(57)【要約】【課題】標的昆虫により良く効くδ内毒素変異体を選抜するためのシステムを提供する。【解決手段】標的昆虫に対して殺虫活性を増した毒素タンパク質の変異体を選抜する方法であって、殺虫性の毒素タンパク質をその受容体に結合性を持った形でＴ７ファージに発現させた毒素提示ファージを作製すること、上記受容体を結合させた担体を用いて、それらに結合親和性を有する毒素提示ファージを選抜すること、上記システムを利用して、受容体に対して結合親和性を増した変異体を選抜すること、を特徴とする変異体の選抜方法、上記変異体を活性本体として含む殺虫性組成物、及び上記変異体をコードする遺伝子を発現可能に導入した害虫抵抗性植物。【選択図】図１
2007089524.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的昆虫に対して殺虫活性を増した毒素タンパク質の変異体を選抜する方法であって、
（１）殺虫性の毒素タンパク質をその受容体に結合性を持った形でＴ７ファージに発現させた毒素提示ファージを作製する、
（２）上記受容体を結合させた担体を用いて、それらに結合親和性を有する毒素提示ファージを選抜する、
（３）上記システムを利用して、受容体に対して結合親和性を増した変異体を選抜する、
ことを特徴とする変異体の選抜方法。
【請求項２】
毒素提示ファージ発現ベクターを宿主に感染させて増殖させ、ファージクローンをクローニングして、毒素提示ファージを取得する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記システムを利用して、変異体ライブラリーを構築し、それらの変異体の中から受容体に対して結合親和性を増した変異体を選抜する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
殺虫性の毒素タンパク質としてδ内毒素を使用し、受容体としてｃａｄｈｅｒｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ、δ内毒素結合性分子、又は受容体代替物を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
既存の殺虫性の毒素タンパク質に変異を入れた変異体を用いて、変異体の選抜を繰り返すことにより、結合親和性を増した目的の変異体を取得する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
担体が、プレート、ゲル、メンブレン、繊維又はビーズである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
変異体の選抜工程において、受容体を結合させた磁気ビーズを用いて毒素提示ファージを濃縮する操作を繰り返して、濃縮された毒素提示ファージを取得する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の選抜方法で取得した、受容体に対して結合親和性を増した変異体、又はその変異体をコードする遺伝子。
【請求項９】
請求項８に記載の変異体を活性本体として含有することを特徴とする殺虫性組成物。
【請求項１０】
請求項８に記載の変異体をコードする遺伝子を発現可能に植物体に導入したことを特徴とする害虫抵抗性組換え植物体。
【請求項１１】
植物体が、食用作物である、請求項１０に記載の害虫抵抗性組換え植物体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、殺虫性の毒素タンパク質の選抜方法、及び該方法で選抜された毒素タンパク質とその応用技術に関するものであり、更に詳しくは、標的昆虫に特異的に作用する殺虫性の毒素タンパク質変異体の選抜方法、該選抜方法を利用して取得した、受容体に対して結合親和性を増した毒素タンパク質変異体、該変異体をコードする遺伝子、上記変異体を活性本体として含む殺虫性組成物、及び上記変異体遺伝子を導入した害虫抵抗性組換え植物体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＢＴ菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌）は、グラム陽性の土壌細菌であり、人畜環境に無害な殺虫性のタンパク質であるδ内毒素を産生する。人類は、これまで、殺虫剤や害虫抵抗性組換え作物の活性本体として実用に値するＢＴ菌δ内毒素の開発を、土壌から何千ものＢＴ菌を分離し、それを標的害虫でその致死活性を生物検定することを通して行ってきた（非特許文献１）。このような操作が１９４０年代から世界中で行われて来た結果、何十万にも及ぶ菌株の中からかなりの数の有用なＢＴ菌株が発見され、そのうちの一部は、微生物殺虫剤に応用されるに至っている。また、ＢＴ菌δ内毒素の一部は、組換え作物に害虫抵抗性を与えるための遺伝子素材になっている（非特許文献２）。
【０００３】
一方、抗体の変異体をファージ上に発現させた変異体ライブラリーを構築し、該抗原に対して結合性を持つ変異体を選抜することで、その抗原に対してより良く結合する抗体を選抜する、進化分子工学的手法が大きな成果をあげて来た（非特許文献３、４）。これによって、天然に存在する抗体タンパク質が利用可能になるばかりでなく、目的の性質を獲得した抗体タンパク質を、抗体利用技術として、人類は自ら育て上げることが可能になった。
【０００４】
合成殺虫剤においては、何万かの検体に１つの割合で殺虫剤として上市されるものが見つかることが経験上分かっており、企業は、開発コストを予め計算できる。しかし、例えば、ＢＴ菌あるいはそのδ内毒素の場合は、土壌からのＢＴ菌の分離に多大な労力と時間、費用がかかるばかりか、目的害虫に良く効くＢＴ菌が必ず見つかるとの保証もなく、開発コストが読めない状況にある。そこで、ＢＴ菌の開発には、他の方法の誕生が望まれている。また、仮に、標的害虫に効くＢＴ菌が見つかったとしても、それらのほとんどは、合成殺虫剤に比べると、効き目が弱く、開発と生産のコストが高い割には良い商品が作れないで来た。よって、それらのＢＴ菌の活性の本体であるδ内毒素の比活性を高める技術が望まれている。
【０００５】
一方、抗体タンパク質で成功を収めた進化分子工学は、ファージディスプレイ法という技術を用いて、Ｍ１３ファージ上に抗体タンパク質を発現させることで、始めて実用的な位地に到達した。ところで、この技術は、様々な結合性タンパク質の結合親和性の改良に利用できると考えられる。したがって、この技術は、δ内毒素の昆虫の受容体への結合親和性の改良にも原理的には応用できる可能性があるはずである。
【０００６】
しかし、現実には、δ内毒素が大腸菌に悪さをするなどの理由からか、世界のどの研究室も、進化分子工学で使用できる条件を満たすδ内毒素のファージディスプレイを実現できずにおり（非特許文献５、６）、δ内毒素の進化分子工学は、実現していないのが実情である。
【０００７】
もし、ファージディスプレイ法の利用が可能になれば、比較的簡単に得られる「あまり効かないＢＴ菌δ内毒素」を出発材料にして、それを進化分子工学的に改良し、標的害虫の受容体によく結合し、結果的にその害虫に良く効くδ内毒素を生み出すシステムを構築することが可能になると考えられる。しかし、現実には、このように機能的なファージディスプレイ法の利用が実現されなかったこともあり、昆虫の消化管の受容体を結合対象とした進化分子工学を実施する上で必要になるファージ及び毒素タンパク質変異体の「選抜系」も未完成のままである。
【０００８】
一方、ＢＴ菌が産生するδ内毒素は、標的昆虫に対して非常に高い殺虫特異性を示し、しかも環境中で分解され、汚染源となる可能性がないため、化学殺虫剤の代替品として注目されている。しかし、ＢＴ菌δ内毒素は、耐性昆虫の出現、殺菌スペクトラムが狭いなどの問題点があり、その改良が求められており、特に、受容体に対して高い結合性を有する毒素タンパク質変異体の開発が重要な課題となっている。
