(57)【要約】      （修正有）【課題】原核生物および真核生物の両方で機能するタンパク質発現系を構築する。【解決手段】アウレオバシジウム・プルランス由来のシグナル配列は、酵母におけるペプチダーゼＫＥＸ２の認識様配列と、大腸菌におけるＳｅｃシステムにおいて広く保存されているコンセンサス配列の双方を持ち合わせていることが明らかとなった。このシグナル配列とキシラナーゼ配列を、適切な発現ベクターを用いて酵母および大腸菌においてそれぞれ発現させた。その結果、どちらの宿主においても培養液上清中にキシラナーゼ活性が示された。このことより、該シグナル配列は酵母および大腸菌の双方で機能を示すことが明らかになった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌を宿主として好酸性キシラナーゼを培地中に生産させることを特徴とする好酸性キシラナーゼの生産方法。
【請求項２】
前記好酸性キシラナーゼの培地中への生産に関するシグナル配列が配列番号２記載のアミノ酸配列であり、カビ由来であることを特徴とする請求項１記載の好酸性キシラナーゼの生産方法。
【請求項３】
好酸性キシラナーゼを培養液上清中に生産させることを特徴とする組み換え大腸菌。
【請求項４】
前記好酸性キシラナーゼの培地中への生産に関するシグナル配列が配列番号２記載のアミノ酸配列であり、カビ由来であることを特徴とする請求項３記載の組み換え大腸菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、微生物を用いた有用タンパク質の分泌に関するものであり、詳しくは原核生物である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の培養液上清中に生産させるシグナル配列、および真核生物である取得菌株の不完全菌類アウレオバシジウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）はもとより、酵母ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の菌体外に分泌させるシグナル配列に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  （菌株の由来）
カビの一種であるアウレオバシジウム・プルランスは、原糖、果実の表面、醸造場や土壌中に生息している不完全菌類である。この菌は、α−１，６結合を持つ多糖プルランの生成やグルコン酸の生成、およびキシラン分解酵素の産生を行うものが存在することが知られている。発明者の保有している保存菌株アウレオバシジウム・プルランスＡＴＣＣ２０５２４株からは既に、至適ｐＨ２．０であるグリコシル・ハイドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー１１に属する好酸性キシラナーゼを単離・精製し、そのコードする遺伝子をクローニングしている。【０００３】  （シグナル配列について）
この菌株の菌体外液より取得した好酸性キシラナーゼは、非特許文献１に記載されている配列表の配列番号１に示すＤＮＡの塩基配列によりコードされる３４残基のアミン酸よりなるシグナル配列（配列番号２）を持っている。このシグナル配列は、アウレオバシジウム・プルランスにおいて好酸性キシラナーゼを菌体外に約２．５ｍｇ／Ｌ分泌することが可能である。さらに、このシグナル配列は高分泌に関与する２段階のプロセシングを受けるプレ・プロ配列であることが示唆されている。【０００４】  （酵母での分泌系構築、キシラナーゼ）
上記のシグナル配列を含む好酸性キシラナーゼをコードする遺伝子を、メタノール誘導性プロモーターをもつ発現ベクターｐＰＩＣ３．５（インビトロジェン社）のマルチクローニングサイトに組込むことにより、ｐＸＹＮ１１９を作製した。次に、直鎖状にしたｐＸＹＮ１１９にて酵母ピチア・パストリスＧＳ１１５株を形質転換し、形質転換体を取得した。【０００５】  （酵母での分泌確認）
上記の形質転換体を２４時間ごとにメタノールを加え誘導を維持した結果、シグナル配列によりキシラナーゼ活性を菌体外に検出することができた。この菌体外に分泌したキシラナーゼを各種クロマトグラフィーにて精製した結果、その分泌量は１７８ｍｇ／Ｌであることが非特許文献２において明らかとされている。【０００６】
【非特許文献１】Ｋａｚｕｙｏｓｈｉ  Ｏｈｔａ，Ｓａｔｏｓｈｉ  Ｍｏｒｉｙａｍａ，Ｈｉｄｅｎｏｒｉ  Ｔａｎａｋａ，Ｔａｋａｔｏ  Ｓｈｉｇｅ，ａｎｄ  Ｈｉｄｅｔｏｓｈｉ  Ａｋｉｍｏｔｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９２，２６２−２７０，２００１
