(57)【要約】【課題】クルクミンをはじめとするフェノール性化合物の経済的かつ効率的な配糖化方法を提供する。【解決手段】下記（１）および（２）の反応を、スクロース合成酵素およびグルコース転移酵素を含有した一容器内で行なうことを特徴とする、フェノール性化合物のグルコース配糖体の製造方法：（１）スクロース合成酵素の存在下、ヌクレオシド２リン酸とスクロースとを反応させてヌクレオシド２リン酸−グルコースを生成する工程、および（２）糖転移酵素の存在下、ヌクレオシド２リン酸−グルコースとフェノール性化合物とを反応させて、ヌクレオシド２リン酸とフェノール性化合物のグルコース配糖体を生成する工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）および（２）の反応を、スクロース合成酵素およびグルコース転移酵素を含有した一容器内で行なうことを特徴とする、フェノール性化合物のグルコース配糖体の製造方法：
（１）スクロース合成酵素の存在下、ヌクレオシド２リン酸とスクロースとを反応させてヌクレオシド２リン酸−グルコースを生成する工程、および
（２）グルコース転移酵素の存在下、ヌクレオシド２リン酸−グルコースとフェノール性化合物とを反応させて、ヌクレオシド２リン酸とフェノール性化合物のグルコース配糖体を生成する工程。
【請求項２】
上記反応（２）で使用するヌクレオシド２リン酸−グルコースが反応（１）で生成したものであり、また上記反応（１）で使用するヌクレオシド２リン酸が反応（２）で生成したものである、請求項１に記載するのフェノール性化合物のグルコース配糖体の製造方法。
【請求項３】
ヌクレオシド２リン酸がウリジン２リン酸（ＵＤＰ）、ヌクレオシド２リン酸−グルコースがウリジンジホスホグルコース（ＵＤＰ-グルコース）、グルコース転移酵素がＵＤＰ-グルコシルトランスフェラーゼ、およびスクロース合成酵素がＵＤＰ-グルコース：Ｄ−フルクトース２グルコシルトランスフェラーゼである請求項１または２に記載するフェノール性化合物のグルコース配糖体の製造方法。
【請求項４】
スクロース合成酵素が下記（ア）または（イ）に記載するタンパク質からなる酵素である、請求項１乃至３のいずれかに記載の製造方法：
（ア）配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（イ）配列番号１に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加してなるアミノ酸配列を有し、スクロースの合成反応およびその逆反応を触媒する活性を有するタンパク質。
【請求項５】
スクロース合成酵素が下記（ウ）または（エ）に記載するＤＮＡによってコードされるタンパク質からなる酵素である、請求項１乃至３のいずれかに記載の製造方法：
（ウ）配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
（エ）配列番号２に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、スクロースの合成反応およびその逆反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
グルコース転移酵素が下記（ａ）または（ｂ）に記載するタンパク質からなる酵素である、請求項１乃至５のいずれかに記載の製造方法：
（ａ）配列番号３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号３に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加してなるアミノ酸配列を有し、グルコース転移活性を有するタンパク質。
【請求項７】
グルコース転移酵素が下記（ｃ）または（ｄ）に記載するＤＮＡによってコードされるタンパク質からなる酵素である、請求項１乃至５のいずれかに記載の製造方法：
（ｃ）配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、グルコース転移活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
フェノール性化合物がクルクミンであって、フェノール性化合物のグルコース配糖体がクルクミンのグルコース配糖体である請求項１乃至７のいずれかに記載する製造方法。
【請求項９】
フェノール性化合物のグルコース配糖体がクルクミンモノグルコサイドまたはクルクミンジグルコサイドである請求項８に記載する製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、one-pot multi-enzyme systemによるフェノール性化合物のグルコース配糖体の製造方法に関する。より詳細には、本発明は一つの容器内で2つの酵素反応を同時に行い、一方の酵素反応によって生じる生成物を他方の酵素反応の基質としてリサイクル使用することによって、経済的かつ効率的に所望のフェノール性化合物のグルコース配糖体を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
昨今の健康食品ブーム、サプリメントブームとともに広く世の中に認知され浸透した化合物の一つにクルクミン（curcumin）がある。クルクミンはショウガ科ウコン（Curcuma longa）の根茎に含まれるジアリルヘプタノイド構造を有する化合物であり、民間薬としてはアルコール性肝障害に用いられており(非特許文献１)、食品分野では黄色色素として利用されている。また、最近では、抗酸化活性(非特許文献２)、抗炎症活性(非特許文献３)、抗腫瘍活性(非特許文献４)、抗アルツハイマー病作用(非特許文献５及び６)など様々な生理活性が報告されており、さらに、これらの活性が生理的に重要な分子であるNF-κB, PPAR-γなどの転写因子、COX2やiNOSなどの酵素、TNF, IL-1および IL-6などのサイトカインをターゲットとしたものであることがわかってきた(非特許文献７)。しかしながら、クルクミンは水に対して難溶性であり、アルカリ条件下で不安定であるなど、取り扱いが困難な面も同時に存在するため、その有効性を広く発揮し、活用するには多くの検討が必要である。
【０００３】
クルクミンのように、有用性が認められながらも毒性や、難水溶性や不安定性のためにその利用が制限されている有機化合物は少なくない。有機化合物の水溶性や安定性を増加させるための有効な手段の一つは糖を抱合して配糖体とすることである。化学合成による配糖化には、反応基質の保護と反応産物の脱保護に加えて、使用した有機(金属)触媒や反応副産物を除去するステップが必要であり、必ずしも効率的ではない(非特許文献８および９)。このため、有機化合物の配糖化には、一般的に配糖化酵素が利用されている。
【０００４】
本発明者らは、すでに、ニチニチソウに由来する糖転移酵素CaUGT2を用いてクルクミン等のフェノール性化合物を配糖化する方法を提案している（特許文献１）。当該反応によると、図１に示すように、クルクミンなどのフェノール性化合物は、糖転移酵素CaUGT2の存在下で、糖供与体：uridine-5’diphosphoglucose（以下、「ウリジン２リン酸−グルコース」または「UDPG」という）と反応して配糖化され、クルクミンのグルコース配糖体が生成する。なお、当該クルクミン配糖体には、クルクミンの2つのフェノール性水酸基の１または両方にグルコースが抱合したクルクミンモノグルコシド（curcumin 4’-O-β-D-glucoside）およびクルクミンジグルコシド（curcumin 4’,4”-O-β-D-diglucoside）が含まれる（図２）。
【０００５】
これらのクルクミン配糖体は、クルクミンに比して水溶性が著しく高いこと、具体的には、クルクミンモノグルコシドおよびクルクミンジグルコシドの水溶性は、それぞれクルクミンの230倍および約1,200万であること、またクルクミンを配糖化することによってアルカリに対する安定性が顕著に高まることを知られている（特許文献１、10）。
【非特許文献１】Nanji AA., (2003), Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284, G321-327
【非特許文献２】Das KC and Das CK (2002) Curcumin (diferuloylmethane), a singlet oxygen (1O2) quencher. Biochem Bilphys Res Commun,295,62-6.
