(57)【要約】      （修正有）【課題】有用遺伝子を動物細胞において効率よく発現させるプロモーター、及び該プロモーターを用いた遺伝子発現方法を提供する。【解決手段】特定な配列又はその一部を含むＤＮＡであって、かつ、動物細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ、該ＤＮＡと有用遺伝子とを発現可能な状態で連結したことを特徴とする組換えＤＮＡ、該組換えＤＮＡを含有するベクター、該組換えＤＮＡを導入してなる動物細胞、該ベクターで形質転換されてなる動物細胞、該動物細胞を有する動物、該ＤＮＡを用いた動物細胞によるタンパク質の製造方法、有用遺伝子の発現方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号４で示される配列又はその一部を含むＤＮＡであって、かつ、動物細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ。
【請求項２】
配列表の配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群より選択される配列又はその一部を含む請求項１記載のＤＮＡ
【請求項３】
請求項１又は２記載のＤＮＡとハイブリダイズすることができるＤＮＡであって、かつ、動物細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか一項に記載のＤＮＡと有用遺伝子とを発現可能な状態で連結したことを特徴とする組換えＤＮＡ。
【請求項５】
有用遺伝子がタンパク質をコードする核酸、アンチセンスＲＮＡをコードする核酸、デコイをコードする核酸、リボザイムをコードする核酸、ｓｉＲＮＡをコードする核酸、ｓｈＲＮＡをコードする核酸、及びアプタマーをコードする核酸からなる群より選択される核酸であることを特徴とする請求項４記載の組換えＤＮＡ。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の組換えＤＮＡ又は該組換えＤＮＡに対応する配列を有する組換えＲＮＡを含有するベクター。
【請求項７】
ベクターがプラスミドベクター又はウイルスベクターであることを特徴とする請求項６記載のベクター。
【請求項８】
請求項４又は５に記載の組換えＤＮＡを導入してなる動物細胞。
【請求項９】
請求項６又は７に記載のベクターで形質転換されてなる動物細胞。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の動物細胞を有する動物。
【請求項１１】
請求項１〜３いずれか一項に記載のＤＮＡの下流にタンパク質をコードする核酸を発現可能に連結し、得られる組換えＤＮＡ又は該組換えＤＮＡに対応する配列を有する組換えＲＮＡを含有するベクターで形質転換された動物細胞を培養し、次いで培養物から該タンパク質を採取することを特徴とする動物細胞によるタンパク質の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜３いずれか一項に記載のＤＮＡの下流に有用遺伝子を発現可能に連結し、得られる組換えＤＮＡを動物細胞に導入し、次いでその動物細胞を培養することを特徴とする動物細胞による有用遺伝子の発現方法。
【請求項１３】
請求項１〜３いずれか一項に記載のＤＮＡの下流に有用遺伝子を発現可能に連結し、得られる組換えＤＮＡ又は該組換えＤＮＡに対応する配列を有する組換えＲＮＡを含有するベクターで動物細胞を形質転換し、次いでその動物細胞を培養することを特徴とする動物細胞による有用遺伝子の発現方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規なプロモーターおよび該プロモーターを用いた遺伝子発現方法に関する。更に詳しくは、動物細胞中で働き得る新規なプロモーターを含むＤＮＡ、該プロモーターの下流にタンパク質をコードする核酸を連結して得られるＤＮＡを含有するベクターを用いるタンパク質の製造方法、及び該プロモーターの下流に有用遺伝子を連結して得られたＤＮＡあるいは該ＤＮＡを含有するベクターを動物細胞に導入することによる有用遺伝子の発現方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
動物由来の有用遺伝子産物を遺伝子工学的に製造する場合、大腸菌、枯草菌、酵母等の微生物宿主を用いると遺伝子産物が発現されなかったり、遺伝子産物である蛋白が正しい立体構造をとらない、翻訳後修飾が正しくなされない等の理由で活性を持たなかったりすることがしばしば起こる。その問題の解決のために動物細胞が宿主として用いられることが多く、この場合プロモーターの選択が発現効率に大きな影響を与える。従来、頻繁に用いられてきた動物細胞用プロモーターとしては、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、アクチンプロモーター等がある。
ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ）遺伝子のプロモーターとしては、Ｈ２０４プロモーター（例えば、特許文献１および非特許文献１）およびＨ１５プロモーター（非特許文献１）が知られている。
【特許文献１】特開平９−１０７９７７号公報
【非特許文献１】ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第２３８巻、第８５３〜８６１頁（１９９６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
動物細胞を宿主として有用遺伝子産物を大量に生産する場合、従来用いられてきた動物細胞用プロモーターは宿主細胞の種類によっては転写活性の点で必ずしも満足のいくものではなく、新規プロモーターの開発が待ち望まれている。したがって、本発明の第１の目的は、動物細胞においてプロモーター活性を有する新規ＤＮＡを提供することにある。本発明の第２の目的は、本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡと有用遺伝子とを発現可能な状態で連結した組換えＤＮＡを提供することにある。本発明の第３の目的は、本発明の組換えＤＮＡ又は該組換えＤＮＡに対応する配列を有する組換えＲＮＡを含有するベクターを提供することにある。本発明の第４の目的は、本発明の組換えＤＮＡを有する動物細胞および該動物細胞を有する動物を提供することにある。本発明の第５の目的は、該プロモーターを用いるタンパク質の製造方法を提供することにある。本発明の第６の目的は、該プロモーターを用いる有用遺伝子の発現方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、動物細胞で転写活性を示す新規プロモーターを得る目的で鋭意研究を続けたところ、ヒトＧｎＴ−ＩＩＩ遺伝子の上流に新規プロモーターが存在することを見出した。このプロモーターを含むＤＮＡの塩基配列を決定し、該ＤＮＡを西洋ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流に連結してルシフェラーゼ遺伝子の発現を行わしめたところ、該プロモーターが新規プロモーターであることを確認した。本発明はかかる発見に基づきさらに研究を進めて完成するに至ったものである。
