(57)【要約】【課題】安全性の向上した変性組換えウイルスを使用し、短時間に動物の生体内でウイルス感染に十分な防御免疫反応を誘発できる抗原および抗体を提供する。【解決手段】腫瘍ウイルスの１つであるHTLV-Iの菌株1171のエンベロープタンパク質をコードする外来DNAを非必須領域に組み込んだ、弱毒化された変性組換えウイルスのインビトロ発現からHTLVウイルス抗原を調製する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
変性組換えウイルスのインビトロ発現から調製されるHTLVウイルス抗原であって、前記変性組換えウイルスが、ウイルスにコードされる遺伝子機能が不活化されることによりビルレンスが弱毒化されており、前記変性組換えウイルスがさらに、該ウイルスゲノムの非必須領域に外来DNAを含み、該外来DNAが、HTLV-I1171のエンベロープタンパク質をコードすることを特徴とするHTLVウイルス抗原。
【請求項２】
前記変性組換えウイルスがポックスウイルスであることを特徴とする請求項１記載の抗原。
【請求項３】
前記ポックスウイルスがワクシニアウイルスであることを特徴とする請求項２記載の抗原。
【請求項４】
前記ワクシニアウイルスの遺伝子機能が、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを欠失させることにより不活化されることを特徴とする請求項３記載の抗原。
【請求項５】
前記ワクシニアウイルスの前記欠失された遺伝子機能が、C7L-K1Lオープンリーディングフレーム、または宿主域領域を含むことを特徴とする請求項４記載の抗原。
【請求項６】
前記ワクシニアウイルスの少なくとも１つの追加のオープンリーディングフレームが欠失されており、該追加のオープンリーディングフレームが、J2R、B13R+B14R、A26L、A56R、およびI4Lからなる群より選択されることを特徴とする請求項５記載の抗原。
【請求項７】
前記ワクシニアウイルスの少なくとも１つの追加のオープンリーディングフレームが欠失されており、該追加のオープンリーディングフレームが、チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、A型封入体領域、血球凝集素遺伝子、およびリボヌクレオチドレダクターゼ大サブユニットからなる群より選択されることを特徴とする請求項５記載の抗原。
【請求項８】
J2R、B13R+B14R、A26L、A56R、C7L-K1LおよびI4Lが、前記ワクシニアウイルスから欠失されることを特徴とする請求項６記載の抗原。
【請求項９】
チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、A型封入体領域、血球凝集素遺伝子、宿主域領域、およびリボヌクレオチドレダクターゼ大サブユニットが、前記ワクシニアウイルスから欠失されることを特徴とする請求項７記載の抗原。
【請求項１０】
前記ワクシニアウイルスがNYVAC組換えウイルスであることを特徴とする請求項８記載の抗原。
【請求項１１】
前記ワクシニアウイルスがNYVAC組換えウイルスであることを特徴とする請求項９記載の抗原。
【請求項１２】
前記NYVAC組換えウイルスがvP1181であることを特徴とする請求項８または９記載の抗原。
【請求項１３】
変性により宿主内におけるビルレンスが弱毒化された変性組換えトリポックスウイルスのインビトロ発現から調製されるHTLVウイルス抗原であって、該変性組換えウイルスが、該ウイルスゲノムの非必須領域に外来DNAを含み、該外来DNAが、HTLV-I1171のエンベロープタンパク質をコードすることを特徴とするHTLVウイルス抗原。
【請求項１４】
前記変性組換えトリポックスウイルスが、カナリアポックスウイルスであることを特徴とする請求項１３記載の抗原。
【請求項１５】
前記カナリアポックスウイルスが、ニワトリ胚繊維芽細胞における200回以上の連続継代により弱毒化されたRentschlerワクチン株であり、そのマスター種株は、寒天培地下の4回の連続的なプラーク精製に供された後、そのプラーククローンが5回の追加の継代により増幅されることを特徴とする請求項１４記載の抗原。
【請求項１６】
前記カナリアポックスウイルスが、ALVAC組換えウイルスであることを特徴とする請求項１５記載の抗原。
【請求項１７】
前記ALVAC組換えウイルスが、vCP203であることを特徴とする請求項１６記載の抗原。
【請求項１８】
請求項１から１７いずれか１項記載のHTLVウイルス抗原の投与により誘発される抗体。
【請求項１９】
変性組換えウイルス由来の抗原のインビボ発現から誘発される抗体であって、前記変性組換えウイルスが、ウイルスにコードされる遺伝子機能が不活化されることによりビルレンスが弱毒化されており、前記変性組換えウイルスがさらに、該ウイルスゲノムの非必須領域に外来DNAを含み、該外来DNAが、HTLV-I1171のエンベロープタンパク質をコードすることを特徴とする抗体。
【請求項２０】
前記変性組換えウイルスがポックスウイルスであることを特徴とする請求項１９記載の抗体。
【請求項２１】
前記ポックスウイルスがワクシニアウイルスであることを特徴とする請求項２０記載の抗体。
【請求項２２】
前記ワクシニアウイルスの遺伝子機能が、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを欠失させることにより不活化されることを特徴とする請求項２１記載の抗体。
【請求項２３】
前記ワクシニアウイルスの前記欠失された遺伝子機能が、C7L-K1Lオープンリーディングフレーム、または宿主域領域を含むことを特徴とする請求項２２記載の抗体。
【請求項２４】
前記ワクシニアウイルスの少なくとも１つの追加のオープンリーディングフレームが欠失されており、該追加のオープンリーディングフレームが、J2R、B13R+B14R、A26L、A56R、およびI4Lからなる群より選択されることを特徴とする請求項２２記載の抗体。
【請求項２５】
前記ワクシニアウイルスの少なくとも１つの追加のオープンリーディングフレームが欠失されており、該追加のオープンリーディングフレームが、チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、A型封入体領域、血球凝集素遺伝子、およびリボヌクレオチドレダクターゼ大サブユニットからなる群より選択されることを特徴とする請求項２２記載の抗体。
【請求項２６】
J2R、B13R+B14R、A26L、A56R、C7L-K1LおよびI4Lが、前記ワクシニアウイルスから欠失されることを特徴とする請求項２４記載の抗体。
【請求項２７】
チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、A型封入体領域、血球凝集素遺伝子、宿主域領域、およびリボヌクレオチドレダクターゼ大サブユニットが、前記ワクシニアウイルスから欠失されることを特徴とする請求項２５記載の抗体。
【請求項２８】
前記ワクシニアウイルスがNYVAC組換えウイルスであることを特徴とする請求項２６記載の抗体。
【請求項２９】
前記ワクシニアウイルスがNYVAC組換えウイルスであることを特徴とする請求項２７記載の抗体。
【請求項３０】
前記ワクシニアウイルスがvP1181であることを特徴とする請求項２６または２７記載の抗体。
【請求項３１】
変性により宿主内におけるビルレンスが弱毒化された変性組換えトリポックスウイルス由来の抗原のインビボ発現から誘発される抗体であって、該変性組換えウイルスが、該ウイルスゲノムの非必須領域に外来DNAを含み、該外来DNAが、HTLV-I1171のエンベロープタンパク質をコードすることを特徴とする抗体。
【請求項３２】
前記組換えトリポックスウイルスが、カナリアポックスウイルスであることを特徴とする請求項３１記載の抗体。
【請求項３３】
前記カナリアポックスウイルスが、ニワトリ胚繊維芽細胞における200回以上の連続継代により弱毒化されたRentschlerワクチン株であり、そのマスター種株は、寒天培地下の4回の連続的なプラーク精製に供された後、そのプラーククローンが5回の追加の継代により増幅されることを特徴とする請求項３２記載の抗体。
【請求項３４】
前記カナリアポックスウイルスが、ALVAC組換えウイルスであることを特徴とする請求項３３記載の抗体。
【請求項３５】
前記ALVAC組換えウイルスが、vCP203であることを特徴とする請求項３４記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、1993年８月12日付で出願された米国特許出願第08/105,483号の一部係属出願であり、該08/105,483号出願は、1992年３月６日付で出願された米国特許出願第07/847,951号出願の係属出願であり、該07/847,951号出願は、1991年６月11日付で出願された米国特許出願第07/713,967号の一部係属出願であり、該07/713,967号出願は、1991年３月17日付で米国特許出願第07/666,056号として出願され、1993年３月24日付で米国特許出願第08/036,217号として許可され、そして1994年11月15日付で米国特許第5,364,773 号として特許付与された出願の一部係属出願である。また、1994年４月６日付で出願された米国特許出願第08/223,842号を参照するが、該08/223,842号出願は、1992年６月11日付で出願された米国特許第07/897,382号の一部係属出願として出願されたものであり、該07/897,382号出願は、1991年６月14日付で出願された米国特許第07/715,921の一部係属出願である。さらに、1993年１月20日付で出願された米国特許出願第08/007,115号の一部係属出願として、1994年11月19日付で出願された継続中の出願第08/184,009号についても言及する。本明細書中ではこれらの各出願および特許が参照されるものとする。
【０００２】
本発明は、変性ポックスウイルスならびにそれを製造する方法および使用する方法に関し、例えば、「ＨＴＬＶ」で変性された組換えポックスウイルス−ヒトＴ細胞白血病ウイルス（例えば、弱毒化組換え体、特にＮＹＶＡＣ系またはＡＬＶＡＣ系ＨＴＬＶ組換え体）のようなワクシニアウイルスまたはトリポックス（例えば、カナリアポックスまたは家禽ポックス）に関する。さらに詳細には、本発明は、外来遺伝子を挿入し発現させて、ＨＴＬＶウイルスに対して免疫応答を誘起するための安全な免疫化媒体として用いられる改良ベクターに関する。すなわち、本発明は、ＨＴＬＶの遺伝子産物を発現する組換えポックスウイルス、および、宿主またはインビトロ（例えば、半ビボモダリティ）投与されたＨＴＬＶ感染に対して免疫応答を誘起する免疫原性組成物に関し、さらには、該ポックスウイルスの発現産物であって、それ自身が免疫応答を誘起、例えば抗体を産生するのに有用な生成物に関し、ここで、該抗体は、血清反応陽性または血清反応陰性の個体におけるＨＴＬＶ感染に対して有用であり、また、該発現産物またはそれから誘起される抗体は、動物またはヒトまたは培養細胞から単離されることにより、ウイルスもしくは感染細胞またはその他の系における抗原または生成物の発現の検出用の診断キット、試験または分析法を構築するのに有用なものである。そのような単離された発現産物は、各種の系、宿主、血清もしくはサンプルにおける抗体の検出、または抗体の産生に特に有用である。
【０００３】
本出願においては、幾つかの刊行物を参照している。これらの参考文献は、本明細書の末尾の特許請求の範囲の前にまとめて引用しているか、あるいは、刊行物について言及している個所においてそれぞれの刊行物を引用しており、それらの内容を本明細書中に包含させることとする。
【背景技術】
【０００４】
外来遺伝子を挿入し発現させるためにはワクシニアウイルス、および最近は、その他のポックスウイルスが用いられている。生きた感染性ポックスウイルス内に外来遺伝子を挿入する基本的な手法は、ドナープラスミド内の外来遺伝子をはさむ（フランキングする）ポックスＤＮＡ配列と、レスキューウイルスであるポックスウイルス内に存在する相同配列との間で組換えを起こすことである（Piccini 他、1987）。
【０００５】
詳述すれば、組換えポックスウイルスは、当該技術分野で既知であり、また、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４および特許文献５に記載のワクシニアウイルスまたはトリポックスウイルスのようなポックスウイルスの合成組換体を創製する方法（これらの特許の開示を参考のために本明細書に引用しておく。）に類似の２つの工程で構築される。
【０００６】
第１の工程として、当該ウイルスに挿入すべきＤＮＡ遺伝子配列、特に、非ポックス源からのオープンリーディングフレームが、ポックスウイルスＤＮＡの一部に相同的なＤＮＡが予め挿入されている大腸菌プラスミド構造体に導入される。これとは別に、挿入されるべきＤＮＡ遺伝子配列をプロモータに連結しておく。プラスミド構造体におけるプロモータ−遺伝子の連結部の位置は、非必須（nonessential）遺伝子座を含有するポックスＤＮＡの領域をはさむＤＮＡ配列に相同的なＤＮＡにより、該プロモータ−遺伝子連結部が両端にあるようにしておく。このようにして得られたプラスミド構造体は、次いで、大腸菌内で培養、増幅され（Clewell 、1972）、単離される( Clewell 他、1969；Maniatis他、1982）。第２の工程として、挿入されるべきＤＮＡ遺伝子配列を含有する単離後のプラスミドは、ポックスウイルスとともに、培養細胞、例えば、ニワトリ肺線維芽細胞に形質転換（トランスフェクト）される。プラスミド内の相同的ポックスＤＮＡと、ウイスルゲノムとの間の組換えにより、ポックスウイルスのゲノムの非必須領域に外来ＤＮＡ配列が存在する変性ポックスウイルスが得られる。「外来（foreign)」ＤＮＡ配列という語は、外因性ＤＮＡ、特に非ポックス源からのＤＮＡであって、該外因性ＤＮＡが導入されているゲノムによって通常は産生されない遺伝子産物をコードするＤＮＡを指称する。
【０００７】
遺伝子組換えは、一般に、２つのＤＮＡ鎖間の相同的ＤＮＡ部分の交換である。ウイルスによっては、ＤＮＡの代わりにＲＮＡとなることもある。核酸の相同的部分とは、同じ配列の核酸塩基を有する核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の一部分である。
【０００８】
遺伝子組換えは、本来、感染宿主細胞内で新しいウイルスゲノムが複製または産生される間に起こり得る。すなわち、２種またはそれ以上の異なるウイルスまたは遺伝子構造体で共感染された（co-infected)宿主細胞内で起こるウイルス複製サイクル中に、ウイルス遺伝子間の遺伝子組換えが起こり得る。第１のゲノム由来のＤＮＡの一部を交換させることにより、この第１のウイルスゲノムに相同的なＤＮＡを有する第２の共感染性ウイルスのゲノムの一部が構成される。
【０００９】
しかしながら、組換えは、完全に相補的でない異なるゲノムにおけるＤＮＡ部分間でも起こり得る。第１のゲノム由来のそのようなＤＮＡの一部分が別のゲノムの一部分に相同的であるが、その第１のＤＮＡ部分に、例えば、遺伝子マーカーや抗原決定基をコードする遺伝子が挿入されて存在されているような場合には、組換えが起こり、その組換え産物は組換えウイルスゲノム内のそのような遺伝子マーカーや遺伝子の存在により検出され得るようになる。最近は、組換えワクシニアウイルスを調製するためにその他の戦略も報告されている。
【００１０】
変性された感染性ウイルスにより、挿入されたＤＮＡ遺伝子配列の発現を成功させるためには２つの条件が要求される。第１に、ウイルスの非必須領域に挿入を行い、変性ウイルスの生存性が維持されるようにしなければならない。挿入ＤＮＡの発現に関する第２の条件は、該挿入ＤＮＡに対して至適な関係でプロモータが存在しているということである。プロモータの位置は、発現されるべきＤＮＡ配列の上流にあるようにしなければならない。
【００１１】
ワクシニアウイルスは天然痘に対する免疫処置に使用されて成功をおさめ、１９８０年には世界的に天然痘を撲滅させた。その歴史の過程でワクシニアの多くの菌株が出現した。これらの異なる菌株は、種々の免疫原性を示し、また、程度の差はあるが、いろいろな合併症に関連する可能性があるとされ、その最も深刻なものはワクチン接種後の脳炎と全身性ワクシニアである（Behbehani 、1993）。
【００１２】
天然痘の撲滅に伴い、ワクシニアの新しい役割、すなわち、外来遺伝子を発現させるための遺伝子工学用ベクターとして役割が重要となった。きわめて多くの異種抗原をコードする遺伝子がワクシニア内で発現され、その結果、対応する病原体による攻撃に対する防御免疫をもたらしたことも多い（Tartaglia他による総説、1990a)。
【００１３】
ワクシニアウイルスの遺伝学的経歴は、発現される外来免疫原の防御効能に影響を与えることが示されている。例えば、ワクシニアウイルスのWyeth ワクチン株内でエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ｇｐ340 が発現されても、ＥＢＶウイルスで引き起こされるリンパ腫に対してタマリンを防御しなかったが、ワクシニアウイルスのＷＲ研究室株内で同じ遺伝子を発現させると防御効果があった（Morgan他、1988）。
【００１４】
ワクシニアウイルスに基づき組換えワクチンを得ようとする場合には効力と安全性との間に精密なバランスをとることがきわめて重要である。組換えウイルスが与える免疫原は、ワクチン投与された動物内で防御能のある免疫応答を誘起するが、実質的に病原性が無いものでなければならない。したがって、ベクター株を弱毒化することが、現在の技術状況では最も望ましいであろう。
【００１５】
多くのワクシニア遺伝子が、組織培養におけるウイルスの成長に非必須であることが確認されており、それらを削除し不活化することにより、いろいろな動物系におけるビルレンス（毒性）が減少される。
【００１６】
ワクシニアウイルス  チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする遺伝子についてはマッピングが行われ（Hruby 他、1982）、また、配列決定も行われている（Hruby 他、1993；Weir他、1993）。チミジキナーゼ遺伝子が不活化または完全に欠失しても、広範な組織培養中でワクシニアウイルスの増殖は妨げられない。また、ＴＫ− ワクシニアウイルスは各種の投与法により各種の宿主における接種部位においてインビボ複製する能力を有する。
【００１７】
単純ヘルペスウイルス２型については、ＴＫ− ウイルスをモルモットに膣内投与すると、ＴＫ＋ ウイルスの投与の場合よりも脊髄中のウイルス力価がかなり低くなることが示された（Stanberry 他、1985）。ヘルペスウイルスではインビトロでのＴＫ活性は、代謝の活発な細胞中ではウイルスの増殖に重要でないが、静止細胞中ではウイルス増殖に必須であることが示された(gamieson他、1974）。
【００１８】
マウスに脳内投与および腹膜内投与することによりＴＫ− ワクシニアが弱毒化されることが示された（Buller他、1985）。神経毒性のあるＷＲ実験室株およびWyeth ワクチン株の双方について弱毒化が認められた。皮膚内投与されたマウスにおいては、ＴＫ− 組換えワクシニアが、親株のＴＫ＋ ワクシニアウイルスと同等の抗ワクシニア中和抗体を産生したが、これは、この試験系では、ＴＫ機能の喪失がワクシニアウイルスベクターの免疫原性を有意に減少させないことを示唆している。ＴＫ− およびＴＫ＋ の組換えワクシニアウイルス（ＷＲ株）をマウスに鼻内接種すると、他の部位（脳を含む）へのウイルスの伝播が有意に減少したことが見出された（Taylor他、1991a)。
【００１９】
ヌクレオチドの代謝に関連する別の酵素は、リボヌクレオチドレダクターゼである。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）内でコードされているリボヌクレオチドレダクターゼの活性が、その大サブユニットをコードしている遺伝子を欠失させることにより喪失しても、インビトロの分裂細胞中でのウイルス増殖やＤＮＡ合成は影響されないが、無血清細胞でのウイルスの増殖能力は極めて損なわれることが示された（Goldstein 他、1988）。眼部の急性ＨＳＶ感染および三叉神経ガングリオンにおける再活性性潜伏感染に関するマウスモデルを用いた場合、リボヌクレオチドレダクターゼの大サブユニットを欠失したＨＳＶについては、野生型ＨＳＶに比べてビルレンスが減少することが示された（Jacobson他、1989）。
【００２０】
ワクシニアウイルスにおいては、リボヌクレオチドレダクターゼの小サブユニット（Slabaugh他、1988）および大サブユニット（Schmidtt他、1988）のいずれも同定されている。ワクシニアウイルスのＷＲ株においてリボヌクレオチドレダクターゼを挿入不活化すると、ウイルスの弱毒化がもたらされ、これはマウスに頭蓋内接種することによって測定される（Child 他、1990）。
【００２１】
ワクシニアウイルスの血球凝集素（ＨＡ）遺伝子についてはマッピングおよび配列決定が行われている（Shida 、1986）。ワクシニアウイルスのＨＡ遺伝子は、組織培養中の増殖にとって非必須なものである（Ichihashi 他、1971）。ワクシニアウイルスのＨＡ遺伝子を不活化すると、頭蓋内投与されたラビットにおいては神経毒性化が減少し、また、皮膚内投与部位におけるラビットの損傷は小さくなっていた（Shida 他、1988）。ＨＡの遺伝子座を利用して、ワクシニアウイルスのＷＲ株（Shida 他、1987）、Lister株の誘導体（Shida 他、1988）およびCopenhagen株（Guo 他、1989）に外来遺伝子を挿入している。外来遺伝子を発現する組換えＨＡ− ワクシニアウイルスは、免疫原性があり（Guo 他、1989；Itamura 他、1990；Shida 他、1988；Shida 他、1987）、また、関連する病原体による攻撃に対して防御効果を有する（Guo他、1989；Shida他、1987）ことが示された。  牛痘ウイルス（Brighton赤色株）は、鶏卵の漿尿膜上に赤色（出血性）痘瘡を生じさせる。牛痘ゲノム内で自然欠失すると白色痘瘡を生じる変異体となる（Pichup他、1984）。出血性機能（ｕ）は、初期遺伝子によってコードされた３８ｋＤａのタンパク質によることがマッピングされている（Pickup他、1986）。この遺伝子は、セリンプロテアーゼインヒビターと相同性を有し、牛痘ウイルスに対する宿主の炎症応答を阻害し（Palumbo 他、1989）、また、血液凝固のインヒビターである。
【００２２】
このｕ遺伝子は、ワクシニアウイルスのＷＲ株中に存在する（Kotwal他、1989b)。外来遺伝子を挿入することによりｕ領域が不活化されているＷＲワクシニアウイルス組換え体が接種されたマウスは、ｕ遺伝子がインタクトのままである類似の組換えワクシニアウイルスが接種されたマウスよりも、該外来遺伝子に対して高い抗体レベルを産生する（Zhou他、1990）。このｕ領域は、ワクシニアウイルスのCopenhagen株内で欠陥性非機能形態として存在する（Goebel他による報告（1990a,b)においてＢ１３およびＢ１４と称されているオープンリーディングフレーム）。
【００２３】
感染細胞内において牛痘ウイルスは、細胞質Ａ型封入体（ＡＴＩ）として局在化している（Kato他、1959）。ＡＴＩの機能は、動物から動物への伝播に際して牛痘ウイルスビリオンを防護することにあると考えられている（Bevgoin 他、1971）。牛痘ゲノムのＡＴＩ領域は１６０ｋＤａのタンパク質をコードしており、これがＡＴＩ封入体のマトリックスを形成する（Funahashi 他、1988；Patel 他、1987）。ワクシニアウイルスは、そのゲノムに相同領域を含有するが、一般にＡＴＩを産生しない。ワクシニアのＷＲ株においては、ゲノムのＡＴＩ領域は９４ｋＤａのタンパク質として翻訳される（Patel 他、1988）。ワクシニアウイルスのCopenhagen株においては、ＡＴＩ領域に相応するＤＮＡ配列の大部分は欠失されており、該領域の残存する３´末端はＡＴＩ領域の上流にある配列と融合して、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）Ａ２６Ｌを形成する（Goebel他、1990a,b)。
【００２４】
ワクシニアウイルスの左末端近傍については、各種の自然欠失（Altenburger 他、1989；Drillien他、1981；Lai 他、1989；Moss他、1981；Paez他、1985；Panicali他、1981）や人為的欠失が報告されている。１０ｋｂが自然欠失したワクシニアウイルスのＷＲ株（Moss他、1981；Panicali他、1981）は、マウスに頭蓋内接種することにより弱毒化されることが示された（Buller他、1985）。後に、この欠失部は１７ヶのＯＲＦを含む可能性が示された（Kotwal他、1988b)。該欠失部内にある特別の遺伝子としては、ビロカインＮ１Ｌおよび３５ｋＤａタンパク質（Goebel他による1990a,b の報告でＣ３Ｌと称されたもの）が挙げられる。Ｎ１Ｌを挿入不活化すると、通常のマウスおよびヌードマウスのいずれについても、頭蓋内接種によりビルレンスが減少する（Kotwa 他、1989a)。上記の３５ｋＤａタンパク質は、ワクシニアウイルス感染細胞の培地にＮ１Ｌと同様に分泌される。このタンパク質は、補体コントロールタンパク質群、特に補体４Ｂ結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）に相同性である（Kotwal他、1988a)。細胞性Ｃ４ｂｐと同様に、ワクシニアの３５ｋＤａタンパク質は補体の第４成分と結合し、古典的補体カスケードを阻害する（Kotwal他、1990）。このように、ワクシニアの３５ｋＤａタンパク質は、該ウイルスが宿主の防御機構を回避するのを助けることに関与しているものと考えられる。
【００２５】
ワクシニアゲノムの左末端は、宿主域遺伝子として同定された２つの遺伝子、Ｋ１Ｌ（Gillard 他、1986）およびＣ７Ｌ（Perkus他、1990）を含む。これらの遺伝子の双方が欠失すると、各種のヒト細胞系でワクシニアウイルスの増殖能が減少する（Perkus他、1990）。
