(57)【要約】【課題】  酢酸イソアミルを高生産し、Ｅ/Ａ比が高い酒類を製造できる醸造用酵母、及び該醸造用を使用した香り豊かな酒類の製造方法の提供を目的とする。【解決手段】  ハイグロマイシンＢに対して耐性を示す変異株を選択することにより、高頻度で酢酸イソアミルを高生産する酵母を取得する。さらに、該変異株を使用することにより、酢酸イソアミルを高濃度に含むことを特徴とする香り豊かな酒類を、コスト、時間及び手間をかけることなく、安定して製造することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
醸造用酵母を、ハイグロマイシンＢを添加した培地中で培養し、醸造用酵母の母集団からハイグロマイシンＢに対して耐性を示す変異株を選択することを特徴とする、酢酸イソアミル高生産性酵母の育種方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法によって育種された、酢酸イソアミル高生産性のハイグロマイシンＢ耐性酵母変異株。
【請求項３】
受託番号  NITE  P−134である請求項２に記載のハイグロマイシンＢ耐性酵母変異株。
【請求項４】
請求項２又は３に記載のハイグロマイシンＢ耐性酵母変異株を用いることを特徴とする酒類の製造方法。
【請求項５】
請求項４に記載の製造方法によって製造され、酢酸イソアミルのイソアミルアルコールに対する濃度比率（百分率）が８以上であることを特徴とする酒類。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイグロマイシンＢ耐性を示す酢酸イソアミルを多く生成する酵母、及び該酵母を用いた香り豊かな酒類の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
低精白米を用い、吟醸造りほど低温下で発酵させない普通酒仕込みにおいては、香気豊かな清酒を製造することは困難である。また他の酒類においても、香り豊かな酒を安定的に製造することは困難である。
【０００３】
酢酸イソアミルは、イソアミルアルコールとアセチルＣｏＡからアルコールアセチルトランスフェラーゼによって生成される。酢酸イソアミルは、バナナ様の華やかな香りを有した香気成分であり、特に清酒においては吟醸香の主要成分の一つである。従来、清酒中の酢酸イソアミルを多くするには、高精白米を用い、低温下で発酵させる吟醸造りを行う必要があった。しかし、この方法ではコスト、時間及び手間が大きくかかるという欠点があった。
【０００４】
一方、様々な方法により取得された酢酸イソアミル高生産性の醸造用酵母を使用することにより、酒類中の酢酸イソアミル濃度を増加させることも検討されてきた。例えば、ロイシンアナログ耐性株を使用する方法（特許文献１）、酢酸イソアミル低分解株を使用する方法（特許文献２）、アンホテリシンＢ耐性株を使用する方法（特許文献３）、アンチマイシンＡ耐性株を使用する方法（特許文献４）が知られている。また、遺伝子工学的手法により酢酸イソアミル合成酵素遺伝子を高発現させる方法（特許文献５）も知られている。
【特許文献１】特開昭６２−６６６９号公報
【特許文献２】特開平１０−２７６７６７号公報
【特許文献３】特開平７−１８４６３９号公報
【特許文献４】特開２００３−２５０５２３号公報
【特許文献５】特開平６−０６２８４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、酢酸イソアミル高生産性の醸造用酵母を使用し、酒類中の酢酸イソアミル濃度を増加させても、イソアミルアルコール濃度も増加し、酢酸イソアミル／イソアミルアルコールの濃度比率（百分率、Ｅ/Ａ比）が増加しないという問題点や、イソアミルアルコール濃度が増えない場合には、酢酸イソアミル濃度の増加量がそれほど大きくならないという問題点があった。
【０００６】
Ｅ/Ａ比は、値が大きいほうが良いとされ、酒類の吟醸香の良し悪しを評価する一つの指標とされる。例えば、特許文献３には、Ｅ/Ａ比が7.4である醸造用酵母が開示されているが、Ｅ/Ａ比が8以上となる醸造用酵母は、今まで存在しなかった。従って、イソアミルアルコール濃度は増加せず、酢酸イソアミル濃度が大きく増加するような醸造用酵母、及びそのような醸造用酵母を使用する酒類の製造方法が待たれていた。
【０００７】
