(57)【要約】      （修正有）【課題】環境サンプルから夾雑物を除き、高純度のＤＮＡを精製する方法を提供する。さらに、環境ＤＮＡを用いてファージディスプレイライブラリーを作製し、当該ディスプレイライブラリーからタンパク質をコードする遺伝子を効率的にスクリーニングする方法を提供する。【解決手段】土壌より環境ＤＮＡを抽出、精製して、ファージディスプレイライブラリーを作製し、バイオパンニングの手法にて、固相化ストレプトアビジンもしくはアビジンを用いて、結合クローン群を濃縮冨化する。それらのプラークをメンブレンブロットして、酵素標識ストレプトアビジンもしくはアビジンで染色し、ビオチン含有タンパク質のディスプレイクローンを検出し、ビオチン含有タンパク質をスクリーニングする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタゲノムディスプレイライブラリーからビオチン含有タンパク質をクローニングする方法。
【請求項２】
ストレプトアビジンまたはアビジンを用いてビオチン含有タンパク質を選出する請求項１の方法。
【請求項３】
ストレプトアビジンまたはアビジンを用いてビオチン含有タンパク質を検出することを特徴とする請求項１の方法
【請求項４】
請求項１または２に記載の方法で得られたビオチン含有タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環境サンプル由来のＤＮＡからビオチンを含有するタンパク質をコードする遺伝子を効率的に得るスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
＜土壌からのＤＮＡ精製＞
従来、遺伝子工学において使用するＤＮＡは、通常、純粋培養した微生物や細胞からの抽出及び精製によって調製される。当該調製の際の夾雑物は、培地や微生物等に由来の物質に限られている。今日では、それら夾雑物からのＤＮＡの精製方法は、種々の場合に応じて確立されている。
以下で使用する「環境」とは、例えば、土壌、汚泥、下水、河川、湖沼、海水、海底、昆虫・動物・植物の個体の組織内部及び表面並びに排泄物などの微生物が生息している環境を意味する。
「環境サンプル」とは、環境から採取したサンプルを意味する。即ち、微生物や細胞等の純粋培養の場合とは異なり、土壌や汚泥等の環境サンプルからＤＮＡを抽出及び精製する場合には、環境サンプルに由来する様々な夾雑物からＤＮＡを分離する必要がある。特に、土壌はフミンと呼ばれる物質を多量に含む。フミンとは、動植物の遺体が微生物分解を受け、その分解物が重合した天然有機物質である。フミンは、通常の化学物質のような単一の分子構造を有していない。フミンの元素構成は、例えば炭素約５８％、水素約４％、窒素１．５〜６．０％であり、残りの大半は酸素で、その他２％以下の灰分等を含んでいる。フミンは、フミン酸、フルボ酸及びヒマトメラン酸に分類され、いずれもアルカリ可溶性である。アルカリ溶液でフミンを抽出し、次いで酸性にし、ｐＨ１での可溶成分がフルボ酸であり、沈殿物をアルコール抽出したアルコール可溶成分がヒマトメラン酸、その不溶成分がフミン酸である。なお、植物体起源のフミン酸は、腐植酸と呼ばれる場合もある。さらに、フミン酸には、海洋や湖沼の動物性プランクトン起源のものも含まれる。
【０００３】
ところで、フミン酸は、ＤＮＡと分子量分布や電荷が似ているために、環境サンプルからＤＮＡを精製する場合にはＤＮＡと挙動を共にし、大きな障害となる。ＤＮＡの精製度は、簡便には、紫外部−可視部の吸光度波形やλ２６０ｎｍ／２８０ｎｍ比及びλ２６０ｎｍ／２３０ｎｍ比で判断できる。ＤＮＡはλ２６０ｎｍに、タンパク質はλ２８０ｎｍに、そしてフミン酸はλ２３０ｎｍに極大吸収がある。ＤＮＡに対してタンパク質やフミン酸の混入が多い場合は、それぞれλ２６０ｎｍ／２８０ｎｍ比及びλ２６０ｎｍ／２３０ｎｍ比が低くなる。ＤＮＡの純度は、目的に応じて選択することができるが、一般的には、純度のよいＤＮＡは、λ２６０ｎｍ／２８０ｎｍ＝１．８〜２．０及びλ２６０ｎｍ／２３０ｎｍ＞２．０である。
【０００４】
今日まで幾つかの土壌サンプル由来のＤＮＡ（以下、「土壌ＤＮＡ」という）の精製方法に関する報告がなされている。それらの報告を、精製プロトコールとともに以下の表１にまとめた。
【０００５】
【表１】
2007089490.tif 000002
【０００６】
表１に示すように、従来の土壌ＤＮＡの精製方法において、精製した土壌ＤＮＡのλ２６０ｎｍ／２８０ｎｍ比及びλ２６０ｎｍ／２３０ｎｍ比は、最高でそれぞれ１．２程度及び１．４程度であり、純度は低い。なお、表１に示す非特許文献３においては、ゲル濾過担体の種類に応じたＤＮＡとフミン酸との分離効果を検討し、セファロース２Ｂが最も有用であることを報告している。
【０００７】
一方、特許文献１には、まずＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ及びポリビニルピロリドンを含むバッファーで土壌を超音波処理して抽出した後、ＴＥバッファーに溶解し、４つの精製プロトコールを用いて土壌ＤＮＡを回収することが記載されている。そして、精製した土壌ＤＮＡをＰＣＲに供することで、純度を評価している。４つのプロトコールのうち、プロトコールＡ（Ｅｌｕｔｉｐ  ｄ  カラム（陰イオン交換樹脂）のみを使用）及びプロトコールＢ（Ｓｅｐｈａｃｒｌ  Ｓ２００（ゲル濾過）とそれに続いてＥｌｕｔｉｐ  ｄカラムを使用）では、回収不能であるか又はＰＣＲにおいてＰＣＲ産物が検出されなかった。また、プロトコールＤ（Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ４００  ＨＲカラムとそれに続いてＥｌｕｔｉｐ  ｄカラムを使用）では、ＰＣＲにおいてＰＣＲ産物が検出された。
【０００８】
以上のように、従来の土壌ＤＮＡの精製方法において精製された土壌ＤＮＡの純度は、ＰＣＲにおける鋳型として使用できる程度で、未だ不十分であった。
【０００９】
近年、実験室において培養可能な微生物は、土壌などの環境中に存在する全微生物の１％足らずであることが認識されている（非特許文献８）。微生物を培養することなく、直接環境サンプルからＤＮＡを回収して、ライブラリー化することで従来、手付かずであった遺伝子にもアクセス可能となり、有用遺伝子のクローニング機会が飛躍的に増すことが期待できる。そこで、目的とするエンリッチ可能なライブラリー作製に用いることができる高純度の環境ＤＮＡを精製する方法が望まれる。
【００１０】
＜従来の酵素スクリーニング＞
従来の酵素スクリーニングによって微生物から見出された種々の酵素は、食品加工、化成品、医薬、農薬及びバイオマス等の様々な産業で利用されている。さらに、将来的にも、環境負荷軽減の社会的要請に伴い、グリーンケミストリーが提唱されていることから、より多くの工業プロセスへの生体触媒、すなわち、酵素の利用が検討されている（非特許文献９）。
【００１１】
今日、産業で利用されている多くの酵素は、目的とする触媒活性を有する微生物を土壌よりスクリーニングする方法によって単離・同定された。当該スクリーニング方法の共通する手順は、微生物の純粋培養である。個々の微生物を、種々の培地や条件下で培養し、コロニーを無作為に選択する。あるいは、培養後、抗生物質や栄養要求性などの選択的なふるいに供することで所定の微生物を選択する。さらに目的の酵素が微生物の生育に必要不可欠である条件を設定することで、目的の酵素を有する微生物を選択することができる。例えば、耐熱性酵素を得ようとする場合には、１００℃近い環境で生育できる微生物のみを選抜する。一方、低温下で活性の高い酵素を得る場合には、低温下でよく増殖する微生物を選抜する。また、標的とする特定の基質を分解又は変換させることができる酵素を得ようとする場合には、ハローや呈色反応により基質分解を識別できる培地で選択を行う。あるいは、標的とする特定の基質が唯一の炭素源又は窒素源である培地において増殖する微生物を選抜する。
【００１２】
＜従来の酵素スクリーニングの問題点＞
以上のように、従来の酵素スクリーニング方法では微生物の1次スクリーニング工程で、通常、何千、何万のものコロニーについてアッセイし、また微生物の増殖が確認できるまで３週間も要する場合がある。次いで、１次スクリーニング工程で得られた微生物が有する目的の酵素の活性を調べ、十分なレベルの性能を示すものを選択する。さらに、酵素遺伝子を単離する場合には、選択した微生物から酵素遺伝子を単離し、クローニングする必要がある。従って、従来の酵素スクリーニング方法は、かなりの労力と時間を要するという問題がある。
【００１３】
また、上述したように、実験室において培養可能な微生物は、土壌などの環境中に存在する全微生物の１％足らずであると云われていることから、環境中には、培養できない微生物が多く存在する。
【００１４】
＜メタゲノムライブラリー＞
そこで、近年、培養可能な微生物からの酵素スクリーニングに代わり、微生物を培養することなく、微生物を含む環境サンプルを使用することで、目的の遺伝資源にアクセスするアプローチがなされている（特許文献２〜３及び非特許文献１０〜１２）。そのアプローチの概要は、まず土壌などの環境サンプルからＤＮＡを精製する。次いで、精製したＤＮＡを適当なベクターに連結し、適当な宿主に導入したライブラリーを作製する。さらに作製したライブラリーから、目的の遺伝子を有するクローンを探すというものである。環境サンプルからＤＮＡを回収し、作製したライブラリーは、通常の１種の生物に由来するライブラリーとは異なり、多種類の生物に由来する混合ゲノムから成るライブラリーである。環境中の微生物の存在密度は、環境によって異なる。例えば、表層土壌は存在密度が高く、多いところで１ｇの土壌中に１０8〜１０10個の微生物が存在する（非特許文献１３）。さらに、各微生物種の存在比率には差異があるが、少なくとも数千から１万に及ぶ多様な微生物種が環境では混在する（非特許文献１４）。従って、環境サンプルから作製したライブラリーは、極めて多様で複雑度の高い構成となる。このようなライブラリーは、メタゲノムライブラリーと呼ばれる場合がある（非特許文献１５）。
【００１５】
ところで、従来の遺伝子ライブラリーにおいて重要なパラメーターは、対象となる生物種が有する遺伝子数又はゲノムサイズ及び当該遺伝子数又はゲノムサイズを１００％包含するのに必要とされるライブラリーサイズである。例えば、ある有用なアミラーゼを生産するバシルス属細菌株からアミラーゼ遺伝子をクローニングすべく、遺伝子ライブラリーを作製する。当該細菌株のゲノムサイズが５Ｍｂｐであり、またアミラーゼ遺伝子が分断される場合も考慮すれば、アミラーゼ遺伝子を単離するための遺伝子ライブラリーは、１クローンの平均インサートが５Ｋｂｐとすると、インサート合計が約１０倍の５０Ｍｂｐのライブラリー、すなわち、１０4個の独立クローンを含むように作製すればよい。このように、１種類の生物種が有する遺伝子の中から、目的とする遺伝子の存在が明らかである場合には、遺伝子ライブラリーに含むべきクローン数を決定することができる。
