性の粘着テープ１０を、液面駐止用チャンバー４Ａの全面を覆うように貼付し、貫通孔を封止している。このような態様により、簡便で且つ検体溶液の漏出や測定誤差を招かない封止を達成できる。
【００５８】
前記工程（Ｂ）は、従来の分析チップにおける操作と全く同様に行うことができる。前記工程（Ｂ）は、好ましくは前記分析チップとして前記担体の表面であって前記空隙内に位置する領域上に固定化された選択結合性物質を有するものを用い、前記被検物質と前記選択結合性物質とを相互作用させ、前記被検物質を前記選択結合性物質を介して前記担体に結合させることにより行うことができる。反応温度及び時間は、ハイブリダイズさせる核酸の鎖長や、免疫反応に関与する抗原及び／又は抗体の種類等に応じて適宜選択されるが、核酸のハイブリダイゼーションの場合、通常、３０℃〜７０℃程度で１分間〜十数時間、免疫反応の場合には、通常、室温〜４０℃程度で１分間〜数時間程度である。また、前記工程（Ｂ）においては、必要に応じて、分析チップを揺動、回転等させ、選択的結合を促進することができる。選択的結合が終了した後、通常はカバー部材を脱離させた後、次の工程（Ｃ）に供することができる。
【００５９】
前記工程（Ｃ）も、従来の分析チップにおける操作と全く同様に行うことができる。例えば、適宜蛍光標識され、選択結合性物質と結合した被検物質の量について、公知のスキャナ等により、その蛍光量を読み取ることにより測定することができる。
【００６０】
本発明の分析方法において、選択結合性物質として核酸を固定化した場合には、この核酸又はその一部と相補的な配列を有する核酸を測定することができる。また、選択結合性物質として抗体又は抗原を固定化した場合には、この抗体又は抗原と免疫反応する抗原又は抗体を測定することができる。なお、本明細書でいう「測定」は検出と定量の両者を示すものである。
【００６１】
本発明の分析キットは、前記本発明の分析チップのうち貫通孔を有するものと、前記カバー部材に貼付し前記貫通孔を封止する封止部材とを含む。当該封止部材としては、前記本発明の分析方法の工程（Ａ）において説明したものと同様のものを含むことができる。本発明の分析キットは、前記本発明の分析方法に従って使用することができる。
【実施例】
【００６２】
実施例１
（ＤＮＡ固定化担体の作製）
平均分子量５万のＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）９９質量部及びカーボンブラック（三菱化学製  商品名  ＃３０５０Ｂ）１質量部を混合し樹脂組成物を調製した。
公知の方法であるＬＩＧＡ（Lithographie Galvanoformung Abformung）プロセスを用いて、射出成形用の型を作製した。この型を用い、上記樹脂組成物を射出成型し、後述する通りの形状を有する黒色の担体を得た。
【００６３】
担体の形状は、大きさが縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚み１ｍｍであり、担体の中央部分を除き表面は平坦であった。担体の中央部分には、縦横１０ｍｍ、深さ０．２ｍｍの矩形の凹んだ部分が設けてあり、この凹みの中に、直径０．２ｍｍ、高さ０．２ｍｍの凸部１Ａを６４箇所（８×８）設けた。凹凸部分の凸部上面の高さ（６４箇所の凸部の高さの平均値）と平坦部分８との高さの差を測定したところ、３μｍ以下であった。また、６４個の凸部上面の高さのばらつき（最も高い凸部上面の高さと最も低い凸部上面との高さの差）を測定したところ、３μｍ以下であった。さらに、凸部のピッチ凸部中央部から隣接した凸部中央部までの距離）は０．６ｍｍであった。
【００６４】
この黒色担体の分光反射率と、分光透過率を測定したところ、分光反射率は、可視光領域（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）のいずれの波長でも５％以下であり、また、同範囲の波長で、厚み方向の透過率は０．５％以下であった。分光反射率、分光透過率とも、可視光領域において特定のスペクトルパターン（ピークなど）はなく、スペクトルは一様にフラットであった。なお、分光反射率は、ＪＩＳ  Ｚ  ８７２２の条件Ｃに適合した照明・受光光学系を搭載した装置（ミノルタカメラ製、ＣＭ−２００２）を用いて、担体からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。
【００６５】
（プローブＤＮＡの固定化）
配列番号１に示される配列を有し、５’末端がアミノ化されたＤＮＡを合成した。このＤＮＡを、固定化した。
