(57)【要約】      （修正有） 【課題】抗ウイルス剤等、特にアンチセンス医薬の原料として使用される２’−デオキシアデノシンおよび２’−デオキシグアノシンの効率的・工業的製法の提供。【解決手段】クレブシエラ属細菌を用いて、無機リン酸もしくはその塩の存在下で、アデニン、アデノシンもしくは５’−アデニル酸から２’−デオキシアデノシンを生成する方法。ならびに、同様の条件で、グアニン、グアノシンもしくは５’−グアニル酸から２’−デオキシグアノシンを生成する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
無機リン酸もしくはその塩の存在下でチミジンと、アデニン、アデノシンもしくは５’-アデニル酸から２‘−デオキシアデノシンを生成する能力を有するクレブシエラ属に属する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体もしくは該微生物菌体の処理物を無機リン酸もしくはその塩の存在下でチミジンとアデニン、アデノシン、もしくは５’−アデニル酸に作用させて２’−デオキシアデノシンを生成させ、これを採取することを特徴とする２‘−デオキシアデノシンの製造法。
【請求項２】
無機リン酸もしくはその塩の存在下でチミジンと、グアニン、グアノシンもしくは５’-グアニル酸から２‘−デオキシグアノシンを生成する能力を有するクレブシエラ属に属する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体もしくは該微生物菌体の処理物を無機リン酸もしくはその塩の存在下でチミジンと、グアニン、グアノシン、もしくは５’−グアニル酸に作用させて２’−デオキシグアノシンを生成させ、これを採取することを特徴とする２‘−デオキシグアノシンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
２’−デオキシアデノシンおよび２’−デオキシグアノシンは医薬原料、特に最近話題になっているアンチセンス医薬の原料として大量合成が望まれている。
【背景技術】
【０００２】
２’−デオキシアデノシンおよび２’−デオキシグアノシンの製造法としては化学合成法の収率が非常に低いため、工業的製造法はＤＮＡ（デオキシリボ核酸）の加水分解物よりの抽出が中心となっている。
しかしながら、本方法では使用する微生物にわずかながら基質のヌクレオチドを分解する活性が存在し、基質が一部分解されるため、反応液中に副生物が生成し、さらに基質の分解により収率が低下する。また、菌体当りの活性が低いため、高濃度の基質を添加して反応を行えない等の欠点があった。しかし、従来の抽出法においては、ＤＮＡの加水分解物中に目的の２’−デオキシアデノシンおよび２’−デオキシグアノシン以外に２’−デオキシシチジン、チミジンが含まれており、抽出工程が煩雑、コスト高の方法であるため、更に効率の良い方法の開発が望まれていた。
【０００３】
微生物のヌクレオシドホスホリラーゼを利用する２’−デオキシヌクレオシドの生化学的生産方法としては、２’−デオキシプリンヌクレオシドとしては２’−デオキシリボフラノシルプリン、２’−デオキシリボフラノシルチオグアニンの製造法（特開昭５８−６３３９３）、２’−デオキシピリミジンヌクレオシドとしては２’−デオキシシチジン（特開平０１−０６０３９６）およびチミジン（特開平０１−１０４１９０）の製造法が知られているが、２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシグアノシンの製造法は全く知られていなかった。
【特許文献１】特開昭５８−６３３９３
【非特許文献１】Eur. J. Biochem., Vol.51, (1975) p.253-265
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、２’−デオキシアデノシンおよび２’−デオキシグアノシンの工業的に安価で効率の良い製造法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで本発明者は、効率の良い２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシグアノシンの製造法を確立すべく鋭意検討を重ねた結果、
