(57)【要約】      （修正有）【課題】標的酵素の活性を測定する方法、標的酵素の活性を測定するためのキット、およびバイオセンサを提供する。【解決手段】（ａ）標的酵素を基材に固定化させる工程、（ｂ）結合調節分子および標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体を前記基材に接触させる工程、（ｃ）前記標的酵素の触媒作用によりゲル化する基質を前記基材に接触させる工程、および（ｄ）ＩＥＲ法を利用して、前記基材に照射した光の反射光強度を測定する工程を含み、前記標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体は、第１および第２のオリゴヌクレオチドを含み、前記第１のオリゴヌクレオチドは、第１の塩基配列と、前記結合調節分子に結合しうる結合調節分子アプタマーの塩基配列とを含み、前記第２のオリゴヌクレオチドは、第２の塩基配列と、前記結合調節分子アプタマーの塩基配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列とを含んでなる。【選択図】図１
2007327946.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）標的酵素を基材に固定化させる工程、
（ｂ）結合調節分子および標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体を前記基材に接触させる工程、
（ｃ）前記標的酵素の触媒作用によりゲル化する基質を前記基材に接触させる工程、および
（ｄ）ＩＥＲ法を利用して、前記基材に照射した光の反射光強度を測定する工程
を含み、
前記複合体は、第１および第２のオリゴヌクレオチドを含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドは、第１の塩基配列と、前記結合調節分子に結合しうる結合調節分子アプタマーの塩基配列とを含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドは、第２の塩基配列と、前記結合調節分子アプタマーの塩基配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列とを含み、
前記第１および第２の塩基配列は、前記標的酵素と結合して該標的酵素の特性を変化させることができる標的酵素アプタマーを分割して得られる、標的酵素の活性を測定する方法。
【請求項２】
請求項１において、
第１および第２の塩基配列は、前記標的酵素アプタマーを２つに分割して得られる、標的酵素の活性を測定する方法。
【請求項３】
請求項１または２において、
前記（ｃ）において、前記標的酵素と前記複合体との結合が弱まる結果、前記基質に対する前記標的酵素の活性が上昇し、前記基材上でゲルの形成が進行する、標的酵素の活性を測定する方法。
【請求項４】
（ａ）標的酵素を基材に固定化させる工程、
（ｂ）結合調節分子および標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体を前記基材に接触させる工程、
（ｃ）前記標的酵素の触媒作用によりゲル化する基質を前記基材に接触させる工程、および
（ｄ）ＩＥＲ法を利用して、前記基材に照射した光の反射光強度を測定する工程
を含み、
前記複合体は、
前記標的酵素と結合して該標的酵素の特性を変化させることができる標的酵素アプタマーの塩基配列と、
前記結合調節分子に結合しうる結合調節分子アプタマーの塩基配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列と、
を含む、標的酵素の活性を測定する方法。
【請求項５】
請求項４において、
前記（ｃ）において、前記標的酵素と前記複合体との結合が強まる結果、前記基質に対する前記標的酵素の活性が低下し、前記基材上でゲルの形成が抑制される、標的酵素の活性を測定する方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかにおいて、
前記（ｂ）の後、前記（ｃ）の前に、（ｅ）前記基材を洗浄する工程をさらに含む、標的酵素の活性を測定する方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかにおいて、
前記標的酵素がトロンビンである、標的酵素の活性を測定する方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかにおいて、
前記結合調節分子が核酸、低分子化合物、またはタンパク質である、標的酵素の活性を測定する方法。
【請求項９】
標的酵素と、
結合調節分子と、
標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体と、
前記標的酵素の触媒作用によりゲル化する基質と、
を含み、
前記複合体は、第１および第２のオリゴヌクレオチドを含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドは、第１の塩基配列と、前記結合調節分子に結合しうる結合調節分子アプタマーの塩基配列とを含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドは、第２の塩基配列と、前記結合調節分子アプタマーの塩基配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列とを含み、
前記第１および第２の塩基配列は、前記標的酵素と結合して該標的酵素の特性を変化させることができる標的酵素アプタマーを分割して得られる、標的酵素の活性を測定するためのキット。
【請求項１０】
標的酵素と、
結合調節分子と、
標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体と、
前記標的酵素の触媒作用によりゲル化する基質と、
を含み、
前記複合体は、
前記標的酵素と結合して該標的酵素の特性を変化させることができる標的酵素アプタマーの塩基配列と、
前記結合調節分子に結合しうる結合調節分子アプタマーの塩基配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列と、
を含む、標的酵素の活性を測定するためのキット。
【請求項１１】
標的酵素を基材に固定化した後、結合調節分子および標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体を添加し、次いで、前記標的酵素の触媒作用によりゲル化する基質を添加して、該標識酵素と前記基質とを反応させる反応部と、
ＩＥＲ法を利用して、前記基材に照射した光の反射光強度を測定する測定部と、
を含み、
前記複合体は、第１および第２のオリゴヌクレオチドを含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドは、第１の塩基配列と、前記結合調節分子に結合しうる結合調節分子アプタマーの塩基配列とを含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドは、第２の塩基配列と、前記結合調節分子アプタマーの塩基配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列とを含み、
前記第１および第２の塩基配列は、前記標的酵素と結合して該標的酵素の特性を変化させることができる標的酵素アプタマーを分割して得られる、標的酵素の活性を測定するためのバイオセンサ。
【請求項１２】
標的酵素を基材に固定化した後、結合調節分子および標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体を添加し、次いで、前記標的酵素の触媒作用によりゲル化する基質を添加して、該標識酵素と前記基質とを反応させる反応部と、
ＩＥＲ法を利用して、前記基材に照射した光の反射光強度を測定する測定部と、
を含み、
前記複合体は、
前記標的酵素と結合して該標的酵素の特性を変化させることができる標的酵素アプタマーの塩基配列と、
前記結合調節分子に結合しうる結合調節分子アプタマーの塩基配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列と、
を含む、標的酵素の活性を測定するためのバイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的酵素の活性を測定する方法、標的酵素の活性を測定するためのキット、および標的酵素の活性を測定するためのバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査では、病気の診断、治療、早期発見のための一指標として、血中や尿中の標的酵素の活性が測定されている。標的酵素の活性は一般に、吸光度法、蛍光法、発光法により測定されている。例えば、血液凝固能の一指標として、血液中の標的酵素（トロンビン）の活性が測定されている（非特許文献１）。
【０００３】
トロンビンの活性の評価は、一般に、血漿中で金属球を回転させた状態でフィブリノーゲンを添加することにより、血漿中のトロンビンによる酵素反応によってフィブリノーゲンがフィブリンへと分解される結果、血漿が凝固して金属球が停止するまでの時間を測定することにより行なわれる。
