(57)【要約】【課題】炭疽病に抵抗性の市販のトウガラシ品種を開発すること。【解決手段】本発明は、Ｃａｐｃｉｃｕｍ  ｂａｃｃａｔｕｍ由来の病原関連タンパク質１０をコードする、配列番号１の、単離された核酸分子を提供する。さらに、本発明は、ｃＤＮＡクローンによってコードされる、配列番号２の、単離された病原関連１０（ＣｂＰＲ−１０）タンパク質であって、該ＣｂＰＲ−１０タンパク質は、ホスフェート結合ループ（Ｐ−ループ）モチーフＧｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙをさらに含み、ここでＸは任意のアミノ酸を意味する、ＣｂＰＲ−１０タンパク質を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃａｐｃｉｃｕｍ  ｂａｃｃａｔｕｍ由来の病原関連タンパク質１０をコードする、配列番号１の、単離された核酸分子。
【請求項２】
ｃＤＮＡクローンによってコードされる、配列番号２の、単離された病原関連１０（ＣｂＰＲ−１０）タンパク質であって、該ＣｂＰＲ−１０タンパク質は、ホスフェート結合ループ（Ｐ−ループ）モチーフＧｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙをさらに含み、ここでＸは任意のアミノ酸を意味する、ＣｂＰＲ−１０タンパク質。
【請求項３】
調節配列とともに配列番号１のポリヌクレオチドを含む、Ｅ．ｃｏｌｉまたは植物の細胞の形質転換のための発現ベクター。
【請求項４】
微生物または植物細胞において、請求項３に記載の発現ベクターの発現によって得られるタンパク質。
【請求項５】
請求項３に記載の発現ベクターで形質転換された、微生物。
【請求項６】
請求項３に記載の発現ベクターで形質転換された、トランスジェニック植物細胞。
【請求項７】
請求項６に記載のトランスジェニック植物細胞から生長した、抵抗性が増強された、トランスジェニック植物。
【請求項８】
誘導性病原関連タンパク質１０遺伝子プロモーターであって、該プロモーターは、Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｂａｃｃａｔｕｍにおけるタンパク質の発現を天然で駆動する、配列番号３の核酸分子である、誘導性病原関連タンパク質１０遺伝子プロモーター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｂａｃｃａｔｕｍ由来の病原関連−１０（ＣｂＰＲ−１０）タンパク質をコードするＤＮＡ配列に関する。このｇＤＮＡは、プロモーターについての新規核酸配列を含む。ＣｂＰＲ−１０ポリペプチドは、弱いリボヌクレアーゼ活性を示し、この活性は、そのタンパク質の真菌誘導性のリン酸化の後に強くなる。本発明はまた、植物の形質転換のためまたは産業上の使用のための遺伝子構築物中に、本発明または他の適切なプロモーターおよびターミネーターと融合されたｃＤＮＡ配列を含む配列に関する。この遺伝子構築物の植物中のそのような発現は、植物病原性真菌、特に炭疽病真菌に対する増加した抵抗性を生じる。
【背景技術】
【０００２】
（先行技術の説明）
植物は、植物病原体の侵入に対して、協調されそして統合された代謝性変更のセットによって応答する。この病原体に抵抗するために、過敏感反応（ＨＲ）および全身性の後天性抵抗性（ＳＡＲ）の発生に付随して、それぞれその植物の感染部位および遠位部分において種々の遺伝子が誘導される。これらの遺伝子としては、病原性関連（ＰＲ）タンパク質および抗生物質タンパク質などが挙げられる。
【０００３】
このＰＲタンパク質は、病原性感染に応答して植物において合成されるクラスのタンパク質である。通常、ＰＲタンパク質は、健常な植物には存在しないが、病原性のストレスまたは関連するストレスに応答して合成される。最近の提案では、ＰＲタンパク質は、その配列、血清学的特性および生物学的活性に基づいて１４のファミリーに分類されている。ほとんどのＰＲが細胞外タンパク質であるところ、ＰＲ−１０は、エリシター（ｅｌｉｃｉｔｏｒ）での処理の際にパセリ培養細胞において細胞内タンパク質として最初に記載される。この細胞内ＰＲ−１０は、植物細胞においてウイルスＲＮＡまたは他の病原体のＲＮＡを切断する能力を有すると推定される。非特許文献６（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）によれば、Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍから単離されたＣａＰＲ−１０タンパク質は、ＴＭＶ−Ｐ０接種の際にリン酸化され、そしてウイルスＲＮＡを切断し得る種類のＲＮａｓｅとして機能する。また、組み換えＣａＰＲ−１０は、卵菌類の増殖およびウイルス感染を阻害した。従って、細胞質ゾル性のリン酸化されたＰＲ−１０タンパク質は、病原体感染に対して誘導性の防御機構の活性成分であると示唆されている。
【０００４】
栽培されているトウガラシ（ｐｅｐｐｅｒ）の大部分の系統は、Ｃ．ａｎｎｕｕｍ種から開発されている。これらの種は、炭疽病真菌に非常に感受性である。炭疽病病害の病原性因子であるＣｏｌｌｅｔｏｒｉｃｈｕｍ  ａｃｕｔａｔｕｍは、広く栽培されているトウガラシ品種において最も破滅的な病害を引き起こし、そして重大な経済的な損失を生じる。炭疽病真菌によって、ほとんどの重大な障害が、トウガラシの果実に生じる。この病原体は、クチクラ細胞に浸透した後、壊死性となり、その結果、真菌の菌糸がその果実のクチクラ下の組織中で細胞内にコロニーを作る。ＰＲ−１０は、植物細胞の細胞質に局在化することから、このＰＲ−１０は、真菌感染の間のＰＲ−１０タンパク質の阻害効果を試験するのに価値がある。従って、本発明者らは、Ｃ．ｂａｃｃａｔｕｍ由来のＰＲ−１０遺伝子を単離し、そして特徴付けた。この遺伝子は、炭疽病真菌と不適合性の相互作用を示した。また、相対的なリボヌクレアーゼおよび抗真菌活性を、以前に報告された感受性の種であるＣ．ａｎｎｕｕｍのＣａＰＲ−１０タンパク質と比較した。
