(57)【要約】  【課題】  被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法等を提供する。  【解決手段】  哺乳動物に被験物質を接触させ（第一工程）、第一工程で被験物質を接触させた哺乳動物を、第一工程における接触開始後１２時間以内に可視光の照射下で飼育し（第二工程）、第二工程で飼育された哺乳動物における皮膚反応の有無又はその程度を検査し（第三工程）、第三工程の検査結果によって被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力の有無又はその程度を評価し、被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力を検定する（第四工程）。該検定方法の陽性対照としての、ベンゾ（ａ）ピレン又はアクリジンの使用も提供される。さらに、該検定方法を用いて、所望の可視光皮膚刺激誘発能力を有する、又は有さない物質を探索する方法も提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（１）〜（４）を有することを特徴とする可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法。
（１）哺乳動物に被験物質を接触させる第一工程、
（２）第一工程で被験物質を接触させた哺乳動物を、第一工程における接触開始後１２時間以内に可視光の照射下で飼育する第二工程、
（３）第二工程で飼育された哺乳動物における皮膚反応の有無又はその程度を検査する第三工程、
（４）第三工程の検査結果によって被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力の有無又はその程度を評価し、被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力を検定する第四工程。
【請求項２】
可視光は、複数の波長においてエネルギー極大値を有する分光分布を有する可視光であることを特徴とする請求項１記載の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法。
【請求項３】
前記第四工程において、前記第三工程の検査結果と、対照の哺乳動物における皮膚反応の有無又はその程度の検査結果とを比較し、その差異に基づいて被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力の有無又はその程度を評価することを特徴とする請求項１又は２記載の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法。
【請求項４】
前記対照は、哺乳動物に既知の可視光皮膚刺激誘発物質を接触させた陽性対照を含むことを特徴とする請求項３記載の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法。
【請求項５】
前記可視光皮膚刺激誘発物質は、ベンゾ（ａ）ピレン又はアクリジンであることを特徴とする請求項４記載の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法。
【請求項６】
前記第二工程の後、飼育された哺乳動物に再び被験物質を接触させ、被験物質接触開始後１２時間以内に該哺乳動物を可視光の照射下で再び飼育する工程、を１回以上繰り返した後、第三工程に供することを特徴とする請求項１〜５のいずれかの請求項記載の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法。
【請求項７】
前記哺乳動物は、モルモット、ラット、マウス又はウサギであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかの請求項記載の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法。
【請求項８】
可視光の照射強度が１５０ルクス以上であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかの請求項記載の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかの請求項記載の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法のための、陽性対照としてのベンゾ（ａ）ピレンの使用。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかの請求項記載の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法のための、陽性対照としてのアクリジンの使用。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれかの請求項記載の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法に用いるための陽性対照試薬であって、ベンゾ（ａ）ピレンを含有することを特徴とする陽性対照試薬。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれかの請求項記載の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法に用いるための陽性対照試薬であって、アクリジンを含有することを特徴とする陽性対照試薬。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれかの請求項記載の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法によって、被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力を検定し、所望の可視光皮膚刺激誘発能力を有する物質を選抜することを特徴とする可視光皮膚刺激誘発物質の探索方法。