【非特許文献２】Ｈｉｄｅｎｏｒｉ  Ｔａｎａｋａ，Ｔｏｍｏｋｏ  Ｏｋｕｎｏ，Ｓａｔｏｓｈｉ  Ｍｏｒｉｙａｍａ，Ｍｉｃｈｉｏ  Ｍｕｇｕｒｕｍａ，ａｎｄ  Ｋａｚｕｙｏｓｈｉ  Ｏｈｔａ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９８，３３８−３４３，２００４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  大腸菌におけるタンパク質の分泌生産は、分泌されるタンパク質が通常多くないため、目的タンパク質の単離が容易であること、プロテアーゼ消化を受けにくいこと、および、ペリプラズム領域は還元的条件であるためにジスルフィド結合を形成しやすく正常な機能を維持したタンパク質を取得できる可能性が高くなるため注目されている。異種タンパク質生産において、大腸菌は生育が速く培養が容易で取り扱いやすいため最もよく用いられる宿主である。しかしながら、大腸菌は原核生物であるため、翻訳後修飾が起こらないなどの問題により、真核生物由来のタンパク質においては正常に機能しない場合もある。【０００８】  これに対し、酵母などの真核生物は、翻訳後修飾の問題が発生しにくいので、真核生物由来のタンパク質を正常に機能させることができる可能性が高くなる。
従って、原核生物である大腸菌、および真核生物である酵母といった双方の宿主において異種タンパク質発現系を構築し、条件を検討することは、有用物質生産の観点から重要なことである。【０００９】  そこで、本発明は、原核生物および真核生物の両方で機能するタンパク質発現系の構築することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】  本発明者らは、配列番号１記載の塩基配列の形質転換及びその結果得られる形質転換体がどのような有用物質を生産できるかについて、鋭意研究を行った。【００１１】  配列番号１記載の塩基配列によりコードされるシグナル配列（配列番号２）を検討した結果、酵母において報告されているシグナルペプチダーゼＫＥＸ２と原核生物におけるシグナルペプチダーゼの双方の認識部位を持つことが推定された。【００１２】  本発明者は、アウレオバシジウム・プルランス由来シグナル配列を用いて酵母以外の形質転換について鋭意検討の結果、大腸菌を用いて培養液上清中にタンパク質を生産する系を構築することに到達した。即ち本発明は、カビより単離されたシグナル配列と該配列を含むベクター及びそれにより形質転換された大腸菌である。【００１３】  すなわち本発明は、原核生物好ましくは大腸菌において培養液上清中にタンパク質を生産することが可能で、真核生物好ましくは酵母において菌体外に分泌することが可能なシグナル配列をコードする塩基配列の取得、およびこの塩基配列を含む発現ベクターの構築と、この発現ベクターにより形質転換された大腸菌である。このシグナル配列は、大腸菌におけるＳｅｃシステムに従った認識部位および酵母におけるシグナルペプチダーゼＫＥＸ２の認識部位も併せ持つ、高効率型シグナル配列である。【００１４】  従って、本発明によれば、多糖分解酵素に限らず、各種酵素およびインターフェロンやインターロイキンなどのサイトカインや、ホルモンなどの有用タンパク質をコードする遺伝子と本発明のシグナル配列を発現ベクターに導入し、形質転換することで培養液上清中に生産することができるようになると期待できる。【００１５】  さらに本発明は、培養液上清中に生産を行うために必要なのはシグナル配列のみであるため、特有の形質を持つ菌株に対し、さらなる形質を付加することが可能である。また、ベクターを変更することにより、原核生物、真核生物の別なく導入する宿主細胞を変えることが可能になり、使用目的に応じ至適な宿主を選択することができる可能性を秘めている。【００１６】  本発明のシグナル配列の機能を利用して有用なタンパク質を生産する可能性の別な可能性として、マンナナーゼ生産を挙げることが出来る。例えば、特開２００５−１６０４７６号公報に記されているような新規のマンナナーゼ配列を導入して、発現ベクター及び宿主細胞を好ましく選定することにより、菌体外に生産できる可能性を有している。【００１７】  本発明のシグナル配列の機能を利用する別な可能性として、優良な形質を持っている微生物への遺伝子導入により、さらなる改良を行うことが挙げられる。例えば、本発明のシグナル配列と多糖分解酵素をコードする遺伝子を発現ベクターに導入し、エタノール生産能が付与された大腸菌Ｋ０１１（米国特許第５，４２４，２０２号および米国特許第５，８２１，０９３号）を形質転換することにより、多糖から直接エタノール生産ができる菌株を作出できる可能性を有している。