【０００５】
いくつかのＣａｐｓｉｃｕｍ属について、炭疽病真菌に抵抗性を示す受託物（例えば、Ｃ．ｂａｃｃａｔｕｍおよびＣ．ｃｈｉｎｅｎｓｅの種）が存在する。抵抗性の種の防御関連遺伝子が利用可能となる場合、そのことで感受性の種にその遺伝子を移入する機会が提供される。最近、遺伝子工学技術は、真菌抵抗性種から単離された抵抗性関連遺伝子を用いた制御システムの開発を通じて、栽培されているトウガラシ系統における破滅的な病害からの救済を提供しつつある。究極的には、ＣｂＰＲ−１０タンパク質のバイオテクノロジー上の応用は、有毒な副作用なしに、トウガラシ栽培において農地管理上意味のあるレベルの病害制御を提供し得る。
【非特許文献１】Ｂａｎｔｉｇｎｉｅｓ  Ｂ，  Ｓｅｇｕｉｎ  Ｊ，  Ｍｕｚａｃ  Ｉ，  Ｄｅｄａｌｄｅｃｈａｍｐ  Ｆ，  Ｇｕｌｉｃｋ  Ｐ，  Ｉｂｒａｈｉｍ  Ｒ  （２０００）．  Ｄｉｒｅｃｔ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ＰＲ−１０−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｗｈｉｔｅ  ｌｕｐｉｎ  ｒｏｏｔｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  ｂｉｏｌ．  ４２：  ８７１−８１
【非特許文献２】Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ＭＭ  （１９７６）．  Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｇｒａｍ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７２：  ２４８−２５４
【非特許文献３】Ｋｉｍ  ＫＨ，  Ｙｏｏｎ  ＪＢ，  Ｐａｒｋ  ＨＧ，  Ｐａｒｋ  ＥＷ，  Ｋｉｍ  ＹＨ  （２００４）．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｏｆ  ｃｈｉｌｉ  ｐｅｐｐｅｒ  ｆｒｕｉｔ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ９４：  １２９５−１３０４
【非特許文献４】Ｌａｅｍｍｌｉ  ＵＫ  （１９７０）．  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４．  Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：  ６８０−６８５
【非特許文献５】Ｍａｔｔｏｎ  ＤＰ，  Ｂｒｉｓｓｏｎ  Ｎ  （１９８９）．  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｏｆ  ｐｏｔａｔｏ．  Ｍｏｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ  ２：  ３２５−３３１
【非特許文献６】Ｐａｒｋ  Ｃ−Ｊ，  Ｋｉｍ  Ｋ−Ｊ，  Ｓｈｉｎ  Ｒ，  Ｐａｒｋ  ＪＭ，  Ｓｈｉｎ  ＹＣ，  Ｐａｅｋ  ＫＨ  （２００４）．  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １０  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｏｔ  ｐｅｐｐｅｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｓ  ａ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ａｎ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３７：  １８６−１９８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、炭疽病に抵抗性の市販のトウガラシ品種を開発することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、配列番号２の病原関連タンパク質１０（ＣｂＰＲ−１０）と命名された、Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｂａｃｃａｔｕｍ由来の配列番号１のｃＤＮＡクローンに関する。Ｃ．ｂａｃｃａｔｕｍの果実は、炭疽病真菌であるＣｏｌｌｅｔｏｒｉｃｈｕｍ  ａｃｕｔａｔｕｍに対して抵抗性である。しかし、ほとんどの商用のトウガラシ品種は、Ｃ．ａｎｎｕｕｍから開発されており、この品種は、その真菌に対して非常に感受性である。これまで、炭疽病に抵抗性の市販の品種は、開発されていない。この研究において、炭疽病真菌は、果実のクチクラ細胞にコロニー形成することから、細胞内病原性関連タンパク質ＰＲ−１０を抵抗性のトウガラシ種からクローニングし、そしてその真菌を伴う果実の不適合性の反応において機能的な関連を明らかにした。
【０００８】
