(57)【要約】【課題】  抗凝固活性を有する薬剤の新規評価方法の提供。【解決手段】  本発明は、血小板を含んだ試料に、抗凝固活性を有する又は有すると予想される試験薬剤を添加し、当該血小板から放出される内因性セロトニンの量を測定することを特徴とする、抗血小板活性及び／又は抗凝固活性を持つ薬剤の評価方法を提供する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板を含んだ試料に、抗凝固活性を有する又は有すると予想される試験薬剤を添加し、当該血小板から放出される内因性セロトニンの量を測定することを特徴とする、抗血小板活性及び／又は抗凝固活性を持つ薬剤の評価方法。
【請求項２】
前記血小板を含んだ試料に凝固促進する試薬をさらに添加する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記血小板を含んだ試料が抗凝固剤を添加することで血小板の凝固活性を阻害したものである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記抗凝固剤がクエン酸３ナトリウム及びエチレンジアミン４酢酸２カリウムからなる群から選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
抗凝固活性を有する薬剤を入れた場合と入れない場合について、血小板から放出される内因性セロトニンの量を測定し、比較することにより評価を実施する、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板からの内因性セロトニン放出を指標とした、抗凝固活性を有する薬剤の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化が主たる原因である冠動脈疾患、脳血管障害などの治療において、血液の抗凝固活性を有する薬剤はよく使われている。代表的な薬剤としては、血漿中のアンチトロンビンIIIと複合体を形成し、抗トロンビン作用、抗Ｘａ因子作用など強力な抗凝固作用を示すヘパリン、血小板の活性化を阻害するアスピリンなどがある。このような抗凝固活性を有する薬物のスクリーニングおよび性能を評価するための方法は医療及び臨床検査などの分野などにおいて重要視されている。
【０００３】
抗凝固活性を有する薬剤の評価方法では、まずクエン酸３ナトリウムにより凝固を抑制した血小板を含んだ血漿にかかる薬剤を入れ、エピネフリンとＡＤＰ（アデノシン２燐酸）を入れてから攪拌することにより凝集を開始させる工程を行う。そして、濁度により凝集の進み方をモニターすることにより抗凝固活性の評価を行う方法がある（Ｇｏｔｏ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１９９８，１０１，ｐ４７９（非特許文献１））。凝集を活性化させるものとしては、エピネフリンとＡＤＰ以外に、カルシウムイオン、コラーゲン、セロトニンなどが挙げられる。また、血小板の活性化を阻害する薬剤の評価方法としては、まず得られた血小板を含んだ血漿から血小板を取り出し、緩衝液中に再度懸濁し、かかる薬剤を入れ、次いでカルシウムイオンを入れてから攪拌することによりずり応力に暴露し、凝集を開始させる方法が挙げられる（非特許文献１）。この場合、凝集を活性化させる試薬を入れずに、ずり応力に暴露するだけでも凝集を開始することも出来る（Ｇｏｔｏ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００２，１０５，ｐ２５３１（非特許文献２））。そして、透過光や散乱光の変化により凝集の進み方をモニターし、抗凝固活性の評価を行う。レーザー光を用いると、その透過光の変化は凝集塊の数を反映する。
【０００４】
これらの方法は、凝固の進み具合について時間を追って簡単にモニター出来る利点があるものの、加えた薬物の種類および濃度により、その凝集曲線の形は異なり、定量的に評価するのは困難である。結果を定量的に表す場合には、一定時間後の濁度を凝集の測定値として用いるが、実験条件により凝集曲線が交わる場合があり、時間によりその凝集度の順が逆転することがある。
