(57)【要約】【課題】日本人における関節リウマチ（RA）疾患感受性遺伝子、及び関節リウマチの発症リスクを検出し判定する方法の提供。この検出方法に使用される関節リウマチ易罹患診断マーカー、プローブ、プライマー並びに試薬キットの提供。【解決手段】ヒトRA疾患感受性遺伝子としてPRKCH遺伝子を、また、RA疾患感受性SNPとして、PK015、PK032、PK033（以上、LDブロックＡに存在）、PK035、PK037、PK039、PK040（以上、LDブロックＢに存在）、Ex9、Add9-1、Add9-2、Int9-1、Add9-3（以上、LDブロックＣに存在）を提供する。さらに、RA罹患リスクを検出する方法として、ヒト被験者から得られるゲノムＤＮＡを対象として、上記各ブロックから選択される少なくとも２つのLDブロック中のSNPの中から各々少なくとも１つのSNPを検出し同定する工程を含む方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すアミノ酸配列を有する変異ヒトプロテインキナーゼＣエタ。
【請求項２】
請求項１に記載する変異ヒトプロテインキナーゼＣエタをコードするヒトＰＲＫＣＨ遺伝子またはその遺伝子産物。
【請求項３】
下記の２１からなる群から選択される少なくとも一つのオリゴまたはポリヌクレオチドからなる、関節リウマチの罹患診断マーカー：
(1) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、77624位（PK011）に位置するＣまたはＴを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(2) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、77995位（SNP316）に位置するＣまたはＴを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(3) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、79479位（PK015）に位置するＧまたはＡを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(4) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、80267位（PK018）に位置するＣまたはＴを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(5) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、81682位（PK022）に位置するＡまたはＧを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(6) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85179位（PK028）に位置するＴまたはＣを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(7) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85309位（PK030）に位置するＡまたはＴを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(8) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85639位（PK031）に位置するＴまたはＣを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(9) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85859位（PK032）に位置するＧまたはＴを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(10) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85933位（SNP317）に位置するＡまたはＧを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(11) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、86306位（PK033）に位置するＡまたはＧを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(12) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、88042位（PK035）に位置するＡまたはＧを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(13) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、88549位（PK037）に位置するＴまたはＧを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(14) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、90690位（PK039）に位置するＴまたはＣを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(15) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、90983位（PK040）に位置するＡまたはＧを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(16) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、128663位（Int5）に位置するＡまたはＧを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(17) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、135724位（Ex9）に位置するＧまたはＡを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(18) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、144962位（Add9-1）に位置するＴまたはＣを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(19）ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、145076位（Add9-2）に位置するＡまたはＧを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(20) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、145503位（Int9-1）に位置するＣまたはＴを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(21) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、148285位（Add9-3）に位置するＧまたはＡを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド。
【請求項４】
ヒト被験者から得られるゲノムＤＮＡを対象として、下記Ａ群〜Ｃ群から選択される少なくとも２群に記載する塩基の中から各々少なくとも１つの塩基を検出し同定する工程を含む、当該被験者について関節リウマチの罹患リスクを検出する方法：
Ａ群 
(1) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の77624位（PK011）の塩基
(2) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の77995位（SNP316）の塩基
(3) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の79479位（PK015）の塩基
(4) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の80267位（PK018）の塩基
(5) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の81682位（PK022）の塩基
(6) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の85179位（PK028）の塩基
(7) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の85309位（PK030）の塩基
(8) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の85639位（PK031）の塩基
(9) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の85859位（PK032）の塩基
(10) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の85933位（SNP317）の塩基
(11) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の86306位（PK033）の塩基
Ｂ群
(12) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の88042位（PK035）の塩基
(13) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の88549位（PK037）の塩基
(14) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の90690位（PK039）の塩基
(15) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の90983位（PK040）の塩基
Ｃ群
(16) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の128663位（Int5）の塩基
(17) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の135724位（Ex9）の塩基
(18) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の144962位（Add9-1）の塩基
(19）ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の145076位（Add9-2）の塩基
(20）ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の145503位（Int9-1）の塩基
(21）ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の148285位（Add9-3）の塩基
【請求項５】
ヒト被験者から得られるゲノムＤＮＡを対象として、Ａ群(3)の塩基（PK015）、Ｂ群(13)の塩基（PK037）及びＣ群(20)の塩基（Int9-1）から選択される少なくとも２つの塩基を検出し同定する工程、及び
上記で検出し同定した少なくとも２つの塩基が、下記の条件：
Ａ群(3)の塩基（PK015）：アデニン
Ｂ群(13)の塩基（PK037）：グアニン
Ｃ群(20)の塩基（Int9-1）：シトシンまたはチミン
を満たしている場合に当該被験者が関節リウマチ易罹患性であると判定する工程を有する、請求項４に記載する関節リウマチの罹患リスクを検出する方法。
【請求項６】
ヒト被験者から得られるゲノムＤＮＡを対象として、少なくともＣ群(17)の塩基（Ex9）を検出し同定する工程を有し、検出し同定した当該塩基（Ex9）がアデニン（Ａ）である場合に当該被験者が関節リウマチ易罹患性であると判定する工程を有する、請求項４に記載する関節リウマチの罹患リスクを検出する方法。
【請求項７】
ヒト被験者の生体試料を対象として、ヒトプロテインキナーゼＣエタの３７４番目のアミノ酸変異（Ｖ→Ｉ）の有無を検出するか、または当該アミノ酸変異をもたらす遺伝子多型を検出する工程を有する、当該被験者について関節リウマチの罹患リスクを検出する方法。
【請求項８】
下記の(1)〜(21)からなる群から選択される少なくとも一つのオリゴまたはポリヌクレオチド（但し、当該オリゴ若しくはポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１５〜３０塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物からなる、関節リウマチ発症リスクを検出するために用いられるプライマー：
(1) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、77624位（PK011）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(2) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、77995位（SNP316）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(3) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、79479位（PK015）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(4) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、80267位（PK018）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(5) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、81682位（PK022）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(6) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85179位（PK028）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(7) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85309位（PK030）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(8) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85639位（PK031）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(9) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85859位（PK032）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(10) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85933位（SNP317）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(11) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、86306位（PK033）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(12) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、88042位（PK035）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(13) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、88549位（PK037）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(14) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、90690位（PK039）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(15) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、90983位（PK040）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(16) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、128663位（Int5）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(17) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、135724位（Ex9）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(18) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、144962位（Add9-1）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(19) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、145076位（Add9-2）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(20) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、145503位（Int9-1）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(21) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、148285位（Add9-3）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド。
【請求項９】
下記の(1)〜(21)からなる群から選択される少なくとも一つのオリゴまたはポリヌクレオチド（但し、当該オリゴ若しくはポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１６〜５００塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物からなる、関節リウマチ発症リスクを検出するために用いられるプローブ：
