(57)【要約】【課題】リンフォトキシン−βレセプターのシグナリングを活性化し、次いで、腫瘍細胞において強力な抗増殖効果を誘発するために有用な組成物および方法の提供。【解決手段】新形成の発達、重篤性または効果を処置または減少させるための方法であって、LT−α/βヘテロメリック複合体の治療的有効量ならびに薬学的に受容可能なキャリアを投与する工程を包含する、方法であって、１つの実施形態において、上記LT−α/βヘテロメリック複合体が、ＬＴ−α１／β２ヘテロメリック複合体であり、また、別の実施形態において、上記LT−α/βヘテロメリック複合体が、可溶性LT−α/βヘテロメリック複合体である、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載されるような、抗腫瘍因子としてのリンフォトキシン−α/β複合体および抗リンフォトキシン−βレセプター抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、リンフォトキシン−βレセプターのシグナリングを活性化し、次いで、腫瘍細胞において強力な抗増殖効果を誘発するために有用な組成物および方法に関する。より詳細には、本発明は、リンフォトキシン−αと複数のサブユニットのリンフォトキシン−βとの間で形成されるリンフォトキシンヘテロメリック複合体に関する。このヘテロメリック複合体は、リンフォトキシン−βレセプター活性化因子の存在下で腫瘍細胞における細胞傷害性効果を誘導する。本発明の範囲にはまた、リンフォトキシン−α/β複合体の存在下または非存在下のいずれかで、単独で、または他のリンフォトキシン−βレセプター活性化因子と組み合わせて、リンフォトキシン−βレセプター活性化因子として作用するリンフォトキシン−βレセプターに対する抗体が含まれる。このような抗体を選択するためのスクリーニング方法を提供する。本発明はまた、他のリンフォトキシン−βレセプター活性化因子の存在下で、架橋した抗リンフォトキシン−βレセプター抗体を用いて腫瘍細胞の細胞傷害性を増強するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
腫瘍壊死因子（TNF）レセプターファミリーは、そのシグナリングが壊死またはアポトーシス（プログラムされた細胞死）による腫瘍細胞死を誘導し得るいくつかのメンバーを有する。リガンドであるTNFおよびリンフォトキシン−α（LT−α；以前はTNF−βと呼ばれた）は、TNFレセプター（p60およびp80；本明細書中では「TNF−R」と呼ぶ）に結合し、それを活性化する。TNF−Rシグナリングは、正常細胞において感染またはストレスに対する全身性の免疫応答を開始するが、形質転換された表現型を有する細胞または腫瘍細胞に対して細胞傷害性である。TNF−Rシグナリングは、腫瘍細胞およびウイルス感染細胞を選択的に溶解し得る。腫瘍細胞におけるTNF−Rシグナリングの細胞傷害性効果は、インターフェロン−γ（IFN−γ）および種々の従来の化学療法剤によって増強される。
【０００３】
治療目的のために腫瘍細胞においてTNF−Rシグナリングによって誘導される抗増殖活性または細胞傷害性活性を利用することは、有用であるだろう。しかし、TNF−R活性化は、前炎症性（proinflammatory）カスケードの開始を含む、種々の免疫調節応答における他面発現性効果を有する。従って、ヒトにおいて全身的毒性に至る同時刺激炎症反応を伴わずに腫瘍細胞に対しTNF−Rシグナリングの細胞傷害性効果を指向させることは可能ではなかった。
【０００４】
同様に、Fasレセプター（FasR）と呼ばれる別のTNF−関連レセプターの刺激は、種々の腫瘍細胞型および非腫瘍細胞型の両方において、プログラムされた細胞死による細胞傷害性を引き起こし得る。しかし、FasRの活性化は、急速な肝臓壊死を引き起こすことが示されており、従って、ヒトにおけるその治療的適用を妨げている。
【０００５】
近年、LT−βレセプター（LT−β−R）と呼ばれるTNFファミリー内の別のレセプターが同定された（Croweら、Science,  264,  707−10頁  (1994)）。LT−β−Rは、リンフォトキシン−β（LT−β）と呼ばれる別のTNF−関連ポリペプチドと共にLT−αサブユニットを含むヘテロメリックリンフォトキシン複合体LT−α/βを結合する。これらのLT−α/β複合体は、膜結合性であり、そしてほとんどは、LT−α1/β2化学量論を有する（Browningら、Cell,  72  847−56頁  (1993);  Browningら、J.  Immunol.,  154,  33−46頁  (1995)）。
【０００６】
TNF−Rおよび他のTNF様レセプターに類似していることにより、LT−β−Rシグナリングの活性化は、細胞表面上の多数のレセプターが極めて接近したときに生じると考えられる（Croweら、Science,  264,  707−10頁  (1994)）。このプロセスは、レセプタークラスタリングといわれる。TNFおよびLTリガンドは、１つより多くのレセプターに同時に結合し、従って、それらを集合させ得る多価複合体である。他の系においてレセプター活性化のための手段としてのレセプタークラスタリングは、特にレセプターチロシンキナーゼについて、十分に立証されている（UllrichおよびSchlessinger,  Cell,  61,  203−212頁  (1990);  Kolanusら、Cell,  74,  171−83頁  (1993)）。従って、標的腫瘍細胞の表面におけるLT−β−R分子のクラスタリングおよび下流のシグナリングを誘導し得るLT−α1/β2リガンドおよび/またはLT−β−R活性化因子を投与することは、これらの細胞におけるLT−β−R経路を直接的に刺激するために有用であろう。
【０００７】
LT−β−Rによるシグナリングは、TNF−Rのように、腫瘍細胞において細胞傷害性および細胞死に至る経路を活性化し得る。重要なことに、LT−α1/β2リガンドは、顕著な親和性でTNF−Rに結合するわけではない。この理由のため、腫瘍細胞において指向されたLT−β−R活性化は、TNF−α活性化と関連した炎症性経路を刺激することなく、これらの細胞において細胞傷害性を引き起こすだろう。従って、LT−α1/β2および/または他のLT−β−R活性化因子での処置は、TNF−RまたはFasR活性化が抗腫瘍処置として試みられたときに生じた強力な副作用の問題を克服すると同時に、腫瘍形成細胞（新形成）の発達、重篤性、または効果を処置または減少させるために有用であるだろう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によって、以下が提供される：
（１）新形成の発達、重篤性または効果を処置または減少させるための方法であって、LT−α/βヘテロメリック複合体の治療的有効量ならびに薬学的に受容可能なキャリアを投与する工程を包含する、方法。
（２）前記LT−α/βヘテロメリック複合体が、ＬＴ−α１／β２ヘテロメリック複合体である、項目１に記載の方法。
（３）項目１に記載の方法であって、ここで、前記LT−α/βヘテロメリック複合体が、可溶性LT−α/βヘテロメリック複合体である、項目１に記載の方法。
（４）項目１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記LT−αが、天然のヒトまたは動物リンフォトキシン−α、組換えリンフォトキシン−α、可溶性リンフォトキシン−α、分泌されたリンフォトキシン−α、LT−α生物活性を有するリンフォトキシン−αムテイン、またはこれらのうちいずれかのリンフォトキシン−αフラグメントであって、LT−α生物活性を有するフラグメントからなる群より選択される、方法。
（５）項目１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記LT−βが、天然のヒトまたは動物リンフォトキシン−β、組換えリンフォトキシン−β、可溶性リンフォトキシン−β、分泌されたリンフォトキシン−β、LT−β生物活性を有するリンフォトキシン−βムテイン、またはこれらのうちいずれかのリンフォトキシン−βフラグメントであって、LT−β生物活性を有するフラグメントからなる群より選択される、方法。
（６）項目３に記載の方法であって、前記ＬＴ−βサブユニットがアミノ酸４４と８８との間で切断され、そのＮ末端部分がＩ型リーダー配列で置換されている、方法。
（７）項目６に記載の方法であって、前記Ｉ型リーダー配列が、血管細胞接着分子−1（VCAM−1）リーダー配列である、方法。
（８）項目１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、前記LT−α/βヘテロメリック複合体は少なくとも１つのLT−β−R活性化因子の治療的有効量の存在下で投与される、方法。
（９）１つのLT−β−R活性化因子が治療的有効量のIFN−γを含む、項目８に記載の方法。
（１０）第２のLT−β−R活性化因子が治療的有効量の抗LT−β−R抗体を含む、項目９に記載の方法。
（１１）前記抗LT−β−R抗体がモノクローナル抗体である、項目１０に記載の方法。
（１２）前記抗LT−β−Rモノクローナル抗体が、抗LT−β−R  mAb  BKA11、CDH10、BCG6およびBHA10からなる群から選択される、項目１１に記載の方法。
（１３）新形成の発達、重篤性、または効果を処置または減少させるための方法であって、少なくとも１つのLT−β−R活性化因子の治療的有効量および薬学的に受容可能なキャリアを投与する工程を包含する、方法。
（１４）少なくとも１つのLT−β−R活性化因子が抗LT−β−R抗体を含む、項目１３に記載の方法。
（１５）前記抗LT−β−R抗体がCBE11である、項目１４に記載の方法。
（１６）LT−β−Rの重複しないエピトープに対して指向された、少なくとも２つの抗LT−β−Rモノクローナル抗体を含む、項目１３に記載の方法。
（１７）１つの抗LT−β−Rモノクローナル抗体が、AGH1およびBDA8からなる群から選択され、そして別の抗LT−β−Rモノクローナル抗体が、BCG6、BHA10、BKA11、CDH10、およびCBE11からなる群から選択される、項目１６に記載の方法。
（１８）１つの抗LT−β−Rモノクローナル抗体が、BCG6およびBHA10からなる群から選択され、そして別の抗LT−β−Rモノクローナル抗体が、AGH1、BDA8、BKA11、CDH10、およびCBE11からなる群から選択される、項目９に記載の方法。
（１９）１つの抗LT−β−Rモノクローナル抗体が、BKA11およびCDH10からなる群から選択され、そして別の抗LT−β−Rモノクローナル抗体が、AGH1およびBDA8、BCG6、BHA10、およびCBE11からなる群から選択される、項目１６に記載の方法。
（２０）１つの抗LT−β−Rモノクローナル抗体がCBE11であり、そして別の抗LT−β−Rモノクローナル抗体が、AGH1、BDA8、BCG6、BHA10、BKA11、CDH10、およびCBE11からなる群から選択される、項目１６に記載の方法。
（２１）前記抗LT−β−Rモノクローナル抗体がCBE11およびBHA10である、項目１６に記載の方法。
（２２）前記抗LT−β−Rモノクローナル抗体がCBE11およびCDH10である、項目１６に記載の方法。
（２３）前記抗LT−β−Rモノクローナル抗体がAGH1およびCDH10である、項目１６に記載の方法。
（２４）１つのLT−β−R活性化因子がIFN−γである、項目１３〜２３のいずれかに記載の方法。
（２５）新形成の発達、重篤性、または効果を処置または減少させるための方法であって、第２のLT−β−R活性化因子および薬学的に受容可能なキャリアの存在下で、第１のLT−β−R活性化因子として架橋した抗LT−β−R抗体の治療的有効量を投与する工程を包含する、方法。
（２６）前記架橋した抗LT−β−R抗体が表面上で非共有結合的に固定化される、項目２５に記載の方法。
（２７）前記架橋した抗LT−β−R抗体が表面上で共有結合的に固定化される、項目２５に記載の方法。
（２８）前記架橋した抗LT−β−R抗体が、抗LT−β−R抗体架橋剤により溶液中で非共有結合的に集合する、項目２５に記載の方法。
（２９）前記抗LT−β−R抗体架橋剤が、前記抗LT−β−R抗体に対する２次抗体を含む、項目２８に記載の方法。
（３０）前記抗LT−β−R抗体架橋剤が、抗LT−β−R抗体に結合するFcレセプターを含む、項目２８に記載の方法。
（３１）前記架橋した抗LT−β−R抗体が、化学的抗LT−β−R抗体架橋剤により溶液中で共有結合的に集合する、項目２５に記載の方法。
（３２）前記第２のLT−β−R活性化因子がIFN−γを含む、項目２５〜３１のいずれかに記載の方法。
（３３）新形成の発達、重篤性、または効果を処置または減少させるための方法であって、少なくとも１つのLT−β−R活性化因子の治療的有効量および薬学的に受容可能なキャリアを投与する工程を包含する、方法。
（３４）少なくとも１つのLT−β−R活性化因子が抗LT−β−R抗体を含む、項目３３に記載の方法。
（３５）前記抗LT−β−R抗体がCBE11である、項目３４に記載の方法。
（３６）LT−α/βヘテロメリック複合体の存在下で作用するLT−β−R活性化因子を選択するための方法であって、以下の工程：
a)LT−α/βヘテロメリック複合体、有効量の第１のLT−β−R活性化因子、および第２の推定のLT−β−R活性化因子の存在下で腫瘍細胞を培養する工程；および
b)該第２の推定のLT−β−R活性化因子が、該第１のLT−β−R活性化因子の存在下で該LT−α/βヘテロメリック複合体の抗腫瘍活性を増大するかどうかを決定する工程、
を包含する、方法。
（３７）前記第１のLT−β−R活性化因子がIFN−γである、項目２９に記載の方法。
（３８）前記LT−α/βヘテロメリック複合体がLT−α1/β2化学量論を有する、項目２９に記載の方法。
（３９）薬学的組成物であって、
治療有効量のＬＴ−α／βヘテロメリック複合体複合体および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（４０）前記ＬＴ−α／βヘテロメリック複合体が、LT−α/β化学量論を有する、項目３９に記載の薬学的組成物。
