(57)【要約】【課題】微粒子に抗体等を固定化して測定を行う方法においては，化学結合により抗体等を効率的に固定化するために，簡易的かつ迅速に，しかも低コストで微粒子への固定化反応を評価できるようなシステムが求められている。【解決手段】そこで本発明では，カルボキシル基を有する微粒子１を第１の物質と反応させてカルボジイミド化する第１の工程と，カルボジイミド化した微粒子の中間体を第２の物質４と反応させてエステル化により活性化する第２の工程と，第２の工程により活性化した微粒子の中間体５をアミノ基を有する第３の物質８と反応させて第２の物質４を脱離する第３の工程と，脱離した第２の物質の量を吸光度測定により測定する第４の工程から成る微粒子への固定化対象物質の固定化の間接評価方法を提案する。【選択図】    図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボキシル基を有する微粒子を第１の物質と反応させてカルボジイミド化する第１の工程と，カルボジイミド化した微粒子の中間体を第２の物質と反応させてエステル化により活性化する第２の工程と，第２の工程により活性化した微粒子の中間体をアミノ基を有する第３の物質と反応させて第２の物質を脱離する第３の工程と，脱離した第２の物質の量を吸光度測定により測定する第４の工程から成る微粒子への固定化対象物質の固定化の間接評価方法。
【請求項２】
第１の物質が、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロビル）カルボジイミドヒドロクロリド（EDC）である請求項１に記載の微粒子への対象物質の固定化の間接評価方法。
【請求項３】
第２の物質がＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（Sulfo-NHS）である請求項１に記載の微粒子への対象物質の固定化の間接評価方法。
【請求項４】
第２の物質がＮ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）である請求項１に記載の微粒子への対象物質の固定化の間接評価方法。
【請求項５】
第３の物質が第一級アミンである請求項１に記載の微粒子への対象物質の固定化の間接評価方法。
【請求項６】
第一級アミンがエタノールアミンである請求項４−に記載の微粒子への対象物質の固定化の間接評価方法。
【請求項７】
固定化対象物質が抗原又は抗体である請求項１に記載の微粒子への対象物質の固定化の間接評価方法。
【請求項８】
固定化対象物質が核酸である請求項１に記載の微粒子への対象物質の固定化の間接評価方法。
【請求項９】
微粒子がポリスチレン粒子である請求項１に記載の微粒子への対象物質の固定化の間接評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微粒子への固定化対象物質の固定化の間接評価方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
例えばポリスチレンビーズ等の微粒子に抗体や抗原等の蛋白質やDNAやRNA等の核酸を固定化して測定を行う各種の方法が従来から知られている。
【０００３】
例えば特許文献１には，測定対象物である抗原と，ポリスチレンビーズや磁性微粒子に固定化された抗体と、標識試薬を固定化した抗体とから生成する固定化抗体−抗原−標識抗体の複合体を反応槽から検出器に導入し，この複合体の標識抗体からの信号を検出器によって測定することにより試料中の抗原濃度を測定する免疫測定装置が記載されている。
【０００４】
このような測定分野において，ポリスチレン等のカルボキシル基を有する微粒子に抗体や抗原等の蛋白質やDNAやRNA等の核酸を固定化するための方法の一つとして，次に示すような抗体の結合反応方法がある。
【０００５】
この結合反応方法では，まず第１の工程として，図１に示すように，カルボキシル基を有する微粒子１を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロビル）カルボジイミドヒドロクロリド（EDC）２と反応させて，カルボジイミド化した微粒子の中間体３を得る。
【０００６】
次いで，第２の工程として，図２に示すように，第１の工程において，カルボジイミド化した微粒子の中間体３を，Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（Sulfo-NHS）４と反応させて，Sulfo-NHSエステル化により活性化した微粒子の中間体５を得る。
【０００７】
次いで，第３の工程として，図３に示すように，第２の工程においてエステル化により活性化した微粒子の中間体５と，例えば抗体６のアミノ基を反応させ，アミド結合を用いて抗体６を固定化した微粒子１を得る。こうして，この抗体等を固定化した微粒子１を利用して免疫測定等の測定を行うことができる。
【０００８】
以上の方法を用いた方法では，第２の工程において，Sulfo-NHSエステル化により活性化した微粒子の中間体５が正常に合成されないと，第３の工程において，アミド結合を用いて抗体６を固定化した微粒子１を得ることができない。逆に，第２の工程において，Sulfo-NHSエステル化により活性化した微粒子の中間体５が正常に合成されると，第３の工程においてアミド結合を用いて抗体６を固定化した微粒子１を確実に得ることが可能である。