（１）デオキシリボース−１−リン酸もしくはその塩と、アデニン、アデノシンもしくは５’−アデニル酸から微生物の作用により２’−デオキシアデノシンが生成すること、
（２）無機リン酸もしくはその塩の存在下で２’−デオキウリジンもしくはチミジンと、アデニン、アデノシンもしくは５’−アデニル酸から微生物の作用により２’−デオキシアデノシンが生成すること、
（３）２’−デオキシリボース−１−リン酸もしくはその塩と、グアニン、グアノシンもしくは５’−グアニル酸から微生物の作用により２’−デオキシグアノシンが生成すること、
（４）無機リン酸もしくはその塩の存在下で２’−デオキウリジンもしくはチミジンと、グアニン、グアノシンもしくは５’−グアニル酸から微生物の作用により２’−デオキシグアノシンが生成すること
を見いだし、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
２’−デオキシリボース−１−リン酸、２’−デオキシウリジンまたはチミジンと反応させる塩基および塩基誘導体は、上記アデニン、アデノシン、５’−アデニル酸、グアニン、グアノシン、５’−グアニル酸にかかわらず、酵素反応が進行するものであれば対応する２’−デオキシヌクレオシドを生成することができる。
【０００７】
即ち本発明は、
（１）２’−デオキシリボース−１−リン酸もしくはその塩と、アデニン、アデノシンもしくは５’−アデニル酸から２’−デオキシアデノシンを生成する能力を有し、アクロモバクター属、アグロバクテリウム属、アシネトバクター属、アルカリゲネス属、アースロバクター属、エアロモナス属、エシェリヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、キサントモナス属、クレブシエラ属、クルチア属、クルイヘラ属、コリネバクテリウム属、ザルチナ属、サルモネラ属、シトロバクター属、シュードモナス属、ストレプトマイセス属、スポロザルチナ属、スタフィロコッカス属、セラチア属、セルロモナス属、ノカルディア属、バチルス属、ハフニア属、ビブリオ属、フラボバクテリウム属、プラノコッカス属、ブレビバクテリウム属、、プロタミノバクター属、プロテウス属、ヘモフィラス属、ミクロコッカス属、ミコプラナ属、ミクロバクテリウム属、リゾビウム属またはロドコッカス属に属する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体もしくは該微生物菌体の処理物を２’−デオキシリボース−１−リン酸もしくはその塩と、アデニン、アデノシンもしくは５’−アデニル酸に作用させて２’−デオキシアデノシンを生成させ、これを採取することを特徴とする２’−デオキシアデノシンの製造法、
（２）無機リン酸もしくはその塩の存在下で２’−デオキウリジンもしくはチミジンと、アデニン、アデノシンもしくは５’−アデニル酸から２’−デオキシアデノシンを生成する能力を有し、アクロモバクター属、アグロバクテリウム属、アシネトバクター属、アルカリゲネス属、アースロバクター属、エアロモナス属、エシェリヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、キサントモナス属、クレブシエラ属、クルチア属、クルイヘラ属、コリネバクテリウム属、ザルチナ属、サルモネラ属、シトロバクター属、シュードモナス属、ストレプトマイセス属、スポロザルチナ属、スタフィロコッカス属、セラチア属、セルロモナス属、ノカルディア属、バチルス属、ハフニア属、ビブリオ属、フラボバクテリウム属、プラノコッカス属、ブレビバクテリウム属、、プロタミノバクター属、プロテウス属、ヘモフィラス属、ミクロコッカス属、ミコプラナ属、ミクロバクテリウム属、リゾビウム属またはロドコッカス属に属する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体もしくは該微生物菌体の処理物を無機リン酸もしくはその塩の存在下で２’−デオキウリジンもしくはチミジンと、アデニン、アデノシンもしくは５’−アデニル酸に作用させて２’−デオキシアデノシンを生成させ、これを採取することを特徴とする２’−デオキシアデノシンの製造法。