【００１６】
＜従来のメタゲノムライブラリーの問題点＞
一方、メタゲノムライブラリーは、数千種以上の微生物が有する遺伝子を含む複雑度の高い混合ゲノムライブラリーである。従って、メタゲノムライブラリーから目的の遺伝子を単離しようとする場合には、膨大な数のクローンをスクリーニングする必要がある。このように、メタゲノムライブラリーは、これまで未知の機能を有する遺伝子を単離することが期待できる一方で、極めてハイスループットで行うことが重要となる。
【００１７】
既に報告されているメタゲノムライブラリーにおいては、ベクターは、２０Ｋｂｐ〜１００Ｋｂｐの大きなＤＮＡ断片を含むことができるコスミドベクターやＢＡＣベクターが採用されている。大きなＤＮＡ断片を含むことができるベクターを使用した場合には、目的の遺伝子が無傷で回収しやすい。しかしながら、メタゲノムライブラリー中のＤＮＡは、未知の微生物由来である。遺伝子の発現調節に関わる機構は、生物種によって異なることがよく知られている。例えば、開始コドン上流の存在するシャイン−ダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列は１６ＳリボソームＲＮＡ配列と相補的であり、当該配列の開始コドンまでの距離は翻訳開始頻度に影響する。なお、多くの大腸菌遺伝子の上流に存在するシャイン−ダルガルノ配列は、枯草菌中では認識されない。そのため、大腸菌遺伝子は、枯草菌に導入した場合には翻訳されない（非特許文献１６）。このように、異種遺伝子が、他の宿主で発現されるとは限らない。従って、メタゲノムライブラリーのスクリーニング手段が発現タンパク質に依存する場合には、宿主中で転写や翻訳開始シグナルなどが機能する遺伝子だけが発現することとなる。
【００１８】
＜ファージディスプレイ法およびインビトロ発現法＞
一方、ファージディスプレイライブラリー法は、以下の工程を含む方法である。まず、コートタンパク質に融合した無作為なアミノ酸配列のペプチドをファージ表面上にディスプレイさせる。次いで、ペプチドをディスプレイしたファージ集団から、アフィニティセレクションによってリガンドタンパク質に親和的に結合する配列を有するクローン群を選抜し、増幅する。この選抜と増幅のサイクルを繰り返すことで、目的のクローンをエンリッチする（Ｓ／Ｎ比を上げる）。なお、ファージディスプレイライブラリー法では、ペプチドをディスプレイしたファージとペプチドをコードする遺伝子とが関連している。さらに、ファージは増幅可能であることから、１回の操作で１０10〜１０12という多数のクローンを検索できる。ファージディスプレイライブラリーは、約２０年前に発表されて以来、種々の応用がなされている（非特許文献１７）。例えば、ランダムペプチドライブラリーを用いて、抗体のエピトープの同定又は新規な生理活性を有するオリゴペプチドの探索がなされている。また、抗体ライブラリーを用いて、短期間にモノクローナル抗体が取得される。さらに、抗体ライブラリーを用いて、より親和性の高い抗体が創出されている。あるいは、酵素変異体ライブラリーから酵素を得る試みがなされている。さらに、クローン増幅可能なコンビナトリアルライブラリー技術としてはファージに限らず、リボソームディスプレイ（非特許文献１８）に代表される、より多様度が高いｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写翻訳系での発現をベースとした方法にも採用されている。
【００１９】
＜ビオチン依存酵素＞
ビオチンはビタミンＨの別称であり、ヒトの４６種の必須栄養素の１つで、皮膚、筋肉及び神経系の健康に不可欠である。ビオチンは後述するように、種々の重要な生合成経路で働くビオチン依存酵素の活性発現に不可欠な化合物である。このため、ビオチンは、微生物の成長にとっても必要である。ビオチン依存酵素は酵素内に共有結合したビオチンを補酵素として利用して、炭酸の固定化や、脱炭酸反応、炭酸の転移反応を触媒する。炭酸の固定化を行う酵素としては、固定化する基質に応じてアセチル−ＣｏＡ  カルボキシラーゼ（ＡＣＣ、脂肪酸生合成経路）やピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＣ、糖新生）、プロピオニルＣｏＡ カルボキシラーゼ（アミノ酸生合成）、メチルクロトニルＣｏＡ カルボキシラーゼ（アミノ酸代謝）、ゲラニルＣｏＡ カルボキシラーゼ、オキザロ酢酸脱炭酸酵素（アミノ酸代謝）、メチルマロニルＣｏＡ カルボキシラーゼ（アミノ酸合成）、トランスカルボキシラーゼ（アミノ酸合成）、尿素脱アミド酵素（尿素回路）、等が知られている。これらのビオチン依存カルボキシラーゼの反応は、２段階の部分反応から成り立っており、１段階目の反応は液中の炭酸をビオチンに固定化する反応で、ビオチンカルボキシラーゼ（ＢＣ）ドメインが触媒し、２段階目の反応はビオチンに固定化された炭酸を基質に転移する反応で、カルボキシルトランスフェラーゼ（ＣＴ）ドメインが触媒する。ビオチン依存酵素は真核生物、原核生物の種々の生合成経路に見られる。酵素的に異なる種類のビオチン依存酵素間のアミノ酸配列相同性は極めて低い。ビオチン依存酵素の立体構造に関する研究は、ここ数年で大きな進歩があり、徐々にこれらの酵素の全貌が明らかになりつつある。しかし依然として酵素の詳細な反応機構、とりわけＣＴの反応に関しては不明な点が多い。中でもＰＣについては立体構造がまだ解明されていないこともあり、多くの検討課題が残っている。
メチルクロトニルＣｏＡカルボキシラーゼ（MCC: EC6.4.1.4)はミトコンドリアの膜に存在しロイシン代謝に関与するビオチン酵素であり、ヒトでは常染色性劣性遺伝を示すＭＣＣ欠損症が２６例報告されている。臨床症状は様々で日本人の２例の経過も互いに異なり，症状発現と本酵素の関係は不明である。
ビオチン依存酵素の反応の研究は、増殖制御、酵素活性制御にとって重要であり、それらの特性を理解し、制御する情報を得るために酵素学的研究対象とされている（非特許文献１９）。
植物のアセチル−ＣｏＡ カルボキラーゼはある種の除草剤の標的であることが知られており（非特許文献２０）、本酵素の種々のタイプを研究することで除草剤の耐性・感受性の制御に応用可能であろう。
酵素をＸ線解析するには物質的に十分な量、例えば数百ｍｇオーダーの精製タンパク質が必要であり、通常はクローン化した目的遺伝子を遺伝子組換えによって適当な宿主細胞で大量発現させて調製される。従来は、これらのビオチン依存酵素を精製し、プロテアーゼ部分消化断片からアミノ酸配列解析する。そのアミノ酸をコードする縮退ＤＮＡ配列のプローブを放射標識またはビオチンやジゴキシゲニン標識してハイブリダイゼーションにより、ｃＤＮＡライブラリーまたはＤＮＡライブラリーを検索、単離する（非特許文献２１）。縮退ＤＮＡ配列からプライマーを作製し、ＰＣＲ法でクローン化できる場合もあるが、通常は縮退ＤＮＡ配列ではノイズバンドが多数出現するため困難な場合が多い。別法としては、精製酵素を抗原として抗体を得て、ｃＤＮＡまたはゲノミックＤＮＡ発現ライブラリーを免疫染色して検索する場合もある（非特許文献２２）。これらの方法では、酵素の精製、部分アミノ酸配列の決定、抗体の取得などの工程に労力と時間を多く要する。
アフィニティ精製抗ＡＣＣ抗体でベイカー酵母のλgt11発現ライブラリーをスクリーニング。ポジティブクロンのDNA配列を放射性DNAプローブを調整、EMBL3ゲノムライブラリーでACC遺伝子を含むより大きなＤＮＡ断片を取得。
【００２０】
【特許文献１】特表2003-520578号公報
【特許文献２】特表2000−513933号公報
【特許文献３】特表2001−520055号公報
【非特許文献１】C. Joe-Chanら, J. Microbiol., 34(3):229, 1996
【非特許文献２】D. N. Millerら, Appl. Environ. Microbiol., 65 (11): 4715, 1999
【非特許文献３】D. N. Miller, J, Microbiological Methods, 44, 49, 2000
【非特許文献４】C. Schabereiter-Gurtnerら, J. Microbiol. Methods, 45: 77, 2001
【非特許文献５】H. Burgmannら, J. Microbiol. Methods, 45: 7, 2001
【非特許文献６】D. A. Santosa, Molecular Biotechnology, 17: 59, 2001
【非特許文献７】E. M. Jamesら, FEMS Microbiol. Ecol., 36: 139, 2001
【非特許文献８】Amann RI, Ludwig W, Schleifer KH., Microbiol Rev., 59(1):143-69, 1995
【非特許文献９】太田博道, 「生体触媒とグリーンケミストリー」, ケミカルエンジニヤリング, vol.46,no.7, p49-53, 2001
【非特許文献１０】Rondon, M.R.ら, Appl. Environ. Microbiol., 66(6):2541-7, 2000
【非特許文献１１】MacNeil, I. A.ら, J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 3(2): 301-8, 2001
【非特許文献１２】Knietsch A.ら, J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 5(1): 46-56, 2003
【非特許文献１３】今中忠行 監修 「微生物利用の大展開」 エヌ・ティー・エヌ, p.250-254, 2002
【非特許文献１４】Torsvik V.ら, Appl. Environ. Microbiol., 56(3): 782-7, 1990
【非特許文献１５】Handelsman J, Rondon MR, Brady SF, Clardy J, Goodman RM, Chem. Biol., 5(10): R245-9, 1998
【非特許文献１６】Band L, Henner DJ., DNA., 3(1):17-21, 1984
【非特許文献１７】Smith, G. P., Curr. Opin. Biotechnol., 2(5):668-73, 1991
【非特許文献１８】Mattheakis, L. C., Bhatt, R. R.及びDower, W. J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91, p.9022, 1994
【非特許文献１９】S. Jitrapakdee and J. C. Wallace, Current Protein and Peptide Science, 4: 217, 2003
【非特許文献２０】K. A. Walker, S. M. Ridley, T. Lewis and J. L. Harwood, Biochem. J., 254(1):307.