【０００５】
凝固曲線の形が多様化する理由の１つとしては、凝集の進み方として、小さな塊が出来、更にそれらが凝集して大きな塊になるところに起因する。光源としてレーザーを用いた場合を例にとると、大きく分けて次の２つのパターンが考えられる。なお、前述したようにレーザー光源を用いた場合には、凝集塊の個数が凝集度に反映される。
パターン１；最初の段階で小さな凝集塊が出来て、少し時間をおいて、それらがさらに結合し大きな凝集塊が形成される。この場合、凝集曲線は、ある一定時間まで上昇するが、大きな凝集塊が形成される時間においては、凝集塊の数が減少するため、凝集曲線は下降する。
パターン２：小さな凝集塊が出来ながら、大きな凝集塊も早い段階から形成が始まる。この場合には、凝集曲線はある値まで上昇し、その後は一定となる。
【０００６】
このことが原因で、薬剤の種類及びその濃度により、小さな塊が生ずることを主体に抗凝集活性を阻害するのか、大きな塊が生ずることを主体に抗凝集活性を阻害するのかで、その凝集曲線の形が変化する。
【０００７】
コラーゲンで表面を覆ったプレートの表面上に血小板を含んだ試料を流し、プレート表面に現れた凝集塊を観察することにより凝集度の進み具合を評価する方法もある（Ａｂｕｌｅｎｃｉａ  ＪＰ  ｅｔ  ａｌ，Ａｒｔｅｒｉｏｓｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ，２００１，２１，ｐ１４９（非特許文献３））。
【０００８】
この方法では、プレート上の凝集塊の面積、高さ、体積などを基準に凝集度の定量化を行えるが、この測定方法は煩雑であり、特別な装置が必要であるという欠点を有する。
【０００９】
Ｃ14の含んだ放射同位体を含んだセロトニンで血小板を処理してそれに取り込ませ、この血小板を緩衝液または血漿に再度懸濁し、そして評価すべき薬物および凝集を活性化する試薬を入れ、その際に血小板から放出される放射同位体量を測定することにより薬剤の動態を評価する方法がある（Ｊｏｓｅｐｈ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，１９９０，７５，ｐ３９９（非特許文献４）；  Ｌａｓｓｉｌａ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，Ａｒｔｅｒｉｏｓｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ，１９９７，１７，ｐ３５７８（非特許文献５））。
【００１０】
しかしながら、この方法は、血小板に放射同位体の含んだセロトニンを取り込ませるためのインキュベート処理する必要がある。また、実験に用いる血小板は凝集実験に用いるために完全に不活化させることができないため、インキュベートの際に少なからず血小板の活性化が亢進される。また、血小板表面にはセロトニンを取り込むトランスポーター以外にセロトニンリセプターがあり、加えたセロトニンがこのセロトニンリセプターを介して血小板を活性化する。このような活性化の進んだ血小板を用いた薬剤の評価結果は、生体内での薬剤の動態を反映しない可能性が高い。
【００１１】
【非特許文献１】J. Clin. Invest., 1998, 101, p479
【非特許文献２】Circulation, 2002, 105, p.2531
【非特許文献３】Arteriosler. Thromb. Vasc. Biol., 2001, 21, p.149
【非特許文献４】Blood, 1990, 75, p.399
【非特許文献５】Arteriosler. Thromb. Vasc. Biol., 1997, 17, p.3578
【非特許文献６】Clin. Biochem, 2004, 37, p.191
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、従来の抗凝固活性を有する薬剤の評価方法のもつ欠点、即ち、定量化が困難であるとか、高度で複雑な設備や面倒な操作を必要とするといった問題の解消された、新規の抗凝固活性を有する薬剤の評価方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
