(57)【要約】【課題】免疫細胞において、ユビキチン／プロテアソーム依存性分解経路を介してｐ６５媒介シグナル伝達を調節するメカニズムをさらに解析し、この経路を担う因子を同定すること、並びにこれらの知見を創薬等に応用すること。【解決手段】  ＳＬＩＭの発現又は機能を調節する物質を含む、ｐ６５媒介シグナル伝達の調節剤；被験物が、ＳＬＩＭの発現又は機能を調節し得るか否かを評価することを含む、ｐ６５媒介シグナル伝達の調節剤のスクリーニング方法；ＴＬＲリガンドが投与された、ＳＬＩＭ欠損非ヒト動物；ＴＬＲリガンドで処理された、ＳＬＩＭ欠損細胞；ＳＬＩＭ及びＨＳＰ９０を含む複合体など。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＬＩＭの発現又は機能を調節する物質を含む、ｐ６５媒介シグナル伝達の調節剤。
【請求項２】
ＳＬＩＭの発現又は機能を調節する物質が、ＳＬＩＭの発現又は機能を促進する物質である、ｐ６５媒介シグナル伝達の阻害剤である、請求項１記載の剤。
【請求項３】
ＳＬＩＭの発現又は機能を促進する物質が、ＳＬＩＭ発現ベクター、又はＨＳＰの発現又は機能を抑制する物質である、請求項２記載の剤。
【請求項４】
ｐ６５媒介シグナル伝達の阻害剤が、炎症性疾患及び自己免疫疾患からなる群より選ばれる疾患に対する医薬である、請求項２記載の剤。
【請求項５】
ＳＬＩＭの発現又は機能を調節する物質が、ＳＬＩＭの発現又は機能を抑制する物質である、ｐ６５媒介シグナル伝達の活性化剤である、請求項１記載の剤。
【請求項６】
ＳＬＩＭの発現又は機能を抑制する物質が、ＨＳＰ発現ベクターである、請求項５記載の剤。
【請求項７】
ＨＳＰがＨＳＰ９０である、請求項６記載の剤。
【請求項８】
ｐ６５媒介シグナル伝達の活性化剤が、感染症及び悪性腫瘍からなる群より選ばれる疾患に対する医薬である、請求項５記載の剤。
【請求項９】
ＴＬＲリガンドが投与された、ＳＬＩＭ欠損非ヒト動物。
【請求項１０】
ＴＬＲリガンドで処理された、ＳＬＩＭ欠損細胞。
【請求項１１】
被験物が、ＳＬＩＭの発現又は機能を調節し得るか否かを評価することを含む、ｐ６５媒介シグナル伝達を調節し得る物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
１）ＳＬＩＭの発現を測定可能な細胞を用いたＳＬＩＭの発現の測定、２）ＳＬＩＭの機能を測定可能な再構成系を用いたＳＬＩＭの機能の測定、３）ＳＬＩＭの機能を測定可能な細胞系を用いたＳＬＩＭの機能の測定、４）動物を用いたＳＬＩＭの発現又は機能の測定のいずれかにより行われる、請求項１１記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
該評価が、被験物がＳＬＩＭによるｐ６５のユビキチン化の調節能を有するか否か、あるいはＳＬＩＭによるｐ６５のＰＭＬ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｂｏｄｙへの隔離の調節能を有するか否かの評価に基づき行われる、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
該評価が、被験物がＳＬＩＭ及びＨＳＰ９０を含む複合体の形成能を調節するか否か、あるいは被験物がＳＬＩＭ及びアクチニンを含む複合体の形成能を調節するか否かの評価に基づき行われる、請求項１１記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
ＴＬＲリガンド刺激下で行われる、請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
ＳＬＩＭ及びＨＳＰ９０を含む、複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｐ６５媒介シグナル伝達の調節剤及びそのスクリーニング方法、並びに所定のＳＬＩＭ欠損動物・細胞などを提供する。
【背景技術】
【０００２】
転写因子のＮＦ−κＢ（nuclear factor-κB）／Ｒｅｌファミリーは、５つのメンバー、即ちｐ６５／ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、ｃ−Ｒｅｌ、ｐ５０及びｐ５２から構成される。マクロファージ、樹状細胞及び線維芽細胞等の自然免疫細胞では、ｐ６５とｐ５０のヘテロダイマーが、ＴＬＲリガンド及びサイトカイン（例、ＴＮＦα、ＩＬ−１）の刺激により活性化され得る（Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ＮＦ−κＢ経路と呼ばれる）。細胞を刺激すると、ＩκＢ（inhibitor of κB）タンパク質（細胞質中のＮＦ−κＢタンパク質に結合し、それを細胞質内に隔離している）が先ず分解され、次いでＮＦ−κＢタンパク質が核内に移行して、微生物性病原体に対する宿主防御に必須である一連の遺伝子群（炎症性サイトカイン及びケモカインを含む）の発現を協調的に誘導する。一方、これらの細胞におけるＮＦ−κＢの調節異常（ＮＦ−κＢシグナル伝達の構成的活性化を生じる）は、幾つかのヒト免疫疾患（例、喘息、関節炎及び炎症性腸疾患）を引き起こすことが報告されている。このことは、ＮＦ−κＢシグナル伝達が、適切な時点で終結することの重要性を示唆する。この調節を説明する幾つかのメカニズムが提唱されている。一つは、再合成されたＩκＢタンパク質が核内へと移行して、ＮＦ−κＢを細胞質内へ戻す輸送経路である。もう１つの重要なメカニズムは、核内におけるＮＦ−κＢ・ｐ６５タンパク質のユビキチン／プロテアソーム依存性分解であり、これは、ＩκＢと相乗的にＮＦ−κＢシグナル伝達を不活性化する。
【０００３】
しかしながら、ＮＦ−κＢが核内で分解され、その活性化を終結させる様式については未だ十分に理解されてはいない。さらに、核内ｐ６５タンパク質のユビキチン化を媒介するユビキチンリガーゼは未だ同定されていない。
【０００４】
なお、本発明者らの今回の研究成果に関連する技術分野における先行技術としては、以下が挙げられる。
非特許文献１には、ａ）ｐ６５がＰＭＬ (Promyelocytic leukemia protein) と会合し得ること、ｂ）ＰＭＬの過剰発現がＰＭＬ Nuclear body（ＰＭＬを始めとする幾つかの蛋白質を含む核内の隔離された構造で、核内に点状に分布する）へのｐ６５のトランスロケーションを誘導し得ること、ｃ）ＰＭＬの過剰発現がｐ６５のＤＮＡへの結合を阻害することによりその転写活性を抑制すること、並びにｄ）ＰＭＬがこのｐ６５に対する抑制作用を介してＴＮＦαによる細胞のアポトーシスを促進することが記載されている。
非特許文献２〜４には、ａ）ｐ５３、Ｍｙｃ及びＬＥＦ−１等の幾つかのタンパク質が、ＰＭＬNuclear bodyへと輸送されること、ｂ）ＰＭＬNuclear bodyが転写因子の活性化を正と負の両方向に制御する機能を有すること、並びにｃ）ＰＭＬNuclear bodyが核内での蛋白分解を担う特殊な分画であることが示唆されている。
非特許文献５には、ａ）ＳＬＩＭが、ＣＤ４＋Ｔ細胞においてＳＴＡＴ４及びＳＴＡＴ１に対して作用する核内ユビキチンリガーゼとして同定されたこと、ｂ）ＳＬＩＭの強制発現により、ＳＴＡＴ４とＳＴＡＴ１のプロテアソーム依存性の蛋白分解およびチロシン脱リン酸化が促進されること、ｃ）ＳＬＩＭが、ＳＴＡＴ４タンパク質のポリユビキチン化、及びその後の分解を、ＬＩＭドメインを介して媒介すること、ｄ）ＳＬＩＭ（−／−）マウスが作製されたこと、並びにｅ）ＳＬＩＭ（−／−）マウス由来ＣＤ４＋Ｔ細胞においてＴｈ１細胞分化が亢進し、ＳＴＡＴ４タンパク質レベルが増加していることが記載されている。
非特許文献６には、ＳＬＩＭがアクチン結合タンパク質であるα−アクチニンに結合し得ることが記載されている。
非特許文献７には、ｐ６５がユビキチン化されてプロテアソーム依存性に分解されることにより不活性化され得ることが記載されている。
【非特許文献１】Wu, W-S et al., J. Biol. Chem. 278: 12294-12304 (2003)
【非特許文献２】Zhong S. et al., Nature Cell Biol., 2: E85-90 (2000)
【非特許文献３】Smith KP et al., J. Cell Biochem. 93: 1282-1296 (2004)
【非特許文献４】Sachdev S. et al., Genes & Dev. 15: 3088-3013 (2001)
【非特許文献５】Tanaka T. et al., Immunity 22: 729-736 (2005)
【非特許文献６】Torrad M. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 45: 3955-3963 (2004)
【非特許文献７】Sccanti S. et al., J. Exp. Med., 200: 107-113 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、自然免疫細胞において、ユビキチン／プロテアソーム依存性分解経路を介してｐ６５媒介シグナル伝達を調節するメカニズムをさらに解析し、この経路を担う因子を同定すること、並びにこれらの知見を創薬等に応用することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ユビキチンＥ３リガーゼとして作用する核内ＰＤＺ／ＬＩＭタンパク質であるＳＬＩＭ（STAT-interacting LIM protein）がＮＫ−κＢ・ｐ６５媒介シグナル伝達を負に調節する因子であること、並びにこの調節系にはＨＳＰ９０等の他の因子も関与することなどを見出した。ＮＦ−κＢシグナル伝達の異常は炎症性疾患等の疾患と関連し得ることから、本発明者らの知見により、このような疾患の予防・治療薬の開発などが可能になると考えられる。
【０００７】
以上の知見に基づき、本発明者らは、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の発明などを提供する。
〔１〕ＳＬＩＭの発現又は機能を調節する物質を含む、ｐ６５媒介シグナル伝達の調節剤；
〔２〕ＳＬＩＭの発現又は機能を調節する物質が、ＳＬＩＭの発現又は機能を促進する物質である、ｐ６５媒介シグナル伝達の阻害剤である、上記〔１〕の剤；
〔３〕ＳＬＩＭの発現又は機能を促進する物質が、ＳＬＩＭ発現ベクター、又はＨＳＰの発現又は機能を抑制する物質である、上記〔２〕の剤；
〔４〕ｐ６５媒介シグナル伝達の阻害剤が、炎症性疾患及び自己免疫疾患からなる群より選ばれる疾患に対する医薬である、上記〔２〕の剤；
〔５〕ＳＬＩＭの発現又は機能を調節する物質が、ＳＬＩＭの発現又は機能を抑制する物質である、ｐ６５媒介シグナル伝達の活性化剤である、上記〔１〕の剤；
