(57)【要約】【課題】精子運動率の改善が望まれている。【解決手段】アンギオテンシンＩＩ、その塩類またはアミド類を用いて運動性に乏しい精子の運動性を改善することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物精子のパーセンテージ表示の運動性の促進において用いるための組成物であって、低運動性精子と接触させるためのアンギオテンシンＩＩまたはその塩類またはアミド類と、許容される担体とを含む、組成物。
【請求項２】
哺乳動物卵子の低運動性精子との受精にて用いるための組成物であって、哺乳動物精子のパーセンテージ表示の運動性を促進するためのアンギオテンシンＩＩまたはその塩類またはアミド類と、許容される担体とを含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物の卵子受精とりわけ人間の卵子受精を促進するために用いられるアンギオテンシンIIを含む組成物に、或いはそれの類似物を含む組成物に関するものである。特に本発明は、精子の運動性を促進するためのアンギオテンシンIIを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アンギオテンシンIIは、オクタペプチドであるが、通常は血液の中で生成される。すなわち、まずレニン（腎臓から分泌された酵素）が、アンギオテンシノーゲンに作用し、ディカペプティド（decapeptide）先駆物質すなわちアンギオテンシンＩを生成させる。そして、ジペプチダーゼ「アンギオテンシン転換酵素」による作用が発生する。この酵素は、アンギオテンシンＩに作用し、アンギオテンシンIIを生成させる。さらに、アンギオテンシンIIは、アミノペプチダーゼによる加水分解を経過し、ヘプタペプチドのアンギオテンシンIII（アンギオテンシン１−７）を生成する。
ホルモンのアンギオテンシンIIによって、（アンギオテンシン／レニン）系統の一部が生成される。当該系統によって、体内の電解質平衡および血圧をコントロールすることができる。哺乳動物の体内には、アンギオテンシンIIが作用できる数種類の内臓組織があり、これらの内蔵組織は例えば腎上体の腺、子宮、肝臓、脳および腎臓である。
いままで既に確立されたアンギオテンシンIIの複数の作用のうち、血管収縮作用が知られており、該血管収縮作用に起因して高血圧症が生じる。従って、高血圧に関する大多数の治療では、色々な方法から適切な方法を選んでなるべくアンギオテンシンの作用を抑制しようとしている。また、アンギオテンシンIIは、腎上体の皮質により、アルドステロンの分泌作用をも促進する。アルドステロンは、一種の強いホルモンであって、主として腎臓に作用しナトリウムの保持力を促進する。そのため、その中でも、脈管構造に直接作用するアンギオテンシンの血圧上昇作用を増大している。
【０００３】
また、アンギオテンシンIIは脳の各箇所に作用することも知られており、その作用の一つは、喉が渇いたり飲物を飲んだりするときの調整作用を果たしている。
さらに、アンギオテンシンは、脈管構造に対して栄養性効果を有し、動脈壁部の組織成長を促進している。そして、アンギオテンシンは、アンギオゲニク的である（angiogenic）とも判断され、新しく発展する筋肉組織の血管新生を引き起こす。
アンギオテンシンIIに関して既に知られている大多数の効果は、ＡＴ１特殊型のアンギオテンシンII受容体を経て現れているが、該受容体は、七つの生体膜領域を有するものである。また、該受容体はクローン化されると共に、各種筋肉組織と連続的につながっている。さらに該受容体は、３５９アミノ酸ポリペプチドでありその予想分子量が約４０ｋＤであることが判った（バーンステインおよびアレグザンダー、１９９２年、生理報告１３，３８１−３８６）。光−親和力の標識および架橋剤を用いた研究によると、成熟の受容体分子量はそれぞれ約６５ｋＤおよび１１６ｋＤであり、これらは、余剰細胞状領域内のアスパラギン残留物のグリコーサイレーション（glycosylation）を反映している。