【非特許文献２１】H. KONDO, K. SHIRATSUCHI, T. YOSHIMOTOA, T. MASUDA, A. KITAZONO, D. TSURUO, M. ANAI, M. SEKIGUCHI AND T. TANABE, Proc. Nadl. Acad. Sci. USA 88: 9730, 1991
【非特許文献２２】W. Al-Feel, S. S. Chirala, and S. J. Wakil. Proc Natl Acad Sci U S A. 89(10):4534, 1992.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
上述したように、従来の土壌ＤＮＡの精製方法により精製された土壌ＤＮＡは、種々の遺伝子工学的処理に使用するには未だ純度が不十分であった。そこでファージパッケージング反応やインビトロ転写翻訳系のような夾雑物感受性の高い反応にも使用可能な高純度環境ＤＮＡを調製する。一方、メタゲノムライブラリー中の遺伝子は、未知の微生物に由来するので、使用した宿主中で発現する否かは不明であった。そのため、メタゲノムライブラリーにおける遺伝子の中には、発現効率が低いもの又は発現しないものが存在するという問題があった。さらに、メタゲノムライブラリーをスクリーニングする際には、膨大な数のクローンをスクリーニングする必要があり、効率的に行うことが望まれる。
【００２２】
そこで、本発明は、上述した実状に鑑み、環境サンプルから夾雑物を除き、高純度のＤＮＡを精製する方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、環境ＤＮＡを用いてファージディスプレイライブラリーを作製し、当該ディスプレイライブラリーからタンパク質をコードする遺伝子を効率的にスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
上述した目的を達成するため、本発明者が鋭意検討した結果、環境サンプルからＤＮＡを回収し、回収したＤＮＡをゲル濾過クロマトグラフィーに供し、得られたＤＮＡを含む画分をイオン交換クロマトグラフィーに供することで、高純度の環境サンプル由来の環境ＤＮＡを得ることができることを見出した。さらに、環境サンプル由来の環境ＤＮＡのファージディスプレイライブラリーやインビトロ発現ライブラリーを作製し、上記ライブラリーとリガンドとの相互作用に基づいてスクリーニングすることにより、タンパク質をコードする遺伝子を効率的にスクリーニングできることを見出し、本発明を完成するに至った。
特にビオチン含有タンパク質は、メタゲノムディスプレイライブラリーからストレプトアビジンもしくはアビジンをリガンドとして収集し、選択的に溶出して得ることができる。
以下に例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるべきものではない。即ち、本発明は、土壌より環境ＤＮＡを抽出、精製して、ファージディスプレイライブラリーを作製し、バイオパンニングの手法にて、固相化ストレプトアビジンもしくはアビジンを用いて、結合クローン群を濃縮冨化する。それらのプラークをメンブレンブロットして、酵素標識ストレプトアビジンもしくはアビジンで染色し、ビオチン含有タンパク質のディスプレイクローンを検出し、ビオチン含有タンパク質をスクリーニングする。なお、メタゲノムディスプレイライブラリーとは、メタゲノム由来ＤＮＡを用いて、ファージディスプレイ法やリボソームディスプレイ法のように、発現タンパク質とそれをコードする遺伝子を物理的にリンクさせた容易に増幅可能なクローンまたはユニットから成るライブラリーである。
【００２４】
本発明は、以下を包含する。
（１）環境サンプルからＤＮＡを回収し、回収したＤＮＡをゲル濾過クロマトグラフィーに供し、得られたＤＮＡを含む画分をイオン交換クロマトグラフィーに供することを含む、環境サンプル由来の環境ＤＮＡの精製方法。
（２）ビーズを用いて環境サンプルを破砕することによりＤＮＡを回収することを特徴とする、（１）記載の環境サンプル由来の環境ＤＮＡの精製方法。
（３）環境サンプルからＤＮＡを回収した後、回収したＤＮＡを部分分解に供することを含む、（１）記載の環境サンプル由来の環境ＤＮＡの精製方法。
（４）上記ゲル濾過クロマトグラフィーにおける排除限界が１０5Ｄａ以上であることを特徴とする、（１）記載の環境サンプル由来の環境ＤＮＡの精製方法。
（５）上記精製したＤＮＡのサイズが０．５〜５Ｋｂｐであることを特徴とする、（１）記載の環境サンプル由来の環境ＤＮＡの精製方法。
（６）環境サンプル由来の環境ＤＮＡのファージディスプレイライブラリーもしくはインビトロ発現ライブラリーを作製し、これらのライブラリーとリガンドとの相互作用に基づいてスクリーニングすることを含む、タンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法。
（７）上記環境サンプル由来の環境ＤＮＡが（１）〜（５）のいずれか１項に記載の環境サンプル由来ＤＮＡの精製方法により精製されたものであることを特徴とする、（６）記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法。
【００２５】
（８）上記リガンドがビオチン含有タンパク質であることを特徴とする、（６）記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法。
（９）上記リガンドがストレプトアビジンもしくはアビジンであることを特徴とする、（６）記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法。
（１０）エンリッチした集団からビオチン含有タンパク質発現クローンを標識ストレプトアビジンもしくはアビジンで染色、検出するスクリーング方法。
（１１）（６）記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法でエンリッチしたＤＮＡ断片を、増幅し、まとめて発現ベクターに移し、宿主に導入し、挿入遺伝子から発現した活性に基いて目的クローンをスクリーニングする方法。
（１２）２種以上のリガンドおよび／または担体の組み合わせによる（６）記載のタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法。
即ち、本発明は、
Ａ：メタゲノムディスプレイライブラリーからビオチン含有タンパク質をクローニングする方法であり、
Ｂ：ストレプトアビジンまたはアビジンを用いてビオチン含有タンパク質を選出する上記Ａ記載の方法であり、
Ｃ：ストレプトアビジンまたはアビジンを用いてビオチン含有タンパク質を検出することを特徴とする上記Ａ記載の方法であり、
Ｄ：上記ＡまたはＢに記載の方法で得られたビオチン含有タンパク質
である。
【発明の効果】
【００２６】
本発明は、メタゲノムディスプレイライブラリーからストレプトアビジンもしくはアビジンを用いて容易にビオチン含有タンパク質を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る環境サンプル由来の環境ＤＮＡの精製方法は、環境サンプルからＤＮＡを回収し、回収したＤＮＡをゲル濾過クロマトグラフィーに供し、得られたＤＮＡを含む画分をイオン交換クロマトグラフィーに供することを含む方法である。本発明に係る環境ＤＮＡの精製方法によれば、高純度の環境ＤＮＡを得ることができる。
【００２８】
本発明において「環境」とは、例えば、土壌、汚泥、下水、河川、湖沼、海水、海底、昆虫・動物・植物の個体の組織内部及び表面並びに排泄物などの微生物の生息環境を意味する。
本発明において「環境サンプル」とは、環境から採取したサンプルであり、更に土壌、汚泥、海底等から採取したサンプルであることが好ましく、特にフミン酸を含有するものが好ましい。また、環境サンプルとは、環境から採取したサンプルに培地等を添加して培養したものではないものが好ましい。
本発明において「環境ＤＮＡ」とは、環境サンプルから得たＤＮＡを意味する。
本発明において「土壌ＤＮＡ」とは、環境サンプル中における土壌サンプルから得たＤＮＡを意味する。
本発明において「ディスプレイライブラリー」とは、ファージディスプレイライブラリーおよびインビトロ発現ライブラリーを意味する。そしてインビトロ発現ライブラリーとは、リボソームディスプレイライブラリー、エマルジョン法、ＳＴＡＢＬＥ法、およびインビトロウイルス法等のことを意味する。
本発明において「粉砕」とは、環境サンプルが塊状である場合、この塊状を細かくすることを含むが、環境サンプル中の微生物等の細胞中からＤＮＡを細胞外に放出させる操作を意味する。
【００２９】
本発明に係る環境DNAの精製方法においては、まず、環境サンプルからDNAを回収する。この方法について概要を記載する。
環境サンプルが塊状である場合にはよく破砕する。また、環境サンプル中に存在する微生物中のＤＮＡを抽出することができれば如何様な手段を用いてもよい。例えば、ＤＮＡ抽出手段として粉砕が挙げられる。この破砕手段としては、例えば、ビーズビーティング、ソニケーション等を用いることができる。
【００３０】
次いで、環境サンプルを適当量(例えば、環境サンプルと等量)のバッファーに懸濁する。バッファーとしては、例えば、Tris-HClやPBS等が挙げられる。なお、バッファーのpHは、中性から弱アルカリ、すなわち、pH7〜9が好ましく、より好ましくはpH7〜8とする。また、バッファーの塩濃度は、0.1M〜2Mが好ましく、より好ましくは1M〜2Mとする。さらにバッファーにTritonX-100、Tween20、Nonidet P-40等の界面活性剤を添加することで、環境サンプルの分散をよくすることができる。
【００３１】
次に、上記懸濁液に対して、グラスビーズを環境サンプルに加えて粉砕処理を行う。このグラスビーズの使用量は、環境サンプルに対し１／３〜２倍重量が好ましく、より好ましくは１／２〜同重量である。添加するグラスビーズの粒径は、５０〜１０００μｍが好ましく、100μｍ〜500μｍであることがより好ましい。
懸濁液及びグラスビーズを含む容器を密閉し振盪攪拌する。ビーズは硬質であればグラス以外の材質でもよい。当該操作により、環境サンプルに含まれる微生物の菌体を破砕することができる。あるいは、フレンチプレスや超音波処理等に供することで、微生物などの菌体を破砕してもよい。
【００３２】
環境サンプルに含まれる微生物の菌体を破砕した後に、例えば、遠心分離又は濾過により、環境DNAを含む上清を回収する。回収した上清をフェノール処理やエタノール沈殿等の一般的な方法に供することで、上清に含まれるタンパク質を除去し、環境DNAを抽出することができる。あるいは、上記において、懸濁液をグラスビーズとともに振盪攪拌した場合には、振盪攪拌後、懸濁液の塩濃度を1M〜2Mの高濃度に換えることで、ガラスビーズに環境DNAを吸着させる。吸着後、環境DNAが吸着したガラスビーズを洗浄し、ＤＮＡ溶出処理することで、環境DNAを回収することができる。このことから環境DNAを吸着できるガラスビーズを用いることにより、環境サンプルから容易に環境DNAを得ることができる。このことから、本発明において、このようなガラスビースを用いることがより好ましい。