〔６〕ＳＬＩＭの発現又は機能を抑制する物質が、ＨＳＰ発現ベクターである、上記〔５〕の剤；
〔７〕ＨＳＰがＨＳＰ９０である、上記〔６〕の剤；
〔８〕ｐ６５媒介シグナル伝達の活性化剤が、感染症及び悪性腫瘍からなる群より選ばれる疾患に対する医薬である、上記〔５〕の剤；
〔９〕ＴＬＲリガンドが投与された、ＳＬＩＭ欠損非ヒト動物；
〔１０〕ＴＬＲリガンドで処理された、ＳＬＩＭ欠損細胞；
〔１１〕被験物が、ＳＬＩＭの発現又は機能を調節し得るか否かを評価することを含む、ｐ６５媒介シグナル伝達を調節し得る物質のスクリーニング方法；
〔１２〕１）ＳＬＩＭの発現を測定可能な細胞を用いたＳＬＩＭの発現の測定、２）ＳＬＩＭの機能を測定可能な再構成系を用いたＳＬＩＭの機能の測定、３）ＳＬＩＭの機能を測定可能な細胞系を用いたＳＬＩＭの機能の測定、４）動物を用いたＳＬＩＭの発現又は機能の測定のいずれかにより行われる、上記〔１１〕のスクリーニング方法；
〔１３〕該評価が、被験物がＳＬＩＭによるｐ６５のユビキチン化の調節能を有するか否か、あるいはＳＬＩＭによるｐ６５のＰＭＬ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｂｏｄｙへの隔離の調節能を有するか否かの評価に基づき行われる、上記〔１１〕の方法；
〔１４〕該評価が、被験物がＳＬＩＭ及びＨＳＰ９０を含む複合体の形成能を調節するか否か、あるいは被験物がＳＬＩＭ及びアクチニンを含む複合体の形成能を調節するか否かの評価に基づき行われる、上記〔１１〕のスクリーニング方法；
〔１５〕ＴＬＲリガンド刺激下で行われる、上記〔１１〕の方法；
〔１６〕ＳＬＩＭ及びＨＳＰ９０を含む、複合体。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の調節剤は、例えば、ｐ６５媒介シグナル伝達の抑制が所望される疾患、例えば、炎症性疾患、自己免疫疾患に対する医薬、並びにｐ６５媒介シグナル伝達の促進が所望される疾患、例えば、感染症、悪性腫瘍に対する医薬として有用であり得る。
本発明の動物及び細胞は、例えば、炎症性疾患、自己免疫疾患等の疾患のモデル動物及びモデル細胞として、並びにｐ６５媒介シグナル伝達の解析、及び上記疾患の予防・治療剤の開発に有用であり得る。
本発明のスクリーニング方法は、例えば、ｐ６５媒介シグナル伝達の調節が所望される疾患に対する医薬の開発などに有用であり得る。
本発明の複合体は、例えば、本発明のスクリーニング方法に有用であり得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、ＳＬＩＭの発現又は機能を調節する物質を含む、ｐ６５媒介シグナル伝達の調節剤を提供する。
【００１０】
一実施形態では、ＳＬＩＭの発現又は機能を調節する物質は、ＳＬＩＭの発現又は機能を促進する物質であり得る。なお、本明細書で使用される場合、ＳＬＩＭの発現の促進としては、ＳＬＩＭ（タンパク質）自体の補充をも含むものとする。ＳＬＩＭの発現又は機能を促進する物質としては、例えば、ＳＬＩＭ又はアクチニン（タンパク質）、ＳＬＩＭ又はアクチニンをコードする核酸を含む発現ベクター（ＳＬＩＭ又はアクチニン発現ベクター）、ＨＳＰ（例、ＨＳＰ９０）の発現又は機能を抑制する物質（例、アンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、ＨＳＰ９０ドミナントネガティブ変異体、低分子化合物（例、ゲルダナマイシン、１７−ＡＡＧ（１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン）、１７−ＡＧ（１７−アミノ−ゲルダナマイシン）、ラジシコール (Radicicol)、ノボビオシン (Novobiocin)）が挙げられる。これらの物質は、自体公知の方法により作製できる。なお、例えば、ヒトＳＬＩＭについては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＹ００７７２９を参照のこと。
【００１１】
本発明の剤に含まれ得るＳＬＩＭ又はアクチニンは、上述の動物由来の天然ＳＬＩＭ又はアクチニンあるいはそれらの変異体であり得るが、好ましくはヒト由来の天然ＳＬＩＭ又はアクチニンあるいはそれらの変異体であり得る。ＳＬＩＭは、ｐ６５のユビキチン化を担うＬＩＭドメイン、及びPML Nuclear bodyへのｐ６５の隔離（sequestration）を担うＰＤＺドメインを併有する限り、あるいはそれらの機能を保持する限り、そのコードするアミノ酸配列において１以上のアミノ酸の変異（例、欠失、置換、付加、挿入）を有していてもよい。アクチニンは、ＳＬＩＭへの結合を担うドメイン、アクチンへの結合を担うドメインを併有する限り、あるいはそれらの機能を保持する限り、そのコードするアミノ酸配列において１以上のアミノ酸の変異（例、欠失、置換、付加、挿入）を有していてもよい。
【００１２】
本発明の剤に含まれ得るＳＬＩＭ及びアクチニンはまた、天然のＳＬＩＭ又はアクチニン発現細胞から回収され得るタンパク質、又は組換えタンパク質であり得る。ＳＬＩＭは、自体公知の方法により調製でき、例えば、ａ）天然のＳＬＩＭ発現細胞（例、マクロファージ、樹状細胞、線維芽細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞）からＳＬＩＭを回収してもよく、ｂ）宿主細胞（例、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞）にＳＬＩＭ発現ベクター（後述）を導入することにより形質転換体を作製し、該形質転換体により産生されるＳＬＩＭを回収してもよく、ｃ）ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセート等を用いる無細胞系によりＳＬＩＭを合成してもよい。アクチニンもまた同様に調製できる。ＳＬＩＭ及びアクチニンは、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィー、ＳＬＩＭ抗体の使用などの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；これらを組合せた方法などにより適宜精製される。
【００１３】
別の実施形態では、ＳＬＩＭの発現又は機能を調節する物質は、ＳＬＩＭの発現又は機能を抑制する物質であり得る。ＳＬＩＭの発現又は機能を抑制する物質としては、例えば、ＳＬＩＭ又はアクチニンに対するアンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びＨＳＰ（例、ＨＳＰ９０）、並びにこれらをコードする核酸を含む発現ベクター、低分子化合物が挙げられる。これらの物質は、自体公知の方法により作製できる。
【００１４】
ＳＬＩＭの発現又は機能を調節する物質が、核酸分子又はタンパク質分子である場合、本発明の剤は、核酸分子又はタンパク質分子をコードする核酸分子を含む発現ベクターを有効成分とすることもできる。当該発現ベクターは、上記の核酸分子をコードするオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドが、投与対象である哺乳動物の細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されていなければならない。使用されるプロモーターは、投与対象で機能し得るものであれば特に制限されず、例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター、ならびにβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成タンパク質遺伝子プロモーターなどが挙げられる。また、使用されるプロモーターとしては、ＳＬＩＭ発現細胞（例、マクロファージ、樹状細胞、線維芽細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞）に特異的なプロモーターを用いてもよい。このようなプロモーターは、ＳＬＩＭ発現細胞に特異的に発現している任意の遺伝子のプロモーターであり得る。
【００１５】
発現ベクターは、好ましくは核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含む。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含むこともできる。
【００１６】
発現ベクターとして使用される基本骨格のベクターは、プラスミド又はウイルスベクターであり得るが、ヒト等の哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、レンチウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。
【００１７】
本発明の剤は、ＳＬＩＭの発現又は機能を調節する物質に加え、任意の担体、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００１８】
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤、あるいは散剤、顆粒剤等である。
【００１９】
非経口的な投与（例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入など）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【００２０】
本発明の剤の投与量は、有効成分の活性や種類、投与様式（例、経口、非経口）、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．００１ｍｇ〜約２．０ｇである。
【００２１】
本発明の剤は、例えば、医薬、試薬又は食品として有用である。
【００２２】
詳細には、本発明の剤は、ＳＬＩＭの発現又は機能を調節する物質として、例えばＳＬＩＭの発現又は機能を促進する物質を含む場合、ｐ６５媒介シグナル伝達を抑制し得る。本発明者らは、ＳＬＩＭがｐ６５を基質とするＥ３リガーゼとして作用し、ｐ６５媒介シグナル伝達を負に調節し得る、即ち、抑制し得る因子であることを見出した。この場合、本発明の剤は、ｐ６５媒介シグナル伝達の抑制が所望される疾患の予防・治療、あるいは該シグナル伝達が抑制された疾患モデル（例、細胞、動物）の作製のために使用され得る。ｐ６５媒介シグナル伝達の抑制が所望される疾患としては、例えば、炎症性疾患（例、クローン病、潰瘍性大腸炎、慢性気管支喘息、アトピー性皮膚炎、成人型および小児型呼吸窮迫症候群、インフルエンザ脳症）、自己免疫疾患（例、慢性関節リウマチ、川崎病、結節性多発動脈炎、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーシス）などが挙げられる。ｐ６５媒介シグナル伝達が抑制された疾患モデルにおけるｐ６５媒介シグナル伝達が抑制された疾患は、ｐ６５媒介シグナル伝達の促進が所望される後述の疾患と同様であり得る。
