(57)【要約】【課題】動物の消化活動を補助し、感染症などの予防、改善など宿主に好ましい作用を及ぼす細菌を含む飼料添加剤及びこれを含む飼料を用いて動物を飼育する方法を提供する。【解決手段】バチルス・チューリンゲンシスを含む飼料添加剤を飼料に添加して動物に投与する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）を含む飼料添加剤。
【請求項２】
前記バチルス・チューリンゲンシスが、胆汁酸耐性であることを特徴とする請求項１に記載の飼料添加剤。
【請求項３】
前記バチルス・チューリンゲンシスが、さらに細菌自己誘発因子不活性化能を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の飼料添加剤。
【請求項４】
バチルス・チューリンゲンシスが、バチルス・チューリンゲンシス・サブスピーシーズ・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis） ＢＧＳＣ ４Ａ３株、バチルス・チューリンゲンシス・サブスピーシーズ・クルスターキ（Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki） ＢＧＳＣ ４Ｄ１株、バチルス・チューリンゲンシス・サブスピーシーズ・アイザワイ（Bacillus thuringiensis subsp. aizawai） ＢＧＳＣ ４Ｊ４株、バチルス・チューリンゲンシス・サブスピーシーズ・イスラエレンシス（Bacillus thuringiensis subsp. israelensis） ＢＧＳＣ ４Ｑ７株、若しくはこれらの変異株を含む、請求項１〜３の何れか一項に記載の飼料添加剤。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか一項に記載の飼料添加剤を含む飼料。
【請求項６】
請求項５に記載の飼料を動物に投与する工程を含む動物の飼育方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）を含む飼料添加剤及び該細菌を用いて動物を飼育する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、畜産業、ペット産業などの領域において、動物の消化活動を補助し、腸内細菌を増強したり、腸内の有毒細菌の増殖を抑制したりすることにより、動物の成長を促進するために、プロバイオティクス細菌の利用が拡大している。プロバイオティクスは、生きたまま宿主の腸に到達し、腸内フローラのバランスを改善することにより、整腸作用や免疫調節作用など、宿主に有益な作用をもたらす。
細菌をプロバイオティクスとして利用するためには、胃液などに耐性を有し、生きたまま腸に到達し、腸内で増殖する能力を有することなどが要求される。
【０００３】
例えば、胆汁酸耐性であるバチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）、バチルス・クラウジ（Bacillus clausii）を動物の体重増加の促進、各種酵素産生による消化補助、及び病原体増殖制御を目的として動物用飼料強化剤として用いることが報告されている（特許文献１）。また、胆汁酸耐性であるバチルス属細菌（特許文献２、３、非特許文献１）、ラクトバチルス属細菌（特許文献４）などが知られている。
【０００４】
恒温動物の体表や体内は、厳しい自然環境に比べて細菌の増殖に好ましい環境であり、ヒトを始めとする動物の腸管内にはさまざまなフローラが形成され、共生・拮抗の諸現象がみられる。腸内細菌フローラはさまざまな原因で変動し、時にフローラのバランスが崩れて異常フローラが形成される。
感染症を引き起こす病原菌は、動物の腸内に定着するために異常フローラのニッチを常に求めている。通常は、病原菌が腸内に侵入した場合であっても、宿主の生体防御機構により排除されたり、他の細菌により増殖が抑制されたりする。その一方で、例えば、ピロリ菌や緑膿菌のように一定の菌数にまで増殖し、動物腸内に定着し宿主に慢性疾患を引き起こす細菌も存在する。このような細菌は、細菌の腸内への付着、侵入、初期増殖の過程で宿主の生態防御機構に感知されることなく、十分に菌密度が高まってから、種々の病原性因子を一挙に生産して組織を破壊する。これを実現するしくみが細菌自身が産生する自己誘発因子を介した情報伝達機構（cell-to-cell signaling）、すなわち細菌自己誘発機構（菌体密度感知機構）である。この機構はビブリオ属細菌（Vibrio fischeri）の培養において、細菌の増殖に応じて蛍光物質が産生されるという現象の発見から見出されたものであり（非特許文献２）、その後、緑膿菌（Pseudomonas）をはじめとする多くの病原細菌において、本機構が発見され、病原因子発現がコントロールされている事実が明らかとなっている。また、シュードモナス属以外にも、バークホリデリア属（Burkholderia）、エンテロバクター属（Enterobacter）、ビブリオ属（Vibrio）、セラチア属（Serratia）、サルモネラ属（Salmonella）など、臨床上重要な多くの細菌が自己誘発機構を有していることが報告されている（非特許文献３）。
【０００５】
このような細菌自己誘発機構のシグナル伝達を担うのが細菌自己誘発因子であり、グラム陰性細菌の細菌自己誘発因子としては、アシルホモセリンラクトンが広範囲に保存されている。細菌自己誘発因子は、細菌の外膜を自由に通過できる分子であり、環境中の細菌密度が低い場合には自己誘発因子濃度が低く、生物活性を示さない。ところが、細菌の増殖が進み環境中の細菌密度が高まるに従って細菌内外の自己誘発因子濃度も高まり、これがある一定の閾値に達したとき、各種病原因子などのターゲット遺伝子の発現を促進する