最近のハイブリドーマ細胞株の研究（バーカー，エス、生理報告誌１１，２４１−２４５，１９９３年）によると、モノクローナル抗体を生成してＡＴ1特殊型のアンギオテンシンII受容体に供給することが可能である。その結果、このような受容体は、成熟ネズミおよび人間の精子の尾に存在し、交尾したネズミの膣洗浄により得られた自由泳動の精子および人間に射精後の精子に存在していることが判った。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
さらに発見されたのは、アンギオテンシンIIまたはこれの類似物によって、精子の運動力およびこれらの線形運動速度も増加されることが判明した。
卵子を受精させる精子の能力は精子の運動力に緊密に係わっていることから、アンギオテンシンIIに関してこの新しく発見した性質を利用することによって、卵子の受精を促進することができるようになった。
本発明における第１形態によれば、哺乳動物の卵子の受精を促進するために、アンギオテンシンII、その塩類またはこれの類似物の用途が提供された。このような受精は、試験管内で行われることが可能である。
本発明における第２形態によれば、精子の運動力を増加するために、アンギオテンシンII、その塩類またはこれの類似物の用途が提供された。
本発明におけるもう一つの形態によれば、卵子の受精を促進し、特に試験管での卵子受精を促進するために用いられる薬物を製造するために、アンギオテンシンII、その塩類またはこれの類似物の用途が提供された。
精子の運動性を促進することで受精を促進するために用いられるアンギオテンシンIIの類似物は、アンギオテンシンIIアミドである。
【０００５】
試験管での受精に関する標準の手順は、「試験管での受精：男性不妊症の治療，ジェ．，エドワーズ，アル等．１９８５年，生殖力と不妊症，４４，４２２−４３２」の中に記載されている。通常、精子サンプルは、ＭＥＭ組織培養媒体で洗浄されたあと、約４００ｇの重量で遠心分離され、そして再懸濁されてから再遠心分離される。その後、上記した精子サンプルは、数滴のＭＥＭ養液で再懸濁されて、０．５ｍｌの新鮮媒体を上層部において層として形成させる。それから、定温器の中で３７℃の温度に３０分間保たれ後、本質的に運動性をもつ精子を含有する上部３０％の媒体が定温器から移送され、ＭＥＭ中の卵母細胞に分散（１個の卵母細胞あたり約１００００個の精子）される。そして、２４時間放置する中で受精を発生させる。
本発明における更にもう一つの形態によると、哺乳動物卵子の試験管での受精を促進する方法が提供された。該方法は、アンギオテンシIIまたはその塩類またはその類似物を、卵母細胞および精子を含む培養媒体に添加することを特徴としている。
アンギオテンシンIIまたはその類似物の添加を洗浄の時点または卵母細胞最後の培養時点で行うことができる。培養媒体への添加に際して、アンギオテンシンIIまたはその類似物は、好ましくは１ｎｍｏｌｅ／ｌの濃度で添加されることである。
【０００６】
以下、実施例を参照して本発明を詳細に説明する。
実施例１
精子の運動性に対するアンギオテンシンIIによる刺激の効果
１２人の志願者から人間の精子サンプルを採取して、ニューハンム（Newham）病院の患者から生殖力研究クリニックの研究に対して協力してもらった。これらの精子サンプルを、アール（Earle）塩（ＭＥＭ）およびグルタミンを含む改質後の最小限の媒体の中で懸濁して、オリンパスＡＲＴＦ−２ビデオカメラを装着したオリンパス反転顕微鏡を用いて、マクラー（Makler）チャンバーで観察した。ＭＥＭのみ（刺激されていない対照例）と混合し、また、１ｎｍｏｌｅ／ｌのアンギオテンシンIIアミドを含有するＭＥＭと混合した後の１分および５分のときに、フィールド状態をビデオテープに記録し、パーセンテージで精子の運動性を評価した。
そして、ビデオテープを再生し、フレームを停止してフィールド内の全ての精子を数え、その後、ビデオテープの前進モードで不活性の精子を数え、すなわち観察期間内にわたってマクラーチャンバーの格子内において隣の区域（１００μｍ）へ遊動しない精子を数えることで、パーセンテージで精子の運動性を調べた。実際は、精子は完全に不活動性になっているか、自由に遊動しているかというどちらか一方となるので、上記した概念の厳格な使用は、めったに必要としない。