【０００９】
以上の方法を用いて微粒子に抗体等が確実に固定化されるか否かの評価を行う場合，従来は，上記第３の工程において得られた抗体６を固定化した微粒子１に，図４に示すように，フルオレセインイソチオシアネート（FITC）等の蛍光色素により標識した二次抗体７を反応させて，二次抗体標識を行い，これをフローサイトメータやプレートリーダ等の測定器を用いて測定することにより評価を行っていた。
【特許文献１】特開平１０−１１１２９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら上述した従来の評価方法では，次に示すような課題があった。
１．上述した通り，第１の工程から第３の工程に至る工程が正常に行われているか否かの確認は，第３の工程後に，二次抗体標識により行うので，化学結合で結合した抗体も，物理吸着で結合した抗体も，渾然一体として微粒子に固定化された抗体として測定されてしまい，正常な結合化を正確に評価できない。
２．第３の工程において使用する一次抗体と，その後使用する標識付二次抗体は極めて高価なため，微粒子に抗体が化学結合により固定化されたかどうかの評価のためだけにこれらの抗体を使用することは無駄である。
３．抗体が化学結合により固定化された微粒子に標識付二次抗体を結合させて測定するフローサイトメータやプレートリーダ等の測定器は非常に高価であり，どこの施設にでも常備されているものではない。
【００１１】
以上のことから，化学結合により抗体を微粒子に効率的に固定化するために，簡易的かつ迅速に，しかも低コストで抗体の微粒子への固定化反応を評価できるようなシステムが求められている。
本発明は以上の課題を解決することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上述した課題を解決するために，本発明では，カルボキシル基を有する微粒子を第１の物質と反応させてカルボジイミド化する第１の工程と，カルボジイミド化した微粒子の中間体を第２の物質と反応させてエステル化により活性化する第２の工程と，第２の工程により活性化した微粒子の中間体をアミノ基を有する第３の物質と反応させて第２の物質を脱離する第３の工程と，脱離した第２の物質の量を吸光度測定により測定する第４の工程から成る微粒子への固定化対象物質の固定化の間接的評価方法を提案する。
【００１３】
そして本発明では，上記の方法において，第１の物質として１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロビル）カルボジイミドヒドロクロリド（EDC）を用いることを提案する。
【００１４】
また本発明では，上記の方法において，第２の物質としてＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（Sulfo-NHS）やＮ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）を用いることを提案する。
【００１５】
また本発明では，上記の方法において，第３の物質として第一級アミンを用いることを提案する。そして本発明では、第一級アミンとしてエタノールアミンを用いることを提案する。
【００１６】
また本発明では，上記の方法において，固定化対象物質は抗原又は抗体とすることができる。
【００１７】
また本発明では，上記の方法において，固定化対象物質は核酸とすることができる。
【００１８】
また本発明では，上記の方法において，微粒子はポリスチレン粒子とすることができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明では第１の工程においてカルボキシル基を有する微粒子を第１の物質と反応させてカルボジイミド化し，次いで第２の工程においてカルボジイミド化した微粒子の中間体を第２の物質と反応させてエステル化により活性化した微粒子を得た後，第３の工程においてアミノ基を有する第３の物質と反応させて第２の物質を脱離し，この第２の物質の脱離した量を吸光度測定により測定することにより，第２の工程においてエステル化により活性化した微粒子の中間体が確実に合成されたか否かを評価することができる。
【００２０】
上述したとおり，第２の工程において，エステル化により活性化した微粒子の中間体が正常に合成されると，その後，アミド結合を用いて抗体等を固定化した微粒子を確実に得ることが可能であるので，第２の工程においてエステル化により活性化した微粒子の中間体が確実に合成されたか否かを評価することにより，次の工程においてアミド結合を用いて抗体等を固定化した微粒子が確実に得られるか否かを間接的に評価することができる。
【００２１】
このため従来の方法のように，物理吸着で微粒子に結合した抗体等を，渾然一体に測定してしまうことを防ぐことができる。
【００２２】
また，フローサイトメータやプレートリーダ等の高価な装置を使用する必要がなくなる。
【００２３】
また，例えば微粒子に抗体を固定化する場合において，それが確実に行われるか否かの評価を行う際に，高価な一次抗体や二次抗体を使用する必要がなくなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
次に本発明の実施の形態を添付図面を参照して説明する。
