(57)【要約】【課題】  細胞に高効率に物質を導入することが可能な、リポソームに基づく物質導入担体、物質導入方法及び物質導入用キットを提供する。【解決手段】  熱変性させたｍＲＮＡとカチオン性脂質であるＤＯＴＡＰとを重炭酸緩衝ＤＭＥＭ培地に溶解し、室温で１５分間インキュベートした後、ＣａＣｌ２を加え、３７℃で３０分間インキュベートすることにより、ｍＲＮＡ導入担体であるｍＲＮＡ−リポソーム−炭酸アパタイト粒子複合体を作製する。このｍＲＮＡ−リポソーム−炭酸アパタイト粒子複合体を標的細胞と共にインキュベートすることにより、ｍＲＮＡを高効率に導入し、発現させることができる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソームにアパタイト粒子が結合していることを特徴とする物質導入担体。
【請求項２】
上記リポソームは、カチオン性リポソームであることを特徴とする請求項１記載の物質導入担体。
【請求項３】
上記アパタイト粒子は、重炭酸イオンとカルシウムイオンとから形成された炭酸アパタイト粒子であることを特徴とする請求項１記載の物質導入担体。
【請求項４】
細胞に導入する所望の物質と複合体を形成し、又は上記所望の物質が封入されていることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１記載の物質導入担体。
【請求項５】
請求項４記載の物質導入担体を標的細胞とインキュベートすることにより、上記標的細胞中に所望の物質を導入することを特徴とする物質導入方法。
【請求項６】
カルシウム塩、重炭酸塩又は無機リン酸塩、及びリポソーム材料を含むことを特徴とする物質導入用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞に薬剤、生理活性物質、或いはＤＮＡ、ＲＮＡ等を導入する際に用いて好適な物質導入担体、物質導入方法及び物質導入用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医学の分野において、患部に直接作用し、高い効果を示す副作用の少ない薬品の開発が盛んに行われている。特に、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）と呼ばれる方法は、標的細胞、標的組織に対して特異的に薬剤等の有効成分を運搬し、目的箇所で有効成分を作用させることのできる方法として注目されている。
【０００３】
また、最近の分子細胞生物学の分野においても、標的細胞へのＤＮＡ導入は、遺伝子の構造、機能或いは制御機構を解析する際に不可欠となっている。また、この技術は、医療分野で重要となるタンパク質の産業ベースでの生産、遺伝子治療、或いはＤＮＡワクチンにおいても極めて重要である。
【０００４】
細胞に薬剤、生理活性物質、ＤＮＡ等の物質を導入する方法としては種々知られているが、そのうち安全性の高い物質導入方法としてリポソーム法がある。この方法は、ウイルスベクター法のように免疫反応の危険性がなく、超音波法やエレクトロポレーション法のように細胞に障害を与えることがなく、特殊な装置も必要ないため、多くの研究者によって一般的に実施されているが、細胞への物質導入効率が低いという問題がある。そこで、細胞への物質導入効率を高めるため、リポソームの構成成分として、主成分である中性のリン脂質以外に正電荷を有するカチオン性脂質を添加し、カチオン性リポソームとする試みが行われている。
【０００５】
さらに、このカチオン性リポソームにより細胞にｍＲＮＡを導入する試みも行われている（非特許文献１，２を参照）。細胞にＤＮＡを導入する場合、そのＤＮＡがコードしているタンパク質を発現させるには、ＤＮＡが核膜を通過して核内に移行する必要があるが、in vivoでの標的細胞の殆どは核膜が消失していない非分裂細胞であるため、そのタンパク質の発現効率が低下してしまう。一方、ｍＲＮＡの場合、そのｍＲＮＡが核内に移行しなくても細胞質中でタンパク質を発現させることができるため、非分裂細胞中でタンパク質を発現させたい場合に好適である。なお、この場合、タンパク質の発現は一時的なものであるが、このような一時的な発現であっても、多くの疾患に対して、或いは癌ワクチン療法において効果的である（非特許文献３，４を参照）。
【０００６】