凝集塊は血小板が活性化し、フィブリンを介して互いに結合することにより生ずる。血小板は活性化するときに、α顆粒と濃染顆粒からさまざまな物質を放出する。α顆粒中の物質は、血小板中の蛋白質のリン酸化による活性化のみによって血小板から放出されるが、濃染顆粒からの放出は、リン酸化だけでなく血小板中へのカルシウムイオンの流入が必要である。
【００１４】
我々は、凝集を定量化するために血小板から放出する物質に注目し、そしてキレート剤による処理のみでコントロールすることの出来る濃染顆粒から放出される凝固活性を有する生理活性物質に注目したところ、数あるそのような生理活性物質の中で、セロトニンに限り、抗凝固活性を有する薬剤の定量評価の指標として有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
従って、本願は以下の発明を包含する。
（１）血小板を含んだ試料に由来する血漿試料に、抗凝固活性を有する又は有すると予想される試験薬剤を添加し、当該血小板から放出される内因性セロトニンの量を測定することを特徴とする、抗血小板活性及び／又は抗凝固活性を持つ薬剤の評価方法。
（２）前記血小板を含んだ試料に凝固促進する試薬をさらに添加する、（１）の方法。
（３）前記血小板を含んだ試料が抗凝固剤を添加することで血小板の凝固活性を阻害したものである、（１）又は（２）の方法。
（４）前記抗凝固剤がクエン酸３ナトリウム及びエチレンジアミン４酢酸２カリウムからなる群から選択される、（３）の方法。
（５）抗凝固活性を有する薬剤を入れた場合と入れない場合について、血小板から放出される内因性セロトニンの量を測定し、比較することにより評価を実施する、（１）〜（４）のいずれかの方法。
【発明の効果】
【００１６】
凝集塊の主体である血小板から放出されるものであれば、凝集塊の大きさは関与せずに、凝集した血小板数を反映することにより、抗凝固活性を有する薬剤をより定量的に評価出来る。そして、本方法は、遠心分離機、ずり応力に暴露するための攪拌装置があればよく、比較的簡便である。また、血小板を含んだ試料に試験薬剤を添加後、血小板を除去した試料から、セロトニン測定のみを行う場合については、セロトニンを測定する試薬および機器を準備して測定してもよいし、外部の分析機関に依頼することも出来る。
【００１７】
また、本方法の特徴は、得られた血液を遠心分離することにより血小板を含んだ試料を採取し、放射同位体を含んだセロトニンを血小板に取り込ませるなどの処理することなく、実験に供することができる点にある。この放射標識したセロトニンによる血小板の前操作は、血小板の活性化を亢進させ、評価精度を低下させる。本発明によれば内因性セロトニンの量を測定するために、標識したセロトニンによる血小板の処理が必要ないため、より生体内に近い条件で薬物の動態を反映する結果が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
上述のとおり、本発明は、血漿試料に由来する血小板を含んだ試料に、抗凝固活性を有する又は有すると予想される試験薬剤を添加し、当該血小板から放出される内因性セロトニンの量を測定することを特徴とする、抗血小板活性及び／又は抗凝固活性を持つ薬剤の評価方法、に関する。
【００１９】
具体的には、採血した血液に、クエン酸塩、例えばクエン酸３ナトリウムやエチレンジアミン４酢酸、例えばエチレンジアミン４酢酸２カリウムなどの血小板の凝固活性を阻害するのに有効なキレート系の抗凝固剤を、血小板の凝固活性を阻害するのに有効な量において加えることで血小板の凝固活性を阻害し、次いで遠心分離（例えば120ｇで15分）などにより活性の阻害された血小板を含んだ試料を得る。また、その血小板を含んだ試料をさらに遠心分離（例えば２００ｇで２０分）などにより血小板のみを沈殿画分として取得し、緩衝液（例えば１３５mmol／ｌ食塩＋１２mmol／ｌ炭酸１水素２ナトリウム＋２．９mmol／ｌ塩化カリウム＋０．３６mmol／ｌリン酸２水素１ナトリウム＋１mmol／ｌ塩化マグネシウム＋５mmol／ｌ  ＨＥＰＥＳ＋５mmol／ｌグルコース  pH７．