【０００５】
即ち、本発明の要旨は、（１）  配列表の配列番号４で示される配列又はその一部を含むＤＮＡであって、かつ、動物細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ、（２）  配列表の配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群より選択される配列又はその一部を含む（１）記載のＤＮＡ、（３）  前記（１）又は（２）に記載のＤＮＡとハイブリダイズすることができるＤＮＡであって、かつ、動物細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ、（４）  前記（１）〜（３）のいずれかに記載のＤＮＡと有用遺伝子とを発現可能な状態で連結したことを特徴とする組換えＤＮＡ、（５）  有用遺伝子がタンパク質をコードする核酸、アンチセンスＲＮＡをコードする核酸、デコイをコードする核酸、リボザイムをコードする核酸、ｓｉＲＮＡをコードする核酸、ｓｈＲＮＡをコードする核酸、及びアプタマーをコードする核酸からなる群より選択される核酸であることを特徴とする前記（４）記載の組換えＤＮＡ、（６）  前記（４）又は（５）に記載の組換えＤＮＡ又は該組換えＤＮＡに対応する配列を有する組換えＲＮＡを含有するベクター、（７）  ベクターがプラスミドベクター又はウイルスベクターであることを特徴とする前記（６）記載のベクター、（８）  前記（４）又は（５）に記載の組換えＤＮＡを導入してなる動物細胞、（９）  前記（６）又は（７）に記載のベクターで形質転換されてなる動物細胞、（１０）  前記（８）又は（９）に記載の動物細胞を有する動物、（１１）  前記（１）〜（３）のいずれかに記載のＤＮＡの下流にタンパク質をコードする核酸を発現可能に連結し、得られる組換えＤＮＡを含有するベクターで形質転換された動物細胞を培養し、次いで培養物から該タンパク質を採取することを特徴とする動物細胞によるタンパク質の製造方法、（１２）  前記（１）〜（３）のいずれかに記載のＤＮＡの下流に有用遺伝子を発現可能に連結し、得られる組換えＤＮＡを動物細胞に導入し、次いでその動物細胞を培養することを特徴とする動物細胞による有用遺伝子の発現方法、（１３）  前記（１）〜（３）のいずれかに記載のＤＮＡの下流に有用遺伝子を発現可能に連結し、得られる組換えＤＮＡ又は該組換えＤＮＡに対応する配列を有する組換えＲＮＡを含有するベクターで動物細胞を形質転換し、次いでその動物細胞を培養することを特徴とする動物細胞による有用遺伝子の発現方法、に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のＤＮＡ断片をプロモーターとして用いることにより、目的の有用遺伝子を動物細胞において効率よく発現させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下に本発明について詳細に説明する。本明細書で言う「プロモーター」とは、特定の転写開始点（＋１）からＲＮＡポリメラーゼに転写を開始させる機能を担っているＤＮＡ配列を意味する。プロモーターの構成要素として、転写開始点から２０〜３０塩基対上流のＴＡＴＡボックスがよく知られているが、これを持たないプロモーターも多く存在するので、本明細書ではＴＡＴＡボックスの有無に関係なく上記機能を有するＤＮＡ配列をプロモーターと呼ぶ。また、この領域以外に、発現調節のためにＲＮＡポリメラーゼ以外のタンパク質が会合するために必要な領域を含んでいてもよい。また本明細書中で「プロモーター領域」と記載する場合があるが、これは本明細書で言うプロモーターを含む領域のことを示す。
【０００８】
本明細書で言う「プロモーター活性」とは、プロモーターの下流に発現可能な状態でＤＮＡを連結し、宿主（動物細胞）に導入した際、宿主内において該ＤＮＡからのＲＮＡの転写を開始させる能力および機能を有することを示す。一般的に、プロモーターの下流に、定量が容易に行えるタンパク質をコードする遺伝子（レポーター遺伝子）を発現可能な状態で連結し、これを宿主に導入し、発現されるタンパク質の量を測定することでプロモーター活性の有無や強弱を知ることができる。これと同様に、プロモーターの下流に発現可能な状態で有用遺伝子を連結し、宿主に導入した際、宿主内または宿主外において有用遺伝子の遺伝子産物の発現が確認された場合、そのプロモーターは導入した宿主においてプロモーター活性を有することになる。
【０００９】
本明細書で言う「動物細胞」の例としてはヒト由来の細胞が挙げられるが、本発明のプロモーターがその動物細胞内においてプロモーター活性を有するものであれば特に限定されるものではない。ヒト由来の細胞の他に、例えば、ヒト以外の哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、サル、チンパンジー等）、鳥類（例えば、ニワトリ、七面鳥、ウズラ、アヒル、カモ等）、爬虫類（例えば、ヘビ、ワニ、カメ等）、両生類（例えば、カエル、サンショウウオ、イモリ等）、魚類（例えば、アジ、サバ、スズキ、タイ、ハタ、ブリ、マグロ、サケ、マス、コイ、アユ、ウナギ、ヒラメ、サメ、エイ、チョウザメ等）、及び昆虫類（ショウジョウバエ、カイコ、ヨトウガ等）由来の細胞が挙げられる。
【００１０】
本明細書で言う「有用遺伝子」としては、動物細胞において発現可能なタンパク質をコードする核酸、動物細胞由来の遺伝子のアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡをコードする核酸、動物細胞由来の転写因子の結合タンパク質をコードする遺伝子あるいは転写因子の結合部位の配列または類似の配列を持つデコイをコードする核酸、動物細胞由来のｍＲＮＡを切断するリボザイムをコードする核酸、ｓｉＲＮＡをコードする核酸、及びｓｈＲＮＡをコードする核酸が挙げられる。ここで、動物細胞において発現可能なタンパク質としては、ヒトＧｎＴ−ＩＩＩ以外のタンパク質が例示される。
【００１１】
動物細胞において発現可能なタンパク質をコードする核酸としては脊椎動物由来のものが挙げられるが、本発明においてこれは限定されるものではなく、動物細胞において発現可能であれば、細菌類、放線菌類、古細菌類、酵母類、糸状菌類、子嚢菌類、担子菌類等の微生物由来のもの、植物、昆虫等の生物由来のもの、あるいはウイルス由来のもの、ウイロイド由来のもの、及びバクテリオファージ由来のものも本明細書で言う有用遺伝子に含まれる。
【００１２】