【００３３】
本発明に係る環境DNAの精製方法において、回収した環境DNAをさらに低分子化する場合には、回収した環境DNAをデオキシリボヌクレアーゼ(以下、「DNアーゼ」という)と反応させることで、部分分解してもよい。DNアーゼとしては、タイプIヌクレアーゼのような特異性の低いものが好ましく、例えば、DNアーゼIが挙げられる。あるいは、環境DNAを超音波処理に供し、物理的に環境DNAをせん断することで、低分子化してもよい。なお、部分分解の条件は、最終的に精製した際に、目的とするDNAサイズが得られる条件を選択する。例えば、DNアーゼIを使用して、2Kbpサイズの環境DNA断片が多く得られるための条件は、以下の反応条件が挙げられる。
○反応条件
バッファー組成：３０ｍＭ ＮａＯＡｃ，ｐＨ５．２，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2
ＤＮＡ濃度    ：４５０μｇ／ｍｌ
ＤＮａｓｅ  Ｉ：１５Ｕ／ｍｌ
反応温度と時間：２５℃で１５分
【００３４】
一方、本発明に係る環境ＤＮＡの精製方法では、回収した環境ＤＮＡをゲル濾過クロマトグラフィーに供する。ゲル濾過クロマトグラフィーにおける排除限界は、デキストラン換算で、１０5Ｄａ以上、好ましくは５×１０6Ｄａ以上であることが好ましい。ゲル濾過クロマトグラフィーに使用する、ゲル濾過担体及び／又はカラムとしては、例えば、Sephacryl S-300HR、Sephacryl S-400HR、Sephacryl S-500HR、Sepharose CL4B、Sepharose CL6B、Superose 6及びSuperose12などが挙げられる。さらに、上記排除限界を有するものであれば、高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＨＰＬＣ」という）用の担体及び／又はカラムを用いてもよい。
【００３５】
ゲル濾過クロマトグラフィーで使用するバッファーとしては、例えば、TE (10mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA)、TES(10mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA, 0.2M NaCl)等が挙げられる。
【００３６】
環境ＤＮＡをゲル濾過クロマトグラフィーに供した後、溶出することで得られた画分が環境ＤＮＡを含むか否かは、例えば、画分の一部をアガロースゲル電気泳動に供することで確認することができる。また、得られた画分の環境ＤＮＡの純度溶出位置は、画分の吸光度を測定し、紫外部−可視部の吸光度波形、λ２６０ｎｍ／２８０ｎｍ比及びλ２６０ｎｍ／２３０ｎｍ比で判断することができる。各画分の一部をアガロースゲル電気泳動に供し、目的のサイズの環境ＤＮＡを含む画分を選択してもよい。
【００３７】
本発明に係る環境ＤＮＡの精製方法では、さらに環境ＤＮＡの純度を上げるために、ゲル濾過クロマトグラフィーによって得られた環境ＤＮＡを含む画分をイオン交換クロマトグラフィーに供してもよい。樹脂はＤＥＡＥのような弱陰イオン交換樹脂を用いることが好ましい。例えば、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２Ｍ  ＮａＣｌ程度の低イオン強度のバッファーで環境ＤＮＡを吸着させ、同バッファーで塩濃度０．５Ｍ  ＮａＣｌ程度のもので環境ＤＮＡ以外の不純物を洗浄除去し、同バッファーで塩濃度１．０Ｍ  ＮａＣｌ程度のもので環境ＤＮＡを溶出する。
【００３８】
イオン交換クロマトグラフィーに供した後、得られた環境ＤＮＡの純度は、吸光度を測定し、紫外部−可視部の吸光度波形、λ２６０ｎｍ／２８０ｎｍ比及びλ２６０ｎｍ／２３０ｎｍ比で判断することができる。λ２６０ｎｍ／２８０ｎｍ比が１．８〜２．０である場合に、及び／又はλ２６０ｎｍ／２３０ｎｍ比が２．０以上である場合に、フミン酸及びタンパク質等の夾雑物から環境ＤＮＡを分離でき、純度の高い環境ＤＮＡが得られたと判断することができる。
本発明に係る環境ＤＮＡの精製方法では、ゲル濾過クロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーとの順番を上記記載と逆にしてもよく、単独で用いてもよい。本発明に係る環境ＤＮＡの精製方法において、ゲル濾過クロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーとの用いるものが好ましい。
本発明に係る環境ＤＮＡの精製方法では更にサイズを限定する場合には、アガロースゲル電気泳動後にゲルからＤＮＡ断片を切り出し、市販のスピンカラム、例えばキアゲン（株）のＱＩＡ  ｑｕｉｃｋで精製することができる。
本発明に係る環境ＤＮＡの精製方法では、例えば、環境ＤＮＡのサイズが０．５ｋｂｐ〜５ｋｂｐとなるように精製することができ、更に好ましくは０．６〜４ｋｂｐであり、特に好ましくは０．８〜３ｋｂｐである。
【００３９】
以上のように、本発明に係る環境ＤＮＡの精製方法によれば、純度の高い環境ＤＮＡを得ることができる。遺伝子ライブラリーの作製のための遺伝子工学的な処理、例えば制限酵素処理、ＰＣＲ、連結、形質転換、ファージ粒子へのパッケージング及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写翻訳などの種々の反応においては、夾雑物の影響を受けやすい。本発明に係る環境ＤＮＡの精製方法によって得られた環境ＤＮＡは、純度が高いので、上述した種々の反応において不都合なく使用することができる。
【００４０】
一方、本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法（以下、「本発明に係るスクリーニング方法」という）は、環境ＤＮＡのディスプレイライブラリーを作製し、上記ディスプレイライブラリーとリガンド（ストレプトアビジンまたはアビジン）との相互作用に基づいてリガンド認識クローン群をエンリッチしてスクリーニングすることを含む方法である。本発明に係るスクリーニング方法によれば、リガンドを認識するタンパク質をコードする遺伝子を環境ＤＮＡの中より、多数のクローンを一括して検索することができるので、短期間で省力的にスクリーニングすることができる。ここで、「タンパク質をコードする遺伝子」とは、活性や機能を有するタンパク質をコードする遺伝子又は遺伝子断片を意味する。
【００４１】
本発明に係るスクリーニング方法で使用する環境ＤＮＡとしては、例えば上述した本発明に係る環境ＤＮＡの精製方法で精製された環境ＤＮＡが挙げられる。
【００４２】
本発明に係るスクリーニング方法では、まず環境ＤＮＡのディスプレイライブラリーを作製する。
【００４３】
ディスプレイライブラリーとしては、例えば、ファージディスプレイライブラリー、リボソームディスプレイライブラリー(L. C. Matthekis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91, p.9022, 1994)、エマルジョン法(Tawfik D. S. & Griffth, A. D., Nat. Biotechnol., 16, p.652-656, 1998.)、STABLE法(Doi, N. and Yanagawa, H., FEBS Lett., 457, p.227-230, 1999)、インビトロウイルス法（Roberts, R. W & Szostak, J. W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 94, p.12297）等が挙げられる。
【００４４】
ディスプレイライブラリーの作製においては、まず環境ＤＮＡをベクターに連結させる。このベクターとして使用できるものとしては、λ系ファージ、Ｔ７系ファージ、Ｍ１３系ファージ及びＴ４系ファージ等が挙げられる。
【００４５】
環境ＤＮＡをベクターに挿入するには、適当な制限酵素で環境ＤＮＡを切断し、次いでこれを適当なベクターＤＮＡの制限酵素切断部位又はマルチクローニングサイトに挿入して、ベクターに連結する方法が挙げられる。環境ＤＮＡを平滑末端化し、ベクターの制限酵素切断部位又はマルチクローニングサイトに適合するようにアダプターを連結することもできる。
【００４６】
また、ベクターにおいて、宿主で発現し得るタンパク質をコードする遺伝子の内部あるいは当該タンパク質のＮ末端又はＣ末端をコードする塩基配列に環境ＤＮＡを挿入することもできる。例えば、ファージディスプレイライブラリーにおいては、ファージ中のコートタンパク質をコードする遺伝子の内部あるいは当該コートタンパク質のＮ末端又はＣ末端をコードする塩基配列に環境ＤＮＡを挿入する。このことにより、環境ＤＮＡによってコードされるタンパク質又はペプチドをコートタンパク質との融合タンパク質として、ファージ上に提示させることができる。従って、環境ＤＮＡによってコードされるタンパク質又はペプチドはファージ上に提示される。
【００４７】
さらにベクターは、環境ＤＮＡの他に、例えば、遺伝子発現制御領域、レポーター遺伝子及び選択マーカーを含むことができる。遺伝子発現制御領域としては、例えば、プロモーター、翻訳開始シグナル、エンハンサーなどのシスエレメント等が挙げられる。レポーター遺伝子としては、例えば、ＧＦＰやルシフェラーゼのような蛍光、発光遺伝子、利用しやすい抗体の抗原となるタンパク質遺伝子等が挙げられる。選択マーカーとしては、例えば、Ａｍｐｒ、Ｔｅｔｒ、Ｃｍｒ、Ｋｍｒ、ＡＵＲ１−Ｃ等の抗生物質耐性遺伝子等が挙げられる。なお、遺伝子発現制御領域、レポーター遺伝子及び選択マーカー等のベクターへの挿入方法は、上述した環境ＤＮＡのベクターの挿入方法と同様である。
【００４８】
次いで、環境DNAを含む組換えベクターを、宿主中に導入することにより、形質転換体を得ることができる。宿主としては、上記組換えベクターを増殖させることができるものであれば特に限定されるものではない。
【００４９】
細菌への上記組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されない。例えば、ファージ感染、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００５０】
次いで、形質転換体を増殖させることで、環境ＤＮＡを含む組換えベクターを増幅することができる。
【００５１】
なお、組換えベクターに使用したベクターがλファージ、Ｔ７ファージ及びＴ４ファージなどのファージＤＮＡである場合には、パッケージング反応終了後に、大腸菌等の宿主に感染させることで、形質転換することができる。次いで、形質転換した大腸菌を増殖させることで、組換えファージＤＮＡを増幅させることができる。次いで、宿主を溶菌させることで、増幅したファージを得ることができる。
