(57)【要約】【課題】精度よく生理活性物質と検体物質との反応を測定可能な測定チップ、及び、この測定チップの固定化膜を製膜する製膜方法を提供する。【解決手段】測定チップ１０は、誘電体ブロック１２、薄膜１４、固定化膜１６を備えている。誘電体ブロック１２は、光ビームに対して透明な透明樹脂等で構成されており、断面が台形の棒状とされている。誘電体ブロック１２の互いに平行な２面の内の広い側上面に、薄膜１４が形成され、薄膜１４上に固定化膜１６が形成されている。測定チップ１０の固定化膜１６側表面には、モニター部１８が構成されている。モニター部１８は、固定化膜１６を製膜する際に、製膜状態をモニターするために光が照射される部分であり、測定部Ｅと異なる位置に構成されている。  【選択図】図１
2007212236.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
平坦面に形成された薄膜上に生理活性物質を固定可能な固定化膜を製膜する製膜方法であって、
前記薄膜上での製膜状態をモニターしつつ前記薄膜上に前記固定化膜を製膜するための第１製膜物質を供給し、
前記モニターで前記薄膜上での製膜状態が所望の製膜状態と判断された後に、前記第１成膜物質を前記固定化膜を製膜するための第２製膜物質と置換し、
多段階で前記固定化膜を製膜する製膜方法。
【請求項２】
前記製膜状態のモニターは、非電気化学的な方法で行われること、を特徴とする請求項１に記載の製膜方法。
【請求項３】
前記平坦面は透明部材の表面に構成され、
前記製膜状態のモニターは、前記透明部材側から前記薄膜へ光を照射して、この光の全反射減衰を利用することにより行われること、を特徴とする請求項２に記載の製膜方法。
【請求項４】
前記光は、前記生理活性物質が固定されると測定部と異なる位置に照射されること、を特徴とする請求項３に記載の製膜方法。
【請求項５】
前記光の照射される面積は、前記固定化膜の全面積の１０％以下であることを特徴とする請求項４に記載の製膜方法。
【請求項６】
透明部材の平坦面に形成された薄膜と、
上面にモニター部を有し、このモニター部への光の照射によりモニターされつつ前記薄膜上に形成され、生理活性物質を固定可能な固定化膜と、
前記固定化膜上の前記モニター部と異なる位置に構成され生理活性物質が固定される測定部と、
を備えた測定チップ。
【請求項７】
前記モニター部は前記固定化膜の全面積の１０％以下であることを特徴とする請求項６に記載の測定チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性物質を固定可能な固定化膜を有する測定チップ、及び、この測定チップの固定化膜を製膜する製膜方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。
【０００３】
上記した技術においては、いずれの場合も、生理活性物質を固定化する表面が重要である。以下、当技術分野で最も使われている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を例として、説明する。
【０００４】
一般に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）、透明基板に蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜（固定化膜）を備え、その官能基を介して、金属表面に生理活性物質を固定化する。そして、固定化された生理活性物質へ検体物質を供給し、金属膜へ光を照射し、この光の全反射減衰を利用することにより、生理活性物質と検体物質との間の特異的な結合反応を測定して、生体分子間の相互作用を分析する。
【０００５】
ところで、生理活性物質を固定化できる固定化膜を有する測定チップとして、金属と結合する官能基、鎖長の原子数が１０を超えるリンカー、及び生理活性物質と結合できる官能基を有する化合物を用いたものが報告されている（特許文献１を参照）。また、金属膜と、該金属膜の上に形成されたプラズマ重合膜からなる測定チップが報告されている（特許文献２を参照）。さらに、リンカーを介して、金属表面に親水性のハイドロゲルを固定化することで、物理吸着を抑制する方法も使用されている（特許文献１、特許文献３及び特許文献４を参照）。
【０００６】
これらの固定化膜は、生理活性物質と検体物質との間の反応を精度よく測定するために、所望の膜厚で形成されることが好ましい。そこで、固定化膜の状態をモニターすることが考えられる。例えば、固定化膜の状態をモニターする方法としては、エリプソメトリの原理で計測できるが、膜厚が物理量として直接測定されないため、非線形演算が必要で測定誤差を生じるといった問題があった（特許文献５、６、７参照）。
【特許文献１】特許第２８１５１２０号
