(57)【要約】      （修正有）【課題】低コスト、且つ優れた収率で乳酸を製造する方法、並びにチアミンの使用方法を提供する。【解決手段】乳酸生成能を有しない酵母に対して乳酸脱水素酵素を機能しうるかたちで導入した変異酵母サッカロマイセス  セレビシエを、チアミン濃度０．０５mg/L以上の存在下で培養する乳酸の製造方法、さらに、ピルビン酸脱炭酸酵素１が破壊されているサッカロマイセス  セレビシエでは、エタノール生産を抑制しながら、乳酸生成を促進する方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
チアミンを含有する培地で乳酸生成微生物を培養し、その後、当該培地から乳酸成分を回収する、乳酸の製造方法。
【請求項２】
上記培地中のチアミン濃度を0.05mg/L以上とする、請求項１記載の乳酸の製造方法。
【請求項３】
上記乳酸生成微生物は、乳酸生成能を有しない酵母に対して乳酸脱水素酵素を機能しうるかたちで導入した変異酵母である、請求項１記載の乳酸の製造方法。
【請求項４】
上記酵母はサッカロマイセス セレビシエである、請求項３記載の乳酸の製造方法。
【請求項５】
上記サッカロマイセス セレビシエはピルビン酸脱炭酸酵素１が破壊されているものである、請求項４記載の乳酸の製造方法。
【請求項６】
上記培地に対して上記チアミンを添加する、請求項１記載の乳酸の製造方法。
【請求項７】
上記培地は合成培地である、請求項１記載の乳酸の製造方法。
【請求項８】
チアミンを主成分とする、乳酸生成促進剤。
【請求項９】
培地に含有させて乳酸生成微生物を培養することで、培地中に含まれる乳酸成分の収率を向上させる、チアミンの使用方法。
【請求項１０】
上記培地中のチアミン濃度を0.05mg/L以上とする、請求項９記載のチアミンの使用方法。
【請求項１１】
上記乳酸生成微生物は、乳酸生成能を有しない酵母に対して乳酸脱水素酵素を機能しうるかたちで導入した変異酵母である、請求項９記載のチアミンの使用方法。
【請求項１２】
非中和条件で培養する、請求項９記載のチアミンの使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸生成能を有する酵母を用いた乳酸の製造方法に関し、具体的には、乳酸を高効率で生産するための乳酸の製造方法及び乳酸生成促進剤、並びにチアミンの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、発酵法による乳酸製造は、ショ糖、ブドウ糖、澱粉やセルロース系物質等の糖類を原料として乳酸生成能力を有する種々の微生物の発酵を利用して行われている。しかし生成速度など発酵生産効率が未だ不十分であり、この点に関しての改良が望まれている。
【０００３】
そこで、乳酸の生産効率を向上させることを目的として、乳酸発酵の際に、発酵培地に酵母エキス、ペプトン、肉エキスや麦芽エキスなどを添加する方法がよく知られている。これらの物質を添加することは、主としてアミノ酸、核酸および無機質などを含む微生物の増殖必須栄養素を提供することであると考えられているが、これらの化各物によって微生物内で乳酸発酵生産の効率が向上する理由は明らかにはされていない。発酵培地に酵母エキス等を添加することで乳酸の比率が向上するが、酵母エキス等に要するコストを負担しなければならず、また、酵母エキス等は有機物栄養素を多く含むために培地から乳酸成分を精製する工程にも多くのコストを要することとなる。安価で効率よく乳酸を生産するためには、発酵培地が低価格であり、乳酸の精製工程に負担がかからない、有機物栄養素が少ない貧栄養な培地を用いることが望ましい。
【０００４】
一方、乳酸とエタノールを発酵産物とする酵母においては、外部より添加されるニコチン酸により乳酸収率が向上するとの報告(非特許文献１：J. Ind. Microbiol, Biotechnol.,2004,31(5);209-15)がある。また、培地に添加されたピルビン酸の存在下で乳酸生成菌を培養することで、乳酸収率が向上するとの報告(特許文献１：特開2003-159091号公報)がある。
【０００５】
しかしながら、非特許文献１及び特許文献２に関するもの以外に、乳酸生成能を有する微生物において、単一の化合物を添加することで乳酸の生産効率を向上させたという報告はない。また、これらの技術による乳酸生成効率も十分とは言えないレベルである。
【０００６】
【特許文献１】特開2003-159091号公報
【非特許文献１】非特許文献１：J. Ind. Microbiol, Biotechnol.,2004,31(5);209-15