【００２３】
一方、本発明の剤は、ＳＬＩＭの発現又は機能を調節する物質として、例えばＳＬＩＭの発現又は機能を抑制する物質を含む場合、ｐ６５媒介シグナル伝達を促進し得る。本発明者らは、ＳＬＩＭがｐ６５を基質とするＥ３リガーゼとして作用し、ｐ６５媒介シグナル伝達を負に調節し得る、即ち、抑制し得る因子であることを見出した。従って、本発明の剤は、ＳＬＩＭの発現又は機能を抑制する物質を含む場合、ｐ６５媒介シグナル伝達を促進し得る。この場合、本発明の剤は、ｐ６５媒介シグナル伝達の促進が所望される疾患の予防・治療、あるいはｐ６５媒介シグナル伝達が促進された疾患モデル（例、細胞、動物）の作製に使用され得る。ｐ６５媒介シグナル伝達の促進が所望される疾患としては、例えば、感染症（例、細菌、ウイルス、真菌感染症）、悪性腫瘍が挙げられる。ｐ６５媒介シグナル伝達が促進された疾患モデルにおけるｐ６５媒介シグナル伝達が促進された疾患は、ｐ６５媒介シグナル伝達の抑制が所望される上述の疾患と同様であり得る。
【００２４】
（動物及び細胞）
本発明は、ＴＬＲリガンドが投与されたＳＬＩＭ欠損非ヒト動物を提供する。
【００２５】
ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）リガンドとしてはＴＬＲを介して刺激シグナルを細胞内に導入可能なものである限り特に限定されず、例えば、ＬＰＳ、ＣｐＧ  ＤＮＡ、１本鎖又は２本鎖ＲＮＡ、抗ウイルス薬（イミダゾキノリン）、フラジェリン、ペプチドグリカン、細菌由来リポペプチド、マイコプラズマ由来リポペプチドが挙げられる。
【００２６】
本発明の動物の種としては特に限定されず、例えば、げっ歯類（例、マウス、ラット）等の哺乳動物、ゼブラフィッシュ等の魚類が挙げられる。なお、ＳＬＩＭ欠損動物としては、例えば、ＳＬＩＭ欠損マウスが公知である（Tanaka T. et al, Immunity 22: 729-736 (2005) 参照）。
【００２７】
本発明の動物は、上記ＳＬＩＭ欠損動物にＴＲＬリガンドを投与することにより作製できる。ＴＲＬリガンドとしては上述のものが用いられ得る。ＳＬＩＭ欠損動物に対するＴＲＬリガンドの投与は自体公知の方法により行われ得る。
【００２８】
本発明はまた、ＴＬＲリガンドで処理されたＳＬＩＭ欠損細胞を提供する。
【００２９】
本発明の細胞は、ヒトを含む任意の動物（ヒト以外の動物については、例えば、上述の動物を参照）に由来する細胞であり得る。本発明の細胞はまた、任意の組織に由来する細胞であり得るが、好ましくは免疫細胞（例、マクロファージ、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞）、線維芽細胞、骨髄細胞、脾細胞、血管内皮細胞であり得る。本発明の細胞はまた、初代培養細胞、細胞株のいずれであってもよい。
【００３０】
本発明の細胞は、例えば、ＳＬＩＭ欠損動物から単離された細胞をＴＬＲリガンドで処理することにより作製できる。ＳＬＩＭ欠損動物由来の細胞は、遺伝子工学的手法等の方法により改変された細胞であってもよい。細胞の単離及び改変は、自体公知の方法により行うことができる（例えば、Current Protocols in Cell Biology, John Wiley & Sons, Inc.(2001)；機能細胞の分離と培養，丸善書店 (1987) 参照）。ＴＬＲリガンドによる細胞の処理は、自体公知の方法により行われ得る。
【００３１】
本発明の動物は、ＴＬＲリガンドによる処置の致死的効果について、野生型動物に比し、より感受性が高いという特徴を有し得る。本発明の細胞は、ＴＬＲリガンドによる処理により、野生型細胞に比し、より高量の炎症性サイトカインを産生し得る。従って、本発明の動物及び細胞は、例えば、炎症性疾患、自己免疫疾患のモデル動物及びモデル細胞として有用である。本発明の動物及び細胞はまた、ｐ６５媒介シグナル伝達の解析、並びに上記疾患の予防・治療剤の開発などに有用である。例えば、本発明の動物における遺伝子発現を網羅的に解析することで、炎症性疾患、自己免疫疾患を始めとする病的表現型に関与する他の遺伝子の同定が可能となる。この場合、例えば、本発明の動物及び細胞において、遺伝子発現の網羅的解析を可能にする手段（例えば、マイクロアレイ）により遺伝子発現プロフィールが測定され、野生型動物又は他の疾患モデル動物等のコントロール動物（同種又は異種動物）の遺伝子発現プロフィールと比較される。また、本発明の動物及び細胞（必要に応じて被験物が投与又は接触され得る）の発現プロフィールを経時的に追跡し、疾患の状態と発現プロフィールの変化との連動性を評価することもできる。
【００３２】
（スクリーニング方法）
本発明は、被験物がＳＬＩＭの発現又は機能を調節し得るか否かを評価することを含む、医薬、試薬又は食品として有効であり得る、ｐ６５媒介シグナル伝達を調節し得る物質のスクリーニング方法、ならびに当該スクリーニング方法により得られる物質、及び当該物質を含む剤を提供する。
【００３３】
スクリーニング方法に供される被験物は、いかなる化合物又は組成物であってもよく、例えば、核酸（例、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）、糖質（例、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖）、脂質（例、飽和又は不飽和の直鎖、分岐鎖及び／又は環を含む脂肪酸）、アミノ酸、タンパク質（例、オリゴペプチド、ポリペプチド）、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、天然成分（例、微生物、動植物、海洋生物等由来の成分）、あるいは食品、飲料水等が挙げられる。
【００３４】
本発明のスクリーニング方法は、被験物がＳＬＩＭの発現又は機能を調節し得るか否かを評価可能である限り、如何なる形態でも行われ得る。例えば、本発明のスクリーニング方法は、１）ＳＬＩＭの発現を測定可能な細胞を用いたＳＬＩＭの発現の測定、２）ＳＬＩＭの機能を測定可能な再構成系を用いたＳＬＩＭの機能の測定、３）ＳＬＩＭの機能を測定可能な細胞系を用いたＳＬＩＭの機能の測定、４）動物を用いたＳＬＩＭの発現又は機能の測定などに基づき行われ得る。なお、本発明のスクリーニング方法は、ＴＬＲリガンドによる刺激下で行われてもよい。
【００３５】
上記１）において、ＳＬＩＭの発現を測定可能な細胞を用いるスクリーニング方法は、例えば、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含み得る：
（ａ）被験物とＳＬＩＭの発現を測定可能な細胞とを接触させる工程；
（ｂ）被験物を接触させた細胞におけるＳＬＩＭの発現量を測定し、該発現量を被験物を接触させない対照細胞におけるＳＬＩＭの発現量と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＳＬＩＭの発現量を調節する被験物を選択する工程。
【００３６】
上記方法の工程（ａ）では、被験物がＳＬＩＭの発現を測定可能な細胞と接触条件下におかれる。ＳＬＩＭの発現を測定可能な細胞に対する被験物の接触は、培地中で行われ得る。
【００３７】
ＳＬＩＭの発現を測定可能な細胞とは、ＳＬＩＭの産物（例、転写産物、翻訳産物）の発現レベルを直接的又は間接的に評価可能な細胞をいう。ＳＬＩＭの産物の発現レベルを直接的に評価可能な細胞は、ＳＬＩＭ発現細胞であり得、一方、ＳＬＩＭの産物の発現レベルを間接的に評価可能な細胞は、ＳＬＩＭ遺伝子の転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞であり得る。ＳＬＩＭの発現を測定可能な細胞は、上述した動物の細胞であり得る。
【００３８】
ＳＬＩＭ発現細胞は、ＳＬＩＭを潜在的に発現するものである限り特に限定されない。かかる細胞は、当業者であれば容易に同定でき、初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などを使用できる。また、ＳＬＩＭ発現細胞としては、マクロファージ等の免疫細胞を使用することもまた好ましい。また、炎症性疾患等の上述の疾患のモデル動物由来の細胞を用いてもよい。
【００３９】
ＳＬＩＭ遺伝子の転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞は、ＳＬＩＭ遺伝子の転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子を含む細胞である。ＳＬＩＭ遺伝子の転写調節領域、レポーター遺伝子は、発現ベクター中に挿入され得る。ＳＬＩＭ遺伝子の転写調節領域は、ＳＬＩＭの発現を制御し得る領域である限り特に限定されないが、例えば、各ＳＬＩＭ遺伝子の転写開始点から上流約２ｋｂｐまでの領域、あるいは該領域の塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つこれらのＳＬＩＭの転写を制御する能力を有する領域などが挙げられる。レポーター遺伝子は、検出可能なタンパク質又は検出可能な物質を生成する酵素をコードする遺伝子であればよく、例えばＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子、ＬＵＣ（ルシフェラーゼ）遺伝子、ＣＡＴ（クロラムフェニコルアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子等が挙げられる。
【００４０】
ＳＬＩＭ遺伝子の転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子が導入される細胞は、ＳＬＩＭ遺伝子の転写調節機能を評価できる限り、即ち、該レポーター遺伝子の発現量が定量的に解析可能である限り特に限定されない。しかしながら、ＳＬＩＭに対する生理的な転写調節因子を発現し、ＳＬＩＭの発現調節の評価により適切であると考えられることから、該導入される細胞としては、ＳＬＩＭ発現細胞が好ましい。
【００４１】
被験物とＳＬＩＭの発現を測定可能な細胞とが接触される培地は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地などである。培養条件もまた、用いられる細胞の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１２〜約７２時間である。
【００４２】
上記方法の工程（ｂ）では、先ず、被験物を接触させた細胞におけるＳＬＩＭの発現量が測定される。発現量の測定は、用いた細胞の種類などを考慮し、上述した自体公知の方法により行われ得る。また、ＳＬＩＭの発現を測定可能な細胞として、ＳＬＩＭ転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞を用いた場合、発現量は、レポーターのシグナル強度に基づき測定され得る。