【特許文献２】特開平９−２６４８４３号
【特許文献３】米国特許第５４３６１６１号
【特許文献４】特開平８−１９３９４８号公報
【特許文献５】ＷＯ０１／５９４０３号
【特許文献６】ＥＰ１２６１８４０Ｂ１号
【特許文献７】ＵＳ２００５／００２５６７６Ａ１号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記した従来技術の問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、精度よく生理活性物質と検体物質との反応を測定可能な測定チップ、及び、この測定チップの固定化膜を製膜する製膜方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明の製膜方法は、平坦面に形成された薄膜上に生理活性物質を固定可能な固定化膜を製膜する製膜方法であって、前記薄膜上での製膜状態をモニターしつつ前記薄膜上に前記固定化膜を製膜するための第１製膜物質を供給し、前記モニターで前記薄膜上での製膜状態が所望の製膜状態と判断された後に、前記第１成膜物質を前記固定化膜を製膜するための第２製膜物質と置換し、多段階で前記固定化膜を製膜するものである。
【０００９】
上記製膜方法では、製膜状態をモニターし、第１製膜物質を供給して所望の製膜状態が得られた後に第２製膜物質を供給する。したがって、第１製膜物質による製膜が不十分な状態で次工程が行われることが防止でき、精度よく多段階で固定化膜を製膜することができる。
【００１０】
なお、本発明の製膜方法は、請求項２に記載のように、前記製膜状態のモニターが、非電気化学的な方法で行われること、が好ましい。
【００１１】
非電気化学的な方法を用いることにより、モニターにより固定化膜の製膜が阻害されることを抑制することができる。
【００１２】
また、本発明の製膜方法は、請求項３に記載のように、前記平坦面は透明部材の表面に構成され、前記製膜状態のモニターは、前記透明部材側から前記薄膜へ光を照射して、この光の全反射減衰を利用することにより行われること、を特徴とすることができる。
【００１３】
このように、光の全反射減衰を利用することにより、固定化膜の製膜をモニターすることができる。
【００１４】
また、本発明の製膜方法は、請求項４に記載のように、前記光は、前記生理活性物質が固定されると測定部と異なる位置に照射されることが好ましい。
【００１５】
製膜される固定化膜によっては、光の照射により影響を受けるものもあることから、モニター用に光を照射する位置は、測定部として使用する位置とは異なることが好ましい。
【００１６】
また、本発明の製膜方法は、請求項５に記載のように、前記光の照射される面積は、前記固定化膜の全面積の１０％以下であることが好ましい。
【００１７】
請求項６に記載の測定チップは、透明部材の平坦面に形成された薄膜と、上面にモニター部を有し、このモニター部への光の照射によりモニターされつつ前記薄膜上に形成され、生理活性物質を固定可能な固定化膜と、前記固定化膜上の前記モニター部と異なる位置に構成され生理活性物質が固定される測定部と、を含んで構成されている。
【００１８】
ここで、薄膜は、白金、金、銀などにより構成することができる。上記構成によれば、モニター用に光の照射されるモニター部と、生理活性物質が固定されて測定が行われる測定部とが、異なる位置に配置されている。したがって、モニター用の光の照射による測定部への影響はなく、精度よく生理活性物質と検体物質との反応を測定することができる。
【００１９】
なお、前記モニター部は、請求項７に記載のように、前記固定化膜の全面積の１０％以下であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は上記構成としたので、精度よく生理活性物質と検体物質との反応を測定可能な測定チップ、及び、この測定チップの固定化膜を製膜する製膜方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の実施形態について説明する。
【００２２】
本実施形態の測定チップ１０は、生理活性物質ＬＧを固定して、検体物質との間の相互作用を測定するためのものである。生理活性物質ＬＧは、図１に示すように、測定チップ１０の表面に構成されている。以下、生理活性物質ＬＧが固定されるこの位置を「測定部Ｅ」という。
【００２３】
本実施形態の測定チップ１０は、図１に示すように、誘電体ブロック１２、薄膜１４、固定化膜１６を備えている。誘電体ブロック１２は、光ビームに対して透明な透明樹脂等で構成されており、断面が台形の棒状とされている。誘電体ブロック１２の互いに平行な２面の内の広い側上面に、薄膜１４が形成され、薄膜１４上に固定化膜１６が形成されている。測定チップ１０の固定化膜１６側表面には、モニター部１８が構成されている。モニター部１８は、固定化膜１６を製膜する際に、製膜状態をモニターするために光が照射される部分である。モニター部１８は、測定部Ｅと異なる位置に構成されている。測定部Ｅは、生理活性物質ＬＧの固定される領域であり、測定部Ｅ上には、生理活性物質ＬＧへ試料を供給するための流路が構成される。
