(57)【要約】      （修正有）【課題】大量の副生物の生成や酵素活性の阻害されない含硫ヒドロキシカルボン酸の製造法の提供。【解決手段】式（１）2007159501.tif 000008（式中、Ｒ１は水素、炭素数１−８のアルキル基、または、炭素数６−２０のアリール基。）で示される含硫ジヒドロキシ化合物に、当該含硫ジヒドロキシ化合物を対応するα−ヒドロキシカルボン酸化合物に変換する能力を有する、１級または２級のアルコール存在下で培養したロドコッカス・ロドクラウス、または、ロドコッカス・エスピーに属する微生物の菌体又は菌体処理物を作用させることを特徴とする、式（２）2007159501.tif 000009（式中、Ｒ１は前記と同じ。）で示される含硫α-ヒドロキシカルボン酸化合物の製造法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）：
【化１】
2007159501.tif 000006
（式中、Ｒ１は水素、炭素数１−８のアルキル基、または、炭素数６−２０のアリール基を表す。）
で示される含硫ジヒドロキシ化合物に、当該含硫ジヒドロキシ化合物を対応するα−ヒドロキシカルボン酸化合物に変換する能力を有する、１級または２級のアルコール存在下で培養したロドコッカス・ロドクラウス（Rhodococcus  rhodochrous）またはロドコッカス・エスピー（Rhodococcus  sp.）に属する微生物の菌体又は菌体処理物を作用させることを特徴とする式（２）：
【化２】
2007159501.tif 000007
（式中、Ｒ１は前記と同じ意味を表す。）
で示される含硫α-ヒドロキシカルボン酸化合物の製造法。
【請求項２】
微生物が、ロドコッカス・ロドクラウス（Rhodococcus  rhodochrous）ATCC15610株、または、ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus  sp.）ATCC19148株の微生物である請求項１に記載の製造法。
【請求項３】
Ｒ１が炭素数１−８のアルキル基である請求項１又は２に記載の製造法。
【請求項４】
１級または２級のアルコールが１級または２級の炭素数１〜５のアルコールである請求項１〜３に記載の製造法。
【請求項５】
１級または２級のアルコールがメタノール、エタノール、１-プロパノール、２-プロパノール、１−ブタノール、２−メチル−１−プロパノールまたは２，２−ジメチル−１−プロパノールである請求項１〜３に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、含硫ヒドロキシカルボン酸の製造法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、含硫ヒドロキシカルボン酸を製造するには、シアンヒドリンを加水分解する方法が用いられていた。工業的には触媒として硫酸を使用する方法が知られている。また、ヒドロキシニトリル化合物を微生物の作用により加水分解して対応するヒドロキシカルボン酸に変換する方法（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３参照）等が知られている。
しかしながら、触媒として硫酸を使用する方法では、ヒドロキシニトリル化合物と硫酸とが反応した結果、目的物であるヒドロキシカルボン酸と等モル量の硫酸アンモニウムとが副生するために当該副生物の回収工程等が必要となり、工程が煩雑になり、また、微生物を用いてヒドロキシニトリル化合物から対応するヒドロキシカルボン酸化合物を製造する方法では、ヒドロキシニトリル化合物からの分解物であるシアン等により微生物が保持する酵素活性が阻害されたり、生成する大量のアンモニウム塩の処理等が必要となるという問題点があり、製造コストの増大を伴うものであった。
【０００３】
【特許文献１】特公昭５８−１５１２０号公報
【特許文献２】特開平２−８４１９８号公報
【特許文献３】特開平４−４０８９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
大量の副生物の生成や酵素活性の阻害される恐れのない含硫ヒドロキシカルボン酸の製造法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
即ち、本発明は、
１．式（１）
【０００６】
【化１】
2007159501.tif 000002
（式中、Ｒ１は水素、炭素数１−８のアルキル基、または、炭素数６−２０のアリール基を表す。）
で示される含硫ジヒドロキシ化合物に、当該含硫ジヒドロキシ化合物を対応するα−ヒドロキシカルボン酸化合物に変換する能力を有する、１級または２級のアルコール存在下で培養したロドコッカス・ロドクラウス（Rhodococcus  rhodochrous）、または、ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus  sp.）に属する微生物の菌体又は菌体処理物を作用させることを特徴とする、式（２）
【０００７】
【化２】
2007159501.tif 000003
（式中、Ｒ１は前記と同じ意味を表す。）
で示される含硫α-ヒドロキシカルボン酸化合物の製造法（以下、本発明製造法と記すこともある。）；
