(57)【要約】【課題】耐塩性向上活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ断片、および耐塩性向上活性を有するＤＮＡ断片のスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】ＤＮＡ断片は、カイメン（stylissa massa）の共在微生物由来であり、かつ、耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カイメン（stylissa massa）の共在微生物由来であり、かつ、耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ断片。
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｃ）記載のいずれかのタンパク質をコードする、ＤＮＡ断片。
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と相同性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質
【請求項３】
配列番号１、２、および３のいずれかにより表される塩基配列またはその相補的配列を有する、ＤＮＡ断片。
【請求項４】
配列番号１、２、および３のいずれかにより表される塩基配列において、１または数個の塩基が置換、欠失、もしくは付加されている塩基配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ断片。
【請求項５】
配列番号１、２、および３のいずれかにより表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ断片。
【請求項６】
請求項３に記載のＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ断片。
【請求項７】
以下の（ａ）〜（ｃ）のうちいずれか１つの塩基配列またはその相補的配列と、以下の（ｄ）〜（ｉ）のうち少なくとも１つの塩基配列またはその相補的配列と、を含む、ＤＮＡ断片。
（ａ）配列番号１により表される塩基配列
（ｂ）配列番号１により表される塩基配列の一部または全部を含み、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号１により表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｄ）配列番号２により表される塩基配列
（ｅ）配列番号２により表される塩基配列の一部または全部を含み、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｆ）配列番号２により表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｇ）配列番号３により表される塩基配列
（ｈ）配列番号３により表される塩基配列の一部または全部を含み、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｉ）配列番号３により表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれかに記載のＤＮＡ断片を含む、発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより得られる、形質転換体。
【請求項１０】
請求項９において、
前記宿主細胞は微生物細胞である、形質転換体。
【請求項１１】
請求項９または１０において、
耐塩性向上活性を有する、形質転換体。
【請求項１２】
カイメン（stylissa massa）の共在微生物由来であり、かつ、耐塩性向上活性を有するタンパク質。
【請求項１３】
配列番号４、５、および６のいずれかにより表されるアミノ酸配列を有する、タンパク質。
【請求項１４】
配列番号４、５、および６のいずれかにより表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されているアミノ酸配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有する、タンパク質。
【請求項１５】
配列番号４、５、および６のいずれかにより表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有する、タンパク質。
【請求項１６】
カイメン（stylissa massa）の共在微生物から複数のＤＮＡ断片を抽出すること、
前記複数のＤＮＡ断片がそれぞれ挿入された複数の発現ベクターを作製することにより、ライブラリを構築すること、および
前記複数の発現ベクターを宿主細胞に導入し、該宿主細胞を塩ストレス性条件下で培養することにより、耐塩性向上活性を有するクローンを選択すること、
を含む、耐塩性向上活性を有するＤＮＡ断片のスクリーニング方法。
【請求項１７】
請求項１６において、
前記宿主細胞が微生物細胞である、耐塩性向上活性を有するＤＮＡ断片のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、海洋メタゲノム由来の耐塩性向上に関与する遺伝子、ならびに該遺伝子の利用に関する。より具体的には、本発明は、耐塩性向上活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ断片、ならびに耐塩性向上活性を有するＤＮＡ断片のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自然界に存在する生物は種々の環境耐塩性に曝されている。特に、塩ストレスは、多くの高等植物や微生物の生育を阻害する最も大きな要因の１つである。高等植物や各種微生物の耐塩性活性の強化は、農産物生産および発酵生産の増大につながるため、遺伝子導入によりこれらの生物の耐塩性活性を強化させる試みが、活発に進められている。
【０００３】
耐塩性活性を強化する機能を有するタンパク質は、適合溶質(グリシンベタイン、マンニトール、トレハロース、プロリン)合成酵素、イオンホメオスタシスに関与する酵素(Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター)、およびこれらの遺伝子の発現を制御する転写調節因子に大別することができる。これらのタンパク質を発現した形質転換細胞で耐塩性活性の向上が認められた例が近年多数報告されている。
【０００４】
例えば、コリンオキシダーゼをコードする遺伝子が染色体ＤＮＡ中に導入されたユーカリ属の植物体（例えば、特許文献１参照）、耐塩性藍藻（Aphanothec eha1opytica）由来Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターをコードするＤＮＡ（例えば、特許文献２参照）、植物の細胞内におけるプロリン分解系の酵素をコードする遺伝子の発現を抑制することを特徴とする植物の耐塩性を上昇させる方法（例えば、特許文献３参照）がそれぞれ報告されている。
【０００５】
しかしながら、上記の耐塩性活性強化因子を発現した生物を、農業や各種微生物産業に応用するためには、上記の適合溶質合成系酵素やアンチポーターだけでは不十分であると思われる。
【０００６】
近年、本特許出願の発明者が、塩生植物から全く新しいタイプの耐塩性活性強化遺伝子を発見した例を報告しており（例えば、非特許文献１，２および特許文献４参照）、今後も未知の遺伝子資源に注目することで、さらに新しいタイプの耐塩性活性強化遺伝子の発見が期待できる。新しいタイプの耐塩性活性強化遺伝子を発見することができれば、それを単独で用いることによって、あるいは、既知の耐塩性活性強化遺伝子と複合的に組み合わせることによって、従来にない耐塩性植物や微生物を作出できると期待できる。しかしながら、現状はその十分な探索がなされていない。
【０００７】
環境中の微生物のうち、平板培養法などの既存の方法によって実験室内で培養できるものは、実際に環境中に存在する微生物のわずか１％未満とされている（非特許文献３）。したがって、「培養できない微生物」を遺伝子資源として注目すれば、従来にない新規耐塩性遺伝子の発見が期待できる。