。
【０００６】
病原菌の細菌自己誘発機構により起こる感染症を予防、治療する方法として、従来は抗生物質の投与が行われてきたが、この方法は、薬剤耐性菌の出現などが問題となっている。このため、抗生物質により病原菌の菌体自体を死滅させるのではなく、細菌自己誘発因子を不活性化することにより、病原性因子の生産を抑制し、感染症の発生を防止又は減少する方法が報告されている(特許文献５)。この方法は、細菌自己誘発因子を不活性化するために、細菌自己誘発因子不活性化タンパク質を動物に投与するか、又は動物の細胞に細菌自己誘発因子不活性化タンパク質をコードする核酸配列を導入し、該核酸配列を発現させるものである。しかしながら、細菌自己誘発因子不活性化タンパク質を動物に投与する方法は、該タンパク質が胃を通過する過程で消化分解されてしまい、腸管に到達しないという問題があった。また、該タンパク質をコードする核酸配列を動物の細胞に導入・発現させる方法は、畜産業やペット産業においてすでに飼育している動物の疾病を予防・治療することができないといった問題があった。
【０００７】
また、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）が、植物病原菌であるエルベニア・カルトボーラ（Erwinia carotovora）の菌体密度感知機構に依存した（quorum-sensing dependent）病原性を抑制することが報告されている（非特許文献４）。具体的には、バチルス・チューリンゲンシスが、菌体密度感知シグナル因子（アシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ））を分解する酵素であるＡＨＬ−ラクトナーゼを産生し、ＡＨＬの蓄積を抑制することが報告されている。このようなバチルス・チューリンゲンシスは、安全な微生物殺虫剤として広く農業生産の場に受け入れられているが、プロバイオティクスとして動物に投与した場合の効果や影響は一切知られていなかった。すなわち、これまでバチルス・チューリンゲンシスを飼料に添加し、動物の感染症の予防・改善に利用することについては、全く検討されていなかった。このような技術背景において、動物の飼料添加剤に用いることができる新たな細菌種が求められていた。
【０００８】
【特許文献１】特表２００５−５０７６７０号公報
【特許文献２】特開平５−２６８９４４号公報
【特許文献３】国際公開第９６／０２４６５９号パンフレット
【特許文献４】特表２００４−５２３２４１号公報
【特許文献５】特表２００３−５０４０２８号公報
【非特許文献１】「インターナショナル  ジャーナル  オブ  フード  マイクロバイオロジー（international Journal of Food Microbiology）」２０００年，第６１巻，ｐ．１９３−１９７
【非特許文献２】Kaplan,H. et al.， 「ザ  ジャーナル  オブ  バクテリオロジー  （Journal of Bacteriology）」１９８５年，第１６３巻，ｐ．１２１０−１２１４
【非特許文献３】Tateda,K., 「ザ  ラング  パースペクティブス（The Lung Perspectives）」２００５年，第１３巻，ｐ．２６１−２６５
【非特許文献４】Yi-Hu Dong et al., 「アプライド  アンド  インバイロメンタル  マイクロバイオロジー（Applied and Environmental Microbiology）」２００４年，第７０巻，ｐ．９５４−９６０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、近年有用性が認められてきているプロバイオティクスを用いることにより、ヒトを除く動物（以下、単に動物という。）の成長を促進したり、感染症などを予防・改善したりするのに有用な手段を提供することを課題とする。そこで、本発明は、動物に利用できるプロバイオティクスのうち新たな細菌種を含有する飼料添加剤及びこれを利用して動物を飼育する方法を提供することを課題とする。また、胆汁酸耐性である細菌を含有
する飼料添加剤及びこれを利用して動物を飼育する方法を提供することを課題とする。さらに、本発明は、感染症を引き起こす病原菌の細菌自己誘発因子を不活性化させることにより、動物の感染症を予防・治療する手段を提供することを課題とする。そこで、本発明は、さらに細菌自己誘発因子を不活性化する能力を有する細菌を含有する飼料添加剤及びこれを利用して動物を飼育する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、バチルス・チューリンゲンシスがプロバイオティクスとして優れた特性を有することを発見し、バチルス・チューリンゲンシスの細菌の胞子を動物に投与することにより、細菌胞子は胃を生きたまま通過し、胆汁酸で死滅することなく腸内で発芽・増殖し、腸内フローラのバランスを改善し、宿主にさまざまな好ましい作用を及ぼすことを見出した。さらに、これらのバチルス・チューリンゲンシスは優れた胆汁酸耐性を有し、さらに動物の腸内において細菌自己誘発因子を不活性化する能力を有していることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）を含む飼料添加剤。
（２）前記バチルス・チューリンゲンシスが、胆汁酸耐性であることを特徴とする（１）に記載の飼料添加剤。
（３）前記バチルス・チューリンゲンシスが、さらに細菌自己誘発因子不活性化能を有することを特徴とする、（１）又は（２）に記載の飼料添加剤。