【００４３】
次いで、被験物を接触させた細胞におけるＳＬＩＭの発現量が、被験物を接触させない対照細胞におけるＳＬＩＭの発現量と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物を接触させない対照細胞におけるＳＬＩＭの発現量は、被験物を接触させた細胞におけるＳＬＩＭの発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
【００４４】
上記方法の工程（ｃ）では、ＳＬＩＭの発現量を調節する被験物が選択される。例えば、ＳＬＩＭの発現量を増加させる（発現を促進する）被験物は、ｐ６５媒介シグナル伝達の抑制が所望される疾患の予防・治療などに有用であり、ＳＬＩＭの発現量を減少させる（発現を抑制する）被験物は、ｐ６５媒介シグナル伝達の促進が所望される疾患の予防・治療などに有用である。
【００４５】
上記２）において、ＳＬＩＭの機能を測定可能な再構成系とは、ＳＬＩＭ（タンパク質）及びその他の因子（例、タンパク質）を含む、被験物によるＳＬＩＭの機能調節能を評価可能な非培養細胞系をいう。
【００４６】
一実施形態では、ＳＬＩＭの機能を測定可能な再構成系を用いる本発明のスクリーニング方法は、被験物がＳＬＩＭ及びその結合対（例、ＨＳＰ９０等のＨＳＰ、アクチニン）を含む複合体の形成能を調節するか否かを評価することにより行われ得る。このようなスクリーニング方法は、例えば、下記の工程（ａ１）〜（ｃ１）を含み得る：
（ａ１）被験物、ならびにＳＬＩＭ及びその結合対を接触させる工程；
（ｂ１）被験物を接触させた場合におけるＳＬＩＭ及びその結合対を含む複合体量を測定し、該複合体量を被験物を接触させない場合の複合体量と比較する工程；
（ｃ１）上記（ｂ１）の比較結果に基づいて、ＳＬＩＭ及びその結合対を含む複合体量を調節する被験物を選択する工程。
【００４７】
上記方法の工程（ａ１）では、ＳＬＩＭ及びその結合対を含む複合体の形成が可能であるアッセイ系において、被験物、ＳＬＩＭ及びその結合対が接触される。その結合対としては、ＨＳＰ９０等のＨＳＰ、アクチニンが挙げられる。なお、ＳＬＩＭ及びその結合対の一方又は双方は、それらの複合体の検出を容易にするため標識されていてもよい。標識としては、例えば、標識用物質（例、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ等の蛍光物質、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質）による標識の他、レポーター遺伝子によりコードされ得るタンパク質との融合が挙げられる。また、本アッセイ系では、ＳＬＩＭ及び／又はその結合対等を含む細胞ホモジネート（例、ＳＬＩＭ発現ベクター及び／又はＳＬＩＭ結合対の発現ベクターをトランスフェクトした細胞のホモジネート）も使用することができる。
【００４８】
上記方法の工程（ｂ１）では、先ず、被験物を接触させた場合における複合体量が測定される。複合体量の測定は、自体公知の方法により行うことができ、例えば、免疫学的手法（例、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴を利用する相互作用解析法（例、BiacoreＴＭの使用）が挙げられる。
【００４９】
次いで、被験物を接触させた場合の複合体量が、被験物を接触させない場合の複合体量と比較される。複合体量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物を接触させない場合の複合体量は、被験物を接触させた場合の複合体量の測定に対し、事前に測定した複合体量であっても、同時に測定した複合体量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した複合体量であることが好ましい。
【００５０】
上記方法の工程（ｃ１）では、複合体量を調節する被験物が選択される。例えば、ＳＬＩＭ及びＨＳＰを含む複合体量を増加させる（複合体の形成を促進する）、又はＳＬＩＭ及びアクチニンを含む複合体量を減少させる（複合体の形成を抑制する）被験物は、ｐ６５媒介シグナル伝達の促進が所望される疾患の予防・治療などに有用であり、ＳＬＩＭ及びＨＳＰを含む複合体量を減少させる、又はＳＬＩＭ及びアクチニンを含む複合体量を増加させる被験物は、ｐ６５媒介シグナル伝達の抑制が所望される疾患の予防・治療などに有用である。
【００５１】
別の実施形態では、ＳＬＩＭの機能を測定可能な再構成系を用いる本発明のスクリーニング方法は、例えば、被験物がＳＬＩＭによるｐ６５のユビキチン化の調節能を有するか否かを評価することにより行われ得る。このようなスクリーニング方法は、例えば、下記の工程（ａ２）〜（ｃ２）を含み得る：
（ａ２）被験物、ならびにＳＬＩＭ及びユビキチン化反応に必要な因子を接触させる工程；
（ｂ２）被験物を接触させた場合におけるユビキチン化ＳＬＩＭ量を測定し、該複合体量を被験物を接触させない場合のユビキチン化ＳＬＩＭ量と比較する工程；
（ｃ２）上記（ｂ２）の比較結果に基づいて、ユビキチン化ＳＬＩＭ量を含む複合体量を調節する被験物を選択する工程。
【００５２】
上記方法の工程（ａ２）では、ＳＬＩＭの自己ユビキチン化が可能であるアッセイ系において、被験物、ＳＬＩＭ及びユビキチン化反応に必要な因子が接触される。ユビキチン化反応に必要な因子としては、例えば、ユビキチン、Ｅ１、Ｅ２が挙げられる。また、本アッセイ系では、ｐ６５をさらに接触させることもできる。
【００５３】
上記方法の工程（ｂ２）では、先ず、被験物を接触させた場合におけるユビキチン化ＳＬＩＭ量が測定される。ユビキチン化ＳＬＩＭ量の測定は、自体公知の方法により行うことができ、例えば、ウエスタンブロッティング法等の免疫学的手法が挙げられる。
【００５４】
次いで、被験物を接触させた場合のユビキチン化ＳＬＩＭ量（又はｐ６５をさらに接触させた場合には、ユビキチン化ｐ６５量。以下省略）が、被験物を接触させない場合のユビキチン化ＳＬＩＭ量と比較される。ユビキチン化ＳＬＩＭ量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物を接触させない場合のユビキチン化ＳＬＩＭ量は、被験物を接触させた場合のユビキチン化ＳＬＩＭ量の測定に対し、事前に測定したユビキチン化ＳＬＩＭ量であっても、同時に測定したユビキチン化ＳＬＩＭ量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定したユビキチン化ＳＬＩＭ量であることが好ましい。
【００５５】
上記方法の工程（ｃ２）では、ユビキチン化ＳＬＩＭ量を調節する被験物が選択される。例えば、ユビキチン化ＳＬＩＭ量を減少させる（ユビキチン化を抑制する）被験物は、ｐ６５媒介シグナル伝達の促進が所望される疾患の予防・治療などに有用であり、ユビキチン化ＳＬＩＭ量を増加させる（ユビキチン化を促進する）被験物は、ｐ６５媒介シグナル伝達の抑制が所望される疾患の予防・治療などに有用である。なお、本自己ユビキチン化アッセイの詳細については、例えば、Tanaka T. et al, Immunity 22: 729-736 (2005) を参照のこと。なお、再構成系におけるＳＬＩＭの自己ユビキチン化能は、ＳＬＩＭのＬＩＭドメインが、細胞内で実際の基質をユビキチン化する活性を反映していると考えられている。
【００５６】
上記３）において、ＳＬＩＭの機能を測定可能な細胞系を用いたＳＬＩＭの機能を測定するスクリーニング方法は、例えば、ｉ）被験物がＳＬＩＭによるｐ６５のユビキチン化の調節能を有するか否か、ｉｉ）ＳＬＩＭによるｐ６５のPML Nuclear Bodyへの隔離の調節能を有するか否か、あるいはｉｉｉ）ＳＬＩＭ及びその結合対（例、ＨＳＰ、アクチニン）を含む複合体量を調節するか否かの評価により行われ得る。このようなスクリーニング方法は、例えば、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含み得る：
（ａ）被験物とＳＬＩＭ発現細胞とを接触させる工程；
（ｂ）被験物を接触させた細胞におけるＳＬＩＭの機能レベルを測定し、該機能レベルを、被験物を接触させない対照細胞における機能レベルと比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＳＬＩＭの機能レベルを調節する被験物を選択する工程。
【００５７】
上記方法の工程（ａ）では、被験物がＳＬＩＭ発現細胞と接触条件下におかれる。ＳＬＩＭ発現細胞に対する被験物の接触は、培地中で行われ得る。ここで用いられるＳＬＩＭ発現細胞は、タンパク質レベルでのＳＬＩＭのアッセイが可能な程度にＳＬＩＭを発現し得る細胞であり得る。このようなＳＬＩＭ発現細胞の好ましい例としては、ＳＬＩＭ発現ベクター及び／又はＨＳＰ発現ベクターがトランスフェクトされた細胞（例、肥満細胞、Ｔ細胞）、ＳＬＩＭ及びＨＳＰの天然発現細胞（例、マクロファージ等の免疫細胞）が挙げられる。ＳＬＩＭ発現細胞に対する被験物の接触は、培地中で行われ得る。本工程はまた、ＴＬＲリガンド処理（刺激）下で行われ得る。
【００５８】
上記方法の工程（ｂ）では、先ず、被験物を接触させた細胞におけるＳＬＩＭの機能レベルが測定される。例えば、ｉ）については、ユビキチン化ｐ６５量の測定（例、実施例及びTanaka T. et al, Immunity 22: 729-736 (2005) 参照）により行われ得る。ｉｉ）については、核の不溶性画分（PML Nuclear Bodyに対応）中のｐ６５量の測定（例、実施例参照）により、あるいはマーカータンパク質（例、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質、Ｆｌａｇ、Ｈｉｓ等のタグ付加タンパク質）と融合させたｐ６５の核内局在の測定により行われ得る。ｉｉｉ）については、上記２）の（ｂ１）の方法の他、ツーハイブリッドシステムにより測定できる。なお、本工程（ｂ）における機能レベルの比較は、上記方法２）と同様に行われ得る。
【００５９】
上記方法の工程（ｃ）では、ＳＬＩＭの機能レベルを調節する被験物が選択される。例えば、ＳＬＩＭの機能レベルを増加させる（機能を促進する）被験物は、ｐ６５媒介シグナル伝達の抑制が所望される疾患の予防・治療などに有用であり、ＳＬＩＭの機能レベルを減少させる（機能を抑制する）被験物は、ｐ６５媒介シグナル伝達の促進が所望される疾患の予防・治療などに有用である。
【００６０】
上記４）において、動物を用いる本発明のスクリーニング方法は、例えば、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含み得る：
（ａ）被験物を動物に投与する工程；
