(57)【要約】      （修正有）【課題】真菌の属による分類を目的に、同じ属の菌種は一括検出が可能で、しかも、他の属の細菌は区別して検出できるような、プローブとプライマーを提供する。【解決手段】カンジダ属、アスペルギルス属等の感染症起炎菌の、遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブは、第１群乃至第９群のうちの一つの群に属する塩基配列の、少なくとも一つの配列を含んで構成される。また、プローブによる検出に先立って、検体中の核酸を増幅するためのプライマー・セットを提示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染症起炎菌遺伝子を検出するためのプローブセットであって、
（１）下記第１群乃至第９群から選ばれる何れかの群に属する第１のプローブと、
下記第１群乃至第９群から選ばれる何れかの群に属し、且つ前記第１のプローブが属する群に属しない第２のプローブとを含むか、または
（２）前記第１のプローブに対して相補的な塩基配列からなる第３のプローブと、前記第２のプローブに対して相補的な塩基配列からなる第４のプローブとを含む、
ことを特徴とするプローブセット。
第１群：
（１）acgatacagggcccttttgggt（配列番号１）からなる塩基配列を有するプローブ
（２）atctttttcgatgcgtactggaccag（配列番号２）からなる塩基配列を有するプローブ
（３）gccatttatggcgaaccaggactt（配列番号３）からなる塩基配列を有するプローブ
（４）aggacgttatggttctattgtgttggtt（配列番号４）からなる塩基配列を有するプローブ
（５）ggactatcgactccaagtcgatgga（配列番号５）からなる塩基配列を有するプローブ
第２群：
（１）cggtccgattttttcgtgtactgga（配列番号６）からなる塩基配列を有するプローブ
（２）aaccccaagtccttgtggcttg（配列番号７）からなる塩基配列を有するプローブ
（３）tggaataatggaataggacgtttggttct（配列番号８）からなる塩基配列を有するプローブ
（４）ttttagtgacccactcggcacct（配列番号９）からなる塩基配列を有するプローブ
（５）gctagcatttgctggttgtccact（配列番号10）からなる塩基配列を有するプローブ
第３群：
（１）gatacagggccctttcgggtct（配列番号11）からなる塩基配列を有するプローブ
（２）ttttggcgagtactggacccaac（配列番号12）からなる塩基配列を有するプローブ
（３）ctaaccattcgcccttgtggtgtt（配列番号13）からなる塩基配列を有するプローブ
（４）atcgggtgttgttctttttttgacgc（配列番号14）からなる塩基配列を有するプローブ
（５）aaatagtgctgctagcttttgctggt（配列番号15）からなる塩基配列を有するプローブ
第４群：
（１）atataacgatacagggcctttggtcttg（配列番号16）からなる塩基配列を有するプローブ
（２）ggcggacggtctacctatggtaa（配列番号17）からなる塩基配列を有するプローブ
（３）accaggacgattactttgaggaaattaga（配列番号18）からなる塩基配列を有するプローブ
（４）ggtggtgctactttgcccactc（配列番号19）からなる塩基配列を有するプローブ
（５）agacttctcttgatcttacgggtggt（配列番号20）からなる塩基配列を有するプローブ
（６）aaatagggctgcgagcatctgc（配列番号21）からなる塩基配列を有するプローブ
第５群：
（１）gccggtccatcttttttgatgcgta（配列番号22）からなる塩基配列を有するプローブ
（２）tctggctagcctttttggcgaac（配列番号23）からなる塩基配列を有するプローブ
（３）tcagtattcagtagtcagaggcgaaattc（配列番号24）からなる塩基配列を有するプローブ
（４）tgttgttcttttattgacgcaatcggc（配列番号25）からなる塩基配列を有するプローブ
（５）tgctgctagcatttgctggtatagtc（配列番号26）からなる塩基配列を有するプローブ
第６群：
（１）acaatacagggctcttttgggcc（配列番号27）からなる塩基配列を有するプローブ
（２）ctggtggtcctgtatgctctttactg（配列番号28）からなる塩基配列を有するプローブ
（３）ttgacggaagaccaacaactgcg（配列番号29）からなる塩基配列を有するプローブ
（４）gatcggcccacgtcaatctctg（配列番号30）からなる塩基配列を有するプローブ
（５）cggcgtctagtcgacggaagtt（配列番号31）からなる塩基配列を有するプローブ
第７群：
（１）gaggaacggtctgccttacggta（配列番号32）からなる塩基配列を有するプローブ
（２）ttcattgagtgtgcggtggaacc（配列番号33）からなる塩基配列を有するプローブ
（３）cttagatttacggaagactaacaactgcg（配列番号34）からなる塩基配列を有するプローブ
（４）tcggtccacgttattttctgactgga（配列番号35）からなる塩基配列を有するプローブ
（５）ggactaacagcgtttagctgttggaa（配列番号36）からなる塩基配列を有するプローブ
第８群：
（１）ttctggggaacctcatggcctt（配列番号37）からなる塩基配列を有するプローブ
（２）atagggatagtcgggggcgtca（配列番号38）からなる塩基配列を有するプローブ
（３）aaagcattcgccaaggatgttttcattaa（配列番号39）からなる塩基配列を有するプローブ
（４）cggtgtttctatgatgacccgctc（配列番号40）からなる塩基配列を有するプローブ
（５）cttcttagggggactatcggctca（配列番号41）からなる塩基配列を有するプローブ
第９群：
（１）ggggctcttttgggtctcgtaatt（配列番号42）からなる塩基配列を有するプローブ
（２）ctggggaatctcatggccttcac（配列番号43）からなる塩基配列を有するプローブ
（３）ggatagtcgggggcgtcagtatt（配列番号44）からなる塩基配列を有するプローブ
（４）gtgtttctattatgacccgttcggca（配列番号45）からなる塩基配列を有するプローブ
（５）agacctcggcccttaaatagccc（配列番号46）からなる塩基配列を有するプローブ。
【請求項２】
請求項１に記載のプローブセットを構成する複数のプローブの各々が、固相担体上に、互いに隔離して配置されていることを特徴とするプローブ固定担体。
【請求項３】
プローブ固定担体を用いた検体中での感染症起炎菌遺伝子の検出方法において、
（ｉ）請求項２に記載のプローブ固定担体と検体とを反応させる工程と、
（ｉｉ）前記検体中の核酸と反応したオリゴヌクレオチドの有無を検出する工程と、
を有することを特徴とする感染症起炎菌遺伝子の検出方法。
【請求項４】
前記工程（ｉ）に先立って、前記検体に、gccctatcaactttcgatggtaggatag（配列番号47）の塩基配列からなるプライマーと、以下の２種のプライマー：
（Ａ）aatgctctatccccagcacgac（配列番号48）からなるプライマー、及び