【非特許文献１】R.W. Malone, P.L. Flenger, I.M. Verma,“Cationic Liposome - mediated RNA transfection.”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 (1989), p.6077-6081
【非特許文献２】D. Lu, R. Benjamin, M. Kim, R.M. Conry, D.T. Curiel,“Optimization of methods to achieve mRNA - mediated transfection of tumor cells in vitro and in vivo exploying cationic liposome vectors.”, Cancer Gene Ther., 1 (1994), p.245-252
【非特許文献３】D.M. Anderson, L.L. Hall, A.R. Ayyalapu, V.R. Irion, M.H. Nantz and J.G. Hecker,“Stability of mRNA/Cationic Lipid Lipoplexes in Human and Rat Cerebrospinal fluid: Methids and Evidence for Nonviral mRNA Gene Delivery to the Central Nervous System.”, Human Gene Ther., 14 (2003), p.191-202
【非特許文献４】D.A. Mitchell, S.K. Nair,“RNA transfected dendritic cells as cancer vaccines.”, Curr. Opin. Mol. Ther., 2 (2000), p.176-181
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように、リポソームを用いた物質導入方法は、カチオン性リポソームとすることによりその導入効率が改善されているが、未だ十分とは言えず、細胞にさらに高効率に物質を導入する方法が望まれていた。
【０００８】
本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、細胞に高効率に物質を導入することが可能な、リポソームに基づく物質導入担体、物質導入方法及び物質導入用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本件発明者等は、上述した目的を達成するために、様々な観点から鋭意研究を重ねてきた。その結果、アパタイト粒子を結合させたリポソームを物質導入担体として用いることにより、細胞に高効率に物質を導入することができることを見出した。本発明は、このような知見に基づいて完成されたものである。
【００１０】
すなわち、本発明に係る物質導入担体は、リポソームにアパタイト粒子が結合していることを特徴とする。
【００１１】
また、本発明に係る物質導入方法は、細胞に導入する所望の物質と複合体を形成し、又は上記所望の物質が封入された物質導入担体を標的細胞とインキュベートすることにより、上記標的細胞中に所望の物質を導入することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明に係る物質導入用キットは、カルシウム塩、重炭酸塩又は無機リン酸塩、及びリポソーム材料を含むことを特徴とする。
【００１３】
このように、アパタイト粒子を結合させたリポソームにより、細胞に高効率に物質を導入することができる点については、これまで全く報告されたことがなく、本件発明者等によって初めて見出されたものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、アパタイト粒子を結合させたリポソームを物質導入担体として用いることにより、細胞に高効率に物質を導入することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を適用した実施の形態について、具体的な実験結果を参照しながら詳細に説明する。
【００１６】
細胞の培養