ＣｂＰＲ−１０の推定アミノ酸配列は、Ｃ．ａｎｎｕｕｍ種に由来のＣａＰＲ−１０と９６％の同一性を示し、そしてＰＲ−１０タンパク質の間で保存されるＰ−ループを含む。しかし、いくつかの推定リン酸化部位は、ＣａＰＲ−１０のものとは異なる。１９ｋＤａの推定サイズを有するリン酸化されたＣｂＰＲ−１０タンパク質は、Ｃ．ｂａｃｃａｔｕｍの感染果実における１８ｋＤａと一致して明らかに検出可能であった。他方、１８ｋＤａは、Ｃ．ａｎｎｕｕｍのものにおいてのみ検出可能である。免疫組織化学的な検査によって、ＰＲ−１０蓄積が未熟な果実の表皮細胞および数層のクチクラ下細胞に局在化していることが明らかになった。感染後、タンパク質の蓄積は、両方の細胞層において顕著に増加しており、特に、Ｃ．ｂａｃｃａｔｕｍの果実において顕著に増加していた。ＣｂＰＲ−１０遺伝子の発現は、真菌感染によって誘導されたが、発現レベルは、Ｃ．ｂａｃｃａｔｕｍにおいてはるかにより高かった。その酵素特性の特徴づけによって、組み換えＣｂＰＲ−１０タンパク質が、ＣａＰＲ−１０タンパク質よりも強いリボヌクレオチド分解（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）活性を呈示し、そして炭疽病真菌に対してよりよい抗真菌活性もまた示すことが示された。
【０００９】
調節配列は、遺伝子の時間的および／または空間的な発現の制御において有用であり得る。従って、感染部位において活性であるプロモーターの同定に関心が高い。病原誘導性プロモーターの可能な供給源は、防御関連遺伝子の病原関連（ＰＲ）ファミリーである。代表的には、ＰＲタンパク質は、その病原体に応答して植物組織の感染部位に発現される。この実験において、病原関連タンパク質１０の調節領域を含む核酸配列が単離され、そしてＣｂＰＲ１０遺伝子の発現を調節する能力によって特徴付けられた。
【００１０】
従って、本発明は、以下を提供する。
【００１１】
１つの局面において、本発明は、Ｃａｐｃｉｃｕｍ  ｂａｃｃａｔｕｍ由来の病原関連タンパク質１０をコードする配列番号１の、単離された核酸分子を提供する。
【００１２】
１つの局面において、本発明は、ｃＤＮＡクローンによってコードされる配列番号２の、単離された病原関連１０（ＣｂＰＲ−１０）タンパク質を提供する。ここで、該ＣｂＰＲ−１０タンパク質は、ホスフェート結合ループ（Ｐ−ループ）モチーフＧｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙをさらに含み、ここでＸは任意のアミノ酸を意味する。
【００１３】
１つの局面において、本発明は、制御配列とともに配列番号１のポリヌクレオチドを含む、Ｅ．ｃｏｌｉまたは植物の細胞の形質転換のための発現ベクターを提供する。
【００１４】
１つの局面において、本発明は、微生物または植物細胞において、本発明の発現ベクターの発現によって得られるタンパク質を提供する。
【００１５】
１つの局面において、本発明は、本発明の発現ベクターで形質転換された、微生物を提供する。
【００１６】
１つの局面において、本発明は、本発明の発現ベクターで形質転換されたトランスジェニック植物細胞を提供する。
【００１７】
１つの局面において、本発明は、本発明のトランスジェニック植物細胞から生長した、抵抗性が増強された、トランスジェニック植物を提供する。
【００１８】
１つの局面において、本発明は、誘導性病原関連タンパク質１０遺伝子プロモーターを提供する。ここでこのプロモーターは、Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｂａｃｃａｔｕｍにおけるタンパク質の発現を天然で駆動する配列番号３の核酸分子である。
【００１９】
本発明は、Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｂａｃｃａｔｕｍにおける病原関連タンパク質−１０（ＣｂＰＲ−１０）遺伝子を含む、ｇＤＮＡ配列および対応するｃＤＮＡ配列に関する。このＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドは、リボヌクレアーゼ活性を有し、この活性は、この酵素を、真菌病原体の増殖を阻害する際に非常に効果的にする。本明細書中に開示されるＤＮＡ配列の使用は、真菌病原体に対する抵抗性が増強されたトランスジェニック植物（特に、遺伝子的に形質転換されたトウガラシ植物）の産生のための、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質および遺伝子構築物を含む。
【発明の効果】
【００２０】
炭疽病に抵抗性の市販のトウガラシ品種および関連技術が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、ＣｂＰＲ−１０と命名されるｃＤＮＡクローンを提供する。このクローンは、Ｃ．ａｃｕｔａｔｕｍと不適合の相互作用を示すＣ．ｂａｃｃａｔｕｍの未熟な感染果実から単離した（図１）。従って、ＣｂＰＲ−１０に対応するｇＤＮＡ配列を、Ｃ．ｂａｃｃａｔｕｍからクローニングした。この配列は、配列番号３のプロモーターおよびＣｂＰＲ−１０遺伝子のコード領域を含む。このプロモーターは、転写開始部位を含み、この部位は、感染組織における転写開始に有利である（図２）。ついで、ｃＤＮＡの全長をクローニングした。この全長ｃＤＮＡは、ヌクレオチド位置１での最初の翻訳開始（ＡＴＧ）から４７８位置の翻訳終始（ＴＧＡ）までの４８０ｂｐのオープンリーディングフレームを含む。ＣａＰＲ−１０のヌクレオチド配列は、１５９アミノ酸のポリペプチドをコードし、これは、１７．３ｋＤａの推定分子量を有する。このｃＤＮＡのアミノ酸配列は、他の植物において見出された病原関連タンパク質１０（ＰＲ−１０）をコードする遺伝子と高度に相同である。特に、このヌクレオチド配列は、Ｃ．ａｎｎｕｕｍ由来のＣａＰＲ−１０の配列とはほとんど同一である（図３）。従って、このクローンは、Ｃ．ｂａｃｃａｔｕｍの病原関連タンパク質１０にちなんでＣｂＰＲ−１０と命名された。このヌクレオチド配列に基づいて、ＣｂＰＲ−１０遺伝子は、ＰＲ−１０ファミリーに属する。配列同一性は、それぞれ、Ｃ．ａｎｎｕｕｍ、Ｃ．ｃｈｉｎｅｎｓｅおよびＳｏｌａｎｕｍ  ｖｉｒｇｉｎｉａｎｕｍ由来のＰＲ−１０に対して９８％、９０％および８３％が最も高い。
