(57)【要約】【課題】抗原−抗体反応を検出することに基づく各種検出方法における検出感度及び精度の向上を図ることが期待できる特定分子結合能を有する基体―タンパク質複合体を提供することにある。【解決手段】標的物質に対する結合部位を有する第１のドメインと、非特異吸着抑制剤に対する結合部位を有する第２のドメインを組み合わせて結合性タンパク分子を形成し、基体表面に配置した非特異吸着抑制剤に対して第２のドメインを介してこれを結合することで、標的物質捕捉用の基体−タンパク質複合体からなる素子を得る。【選択図】図２２
2007091736.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構成要素：
（１）非特異吸着抑制剤に対する結合部位を有し、抗体重鎖の可変領域の少なくとも一部を含むドメイン、
（２）標的物質に対する結合部位を有し、抗体軽鎖の可変領域の少なくとも一部を含むドメイン、
（３）前記標的物質に対する結合部位を有し、抗体重鎖の可変領域の少なくとも一部を含むドメイン、
（４）非特異吸着抑制剤に対する結合部位を有し、抗体軽鎖の可変領域の少なくとも一部を含むドメイン、
のうち、構成要素（１）及び（４）からなる第１群から選択された少なくとも１以上と、要素（２）及び（３）からなる第２群から選択された少なくとも１以上と、を有することを特徴とする結合性タンパク分子。
【請求項２】
非特異吸着抑制剤に対する結合部位を備え、該結合部位として抗体の可変領域の一部を含む第１のドメインと、標的物質に対する結合部位を備え、該結合部位として抗体の可変領域の一部を含む第２のドメインと、を有し、第１のドメインと、第２のドメインと、がリンカーを介して結合していることを特徴とする結合性タンパク分子。
【請求項３】
前記構成要素のうちの２つの構成要素が連結した連結体を有する請求項１に記載の結合性タンパク分子。
【請求項４】
前記連結体が前記構成要素（１）と（２）、及び（３）と（４）の組み合わせで連結している請求項３に記載の結合性タンパク分子。
【請求項５】
前記連結体の連結部分が、１以上のアミノ酸からなるペプチド構造を含んでなる請求項３に記載の結合性タンパク分子。
【請求項６】
前記非特異吸着抑制剤が、非特異吸着抑制能を有する官能基を少なくとも一部に含むポリマーである、請求項１に記載の結合性タンパク分子。
【請求項７】
前記非特異吸着抑制能を有する官能基を少なくとも一部に含むポリマーが、エチレングリコール基を少なくとも一部に含むポリマーである請求項６に記載の結合性タンパク分子。
【請求項８】
前記エチレングリコール基を少なくとも一部に含むポリマーが、ポリエチレングリコール及びその誘導体から選択された少なくとも１種である請求項７に記載の結合性タンパク分子。
【請求項９】
前記構成要素（１）のドメインが、下記配列番号１から配列番号３：
配列番号１：NYWIN、
配列番号２：NSYPGSSSTNYNEKFK、
配列番号３：YCARSG、
に示すアミノ酸配列の１以上を含んでなる請求項８に記載の結合性タンパク分子。
【請求項１０】
前記構成要素（１）のドメインの有するアミノ酸配列が、下記（Ａ）〜（Ｆ）：
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列（NYWIN）、
（Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列（NSYPGSSSTNYNEKFK）
（Ｃ）配列番号３のアミノ酸配列（YCARSG）、
（Ｄ）配列番号１のアミノ酸配列に対して一もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
（Ｅ）配列番号２のアミノ酸配列に対して一もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
（Ｆ）配列番号３のアミノ酸配列に対して一もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなる群から選択されたアミノ酸配列の１以上を有する請求項８に記載の結合性タンパク分子。
【請求項１１】
前記構成要素（４）のドメインが、下記配列番号４から配列番号６：
配列番号４：RSSQIVHSNG、
配列番号５：KVSNRFS、
配列番号６：FQGSHVPLT、
に示すアミノ酸配列の１以上を含んでなる請求項８に記載の結合性タンパク分子。
【請求項１２】
前記構成要素（４）のドメインの有するアミノ酸配列が、下記（Ａ）〜（Ｆ）：
（Ａ）配列番号４のアミノ酸配列（RSSQSIVHSNGNTYLD）、
（Ｂ）配列番号５のアミノ酸配列（KVSNRFS）
（Ｃ）配列番号６のアミノ酸配列（FQGSHVPLT）、
（Ｄ）配列番号４のアミノ酸配列に対して一もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
（Ｅ）配列番号５のアミノ酸配列に対して一もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
（Ｆ）配列番号６のアミノ酸配列に対して一もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなる群から選択されたアミノ酸配列の１以上を有する請求項８に記載の結合性タンパク分子。
【請求項１３】
前記非特異吸着抑制能を有する官能基を少なくとも一部に含むポリマーが、リン脂質基を少なくとも一部に含むポリマーである、請求項６に記載の結合性タンパク分子。
【請求項１４】
前記リン脂質基を少なくとも一部に含む分子が、ホスファチジルコリン基及びその誘導体からなる基から選択された少なくとも１種を一部に含むポリマーである請求項１３に記載の結合性タンパク分子。
【請求項１５】
前記構成要素（１）のドメインが、下記配列番号７から配列番号９：
配列番号７：GFTFSDFYME、
配列番号８：ASRNKANDYTTEYSASVK、
配列番号９：DYYGSSYWYFDV、
に示すアミノ酸配列の１以上を含んでなる請求項１４に記載の結合性タンパク分子。
【請求項１６】
前記構成要素（１）のドメインの有するアミノ酸配列が、下記（Ａ）〜（Ｆ）：
（Ａ）配列番号７のアミノ酸配列（GFTFSDFYME）、
（Ｂ）配列番号８のアミノ酸配列（ASRNKANDYTTEYSASVK）、
（Ｃ）配列番号９のアミノ酸配列（DYYGSSYWYFDV）、
（Ｄ）配列番号７のアミノ酸配列に対して一もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしく
は付加されたアミノ酸配列、
（Ｅ）配列番号８のアミノ酸配列に対して一もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしく
は付加されたアミノ酸配列、
（Ｆ）配列番号９のアミノ酸配列に対して一もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしく
は付加されたアミノ酸配列、
からなる群から選択されたアミノ酸配列の１以上を有する請求１４に記載の結合性タンパク分子。
【請求項１７】
前記構成要素（４）のドメインが、下記配列番号１０から配列番号１２：
配列番号１０：TASESLYSSKHVHYLA、
配列番号１１：GASNRYI、
配列番号１２：AQFYSYPL、
に示すアミノ酸配列の１以上を含んでなる請求項１４に記載の結合性タンパク分子。
【請求項１８】
前記構成要素（4）のドメインの有するアミノ酸配列が、下記（Ａ）〜（Ｆ）：
（Ａ）配列番号１０のアミノ酸配列（TASESLYSSKHVHYLA）、
（Ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列（GASNRYI）
（Ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列（AQFYSYPL）、
（Ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して一もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
（Ｅ）配列番号１１のアミノ酸配列に対して一もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
（Ｆ）配列番号１２のアミノ酸配列に対して一もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなる群から選択されたアミノ酸配列の１以上を有する請求項１４に記載の結合性タンパク分子。
【請求項１９】
標的物質に対する結合部位を有する結合性タンパク分子と、該結合性タンパク分子に結合した非特異吸着抑制剤と、を有するタンパク質複合体であって、
前記標的物質に対する結合部位を有する結合性タンパク分子が、請求項１から１８のいずれかに記載の結合性タンパク分子であることを特徴とするタンパク質複合体。
【請求項２０】
基体と、該基体上の少なくとも一部に配置された非特異吸着抑制剤、及び標的物質に対する結合部位を有する結合性タンパク分子と、を有する基体−タンパク質複合体であって、
前記標的物質に対する結合部位を有する結合性タンパク分子が、請求項１から１８のいずれかに記載の結合性タンパク分子であることを特徴とする基体−タンパク質複合体。
【請求項２１】
基体と、標的物質に対する結合部位を有するタンパク質と、を有する基体−タンパク質複合体を製造する方法であって、
（工程Ａ）基体の表面に非特異吸着抑制剤を配置する工程と、
（工程Ｂ）基体上に配置された非特異吸着抑制剤に、標的物質に対する結合部位を有するタンパク質を結合させる工程と、
を有し、
前記標的物質に対する結合部位を有するタンパク質が、請求項１乃至１８のいずれかに記載の結合性タンパク分子であることを特徴とする基体−タンパク質複合体の製造方法。
【請求項２２】
前記（工程Ａ）及び（工程Ｂ）に加えて、
（工程Ｃ）前記非特異吸着抑制剤と前記結合性タンパク分子との間に架橋分子を介して共有結合を形成する工程、
を有する請求項２１に記載の製造方法。
【請求項２３】
前記架橋分子が、光反応性原子団を含んでいる請求項２２に記載の製造方法。
【請求項２４】
基体と、該基体の表面に固定された標的物質捕捉タンパク質と、を有し、該標的物質捕捉タンパク質が固定された領域を反応領域とする標的物質捕捉素子において、
前記標的物質捕捉タンパク質が請求項１及至１８のいずれかに記載の結合性タンパク分子であり、該結合性タンパク分子が、該反応領域上に配置された非特異吸着抑制剤を介して前記基体表面に固定されていることを特徴とする標的物質捕捉素子。
【請求項２５】
標的物質の検出方法であって、
請求項２４に記載の標的物質捕捉素子に試料を接触させる工程と、
前記試料中に標的物質が含まれている場合に前記標的物質捕捉素子に標的物質が捕捉された状態を検出する工程と、を有することを特徴とする標的物質の検出方法。
【請求項２６】
標的物質の検出装置において、
請求項２４に記載の標的物質捕捉素子と試料とを反応させるための反応領域と、
該標的物質捕捉素子に標的物質が捕捉された状態を検出するための検出手段と、
を有すことを特徴とする標的物質検出装置。
【請求項２７】
標的物質捕捉方法であって、
請求項２４に記載の標的物質捕捉素子に試料を接触させて、該標的物質捕捉素子に標的物質を捕捉する工程と、
前記標的物質を捕捉した該標的物質捕捉素子を洗浄して、該標的物質捕捉素子に捕捉されなかった物質を該捕捉された標的物質と分離する工程と、
を有することを特徴とする標的物質の捕捉方法。
【請求項２８】
標的物質の捕捉装置において、
請求項２４に記載の標的物質捕捉素子と試料とを反応させるための反応領域と、
該標的物質捕捉素子に捕捉された標的物質と、該標的物質捕捉素子に捕捉されなかった物質を該標的物質捕捉素子から洗浄除去するための手段と、を有すことを特徴とする標的物質捕捉装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数のドメインからなり、標的物質に対する結合部位を有する結合性タンパク分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、タンパク質、特に抗体及びその分子認識部位を含む断片を利用したイムノアッセイが、医療診断領域で活用されてきた。近年、微量検出技術や微小構造作製技術等の周辺技術の進展により、抗原‐抗体反応を応用した分析物（標的物質）の検出及び定量のための各種デバイスが開発されている。例えば、免疫センサー、タンパク質マイクロアレイ等の診断、検出、スクリーニング用のデバイスの利用も行われるようになってきている。更に、これらのデバイスのゲノム解析に基づく、特定の疾病に関与する抗原タンパク質の検出や探索のための用途、特定の病原微生物やウイルスの検出用途は拡大している。更に、これらのデバイスは、環境ホルモンやアレルゲン物質の検出といった環境計測や食品製造工程管理、更には毒性化学物質の検出といった軍事用途に至るまで幅広く応用され始めている。
【０００３】
一方、上述した各種の検出や探索に用いられる試料の採取量は限られており、かつ標的物質は様々な物質が複雑に混在した中に微量しか含まれていないことが多いため、分析法には高い精度(再現性)と感度が要求される。更に、分析法には、信頼度の高い分析結果を正確に得られることが求められている。
【０００４】
精度、感度、信頼性の高い分析法を確立するためには、上述の周辺技術の更なる進展のみならず、技術の中心部といえる抗原−抗体反応あるいはそれに準じたタンパク質特異的認識反応の最適化が必要である。その中でも、いまだ十分に解決されていない課題として、
（１）抗体等の標的物質捕捉分子の配向固定化、及び
（２）標的物質以外の挟雑物による反応領域への非特異的吸着、
が挙げられる。これらの課題を解決するべく、以下に示すような様々な技術開発が行われてきている。
【０００５】
特許第３００７４２３号明細書には、多孔質固相担体材料上に固定化した特異的結合剤を含む免疫吸着剤材料が開示されている。この免疫吸着剤材料は、特異的結合剤が元の単数もしくは複数の抗体の如何なる実質的部分とも結合していない１種類以上の可変領域タンパク質（ＶＨ及び／又はＶＬ）を含んでいる。同明細書には、Ｆｖのような小さな特異的結合性物質を活性をさほど失わずに固相に直接固定化する方法が開示さている。更に、同明細書には、以下のｉ）及びii）の要素を含んでなる抗体断片としての特異的結合剤を固相担体に固定化する方法が開示されている。
ｉ）元の単数もしくは複数の抗体の如何なる実質的部分とも結合していない１種類以上の可変領域タンパク質（ＶＨ及び／又はＶＬ）。
ii)基本的な特異的結合特性には寄与しないが該結合剤の基本的な特異的結合活性にさほど影響を与えることなく該固相担体材料と化学的手段もしくは他の手段でカップリングし得る化学基（好ましくはペプチド基）。