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれかの請求項記載の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法によって、被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力を検定し、所望の可視光皮膚刺激誘発能力を有さない物質を選抜することを特徴とする可視光皮膚刺激非誘発物質の探索方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法、及びその利用等に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の物質等による毒性又は副作用発現の表現型の一つとして、光皮膚刺激性が知られている。光皮膚刺激性は、紫外線皮膚刺激誘発能力を有する物質が皮膚に接触した後、太陽光を浴びることによって発現する毒性であり、太陽光の中の紫外線に起因することが知られている。
【０００３】
物質が有する紫外線によって皮膚刺激性が誘発される能力（紫外線皮膚刺激誘発能力）を評価する方法としては、動物を用いるインビボの方法と、細胞等を用いるインビトロの方法が知られている。このうち、インビボの方法の概略は以下のとおりである。すなわち、被験物質をモルモット等の皮膚に塗布し、一定時間放置した後、被験物質を拭き取り、紫外線を照射し、数日間の皮膚反応を観察する。そして、塗布・照射部位の皮膚反応（例えば、紅斑と浮腫）の程度によって、被験物質の紫外線皮膚刺激誘発能力を評価する。この際、陽性対照（ポジティブ対照）に使用する紫外線皮膚刺激誘発能力を有する物質（紫外線皮膚刺激誘発物質）として、８−メトキシソラレン（8-methoxypsoralen, 8-MOP）等が知られている。また、インビボの方法をより高感度で行なうために、へアレスドッグを用いる方法も開発されている（特許文献１）。一方、インビトロの方法としては、被験物質を白血球に接触させて紫外線を照射する方法（特許文献２）や、被験物質を多糖類等の高分子化合物と共に紫外線照射し、該高分子化合物の光分解反応をもって評価する方法（特許文献３）が提案されている。
【０００４】
一方、紫外線ではなく可視光によって活性化される物質が見つかってきており、注目を集めている。可視光によって活性化される物質には、紫外線と同様に、可視光によって皮膚刺激性が誘発される能力（可視光皮膚刺激誘発能力）を有する物質（可視光皮膚刺激誘発物質）が存在すると考えられ、物質が有する可視光皮膚刺激誘発能力を正しく評価し、検定する方法等が求められている。そのような検定方法等があれば、被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力を効率的に検定でき、その検定結果を用いて新規の可視光皮膚刺激誘発物質又は可視光皮膚刺激誘発能力を有さない物質（可視光皮膚刺激非誘発物質）を簡便に探索することが可能となる。
【特許文献１】特開平６−６６７８４号公報
【特許文献２】特開平７−１９０９３６号公報
【特許文献３】特開２００１−９１５１０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、物質が有する可視光皮膚刺激誘発能力を正しく評価する方法は確立しておらず、効率的に可視光皮膚刺激誘発能力の検定を行なうことができない。さらに、可視光皮膚刺激誘発能力の検定に陽性対照として使用できる可視光皮膚刺激誘発物質も今までに殆んど知られていない。同様に、所望の新規可視光皮膚刺激誘発物質又は所望の新規可視光皮膚刺激非誘発物質を選抜する方法も確立しておらず、簡便に可視光皮膚刺激誘発物質を探索することができない。
【０００６】
本発明の目的は、物質が有する可視光皮膚刺激誘発能力を検定する方法を提供し、同時に、該検定方法に用いることができる陽性対照物質、及び、該検定方法に用いることができる陽性対照試薬、該検定方法を用いる可視光皮膚刺激誘発物質の探索方法、該検定方法を用いる可視光皮膚刺激非誘発物質の探索方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、物質が有する可視光皮膚刺激誘発能力を効率的に検定する方法を開発すべく、哺乳動物を用いた可視光皮膚刺激誘発能力の評価系を構築することを試みた。その結果、被験物質を接触させた哺乳動物を、被験物質接触開始後１２時間以内に可視光の照射下で飼育し、その皮膚反応を検査することにより、被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力を効率的に検定することができることを見出した。さらに、該検定方法に陽性対照として用いることができる可視光皮膚刺激誘発物質を見出した。さらに、該検定方法を用いて所望の可視光皮膚刺激誘発物質又は可視光皮膚刺激非誘発物質を簡便に探索できることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
【０００８】
請求項１記載の発明は、下記工程（１）〜（４）を有することを特徴とする可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法である。
（１）哺乳動物に被験物質を接触させる第一工程、
（２）第一工程で被験物質を接触させた哺乳動物を、第一工程における接触開始後１２時間以内に可視光の照射下で飼育する第二工程、
（３）第二工程で飼育された哺乳動物における皮膚反応の有無又はその程度を検査する第三工程、
（４）第三工程の検査結果によって被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力の有無又はその程度を評価し、被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力を検定する第四工程。