本明細書で言う「デコイ」とは、動物細胞由来の転写因子の結合タンパク質をコードする遺伝子あるいは転写因子の結合部位の配列または類似の配列を持つ核酸を示し、これらを「おとり」として細胞内に導入することで転写因子の作用を抑制するものを言う。本明細書において「リボザイム」とは、特定の配列を持つＲＮＡを切断する活性を持ったＲＮＡをいい、標的となるＲＮＡがタンパク質をコードする場合には当該タンパク質の翻訳を阻害する。リボザイムは標的とするＲＮＡの塩基配列に基づいて設計可能であり、例えば、ハンマーヘッド型リボザイムとしては、フェブス  レター（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ）、第２２８巻、第２２８〜２３０頁（１９８８）に記載の方法を用いることができる。また、ハンマ−ヘッド型リボザイムだけでなく、ヘアピン型リボザイム、デルタ型リボザイムなどのリボザイムの種類に関わらず、特定の配列を持つＲＮＡを切断するものであれば本明細書で言うリボザイムに含まれる。本明細書において「ｓｉＲＮＡ」および「ｓｈＲＮＡ」とはＲＮＡ干渉〔例えば、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第４１１巻、第６８３６号、第４９４〜４９８頁（２００１）およびプロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）、第９８巻、第１７号、９７４２〜９７４７頁（２００１）〕を惹起しうる核酸をいい、標的となるＲＮＡがタンパク質をコードする場合には当該タンパク質の翻訳を阻害する。ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは標的とするＲＮＡの塩基配列に基づいて設計可能であり、動物細胞内においてＲＮＡ干渉を惹起しうるＲＮＡであれば本明細書で言うｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡに含まれる。
【００１３】
本発明で言う「アプタマー」とは、特定の物質に特異的に結合するオリゴヌクレオチド、オリゴペプチド又はこれらの複合体を意味する。
【００１４】
本発明で言う「組換えＤＮＡに対応する配列を有する組換えＲＮＡ」とは、組換えＤＮＡに相同な配列を有する組換えＲＮＡ、すなわち、組換えＤＮＡ配列中のチミン（Ｔ）をウラシル（Ｕ）で置換した配列を持つ組換えＲＮＡのこと、又は組換えＤＮＡと相補的な配列を有する組換えＲＮＡのことを示す。
【００１５】
本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡ断片の下流に有用遺伝子を発現可能な状態で連結することにより、該遺伝子の発現を可能とすること、又は該遺伝子の発現を増強することができる。即ち、本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡと有用遺伝子とを発現可能な状態で連結してなる組換えＤＮＡがベクターを介してまたはベクターを用いずに導入された動物細胞において、有用遺伝子が発現する。ベクターとしては、プラスミドベクターまたはウイルスベクターが好ましく使用される。ベクターを使用しない場合には、ＤＮＡ断片を公知の方法、例えば以下の文献記載の方法で導入できる〔ビロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第５２巻、第４５６〜４６７頁（１９７３）、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第７巻、第２７４５〜２７５２頁（１９８７）、ジャーナル・オブ・ザ・ナショナル・カンサー・インスティチュート（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、第４１巻、第３５１〜３５７頁（１９６８）、ジ・エンボ・ジャーナル（Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ）、第１巻、第８４１〜８４５頁（１９８２）〕。
【００１６】
本発明のこのような組換えＤＮＡ断片を持つ動物細胞およびこのような動物細胞を持つ動物も本発明の範囲に含まれる。このような動物としてはヒト以外の動物が例示され、例えば、ヒト以外の哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、サル、チンパンジー等）、鳥類（例えば、ニワトリ、七面鳥、ウズラ、アヒル、カモ等）、爬虫類（例えば、ヘビ、ワニ、カメ等）、両生類（例えば、カエル、サンショウウオ、イモリ等）、魚類（例えば、アジ、サバ、スズキ、タイ、ハタ、ブリ、マグロ、サケ、マス、コイ、アユ、ウナギ、ヒラメ、サメ、エイ、チョウザメ等）、及び昆虫類（ショウジョウバエ、カイコ、ヨトウガ等）が挙げられる。本発明により発現させることができる有用遺伝子としては、前記のように例えばタンパク質をコードする核酸、アンチセンスＲＮＡをコードする核酸、デコイをコードする核酸、リボザイムをコードする核酸、ｓｉＲＮＡをコードする核酸、ｓｈＲＮＡをコードする核酸、及びアプタマーをコードする核酸などが挙げられる。
【００１７】
また、本発明は目的のタンパク質を生産する方法、本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡ断片を使用する有用遺伝子の発現方法を開示している。即ち、本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡの下流にタンパク質をコードする核酸を発現可能に連結し、得られる組換えＤＮＡをベクターを介して又はベクターを用いずに動物細胞に導入し、該動物細胞を培養し、培養物から該タンパク質を採取することによるタンパク質の製造方法も本発明の範囲に含まれる。同様に、本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡの下流に有用遺伝子を発現可能に連結し、得られる組換えＤＮＡを動物細胞に導入し、培養することによる有用遺伝子の発現方法、あるいは該組換えＤＮＡを含有するベクターで動物細胞を形質転換し、その動物細胞を培養することによる動物細胞による有用遺伝子の発現方法も本発明の範囲に含まれる。
【００１８】
本発明のＤＮＡは、動物細胞において機能するプロモーター活性を有するものであり、配列表の配列番号４で示されるＤＮＡ配列の全部又はその一部を含むものである。即ち、本発明のＤＮＡ断片は、新規なプロモーターを含むＤＮＡ断片であり、該プロモーターを含む限り、配列番号４で示されるＤＮＡ配列の中のいかなるＤＮＡ断片であってもよく、あるいは、配列番号４で示されるＤＮＡ配列の一部を含むいかなるＤＮＡ断片であってもよい。例えば、特に限定されるものではないが、配列番号１で示されるＤＮＡ断片、配列番号２で示されるＤＮＡ断片、及び配列番号３で示されるＤＮＡ断片の全部又は一部、もしくはそれらを含有するＤＮＡ断片等が挙げられる。
【００１９】
また、本発明のＤＮＡの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって、動物細胞においてプロモーター活性を有するものも、本発明に包含される。
【００２０】