先ず、実験に用いる細胞を培養した。具体的には、２５ｃｍ２のフラスコ中に、１０％ ＦＢＳ（fetal bovine serum）、培地１ｍｌ当たり５０μｇのペニシリン及びストレプトマイシン、及び、培地１ｍｌ当たり１００μｇのネオマイシンを含有したＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle's medium）培地（Gibco BRL 社製）を加え、この培地中で３７℃、５％ ＣＯ２の条件下、ヒト子宮頸部癌細胞株ＨｅＬａと、マウス線維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３とをそれぞれ培養した。
【００１７】
また、ＩＣＲマウス（雌、５〜７週齢）の肝臓から改良in situ 潅流法（modified in situ perfusion method）により単離した初代肝細胞をコラーゲンをコートした２４穴プレートに播種し、同様にＤＭＥＭ培地中で培養した。この初代肝細胞は非分裂細胞と考えられるため、ｍＲＮＡのトランスフェクションを評価するのに好適である。
【００１８】
ｍＲＮＡの準備
次に、細胞に導入する所望の物質としてｍＲＮＡを準備した。具体的には、SP6 RiboMAXTM キット（Promega 社製）をマニュアルに従って使用し、m7G(5')pppG(5')キャップアナログ（Ambion 社製）の存在下、又は非存在下、ポリＡテール（Ａ３０）を有するルシフェラーゼＳＰ６コントロールＤＮＡ（Promega 社製）をin vitro で翻訳することにより、ルシフェラーゼ遺伝子のｍＲＮＡを得た。キャップアナログとＧＴＰとの比は５：１とし、キャップアナログを用いない場合にはＧＴＰの濃度を５ｍＭまで増加させた。in vitro で翻訳されたｍＲＮＡ（キャップ構造を有するものと有さないものとを含む）をゲル電気泳動で確認したところ、約１８００ｂｐであった。
【００１９】
その後、ｍＲＮＡを精製するため、ｍＲＮＡをRQ1 DNase1（Promega 社製）で処理した後、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールとクロロホルムとを用いてｍＲＮＡを抽出し、酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）とエタノールとを加えて沈殿させた。そして、沈殿したｍＲＮＡを７０％ エタノールで洗浄した後、水に溶解した。得られたｍＲＮＡは２６０ｎｍでの吸光度を測定することにより定量し、さらに６５℃で１５分間加熱して変性させた後、アガロースゲル電気泳動で確認した。
【００２０】
リポソームの準備
次に、実験に用いるリポソームを準備した。リポソームを形成するリポソーム材料としては、カチオン性脂質であるＤＯＴＡＰ（N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethyl ammonium chloride；Sigma 社製）を用いた。具体的には、クロロホルム中に分散したＤＯＴＡＰからクロロホルムを蒸発させ、蒸留水に分散させた後、ＤＯＴＡＰのゲル−液晶相転移温度よりも高い温度（５０℃）で１０分間撹拌した。そして、得られた乳状液に対して、Branson sonifer 250（Branson Sci.,USA 社製）を用いて温度制御下で１０分間超音波処理を施した。なお、乳状液が激しく泡立つのを防ぐため、超音波パワーは最小とした。
【００２１】
ｍＲＮＡ−リポソーム−炭酸アパタイト粒子複合体の作製
次に、細胞へのｍＲＮＡ導入に用いるｍＲＮＡ−リポソーム−炭酸アパタイト粒子複合体を作製した。また、コントロールとして、ｍＲＮＡ−炭酸アパタイト粒子複合体、及びｍＲＮＡ−リポソーム複合体も併せて作製した。
【００２２】
具体的に、ｍＲＮＡ−炭酸アパタイト粒子複合体は、３μｇの熱変性させたｍＲＮＡと４μｌの１Ｍ ＣａＣｌ２とを１ｍｌの無血清の重炭酸（ＨＣＯ３−）緩衝培地（ＤＭＥＭ培地又はＷＥ（Williams' E）培地；ｐＨ７．４）に加えて混合し、３７℃で３０分間インキュベートすることにより作製した。
【００２３】
また、ｍＲＮＡ−リポソーム複合体は、３μｇの熱変性させたｍＲＮＡと４〜１６μｇのＤＯＴＡＰとをそれぞれ１００μｌのＤＭＥＭ培地（ｐＨ７．５）中に溶解し、１５分後、ｍＲＮＡ溶液にＤＯＴＡＰを加えて室温で４０分間インキュベートすることにより作製した。最終的にＤＭＥＭ培地（ｐＨ７．５）を加えることにより全量を１ｍｌに調整した。