【特許文献１】特開２００３−１４３９８８号公報
【特許文献２】特開２００３−１８０３７３号公報
【特許文献３】特開２００３−１８６８７９号公報
【特許文献４】特開２００１−３３３７８４号公報
【非特許文献１】Yamada A, Sekiguchi M, Mimura T, Ozeki Y. 2002a. The Role of Plant CCTα in Salt- and Osmotic- Stress Tolerance. Plant Cell Physiol. 43:1043-1048，
【非特許文献２】Yamada A, Saitoh T, Mimura T, Ozeki Y. 2002b. Expression of Mangrove Allene Cyclase Enhances Salt Tolerance in Escherichia coli, Yeast, and Tobacco Cells. Plant Cell Physiol. 43: 903-910
【非特許文献３】Amann RI, Ludwig W, Schleifer KH. 1995. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59:143-69
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、耐塩性向上遺伝子を探索するための遺伝子資源として、海水中の浮遊微生物を濃縮または共在させるカイメン（stylissa massa）に着目し、カイメン共在微生物より抽出されたＤＮＡ断片から「メタゲノムライブラリ」を構築して、全く新しいタイプの耐塩性遺伝子の同定に成功した。
【０００９】
本発明の目的は、耐塩性向上活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ断片、および耐塩性向上活性を有するＤＮＡ断片のスクリーニング方法を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片を含む発現ベクター、ならびに、前記発現ベクターを宿主細胞に導入することにより得られる形質転換体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の態様のＤＮＡ断片は、
カイメン（stylissa massa）の共在微生物由来であり、かつ、耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードすることができる。
【００１２】
本発明において、「カイメンの共在微生物由来であるＤＮＡ断片」には、（i）カイメンの共在微生物から抽出されたＤＮＡ断片、（ii）カイメンの共在微生物から抽出されたＤＮＡ断片の一部を構成するＤＮＡ断片、ならびに、（iii）（i）または（ii）のＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて作製された複製物が含まれるものとする。
【００１３】
本発明の第２の態様のＤＮＡ断片は、以下の（ａ）〜（ｃ）記載のいずれかのタンパク質をコードすることができる。
【００１４】
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と相同性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質。
【００１５】
本発明の第３の態様のＤＮＡ断片は、配列番号１、２、および３のいずれかにより表される塩基配列またはその相補的配列を有することができる。
【００１６】
本発明の第４の態様のＤＮＡ断片は、配列番号１、２、および３のいずれかにより表される塩基配列において、１または数個の塩基が置換、欠失、もしくは付加されている塩基配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードすることができる。
【００１７】
本発明の第５の態様のＤＮＡ断片は、配列番号１、２、および３のいずれかにより表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードすることができる。
【００１８】
本発明の第６の態様のＤＮＡ断片は、ＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードすることができる。
【００１９】
本発明の第７の態様のＤＮＡ断片は、以下の（ａ）〜（ｃ）のうちいずれか１つの塩基配列またはその相補的配列と、以下の（ｄ）〜（ｉ）のうち少なくとも１つの塩基配列またはその相補的配列と、を含むことができる。
【００２０】
（ａ）配列番号１により表される塩基配列
（ｂ）配列番号１により表される塩基配列の一部または全部を含み、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号１により表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｄ）配列番号２により表される塩基配列
（ｅ）配列番号２により表される塩基配列の一部または全部を含み、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｆ）配列番号２により表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｇ）配列番号３により表される塩基配列
（ｈ）配列番号３により表される塩基配列の一部または全部を含み、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｉ）配列番号３により表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【００２１】
本発明の第８の態様の発現ベクターは、上記本発明の第１〜第７の態様のいずれかに記載のＤＮＡ断片を含むことができる。
【００２２】
本発明の第９の態様の形質転換体は、上記本発明の第８の態様の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより得ることができる。この場合、前記宿主細胞は微生物細胞であることができる。さらに、この場合、前記形質転換体は耐塩性向上活性を有することができる。
【００２３】
本発明の第１０の態様のタンパク質は、カイメン（stylissa massa）の共在微生物由来であり、かつ、耐塩性向上活性を有することができる。
【００２４】
本発明において、「カイメンの共在微生物由来であるＤＮＡ断片」には、（i）カイメンの共在微生物から抽出されたタンパク質、ならびに、（ii）カイメンの共在微生物から抽出されたＤＮＡ断片の一部または全部の塩基配列に基づいて作製されたタンパク質が含まれるものとする。
【００２５】
本発明の第１１の態様のタンパク質は、配列番号４、５、および６のいずれかにより表されるアミノ酸配列を有することができる。
【００２６】
本発明の第１２の態様のタンパク質は、配列番号４、５、および６のいずれかにより表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されているアミノ酸配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有することができる。
【００２７】
本発明の第１３の態様のタンパク質は、配列番号４、５、および６のいずれかにより表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有することができる。
【００２８】
本発明の第１４の態様の耐塩性向上活性を有するＤＮＡ断片のスクリーニング方法は、
カイメン（stylissa massa）の共在微生物から複数のＤＮＡ断片を抽出すること、
前記複数のＤＮＡ断片がそれぞれ挿入された複数の発現ベクターを作製することにより、ライブラリを構築すること、および
前記複数の発現ベクターを宿主細胞に導入し、該宿主細胞を塩ストレス条件下で培養することにより、耐塩性向上活性を有するクローンを選択すること、
を含むことができる。
【００２９】