(1) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、77624位（PK011）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(2) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、77995位（SNP316）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(3) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、79479位（PK015）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(4) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、80267位（PK018）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(5) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、81682位（PK022）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(6) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85179位（PK028）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(7) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85309位（PK030）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(8) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85639位（PK031）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(9) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85859位（PK032）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(10) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85933位（SNP317）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(11) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、86306位（PK033）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(12) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、88042位（PK035）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(13) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、88549位（PK037）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(14) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、90690位（PK039）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(15) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、90983位（PK040）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(16) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、128663位（Int5）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(17) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、135724位（Ex9）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(18) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、144962位（Add9-1）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(19) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、145076位（Add9-2）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(20) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、145503位（Int9-1）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(21) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、148285位（Add9-3）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド。
【請求項１０】
任意の固相に固定してなる固相化プローブである請求項９に記載するプローブ。
【請求項１１】
請求項８に記載するプライマー、または／及び請求項９若しくは１０に記載するプローブを含む、関節リウマチ罹患リスク検出用試薬、または当該試薬を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節リウマチ感受性遺伝子に関する。また本発明は、関節リウマチ罹患の危険度を測定し判定する方法に関する。当該方法は、より詳細にはヒトゲノムＤＮＡを含む試料から、関節リウマチ罹患に関連したＳＮＰｓ（単一塩基多型）、好ましくはハプロタイプを検出することにより、該試料提供者（被験者）が関節リウマチに罹患する潜在的な危険度を有するか否かを検出し、判定する方法である。さらに本発明は、かかる検出方法の実施にあたり有効に使用することができる関節リウマチ罹患診断マーカー、プローブ、プライマー並びに試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（Rheumatoid Arthritis ：（RA [ MIM 180300 ]）（以下、「RA」ともいう）は、自己免疫性の全身炎症性疾患であり、罹患者は全世界の人口の約１％である。ＲＡは、滑膜の炎症とそれに伴う軟骨・骨破壊による関節破壊を特徴とする。遺伝的要因と環境要因が発症に関与するとされているが、その詳細な病因はいまだ明らかにされていない。一卵性および二卵性双生児研究で、遺伝的背景が疾患感受性の約60％を占めることが明らかにされている（非特許文献１）。
【０００３】
従来より多くの関節リウマチ感受性座位が報告されているが、複数の人種間で再現性をもってＲＡと連鎖を示したのはHLA-DRB1座位のみである (非特許文献２〜４)。しかしながら、HLAですら、ＲＡの遺伝的背景の３分の１に寄与するのみであると考えられている(非特許文献５)。
【０００４】
最近、ゲノムワイドアプローチもしくは候補遺伝子領域アプローチに基づいて、ＲＡの感受性遺伝子として、SLC22A4(非特許文献６), PADI4 (非特許文献７), PTPN22 (非特許文献８) 、及びFCRL3 (非特許文献９）が報告されている。また、全ゲノムにたいする罹患同胞対解析により、1q13、3q13、6q21-23、14q21-23、16pと18q21-23などがＲＡの疾患感受性領域として報告されている(非特許文献１０〜１３)。これらのＲＡ感受性領域のなかで、14q21-23（D14S285）はヨーロッパの白人において、Ｐ＝0.049でＲＡと関連を示し（非特許文献１０）、また14q21-23（D14S276）は日本人と英国の白人の両方においてＲＡと連鎖を示している。
【０００５】
しかしながら、前述するように、ＲＡは遺伝的要因と環境的要因とが共に関与して発症にいたる多因子疾患であるため、一遺伝子の変異や異常だけからその罹患リスクを判断することは困難であり、さらなる検討が求められている。
【非特許文献１】MacGregor AJ, Snieder H, Rigby AS, Koskenvuo M, Kaprio J, Aho K, Silman AJ (2000) Characterizing the quantitative genetic contribution to rheumatoid arthritis using data from twins. Arthritis Rheum 43:30-37
【非特許文献２】Wordsworth BP, Lanchbury JS, Sakkas LI, Welsh KI, Panayi GS, Bell JI (1989) HLA-DR4 subtype frequencies in rheumatoid arthritis indicate that DRB1 is the major susceptibility locus within the HLA class II region. Proc Natl Acad Sci U S A 86:10049-10053
【非特許文献３】Del Rincon I, Battafarano DF, Arroyo RA, Murphy FT, Fischbach M, Escalante A (2003) Ethnic variation in the clinical manifestations of rheumatoid arthritis: role of HLA-DRB1 alleles. Arthritis Rheum 15:200-208
【非特許文献４】Wakitani S, Murata N, Toda Y, Ogawa R, Kaneshige T, Nishimura Y, Ochi T (1997) The relationship between HLA-DRB1 alleles and disease subsets of rheumatoid arthritis in Japanese. Br J Rheumatol 36:630-63
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【非特許文献６】Tokuhiro S, Yamada R, Chang X, Suzuki A, Kochi Y, Sawada T, Suzuki M, Nagasaki M, Ohtsuki M, Ono M, Furukawa H, Nagashima M, Yoshino S, Mabuchi A, Sekine A, Saito S, Takahashi A, Tsunoda T, Nakamura Y, Yamamoto K (2003) An intronic SNP in a RUNX1 binding site of SLC22A4, encoding an organic cation transporter, is associated with rheumatoid arthritis. Nat Genet 35:341-348
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、日本人における関節リウマチの発症に有意に関連する遺伝子多型並びに関節リウマチ感受性遺伝子を提供し、さらにこれらの情報をもとにして個々の被験者について関節リウマチの罹患リスクを判定するための方法を提供することである。さらに本発明の目的は、当該方法を簡便に実施するために有用な試薬および試薬キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、日本人集団を対象として、関節リウマチ（ＲＡ）の発症に関与するＲＡ疾患感受性遺伝子および遺伝子多型を見いだすことを目的として、かねてより複数の人種間で繰り返して連鎖が報告されてきた領域（第１４染色体長腕21-23：14q21-23）を候補領域として選択し、関節リウマチ患者と対照者との間（ケースコントロール間）での感受性領域に存在するマーカーＳＮＰのアレル頻度の差を比較調査した結果、当該ヒト第１４染色体（14q21-23）に存在するＰＲＫＣＨ遺伝子のイントロン２およびエクソン９の中にケースコントロール間でアレル頻度に有意差を認める特定の遺伝子多型を有する領域が３箇所存在することを見いだした。そして、個々の被験者について当該領域の遺伝子多型、好ましくはこれら領域の少なくとも２領域の遺伝子多型の組み合せを検出することにより、当該被験者について関節リウマチを発症する潜在的な危険度が、高い確率で検出できることを見いだし、本発明を完成するにいたった。
【０００８】
すなわち、本発明は下記の発明を提供するものである：
項１．配列番号１に示すアミノ酸配列を有する変異ヒトプロテインキナーゼＣエタ。
項２．項１に記載する変異ヒトプロテインキナーゼＣエタをコードするヒトＰＲＫＣＨ遺伝子またはその遺伝子産物。
【０００９】
項３．下記の２１からなる群から選択される少なくとも一つのオリゴまたはポリヌクレオチドからなる、関節リウマチの罹患診断マーカー：
(1) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、77624位（PK011）に位置するＣまたはＴを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(2) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、77995位（SNP316）に位置するＣまたはＴを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(3) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、79479位（PK015）に位置するＧまたはＡを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(4) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、80267位（PK018）に位置するＣまたはＴを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(5) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、81682位（PK022）に位置するＡまたはＧを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(6) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85179位（PK028）に位置するＴまたはＣを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(7) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85309位（PK030）に位置するＡまたはＴを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(8) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85639位（PK031）に位置するＴまたはＣを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(9) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85859位（PK032）に位置するＧまたはＴを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(10) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85933位（SNP317）に位置するＡまたはＧを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(11) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、86306位（PK033）に位置するＡまたはＧを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(12) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、88042位（PK035）に位置するＡまたはＧを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(13) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、88549位（PK037）に位置するＴまたはＧを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(14) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、90690位（PK039）に位置するＴまたはＣを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(15) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、90983位（PK040）に位置するＡまたはＧを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(16) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、128663位（Int5）に位置するＡまたはＧを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(17) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、135724位（Ex9）に位置するＧまたはＡを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(18) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、144962位（Add9-1）に位置するＴまたはＣを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(19）ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、145076位（Add9-2）に位置するＡまたはＧを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(20) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、145503位（Int9-1）に位置するＣまたはＴを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド、