ここで「ストリンジェントな条件」とは、例えば、モレキュラー  クローニング  ア  ラボラトリー  マニュアル、第２版、Ｊ．サムブルック他著（第１章、第６２頁、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー社、１９８９年発行）等の文献に記載の条件が挙げられ、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ＳＤＳと５×デンハルト〔Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕と１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡとを含む溶液中、用いるプローブのＴｍ−２５℃の温度で一晩保温する条件等が挙げられる。
【００２１】
また、上記のハイブリダイゼーションには、配列番号１〜４に示される塩基配列をもとに作製されたオリゴヌクレオチドプローブを使用してもよい。
オリゴヌクレオチドプローブのＴｍは、例えば、下記式：
Ｔｍ＝８１．５−１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）
（式中、Ｎはオリゴヌクレオチドプローブの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはオリゴヌクレオチドプローブ中のグアニン及びシトシン残基の含有量である）
により求められる。
【００２２】
また、オリゴヌクレオチドプローブの鎖長が１８塩基より短い場合、Ｔｍは、例えばＡ＋Ｔ（アデニン＋チミン）残基の含有量と２℃との積と、Ｇ＋Ｃ残基の含有量と４℃との積との和〔（Ａ＋Ｔ）×２＋（Ｇ＋Ｃ）×４〕により推定することができる。
【００２３】
前記オリゴヌクレオチドプローブの鎖長は、特に限定されないが、非特異的なハイブリダイゼーション及び非特異的なアニーリングを防止する観点から、好ましくは６塩基以上、更に好ましくは１０塩基以上であることが望ましい。また、オリゴヌクレオチドの合成の観点から、好ましくは１００塩基以下であり、更に好ましくは３０塩基以下であることが望ましい。
【００２４】
オリゴヌクレオチドの設計は当業者に公知であり、例えば、ラボマニュアルＰＣＲ、第１３〜１６頁、１９９６年宝酒造社発行を参考に設計することができる。また市販のソフト、例えば、ＯＬＩＧＯＴＭ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（タカラバイオ社製）を使用することができる。こうして設計されたオリゴヌクレオチドは公知の方法、例えば、ホスホアミダイト法、リン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等を用いて合成することができる。
【００２５】
本発明の動物細胞用のプロモーターは次のようにして発見されたものである。ヒトＧｎＴ−ＩＩＩ遺伝子は、井原ら〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第１１３巻、第６９２〜６９８頁（１９９３）〕によって、胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムコスミドライブラリーから単離されている。ヒト胎盤由来ｍＲＮＡを鋳型とし、配列表の配列番号５および配列番号６で示されるＧｎＴ−ＩＩＩ遺伝子特異的な合成ＤＮＡをアンチセンスプライマーとして用いてネスティッドＰＣＲ法により５’−ラピッド  アンプリフィケーション  オブ  ｃＤＮＡ  エンド（５’−ＲＡＣＥ）を行ったところ、配列表の配列番号７で示されるｃＤＮＡが得られた。以下、この転写産物をＦ２−１と呼ぶ。この結果から、Ｆ２−１の転写開始点の上流に相当するヒトゲノム配列がプロモーター活性を有すると予想された。ヒトゲノムＤＮＡ配列に対してホモロジーサーチを行ったところ、Ｆ２−１の転写開始点はＧｎＴ−ＩＩＩ開始コドンの約１５ｋｂ上流に位置することが明らかになった。以下、Ｆ２−１の転写開始点を含むエキソンをＦ２−１エキソン−１と呼ぶ。
【００２６】
ヒトゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列表の配列番号８で示される合成ＤＮＡと配列番号９で示される合成ＤＮＡをプライマーに用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、Ｆ２−１エキソン−１およびその上流域を含む約６ｋｂの領域を増幅した。この増幅産物をプラスミドベクターにクローニングし（このプラスミドをＧＮＴ３−ＰＣＲ５と呼ぶ）、Ｆ２−１エキソン−１の上流から該エキソンの３’末端付近までを含む約３．２ｋｂのＤＮＡ断片（断片Ａと呼ぶ）を西洋ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流に連結し、Ｈｕｈ７細胞（理研バイオリソースセンター、ＲＣＢ１３６６）に導入した。細胞を破砕した後、ルシフェラーゼ活性を測定したところ、この断片がプロモーター活性を有することが明らかになった。
【００２７】
更に、断片Ａの上流部分を欠失させた約０．６ｋｂの領域（断片Ｂと呼ぶ）、約０．３ｋｂの領域（断片Ｃと呼ぶ）及び約０．２ｋｂの領域（断片Ｄと呼ぶ）もプロモーター活性を有し、特に断片Ｂは断片Ａよりも強いプロモーター活性を有することが分かった。このようにして、本発明者らは、ヒトＧｎＴ−ＩＩＩ遺伝子のコード域上流約１５ｋｂに位置する約０．２〜約３．２ｋｂを含むＤＮＡ断片が強いプロモーター活性を持つことを明らかにし、本発明に到達するに至った。以下に本発明のＤＮＡ断片の取得方法について詳細に説明する。なお、特許請求の範囲に含まれるものであれば、下記の方法以外の方法により取得されたＤＮＡ断片も本発明のＤＮＡ断片である。
【００２８】
（１）本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡ断片の塩基配列
適宜設計したプライマーを用い、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、ヒトＧｎＴ−ＩＩＩ遺伝子の上流部をＰＣＲにより増幅する。例えば配列表の配列番号８および配列番号９により示されるプライマーを用いた場合、約６ｋｂのＤＮＡ断片が増幅する。この断片を有用遺伝子との連結、該断片の部分配列の切り出し、塩基配列の決定等の目的に使用しやすいようにプラスミドベクター、たとえば、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔベクターシステム（プロメガ社製）にクローニングしてＧＮＴ３−ＰＣＲ５を得る。
【００２９】
ＧＮＴ３−ＰＣＲ５にクローニングされた約６ｋｂの断片の塩基配列は、例えばジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、第７４巻、第５４６３〜５４６７頁（１９７７）〕によって決定可能である。本発明では、公開されているヒトゲノムＤＮＡ配列（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）をもとに約３００塩基間隔にプライマーを設計し、ジデオキシ反応を行うことによってＧＮＴ３−ＰＣＲ５の塩基配列を決定した。その部分配列である断片Ａの配列は、配列表の配列番号１に示すとおりである。「（２）本発明のプロモーターを含むＤＮＡ断片の調製」に記載する方法により調整された断片Ｂ、断片Ｃおよび断片Ｄの配列は、配列表の配列番号２〜４に示すとおりである。