（４１）前記ＬＲ−α／βヘテロメリック複合体が、可溶性である、項目３９に記載の薬学的組成物。
（４２）少なくとも１つのLT−β−R活性化因子の治療的有効量をさらに含有する、項目３９〜４１のいずれかに記載の薬学的組成物。
（４３）１つのLT−β−R活性化因子がIFN−γである、項目４２に記載の薬学的組成物。
（４４）１つのLT−β−R活性化因子が抗LT−β−R抗体である、項目４２に記載の薬学的組成物。
（４５）前記抗LT−β−R抗体がモノクローナル抗体である、項目４４に記載の薬学的組成物。
（４６）前記抗LT−β−Rモノクローナル抗体が、抗LT−β−R  mAb  BKA11、CDH10、BCG6、およびBHA10からなる群から選択される、項目４５に記載の薬学的組成物。
（４７）外因性のLT−α/βヘテロメリック複合体を含まない少なくとも２つのLT−β−R活性化因子の治療的有効量、および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
（４８）少なくとも１つのLT−β−R活性化因子が抗LT−β−R抗体を含む、項目４７に記載の薬学的組成物。
（４９）前記抗LT−β−R抗体がモノクローナル抗体である、項目４８に記載の薬学的組成物。
（５０）前記抗LT−β−Rモノクローナル抗体がCBE11である、項目４９に記載の薬学的組成物。
（５１）少なくとも２つのLT−β−R活性化因子が、LT−β−Rの重複しないエピトープに対して指向された抗LT−β−Rモノクローナル抗体を含む、項目４７に記載の薬学的組成物。
（５２）１つの抗LT−β−Rモノクローナル抗体が、AGH1およびBDA8からなる群から選択され、ならびに別の抗LT−β−Rモノクローナル抗体が、BCG6、BHA10、BKA11、CDH10、およびCBE11からなる群から選択される、項目５１に記載の薬学的組成物。
（５３）１つの抗LT−β−Rモノクローナル抗体が、BCG6およびBHA10からなる群から選択され、ならびに別の抗LT−β−Rモノクローナル抗体が、AGH1、BDA8、BKA11、CDH10、およびCBE11からなる群から選択される、項目５１に記載の薬学的組成物。
（５４）１つの抗LT−β−Rモノクローナル抗体が、BKA11およびCDH10からなる群から選択され、ならびに別の抗LT−β−Rモノクローナル抗体が、AGH1およびBDA8、BCG6、BHA10、およびCBE11からなる群から選択される、項目５１に記載の薬学的組成物。
（５５）１つの抗LT−β−Rモノクローナル抗体がCBE11であり、および別の抗LT−β−Rモノクローナル抗体が、AGH1、BDA8、BCG6、BHA10、BKA11、CDH10、およびCBE11からなる群から選択される、項目５１に記載の薬学的組成物。
（５６）前記抗LT−β−Rモノクローナル抗体が、CBE11およびBHA10である、項目５１に記載の薬学的組成物。
（５７）前記抗LT−β−Rモノクローナル抗体が、CBE11およびCDH10である、項目５１に記載の薬学的組成物。
（５８）前記抗LT−β−Rモノクローナル抗体が、AGH1およびCDH10である、項目５１に記載の薬学的組成物。
（５９）前記LT−β−R活性化因子の１つとしてIFN−γをさらに含有する、項目５１〜５８のいずれかに記載の薬学的組成物。
（６０）LT−β−R活性化因子としての治療的有効量の架橋した抗LT−β−R抗体、および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
（６１）前記架橋した抗LT−β−R抗体が表面上で非共有結合的に固定化された、項目６０に記載の薬学的組成物。
（６２）前記架橋した抗LT−β−R抗体が表面上で共有結合的に固定化された、項目６０に記載の薬学的組成物。
（６３）前記架橋した抗LT−β−R抗体が、抗LT−β−R抗体架橋剤により溶液中で非共有結合的に集合する、項目６０に記載の薬学的組成物。
（６４）前記抗LT−β−R抗体架橋剤が、前記抗LT−β−R抗体に対する２次抗体を含む、項目６３に記載の薬学的組成物。
（６５）前記架橋した抗LT−β−R抗体が、化学的抗LT−β−R抗体架橋剤により溶液中で共有結合的に集合する、項目６０に記載の薬学的組成物。
（６６）第２のLT−β−R活性化因子としてIFN−γをさらに含有する、項目６０〜６５のいずれかに記載の薬学的組成物。
（６７）外因性のLT−α/βヘテロメリック複合体を含まない少なくとも１つのLT−β−R活性化因子の治療的有効量、および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
（６８）少なくとも１つのLT−β−R活性化因子が抗LT−β−R抗体を含む、項目６７に記載の薬学的組成物。
（６９）前記抗LT−β−R抗体がCBE11である、項目６７に記載の薬学的組成物。
（７０）項目３６に記載の方法により選択された、LT−β−R活性化因子。
【０００９】
発明の要旨
本発明は、TNF−Rに関連した炎症反応の同時刺激を伴わずに、LT−β−Rシグナリングを刺激することによって腫瘍細胞を処置するための薬学的組成物および方法を提供することにより、上記の問題を解決する。１つの実施態様において、LT−αと複数のLT−βのサブユニットとの間に形成されるリンフォトキシン複合体（LT−α/βヘテロメリック複合体）が提供される。これは、LT−β−R活性化因子の存在下で、LT−β−Rを有する細胞において細胞傷害性効果を誘導する。本実施態様の好ましい組成物および方法は、LT−β−R活性化因子の存在下でのLT−α1/β2複合体を含む。より好ましくは、LT−α1/β2複合体は、膜結合形態よりもむしろ可溶性形態であり、そしてLT−β−R活性化因子は、IFN−γである。
【００１０】
本発明の別の実施態様において、LT−β−Rに対する少なくとも１つの抗体（抗LT−β−R  Ab）が、LT−α/βヘテロメリック複合体と共に、第２のLT−β−R活性化因子として用いられる。本実施態様の好ましい組成物および方法は、第１の活性化因子としてのIFN−γ、および第２のLT−β−R活性化因子としての少なくとも１つの抗LT−β−R  Abの存在下でのLT−α1/β2によって特徴付けられる。より好ましくは、LT−α1/β2複合体は可溶性であり、そして抗体はモノクローナル抗体（抗LT−β−R  mAb）である。
【００１１】
本発明の別の実施態様において、第２のLT−β−R活性化因子の存在下または非存在下での少なくとも１つの抗LT−β−R  Abは、外因性のLT−α/βヘテロメリック複合体を伴わずに用いられる。本実施態様の好ましい組成物および方法は、少なくとも２つの抗LT−β−Rモノクローナル抗体（抗LT−β−R  mAb）を含み、これは、IFN−γと共同してLT−β−Rの重複しないエピトープを認識する。
【００１２】
さらなる実施態様において、本発明は、第２のLT−β−R活性化因子と共に使用される架橋された抗LT−β−R  Abによって特徴付けられる腫瘍細胞細胞傷害性を増強するための薬学的組成物および方法を提供する。１つの好ましい実施態様において、個々の抗LT−β−R  Abを表面上に架橋することによって固定化する。別の実施態様において、抗LT−β−R  Abを溶液中で架橋する。より好ましくは、抗LT−β−R  Abはモノクローナル抗体であり、そして第２のLT−β−R活性化因子はIFN−γである。
【００１３】
本発明はさらに、腫瘍細胞死を促進するLT−α/βヘテロメリック複合体と共同して機能する、抗LT−β−R  AbのようなLT−β−R活性化因子を選択するための新規のスクリーニングプロセスを提供する。このアッセイは、細胞傷害性アッセイにおけるLT−β−R活性化因子の存在下でのLT−α/βヘテロメリック複合体に対するヒト腺癌細胞の増大した感受性を利用する。推定のLT−β−R活性化因子をテストするために用いられる手順を、抗LT−β−R抗体の場合について例証する。この手順は以下の工程を含む：
１）腫瘍細胞（例えば、HT29ヒト腺癌細胞）を、IFN−γを含有する培地中で数日間培養し、そして、アッセイされる特定の抗LT−β−R  Abの存在下または非存在下でLT−α1/β2を精製する；
２）細胞を、生細胞を染色する色素で処理する；そして
３）各サンプルにおいて、染色された細胞の数を定量して、LT−α1/β2、IFN−γ、およびテスト抗LT−β−R  Abの存在下で殺傷された腫瘍細胞の割合を決定する。あるいは、生存細胞の数を、細胞生存力を測定する多くの周知のアッセイ（例えば、DNAへの3H−チミジンの取り込み）のいずれかにより決定し得る。
【００１４】
このアッセイにおいて殺傷される腫瘍細胞の割合を顕著に増加する抗LT−β−R  Ab（またはAbの組み合わせ）は、本発明の範囲内のLT−β−R活性化因子である。この細胞傷害性アッセイは、LT−α/βヘテロメリック複合体と共同して機能する新規のLT−β−R活性化因子を同定するために適用され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本明細書に記述する発明が完全に理解され得るように、以下に詳細な説明を記載する。
【００１６】
用語「抗腫瘍活性」は、ある物質または組成物が、その物質または組成物と相互作用する腫瘍細胞の増殖をブロックするか、もしくはその腫瘍細胞の死を誘導する能力をいう。
【００１７】
用語「アポトーシス」は、プログラムされた細胞死の過程をいう。
【００１８】
用語「細胞傷害性活性」は、ある物質または組成物が、その物質または組成物と相互作用する細胞の死を誘導する能力をいう。
【００１９】
用語「エピトープ」（または抗原決定基）は、抗体分子上の単一の抗原結合部位と結合する、分子の部分と定義される。モノクローナル抗体（mAb）は、単一のエピトープを認識する。ポリクローナル抗体（Ab）は通常、複数のエピトープを認識する。
【００２０】
抗体の「Fcドメイン」とは、CH2、CH3、およびヒンジ領域を含むが、抗原結合部位を欠く、その分子の一部をいう。
【００２１】
用語「インターフェロン誘導因子」は、I型インターフェロン（IFN−α、IFN−β）またはII型インターフェロン（IFN−γ）のいずれかの内因性の産生を直接的または間接的に刺激し得る任意の因子をいう。インターフェロン誘導因子の例には、二本鎖RNA分子および種々の植物由来化合物または医薬由来化合物が含まれる。
【００２２】
用語「LT−αムテイン」および「LT−βムテイン」は、対応する天然ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸変化を有するLT−αまたはLT−βポリペプチドをいう。
【００２３】
用語「LT−β−R活性化因子」は、LT−β−Rに結合するリガンド、細胞表面LT−β−RクラスタリングまたはLT−β−Rシグナリングを増加させ得る任意の因子、もしくはLT−β−Rシグナルが細胞内で通訳される程度に影響を与え得る任意の因子をいう。LT−β−R活性化因子の例には、IFN−α、IFN−γ、TNF、インターフェロン誘導因子、可溶性抗LT−β−R  Ab、架橋した抗LT−β−R  Ab、および多価抗LT−β−R  Abが含まれる。
【００２４】
用語「LT−β−Rシグナリング」は、LT−β−R経路に関係する全ての分子反応、およびその結果生じる以降の分子反応をいう。
【００２５】
用語「抗LT−βレセプター抗体」（「抗LT−β−R  Ab」）は、LT−βレセプターの少なくとも１つのエピトープを認識し、そしてそれに結合する任意の抗体をいう。
【００２６】
用語「抗LT−βレセプターモノクローナル抗体」（「抗LT−β−R  mAb」）は、LT−β−Rの単一のエピトープを認識し、そしてそれに結合する任意のモノクローナル抗体をいう。
【００２７】
用語「架橋した抗LT−β−R（m）Ab」は、抗LT−β−R抗体（AbまたはmAb）架橋剤を用いて互いに架橋されて溶液中で抗体の塊りを形成しているか、または表面もしくはマトリックスに互いに極めて接近して固定化されている、LT−β−Rに対する抗体をいう。
【００２８】
用語「抗LT−β−R  Ab（またはmAb）架橋剤」は、抗LT−β−R  Abが標的細胞表面LT−βレセプターに結合し、そのクラスタリングを増強し得るように、溶液中で抗LT−β−R  Abを共有結合的または非共有結合的に集合させ得る任意の薬剤をいう。そのような架橋剤には、化学的架橋剤、抗LT−β−R  AbまたはmAbの一部と反応する二次抗体、および抗LT−β−R  Abに結合し得る（内因性または添加された外因性のいずれかの）可溶性または表面結合性Fcレセプターが含まれるが、これらに限定されない。
【００２９】
用語「LT−α生物活性」、「LT−β生物活性」、および「LT−α/β生物活性」は、次のように定義される：１）対応する天然のサブユニットまたはサブユニットの複合体の少なくとも１つのエピトープに対する抗体との免疫学的交差反応性；あるいは２）そのLTサブユニットまたはサブユニットの複合体が、TNF−RまたはLT−β−RのようなLT特異的レセプター上のリガンド結合部位に関して競合する能力；あるいは３）天然のLTサブユニットまたは複合体と質的に共通する免疫調節応答または細胞傷害性活性を刺激する能力を有すること。
【００３０】
用語「LT−α/βヘテロメリック複合体」は、少なくとも１つのLT−αサブユニットと１つより多くのLT−βサブユニットとの間の安定な会合体をいう。これらのサブユニットは静電気相互作用、ファンデルワールス相互作用、または共有結合相互作用によって会合し得る。LT−α/βヘテロメリック複合体は、少なくとも２つの隣接するLT−βサブユニットを有し、かつ隣接するLT−αサブユニットを欠くことが好ましい。この複合体がLT−α1/β2化学量論を有することが最も好ましい。
【００３１】
用語「多価リガンド」は、１つより多くのレセプター結合部位を有し、かつ少なくとも２つのレセプター分子に同時に結合し、そしてそれらを極めて接近させ得る分子または複合体をいう。
【００３２】
