(57)【要約】【課題】ｓｉＲＮＡを皮膚に電気浸透する方法であって、患者に対して大きな負担をかけることなく、ｓｉＲＮＡを導入部位へ経皮導入することができる。【解決手段】イオントフォレーシス装置１０の薬液保持部２４０に、イオンに解離したｓｉＲＮＡを保持し、イオントフォレーシス装置１０と生体の皮膚とを通電させることにより薬液保持部２４０に保持されたｓｉＲＮＡを皮膚に電気浸透する。イオントフォレーシス装置１０は、イオン交換膜を用いてもよい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオントフォレーシス装置の薬液保持部に、イオンに解離したｓｉＲＮＡを保持し、
前記イオントフォレーシス装置と生体の皮膚とを通電させることにより前記薬液保持部に保持された前記ｓｉＲＮＡを前記皮膚に電気浸透する方法。
【請求項２】
前記ｓｉＲＮＡをリポソームに保持して、前記リポソームを前記皮膚に電気浸透する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｓｉＲＮＡを化学修飾して、前記化学修飾したｓｉＲＮＡを前記皮膚に電気浸透する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記イオントフォレーシス装置は、
電源における、イオンに解離した前記ｓｉＲＮＡと同じ導電型である第１導電型の端子に電気的に接続される第１電極部材、および、前記薬液保持部に対して前記第１電極部材と反対側に配され、前記第１導電型のイオンを選択的に透過する第１導電型のイオン交換膜を有する作用側電極構造体と、
前記電源における、前記第１導電型と反対の導電型である第２導電型の端子に電気的に接続される非作用側電極構造体と
を備える請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記作用側電極構造体は、
前記第１電極部材に電気的に接続され、電解液を保持する第１電解液保持部、
および、前記第１電極部材との間で前記第１電解液保持部を挟み、前記第２導電型のイオンを選択的に透過する第２導電型のイオン交換膜
を有し、
前記第１電解液保持部および前記第２導電型のイオン交換膜は、前記第１電極部材と前記薬液保持部との間に配される請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人間、動物等の生体における所望の皮膚、粘膜等の表面組織を構成する細胞において、標的遺伝子の発現を抑制し得るｓｉＲＮＡを経皮的に導入する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ：ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ）を生体の細胞内に導入すると、それと相同な遺伝子のｍＲＮＡが破壊され、そのタンパク質の発現が抑制されることが知られている。この現象はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ：ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）と呼ばれ、１９８８年に線虫を用いた実験で初めて報告された。その後、このＲＮＡｉは哺乳動物細胞でも認められることが分かり、長いｄｓＲＮＡを種々の細胞株に導入してＲＮＡｉを誘導する試みがなされたが、成功例はほとんど報告されていない（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
しかしながら、近年、より短いｄｓＲＮＡ（２１〜２３塩基対）を哺乳動物の培養細胞に導入するとターゲットのｍＲＮＡが破壊されることが報告された。このようなＲＮＡｉを誘導する短いｄｓＲＮＡはｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）と呼ばれている。ｓｉＲＮＡを哺乳動物細胞に導入することにより、標的遺伝子のｍＲＮＡを破壊し、そのタンパク質の発現を抑制できる（ノックアウトできる）ので、遺伝子の機能を探索できるとともに、遺伝子治療等に利用できる画期的な技術として注目されている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