この場合、前記宿主細胞が微生物細胞であることができる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明のＤＮＡ断片によれば、カイメン（stylissa massa）の共在微生物由来であり、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードするため、本発明のＤＮＡ断片を用いることにより、高等植物や微生物などの幅広い生物群の耐塩性活性を向上させることができる。
【００３１】
微生物によるアミノ酸などの有用物質の生産を行なう場合、生産物（代謝産物）による塩ストレスが生じ、この塩ストレスが、微生物の有用物質生産能に悪影響をもたらす現象が知られている。この場合、本発明の耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片を微生物に導入することにより、塩ストレスによる悪影響を受けることなく有用物質の生産を行なうことができる。
【００３２】
また、近年、土壌における塩分の集積により可耕地が激減していることを鑑みれば、本発明の耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片を、農業における生産性向上に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
１．耐塩性向上活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ断片、発現ベクター、および形質転換体
１．１．ＤＮＡ断片およびタンパク質
本発明のＤＮＡ断片としては、例えば以下の態様（Ａ）〜（Ｆ）が挙げられる。
【００３４】
（Ａ）カイメン（stylissa massa）の共在微生物から抽出され、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片
（Ｂ）以下の（ａ）〜（ｃ）記載のいずれかのタンパク質をコードするＤＮＡ断片
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と相同性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号１、２、および３のいずれかにより表される塩基配列またはその相補的配列を有するＤＮＡ断片
（Ｄ）配列番号１、２、および３のいずれかにより表される塩基配列において、１または数個の塩基が置換、欠失、もしくは付加されている塩基配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片
（Ｅ）配列番号１、２、および３のいずれかにより表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片
（Ｆ）以下の（ａ）〜（ｃ）のうちいずれか１つの塩基配列またはその相補的配列と、以下の（ｄ）〜（ｉ）のうち少なくとも１つの塩基配列またはその相補的配列と、を含むＤＮＡ断片
（ａ）配列番号１により表される塩基配列
（ｂ）配列番号１により表される塩基配列の一部または全部を含み、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号１により表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｄ）配列番号２により表される塩基配列
（ｅ）配列番号２により表される塩基配列の一部または全部を含み、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｆ）配列番号２により表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｇ）配列番号３により表される塩基配列
（ｈ）配列番号３により表される塩基配列の一部または全部を含み、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｉ）配列番号３により表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
上記態様（Ｂ）〜（Ｆ）のＤＮＡ断片は、（i）カイメンの共在微生物から抽出されたＤＮＡ断片、（ii）（i）のＤＮＡ断片の一部を構成するＤＮＡ断片、ならびに、（iii）（i）または（ii）のＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて作製された複製物であってもよい。
【００３５】
また、本発明のタンパク質としては、例えば以下の態様（Ａ）〜（Ｃ）が挙げられる。
【００３６】
（Ａ）配列番号４、５、および６のいずれかにより表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列番号４、５、および６のいずれかにより表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されているアミノ酸配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号４、５、および６のいずれかにより表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質
上記態様（Ａ）〜（Ｃ）のタンパク質は、（i）カイメンの共在微生物から抽出されたタンパク質、または、（ii）カイメンの共在微生物から抽出されたＤＮＡ断片の一部または全部の塩基配列に基づいて作製されたタンパク質であってもよい。上記（ii）のタンパク質は、公知の方法（例えば、遺伝子組み換え法，化学合成法など）を用いて得ることができる。
【００３７】
本発明において、「耐塩性」とは、塩ストレスに対する耐性をいい、「耐塩性」が高い生物ほど、塩濃度が高い条件下で生存することができる。限定されないが、例えば、本発明の耐塩性向上活性を有するＤＮＡ断片が導入された微生物は、本発明の耐塩性向上活性を有するＤＮＡ断片が導入されていない微生物と比較して、所定濃度の塩存在下で統計学上有意に優れた増殖を示すことになる。また、限定されないが、例えば、耐塩性向上活性を有するタンパク質を発現する微生物は、本発明の耐塩性向上活性を有するタンパク質を発現していない微生物と比較して、所定濃度の塩存在下で統計学上有意に優れた増殖を示すことになる。
【００３８】
また、「塩」とは、陽イオンと陰イオンとが電荷を中和させる形で生じた化合物の総称をいう（岩波理化学辞典第５版、２８０頁、岩波書店（２０００））。本発明において「耐塩性」の対象となる塩の種類は限定されないが、本発明のＤＮＡ断片は特に、一価の陽イオンを含む塩（例えば、ＮａＣｌ，ＬｉＣｌ，ＫＣｌ）に対して高い耐性を有する。
【００３９】
上記「１または数個の塩基配列が置換、欠失、もしくは付加されている塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基配列が置換、欠失、もしくは付加されている塩基配列を意味する。
【００４０】
また、上記「１または数個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されているアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されているアミノ酸配列を意味する。
【００４１】
例えば、１もしくは数個の塩基が置換、欠失、もしくは付加されているＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、化学合成法、遺伝子工学的手法、突然変異誘発法などの当業者に既知の任意の方法により作製することができる。具体的には、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡ断片に対して、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射させる方法、遺伝子工学的な手法（例えば、部位特異的変異誘発法、制限酵素による切断、エキソヌクレアーゼによる消化）などを用いて、ＤＮＡ断片に変異を導入することにより、変異ＤＮＡを得ることができる。
【００４２】
遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は、特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989.（以下、「モレキュラークローニング第２版」と略す。）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons（1987-1997）などに記載の方法に準じて行なうことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されているアミノ酸配列を有するタンパク質を得ることができる。
【００４３】
上記「配列番号１、２、および３のいずれかにより表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列」とは、配列番号１、２、および３のいずれかにより表される塩基配列との相同性が７０％であれば特に制限されるものではなく、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上であることを意味する。
【００４４】
本発明において、塩基配列の相同性は、当該技術分野において知られている相同性検索アルゴリズムを利用して決定することができる。このようなアルゴリズムとしては、ＢＬＡＳＴが挙げられ、その使用方法は当業者によく知られている。
【００４５】
また、上記「配列番号４、５、および６のいずれかにより表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列」とは、配列番号４、５、および６のいずれかにより表されるアミノ酸配列との相同性が７０％であれば特に制限されるものではなく、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上であることを意味する。
【００４６】
上記本発明の配列番号１に示される塩基配列またはその相補的配列の一部もしくは全部を含み、かつ、耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片としては、例えば、配列番号７で表される塩基配列またはその相補的配列を含むＤＮＡを具体的に例示することができる。
【００４７】
上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、例えば、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などの公知の方法を用いて得られるＤＮＡ断片をいい、具体的には、コロニーまたはプラーク由来のＤＮＡ断片が固定化されたフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行なった後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む。）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版などに記載されている方法に準じて行なうことができる。
【００４８】
例えば、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができるＤＮＡ断片としては、プローブとして使用可能なＤＮＡ断片の塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡ断片を好適に例示することができる。
【００４９】
なお、本発明のＤＮＡ断片は、配列番号１、２、または３に表される塩基配列またはその一部を有するＤＮＡ断片を使用し、他の生物体などにより、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができるほか、上述の変異ＤＮＡの作製方法によっても調製することができる。
【００５０】
上記本発明のＤＮＡ断片およびタンパク質を用いることにより、動物および植物ならびにこれらの組織、器官、細胞、ならびに細菌、酵母、カビなどの微生物の耐塩性を向上させることができる。
【００５１】
１．２．耐塩性向上活性を有するＤＮＡ断片のスクリーニング方法
本発明の耐塩性向上活性を有するＤＮＡ断片のスクリーニング方法は、（i）カイメン（stylissa massa）の共在微生物から複数のＤＮＡ断片を抽出すること、（ii）前記複数のＤＮＡ断片がそれぞれ挿入された複数の発現ベクターを作製することにより、ライブラリを構築すること、および、（iii）前記複数の発現ベクターを宿主細胞に導入し、該宿主細胞を塩ストレス性条件下で培養することにより、耐塩性向上活性を有するクローンを選択すること、を含む。
【００５２】
カイメンの共在微生物（例えばバクテリア）から抽出されたＤＮＡ断片には、耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む遺伝子ＤＮＡが含まれている。
【００５３】
（i）カイメンの共在バクテリアから複数のＤＮＡ断片を抽出する方法としては、例えば、カイメンから組織および核を除去することにより、カイメン共在バクテリアを回収した後、該バクテリアを溶解して粗製ＤＮＡを得、この粗製ＤＮＡを公知の方法にて精製することにより、複数のＤＮＡ断片を得る方法が挙げられる。なお、必要に応じて、回収されたＤＮＡを制限酵素または物理的に適当な長さに断片化してもよい。
【００５４】
（ii）前記複数のＤＮＡ断片がそれぞれ挿入された複数の発現ベクターを作製することにより、ライブラリを構築する際に用いる発現ベクターとしては、例えば、プラスミド、フォスミド、ファージ（例えばλファージ）、コスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣが挙げられる。ここで使用される発現ベクターとしては、具体的には、本発明の発現ベクターとして後述するものを使用することができる。
【００５５】
フォスミドを用いたライブラリの構築は、例えば、コピー・コントロール・フォスミド・ライブラリ・プロダクション・キット（Copy Control Fosmid Library Prodution Kit（EPICENTRE社））を用いて行なうことができる（EPICENTRE社のカタログNo．CCFOS110参照）。このキットを用いてライブラリを構築する場合、例えば、上述の方法で得られたカイメン共在バクテリアから抽出された精製ＤＮＡに対して平滑末端化処理を行ない、必要に応じて、回収されたＤＮＡをより短い断片に切断した後、パルスフィールド電気泳動により30-50kbpのＤＮＡ断片を回収し、次いで、このＤＮＡ断片を発現ベクター（コピーコントロール（CopyControl）pCC1FOS（商標）フォスミド）に導入して、前記ＤＮＡ断片が導入された発現ベクターを得る。次いで、この発現ベクターを形質転換大腸菌に導入することにより、カイメンに共在するバクテリアのメタゲノムライブラリを構築することができる。発現ベクターを形質転換大腸菌に導入する方法としては、後述する公知の方法を用いることができる。ここで、「メタゲノム」とは、微生物が生育する環境から培養を経ないで回収された微生物のゲノムをいう。
【００５６】
（iii）前記複数の発現ベクターを宿主細胞に導入し、該宿主細胞を塩ストレス性条件下で培養することにより、耐塩性向上活性を有するクローンを選択する方法においては、例えば、発現ベクターとして上述のフォスミドを使用し、かつ、宿主細胞として微生物細胞（例えば大腸菌）を使用することができる。
【００５７】
この場合、前記複数のＤＮＡ断片がそれぞれ挿入された複数のフォスミドを大腸菌に導入し、この大腸菌を塩ストレス性条件下で培養することにより、耐塩性向上活性を有するクローンを選択することができる。ここで、塩ストレス性条件とは、その宿主細胞の通常の成育条件の塩濃度よりも高い塩濃度条件のことをいい、その塩濃度は特に限定されない。より具体的には、大腸菌の生育用培地に所定量の塩を添加することにより、塩ストレス性条件を設定することができる。また、この塩ストレス性条件下で大腸菌を培養することにより、該大腸菌が塩ストレス性向上活性を有するか否かを判断することができる。
【００５８】
耐塩性向上活性を有するクローンの選択は例えば、目視による方法、細胞内の塩濃度を測定する方法（例えば、McLaggan D, Naprstek J, Buurman ET, Epstein W. 1994. Interdependence of K+ and Glutamate Accumulation during Osmotic Adaptation of Escherichia coli. J. Bacteriol. 269:1911-1917参照）、あるいはこれらの組み合わせにより行なうことができる。