【非特許文献３】Bharti AC, Donanto N, Singh S and Aggarwal BB (2003) Curcumin (diferuloylmethane) down-regulates the constitutive activation of nuclear factor-κB and IκBα kinase in fuman multiple myeloma cells, leading to suppression of proliferation and induction of apotosis. Blood,101, 1053-1062.
【非特許文献４】Kawamori T, Lubet R, Steele VE, Kelloff GI, Kaskey RB, Ral CV and Raddy BS (1999) Chemopreventive effect of curcumin, a naturally occurring anti-inflammatory agent, during the promotion/progression stages of colon cancer. Cancer Res, 99,597-601.
【非特許文献５】Frautschy SA, Hu W, Kim P, Miller SA, Chu T, Harris-White ME and Cole GM (2001) Neurobiol Aging,22,993-1005.
【非特許文献６】Yang F, Lim GP, Begum AN, Ubeda OJ, Simmons MR, Ambegaokar SS, Chen PP, Kayed R, Glabe CG, Frautschy SA, Cole GM (2005) Curcumin inhibits formation of amyloid β oligomers and fibrils, binds plaques, and reduces amyloid in Vivo. J Biol Chem, 280(7),5892-901.
【非特許文献７】Shishodia S, Sethi G, Aggarwal BB (2005) Curcumin:getting back to the roots. Ann N Y Acad Sci,1056,206-17.
【非特許文献８】Bouktaib M, Atmani A, Rolando C (2002) Regio- and stereoselective synthesis of the major metabolite of quercetin, quercetin-3-O-β-D-glucoside. Tetrahedron Lett, 43,35,6263-6266.
【非特許文献９】Li M, Han X, Yu B (2002) Synthesis of quercetin 3-O-(2´´-galloyl)-α-L-arabinopyranoside.Tetrahedron  Lett, 43, 51, 9467-9470.
【非特許文献１０】Kaminaga Y, Nagatsu A, Akiyama T, Sugimoto N, Yamazaki T, Maitani T, Mizukami H (2003) Production of unnatural glucosides of curcumin with drastically enhanced water solubility by cell suspension cultures of Catharanthus roseus. FEBS Lett.555(2),311-6.
【特許文献１】特開2005−312325号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、クルクミン等のフェノール性化合物の効率的な配糖化方法を検討していたところ、上記配糖化反応（図１）の産物であるＵＤＰ（uridine-5’diphosphoric acid）が、その反応系に存在することによって、当該配糖化反応が阻害されることがわかった（実施例３）。これはＵＤＰとＵＤＰＧとの間で競合阻害が生じていることが原因であると考えられる。
【０００７】
このことから、糖転移酵素CaUGT2を用いたフェノール性化合物の配糖化には、反応産物であるＵＤＰが反応系に存在することによる配糖化効率の低下という問題がある。また、糖供与体として使用するＵＤＰＧが高価であるという問題もある。従って、かかる配糖化酵素CaUGT2を用いた配糖体製造を実用化するためには、これらの問題を解決することが必要である。
【０００８】
本発明の目的は、糖転移酵素を用いたクルクミンなどのフェノール性化合物の配糖化においてかかる問題を解消することである。具体的には、本発明は配糖化酵素を用いたフェノール性化合物配糖体の経済的かつ効率的な製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
最近、基質の供給が困難な化合物を生合成する方法として、one-pot multi-enzyme systemが注目を集めている。このシステムは一つの反応系中で、複数の酵素を用いて複数の反応を同時に行うもので、この方法によれば多段階の反応を効率よく一つの容器内で進行させることができる。具体的には、当該方法によれば、安価かつ単純構造の原料を利用して複雑な構造を持つ目的化合物を取得できることが期待できる。また、反応産物が反応を阻害する場合に、その反応産物をその反応に影響しない他の化合物に変換したり、他の酵素反応に利用できる反応基質に変換してリサイクル使用することも可能である。
【００１０】
そこで、本発明者らは、上記問題を解消するためにone-pot multi-enzyme systemの構築を検討していたところ、図１に示す酵素反応（グルコシル化反応）に加えて、ＵＤＰとスクロースを基質とするスクロース合成酵素反応を用いることによって、これが可能であることを見出した。具体的には、当該systemは、図３に示すように、グルコシル化反応（２）で生成するＵＤＰが、スクロース合成酵素反応（１）の基質としてリサイクル使用でき、かつスクロース合成酵素反応（１）による生成産物であるＵＤＰＧが、さらにグルコシル化反応(２)の基質として利用できる方法である。すなわち、当該方法によれば、グルコシル化反応（２）から生成される反応産物ＵＤＰは、直ちにスクロース合成酵素反応（１）でリサイクル使用されて反応系から排除されるため、グルコシル化反応（２）に悪影響を与えず、しかも、グルコシル化反応（２）に必要な高価な基質ＵＤＰＧは、安価な原料を基質とする上記スクロース合成酵素反応（１）から供給されるため、効率的かつ経済的に、所望のフェノール性化合物のグルコース配糖体を製造することができる。
【００１１】
本発明は、かかる知見に基づいて完成したものである。
【００１２】
すなわち、本発明は、下記に掲げるものである：
項１．下記（１）および（２）の反応を、スクロース合成酵素およびグルコース転移酵素を含有した一容器内で行なうことを特徴とする、フェノール性化合物のグルコース配糖体の製造方法：
（１）スクロース合成酵素の存在下、ヌクレオシド２リン酸とスクロースとを反応させてヌクレオシド２リン酸−グルコースを生成する工程、および
（２）グルコース転移酵素の存在下、ヌクレオシド２リン酸−グルコースとフェノール性化合物とを反応させて、ヌクレオシド２リン酸とフェノール性化合物のグルコース配糖体を生成する工程。
【００１３】
項２．上記反応（２）で使用するヌクレオシド２リン酸−グルコースが反応（１）で生成したものであり、また上記反応（１）で使用するヌクレオシド２リン酸が反応（２）で生成したものである、項１に記載するのフェノール性化合物のグルコース配糖体の製造方法。
【００１４】
項３．ヌクレオシド２リン酸がウリジン２リン酸（ＵＤＰ）、ヌクレオシド２リン酸−グルコースがウリジンジホスホグルコース（ＵＤＰ-グルコース）、グルコース転移酵素がＵＤＰ-グルコシルトランスフェラーゼ、およびスクロース合成酵素がＵＤＰ-グルコース：Ｄ−フルクトース２グルコシルトランスフェラーゼである項１または２に記載するフェノール性化合物のグルコース配糖体の製造方法。
【００１５】
項４．スクロース合成酵素が下記（ア）または（イ）に記載するタンパク質からなる酵素である、項１乃至３のいずれかに記載の製造方法：