「I型リーダー配列」とは、真核生物タンパク質のアミノ末端部分であって、そのタンパク質を小胞体（ER）膜に、そしてしばしば全分泌経路に送るためのシグナルとして機能する。通常、リーダー配列は、ER膜中のシグナルぺプチダーゼによって切除される。
【００３３】
「シグナル配列」は、真核生物Ｉ型リーダー配列の原核生物宿主における機能的等価物であり、そしてタンパク質の細菌の脂質二重層膜中への移動、または細菌の脂質二重層膜の向こう側への移動を指示する。
【００３４】
「可溶性LT−α/βヘテロメリック複合体」とは、ポリペプチドを膜に局在化させるアミノ酸配列が削除または不活化され、LT−βサブユニットが可溶性になっている、可溶性LT−βサブユニットを含むLT−α/βヘテロメリック複合体である。可溶性LT−α/βヘテロメリック複合体は、両サブユニットを発現するように操作された適切な宿主細胞によって分泌され得る。
【００３５】
「表面LT−α/β複合体」とは、LT−αサブユニットおよび膜結合性LT−βサブユニットを含み、細胞表面に提示される複合体である。
【００３６】
膜結合性LT−α/β複合体の産生
細胞表面リンフォトキシン複合体は、高レベルのLTを発現するCD4＋T細胞ハイブリドーマ細胞（II−23.D7）中で特徴づけられている（Browningら,  J.  Immunol.,  147,  1230−37頁（1991）；Androlewiczら,  J.  Biol.  Chem.,  267,  2542−47頁（1992））。成熟LT−αは膜貫通ドメインを欠き、そして少なくとも１つの膜結合性LT−βサブユニットとの相互作用を介して、細胞表面に局在化している。膜結合性（表面）LT−α/βヘテロメリック複合体は、主としてLT−α1/β2化学量論を有する。
【００３７】
細胞膜タンパク質としてのLT−βは合成の間にLT−αに結合し、従って、LT−αを細胞膜に「標的化」する。LT−βの不在下では、LT−αは細胞外培地に分泌される。通常は、膜へのタンパク質輸出に先立って、LTサブユニットは細胞の内側で複合体に会合する。LT−βサブユニットが一旦膜に挿入されると、それらは分泌されたLT−αと安定な複合体を形成しない。従って、膜結合型のLT−α/βヘテロメリック複合体が所望であれば、所望のLT−αサブユニットとLT−βサブユニットとを同じ細胞内で同時発現させることが好ましい。
【００３８】
表面LT−α/βヘテロメリック複合体は、宿主細胞をLT−α遺伝子およびLT−β遺伝子の両方で同時にトランスフェクションすることによって、再構築され得る。表面LT複合体は、どちらかのLT遺伝子のみを発現する安定な細胞株において観察され得ない。しかし、宿主細胞が通常大量のLT−αを産生する場合（例えばRPMI  1788細胞；下記参照）、所望のLT−βポリペプチドをコードするLT−β遺伝子を用いたトランスフェクションは、完全長LT−αサブユニットを含むLT−α/β複合体を作製するのに十分であるはずである。
【００３９】
多くの真核生物発現系におけるLT−αポリペプチドとLT−βポリペプチドとの同時発現は、それらの会合および活性なリガンドとしての輸出とを導く（Croweら,  J.  Immunol.  Methods,  168,  79−89頁（1994））。使用され得る宿主系には、CHO細胞、COS細胞、Ｂ細胞（骨髄腫を含む）、バキュロウイルス感染昆虫細胞、および酵母が含まれるが、これらに限定されない。
【００４０】
本発明のLT−α/βヘテロメリック複合体のLT−αサブユニットは、リンフォトキシン−α、天然のヒトまたは動物リンフォトキシン−α、組換えリンフォトキシン−α、可溶性リンフォトキシン−α、分泌されたリンフォトキシン−α、LT−α生物活性を有するリンフォトキシン−αムテイン、またはLT−α生物活性を有する上記のうちのいずれかのリンフォトキシン−αフラグメントから選択され得る。
【００４１】
LT−αポリペプチドは、その活性フラグメントを含む分子の任意の可溶性形態であり得、天然のLT−αリーダー配列が切除される真核生物発現系内で産生され得る。あるいは、成熟LT−α配列の異種シグナル配列との融合物を使用して、他の宿主系におけるLT−αの分泌を最大にし得る。シグナルは意図する宿主細胞に基づいて選択され、そしてこれには細菌配列、酵母配列、哺乳類配列、およびウイルス配列が含まれ得る。天然のシグナルまたは血管細胞接着分子−1（VCAM−1）シグナル配列が、哺乳類発現系での使用に適している。
【００４２】
LT−αポリペプチドはまた、長い血漿半減期を持つポリペプチド（例えば免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント）に融合され得る。血漿半減期を増大させるために使用され得る血漿タンパク質には、血清アルブミン、免疫グロブリン、アポリポタンパク質、およびトランスフェリンが含まれる。ポリエチレングリコール（PEG）の連結は、ポリペプチドを安定化し、そしてその免疫原性を低下させ得る。LT−α融合タンパク質が処置されるべき被験体において有意に免疫原性でなく、そして血漿タンパク質が、その正常な生物活性により、被験体に望ましくない副作用を引き起こさないことが好ましい。
【００４３】
ヒトLT−αはＮおよびＯ残基がグリコシル化され、そしてその供給源に依存して、かなりの糖に基づく微変異性を示す。LT複合体を形成するために選択した特定のLT−αのオリゴサッカライド組成は、インビボのクリアランス速度に影響を与え得る（Fukushimaら,  Arch.  Biochem.  Biophys.,  304,  144−53頁（1993））。グリコシル化変種は異なる宿主細胞内における発現によって産生され得るので、これはLT−αの供給源を選択する際に考慮すべき１つのファクターである。
【００４４】
LT−αは、LT−αを構成的に分泌し、かつホルボールエステルPMAで処理することによってより高レベルの分泌を誘導し得るＢリンパ芽球様株RPMI  1788から精製され得る（Aggarwalら,  J.  Biol.  Chem.,  259,  686−91頁（1984））。あるいは、クローニングされたヒトLT−α遺伝子を用いて、バクテリア（Schoenfeldら,  J.  Biol.  Chem.,  266,  3863−69頁（1991））；バキュロウイルス感染昆虫細胞（Croweら,  J.  Immunol.  Methods,  168,  70−89頁（1994））；および哺乳類細胞（BrowningおよびRibolini,  J.  Immunol.,  143,  1859−67（1989））；Fukushimaら,  Arch.  Biochem.  Biophys.,  304,  144−53頁（1993））を含む種々の宿主系において、LT−αポリペプチドを組換え的に生産し得る。
【００４５】
LT−α生物活性を有するポリペプチドフラグメントをコードするLT−α遺伝子の部分は、日常的なスクリーニングアッセイを用いて評価され得る。LT−α生物活性の有用なスクリーニングアッセイには、TNF−Rに結合した天然のLT−αを用いる競合阻害アッセイ、または当該分野で公知のアッセイで、腫瘍細胞の細胞傷害性を誘導するLT−αの能力を、阻害によって直接的または間接的に測定することが含まれる。好ましくは、LT−αフラグメントをLT−βとのヘテロメリック複合体に会合させ、そしてその複合体を、LT−β−Rに結合したLT−α/βとの競合阻害によって、LT−α/β生物活性についてアッセイするか、または本明細書中に開示されるアッセイで、腫瘍細胞の細胞傷害性を誘導するそれらの能力についてアッセイする。
【００４６】
p33とも呼ばれるリンフォトキシン−βは、Ｔリンパ球、Ｔ細胞株、Ｂ細胞株、およびリンフォカインで活性化されたキラー細胞の表面で同定されている。LT−βは、本願出願人の同時係属中の国際出願PCT/US91/04588（WO  92/00329として1992年1月9日に公開）；および同PCT/US93/11669（WO  94/13808として1994年6月23日に公開）の主題である（これらは参考として本明細書に援用される）。
【００４７】
LT−β遺伝子は240〜244アミノ酸のポリペプチドをコードする（Browningら,  Cell,  72,  847−56頁（1993））。LT−βは、短いＮ末端細胞質ドメインと、それに続く30個の疎水性アミノ酸の膜固定ドメインとを有するII型膜タンパク質である。これは単一のＮ結合グリコシル化部位を有し、そしてサブユニット間のジスルフィド結合形成には関与しないと思われるシステイン残基を１つだけ有する。
【００４８】
本発明のLT−α/βヘテロメリック複合体を含むLT−βサブユニットは、リンフォトキシン−β、天然のヒトまたは動物リンフォトキシン−β、組換えリンフォトキシン−β、可溶性リンフォトキシン−β、分泌されたリンフォトキシン−β、LT−β生物活性を有するリンフォトキシン−βムテイン、あるいはLT−β生物活性を有する上記のうちのいずれかのリンフォトキシン−βフラグメントから選択され得る。
【００４９】
LT−αポリペプチドについて前記のように、LT−βポリペプチドも、その可溶性または血漿半減期を増大させるために、同じ方法を用いて修飾され得る。同様に、LT−β生物活性を有するポリペプチドフラグメントをコードするLT−β遺伝子の部分を、LT−αについて論じたような日常的スクリーニングアッセイを用いて、評価し得る。
【００５０】
可溶性複合体の産生
可溶性（非膜結合性）LT−α/βヘテロメリック複合体は、膜結合性形態から可溶性形態に変化したLT−βサブユニットを含む。これらの複合体は、本願出願人の同時係属中の国際出願（WO  94/13808として1992年1月9日に公開されたPCT/US93/11669）に詳述されている。可溶性LT−βペプチドは、膜貫通領域の末端（すなわちアミノ酸番号44付近）と最初のTNF相同領域（すなわちアミノ酸番号88）の間のいずれかの位置で切断されるリンフォトキシン−βのアミノ酸配列によって規定される（番号付与法はBrowningら,  Cell,  72,  847−56頁（1993）に従う）。
【００５１】
可溶性LT−βポリペプチドは、LT−βのＮ末端を切断し、細胞質テールおよび膜貫通領域を除去することによって産生され得る（Croweら,  Science,  264,  707−710頁（1994））。あるいは、欠失によって、または、膜貫通ドメインを含む通常疎水性のアミノ酸残基を親水性残基で置換することによって、膜貫通ドメインを不活化してもよい。いずれも場合も、実質的に親水性のハイドロパシープロフィールが作られ、それが脂質親和性を減少し、そして水溶性を改善する。膜貫通ドメインの欠失は、潜在的に免疫原性のエピトープの導入を避けるので、親水性アミノ酸残基による置換よりも好ましい。
【００５２】
欠失または不活化した膜貫通ドメインは、Ｉ型リーダー配列（例えばVCAM−1リーダー）と置換するか、またはＩ型リーダー配列に連結され得、その結果val40とpro88との間のどこかの配列で始まるタンパク質を分泌する。可溶性LT−βポリペプチドはそのＮ末端に任意の数の周知のリーダー配列を含み得る。このような配列を、真核生物系においてそのペプチドを発現させ、そしてその分泌経路に標的化させ得る。例えば、Ernstら、米国特許第5,082,783号（1992）を参照のこと。
【００５３】
可溶性LT−α/βヘテロメリック複合体は、LT−αおよび可溶性LT−βをコードするDNAで適切な宿主細胞を同時にトランスフェクションすることによって産生され得る（Croweら,  J.  Immunol.  Methods,  168,  79−89頁（1994））。LT−αの不在下で分泌される可溶性LT−βは高度にオリゴマー化される。しかし、LT−αと同時に発現される場合、両方のタンパク質を含有する70kDaの三量体様構造が形成される。通常はLT−αのみを発現する細胞株（例えば前記のRPMI  1788細胞）を、可溶性LT−βポリペプチドをコードする遺伝子でトランスフェクションすることによって、可溶性LT−α1/β2ヘテロメリック複合体を産生することもできる。
【００５４】
LT−αポリペプチドおよびLT−βポリペプチドを別々に合成し、それらを温和な界面活性剤を用いて変性し、混合し、そして界面活性剤を除去することによって復元して、分離され得る混合したLTヘテロメリック複合体を形成させ得る（下記参照）。
【００５５】
LT−α1/β2複合体の精製
TNFレセプターおよびLT−βレセプターをアフィニティー精製試薬として使用するクロマトグラフィーによって、異なるサブユニット化学量論を含む同時発現複合体から、可溶性LT−α1/β2ヘテロメリック複合体を分離する。TNFレセプターはLT複合体のα/α裂溝内のみに結合する。LT−βレセプターはヘテロメリックLT−α/β複合体のβ/β裂溝に高い親和性で結合し、そしてα/β裂溝に低い親和性で結合する。従って、LT−α3およびLT−α2/β1はTNF−Rに結合する。LT−β−RもLT−α2/β1三量体に（α/β裂溝内で）結合し得るが、LT−α3に結合し得ない。さらに、LT−β−RはLT−α1/β2およびLT−βn（このような調製物の正確な組成はわからないが、それらは大きな集合体である）に結合する（しかし、TNF−Rはこれらに結合しない）。
【００５６】
レセプターアフィニティー試薬は、可溶性細胞外ドメイン（例えばLoetscherら,  J.  Biol.  Chem.,  266,  18324−29頁（1991））、または免疫グロブリンFcドメインにカップリングした細胞外リガンド結合ドメインを有するキメラタンパク質（Loetscherら,  J.  Biol.  Chem.,  266,  18324−29頁（1991）；Croweら,  Science,  264,  707−710頁（1994））のいずれかとして調製され得る。レセプターは、日常的な手法を用いる化学的架橋によって、アフィニティーマトリックスにカップリングされる。
【００５７】
レセプターおよび免疫アフィニティークロマトグラフィーを用いてLT−α1/β2リガンドを精製し得る計画は２種類ある。第１の計画では、LT−αと先端を切断したLT−β形態とを同時発現する適切な発現系から得た上清をTNF−Rカラムに通す。TNF−RはLT−α3三量体およびLT−α2/β1三量体に結合する。TNF−Rカラムからの流出液はLT−β（n）およびLT−α1/β2を含む。