【発明の効果】
【００１８】  本発明に因れば、様々な有用タンパク質を簡便に効率よく生産することが可能になる。
驚くべき事には、該配列は真核生物由来の菌体外分泌シグナルにも関わらず、原核生物である大腸菌においても認識されるシグナル配列であり、その双方で使用可能な系を構築することが可能となった。さらには、発現させるタンパク質によっては、大腸菌においても培養液上清中にタンパク質の生産を可能とするシグナル配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】  以下、本発明を詳細に説明する。
（大腸菌での系の構築、好酸性キシラナーゼ）
該シグナル配列を含む好酸性キシラナーゼをコードする遺伝子を、ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトに組込むことにより、発現ベクターｐＥＸＮ１０２を作製した。次に、この発現ベクターによって大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、形質転換体を取得した。【００２０】  （大腸菌での発現確認、好酸性キシラナーゼ）
該形質転換体を濁度（測定波長６６０ｎｍ）が０．２に到達するまでアンピシリンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）液体培地で培養した後、イソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ、終濃度０．５ｍＭ）を培地に添加してキシラナーゼ遺伝子の発現を誘導した。４時間の培養後、大腸菌を遠心分離して上清を回収した。沈殿させた大腸菌は緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で洗浄し、同緩衝液に再懸濁させた。この懸濁液をフレンチプレスにより破砕し、遠心分離後、細胞破砕液上清を回収した。ソモギ・ネルソン法により回収した培養液上清および細胞破砕液上清のキシラナーゼ活性を測定した。【００２１】  その結果、細胞破砕液上清中にキシラナーゼ活性はほぼ確認できず、培養液上清中に大部分のキシラナーゼ活性が認められた。【００２２】  （大腸菌での発現確認、別菌株由来の中性キシラナーゼ）
さらに、別のキシラナーゼについても同様の機能を示すことを確認するため、該シグナル配列と糸状菌ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）由来の中性キシラナーゼ配列とを融合したものについても同様の確認を行った。【００２３】  その結果、細胞破砕液上清中にキシラナーゼ活性はほぼ確認できず、培養液上清中に大部分のキシラナーゼ活性が認められた。
【実施例】
【００２４】  以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。【００２５】  （シグナル配列の由来）
非特許文献１においてアウレオバシジウム・プルランスより好酸性キシラナーゼを精製し、そのコードする遺伝子（配列番号１）を取得した。この取得した遺伝子には、アミノ酸３４残基よりなる菌体外分泌シグナル配列が含まれていた。【００２６】  （認識位置の推定）
シグナル配列（配列番号２）には、酵母におけるペプチダーゼＫＥＸ２の認識様配列が含まれており、非特許文献１においてアウレオバシジウム・プルランスにおいても同様の位置にて切断されることが明らかとなった。さらに、原核生物、特に大腸菌におけるＳｅｃシステムにおいて広く保存されているコンセンサス配列、アラニン−Ｘ−アラニンが配列番号２の２０〜２２、２２〜２４、２４〜２６番目の３カ所に存在した。さらにＳｅｃシステムのシグナル配列が一般的に持つ特徴であるＮ末端側に正に荷電したアミノ酸からなる短い領域を有し、中間に疎水性アミノ酸が存在するという特徴もアラニン−Ｘ−アラニン配列より上流域に併せ持っていた。【００２７】  （大腸菌での系の構築、好酸性キシラナーゼ）