【００２６】
この他に、本来的に宿主が制限されているポックスウイルスであるトリポックスウイルスを使用する２つのワクチンベクター系がある。すなわち、家禽ポックスウイルス（ＦＰＶ：fowlpoxvirus）およびカナリアポックスウイルス（canarypoxvirus）の両者に工夫を施して外来遺伝子産物を発現させてきた。家禽ポックスウイルス（ＦＰＶ）は、ポックスウイルス科のトリポックス(Avipox)属の基本ウイルスである。このウイルスは、家禽類に経済的に重要な疾病を引き起こすが、１９２０年代から弱毒化生ワクチンを使用することにより良好な対策が講じられてきた。トリポックスウイルスの複製は鳥類に限られ（Matthews他、1982）、ヒトを含む非鳥類においてトリポックスウイルスの感染が起こったという文献の報告は存しない。このように宿主が制限されているので、他の種にウイルスが伝染することに対する本質的な安全性が確保され、トリポックスウイルス由来のワクチンベクターは魅力ある手段として動物やヒトへ応用される。
【００２７】
ＦＰＶは、家禽類病原体由来の抗原を発現する優れたベクターとして使用されてきた。ビルレントトリインフルエンザウイルスの血球凝集素タンパク質がＦＰＶ組換え体で発現された（Taylor他、1988a)。この組換え体をニワトリおよび七面鳥に接種すると、同種または異種のビルレントインフルエンザウイルスのいずれの攻撃に対しても防御能のある免疫応答が誘起された（Taylor他、1988a)。ニューカッスル病ウイルスの表面糖タンパクを発現するＦＰＶ組換え体も開発された（Taylor他、1990；Edbauer 他、1990）。
【００２８】
宿主制限によりＦＰＶおよびＣＰＶの複製はトリ系に限られているにも拘わらず、これらのウイルスから誘導された組換え体は、非トリ源細胞において外来遺伝子を発現することが見出された。さらに、そのような組換え体ウイルスは、該外来遺伝子産物に対する免疫応答を引き起こし、場合によっては、相応する病原体による攻撃に対する防御能を有することが示された（Tartaglia 他、1993a,b ；Taylor他、1992；1991b ；1988b)。
【００２９】
ヒトＴ細胞白血病／リンパ腫ウイルスタイプI（ＨＴＬＶ−I）ならびにヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）は、それぞれ、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）および熱帯性痙性不全対麻痺／ＨＴＬＶ−I関連ミエロパーシー（ＴＳＰ／ＨＡＭ）ならびに後天性免疫不全症候群を引き起こすレトロウイルスであり（Gallo, 1987 ; Poiesz, 1980 ; Hinuma, 1981 ; Barre-Siniuss, 1983 ; Popovic, 1984 ; Gallo, 1986)、密着接触（例えば、性交、母子間など）および血液または血液製剤の輸注によって伝染される。しかしながら、ＨＩＶ−１とは対照的に、ＨＴＬＶ−Iは汚染された冷凍保存第VIII因子製剤によってはあまり伝染されないということが明らかにされていることから、ＨＴＬＶ−Iの伝染は無細胞ウイルスからよりは、主として感染細胞を介して起こるものと考えられる。このことは、無細胞ＨＴＬＶ−Iのインビトロ伝染は、標的細胞とともに感染細胞を共培養する場合に比べてきわめて効率が悪いという以前の結果（DeRossi, 1985)、および、ＨＴＬＶ−Iの変異は比較的少なく（Gallo, 1987 ; Gessain, 1992)、ウイルス伝染ではなくプロウイルスであることを示唆していることからも裏づけられる。ＨＴＬＶ−Iは、他の動物性腫瘍ウイルスよりも遺伝学的に複雑であり、そして、ＨＴＬＶ−IIの他に知られた唯一のヒト腫瘍ウイルスである（Kalyanaraman, 1982）。ＨＴＬＶ−Iの遺伝学的複雑さは、ＨＩＶのそれと酷似している（Gallo,1986) 。事実、ＨＴＬＶとＨＩＶは、類似の機能を有する調節タンパク質を共有しており（tax / tat, rex / rev）、また、多数の補助遺伝子を共有し［ＨＴＬＶ−Iのvpf, vif, nef, vpu ( Haseltine, 1989 ), ＨＴＬＶ−Iのｐ12Ｉ 、ｐ13ＩＩ、ｐ30ＩＩおよびｐ21ｒｅｘ (Kiyokawa, 1985 ; Koralnik, 1993) ］、これらは、ヒトＴ細胞に感染する際して当該病原体を適応化するのに関与するものと考えられる。両方のウイルスとも、インビボおよびインビトロ（６、13、14）においてＣＤ４＋ Ｔ細胞に感染するが、ＨＴＬＶは他のＴ細胞サ
ブタイプにも感染する。
【００３０】
ＨＩＶに関する製剤の開発（例えば、ワクチンの開発）においては遺伝学的および免疫学的変異（LaRosa, 1990 ; Ruxche, 1988)が関心事であるが、ＨＴＬＶ−Iの場合は、遺伝学的変異は非常に少ない（Gassain, 1992 ; Paine, 1991 ; Schulz, 1991 ; Komourian, 1991）。しかしながら、全世界的に共通（コスモポリタン）タイプのＨＴＬＶ−IおよびＨＴＬＶ−IIに加えて、ザイール（Gessain,1992) およびメラネシア（Gessain, 1993 ; Sherman, 1992)のような赤道地域から遺伝学的に区別されるＨＴＬＶ−Iの他のタイプが発見されたことにより、免疫されたウサギの誘発試験（チャレンジ）に使用され得る広範な遺伝学的変異体（エンベロープ遺伝子における変異範囲３〜30％）が得られるようになった。予備試験によると、アフリカ型、コスモポリタン型およびメラネシア型のＨＴＬＶ間の交差中和は検出され得る。異種のウイルスに対する力価は低い。このことは、天然のＨＴＬＶ感染に対する防御において中和抗体が重要であるとすれば、１種より多くの変異体からワクチンを構成すべきことを示唆している。ＨＴＬＶ−I生成物を発現させる効果的な手段が得ることができれば、例えば、免疫組成物ないしはワクチン組成物として、または、そのような組成物を調製する手段として、または、ＨＴＬＶ−I生成物もしくは該生成物に対する抗体を調製して分析系、キットもしくはテスト系を構築するのに有用であり、特に、ＨＴＬＶ−Iが風土病化している世界の諸地域、例えば、日本の一部、カリブ海、アフリカおよび南米の一部に貢献することができるであろう。例えば、高度に弱毒化したポックスウイルスＨＴＬＶ−Ienv を単独、または、これと組合わせて、精製したＨＴＬＶ−I前駆体エンベロープ蛋白（gp63）から成るサブユニットをブースターとして使用すれば、免疫組成物ないしはワクチン組成物として、また、抗原や抗体を調製して、分析系、キット、テスト系を構築するのに有用であろう。ウサギは、ＨＴＬＶ−I感染に対する感受性が非常に高いが、ヒトのＡＴＬまたはＴＳＰ／ＨＡＭに類似する疾病を出現させない（Miyoshi, 1985)。しかし、ウサギのＨＴＬＶ−I感染は、ワクチン研究における経済的で効率的な動物モデルを提供する。
【００３１】
かくして、ＨＴＬＶ組換えポックスウイルスならびにそれから得られる組成物および生成物、特にＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣに基づくＨＴＬＶ組換え体ならびにそれから得られる組成物および生成物、特に、ＨＴＬＶenv の一部または全部をコードするような該組換え体ならびにそれから得られる組成物および生成物が提供されれば、現在の技術レベルを前進させるきわめて望ましいものとなるであろう。
【特許文献１】米国特許第４７６９３３０号明細書
【特許文献２】米国特許第４７７２８４８号明細書
【特許文献３】米国特許第４６０３１１２号明細書
【特許文献４】米国特許第５１００５８７号明細書
【特許文献５】米国特許第５１７９９９３号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３２】
したがって、本発明の目的は、安全性の向上した変性組換えウイルスを提供し、且つ、そのような組換えウイルスを製造する方法を提供することにある。
【００３３】
本発明の別の目的は、既知の組換えポックスウイルスワクチンに比べて安全性のレベルが高くなった組換えポックスウイルス抗原、ワクチンまたは免疫学的組成物を提供することにある。
【００３４】
本発明のさらに別の目的は、宿主内で遺伝子産物を発現するための変性ベクターであって、該宿主内で弱毒化されたビルレンスを有するように変性されたベクターを提供することにある。
【００３５】
本発明の他の目的は、安全性のレベルが高くなった変性組換えウイルスまたは変性ベクターを用いて、インビトロ培養細胞内で遺伝子産物を発現させる方法を提供することにある。
【００３６】
本発明のこれらの目的およびその他の目的ならびに効果は、以下の記述から一層明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００３７】
一つの態様として、本発明は、変性組換えウイルスであって、該ウイルスにコードされている遺伝子機能が不活化されていることによりビルレンスが弱毒化され安全性が高められた組換えウイルスに関する。その遺伝子機能は、非必須的なものである場合もあれば、ビルレンスに関連している場合もある。
【００３８】
ウイルスとしてはポックスウイルスが有利であり、特にワクシニアウイルスまたはトリポックスウイルス、例えば家禽ポックスウイルスまたはカナリアポックスウイルスである。この変性組換えウイルスは、そのウイルスゲノムの非必須領域に、ＨＴＬＶ由来の抗原またはエピトープ（例えば、ＨＴＬＶenv)をコードする外来ＤＮＡ配列を含むことができる。
【００３９】
他の態様として、本発明は、接種された宿主動物内に免疫応答を誘起する抗原性、免疫原性、ないしはワクチン組成物または治療用組成物に関し、該ワクチンは、担体と変性組換えウイルスとを含み、該組換えウイルスは、ウイルスにコードされている非必須遺伝子機能が不活化されていることによりビルレンスが弱毒化され安全性が向上している。本発明に従うこの組成物に用いられるウイルスはポックスウイルスが有利であり、特にワクシニアウイルスまたはトリポックスウイルス、例えば、家禽ポックスウイルスまたはカナリアポックスウイルスである。この変性組換えウイルスは、そのウイルスゲノムの非必須領域に、抗原性タンパク質（例えば、ＨＴＬＶenv のようなＨＴＬＶ由来のもの）をコードする外来ＤＮＡ配列を含むことができる。
【００４０】
さらに別の態様として、本発明は、変性組換えウイルスを含有する免疫原性組成物に関し、該変性組換えウイルスは、ウイルスにコードされている非必須遺伝子機能が不活化されていることによりビルレンスが弱毒化され安全性が高められている。この変性組換えウイルスは、そのウイルスゲノムの非必須領域に、抗原性タンパク質（例えば、ＨＴＬＶenv のようなＨＴＬＶ由来のもの）をコードする外来ＤＮＡ配列を含み、該組成物は、宿主に投与されると、該抗原に特異的な免疫応答を誘起する能力を有する。
【００４１】
別の態様として、本発明は、インビトロ培養される細胞に、ビルレンスが弱毒化され安全性が高められた変性組換えウイルスを導入することにより該細胞内で遺伝子産物を発現させる方法に関する。この変性組換えウイルスは、そのウイルスゲノムの非必須領域に、抗原性タンパク質、例えば、ＨＴＬＶenv のようなＨＴＬＶ由来のタンパク質をコードする外来ＤＮＡ配列を含み得る。その後、該細胞は、個体に直接再注入されるか、または、再注入のために特定の反応性を増幅するのに使用する（半ビボ治療）ことができる。
【００４２】
別の態様として、本発明は、インビトロ培養される細胞に、ビルレンスが弱毒化され安全性が高められた変性組換えウイルスを導入することにより該細胞内で遺伝子産物を発現させる方法に関する。この変性組換えウイルスは、そのウイルスゲノムの非必須領域に、抗原性タンパク質、例えば、ＨＴＬＶenv のようなＨＴＬＶ由来のタンパク質をコードする外来ＤＮＡ配列を含むことができる。得られた遺伝子産物は、ヒトまた動物に投与されて免疫応答を刺激することができる。産生された抗体は、各個体内でＨＴＬＶの予防および治療に有用であり、また、ヒトもしくは動物由来の抗体または単離されたインビトロ発現産物は、診断キット、アッセイまたはテストに用いられて、血清のようなサンプル中のＨＴＬＶもしくはＨＴＬＶ由来の抗原またはそれらに対する抗体の有無（したがって、該ウイルスもしくは該産物、または該ウイルスもしくは抗原に対する免疫応答の有無）を測定するのに用いることができる。
【００４３】
さらに別の態様として、本発明は変性組換えウイルスに関し、該組換えウイルスは、ウイルスにコードされている非必須遺伝子機能が不活化されていることによりビルレンスが弱毒化されており、さらに、ウイルスゲノムの非必須領域に外来源のＤＮＡを含有している。このＤＮＡは、ＨＴＬＶenv のようなＨＴＬＶコードすることができるものである。特に、遺伝子機能は、ビルレンス因子をコードするオープンリーディングフレームを欠失させることにより、または、自然の宿主制限ウイルスを利用することによって不活化されている。本発明に従って用いるウイルスは、ポックスウイルスが有利であり、特にワクシニアウイルスまたはトリポックスウイルス、例えば家禽ポックスウイルスまたはカナリアポックスウイルスである。オープンリーディングフレームは、Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ５６Ｒ、Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ、およびＩ４Ｌ（Goebel他による1990a,b の報告における名称による）から成る群、ならびにそれらの組合せより選択されるのが好ましい。ここで、オープンリーディングフレームは、チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体、血球凝集素遺伝子、宿主域遺伝子領域もしくはリボヌクレオチドレダクターゼの大サブユニット、またはそれらの組合せから成る。ワクシニアウイルスの好適な変性Copenhagen株は、ＮＹＶＡＣとして同定されたものであり（Tartaglia 他、1992）、Ｊ２Ｒ、Ｂ13Ｒ＋Ｂ14Ｒ、Ａ26Ｒ、Ｃ７Ｌ−Ｋ11およびＩ４Ｌまたはチミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、血球凝集遺伝子、宿主域領域、リボヌクレオチドレダクターゼの大サブユニットが欠失されたワクシニアウイルスである（米国特許第5,364,773 号も参照されたい）。他の好適なポックスウイルスは、ＡＬＶＡＣであり、カナリアポックスウイルス（Rentschlerワクチン株）が、例えば、ニワトリ胚繊維芽細胞による200 回以上の継代培養により弱毒化され、そのマスター種株が寒天培地下の４回の連続的なプラーク精製に供された後、５回の追加の継代培養により増幅されたものである。
【００４４】
本発明は、さらに別の態様として、本発明による組換えポックスウイルスの発現産物およびその使用、例えば、治療、予防、診断または試験に用いられる抗原性組成物ないしはワクチン組成物を調製することに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
新しいワクシニアワクチン株を開発するため、既知のまたは潜在的なビルレンス因子をコードするゲノムの６つの非必須領域を欠失させることにより、ワクシニアウイルスのCopenhagen株ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）を変性した。配列の欠失に関しては以下に詳述している（米国特許第5,364,773 号参照）。ワクシニアの制限フラグメント（制限酵素断片）、オープンリーディングフレームおよびヌクレオチド位置の呼称は、Goebel他（1990a,b)の報告における用語法に基づく。
【００４６】
また、挿入する外来遺伝子を受容できるように欠失位置を工夫した。
【００４７】
ＮＹＶＡＣから欠失させた領域については以下に掲記している。また、該欠失領域の略称およびオープンリーディングフレームの呼称（Geobel他、1990a,b)ならびに特定の欠失領域を含有するワクシニア組換え体の呼称（ｖＰ）も併せて掲記する：
(1)   チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ；Ｊ２Ｒ）ｖＰ４１０；
(2)   出血性領域（ｕ；Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）ｖＰ５５３；
(3)   Ａ型封入体領域（ＡＴＩ；Ａ２６Ｌ）ｖＰ６１８；
(4)   血球凝集素遺伝子（ＨＡ；Ａ５６Ｒ）ｖＰ７２３；
(5)   宿主域遺伝子領域（Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ）ｖＰ８０４；
(6)   リボヌクレオチドレダクターゼ大サブユニット（Ｉ４Ｌ）ｖＰ８６６
（ＮＹＶＡＣ）
ＮＹＶＡＣは、ビルレンスおよび宿主域に関連する遺伝子産物をコードする18のオープンリーディングフレームを欠失させることにより遺伝子工学的手法で得られたワクシニアウイルス株である。ＮＹＶＡＣは高度に弱毒化されるが、このことは以下のような多くの特徴から判る：ｉ）新生マウスに脳内接種するとビルレンスが減少すること、ii）遺伝学的に（ｎｕ＋  ／ｎｕ＋  ）または化学的（シクロホスホアミド）に免疫無防備状態マウスにおける無毒性、iii)免疫無防備状態マウスにおいて、播種性感染が起こらなくなること、iv）ウサギ皮膚の硬結や潰瘍形成がなくなること、ｖ）接種部位からの迅速なクリアランス、vi）多くの組織培養細胞系（ヒト由来のものを含む）において複製能が激減すること。これにも拘わらず、ＮＹＶＡＣに基づくベクターは、外来性免疫原に対して優れた応答を誘起し防御免疫を提供する。
【００４８】
ＴＲＯＶＡＣは弱毒化家禽ポックスであり、１日齢のヒナへのワクチン接種がライセンスされている家禽ポックスウイルスＦＰ−１ワクチン株からプラークを単離して得られたものである。また、ＡＬＶＡＣは弱毒化カナリアポックスを基礎とするベクターであり、ライセンスされているカナリアポックスワクチンKanapox （Tartaglia 他、1992）からプラークをクローニングして得られたものである。ＡＬＶＡＣの一般的性質には、Kanapox の一般的性質と同じものがある。外来免疫源を発現するＡＬＶＡＣ系組換えウイルスは、ワクチンベクターとしても有効であることが示されている（Tartaglia 他、1993a,b)。このトリポックスベクターは、その複製がトリ類に限定されている。ヒトの培養細胞においては、ウイルスのＤＮＡ合成に先行してウイルス複製サイクルの初期にカナリヤポックスウイルスの複製は中断してしまう。しかしながら、外来免疫原を発現するように工夫すれば、哺乳動物細胞中でインビトロで真正な発現とプロセシングが認められ、多くの哺乳動物種に接種すると該外来免疫原に対する抗体および細胞性免疫応答を誘発し、同種の病原体の攻撃に対する防御を与える（Taylor他、1992；Taylor他、1993）。カナリアポックス／狂犬病糖タンパク質組換え体（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ）に関するヨーロッパおよび米国における最近の第二相臨床試験によれば、この試験ワクチンは、充分に耐性があり、防御レベルの狂犬病ウイルス中和抗体を誘記することが示された（Cadoz 他、1992；Fries 他、1992）。さらに、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ被接種者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）は、精製狂犬病ウイルスで刺激すると有意レベルのリンパ球増殖を示した（Fries 他、1992）。
【００４９】
また、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣは、以下の点において、あらゆるポックスウイルスの中でも独特であると考えられている。すなわち、米国公衆衛生局のＮＩＨ（Institute of Health)の組換えＤＮＡ勧告委員会（Recombinant DNA Advisory Committee）は、ウイルスやベクターのような遺伝子材料の物理的封じ込めに関するガイドライン、すなわち、特定のウイルスやベクターの病原性に基づくそれらのウイルスやベクターの利用における安全な取扱に関するガイドラインを出しているが、この物理的封じ込めのレベルをＢＳＬ２からＢＳＬ１に下げることを認めた。ここで、他のいずれのポックスウイルスもＢＳＬ１の物理的封じ込めレベルを満足していない。ワクシニアウイルスのCopenhagen株（最も一般的な天然痘ワクチンである）ですら、これよりも高い物理的封じ込みレベル、すなわち、ＢＳＬ２を有する。このように、当該分野においては、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣは他のポックスウイルスよりも病原性が低いことが認められている。
【００５０】
高度に弱毒化されたポックスウイルスワクチンベクターＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣを用いて、ヒトＴ細胞白血球／リンパ種ウイルスタイプＩ（ＨＴＬＶ−I）１７１１の全エンベロープタンパク質（西アフリカの健康なＨＴＬＶ−I感染患者由来）を発現させた。
【００５１】
ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣを基礎とするＨＴＬＶ−Ienv 組換えウイルスの調製と発現：ＨＴＬＶ−Ienv 配列は、ＳｓｔＩ−Ｓｓｔ−Ｉ8.5kb のＨＴＬＶ−IゲノムＤＮＡを含有するプラスミドｐ１７−１１から入手した。該env 配列を、ワクシニアウイルスの初期／即時Ｉ３Ｌプロモータと正確にＡＴＧが対応するように融合させることにより、ポックスウイルス／ＨＴＬＶ−Ｉenv 発現カセットを構築した。このＩ３Ｌ／ＨＴＬＶ−Ienv 発現カセットを一般的な挿入プラスミドｐＳＰＨＡ６に挿入することにより挿入プラスミドｐＭＡＷ０１８を調製した。このプラスミドｐＭＡＷ０１８を用いて、レスキューウイルスとしてＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）とのインビトロ組換えアッセイを行い、ＮＹＶＡＣ、ＨＴＬＶ−Ienv （ｖＰ１１８１）を得た。このプラスミドとの組換えにより、ＮＹＶＡＣのＨＡ遺伝子座にＩ３Ｌ／ＨＴＬＶ−Ｉenv が挿入された。一般的挿入プラスミドｐＶＱＣ５ＬＳＰ６にＩ３Ｌ／ＨＴＬＶ−Ienv 発現カセットを挿入することにより挿入プラスミドｐＭＡＷＯ１７を調製した。このプラスミドｐＭＡＷＯ１７を用い、レスキューウイルスとしてのＡＬＶＡＣ（ｖＣＰｐｐ）とのインビトロ組換えアッセイを行いＡＬＶＡＣ  ＨＴＬＶ−Ienv （ｖＣＰ２０３）を得た。この挿入により、ＡＬＶＡＣのＣ５遺伝子座にＩ３Ｌ／ＨＴＬＶ−Ienv 発現カットが配置された。
【００５２】
これらの組換え体を用いてニュージーランド（New Zealand)白ウサギを免疫した。免疫法としては、ポックスウイルスの組換え体を単独接種する場合の他に、サブユニットブーストとしてアラムに溶かしたｇｐ６３ＨＴＬＶ−Iエンベロープ前駆体タンパク質を用いて追加免疫を行う場合も含ませた。もちろん、ｇｐ６３ＨＴＬＶエンベロープ前駆体は、本発明の組換え体と同時にまたはその後に投与することもできる。ウサギは全て、ＨＴＬＶ−IBOU 分離物の初代培養由来の有細胞ＨＴＬＶ−Iチャレンジ（５×１０４ 細胞）に供した。その結果、ＡＬＶＡＣを基礎とするＨＴＬＶ−Ienv ワクチンを１０７pfuで２回接種すると、最終免疫の５ヶ月後のウイルスのチャレンジに対して該動物を防御していた。しかしながら、驚くべきことに、ＡＬＶＡＣ−env にｇｐ６３の２回の追加免疫を組み合わせて用いると、防御を付与することができず、サブユニット製剤の投与は有害である可能性が示唆された。さらに重要なことは、５ヶ月の防御機能が与えられるということから、本発明の組換え体、またはそのような組換え体を含有する組成物またはその発現産物を動物（例えばウサギ）またはヒトに周期的に（例えば、年３回または年２回）ワクチン接種または投与することも考えられ、かくして、家禽（例えば、ウサギ）の集団がＨＴＬＶに感染したり、ＨＴＬＶキャリアになることを防止するのを助けることもでき、ＨＴＬＶ感染動物またはＨＴＬＶのキャリア動物がＨＴＬＶに羅病する可能性およびヒトと動物または動物間の密着接触の可能性を防ぐ。
【００５３】
さらに、ＮＹＶＡＣ  ＨＴＬＶ−Ienv 組換え体の場合は、最初の免疫から２ヶ月後という早期に防御機能が付与された。ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣによるこの臨床試験においては防御処理を受けた動物は、ＨＴＬＶ−IBOU に感染した動物由来の血液５ｍｌを用いた最初のチャレンジの５ヶ月後、再チャレンジに供され、その後感染した。しかしながら、組換え体によって与えられた防御機能から、該組換え体の有用性およびその発現産物の有用性は明らかである。
【００５４】
ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣ各ベクターの弱毒化プロフィルおよびそれらが体液性免疫応答および細胞性免疫応答を誘発する能力を有することから明らかなように（Tartaglia 他、1993a,b, Taylor 他、1992 ; Konishi他、1992）、それらの組換えウイルスは、既述のワクシニア系組換えウイルスよりも顕著な利点を有している。
【００５５】
本発明の組換えウイルスまたはその発現産物による組成物、例えば、免疫原性、抗原性もしくはワクチン組成物または治療組成物は、非経口経路（皮内、筋肉または皮下）で投与することができる。そのような投与により全身性免疫応答が可能となる。
【００５６】