（Ｂ）tcggcaccttacgagaaatcaaagt （配列番号49）からなるプライマー
の少なくとも１つと、を有するプライマーセットを用いた増幅処理を行う工程を有する請求項３に記載の検出方法。
【請求項５】
請求項２に記載のプローブ固定担体を用いた感染症起炎菌の検出を行う際の検体中の核酸を予め増幅させておくためのプライマーセットであって、
gccctatcaactttcgatggtaggatag（配列番号47）の塩基配列からなるプライマーと、
以下の２種のプライマー：
（１）aatgctctatccccagcacgac（配列番号48）からなるプライマー、及び
（２）tcggcaccttacgagaaatcaaagt （配列番号49）からなるプライマー
の少なくとも１つと、
を有することを特徴とするプライマーセット。
【請求項６】
請求項１に記載のプローブセット若しくは請求項２に記載のプローブ固定担体と、請求項５に記載のプライマ−セットとを含むことを特徴とする感染症起炎菌検出用のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感染による疾患の原因菌の検出および同定に有用な感染症起炎菌由来のプローブセット及びそれを担体に固定したプローブ固定担体に関する。本発明は更に、このプローブセットを用いた感染症起炎菌遺伝子の検出方法に関する。本発明は更に、この検出方法に用いる検体中の核酸を効果的に予め増幅しておくためのプライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
検体中の病原真菌をより迅速かつ確実に検出するための試薬並びに方法が従来より提案されてきている。例えば特許文献１は、カンジダ症及びアスペルギルス症の起炎菌を検出するためのプローブ及びプライマ−として用い得る特定の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及びそれを用いた対象菌の検出方法が開示されている。また、同特許文献には、複数の対象菌を共通にＰＣＲで増幅するためのプライマ−セットが開示され、それを用いて検体中の複数の対象となる真菌をＰＣＲで増幅した後、各菌に特異的な配列部分を各菌に固有のプローブを用いるハイブリダイゼーションアッセイで検出し、検体中の真菌の菌種を同定する方法も開示されている。
【０００３】
一方、複数の異なる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを同時的に検出可能な方法として、当該塩基配列の各々に相補的な配列を有するプローブを固相上に隔離して配置したプローブアレイを用いる方法が知られている（特許文献２）。
【特許文献１】特開平８−８９２５４号公報
【特許文献２】特開２００４−３１３１８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、複数の真菌をプローブアレイ等を用いて同時的に、特異的且つ互いの存在情報への影響（クロスコンタミネーション）を抑えつつ検出可能なプローブを設定することは、決して容易なことではなく、同時に検出しようとする複数の対象菌に応じて個々的に設定せざるを得ないのが実状である。このような状況の下、本願発明者らは、下記の９つの真菌について、クロスコンタミネーションをより低いレベルに抑えつつ同時的に検出するのに好適に用いることのできるプローブについて検討を行った。
１）Candida albicans（カンジダ  アルビカンス）。
２）Candida glabrata（カンジダ  グラブラタ）。
３）Candida guilliermondii（カンジダ  ギリエルモンジ）。
４）Candida krusei（カンジダ  クルセイ）。
５）Candida parapsilosis（カンジダ  パラプシローシス）。
６）Cryptococcus neoformans（クリプトコッカス  ネオフォルマンス）。
７）Trichosporon beigelii（トリコスポロン  ベイゲリ）。
８）Aspergillus fumigatus（アスペルギルス  フミガーツス）。
９）Aspergillus niger（アスペルギルス  ニガー）。
【０００５】
本発明の第１の目的は、上記９つの菌から選ばれる少なくとも２つの菌を同時的に、より正確に同定することのできるプローブセットを提供することを目的とする。また本発明の他の目的は、上記９つの菌から選ばれる少なくとも２つの菌を同時的に、より正確に同定する為に用いることのできるプローブ固定担体を提供することを目的とする。更に本発明の他の目的は、上記９つの菌を選択的に、且つ上記プローブセットを構成するオリゴヌクレオチドによって検出可能に増幅することのできるプライマ−セットを提供することを目的とする。更にまた本発明の他の目的は、検体中に上記９つの菌から選ばれる少なくとも２つの菌が含まれている場合に、それらをより迅速に、且つより正確に検出することのできる感染症起炎菌検出用のキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に係る感染症起炎菌検出用プローブセットは、
（１）下記第１群乃至第９群から選ばれる何れかの群に属する第１のプローブと、
下記第１群乃至第９群から選ばれる何れかの群に属し、且つ前記第１のプローブが属する群に属しない第２のプローブとを含むか、または、
（２）前記第１のプローブに対して相補的な塩基配列からなる第３のプローブと、
前記第２のプローブに対して相補的な塩基配列からなる第４のプローブとを含む、
ことを特徴とする。
第１群：
（１）acgatacagggcccttttgggt（配列番号1）からなる塩基配列を有するプローブ
（２）atctttttcgatgcgtactggaccag（配列番号2）からなる塩基配列を有するプローブ
（３）gccatttatggcgaaccaggactt（配列番号3）からなる塩基配列を有するプローブ
（４）aggacgttatggttctattgtgttggtt（配列番号4）からなる塩基配列を有するプローブ
（５）ggactatcgactccaagtcgatgga（配列番号5）からなる塩基配列を有するプローブ
第２群：
（１）cggtccgattttttcgtgtactgga（配列番号6）からなる塩基配列を有するプローブ
（２）aaccccaagtccttgtggcttg（配列番号7）からなる塩基配列を有するプローブ
（３）tggaataatggaataggacgtttggttct（配列番号8）からなる塩基配列を有するプローブ
（４）ttttagtgacccactcggcacct（配列番号9）からなる塩基配列を有するプローブ
（５）gctagcatttgctggttgtccact（配列番号10）からなる塩基配列を有するプローブ
第３群：
（１）gatacagggccctttcgggtct（配列番号11）からなる塩基配列を有するプローブ
（２）ttttggcgagtactggacccaac（配列番号12）からなる塩基配列を有するプローブ
（３）ctaaccattcgcccttgtggtgtt（配列番号13）からなる塩基配列を有するプローブ
（４）atcgggtgttgttctttttttgacgc（配列番号14）からなる塩基配列を有するプローブ
（５）aaatagtgctgctagcttttgctggt（配列番号15）からなる塩基配列を有するプローブ
第４群：
（１）atataacgatacagggcctttggtcttg（配列番号16）からなる塩基配列を有するプローブ
（２）ggcggacggtctacctatggtaa（配列番号17）からなる塩基配列を有するプローブ