しかしながら、ｓｉＲＮＡを生体の所望の局所部位に導入する方法は未だ確立されているとはいえず、例えば、電気穿孔法（所謂エレクトロポレーション）により局所領域の細胞集団の細胞膜を一時的に穿孔してｓｉＲＮＡを細胞内に導入することで、目的とするタンパク質の発現を抑制する方法並びに装置が知られている（例えば、特許文献２参照）。
【特許文献１】特開２００５−１１５６６２号公報
【特許文献２】特開２００５−２２４１９８号公報
【非特許文献１】Ｄｏｎｚｅ，  Ｏ．  ａｎｄ  Ｐｉｃａｒｄ，  Ｄ．  （２００２）  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｉＲＮＡｓ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  ３０，  ｅ４６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記特許文献２に開示されているｓｉＲＮＡの細胞内への導入方法並びに装置は、生体内部に差し込んだ針状の電極にパルス電圧をかけて、ｓｉＲＮＡを細胞内へ導入している。パルス電圧のパルス幅は短時間ではあるが、数kＶの電圧がかけられる場合もあり、また、電極を生体内部に差し込むので、適用対象者（以下、「患者」と称する）の負担が大きい。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために、本発明の第１の形態においては、イオントフォレーシス装置の薬液保持部に、イオンに解離したｓｉＲＮＡを保持し、イオントフォレーシス装置と皮膚とを通電させることにより薬液保持部に保持されたｓｉＲＮＡを皮膚に電気浸透する。これにより、患者に対して大きな負担をかけることなく、ｓｉＲＮＡを生体へ経皮導入することができる。
【０００７】
また、上記イオントフォレーシス装置は、ｓｉＲＮＡをリポソームに保持して、このリポソームを皮膚に電気浸透してもよい。これにより、生体へ経皮導入したｓｉＲＮＡに対する免疫反応を抑えることができ、また、導入部位の細胞内への取り込み量を増加させることができる。
【０００８】
また、上記イオントフォレーシス装置は、ｓｉＲＮＡを化学修飾して、この化学修飾したｓｉＲＮＡを皮膚に電気浸透してもよい。これにより、ｓｉＲＮＡの生体への導入効率を高めることができる。また、生体へ経皮導入したｓｉＲＮＡの生体内における安定性が向上する。
【０００９】
また、上記イオントフォレーシス装置は、電源における、イオンに解離したｓｉＲＮＡと同じ導電型である第１導電型の端子に電気的に接続される第１電極部材、および、薬液保持部に対して第１電極部材と反対側に配され、第１導電型のイオンを選択的に透過する第１導電型のイオン交換膜を有する作用側電極構造体と、電源における、第１導電型と反対の導電型である第２導電型の端子に電気的に接続される非作用側電極構造体とを備えてもよい。これにより、作用側電極構造体と当接する皮膚の熱傷、炎症などを防ぐことができるので、安全にｓｉＲＮＡを生体へ経皮導入することができる。
【００１０】
また、上記作用側電極構造体は、第１電極部材に電気的に接続され、電解液を保持する第１電解液保持部、および、第１電極部材との間で第１電解液保持部を挟み、第２導電型のイオンを選択的に透過する第２導電型のイオン交換膜を有し、第１電解液保持部および第２導電型のイオン交換膜は、第１電極部材と薬液保持部との間に配されてもよい。これにより、安定した通電状態のもとでイオントフォレーシスを適用することができ、さらに、作用側電極構造体と当接する皮膚の熱傷、炎症などを防ぐことができるので、安全かつ効率よくｓｉＲＮＡを生体へ経皮導入することができる。
【００１１】