【００５９】
より具体的には、上述の方法で得られた耐塩性向上活性を有するクローンに挿入された配列をシーケンスし、該配列をＰＣＲ、もしくは適当な制限酵素で処理することにより、適当な制限酵素で処理することにより、耐塩性向上活性を有するＤＮＡ断片を得、このＤＮＡ断片を発現ベクターに導入し、該発現ベクターを宿主細胞に導入して得られた形質転換体について、上述の細胞内の塩濃度を測定する方法にて耐塩性を評価することにより、耐塩性向上活性を有するクローンを選択することができる。
【００６０】
本発明の耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片は、上述のスクリーニング方法によって得られた耐塩性向上活性を有するクローンを適当な制限酵素で処理することにより得ることができる。
【００６１】
１．３．タンパク質の取得および調製方法
本発明のタンパク質はまた、天然由来の単離されたタンパク質、化学合成されたタンパク質、および遺伝子組み換え技術により作製された組み換えタンパク質のいずれでもよい。
【００６２】
天然由来の単離されたタンパク質を取得する場合、かかるタンパク質を発現している細胞または組織からタンパク質の単離および精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明のタンパク質を取得することができる。
【００６３】
化学合成によりタンパク質を調製する場合、例えば、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法にしたがって、本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して、本発明のタンパク質を合成することもできる。
【００６４】
遺伝子組換え技術によりタンパク質を調製する場合、タンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を好適な発現系に導入することにより、本発明のタンパク質を調製することができる。
【００６５】
これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能である点で、遺伝子組換え技術による調製が好ましい。
【００６６】
本発明のＤＮＡ断片は、組換えタンパク質の調製に利用することができる。組換えタンパク質の調製は、上記本発明のＤＮＡ断片を適当な発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞に導入して形質転換体を作製し、次いで、この形質転換体を培養して、発現したタンパク質を該形質転換体またはその培養上清から回収することにより行なうことができる。
【００６７】
遺伝子組み換え技術により本発明のタンパク質を製造する場合、形質転換細菌、形質転換酵母、形質転換植物細胞などの形質転換体を培養し、該形質転換体またはその培養液の上清から回収する方法を用いることができる。
【００６８】
また、遺伝子組換え技術によって本発明のタンパク質を調製する場合、かかるタンパク質を細胞培養物から回収し精製するためには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーなどの公知の方法（好ましくは高速液体クロマトグラフィー）が用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いられるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体などの抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合、このペプチドタグに親和性のある物質を結合させたカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。また、本発明のタンパク質が細胞膜に発現している場合、細胞膜分解酵素を作用させた後、上記の精製処理を行なうことにより、精製標品を得ることができる。
【００６９】
さらに、配列番号４、５、および６のいずれかにより表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されているアミノ酸配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質、あるいは、配列番号４、５、および６のいずれかにより表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質は、配列番号１、２、および３のいずれかにより表される塩基配列に基づいて、当業者が適宜調製または取得することができる。
【００７０】
例えば、配列番号１に示される塩基配列またはその一部を有するＤＮＡ断片をプローブとして、カイメン共在微生物以外の生物より、該ＤＮＡ断片のホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより、ホモログＤＮＡを単離することができる。このホモログＤＮＡの全長ＤＮＡをクローニングした後、発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞で発現させることにより、該ホモログＤＮＡによりコードされるタンパク質を製造することができる。
【００７１】
上記本発明のタンパク質とマーカータンパク質および／またはペプチドタグとを結合させることにより、融合タンパク質を作製することもできる。ここで、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰなどの酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰなどの蛍光物質などを具体的に挙げることができる。また、ペプチドタグとしては、ＨＡ，ＦＬＡＧ，Ｍｙｃなどのエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジンなどの親和性タンパク質などを具体的に挙げることができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグとの親和性を利用したタンパク質精製および検出、ならびに、本発明のタンパク質に対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００７２】
本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体を作製することも可能である。かかる抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体などの免疫特異的な抗体を挙げることができる。この抗体は、配列番号４、５、または６により表されるアミノ酸配列を含むタンパク質、配列番号４、５、または６により表されるアミノ酸配列と相同性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、耐塩性向上活性を有するタンパク質、あるいは、配列番号４、５、または６により表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されているアミノ酸配列を有するタンパク質を抗原として用いて作製することができる。これらの抗体は、耐塩性向上活性を有するタンパク質の分子機構を明らかにするうえで有用である。
【００７３】
上記耐塩性向上活性を有するタンパク質に対する抗体は、慣用のプロトコルを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に耐塩性向上活性を有するタンパク質またはエピトープを含む断片、類似体もしくは細胞を投与することにより産生され、例えば、モノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらすハイブリドーマ技法（Nature, 256, 494-497, 1975）、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Immunology Today, 4, 72, 1983）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）などの任意の技法を用いることができる。