【０００９】
従来技術として、例えば、害虫の中腸の刷子縁膜上に存在するＢＴ菌δ内毒素に対する結合性タンパク質（ＢＰ）と特異的に反応する抗体及び該抗体を利用したＢＰを認識するＢＴ菌δ内毒素の同定方法等が提案されている（特許文献１）。また、昆虫に経口施用するのに適したＢＴ菌のδ内毒素変異体もしくは誘導体を含む殺昆虫組成物が提案されている（特許文献２）。
【００１０】
また、ＢＴ菌株又はそれに由来する全長のＣｒｙｌＩＩ毒素、Ｃｙｔ毒素等のδ内毒素がイネミズゾウリムシが食害する植物組織中で発現されるように、ＢＴ菌殺虫性構造遺伝子をイネ植物ゲノムの中に挿入することによって、該イネミズゾウリムシに植物体中からＢＴ菌δ内毒素を投与する方法が提案されている（特許文献３）。また、双翅目の害虫に対する農薬活性を有し、少なくとも約０．０５％／ｇのＢＴ菌δ内毒素を含む農薬組成物が提案されている（特許文献４）。更に、ＣｒｙｌＦコアＮ末端側毒素部分と、ＣｒｙｌＡｂ毒素又はＣｒｙｌＡｃ／ＣｒｙｌＡｂキメラ毒素由来の異種のＣ末端側プロ毒素部分とを含むキメラ毒素を使用して、ＢＴ菌内毒素をコードする遺伝子を改編することによって、シュードモナスにおけるＢＴ菌内毒素の発現を改良する方法が提案されている（特許文献５）。
【００１１】
【特許文献１】特開平５−２０２０９９号公報
【特許文献２】特表２００１−５０８０３２９号公報
【特許文献３】特表平１１−５０１３１８号公報
【特許文献４】特表平１０−５０４４５１号公報
【特許文献５】特表平１０−５００２９２号公報
【非特許文献１】岡田斉夫ら編、天敵微生物の研究手法、２２２ｐ．、日本植物防疫協会（１９９３）
【非特許文献２】佐藤令一、昆虫病原細菌の資材化、ｐｐ１９４−２１４、（微生物の資材化：研究の最前線  鈴井孝仁、岡田斎夫、国見裕久、牧野孝宏、斉藤雅典、宮下清貴  編３６４ｐｐ．）ソフトサイエンス社（２０００）
【非特許文献３】Schier R, Bye J, Apell G, McCallA, Adams GP, Malmqvist M, Weiner LM, Marks JD. Isolation of high-affinity monomerichuman anti-c-erbB-2 single chain Fv using affinity-driven selection. J Mol Biol.1996 Jan 12;255(1):28-43
【非特許文献４】Thompson J, Pope T, Tung JS, ChanC, Hollis G, Mark G, Johnson KS. Affinity maturation of a high-affinity human monoclonalantibody against the third hypervariable loop of human immunodeficiency virus: useof phage display to improve affinity and broaden strain reactivity. J Mol Biol.1996 Feb 16;256(1):77-88
【非特許文献５】Kasman LM, Lukowiak AA, GarczynskiSF, McNall RJ, Youngman P, Adang MJ. Phage display of a biologically active Bacillusthuringiensis toxin. Appl Environ Microbiol. 1998 Aug;64(8):2995-3003
【非特許文献６】Marzari R, Edomi P, Bhatnagar RK,Ahmad S, Selvapandiyan A, Bradbury A. Phage display of Bacillus thuringiensis CryIA(a)insecticidal toxin. FEBS Lett. 1997 Jul 7;411(1):27-31
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
このような状況の中で、本発明者は、上記従来技術に鑑みて、昆虫の消化管の受容体を結合対象とした進化分子工学を実施可能にする新しい「選抜系」を確立することを目標として鋭意研究を重ねた結果、昆虫の消化管上の受容体であるｃａｄｈｅｒｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎに結合性を持った形でＢＴ菌δ内毒素をＴ７ファージ上に発現させることに成功すると共に、更に、これを利用して、上記受容体を結合させた担体を用いて、それらに結合する毒素提示ファージを選抜する方法を確立することに成功し、更に研究を重ねて、本発明を完成するに至った。
【００１３】
本発明は、標的昆虫に対してより良く効く殺虫性の毒素タンパク質の変異体を選抜する方法を提供することを目的とするものである。また、本発明は、様々な変異体の中から受容体に対して結合親和性を増した変異体を選抜すること、また、それにより、標的の昆虫に対して殺虫活性を増した変異体を選抜することを可能とする新規殺虫性毒素タンパク質変異体の選抜方法を提供することを目的とするものである。更に、本発明は、上記変異体を活性本体とする殺虫性組成物、上記変異体をコードする遺伝子を発現可能に植物体に導入した害虫抵抗性組換え植物体を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）標的昆虫に対して殺虫活性を増した毒素タンパク質の変異体を選抜する方法であって、
１）殺虫性の毒素タンパク質をその受容体に結合性を持った形でＴ７ファージに発現させた毒素提示ファージを作製する、
２）上記受容体を結合させた担体を用いて、それらに結合親和性を有する毒素提示ファージを選抜する、
３）上記システムを利用して、受容体に対して結合親和性を増した変異体を選抜する、
ことを特徴とする変異体の選抜方法。
（２）毒素提示ファージ発現ベクターを宿主に感染させて増殖させ、ファージクローンをクローニングして、毒素提示ファージを取得する、前記（１）に記載の方法。
（３）上記システムを利用して、変異体ライブラリーを構築し、それらの変異体の中から受容体に対して結合親和性を増した変異体を選抜する、前記（１）に記載の方法。
（４）殺虫性の毒素タンパク質としてδ内毒素を使用し、受容体としてｃａｄｈｅｒｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ、δ内毒素結合性分子、又は受容体代替物を使用する、前記（１）に記載の方法。
（５）既存の殺虫性の毒素タンパク質に変異を入れた変異体を用いて、変異体の選抜を繰り返すことにより、結合親和性を増した目的の変異体を取得する、前記（１）に記載の方法。
（６）担体が、プレート、ゲル、メンブレン、繊維又はビーズである、前記（１）に記載の方法。
（７）変異体の選抜工程において、受容体を結合させた磁気ビーズを用いて毒素提示ファージを濃縮する操作を繰り返して、濃縮された毒素提示ファージを取得する、前記（１）に記載の方法。
（８）前記（１）から（７）のいずれかに記載の選抜方法で取得した、受容体に対して結合親和性を増した変異体、又はその変異体をコードする遺伝子。
（９）前記（８）に記載の変異体を活性本体として含有することを特徴とする殺虫性組成物。
（１０）前記（８）に記載の変異体をコードする遺伝子を発現可能に植物体に導入したことを特徴とする害虫抵抗性組換え植物体。
（１１）植物体が、食用作物である、前記（１０）に記載の害虫抵抗性組換え植物体。