【０００９】
本発明は可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法にかかり、哺乳動物に被験物質を接触させ（第一工程）、第一工程で被験物質を接触させた哺乳動物を、第一工程における接触開始後１２時間以内に可視光の照射下で飼育し（第二工程）、第二工程で飼育した哺乳動物における皮膚反応の有無又はその程度を検査し（第三工程）、第三工程の検査結果によって被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力の有無又はその程度を評価し、被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力を検定する（第四工程）。本発明の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法によれば、被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力の検定を効率的に行なうことができる。
【００１０】
請求項２記載の発明は、可視光は、複数の波長においてエネルギー極大値を有する分光分布を有する可視光であることを特徴とする請求項１記載の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法である。
【００１１】
本発明の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法では、複数の波長においてエネルギー極大を有する分光分布を有する可視光を用いる。かかる構成により、より正確かつ効率的に被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力を検定することができる。
【００１２】
請求項３記載の発明は、前記第四工程において、前記第三工程の検査結果と、対照の哺乳動物における皮膚反応の有無又はその程度の検査結果とを比較し、その差異に基づいて被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力の有無又はその程度を評価することを特徴とする請求項１又は２記載の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法である。
【００１３】
本発明の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法では、対照の哺乳動物を設定し、被験物質を接触させた哺乳動物における皮膚反応の検査結果と、対照の哺乳動物における皮膚反応の検査結果とを比較し、その差異に基づいて被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力の有無又はその程度を評価する。かかる構成により、より正確かつ効率的に被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力を検定することができる。なお、対照としては、例えば、陰性対照及び陽性対照の両方が適用可能である。
【００１４】
請求項４記載の発明は、哺乳動物に既知の可視光皮膚刺激誘発物質を接触させた陽性対照を含むことを特徴とする請求項３記載の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法である。
【００１５】
本発明の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法では、哺乳動物に既知の可視光皮膚刺激誘発物質を接触させた陽性対照を用いる。かかる構成により、より正確かつ効率的に被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力を検定することができる。さらに、陽性対照の可視光皮膚刺激誘発物質が有する可視光皮膚刺激誘発能力との比較で、被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力を定量的に評価し、検定することもできる。
【００１６】
請求項５記載の発明は、前記可視光皮膚刺激誘発物質は、ベンゾ（ａ）ピレン又はアクリジンであることを特徴とする請求項４記載の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法である。
【００１７】
ベンゾ（ａ）ピレン（Benzo(a)pyrene、化学名：3,4-Benzpyrene、化学式：C20H12）は５個のベンゼン環を持つ多環芳香族炭化水素である。また、アクリジン（Acridine、化学式：C13H9N）は窒素を含むヘテロ環化合物である。ベンゾ（ａ）ピレンとアクリジンとが可視光皮膚刺激誘発能力を有することは、本発明者らによって初めて明らかにされた。そして、本発明の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法では、ベンゾ（ａ）ピレン又はアクリジンを、陽性対照の哺乳動物に接触させる。かかる構成により、ベンゾ（ａ）ピレン又はアクリジンが有する可視光皮膚刺激誘発能力との比較で、被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力を定量的に評価し、検定することもできる。
【００１８】
請求項６記載の発明は、前記第二工程の後、飼育された哺乳動物に再び被験物質を接触させ、被験物質接触開始後１２時間以内に該哺乳動物を可視光の照射下で再び飼育する工程、を１回以上繰り返した後、第三工程に供することを特徴とする請求項１〜５のいずれかの請求項記載の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法である。
【００１９】