さらに概説すれば、本発明に従う抗原性、免疫原性もしくはワクチン組成物または治療組成物（本発明のポックスウイルス組換え体を含有する組成物）は、製薬技術分野における当業者に周知の標準的な方法に従って調製することができる。それらの組成物は、患者の年齢、性別、体重、および症状、ならびに投与経路を考慮しながら、適当な投与量で医学分野の当業者に周知の方法に従って投与することができる。該組成物は、単独投与することもできるが、さらに、本発明の組成物、または他の免疫原性、抗原性もしくはワクチン組成物または治療組成物と同時に、または、それらとともに特定の順序で逐次的に、血清反応陽性のヒトに投与することもできる。また、該組成物は、単独投与することもできるが、本発明の組成物、または他の免疫原性、抗原性もしくはワクチン組成物または治療組成物と同時に、またはそれらとともに特定の順序で逐次的に、血清反応陰性のヒトに投与することもできる。他の組成物とは、ＨＴＬＶ由来の精製抗原または組換えポックスウイルスもしくは他のベクター系によって発現されたそのような抗原由来のものが挙げられる。他の組成物としては、また、他のＨＴＬＶ抗原を発現する組換えポックスウイルスまたは生体応答調節剤が挙げられる。これらの場合においても、患者の年齢、性別、体重および症状ならび投与経路などの因子を考慮する。
【００５７】
本発明の組成物は、例えば、腔部（例えば、口、鼻、肛門、膣など）投与用の液状製剤、例えば、サスペンション、シロップまたはエリキジールなど；さらには、非経口、皮下、皮内、筋肉内または静脈内投与（例えば、静注）用製剤、例えば、無菌のサスペンションまたはエマルションの形態をとる。それらの組成物においては、組換えポックスウイルスに、適当なキャリア、稀釈剤、または賦形剤、例えば無菌水、生理食塩水、ブドウ糖などを混合させてもよい。
【００５８】
さらに、本発明の組換えポックスウイルスの発現産物を直接使用して、血清反応陰性もしくは血清反応陽性のヒトまたは動物における免疫応答を刺激することもできる。すなわち、上述の組成物における本発明の組換えウイルスの代わりにまたはそれとともに、該発現産物を使用して本発明に従う組成物とすることもできる。
【００５９】
また、本発明の組換えポックスウイルスおよびそれに由来する発現産物は、ヒトおよび動物における免疫または抗体応答を刺激し、したがって該産物は抗原となる。これらの抗体または抗原から、当該技術分野で周知の手法により、モノクローナル抗体を調製することができ、そして、周知の抗体結合分析系、診断キットまたはテスト系においてこれらのモノクローナル抗体または抗原を使用して、特定のＨＴＬＶ抗原の有無、したがって、（ＨＴＬＶまたはその他の系において）該ウイルスまた抗原の発現の有無を測定したり、または、該ウイルスまたは抗原に対する免疫応答が刺激されたか否かを判定することができる。これらのモノクローナル抗体または抗原は、免疫吸着クロマトグラフィーに使用されて、ＨＴＬＶまたは本発明の組換えポックスウイルスの発現産物を回収したり単離することもできる。
【００６０】
さらに、詳述すれば、本発明に従う組換え体および組成物は、以下のような多くの用途を有する：
(i)   血清反応陰性のヒトにおける免疫応答の誘発（ワクチン接種またはワク    チン接種の一部として）；
(ii)  血清反応陽性のヒトの治療；および
(iii) ウイルス感染のリスクを伴わないインビトロでのＨＴＬＶタンパク質の    調製。
【００６１】
本発明の組換えポックスウイルスの発現産物は、直接使用されて、血清反応陰性もしくは血清反応陽性のヒトまたは動物における免疫応答を刺激することができる。すなわち、本発明の組換えポックスウイルスに代えてまたはそれとともに、該発現産物を使用して本発明の組成物を調製することもできる。
【００６２】
さらに、本発明の組換えポックスウイルスおよびそれに由来する発現産物は、ヒトおよび動物における免疫または抗体応答を刺激する。これらの抗体から、当該分野で周知の手法によりモノクローナル抗体を調製することができ、そして、これらのモノクローナル抗体または本発明に従うポックスウイルスの発現産物もしくは組成物を周知の抗体結合分析系、診断キットまたはテスト系に使用して、特定のＨＴＬＶ抗原または抗体の有無、したがって、該ウイルスの有無を測定したり、あるいは、該ウイルスまたは抗原に対する免疫応答が刺激されたか否かを判定することができる。これらのモノクローナル抗体を免疫吸着クロマトグラフィーに使用して、ＨＴＬＶまたは本発明の組換えポックスウイルスの発現産物を回収、単離または検出することもできる。モノクローナル抗体を製造する方法およびモノクローナル抗体の使用方法、ならびにＨＴＬＶ抗原（本発明のポックスウイルスの発現産物および組成物）の使用法などは当該技術分野における当業者には周知である。それらは、診断法、キット、テスト系または分析系などに使用されるとともに、免疫吸着クロマトグラフィーまたは免疫沈降法による物質回収に使用され得る。
【００６３】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞により産生される免疫グロブリンである。モノクローナル抗体は、単一の抗原決定基に反応し、通常の血清由来の抗体よりも高い特異性を与える。さらに、多数のモノクローナル抗体にスクリーニングを行うことにより、所望の特異性、アビディディ（抗原結合力）およびイソタイプを有する個々の抗体を選択することができる。ハイブリドーマ細胞系は、化学的に同一の抗体の恒常的且つ安価な供給源となり、そして、そのような抗体の調製は容易に標準化できる。モノクローナル抗体を産生する方法は当該技術分野における当業者には周知であり、例えば、Koprowski 他による米国特許第4,196,265 号1983年３月８日発行）を参考に引用しておく。
【００６４】
モノクローナル抗体の用途も既知である。そのような用途の一つは診断法に利用するものであり、例えば1983年３月８日付でDavid,G.およびGreene,H. に付与された米国特許第4,376,110 号を引用しておく。モノクローナル抗体は、免疫吸着クロマトグラフィーにより物質を回収するのにも利用されており、例えば、Milstein,C. による「Scientific American 243 : 66, 70 (1980) 」を引用しておく。  さらに、本発明に従う組換えポックスウイルスおよびその発現産物は、インビトロまたは半ビボ（後に患者に再注入）で細胞の応答を刺激するのに使用することができる。患者の血清反応が陰性の場合、再注入により、免疫応答、例えば能動免疫のような免疫または抗原応答を刺激する。血清反応陽性の患者においては、再注入が、ＨＴＬＶに対する免疫系を刺激または増強する。
【００６５】
従って、本発明の組換えポックスウイルスは以下のような幾つかの用途を有する：血清反応陰性の患者に投与されるような抗原性、免疫性またはワクシン組成物へ使用。ＨＴＬＶに対する免疫系を刺激または増強して治療が必要な血清反応陽性なヒト用組成物への使用。インビトロで抗原性を産生させ、これをさらに、抗原性、免疫性もしくはワクチン組成物または治療組成物に使用すること。以下の用途に使用され得るような抗体（直接投与するか、または本発明の組換えポックスウイルスの発現産物を投与することによる）または該発現産物または抗原を産生させること：すなわち、診断系、テスト系またはキットに使用して、血清のようなサンプル中における抗原の有無を確認、例えば、血清のようなサンプル中のＨＴＬＶの有無を確認したり、あるいは、該ウイルスまたは特定の抗原に対する免疫応答が誘起されたか否かを判定したり、さらには、免疫吸着クロマトグラフィー、免疫沈降またはこれらに類似する手法に使用すること。
【００６６】
分析系、キットまたはテスト系における組換え抗原の使用に関しては、ヨーロッパ特許出願第89 202 922.4（1989年11月20日出願）「エイズ用スキンテストおよびテストキット（Skin Test and Test Kit For Aids)」、ＮＴＩＳpublication No. p890-238429 「ＨＴＬＶ−III  ＤＮＡのクローニングおよび発現（Cloning and Expression of ＨＴＬＶ−III  ＤＮＡ）」（1990年11月発行）（Chang により１月23日出願の米国特許出願第06/693,866号）を参考に引用し、また、抗原を利用する分析系については、Essex 他による米国特許第4,725,669 号を参考に引用しておく。
【００６７】
本発明の実施態様としてはその他の用途もある。
【００６８】
本発明およびその効果をさらに明らかにするため以下に実施例を示す。
【００６９】
実  施  例
ＤＮＡクローニングおよび合成
標準的な方法（Maniatis他、1982；Perkus他、1985；Piccini 他、1987）によりプラスミドを構築し、スクリーニングし培養した。制限エンドヌクレアーゼは、米国メリーランド州GaithersburgのBethesda Research Laboratories, 米国マサチューセッツ州Beverly のNew England Biolabs,および米国インディアナ州IndianapolisのBoehringer Mannheim Biochemicalsから入手した。大腸菌ポリメラーゼのクレノウ断片は、Boehringer Mannheim Biochemicalsから入手した。ＢＡＬ−３１エクソヌクレアーゼおよびファージＴ４のＤＮＡリガーゼはNew England Biolabs から入手した。各試薬は供給業者の指示に従って使用した。
【００７０】
合成オリゴデオキシリボヌクレオチドは、既述のように（Perkus他、1989）Biosearch 8750またはApplied Biosystems 380B ＤＮＡ合成装置を用いて調製した。ＤＮＡ配列決定は、既述の手法に従い（Guo 他、1989）シークエナーゼ（Sequenase)を用いて（Tabor 他、1987）ジデオキシ−チェインターミネーション法により（Sanger他、1977）行った。配列確認のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅（Engelke 他、1988）は、自動式Perkin Elmer Cetus  ＤＮＡ熱サイクル装置（ＤＮＡ Thermal Cycler)によりカスタム合成オリゴヌクレオチドプライマーおよびGeneAmp ＤＮＡ増幅試薬キット（米国コネチカット州Norwalk のPerkin Elmer Cetus社製）を用いて実施した。プラスミドからの過剰ＤＮＡ配  列の欠失は、制限エンドヌクレアーゼ分解、その後、ＢＡＬ−３１エクソヌクレアーゼによる制限分解および合成オリゴヌクレオチドによる突然変異法（Mandecki,1986)により行った。
【００７１】
細胞、ウイルスおよびトランスフェクション
ワクシニアウイルスのCopenhagen株の起源および培養条件は既に明らかにされている（Guo 他、1989）。組換えによる組換えウイルスの調製、ニトロセルロースフィルターを用いるインサイトウハイブリダイゼーションおよびβ−ガラクトシダーゼ活性を利用するスクリーニングについては既に明らかにされている（Piccini 他、1987）。
【００７２】
ワクシニアウイルスのCopenhagen株およびＮＹＶＡＣの起源および培養条件は既に明らかにされている（Guo 他、1989；Tartaglia 他、1992）。組換えによる組換えウイルスの調製、ニトロセルロースフィルターを用いるインサイトウハイブリダイゼーション、およびβ−ガラクトシダーゼを利用するスクリーニングについては既に明らかにされている（Panicali他、1982；Perkus他、1989）。
【００７３】
カナリアポックスウイルスの親株（Rentschler株）はカナリアのワクシニア菌株である。このワクチン株は、野生型の単離が入手され、ニワトリ胚繊維芽細胞を用いる200 回以上の継代培養により弱毒化されたものである。そのマスターウイルス種株は寒天培地下の４回の連続的なプラーク精製に供され、そのプラーククローンの１つが５回の追加の継代培養により増幅され、その後、このストックウイルスが親ウイルスとしてインビトロ組換え試験に使用されてきた。
【００７４】
ＦＰ−１と命名された家禽ポックスウイルス（ＦＰＶ）株については既に明らかにされている（Taylor他、1988a)。これは、日齢のヒナのワクチン接種に有用な弱毒化ワクチン株である。親ウイルス株Duvette は、フランスにおいてニワトリヒナから家禽ポックス疥癬として入手された。このウイルスが胚鶏卵での約50回の連続的な継代培養の後、ニワトリ胚繊維芽細胞における25回の継代培養により弱毒化された。該ウイルスは４回の連続的なプラーク精製に供された。プラークの１つが単離され、初代ＣＥＦ細胞中で増幅され、ＴＲＯＶＡＣと命名されたストックウイルスが樹立された。
【００７５】
ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣ各ウイルスベクターおよびそれらの誘導体の増殖については既に記述されている（Piccini 他、1987；Taylor他、1988a,b)。増殖にベロ細胞やニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）を使用することも既に明らかにされている（Taylor他、1988a,b)。
【００７６】
ＮＹＶＡＣおよび特に実施例１から６に関しては、米国特許第5,364,773 号を参照されたく、ここに引用する。
【実施例１】
【００７７】
実施例１−チミジンキナーゼ遺伝子（Ｊ２Ｒ）を欠失させるためのプラスミドｐ ＳＤ４６０の構築
図１に関連して、プラスミドｐＳＤ４０６は、ｐＵＣ８にクローニングしたワクシニアＨｉｎｄIII Ｊ（位置83359 〜88377)を含有する。ｐＳＤ４０６をＨｉｎｄIII とＰｖｕIIで切断し、ＨｉｎｄIII の左側の1.7kb のフラグメントを、ＨｉｎｄIII ／ＳｍａI で切断したｐＵＣ８にクローニングしてｐＳＤ４４７を調製した。ｐＳＤ４４７は、Ｊ２Ｒの全遺伝子を含有する（位置83855 〜84385)。開始コドンはＮｌａIII 部位内に含まれており、また、終止コドンはＳｓｐI 部位内に含まれている。転写の方向は図１内の矢印で示す。
【００７８】
左側のフランキングアームを得るために、ｐＳＤ４４７から0.8kb のＨｉｎｄIII ／ＥｃｏＲＩフラグメントを分離し、次いでＮｌａIII で分解して0.5kb のＨｉｎｄIII ／ＮｌａIII フラグメントを分離した。以下の配列を有するアニーニングした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４３／ＭＰＳＹＮ４４（ＳＥＱＩＤ  NO:1／ＳＥＱ  ＩＤ  NO:2）を0.5kb のＨｉｎｄIII ／ＮｌａIII フラグメントと連結（ライゲート）し、ＨｉｎｄIII ／ＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ１８ベクタープラスミドに導入して、プラスミドｐＳＤ４４９を得た。
【００７９】
2007254489.tif 000002
ワクシニアの右側のフランキングアームおよびｐＵＣベクター配列を含有する制限酵素フラグメントを得るために、ワクシニア配列内でＳｓｐＩ（部分的）を用い、またｐＵＣ／ワクシニア結合部においてＨｉｎｄIII を用いてｐＳＤ４４７を切断して、2.9kb のベクターフラグメントを分離した。このベクターをフラグメントを、以下の配列を有するアニーリングした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４５／ＭＰＳＹＮ４６（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:3／ＳＥＱ  ＩＤ  NO:4）と連結して、ｐＳＤ４５９を得た。
【００８０】
2007254489.tif 000003
左側フランキングアームと右側フランキングアームを結合させて１つのプラスミドとするために、ｐＳＤ４４９から0.5kb のＨｉｎｄIII ／ＳｍａＩフラグメントを分離し、これを、ＨｉｎｄIII ／ＳｍａＩで切断されたｐＳＤ４５９ベクタープラスミドに連結してｐＳＤ４６０を調製した。このｐＳＤ４６０をドナープラスミドとして用い、野性型親ワクシニアウイルスCopenhagen株ＶＣ−２との組換えを実施した。鋳型としてＭＰＳＹＮ４５（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:3）およびプライマーとして相補的な20マー（20mer)オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４７（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:5）（５′TTAGTTAATTAGGCGGCCGC３′）を用いるプライマー延長法により３２Ｐがラベルされたプローブを合成した。組換えウイルスｖＰ４１０の同定はプラークハイブリダイゼーションにより行った。
【実施例２】
【００８１】
実施例２−出血性領域（Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）を欠失させるためのプラスミド ｐＳＤ４８６の構築
図２において、プラスミドｐＳＤ４１９は、ｐＵＣ８にクローニングされたワクシニアＳａｌＩ  Ｇ（位置160,774 〜173,351)を含有する。ｐＳＤ４２２は、右側に隣接するワクシニアＳａｌＩフラグメントＳａｌＩ  Ｇ（位置173,351 〜182,746)（ｐＵＣ８にクローニングされている）を含有している。出血性領域ｕ、Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ（位置172,549 〜173,552)が欠失されたプラスミドを構築するため、左側フランキングアーム源としてｐＳＤ４１９を用い、また、右側フランキングアーム源としてｐＳＤ４２２を用いた。ｕ領域の転写方向は図２の矢印で示す。
【００８２】
ｐＳＤ４１９から非所望配列を除去するために、ＮｃｏＩ／ＳｍａＩを用いてｐＳＤ４１９を分解し、次いで大腸菌のクレノウ断片を用いる平滑末端化および連結（ライゲーション）を行うことにより、ＮｃｏＩ部位（位置172,253)の左側の配列を除去してプラスミドｐＳＤ４７６を得た。Ｂ１４Ｒの終結コドンにおけるＨｐａＩを用いるｐＳＤ４２２の分解およびＮｒｕＩによる分解によりワクシニアの右側フランキングアーム0.3kb を得た。この0.3kb のフラグメントを単離、ｐＳＤ４７６から単離された3.4kb のＨｉｎｃIIベクターフラグメントに連結て、プラスミドｐＳＤ４７７を得た。ｐＳＤ４７７におけるワクシニアｕ領域の部分血失位置は三角形で示している。ｐＳＤ４７７における残りのＢ１３Ｒコーデ配列を除去するため、ＣｌａＩ／ＨｐａＩを用いる酵素分解を行い、得られたベクターフラグメントを、以下の配列を有するアニーリングされた合成オリゴヌクレオチドＳＤ22mer ／ＳＤ20mer （ＳＥＱ  ＩＤ  NO:6／ＳＥＱ  ＩＤ  NO:7）に連結して、ｐＳＤ４７９を調製した。
【００８３】
2007254489.tif 000004
ｐＳＤ４７９は、開始コドン（下線）を含有し、その後にＢａｍＨＩ部位がある。ｕプロモーターの制御下にＢ１３−Ｂ１４（ｕ）欠失位置に大腸菌ベーターガラクトシダーゼを入れるために、ベーターガラクトシダーゼ遺伝子（Shapira 他、1983）を含有する3.2kb のＢａｍＨＩフラグメントをｐＳＤ４７９のＢａｍＨＩ部位に挿入して、ｐＳＤ４７９ＢＧを調製した。このｐＳＤ４７９ＢＧをドナープラスミドとして、ワクシニアウイルスｖＰ４１０との組換えを実施した。組換えワクシニアウイルスｖＰ５３３を、発色性基質Ｘ−ｇａｌの存在下に青色のプラークとして分離した。ｖＰ５３３においては、Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ領域が欠失され、ベーターガラクトシダーゼによって置換されている。
【００８４】
ｖＰ５３３からベーターガラクトシダーゼを取り除くために、ポリリンカー領域を含有するがｕ欠失結合部に開始コドンを有しないｐＳＤ４７７の誘導体であるプラスミドｐＳＤ４８６を用いた。先ず、上述のｐＳＤ４７７由来のＣｌａＩ／ＨｐａＩベクターフラグメントを、以下の配列を有するアニーリングされた合成オリゴヌクレオチドＳＤ42mer ／ＳＤ40mer （ＳＥＱ  ＩＤ  NO:8／ＳＥＱＩＤ  NO:9）に連結して、プラスミドｐＳＤ４７８を調製した。
【００８５】
2007254489.tif 000005
次に、ｐＵＣ／ワクシニア結合部におけるＥｃｏＲＩ部位を破壊するため、ＥｃｏＲＩを用いてｐＳＤ４７８を酵素分解し、その後、大腸菌ポリメラーゼのクレノウ断片を用いる平滑末端化および連結（ライゲーション）を行うことにより、ｐＳＤ４７８Ｅ−  を得た。このｐＳＤ４７８Ｅ−  をＢａｍＨＩおよびＨｐａＩを用いて分解し、以下に示す配列を有するアニーリングされた合成オリゴヌクレオチドＨＥＭ５／ＨＥＭ６（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:10 ／ＳＥＱ  ＩＤ  NO:11)に連結して、プラスミドｐＳＤ４８６を調製した。
【００８６】
2007254489.tif 000006
ｐＳＤ４８６をドナープラスミドとして用い、組換えワクシニアウイルスｖＰ５３３との組換えを行ってｖＰ５５３を得た。このｖＰ５５３は、Ｘ−ｇａｌの存在下に明瞭なプラークとして単離された。
【実施例３】
【００８７】
実施例３−ＡＴＩ領域（Ａ２６Ｌ）を欠失させるプラスミドｐＭＰ４９４Δの構築
図３において、ｐＳＤ４１４は、ｐＵＣ８にクローニングされたＳａｌＩ  Ｂを含有する。Ａ２６Ｌ領域の左側の非所望ＤＮＡ配列を取り除くために、ｐＳＤ４１４を、ワクシニア配列内でＸｂａＩを用いて切断し、またｐＵＣ／ワクシニア結合部においてＨｉｎｄIII を用いる切断を行い、次に、大腸菌ポリメラーゼのクレノウ断片を用いる平滑末端および連結を行うことにより、プラスミドｐＳＤ４８３を得た。Ａ２６Ｌ領域の右側の非所望ワクシニアＤＮＡ配列を除去するために、ＥｃｏＲＩを用いてｐＳＤ４８３を切断し（位置140,665 およびｐＵＣ／ワクシニア結合部）、連結処理（ライゲーション）を行ってプラスミドｐＳＤ４８４を形成した。Ａ２６Ｌコード領域を取り除くため、ＮｄｅＩ（部分的）を用いてＡ２６ＬのＯＲＦの少し上流を切断し（位置139,004)且つＨｐａＩを用いてＡ２６ＬのＯＲＦの少し下流を切断（位置137,889)した。5.2kb のベクターフラグメントを単離し、これを以下の配列を有するアニーリングされた合成オリゴヌクレオチドＡＴＩ３／ＡＴＩ４（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:12 ／ＳＥＱ  ＩＤ  NO:13)と連結して、Ａ２６Ｌの上流領域を再構成し、下記の配列に示すようなＢａｌII、ＥｃｏＲＩおよびＨｐａＩの制限部位を含有する短いポリリンカー領域とＡ２６ＬのＯＲＦを置換した。
【００８８】
2007254489.tif 000007
得られたプラスミドをｐＳＤ４８５と命名した。ｐＳＤ４８５のポリリンカー領域におけるＢａｌII部位およびＥｃｏＲＩ部位は唯一のものではないので、ＢｇｌIIを用いる分解（位置140,136)およびｐＵＣ／ワクシニア結合部におけるＥｃｏＲＩによる分解を行い、その後、大腸菌ポリメラーゼのクレノウ断片を用いる平滑末端化および連結（ライゲーション）により、プラスミド４８３（上述）から非所望のＢａｌII部位およびＥｃｏＲＩ部位を除去した。得られたプラスミドをｐＳＤ４８９と命名した。ｐＳＤ４８９由来でＡ２６ＬのＯＲＦを含有する1.8kb のＣｌａＩ（位置137,198)／ＥｃｏＲＩ（位置139,048)フラグメントを対応する0.7kb でポリリンカーを含有するｐＳＤ４８５由来のＣｌａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントと置換することによりｐＳＤ４９２を得た。このｐＳＤ４９２のポリリンカー領域におけるＢｇｌII部位およびＥｃｏＲＩ部位は唯一のものである。
【００８９】
ｐＳＤ４９２のＢｇｌII部位に、１１ｋＤａのワクシニアプロモーター（Bertholet 他、1985；Perkus他、1990）の制御下に大腸菌ベーターガラクトシダーゼ遺伝子（Shapira 他、1983）を含有する3.3kb のＢｇｌIIカセットを挿入して、ｐＳＤ４９３ＫＢＧを形成した。このプラスミドｐＳＤ４９３ＫＢＧを用いて、レスキューウイルスｖＰ５５３との組換えを行った。Ａ２６Ｌ欠失領域にベーターガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルスｖＰ５８１が、Ｘ−ｇａｌの存在下に青色のプラークとして単離された。
【００９０】
ワクシニア組換えウイルスｖＰ５８１からベーターガラクトシダーゼを欠失させるプラスミドを調製するために、以下の配列を有する合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ１７７（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:14)を用いる突然変異法（Mandeck 、1986）によりプラスミドｐＳＤ４９２のポリリンカー領域を欠失させた。
【００９１】
2007254489.tif 000008
得られたプラスミドｐＭＰ４９４Δにおいては、位置［137,889 〜138,937 ］をカバーし、Ａ２６ＬのＯＲＦ全体を含むワクシニアＤＮＡが欠失されている。このｐＭＰ４９４Δとベーターガラクトシダーゼ含有ワクシニア組換え体ｖＰ５８１との間の組換えにより、ワクシニア欠失変異体ｖＰ６１８が得られ、Ｘ−ｇａｌの存在下に明瞭なプラークとして単離された。
【実施例４】
【００９２】
実施例４−血球凝集素遺伝子（Ａ５６Ｒ）を欠失させるためのプラスミドｐＳＤ ４６７の構築