（４）バチルス・チューリンゲンシスが、バチルス・チューリンゲンシス・サブスピーシーズ・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis） ＢＧＳＣ
４Ａ３株、バチルス・チューリンゲンシス・サブスピーシーズ・クルスターキ（Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki） ＢＧＳＣ ４Ｄ１株、バチルス・チューリンゲンシス・サブスピーシーズ・アイザワイ（Bacillus thuringiensis subsp. aizawai） ＢＧＳＣ ４Ｊ４株、バチルス・チューリンゲンシス・サブスピーシーズ・イスラエレンシス（Bacillus thuringiensis subsp. israelensis） ＢＧＳＣ ４Ｑ７株、若しくはこれらの変異株を含む、請求項１〜３の何れか一項に記載の飼料添加剤。
（５）（１）〜（４）の何れか一に記載の飼料添加剤を含む飼料。
（６）（５）に記載の飼料を動物に投与する工程を含む動物の飼育方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の飼料添加剤を含む飼料を動物に投与することにより、動物の腸内で細菌が増殖し、有害な腐敗細菌群の働きを抑え、腸内フローラのバランスを改善し、腸の働きを整え、動物の体重増加を促進する。また、乳牛の乳の質を向上させるなどのさまざまな好ましい作用をもたらす。さらに、本発明の飼料添加剤に含まれる細菌は細菌自己誘発因子の分解酵素を産生し、腸内の細菌自己誘発因子を不活性化し、病原菌の病原性因子の産生を抑制する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の飼料添加剤は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）を含有することを特徴とする。
バチルス・チューリンゲンシスとは、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）第９版（１９９４）において「バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）」に分類される細菌である。
【００１４】
本発明の飼料添加剤に用いるバチルス・チューリンゲンシスの亜種は、特に制限されない。例えば、バチルス・チューリンゲンシス・サブスピーシーズ・チューリンゲンシス（
Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis）、バチルス・チューリンゲンシス・サブスピーシーズ・クルスターキ（Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki）、バチルス・チューリンゲンシス・サブスピーシーズ・アイザワイ（Bacillus thuringiensis subsp. aizawai）、バチルス・チューリンゲンシス・サブスピーシーズ・イスラエレンシス（Bacillus thuringiensis subsp. israelensis）などを好ましく用いることができる。この中では、例えば、バチルス・チューリンゲンシス・サブスピーシーズ・チューリンゲンシス ＢＧＳＣ ４Ａ３株、バチルス・チューリンゲンシス・サブスピーシーズ・クルスターキ ＢＧＳＣ ４Ｄ１株、バチルス・チューリンゲンシス・サブスピーシーズ・アイザワイ
ＢＧＳＣ ４Ｊ４株、バチルス・チューリンゲンシス・サブスピーシーズ・イスラエレンシス ＢＧＳＣ ４Ｑ７株などを好ましく用いることができる。ＢＧＳＣ ４Ａ３、ＢＧＳＣ ４Ｄ１、ＢＧＳＣ ４Ｊ４、ＢＧＳＣ ４Ｑ７はBacillus Genetic Stock Center（ＢＧＳＣ）（The Department of Biochemist）に登録されている菌株である。
【００１５】
また、本発明の飼料添加剤には、ＢＧＳＣ ４Ａ３、ＢＧＳＣ ４Ｄ１、ＢＧＳＣ ４Ｊ４、ＢＧＳＣ ４Ｑ７の変異株を用いることができる。変異株としては、上記各菌株が自然変異したものや各菌株を化学的変異剤や紫外線等で変異処理することにより得たものを用いることができる。本発明においては、このような変異株から、上記各菌株と同じ胆汁酸耐性、細菌自己誘発因子不活性化能、通性嫌気性、耐酸性の少なくとも一つを有する変異株を用いることが好ましい。これらの菌学的性質については、後述する。さらに上記以外の菌学的性質も上記各菌株と同様である変異株を用いることも好ましい。
【００１６】
本発明の飼料添加剤に用いるバチルス・チューリンゲンシスは、胆汁酸耐性であることが好ましい。
「胆汁酸耐性である」とは、高濃度の胆汁酸を含有する培地において、発芽・増殖する能力を有する胞子を形成することをいう。
胆汁酸とは、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類の胆汁中に広く見出される４環構造のステロイドをいい、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸及びウルソデオキシコール酸が含まれる。通常、動物の体内では、胆汁酸は、胆汁中でグリシンやタウリンとアミド結合した抱合型として存在し、ナトリウム塩となっている。本明細書において単に「胆汁酸」という場合は、上記胆汁酸及びこれらの塩並びにこれらの抱合体を含む。
【００１７】
高濃度の胆汁酸を含有する培地とは、例えば、新鮮胆汁を１０倍に濃縮・乾固した胆汁末（Ｏｘｇａｌｌ、Ｄｉｆｃｏ製）を含む培地であって、胆汁末の濃度が、０．３質量％以上、好ましくは１質量％以上、さらに好ましくは３質量％以上であるものが挙げられる。また、「発芽・増殖する能力を有する」とは、上記のような高濃度の胆汁酸を含有する培地に胞子を接種し、胆汁酸濃度以外の条件をバチルス・チューリンゲンシスの培養に好適な条件にした場合に、細菌が発芽し、増殖分裂を再開し、コロニーが形成されることをいう。