(21) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、148285位（Add9-3）に位置するＧまたはＡを挟んで5’側および3’側に各々最長300塩基長の塩基配列を有するオリゴまたはポリヌクレオチド。
【００１０】
項４． ヒト被験者から得られるゲノムＤＮＡを対象として、下記Ａ群〜Ｃ群から選択される少なくとも２群に記載する塩基の中から各々少なくとも１つの塩基を検出し同定する工程を含む、当該被験者について関節リウマチの罹患リスクを検出する方法：
Ａ群 
(1) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の77624位（PK011）の塩基
(2) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の77995位（SNP316）の塩基
(3) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の79479位（PK015）の塩基
(4) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の80267位（PK018）の塩基
(5) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の81682位（PK022）の塩基
(6) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の85179位（PK028）の塩基
(7) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の85309位（PK030）の塩基
(8) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の85639位（PK031）の塩基
(9) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の85859位（PK032）の塩基
(10) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の85933位（SNP317）の塩基
(11) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の86306位（PK033）の塩基
Ｂ群
(12) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の88042位（PK035）の塩基
(13) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の88549位（PK037）の塩基
(14) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の90690位（PK039）の塩基
(15) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の90983位（PK040）の塩基
Ｃ群
(16) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の128663位（Int5）の塩基
(17) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の135724位（Ex9）の塩基
(18) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の144962位（Add9-1）の塩基
(19）ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の145076位（Add9-2）の塩基
(20）ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の145503位（Int9-1）の塩基
(21）ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の148285位（Add9-3）の塩基
項５．ヒト被験者から得られるゲノムＤＮＡを対象として、Ａ群(3)の塩基（PK015）、Ｂ群(13)の塩基（PK037）及びＣ群(20)の塩基（Int9-1）から選択される少なくとも２つの塩基を検出し同定する工程、及び
上記で検出し同定した少なくとも２つの塩基が、下記の条件：
Ａ群(3)の塩基（PK015）：アデニン
Ｂ群(13)の塩基（PK037）：グアニン
Ｃ群(20)の塩基（Int9-1）：シトシンまたはチミン
を満たしている場合に当該被験者が関節リウマチ易罹患性であると判定する工程を有する、項４に記載する関節リウマチの罹患リスクを検出する方法。
【００１１】
項６． ヒト被験者から得られるゲノムＤＮＡを対象として、少なくともＣ群(17)の塩基（Ex9）を検出し同定する工程を有し、検出し同定した当該塩基（Ex9）がアデニン（Ａ）である場合に当該被験者が関節リウマチ易罹患性であると判定する工程を有する、項４に記載する関節リウマチの罹患リスクを検出する方法。
項７．ヒト被験者の生体試料を対象として、ヒトプロテインキナーゼＣエタの３７４番目のアミノ酸変異（Ｖ→Ｉ）の有無を検出するか、または当該アミノ酸変異をもたらす遺伝子多型を検出する工程を有する、当該被験者について関節リウマチの罹患リスクを検出する方法。
項８．下記の(1)〜(21)からなる群から選択される少なくとも一つのオリゴまたはポリヌクレオチド（但し、当該オリゴ若しくはポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１５〜３０塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物からなる、関節リウマチ発症リスクを検出するために用いられるプライマー：
(1) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、77624位（PK011）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(2) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、77995位（SNP316）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(3) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、79479位（PK015）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(4) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、80267位（PK018）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(5) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、81682位（PK022）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(6) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85179位（PK028）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(7) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85309位（PK030）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(8) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85639位（PK031）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(9) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85859位（PK032）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(10) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85933位（SNP317）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(11) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、86306位（PK033）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(12) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、88042位（PK035）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(13) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、88549位（PK037）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(14) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、90690位（PK039）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(15) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、90983位（PK040）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(16) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、128663位（Int5）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(17) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、135724位（Ex9）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(18) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、144962位（Add9-1）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(19) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、145076位（Add9-2）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(20) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、145503位（Int9-1）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(21) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、148285位（Add9-3）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド。
【００１２】
項９．下記の(1)〜(21)からなる群から選択される少なくとも一つのオリゴまたはポリヌクレオチド（但し、当該オリゴ若しくはポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１６〜５００塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物からなる、関節リウマチ発症リスクを検出するために用いられるプローブ：
(1) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、77624位（PK011）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(2) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、77995位（SNP316）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(3) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、79479位（PK015）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(4) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、80267位（PK018）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(5) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、81682位（PK022）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(6) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85179位（PK028）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(7) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85309位（PK030）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(8) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85639位（PK031）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(9) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85859位（PK032）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(10) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85933位（SNP317）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(11) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、86306位（PK033）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(12) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、88042位（PK035）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(13) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、88549位（PK037）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(14) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、90690位（PK039）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(15) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、90983位（PK040）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(16) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、128663位（Int5）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(17) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、135724位（Ex9）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(18) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、144962位（Add9-1）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(19) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、145076位（Add9-2）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(20) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、145503位（Int9-1）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(21) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、148285位（Add9-3）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド。
項１０．任意の固相に固定してなる固相化プローブである項９に記載するプローブ。
項１１．項８に記載するプライマー、または／及び項９若しくは１０に記載するプローブを含む、関節リウマチ罹患リスク検出用試薬、または当該試薬を含むキット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、関節リウマチ（ＲＡ）を発症する相対的な危険度を簡便に検出することができる。本発明の検出方法は、in vitroでしかも医師等の専門的な知識を要することなく簡単に実施することができる方法である。本発明の検出方法によってＲＡを発症する潜在的な危険度が相対的に高いことが判明した被験者に対しては、その旨を告知し、予めＲＡの発症を防ぐか、または少しでも遅延させるための的確な対策を講じることができる。従って、本発明は、ＲＡの発症を予防するための、またはＲＡ発症を遅延させるための検査方法として極めて有用である。さらに本発明は上記検出法において使用される試薬を提供するものであり、これにより上記方法を簡便に実施することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
１．本発明で使用する用語の定義
