(57)【要約】【課題】簡便かつ高感度な生物学的測定方法を提供する。【解決手段】被検物質を含む液状測定試料と、被検物質と特異的に結合する第１の物質が結合又は吸着した磁性体含有粒子とを反応させて被検物質−磁性体含有粒子複合体を作製する工程１と、磁気により前記被検物質−磁性体含有粒子複合体と、液状測定試料とを分離する工程２と、前記被検物質−磁性体含有粒子複合体を測定妨害物質を含まない溶液に分散させて分散液を調製する工程３と、被検物質と特異的に結合する第２の物質が固定化された固定相と、前記分散液とを反応させる工程４と、前記分散液を反応させた固定相の磁性量を測定することにより、前記液状測定試料中における前記被検物質の量を算出する工程５とを有する生物学的測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質を含む液状測定試料と、被検物質と特異的に結合する第１の物質が結合又は吸着した磁性体含有粒子とを反応させて被検物質−磁性体含有粒子複合体を作製する工程１と、
磁気により前記被検物質−磁性体含有粒子複合体と、液状測定試料とを分離する工程２と、
前記被検物質−磁性体含有粒子複合体を測定妨害物質を含まない溶液に分散させて分散液を調製する工程３と、
被検物質と特異的に結合する第２の物質が固定化された固定相と、前記分散液とを反応させる工程４と、
前記分散液を反応させた固定相の磁性量を測定することにより、前記液状測定試料中における前記被検物質の量を算出する工程５とを有する
ことを特徴とする生物学的測定方法。
【請求項２】
免疫クロマト法であることを特徴とする請求項１記載の生物学的測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、簡便かつ高感度な生物学的測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗原−抗体反応、リガンド−レセプター反応、糖−レクチン反応等の生物学的測定方法は、極めて特異性が高い反応であり、このような生物学的反応を利用した測定は、薬物、細菌、疾病等の検査等の医療分野を中心に、食品、工業製品、環境試料中の微量物質検出等に広く応用されつつある。なかでも、抗原−抗体反応を利用した生物学的測定方法は、極めて広い分野において利用されている。
【０００３】
生物学的測定方法の最大の利点は、生体の高度な物質間相互作用を利用して、これまで物理化学的な方法ではなし得なかった選択性を有する目的物質の検出、定量等ができることにあり、医療、食品、飲料水、下水、環境試料等の様々な試料中の低分子化合物から生体高分子まで広範囲な物質を検出できる可能性を有している。
【０００４】
近年、このような生物学的反応を利用した自動測定装置が数多く提案されている。例えば、現在最も広く利用されている方法の一つは、酵素結合抗体法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）を利用して、被測定物質の検出を自動化するものである。酵素結合抗体法では、通常、固相として９６穴ミクロプレート上に抗原又は抗体質を固定し、固定した抗原又は抗体と特異的に結合する酵素標識物質を試料に加えて反応させた後、プレート上の酵素活性から試料中の未知物質の有無や未知濃度を決定する方法である。現在では、酵素標識のみならず、蛍光や放射性等の標識も利用されている。この方法は、多検体を一度に分析できるため簡便性に優れる。
【０００５】
更に近年では、より簡便かつ迅速であることから、免疫クロマト法が多用されるようになってきている。免疫クロマト法では、通常、少なくとも２種類の抗体を利用したサンドイッチ法が採用されている。すなわち、標識された抗体を含む試薬と測定試料とを反応させ、被検物質と標識抗体とを結合し、これをもう一つの抗体が固定化されたメンブレンに流すことにより、固定化部位に標識された抗体が結合した被検物質を捕捉するというものである。このようなサンドイッチ法を採用した免疫クロマト法としては、種々の変法が提案されており、例えば、特許文献１〜５に開示されている。
【０００６】
しかしながら、免疫クロマト法は、測定試料によっては、標識された抗体を含む試薬が凝集してメンブレンを展開しない問題や、メンブレンの抗体固定化部位に非特異的に試薬が捕捉されてしまうという問題があった。特に、視覚的検知に有効である、色素や染料を含有した有機ポリマーからなる着色ラテックスを標識粒子として用いる場合に発生する問題である。
このような免疫クロマト法の問題は、その他の生物学的反応を利用した種々の測定法にも共通するものであった。
【特許文献１】特開昭６３−１５９７６１号公報
【特許文献２】特開平２−４９１６１号公報
【特許文献３】特表平８−５０８５６９号公報
【特許文献４】特開平１０−７３５９２号公報