（ｂ）被験物を投与した動物におけるＳＬＩＭの発現量又は機能レベルを測定し、該発現量を被験物を投与しない対照動物におけるＳＬＩＭの発現量又は機能レベルと比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＳＬＩＭの発現量又は機能レベルを調節する被験物を選択する工程。
なお、本方法論は、（ｂ）及び（ｃ）の工程のみを必須とすることもできる。
【００６１】
上記方法の工程（ａ）では、動物として、任意の動物、例えば、本発明の動物（ＴＬＲリガンドが投与された動物）、疾患モデル動物が使用され得る。被験物の動物への投与は自体公知の方法により行われ得る。
【００６２】
上記方法の工程（ｂ）では、ＳＬＩＭの発現量又は機能レベルの測定は自体公知の方法により測定され得る。例えば、動物から単離又は採取された免疫細胞におけるＳＬＩＭの発現量又は機能レベルが、上記１）〜３）の方法の工程（ｂ）と同様の方法論により測定され得る。本工程（ｂ）における発現量の比較及び上記方法の工程（ｃ）もまた、上記１）〜３）の方法論と同様に行われ得る。
【００６３】
（その他）
本発明は、ＳＬＩＭ及びＨＳＰ（例、ＨＳＰ９０）を含む複合体、並びにその作製方法及び検出方法を提供する。このような複合体の作製は、精製タンパク質又は組換えタンパク質を用いる自体公知の方法により行われ得る。このような複合体の検出は、抗ＳＬＩＭ抗体及び／又は抗ＨＳＰ抗体を用いる抗体免疫学的手法により行われ得る。本発明の複合体は、本発明のスクリーニング方法に有用である。
【００６４】
本発明はまた、ＳＬＩＭ発現ベクターが導入されたＨＳＰ天然発現細胞、ＨＳＰ発現ベクターが導入されたＳＬＩＭ天然発現細胞、ＳＬＩＭ及びＨＳＰを発現する１又は２個のベクター（例、発現ベクターの組合せ、共発現ベクター）が導入された細胞を提供する。本発明のこのような細胞は、本発明のスクリーニングに有用である。
【００６５】
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【００６６】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。
【実施例】
【００６７】
材料及び方法
１．プラスミド、試薬及び抗体
ｐ６５発現プラスミド（Ｆｌａｇ−タグ及びｐ６５のコーディング領域）をｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｔｏｒｇｅｎ）に挿入した。Ｆｌａｇ−ｐ６５をｐＣＩＩ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＩＲＥＳ−Ｖｅｎｕｓ（Ｈ．Ｍｉｙｏｓｈｉ及びＡ．Ｍｉｙａｗａｋｉから快くご提供頂いた）に挿入することにより、Ｆｌａｇ−ｐ６５−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを作製した。Ｃ−Ｍｙｃ−ＳＬＩＭは、Ｍ．Ｇｒｕｓｂｙから頂いた。ＳＬＩＭ変異体のΔＬＩＭ及びΔＰＤＺについては、マウスＳＬＩＭのアミノ酸８０−３５０又は１−２８０をｐＣＭＶ−Ｍｙｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にそれぞれサブクローニングした（Ｍ．Ｇｒｕｓｂｙより快くご提供頂いた）。ＥＬＡＭ−１プロモーター領域を含むルシフェラーゼレポーター構築物は、Ｄ．Ｇｏｌｅｎｂｏｃｋから頂いた。ＬＰＳ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）は、Ｓｉｇｍａから購入した。ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ１６６８）は、Ｈｏｋｋａｉｄｏ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅから購入した。ポリ（Ｉ：Ｃ）は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。ヒトＴＮＦαは、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。ＭＧ１３２は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した。Ｄ−ガラクトサミン、ラトランクリンＡ（Latrunculin A）、サイトカラシンＤ及びノコダゾール（nocodazole）は、Ｓｉｇｍａから購入した。ゲルダナマイシンは、ＷＡＫＯ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。抗ｐ６５、ｐ５０、Ｓｐ１、ＨＳＰ９０、ＰＫＣ、ＬａｍｉｎＢ、Ｉ−κＢα及びＰＭＬ抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。抗Ｆｌａｇ、ＳＣ−３５、及びα−アクチニン抗体は、Ｓｉｇｍａから購入した。抗ユビキチン抗体は、Ｚｙｍｅｄから購入した。抗２０Ｓプロテアソーム抗体は、Ａｆｆｉｎｉｔｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓから購入した。抗ホスホｐ６５（Ｓｅｒ５３６）及びホスホＩ−κＢα（Ｓｅｒ３２）抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから購入した。
【００６８】
２．細胞、トランスフェクション、レポーターアッセイ
２９３Ｔ、ＲＡＷ２６７．４、ＣＯＳ７、３Ｔ３細胞は、１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中で維持した。ＳＬＩＭ欠損マウスでの実験に用いた常在性マクロファージは、マウス腹腔よりＰＢＳで回収した。腹腔マクロファージ（ＰＭ）は、４％チオグリコレート（thioglycolate）の腹腔内注射から４日後に腹腔より採取した。マウス胎児性線維芽細胞（ＭＥＦ）は、既報記載の通り１３．５ｄｐｃ胚より調製した。トランスフェクションについては、示された細胞に、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて一過的にトランスフェクトした。レポーターアッセイについては、ＲＡＷ２６７．４細胞又はＭＥＦに、ＥＬＡＭ−１ルシフェラーゼ構築物（０．１μｇ）を、ＳＬＩＭ又はその変異体（０．６μｇ）およびｐ６５（０．１μｇ）と共に、又はそれを伴わずにトランスフェクトした。細胞をトランスフェクション２４時間後に溶解し、ルシフェラーゼ活性を、製造業者のプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ）の通りに測定した。
【００６９】
３．細胞内（subcellular）分画
細胞質、核可溶性、及び核不溶性抽出液は、以下の通り調製した。先ず、細胞を低張バッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２０％グリセロール）を用いて氷上で１０分間溶解した。遠心分離（５０００ｒｐｍ、１分）後、上清を回収し、細胞質画分として使用した。次いで、ペレットに高張バッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０％グリセロール、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、４００ｍＭ  ＮａＣｌ）を加えて、短時間ボルテックスした後、氷上で２０分間溶解させた。遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分）後、上清を回収し、核可溶性画分として使用した。次いで、ペレットに不溶性バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、１０ｍＭヨードアセトアミド）を加えて５０分間ボルテックスにて抽出した。遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分）後の上清を、核不溶性画分として用いた。
【００７０】
４．免疫沈降
全細胞抽出液は、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．５％  ＮＰ−４０、及びプロテアーゼインヒビター中において細胞を溶解することにより調製した。抽出液を、示された抗体及びプロテインＧ−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とともにインキュベートし、４回洗浄し、示された抗体による免疫ブロット解析に供した。
【００７１】
５．ユビキチン化アッセイ
内因性ｐ６５のユビキチン化アッセイについては、１０ｍＭ  Ｎ−エチルアミドを含有するＲＩＰＡバッファーを用いて調製された全細胞抽出液、あるいは細胞質・核抽出液を、抗ｐ６５抗体による免疫沈降及び抗ユビキチン抗体による免疫ブロットに供した。過剰発現させたｐ６５のユビキチン化アッセイについては、２９３Ｔ細胞に、ｐ６５、ヒスチジンタグのユビキチン及びＳＬＩＭ又はその変異体をトランスフェクトし、ヒスチジン標識されたタンパク質を、既報記載の通り精製し、抗ｐ６５抗体による免疫ブロットに供した。
【００７２】
６．免疫蛍光及び共焦点顕微鏡
２９３Ｔ細胞又はＭＥＦを、ポリＬリジンでコーティングしたスライド上に播種した。２９３Ｔ細胞については、一過的にトランスフェクトした細胞を、４％パラホルムアルデヒドを用いて１５分間固定し、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１０分間透過処理（permeabilize）した。ＭＥＦについては、細胞を、既報記載の通りスライド上において異なった３種類のバッファーで順番に抽出し、続いて４％パラホルムアルデヒドを用いて１５分間固定した。細胞を１０％ＦＣＳによりブロックし、一次及び二次抗体（それぞれＴＢＳＴで１：１００及び１：５００に希釈）と共にインキュベートした。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒシリーズ結合体化二次抗体は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅから購入した。ＤＡＰＩ（４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドールヒドロクロリド，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて核を染色した。画像は、Ｌｅｉｃａ共焦点顕微鏡で得た。
【００７３】
７．ＲＴ−ＰＣＲ