本発明の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法においては、第二工程の後（第三工程の前）に、「飼育された哺乳動物に再び被験物質を接触させ、被験物質接触開始後１２時間以内に該哺乳動物を可視光の照射下で再び飼育する工程」を１回以上繰り返した後、第三工程に供する。すなわち、本発明の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法では、被験物質を哺乳動物に反復接触させる。かかる構成により、高感度に被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力を検定することができる。
【００２０】
請求項７記載の発明は、前記哺乳動物は、モルモット、ラット、マウス又はウサギであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかの請求項記載の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法である。
【００２１】
かかる構成により、哺乳動物の取り扱いが容易となり、より簡便に被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力を検定することができる。
【００２２】
請求項８記載の発明は、可視光の照射強度が１５０ルクス以上であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかの請求項記載の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法である。
【００２３】
かかる構成により、より確実に被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力を発現させることができ、可視光皮膚刺激誘発能力の検定が容易となる。
【００２４】
請求項９記載の発明は、請求項１〜８のいずれかの請求項記載の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法のための、陽性対照としてのベンゾ（ａ）ピレンの使用である。
【００２５】
また請求項１０記載の発明は、請求項１〜８のいずれかの請求項記載の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法のための、陽性対照としてのアクリジンの使用である。
【００２６】
本発明は、可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法のための、陽性対照としてのベンゾ（ａ）ピレンの使用又はアクリジンの使用にかかるものである。本発明によれば、ベンゾ（ａ）ピレン又はアクリジンが有する可視光皮膚刺激誘発能力との比較で、被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力を定量的に評価し、検定することもできる。
【００２７】
請求項１１記載の発明は、請求項１〜８のいずれかの請求項記載の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法に用いるための陽性対照試薬であって、ベンゾ（ａ）ピレンを含有することを特徴とする陽性対照試薬である。
【００２８】
また請求項１２記載の発明は、請求項１〜８のいずれかの請求項記載の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法に用いるための陽性対照試薬であって、アクリジンを含有することを特徴とする陽性対照試薬である。
【００２９】
本発明は陽性対照試薬にかかり、ベンゾ（ａ）ピレン又はアクリジンを含有することを特徴とし、本発明の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法に陽性対照試薬として使用される。本発明の陽性対照試薬を用いれば、本発明の可視光皮膚刺激誘発能力の検定における陽性対照の実験を簡便に行なうことができる。
【００３０】
請求項１３記載の発明は、請求項１〜８のいずれかの請求項記載の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法によって、被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力を検定し、所望の可視光皮膚刺激誘発能力を有する物質を選抜することを特徴とする可視光皮膚刺激誘発物質の探索方法である。
【００３１】
本発明は可視光皮膚刺激誘発物質の探索方法にかかり、上記された可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法によって、被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力を検定し、所望の可視光皮膚刺激誘発能力を有する物質を選抜することを特徴とする。かかる構成により、所望の可視光皮膚刺激誘発物質を簡便に探索することができる。
【００３２】
請求項１４記載の発明は、請求項１〜８のいずれかの請求項記載の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法によって、被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力を検定し、所望の可視光皮膚刺激誘発能力を有さない物質を選抜することを特徴とする可視光皮膚刺激非誘発物質の探索方法である。
【００３３】