【０００４】
しかしながら、この評価試験では、血漿が凝固して金属球が停止するまでの時間によって血液凝固能が評価されるため、トロンビンの活性を定量的に測定することが困難である。
【非特許文献１】血液凝固検査ハンドブック改訂第２版、福武勝博ほか編、克誠堂出版
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、標的酵素の活性を定量的に測定することができる標的酵素の活性を測定する方法、標的酵素の活性を測定するためのキット、および標的酵素の活性を測定するためのバイオセンサを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一態様に係る標的酵素の活性を測定する方法は、
（ａ）標的酵素を基材に固定化させる工程、
（ｂ）結合調節分子および標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体を前記基材に接触させる工程、
（ｃ）前記標的酵素の触媒作用によりゲル化する基質を前記基材に接触させる工程、および
（ｄ）ＩＥＲ法を利用して、前記基材に照射した光の反射光強度を測定する工程
を含み、
前記複合体は、第１および第２のオリゴヌクレオチドを含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドは、第１の塩基配列と、前記結合調節分子に結合しうる結合調節分子アプタマーの塩基配列とを含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドは、第２の塩基配列と、前記結合調節分子アプタマーの塩基配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列とを含み、
前記第１および第２の塩基配列は、前記標的酵素と結合して該標的酵素の特性を変化させることができる標的酵素アプタマーを分割して得られる。
【０００７】
この場合、第１および第２の塩基配列は、前記標的酵素アプタマーを２つに分割して得られることができる。
【０００８】
さらに、この場合、前記（ｃ）において、前記標的酵素と前記複合体との結合が弱まる結果、前記基質に対する前記標的酵素の活性が上昇し、前記基材上でゲルの形成が進行することができる。
【０００９】
本発明の一態様に係る標的酵素の活性を測定する方法は、
（ａ）標的酵素を基材に固定化させる工程、
（ｂ）結合調節分子および標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体を前記基材に接触させる工程、
（ｃ）前記標的酵素の触媒作用によりゲル化する基質を前記基材に接触させる工程、および
（ｄ）ＩＥＲ法を利用して、前記基材に照射した光の反射光強度を測定する工程
を含み、
前記複合体は、
前記標的酵素と結合して該標的酵素の特性を変化させることができる標的酵素アプタマーの塩基配列と、
前記結合調節分子に結合しうる結合調節分子アプタマーの塩基配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列と、を含む。
【００１０】
この場合、前記（ｃ）において、前記標的酵素と前記複合体との結合が強まる結果、前記基質に対する前記標的酵素の活性が低下し、前記基材上でゲルの形成が抑制されることができる。
【００１１】
上記方法では、前記（ｂ）の後、前記（ｃ）の前に、（ｅ）前記基材を洗浄する工程をさらに含むことができる。
【００１２】
上記方法では、前記標的酵素がトロンビンであることができる。
【００１３】
上記方法では、前記結合調節分子が核酸、低分子化合物、またはタンパク質であることができる。
【００１４】
本発明の一態様に係る標的酵素の活性を測定するためのキットは、
標的酵素と、
結合調節分子と、
標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体と、
前記標的酵素の触媒作用によりゲル化する基質と、
を含み、
前記複合体は、第１および第２のオリゴヌクレオチドを含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドは、第１の塩基配列と、前記結合調節分子に結合しうる結合調節分子アプタマーの塩基配列とを含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドは、第２の塩基配列と、前記結合調節分子アプタマーの塩基配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列とを含み、
前記第１および第２の塩基配列は、前記標的酵素と結合して該標的酵素の特性を変化させることができる標的酵素アプタマーを分割して得られる。
【００１５】
本発明の一態様に係る標的酵素の活性を測定するためのキットは、
標的酵素と、
結合調節分子と、
標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体と、
前記標的酵素の触媒作用によりゲル化する基質と、
を含み、
前記複合体は、
前記標的酵素と結合して該標的酵素の特性を変化させることができる標的酵素アプタマーの塩基配列と、
前記結合調節分子に結合しうる結合調節分子アプタマーの塩基配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列と、を含む。
【００１６】
本発明の一態様に係る標的酵素の活性を測定するためのバイオセンサは、
標的酵素を基材に固定化した後、結合調節分子および標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体を添加し、次いで、前記標的酵素の触媒作用によりゲル化する基質を添加して、該標識酵素と前記基質とを反応させる反応部と、
ＩＥＲ法を利用して、前記基材に照射した光の反射光強度を測定する測定部と、
を含み、
前記複合体は、第１および第２のオリゴヌクレオチドを含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドは、第１の塩基配列と、前記結合調節分子に結合しうる結合調節分子アプタマーの塩基配列とを含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドは、第２の塩基配列と、前記結合調節分子アプタマーの塩基配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列とを含み、
前記第１および第２の塩基配列は、前記標的酵素と結合して該標的酵素の特性を変化させることができる標的酵素アプタマーを分割して得られる。
【００１７】
本発明の一態様に係る標的酵素の活性を測定するためのバイオセンサは、
標的酵素を基材に固定化した後、結合調節分子および標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体を添加し、次いで、前記標的酵素の触媒作用によりゲル化する基質を添加して、該標識酵素と前記基質とを反応させる反応部と、
ＩＥＲ法を利用して、前記基材に照射した光の反射光強度を測定する測定部と、
を含み、
前記複合体は、
前記標的酵素と結合して該標的酵素の特性を変化させることができる標的酵素アプタマーの塩基配列と、
前記結合調節分子に結合しうる結合調節分子アプタマーの塩基配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列と、を含む。
【発明の効果】
【００１８】
上記方法によれば、簡便な操作手段により標的酵素の活性を定量的に測定することができる。また、上記方法は、ＩＥＲ法を利用することにより、標的酵素の活性の測定を簡易な光学的手法により行うことができることから、蛍光光度計等の高価な大型機器を必要としないという利点を有する。さらに、上記方法によれば、熱的安定性および設計が容易なアプタマーを使用するため、安定した測定結果を得ることができる。加えて、上記方法によって標的酵素の活性を測定することにより、結合調節分子の検出を行うこともできる。
【００１９】
また、上記キットおよびバイオセンサによれば、共存物質の影響が少ないうえに、簡便な装置によって、標的酵素の活性を定量的に測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の一実施形態に係る標的酵素の活性を測定する方法、標的酵素の活性を測定するためのキット、および標的酵素の活性を測定するためのバイオセンサについて詳細に説明する。
【００２１】
１．標的酵素の活性を測定する方法
１．１．第１の実施形態
本発明の第１の実施形態に係る標的酵素の活性を測定する方法は、
（ａ）標的酵素を基材に固定化させる工程、
（ｂ）結合調節分子および標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体を基材に接触させる工程、
（ｃ）標的酵素の触媒作用によりゲル化する基質を基材に接触させる工程、および
（ｄ）ＩＥＲ法を利用して、基材に照射した光の反射光強度を測定する工程
を含み、