【０００６】
特許第３０９５４１５号明細書には、以下の（ａ）抗体断片に加えて、（ｂ）担持担体又は（ｃ）非抗体部分を含み、該抗体断片の免疫反応性を保持している可溶性免疫複合体が開示されている。
（ａ）軽鎖の可変部のアミノ酸の18位近傍に結合した天然に存在しない炭水化物部分をもつ該軽鎖の可変部を含む、Fab、Fab’、Ｆ（ab）２、Ｆ（ab’）２、Fv、及び一本鎖Fvからなる群から選択される糖鎖形成された抗体断片。
（ｂ）少なくとも１つの遊離アミン基をもつポリマー担体、及び、該ポリマー担体と共有結合した複数の薬剤、毒素、キレート剤、ボロンアデンド、又は検出可能な標識分子を含み、該ポリマー担体の少なくとも１つの遊離アミン基を介して、該抗体断片の該炭水化物部分と共有結合している担持担体。
（ｃ）薬剤、毒素、キレート剤、ボロンアデンド、又は検出可能な標識分子からなる群から選択され、各々が該抗体断片の該炭水化物部分と共有結合している少なくとも１つの非抗体部分。
【０００７】
特表２００２−５２０６１８号公報には、パッチを含むタンパク質のアレイが開示されている。このパッチは、
（ａ）基板；
（ｂ）該基板表面のいくつかまたは全ての上の少なくとも１つの有機薄膜；および
（ｃ）有機薄膜によって被覆された該基板表面の部分上の別々の既知の領域に配置された複数のパッチである。そして、これらのパッチの各々は、下にある有機薄膜上に固定されたタンパク質を含む。更に、この有機薄膜が含む単層は、
式：（Ｘ）aＲ（Ｙ）b
の分子を含む自己組織化単層を含む。ここでＲは、スペーサーであり、Ｘは、Ｒを前記表面に結合させる官能基であり、Ｙは、前記タンパク質を該単層に結合させるための官能基であり、そしてａおよびｂは、独立して整数である。
【特許文献１】特許第３００７４２３号明細書
【特許文献２】特許第３０９５４１５号明細書
【特許文献３】特表２００２−５２０６１８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したように、タンパク質の分子認識、その中でも特に抗原−抗体反応を検出することに基づく各種のデバイスの用途の拡大に伴って、診断、検出、スクリーニングデバイスにおける精度、感度、信頼性の高い分析手法を確立することが要求されてきている。これらのデバイスとしては、イムノアッセイキット、免疫センサー、タンパク質マイクロアレイ等がある。かかる要求に対応するために、特に
（１）抗体等の標的物質捕捉分子の配向固定化、
（２）標的物質以外の挟雑物による反応領域への非特異的吸着、
という課題を解決するために様々な研究開発が進められている。しかしながら、これらの技術は必ずしも上記課題を双方とも解決するには十分というわけではなく、更なる高感度、高精度な素子を開発するためには、広く応用ができる信頼性の高い解決手段が求められている。本発明の目的は、抗原−抗体反応を検出することに基づく各種検出方法における検出感度及び精度の向上を図ることが期待できる標的物質結合能を有する基体―タンパク質複合体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述のような課題を解決すべく本発明者らは鋭意研究の結果、以下の各手段を同時に提供し得る発明に至った。
（１）抗体の標的物質認識領域を十分利用可能な形で分子を配向しうる結合性タンパク分子及びそれを固定する手段、
（２）本発明の素子上の反応領域において結合性タンパク分子からなる標的物質捕捉分子への標的物質の特異的結合以外の種々の非特異的な結合及び吸着を抑制する手段。
【００１０】
本発明の結合性タンパク分子は、
下記構成要素：
（１）非特異吸着抑制剤に対する結合部位を有し、抗体重鎖の可変領域の少なくとも一部を含むドメイン、
（２）標的物質に対する結合部位を有し、抗体軽鎖の可変領域の少なくとも一部を含むドメイン、
（３）前記標的物質に対する結合部位を有し、抗体重鎖の可変領域の少なくとも一部を含むドメイン、
（４）非特異吸着抑制剤に対する結合部位を有し、抗体軽鎖の可変領域の少なくとも一部を含むドメイン、のうち、構成要素（１）及び（４）からなる第１群から選択された少なくとも１以上と、要素（２）及び（３）からなる第２群から選択された少なくとも１以上と、を有することを特徴とする結合性タンパク分子である。また、別に本発明の結合性タンパク分子は、非特異吸着抑制剤に対する結合部位を備え、該結合部位として抗体の可変領域の一部を含む第１のドメインと、標的物質に対する結合部位を備え、該結合部位として抗体の可変領域の一部を含む第２のドメインと、を有し、第１のドメインと、第２のドメインと、がリンカーを介して結合していることを特徴とする結合性タンパク分子である。
【００１１】
本発明のタンパク質複合体は、標的物質に対する結合部位を有するタンパク分子と、該タンパク分子に結合した非特異吸着抑制剤と、を有するタンパク質複合体であって、前記標的物質に対する結合部位を有するタンパク分子が、上記構成の結合性タンパク分子からなることを特徴とするタンパク質複合体である。
【００１２】
本発明の基体−タンパク質複合体は、基体と、該基体上の少なくとも一部に配置された非特異吸着抑制剤、及び標的物質に対する結合部位を有する結合性タンパク分子と、を有する基体−タンパク質複合体であって、前記標的物質に対する結合部位を有する結合性タンパク分子が、上記の構成の結合性タンパク質であることを特徴とする基体−タンパク質複合体である。
【００１３】
本発明の基体−タンパク質複合体の製造方法は、
基体と、標的物質に対する結合部位を有するタンパク質と、を有する基体−タンパク質複合体を製造する方法であって、
（工程Ａ）基体の表面に非特異吸着抑制剤を配置する工程と、
（工程Ｂ）基体上に配置された非特異吸着抑制剤に、標的物質に対する結合部位を有するタンパク質を結合させる工程と、
を有し、
前記標的物質に対する結合部位を有するタンパク質が、上記構成の結合性タンパク分子であることを特徴とする基体−タンパク質複合体の製造方法である。
【００１４】
本発明の標的物質捕捉素子は、基体と、該基体の表面に固定された標的物質捕捉タンパク質と、を有し、該標的物質捕捉タンパク質が固定された領域を反応領域とする標的物質捕捉素子において、
前記標的物質捕捉タンパク質が上記構成の結合性タンパク分子であり、該結合性タンパク分子が、該反応領域上に配置された非特異吸着抑制剤を介して前記基体表面に固定されていることを特徴とする標的物質捕捉素子である。
【００１５】
本発明の標的物質の検出方法は、上記の構成の標的物質捕捉素子に試料を接触させる工程と、前記試料中に標的物質が含まれている場合に前記標的物質捕捉素子に標的物質が捕捉された状態を検出する工程と、を有することを特徴とする標的物質の検出方法である。
【００１６】
本発明の標的物質検出装置は、上記の構成の標的物質捕捉素子と試料とを反応させるための反応領域と、該標的物質捕捉素子に標的物質が捕捉された状態を検出するための検出手段と、を有すことを特徴とする標的物質検出装置である。
【００１７】
本発明の標的物質の捕捉方法は、上記構成の標的物質捕捉素子に試料を接触させて、該標的物質捕捉素子に標的物質を捕捉する工程と、前記標的物質を捕捉した該標的物質捕捉素子を洗浄して、該標的物質捕捉素子に捕捉されなかった物質を該捕捉された標的物質と分離する工程と、を有することを特徴とする標的物質の捕捉方法である。
【００１８】
本発明の標的物質の捕捉装置は、上記構成の標的物質捕捉素子と試料とを反応させるための反応領域と、該標的物質捕捉素子に捕捉された標的物質と、該標的物質捕捉素子に捕捉されなかった物質を該標的物質捕捉素子から洗浄除去するための手段と、を有すことを特徴とする標的物質捕捉装置である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明では、非特異吸着抑制剤に親和性のある抗体または抗体断片と、標的物質に親和性を有する抗体または抗体断片を組み合わせて結合性タンパク分子を構成している。この構成は、素子上の反応領域において結合性タンパク分子からなる標的物質捕捉分子への標的物質の特異的結合以外の種々の非特異的な結合及び吸着を効果的に防止するためのものである。本発明においては、上記の構成に加えて、非特異吸着抑制剤を反応領域の基体表面に吸着させた状態で結合性タンパク分子と複合体の構成を形成させている。
【００２０】
これらの構成により、以下の効果を同時に達成可能となる。
（１）結合性タンパク分子の非特異吸着抑制剤親和性抗体断片が、非特異吸着抑制剤を介して基体方向に配向され、標的物質親和性抗体断片が必然的に基体とは異なる方向に配向される。その結果、標的物質認識領域を十分利用可能な形で分子を配向させることが可能となる。
（２）反応領域に位置する基体表面において、結合性タンパク分子が占める領域以外は、標的物質以外の挟雑物の反応領域への非特異的吸着を防止する非特異吸着抑制剤により占められるため、結果的に標的物質以外の挟雑物の反応領域への非特異的吸着が防止される。
【００２１】
かかる効果を有する本発明によれば、タンパク質の分子認識、その中でも特に抗原−抗体反応に基づく、診断、検出、スクリーニング用のデバイスを用いた、より精度、感度、信頼性の高い分離・分析手法を確立できる。これらのデバイスとしては、イムノアッセイキット、免疫センサー、タンパク質マイクロアレイ等を挙げることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
まず、以下の各用語について説明する。
＜非特異吸着抑制剤、抗体、免疫グロブリン、抗体フラグメント、抗体断片、可変ドメイン、軽鎖／重鎖、機能的部分、結合性タンパク分子＞
＜非特異吸着抑制剤＞
非特異吸着抑制剤は、本発明の目的効果を達成し得るものであればいかなるものであってもよい。中でも本発明が解決する課題点の一つである、標的物質以外の挟雑物による反応領域への非特異的吸着を抑制または防止するための機能を有するものが望ましい。そのような非特異吸着抑制剤としては、生体由来物質および非生体由来物質を利用することができる。生体由来物質として、例えば、ウシ血清アルブミン、カゼイン、スキムミルク、等の標的物質との相互作用のない生体由来物質が公知の非特異吸着抑制剤として挙げられる。更に、これらの生体由来物質を修飾して得られる誘導体で非特異吸着抑制剤としての機能を有するものも利用できる。
【００２３】
また、非生体由来物質として、非特異吸着抑制能を有する官能基の１以上を、少なくとも一部に含むポリマーを非特異吸着抑制剤として利用できる。そのような官能基としては、基体表面への物質の非特異的な吸着を防止または抑制するとされるものであればいかなるものでもよい。かかる官能基としては、ヒドロキシル基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブチル基、ｔ−ブチル基、２−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシプロピル基、３−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシイソプロピル基、２−ヒドロキシブチル基、３−ヒドロキシブチル基、４−ヒドロキシブチル基、スチレン基、スルホニル基、ホスホニル基、アミノ基、メチルアミノ基、エチルアミノ基、イソプロピルアミノ基、アミド基、メチルアミド基、エチルアミド基、イソプロピルアミド基、ピロリドン基、エチレングリコール基、リン脂質基、コリン基、ホスファチジルコリン基及びこれらの誘導体からなる基を挙げることができる。また、糖などの親水性分子を後に結合させるためのものであってもよい。これらの中では、エチレングリコール基及びその誘導体からなる基の一種以上を一部に含む非特異吸着抑制機能を有するポリマー、更には、ホスファチジルコリン基及びその誘導体からなる基の一種以上を一部に含む非特異吸着抑制機能を有するポリマーが好ましい。
【００２４】
非特異吸着抑制剤としてこれらの物質を基体の表面に配置する方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、非特異吸着抑制剤を含む溶液中に基体を一定時間浸漬することにより基体表面上に非特異吸着抑制剤を配置することができる。また、基体表面を修飾し、非特異吸着抑制剤と基体表面との間に化学結合を形成させることにより、基体表面上に非特異吸着抑制剤を配置することができる。基体の修飾方法としては、疎水膜を作成したり、基体上にアルカンチオール誘導体で自己組織化膜(SAM)を形成したりする方法等があるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
＜抗体、免疫グロブリン＞
「抗体」とは、自然界の生物体内で産生される、あるいは遺伝子組み替え技術やタンパク工学技術、更には有機反応等により全体的または部分的に合成された免疫グロブリンを意味する。特異的結合能を保持するその全ての誘導体もまた、「抗体」に含まれる。この用語はまた、免疫グロブリンの結合ドメインに相同か、または高度に相同な結合ドメインを有する任意のタンパク質を含む（キメラ抗体およびヒト化抗体を含む）。これらの「抗体」、或いは「免疫グロブリン」としては、自然界の生物体内で産生させたもの、全体的または部分的に遺伝子工学的手法などを用いて合成されたもの、更には、これらに修飾を加えたもの、などが利用できる。
【００２６】
「抗体」、或いは「免疫グロブリン」は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。
【００２７】
「抗体」、或いは「免疫グロブリン」は、任意の免疫グロブリンクラスのメンバーであり得、任意のヒトのクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ）を含むことができる。しかし、ＩｇＧクラスの誘導体が本発明においてより好ましい。
【００２８】
＜抗体フラグメント、抗体断片＞
「抗体フラグメント」或いは「抗体断片」とは、抗体或いは免疫グロブリンの全長に満たない抗体の任意の分子或いは複合体をいう。抗体フラグメントとしては、全長抗体の特異的結合能力の重要な部分を少なくとも保持するものが好ましい。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ディアボディー、およびＦｄフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