【００１５】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、標的昆虫に対して殺虫活性を増した毒素タンパク質の変異体を選抜する方法であって、（１）殺虫性の毒素タンパク質をその受容体に結合性を持った形でＴ７ファージに発現させた毒素提示ファージを作製する、（２）上記受容体を結合させた担体を用いて、それらに結合親和性を有する毒素提示ファージを選抜する、（３）上記システムを利用して、受容体に対して結合親和性を増した変異体を選抜する、ことからなる変異体の選抜方法の点、及び上記システムを利用して、変異体ライブラリーを構築し、それらの変異体の中から受容体に対して結合親和性を増した変異体を選抜する上記の方法の点、に特徴を有するものである。
【００１６】
また、本発明は、上記の選抜方法で取得した、受容体に対して結合親和性を増した変異体、又はその変異体をコードする遺伝子の点、上記の変異体を活性本体として含有することを特徴とする殺虫性組成物の点、及び上記の変異体をコードする遺伝子を発現可能に植物体に導入したことを特徴とする害虫抵抗性組換え植物体の点、に特徴を有するものである。
【００１７】
本発明において、殺虫性の毒素タンパク質としては、例えば、人畜環境に無害な殺虫性の毒素タンパク質であるＢＴ菌のδ内毒素、そのタンパク質に任意の変異を入れた変異体もしくは誘導体が例示されるが、これらに限定されるものではなく、これらと同等ないし類似の機能性を有するものであればその種類に制限されることなく本発明の対象とされる。それらとしては、例えば、細菌が作る他の殺虫性毒素タンパク質あるいは植物が作る毒素タンパク質等が例示される。本発明では、上記δ内毒素のように、既存の殺虫性の毒素タンパク質であって、昆虫の消化管上等に存在する受容体との結合親和性を増した変異体を選抜することで、結果的に標的の昆虫に対して殺虫活性を増大した変異体の選抜が可能になる殺虫性の毒素タンパク質変異体を使用することが望ましい。また、本発明では、上記受容体として、上記毒素タンパク質の受容体、アミノペプチダーゼＮのように、生理的な意味で機能的であることが示される毒素タンパク質結合性分子、受容体候補分子等の適宜の受容体代替物を使用することができる。以下、本明細書では、殺虫性の毒素タンパク質として、ＢＴ菌δ内毒素タンパク質及びその変異体を用いた方法を例として説明する。
【００１８】
本発明では、好適には、例えば、ＢＴ菌δ内毒素タンパク質をＴ７ファージのキャプシドタンパク質上に提示するためのＴ７ファージ発現ベクターが構築される。この場合、Ｔ７ファージ発現ベクターには、市販の製品（Ｎｏｖａｇｅｎ社のＴ７Ｓｅｌｅｃｔ１０−３ｂ等）を使用することができる。δ内毒素の遺伝子としては、例えば、Ｃｒｙ１Ａａ毒素及びＣｒｙ１Ａｂ毒素等の任意の遺伝子領域を使用し、これを任意のプライマーを用いてＰＣＲで増幅させる。得られた増幅断片を制限酵素で消化した後、同様にして消化したＴ７ファージ発現ベクターに挿入し、完成した毒素提示ファージ発現ベクターはＰａｋａｇｉｎｋ  Ｋｉｔでパッケージングしてファージ粒子とし、これを大腸菌等の宿主に感染させて増殖させ、ファージクローンをクローニングして、毒素提示ファージを取得する。
【００１９】
この場合、宿主としては、好適には、例えば、大腸菌が例示されるが、これに制限されるものではなく、上記δ内毒素の所定の遺伝子領域を発現できるファージクローンをクローニングできるものであれば適宜の宿主を使用することができる。上記方法によるδ内毒素（Ｃｒｙ１Ａａ毒素、Ｃｒｙ１Ａｂ毒素等１００にも及ぶδ内毒素サブクラスの各毒素等）のタンパク質をコードする遺伝子挿入ファージクローンの作製工程により、δ内毒素タンパク質がファージ上に提示されている、また、そのタンパク質が、ｃａｐｓｉｄｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １０Ｂとの融合タンパク質として発現されているδ内毒素提示ファージを取得することができる。
【００２０】
次に、本発明では、上記システムを利用して、変異体ライブラリーを構築し、それらの変異体の中から受容体に対して結合親和性を増した変異体を選抜する。この場合、既存の殺虫性のδ内毒素タンパク質に変異を入れた変異体を用いて、変異体の選抜を繰り返すことにより、結合親和性を増した目的の変異体を取得する。δ内毒素タンパク質に変異を入れる手法は、任意の方法を使用することができ、任意の配列の変異体を利用することができる。また、本発明では、変異体の選抜工程において、受容体を結合させた磁気ビーズを用いて、δ内毒素提示ファージを濃縮する濃縮操作を行うことができる。この濃縮操作を繰り返すことで、濃縮されたδ内毒素提示ファージを取得することができる。
【００２１】
次に、上記δ内毒素遺伝子挿入ファージが、δ内毒素の受容体に結合する本来の受容体結合能力を持っているかどうか調べたところ、上記δ内毒素提示ファージは、受容体に対する結合親和性を有していること、また、δ内毒素及び受容体の種類によって、その結合親和性に差があることが明らかとなった。すなわち、本発明では、様々のδ内毒素及び受容体の種類を任意に組み合わせることで、例えば、受容体に対して結合性を持たないファージあるいはδ内毒素を発現していても結合性が低いファージから、δ内毒素を発現していて、受容体に対して高い結合親和性を持つファージを選抜することができ、それにより、δ内毒素提示ファージの選抜システムを確立できることができる。
【００２２】
また、本発明では、受容体を結合させた担体を用いることにより、δ内毒素提示ファージとｗｉｌｄ−ｔｙｐｅファージとの間の結合性の差が大きくなることから、それらの結合親和性の差を利用して結合親和性の高いファージを高効率に選抜できる新しいファージ選抜系を構築することが可能である。本発明では、上記担体として、例えば、プレートやビーズが利用され、それらとして、好適には、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、Ｃｏｓｔｅｒ  ９０１８  Ｍｉｃｒｏ−ｗｅｌｌ  ＰｌａｔｅやＰｒｏｍｅｇａ社製Ｍａｇｎｅ  ＧＳＴＴＭ  Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅが例示される。
【００２３】
本発明では、上述のδ内毒素提示ファージを用いて、様々の変異を導入したδ内毒素タンパク質変異体のライブラリーを構築し、それらの中から受容体に対して結合親和性を増した変異体を選抜することができる。その場合、上述のように、磁気ビーズ法による濃縮操作を行うことが可能であり、濃縮操作を連続的に実施することにより、例えば、特定のδ内毒素提示ファージを約２００〜１３０，０００倍濃縮することが可能である。このように、本発明では、δ内毒素提示ファージによる変異体ライブラリーから、上記濃縮操作を繰り返すことで、受容体に対して結合親和性の高い所望のクローンを効率良く濃縮することが可能である。
【００２４】
次に、本発明では、上記δ内毒素提示ファージクローンから常法により所望のδ内毒素タンパク質変異体を回収し、該変異体のアミノ酸配列に基づいて設計した特定の変異体をコードする遺伝子を用いて、適宜の遺伝子組換え手法により、変異体を大量に産生することが可能である。得られた受容体に対して高い結合親和性を持った変異体は、それを殺虫性組成物の活性本体として利用することが可能であり、また、上記変異体をコードする遺伝子を適宜の手法により発現可能に植物体に導入することにより、害虫抵抗性植物体を作出することが可能である。本発明においては、上記手法により選抜した、受容体に対して結合親和性を増した様々の変異体及びその遺伝子を用いて、上述の手法に準じて所望の殺虫剤、及び害虫抵抗性作物を、任意に設計し、作製することができる。
【００２５】