なお、上記の発明の概要は、本発明の必要な特徴の全てを列挙したものではなく、これらの特徴群のサブコンビネーションもまた、発明となりうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、発明の実施の形態を通じて本発明を説明するが、以下の実施形態は特許請求の範囲にかかる発明を限定するものではなく、また実施形態の中で説明されている特徴の組み合わせの全てが発明の解決手段に必須であるとは限らない。
【００１３】
図１は、本発明の実施形態に係るイオントフォレーシス装置１０の概略側面図である。図１に示すイオントフォレーシス装置１０は、生体の皮膚と通電することによりｓｉＲＮＡを皮膚に電気浸透する方法を提供するものである。
【００１４】
ここで、ｓｉＲＮＡとは、配列が標的遺伝子と同一である二重鎖の領域を含み、特定の標的遺伝子をサイレンシングまたは阻害することができる２１〜２３塩基対程度の短い二重鎖ＲＮＡ分子を意味し、塩基配列については特に限定されない。したがって、生体における導入部位の標的遺伝子のｍＲＮＡを破壊し、そのタンパク質の発現を抑制するために必要なｓｉＲＮＡを所望に選択することができる。
【００１５】
ｓｉＲＮＡを作製する方法としては、例えば、有機化学的にＲＮＡを合成するホスホアミダイト法が知られている。また、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用して２組の鋳型ＤＮＡよりセンス鎖ＲＮＡおよびアンチセンス鎖ＲＮＡを作製し、それを２本鎖化することでｓｉＲＮＡを作製する方法もある。
【００１６】
図１に示すイオントフォレーシス装置１０は、ｓｉＲＮＡをリポソームに保持して、皮膚に電気浸透してもよい。リポソームは、主としてリン脂質が二分子膜構造を形成した微少胞球で、内部の水相やリン脂質二分子膜中に薬物等、種々の物質を取り込む性質がある。よって、薬物の選択分布、放出制御、吸収促進、などを目的とする薬物キャリアーと用いられる。本実施形態において、リポソームは、内部の水相を単一のリン脂質二分子膜が取り囲んだ一枚膜、リン脂質二分子膜が水相を介して、何層にも重なった多重層の形状で利用される。リポソームを形成させるために用いるリン脂質としては、例えば、卵黄、大豆あるいはその他の動・植物に由来するホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファジルイノシトール，ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリンや、合成により得られるジパルミトイルレシチン、ジステアロイルレシチン、ジミリストイルレシチン等が挙げられる。
【００１７】
また、ｓｉＲＮＡを化学修飾して、皮膚に電気浸透してもよい。ここで、化学修飾とは、例えば、スクシニル化あるいはマレイル化による負電荷の付与、ポリエチレングリコールとの結合、弱い負電荷を持つカルボキシメチルデキストランとの結合、コレステロール修飾、ガラクトース修飾、マンノース修飾、などが挙げられる。これにより、ｓｉＲＮＡを負の電荷に帯電させて生体への導入効率を高めたり、導入したｓｉＲＮＡの生体内における安定性を向上させたりすることができる。
【００１８】
図１に示すイオントフォレーシス装置１０は、装置本体５０、作用側電極構造体２００、および非作用側電極構造体３００を備える。以下の説明において、正（＋）または負（−）の一方の電気的な極性を第１導電型といい、他方を第２導電型という。
【００１９】
図１に示すように、作用側電極構造体２００は、装置本体５０側から（図１の上側）、皮膚に装着される場合の皮膚側（図１の下側）に向かって、第１電極部材２１０、薬液保持部２４０、および、第１導電型のイオン交換膜２５０をこの順に有し、上面および側面は、容器２６０で覆われる。
【００２０】