２．前記微生物が、ロドコッカス・ロドクラウス（Rhodococcus  rhodochrous）ATCC15610株、または、ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus  sp.）ATCC19148株の微生物である前項１記載の製造法；
３．式（１）で示される含硫ジヒドロキシ化合物におけるＲ１が炭素数１−８アルキル基である前項１又は２記載の製造法；
４．１級または２級のアルコールが１級または２級の炭素数１〜５のアルコールである前項１〜３記載の製造法；
５．１級または２級のアルコールがメタノール、エタノール、１-プロパノール、２-プロパノール、１−ブタノール、２−メチル−１−プロパノール、２，２−ジメチル−１−プロパノールである前項１〜３記載の製造法；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、大量の副生物の生成や酵素活性の阻害される恐れのなく、含硫ヒドロキシカルボン酸化合物を効果的に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明製造法について説明する。
式（１）で示される含硫ジヒドロキシ化合物、及び、式（２）で示される含硫ヒドロキシカルボン酸化合物において、Ｒ１で示される炭素数１−８アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基を挙げることができる。また、Ｒ１で示される炭素数６−２０のアリール基としては、例えば、フェニル基、トリル基、キシリル基、ナフチル基等が挙げられる。
式（１）で示される含硫ジヒドロキシ化合物におけるＲ１は、好ましくは、炭素数１−８のアルキル基である。
尚、本発明製造法により製造され反応液から回収される、式（１）で示される含硫ジヒドロキシ化合物に対応した式（２）で示される含硫ヒドロキシカルボン酸化合物は、塩の形であってもよい。
式（１）の化合物は、例えば、EP1260500もしくはJ. Agri. Food Chem.(1975)1137に記載の方法またはそれに準じて製造することもできる。
【００１０】
本発明製造法において用いられる含硫ジヒドロキシ化合物を対応するα−ヒドロキシカルボン酸に変換する能力を有する、ロドコッカス・ロドクラウス（Rhodococcus rhodochrous）、ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）等の微生物であってアルコール存在下で培養した菌体又は菌体処理物としては、例えば、含硫ジヒドロキシ化合物を対応するα−ヒドロキシカルボン酸に変換する能力を有する、ロドコッカス・ロドクラウス（Rhodococcus  rhodochrous）ATCC15610及びロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）ATCC19148の微生物であって、水の存在下に培養された菌体又は菌体処理物が挙げられる。
【００１１】
本発明の方法によれば、式（１）で示される含硫ジヒドロキシ化合物の一級ヒドロキシル基を優先的に酸化できる。ここで「優先的に酸化できる」とは、含硫ジヒドロキシ化合物の二級ヒドロキシル基の酸化やスルフィド酸化よりも一級ヒドロキシル基の酸化が優先的に進行するという意味である。
【００１２】
本発明製造法において用いられるロドコッカス・ロドクラウス（Rhodococcus rhodochrous）、ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）等の微生物は、炭素源、窒素源、有機塩、無機塩等を適宜含有する各種の微生物を培養するための培地を用いて培養すればよい。
【００１３】
当該培地に含まれる炭素源としては、例えば、グルコース、スクロース、グリセロール、でんぷん、アルコール、有機酸及び廃糖蜜が挙げられる。アルコール類としては特に、1級または２級の炭素数１〜５までのアルコール類がよく、例えば、メタノール、エタノール、１-プロパノール、２-プロパノール、１−ブタノール、２−メチル−１−プロパノール、２，２−ジメチル−１−プロパノールが挙げられる。アルコールを添加した培地で上記微生物を培養することにより、反応性を高めることができる。窒素源としては、例えば、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、カザミノ酸、麦芽エキス、大豆粉、コーンスティプリカー（corn steep liquor）、綿実粉、乾燥酵母、硫安及び硝酸ナトリウムが挙げられ、有機塩及び無機塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸ナトリウム、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム、炭酸カルシウム、酢酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸銅、硫酸亜鉛、硫酸第１鉄及び塩化コバルトが挙げられる。
【００１４】
培養方法としては、例えば、固体培養、液体培養（試験管培養、フラスコ培養、ジャーファーメンター培養等）が挙げられる。
培養温度及び培養液のｐＨは、本微生物が生育する範囲であれば特に限定されるものではないが、例えば、培養温度は約１５〜４５℃の範囲、培養液のｐＨは約４〜８の範囲を挙げることができる。培養時間は、培養条件により適宜選択することができるが、通常、約１〜７日間である。