【００２２】
ＣｂＰＲ−１０遺伝子の発現パターンを、炭疽病真菌を有するＣ．ｂａｃｃａｔｕｍの感染果実において調査し、そして感受反応性を示すＣ．ａｎｎｕｕｍにおけるＣａＰＲ−１０遺伝子と比較した。ＲＴ−ＰＣＲ分析を、種々の時点において両方の種の感染果実から抽出したトータルＲＮＡを用いて行った（図４Ａ）。Ｃ．ｂａｃｃａｔｕｍにおけるＣｂＰＲ−１０は、一日目に真菌感染によって誘導され、二日目にピークとなり、ついで接種後減少した。しかし、Ｃ．ａｎｎｕｕｍにおけるＣａＰＲ１０の誘導レベルは、一日目および三日目においてはるかに低いレベルで二重の発現パターンを示した。
【００２３】
本発明者らは、ＰＲ−１０蓄積の時間経過が感染果実における炭疽病症状発生と相関するかどうかを調べた。ウェスタンブロット分析を、両方の種の果実から抽出した可溶性タンパク質を用いて行った。抗ＣａＰＲ−１０抗体を用いて、ＰＲ−１０に対応する１８ｋＤａタンパク質を、未熟果実において検出した（図４Ｂ）。Ｃ．ｂａｃｃａｔｕｍの抵抗性反応において、イムノブロット分析は、１８ｋＤａのレベルがわずかに上昇すること、１９ｋＤａバンドが、炭疽病真菌での感染後一日目において現れること、およびこれらのバンドがその果実においてさらに維持されることが示された。しかし、Ｃ．ａｎｎｕｕｍの感受性反応において、ＣａＰＲ−１０タンパク質の基礎レベルは、一日目に顕著に減少し、ついでわずかに上昇した。興味深いことに、１９ｋＤａバンドは、Ｃ．ｂａｃｃａｔｕｍの感染果実においてのみ明らかに検出可能であったのに対して、他方、Ｃ．ａｎｎｕｕｍの感染果実では検出不能であった。これらのデータは、１９ｋＤａにおけるＣｂＰＲ−１０タンパク質のリン酸化が、炭疽病真菌に対するＣ．ｂａｃｃａｔｕｍの果実の抵抗性応答に関連することを示唆する。
【００２４】
以前の研究において、植物内接種したＣ．ｂａｃｃａｔｕｍの抵抗性果実において病変は形成されなかったが、炭疽病真菌を伴うＣ．ａｎｎｕｕｍの感染果実において典型的な炭疽病症状が発生した。従って、免疫組織化学研究を行って、両方の種の感染果実におけるＰＲ−１０タンパク質の蓄積および局在を明らかにした。ＰＲ−１０タンパク質は、シグナルペプチドを示さない配列分析から予測されるとおり、細胞質ゾルに局在化している（図５）。ＣｂＰＲ−１０のより高い蓄積は、Ｃ．ｂａｃｃａｔｕｍの果実表皮細胞において検出され、そして真菌誘導蓄積もまた、感染段階の間Ｃ．ｂａｃｃａｔｕｍにおいてクチクラおよびクチクラ下の両方の層においてはるかにより高かった。
【００２５】
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現された組み換えＰＲ−１０タンパク質は、トウガラシトータルＲＮＡを切断することが示されたが、ＣｂＰＲ−１０の相対活性は、ＣａＰＲ−１０よりもはるかに強かった（図７および図８）。ＣｂＰＲ−１０の生物学的特性を明らかにするために、組み換えＣｂＰＲ−１０の抗真菌活性を調べた。この真菌の正常な発達は、このタンパク質の塗布によって重篤に障害され、その結果、真菌菌糸が伸長しそして分岐する傾向を見せ、特に、付着器形成が、真菌発達の間ブロックされた。ＣａＰＲ−１０とＣｂＰＲ−１０との間の抗真菌活性には有意な相違はなかったが、真菌の生存性は、ＣａＰＲ−１０よりもＣｂＰＲ−１０によって有効に障害された（図９）。
【００２６】
本発明は、宿主細胞におけるＣｂＰＲ−１０の発現を制御する調節ヌクレオチド配列を伴ってＣｂＰＲ−１０のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを包含する。この宿主発現ベクター系は、組み換え発現ベクターで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉまたは植物を包含する。
【実施例】
【００２７】
（材料および方法）
（植物材料）Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ａｃｕｔａｔｕｍに対して抵抗性であることが識別されているＣａｐｓｉｃｕｍ  ｂａｃｃａｔｍ  ｃｖ．ＰＢＣ８０を用いた。感受性植物として、Ｃ．ａｎｎｕｕｍ  ｃｖ．Ｙｅｏ−ｊｕを用いた。これら植物は、保護された温室条件下２５℃で成長させた。８ヶ月齢のトウガラシ植物の完全に成長した未成熟の未熟果実を核酸抽出および病原体接種のために用いた。
【００２８】
（植物病原体および接種）接種調製物および人為的接種手順は、わずかに改変されたＫｉｍらの方法（２００４）（非特許文献３）に従った。韓国で分離されたＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ａｃｕｔａｔｕｍ、ＫＳＣａ−１を炭疽病病原体として用いた。この分離体は、ポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）培地（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）上、２５℃で、交代する１６時間蛍光灯光、および８時間暗黒下で成長させた。７日目のＰＤＡプレートに蒸留水を張り、そして真菌のコロニーをこのプレートから穏やかに掻きとった。次いで、懸濁液を４層のチーズクロスで濾過し、菌糸残渣を除去した。接種物濃度を、血球計で５×１０５分生子／ｍＬに調節した。創傷接種方法として、正確に調節可能な創傷深さをもつニードルに固有のマイクロインジェクションを用いた。採取した果実を、一度、蒸留水で洗浄し、そして２μＬの分生子懸濁物で、通常、果実表皮の３つの部位において、かつ０．８ｍｍの深さに注入した。接種された果実を、４層の湿潤キッチンタオルで湿潤化したアクリルボックス中に配置した。これらアクリルボックスは、塩化ビニルのラップで堅くシールされ、ほぼ１００％の相対湿度を維持し、そして２５℃でインキュベートした。