（３）accaggacgattactttgaggaaattaga（配列番号18）からなる塩基配列を有するプローブ
（４）ggtggtgctactttgcccactc（配列番号19）からなる塩基配列を有するプローブ
（５）agacttctcttgatcttacgggtggt（配列番号20）からなる塩基配列を有するプローブ
（６）aaatagggctgcgagcatctgc（配列番号21）からなる塩基配列を有するプローブ
第５群：
（１）gccggtccatcttttttgatgcgta（配列番号22）からなる塩基配列を有するプローブ
（２）tctggctagcctttttggcgaac（配列番号23）からなる塩基配列を有するプローブ
（３）tcagtattcagtagtcagaggcgaaattc（配列番号24）からなる塩基配列を有するプローブ
（４）tgttgttcttttattgacgcaatcggc（配列番号25）からなる塩基配列を有するプローブ
（５）tgctgctagcatttgctggtatagtc（配列番号26）からなる塩基配列を有するプローブ
第６群：
（１）acaatacagggctcttttgggcc（配列番号27）からなる塩基配列を有するプローブ
（２）ctggtggtcctgtatgctctttactg（配列番号28）からなる塩基配列を有するプローブ
（３）ttgacggaagaccaacaactgcg（配列番号29）からなる塩基配列を有するプローブ
（４）gatcggcccacgtcaatctctg（配列番号30）からなる塩基配列を有するプローブ
（５）cggcgtctagtcgacggaagtt（配列番号31）からなる塩基配列を有するプローブ
第７群：
（１）gaggaacggtctgccttacggta（配列番号32）からなる塩基配列を有するプローブ
（２）ttcattgagtgtgcggtggaacc（配列番号33）からなる塩基配列を有するプローブ
（３）cttagatttacggaagactaacaactgcg（配列番号34）からなる塩基配列を有するプローブ
（４）tcggtccacgttattttctgactgga（配列番号35）からなる塩基配列を有するプローブ
（５）ggactaacagcgtttagctgttggaa（配列番号36）からなる塩基配列を有するプローブ
第８群：
（１）ttctggggaacctcatggcctt（配列番号37）からなる塩基配列を有するプローブ
（２）atagggatagtcgggggcgtca（配列番号38）からなる塩基配列を有するプローブ
（３）aaagcattcgccaaggatgttttcattaa（配列番号39）からなる塩基配列を有するプローブ
（４）cggtgtttctatgatgacccgctc（配列番号40）からなる塩基配列を有するプローブ
（５）cttcttagggggactatcggctca（配列番号41）からなる塩基配列を有するプローブ
第９群：
（１）ggggctcttttgggtctcgtaatt（配列番号42）からなる塩基配列を有するプローブ
（２）ctggggaatctcatggccttcac（配列番号43）からなる塩基配列を有するプローブ
（３）ggatagtcgggggcgtcagtatt（配列番号44）からなる塩基配列を有するプローブ
（４）gtgtttctattatgacccgttcggca（配列番号45）からなる塩基配列を有するプローブ
（５）agacctcggcccttaaatagccc（配列番号46）からなる塩基配列を有するプローブ。
【０００７】
本発明のプローブ固定担体は、固相担体上に、異なる複数のプローブのそれぞれを所定位置に区分して化学結合により固定したプローブ固定担体において、前記異なる複数のプローブとして上記構成の感染症起炎菌検出用プローブセットを用いたことを特徴とするプローブ固定担体である。
【０００８】
本発明の感染症起炎菌遺伝子の検出方法は、プローブ固定担体を用いた検体中での感染症起炎菌遺伝子の検出方法において、
上記構成のプローブ固定担体と検体とを反応させる工程と、
前記検体中の核酸と反応したプローブの有無を検出する工程と、
前記検体中の核酸と反応したプローブが有る場合に、該プローブ塩基配列に基づいて検体に含まれる感染症起炎菌遺伝子を特定する工程と、
を有することを特徴とする感染症起炎菌遺伝子の検出方法である。
【０００９】
本発明のプライマーセットは、上記構成のプローブ固定担体を用いた感染症起炎菌の検出を行う際の検体中の核酸を予め増幅させておくためのプライマーセットであって、
gccctatcaactttcgatggtaggatag（配列番号47）の塩基配列からなるプライマーと、
以下の２種のプライマー：
（１）aatgctctatccccagcacgac（配列番号48）からなるプライマー、及び
（２）tcggcaccttacgagaaatcaaagt （配列番号49）からなるプライマー
の少なくとも１つと、
を有することを特徴とするプライマーセットである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、検体が、上記した９つの感染症の原因菌から選ばれる少なくとも２つの菌に複合的に感染している場合に、該検体から当該２つ若しくはそれ以上の菌を同時的に同定することができる。従って、検体が複数の真菌により複合感染しているか否かの判定、及び複合感染している場合の原因菌の特定をより迅速かつ正確に行うことができる。また、本発明に係るプライマ−セットによれば、本発明に係るプローブセットを用いて複合感染が疑われる検体の検査を行う際に、上記９つの感染症起炎菌を選択的に、且つ該プローブセットを構成するプローブとの反応特異性を失わせることなしに増幅させることができる。従って、本発明に係るプライマ−セットを検体の増幅に用いることにより、本発明に係るプローブセットやプローブ固定担体を用いた検体の検査のより一層の迅速化、正確化が図られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００１２】
以下の実施形態では、感染症の起炎菌同定の為のオリゴヌクレオチドプローブ（以下単にプローブという）のセットが示される。このプローブセットを用いることで以下の９種の感染により炎症を引き起こす真菌のいずれか１つ、あるいはその複数種を検出可能である。
１）Candida albicans（カンジダ  アルビカンス）。
２）Candida glabrata（カンジダ  グラブラタ）。
３）Candida guilliermondii（カンジダ  ギリエルモンジ）。
４）Candida krusei（カンジダ  クルセイ）。
５）Candida parapsilosis（カンジダ  パラプシローシス）。
６）Cryptococcus neoformans（クリプトコッカス  ネオフォルマンス）。
７）Trichosporon beigelii（トリコスポロン  ベイゲリ）。
８）Aspergillus fumigatus（アスペルギルス  フミガーツス）。
９）Aspergillus niger（アスペルギルス  ニガー）。
【００１３】
すなわち、上記９種類の感染症起炎菌の遺伝子のうちの18s rRNA遺伝子配列を過不足なく検出するための核酸プローブセットが開示される。
【００１４】
本実施形態によれば、感染症起炎菌の遺伝子そのもの、あるいはその遺伝子に特有な塩基配列を有する核酸を含む検体（検査用溶液）と反応せしめるためのプローブセットのプローブは、以下の第１群〜第９群の少なくとも２つの群のそれぞれから選択される。
第１群：
（１）acgatacagggcccttttgggt（配列番号1）からなる塩基配列を有するプローブ