【００１５】
培養された菌体は、そのまま本発明製造法に用いることができる。本微生物の菌体をそのまま用いる方法としては、（１）培養液をそのまま用いる方法、（２）培養液の遠心分離等により菌体を集め、集められた菌体（必要に応じて、緩衝液又は水で洗浄した後の湿菌体）を用いる方法等を挙げることができる。
【００１６】
また本発明製造法においては、上記のようにて得られた菌体処理物を用いることもできる。当該菌体処理物としては、例えば、培養して得られた菌体を有機溶媒（アセトン、エタノール等）処理したもの、凍結乾燥処理したもの若しくはアルカリ処理したもの、又は、菌体を物理的若しくは酵素的に破砕したもの、又は、これらのものから分離・抽出された粗酵素等を挙げることができる。さらに、菌体処理物には、前記処理を施した後、公知の方法により固定化処理したものも含まれる。
【００１７】
本発明製造法は、通常、水の存在下で行われる。この場合の水は、緩衝液の形態であってもよい。当該緩衝液に用いられる緩衝剤としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸のアルカリ金属塩、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の酢酸のアルカリ金属塩等が挙げられる。
また本発明製造法は、さらに疎水性有機溶媒を用いて、水と疎水性有機溶媒との存在下で行うこともできる。この場合に用いられる疎水性有機溶媒としては、例えば、ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル等のエステル類、ｎ−ブチルアルコール、ｎ−アミルアルコール、ｎ−オクチルアルコール等のアルコール類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メチル−ｔ−ブチルエーテル等のエーテル類、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類及びこれらの混合物が挙げられる。
また本発明製造法は、さらに親水性有機溶媒を用いて、水と親水性有機溶媒との存在下で行うこともできる。この場合に用いられる親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノールなどのアルコール類、アセトンなどのケトン、ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル類及びこれらの混合物が挙げられる。
【００１８】
本発明製造法は、通常、水層のｐＨが３〜１０の範囲内で行われるが、反応が進行する範囲内で適宜変化させてもよい。
【００１９】
本発明製造法は、通常、約０〜６０℃の範囲内で行われるが、反応が進行する範囲内で適宜変化させてもよい。
【００２０】
本発明製造法は、通常、約０．５時間〜約１０日間の範囲内で行われる。反応の終点は、原料化合物である含硫ジヒドロキシ化合物の添加終了後、例えば、反応液中の当該含硫ジヒドロキシ化合物の量を、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー等により測定することにより確認することができる。
【００２１】
本発明製造法における原料化合物である含硫ジヒドロキシ化合物の濃度は、通常、５０％（ｗ／ｖ）の以下であり、反応系中の当該含硫ジヒドロキシ化合物の濃度をほぼ一定に保つために、当該含硫ジヒドロキシ化合物を反応系に連続又は逐次加えてもよい。
【００２２】
本発明製造法では、必要に応じて反応系に、例えば、グルコース、シュークロース、フルクトース等の糖類、又は、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）若しくはＴｗｅｅｎ６０（登録商標）等の界面活性剤等を加えることもできる。
【００２３】
反応終了後、反応液を有機溶媒抽出、濾過、濃縮等の通常の後処理を行うことにより、前記含硫ジヒドロキシ化合物に対応した含硫ヒドロキシカルボン酸化合物を反応液から回収すればよい。回収された含硫ヒドロキシカルボン酸化合物は、必要に応じて、カラムクロマトグラフィー、蒸留等によりさらに精製することもできる。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明製造法を実施例により詳細に説明するが、本発明製造法はこれらの例に限定されるものではない。
【００２５】
４−（メチルチオ）ブタン−１，２−ジオールの合成例
磁気回転子を付した１００ｍＬフラスコに、３−ブテン−１，２−ジオール  ８８０ｍｇとアゾビスイソブチロニトリル１０ｍｇとを加えた。当該混合物を２５℃保温下で攪拌しながら、これにメタンチオールを１時間バブリングした。さらに、当該混合物を同温度で１時間攪拌した後、これに窒素を０．５時間バブリングすることにより、残存するメタンチオールを除去し、最終的に１２４５ｍｇの無色オイルを得た。このオイルをガスクロマトグラフィ面積百分率法により分析したところ、４−（メチルチオ）ブタン−１，２−ジオールの収率は７２．５％であった。尚、未反応のまま残存した３−ブテン−１，２−ジオールの量は、仕込み量の２６．６％であった。