δ内毒素は、昆虫に摂食されると、中腸のアルカリ条件によって可溶化され、中腸内のプロテアーゼによりプロセッシングを受け、標的昆虫に対して殺虫活性を持つ活性型トキシンになる。この活性型トキシンは、昆虫の中腸細胞膜上に存在する受容体と結合し、膜上で構造変化を起こし、ポアを形成することにより浸透圧バランスが崩れ、上皮細胞の溶解や膨張が起こり、細胞が破裂し、それにより、標的昆虫は、腸における栄養分の吸収機能が損なわれ。死に至る。本発明は、そのようなδ内毒素の変異体を種々設計、作製し、それらの変異体の中から、受容体に対して結合親和性を増した特定の変異体を選抜するための新しい選抜系を提供するものとして有用であり、また、そのような変異体を活性本体とする殺虫剤、及びそのような変異体をコードする遺伝子を発現可能に作物体に導入した害虫抵抗性作物を提供するものとして有用である。
【００２６】
以上のように、本発明について、ＢＴ菌のδ内毒素タンパク質を例に具体的に説明したが、本発明は、上記δ内毒素タンパク質の場合に制限されるものではなく、δ内毒素タンパク質の任意の変異体、その誘導体、更には、これらと同等ないし類似の機能及び作用機作を有するあらゆる種類の毒素タンパク質、その変異体及び誘導体の場合にも、同様に適用することができる。本発明では、上記毒素提示ファージの構築方法、それを利用した変異体ライブラリーの構築方法、上記変異体の選抜システムを利用することで、あらゆる種類の殺虫性の毒素タンパク質及び受容体に適用可能な変異体の選抜系を確立することが可能であり、それにより、それらに対応した所望の標的昆虫に適用可能な殺虫剤、及び害虫抵抗性を付与した食用作物等のあらゆる種類の植物体を提供することを実現することができる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）殺虫性の毒素タンパク質の変異体をファージ上に発現させた毒素提示ファージを利用した変異体ライブラリーを構築し、受容体に対して選抜することで、その受容体に対してより良く結合する変異体を選抜することが可能である。
（２）このような進化分子工学的手法を利用することにより、天然に存在する遺伝子やその発現産物であるタンパク質をただ利用することから脱却し、目的の性質を獲得したタンパク質を自ら育て上げることで所望の変異体を取得することが可能である。
（３）同様の原理で、例えば、標的昆虫から調製した受容体分子であるｃａｄｈｅｒｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎと、その昆虫に弱い活性を持つδ内毒素の遺伝子から準備した変異体δ内毒素ライブラリーを構築することが可能であり、それを利用して、選抜法であるパニング法やビーズ法により、その昆虫のｃａｄｈｅｒｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎに対して結合親和性を増したδ内毒素を生み出すことが可能である。
（４）また、標的昆虫に強い殺虫活性を持つδ内毒素の遺伝子から準備した変異体δ内毒素ライブラリーを利用して、上記選抜を繰り返すことにより、その昆虫のｃａｄｈｅｒｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎに対して更に高い結合親和性を持つδ内毒素を取得することが可能である。
（５）薬理学的に言えば、受容体に結合親和性を増した変異物質は、出発物質よりも低濃度で作用することになり、結果として活性が増したことになる。すなわち、本発明の方法を用いることで、進化分子工学的に、標的の昆虫に対してより効くδ内毒素を作製することが可能になる。更に、上記のようなδ内毒素ライブラリーとｃａｄｈｅｒｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ等を用いて受容体に結合親和性を増した変異体を選抜することにより、これまで有効な天然のδ内毒素がまったく知られていなかった昆虫に対して活性をもつδ内毒素を生み出すことも可能である。
（６）そのようにして作製したδ内毒素のバラエティーは、容易に天然に存在し、人類が現実的に発見できる数をはるかに超越したものになり得る。しかも、それらは、天然のδ内毒素と同様のフォールディングを持つタンパク質であり、ＢＴ菌が産生する多くの天然の変異体δ内毒素と化学的には本質的な違いがないものと考えられる。
（７）本発明により、人畜や地球環境に対しては天然のδ内毒素と全く同様に安全なタンパク質を進化分子工学で創出し、それを利用した新規殺虫剤、及び害虫抵抗性作物を提供できる。
（８）また、今後明らかにされる可能性のある第２、第３の受容体をｃａｄｈｅｒｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎの代替物として使うことにより、それらを介して昆虫を殺すδ内毒素を生み出すことも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２９】
（１）Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージ及びＣｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージ発現ベクターの構築
２種類のδ内毒素（Ｃｒｙ１Ａａ毒素及びＣｒｙ１Ａｂ毒素）について、Ｔ７ファージのキャプシドタンパク質上に提示するためのベクターを構築した。Ｃｒｙ１Ａａ及びＣｒｙ１Ａｂ発現ファージベクターの構築法の概要を図１に示す。Ｔ７ファージ発現ベクターには、Ｎｏｖａｇｅｎ社のＴ７Ｓｅｌｅｃｔ１０−３ｂを用いた。まず、Ｃｒｙ１Ａａ毒素及びＣｒｙ１Ａｂ毒素のドメイン１から３を含む遺伝子領域（２９〜６１８位のアミノ酸）をＰＣＲで増幅した。
【００３０】
プライマーには、制限酵素切断部位を導入したａｃｔ−Ａｓ−ｓ−Ｂａｍ（５’−ＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＡＴＡＧＡＡＡＣＴＧＧＴＴＡＣＡＣＣＣＣＡＡＴ−３’）とａｃｔ−Ａａ−ａｓ−Ｎｏｔ（５’−ＴＣＡＴＴＣＡＣＣＧＣＣＣＧＣＣＧＧＣＧＴＣＴＴＴＣＴＡＡＡＴＣＡＴＡＴＴＣＴＧＣＣＴＣＡＡ−３’）を用いた。得られた増幅断片をＢａｍＨＩもしくはＮｏｔＩで消化した後、それらをＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化したＴ７Ｓｅｌｅｃｔ１０−３ｂベクターに挿入した。完成したＣｒｙ１Ａ毒素発現ファージベクターは、Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔでパッケージングしてファージ粒子とし、大腸菌に感染させて増殖させ、ファージクローンをクローニングした。
【００３１】
（２）δ内毒素のＴ７ファージ上発現の確認
得られたＣｒｙ１Ａａ毒素及びＣｒｙ１Ａｂ毒素遺伝子挿入ファージクローンが、本当にそれぞれの毒素タンパク質をファージ上に提示していることを確かめることを目的に、以下の２つの実験を実施した。
【００３２】
まず、それぞれのファージクローンを大腸菌と混合した後、プレートに蒔きこみ、多数のプラークを作らせ、そこにニトロセルロース膜にのせてファージ粒子を転写した。膜を仔牛血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングした後、１次抗体としてＣｒｙ１Ａａ毒素特異的マウスモノクローナル抗体（２Ｆ９）もしくは抗Ｃｒｙ１Ａａ毒素マウス血清と、また、２次血清としては、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体と反応させ、ＥＣＬ検出試薬でファージ上に各毒素が発現しているかを検討した。その結果を図２のＡ〜Ｆに示す。
【００３３】
その結果、モノクローナル抗体２Ｆ９に対しては、何も発現していないＴ７ファージ（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ  ファージ）とＣｒｙ１Ａｂ毒素遺伝子挿入ファージは全く反応しなかったが（図２Ｂ及びＣ）、Ｃｒｙ１Ａａ毒素遺伝子挿入ファージは、強いシグナルが得られた（図２Ａ）。