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、上述したような実状に鑑み、低コスト、且つ優れた収率で乳酸を製造することができる、新規な乳酸生成促進剤を提供することを目的とし、これにより低コストで高収率な乳酸の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述した目的を達成するため本発明者らが鋭意検討した結果、乳酸生成微生物をチアミンの存在下で培養することによって乳酸生成を促進できることを見いだし、本発明を完成するに至った。特に、エタノール生産能を併せ持つ乳酸生成微生物を使用した場合には、エタノール生産を抑制しながら、乳酸生成を促進することができることを見いだした。
【０００９】
すなわち、本発明に係る乳酸の製造方法は、チアミンを含有する培地で乳酸生成微生物を培養し、その後、当該培地から乳酸成分を回収するものである。本発明に係る乳酸の製造方法では、上記培地中のチアミン濃度を0.05mg/L以上とすることが好ましい。本発明に係る乳酸の製造方法において、上記乳酸生成微生物としては、例えば、乳酸生成能を有しない酵母に対して乳酸脱水素酵素を機能しうるかたちで導入した変異酵母を使用することができる。
【００１０】
チアミン（別称：ビタミンB1）は、ピロリン酸エステルのかたち、すなわちチアミンピロリン酸として酵母においてピルビン酸脱水素酵素（PDC）の補酵素として作用することが知られている。ピルビン酸脱水素酵素は、ピルビン酸を基質としてアセトアルデヒドを合成する活性を有している。アセトアルデヒドは、酵母等のエタノール生産能微生物においては還元されてエタノールとなる。例えば、サッカロミセス属に属する酵母はPDC1遺伝子、PDC5遺伝子及びPDC6遺伝子の3種類のPDC遺伝子を保持しているが、通常機能しているのはPDC1遺伝子であり、PDC1遺伝子が機能していない場合にPDC5遺伝子が活性化される。本機能はオートレギュレーション機構と呼ばれている。PDC6遺伝子の役割は不明である(Eur. J. Biochem., 1999, 262(1), 191-201参照)。また、サッカロミセス属に属する酵母の野生株とPDC１遺伝子破壊株とをチアミン添加培地及びチアミン欠乏培地で培養したところ、PDC酵素活性がチアミン添加培地より欠乏培地のほうがやや低いことが報告されている(FEBS Lett., 1999, 449(2-3), 245-250)。
【００１１】
このような知見及び微生物における解糖系のエタノール生合成経路を考慮すると、ピルビン酸脱水素酵素の補酵素として作用するチアミンの存在下において、エタノール生産が上昇すると予測される。
【００１２】
しかしながら、エタノール生産能を有する微生物をチアミンの存在下で培養したところ、この予測を裏切り、エタノール生産が抑制され、且つ乳酸生成が促進される。これは、当業者の予測を遙かに超える知見であって、チアミンが乳酸生成促進効果といった新たな機能を有していることを実証したことになる。
【００１３】
この知見に基づいて本発明は、チアミンを主成分とする乳酸生成促進剤を提供することができる。さらに、本発明は、培地に含有させて乳酸生成微生物を培養することで、培地中に含まれる乳酸成分の収率を向上させる、チアミンの使用方法を提供することができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、乳酸生成能を有する微生物を用いた乳酸の製造において、乳酸の生産効率を大幅に向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明に係る乳酸の製造方法では、乳酸生成能を有する微生物をチアミンの存在下で培養する。
【００１６】
乳酸生成能を有する微生物とは、糖類の存在下にL-乳酸及び/又はD-乳酸を生成する能力を有する微生物を意味する。乳酸生成能を有する微生物としては、天然から採取された微生物及び乳酸生成関連遺伝子等が機能するように形質転換された微生物を挙げることができる。本発明においては、天然の微生物及び形質転換された微生物のいずれを使用してもよい。具体的に乳酸生成能を有する微生物としては、例えばラクトバシルス(Lactobacillus)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、ペディオコッカス(Pediococcus)属、アエロコッカス(Aerococcus)属、カルボバクテリウム(Carbobacterium)属、エンテロコッカス(Enterococcus)属、エリシペロトリックス(Erysipclothorix)属、ゲメラ(Gemella)属、グロビカテラ(Globicatella)属、ラクトコッカス(Lactococcus)属、ロイコノストック(Leuconostoc)属、テトラゲノコッカス(Tetragenococcus)属、ヴァゴコッカス(Vagococcus)属、コリネ型細菌(Corynebacterium, Brevibacterium)、マイコバクテリウム(Mycobacterium)属、アースロバクター(Arthrobacter)属、エシェリチィア(Escherichia)属、セラチア(Serratia)属、アナエロビオスピラム(Anaerobioapirillum)属及びリゾプス(Rhizopus)属に属する微生物を挙げることができる。また、本発明においては、乳酸生成能を有する微生物として微細藻類を使用することもできる。
