(57)【要約】  【課題】  血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の発症の有無、又は将来の発症リスクを判定等する。  【解決手段】  被検者の体液中における３種のマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の発症の有無、又は将来の発症リスクを判定する。マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体にマーカー物質を捕捉して、体液中のマーカー物質の濃度を算出することもできる。さらに、該マーカー物質を指標とした、被検物質が有する血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を評価する物質の評価方法、及び、該評価方法を用いる物質のスクリーニング方法、酢酸を有効成分として含有する疾病の予防剤も提供される。【選択図】  図１
2007064747.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者の体液中における下記マーカー物質（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つの濃度を健常値と比較し、血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の発症の有無、又は将来の発症リスクを判定することを特徴とする疾病の診断方法。
（ａ）ｐＨ７．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３０６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｂ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８３３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｃ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８９８０のイオンピークを生じるタンパク質。
【請求項２】
前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１に記載の疾病の診断方法。
【請求項３】
前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項１又は２に記載の疾病の診断方法。
【請求項４】
前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項３に記載の疾病の診断方法。
【請求項５】
前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項３又は４に記載の疾病の診断方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の疾病の診断方法によって、被検物質を摂取させた被検者を診断し、該診断結果に基づいて被検物質が有する血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする物質の評価方法。
【請求項７】
被検物質とコレステロールとを同時摂取させた動物の体液中における下記マーカー物質（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被検物質が有する血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする物質の評価方法。
（ａ）ｐＨ７．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３０６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｂ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８３３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｃ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８９８０のイオンピークを生じるタンパク質。
【請求項８】
前記基準値は、高コレステロール食を摂取させた動物の体液中における前記マーカー物質の濃度であることを特徴とする請求項７に記載の物質の評価方法。
【請求項９】
前記体液は、血液であることを特徴とする請求項７又は８に記載の物質の評価方法。
【請求項１０】
前記動物は、ラットであることを特徴とする請求項７〜９のいずれかに記載の物質の評価方法。
【請求項１１】
前記被検物質は、食品素材であることを特徴とする請求項７〜１０のいずれかに記載の物質の評価方法。
【請求項１２】
前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項７〜１１のいずれかに記載の物質の評価方法。
【請求項１３】
前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項１２に記載の物質の評価方法。
【請求項１４】
前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の物質の評価方法。
【請求項１５】
請求項６〜１４のいずれかに記載の物質の評価方法によって被検物質を評価し、血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法。
【請求項１６】
体液中における下記マーカー物質（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つの濃度を健常値に維持又は回復する効果と、血中コレステロール濃度及び／又は血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の将来の発症リスクを低減する効果とを有し、酢酸を有効成分として含有する疾病の予防剤。
（ａ）ｐＨ７．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３０６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｂ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８３３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｃ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８９８０のイオンピークを生じるタンパク質。
【請求項１７】
機能性食品として使用される請求項１６に記載の疾病の予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾病の診断方法、物質の評価方法、物質のスクリーニング方法、及び疾病の予防剤に関し、さらに詳細には、被検者の体液中におけるマーカー物質の濃度を指標として、血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の発症の有無、又は将来の発症リスクを判定する疾病の診断方法、該診断方法を用いて被検物質が有する血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を評価する物質の評価方法、被検物質とコレステロールとを同時摂取させた動物の体液中におけるマーカー物質の濃度を指標して、被検物質が有する血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を評価する物質の評価方法、該評価方法を用いて血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングする物質のスクリーニング方法、及び、体液中における上記マーカー物質の濃度を健常値に維持又は回復する効果と、血中コレステロール濃度及び／又は血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の将来の発症リスクを低減する効果とを有する疾病の予防剤、に関する。
【背景技術】
【０００２】
食生活の欧米化に伴って動物脂肪の摂取量が増大し、脂質代謝異常等の生活習慣病が増加している。例えば、高脂肪食や高カロリー食の摂取によって脂質代謝に異常が起こり、その結果、血液中の脂質量が異常に増加して高脂血症となることがわかっている。血液中の脂質には、コレステロール、中性脂肪（トリグリセライド）、リン脂質、及び遊離脂肪酸の４種があるが、コレステロールは動脈硬化との関連性において特に問題視されている。また、中性脂肪は肥満等に関連することがわかっている。
【０００３】
一方、食酢が、上昇した血中コレステロール濃度を低下させる作用を有することが、臨床試験により明らかにされている（非特許文献１、非特許文献２）。この食酢の効果は、食酢の主成分である酢酸によるものである。
【非特許文献１】伏見宗士，「境界域および軽度コレステロール血症者に対する食酢摂取の有用性および安全性」，第５９回日本栄養食糧学会要旨集，２００５年