【００５８】
第２の計画では、全てのLT−β含有形態（LT−β（n）、LT−α1/β2、およびLT−α2/β1）をLT−β−Rカラムに結合させ、そしてカオトロフ(chaotrophe)またはpH変化のような古典的な方法を用いて、そのカラムから溶出させる。（LT−α3はこのカラムを通過する）。その溶出液を中和するか、またはカオトロフを除去し、次いでその溶出液を、LT−α2/β1三量体のみに結合するTNF−Rカラムに通す。このカラムの流出液はLT−β（n）およびLT−α1/β2三量体を含む。
【００５９】
両方の場合で、当該分野で公知のゲルろ過および/またはイオン交換クロマトグラフィー手順を続けて行なうことによって、純粋なLT−α1/β2三量体をLT−βから分離し得る。
【００６０】
あるいは、異なる形態のLT−α/βヘテロメリック複合体を、種々の従来のクロマトグラフィー手段で分離および精製し得る。一連の従来の精製法を上記の免疫アフィニティー精製段階の１つと組み合わせることも好ましいかもしれない。
【００６１】
抗LT−β−R抗体の供給源
ヒトLT−βレセプターに対するポリクローナル抗体血清は、ヤギ、ウサギまたはマウスなどの動物に、完全フロイントアジュバント中のヒトLT−βレセプターFc融合タンパク質（実施例２）を皮下注射した後、完全フロイントアジュバントで追加抗原を腹腔内または皮下に注射することによる従来の技術を用いて調製される。LT−βレセプターに対する所望の抗体を含有するポリクローナル抗血清を、従来の手法でスクリーニングする。
【００６２】
ヒトLT−βレセプターFc融合タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体（mAb）は、アジュバントの非存在下、プロテインAセファロースビーズに結合したCHO細胞由来の組換えLT−βレセプターFc融合タンパク質（LT−β−R−Fc）を用いて、RBFマウスを繰り返し腹腔内免疫することによって調製される。最後に、動物に可溶性LT−β−R−Fcを（腹腔内および動脈内の両方で）追加抗原注射し、古典的なプロトコルで脾細胞を融合し、ハイブリドーマをELISAでスクリーニングする（Lingら,  J.  Interferon  and  Cytokine  Res.,  15,  53−59頁（1995））。さらにハイブリドーマを、表面LT−α1/β2を発現する活性化II−23ハイブリドーマのLT−β−R−Fc被覆プレートに対する結合を妨害する能力について、細胞選別（panning）アッセイでスクリーニングする。純粋なmAbを、ハイブリドーマ培養上清からIgGのプロテインAセファロース精製によって調製する。
【００６３】
種々の形態の抗LT−β−R抗体もまた、標準的な組換えDNA技術（WinterおよびMilstein,  Nature,  349,  293−99頁（1991））を用いて作成し得る。例えば、ある動物抗体由来の抗原結合ドメインがヒト定常ドメインに連結されている「キメラ」抗体を構築し得る（例えば、Cabillyら；米国特許第4,816,567号；Morrisonら,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.,  81,  6851−55頁（1994））。キメラ抗体は、ヒトの臨床処置に使用された場合、動物抗体により誘発され観測される免疫原性応答を減少させる。
【００６４】
さらに、LT−β−Rを認識する組換え「ヒト化抗体」を合成し得る。ヒト化抗体は、その中に特異的抗原結合に寄与する領域が挿入されている、ヒトIgG配列を主に含むキメラである（例えば、WO  94/04679）。動物を所望の抗原で免疫化し、対応する抗体を単離し、そして特異的抗原結合に寄与する可変領域配列の一部を取り出す。次に、その動物由来の抗原結合領域を、抗原結合領域が欠失しているヒト抗体遺伝子の適当な位置にクローニングする。ヒト化抗体は、ヒト抗体における異種（種間）配列の使用を最小にし、そして処置される被験体における免疫応答をほとんど誘発しそうにない。
【００６５】
クラスが異なる組換え抗LT−β−R抗体の構築もまた、クラスが異なる免疫グロブリンから単離された、抗LT−β−R可変ドメインおよびヒト定常ドメイン（CH1、CH2、CH3）を含むキメラまたはヒト化抗体を作成することによって達成され得る。例えば、抗原結合部位価が高い抗LT−β−R  IgM抗体は、ヒトμ鎖定常領域を保持するベクターに抗原結合部位をクローニングすることによって組換え生産され得る（Arulanandamら,  J.  Exp.  Med.,  177,  1439−50頁（1993）；Laneら,  Eur.  J.  Immunol.,  22,  2573−78頁（1993）；Trauneckerら,  Nature,  339,  68−70頁（1989））。
【００６６】
さらに、標準的な組換えDNA技術を用いて、抗原結合部位近傍のアミノ酸残基を変えることによって、組換え抗体のその抗原との結合親和性を変化させ得る。ヒト化抗体の抗原結合親和性は、分子モデリングに基づいて変異誘発によって増大し得る（Queenら,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.,  86,  10029−33頁（1989）；WO  94/04679）。
【００６７】
標的とする組織タイプまたは構想した特定の処置計画に応じて、LT−β−Rに対する抗LT−β−R  Abの親和性を増大させたり、または減少させたりすることが望ましいだろう。例えば、半予防処置のために、LT−β経路を介してシグナルする能力が減少することにより一定レベルの抗LT−β−R  Abで、患者を処置することが有利であり得る。また、LT−β−Rに対する親和性が増大している抗LT−β−R  Abは、短期間の腫瘍標的処置に都合がよいだろう。
【００６８】
LT−β−R活性化因子に関する抗LT−β−R抗体のスクリーニング
本発明の抗LT−β−R抗体は、IFN−γなどのLT−β−R活性化因子の存在下、LT−α/βヘテロメリック複合体（好ましくは、LT−α1/β2）の抗腫瘍活性を増強し得る。これらの抗LT−β−R抗体もまた、本明細書では、LT−β−R活性化因子と呼ぶ。LT−β−R活性化因子として作用する抗体は、次のように選択される：
1）HT29細胞のような腫瘍細胞を含有する一連の組織培養ウェルを、IFN−γのようなLT−β−R活性化因子および精製LT−α/βヘテロメリック複合体（好ましくは、LT−α1/β2）を含有する培地中で、試験される抗LT−β−R  Abの連続希釈液の存在下または非存在下、３〜４日間培養する；
2）MTTなどのミトコンドリア機能を測定する生体色素染色剤を細胞混合物に加え、そして数時間反応させる；
3）各ウェル中の混合物の光学密度を550nmの波長光で定量する（OD550）。OD550は、各ウェル中でLT−α/βヘテロメリック複合体、LT−β−R活性化因子および試験の抗LT−β−R  Abの存在下で死滅した腫瘍細胞の数に逆比例する。
【００６９】
LT−α1/β2およびIFN−γの存在下でLT−β−R活性化因子として独自に作用する本発明の好ましい抗体には、BKA11、CDH10、BHA10およびBCG6の抗LT−β−R  mABが含まれる（下記表２）。
【００７０】
抗LT−β−R抗体の架橋
本発明の架橋した抗LT−β−R抗体は、IFN−γのような第２のLT−β−R活性化因子の存在下、外因性のLT−α/βヘテロメリック複合体なしで、独自にLT−β−R活性化因子として作用する。架橋した抗LT−β−R  Abは、細胞表面LT−βレセプターに結合して、そのクラスタリングを誘発し、それによって、LT−βレセプターが媒介する標的細胞の死を活性化するようである。
【００７１】
一つの実施態様において、１つ以上のタイプの抗LT−β−R抗体を、水不溶性マトリックスまたは表面への固定化によって架橋する。抗体を水不溶性支持マトリックスまたは表面に架橋するには、二官能性薬剤による誘導体化が便利である。水不溶性支持マトリックスまたは表面への抗体の架橋を達成するのによく使用される薬剤には、1,1−ビス（ジアゾアセチル）−2−フェニルエタン、グルチルアルデヒド（glutyraldehyde）、N−ヒドロキシスクシンアミドエステル（4−アジドサリチル酸とのエステルを含む）、ホモ二官能性イミドエステル（ジスクシンイミジルエステルを含む）および二官能性マレイミド（ビス−N−マレイミド−1,8−オクタンなど）が含まれる。メチル−3−［（p−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化薬剤は、光により刺激されて選択的に架橋され得る光活性化中間体を形成する。米国特許第3,959,080号、同第3,969,287号、同第3,691,016号、同第4,195,128号、同第4,247,642号、同第4,229,537号、同第4,055,635号および同第4,330,440号に記載される、臭化シアン活性化炭水化物のような反応性の水不溶性マトリックスおよびその基質もまた、タンパク質の固定化および架橋に使用され得る。
【００７２】
抗体を結合させる表面は、非タンパク質性ポリマー、通常は、天然または合成起源のいずれかの親水性ポリマーであり得る。ポリビニルアルコール（PVA）およびポリビニルピロリドン（PVP）などの親水性ポリビニルポリマーを使用し得る。ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレンエステルまたはメトキシポリエチレングリコール、ポリオキシアルキレン（ポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンなど）、ならびにポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンのブロック共重合体（プルロニクス）などのポリアルキレンエーテル；ポリメタクリレート；カーボマー（carbomer）；糖の単量体D−マンノース、D−およびL−ガラクトース、フコース、フルクトース、D−キシロース、L−アラビノース、D−グルクロン酸、シアル酸、D−ガラクツロン酸、D−マンヌロン酸（例えば、ポリマンヌロン酸またはアルギン酸）、D−グルコサミン、D−ガラクトサミン、D−グルコースおよびノイラミン酸を含む分枝状または非分枝状多糖（乳糖、アミロペクチン、でん粉、ヒドロキシエチルでん粉、アミロース、デキストラン硫酸、デキストラン、デキストリン、グリコーゲンなどのホモ多糖およびヘテロ多糖、またはヒアルロン酸などの酸ムコ多糖の多糖サブユニットを含む）；ポリソルビトールおよびポリマンニトールなどの糖アルコールのポリマー；ヘパリンまたはヘパロンもまた有用である。
【００７３】
架橋前のポリマーは水溶性であることが好ましく、そして抗体との多重架橋の発生を避けるために反応性の化学基を１つだけ含有することが好ましい。いずれにせよ、架橋を減じ、そして実質上均一な分子量範囲を持つ生成物を、直接的に、あるいはその後のゲルろ過またはクロマトグラフィー工程のいずれかによって回収するために、反応条件を最適化すべきである。架橋した抗体マトリックスの至適分子量は、本明細書に開示された細胞傷害性アッセイおよびレセプター結合アッセイを用いる日常的な実験によって決定される。
【００７４】
架橋後の最終結合体は、血液のような生理学的液体に可溶であることが好ましい。ポリマーは、その結合体形態で高度な免疫原性を持つべきでなく、静脈内注入または注射のいずれかが投与経路と意図される場合、それに適合する粘度を持つべきである。
【００７５】
ポリマーは水不溶性であってもよい。使用され得る材料には、親水性ゲル、または抗体を固定化し得る表面を持つ成形物（外科用チューブ、カテーテル、または排液導管など）が含まれる。生物学的に適合性で、生理学的環境下で実質上不活性な固形支持材料を使用することが好ましい。ある材料が、患者の体内に設置された時、実質上、免疫応答（炎症を含む）を刺激しないか、または繊維形成細胞を誘引したりしない場合、それは生物学的に適合性である。
【００７６】
抗LT−β−R  Abはまた、その一次抗LT−β−R  Abに結合する二次抗体（例えば、ヤギ抗マウスIgG抗体；実施例7を参照のこと）で共有結合的または非共有結合的に被覆された表面に固定化され得る。個別に試験された各抗LT−β−R  mAbは、二次抗体を有する表面に固定化されると、IFN−γの存在下、LT−β−R活性化因子として作用する（図４および７）。
【００７７】
別の実施態様では、溶液中の架橋した抗LT−β−R  Abは、LT−β−R活性化因子として作用する。抗LT−β−R  Abは、抗LT−β−R  Ab（またはmAb）架橋剤により架橋され得る。本発明の抗LT−β−R  Ab（またはmAb）架橋剤は、架橋した抗LT−β−R  Ab（またはmAb）が標的細胞表面LT−β−Rクラスタリングに結合し得、そしてそれを増強し得るように、溶液中で抗LT−β−R  Ab（またはmAb）を共有結合的に連結するか、または非共有結合的に集合させ得るいずれかの任意の薬剤である。そのような抗LT−β−R  Ab（またはmAb）架橋剤には、前記のように制御された方法で抗体と反応し得る化学的架橋試薬が含まれるが、それらに限られるわけではない。あるいは、活性を妨害することなく、複数の一次抗LT−β−R  Abに結合し、そしてそれらを集合させる二次抗体、セファロースA、Fcレセプター、または他の薬剤を用いて、溶液中で抗LT−β−R  Ab凝集体を形成させ得る。
【００７８】
溶液中の複数の抗LT−β−R  AbはLT−β−R活性化因子として作用する
本発明は、表面LT−β−Rクラスタリングを増強することによってLT−β−R活性化因子として作用する溶液中の複数の抗LT−β−R  Abを含む組成物を提供する。LT−β−Rの異なるエピトープに対するポリクローナル抗LT−β−R  Abを使用し得る。好ましくは、抗LT−β−R  Abは、LT−β−Rの異なる重複しないエピトープに対するモノクローナルAbである。