４）に懸濁して血小板を含んだ試料として用いても良い。また、キレート系の抗凝固剤を加えた、採血した血液をそのまま用いても良い。血液は、ヒト、あるいはその他の温血動物、例えばサル、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、などから採血したものであってよい。血小板の凝固活性を阻害するのに有効な他のキレート化剤としては、特に限定することなく、クエン酸３ナトリウム以外の他のクエン酸塩、エチレンジアミン４酢酸２カリウム以外の他のエチレンジアミン４酢酸塩、ジアミノプロパノール４酢酸あるいはその塩、ジアミノプロパン４酢酸あるいはその塩、エチレンジアミン２酢酸あるいはその塩、エチレンジアミン２プロピオン酸あるいはその塩などが挙げられる。また、血小板の凝固活性を阻害するのに有効なキレート系の抗凝固剤の使用量は、使用する抗凝固剤の種類にも依存するが、３．８％のクエン酸３ナトリウム溶液を血液試料に加えるのであれば、血液試料に対し１０〜２０％容量を、エチレンジアミン４酢酸２ナトリウムを血液試料に加えるのであれば、全体で１〜５mg／mlになるように加えることが、適当であろう。
【００２０】
これらの血小板を含んだ試料に、抗凝固活性を評価すべき薬剤又は抗凝固活性を示す可能性がある候補薬剤を入れ、更にエピネフリン、ＡＤＰ、カルシウムイオン、コラーゲン、外因性セロトニンなどといった凝固活性を促進又は刺激する試薬を任意的に混合する。または、これらの凝固活性を促進又は刺激する試薬は入れなくともよい。凝固活性を促進又は刺激する試薬として外因性セロトニンを用いる場合には、最初の投入量との差により内因性セロトニンの放出量を算出するが、測定精度が低下するため、セロトニン以外の物質を入れるか、または凝固活性を促進又は刺激する試薬を全く入れないことが望ましい。
【００２１】
この混合試料を、攪拌などにより、ずりに一定時間暴露し、その後遠心分離などにより血小板を除去して、その中の内因性セロトニン濃度をＨＰＬＣ法（Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００４，３７，ｐ１９１（非特許文献６））やイムノアッセイ（例えば、ＭＰ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬＳ社から市販されているＳｅｒｏｔｏｎｉｎ  ＥＬＩＳＡキット）などにより定量することにより、その凝固の進み具合（凝集度）を確認することが出来る。凝集活性を亢進させるために攪拌を用いる場合には、その攪拌によるずり環境への暴露は特に制限されるものではないが、例えば、血小板を含有する試料を円錐平板回転粘度計内において適当なずり速度、例えば１００〜５０，０００ｓ-1、好ましくは１，０００〜２０，０００ｓ-1程度のずり速度に、適当な時間、例えば１０秒〜３０分、好ましくは１分〜１０分程度曝露することにより行う。また、１〜１００μｍ程度の内径のキャピラリー配管に一定時間測定試料を流し、血小板の凝集活性を亢進させることもできる。例えば、シリコン単結晶基板に加工したキャピラリー流路を持つセルを有した装置が販売されている（細胞マイクロレオロジー測定装置ＭＣＦＡＮＫＨシリーズ、日立原町電子工業株式会社製）。また、５mm程度の筒状のセルを持ち、セル中をマグネットスターラにより、単に攪拌するような血小板凝集測定装置を用いて、測定試料の凝集活性を亢進させても良い（例えば、コーワＰＡ−２００、興和株式会社製）。一定時間放置して凝集活性を亢進させる時には、通常、凝集活性を亢進させるために、攪拌、細い流路を流すなどの操作を行ってよいが、ただ放置してもかまわない。そして、投入する薬剤を加える、加えない、加える濃度を変更させたりするなどして試験条件を変え、比較検討することでその薬剤の抗凝固活性の評価を行うことが出来る。また、凝固を開始する前と、開始して一定時間たった時点での比較を行ったり、凝固を開始してからの時間を変え、血小板からの放出するセロトニンの変化量により薬物の評価を行うことも出来る。また、この方法は、抗凝固活性を有する候補薬物のスクリーニングにも使用することが出来る。
【００２２】