【特許文献５】特開平１０−９０２６７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記現状に鑑み、簡便かつ高感度な生物学的測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、被検物質を含む液状測定試料と、被検物質と特異的に結合する第１の物質が結合又は吸着した磁性体含有粒子とを反応させて被検物質−磁性体含有粒子複合体を作製する工程１と、磁気により上記被検物質−磁性体含有粒子複合体と、液状測定試料とを分離する工程２と、上記被検物質−磁性体含有粒子複合体を測定妨害物質を含まない溶液に分散させて分散液を調製する工程３と、被検物質と特異的に結合する第２の物質が固定化された固定相と、上記分散液とを反応させる工程４と、上記分散液を反応させた固定相の磁性量を測定することにより、上記液状測定試料中における上記被検物質の量を算出する工程５とを有する生物学的測定方法である。
以下に本発明を詳述する。
【０００９】
本発明者らは、鋭意検討の結果、被検物質の量を測定する前に、磁気を用いて、測定物質中の被検物質と、測定物質中の被検物質以外の物質とを分離することにより、標識された抗体を含む試薬が凝集してメンブレンを展開しないという問題や、メンブレンの抗体固定化部位に非特異的に試薬が捕捉されてしまうという問題が生じることなく簡便かつ高感度に被検物質の量を測定することができるということを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
本発明の生物学的測定方法は、まず、図１の（ａ）、（ｂ）に示すように、被検物質を含む液状測定試料と、被検物質と特異的に結合する第１の物質が結合又は吸着した磁性体含有粒子とを反応させて被検物質−磁性体含有粒子複合体を作製する工程１を有する。
【００１１】
本発明の生物学的測定方法の測定対象となる被検物質としては、生物学的な反応をし得るものであれば特に限定されず、例えば、各種疾病や健康状態等の診断マーカー；農薬や環境ホルモン類等の環境関連物質；食品検査を目的とした化学物質等が挙げられる。なかでも、絨毛性ゴナドトロピン、Ｃ反応性タンパク質、黄体形成ホルモン、成長ホルモン、ガン胎児性抗原、αフェトプロテイン、濾胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）等の哺乳動物由来のペプチド又はタンパク質；サルモネラ菌、大腸菌、赤痢菌、結核菌等の微生物由来のタンパク質又は微生物菌体自体；ＨＩＶウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス等のウイルス由来のタンパク質又はウイルス粒子自体等のいわゆる抗原となる物質の検出に本発明の生物学的測定方法は好適に用いることができる。
【００１２】
本発明の生物学的測定方法の対象となる上記被検物質を含む液状測定試料としては特に限定されず、例えば、尿、血液、血漿、血清、唾液、乳、汗等の体液及びそれらの分画物等の生体由来の試料；井戸水、地下水、水道水、果汁等の天然由来の試料；土壌、汚泥等を水系媒体で抽出した抽出液；食料品、野菜、肉、卵等の粉砕物を水系媒体に懸濁した試料等が挙げられる。特に、血液、血漿、血清が挙げられる。
【００１３】
上記被検物質と特異的に結合する第１の物質としては、目的とする被検物質と生物学的に特異的に結合する物質であれば特に限定されず、例えば、被検物質が抗原である場合にはこれに対する抗体等が挙げられる。
上記抗体としては、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく、キメラ抗体、Ｆａｂ抗体、（Ｆａｂ）２抗体等の形態であってもよい。
【００１４】
上記被検物質を含む液状測定試料と、被検物質と特異的に結合する第１の物質が結合又は吸着した磁性体含有粒子とを反応させる方法としては特に限定されず、適当な溶媒に対して、被検物質と特異的に結合する第１の物質が結合又は吸着した磁性体含有粒子とを添加し、適当な温度条件の下で攪拌すればよい。
【００１５】
上記磁性体含有粒子は、本発明の生物学的測定方法において標識物質として機能するものである。
【００１６】
上記磁性体含有粒子としては特に限定されないが、有機高分子物質と、上記有機高分子物質中に分散した磁性体とからなるものであることが好ましい。
【００１７】
この場合、上記有機高分子物質は、磁性体含有粒子のマトリックスとしての役割を有する。上記有機高分子物質としては、スチレン系モノマーに由来するセグメントを有する共重合体であることが好ましい。スチレン系モノマーに由来するセグメントを有することにより、磁性体含有粒子の水系媒体中における分散性が向上する。
【００１８】
上記スチレン系モノマーとしては特に限定されず、例えば、スチレン、α−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、ｐ−クロロスチレン、クロロメチルスチレン、二官能性のジビニルベンゼン等が挙げられる。これらのスチレン系モノマーは単独で用いられてもよいし、２種以上が併用されてもよい。