【００３４】
一方、抗Ｃｒｙ１Ａａ毒素マウス血清に対しては、ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅファージは全く反応しなかったが（図２Ｆ）、Ｃｒｙ１Ａａ毒素遺伝子挿入ファージは、強く反応した（図２Ｄ）。また、Ｃｒｙ１Ａｂ毒素遺伝子挿入ファージでは、Ｃｒｙ１Ａａ毒素遺伝子挿入ファージの場合より若干弱いシグナルが得られた（図２Ｅ）。
【００３５】
１次抗体として用いた抗Ｃｒｙ１Ａａ毒素マウス血清は、Ｃｒｙ１Ａａ毒素に対して作製したものである。一方、Ｃｒｙ１Ａｂ毒素は、Ｃｒｙ１Ａａ毒素と６０アミノ酸残基が異なっている。したがって、Ｃｒｙ１Ａｂ毒素に対して、この１次抗体は、Ｃｒｙ１Ａａ毒素よりも若干弱く反応したものと考えられた。
【００３６】
次に、Ｃｒｙ１Ａａ毒素遺伝子挿入ファージとＣｒｙ１Ａｂ毒素遺伝子挿入ファージを大量に準備し、それぞれをＳＤＳ−ＰＡＧＥのサンプルバッファーに溶解して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、得られたタンパク質バンドをニトロセルロース膜に転写して、抗Ｃｒｙ１Ａａ毒素血清等を用いて前記の実験と同様の操作を行い、ウエスタンブロッティングを行った。その結果を図２Ｇに示す。
【００３７】
その結果、ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅファージからは何のバンドも見られなかったが、Ｃｒｙ１Ａａ毒素遺伝子挿入ファージとＣｒｙ１Ａｂ毒素遺伝子挿入ファージからは、約１０５  ｋＤａのバンドが観察された（図２Ｇ）。それぞれのδ内毒素は、Ｔ７ファージのｃａｐｓｉｄｅ  ｐｒｏｔｅｉｎである１０ＢのＣ末端に結合し形で発現するので、理論上は１０３  ｋＤａのタンパク質になっているはずであるが、得られたバンドは、これにほぼ一致する大きさを持っており、Ｔ７ファージ上に提示されている融合タンパク質であると考えられた。
【００３８】
以上の二つの実験結果から、Ｃｒｙ１Ａａ毒素遺伝子挿入ファージとＣｒｙ１Ａｂ毒素遺伝子挿入ファージでは、それぞれの毒素タンパク質が、ｃａｐｓｉｄｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  である１０Ｂとの融合タンパク質として発現していることが示された。
【００３９】
（３）δ内毒素提示ファージの受容体への結合能力の確認
δ内毒素提示ファージが毒素の受容体に結合する能力を持っているか、換言すると、このようにして提示されたδ内毒素が本来の受容体結合能力を持っているか否かを確認する目的で、カイコ中腸における受容体の一つであるｃａｄｈｅｒｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢｔＲ１７５）を結合対象として用いて実験を行った。この実験では、Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージ及びＣｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージの受容体分子ＢｔＲ１７５への結合性を調べるために、ファージを、ＢｔＲ１７５を結合させた、あるいはさせていない対照区のプレートもしくは磁気ビーズと混合し、撹拌した後、それらをＰＢＳＴで５回洗浄した。次に、磁気ビーズに結合しているファージを、１％ＳＤＳ  ＰＢＳＴで溶出し、大腸菌に感染させｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔを算出した。
【００４０】
すなわち、まず、バイオパニングによってＣｒｙ１Ａａ毒素提示ファージ及びＣｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージのＢｔＲ１７５に対する結合能力をｗｉｌｄ−ｔｙｐｅファージと比較した。すなわち、ＥＬＩＳＡプレートにＢｔＲ１７５をコーティングしたものと、しないものを用意し、ファージを添加して震盪し、洗浄後に、プレートに結合しているファージの数を測定した。
【００４１】
Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージの場合は、ＢｔＲ１７５をコーティングプレートでは添加した２．８×１０１０個のファージのうち、１．４×１０７個がプレートに結合した（図３Ａ）。また、「バイオパニング後のファージ数／バイオパニング前のファージ数」をｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｎｄｅｘ（ＢＩ）と定義して計算すると、４．９×１０−４であった。
【００４２】
一方、コーティングしていないプレートでは、添加した２．８×１０１０個のファージのうち、１．７×１０５個がプレートに結合していた（ＢＩ＝６．１×１０−６）。Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージのＢｔＲ１７５コーティングプレートに対する結合親和性（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｎｄｅｘ）はコーティングしていないプレートに対する結合親和性の約８０倍であった。Ｃｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージでは、ＢｔＲ１７５コーティングプレートでは添加した４．３×１０９個のファージのうち、６．５×１０５個がプレートに結合していた（ＢＩ＝１．５×１０−４）（図３Ａ）。
【００４３】
また、コーティングしていないプレートでは、添加した４．３×１０９個のファージのうち、１．３×１０４個がプレートに結合していた（ＢＩ＝３．２×１０−６）。ＢｔＲ１７５コーティングプレートへのＣｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージの結合親和性はコーティングしていないプレートへの結合親和性の約４７倍であった。ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ファージでは、７．１×１０９個のファージのうち、１．４  ×１０５個がＢｔＲ１７５コーティングプレートに結合した（ＢＩ＝２．０×１０−５）（図３Ａ）。
【００４４】
また、コーティングしていないプレートでは、添加した７．１×１０９個のファージのうち、４．８×１０４個がプレートに結合していた（ＢＩ＝６．８×１０−６）。Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅファージの場合には、ＢｔＲ１７５コーティングプレートとコーティングしていないプレートとの間で結合親和性にほとんど差が見られなかった。Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージ及びＣｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージのＢｔＲ１７５に対する結合親和性（ＢＩ）は、ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅファージに対してそれぞれ約２５倍と８倍であった。
【００４５】
次に、磁気ビーズを用いて、Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージ及びＣｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージの結合能力をｗｉｌｄ−ｔｙｐｅファージと比較した。すなわち、磁気ビーズにＢｔＲ１７５をコーティングしたものと、しないものを用意し、ファージを添加し、撹拌し、洗浄後に、磁気ビーズに結合しているファージの数を測定した。ＢｔＲ１７５コーティングビーズでは、Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージは、添加した２．２×１０１０個のファージのうち、４．１×１０８個が磁気ビーズに結合していた（ＢＩ＝１．９×１０−２）（図３Ｂ）。