（ア）配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（イ）配列番号１に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加してなるアミノ酸配列を有し、スクロースの合成反応およびその逆反応を触媒する活性を有するタンパク質。
【００１６】
項５．スクロース合成酵素が下記（ウ）または（エ）に記載するＤＮＡによってコードされるタンパク質からなる酵素である、項１乃至３のいずれかに記載の製造方法：
（ウ）配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
（エ）配列番号２に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、スクロースの合成反応およびその逆反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１７】
項６．グルコース転移酵素が下記（ａ）または（ｂ）に記載するタンパク質からなる酵素である、項１乃至５のいずれかに記載の製造方法：
（ａ）配列番号３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号３に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加してなるアミノ酸配列を有し、グルコース転移活性を有するタンパク質。
【００１８】
項７．グルコース転移酵素が下記（ｃ）または（ｄ）に記載するＤＮＡによってコードされるタンパク質からなる酵素である、項１乃至５のいずれかに記載の製造方法：
（ｃ）配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、グルコース転移活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１９】
項８．フェノール性化合物がクルクミンであって、フェノール性化合物のグルコース配糖体がクルクミンのグルコース配糖体である項１乃至７のいずれかに記載する製造方法。
【００２０】
項９．フェノール性化合物のグルコース配糖体がクルクミンモノグルコサイドまたはクルクミンジグルコサイドである項８に記載する製造方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の製造方法は、フェノール性化合物、特にウコンの色素成分（クルクミン）の配糖化に好適に利用することができる。特に本発明の製造方法は、フェノール性化合物、特に食品や医薬分野において有用でありながらも、難溶性ゆえに用途が限られていたクルクミンを経済的かつ効率的に配糖化（グルコシル化）することができる方法であり、それによってクルクミンの水溶性を増大させることができる。ゆえに、本発明は、クルクミン配糖体の経済的かつ効率のよい製造方法、言い換えれば水性クルクミンの経済的かつ効率的な製造方法を提供するものである。
【００２２】
かかる方法で調製されるクルクミンの配糖体（curcumin 4’-O-β-D-glucoside(CG5)及びcurcumin 4’,4”-O-β-D-diglucoside（CG3））は、水または水溶液に高い溶解度をもって可溶性である。さらに、クルクミンはアルカリ性の条件下で、本来の黄色の色調が赤く変化するという性質を有するものであるが、その配糖体であるcurcumin 4’,4”-O-β-D-diglucoside（CG3）は、ｐＨに関わらず、安定した色調（黄色）を維持することができる。
【００２３】
かかるクルクミン配糖体を用いることによって、水溶性で、高い色価を有するウコン色素製剤を提供することができる。このため、当該ウコン色素製剤によれば優れた着色力（発色性）を発揮することができる。かかる水性ウコン色素製剤は、例えば水を原料の１つとして用いて調製される飲食物、化粧品、医薬品、医薬部外品及び飼料などといった水性製品の着色料として有効に使用することができる。さらに当該水性ウコン色素製剤は、酸性条件下でも不溶物（濁りや析出物）を生じることなく安定した溶解性を有し、また中でも色素成分としてcurcumin 4’,4”-O-β-D-diglucoside（CG3）を用いる場合は、液性によって色調が変わらず、安定した色調（黄色）を有するため、従来のクルクミンを色素成分とするウコン色素では安定性や色調の点から使用が困難であった酸性やアルカリ性の飲食物、例えば乳酸菌飲料、炭酸飲料、果実飲料、酸性清涼飲料または漬け物などの酸性飲食物の着色にも有効に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明のフェノール性化合物のグルコース配糖体の製造方法は、下記（１）および（２）の反応を、スクロース合成酵素およびグルコース転移酵素を含有した一容器内で同時に行なうことを特徴とする：
（１）スクロース合成酵素の存在下、ヌクレオシド２リン酸とスクロースとを反応させてヌクレオシド２リン酸−グルコースを生成する工程、および
（２）グルコース転移酵素の存在下、ヌクレオシド２リン酸−グルコースとフェノール性化合物とを反応させて、ヌクレオシド２リン酸とフェノール性化合物のグルコース配糖体を生成する工程。
【００２５】
反応（１）について
反応（１）で使用されるスクロース合成酵素としては、好ましくはUDP-glucose:D-fructose 2-glucosyltransferase（EC2.4.1.13）を挙げることができる。当該UDP-glucose:D-fructose 2-glucosyltransferaseは、ウリジン２リン酸-グルコースと（ＵＤＰ-グルコース）とフルクトースからスクロースを合成する反応を触媒する酵素として発見された酵素であるが、スクロースの濃度が高いときには、その逆反応を触媒する作用を有している。この場合、UDP-glucose:D-fructose 2-glucosyltransferaseは、スクロースとウリジン２リン酸（ＵＤＰ：uridine-5’diphosphoric acid）を基質としてＵＤＰ-グルコースとフルクトースを生成する反応を触媒する。但し、スクロース合成酵素はこれに限られず、ヌクレオシド２リン酸とフルクトースからスクロースを合成する反応（スクロース合成反応）とこの逆反応を触媒することができる酵素であればよい。
【００２６】
反応（１）で使用されるスクロース合成酵素、特にUDP-glucose:D-fructose 2-glucosyltransferaseとして、より具体的にはシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）に由来するAtSUS1を挙げることができる（Baud S, Vaultier MN, Rochat C Structure and expression profile of the sucrose synthase multigene family in Arabidopsis. J Exp Bot,55(396),397-409）。当該酵素（AtSUS1）のアミノ酸配列を後記配列表の配列番号１に記載する。
【００２７】
当該スクロース合成酵素は、かかる特定のアミノ酸配列を有するものに制限されず、その機能的同等物であってもよい。ここで機能的同等物としては、配列番号１に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加してなるアミノ酸配列を有し、少なくとも前述するようにヌクレオシド２リン酸-グルコースとフルクトースからスクロースを合成する反応（スクロース合成反応）を触媒する活性並びにその逆反応を触媒する活性を有するタンパク質を挙げることができる。より好ましくは配列番号１に示すアミノ酸配列とアミノ酸配列において８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有し、且つ上記の活性を有するタンパク質を挙げることができる。
【００２８】