ｘｙｎＩの塩基配列（非特許文献１）をもとに、制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位を付加した５′−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＣＣＧＧＣＣＣＣＧＧＴＧＧＣＡＴＣＡＡ−３′（プライマー１）と５′−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴＴＣＧＣＣＡＣＴＡＴ−３′（プライマー２）および制限酵素ＳｍａＩ切断部位を付加した５′−ＴＣＣＣＣＣＧＧＧＧＧＡＴＧＡＣＡＴＣＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＴＡＡＣＧＣＴ−３′（プライマー３）の３種類のプライマーを合成した。２００μｌのＰＣＲチューブに１．０μｌのｘｙｎＩを含むｃＤＮＡ、１．０μｌのプライマー１（１０μＭ）、１．０μｌのプライマー３（１０μＭ）、１５．７５μｌの純水、２．５μｌの１０×ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡社）、１．０μｌのＭｇＳＯ４（２５ｍＭ；東洋紡社）、２．５μｌのｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ／ｅａｃｈ；東洋紡社）、０．２５μｌのＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１ｕｎｉｔ／μｌ；東洋紡社）を加えて調製した溶液を、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの活性化条件を９４℃で２分間、ＤＮＡの変性条件を９４℃で１５秒間、プライマーのアニーリング条件を６４℃で３０秒間、プライマーの伸長条件を６８℃で１分間の各条件でサーマルサイクラー（タカラバイオ社）を用いて３０サイクル反応させた。これにより、シグナル配列を含まないｘｙｎＩのｃＤＮＡ断片を増幅した。また、プライマー２とプライマー３を用いてＰＣＲを行い、シグナル配列を含むｘｙｎＩのｃＤＮＡ断片を増幅した。【００２８】  上記のように調製した２種類のｘｙｎＩのｃＤＮＡ断片とｐＵＣ１８をそれぞれ３０ユニットの制限酵素ＳｍａＩで消化しエタノール沈殿後、２４ユニットの制限酵素ＥｃｏＲＩでさらに消化し、１％アガロースゲルにて電気泳動し、キアクイック・ゲル・エクストラクション・キット（キアゲン社）を用いて、約６００ｂｐのシグナル配列を含まないｘｙｎＩのｃＤＮＡ断片と約７００ｂｐのシグナル配列を含むｘｙｎＩのｃＤＮＡ断片と約２７００ｂｐのｐＵＣ１８を精製した。【００２９】  ライゲーション・コンビニエンス・キット（ニッポンジーン社）を用いて、１６℃、５分間ライゲーション反応を行い、上記のように調製したｐＵＣ１８のＬａｃプロモーター下流のマルチクローニングサイトに、シグナル配列を含まないｘｙｒＩのｃＤＮＡ断片またはシグナル配列を含むｘｙｎＩのｃＤＮＡ断片を挿入した発現ベクターｐＥＸＮ１０１およびｐＥＸＮ１０２をそれぞれ作製した。ｐＥＸＮ１０１とｐＥＸＮ１０２をそれぞれ大腸菌ＪＭ１０９コンピテント・セル（タカラバイオ社）と混合し、４２℃で４５秒間加温した後、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート培地に均等に広げ、３７℃で培養後プレート上に生育する形質転換体を得た。これら形質転換体のコロニーを鋳型として、上述したプライマーの組み合わせによるＰＣＲを行い、ｘｙｎＩの断片の増幅を確認できたものを目的の形質転換体とし、それぞれ大腸菌ＪＭ１０９（ｐＥＸＮ１０１）と大腸菌ＪＭ１０９（ｐＥＸＮ１０２）とした。【００３０】  （大腸菌での発現確認、好酸性キシラナーゼ）
大腸菌ＪＭ１０９（ｐＥＸＮ１０１）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＥＸＮ１０２）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＣ１８）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ液体培地にて、濁度（測定波長６６０ｎｍ）が０．２に到達するまで３７℃で回転振とう培養した後、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭで培地に添加してキシラナーゼ遺伝子の発現を誘導した。さらに３７℃で４時間培養した後、遠心分離（１，５００×ｇ、５分間）し培養液上清として回収した。菌体を５ｍｌのＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で２回洗浄し、最終的に５ｍｌの同緩衝液に再懸濁の後、フレンチプレス（大岳製作所）により細胞を破砕した。この破砕液を遠心分離（８，０００×ｇ、３分間）し、上清を細胞破砕液として回収した。【００３１】  キシランに対する酵素活性は、酵素液１ｍｌあたり１分間に１μｍｏｌの還元糖（キシロースとして計算する）を生成する酵素量を、１ユニット（単位）と定義した。【００３２】  回収した培養液上清と細胞破砕液上清をそれぞれ０．