抗体フラグメントは、任意の手段によって産生され得る。例えば、抗体フラグメントは、酵素的または化学的に、インタクトな抗体のフラグメント化によって産生され得る。あるいは部分抗体配列をコードする遺伝子より組換え的に産生され得る。あるいは、抗体フラグメントは、全体的にまたは部分的に合成的に産生され得る。抗体フラグメントは、必要に応じて、一本鎖抗体フラグメントとすることもできる。あるいは、フラグメントは、例えば、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）結合によって連結される複数の鎖を含み得る。フラグメントはまた、必要に応じて、複数の分子の複合体でも良い。機能的な抗体フラグメントは、代表的には、少なくとも約５０アミノ酸を含み、より代表的には少なくとも、約２００アミノ酸を含む。
【００３０】
＜可変ドメイン、軽鎖／重鎖＞
「可変ドメイン」とは、標的物質（抗原）の種類により特異的な結合／捕捉機能を発揮するために前記抗原毎に異なるアミノ酸配列部分を有する、免疫グロブリンの先端のドメインであり、通常Ｆｖと記される。Ｆｖはまた、「重鎖の可変ドメイン（以下、ＶＨと記す場合もある）」、及び「重鎖の可変ドメイン（以下、ＶＬと記す場合もある）」から成り、免疫グロブリンＧではＶＨ、ＶＬドメインを通常それぞれ２ずつ含む。
【００３１】
＜機能的部分＞
「免疫グロブリン重鎖或いは軽鎖の可変ドメインの機能部分（以下単に「機能部分」と記す場合もある）」とは、可変ドメインのなかで標的物質（抗原）との間の特異性を実際に担っている部分である。狭義には、ＣＤＲ（complementarity determining region：超可変領域）と呼ばれる部分及びその周縁部分を指し、広義にはそれらが抗原−抗体結合をするために必要なＣＤＲ構造に寄与するフレームワーク構造をも含んで指すものである。
【００３２】
＜結合性タンパク分子＞
本発明における結合性タンパク分子は、上記のような「抗体」または「免疫グロブリン」、「抗体フラグメント」または「抗体断片」を用いて構成することができる。また、抗体の可変領域部（Ｆｖ）またはその一部を用いて構成されたものでもよく、例えばＦｖを構成する重鎖可変領域（ＶＨ）や軽鎖可変領域（ＶＬ）またはその一部を用いて構成されたものでもよい。
【００３３】
本発明における結合性タンパク分子は、下記構成要素のうち、構成要素（１）及び（４）からなる第１群から選択された少なくとも１以上、及び構成要素（２）及び（３）からなる第２群から選択された少なくとも１以上、をそれぞれ含む、結合性タンパク分子である。
（１）非特異吸着抑制剤に対する結合部位を有し、抗体重鎖の可変領域の少なくとも一部を含むドメイン。
（２）標的物質に対する結合部位を有し、抗体軽鎖の可変領域の少なくとも一部を含むドメイン。
（３）標的物質に対する結合部位を有し、抗体重鎖の可変領域の少なくとも一部を含むドメイン。
（４）非特異吸着抑制剤に対する結合部位を有し、抗体軽鎖の可変領域の少なくとも一部を含むドメイン。
【００３４】
なお、上記の（２）のドメインが結合する標的物質と（３）のドメインが結合する標的物質は同一分子である。
【００３５】
より望ましくは、結合性タンパク分子は、上記の構成要素のうちの２つの構成要素が連結した連結体を有する。例えば、３ドメイン構成の場合には、３つのドメインのうちの２ドメインを連結して１つの連結体が結合性タンパク分子に含まれるようにしてもよい。また、４ドメイン構成の場合には、４つのドメインのうちの２ドメインを連結して１つの連結体が結合性タンパク分子に含まれるようにしてもよく、あるいは４つのドメインのうちの各２ドメインを連結して２つの連結体が結合性タンパク分子に含まれるようにしてもよい。更に望ましくは、連結体が、構成要素（１）と（２）、及び（３）と（４）の組み合わせで連結している。すなわち、結合性タンパク分子は、この連結体として、構成要素（１）と（２）の第一の連結体と、構成要素（３）と（４）の第２の連結体を少なくとも含むことが更に望ましい。
【００３６】
非特異吸着抑制剤に結合する部位を有する抗体断片の例として、以下にポリエチレングリコールに対して親和性を有するドメインを示す。構成要素（１）のドメインとしては、下記配列番号１から配列番号３に示すアミノ酸配列の１以上を含むものが好ましい。
配列番号１：NYWIN。
配列番号２：NSYPGSSSTNYNEKFK。
配列番号３：YCARSG。
【００３７】
更に、構成要素（１）のドメインは、下記（Ａ）から（Ｆ）からなる群から選択されたアミノ酸配列の1以上を有するものが好ましい。
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列（NYWIN）。
（Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列（NSYPGSSSTNYNEKFK）。
（Ｃ）配列番号３のアミノ酸配列（YCARSG）。
（Ｄ）配列番号１のアミノ酸配列に対して一もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
（Ｅ）配列番号２のアミノ酸配列に対して一もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
（Ｆ）配列番号３のアミノ酸配列に対して一もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
【００３８】
また、構成要素（４）のドメインは、下記配列番号４から配列番号６に示すアミノ酸配列の１以上を含んでなるものが好ましい。
配列番号４のアミノ酸配列（RSSQSIVHSNGNTYLD）。
配列番号５のアミノ酸配列（KVSNRFS）。
配列番号６のアミノ酸配列（FQGSHVPLT）。
【００３９】
構成要素（４）のドメインの有するアミノ酸配列が、下記（Ａ）乃至（Ｆ）からなる群から選択されたアミノ酸配列の1以上を有するものが好ましい。
（Ａ）配列番号４のアミノ酸配列（RSSQSIVHSNGNTYLD）。
（Ｂ）配列番号５のアミノ酸配列（KVSNRFS）。
（Ｃ）配列番号６のアミノ酸配列（FQGSHVPLT）。
（Ｄ）配列番号４のアミノ酸配列に対して一もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
（Ｅ）配列番号５のアミノ酸配列に対して一もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
（Ｆ）配列番号６のアミノ酸配列に対して一もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
【００４０】
更に、非特異吸着抑制剤に対して親和性を有するドメインの一例として、以下にホスファチジルコリンに対して親和性を有するドメインを示す。
【００４１】
前記構成要素（1）のドメインとしては、下記配列番号７から配列番号９に示すアミノ酸配列の１以上を含んでなるものが好ましい。
配列番号７：GFTFSDFYME。
配列番号８：ASRNKANDYTTEYSASVK。
配列番号９：DYYGSSYWYFDV。
【００４２】
構成要素（１）のドメインの有するアミノ酸配列が、下記（Ａ）乃至（Ｆ）からなる群から選択されたアミノ酸配列の１以上を有するものが好ましい。
（Ａ）配列番号７のアミノ酸配列（GFTFSDFYME）。
（Ｂ）配列番号８のアミノ酸配列（ASRNKANDYTTEYSASVK）。
（Ｃ）配列番号９のアミノ酸配列（DYYGSSYWYFDV）。
（Ｄ）配列番号７のアミノ酸配列に対して一もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
（Ｅ）配列番号８のアミノ酸配列に対して一もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
（Ｆ）配列番号９のアミノ酸配列に対して一もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
【００４３】
また、構成要素（４）のドメインが、下記配列番号１０から配列番号１２に示すアミノ酸配列の1以上を含んでなるものが好ましい。
配列番号１０：TASESLYSSKHVHYLA。
配列番号１１：GASNRYI。
配列番号１２：AQFYSYPL。
【００４４】
構成要素（４）のドメインの有するアミノ酸配列が、下記（Ａ）乃至（Ｆ）からなる群から選択されたアミノ酸配列の１以上を有するものが好ましい。
（Ａ）配列番号１０のアミノ酸配列（TASESLYSSKHVHYLA）。
（Ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列（GASNRYI）。
（Ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列（AQFYSYPL）。
（Ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して一もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
（Ｅ）配列番号１１のアミノ酸配列に対して一もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
（Ｆ）配列番号１２のアミノ酸配列に対して一もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
【００４５】
以下に、このような抗体または抗体断片を用いた本発明の結合性タンパク分子の一例を詳細に説明する。図１に、本発明の結合性タンパク分子の最も好ましい形態の模式図を示す。ドメイン１及びドメイン４の一方は、抗体重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）及びその機能的部分からなる非特異吸着抑制剤に対する結合部位を有し、他方は、抗体軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）及びその機能的部分からなる非特異吸着抑制剤に対する結合部位を有する。即ち、ドメイン１と４の組み合わせで非特異吸着抑制剤に対する結合部位を有し、Ｆｖ分子を形成している。更に、ドメイン２及び３の一方は、抗体重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）およびその機能的部分からなる標的物質に対する結合部位を有し、他方は、抗体軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）およびその機能的部分からなる標的物質に対する結合部位を有する。即ちドメイン２と３の組み合わせで標的物質に対する結合部位を有し、Ｆｖ分子を形成している。なお、標的物質については後述する。
【００４６】
また、ドメイン１とドメイン３、ドメイン４とドメイン３はリンカー５により連結されている。リンカー５は、１から１０アミノ酸残基程度、より好ましくは１から５アミノ酸残基程度のペプチド構造を有している。ドメイン２と３、及びドメイン１と４がそれぞれ相補的な関係にあるＶＬ−ＶＨの組み合わせの場合は、図２に示すようにドメイン１とドメイン３を連結する１本のみでリンカー５が構成される場合もあり得る。また、ドメイン２と３、及びドメイン１と４がそれぞれ相補的な関係にあるＶＬ−ＶＨの組み合わせの場合には、図２のようなドメイン１とドメイン３の連結の代わりに、ドメイン２と４のみをリンカーで連結する構造としてもよい。
【００４７】
更に本発明の結合性タンパク分子は、必ずしもＦｖフラグメントを構成する必要は無い。例えば、図３に示すような、ドメイン１とドメイン２、及びドメイン１とドメイン３の組み合わせ、或いは図４に示すような、ドメイン３とドメイン１、及びドメイン３とドメイン４の組み合わせから構成される場合もあり得る。なお、図３に示す構成において、ドメイン１の代わりにドメイン４を、図４に示す構成におけるドメイン３の代わりにドメイン２を用いることもできる。要するに、標的物質や、非特異吸着抑制剤に対しより望ましい特異性及び／或いは親和性を発揮し得る構成とすればよい。
【００４８】
図５には、本発明の結合性タンパク分子の最小限の構成の模式図を示す。番号の対応は図１と同様である。抗体軽鎖（ＶＬ）或いは重鎖（ＶＨ）の可変領域の少なくとも一部を含むドメインには、ＣＤＲ（超可変領域：実際に対象物質と特異的親和性を有する部分（結合部位））がそれぞれ３箇所存在する。そのため、非特異吸着抑制剤及び標的物質に対し、各１ドメインずつで十分な親和性を発揮し得る場合には、先に挙げた第１群及び第２群から各々１ドメインを選択してリンカーで連結した構成とすることができる。図５に着目すると本発明の結合性タンパク分子は、非特異吸着抑制剤に対する結合部位を備え、該結合部位として抗体の可変領域の一部を含む第１のドメインと、標的物質に対する結合部位を備え、該結合部位として抗体の可変領域の一部を含む第２のドメインと、を有し、第１のドメインと、第２のドメインと、がリンカーを介して結合している結合性タンパク分子ということができる。
【００４９】
図６に、本発明の結合性タンパク分子の別の構成の模式図を示す。番号の対応は図１と同様である。図６の結合性タンパク分子は、３ドメイン構造を有する。この３ドメイン構造では、標的物質に対しては抗体軽鎖（ＶＬ）或いは重鎖（ＶＨ）の可変領域の少なくとも一部を含むドメインのうち、１ドメインのみで十分な親和性が発揮される。一方、非特異吸着抑制剤に対しては抗体軽鎖（ＶＬ）の可変領域の少なくとも一部を含むドメインと、重鎖（ＶＨ）の可変領域の少なくとも一部を含むドメインとの２ドメインが揃う事により親和性が発揮される。
【００５０】
このように、結合性タンパク分子を構成するドメインの数は、標的物質に対する親和性を得るための必要なドメインの数（１以上）と、非特異吸着抑制剤に対する親和性を得るために必要なドメインの数（１以上）と、を目的に応じて選択して決定することができる。
【００５１】
図７に、本発明の結合性タンパク分子の別の構成の模式図を示す。番号の対応は図１と同様である。この３ドメイン構成の形態では、非特異吸着抑制剤に対しては抗体軽鎖（ＶＬ）或いは重鎖（ＶＨ）の可変領域の少なくとも一部を含むドメインのうち１ドメインのみで十分な親和性が発揮される。一方、標的物質に対しては、抗体軽鎖（ＶＬ）の可変領域の少なくとも一部を含むドメインと、重鎖（ＶＨ）の可変領域の少なくとも一部を含むドメインとの２ドメインが揃う事により親和性が発揮される。
【００５２】
本発明の結合タンパクの最も好ましい形態（図１）は、いわゆる「ディアボディー(diabody)」(Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448, 1993)と言われるものである。「ディアボディー」には、極めて短いリンカーによってともに連結された抗体可変VHおよびVLドメインが含まれる。このリンカーは、一本鎖Fv断片を形成するようにVHドメインとVLドメインを結合させるには短すぎる様に設計されているため、２鎖のVHドメインとVLドメインが会合して二量体を形成する。その結果、２つの結合部位を有する分子が産生され、「ディアボディー」とはこのことを意味する(Perisic et al., Structure 2, 1217-1226, 1994)。二重特異性「ディアボディー」は、１つの細胞からのVH(A)-VL(B)およびVH(B)-VL(A)構造の２鎖の発現により産生される。この場合、VLは、抗体軽(L)鎖の可変(V)ドメインを意味し、VHは、重(H)鎖の可変ドメイン(V)を意味し、これら可変ドメインが抗原(A)または(B)に結合する。VH部分とVL部分の会合により、機能的に有効な結合部位を有するヘテロ二量体断片となるものである。