【００２９】
（遺伝子クローニング、配列および遺伝子発現分析）トータルＲＮＡを、感染未熟果実から、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造業者の指示書に従って抽出した。順方向プライマー、５’ＡＴＧＧＧＴＧＣＴＴＡＴＡＣＣＴ３’（配列番号５）および逆プライマー５’ＴＴＡＡＡＣＡＴＡＧＡＣＡＧＡＡＧＧＡ３’（配列番号６）をＲＴ−ＰＣＲのために用いた。完全長ｃＤＮＡのＰＣＲ産物は、ｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）中にクローン化され、そして配列決定した。ｃＤＮＡ配列決定は、ＡＬＦｅｘｐｒｅｓｓ自動化ＤＮＡシークエンサー（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＫ）で実施した。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の分析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、ｖｅｒｓｉｏｎ２．１（Ｈｉｔａｃｈｉ、ＵＳＡ）のためのＤＮＡＳＩＳ配列分析ソフトウェアで実施した。相同性サーチのために、これらＤＮＡ配列を、ＢＬＡＳＴ電子サーバーを用いてＮＣＢＩ非重複データベース中の配列と比較した。ＰＲ−１０遺伝子の発現レベルを決定するために、ＲＴ−ＰＣＲ分析を、テンブレートとして感染果実から抽出された１００ｎｇのトータルＲＮＡを用いて実施した。
【００３０】
（ＰＣＲによるｇＤＮＡのクローニング）ＣｂＰＲ−１０遺伝子のコード領域を、テンブレートとしてＣ．ｂａｃｃａｔｕｍのｇＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。用いたプライマーは、５’ＡＴＧＧＧＴＧＣＴＴＡＴＡＣＣＴ３’（配列番号７）および５’ＴＴＡＡＡＣＡＴＡＧＡＣＡＧＡＡＧＡＴ３’（配列番号８）であった。次いで、ＰＲ−１０遺伝子の上流領域を逆ＰＣＲを用いてクローン化するために、トウガラシゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして自己連結して環状ＤＮＡフラグメントを形成した。これらを、ＬＡまたはＥｘ  Ｔａｑポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ、Ｊａｐａｎ）を、ＰＲ−１０配列のＮ末端に対応するプライマーのセットとともに用いて増幅した。温度サイクルは以下の通りであった：９４℃１分間、次いで、９４℃１分間の３０サイクル、６０℃３分間、および７０℃１分間。ＣｂＰＲ−１０配列の部分を含む１．２ｋｂＰＣＲ産物を、Ｔｏｐｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）中にサブクローン化し、そして配列決定した。
【００３１】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット分析、および免疫組織化学）ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、トータルタンパク質を、Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０）（非特許文献４）に従って１２％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、そしてフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレン上に電気的に移した。免疫ブロット分析には、一次抗体を１：１５００希釈で用いた。アルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ラット抗体を、二次抗体として１：５０００希釈で用いた。この二次抗体は、ルミノール（ＥＣＬ、ＵＳＡ）で可視化した。
【００３２】
免疫局在化研究には、トウガラシ果実を、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０中の１％グルタルアルデヒド／３％パラホルムアルデヒド中で固定し、エタノール中で脱水し、そしてパラフィン中に-包埋した。組織を、横に切片化して厚さ１０μｍのスライスにした。免疫標識化には、脱パラフィン切片を、一次抗体と１２時間１２℃でインキュベートした。組換えＣａＰＲ−１０タンパク質に対するポリクローナル抗体は、１：２０００の希釈で用いた。対照組織を、免疫前血清とともにインキュベートした。次いで、これら切片を、ヤギ抗ラットのビオチン化二次抗体（ＤＡＫＯ、ＵＳＡ）とインキュベートした。検出のために、この二次抗体は、製造業者の指示書（ＤＡＫＯ、ＵＳＡ）に従って３−アミノ−９−エチルカルバゾールで着色された。
【００３３】