標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体は、第１および第２のオリゴヌクレオチドを含み、
第１のオリゴヌクレオチドは、第１の塩基配列と、結合調節分子に結合しうる結合調節分子アプタマーの塩基配列とを含み、
第２のオリゴヌクレオチドは、第２の塩基配列と、結合調節分子アプタマーの塩基配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列とを含み、
第１および第２の塩基配列は、標的酵素と結合して該標的酵素の特性を変化させることができる標的酵素アプタマーを分割して得られる。
【００２２】
ここで、第１および第２の塩基配列は、標的酵素アプタマーを２つに分割して得ることができる。
【００２３】
前記（ｃ）において、標的酵素と標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体との結合が弱まる結果、基質に対する標的酵素の活性が上昇し、基材上でゲルの形成が進行する。
【００２４】
第１の実施形態において、標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体は、結合調節分子の非存在下では、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドとが相補鎖を形成することにより、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドとが一体化して標的酵素と結合するため、標的酵素の活性が低下する（図１の中央図参照）。一方、結合調節分子の存在下では、結合調節分子と第２のオリゴヌクレオチドと結合することにより、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドとが分離する結果、標的酵素が遊離の状態で存在するため、標的酵素の活性が高まる（図１の右図参照）。また、第１の実施形態に係る標的酵素の活性を測定する方法によって標的酵素の活性を測定することにより、結合調節分子の検出を行うこともできる。
【００２５】
１．２．第２の実施形態
本発明の第２の実施形態に係る標的酵素の活性を測定する方法は、
（ａ）標的酵素を基材に固定化させる工程、
（ｂ）結合調節分子および標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体を基材に接触させる工程、
（ｃ）標的酵素の触媒作用によりゲル化する基質を基材に接触させる工程、および
（ｄ）ＩＥＲ法を利用して、基材に照射した光の反射光強度を測定する工程
を含み、
標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体は、標的酵素と結合して該標的酵素の特性を変化させることができる標的酵素アプタマーの塩基配列と、結合調節分子に結合しうる結合調節分子アプタマーの塩基配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列とを含む。
【００２６】
ここで、前記（ｃ）において、標的酵素と標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体との結合が強まる結果、基質に対する標的酵素の活性が低下し、基材上でゲルの形成が抑制される。
【００２７】
第２の実施形態に係る標的酵素の活性を測定する方法によれば、標的酵素と結合して該標的酵素の特性を変化させることができる標的酵素アプタマーの塩基配列と、結合調節分子に結合しうる結合調節分子アプタマーの塩基配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列とを含む標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体を使用することにより、該複合体が一本のオリゴヌクレオチドから構成されるため、試料中の共存物質の種類や濃度が多少変化しても、該複合体が標的酵素アプタマーとしての構造を確実に構築することができる。これにより、標的酵素の活性をより正確に測定することができる。また、第２の実施形態に係る標的酵素の活性を測定する方法によって標的酵素の活性を測定することにより、結合調節分子の検出を行うこともできる。
【００２８】
１．３．各工程の説明
１．３．１．（ａ）工程
（ａ）工程は、標的酵素を基材に固定化させる工程である。
【００２９】
１．３．１−１．標的酵素
標的酵素は、本実施形態に係る標的酵素の活性を測定する方法において、その測定の対象（標的）となる酵素である。
【００３０】
標的酵素は、基質をゲル化させる反応を触媒する酵素である。標的酵素は、基質に作用してゲルを生じさせ、膜の膜厚の変化を生じさせることのできる酵素であれば、特に限定されない。ゲル化反応に必要な酵素はごく少量であるので、本実施形態に係る標的酵素の活性を測定する方法によれば、ごく少量の標的酵素を検出することができる。
【００３１】
標的酵素としては、例えば、プロテアーゼ、ペプチターゼ等を挙げることができるが、これに限定されない。この場合、基質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド等を挙げることができる。
【００３２】
より好ましくは、標的酵素は、血液凝固反応に関与する酵素である。さらに好ましくは、標的酵素はトロンビンであり、基質はフィブリノーゲンである。なぜなら、トロンビンによるフィブリノーゲンのゲル化は、共存物質の影響を受けにくく、安定した測定が可能だからである。この場合、血液凝固反応に関与する酵素であるトロンビンによって、基質であるフィブリノーゲンが加水分解されてゲル化し、不溶性のフィプリンが生成される。これによって、膜の膜厚に変化が生じる。
【００３３】
あるいは、本実施形態において、エンドトキシン（内毒素）によるゲル化反応を利用してもよい。より具体的には、カブトガニの血液凝固反応の１つである、エンドトキシンまたはグリカン類（例えば、β−Ｄ−グリカン等）とカブトガニ血球抽出物（ＬＡＬ、ライセート）とによるゲル化反応を利用することができる。特に、エンドトキシンまたはグリカン類とカブトガニ血球抽出物とによるゲル化反応は、リム／レス試験として医薬品等の品質管理等の分野で利用されており、取り扱いが容易であるため、本実施形態において好適なゲル化反応である。
【００３４】
カブトガニ血球成分によるゲル化は、以下に説明する反応機能により進行する。すなわち、カブトガニのライセート中には、エンドトキシンに反応し活性化されるＣ因子系とβ−Ｄ−グリカン（植物多糖で、真菌細胞壁の構成成分の１つ）と反応し活性化されるＧ因子系が確認されており、これら２つの経路は途中からは共通である。すなわち、不活性型凝固酵素（ｐｒｏｃｌｏｔｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）が活性化され、凝固酵素（Ｃｌｏｔｔｉｎ  ｇｅｎｚｙｍｅ）が生成され、この酵素がその基質であるコアグローゲン（ｃｏａｇｕｌｏｇｅｎ）を部分水解させ、その結果、ペプチドＣ（ｐｅｐｔｉｄｅＣ）が遊離し、コアグリン（ｃｏａｇｕｌｉｎ）が生成しゲル化する。
【００３５】
エンドトキシンと特異的に反応しゲル化するカブトガニ血球成分由来の試薬は、現在、和光純薬工業（コード番号：２９８−２２３４１）および生化学工業（エンドスペシー：登録商標）から市販されており、容易に入手することが可能である。前者はカブトガニのライセートをデキストラン硫酸セファロースカラムで分画後、Ｇ因子系の画分を除いて再構成したものである。後者は、ライセートにカルポキシメチル化カードラン（β−Ｄ−グリカン）を大過剰添加し、Ｇ因子系の活性化を逆に抑制させてエンドトキシン特異的にしたものである。一方、グリカン等と特異的に反応しゲル化するカブトガニ血球成分由来の試薬は、生化学工業、マルハ、和光純薬工業（商品名：β−グリカンテストワコ一等）から市販されている。その他、特異性はないが、ゲル化する試薬が生化学工業（商品名：エンドトキシントキシンテストーＤ等）から市販されている。
【００３６】
さらに他の好適なゲル化反応として、ペプチドグリカン（細菌の細胞壁成分の１つ）やβ−グリカン（真菌の細胞壁成分の１つ）等のグリカン類によって活性化されるカイコ体液抽出物によるゲル化反応を挙げることができる。また、カイコ体液抽出物は、ＳＬＰ試薬セットとして和光純薬工業から市販されており（コード番号：２９７−５１５００）、容易に入手可能であり好適である。
【００３７】
また、本実施形態で使用可能な標的酵素として、活性化される前の不活性型の酵素や、活性型酵素の前駆体を利用することもできる。さらに、本実施形態で使用できる基質としては、標的酵素が直接的に作用し、ゲル化する基質だけでなく、この基質の前駆体等を利用することができる。すなわち、ここで、「基質」とは、標的酵素が直接的に作用する基質だけでなく、その前駆体をも含む概念である。また、本実施形態で使用可能な基質は、１種類の基質だけでもよく、２種類以上の基質の混合物であってもよい。また、本実施形態においては、種々の活性化物質を基質の他に添加することもできる。例えば、ゲル化反応が、複数の反応を含むカスケード反応である場合、該カスケード反応を活性化させる活性化物質等を反応系に添加することができる。
【００３８】
１．３．１−２．基材
