(57)【要約】【課題】新しい美白剤を提供することを目的とする。【解決手段】枳実抽出物にチロシナーゼ阻害活性を見出し、メラニン産生抑制作用および細胞賦活作用があることを確認して本発明を完成した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
枳実から抽出した成分を含んでなる美白剤。
【請求項２】
水および／またはエタノールを用いて抽出された成分を含む、請求項１の美白剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然成分、より詳しくは、柑橘類の果実の一種である枳実（キジツ）を有効成分として含有する美白剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
健康で美しい肌を保つことは老若男女を問わず大きな関心事であるが、とりわけ我が国では女性の白い肌に対する憧れは大きい。
人の皮膚の色は、表皮中のメラニン量、毛細血管の血流量、食物由来の色素、角質層の厚さ等種々の因子によって影響を受けるが、中でもメラニン色素が及ぼす影響が重大である。いわゆるシミ、ソバカス、くすみおよび日焼け後の皮膚黒色化等の色素沈着は、皮膚内に存在する色素細胞内のメラニン生成過程の亢進により、角化細胞内にメラニン顆粒が異常蓄積したメラノソーム沈着症と考えることができる。
【０００３】
下式
【化１】
2007063191.tif 000002
はアミノ酸であるチロシンを出発物質として、メラニンが合成される経路を示す。色素細胞内でチロシナーゼの作用によりチロシンが酸化されてドーパ、次いでドーパキノンに変換され、これが更に自動酸化によってドーパクロム、5,6-ジヒドロキシインドールを経由し、インドール5,6-キノンが重合して最終的にメラニン色素が生成される。この反応過程において酵素のチロシナーゼが重要な役割を担っている。
【０００４】
一方、枳実（キジツ）とはミカン科のダイダイまたはナツミカンの未熟果実をそのまま、またはそれを半分に横切りして乾燥させた生薬である。漢方では、飲食停滞による腹部膨満感・腹部の緊張緩解や鎮咳去痰を目的に配合される。また枳実に含まれるフラボノイドのヘスペリジン、ネオヘスペリジン、ナリンギン等にはカラゲニン浮腫抑制等の抗炎症作用が知られているが、枳実についてチロシナーゼ阻害作用や細胞賦活作用は知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は新たな美白剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、枳実抽出物がチロシナーゼ阻害作用を有することを見出し、さらにメラノーマ細胞を用いた試験で実際にメラニンの産生を抑制する効果を確認した。また、細胞賦活作用があることも確認した。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の美白剤は、チロシナーゼ阻害作用、メラニン産生阻害作用および細胞賦活作用を有し、優れた美白効果を有する。そして、本発明美白剤を含有する外用剤はシミ、ソバカス、くすみおよび日焼け後の皮膚黒色化等の色素沈着を予防若しくは改善する効果が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の実施にあたり、枳実は乾燥した未熟果実を適宜粉末化して、または各種溶媒で抽出して用いることができる。抽出溶媒としては、水、エタノール、ヘキサン等が使用できるが、特にエタノール若しくはエタノール−水の混合溶媒が好ましい。
本発明の美白剤は、常法に従って、一般の皮膚外用剤の有効成分として使用することができる。また、その皮膚外用剤の剤型も目的に応じて任意に選択可能であり、例えば化粧水、クリーム、軟膏、乳液、ローション、オイル、溶液、パック等の基礎化粧料、洗顔料や皮膚洗浄料、マッサージ用剤、クレンジング用剤、ファンデーション、口紅、ほお紅、アイシャドウ、アイライナー等のメークアップ化粧料、パップ剤、プラスター剤、テープ剤、シート剤、貼付剤、エアゾール剤、浴用剤等が挙げられる。その配合量は、皮膚外用剤の種類、品質、求められる作用の程度により異なるが、通常、製剤全量中の０．０００１重量％以上の濃度範囲で使用される。好ましくは、０．０１〜５０．０重量％、特に好ましくは０．１〜２０重量％である。