【００１７】
乳酸生成能を有しない微生物に乳酸生成能を付与する際には、例えば、乳酸の生合成に関与する遺伝子で乳酸生成能を有しない微生物を形質転換する方法を適用できる。乳酸の生合成に関与する遺伝子としては、特開2003-259878号公報に記載されている乳酸脱水素酵素遺伝子や、乳酸菌由来の遺伝子（J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31, 209-215、特表2005-518197号）、巨大菌（バチルス メガテリウム）由来の遺伝子（特表2005-518197号）、カビ（リゾプス属）由来の遺伝子（J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 30, 22-275）、ウシ由来の遺伝子（Appl. Environ. Microbiol. 67, 5621-5625）等を例示することができる。使用可能な遺伝子としては、乳酸菌等の原核生物、カビ等の真核生物、植物や動物並びに昆虫等の高等真核生物に由来する乳酸脱水素酵素を挙げることができる。
【００１８】
特に、乳酸生成能を有する微生物としては、特開2003-259878号公報に記載されている乳酸脱水素酵素遺伝子を導入した酵母を使用することが好ましい。当該乳酸脱水素酵素遺伝子は、酵母における発現が最適化されているため、酵母に形質転換されるとL-乳酸を高効率で生産することができる。なお、形質転換微生物の例としては、組み換え酵母(Appl. Environ. Microbiol.,1999,65(9);4211-4215)や組み換え大腸菌(Appl. Environ. Microbiol.,1999,65(4);1384-1389)などを挙げることができる。
【００１９】
また、本発明に係る乳酸の製造方法においては、乳酸生成能を有する微生物を1種類単独で用いても良いが、複数種を混合して用いることもできる。
【００２０】
本発明に係る乳酸の製造方法において、チアミン（別称：ビタミンB1）は、遊離の形態で使用することができるが、塩酸塩或いは硝酸塩のいずれの形態で使用することもできる。また、本発明においては、チアミンの類縁化合物を使用することもできる。チアミンの類縁化合物としては、チアミンピロリン酸、チアミンジスルフィド、アリチアミン、ジアセチルチアミン及びジベンゾイルチアミンを挙げることができる。本発明に係る乳酸の製造方法においては、これらチアミン及びチアミン類縁化合物を1種類単独で用いても良いが、複数種を混合して用いることもできる。
【００２１】
本発明に係る乳酸の製造方法において、培地に含まれるチアミン濃度は0.05mg/L以上であることが好ましい。培地のチアミン濃度が0.05mg/L以上である場合には、乳酸生成能をより顕著に向上させることが可能となる。また、乳酸生成能を有する微生物としてエタノール発酵能を併せ持つ微生物（例えば、乳酸脱水素酵素遺伝子を導入した酵母）を用いた場合には、培地中のチアミン濃度を0.05mg/L以上とすることによって、エタノール生産を抑制する効果がより顕著に表れることとなる。
【００２２】
本発明に係る乳酸の製造方法において、培地の組成は、チアミンを含む組成であって、乳酸生成能を有する微生物が生育し、且つ乳酸を生産できる各種栄養素を含む組成であれば特に限定されない。培地に含まれる資化炭素源としては、微生物に応じて適宜選択されるが、例えば、グルコース、マルトース、スクロース、糖蜜、コーンスティープリカーそしてセルロース系物質からの糖類などが用いられる。
【００２３】
また、培地に含まれる窒素源としては、例えば、酵母エキス、ヘプトンそしてホエーなどが用いられるが、安価で精製工程に負担がかからない培地にするには、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩などの無機態窒素や尿素のほうが好ましい。また、無機物栄養源としては、例えば、リン酸カリウム、硫酸マグネシウムやFe(鉄)、Mn(マンガン)化合物なども使用される。さらには、培地には、pH調整剤が含まれていても良い。
【００２４】
本発明に係る乳酸の製造方法において、乳酸は回分式、連続式のいずれの方式で生産してもよい。また、乳酸生成能を有する微生物を固定化担体に担持して乳酸を生産する方式も可能である。乳酸発酵を行うには上記培地に乳酸生成能を有する微生物を接種し、例えば培地pHが約2〜9程度で行われる。乳酸生成温度に関しては特に限定されないが、通常約20〜40℃程度で行われる。しかし、使用する微生物によっては更に高い温度でも可能である。乳酸生成に要する反応時間に関しても特に限定されず、本発明の効果が認められる限り任意の反応時間で実施される。これらの条件の最適化は当業者においては容易に定めることのできるものである。