標的酵素を固定化する基材としては、公知のあらゆる材料を使用することができる。したがって、例えば、多孔性ガラス、シリカゲル、ヒドロキシアパタイト等の無機高分子化合物；金、銀、白金等の金属が基材として利用可能である。さらに、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリスチレン、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート等の合成高分子；デンプン、グルテン、キチン、セルロース、天然ゴム等の天然高分子；およびこれらの誘導体を挙げることができる。また、疎水基を有するアガロース誘導体、ニトロセルロース、およびそれらの誘導体等を基材として挙げることができる。
【００３９】
特に、本発明ではＩＥＲ法を採用しているため、ガラスなどの高反射性基材を用いることが好ましい。
【００４０】
さらに、上記の基材の形状は、特に限定されず、使用方法に応じて、マイクロプレート、ビーズ、フイルム、シート、膜、チューブ、繊維、スティック等の形状とすることができる。また、基材として、多孔性の物質を採用することもできる。
【００４１】
１．３．２．（ｂ）工程
（ｂ）工程は、結合調節分子および標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体を基材に接触させる工程である。
【００４２】
１．３．２−１．結合調節分子
結合調節分子は、標的酵素と、標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体との結合を調節する物質である。また、結合調節分子は１種類であっても、２種類以上であってもよい。
【００４３】
結合調節分子は、例えば、核酸、低分子化合物、またはタンパク質であることができる。結合調節分子は、結合調節分子に結合しうる結合調節分子アプタマーが存在するものであることが好ましい。このような結合調節分子としては、アデノシンなどのヌクレオチドや、プローブＤＮＡなどのオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００４４】
結合調節分子アプタマーが確認されている結合調節分子の他の例としては、以下のものが挙げられる：Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｒ１７コートタンパク質、ＭＳ２コートタンパク質、Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｓ１タンパク質、Ｅ．Ｃｏｌｉ ｒｈｏタンパク質、Ｅ．Ｃｏｌｉ ３０Ｓ粒子＋Ｓ１、Ｅ．Ｃｏｌｉ ３０Ｓ粒子−Ｓ１、Ｅ．Ｃｏｌｉ ｍｅｔＪタンパク質、ＱＢレプリカーゼ、ＨＩＶ−１ Ｒｅｖタンパク質、ＨＩＶ−１ ｔａｔタンパク質、ＨＩＶ−１ｉｎｔタンパク質、ＨＩＶ−１リバーストランスクリプターゼ、ＭＭＬＶリバーストランスクリプターゼ、ＡＭＶリバーストランスクリプターゼ、ＦＩＶリバーストランスクリプターゼ、ＨＴＬＶ−１ ｒｅｘペプチド、Ｕ１Ａ、Ｕ２ＡＦ、トロンビン、エラスターゼ、テオフィリン、ヒト絨毛性腺刺激ホルモン、ｐＰＬＡ２、ＮＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、抗ｇｐ−１０抗体、ＳＬＥモノクローナル抗体、抗インスリンレセプター、ＩｇＥ、ＦＭＮ、ＡＭＰ、アルギニン、シトルリン、トブラマイシン、ネオマイシンＢ、ヘマトポルフィリン、キチン、コール酸（Hermann, et, al., (2000), Adaptive recognition by nucleic acid aptamers, Science, 287, 820-825.）。
【００４５】
また、アプタマーの選択および応用に関するさらに詳細な説明は、Osborene SE, Ellington, AD. (1997), Nucleic Acid Selection and the Challenge of Combinatorial Chemistry. Chem Rev. Apr1; 97(2):349-370に見いだすことができる。
【００４６】
１．３．２−２．アプタマー
本明細書において、「アプタマー」とは、特定の分子に結合する核酸リガンドを表す。アプタマーは一般に、ＤＮＡ合成機で固相合成することにより容易に製造することができる。
【００４７】
（Ａ）標的酵素アプタマー
標的酵素アプタマーは、標的酵素との結合様式を変化させて、該標的酵素の特性を変化させることができるアプタマーである。
【００４８】
標的酵素アプタマーと標的酵素との結合様式が変化することにより、標的酵素の特性が変化する。この結合様式の変化は、アプタマーの構造の変化によるものと考えられる。しかしながら、標的酵素アプタマーは、結合様式の変化のメカニズムにより限定されるものではない。
【００４９】
（Ｂ）結合調節分子アプタマー
結合調節分子アプタマーは、結合調節分子に結合しうるアプタマーである。例えば、後述する実施例に示されるように、結合調節分子がアデノシンである場合、結合調節分子アプタマーはアデノシンアプタマーであり、結合調節分子がＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡポリメラーゼ中の塩基配列である場合、結合調節分子アプタマーは該塩基配列に結合しうるアプタマーである。結合調節分子がＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡポリメラーゼ中の塩基配列である場合、結合調節分子アプタマーは、一般にプローブＤＮＡと呼ばれる、該塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００５０】
（Ｃ）標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体
標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体は、標的酵素アプタマーと、結合調節分子アプタマーとの両方の機能を有するアプタマーである。
【００５１】
標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体は、２つ以上の分離したオリゴヌクレオチドから構成されていてもよいし（第１の実施形態）、あるいは、１つのオリゴヌクレオチドから構成されていてもよい（第２の実施形態）。
【００５２】
第１の実施形態に係る標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体は、結合調節分子の非存在下では標的酵素アプタマーとして機能し、結合調節分子の存在下では結合調節分子アプタマーとして機能する（図１参照）。
【００５３】
これに対して、第２の実施形態に係る標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体は、結合調節分子の非存在下では、結合調節分子アプタマーおよび標的酵素アプタマーのいずれとしても機能せず、結合調節分子の存在下では、結合調節分子アプタマーおよび標的酵素アプタマーの両方として機能する（図６参照）。
【００５４】
（Ｃ−１）第１の実施形態に係る標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体
上記第１の実施形態に係る方法においては、第１および第２のオリゴヌクレオチドを含む標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体を使用することができる。すなわち、標的酵素アプタマーを少なくとも２つに分割し、その一方（第１の塩基配列）に結合調節分子アプタマーの塩基配列を付加して第１オリゴヌクレオチドとし、もう一方（第２の塩基配列）に結合調節分子アプタマーの少なくとも一部と相補的な塩基配列を付加して第２のオリゴヌクレオチドとし、この第１および第２のオリゴヌクレオチドからなる混合物を標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体として使用することができる。
【００５５】
この場合、標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体と標的酵素との結合様式が変化し（該複合体と標的酵素との結合が弱まり）、その結果、標的酵素の特性が変化する（標的酵素の活性が上昇する）。すなわち、標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体と標的酵素との結合が弱まることにより、標的酵素の活性を高めることができる。
【００５６】
上記第１の実施形態に係る方法において、標的酵素がトロンビンであって、結合調節分子がアデノシンである場合、使用可能な標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体としては、以下に示す配列を有する標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体４，６，７が挙げられる（図２および図３参照）。
【００５７】
（ｉ）複合体４：第１のオリゴヌクレオチド３と第２のオリゴヌクレオチド２との複合体