【００７９】
LT−βレセプターの活性化に対する結合抗LT−β−R  mAbアプローチは、２つの重複しないエピトープの結合を必要とする。さらに、有益なレセプター集合は特定のエピトープによってのみ達成されるようである。本発明者らは、少なくとも４つのユニークなLT−β−R免疫反応性エピトープの存在を同定した。（新しいmAbによって規定される）更なるエピトープは、免疫化したマウスの脾細胞を融合し続けることによって、異なる動物種を免疫化することによって、そして異なる免疫化経路を用いることによって、同定され得る。
【００８０】
エピトープはまた、異なるmAbがLT−β−Rに対する結合について互いに競合する能力を、BIAcoreクロマトグラフィー技術を用いて評価することによって直接マッピングされ得る（Pharmacia  BIAtechnology  Handbook「Epitope  Mapping」6.3.2節（1994年5月）；Johneら,  J.  Immunol.  Methods,  160,  191−8頁（1993）もまた参照のこと）。
【００８１】
個々のLT−β−R  mAbは、細胞溶解アッセイにおける腫瘍細胞の殺傷において、他のLT−β−R  mAbと一緒になって助ける能力によって、少なくとも４つのクラスに分類され得る（実施例８；表１）。例えば、グループIに属するBDA8  mAbは、グループIに属するAGH1  mAbと共同して、腫瘍細胞細胞傷害性を促進するようには作用しない。また、グループIIIのBKA11  mAbおよびCDH10  mAbも、腫瘍細胞細胞傷害性アッセイにおいて協力し合わない。
【００８２】
図5A〜5Cは、LT−β−R活性化因子としてのIFN−γの存在下、代表的な抗LT−β−R  mAb単独、および細胞傷害性アッセイにおける腫瘍細胞に協同して投与した場合の効果を示す。グループIVの抗LT−β−R  mAbであるCBE11を単独で用いると、わずかな細胞傷害効果を示し、この効果は、グループIIのmAbであるBHA10と組み合わせることによって増大する（図5A）。CBE11は、グループIIIのmAbであるCDH10によって、同様の効果を誘発する（図5B）。
【００８３】
溶液中の抗LT−β−R  mAbの組み合わせを投与することによって誘発される細胞傷害性は、HT29腫瘍細胞株に特有なわけではない。図5Cは、グループIのAGH1  mAbとグループIIIのCDH10  mAbが共同作用して、ヒト腺癌腫瘍由来の２つの異なる腫瘍細胞株（HT29細胞およびWiDr細胞）を殺すことを示している。
【００８４】
抗LT−β−R  mAbの特徴の要約
本発明の抗LT−β−R  mAbのすべては、固定化によって架橋されると、IFN−γのような第２のLT−β−R活性化因子の存在下、LT−β−R活性化因子として作用する。溶液中でLT−α1/β2の存在下または非存在下で、抗LT−β−R  mAbがLT−β−R活性化因子として作用する能力は、試験時点における細胞の状態によってしばしば変化する。表２（下記）は、本発明が特徴付けた抗LT−β−R  mAbの特性を要約したものである。
【００８５】
グループIのmAbであるBDA8およびAGH1は、LT−α1/β2の存在下で、溶液中でLT−β−R活性化因子として機能しない。実際には、BDA8  mAbはLT−α1/β2の抗腫瘍効果を妨害する（図3Bおよび表２）。対照的に、グループIIの抗LT−β−R  mAbであるBCG6およびBHA10は、LT−α1/β2と共に投与された場合、アゴニストおよびアンタゴニストの混合した効果を有する。グループIIIの抗LT−β−R  mAbであるBKA11およびCDH10は、グループIIのmAbであるBCG6およびBHA10の場合によく認められるアンタゴニスト効果を示すことなく、LT−α1/β2および第２のLT−β−R活性化因子（IFN−γなど）の存在下で抗腫瘍効果を増強するLT−β−R活性化因子として作用し得る点でユニークである。
【００８６】
腫瘍細胞細胞溶解アッセイにおいて協調する能力に基づく抗LT−β−R  mAbの分類は、それらがLT−β−Rの異なるエピトープと相互作用することを反映しているということを、心に留めて置くことは重要である。しかし、１つのグループを構成するmAbが、それらの同族エピトープに対して同じ結合親和性を持つとは限らない。従って、同じグループまたは異なるグループに属する異なるmAbの効果を比較したときに認められる一定しない結果は、結合親和性の相違を表し得る。従って、LT−β−Rに対してより高い結合親和性を持つグループIまたはグループIVのmAbであって、LT−α1/β2の存在下で、LT−β−R活性化因子として、グループIIIのmAbのように機能するものを単離し得る可能性がある。
【００８７】
前記の抗LT−β−R  mAbを産生するハイブリドーマ細胞株またはそのサブクローンは、ブダペスト条約の規定に基づき、1995年1月12日に、American  Type  Culture  Collection（ATCC；メリーランド州ロックビル）に寄託され、下記のATCC受託番号を割り当てられた。
【００８８】
【表１Ａ】
2007169296.tif 000002
【００８９】
上記ATCC寄託物の一般に対する分譲に関するすべての制約は、本願に対する特許の付与後、撤回不能に取り除かれる。
【００９０】
抗LT−β−R  IgMモノクローナル抗体はLT−β−R活性化因子として機能する
通常の２つより多いIgG抗原結合部位を含む抗LT−β−R  mAbはまた、溶液中で細胞表面LT−β−R架橋剤として機能し、それゆえに本発明のLT−β−R活性化因子の定義に包含される。標準的な組換えDNA技術およびハイブリドーマ技術を用いて、抗LT−β−R  mAbの抗原結合部位を、10個の抗原結合部位を有するIgM分子に構築し得る（実施例12）。
【００９１】
あるいは、当業者は、抗原による１回の免疫後にハイブリドーマ融合技術を用いて単離される完全なマウス（または他の動物）のIgM分子を集め、それを富化し得る。IgM分子を富化する一方法は、CD40シグナリング欠損マウスを免疫することである（Kawabeら、  Immunity,  1,  167−78頁（1994）；Xuら,  Immunity,  1,  423−31頁（1994））。これらのマウスはIgGを効果的に産生し得ず、それゆえ抗原による攻撃に対するそれらの応答がIgMアイソタイプを富化させる。
【００９２】
抗LT−β−R  IgM抗体は、その増大した結合力価により、膜の面内でLT−β−R分子を効果的に集合させ得、それにより、２つの抗原結合部位を有するIgG対照物に比べて、LT−β−Rシグナリングを増大させ得る。レセプタークラスタリングにおける多価抗体の増大した効率の顕著な例が、Fasレセプターに対する抗体で認められ、溶液中において、IgM形態は極めて強力で、そして通常の二価IgGは効果的でない（YoniharaおよびYonihara,  J.  Exp.  Med.,  169,  1747−56頁（1989）；Aldersonら,  Int.  Immunol.,  6,  1799−1806頁（1994））。
【００９３】
同様に、Fasレセプターに対するapo−1  mAbはIgG3  mAbである。このmAbは、より大きな多価形態に集合する、IgG3サブタイプに特有のFc相互作用に依存する強力な細胞傷害性因子である。Fc領域の除去は、より大きな集合体に会合し得ず、不活性なF(ab)2型を形成する（Dheinら,  J.  Immunol.,  149,  3166−73頁（1992））。従って、抗LT−β−R  mAbのIgMバージョンは強力な抗腫瘍因子になることが予想される。
【００９４】
抗LT−β−R  mAbはマウスにおける腫瘍成長を阻害する
インビトロでヒト腫瘍細胞成長を阻害する抗LT−β−R  mAbのようなLT−β−R活性化因子の能力（実施例６〜８および13）は、インビボでの抗腫瘍形成活性の指標となり得る。免疫不全（SCID）マウスで行なった実験は、抗LT−β−R  mAb（CBE11）がヒト腺癌WiDr細胞による腫瘍形成を効率よく防止し得ることを示す（実施例14；図６）。WiDr細胞を皮下（s.c.）接種したマウスは、２週間以内に測定し得る腫瘍を形成する。WiDr細胞の皮下接種と同時にマウスがCBE11  mAbで腹腔内処理される場合、腫瘍の外成長は著しく妨害された（図6A）。CBE11抗LT−β−R  mAbの抗腫瘍作用は、IFN−γの添加によって増大された。しかし、外因性IFN−γがなくても、CBE11は効果的であった。CBE11＋IFN−γ群では、16匹中７匹の動物が完全に腫瘍を消失したが、残りの動物は２ヶ月経っても発達しない小さい瘤を有した。CBE11のみで処理したマウスは、30日時点のCBE11＋IFN−γ群と同様であった。しかし、CBE11のみで処理したマウスは、結局、ゆっくりと成長する腫瘍を発達させた。CBE11（＋／−  IFN−γ）群とコントロール群（生理食塩水、IFN−γのみ、およびコントロール抗ヒトLFA−3  mAb（1E6）＋IFN−γ）との間には統計学的に有意な差異が存在したが、コントロール群の間には有意な差異は存在しなかった。1E6  mAbおよびCBE11  mAbはともにIgG1抗体である。1E6  mAbは腫瘍細胞を効果的に覆うが、腫瘍成長を阻止しない。従って、補体またはナチュラルキラー細胞によって媒介される事象が、CBE11抗LT−β−R  mAbの抗腫瘍活性についての唯一の根拠ではない。
【００９５】
外因性IFN−γの不在下におけるインビボでの腫瘍成長の阻害についてのCBE11  mAbの効力は、予想外であった。なぜなら、測定し得るLT−β−Rに基づくインビトロの細胞傷害性効果について、IFN−γに対する依存性が存在したからである。ヒトIFN−γレセプターに対するマウスIFN−γの交差がいくらか存在するか、または他の機構がインビボで関与し得るかのいずれかである。
【００９６】
CBE11抗LT−β−R  mAbはまた、マウスにおいて確立した腫瘍の成長を阻害し得る（図6B）。第１日にマウスにWiDrヒト腺癌細胞を皮下接種し、そして腫瘍を15日間発達させた（実施例14）。IFN−γのみ、またはコントロール抗ヒトLFA−3  mAb（1E6）＋IFN−γを腹腔内処理した動物における腫瘍は、７週間の実験の間にわたって、大きくなり続けた。対照的に、CBE11抗LT−β−R  mAb（＋IFN−γまたは単独）で処理した腫瘍は成長を停止し、そして３週間の期間にわたってCBE11抗体を３回注射した後、接種後49日（この時点で実験を終了した）まで腫瘍成長が阻止された（図6B）。
【００９７】
これらの実験は、LT−β−Rシグナリングを活性化する抗LT−β−R  mAbが、インビボで、初期段階で腫瘍形成を効果的に阻害し得、そしてそれより遅い腫瘍形成の段階で継続した腫瘍細胞成長もまた妨害し得ることを示す。これらの実験はまた、単一のLT−β−R活性化因子の投与が、冒された動物において新形成の発達、重篤性または効果を処置または減少させるために有効であり得ることを示す。
【００９８】
実施例14に記載の手順を用いて、インビボでの腫瘍細胞成長を阻害するように、単独でまたは組み合わせで機能する本発明のLT−β−R活性化因子を同定し得る。他のLT−β−R活性化因子（インビトロ腫瘍細胞細胞傷害性アッセイを用いて同定されるものを含むが、それらに限られない）は、動物またはヒトに単独でまたは組み合わせのいずれかによって投与された場合に、インビボで同様の抗腫瘍効果を有し得ることが予想される。
【００９９】
IFN−γおよび他のLT−β−R活性化因子の使用
LT−α/βヘテロメリック複合体、および架橋したまたは複数の抗LT−β−R  Abの腫瘍細胞に対する細胞傷害性効果は、LT−β−R活性化因子（特に、IFN−γ）の存在によって増強される。腸由来のヒト腺癌細胞（HT29細胞）は、FasRシグナリング（YoneharaおよびYonehara,  J.  Exp.  Med.,  169,  1747−56頁（1989））；ならびにIFN−γ存在下でのTNFおよびLT−α（Browningら,  J.  Immunol.,  143,  1859−67頁（1989））に感受性であることが既に示されている。
【０１００】
本発明のLT−α/βヘテロメリック複合体、抗LT−β−R  Abまたは他のLT−β−R活性化因子の抗腫瘍活性を増強するために必要なLT−β−R活性化因子の量は、処置される細胞または組織のタイプおよび処理法に依存し、そして通常の手順を用いて実験的に決定され得る。LT−β−R活性化因子は、上記で挙げたファクターを考慮して、投与される他のLT−β−R活性化因子に関して有効であるような濃度で投与され得るか、またはそのような速度で送達され得る。
【０１０１】
あるいは、標的腫瘍細胞を囲む細胞または組織によって産生され得る内因性LT−β−R活性化因子（例えば、IFN−γのようなインターフェロン）に依存し得る。内因性IFN−γは通常、ウイルス感染の際に産生され、そして腫瘍の近傍においても見出される（Dingeら,  Immunity,  1,  447−56頁（1994））。
【０１０２】
インターフェロン（好ましくはIFN−γ）を誘導し得、そしてLT−α/βヘテロメリック複合体および抗LT−β−R  mAbの腫瘍細胞に対する細胞傷害性効果を増強する因子は、いずれも本発明のLT−β−R活性化因子の群に包含される。ウイルス感染は通常、IFN−γ産生を誘導するが、他の因子によっても内因性IFN−γのレベルは増強され得る（実施例10）。例えば、二本鎖RNA（dsRNA）処理によるインターフェロン産生が、臨床試験によって示されている。従って、ポリリボグアニル酸/ポリリボシチジル酸（ポリrG/rC）および他の形態のdsRNAは、インターフェロン誘導物質として有効である（Juraskovaら,  Eur.  J.  Pharmacol.,  221,  107−11頁（1992））。
【０１０３】