【００１８】
胆汁酸耐性であるバチルス・チューリンゲンシスは、例えば、以下のようにして得ることができる。バチルス・チューリンゲンシスを含む分離源を胞子形成に適した条件で培養し、胞子を形成させる。得られた胞子を、上記高濃度の胆汁酸添加培地に接種し、培養を行った後、形成したコロニーを分離する。このコロニーの中から、バチルス・チューリンゲンシスの菌学的性質を有するものを選抜する。
【００１９】
本発明の飼料添加剤に用いるバチルス・チューリンゲンシスは、細菌自己誘発因子不活性化能を有するものを用いることが好ましい。「細菌自己誘発因子」とは、細菌自己誘発機構の細胞間伝達を担うシグナル分子であって、細菌が増殖したときに特定の物質を生産する遺伝子の発現を促進するシグナル分子をいう。細菌自己誘発因子としては、例えば、
N-butanoyl-L-homoserine lactone (BHL)、N-(3-hydroxybutanoyl)-L-homoserine lactone (HBHL)、N-(3-oxobutanoyl)-L-homoserine lactone (OBHL)、N-hexanoyl-L-homoserine
lactone (HHL)、N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone (OHHL)、N-octanoyl-L-homoserine lactone (OHL)、N-(3-oxooctanoyl)-L-homoserine lactone(OOHL)、N-(3-oxodecanoyl)-L-homoserine lactone (ODHL)、N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone (OdDHL)が挙げられる。「細菌自己誘発因子不活性化能を有する」とは、例えば細菌自己誘発因子の分解酵素を産生する能力を有することをいう。「酵素を産生する」とは、菌体を培養した場合、培地中に酵素活性が検出できる程度に、産生することをいう。
また、「細菌自己誘発因子不活性化能を有する」とは、細菌自己誘発因子により誘導される病原性因子などの特定の物質が、産生されることを抑制することをいう。
【００２０】
バチルス・チューリンゲンシスの細菌自己誘発因子不活性能は、例えば以下の方法で確認することができる。検体であるバチルス・チューリンゲンシスを細菌自己誘発因子を含む培養液で培養し、この培養液を細菌自己誘発機構を有する細菌を接種した培地に添加し、一定時間培養した場合に、細菌自己誘発機構を有する細菌が細菌自己誘発因子の影響により特定物質を生産するか否かを適当なマーカーを用いて確認する。特定物質が検出された場合には、細菌自己誘発因子が不活性化されていないことが分かり、一方で特定物質が検出されない場合には、細菌自己誘発因子が不活性化され細菌自己誘発機構が誘導されていないことが分かる。細菌自己誘発機構を有する細菌として、例えば、細菌自己誘発因子が一定濃度に達すると色素物質を生産する細菌種を用いることができる。例えば、検体であるバチルス・チューリンゲンシスをＯＨＨＬを含む培養液で一定時間培養した後、培養液を細菌自己誘発機構により紫色の色素(ビオラセイン、violacein)を合成するクロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）の細菌自己誘発因子生合成遺伝子欠損株が生育する培地に添加して、ビオラセインの誘導の有無を試験する方法が挙げられる（McClean,K. et al, 「マイクロバイオロジー（Microbiology）」１９９７年, 第１４３巻, ｐ．３７０３−３７１１）。
【００２１】
本発明の飼料添加剤に用いるバチルス・チューリンゲンシスは、さらに嫌気的条件下で増殖できる通性嫌気性であることが好ましい。嫌気的条件とは、例えば、動物の腸内に含まれる気体中の酸素濃度以下の条件を意味する。実験室的には、例えば、２０℃で測定した酸化還元電位が通常−１０ｍＶ以下、好ましくは−５０ｍＶ以下である条件をいう。酸化還元電位は、通常用いられる市販の酸化還元電位計で測定することができる。動物の消化管は、微好気的条件又は嫌気的条件であるため、このような細菌を用いることにより、腸管内の環境下でも十分に細菌が増殖する。
【００２２】
本発明の飼料添加剤に用いるバチルス・チューリンゲンシスは、さらに耐酸性であることが好ましい。このような細菌を用いることにより、胃内部においても細菌が死滅することなく、腸まで到達する。「耐酸性である」とは、細菌を動物に投与した場合に、胃内部の条件下（食物を摂取した状態で通常ｐＨ３．５〜６）でも死滅せず、腸に達した場合に増殖可能な程度の菌数を維持していることをいう。バチルス・チューリンゲンシスの胞子は通常耐酸性であるため、胞子を用いる場合は、特に問題とならない。
バチルス・チューリンゲンシスが、動物に摂取させた場合に、細菌が胃内部で死滅することなく腸まで到達していることは、例えば、動物の排泄物中の菌体の濃度を測定することによって確認することができる。
【００２３】
本発明の飼料添加剤におけるバチルス・チューリンゲンシスの菌体の濃度は、飼料に添加・混合するのに適した濃度であればよく、配合する食品、飼料の種類、与える対象の種類や体重、投与目的などに応じて最適な濃度を決定することができる。通常は、飼料添加剤全量に対して、１×１０3〜１×１０11ＣＦＵ／ｇ（コロニー形成単位）、好ましくは１×１０4〜１×１０10ＣＦＵ／ｇ、さらに好ましくは１×１０5〜１×１０9ＣＦＵ／ｇ
とすることができる。
【００２４】