１Ｍ酢酸ナトリウム−ＨＣｌ．緩衝液（ｐＨ２．０）で２倍に希釈し、ソモギ・ネルソン法により基質にブナ由来キシラン（シグマ社）を用いてキシラナーゼ活性を測定した。その結果、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＥＸＮ１０１）に関しては、培養液上清では活性が認められず、破砕液上清では３８ミリ・ユニットの活性を示した。大腸菌ＪＭ１０９（ｐＥＸＮ１０２）に関しては、培養液上清では８０ミリ・ユニット、破砕液上清では活性が認められなかった。コントロールとして用いた大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＣ１８）に関しては、培養液上清と破砕液上清の両方でキシラナーゼ活性を示さなかった。つまり該シグナル配列を含まないキシラナーゼ活性の大部分が細胞破砕液上清中に存在したのに対し、該シグナル配列を含むキシラナーゼ活性の大部分は培養液上清中に存在した。【００３３】  （大腸菌での系の構築、中性キシラナーゼ）
中性キシラナーゼをペニシリウム・シトリナムより取得するために、制限酵素ＫｐｎＩ切断部位を付加した５′−ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＴＧＣＣＧＴＣＴＣＴＧＡＣＴＴＣＧ−３′（プライマー４）と制限酵素ＸｂａＩ切断部位を付加した５′−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＴＡＧＣＴＡＡＣＡＧＴＡＡＴＡＴＣＡＧ−３′（プライマー５）の２種類のプライマーを合成した。２００μｌのＰＣＲチューブに１．０μｌのペニシリウム・シトリナムのｃＤＮＡ、１．０μｌのプライマー４（１０μＭ）、１．０μｌのプライマー５（１０μＭ）、１５．７５μｌの純水、２．５μｌの１０×ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡社）、１．０μｌのＭｇＳＯ４（２５ｍＭ；東洋紡社）、２．５μｌのｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ／ｅａｃｈ；東洋紡社）、０．２５μｌのＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１ｕｎｉｔ／μ１；東洋紡社）を加えて調製した溶液を、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの活性化条件を９４℃で２分間、ＤＮＡの変性条件を９４℃で１５秒間、プライマーのアニーリング条件を５１℃で３０秒間、プライマーの伸長条件を６８℃で１分間の各条件でサーマルサイクラー（タカラバイオ社）を用いて３０サイクル反応させた。これにより、ペニシリウム・シトリナムのシグナル配列を含む中性キシラナーゼをコードする塩基配列を増幅した。
また、ｘｙｎＩの塩基配列（非特許文献１）をもとに、制限酵素ＫｐｎＩ切断部位を付加した５′−ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴＴＣＧＣＣＡＣＴ−３′（プライマー６）を合成し、ｘｙｎＩの塩基配列（非特許文献１）および先に得られたペニシリウム・シトリナムの中性キシラナーゼをコードする塩基配列をもとに、５′−ＴＡＴＡＡＧＡＴＴＣＡＣＧＣＴＣＧＡＴＡ−３′（プライマー７）と５′−ＴＡＴＣＧＡＧＣＧＴＧＡＡＴＣＴＴＡＴＡ−３′（プライマー８）を合成した。２００μｌのＰＣＲチューブに１．０μｌのｘｙｎＩのｃＤＮＡ、１．０μｌのプライマー６（１０μＭ）、１．０μｌのプライマー７（１０μＭ）、１５．７５μｌの純水、２．５μｌの１０×ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡社）、１．０μｌのＭｇＳＯ４（２５ｍＭ；東洋紡社）、２．５μｌのｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ／ｅａｃｈ；東洋紡社）、０．２５μｌのＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１ｕｎｉｔ／μｌ；東洋紡社）を加えて調製した溶液を、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの活性化条件を９４℃で２分間、ＤＮＡの変性条件を９４℃で１５秒間、プライマーのアニーリング条件を５０℃で３０秒間、プライマーの伸長条件を６８℃で１分間の各条件でサーマルサイクラー（タカラバイオ社）を用いて３０サイクル反応させた。