まず第１の工程では，従来の方法と同様に，図１に示すように，カルボキシル基を有する微粒子１を，１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロビル）カルボジイミドヒドロクロリド（EDC）２と反応させて，カルボジイミド化した微粒子の中間体３を得る。ここで微粒子としては，例えば直径3〜10μｍ程度のポリスチレン粒子を用いることができる。この場合，微粒子１の表面の官能基密度は4〜35μmol/gとするのが好ましい。
【００２５】
次いで，第２の工程では，やはり従来の方法と同様に，図２に示すように，第１の工程において，カルボジイミド化した微粒子の中間体３を，Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（Sulfo-NHS）４と反応させて，Sulfo-NHSエステル化により活性化した微粒子の中間体５を得る。
【００２６】
次いで，第３の工程では，従来の方法とは異なり，図５に示すように，Sulfo-NHSエステル化により活性化した微粒子１の中間体５を，エタノールアミン８と反応させる。この反応は置換反応であり，Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（Sulfo-NHS）４が置換反応によりエタノールアミンと置換されて，脱離する。
【００２７】
ここで，Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（Sulfo-NHS）４は，260ｎｍ付近での特異的な吸収波長を有するので，第４の工程において，その波長における吸光度測定を行うことにより，濃度，従って，脱離した量を確実に測定することができる。この吸光度測定は，分光器又は吸光度計のような一般的な測定装置により，容易に，そして迅速に行うことができる。
【００２８】
こうして，本発明では，脱離したＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（Sulfo-NHS）４の量を測定することにより，第２の工程においてSulfo-NHSエステル化が確実に行われたか否か，即ちSulfo-NHSエステル化により活性化した微粒子１の中間体５が正常に合成されたか否かを評価することができる。
【００２９】
そして，第２の工程において，Sulfo-NHSエステル化により活性化した微粒子の中間体５が正常に合成されると，その後，アミド結合を用いて抗体を固定化した微粒子を確実に得ることが可能であるので，第２の工程においてエステル化により活性化した微粒子の中間体が確実に合成されたか否かを評価することにより，次の工程においてアミド結合を用いて抗体を固定化した微粒子が確実に得られるか否かを間接的に評価することができる。
【００３０】
尚，Sulfo-NHSエステル化により活性化した微粒子１の中間体５の表面上の全てのSulfo-NHSエステルと抗体が反応することは困難である。その理由は，抗体自体が直径10nmぐらいのナノ微粒子であるからである．例えば，約5μmの微粒子表面上の官能基数は100000000〜3000000000程度であるが，実際それに結合することができる抗体の数は最大でも1200000個程度である．しかしながら，上記第３の工程に用いるエタノールアミンは，抗体よりも小さいため，微粒子表面上の全てのsulfo-NHSエステルと反応することが可能である．このため，エタノールアミンでsulfo-NHSの置換反応を行う本発明の方法では，微粒子表面上のsulfo-NHSエステル化の定量を，より正確に行うことが可能である。
【実施例１】
【００３１】
以下に本発明の実施例を示す。
(１)  使用する試薬等
・微粒子：polystyrene calboxylate
Surface functional group=COOH
Solid content=4w/v％
Diameter=5.3μm
Charge density= 35μeq/gram
Color=blue
・バッファ：PBS pH7.4
・Sulfo-NHS(N-Hydroxysulfosuccinimide)  MW=217.14
・EDC(1-Ethyl-3-[3-Dimethylaminopropyl]
carbodiimide Hydrochloride)
MW=191.7
・エタノールアミン・・・5M  pH約10程度
(２)  操作手順
1.  Stock用微粒子を約20秒間ボルテックスミキサーにより，再懸濁する。
2.  Stock用微粒子のうち5.0×106個，10.31μlをマイクロチューブに分注する。
3.  マイクロチューブに300μlのバッファーを加え，20秒ボルテックスミキサーにより再懸濁する。(洗浄)
4.  マイクロチューブを8000G，2分，25℃，高速遠心分離にかけ，ペレット状にする。
5.  マイクロチューブの上清を取り除き，タッピングする。
6.  マイクロチューブにバッファー，各量を加え，20秒ボルテックスミキサーにより再懸濁する。
7.  マイクロチューブにSulfo-NHS，50mg/mlを加え，ボルテックスミキサーによりゆっくりかきまぜる。
8.  マイクロチューブにEDC，50mg/mlを加え，ボルテックスミキサーによりゆっくりかきまぜる。
9.  10分ごとにボルテックスミキサーをかけながら，20分，25 ℃で，インキュベートする。
10分(インキュベート)→ボルテックスミキサー→10分(インキュベート)
