(57)【要約】【課題】耐圧性が高く、膨潤・収縮が少なく、特にイオン交換液体クロマトグラフィーに適した液体クロマトグラフィー用担体及び液体クロマトグラフィー用担体の製造方法を提供する。【解決手段】多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体からなる液体クロマトグラフィー用担体であって、前記多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体は、表面にのみイオン交換基を２０μｅｑ／ｇ以上有し、かつ、１００ｎｍ未満の直径を有する孔Ａと、６００ｎｍ以上の直径を有する孔Ｂとを有し、前記孔Ｂの全容積は、前記多孔性の疎水性ポリマー連続体の全孔容積の１０％以上である液体クロマトグラフィー用担体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体からなる液体クロマトグラフィー用担体であって、
前記多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体は、表面にのみイオン交換基を２０μｅｑ／ｇ以上有し、かつ、１００ｎｍ未満の直径を有する孔Ａと、６００ｎｍ以上の直径を有する孔Ｂとを有し、前記孔Ｂの全容積は、前記多孔性の疎水性ポリマー連続体の全孔容積の１０％以上である
ことを特徴とする液体クロマトグラフィー用担体。
【請求項２】
多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体は、水溶解度が５重量％以下の（メタ）アクリル酸誘導体又はスチレン誘導体からなる架橋性モノマーを含有する疎水性架橋モノマー組成物を重合してなるものであって、前記疎水性架橋モノマー組成物における前記架橋性モノマーの含有量が２５重量％以上であることを特徴とする請求項１記載の液体クロマトグラフィー用担体。
【請求項３】
請求項１記載の液体クロマトグラフィー用担体の製造方法であって、
疎水性架橋モノマー組成物とポロゲンとを体積比で１０：９０〜６０：４０、及び、重合開始剤を前記疎水性架橋モノマー組成物１００重量部に対して０．２〜５重量部含有する混合組成物を重合させて多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体を調製する工程１と、
前記多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体を、洗浄溶媒を用いて洗浄することにより、未反応の前記疎水性架橋モノマー組成物及び前記ポロゲンを除去する工程２と、
前記多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体と、前記多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体の表面に存在する官能基と反応してイオン交換基を生成する物質とを反応させることにより、前記多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体の表面にのみイオン交換基を付与する工程３とからなる
ことを特徴とする液体クロマトグラフィー用担体の製造方法。
【請求項４】
疎水性架橋モノマー組成物は、水溶解度が５重量％以下の（メタ）アクリル酸誘導体又はスチレン誘導体からなる架橋性モノマーを含有することを特徴とする請求項３記載の液体クロマトグラフィー用担体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐圧性が高く、膨潤・収縮が少なく、特にイオン交換液体クロマトグラフィーに適した液体クロマトグラフィー用担体及び液体クロマトグラフィー用担体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
液体クロマトグラフィー法のなかでも特に、イオン交換液体クロマトグラフィー法は、イオン性を有する物質の分離に汎用されており、なかでも、糖化ヘモグロビンをはじめ、各種生体関連物質の分離分析に極めて有効な方法として知られている。
【０００３】
イオン交換液体クロマトグラフィー法では、分析対象物質や混合物の非特異吸着により測定精度が低下することがあるため、この非特異吸着を抑制する必要があり、また、近年この方法が臨床検査等にも用いられているため高い測定精度が求められている。
【０００４】
例えば、特許文献１には、疎水性架橋ポリマーの表面にイオン交換基を有する液体クロマトグラフィー用充填剤が開示されている。この充填剤は、水系媒体中でも膨張したり収縮したりすることがなく、耐圧性に優れるものであるため、高い測定精度が期待できるが、粒子状であるため、カラムを製造する際には、充填剤を詰め込む必要があり、調整が困難であるという問題や、カラム及び流路内にかかる背圧が大きいという問題があった。
【０００５】
このような問題に対し、非特許文献１には、イオン交換基を有する多孔性ポリマー連続体の製造方法が開示されている。この方法により製造される多孔性ポリマー連続体は、粒子間体積が存在していないことから、カラムに用いる管内で製造されることにより密に詰まっており、非常に高い透過率が得られることで、カラム効率が非常に高くなる。また、粒子を詰め込む必要がなく、カラムを製造することができるため調整が容易であり、粒子を詰め込んで得られるカラムよりもカラム内の空隙率が大きくなるため、カラム及び流路内にかかる背圧が小さくなるという利点がある。