【００１９】
上記スチレン系モノマーに由来するセグメントの含有量の好ましい下限は６０重量％である。６０重量％未満であると、得られる磁性体含有粒子の水系媒体中での分散性が劣ることがある。
【００２０】
上記有機高分子物質は、スチレン系モノマーに由来するセグメントのほかに、反応性官能基を含有するビニルモノマーに由来するセグメントを有していてもよい。反応性官能基を含有するビニルモノマーに由来するセグメントを有することにより、該反応性官能基を介して抗原や抗体を容易に結合することができる。
【００２１】
上記反応性官能基を含有するビニルモノマーの反応性官能基としては、抗原や抗体等を共有結合により結合可能なものであれば特に限定されず、例えば、カルボキシル基、水酸基、エポキシ基、アミノ基、トリエチルアンモニウム基、ジメチルアミノ基、スルホン酸基等が挙げられる。このような反応性官能基を含有するビニルモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸−２−ヒドロキシエチル、グリシジル（メタ）アクリレート、トリエチルアンモニウム（メタ）アクリレート、ジメチルアミノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。これらの反応性官能基を含有するビニルモノマーは単独で用いられてもよいし、２種以上が併用されてもよい。
【００２２】
上記共重合体は、その他のビニルモノマーに由来するセグメントを有していてもよい。
その他のビニルモノマーとしては特に限定されず、例えば、塩化ビニル；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル類；アクリロニトリル等の不飽和ニトリル類；（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル、（メタ）アクリル酸ステアリル、エチレングリコール（メタ）アクリレート、トリフルオロエチル（メタ）アクリレート、ペンタフルオロプロピル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、グリシジルメタクリレート、テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステル誘導体等が挙げられる。これら単量体は単独で用いられてもよいし、２種以上が併用されてもよい。
上記共重合体は、架橋性モノマーに由来するセグメントを有していてもよいし、これらのセグメントにより架橋が施されていてもよい。
【００２３】
上記架橋性モノマーとしては特に限定されず、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリトリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、ジアリルフタレート及びその異性体、トリアリルイソシアヌレート及びその誘導体等が挙げられる。これら架橋性単量体は単独で用いられてもよいし、２種以上が併用されてもよい。
【００２４】
上記磁性体としては特に限定されないが、残留磁気がない超常磁性を有するものが好適である。残留磁気があると自己凝集しやすくなり、クロマト展開性が劣ることがある。
上記超常磁性を有する磁性体としては特に限定されず、例えば、四三酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、γ−重三二酸化鉄（γ−Ｆｅ２Ｏ３）等の各種フェライト類；鉄、マンガン、コバルト等の金属又はこれらの合金等が挙げられる。なかでもフェライト類が好適であり、なかでも四三酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）が好適である。
このような磁性体としては、Ｆｅ２＋とＦｅ３＋とを１：２の割合で含む混合液を塩基性の溶液に滴下することでＦｅ３Ｏ４が得られる共沈反応法により調製したもの等を用いることができる。また、フェリコロイドＨＣ−５０（タイホー工業社製）、ＨＸ―２０（シグマハイケミカル社製）等の市販品も用いることができる。
【００２５】
上記有機高分子物質中における磁性体の分散径の好ましい下限は１ｎｍ、好ましい上限は３０ｎｍである。１ｎｍ未満であると、磁性体の製造自体が困難であることに加え、磁性体の磁性応答特性が減少し、標識として用いたときの感度が低下することがある。３０ｎｍを超えると、残留磁気を生じやすくなり、自己凝集しやすくなることに加え、磁性体が磁性体含有粒子の表面に露出しやすくなることがある。より好ましい下限は５ｎｍ、より好ましい上限は２０ｎｍである。
【００２６】