10. マイクロチューブを8000G，2分，25℃，高速遠心分離にかけ，ペレット状にする。
11. マイクロチューブの上清を取り除き，タッピングする。
12. マイクロチューブにバッファー，250μlを加え，20秒ボルテックスミキサーにより再懸濁する。(洗浄)
13. マイクロチューブの上清を取り除き，タッピングする。
14. マイクロチューブにバッファー100μlを加え，20秒ボルテックスミキサーにより再懸濁する。
15. 5Mエタノールアミンを200μl ずつ各々のマイクロチューブに加える。
16. 各々のマイクロチューブをボルテックスミキサーで混合する。
17. 各々のマイクロチューブを回転させながら30分，25℃，インキュベートする。
18．マイクロチューブを8000G，2分，25℃，高速遠心分離にかけ，ペレット状にする。
19. マイクロチューブの上清を取り除き，タッピングする。
20. マイクロチューブにバッファーを500μl加え，20秒ボルテックスミキサーにより再懸濁する。(洗浄)
21. マイクロチューブを8000G，2分，25℃，高速遠心分離にかけ，ペレット状にする。
22. マイクロチューブの上清を取り除き，タッピングする。
23. マイクロチューブにバッファーを500μl加え，20秒ボルテックスミキサーにより再懸濁する。(洗浄)
24. マイクロチューブを8000G，2分，25℃，高速遠心分離にかけ，ペレット状にする。次いで，マイクロチューブの上清を別のチューブに移し，吸光度測定(吸収波長260nm付近)による評価を行う。この吸光度測定においては，予め，標準として，sulfo-NHSを用いて希釈系列による濃度と吸光度の検量線を引いておく。
【００３２】
尚、以上に説明した実施の形態では、カルボジイミド化した微粒子の中間体と反応させてエステル化により活性化する第２の物質としてSulfo-NHSを用いているが、これに代えて、NHSを用いることができる。
【００３３】
また以上に説明した実施の形態では、アミノ基を有する第３の物質としてエタノールアミンを用いているが、第３の物質としては、第一級アミンの中から適宜に選択して用いることができる。但し、エタノールアミンは、反応性が高く、置換がしやすいので、好適である。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明は以上のとおり，第１の工程においてカルボキシル基を有する微粒子を第１の物質と反応させてカルボジイミド化し，次いで第２の工程においてカルボジイミド化した微粒子の中間体を第２の物質と反応させてエステル化により活性化した微粒子の中間体を得た後，第３の工程においてアミノ基を有する第３の物質と反応させて第２の物質を脱離し，この第２の物質の脱離した量を吸光度測定により測定することにより，第２の工程においてエステル化により活性化した微粒子が確実に合成されたか否かを評価することができので，以下に示すような特徴を有し，産業上の利用可能性が大である。
【００３５】
１．上述したとおり，第２の工程において，エステル化により活性化した微粒子の中間体が正常に合成されると，その後，アミド結合を用いて抗体等を固定化した微粒子を確実に得ることが可能であるので，第２の工程においてエステル化により活性化した微粒子の中間体が確実に合成されたか否かを評価することにより，次の工程においてアミド結合を用いて抗体等を固定化した微粒子が確実に得られるか否かを間接的に評価することができる。
２．このため従来の方法のように，物理吸着で微粒子に結合した抗体等を，渾然一体に測定してしまうことを防ぐことができる。
３．また，フローサイトメータやプレートリーダ等の高価な装置を使用する必要がなくなる。
４．例えば微粒子に抗体を固定化する場合において，それが確実に行われるか否かの評価を行う際に，高価な一次抗体や二次抗体を使用する必要がなくなる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明及び従来の方法における第１の工程の反応を示す説明図である。
【図２】本発明及び従来の方法における第２の工程の反応を示す説明図である。
【図３】従来の方法における第３の工程の反応を示す説明図である。
【図４】従来の方法において，第３の工程において抗体が確実に固定化されたか否かの確認を行うための二次抗体標識を行う反応を示す説明図である。
【図５】本発明の方法における第３の工程の反応を示す説明図である。
【符号の説明】
【００３７】
１    微粒子
２    第１の物質…１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロビル）カルボジイミドヒドロクロリド（EDC）
３    カルボジイミド化した微粒子の中間体
４    第２の物質…Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（Sulfo-NHS）又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）
５    エステル化により活性化した微粒子の中間体
６    抗体
７    二次抗体
８    第３の物質…第一級アミン（エタノールアミン）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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