【非特許文献２】「食酢の主成分『酢酸』による血中コレステロール値の低下作用を確認」，平成１７年５月１８日，［平成１７年８月１８日検索］，インターネット＜URL：http://www.mizkangroup.co.jp/newsrelease/2005news/050518.html＞
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
動脈硬化等の血中コレステロール濃度の上昇に伴う疾病については、自覚症状が少なく、発見されたときには重篤な状態になっていることも多い。血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病についても同様である。よって、血中コレステロール濃度の上昇に伴う疾病や、血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病については、予防をすることが大事である。そのためには、当該疾病の発症の有無のみならず、将来の発症リスクを判定する診断技術が求められる。そうすれば、血中コレステロール濃度及び／又は血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病が発症する前に、生活習慣の是正、食事制限、運動等の処置を行うことができ、当該疾病の発症を予防することが可能になる。さらに、当該疾病の発症リスクを低減させるような効果を有する食品素材等があれば、そのような食品素材を含む食品を日常的に摂取することで、動脈硬化等の当該疾病を容易に予防することができる。
【０００５】
しかし、当該疾患の発症の有無に加えて、将来の発症リスクを判定する診断技術は確立しておらず、物質が有する当該疾病の改善効果や発症リスクを低減させる効果を評価する方法、及び、当該疾患の改善効果や発症リスクを低減させる効果を有する物質をスクリーニングする方法も開発されていない。
【０００６】
本発明の目的は、血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の発症の有無、又は将来の発症リスクを判定する診断方法を提供し、さらに、被検物質が有する血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を評価する方法、及び、該評価方法を用いて血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングする方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、コレステロールを通常より多く含む飼料（高コレステロール食）を摂取させて血中コレステロール濃度及び／又は血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病を発症しているか、将来の発症リスクを高くした動物群を設定した。そして、当該動物の体液を質量分析計によるプロテオーム解析により網羅的に解析し、当該動物に特異的なマーカー物質を検索した。その結果、そのようなタンパク質を複数見出した。そして、被検者の体液中における当該タンパク質の濃度を指標として、血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の発症の有無、又は将来の発症リスクの判定する系を構築した。さらに、この系を用いて、被検物質が有する血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を評価する系を構築した。さらに、被検物質とコレステロールとを同時摂取させた動物の体液中における当該タンパク質の濃度を指標として、被検物質が有する血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を評価する系を構築した。さらに、当該評価方法を用いて、血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質のスクリーニングする系を構築した。またさらに、酢酸が体液中における上記マーカー物質の濃度を健常値に維持又は回復する効果と、当該疾病の将来の発症リスクの低減効果とを有することを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
【０００８】
請求項１に記載の発明は、被検者の体液中における下記マーカー物質（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つの濃度を健常値と比較し、血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の発症の有無、又は将来の発症リスクを判定することを特徴とする疾病の診断方法である。
（ａ）ｐＨ７．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３０６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｂ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８３３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｃ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８９８０のイオンピークを生じるタンパク質。
【０００９】
本発明の疾病の診断方法は、被検者の体液中における上記マーカー物質（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つの濃度を健常値と比較し、血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の発症の有無、又は将来の発症リスクを判定するものである。本発明の疾病の診断方法では、血中コレステロール又は血中中性脂肪を直接指標とするのではなく、別のマーカー物質を指標とするので、血中コレステロール濃度及び／又は血中中性脂肪濃度が上昇する前の状態をも捉えることができる。その結果、血中コレステロール濃度及び／又は血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の発症の有無に加え、当該疾病の将来の発症リスクを判定することができる。
【００１０】
ここで、「血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病」には、血中コレステロール濃度及び／又は血中中性脂肪濃度の上昇に起因する全ての疾病が含まれ、直接的には高コレステロール血症及び高脂血症、間接的には、動脈硬化、脂肪肝、肥満等が含まれる。また、「将来の発症リスクを判定する」とは、疾病を発症していない時点において、将来、その疾病に罹患する可能性（危険性）の有無、又はその可能性（危険性）の程度を判定することをいう。
【００１１】
ここで、各マーカー物質における質量／電荷比（以下、「Ｍ／Ｚ」と略記することもある。）の「約３０６０」、「約８３３０」、「約８９８０」の値は、質量分析における測定値の誤差範囲を考慮した値であり、概ね±０．２％の幅を有する。すなわち、約３０６０は概ね３０６０±０．２％、約８３３０は概ね８３３０±０．２％、約８９８０は概ね８９８０±０．２％を表す。また、これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質である。なお、被検者が血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の発症している場合、又は当該疾病の将来の発症リスクが高い場合、体液中のマーカー物質（ａ）及び（ｂ）の濃度はより低値を示し、マーカー物質（ｃ）の濃度はより高値を示す。
【００１２】
請求項２に記載の発明は、前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１に記載の疾病の診断方法である。
【００１３】
かかる構成により、測定試料となる体液を簡単に採取でき、より簡便かつ迅速に、血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の発症の有無、又は将来の発症リスクを判定することができる。
【００１４】
請求項３に記載の発明は、前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項１又は２に記載の疾病の診断方法である。
【００１５】
本発明の疾病の診断方法においては、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を使用する。そして、該担体に体液又は体液成分を接触させて、体液又は体液成分に含まれるマーカー物質を、マーカー物質に対する親和性を有する物質を介して担体上に捕捉し、捕捉されたマーカー物質の量に基づいて体液中のマーカー物質の濃度を算出する。本発明の疾病の診断方法によれば、担体上に捕捉されたマーカー物質を測定対象とするので、測定試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、体液成分の例としては、体液が血液である場合の血清又は血漿が挙げられる。