本発明は可視光皮膚刺激非誘発物質の探索方法にかかり、上記された可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法によって、被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力を検定し、所望の可視光皮膚刺激誘発能力を有さない物質を選抜することを特徴とする。かかる構成により、所望の可視光皮膚刺激非誘発物質を簡便に探索することができる。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法によれば、被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力の検定を効率的に行なうことができる。さらに、本発明では、該検定方法に陽性対照として用いることができる可視光皮膚刺激誘発物質を提供することができる。
【００３５】
本発明の可視光皮膚刺激誘発物質の探索方法によれば、所望の可視光皮膚刺激誘発物質又は可視光皮膚刺激非誘発物質の探索を簡便に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
以下、本発明を実施するための最良の形態について詳細に説明する。
【００３７】
本発明の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法は、下記工程（１）〜（４）、
（１）哺乳動物に被験物質を接触させる第一工程、
（２）第一工程で被験物質を接触させた哺乳動物を、第一工程における接触開始後１２時間以内に可視光の照射下で飼育する第二工程、
（３）第二工程で飼育された哺乳動物における皮膚反応の有無又はその程度を検査する第三工程、
（４）第三工程の検査結果によって被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力の有無又はその程度を評価し、被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力を検定する第四工程、
を有する。
【００３８】
本発明の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法に使用される被験物質としては特に限定はなく、全ての化学物質が対象となるが、例えば、化粧品、医薬品、食品等に適用される化学物質が被験物質として使用される。
【００３９】
本発明の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法で使用される哺乳動物は、飼育可能であれば特に制限はない。好ましい実施形態では、小型でかつ飼育が容易なモルモット、ラット、マウス又はウサギが用いられる。用いられる哺乳動物の個体数については、多いほど正確な検定結果が得られるが、一般的には、３〜２０匹、好ましくは５〜１０匹程度である。
【００４０】
上記第一工程では、哺乳動物に被験物質を接触させる。哺乳動物に被験物質を接触させるには、哺乳動物の皮膚に被験物質を体外から接触させてもよいし、また体内から接触させてもよい。前者の場合において、被験物質を哺乳動物に接触させる方法としては、特に限定はなく、被験物質の形状によって種々の方法が選択可能である。被験物質が液体の場合には、例えば、原液又は適宜の溶媒で希釈された希釈液を、皮膚に塗布、スポット、噴霧等することにより、被験物質を皮膚に体外から接触させることができる。その他、適宜の基剤に液体の被験物質を保持させて軟膏とし、該軟膏を哺乳動物の皮膚に塗ることによっても、被験物質を皮膚に体外から接触させることができる。一方、被験物質が固体の場合には、例えば、適宜の溶媒に溶かして溶液とし、該溶液を哺乳動物の皮膚に塗布、スポット、噴霧等することにより被験物質を皮膚に体外から接触させることができる。適宜の基剤に被験物質の溶液を含ませて軟膏とし、該軟膏を哺乳動物の皮膚に塗ることによっても、被験物質を皮膚に体外から接触させることができる。また、被験物質が不溶性の固体である場合には、例えば、適宜の液状媒体に被験物質を分散させて、同様に塗布等することができる。さらに、適宜の基剤に固体の被験物質を分散させて軟膏とし、該軟膏を哺乳動物の皮膚に塗ることによっても、被験物質を皮膚に体外から接触させることができる。また、哺乳動物の体毛を剃って皮膚を露出させると、被験物質の皮膚への接触が容易に行なえる。一方、へアレスマウス等の体毛のない哺乳動物を用いれば、体毛を剃る必要はなく簡便である。後者の場合において、被験物質を哺乳動物に接触させる方法としては、例えば、被験物質の原液又は適宜の溶媒で希釈された希釈液を、皮内に注射することにより、被験物質を皮膚に体内から接触させることができる。
【００４１】
哺乳動物に接触させる被験物質の濃度及び適用量については、特に限定はなく、被験物質の種類、予想される被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力、第二工程での飼育時間、第二工程での可視光照射時間等によって適宜決定すればよい。例えば、被験物質が液体の場合には原液を、被験物質が粉末状の固体の場合には適宜の媒体で湿らせたものを最高濃度とし、該最高濃度の１／２〜１／１０００程度の希釈範囲内の濃度及び適用量を好ましく用いることができる。
【００４２】
上記第二工程では、第一工程で被験物質を接触させた哺乳動物を、第一工程における接触開始後１２時間以内に可視光の照射下で飼育する。そして、被験物質が可視光皮膚刺激誘発能力を有する場合には、本工程でその可視光皮膚刺激誘発能力を発現させることができる。
【００４３】
好ましい実施形態では、第一工程における接触開始後６時間以内、より好ましくは４時間以内、特に好ましくは実質的に直後（具体的には例えば、３０分間以内）に可視光の照射下で飼育する。ちなみに、第一工程における接触開始後から第二工程における可視光の照射開始前までの期間において、第一工程で被験物質を接触させた哺乳動物は、例えば、１５〜３０℃程度、好ましくは１８〜２８℃程度、より好ましくは２０〜２６℃程度の飼育温度下でかつ可視光の非照射下で飼育しておけばよい。
【００４４】
好ましい実施形態では、「可視光」は、複数の波長においてエネルギー極大値を有する分光分布を有する可視光である。このような可視光の代表例としては、家庭用一般蛍光灯が発する光等を挙げることができる。すなわち、青色領域（４００ｎｍ付近）、緑色領域（５５０ｎｍ付近）及び桃色領域（６５０ｎｍ付近）においてエネルギー極大値を有する可視光等が挙げられる。