しかし、この製造方法で得られる多孔性ポリマー連続体は、イオン交換基がポリマー内部に存在するため、水系媒体中で膨潤・収縮しやすく、耐圧性に劣るという問題や、液体クロマトグラフィーに用いた際に、溶離液の平衡化が遅いため、ピークがブロードになるという問題があった。
【特許文献１】特開平３−７３８４８号公報
【非特許文献１】Ｆｒｅｃｈｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７，ｖｏｌｕｍｅ６９，ｐ．３６４６−３６４９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記現状に鑑み、耐圧性が高く、膨潤・収縮が少なく、特にイオン交換液体クロマトグラフィーに適した液体クロマトグラフィー用担体及び液体クロマトグラフィー用担体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体からなる液体クロマトグラフィー用担体であって、上記多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体は、表面にのみイオン交換基を２０μｅｑ／ｇ以上有し、かつ、１００ｎｍ未満の直径を有する孔Ａと、６００ｎｍ以上の直径を有する孔Ｂとを有し、上記孔Ｂの全容積は、上記多孔性の疎水性ポリマー連続体の全孔容積の１０％以上である液体クロマトグラフィー用担体である。
以下に本発明を詳述する。
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討の結果、一定の範囲の小さい孔と、一定の範囲の大きい孔とを有する多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体の表面のみにイオン交換基を付着させてなる担体は、水系媒体中でも膨潤・収縮することがなく、耐圧性に優れるため、特にイオン交換液体クロマトグラフィーに適した液体クロマトグラフィー用担体となるということを見いだし、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
本発明の液体クロマトグラフィー用担体は、多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体からなり、表面にのみイオン交換基を有する。
これにより、本発明の液体クロマトグラフィー用担体は、水系媒体中でも膨潤・収縮することがなく、耐圧性に優れるものとなる。
【００１０】
上記イオン交換基は、タンパク等の親水性物質の非特異吸着を防ぎつつ分離する役割を有する。
上記イオン交換基としては特に限定されず、たとえば、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ−２−ヒドロキシプロピル基、第４級トリメチルアミノ基、スルホン酸基、カルボキシメチル基等が挙げられる。
【００１１】
上記イオン交換基の量の下限は２０μｅｑ／ｇである。２０μｅｑ／ｇ未満であると、液体クロマトグラフィー用担体として充分な分離能を発揮できない。好ましい下限は３０μｅｑ／ｇ、好ましい上限は２００μｅｑ／ｇである。
【００１２】
上記多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体としては、例えば、水溶解度が５重量％以下の（メタ）アクリル酸誘導体又はスチレン誘導体からなる架橋性モノマーを含有する疎水性架橋モノマー組成物を重合してなるものを用いることができる。
このような疎水性架橋モノマー組成物を重合してなるものを用いることにより、得られる多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体は、その内部にほとんどイオン交換基（親水性基）を有さず、水系媒体中でも膨潤・収縮することがない。
ここで、水溶解度とは、水１００ｍＬに架橋性モノマー２０ｍＬを加え、室温で１０分間×３回攪拌し２０℃の保温器で一晩放置し、その後、水に溶解した架橋性モノマー量を水素炎ガスクロマトグラフィーで二重結合（ＰＳＤＢ）法により測定し、算出した値である。
【００１３】
上記水溶解度が５重量％以下の（メタ）アクリル酸誘導体としては特に限定されず、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，３−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサグリコールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタントリ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジメタクリレート、テトラメチロールメタントリアクリレート、テトラメチロールメタンテトラアクリレート、テトラメチロールプロパントリメタクリレート等の分子内に重合性不飽和結合を２つ以上有するものが挙げられる。
【００１４】