第２のオリゴヌクレオチド２：
5’CACTGGTAGGTTGGTGTGGTTACCTTCCTCCG’3  （配列番号１）
第１のオリゴヌクレオチド３：
5’ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGTTGGGGCCAGTG’3  （配列番号２）
（ｉｉ）複合体６：第２のオリゴヌクレオチド２’と第１のオリゴヌクレオチド３との複合体
第２のオリゴヌクレオチド２’：
5’CACTGGTAGGTTGGTGTGGTTACCTTCCT’3  （配列番号３）
（ｉｉｉ）複合体７：第２のオリゴヌクレオチド２”と第１のオリゴヌクレオチド３との複合体
第２のオリゴヌクレオチド２”：
5’CACTGGTAGGTTGGTGTGGTTACCT  3’（配列番号５）
【００５８】
図２および図３に示すように、複合体４，６，７が存在する場合、複合体４，６，７と標的酵素（トロンビン）との結合様式が強まる。その結果、トロンビンの活性が低下する。
【００５９】
これに対して、標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体とともに、結合調節分子（アデノシン）が存在する場合（図３の５の場合）、第１のオリゴヌクレオチド３と結合調節分子とが結合することにより、第１のオリゴヌクレオチド３と第２のオリゴヌクレオチド２ととの結合が弱まる結果、トロンビンと第１および第２のオリゴヌクレオチド３，２との結合が弱くなる。その結果、トロンビンの活性を増加させることができる。
【００６０】
（Ｃ−２）第２の実施形態に係る標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体
上記第２の実施形態に係る方法においては、標的酵素と結合して該標的酵素の特性を変化させることができる標的酵素アプタマーの塩基配列と、結合調節分子に結合しうる結合調節分子アプタマーの塩基配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列とを含む標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体を使用することができる。
【００６１】
この場合、標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体と標的酵素との結合様式が変化し（該複合体と標的酵素との結合が強まり）、その結果、標的酵素の特性が変化する（標的酵素の活性が低下する）。すなわち、標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体と標的酵素との結合が強まることにより、標的酵素の活性を低下させることができる。
【００６２】
上記第２の実施形態に係る方法において、標的酵素がトロンビンである場合、使用可能な標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体としては、例えば、以下に示す配列を有する標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体１４が挙げられる（図７および図８参照）。
【００６３】
この複合体１４は、トロンビンアプタマー８の塩基配列（配列番号４）と、ＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡポリメラーゼ中の２７ｍｅｒの塩基配列（結合調節ＤＮＡ）１５（配列番号６）と相補的な塩基配列１６（配列番号８）とを有する。この場合、標的酵素アプタマーは、トロンビンアプタマー８であり、結合調節分子は、ＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡポリメラーゼ中の２７ｍｅｒの塩基配列（結合調節ＤＮＡ）１５である。
【００６４】
（ｉ）トロンビンアプタマー８：
5’CACTGGTAGGTTGGTGTGGTTGGGGCCAGTG  3’（配列番号４）
（ｉｉ）結合調節ＤＮＡ１５：
5’TTAAGTGAGATGGTCATGTGTGGCGGC  3’（配列番号６）
（ｉｉｉ）複合体１４：
5’CACTGGTAGGTTGGTGTGGTTGGGGCCAGTGGCCGCCACACATGACCATCT
CACTTAA  3’（配列番号７）
（ｉｖ）結合調節ＤＮＡ１５と相補的な塩基配列１６：
5’GCCGCCACACATGACCATCTCACTTAA  3’（配列番号８）
【００６５】
図７の３に示すように、結合調節分子（結合調節ＤＮＡ）１５が存在しない場合、複合体１４と標的酵素（トロンビン）との結合が弱まるため、遊離のトロンビンが増加する。その結果、トロンビンの活性が増加する。
【００６６】
これに対して、図７の４に示すように、結合調節ＤＮＡ１５が存在する場合、複合体１４と結合調節分子とが結合することにより、複合体１４の構造が変化し、トロンビンと複合体１４との結合が強くなる。その結果、遊離のトロンビンが減少するため、トロンビンの活性が低下する。
【００６７】
１．３．３．（ｃ）工程
（ｃ）工程は、標的酵素の触媒作用によりゲル化する基質を基材に接触させる工程である。
【００６８】
なお、（ｂ）工程を行った後、（ｃ）工程を行う前に、（ｅ）基材を洗浄する工程をさらに行なってもよい。（ｅ）基材を洗浄する工程により、遊離の結合調節分子および標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体を除去することができるため、標的酵素の活性をより正確に測定することができる。
【００６９】
（ｅ）基材を洗浄する工程は例えば、結合調節分子および標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体を含む溶液を回収することにより行われる。
【００７０】
１．３．４．（ｄ）工程
（ｄ）工程は、ＩＥＲ法を利用して、基材に照射した光の反射光強度を測定する工程である。
【００７１】
すなわち、標的酵素の活性は、ＩＥＲ法を利用して、標的酵素を固定化した基材に照射した光の反射光強度を測定することにより検出することができる。
【００７２】
本実施形態に係る標的酵素の活性を測定する方法においては、標的酵素および基質によるゲル化反応に伴う膜厚の変化をＩＥＲ法（Interference Enhanced Reflection Method：干渉増幅反射法）によって測定することによって、標的酵素の活性を定量的に測定することができる。ＩＥＲ法は、比較的簡単な測定装置により測定することができ、かつ、汎用器の開発が容易であることから、好ましい測定方法である。
【００７３】
ＩＥＲ法は、ある角度で入射された光の、膜の空気側（又は溶液側）と基材側からの２つの界面からの反射光同士の干渉現象を利用する方法である。例えば、ある膜厚では、２つの界面からの光の位相が強め合うことにより膜厚の増加と共に反射光強度が増加し、また、別の膜厚では、２つの界面からの光の位相が弱め合うことにより膜厚の増加と共に反射光強度が減少する。さらに、反射強度が減少モードから増加モードへ移行する膜厚では、反射強度がゼロとなる無反射状態（Ａｎｔｉ−Ｒｅｆｌｅｃｔｉｖｅ Ｃｏａｔｉｎｇ；ＡＲコート膜）となる。したがって、ＩＥＲ法においては、検出される反射光強度が、膜の光学膜厚（屈折率と膜厚の積）に応じて、サインカーブ状に変化する。よって、標的酵素の働きによって、膜の膜厚が変化した場合、基材に照射した光の反射光強度を測定することにより、膜厚を測定することができる。この膜厚の変化から、標的酵素の活性を定量的に測定することができる。
【００７４】
例えば、特開平６−２２２００６号公報、特開平７−２６０７７３号公報、特開平６−３４１８９４号公報、特開平８−１８４５６０号公報、特開平９−３２９５５３号公報、特開平１０−１０４１６３号公報、特開２００４−１１７３２５号公報にＩＥＲ法に関する記載がある。
【００７５】
２．標的酵素の活性を測定するためのキット
本発明の第３の実施形態に係る標的酵素の活性を測定するためのキット（以下、「測定キット」とする。）は、標的酵素と、結合調節分子と、標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体と、標的酵素の触媒作用によりゲル化する基質と、を含む。
【００７６】
この場合、標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体は、第１および第２のオリゴヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドは、第１の塩基配列と、結合調節分子に結合しうる結合調節分子アプタマーの塩基配列とを含み、第２のオリゴヌクレオチドは、第２の塩基配列と、結合調節分子アプタマーの塩基配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列とを含み、第１および第２の塩基配列は、標的酵素と結合して標的酵素の特性を変化させることができる標的酵素アプタマーを分割して得られるものであってもよい。
【００７７】