上記の担体を１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に７０℃で１２時間浸漬した。これを、純水、０．１ＮのＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄し、担体表面にカルボキシル基を生成した。
【００６６】
ＤＮＡを純水に０．３ｎｍｏｌ／μｌの濃度で溶かして、ストックソリューションとした。担体に点着する際は、ＰＢＳ（ＮａＣｌを８ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏを２．９ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、ＫＨ2ＰＯ4を０．２ｇ純水に溶かし１ｌにメスアップしたものにｐＨ調整用の塩酸を加えたもの、ｐＨ５．５）でプローブＤＮＡの終濃度を０．０３ｎｍｏｌ／μｌとし、かつ、担体表面のカルボン酸とプローブＤＮＡの末端のアミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍｌとした。そして、この混合溶液をガラスキャピラリーで担体凸部上面に点着した。次いで、担体を密閉したプラスチック容器に入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートして、純水で洗浄し、担体凸部上面上に固定化プローブＤＮＡを得た。
【００６７】
（検体ＤＮＡの調製）
検体ＤＮＡとして、上記ＤＮＡ固定化担体に固定化されたプローブＤＮＡとハイブリダイズ可能な、配列番号４の塩基配列を持つＤＮＡ（９６８塩基）を用いた。このＤＮＡの調製方法を以下に示す。
配列番号２と配列番号３の塩基配列を持つＤＮＡを合成した。これらをそれぞれ純水に溶解して濃度１００μＭの水溶液とした。次いで、ｐＫＦ３  プラスミドＤＮＡ（タカラバイオ（株）製品番号；３１００）（配列番号５：２２４６塩基）を用意して、これをテンプレートとし、配列番号２および配列番号３のＤＮＡをプライマーとして、ＰＣＲ反応（Polymerase Chain Reaction）により増幅を行った。
【００６８】
ＰＣＲの条件は以下の通りである。すなわち、ＥｘＴａｑ  ２μｌ、１０×ＥｘＢｕｆｆｅｒ  ４０μｌ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  ３２μｌ（以上はタカラバイオ（株）製  製品番号ＲＲ００１Ａに付属）、配列番号２のＤＮＡ溶液を２μｌ、配列番号３のＤＮＡ溶液を２μｌ、テンプレート（配列番号５）を０．２μｌ加え、純水によりトータル４００μｌにメスアップした。これらの混合液を、４つのマイクロチューブに分け、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲ反応を行った。これを、エタノール沈殿により精製し、４０μｌの純水に溶解した。ＰＣＲ反応後の溶液の一部をとり電気泳動で確認したところ、増幅したＤＮＡの塩基長は、およそ９６０塩基であり配列番号４（９６８塩基）に示す配列を有するＤＮＡが増幅されていることを確認した。
【００６９】
次いで、９塩基のランダムプライマー（タカラバイオ（株）製；製品番号３８０２）を６ｍｇ／ｍｌの濃度に溶かし、上記のＰＣＲ反応後精製したＤＮＡ溶液に２μｌ加えた。この溶液を１００℃に加熱した後、氷上で急冷した。これらにKlenow Fragment（タカラバイオ（株）製；製品番号２１４０ＡＫ）付属のバッファーを５μｌ、ｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰの濃度はそれぞれ２．５ｍＭ、ｄＣＴＰの濃度は４００μＭ）を２．５μｌ加えた。さらに、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ（アマシャムファルマシアバイオテク製；製品番号ＰＡ５３０２１）を２μｌ加えた。この溶液に１０ＵのKlenow Fragmentを加え、３７℃で２０時間インキュベートし、Ｃｙ３で標識された検体ＤＮＡを得た。なお、標識の際ランダムプライマーを用いたので検体ＤＮＡの長さには、ばらつきがある。最も長い検体ＤＮＡは配列番号４（９６８塩基）となる。なお、検体ＤＮＡの溶液を取り出して、電気泳動で確認したところ、９６０塩基に相当する付近にもっとも強いバンドが現れ、それより短い塩基長に対応する領域に薄くスメアがかかった状態であった。そして、これをエタノール沈殿により精製し、乾燥した。