上記水溶解度が５重量％以下のスチレン誘導体としては特に限定されず、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルエチルベンゼン、ジビニルナフタレン等の分子内に重合性不飽和結合を２つ以上有するものが挙げられる。
【００１５】
上記疎水性架橋モノマー組成物は、更に非架橋性モノマーを含有してもよい。上記非架橋性モノマーは、水溶解度が５重量％以下であることが好ましい。５重量％を超えるものを用いると、得られる多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体の内部にイオン交換基（親水性基）が生成し、水系媒体中で膨潤・収縮することがある。
上記非架橋性モノマーとしては、上記架橋性モノマーと共に重合され得る疎水性の重合性モノマーであれば特に限定されず、例えば、塩化ビニル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ステアリン酸ビニル等のビニルエステル類；（メタ）アクリロニトリル等の不飽和ニトリル類；（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エチル（メタ）アクリルアミド等の酸アミド類、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、イソプロピル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、アクリロニトリル、グリシジルメタクリレート等の（メタ）アクリル酸エステル誘導体；スチレン、α−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、クロロメチルスチレン等のスチレン誘導体等の分子内に重合性不飽和結合を１つ有するものが挙げられる。
【００１６】
上記疎水性架橋モノマー組成物においては、上記架橋性モノマーの含有量の好ましい下限は２５重量％である。２５重量％未満であると、得られる液体クロマトグラフィー用担体が水系媒体中で膨潤・収縮することがある。より好ましい下限は５０重量％である。
【００１７】
本発明の液体クロマトグラフィー用担体を構成する多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体は、１００ｎｍ未満の直径を有する孔Ａと、６００ｎｍ以上の直径を有する孔Ｂとを有する。
【００１８】
上記孔Ａは、本発明の液体クロマトグラフィー用担体の表面積を充分に大きくして、液体クロマトグラフィー用担体として充分な分離能を発揮させる役割を果たすものである。１００ｎｍを超えると、実質的な表面積が小さくなり、充分な分解能が得られない。また、イオン交換に寄与しないことから、下限は０．１ｎｍである。直径の好ましい範囲は０．８〜５０ｎｍであり、より好ましい範囲は１〜２５ｎｍである。
なお、上記孔Ａの直径は、自動比表面積測定装置等を用いて測定することができる。
【００１９】
上記孔Ｂは、液体クロマトグラフィー用担体として用いたときに、試料や溶離液を比較的低い背圧で透過させる役割を果たすものである。６００ｎｍ未満であると、流路にかかる背圧が高くなりすぎる。また、分離能が低下することから上限は１００００ｎｍである。直径の好ましい範囲は８００〜４０００ｎｍであり、より好ましい範囲は１０００〜４０００ｎｍである。
なお、上記孔Ｂの直径は、水銀ポロシメーター等を用いて測定することができる。
【００２０】
上記孔Ｂの全容積は、上記多孔性の疎水性ポリマー連続体の全孔容積に対して下限が１０％である。１０％未満であると、本発明の液体クロマトグラフィー用担体を用いてカラムを製造した際に、カラム及び流路内にかかる背圧が高くなりすぎる。好ましい下限は２０％、好ましい上限は９０％、より好ましい下限は５０％、より好ましい上限は９９％である。
【００２１】
本発明の液体クロマトグラフィー用担体の製造方法としては特に限定されず、例えば、疎水性架橋モノマー組成物とポロゲンとを体積比で１０：９０〜６０：４０、及び、重合開始剤を上記疎水性架橋モノマー組成物１００重量部に対して０．２〜５重量部含有する混合組成物を重合させて多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体を調製する工程１と、上記多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体を、洗浄溶媒を用いて洗浄することにより、未反応の上記疎水性架橋モノマー組成物及び上記ポロゲンを除去する工程２と、上記多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体と、上記多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体の表面に存在する官能基と反応してイオン交換基を生成する物質とを反応させることにより、上記多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体の表面にのみイオン交換基を付与する工程３とからなる方法が挙げられる。
このような液体クロマトグラフィー用担体の製造方法もまた、本発明の１つである。
以下、この液体クロマトグラフィー用担体の製造方法について詳述する。