【００２４】
測定チップ１０の薄膜１４の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、メッキ法等によって行うことができる。材料は金属または金属酸化物、半導体、有機物から選ばれる。好ましくは、金属または金属酸化物でさらに好ましくは、金、銀、銅、白金又はアルミニウムからなる群より選ばれる自由電子金属からなるものである。例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記誘電体ブロック１２への付着性を考慮して、誘電体ブロック１２と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００２５】
薄膜１４の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上、１０ｎｍ以下であるのが好ましい。
【００２６】
本実施形態では、固定化膜１６を、製膜状態をモニターしつつ形成するが、そのモニター方法として、非電気化学的方法、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などを用いることができる。
【００２７】
ここでは、表面プラズモン共鳴用バイオセンサーを用いる例について説明する。
【００２８】
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴の現象を利用して、生理活性物質と被験物質との相互作用を測定するものである。
【００２９】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界で反射された光の強度が、金属側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、反射された光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【００３０】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は、基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロック（本実施形態の誘電体ブロック１２に対応）と、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜（本実施形態の薄膜１４に対応）と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段を備えている。
【００３１】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出したりすることができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【００３２】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【００３３】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【００３４】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【００３５】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻  第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００３６】
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
【００３７】
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。
【００３８】
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。
【００３９】
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩｇＧ抗体を特定物質として用いることができる。
【００４０】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特願２０００−３９８３０９号参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。
【００４１】