（２）atctttttcgatgcgtactggaccag（配列番号2）からなる塩基配列を有するプローブ
（３）gccatttatggcgaaccaggactt（配列番号3）からなる塩基配列を有するプローブ
（４）aggacgttatggttctattgtgttggtt（配列番号4）からなる塩基配列を有するプローブ
（５）ggactatcgactccaagtcgatgga（配列番号5）からなる塩基配列を有するプローブ
第２群：
（１）cggtccgattttttcgtgtactgga（配列番号6）からなる塩基配列を有するプローブ
（２）aaccccaagtccttgtggcttg（配列番号7）からなる塩基配列を有するプローブ
（３）tggaataatggaataggacgtttggttct（配列番号8）からなる塩基配列を有するプローブ
（４）ttttagtgacccactcggcacct（配列番号9）からなる塩基配列を有するプローブ
（５）gctagcatttgctggttgtccact（配列番号10）からなる塩基配列を有するプローブ
第３群：
（１）gatacagggccctttcgggtct（配列番号11）からなる塩基配列を有するプローブ
（２）ttttggcgagtactggacccaac（配列番号12）からなる塩基配列を有するプローブ
（３）ctaaccattcgcccttgtggtgtt（配列番号13）からなる塩基配列を有するプローブ
（４）atcgggtgttgttctttttttgacgc（配列番号14）からなる塩基配列を有するプローブ
（５）aaatagtgctgctagcttttgctggt（配列番号15）からなる塩基配列を有するプローブ
第４群：
（１）atataacgatacagggcctttggtcttg（配列番号16）からなる塩基配列を有するプローブ
（２）ggcggacggtctacctatggtaa（配列番号17）からなる塩基配列を有するプローブ
（３）accaggacgattactttgaggaaattaga（配列番号18）からなる塩基配列を有するプローブ
（４）ggtggtgctactttgcccactc（配列番号19）からなる塩基配列を有するプローブ
（５）agacttctcttgatcttacgggtggt（配列番号20）からなる塩基配列を有するプローブ
（６）aaatagggctgcgagcatctgc（配列番号21）からなる塩基配列を有するプローブ
第５群：
（１）gccggtccatcttttttgatgcgta（配列番号22）からなる塩基配列を有するプローブ
（２）tctggctagcctttttggcgaac（配列番号23）からなる塩基配列を有するプローブ
（３）tcagtattcagtagtcagaggcgaaattc（配列番号24）からなる塩基配列を有するプローブ
（４）tgttgttcttttattgacgcaatcggc（配列番号25）からなる塩基配列を有するプローブ
（５）tgctgctagcatttgctggtatagtc（配列番号26）からなる塩基配列を有するプローブ
第６群：
（１）acaatacagggctcttttgggcc（配列番号27）からなる塩基配列を有するプローブ
（２）ctggtggtcctgtatgctctttactg（配列番号28）からなる塩基配列を有するプローブ
（３）ttgacggaagaccaacaactgcg（配列番号29）からなる塩基配列を有するプローブ
（４）gatcggcccacgtcaatctctg（配列番号30）からなる塩基配列を有するプローブ
（５）cggcgtctagtcgacggaagtt（配列番号31）からなる塩基配列を有するプローブ
第７群：
（１）gaggaacggtctgccttacggta（配列番号32）からなる塩基配列を有するプローブ
（２）ttcattgagtgtgcggtggaacc（配列番号33）からなる塩基配列を有するプローブ
（３）cttagatttacggaagactaacaactgcg（配列番号34）からなる塩基配列を有するプローブ
（４）tcggtccacgttattttctgactgga（配列番号35）からなる塩基配列を有するプローブ
（５）ggactaacagcgtttagctgttggaa（配列番号36）からなる塩基配列を有するプローブ
第８群：
（１）ttctggggaacctcatggcctt（配列番号37）からなる塩基配列を有するプローブ
（２）atagggatagtcgggggcgtca（配列番号38）からなる塩基配列を有するプローブ
（３）aaagcattcgccaaggatgttttcattaa（配列番号39）からなる塩基配列を有するプローブ
（４）cggtgtttctatgatgacccgctc（配列番号40）からなる塩基配列を有するプローブ
（５）cttcttagggggactatcggctca（配列番号41）からなる塩基配列を有するプローブ
第９群：
（１）ggggctcttttgggtctcgtaatt（配列番号42）からなる塩基配列を有するプローブ
（２）ctggggaatctcatggccttcac（配列番号43）からなる塩基配列を有するプローブ
（３）ggatagtcgggggcgtcagtatt（配列番号44）からなる塩基配列を有するプローブ
（４）gtgtttctattatgacccgttcggca（配列番号45）からなる塩基配列を有するプローブ
（５）agacctcggcccttaaatagccc（配列番号46）からなる塩基配列を有するプローブ。
【００１５】
上記の各群は、それぞれ５種のプローブが属しており、第１群〜第９群から選択された少なくとも２つの群のそれぞれから少なくとも１種のプローブを用いてプローブセットを構成することができる。従って、本実施形態にかかるプローブセットは、最少で２種のプローブからなり、最大で４５種のプローブから構成される。
【００１６】
ここで、各群の検出機能は以下のとおりである。
第１群：Candida albicans検出用。
第２群： Candida glabrata検出用。
第３群： Candida guilliermondii検出用。
第４群： Candida krusei検出用。
第５群： Candida parapsilosis検出用。
第６群： Cryptococcus neoformans検出用。
第７群： Trichosporon beigelii検出用。
第８群： Aspergillus fumigatus検出用。
第９群： Aspergillus niger検出用。
【００１７】
これらのプローブ配列の相補的な配列もまた、同じ機能を有する為にプローブ配列として有効であり、これらの相補配列を有するプローブの２以上を用いてプローブセットを構成することができる。
【００１８】
各菌のプローブの設計は、１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をコーディングしているゲノム部分より、当該菌に対し非常に特異性が高く、また、それぞれのプローブ塩基配列でばらつきがなく、十分なハイブリダイゼーション感度が期待できるように行なった。
【００１９】
これらのオリゴヌクレオチドプローブは、担体上に結合された２種以上のプローブと検体とのハイブリダイゼーション反応において、安定なハイブリッド体を形成し、良好な結果を与えるように設計されている。
【００２０】