あるいは、この場合、標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体は、標的酵素と結合して標的酵素の特性を変化させることができる標的酵素アプタマーの塩基配列と、結合調節分子に結合しうる結合調節分子アプタマーの塩基配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列とを含んでいてもよい。
【００７８】
本実施形態に係る測定キットは、さらに、標識酵素を固定化するための基材、標準溶液、ゲル化反応の増感剤、バッファー、使用説明書、パッケージ等を含んでもよい。
【００７９】
３．標的酵素の活性を測定するためのバイオセンサ
本発明の第４の実施形態に係る標的酵素の活性を測定するためのバイオセンサは、反応部および測定部を含む。
【００８０】
この場合、反応部では、標的酵素を基材に固定化した後、結合調節分子および標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体を添加し、次いで、標的酵素の触媒作用によりゲル化する基質を添加して、標識酵素と基質とを反応させる。また、測定部では、ＩＥＲ法を利用して、基材に照射した光の反射光強度が測定される。
【００８１】
この場合、標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体は、第１および第２のオリゴヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドは、第１の塩基配列と、結合調節分子に結合しうる結合調節分子アプタマーの塩基配列とを含み、第２のオリゴヌクレオチドは、第２の塩基配列と、結合調節分子アプタマーの塩基配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列とを含み、第１および第２の塩基配列は、標的酵素と結合して標的酵素の特性を変化させることができる標的酵素アプタマーを分割して得ることができる。
【００８２】
あるいは、この場合、標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体は、標的酵素と結合して標的酵素の特性を変化させることができる標的酵素アプタマーの塩基配列と、結合調節分子に結合しうる結合調節分子アプタマーの塩基配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列とを含むことができる。
【００８３】
４．実施例
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００８４】
４．１．実施例１
実施例１では、上記第１の実施形態に係る標的酵素の活性を測定する方法の検証を行った。
【００８５】
より具体的には、実施例１においては、ＤＮＡ合成機で固相合成されたオリゴヌクレオチド２〜８（図３参照）をそれぞれ使用し、これらを加熱した場合、標的酵素（トロンビン）の活性が変化するかどうかを確認した。なお、各アプタマーの配列は以下の通りである。
【００８６】
（ｉ）第２のオリゴヌクレオチド２：
5’CACTGGTAGGTTGGTGTGGTTACCTTCCTCCG  3’（配列番号１）
（ｉｉ）第１のオリゴヌクレオチド３：
5’ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGTTGGGGCCAGTG  3’（配列番号２）
（ｉｉｉ）標的酵素アプタマー・プローブ複合体４：
第１のオリゴヌクレオチド３と第２のオリゴヌクレオチド２との複合体
（ｉｖ）混合物５：
標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体４と、結合調節分子（アデノシン１ｍＭ）との混合物
（ｖ）標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体６：
第１のオリゴヌクレオチド３と第２のオリゴヌクレオチド２’との複合体（複合体６では、第２のオリゴヌクレオチド２’の３’末端から８塩基が第１のオリゴヌクレオチド３とハイブリダイズしうる。）
第２のオリゴヌクレオチド２’：
5’CACTGGTAGGTTGGTGTGGTTACCTTCCT  3’（配列番号３）
（ｖｉ）標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体７：
第１のオリゴヌクレオチド３と第２のオリゴヌクレオチド２”との複合体（複合体７では、第２のオリゴヌクレオチド２”の３’末端から４塩基が、第１のオリゴヌクレオチド３とハイブリダイズしうる。）
第２のオリゴヌクレオチド２”：
5’CACTGGTAGGTTGGTGTGGTTACCT  3’（配列番号５）
（ｖｉｉ）標的酵素アプタマー（トロンビンアプタマー）８：
5’CACTGGTAGGTTGGTGTGGTTGGGGCCAGTG  3’（配列番号４）
【００８７】
まず、各オリゴヌクレオチド（２００ｎＭ）と、バッファー（ｐＨ７．４、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，１００ｍＭ ＮａＣｌ）とを混合して全量９０μｌとした溶液Ａを室温にて３０秒間インキュベートし、次いで急冷した後、この溶液とトロンビン（標的酵素）（１Ｕｎｉｔ）（和光純薬工業）とを混合して溶液Ｂを調製した。次に、この溶液Ｂと１．４ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン（基質）１００μｌ（和光純薬工業）とを混合して得られた溶液Ｃについて、凝固時間（秒）をそれぞれ測定した。その結果を図３に示す。
【００８８】
なお、本実施例および後述する実施例において、凝固時間は、溶液が固まる時間であり、凝固時間は、自動血液凝固測定装置（ＫＣ４Ａ ｍｉｃｒｏ，ＡＭＥＬＵＮＧ）により測定された。
【００８９】
また、図３において、横軸の「１」は、オリゴヌクレオチドを使用しない場合の測定結果を示し、横軸の「２」〜「８」はそれぞれ、オリゴヌクレオチド２〜８を使用した場合の測定結果を示す。ここで、溶液の凝固時間が長いほど、標的酵素（トロンビン）の活性（フィブリノーゲンからフィブリンに変換する能力）が低いといえる。
【００９０】
図３によれば、オリゴヌクレオチド４，６，８および混合物５を使用した場合、これらを使用しない場合と比較して、標的酵素（トロンビン）の活性が低いことが確認された。
【００９１】
また、結合調節分子（アデノシン）の存在下でオリゴヌクレオチド２および３を使用した場合（混合物５を使用した場合；図３の横軸「５」参照）、アデノシンの非存在下で第１および第２のオリゴヌクレオチド３，２を使用した場合（図３の横軸「４」参照）と比較して、標的酵素（トロンビン）の活性が高かった。その理由としては、アデノシンが存在する場合、アデノシンが存在しない場合と比較して、第１のオリゴヌクレオチド３と第２のオリゴヌクレオチド２とのハイブリダイズが抑制され、アプタマーのトロンビンへの結合が弱まったため、トロンビンの活性が増加したことが推測される。
【００９２】
４．２．実施例２
実施例２では、上記第１の実施形態に係る標的酵素の活性を測定する方法の検証を行った。
【００９３】
より具体的には、実施例２では、混合物５および異なる濃度の結合調節分子（アデノシン）およびシチジンの存在下での標的酵素（トロンビン）の活性を測定した。
【００９４】
まず、混合物５（１μＭ）と、バッファー（ｐＨ７．４、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，１００ｍＭ ＮａＣｌ）とを混合して全量９０μｌとした溶液Ａを室温にて３０秒間インキュベートし、次いで急冷した後、この溶液とトロンビン（標的酵素）（５４ｎＭ）（和光純薬工業）とを混合して溶液Ｂを調製した。次に、この溶液Ｂと１．０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン（基質）１００μｌ（和光純薬工業）とを混合して得られた溶液Ｃについて、凝固時間（秒）をそれぞれ測定した。その結果を図４に示す。
【００９５】
図４によれば、異なるシチジンの濃度においても凝固時間はほとんど変化しなかったのに対して、アデノシンの濃度が上昇するにつれて凝固時間が短くなることが確認された。すなわち、シチジンは、標的酵素（トロンビン）の活性に影響をほとんど与えなかったのに対して、アデノシンは、濃度が高くなるほど標的酵素（トロンビン）の活性が増加することが明らかになった。
【００９６】
以上の結果より、結合調節分子（アデノシン）を標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体４と共存させることにより、標的酵素（トロンビン）の活性を制御できることが理解できる。
【００９７】
４．３．実施例３
実施例３では、上記第１の実施形態に係る標的酵素の活性を測定する方法の検証を行った。
【００９８】
より具体的には、実施例３では、標的酵素（トロンビン）と基質（フィブリノーゲン）との反応により生じるゲルをＩＥＲ法により測定した。すなわち、実施例３においては、トロンビンを固定化した基板に光（波長６７０ｎｍ）を照射して得られた反射光のシグナル強度を測定した。
【００９９】
４．３．１．実験手順