【００２２】
本発明の液体クロマトグラフィー用担体の製造方法は、疎水性架橋モノマー組成物とポロゲンとを体積比で１０：９０〜６０：４０、及び、重合開始剤を上記疎水性架橋モノマー組成物１００重量部に対して０．２〜５重量部含有する混合組成物を重合させて多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体を調製する工程１を有する。
【００２３】
上記疎水性架橋モノマー組成物としては特に限定されず、上述したように、水溶解度が５重量％以下の（メタ）アクリル酸誘導体又はスチレン誘導体からなる架橋性モノマーを含有することが好ましい。
【００２４】
上記ポロゲンは、上記混合組成物の共重合体に孔を発生させる目的で用いられる。
上記ポロゲンとしては特に限定されず、例えば、水、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、エステル類、アルコール類、ケトン類、エーテル類、可溶ポリマー類の溶液、及び、これらの混合物等が挙げられる。
【００２５】
上記混合組成物中においては、上記疎水性架橋モノマー組成物とポロゲンとが体積比で１０：９０〜６０：４０であることが好ましい。上記疎水性架橋モノマー組成物が体積比で１０未満であると、孔の数が多すぎて充分な強度が得られないことがあり、上記疎水性架橋モノマー組成物が体積比で６０を超えると、充分な数の孔が得られないことがある。より好ましくは、上記疎水性架橋モノマー組成物とポロゲンとが体積比で２０：８０〜５０：５０である。
【００２６】
上記重合開始剤としては特に限定されず、例えば、過硫酸ナトリウム、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム等の過硫酸塩、ｏ−ベンゾイルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド、オクタノイルパーオキサイド、ｏ−クロロベンゾイルパーオキサイド、アセチルパーオキサイド、ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシアセテート、ｔ−ブチルパーオキシイソブチレート、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイド等の有機過酸化物；２，２−アゾビスイソブチロニトリル、２，２−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、４，４−アゾビス（４−シアノペンタン酸）、２，２−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）、２，２−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル等のアゾ化合物等のフリーラジカルを発生するものが挙げられる。
【００２７】
上記混合組成物中における上記重合開始剤の含有量としては特に限定されないが、疎水性架橋モノマー組成物１００重量部に対して好ましい下限は０．２重量部、好ましい上限は５重量部である。０．２重量部未満であると、重合が起こりにくくなり、５重量部を超えてもそれ以上の効果が得られない。
【００２８】
上記混合組成物は、上記混合組成物中に窒素、アルゴン等の不活性ガスをバブリングする方法等により脱気されて重合されることが好ましい。
【００２９】
上記重合の方法としては特に限定されず、反応容器内に上記混合組成物を加えた後、窒素、アルゴン等の不活性雰囲気内で、用いる開始剤やモノマーの種類に合わせて適宜２〜２４時間程度、５０〜９０℃の湯浴、オイルバス等で加熱すればよい。なお、上記混合組成物は、反応容器内に一度に加えてもよいし、分割して加えてもよく、後者の場合には、各添加後から次の添加を行うまで重合すればよい。
【００３０】
上記反応容器の材質としては、混合組成物を重合させている間に容積が変化しないものであれば特に限定されず、例えば、金属、ガラス、硬質ポリマー等が挙げられる。
【００３１】
なお、上記反応容器として管を用いると、液体クロマトグラフィー用担体を生成した後にカラムに詰め込む作業を省くことができ、この管をそのままカラムに用いることができることから好適である。この場合には、管の各末端を液体クロマトグラフィーに連結させるのに適した継ぎ手で閉じればよい。
またこの場合には、上記混合組成物が重合してなる多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体は、上記管の内部断面領域を完全に横切って伸びた状態となり、長さは５〜２００ｍｍ程度となる。
なお、上記多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体の長さを伸ばしたい場合には、数種類の多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体を同一管内で製造してもよい。
【００３２】
本発明の液体クロマトグラフィー用担体の製造方法は、上記多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体を、洗浄溶媒を用いて洗浄することにより、未反応の上記疎水性架橋モノマー組成物及び上記ポロゲンを除去する工程２を有する。