【００５３】
図１におけるドメイン２及びドメイン３は標的物質に対する結合部位を有する。ドメイン２は、抗体軽鎖の少なくとも一部を含み、ドメイン３は重鎖の可変領域の少なくとも一部を含む。これらのドメインとしては、その遺伝子配列が既知であるものを用いることができる。
【００５４】
＜結合性タンパク分子の取得方法＞
本発明の結合性タンパク分子における、標的物質に対して結合能を有するこのような抗体重鎖可変領域（ＶＨ）、または抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を取得する方法の一つとして免疫法がある。すなわち、前述の非特異吸着抑制剤または標的物質にて免疫した動物から、その動物の種類に応じて、血清、乳（常乳あるいは初乳）、または卵黄等から常法によって抗体（ポリクローナル抗体）を採取し、必要に応じて更に断片化などの処理を行って所望の可変領域を得る。
【００５５】
一方、モノクローナル抗体産生細胞を用いた融合法により所望の可変領域を得ることもできる。この場合、まず、脾臓細胞やリンパ節細胞等の抗体産生細胞を分離し、モノクローナル抗体産生細胞を得る。得られたモノクローナル抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合し、増殖を半永久化する。このとき、細胞融合に使用するミエローマ細胞としては、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２）のような細胞株を挙げることができる。次いで、得られたハイブリドーマから目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択し、これを培養し抗体を回収する。
【００５６】
更に、本発明の結合性タンパク分子は、公知の技術により、例えば、米国特許第4,474,493号明細書に開示されているクワドローマの生成、すなわちハイブリドーマの更なる融合により取得することができる。更には、半分子の化学的再結合〔Science 229:81（1985）〕により、本発明の結合性タンパク分子を取得することもできる。免疫法、融合法、ハイブリドーマの選択、抗体の回収等は公知の常法により行うことができる。ＶＨまたはＶＬをコードする遺伝子は、これらVHおよびVL抗体遺伝子を増幅することのできる公知のプライマーを用いて得ることができる。
【００５７】
更に、ＶＨまたはＶＬ遺伝子ライブラリーを作製し、それらをタンパク質として網羅的にウイルス或いは細胞の表層に融合タンパク質として発現させて、非特異吸着抑制剤または標的物質に対する結合性により選択する方法が利用できる。
【００５８】
前記遺伝子ライブラリーは、たとえば、臍帯血、扁桃、骨髄、あるいは末梢血細胞や脾細胞等から得ることができる。具体的には、まず、ヒト末梢血細胞からｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。次に、ヒトＶＨ、ＶＬをコードする配列をプローブとして、ヒトＶＨまたはＶＬのｃＤＮＡライブラリーを作製する。例えば、ヒトＶＨファミリー（ＶＨ１乃至７）をファミリー毎に幅広く増幅することができるプライマーやヒトＶＬを増幅できるプライマーは公知である。これらＶＨ、ＶＬ毎にプライマーを組み合わせてＲＴ−ＰＣＲを行い、ＶＨ、ＶＬをコードした遺伝子を取得する。得られた抗体配列を基にして、超可変領域部をコードする遺伝子を人工合成することにより、多様かつ大規模なライブラリーを作製し利用することができる。
【００５９】
また、ファージディスプレー法を用いることも可能である。ファージディスプレー法では、まず、ＶＨ、ＶＬまたはそれら含む複合体（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ）をコードした遺伝子ライブラリーを、ファージ外殻タンパク質をコードした遺伝子と結合し、ファージミドライブラリーを作製する。次に、それらを大腸菌に形質転換し、種々のＶＨまたはＶＬを外殻タンパク質の一部として有するファージとして発現させる。それらのファージから、上記と同様にして非特異吸着抑制剤または標的物質に対する結合性により所望とするＶＨまたはＶＬを選択することができる。ファージに融合タンパク質として提示されたＶＨまたはＶＬをコードする遺伝子は、ファージ内にファージミドにコードされているので、それらのＤＮＡシークエンス解析をすることにより、融合タンパク質を特定する方法のひとつとして利用できる。
【００６０】
以下に、非特異吸着抑制剤としてホスファチジルコリンを挙げ、ファージディスプレイ法を用いてホスファチジルコリンに対して特異的親和性を有するＶＨまたはＶＬの取得方法を例示する。
【００６１】
ファージディスプレイライブラリーの作成及びインビトロスクリーニングは、公知の方法により行うことができる。まず、既存の市販されているファージライブラリー、または上記のようにして得られた遺伝子ライブラリーからファージミドベクターの外殻表面に上記抗体遺伝子を発現できるように構築したファージライブラリーを作製する。続いて、ホスファチジルコリンに結合性を有する抗体断片を提示したファージクローンのスクリーニングを行う。タイタープレートウェルまたは不溶性担体等の固相にホスファチジルコリン膜を形成する。続いて、ホスファチジルコリン膜にファージライブラリー溶液を加えて適当な時間インキュベートする。結合しなかったファージを洗浄して除去した後、固相に残ったファージを回収する。回収した前記ファージを大腸菌に感染させ、新たなファージライブラリーを作製する。この一連の操作（ラウンド）によって、ターゲットに有意な親和性を持つリガンドを提示したファージは102〜104倍に濃縮される。回収したファージを宿主大腸菌に感染させて増幅し、バイオパニングを繰り返せば、3〜5ラウンド後に回収されたファージはターゲットに対して有意な親和性を持つ配列を提示したファージに収束されたファージライブラリーを得る。ここで選択されたファージからＤＮＡを抽出し、そのＤＮＡ塩基配列を決定することにより、ファージが発現するホスファジチルコリンと特異的に発現するＶＨまたはＶＬを得ることができる。
【００６２】
＜結合性タンパク分子の製造方法＞
また、本発明の結合性タンパク分子は、必要とされるドメインをコードする遺伝子をプラスミドやコスミドといったベクターに組み込み、大腸菌や酵母等の細胞に導入することにより各ドメインを発現させることにより生産することができる。生産に際しては、シグナルペプチドをベクターに導入して結合性タンパク分子を細胞外へ分泌させて単離精製する方法が利用できる。細胞内不溶顆粒体（inclusion body）として生産する場合は、この顆粒体を尿素や塩酸−グアニジン等の変性剤で変性させ、段階的透析や分子シャペロン等の添加により立体構造を回復させる（巻き戻し或いはリフォールディング）手法が利用できる。更に、大腸菌や小麦胚芽、更には昆虫や動物細胞等の細胞抽出液の存在下、所謂「無細胞系（in vitro）」でこれらの結合性タンパク分子を生産することも可能である。
【００６３】
＜タンパク質複合体＞
本発明のタンパク質複合体は、上記構成の結合性タンパク分子の有する非特異吸着抑制剤に対する結合部位を利用して、これに非特異吸着抑制剤を結合させた構成を有する。図８に、本発明のタンパク質複合体の最も好ましい形態の模式図を示す。ドメイン１及びドメイン４の一方は、非特異吸着抑制剤に対する結合部位を有し、抗体重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）およびその機能的部分であり、他方は、非特異吸着抑制剤に対する結合部位を有し、抗体軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）およびその機能的部分である。即ちドメイン１と４の組み合わせで上記非特異吸着抑制剤に対する結合部位を有し、Ｆｖ分子を形成している。更にドメイン２及びドメイン３の何れか一方は、標的物質（標的物質については後述する）に対する結合部位を有し、抗体重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）およびその機能的部分である。他方は、標的物質に対する結合部位を有し、抗体軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）およびその機能的部分である。即ちドメイン２と３の組み合わせで非特異吸着抑制剤に対し結合部位を有するＦｖ分子を形成している。また、ドメイン１及び４の少なくとも一方の結合部位が非特異吸着抑制剤６と結合している。ドメイン１とドメイン３、ドメイン４とドメイン３はリンカー５により連結されている。リンカー５は、１から１０アミノ酸残基程度、より好ましくは１から５アミノ酸残基程度のペプチド構造を有している。
【００６４】
非特異吸着抑制剤に対し結合部位を有するドメイン１及び４と非特異吸着抑制剤との結合を強固にしたい場合には、図９に示す架橋分子を介して両者を共有結合により結合する構成をとることができる。架橋分子については後述する。
【００６５】
ここでリンカーは、ドメイン２と３、及びドメイン１と４がそれぞれ相補的な関係にあるＶＬ−ＶＨの組み合わせであれば図１０及び図１１に示すようにドメイン１とドメイン３を連結する１本のみで構成される場合もあり得る。なお、図１０及び１１の構成において、ドメイン２とドメイン４を連結する１本のみでリンカーを構成してもよい。
【００６６】
更に本発明のタンパク質複合体は、必ずしもＦｖフラグメントを構成する必要は無い。例えば、図１２及び図１３に示すような、ドメイン１とドメイン２、及びドメイン１とドメイン３の組み合わせ、或いは図１４及び図１５に示すような、ドメイン３とドメイン１及びドメイン３とドメイン４の組み合わせから構成される場合もあり得る。また、図１２及び図１３に示す構成ではドメイン１の代わりにドメイン４を用いることもでき、図１４及び図１５に示す構成ではドメイン３の代わりにドメイン２を用いることもできる。すなわち、標的物質或いは非特異吸着抑制剤に対しより望ましい特異性及び或いは親和性を発揮し得る構成とすればよい。
【００６７】
図１６及び図１７に、本発明のタンパク質複合体の最小限の構成の模式図を示す。番号の対応は図８と同様である。抗体軽鎖（ＶＬ）或いは重鎖（ＶＨ）の可変領域の少なくとも一部を含むドメインには、ＣＤＲ（超可変領域：実際に対象物質と特異的親和性を有する部分（結合部位））がそれぞれ３箇所存在する。そのため、非特異吸着抑制剤及び標的物質に対し、各１ドメインずつで十分な親和性を発揮し得る場合には、この複合体中に含まれる結合性タンパク分子を、先に述べた第１群及び第２群から各々１ドメインを選択してリンカーで連結した構成とすることができる。
【００６８】
図１８及び図１９に、本発明のタンパク質複合体の別の構成の模式図を示す。番号の対応は図８と同様である。この３ドメイン構成では、標的物質に対しては抗体軽鎖（ＶＬ）或いは重鎖（ＶＨ）の可変領域の少なくとも一部を含むドメインのうち１ドメインのみで十分な親和性が発揮される。一方、非特異吸着抑制剤に対しては抗体軽鎖（ＶＬ）の可変領域の少なくとも一部を含むドメインと、重鎖（ＶＨ）の可変領域の少なくとも一部を含むドメインとの２ドメインが揃う事により親和性が発揮される。本発明の結合性タンパク分子を、このような３ドメイン構成の形態とし、ドメイン１及び４の少なくとも一方で非特異吸着抑制剤と結合させたタンパク質複合体とすることができる。
【００６９】
図２０及び図２１に、本発明のタンパク質複合体の別の構成の模式図を示す。番号の対応は図８と同様である。この３ドメイン構成では、非特異吸着抑制剤に対しては抗体軽鎖（ＶＬ）或いは重鎖（ＶＨ）の可変領域の少なくとも一部を含むドメインのうち１ドメインのみで十分な親和性が発揮される。一方、標的物質に対しては抗体軽鎖（ＶＬ）の可変領域の少なくとも一部を含むドメインと、重鎖（ＶＨ）の可変領域の少なくとも一部を含むドメインとの２ドメインが揃う事により親和性が発揮される。本発明の結合性タンパク分子を、このような３ドメイン構成の形態とし、ドメイン１及び４の少なくとも一方で非特異吸着抑制剤と結合させたタンパク質複合体とすることができる。
【００７０】
非特異吸着抑制剤からなる部分６に対し親和性を有するドメイン１及び／或いは４と非特異吸着抑制剤からなる部分６との結合を強固にしたい場合には、図２３に示す架橋分子を介して両者を共有結合により結合する構成をとることができる。架橋分子については後述する。
【００７１】
＜基体−タンパク質複合体＞
本発明の基体−タンパク質複合体は、基体の表面に上記構成のタンパク質複合体を固定した構成を有する。図２２に、本発明の基体−タンパク質複合体の最も好ましい形態の模式図を示す。ドメイン１〜４を有するタンパク質複合体の構造は、図８に示したものと同様である。この基体−タンパク質複合体では、タンパク質複合体の非特異吸着抑制剤からなる部分６が基体８の表面に物理的或いは／及び化学的な結合により配置されている。基体については後述する。
【００７２】
更に本発明の基体−タンパク質複合体を構成する結合性タンパク分子としては、先に図２〜７を示して説明したのと同様に各種の形態（図２４、２６、２８、３０、３２及び３４に示された形態）をとることができる。更に、ドメイン１及び４と非特異吸着抑制剤なる部分との結合を強化する構成としても同様の構成（図２５、２７、２９、３１、３３及び３５）が利用できる。
【００７３】
本発明の基体−タンパク質複合体の製造は、
（工程Ａ）基体に非特異吸着抑制剤を接触させ、基体表面に非特異吸着抑制剤を吸着させる工程、
（工程Ｂ）非特異吸着抑制剤に結合性タンパク分子を接触・結合させる工程、
とを含む方法により行うことができる。
【００７４】
図３６に、結合性タンパク分子の（１）から（４）までの４つのドメインが揃った場合の、基体−タンパク質複合体の製造方法の模式図を示す。この場合、８が基体、６が非特異吸着抑制剤、９が結合性タンパク分子を示している。
【００７５】
更に本発明の基体−タンパク質複合体の製造方法は、（工程Ａ）及び（工程Ｂ）に加え