図４において、ワクシニアＳａｌＩ  Ｇ制限フラグメント（位置160,744 〜173,351)は、ＨｉｎｄIII Ａ／Ｂ結合部（位置162,539)を包含している。ｐＳＤ４１９は、ｐＵＣ８にクローニングされたワクシニアＳａｌＩ  Ｇを含有する。血球凝集素（ＨＡ）遺伝子の転写方向は図４における矢印で示されている。ＨｉｎｄIII Ｂ由来のワクシニア配列の除去には、ワクシニア配列内およびｐＵＣ／ワクシニア結合部においてＨｉｎｄIII を用いるｐＳＤ４１９の酵素分解を行い、その後、連結処理（ライゲーション）した。得られたプラスミドｐＳＤ４５６は、左側が0.4kb のワクシニア配列および右側が0.4kb のワクシニア配列で挟まれたＨＡ遺伝子（Ａ５６Ｒ）を含有する。Ａ５６Ｒをコードする配列を除去するために、Ａ５６Ｒコード配列の上流をＲｓａＩ（部分的；位置161,090)でまた、該遺伝子の末端近傍をＥａｇｌ（位置162,054)でｐＳＤ４５６を切断した。ｐＳＤ４５６から3.6kb のＲｓａＩ／ＥａｇＩベクターフラグメントを単離し、以下の配列を有するアニーリングした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ５９（ＳＥＱＩＤ  NO:15)、ＭＰＳＹＮ６２（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:16)、ＭＰＳＹＮ６０（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:17)およびＭＰＳＹＮ６１（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:18)に連結（ライゲート）して、Ａ５６ＲのＯＲＦの上流のＤＮＡ配列を再構成し、Ａ５６ＲのＯＲＦを下記に示すようなポリリンカー領域と置換した。
【００９３】
2007254489.tif 000009
得られたプラスミドがｐＳＤ４６６である。このｐＳＤ４６６におけるワクシニア欠失は位置［161,185 〜162,053 ］を包含する。ｐＳＤ４６６における欠失部位は図４では三角形で示されている。
【００９４】
ｐＳＤ４６６のＢｇｌII部位に、１１ｋＤａのワクシニアプロモーター（Bertholet 他、1985；Guo他、1989）の制御下に大腸菌ベーターガラクトシダーゼ遺伝子（Shapira 他、1983）を含有する3.2kb のＢｇｌII／ＢａｍＨＩ（部分的）カセットを挿入して、ｐＳＤ４６６ＫＢＧを形成した。このプラスミドｐＳＤ４６６ＫＢＧを用いて、レスキューウイルスｖＰ６１８との組換えを行った。Ａ５６Ｒ欠失部位にベーターガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルスｖＰ７０８が、Ｘ−ｇａｌの存在下に青色プラークとして単離された。
【００９５】
ドナープラスミドｐＳＤ４６７を用い、ｖＰ７０８からベーターガラクトシダーゼ配列を除去した。ｐＳＤ４６７はｐＳＤ４６６と同じであるが、但し、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩを用いるｐＳＤ４６６の分解、それに続く大腸菌ポリメラーゼのクレノウ断片を用いる平滑末端化および連結処理（ライゲーション）によりｐＵＣ／ワクシニア結合部からＥｃｏＲＩ部位、ＳｍａＩ部位およびＢａｍＨＩ部位が取り除かれている。ｖＰ７０８とｐＳＤ４６７との間に組換えを行うことにより組み換えワクシニア欠失変異体ｖＰ７２３が得られ、Ｘ−ｇａｌの存在下に明瞭なプラークとして単離された。
【実施例５】
【００９６】
実施例５−オープンリーディングフレーム［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］
を欠失させるためのプラスミドｐＭＰＣＳＫ１Δの構築
図５において、次のワクシニアクローンを利用してｐＭＰＣＳＫ１Δを構築した。ｐＳＤ４２０は、ｐＵＣ８にクローニングされたＳａｌＩ  Ｈである。ｐＳＤ４３５は、ｐＵＣ１８にクローニングされたＫｐｎＩ  Ｆである。ＳｐｈＩでｐＳＤ４３５を切断してｐＳＤ４５１を形成した。このｐＳＤ４５１においては、ＨｉｎｄIII ＭにおけるＳｐｈＩ部位（位置27,416）の左側のＤＮＡ配列が除去されている（Perkus他、1990）。ｐＳＤ４０９は、ｐＵＣ８にクローニングされたＨｉｎｄIII Ｍである。
【００９７】
ワクシニアから［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］遺伝子群を除去する基体を得るために、先ず、以下のように、ワクシニアのＭ２Ｌ欠失座に大腸菌ベーターガラクトシダーゼを挿入した。ｐＳＤ４０９においてＢｇｌII部位を取り除くために、ＢｇｌIIを用いてワクシニア配列（位置28,212）およびＢａｍＨＩを用いてｐＵＣ／ワクシニア結合部において該プラスミドを切断し、次いで連結処理（ライゲーション）を行い、プラスミドｐＭＰ４０９Ｂを形成した。唯一のＳｐｈＩ部位（位置27,416）においてｐＭＰ４０９Ｂを切断した。以下の配列の合成オリゴヌクレオチドを用いる突然変異法（Guo 他、1990；Mandecki，1986）によりＭ２Ｌのコード配列を除去した。
【００９８】
2007254489.tif 000010
得られたプラスミドｐＭＰ４０９Ｄは、上記のようにＭ２Ｌ欠失座に挿入された唯一のＢｇｌII部位を含有する。ＢｇｌIIで切断されたｐＭＰ４０９Ｄに、１１ｋＤａのプロモーター（Bertholet 他、1985）の制御下に大腸菌ベーターガラクトシダーゼ遺伝子（Shapira 他、1983）を含有する3.2kbのＢａｍＨＩ（部分的）／ＢｇｌIIカセットを挿入した。得られたプラスミドｐＭＰ４０９ＤＢＧ（Guo 他、1990）をドナープラスミドとして用い、レスキューワクシニアウイルスｖＰ７２３との組換えを行った。Ｍ２Ｌ欠失座に挿入されたベーターガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルスｖＰ７８４が、Ｘ−ｇａｌの存在下に青色プラークとして単離された。
【００９９】
ワクシニア遺伝子［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］が欠失されたプラスミドを、ＳｍａＩ、ＨｉｎｄIII で切断され、大腸菌ポリメラーゼのクレノウ断片で平滑末端化されたｐＵＣ８に組み込んだ。ワクシニアＨｉｎｄIII Ｃ配列から成る左側のフランキングアームを得るために、ｐＳＤ４２０をＸｂａＩ（位置18,628）で分解した後、大腸菌ポリメラーゼのクレノウ断片を用いる平滑末端化およびＢｇｌII（位置19,706）を用いる分解を行った。ワクシニアＨｉｎｄIII Ｋ配列から成る右側のフランキングアームを選るには、ｐＳＤ４５１をＢｇｌII（位置29,062）およびＥｃｏＲＩ（位置29,778）で分解した。得られたプラスミドｐＭＰ５８１ＣＫは、ＨｉｎｄIII ＣのＢｇｌII部位（位置19,706）とＨｉｎｄIII ＫのＢｇｌII部位との間のワクシニア配列が欠失されている。プラスミドｐＭＰ５８１ＣＫにおけるワクシニア配列の欠失部位は図５に三角形で示している。
【０１００】
ワクシニア欠失部の過剰なＤＮＡを除去するため、プラスミドｐＭＰ５８１ＣＫをワクシニア配列内のＮｃｏＩ部位（位置18,811；19,625）において切断し、Ｂａｌ−３１エクソヌクレアーゼを用いて処理し、さらに、以下の配列を有する合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２３３（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:20)を用いる突然変異法（Mandecki，1986）に供した。
【０１０１】
2007254489.tif 000011
得られたプラスミドｐＭＰＣＳＫ１Δは、12のワクシニアリーデンフレーム［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］を包含する18,805〜29,108位置のワクシニア配列が欠失されている。ｐＭＰＣＳＫ１Δとベーターガラクトシダーゼ含有ワクシニアウイルスｖＰ７８４との間に組換えを行わせることにより、ワクシニア欠失変異体ｖＰ８０４が得られ、Ｘ−ｇａｌの存在下に明瞭なプラークとして単離された。
【実施例６】
【０１０２】
実施例６−リボヌクレオチドレダクターゼ大サブユニットを欠失させるための
プラスミドｐＳＤ５４８の構築
図６において、プラスミドｐＳＤ４０５は、ｐＵＣ８にクローニングされたワクシニアＨｉｎｄIII Ｉ（位置63,875〜70,367）を含有する。このｐＳＤ４０５をワクシニア配列内でＥｃｏＲＩにより、また、ｐＵＣ／ワクシニア結合部においてはＳｍａＩにより消化分解し、連結処理（ライゲーション）することによりプラスミドｐＳＤ５１８を形成した。ｐＳＤ５４８の構築に用いたワクシニア制限フラグメントは、全て、このｐＳＤ５１８由来のものである。
【０１０３】
ワクシニアのＩ４Ｌ遺伝子は、67,371〜65,059の位置に延在している。Ｉ４Ｌの転写方向は、図６において矢印で示されている。Ｉ４Ｌのコード配列の一部が欠失したベクタープラスミドを得るために、ｐＳＤ５１８をＢａｍＨＩ（位置65,381）およびＨｐａＩ（位置67,001）を用いて分解し、且つ、大腸菌のクレノウ断片を用いて円滑末端化した。この4.8kb のベクターフラグメントを、ワクシニアの１１ｋＤａのプロモーター（Bertholet 他、1985；Perkus他、1990）の制御下に大腸菌ベーターガラクトシダーゼ遺伝子（Shapira 他、1983）を含有する3.2kb のＳｍａＩカセットに連結して、プラスミドｐＳＤ５２４ＫＢＧを得た。このｐＳＤ５２４ＫＢＧをドナープラスミドとして、ワクシニアウイルスｖＰ８０４との組換えを行った。Ｉ４Ｌ遺伝子の部分欠失位置にベーターガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルスｖＰ８５５が、Ｘ−ｇａｌの存在下に青色プラークとして単離された。
【０１０４】
ベーターガラクトシダーゼおよび残存するＩ４ＬのＯＲＦをｖＰ８５５から欠失させるために、欠失プラスミド５４８を構築した。以下に詳述し且つ図６に示すように、左側および右側のワクシニアフランキングアームをそれぞれ別個にｐＵＣ８に組み込んだ。
【０１０５】
左側のワクシニアフランキングアームを受け入れるベクタープラスミドを構築するため、ｐＵＣ８をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、以下の配列を有するアニーリングされた合成オリゴヌクレオチド５１８Ａ１／５１８Ａ２（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:21 ／ＳＥＱ  ＩＤ  NO:22)に連結して、プラスミドｐＳＤ５３１を形成した。
【０１０６】
2007254489.tif 000012
ＲｓａＩ（部分的）およびＢａｍＨＩでｐＳＤ５３１を切断し、2.7kb のベクターフラグメントを単離した。ＢｇｌII（位置64,459）でｐＳＤ５１８を切断して0.5kb のフラグメントを単離した。これらの２つのフラグメントを互いに連結して、Ｉ４Ｌのコード配列の左側の完全なワクシニアフランキングアームを含有するｐＳＤ５３７を形成した。
【０１０７】
右側のワクシニアフランキングアームを受け入れるベクタープラスミドを構築するため、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩでｐＵＣ８を切断し、以下に示す配列を有するアニーリングされた合成オリゴヌクレオチド５１８Ｂ１／５１８Ｂ２（ＳＥＱＩＤ  NO:23 ／ＳＥＱ  ＩＤ  NO:24)に連結して、プラスミドｐＳＤ５３２ＷＯ形成した。
【０１０８】
2007254489.tif 000013
このｐＳＤ５３２をＲｓａＩ（部分的）／ＥｃｏＲＩで切断して2.7kb のベクターフラグメントを単離した。ｐＳＤ５１８を、ワクシニア配列内をＲｓａＩ（位置67,436）を用い、また、ワクシニア／ｐＵＣ結合部をＥｃｏＲＩを用いて切断して0.6kb のフラグメントを単離した。Ｉ４Ｌのコード配列の右側の完全なフランキングアームを含有するｐＳＤ５３８を調製した。
【０１０９】
右側のワクシニアフランキングアームは、ｐＳＤ５３８から0.6kb のＥｃｏＲＩ／ＢｇｌIIフラグメントとして単離し、ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌIIで切断されたｐＳＤ５３７内に連結した。得られたプラスミドｐＳＤ５３９においては、Ｉ４ＬのＯＲＦ（位置65,047〜67,836）がポリリンカー領域によって置換されており、該領域は左側を0.6kb のワクシニアＤＮＡにより、また右側を0.6kb のワクシニアＤＮＡにより挟まれており（フランキングされており）、こえらは全てｐＵＣバックグランド内にある。ワクシニア配列内の欠失部は、図６において三角形で示している。ｐＳＤ５３９のｐＵＣ誘導部分のベーターガラクトシダーゼが、組換えワクシニアウイルスｖＰ８５５内のベーターガラクトシダーゼと組換えを行う可能性を回避するため、ｐＳＤ５３９からワクシニアＩ４Ｌ欠失カセットを取り除いてｐＲＣ１１とした。このｐＲＣ１１は、すべてのベーターガラクトシダーゼが除去され、ポリリンカー領域で置換されたｐＵＣ誘導体である（Cokins他、1990）。ｐＳＤをＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩで切断して1.2kb のフラグメントを単離した。このフラグメントを、ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩで切断したｐＲＣ１１（2.35kb）に連結して、ｐＳＤ５４８を形成した。ｐＳＤ５４８とベーターガラクトシダーゼ含有ワクシニア組換え体ｖＰ８５５との間に組換えを行わせることにより、ワクシニア欠失変異体ｖＰ８６６が得られ、Ｘ−ｇａｌの存在下に明瞭なプラークとして単離された。
【０１１０】
組換えワクシニアウイルスｖＰ８６６由来のＤＮＡの分析は、制限酵素分解、次にアガロースゲル上の電気泳動法により行った。制限パターンは予測どおりであった。鋳型としてｖＰ８６６および上で詳述した６つの欠失遺伝子座を挟む（フランキングする）プライマーを用いるポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）（Engelke 他、1988）により予測された大きさのＤＮＡフラグメントが得られた。ＰＣＲで得られたフラグメントの欠失接合領域近傍の配列分析により、接合が期待どおりであることが確認された。上述したような６つの欠失部を有するように工夫した組換えワクシニアウイルスｖＰ８６６をワクシニアウイルス株「ＮＹＶＡＣ」と命名した。
【実施例７】
【０１１１】
実施例７−ＮＹＶＡＣへの狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子の挿入
ワクシニアＨ６プロモーター（Taylor他、1988a,b)の制御下に狂犬病（ウイルス）糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子をＴＫ欠質プラスミドｐＳＤ５１３に挿入した。ｐＳＤ５１３は、ポリリンカーが存在している点を除いては、ｐＳＤ４６０（図１）と同一である。
【０１１２】
図７に示すように、ｐＳＤ４６０をＳｍａＩで切断し、以下の配列を有するアニーリングされた合成オリゴヌクレオチドＶＱ１Ａ／ＶＱ１Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:25 ／ＳＥＱ  ＩＤ  NO:26)に連結することにより該ポリリンカーを挿入することにより、ベクタープラスミドｐＳＤ５１３を形成した。
【０１１３】
2007254489.tif 000014
このｐＳＤ５１３をＳｍａＩで切断し、ワクシニアＨ６プロモーター（Taylor他、1988a,b)の制御下に狂犬病糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子を含有し、ＳｍａＩ末端から成る1.8kb のカセットに連結した。得られたプラスミドをｐＲＷ８４２と命名した。このｐＲＷ８４２をドナープラスミドとして用い、ＮＹＢＡＣレスキューウイルス（ｖＰ８６６）と組換えを行った。狂犬病糖タンパク質Ｇのコード配列に対する３２Ｐラベル化プローブを用いるプラークハイブリダイゼーションにより組換えワクシニアウイルスｖＰ８７９を同定した。
【０１１４】
本発明の変性組換えウイルスは、組換えワクチンベクターとして幾つかの利点を有する。すなわち、ベクターのビルレンスが弱毒化されているので、ワクチン接種による被接種者が無制御（ランナウェー）感染する可能性が減少し、さらに、感染者から非感染者への伝染や環境の汚染も少なくするという利点を有する。
【０１１５】
さらに、本発明の変性組換えウイルスは、インビトロ培養される細胞内で遺伝子産物を発現させるのに用いることもでき、このためには、該細胞内で遺伝子産物をコードし発現する外来遺伝子を有する本発明の変性組換えウイルスを該細胞に導入すればよい。
【実施例８】
【０１１６】
実施例８−狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇを発現するＡＬＶＡＣ組換え体の構築  この実施例は、カナリアポックスウイルスベクターＡＬＶＡＣおよびカナリアポックス−狂犬病ウイルス組換え体ＡＬＶＡＣ−Ｒ（ｖＣＰ６５）の調製ならびにその安全性と効力について記述するものである。
【０１１７】
細胞およびウイルス  親カナリアポックスウイルス（Rentschler株）はカナリア用ワクチン株の１つである。このワクチン株は野性型の単離物から入手され、にわとり胚繊維芽細胞による200 回以上の連続的な継代培養により弱毒化されたものである。マスターウイルス種株は、寒天培地下の４回の連続的なプラーク精製に供され、さらに、プラーククローンの１つが５回の追加の継代培養により増殖された後、該保存ウイルスが親ウイルスとしてインビトロ組換え試験に用いられた。プラーク精製されたカナリアポックス単離物は、ＡＬＶＡＣと命名されている。
【０１１８】
カナリアポックス挿入ベクターの構築  880bp のカナリアポックスＰｖｕIIフラグメントを、ＰＵＣ９のＰｖｕII部位間にクローニングしてｐＲＷ764.5 を調製した。このフラグメントの配列は、図８（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:27)において1372〜2251位置に示されている。オープンリーディングフレームを確認しＣ５と命名した。このオープンリーディングフレームは、該フラグメント内のいつ１６６で開始され且つ位置４８７で終結されていることが明らかにされた。オープンリーディングフレームを阻害することなくＣ５の欠失を行った。位置１６７から位置４５５までの塩基を、配列（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:28)GCTTCCCGGGAATTCTAGCTAGCTAGTTT と置換した。この置換配列は、ＨｉｎｄIII 、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩ挿入部位と、それに後続しワクシニアウイルスＲＮＡポリメラーゼにより認識される翻訳停止シグナルおよび転写終結シグナルを含有している（Yuen他、1987）。Ｃ５オープンリーディングフレームの欠失は以下のように行った。プラスミドｐＲＷ764.5 をＲｓａＩで部分的に切断して線状の生成物を単離した。このＲｓａＩ線状フラグメントをＢｇｌIIで再切断し、かくして、位置１５６から位置４６２までのＲｓａＩからＢｇｌIIまでが欠失したｐＲＷ764.5 フラグメントを単離し、以下の合成オリゴヌクレオチド用ベクターとして使用した。
【０１１９】
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オリゴヌクレオチドＲＷ１４５およびＲＷ１４６をアニーリングし、上述のｐＲＷ764.5 ＲｓａＩおよびＢｇｌIIベクターに挿入した。得られたプラスミドをｐＲＷ８３１と命名した。
【０１２０】
狂犬病Ｇ遺伝子を含有する挿入ベクターの構築  以下にｐＲＷ８３８の構築について説明する。ＡからＥのオリゴヌクレオチド（狂犬病ウイルスＧのＨ６プロモーターの開始コドンと重なっている）をｐＵＣ９にクローニングしてｐＲＷ７３７とした。オリゴヌクレオチドＡ〜ＥはＨ６プロモーターを含有し、ＮｒｕＩで始まり、狂犬病ウイルスＧのＨｉｎｄIII に到り、その後にＢｇｌIIがある。オリゴヌクレオチドＡ〜Ｅ（（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:31)〜（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:35)）の配列は以下のとおりである。
【０１２１】
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また、アニーリングされたオリゴヌクレオチドＡ〜Ｅを図解すると次のようになる。
【０１２２】
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オリゴヌクレオチドＡ〜Ｅをキナーゼ処理し、アニーリングし（95℃で５分間、その後、室温に冷却）、ｐＵＣ９のＰｒｕII部位間に挿入した。得られたプラスミドｐＲＷ７３７をＨｉｎｄIII およびＢｇｌIIで切断し、ｐｔｇ１５５ＰＲＯ(Kieny他、1984）のＨｉｎｄIII −ＢｇｌIIの1.6kbpフラグメント用ベクターとして使用してｐＲＷ７３９を調製した。ｐｔｇ１５５ＰＲＯＨｉｎｄIII 部位は、狂犬病Ｇの翻訳開始コドンの86bp下流にある。また、ｐｔｇ１５５ＰＲＯにおいて、ＢｇｌIIは狂犬病Ｇ翻訳停止コドンの下流にある。ｐＲＷ７３９をＮｒｕＩ用いて部分切断し、さらにＢｇｌIIを用いて完全切断し、かくして、既知のＨ６プロモーター（Taylor他、1988a,b ；Guo他、1989；Perkus他、1989）の３′末端から狂犬病Ｇの全遺伝子までを含有する1.7kbpのＮｒｕＩ−ＢｇｌIIフラグメントをｐＲＷ８２４のＮｒｕＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間に挿入した。得られたプラスミドをｐＲＷ８３２と命名する。ｐＲＷ８２４に挿入することにより、ＮｒｕＩのＨ６プロモーターの５′が付加された。ＳｍａＩの前のＢａｍＨＩのｐＲＷ８２４の配列は、GGATCCCCGGG （ＳＥＱ  ＩＤ  NO:36)である。ｐＲＷ８２４は、ワクシニアウイルスのＨ６プロモーターに非関連遺伝子が確実に結合されたプラスミドである。ＮｒｕＩおよびＢａｍＨＩを用いる分解によりこの非関連遺伝子を切除した。このｐＲＷ８３２のＳｍａＩの1.8kbpフラグメント（Ｈ６をプロモーターとする狂犬病Ｇを含有している）をｐＲＷ８３１のＳｍａＩに挿入して、プラスミドｐＲＷ８３８を調製した。
【０１２３】
ＡＬＶＡＣ−ＲＧの調製  既知のリン酸カルシウム沈降法を用いて（Panicali他、1982；Piccini 他、1987）、ＡＬＶＡＣ感染初代ＣＥＦ細胞にｐＲＷ８３８をトランスフェクトさせた。特定の狂犬病Ｇプローブに対するハイブリダイゼーションにより陽性クローンを選択し、純粋な集団が得られるまで６回の連続的なプラーク精製に供した。次に、代表プラークを増殖して、得られたＡＬＶＡＣ組換え体をＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）と命名した（図９Ａおよび図９Ｂ参照）。配列分析により、狂犬病Ｇ遺伝子がＡＬＶＡＣゲノム内に正しく挿入され、その後の変更が生じていないことを確認した。
【０１２４】
免疫蛍光  成熟狂犬病ウイルス粒子が形成される最終段階においては、糖タンパク質成分はゴルジ体から形質膜に移送され、そこで、細胞膜質および細胞膜の外表面にあるタンパク質本体にカルボキシ末端を延ばしながら蓄積する。ＡＬＶＡＣ−ＲＧ内で発現された狂犬病糖タンパク質が正しく存在していることを確認するために、ＡＬＶＡＣまたはＡＬＶＡＣ−ＲＧで感染された初代ＣＥＦ細胞上で免疫蛍光測定法を実施した。この免疫蛍光法は、既知の手法（Taylor他、1990）に従い、狂犬病Ｇのモノクローナル抗体を用いて行った。ＡＬＶＡＣ−ＲＧを感染させたＣＥＦ細胞においては強い表面蛍光が検出されたが、親のＡＬＶＡＣには蛍光は認められなかった。
【０１２５】
免疫沈降  初代ＣＥＦ細胞、ベロ（Vero）細胞（アフリカミドリザルの腎臓細胞由来の細胞系、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ81）、およびＭＲＣ−５細胞（正常なヒト胎児肺臓由来の繊維芽細胞類似の細胞系、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ171)から予め形成した単層に、既知の手法（Taylor他、1990）に従い、放射ラベルした３５Ｓ−メチオニンの存在下に、１０ｐｆｕ／細胞で、親ウイルスＡＬＶＡＣおよび組換えウイルスＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種した。免疫沈降反応は、狂犬病Ｇ特異的モノクローナル抗体を用いて行った。組換えＡＬＶＡＣ−ＲＧの場合は、分子量がおよそ67kDa の狂犬病特異的糖タンパク質が効率的に発現していることが検出された。非感染細胞または親ウイルスであるＡＬＶＡＣが感染された細胞においては、狂犬病特異的生成物の検出は認められなかった。
【０１２６】
連続継代培養実験  ＡＬＶＡＣを広範囲の非トリ種に適用した研究では、感染の増幅や明白な病気は認められていない（Taylou他、1991b)。しかしながら、親ウイルスおよび組換えウイルスのいずれも非トリ細胞では増殖できないことを確認するため、連続的な継代培養実験を行った。
【０１２７】
以下の細胞基質に２種類のウイルス、すなわち、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種して10代の連続的な盲検（ブラインド）継代培養を行った。
【０１２８】
(1) 11日齢の白色レグホーン胚由来の初代ニワトリ繊維芽（ＣＥＦ）細胞；
(2) ベロ（Vero）細胞−アフリカミドリザルの腎臓細胞由来の無限増殖性細胞
（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ81）；および
(3) ＭＲＣ−５細胞−ヒト胎児の胚組織由来の二倍体細胞系（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ171)。
【０１２９】