【００３０】
（２）本発明のプロモーターを含むＤＮＡ断片の調製
ＧＮＴ３−ＰＣＲ５に挿入されているＤＮＡを鋳型、配列表の配列番号１０および配列番号１１で示される合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行うことにより、約０．６ｋｂの断片Ｂを増幅することができる。配列表の配列番号１０で示されるプライマーはゲノムＤＮＡ配列とミスマッチを有しており、ＮｈｅＩ認識配列を含む。また、配列番号１１で示されるプライマーの５’末端にはＢｇｌＩＩ認識配列が付加されている。したがって、増幅産物はこれらの制限酵素認識配列を両端付近に持つので、適当なベクター、たとえばルシフェラーゼアッセイ用のベクターであるｐＧＬ３−Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）に容易に連結することができる。こうして作製したプラスミドをｐ（Ｆ２−１）−４Ｅと呼ぶ。
断片Ｂの内部にはＳａｃＩ認識部位が存在する。該ＳａｃＩ部位から下流の約０．５ｋｂの断片と、ＧＮＴ３−ＰＣＲ５をＳｍａＩおよびＳａｃＩにより消化して得られる約２．７ｋｂの断片をＳａｃＩ部位にて連結することにより、断片Ａが得られる。具体的には、たとえば次の方法により断片Ｂを含むプラスミドが構築可能である。ｐ（Ｆ２−１）−４ＥをＳａｃＩで消化して約０．２ｋｂの断片を除去し、そこにＧＮＴ３−ＰＣＲ５からＳａｃＩで切り出した約４．４ｋｂの断片を、ヒトゲノム配列と一致する向きに挿入することによりｐ（Ｆ２−１）−１Ｅを得る。ｐＧＬ３−Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒのマルチプルクローニングサイトを切断するＫｐｎＩおよび挿入されたヒトゲノムＤＮＡを切断するＳｍａＩによりｐ（Ｆ２−１）−１Ｅを消化した後、末端を平滑化し、セルフライゲーションさせることにより断片Ａを含むｐ（Ｆ２−１）−２Ｅを得る。
ｐ（Ｆ２−１）−１Ｅの挿入配列の下流側の末端から約０．３ｋｂの位置にＢｌｎＩ認識部位が、約０．２ｋｂの位置にＢｓｔＰＩ認識部位が存在する。ｐ（Ｆ２−１）−１ＥをＢｌｎＩ若しくはＢｓｔＰＩおよびＫｐｎＩで消化し、末端を平滑化した後にセルフライゲーションを行うことにより、断片Ｃを含むｐ（Ｆ２−１）−５Ｅおよび断片Ｄを含むｐ（Ｆ２−１）−８Ｅを作製できる。
これ以外にも、他の制限酵素で消化する方法、超音波処理によりＤＮＡを断片化する方法、ホスホアミダイト法で化学合成する方法、ポリメラーゼ連鎖反応法等を利用して調製する方法等も利用できる。例えば、配列番号１等のＤＮＡ配列から適宜プライマーを調製し、ポリメラーゼ連鎖反応法により所望のＤＮＡ断片を容易に調製することができる。
【００３１】
本発明のプロモーターの塩基配列を利用するハイブリダイゼーション法により、他の細胞由来の遺伝子から本発明のプロモーターを得ることもできる。この場合は、例えば以下の方法が適用できる。まず他の細胞の遺伝子源から得た染色体ＤＮＡのライブラリーを作製する。次にそのライブラリー中のＤＮＡを膜に固定し、この膜をあらかじめ適切な標識を付したプローブ（プローブとしては、配列表の配列番号１に記載したＤＮＡ断片（断片Ａ）、またはその一部、例えば断片Ｂ（配列番号２）、断片Ｃ（配列番号３）、または断片Ｄ（配列番号４）等が使用できる）を含む溶液中で保温し、膜上のＤＮＡとプローブとの間でハイブリッドを形成させる。
【００３２】
例えばＤＮＡを固定化した膜を、６×ＳＳＣ、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツを含む溶液中、６５℃で２０時間、プローブとハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション後、０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを含む溶液中、６５℃で３０分間洗浄することによって非特異的に吸着したプローブを洗い流し、プローブとハイブリッド形成したクローンを同定する。この操作をハイブリッド形成したクローンが単一になるまで繰り返す。こうして得られたクローンの中には、目的のプロモーター又はその一部を含むＤＮＡが挿入されている。
【００３３】
得られたＤＮＡの塩基配列を決定し、本発明のプロモーターの塩基配列と比較して、その相同性から前記のＤＮＡがプロモーターであるかどうかを推定することができる。得られた遺伝子がプロモーターの全てを含まないと考えられる場合には、得られた遺伝子を基にして合成ＤＮＡプライマーを作製し、ＰＣＲにより足りない領域を増幅したり、得られた遺伝子の断片をプローブとして、更にＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング等を行ったりすることにより、本発明のプロモーターにハイブリダイズするプロモーターの全域の塩基配列を決定することができる。こうして得られるプロモーターと推定されるＤＮＡを、レポーター遺伝子、例えば西洋ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流に連結し、動物細胞に導入した後に、該細胞のルシフェラーゼ活性を測定することにより、本発明のプロモーターであるか否かを確認できる。
【００３４】
（３）本発明の有用遺伝子の発現方法
本発明の有用遺伝子の発現方法は、このようにして得られる本発明のプロモーターの下流に有用遺伝子を発現可能に連結して得られる本発明の組換えＤＮＡを動物細胞に導入し、得られた細胞を培養することを特徴とするものである。上記のようにして調製された本発明のプロモーターを含むＤＮＡ断片の下流に目的の有用遺伝子を発現可能に連結するには、ＤＮＡリガーゼやホモポリマー法〔Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、第７５巻、第３７２７〜３７３１頁（１９７８）〕を利用することができる。
【００３５】
本発明に使用できる有用遺伝子としては、例えばインターロイキン１〜１２遺伝子、インターフェロンα、β、γ遺伝子、腫瘍壊死因子遺伝子、コロニー刺激因子遺伝子、エリスロポエチン遺伝子、形質転換増殖因子−β遺伝子、免疫グロブリン遺伝子、組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子、ウロキナーゼ遺伝子、西洋ホタルルシフェラーゼ遺伝子等の動物細胞において発現可能なタンパク質をコードする核酸、動物細胞由来の遺伝子のアンチセンスＲＮＡをコードする核酸、動物細胞由来の転写因子の結合タンパク質をコードする遺伝子あるいは転写因子結合するデコイをコードする核酸、動物細胞由来のｍＲＮＡを切断するリボザイムをコードする核酸、ｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡをコードする核酸、及びアプタマーをコードする核酸等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