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。
【００４２】
本実施形態の測定チップ１０は、表面プラズモン共鳴用バイオセンサー用に用いられ、誘電体ブロック１２がプリズムとして機能し、測定の際には、対向する互いに平行でない２つの側面の内の一方から光ビームが入射され、他方から薄膜１４との界面で全反射された光ビームが出射される。
【００４３】
また、本実施形態では、モニター手段として、図２に示すように、光源５４Ａ、第１光学系５４Ｂ、第２光学系５４Ｃ、受光部５４Ｄ、信号処理部５４Ｅ、を含んで構成される測定装置５４が用いられている。光源５４Ａからは、発散状態の光ビームＬが出射される。光ビームＬは、第１光学系５４Ｂを介して、誘電体ブロック１２のモニター部１８に入射される（図６参照）。モニター部１８において、光ビームＬは、薄膜１４と誘電体ブロック１２との界面に対して種々の入射角成分を含み、かつ全反射角以上の角度で入射される。光ビームＬは、誘電体ブロック１２と薄膜１４との界面で全反射される。全反射された光ビームＬは、第２光学系５４Ｃを経て受光部５４Ｄで受光されて、各々光電変換され、光検出信号が信号処理部５４Ｅへ出力される。信号処理部５４Ｅでは、入力された光検出信号に基づいて所定の処理が行なわれ、モニター部１８の全反射減衰角のデータ（以下「全反射減衰データ」という）が求められる。この全反射減衰データが制御部６１へ出力される。
【００４４】
次に、固定化膜１６について説明する。
【００４５】
固定化膜１６としては、薄膜１４の表面と化学結合を生成する化合物が用いられ、分子内に親水性官能基を有することが好ましい。これは、薄膜１４の表面が水溶液中に存在する際に水和層が形成され、水溶液中の物質の非特異的な吸着を防止する効果があるためである。親水性官能基としては、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1及びＲ2は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＣＨＯ、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシドなどが挙げられる。
【００４６】
白金、金、銀から選ばれた材料から成る薄膜１４の表面と化学結合を形成する化合物としては、特に制限はないが分子内に、［化１］に示す化学式を有するいずれかの官能基を有するものなどが挙げられる。特に−ＳＨ、−Ｓ−、または−Ｓ−Ｓ−を有する化合物が好ましい。ジスルフィド化合物が挙げられる。
【００４７】
【化１】
2007212236.tif 000003
【００４８】
これらの化合物はその溶液を、薄膜１４の表面に接触させることで化学結合を形成し、反応時に化学修飾度（製膜状態）をモニターしながら、最適な反応度で反応を終了させる。モニター手段としては、前述の測定装置５４が用いられる。
【００４９】
また、薄膜１４の表面は高分子化合物で表面修飾されていることが好ましい。高分子化合物は親水性化合物でも疎水性化合物でも良い。親水性の高分子化合物としては、アルブミン、カゼインなどの蛋白質、寒天、アルギン酸ナトリウム、デンプン誘導体などの糖誘導体、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロースなどのセルロース化合物、キチン、キトサンなどの多糖類、ポリビニルアルコール、ポリ−Ｎ−ビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸などの合成親水性高分子などが挙げられる。疎水性の高分子化合物としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド、ポリメチルメタクリレート、ポリエステル、ナイロンなどが挙げられる。
【００５０】
親水性高分子化合物の薄膜１４へのコーティングは常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。また薄膜１４の表面と化学結合する分子を介して化学的に結合しても良い。
【００５１】
これらの高分子材料は、化学薬品、カップリング剤、界面活性剤、表面蒸着などを使用した化学処理、加熱、紫外線、放射線、プラズマ、イオンなどを使用した物理的処理から、表面修飾することが可能である。
【００５２】
上記のようにして形成される高分子化合物被膜層は、生理活性物質と共有結合を生成しうる官能基を有して固定化膜１６が構成されていることが好ましい。生理活性物質と共有結合を生成しうる好ましい官能基としては−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1及びＲ2は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＣＨＯ、−ＮＲ3ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、エポキシ基、またはビニル基などが挙げられる。ここで、低級アルキル基における炭素数は特に限定されないが、一般的にはＣ１〜Ｃ１０程度であり、好ましくはＣ１〜Ｃ６である。