【００７４】
本発明の耐塩性向上活性を有するタンパク質に対する一本鎖抗体を作製するために、一本鎖抗体の調整法（米国特許第4,946,778号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニック植物またはトランスジェニック動物などを利用したり、上記抗体を用いて耐塩性向上活性を有するタンパク質を発現するクローンを単離および同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。
【００７５】
１．４．発現ベクターおよび形質転換体
本発明の発現ベクターは、上記本発明のＤＮＡ断片を含む。本発明の形質転換体は、上記本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより得られる。この場合、前記宿主細胞は微生物細胞（例えば大腸菌）であることができる。また、本発明の形質転換体は、耐塩性向上活性を有する。
【００７６】
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、当業者に公知の方法（例えば、エレクトロポレーション法、ヒートショック法、マイクロインジェクション、遺伝子銃、例えばλファージなどのバクテリオファージを用いる方法などの公知の方法を用いることができる（遺伝子ライブラリの作製法、羊土社（１９９４）・植物細胞工学入門、学会出版センター（１９９８））。形質転換体を培養して、発現されたタンパク質を回収する方法は、当該技術分野においてよく知られている。また、組換えタンパク質を発現させるための形質転換体の培養は、当業者に一般的に用いられている方法および条件にて行なうことができる。
【００７７】
本発明の発現ベクターとしては、本発明のＤＮＡ断片を含み、かつ耐塩性向上活性を有するタンパク質を発現することができる発現ベクターであれば特に限定されない。本発明の発現ベクターは、本発明のＤＮＡ断片を適切にインテグレイトすることにより構築することができる。かかる発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるもの、あるいは、宿主細胞の染色体中に組み込み可能であるものが好ましい。また、本発明のＤＮＡ断片を発現できる位置に、プロモータ、エンハンサー、ターミネータなどの制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。
【００７８】
本発明の発現ベクターとしては、例えば、細菌用発現ベクター、酵母用発現ベクター、植物細胞用発現ベクターが挙げられ、このうち細菌用発現ベクターがより好ましい。
【００７９】
細菌用の発現ベクターとしては、例えば、コピーコントロール（CopyControl）pCC1FOS（商標）ベクター、λファージ、Ｍ１３ファージ、λＺＡＰII、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ＰＥＴ、ｐＢＴＴｒＰ２，ｐＢＴａｃ１，ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、ｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）,ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）,ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）,ｐＱＥ−８（キアゲン社製）,ｐＱＥ−３０（キアゲン社製）,ｐＫＹＰ１０（特開昭58-110600）,ｐＫＹＰ２００（Agric. Biol. Chem., 48, 669(1994)）,ＰＬＳＡ１（Agric. Biol. Chem., 53, 277(1989)），ｐＧＥＬ１（Prod. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306(1985)），ｐＴＰ５，ｐＣ１９４，ｐＵＣ１８（Gene, 33, 103(1985)），ｐＵＣ１９（Gene, 33, 103(1985)），ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製），ｐＳＴＶ２９（宝酒造社製）を挙げることができる。細菌用のプロモータとしては、例えば、ｔｒｐプロモータ（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモータ（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモータ、ＰＲプロモータ、ＰＳＥプロモータなどの大腸菌やファージなどに由来するプロモータ、ＳＰ０１プロモータ、ＳＰ０２プロモータ、ｐｅｎＰプロモータなどを挙げることができる。
【００８０】
また、これらのプロモータを用いて、本発明のＤＮＡ断片を葉緑体移行シグナルやミトコンドリア移行シグナルとの融合タンパク質として形質転換体内に発現させることも本発明に含まれる。
【００８１】
酵母用の発現ベクターとしては、例えば、ｐＹＥＳ２（インビトロジェン社），ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５），ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１），Ｙｃｐ５Ｏ（ＡＴＣＣ３７４１９），ｐＨＳ１９，ｐＨＳ１５などを例示することができる。酵母用のプロモータとしては、例えば、ＰＨＯ５プロモータ、ＰＧＫプロモータ、ＧＡＰプロモータ、ＡＤＨプロモータ、ｇａｌ１プロモータ、ｇａｌ１０プロモータ、ヒートショックタンパク質プロモータ、ＭＦα１プロモータ、ＣＵＰ１プロモータなどのプロモータを例示することができる。
【００８２】
植物細胞用の発現ベクターとしては、Ｔｉプラスミド（Tumor inducing plasmid）、ｐＳＰＯＲＴ１、ｐＴ７Ｂｌｕｅ-Ｔベクター、ｐＩＧ１２１−Ｈｍ（Plant Cell Report, 15, 809-814(1995)）、ｐＢＩ１２１（EMBO J. 6, 3901-3907(1987)）などのプラスミド、あるいは、タバコモザイクウイルス、カリフラワーモザイクウイルス、ジェミニウイルスなどの植物ウイルスベクターなどを例示することができる。植物細胞用のプロモータとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモータ（Mol. Gen. Genet (1990) 220, 389-392）、ルブロースビスフォスフェートカルボキシラーゼスモールサブユニットプロモータなどを挙げることができ、ターミネータとしては、例えばノパリン合成酵素遺伝子のターミネータを挙げることができる。
【００８３】
また、本発明の形質転換体としては、上記本発明の発現ベクターが導入され、かつ少なくとも耐塩性向上活性を有するタンパク質を発現するものであれば特に制限されない。本発明の形質転換体としては、特に限定されないが、例えば、形質転換細菌、形質転換植物細胞、形質転換動物細胞、形質転換酵母を挙げることができ、このうち、形質転換細胞（例えば大腸菌）、形質転換酵母、形質転換植物細胞を形質転換体として好適に例示することができる。これらの形質転換体は、アミノ酸生産などの各種の微生物産業に好適に応用することができる。
【００８４】
２．実施例
以下に、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００８５】
２．１．メタゲノムライブラリの作製
沖縄県石垣島で採取したカイメン（Stylissa massa）を、TENバッファー（3.5％ NaCl，EDTA・2Na（50 mM）， Trisバッファー（10 mM），pH7.5）を加えて破砕し、カイメンの組織および核を除去するために、700Ｇで5分間遠心分離を行ない、上清を回収した。回収した溶液は、さらに7000Ｇで20分間遠心分離を行ない、その沈殿をTENバッファーで３回洗浄して、カイメン共在バクテリアを回収した。
【００８６】