（３）２’−デオキシリボース−１−リン酸もしくはその塩と、グアニン、グアノシンもしくは５’−グアニル酸から２’−デオキシグアノシンを生成する能力を有し、アクロモバクター属、アグロバクテリウム属、アシネトバクター属、アルカリゲネス属、アースロバクター属、エアロモナス属、エシェリヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、キサントモナス属、クレブシエラ属、クルチア属、クルイヘラ属、コリネバクテリウム属、ザルチナ属、サルモネラ属、シトロバクター属、シュードモナス属、ストレプトマイセス属、スポロザルチナ属、スタフィロコッカス属、セラチア属、セルロモナス属、ノカルディア属、バチルス属、ハフニア属、ビブリオ属、フラボバクテリウム属、プラノコッカス属、ブレビバクテリウム属、、プロタミノバクター属、プロテウス属、ヘモフィラス属、ミクロコッカス属、ミコプラナ属、ミクロバクテリウム属、リゾビウム属またはロドコッカス属に属する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体もしくは該微生物菌体の処理物を２’−デオキシリボース−１−リン酸もしくはその塩と、グアニン、グアノシンもしくは５’−グアニル酸に作用させて２’−デオキシグアノシンを生成させ、これを採取することを特徴とする２’−デオキシグアノシンの製造法、
（４）無機リン酸もしくはその塩の存在下で２’−デオキウリジンもしくはチミジンと、グアニン、グアノシンもしくは５’−グアニル酸から２’−デオキシグアノシンを生成する能力を有し、アクロモバクター属、アグロバクテリウム属、アシネトバクター属、アルカリゲネス属、アースロバクター属、エアロモナス属、エシェリヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、キサントモナス属、クレブシエラ属、クルチア属、クルイヘラ属、コリネバクテリウム属、ザルチナ属、サルモネラ属、シトロバクター属、シュードモナス属、ストレプトマイセス属、スポロザルチナ属、スタフィロコッカス属、セラチア属、セルロモナス属、ノカルディア属、バチルス属、ハフニア属、ビブリオ属、フラボバクテリウム属、プラノコッカス属、ブレビバクテリウム属、、プロタミノバクター属、プロテウス属、ヘモフィラス属、ミクロコッカス属、ミコプラナ属、ミクロバクテリウム属、リゾビウム属またはロドコッカス属に属する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体もしくは該微生物菌体の処理物を無機リン酸もしくはその塩の存在下で２’−デオキウリジンもしくはチミジンと、グアニン、グアノシンもしくは５’−グアニル酸に作用させて２’−デオキシグアノシンを生成させ、これを採取することを特徴とする２’−デオキシグアノシンの製造法
に関するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、２’−デオキシアデノシンおよび２’−デオキシグアノシンが工業的に安価で効率良く、製造可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明において使用される微生物は、アクロモバクタ−属、アグロバクテリウム属、アシネトバクター属、アルカリゲネス属、アースロバクター属、エアロモナス属、エシェリヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、キサントモナス属、クレブシエラ属、クルチア属、クルイヘラ属、コリネバクテリウム属、ザルチナ属、サルモネラ属、シトロバクター属、シュードモナス属、ストレプトマイセス属、スポロザルチナ属、スタフィロコッカス属、セラチア属、セルロモナス属、ノカルディア属、バクテリウム属、バチルス属、ハフニア属、ビブリオ属、フラボバクテリウム属、プラノコッカス属、ブレビバクテリウム属、、プロタミノバクター属、プロテウス属、ヘモフィラス属、ミクロコッカス属、ミコプラナ属、ミクロバクテリウム属、リゾビウム属またはロドコッカス属に属し、２’−デオキシリボース−１−リン酸もしくはその塩と、アデニン、アデノシンもしくは５’−アデニル酸から２’−デオキシアデノシンを生成する能力、無機リン酸もしくはその塩の存在下で２’−デオキウリジンもしくはチミジンと、アデニン、アデノシンもしくは５’−アデニル酸から２’−デオキシアデノシンを生成する能力、２’−デオキシリボース−１−リン酸もしくはその塩と、グアニン、グアノシンもしくは５’−グアニル酸から２’−デオキシグアノシンを生成する能力または無機リン酸もしくはその塩の存在下で２’−デオキウリジンもしくはチミジンと、グアニン、グアノシンもしくは５’−グアニル酸から２’−デオキシグアノシンを生成する能力を有するものであればいずれのもでも良いが、具体的には下記に示す微生物を例示することができる。