上記磁性体含有粒子中における磁性体の含有量の好ましい下限は５０重量％、好ましい上限は８０重量％である。５０重量％未満であると、磁性量が低く、極微量の測定対象成分を分析する際に検出が困難となることがあり、８０重量％を超えると、自己凝集しやすくなったり、磁性体含有粒子全体の重量が大きくなり過ぎたりしてクロマト展開性が劣ることがある。より好ましい下限は６０重量％、より好ましい上限は７０重量％である。
【００２７】
上記磁性体含有粒子は、平均粒子径の好ましい下限が５０ｎｍ、好ましい上限が５００ｎｍである。５０ｎｍ未満であると、媒体中に懸濁させたときの分散安定性が悪くなって自己凝集しやすくなることがあり、５００ｎｍを超えると、クロマト担体の孔を通過しにくくなり、クロマト展開性が劣ることがある。より好ましい下限は１００ｎｍ、より好ましい上限は４００ｎｍである。
【００２８】
上記磁性体含有粒子は、粒子径のＣＶ値が５０％未満であることが好ましい。５０％以上であると、粒子径の大きい粒子がクロマト担体の孔を通過しにくくなり、クロマト担体中に残存することがある。
【００２９】
上記磁性体含有粒子は、上記有機高分子物質を構成する炭素元素と上記磁性体を構成する金属元素との構成比率の絶対偏差の好ましい上限が０．３である。
なお、本明細書において絶対偏差とは、上記有機高分子物質を構成する炭素元素と、磁性体を構成する金属元素の同期発光を測定し、粒子毎の炭素元素と金属元素との混在比率のバラツキから算出したその測定データの分散状態を示す偏差値であって、磁性体含有粒子の磁性体含有量のバラツキを示すパラメータである。上記絶対偏差の数値が小さいほど磁性体含有量のバラツキが小さく、即ち磁性体含有粒子の均一性が高く、大きいほど磁性体含有量のバラツキが大きい、すなわち磁性体含有粒子の均一性が低いことを示す。
上記絶対偏差が０．３を超えると、免疫測定法に利用した場合に、測定再現性や定量性が低くなり測定精度が悪化することがあり、得られる測定データの信頼性が低くなる。より好ましい上限は０．２７、更に好ましい上限は０．２５、特に好ましい上限は０．２０である。
【００３０】
上記磁性体含有粒子を製造する方法としては特に限定されず、例えば、懸濁重合法、マイクロサスペンジョン重合法、ミニエマルジョン重合法、分散重合法等を応用した方法が挙げられる。なかでも、粒子径の小さな粒子を容易に製造することができることから、ミニエマルジョン重合法を応用した方法が好適である。
【００３１】
本発明の生物学的測定方法は、磁気により前記被検物質−磁性体含有粒子複合体と、液状測定試料とを分離する工程２を有する。
これにより、磁性体含有粒子の凝集や非特異反応を引き起こす液状測定試料中に存在するタンパク質や脂質等の夾雑物質を除去することが可能となる。
【００３２】
上記磁気を用いた具体的な方法としては、例えば、図１の（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）に示すように、上記被検物質−磁性体含有粒子複合体を含有する溶液を入れた容器の底にフェライト磁石等を近づけて、上記被検物質−磁性体含有粒子複合体を沈殿させた状態で、溶液のみを除去する方法等が挙げられる。
【００３３】
本発明の生物学的測定方法は、図１の（ｅ）、（ｆ）に示すように、上記被検物質−磁性体含有粒子複合体を測定妨害物質を含まない溶液に分散させて分散液を調製する工程３を有する。
【００３４】
上記測定妨害物質とは、磁性体含有粒子の凝集や非特異反応を引き起こすタンパク質や脂質等の夾雑物質等を意味し、例えば、測定対象が血液の場合には、リューマチ因子や異種の免疫グロブリンに対する抗体等のタンパク質や、コレステロール等の脂質が挙げられる。
【００３５】
上記測定妨害物質を含まない溶液とは、上述したような物質を含まない溶液を意味し、例えば、通常の生物学的反応に使用されるような緩衝液、水等が挙げられる。また、これらの溶液には、必要に応じて、特異的な反応に必要なウシ血清アルブミン等のタンパク質や、界面活性剤等を含有させてもよい。
具体的には、例えば、０．１％ウシ血清アルブミンと、０．０１％トリトンＸ−１００と、０．９％塩化ナトリウムとを含む０．１Ｍリン酸緩衝液等が挙げられる。
【００３６】
本発明の生物学的測定方法は、図１の（ｆ）、（ｇ）に示すように、被検物質と特異的に結合する第２の物質が固定化された固定相と、上記分散液とを反応させる工程４を有する。
【００３７】
上記被検物質と特異的に結合する第２の物質としては、目的とする被検物質と生物学的に特異的に結合する物質であり、被検物質と特異的に結合する第１の物質とエピトープが異なるものであれば特に限定されず、例えば、被検物質が抗原である場合にはこれに対する抗体等が挙げられる。上記抗体としては、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく、キメラ抗体、Ｆａｂ抗体、（Ｆａｂ）２抗体等の形態であってもよい。