【００１６】
請求項４に記載の発明は、前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項３に記載の疾病の診断方法である。
【００１７】
本発明の疾病の診断方法では、平面部分を有する担体を用い、マーカー物質に対する親和性を有する物質は該平面部分の一部に固定化されている。かかる構成により、マーカー物質に対する親和性を有する物質を、担体上の複数箇所にスポット的に固定化することができる。その結果、１個の担体で複数の測定試料を同時処理することや、１個の担体で複数のマーカー物質の濃度を同時測定することが可能となり、作業効率がよい。さらに、各スポットの面積を小さくすることにより、微量の測定試料からでもマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、平面部分を有する担体の例としては、チップ等の基板が挙げられる。
【００１８】
請求項５に記載の発明は、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項４に記載の疾病の診断方法である。
【００１９】
本発明の疾病の診断方法においては、マーカー物質に対する親和性を有する物質としてイオン交換体又は抗体を用い、イオン交換体又は抗体を介して測定試料中のマーカー物質を担体上に捕捉する。当該物質がイオン交換体の場合は各種のものが入手容易であり、マーカー物質を捕捉するための担体を容易に調製することができる。また、当該物質が抗体の場合は、より特異的にマーカー物質を捕捉することができる。捕捉されたマーカー物質の量を測定する方法としては、質量分析、イムノアッセイ（抗体の場合）が挙げられる。
【００２０】
請求項６に記載の発明は、請求項１〜５のいずれかに記載の疾病の診断方法によって、被検物質を摂取させた被検者を診断し、該診断結果に基づいて被検物質が有する血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする物質の評価方法である。
【００２１】
本発明は物質の評価方法にかかり、本発明の診断方法によって、被検物質を摂取させた被験者を診断し、その診断結果に基づいて被検物質が有する血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を評価する。本発明の物質の評価方法では、血中コレステロール及び／又は血中中性脂肪濃度を直接指標とするのではなく、別のマーカー物質を指標とするので、被検物質を摂取させた被検者における血中コレステロール濃度及び／又は血中中性脂肪濃度が上昇する前の状態をも捉えることができる。その結果、被検物質が有する血中コレステロール濃度及び／又は血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果に加え、当該疾病の将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。
【００２２】
請求項７に記載の発明は、被検物質とコレステロールとを同時摂取させた動物の体液中における下記マーカー物質（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被検物質が有する血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする物質の評価方法である。
（ａ）ｐＨ７．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３０６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｂ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８３３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｃ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８９８０のイオンピークを生じるタンパク質。
【００２３】
本発明の物質の評価方法は、被検物質とコレステロールとを同時摂取させた動物の体液中における上記（ａ）〜（ｃ）の３種のマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被検物質が有する血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を評価するものである。本発明の物質の評価方法では、血中コレステロールを直接指標とするのではなく、別のマーカー物質を指標とするので、動物における血中コレステロール濃度が上昇する前の状態をも捉えることができる。その結果、被検物質が有する血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果に加え、当該疾病の将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。
【００２４】
請求項８に記載の発明は、前記基準値は、高コレステロール食を摂取させた動物の体液中における前記マーカー物質の濃度であることを特徴とする請求項７に記載の物質の評価方法である。
【００２５】
かかる構成により、より正確に、被検物質が有する血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。ここで、「高コレステロール食」とは、コレステロールを通常より多く含む飼料をいう。高コレステロール食は、例えば、通常の飼料にコレステロールを添加することにより調製することができる。
【００２６】
請求項９に記載の発明は、前記体液は、血液であることを特徴とする請求項７又は８に記載の物質の評価方法である。
【００２７】
かかる構成により、測定試料となる体液を簡単に採取でき、より簡便かつ迅速に、被検物質が有する血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。
【００２８】
請求項１０に記載の発明は、前記動物は、ラットであることを特徴とする請求項７〜９のいずれかに記載の物質の評価方法である。
【００２９】
かかる構成により、動物の取り扱いが容易となり、より簡便かつ迅速に、被検物質が有する血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。
【００３０】
請求項１１に記載の発明は、前記被検物質は、食品素材であることを特徴とする請求項７〜１０のいずれかに記載の物質の評価方法である。
【００３１】
かかる構成により、機能性食品の開発を目的として、血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。
【００３２】
上記した本発明の疾病の診断方法と同様に、本発明の物質の評価方法においても、前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出する構成（請求項１２）、前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されている構成（請求項１３）、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体である構成（請求項１４）が推奨される。
【００３３】
請求項１５に記載の発明は、請求項６〜１４のいずれかに記載の物質の評価方法によって被検物質を評価し、血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法である。
【００３４】
本発明は物質のスクリーニング方法にかかり、被検物質とコレステロールとを同時摂取させた動物の体液中における上記（ａ）〜（ｃ）の３種のマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするものである。本発明の物質のスクリーニング方法では、血中コレステロール及び／又は血中中性脂肪濃度を直接指標とするのではなく、別のマーカー物質を指標とするので、被検者又は動物における血中コレステロール濃度及び／又は血中中性脂肪濃度が上昇する前の状態をも捉えることができる。その結果、血中コレステロール濃度及び／又は血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果を有する物質に加え、当該疾病の将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングすることができる。特に、被検物質が食品素材の場合は、血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果を有する機能性食品、又は将来の発症リスクの低減効果を有する機能性食品の開発に有用な食品素材をスクリーニングすることができる。
【００３５】
請求項１６に記載の発明は、体液中における下記マーカー物質（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つの濃度を健常値に維持又は回復する効果と、血中コレステロール濃度及び／又は血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の将来の発症リスクを低減する効果とを有し、酢酸を有効成分として含有する疾病の予防剤である。