次に、カイメン共在バクテリアからのＤＮＡ抽出および精製を以下の方法で行った。回収されたカイメン共在バクテリアは、リゾチーム（100 mg）、プロテイナーゼＫ（20 mg）、Rnase（10 mg）を含むTEバッファー（Trisバッファー（10 mM），E DTA（1 mM），pH7.6）2mLに懸濁し、37℃で30分間インキュベートし、2倍量のGESバッファー（60％ グアニジンチオシアネート，EDTA（10 mM），0.5％サルコシル）を加え、穏やかに攪拌することで細胞を溶解し、氷上に移した。
【００８７】
次に、1/3量の7.5Mの酢酸アンモニウムを加えて穏やかに攪拌した後、1/10量のCTAB（cetyl trimethyl ammonium bromide）を加え、65℃で１時間インキュベートし、ＤＮＡを抽出した。さらにフェノール／クロロホルム抽出法および塩化セシウム密度勾配法による精製をそれぞれ２回行なうことにより、カイメン共在バクテリアから抽出された精製ＤＮＡを得た。
【００８８】
次いで、カイメンに共在するバクテリアのメタゲノムライブラリを構築した。メタゲノムライブラリの構築は、コピー・コントロール・フォスミド・ライブラリ・プロダクション・キット（Copy Control Fosmid Library Prodution Kit（EPICENTRE社））を用いて以下の方法で行った（EPICENTRE社のカタログNo．CCFOS110参照）。
【００８９】
具体的には、上述の方法で得られたカイメン共在バクテリアから抽出された精製ＤＮＡに対して、前記キットに付属のエンド・リペア・エンザイム・ミックス（End Repair Enzyme Mix）を用いて平滑末端化処理を行なった後、1％ 低融点アガロースゲルを用いたパルスフィールド電気泳動により、35-50kbpのＤＮＡ断片を回収した。次に、前記キットのプロトコルにしたがって、コピーコントロール（CopyControl）pCC1FOS（商標）ベクター（プラスミド）にライゲーションして、フォスミドを得た。次いで、このフォスミドを、前記キットに付属のマックスプラック・ラムダ・パッケージング・エクストラクト（MaxPlax Lambda Packaging Extracts）を用いて形質転換大腸菌（E．coli EPI300）に導入して、カイメンに共在するバクテリアのメタゲノムライブラリを構築した。このライブラリには、約60,000個の独立したクローン（フォスミド）が含まれていた。
【００９０】
２．２．耐塩性向上活性を有するクローンの選抜
次に、耐塩性向上活性を有するクローンの選抜を以下の方法で行なった。
【００９１】
塩ストレス条件下（1MのNaClを含む2YT寒天プレート（クロラムフェニコール：12.5μg/ml））に、上述の方法にて各フォスミドが導入された形質転換大腸菌（E．coli EPI300ＴＭ-TiＲ strain）を植菌し、その後の生育を評価した。目視にて、耐塩性が認められた形質転換大腸菌を選別し、選別された形質転換大腸菌からフォスミドを抽出し、これらのフォスミドをそれぞれ大腸菌（E．coli EPI300ＴＭ-TiＲ strain）に再導入した。
【００９２】
再導入により得られた10,000個以上の形質転換大腸菌の耐塩性を検討した結果、わずか１つの形質転換大腸菌（クローンc132B7を含む大腸菌）のみに、顕著な耐塩性が確認された。
【００９３】
この形質転換大腸菌（クローンc132B7を含む大腸菌）の全シーケンスを調べた結果、約37KbのＤＮＡ断片がクローニングされていることが確認された。
【００９４】
２．３．クローンc132B7が導入された形質転換大腸菌の耐塩性向上活性の評価
次に、クローンc132B7が導入された形質転換大腸菌がどのような表現型を獲得したかについて、詳細な検討を試みた。
【００９５】
まず、コントロール（empty fosmid vector）と、スクリーニングで得られたフォスミドクローンc132B7とを、それぞれ大腸菌（E．coli EPI300ＴＭ-TiＲ strain）に導入し、得られたコロニーをピックアップして、約５時間前培養し、菌体濃度が2.0-3.0（Ａ６００）になるまで2YT液体培地（クロラムフェニコール：12.5μg/ml、pH 7.6）で前培養した。次に、この培地の初期菌体濃度が0.05（Ａ６００）となるように調整してから、4 mlの前記培地をＬ字管で培養して、生育を評価した。なお、生育の評価には、アドバンテック（Advantec）社のバイオフォトレコーダーを用い、34rpmの振とう速度にて37℃で培養した。その結果を図１（ａ）〜図１（ｇ）に示す。
【００９６】
図１（ａ）〜図１（ｇ）において、横軸は時間（ｈ）を、縦軸は600nmの吸光度（Ａ６００）を示す。600nmの吸光度（Ａ６００）が高いほど、細胞濃度（cell concentration）が高いことを示す。また、図１（ａ）〜図１（ｇ）において、「○」は、フォスミドクローンc132B7が導入された形質転換大腸菌の生育を示し、「●」は、空ベクターが導入された形質転換大腸菌の生育を示す。37℃で通常の2YT培地で生育した形質転換大腸菌は、フォスミドクローンc132B7が導入された形質転換大腸菌および対照の形質転換大腸菌のどちらもほぼ同等な生育を示した（図１（ａ）参照）。
【００９７】
また、培地に1.5Mのソルビトールを添加した場合（図１（ｂ）参照）、培地のｐＨを変化させた場合（pH 9の場合，図１（ｃ）参照）、ならびに、培養温度を変化させた場合（培養温度が42℃の場合，図１（ｄ）参照）のいずれにおいても、フォスミドクローンc132B7が導入された形質転換大腸菌の生育および対照の形質転換大腸菌の生育にほとんど差は認められなかった。
【００９８】
これに対して、培地のNaCl濃度を、通常の2YT培地におけるNaCl濃度（86 mM）から800 mMに変化させた場合（図１（ｅ）参照）、通常の2YT培地にLiClを400mM添加した場合（図１（ｆ）参照）、ならびに、通常の2YT培地にKClを500mM添加した場合（図１（ｇ）参照）、フォスミドクローンc132B7が導入された形質転換大腸菌は、対照の形質転換大腸菌と比較して顕著な生育が認められた。
【００９９】
以上の結果から、ＤＮＡ断片（132B7）を含むフォスミドクローンc132B7が導入された形質転換大腸菌は、耐塩性（特に１価の塩に対するストレス耐性）の向上活性を有することが確認された。
【０１００】
２．４．クローンc132B7が導入された形質転換大腸菌の細胞内ナトリウムイオン含量の評価
次に、フォスミドクローンc132B7が導入された形質転換大腸菌の細胞内ナトリウムイオン含量の評価を行なった。対照として、空ベクターが導入された形質転換体を用いた。培養には、86，400，600，800 mMのNaClを含む2YT液体培地（クロラムフェニコール：12.5μg/ml）を用いた。上述の方法と同様の方法にて、フォスミドクローンc132B7が導入された形質転換大腸菌の培養を行ない、定常期に達した形質転換大腸菌を回収し、上述のMcLagganらの方法にしたがって、細胞内のナトリウムイオン含量（細胞タンパク質当たりのＮａ＋含量）を評価した。すなわち、大腸菌を破砕して、イオンクロマトグラフィーを行なうことにより、細胞タンパク質当たりのＮａ＋含量を求めた。
【０１０１】
図２において、「○」は、異なるNaCl濃度の培地で培養された、ＤＮＡ断片132B7が導入された形質転換大腸菌の細胞内Ｎａ＋含量を示し、「●」は、対照である空ベクターが導入された形質転換大腸菌の細胞内Ｎａ＋含量を示す。
【０１０２】
図２に示されるように、培地のNaCl濃度が400mMを超える場合（より具体的には、培地のNaCl濃度600mM以上の場合）、対照の形質転換大腸菌の細胞内ナトリウムイオン含量が大幅に増加したのに対して、フォスミドクローンc132B7が導入された形質転換大腸菌の細胞内ナトリウムイオン含量は、培地のNaCl濃度が86, 400 mMのときのナトリウムイオン含量とほとんど変わらなかった。このことから、フォスミドクローンc132B7の導入により大腸菌に生じる耐塩性向上活性は、細胞内ナトリウムイオン濃度の恒常性の安定化が原因であると考えられる（図２参照）。
【０１０３】
２．５．耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片の同定