上記のようにして得られる本発明の組換えＤＮＡを動物細胞用の適当なベクターに組み込んで本発明のベクターを得ることができる。かかるベクターは非ウイルスベクターであってもよく、ウイルスベクターであってもよい。例えば、ＲＮＡウイルスベクターの場合、当該ウイルスベクターのゲノムには、前記組換えＤＮＡに対応するＲＮＡが含有されている。非ウイルスベクターの例としてはプラスミドベクター、例えばｐＴＭ〔ヌクレイック  アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１０巻、６７１５〜６７３２頁（１９８２）〕、ｃｏｓ２０２〔ジ  エンボ  ジャーナル（Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ）、第６巻、第３５５〜３６１頁（１９８７）〕、ｐ９１２０３（Ｂ）〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２２８巻、第８１０〜８１５頁（１９８５）〕、ＢＣＭＧＳＮｅｏ〔ザ・ジャーナル  オブ  エクスペリメンタル  メディシン（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第１７２巻、第９６９〜９７２頁（１９９０）〕等が挙げられる。
【００３７】
得られた遺伝子発現用のプラスミドは、リン酸カルシウム法〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第７巻、第２７４５〜２７５２頁（１９８７）〕、電気穿孔法〔Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、第８１巻、第７１６１〜７１６５頁（１９８４）〕、ＤＥＡＥ−デキストラン法〔メソッズ  イン  ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２８３頁、カラムら編、ＣＲＣプレス、１９９１年発行〕、リポソーム法〔バイオテクニークス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第６巻、第６８２〜６９０頁（１９８８）〕等によって適当な宿主細胞に導入することができる。ウイルスベクターとしては、例えばレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターは、使用する宿主細胞の種類、必要とする発現量や導入遺伝子の安定性等を考慮して適宜選択すればよい。宿主細胞としては、例えばＣＯＳ１細胞、ＨＥＬＡ細胞、ＣＨＯ−２１細胞、ＢＨＫ−２１細胞等が挙げられる。得られた形質転換細胞を適当な培地で培養することにより、目的の有用遺伝子産物を効率よく製造することができる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【００３９】
実施例１
１μｇのヒト胎盤由来ポリＡ  ＲＮＡ（クロンテック社製）を鋳型とし、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いて５’−ＲＡＣＥを下記のとおり行った。なお、特記した以外の試薬類はキット付属のものを用いた。
【００４０】
まず、１ｓｔストランドｃＤＮＡを合成した。１μｌのヒト胎盤由来ポリＡ  ＲＮＡ（１μｇ／μｌ）、１μｌの５’−ＣＤＳプライマー（１０μＭ、配列表の配列番号１２で示される）、１μｌのＳＭＡＲＴ  ＩＩＡオリゴヌクレオチド（１０μＭ、配列表の配列番号１３で示される）および２μｌの精製水を混合し、７０℃で２分間インキュベートした後、氷上で冷却した。ここに２μｌの５×Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｂｕｆｆｅｒ〔２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３７５ｍＭ  ＫＣｌ、３０ｍＭ  ＭｇＣｌ２〕、１μｌのジチオスレイトール（２０ｍＭ）、１μｌのｄＮＴＰｓ  Ｍｉｘ（各１０ｍＭ）および１μｌのＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを加えて混合し、４２℃で１．５時間反応させた。反応後、２５０μｌのＴｒｉｃｉｎｅ−ＥＤＴＡ  Ｂｕｆｆｅｒ〔１０ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ（ｐＨ８．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ〕を添加し、７２℃で７分間インキュベートすることにより、１ｓｔストランドｃＤＮＡ合成反応液を得た。
【００４１】
次に、ネスティッドＰＣＲによりＧｎＴ−ＩＩＩ  ｃＤＮＡの５’末端付近を増幅した。１μｌの上記１ｓｔストランドｃＤＮＡ合成反応液、２μｌの１０×ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）、１．６μｌのｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ、タカラバイオ社製）、０．４μｌの１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ（配列表の配列番号１４で示されるロングが０．４μＭ、配列表の配列番号１５で示されるショートが２μＭ）、０．４μｌのｈＧ３  ＧＳＰ２  プライマー（１０μＭ、配列表の配列番号６で示される；ＧｎＴ−ＩＩＩ遺伝子の配列に基づき合成）、０．１μｌのＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）および１４．５μｌの精製水を混合し、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３分間のサイクルを４０回繰り返した後、７２℃で１０分間反応させた。
【００４２】
１μｌの上記ＰＣＲ反応液、２μｌの１０×ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ、１．６μｌのｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、０．４μｌのＮｅｓｔｅｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ（１０μＭ、配列表の配列番号１６で示される）、０．４μｌのｈＧ３  ＧＳＰ１  プライマー（１０μＭ、配列表の配列番号５で示される；ＧｎＴ−ＩＩＩ遺伝子の配列に基づき合成）、０．１μｌのＥｘＴａｑおよび１４．５μｌの精製水を混合し、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３分間のサイクルを３０回繰り返した後、７２℃で１０分間反応させた。
【００４３】