抗凝固剤としてのクエン酸ナトリウムの使用は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系の凝固研究において使用する血漿や血小板を採取する際によく使われる抗凝固剤であり、過去のデータの蓄積があることから、実験結果の解釈が容易に行える利点がある。しかしながら、クエン酸３ナトリウムはキレート化力の弱いキレート剤であり、それによる処理では血小板からのセロトニンの放出は完全には止まらない。血液から実験に用いる血小板を含んだ試料を取得する場合には、クエン酸３ナトリウムを用いることは、完全に血小板の活性を止めないで取得できるので、その後に抗凝固活性を有する薬剤の評価を行うために、再度血小板の活性化を促すことが容易であり、利点があるが、セロトニンを測定するための試料を作成する際に、遠心分離などで血小板を除去する時には、更にＥＤＴＡ２Ｋなどの強いキレート剤をいれ、血小板からのセロトニンの放出を止めてから操作を行うことが望ましい。
【実施例】
【００２３】
実施例１
２人の健常人から得た血液に抗凝固剤として血液に対して１０％容量の３．８％クエン酸３ナトリウム溶液を加える。そして、４℃にて、１２０ｇ、１５分間、遠心し、血小板を含んだ試料を得た。これら血小板を含んだ試料に、何も加えない場合（実験条件１）、フィブリノーゲン、ｖＷＦ分子と血小板膜糖蛋白ＧＰIIｂ／IIIａ複合体の結合を阻害する抗体であるＬＪ−ＣＰ８を終濃度４mg／mlを加えた場合（実験条件２）、ＬＪ−ＣＰ８終濃度４mg／mlに加えて、ｖＷＦと血小板表面にあるＧＰＩｂ／ＩＸ複合体との結合を阻害する抗体ＬＪ−Ｐ３終濃度１mg／mlの両者を加えた場合（実験条件３）、フィブリノーゲン、ｖＷＦと血小板膜糖蛋白ＧＰIIｂ／IIIａ複合体との結合、ヒドロネクチンと血小板膜上のインテグリンαｖβ３の結合を阻害する抗体でもある血小板凝集阻害剤ＡＢＣＩＸＩＭＡＢ  ２mg／mlを加えた場合（実験条件４）、ＡＤＰにより血小板が活性化されるレセプターを阻害する分子ＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＣを１０μmol／mlを加えた場合（実験条件５）について、血小板膜表面上における凝固活性を刺激するために血小板を円錐平板回転粘度計内において１０，８００ｓ-1のずり速度に６分間曝露しながら、レーザー光を用い透過光をモニターすることにより、凝集度を評価した（図１、図２）（Ｇｏｔｏ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００２，１０５，ｐ２５３１）。
【００２４】
血小板をずりの環境に曝露する前後の測定試料に１００mMエチレンジアミン４酢酸２ナトリウムの溶液を５％容量入れ、遠心分離（１５００ｇ、１５分間、４℃）にて血小板を含まない血漿を取得し、その中のβトロンボグロブリン（βＴＧ）、血小板第４因子（ＰＦ４）、セロトニン濃度を測定した。セロトニンの測定方法は、Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００４，３７，ｐ１９１に記載された方法により行なった（表３）。βトロンボグロブリン（βＴＧ）（表１）、血小板第４因子（ＰＦ４）（表２）の定量評価は、ロッシュ社のイムノアッセイキット（アセラクロムβＴＧ、アセラクロムＰＦ４）を用いて行なった。
【００２５】
凝集曲線の６分間の凝集度（図１、図２）を見ると、コントロール（実験条件１）に比べ、ＬＪ−ＣＰ８を加えた実験条件２ではやや低下傾向を示し、ＬＪ−ＣＰ８＋ＬＪ−Ｐ３を加えた実験条件３では更に低下傾向を示している。抗凝固活性を有する薬剤として、生体内においては、ＡＢＣＩＸＩＭＡＢ（Ｎｏ  ａｕｔｈｏｒｓ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２０００，１０１，ｐ２７８８）とＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＣ（Ｊａｃｏｂｓｓｏｎ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｔｈｅｒ，２００２，２４，ｐ７５２）は、過去の患者に対する投与実験から推測すると、有効性はＡＢＣＩＸＩＭＡＢの方が高い。