さらに、本発明にかかる感染症起炎菌検出用プローブが固定されたプローブ固定担体（例えばＤＮＡチップ）は、担体の所定位置にプローブを供給し、固定することにより得ることができる。担体へのプローブの供給には、種々の方法が利用できる。例えば、プローブが化学的結合（共有結合など）により担体に固定可能とし、これを含む液体をインクジェット法により担体の所定位置に付与する方法が好適に利用できる。これにより、プローブが担体から剥がれにくくなるうえ、感度が向上するという付帯的な効果も得られる。つまり、従来から一般的に用いられるスタンフォード法と呼ばれるスタンピング法によりＤＮＡチップを作製した場合、塗布したＤＮＡが剥がれやすい場合があるという欠点があった。また、ＤＮＡチップの作製方法としては、担体表面上でのＤＮＡ合成によりプローブを配置する方法がある（例えば、AffymerixのＤＮＡチップ等）。この担体上でプローブを合成する方法では、各プローブ配列ごとの合成収量が異なる為に、各プローブの固定領域（スポット）ごとにプローブの固定量が大幅に異なる場合が生じる。そのような各プローブの固定量にバラツキがあると、それを用いた検出結果に対する正確な評価ができない場合が生じる。このような観点から、本発明にかかるプローブ担体は、上述したインクジェット法を利用して作製されることが、プローブが担体に安定に固定されは剥がれにくく、高感度と高精度の検出ができるプローブ担体を効率良く提供できるという点から好ましい。
【００２１】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００２２】
本実施形態のＤＮＡチップを用いた検査対象としての検体としては、ヒト、家畜等の動物由来の血液、髄液、喀痰、胃液、膣分泌物、口腔内粘液等の体液、尿及び糞便のような排出物等細菌が存在すると思われるあらゆる物を対象とする。また、食中毒、汚染の対象となる食品、飲料水及び温泉水のような環境中の水等、または空気清浄器等のフィルタなど、細菌による汚染が引き起こされる可能性のある媒体全てが挙げられる。さらに、輸出入時における検疫等の動植物も検体としてその対象とする。
【００２３】
上記のような検体がＤＮＡチップとの反応にそのまま利用できる場合には、それをＤＮＡチップと反応させて、その結果を分析する。また、検体をそのままＤＮＡチップと反応させることができない場合には、標的物質の抽出、精製などの必要に応じた処理を検体に行って得たサンプルをＤＮＡチップと反応させる。例えば、標的核酸が含まれている場合にこれを含むと想定される抽出物画分を検体から調製し、更に必要に応じて洗浄や希釈などの処理を行ってサンプル溶液とし、これをＤＮＡチップと反応させてもよい。更に、ＰＣＲ増幅処理などを含む各種の増幅処理を行って標的核酸が検体に含まれている場合にこれを増幅してＤＮＡチップと反応させるサンプルとしてもよい。このような増幅核酸サンプルには、１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子検出用に設計されたＰＣＲ反応用プライマーを用いて調製された増幅検体、或いはＰＣＲ増幅物を元にさらにＰＣＲ反応等を行なって調製された検体、ＰＣＲ以外の増幅方法により調製された検体、可視化のために各種標識法により標識された検体等、いずれの調製法により調製された検体等が含まれる。
【００２４】
また、本実施形態のＤＮＡチップに用いられる担体としては、ガラス基板、プラスチック基板、シリコンウェハー等の平面基板、凹凸のある三次元構造体、ビーズのような球状のもの、棒状、紐状、糸状のもの等の担体としての特性を満たすものであればあらゆるものが利用できる。さらに、その担体の表面をプローブＤＮＡの固定化が可能なように処理したものも含む。特に、表面に化学反応が可能となるように官能基を導入したものは、ハイブリダイゼーション反応の過程でプローブが安定に結合している為に、再現性の点で好ましい形態である。
【００２５】
本発明に用いられる固定化方法としては、例えば、マレイミド基とチオール（−ＳＨ）基との組合せを用いる例が挙げられる。即ち、プローブの末端にチオール（−ＳＨ）基を結合させておき、担体（固相）表面がマレイミド基を有するように処理しておく。これにより、担体表面に供給されたプローブのチオール基と担体表面のマレイミド基とが反応して共有結合が形成されプローブが固定化される。
【００２６】
マレイミド基の導入には、まず、ガラス基板にアミノシランカップリング剤を反応させ、次にそのアミノ基とＥＭＣＳ試薬（N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimide:Ｄｏｊｉｎ社製）との反応によりマレイミド基を導入する方法が利用できる。ＤＮＡへのＳＨ基の導入は、ＤＮＡ自動合成機上5'-Thiol-Modifier C6（Glen Research社製）を用いることにより行なうことができる。
【００２７】
固定化に利用する官能基の組合せとしては、上記したチオール基とマレイミド基の組合わせ以外にも、例えばエポキシ基（固相上）とアミノ基（核酸プローブ末端）の組合わせ等が挙げられる。また、各種シランカップリング剤による表面処理も有効であり、該シランカップリング剤により導入された官能基と反応可能な官能基を導入したオリゴヌクレオチドが用いられる。さらに、官能基を有する樹脂をコーティングする方法も利用可能である。
【００２８】
本発明にかかるプローブ固定担体を用いた感染症起炎菌遺伝子の検出は、上記の構成のプローブ固定担体と検体を反応させる工程と、前記プローブ固定担体上のプローブと検体中の核酸との反応の有無を検出する工程と、前記プローブと検体中の核酸の反応が検出される場合に、検体中の核酸と反応したプローブを特定し、該プローブの塩基配列に基づいて検体中に含まれる感染症起炎菌遺伝子を特定する工程と、を有する感染症起炎菌遺伝子の検出方法により行うことができる。
【００２９】
先に述べたとおり、検体中に含まれる感染症起炎菌の18S rRNA遺伝子配列をＰＣＲで増幅させてこれをプローブ担体と反応させるサンプルとする場合には、感染症起炎菌の検出用プライマーセットを用いることができる。このプライマーセットとしては以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むものが好適である。
（１）5' gccctatcaactttcgatggtaggatag 3'の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２）5' aatgctctatccccagcacgac 3'の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
【実施例】
【００３０】
以下、Candida albicansを検出するための感染症起炎菌検出用プローブを用いた実施例により、本発明を更に詳細に説明する。
【００３１】
（実施例１）
以下の実施例では、２ Ｓｔｅｐ ＰＣＲ法を用いた微生物の検出について説明する。
【００３２】
［１．プローブＤＮＡの準備］
Candida albicans菌検出用プローブとして表１に示す核酸配列を設計した。具体的には、Candida albicans菌の１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をコーディングしているゲノム部分より、以下に示したプローブ塩基配列を選んだ。これらのプローブ塩基配列群は、当該菌に対し非常に特異性が高く、十分かつそれぞれのプローブ塩基配列でばらつきのないハイブリダイゼーション感度が期待できるように設計されている。なお、表１に示す各プローブ塩基配列はこれに完全に一致したものに限定される必要はなく、該各プローブ塩基配列を含む２０から３０程度の塩基長を有するプローブ塩基配列も表１に示す各プローブ塩基配列に含まれるものとする。
【００３３】
【表１】
2007159411.tif 000002
【００３４】