て、非特異吸着抑制剤と結合性タンパク分子との間に架橋分子を介して共有結合を形成する工程（工程Ｃ）を含む場合もある。この場合の、結合性タンパク分子の（１）から（４）までの４つのドメインが揃った場合の、基体−タンパク質複合体の製造方法の模式図を図３７に示す。この場合、架橋分子７の一方の活性基を非特異吸着抑制剤６に反応させ、これを基体８に接触させて基体表面に非特異吸着抑制剤６が固定される。更に、非特異吸着抑制剤に結合性タンパク分子９を接触・結合させた後に、架橋分子７の他方の活性基により非特異吸着抑制剤６と結合性タンパク分子９を結合させて、基体−タンパク質複合体を得る。
【００７６】
また、予め結合性タンパク分子９と非特異吸着抑制剤を架橋分子７により架橋してタンパク質複合体を形成させた後、タンパク質複合体を基体に固定する場合もある。通常、非特異吸着抑制剤は基体に対して親和性が強いため非特異吸着抑制剤の部分が基体に配置される確率が高い。この場合、基体上でのタンパク質複合体の密度を調整するため、タンパク質複合体のみを含む溶液を用いて基体に対する固定反応を行う場合もある。
【００７７】
本発明にかかるタンパク質複合体を構成する非特異吸着抑制剤には、結合性タンパク分子中の先に挙げた第１群のドメインとの間での結合を強化するための構成を付加することもできる。詳細は後記の＜共有結合、光架橋分子＞の項で記載する。
【００７８】
＜基体＞
基体は、本発明の基体−タンパク質複合体を形成しうるものであればいかなる材質、形状のものも利用可能である。基体の材質は、本発明の基体−タンパク質複合体を形成しうるものであればよく、金属、金属酸化物、無機半導体、有機半導体、ガラス類、セラミクス、有機高分子化合物（天然高分子化合物、合成高分子化合物）、プラスチック等から選択することができる。基体は、これらの２種以上の材質の複合材料からなる部分を有するものでもよい。本発明に用いる基体の形状は、本発明の基体−タンパク質複合体を形成しうるものであればいかなる形状でもよく、板状、粒子状、多孔体状、突起状、繊維状、筒状、網目状からすることができる。必要に応じて、これらの形状の２以上を有する基体としてもよい。
【００７９】
基体用の有機高分子化合物としては、スチレン、α−メチルスチレン、β−メチルスチレン、ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、２、４−ジメチルスチレン、ｐ−ｎ−ブチルスチレン、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルスチレン、ｐ−ｎ−ヘキシルスチレン、ｐ−ｎ−オクチルスチレン、ｐ−ｎ−ノニルスチレン、ｐ−ｎ−デシルスチレン、ｐ−ｎ−ドデシルスチレン、ｐ−メトキシスチレン、ｐ−フェニルスチレンなどのスチレン系重合性モノマー、メチルアクリレート、エチルアクリレート、ｎ−プロピルアクリレート、ｉｓｏ−プロピルアクリレート、ｎ−ブチルアクリレート、ｉｓｏ−ブチルアクリレート、ｔｅｒｔ−ブチルアクリレート、ｎ−アミルアクリレート、ｎ−ヘキシルアクリレート、２−エチルヘキシルアクリレート、ｎ−オクチルアクリレート、ｎ−ノニルアクリレート、シクロヘキシルアクリレート、ベンジルアクリレート、ジメチルフォスフェートエチルアクリレート、ジエチルフォスフェートエチルアクリレート、ジブチルフォスフェートエチルアクリレート、２−ベンゾイルオキシエチルアクリレートなどのアクリル系重合性モノマー、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、ｎ−プロピルメタクリレート、ｉｓｏ−プロピルメタクリレート、ｎ−ブチルメタクリレート、ｉｓｏ−ブチルメタクリレート、ｔｅｒｔ−ブチルメタクリレート、ｎ−アミルメタクリレート、ｎ−ヘキシルメタクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ｎ−オクチルメタクリレート、ｎ−ノニルメタクリレート、ジエチルフォスフェートエチルメタクリレート、ジブチルフォスフェートエチルメタクリレートなどのメタクリル系重合性モノマー、メチレン脂肪族モノカルボン酸エステル類、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ベンゾエ酸ビニル、酪酸ビニル、安息香酸ビニル、ギ酸ビニルなどのビニルエステル類、ビニルメチルエーテル、ビニルエチルエーテル、ビニルイソブチルエーテル等のビニルエーテル類、ビニルメチルケトン、ビニルヘキシルケトン、ビニルイソプロピルケトン等のビニルケトン類などのビニル系重合性モノマー、からなる群より選択された重合性モノマーを重合させて製造された有機高分子化合物を挙げることができる。
【００８０】
また、例えば、無機系固形物の例としては、カオリナイト、ベントナイト、タルク、雲母等の粘土鉱物；シリカ、アルミナ、二酸化チタン、酸化亜鉛、マグネタイト、フェライト、NbTa複合酸化物、ＷＯ3、Ｉｎ2Ｏ3、ＭｏＯ3、Ｖ2Ｏ5、ＳｎＯ2、等の金属酸化物；シリカゲル、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウムゲル等の不溶性無機塩；金、銀、プラチナ、銅等の金属；ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＺｎＳ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、等の半導体化合物、ガラス、石英ガラス、シリコン、或いはこれらの複合体などを用いることができるが、勿論、これらに限定されるものではない。
【００８１】
基体の形状に応じた基体用の材料としては以下の具体例を挙げることができる。
【００８２】
フィルムとしては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ジアセテート、トリセテート、セロハン、セルロイド、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリビニルクロライド、ポリビニリデンクロライド、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステルなどのプラスチックからなるフィルムを挙げることができる。
【００８３】
多孔性高分子膜としては、ポリビニルクロライド、ポリビニルアルコール、アセチルセルロース、ポリカーボネート、ナイロン、ポリプロピレン、ポリエチレン、テフロン等からなる多孔性高分子膜を挙げることができる。
【００８４】
膜状やシート状の基体用の布としては、木板、ガラス板、シリコン基板、木綿、レーヨン、アクリル、絹、ポリエステルなどの布を挙げることができる。膜状やシート状の紙としては、上質紙、中質紙、アート紙、ボンド紙、再生紙、バライタ紙、キャストコート紙、ダンボール紙、レジンコート紙などの紙を用いて、膜状やシート状とすることもできる。なお、これら膜状やシート状の材料は、滑らかなものであっても、凹凸のついたものであっても良い。
【００８５】
複合材料からなる基体の例としては、シリコン、シリカ、ガラス、石英ガラス等の基板にフォトリソグラフィーやエッチング、サンドブラスト等の手法で施された微小流路やホール（孔）、或いはそれらの表面に金や銀、白金の薄膜が施されたものを挙げることができる。
【００８６】
基体のその他の形態として、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ＰＣ（ポリカーボネート）、ＰＳ（ポリスチレン）等の基板に微小流路やホール（孔）を設けたものを挙げることができる。
【００８７】
基体のその他の形態としては更に、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーン、フラーレンダイアモンド或いはそれらの集合体；アルミナ、カーボン、フラーレン、ＺｎＯ等からなるナノウイスカー；ＳｉＯ2、アルミノシリケート、その他のメタロシリケート、ＴｉＯ2、ＳｎＯ2、Ｔａ2Ｏ5等からなるメソポーラス薄膜、微粒子、及びモノリス構造体；金、銀、銅、白金等の微粒子；マグネタイト、フェライト、ヘマタイト、ガンマ・ヘマタイト、マグヘマイト等の鉄酸化物微粒子；アルミニウムシリコン混合膜及びそれを陽極酸化したシリコン酸化物ナノ構造体；ポーラスアルミナ薄膜；アルミナナノホール構造体；シリコンナノワイヤー等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８８】
＜共有結合、光架橋分子＞
本発明において、非特異吸着抑制剤と第１群から選択されたドメインとの結合には、タンパク質との共有結合を可能とする活性官能基を分子内に２箇所以上有する架橋分子を利用することが望ましい。この活性官能基としては、通常のタンパク質架橋、修飾反応基としての化学架橋分子種である、N−ヒドロキシサクシンイミドエステル（N-hydroxysuccinimide ester）基、マレイミド（maleimido）基、カルボジイミド（carbodiimide）基、アジピミデート（adipimidate）基、ピメリミデート（pimelimidate）基、スベリミデート（suberimidate）基、ピコリニミデート（picolinimidate）基、ヒドラジド（hydrazide）基、ピリミジルジチオ（pyridyldithio）基、グリシジル（glycidyl）基、エポキシ（epoxy）基、アルデヒド（aldehyde）基等を有する化合物が利用可能である。
【００８９】
更に、光架橋分子種としては、アジド（azide）、ジアゾ（diazo）、ジアジリン（diazirine）カルボニル（carbonyl）などの分子種が挙げられる。これらの分子種は光照射によりアジド→ナイトレン（nitrene）、ジアゾ及びジアジリン→カルベン（carbene）、カルボニル→活性カルボニル（excited carbonyl）或いはカルボニルラジカル（carbonyl radical）といった活性種となり、それぞれ求核的に近傍のタンパク質分子と反応する。これらの分子種を含み実用上好ましい分子骨格及び官能基は、フェニルアジド基、トリフルオロメチルジアジリン基、またはベンゾフェノン基である。その中でも特に下記化学式（１）に示す、トリフルオロメチル基を有するフェニルジアジリン原子団は、生体分子への影響が少ない光照射条件(波長：350nm付近、照射時間：約1時間)で効率的にクロスリンク反応を進行させることが可能である。
【００９０】
【化１】
2007091736.tif 000003
【００９１】
尚、これらのことはＣｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ，２，２７１−２８８（２００２）に詳細に記載されている。
【００９２】
本発明には、これら化学架橋分子種と光架橋分子種の組み合わせとして２分子種以上を一分子内に有する光反応性原子団を含む架橋分子が特に有用である。先に、説明した基体−タンパク質複合体の製造方法における工程（Ｃ）を、この光架橋性の架橋分子を用いて行なうことが好ましい。このような条件を満たす化合物を以下に例示する。
・化学式（２）：N-hydroxysuccinimide ester of 4-[3-(trifluromethyl)-3H- diazirin
-3-yl] benzoic acid、
【００９３】
【化２】
2007091736.tif 000004
【００９４】
・化学式（３）：4-[3-(trifluromethyl)-3H- diazirin-3-yl] benzyl isothiocyanate
【００９５】
【化３】
2007091736.tif 000005
【００９６】
・化学式（４）：N-Hydroxysuccinimidyl-4-azidobenzoate
【００９７】
【化４】
2007091736.tif 000006
【００９８】
・化学式（５）：N-Hydroxysuccinimidyl-4-azidosalicylic acid、
【００９９】
【化５】
2007091736.tif 000007
【０１００】
・化学式（６）：Sulfosuccinimidyl 2-(p-azidosalicylamido)ethyl-1-3'-dithiopropio
nate、
【０１０１】
【化６】
2007091736.tif 000008
【０１０２】
・化学式（７）：Sulfosuccinimidyl 4-(azidosalicylamido)hexanoate、
【０１０３】
【化７】
2007091736.tif 000009
【０１０４】
更に、以下の化合物等の二価性架橋剤も用いることが可能である。
・N-5-Azido-2-nitrobenzoyloxysuccinimide、
・Sulfosuccinimidyl2-[m-azido-o-nitrobenzamido]-ethyl-1,3’-dithiopropionate、
・(N-Succinimidyl-6-[4’-azido-2’-nitrophenylamino] hexanoate、
・Sulfosuccinimidyl-6-[4’-azido-2’-nitrophenylamino] hexanoate。
【０１０５】
＜標的物質＞
本発明に係る「標的物質」は抗原抗体反応を用いた各手法によって抗原となり得る物質であれば如何なる分子も用いることが可能である。本発明の「標的物質捕捉素子」、「標的物質検出素子」、及び「標的物質分離素子」においては、前記抗原が標的物質となり得る。
【０１０６】
本発明の標的物質は、非生体物質と生体物質に大別される。
【０１０７】
非生体物質として産業上利用価値の大きいものとしては、肥満、糖尿病および代謝疾患、神経学的疾患、精神療法、泌尿生殖器疾患、生殖および性医学、炎症、癌、組織修復、皮膚科学、皮膚色素沈着、光老化、薄弱性、骨粗鬆症、心臓血管性疾患、胃腸疾患、抗感染、アレルギーおよび呼吸器疾患、感覚器官障害、睡眠障害および毛髪損失等に関わる種々の疾患に対する薬剤候補分子；環境汚染物質としての塩素置換数／位置の異なるＰＣＢ類；同じく塩素置換数／位置の異なるダイオキシン類；いわゆる環境ホルモンと呼ばれる内分泌撹乱物質（例：ヘキサクロロベンゼン、ペンタクロロフェノール、2,4,5-トリクロロ酢酸、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸、アミトロール、アトラジン、アラクロール、ヘキサクロロシクロヘキサン、エチルパラチオン、クロルデン、オキシクロルデン、ノナクロル、1,2-ジブロモ-3-クロロプロパン、ＤＤＴ、ケルセン、アルドリン、エンドリン、ディルドリン、エンドスルファン（ベンゾエピン）、ヘプタクロル、ヘプタクロルエポキサイド、マラチオン、メソミル、メトキシクロル、マイレックス、ニトロフェン、トキサフェン、トリフルラリン、アルキルフェノール（炭素数５〜９）、ノニルフェノール、オクチノニルフェノール、4-オクチルフェノール、ビスフェノールＡ、フタル酸ジ-2-エチルヘキシル、フタル酸ブチルベンジル、フタル酸ジ-ｎ-ブチル、フタル酸ジシクロヘキシル、フタル酸ジエチル、ベンゾ（ａ）ピレン、2,4ージクロロフェノール、アジピン酸ジ-2-エチルヘキシル、ベンゾフェノン、4-ニトロトルエン、オクタクロロスチレン、アルディカーブ、ベノミル、キーポン（クロルデコン）、マンゼブ（マンコゼブ） 、マンネブ、メチラム、メトリブジン、シペルメトリン、エスフェンバレレート、フェンバレレート、ペルメトリン、ビンクロゾリン、ジネブ、ジラム、フタル酸ジペンチル、フタル酸ジヘキシル、フタル酸ジプロピル）；等が挙げられる。