【００５３】
高分子化合物被膜層を製膜後、薄膜１４の表面に生理活性物質を固定化することができるよう化学修飾することで、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出することが可能となり有用である。
【００５４】
この化学修飾は、水溶液または有機溶剤に薄膜１４の表面を接触させて官能基を導入することにより行うことができる。ここでも、化学修飾度（製膜状態）をモニターしながら、最適な反応度で反応を終了させる。モニター手段としては、前述の測定装置５４が用いられる。
【００５５】
測定チップ１０の固定化膜１６を製膜するための反応段数には特に制限はないが、反応の段数が多いほど製膜の制御が重要となる。このため、製膜反応の段数が多くなるほど製膜状態をモニターしながら製膜を行うことが好ましい。固定化膜１６の製膜は、以下のようにして行われる。
【００５６】
固定化膜１６の製膜を行うために、図３に示すように、液体貯留用のリアクタ２０が用意される。リアクタ２０は、ゴムで一体成型されており、長尺で、底部側が開放された空間Ｒを構成する流路部材２２を有する。流路部材２２は、図４に示すように、保持部材４８によって誘電体ブロック１２に取り付けられた状態で、図６に示すように、薄膜１４との間に薄膜１４に沿った流路２１を構成する。
【００５７】
図３に示すように、流路部材２２の上面には、ピペットチップＣＰを差し込み可能な注入孔２４が長尺方向に複数（本実施形態では１２個）穿孔されている。また、流路部材２２の一端には、空間Ｒと連通された供給口２６が設けられ、流路部材２２の他端には、空間Ｒと連通された排出口２８が設けられている。
【００５８】
流路部材２２の内側には、流路部材２２の上部から空間Ｒへ突出するリブ２３が、長尺方向に沿って等間隔で形成されている。リブ２３により、流路部材２２の強度が補強されている。また、流路部材の側面の下側は、上側よりも水平方向に突出された凸枠２２Ａを備えている。
【００５９】
図４に示すように、リアクタ２０は、保持部材４８により誘電体ブロック１２上に固定される。保持部材４８は、図５にも示すように、押さえ板４８Ａ、及び、載置板４８Ｂを備えている。載置板４８Ｂの周縁部には、押さえ板４８Ａとの接合用柱４８Ｃが角部に設けられている。
【００６０】
押さえ板４８Ａには、リアクタ２０に沿った長尺の開口４９が構成されている。開口４９からは、図４に示すように、流路部材２２の上側が突出される。また、押さえ板４８Ａの側面には、リアクタ２０の供給口２６及び排出口２８を差し込み可能な連通孔５１が構成されている。図２に示すように、押さえ板４８Ａは、流路部材２２の凸枠２２Ａ上に当接して、リアクタ２０を誘電体ブロック１２上に密着させる。リアクタ２０の保持は、載置板４８Ｂ上に誘電体ブロック１２を載置し、その上へリアクタ２０を被せ、その上から押さえ板４８Ａを被せて連通孔５１へ供給口２６及び排出口２８を差し込むことにより行う。これにより、リアクタ２０は誘電体ブロック１２上に保持され、図６に示すように、薄膜１４と流路部材２２との間に流路２１が構成される。
【００６１】
流路２１には、バッファー液ＢＡを供給／排出するためのバッファー液供給装置が接続される。バッファー液供給装置は、図７に示すように、供給用チューブ６０、切換バルブ６２、貯留部６４、排出用チューブ６６、ペリスタポンプ６８、及び、廃液ボトル６９を備えている。供給用チューブ６０、及び、排出用チューブ６６は、リアクタ２０の供給口２６及び排出口２８へ、各々接続される。貯留部６４は、複数のタンクを備え、切換バルブ６２は、バルブの切換により供給用チューブ６０と連通されるタンクを切り換える。ペリスタポンプ６８は、排出用チューブ６６と接続され、吸引により貯留部６０の洗浄液を供給口２６から流路２１へ流入させ、流入したバッファー液ＢＡを排出口２８から流出させて廃液ボトル６９へ排出させる。
【００６２】
次に、固定化膜１６の製膜手順について説明する。
【００６３】
まず、上記のようにして構成された流路２１へ、バッファー液ＢＡを供給する。バッファー液ＢＡの供給は、ベリスタポンプ６８を作動させ、貯留部６０の洗浄液を供給口２６から流路２１へ流入させることにより行う。そして、測定装置５４を作動させて、図６に示すように、光源５４Ａから光を出射してモニター部１８へ入射させ、反射光を受光部５４Ｄで受光して、モニター部１８における所定時間毎の全反射減衰データを継続的に得る。この全反射減衰データにより、固定化膜１６の膜厚状態を知ることができる。