本発明の飼料添加剤に用いるバチルス・チューリンゲンシスを培養する方法は特に制限されず、細菌の性質に応じた適当な条件下で定法により行うことができる。例えば、培養温度は１５〜４５℃で培養することができるが、好ましくは２０〜４２℃、さらに好ましくは２５℃〜３８℃で培養するのがよい。また、培養方法は、静置培養、往復動式振とう培養、回転動式振とう培養、ジャーファーメンター培養などによる液体培養法や固体培養法を用いることができる。
【００２５】
培養に用いる培地成分も特に制限されず、炭素源としてグルコース、ガラクトース、ラクトース、アラビノース、マンノース、シュークロース、デンプン、デンプン加水分解物、糖蜜などの糖類、クエン酸などの有機酸類、グリセリンなどのアルコール類を、窒素源としてアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩類や硝酸塩類、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、塩化マンガン、硫酸第１鉄などの無機塩類、ペプトン、大豆粉、脱脂大豆粕、肉エキス、酵母エキス等を用いることができる。
【００２６】
本発明の飼料添加剤は、菌体の培養後、得られた培養物をそのまま飼料添加剤とすることもできるし、得られた培養物から、菌体を含む一部を分離して、適宜任意成分と混合して飼料添加剤とすることもできる。例えば、固体培地を用いて菌体の培養を行う場合には、菌体を培地と共に粉砕して、適宜任意成分を加えて飼料添加剤とすることもできる。液体培地を用いて菌体の培養を行う場合には、培地を遠心分離することにより菌体を分離するなどした後、菌体を含む画分を飼料添加剤とすることもできる。
【００２７】
また、上記のようにして回収した培養物の粉砕物や菌体は、保存性の観点から乾燥粉末としておくことが好ましい。乾燥は、飼料添加剤の水分含有量が２０質量％以下となるように行うことが好ましい。
乾燥方法は、特に制限されず、自然乾燥、通風乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥などが挙げられるが、この中でも噴霧乾燥及び通風乾燥が好ましく用いられる。乾燥する際には、スキムミルク、グルタミン酸ナトリウム及び糖類などの保護剤を用いることができる。糖類を用いる場合は、グルコースやトレハロースを用いることができる。さらに、乾燥後は、得られた乾燥物に、脱酸素剤、脱水剤を加えて、ガスバリアー性のアルミ袋に入れて密封し、室温から低温で貯蔵することが好ましい。これにより、細菌を長期間生きたまま保存することが可能となる。
また、バチルス・チューリンゲンシスの菌体や培養物に製剤化のための担体や増量剤などの任意の物質をさらに加えて、飼料添加剤に加工することも可能である。
【００２８】
本発明の飼料添加剤においては、バチルス・チューリンゲンシスの菌体は、耐酸性に優れる胞子の状態であることが好ましい。また、保存安定性の面からも胞子であることが好ましい。胞子の状態では熱、乾燥に強いため、飼料添加剤に加工する際に十分に乾燥させることができ、保存安定性が向上する。細菌に胞子を形成させるためには、培養の周期において、培地の組成、培地のｐＨ、培養温度、培養湿度、培養する際の酸素濃度などの培養条件を、その胞子形成条件に適合させるように調整することができる。このような方法として、例えば、Schaeffer,P., J.Millet, J.P.Aubert, 「プロシーディング  オブ  ザ
ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス（Proceedings of the National Academy of Sciences）」米国，１９６５年，第５４巻，ｐ．７０４−７１１に記載されている方法が挙げられる。
【００２９】
本発明の飼料添加剤は、通常用いられる飼料に添加、混合して、動物に摂取させることができる。飼料の種類や成分は、バチルス・チューリンゲンシスが死滅しない限りにおい
て特に制限されず、通常、家畜の飼料やペットフード、動物用サプリメントなど、動物用の飼料として用いられているものを用いることができる。
【００３０】
飼料への飼料添加剤の混合は、飼料添加剤をそのまま混合することができるが、粉末状、固形状の飼料添加剤を添加、混合する場合は、飼料への混合を容易にするために液状又はゲル状の形態にして使用することもできる。この場合は、水、大豆油、菜種油、コーン油などの植物油、液体動物油、ポリビニルアルコールやポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸などの水溶性高分子化合物を液体担体として用いることができる。また、飼料中における菌体濃度の均一性を保つために、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、キサンタンガム、カゼインナトリウム、アラビアゴム、グアーガム、タマリンド種子多糖類などの水溶性多糖類を配合することも好ましい。また、雑菌の繁殖を防ぐために有機酸を配合し、液体生菌剤を酸性にすることもできる。
【００３１】
また、本発明の飼料添加剤を他の飼料成分に添加し、混合することにより動物の成長促進のための飼料、感染症の予防・改善のための飼料を製造することができる。この場合、飼料添加剤の含有量は、与える動物の種類、体重、年齢、性別、使用目的、健康状態、飼料の成分などにより適宜調節することができ、特に制限されないが、例えば、通常は飼料に対して、菌体濃度が１×１０4〜１×１０9ＣＦＵ／ｇとなるように添加することが好ましい。
【００３２】