図１（ａ）に示されるように、刺激されていない対照例の場合は、５分後、パーセンテージでの精子運動性に関して著しい変化が認められていない。一方、図１（ｂ）に示されるように、アンギオテンシンIIによって刺激されたグループにおいては、５分後のパーセンテージでの精子運動性が１分後のパーセンテージでの精子運動性と著しく異なっている。
【０００７】
実施例２
精子運動性に反するＡＴ1受容体の影響
実施例１と同じ方式で得られた六つの精子サンプルを、未改質のＭＥＭと混合させ、或いはＤｕＰ−７５３（１ｎｍｏｌｅ／ｌ）を含有したＭＥＭと混合させる。
パーセンテージでの精子運動性は、実施例１と同じ方法で評価した。
図２から明らかなように、ＤｕＰ−７５３、（２−ｎ−ブチル−４−クロロ−５−ヒドロキシメチル−１−［（２'−（１Ｈ−テトラゾール−５−基）ビフェニル−４−基）メチル］イミダゾール、カリウム塩）の存在下では、パーセンテージでの精子運動性は未処理の対照例の場合と比較して著しく減少されている。
【０００８】
実施例３
精子運動速度へのアンギオテンシンIIの効果
精子サンプルは、実施例１と同じ方式で得た。第１部の精子サンプルは、対照例の条件下に置いた。第２部の精子サンプルには、アンギオテンシンIIアミド（１０ｎｍｏｌｅ／ｌ）を添加した。第３部の精子サンプルは、アンギオテンシンの添加に先だって、ＡＴ1へのモノクロナール抗体で処理された。
マクラーチャンバ一中の格子を横断する前進中の精子の時間を定めることによって、また、手動的に時間を定めることによって、速度を測定した。
図３（ａ）から判るように、アンギオテンシンIIの刺激によって、精子の前進速度は、未処理の対照例の場合に比較して著しく刺激されているが、しかし、モノクロナール抗体の添加によって、アンギオテンシンIIへの反応は抑制されてしまう。
図３（ｂ）から判るように、パーセンテージで示す運動性精子の増加への効果については、同様な結果が得られた。
【０００９】
実施例４
実施例１と同じ方式で精子サンプルを得た。第１部の精子サンプルは、対照例の条件下に置いた。第２部の精子サンプルは、５分間にわたってアンギオテンシンIIにさらされていた。第３部の精子サンプルは、５分間にわたってアンギオテンシンII（１μｍｏｌｅ／ｌ）にさらされた後、その中にＤｕＰ−７５３（１μｍｏｌｅ／ｌ）を添加した。
その後、実施例１と同じ方法を用いて、運動性精子のパーセンテージを測定した。
図４から判るように、対照例の場合に比較して、大部分の精子サンプルの場合には、５分後に、アンギオテンシンIIによって、運動性をもつ精子のパーセンテージを促進した。なお、このような促進は、ＤｕＰ−７５３を添加したサンプルでは、大いに低減されていた。
【００１０】
実施例５
精子運動性へのアンギオテンシンIIの効果
実施例１と同じ方式で精子サンプルを得た。第１部の精子サンプルは、対照例の条件下に置いた。第２部の精子サンプルには、アンギオテンシンIIアミド（１ｎｍｏｌｅ／ｌ）を添加した。
精子の運動性は、コンピューターシステムにより評価された。該コンピューターにより、精子運動性に関与して異なるデータを測定した。例えば、曲線速度（ＶＣＬ）、横方向の頭部変位（ＡＬＨ）を測定した。
図５（ａ）および５（ｂ）は、二つのサンプルにおける運動性精子のパーセンテージを示しており、共に３０分にわたっているが、図においてハッチングの部分は、アンギオテンシンIIアミド（１ｎｍｏｌｅ／ｌ）の存在時の状態を示しており、空白の部分は、アンギオテンシンIIアミドが存在しないときの状態を示している。
図６（ａ）および図６（ｂ）は、図５と同じサンプルに関して、精子の曲線速度（ＶＣＬ）を示している。
図７（ａ）および図７（ｂ）は、図５と同じサンプルに関して、精子の横方向の頭部変位（ＡＬＨ）を示している。
図８は、対照例の場合の精子サンプル（刺激されていない空白の点）と、アンギオテンシンIIで刺激した場合の精子サンプル（黒の点）との、曲線速度（ＶＣＬ）および横方向の頭部変位（ＡＬＨ）を示している。