【００２５】
本発明に係る乳酸の製造方法におていは、このようにして生産した乳酸成分を培地から分離・回収するが、乳酸成分の分離・回収方式には特に限定されない。本発明に係る乳酸の製造方法では、例えば、乳酸成分の分離濃縮手段として従来の乳酸発酵による製造プロセスで用いられる公知の方法を用いることができる。そのような公知の方法としては、例えば、1)石灰乳を加えて中和することからなる乳酸カルシウム再結晶法、2)エーテルなどの溶媒を用いる有機溶媒抽出法、3)生成乳酸をアルコールでエステル化するエステル化分離法、4)イオン交換樹脂を用いるクロマトグラフィ分離法、5)イオン交換膜を用いる電気透析法などが挙げられる。従って、本発明に係る乳酸の製造方法により得られる乳酸成分は、遊離型の乳酸のみならず、例えばナトリウム、カリウムなどとの塩や、例えばメチルエステル、エチルエステルなどのエステルの形態であってもよい。
【００２６】
本発明に係る乳酸の製造方法によれば、乳酸生成能を有する微生物における乳酸生成能を向上させることができ、その結果、高収率で乳酸を製造することができる。本発明に係る乳酸の製造方法は、使用する培地の組成に拘わらず、乳酸生成能を有する微生物における乳酸生成能を向上させることができる。したがって、本発明に係る乳酸の製造方法によれば、比較的安価な合成培地等の貧栄養な培地であっても乳酸生成能の向上を達成することができ、乳酸製造のコストを低減することができる。
【００２７】
特に、本発明に係る乳酸の製造方法によれば、乳酸脱水素酵素遺伝子を導入した酵母等に代表されるエタノール生産能を併せ持つ微生物を用いた場合、エタノール生産を抑制し、且つ、高収率で乳酸を製造することができる。エタノール生産を抑制することによって、培地に含まれる乳酸をより簡易に回収することができる。言い換えれば、乳酸の回収及び精製に要する工程を簡略化することができ、乳酸製造に要するコストを抑制することができる。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例によってより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２９】
〔実施例１〕
乳酸脱水素酵素導入酵母の作製
特開2003-259878号公報に記載された乳酸脱水素酵素遺伝子（LDH遺伝子）を用いて、同公報に記載の方法に準じて乳酸生成能を有する酵母を作製した。本実施例では、胞子形成培地(1％リン酸カリウム、0.1％イーストエキストラクト、0.05％ブドウ糖及び2％寒天を含む)で胞子を形成させ、ホモタリック性を利用して2倍化を行い、2倍体である染色体両方にLDH遺伝子が導入されている株を取得し、これをKCB-27-7株とした。
【００３０】
発酵試験１
得られた形質転換体（KCB-27-7株）について、YPD培地(イーストエキストラクト1％、ペプトン2％及びグルコース2％を含む)に植菌し、30℃で24時間培養を行った。培養終了後、遠心分離(2000g、3分)により菌体を回収した。
【００３１】
発酵培地(スクロース9.6％ 糖蜜0.4％ (NH4)2HPO40.3％ KH2PO4 0.1％)に下記表１記載の濃度になるようにチアミン塩酸塩添加した培地50mlを100ml容のフラスコに入れ、上記菌体を濃度0.5％になるように接種し、80rpm/分(震とう幅40mm)、32℃で3日間発酵を行い、乳酸とエタノールの生産量を検討した。結果を表１に示す。なお、発酵培地に含まれる糖蜜由来のチアミン濃度は0.0036mg/Lであった。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
発酵試験２
得られた形質転換体（KCB-27-7株）について、YPD培地(イーストエキストラクト1％、ペプトン2％及びグルコース2％を含む)に植菌し、30℃で24時間培養を行った。培養終了後、遠心分離(2000g、3分)により菌体を回収した。
【００３４】
発酵培地(グルコース50g/L、(NH4)2S04 5g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4 500mg/L、NaCl 100mg/L、CaCl2 100mg/L、D-ビオチン0.002mg/L、D-パントテン酸カルシウム0.4mg/L、葉酸0.002mg/L、myo-イノシトール、2mg/L ニコチン酸0.4mg/L、P-アミノ安息香酸0.2mg/L、ピリドキシン塩酸塩0.4mg/L、フラビンモノヌクレオチドナトリウム0.2mg/L、H3BO30.5mg/L、CuS04 0.04mg/L、KI 0.1mg/L、FeCl3・6H2O 0.2mg/L、MnS04・5H2O 0.4mg/L、Na2MoO4・2H2O 0.2mg/L及びZnSO4・7H2O 0.4mg/Lを含む)に下記表２記載の濃度になるようにチアミン塩酸塩添加した培地50mlを100ml容のフラスコに入れ、上記菌体を濃度が0.5％になるように接種し、80rpm/分(震とう幅40mm)で32℃3日間発酵を行い、乳酸とエタノールの生産量を検討した。結果を表２に示す。