【００２６】
しかしながら、レーザー光によるモニターによる凝集度の評価においては、健常人Ａでは、ＡＢＣＩＸＩＭＡＢ添加（実験条件４）より、ＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＣ添加（実験条件５）の方が凝集度は低く、凝固阻害がより高いという結果になった（図１）。そして、健常人Ｂについては、６分後においてはＡＢＣＩＸＩＭＡＢ添加（実験条件４）の方が低下傾向にあったが、２．４分ではＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＣ（実験条件５）の方が低下傾向にあった（図１，２）。この図２のＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＣ（実験条件５）の凝集曲線の解釈としては、約１分後までは小さい凝集塊が出来て、それ以後、その凝集塊がさらに凝集して大きな凝集塊になることにより約２．４分まで凝集曲線は下降している。その後、攪拌する力により、再度、大きな凝集塊がくずれて細かくなっているのであろうと推定される。このことから、添加した薬剤の影響により約１．２分から約２．４分に形成された比較的大きな凝集塊はもろい凝集塊なのであろうと推定される。
【００２７】
ずりに曝露する前（ｓｈａｒｅ−）と、ずりに曝露した後（ｓｈａｒｅ＋）に得られた、遠心分離により血小板を含まない血漿について、βＴＧ、ＰＦ４、セロトニンを測定した。攪拌（ずり）前後の差を算出し、薬物を添加しない実験条件１（Ｃｏｎｔｒｏｌ）を１００％として他の実験条件を計算したところ（％値が低いほど凝固阻害が高いことになる。）、βＴＧではＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＣ添加（実験条件５）において凝固阻害が高く、ＰＦ４でも同様であり、セロトニンにおいてはＡＢＣＩＸＩＭＡＢ（実験条件４）において凝集阻害が高かった（表１）。このことは、セロトニンの放出量を評価することにより、生体内に近い条件で薬剤の評価が行えることを示している。また、レーザー光によるモニターでＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＣにおいて阻害率が高かったのは、ＡＲ−Ｃ６９９３１ＭＣが大きな凝集塊の形成をより強く阻害していると考えられる。これは、前述したように、凝集曲線の形からも推測される。また、βＴＧ，ＰＦ４の測定において、ＡＢＣＩＸＩＭＡＢの凝固阻害が高くなかった（放出量が少なくなかった）理由は、測定試料の保存において、α顆粒から放出されるβＴＧやＰＦ４はクエン酸３ナトリウムにより放出を抑えられないことから、これが誤差要因となり正確な凝固阻害が評価出来なかったことによると考えられる。
【００２８】
【表１】
2007064916.tif 000002
【００２９】
【表２】
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【００３０】
【表３】
2007064916.tif 000004
【００３１】
実施例２
蛭より得られた強力なトロンビン阻害剤であるヒルログについて評価した。健常人１名（健常人Ｃ）からの血小板を含んだ試料を用いた。その攪拌後の測定試料に１００mMエチレンジアミン４酢酸２ナトリウムの溶液を５％容量およびＣＴＡＤ溶液（ベクトンディッキンソン製）を１０％容量入れ、遠心分離（１５００ｇ、１５分間、４℃）にて血小板を除去した試料を取得し、その中のβトロンボグロブリン（βＴＧ）、血小板第４因子（ＰＦ４）、セロトニン濃度を測定した。その他は、実施例１と同様に実験を行った。ヒルログの添加濃度は０，５０，１００，５００，１０００μｇ／mlで行った。凝集度の曲線はヒルログの添加量が濃くなるにつれて凝集度が低下した、すなわち、凝集阻害が高くなった（図３）。６分後の試料中のβＴＧ，ＰＦ４、セロトニン濃度を表４に示す。表４中の％値は、ヒルログを添加しないコントロール実験を１００％とした比率を示した。この値が低下するほど凝固阻害が高いことを表す。