（ａ）ｐＨ７．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３０６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｂ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８３３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｃ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８９８０のイオンピークを生じるタンパク質。
【００３６】
本発明は疾病の予防剤にかかり、酢酸を有効成分として含有し、体液中における上記マーカー物質（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つの濃度を健常値に維持又は回復する効果と、血中コレステロール濃度及び／又は血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の将来の発症リスクを低減する効果とを有するものである。本発明の疾病の予防剤によれば、上昇した血中コレステロール濃度及び／又は血中中性脂肪濃度を下げることでは改善が難しい動脈硬化等の血中コレステロール濃度上昇及び／又は血中中性脂肪濃度に伴う疾病を予防し、その発症リスクを低減することができる。
【００３７】
請求項１７に記載の発明は、機能性食品として使用される請求項１６に記載の疾病の予防剤である。
【００３８】
かかる構成により、日常的に摂取することができ、簡便に動脈硬化等の血中コレステロール濃度及び／又は血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の将来の発症リスクを低減することができる。
【発明の効果】
【００３９】
本発明の疾病の診断方法によれば、血中コレステロール濃度及び／又は血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の発症の有無に加え、当該疾病の将来の発症リスクを判定することができる。
【００４０】
本発明の物質の評価方法によれば、被検物質が有する血中コレステロール濃度及び／又は血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果に加え、当該疾病の将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。
【００４１】
本発明の物質のスクリーニング方法によれば、血中コレステロール濃度及び／又は血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果を有する物質に加え、当該疾病の将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングすることができる。
【００４２】
本発明の疾病の予防剤によれば、動脈硬化等の血中コレステロール濃度及び／又は血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病を予防し、その発症リスクを低減することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
以下、本発明を実施するための最良の形態について詳細に説明する。
【００４４】
本発明の疾病の診断方法は、被検者の体液中における下記マーカー物質（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つの濃度を健常値と比較し、血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の発症の有無、又は将来の発症リスクを判定するものである。
（ａ）ｐＨ７．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３０６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｂ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８３３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（ｃ）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８９８０のイオンピークを生じるタンパク質。
これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質である。なお、被検者が血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の発症している場合、又は当該疾病の将来の発症リスクがある（又は高い）場合は、体液中のマーカー物質（ａ）及び（ｂ）の濃度はより低値を示し、マーカー物質（ｃ）の濃度はより高値を示す。
【００４５】
なお、マーカー物質（ｂ）は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質である。また、マーカー物質（ｃ）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質である。これらのアミノ酸配列は、例えば、各マーカー物質のトリプシン消化物をペプチドマッピングに供することにより、検出される。
【００４６】
本発明の疾病の診断方法で使用する健常値は、例えば、血中コレステロール濃度及び／又は血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病を発症していないと確定診断された健常人における上記マーカー物質（ａ）〜（ｃ）の体液中の濃度データを収集し、その濃度値を元に設定することができる。当該疾病の将来の発症リスクを判定する場合も、当該健常人における濃度値を元に健常値を設定することができる。なお、健常値を段階的に複数設定し、疾病の発症の有無又は将来の発症リスクを定量的に判定することもできる。
【００４７】
本発明の疾病の診断方法において使用する体液としては、血液が好ましく用いられる。特に、被検者から採取した血液から調製した血清又は血漿（体液成分）を測定試料とすることが好ましい。血清又は血漿は遠心分離等の公知の方法で血液から調製することができる。
【００４８】
本発明の疾病の診断方法において、マーカー物質の濃度を測定する方法は、そのマーカー物質の濃度を特異的に測定できる方法であれば、タンパク質の定量に一般に用いられている方法をそのまま用いることができる。例えば、各種のイムノアッセイ、質量分析（ＭＳ）、クロマトグラフィー、電気泳動等を用いることができる。
【００４９】
イムノアッセイによれば、夾雑物質の多い試料のままでも正確にマーカー物質の濃度を測定することができる。イムノアッセイの例としては、抗原抗体結合物を直接的又は間接的に測定する沈降反応、凝集反応、溶血反応などの古典的な方法や、標識法と組み合わせて検出感度を高めたエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）等の方法が挙げられる。なお、これらのイムノアッセイに用いるマーカー物質に特異的な抗体は、モノクローナルでもよいし、ポリクローナルでもよい。
【００５０】
質量分析によれば、各マーカー物質由来のイオンピークを特定し、そのイオンピーク強度をもって各マーカー物質の量（濃度）を測定することができる。質量分析によってマーカー物質の濃度を測定する場合のイオン化の方法としては、マトリクス支援レーザーイオン化（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、ＥＳＩ）のいずれも適用可能であるが、多価イオンの生成が少ないＭＡＬＤＩが好ましい。特に、飛行時間質量分析計（ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒ、ＴＯＦ）と組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによれば、より正確にマーカー物質由来のイオンピークを特定することができる。
【００５１】
電気泳動によりマーカー物質の濃度を測定する場合は、例えば、検査材料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供して目的のマーカー物質を分離し、適宜の色素や蛍光物質でゲルを染色し、目的のマーカー物質に相当するバンドの濃さや蛍光強度を測定すればよい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥだけではマーカー物質の分離が不十分な場合は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）と組み合わせた２次元電気泳動を用いることもできる。さらに、ゲルから直接検出するのではなく、ウエスタンブロッティングを行って膜上のマーカー物質の量を測定することもできる。