これにより、ｘｙｎＩのシグナル配列のｃＤＮＡ断片を増幅した。また、プライマー８とプライマー５の組み合わせで同様にＰＣＲを行い、ペニシリウム・シトリナムの中性キシラナーゼの成熟タンパク質のｃＤＮＡ断片を増幅した。次に、この２種類の増幅断片を混合し、プライマーを加えずに先ほどと同じ温度条件でＰＣＲを５サイクル行った。これを１％アガロースゲル電気泳動により分離し、目的のシグナル配列との融合された断片を精製した。精製した断片を鋳型とし、プライマー６および５を用いて再度ＰＣＲを３０サイクル行った。この反応液を１％アガロースゲル電気泳動により分離し、目的の該シグナル配列と融合された断片を精製した。【００３４】  上記のように調製した該シグナル配列と中性キシラナーゼ配列を融合させた断片と、ｐＵＣ１８をそれぞれ１５ユニットの制限酵素ＫｐｎＩと制限酵素ＸｂａＩで消化し、１％アガロースゲルにて電気泳動し、キアクイック・ゲル・エクストラクション・キット（キアゲン社）を用いて、約６５０ｂｐの中性キシラナーゼ由来のシグナル配列を含む断片と約６５０ｂｐのｘｙｎＩの該シグナル配列を含む中性キシラナーゼの断片、および約２７００ｂｐのｐＵＣ１８を精製した。【００３５】  ライゲーション・コンビニエンス・キット（ニッポンジーン社）を用いて、１６℃、５分間ライゲーション反応を行い、上記のように調製したｐＵＣ１８のＬａｃプロモーター下流のマルチクローニングサイトに、中性キシラナーゼ由来のシグナル配列を含む断片またｘｙｎＩの該シグナル配列を含む中性キシラナーゼ断片を挿入した発現ベクターｐＥＸＮ３０１およびｐＥＸＮ４０１をそれぞれ作製した。ｐＥＸＮ３０１とｐＥＸＮ４０１をそれぞれ大腸菌ＪＭ１０９コンピテント・セル（タカラバイオ社）と混合し、４２℃で４５秒間加温した後、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＢプレート培地に均等に広げ、３７℃で培養後プレート上に生育する形質転換体を得た。これら形質転換体のコロニーを鋳型として、上述したプライマーの組み合わせによるＰＣＲを行い、ｘｙｎＩのｃＤＮＡ断片の増幅を確認できたものを目的の形質転換体とし、それぞれ大腸菌ＪＭ１０９（ｐＥＸＮ３０１）と大腸菌ＪＭ１０９（ｐＥＸＮ４０１）とした。【００３６】  （大腸菌での発現確認、中性キシラナーゼ）
大腸菌ＪＭ１０９（ｐＥＸＮ３０１）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＥＸＮ４０１）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ液体培地にて、濁度（測定波長６６０ｎｍ）が０．２に到達するまで３７℃で回転振とう培養した後、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭで培地に添加してキシラナーゼ遺伝子の発現を誘導した。さらに３７℃で４時間培養した後、遠心分離（１，５００×ｇ、５分間）し上清を回収した。菌体を５ｍｌのＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で２回洗浄し、最終的に５ｍｌの同緩衝液に再懸濁の後、フレンチプレス（大岳製作所）により細胞を破砕した。この破砕液を遠心分離（８，０００×ｇ、３分間）し、上清を細胞破砕液として回収した。【００３７】  回収した培養液上清と細胞破砕液上清をそれぞれ０．１Ｍ酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で２倍に希釈し、ソモギ・ネルソン法により基質にブナ由来キシラン（シグマ社）を用いてキシラナーゼ活性を測定した。その結果、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＥＸＮ３０１）に関しては、培養液上清には活性が認められず、破砕液上清に１０ミリ・ユニットの活性を示した。大腸菌ＪＭ１０９（ｐＥＸＮ４０１）に関しては、培養液上清では６０ミリ・ユニット、破砕液上清では４４ミリ・ユニットの活性を示した。つまりｘｙｎＩの該シグナル配列を含まない中性キシラナーゼが培養液上清中に存在しなかったのに対し、ｘｙｎＩの該シグナル配列を含む中性キシラナーゼは培養液上清中にも存在した。
【産業上の利用可能性】
【００３８】  本発明によれば、有用タンパク質生産が原核のみならず真核生物の両方で可能となり、多糖分解酵素に限らず、各種酵素およびインターフェロンやインターロイキンなどのサイトカインや、ホルモンなどの有用タンパク質の生産ができると期待でき、産業上有益な技術となる可能性がある。
【配列表】
2007089555000001.xml