表１中に示したプローブには、ＤＮＡマイクロアレイに固定するための官能基として、合成後、定法に従って核酸の5'末端にチオール基を導入した。官能基の導入後、精製し、凍結乾燥した。凍結乾燥した内部標準用プローブは、−３０℃の冷凍庫に保存した。
【００３５】
［２．ＰＣＲプライマーの準備］
［２−1．検体増幅用ＰＣＲプライマーの準備］
起炎菌検出用の為の１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（標的遺伝子）増幅用ＰＣＲプライマーとして表２に示す核酸配列を設計した。具体的には、１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をコーディングしているゲノム部分を特異的に増幅するプライマーセット、つまり約１７００塩基長の１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子コーディング領域の両端部分で、特異的な融解温度をできるだけ揃えたプライマーを設計した。なお、菌種が異なっても同時に増幅することができるように、真菌に共通する領域からプライマーを設計した。
【００３６】
【表２】
2007159411.tif 000003
【００３７】
上記表２中に示したプライマーは、合成後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、それぞれのプライマー濃度が、最終濃度10pmol/μlとなるようにＴＥ緩衝液に溶解した。
【００３８】
［２−２．標識用ＰＣＲプライマーの準備］
上述の検体増幅用のプライマーと同様に、標識用のプライマーを以下の表３に示すように設計した。
【００３９】
【表３】
2007159411.tif 000004
【００４０】
表３中に示したプライマーには、蛍光色素としてCy3を用いて、標識を行なった。
【００４１】
合成後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、標識プライマー濃度が、最終濃度10pmol/μlとなるようにＴＥ緩衝液に溶解した。
【００４２】
［３．Candida albicans Ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ（モデル検体）の抽出］
［３−１．微生物の培養  ＆  Ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ 抽出］
まず、Candida albicans標準株（ATCC18804）を、定法に従って培養した。この微生物培養液から、核酸精製キット(FastPrep FP100A・FastDNA Kit:フナコシ株式会社製)を用いて、Ｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡの抽出と精製を行なった。
【００４３】
［３−２． 回収したＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡの検査］
回収された微生物（Candida albicans）のＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡは、定法に従って、アガロース電気泳動と260/280nmの吸光度測定を行い、その品質（低分子核酸の混入量、分解の程度）と回収量を検定した。本実施例では、約10μgのＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡ が回収され、Ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡのデグラデーションやｒＲＮＡの混入は認められなかった。回収したＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡは、最終濃度50ng/μlとなるようにＴＥ緩衝液に溶解し、以下の実施例に使用した。
【００４４】
［４．ＤＮＡマイクロアレイの作製］
［４−１．ガラス基板の洗浄］
合成石英のガラス基板（サイズ：25mm×75mm×1mm、飯山特殊ガラス社製）を耐熱、耐アルカリ のラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩洗浄液中で浸した後、20分間超音波洗浄を行った。続いて基板を取り出し、軽く純水ですすいだ後、超純水中で20分超音波洗浄をおこなった。次に８０℃に加熱した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に10分間基板を浸した。再び純水洗浄と超純水洗浄を行い、ＤＮＡチップ用の石英ガラス基板を用意した。
【００４５】
［４−２．表面処理］
シランカップリング剤KBM-603（信越シリコーン社製）を、１重量(wt）％の濃度となるように純水中に溶解させ、２時間室温で攪拌した。続いて、先に洗浄したガラス基板をシランカップリング剤水溶液に浸し、２０分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に乾燥した基板を１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークし、カップリング剤処理を完結させ、基板表面にアミノ基を導入した。次いで、Ｎ−マレイミドカプロイロキシスクシイミド（以下ＥＭＣＳと略す）を、ジメチルスルホキシドとエタノールの１：１混合（容量比）溶媒中に最終濃度が0.3mg/mlとなるように溶解したＥＭＣＳ溶液を用意した。ＥＭＣＳは、同仁化学研究所社製のＮ−マレイミドカプロイロキシスクシイミド（N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimido）である。
【００４６】
ベークの終了したガラス基板を放冷し、調製したＥＭＣＳ溶液中に室温で２時間浸した。この処理により、シランカップリング剤によって表面に導入されたアミノ基とＥＭＣＳのスクシイミド基が反応し、ガラス基板表面にマレイミド基が導入された。ＥＭＣＳ溶液から引き上げたガラス基板を、先述のＥＭＣＳを溶解した混合溶媒を用いて洗浄し、さらにエタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。
【００４７】
［４−３．プローブＤＮＡ］
実施例１の［１．プローブＤＮＡの準備］で作製した微生物検出用プローブを純水に溶解し、それぞれ、最終濃度（インク溶解時）１０μＭとなるように分注した後、凍結乾燥を行い、水分を除いた。
【００４８】
［４−４．ＢＪプリンタによるＤＮＡ吐出、および基板への結合］
グリセリン7.5wt%、チオジグリコール7.5wt%、尿素7.5wt%、アセチレノールEH（川研ファインケミカル社製）1.0wt%を含む水溶液を用意した。続いて、先に用意した５種類のプローブ（表１）の夫々を上記の混合溶媒に規定濃度なるように溶解した。得られたＤＮＡ溶液をバブルジェットプリンタ（商品名：BJF-850  キヤノン社製）用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。
【００４９】
なおここで用いたバブルジェットプリンタは平板への印刷が可能なように改造を施したものである。またこのバブルジェットプリンタは、所定のファイル作成方法に従って印字パターンを入力することにより、約5ピコリットルのＤＮＡ溶液を約120μmピッチでスポッティングすることが可能となっている。
【００５０】
続いて、この改造バブルジェットプリンタを用いて、１枚のガラス基板に対して、印字操作を行い、アレイを作製した。印字が確実に行われていることを確認した後、３０分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基と核酸プローブ末端のチオール基とを反応させた。