【００５２】
クロマトグラフィーによってマーカー物質の濃度を測定する場合は、例えば、液体高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による方法を用いることができる。すなわち、試料をＨＰＬＣに供して目的のマーカー物質を分離し、そのクロマトグラムのピーク面積を測定することにより試料中のマーカー物質の濃度を測定することができる。
【００５３】
好ましい実施形態では、マーカー物質を担体上に捕捉し、その捕捉されたマーカー物質を測定対象とする。すなわち、マーカー物質に対する親和性を有する物質を担体に固定化し、その親和性を有する物質を介してマーカー物質を担体上に捕捉する。そして、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出する。本実施形態によれば、試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。本実施形態において用いることができる担体の例としては、ビーズ、金属、ガラス、樹脂等のような一般的なものの他、基板のような、平面部分を有する担体を用いることができる。基板を用いる場合は、その平面部分の一部にマーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化することが好ましい。例としては、基板としてチップを用い、その表面の複数箇所にスポット的にマーカー物質に親和性を有する物質を固定化した担体が挙げられる。なお「親和性」の例としては、イオン結合、さらに、抗原と抗体、酵素と基質、若しくはホルモンとレセプターのようなバイオアフィニティ、金属キレート体とタンパク質中のヒスチジン残基等とのアフィニティ、疎水性相互作用のような化学的な相互作用、が挙げられる。
【００５４】
イオン結合によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、イオン交換体を担体に固定化する。この場合、イオン交換体には陽イオン交換体、陰イオン交換体のいずれも用いることができ、さらに、強陽イオン交換体、弱陽イオン交換体、強陰イオン交換体、弱陰イオン交換体のいずれも用いることができるが、弱陽イオン交換体が好ましく用いられる。弱陽イオン交換体の例としては、カルボキシメチル（ＣＭ）等の弱陽イオン交換基を有するものが挙げられる。また、強陽イオン交換体の例としては、スルホプロピル（ＳＰ）等の強陽イオン交換基を有するものが挙げられる。また、弱陰イオン交換体の例としては、ジメチルアミノエチル（ＤＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）等の弱陰イオン交換基を有するものが挙げられる。さらに、強陰イオン交換体の例としては、４級アンモニウム（トリメチルアミノメチル）（ＱＡ）、４級アミノエチル（ジエチル，モノ・２−ヒドロキシブチルアミノエチル）（ＱＡＥ）、４級アンモニウム（トリメチルアンモニウム）（ＱＭＡ）等の強陰イオン交換基を有するものが挙げられる。
【００５５】
抗体によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、マーカー物質に特異的な抗体を担体に固定化すればよい。
【００５６】
金属キレート体を介してマーカー物質を捕捉する場合は、例えば、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、Ｎｉ2+、Ｃｏ2+、Ａｌ3+、Ｆｅ3+、Ｇａ3+等の金属キレート体を固定化した担体を用いることができる。疎水性相互作用によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、担体に疎水基をもつ物質を固定化する。疎水基の例としては、Ｃ４〜Ｃ２０のアルキル基、フェニル基等が挙げられる。
【００５７】
本実施形態においてマーカー物質の測定方法にイムノアッセイを用いる場合は、抗体を固定化した担体を用いることが好ましい。このようにすれば、担体に固定化された抗体を１次抗体としたイムノアッセイの系を簡単に構築することができる。例えば、マーカー物質に特異的でエピトープの異なる２種類の抗体を用意し、一方を１次抗体として担体に固定化し、他方を２次抗体として酵素標識し、サンドイッチＥＩＡの系を構築することができる。その他、結合阻止法や競合法によるイムノアッセイの系も構築可能である。さらに、担体として基板を用いる場合は、抗体チップによるイムノアッセイが可能である。抗体チップによれば、複数のマーカー物質の濃度を同時に測定でき、迅速な測定が可能である。
【００５８】
一方、本実施形態において質量分析を用いる場合は、例えば、抗体の他、イオン交換体や疎水基を固定化した担体を用いることができる。なお、イオン結合や疎水性相互作用は抗原と抗体等のバイオアフィニティほどの特異性がないので、イオン交換基や疎水基を固定化した担体を用いる場合はマーカー物質以外の物質も担体上に捕捉されうるが、質量分析によれば分子量を反映した質量分析計スペクトルによって定量するので、問題はない。特に、担体として基板を用い、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）−飛行時間質量分析（ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（以下、「ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ」と称する）を行うことにより、マーカー物質の濃度をより正確に測定することができる。使用できる基板の種類としては、陽イオン交換基板、陰イオン交換基板、順相基板、逆相基板、金属イオン基板、抗体基板等を用いることができるが、陽イオン交換基板、特に、弱陽イオン交換基板が好ましく用いられる。
【００５９】
本発明の疾病の診断方法によって実際に診断を行なう手順の一例を、順を追って説明する。この例では被検者の体液として血液を用い、血清を測定試料とする。マーカー物質の濃度はＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって測定する。
【００６０】
まず、被検者から血液を採取し、血清を調製して測定試料とする。次に、調製した血清をｐＨ１０．５の条件でＱＡＥ等の強陰イオン交換樹脂カラムに供する。このとき、上記のマーカー物質（ａ）〜（ｃ）は全て強陰イオン交換樹脂に捕捉される。次に、該強陰イオン交換樹脂カラムを、ｐＨ１０．０、ｐＨ９．０、ｐＨ８．０、ｐＨ７．０、ｐＨ５．０、ｐＨ４．０、ｐＨ３．０、及び有機溶媒の条件で順次溶出し、各画分を回収する。
【００６１】
まず、ｐＨ７．０の溶出画分をＣＭ等の弱陽イオン交換基板に接触させ、次いで、ｐＨ７．０の条件で洗浄する。このとき、マーカー物質（ａ）が基板上に捕捉される。一方、ｐＨ３．０の溶出画分をＣＭ等の弱陽イオン交換基板に接触させ、次いで、ｐＨ４．０の条件で洗浄する。このとき、マーカー物質（ｂ）と（ｃ）が基板上に捕捉される。
【００６２】
次に、各基板をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供し、検出される各マーカー物質のイオンピークの強度を測定する。すなわち、マーカー物質（ａ）の濃度はＭ／Ｚが約３０６０のイオンピーク強度から、マーカー物質（ｂ）の濃度はＭ／Ｚが約８３３０のイオンピーク強度から、マーカー物質（ｃ）の濃度はＭ／Ｚが約８９８０のイオンピーク強度から、算出される。そして、各イオンピーク強度をあらかじめ設定した各健常値と比較する。各健常値は、あらかじめ健常者の血液で同様の操作を行って得たイオンピーク強度を元に設定する。そして、マーカー物質（ａ）の濃度が健常値より低いか、マーカー物質（ｂ）の濃度が健常値より低いか、マーカー物質（ｃ）の濃度が健常値より高い場合、被検者が血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の発症している、又は当該疾病の将来の発症リスクがあると判定する。この際、全てのマーカー物質において陽性であった場合は、一部のマーカー物質のみ陽性であった場合に比べてより当該疾病の将来の発症リスクが高いと判定することもできる。
【００６３】
本発明の物質の評価方法は、２つの様相を含む。１つの様相では、本発明の疾病の診断方法によって、被検物質を摂取させた被検者を診断し、該診断結果に基づいて被検物質が有する血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を評価する。本様相の物質の評価方法においても、上記した本発明の疾病の診断方法の実施形態と全く同様の実施形態をとることができる。
【００６４】
本発明の物質の評価方法の他の様相では、被検物質とコレステロールとを同時摂取させた動物の体液中における上記マーカー物質（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被検物質が有する血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を評価するものである。なお、被検物質が血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有する場合、体液中のマーカー物質（ａ）及び（ｂ）の濃度はより高値を示し、マーカー物質（ｃ）の濃度はより低値を示す。