総ＲＮＡは、Ｓｅｐａｓｏｌ（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）を用いて調製し、ｃＤＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により増幅した。ＰＣＲに用いたプライマー対は、以下の通りである；Ｆｌａｇ−ｐ６５，５’−ＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＣ−３’（配列番号１）及び５’−ＧＴＣＡＧＣＣＴＣＡＴＡＧＴＡＧＣＣＡＴＣ−３’（配列番号２）；ヒトアクチン，５’−ＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＣＧＣＣ−３’（配列番号３）及び５’−ＴＴＣＡＴＧＡＧＧＴＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＧＴＣＣ−３’（配列番号４）。
【００７４】
８．ＳＬＩＭ（−／−）マウスによる実験
ＳＬＩＭ（−／−）マウスの作製は、既報に記載されている（Tanaka T. et al, Immunity 22： 729-736 (2005)）。全てのマウスは、特定の病原体がフリーな条件下で維持し、Ｂａｌｂ／ｃと７回バッククロスした後に用いた。常在性マクロファージは、ＰＢＳで洗浄することにより腹腔内から回収し、ＬＰＳで２４時間刺激した。上清中へのＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−６の産生をＥＬＩＳＡによりアッセイした。エンドトキシンショック実験については、図に示す用量のＬＰＳ単独またはＬＰＳとＤ−ガラクトサミンをマウスに腹腔内注射し、生存をモニターした。
【００７５】
実施例１：ＴＬＲリガンド刺激後におこる核内ｐ６５のユビキチン化・分解、およびアクチン依存性の核不溶性区画へのトランスロケーション
本発明者らは最初に、内因性ＮＦ−κＢ・ｐ６５タンパク質がＴＬＲリガンド刺激に対する応答によりユビキチン化され得るか否かについて調べた。ＲＡＷ２６４．７細胞を、プロテアソームインヒビターＭＧ１３２の不在又は存在下においてＬＰＳにより刺激した。全細胞抽出液を、抗ｐ６５で免疫沈降し、抗ユビキチンでブロッティングした。ｐ６５タンパク質のポリユビキチン化が、ＭＧ１３２の存在下で検出され、ＬＰＳ刺激によりさらに増強された（図１ａ）。同様の結果が、ＬＰＳで刺激した初代培養腹腔マクロファージ及び初代培養胎児性線維芽細胞（ＭＥＦ）を使用した場合に得られた。さらに、ｐ６５は、他のＴＬＲリガンドであるＣｐＧ及びポリＩ：Ｃの刺激によってもユビキチン化された（図１ｂ）。ｐ６５タンパク質のユビキチン化が生じる細胞内部位を決定するため、本発明者らはさらに、ＬＰＳ及び／又はＭＧ１３２で刺激した細胞から細胞質・核抽出液を調製した。図１ｃは、細胞質ではなく核のｐ６５がユビキチン化されたことを明確に示す。ユビキチン化タンパク質はプロテアソーム依存性経路を介して分解される傾向があるので、本発明者らは次に、核内におけるｐ６５タンパク質の定常状態レベルについて調べた（図１ｄ）。細胞をＬＰＳで刺激した場合、ｐ６５は可溶性核画分中に容易に検出された。さらに、ｐ６５は、同時に、より少ない量ではあったが、不溶性核画分中にも検出された。次いで、細胞を洗浄して培地からＬＰＳを除去したところ、可溶性画分中の核ｐ６５は、２時間で最初のレベルに減少した。興味深いことに、これらの細胞をＭＧ１３２処理すると、不溶性画分でのみｐ６５タンパク質レベルを回復させ、可溶性画分では回復させなかった。これらのデータは、ＬＰＳ刺激により核へと進入するｐ６５タンパク質の一部が核の可溶性区画から不溶性区画へとトランスロケートされ、さらにこの分画においてｐ６５タンパク質がプロテアソーム依存性に分解されていることを示唆する。核不溶性区画中のｐ６５タンパク質を可視化するため、細胞をＬＰＳで刺激し、次いで界面活性剤、高塩（high salt）、及びＤＮａｓｅＩで連続的に抽出し、蛍光共焦点顕微鏡により観察した（図１ｅ）。これらの抽出により、本発明者らは、核内の分離された巣（foci）として不溶性ｐ６５タンパク質を検出することができた。それらの形態及びｐ６５がＰＭＬタンパク質と会合し得ることを示す従来の研究（Wu, W-S et al., J. Biol. Chem. 278: 12294-12304 (2003)）に基づくと、これらの巣は、タンパク質分解部位として働く核内における隔離された区画であるＰＭＬ Nuclear bodyであり得ると考えられた。最近の研究は、アクチンが核内にも局在し、転写調節に関与することを実証している（Torrad M. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 45: 3955-3963 (2004)）。次いで、本発明者らはアクチン線維形成インヒビターがｐ６５のNuclear bodyへのトランスロケーションに影響するか否かを試験した。核アクチンの特異的インヒビターであるラトランクリンＡは、ＬＰＳに対する応答においてｐ６５タンパク質のトランスロケーションを傷害したが、アクチン形成の一般的インヒビターであるサイトカラシンＤ、又は微小管インヒビターであるノコダゾールは傷害しなかった（図１ｆ）。このことは、Nuclear bodyへのｐ６５の核内トラフィッキングが核アクチン線維に依存することを暗示する。
【００７６】
実施例２：ＳＬＩＭのｐ６５への結合および、ＳＬＩＭの強制発現によるｐ６５の転写活性の抑制
本発明者らは次いで、核内におけるｐ６５タンパク質のユビキチン化を媒介するユビキチンＥ３リガーゼの探索を試みた。ＳＬＩＭは、Ｎ末端にＰＤＺドメイン、Ｃ末端にＬＩＭドメインを含む核タンパク質である。ＳＬＩＭは、ＣＤ４＋Ｔ細胞においてＳＴＡＴ４及びＳＴＡＴ１に対して作用する核ユビキチンリガーゼとして最初に同定された（Tanaka T. et al, Immunity 22: 729-736 (2005)）。本発明者らは、ＳＬＩＭがｐ６５に対する核ユビキチンＥ３リガーゼである得る可能性について調べた。ＳＬＩＭは、他のタイプの細胞においてｍＲＮＡレベルで発現していることが報告されている（Tanaka T. et al, Immunity 22: 729-736 (2005)）ので、本発明者らは先ず、ＳＬＩＭが自然免疫細胞においてタンパク質レベルで発現しているか否かを試験した。ＳＬＩＭは、ＬＰＳ刺激とは無関係に、マクロファージ、樹状細胞及び線維芽細胞の核に発現しており、細胞質には発現していなかった（図２ａ）。これらの結果により、本発明者らは、ＳＬＩＭがｐ６５に対する核ユビキチンリガーゼの候補である可能性を予測した。ＳＬＩＭ及びｐ６５の相互作用を試験するため、２９３Ｔ細胞に、ｃ−ｍｙｃタグ化ＳＬＩＭをコードする発現プラスミドを、ｐ６５と共に一過的にトランスフェクトした。トランスフェクタントを未処理のまま、又はＴＮＦαで３０分間処理し、共免疫沈降に供した。刺激しない場合でも、ＳＬＩＭ及びｐ６５の相互作用が弱く検出され、ＴＮＦα刺激によりさらに増強された（図２ｂ）。本発明者らはさらに、ｃ−ｍｙｃタグ化ＳＬＩＭ及び内因性ｐ６５の相互作用を調べた。図２ｃに示されるように、ＳＬＩＭは、ｐ６５と会合できるが、ｐ５０とは会合できない。ｐ６５媒介シグナル伝達に対するＳＬＩＭの効果を解明するため、細胞に、ＥＬＡＭ１遺伝子プロモーター由来のＮＦ−κＢ結合部位を含むルシフェラーゼレポーター構築物を、ＳＬＩＭ発現プラスミドと共にトランスフェクトした。ＬＰＳ刺激又はｐ６５発現プラスミドの共トランスフェクタトのいずれもレポーター活性を活性化したが、ＳＬＩＭはこれらのレポーターの活性化をいずれも著明に阻害した。このことは、ＳＬＩＭがｐ６５の活性を直接的に阻害することを示唆する（図２ｄ）。さらに、同様の結果が、ＬＰＳの代わりにＴＮＦαで細胞を刺激した場合にも得られた（図２ｅ）。
【００７７】
実施例３：ＳＬＩＭによる核内ｐ６５のユビキチン化・分解、および核不溶性分画へのトランスロケーション
ＳＬＩＭは、ＳＴＡＴ４タンパク質のポリユビキチン化、及びその後の分解を、ＬＩＭドメインを介して媒介することが報告されている（Tanaka T. et al, Immunity 22: 729-736 (2005)）。本発明者らは、ＳＬＩＭがｐ６５タンパク質に対して同様の活性を有するか否かを調べた。図３ａに示されるように、ｐ６５タンパク質のユビキチン化が、ｐ６５及びヒスチジン標識したユビキチンの共発現により最小限ながら検出され、ＳＬＩＭ共発現により劇的に増強した。ユビキチンＥ３リガーゼ活性を有するＬＩＭドメインの欠失は、ＳＬＩＭがｐ６５をユビキチン化する活性、及びＳＬＩＭ自体の自己ユビキチン化活性を傷害した（図３ｂ）。本発明者らは次に、ＳＬＩＭがｐ６５分解を誘導し得るか否かを調べた。ｐ６５の定常状態レベルは、核でのみＳＬＩＭにより著明に低減し、細胞質では低減しなかった（図３ｃ）。一方、ｐ６５  ｍＲＮＡレベルは、ＳＬＩＭの共発現により変化しなかった（図３ｄ）。さらに、これらのトランスフェクタントの核の可溶性・不溶性画分を使用する免疫ブロット解析は、ＳＬＩＭがｐ６５タンパク質を核不溶性画分へとトランスロケートする活性を有することを実証した（図３ｅ）。これらの細胞をＭＧ１３２処理すると、不溶性画分でのみｐ６５タンパク質レベルが回復し、可溶性画分では回復しなかった。さらに、ラトランクリンＡによるこれらの細胞の処理は、ｐ６５タンパク質のＳＬＩＭ誘導性核内トランスロケーションを傷害した（図３ｆ）。これらのデータは、ＳＬＩＭが核内のｐ６５タンパク質をユビキチン化し、次いでアクチン依存性様式により、それらを核不溶性区画（ここでｐ６５タンパク質の分解が引き続いて生じる）へとトランスロケートする活性を有することを暗示する。
【００７８】
実施例４：ＳＬＩＭのＬＩＭドメインによるｐ６５のユビキチン化・分解、およびＰＤＺドメインによるｐ６５のＰＭＬ Nuclear bodyへの隔離
ＳＬＩＭのどの領域がＳＬＩＭのこれらの活性を担うかを決定するため、本発明者らは次に、ＰＤＺドメインを欠くＳＬＩＭ変異体の発現プラスミド（ΔＰＤＺ）又はＬＩＭドメインを欠くＳＬＩＭ変異体の発現プラスミド（ΔＬＩＭ）を作製し、それらをｐ６５発現プラスミドと共にＳＬＩＭ欠損ＭＥＦにトランスフェクトした。図４ａに示されるように、ΔＰＤＺは、不溶性画分にｐ６５タンパク質をトランスロケートする活性を損なった。このことは、ＰＤＺドメインが、ｐ６５タンパク質の核内トラフィッキングに関与することを示唆する。一方、ΔＬＩＭによるｐ６５のトランスロケーションは、野生型ＳＬＩＭと同程度であった。このことは、ｐ６５の核内トラフィッキングが単にそのユビキチン化に依存するわけではないことを暗示する。なぜなら、図３ｂに示されるように、ΔＬＩＭは、ｐ６５タンパク質をユビキチン化する活性が傷害されているからである。しかし、ΔＬＩＭトランスフェクタントの不溶性画分におけるｐ６５タンパク質レベルは、ΔＬＩＭのＥ３リガーゼ活性の傷害を反映して、有意に増強した。ＥＬＡＭ１プロモーターレポーターをＳＬＩＭ変異体と共に使用するルシフェラーゼアッセイは、ΔＬＩＭではなくΔＰＤＺがｐ６５媒介遺伝子活性化を阻害できないことを示した。このことは、不溶性区画へのｐ６５の隔離が、ｐ６５活性化を終結するのに十分であることを示唆する（図４ｂ）。ｐ６５の核内における局在（subnuclear localization）に対するＳＬＩＭ変異体の効果をさらに調べるため、本発明者らは次に、Ｆｌａｇタグ化ｐ６５及びＧＦＰタンパク質の双方が発現するＦｌａｇ−ｐ６５−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ発現プラスミドを作製した。２９３Ｔ細胞に、このコンストラクトをＳＬＩＭ変異体プラスミドと共にトランスフェクトし、共焦点顕微鏡を使用する免疫蛍光実験に供した（図４ｃ）。本発明者らは、Ｆｌａｇ−ｐ６５及びＧＦＰ二重陽性細胞／総ＧＦＰ陽性細胞の百分率を算定することにより各変異体の効果を評価した（表１）。