【００６４】
次に、バッファー液ＢＡの供給を停止し、流路２１へ、固定化膜１６を製膜するための第１製膜物質を含んだ第１溶液Ｙ１を供給する。この供給は、注入孔２４にピペットチップＣＰを差し込んで行う。そして、測定装置５４により得られる全反射減衰データにより所定の膜厚が得られたと判断されるまで待機する。所定の膜厚が得られた後、流路２１へ、再びバッファー液ＢＡを供給して洗浄する。
【００６５】
次に、固定化膜１６を製膜するための第２製膜物質を含んだ第２溶液Ｙ２を供給する。この供給も、注入孔２４にピペットチップＣＰを差し込んで行う。そして、測定装置５４により得られる全反射減衰データにより、所定の膜厚が得られたと判断されるまで待機する。所定の膜厚が得られた後、流路２１へ、再びバッファー液ＢＡを供給して洗浄し、固定化膜１６の製膜が終了する。
【００６６】
本実施形態によれば、固定化膜１６の製膜状態をモニターし、所定の膜圧が得られた後に次の処理へ移行するので、精度よく固定化膜１６を製膜することができる。
【００６７】
また、本実施形態によれば、モニター部１８を測定部Ｅと異なる位置に構成しているので、光の照射により固定化膜１６への影響があった場合（例えば、光の照射、発熱に起因する反応阻害など）でも、実際の生理活性物質ＬＧと検体物質との間の相互作用の測定への影響を防止することができる。
【００６８】
なお、検出法がＱＣＭの場合にも、測定チップのモニター部が高周波数で振動して反応への影響が懸念されるため、モニター部と測定部とは異なる位置であることが好ましい。
【００６９】
また、モニター部１８は、図８に示すように、各測定部Ｅに隣接する位置に複数構成することもできる。このように、各測定部Ｅに対応する位置に複数構成することにより、製膜状態を平均的に測定することができる。
【００７０】
また、本実施形態では、測定チップ１０として、プリズムとして機能する誘電体ブロックを備えたものを使用した例について説明したが、図９に示すように、平板の透明プレート１３上に薄膜１４を形成して、測定チップ１１を構成することもできる。この場合には、別体で測定用のプリズムを使用して、製膜状態のモニターを行う。
【００７１】
また、モニター部１８は、製膜する固定化膜１６の全面積の１０％以下であることが好ましい。これは、モニター部１８と測定部Ｅとを異なる位置に配置することと、測定部Ｅとして必要な面積を考慮したものである。
【００７２】
ところで、通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。
【００７３】
上記のようにして得られた測定チップ１０の表面において、固定化膜１６の官能基を介して生理活性物質ＬＧを共有結合させることによって、薄膜１４に生理活性物質を固定化することができる。
【００７４】
生理活性物質ＬＧを固定化するために、測定チップ１０上に生理活性物質ＬＧを供給するための流路を構成するには、図１０に示すように、誘電体ブロック１２上の固定化膜１６が形成された表面に、流路部材１７を配置する。流路部材１７の下面には固定化膜１６へ露出する流路溝が形成されており、上面に形成された供給口１７Ａ及び排出口１７Ｂと連通されて、固定化膜１６との間に、流路１７Ｃが構成される。流路部材１７を誘電体ブロック１２上に保持するために、保持部材１９が取り付けられ、保持部材１９の上面に接着部材１９Ａを介して蒸発防止部材１９Ｂが取り付けられて、流路部材１７が固定される。
【００７５】
本実施形態の測定チップ１０の表面上に固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【００７６】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原２６、８６、５５、１１１  、１５７  などに対する抗体等を使用することができる。
【００７７】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００７８】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
【００７９】
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
【００８０】
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
【００８１】
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
【００８２】
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
【００８３】
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