【００６５】
好ましい実施形態では、上記基準値として、高コレステロール食を摂取させた動物の体液中における前記マーカー物質の濃度を用いる。すなわち、高コレステロール食を摂取させる動物では飼育日数の経過とともに血中コレステロール濃度及び／又は血中中性脂肪濃度が上昇するので、血中コレステロール濃度及び／又は血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病を発症しているか、将来の発症リスクが高いと考えられ、本実施形態では当該基準値は「異常値」となる。そして、被検物質とコレステロールとを同時摂取させた動物における値（測定値）と当該基準値（異常値）とを比較し、測定値が基準値と有意に差がありかつ正常側である場合（正常側に維持された場合）に、当該被検物質が血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。具体的には、マーカー物質（ａ）又は（ｂ）を指標とする場合は、測定値が当該基準値に比べて有意に高いときに、マーカー物質（ｃ）を指標とする場合は、測定値が基準値に比べて有意に低いときに、当該被検物質が血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。なお、高コレステロール食は、例えば、通常食にコレステロールを添加することにより調製することができる。高コレステロール食におけるコレステロール含量としては特に限定はないが、例えば０．１〜１０％の範囲を挙げることができる。
【００６６】
さらに、基準値は複数あってもよい。例えば、上記の異常値に加え、通常食を摂取させた動物における値（正常値。陰性対照。）を基準値に加えることができる。具体的には、（１）通常食を摂取（正常値）、（２）高コレステロール食を摂取（異常値）、（３）被検物質とコレステロールとを同時摂取、の３群を設定し、動物を飼育する。そして、各動物の体液中の上記マーカー物質を測定し、各測定値を比較する。このとき、（１）と（２）とで有意差があり、（３）と（２）とで有意差があり、かつ（３）が（２）に比べて正常側（（１）に近い側）である場合（正常側に維持された場合）に、当該被検物質が血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。すなわち、被検物質に血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果があれば、（３）において血中コレステロール濃度及び／又は血中中性脂肪濃度が正常値に維持され、マーカー物質の濃度が正常値である（１）に近い値をとる。
【００６７】
さらに、基準値として、血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有する既知物質とコレステロールとを同時摂取させた動物における値（陽性対照）を加えることもできる。具体的には、上記（１）〜（３）に加えて、（４）上記既知物質とコレステロールとを同時摂取させる群、を設定し、動物を飼育する。このとき、（１）と（２）とで有意差があり、（３）と（２）とで有意差があり、かつ（３）が（２）に比べて正常側（（１）及び（４）に近い側）である場合に、当該被検物質が血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。すなわち、このような被検物質は、（４）で採用した上記既知物質と同様の挙動を示し、同様の作用を有する物質といえる。
【００６８】
本様相の物質の評価方法に使用する動物としては、特に限定はなく、例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタ等を使用することができる。特に、ラットとマウスはその飼育が容易であるので、本様相の物質の評価方法に好ましくに用いられる。動物の飼育方法としては特に限定はなく、例えば、飼料を自由摂取させて、３〜２０日程度飼育すればよい。
【００６９】
本様相の物質の評価方法において使用する動物の体液としては、血液が好ましく用いられる。特に、血液から調製した血清又は血漿（体液成分）を測定試料とすることが好ましい。血清又は血漿は遠心分離等の公知の方法で血液から調製することができる。
【００７０】
本様相の物質の評価方法によって実際に被検物質の評価を行なう手順の一例を、順を追って説明する。この例では、まず、（１）通常食を摂取、（２）高コレステロール食を摂取、（３）被検物質とコレステロールを同時摂取、の３群のラットの群を設定する。また、動物の体液として血液を用い、血清を測定試料とする。マーカー物質の濃度はＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって測定する。
【００７１】
まず、ラットを各群に数匹ずつ用意し、それぞれの餌を摂取させる。３〜２０日間飼育後、各ラットから全血を採取する。さらに、採取した血液から血清を調製し、測定試料とする。次に、上記した本発明の疾病の診断方法によって実際に診断を行なう手順の一例と同様の手順によって、調製した血清を分画し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、検出される各マーカー物質のイオンピークの強度を測定する。そして、各イオンピーク強度を（１）〜（３）の群で相互比較する。このとき、マーカー物質（ａ）又は（ｂ）を指標とする場合は、（１）の値が（２）の値と比較して有意に高く、かつ（３）の値が（２）の値と比較して有意に高いときに、当該被検物質が血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価する。また、マーカー物質（ｃ）を指標とする場合は、（１）の値が（２）の値と比較して有意に低く、かつ（３）の値が（２）の値と比較して有意に低いときに、当該被検物質が血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価する。
【００７２】
本発明の物質の評価方法における被検物質としては、食品素材、医薬原体などが挙げられる。特に、食品素材を評価対象とする場合は、機能性食品の開発に役立てることができる。
【００７３】
本発明の物質の評価方法を簡便に行なうために、必要な試薬類をまとめて評価用キットを構築することができる。当該評価用キットとしては、例えば、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むものが挙げられる。特に、担体として、ＣＭ等の弱陽イオン交換体やマーカー物質に対する抗体を固定化した基板を含めた評価用キットによれば、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳや抗体チップによるイムノアッセイを簡便に行なうことができる。本キット中には他の試薬類、例えば、標準物質、前処理用の各種緩衝液等を含めてもよい。
【００７４】
本発明の物質のスクリーニング方法は、本発明の物質の評価方法によって被検物質を評価し、血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするものである。本発明の物質のスクリーニング方法においても、上記した本発明の物質の評価方法の実施形態と全く同様の実施形態をとることができる。さらに、上記した評価用キットと同様の構成からなるスクリーニング用キットを構築することもできる。
【００７５】
本発明の疾病の予防剤は、体液中における下記マーカー物質（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つの濃度を健常値に維持又は回復する効果と、血中コレステロール濃度及び／又は血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の将来の発症リスクを低減する効果とを有し、酢酸を有効成分として含有するものである。本発明の予防剤の形態としては特に制限はなく、酢酸を希釈した液体状、適宜の基剤に酢酸を含ませた固体状等が挙げられるが、酢酸を含む飲料の形態が摂取容易であり好ましい。すなわち、そのような飲料は機能性食品として日常的に食することが可能である。当該飲料における酢酸の含量としては、例えば、食酢の酢酸含量である５％程度を挙げることができる。酢酸の１日当たりの摂取量としては、１００〜２０００ｍｇ程度（２〜４０ｍＬ程度の食酢に相当）、好ましくは５００〜１５００ｍｇ程度（１０〜３０ｍＬ程度の食酢に相当）を挙げることができる。
【００７６】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７７】
１．マーカー物質の探索
５週齢のＳＤラット（日本ＳＬＣ社）を１群当たり８匹用意した。第１群のラットには、普通食としてＡＩＮ９３Ｇ（オリエンタル酵母社）を摂取させた（正常ラットの群）。一方、第２群のラットには、高コレステロール食として１％コレステロールを含むＡＩＮ９３Ｇを摂取させた（血中コレステロール濃度及び／又は血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病を発症しているか、将来の発症リスクが高いラットの群）。各飼料は自由摂取させ、１９日間飼育した。その後、各群から異常が特になかった４匹を任意に選び、全血を採取し、血清を調製した（各群４サンプル）。さらに、各群ごとに各血清を１５μＬずつ混合し（計６０μＬ）、血清サンプルを作製した（各群１サンプル）。