本明細書における塩基配列（ヌクレオチド配列）、核酸などの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAc-IUB communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138; 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作製のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００１５】
本明細書中において「遺伝子」は、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、及び１本鎖ＤＮＡ（センス鎖）、並びに当該センス鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）、及びそれらの断片のいずれもが含まれる、また、本明細書で「遺伝子」とは、特に言及しない限り、調節領域、コード領域、エクソン、及びイントロンを区別することなく示すものとする。
【００１６】
また、本明細書中において、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、核酸と同義であって、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むものとする。また、これらは２本鎖であっても１本鎖であってもよく、ある配列を有する「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」）といった場合、特に言及しない限り、これに相補的な配列を有する「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」）も包括的に意味するものとする。さらに、「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」）がＲＮＡである場合、配列表に示される塩基記号「Ｔ」は「Ｕ」と読み替えられるものとする。
【００１７】
本明細書において「遺伝子多型」とは、２つ以上の遺伝的に決定された対立遺伝子がある場合にそれらの対立遺伝子を指す。具体的には、ヒトの集団において、ある一個体のゲノム配列を基準として、他の１または複数の個体ゲノム中の特定部位に、１又は複数のヌクレオチドの置換、欠失、挿入、転移、逆位などの変異が存在するとき、その変異が当該１または複数の個体に生じた突然変異でないことが統計学的に確実か、または当該個体内特異変異でなく、１％以上の頻度で集団内に存在することが家系的に証明される場合、その変異を「遺伝子多型」とする。本明細書で用いる「遺伝子多型」の意味には、単一のヌクレオチドの変化によって引き起こされる多型であるいわゆる１塩基多型〔Single Nucleotide Polymorphism：ＳＮＰ（又はＳＮＰｓ）〕と連続した複数ヌクレオチドにわたる多型の両方が含まれる。「一塩基多型」とは、単一の核酸の変化によって引き起こされる多型である。多型は選択された集団の１％より大きな頻度、好ましくは１０％以上の頻度で存在する。また「ハプロタイプ」とは、一つのアレル（ハプロイド）に存在する遺伝子変異の組み合わせをいう。
【００１８】
本明細書において「関節リウマチ疾患感受性遺伝子」（ＲＡ疾患感受性遺伝子）とは、多遺伝子性疾患である関節リウマチ（ＲＡ）を発症しやすい体質を決める遺伝子のことをいう。
【００１９】
また、本明細書において「アレル頻度」とは、一つの遺伝子の座位について、集団中に存在する全遺伝子数のうち、その対立遺伝子が占める割合をいう。
【００２０】
本明細書において「連鎖不平衡」とは、集団における任意の対立遺伝子の組み合わせの頻度について、偶然によって期待されるよりも、より頻繁に近傍の特定対立と出現する関係のことをいう。例えば、遺伝子座Ｘが対立遺伝子ａ及びｂ（これらの等しい頻度で存在する）を有し、近傍の遺伝子座Ｙが対立遺伝子ｃ及びｄ（これらは等しい頻度で存在する）を有する場合、別の遺伝子多型の組み合わせであるハプロタイプａｃは、集団において０.２５の頻度で存在することが期待される。ハプロタイプａｃがこうした期待値よりも大きい場合、つまりａｃという特定の遺伝子型が頻繁に出現する場合、対立遺伝子ａｃは連鎖不平衡にあるという。連鎖不平衡は、対立遺伝子の特定の組み合わせの自然選択または集団に導入された時期が進化的にみて最近であることによって生じたもので、連鎖する対立遺伝子同士が平衡に達していないことから生じ得る。従って、民族や人種などのように、別の集団においては連鎖不平衡の様式は異なり、ある集団においてａｃが連鎖不平衡である場合でも、別の集団でａｄが連鎖不平衡の関係である場合もある。連鎖不平衡における遺伝子多型の検出は、当該多型そのものが直接疾患を引き起こさないにも拘わらず、疾患に対する感受性を検出するのに有効である。例えば、ある遺伝子座Ｘの対立遺伝子ａについて、それが疾患の原因遺伝子要素ではないが、遺伝子座Ｙの対立遺伝子ｃとの連鎖不平衡により、疾患感受性を示し得ることがある。
【００２１】
本明細書において「連鎖不平衡解析」とは、ゲノム領域における連鎖不平衡の強さの度合いを解析することをいう。例えば、連鎖不平衡解析は２つのマーカー間での連鎖不平衡の強さを示す連鎖不平衡係数｜Ｄ’｜を健常者（対照者）のタイピングデータから算出することで行うことができる。
【００２２】
本明細書において「マイナーアレル」とは、一つの遺伝子の座位について２つの対立遺伝子が存在する場合において、遺伝子頻度の低い対立遺伝子（アレル）をいう。
【００２３】
なお、本明細書に記載する各塩基番号は、The National Center for Biotechnology Information data baseの位置情報に基づくものである。また、本明細書において「ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列」という場合の位置情報「xxxx位」というのは、ＰＲＫＣＨ遺伝子のエクソン１の１番目の塩基を１としたときの位置情報を意味する。
【００２４】
２．関節リウマチ疾患感受性遺伝子
多因子疾患である関節リウマチ（ＲＡ）の遺伝的要因や環境因子を同定することは、個々の因子が病因や病態に関与する度合いが少ないがゆえに困難である。均一に配置された頻度の高いＳＮＰを使用して、広範囲領域にわたってケースコントロール関連解析を行うアプローチ（領域ワイドのケースコントロール関連解析）は、多因子疾患であるＲＡの疾患感受性遺伝子を同定するための効果的かつ強力なアプローチである。
【００２５】
そこで本発明者らは、日本人におけるＲＡ疾患感受性遺伝子を探索するために、第１４番染色体のq21-23（14q21-23）の領域をＲＡの感受性候補領域として選び、gene-centric evenly-spaced common SNP「遺伝子領域に均一に配置された頻度の高い一塩基多型（SNP）」を用いて、領域ワイドのケースコントロール関連解析ならびに連鎖不平衡（LD）マッピングを行うことにより、14q22に位置するプロテインキナーゼＣエタをコードするヒトＰＲＫＣＨ遺伝子がＲＡの感受性を規定する遺伝子であることを見出した。当該ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子は、ヒト第１４染色体のゲノム配列（Genbank Sequence Accession IDs: NC 000014）中、塩基番号60,858,268番〜61,087,451番に位置する229,184bpの遺伝子である（Gene Name: Homo sapiens gene PRKCH, encoding protein kinase C, eta）。
【００２６】
なお本発明のＲＡ疾患感受性遺伝子の同定は、実施例に記載するように、具体的には下記に説明する方法によって行われた。  
【００２７】
前述するようにＲＡの感受性候補領域として第１４番染色体のq21-23（14q21-23）を選択し、その領域内に等間隔に配置された４２２のＳＮＰを用いて、２段階のケースコントロール関連解析を行った。４２２のＳＮＰのうち２つのＳＮＰ（SNP316とSNP317）がＲＡと有意な関連を示し、続いて行った追加タイピングと連鎖不平衡解析により、ＲＡ疾患感受性座位はＰＲＫＣＨ遺伝子のイントロン２にある異なる２つの連鎖不平衡ブロック（連鎖不平衡ブロックＡ、連鎖不平衡ブロックＢ）に存在することが明らかになった。なお、ここで連鎖不平衡ブロックＡ（ＬＤブロックＡ）はヒト第１４染色体のゲノム配列中、塩基番号60,935,892番〜60,945,653番（ＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列中、77624 〜87385位に相当する）に位置する領域であり、連鎖不平衡ブロックＢ（ＬＤブロックＢ）はヒト第１４染色体のゲノム配列中、塩基番号60,946,310番〜60,949,251番（ＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列中、88042〜90983位に相当する）に位置する領域である。ＬＤブロックＡおよびＢには、図５に示すように各々１４つおよび４つのＳＮＰが存在している。
【００２８】
次いでブロックＡを構成する１４つのＳＮＰに対して、進化論に基づくハプロタイプ解析を行い、３つの疾患感受性候補ＳＮＰ（PK015、PK032、PK033）を同定した。ブロックＢに存在する有意ＳＮＰ（PK035、PK037、PK039、PK040）はブロックＡの上記ＳＮＰと中程度の連鎖不平衡の状態にあった。しかし、その他のパラメータ（ＬＤＵや組み替え率）から、ブロックＡとブロックＢは一連のＬＤブロックではなく別個のＬＤブロックであると考えられた。
【００２９】
さらにＰＲＫＣＨ遺伝子の全コード領域をシークエンスした。これから、プロテインキナーゼＣエタのＡＴＰ結合サイトをコードするエクソン９に、アミノ酸置換（V374I）を伴う非同義置換ＳＮＰ（Ex9）を同定した。この非同義置換ＳＮＰはアレル頻度が高く（>0.2）、ＲＡと有意な関連を示した（p=0.0016）。さらに、このＳＮＰはイントロン２の有意ＳＮＰと低い連鎖不平衡の関係にあった。このＳＮＰ（Ex9）のほか、ＲＡと有意な関連を示すＳＮＰを含む領域を連鎖不平衡ブロックＣとした（図５参照）。当該連鎖不平衡ブロックＣ（ＬＤブロックＣ）はヒト第１４染色体のゲノム配列中、塩基番号60,986,931番〜61,006,553番（ＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列中、128663〜148285位に相当する）に位置する領域である。
【００３０】
次いで、これら別々の３つの連鎖不平衡ブロック（ＬＤブロックＡ〜Ｃ）に存在するＳＮＰの相互関係を明らかにするために、それぞれのブロックから最も強い有意差を示したＳＮＰ (PK015, PK037, Int9-1)を選択し、それぞれのＳＮＰ同士の遺伝子型の組み合わせの分布をケースコントロール間で比較した。その結果、それぞれのＳＮＰの遺伝子型の２もしくは３つの組み合わせは、ＳＮＰ単独でのオッズ比よりもすべて高いオッズ比を示した。このことから、上記ヒト第１４染色体（14q22）に位置するヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列上の３つの連鎖不平衡ブロックに存在するそれぞれのＳＮＰが相互的にＲＡ疾患感受性に寄与していると考えられた。
【００３１】
なお、本発明においてＲＡ疾患感受性遺伝子として同定されたヒトＰＲＫＣＨ遺伝子は、これまでに行われた罹患同胞対解析で連鎖を示したマイクロサテライトマーカー（D14S285とD14S276）から、約６Ｍｂ離れた位置に存在する遺伝子である。また最近、日本人のゲノムワイドのケースコントロール関連解析が報告されているが(Tamiya G, Shinya M, Imanishi T, Ikuta T, Makino S, Okamoto K, Furugaki K et al. (2005) Whole genome association study of rheumatoid arthritis using 27,039 microsatellites. Hum Mol Genet 14:2305-2321)、その中で、ＲＡ疾患感受性遺伝子とされたＲＴＮ１遺伝子（14q32.1）は、本発明で同定したＰＲＫＣＨ遺伝子の約１.８Ｍｂ上流に存在する遺伝子である。
【００３２】
ＰＲＫＣＨ遺伝子がコードするプロテインキナーゼＣ-エタ（PKCエタ）が属するプロテインキナーゼＣ（PKC）は、リン脂質依存性のセリン/スレオニン・キナーゼであり、少なくとも１１のアイソフォームからなり、さまざまな細胞内シグナル伝達に関与することが報告されている。一般に、ＰＫＣアイソフォームは共同分子の依存性に応じて下記の３種類に分類される：
(1)ジアシルグリセロールや酸性フォスファターゼやCa2+依存性のconventional PKC（アルファ、ベータ、ガンマ）
(2) Ca2+非依存性のNovel PKC（デルタ、エプシロン、エタ、シータとミュー）
(3) ジアシルグリセロールとCa2+のどちらによっても活性化されないAtypical PKC（ゼータとラムダ）。
【００３３】
それぞれのＰＫＣアイソフォームは異なった組織分布を示すことが報告されており、それぞれの組織や細胞はしばしば複数のアイソフォームを発現する。ＰＫＣエタは、novel PKCサブグループのメンバーであって、当初、人間の皮膚と肺のcDNAライブラリーから分離されたものである(Osada et al. (1990) A phorbol ester receptor/protein kinase, nPKC eta, a new member of the protein kinase C family predominantly expressed in lung and skin. J Biol Chem 265:22434-22440）。
【００３４】
いくつかのＰＫＣに関してノックアウトマウスが作成されており、様々な細胞機能、特に中枢神経系と免疫系に関わることが報告されている(Abeliovich A, et al., (1993) PKC gamma mutant mice exhibit mild deficits in spatial and contextual learning. Cell 31: 1263-1271; Leitges M, et al., (1996) Immunodeficiency in protein kinase cbeta-deficient mice. Science 273:788-791; Leitges M, et al., (2001) Targeted disruption of the zetaPKC gene results in the impairment of the NF-kappaB pathway. Mol Cell 8:771-780; Hodge CW, et al., (1999) Supersensitivity to allosteric GABA(A) receptor modulators and alcohol in mice lacking PKCepsilon. Nat Neurosci 2:997-1002; Sun Z, et al., (2000) PKC-theta is required for TCR-induced NF-kappaB activation in mature but not immature T lymphocytes. Nature 23:402-407; Mecklenbrauker I, et al., (2002) Protein kinase Cdelta controls self-antigen-induced B-cell tolerance. Nature 25:860-865; Miyamoto A, et al., (2002) Increased proliferation of B cells and auto-immunity in mice lacking protein kinase Cdelta. Nature 25:865-869)。
【００３５】
ＰＫＣエタのノックアウトマウスは、野生型マウスと比較して明らかな外見上の相違は認められなかったが、ＰＫＣエタが上皮細胞の再生やリモデリングを通して腫瘍発生に関与することがin vivo で示されている(Chida K, et al., (2003) Disruption of protein kinase Ceta results in impairment of wound healing and enhancement of tumor formation in mouse skin carcinogenesis. Cancer Res 15:2404-2408)。また、ＰＫＣエタは様々な免疫系の機能、例えば、サイトカイン生産(Fima E, et al., (1999) Expression of PKCeta in NIH-3T3 cells promotes production of the pro-inflammatory cytokine interleukin-6. Eur Cytokine Netw 10:491-500) またはＢ細胞分化(Morrow TA, et al., (1999) Pro-B-cell-specific transcription and proapoptotic function of protein kinase Ceta. Mol Cell Biol 19:5608-5618)に関係していることが報告されている。さらに、炎症性関節炎患者から得られた単球由来のマクロファージ（PB-MDM）において、ＰＫＣエタは誘導性ＮＯ合成酵素（iNOS）の発現に相関していることが報告されている。また、MCF-7細胞において、ＰＲＫＣＨを過剰発現することにより、カスパーゼの活性化を阻害し、ＴＮＦ誘導性のアポトーシスを抑制することが報告されている(Akkaraju GR, et al., (2000) Overexpression of protein kinase C-eta attenuates caspase activation and tumor necrosis factor-alpha-induced cell death. Biochem Biophys Res Commun 279:103-107)。
【００３６】
実施例に示すように、ＰＲＫＣＨ遺伝子は脾臓を含むヒト組織でユビキタスに発現していた。またＴ細胞のセルラインでＰＲＫＣＨが強く発現していることが報告されていることから、ＰＲＫＣＨは自己免疫に関与している可能性が考えられる。
【００３７】
以上のことは、ＰＲＫＣＨ遺伝子が、有力な関節リウマチ（ＲＡ）の疾患感受性遺伝子であるという本発明の知見を裏付けるものである。
【００３８】
前述するように、ＰＲＫＣＨ遺伝子の全コード領域をシークエンスすることによって見出されたエクソン９上の非同義置換ＳＮＰ（Ex9）（ＰＲＫＣＨ遺伝子の135724位、G/A）は、ＰＲＫＣＨ遺伝子の発現産物であるプロテインキナーゼＣエタ（ＰＫＣエタ）の３７４番目のアミノ酸置換（Ｖ→Ｉ）を伴う。このことから、ＰＫＣエタの３７４番目のアミノ酸置換（Ｖ→Ｉ）（「アミノ酸置換（V374I）」ともいう）は、ヒト被験者について関節リウマチの易罹患性を判断する指標となる。すなわち、当該アミノ酸置換（V374I）を有するＰＫＣエタ（変異ＰＫＣエタ（V374I））またはこの遺伝子〔ＰＲＫＣＨ遺伝子（G135724A）（ＰＲＫＣＨ遺伝子（DNA）の135724位のグアニンがアデニンに置換されている）〕を保有するヒトは、ＲＡ易罹患性と判断することができる。