甘草（Glycyrrhiza  glabra）由来のインターフェロン刺激物質（Acharyaら,  Indian  J.  Med.  Res.,  98,  69−74頁（1993））および医薬品（その多くは経口投与し得る）はまた、内因性インターフェロンレベルの増加のために使用され得る。このようなインターフェロン誘導物質としては、次の物質が挙げられる：イミキモド（imiquimod）（Bernsteinら,  Antiviral  Res.,  20,  45−55頁（1994）；サパラル（saparal）（Paramonovaら,  Vopr.  Virusol.,  39,  131−34頁（1994））；ブロピリミン（bropirimine）のようなアリールピリミドン（OnishiおよびMachida,  Hinyokika  Kiyo,  40,  195−200頁（1994））；リドスチン（Ridostin）（Cheknevら,  Vopr.  Virusol.,  39,  125−28頁（1994））。
【０１０４】
これらのインターフェロン誘導因子のいくつかは、IFN−αのようなI型インターフェロンの誘導物質であるとして特徴付けられている。Ｉ型インターフェロンはまた、LT−β−R活性化因子として機能し得るが、IFN−γより効力が弱い。
【０１０５】
LT−α/β複合体およびLT−β−R活性化因子を用いる処置
本発明の組成物は、取り組まれる特定の臨床状態を処置するために、有効用量で投与される。与えられた適用に関して好ましい医薬処方および治療的に有効用量レジメンの決定は、十分に当業者の範囲内であり、例えば患者の状態および体重、望ましい処置の程度ならびにその処置に対するその患者の耐性が考慮される。
【０１０６】
代表的には、ヒトは、重篤な毒性が顕在化する以前に、100−200mg/m2のTNFまで耐性であり得る（Schillerら,  Cancer  Res.,  51,  1651−58（1991））。マウスでは、５×104ユニットの組換えヒトIFN−γを与える１〜５mg/マウス/日の範囲での投与が、ヒト原発性腫瘍の衰退をもたらした（Balkwillら,  CIBA基金シンポジウム（1987）；Havellら,  J.  Exp.  Med.,  167,  1067−85頁（1988））。HT29細胞溶解アッセイにおけるTNFおよびLT−α1/β2の相対的な効果に基づいて、約５〜25mg/マウス/日のLT−α1/β2の治療的な投与量範囲が提供される。ヒトに外挿することにより、少なくとも1mg/m2のLT−α1/β2用量が、IFN−γのようなLT−β−R活性化因子との組み合わせで必要になることが予想される。
【０１０７】
歴史的には、IFN−γ療法は、100〜250mg/m2の範囲の最大許容投与量か、または10〜25mg/m2の範囲の「免疫調節」レベルのいずれかで管理されていた（例えば、Koppら,  J.  Immunother.,  13,  181−90頁（1993）を参照のこと）。２つのインターフェロンを用いる組み合わせ療法では、４×106ユニット/m2のIFN−αおよび約250mg/m2のIFN−γが使用されてきた（Niederleら,  Leuk.  Lymphoma,  9,  111−19（1993））。本明細書中に記載のLT−α/βヘテロメリック複合体または精製LT−β−R  Abと組み合わせた約25〜100mg/m2の中間投与量のIFN−γは、処置投与量を最適化するための出発点として好適であることが予想される。
【０１０８】
本発明のLT−α/βヘテロメリック複合体および架橋した抗LT−β−R  Ab（単離および精製形態の抗体もしくは複合体、その塩またはそれらの薬学的に受容可能な誘導体を含む）の投与は、抗腫瘍活性を示す因子の通常受容可能な任意の投与法を用いて達成され得る。
【０１０９】
これらの治療法で使用される薬学的組成物はまた、種々の形態をとり得る。これらには、例えば、錠剤、丸薬、粉末剤、液体溶液剤または懸濁剤、坐薬、ならびに注射可能および注入可能溶液のような固体、半固体および液体の投薬形態が含まれる。好ましい形態は、投与および治療的適用の目的とする方法に依存する。投与法には、経口投与、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、病巣内投与または局所投与が含まれ得る。
【０１１０】
LT−α/βヘテロメリック複合体、IFN−γおよび抗LT−β−R  Abを、例えば、取り込みまたは安定性を刺激するコファクターと共に、もしくはこれらを伴わずに、滅菌等張処方物中に入れ得る。処方物は液体であることが好ましく、または凍結乾燥粉末であり得る。例えば、LT複合体および/または抗LT−β−R  AbならびにIFN−γを、5.0mg/mlクエン酸一水和物、2.7mg/mlクエン酸三ナトリウム、41mg/mlマンニトール、１mg/mlグリシンおよび１mg/mlポリソルベート20を含む処方緩衝液で希釈し得る。この溶液を凍結乾燥し、冷蔵庫に保存し、そして投与前に滅菌注射用水（USP）で再構成し得る。
【０１１１】
本組成物はまた、当該分野において周知の通常の薬学的に受容可能なキャリア（例えば、Remington's  Pharmaceutical  Sciences,第16版,  1980,  Mac  Publishing  Companyを参照のこと）を含むことも好ましい。そのような薬学的に受容可能なキャリアとしては、ヒト血清アルブミンまたは血漿調製物のような他の医療用薬剤、キャリア、遺伝子キャリア、アジュバント、賦形剤などを挙げ得る。本組成物は単位投与形態であることが好ましく、そして通常は１日に１回以上投与される。
【０１１２】
冒された組織または血流とつながる近傍または他の場所に投与される微小球、リポソーム、他の微小粒子送達系または徐放性処方物を用いて、本発明の薬学的組成物はまた投与され得る。徐放性キャリアの好適な例として、坐薬またはマイクロカプセルのような成形物の形態の半透過性ポリマーマトリックスが挙げられる。移植可能な、またはマイクロカプセル状の徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第3,773,319号；EP  58,481）、L−グルタミン酸およびγ−エチル−L−グルタミン酸の共重合体（Sidmanら,  Biopolymers,  22,  547−56頁（1985））；ポリ（2−ヒドロキシエチルメタクリレート）またはエチレンビニルアセテート（Langerら,  J.  Biomed.  Mater.  Res.,  15,  167−277頁（1981）；Langerら,  Chem.  Tech.,  12,  98−105頁（1982））が挙げられる。
【０１１３】
LT−α/βヘテロメリック複合体および/または抗LT−β−R  AbならびにIFN−γを含有するリポソームは、周知の方法により調製され得る（例えば、DE  3,218,121；Epsteinら,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.,  82,  3688−92頁（1985）；Hwangら,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.,  77,  4030−34頁（1980）；米国特許第4,485,045号および同第4,544,545号を参照のこと）。通常、リポソームは、小さく（約200〜800オングストローム）単層形態で、その脂質含量は約30モル％コレステロールより多い。コレステロールの割合が選択されて、LT複合体および/または抗LT−β−R  AbならびにIFN−γの最適放出速度を制御する。
【０１１４】
本発明のLT−α/βヘテロメリック複合体および抗LT−β−R  Abはまた、腫瘍領域に代表的に見出されるIFN−γを補うために、他のLT−β−R活性化因子、化学療法剤またはIFN−γを含有するリポソームに接合され得る。LT複合体および抗LT−β−R  Abのリポソームへの接合は、標的化送達のためにトキシンまたは化学療法剤を抗体に結合するために広く使用されているヘテロ二官能性架橋剤のような、任意の既知架橋剤によって達成され得る。リポソームへの接合はまた、炭水化物指向性架橋剤である4−（4−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（MPBH）を用いて達成され得る（Duzgunesら,J.  Cell.  Biochem.  Abst.  Suppl.  16E  77（1992））。
【０１１５】
抗LT−β−R活性化に基づく治療用組成物の利点
LT−β−R活性化に基づく抗腫瘍療法はいくつかの利点を有する。LT−β−RはLT−α/βヘテロメリック複合体に結合し、この際、β/β裂溝には高い親和性を伴うが、隣接するLT−αサブユニットとLT−βサブユニットとの間の境界面に形成されるα/β裂溝には低い親和性を伴う。対照的に、TNFレセプターは、α/α裂溝にのみ高い親和性を伴って、LT−α/βヘテロメリック複合体に結合する。従って、精製されたLT−α1/β2複合体は、隣接するLT−βサブユニット間でLT−β−Rに高い親和性で結合するが、α/α裂溝を欠くので、TNFレセプターを介したシグナリングを交差活性化しない。従って、本発明のLT−α/βヘテロメリック複合体は、TNFが関連する炎症反応を刺激しない。
【０１１６】
LT−α1/β2投与は、比較的高いレベルでも、炎症反応に関連する内皮細胞変化を活性化しない。この理由により、LT−β−Rを活性化する薬学的組成物および治療法を用いても、TNFで観察される炎症カスケードの活性化による副作用は問題にならない。
【０１１７】
ヒトLT−α1/β2は、ヒトLT−β−Rと同様に、マウスLT−β−Rにも実質的に結合する。マウス一匹あたり100mgのヒトLT−α1/β2の注射は致命的ではなく（実施例11）、全動物に対して、LT−β−Rの刺激が、FasRまたはp60  TNF−R活性化で同様の実験を行なった場合に認められる過剰毒性を有さないことを示唆している。
【０１１８】
ヒトのこの経路を誘発するために特定の抗LT−β−Rモノクローナル抗体または抗体の組み合わせを使用することは、LT−α/βヘテロメリック複合体による治療に対して、いくつかの利点を有し得る。抗レセプター抗体療法は、リガンドによる治療と比較してより選択的である。さらに、組換え形態の抗LT−β−R  mAbは、可溶性LT−α/βヘテロメリック複合体よりも、操作および大規模な生産がより容易である。
【０１１９】
これらのmAbまたはLT−α/βヘテロメリック複合体は通常の抗腫瘍療法（すなわち放射線療法および化学療法）と組み合わせて腫瘍を患う患者に投与されることが想定される。LT−β−R活性化と通常の化学療法との組み合わせ処置は、通常の抗腫瘍療法を単独で使用する場合より、患者から腫瘍形成性細胞を取り除くのにより適した腫瘍殺傷活性を有する追加ファクターを提供し得る。
【０１２０】
さらに、このアプローチは比較的少ない副作用を有し得、従って、転移していないと思われる癌腫の場合において、または特定のタイプの癌について遺伝的先天性を示す家族からの患者において、半予防的な意味で用い得る。
【０１２１】
以下に、本発明のLT−α/βヘテロメリック複合体および抗LT−β−R  mAbならびにそれらを特徴付けるために使用する方法を例示する実施例を挙げる。これらの実施例は本発明を制限するように解釈されない。これらの実施例は例示の用途を包含し、そして本発明は請求の範囲によってのみ制限される。
【０１２２】
実施例１
LT−α/β形態を含むバキュロウイルス感染昆虫細胞上清の作製
全長LT−αまたはLT−β分泌形態のいずれかをコードする組換えバキュロウイルスを、記載のように作製した（Croweら,Science,264,707〜710頁  (1994)）。ハイファイブ昆虫細胞(high  five  insect  cells)（Invitrogen,San  Diego,CA.）を、血清を有さない7.2リットルのSF  900−II（Gibco）培地中に２×105細胞/mlの密度で接種した。48時間後、培地は1.8×106細胞/mlに達し、そして150ml（３×108PFU/ml）のLT−βおよび300mlのLT−αバキュロウイルスストックで感染させた。２日後、培地を回収し、そして細胞破片を遠心分離によって取り除いた。EDTAおよびPMSF(最終濃度１mM  EDTAおよび150μM  PMSF)の添加後、澄明化した上清を、S1YM10(Amicon)スパイラルカートリッジを用いる遠心分離によって10倍に濃縮した。濃縮物を、120mlずつ６つに分け、そしてアリコートを精製前に−70℃で保存した。
【０１２３】
実施例２
免疫グロブリンFcキメラとしての可溶性LT−βレセプターの調製
膜貫通領域に相当するLT−β−Rの細胞外ドメインを、5'および3'末端上にNotIおよびSalI制限酵素部位をそれぞれ組み込んだプライマーを用いるcDNAクローン由来のPCRによって増幅した(Browingら,J.Immunol.,154,33〜46頁  (1995))。増幅した産物を、NotIおよびSalIで切断し、精製し、そしてヒトIgG1のFc領域をコードするSalI−NotIフラグメントと一緒にNotI直線化ベクターpMDR901内に連結した。得られたベクターは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子および独立したプロモーターによって駆動するLT−β−R−Fcキメラを含有した。ベクターをCHO  dhfr−細胞内にエレクトロポレーションし、そしてメソトレキセート耐性クローンを、標準的な手順に従って単離した。培地中にLT−β−R−Fcを分泌し、そして最も高いレベルのキメラタンパク質を産生する細胞株の選択のためにELISAアッセイを用いた。高生産細胞株を大量に増殖させ、そして馴化培地を回収した。純粋なタンパク質を、Protein  A  sepharose  fast  flowアフィニティークロマトグラフィーによって単離した。
【０１２４】
実施例３
TNF−RおよびLT−β−Rを用いるLT−α1/β2のアフィニティー精製