【００３８】
上記固定相としては特に限定されず、例えば、マイクロプレート、免疫クロマト法のメンブレン、マイクロ流路を有するチップ等が挙げられる。なかでも、免疫クロマト法のメンブレンが好適に用いられる。
【００３９】
上記被検物質と特異的に結合する第２の物質を固定相に固定化する方法としては特に限定されず、例えば、免疫クロマト法の試験片を作製する際に通常行われる方法等が挙げられ、具体的には、多孔質の担体に捕捉物質が固定化された固定相に、試料導入材料や吸収材料等が組み合わされた試験片等を用いることができる。
【００４０】
上記試験片の形態としては特に限定されず、例えば、ラテラルフロータイプ、フロースルータイプ等が挙げられる。
【００４１】
上記多孔質の担体としては、移動相を適度な速度で展開することができるものであれば特に限定されず、例えば、メンブランフィルターや、ニトロセルロース、ガラス濾紙等の多孔質体が挙げられる。本発明では、移動相を展開した後に、磁性量を測定するため、非磁性材料からなる担体を用いることが好ましい。
【００４２】
上記試料導入材料は、移動相の展開速度や展開量等を制御することを目的として用いられるものであり、移動相を適度な速度で展開することができるものであれば特に限定されず、例えば、メンブランフィルターや、ニトロセルロース、ガラス濾紙等の多孔質体が挙げられる。
【００４３】
上記吸水材料は、過剰の試料を迅速に吸収することを目的として用いられるものであり、毛細管現象により、多孔質の担体を展開した測定試料液を吸収するものであれば特に限定されず、例えば、セルロースやコットン等の吸水性材料が挙げられる。
【００４４】
本発明の生物学的測定方法は、上記分散液と反応した固定相の磁性量を測定することにより、上記測定試料中における上記被検物質の量を算出する工程５を有する。
【００４５】
上記磁性量を測定する方法としては特に限定されず、例えば、ホールセンサーやＧＭＲセンサ等の磁気センサを用いる方法や磁気緩和測定を利用する方法等が挙げられる。このようにして測定した磁性量の計測結果をもとに、予め作成した検量線から被検物質量を求めることができる。
【００４６】
本発明の生物学的測定方法は、抗体を含む試薬と、測定試薬とを反応させ、測定試薬中に含まれる抗原と標識抗体とを結合させ、これをもう１つの抗体が固定化されたクロマト担体に流すことにより、クロマト担体中で抗原を捕捉し、捕捉された抗原の標識をもとに分析するという免疫クロマト法として特に好適である。
【発明の効果】
【００４７】
本発明によれば、簡便かつ高感度な生物学的測定方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００４９】
（実施例１）
（１）抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体結合磁性体含有粒子の作製
磁性体含有粒子（ポリスチレン系、磁性体含有量６０％、平均粒子径０．３μｍ、積水化学社製）５．０ｍｇに、０．０２Ｍリン酸バッファー１．０ｍＬを添加し、超音波で再分散後、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離し、上清を除去した。この遠心洗浄操作を３回繰り返した。
続いて、得られた磁性体含有粒子に、０．０２Ｍリン酸バッファー１．０ｍＬを添加し、抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体１００μｇ加え、３７℃恒温槽中で２時間攪拌した。その後、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離を行い、未反応の抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体を除去した。なお、粒子への抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体結合量は、上清の蛋白濃度測定から仕込みの７２％であることを確認した。
得られた磁性体含有粒子を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍＬに懸濁させ、再度遠心分離を行った。その後、磁性体含有粒子を、牛血清アルブミンが１％（ｗ／ｖ）濃度になるように調整した１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍＬに懸濁させ、３７℃恒温槽で１時間撹拌し、ブロッキング処理を行った。次いで、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離を行い、牛血清アルブミン及びグリセロールを各々１％（ｗ／ｖ）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）濃度になるように調整した１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍＬに分散させ、免疫測定用粒子（抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体結合磁性体含有粒子）を得た。