【００５１】
［４−５．洗浄］
３０分間の反応後、100mMのNaClを含む10mMのリン酸緩衝液(pH7.0)により表面に残ったＤＮＡ溶液を洗い流し、ガラス基板表面に一本鎖ＤＮＡが固定した遺伝子チップを得た。
【００５２】
［５．検体の増幅と標識化］
［５−1．検体の増幅：１ｓｔ ＰＣＲ］
検体となる微生物遺伝子の増幅（１ｓｔ ＰＣＲ）、および、標識化（２ｎｄ ＰＣＲ）反応を以下の表４に示す。
【００５３】
【表４】
2007159411.tif 000005
【００５４】
上記組成の反応液を図１に示すプロトコールに従って、市販のサーマルサイクラーで増幅反応を行った。
【００５５】
反応終了後、精製用カラム（QIAGEN  QIAquick PCR Purification Kit）を用いて精製した後、増幅産物の定量を行なった。
【００５６】
［５−２．標識化反応：２ｎｄ ＰＣＲ］
表５の組成の反応液を以下の図２に示すプロトコールに従って、市販のサーマルサイクラーで増幅反応を行った。
【００５７】
【表５】
2007159411.tif 000006
【００５８】
反応終了後、精製用カラム（QIAGEN  QIAquick PCR Purification Kit）を用いて精製し、標識化検体とした。
【００５９】
［６．ハイブリダイゼーション］
上述の［４．ＤＮＡマイクロアレイの作製］で作製した遺伝子チップと［５．検体の増幅と標識化］で作製した標識化検体を用いて検出反応を行った。
【００６０】
［６−１．遺伝子チップのブロッキング］
BSA（牛血清アルブミンFraction V：Sigma社製）を１wt％となるように100mM NaCl/10mM Phosphate Bufferに溶解した。次に、この溶液に［４．ＤＮＡマイクロアレイの作製］で作製した遺伝子チップを室温で2時間浸し、ブロッキングを行った。ブロッキング終了後、以下の洗浄液で洗浄を行った後、純水でリンスしてからスピンドライ装置で水切りを行った。
洗浄液：
0.1wt％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む2×SSC溶液(NaCl 300mM 、Sodium Citrate (trisodium citrate dihydrate, C6H5Na3・2H2O) 30mM、ｐＨ7.0）
［６−２．ハイブリダイゼーション］
水切りした遺伝子チップをハイブリダイゼーション装置（Genomic Solutions Inc.  Hybridization Station）にセットし、以下に示すハイブリダイゼーション溶液、条件でハイブリダイゼーション反応を行った。
【００６１】
［６−３．］ハイブリダイゼーション溶液
6xSSPE / 10% Formamide / Target(2nd PCR Products 全量)/ 0.05wt% SDS
(6xSSPE: NaCl 900mM、NaH2PO4・H2O 50mM、EDTA 6mM、p.H. 7.4)
［６−４．ハイブリダイゼーション条件］
65℃  3min  →  92℃  2min  →  45℃  3hr  →  Wash  2ｘSSC / 0.1% SDS  at 25℃  →  Wash  2xSSC at 20℃  → (Rinse with H2O  :  Manual)  →  Spin dry。
【００６２】
［７．微生物の検出（蛍光測定）］
上記ハイブリダイゼーション反応終了後の遺伝子チップを遺伝子チップ用蛍光検出装置（Axon社製、GenePix 4000B）を用いで蛍光測定を行った。その結果、再現性良く、十分なシグナルでCandida albicansを検出することができた。また、他の菌のプローブに対する明確なハイブリッド体は検出されなかった。
【００６３】
[８．その他の菌種の検出]
上記と同様にして以下に挙げる各菌種の検出のためのプローブセットの設計、作成及び検査処理（ハイブリダイゼーション反応）を行った。表６〜１４にプローブセットに用いたプローブの有する配列を配列番号で示した。
（１）Candida glabrata。
（２）Candida guilliermondii。
（３）Candida krusei。
（４）Candida parapsilosis。
（５）Cryptococcus neoformans。
（６）Trichosporon beigelii。
（７）Aspergillus fumigatus。
（８）Aspergillus niger。
［９.結果］
結果を以下の表６〜表１４に示す。実際に得られた輝度値のＳＮ比により、次の記号で示す。ＳＮ比が3より大きい場合「＋＋＋」、ＳＮ比が2より大きく3以下の場合「＋＋」、SN比が1より小さく2以下の場合「＋」、ＳＮ比が1以下の場合「−」となっている。
【００６４】
【表６】
2007159411.tif 000007
【００６５】
【表７】
2007159411.tif 000008
【００６６】
【表８】
2007159411.tif 000009
【００６７】
【表９】
2007159411.tif 000010
【００６８】
【表１０】
2007159411.tif 000011
【００６９】
【表１１】
2007159411.tif 000012
【００７０】
【表１２】
2007159411.tif 000013
【００７１】
【表１３】
2007159411.tif 000014
【００７２】
【表１４】
2007159411.tif 000015
【００７３】
以上説明したように、上記実施例によれば、表６〜１４に記載の９種菌を検出可能なプローブセットを固定したＤＮＡマイクロアレイを作製できた。更に、このＤＮＡマイクロアレイを用いて、感染症起炎菌を同定することが可能になり、微生物由来のＤＮＡプローブの問題を解決した。すなわち、オリゴヌクレオチドプローブは化学的に大量合成が可能であり、精製や濃度のコントロールが可能である。また、真菌の種による分類を目的に、同じ種の菌種は一括検出が可能で、しかも、他の種の真菌は区別して検出できるようなプローブセットが提供できた。
【００７４】
また、上記実施形態によれば、感染症起炎菌遺伝子の１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を過不足なく検出することにより、該感染症起炎菌の存在を効率良く、また高い精度で判定することができる。
【００７５】
（実施例２）
以下の実施例では、実施例１で用いた９種菌の増幅について説明する。
【００７６】
［１．検体増幅用ＰＣＲプライマーの準備］
検体増幅用のための１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（標的遺伝子）増幅用ＰＣＲプライマーとして、下記の表１５に示す核酸配列を設計した。
【００７７】
具体的には、１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をコーディングしているゲノム部分を特異的に増幅するプライマーセット、つまり約１７００塩基長の１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子コーディング領域の両端部分で、特異的な融解温度をできるだけ揃えたプライマーを設計した。なお、変異株や、ゲノム上に複数存在する１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子コーディング領域も同時に増幅できるように、プライマーを設計した。
【００７８】