【００３３】
上記洗浄溶媒としては特に限定されず、例えば、メタノール、エタノール、ベンゼン、トルエン、アセトン、テトラヒドロフラン、ジオキサン等が挙げられる。
上記洗浄溶媒を用いて洗浄する際には、洗浄溶媒で洗浄した後、水で洗浄し、更に洗浄溶媒で洗浄してもよいし、洗浄溶媒を用いて連続して洗浄してもよい。
特に、上記反応容器として管を用いている場合には、洗浄の際には、重合して得られた多孔性の疎水性架橋ポリマーが詰まっている上記管を通して、上記洗浄溶媒をポンプ輸送すればよい。
【００３４】
本発明の液体クロマトグラフィー用担体の製造方法は、上記多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体と、上記多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体の表面に存在する官能基と反応してイオン交換基を生成する物質とを反応させることにより、上記多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体の表面にのみイオン交換基を付与する工程３を有する。
本発明の液体クロマトグラフィー用担体の製造方法においては、工程１及び工程２により疎水性の架橋ポリマー連続体を作製し、更に、工程３を行うことにより、疎水性の架橋ポリマー連続体の表面にのみイオン交換基を付与することができることから、得られる液体クロマトグラフィー用担体は、水系媒体中でも膨潤・収縮することがなく、耐圧性に優れたものとなる。
【００３５】
上記多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体の表面に存在する官能基と反応してイオン交換基を生成する物質としては特に限定されず、例えば、ジエチルアミン、塩酸トリエチルアミン、亜硫酸ナトリウム、クロロ酢酸、発煙硫酸−１，４−ジオキサン複合体等が挙げられる。
例えば、上記多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体が、エポキシ基を有するポリマーを含有する場合には、ジエチルアミンとの反応によりＮ，Ｎ−ジエチルアミノ−２−ヒドロキシプロピル基が付与され、塩酸トリエチルアミンとの反応により第４級トリメチルアミノ基が付与され、亜硫酸ナトリウムとの反応によりスルホン酸基が付与され、また、該エポキシ基が加水分解された後、クロロ酢酸との反応によりカルボキシメチル基が付与され、発煙硫酸−１，４−ジオキサン複合体との反応によりスルホン酸基が付与される。
【００３６】
本発明の液体クロマトグラフィー用担体は、疎水性架橋ポリマー連続体として架橋度の高いポリマーを用いているため、機械的強度が極めて大きく、耐圧性に優れたものとなる。
更に、上記疎水性架橋ポリマー連続体の内部にはイオン交換基が存在していないため、膨潤及び収縮の度合いが極めて低い。
多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体の表面は、イオン交換基で覆われているため、タンパク等の非特異吸着がない。また、多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体の表面にイオン交換基を付与する際、表面に存在する官能基と反応する物質の量・濃度や反応時間、反応温度、反応ｐＨを変えることにより、多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体の表面に付与するイオン交換基量を調節できるので、分析又は分離を目的とする親水性物質の種類に応じた所望のイオン交換クロマトグラフィー用担体となり、また、広いｐＨ範囲で使用することが可能である。
本発明の液体クロマトグラフィー用担体は、多孔性のポリマー連続体であるため、粒子間体積が存在していないことからカラムに密に詰めることができ、非常に高い透過率が得られることで、カラム効率が非常に高くなる。また、カラムおよび流路内にかかる背圧が小さいので、迅速分析・分離が可能となり、背圧が高いために起こる配管からの液漏れも起こりにくい。
【発明の効果】
【００３７】
本発明によれば、耐圧性が高く、膨潤・収縮が少なく、特にイオン交換液体クロマトグラフィーに適した液体クロマトグラフィー用担体及び液体クロマトグラフィー用担体の製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００３９】
（実施例１）
（１）カラムの作製
液体クロマトグラフィーに取り付けるに適した継ぎ手が両末端に備わっているステンレス鋼製管（内部直径４．６ｍｍ、長さ３５ｍｍ）の１つの末端を、鋼製ナットストッパーで閉じ、この管を窒素パージした後、そのもう一つの末端をシリコンゴム隔壁で閉じた。