また、本発明のスクロース合成酵素には、配列表：配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるタンパク質、並びにその機能的同等物が含まれる。ここで機能的同等物としては、配列番号２で示される塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ（以下、これを「ホモログ」という）によってコードされるタンパク質であって、且つヌクレオシド２リン酸-グルコースとフルクトースからスクロースを合成する反応（スクロース合成反応）を触媒する活性並びにその逆反応を触媒する活性を有するタンパク質を挙げることができる。
【００２９】
なお、ここで配列番号２に示される塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズする「ストリンジェントな条件」は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol.152, Academic Press, San Diego CA)に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えば、ハイブリダイズ後の洗浄条件（いわゆるこれが「ストリンジェントな条件」）として、通常「2×SSC、0.1％SDS、室温」程度の条件を挙げることができる。かかる条件で洗浄しても、上記配列番号２に示される塩基配列の相補鎖とハイブリダイズ状態を維持するものは、上記本発明でいうホモログに含まれる。特に制限されないが、厳しいハイブリダイズ条件として「1×SSC、0.1％SDS、45℃」程度、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.2×SSC、0.1％SDS、60℃」、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1％SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。斯くして得られるホモログは、配列番号２に示される塩基配列と少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するものである。
【００３０】
なお、本発明で用いるスクロース合成酵素は、本発明で開示する情報に基づいて慣用の化学的または遺伝子工学的手法によって製造することができる。また、アミノ酸配列における改変は、当業界において既に公知な方法、例えば部位特異的変異導入法（Current Protocols I molecular Biology edit. Ausubel et al.,(1987) Publish, John Wily & Sons Section 8.1-8.5)等を用いて、改変しようとするアミノ酸配列に、適宜、置換、欠失、挿入、付加などの変異を導入することによって行うことができる。
【００３１】
反応（１）においてグルコース供与基質（ドナー基質）としてスクロースが使用される。当該スクロースは、グルコースとフルクトースがグルコシド結合でつながった二糖類であり、上記スクロース合成酵素を触媒とする反応によって、そのグルコース分子が、グルコース受容基質（アクセプター基質）であるヌクレオシド２リン酸に転移して、ヌクレオシド２リン酸−グルコースが生成することになる。かくして得られるヌクレオシド２リン酸−グルコースは、下記の反応（２）において、グルコース供与基質として用いることができる。
【００３２】
なお、上記反応（２）においてグルコース受容基質として用いられるヌクレオシド２リン酸は、スクロース合成酵素による触媒の下、グルコース供与基質からグルコースを受け取り、ヌクレオシド２リン酸−グルコースを形成するものであれば特に制限されない。具体的には、ウリジン２リン酸を挙げることができる。
【００３３】
グルコシル化反応（２）について
反応（２）で使用されるグルコース転移酵素は、グルコース供与基質からグルコースを転移してフェノール性化合物にグルコース鎖を付加する活性を有する酵素である。
【００３４】
ここで本発明が対象とするフェノール性化合物は、フェノール基を有する化合物を広く意味するものであるが、具体的には、下式で示されるp-nitrophenol：
【００３５】
【化１】
2007330112.tif 000002
vanillin:
【００３６】
【化２】
2007330112.tif 000003
esculetin：
【００３７】
【化３】
2007330112.tif 000004
scopoletin：
【００３８】
【化４】
2007330112.tif 000005
curcumin：
【００３９】
【化５】
2007330112.tif 000006
およびcurcumin 4’-O-β-D-glucoside (CG5)：
【００４０】
【化６】
2007330112.tif 000007
【００４１】
を挙げることができる。
【００４２】
好ましくはクルクミン（curcumin）およびcurcumin 4’-O-β-D-glucoside (以下、単に「クルクミンモノグルコサイド」ともいう)であり、より好ましくはクルクミンである。
【００４３】
グルコース供与基質としては、ヌクレオシドの結合によって活性化されたヌクレオシド２リン酸−グルコースを使用することができる。具体的には、ウリジン２リン酸−グルコース（UDPG：Uridine 5’-diphospho-α-D-glucose）を挙げることができる。
【００４４】
反応（２）で使用されるグルコース転移酵素として、好ましくはフェノール性化合物をグルコシル化する活性を有するものである。特に好ましくはクルクミンまたはクルクミンモノグルコサイドとの反応を触媒し、これらのフェノール性化合物をグルコシル化する活性を有するものである。
【００４５】
かかる特性を有するグルコース転移酵素として、好ましくはＵＤＰ-グルコシルトランスフェラーゼ（UDP-glycosyltransferase：UGTase）を挙げることができる。より好ましくは配列表：配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するUGTaseである。
【００４６】
なお、本発明で使用されるグルコース転移酵素は、かかる特定のアミノ酸配列を有する酵素に制限されず、その機能的同等物であってもよい。ここで機能的同等物としては、配列番号３に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加してなるアミノ酸配列を有し、少なくとも前述するクルクミンまたはクルクミンモノグルコサイドに対するグルコシル化活性（グルコース転移活性）を有するタンパク質を挙げることができる。より好ましくは配列番号３に示すアミノ酸配列と、アミノ酸配列において６５％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、一層好ましくは９０％以上、より一層好ましくは９５％以上の同一性を有し、且つクルクミンまたはクルクミンモノグルコサイドをグルコシル化する活性を有するタンパク質を挙げることができる。
【００４７】
また、本発明のグルコース転移酵素には、配列表：配列番号４で示される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるタンパク質、並びにその機能的同等物が含まれる。ここで機能的同等物としては、配列番号４で示される塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ（ホモログ）によってコードされるタンパク質であって、且つクルクミンまたはクルクミンモノグルコサイドに対するグルコシル化活性（グルコース転移活性）を有するタンパク質を挙げることができる。
【００４８】
なお、ここで配列番号４に示される塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズする「ストリンジェントな条件」は、前述の通り、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えば、ハイブリダイズ後の洗浄条件（いわゆるこれが「ストリンジェントな条件」）として、通常「2×SSC、0.1％SDS、室温」程度の条件を挙げることができる。かかる条件で洗浄しても、上記配列番号４に示される塩基配列の相補鎖とハイブリダイズ状態を維持するものは、上記本発明でいうホモログに含まれる。斯くして得られるホモログは、配列番号４に示される塩基配列と少なくとも６５％、好ましくは７５％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するものである。
