(57)【要約】【課題】  新生児壊死性腸炎疾患の予防に優れた効果を発揮する薬剤の提供。【解決手段】  ｎ-3系長鎖多価不飽和脂肪酸又はそのエステルを有効成分として含有する新生児壊死性腸炎疾患予防剤。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｎ-3系長鎖多価不飽和脂肪酸又はそのエステルを有効成分として含有する新生児壊死性腸炎疾患予防剤。
【請求項２】
ｎ-3系長鎖多価不飽和脂肪酸が、ドコサヘキサエン酸又はエイコサペンタエン酸である請求項１記載の予防剤。
【請求項３】
母体に投与するものである、請求項１又は２記載の予防剤。
【請求項４】
転写因子NF-κBの転写活性阻害に基づくものである、請求項１又は２記載の予防剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の予防剤を含有する飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新生児壊死性腸炎疾患を予防する医薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
新生児壊死性腸炎（以下「NEC」）は、腸管の虚血性壊死を主徴とし、腸管穿孔、腹膜炎、敗血症、ショック等を併発する極めて重篤な後天性腸疾患である。NECは早産児や極低出生体重児において多く発生することが知られている。近年、新生児医療が向上しているのにも関わらず、NECによる死亡率は依然として高く、未だその原因や予防法については明らかにされていない。中でも、胃腸管の未熟性、分娩前後の低酸素状態、腸管腔内の損傷、腸管壁の細菌感染、人工乳投与等が主な要因として考えられている。
従来より、NECを発症した新生児に対し、経口投与の中止、抗生物質投与あるいは外科的介入等による治療が行われている。また、NECの予防については、低出生体重児の出生予防、免疫グロブリンの経口投与による感染防御（非特許文献１参照）；ステロイドの母体投与により腸管の成熟を促す方法（非特許文献２参照）；ビフィズス菌や乳酸桿菌投与により腸管の細菌叢安定化を促す方法（非特許文献３参照）；多価不飽和脂肪酸を新生児に投与する方法（非特許文献４参照）等が報告されている。
【０００３】
一般に多細胞生物は、サイトカイン等を介した細胞間の情報伝達をもとに細胞内シグナル伝達系を駆動し、複数の転写因子の活性制御を行うことにより細胞機能に関わる遺伝子群の発現誘導を制御している。転写因子の一つであるNF-κBは、免疫グロブリンκ軽鎖のエンハンサーに結合する因子として同定された二量体であり（非特許文献５参照）、その活性は腫瘍壊死因子α（TNF-α）、IL-１によって活性化される。細胞質では阻害因子IκBがNF-κBの二量体に結合して不活性型としているが、TNF-α又IL-１のシグナルは最終的にIκBを分解に至らせ、二量体を活性化する。IκBが分解されるとNF-κBは核内に移行し標的遺伝子の発現を誘導する。NF-κBがその発現制御に関与すると考えられている遺伝子群としては、主に炎症・免疫応答に関わる遺伝子、アポトーシスなどの過程に含まれる遺伝子が知られている。従って、NF-κB活性に至るカスケードを遮断することによって様々な疾患を予防・治療できると期待されている。
【非特許文献１】Rubaltelli FF, et al. Dev Pharmacol Ther 17, 138-143(1991)
【非特許文献２】Nanthakumar NN, et al. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 288, G85-92 (2005)
【非特許文献３】Hoyos AB. Int J Infect Dis. 3, 197-202 (1999)
【非特許文献４】Caplan MS, et al. Pediatric Research 49, 647-652 (2001)
【非特許文献５】Sen R, Baltimore D, Cell 46, 705-716 (1986)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
重篤な疾患とされる新生児壊死性腸炎疾患は、罹患すると死亡率が５５〜６５％と極めて高く（志村浩二著、小児科診療、第１１巻、第１８０７−１８１１頁、１９９９年）、胎児の段階で予防することが従来より課題となっていた。
本発明は、妊娠期の母体に投与することで、新生児壊死性腸炎疾患の予防に優れた効果を発揮する薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、ラット胎児を用いたNEC疾患モデルを作成し、NEC発症について検討したところ、NEC発症群においてIκBファミリーであるIκB-α、IκB-βタンパクの発現の増強を認め、NECの発生機序における炎症性シグナル分子であるNF-κBの関与を見出した。また、NEC発症群では、抗炎症性シグナル分子であるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ファミリーγ（PPARγ）の発現も有意に高く、NECの病態において抗炎症的に働いている可能性が示唆された。