【００７０】
この標識化された検体ＤＮＡを、１重量％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、５×ＳＳＣ（５×ＳＳＣとは、２０×ＳＳＣ（シグマ製）を純水にて４倍に希釈したもの。）、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡの溶液（各濃度はいずれも終濃度）、４００μｌに溶解し、ハイブリダイゼーション用のストック溶液とした。
【００７１】
以下の実施例、比較例において、ハイブリダイゼーションの際の検体溶液は、特に断りのない限り、上記で調製したストック溶液を、１重量％ＢＳＡ、５×ＳＳＣ、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡ、０．１重量％ＳＤＳの溶液（各濃度はいずれも終濃度）で２００倍に希釈したものを用いた。なお、この溶液の検体ＤＮＡの濃度を測定したところ、１．５ｎｇ／μＬであった。
【００７２】
（担体へのカバー部材の接着−分析チップの作製）
厚さ１ｍｍのＰＭＭＡ板から切削加工によりカバー部材を作製した。シリコーン系エラストマー（シルガード）３を接着部材とし、これに直径１０μｍのスペーサーシリカ（トクヤマ製；製品番号ＬＳ−Ｈ０１０）を接着部材に対し０．1容量％の割合で混合し、ディスペンサーを用いて前記担体の凹部から離れた場所に接着部材を塗布した。前記カバー部材をプローブＤＮＡ固定化領域に被さるように設置し、カバー部材の上から５０ｇ重の荷重を掛け、接着部材が接着面全域に広がるまで、４２℃のオーブン内で２時間静置した。接着部材が全面に広がるのを確認した後、荷重を取り外し、接着部材が完全に固まるまで静置した。これにより分析チップを得た。
【００７３】
（接着部材の厚み測定）
接着部材の厚みを、マイクロメーターを用いて以下の手順で算出した。担体にカバー部材を接着した状態の分析チップ全体の厚みを測定し、そこから担体とカバー部材各々の厚みを差し引くことで、接着部材のみの厚みを算出した。その結果、各辺における接着部材の厚みは、各々１１μｍ、１０μｍ、９μｍ、１２μｍと、ほぼスペーサーシリカ直径サイズと同程度であり、担体とカバー部材との間隔がほぼ一定に保たれていることが確認できた。
【００７４】
（ハイブリダイゼーション）
上記で得られた分析チップに上記検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた。具体的には、マイクロピペットを用いてハイブリダイゼーション用の溶液５０μｌを貫通孔より注入した。この際、同時に４枚の同じ分析チップで同様の操作を行ったところ、各チップ（分析チップ１〜４）におけるアプライ溶液量は、３８μｌ、３７μｌ、３７μｌ、３８μｌであり、全てのチップにおいてハイブリダイゼーション溶液のアプライ量にバラツキはなく、ほぼ同量であった。
【００７５】
その後、カプトンテープ（アズワン株式会社製、型番  ５−５０１８−０１）で貫通孔を塞いだ。但し、カプトンテープとしては３ｍｍ角にカットしたもの４枚を用い、それぞれで１つずつの貫通孔を塞ぐこととした。その後、分析チップを４２℃の条件で１６時間インキュベートした。インキュベート後、担体からカバー部材と両面テープを脱離後に担体を洗浄、乾燥した。
ハイブリダイゼーション中、攪拌子は空隙内でスムーズかつ十分に移動しており、反応溶液が十分に攪拌されていることが確認できた。
【００７６】
（ハイブリダイゼーション後のシグナル評価）
分析チップのプローブＤＮＡを固定化した凸部３箇所（スポット１〜３）の蛍光強度を測定して、検体ＤＮＡとプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーション結果を評価した。ＤＮＡチップ用のスキャナー（Axon Instruments社のGenePix 4000B）４に上記処理後の担体をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態で測定を行った。その結果を表１に示す。ここで示す３つの蛍光強度は、異なる凸部３箇所のハイブリダイゼーション後の蛍光強度の値である。
【００７７】
以上の計４枚の分析チップ（分析チップ１〜４）について蛍光強度を測定した結果を表１に示す。各々の分析チップにおいて、スポット１〜３の３箇所全てにおいて十分な蛍光強度が得られ、スポット場所の違いによるハイブリダイゼーション反応のバラツキは見られなかった。また、４枚の分析チップ間での蛍光強度のバラツキもほとんどなく、再現性の高い測定データが得られた。