【００４９】
かかるグルコース転移酵素は、本発明で開示するアミノ酸配列に基づいて、慣用に従って化学的または遺伝子工学的手法によって製造することができる。また、スクロース合成酵素と同様に、アミノ酸配列における改変は、当業界において既に公知な方法、例えば部位特異的変異導入法（Current Protocols I molecular Biology edit. Ausubel et al.,(1987) Publish, John Wily & Sons Section 8.1-8.5)等を用いて、改変しようとするアミノ酸配列に、適宜、置換、欠失、挿入、付加などの変異を導入することによって行うことができる。
【００５０】
かかるグルコース転移酵素の存在下で、上記フェノール性化合物とヌクレオシド２リン酸−グルコース（グルコース供与基質）とを反応させることにより、使用するフェノール性化合物に応じて目的のグルコース配糖体を製造することができる。例えば、上記フェノール性化合物のグルコース配糖体としては、p-nitrophenolについてはp-nitrophenyl-β-D-glucoside、vanillinについてはglucovanillin、esculetinについてはesculin、scopoletinについてはscopolin、curcuminについてはcurcumin 4’-O-β-D-glucoside(CG5)及びcurcumin 4’,4”-O-β-D-diglucoside（CG3）、並びにcurcumin 4’-O-β-D-glucoside (CG5)についてはcurcumin 4’,4”-O-β-D-diglucoside(CG3)を挙げることができる。
【００５１】
（３）one-pot two-enzyme reactionについて
本発明の、フェノール性化合物のグルコース配糖体の製造方法は、反応（１）で生成されたヌクレオシド２リン酸−グルコースを、グルコシル化反応（２）のグルコース供与基質として使用し、反応（２）で生成されたヌクレオシド２リン酸を、上記反応（１）のグルコース受容基質としてリサイクル使用することを特徴とする。
【００５２】
当該本発明の製造方法は、１つの容器の中に、反応（１）に必要なスクロース合成酵素とその反応基質であるスクロース（グルコース供与基質）、ならびに反応（２）に必要なグルコース転移酵素とその反応基質であるヌクレオシド２リン酸−グルコース（グルコース供与基質）およびフェノール性化合物（グルコース受容基質）を配合することによって実施することができる。容器の中にこれらの成分を配合すると、まず、グルコシル化反応（２）が進行して、グルコース転移酵素の下でフェノール性化合物とヌクレオシド２リン酸−グルコースが反応してフェノール性化合物のグルコース配糖体が生成される。次いで、この反応で生成したヌクレオシド２リン酸は、反応（１）のスクロース合成酵素の作用によりスクロース（グルコース供与基質）と反応して、ヌクレオシド２リン酸−グルコースが生成する。かかるヌクレオシド２リン酸−グルコースは、再びグルコシル化反応（２）のフェノール性化合物のグルコース供与体として使用される。
【００５３】
こうしたone-pot two-enzyme反応は、通常、水または緩衝液のような水性媒体の中で実施することができる。当該水性媒体（反応液）のｐＨ、反応温度、反応時間、各種酵素、各種基質の濃度などといった各種の反応条件は、グルコシル化する対象のフェノール性化合物の種類などによって適宜設定調整することができる。一般に、反応液のｐＨとしてはｐＨ６〜１０、好ましくはｐＨ７〜９；反応温度としては５〜４０℃、好ましくは１５〜４０℃、より好ましくは２５〜３５℃；反応時間としては０.５〜５０時間、好ましくは０.５〜１０時間程度を目安として実施することができる。
【００５４】
反応液中、反応（１）におけるグルコース供与基質であるスクロースの濃度は、スクロース合成酵素がスクロース合成反応とは逆の反応を触媒する濃度であれば制限はされないが、通常、３０μmol/ml以上の濃度を挙げることができる。好ましくは３０〜１０００μmol/ml、より好ましくは３０〜３００μmol/mlを例示することができる。また反応（２）におけるグルコース受取基質であるフェノール性化合物の濃度も特に制限されない。通常１０nmol/ml以上の範囲で適宜調整することができる。例えば１０〜５０００nmol/ml、好ましくは１０〜５００nmol/mlの範囲を挙げることができる。
【００５５】
また反応開始時の反応液中に配合するヌクレオシド２リン酸−グルコースの濃度としては、特に制限されないが、２０〜５０００nmol/ml、好ましくは２００〜１０００nmol/mlの範囲を挙げることができる。なお、反応開始時には、反応（１）のグルコース受容基質であるヌクレオシド２リン酸は配合しないことが好ましい。当該ヌクレオシド２リン酸はグルコシル化反応（２）の反応生成物でもあるため、当該反応（２）の反応基質と競合してグルコシル化を阻害するからである。
【００５６】
反応液中のスクロース合成酵素およびグルコース転移酵素の濃度も特に制限されないが、スクロース合成酵素としてはタンパク質量に換算して１５０μg/ml程度、グルコース転移酵素としてはタンパク質量に換算して１００μg/ml程度を例示することができる。反応液中のスクロース合成酵素とグルコース転移酵素の最適な割合としては、モル比で１：１、重量比で１.５：１を挙げることができる。ゆえにかかる割合を考慮して適宜調整することができる。例えば、工業的に利用する場合には、スクロース合成酵素の濃度として１．５〜１５００μｇ/ｍｌ、好ましくは１５〜７５０μｇ/ｍｌ、グルコース転移酵素の濃度として１〜１０００μｇ/ｍｌ、好ましくは１０〜５００μｇ/ｍｌを挙げることができる。
【００５７】
斯くして製造されるフェノール性化合物のグルコース配糖体は、さらに上記反応液から慣用の方法、例えば逆相カラムなどを装着した液体クロマトグラフィーなどを利用して単離することができ、また必要に応じて精製することもできる。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例を挙げて、本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例等に限定されるものではない。
【００５９】
実施例１  糖転移酵素（CaUGT2）の調製
（１）ニチニチソウ由来CaUGT2 cDNAのクローニング
植物の第二次代謝関連UGTase(UDT-glycosyltransferase)には、よく保存されたドメインである「PSPG-Box」がある。PSPG-Box内でも特に保存されたアミノ酸配列として「HCGWNS」を選択し、これをもとに、degenerate primerとして UGT2mF（5'-TT(T/C)(T/C/G)TI(A/T)(G/C)ICA(T/C)TG(T/C)GGITGGAA：Iはinosine、例えば、（T/C）はTとCの混合物を示す；配列番号５）を設計した。このプライマーとライブラリーベクター〔λZAP IIベクター（Stratagene）〕のinsert 3’-下流側に共通して存在するプライマー（M13 forward プライマー）を用いて、methyl jasmonate（MJ）処理したニチニチソウ培養細胞を用いて作成したcDNAライブラリーを鋳型としてPCRを行い、UGTase cDNAの3’断片を増幅した。なお、cDNAライブラリーは、MJ処理したニチニチソウ培養細胞から抽出したmRNAを材料として、λZAP-cDNA Synthesis Kit/Gigapack II Gold Packaing Extract (Stratagene)を用いて常法に従って作成した。上記PCRの結果、得られた約500bpの増幅産物（DNA断片）を、pCR2.1-TOPOベクター（Invitrogen）に、プロトコールに従ってサブクローニングした。次いで得られたクローンのうち、無作為に選択した30個のクローンについてシークエンスを行い、得られた塩基配列についてBlastXを用いたデータベース検索を行った。その結果、30個中８個のクローンが植物由来のUGTaseに近似した塩基配列を有していることが分かった。
【００６０】