【００２４】
また、ｍＲＮＡ−リポソーム−炭酸アパタイト粒子複合体は、上述と同様にして熱変性させたｍＲＮＡとＤＯＴＡＰとを重炭酸緩衝ＤＭＥＭ培地（ｐＨ７．５）に溶解した溶液を準備し、室温で１５分間インキュベートした後、４ｍＭ ＣａＣｌ２を加えて全量を１ｍｌに調整し、３７℃で３０分間インキュベートすることにより作製した。
【００２５】
ｍＲＮＡ−リポソーム−炭酸アパタイト粒子複合体を用いた細胞へのｍＲＮＡ導入、及び細胞内におけるルシフェラーゼの発現
次に、ｍＲＮＡ−リポソーム−炭酸アパタイト粒子複合体と、コントロールとしてのｍＲＮＡ−炭酸アパタイト粒子複合体、ｍＲＮＡ−リポソーム複合体とを用いて、細胞内にｍＲＮＡを導入すると共に、細胞内でのルシフェラーゼの発現を確認した。
【００２６】
具体的には、先ず、ｍＲＮＡを導入する前日に、増殖過程に同調させた細胞を２４穴プレート中に１０００００個／ウェルとなるように播種し、培養した。
【００２７】
続いて、洗浄した細胞に対して、各複合体を含む溶液と終濃度１０％となるようにＦＢＳとを加え、３７℃で２〜４時間インキュベートした。そして４時間後、溶液を新しい血清培地と交換し、さらに６〜１２時間インキュベートした。その後、細胞を溶解バッファ（Promega 社製）に溶解し、光量子カウンタ（TD-20/20 Luminometer, Promega 社製）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。なお、ルシフェラーゼ活性は、細胞タンパク質１ｍｇ当たりの発光量で表現した。
【００２８】
８０％コンフルエントのＨｅＬａ細胞に対してｍＲＮＡを導入した場合のルシフェラーゼの発現状況を図１に示す。図１から分かるように、ＤＯＴＡＰが４〜１６μｇ／ｍｌの何れの濃度であっても、リポソーム−炭酸アパタイト粒子複合体（ＤＯＴＡＰ＋ＣＡ）を用いてｍＲＮＡを導入した場合の方が、リポソーム（ＤＯＴＡＰ）を用いてｍＲＮＡを導入した場合よりも、ルシフェラーゼの発現効率が約１０倍高かった。なお、図１から、ＤＯＴＡＰの至適濃度は６〜１０μｇ／ｍｌであったため、ＮＩＨ３Ｔ３細胞及び初代肝細胞に対しては、ＤＯＴＡＰの濃度を６〜１０μｇ／ｍｌとした。
【００２９】
続いて、８０％コンフルエントのＮＩＨ３Ｔ３細胞に対してｍＲＮＡを導入した場合のルシフェラーゼの発現状況を図２に示す。図２から分かるように、リポソームに炭酸アパタイト粒子を結合させている場合（＋ＣＡ）の方が、結合させていない場合（−ＣＡ）よりも、ルシフェラーゼの発現効率が９〜１４倍高かった。
【００３０】
続いて、５０％コンフルエントの初代肝細胞に対してｍＲＮＡを導入した場合のルシフェラーゼの発現状況を図３に示す。図３から分かるように、リポソーム−炭酸アパタイト粒子複合体（ＤＯＴＡＰ＋ＣＡ）を用いてｍＲＮＡを導入した場合の方が、リポソーム（ＤＯＴＡＰ）を用いてｍＲＮＡを導入した場合よりも、ルシフェラーゼの発現効率が約１０倍高かった。
【００３１】
なお、図１〜図３には示していないが、炭酸アパタイト粒子を用いてｍＲＮＡを導入した場合には、ルシフェラーゼの発現が確認されなかった。
【００３２】
血清の有無によるルシフェラーゼ発現効率への影響
次に、８μｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを用いたｍＲＮＡ−リポソーム−炭酸アパタイト粒子複合体と、８μｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを用いたコントロールとしてのｍＲＮＡ−リポソーム複合体とを用いて、細胞内にｍＲＮＡを導入する際の血清の有無による細胞内でのルシフェラーゼ発現効率への影響を確認した。
【００３３】
具体的には、先ず、ｍＲＮＡを導入する前日に、増殖過程に同調させたＨｅＬａ細胞を２４穴プレート中に１０００００個／ウェルとなるように播種し、培養した。
【００３４】