（組換えＣａＰＲ−１０タンパク質および組換えＣｂＰＲ−１０タンパク質）ＣａＰＲ−１０およびＣｂＰＲ−１０ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームを、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、そして発現ベクターｐＧＥＸ６ｐ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓｗｅｄｅｎ）中のＥｃｏＲＩ部位とＸｈｏＩ部位との間に、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）コード配列とインフレームで挿入した。各ＧＳＴ融合タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現し、そして製造業者の指示書に従って精製した。タンパク質の濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、１９７６）により決定した。ＰｒｅＳｃｉｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ消化後の純粋なＣａＰＲ−１０またはＣｂＰＲ−１０タンパク質を、リボヌクレアーゼおよび抗真菌活性の分析のために用いた。
【００３４】
（組換えＣｂＰＲ−タンパク質のリボヌクレアーゼ活性）ＲＮＡ分解アッセイは、Ｂａｎｔｉｇｎｉｅｓら（２０００）により記載の方法に従って実施された。
【００３５】
（ＣｂＰＲ−１０タンパク質の抗真菌活性）Ｃ．ａｃｕｔａｔｕｍのモノクローナルＫＳＣａ−１分離体を、ポテトデキストロース寒天（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）上、暗闇中２８℃で７日間培養した。胞子を採集し、そして滅菌蒸留水に懸濁した。１０マイクロリットルの胞子懸濁物（１ｍｌあたり５×１０５胞子）を、組換えタンパク質またはＰＢＳ緩衝液の１０μｌで補正された滴下培養で用い、そしてカバーグラスに付与された。これらカバーグラスを、湿潤化チャンバー中、暗闇で２４時間、２５℃でインキュベートした。真菌の生存率を観察するために、発芽した胞子を、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ生存性キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅ、ＵＳＡ）で染色した。
【００３６】
（ＣｂＰＲ−１０ｃＤＮＡのクローニングおよび配列分析）
ＲＴ−ＰＣＲを用いることにより、ｃＤＮＡフラグメントを、炭疽病真菌であるＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ａｃｕｔａｔｕｍで感染したＣａｐｓｉｃｕｍ  ｂａｃｃａｔｕｍの非成熟の未熟果実からクローン化した。完全長ｃＤＮＡクローンを、ＣｂＰＲ−１０（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｂａｃｃａｔｕｍ病原関連タンパク質１０）と命名した。このＣｂＰＲ−１０ｃＤＮＡは、４８０塩基対（ｂｐ）長であって、そして推定分子量１８キロダルトン（ｋＤａ）をもつ１５９アミノ酸の推定タンパク質をコードする（図２）。このＣｂＰＲ−１０タンパク質は、ＰＲ−１０タンパク質間で保存されている「Ｐ−ルーフ」を含み、そしてＮｅｔＰｈｏｓ  ＷＷＷサーバーによって推定されるいくつかの推定リン酸化部位を有する（図３）。ＣｂＰＲ−１０タンパク質は、Ｃ．ａｎｎｕｕｍからのＣａＰＲ−１０と９５％同一性（Ｐａｒｋら、２００４）、およびポテトからのＳＴＨ−１０タンパク質と６１％同一性の、非常に高い相同性を共有する（ＭａｔｔｏｎおよびＢｒｉｓｓｏｎ、１９８９）（非特許文献５）。
【００３７】
（ＣｂＰＲ−１０ｇＤＮＡのクローニングおよび配列分析）
ＣｂＰＲ−１０遺伝子の内部領域を、ＰＣＲ法によりクローン化した。プライマーを、ＣａＰＲ−１０遺伝子のヌクレオチド配列を基に設計した。なぜなら、ＣｂＰＲ−１０の配列は、ＣａＰＲ−１０遺伝子の配列と９６％の同一性を示したからである。１０２５ｂｐの増幅産物は、イントロン配列および３’ＵＴＲ領域に介在する２つのエキソンを含む。次いで、逆ＰＣＲ（ｉＰＣＲ）を行い、この遺伝子の調節領域をクローン化した。１．３ｋｂの産物を、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したＣ．ｂａｃｃａｔｕｍ  ｇＤＮＡを含むＰＣＲ反応で増幅した（図２）。プロモーター配列を、ＡＴＧ開始コドンの１１５４ｂｐ上流の領域について決定した。ＳＡ応答要素（ＴＣＡ）、エリシター応答要素（ＥＬＩボックス）、ヒートショック要素（ＨＳＥ）、創傷応答要素（ＷＵＮ）、ＴＡＴＡボックスなどのような、誘導性遺伝子中で先に特徴付けられた要素に対し顕著な類似性を有する多くの配列が同定された。
【００３８】
（真菌感染によるＰＲ−１０遺伝子の誘導）
真菌感染の間のＰＲ−１０の発現を評価するために、炭疽病真菌の胞子懸濁物を接種し、Ｃ．ｂａｃｃａｔｕｍおよびＣ．ａｎｎｕｕｍの未熟果実における抵抗性反応および感受性反応をそれぞれ惹起した。半定量逆ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を、異なる疾患症状を示す両方の果実中で行った（図４Ａ）。この結果は、Ｃ．ｂａｃｃａｔｕｍ中のＣｂＰＲ−１０のｍＲＮＡレベルが、接種後、第１日目に誘導され、第２日目にピークとなり、そして次に減少することを示す。しかし、Ｃ．ａｎｎｕｕｍ中のＣａＰＲ−１０の誘導されたレベルは、かなりより少ないレベルで第１日目および第３日目に二重の発現パターンを示した。
【００３９】
（真菌感染によるＰＲ−１０タンパク質の誘導およびリン酸化）