各細胞につき３ヶの60mm培養皿を用い各皿に２×10６ ヶの細胞が含有されるようにして、0.1pfu／細胞のm.o.i.で最初の接種を行った。培養皿の１つは、ＤＮＡ複製の阻害剤であるシトシンアラビノシド（Ara Ｃ）40μg/mlの存在下に接種を行った。37℃で１時間の吸着期間の後、接種物を除去し、単層を洗浄して非吸着ウイルスを取り除いた。この時点で、培地の置換を行い、２つの培養皿（サンプルｔ０およびサンプルｔ７）には５mlのＥＭＥＭ＋２％ＮＢＣＳを入れ、また、第３番目の培養皿（サンプルｔ７Ａ）には40μg/mlのAra Ｃを含有する５mlのＥＭＥＭ＋２％ＮＢＣＳを入れた。サンプルｔ０は−70℃で凍結して残存する導入ウイルスの指標とした。サンプルｔ７およびサンプルｔ７Ａは37℃で７日間培養し、その後、内容物をハーベストし、間接音波処理により細胞を破砕した。
【０１３０】
各細胞基質のサンプルｔ７の１mlを同じ細胞基質の３つの培養皿に稀釈せずに接種し（サンプルｔ０、ｔ７およびｔ７Ａとする）、さらに、初代ＣＥＦ細胞の１つの培養皿に接種した。サンプルｔ０、サンプルｔ７およびサンプルｔ７Ａは継代用に処理した。ＣＥＦ細胞への追加接種は、非トリ細胞中に存在し得るようなウイルスに対する高感度検出用の増殖工程に供した。
【０１３１】
この操作を繰り返して、10代の連続ブラインド継代培養（ＣＥＦおよびＭＲＣ−５）または８代の連続ブラインド継代培養を行った。サンプルを凍結し、３回解凍して初代ＣＥＦ単層上で滴定を行うことにより分析した。
【０１３２】
次に、寒天培地下にＣＥＦ単層上でプラーク滴定を行うことによりウイルス収量を測定した。実験結果をまとめて図１および図２に示す。
【０１３３】
この結果から、親のＡＬＶＡＣおよび組換え体のＡＬＶＡＣ−ＲＧの両方とも、ＣＥＦ単層上で複製を持続する能力を有し力価の損失はないことが示されている。ベロ（Vero）細胞においては、ＡＬＶＡＣについては第２代後、また、ＡＬＶＡＣ−ＲＧについては第１代後にウイルスのレベルは検出レベル以下に低下した。ＭＲＣ−５においても同様の結果が示され、第１代後にはウイルスが検出されなかった。図１および図２には第４代までの結果しか示していないが継代培養を第９代（Vero）および第10代（ＭＲＣ−５）まで行ったところ、これらの非トリ細胞においてはいずれのウイルスも検知可能となるように成長適応化していなかった。
【０１３４】
第１代においては、ＭＲＣ−５細胞およびVero細胞のｔ７サンプルには比較的高レベルのウイルスが存在した。しかしながら、このレベルは、ｔ０サンプルおよびウイルスの複製が起こり得ないようにシトシンアラビノシドの存在下に接種を行ったｔ７Ａサンプルにおいて見られるレベルに等しかった。このことは、非トリ細胞において７日目に認められたウイルスレベルは、残存ウイルスを表し新たに複製されたウイルスではないことを示している。
【０１３５】
分析をさらに高感度にするため、各細胞基質から７日目にハーベストしたものの一部を、許容ＣＥＦ単層に接種し、細胞変性効果（ＣＰＥ）が認められた時にハーベストするか、またはＣＰＥが示されない場合は７日目にハーベストした。この実験結果を図３に示す。許容細胞基質による増殖後においも、ＭＲＣ−５細胞およびVero細胞においては、更に２代の継代でウイルスが検出されるでけであった。これらの結果から、採用した条件下では、Vero細胞またはＭＲＣ−５細胞においてはいずれのウイルスも増殖できるように適応化できないことが明らかである。
【０１３６】
アカゲザルへの接種  ＨＩＶに関して血清反応陽性の４匹のアカゲザルに先ずＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種した（図４）。100 日後、該動物に再接種してブースター効果を調べ、さらに、追加の７匹のアカゲザルにいろいろな投与量で接種を行った。適当な間隔で血液を抜き出し、56℃において30分間の加熱不活性化後、迅速蛍光フォーカム阻止（Rapid Fluorescent Focus Inhibition：ＲＦＦＩ）分析法（Smith 他、1973）により狂犬病ウイルス抗体の存在を血清分析した。
【０１３７】
チンパンジーへの接種  オトナのオスのチンパンジー２匹（体重範囲50〜65kg）に、ｖＣＰ６５を１×10７pfuで筋肉内また皮下接種した。該動物の反応を観察し、また、規則的な間隔で採血を行いＲＦＦＩテスト（Smith 他、1973）により抗狂犬病ウイルス抗体の存在を分析した。最初の接種から13週間後、同じ投与量で該動物に再接種した。
【０１３８】
マウスへの接種  グループ分けしたマウスに、異なるバッチ由来のｖＣＰ６５をいろいろな希釈度で50〜100 μｌ接種した。マウスへの接種は肉趾に接種した。14日目に、狂犬病ウイルスのビルレント性ＣＶＳ株を15〜43マウスＬＤ５０で頭蓋内接種することによりマウスのチャレンジを行った。マウスの生存率を監視し、接種から28日目における50％防御投与量（ＰＤ５０）を求めた。
【０１３９】
イヌおよびネコへの接種  10匹のビーグル犬（５ヶ月齢）および10匹のネコ（４ヶ月齢）に、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを6.7 または7.7log１０ＴＣＩＤ５０で皮下接種した。４匹のイヌおよび４匹のネコには接種を行わなかった。接種後14日および28日後にそれらの動物の採血を行い、ＲＦＦＩテストにより抗狂犬病ウイルス抗体を分析した。6.7log１０ＴＣＩＤ５０のＡＬＶＡＣ−ＲＧが投与された動物については、接種後29日目に、ＮＹＧＳ狂犬病ウイルスチャレンジ株の3.7log１０（マウスＬＤ５０）（ビーグル犬）または4.3log１０（マウスＬＤ５０）（ネコ）を用いてチャレンジを行った。
【０１４０】
リスザルへの接種  各グループに４匹のリスザル（Saimiri Sciureus）から成る３グループのリスザルに、３種類のウイルスの１つ、すなわち、(a) ＡＬＶＡＣ（カナリアポックス親ウイルス）、(b) ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（狂犬病Ｇ糖タンパク質を発現する組換体、または(c) ｖＣＰ３７（ネコ白血病ウイルスのエンベロープ糖タンパク質を発現するカナリアポックス組換え体）を接種した。接種はケタミン麻酔下に実施した。各動物は以下を同時に投与された：(1) 乱刺を行わずに右目の表面に滴注された20μｌ、(2) 口中に数滴として100 μｌ、(3) 右腕の外表面の毛をそった皮膚内の２つの注射部位にそれぞれ100 μｌ；および(4) 右大腿の前部筋肉に100 μｌ。
【０１４１】
４匹のサルに各ウイルスを接種し、２匹についてはlog１０pfuとして全量5.0 とし、また、他の２匹についてはlog１０pfuとして7.0 とした。規則的な間隔で該動物の採血を行い、血清を分析してＲＦＦＩテスト（Smith 他、1973）により抗狂犬病ウイルス抗体を調べた。接種に対する該動物の反応を毎日観察した。最初の接種から６ヶ月後、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを投与された４匹のリスザル、ｖＣＰ３７が当初投与された２匹のリスザルに加えて非投与のリスザル１匹に、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを6.5log１０pfu で皮下接種した。血清を分析して、ＲＦＦＩテスト（Smith 他、1973）により狂犬病ウイルス中和抗体の存在を調べた。
【０１４２】
ヒト細胞系へのＡＬＶＡＣ−ＲＧの接種  当該ウイルスが複製しない非トリ細胞内で外来遺伝子が効率的に発現されるか否かを判定するため、５種類の細胞系、すなわち、１種類のトリ系および４種類の非トリ系について分析を行い、ウイルス収量、外来狂犬病Ｇ遺伝子の発現およびウイルス特異的ＤＮＡ蓄積を調べた。接種した細胞は次のとおりである。
【０１４３】
(a) Vero細胞。アフリカミドリザル腎臓細胞。ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ81。
【０１４４】
(b) ＭＲＣ−５細胞。ヒト胎児肺細胞。ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ171 。
【０１４５】
(c) ＷＩＳＨ細胞。ヒト羊膜由来。ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ25。
【０１４６】
(d) Detroit-532 細胞。ヒト包皮由来。ダウン症候群。ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ54。
【０１４７】
(e) 初代ＣＥＦ細胞。
【０１４８】
11日齢白色レグホーン胚由来のニワトリ胚繊維芽細胞を陽性対象として用いた。接種は全て、下記のように予め調製した２×10６ 細胞から成る単層に実施した。
【０１４９】
Ａ．ＤＮＡ分析法。
【０１５０】
各細胞系について３ヶの培養皿を用い、被試験ウイルスを５pfu ／細胞で接種し、さらに、各細胞系について１ヶの培養皿を追加し非接種用とした。培養皿の１つについては、40μg/mlのシトシスアラビノシド（Ａｒａ  Ｃ）の存在下に培養を行った。37℃において60分間の吸着期間の後、接種物を除き、単層を２回洗浄して非吸着ウイルスを除去した。次いで、培地（Ａｒａ  Ｃを含有するもの、または含有しないもの）の交換を行った。培養皿の１つ（Ａｒａ  Ｃを含有しないもの）からは、時間ゼロにおけるサンプルとして細胞をハーベストした。残りの皿は、37℃で72時間保持した後、細胞をハーベストしてＤＮＡ蓄積の分析に用いた。２×10６ 細胞から成る各サンプルを40ｍＭのＥＤＴＡを含有する0.5ml のリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）に再懸濁して37℃で５分間保温した。42℃で予め加温し120 ｍＭのＥＤＴＡを含有する等体積の1.5 ％アガロースを細胞懸濁液に添加してゆっくり混合した。該懸濁液をアガロースプラグモールドに移し、少なくとも15分間放置して硬化させた。次いで、アガロースプラグを取り除き、該プラグを覆うような体積の溶解緩衝液（１％のサルコシル、100 μg/mlのプロティナーゼＫ10ｍＭのトリスＨＣｌ  ｐＨ7.5 、200ml のＥＤＴＡ）内で50℃において12〜16時間保持した。次に、該溶解緩衝液を5.0ml の無菌0.5 ×ＴＢＥ（44.5mlのトリス−ボロン酸、44.5ｍＭのボロン酸、0.5 ｍＭのＥＤＴＡ）と置換して、ＴＢＥ緩衝液を３回変えながら４℃において６時間平衡化した。
【０１５１】
パルス電場式電気泳動装置を用いて細胞ＲＮＡおよびＤＮＡからプラグ内にあるウイルスＤＮＡを分別した。電気泳動は、ランプ50〜90秒とし0.5 ×ＴＢＥ内で15℃において、180vで20時間実施した。ラムダＤＮＡの分子量を標準としてＤＮＡを走行させた。電気泳動後、エチジウムブロミドで染色することによりウイルスＤＮＡのバンドを可視化した。次にＤＮＡをニトロセルロース膜に移し、精製ＡＬＶＡＣゲノムＤＮＡから調製した放射ラベル化プローブを用いて分析した。
【０１５２】
Ｂ．ウイルス収量の推定
培養皿への接種は上記と同じように行った。但し、感染多重度は0.1pfu／細胞とした。感染72時間後、凍結および解凍サイクルを３回連続的に実施することにより細胞を溶解した。ＣＥＦ単層上でプラーク滴定を行うことによりウイルス収量を調べた。
【０１５３】
Ｃ．狂犬病Ｇ遺伝子の発現の分析
組換えウイルスまたは親ウイルスを10pfu ／細胞の多重度で培養皿に接種するとともに、追加の皿を非感染ウイルス対照用とした。１時間の吸着期間の後、培地を除去し、無メチオニン培地と置換した。30分後、この培地を、25μCi/ml の３５Ｓ−メチオニンを含有する無メチオニン培地と置換した。感染細胞を一晩かけて（約16時間）ラベル化し、次に、Ａ緩衝液を添加することにより溶解した。狂犬病Ｇ特異的モノクローナル抗体を用い既知の手法に従い（Taylor他、1990）、免疫沈降を実施した。
【０１５４】
結果：ウイルス収量の推定
細胞当たり0.1pfuで接種した72時間後に行ったウイルス収量を求める滴定分析の結果を表５に示す。この結果が示すように、トリ細胞においては強い感染が生じ得るが、４種類の非トリ細胞系においてはこの方法ではウイルス収量の増加を検知することはできない。
【０１５５】
ウイルスＤＮＡの蓄積の分析  非トリ細胞におけるウイルス複製の阻害がＤＮＡ複数の前または後に生じたか否かということを判定するために、細胞リゼイト（溶菌液）からのＤＮＡを電気泳動法により分画し、ニトロセルロースに移し、ウイルス特異的ＤＮＡをプローブ分析した。非感染ＣＥＦ細胞、時間ゼロにおけるＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染細胞、接種72時間後のＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染ＣＥＦ細胞および接種72時間後のＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染ＣＥＦ細胞（40μg/mlのシトシンアラビノシド存在下）由来のＤＮＡはいずれもある程度のバックグランド活性を示したが、これは、おそらく、放射ラベル化ＡＬＶＡＣ  ＤＮＡプローブの調製に際して混入したＣＥＦ細胞ＤＮＡに因るものと思われる。しかしながら、接種72時間後のＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染ＣＥＦ細胞は、約350kbpの領域にＡＬＶＡＣ特異的ウイルスＤＮＡの蓄積を表す強いバンドを示した。ＤＮＡ合成阻害剤であるシトシンアラビノシドの存在下に培養物を培養してもそのようなバンドは検出されなかった。
【０１５６】
Vero細胞で得られた相応するサンプルについては、時間ゼロにおけるＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染Vero細胞において約350kbpにおいて非常に弱いバンドが示された。このレベルは残存ウイルスを表すものであった。接種72時間後にはバンド強さが増加されており、このことは、Vero細胞においてはある程度のレベルのウイルス特異的ＤＮＡ複製が起こったが、ウイルス子孫の増加を生じさせはしなかったということを示唆している。ＭＲＣ−５細胞で得られた相応するサンプルにおいては、これらの条件下でウイルス特異的ＤＮＡの蓄積は検出されなかった。この実験を広げ、追加のヒト細胞系、すなわちＷＩＳＨ細胞およびDetroit-532細胞についても実施した。ＡＬＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞を陽性対照とした。ＡＬＶＡＣ−ＲＧが接種されたＷＩＳＨ細胞およびDetroit 細胞のいずれにおいてもウイルス特異的ＤＮＡ蓄積は検出されなかった。なお、この方法の検出限界は完全には確認されておらず、ウイルスＤＮＡ蓄積は起こっているのかも知れないが、該方法の感度よりも低いレベルであろう。  ３Ｈ−チミジンを導入することによりウイルスＤＮＡ複製が測定されるようにした他の実験は、Vero細胞およびＭＲＣ−５細胞に関して得られた上記の結果を支持している。
【０１５７】
狂犬病遺伝子の発現分析  ウイルス遺伝子、特に挿入された外来遺伝子の発現が、ウイルスＤＮＡ複製の非存在下においてもヒト細胞系で起こっているか否かを判定するために、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ−ＲＧを感染させたトリ系細胞および非トリ系細胞由来の３５Ｓ−メチオニンラベル化リゼイトについて免疫沈降実験を実施した。狂犬病Ｇ特異的モノクローナル抗体を用いる免疫沈降実験の結果、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを感染させたＣＥＦ、Vero、ＭＲＣ−５、ＷＩＳＨおよびDetroit の各細胞において67ｋＤａの糖タンパク質から成る特異的免疫沈降が認められた。非感染細胞および親ウイルスを感染させた細胞のリゼイトのいずれにおいても、そのような特異的狂犬病遺伝子産物は検出されなかった。
【０１５８】
この実験結果が示唆することは、分析したヒト細胞系においては、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ組換え体はＨ６初期／後期ワクシニアウイルスプロモータの転写制限下に感染を開始し外来遺伝子産物を発現させることはできるが、ＤＮＡ複製を介する複製は進行せず、また、検知され得るようなウイルス子孫は産生しなかったということである。Vero細胞においては、ある程度のレベルのＡＬＶＡＣ−ＲＧ特異的ＤＮＡ複製は認められたが、この方法ではウイルス子孫は検出されなかった。これらの結果から、分析したヒト細胞系においてはウイルス複製の阻止はＤＮＡ複製の開始前に起こるが、Vero細胞においてはウイルスＤＮＡ複製の開始後に該阻止が起こるのであろう。
【０１５９】
ＡＬＶＡＣ−ＲＧ内で発現された狂犬病糖タンパク質が免疫原性を有するか否かを判定するために、多くの動物種に該組換え体を接種してテストした。現行の狂犬病ワクチンの効力はマウスモデル系で評価されている。そこで、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを用いて同様のテストを行った。感染力価が6.7 から8.4 （log１０ （ＴＣＩＤ５０/ml)）の範囲にある９種類のウイルス調製物（種ウイルスを10回組織培養による継代培養して得られたワクチンバッチ(J) を含む）を連続的に稀釈し、50〜100 μｌの稀釈液を４週齢から６週齢のマウスの肉趾に接種した。14日後に、マウス  ＬＤ５０（対照用マウスグループにおける致死滴定量から求めた）が15から43の狂犬病ウイルスＣＶＳ株300 μｌを頭蓋内投与してマウスをチャレンジした。ＰＤ５０（50％防御投与量）として表す効力をチャレンジから14日目に計算した。実験結果を表６に示す。この結果から、ＡＬＶＡＣ−ＲＧは狂犬病ウイルスのチャレンジに対して恒常的にマウスを防御することができ、ＰＤ５０値は、3.33から4.56の範囲にあり平均値3.73（ＳＴＤ0.48）であることが示されている。追加実験として、6.0log１０ＴＣＩＤのＡＬＶＡＣ−ＲＧを含有するウイルス50μｌまたは等体積の非感染細胞懸濁液をオスのマウスに頭蓋内接種した。接種から１日、３日および６日目にマウスを殺し、その脳を取り出し、固定化し薄片に切断した。組織病理学検査によれば、マウス内にＡＬＶＡＣ−ＲＧの神経毒性の証拠は認められなかった。
【０１６０】
イヌおよびネコに対するＡＬＶＡＣ−ＲＧの安全性および効力を評価するため、14ヶ月齢および５ヶ月齢のビーグル犬、ならびに14ヶ月齢および４ヶ月齢のネコから成るグループの分析を行った。該イヌおよびネコのそれぞれについて４匹にはワクチン接種を行わなかった。該動物の５匹には6.7 log１０ ＴＣＩＤ５０で皮下投与した。動物の採血を行い、抗狂犬病抗体の分析を行った。非投与または6.7log１０ＴＣＩＤのＡＬＶＡＣ−ＲＧを投与した動物に対しては、接種から29日目に、ＮＹＧＳ狂犬病ウイルスチャレンジ株の3.7log１０（マウスＬＤ５０）（ビーグル犬、側部筋に）または4.3log１０（マウスＬＤ５０）（ネコ、頸部に）を用いてチャレンジを行った。実験結果を表７に示す。
【０１６１】
ネコおよびイヌのいずれにおいて且ついずれの接種ウイルス投与量においても接種に対する副作用は認められなかった。6.7log１０ＴＣＩＤ５０で免疫された５匹のイヌのうち４匹は、ワクチン接種14日目に抗体力価を示し、29日目には全てのイヌが抗体力価を有した。全てのイヌが、４匹の対照用イヌの３匹を殺したようなチャレンジに対して防御された。ネコの場合、6.7log１０ＴＣＩＤ５０で投与された５匹のネコのうち、３匹が14日目に特異的抗体力価を有し、そして、29日目には全てが陽性となったが、平均抗体力価は低く2.9 ＩＵであった。対照用ネコの全てを殺したようなチャレンジに対して、５匹のネコのうち３匹が生存した。7.7log１０ＴＣＩＤ５０で免疫したネコは全て14日目に抗体力価を示し、29日目には幾何平均力価は8.1 国際単位（ＩＵ）であった。
【０１６２】
ＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ−ＲＧおよび非関連カナリアポックスウイルス組換え体の接種に対するリスザル（Saimiri Sciureus）の免疫応答を試験した。幾つかのグループに分けたリスザルに上述したように接種を行い、血清を分析して狂犬病特異的抗体の有無を調べた。皮内投与に対する軽い典型的な皮膚反応を除いては、いずれのサルにおいても副作用は認められなかった。投与から２日目および４日目だけは、皮内接種後の皮膚損傷部から少量の残留ウイルスを単離した。７日目以降は全て陰性であった。筋注に対する局部反応は認められなかった。ＡＬＶＡＣ−ＲＧが接種された４匹のサルは全て、ＲＦＦＩテスト測定すると、抗狂犬病血清中和抗体を産生してた。最初の接種から約６ヶ月後、全てのサルおよび追加の非接種サル１匹に、左側大腿部の外表面に6.5log１０ＴＣＩＤ５０のＡＬＶＡＣ−ＲＧを皮下経路で再接種した。血清を分析して抗狂犬病抗体の存在を調べた。結果を表８に示す。
【０１６３】
狂犬病ウイルス観感染の匹のサルのうち４匹は、ＡＬＶＡＣ−ＲＧの接種７日後に血清学的応答を示した。接種11日後には５匹のサル全てが検出可能な抗体を有した。予め狂犬病糖タンパク質に感染された４匹のサルについては、ワクチン接種から３日から７日の間に血清中和力価に有意の増加が認められた。この結果から、リスザルにＡＬＶＡＣ−ＲＧをワクチン接種すると副作用は生じず、一次中和抗体応答が誘起され得ることが示された。ＡＬＶＡＣに、または非関連外来遺伝子を発現するカナリアポックス組換え体に予め感染していても、再ワクチン接種に際して、抗狂犬病免疫の誘発を妨げない。
【０１６４】
ＨＩＶ−２に関して血清反応陽性のアカゲザルにおいてＡＬＶＡＣ−ＲＧ接種に対する免疫応答を調べた。該動物に上述のように接種を行い、ＲＦＦＩテストにより抗狂犬病血清中和抗体の有無を分析した。表９に結果を示すように、皮下接種されたＨＩＶ−２陽性アカゲザルは、１回の接種から11日目までに抗狂犬病抗体を産生した。最初の接種から約３ヶ月後に与えたブースター接種後に既往応答が検出された。該組換え体が経口投与された動物には何らかの応答も検出されなかった。更に、一連の６匹のアカゲザルに投与量を減少させながらＡＬＶＡＣ−ＲＧを筋肉内または皮下投与した。接種された６匹のうち５匹がワクチン接種から14日目までに応答を示したが抗体力価に有意の差は無かった。
【０１６５】
以前にＨＩＶ感染した２匹のチンパンジーに7.0log１０pfu のＡＬＶＡＣ−ＲＧを皮下または筋肉内接種した。該接種から３ヶ月後に両チンパンジーに同じ方法で再ワクチン接種した。結果を表10に示す。
【０１６６】
筋肉内または皮下接種のいずれにおいても接種に対する副作用は見られなかった。いずれのチンパンジーも初回接種から14日目までに応答し、そして、再接種後に応答の強い増強が検出された。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【実施例９】
【０１６７】
実施例９−狂犬病糖タンパク質を発現するカナリアポックス
（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ：ｖＣＰ６５）を用いるヒトの免疫化
実施例９および図９Ａおよび図９Ｂで記述したようにＡＬＢＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）を調製した。スケールアップおよびワクチン生産のため、ＳＰＦ卵由来の初代ＣＥＦにおいてＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ）を増殖させた。細胞を0.1 の多重度で感染させ、37℃において３日間培養した。
【０１６８】
該感染細胞から成る無血清培地で超音波破砕することによりワクチンウイルスの懸濁液を得た。次に、細胞破片を遠心分離とろ過により取り除いた。得られた清澄な懸濁液に凍結乾燥安定剤（アミノ酸の混合物）を加え、単一投与用バイアル内に分散させ、凍結乾燥した。凍結乾燥の前に、無血清培地および凍結乾燥剤の混合物に入れたウイルス懸濁液を連続的に10倍稀釈することにより力価が徐々に低下した３種類のバッチを調製した。
【０１６９】
細胞基質、培地およびウイルス種株ならびに最終生成物には品質管理試験を行った。望ましくない特徴は見出されなかった。
【０１７０】
前臨床データ  インビトロ試験によれば、ＶＥＲＯ細胞またはＭＲＣ−５細胞はＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の増殖を支持せず、８回の連続継代培養（ＶＥＲＯの場合）および10回の連続継代培養（ＭＲＣの場合）によって、これらの非トリ細胞系において当該ウイルスが検出され得るように増殖適応化されないことが示された。ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）が感染または接種されたヒト細胞系（ＭＲＣ−５、ＷＩＳＨ、Detroit-532 、ＨＥＬ、ＨＮＫまたはＥＢＶ形質転換リンパ芽球細胞）の分析では、ウイルス特異的ＤＮＡの蓄積は認められず、これらの細胞においてはＤＮＡ合成の前に複製の阻害が起こることが示唆された。しかしながら、重要なことには、試験された全ての細胞系において狂犬病ウイルス糖タンパク質の発現から、カナリアポックス複製サイクルにおける不稔過程はウイルスＤＮＡ複製に先行して起こることが示唆された。
【０１７１】
一連の動物実験においてＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の安全性と効力が明らかにされた。多数の動物種、例えばカナリア、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、実験用げっ歯類（マウスの乳獣および成獣）、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、リスザル、アカゲザルおよびチンパンジーに、10５ から10８pfuの投与量範囲に接種が行われた。各種の投与経路を検討し、最も一般的には皮下、筋肉内および皮下投与であったが、経口（サル類およびマウス）や頭蓋内投与（マウス）も採用した。
【０１７２】