ファージディスプレイライブラリーでは、増幅したファージをそのままライブラリーとして使用することができる。ファージディスプレイライブラリーにおいて、ファージが環境ＤＮＡを有するか否かは、プラークＰＣＲ等のＰＣＲにより確認することができる。
インビトロ発現ライブラリーにおいては、細胞は用いずに細胞抽出液を用いて鋳型ＲＮＡから翻訳または鋳型ＤＮＡから転写翻訳を行わせライブラリーとする。環境ＤＮＡは細胞抽出液中でタンパク質として発現できるよう、プラスミドベクターと連結したり、プロモーターや翻訳開始信号を保有し、融合タンパク質相手をコードするＤＮＡ断片と連結して鋳型として用いる。
【００５２】
一方、本発明に係るスクリーニング方法では、環境ＤＮＡのディスプレイライブラリーに対する対象のリガンドを固定化担体に固定化することができる。あるいは、対象のリガンドを標識化することができる。
【００５３】
本発明に係るスクリーニング方法において、リガンドとしては、例えば多糖類、タンパク質、脂質等のような高分子の酵素基質；ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＦＭＮ、ＳＡＭ、アセチルＣｏＡ、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ｃＡＭＰ、ＧＳＴ、リボフラビン等のような補酵素；アミラーゼインヒビター、プロテアーゼインヒビター等の酵素インヒビター；糖、アミノ酸、脂肪等のような低分子酵素基質；生体内代謝産物；医薬品等の薬物等が挙げられる。
【００５４】
例えば、環境ＤＮＡのディスプレイライブラリーから、酵素又は酵素断片をスクリーニングする場合には、基質や補酵素や阻害剤をリガンドとする。なお、活性の高い加水分解酵素をスクリーニングする場合には、リガンドとは結合するが、リガンドが分解されない条件でスクリーニングを行う。さらに、デンプンやセルロースのような不溶性粒子をリガンドとする場合には、当該リガンドをそのまま固相として使用することができる。
【００５５】
２種以上のリガンドビーズや担体の使用を組み合わせて、両方のリガンドを認識する集団や片方のリガンドのみ認識する集団の選抜、または担体自体に結合するものの除去を行うことができる。
【００５６】
固定化担体としては、例えば、アガロースビーズ、イムノビーズ、親水性ビーズ及び磁性ビーズなどのビーズ、並びに酵素免疫測定法（ＥＩＡ）用のプレート等が挙げられる。あるいは、既に様々な物質を担持した市販のアガロースビーズ（例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）をそのまま使用することもできる。その場合には、当該アガロースビーズに担持された物質がリガンドとなる。
【００５７】
本発明に係るスクリーニング方法では、固定化担体に対して対象のリガンドを相互作用させ、当該対象のリガンドと固定化担体とを結合させる。例えば、固定化担体表面に配したアミノ基、カルボキシル基、水酸基、エポキシ基及びトシル基などの官能基を利用して、リガンドを共有結合させることができる。固定化担体の官能基がカルボキシル基である場合、例えば固定化対象のリガンドに存在するアミノ基と官能基との間で共有結合を形成、すなわちアミンカップリングを形成することができる。また、固定化担体の官能基がカルボキシル基である場合、カルボキシル基をＰＤＥＡ化することにより、対象のリガンドに存在する遊離のチオール基と反応基との共有結合を形成、すなわちリガンドチオールカップリングを形成することができる。さらに、対象のリガンドがカルボキシル基を有する場合、予め当該リガンドをＰＤＥＡ  （２−（２−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｄｉｔｈｉｏ）  ｅｔｈａｎｅａｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）と反応させてカルボキシル基をＰＤＥＡ化する。また、固定化担体のカルボキシル基を活性化させた後に、当該カルボキシル基をｃｙｓｔａｍｉｎｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅと反応させ、その後ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ）で還元することによりチオール基に変換する。そして、ＰＤＥＡ化したカルボキシル基と、固定化担体側のチオール基との間で共有結合（ジスルフィド結合）を形成する。すなわち、サーフェスチオールカップリングを形成することができる。
【００５８】
また、本発明に係るスクリーニング方法では、対象のリガンドを標識化することで、当該標識に基づいてリガンドに結合したクローンを溶出することができる。標識化としては、例えば、ビオチン化や蛍光物質等による標識が挙げられる。例えば、対象のリガンドをビオチン化し、溶液中でリガンドとディスプレイライブラリーとを相互作用させる。次いで、ストレプトアビジンもしくはアビジンビーズを用いて、当該リガンドに結合したクローンを溶出することができる。
【００５９】
本発明に係るスクリーニング方法では、ディスプレイライブラリーとリガンドとの相互作用に基づいてスクリーニングする。ここで相互作用とは、ディスプレイライブラリーとリガンドとの親和的結合や酵素反応等を意味する。スクリーニングは、アフィニティーセレクションにより行われる。アフィニティーセレクションは、結合反応、洗浄及び溶出等の工程より成る。
【００６０】
バッファーには、EIAと同様に疎水性相互作用によるノイズを軽減するために、0.05〜1％程度のTween20、Triton-X100及びNP-40などの非極性界面活性剤を添加することができる。バッファーのpHは、pH2〜12の範囲で目的に応じて一般的な生化学バッファーを選択すればよい。例えば、ファージディスプレイライブラリー中のファージの生存が許容できないバッファーのpHの範囲であっても、1サイクルのみのアフィニティーセレクションは可能である。
【００６１】
一方、リガンドを担持する固定化担体は、必要に応じて、0.1〜5％程度のBSA、スキムミルク、ゼラチン又はコラーゲンなどのタンパク質性ブロッキング剤中で1時間以上置き、ブロッキングする。低分子リガンドによってはブロッキングしない方が好ましい場合もある。
【００６２】
アフィニティーセレクションにおいての結合反応は、目的に応じて-10℃〜80℃で行うことができる。また、この結合反応の反応時間は、目的とする結合特性やKon値に応じて1分〜24時間の間で行えばよい。通常、ファージディスプレイライブラリーは、大腸菌等の宿主に感染させ、この宿主が溶菌した溶菌液を用いて操作する。この溶菌液中にリガンドとの結合反応を阻害するような物質が含まれている場合は、適当な孔サイズのゲル濾過膜又は透析により当該阻害物質を除去し、バッファーを置換することにより使用することができる。あるいは、この溶菌液中のファージをポリエチレングリコール等で沈殿させ、上清を交換したものを用いてもよい。
【００６３】
アフィニティーセレクションにおいて洗浄は、リガンドを担持する固定化担体の体積の10倍〜50倍程度の洗浄バッファーで1分以上混合し、バッファーを交換する。この交換の回数は、例えば1回〜20回とすることができる。洗浄バッファーの除去は、リガンドを担持する固定化担体の遠心沈殿または遠心フィルター後、吸引除去などで行う。あるいは、フィルターユニットとスピンカラムまたはバキュアム方式によって洗浄バッファーを除去してもよい。また2相分配法や磁気ビーズを利用した洗浄もできる。
【００６４】
一方、アフィニティーセレクションにおいて溶出は、一般的には、対象のリガンドと競合するリガンド溶液を用いて、温和な条件で競合的に溶出するのが好ましい。必要に応じて対象のリガンドとディスプレイライブラリー中のクローンとの相互作用を壊すような、強い条件、例えば低いｐＨ若しくは高いｐH、高温下若しくは低温下、又は尿素や界面活性剤等を含むバッファーで溶出することも可能である。また溶出剤が以後の操作で宿主に不都合な場合は溶出操作は行わず、ビーズに結合したまま、宿主細菌に添加することもできる。
【００６５】
この溶出液は、通常はクローン増幅に供する。また、選択性を向上させるために更に異なるリガンドを用いてアフィニティーセレクションを行ってもよい。
【００６６】
ファージディスプレイライブラリーより得られた溶出液中のファージクローンは、大腸菌などの宿主に感染させることで増幅することができる。なお、溶出液に対象のリガンドを含む場合又は対象のリガンドと競合する溶液を用いた場合は、増幅サイクルを阻害するので、ファージクローンを宿主に感染後、ファージ感染宿主を遠心分離することによりこれを除去することができる。あるいは、ファージ感染宿主を溶菌した後、溶菌液からバッファー置換により、リガンド又はリガンドと競合する溶液を除去することができる。ファージクローンの増幅は、溶菌液のファージ力価をモニターすることにより確認することができる。
【００６７】
一方、ファージを利用しないディスプレイライブラリーの場合には、PCR等により遺伝子増幅を行う。
【００６８】
ファージクローンの増幅又は遺伝子のPCR等による増幅後、ファージクローン又はPCR等の産物を鋳型としたプラークPCR等のPCRにより、スクリーニングされた環境DNAを増幅する。次いで、この増幅したものをアガロースゲル電気泳動に供することで、環境DNAを確認することができる。さらに、環境DNAの配列決定分析により、環境DNAの塩基配列を決定することができる。
【００６９】
本発明に係るスクリーニング方法において、ディスプレイライブラリーがファージディスプレイライブラリーを用いた場合には、環境DNAから発現されるタンパク質やペプチドは、ファージ表面上に融合タンパク質として提示される。得られた環境DNAは、完全なコーディング配列ではなく、通常、N末端配列又はC末端配列を一部欠いている場合がある。そこで、得られたファージクローンが有する環境DNAの配列情報から、完全なコーディング領域を得るために、RACE（Rapid Amplification of ｃDNA ends）と同様の手順で、上流もしくは下流のコーディング領域を補う必要がある。スクリーニング前のファージディスプレイライブラリーには、非翻訳領域があるために融合しなかったクローンも含まれている。そのため、上流もしくは下流のコーディング領域の配列情報を得るためには、クローンから得た配列情報に基づいて、外側に向かうプライマーとアダプター配列又はファージDNA配列を含むプライマーとを用いて、スクリーニング前のファージディスプレイライブラリーDNAを鋳型としてPCRを行う。
【００７０】
このようにして上流又は下流のコーディング領域が得られたら、例えば、切りつなぎやリコンビナントPCR法(Higuchi, R., 「Recombinant PCR」, PCR Protocols, p.177-183, M. A. Innisら編, Academic Press, Inc.,1990)によって連結し、完全なコーディング領域を得ることができる。