まず、ガラス基板（１４．５ｍｍ×１４．５ｍｍ）を、１０％ ３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（γ−ＡＰＴＥＳ：信越化学工業製）中で９９℃にて一晩インキュベートし、次いで、２％グルタルアルデヒド（和光純薬工業製）溶液で室温にて３時間処理した（処理１）。
【０１００】
次に、上記基板上にトロンビン溶液（ヒトトロンビン１０μｇ／ｍｌ：和光純薬工業製）を１ｍｌ添加し、室温にて３時間インキュベートして、基板上に標的酵素（トロンビン）が固定された基板（トロンビン固定化基板）を作製した（処理２）。
【０１０１】
次いで、終濃度１ｍＭの結合調節分子（アデノシン）存在下で、終濃度１０ｎＭの標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体４を室温で１０分間インキュベートし、その混合溶液をトロンビン固定化基板に添加し、室温で１０分間インキュベートした（ｖｏｌｕｍｅ  ２００μｌ）（処理３）。
【０１０２】
その後、混合溶液を回収し、室温でインキュベートしておいた基質（フィブリノーゲン）溶液（終濃度２ｍｇ／０．６ｍｌ、Ｔｏｔａｌｖｏｌｕｍｅ ２００μ１：和光純薬工業製）をトロンビン固定化基板に添加し、ＩＥＲシグナル強度を測定した（処理４）。その結果を図５の（１）に示す。
【０１０３】
一方、処理１，２を行った後、処理３において、アデノシンの非存在下で同様の操作を行った後、処理４を行ってＩＥＲシグナル強度を測定した。その結果を図５の（２）に示す。
【０１０４】
さらに、処理１，２を行った後、処理３を行わずに処理４を行った結果を図５の（３）に示す。
【０１０５】
４．３．２．測定結果
図５の（３）によれば、標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体４が存在しないため、標的酵素（トロンビン）の活性によりゲル化反応が進行した。すなわち、トロンビンが固定化された基板では、標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体４の非存在下で基質（フィブリノーゲン）を添加するとゲル化が起こり、このゲルによる膜厚をＩＥＲ法により測定することにより、トロンビンの活性を測定できることが確認された。
【０１０６】
したがって、標的酵素としてトロンビンを固定化した基板に、基質であるフィブリノーゲンを添加すると、フィブリノーゲンがフィブリンに分解されてゲル化が生じ、このゲル化により生じた膜の膜厚をＩＥＲ法により測定測定することにより、標的酵素（トロンビン）の活性を測定できることが確認された。また、標的酵素（トロンビン）の活性を測定することにより、結合調節分子（アデノシン）の検出を行うことができることが確認された。
【０１０７】
これに対して、図５の（１）によれば、標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体４の存在により、標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体４と標的酵素（トロンビン）との結合が強まるため、標的酵素（トロンビン）の活性が低下し、ゲル化反応が抑制されたと推測される。
【０１０８】
一方、図５の（２）によれば、結合調節分子（アデノシン）の存在により、標的酵素（トロンビン）の活性は、図５の（１）の場合と比較して上昇した。このため、図５の（２）では、ゲル化反応は図５の（１）よりも進行した。その理由としては、以下の理由が推測される。
【０１０９】
図５の（２）では、結合調節分子（アデノシン）の存在により、第１のオリゴヌクレオチド３と第２のオリゴヌクレオチド２とのハイブリダイズが抑制されるため、標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体４が開裂して、第１のオリゴヌクレオチド３および第２のオリゴヌクレオチド２が分離して存在する結果、第１および第２のオリゴヌクレオチド３，２と標的酵素（トロンビン）との結合が弱まる。その結果、標的酵素（トロンビン）の活性が上昇するため、ゲル化が進行したと推測される。
【０１１０】
４．４．実施例４
実施例４では、上記第２の実施形態に係る標的酵素の活性を測定する方法の検証を行った。
【０１１１】
具体的には、実施例４では、標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体１４および結合調節分子（結合調節ＤＮＡ）１５存在下での標的酵素（トロンビン）の活性を測定した。
【０１１２】
実施例４で用いる標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体１４は、トロンビンアプタマー８の３’末端に、結合調節ＤＮＡ１５と相補的な塩基配列を付加したものである。結合調節ＤＮＡ１５は、ＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡポリメラーゼ中の２７ｍｅｒの塩基配列（配列番号６）である。
【０１１３】
（ｉ）結合調節ＤＮＡ１５（２７ｍｅｒの塩基配列）：
5’TTAAGTGAGATGGTCATGTGTGGCGGC  3’（配列番号６）
（ｉｉ）標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体１４：
5’CACTGGTAGGTTGGTGTGGTTGGGGCCAGTGGCCGCCACACATGACCATCT
CACTTAA  3’（配列番号７）
【０１１４】
まず、標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体１４（１μＭ）と、結合調節ＤＮＡ１５（１μＭ）と、バッファー（ｐＨ７．４、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，１００ｍＭ ＮａＣｌ）とを混合して全量９０μｌとした溶液Ａを室温にて３０秒間インキュベートし、次いで急冷した後、この溶液Ａとトロンビン（標的酵素）（５４ｎＭ）（和光純薬工業）とを混合して溶液Ｂを調製した。次に、この溶液Ｂと１．０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン（基質）１００μｌ（和光純薬工業）とを混合して得られた溶液Ｃについて、凝固時間（秒）をそれぞれ測定した。その結果を図７に示す。
【０１１５】
図７において、「１」は、コントロールとして、溶液Ａを使用せずに溶液Ｂを調製した場合（複合体１４および結合調節ＤＮＡ１５の非存在下でトロンビンとフィブリノーゲンとを混合した場合）を示し、「２」は、複合体１４および結合調節ＤＮＡ１５のかわりにトロンビンアプタマー８を用いた場合（トロンビンアプタマー８の存在下でトロンビンとフィブリノーゲンとを混合した場合）を示し、「３」は、結合調節ＤＮＡ１５を使用しない溶液Ａを用いて調製された溶液Ｂを使用した場合（結合調節ＤＮＡ１５の非存在下かつ複合体１４の存在下でトロンビンとフィブリノーゲンとを混合した場合）を示し、「４」は、溶液Ａを用いて調製された溶液Ｂを使用した場合（複合体１４および結合調節ＤＮＡ１５の存在下でトロンビンとフィブリノーゲンとを混合した場合）を示す。
【０１１６】
図７によれば、結合調節ＤＮＡ１５の非存在下でかつ複合体１４の存在下でトロンビンとフィブリノーゲンとを混合した場合（３の場合）、コントロール（１の場合）と同様の凝固時間であった。このことから、結合調節ＤＮＡ１５の非存在下でかつ複合体１４の存在下でトロンビンとフィブリノーゲンとを混合した場合、複合体１４と標的酵素（トロンビン）との結合が弱まるため、トロンビンの活性が上昇したことが理解できる。
【０１１７】
これに対して、複合体１４および結合調節ＤＮＡ１５の存在下でトロンビンとフィブリノーゲンとを混合した場合（４の場合）の凝固時間は、結合調節ＤＮＡ１５の非存在下でかつ複合体１４の存在下でトロンビンとフィブリノーゲンとを混合した場合（３の場合）の凝固時間と比較して大幅に増加した。このことから、複合体１４および結合調節ＤＮＡ１５の存在下でトロンビンとフィブリノーゲンとを混合した場合、結合調節ＤＮＡ１５が複合体１４中の相補鎖部分とハイブリダイズする結果、複合体１４と標的酵素（トロンビン）との結合が強まるため、トロンビンの活性が低下したことが理解できる。
【０１１８】
４．５．実施例５
実施例５では、上記第２の実施形態に係る標的酵素の活性を測定する方法の検証を行った。
【０１１９】
より具体的には、実施例５では、標的酵素（トロンビン）と基質（フィブリノーゲン）との反応により生じるゲルの形成の有無をＩＥＲ法により測定した。なお、測定に用いた機器は、実施例３と同様のものを使用した。
【０１２０】
４．５．１．実験手順
まず、ガラス基板（１４．５ｍｍ×１４．５ｍｍ）を、１０％ ３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（γ−ＡＰＴＥＳ：信越化学工業製）中で９９℃にて一晩インキュベートし、次いで、２％グルタルアルデヒド（和光純薬工業製）溶液で室温にて３時間処理した（処理１）。
【０１２１】
次に、上記基板上にトロンビン溶液（ヒトトロンビン１０μｇ／ｍｌ：和光純薬工業製）を１ｍｌ添加し、室温にて３時間インキュベートして、基板上に標的酵素（トロンビン）が固定された基板（トロンビン固定化基板）を作製した（処理２）。