本発明は、酢酸イソアミルを高生産し、Ｅ/Ａ比が高い酒類を製造できる醸造用酵母、及び該醸造用を使用した香り豊かな酒類の製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討した結果、醸造用酵母のハイグロマイシンＢ耐性変異株が、高頻度の確率で酢酸イソアミル高生産株であり、しかもＥ/Ａ比も高い株であることを見出した。これらは本発明者らによる新規知見であり、更に該酵母を用い、一般的な方法に従って醸造することにより、香気豊かなアルコール飲料が簡便に得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
具体的に、本発明は、醸造用酵母を、ハイグロマイシンＢを添加した培地中で培養し、醸造用酵母の母集団からハイグロマイシンＢに対して耐性を示す変異株を選択することを特徴とする、酢酸イソアミル高生産性酵母の育種方法に関する（請求項１）。
【００１０】
また、本発明は、請求項１に記載の方法によって育種された、酢酸イソアミル高生産性のハイグロマイシンＢ耐性酵母変異株に関する（請求項２）。
【００１１】
ハイグロマイシンＢ耐性酵母変異株としては、独立行政法人製品評価技術基盤機構・特許生物寄託センターに寄託されている、受託番号  NITE  P−134の変異株が好ましい（請求項３）。このハイグロマイシンＢ耐性酵母変異株を用いて酒類を製造すると、酒類のＥ／Ａ比を10以上とすることが可能である。
【００１２】
また、本発明は、請求項２又は３に記載のハイグロマイシンＢ耐性酵母変異株を用いることを特徴とする酒類の製造方法に関する（請求項４）。
【００１３】
また、本発明は、請求項４に記載の製造方法によって製造され、酢酸イソアミルのイソアミルアルコールに対する濃度比率（百分率、Ｅ/Ａ比）が８以上であることを特徴とする酒類に関する（請求項５）。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の酢酸イソアミル高生産性酵母の育種方法は、醸造用酵母からハイグロマイシンＢ耐性変異株を選抜することにより、高頻度に酢酸イソアミル高生産変異株を得ることができる。また、この変異株を用いる本発明の酒類の製造方法は、従来の酵母変異株を使用する酒類の製造方法と比較して、Ｅ／Ａ比が高く、香り豊かな酒類を安定的に製造することができる。しかも、吟醸仕込みのようなコストや手間もかからない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本発明は、これらに限定されるものではない。
【００１６】
本発明の酢酸イソアミル高生産性酵母の育種方法では、醸造用酵母を、アミノグリコシド系抗生物質であるハイグロマイシンＢを含有した選択培地で培養し、生育してきたハイグロマイシンＢ耐性変異株から、酢酸イソアミル高生産変異株をスクリーニングすることを特徴とする。
【００１７】
ハイグロマイシンＢ耐性変異株を選択するための対象としては、醸造用実用株、薬剤又は紫外線による変異処理株、遺伝子破壊株、又は天然の醸造用酵母からの分離株等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
選択培地中に添加するハイグロマイシンＢ濃度は、通常0.01〜10 mg/mLとするが、好ましくは0.1〜2 mg/mL、さらに好ましくは0.5〜1.5 mg/mLとする。このようなハイグロマイシンＢ濃度で生育できる株を選択することにより、ハイグロマイシンＢ耐性変異株を高頻度で得ることができる。
【００１９】
選択培地の基本培地は、完全培地、最少培地等、特に問わないが、炭素源にグリセロールを使用することにより、より明確な選択を行うことができる。
【００２０】
〔実施例１〕
＜ハイグロマイシンＢ耐性変異株の分離＞
本発明の実施例１として、酢酸イソアミル高生産株であるハイグロマイシンＢ耐性変異株の分離方法の一例を説明する。なお、特に断りのない限り、本明細書において、アルコール濃度は％(v/v)で、その他の物質の濃度は％(w/v)で表す。
【００２１】
（変異処理）
清酒用泡なし酵母（Saccharomyces cerevisiae）である日本醸造協会701号（以下、K-701と略述する）を親株とし、以下の工程で変異処理を行った。
【００２２】
まず、K-701を10 mLのＹＰＤ液体培地（酵母エキス1％、ポリペプトン2％、グルコース2％）中、30℃で一晩振盪培養した。次に、集菌した菌体を、10 mLの滅菌水で洗浄後、9.7 mLの0.1Ｍリン酸バッファー（pH 7.0）に懸濁させた。次に、0.3 mLのエチルメタンスルホネート（EMS）を加え、30℃で50分間穏やかに振盪した。次に、集菌した菌体を、10 mLの5％チオ硫酸ナトリウムで洗浄し、さらに菌体を10 mLの滅菌水で2回洗浄した。