【００７１】
また、得られたファージクローンが有する環境DNAの配列情報を、塩基配列レベル又はアミノ酸配列レベルで遺伝子データベースと照合し、相同性分析を行うことで、当該環境DNAがコードするタンパク質の機能又は活性を予測することができる。
【００７２】
環境DNAから遺伝子又は遺伝子断片を単離し、同定した場合には、上述したように、当該遺伝子又は遺伝子断片を宿主に導入することで、形質転換体を得る。形質転換体において当該遺伝子又は遺伝子断片がコードするタンパク質又はペプチドを発現させることで、当該タンパク質又はペプチドが有する機能や活性を調べることができる。
【００７３】
エンリッチされた集団の中には、完全なコーディング領域ではなくとも触媒活性を発揮できる領域を保持したクローンが含まれていることがある。更に省力化できる手法として、エンリッチされた集団のインサートに対して、アダプター配列かベクター配列のような共通配列のプライマーを用いてまとめてPCR法などで増幅する。そして、これを適当な細胞内発現ベクターまたは分泌発現ベクターに連結し、形質転換体をまとめて得て、エンリッチされたミニ発現ライブラリーとすることもできる。これらを、従来法のように目視で選抜できるような試薬を含む寒天培地で活性クローンを選抜することができる。従来法と異なる点は、既に特定リガンドを認識して結合するクローン集団として例えば１０００倍程度、エンリッチされている点で、目的クローンの頻度向上が期待できる。
活性を検出方法としては、次のようにすることができる。例えば、糖やタンパク質や脂肪の加水分解活性を探す場合は、デンプン、カゼイン、油脂などの水不溶性基質を培地に混合して培養し、分解されたクリアーゾーンまたはハローを探す。その他、従来の酵素スクリーニングに用いられる、pH指示薬や種々の酵素活性測定用の呈色反応、蛍光反応、発光反応試薬、抗体などが利用できる。
【００７４】
以上のように本発明に係るスクリーニング方法によれば、環境DNAから作製したディスプレイライブラリーから目的のタンパク質をコードする遺伝子を効率的にスクリーニングすることができる。本発明に係るスクリーニング方法においてファージディスプレイライブラリーを採用した場合には、リガンドと結合したファージクローン群を濃縮し、増幅することができる。従って、目的のタンパク質をコードする遺伝子を選抜する際の労力と時間が大幅に節約することができる。
【００７５】
培地成分および大腸菌溶菌液等にはビオチンが含まれており、ビオチン結合タンパク質のスクリーニングに対し妨害する。このことから、ビオチン結合タンパク質のスクリーニングを実施する前にビオチンを除去する。
本発明のスクリーニング方法を利用して得られるビオチン含有タンパク質は、ビオチン依存酵素のようなカルボキシル基を修飾（例：カルボキシル化、脱カルボキシル化またはカルボキシル基の転移等）する活性等を有すると考えられる。今回、このスクリーニング方法の有用性を示すために行った実施例において得られたタンパク質は、カルボキシル基の修飾等に利用できることが期待できる。特にアセチルＣｏＡカルボキシラーゼと相同性の高いタンパク質は、脂肪酸の合成や修飾等に利用できる可能性がある。
【００７６】
＜実施例＞
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００７７】
＜試験例１＞環境DNAの精製
1−1．土壌からのDNA抽出
つくば市大久保の森林において、落葉下表層土から下に10cmの位置にある黒色腐葉土を、2001年11月に採取した。この土壌サンプル16gとUltraCleanTM；Soil DNA kit Mega Prep (MoBio Lab., Inc.), Catalog#12900-10, Lot #SD1I13とを用いて、マニュアルに従って、DNAを抽出し、約1.4mgのDNAが得られた。得られたDNA溶液はやや褐色に着色していた。
【００７８】
土壌から得られたDNA(以下、「土壌DNA」という)を、吸光度測定に供した。測定の結果、得られた吸光度波形を図１A及びBに示す。図１Aは、陽性対照である純粋DNA標品(λファージ)の吸光度波形である。一方、図１Bは、土壌DNAの吸光度波形である。
また、λ260nm/230nm比は、純粋DNA標品(λファージ)が1.49、土壌DNAが0.95であった。
【００７９】
1−2．ゲル濾過クロマトグラフィーによる土壌DNAの予備検討
次に、上記1−1で得られた土壌DNA溶液をゲル濾過クロマトグラフィーに供した。
ゲル濾過クロマトグラフィーは、以下の条件で行った。
○ゲル濾過クロマトグラフィーの条件
サンプル  ：土壌ＤＮＡ（９５μｇ）溶液２７０μｌ
ゲル      ：Sepharose CL4B（Amersham-Pharmacia）３ｍｌ
バッファー：ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭＥＤＴＡ）
画分容量  ：約３５０μｌ
【００８０】
ゲル濾過クロマトグラフィーは、フロースルー画分であるFr.＃4から土壌DNAの溶出が始まり、およそFr.＃10まで続いた。土壌DNA溶液に含まれる褐色物質は、主に低分子側に分布した。
【００８１】
画分のUV吸収波形を図２に示す。また、Fr.＃4のλ260nm/230nm及びλ260nm/280nm比はそれぞれ、1.83及び1.57であった。さらに、Fr.＃8のλ260nm/230nm及びλ260nm/280nm比はそれぞれ、2.0及び1.1であった。
【００８２】
以上の結果から、当該分画範囲のゲル濾過は、λ260nm/230nm比が高いことから、大部分のフミン酸を分離するのに有効であった。しかし、当該分画範囲のゲル濾過は精製度の向上に有効ではあるものの、λ260nm/280nm比が低いことから、タンパク質が混在しており、不十分であることが判った。
【００８３】
1−3．土壌DNAの部分分解の条件検討
上記1−1で得られた土壌DNAを用いて、DNaseIによる部分分解で2Kbpが最も多く生じる条件を調べた。DNアーゼI以外の反応条件は、以下に示す通りであった。反応は、5mMEDTAを添加することで停止させた。
○反応条件１
バッファー組成：３０ｍＭ ＮａＯＡｃ，ｐＨ５．２，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2
反応温度と時間：２５℃で１５分
【００８４】
反応生成物をアガロースゲル電気泳動に供した。結果を図３に示す。図３において、各レーンは、以下に示すDNaseI濃度(U/ml)で処理したサンプルである；レーン1：245 U/ml、レーン2：122 U/ml、レーン3：61 U/ml、レーン4：30.6 U/ml、レーン5：15.3 U/ml及びレーン6：0 U/ml。また、レーンM及び7は、分子量マーカー(1Kb ladder marker)である。
【００８５】
図３から判るように、約15 U/ml(すなわち、レーン5の15.3 U/ml)の濃度のDNアーゼIで土壌DNAを処理した場合に、2KbpのDNA断片が最も多く生じることが判った。
【００８６】
1−4．土壌DNAのFPLCによる精製
上記1−1で得られた土壌DNAを、上記の反応条件１で、DNアーゼI(15U/ml)で処理し、部分分解することで、2KbpのDNA断片を得た。次いで、土壌由来夾雑物と低分子DNAを除く目的で、2KbpのDNA断片を含むサンプルを、ゲル濾過用カラムSuperose 6 (Amersham-Pharmacia)を用いたFPLCに供した。なお、FPLCは、下記の条件で行った。
○ＦＰＬＣ分析条件
サンプル    ：ＤＮアーゼＩで部分分解した土壌ＤＮＡ（１００μｇ）を含む溶液
１００μｌ
ゲル        ：Superose６（排除限界  ４×１０7Ｄａ）１０ｍｍ×３００ｍｍ
バッファー  ：ＴＥＳ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，
１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．２Ｍ  ＮａＣｌ）
流量        ：０．３ｍｌ／分
分画容量    ：約１ｍｌ
分析        ：Photometric scaning, AGE(Agarose Gel Electrophoresis)
【００８７】
FPLCのチャート(各画分の280nm吸光度)を図４Aに示す。また、及びFr.＃6〜＃11のアガロースゲル電気泳動パターンを図４Bに示す。
【００８８】
図４Aから判るように、DNAはFr.#7以降に溶出した。なお、図４Bに示すアガロースゲル電気泳動パターンから、Fr.#16以降の吸収はDNA由来ではないことを確認した。
【００８９】
図４Bに示すアガロース電気泳動の結果に基づいて、0.5Kbp以下のDNA断片を避けるために、小断片の少ないFr.#7〜＃9を回収し、プールした。精製度指標の吸光度比は、λ260/
280=約1.7及びλ260/230=約0.55であった。
【００９０】
1−5．イオン交換クロマトグラフィーによる精製
上記1−4で得られたFr.＃7〜＃9のDNAプールの純度をさらに上げるために、上記DNAプール4.5mlを、QIAGEN Plasmid Midi kit(100)を添付マニュアルに従って使用し、精製した。得られたDNAの吸光度スペクトルパターンを図５に示す。図５において、Eluent 1がDNAプールの精製DNA、λ(conc.)及びλ(dil.)が、純粋なDNA標品のファージλDNAを示す。
図５から判るように、吸光度スペクトルパターンに関して、最終精製DNAは、純粋なDNA標品のファージλDNAと比較して全く遜色なかった。最終精製DNAの吸光度比は、λ260nm/280nm=1.91及びλ260nm/230nm=2.12であり、従来の精製土壌DNAと比べて、高純度な土壌DNAが得られた。図６は、DNAプールの精製DNA(レーン4)の電気泳動パターンを示す。図６から判るように、分解は起きておらず、2Kbp付近がメジャーとなっている。
【００９１】
＜試験例２＞メタゲノムディスプレイライブラリーの作製
2−1．アダプターの調製
Hindアダプターを、以下の合成オリゴヌクレオチドHdAd5とpHdAd3とをアニーリングさせることで作製した。
HdAd5：5'-HO-AGCTTAGTGAGTGAGTCCT  3'(配列番号１）
pHdAd3：5'-pAGGACTCACTCACTA  3'(配列番号２)
（pはリン酸化を表す）
【００９２】
また、Ecoアダプターを、以下の合成オリゴヌクレオチドpEcoRIL3とEcoRIAd5とをアニーリングさせることで作製した。
pEcoRIL3：5'-pGTCGACGCGGCCGCG  3'(配列番号３)
(pはリン酸化を表す)
EcoRIAd5：5'-HO-AATTCGCGGCCGCGTCGAC  3'(配列番号４)
【００９３】