【００４５】
第二工程では、被験物質の「可視光照射下での接触時間」を調節することができる。すなわち、飼育時間及び可視光の照射時間を適宜設定することにより、所望の「可視光照射下での接触時間」を実現することができる。なお、可視光の照射は連続的又は間欠的に行なうことができる。可視光の照射を連続的に行なう場合には、飼育時間が「可視光照射下での接触時間」に相当する。例えば、連続的な可視光照射の下で、２４時間、４８時間又は７２時間飼育することにより、２４時間、４８時間又は７２時間の「可視光照射下での接触時間」を実現することができる。一方、可視光の照射を間欠的に行なう場合には、可視光の照射時間が「可視光照射下での接触時間」に相当する。例えば、２４時間の飼育期間中、最初の１２時間を可視光下で飼育し、残りの１２時間を可視光を遮断した状態で飼育することにより、１２時間の「可視光照射下での接触時間」を実現することができる。そして、本工程における「可視光照射下での接触時間」は、例えば、３０分間以上を採用することができ、より好ましくは３時間以上、特に好ましくは１日間以上である。また、哺乳動物の飼育温度としては、例えば、１５〜３０℃程度、好ましくは１８〜２８℃程度、より好ましくは２０〜２６℃程度等を挙げることができる。なお、皮膚に接触している被験物質が曝される温度は、哺乳動物の体温に加えて飼育温度の影響も受けるので、使用する哺乳動物の種類及び被験物質の種類の両方を考慮して飼育温度を設定することがより好ましい。なお、哺乳動物の皮膚に外部から被験物質を接触させる場合には、接触時間の進行は、皮膚上の接触箇所からの接触物質の除去操作の有無により制御することができる。
【００４６】
好ましい実施形態では、上記第二工程の後、飼育された哺乳動物に再び被験物質を接触させ、被験物質接触開始後１２時間以内に該哺乳動物を可視光の照射下で再び飼育する工程、を１回以上繰り返した後、第三工程に供する。すなわち、本実施形態では被験物質を反復接触させる。例えば、哺乳動物の皮膚に外部から被検物質を接触させる場合には、接触時間の進行は、皮膚上の接触箇所を拭いて被験物質を除去することにより止めることができるので、被験物質の「接触」と「拭き取り」とを繰り返すことにより、被験物質を蓄積させずに反復接触を行なうことができる。具体例を挙げると、第二工程で可視光の照射下で２４時間飼育した時点で、皮膚上の被験物質の接触箇所を拭き取って被験物質を除去する。その後ただちに同じ箇所に被験物質を塗布等し、可視光の照射下で再び２４時間飼育する（第１サイクル）。可視光の照射下での飼育２４時間経過時に、皮膚上の被験物質の接触箇所を拭き取って被験物質を除去する。その後ただちに同じ箇所に被験物質を塗布等し、可視光の照射下で再び２４時間飼育する（第２サイクル）。このサイクルを所望の回数だけ繰り返すことにより、反復接触を行なうことができる。一方、「拭き取り」を行なわずに被験物質を蓄積させながら反復接触させる方法も採用可能である。
【００４７】
好ましい実施形態では、可視光の照射強度が１５０ルクス以上であり、より好ましくは５００〜１００００ルクスの範囲であり、特に好ましくは１０００〜６０００ルクスの範囲である。１５０ルクス以上の照射強度とすることにより、より確実に被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力を発現させることができる。
【００４８】
上記第三工程では、第二工程で飼育された哺乳動物における皮膚反応の有無又はその程度を検査する。皮膚反応の有無又はその程度は、例えば、紅斑若しくは浮腫の有無又はそれらの程度を指標として検査することができる。この際、紅斑若しくは浮腫の有無等は肉眼観察によっても判定できるが、色彩色度計で紅斑の色の濃さを測定したり、ノギスで紅斑や浮腫の直径を測定すれば、より正確に判定することができる。なお、被験物質の「接触」と「拭き取り」との繰り返し等により被験物質の反復接触を行なうときには、各サイクルで皮膚反応の有無又はその程度を検査することが好ましい。
【００４９】
上記第四工程では、第三工程の検査結果によって被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力の有無又はその程度を評価し、被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力を検定する。被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力の有無又はその程度を評価する際、対照を設定せずに第三工程の検査結果の絶対値で評価してもよいし、対照を設定し、その検査結果との比較で評価してもよい。
【００５０】
好ましい実施形態では、上記第三工程の検査結果と、対照の哺乳動物における皮膚反応の有無又はその程度の検査結果とを比較し、その差異に基づいて被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力の有無又はその程度を評価する。ここで、「対照」には陰性対照及び陽性対照の両方が設定可能である。陰性対照の例としては、可視光を接触部位に照射しない哺乳動物群、可視光を照射せずに飼育する哺乳動物群、照射強度が弱い可視光の照射下で飼育する哺乳動物群、可視光皮膚刺激誘発能力を有さないことが予め分かっている物質（例えば、溶媒のみ）を接触させる哺乳動物群、等が挙げられる。このような陰性対照を用いる場合には、以下のような検定が可能となる。すなわち、被験物質における皮膚反応の有無又はその程度の検査結果と、陰性対照における皮膚反応の有無又はその程度の検査結果とを比較する。そして、被験物質における皮膚反応の有無又はその程度の方が高い場合には、当該被験物質は可視光皮膚刺激誘発能力を有すると評価し、検定することもできる。
【００５１】