【００２３】
（選択）
上記変異処理を行い、滅菌水で洗浄した後の菌体を、4 mLのＹＰＤ液体培地に懸濁させ、30℃で4.5時間振盪した。この懸濁液のうち200μLを、0.5 mg/mLの濃度でハイグロマイシンＢ を含むＹＰＧ培地プレート（酵母エキス1％、ポリペプトン2％、グリセロール2％、寒天2％）1枚に塗布後、30℃、3日間培養した。そして、この選択培地で生育した株をハイグロマイシンＢ耐性変異株とした。
【００２４】
この選択により、全部で24株のハイグロマイシンＢ耐性変異株を得た。さらに1.5 mg/mLのハイグロマイシンＢを含むＹＰＤ液体培地に植菌し、30℃で1週間静置培養した。この条件で生育した株を選択することで、よりハイグロマイシンＢに耐性を示した変異株を10株取得した。
【００２５】
〔実施例２〕
＜清酒の製造＞
（酢酸イソアミル生産性試験）
上記10株のうち、増殖能がK-701と同程度な変異株3株（変異株１〜変異株３）を選択した。そして、これら変異株3株と、対照株として親株であるK-701を用い、表１に示す仕込配合で清酒の小仕込試験を行った。
【００２６】
【表１】
2007089455.tif 000002
【００２７】
掛米は、精米歩合77％のα米（セブンライス工業株式会社）を使用し、麹米は、精米歩合75％の白米を使用した。発酵温度は、13℃一定で行い、留後13日目に遠心分離により上槽した。
【００２８】
（清酒成分の分析）
次に、この上清について香気成分の定量を行った。香気成分は、n-アミルアルコールを内部標準として、ヘッドスペース法によりガスクロマトグラフィー（FID検出器、島津製作所GC-14A型）を用いて測定した。香気成分の定量結果を、表２に示す。
【００２９】
【表２】
2007089455.tif 000003
【００３０】
表２の各香気成分の濃度単位はppmであり、Ｅ/Ａ比は酢酸イソアミル濃度(ppm)÷イソアミルアルコール濃度(ppm)×100である。使用したハイグロマイシンＢ耐性変異株3株は、親株であるK-701の1.8〜2.6倍の酢酸イソアミルを生成した。特に、変異株２は、約30ppmと非常に高い酢酸イソアミル値を示した。
【００３１】
さらに、これら3株のＥ/Ａ比は、K-701の1.6〜2.7倍であり、Ｅ/Ａ比が8以上であった。このように、ハイグロマイシンＢ耐性変異株から、高頻度で酢酸イソアミル高生産性、かつ、Ｅ/Ａ比の高い変異株を取得することができた。
【００３２】
酢酸エチルについても、変異株１〜変異株３は、親株であるK-701の1.2〜1.8倍であったが、アセトアルデヒドとカプロン酸エチルについては、K-701との差異は認められなかった。このように、変異株１〜変異株３は、香気成分のうち、酢酸イソアミルを、高いＥ/Ａ比で特異的に高産生する能力を有していることが確認された。
【００３３】
次に、上記上清について一般分析及び有機酸の定量を行った。一般分析は、国税庁所定分析法に基づいて測定した。また、有機酸は、島津HPLC有機酸分析システム（カラムSCR-102H）を用いて測定した。その結果を、表３に示す。
【００３４】
【表３】
2007089455.tif 000004
【００３５】
表３の有機酸の濃度単位は、すべてppmである。一般分析及び有機酸定量の結果、変異株１〜変異株３は、対照株と同等の醸造特性を有していることがわかった。
【００３６】
（菌学的性質）
変異株１〜変異株３の中から、最も酢酸イソアミル高生産性であり、かつ、Ｅ/Ａ比の高かった変異株２を選択し、その菌学的性質を調べた。その結果を、表４に示す。なお、この変異株３は、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) HMR-18と表示し、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号  NITE  P−134号として寄託されている。
【００３７】
βアラニン培地での生育やＴＴＣ（塩化トリフェニルテトラゾリウム）染色性から、変異株３（HMR-18）は、親株であるK-701由来であることが示されている。
【００３８】
【表４】
2007089455.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の酢酸イソアミル高生産性酵母は、香り豊かな酒類の醸造用酵母として、酒類製造業において有用である。