解析した８個のクローンのうち７個は5’末端側に「GGGTGGA」の塩基配列を有しており、これを「CaUGT2」と命名した。これから、「CaUGT2」がMJ-inducibleなUGTaseであることが示唆された。
【００６１】
CaUGT2の塩基配列に特異的なプライマーをCaUGT2 5'-TTGGCCGGAGGATTCAAGGG [配列番号６]）として、またライブラリーベクターのinsert 5’-上流側に存在するプライマー（T3プライマー）をforward primer（5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG [配列番号７]）として、PCRを行うことにより、CaUGT2の5’側フラグメントを得た。さらに、これらを組み合わせることにより、CaUGT2について全長ORFを含むcDNAクローンを単離した。
【００６２】
CaUGT2のcDNA塩基配列（配列番号４）とそのORFによってコードされる推定アミノ酸配列（配列番号３）を図４に示す。図４中、四角で囲んだ領域がPSPG-box中の「HCGWNS」である。図４に示すように、CaUGT2は全長1720 bpの塩基配列を有し、487個のアミノ酸からなる蛋白質をコードするORFを含んでいた。推定分子量は55 kDであった。
【００６３】
（２）CaUGT2の大腸菌での発現
上記で調製したCaUGT2のORF領域のcDNAを、pMAL-c2xベクター（New England Biolabs社製）にサブクローニングした。なお、pMAL-c2xベクターは、マルトース結合タンパク質（MBP）をコードするmalE遺伝子を有しているベクターであるため、当該遺伝子の下流に目的遺伝子を導入することによってMBPとの融合タンパク質を発現することができる。さらに、pMAL-c2xベクターは、malE signal sequenceを欠いているため、生じた融合タンパク質（可溶性タンパク質）は細胞質内に発現される。
【００６４】
サブクローニングにあたり、CaUGT2はBamHI及びSalIで切断した。シークエンスで配列を決定した後、大腸菌JM109株に導入した。斯くして調製した組み換えE.coli-CaUGT2（MBP-CaUGT2融合タンパク質）、並びにpMAL-c2xベクターのみを導入したE.coli（コントロール）（E.coli-MBP）を、それぞれ２組ずつ準備して、carbenicillinを添加した2.5mL MMI培地にて37℃で18時間振盪培養し、さらにcarbenicillinを添加した100mL LB培地にて37℃で80分間振盪培養した。次いで、２組のうち１組の培地に、1 mMのIPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)を添加し、さらに30℃で18時間振盪培養を行い、遺伝子発現を誘導した。IPTG添加によって遺伝子発現を誘導したもの（＋）と誘導しないもの（−）を、それぞれ電気泳動にかけた。なお、電気泳動は下記のようにして行った。
【００６５】
＜SDS-PAGE＞
(i) 試料の調製
上記の培養後、菌液を3500rpmで20分間遠心分離し、沈澱物をTE buffer 2mLで洗浄し、ボルテックスした後3500rpmで20分間遠心分離した。沈殿物は液体窒素で急冷し、使用するまで-75℃で保存した。使用時に、各菌体をTE buffer 1mLに懸濁後、液体窒素で凍結し、さらに37℃水溶中で融解し、かかる凍結と融解を２回繰り返した。その後、卵白由来lysozyme（和光純薬）を、終濃度200μg/mLとなるように添加して37℃で15分間インキュべーションした。これを、Hand Sonic UR-20P(Tomy Seiko)を用いて超音波破砕した（Sonication 15秒間＋氷冷15秒間のサイクルを８回）。これを10,000gで20分間遠心分離して、得られた上清を粗酵素液として、使用時まで４℃にて保存した。
【００６６】
(ii) SDS-PAGE
SDS-PAGEは、Laemmliらの方法（Laemmli UK (1970), Nature. 227, 127-135）に従って行った。上記粗酵素液80mLをサンプル緩衝液20mLに溶解して、10分間95℃で煮沸後、SDS-PAGEに供し、パワーサプライ（ATTO社製AE-3113）を用いて電気泳動を行った（泳動条件：10%T ポリアクリルアミドゲル、C．V．150Voltage，1hr）。電気泳動後、ゲルをクマーシーブルー染色した。O/N脱色後、３時間乾燥して電気泳動像を撮影した。なお、サイズマーカーとして、SDS-PAGE MOLECULAR WEIGHT STANDARDS Low range (BIO-RAD)を用いた。斯くして組み換えE.coli- CaUGT2、及びコントロールについていずれも、IPTG誘導（＋）によって予想された分子サイズを有する蛋白質が発現していることを確認した。
【００６７】
（３）CaUGT2の組換え酵素（粗酵素液）によるクルクミンの配糖化反応
（２）において、CaUGT2を発現させた大腸菌（組み換えE.coli-CaUGT2）から調製した粗酵素液について、UDPG存在下で、クルクミンおよびクルクミンモノグルコサイドを基質として配糖化活性を調べた。具体的には、5mMの基質（クルクミン、クルクミンモノグルコサイド）、4mMのUDPG及び粗酵素液（タンパクとして20μg）を含む1M Tris-HCl (pH7.5) 100μLを、30℃で30分間反応させて、その後にメタノール200μl入れて反応を停止し、12,000gで10分間遠心分離して得た上清を、下記条件のHPLCにかけて、反応液中の反応生成物の量を、各標準品（クルクミン、クルクミンモノグルコサイド、クルクミンジグルコサイド）を用いて作成した検量線から算出した。
【００６８】
＜ＨＰＬＣ条件＞
(1)クルクミン及びその配糖体
固定相：COSMOSIL 5C18-ARII column 4.6 x 150mm (ナカライテスク)
移動相：0-14min：40-79% MeOH, 14-15min：79-100% MeOH, 15-20min：100% MeOH  
流速：1.0 mL/min
測定波長：UV 423nm
Rt: クルクミン−15.8min、CG3−7.4min、CG5−11.8min。
【００６９】
結果を図５に示す。図５中、（ａ）は標準品（クルクミン、クルクミンモノグルコサイド、クルクミンジグルコサイド）のクロマトグラム、（ｄ)及び（ｅ）は組み換えE.coli- CaUGT2から調製した粗酵素液（CaUGT2）を用いてそれぞれクルクミン及びクルクミンモノグルコサイドと反応させた反応液のクロマトグラムを示す。これからわかるように、クルクミンを基質とした場合は、30℃で60分の反応でクルクミンモノグルコサイド（curcumin 4’-O-β-D-gulucoside [CG5]）および少量のクルクミンジグルコサイド（curcumin 4’,4”-O-β-D-digulucoside [CG3]）の生成が認められ(図５（ｄ）)、またクルクミンモノグルコサイドを基質とした場合は、クルクミンジグルコサイド（CG3）の生成が認められた（(図５（ｅ））。このことから、CaUGT2はクルクミンに対して配糖化活性を有すると同時に、クルクミンモノグルコサイドに対しても配糖化活性を有していることが確認された。
【００７０】
実施例２  スクロース合成酵素（AtSUS1）の調製
（１）スクロース合成酵素（AtSUS1）について
スクロース合成酵素(UDP-glucose:D-fructose 2-glucosyltransferase, EC2.4.1.13)はUDPGとフルクトースからスクロースを合成する反応を触媒する酵素として発見されたが、反応系におけるスクロース濃度が高い時には、その逆反応を触媒する(杉山達夫ら (2005) 植物の生化学・分子生物学,567-610）。
【００７１】
全ゲノム配列が解読されているシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)には6種類のスクロース合成酵素様遺伝子が存在することが明らかにされている(Baud S, Vaultier MN, Rochat C Structure and expression profile of the sucrose synthase multigene family in Arabidopsis. J Exp Bot,55(396),397-409)。