【００３２】
βＴＧとセロトニンは濃度依存的に凝固阻害が高くなっているが、ＰＦ４は逆に放出量が増え、凝固が進んでいることが認められる。この理由は実施例１と同様に、血小板のα顆粒からＰＦ４の放出を抑えられないことによる誤差要因により、正確な凝固阻害が評価出来なかったのではないかと推測される。この結果は、βＴＧまたはセロトニンの放出量により抗凝固活性が評価できることを示している。しかしながら、βＴＧもクエン酸３ナトリウムの採血において、血小板からの放出を止めることが出来ないので、セロトニンの方が安定して評価出来ると考えられる。
【００３３】
【表４】
2007064916.tif 000005
【００３４】
実施例３
低分子ヘパリンであるダルテパリンナトリウム（商品名フラグミン、ファルマシア社製）を評価した。健常人２名から得られた血小板を含んだ試料を用いた。その他は、実施例２と同様に実験を行った。ダルテパリンナトリウムの添加なし（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と添加濃度０．１，０．５，１．０，５．０IU／mlで行った。凝集度の曲線は、健常人Ｄにおいては、ほとんど変化はなかったが、健常人Ｅにおいては、ダルテパリンナトリウム０．１，５．０IU／mlにおいて凝集阻害が確認され、０．５，１．０IU／mlにおいては逆に凝集が亢進していた（図４，５）。βＴＧ，ＰＦ４において、９０％以下と明らかに凝固阻害が確認されたのは、健常人Ｄのダルテパリンナトリウム０．１IU／mlだけであった。（表５−７）。セロトニンについては、健常人Ｄ，Ｅともに、ダルテパリンナトリウム０．１IU／mlで９０％以下の明らかな凝固阻害が確認された（表５−７）。セロトニンの結果から、健常人Ｅのダルテパリンナトリウム０．１IU／ml添加においても、健常人Ｄほどの明確さはないが、凝集阻害が起きていることが推測される。これは、凝集阻害の評価において、セロトニンが凝集曲線、ＰＦ４，βＴＧに比べ、凝集阻害の評価方法として、優れていることを示している。また、凝集曲線の評価において、健常人Ｅのダルテパリンナトリウム５．０IU／mlで、凝集阻害が認められたのは、高濃度のダルテパリンナトリウムにより、生じた凝集塊が減ったのではなく、小さい凝集塊が数多く生じたことによると考えられる。セロトニンの評価において、ダルテパリンナトリウム１．０IU／mlにおいて凝集が亢進した理由については不明であるが、少なくともダルテパリンナトリウムの抗凝固活性を発揮する濃度はある幅があり、濃度が高すぎると抗凝固活性は見られなくなるのであろうと推測される。
【００３５】
【表５】
2007064916.tif 000006
【００３６】
【表６】
2007064916.tif 000007
【００３７】
【表７】
2007064916.tif 000008
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明により、抗凝固活性を有する薬剤をｉｎ  ｖｉｔｒｏで簡便に評価することが出来る。そして、その評価結果は、生体中で生じるより近い条件下での薬物動態を反映するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】実施例１の方法による、各種血小板凝集阻害剤の凝集度への影響を示す凝集曲線（健常人Ａ）。
【図２】実施例１の方法による、各種血小板凝集阻害剤の凝集度への影響を示す凝集曲線（健常人Ｂ）。
【図３】実施例２の方法による、ヒルログの凝集度への影響を示す凝集曲線（健常人Ｃ）。
【図４】実施例３の方法による、ダルテパリンナトリウムの凝集度への影響を示す凝集曲線（健常人Ｄ）。
【図５】実施例３の方法による、ダルテパリンナトリウムの凝集度への影響を示す凝集曲線（健常人Ｅ）。
【図１】
2007064916.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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