第１電極部材２１０は、導線２０５によって、装置本体５０に内蔵された電源６０の第１導電型である端子６２に電気的に接続される。薬液保持部２４０は、イオンに解離したｓｉＲＮＡを含む薬液を保持する。ここで、薬液とは、例えば緩衝溶液などの水系の溶液であり、イオンに解離したｓｉＲＮＡとは、ｓｉＲＮＡが薬液中でイオンに解離して第１導電型に帯電している状態をいう。第１導電型のイオン交換膜２５０は、第１電極部材２１０との間で薬液保持部２４０を挟み、第１導電型のイオンを選択的に透過する。
【００２１】
容器２６０は、皮膚側の面に、粘着性を有する作用側粘着面２６２を有する。ｓｉＲＮＡの導入時に、容器２６０の作用側粘着面２６２が皮膚へ粘着されることにより、作用側電極構造体２００が生体の導入対象部位に当接保持される。
【００２２】
また、非作用側電極構造体３００は、装置本体５０側から、皮膚に装着される場合の皮膚側に向かって、第２電極部材３１０、第３電解液保持部３４０、および、第２導電型のイオン交換膜３５０をこの順に有し、上面および側面は、容器３６０で覆われる。
【００２３】
第２電極部材３１０は、導線３０５によって、装置本体５０に内蔵された電源６０の第２導電型である端子６４に電気的に接続されている。第３電解液保持部３４０は、電解液を保持する。この電解液には、水の電気分解反応（水の酸化および還元反応）と比較して水の酸化還元電位より低い酸化還元電位を有する酸化および還元しやすい化合物が溶解した溶液を用いる。第２導電型のイオン交換膜３５０は、第２電極部材３１０との間で第３電解液保持部３４０を挟み、第２導電型のイオンを選択的に透過する。
【００２４】
容器３６０は、皮膚側の面に、粘着性を有する非作用側粘着面３６２を有する。ｓｉＲＮＡの導入時に、容器３６０の非作用側粘着面３６２が皮膚へ粘着されることにより、非作用側電極構造体３００が生体の導入対象部位の周囲あるいは連接した部位に当接保持される。
【００２５】
このように、イオントフォレーシス装置１０の作用側電極構造体２００および非作用側電極構造体３００が皮膚と当接した状態で、電源６０から第１電極部材２１０および第２電極部材３１０に対して、イオントフォレーシスを適用するための電力が供給される（電圧がかけられる）と、第１電極部材２１０および第２電極部材３１０の間に皮膚を介して電流が流れ、通電状態となる。
【００２６】
ここで、イオンに解離したｓｉＲＮＡが負（−）に帯電する（アニオンである）場合を例に、図１に示すイオントフォレーシス装置１０の具体的構成について説明する。この場合、第１導電型は負（−）であり、第２導電型は正（＋）である。したがって、作用側電極構造体２００の第１電極部材２１０はカソードとなり、非作用側電極構造体３００の第２電極部材３１０はアノードとなる。また、第１導電型のイオン交換膜２５０にはアニオンを選択的に透過するアニオン交換膜を用い、第２導電型のイオン交換膜３５０にはカチオンを選択的に透過するカチオン交換膜を用いる。
【００２７】
図１に示すイオントフォレーシス装置１０は、通電状態において、以下の作用効果を奏する。すなわち、作用側電極構造体２００では、薬液保持部２４０が保持する薬液に含まれるイオンに解離したｓｉＲＮＡは、電気泳動によりカソードである第１電極部材２１０と反対側（皮膚側）へ移動し、薬液保持部２４０の皮膚側に配設されて皮膚と当接する第１導電型のイオン交換膜２５０を透過して速やかに皮膚へ浸透する。これに対し、生体内のカチオンは第１導電型のイオン交換膜２５０を透過して薬液保持部２４０側へ移動することがない。したがって、安定した通電状態のもとでイオントフォレーシスによりイオンに解離したｓｉＲＮＡを生体へ導入することができる。
【００２８】
一方、非作用側電極構造体３００では、第３電解液保持部３４０が保持する電解液に溶解している化合物が水の酸化還元電位より低い酸化還元電位を有する化合物であるので、アノードである第２電極部材３１０において、水の電気分解反応は起こらない。したがって、水の電気分解反応で発生する気泡（酸素ガス）によって、第２電極部材３１０と第３電解液保持部３４０の保持する電解液との接触が妨げられることで通電抵抗が大きくなるのを防ぐことができる。
【００２９】