さらに好ましい実施形態では、前記対照は、哺乳動物に既知の可視光皮膚刺激誘発物質を接触させた陽性対照を含む。陽性対照の例としては、可視光皮膚刺激誘発能力を有することが予め分かっている基準物質を接触させて、可視光の照射下で飼育する哺乳動物群が挙げられる。このような陽性対照を用いる場合には、以下のような検定が可能となる。すなわち、被験物質における皮膚反応の有無又はその程度の検査結果と、陽性対照における皮膚反応の有無又はその程度の検査結果とを比較する。そして、被験物質における皮膚反応の有無又はその程度の方が高い場合には、当該被験物質は陽性対照で用いた基準物質よりも高い可視光皮膚刺激誘発能力を有すると評価し、検定することもできる。さらに、当該基準物質の各濃度又は各適用量において同様に評価し、検定することにより、当該被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力を定量的に評価し、検定することができる。この際、陽性対照と上記の陰性対照とを併用して設定してもよい。
【００５２】
さらに好ましい実施形態では、ベンゾ（ａ）ピレン、又はアクリジンを基準物質として陽性対照に用いる。ベンゾ（ａ）ピレンとアクリジンとが可視光皮膚刺激誘発能力を有することは、本発明者らによって初めて明らかにされた。
【００５３】
本発明の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法のための、ベンゾ（ａ）ピレンの陽性対照としての使用も、本発明の１つである。さらに、本発明の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法のための、アクリジンの陽性対照としての使用も、本発明の１つである。
【００５４】
本発明の陽性対照試薬の１つの様相は、本発明の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法に用いるための陽性対照試薬であって、ベンゾ（ａ）ピレンを含有する。また、本発明の陽性対照試薬の他の様相は、本発明の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法に用いるための陽性対照試薬であって、アクリジンを含有する。試薬の形状としては、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンをそのまま用いてもよいし、溶媒に溶かして溶液状としてもよい。さらに、適宜の基剤に含有又は分散させた形状でもよい。
【００５５】
本発明の可視光皮膚刺激誘発物質の探索方法は、本発明の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法によって、被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力を検定し、所望の可視光皮膚刺激誘発能力を有する物質を選抜するものである。本発明の可視光皮膚刺激誘発物質の探索方法においても、上記した本発明の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法と同様の実施形態をとることができる。例えば、上記の陰性対照を用いる場合には、被験物質における皮膚反応（例えば、紅斑若しくは浮腫）の有無又はその程度の検査結果と、陰性対照における皮膚反応の有無又はその程度の検査結果とを比較する。そして、陰性対照よりも皮膚反応の有無又はその程度が高い被験物質を選抜すればよい。
【００５６】
一方、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジン等の陽性対照が用いられる場合には、被験物質における皮膚反応の有無又はその程度の検査結果と、陽性対照における皮膚反応の有無又はその程度の検査結果とを比較する。そして、陽性対照よりも皮膚反応の有無又はその程度が高い被験物質を選抜することにより、陽性対照で用いられた基準物質よりも高い可視光皮膚刺激誘発能力を有する物質を選抜することができる。また、陽性対照が用いられる場合には、皮膚反応の有無又はその程度を定量的に評価し、検定することもできる。具体的には、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジン等の基準物質の各濃度又は各適用量において、被験物質に対して同様に評価し、検定することにより、被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力を定量的に評価し、検定することができる、そして、所望の可視光皮膚刺激誘発能力をする物質を選抜する。
【００５７】
本発明の可視光皮膚刺激非誘発物質の探索方法は、本発明の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法によって、被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力を検定し、所望の可視光皮膚刺激誘発能力を有さない物質を選抜するものである。本発明の可視光皮膚刺激非誘発物質の探索方法においても、上記した本発明の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法と同様の実施形態をとることができる。なお、探索の対象となる被験物質は、所望の可視光皮膚刺激誘発能力を有さない物質であれば何でもよく、例えば、低分子化合物、蛋白質、ペプチド等が挙げられる。
【００５８】
本発明の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法に基づくシステム工程を有する装置によれば、被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力の検定をより効率的に行なうことができ、所望の可視光皮膚刺激誘発物質又は可視光皮膚刺激非誘発物質をより簡便に探索することもできる。また、本発明の可視光皮膚刺激誘発能力の検定方法によって得られた可視光皮膚刺激性に関する毒性情報を電子情報記録媒体に記録することにより、毒性情報を包含する有用な電子情報記録媒体を作製することができる。