【０００９】
本発明の美白剤は通常の化粧料に使用される他の美白剤と併せて使用することができ、例えば、Ｌ−アスコルビン酸およびその誘導体、ハイドロキノン誘導体、コウジ酸およびその誘導体、および胎盤抽出物等から任意に選択される一種以上の美白剤と混合して使用することができる。
また、その他通常の化粧料に使用される成分、例えば他の細胞賦活剤（ビタミンＡ、ビタミンＢ、胎盤エキス等）、保湿剤（ポリエチレングリコール、ソルビトール、アラビアゴム等）、抗酸化剤（アスコルビン酸、ステアリン酸エステル、トコフェロール等）、活性酸素消去剤（スーパーオキシドディスムターゼ、カタラーゼ、カテキン等）、紫外線吸収促進剤（ベンゾフェノン誘導体、ｐアミノ安息香酸誘導体、メトキシ桂皮酸誘導体）等の成分や、その他美白剤の形態を構成する上で使用が好ましい添加剤を適宜選択して、本発明美白剤と併用することができる。
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれにより何ら制約を受けることはない。
【実施例】
【００１０】
枳実抽出物の調製
枳実(Citrus aurantium L)は中国産の乾燥粉末を用いた。試料粉末１kgを50%エチルアルコール水溶液（以下、５０％エタノール）３リットルに浸漬し、室温にて48時間放置後、ろ過した。ろ液からエタノールを減圧下で留去し、濃縮して100mLの抽出液を得た。この濃縮液をヘキサン500 mLで２回分配し、ヘキサン画分と水画分に分画した。得られたそれぞれの画分は再度減圧濃縮し、ペースト状とした後、評価試験の試料とした(収量；ヘキサン画分5.2g、水画分16.5g)。ヘキサン画分では、リモネン（Limonene）、リナロール（Linalool）、およびシトロプテン（Citroptene）が主要成分として確認された（ＧＣ−ＭＳによる）。水画分では、ナリンギン（Naringin）、ヘスペリジン（Hesperidin）、ナトリルチン（Natrirutin）、およびネオヘスペリジン（Neohesperidin）が主要成分として確認された（HPLCによる）。
【００１１】
チロシナーゼ抑制試験
上記の試料20μLに基質100μLと酵素液20μLをエッペンチューブに入れ、よく混合し37℃のウォーターバス中で15分間反応させた。その後、反応停止液として0.1N-HClを20μL加え475nmの波長で吸光度を測定した。ブランクには基質と試料のかわりに緩衝液を、コントロールには試料のかわりに緩衝液を用いた。また本実験で用いた緩衝液はpH.6.8のリン酸緩衝液、基質はL-ドーパをリン酸緩衝液で溶解して0.1Mとしたもの、酵素はマッシュルーム由来のチロシナーゼを30Uに調整したものである。尚、供試試料の処理濃度はいずれも50μg/mlとした。枳実のヘキサン画分、水画分、５０％エタノール抽出物につきそれぞれのチロシナーゼ阻害活性を測定し、その抑制率を次式により算出して表１に示した。
【００１２】
【数１】
2007063191.tif 000003
【００１３】
【表１】
2007063191.tif 000004
【００１４】
メラニン合成抑制試験
マウス由来のB16メラノーマ細胞を用いて、同細胞内で産生されるメラニン量に及ぼす効果を試験した。
１）細胞播種
5×10４cell/mLの濃度の上記細胞液を10%FBS-MEM培地を用いて調製し、60mmのディッシュに5mLずつ播種した(1サンプルにつき4-5枚試験を行った)。その後、ＣＯ２インキュベータ(37℃、5%ＣＯ２)で24時間培養した。
２）試料添加
サンプルをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で希釈し濾過滅菌した。また、10%FBS-MEM培地100mLあたり4mLのテオフィリン溶液(テオフィリン0.18gを蒸留水で加熱溶解し、完全に溶けたのを確認した後20mLにメスアップして調製)を添加した培地を調製した。そして、ディッシュの培地を除き、先に調製したテオフィリン入り培地を4.5mL添加し、その後、先に調製した試料溶液を500μL添加した。ここで、ブランクにはPBSを500μL添加した。その後、ＣＯ２インキュベータで３日間培養した。