【００３９】
従って、本発明は、かかる変異プロテインキナーゼＣエタ（V374I）ならびにこの遺伝子（ＰＲＫＣＨ遺伝子（DNA））およびその遺伝子産物（ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ）を、ヒト、特に日本人の関節リウマチの易罹患性を規定する蛋白質ならびに遺伝子および遺伝子産物の一つとして提供する。なお、変異ＰＫＣエタのアミノ酸配列を後述する配列表の配列番号１に、これをコードするＰＲＫＣＨ遺伝子の遺伝子産物（ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ）の塩基配列（ＰＲＫＣＨ遺伝子のコード領域の塩基配列）を配列番号２に示す。
【００４０】
ところで、この変異ＰＫＣエタをもたらすＰＲＫＣＨ遺伝子のエクソン９の非同義置換ＳＮＰ（V374I：rs22030500）は、ＡＴＰ結合配列（GxGx2Gx16K）の１３番目のバリンをイソロイシンに置換するＳＮＰである。ＡＴＰ結合部位はほとんどのＰＫＣ分子間で共通して保存され、酵素活性に不可欠であり、他のプロテインキナーゼＣアイソフォームのＡＴＰ結合部位の点突発変異がキナーゼ活性を失活させることが報告されている(Ohno S, et al., (1990) A point mutation at the putative ATP-binding site of protein kinase C alpha abolishes the kinase activity and renders it down-regulation-insensitive. A molecular link between autophosphorylation and down-regulation. J Biol Chem 15:6296-6300; Ohno S, et al., (1990) A point mutation at the putative ATP-binding site of protein kinase C alpha abolishes the kinase activity and renders it down-regulation-insensitive. A molecular link between autophosphorylation and down-regulation. J Biol Chem 15:6296-6300; Li W, et al., (1995) Characterization of a protein kinase C-delta (PKC-delta) ATP binding mutant. An inactive enzyme that competitively inhibits wild type PKC-delta enzymatic activity. J Biol Chem 27:8311-8318）。
【００４１】
このことから、遺伝子の候補座位の一つであるＬＤブロックＣが、ＲＡの感受性に関わるメカニズムとして、拘束はされないが、この非同義置換ＳＮＰ（V374I：rs22030500）が、ＰＫＣエタの触媒領域のＡＴＰ結合サイトに構造的変化を起こすことによって、ＰＲＫＣＨの酵素活性を変化させることが考えられる。
【００４２】
３．関節リウマチ罹患診断マーカー
本発明は、上記ＲＡ疾患感受性遺伝子であるヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の上記３つの連鎖不平衡ブロック（ＬＤブロックＡ〜Ｃ）内に存在する関節リウマチ疾患感受性ＳＮＰ（ＲＡ疾患感受性ＳＮＰ）を含むオリゴまたはポリヌクレオチドであって、ヒトゲノム上で特異的に認識されるオリゴまたはポリヌクレオチドを、関節リウマチ罹患診断マーカー（ＲＡ罹患診断マーカー）として提供する。
【００４３】
ここでＲＡ疾患感受性ＳＮＰとしては、下記の２１つのＳＮＰを挙げることができる。
（ｉ）ＬＤブロックＡ（ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列中、77624〜87385位）内に存在するＳＮＰである下記(1)〜(11)：
(1) PK011；ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列中、77624位に位置するＳＮＰ
(2) SNP316；ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列中、77995位に位置するＳＮＰ
(3) PK015；ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列中、79479位に位置するＳＮＰ
(4) PK018；ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列中、80267位に位置するＳＮＰ
(5) PK022；ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列中、81682位に位置するＳＮＰ
(6) PK028；ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列中、85179位に位置するＳＮＰ
(7) PK030；ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列中、85309位に位置するＳＮＰ
(8) PK031；ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列中、85639位に位置するＳＮＰ
(9) PK032；ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列中、85859位に位置するＳＮＰ
(10) SNP317；ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列中、85933位に位置するＳＮＰ
(11) PK033；ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列中、86306位に位置するＳＮＰ
（ii）ＬＤブロックＢ（ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列中、88042〜90983位）内に存在するＳＮＰである下記(12)〜(15)：
(12) PK035；ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列中、88042位に位置するＳＮＰ
(13) PK037；ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列中、88549位に位置するＳＮＰ
(14) PK039；ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列中、90690位に位置するＳＮＰ
(15) PK040；ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列中、90983位に位置するＳＮＰ
および
（iii）ＬＤブロックＣ（ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列中、128663〜148285位）内に存在するＳＮＰである下記(16)〜(21)：
(16) Int5  ；ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列中、128663位に位置するＳＮＰ
(17) Ex9   ；ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列中、135724位に位置するＳＮＰ
(18) Add9-1；ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列中、144962位に位置するＳＮＰ
(19) Add9-2；ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列中、145076位に位置するＳＮＰ
(20) Int9-1；ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列中、145503位に位置するＳＮＰ
(21) Add9-3；ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列中、148285位に位置するＳＮＰ。
【００４４】
これらの各ＳＮＰを含むオリゴまたはポリヌクレオチドの長さ（塩基長）は、ヒトゲノム上で特異的に認識される長さであればよく、その限りにおいて特に制限されない。通常１０塩基長以上、好ましくは２０塩基長以上である。従って、本発明のＲＡ罹患診断マーカーは、ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、上記３つのＬＤブロック内に存在する各ＲＡ疾患感受性ＳＮＰ（(1)〜(21)）を中心として、５１塩基（上記各SNPの5’側及び3’側各25塩基ずつ）、２０１塩基（上記各SNPの5’側及び3’側各100塩基ずつ）、６０１塩基（上記各SNPの5’側及び3’側各300塩基ずつ）などを有するオリゴまたはポリヌクレオチドであることができる。
【００４５】
本発明のＲＡ罹患診断マーカーとして、具体的には下記の塩基配列を含有するオリゴまたはポリヌクレオチドを挙げることができる：
(1) PK011（塩基CまたはT）を挟んで、配列番号３記載の塩基配列と配列番号４記載の塩基配列を含有する、塩基長が５１〜６０１の範囲にあるオリゴまたはポリヌクレオチド、
(2) SNP316（塩基CまたはT）を挟んで、配列番号５記載の塩基配列と配列番号６記載の塩基配列を含有する、塩基長が５１〜６０１の範囲にあるオリゴまたはポリヌクレオチド、
(3) PK015（塩基GまたはA）を挟んで、配列番号７記載の塩基配列と配列番号８記載の塩基配列を含有する、塩基長が５１〜６０１の範囲にあるオリゴまたはポリヌクレオチド、
(4) PK018（塩基CまたはT）を挟んで、配列番号９記載の塩基配列と配列番号１０記載の塩基配列を含有する、塩基長が５１〜６０１の範囲にあるオリゴまたはポリヌクレオチド、
(5) PK022（塩基AまたはG）を挟んで、配列番号１１記載の塩基配列と配列番号１２記載の塩基配列を含有する、塩基長が５１〜６０１の範囲にあるオリゴまたはポリヌクレオチド、
(6) PK028（塩基TまたはC）を挟んで、配列番号１３記載の塩基配列と配列番号１４記載の塩基配列を含有する、塩基長が５１〜６０１の範囲にあるオリゴまたはポリヌクレオチド、
(7) PK030（塩基AまたはT）を挟んで、配列番号１５記載の塩基配列と配列番号１６記載の塩基配列を含有する、塩基長が５１〜６０１の範囲にあるオリゴまたはポリヌクレオチド、
(8) PK031（塩基TまたはC）を挟んで、配列番号１７記載の塩基配列と配列番号１８記載の塩基配列を含有する、塩基長が５１〜６０１の範囲にあるオリゴまたはポリヌクレオチド、
(9) PK032（塩基GまたはT）を挟んで、配列番号１９記載の塩基配列と配列番号２０記載の塩基配列を含有する、塩基長が５１〜６０１の範囲にあるオリゴまたはポリヌクレオチド、
(10) SNP317（塩基AまたはG）を挟んで、配列番号２１記載の塩基配列と配列番号２２記載の塩基配列を含有する、塩基長が５１〜６０１の範囲にあるオリゴまたはポリヌクレオチド、
(11) PK033（塩基AまたはG）を挟んで、配列番号２３記載の塩基配列と配列番号２４記載の塩基配列を含有する、塩基長が５１〜６０１の範囲にあるオリゴまたはポリヌクレオチド、
(12) PK035（塩基AまたはG）を挟んで、配列番号２５記載の塩基配列と配列番号２６記載の塩基配列を含有する、塩基長が５１〜６０１の範囲にあるオリゴまたはポリヌクレオチド、
(13) PK037（塩基TまたはG）を挟んで、配列番号２７記載の塩基配列と配列番号２８記載の塩基配列を含有する、塩基長が５１〜６０１の範囲にあるオリゴまたはポリヌクレオチド、
(14) PK039（塩基TまたはC）を挟んで、配列番号２９記載の塩基配列と配列番号３０記載の塩基配列を含有する、塩基長が５１〜６０１の範囲にあるオリゴまたはポリヌクレオチド、
(15) PK040（塩基AまたはG）を挟んで、配列番号３１記載の塩基配列と配列番号３２記載の塩基配列を含有する、塩基長が５１〜６０１の範囲にあるオリゴまたはポリヌクレオチド、
(16) Int5（塩基AまたはG）を挟んで、配列番号３３記載の塩基配列と配列番号３４記載の塩基配列を含有する、塩基長が５１〜６０１の範囲にあるオリゴまたはポリヌクレオチド、
(17) Ex9（塩基GまたはA）を挟んで、配列番号３５記載の塩基配列と配列番号３６記載の塩基配列を含有する、塩基長が５１〜６０１の範囲にあるオリゴまたはポリヌクレオチド、
(18) Add9-1（塩基TまたはC）を挟んで、配列番号３７記載の塩基配列と配列番号３８記載の塩基配列を含有する、塩基長が５１〜６０１の範囲にあるオリゴまたはポリヌクレオチド、
(19) Add9-2（塩基AまたはG）を挟んで、配列番号３９記載の塩基配列と配列番号４０記載の塩基配列を含有する、塩基長が５１〜６０１の範囲にあるオリゴまたはポリヌクレオチド、
(20) Int9-1（塩基CまたはT）を挟んで、配列番号４１記載の塩基配列と配列番号４２記載の塩基配列を含有する、塩基長が５１〜６０１の範囲にあるオリゴまたはポリヌクレオチド、
(21) Add9-3（塩基GまたはA）を挟んで、配列番号４３記載の塩基配列と配列番号４４記載の塩基配列を含有する、塩基長が５１〜６０１の範囲にあるオリゴまたはポリヌクレオチド。
【００４６】
これらの塩基配列で特定されるオリゴまたはポリヌクレオチド（DNA断片）は、関節リウマチに対する罹患性（易罹患性、抵抗性）を規定する遺伝的素因マーカーである。ゆえに、当該マーカーを含む遺伝子を検出することにより、被験者における関節リウマチ罹患の遺伝的素因を検査・診断することができる。この意味で、上記オリゴまたはポリヌクレオチドは、ＲＡ罹患診断マーカーとして規定することができ、かつ使用することができる。
【００４７】
４．関節リウマチの発症リスクを検出する方法
本発明は、また被験者について関節リウマチ（ＲＡ）の罹患危険度（関節リウマチを発症し易いか、発症し難いかの別）を検出する方法を提供する。本発明のＲＡ罹患リスクの検出方法は、被験者から得られるゲノムＤＮＡを対象として、下記Ａ群〜Ｃ群のうち少なくとも２群の中に記載する塩基の中から各群少なくとも１つの塩基を検出し同定する工程を有するものである。
【００４８】
Ａ群 
(1) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の77624位（PK011）の塩基
(2) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の77995位（SNP316）の塩基
(3) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の79479位（PK015）の塩基
(4) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の80267位（PK018）の塩基
(5) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の81682位（PK022）の塩基
(6) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の85179位（PK028）の塩基
(7) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の85309位（PK030）の塩基
(8) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の85639位（PK031）の塩基
(9) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の85859位（PK032）の塩基
(10) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の85933位（SNP317）の塩基
(11) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の86306位（PK033）の塩基。
【００４９】
Ｂ群
(12) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の88042位（PK035）の塩基
(13) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の88549位（PK037）の塩基
(14) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の90690位（PK039）の塩基
(15) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の90983位（PK040）の塩基。
【００５０】
Ｃ群
(16) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の128663位（Int5）の塩基
(17) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の135724位（Ex9）の塩基
(18) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の144962位（Add9-1）の塩基
(19）ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の145076位（Add9-2）の塩基
(20）ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の145503位（Int9-1）の塩基
(21）ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の148285位（Add9-3）の塩基。
【００５１】
なお、Ａ群はＬＤブロックＡ（ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列中、77624〜87385位）内に存在するＲＡ疾患感受性ＳＮＰの集合、Ｂ群はＬＤブロックＢ（ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列中、88042〜90983位）内に存在するＲＡ疾患感受性ＳＮＰの集合、およびＣ群はＬＤブロックＡ（ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列中、128663〜148285位）内に存在するＲＡ疾患感受性ＳＮＰの集合である。
【００５２】