【００７９】
【表１】
2007254465.tif 000002
【００８０】
コントロールトランスフェクタントのうち９３％のトランスフェクタントは、核ｐ６５について均一のパターンを示し、細胞質染色は弱かった。これは、Ｆｌａｇ−ｐ６５が、過剰発現によりそれ自体で核内に移行できるためである（図４ｃ、左パネル）。一方、ＳＬＩＭトランスフェクタントの多くにおいては、核内のｐ６５が消失した（図４ｃ、左−中段パネル）。興味深いことに、細胞質のｐ６５の発現は、これらの細胞において影響されなかった。ΔＰＤＺトランスフェクタントでは、ｐ６５の核内ターゲティング活性が部分的ではあるが傷害されており（図４ｃ、右パネル）、一方、ΔＬＩＭトランスフェクタントは、ＳＬＩＭトランスフェクタントと同レベルの、ｐ６５の核内トランスロケーションを示した（図４ｃ、右の中段パネル）。しかし、ΔＬＩＭトランスフェクタントにおける二重陽性細胞の中の約１７．２％の細胞では、ｐ６５タンパク質は著明なpuncture構造（これは、不十分な分解に起因するｐ６５タンパク質の凝集物であると思われる）を示した。さらに、これらの構造物は、ＰＭＬ及び２０Ｓプロテアソームと共局在したが、スプライシング因子ＳＣ３５とは共局在しなかった（図４ｄ）。これらのデータは、ＳＬＩＭが、ＰＭＬ Nuclear bodyへのｐ６５のターゲティングを増強する活性を有していること、さらにはこの分画において、集積してきたプロテアソームによりｐ６５タンパク質の分解が実際に生じることを示している。最近の研究は、ＳＬＩＭがアクチン結合タンパク質であるα−アクチニンに結合できることを報告した（Torrad M. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 45: 3955-3963 (2004)）。本発明者らはさらに、ＳＬＩＭがそのＰＤＺドメインを介してα−アクチニンと会合できることを実証した（図４ｅ）。α−アクチニンもまた核に局在するので、ＳＬＩＭは、ＰＤＺドメインを介してα−アクチニンに結合することにより、核アクチンと間接的に会合し、核アクチン線維に沿うｐ６５タンパク質の核内トラフィッキングを媒介していると考えられる。
【００８１】
実施例５：ＳＬＩＭ欠損マウスにおけるＬＰＳに対する反応性の亢進、および核内ｐ６５タンパク質レベルの増加
本発明者はさらに、ＳＬＩＭ欠損マウスを用いて個体レベルでのｐ６５媒介シグナル伝達を調べた。エンドトキシンショックに対するマウスモデルを解析するため、マウスに、低用量のＬＰＳ（１及び０．１μｇ）とＤ−ガラクトサミン又は高用量のＬＰＳ（６００μｇ）単独を腹腔内注射した（表２）。
【００８２】
【表２】
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【００８３】
野生型（＋／＋）及びＳＬＩＭ欠損（−／−）マウスに、ＬＰＳ単独、又はＬＰＳとＤ−ガラクトサミンの両者を、示された用量で腹腔内注射した。生存をモニターし、致死百分率を算定した。
【００８４】
表２は、ＳＬＩＭ（−／−）マウスが、野生型マウスに比し、ＬＰＳ処置の致死的効果に対してより感受性が高いことを示す。さらに、ＳＬＩＭ（−／−）マクロファージは、野生型マクロファージに比し、ＬＰＳ刺激に対する応答において、より高量の炎症性サイトカイン（ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−６）を産生した（図５ａ）。本発明者らは次に、ＳＬＩＭ（−／−）細胞におけるｐ６５のタンパク質レベルを調べた。ＬＰＳ刺激ＳＬＩＭ（−／−）マクロファージにおける核ｐ６５タンパク質のレベルは、野生型細胞のものに比し、優位に高かったが、細胞質ｐ６５レベルは影響されなかった（図５ｂ）。同様に、ｐ６５活性化につながる細胞質成分の活性化に特徴的である、ｐ６５及びＩ−κＢαのセリンリン酸化は、ＳＬＩＭ（−／−）細胞において、ＬＰＳに対する応答として正常に誘導された（図５ｃ）。これらのデータは、ＳＬＩＭが個体レベルにおいてもＥ３リガーゼとして機能し、ｐ６５媒介シグナル伝達を負に調節することを示唆する。
【００８５】
実施例６：ＨＳＰ９０のＳＬＩＭへの結合、およびＨＳＰ９０によるＳＬＩＭのユビキチンＥ３リガーゼ活性の負の調節
最後に、本発明者らは、ＳＬＩＭ自身の活性がどのように制御されているのかを調べた。ＳＬＩＭ  ｍＲＮＡの発現レベルは、本発明らが試験した如何なる刺激でも変化しなかった。従って、本発明者らは、ＳＬＩＭと相互作用し、その活性を修飾する分子の存在を検討した。組換えＳＬＩＭの精製過程において、本発明者らは、シャペロンがＳＬＩＭに強力に結合し得ることを見出した。ＳＬＩＭの活性の制御に対するシャペロンの役割を明確にするため、本発明者らは先ず、主要な哺乳動物シャペロンの一つであるＨＳＰ９０とのＳＬＩＭの会合を調べた。図６ａ（左パネル）に示されるように、ＳＬＩＭは、内因性ＨＳＰ９０に結合できる。本発明者らは次に、ＳＬＩＭ誘導性ｐ６５ユビキチン化に対するＨＳＰ９０の効果を調べた。ＨＳＰ９０のインヒビターであるゲルダナマイシンによる細胞の処理は、ｐ６５のＳＬＩＭ誘導性ポリユビキチン化及びＳＬＩＭの自己ユビキチン化の双方を増強した（図６ａ、中段及び右パネル）。このことは、ＨＳＰ９０がＳＬＩＭのＥ３リガーゼ活性を負に調節することを示唆する。さらに、細胞のゲルダナマイシン処理により、内因性ｐ６５タンパク質のポリユビキチン化及びその後の分解も増強された（図６ｂ左及び上段右）。また、この細胞にＭＧ１３２を加えると、核不溶性画分のｐ６５タンパク質レベルが回復した（図６ｂ下−右）。このことは、ゲルダナマイシンによる核ｐ６５タンパク質レベルの低下が、ｐ６５の細胞質から核への移行の傷害によるものではなく、核内でのプロテアソーム依存性分解の増強に起因するものであることを示唆する。本発明者らはさらに、ＨＳＰ９０がｐ６５により媒介される遺伝子活性化を制御する様式を試験した。ゲルダナマイシン処理は、ＬＰＳ誘導性及びｐ６５活性化ＥＬＡＭ１レポーター活性の双方を阻害した（図６ｃ）。これらのデータより、ＨＳＰ９０は、ｐ６５タンパク質のユビキチン化／プロテアソーム依存性分解を、おそらくＳＬＩＭのユビキチンＥ３リガーゼ活性の阻害を介して、負に調節すると考えられる。
【００８６】
以上の結果より、本発明者らは、ＳＬＩＭが以下の２つのメカニズムにより、ｐ６５活性化を終結させる核ユビキチンＥ３リガーゼであると結論付ける：ＬＩＭドメインを介するｐ６５のユビキチン化、及びＰＤＺドメインを介するＰＭＬ核小体へのｐ６５の隔離。ｐ５３、Ｍｙｃ及びＬＥＦ−１等の幾つかのタンパク質は、ＰＭＬ Nuclear bodyへと輸送されることが報告されている（Zhong S. et al, Nature Cell Biol., 2: E85-90 (2000); Smith KP et al, J. Cell Biochem. 93: 1282-1296 (2004); Sachdev S. et al, Genes & Dev. 15: 3088-3013 (2001)）。これらの因子の機能は、この区画において正又は負のいずれかに調節される。本発明者らのデータは、この区画にターゲティングされたユビキチン化ｐ６５がプロテアソーム依存性様式で分解され、次いでｐ６５媒介シグナル伝達を最終的に終結させることを実証した。従来の研究は、ＰＭＬの過剰発現がＰＭＬ Nuclear bodyへのｐ６５のトランスロケーションを誘導できることを示した（Wu, W-S et al., J. Biol. Chem. 278: 12294-12304 (2003)）。本発明者らの予備的データは、ＳＬＩＭがＰＭＬとヘテロダイマーを形成することを示す。このことは、これらの因子がｐ６５タンパク質の隔離を相乗的に媒介することを示唆するが、さらなる研究が必要である。本研究により明らかされた、ｐ６５活性化を終結させる経路は、ヒト炎症性疾患の臨床治療のための有用な標的であり得る。特に、ＳＬＩＭに対するＨＳＰ結合の特異的阻害は、ｐ６５媒介シグナル伝達の活性化を終結させるための良好なツールであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１ａ】図１ａ〜１ｆは、核ｐ６５のユビキチン化、及びアクチン依存性様式によるNuclear bodyへの核ｐ６５のトランスロケーションを示す図である。  ＲＡＷ２６４．７細胞、ＰＭ（腹腔マクロファージ）及びＭＥＦ（マウス胎児性線維芽細胞）を１μｇ／ｍｌ  ＬＰＳで３時間刺激し、続いて１０μＭ  ＭＧ１３２で１時間処理した。全細胞抽出液を、抗ｐ６５抗体による免疫沈降及び抗Ｕｂ又は抗ｐ６５抗体による免疫ブロットに供した。
【図１ｂ】ＲＡＷ２６４．７細胞を、１μＭ  ＣｐＧ、５０μｇ／ｍｌポリ（Ｉ：Ｃ）又は１μｇ／ｍｌ  ＬＰＳにより３時間刺激し、続いて１０μＭ  ＭＧ１３２により１時間処理した。全細胞抽出液を、抗ｐ６５抗体による免疫沈降及び抗Ｕｂ又は抗ｐ６５抗体による免疫ブロットに供した。
【図１ｃ】細胞質・核抽出液を、図１ａの通り刺激されたＲＡＷ２６４．７細胞から調製し、抗ｐ６５抗体による免疫沈降及び抗Ｕｂ又は抗ｐ６５抗体による免疫ブロットに供した。
【図１ｄ】ＭＥＦを、１０ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳで１時間刺激し、洗浄してＬＰＳを除去し、次いで、未処理のまま放置するか、又は１０μＭ  ＭＧ１３２で２時間処理した。核の可溶性・不溶性画分を調製し、抗ｐ６５抗体で免疫ブロットした。Ｓｐ１（核可溶性画分中のタンパク質）及びラミンＢ（核不溶性画分中のタンパク質）に対する抗体を用いて、各抽出液の分画を確認した。
【図１ｅ】ＭＥＦを、１μｇ／ｍｌ  ＬＰＳで１時間刺激し、これを未処理のまま、または、連続して、ＣＳＫバッファー（界面活性剤）、抽出バッファー（高塩）、及びＤＮａｓｅＩバッファー（ＤＮａｓｅ）を用いて抽出し、抗ｐ６５抗体、続いてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５９４標識抗ウサギＩｇＧにより染色して間接的免疫蛍光に供した。