Hindアダプターの作製において、HdAd5(15μl)及びPHdAd3(15μl)(各々終濃度37.5μM)並びに20×SSC(10μl)を混合した。一方、Ecoアダプターの作製において、pEcoRIL3(15μl)及びEcoRIAd5(15μl)(各々終濃度37.5μM)並びに20×SSC（10μl）を混合した。次にこれらの溶液を、Thermal cyclerを用いて96℃にて3分間インキュベートし、1時間かけて60℃まで温度を下げた。次いで、溶液を、60℃にて30分間インキュベートした後、1時間かけて40℃まで温度を下げた。さらに、溶液を、40℃にて30分インキュベートした後、直ちに25℃まで温度を下げ、10分間インキュベートすることで、Hind及びEcoアダプターを得た。アダプターのアニール化は、5％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析することで確認した。
【００９４】
2−2．土壌DNAの末端平滑化
実施例１においてイオン交換クロマトグラフィーにより精製した土壌DNAを、TAKARA Blunting Kitを用いて末端平滑化を行った。次いで、0.5 mlチューブに、土壌DNA2.5μg、10×バッファー1.0μl及び蒸留水4.0μlを加えた。この溶液を、75℃にて5分間インキュベートした後、T4 DNAポリメラーゼ1.0μlを加え、ピペットを用いて穏やかに攪拌した。さらに、溶液を37℃にて5分間インキュベートした後、ボルテックスミキサーにて激しく攪拌して酵素を失活させた。溶液にTEバッファー40μlを添加した後、全溶液を1.5mlチューブに移し替えた。
【００９５】
当該溶液に等量のフェノールを加えて2回抽出を行った後、等量のクロロホルムを加えて抽出を行い、DNA水溶液約90μlを得た。このDNA水溶液にグリコーゲン2.0μl及び3M NaOAc 9.0μlを加えて、よく攪拌した。さらに2.5倍容量の冷エタノールを添加してDNA溶液に加えて、DNAを沈殿させ、15,000rpmにて10分間遠心を行った。次いで、上清を除き、沈殿物を75％エタノールにて洗浄した。エタノールを完全に除いた後、沈殿物をTEバッファー10μlに溶解し、末端平滑化DNA溶液を得た。
【００９６】
2−3．末端平滑化土壌DNAへのアダプター連結
末端平滑化土壌DNAとアダプターとの連結を、TAKARA DNA ligation kit Ver.2を用いて行った。末端平滑化土壌DNAとアダプターとの連結のスキームを図７に示す。まず、末端平滑化土壌DNA4.4μl、蒸留水11.6μl、並びに末端平滑化土壌DNAの約100倍モル数のEco及びHindアダプター（各2.0μl）を混合した。混合液に等量（20μl）のSolutionII溶液および2倍量（40μl）のSolution I 溶液を添加し、16℃にて30分間インキュベーションを行うことで、末端平滑化土壌DNAにアダプターを連結させた。このDNA溶液をフェノール及びクロロホルム抽出に供した後、さらにエタノール沈殿に供した。次いで、沈殿物をTEバッファーに溶解した。
【００９７】
2−4．アガロースゲル電気泳動による連結産物の精製
未反応のアダプターを除くために、上記2−3で得られたアダプター連結産物をアガロースゲル電気泳動に供し、同一ゲル内に流した分子量マーカーを指標に、0.5〜1.3Kbp及び1.3〜2.0Kbpの断片を切り出した（図８）。図８において、レーンMは分子量マーカーを示し、レーンIS11Cは0.5〜1.3Kbpの断片を含むアダプター連結産物IS11Cを示す。また、レーンIS11Bは1.3〜2.0Kbpの断片を含むアダプター連結産物IS11Bを示す。
【００９８】
ゲルから切り出したアダプター連結産物を、QIAGEN社のMini Elute Gel Extraction Kitをマニュアルに従って用いて抽出した。調製したアダプター連結産物に含まれる土壌DNA由来のインサートDNAを形質転換効率に従って評価するために、アダプター連結産物をベクターpUC9 Eco/Hindに挿入し、次いで大腸菌(COMPETENT High DH5α(TOYOBO))に形質転換した。この際、陽性対照DNAとして精製プラスミド由来のcry 1.5Kb Eco/Hind DNA断片と比較して、アダプター連結産物の100fmol当たりの形質転換効率が30％程度であることが確認された。
【００９９】
2−5．土壌DNA由来インサートDNAとベクターDNAとのエタノール共沈殿
好ましいインサート/ベクター比となるようにアダプター連結産物(以下、「インサートDNA」という)とベクターDNA(T7 SELECT 10-3b)を以下の条件に示すように混合した。
○混合条件
ライブラリー＃１７（インサート／ベクター＝４）；
ベクターＤＮＡ溶液            ：５０μｌ（０．５μｇ：２１．５ｆｍｏｌ）
インサートＤＮＡ（アダブター連結産物）ＩＳ１１Ｃ：２μｇ（８６ｆｍｏｌ）
【０１００】
次いで、混合液にグリコーゲン2μlと1／10容量の3M NaOAcを添加した。さらに、2.5倍量の冷エタノールを添加して、氷冷下で放置し、DNAを沈殿させた。沈殿物を15,000rpm、10分間遠心することで回収し、75％エタノールにて洗浄した後、残存するエタノールを減圧下で除去した。
【０１０１】
なお、インサートDNA(アダプター連結産物)IS11Bのライブラリー＃16に関しても、同様にインサートDNA(アダプター連結産物)IS11BとベクターDNAとを共沈殿させた。
【０１０２】
2−6．土壌DNA由来インサートDNAとベクターDNAとの連結
上記インサートDNAとベクターDNAとの共沈殿物に、滅菌蒸留水(S.D.W.)；3.0μl、10xバッファー；0.5μl、10mM ATP；0.5μl及びT4 DNAリガーゼ；1.0μlを加えて全量を5.0μlとした。この反応液を、16℃で17時間、エアーインキュベーター内にてインキュベートすることにより、インサートDNAとベクターDNAとの連結反応を行った。反応後、溶液を次のパッケージング操作に備えて、減圧下で2.5μlまで濃縮した。
【０１０３】
2−7．T7ファージへのパッケージング
Packaging extract (Novagen T7 Select 10-3 cloning kit)12.5μlに、上記2−6で得られたインサートDNA IS11Cを含む組換えベクター2.5μlを加え、泡立たないように気をつけながら合わせた。この溶液を22℃で2時間インキュベートした。2時間後、反応を停止させるために、溶液にLB培地135μlを加え、総量150μlのインサートDNA IS11CをパッケージングしたT7ファージパッケージーング溶液（以下、「ライブラリー＃17」という）を得た。
【０１０４】
一方、インサートDNA IS11Bに関しては、ライブラリー＃17の2倍スケールで行い、インサートDNA IS11BをパッケージングしたT7ファージパッケージーング溶液（以下、「ライブラリー＃16」という）を得た。
【０１０５】
Novagenのマニュアルに従いプラークアッセイにより力価を確認したところ、ライブラリー#16の力価が9.1 x 107pfu/mlであり、また、ライブラリー#17の力価が2.37 x 108pfu/mlであった。
【０１０６】
2−8．インサーション頻度
ライブラリー＃16と＃17のインサーション頻度を調べるために、プラークPCRを行った。まずライブラリー＃16及び＃17のファージ液をプレートに播き、各プレート上に形成されたプラークを妻楊枝にて突き、PCR用Reaction Mixture（プライマー;0.1pmol, Ex Taq enzyme; 0.03Uを含む）15〜20μlに懸濁した。その際プライマーはNovagen社のT7 upおよびT7 downを用いた。PCR反応は、サーマルサイクラーを用いて、1)1サイクル；96℃/3分、2)33サイクル；94℃/30秒、50℃/30秒、72℃/2分、及び3)1サイクル；72℃/10分で行った。反応終了後、PCRサンプル5μlにBPB dye 1μlを添加し、0.8%アガロースゲルにて100Vで35分間電気泳動し、インサートDNAを含むファージの割合を算出した。ライブラリー＃17のアガロースゲル電気泳動の結果を図９に示す。図９において、各レーンの番号はPCRサンプル番号を示し、またレーンMは分子量マーカーを示す。ライブラリー#16において、インサーション頻度は約15％であった。一方、ライブラリー#17において、インサーション頻度は約50％であった。
【０１０７】
2−9．ライブラリーの増幅
ライブラリー#16(300μｌ)及びライブラリー#17(150μl)を、各々5ml及び10mlの宿主大腸菌BLT5615に感染させた後、溶菌化させ、溶菌液ライブラリー#16P1及びライブラリー#17P1を調製した。溶菌液ライブラリー#16P1及びライブラリー#17P1の力価は、双方とも約5 x 1010pfu/mlであった。一方、増幅処理によりインサーション頻度はやや低下した。ライブラリー#16P1において、インサーション頻度は約10％であった。また、ライブラリー#17P1において、インサーション頻度は約33％であった。
【０１０８】
2−10．インサートDNA塩基配列の解析
ライブラリー＃17P1の中で、プラークPCRによりインサートDNAを含むことが確認された20クローンのPCR産物の塩基配列を平均460塩基ほど調べた。そのDNA配列をGenbankなどの既知塩基配列データベースに対してBLASTnによる相同性検索に供した。その結果を表２に示す。
【０１０９】
【表２】
2007089490.tif 000003
【０１１０】
表２に示すように、相同性分析の結果、全てのインサートDNAの塩基配列は相同性の高い意味のあるヒットはなく、新規なDNAであった。この結果は、土壌中微生物の約99％が未同定であることを裏付けており、それらの遺伝資源をディスプレイライブラリー化できることが確認された。
【０１１１】
次にT7 SELECT10-3bのディスプレイタンパク質の融合の相手であるGene10Bと順方向の50アミノ酸以上のオープンリーディングフレーム(ORF)の有無を調べた。表２に示すように、2クローン(クローンNo．5及び17)は、in-frameでORFが融合していた。また、PCR産物の1本鎖のみを配列決定しているため、配列精度は完全ではなかった。そこで、1塩基のフレームシフトORFも数えると、7クローン(クローンNo. 2、5、7、9、10、12及び17)において、ORF融合の可能性があった。
【０１１２】
次いで、インサートDNAを含むクローンについて、translated BLASTxによる相同性検索を行った。translated BLASTxは、クエリー塩基配列を6通りのフレームで翻訳して発生するアミノ酸配列と対象となるデータベースに登録されている各塩基配列を同様に6通りのフレームで翻訳したアミノ酸配列とを照合して、アミノ酸配列レベルで相同性検索を行うプログラムである。その結果、表２に示すように、クローンの約半数において、インサートDNAがコードするアミノ酸配列と機能タンパク質のアミノ酸配列との相同性が見出された。一方、インサートDNAにおいてORFが見出された場合でも、相同性が見つからず機能不明のタンパク質をコードするインサートDNAが多く存在した。