さらに、n-3系長鎖多価不飽和脂肪酸（n-3PUFA）に着目し、n-3系長鎖多価不飽和脂肪酸を出産前母体に投与して、新生児における抗炎症効果を検討したところ、PPARγの発現が高まり、NF-κBを介した炎症の抑制が生じ、新生児のNEC発症が抑制されることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、n-3系長鎖多価不飽和脂肪酸又はそのエステルを有効成分として含有する新生児壊死性腸炎疾患予防剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の薬剤は、NF-κBの阻害因子であるIκBの分解を抑制し、炎症性シグナル分子であるNF-κBを介した炎症を抑制できることから、NF-κBが関与する疾患、特に新生児壊死性腸炎疾患の予防剤として有用である。また、その抗炎症作用により、腸管の炎症を軽度に抑えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明に用いられるn-3系長鎖多価不飽和脂肪酸又はそのエステル（n-3PUFA）としては、炭素数１１以上のn-3系長鎖多価不飽和脂肪酸又はそのエステルが挙げられ、不飽和脂肪酸としては、例えばα−リノレン酸、エイコサペンタエン酸（EPA）、ドコサペンタエン酸（DPA)、ドコサヘキサエン酸（DHA）等が挙げられる。不飽和脂肪酸エステルとしては、例えば炭素数１〜６の低級アルキルエステルが挙げられ、具体的にはメチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル等が挙げられる。このうち、メチルエステル、エチルエステルが好ましい。これらのうち、炭素数２０〜２４の高度不飽和脂肪酸またはそのエステルが好ましく、特にエイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸またはそれらのエステルが好ましい。これらの化合物は単独でまたは２種以上を組み合わせて用いてもよい。
n-3PUFAは、特に限定されず、例えば魚油、エゴマ油、藻類、海洋哺乳類等から分離・精製したものを用いることができる。
【０００９】
本発明の薬剤は、n-3系長鎖多価不飽和脂肪酸又はそのエステルを出産前母体に投与するものである。後記実施例に示すように、本発明の薬剤を母体投与することにより、NEC発生率を顕著に低下させることができ、新生児の壊死性腸炎疾患の予防に優れた効果を発揮する。また、NEC発症例においてもその重症度は低く、腸管の炎症を軽度に抑えることができる。
【００１０】
本発明の薬剤は、用法に応じ種々の剤形の医薬品製剤とすることができ、斯かる剤形としては例えば、散剤、顆粒剤、細粒剤、錠剤、カプセル剤、ドライシロップ剤等の経口投与又は注射剤、坐剤等の非経口投与が挙げられる。
【００１１】
これらの製剤は、母体に影響を与えない限り、その剤形に応じて製剤学的に許容される賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、希釈剤、緩衝剤、等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解補助剤等の医薬品添加物と適宜混合、希釈又は溶解し、常法に従い製造することができる。
【００１２】
本発明の薬剤は、薬剤１ｇあたり、n-3系長鎖多価不飽和脂肪酸又はそのエステルが少なくとも１００ｍｇ以上、特に２００ｍｇ以上含有されていることが好ましい。
【００１３】
本発明の薬剤は、上述したように母体に投与するものであるが、その投与時期は、NECが早産児あるいは極低出生体重児に多く発生することも考慮して、妊娠後期、特に妊娠７ヶ月〜１０ヶ月に投与するのが好ましい。
【００１４】
本発明の薬剤の投与量は、投与対象である母体の体重、年齢、あるいは一日に必要な必須脂肪酸量（栄養所要量）等を考慮して適宜に選択される。例えばドコサヘキサエン酸（DHA）については、１日あたり１２０〜１５００ｍｇ、好ましくは４００〜１２００ｍｇを１日１回から数回に分けて投与することができる。
【００１５】
また、本発明の新生児壊死性腸炎疾患予防剤は、一般的な飲食品に含有させた栄養組成物の形態として製造することが可能であって、当該飲食品は食事療法として摂食することによって、新生児壊死性腸炎疾患の予防に有用である。なお、この場合、本発明の新生児壊死性腸炎疾患予防剤の有効成分であるn-3系長鎖多価不飽和脂肪酸又はそのエステルは、０．１〜１０．０質量％、特に０．５〜５．０質量％の割合で飲食品に含有させることが好ましい。
【実施例】
【００１６】
以下、本発明について実施例をあげて具体的に説明するが、本発明はこれらによって何等限定されるものではない。
【００１７】
参考例  ラット胎児を用いたNEC疾患モデルと炎症性シグナル物質の検討
１）胎生２０日のラット胎児（SD系）を腹部切開にて摘出した。出生後、0.05、0.1、0.15mLの人工乳を経口カテーテルにて単回投与し、生後２４時間の時点で腸管を摘出し、それぞれのNEC発生率を評価した（N=18）。その結果、表１に示すように0.15mL人工乳投与にて高率にNECの発生を認めた。
２）上記より、0.15mLの人工乳を投与したラットをNEC発症群（N=8）とNEC未発症群（N=10）に分け、炎症性シグナル物質の発現強度を検討した。