【００８４】
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【００８５】
生理活性物質が抗体や酵素などの蛋白質又は核酸である場合、その固定化は、生理活性物質のアミノ基、チオール基等を利用し、固定化膜１６の官能基に共有結合させることで行うことができる。
【００８６】
上記のようにして生理活性物質を固定化した測定チップ１０は、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。
【００８７】
即ち、生理活性物質が固定化された測定チップ１０を用いて、これに被験物質を接触させることにより、測定チップ１０に固定化されている生理活性物質と相互作用する物質を検出及び／又は測定することができる。
【００８８】
被験物質としては例えば、上記した生理活性物質と相互作用する物質を含む試料などを使用することができる。
【００８９】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００９０】
１．測定チップの作製
ゼオネックス（日本ゼオン社製）のペレットを２４０℃で溶解し、この溶融物を射出成型器で縦８ｍｍ×横１２０ｍｍ×１．５ｍｍの基板を成型した。この基板上の縦８ｍｍ×横１２０ｍｍのセンサー側表面に、周端辺１ｍｍ以外が開口したマスクを設置し、平行平板型６インチ用スパッタ装置（ＳＨ−５５０、アルバック（株）社製）を用いて、開口部に金の厚さが５０ｎｍになるようにスパッタ製膜を行ない、金薄膜を形成した。
【００９１】
上記基板の金薄膜形成側に、液体を供給するための流路を構成した。流路は、基板の金薄膜が形成された面の周端辺１ｍｍの領域で接触し、横方向の両端に溶液の入口部と出口部を有し、内部に１ｍｍの厚みで溶液を保持するポリジメチルシロキサン樹脂性の部材を設置して構成した。この基板を特開２００１−３３０５６０号公報の図２２に記載の装置（以下、表面プラズモン装置と呼ぶ）に設置した。
【００９２】
流路内にエタノール／水（８０／２０）溶液を充填し、次いで流路内をエタノール／水（８０／２０）中０．１ｍＭ  １６−カルボキシ−１−ヘキサデカンチオールと、０．９ｍＭ  １１−ヒドロキシ−１−ウンデカンチオール溶液に置換した。２５℃で１時間表面処理を行い、再び流路内をエタノール／水（８０／２０）溶液に置換した。この間表面プラズモン装置で共鳴シグナル（ＲＵ値）変化量の検出を継続し、５分間で、３００ＲＵ変化した後、値に変化はみられなくなり、１６−カルボキシ−１−ヘキサデカンチオールおよび１１−ヒドロキシ−１−ウンデカンチオールの表面修飾が飽和したことを確認した。
【００９３】
次いで流路内に１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との１：１混合液を充填し７分静置した。さらに純水で置換後、ＮＨ2−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（Ｍｗ３４００、ＮＥＣＴＥＲ社製）０．１０ｇを５ｍＮ水酸化ナトリウム水溶液１ｍＬに溶解した溶液で置換した。２５℃で１６時間表面処理を行い、再び流路内を純水で置換した。この間表面プラズモン装置で共鳴シグナル（ＲＵ値）変化量の検出を継続し、６時間で、３０００ＲＵ変化した後、値に変化はみられなくなり、ＮＨ2−ＰＥＧ−ＣＯＯＨの表面修飾が飽和したことを確認した。
【００９４】
流路を基板から外し、本発明の測定チップを得た。以下、上記の表面修飾を行った表面をセンサー面という。
【００９５】
２．低分子化合物の非特異吸着の測定
センサー表面に対する非特異的な蛋白質の吸着は、測定時のノイズの原因となるため、極力少ないほうが好ましい。作製した測定チップを用いて、ＣＧＰ−７４５１４Ａ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（シグマ社製）の非特異吸着性を測定した。ここでは、センサー表面の測定チップ作成時に反応をモニターした部分（モニター部）と異なる場所にポリプロピレン製の部材を被せることにより、幅（縦方向）１ｍｍ、長さ（横方法）７．５ｍｍ、深さ１ｍｍの流路を構成し、この流路が構成された測定チップを、表面プラズモン装置に設置した。ＨＢＳ−Ｎバッファー（ビアコア社製）をセルに添加し２０分間静置後、ＣＧＰ−７４５１４Ａ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ溶液（１０μＭ、ＨＢＳ−Ｎバッファー）を流路に添加し１０分間静置した。なお、ＨＢＳ−Ｎバッファーの組成は、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃＡｃｉｄ）０．０１ｍｏｌ／ｌ（ｐＨ７．４）、ＮａＣｌ０．１５ｍｏｌ／ｌである。１０間静置後の共鳴シグナル（ＲＵ値）に変化は見られず、センサー表面は非特異吸着が極めて低かった。