【００７８】
まず、日立製自動分析器７３６−１０を使用して、各血清サンプルのコレステロール濃度を測定した。その結果、第１群のラットでは、飼育終了時において血中コレステロール濃度は５７ｍｇ／ｄＬで正常値であった。一方、第２群のラットでは、飼育終了時に血中コレステロール濃度が１０５ｍｇ／ｄＬにまで上昇していた。同様にして各血清サンプルの中性脂肪濃度を測定した。その結果、第１群のラットでは、飼育終了時において血中中性脂肪濃度は５９ｍｇ／ｄＬで正常値であった。一方、第２群のラットでは、飼育終了時に血中中性脂肪濃度が１１３ｍｇ／ｄＬにまで上昇していた。以上より、本動物実験の成立性が裏付けられた。
【００７９】
強陰イオン交換樹脂Ｑ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄ（バイオセプラ社）の５０％スラリー５００μＬをＵＬＴＲＡＲＥＥ−ＣＬ０．４５μｍ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ（ミリポア社）に添加し、軽く遠心した。次に、カラムを５００μＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭ  グリシン−ＮａＯＨ，０．１％１−ｏ−Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（以下、「ＯＧＰ」と称する。），ｐＨ１０．５）で２回洗浄し、分画用カラムとした。
【００８０】
各血清サンプルに、変性バッファー（９Ｍ  尿素、２％  ＣＨＡＰＳを含む緩衝液Ａ）９０μＬを添加して混合し、４℃で２０分間変性処理した。この変性処理済み血清サンプルに１３５０μＬの緩衝液Ａを加えて１０倍希釈し、以下の分画操作に供した。
【００８１】
１０倍希釈した各サンプルを分画用カラムに供した後、遠心処理（２００×ｇ、５分、４℃）し、素通り画分を回収した。次に、２００μＬの緩衝液Ａを加えて同様の遠心処理を行い、さらに２００μＬの緩衝液Ａを加えて同様の遠心処理を行ない、素通り画分を回収した。次に、２００μＬの緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  グリシン−ＮａＯＨ，０．１％  ＯＧＰ，ｐＨ１０．０）を加えて同様の遠心処理を行い、さらに同じ操作を繰り返してｐＨ１０．０の溶出画分を回収した。同様の操作を、緩衝液Ｃ（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ，０．１％  ＯＧＰ，ｐＨ９．０）、緩衝液Ｄ（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ，０．１％  ＯＧＰ，ｐＨ８．０）、緩衝液Ｅ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ，０．１％  ＯＧＰ，ｐＨ７．０）、緩衝液Ｆ（５０ｍＭ  酢酸ナトリウム−ＨＣｌ，０．１％  ＯＧＰ，ｐＨ５．０）、緩衝液Ｇ（５０ｍＭ  酢酸ナトリウム−ＨＣｌ，０．１％  ＯＧＰ，ｐＨ４．０）、緩衝液Ｈ（５０ｍＭ  クエン酸ナトリウム−ＨＣｌ，０．１％  ＯＧＰ，ｐＨ３．０）、及び、０．１％  トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を順に用いて行い、ｐＨ９．０、ｐＨ８．０、ｐＨ７．０、ｐＨ５．０、ｐＨ４．０、ｐＨ３．０、及び、ＴＦＡの各溶出画分を回収した。
【００８２】
得られた各画分１０μＬをｐＨ４．０のプロテインチップ結合バッファー（１００ｍＭ  酢酸ナトリウム）又はｐＨ７．０のプロテインチップ結合バッファー（１００ｍＭ  リン酸、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）で１０倍希釈した後、陽イオン交換チップＣＭ１０（サイファージェン社）に添加した。同様に、得られた各画分１０μＬをｐＨ７．０のプロテインチップ結合バッファーで１０倍希釈した後、銅修飾チップＩＭＡＣ３０（サイファージェン社）に添加した。各プロテインチップを各結合バッファーで３回洗浄した後に脱イオン水で１回洗浄し、乾燥させた。次に、エネルギー吸収分子であるシナピン酸（ＳＰＡ）を添加し、プロテインチップリーダーＭｏｄｅｌ  ＰＢＳ  ＩＩｃ（サイファージェン社）を用いて、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった。なお、測定分子量範囲（Ｍ／Ｚ）は、３０００〜２０００００の範囲で行なった。また、測定は２連で行い、Ｍ／Ｚの平均値を算出した。データ解析は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｉｐ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＣｉｐｈｅｒｇｅｎＥｘｐｒｅｓｓ  Ｄａｔａ  Ｍａｇｎａｇｅｒ、及びＢｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（いずれもサイファージェン社）を用いて行なった。具体的には、ベースライン補正、分子量校正、スペクトルの正規化処理を行なった後、シングルマーカー解析及び数本のマーカーを組み合わせたマルチフロー解析を行なった。その結果、プロテインチップの種類、画分の種類、チップの洗浄条件等の組み合わせによって多数のピークが検出された。これらのピークのうち、第１群と第２群とで有意に差が見られた複数のピークについて、ｐ値、ＲＯＣ面積、及びイオンピーク強度を算出した。その結果から、３種のピークをピックアップした。
【００８３】
２．マーカー物質（ａ）の特定
ｐＨ７．０の溶出画分を陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ７．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が３０６３（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークは、第１群で高値を示し、第２群で低値を示した。図１に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。図中、髭の上端と下端はそれぞれ最大値と最小値、箱の上辺と下辺はそれぞれ第３四分位（７５パーセンタイル）と第１四分位（２５パーセンタイル）、箱の中の線は中央値である。なお、第３群については後述する（以上、図２、図３についても同じ）。その結果、本ピークのｐ値は０．０３１であった。以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約３０６０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（ａ））が、血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病を発症しているラット、又は将来の発症リスクが高いラットに特異的な物質で、当該疾病のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、ヒトの血液中にもマーカー物質（ａ）が存在する場合に、血中におけるマーカー物質（ａ）の濃度を指標として、血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の発症の有無、又は将来の発症リスクを判定することができることが示された。さらに、被検物質とコレステロールとを同時摂取させた動物の血中におけるマーカー物質（ａ）の濃度を指標として、被検物質が有する血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果の評価、及び、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって血清サンプルを調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約３０６０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００８４】
３．マーカー物質（ｂ）の特定