ここで検出し同定する塩基（SNP）の組合せとしては、Ａ群に属する(1)〜(11)のいずれか１つの塩基（SNP）とＢ群に属する(12)〜(15)のいずれか１つの塩基（SNP）との組合せ；Ａ群に属する(1)〜(11)のいずれか１つの塩基（SNP）とＣ群に属する(16)〜(21)のいずれか１つの塩基（SNP）との組合せ；Ｂ群に属する(12)〜(15)のいずれか１つの塩基（SNP）とＣ群に属する(16)〜(21)のいずれか１つの塩基（SNP）との組合せ；Ａ群に属する(1)〜(11)のいずれか１つの塩基（SNP）とＢ群に属する(12)〜(15)のいずれか１つの塩基（SNP）とＣ群に属する(16)〜(21)のいずれか１つの塩基（SNP）との組合せを挙げることができる。Ａ群に属する塩基（SNP）として、好ましくはPK011, SNP316, PK015, PK022, PK028, PK030, PK031, PK032, SNP317,および PK033であり、より好ましくはPK011およびPK015である。またＢ群に属する塩基（SNP）として、好ましくはPK035, PK037,およびPK039であり、より好ましくはPK037である。さらにＣ群に属する塩基（SNP）として、好ましくはEx9，Add9-1, Add9-2, Int9-1および Add9-3であり、より好ましくはEx9，Int9-1および Add9-3を挙げることができる。
【００５３】
本発明の検出方法として好ましくは、ヒト被験者から得られるゲノムＤＮＡを対象として、Ａ群(1)の塩基（PK015）、Ｂ群(5)の塩基（PK037）及びＣ群(11)の塩基（Int9-1）から選択される少なくとも２つの塩基を検出し同定する工程を有する方法である。当該方法は、さらに、検出し同定した少なくとも２つの塩基が、下記の条件：
Ａ群(3)の塩基（PK015）：アデニン
Ｂ群(13)の塩基（PK037）：グアニン 
Ｃ群(20)の塩基（Int9-1）：チミン
を満たしている場合に当該被験者が関節リウマチに罹りやすい（ＲＡ易罹患性）と判定する工程を有することができる。
【００５４】
当該方法によれば、ＲＡ易罹患性及びＲＡ難罹患性の別、すなわちＲＡ罹患リスクを判定し診断することができる。当該ＲＡ罹患リスクの判定（診断）は、上記塩基の別を判断基準（判断指標）として医師等の専門知識を有する者の判断を要することなく、機械的に行なうことができる。このため、本発明の方法は、関節リウマチの罹患危険度の検出方法と言うことができる。
【００５５】
なお、上記ゲノムＤＮＡの抽出および目的塩基の検出は、公知の方法〔例えば、Bruce, et al., Geneme Analysis/A laboratory Manual (vol.4), Cold Spring Harbor Laboratory, NY., (1999)〕を用いて行うことができる。
【００５６】
ゲノムＤＮＡの抽出を行う検体は、被験者および臨床検体等から単離されたあらゆる細胞（培養細胞を含む。但し生殖細胞は除く）、組織（培養組織を含む）、臓器、または体液（例えば、唾液、リンパ液、気道粘膜、精液、汗、尿等）などを材料とすることができる。該材料としては末梢血から分離した白血球または単核球が好ましく、特に白血球が最も好適である。これらの材料は、臨床検査において通常用いられる方法に従って単離することができる。
【００５７】
例えば白血球を材料とする場合、まず被験者より単離した末梢血から常法に従って白血球を分離する。次いで、得られた白血球にプロティナーゼＫとドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加えてタンパク質を分解、変性させた後、フェノール／クロロホルム抽出を行うことによりゲノムＤＮＡ（ＲＮＡを含む）を得る。ＲＮＡは、必要に応じてＲＮaseにより除去することができる。なお、ゲノムＤＮＡの抽出は、上記の方法に限定されず、当該技術分野で周知の方法（例えば、Sambrook J. et. al., “Molecular Cloning: A Laboratry Manual (2nd Ed.)”Cold Spring Harbor Laboratory, NY）や、市販のＤＮＡ抽出キット等を利用して行なうことができる。さらに必要に応じて、ヒト第１４染色体上のＰＲＫＣＨ遺伝子またはそのイントロン２およびエクソン９を含むＤＮＡを単離してもよい。当該ＤＮＡの単離は、ＰＲＫＣＨ遺伝子またはそのイントロン２またはエクソン９にハイブリダイズするプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によって行うことができる。
【００５８】
目的塩基を検出する工程において、上記のようにして得られたヒトゲノムＤＮＡを含む抽出物から、関節リウマチに極めて関連性の深いＲＡ疾患感受性ＳＮＰを検出する。なお、当該塩基の検出は、ヒトゲノムＤＮＡを含む試料からさらに単離したヒト第１４染色体上のＰＲＫＣＨ遺伝子、好ましくはそのイントロン２（ＬＤブロックＡ、ＬＤブロックＢ）およびエクソン９を含むＬＤブロックＣ中の塩基配列を直接決定し、各ブロック内に位置する各種ＳＮＰの塩基の変異を調べる方法によってもよい。
【００５９】
例えば目的の塩基を検出する方法としては、上記のように該当領域の遺伝子配列を直接決定する方法の他に、多型配列が制限酵素認識部位である場合は、制限酵素切断パターンの相違を利用して、遺伝子型を決定する方法（以下、ＲＦＬＰという）、多型特異的なプローブを用いハイブリダイゼーションを基本とする方法（例えば、チップやガラススライド、ナイロン膜上に特定なプローブを張り付け、それらのプローブに対するハイブリダイゼーション強度の差を検出することによって、多型の種類を決定する、または、特異的なプローブのハイブリダイゼーションの効率を、鋳型２本鎖増幅時にポリメレースが分解するプローブの量を検出することにより遺伝子型を特定する方法、ある種の２本鎖特異的な蛍光色素が発する蛍光を温度変化を追うことにより２本鎖融解の温度差を検出し、これにより多型を特定する方法、多型部位特異的なオリゴプローブの両端に相補的な配列を付け、温度によって該当プローブが自己分子内で２次構造をつくるか、ターゲット領域にハイブリダイズするかの差を利用して遺伝子型を特定する方法など）がある。また、さらに鋳型特異的なプライマーからポリメレースによって塩基伸長反応を行わせ、その際に多型部位に取り込まれる塩基を特定する方法（ダイデオキシヌクレオタイドを用い、それぞれを蛍光標識し、それぞれの蛍光を検出する方法、取り込まれたダイデオキシヌクレオタイドをマススペクトロメトリーにより検出する方法）、さらに鋳型特異的なプライマーに続いて変異部位に相補的な塩基対または非相補的な塩基対の有無を酵素によって認識させる方法などがある。
【００６０】
以下、従来公知の代表的な遺伝子多型の検出方法を列記するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００６１】
(a)ＲＦＬＰ（制限酵素切断断片長多型）法、（b）ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析）〔Biotechniques, 16, 296-297 (1994)、及びBiotechniques, 21, 510-514 (1996)〕、（c）ＡＳＯ（Allele Specific Oligonucleotide）ハイブリダイゼーション法〔Clin. Chim. Acta, 189, 153-157 (1990)〕、（d）ダイレクトシークエンス法〔Biotechniques, 11, 246-249 (1991)〕、（e）ＡＲＭＳ（Amplification Refracting Mutation System）法〔Nuc. Acids. Res., 19, 3561-3567 (1991)；Nuc. Acids. Res., 20, 4831-4837 (1992)〕、（f）変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis；ＤＧＧＥ）法〔Biotechniques, 27, 1016-1018 (1999)〕、（g）ＲＮaseＡ切断法〔DNA Cell. Biol., 14, 87-94 (1995)〕、（h）化学切断法〔Biotechniques, 21, 216-218 (1996)〕、（i）ＤＯＬ（Dye-labeled Oligonucleotide Ligation）法〔Genome Res., 8, 549-556 (1998)〕、（j）ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法〔Genet. Anal., 14, 143-149 (1999)；J. Clin. Microbiol., 34, 2933-2936 (1996)〕、（k）インベーダー法〔Science, 5109, 778-783 (1993)；J.Biol.Chem., 30,21387-21394 (1999)；Nat. Biotechnol., 17, 292-296 (1999)〕、（l）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法（Matrix Assisted Laser Desorption-time of Flight/Mass Spectrometry）法〔Genome Res., 7, 378-388 (1997)；Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem., 35, 545-548 (1997)〕、（m）ＴＤＩ（Template-directed Dye-terminator Incorporation）法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10756-10761 (1997)〕、（n）モレキュラー・ビーコン（Molecular Beacons）法〔Nat. Biotechnol., 1, p49-53 (1998)；遺伝子医学、4, p46-48 (2000)〕、（o）ダイナミック・アレル−スペシフィック・ハイブリダイゼーション（Dynamic Allele-Specific Hybridization；ＤＡＳＨ）法〔Nat.Biotechnol.,1.p.87-88 (1999)；遺伝子医学,4, 47-48 (2000)〕、（p）パドロック・プローブ（Padlock Probe）法〔Nat. Genet.,3,p225-232 (1998) ；遺伝子医学,4, p50-51 (2000)〕、（q）ＵＣＡＮ法〔タカラ酒造株式会社ホームぺージ（http://www.takara.co.jp）参照〕、（r）ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイ（「ＳＮＰ遺伝子多型の戦略」松原謙一・榊佳之、中山書店、p128-135）、（s）ＥＣＡ法〔Anal. Chem., 72, 1334-1341, (2000)〕。
【００６２】
以上は代表的な遺伝子多型検出方法であるが、本発明のＲＡ罹患リスクの判定には、これらに限定されず、他の公知または将来開発される遺伝子多型検出方法を広く用いることができる。また、本発明の遺伝子多型検出に際して、これらの遺伝子多型検出方法を単独で使用してもよいし、また２以上を組み合わせて使用することもできる。
【００６３】
なお、上記塩基（SNP）のうち、Ｃ群の(17)の塩基（Ex9）における多型は、ＰＲＫＣＨ遺伝子によってコードされるプロテインキナーゼＣエタ（ＰＫＣエタ）のアミノ酸の変異（V374I）を伴う。そこで本発明の方法は、上記塩基について遺伝子多型の有無を直接検出する方法に限らず、遺伝子変異の結果生じた遺伝子産物ＰＫＣエタの３７４番目のアミノ酸変異（Ｖ→Ｉ）を検出することによっても行うことができる。かかる方法としては、被験者のＰＲＫＣＨ遺伝子の発現産物（例えば、mRNA、PKCエタ）について上記アミノ酸変異が生じているかどうかを測定する方法を挙げることができる。具体的には、ＰＲＫＣＨ遺伝子の発現産物の配列を決定する方法のほか、ＰＫＣエタまたは変異ＰＫＣエタ（V374I）に対する抗体を用いたウエスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免役沈降法、酵素結合免疫測定法（ELISA）。及び免疫蛍光法、またはＰＫＣエタの３７４番目のアミノ酸変異（Ｖ→Ｉ）によって生じた（または消失した）活性を測定する方法を例示することができる。
【００６４】
本発明の方法によって、関節リウマチ（ＲＡ）を発症する潜在的な危険度が相対的に高いことが判明した被験者に対しては、その旨を告知し、予めＲＡの発症を防ぐための的確な対策を講じることができる。従って、本発明は、ＲＡの発症を予防するための検査方法として、さらにはＲＡに伴って生じる他の疾患や症状発生の予防のための検査方法として極めて有用である。
【００６５】
５．関節リウマチ発症リスクの検出用試薬、これを含むキット
（１）プローブ
目的とする塩基（ＲＡ疾患感受性ＳＮＰ）並びに当該塩基を含むヌクレオチドの検出には、ヒト第１４染色体のＰＲＫＣＨ遺伝子上のＲＡ疾患感受性ＳＮＰを含むオリゴまたはポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし、当該ＳＮＰを検出することができるオリゴまたはポリヌクレオチドが用いられる。かかるオリゴまたはポリヌクレオチドは、上記ＰＲＫＣＨ遺伝子上において個々のＳＮＰ（(1)〜(21)）を各々含む１６〜５００塩基長、好ましくは２０〜２００塩基長、より好ましくは２０〜５０塩基長の連続した遺伝子領域と特異的にハイブリダイズするように、上記塩基長を有するオリゴまたはポリヌクレオチドとして設計される。
【００６６】
ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら、Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 第２版、1989に記載の条件）において、他のＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。好適には当該オリゴまたはポリヌクレオチドは、上記検出するＳＮＰを含む遺伝子領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有することが望ましいが、かかる特異的なハイブリダイゼーションが可能であれば、完全に相補的である必要はない。
【００６７】
かかるオリゴまたはポリヌクレオチドとしては、下記(1)〜(21)からなる群から選択される少なくとも一つのオリゴまたはポリヌクレオチド（但し、当該オリゴ若しくはポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００６８】
(1) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、77624位（PK011）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(2) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、77995位（SNP316）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(3) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、79479位（PK015）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(4) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、80267位（PK018）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(5) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、81682位（PK022）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(6) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85179位（PK028）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(7) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85309位（PK030）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(8) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85639位（PK031）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(9) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85859位（PK032）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(10) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85933位（SNP317）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(11) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、86306位（PK033）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(12) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、88042位（PK035）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(13) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、88549位（PK037）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(14) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、90690位（PK039）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(15) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、90983位（PK040）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(16) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、128663位（Int5）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(17) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、135724位（Ex9）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(18) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、144962位（Add9-1）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(19) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、145076位（Add9-2）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(20) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、145503位（Int9-1）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(21) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、148285位（Add9-3）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド。