【０１０８】
生体物質には、核酸、タンパク質、糖鎖、脂質及びそれらの複合体から選択される生体物質が含まれる。更に詳しくは、核酸、タンパク質、糖鎖、脂質から選択される生体分子を含んでなるものであり、具体的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、遺伝子、染色体、細胞膜、ウイルス、抗原、抗体、レクチン、ハプテン、ホルモン、レセプタ、酵素、ペプチド、スフィンゴ糖、スフィンゴ脂質の何れかから選択された物質を含むものであれば、如何なる物質にも本発明を適用することができる。更には、前記の「生体物質」を産生する細菌や細胞そのものも、本発明が対象とする「生体物質」として標的物質となり得る。具体的なタンパク質としては、いわゆる疾病マーカーが挙げられる。
【０１０９】
例としては、胎児期に肝細胞で産生され胎児血中に存在する酸性糖蛋白であり、肝細胞癌（原発性肝癌）、肝芽腫、転移性肝癌、ヨークサック腫瘍のマーカーとなるα-フェトプロテイン（AFP）、肝実質障害時に出現する異常プロトロンビンであり、肝細胞癌で特異的に出現することが確認されるPIVKA-II；免疫組織化学的に乳癌特異抗原である糖蛋白で、原発性進行乳癌、再発・転移乳癌のマーカーとなるBCA225；ヒト胎児の血清、腸および脳組織抽出液に発見された塩基性胎児蛋白であり、卵巣癌、睾丸腫瘍、前立腺癌、膵癌、胆道癌、肝細胞癌、腎臓癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、大腸癌のマーカーである塩基性フェトプロテイン（BFP）；進行乳癌、再発乳癌、原発性乳癌、卵巣癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるCA15-3；膵癌、胆道癌、胃癌、肝癌、大腸癌、卵巣癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるCA19-9；卵巣癌、乳癌、結腸・直腸癌、胃癌、膵癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるCA72-4；卵巣癌（特に漿液性嚢胞腺癌）、子宮体部腺癌、卵管癌、子宮頸部腺癌、膵癌、肺癌、大腸癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるCA125；上皮性卵巣癌、卵管癌、肺癌、肝細胞癌、膵癌マーカーとなる糖蛋白であるCA130；卵巣癌（特に漿液性嚢胞腺癌）、子宮体部腺癌、子宮頸部腺癌のマーカーとなるコア蛋白抗原であるCA602；卵巣癌（特に粘液性嚢胞腺癌）、子宮頸部腺癌、子宮体部腺癌のマーカーとなる母核糖鎖関連抗原であるCA54/61（CA546）；大腸癌、胃癌、直腸癌、胆道癌、膵癌、肺癌、乳癌、子宮癌、尿路系癌等の腫瘍関連のマーカー抗原として現在、癌診断の補助に最も広く利用されている癌胎児性抗原（CEA）；膵癌、胆道癌、肝細胞癌、胃癌、卵巣癌、大腸癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるDUPAN-2；膵臓に存在し、結合組織の弾性線維エラスチン（動脈壁や腱などを構成する）を特異的に加水分解する膵外分泌蛋白分解酵素であり、膵癌、膵嚢癌、胆道癌のマーカーとなるエラスターゼ１；ヒト癌患者の腹水や血清中に高濃度に存在する糖蛋白であり、肺癌、白血病、食道癌、膵癌、卵巣癌、腎癌、胆管癌、胃癌、膀胱癌、大腸癌、甲状腺癌、悪性リンパ腫のマーカーとなる免疫抑制酸性蛋白（IAP）；膵癌、胆道癌、乳癌、大腸癌、肝細胞癌、肺腺癌、胃癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるNCC-ST-439；前立腺癌のマーカーとなる糖蛋白質であるγ-セミノプロテイン（γ-Sm）；ヒト前立腺組織から抽出された糖蛋白であり、前立腺組織のみに存在し、それゆえ前立腺癌のマーカーとなる前立腺特異抗原（PSA）；前立腺から分泌される酸性pH下でリン酸エステルを水解する酵素であり、前立腺癌の腫瘍マーカーとして用いられる前立腺酸性フォスファターゼ（PAP）；神経組織及び神経内分泌細胞に特異的に存在する解糖系酵素であり、肺癌（特に肺小細胞癌）、神経芽細胞腫、神経系腫瘍、膵小島癌、食道小細胞癌、胃癌、腎臓癌、乳癌のマーカーとなる神経特異エノラーゼ（NSE）；子宮頸部扁平上皮癌の肝転移巣から抽出・精製された蛋白質であり、子宮癌（頸部扁平上皮癌）、肺癌、食道癌、頭頸部癌、皮膚癌のマーカーとなる扁平上皮癌関連抗原（SCC抗原）；肺腺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、膵癌、卵巣癌、子宮癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるシアリルLeX-i抗原（SLX）；膵癌、胆道癌、肝癌、胃癌、大腸癌のマーカーとなる糖鎖抗原��あるSPan-1；食道癌、胃癌、直腸・結腸癌、乳癌、肝細胞癌、胆道癌、膵癌、肺癌、子宮癌のマーカーであり、特に他の腫瘍マーカーと組み合わせて進行癌を推測し、再発予知・治療経過観察として有用である単鎖ポリペプチドである組織ポリペプタイド抗原（TPA）；卵巣癌、転移性卵巣癌、胃癌、大腸癌、胆道系癌、膵癌、肺癌のマーカーとなる母核糖鎖抗原であるシアリルTn抗原（STN）；肺の非小細胞癌、特に肺の扁平上皮癌の検出に有効な腫瘍マーカーであるシフラ（cytokeratin；CYFRA）；胃液中に分泌される蛋白消化酵素であるペプシンの2種（PG I・PG II ）の不活性型前駆体であり、胃潰瘍（特に低位胃潰瘍）、十二指腸潰瘍（特に再発、難治例）、ブルンネル腺腫、ゾーリンガーエリソン症候群、急性胃炎のマーカーとなるペプシノゲン（PG）；組織障害や感染により、血漿中で変化する急性相反応蛋白であり、急性心筋梗塞等により心筋に壊死が起こると、高値を示すＣ-反応性蛋白（CRP）；組織障害や感染により、血漿中で変化する急性相反応蛋白である血清アミロイドA蛋白(SAA)；主に心筋や骨格筋に存在する分子量約17500のヘム蛋白であり、急性心筋梗塞、筋ジストロフィー、多発性筋炎、皮膚筋炎のマーカーとなるミオグロビン；骨格筋,心筋の可溶性分画を中心に存在し、細胞の損傷によって血液中に遊出する酵素であって、急性心筋梗塞、甲状腺機能低下症、進行性筋ジストロフィー症、多発性筋炎のマーカーとなるクレアチンキナーゼ(CK) （骨格筋由来のCK-MM型,脳,平滑筋由来のCK-BB型,心筋由来のCK-MB型の3種のアイソザイム及びミトコンドリア・アイソザイムや免疫グロブリンとの結合型CK(マクロCK)）；横紋筋の薄いフィラメント上でトロポニンI,Cとともにトロポニン複合体を形成し、筋収縮の調節に関与している分子量39,000の蛋白であり、横紋筋融解症、心筋炎、心筋梗塞、腎不全のマーカーとなるトロポニンT；骨格筋・心筋いずれの細胞にも含まれる蛋白であり、測定結果の上昇は骨格筋、心筋の障害や壊死を意味するため、急性心筋梗塞症、筋ジストロフィー、腎不全のマーカーとなる心室筋ミオシン軽鎖I；などを挙げることができる。また、近年ストレスマーカーとして注目されてきているクロモグラニンＡ、チオレドキシン、8-ＯＨdG、コルチゾール等も標的物質に含まれる。
【０１１０】
＜標的物質捕捉素子＞
先に説明した基体−タンパク質複合体における第２群を構成するドメインが結合する特定分子を標的物質とすることで標的物質捕捉素子を得ることができる。
【０１１１】
＜標的物質の検出方法及び装置＞
上記の標的物質捕捉素子と試料を反応させ、試料中に標的物質が含まれている場合に標的物質捕捉素子に標的物質が捕捉された状態を検出することで、試料中における標的物質の存在を検出することが可能となる。標的物質捕捉素子に標的物質が捕捉された状態の検出は、標的物質の捕捉前後での標的物質捕捉素子における物理的及び／または化学的変化を、直接あるいは間接的に測定することにより行うことができる。各種アッセイの分野で利用されている色素を用いた標識を利用する検出方法、標的物質の捕捉に基づく光学的変化を測定する方法などを用いることができる。また、標的物質捕捉素子と試料とを反応させる領域を形成した反応用デバイスと、標的物質捕捉素子に標的物質が捕捉された状態の検出を行なう検出手段とを少なくとも用いて標的物質検出装置を構成することができる。
【０１１２】
＜標的物質捕捉方法及び装置＞
上記の標的物質捕捉素子と試料を反応させ、試料中に標的物質が含まれている場合に標的物質捕捉素子に標的物質を捕捉することができる。標的物質を捕捉した標的物質捕捉素子を洗浄することで、試料中に含まれていたその他の成分と標的物質を分離することができる。図３８に、標的物質捕捉素子の有するドメイン２及び３がこれらと特異的に結合し得る標的物質１０を選択的に捕捉する工程を模式的に示す。標的物質１０は、捕捉対象ではない物質１１と区別されて標的物質捕捉素子に捕捉される。本発明における標的物質捕捉素子では、基体の表面に吸着した非特異吸着抑制剤或いはその誘導体が、基体表面をブロックし、基体への物質の非特異的吸着を効果的に防止できる。そのため、より精度の良い標的物質の分離を行うことが可能となる。また、標的物質捕捉素子と試料とを反応させる領域を形成した反応用デバイスと、標的物質捕捉素子に標的物質が捕捉された状態での洗浄を行なう手段とを少なくとも用いて標的物質捕捉装置を構成することができる。
【０１１３】
＜本発明の用途＞
本発明にかかる結合性タンパク分子、それを用いたタンパク質複合体及び基体−タンパク質複合体は、イムノアッセイ、免疫センサー、タンパク質マイクロアレイによる測定等のタンパク質の分子認識作用を利用した検出手法／キット／装置などに好適に利用可能である。また、タンパク質の分子認識作用を利用したスクリーニング手法／キット／装置、イムノクロマト手法／キット／装置、化学物質や生体物質の分離精製手法／キット／装置、などにも好適に利用可能である。
【実施例】
【０１１４】
以下に実施例を用いて本発明の効果を具体的に説明する。尚、以下の実施例では標的物質の例としてニワトリ卵白リゾチーム（以下ＨＥＬと記載する場合もある）を用いる。しかしながら、上述のように、対応する抗体が取得されかつそのＦｖ領域の塩基及び／或いはアミノ酸配列が既知のものであれば如何なる物質も本発明の標的物質として利用可能である。
【０１１５】
（実施例１）PEG及びHEL結合二重特異性抗体断片の取得
（１）PEG結合性ＶHコード核酸断片の調製
国際公開第WO 02/094853号パンフレットに開示のPEG結合性ＶＨ（配列番号：４９、５０）の５’末端側に制限酵素ＮｃｏＩ切断部位、３’末端側に制限酵素ＮｈｅＩ切断部位を配置する。こうしてベクター導入用のPEG結合性ＶＨ（以下、ＶＨ（PEG））を作製する。すなわち、以下のプライマーを用いて、市販のＰＣＲキットを当業者の推奨する調合に準じた方法によって、オーバラップＰＣＲを行い、約３５０ｂｐの塩基対から人工核酸を得る。
・PEG-VH F-1（配列番号：１３）
NNNNNCCATGGCAGGTCCAACTGCAGCAGCCCGGTGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGG
・PEG-VH F-2（配列番号：１４）
GAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAAATTCTTATCCTGGTAGTAGTAGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGC
・PEG-VH F-3（配列番号：１５）
TAGACACATCCTCCAGTACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGACGACTCTGCGGTCTTTTATTGTGCAAGATCGGGGCC
・PEG-VH R-1（配列番号：１６）
CCTTGTCCAGGCCTCTGCTTCACCCAGTTTATCCAATAATTGGTGAAAATGTAGCCAGAAGCCTTGCAGGACAGC
・PEG-VH R-2（配列番号：１７）
GGCTGTACTGGAGGATGTGTCTACAGTCAGTGTGGCCTTGCTCTTGAACTTCTCATTGTA
・PEG-VH R-3（配列番号：１８）
NNNNNGCTAGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCCCTTGGCCCCAGGAAGCAAACCAGGCCGTCCCAGTTGGCCCCGATCTTGCACAATAAAAGACC
更に、PEG-ＶＨ F1およびPEG-VH R-1を使用し、市販のシークエンス反応キットと反応液組成によりＢＩＧＤＹＥ−ＰＣＲ反応を行った。温度サイクルは９６℃×３min→（９４℃×１ｍｉｎ→５０℃×１ｍｉｎ→６８℃×４ｍｉｎ）×３０ＣＹＣＬＥ→４℃とする。目的のＶＨをコードする塩基配列を有する断片が得られたことを確認する。
【０１１６】
（２）PEG結合性ＶＬコード核酸断片の調製
国際公開第WO 02/094853号パンフレットに開示のPEG結合性ＶＬ（配列番号：５１、５２）の５’末端側に制限酵素ＮｈｅＩ切断部位及びリンカー（ＧＧＧＧＳ）をコードする核酸、３’末端側に制限酵素ＳａｃII切断部位を配置する。こうしてベクター挿入用のＢＳＡ結合性ＶＬ（以下、ＶＬ（PEG））を作製する。すなわち、以下のプライマーを使用する以外は、（１）と同様にして核酸断片を得て、目的のＶＬの塩基配列を有することを確認する。
・PEG-VLF-1（配列番号：１９）
NNNNNGCTAGCGGTGGCGGTGGCTCTGATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGC
・PEG-VLF-2（配列番号：２０）
TTTAGATTGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGG
・PEG-VLF-3（配列番号：２１）
CAGATTTCACACTCAAGATCACCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGG
・PEG-VLR-1（配列番号：２２）
GTTTCTGCAGGTACCAATCTAAATAGGTGTTTCCATTACTATGTACAATGCTCTGACTAGATCTGCAAGAGATGG