本発明の飼料を摂取させる動物の種類は、特に制限されず、例えば、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類などが挙げられる。この中でも特に、家禽、豚、牛などの家畜に好ましく用いることができる。動物に摂取させる飼料の量は、動物の種類、体重、年齢、性別、使用目的、健康状態、飼料の成分などにより適宜調節することができる。また、動物を飼育する方法も、本発明の飼料添加剤を投与する以外には特に制限されず、通常用いられている方法により行うことができる。
【実施例】
【００３３】
（１）胆汁酸耐性及び嫌気性の試験
脱イオン水１，０００ｍｌに普通寒天培地「ニッスイ」（日水製薬（株）製）を３５g加え、オートクレーブで滅菌した。滅菌後４５℃まで冷却してから、胆汁末（Ｏｘｇａｌｌ、Ｄｉｆｃｏ製）をセルロース混合エステルタイプメンブレンフィルター（孔径０．４５μｍ、アドバンテック東洋（株）製）で濾過滅菌してから加え、胆汁末濃度が０．３質量％、１質量％及び３質量％である、胆汁酸添加普通寒天平板培地を作製した。
バチルス・チューリンゲンシスに属する、ＢＧＳＣ ４Ａ３、ＢＧＳＣ ４Ｄ１、ＢＧＳＣ ４Ｊ４、及びＢＧＳＣ ４Ｑ７をそれぞれ、胆汁酸未添加普通寒天平板培地（脱イオン水１，０００ｍｌ、「ニッスイ」３５ｇ）に接種し３７℃で一夜培養した。培養後、平板培地に形成されたコロニーから、菌体を分離し、滅菌済みディスポループを用いて上記で作製した胆汁末添加平板培地に接種した。３７℃で２日間培養し、コロニー形成の有無を確認した。
【００３４】
また、ＢＧＳＣ ４Ａ３、ＢＧＳＣ ４Ｄ１、ＢＧＳＣ ４Ｊ４、及びＢＧＳＣ ４Ｑ７の嫌気条件下での増殖能を確認する目的で、上記で作製した胆汁末無添加平板培地に各菌株を接種し、アネロパックケンキ（三菱ガス化学株式会社製）を用いて、嫌気条件下３７℃で２日間培養し、コロニー形成の有無を確認した。
【００３５】
一方、比較例としてバチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans） ＡＴＣＣ８０３８株、バチルス・コアギュランス ＮＢＲＣ１２５８３株、バチルス・コアギュランス ＤＳＭ２３１２株、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis） ＮＢＲＣ３００９株、バチルス・サブチルス ＮＢＲＣ３０２５株、バチルス・サブチルス ＮＢＲＣ３１０８株
、バチルス・サブチルス ＮＢＲＣ３３３６株、バチルス・クラウジ（Bacillus clausii） ＤＳＭ２５１２株、バチルス・クラウジ ＤＳＭ２５１５株、バチルス・クラウジ ＤＳＭ２５２５株、及びバチルス・クラウジ ＤＳＭ８７１６株をそれぞれ、同様に胆汁末添加培地に接種し、３７℃で２日間培養した。また、嫌気条件下での増殖試験も同様に行った。
なお、ＡＴＣＣ８０３８はAmerican Type Culture Collection (ＡＴＣＣ)に、ＮＢＲＣ１２５８３、ＮＢＲＣ３００９、ＮＢＲＣ３０２５、ＮＢＲＣ３１０８、及びＮＢＲＣ３３３６は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の生物遺伝資源部門(ＮＢＲＣ)に、ＤＳＭ２３１２、ＤＳＭ２５１２、ＤＳＭ２５１５、ＤＳＭ２５２５、及びＤＳＭ８７１６はDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ＤＳＭＺ）にそれぞれ登録されている株である。
結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】
2007159563.tif 000002
【００３７】
実施例１、２、３及び４のバチルス・チューリンゲンシスは、胆汁末濃度が０．３質量％、１質量％及び３質量％である普通寒天平板培地の全てにおいてコロニーを形成し、嫌気条件下でも増殖できることが確認された。
一方、比較例１、２及び３のバチルス・コアギュランスは、嫌気条件下では増殖できることが確認されたが、胆汁末濃度が０．３質量％の普通寒天培地平板に僅かにコロニーを形成するに止まり、胆汁末濃度が１質量％及び３質量％では全くコロニーを形成できず、実施例のバチルス・チューリンゲンシスに比べ胆汁酸耐性に劣ることが示された。また、比較例４、５、６及び７のバチルス・サブチルスは、胆汁酸には耐性を示したが嫌気条件下では増殖できなかった。さらに、比較例８、９、１０及び１１のバチルス・クラウジＤＳＭ２５１２、ＤＳＭ２５１５、ＤＳＭ２５２５、ＤＳＭ８７１６は、胆汁酸には耐性を示したが嫌気条件下では増殖できなかった。
【００３８】
（２）細菌自己誘発因子不活性化能の試験
細菌自己誘発因子産生遺伝子を破壊したクロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）ＣＶ０２６株を用いて細菌自己誘発機構の誘導の有無を確認する試験を行った(McClean,K. et al., Microbiology, 143, 3703-3711 (1997))。ＣＶ０２６株は、細菌自己誘発因子であるＮ−ヘキサノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン（ＨＨＬ）の生合成遺伝子が破壊された菌株であり、外部からＨＨＬなどのアシルホモセリンラクトン（ＡＨＬ）を添加しなければ、細菌自己誘発機構を発現しないため、紫色の色素(ビオラセイン、violacein)を合成しない。ＡＨＬとしては、ＨＨＬ以外にＮ−（３−オキソヘキサノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン（ＯＨＨＬ）を添加しても細菌自己誘発機構を発現させることができる。本試験の具体的な方法は、以下の通りである。
【００３９】
クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）ＣＶ０２６株をＬＢ培地に接種し、２８℃で一夜振とう培養した。次いで、オートクレーブで滅菌後４５℃まで冷却した半流動ＬＢ寒天培地(０．３％)５ｍｌに、上記で得たＣＶ０２６の培養液を５０μｌ、濾過滅菌したカナマイシンの２％水溶液を５０μｌ加え、この半流動ＬＢ寒天培地５ｍｌを、あらかじめ直径９ｃｍのシャーレに用意しておいたＬＢ寒天培地に重層した。寒天を固化させた後に、このＬＢ寒天培地にコルクポーラーを用いて直径６ｍｍの穴をあけた。
なお、ＣＶ０２６はＮＣＴＣ１３２７８としてNational Collection of Type Cultures （ＮＣＴＣ）に登録されている株である。
【００４０】
ＬＢ培地１０ｍｌに５００μＭのＯＨＨＬ（Ｓｉｇｍａ製）を０．５ｍｌ加え、２８℃で４時間置いたものをポジティブコントロールとした。また、何も加えないＬＢ培地を同様に処理したものをネガティブコントロールとした。それぞれのコントロールを５０μｌずつ、上記で作製したＣＶ０２６を含むＬＢ培地の穴に添加し、２８℃で２４時間培養した。その結果、ＯＨＨＬを添加したポジティブコントロールを添加したものでは、培地の穴の周りにビオラセインの誘導が確認され、ＯＨＨＬを添加しないネガティブコントロールを添加したものでは、ビオラセインの誘導は確認されなかった。これより、ＣＶ０２６は、ＯＨＨＬの存在下で培養すると、細菌自己誘発機構を発現しビオラセインを誘導する一方で、ＯＨＨＬの非存在下で培養しても、細菌自己誘発機構が発現せず、ビオラセインを誘導しないことが確認された。
【００４１】
次に、バチルス属細菌のＯＨＨＬ不活性化能を調べるために、以下の手順でバチルス属細菌とＯＨＨＬを反応させた。
バチルス・チューリンゲンシスＢＧＳＣ ４Ａ３、ＢＧＳＣ ４Ｄ１、ＢＧＳＣ ４Ｊ４、ＢＧＳＣ ４Ｑ７（実施例１〜４）、及び表２に示すバチルス・コアギュランス（比較例１〜３）、バチルス・サブチルス（比較例４〜７）、バチルス・クラウジ（比較例８〜１１）をそれぞれＬＢ培地に接種し、３７℃で一夜振とう培養した。次いで、吸光度(６
６０ｎｍ)を１．０に調整した培養液１０ｍｌに、ＯＨＨＬを０．５ｍｌ加え、２８℃で４時間反応を行った。それぞれの反応液を５０μｌずつ、上記で作製したＣＶ０２６を含むＬＢ培地の穴に添加し、２８℃で２４時間培養した。培養後、それぞれの培地の穴の周りのビオラセインの誘導の有無を観察した。
結果を表２に示す。
【００４２】
【表２】
2007159563.tif 000003
【００４３】
実施例１、２、３及び４のバチルス・チューリンゲンシスの全ての株において、ビオラセインの誘導が認められなかった。一方、比較例１、２及び３のバチルス・コアギュラン
ス、比較例４、５、６及び７のバチルス・サブチルス、比較例８、９、１０及び１１のバチルス・クラウジの全ての株においては、ビオラセインの誘導が認められた。この結果から、実施例１〜４のバチルス・チューリンゲンシスは、ＯＨＨＬの分解酵素を産生することによりＯＨＨＬを不活性化し、ＣＶ０２６の細菌自己誘発機構の発現を抑制した一方で、比較例のバチルス属細菌は、ＯＨＨＬを不活性化しなかったと考えられる。
【００４４】
（３）飼料添加剤の製造
下記組成の胞子形成培地を用いて、ＢＧＳＣ ４Ａ３、ＢＧＳＣ ４Ｄ１、ＢＧＳＣ ４Ｊ４及びＢＧＳＣ ４Ｑ７をそれぞれ３７℃で７２時間液体培養した（「プロシーディング  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス（Proceedings of the National Academy of Sciences）」米国，１９６５年，第５４巻，ｐ．７０４−７１１）。得られた培養液を遠心分離し、菌体を集めた。得られた菌体を凍結乾燥した後に粉砕し、胞子密度が５×１０8ＣＦＵ／ｇになるように乳糖を加え、飼料添加剤を製造し、それぞれ製造例１〜４とした。胞子密度は、製造した飼料添加剤を適当な濃度まで滅菌水で希釈し、７０℃で３０分間加熱することにより栄養細胞のみを死滅させてから普通寒天培地に接種し、形成されたコロニー数を計数することにより測定した。
【００４５】
（胞子形成培地成分）
ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ製）      ８．０    ｇ
ＫＣｌ                                            １．０    ｇ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                                 ０．２５  ｇ
ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ                                 ０．００２ｇ
ｐＨを７．０に調整し、全量                        １，０００ｍｌ
上記成分をオートクレーブ滅菌した後、滅菌済みＣａＣｌ2溶液及びＦｅＳＯ4溶液をそれぞれ５×１０-4 Ｍ及び １×１０-6 Ｍになるように添加した。
【００４６】
一方、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans） ＮＢＲＣ１２５８３株及びバチルス・サブチルス（Bacillus subtilis） ＮＢＲＣ３００９株を用いて上記と同様にして飼料添加剤を製造し、それぞれ比較製造例１及び２とした。
【００４７】
（４）鶏ヒナ成長試験