抗ＰＲ−１０抗体を用い、１８ｋＤａの推定サイズをもつＰＲ−１０に対応する１８ｋＤａタンパク質が、炭疽病真菌で感染されたトウガラシ果実中で検出された（図４Ｂ）。抵抗性反応では、免疫ブロット分析は、ＣｂＰＲ−１０タンパク質のレベルが、炭疽病真菌での感染後第１日目にわずかに増加し、そしてＣ．ｂａｃｃａｔｕｍの果実中でさらに維持されることを示した。感受性反応では、しかし、ＣａＰＲ−１０タンパク質の基礎レベルは、第１日目に有意に減少し、そして次にＣ．ａｎｎｕｕｍのそれにおいてわずかに増加した。１９ｋＤａの推定サイズを有するリン酸化ＰＲ−１０タンパク質は、Ｃ．ｂａｃｃａｔｕｍの感染果実で明瞭に検出可能であり、その一方、Ｃ．ａｎｎｕｕｍの感染果実で検出可能でなかった。約２０ｋＤａの分子量をもつ未知の弱いバンドは、Ｃ．ｂａｃｃａｔｕｍおよびＣ．ａｎｎｕｕｍの両方において抗ＣａＰＲ−１０抗体と交差反応した。これらのデータは、ＣｂＰＲ−１０タンパク質のリン酸化が、炭素病真菌に対するＣ．ｂａｃｃａｔｕｍの果実の抵抗性応答に恐らく関係していることを示唆する。
【００４０】
（感染されたトウガラシ果実中のＰＲ−１０タンパク質の免疫局在化）
真菌感染の間のＰＲ−１０タンパク質の局在化および蓄積を明確にするために、このタンパク質の免疫組織化学的調査を両方の種の果実の横断切片で実施した。これら切片は、炭素病真菌で感染した未熟果実から、０、２４、４８および７２ＨＡＩで各々調製された（図５）。ＰＲ−１０タンパク質の蓄積は、０ＨＡＩで両方の果実中で外側表皮細胞中に稀に局在化されていた。真菌感染後、ＰＲ−１０蓄積は、果実の表皮細胞および果実の表皮下層中で段階的に増加した。しかし、タンパク質の量は、Ｃ．ａｎｕｕｍの果実中でよりもＣ．ｂａｃｃａｔｕｍの果実中で有意に高かった。これら結果は、ＣｂＰＲ−１０タンパク質が、通常の発生の間にトウガラシ果実の表皮細胞中で局在化されていることを示唆する。真菌で誘導されたＣｂＰＲ−１０蓄積は、Ｃ．ｂａｃｃａｔｕｍの果実の皮層の柔組織細胞および表皮細胞で大量に生じ、その一方、かなりより低い量のＣａＰＲ−１０タンパク質が、Ｃ．ａｎｎｕｍの正常または感染果実中で観察された。
【００４１】
（組換えＣｂＰＲ−１０タンパク質のリボヌクレアーゼ活性）
ＣｂＰＲ−１０タンパク質の機能的活性をアクセスするために、組換えＣｂＰＲ−１０タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現し、精製し（図６）、そしてＢａｎｔｉｇｎｉｅｓら（２０００）（非特許文献１）の方法に従ってリボヌクレアーゼ活性について試験した。未熟トウガラシ果実から抽出されたトータルＲＮＡを、組換えＣｂＰＲ−１０およびＣａＰＲ−１０またはＲＮａｓｅＡ（ＳＩＧＭＡ、ＵＳＡ）とインキュベートした。ＲＮａｓｅＡを、ボジティブ対照として用い、そして組換えＣａＰＲ−１０タンパク質を、Ｃ．ａｎｎｕｕｍとＣ．ｂａｃｃｕｔｕｍとの間の相対的酵素活性の比較のために用いた。図７では、ＣｂＰＲ−１０の相対的により強い酵素活性は、アガロースゲル中の分解産物のＣａＰＲ−１０のそれより速い移動として示されている。別の対照として、ＲＮａｓｅは、同じ条件下でトウガラシＲＮＡを完全に分解する。図８は、相対的酵素活性が、経時的に、ＣａＰＲ−１０とＣｂＰＲ−１０との間で比較されたことを示す。この結果は、ＣｂＰＲ−１０が、ＣａＰＲ−１０よりかなりより強いリボヌクレアーゼ活性を有していたことを示す。
【００４２】
（組換えＣｂＰＲ−１０とＣａＰＲ−１０タンパク質との間の抗真菌活性）
組換えＣｂＰＲ−１０の抗真菌活性を調査し、植物中のＣｂＰＲ−１０の生物学的性質を明瞭にした。炭疽病真菌の成長に対するＣｂＰＲ−１０の影響を調査するために、組換えＣｂＰＲ−１０タンパク質を真菌胞子で補正した。ＣａＰＲタンパク質の関連する活性をポジティブ対照として比較した。真菌の胞子は、１時間で発芽し始め、そしてカバーグラスの表面の配置後６時間で第１の付着器を発生した。しかし、この真菌の正常な発生は、組換えＰＲ−１０タンパク質の付与によって重篤に損傷された。このタンパク質の低濃度では、菌糸の先端部は、付着器を発生することなく細長くかつ分岐する傾向にあった（図９）。これら胞子の発芽は、ＣａＰＲ−１０タンパク質およびＣｂＰＲ−１０タンパク質の両方の０．５ｍｇ／ｍｌで完全にブロックされた。さらに、異常成長を示す真菌の生存性をＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ細菌生存性キットで染色することによって調査した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅ、ＵＳＡ）。これらの結果は、これら真菌の生存性は、０．０５ｍｇ／Ｌ程度のＰＲ−１０タンパク質で重篤に影響されたことを示した。
【００４３】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
炭疽病真菌に対して抵抗性が高まったトウガラシが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ａｃｕｔａｔｕｍのＫＳＣａ−１分離株への接種後７日におけるそれぞれ感受性および抵抗性のトウガラシであるＣａｐｃｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ  ｃｖ．Ｙｅｏ−ｊｕおよびＣａｐｓｉｃｕｍ  ｂａｃｃａｔｕｍ  ｃｖ．ＰＢＣ８０の果実において発生した炭疽病症状を示す。