・PEG-VLR-2（配列番号：２３）
GGTGATCTTGAGTGTGAAATCTGTCCCTGATCCCCTGCCACTGAACCTGTCTGGGACCCCAGAAAATCGGTTGGAAACTTTGT
・PEG-VLR-3（配列番号：２４）
NNNNNCCGCGGAGCCCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCAGCACCGAACGTGAGCGGAACATGTGAACCTTGAAAGCAGTAATAAACTCCCAGA
（３）ＨＥＬ結合性ＶＨコード核酸断片の調製
ＨＥＬ結合性ＶＨ（配列番号：５３、５４）の５末端側に制限酵素ＮｃｏＩ切断部位、３’末端側に制限酵素ＮｈｅＩ切断部位を配置したベクター導入用のＨＥＬ結合性ＶＨ（以下、ＶＨ（HEL））を作製する。すなわち、以下のプライマーを使用する以外は、（１）と同様にして核酸断片を得て、目的のＶＨの塩基配列を有することを確認する。
・HEL−ＶＨ Ｆ１（配列番号：２５）
NNNNNCCATGGGATATCCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCGAGCCTCGTCAAGCCGTCGCAGACCCTGTCGCTCACCTGCAGCGTCACCGGCGA
・HEL−ＶＨ F２（配列番号：２６）
GCCTCGAGTACATGGGCTACGTCAGCTACTCGGGCAGCACCTACTACAACCCCTCGCTGAAGAGCCGCATCTCGATCACCCGCGACACCT
・HEL−ＶＨ F３（配列番号：２７）
GCCACCTACTACTGCGCGAACTGGGACGGCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTCGTCACCGTCTCCGCG
・HEL−ＶＨ R１（配列番号：２８）
GTAGCCCATGTACTCGAGGCGGTTGCCGGGGAACTTGCGGATCCACGACCAGTAGTCCGAGGTGATCGAGTCGCCGGTGACGCTGCAGGT
・HEL−ＶＨ R２（配列番号：２９）
TTCGCGCAGTAGTAGGTGGCGGTGTCCTCGGTGGTGACCGAGTTGAGGTCCAGGTAGTACTGGTTCTTGGAGGTGTCGCGGGTGATCGAG
・HEL−ＶＨ R３（配列番号：３０）
NNNNN GCTAGCCGCGGAGACGGTGACGAGG
（４）ＨＥＬ結合性ＶＬコード核酸断片の調製
ＨＥＬ結合性ＶＬ（配列Ｄ、配列番号：５５、５６）の５末端側に制限酵素ＮｈｅＩ切断部位及びリンカー（ＧＧＧＧＳ）をコードする核酸、３’末端側に制限酵素ＳａｃＩＩ切断部位を配置する。こうして、ベクター挿入用のＨＥＬ結合性ＶＬ（以下、ＶＬ（HEL））を作製する。すなわち、以下のプライマーを使用する以外は、（１）と同様にして核酸断片を得て、目的のＶＬの塩基配列を有することを確認する。
・HEL−ＶＬ  F１（配列番号：３１）
NNNNNGCTAGCGGTGGCGGTGGCTCTGATATCGTCCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTCTCGGTCACCCCCGGCAACTCGGTGTCCCTCTCGTGCCGCGCCTCGCA
・HEL−ＶＬ F２（配列番号：３２）
CGCGCCTCCTGATCAAGTACGCCAGCCAGTCGATCTCGGGGATCCCGTCGCGCTTCAGCGGCTCGGGCTCGGGCACCGAC
・HEL−ＶＬ F３（配列番号：３３）
GCATGTACTTCTGCCAGCAGTCGAACAGCTGGCCGTACACCTTCGGCGGC GGTACCAAGCTGATCATCACGGCC
・HEL−ＶＬ R１（配列番号：３４）
GTACTTGATCAGGAGGCGCGGGCTCTCGTGCGACTTCTGCTGATACCAGTGGAGGTTGTTGCCGATCGACTGCGAGGCGCGGCACGAGAG
・HEL−ＶＬ R２（配列番号：３５）
CTGCTGGCAGAAGTACATGCCGAAGTCCTCCGTCTCGACGCTGTTGATCGACAGGGTGAAGTCGGTGCCCGAGCCCGAGC
・HEL−ＶＬ R３（配列番号：３６）
NNNNN CCGCG G GGCCGTGATGATCAGCTTGGTACC
（５）発現ベクター作製
上記４種の核酸断片用いてを２つの発現ベクターを以下の構成で構築する。
（５−１）ＶＨ（PEG）−ＶＬ（HEL）発現用ベクター（ｐPEG−ＨＥＬ）の作製  （図４１）
（i）ＶＨ（PEG）の挿入
図４０に示したプラスミドｐＵＴ−ＸＸ２を、制限酵素ＮｃｏＩ／ＮｈｅＩ（ともにＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）で切断し、スピンカラム  S-４００ ＨＲ（GEヘススケアバイオサンエンス）する。次に、同様に制限酵素ＮｃｏＩ／ＮｈｅＩにて切断した前記ＶＨpegを切断し、切断断片を市販のゲル精製キット（ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ｓｙｓｔｅｍ：  Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して精製する。上記二つの断片を、市販のＴ４リガーゼキット（Ｒｏｃｈｅ社）を業者推奨の方法にて調合しライゲーションを行う。ライゲーション溶液をＪＭ１０９コンピテントセル（Ｐｒｏｍｅｇａ社）４０μＬにヒートショック法により形質転換した後に、ＬＢ／アンピシリン（ａｍｐ．）プレートに撒き、３７℃にて一晩静置する。
【０１１７】
次に、プレート中から任意のコロニーをＬＢ／ａｍｐ．  ３ｍＬ液体培地に植え継ぎ、３７℃にて一晩振盪培養を行う。その後、市販のＭｉｎｉＰｒｅｐｓキット（Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して、プラスミドを回収する。得られたプラスミドを、PEG−ＶＨ  F１およびPEG−VH R1を使用して前記シークエンス方法にて塩基配列を確認したところ、目的の断片が挿入されていることを確認する。
（ii）ＶＬ（HEL）の挿入
上記（i）で得られたプラスミドｐＵＴ-ＶＨ（PEG）を制限酵素ＮｈｅＩ／ＳａｃＩＩで切断し、スピンカラム  ４００ＨＲ（アマシャムサイエンス）する。次に、同様に制限酵素ＮｈｅＩ／ＳａｃＩＩにて切断したＶＬ（PEG）を得る。以下、上記（i）と同様にして、ライゲーション及び目的のＶＨpeg−ＶＬｈ（ＶＨ（PEG）−ＶＬ（HEL））発現用プラスミドｐPHELであることを確認する（確認用プライマーは、ＶＬ−HEL F１およびVL−HEL R1）。
【０１１８】
（５−２）ＶＨ（HEL）−ＶＬ（PEG）  発現用ベクター（ｐＨEL−PEG）の作製（図４２）
（ｉ）ＶＨ（HEL）の挿入
上記（５−１）の（ｉ）と同様の方法にてＶＨｈをプラスミドｐＵＴ−ＸＸ２に挿入し、得られたプラスミドが目的のプラスミドであることを確認する。（確認用プライマーは、HEL−ＶＨ F１およびHEL−VH R1）
（ii）ＶＬ（PEG）の挿入
ＶＬpegを上記（ｉ）で得られたプラスミドに上記（５−１）（ii）と同様の方法にて挿入し、得られたプラスミドが目的のＶＨｈ−ＶＬpeg（ＶＨ（HEL）−ＶＬ（PEG））発現用ベクターｐＨEL−PEGであることを、（１）と同様にして確認する。（確認用プライマーはPEG−VL F1およびPEG−VL R1）
（６）タンパク発現及び精製
上記（５−１）（ii）で得られたＶＨpeg−ＶＬｈ、及び（５−２）（ii）で得られたＶＨｈ−ＶＬpegのポリペプチドを発現する発現ベクターを、個別の系において以下に記すタンパク発現及び精製工程で処理を行い、それぞれポリペプチド鎖pPEG−HELおよびpHEL−PEGとして取得する。
ａ）形質転換
上記２つの発現ベクターを、それぞれ異なるＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル溶液４０μＬを形質転換する。形質転換は、ヒートショックを氷中→４２℃×９０ｓｅｃ→氷中の条件でおこなう。ヒートショックにより形質転換した上記ＢＬ２１溶液にＬＢ培地７５０μＬを加え、一時間３７℃にて振盪培養を行った。その後、６０００ｒｐｍ×５分間遠心を行う。培養上清６５０μＬを廃棄し、残った培養上清と沈殿となった細胞画分を攪拌し、ＬＢ／ａｍｐ．プレートに撒き、一晩３７℃にて静置する。
ｂ）予備培養
プレート上のコロニーを無作為に選択し、３．０ｍＬ  ＬＢ／ａｍｐ．培地にて２８℃にて一晩振盪培養を行う。
ｃ）本培養
上記予備培養溶液を２×ＹＴ培地  ７５０ＭＬに植え継ぎ、更に培養を２８℃にて継続した。ＯＤ６００が０．８を越えた時点で、終濃度が１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加え、更に２８℃にて終夜培養を行う。
ｄ）精製
目的のポリペプチド鎖を不溶性顆粒画分から以下の工程により精製する。
（ｉ）不溶性顆粒の回収
上記ｃ）で得られた培養液を６０００ｒｐｍ×３０ｍｉｎにて遠心し、沈殿を菌体画分として得る。得られた菌体をトリス溶液（２０ｍＭ  トリス／５００ｍＭ  ＮａＣｌ）１５ｍｌに氷中にて懸濁する。得られた懸濁液をフレンチプレスにて破砕し、菌破砕液を得る。次に、菌破砕液を１２，０００ｒｐｍ×１５ｍｉｎで遠心を行い、上清を除き、沈殿を不溶性顆粒画分として得る。
（ii）不溶性顆粒画分の可溶化
上記（ｉ）で得られた不溶性画分を６Ｍ  塩酸グアニジン／トリス溶液  １０ｍＬを加えて、一晩浸漬する。次に、１２，０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎで遠心し、上清を可溶化溶液として得る。
（iii）金属キレートカラム
金属キレートカラム担体として、Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いる。カラム調製やサンプル負荷、及び洗浄工程は、前記業者の推奨方法に準拠し、室温（２０℃）にて行う。目的であるＨｉｓタグ融合のポリペプチドの溶出は６０ｍＭイミダゾール／Ｔｒｉｓ溶液にて行う。溶出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（アクリルアミド１５％）の結果、単一バンドであり、精製されていることを確認する。
（iv）透析
上記溶出液に対して、外液を６Ｍ  塩酸グアニンジン／Ｔｒｉｓ溶液として４℃にて透析を行い、溶出液中のイミダゾールの除去を行い、上記それぞれのポリペプチド鎖溶液を得る。
（ｖ）リフォールディング
上記と同様にして、ＶＨpeｇ−ＶＬｈ及びＶＨｈ−ＶＬpeｇのそれぞれのポリペプチド鎖溶液を以下の工程により別個に、脱塩酸グアニンジンを透析（４℃）にて行いながらタンパク質のリフォールディングを行う。
（ａ）  ６Ｍ  塩酸グアニジン／Ｔｒｉｓ溶液を用い、それぞれのポリペプチド鎖のモル吸光係数とΔＯ．Ｄ．（２８０ｎｍ−３２０ｎｍ）値から濃度７．５μＭのサンプル（希釈後体積１０ｍｌ）を調製する。次にβ−メルカプトエタノール（還元剤）を終濃度３７５μＭ（タンパク濃度５０倍）になるよう添加、室温、暗所で４時間還元を行う。このサンプル溶液を透析バック（ＭＷＣＯ：１４，０００）に入れ、透析用サンプルとする。
（ｂ）透析外液を６Ｍ塩酸グアニンジン／トリス溶液として、透析サンプルを浸漬し、緩やかに攪拌しながら６時間透析する。
（ｃ）外液の塩酸グアニジン濃度を３Ｍ、２Ｍと段階的に下げる。それぞれの外液濃度において、６時間透析する。
（ｄ）酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を終濃度３７５μＭ、Ｌ−Ａｒｇを終濃度０．４Ｍ）となるようにトリス溶液に加える。更に、上記（ｃ）の２Ｍの透析外液を加え、塩酸グアニジン濃度が１Ｍとし、ｐＨをＮａＯＨで、ｐＨ８．０（４℃）に調製した溶液にて、１２時間緩やかに攪拌しながら透析する。
（ｅ）上記（ｄ）と同様の作業にて塩酸グアニジン濃度０．５Ｍの含Ｌ−Ａｒｇ  トリス溶液を整し、更に１２時間透析する。
（ｆ）最後にトリス溶液にて１２時間透析する。
（ｇ）透析終了後、１００００ｒｐｍで約２０分遠心分離し凝集体と上清を分離する。
【０１１９】
（vi）２量化画分の精製
上記（ｖ）で得られた個々の５μＭ  ポリペプチド（ＶＨpeg−ＶＬｈ、ＶＨｈ−ＶＬpeg）溶液を混合し、４℃にて一晩する。次に、セファデックス７５カラム（カラム：バッファー  ２０ｍＭ  トリス、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、流速  １ｍｌ／ｍｉｎ）にて二量体化した６０ｋＤａ相当（インジェクションから約１８分）のフラクションを得る。
（vii）緩衝液置換
以下の結合実験を行う為、緩衝液をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に置換する。緩衝液の置換は、透析により行う。透析バックとして、ＲＣ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｒｏ２（ＭＷＣＯ１２，０００〜１４，０００：Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社製）を用いる。上記透析バックに（vii）で得られる二量化タンパク質画分を入れ、外液をＰＢＳ５００ｍＬとし、ゆっくりと攪拌しながら透析を行う。外液は６時間毎に３回交換する。これにより得られた溶液をＳＰＲ測定用サンプルとする。
【０１２０】
（実施例２）  金基板上へのポリエチレングリコール（PEG）の固定化
実施例１で得られた２量化タンパク質画分の、金基板上に吸着させたPEGに対する結合性をＳＰＲにて測定する。ＳＰＲ測定装置として、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００（ＢＩＡｃｏｒｅ社製）を使用する。未使用のSIA-Kit Au金蒸着基板を、１０ｍｇ／ｍｌのPEG3-OH alkanethiol (東洋紡株式会社、SPSPT0011)のエタノール溶液に浸漬させることにより、金基板表面にPEG鎖を有する単分子膜を形成する。エタノール溶液で基板を洗浄した後、窒素雰囲気下で乾燥させる。この金基板をSPR装置に装着し、ランニングバッファーをインジェクションする。SPRシグナルが安定した後、実施例１で得た５００ｎＭの２量化タンパク質/PBST溶液を、４０μＬインジェクションする。PEGに対する結合性を示すカーブを得る。尚、その他の諸条件は以下の通りである。
・温度：２５℃
・流速：１μＬ／ｍｉｎ
（実施例３）ＳＰＲ測定によるＨＥＬ結合性評価