図２は、他の実施形態であるイオントフォレーシス装置１０の概略断面図である。図２に示すイオントフォレーシス装置１０は、図１に示すイオントフォレーシス装置１０の構成に加えて、作用側電極構造体２００の第１電極部材２１０と薬液保持部２４０との間に、第１電極部材２１０側から薬液保持部２４０側に向かって、第１電解液保持部２２０、および第２導電型のイオン交換膜２３０をこの順に有する。第２導電型のイオン交換膜２３０は、第１電極部材２１０との間で第１電解液保持部２２０を挟み、第２導電型のイオンを選択的に透過する。
【００３０】
さらに、非作用側電極構造体３００の第２電極部材３１０と第３電解液保持部３４０との間に、第２電極部材３１０側から第３電解液保持部３４０側に向かって、第２電解液保持部３２０、および第１導電型のイオン交換膜３３０をこの順に有する。第１導電型のイオン交換膜３３０は、第２電極部材３１０との間で第２電解液保持部３２０を挟み、第１導電型のイオンを選択的に透過する。
【００３１】
第１電解液保持部２２０および第２電解液保持部３２０は、図１に示すイオントフォレーシス装置１０の第３電解液保持部３４０が保持する電解液と同様に、水の電気分解反応（水の酸化および還元反応）と比較して水の酸化還元電位より低い酸化還元電位を有する酸化および還元しやすい化合物が溶解した溶液を用いる。
【００３２】
ここで、イオンに解離したｓｉＲＮＡが負（−）に帯電する（アニオンとなる）場合を例に、図２に示すイオントフォレーシス装置１０の具体的構成について説明する。この場合、第１導電型は負（−）であり、第２導電型は正（＋）である。したがって、第２導電型のイオン交換膜２３０にはカチオン交換膜を用い、第１導電型のイオン交換膜３３０にはアニオン交換膜を用いる。図２に示すイオントフォレーシス装置１０の他の構成ついては、図１に示すイオントフォレーシス装置１０と同じ参照番号を付したものは具体的な構成が同じであるので説明を省略する。
【００３３】
図２に示すイオントフォレーシス装置１０は、通電状態において、図１に示すイオントフォレーシス装置１０の通電状態における作用効果に加えて、以下の作用効果を奏する。すなわち、作用側電極構造体２００の薬液保持部２４０に含まれる、ｓｉＲＮＡのイオンに解離に伴って生じたカチオンは、第１電極部材２１０側へ移動し、カチオン交換膜である第２導電型のイオン交換膜２３０を透過して第１電解液保持部２２０側へ移動する。したがって、通電状態において、薬液保持部２４０のイオンバランスが崩れないので、ｐＨの変化は生じにくい。故に、通電抵抗が大きくなりにくいので、イオンに解離したｓｉＲＮＡの輸送効率の低下を抑えることができる。
【００３４】
なお、化学修飾したｓｉＲＮＡを導入する場合などで、イオンに解離したｓｉＲＮＡが正（＋）に帯電する（カチオンである）場合は、第１導電型は正（＋）であり、第２導電型は負（−）である。したがって、図１および図２に示すイオントフォレーシス装置１０における、第１電極部材２１０および第２電極部材３１０の電気的な極性は逆になり、また、第２導電型のイオン交換膜２３０、第１導電型のイオン交換膜２５０、第１導電型のイオン交換膜３３０、および第２導電型のイオン交換膜３５０の種類（イオン選択特性）はそれぞれ反対のものになる。
【００３５】
図１および図２に示す実施形態において、薬液保持部２４０は、薬液をそのまま保持してもよく、また、ゲルや、薬液を吸水性のポリマーなどに含浸させて保持してもよい。また、薬液中のｓｉＲＮＡの濃度は、およそ１０ｎＭ以下であることが好ましい。
【００３６】
また、作用側電極構造体２００の第１電解液保持部２２０、非作用側電極構造体３００の第２電解液保持部３２０および第３電解液保持部３４０は、上記のように、電解液として、水の電気分解反応（水の酸化および還元反応）と比較して水の酸化還元電位より低い酸化還元電位を有する酸化および還元しやすい化合物が溶解した溶液を用いることが好ましい。例えば、第一硫酸鉄（ＦｅＳＯ４）と第二硫酸鉄〔Ｆｅ２（ＳＯ４）３〕の混合水溶液、アスコルビン酸ナトリウム水溶液、乳酸およびフマル酸ナトリウムの混合水溶液、などが挙げられる。また、これら電解液の保持形態は、例えば、ゲルや、所望の媒体（ガーゼ、吸水性高分子材料など）に含浸させたタイプのものや、電解液をそのまま保持する溶液タイプのものなどであってもよい。