【００６９】
当該オリゴまたはポリヌクレオチドは、被験者について関節リウマチに対する罹患性を判定するために、ヒト第１４染色体上のＰＲＫＣＨ遺伝子上に位置するＲＡ疾患受性ＳＮＰ（(1)〜(21)）を含むオリゴまたはポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴまたはポリヌクレオチド「プローブ」として設計される。なお、これらのオリゴまたはポリヌクレオチドは、ＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列に基づいて、例えば市販のヌクレオチド合成機によって常法に従って作成することができる。
【００７０】
さらに好ましくは、当該プローブは、上記各ＳＮＰ（(1)〜(21)）を含むオリゴヌクレオチドが検出できるように、放射性物質、蛍光物質、化学発光物質、または酵素等で標識される（後述）。
【００７１】
上記プローブ（オリゴまたはポリヌクレオチド）は任意の固相に固定化して用いることもできる。このため本発明はまた、上記プローブ（オリゴまたはポリヌクレオチド）を固定化プローブ（例えばプローブを固定化した遺伝子チップ、ｃＤＮＡマイクロアレイ、オリゴＤＮＡアレイ、メンブレンフィルター等）として提供するものである。当該プローブは、好適にはＲＡ疾患感受性遺伝子検出用のＤＮＡチップとして利用することができる。
【００７２】
固定化に使用される固相は、オリゴまたはポリヌクレオチドを固定化できるものであれば特に制限されることなく、例えばガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリーまたはその他の基板等を挙げることができる。固相へのオリゴまたはポリヌクレオチドの固定は、予め合成したオリゴまたはポリヌクレオチドを固相上に載せる方法であっても、また目的とするオリゴまたはポリヌクレオチドを固相上で合成する方法であってもよい。固定方法は、例えばＤＮＡマイクロアレイであれば、市販のスポッター（Amersham社製など）を利用するなど、固定化プローブの種類に応じて当該技術分野で周知である〔例えば、photolithographic技術(Affymetrix社)、インクジェット技術(Rosetta Inpharmatics社)によるオリゴヌクレオチドのin situ合成等〕。
【００７３】
例えば、ＡＳＯ法の一例であるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法〔Livak KJ. Gene Anal 14, 143 (1999), Morris T et al., J Clin Microbiol 34, 2933 (1996)〕の場合、各種のＲＡ疾患感受性ＳＮＰを含む領域に相補的な２０塩基長程度のオリゴヌクレオチドがプローブとして設計される。当該プローブは、5’末端を蛍光色素、3’末端を消光物質により標識され、検体ＤＮＡと特異的にハイブリダイズするが、そのままでは発光せず、別に加えられたＰＣＲプライマーの上流からの伸長反応により5’側の蛍光色素結合が切断され、遊離した蛍光色素により検出される。
【００７４】
ＡＳＯ法の別の１例であるＩｎｖａｄｅ法〔Lyamichev V. et al., Nat Biotechnol 17, 292 (1999)〕では、多型部位に隣接する配列（3’側と5’側の２種）に相補的なオリゴヌクレオチドがプローブとして設計される。検出は、これら２種のプローブと検体とは無関係な第３のプローブによって達成される。 
【００７５】
（２）プライマー
本発明は、またヒト第１４染色体のＰＲＫＣＨ遺伝子上のＲＡ疾患感受性ＳＮＰを含む配列領域を特異的に増幅するためのプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドを提供する。
【００７６】
かかるオリゴまたはポリヌクレオチドとしては、下記(1)〜(21)からなる群から選択される少なくとも一つのオリゴまたはポリヌクレオチド（但し、当該オリゴ若しくはポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１５〜３０塩基長のオリゴまたはポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００７７】
(1) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、77624位（PK011）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(2) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、77995位（SNP316）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(3) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、79479位（PK015）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(4) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、80267位（PK018）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(5) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、81682位（PK022）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(6) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85179位（PK028）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(7) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85309位（PK030）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(8) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85639位（PK031）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(9) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85859位（PK032）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(10) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、85933位（SNP317）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(11) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、86306位（PK033）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(12) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、88042位（PK035）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(13) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、88549 位（PK037）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(14) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、90690位（PK039）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(15) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、90983位（PK040）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(16) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、128663位（Int5）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(17) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、135724位（Ex9）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(18) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、144962位（Add9-1）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(19) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、145076位（Add9-2）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(20) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、145503位（Int9-1）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド、
(21) ヒトＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列において、148285位（Add9-3）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド。
【００７８】
このようなオリゴヌクレオチドは、ＰＲＫＣＨ遺伝子において、ＲＡ疾患感受性ＳＮＰの塩基（ヌクレオチド）を含む連続したオリゴまたはポリヌクレオチドの１部に特異的にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５〜３０塩基長、好ましくは１８〜２５塩基長程度のオリゴヌクレオチドとして設計される。増幅するオリゴまたはポリヌクレオチドの長さは、用いられる検出方法に応じて適宜設定されるが、一般的には１５〜１０００塩基長、好ましくは２０〜５００塩基長、より好ましくは２０〜２００塩基長である。
【００７９】
ヒト第１４染色体のＰＲＫＣＨ遺伝子上の、各種ＲＡ疾患感受性ＳＮＰ（(1)〜(21)）近傍の１５塩基以上連続した塩基配列に特異的にハイブリダイズする塩基配列を有する上記の各種オリゴヌクレオチドは、本発明においてプライマーとして利用することができる。なお、これらのオリゴヌクレオチドは、ＰＲＫＣＨ遺伝子の塩基配列に基づいて、例えば市販のヌクレオチド合成機によって常法に従って作成することができる。
【００８０】
Ｍａｓｓ Ａｒｒａｙ法にＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ／ＭＳ（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry）を応用した方法〔Haff LA et al. Genome Res 7, 378 (1997), Little DP et al., Nature Medicine vol.3, No.12, 1413-1416, (1997)〕を例にとって、プライマーの具体的な利用方法を説明する。この場合、シリコンチップ上に固定した検体ＤＮＡに前記プライマーをハイブリダイズさせ、ｄｄＮＴＰを添加して一塩基だけを伸長させる。次いで、一塩基伸長産物を分離し、質量分析法により多型を検出する。この方法では、プライマーは通常１５塩基長以上で可能な限り短く設計することが望ましい。
【００８１】
（３）標識物
上記本発明のプローブまたはプライマーには、遺伝子多型検出のための適当な標識物、例えば蛍光色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン等が付加されたものが含まれる。
【００８２】
なお、本発明において用いられる蛍光色素としては、一般にヌクレオチドを標識して、核酸の検出や定量に用いられるものが好適に使用でき、例えば、ＨＥＸ（4,7,2’,4’,5’,7’-hexachloro-6-carboxylfluorescein、緑色蛍光色素）、フルオレセイン（fluorescein）、ＮＥＤ（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄色蛍光色素）、あるいは、６−ＦＡＭ（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄緑色蛍光色素）、ローダミン（rhodamin）またはその誘導体〔例えば、テトラメチルローダミン（TMR）〕を挙げることができるが、これらに限定されない。蛍光色素でヌクレオチドを標識する方法は、公知の標識法のうち適当なものを使用することができる〔Nature Biotechnology, 14, 303-308 (1996)参照〕。また、市販の蛍光標識キットを使用することもできる（例えば、アマシャム・ファルマシア社製、オリゴヌクレオチドＥＣＬ  ３’−オリゴラベリングシステム等）。
【００８３】
また、本発明のプライマーには、その末端に多型検出のためのリンカー配列が付加されたものも含まれる。このようなリンカー配列としては、例えば、前述したインベーダー法で用いられるオリゴヌクレオチド５’末端に付加される、フラップ（多型近傍の配列とは全く無関係な配列）等が挙げられる。
【００８４】
以上の、プローブまたはプライマー（標識されていてもよい）は、ＲＡ発症リスクの検出用試薬として利用することができる。
【００８５】
（４）関節リウマチ罹患リスク検出用試薬キット
本発明はまた、上記ＲＡ罹患リスク検出用試薬をキットとして提供するものである。当該キットは、上記プローブまたはプライマーとして用いられるオリゴまたはポリヌクレオチド（なお、これらは標識されていても、また固相に固定化されていてもよい）を少なくとも１つ含むものである。本発明のキットは上記プローブまたはプライマーの他、必要に応じてハイブリダイゼーション用の試薬、プローブの標識、ラベル体の検出剤、緩衝液など、本発明の方法の実施に必要な他の試薬、器具などを適宜含んでいてもよい。
【実施例】
【００８６】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００８７】
解析対象
下記の実施例で示す解析は、合計1946人の日本人の被験者を対象として行った。1946人のうち、950人は関節リウマチ患者（ＲＡ患者）（199人の男性と751人の女性）であり、996人は非関節リウマチ患者（対照者）（229人の男性と767人の女性）である。すべてのＲＡ患者はＡＣＲの診断基準を満たし、発症から最低３年以上経過した症例者である。本研究は、徳島大学倫理委員会の承認を得ており、全ての参加者から、書面でのインフォームドコンセントが得られたのちに採血を行い、標準のプロトコルを用いて、末梢血白血球からゲノムＤＮＡを抽出し、被験サンプルとして使用した。
【００８８】
統計分析
下記の実施例において、ＳＮＰのアレル頻度に関する関連検定は、２Ｘ２の分割表を作成し、カイ２乗検定を行った。permutation 法を利用したハプロタイプ頻度のカイ２乗検定は、SNPAlyze ver.3.2プロ（DYNACOM、日本）を用いて行った。ペアワイズの連鎖不平衡の程度は、連鎖不平衡係数（|Ｄ‘|）と相関係数（r2）を算出することによって評価した。強い連鎖不平衡にあるＳＮＰのハプロタイプ推定や、連続して隣り合う２ＳＮＰ間の組換え率の推定は、Bayesian統計方法により、遺伝子タイピング・データからハプロタイプを推定するPHASE ver2.1プログラム(Stephens M, et al.,(2001) Am J Hum Genet 68:978-989、Stephens M, Donnelly P (2003) A comparison of Bayesian methods for haplotype reconstruction from population genotype data. Am J Hum Genet 73:1162-1169）でおこなった。
【００８９】
進化論に基づくハプロタイプ分析は、EHAPプログラム(Seltman H, Roeder K, Devlin B (2003) Evolutionary-based association analysis using haplotype data. Genet Epidemiol. 25:48-5)を使用して行った。このプログラムは、一般線形化モデルを用いて、集団内での特定のハプロタイプの進化・発生関係を検定するプログラムである。まず、ハプロタイプの分岐図を作成し（０−ステップ）、それから、ワンステップとして、１回の変異によって生じたハプロタイプを内部の（より以前から存在した）ハプロタイプに纏める。このステップを最終的に収束するまで行い、ＲＡ患者（ケース）と対照者（コントロール）との間で分布が異なるハプロタイプ群を推定する。
【００９０】
実施例１ 
（１）ＲＡの感受性候補領域の選択
従来、全ゲノムに対する罹患同胞対解析により、1q13、3q13、6q21-23、14q21-23、16pと18q21-23などが関節リウマチの疾患感受性領域として報告されている(非特許文献１０：Cornelis et al. 1998、 非特許文献１１：Shiozawa et al. 1998、 非特許文献１２：Jawaheer et al. 2001、 非特許文献１３：Mackay et al. 2002)。これらのＲＡ疾患感受性領域のなかで、マーカーD14S285はヨーロッパの白人においてＰ＝0.049でＲＡと関連を示し（非特許文献１０：Cornelis et al. 1998）、またマーカー14q21-23は日本人と英国人（白人）の両方においてＲＡと連鎖を示す。
【００９１】
本発明では、これら２つのマーカーを含む第１４番染色体の長腕21-23（14q21-23）の２７Ｍｂの領域をＲＡの感受性候補領域として選択し、領域ワイドのケースコントロール関連解析を行った。
【００９２】
公共のデータベース（dbSNPやTSC SNPやセレラ・ディスカバリー・システム）を検索し、上記候補領域（27Mb）に存在する多数のＳＮＰの中から、下記の基準(ｉ)〜(iii)を満たすＳＮＰ（遺伝子領域に等間隔で配置された頻度の高いＳＮＰ）を選択した：
（i）遺伝子領域の上流・下流のそれぞれ１０ｋｂを含む領域内に存在するＳＮＰであること、
（ii）可能な限り１０ｋｂに１つの割合で配置されたＳＮＰであること、
（iii）日本人対照者４６名のコントロールサンプルにおいてアレル頻度が１５％以上であること。