非架橋性モノマーとして２．０ｇのグリシジルメタクリレート、架橋性モノマーとして１．３ｇのトリメチレングリコールジメタクリレート、０．５ｇの２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプロパン、０．１５ｇのテトラメチロールメタントリアクリレート、０．０５ｇのテトラメチロールメタンテトラアクリレート、ポロゲンとして０．６ｇの水、２．４ｇのメタノール、３．０ｇのエチレングリコール、及び、重合開始剤として０．０４ｇのアゾビスイソブチロニトリルを混合することによって、混合組成物を調製した。この混合組成物に窒素を１０分間バブリングすることによって、存在している酸素を除去した。この混合組成物０．７ｍＬを、その隔壁を通してその管の中に注入した後、熱電対で６０℃にしたオイルバスの中で加熱することにより重合を開始させた。５時間後、管をオイルバスから取り出し、放置して室温まで冷却した後、この管の両末端にあるストッパーを取り外して、標準的なクロマトグラフィーカラム継ぎ手に取り替えた。この時点で、このカラムは、長さが３５ｍｍの多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体を含んでいた。このカラムにメタノールを送液し洗浄することで、未反応モノマーやポロゲンを除去した。
このカラムに、７５℃条件下で、１Ｍの亜硫酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．０）２０ｍＬを１５時間かけて送液した。重合させたグリシジルメタクリレート単位のエポキシ基が亜硫酸イオンと反応することで、スルホン酸基が生じた。この反応が終了した後、このカラムを水で洗浄することにより、多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体が形成されたカラムを得た。
【００４０】
（２）カラムを用いた分析
陽イオン交換カラムとしてのタンパク分離能を評価するため、数種のタンパクの混合物の分析を行った。溶離は、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、以下Ａ液と表す）；及びＡ液と５００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）との等量混合物（以下Ｂ液と表す）を用い、Ａ液１００％からＢ液１００％へのリニアグラジエント法により行った。得られたクロマトグラムを図１に示した。
さらにアークレイ社製Ｈｉ−ＡＵＴＯ  Ａ１ｃ（以下、本装置ともいう）でヒト血液の分析を行い、分離能等を比較した。測定方法は次の通りである。
ヒト血液検体として、同一人（健常人）の血液を採取後直ちにヘパリンを添加したものを用いた。血液検体は、本装置付属の専用溶血液２１Ｌ（ノニオン系界面活性剤を含むリン酸緩衝液）によって、自動的に２９０倍に希釈・溶血される。溶離液は本装置付属の専用試薬であるＣ液（ｐＨ５．４のリン酸緩衝液）、Ｄ液（ｐＨ８．１のリン酸緩衝液）及びＥ液（ｐＨ５．４のリン酸緩衝液）を使用した。得られたクロマトグラムを図２に示した。
【００４１】
（実施例２）
非架橋性モノマーとして１．４ｇのグリシジルメタクリレート、架橋性モノマーとして１．７ｇのトリメチレングリコールジメタクリレート、０．７ｇの２−ヒドロキシ１，３−ジメタクリロキシプロパン、０．２ｇのテトラメチロールメタントリアクリレート、０．０７ｇのテトラメチロールメタンテトラアクリレートを用いたこと以外は、実施例１と同様にして、多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体が形成されたカラムを得た。
陽イオン交換カラムとしてのタンパク分離能を評価するため、実施例１と同様にしてヒト血液の分析を行った。得られたクロマトグラムを図３に示した。
【００４２】
（実施例３）
非架橋性モノマーとして３．６ｇのグリシジルメタクリレート、架橋性モノマーとして０．３ｇのトリメチレングリコールジメタクリレート、０．１ｇの２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプロパン、０．０３ｇのテトラメチロールメタントリアクリレート、０．０１ｇのテトラメチロールメタンテトラアクリレートを用いたこと以外は、実施例１と同様にして、多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体が形成されたカラムを得た。
陽イオン交換カラムとしてのタンパク分離能を評価するため、実施例１と同様にしてヒト血液の分析を行った。得られたクロマトグラムを図４に示した。
【００４３】
（実施例４）
実施例１と同様にして、未反応モノマーやポロゲンを除去した多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体が形成されたカラムを得た。このカラムに、５６℃条件下で、ジエチルアミン２０ｍＬを１５時間かけて送液した。重合させたグリシジルメタクリレート単位のエポキシ基がジエチルアミンと反応することで、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ−２−ヒドロキシプロビル基が生じた。この反応が終了した後、カラムをメタノール、水で洗浄することにより、多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体が形成されたカラムを得た。