【００４６】
一方、コーティングしてないビーズでは、添加した２．２×１０１０個のファージのうち、４．６×１０６個が磁気ビーズに結合していた（ＢＩ＝２．１×１０−４）（図３Ｂ）。ＢｔＲ１７５コーティングビーズへのＣｒｙ１Ａａ毒素提示ファージの結合親和性（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｎｄｅｘ）は、コーティングしてないビーズへの結合親和性の約９０倍であった。ＢｔＲ１７５コーティングビーズでは、Ｃｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージは添加した１．１×１０１０個のうち、６．５×１０７個が磁気ビーズに結合していた（ＢＩ＝５．９×１０−３）（図３Ｂ）。
【００４７】
また、コーティングしてないビーズでは、添加した２．２×１０１０個のファージのうち、１．５×１０７個が磁気ビーズに結合していた（ＢＩ＝６．８×１０−４）。ＢｔＲ１７５コーティングビーズへのＣｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージの結合親和性（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｎｄｅｘ）は、コーティングしてないビーズへの結合親和性の約９倍であった。ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅファージの場合は、ＢｔＲ１７５コーティングビーズでは添加した７．５×１０９個のファージのうち、１．３×１０６個が磁気ビーズに結合していた（ＢＩ＝１．７×１０−４）（図３Ｂ）。
【００４８】
また、コーティングしてないビーズでは、添加した７．５×１０９個のファージのうち、４．５×１０６個が磁気ビーズに結合していた（ＢＩ＝６×１０−４）。ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅファージの場合には、ＢｔＲ１７５コーティングビーズとコーティングしてないビーズとの間で結合数に差がほとんど見られなかった。Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージ及びＣｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージのＢｔＲ１７５に対する結合親和性（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｎｄｅｘ）は、Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅファージに対してそれぞれ約１１２倍と３５倍であった。
【００４９】
以上の結果から、Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージとＣｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージは、ＢｔＲ１７５に対して結合性を持っていると考えられた。また、Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージは、Ｃｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージよりもＢｔＲ１７５に対して結合親和性が高いことが明らかになった。更にまた、このようなシステムを利用して、ＢｔＲ１７５に対して結合性を持たないファージあるいはＣｒｙ１Ａ毒素を発現していても結合性が低いファージから、Ｃｒｙ１Ａ毒素を発現しており、ＢｔＲ１７５に対して高い結合性を持つファージを選抜できることが示唆された。同様に、特に磁気ビーズでは、Ｃｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージもしくはＣｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージとｗｉｌｄ−ｔｙｐｅファージとの間の結合性の差が大きく、結合親和性の差を利用した選抜系としては優れていることが明らかになった。
【００５０】
（４）磁気ビーズ法のδ内毒素提示ファージスクリーニング系としての評価
磁気ビーズ法は、ファージディスプレイした変異導入ＳｃＦＶ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：一本鎖抗体）のライブラリーから結合親和性の高いクローンを選抜する上で最も強力な方法の一つである。そこで、磁気ビーズ法がファージディスプレイ法を利用したＣｒｙ１Ａ  毒素のＢｔＲ１７５１に対する結合親和性向上を図る進化分子工学にも応用できるか否かを検討した。
【００５１】
Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージあるいはＣｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージの比率が１０％、１％、及び０．１％の比率になるように、Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅファージと混合し、また、Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージの比率が２．５％及び０．７５％になるように、Ｃｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージと混合した、合計１０９個のファージ液を調製した。そのファージ液に、ＢｔＲ１７５を結合させた磁気ビーズを混合、撹拌した後、それらをＰＢＳＴで５回洗浄した。
【００５２】
次に、磁気ビーズに結合しているファージを１％ＳＤＳ  ＰＢＳＴで溶出し、磁気ビーズ濃縮前後のファージ混合液を大腸菌に感染させ、プラークを作らせた。プラークをニトロセルロース膜に写し取り、ＢＳＡでブロッキングした後、Ｃｒｙ１Ａａ毒素特異的モノクローナル抗体２Ｆ９でＣｒｙ１Ａａ毒素提示ファージを、また、抗Ｃｒｙ１Ａａ毒素血清にてＣｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージを検出し、Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージ及びＣｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージの比率を算出した。実験は２連で行った。
【００５３】
すなわち、合計１０９個のファージ中に、Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージがｗｉｌｄ−ｔｙｐｅファージに対して１０％、１％あるいは０．１％になるように混合し、ＢｔＲ１７５コーティングビーズと一緒に撹拌した後、磁気ビーズに結合したファージを回収し、大腸菌プレートに作らせたプラークに対してＣｒｙ１Ａａ毒素特異的モノクロー抗体を用いて、蒸気（２）の要領で、Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージを抗血清で検出することにより、全てのプラーク中のＣｒｙ１Ａａ毒素提示ファージの比率を算出した。
【００５４】