【００５０】
（２）固定相の作製
ニトロセルロースメンブレン（ＳＲＨＦ  Ｐ７０、日本ミリポア社製）を幅２０ｃｍ×長さ６ｃｍに裁断し、その長さ方向上端より２ｃｍの部位（反応部位）に、抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体を２．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにトリス塩酸緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解した溶液を幅０．７ｍｍの直線状に塗布した。その後、３７℃で２時間乾燥した後、牛血清アルブミン（和光純薬社製）を１重量％の濃度になるようにリン酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）に溶解した溶液に１時間浸漬し、ブロッキング処理を行った。さらにその後、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウムを０．１重量％の濃度になるようにリン酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）に溶解した溶液にて洗浄後、シリカゲルデシケーター内で室温下にて乾燥し、抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体を固定化した試験片を得た。
得られた試験片を幅５ｍｍに裁断し、長さ方向上端に幅５ｍｍ×長さ２０ｍｍの吸水パッド（ＡＰ２２、日本ミリポア社製）を、下端に幅５ｍｍ×長さ１５ｍｍのコンジュゲートパッド（グラスファイバー、日本ミリポア社製）を重ね、透明なテープで固定して試験片とした。
【００５１】
（３）測定試料用溶液の調製
ｈＣＧ濃度が０ｍＩＵ／ｍＬ、５ｍＩＵ／ｍＬ、５０ｍＩＵ／ｍＬ、１００ｍＩＵ／ｍＬになるよう血漿中に混合することにより各測定試料用溶液を調製した。
【００５２】
（４）磁性量の測定
各測定試料用溶液２００μＬに免疫測定用粒子１０μｇを添加し、１０分間混合した。次いで、容器の底にフェライト磁石を近づけて、免疫測定用粒子を集めた状態で、反応液を除去した。続いて、牛血清アルブミンが１％（ｗ／ｖ）濃度、トリトン−Ｘを０．０１％（ｗ／ｖ）の濃度になるように調整した５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）２００μＬを添加し、再分散させ、作製した試験片のコンジュゲートパッドに１００μＬをそれぞれ滴下した。
滴下から２０分経過後、市販のＧＭＲセンサ（差動磁界センサ、ＮＶＥ社製）を用いて、試験片の反応部位の磁性量を測定した。
測定結果を表１に示した。
【００５３】
（比較例１）
実施例１と同様にして抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体結合磁性体含有粒子、固定相及び試験液を作製し、各試験液２００μＬに免疫測定用粒子１０μｇを添加し、１０分間混合した後、作製した試験片のコンジュゲートパッドに１００μＬをそれぞれ滴下した。
滴下から２０分経過後、市販のＧＭＲセンサ（差動磁界センサ、ＮＶＥ社製）を用いて、試験片の反応部位の磁性量を測定した。
測定結果を表１に示した。
【００５４】
【表１】
2007327777.tif 000002
【００５５】
表１より、実施例１の方法は、低濃度のｈＣＧが検出可能であり、かつ、検出された磁性量はｈＣＧ濃度に依存していることが確認された。
一方、磁石による分離を行わなかった比較例１では、試験片への免疫測定用粒子の残留があり、また、試験液０ｍＩＵ／ｍＬにおいて抗体固定化部への非特異吸着（磁性量の検出）が認められ、実施例１に比べ、検出感度、精度が低い結果となった。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明によれば、簡便かつ高感度な生物学的測定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】本発明の生物学的測定方法の一例を模式的に示した図である。
【符号の説明】
【００５８】
１  被検物質
２  被検物質と特異的に結合する第１の物質
３  磁性体含有粒子
４  被検物質−磁性体含有粒子複合体
５  磁気
６  測定妨害物質を含まない溶液
７  被検物質と特異的に結合する第２の物質
８  固定相
【図１】
2007327777.tif 000003