陰イオン交換カラムとしてのタンパク分離能を評価するため、数種のタンパクの混合物の分析を行った。溶離は、２０ｍＭピペラジン−塩酸緩衝液（ｐＨ６．０、以下Ｆ液と表す）；及びＦ液と５００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）との等量混合物（以下Ｇ液と表す）を用い、Ｆ液１００％からＧ液１００％へのリニアグラジエント法により行った。得られたクロマトグラムを図５に示した。
【００４４】
（比較例１）
ポロゲンとして０．６ｇの水、５．４ｇのメタノールを用いたこと以外は実施例１と同様にして、多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体が形成されたカラムを得た。カラムをポンプに繋ぎ、水を６０ＭＰａで定圧送液したが、カラムを通る水の流れは全く観察されなかった。
【００４５】
（比較例２）
実施例１と同様にして、未反応モノマーやポロゲンを除去した多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体を得た。このカラムに、７５℃条件下で、１Ｍの亜硫酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．０）２．７ｍＬを２時間かけて送液した。この反応が終了した後、このカラムを水で洗浄することにより、多孔性の疎水性架橋ポリマー連続体が形成されたカラムを得た。
陽イオン交換カラムとしてのタンパク分離能を評価するため、実施例１と同様にして、ヒト血液の分析を行った。得られたクロマトグラムを図６に示した。図６の結果を、図２と比較すると、明らかにピークがブロードになり、分離能が劣っていることがわかった。
【００４６】
＜評価＞
実施例１〜４及び比較例１〜２で得られた液体クロマトグラフィー用担体及びカラムについて以下の評価を行った。結果を表１に示した。
【００４７】
（１）担体のイオン交換基量の測定
陽イオン交換基を有するものでは、１ｍＭ硫酸銅水溶液を送液し、イオン交換基に吸着した銅イオン量を測定することで、イオン交換基量を求めた。
陰イオン交換基を有するものでは、まず、カラムに５００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．１）を送液しておき、それを２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．１）にかえて送液し、その時の溶出液のｐＨ変位を測定することで、イオン交換基量を求めた。
【００４８】
（２）担体の孔径、細孔容積測定
カラムから重合した担体を取り出し、真空乾燥機で乾燥し、粉砕して小さな片にした。
１００ｎｍ以下の孔の孔径、細孔容積は、約１ｃｍ角の乾燥片を用い、水銀ポロシメーターを用いて測定した。
また、６００ｎｍ以上の孔の孔径、細孔容積は、約０．５ｃｍ角の乾燥片を用い、自動比表面積測定装置を用いて測定した。
【００４９】
（３）担体の耐圧性評価
カラムをポンプに繋ぎ、水を６０ＭＰａで定圧送液した。その後、カラムを開け、担体を取り出し、光学顕微鏡で観察し状態を確認し、以下の基準により評価した。
○：定圧送液前と同様の形状を維持していた。
△：担体の一部が破損していた。
×：担体がほとんど破損していた。
【００５０】
（４）背圧測定
液体クロマトグラフィー用送液ポンプの圧力計を用いて背圧を測定した。
【００５１】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明によれば、耐圧性が高く、膨潤・収縮が少なく、特にイオン交換液体クロマトグラフィーに適した液体クロマトグラフィー用担体及び液体クロマトグラフィー用担体の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】実施例１で得られたカラムを用いて、タンパクの混合物の分析を行った結果得られたクロマトグラムである。
【図２】実施例１で得られたカラムを用いて、ヒト血液の混合物の分析を行った結果得られたクロマトグラムである。
【図３】実施例２で得られたカラムを用いて、ヒト血液の混合物の分析を行った結果得られたクロマトグラムである。
【図４】実施例３で得られたカラムを用いて、ヒト血液の混合物の分析を行った結果得られたクロマトグラムである。
【図５】実施例４で得られたカラムを用いて、タンパクの混合物の分析を行った結果得られたクロマトグラムである。
【図６】比較例２で得られたカラムを用いて、ヒト血液の混合物の分析を行った結果得られたクロマトグラムである。
【符号の説明】
【００５４】
１  ミオグロビン（ウマ骨格由来）に起因するピーク
２  α−キモトリプシノーゲン（ウシ膵臓由来）に起因するピーク
３  リボヌクレアーゼＡ（ウシ膵臓由来）に起因するピーク
４  リゾチーム（ニワトリ卵白由来）に起因するピーク
５  ＨｂＡ１ａ及びＡ１ｂに起因するピーク
６  胎児性Ｈｂ（Ｆ）に起因するピーク
７  不安定型ＨｂＡ１ｃに起因するピーク
８  安定型ＨｂＡ１ｃに起因するピーク
９  ＨｂＡ０に起因するピーク
１０  コナルブミンに起因するピーク
１１  トランスフェリンに起因するピーク
１２  オブアルブミンに起因するピーク
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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