その結果、磁気ビーズによる濃縮操作によって、操作前には１０％だったものが平均６５％に、１％だったものが平均４２％に、また０．１％だったものが平均７．４％になり、Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージはそれぞれ６．５倍、４２倍、及び７４倍濃縮された（図４Ａ）。また、合計１０９個のファージ中にＣｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージがＷｉｌｄ−ｔｙｐｅファージに対して、１０％、１％あるいは０．１％なるように混合した場合には、磁気ビーズによる濃縮操作によりＣｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージの比率がそれぞれ平均６９％、２３％、及び３．５％になり、Ｃｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージは、それぞれ６．９倍、２３倍及び３５倍濃縮された（図４Ｂ）。
【００５５】
次に、Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージとＣｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージのように、結合親和性の差が小さい２種類のファージの混合物の中から、親和性のより高いファージを磁気ビーズ法によって濃縮できるか否かを検討した。Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージをＣｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージに対して２．５％あるいは０．７５％になるように混合し、合計１０９個のファージに対して、ＢｔＲ１７５コーティングビーズで濃縮操作を行い、Ｃｒｙ１Ａａ毒素特異的モノクローナル抗体を用いて、濃縮後のＣｒｙ１Ａａ毒素提示ファージとＣｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージの比率を算出した。
【００５６】
その結果、Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージの割合は、それぞれ平均１７．８％及び６．８％となり、結合親和性のより高いＣｒｙ１Ａａ毒素提示ファージが７．１倍及び９．０倍濃縮された（図４Ｃ）。以上のことから、磁気ビーズによる濃縮操作法はＢｔＲ１７５１に対してより高い結合親和性を持つファージの選抜に使えること、すなわちＣｒｙ１Ａ毒素の結合親和性の向上（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）にも応用できることが明らかになった。
【００５７】
（５）Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージのＣｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージからの濃縮
更に、磁気ビーズによる濃縮操作を繰り返すことにより、微量しか含まれていない結合親和性の高いファージを、低いファージの中から理論どおりに濃縮できるかを確かめるために、Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージとＣｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージを１：１０、１：１０３、及び１：１０６の比率で混合した合計１０９個のファージに対して磁気ビーズによる濃縮操作を連続的に実施した。
【００５８】
すなわち、Ｃｒｙ１Ａａ  毒素提示ファージとＣｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージを１：１０、１：１０００、１：１００００００の比率で混ぜ、合計１０９個のファージ液を調製した。そのファージ液にＢｔＲ１７５を結合させた磁気ビーズを加え、１０分間撹拌した後ＰＢＳＴで５回洗浄した後磁気ビーズに結合しているファージを１％ＳＤＳ  ＰＢＳＴで溶出し、大腸菌に感染させたファージを増殖させた。得られたファージに対してＢｔＲ１７５結合磁気ビーズを加え濃縮操作を行った。
【００５９】
濃縮操作後にビーズから回収したファージのプラークに対しては、抗Ｃｒｙ１Ａａ毒素血清とＣｒｙ１Ａａ毒素特異的モノクローナル抗体を用いてイムノアッセイを行い、Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージとＣｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージの比率を算出した。
【００６０】
次に、このファージを大腸菌に感染させ、増殖させ、これを更に磁気ビーズによる濃縮操作にかけた。これらの工程を９ラウンドまで行い、Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージとＣｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージの比率の変化を追跡した。
【００６１】
１：１０の比率でスタートした場合には、５ラウンドまでにＣｒｙ１Ａａ毒素提示ファージの比率は約８０％に到達した（図５Ａ）。また、１：１０３でスタートした場合には、５ラウンドまでにＣｒｙ１Ａａ毒素提示ファージの比率は２０％以上に到達し、Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージは約２００倍濃縮された（図５Ａ）。
【００６２】
一方、濃度の異なるＣｒｙ１Ａａ毒素提示ファージの溶液にＣｒｙ１Ａａ毒素特異的プライマーとポリメラーゼを入れてＰＣＲを行い、Ｃｒｙ１Ａａ毒素ＤＮＡの挿入断片を増幅させると、１０２から１０７の範囲でファージ数に比例した濃さのバンドが認められた（図５Ｂ）。
【００６３】
そこで、１：１０６でスタートした場合のＣｒｙ１Ａａ毒素ファージの比率の向上については、まずはこのシステムを用いて評価した。その結果、ラウンド０からラウンド９のファージから増幅したＣｒｙ１Ａａ毒素ＤＮＡのバンドはラウンドを重ねるごとに明らかに濃くなった。すなわち、ラウンド９では約１０００００倍のＣｒｙ１Ａａ毒素提示ファージの濃縮が示唆された（図５Ｃ）。そこで、ラウンド６から９終了後のファージに対してはプラークに対してイムノアッセイを行った。その結果、ラウンド９終了ファージでは、Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージは約１３％に到達しており、１３０，０００倍のＣｒｙ１Ａａ毒素提示ファージの濃縮が達成されたことが明らかになった（図５Ａ）。
【００６４】
以上のことから、ＢｔＲ１７５に対して結合親和性の高い、少数しか含まれないファージを、磁気ビーズ法で濃縮できることが明らかになった。実際には、１０７−１０９程度のＣｒｙ毒素変異体ライブラリーが作られ、１０００倍程度に増幅された後でスクリーニングが実施されると考えられる。したがって、もしｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ毒素の結合親和性に勝る変異体が１クローン存在するとしたら、増幅後の１０１０−１０１２のライブラリーから、１０から１５回程度の磁気ビーズによる濃縮操作を繰り返せば、このクローンを濃縮できることになる。
【００６５】