次いで、得られた無色オイルに、４−（メチルチオ）ブタン−１，２―ジオールの濃度が１０％（w/v）となるように水を加えた後、当該混合物から不溶分（即ち、アゾビスイソブチロニトリル）をろ過操作によって除去することにより、実施例１、または実施例２で用いられる原料（１０％（w/v）の４−（メチルチオ）ブタン−１，２―ジオール水溶液）を得た。
【００２６】
実施例１  （本発明製造法による、含硫ジヒドロキシ化合物からの含硫ヒドロキシカルボン酸化合物の製造例）
試験管に滅菌済み培地（１Ｌの水に、表１で示された各種アルコール類２０ｇ、ポリペプトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、肉エキス３ｇ、硫酸アンモニウム０．２ｇ、リン酸２水素カリウム１ｇ及び硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇを加えた後、ｐＨを７．０に調整したもの）５ｍｌを入れ、これにRhodococcus rhodochrous ATCC15610株を植菌した。これを３０℃で好気条件下、振盪培養した。培養終了後、遠心分離により菌体を分離することにより、生菌体を得た。ねじ口試験管に０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７）を１ｍｌ入れ、これに上記の生菌体を加えた後、懸濁した。当該懸濁液に、原料（１０％（w/v）の４−（メチルチオ）ブタン−１，２―ジオール水溶液）を０．１ｍｌ（即ち、４−（メチルチオ）ブタン−１，２―ジオールが最終濃度として１％（w/v）となるように）を添加した後、得られた混合物を３０℃で２４時間振盪させた。
反応終了後、反応液を０.５ｍｌサンプリングした。当該サンプリング液から菌体を除去した後、生成した２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の量を液体クロマトグラフィーにより分析した。得られた結果を表１に示す。
（含量分析条件）
カラム：Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８（４．６ｍｍφ×１５ｃｍ、３μｍ）（Ｉｍｔａｋｔ社製）
移動相：Ａ液  ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液  メタノール
時間(分)  Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０  ８０：２０
１０  ８０：２０
２０  ５０：５０
３０  ５０：５０
３０.１  ８０：２０
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２２０ｎｍ
【００２７】
【表１】
2007159501.tif 000004
【００２８】
実施例２  （本発明製造法による、含硫ジヒドロキシ化合物からの含硫ヒドロキシカルボン酸化合物の製造例）
試験管に滅菌済み培地（１Ｌの水に、表２で示された各種アルコール類２０ｇ、ポリペプトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、肉エキス３ｇ、硫酸アンモニウム０．２ｇ、リン酸２水素カリウム１ｇ及び硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇを加えた後、ｐＨを７．０に調整したもの）５ｍｌを入れ、これにRhodococcus sp. ATCC19148株を植菌した。これを３０℃で好気条件下、振盪培養した。培養終了後、遠心分離により菌体を分離することにより、生菌体を得た。ねじ口試験管に０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７）を１ｍｌ入れ、これに上記の生菌体を加えた後、懸濁した。当該懸濁液に、原料（１０％（w/v）の４−（メチルチオ）ブタン−１，２―ジオール水溶液）を０．１ｍｌ（即ち、４−（メチルチオ）ブタン−１，２―ジオールが最終濃度として１％（w/v）となるように）を添加した後、得られた混合物を３０℃で２４時間振盪させた。
反応終了後、反応液を０.５ｍｌサンプリングした。当該サンプリング液から菌体を除去した後、生成した２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の量を液体クロマトグラフィーにより分析した。得られた結果を表２に示す。
（含量分析条件）
カラム：Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８（４．６ｍｍφ×１５ｃｍ、３μｍ）（Ｉｍｔａｋｔ社製）
移動相：Ａ液  ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液  メタノール
時間(分)  Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０  ８０：２０
１０  ８０：２０
２０  ５０：５０
３０  ５０：５０
３０.１  ８０：２０
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２２０ｎｍ
【００２９】
【表２】
2007159501.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明により、含硫ヒドロキシカルボン酸化合物を効率的に製造することができる。