【００１０】
アクロモハ゛クター ヒ゛スコサス (Achromobacter viscosus)  ATCC 12448
アク゛ロハ゛クテリウム ツメファシエンス (Agrobacterium tumefaciens)  ATCC 4720   
アシネトハ゛クター ルオフィー (Acinetobacter johnsonii) ATCC 9036
アルカリケ゛ネス フェカリス (Alcaligenes faecalis  subsp. faecalis) ATCC 8750  
アースロハ゛クター オキシタ゛ンス (Arthrobacter oxydans) ATCC 14358
エアロモナス サルモニシタ゛ (Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida) ATCC 14174
エシェリヒア コリ (Escherichia coli)  ATCC 10798
エンテロハ゛クター クロアカエ (Enterobacter cloacae)  ATCC 7256
エルヒ゛ニア ヘルヒ゛コラ (Erwinia herbicola)  ATCC 1453
キサントモナス シトリ (Xanthomonas citri) AJ 2785(FERM P-3396)
クレフ゛シエラ ニューモニアエ (Klebsiella pneumoniae) IFO 3321
クルチア ソ゛フィー (Kurthia zopfii)  ATCC 6900  
クルイヘラ シトロフィラ (Kluyvera citrophila) AJ 2626(FERM P-8193)
コリネハ゛クテリウム アセトアシト゛フィラム (Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC 21407
サ゛ルチナ ルテア (Sartina lutea) AJ 1218（FERM P-7400） 
サルモネラ チフミリウム (Salmonella typhimurium) AJ 2636(FERM P-3753)
シトロハ゛クター フロインテ゛ィ (Citrobacter freundi) ATCC 8090
シュート゛モナス テ゛ィミニュータ (Pseudomonas diminuta) ATCC 11568
ストレフ゜トマイセス タナシエンス (Streptomyces tanashiens)  ATCC 15238
スホ゜ロサ゛ルチナ ウレアエ (Sporosarcina ureae)  IFO 12698
スタフィロコッカス エヒ゜テ゛ルミテ゛ィス (Staphyrococcus epidermidis) ATCC 155
セラチア マルセッセンス (Serratia marcescens)  ATCC 14226
セルロモナス フラヒ゛ケ゛ラ (Cellulomonas flavigera) ATCC 486
ノカルテ゛ィア アステロイテ゛ス (Nocardia asteroides)  ATCC 19247
ハ゛チルス ス゛フ゛チリス (Bacillus subtilis)  ATCC 6633
ハフニア アルヘ゛イ (Hafnia alvei) ATCC 9760
ヒ゛フ゛リオ メチュニコヒ゛ (Vibrio metschnikovii) ATCC 7708
フラホ゛ハ゛クテリウム フ゛レヘ゛ (Flavobacterium breve) ATCC 14234
フ゜ラノコッカス ユーシナタス (Planococcus eucinatus) AJ 1656(FERM P-9133)
フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム フ゜シルム (Brevibacterium pusillum) ATCC 19096
フ゜ロタミノハ゛クター アルホ゛フラフ゛ス (Protaminobacter alboflavus) ATCC 8458