上記のネスティッドＰＣＲにより得られた増幅産物をｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（ノバジェン社製）にライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られた形質転換体のうち１クローンからプラスミドを調製し、挿入ＤＮＡの塩基配列を決定した。この結果、本プラスミドには配列表の配列番号７で示されるＤＮＡが挿入されていた。この配列を持つ転写産物をＦ２−１と名付けた。
【００４４】
実施例２
健常人末梢血単核球から常法によりゲノムＤＮＡを調製した。これを鋳型、配列表の配列番号８及び配列番号９で示される合成ＤＮＡをプライマーとし、ＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。この増幅産物をｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉと連結し、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。形質転換体から１個のクローンを選択し、ここからプラスミドＧＮＴ３−ＰＣＲ５を得た。公開されているヒトゲノムＤＮＡ配列をもとに約３００塩基間隔に設計したプライマーを用いてジデオキシ法によりＧＮＴ３−ＰＣＲ５の挿入配列の塩基配列を決定した。
【００４５】
実施例３
以下のようにしてルシフェラーゼアッセイ用のベクターを構築した。各ベクターに含まれるＧｎＴ−ＩＩＩプロモーター領域を図１に示す。
【００４６】
ＧＮＴ３−ＰＣＲ５の挿入配列を鋳型、配列表の配列番号１０及び配列番号１１で示される合成ＤＮＡをプライマーとし、ＥｘＴａｑを用いてＰＣＲを行った。増幅産物をＮｈｅＩとＢｇｌＩＩにより消化し、同じ制限酵素で消化したｐＧＬ３−Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒと連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換体から１個のクローンを選択し、ここからプラスミドｐ（Ｆ２−１）−４Ｅを得た。挿入配列の塩基配列を決定したところ、ＧＮＴ３−ＰＣＲ５の挿入配列の塩基配列とプライマー配列から予測される配列と一致しており、ｐ（Ｆ２−１）−４Ｅは断片Ｂを含むことが明らかになった。
【００４７】
ＧＮＴ３−ＰＣＲ５をＳａｃＩで消化して約４．４ｋｂの断片を精製した。この断片をＳａｃＩで消化したｐ（Ｆ２−１）−４Ｅと連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。複数クローンの形質転換体からプラスミドを調製し、制限酵素解析により４．４ｋｂ  ＳａｃＩ断片の向きを決定した。ヒトゲノムＤＮＡと同じ向きにＳａｃＩ断片が挿入されているクローンをこの中から選択し、ｐ（Ｆ２−１）−１Ｅを得た。ｐ（Ｆ２−１）−１Ｅは約５．０ｋｂのヒトゲノムＤＮＡを含む。
【００４８】
ｐ（Ｆ２−１）−１ＥをＫｐｎＩで消化した後、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて末端を平滑化した。さらにＳｍａＩで消化した後、ライゲーションを行い、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。ｐ（Ｆ２−１）−１Ｅから１．７ｋｂ  ＫｐｎＩ−ＳｍａＩ断片を欠失し、断片Ａを含むプラスミドであるｐ（Ｆ２−１）−２Ｅを形質転換体から得た。
【００４９】
ｐ（Ｆ２−１）−１ＥをＫｐｎＩとＢｌｎＩで消化し、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて末端を平滑化した後、ライゲーションを行い、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。ｐ（Ｆ２−１）−１Ｅから４．７ｋｂ  ＫｐｎＩ−ＢｌｎＩ断片を欠失し、断片Ｃを含むプラスミドであるｐ（Ｆ２−１）−５Ｅを形質転換体から得た。
【００５０】
ｐ（Ｆ２−１）−１ＥをＫｐｎＩとＢｓｔＰＩで消化し、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて末端を平滑化した後、ライゲーションを行い、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。ｐ（Ｆ２−１）−１Ｅから４．８ｋｂ  ＫｐｎＩ−ＢｓｔＰＩ断片を欠失し、断片Ｄを含むプラスミドであるｐ（Ｆ２−１）−８Ｅを形質転換体から得た。
【００５１】
実施例４
ヒト肝がん細胞株Ｈｕｈ７（理研バイオリソースセンター、ＲＣＢ１３６６）を１×１０５個／ｍｌとなるように１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、２４穴プレートのウェルに０．５ｍｌずつ加えて５％ＣＯ２存在下、３７℃で２４時間培養した。
【００５２】
１．２μｇのｐ（Ｆ２−１）−２Ｅ、ｐ（Ｆ２−１）−４Ｅ、ｐ（Ｆ２−１）−５Ｅ、ｐ（Ｆ２−１）−８Ｅもしくは陰性対照のｐＧＬ３−Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒ、および０．４μｌの補正用プラスミドｐＲＬ−ＴＫ（プロメガ社製）を、５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地（インビトロジェン社製）に溶解した。一方、５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地に２μｌのリポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社製）を加えて室温で５分間放置した。ここに上記プラスミド溶液を添加し、さらに２０分間室温で放置した後、上記Ｈｕｈ７細胞培養液に添加した。５％ＣＯ２存在下、３７℃で４８時間培養した。
【００５３】
培地を除去したあとリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を加えて軽く振盪してウェルの内側を洗浄し、はがれた細胞とともにＰＢＳを除去した。１ウェルあたり１００μｌの、蒸留水で５倍希釈した５×Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（プロメガ社製）を添加し、室温で１５分間緩やかに振盪して細胞溶解液を調製した。
【００５４】
Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ９４０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒ（ベルトールド社製）を用いてホタルルシフェラーゼ活性およびウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した。なお、１回の測定あたり、１０μｌの細胞溶解液と５０μｌのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＩＩ〔１バイアルのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（プロメガ社製）を１０ｍｌのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（プロメガ社製）に懸濁する〕および５０μｌのＳｔｏｐ  ＆  Ｇｌｏ  Ｒｅａｇｅｎｔ〔５０×Ｓｔｏｐ  ＆  Ｇｌｏ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（プロメガ社製）に５０倍量のＳｔｏｐ  ＆  Ｇｌｏ  Ｂｕｆｆｅｒ（プロメガ社製）を加える〕を使用した。ホタルルシフェラーゼによる発光強度をウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度で除することにより、プロモーター活性を算出した。