【００７２】
そこで本実施例では、スクロース合成酵素として、上記シロイヌナズナに由来するAtSUS1を使用した。なお、AtSUS1のcDNAはクローニングされ、その遺伝子産物は機能的にもスクロース合成酵素であることが確認されている（上記文献）。
【００７３】
（２）スクロース合成酵素（AtSUS1）の発現
まず、シロイヌナズナからRNasesy Plant Mini Kit（QUAGEN）を用いてtotal RNAを抽出し、次いで、ReverTraAceR（TOYOBO）を用いてそのプロトコールに従って逆転写反応を行うことによりfirst strand cDNAを得た。次に、得られたfirst strand cDNAを鋳型として、下記のプライマーを使用して、Polymerase Chain Reaction (PCR)（94℃5分、94℃30秒、55℃30秒、68℃2.5分、68℃5分、4℃  Holdの反応を30サイクル）を行い、約2.4 KbpのAtSUS1 cDNA断片を得た。
【００７４】
＜プライマー＞
フォワードプライマー（AtSUS1_KpnI_FW）：CGGTACCATGGCAAACGCTGAACGTATG（配列番号８）
リバースプライマー（AtSUS1_PstI_RV）：GCTGCAGTAATCATCTTGTGCAAGAGGAA（配列番号９）
これをpCR-TOPOベクターにクローニングし、その塩基配列を確認した後、pQE 30ベクターにサブクローニングし、これをコンピテント細胞（大腸菌(JM 109)）に導入して、発現させた。
【００７５】
（３）スクロース合成酵素（AtSUS1）の調製
（２）で組換えAtSUS1（pQE- AtSUS1）を発現した大腸菌に、50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5)を適量加えvortexで攪拌して懸濁し、液体窒素で一旦凍結した後、30℃の水浴で融解した。これを超音波破砕機(TOMY UD-200)を用いて、氷冷しながら超音波破砕を行った。ついで、4℃、9,000 g、20 min遠心分離し、上清を可溶性画分、沈殿を不溶性画分として、粗酵素溶液を調製した。
【００７６】
組換えAtSUS1は粗酵素溶液からNi2+-NTA-agarose resinを用いて精製し、SDS-PAGE（10％ポリアクリルアミドゲル）によって確認した（図６（Ａ）のレーン4-7)。なお、図６（Ａ）のレーン2は、粗酵素溶液の電気泳動像である。
【００７７】
なお、図６（Ｂ）は、実施例１でクローニングしたCaUGT2を、上記と同様にしてpQE 30ベクターにサブクローニングし、これを大腸菌で発現させた粗酵素溶液（レーン2）、およびNi2+-NTA-agarose resinを用いて精製したCaUGT2 （レーン4-7）の電気泳動像である。
【００７８】
（４）AtSUS1の組換え酵素（粗酵素液）によるUDPGの生産
上記で調製した組換えAtSUS1を用いてUDPGの生産を検討した。
(4-1) 反応時間の検討
基質としてスクロース 300 mMおよびUDP 10 mMを含む50 mM Tris HCl buffer (pH 7.5) 1 mLに、AtSUS1粗酵素液(タンパク量として約1 mg)を加え、30℃でインキュベートし、経時的にUDPGの生成量を測定した。結果を図７に示す。
【００７９】
図からわかるように、反応開始10分後には、添加したUDPのほとんどがAtSUS1によってUDPGに変換されていることが確認できた。このことから、スクラロース合成酵素（AtSUS1）によるUDPからUDPGの産生は非常にすみやかで効率が良く行われることがわかった。
【００８０】
(4-2)  UDP濃度の検討
上記の反応系を用い、終濃度がそれぞれ10, 20, 40 mMとなるようにUDP量を変えて、反応30分後のUDPG生成量を測定した。結果を図８に示す。
【００８１】
図からわかるように、AtSUS1は、配合したUDPのほとんどをUDPGに変換することがわかった。さらに配合するUDPの量を50, 100,および200 mMと上げて検討を行ったところ、UDP濃度が100 mM付近までは、そのほとんどをUDPGに変換するが、それ以上UDP濃度を上げてもUDPGの生成量は変わらないことがわかった。
【００８２】
(4-3)  スクロース濃度の検討
上述の反応系を用い、終濃度がそれぞれ30, 75, 150, 300 mMとなるようにスクロース量を変えて、反応30分後のUDPG生成量を測定した。結果を図９に示す。
【００８３】
図からわかるように、スクロース量に応じてUDPGの生成量も増加した。
【００８４】
実施例３    配糖化反応産物UDPによるCaUGT2配糖化反応の阻害
配糖化酵素であるrhamnosyltransferase (UDP-rhamnose:flavanone-7-O-glucoside-2´´-O-rhamnosyltransferase)による糖転移反応では、uridine-5´-diphosphate (UDP)を添加することで、酵素反応が著しく阻害されることが報告されている(Bar-Peled M, Lewinsohn E, Fluhr R, Gressel J (1991) UDP-rhamnose:Flavanone-7-O- glucoside-2´´-O-rhamnosyltransferase. Purification and characterization of an enzyme catalyzing the production of bitter compounds in citrus. J Biol Chem.266(31),20953-9）。配糖化酵素CaUGT2による配糖化反応においても、配糖化反応産物であるUDPがUDPGと競合してCaUGT2による配糖化反応を阻害することが十分に考えられる。
【００８５】
そこで、UDPG 5 mM存在下でUDP濃度を変化させて（0, 0.5, 1, 2,または 5 mM）、精製CaUGT2による配糖化反応を比較した。具体的には、基質としてクルクミン 0.25 mM、UDPG 5 mMを含む50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) 100 μLにCaUGT2精製酵素液(タンパク量として約5 μg)を加え、これにUDPの終濃度を0, 0.5, 1, 2,または 5 mMになるように添加して、30℃で5 分間インキュベートし、クルクミン配糖体の生成量をHPLCで測定した。また、比較実験として、UDPに代えて、UMP 5 mMを配糖した系についても同様に30℃で5 分間インキュベートし、クルクミン配糖体の生成量をHPLCで測定した。
【００８６】
＜HPLC条件＞
カラム：Cosmosil 5C18-ARII column 4.6×150 mm (Nacalai Tesque)
移動相：溶媒A  H2O   溶媒B  MeOH
グラジェント：0-14 min, 40-79%MeOH : 14-15 min, 79-100%MeOH : 15-20 min, 100%MeOH : 20-22 min, 100-80%MeOH : 22-25 min, 80-60%MeOH : 25-28 min, 60-40%MeOH : 28-30 min, 40%MeOH
流速：1.0 mL/min
測定波長：423 nm。
【００８７】
結果を図１０に示す。
【００８８】
図１０からわかるように、配糖化反応系にUDPGとUDPが等モル存在する場合には配糖体生成量が、UDPが存在しない場合の配糖体生成量（100％）の５％程度まで下がった。さらに配糖化反応系にUDPGの1/10量のUDPが存在する場合でも、配糖体生成量はUDPが存在しない場合の３０％程度まで下がることがわかった。一方、UMPは酵素活性を全く阻害しなかった。
【００８９】
実施例４  one-pot two-enzyme systemの構築（図３）
実施例２で調製したスクロース合成酵素の精製物（精製AtSUS1）と実施例２で調製した配糖体化酵素の精製物（精製CaUGT2）を組み合わせて、図３に示すone-pot two-enzyme systemを構築した。