【図２】図２は、Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｂａｃｃａｔｕｍから単離された病原関連１０タンパク質（ＣｂＰＲ−１０）の配列番号２の推定アミノ酸配列およびｇＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【図３】図３は、配列番号２のＣｂＰＲ−１０の推定アミノ酸配列と、配列番号４のＣａＰＲ−１０とのアラインメントを示す。ＣｂＰＲ−１０がコードするポリペプチドを、Ｃａｐｃｉｓｕｍ  ａｎｎｕｕｍ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．  ＡＦ２４４１２１）由来の病原関連１０タンパク質（ＣａＰＲ−１０）とアラインメントした。Ｐ−ループモチーフに下線を引き、そして推定リン酸化部位を四角で囲んでいる。２つの種の間の配列変動をアラインメントし、そして標識している。
【図４】図４は、炭疽病真菌を接種したそれぞれのトウガラシ種からの果実におけるＣａＰＲ−１０およびＣｂＰＲ−１０の遺伝子発現（Ａ）およびタンパク質蓄積（Ｂ）を示す。Ａにおいて、トータルＲＮＡを０ＨＡＩ（感染後時間）、２４ＨＡＩ、４８ＨＡＩおよび７２ＨＡＩにて果実から調製し、そして１００ｎｇのトータルＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲ分析のためのテンプレートとして使用した。Ｂにおいて、ＰＲ−１０タンパク質（２μｇ）の免疫ブロットを、感染したトウガラシ果実において行った。可溶性タンパク質を、炭疽病真菌に感染した環実から、０ＨＡＩ、２４ＨＡＩ、４８ＨＡＩおよび７２ＨＡＩにて抽出した。この組み換えＣａＰＲ−１０に対して惹起されたポリクローナル抗体を、１：１５００希釈で用い、そしてＨＲＰ結合体化された抗ラットＩｇＧ抗体を、１：５０００希釈で二次抗体として用いた。
【図５】図５は、それぞれ感受性種および抵抗性種であるＣ．ａｎｎｕｕｍおよびＣ．ｂａｃｃａｔｕｍの感染果実におけるＣａＰＲ−１０およびＣｂＰＲ−１０の免疫局在化を示す。これらのトウガラシ果実に、Ｃ．ａｃｕｔａｔｕｍを接種し、そして０ＨＡ、２４ＨＡＩ、４８ＨＡＩおよび７２ＨＡＩにて接種部位からサンプルを調製した。この切片を、組み換えＣａＰＲ−１０に対するポリクローナル抗体とインキュベートし、そしてペルオキシダーゼ標識二次抗体を用いて検出した。ＰＲ−１０タンパク質の局在化は、赤い色によって検出する。免疫前血清を用いた対照実験は、何ら反応を示さなかった（データ示さず）。バーは１００μｍを示す。
【図６】図６は、組み換えＣａＰＲ−１０タンパク質および組み換えＣｂＰＲ−１０タンパク質の発現および精製を示す。種々の精製工程におけるＥ．ｃｏｌｉにおいて産生された組み換えＰＲ−１０タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析が示される。レーンＭ、タンパク質分子量マーカーサイズ（ｋＤａ）、左から、レーン１、ＧＳＴタンパク質をコードするｐＧＥＸ６ｐ−１プラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１細胞の可溶性画分；レーン２、ＧＳＴ−ＣａＰＲ−１０タンパク質をコードするｐＧＥＸ６Ｐ−１／ＣａＰＲ−１０を有し、ＩＰＴＧなしで増殖されたＥ．ｃｏｌｉの可溶性画分；レーン３、レーン２と同じ、ただしＩＰＴＧで誘導したもの；レーン４、ＧＳＴ−ＳｂＰＲ−１０タンパク質をコードするｐＧＥＸ６Ｐ−１／ＣｂＰＲ−１０を有し、ＩＰＴＧなしで増殖されたＥ．ｃｏｌｉの可溶性画分；レーン５、レーン４と同じ、但しＩＰＴＧで誘導したもの；レーン６、精製したＧＳＴ／ＣａＰＲ−１０融合タンパク質；レーン７、精製したＧＳＴ／ＣｂＰＲ−１０融合タンパク質；レーン８、切断したＣａＰＲ−１０タンパク質；レーン９、切断したＣｂＰＲ−１０タンパク質。
【図７】図７は、トウガラシトータルＲＮＡに対する組み換えＰＲ−１０タンパク質のリボヌクレオチド分解活性を示す。各々の反応混合物は、５μｇのトウガラシ果実由来のトータルＲＮＡを含み、そして５６℃で３時間インキュベートされた。加水分解されたＲＮＡを、１．０％アガロースゲルで分離した。レーン１、ＲＮＡ＋蒸留水；レーン２、ＲＮＡ＋タンパク質溶出緩衝液；レーン３、ＲＮＡ＋ＣａＰＲ１０タンパク質（２μｇ）；レーン４、ＲＮＡ＋ＣｂＰＲ１０タンパク質（２μｇ）；レーン５、ＲＮＡ＋ＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）。ＲＮＡの相対レベルを、その下の棒グラフに示す。
【図８】図８は、トウガラシトータルＲＮＡに対する組み換えＰＲ−１０タンパク質のリボヌクレオチド分解活性によるＲＮＡ分解の時間経過である。各々の反応混合物は、５μｇのトウガラシ果実由来のトータルＲＮＡを含み、そして５６℃で３時間インキュベートされた。加水分解されたＲＮＡを、１．０％アガロースゲルで分離した。上のゲル、ＲＮＡ＋ＣａＰＲ１０（２μｇ）；下のゲル、ＲＮＡ＋ＣｂＰＲ１０（２μｇ）。ＲＮＡの相対レベルを、その下の棒グラフに示す。
【図９】図９は、炭疽病真菌の胞子に対して組み換えＰＲ−１０タンパク質を加えた後２４時間でのインビトロ真菌阻害アッセイの顕微鏡観察物を示す。この真菌の生存性は、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ細菌生存性キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅ，ＵＳＡ）を用いることによって判定した。左パネル：組み換えＣａＰＲ−１０タンパク質を、０、０．０５ｍｇ／Ｌおよび０．５ｍｇ／Ｌで加えた。右パネル：組み換えＣｂＰＲ−１０タンパク質を、０、０．０５ｍｇ／Ｌおよび０．５ｍｇ／Ｌで加えた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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