検体からRNA抽出キット（RNA STAT 60 Reagent, Tel-Test社製）を用いて常法によりtotal RNAを抽出した。DNaseI処理後、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）によりcDNAを合成し、IκB-α、IκB-βおよびPPARγのｍRNA発現量を半定量化した。RT-PCR用のプライマーとして、PPAR-γ:センスプライマー５’-GACACAGAGATGCCATTCTG-３’（配列番号１）及びアンチセンスプライマー５’-CACAAGCATGGACTCCATAG-３’(配列番号２）、IκB-α：センスプライマー５’-GACGAGGATTACGAGCAGAT-３’(配列番号３）及びアンチセンスプライマー５’-CCTGGTAGGTTACTCTGTTG-３’(配列番号４）、IκB-β：センスプライマー５’-CCCAAGAGATGCCTCAGATA-３’(配列番号５）及びアンチセンスプライマー５’-GCCTTCATCTCTGTTGTCAC-３’(配列番号６）、GAPDH：センスプライマー５’-GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT-３’(配列番号７）及びアンチセンスプライマー５’-AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAGTC-３’(配列番号８）を用いた。グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）を内部標準として用い、それぞれのmRNA発現はRT-PCRにより得られた産物をGAPDHとの比により定量化した。
３）結果を図１に示す。図１に示したように、IκB-α、IκB-β及びPPARγの各mRNA発現量をGAPDHの発現量に対する比として比較すると、NEC非発症群に比べNEC発症群で有意に増加していた。このことより、NEC発生機序におけるNF-κBの関与が示唆された。また、NEC発症群におけるPPARγmRNA発現も有意に高かったことから、NEC病態において、抗炎症的な働きをしていることが示唆された。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
実施例１  n-3系長鎖多価不飽和脂肪酸の母体投与による免疫反応の変化の検討
１）１２週齢のSD系妊娠ラットに対し、表２に示すDHA、EPAあるいは大豆油(対照群)各2.5g／kgを妊娠７日目から胎児摘出までの２週間それぞれ経口投与した（N=2）。ラット胎児を腹部切開にて摘出し、出生後0.15mLの人工乳を経口カテーテルにて単回投与した。保育器で２４時間飼育の時点で腸管を摘出し、NEC発生の有無を確認した。なお、DHAあるいはEPA投与群には、必須脂肪酸として大豆油５２％投与を要する。
【００２０】
【表２】
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【００２１】
２）炎症性シグナル物質のmRNA発現レベルの検討
NECを発症したラットを検体として用いた。上記参考例と同様に、消化管からRNA抽出キットを用いて常法によりtotal RNAを抽出した。DNaseI処理後、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）によりcDNAを合成し、IκB-α、IκB-βおよびPPARγのmRNA発現量を半定量化した。PCR産物は、電気泳動により染色・可視化した。なお、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）を内部標準として用いて補正した。
３）結果
NEC発生率を図２に示す。対照群に比べ、DHA及びEPA投与群から出生したラットはNEC発生率が低かった。また、DHA及びEPA投与群のNEC発症例は、対照群の発症例に比べ、肉眼的（腸管の壊死、充血、浮腫、腹水）及び組織学的に炎症所見が軽度であった。
NEC発症例におけるIκB-α、IκB-βおよびPPARγのmRNA発現レベルを図３に示す。各mRNA発現量をGAPDHの発現量に対する比として比較すると、NEC発症例では、DHA及びEPA投与群において対照群よりPPARγmRNAの発現がより増強していた。一方、IκB-α、IκB-βのmRNA発現が減弱していた。
これらの結果より、n-3PUFAの母体投与により、ラット胎児中IκBの分解が抑制され、またPPARγの発現が高まり、NF-κBを介した炎症の抑制が生じ、胎児のNEC発症が抑制されることが確認された。
【００２２】
実施例２  NEC予防用栄養組成物の製造
市販のDHA油を使用して、表３に示した配合に基づいて各種原料を混合し、２０％調乳液を調製して、均質化した後、殺菌濃縮して常法により乾燥し、NEC予防用栄養組成物（粉乳）を製造した。
【００２３】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】NEC発症群及びNEC非発症群におけるIκB-α、IκB-βおよびPPARγのmRNA発現量を示す図である。
【図２】対照群、DHA投与群およびEPA投与群におけるNEC発生率を示す図である。
【図３】電気泳動による、IκB-α、IκB-βおよびPPARγのmRNA発現を示す図である（NEC発症例）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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