カナリアにおいては、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）は、乱刺部位に「癒着」損傷を引き起こしたが、疾病や死亡の徴候はなかった。ウサギへの皮内接種は典型的なポックスウイルス接種反応を示したが、この反応が拡がることはなく、７日から10日で治癒した。いずれの動物においてもカナリアポックスに因る副作用は無かった。げっ歯類、イヌ、ネコおよび霊長動物にＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ）を接種した後、迅速蛍光フォーカス阻害テスト（ＲＦＦＩＴ）によって測定すると、抗狂犬病抗体が産生していることにより免疫原性があることが明らかにされた。また、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）で免疫したマウス、イヌ、およびネコに狂犬病ウイルスをチャレンジすることにより防御機能が発現することも明らかにされた。
【０１７３】
ボランティア  狂犬病免疫化の前略のない年齢20〜45才の25人の健康な成人を登録した。病歴調査、身体検査および血液の化学分析を行うことにより、これらのボランティアの健康状態を調べた。妊娠、アレルギー症、あらゆる種類の免疫低下症、慢性的な衰弱症、がん、過去３ヶ月以内の免疫グロブリンの投与、およびヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）またはＢ型肝炎表面抗原に対する血清反応陽性を有する者は排除した。
【０１７４】
試験計画  標準的なヒトジプロイド細胞狂犬病ワクチン（ＨＤＣ）（フランスLyonのPasteur Merieux Serum & Vaccine 製）または対象ワクチンＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）のいずれかが投与されるようにボランティアを無作為に振り分けた。
【０１７５】
この試験は投与量（用量）漸増試験とした。３つのバッチ由来の試験対象ワクチンＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）を３グループのボランティア（グループＡ，ＢおよびＣ）に２週間間隔で逐次的に使用した。それらの３つのバッチの濃度は、それぞれ、１回の投与当たり、10３．５ 、10４．５ および10５．５ ＴＣＩＤ５０（Tissue Culture Infectious Dose : 50 ％組織培養感染量）とした。
【０１７６】
各ボランティアには、２週間間隔で三角筋域に同一のワクチンを２回皮下投与（注射）した。最初の投与時にはボランティアには投与ワクチンの種類を知らせないが、研究者には分かるようにした。
【０１７７】
第２回目の投与時に即時過敏症を可及的に少なくするため、実験対象ワクチンの中間用量が投与されるように割り当てられたグループＢのボランティアには、１時間前に低用量を投与し、また、高用量グループ（グループＣ）のボランティアには１時間間隔で低用量および中間用量を逐次投与した。
【０１７８】
６ヶ月後、最も高用量のＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の被投与者（グループＣ）およびＨＤＣワクチンの被投与者に第３回目のワクチン投与を行った。次に、該被投与者に無作為に分けて以前と同一のワクチンまたは別のもう一方のワクチンを投与した。このようにして、以下の免疫化スケジュールに対応する４つのグループを構成した：１．ＨＤＣ、ＨＤＣ−ＨＤＣ；２．ＨＤＣ、ＨＤＣ−ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）；３．ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）−ＨＤＣ；４．ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）。
【０１７９】
副作用の観察  すべての被験者を投与１時間後に観察し、さらに次の５日間にわたり毎日検査した。次の３週間、局部反応および全身反応について尋ね、１週間に２度、電話により質問した。
【０１８０】
実験室における分析  登録前、ならびに各投与後２日目、４日目および６日目に血液標本を採取した。実施した分析には、血球数、肝臓酵素およびクレアチンキナーゼの分析を含む。
【０１８１】
抗体分析  最初の投与の７日前ならびに実験開始から７日、28日、35日、56日、173 日、187 日および208 日目に抗体分析を行った。
【０１８２】
中和抗体のレベルの測定には、迅速蛍光フォーカス阻害テスト（ＲＦＩＩＴ）（Smith 他、1973）を採用した。カナリアポックス抗体は、直接ＥＬＩＳＡにより測定した。これには、抗原、すなわち、0.1 ％Triton×100 で破砕した精製カナリアポックスウイルスの懸濁液をマイクロプレートに被覆した。血清の固定化稀釈液を室温下で２時間反応させ、ペルオキダーゼでラベルした抗ヒトＩｇＧヤギ抗体を用いて反応性抗体を出現させた。結果を490nm における光学密度として表した。
【０１８３】
分析  25名を被験者として試験を行った。男性が10名、女性が15名であり、平均年齢は31.9才（21才〜48才）であった。３名を除く全てが、以前に種痘のワクチン接種を受けていた。残りの３名の被験者は瘢痕およびワクチン接種の前歴がなかった。３名の被験者に試験対象ワクチンの低用量のそれぞれ（10３．５ および10４．５ ＴＣＩＤ５０）を投与し、９名の被験者には10５．５ ＴＣＩＤ５０を投与し、さらに10名の被験者にＨＤＣワクチンを投与した。
【０１８４】
安全性（表11）  初回免疫に際して、投与から24時間以内に37.7℃より高い熱を示したのは、ＨＤＣを投与された者の１名（37.8℃）および10５．５ ＴＣＩＤ５０のｖＣＰ６５を投与された者の１名（38℃）であった。ワクチン接種によるその他の全身性反応はいずれの被投与者にも見られなかった。
【０１８５】
皮下接種によるＨＤＣワクチンの被投与者の9/10に、また、10３．５ 、10４．５ および10５．５ ＴＣＩＤ５０のｖＣＰ６５被投与者には、それぞれ0/3 、1/3 および9/9 に局部的反応が見られた。
【０１８６】
痛覚が最も一般的な症状であったが、常に軽いものであった。他の局所的症状として発赤および硬結があったが、これらも軽く且つ一過性のものであった。すべての症状は一般に24時間以内におさまり、72時間以上持続することはなかった。
【０１８７】
血球数、肝臓酵素またはクレアチンキナーゼの値に有意の変化はなかった。
【０１８８】
免疫応答：狂犬病に対する中和抗体（表12）  最初の投与から28日後、ＨＤＣ被投与者のすべてが（感染）防御力価（＞0.5IU/ml）を有していた。これに対して、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の被投与者においては、この防御力価に達したのは、グループＡおよびＢ（10３．５ および10４．５ ＴＣＩＤ５０）の被投与者にはなく、またグループでは2/9 のみであった。
【０１８９】
56日目（すなわち、２回目接種（二次接種）から28日目）に、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）ワクチン被投与者においては、グループＡでは0/3 、グループＢでは2/3 およびグループＣでは9/9 が防御力価を取得し、また、ＨＤＣ被投与者においては10名の全てにおいて、この防御力価が持続されていた。
【０１９０】
56日目における幾何平均力価は、グループＡ、Ｂ、ＣおよびＨＤＣにおいて、それぞれ、0.05、0.47、4.4 および11.5IU/ml であった。
【０１９１】
180 日目には、すべての被験者において狂犬病抗体力価はかなり低下したが、ＨＣＤ被投与者のうち5/10、また、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）被投与者のうち5/9 においては、最低防御力価0.5IU/ml以上に持続されていた。ＨＣＤグループおよびグループＣにおける幾何平均力価は、それぞれ、0.51および0.45IU/ mlであった。
【０１９２】
カナリアポックスウイルスに対する抗体（表13）  被投与者に高力価カナリアとの接触の前歴が無いにも拘わらず、0.22から1.23O.D.の広範囲にわたる前免疫（pre-immune）力価が認められた。前免疫力価とその後の第２回目の投与による力価との差の２倍以上増加した場合に血清変換（seroconversion）が起こったと定義すれば、グループＢの被験者の1/3 、グループＣの被験者の9/9 に血清変換が起こったが、グループＡまたはＨＤＣの被験者には血清変換はなかった。
【０１９３】
ブースター投与  ６ヶ月後のブースター投与（追加接種）時にはワクチンは充分に耐性になった。ＨＤＣブースター被投与者の2/9 、また、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）ブースター被投与者の1/10に発熱が見られた。局部反応は、ＨＤＣブースター被投与者の5/9 、また、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）ブースター被投与者の6/10に認めれたた。
【０１９４】
観察結果  図11Ａ〜図11Ｄは、狂犬病中和抗体力価（ＲＦＦＩＴによる。単位IU/ml)を示すグラフであり、ボランティアに対するＨＤＣまたはｖＣＰ６５（10 ５．５ＴＣＩＤ）のブースター効果を示している（該ボランティアには以前に同一のワクチンまたはもう一方のワクチンを接種）。ワクチン接種は０日、28日および180 日目に実施した。抗体力価の測定は、０日、７日、28日、35日、56日、173 日、187 日および208 日目に行った。
【０１９５】
図11Ａ〜図11Ｂに示すように、ブースター投与するとどの免疫スケジュールでも全ての被験者に狂犬病抗体力価の上昇をもたらした。しかしながら、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）ブースターは、全体的に、ＨＤＣブースターよりも低い免疫応答を誘発しており、また、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）−ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の順序から成るグループは、他の３つのグループよりも実質的に力価が低くなっていた。さらに、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）をブースター投与すると、以前にＨＤＣワクチンが投与された被験者の3/5 に、また、以前にＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）で免疫化された被験者の全てに、カナリアポックス抗体力価の上昇をもたらした。
【０１９６】
一般的に、ｖＣＰ６５の投与による局所的副作用からウイルスの局所的複製が起こっていることは示されなかった。特に、ワクチン接種後に見られるような皮膚障害はなかった。このように見かけ上はウイルスの複製が無いにも拘わらず、該投与により、カナリアポックスベクターおよび発現された狂犬病糖タンパク質の双方に対する有意量の抗体がボランティアに産生された。
【０１９７】
狂犬病中和抗体の分析は、迅速蛍光フォーカス阻害テスト（ＲＦＦＩＴ）により実施したが、この方法は、マウスにおける血清中和テストと優れた相関性を有することで知られている。10５．５ ＴＣＩＤ５０の被投与者９名のうち５名は、初回投与後の応答レベルが低かった。最も用量（投与量）の高い被投与者全員、また、中間用量の被投与者も３名のうち２名において、２回目の投与後に防御力価を有する狂犬病抗体が得られた。この試験においては、両ワクチンとも、生ワクチンについては、一般的に推奨されているが不活性ＨＤＣワクチンには勧められていない皮下投与により接種した。この投与経路を選択したのは、投入部位（注射部位）を入念に調べることができる点において最良であるからであるが、このために、ＨＤＣ被投与者における抗体の出現が遅くなったことも考えられる：事実、ＨＤＣ被投与者のいずれも７日目には抗体上昇を示さず、一方、ＨＤＣワクチン筋肉内投与する多くの試験においては、被験者の大部分に抗体上昇が認められている（Klietmann 他、国際赤十字（ジュネーブ）、1981；Kuwert他、国際赤十字（ジュネーブ）、1981）。しかしながら、本発明は必ずしも皮下投与に限定されるものではない。
【０１９８】
対象ワクチンにおける狂犬病中和抗体のＧＭＴ（幾何平均力価：geometric mean fiters)は、ＨＤＣ対象ワクチンよりも低かったが、防御に必要な最低力価を充分に上まわるものであった。３種類の投与量を採用した本試験において得られた明瞭な用量依存性応答が示すように、投与量が高い程、強い応答を誘発する。当業者であれば本明細書の開示から、所与の患者に至適な投与量を選択できることは明らかであろう。
【０１９９】
本実施例の他の重要な結果は、抗体応答を増強（ブースト）する能力である。免疫スケジュールの如何に拘わらず６ヶ月目の投与後には全ての被験者に狂犬病抗体力価の上昇が見られており、このことは、カナリアポックスウイルスまたは狂犬病糖タンパク質により誘発された既存の免疫は、当該組換えワクチンまたは従来からのＨＤＣ狂犬病ワクチンによるブースター（追加接種）に対する阻害作用を有しないということを示している。このことは、ワクシニア組換え体をヒトに用いた場合、既存の免疫によって免疫応答が阻害されるという従来の知見（Cooney他；Etinger 他）とは対照的である。
【０２００】
かくして、本実施例が明示するように、非複製性ポックスウイルスはヒトにおいて免疫化ベクターとして機能することができ、その際、複製性の作用物質が免疫応答に与えるような全ての利点を有しながら、完全に許容性のウイルスが引き起こすような安全上の問題はない。そして、本実施例および他の実施例の教示から、狂犬病ウイルスまたはそのコードもしくは発現産物を含有する組換え体を投与または免疫接種するに際して、至適な投与量（用量）または投与方式や投与経路を選択することは、インビトロ発現法とともに当業者には明らかであろう。
【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【実施例１０】
【０２０１】
実施例10−ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣと各種のワクシニアウイルス株
とのＬＤ５０の比較
マウス  異系交配したオスのスイス・ウェブスター（Swiss Webster)マウスをTaconic Farms （米国ニューヨーク州Germantown）から購入し、３週齢（「標準」マウス）になって使用に供されるまで、マウス飼料と水を任意に（adlibitum)に与えて飼育した。異系交配したオスとメスのスイス・ウェブスター新生マウスはTaconic Faums によって実施された計画妊娠に従って入手した。新生マウスは全て出産から２日以内に引き渡されたものである。
【０２０２】
ウイルス  ＡＬＶＡＣは、カナリアポックスウイルスの集団をプラーク精製し、初代ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）内で調製されたものである。ショ糖密度勾配遠心により精製した後、ＣＥＦ細胞内のＡＬＶＡＣのプラーク形成単位を測定した。ワクシニアウイルスのＷＲ（Ｌ）変異株はＷＲの大プラーク表現型を選択することによって得られたものである（Panicali他、1981）。ワクシニアウイルスのWyeth ワクチン株（New York State Board of Health）はPharmaceuticals Calf Lymph Type vaccine Dryvaxから管理番号302001Bとして入手したものである。ワクシニアウイルスのCopenhagen株ＶＣ−２はフランスのInstitute Merieux から入手した。ワクシニアウイルスのＮＹＶＡＣ株はCopenhagen株ＶＣ−２から誘導されたものである。Wyeth株をのぞき、これらの株は全て、アフリカミドリザルの腎臓由来のVero細胞で培養し、ショ糖密度勾配遠心法により精製し、そしてVero細胞上のプラーク形成単位を測定した。Wyeth株はＣＥＦ細胞内で培養し、ＣＥＦ細胞内のプラーク形成単位を測定した。
【０２０３】
接種  各グループ10匹から成る標準マウスにウイルス稀釈液の１つの0.05mlを頭蓋内（ic）接種した。ウイルス稀釈液は保存ウイルス液を連続的に10倍稀釈することによって調製した。場合によっては、保存ウイルス液を稀釈せずに接種した。
【０２０４】
各グループ10匹から成る新生マウス（１日齢または２日齢）にも標準マウスと同様にic接種した。但し、接種量は0.03mlとして使用した。
【０２０５】
すべてのマウスについて、毎日、接種から14日間（新生マウスの場合）または21日間（標準マウスの場合）にわたって死亡率を観察した。接種の翌朝に死亡したマウスは、外傷による死亡の可能性があるので排除した。
【０２０６】
試験対象個体数の50％を死亡させるのに要する致死量（ＬＤ５０）は、ReedおよびMuenchの比例法に従って求めた。
【０２０７】
若い異系交配標準マウスにおけるic投与によるＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣと各種のワクシニアウイルス株とのＬＤ５０の比較  若い標準マウスにおいては、ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣのビルレンス（毒力）は、試験した他のワクシニアウイルス株よりも数桁低かった（表14）。ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣは、Wyeth 株よりも3,000 倍以上平常マウスにおけるビルレンスが低く；親株であるＶＣ−２株よりも12,500倍以上ビルレンスが低く；そして、ＷＲ（Ｌ）変異株よりも63,000,000倍以上ビルレンスが低いことが見出された。これらの結果から、ＮＹＶＡＣは他のワクシニアウイルスよりも高度に弱毒化されており、また、ＡＬＶＡＣは頭蓋内投与された場合、若いマウスには一般に非ビルレンス性であると考えられる。但し、両者ともきわめて高投与量の場合（ＡＬＶＡＣを3.85×10８PFU、ＮＹＶＡＣを３×10８PFU）、未だ不明の機序により、この投与経路によりマウスの死亡をもたらすことがある。
【０２０８】
異系交配新生マウスにおけるic投与によるＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣと各種のワクシニア株とのＬＤ５０の比較  新生マウスにおける５種類のポックスウイルス株の相対的ビルレンスを頭蓋内（ic）チャレンジモデル系における滴定によって調べた（表15）。ＬＤ５０の値が示したところによれば、ＡＬＶＡＣは、ワクシニアウイルスのWyeth 株よりも100,000 倍以上ビルレンスが低く；ワクシニアウイルスのCopenhagenＶＣ−２株よりも200,000 倍以上ビルレンスが低く；そして、ワクシニアウイルスのＷＲ（Ｌ）変異株よりも25,000,000倍以上ビルレンスが低い。但し、試験した最高投与量（6.3 ×10７PFU）においては、100 ％死亡率となった。6.3 ×10６PFUでは33.3％の死亡率が認められた。最高投与量グループ（約6.3 ＬＤ５０）の平均生存時間（ＭＳＴ）が6.7 ±1.5 日であることから、死因は（未だはっきりしないが）おそらく毒性または外傷性によるものではないであろう。チャレンジ投与量５ＬＤ５０におけるＷＲ（Ｌ）と比較すると、ＡＬＶＡＣがチャレンジされたマウスのＭＳＴは有意に長いものであった（Ｐ＝0.001)。
【０２０９】
ＮＹＶＡＣと比較すると、Wyeth は15,000倍以上ビルレンスが高く；ＶＣ−２は35,000倍以上ビルレンスが高く；そして、ＷＲ（Ｌ）は3,000,000 倍以上ビルレンスが高いことが見出された。ＡＬＶＡＣの場合と同様に、ＮＹＶＡＣの投与量が高くなる（６×10８PFUおよび６×10７PFU）と、100 ％死亡率となった。しかしながら、そのような最高用量（380 ＬＤ５０に相応）でチャレンジされたマウスのＭＳＴは僅か２日（２日目に９匹死亡、４日目に１匹死亡）であった。これに対して、最高用量（500 ＬＤ５０に等しい）のＷＲ（Ｌ）でチャレンジされたマウスは全て４日目まで生存した。
【表１４】
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【表１５】
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【実施例１１】
【０２１０】
実施例11．−ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）およびＮＹＶＡ−ＲＧ（ｖＰ８７９）
の評価
免疫沈降  トリ細胞または非トリ細胞から成り予め形成した単層に親ウイルスであるＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）ウイルスまたはＮＹＶＡ−ＲＧ（ｖＰ８７９）ウイルスを10pfu ／細胞接種した。この接種は２％の透析したウシ胎児血清を添加した無メチオニンＥＭＥＭ内に実施した。１時間保温した後、接種物を除き、培地を20μCi/ml の３５Ｓ−メチオニンを含有するＥＭＥＭ（無メチオニン）と置換した。一晩、約16時間培養した後、緩衝液Ａ（１％のNonidet P-40、10mMトリス（ｐＨ7.4)、150mM のＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、0.01％のアジ化ナトリウム、アプロチニン500 単位／ml、および0.02％のフェニル・メチル・スルホニル・フルオリド）を添加して細胞を溶解した。免疫沈降には、狂犬病糖タンパク質特異的モノクローナル抗体24−3F10（入手先：米国ニューヨーク州AlbanyのGriffith Laboratories, New York State Department of HealthのC. Trinarchi博士）およびラットの抗マウスコンジュゲート（入手先：Boehringer Mannheim Corporation,カタログ番号605-500)を使用した。支持マトリックスとしてプロテインＡセファロースＣＬ−４８（入手先：米国ニュージャージー州PiscatawayのPharmacia LKB Biotechnology 社）を用いた。10％ポリアクリルアミドゲル上で免疫沈降物を分画した(Dreyfuss 他、1984）。ゲルを固定化し、蛍光写真に供するため１ＭのＮａ−サリシレートで１時間処理し、Kodak のＸＡＲ−２フィルムに露光して免疫沈降したタンパク質種を現像した。
【０２１１】
動物源  ニュージーランド（New zealand)白色ラビットをHare-Marland（米国ニュージャージー州Hewitt）から入手した。３週齢のオスの異系交配スイス・ウェブスター（Swiss Webster)マウス、計画妊娠しているメスの異系交配スイス・ウェブスターマウス、および４週齢のスイス・ウェブスターヌードマウス（ｎｕ＋  ｎｕ＋  ) Taconic Farms社（米国ニューヨーク州Germantown）から入手した。これらの動物は全てＮＩＨのガイドラインに従って飼育した。動物のプロトコールは全てＩＡＣＵＣによって承認されたものである。必要と考えられた場合には、明らかに致命的な疾病を有しているマウスは安楽死させた。
【０２１２】
ウサギにおける障害評価  ２匹のウサギのそれぞれに、10４ 、 10５ 、 10６ 、 10７ もしくは10８pfuの各被験ウイルスを含有するＰＢＳまたはＰＢＳ単独0.1ml を複数部位に皮内接種した。４日目から障害が消散するまでウサギを毎日観察した。硬結および潰瘍形成を測定し記録した。
【０２１３】
接種部位からのウイルス回収  １匹のウサギに、10６ 、 10７ もしくは10８pfuの各試験ウイルスを含有するＰＢＳまたはＰＢＳ単独0.1ml を複数の部位に皮内接種した。11日目に、ウサギを安楽死させ、各接種部位から採取した皮膚のバイオプシー標本を機械的破砕および間接音波処理により無菌的に調製してウイルスを回収した。ＣＥＦ単層上のプラーク滴定により感染ウイルスを分析した。
【０２１４】
マウス内のビルレンス  各グループ10匹から成るマウス、または５匹から成るヌードマウスに、0.5ml の無菌ＰＢＳに溶かしたウイルスの数倍稀釈液の１つをip接種した。実施例11も参照。
【０２１５】
シクロホスホアミド（ＣＹ）処理  −２日目に４mg（0.02ml）のＣＹ（ＳＩＧＭＡ製）をマウスにip注入した後、０日目にウイルス注入を行った。ウイルス注入後、次のようにマウスにＣＹをip注入した：１日目に４mg；４日、７日および11日目に２mg；14日、18日、21日、25日および28日目に３mg。Coulter 計数装置を用い11日目に白血球を計数することにより免疫抑制を間接観察した。平均白血球数は、非処理マウス（ｎ＝４）については13,500白血球／μｌ、また、ＣＹ処理した対照マウスについては4,220白血球／μｌであった。
【０２１６】
ＬＤ５０の計算  ReedおよびMuech による比例法（ReedおよびMuench, 1938）により、50％死亡率をもたらすのに要する致死量（ＬＤ５０）を求めた。
【０２１７】
マウス内のＮＹＶＡＣ−ＲＧの効力試験  ４週齢から６週齢のマウスの肉趾に、ＶＶ−ＲＧ（Kieny 他、1984）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（Taylor他、1991b)、またはＮＹＶＡＣ−ＲＧのいずれかの一定範囲稀釈液（50％組織培養感染料（ＴＣＩＤ５０）として2.8 〜8.0)の50〜100 μｌを接種した。各グループは８匹のマウスから構成した。ワクチン接種後14日目において、狂犬病ウイルスＣＶＳ株（0.03ml）の15ＬＤ５０を頭蓋内接種することによりマウスへのチャレンジを行った。28日目に生存マウスを数え、50％防御投与量（ＰＤ５０）を求めた。
【０２１８】
ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）の誘導  ワクシニアウイルスのＮＹＶＡＣ株は、Copenhagenワクチン株をプラーククローニングして得られたＶＣ−２から調製されたものである。ＶＣ−２からＮＹＶＡＣを調製するためには、本明細書において既述したような一連の操作を行って、18ヶのワクシニアのＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）（ビルレンスに関連する多数のウイルスの機能を含む）を正確に欠失させた。これらの欠失を行うに当たっては、非所望の新規なオープンリーディングフレームが出現しないように設計した。図10は、ＮＹＶＡＣを調製するのに欠失させたＯＲＦを図示する。図10の上部には、ワクシニアウイルスゲノム（ＶＣ−２プラーク単離物、Cophenhagen 株）のＨｉｎｄIII 制限マップを示す。ＮＹＶＡＣを調製するのに逐次欠失させたＶＣ−２の６つの領域を拡げて示している。これらの欠失については本明細書において既述した（実施例１から実施例６）。そのような欠失位置の下に、該位置から欠失させたＯＲＦを、その遺伝子産物の機能ないしはホモロジーおよび分子量とともに掲記している。
【０２１９】
ヒト組織細胞系におけるＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣの複製試験  ヒト由来の細胞におけるワクシニアウイルスのＮＹＶＡＣ株（ｖＰ８６６）の複製レベルを調べるため、６種類の細胞系に、液体培養条件下、導入多重度0.1pfu／細胞で接種した。親株のCophenhagen クローン（ＶＣ−２）の接種も併せて行った。初代ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）（10〜11日齢のＳＰＦ源の胚卵。米国コネチカット州StorrsのSpafas社製）使用して全てのウイルスに対する許容細胞基質とした。２つの基準、すなわち、産生的なウイルス複製が生じているかということ、および、外来抗原が発現しているかということに基づいて培養物の分析を行った。
【０２２０】
ヒト由来のいろいろな細胞におけるＮＹＶＡＣの複製能を表16に示す。ＶＣ−２およびＮＹＶＡＣのいずれもＣＥＦ細胞内で複製する能力を有するが、ＮＹＶＡＣの方が幾分収量（産生量）が低い。ＶＣ−２も、ＥＢＶ形質転換リンパ球芽細胞系ＪＴ−１（エプステインバーウイルスで形質転換されたヒトリンパ球芽細胞系。Rickinso他(1984)を参照）を除き、試験した６種類のヒト由来細胞系で産生的複製能力を有している。これに対して、ＮＹＶＡＣは、試験したヒト由来細胞系のいずれにおいてもその複製能力が高度に減弱されている。ＮＹＶＡＣを感染させたＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ171 、ヒト胎児肺由来）、ＤＥＴＲＯＩＴ５３２（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ54。ヒト包皮、ダウン症候群）、ＨＥＬ２９９（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ137 、ヒト胎児肺細胞）、およびＨＮＫ（ヒト新生児腎臓細胞。米国メリーランド州Wakersville のWhittiker Bioproducts 社製、カタログ＃70-151）から、残存ウイルスレベルを超える感染ウイルスの僅かな増加が見られている。これらの細胞系における複製は、ＮＹＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞または親株のＶＣ−２から得られたウイルス収量（産生量）に比較すると有意に減少していた（表16）。注目すべきことには、ＮＹＶＡＣおよびＶＣ−２のいずれについても、24時間におけるウイルス収量は72時間の収量に等しい。したがって、該ヒト由来細胞系培養物を更に48時間（ウイルス生成サイクルの２回分）培養させると、相対的なウイルス収量を上昇させたかも知れない。
【０２２１】
上記のヒト由来細胞系においては、ウイルス収量が低かったことに一致して、ＭＲＣ−５およびＤＥＴＲＯＩＴ５３２においてもＮＹＶＡＣ特異的ＤＮＡの複製は、検出可能ではあったが、そのレベルは低かった。ＮＹＶＡＣを感染させたＭＲＣ−５およびＤＥＴＲＯＩＴ５３２細胞系におけるＤＮＡ複製レベルは、ＮＹＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞で見出されたレベルと比較すると、ウイルス収量において近似していた。その他のヒト由来細胞のいずれにおいてもＮＹＶＡＣ特異的ウイルスＤＮＡ複製は見出されなかった。
【０２２２】
トリポックスウイルスであるＡＬＶＡＣを用いても同様の実験を行った。このウイルス複製の結果も表16に示す。いずれのヒト細胞系においても子孫ウイルス（子ウイルス）は検出されず、カナリアポックスウイルスの宿主域によりトリ種に制限されていることに相反しない。さらに、いずれのヒト由来細胞系においてもＡＬＶＡＣ特異的なＤＮＡ蓄積は検出されなかったという事実も、それらのヒト由来細胞のおいてＡＬＶＡＣの産生的複製が起こらないということに矛盾していない。
【０２２３】
ヒト細胞におけるＮＹＶＡ−ＲＧ（ｖＰ８７９）による狂犬病糖タンパク質の発現  産生的ウイルス複製が実質的に起こらない場合においても外来遺伝子の効率的な発現が得られるかということを判定するために、上記と同じ細胞系に、３５Ｓ−メチオニンの存在下に、狂犬病ウイルス糖タンパク質発現性のＮＹＶＡＣ組換え体（ｖＰ８７９、実施例７）を接種した。該狂犬病糖タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を用い、放射ラベルした培養リゼイトから狂犬病糖タンパク質を免疫沈降させた。６７ｋＤａのタンパク質の免疫沈降物が得られたが、これは狂犬病糖タンパク質が完全にグリコシレートされた形態に一致する。非感染細胞リゼイトまたは親のＮＹＶＡＣが感染した細胞リゼイトにおいて血清学的に交差性の生成物は検出されなかった。分析した他の細胞においても同様の結果が得られた。
【０２２４】
ウサギ皮膚への接種  ワクシニアウイルス株の病原性の尺度として、皮内（ic）接種後のウサギの皮膚障害およびその特徴が利用されている（Buller他、1988；Child 他、1990；Fenner他、1958；Flexner 他、1987；Ghendon およびChernos 1964）。そこで、ワクシニア株ＷＲ（ＣＶ−１細胞ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ70をプラーク精製したＡＴＣＣ＃ＶＲ119 として、これらからＬ変異体として単離、選択されたプラークから成るＡＴＣＣ＃ＶＲ2035。Panicali他(1981)参照）、ＷＹＥＴＨ（ＡＴＣＣ＃ＶＲ325 。米国ペンシルバニア州MariettaのWyeth Laboratories社からＤＲＹＶＡＣとして市販）、COPENHAGEN（ＶＣ−２）およびＮＹＶＡＣを２匹のウサギ（Ａ０６９およびＡ１２８）にid接種した場合の障害の特徴を調べた。これらの２匹のウサギはウイルスに対する全体的な感度が異なっており、ウサギＡ１２８の方がウサギＡ０６９よりも応答性が低かった。ウサギＡ１２８においては障害は比較的軽くて、接種後27日目までに消散した。ウサギＡ０６９においては、障害程度は強く（特にＷＲ接種部位）、49日経過後ようやく消散した。また、障害の強さは、リンパ液排出網状組織に対する接種部位の相対的な位置に依存していた。特に脊椎上に位置する部位の障害が強く、脾腹にある障害が消散するのに長い時間を要した。４日目から最後の障害が消えるまで全ての障害を毎日調べ、障害の最大サイズの平均値および消散までの日を求めた（表17）。対照であるＰＢＳの注入部位には局部反応は見られなかった。ＷＲ、ＶＣ−２およびＷＹＥＴＨワクシニアウイルス株の注入部位には潰瘍性障害が見られた。重要なことは、ＮＹＶＡＣの接種部位には硬結または潰瘍性障害が観察されなかったということである。
【０２２５】
接種部位における感染性ウイルスの残存  接種部位における各ウイルスの相対的な残存性を調べるため、10６ 、 10７ 、または10８pfuのＶＣ−２、ＷＲ、ＷＹＥＴＨまたはＮＹＶＡＣを含有する0.1ml のＰＢＳをウサギの複数部位に皮内接種した。各ウイルスについて、10７pfuを脊椎上に投与し、その両側に10６ および10８ を投与した。接種部位を11日間にわたって毎日観察した。ＷＲが最も強い反応を示し、次いで、ＶＣ−２およびＷＹＥＴＨとなった（表18）。潰瘍が最初に見出されたのは、ＷＲおよびＷＹＥＴＨについては９日目、ＶＣ−２については10日目であった。ＮＹＶＡＣまたは対照用ＰＢＳが接種された部位は硬結または潰瘍形成を示さなかった。接種後11日前に、接種部位から皮膚サンプルを切除し、機械的に破砕し、ＣＥＦ細胞上でウイルスを滴定した。結果を表18に示す。いずれの場合においても、この時点では投与量よりも多量のウイルスは回収されなかった。ワクシニア株ＷＲの回収量は、ウイルス投与量とは無関係に約10６pfuであった。ワクシニア株ＷＹＥＴＨおよびＶＣ−２の回収量は投与量と関係なく10３ から10４ であった。ＮＹＶＡＣを接種した部位からは感染性ウイルスは回収されなかった。
【０２２６】
遺伝的または化学的に免疫不全性のマウスへの接種  ヌードマウスに高投与量のＮＹＶＡＣ（５×10８pfu）またはＡＬＶＡＣ（10９pfu）を腹腔内投与したが、10日間の観察期間を通じ、死亡、障害および明らかな疾病を引き起こすことはなかった。これに対して、ＷＲ（10３ から10４pfu）、ＷＹＥＴＨ（５×10７ または10８pfu）またはＶＣ−２（10４ から10９pfu）を接種されたマウスは、先ず趾部に、次いで尾部にポックスウイルスに典型的な播種性障害を示し、その後、幾つかのマウスにおいては睾丸炎が見られた。ＷＲまたはＷＹＥＴＨを感染させたマウスは播種性障害が出現すると、一般的に、最終的には死亡したが、ＶＣ−２を感染させたマウスは多くの場合、最終的には回復した。ＬＤ５０計算値を表19に示す。  さらに詳述すると、ＶＣ−２を接種されたマウスは先ず趾部に、そして、それより１〜２日後には尾部に障害（赤色丘疹）を示す。これらの障害は、高投与量（10９ 、10８ 、10７ および10６pfu）を投与されたマウスについては接種後から11〜13日目、10５pfuを投与されたマウスにおいては接種後16日目、また、10４pfuを投与されたマウスにおいては接種後21日目に出現した。10３ および10４ を投与されたマウスにおいては100 日間の観察期間中障害は見出されなかった。10９ および10８pfuを投与されたマウスにおいては接種後23日目に、また、他のグループのマウス（10７ から10４pfu）においては、それより約７日後に睾丸炎が認められた。睾丸炎は10９ および10８ 投与グループにおいて特に強く、次第に後退してはゆくが、100 日間の観察期間の終わりまで認められた。数匹のマウスの皮膚には、接種後30〜35日目に幾つかのポックス性の障害が認められた。これらのポックス障害の多くは、一般に接種後60〜90日目に治癒した。10９pfuを接種されたグループのマウスのうち１匹のみが死亡し（接種後34日）、また、10８pfuを投与されたグループのマウスの１匹が死亡（接種後94日）した。ＶＣ−２が接種されたマウスにその他の死亡は見られなかった。
【０２２７】
10４pfuのＷＲワクシア株を接種されたマウスは、接種後17日目にポックス性障害を示し始めた。これらの障害は、ＶＣ−２接種マウスに見られた障害と同じであった（趾部、尾部の腫脹）。10３pfuのＷＲ株を接種されたマウスでは接種後34日目まで障害は出現しなかった。睾丸炎が認められたのは高用量のＷＲ（10４pfu）が接種されたマウスのみであった。観察期間の後期に口の周りに障害が現れマウスは食餌を止めた。10４pfuのＷＲを接種したマウスは全て、接種後21日から31日目に死亡するか、必要に応じて安楽死させた。10３pfuのＷＲを投与した５匹のうち４匹は、接種後35日から57日目に死亡するか、必要と考えられた場合は安楽死させた。低投与量のＷＲ（１から100pfu）が接種されたマウスには死亡は認められなかった。
【０２２８】
高投与量（５×10７ および５×10８pfu）のワクシニアＷＹＥＴＨ株を投与したマウスは、趾部および尾部に障害を示し、睾丸炎が発生し、そして死亡した。５×10６pfuまたはそれ以下のＷＹＥＴＨを投与したマウスは疾病や障害の症状を示さなかった。
【０２２９】
表19に示すように、ＣＹ処理されたマウスは、ポックスウイルスのビルレンスを分析するのにヌードマウスの場合よりも高感度のモデル系を与える。ＷＲ、ＷＹＥＴＨ、およびＶＣ−２に関するＬＤ５０値は、このモデル系においてはヌードマウスモデルの場合よりも有意に低くなっていた。さらに、ＷＹＥＴＨ、ＷＲおよびＶＣ−Ｒワクシニアウイルスをマウスに投与した場合、以下に記すように、各ウイルスをさらに高い用量で投与することにより障害が出現し、この結果、障害の形成がさらに迅速になっている。ヌードマウスにおいて見られたように、ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣを注入されたＣＹ処理マウスは障害を示さなかった。しかしながら、ヌードマウスの場合とは異なり、ＮＹＶＡＤまたはＡＬＶＡＣを用いてチャレンジされたＣＹ処理マウスにおいては、投与量とは無関係に、死亡が見られたものもあった。このような不規則な発病が死因と関係するかは疑問である。
【０２３０】
ＷＹＥＴＨが投与されたマウスはいずれの投与量においても（9.5 ×10４ から9.5 ×10８pfu）、接種後７日目から15日目の間に尾部および／または趾部にポックス性障害を示した。さらに、尾部および趾部は腫脹した。尾部での障害の出現は、ポックス性障害の典型的なものであり、丘疹の形成、潰瘍形成、そして最後には痂皮の形成を伴う。ＶＣ−２が投与されたマウスも、すべての投与量において（1.65×10５ から1.65×10９pfu）、ＷＹＥＴＨ投与マウスの場合に類似した尾部および／または趾部にポックス性障害を示した。これより低用量のＷＲウイルスを投与したマウスには障害は見られなかったが、これらのグループで死亡は生じた。
【０２３１】
ＮＹＶＡＣ−ＲＧの効力試験  ワクシニアウイルスのCOPENHAGEN株を弱毒化すすることにより、それから得られるＮＹＶＡＣ株のベクターとしての有用性を実質的に変化させていないことを明らかにするため、比較効力試験を行った。該ウイルスを弱毒化するのに行われた一連の遺伝子操作中の該ベクターの免疫原性能を調べるため、リポーター外来抗原として狂犬病ウイルスの糖タンパク質を利用した。該狂犬病糖タンパク質を発現するベクターの感染防御効力の評価は狂犬病に関する標準的なＮＩＨマウス効力試験によった（Seligmann 、1973）。表20に示しているように、高度に弱毒化したＮＹＶＡＣベクターについて得られるＰＤ５０値は、ｔｋ遺伝子座に狂犬病遺伝子を含有するCOPENHAGEN由来組換え体を用いて得られた値（Kieny 他、1984）と同じであり、また、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（トリ種に複製が制限されているカナリアポックス由来ベクター）について得られたＰＤ５０に近似している。
【０２３２】
考察  よく知られたビルレンス遺伝子が欠失され且つ限定されたインビトロ増殖特性を有するＮＹＶＡＣを動物モデル系で分析して、その弱毒化特性を調べた。これらの試験に当たって、神経毒性のあるワクシニアウイルスの実験室株、ＷＲ、２種類のワクシニアウイルスワクチン株、ＷＹＥＴＨ（New York City Board of Health)およびCOPENHAGEN株、さらには、カナリアポックスウイルス株であるＡＬＶＡＣとの比較を行った（実施例11も参照）。さらに、マウスチャレンジモデルおよびウサギ皮膚モデルにより、これらのウイルスの相対的な免疫原性能が明らかになった。すなわち、ＷＲが最もビルレンスの高い株であり、ＷＹＥＴＨおよびCOPENHAGEN（ＶＣ−２）は弱毒化ワクチン株として既に利用されているような特徴を有し、そして、ＡＬＶＡＣは複製がトリ種に制限されるようなポックスウイルスの１例であることが理解された。これらのインビボ分析は、ワクシニアウイルス株ＷＲ、ＷＹＥＴＨおよびCOPENHAGEN（ＶＣ−２）に比べるとＮＹＶＡＣが高度に弱毒化された特性を有するものであることを明示している（実施例14〜20）。重要なことは、ＮＹＶＡＣにおけるＬＤ５０値は、トリ宿主制限トリポックスウイルスであるＡＬＶＡＣにおいて見出された値に匹敵したということである。ＮＹＶＡＣに因る死亡は、ＡＬＶＡＣと同様に、きわめて高用量のウイルスが頭蓋投与された場合のみ見出された（実施例11、表14、15、19）。この死亡が多量のタンパク質を接種した非特異性に因るものであるか否かは未だ明らかでない。免疫無防備状態マウスモデル（ヌードマウスおよびＣＹ処理マウス）における分析からも、ＷＲ、ＷＹＥＴＨおよびCOPENHAGEN株に比べてＮＹＶＡＣが高度に弱毒化された特徴を有することが明らかにされた。重要なことは、ＮＹＶＡＣ接種動物またはＡＬＶＡＣ接種モデルにおいては、観察期間を通して、ワクシニア感染の播種やワクシニア性疾病の形跡が見出されなかったということである。ＮＹＶＡＣにおいて複数のビルレンス関連遺伝子を欠失させると、病原性に関する相乗効果が示された。ＮＹＶＡＣの接種特性を知る別の手段としてウサギ皮膚への皮内投与を行った（表17および18）。非トリ種において複製能力を有しないウイルスであるＡＬＶＡＣに関する結果を考察すると、接種部位における複製能力のみが反応性に相関しているのではない。ＡＬＶＡＣの皮内接種は投与量に依存して硬結域をもたらしたからである。すなわち、ウイルスの複製能力以外の因子が障害の形成に寄与しているものと推測される。ＮＹＶＡＣにおいてビルレンスに関連する特定の遺伝子を欠失させると障害の発生が防止される。
【０２３３】
さらに、本実施例および既述の実施例（実施例９を含む）の結果から、ＷＲ、ならびに既に利用されているワクシニアウイルスワクチン株であるＷＹＥＴＨおよびCOPENHAGENに比べてＮＹＶＡＣが高度に弱毒化された特性を有することが明らかである。事実、試験した動物モデル系におけるＮＹＶＡＣの病原性プロフィルは、トリ種においてのみ産生的複製を行うことで知られたポックスウイルスであるＡＬＶＡＣのプロフィルに類似していた。ＮＹＶＡＣの産生的複製能がヒト（表16）およびその他の動物（マウス、ブタ、イヌおよびウマを含む）由来の細胞において見かけ上制限されていることが重要な障壁となって、ワクチン接種されたヒトの中で播種する可能性の低いベクターを提供できることに加えて、ワクチン非接種者または一般的な環境への伝染を制限したり防止することになる。
【０２３４】
重要なことは、ＮＹＶＡＣ系ワクチンが効力を有することが示されたことである。各種の病原体由来の外来遺伝子産物を発現するＮＹＶＡＣ組換え体は、霊長類を含む幾つかの動物種において該外来遺伝子産物に対する免疫応答を引き起こした。特に、狂犬病糖タンパク質を発現するＮＹＶＡＣを基礎とする組換え体は致死的な狂犬病ウイルスのチャレンジに対してマウスを防御する能力を有した。該ＮＹＶＡＣ由来狂犬病糖タンパク質組換え体の効力は、ｔｋ遺伝子座に狂犬病糖タンパク質を含有するCOPENHAGEN由来組み換えたいのＰＤ５０に匹敵するものであった（表20）。また、ＮＹＶＡＣを基礎とする組換え体は、ウサギにおいて麻疹ウイルス中和抗体を誘起し、ブタにおける擬狂犬病ウイルスおよび日本脳炎ウイルスのチャレンジに対して防御機能を有した。高度に弱毒化されたＮＹＶＡＣ株は、ヒト、動物、医学および獣医学の分野での利用において安全であるという利点を有する（Tartaglia 他、1992）。さらに、一般の実験的発現ベクター系としてＮＹＶＡＣを使用すれば、ワクシニアウイルスに関連する生物学的危険性（ハザード）が激減する。
【０２３５】
本実施例およびその他の実施例（実施例10を含む）の結果が示すように、次のような基準によりＮＹＶＡＣが高度に弱毒化されたものであることを明らかにした：ａ）接種部位に硬結または潰瘍化が検出されないこと（ウサギ皮膚）；ｂ）皮内接種部位から感染ウイルスが迅速に存在しなくなること（ウサギ皮膚）；ｃ）睾丸炎症がないこと（ヌードマウス）；ｄ）ビルレンスが激減していること（３週齢マウスおよび新生マウスの両方における頭蓋内チャレンジ）；ｅ）免疫不全被験体において病原性が激減しており播種しないこと（ヌードおよびシクロホスホアミド処理マウス）；およびｆ）各種のヒト組織培養細胞において複製能が著しく減少していること。そして、高度に弱毒化されているのにも拘わらず、ＮＹＶＡＣは、ベクターとして、外来遺伝子に対する強力な免疫応答を保有している。
【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【実施例１２】
【０２３６】
実施例12−ＨＴＬＶ−１  ＥＮＶを発現するＮＹＶＡＣ組換え体の調製
西アフリカ患者の初代細胞培養から得たＨＴＬＶ−Ｉ１７１１分子クローン由来のＤＮＡプラスミドを用いて、ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ  ＨＴＬＶ−Ｉ  エンベロープ組換えワクチンを構築した。系統発生学的には、ＨＴＬＶ−Ｉ１７１１は、ＨＴＬＶ−Ｉのコスモポリタン（cosmopolitan）科に属する。
【０２３７】
Ｉ３ＬをプロモーターとするヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−I）のエンベロープの遺伝子を含むドナー遺伝子は次にような手法により調製した。Ｉ３ＬプロモーターがＨＴＬＶ−Iエンベロープ遺伝子の５′末端に融着した100bp のＰＣＲフラグメントＰＣＲ−ＨＴＬＶ１８は、オリゴヌクレオチドプライマーＭＷ０９３（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:37 ；５′−ATCATCGGTACCACATCATGCAGTGGTTAAAC−３′）およびＭＷ１１０（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:38 ；５′−GGCGAGAAACTTACCCATGATTAAACCTAAATAATTG −３′）を用いて、プラスミドｐＭＭ１０２から調製した。Ｉ３Ｌプロモーターの３′末端がＨＴＬＶ−Iエンベロープの全遺伝子に融合した1,500bp のＰＣＲフラグメントｐＣＲ−ＨＴＬＶ２１は、オリゴヌクレオチドプライマーＭＷ１１３（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:39 ；５′−CAATTATTTAGGTTTAATCATGGGTAAGTTTCTCGCC −３′）およびＭＷ１１６（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:40 ；５′−ATCATCTCTAGAATAAAAATTACAGGGATGACTCAGGG−３′）を用いて、プラスミドｐ１７−ＳＳＴ（全ＨＴＬＶ−Iヌクレオチド配列を含有する）から調製した。Ｉ３Ｌをプロモーターとするエンベロープ遺伝子を含有する1600bpのＰＣＲフラグメントＰＣＲ−ＨＴＬＶ２４は、ＰＣＲフラグメントＰＣＲ−ＨＴＬＶ１８およびＰＣＲ−ＨＴＬＶ２１を鋳型とし、オリゴヌクレオチドプライマーＭＷ０９３（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:37)およびＭＷ１１６（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:40)を用いるＰＣＲ反応により調製した。次に、Ｉ３Ｌをプロモーターとするエンベロープ遺伝子をｐＢＳＫ内にクローニングした。この操作は次に３つの工程で実施した。１）Ｉ３Ｌプロモーターおよび当該エンベロープ遺伝子の５′末端をｐＢＳＫ内にクローニングした。これは、1600bpのＰＣＲフラグメントＰＣＲ−ＨＴＬＶ２４をＫｐｎＩを用いて酵素分解し、得られた1,100bpのフラグメントをｐＢＳＫのＫｐｎＩ部位にクローニングすることにより行った。この操作によって調整したプラスミドをｐＭＡＷ０１５と命名した。２）エンベロープ遺伝子の３′末端をｐＢＳＫ内にクローニングした。これは、1600bpのＰＣＲフラグメントＰＣＲ−ＨＴＬＶ２４をＫｐｎＩおよびＸｂａＩを用いて分解し、得られた530bp のフラグメントを、ｐＢＳＫの2900bpのＫｐｎＩ−ＸｂａＩフラグメント内にクローニングすることのより行った。この操作によって得られたプラスミドをｐＭＡＷ０１３と命名した。３）次に、Ｉ３Ｌプロモーターおよびエンベロープ遺伝子の５′末端を、エンベロープ遺伝子の３′末端の上流にクローニングした。これは、ｐＭＡＷ０１５のＫｐｎＩ1,000bp フラグメント（Ｉ３Ｌプロモーターおよびエンベロープ遺伝子の５′末端を含有する）をｐＭＡＷ０１３のＫｐｎＩ部位にクローニングすることにより行った。この操作によって調整したプラスミドをｐＭＡＷ０１６と命名した。
【０２３８】
次に、Ｉ３Ｌをプロモーターとするエンベロープ遺伝子をカナリアポックスのＣ５フランキングアーム間にクローニングした。これは、ｐＭＡＷ１６のＫｐｎＩ−ＸｂａＩ部分分解1,600bp フラグメント（Ｉ３Ｌをプロモーターとするエンベロープ遺伝子を含有）を、ｐＶＱＣ５ＬＳＰ６の4,800bP のＸｐｎＩ−ＸｂａＩフラグメントにクローニングすることにより行った。この操作により調製したプラスミドをｐＭＡＷ０１７と命名した。
【０２３９】
ｐＶＱＣ５ＬＳＰ６を調製するためには、ＢａｍＨＩによりｐＣ５ＬＳＰを酵素分解し、アニーリングされたオリゴヌクレオチドＣＰ３２（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:41)（５′−GATCTTAATTAATTAGTCATCAGGCAGGGCGAGAACGAGACTATCTGCTCGTTAATTAATTAGGTCGACG−３′）およびＣＰ３３（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:42）（５′−GATCCGTCGACCTAATTAATTAACGAGCACATAGTCTCGTTCTCGCCCTGCCTGATGACTAATTAATTAA−３′）に連結（ライゲート）した。