【００７８】
【表１】
2007304094.tif 000003
【００７９】
比較例１
接着部材にスペーサーシリカを混合しないこと、担体にカバー部材を接着させる際に荷重を掛けないこと以外は実施例１と同様に操作して分析チップを調製し、接着部材の厚み測定、ハイブリダイゼーション時におけるアプライ量の計測、及びハイブリダイゼーション後の蛍光強度の測定を行った。
【００８０】
カバー部材を接着する際、荷重を掛けなければ接着部材が接着面全域に均一に広がらなかった。各辺における接着部材の厚みを測定した結果、２４μｍ、３７μｍ、３１μｍ、２５μｍと４辺にバラツキが生じた。また、全体的にカバー部材が浮いた状態となっていることが確認された。このため、接着力が低下し、ハイブリダイゼーションの最中に、カバー部材が剥がれるものがあった。
【００８１】
上記で得られた分析チップ４枚（分析チップ５〜８）を同様にハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーション溶液のアプライ量は、分析チップ５〜８についてそれぞれ４０μｌ、４３μｌ、３８μｌ、３５μｌとなり、分析チップによるバラツキが生じた。
４枚の分析チップ（分析チップ５〜８）の蛍光強度を比較すると、分析チップ間でバラツキが見られ、再現性の低いデータが得られた。その結果を表２に示す。
【００８２】
【表２】
2007304094.tif 000004
【００８３】
比較例２
接着部材にスペーサーシリカを混合しないこと以外は実施例１と同様に操作して分析チップを調製し、接着部材の厚み測定、ハイブリダイゼーション時におけるアプライ量計測、及びハイブリダイゼーション後のシグナル強度の測定を行った。
【００８４】
各辺の接着部材の厚みを測定した結果、６μｍ、１８μｍ、１２μｍ、１４μｍであり、各辺において接着部材の厚みにバラツキが生じた。スペーサービーズが存在しないため、荷重が不均一にかかり、担体とカバー部材との間隔が一定に保たれていないことが確認された。
【００８５】
上記で得られた分析チップ４枚（分析チップ９〜１２）を同様にハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーション溶液のアプライ量は、分析チップ９〜１２についてそれぞれ３０μｌ、３５μｌ、３７μｌ、３１μｌとなり、分析チップによるバラツキが生じた。
４枚の分析チップ（分析チップ９〜１２）の蛍光強度を比較すると、分析チップ間でその値にバラツキが見られ、再現性の低いデータが得られた。結果を表３に示す。
【００８６】
【表３】
2007304094.tif 000005
【００８７】
実施例２
スペーサービーズとして、直径１０μｍのスペーサーシリカ（トクヤマ製；製品番号ＬＳ−Ｈ０１０）の代わりに、１００％アクリル樹脂製のプラスチックスペーサー（早川ゴム株式会社製；製品番号Ｌ−１１）の直径５１．９μｍのものを用いたこと以外は、実施例１と同様に操作して分析チップを調製し、接着部材の厚み測定、ハイブリダイゼーション時におけるアプライ量の計測、及びハイブリダイゼーション後の蛍光強度の測定を行った。
【００８８】
各辺における接着部材の厚みは、各々５２μｍ、５３μｍ、５４μｍ、５３μｍと、ほぼスペーサービーズ直径サイズと同程度であり、担体とカバー部材との間隔がほぼ一定に保たれていることが確認できた。
【００８９】
上記で得られた分析チップ４枚（分析チップ１３〜１６）を同様にハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーション溶液のアプライ量は、分析チップ１３〜１６についてそれぞれ４０μｌ、４０μｌ、３９μｌ、４０μｌであり、全てのチップにおいてハイブリダイゼーション溶液のアプライ量にバラツキはなく、ほぼ同量であった。
【００９０】
以上の計４枚の分析チップ（分析チップ１３〜１６）について蛍光強度を測定した結果を表４に示す。各々の分析チップにおいて、スポット１〜３の３箇所全てにおいて十分な蛍光強度が得られ、スポット場所の違いによるハイブリダイゼーション反応のバラツキは見られなかった。また、４枚の分析チップ間での蛍光強度のバラツキもほとんどなく、再現性の高い測定データが得られた。
【００９１】
【表４】
2007304094.tif 000006
【００９２】
実施例３