フ゜ロテウス レッテケ゛リ (Proteus rettegeri) AJ 2770(FERM BP-941)
ヘモフィラス インフルエンサ゛エ (Haemophilus influenzae) ATCC 9134
ミクロコッカス ルテウス (Micrococcus luteus)  ATCC 4698 
ミコフ゜ラナ テ゛ィモルファ (Mycoplana dimorpha)  ATCC 4279
ミクロハ゛クテリウム ラクチクム (Microbacterium lacticum) ATCC 8180  
リソ゛ヒ゛ウム メィロッティ (Rhizobium melilotti) AJ 2823(FERM P-8197)
ロト゛コッカス ロト゛クラウス (Rhodococcus rhodochraus) ATCC 19149
【００１１】
上記菌株の内、キサントモナス シトリ (Xanthomonas citri) AJ 2785(FERM P-3396)は、
国際寄託当局：通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）に昭和５１年１月２７日に寄託された受託番号FERM P-3396の菌株であり、クルイヘラ シトロフィラ (Kluyvera citrophila) AJ 2626(FERM P-8193)は、同寄託当局に昭和６０年４月２３日に寄託された受託番号FERM P-8193の菌株であり、サ゛ルチナ ルテア (Sartina lutea) AJ 1218（FERM P-7400）は、同寄託当局に昭和５９年１月２０日に寄託された受託番号FERM P-7400の菌株であり、サルモネラ チフミリウム (Salmonella typhimurium) AJ 2636(FERM P-3753)は、同寄託当局に昭和５１年１０月６日に寄託された受託番号FERM P-3753の菌株であり、フ゜ラノコッカス ユーシナタス (Planococcus eucinatus) AJ 1656(FERM P-9133)は、同寄託当局に昭和６２年１月１９日に寄託された受託番号FERM P-9133の菌株であり、フ゜ロテウス レッテケ゛リ (Proteus rettegeri) AJ 2770(FERM BP-941)は、同寄託当局に昭和６０年４月２５日に寄託され、昭和６０年１１月２８日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された受託番号FERM BP-941の菌株であり、リソ゛ヒ゛ウム メィロッティ (Rhizobium melilotti) AJ 2823(FERM P-8197)は、同寄託当局に昭和６０年４月２５日に寄託された受託番号FERM P-8197の菌株である。
【００１２】
これらの微生物を用いて２’−デオキシアデノシンもしくは２’−デオキシグアノシンせしめる方法は、微生物の培養中に基質を添加する培養法を用いても良いし、また培養した菌体あるいはこの処理物を基質に作用させる静止菌体法を用いても良い。
培養法を用いる場合には、炭素源、窒素源、リン源、Ｓ源、無機イオン等、更に必要ならばビタミン、有機窒素源を含有する通常の培地を用いれば良い。
炭素源としては、グルコ−ス等の炭水化物、グリセロ−ル等のアルコ−ル類、酢酸等の有機酸、窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、硝酸およびその塩等、リン源としてはリン酸１カリウム等の無機リン酸およびその塩等、Ｓ源としては硫酸マグネシウム等、無機イオンとしては、マグネシウムイオン、カリウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、その他が必要に応じ適宜使用される。有機栄養源としては、ビタミン、アミノ酸等及びこれらを含有する酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コ−ンスティ−プリカ−、カゼイン分解物その他が適宜用いられる。培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下pH５〜８及び温度25〜40℃の範囲内でpH及び温度を適当に制限しつつ12〜72時間程度培養を行なえばよい。