また、特にヒトのゲノムと菌のゲノムとが混入している実験系であっても、菌のゲノムのみを選択的に増幅することができるように、プライマーを設計した。
【００７９】
【表１５】
2007159411.tif 000016
【００８０】
表１５中に示したプライマーは、合成後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製され、Forward Primerと2種のReverse Primerの全てを混合した。その際、それぞれのプライマー濃度が、最終濃度10 pmol/μlとなるようにＴＥ緩衝液に溶解した。なお本実施例では２種のReverse Primerを用いたが、いずれか1種類を用いるようにしても良い。
【００８１】
［２．Candida albicans Ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ（モデル検体）の抽出］
［２−１．微生物の培養  ＆  Ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ の抽出］
まず、Candida albicans標準株（ATCC18804）を、定法に従って培養した。この微生物培養液から、核酸精製キット(FastPrep FP100A・FastDNA Kit:フナコシ株式会社製)を用いて、Ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡの抽出と精製を行なった。
【００８２】
［２−２．回収したＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡの検査］
回収された微生物（Candida albicans）のＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡは、定法に従って、アガロース電気泳動と260/280nmの吸光度測定を行ない、その品質（低分子核酸の混入量、分解の程度）と回収量を検定した。本実施例では、約10μgのＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡ が回収され、Ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡのデグラデーションやｒRNAの混入は認められなかった。回収したGenome ＤＮＡは、最終濃度50ng/μlとなるようにＴＥ緩衝液に溶解し、以下に使用した。
【００８３】
上記ＤＮＡを用いて以下の表１６に示す反応溶液を調製した。
【００８４】
【表１６】
2007159411.tif 000017
【００８５】
上記の組成の反応液を図１に示すプロトコールに従って、市販のサーマルサイクラーで増幅反応を行なった。反応終了後、精製用カラム（QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit）を用いて精製した後、増幅産物にゲル電気泳動を行なった。その結果、9菌種いずれも1700塩基対領域付近に1バンドが検出され、良好にＰＣＲ反応が行なわれていることが確認できた。
【００８６】
（実施例３）
以下の実施例では、実施例２で使用したプライマーでヒトゲノム中の１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をコーディングしている部分が増幅されないことを説明する。
【００８７】
ヒトゲノムをＰＣＲ反応用のテンプレートとして、実施例２と同様、プライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行なった。その結果、ＰＣＲにより増幅されたとみられるバンドは検出されず、実施例２中の表１５におけるプライマーセットでは、ヒトゲノムの増幅は行なわれないことが確認できた。このことは、ヒトゲノムと菌ゲノムとが混入しているとみられる臨床検体に対して、本発明によるプライマーセットでは、菌ゲノムの１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のみを選択的に増幅できることを示している。
【００８８】
（実施例４）
以下の実施例では、２つの菌が検体中に含まれている場合に、それぞれの菌を同時に検出できることを説明する。
［１． 検体モデルの作成］
実施例1の［３−１．微生物の培養＆ＧｅｎｏｍｅＤＮＡ］に説明する方法により、Candida kruseiとAspergillus fumigatusを培養し、Ｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡの抽出と精製を行なった。
［２．遺伝子チップの作成］
実施例１の［４． 検体の増幅と標識化］に説明する方法により、ＤＮＡマイクロアレイを作成した。今回は、Candida kruseiとAspergillus fumigatusが同時に検出できることを説明するのが目的であるため、以下の表１７に示すプローブに限定して固定したＤＮＡマイクロアレイを作成した。
【００８９】
【表１７】
2007159411.tif 000018
【００９０】
［３． 検体の増幅と標識化］
実施例1の［５． 検体の増幅と標識化］に説明する方法により、［１．検体モデルの作成］にて抽出・精製したCandida kruseiとAspergillus fumigatusのＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡを混合したTemplate DNAの増幅と標識化を行なった。
【００９１】
［４．ハイブリダイゼーション］
上述の［２． 検体の増幅と標識化］で作成した標識化検体と、実施例１の［４．ＤＮＡマイクロアレイの作製］で作製した遺伝子チップを用いて、実施例１［６．ハイブリダイゼーション］にて説明する検出反応を行なった。
【００９２】
［５．微生物の検出（蛍光検出）］
上記ハイブリダイゼーション反応終了後の遺伝子チップを遺伝子チップ用傾向検出装置(Axon社製、GenePxi 4000B)を用いて蛍光測定を行なった。同様の実験を二度行ない得られた輝度を標準化した結果を以下の表１８に示す。
【００９３】
なお、実際に得られた輝度値のＳＮ比により、次の記号で示す。ＳＮ比が3より大きい場合「＋＋＋」、ＳＮ比が2より大きく3以下の場合「＋＋」、SN比が1より小さく2以下の場合「＋」、ＳＮ比が1以下の場合「−」となっている。
【００９４】
【表１８】
2007159411.tif 000019
【００９５】
一回目の実験と二回目の実験で、輝度の絶対値に違いはあったが、標準化した結果、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号39、配列番号40、配列番号41の輝度が著しく高くなることが分かった。この配列番号のプローブは表１７に示すように、それぞれCandida kruseiとAspergillus fumigatusを判別するプローブであり、以上の結果より検体中に二種類の菌のＧｅｎｏｍｅが含まれていても、本実施例に示すＤＮＡチップにてそれぞれの存在を判別できることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】ＰＣＲの条件を示す図である。
【図２】ＰＣＲの条件を示す図である。
【図１】
2007159411.tif 000020
【図２】
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【配列表】
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