【００９６】
３．蛋白質・検体化合物間の相互作用の測定
センサー表面に構成した、幅（縦方向）１ｍｍ、長さ（横方法）７．５ｍｍ、深さ１ｍｍの流路内に１−エチルー２、３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（２００ｍＭ）と、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（５０ｍＭ）との混合液で１０分間充填し、次に５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４．５、ビアコア社製）で置換した。次に、ＰｒｏｔｅｉｎＡ（ナカライテスク社製）溶液（１００μｇ／ｍＬ、５０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４．５）をセル内に１０分間充填し、その後５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４．５）で置換した。
【００９７】
さらに、エタノールアミン・ＨＣｌ溶液（１Ｍ、ｐＨ８．５）を１０分間充填した後、５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４．５）で置換することにより、ＰｒｏｔｅｉｎＡと反応せずに残存した活性化ＣＯＯＨ基をブロックした。
【００９８】
さらに、ＮａＯＨ水溶液（１０ｍＭ）を１分間充填した後、ＨＢＳ−ＥＰバッファー（ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃＡｃｉｄ）０．０１ｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．４）、ＮａＣｌ  ０．１５ｍｏｌ／Ｌ、ＥＤＴＡ  ０．００３ｍｏｌ／Ｌ、ｓｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０  ０．００５重量％、ビアコア社製）で置換することにより、センサー表面に非特異的に吸着しているＰｒｏｔｅｉｎＡを除去した。このサンプルをＰｒｏｔｅｉｎＡ固定測定チップと呼ぶ。
【００９９】
ＰｒｏｔｅｉｎＡ固定測定チップを表面プラズモン測定装置にセットした。流路内をＨＢＳ−ＥＰバッファーで満たし、測定を開始した。流路内をｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（コスモバイオ社製）溶液（１０μｇ／ｍＬ、ＨＢＳ−ＥＰバッファー）に置き換え、５分間静置した。５分後、６００ＲＵの信号変化を示し、上記測定チップを用いることで蛋白質と検体物質との相互作用を検出することができた。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】本実施形態の測定チップの斜視図である。
【図２】本実施形態の測定チップに光が照射されている状態を示す断面図と、測定装置の概略ブロック図である。
【図３】本実施形態のリアクタの（Ａ）は上面側から見た斜視図であり、（Ｂ）は下面側から見た斜視図である。
【図４】本実施形態の測定チップ上にリアクタを保持部材を用いて固定した状態を示す斜視図である。
【図５】本実施形態の測定チップ上にリアクタを固定する場合の保持部材との関係を示す分解斜視図である。
【図６】本実施形態のリアクタにより測定チップ上に構成された流路の横断面図である。
【図７】本実施形態の測定チップへ、バッファー液を供給する機構と、製膜用溶液を供給する機構を示す概略図である。
【図８】本実施形態の測定チップの変形例を示す斜視図である。
【図９】本実施形態の測定チップの他の変形例を示す斜視図である。
【図１０】本実施形態の測定チップへ生理活性物質を固定するための流路を構成するための部材を示す分解斜視図である。
【符号の説明】
【０１０１】
１０  測定チップ
１１  測定チップ
１４  薄膜
１６  固定化膜
１８  モニター部
２１  流路
２０  リアクタ
５４  測定装置
Ｅ    測定部
【図１】
2007212236.tif 000004
【図２】
2007212236.tif 000005
【図３】
2007212236.tif 000006
【図４】
2007212236.tif 000007
【図５】
2007212236.tif 000008
【図６】
2007212236.tif 000009
【図７】
2007212236.tif 000010
【図８】
2007212236.tif 000011
【図９】
2007212236.tif 000012
【図１０】
2007212236.tif 000013