次に、フォスミドクローンc132B7のＤＮＡ断片132B7のデリーションクローンシリーズを作成し、全長約37ＫｂのＤＮＡ断片132B7のうち、どの領域が耐塩性向上に機能しているかを検討した。
【０１０４】
予備的な検討として、図３に示される約１０Ｋｂ付近（ORF1近傍）の塩基配列のみが導入された形質転換大腸菌を作成し、上述の方法と同様の方法によって、その耐塩性向上活性を評価したところ、フォスミドクローンc132B7が導入された形質転換大腸菌と同等の耐塩性向上活性が認められた。このため、約１０Ｋｂ付近に存在するORFを含むサブクローン（c132B7J-7，c132B7J-5，図３参照）を作成し、耐塩性の向上活性を評価した。
【０１０５】
図３において、各領域は、ＰＣＲで増幅したものをフォスミドにクローニングすることにより、サブクローンを作製した。このサブクローンは機能領域同定実験に使用された。また、サブクローンにはＰＣＲ変異が入っていないことを確認した。
【０１０６】
5 ’-GAAATGTTCGGGAGGGTGAATTCGGTGA-3’と、
5 ’-AGTG GCCGGCAAGCTTGTACTCGCAACC-3’との２つのプライマーを用いて、ＤＮＡ断片132B7の全長をテンプレートとしてPCRで増幅した後、EcoRI，HindIIIで制限酵素処理し、フォスミド（EcoRI、HindIIIサイト）にクローニングすることにより、配列番号７で表される塩基配列132B7J-7を有するＤＮＡ断片が導入されたサブクローンc132B7J-7を作製した。
【０１０７】
塩基配列132B7J-7はまた、図５に示されている。図５においては、開始コドンが一重線のアンダーラインで示され、終止コドンが二重線のアンダーラインで示されている。
【０１０８】
配列番号７で表される塩基配列132B7J-7は、配列番号１で表される塩基配列132B7J-5（ORF1）、配列番号２で表される塩基配列ORF2、および配列番号３で表される塩基配列ORF3を含む。
【０１０９】
また、5 ’-GAAATGTTCGGGAGGGTGAATTCGGTGA-3’と、
5 ’-GGATCAAGCTTGCGCCCGCCGTCAAA-3’との２つのプライマーを用いて、サブクローンc132B7J-7を作製する場合と同様の方法にて、フォスミド（EcoRI、HindIIIサイト）にクローニングすることにより、配列番号１で表される塩基配列132B7J-5（ORF1）を有するＤＮＡ断片が導入されたサブクローンc132B7J-5を作製した。
【０１１０】
得られた各デリーションクローン（サブクローンc132B7J-7, c132B7J-5）を大腸菌（E．coli EPI300ＴＭ-TiＲ strain）に導入して、形質転換大腸菌を作製した。そして、上述の方法と同様の方法にて、培地中のNaCl濃度が異なる場合における形質転換大腸菌の耐塩性向上活性を評価した（図４（ａ）〜図４（ｆ）参照）。
【０１１１】
図４（ａ）〜図４（ｆ）は、塩基配列132B7J-7を有するＤＮＡ断片が導入された形質転換大腸菌（○）、ならびに、塩基配列132B7J-5（◇）を有するＤＮＡ断片が導入された形質転換大腸菌の耐塩性向上活性の評価結果を示す。ここで、培地が各NaCl濃度である場合の生育曲線（図４（ａ）〜図４（ｆ）参照）を指標として評価を行なった。また、図４（ａ）〜図４（ｆ）において、「●」は、対照である空ベクターが導入された形質転換大腸菌の耐塩性向上活性の評価結果を示す。
【０１１２】
その結果、図４（ａ）〜図４（ｆ）に示されるように、サブクローンc132B7J-5が導入された形質転換大腸菌（◇）およびサブクローンc132B7J-7が導入された形質転換大腸菌（○）の両方において、耐塩性向上活性が確認された。
【０１１３】
特に、サブクローンc132B7J-7が導入された形質転換大腸菌（○）、すなわち、塩基配列132B7J-7（塩基配列ORF1の下流に２つの塩基配列ORF（ORF2, ORF3）が存在する塩基配列）を有するＤＮＡ断片が導入された形質転換大腸菌においては、全長約３７ＫｂのＤＮＡ断片（132B7）が導入された形質転換大腸菌（図１参照）と同等の耐塩性性向上活性が認められた。
【０１１４】
以上の結果より、塩基配列ORF１を有するＤＮＡ断片を大腸菌に導入することにより、耐塩性向上活性が認められ、これに加えて、塩基配列ORF１と、塩基配列ORF１の下流に存在する塩基配列ORF2, ORF3とを有するＤＮＡ断片を導入することにより、耐塩性向上活性をより高められることが明らかになった。
【０１１５】
塩基配列ORF1, ORF2, ORF3はそれぞれ、配列番号１，２，３に表される。また、各ＯＲＦのアミノ酸配列を図６に示す。ＢＬＡＳＴ２（http://blast.genome.jp/）を用いて、各塩基配列と最も相同性の高い既知の配列を検索した結果を以下に示す。
【０１１６】
塩基配列ORF1は、Nitrosospira multiformis ATCC 25196由来の ATP-dependent metalloprotease FtsHと７１％の相同性を有し、大腸菌のFtsH遺伝子とも６４％の相同性を有することが明らかになった。
【０１１７】
また、大腸菌のFtsH遺伝子をクローニングし、耐塩性向上活性を測定した結果、NaClの濃度が800 mMである培地で培養した場合、空ベクターが導入された形質転換大腸菌（対照）では、600nmの吸光度が0.5であったのに対し、大腸菌のFtsH遺伝子が導入された形質転換大腸菌では、600nmの吸光度が1.0-1.5に達し、ごくわずかな耐塩性活性の向上が認められた。しかしながら、塩基配列132B7J-5（=ORF1）を有するＤＮＡ断片が導入された形質転換大腸菌の600nmの吸光度が2.0-2.5であったことから、本実施例で示された塩基配列ORF1の導入による大腸菌の耐塩性の向上は、塩基配列ORF1に特有であると理解できる。
【０１１８】
塩基配列ORF2は、Xanthomonas oryzae由来の酵素（dihydropteroate synthase）と５７％の相同性を有するが、この酵素と耐塩性との関連性はこれまでに報告されていない。
【０１１９】
塩基配列ORF3は、Thiobacillus denitrificans ATCC 25259 の酵素（phosphoglucosamine mutase）と５４％の相同性を有するが、この酵素と耐塩性との関連性はこれまでに報告されていない。
【０１２０】
以上の結果により、本発明の新規遺伝子群が導入された形質転換大腸菌には耐塩性向上活性が認められた。これにより、本発明の新規遺伝子群は、様々な微生物（例えばバクテリア）の耐塩性活性の向上に利用できる。また、本実施例に記載されているように、耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片を含む発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換する方法は、大腸菌以外の各種微生物にも応用することができるため、該方法の各種の微生物産業への応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】図１（ａ）〜図１（ｇ）は、カイメン（stylissa massa）の共在バクテリア由来のＤＮＡ断片（132B7）が導入された形質転換大腸菌（○）の各種ストレス耐性の評価結果を示す。
【図２】図２は、異なるNaCl濃度の培地で培養したときの、塩基配列132B7を有するＤＮＡ断片が導入された形質転換大腸菌の細胞内Ｎａ＋含量の評価結果を示す。
【図３】図３（ａ）〜図３（ｆ）は、ＤＮＡ断片132B7（全長約37 Kb）の機能領域を同定するためのデリーションクローン作成方法を模式的に示す図である。
【図４】図４（ａ）〜図４（ｆ）は、塩基配列132B7J-7を有するＤＮＡ断片が導入された形質転換大腸菌（○）、ならびに、塩基配列132B7J-5を有するＤＮＡ断片（◇）が導入された形質転換大腸菌の耐塩性向上活性の評価結果を示す。
【図５】図５は、塩基配列132B7J-7を示す。
【図６】図６は、塩基配列ORF1, 2, 3を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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