続いて、洗浄した細胞に対して各複合体を含む溶液と終濃度１０％となるようにＦＢＳとを加えたサンプルと、ＦＢＳを加えていないサンプルとを調製し、３７℃で２〜４時間インキュベートした。そして４時間後、溶液を新しい血清培地と交換し、さらに６〜１２時間インキュベートした。その後、細胞を溶解バッファ（Promega 社製）に溶解し、光量子カウンタ（TD-20/20 Luminometer, Promega 社製）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。なお、ルシフェラーゼ活性は、細胞タンパク質１ｍｇ当たりの発光量で表現した。
【００３５】
８０％コンフルエントのＨｅＬａ細胞に対してｍＲＮＡを導入した場合のルシフェラーゼの発現状況を図４に示す。図４から分かるように、血清存在下（Ｓ＋）でｍＲＮＡを導入した場合であっても、血清非存在下（Ｓ−）でｍＲＮＡを導入した場合と比較してルシフェラーゼの発現効率は低下しておらず、十分な発現効率を示している。
【００３６】
以上、具体的な実験結果を参照しながら説明したように、ｍＲＮＡ−リポソーム−炭酸アパタイト粒子複合体を用いることにより、分裂細胞のみならず非分裂細胞に対しても高効率にｍＲＮＡを導入できる。特に、このｍＲＮＡの導入効率は血清存在下においても低下しない。また、この物質導入方法を応用することで、カルシウム塩、重炭酸塩、及びリポソーム材料を含む物質導入用キットを実現することができる。
【００３７】
ここで、リポソームに炭酸アパタイト粒子を結合させることでｍＲＮＡの発現効率が上昇した第１の理由としては、リポソームに炭酸アパタイト粒子を結合させることにより、細胞表面での複合体の濃度が上昇し、その結果、ｍＲＮＡの細胞内への取り込みが増加したためと推測される。
【００３８】
この現象を確認するため、エチジウムモノアジド（ＥＭＡ）でラベルしたｍＲＮＡをＨｅＬａ細胞に導入し、４時間後に蛍光顕微鏡で観察したところ、高レベルのｍＲＮＡが細胞に取り込まれていた。さらに、ｍＲＮＡ−リポソーム−炭酸アパタイト粒子複合体を用いた場合には２時間のインキュベーションで導入効率が最大に達するのに対して、ｍＲＮＡ−リポソーム複合体を用いた場合には４時間のインキュベーションが必要であった。このことからも、アパタイト粒子の存在によって複合体の取り込みが促進していることが分かる。
【００３９】
また、ｍＲＮＡの発現効率が上昇した第２の理由としては、炭酸アパタイト粒子はｐＨ感受性の無機結晶でありエンドソームを中和する能力があるため、エンドソーム内のｐＨ変化により、ｍＲＮＡが速やかにエンドソームから細胞質中に放出されるためと推測される。
【００４０】
なお、本発明は上述した実施の形態のみに限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能であることは勿論である。
【００４１】
例えば、上述した実施の形態では炭酸アパタイト粒子を用いたが、リン酸アパタイト粒子を用いるようにしても構わない。この場合、重炭酸緩衝培地の代わりにリン酸緩衝培地を用いればよく、物質導入用キットには重炭酸塩の代わりに無機リン酸塩を含めればよい。
【００４２】
また、上述した実施の形態では、ｍＲＮＡとの複合体を作製して細胞にｍＲＮＡを導入するものとして説明したが、薬剤、生理活性物質、ＤＮＡ等との複合体を作製して細胞にこれらの物質を導入するようにしても構わない。
【００４３】
また、上述した実施の形態では、複合体を作製するものとして説明したが、炭酸アパタイト粒子を結合させたリポソーム内にｍＲＮＡや、薬剤、生理活性物質、ＤＮＡ等を封入するようにしても構わない。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ＨｅＬａ細胞に対してｍＲＮＡを導入した場合のルシフェラーゼの発現状況を示す図である。
【図２】ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対してｍＲＮＡを導入した場合のルシフェラーゼの発現状況を示す図である。
【図３】初代肝細胞に対してｍＲＮＡを導入した場合のルシフェラーゼの発現状況を示す図である。
【図４】ＨｅＬａ細胞に対して血清存在下、又は非存在下でｍＲＮＡを導入した場合のルシフェラーゼの発現状況を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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