【図１ｆ】ＭＥＦを、２μｇ／ｍｌ  ラトランクリンＡ（Ｌａｔ．Ａ）、１０μＭサイトカラシンＤ（Ｃｙｔ．Ｄ）、又は１０μＭノコダゾール（ＮＣＺ）で１時間予備処理し、続いて１００ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳで３０分間刺激した。核の可溶性・不溶性画分を調製し、示された抗体で免疫ブロットした。
【図２ａ】図２ａ〜ｅは、ｐ６５へのＳＬＩＭの結合、及びｐ６５媒介トランス活性化のＳＬＩＭによる阻害を示す図である。  細胞質・核抽出液を腹腔マクロファージ（ＰＭ）又は胎児性線維芽細胞（ＭＥＦ）から調製し、抗ＳＬＩＭ抗血清で免疫ブロットした。抗ＰＫＣ又はＨＳＰ９０（細胞質用）及び抗Ｓｐ１（核用）抗体を用いて、各抽出液の純度をチェックした。
【図２ｂ】ＣＯＳ７細胞に、Ｆｌａｇタグｐ６５と共に、ｃ−ｍｙｃ−ＳＬＩＭ（ＷＴ）又はフレームシフト（ＦＳ）変異体の発現プラスミドをトランスフェクトした。未処理の、又はヒトＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）で３０分間処理した全細胞抽出液を、抗ｃ−Ｍｙｃ抗体で免疫沈降し、抗Ｆｌａｇ抗体で免疫ブロットした。
【図２ｃ】２９３Ｔ細胞に、ｃ−ｍｙｃ−ＳＬＩＭ（ＷＴ）又はフレームシフト（ＦＳ）変異体をトランスフェクトした。全細胞抽出液を抗ｃ−Ｍｙｃ抗体で免疫沈降し、抗ｐ６５又は抗ｐ５０抗体で免疫ブロットした。
【図２ｄ】ＭＥＦに、ＥＬＡＭ−１レポーター構築物を、ＳＬＩＭ発現プラスミド（左パネル）を伴わずに、又はそれと共にトランスフェクトした。ＭＥＦに、ＥＬＡＭ−１レポーター構築物を、ｐ６５を伴わずに、又はそれと共に、かつＳＬＩＭ発現プラスミドを伴わずに、又はそれと共にトランスフェクトした（右パネル）。ルシフェラーゼ活性は、ＬＰＳ刺激せずに（右パネル）、又はＬＰＳ刺激（１００ｎｇ／ｍｌ、５時間）（左パネル）して測定した。
【図２ｅ】ＲＡＷ２６４．７細胞に、ＥＬＡＭ−１ルシフェラーゼレポーターをＳＬＩＭ発現プラスミドを伴わずに、又はそれと共にトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性を、ＴＮＦα刺激（１０ｎｇ／ｍｌ，５時間）せずに、又はＴＮＦα刺激（１０ｎｇ／ｍｌ，５時間）して測定した。
【図３ａ】図３ａ〜ｆは、ＳＬＩＭによる、ｐ６５のユビキチン化、核内トランスロケーション及び分解の促進を示す図である。  ２９３Ｔ細胞に、Ｈｉｓ−ユビキチン、ｐ６５及びＳＬＩＭ（ＷＴ）又はフレームシフト（ＦＳ）変異体の発現プラスミドをトランスフェクトした。ヒスチジン標識されたタンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡビーズにより精製し、抗ｐ６５抗体により免疫ブロットした。
【図３ｂ】２９３Ｔ細胞に、Ｈｉｓ−ユビキチン、ｐ６５及びＳＬＩＭ（ＷＴ）、フレームシフト（ＦＳ）又はＬＩＭドメイン欠失（ΔＬＩＭ）変異体の発現プラスミドをトランスフェクトした。ヒスチジン標識されたタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡビーズにより精製し、抗ｐ６５（左パネル）又は抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（右パネル）により免疫ブロットした。
【図３ｃ】２９３Ｔ細胞に、Ｆｌａｇタグ化ｐ６５及びＳＬＩＭ（ＷＴ）又はフレームシフト（ＦＳ）変異体の発現プラスミドをトランスフェクトした。細胞質・核抽出液を、示された抗体による免疫ブロットに供した。
【図３ｄ】総ＲＮＡを図３ｃと同じトランスフェクタントから抽出した。ｃＤＮＡを作製し、示されたプライマー対を用いてＰＣＲに供した。
【図３ｅ】ＭＥＦに、ｐ６５及びＳＬＩＭ（ＷＴ）又はフレームシフト（ＦＳ）変異体の発現プラスミドをトランスフェクトした。未処理の、又はＭＧ１３２（１０μＭ）により５時間処理された核の可溶性・不溶性画分を抽出し、抗Ｆｌａｇ又は抗ｃ−Ｍｙｃ抗体による免疫ブロットに供した。
【図３ｆ】ＭＥＦに、ｐ６５及びＳＬＩＭ（ＷＴ）又はフレームシフト（ＳＦ）変異体の発現プラスミドをトランスフェクトした。未処理の、又はラトランクリンＡ（Ｌａｔ．Ａ）（０．２μＭ）により２０時間処理された核の可溶性・不溶性画分を抽出し、示されたＡｂによる免疫ブロットに供した。
【図４ａ】図４ａ〜ｅは、ＳＬＩＭのＬＩＭドメインとＰＤＺドメインのそれぞれの役割を示す図である。  ２９３Ｔ細胞に、ｐ６５及びＳＬＩＭ（ＷＴ）、フレームシフト（ＦＳ）、ＬＩＭドメイン欠失（ΔＬＩＭ）又はＰＤＺドメイン欠失（ΔＰＤＺ）変異体の発現プラスミドをトランスフェクトした。未処理の、又はＭＧ１３２（１０μＭ）で５時間処理された、核の可溶性・不溶性画分を抽出し、示されたＡｂによる免疫ブロットに供した。
【図４ｂ】ＳＬＩＭ（−／−）ＭＥＦに、ＥＬＡＭ−１ルシフェラーゼレポータープラスミド及びＳＬＩＭ（ＷＴ）、フレームシフト（ＦＳ）、ＬＩＭドメイン欠失（ΔＬＩＭ）又はＰＤＺドメイン欠失（ΔＰＤＺ）変異体をトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性を、１００ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳにより５時間刺激せずに、又は刺激して測定した。
【図４ｃ】２９３Ｔ細胞に、Ｆｌａｇ−ｐ６５−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ、及びＳＬＩＭ（ＷＴ）、フレームシフト（ＦＳ）、ＬＩＭドメイン欠失（ΔＬＩＭ）又はＰＤＺドメイン欠失（ΔＰＤＺ）変異体の発現プラスミドをトランスフェクトした。細胞を、ビオチン化抗Ｆｌａｇ抗体、続いてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５９４標識ストレプトアビジン（上段パネル）により染色した。中段パネルは、ＧＦＰの発現を示し、低段パネルは、ＤＡＰＩによるＤＮＡ染色を示す。
【図４ｄ】２９３Ｔ細胞に、ｐ６５及びＳＬＩＭのＬＩＭドメイン欠失（ΔＬＩＭ）変異体の発現プラスミドをトランスフェクトした。細胞をビオチン抗Ｆｌａｇ抗体、続いてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４標識ストレプトアビジン、及び抗ＰＭＬ、ＳＣ３５又は２０Ｓプロテアソーム抗体により、その後ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗マウスＩｇＧにより染色した。
【図４ｅ】２９３Ｔ細胞に、ＳＬＩＭ（ＷＴ）、フレームシフト（ＦＳ）、ＬＩＭドメイン欠失（ΔＬＩＭ）又はＰＤＺドメイン欠失（ΔＰＤＺ）変異体の発現プラスミドをトランスフェクトした。全細胞抽出液を調製し、抗ｃ−ｍｙｃ抗体による免疫沈降及び抗α−アクチニン抗体による免疫ブロットに供した。
【図５ａ】図５ａ〜ｃは、ＳＬＩＭ欠損マクロファージにおけるサイトカイン産生の増強及び核ｐ６５タンパク質レベルの増加を示す図である。なお、図５ａ〜ｃに示される実験で用いた常在性腹腔マクロファージは、野生型（＋／＋）及びＳＬＩＭ欠損（−／−）マウスから調製した。  細胞を、示されるようにＬＰＳを用いずに、又はそれを用いて２４時間刺激した。培養上清中へのＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−６産生をＥＬＩＳＡにより測定した。
【図５ｂ】細胞を、示されるようにＬＰＳを用いずに、又はそれを用いて２時間刺激した。細胞質・核抽出液を調製し、抗ｐ６５抗体による免疫ブロットに供した。画分を抗ＨＳＰ９０（細胞質用）又は抗Ｓｐ１（核用）抗体により確認した。
【図５ｃ】細胞を、示されるようにＬＰＳを用いずに、又はそれを用いて２時間刺激した。細胞質抽出液を調製し、示された抗体による免疫ブロットに供した。
【図６ａ】図６ａ〜ｃは、ＨＳＰ９０によるＳＬＩＭ媒介ｐ６５ユビキチン化及び分解の負の調節を示す図である。  （左パネル）２９３Ｔ細胞に、ＳＬＩＭ（ＷＴ）又はフレームシフト（ＦＳ）変異体をトランスフェクトし、抗ｃ−ｍｙｃ抗体による免疫沈降及び抗ＨＳＰ  Ａｂによる免疫ブロットに供した。（中心及び右パネル）２９３Ｔ細胞に、Ｈｉｓ−ユビキチン、ｐ６５及びＳＬＩＭ（ＷＴ）又はフレームシフト（ＦＳ）変異体の発現プラスミドをトランスフェクトした。未処理の、又はゲルダナマイシン（１０μＭ、５時間）で処理した細胞より、ヒスチジン標識されたタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡビーズにより精製し、抗ｐ６５又は抗ｃ−Ｍｙｃ抗体により免疫ブロットした。
【図６ｂ】左パネル；ＲＡＷ２６４．７細胞を処理せずに、又はゲルダナマイシン（ＧＡ）（１０μＭ）及び／又はＭＧ１３２（１０μＭ）で６時間処理した。全細胞抽出液を調製し、抗ｐ６５抗体による免疫沈降及び抗ユビキチン又は抗ｐ６５抗体による免疫ブロットに供した。右パネル；ＭＥＦを、ＭＧ１３２（１０μＭ）の不在下（右、上）及び存在下（右、下）においてゲルダナマイシン（ＧＡ）（１０μＭ）で６時間予備処理し、次いでＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で３０分間刺激した。核の可溶性（上−右）及び不溶性（下−右）画分を抗ｐ６５抗体により免疫ブロットした。
【図６ｃ】左パネル；ＭＥＦに、ＥＬＡＭ−１ルシフェラーゼレポータープラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクタントを、ゲルダナマイシン（ＧＡ）（１０μＭ、６時間）の不在下又は存在下において、ＬＰＳを用いずに、又はＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍｌ、４時間）を用いて刺激し、ルシフェラーゼ活性を測定した。右パネル；ＭＥＦに、ＥＬＡＭ−１ルシフェラーゼレポータープラスミドを、ｐ６５発現ベクターを伴わずに、又はそれと一緒にトランスフェクトした。未処理の、又はゲルダナマイシン（ＧＡ）（１０μＭ）で６時間処理したルシフェラーゼ活性を測定した。
【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図６ｃ】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図１ｆ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図４ａ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【配列表】
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