LT形態のレセプターアフィニティー精製用樹脂を調製するために、LT−β−R−Fcの精製調製物（本明細書中の実施例２に記載のような）およびTNF−R−p60−Fcの精製調製物  (Croweら,Science,264,707〜10頁(1994))を、製品の説明に本質的に従い、５mg/mlの樹脂でCNBr−sepharose(Pharmacia)上に固定した。この樹脂を、使用前に１溶出サイクル通した。一部（120ml）のS1Y10濃縮物を、LT−αおよびLT−α2/β1に結合する２つの連続的なp60  TNF−R−Fcカラムに通過させた。LT−α1/β2およびLT−βを含む流出液を、LT−β−R−Fcカラムに通過させた。カラムをPBS、0.5M  NaCl添加のPBS、そしてPBSの各５容積で洗浄し、次いで、LT−αおよびLT−α2/β1複合体を、25  mMリン酸ナトリウム、100mM  NaCl(pH  3.5)で溶出した。溶出画分を、1/20容積の0.5Mリン酸ナトリウム(pH  8.6)で直ちに中和し、そして氷上で保存した。タンパク質を含む画分を、280nmにおける吸光度によって同定し、ピークの画分をプールし、そしてカラムからの溶出プールをクーマシーブリリアントブルーで染色したSDS−PAGEによって分析した。上記の溶出により、95％を超える純度のLT−α1/β2が得られた。
【０１２５】
実施例４
精製LT−α1/β2リガンドの特徴付け
実施例３の画分を、ゲル排除クロマトグラフィーによって分子量を決定し、三量体が形成されたかどうか、そして集合体が存在したかどうかを評価した。TSK  G3000  sw×２カラムを流速0.5ml/minで使用し、BioRadゲル濾過タンパク質スタンダード、ならびに３つの異なるLT三量体、LT−α3、LT−α2/β1、およびLT−α1/β2をサイズ分離した。図１は、LT−α1/β2三量体が高分子量の集合体として出現したとしても非常に少ないことを示す。サイズスタンダードとの比較によって、３つの形態は全て三量体（すなわち、約50〜60kDa）であることが示される。三量体であると仮定して、精製LT−α1/β2および精製LT−α2/β1画分中に含まれるLT−βに対するLT−αの化学量論を、クーマシー染色ゲルのデンシトメトリーまたはC4逆相HPLCにおける分離後の２つのピークのピーク高さ分析(peak  height  analysis)のいずれかによって評価した。両方の測定によって、上記のように、アフィニティーカラムから溶出した画分の同一性を確認した。
【０１２６】
調製物の精製度を、BioCAD装置を用いるイオン交換クロマトグラフィーによってさらに評価し、いくつかの異なる緩衝系で弱陽イオン交換樹脂におけるLT−α1/β2およびLT−α2/β1のpHマップを作製した。本方法は、３つの三量体を的確に保持し、そして分離するのに最も高い能力を示すものであり、５ml/分の流速で、16.66mM  MES、16.66mM  HEPES、16.66mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH  6.5)を通塔し、そして20を超えるカラム容積の１M  NaClのグラジエントで溶出する、POROS  CM(カルボキシメチル)カラムを包含する。LT−α1/β2およびLT−α2/β1複合体のBioCADクロマトグラムを図1Bに示す。各三量体、LT−α3、LT−α2/β1およびLT−α1/β2を異なる塩濃度で溶出し、そして種々の調製において、１〜２％を超えるクロスコンタミネーションは認められなかった。
【０１２７】
実施例５
可溶性LT−α1/β2複合体による
HT29ヒト腺癌細胞の死滅
HT29細胞溶解性アッセイは、以前に記載されている(BrowingおよびRibolini、J.Immunol.,143,1859〜67頁  (1989))。代表的なアッセイにおいて、LT−α1/β2（および適用可能な場合、他のサイトカイン）の系列希釈物を、96ウェルプレート中で0.05ml調製し、そしてトリプシン処理した5000個のHT29−14細胞を０または80  U/ml(抗ウイルス単位)のヒトIFN−γを含有する0.05mlの培地に添加した。HT29−14細胞は、より均質であるもとのATCC−由来HT−29株のサブクローン由来である。HT29−14細胞をアッセイに使用した：これら全ての結果はまた、もとのATCC−由来HT29株を用いて観察され得る。３〜４日後、色素MTTのミトコンドリア減少を以下のように測定した：10リットルのMTTを添加し、そして３時間後、減少した色素を10mM  HClを有する0.09mlのイソプロパノールに溶解し、そして550nmでO.D.を測定した。本明細書中で記載のように調製した可溶性レセプター形態、または純粋なヒトIgGを10μl細胞に添加し、５μg/mlの最終濃度にした。
【０１２８】
図2Aは、（FasRシグナリングを刺激する）抗FasレセプターmAb  CH−11；IFN−γとの併用のTNF、LT−α3、  LT−α1/β2およびLT−α2/β1リガンドで処理することによるHT29細胞の死滅を示す。  LT−α1/β2で処理した細胞の観察は、この因子が細胞増殖を単にブロックするよりもむしろ細胞を死滅させていることを示す。IFN−γが存在しなければ、IFN−γの独特な能力を反映するような効果は観察されない。この能力は、細胞がレセプター由来のTNFファミリーのシグナリングを処理する様式に影響する。抗ウイルス活性単位に基づいて定量すると、インターフェロンαおよびインターフェロンβは、IFN−γより100倍効果的ではなかった。
【０１２９】
図2Bは、可溶性LT−β−R−Fc（p60−TNF−R−Fcではない）によるLT−α1/β2の死滅の阻害を示しており、これは細胞傷害性がLT−α1/β2に特異的であることを示している。p60−TNF−R−Fcによる阻害が認められないことは、混入しているLT−α（１％未満であることが知られている）が、LT−α1/β2の細胞傷害性活性の原因ではあり得ないことを示す。
【０１３０】
実施例６
抗LT−β−R  mAbは、LT−α1/β2複合体による
HT29細胞の死滅を増強する
細胞溶解性アッセイを、実施例５に記載のように行った。ただし、IFN−γおよび抗LT−β−R  mAb（0.01〜1000  ng/mlの系列）を細胞に２×最終濃度で添加し、次いで50μlの細胞溶液を、希釈したLT−α1/β2を含むウェルに添加した。増殖を実施例５に記載のように評価した。図３は、LT−α1/β2細胞傷害性活性を増強する能力が異なる２つの抗LT−β−R  mAbの特異な効果を示す。図3Aは、抗LT−β−R  mAb  CDH10が、用量に依存してLT−α1/β2細胞傷害性活性を増強することを示す。図3Bは、同一のアッセイにおける別の抗LT−β−R  mAb、BDA8の効果を示す。BDA8  mAbは、腫瘍細胞死を増強するよりもむしろLT−α1/β2の細胞傷害性活性を阻害する。
【０１３１】
実施例７
HT29腫瘍細胞を死滅し得る固定化抗−LT−β−R  mAb
プラスチック表面上に抗LT−β−R  mAbを固定化するために、96ウェル組織培養プレートを、50μlの10μ/mlヤギ抗マウスFcポリクローナル抗体（Jackson  ImmunoResearch）で被覆し、PBS中５％FCSで洗浄およびブロックし、その後示した抗LT−β−R  mAbを捕獲し、そしてさらに洗浄した。HT29細胞を、mAb被覆ウェル中にプレート化し、そして細胞溶解性アッセイを実施例５のように行った。図4Aは、HT29細胞に対する固定化BDA8およびCDH10抗LT−β−R  mAbの細胞傷害性効果を示す。各mAbは、表面に固定化する場合、腫瘍細胞に対する細胞傷害性を個々に誘発する。図4Bは、溶液中で個々に試験した同一のBDA8およびCDH10抗−LT−β−R  mAbは、細胞傷害性ではなく、従って、インビトロにおける単一の抗LT−β−R  mAbの細胞傷害性活性は、その固定化の機能であるようであることを示す。
【０１３２】
実施例８
明確なエピトープに対する溶液中抗LT−β−R  mAbの
組み合わせは、HT29細胞を死滅させる
HT29細胞の増殖を、１つまたは２つのいずれかの抗LT−β−R  mAbを増殖培地中でインキュベートすることを除き、実施例５に記載のように評価した。表１は、種々の抗LT−β−R  mAbを溶液中でインキュベートした場合（すなわち、プラスチック上に固定されなかった場合）に観察される、HT29細胞に対する効果を示す。抗LT−β−R  mAbは、HT29細胞溶解性アッセイにおいて、相互の組合せで作用するそれらの相対的能力に基づいて、群I〜IVに決定され得る。細胞溶解性アッセイで得られた抗LT−β−R  mAbの結果は、各異なる群のmAbがLT−β−Rの異なるエピトープを認識することを示唆するレセプター結合のデータと一致する。
【０１３３】
【表１】
2007169296.tif 000003
【０１３４】
表２に、本発明の代表的な抗LT−β−R  mAbの特徴をまとめる。
【０１３５】
【表２】
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【０１３６】
実施例９
腫瘍細胞処置のための内因性IFN−γの信頼性
IFN−γ（本発明の好適なLT−β−R活性化因子）は、抗腫瘍活性を示し、そしてヒトにおいて耐性を有するサイトカインである。腫瘍周辺の環境に存在する内因性IFN−γは、外因性IFN−γの添加を伴わない本発明のLT−β−R活性化因子として機能するのに十分な高濃度で存在し得る。腫瘍付近のIFN−γ濃度は、腫瘍領域からの組織サンプルを用いる標準的な免疫化学技術を用いて確認され得る。IFN−γの内在濃度が、本発明の（本明細書中に記載の細胞溶解性アッセイにより決定された）LT−α/βヘテロメリック複合体または抗LT−β−R  mAbと組み合わせて抗腫瘍活性を誘発するのに十分に高い場合、  本発明の組成物または方法では、IFN−γは第２のLT−β−R活性化因子として投与する必要はない。
【０１３７】
実施例10
腫瘍細胞処置のためのLT−β−R活性化因子としての内因性IFN−γの誘導
IFN−γのようなインターフェロンの内因性産生を誘導し得る化合物は、本発明のLT−β−R活性化因子のグループ内に属する。例えば、インターフェロンは、二本鎖RNA分子（例えば、ポリリボグアニル酸/ポリリボシチジル酸(ポリ−G/C)）での処理によって誘導され得る。
【０１３８】
雌C57/b16（6〜8週齢）に、TNFおよび他の抗腫瘍因子の効果に対してマウスを感作する18mg(600mg/kg)のD−ガラクトサミンを注射し得る。中性の生理食塩水溶液中の系列濃度のポリ−G/C(Juraskovaら、Eur.J.Pharmacol.,221,107〜11頁  (1992))を、精製LT−α1/β2(10〜100μg)に添加し、そしてこの溶液を腹膜内(i.p.)注射としてマウスに投与した。  LT−α1/β2の抗腫瘍活性は、ポリ−rG/rC二本鎖RNAの存在によって増強される。
【０１３９】
同様に、植物Glycyrrhiza  glabra由来のインターフェロン刺激物質（Acharyaら、Indian  J.Med.Res.,98,69〜74頁  (1993)）は、40〜100ml/日の用量範囲でヒトに対して静脈内に投与され得る。  LT−α/βヘテロメリック複合体または抗LT−β−R  Abのいずれかの存在下で、LT−β−R活性化の至適量を、経験的に決定し得、そして腫瘍型、送達の様式、および送達スケジュールのようなファクターに依存する。
【０１４０】
Imiquimod  R−873(Bernsteinら、Antiviral  Res.,20,45〜55頁  (1994))；Saparal(Paramonovaら、Vopr.Virusol.,39,131〜34  (1994))；Bropirimine(OnishiおよびMachida、Hinvokika  Kiyo,40,195〜200頁  (1994))；またはRidostin(Cheknevら、Vopr.Virusol.,39,125〜28頁  (1994))もまた、  LT−α/βヘテロメリック複合体、抗LT−β−R  Ab、またはそれらの組み合わせに併用して、LT−β−R活性化因子として投与し得る。各々の場合、送達の好ましい様式および至適量を、日常的な臨床手順による最適化のため開始点として公表された報告を用いて経験的に決定し得る。
【０１４１】
実施例11
マウスはヒトLT−α1/β2の注射に耐性である
数日間施設に順応させた雌C57/b16（6〜8週齢）に、TNFおよび他の抗腫瘍因子の効果に対してマウスを感作する18mg(600mg/kg)のD−ガラクトサミンをi.p.注射した。次いで、ヒトTNF、LT−αまたはLT−α1/β2のいずれかをi.p.で投与した。表３に、注射24時間後の処置マウスの生存を示す。
【０１４２】
【表３】
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【０１４３】
実施例12
組換え抗LT−β−R  IgMモノクローナル抗体の構築
免疫不全マウスにおける標準的な腫瘍成長モデルを組み合わせた上記の抗腫瘍細胞傷害性アッセイを用いて、適切な特性を有する抗LT−β−R  IgGを選択し得る。選択した抗LT−β−R  IgGのIgG重鎖および軽鎖の各可変ドメインにハイブリダイズする普遍プライマー(universal  primer)を、標準的な逆転写酵素/PCR方法論を用いる分泌性のハイブリドーマ細胞株から単離したRNA由来の可変ドメインDNAを調製するために使用し得る。これらのプロトコルは、記載されている（Arulanandamら、J.Exp.Med.,177,1439〜50頁  (1993)；Laneら、Eur.J.Immunol.,22,2573〜78頁  (1993)；Trauneckerら、Nature,339,68〜70頁  (1989)）。
【０１４４】
次いで、増殖させた産生物を、ヒトCH1、CH2、CH3  μ鎖ドメインを含むベクター内に組み込んだ。単一の宿主における２つの鎖の同時発現は、五量体のIgM分子内への重鎖および軽鎖の組み込みを可能にする。この分子は、ヒト定常領域に結合するマウス可変領域を含むキメラである。