鶏ヒナの飼料（ＳＤブロイラー前後期用、日本配合飼料（株）製、抗菌性物質無添加飼料）全質量に対して、おのおの製造例１〜４の飼料添加剤を０．２質量％となるように混合した飼料を、実施例５〜８とした。ブロイラー種鶏(銘柄：チャンキー)由来の種卵より孵化した鶏ヒナ１２羽を一群として、各群に実施例５〜８の飼料を５６日間与え、成長試験を行った。一方、比較製造例１及び２の飼料添加剤を０．２％となるように混合した飼料を、比較例１２及び１３とした。飼料添加剤の代わりに乳糖を０．２％混合した飼料を対照例とし、同様に成長試験を行った。
５６日後の各群の鶏ヒナの体重を測定し、それぞれの群の平均値を算出した。また、飼育期間中の糞中における添加菌の菌体濃度を測定し、それぞれの平均濃度を算出した。
結果を表３に示す。
【００４８】
【表３】
2007159563.tif 000004
【００４９】
実施例５〜８の飼料添加剤を与えた鶏ヒナは、比較例１２及び１３に比して体重の増加が大きかった。また、実施例５〜８の飼料添加剤を与えた鶏ヒナの糞からは、１１．３×１０6 ＣＦＵ／ｇ(グラム生鶏糞)以上の添加菌が検出され、比較例に比して明らかに菌数が増加していた。これより、本発明の飼料添加剤に用いるバチルス・チューリンゲンシス細菌の胞子を含有する動物用飼料添加剤は、胃や腸の消化管内で死滅することなく、腸内でコロニーを形成し、動物の体重増加を促進することが示された。
【００５０】
（５）豚飼養試験
製造例１及び３の飼料添加剤と養豚用標準飼料（プレミアパワー、昭和産業（株）製）を混合した飼料を、それぞれ実施例９及び１０とし、子豚３０頭を一群として給餌した。同様に、比較製造例１の飼料添加剤と養豚用標準飼料を混合した飼料を、比較例１４とし、子豚に給餌した。飼料添加剤の代わりに乳糖を混合した飼料を対照例とし、子豚に給餌した。
２１日後の各群の子豚の体重を測定し、それぞれの群の平均値を算出した。また、この期間中に下痢 、軟便の発生状況を観察し、子豚１頭が下痢または軟便を起こした日数を１日１ポイントとして集計し、この結果を下痢、軟便得点として評価した。
結果を表４に示す。
【００５１】
【表４】
2007159563.tif 000005
【００５２】
実施例９及び１０の飼料添加剤を与えた子豚は、比較例１４の飼料添加剤を与えた子豚に比して体重の増加が大きかった。また、実施例９及び１０の飼料添加剤を与えた子豚は、比較例の飼料添加剤を与えた子豚に比して下痢、軟便得点が明らかに低かった。これより、本発明の飼料添加剤に用いるバチルス・チューリンゲンシス細菌の胞子を含有する飼料添加剤は、子豚の体重増加を促進し、下痢、軟便の予防、改善にも効果を有することが示された。
【００５３】
（６）子牛飼育試験
生後１週齢の雄子牛（ホルスタイン種）６頭を一群として飼育した。各群の子牛に下記に示す代用乳に製造例１及び３の飼料添加剤をそれぞれ２質量％添加したものを実施例１１及び１２とし、比較製造例１の飼料添加剤を２質量％添加したものを比較例１５とした。対照例には同量の乳糖を添加した。これらの代用乳及び哺乳期子牛育成用飼料（うしっ子、雪印種苗（株）製）を３５日齢まで給餌、飼育し、飼育期間中における下痢、軟便の発生状況と体重増加を調べた。
【００５４】
（代用乳組成）
（質量％）
脱脂粉乳                                ６９
ホエー                                  １０
牛脂                                    １２．２
レシチン                                  ０．８
ビタミン、ミネラル、その他の添加物        ８
【００５５】
（下痢、軟便の発生状況の評価基準）
多い：試験期間中の下痢の発生延べ頭数が１０頭以上
少ない：試験期間中の下痢の発生延べ頭数が１０頭未満５頭以上
著しく少ない：試験期間中の下痢の発生延ベ頭数が５頭未満
結果を表５に示す。
【００５６】
【表５】
2007159563.tif 000006
【００５７】
実施例１１及び１２の飼料添加剤を与えた子牛は、比較例１５に比して体重の増加が大きかった。また、実施例１１及び１２の飼料添加剤を与えた子牛は、比較例に比して下痢、軟便の発生状況が明らかに低かった。これより、本発明の飼料添加剤に用いるバチルス・チューリンゲンシス細菌の胞子を含有する飼料添加剤は、子牛の体重増加を促進し、下痢、軟便の予防、改善効果があることが示された。
【００５８】
鳥ヒナ、子豚、子牛の成長、飼育試験の結果から、本発明の飼料添加剤を含む飼料を与えると、バチルス・チューリンゲンシスが腸内に高い確率で定着し、飼料の消化吸収を向上させ成長を促進し、さらに下痢や軟便などの好ましくない症状を予防、改善することが分かった。
【００５９】
（７）乳質の向上作用試験
製造例１及び３の飼料添加剤と乳牛用飼料(とうもろこし４．５ｋｇ、大麦２．５ｋｇ、ビート１．１〜１．８ｋｇ、綿実１．８ｋｇ、脱脂大豆１．４〜１．６ｋｇ、大豆０．６ｋｇ〜１．２ｋｇ、乾燥草１０〜１２ｋｇ、水１６０〜２２０Ｌ)を混合した飼料を、おのおの実施例１３及び１４とし、乳牛 (ホルスタイン)３０頭を一群としてそれぞれ摂取させた。比較製造例１の飼料添加剤と乳牛用飼料を混合した飼料を比較例１６とし、同様に摂取させた。また、飼料添加剤の代わりに乳糖を混合した飼料を対照例とし、同様に摂取させた。
各群の乳牛から1０日間隔で１７回にわたり搾乳し、牛乳の乳脂肪率、乳蛋白質率及び無脂乳固形分率について測定し、平均値を算出した。
結果を表６に示す。
【００６０】
【表６】
2007159563.tif 000007
【００６１】
実施例１３及び１４の飼料添加剤を与えた乳牛から生産される牛乳の乳脂肪率、乳蛋白質率及び無脂乳固形分率は、何れも比較例１６に比して大きかった。これより、本発明の飼料添加剤に用いるバチルス・チューリンゲンシス細菌の胞子を含有する飼料添加剤は、乳牛の乳質を向上させる効果があることが示された。