【００５５】
この結果、ｐ（Ｆ２−１）−２Ｅ、ｐ（Ｆ２−１）−４Ｅ、ｐ（Ｆ２−１）−５Ｅおよびｐ（Ｆ２−１）−８ＥをトランスフェクトしたＨｕｈ７細胞において高いホタルルシフェラーゼ活性が見られた。すなわち、断片Ａ、断片Ｂ、断片Ｃおよび断片ＤはＨｕｈ７細胞においてプロモーター活性を示した。その結果を図２に示す。図２は各ルシフェラーゼアッセイ用ベクターをトランスフェクトしたＨｕｈ７細胞のルシフェラーゼ活性を表すものであり、横軸はホタルルシフェラーゼによる発光強度を内部標準であるウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度で除したものである。
【００５６】
実施例５
ヒト胃がん細胞株ＫＡＴＯＩＩＩ（ＪＣＲＢ細胞バンク、ＪＣＲＢ０６１１）、Ｈｕｈ７細胞およびヒト肝がん細胞株ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ  ＨＢ−８０６５）を、それぞれ２.２×１０５個／ｍｌ、１．６×１０５個／ｍｌおよび１．２×１０５個／ｍｌとなるように１０％  ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、２４穴プレートのウェルに０．５ｍｌずつ加えて５％ＣＯ２存在下、３７℃で２４時間培養した。
【００５７】
０．６μｇのｐ（Ｆ２−１）−５Ｅもしくは陰性対照のｐＧＬ３−Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒ、および０．２μｇの補正用プラスミドｐＲＬ−ＴＫを、５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地に溶解した。一方、５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地に０．６μｌのリポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社製）を加えて室温で５分間放置した。ここに上記プラスミド溶液を添加し、さらに２０分間室温で放置した後、上記細胞培養液に添加した。５％ＣＯ２存在下、３７℃で２４時間培養した。
【００５８】
培地を除去したあとＰＢＳを加えて軽く振盪してウェルの内側を洗浄し、はがれた細胞とともにＰＢＳを除去した。１ウェルあたり１００μｌの、蒸留水で５倍希釈した５×Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを添加し、室温で１５分間緩やかに振盪したあと１５０００ｒｐｍ、１分間の遠心分離により得た上清を細胞溶解液とした。
【００５９】
Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ９４０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒを用いてホタルルシフェラーゼ活性およびウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した。なお、１回の測定あたり、１０μｌの細胞溶解液と５０μｌのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＩＩおよび５０μｌのＳｔｏｐ  ＆  Ｇｌｏ  Ｒｅａｇｅｎｔを使用した。ホタルルシフェラーゼによる発光強度をウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度で除することにより、プロモーター活性を算出した。
【００６０】
この結果、ｐ（Ｆ２−１）−５ＥをトランスフェクトしたＫＡＴＯＩＩＩ細胞、Ｈｕｈ７細胞およびＨｅｐＧ２細胞において高いホタルルシフェラーゼ活性が見られた。すなわち、断片Ｃはこれら３種類の細胞においてプロモーター活性を示した。その結果を図３に示す。図３はｐ（Ｆ２−１）−５Ｅをトランスフェクトした細胞のルシフェラーゼ活性を表すものであり、縦軸はホタルルシフェラーゼによる発光強度を内部標準であるウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度で除したものである。図３において、白い棒グラフは陰性対照であるｐＧＬ３−Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒをトランスフェクトした細胞におけるルシフェラーゼ活性を、黒い棒グラフはｐ（Ｆ２−１）−５Ｅをトランスフェクトした細胞におけるルシフェラーゼ活性を示す。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、各ルシフェラーゼアッセイ用ベクターに含まれるプロモーター領域を示す図である。
【図２】図２は、各ルシフェラーゼアッセイ用ベクターをトランスフェクトしたＨｕｈ７細胞のルシフェラーゼ活性を表す図である。
【図３】図３は、ｐ（Ｆ２−１）−５Ｅをトランスフェクトした細胞株のルシフェラーゼ活性を表す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００６２】
SEQ ID NO:5; PCR primer hG3 GSP1.
SEQ ID NO:6; PCR primer hG3 GSP2.
SEQ ID NO:8; PCR primer to amplify a F2-1 exon and upstream region thereof.
SEQ ID NO:9; PCR primer to amplify a F2-1 exon and upstream region thereof.
SEQ ID NO:10; PCR primer to anplify a fragment B.
SEQ ID NO:11; PCR primer to amplify a fragment B.
SEQ ID NO:12; 5'-CDS primer.
SEQ ID NO:13; SMART IIA oligonucleotide.
SEQ ID NO:14; PCR primer UPM long.
SEQ ID NO:15; PCR primer UPM short.
SEQ ID NO:16; Nested universal primer A.
【図１】
2007159568.tif 000002
【図２】
2007159568.tif 000003
【図３】
2007159568.tif 000004
【配列表】
2007159568000001.app