実施例２においてPEG結合性をＳＰＲ評価したサンプルに引き続き、連続して０．５、１．０、２．０μM ＨＥＬ／ＰＢＳＴ溶液をインジェクションし、金基板上に固定化したPEGに結合した２量化タンパク質画分のＨＥＬに対する結合性をＳＰＲにて測定する。SPRシグナル強度は、HEL濃度に依存性を示す。尚、その他の諸条件は以下の通りである。
・温度：２５℃
・流速：１μＬ／ｍｉｎ
（実施例４）PC及びHEL結合二重特異性抗体断片の取得
(１) PC結合性ＶHコード核酸断片の調製
Protein  engineering、12（７）、６０５−６１１（１９９９）に開示されているPC結合性VH（配列x、配列番号：５７、５８）の５‘末端側に制限酵素ＮｃｏＩ切断部位、３’末端側に制限酵素ＮｈｅＩを配置する。こうしてベクター導入用のPEG結合性ＶＨ（以下、ＶＨ（PC））を作製する。すなわち、以下のプライマーを使用する以外は、実施例１と同様にして核酸断片を得て、目的のＶＬの塩基配列を有することを確認する。
・PC-VHF1（配列番号：３７）
NNNNNCCATGGGAAGTTAAATTAGTTGAATCTGGTGGTGGTTTAGTTCAACCTGGTGGTTCTTTACGTTTATCTTGTG
・PC-VHF2（配列番号：３８）
TGGAATGGGTTCGTCAACCTCCTGGTAAACGTTTAGAATGGATTGCTGCTTCTCGTAATAAAGCTAATGATTATACTAC
・PC-VHF3（配列番号：３９）
GTGATACTTCTCAATCTATTTTATATTTACAAATGAATGCTTTACGTGCTGAAGATACTGCTATTTATTATTGTGCTCG
・PC-VHR1（配列番号：４０）
AGGTTGACGAACCCATTCCATATAAAAATCAGAAAAAGTAAAACCAGAAGTAGCACAAGATAAACGTAAAGAACC
・PC-VHR2（配列番号：４１）
TAAAATAGATTGAGAAGTATCACGAGAAACAATAAAACGACCTTTAACAGAAGCAGAATATTCAGTAGTATAATCATTAGCTTTATTACG
・PC-VHR3（配列番号：４２）
NNNNNGCTAGCAGAAGAAGTAACAGTAGTACCAGCACCCCAAACATCAAAATACCAATAAGAAGAACCATAATAATCACGAGCACAATAATAAATAGC
(2) PC結合性ＶＬコード核酸断片の調製
PC結合性PC結合性ＶＬ（配列番号：５９、６０）の５’末端側に制限酵素ＮｈｅＩ切断部位及びリンカー（ＧＧＧＧＳ）をコードする核酸、３’末端側に制限酵素ＳａｃII切断部位を配置する。こうしてベクター挿入用のPC結合性ＶＬ（以下、ＶＬ（PC））を作製する。すなわち、以下のプライマーを使用する以外は、(1)と同様にして核酸断片を得て、目的のＶＬの塩基配列を有することを確認する。
・PC-VLF1（配列番号：４３）
NNNNNGCTAGCGGTGGCGGTGGCTCTGATATTGTTATGACTCAATCTCCTACTTTTTTAGCTGTTACTGCTTCTAAAAAAGTTACTATTTCTTGTACTGCTTCTG
・PC-VLF2（配列番号：４４）
CATGTTCATTATTTAGCTTGGTATCAAAAAAAACCTGAACAATCTCCTAAATTATTAATTTATGGTGCTTCTAATCGTTATATTGG
・PC-VLF3（配列番号：４５）
CTGATTTTACTTTAACTATTTCTTCTGTTCAAGTTGAAGATTTAACTCATTATTATTGTG
・PC-VLR1（配列番号：４６）
AAGCTAAATAATGAACATGTTTAGAAGAATATAAAGATTCAGAAGCAGTACAAGAAATAGTAACTTTTTTAGAAGC
・PC-VLR2（配列番号：４７）
AATAGTTAAAGTAAAATCAGTACCAGAACCAGAACCAGTAAAACGATCAGGAACACCAATATAACGATTAGAAGCACC
・PC-VLR3（配列番号：４８）
NNNNNCCGCGGACGTTTTAATTCTAATTTAGTACCAGCACCAAAAGTTAAAGGATAAGAATAAAATTGAGCACAATAATAATGAGTTAAATC
（５）発現ベクター作製
実施例１と同様にして上記４種の核酸断片（（１）ＨＥＬ結合性ＶＨコード核酸、（２）ＨＥＬ結合性ＶLコード核酸の核酸断片、（３）PC結合性ＶHコード核酸断片及び（４）PC結合性ＶLコード核酸断片）を用いて２つの発現ベクターを以下の構成で構築する。
（５−１）VH（PC）−VL（HEL）発現用ベクター（ｐPC−HEL）の作製
（ｉ）ＶＨ（PC）の挿入
実施例１の（５−１）の（ｉ）と同様の方法にてＶＨ（PC）をプラスミドｐＵＴ−ＸＸ２に挿入し、得られたプラスミドが目的のプラスミドであることを確認する。（確認用プライマーは、ＶＨ（PC） F1およびＶＨ（PC）Ｒ１）。
（ii）ＶＬ（HEL）の挿入
ＶＬ（HEL）を上記（ｉ）で得られたプラスミドに実施例１の（５−１）（ii）と同様の方法にて挿入し、得られたプラスミドが目的のＶＨ（PC）−ＶＬ（HEL）発現用ベクターｐPC−HELであることを、（１）と同様にして確認する。（確認用プライマーは、HEL−ＶＬ F1およびHEL−VL R1）。
【０１２１】
（５−２）VH（HEL）−VL（PC）発現用ベクター（ｐHEL−PC）の作製
（i）VH（HEL）の挿入
上記（５−１）の（ｉ）と同様の方法にてＶＨ（HEL）をプラスミドｐＵＴ−ＸＸ２に挿入し、得られたプラスミドが目的のプラスミドであることを確認する。（確認用プライマーは、HEL−VH F１およびHEL−ＶＨ Ｒ１）。
（ii）VL（PC）の挿入
VL（PC）を上記（i）で得られたプラスミドに上記（５−１）（ii）と同様の方法にて
挿入し、得られたプラスミドが目的のＶＨ（HEL）−ＶＬ（PC）発現用ベクターｐHEL−PCであることを、（１）と同様にして確認する。（確認用プライマーは、HEL−ＶＬ F1およびHEL−VL R1）
（６）タンパク質発現及び精製
上記（５−１）（ii）で得られたＶＨ（PC）−ＶＬ（HEL）、及び（５−２）（ii）で
得られたＶＨ（HEL）−ＶＬ（PC）のポリペプチドを発現するベクターを、上記実施例１の（６）と同様の方法にて、VH（PC）−VL（HEL）及びVH（HEL）−VL（PC）の2量化タンパク質を得る。
【０１２２】
（実施例５）  金基板上へのホスファチジルコリン（PC）の固定化
実施例４で得られた２量化タンパク質画分の、金基板上に吸着させたPCに対する結合性を実施例２と同様にＳＰＲにて測定する。未使用のSPRセンサーチップHPAを用いて、金薄膜表面にPCを固定化する。PCとして10mMのホスファチジルコリン（シグマ株式会社）のクロロホルム溶液を調製する。エバポレータにて減圧乾燥し、されに真空ポンプで2時間乾燥させる。乾燥後、0.5 mlのPBSを添加し、懸濁する。液体窒素噴射により凍結融解を5回繰り返す。リポソーム調製器（AVESTIN社）によりリポソームを調製する。SPR装置の流路系を洗浄した後、HBS-Nバッファー（Biacore社）で0.5 mMに調製したリポソーム溶液を用いてPCを固定化する。PCする結合性を示すカーブを得る。尚、その他の固定化の諸条件は以下の通りである。
・温度：２５℃
・流速：５μＬ／ｍｉｎ
・界面活性剤（４０ ｍM n-Octyl-b-glucoside）：5 min 
・流速：５μＬ／ｍｉｎ
・リポソーム溶液：30 min
・50 mM NaOH： 1 min
・ランニングバッファー（PBST）。
【０１２３】
（実施例６）ＳＰＲ測定によるＨＥＬ結合性評価
実施例５においてPC結合性をＳＰＲ評価したサンプルに引き続き、連続して０．５、１．０、２．０μＭ  ＨＥＬ／ＰＢＳＴ溶液をインジェクションし、金基板上に固定化したPCに結合した２量化タンパク質画分のＨＥＬに対する結合性をＳＰＲにて測定する。SPRシグナル強度は、HEL濃度に依存性を示す。尚、その他の諸条件は以下の通りである。
・温度：２５℃
・流速：１μＬ／ｍｉｎ。
【０１２４】
（実施例７）PEG架橋型結合性タンパク分子の評価
以下の作業は全て４℃、遮光下で行う。未使用のSIA-Kit Au金蒸着基板を、金基板表面１０ｍｇ／ｍｌのPEG6-COOH アルカンチオールのエタノール溶液に浸漬する。０．２M M(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide (EDC)／０．０５M  N-hydroxysuccinimide ester of 4-[3-(trifluromethyl)-3H- diazirin-3-yl] benzoic acid酢酸緩衝液を加え、２４時間反応させる。水で基板を洗浄した後、窒素雰囲気下、15℃に保ちながら高圧水銀灯で330nmから400nmの光を１時間照射する。基板を実施例１で用いたのと同様のＳＰＲ装置に上記のように作製した基板を装着する。流路にランニングバッファーを流し、余分な試料を洗浄する。次に、実施例３と同様に、１μＭ  ＨＥＬ溶液をインジェクションし、金基板上に吸着した光架橋結合タンパク試料の、ＨＥＬに対する結合性をＳＰＲにて測定する。SPRシグナル強度は、HEL濃度に依存性を示す。尚、その他の諸条件は以下の通りである。
・温度：２５℃
・流速：１μＬ／ｍｉｎ
（実施例８）PEG架橋型結合性タンパク分子を用いた標的物質検出素子の作製及び評価
図３９に示すマイクロ流体チップをＰＤＭＳの成型により作製する。上カバーの無い状態でまず流路を、末端をアミノ化したPEGアルカンチオール／エタノール溶液）で満たし、３０分間静置後、エタノールで流路を洗浄する。流路を窒素パージ後、４℃、遮光下で、酢酸緩衝液を液体ディスペンサ（武蔵エンジニアリング社製：SHOTMASTER300）により図３９に示す位置２２にスポットする。酢酸緩衝液は、4-[3-(trifluromethyl)-3H- diazirin-3-yl] benzoic acid のN-hydroxysuccinimide esterを含む。溶液が蒸発しないようにカバーをかけ、静置して、エステルのＮＨＳ基とPEG末端のアミノ基との反応を行う。２４時間後、流路を洗浄し、窒素パージ後、同様のスポット位置へ実施例１で作製した結合性タンパク分子溶液をスポットし、15℃に保ちながら高圧水銀灯で330nmから400nmの光を１時間照射する。ＰＢＳＴ溶液で洗浄後、カバーを固定する。１μＭ  ＨＥＬ溶液を図３９の導入ポート２１から流速２μＬ／ｍｉｎで２０分間導入し、ＰＢＳＴ溶液で再度洗浄後、１μＭ  抗ＨＥＬ抗体のＰＢＳＴ溶液で流路を満たし、静置する。１時間後、流路をＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、１０μＭ  ローダミン結合抗ＩｇＧ抗体のＰＢＳＴ溶液で満たし、静置する。１時間後、流路をＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、蛍光顕微鏡にて観察する。その結果、前記結合性タンパク分子がスポットされた位置に蛍光が観察される。次に、標的物質であるＨＥＬ溶液の濃度を１／１０、１／１００とし、同様の操作を行うと、その蛍光強度はＨＥＬの濃度に相関することが確認される。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】本発明の結合性タンパク分子の構成の一例を示す図である。
【図２】本発明の結合性タンパク分子の構成の一例を示す図である。
【図３】本発明の結合性タンパク分子の構成の一例を示す図である。
【図４】本発明の結合性タンパク分子の構成の一例を示す図である。
【図５】本発明の結合性タンパク分子の構成の一例を示す図である。
【図６】本発明の結合性タンパク分子の構成の一例を示す図である。
【図７】本発明の結合性タンパク分子の構成の一例を示す図である。
【図８】本発明のタンパク質複合体の構成の一例を示す図である。
【図９】本発明のタンパク質複合体の構成の一例を示す図である。
【図１０】本発明のタンパク質複合体の構成の一例を示す図である。
【図１１】本発明のタンパク質複合体の構成の一例を示す図である。
【図１２】本発明のタンパク質複合体の構成の一例を示す図である。
【図１３】本発明のタンパク質複合体の構成の一例を示す図である。
【図１４】本発明のタンパク質複合体の構成の一例を示す図である。
【図１５】本発明のタンパク質複合体の構成の一例を示す図である。
【図１６】本発明のタンパク質複合体の構成の一例を示す図である。
【図１７】本発明のタンパク質複合体の構成の一例を示す図である。
【図１８】本発明のタンパク質複合体の構成の一例を示す図である。
【図１９】本発明のタンパク質複合体の構成の一例を示す図である。
【図２０】本発明のタンパク質複合体の構成の一例を示す図である。
【図２１】本発明のタンパク質複合体の構成の一例を示す図である。
【図２２】本発明の基体−タンパク複合体の構成の一例を示す図である。
【図２３】本発明の基体−タンパク複合体の構成の一例を示す図である。
【図２４】本発明の基体−タンパク複合体の構成の一例を示す図である。
【図２５】本発明の基体−タンパク複合体の構成の一例を示す図である。
【図２６】本発明の基体−タンパク複合体の構成の一例を示す図である。
【図２７】本発明の基体−タンパク複合体の構成の一例を示す図である。
【図２８】本発明の基体−タンパク複合体の構成の一例を示す図である。
【図２９】本発明の基体−タンパク複合体の構成の一例を示す図である。
【図３０】本発明の基体−タンパク複合体の構成の一例を示す図である。
【図３１】本発明の基体−タンパク複合体の構成の一例を示す図である。
【図３２】本発明の基体−タンパク複合体の構成の一例を示す図である。
【図３３】本発明の基体−タンパク複合体の構成の一例を示す図である。
【図３４】本発明の基体−タンパク複合体の構成の一例を示す図である。
【図３５】本発明の基体−タンパク複合体の構成の一例を示す図である。
【図３６】本発明の基体−タンパク複合体の製造方法の一例を示す図である。
【図３７】本発明の基体−タンパク複合体の製造方法の一例を示す図である。
【図３８】本発明の基体−タンパク複合体を用いた標的物質の捕捉を示す図である。
【図３９】流路を形成した基体の構造を示す図である。
【図４０】ｐＵＴ−ＸＸ２の構造を示す図である。
【図４１】ＶＨ（PEG）−ＶＬ（HEL）発現用ベクター（ｐPEG−ＨＥＬ）の作製工程を示す図である。
【図４２】ＶＨ（HEL）−ＶＬ（PEG）発現用ベクター（ｐＨEL−PEG）の作製工程を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【配列表】
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