ｐＨ３．０の溶出画分を陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ４．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が８３２５（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークは、第１群で高値を示し、第２群で低値を示した。図２に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、ｐ値は０．０２１であった。以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約８３３０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（ｂ））の血中濃度が、血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病を発症しているラット、又は将来の発症リスクが高いラットに特異的な物質で、当該疾病のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、ヒトの血液中にもマーカー物質（ｂ）が存在する場合に、血中におけるマーカー物質（ｂ）の濃度を指標として、血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の発症の有無、又は将来の発症リスクを判定することができることが示された。さらに、被検物質とコレステロールとを同時摂取させた動物の血中におけるマーカー物質（ｂ）の濃度を指標として、被検物質が有する血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果の評価、及び、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって血清サンプルを調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約８３３０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００８５】
さらに、以下の手順で、マーカー物質（ｂ）に対してペプチドマッピングを行なった。すなわち、ｐＨ３．０の溶出画分を非還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、マーカー物質（ｂ）に相当するバンドを確認した。そのバンドに対して、ゲル内でトリプシン消化し、精製したポリペプチドを回収し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供した。その結果、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが検出された。なお、別途このバンドを切り出し、８Ｍ  尿素，１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む緩衝液を用いてタンパク質を抽出した。この抽出されたタンパク質に対して、ＣＭ１０プロテインチップを用いて同様のＳＥＬＤＩ−ＭＳ−ＴＯＦを行った。その結果、マーカー物質（ｂ）に由来する質量／電荷比が約８３３０のピークが検出され、このバンドにマーカー物質（ｂ）が含まれることが確認された。
【００８６】
４．マーカー物質（ｃ）の特定
ｐＨ３．０の溶出画分を陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ４．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が８９８０（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークは、第１群で低値を示し、第２群で高値を示した。図３に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、ｐ値は０．０１５であった。以上より、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約８９８０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（ｃ））の血中濃度が、血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病を発症しているラット、又は将来の発症リスクが高いラットに特異的な物質で、当該疾病のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、ヒトの血液中にもマーカー物質（ｃ）が存在する場合に、血中におけるマーカー物質（ｃ）の濃度を指標として、血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の発症の有無、又は将来の発症リスクを判定することができることが示された。さらに、被検物質とコレステロールとを同時摂取させた動物の血中におけるマーカー物質（ｃ）の濃度を指標として、被検物質が有する血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果の評価、及び、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。例えば、所望の被検物質を使用して同様の動物実験を行なって血清サンプルを調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約８９８０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被検物質は、血中コレステロール濃度及び／若しくは血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
【００８７】
さらに、以下の手順で、マーカー物質（ｃ）に対してペプチドマッピングを行なった。すなわち、ｐＨ３．０の溶出画分を還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、マーカー物質（ｃ）に相当するバンドを確認した。そのバンドに対して、ゲル内でトリプシン消化し、精製したポリペプチドを回収し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供した。その結果、配列番号２及び配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる２種のポリペプチドが検出された。なお、別途このバンドを切り出し、８Ｍ  尿素，１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む緩衝液を用いてタンパク質を抽出した。この抽出されたタンパク質に対して、ＣＭ１０プロテインチップを用いて同様のＳＥＬＤＩ−ＭＳ−ＴＯＦを行った。その結果、マーカー物質（ｃ）に由来する質量／電荷比が約８９８０のピークが検出され、このバンドにマーカー物質（ｃ）が含まれることが確認された。
【００８８】
５．モデル被検物質を用いた評価実験
モデル被検物質として酢酸を選択し、飼料以外は全て上記１と同じ条件の動物実験を、上記１の第１群、第２群と同時並行で行なった。すなわち、第３群として、酢酸とコレステロールとを同時摂取させるラットの群を設定した。飼料として、１％コレステロールと０．３％酢酸を含むＡＩＮ９３Ｇ（酢酸を添加した高コレステロール食）を自由摂取させた。飼育終了後、上記した第１群と第２群のラットの場合と同様にして。血清の調製、分画、及び、ＣＭ１０プロテインチップを用いたＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった。そして、マーカー物質（ａ）に由来する質量／電荷比が約３０６０のピーク、マーカー物質（ｂ）に由来する質量／電荷比が約８３３０のピーク、及びマーカー物質（ｃ）に由来する質量／電荷比が約８９８０のピークの強度を算出した。その結果、図１に示すように、マーカー物質（ａ）については、第３群では第２群に比べて高値を示し、第１群に近い値に維持されていた。また、図２に示すように、マーカー物質（ｂ）については、第３群では第２群に比べて高値を示し、第１群に近い値に維持されていた。また、図３に示すように、マーカー物質（ｃ）については、第３群では第２群に比べて低値を示し、第１群に近い値に維持されていた。以上より、酢酸がマーカー物質（ａ）〜（ｃ）の濃度を正常値に維持又は回復し、血中コレステロール濃度及び／又は血中中性脂肪濃度の上昇に伴う疾病の将来の発症リスクを低減する効果を有することがわかった。
【００８９】
なお、日立製自動分析器７３６−１０を使用して、第３群の血清サンプルのコレステロール濃度を測定したところ、８５ｍｇ／ｄＬであった。すなわち、第２群の血清サンプルよりも低く、血中コレステロール濃度の上昇が抑えられていた。同様に第３群の血清サンプルの中性脂肪濃度を測定したところ、７４ｍｇ／ｄＬであった。すなわち、第２群の血清サンプルよりも低く、血中中性脂肪濃度の上昇が抑えられていた。以上より、本動物実験の成立性が裏付けられた。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】質量／電荷比が３０６３（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図２】質量／電荷比が８３２５（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図３】質量／電荷比が８９８０（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。
【図１】
2007064747.tif 000003
【図２】
2007064747.tif 000004
【図３】
2007064747.tif 000005
【配列表】
2007064747000001.app