【実施例１】
【０１１３】
１）ライブラりー溶液の調製
前培養したＢＬＴ５６１５を新鮮なＬＢ液体培地１０ｍｌに２％添加し、６００ｎｍの吸光度で０．５になるまで３７℃で浸とう培養した（誘導ＢＬＴ５６１５）。０．５Ｍ  ＩＰＴＧを２０μｌ添加し更に３０分培養を継続した。メタゲノムライブラリーＬ１７Ｐ２を５０μｌ添加し２時間培養した。培養液は溶菌して清澄化した。培養液を１００００ｘｇで１０分遠心して上清液を回収した。この上清を遠心限外ろ過ユニットアミコン製ＹＭ−１００にかけ、３回の洗浄でＰＢＳ−Ｔ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０含有）に置換し、９倍濃宿液として以下の実験に用いた（ＰＢＳＴ置換Ｌ１７Ｐ２）。ファージ濃度はおよそ２ｘ１０11ｐｆｕ／ｍｌであった。
【０１１４】
２）パンニング
シリコナイズされたマイクロチューブにＰＢＳＴ置換Ｌ１７Ｐ２を５０μｌを入れ、４．５μｌの０．４Ｍ  ＮａＣｌを添加し、ついでＰＢＳ５Ｔ（０．５Ｍ  ＮａＣｌのＰＢＳＴ）で平衡化した５００μｇのストレプトアビジン磁性ビーズ（ＮＥＢ製）を添加した。懸濁状態を保ち、室温で２０分置いた。マグネットでビーズを回収し上清を除去した。０．４ｍｌのＰＢＳ５Ｔを添加しビーズを懸濁し５分後にマグネットを用いて上清を除去した。この５分間の洗浄を３回した後、洗浄時間を２０分間のものを１回、３０分間のものを１回行った。このようにして洗浄した磁性ビーズに１０μｌの１％ＳＤＳを添加し、３分後に上清を回収し、０．５ｍｌのＬＢ培地と混合し、１ｍｌの誘導ＢＬＴ５６１５に感染させた。１時間後に溶菌液を１００００ｘｇで１０分遠心して上清液を回収し、ＹＭ−１００でＰＢＳ５Ｔに置換した。ここまでを１ラウンドとし、この工程を３ラウンド行った。３ラウンド目の回収ファージは１〜４ｘ１０6  ｐｆｕであった。
【０１１５】
３）２次スクリーニング
３ラウンド目の溶出液を、プレーティングして、適当数のプラークを形成させた。これに、ニトロセルロースメンブレン（Ａｍｅｒｃｈａｍ  Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ  Ｅｘｔｒａ  径８２ｍｍ）を接触させてブロットし、ビオチンフリー３％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０含有、ＰＩＥＲＣＥ製）で１時間以上ブロッキングした。次にアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（ＫＰＬ  Ｃａｔ．＃４７５−３０００、以後ＡＰ−ＳＡと略）を千分の１容添加し、３０分間混合した。溶液を捨て、メンブレンを１５ｍｌのＴＢＳＴで５分間洗浄した。ＴＢＳＴを交換し、更に各５分間２回洗浄した。ＴＢＳＴを捨て、８ｍｌのアルカリフォスファターゼ基質溶液を添加し、室温で１時間振とうして発色反応を行った。およそ１００〜２００プラークに１つの割合で発色プラークが見られた（図１０Ｂ、このものでは、３個認められている）。なお、パンニング開始前のライブラリーファージでは、発色プラークは見られなかった（図１０Ａ）ことから、パンニングよりＡＰ−ＳＡ結合ファージがエンリッチされたと考えられる。そして、発色プラークはＡＰ−ＳＡが結合したことから、ビオチンを多く含むものを有していることを意味している。
【０１１６】
４）ポジティブクローンの単離とインサートＤＮＡの増幅
染色されたプラークを爪楊枝で突き、３０μｌのLB培地に懸濁した。この溶液を２５μl反応液当たり１μｌ用い、プライマーに
TSSP          5'-TCgCCgTgCTAACTTCCAAg    (配列番号５)
T7Down 5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA
を用い、KOD DNAポリメラーゼ（TOYOBO）を用いてマニュアルに従い  以下プログラムでPCRを行った。
９６℃  ３分      １サイクル  （９６℃  １５秒→５０℃  １５秒→７２℃  ２０秒）  ３０サイクル、２２℃  １分  １サイクル
増幅ＤＮＡは２％アガロースゲル電気泳動で増幅ＤＮＡを確認した。その結果、これらのクローンのインサートは、およそ０．７〜１Ｋｂｐであった（図１１）。
【０１１７】
５）塩基配列解析
これらのDNA（表３、クローン名：１ＳＡＳＤ３１、１ＳＡＳＤ３２および１ＳＡＳＤ３4）を上流から、T7UPプライマーを用いて塩基配列解析と相同性解析（the UniProt Knowledgebase (Swiss-Prot + TrEMBL)を使用）を行った（図１２A、配列番号６および７、図１２Ｂ、配列番号８および９、図１２Ｃ、配列番号１０および１１）。その結果、いずれのクローンもビオチン依存酵素として知られているタンパク質のビオチン結合部位と相同性が見られた。
【０１１８】
【表３】
2007089490.tif 000004
【実施例２】
【０１１９】
実施例１と同様に操作し、クローン（表３、１ＳＡＳＤ１３）を得て、塩基配列解析を行った（図１３、配列番号１２および１３）。この結果、このクローンもビオチン依存酵素として知られているタンパク質のビオチン結合部位と相同性が見られた。
【０１２０】
以上の結果から、メタゲノムディスプレイライブラリーからストレプトアビジンビーズによって、ビオチン依存酵素のビオチン結合部位を含むクローンが効率よくエンリッチされたことを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１２１】
メタゲノムディスプレイライブラリーからストレプトアビジンもしくはアビジンを用いて容易にビオチン含有タンパク質を得ることができることから、産業に有用なタンパク質を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１Ａ】図１Ａは、UltraCleanで回収した陽性対照である純粋DNA標品(λファージ)の吸光度波形を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、UltraCleanで回収した土壌DNAの吸光度波形を示す。
【図２】図２は、ゲル濾過クロマトグラフィー後の土壌DNAを含む画分の吸光度波形を示す。
【図３】図３は、DNaseIによる部分分解に供した土壌DNAのアガロースゲル電気泳動パターンを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、FPLCの際の各画分の280nm吸光度を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、FPLC後の各画分のアガロースゲル電気泳動パターンを示す。
【図５】図５は、精製ファージλDNAと比較した精製土壌DNAの吸光度スペクトルパターンを示す。
【図６】図６は、精製土壌DNAのアガロースゲル電気泳動パターンを示す。
【図７】図７は、末端平滑化土壌DNAとアダプターとの連結のスキームを示す。
【図８】図８は、アダプター連結後にゲルから精製したDNA断片のアガロースゲル電気泳動パターンを示す。
【図９】図９は、ライブラリー#17のアガロースゲル電気泳動パターンを示す。
【図１０Ａ】パンニング前のライブラリーファージでのプラーク例（発色プラークが認められない）
【図１０Ｂ】パンニング後のライブラリーファージでの発色プラーク例
【図１１】選出したプラークから得たクローンの電気泳動パターン
【図１２Ａ】クローン１ＳＡＳＤ３１のインサートにコードされるアミノ酸配列とUniproデータベースのトップヒット相同性配列とのアラインメントを示す。
【図１２Ｂ】クローン１ＳＡＳＤ３２のインサートにコードされるアミノ酸配列とUniprotデータベースのトップヒット相同性配列とのアラインメントを示す。
【図１２Ｃ】クローン１ＳＡＳＤ３４のインサートにコードされるアミノ酸配列とUniproデータベースのトップヒット相同性配列とのアラインメントを示す。
【図１３】クローン１ＳＡＳＤ１３のインサートにコードされるアミノ酸配列とUniproデータベースのトップヒット相同性配列とのアラインメントを示す。
【符号の説明】
【０１２３】
図１１の１はクローン１ＳＡＳＤ３１のインサートDNAの電気泳動パターンを示す。
図１１の２はクローン２ＳＡＳＤ３２のインサートDNAの電気泳動パターンを示す。
図１１の３はクローン３ＳＡＳＤ３４のインサートDNAの電気泳動パターンを示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１２４】
配列番号１〜４は、合成オリゴヌクレオチドである。
配列番号５は、プライマーである。
配列番号６は、クローン１ＳＡＳＤ３１のインサートDNAの塩基配列である。
配列番号７は、１ＳＡＳＤ３１のインサートDNAにコードされるアミノ酸配列である。
配列番号８は、１ＳＡＳＤ３２のインサートDNAの塩基配列である。
配列番号９は、１ＳＡＳＤ３２のインサートDNAにコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１０は、１ＳＡＳＤ３４のインサートDNAの塩基配列である。
配列番号１１は、１ＳＡＳＤ３４のインサートDNAにコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１２は、１ＳＡＳＤ１３のインサートDNAの塩基配列である。
配列番号１３は、１ＳＡＳＤ１３のインサートDNAにコードされるアミノ酸配列である。
【図１Ａ】
2007089490.tif 000005
【図１Ｂ】
2007089490.tif 000006
【図２】
2007089490.tif 000007
【図４Ａ】
2007089490.tif 000008
【図５】
2007089490.tif 000009
【図７】
2007089490.tif 000010
【図１２Ａ】
2007089490.tif 000011
【図１２Ｂ】
2007089490.tif 000012
【図１２Ｃ】
2007089490.tif 000013
【図１３】
2007089490.tif 000014
【図３】
2007089490.tif 000015
【図４Ｂ】
2007089490.tif 000016
【図６】
2007089490.tif 000017
【図８】
2007089490.tif 000018
【図９】
2007089490.tif 000019
【図１０Ａ】
2007089490.tif 000020
【図１０Ｂ】
2007089490.tif 000021
【図１１】
2007089490.tif 000022
【配列表】
2007089490000001.app