【００５９】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６０】
本実施例では、被験物質の単回接触によって可視光皮膚刺激誘発能力の検定及び可視光皮膚刺激誘発物質の探索ができることを示した。さらに、ベンゾ（ａ）ピレン及びアクリジンが、該検定方法、該探索方法における陽性対照として使用できることを示した。
【００６１】
ベンゾ（ａ）ピレン（和光純薬社）をアセトンに溶解し、０．０１％（ｗ／ｖ）、０．１％（ｗ／ｖ）及び１％（ｗ／ｖ）の濃度からなる各試験液を調製した。また、アクリジン（和光純薬社）をアセトンに溶解し、０．３％（ｗ／ｖ）及び１％（ｗ／ｖ）の濃度からなる各試験液を調製した。
【００６２】
一方、３週齢のＨａｒｔｌｅｙ系モルモット（雌、ＳＬＣ社）を１週間検疫し、異常が無いことを確認した。検疫終了後、各モルモットの背部生中線付近を、電気バリカンを用いて皮膚を傷つけないように広く毛刈した。次に、各モルモットの毛刈部分に各試験液０．０１ｍＬを塗布し、各モルモットにベンゾ（ａ）ピレン又はアクリジンを適用した。各被験物質が適用された直後に、前記の各モルモットを、可視光の照射・非照射と飼育室内の温度調整とを精密制御できる専用飼育装置にて、家庭用一般蛍光灯による６０００ルクスの可視光の照射下、飼育温度２０．０〜２５．５℃の条件で１日間飼育した。なお、１日のうちの照射時間は、最初の１２時間を照射、残りの１２時間を非照射とした。次に、各モルモットの毛刈部分をアセトンで拭いて被験物質を除去した後、さらに、家庭用一般蛍光灯による６０００ルクスの可視光の照射下、飼育温度２０．０〜２５．５℃の条件で３日間飼育した。この際も、１日のうちの照射時間は、最初の１２時間を照射、残りの１２時間を非照射とした。一方、陰性対照として、可視光の照度を室内照度（家庭用一般蛍光灯による１５０ルクス）とした群を設定した。また、各群とも５匹以上のモルモットで構成した。
【００６３】
３日間飼育後の各モルモットについて、皮膚反応の有無又はその程度を評価するために、紅斑及び浮腫の有無とそれらの大きさに応じて、０点（無）、１点（軽度）、２点（中等度）、３点（重度）の評点を付け、各群で平均値を算出した。結果を第１表に示す。第１表中、「＋」は家庭用一般蛍光灯による６０００ルクスの可視光を照射した群、「−」は室内照度（家庭用一般蛍光灯による１５０ルクス）で飼育した陰性対照の群を示す。すなわち、各濃度のベンゾ（ａ）ピレン、各濃度のアクリジンにおいて、１，２，３日目の全ての時点で、家庭用一般蛍光灯による６０００ルクスの可視光を照射した群の方が、室内照度（家庭用一般蛍光灯による１５０ルクス）とした陰性対照の群に比べて高い評点を示し、皮膚刺激が誘発されていた。これは、ベンゾ（ａ）ピレンとアクリジンとが可視光皮膚刺激誘発能力を有することを示しており、本発明者らが初めて見出した知見である。以上より、本実施例の手順（単回接触）によって被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力を検定でき、かつ、被験物質の中から可視光皮膚刺激誘発物質を探索できることが示された。さらに、ベンゾ（ａ）ピレンとアクリジンとが、本検定方法の陽性対照として使用できることが示された。
【表１】
2007064718.tif 000002
【実施例２】
【００６４】
本実施例では、被験物質の反復接触によって可視光皮膚刺激誘発能力の検定及び可視光皮膚刺激誘発物質の探索ができることを示した。
【００６５】
被験物質を反復接触させる以外は、実施例１と同様にして以下の実験を行なった。すなわち、ベンゾ（ａ）ピレンの０．００１％試験液０．０１ｍＬをモルモットの毛刈部分に塗布し、各モルモットにベンゾ（ａ）ピレンを適用した。次に、ベンゾ（ａ）ピレンが適用された直後に、前記の各モルモットを、家庭用一般蛍光灯による６０００ルクスの可視光の照射下、飼育温度２０．０〜２５．５℃の条件で１日間飼育した（１２時間照射＋１２時間非照射）。次に、各モルモットの毛刈部分をアセトンで拭いて被験物質を除去した後、再度、ベンゾ（ａ）ピレンの０．００１％試験液０．０１ｍＬをモルモットの毛刈部分に塗布し、同じ条件で１日間飼育した。この「塗布・飼育・拭き取り」のサイクルを１４回繰り返しながら、モルモットを１４日間飼育した。なお、陰性対照として、可視光の照度を室内照度（家庭用一般蛍光灯による１５０ルクス）とした群を設定した。そして、実施例１と同様にして、ベンゾ（ａ）ピレンの可視光皮膚刺激誘発能力を検定した。結果を第２表に示す。第２表中、「＋」は家庭用一般蛍光灯による６０００ルクスの可視光を照射した群、「−」は室内照度（家庭用一般蛍光灯による１５０ルクス）で飼育した陰性対照の群を示す。さらに、１〜１４の整数は飼育日数を示す。すなわち、飼育４日目以降において、家庭用一般蛍光灯による６０００ルクスの可視光を照射した群の方が、室内照度（家庭用一般蛍光灯による１５０ルクス）とした陰性対照の群に比べて高い評点を示し、皮膚刺激が誘発されていた。これは、ベンゾ（ａ）ピレンが可視光皮膚刺激誘発能力を有することを示しており、本発明者らが初めて見出した知見である。以上より、本実施例の手順（反復接触）によっても被験物質の可視光皮膚刺激誘発能力を検定でき、かつ、被験物質の中から可視光皮膚刺激誘発物質を探索できることが示された。さらに、ベンゾ（ａ）ピレンが、本検定方法の陽性対照として使用できることが示された。
【表２】
2007064718.tif 000003
【実施例３】
【００６６】
ベンゾ（ａ）ピレン１０ｍｇをアセトン１００ｍＬに溶解し、ベンゾ（ａ）ピレンを含有する陽性対照試薬を調製した。さらに、アクリジン３００ｍｇをアセトン１００ｍＬに溶解し、アクリジンを含有する陽性対照試薬を調製した。