スペーサービーズとして、直径１０μｍのスペーサーシリカ（トクヤマ製；製品番号ＬＳ−Ｈ０１０）の代わりに、１００％アクリル樹脂製のプラスチックスペーサー（早川ゴム株式会社製；製品番号Ｌ−１１）で直径２４．６μｍのものを用いたこと以外は、実施例１と同様に操作して分析チップを調製し、接着部材の厚み測定、ハイブリダイゼーション時におけるアプライ量の計測、及びハイブリダイゼーション後の蛍光強度の測定を行った。
【００９３】
各辺における接着部材の厚みは、各々２５μｍ、２６μｍ、２５μｍ、２５μｍと、ほぼスペーサービーズ直径サイズと同程度であり、担体とカバー部材との間隔がほぼ一定に保たれていることが確認できた。
【００９４】
上記で得られた分析チップ４枚（分析チップ１７〜２０）を同様にハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーション溶液のアプライ量は、分析チップ１７〜２０についてそれぞれ３９μｌ、３８μｌ、３９μｌ、３９μｌであり、全てのチップにおいてハイブリダイゼーション溶液のアプライ量にバラツキはなく、ほぼ同量であった。
【００９５】
以上の計４枚の分析チップ（分析チップ１７〜２０）について蛍光強度を測定した結果を表５に示す。各々の分析チップにおいて、スポット１〜３の３箇所全てにおいて十分な蛍光強度が得られ、スポット場所の違いによるハイブリダイゼーション反応のバラツキは見られなかった。また、４枚の分析チップ間での蛍光強度のバラツキもほとんどなく、再現性の高い測定データが得られた。
【００９６】
【表５】
2007304094.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は、本発明の分析チップの一例を概略的に示す斜視図である。
【図２】図２は、図１に示される本発明の分析チップを矢印Ａ１に沿った面で切断した断面図である。
【図３】図３は、本発明の分析チップの別の一例を示す断面図である。
【図４】図４は、本発明の分析チップの別の一例を示す断面図である。
【図５】図５は、接着部材部分を突出させてなるカバー部材を備える本発明の分析チップの別の一例を概略的に示す部分断面図である。
【図６】図６は、仕切り構造を有する本発明の分析チップの一例を概略的に示す縦断面図である。
【図７】図７は、仕切り構造を有する本発明の分析チップの別の一例を概略的に示す縦断面図である。
【図８】図８は、本発明の分析チップの別の一例を概略的に示す縦断面図である。
【図９】図９は、複数のカバー部材を有する本発明の分析チップの別の一例を概略的に示す斜視図である。
【図１０】図１０は、図９に示される本発明の分析チップを矢印Ａ２に沿った面で切断した部分断面図である。
【図１１】図１１は、本発明の分析チップに用いられる担体の一例を概略的に示す斜視図である。
【図１２】図１２は、図１１に例示される担体の縦断面図である。
【図１３】図１３は、本発明の分析チップを用いた反応の結果を読み取る治具及びスキャナーの一例を概略的に示す縦断面図である。
【図１４】図１４は、本発明の分析チップの別の一例を概略的に示す縦断面図である。
【符号の説明】
【００９８】
１  カバー部材
１Ａ  カバー部材の凸部
２  担体
３、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ  接着部材
４  貫通孔
４Ａ  液面駐止用チャンバー
５  空隙（空間）
６  担体表面の凸部
７  撹拌子
８  平坦部
９  選択結合性物質
１０  封止部材
１１  対物レンズ
１２  レーザー励起光
１３  マイクロアレイを治具に突き当てるためのバネ
１４  治具
１５  治具突き当て面
Ｓ    スペーサービーズ
Ｒ１  選択結合性物質が固定化された領域
【図１】
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【図２】
2007304094.tif 000009
【図３】
2007304094.tif 000010
【図４】
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【図５】
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【図６】
2007304094.tif 000013
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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