【００１５】
３）メラニン抽出
トリプシン5mLで細胞を洗った後、トリプシン1mLを加え37℃のＣＯ２インキュベータで5分間処理を行った。細胞が完全に剥がれたら培地４mLを添加し、15mL遠沈管に移した。またディッシュに残った細胞はPBSを１mL入れて洗って採取した。その後、250×g (1500rpm)で10分間遠心分離し、上清を除去した。その後、エタノール:ジエチルエーテル=3:1溶液1mLを加えボルテックスミキサーでよく攪拌し、250×g(1500 rpm)で10分間遠心分離し、上清を除去した。その後、ジエチルエーテル１mLで洗い250×g (1500 rpm)で遠心分離し、上清を除去した後、1時間60℃の乾熱滅菌機で乾燥させた。乾燥した沈殿物を10% DMSO、1N NaOH溶液を1 mL加え80-90℃のお湯につけて溶解した。その後、分光光度計で1N NaOHをブランクとして420 nmの吸光度を測定した。
４）結果
コントロール群(0.5% FBS)を100として、各分画の吸光度を同じ比率で比較し、結果をグラフで表した（図１）。
陽性対照薬のアルブチン10 ppmと比べ、枳実の５０％エタノール抽出物1 ppm、および水抽出物1 ppmはほぼ同じような強い抑制作用を示した。
【００１６】
細胞賦活作用
皮膚線維芽細胞（NB1RGB）の細胞増殖率（％）に及ぼす効果を調べることにより、細胞賦活効果を試験した。
１）細胞播種
2.5×10４cell/mLの濃度のNB1RGB細胞液を5% FBS-MEM培地を用いて調製し、96ウェルプレートに200μLずつ播種した。その後、ＣＯ２インキュベータ(37℃、5%ＣＯ２)で24時問培養した。
２）試料添加
試料を0.5% FBS-MEM培地で希釈し濾過滅菌した。そして、96ウェルプレートの培地を除き、0.5% FBS-MEM培地を100μL添加した。その後、先に調製した試料溶液を100μL添加した。ここで、ブランクには0.5% FBS-MEM培地を100μL添加し、陽性対照としては、アルブチンを5% FBS-MEM培地で希釈して添加した。その後、ＣＯ２インキュベータで７日間培養した。
【００１７】
３）ニュートラルレッド染色
50μL/mLのニュートラルレッド200μLを5% FBS-MEM培地19.8mLに加えた培地を調製した。96ウェルプレートの培地を除き、この培地を200μL添加し、ＣＯ２インキュベータで２時間培養した。
４）細胞増殖率測定
培地を捨て、細胞を固定するために1%CaC1２−1%ホルマリン溶液(10% CaC1２10mL、ホルムアルデヒド2.7mL、および蒸留水87.3mLで調製)100μLを添加し、１分間攪拌した。その後、ニュートラルレッドを抽出するため1%酢酸−50%エタノール(酢酸1mL、エタノール50mL、および蒸留水49mLで調製)100μLを添加し、15分間攪拌した。その後、マイクロプレートリーダーで570nm(バックグラウンド600nm)の吸光度を測定し、細胞の増殖率（％）を計算した。
５）結果
コントロール群（0.5%FBS）を１００として、各分画の吸光度を同じ比率で表し、細胞増殖率（％）としてグラフに示した（図２）。
陽性対照薬のアルブチン100ppmと比べ、枳実の５０％エタノール抽出物100ppm、水抽出物10ppmはやや活性が弱いが、コントロール群より2.5‐3倍強い細胞賦活活性を示した。
【産業上の利用可能性】
【００１８】
本発明の美白剤はメラニン産生抑制作用および細胞賦活作用を有するため、皮膚外用剤に配合して美白・美肌効果を有する化粧料を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】枳実抽出物のメラニン合成抑制効果を示す。グラフの横棒は細胞内におけるメラニン合成比率を対照を１００として表した。
【図２】枳実抽出物の細胞賦活効果を示す。グラフの横棒は細胞生存率を対照を１００として表した。
【符号の説明】
【００２０】
図１および図２において、以下のとおりである。
Ａ：枳実のヘキサン画分
Ｂ：枳実の水画分
Ｃ：枳実の５０％エタノール抽出物
【図１】
2007063191.tif 000005
【図２】
2007063191.tif 000006