【０１４５】
あるいは、可変領域の実際の結合領域のみをコードするDNAを増幅するために、PCRを用いるプロセスを使用し得る。次いで、増幅したDNAを、抗原との結合に関する実際のアミノ酸を除く全てのヒトIgG配列を含むベクター内に挿入する。このような構築物を、「ヒト化」抗体と呼び、そしてこれらの産生についての詳細な方法は、周知である（例えば、WO  94/04679）。
【０１４６】
実施例13
抗LT−β−R  IgMモノクローナル抗体は、LT−β−R活性化因子として機能する
抗LT−β−R  IgM抗体を、実施例12に記載の組換え形態で調製し得る。あるいは、正常なマウスの一次免疫化またはCD40シグナリング欠損マウスの広範囲の免疫化(extensive  immunization)を用いるハブリドーマ融合技術によって単離した完全マウスIgMを(Kawabeら、Immunity,１,167〜78頁  (1994)；Xuら、Immunity,１,423〜31頁  (1994))、抗LT−β−R  IgM  mAbの供給源として使用し得る。
【０１４７】
抗LT−β−R  IgM  mAbは、IFN−γ存在下でHT29細胞溶解性アッセイにおいて用量応答比較によって測定されるように、それらの正常な二価のIgG相対物よりも、LT−β−R活性化因子としてより顕著に効力がある。抗LT−β−R  IgM  mAbは、それらが固定された場合およびそれらが溶液中で投与される場合の両方でLT−β−R活性化因子として機能する。さらに、本発明者らは、それらがLT−α/βヘテロメリック複合体の抗腫瘍活性を増加すると予想している。
【０１４８】
実施例14
抗LT−β−Rモノクローナル抗体は、SCIDマウス中の
ヒト腫瘍細胞の増殖を阻害する
Balb/c  SCIDマウス(Jackson  Labs,Bar  Harbor,ME)に、１×106個のトリプシン処理し、そして洗浄した0.2mlの容積のPBS中のヒト腺癌WiDr細胞を動物の背部に皮下(s.c.)注射した。注射したWiDr細胞は、マウス中で腫瘍を形成し、そして腫瘍増殖を阻害する抗LT−β−R  mAbの能力をモニターした。１つの実験のセットにおいて、マウスにWiDr細胞をs.c.で接種すると同時に、CBE11抗LT−β−R  mAbの添加または無添加（ヒトIFN−γ(106抗ウイルス単位/マウス)の添加または無添加のいずれか）で処置した（図6A）。抗体およびIFN−γを、単独または一緒に0.2ml中にi.p.注射によって投与した。コントロールマウスに、生理食塩水のみ、IFN−γのみ、またはIFN−γ添加のコントロール抗ヒトLFA−3  mAb(1E6)を注射した。得られた各腫瘍のサイズを接種30日後に評価した。腫瘍容積を、(ccで)２次元のカリパス測定によって決定した半径から算定した。CBE11または1E6  mAbで処理した動物に、10μg/マウスまたは50μg/マウスの抗体を与えた（図6A；それぞれ点付きの丸および白丸）。
【０１４９】
別の実験のセットにおいて、マウスにWiDr細胞をs.c.接種し、そして腫瘍を15日間増殖させ、マウスをCBE11抗LT−β−R  mAbで処理した（図6B）。15日目（抗体処置前）に、腫瘍容積の平均は、平均的な直径0.53cmで0.076ccであった。次いで、CBE11抗LT−β−R  mAb(50μg)を、12動物の群に対して0.2ml、i.p.注射により（ヒトIFN−γ(106抗ウイルス単位/マウス)の添加または無添加のいずれかで）投与した。注射を、３週間にわたり、さらに３回繰り返した。コントロール群（12マウス/群）に、IFN−γのみ(106抗ウイルス単位/マウス)または50μgのコントロール抗ヒトLFA−3  mAb(1E6)＋IFN−γ(106抗ウイルス単位/マウス)を注射した。15日目に存在する腫瘍の増殖を、期間中（腫瘍細胞接種後15日目〜49日目）に評価した。図6Bに示す結果を、盲検形式(blinded  format)で測定した。IFN−γの添加または無添加のいずれかでのCBE11  mAbで処置した腫瘍は、増殖を停止した。３週間にわたるCBE11  mAb(＋／−  IFN−γ)の３回の注射の後、腫瘍の増殖は接種後少なくとも７週間で抑制され、この時点で実験を終了した。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１Ａ】図１Ａ。TNF−RおよびLT−β−Rの免疫アフィニティークロマトグラフィーにより分離された精製LT−α/βヘテロメリック複合体形態のサイズ分析。精製タンパク質を、リン酸緩衝生理食塩水中のTSK  3000  HPLC樹脂上で分析した。種々のサイズマーカーの位置を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂ。BioCad器械（Perceptive  Biosystems）におけるPorosカルボキシメチルカラム（4.6mm×100mm）を用いた、精製LT形態のイオン交換分析。27μgの各サンプルタンパク質をカラムにロードし、そして16.66μM  Hepes、16.66μM酢酸ナトリウム、および16.66μM  Mes緩衝液（pH6.5）を含む緩衝液中で５ml/分で20カラム容量を越える０〜１MのNaClの勾配で溶出した。
【図２Ａ】図２Ａ。80  U/mlのIFN−γ存在下または非存在下のいずれかでのヒト腺癌HT29細胞における抗FasレセプターmAb  CH−11（−●−）；TNF（−○−）；LT−α（−□−）；LT−α1/β2（−■−）；およびLT−α2/β1（−◆−）の細胞傷害性活性の比較。
【図２Ｂ】図２Ｂ。80  U/mlのIFN−γ存在下での図２Ａにおける細胞傷害性効果を阻害する、５μg/mlのヒトIgG（−●−）、可溶性p60TNF−R−Fc（−○−）、および可溶性LT−β−R−Fcレセプター−免疫グロブリンキメラ（−□−）の能力の比較。
【図３】図３。抗LT−β−R  mAbは、ヒト腺癌HT29細胞におけるLT−α1/β2の細胞傷害性効果を増強する。（Ａ）HT29細胞におけるLT−α1/β2細胞傷害性効果は、抗LT−β−R  mAb  CDH10の存在によって増強される。LT−α1/β2の効果を、mAbなし（−●−）、ならびに0.5μg/mlのコントロールIgG1（−■−）、0.05μg/mlのCDH10（−○−）、および0.5μg/mlのCDH10（−□−）の存在下で測定した。（Ｂ）HT29細胞におけるLT−α1/β2の細胞傷害性効果は、抗LT−β−R  mAb  BDA8の存在によって阻害される。  LT−α1/β2の効果を、２μg/mlのコントロールIgG1（−■−）または抗LT−β−R  mAb  BDA8（−□−）の存在下で測定した。このアッセイにおけるCDH10とBDA8抗LT−β−R  mAbとの間の挙動の差異は、それらがLT−β−Rの異なるエピトープに指向されるということの１つの指標である。
【図４】図４。固定化した抗LT−β−R  mAbは、ヒト腺癌HT29細胞に対して細胞傷害性である。（Ａ）抗LT−β−R  mAbは、表面上に固定化された場合、HT29細胞において直接的な細胞傷害性効果を有する。プレートを、IgG1（−●−）、非関連の豊富な細胞表面抗原H29/26に対するmAb（−■−）、BDA8（−○−）、およびCDH10（−□−）で被覆した。（Ｂ）HT29細胞の増殖における可溶性抗LT−β−R  mAb単独の効果。記号は（Ａ）と同じである。可溶性形態でこれらの抗LT−β−R  mAbは、個々に投与された場合、HT29細胞において顕著な細胞傷害性効果を有さない。
【図５】図５。可溶性抗LT−β−R  mAbのペアで処置することによる腫瘍細胞の増強された細胞傷害性の代表的な定量。（Ａ）コントロールIgG1  (100ng/ml)、抗LT−β−R  mAb  BHA10  (100ng/ml)、抗LT−β−R  mAb  CBE11  (50ng/ml)、BHA10  (100ng/ml)  ＋IgG  (100ng/ml)、およびBHA10  (100ng/ml)＋CBE11  (50ng/ml)のHT29細胞における細胞傷害性効果。IFN−γは80  U/mlで存在した。（Ｂ）コントロールIgG1  (100ng/ml)、抗LT−β−R  mAb  CDH10  (100ng/ml)、抗LT−β−R  mAb  CBE11  (50ng/ml)、CDH10  (100ng/ml)  ＋IgG  (100ng/ml)、およびCDH10  (100ng/ml)＋CBE11  (50ng/ml)のHT29細胞における細胞傷害性効果。IFN−γは80  U/mlで存在した。（Ｃ）コントロールIgG1  (100ng/ml)、抗LT−β−R  mAb  CDH10  (33ng/ml)、抗LT−β−R  mAb  AGH1  (50ng/ml)、  およびCDH10  (33ng/ml)＋AGH1  (50ng/ml)のHT29細胞における細胞傷害性効果。IFN−γは80  U/mlで存在した。（Ｄ）細胞傷害性アッセイにおいてWiDrヒト腺癌細胞を用いた（RaitanoおよびKorc,  J.  Biol.  Chem.,  265,  10466−472頁  (1990)）こと以外は、（Ｃ）と同じである。
【図６】図６。抗LT−β−R  mAbで処置したSCIDマウスにおける腫瘍サイズ。（Ａ）抗体の同時処置を伴った接種後30日目のSCIDマウスにおけるヒト腺癌WiDr腫瘍のサイズ。マウスを、生理食塩水、IFN−γ単独、IFN−γを伴うおよびIFN−γを伴わない抗LT−β−R  mAb（CBE11）、ならびにIFN−γを伴うコントロールの抗ヒトLFA−3  mAb（1E6）で、１日目および２日目に処置した。各群の平均を横棒で示す。５群の平均、標準偏差、および動物数（括弧内）は、以下の通りであった（左から右に）：0.88＋／−0.59  (14)、1.21＋／−0.7  (21)、0.041＋／−0.052  (16)、0.11＋／−0.1  (12)、および0.98＋／−1.16  (12)。（Ｂ）腫瘍細胞接種後14〜49日のSCIDマウス（接種後15日目に抗体処置をした）におけるヒト腺癌WiDr腫瘍のサイズ。腫瘍を、いずれの処置も伴わずに、平均直径0.53cm  (0.076cc)まで増殖させ、そして腹腔内注入を15日目に開始し、そして矢印で示されたように継続した。IFN−γ単独（１×106  U/注入）（−□−）、50μgの1E6抗LFA−3  mAbを伴うIFN−γ（−○−）、50μgのCBE11抗LT−β−R  mAbを伴うIFN−γ（−△−）、または50μgのCBE11抗LT−β−R  mAb単独（データは示さない）のいずれかで処置した一群12匹の動物についての平均および標準偏差を示す。
【数１】
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【数２】
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【数３】
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【数４】
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【数５】
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【数６】
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【数７】
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【数８】
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【数９】
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【数１０】
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【数１１】
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【数１２】
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【数１３】
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【数１４】
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【数１５】
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【数１６】
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【数１７】
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【数１８】
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【数１９】
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【数２０】
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【数２１】
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【数２２】
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【数２３】
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【数２４】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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