【００３７】
また、イオントフォレーシスを適用するための電圧は、０〜１０Ｖ程度の直流電圧が好ましい。また、低周波治療器のようにパルス電圧をかけたり、あるいは、徐々に電圧を上げたり、あるいは、下げてもよい。体内を流れる電流は０．０１〜５ｍＡの範囲が好ましいが、第１電極部材２１０および第２電極部材３１０の面積や導入部位、さらには患者の個体差などによって増減させて、痛みや熱感を与えない程度に設定することが望ましい。
【００３８】
また、イオントフォレーシス装置１０における電源６０の配設態様は、装置本体５０に内蔵する形態に限定されず、例えば、電池、定電圧装置、定電流装置、定電圧・定電流装置（ガルバノ装置）などを所望の形態に配設してもよい。
【００３９】
また、第１電極部材２１０、および第２電極部材３１０の電極材は、例えば、炭素、白金などの導電性材料など、イオンに解離したｓｉＲＮＡの特性に応じて所望のものを用いてもよい。
【００４０】
また、アニオン交換膜は、例えば、高分子の側鎖に四級化されたアンモニウム基を有するもの、カチオン交換膜としては、例えば、高分子の側鎖にスルホン酸基を有するものなど所望のものでよく、これらはイオンに解離したｓｉＲＮＡの種類などによって適宜組み合わせてもよい。
【００４１】
また、容器２６０および容器３６０は、非イオン伝導性および電気絶縁性を有し、さらに、可塑性、柔軟性、可撓性、および形状保持性の少なくとも一つを有する材料にて作製されるのが望ましい。例えば、アクリル、ポリ塩化ビニル、ポリアクリル、ポリアミド、ポリスルホン、ポリスチレン、ポリオキシメチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、およびこれらの素材の共重合体などが適当である。
【００４２】
また、作用側電極構造体２００および非作用側電極構造体３００を皮膚に当接保持する手段は、作用側粘着面２６２および非作用側粘着面３６２で皮膚へ粘着して当接保持する手段に限定されない。例えば、装置本体５０を手で持って皮膚の導入部位に押し当てて当接させる、あるいは、治具などで患者の体の一部と固定する、など所望の手段を用いてもよい。
【００４３】
以上、本実施形態によれば、患者に対して大きな負担をかけることなく、ｓｉＲＮＡを生体へ経皮導入することができる。また、本実施形態のイオントフォレーシス装置１０によれば、作用側電極構造体２００と当接する皮膚の熱傷、炎症などを防ぐことができるので、安全にｓｉＲＮＡを生体へ経皮導入することができる。
【００４４】
以上、本発明を実施の形態を用いて説明したが、本発明の技術的範囲は上記実施の形態に記載の範囲には限定されない。上記実施の形態に、多様な変更または改良を加えることが可能であることが当業者に明らかである。その様な変更または改良を加えた形態も本発明の技術的範囲に含まれ得ることが、特許請求の範囲の記載から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の実施形態に係るイオントフォレーシス装置１０の概略断面図である。
【図２】他の実施形態であるイオントフォレーシス装置１０の概略断面図である。
【符号の説明】
【００４６】
１０  イオントフォレーシス装置、５０  装置本体、６０  電源、６２  端子、６４  端子、２００  作用側電極構造体、２１０  第１電極部材、２２０  第１電解液保持部、２３０  第２導電型のイオン交換膜、２４０  薬液保持部、２５０  第１導電型のイオン交換膜、２６０  容器、２６２  作用側粘着面、３００  非作用側電極構造体、３１０  第２電極部材、３２０  第２電解液保持部、３３０  第１導電型のイオン交換膜、３４０  第３電解液保持部、３５０  第２導電型のイオン交換膜、３６０  容器、３６２  非作用側粘着面
【図１】
2007089911.tif 000003
【図２】
2007089911.tif 000004