【００３５】
【表２】
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【００３６】
以上、発酵試験１及び２の結果から、乳酸生成能を有する微生物をチアミン存在下で培養することによって、当該微生物による乳酸生成能が向上していることが分かる。また、本実施例では、乳酸生成能を有する酵母を用いているが、当該酵母によるエタノール生産が抑制されることも実証された。さらに、発酵試験２の結果から、発酵培地として比較的安価な合成培地を用いた場合であっても、エタノール生産を抑制しながら乳酸を高収率で製造できることが明らかとなった。
【００３７】
〔比較例〕
上述した実施例と比較するため、乳酸生成能を有しない酵母を用いてチアミン存在下で発酵試験を行った。なお、チアミンは、チアミン-2-リン酸に生合成され、解糖系のエタノール生合成経路に関わるピルビン酸脱炭酸酵素の補酵素となる。したがって、培地に対してチアミンを添加することで、エタノール生産量の向上につながることが知られている(長野食工試研報30、第49-52頁参照)。
【００３８】
本比較例では、LDH遺伝子が導入されていない野生株の酵母Saccharomyces cerevisiae OC-2株(ATCC Number:46276)をYPD培地(イーストエキストラクト1％、ペプトン2％及びグルコース2％を含む)に植菌し、30℃で24時間培養を行った。培養終了後、遠心分離(2000g、3分)により菌体を回収した。
【００３９】
発酵培地(スクロース19.9％、糖蜜0.1％、(NH4)2HPO40.3％及びKH2PO4 0.1％を含む。但し糖蜜はスクロース換算の濃度とする。)に下記表３記載の濃度になるようにチアミン塩酸塩添加した培地50mlを100ml容のフラスコに入れ、上記菌体を濃度が0.3％になるように接種し、80rpm/分(震とう幅40mm)で32℃3日間発酵を行い、24時間毎にサンプリングを行い、エタノールの生産量を検討した。結果を表３に示す。なお、発酵培地に含まれる糖蜜由来のチアミン濃度は0.0009mg/Lであった。
【００４０】
【表３】
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【００４１】
表３に示したように、乳酸生成能を有しない酵母を用いた場合、培地中に含まれるチアミンによってエタノール生産が向上している。この表３に示した結果を考慮すると、上述した実施例においてもエタノール生産が向上することが予測される。しかしながら、表１及び２に示したように、乳酸生成能を有する酵母においてはエタノール生産が抑制されており、当業者の予測に反した結果であることが理解できる。
【００４２】
〔実施例２〕
本実施例では、培地中のチアミン濃度と、乳酸生成向上効果及びエタノール生産抑制効果との関係を詳細に検討した。
【００４３】
具体的には、LDH遺伝子が6コピー導入されたSaccharomyces cerevisiae T165株(Appl Environ Microbiol.171.2789-2792参照)について、YPD培地(イーストエキストラクト1％、ペプトン2％及びグルコース2％を含む)に植菌し、30℃で24時間培養を行った。培養終了後、遠心分離(2000g、3分)により菌体を回収した。
【００４４】
発酵培地(スクロース6.72％、糖蜜0.28％、(NH4)2HPO40.3％及びKH2PO4 0.1％を含む。但し糖蜜はスクロース換算の濃度とする。)に所定量のチアミン塩酸塩添加した培地50mlを100m1容のフラスコに入れ、上記菌体を濃度が0.5％になるように接種し、80rpm/分(震とう幅40mm)で32℃3日間発酵を行い、乳酸とエタノールの生産量を検討した。結果を図１に示す。なお、発酵培地に含まれる糖蜜由来のチアミン濃度は0.0022mg/Lであった。
【００４５】
図１に示すように、培地中のチアミン濃度が0.05mg/L以上である場合には乳酸生成効率が非常に高い値を示している。特に、培地中のチアミン濃度0.05mg/Lを境として、乳酸の生産効率が急激に上昇していることが分かる。また、培地中のチアミン濃度0.05mg/Lを境として、エタノール生産効率が急激に下降していることが分かる。この結果から、培地中のチアミン濃度が0.05mg/L以上であれば、高収率で乳酸を製造できることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】培地中のチアミン濃度と、乳酸の収率及びエタノール収率との関係を示す特性図である。
【図１】
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