本発明では、特に、上記実施例によって以下の事項が明らかとなった。すなわち、毒素変異体ライブラリーの中から、受容体に対して高い結合親和性を持つ毒素変異体の選抜を可能にする「ファージ上に毒素変異体を提示するシステム」を構築できた。また、昆虫の消化管上にある受容体、ｃａｄｈｅｒｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎを９６穴プレートもしくは磁気ビーズに結合させ、それを結合対象とすることで、「毒素の変異体ライブラリーの中から、受容体に対して高い結合親和性を持つものを選抜できるシステム」を構築できた。また、上記手法を組み合わせることで、「毒素変異体ライブラリーの中から、受容体に対して高い結合親和性を持つものを選抜することを通して、結果的に、標的の昆虫に強い殺虫活性を持つ毒素変異体を選抜することが可能な」毒素変異体の進化分子工学や様々な変異体ライブラリーの選抜に使えるシステムが確立された。更に、それにより、土壌から簡単に見つかる弱い活性しか持っていない毒素タンパク質を出発材料にして、ある目的の害虫に効く変異体タンパク質を任意に生み出すことが可能になった。また、良く効く毒素タンパク質を出発材料にして、更に活性の高い毒素変異体を開発することが可能になった。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
以上詳述したように、本発明は、標的昆虫に対してより良く効く殺虫性の毒素タンパク質変異体を選抜するためのシステムに係るものであり、従来、土壌からのＢＴ菌の分離とそれに対する昆虫を用いた生物検定を基にした開発法に依存して「微生物殺虫剤」というジャンルと「害虫抵抗性組換え食品」と言うジャンルが生まれ、現在でも重要な商品として作られているが、これに対して、本発明によれば、簡単に見つかる弱い活性しか持っていない殺虫性の毒素を出発材料にして、ある目的の害虫に効く変異体タンパク質を任意に生み出すことが可能になった。また、良く効く毒素を出発材料にして、更に活性の高い毒素を開発することが可能になった。すなわち、容易に入手できるタンパク質を材料にして、より有用なタンパク質を育て上げる（分子育種する）ことが可能になり、結果として、このようにして育種した毒素変異体を利用する「タンパク質殺虫剤」とでも言うべき新技術・新製品ジャンルを社会に生み出すことが可能になる。世界における殺虫剤の市場は莫大であるが、この新しいジャンルは、産業的に抗体工学の製品をしのぐものに成長する可能性を秘めているものとして高く期待される。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】Ｃｒｙ１Ａａ及びＣｒｙ１Ａｂ発現ファージベクターの構築法を示す。
【図２】Ｃｒｙ１Ａａ毒素もしくはＣｒｙ１Ａｂ毒素のファージ上発現の抗体を用いた解析結果を示す。図中、Ａ―Ｇは、以下の事項を示す。Ａ−Ｃ：Ｃｒｙ１Ａａ毒素特異的モノクローナル抗体（２Ｆ９）へのＣｒｙ１Ａａ毒素提示ファージ（Ａ）、Ｃｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージ（Ｂ）及びｗｉｌｄ−ｔｙｐｅファージ（Ｃ）のプラークの反応。Ｄ−Ｆ：抗Ｃｒｙ１Ａａ毒素血清へのＣｒｙ１Ａａ毒素提示ファージ（Ｄ）、Ｃｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージ（Ｅ）及びｗｉｌｄ−ｔｙｐｅファージ（Ｆ）のプラークの反応。Ｇ：ウエスタンブロッティングによる各ファージタンパク質の抗Ｃｒｙ１Ａａ毒素血清への反応。レーン１；活性型Ｃｒｙ１Ａａ  毒素、レーン２；Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージ、レーン３；Ｃｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージ、レーン４；ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅファージ。
【図３】Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージ及びＣｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージの受容体分子ＢｔＲ１７５  への結合性を示す。図中、Ａ−Ｂは、以下の事項を示す。Ａ；バイオパニングによる結合性の評価。Ｂ；  磁気ビーズによる結合性の評価。●；ＢｔＲ１７５結合区におけるＣｒｙ１Ａａ毒素提示ファージの結合、○；対照区におけるＣｒｙ１Ａａ  毒素提示ファージの結合；◆：ＢｔＲ１７５結合区におけるＣｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージの結合、◇；対照区におけるＣｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージの結合、■；ＢｔＲ１７５結合区におけるｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ファージの結合、□；対照区におけるｗｉｌｄ−ｔｙｐｅファージの結合。
【図４】磁気ビーズ法のＣｒｙ１Ａ毒素提示ファージの選抜能力の調査結果を示す。図中、Ａ−Ｃは、以下の事項を示す。Ａ；Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージとＷｉｌｄ−ｔｙｐｅファージの混合区。Ｂ；Ｃｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージとＷｉｌｄ−ｔｙｐｅファージの混合区。●及び○；出発時Ｃｒｙ１Ａ毒素提示ファージ混合比率１０％、◆及び◇；出発時Ｃｒｙ１Ａ毒素提示ファージ混合比率１％、■及び□；出発時Ｃｒｙ１Ａ毒素提示ファージ混合比率０．１％。Ｃ；  Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージとＣｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージの混合区。●及び○；出発時Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージ混合比率２．５％、◆及び◇；出発時Ｃｒｙ１Ａａ  毒素提示ファージ混合比率０．７５％。
【図５】Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージのＣｒｙ１Ａｂ毒素提示ファージからの濃縮操作の結果を示す。図中、Ａ−Ｃは、以下の事項を示す。Ａ；濃縮サイクルの過程で磁気ビーズから溶出したファージの一部を大腸菌に感染させ、プラークを作らせ、プラークをニトロセルロース膜に写し取り、ＢＳＡでブロッキングした後、Ｃｒｙ１Ａａ毒素特異的モノクローナル抗体２Ｆ９でＣｒｙ１Ａａ毒素提示ファージを検出し、Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージの比率をモニターした結果を示す。  ●及び○；出発時混合比１：１０、◆及び◇；出発時混合比１：１０００、■及び□；出発時混合比１：１００００００。Ｂ−Ｃ：出発時混合比１：１００００００の実験区で、Ｃｒｙ１Ａａ毒素特異的プライマーを用いてファージ液に対してＰＣＲを行い、Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージを用いた標準反応（Ｂ）と比較することによって、濃縮ラウンド０  から９（Ｒ０〜Ｒ９）に含まれるＣｒｙ１Ａａ毒素ＤＮＡ量を定量的に評価し、Ｃｒｙ１Ａａ毒素提示ファージの濃縮程度をモニターした（Ｃ）結果を示す。
【図３】
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【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図５】
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【配列表】
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