（１）具体的には、まず、基質としてクルクミン 0.5 mM、UDPG 2 mM、スクロース 300 mMを含む50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) 100μLに精製CaUGT2(タンパク量として約10 μg)を加え、30℃でインキュベートし、経時的にクルクミン配糖体の生成量をHPLCで測定した（Ａ）。当該反応系において、精製CaUGT2を2倍量にしたもの（Ｂ）、精製AtSUS1(タンパク量として約5 μg)を加えたもの（Ｃ）、精製CaUGT2を２倍量にし、精製AtSUS1（タンパク量として約5 μg）を加えたもの（Ｄ）についても同様に、クルクミン配糖体の生成量をHPLCで測定し、上記（Ａ）と比較した。結果を図１１に示す。
【００９０】
その結果、（Ａ）では反応時間120分でもクルクミンのクルクミン配糖体（クルクミンジグルコシド (CDG)）への転換率は50％程度であるのに対して、（Ｂ）の精製CaUGT2を倍増した場合では、上記と同じ反応時間（120分）でCDGへの転換率は70％に増加していた。一方、（Ｃ）のAtSUS1を加えた場合では、反応時間60 分で添加したクルクミンのほとんどがCDGに転換されており、さらに、（Ｄ）のCaUGT2を倍増し、AtSUS1を加えたものでは反応時間30分でクルクミンのほとんどがCDGに転換されていた。このことから、CaUGT2による配糖化反応とAtSUS1とを組み合わせることによって、クルクミンの配糖化が促進されることわかる。
【００９１】
なお、結果としては示していないが、上記100μLの系においてAtSUS1を5μg以上加えても、それ以上に配糖化の効率性が上がることはなかった。このことから、AtSUS1の活性は非常に強く、反応系に存在するUDPは直ちにUDPGに転換されることが示唆される。
【００９２】
（２）次に、上記の反応系において、UDPGの終濃度を0.2, 0.5, 1,または 2 mMとし、30℃で60分間インキュベートした。次いで各反応系におけるクルクミン配糖体の生成量をHPLCで測定し、反応系にAtSUS1が存在する場合のクルクミン配糖体の生成量(＋AtSUS1)と、AtSUS1が存在しない場合のクルクミン配糖体の生成量(−AtSUS1)とを比較した。結果を図１２に示す。
【００９３】
その結果、AtSUS1非存在下(−AtSUS1)ではクルクミン 0.5 mMに対してUDPG を2 mMを加えてもクルクミンのCDGへの転換率は40％にも満たなかったのに対して、AtSUS１の存在下では、上記の1/10に相当する0.2 mM のUDPGを加えた場合でもAtSUS1非存在下でのCDGへの転換率を上回っていた。
【００９４】
またAtSUS１の存在下では、UDPGを1または2 mM用いることによって、配合したクルクミンのほとんどが60 分以内にCDGに転換された。
【００９５】
実験例５  クルクミンのグルコース配糖体の安定性
（１）クルクミンのフェノール性水酸基にグルコースが一つ付加したクルクミンモノグルコシド(CMG)の水溶性はクルクミンの230倍、グルコースが二つ付加したクルクミンジグルコシド(CDG)の水溶性はクルクミンの1,200万倍に達することが報告されている(Kaminaga Y, Nagatsu A, Akiyama T, Sugimoto N, Yamazaki T, Maitani T, Mizukami H (2003) Production of unnatural glucosides of curcumin with drastically enhanced water solubility by cell suspension cultures of Catharanthus roseus. FEBS Lett.555(2),311-6）。このことは、上記実施例４で示した配糖化が、クルクミンの水溶性を上昇させるのに極めて有効な手段であることを示している。
【００９６】
（２）また、クルクミンはアルカリ条件下では水に溶解するが、不安定であることが知られている。そこで、難溶性のクルクミンでも比較的溶けやすいｐＨ10のホウ酸緩衝液中での安定性を、その配糖体（CMG、CDG）と比較した。
【００９７】
具体的には、クルクミンまたはCMG、およびCDGを含むホウ酸緩衝液 (pH10) 500 μLを37℃でインキュベートし、経時的にクルクミン配糖体の生成量をHPLCで測定した。結果を図１３に示す。
【００９８】
図１３からわかるように、クルクミンはｐＨ10の緩衝溶液中で急速に分解され、1時間後にはほぼ完全に消失した。一方、クルクミンの配糖体はクルクミンモノグルコシド(CMG)もクルクミンジグルコシド（CDG）もいずれも、アルカリ条件下でクルクミンと比較して安定性であり、特に、CDGについては2時間後でも約80％がそのままの形で存在していた。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】フェノール性化合物（クルクミン）の配糖化反応の概略図を示す。
【図２】フェノール性化合物であるクルクミンとそのグルコース配糖体の構造を示す。
【図３】one-pot two-enzyme systemによるフェノール性化合物（クルクミン）の配糖化反応の概略図を示す。
【図４】CaUGT2のcDNAの塩基配列とそのORFによってコードされる推定アミノ酸配列を示す図である。四角で囲んだ領域は、PSPG-box内の「HCGWNS」である。
【図５】CaUGT2の組み換え酵素（粗酵素）によるクルクミンの配糖化反応を調べたHPLCのクロマトグラムである（実施例１（３））。（ａ）は標準品（クルクミン、クルクミンモノグルコサイド、クルクミンジグルコサイド）のクロマトグラム、（ｄ)及び（ｅ）は組み換えE.coli- CaUGT2から調製した粗酵素液（CaUGT2）を用いてそれぞれクルクミン及びクルクミンモノグルコサイドと反応させた反応液のクロマトグラムを示す。
【図６】（Ａ）組換えAtSUS1をSDS-PAGE（10％ポリアクリルアミドゲル）にかけた電気泳動像を示す。レーン4-7は組換えAtSUS1の精製物、レーン2は、組換えAtSUS1の粗酵素溶液の電気泳動像である。（Ｂ）実施例１でクローニングしたCaUGT2の粗酵素溶液（レーン2）、およびその精製物（レーン4-7）の電気泳動像である。
【図７】スクロースとウリジン２リン酸（UDP）を基質としたスクロース合成酵素（AtSUS1）反応による、ウリジン２リン酸−グルコース（UDPG）の生成量を経時的に測定した結果を示す（実施例２(4-1)）。
【図８】スクロースとUDPを基質としたスクロース合成酵素（AtSUS1）反応における、UDP濃度によるUDPGの生成量を測定した結果を示す（実施例２(4-2)）。
【図９】スクロースとUDPを基質としたスクロース合成酵素（AtSUS1）反応における、スクロース濃度によるUDPGの生成量を測定した結果を示す（実施例２(4-3)）。
【図１０】配糖化反応生成物（ウリジン２リン酸（UDP））存在によるCaUGT2配糖化反応の阻害の影響をみた実験結果を示す図である（実施例３）。
【図１１】one-pot two-enzyme system（図３）を利用したクルクミンの生成量を測定した結果を示す（実施例４）。
【図１２】one-pot two-enzyme system（図３）において、反応系にスクロース合成酵素（AtSUS1）が存在する場合（＋AtSUS1）と存在しない場合（−AtSUS1）で、クルクミン配糖体の生成量を比較した結果を示す（実施例４）。
【図１３】クルクミン配糖体のアルカリ条件下での安定性を、クルクミンと比較した結果を示す（実施例５）。
【配列表フリーテキスト】
【０１００】
配列番号５は、degenerate primer（UGT2mF）の塩基配列を示す。
配列番号６は、CaUGT2の塩基配列に特異的なプライマーの塩基配列を示す。
配列番号７は、ライブラリーベクターのinsert 5’-上流側に存在するプライマー（T3プライマー）の塩基配列を示す。
配列番号８は、スクロース合成酵素（AtSUS1）のクローニングに使用したフォワードプライマー（AtSUS1_KpnI_FW）の塩基配列を示す。
配列番号９は、スクロース合成酵素（AtSUS1）のクローニングに使用したリバースプライマー（AtSUS1_PstI_RV）の塩基配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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