【００９３】
その結果、４３８個のＳＮＰを関連解析のマーカーＳＮＰとして選択した。これらのマーカーＳＮＰ間の距離は平均１６．９ｋｂで中央値は１０．３ｋｂであった。また、４３８個のうち、マーカー間の距離が１００ｋｂを超えるものが４１個あった。
【００９４】
（２）ジェノタイピング
第１ステージとして、ＲＡ患者と対照者の各々３８０名の被験サンプル（計760例）を対象として、ＲＡの感受性候補領域（14q21-23）に対して、上記で選択したマーカーＳＮＰ（合計438SNP）についてＳＮＰsタイピングを行った。ＳＮＰsタイピングは、２つのＳＮＰ（rs2230500とrs2230501）については、ダイレクトシークエンスによって行う以外は、すべてTaqManケミストリを用いて、384ウェルプレートフォーマットによりABI PRISM 7900HT Sequence Detection System（アプライドバイオシステム社製、米国）を用いることで行った。TaqManアッセイを行ったうち、４２２のＳＮＰがタイピング可能であった。これらの４２２ＳＮＰのうち、４０７のＳＮＰ（96.4%）は、候補領域（14q21-23）内に位置する７９個の遺伝子領域内に配置されており、全体の遺伝子カバー率は４６.４％であった。このうち、４５のＳＮＰは、ＲＡ患者と対照者の両方においてアレル頻度が１５％以下であるか、ハーディーワインベルグ平衡を満たさなかった（対照者サンプルにおいて、p<0.05）ため、解析から除外した。その結果、３７つのＳＮＰが、p＜０．０５で有意差を示したため、次の第２ステージでは、これらをＲＡ疾患感受性候補ＳＮＰとして、ＲＡ患者と対照者の各々５７０名の被験サンプル（計1140例）を対象に解析を行った。
【００９５】
第２ステージの解析の結果、これら３７つのＳＮＰの中で、３ＳＮＰが、上記と同様に、ＲＡ患者と対照者の両方においてアレル頻度が１５％以下であるか、ハーディーワインベルグ平衡を満たさなかった（対照者サンプルにおいて、p<0.05）ため、解析から除外した。残りの３４ＳＮＰのうち、３ＳＮＰ（SNP317, SNP382およびSNP383）が、再現性をもって有意差（p<0.05）を示した（図１）。
【００９６】
この３４ＳＮＰに関して、第１ステージと第２ステージのデータを併せて全体としてＲＡ患者と対照者の各々９５０名の被験サンプル（計1900例）を対象にして関連検定を行った結果、プロテインキナーゼＣ（PKC）ファミリーに属するプロテインキナーゼＣエタ（protein kinase C, eta）をコードする遺伝子であるＰＲＫＣＨ遺伝子（MIM 605437）のイントロン２に存在する２つのＳＮＰ（SNP316およびSNP317）が、アレル頻度比較で、ＲＡと最も高い関連を示した（SNP316： p=0.00054、SNP317：p=0.00013、オッズ比（OR）=1.33、95%信頼区間 1.13-1.57とOR= 1.37、1.17-1.62）（図１及び図２参照）。
【００９７】
このことから、ＰＲＫＣＨ遺伝子は日本人の関節リウマチ感受性遺伝子であると考えられた。
【００９８】
（３）ＲＡ疾患感受性領域のＳＮＰ探索とタイピング
さらにＲＡ疾患感受性領域を絞り込むために、公共のデータベース（dbSNPやTSC SNPやセレラ・ディスカバリー・システム）から、上記で有意差を示した２つのＳＮＰ（SNP316とSNP317）周辺に存在する５つのＳＮＰ（UTR-1、Ex2、PK032、Int2-4、SNP318）を選択して、合計７つのＳＮＰについて、ＲＡ患者と対照者の各々９５０名の被験サンプル（計1900例）を対象にしてタイピングを行った。この追加タイピングのデータを加えて、連鎖不平衡分析を行った結果、ＲＡ疾患感受性領域は、第１４染色体長腕21-23（14q21-23）中のrs3742633（Ex2）からrs2209386（Int2-4）までの約２６ｋｂの中に存在することが分かった（図３参照）。
【００９９】
次いで、この感受性領域を詳細に調査するため、これらのＳＮＰのうち強い連鎖不平衡（|D’|>0.99）にある３つのＳＮＰ（SNP316、PK032、SNP317）で構成されるハプロタイプの頻度に基づいて選択されたＲＡ患者及び対照者の各１２名の被験サンプル（計24例）を用いて、この２６ｋｂの領域（rs3742633−rs2209386）をダイレクトシークエンスした結果、６３個の多型（６１つのＳＮＰと２つの挿入欠失多型）が同定された。なお、ダイレクトシークエンスは、BigDye Terminator Cycle Sequencingキットver 1.1を用いてABI 3730xl DNAアナライザー（アプライドバイオシステム）にて行った。
【０１００】
これらの多型のうち、１１つの多型（ＳＮＰ）はアレル頻度が５％以下であり、残りの５２つの多型はアレル頻度が５％以上であった。この領域のおおよその連鎖不平衡パターンを推定するために、これら頻度の高い５２つの多型（図４）についてペアワイズの連鎖不平衡解析を行い、互いに強い相関関係(r2>0.8)にある多型をグループ分けした。
【０１０１】
次いで各グループの各々からそれぞれ１つずつ代表ＳＮＰを選択し、ＲＡ患者と対照者の各々９５０名の全被験サンプル（計1900例）に対してタイピングを行った。その結果、３つの代表ＳＮＰが関節リウマチと有意な関連を示した。このため、これらの３つのグループに含まれる他のＳＮＰをタイピングした。その結果、この領域内に存在する２６個のＳＮＰがタイピングされ、マーカー間隔は平均１ｋｂであった。中でも３つのＳＮＰ(PK011, PK015 と PK037)が最も強い有意差を示し（PK011：p=0.000059, OR=0.719 95% CI 0.618-0.834 ／ PK015：p= 0.000077, OR=0.770 95% CI 0.675-0.875 ／ PK037：p=0.000062,  OR=1.30 95% CI 1.134-1.475）、多重検定の補正であるボンフェローニの補正を行っても有意差を示した（PK011：p=0.027、PK015：p=0.035、PK037：p=0.028、 458回の検定で補正）(図５)。
【０１０２】
（４）詳細なＬＤマッピング
この２６ｋｂのＲＡ疾患感受性領域（rs3742633−rs2209386）に関してより詳細な連鎖不平衡マッピングを行うために、稠密に配置されたＳＮＰマーカーを用いて、３つのパラメータ（|D’|、 LDU、および組み替え率）を検討した(図６)。|D’| によるＬＤマッピングにより、２つの異なったＬＤブロックがこの２６ｋｂの領域に存在することが明らかになった(図６の上パネル)。そこで、この領域をより正確に分析するために、ＬＤＭＡＰプログラム(Maniatis N, Collins A, Xu CF, McCarthy LC, Hewett DR, Tapper W, Ennis S, Ke X, Morton NE (2002) The first linkage disequilibrium (LD) maps: delineation of hot and cold blocks by diplotype analysis. Proc Natl Acad Sci U S A 99:2228-2233)を用いた。その結果、PK011からPK034までの１４つのＳＮＰで構成される９.７ｋｂの領域にプラトー領域（ブロックＡ）が認められ、それに続いてＬＤＵのステップアップによって区別される約３ｋｂのプラトー領域（ブロックＢ）が認められた。
【０１０３】
次いで、ＬＤＵによるＬＤマッピングをさらに確認するために、このプラトー領域（ブロックＡとブロックＢ）で隣り合うＳＮＰ間での組換え率を、PHASE v2.1ソフトウェア(Stephens M, Smith NJ, Donnelly P (2001) A new statistical method for haplotype reconstruction from population data. Am J Hum Genet 68:978-989、Stephens M, Donnelly P (2003) A comparison of Bayesian methods for haplotype reconstruction from population genotype data. Am J Hum Genet 73:1162-1169)を用いて解析した。その結果、ブロックＡとＢのそれぞれのプラトー領域は低い組換え率を示した。一方、ブロックＡとブロックＢとの境界は高い組み替え率を示し、２つのブロックの間に明らかな歴史的組み替えが存在していることが明らかとなった(図６の下パネル）。
【０１０４】
（５）進化に基づいたハプロタイプ解析
ブロックＡにおけるハプロタイプと関節リウマチ（ＲＡ）との関連を検証するために、ＥＨＡＰプログラム(Seltman H, Roeder K, Devlin B (2003) Evolutionary-based association analysis using haplotype data. Genet Epidemiol. 25:48-5)を用いて、進化に基づいたハプロタイプ解析を行った。ＥＨＡＰプログラムは、多座位のデータをハプロタイプとして解析して、ハプロタイプと表現型の間に関係があるかどうか解析するプログラムである。
【０１０５】
Bayesian統計方法に基づいたPHASE v2.1ソフトウェアを用いて、ブロックＡ内の１４つのＳＮＰについて、ＲＡ患者と対照者（各950名）をあわせた全体集団（各1900名）でのハプロタイプ頻度を推定した（図７）。その結果、全てのハプロタイプの約９８％を占める５つの頻度の高いハプロタイプ（#１〜５）が推定され、５つのＳＮＰ（PK011、PK018、PK019、PK032、及びPK034）が、ハプロタイプタギングＳＮＰ（htSNP）として選出された。この５つのhtSNPを用いてＥＨＡＰ解析した結果、ＡからＨの８つのハプロタイプが観察され、ハプロタイプの派生関係をしめす分岐図が得られた（図８）。分岐論的解析は、真の疾患感受性座位と連鎖不平衡にあるマーカー座位を検出する方法である。この解析の結果、ＲＡ疾患感受性を規定する座位がハプロタイプＡからＣまで派生の過程で発生したことが判明した（scoreテストp=0.0004）。ハプロタイプＡは、PK032によってハプロタイプＣと区別されるので、PK032をhtSNPとするＳＮＰ群（PK015、PK032、PK033）がＲＡの候補感受性ＳＮＰ群と考えられた。ブロックＢにおいては、領域内に４つのＳＮＰしか存在しないためＥＨＡＰプログラムを適用することができなかった。ブロックＡとブロックＢのそれぞれのＳＮＰを用いたハプロタイプ関連解析をした結果は、有意差を認めたが、それぞれのＳＮＰの単独での検定の有意差とほぼ同様であった(図９ＡとＢ)。
【０１０６】
実施例２
（１）PRKCH遺伝子の全コード領域のＳＮＰ検索と遺伝子タイピング
ＰＲＫＣＨ遺伝子の全コード領域とエクソンとイントロンの境界領域に関して、２４サンプル（ＲＡ患者と対照者各１２名の被験サンプル）を用いてダイレクトシークエンスを行った。その結果、エクソン９とエクソン１２に存在する３つの多型を同定し、これらの多型について、ＲＡ患者と対照者の計１９００名の全サンプル（計1900例）においてタイピングを行った。
【０１０７】
その結果、エクソン９に存在するアミノ酸置換をともなうＳＮＰ（V374I, rs2230500、SNP-ID：Ex9）が、関節リウマチ（ＲＡ）と有意な関連を示した(p=0.0016, オッズ比1.284  95% 信頼区間1.108-1.496で、図５参照)。このＳＮＰの周辺のＳＮＰについて追加タイピングと連鎖不平衡解析を行うことにより、このＳＮＰ（Ex9）はブロックＡやブロックＢとは別の連鎖不平衡ブロック（ブロックＣ）に存在することがわかり、そのブロックＣ内に存在する他のＳＮＰ（Add-9-1、Add-9-2、Int9-1、Add-9-3）もＲＡと有意な関連を示した(図５参照)。
【０１０８】
（２）複数のＲＡ感受性候補ＳＮＰの組み合わせ解析
ブロックＡに関して、進化論に基づくハプロタイプ関連解析で得られた３つの候補ＳＮＰ（PK015、PK032、PK033）の中で、最も強い有意差を認めたPK015と、ブロックＢとＣのそれぞれにおいて最も強い有意差を示したPK037とInt9-1を、ＲＡの感受性候補ＳＮＰとして選択した。この３つのＳＮＰ（PK015、PK037、Int9-1）の組み合わせのＲＡ感受性への効果を調査するために、これら３つのＳＮＰから考えられうる遺伝子型の各組合わせのオッズ比を算出した(図１０)。最も高いオッズ比は、PK037とInt9-1の感受性アレルのホモの組み合わせ（PK037：G/G、Int9-1：T/T）で認められた（OR=2.981、95% CI:1.45-6.13）。３つのＳＮＰ（PK015、PK037、Int9-1）の各々のペアワイズ（図１０Ａ〜Ｃ）または三つのＳＮＰの組合せ（図１０Ｄ）は、各々のＳＮＰの単点のオッズ比より高いオッズ比を示した。
【０１０９】
（３）ヒト組織でのＰＲＫＣＨ遺伝子の発現
ＲＡ患者のさまざまな組織（脳、骨髄、腎臓、心臓、脾臓および副腎）と滑膜細胞（FLS）を対象として、リアルタイムＰＣＲによってPRKCH mRNAの発現を調べた。なお、滑膜細胞（FLS）は、ＲＡ患者から人工膝関節全置換時に集めた滑膜組織を、10%のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で培養することによって調製した(Mishiro T, Nakano S, Takahara S, Miki M, Nakamura Y, Yasuoka S, Nikawa T, Yasui N (2004) Relationship between cathepsin B and thrombin in rheumatoid arthritis. J Rheumatol 31:1265-1273)。滑膜細胞（FLS）からのトータルＲＮＡは、RNeasy Mini Kit （Qiagen）を使用して抽出した。
【０１１０】
他のヒト組織（脳、骨髄、腎臓、心臓、脾臓および副腎）のｍＲＮＡは、Human Total RNA Master PanelIIキット（BD Biosciences、San Jose、CA）を用いて調製した。逆転写反応はランダムヘキサマーで、SuperScriptII（インビトロジェン、Carlsbad,CA）を用いて行った。リアルタイムＰＣＲは、TaqMan（登録商標）Gene Expression Assays Probeを用いてＡＢＩ 7900 Sequence Detection System（アプライドバイオシステム）で行った。リアルタイムＰＣＲのテンプレートとして肺由来のｍＲＮＡの希釈系列をスタンダードとして検量線を作成し、ＡＣＴＢ（actin, beta）の発現量を用いてＰＲＫＣＨの発現量を補正した。
【０１１１】
その結果、ＰＲＫＣＨは脾臓を含むさまざまなヒト組織内に遍在的に発現していた。しかし、ＲＡ患者の滑膜細胞（ＦＬＳ）には、他の組織（脳、骨髄、腎臓、心臓、副腎皮質）に比較して微量しか発現していなかった(図１１)。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】各ステージにおいて選択された関節リウマチ（ＲＡ）疾患感受性候補とＲＡとの関連検定の結果を纏めた図である。
【図２】ヒト第１４染色体長腕21-23（14q21-23）の全マーカーＳＮＰの関連検定の結果を示すグラフ（下パネル）と対応する候補領域14q21-23の遺伝子位置を示す。全サンプル（ＲＡ患者と対照者各950名ずつ）で解析された５８ＳＮＰの結果と第１ステージ（ＲＡ患者と対照者各380名ずつ）で解析された残りのＳＮＰの結果を纏めてグラフにしている。
【図３】有意ＳＮＰ（SNP316とSNP317）の周辺の７つのＳＮＰsのペアワイズＬＤ値を示す図ｙである。左下に｜Ｄ’｜を示し、右上にｒ２を示す。強い連鎖不平衡（｜D’｜値＞0.95、ｒ２＞0.95）にあるSNPの組合せは灰色で示す。
【図４】ＰＲＫＣＨ遺伝子内のＳＮＰについて、dbSNP、メジャーアレル／マイナーアレル、アレル頻度（MAF§：シークエンスを行った24サンプルでのアレイ頻度を示す）、染色体上での位置を纏めた図である。なお、各ＳＮＰの染色体上の位置情報は、UCSC（the University of California, Santa Cruz）Genome Bioinformatics site（http://genome.ucsc.edu/index.html/）より取得した。
【図５】ＰＲＫＣＨ遺伝子内のＳＮＰの関連解析の結果を纏めた図である。合わせて、ＬＤブロックＡ〜Ｃに属するＳＮＰについても記載する。図中、「MAF」は第１＋第２ステージサンプル（RA患者と対照者の各950名ずつ）でのマイナーアレル頻度MAFを示す。また「Odds ratio」は、ＲＡ感受性に対するマイナーアレルのオッズ比を示す。なお、「p-value」は多重検定に対して補正をしていないｐ値を示す。
【図６】ＰＲＫＣＨ遺伝子内のＳＮＰs連鎖不平衡マップを示す。上パネルは、PRKCH遺伝子の42ＳＮＰのペアワイズＬＤ値（｜D’｜）をGOLD（the graphical overview of linkage disequilibrium）（Abecasis and Cookson 2000）プログラムを用いて描画したものである。これらのＳＮＰの物理的な位置とＰＲＫＣＨ遺伝子のエクソン・イントロン構造を中パネルに示す。中パネル中、黒バーはイントロン２の連鎖不平衡領域を示し、灰色のバーはエクソン９を含む連鎖不平衡ブロックを示す。イントロン２の有意ＳＮＰはアスタリスク（＊）でマークし、エクソン９の非同義置換ＳＮＰはシャープ（＃）でマークされている。下パネルがそれぞれ隣り合うＳＮＰ間の組換率を棒グラフで、ＬＤＵのグラフを折れ線で示す。
【図７】連鎖不平衡ブロックＡの１４ＳＮＰで構成されるハプロタイプの頻度を示す。全体のハプロタイプ頻度の９８％を示すハプロタイプ＃１−５を示す。なお、アスタリスク（＊）は、ハプロタイプタギングＳＮＰs（htSNPs）である。
【図８】連鎖不平衡ブロックＡの５つのhtＳＮＰからなる８つのハプロタイプ（Ａ−Ｈ）の頻度（左図）とそれらのハプロタイプの分岐図（右図）を示す。分岐図中、各ハプロタイプは円で示され、ハプロタイプの派生の過程で生じた変異を線で表している。円の大きさはそれぞれのハプロタイプ頻度に対応している。PK032によって、２群のハプロタイプ（ハプロタイプA,B,D及びGとハプロタイプC,E,F及びH）に分類される。
【図９】連鎖不平衡ブロックＡ（Ａ図）及びＢ（Ｂ図）での、有意ＳＮＰからなるハプロタイプの関連検定の結果を示す。なお、多重検定に対するｐ値の補正は10000回のpermutation法を用いた。
【図１０】ＰＲＫＣＨ遺伝子内の異なる連鎖不平衡ブロックＡ〜Ｃから選択された３つのＳＮＰ（PK015、PK037、Int9-1）の遺伝子ガタの組合せの関連解析の結果を示す。OR（オッズ比）は非感受性アレルのホモ接合体同士の組み合わせを参照（1.000）としたオッズ比、ｐ値は非感受性アレルのホモ接合体同士の組み合わせを参照としたカイ二乗検定のｐ値である。有意なp値、オッズ比は太字で示す。
【図１１】リアルタイムＰＣＲを用いた各種のヒト組織（脳、骨髄、腎臓、心臓、脾臓、副腎）および滑膜細胞（FLS）におけるＰＲＫＣＨ  ｍＲＮＡの発現量を示す。なお、ＰＲＫＣＨ  ｍＲＮＡの発現量はＡＣＴＢ  ｍＲＮＡの発現量に対する相対値で示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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