図示から明らかなように、アンギオテンシンIIアミドによって、曲線速度（ＶＣＬ）および横方向の頭部変位（ＡＬＨ）が刺激されている。当該２種類のパラメーター（曲線速度および頭部変位）に比例して、受精性が促進されるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】刺激されていない対照群、およびアンギオテンシンＩＩを用いて刺激された群の精子運動率を示す。
【図２】ＤｕＰ−７５３の精子運動率に対する阻害効果を示す。
【図３】モノクローナル抗体の精子運動率および運動速度に対する効果を示す。
【図４】ＤｕＰ−７５３のアンギオテンシンＩＩを添加した精子に対する運動率の阻害効果を示す。
【図５】アンギオテンシンＩＩアミド類の精子運動性に対する効果を示す。
【図６】同一サンプルのＶＣＬのアッセイを示す。
【図７】同一サンプルのＡＬＨのアッセイを示す。
【図８】対照とアンギオテンシンＩＩで刺激した精子サンプルにおけるＶＣＬとＡＬＨとの対比関係を示す。
【図１】
2007091753.tif 000002
【図２】
2007091753.tif 000003
【図３】
2007091753.tif 000004
【図４】
2007091753.tif 000005
【図５】
2007091753.tif 000006
【図６】
2007091753.tif 000007
【図７】
2007091753.tif 000008
【図８】
2007091753.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成19年2月5日(2007.2.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験管内で哺乳動物精子のパーセンテージ表示の運動性を促進する方法であって、
男性のヒトからの低運動性哺乳動物精子をアンギオテンシンＩＩまたはその塩類またはアミド類と接触させることを特徴とする方法。
【請求項２】
試験管内で哺乳動物精子のパーセンテージ表示の運動性を促進する方法であって、
ヒト以外の男性の哺乳動物からの低運動性哺乳動物精子をアンギオテンシンＩＩまたはその塩類またはアミド類と接触させることを特徴とする方法。
【請求項３】
哺乳動物卵子の試験管内での受精方法であって、ヒトの第二次卵母細胞と男性のヒトからの低運動性精子とを含有する孵化媒体に対し、アンギオテンシンＩＩまたはその塩類またはアミド類を添加することによって、精子のパーセンテージ表示の運動性を向上させて該卵母細胞の受精を促進することを特徴とする方法。
【請求項４】
哺乳動物卵子の試験管内での受精方法であって、ヒト以外の哺乳動物の第二次卵母細胞とヒト以外の男性の哺乳動物からの低運動性精子とを含有する孵化媒体に対し、アンギオテンシンＩＩまたはその塩類またはアミド類を添加することによって、精子のパーセンテージ表示の運動性を向上させて該卵母細胞の受精を促進することを特徴とする方法。
【請求項５】
哺乳動物精子のパーセンテージ表示の運動性の促進において用いるための組成物であって、低運動性精子と接触させるためのアンギオテンシンＩＩまたはその塩類またはアミド類と、許容される担体とを含む、組成物。
【請求項６】
哺乳動物卵子の低運動性精子との受精にて用いるための組成物であって、哺乳動物精子のパーセンテージ表示の運動性を促進するためのアンギオテンシンＩＩまたはその塩類またはアミド類と、許容される担体とを含む、組成物。
【請求項７】
パーセンテージ表示の運動性の促進した哺乳動物精子を調製する方法であって、オスの哺乳動物から由来の低運動性哺乳動物精子をアンギオテンシンＩＩまたはその塩類またはアミド類と接触させ、哺乳動物精子のパーセンテージ表示の運動性を向上させることを含む、方法。
【請求項８】
パーセンテージ表示の運動性の促進した哺乳動物精子であって、オスの哺乳動物から由来の低運動性哺乳動物精子をアンギオテンシンＩＩまたはその塩類またはアミド類と接触させ、パーセンテージ表示の運動性を向上させた、哺乳動物精子。