【００１３】
具体的には、
（１）２’−デオキシリボース−１−リン酸から２’−デオキシアデノシンを生産する場合には、上記基本培地に２’−デオキシリボース−１−リン酸と、アデニンもしくははアデノシンもしくは５’−アデニル酸を適宜添加し、
（２）２’−デオキシリボース−１−リン酸から２’−デオキシグアノシン２’−デオキシグアノシンを生産する場合には、上記基本培地に２’−デオキシリボ−ス−１−リン酸と、グアニンもしくはグアノシンもしくは５’−グアニル酸を適宜添加し、
（３）２’−デオキウリジンもしくはチミジンから２’−デオキシアデノシンを生産する場合には、上記培地に２’−デオキウリジンもしくはチミジンと、アデニンもしくはアデノシンもしくは５’−アデニル酸を適宜添加し、
または
（４）２’−デオキウリジンもしくはチミジンから２’−デオキシグアノシンを生産する場合には、上記培地に２’−デオキウリジンもしくはチミジンと、グアニンもしくはグアノシンもしくは５’−グアニル酸を適宜添加して
培養を行えば良い。上記基質の添加は培養初期でも培養途中でも構わない。
【００１４】
静止菌体法を用いる場合の酵素源としては、上記基本培地で培養した、上記の方法で得られた培養液そのまま、あるいは洗浄菌体が使用できる他、菌体処理物も使用できる。菌体処理物としては、アセトン乾燥菌体、菌体摩砕物、菌体の超音波あるいはダイノミルあるいはフレンチプレス等処理物、界面活性剤またはトルエン等に接触せしめた菌体、リゾチ−ム、プロテアーゼ等の酵素処理した菌体、菌体より抽出した後、透析処理等で分離したタンパク画分、本反応の酵素活性を有する精製酵素、更に上記菌体または処理物の固定化物等何れもが使用できる。
【００１５】
具体的には、
（１）２’−デオキシリボース−１−リン酸から２’−デオキシアデノシンを生産する場合には、２’−デオキシリボース−１−リン酸と、アデニンもしくははアデノシン、５’−アデニル酸を含む水溶液に前記微生物菌体またはその処理物、
（２）２’−デオキシリボ−ス−１−リン酸から２’−デオキシグアノシン２’−デオキシグアノシンを生産する場合には、２’−デオキシリボース−１−リン酸と、グアニン、グアノシンもしくは５’−グアニル酸を含む水溶液に前記微生物菌体またはその処理物、
（３）２’−デオキウリジンもしくはチミジンから２’−デオキシアデノシンを生産する場合には、２’−デオキウリジンもしくはチミジンと、アデニン、アデノシンもしくは５’−アデニル酸を含む水溶液に前記微生物菌体またはその処理物、
または
（４）２’−デオキウリジンもしくはチミジンから２’−デオキシグアノシンを生産する場合には、２’−デオキウリジンもしくはチミジンと、グアニン、グアノシンもしくは５’−グアニル酸をを含む水溶液に前記微生物菌体またはその処理物を
添加し適宜添加して反応を行えば良い。
【００１６】
反応は通常、温度２０〜８０℃、望ましくは４０〜７０℃で、ｐＨ３〜１１望ましくはｐＨ４〜１０が好結果を与える。反応には静置あるいは撹はんのいずれの方法も採用し得る。反応時間は使用する酵素の活性、基質濃度などの条件によって異なるが、１０分〜１０日間保持反応させれば良い。
このようにして生成した２’−デオキシヌクレオシドを反応終了混合物より採取分離するには、合成吸着樹脂を用いる方法や、その他通常の採取分離方法が採用できる。また２’−デオキシグアノシン、２’−デオキシアデノシンの定量は高速液体クロマトグラフィーを用いる方法で行えば良い。
以下、実施例にて本発明を詳細に説明する。
【実施例】
【００１７】
（実施例 １）
酵母エキス 5 g/l、肉エキス 10 g/l、ペプトン １0 g/l、NaCl 5 g/l を含有する栄養培地（pH 7.0） 50 ml を 坂口フラスコ（500 ml)に入れ、120 ℃にて
20 分間加熱殺菌した。これに、ブイヨン寒天培地で 30℃, 16 時間培養した第１表に示す微生物をそれぞれ１白金耳づつ接種し、30℃にて 18 時間振盪培養した。得られた培養液から菌体を遠心分離により分離した後、50 mM トリスバッファー
(pH 7.2)で洗浄し、更に遠心分離することにより洗浄菌体を調製した。