【０１２２】
次いで、終濃度１００ｎＭの結合調節分子（結合調節ＤＮＡ１５）存在下で、終濃度１００ｎＭの標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体１４を室温で１０分間インキュベートし、その混合溶液をトロンビン固定化基板に添加し、室温で１０分間インキュベートした（ｖｏｌｕｍｅ ２００μｌ）（処理３）。
【０１２３】
その後、混合溶液を回収し、室温でインキュベートしておいた基質（フィブリノーゲン）溶液（終濃度２ｍｇ／０．６ｍｌ、Ｔｏｔａｌｖｏｌｕｍｅ ２００μ１：和光純薬工業製）をトロンビン固定化基板に添加し、ＩＥＲシグナル強度を測定した（処理４）。その結果を図８の（１）に示す。
【０１２４】
一方、処理１，２を行った後、処理３において、結合調節ＤＮＡ１５の非存在下で同様の操作を行った後、処理４を行ってＩＥＲシグナル強度を測定した。その結果を図８の（２）に示す。
【０１２５】
さらに、処理１，２を行った後、処理３を行わずに処理４を行った結果を図８の（３）に示す。
【０１２６】
４．５．２．測定結果
図８の（３）によれば、ＩＥＲシグナル強度は、時間の経過とともに低下した。このことから、図８の（３）では処理３を行わなかったので、標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体１４が基板上に存在しないため、標的酵素（トロンビン）の活性が上昇した結果、ゲル化反応が進行したと推測される。すなわち、トロンビンが固定化された基板では、標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体１４の非存在下で基質（フィブリノーゲン）を添加すると、トロンビンの活性が発現してフィブリノーゲンのゲル化が起こり、このゲルによる膜厚の変化をＩＥＲ法により測定できることが確認された。
【０１２７】
したがって、標的酵素としてトロンビンを固定化した基板に、基質であるフィブリノーゲンを添加すると、フィブリノーゲンがフィプリンに分解されゲル化し、このゲル化により生じた膜の膜厚の変化をＩＥＲ法により測定できることが確認された。これにより、標的酵素（トロンビン）の活性を測定できることが確認された。
【０１２８】
これに対して、図８の（１）によれば、ＩＥＲシグナル強度は、時間の経過とともにほとんど変化しなかった。このことから、標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体１４の存在により、標的酵素（トロンビン）と複合体１４との結合が強まった結果、標的酵素（トロンビン）の活性が低下したため、ゲル化反応が抑制されたことが推測される。
【０１２９】
一方、図８の（２）によれば、ＩＥＲシグナル強度は、時間の経過とともに低下した。このことから、図８の（２）では、結合調節ＤＮＡ１５が存在しないため、標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体１４がトロンビンアプタマーとして機能せず、標的酵素（トロンビン）と複合体１４との結合が弱まった結果、標的酵素（トロンビン）の活性が発現し、ゲル化反応が抑制されたことが推測される。
【０１３０】
以上の結果により、ＩＥＲ法によって、基板に照射した光の反射光強度を測定することにより、標的酵素（トロンビン）の活性を測定できることが確認された。また、標的酵素（トロンビン）の活性を測定することにより、結合調節分子（結合調節ＤＮＡ１５）の検出を行うことができることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１３１】
本発明に係る標的酵素の活性を測定する方法、標的酵素の活性を測定するためのキット、および標的酵素の活性を測定するためのバイオセンサによれば、共存物質の影響が少なく、標的酵素の活性を定量的に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】図１は、本発明の第１の実施形態に係る標的酵素の活性を測定する方法における標的酵素の活性発現機構を模式的に示す図である。
【図２】図２は、本発明の第１の実施形態に係る標的酵素の活性を測定する方法において使用される標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体の構造を模式的に示す図である。
【図３】図３は、各種のアプタマーの存在下で標的酵素（トロンビン）の活性を測定した結果を示す図である（実施例１）。図中、２〜８はそれぞれ、使用したオリゴヌクレオチドを示す。
【図４】図４は、標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体ならびに結合調節分子（アデノシン）またはシチジンの存在下で、標的酵素（トロンビン）の活性を測定した結果を示す図である（実施例２）。
【図５】図５は、標的酵素（トロンビン）を固定化した基板上に基質（フィブリノーゲン）を添加した場合のＩＥＲシグナルの変化を示す図である（実施例３）。図中、（１）は、トロンビン固定化基材を結合調節分子（アデノシン）非存在下にて、標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体４をインキュベートした後、フィブリノーゲンを添加した場合であり、（２）は、トロンビン固定化基材をアデノシン存在下にて標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体４をインキュベートした後、フィブリノーゲンを添加した場合であり、（３）は、トロンビン固定化基材を標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体４とインキュベートせずにフィブリノーゲンを添加した場合である。
【図６】図６は、本発明の第２の実施形態に係る標的酵素の活性を測定する方法における標的酵素の活性抑制機構を模式的に示す図である。
【図７】図７は、標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体ならびに結合調節分子（結合調節ＤＮＡ）の存在下で、標的酵素（トロンビン）の活性を測定した結果を示す図である（実施例４）。図中、１は標識酵素（トロンビン）のみが存在する場合、２は標識酵素（トロンビン）および標的酵素アプタマー（トロンビンアプタマー）８を添加した場合、３は標識酵素（トロンビン）および標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体（３’トロンビン−ＳＡＲＳ ＤＮＡアプタマー複合体）１４を添加した場合、４は標識酵素（トロンビン）、標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体（３’トロンビン−ＳＡＲＳ ＤＮＡアプタマー複合体）１４、および結合調節分子（結合調節ＤＮＡ１５）を添加した場合を示す。
【図８】図８は、標的酵素（トロンビン）を固定化した基板上に基質（フィブリノーゲン）を添加した場合のＩＥＲシグナル強度の変化を示す図である（実施例５）。図中、（１）は、結合調節分子（結合調節ＤＮＡ）１５の存在下にて、トロンビン固定化基板上で標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体（３’トロンビン−ＳＡＲＳ ＤＮＡアプタマー複合体）１４をインキュベートした後、フィブリノーゲンを添加した場合であり、（２）は、結合調節ＤＮＡ１５の非存在下にて、トロンビン固定化基板上で標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体１４をインキュベートした後、フィブリノーゲンを添加した場合であり、（３）は、結合調節ＤＮＡ１５および標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体１４の非存在下にて、トロンビン固定化基板上にフィブリノーゲンを添加した場合である。
【符号の説明】
【０１３３】
２、２’、２”・・・第１のオリゴヌクレオチド
３・・・第２のオリゴヌクレオチド
４、６、７、１４・・・標的酵素アプタマー・結合調節分子アプタマー複合体
５・・・第１のオリゴヌクレオチド３と、第２のオリゴヌクレオチド２と、結合調節分子（アデノシン）の混合物
８・・・標的酵素アプタマー（トロンビンアプタマー）
１０・・・標的酵素（トロンビン）
１５・・・結合調節分子（結合調節ＤＮＡ）
１６・・・結合調節分子と相補的な塩基配列部分
【図１】
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【図２】
2007327946.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
2007327946.tif 000007
【図６】
2007327946.tif 000008
【図７】
2007327946.tif 000009
【図８】
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【配列表】
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