【０２４０】
プラスミドｐＣ５ＬＳＰを調製するには、Ａｓｐ７１８およびＮｏｔＩを用いてポリリンカー内でｐＣ５Ｌを分解し、アルカリホスファターゼで処理した後、キナーゼ処理されアニーリングしたオリゴヌクレオチドＣＰ２６（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:43)（５′−GTACGTGACTAATTAGCTATAAAAAGGATCCGGTACCCTCGAGTCTAGAATCGATCCCGGGTTTTTATGACTAGTTAATCAC−３′）およびＣＰ２７（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:44)（５′−GGCCGTGATTAACTAGTCATAAAAACCCGGGATCGATTCTAGACTCGAGGGTACCGGATCCTTTTTATAGCTAATTAGTCAC−３′）（無能化したＡｓｐ７１８部位、６つのリーディングフレームにおける翻訳停止コドン、ワクシニア初期転写終結シグナル（YuenおよびMoss、1987）、ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、ＸｈｏＩ、ＸｂａＩ、ＣｌａＩ、およびＳｍａＩ制限部位、ワクシニア初期転写終結シグナル、６つのリーディングフレームにおける翻訳停止コドン、ならびに無能化ＮｏｔＩ部位を含有する）に連結した。
【０２４１】
Ｃ５Ｌ挿入ベクターは次のように誘導した。コスミドベクターｐＶＫ１０２（Knauf およびNester、1982）を用い、ｖＣＰ６５（Ｃ５遺伝子座に狂犬病配列を有するＡＬＶＡＣを基礎とする狂犬病Ｇ組換え体）のゲノムライブラリーを構築した。このライブラリーに、ｐＲＷ764.5 内に含有された（Ｃ５遺伝子座）0.9kb のＰｖｕIIカナリアポックスウイルスゲノムフラグメントを用いてプロービングを行った。該カナリアポックスＤＮＡ配列は当初の挿入座を含有するものである。29kbのインサートを含有するクローンの１つを増殖してｐＨＣＯＳ１と命名した。Ｃ５配列を含有するこのコスミドから、3.3kb のＣｌａＩフラグメントをサブクローニングした。このＣｌａＩフラグメントの配列分析を用いて、Ｃ５遺伝子座のマップ（１〜1372）を拡大した。
【０２４２】
Ｃ５挿入ベクターは次のような２つの工程から構築した。オリゴヌクレオチドＣ５Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:45)（５′−ATCATCGAATTCTGAATGTTAAATGTTATACTTTG)およびＣ５Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:46)（GGGGGTACCTTTGAGAGTACCACTTCAG−３′）を用いるＰＣＲ増幅により1535bpの左側のアームを調製した。鋳型としたＤＮＡはｖＣＰ６５ゲノムＤＮＡであり、このフラグメントをＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩで分解したｐＵＣ８にクローニングした。標準的な配列分析法に配列を確認した。404bp の右側アームはオリゴヌクレオチドＣ５Ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:47)（５′−ATCATCCTGCAGGTATTCTAAACTAGGAATAGATG −３′）およびＣ５ＤＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:48)（５′−ATCATCCTGCAGGTATTCTAAACTAGGAATAGATG −３′）を用いるＰＣＲ増幅により調製した。次に、予め調製しＳｍａＩ／ＰｓｔＩ分解左側アームを含有するベクターにクローニングした。標準的な配列分析により全体の構成を確認し、ｐＣ５Ｌと命名した。この挿入プラスミドは、Ｃ５遺伝子座に外来遺伝子を挿入する能力を有する。
【０２４３】
次に、Ｉ３Ｌをプロモーターとするエンベロープ遺伝子をＨＡフランキングアーム間にクローニングした。これは、ｐＭＡＷ０１７のＫｐｎＩ／ＸｂａＩによる部分分解1,600bp フラグメント（Ｉ３Ｌをプロモーターとするエンベロープ遺伝子を含有する）を、ｐＳＰＡＨＡＨ６の3,600bp ＫｐｎＩ−ＸｂａＩフラグメントにクローニングすることにより行った。この操作により構築したプラスミドをｐＭＡＷ０１８と呼称する。
【０２４４】
ここで、ｐＳＰＨＡＨ６の調製は次のように行った。プラスミドｐＭＰ２ＶＣＬ（Ｋ１Ｌ宿主域遺伝子の上流のワクシニア配列内にポリリンカー領域を含有する）を該ポリリンカー内でＨｉｎｄIII およびＸｈｏＩにより酵素分解し、アニーリングされたＳＰＨＰＲＨＡのＡからＤに連結して、ｐＳＰ１２６（ＨｉｎｄIII 、Ｈ６プロモーター（−124 〜−１）（Perkus他、1989）ならびにＸｈｏＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＳａＣＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含有する）を調製した。ここで、ＳＰＨＰＲＨＡ  Ａ〜Ｄの配列は以下のとおりである。
【０２４５】
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プラスミドｐＳＤ５５４（ポリリンカー置換されたＨＡ遺伝子部位の前後のワクシニア配列、および６つのリーディングフレームにおける翻訳終結コドンを含有する）をポリリンカー内でＸｈｏＩにより分解し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて空所を満たし、そして、アルカリホスファターゼで処理した。ＨｉｎｄIII を用いてsp126 を分解し、クレノウ断片で処理した後、ＳｍａＩを用いる酵素分解によりＨ６プロモーターを単離した。このＨ６プロモーターフラグメントをｐＳＤ５４４に連結すると、ポリリンカー領域にＨ６プロモーターＨ６を含有する（ＨＡ転写方向）ｐＳＰＨＡＨ６が得られた。この挿入プラスミドは、ワクシニアＨＡ遺伝子（Ａ５６；Goebel他、1990a,b)を外来遺伝子と置換させる能力を有する。
【０２４６】
ｐＭＡＷ０１８を用いて、レスキューウイルスとしてＮＹＶＡＣとインビトロ組換え実験を行うことによりｖＰ１１８１を得た。
【実施例１３】
【０２４７】
実施例13−ＨＴＬＶ−Ｉ  ＥＮＶを発現するＮＹＶＡＣ組換え体の調製
実施例12において記述したようにして得られたｐＭＡＷ０１７を用いて、レスキューウイルスとしてＡＬＶＡＣとインビトロ組換え実験を行うことによりｖＣＰ２０３を得た。
【実施例１４】
【０２４８】
実施例14−ＨＴＬＶ-のエンベロープ（ｇＰ４６、ｇＰ２１）全体を発現する ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣ組換え体の分析
ＨＴＬＶ−ＩＢＯＵ （ＨＴＬＶのコスモポリタンタイプに属し西インド由来）を感染させたヒトさい帯血細胞の短期共培養により、ＨＴＬＶ−Ｉの細胞結合性（cell-associated)チャレンジを行った。表22に示すように、４対のウサギに、８×10４ 、４×10４ 、２×10４ および１×10４ のＨＴＬＶ−IBOU 感染ヒト細胞を静脈(I.V.)接種した。被接種動物をウイルス感染させた後のウイルス学的状態を確認するため、精製した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、直接培養またはヒトさい帯血細胞との共培養により数回にわたりウイルスの単離を実施した。
【０２４９】
表22に示すように、８×10４ または４×10４ の細胞が接種された各対のウサギはウイルスとの接触後、感染状態になっていた。２×10４ 細胞を用いると２匹のウサギのうち１匹のみが感染し、一方、１×10４ を用いるといずれのウサギも感染状態になっていないことが、ウイルス単離およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により判断された。したがって、ワクチン接種されたウサギをチャレンジする投与量（用量）として５×10４ 細胞を選定した。インビトロ滴定試験に用いたＨＴＬＶ−IBOU 感染ヒト細胞の30％のみが、免疫沈降分析において、ＨＴＬＶ−Iのp19 gag 抗原に対するモノクローナル抗体により染色されたので、該チャレンジ投与量は、大略、ウイルス発現細胞1.5 ×10４ に相当する。
【０２５０】
12匹のウサギを用いてＡＬＶＡＣ  ＨＴＬＶ−Ienv （ｖＣＰ２０３）の試験を行った（表21）。８匹のウサギ（グループ１およびグループ２）には、組換え体ＡＬＶＡＣ  ＨＴＬＶ−Ienv （「Ｒ−ＡＬＶＡＣ」）（ｖＣＰ２０３）を１ヶ月間隔で２回、筋肉内(I.M.)接種した。対照として残りの４匹のウサギ（グループ３）には、非組換えＡＬＶＡＣベクターを投与した。さらに、グループ１のウサギには、最初の接種から４ヶ月目および５ヶ月目に２回、各回100 μｇのバキュロウイルスで発現された（Ａｒｐ、1993）ＨＴＬＶ−Iのエンベロープ前駆体を精製してアラムに溶かした製剤を投与した（表12）。最初の接種から６ヶ月後に、12匹のウサギの全てに、５×10４ のＨＴＬＶ−ＩＢＯＵ 感染細胞をＩ．Ｖ．接種してチャレンジした。ウイルスの感染を調べるため、初代ウサギ培養からのウイルス単離またはヒトさい帯血細胞との共培養を行い、併せて、ウサギＰＢＭＣのＤＮＡのＰＣＲ分析を行った。ＰＣＲに用いたプライマー対は、Ｔ１ＥＲ：５′TATCCTTGCAGGACCATGCATC３′（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:53)およびtler：AAGCAGGAAGAGCAGGAGCG３′（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:54)であり、これによりヌクレオチド6569から6921にわたるＨＴＬＶ−Iのエンベロープ遺伝子フラグメントが増幅された。非組換えＡＬＶＡＣを接種された対照用ウサギ４匹のうち３匹が感染状態になっていた。Ｒ−ＡＬＶＡＣ（ｖＣＰ２０３）を用いる初回接種とgp46サブユニット製剤を用いる追加接種（ブースター）の組合せから成るグループ１においては、４匹のウサギのうち３匹が感染状態になったことが、ウイルス単離およびＰＣＲ分析により判定された。しかしながら、０日目および28日目において２回のＲ−ＡＬＶＡＣ（ｖＣＰ２０３）のみが投与されたグループ２においては４匹のウサギの全てが感染防御されていたことが、ウイルス単離およびＰＣＲによりＨＴＬＶ−Iを検出し得ないことから明らかにされた（表21）。ウサギ34438 はＰＣＲ陽性になったことが１度あったが、そのＰＢＭＣまたは脾臓（死後採取）のいずれからもウイルスは分離されなかった。
【０２５１】
これらのデータは、ＨＴＬＶ−Iのチャレンジに対してウサギに防御免疫応答を誘発するにはＲ−ＡＬＶＡＣ（ｖＣＰ２０３）による免疫化のみで十分であることを示している。さらに、Ｒ−ＡＬＶＡＣ（ｖＣＰ２０３）を用いてＨＴＬＶ−Iに特異的な免疫応答を当初誘発した後、ブースターとしてバキュロウイルスgp63サブユニット製剤を接種する初回／追加免疫プロトコールは感染防御を付与するよう機能しておらず、そして、このことは（必ずしも特定の理論に拘束されることを意図するものではないが）グループ１に見られるように該gp63サブユニット製剤の投与がＲ−ＡＬＶＡＣ（ｖＣＰ２０３）の感染防御能を打ち消してしまうことを示唆している。このプロトコールにおけるウサギの血清分析（図14）は、ウイルス単離およびＰＣＲのデータと矛盾していなかった。事実、ＨＴＬＶ−Iに対する血清変換（seroconversion）は、グループ１および３の感染ウサギにおいてのみ認められた（図14）。
【０２５２】
ＡＬＶＡＣ  ｅｎｖを初回投与した後、追加免疫（ブースト）を行ったプロトコールにおいてウサギの血清中の抗ＨＴＬＶ−I抗体を検出した結果を図14に示す。図14の上方に各ウサギグループに対するワクチン接種プロトコールを示す。数字は、それぞれの接種の時期（月）を示すものである。Cellular Products 社（米国ニューヨーク州Baffalo)から入手したストリップを用いてウェスタンブロット法を実施した。免疫接種から採取した血清は次のとおりである：Ａ、最初のＡＬＶＡＣブーストから１週間後；Ｂ、第２回目のタンパク質ブースト後；Ｃ、チャレンジ時；Ｄ、生きたウイルスのチャレンジから４ヶ月後。
【０２５３】
ＮＹＶＡＣ  ＨＴＬＶ−Ienv （ｖＰ１１８１）の性能を調べるために、４匹のウサギに、２回、すなわち０ヶ月目および１ヶ月目に、10７pfuのＲ−ＮＹＶＡＣ（ｖＰ１１８１）をＩ．Ｍ．投与した。対照用として別の４匹のラビットに同一の投与スケジュールで非組換えＮＹＶＡＣを投与した。第２回の接種から１ヶ月後にすべてのウサギにチャレンジを行った。５×10４ のＨＴＬＶ−ＩＢＯＵ 感染細胞にチャレンジ接触させた後のウイルス単離およびＰＣＲ分析が示したところによれば、ワクチン接種されたウサギは全て、該細胞結合性ウイルスチャレンジに対して感染防御されていたが、対照用ウサギは全て感染していた。予想されたように、対照用ウサギのみにおいて血清変換が認められた（図15）。このように、ＮＹＶＡＣ組換え体は、免疫接種後短期間に、ＨＴＬＶ−Iと接触した動物内にウイルス感染を取り除くのに充分な免疫応答を誘起させる（表23および図15参照）。
【０２５４】
ＮＹＶＡＣ  ｅｎｖが接種されチャレンジを受けたウサギの血清学的応答を図15に示す。ワクチン接種プロトコールの概略は図13の上方に示されている。数字はそれぞれの接種の時期（月）を示すものである。ウェスタンブロット法で試験された血清は次の時期に採取されたものである：Ａ、免疫接種前；Ｂ、最初のブーストから１週間後；Ｃ、チャレンジから４ヶ月後。
【０２５５】
Ｒ−ＡＬＶＡＣおよびＲ−ＮＹＶＡＣ（ｖＣＰ２０３およびｖＰ１１８１）によって付与される免疫期間を評価する１つの手段として、最初のチャレンジ後に感染防御されたと考えられるウサギの全てに対して、ＨＴＬＶ−IBOU 感染細胞による最初のチャレンジから５ヶ月後に再チャレンジを行った。この第２回目のチャレンジは、ＨＴＬＶ−IBOU 感染したウサギ34549 由来のヘパリン化血液５mlで行った（表21参照）。大まかに言えば、１から10％のウサギＰＢＭＣがＨＴＬＶ−Iにより感染されるのが一般的であり、そして該チャレンジ用血液がこの範囲にあるとすれば、２回目のチャレンジ投与量は最初のチャレンジ投与量よりも対数で１から２高いことになろう。ＨＴＬＶ−IBOU 感染したヒト細胞ではなくウサギ血液をチャレンジに用いて、ヒト細胞そのものに対する免疫応答が実験で表示されることを回避するようにした。対照として４匹の未感染ウサギを用いた。ウイルス単離およびＰＣＲ分析が示したところによれば、ワクチン接種されたウサギならびに対照用ウサギの全てが、このＨＴＬＶ−Iチャレンジ接触により感染状態になった（表21および23）。Ｃ９１／ＰＬおよび8166細胞を用いる既知のシンシチウム阻害分析法（Benson、1994）に従って、ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣ組換え体がワクチン接種されたウサギ、ならびに対照用ウサギの全てにおける中和抗体を測定した。ウイルスチャレンジ前にはどのウサギにも中和抗体は検出さらず、そして、（ウイルス単離およびＰＣＲによる判定に従い）感染状態になったウサギのみが、検出され得るＨＴＬＶ−I特異的中和抗体を示した。以上の結果は、ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣを基礎とする組換え体はレトロウイルスのチャレンジに対して防御免疫応答を効果的に誘発する能力があるという従来の知見（Tartaglia, 1992 ; Piccini, 1987 ; Tartaglia, 1993)を裏付けている。例えば、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）のｅｎｖタンパク質およびｇａｇタンパク質を発現するＡＬＶＡＣ系組換え体は、偶発的にＦｅＬＶにチャレンジ接触したネコにおいて持続的ウイルス血症が進行するのを防止することが示されている（Trataglia 、 1993）。さらに、ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ系ＨＩＶ−２組換え体をアカゲザルに使用したパイロット試験では、生のＨＩＶ−２チャレンジに対する感染防御が付与されることが示されており（Franchini)、同様に、ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ系ＨＩＶ−２組換え体が免疫接種された動物においてはＨＩＶ−２によるチャレンジ後に部分的感染防御が認められている（Abimiku)。本発明による上記の結果は、さらに、ＨＴＬＶ−Iのエンベロープ遺伝子を  発現し、おだやかに弱毒化された組換えワクシニアウイルスは、ＨＴＬＶ−I感染ヒト細胞によるチャレンジに対してウサギを感染防御できるという従来の報告（Shida 、1987）とも矛盾しない。すなわち、驚くべきことに、本発明のＨＴＬＶ組換え体において採用されたようにＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣポックスウイルスベクターを高度に弱毒化して安全性を高めても、ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ系ＨＴＬＶ組換え体効力は影響されていない。
【０２５６】
組換えｇｐ６３をブースト（追加接種）してもウサギに感染防御を生じさせないという観測結果は、（特定の説に拘泥するよう意図するものではないが）おそらく、該組み換えｇｐ６３タンパク質がプロセッシングを受け、ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣポックスウイルス感染細部によって発現されたエンベロープタンパク質とはかなり異なる形態で存在したためかも知れない。別の可能性（やはりこの考え方に拘泥するものではないが）は、非天然性（non-native）である組換えｇｐ６３免疫原トランスメンブレン内にある免疫抑制領域が、ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣベクターにより誘発された抗ＨＴＬＶ−I細胞媒介性免疫応答に対して強い阻害効果を及ぼしたということである。しかしながら、ｇｐ６３のアミノ末端側またはカルボキシ末端側の半部分を含有し組換えによる非天然性の大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）融合タンパク質を用いる従来の試験では、混合物として免疫接種した場合、カニクイザルに感染防御を付与していた（Nakamura、1987）。但し、試験対象種が異なり、また、免疫接種プロトコールとしてフロイント完全アジバンドに溶かした組換えタンパク質１〜２mgを用いた後、フロイント不完全アジバンドに溶かしたものでブーストを行っており、接種経路もＩ．Ｖ．投与が含まれている点で異なっている。したがって、免疫化の方法を直接比較することはできない。しかしながら、興味深いのは、大腸菌由来β−ｇａｌ融合タンパク質は、極めて低い抗ＨＴＬＶ−I中和抗体しか産生させなかったということである。このことは、生のＨＴＬＶ−I感染細胞のチャレンジに対する感染防御には強い抗体応答は必要でないかも知れないということを示唆しているが、必ずしも特定の説に拘泥するものではない。
【０２５７】
上で引用したようなレトロウイルスに関する多くの免疫化試験によって報告され、そして、（必ずしも特定の説に拘泥するものではないが）本明細書において強く裏付けられているように、これらの研究のすべて（引用したものおよび本発明によるもの）から認められる一般的な傾向として、レトロウイルスによるチャレンジからの感染防御は、チャレンジ時には非常に低いまたは検出され得ないようなウイルス特異的中和活性の存在下において果たされ得るということかも知れない（Clark, 1991 ; Pedersen, 1986 ; Earl, 1986 ; Miyazawa, 1992 ; Issel, 1992）；すなわち、レトロウイルスに対する感染防御には、免疫系に、当初、至適な細胞性応答を引き起こすことで充分であるということである。
【０２５８】
当初感染防御されたウサギが、感染ウサギから輸注された血液による後のチャレンジに抗しなくなるという事実は、おそらく、輸注されたチャレンジ用投与液にはウサギの感染防御能を超える10〜100 以上の感染細胞が含有されていたことに因るのであろう。しかしながら、（この説に拘泥するものではないが）ＨＴＬＶ−Iは、ウサギ内で継代されたときさらに効率的に複製し得るように適応化した可能性もある；但し、これは証明されていない単なる仮説であり、感染細胞の量が多すぎたということが事実であろう。
【０２５９】
本明細書において記述した結果から示されるように、ＮＹＶＡＣ−ＨＴＬＶおよびＡＬＶＡＣ−ＨＴＬＶ組換え体ならびにそれらから得られる生成物は、既述したような組成物や用途に用いられることができ、例えば、免疫原性、抗原性ないしはワクチン組成物として使用され、あるいは分析系、キットまたは試験系に利用される抗原や抗体を調製するのに用いれれ、さらには、例えば、ＨＴＬＶ−Iのような細胞媒介性ウイルスによる感染を防止することのできるワクチンもしくは免疫化に使用されるのに好適である。
【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【０２６０】
以上のように本発明を好ましい実施態様にそって詳述したが、本発明はそのような特定のものに限定されるものではなく、本発明の技術思想または請求の範囲から逸脱しない多くの変更が可能である。
【参考文献】
【０２６１】
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【図面の簡単な説明】
【０２６２】
【図１】チミジンキナーゼ遺伝子を欠失させ組換えワクシニアウイルスｖＰ４１０を形成するためのプラスミドｐＳＤ４６０の構築法を図示する
【図２】出血性領域を欠失させ組換えワクシニアウイルスｖＰ５５３を形成するためのプラスミドｐＳＤ４８６の構築法を図示する
【図３】ＡＴＩ領域を欠失させ組換えワクシニアウイルスｖＰ６１８を形成するためのプラスミドｐＭＰ４９４Δの構築法を図示する
【図４】血球凝集遺伝子を欠失させ組換えワクシニアウイルスｖＰ７２３を形成するためのプラスミドｐＳＤ４６７の構築法を図示する
【図５】遺伝子群［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］を欠失させ組換えワクシニアウイルスｖＰ８０４を形成するためのプラスミドｐＭＰＣＫ１Δの構築法を図示する
【図６】リボヌクレオチドレダクターゼの大サブユニットを欠失させ組換えワクシニアウイルスｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）を形成するためのプラスミドｐＳＤ５４８の構築法を図示する
【図７】ＴＫ欠失遺伝子座に狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子を挿入し組換えワクシニアウイルスｖＰ８７９を形成するためのプラスミドｐＲＷ８４２の構築法を形成する
【図８】Ｃ５オープンリーディングフレームを含有するカナリアポックスＰｖｕIIフラグメントのＤＮＡ配列（配列識別番号27）を示す
【図９Ａ】組換えカナリアポックスウイルスｖＣＰ６５（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ）の構築法を図示する
【図９Ｂ】組換えカナリアポックスウイルスｖＣＰ６５（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ）の構築法を図示する
【図１０】ＮＹＶＡＣを形成するために欠失させるオープンリーディングフレームを図示する
【図１１Ａ】同一のワクチンを接種するかまたはワクチンを替えて免疫したボランティンの中和抗体力価を表すグラフであり、ＨＤＣおよびｖＣＰ６５（10５．５ ＴＣＩＤ５０）のブースター効果を示す（なお、ワクチン接種は０日、28日および180 日目に行い、抗体力価の測定は０日、７日、28日、35日、56日、173 日、187 日および208 日目に行った）
【図１１Ｂ】同一のワクチンを接種するかまたはワクチンを替えて免疫したボランティンの中和抗体力価を表すグラフであり、ＨＤＣおよびｖＣＰ６５（10５．５ ＴＣＩＤ５０）のブースター効果を示す
【図１１Ｃ】同一のワクチンを接種するかまたはワクチンを替えて免疫したボランティンの中和抗体力価を表すグラフであり、ＨＤＣおよびｖＣＰ６５（10５．５ ＴＣＩＤ５０）のブースター効果を示す
【図１１Ｄ】同一のワクチンを接種するかまたはワクチンを替えて免疫したボランティンの中和抗体力価を表すグラフであり、ＨＤＣおよびｖＣＰ６５（10５．５ ＴＣＩＤ５０）のブースター効果を示す
【図１２】ｖＰ１１８１およびｖＣＰ２０３を調整するためのプラスミドにおける、Ｃ５フランク／Ｉ３Ｌプロモーター／ＨＴＬＶ−Ｉenv ／Ｃ５フランクの配列を示す
【図１３】ｖＰ１１８１およびｖＣＰ２０３を調整するためのプラスミドにおける、ＨＡフランク／Ｉ３Ｌプロモーター／ＨＴＬＶ−Ｉenv ／ＨＡフランクの配列を示す
【図１４】ＡＬＶＡＣ、Ｒ−ＡＬＶＡＣ（ＡＬＶＡＣ−ＨＴＬＶ；ｖＣＰ２０３）、ＮＹＶＡＣ、Ｒ−ＮＹＶＡＣ（ＮＹＶＡＣ−ＨＴＬＶ；ｖＰ１１８１）を接種し、且つ、ＨＴＬＶが感染された細胞または血液でチャレンジした動物の血清学的分析を示す
【図１５】ＡＬＶＡＣ、Ｒ−ＡＬＶＡＣ（ＡＬＶＡＣ−ＨＴＬＶ；ｖＣＰ２０３）、ＮＹＶＡＣ、Ｒ−ＮＹＶＡＣ（ＮＹＶＡＣ−ＨＴＬＶ；ｖＰ１１８１）を接種し、且つ、ＨＴＬＶが感染された細胞または血液でチャレンジした動物の血清学的分析を示す
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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