上記洗浄菌体を 100 mM の２’−デオキシリボース−１−リン酸と 100 mM のアデニン、もしくは 100 mM のグアノシンを含む50 mM のトリスバッファー(pH 7.2) 10 ml に 上記洗浄菌体を 50 g/l になるように添加し、60℃にて 2 時間反応させた。反応液中に生成した２’−デオキシアデノシンあるいは２’−デオキシグアノシンの濃度を高速液体クロマトグラフィーを用いて測定し、その結果を表１に示した。
【００１８】
【表１】
2007159585.tif 000002
【００１９】
（実施例 ２）
酵母エキス 5 g/l、肉エキス 10 g/l、ペプトン １0 g/l、NaCl 5 g/l を含有する栄養培地（pH 7.0） 50 ml を 坂口フラスコ（500 ml)に入れ、120 ℃にて
20 分間加熱殺菌した。これに、ブイヨン寒天培地で 30℃, 16 時間培養した第２表に示す微生物をそれぞれ１白金耳づつ接種し、30℃にて 18 時間振盪培養した。得られた培養液から菌体を遠心分離により分離した後、50 mM リン酸バッファー(pH 7.0)で洗浄し、更に遠心分離することにより洗浄菌体を調製した。
上記洗浄菌体を 100 mM の２’−デオキシウリジンと 100 mM のアデニン、もしくはグアノシンを含む50 mM のリン酸バッファー(pH 7.0) 10 ml に上記洗浄菌体を 50 g/l になるように添加し、60℃にて 2 時間反応させた。
反応液中に生成した２’−デオキシアデノシンあるいは２’−デオキシグアノシンの濃度を高速液体クロマトグラフィーを用いて測定し、その結果を表２に示した。
【００２０】
【表２】
2007159585.tif 000003
【００２１】
（実施例 ３）
酵母エキス 5 g/l、肉エキス 10 g/l、ペプトン １0 g/l、NaCl 5 g/l を含有する栄養培地（pH 7.0） 50 ml を 坂口フラスコ（500 ml)に入れ、120 ℃にて
20 分間加熱殺菌した。これに、ブイヨン寒天培地で 30℃, 16 時間培養したクレフ゛シエラ ニューモニアエ (Klebsiella pneumoniae) IFO 3321 を１白金耳づつ接種し、30℃にて 18 時間振盪培養した。得られた培養液から菌体を遠心分離により分離した後、50 mM リン酸バッファー(pH 7.0)で洗浄し、更に遠心分離することにより洗浄菌体を調製した。
上記洗浄菌体を 100 mM の２’ーデオキシウリジンと 100 mM のアデニン、もしくはアデノシン、もしくは５’-アデニル酸、もしくはグアニン、もしくはグアノシン、もしくは５’ーグアニル酸を含む50 mM のリン酸バッファー(pH 7.0) 
10 ml に 上記洗浄菌体を 50 g/l になるように添加し、60℃にて 2 時間反応させた。
反応液中に生成した２’−デオキシアデノシンあるいは２’−デオキシグアノシンの濃度を高速液体クロマトグラフィーを用いて測定し、その結果を表３に示した。
【００２２】
【表３】
2007159585.tif 000004
【００２３】
（実施例 ４）
酵母エキス 5 g/l、肉エキス 10 g/l、ペプトン １0 g/l、NaCl 5 g/l を含有する栄養培地（pH 7.0） 50 ml を 坂口フラスコ（500 ml)に入れ、120 ℃にて
20 分間加熱殺菌した。これに、ブイヨン寒天培地で 30℃, 16 時間培養したクレフ゛シエラ ニューモニアエ (Klebsiella pneumoniae) IFO 3321 を１白金耳づつ接種し、30℃にて 18 時間振盪培養した。得られた培養液から菌体を遠心分離により分離した後、50 mM リン酸バッファー(pH 7.0)で洗浄し、更に遠心分離することにより洗浄菌体を調製した。
上記洗浄菌体を 100 mM のチミジンと 100 mM のアデニン、もしくはアデノシン、もしくは５’−アデニル酸、もしくはグアニン、もしくはグアノシン、もしくは５’−グアニル酸を含む50 mM のリン酸バッファー(pH 7.0) 10 ml に上記洗浄菌体を 50 g/l になるように添加し、60℃にて 2 時間反応させた。
反応液中に生成した２’−デオキシアデノシンあるいは２’−デオキシグアノシンの濃度を高速液体クロマトグラフィーを用いて測定し、その結果を第４表に示した。
【００２４】
【表４】
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