(57)【要約】      （修正有）【課題】新規なオオムギの条性決定遺伝子の提供ならびに該遺伝子を利用したオオムギの条性の改変方法の提供。【解決手段】オオムギの条性や穂の形態の決定に関与する遺伝子の染色体上の位置および遺伝子の構造が提供された。Vrs1遺伝子をオオムギに導入し、発現を制御することによって、オオムギの条性や穂の形態を改変し得る可能性が見出された。また、オオムギの赤かび病抵抗性を増加させうる可能性が見出された。これにより、オオムギの条性や穂の形態を効率的に改変することによって、望みの用途に見合う形質を有するオオムギの作出が可能となった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のDNA；
（ａ）配列番号：3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
（ｂ）配列番号：1または2に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
（ｃ）配列番号：3に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が人工的に置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
（ｄ）配列番号：1または2に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオオムギ由来のDNA、
（ｅ）配列番号：1または2に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオオムギ由来のDNAであって、配列番号：3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項２】
以下（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のDNA；
（ａ）請求項１に記載のDNAの転写産物と相補的なRNAを発現するDNA、
（ｂ）請求項１に記載のDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAを発現するDNA、
（ｃ）請求項１に記載のDNAの発現を共抑制効果により阻害するRNAを発現するDNA、
（ｄ）請求項１に記載のDNAの転写産物を特異的に切断するRNAi活性を有するRNAを発現するDNA。
【請求項３】
請求項１または２に記載のDNAを含むベクター。
【請求項４】
請求項１または２に記載のDNAを発現可能に保持する形質転換細胞。
【請求項５】
請求項１または２に記載のDNAが導入された形質転換オオムギ細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換オオムギ細胞を含む形質転換オオムギ。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換オオムギの子孫またはクローンである、形質転換オオムギ。
【請求項８】
請求項６または７に記載の形質転換オオムギの繁殖材料。
【請求項９】
請求項６または７に記載の形質転換オオムギの製造方法であって、請求項１または２に記載のDNAをオオムギ細胞に導入し、該オオムギ細胞からオオムギを再生させる工程を含む方法。
【請求項１０】
請求項１（ａ）、（ｂ）または（ｅ）に記載のDNAを二条性ではないオオムギの細胞内で発現させる工程を含む、オオムギの条性または穂の形態を改変する方法。
【請求項１１】
請求項１（ｃ）または（ｄ）に記載のDNAを二条性オオムギの細胞内で発現させる工程を含む、オオムギの条性または穂の形態を改変する方法。
【請求項１２】
請求項２に記載のDNAを二条性オオムギの細胞内で発現させる工程を含む、オオムギの条性または穂の形態を改変する方法。
【請求項１３】
請求項１または２に記載のDNAをオオムギの細胞内で発現させる工程を含む、オオムギに赤かび病抵抗性を付与する方法。
【請求項１４】
請求項１または２に記載のDNA、または請求項３に記載のベクターのいずれか１つを含む、オオムギの赤かび病抵抗性を増加させる薬剤。
【請求項１５】
請求項１に記載のDNAの部分配列からなるDNA。
【請求項１６】
配列番号：4〜29のいずれかに記載の塩基配列からなるDNA。
【請求項１７】
請求項１に記載のDNAの全部または一部を増幅するプライマーセット。
【請求項１８】
以下（ａ）〜（ｒ）のいずれかに示す、少なくとも１つのプライマーセット；
（ａ）配列番号：30に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：31に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｂ）配列番号：32に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：33に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｃ）配列番号：34に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：35に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｄ）配列番号：36に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：37に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｅ）配列番号：38に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：39に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｆ）配列番号：40に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：41に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｇ）配列番号：42に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：43に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｈ）配列番号：44に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：45に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｉ）配列番号：46に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：47に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｊ）配列番号：48に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：49に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｋ）配列番号：50に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：51に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｌ）配列番号：52に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：53に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｍ）配列番号：54に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：55に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｎ）配列番号：56に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：57に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｏ）配列番号：58に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：59に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｐ）配列番号：60に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：61に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｑ）配列番号：62に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：63に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｒ）配列番号：64に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：65に記載の塩基配列からなるDNA。
【請求項１９】
請求項１に記載のDNAまたはその相補配列に相補的な少なくとも１５の連続する塩基を含むDNA。
【請求項２０】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む方法であって、分子量または塩基配列が一致するときに、オオムギが二条性であると判定する方法；
（ａ）オオムギからDNA試料を調製する工程、
（ｂ）該DNA試料から請求項１に記載のDNA領域を増幅する工程、
（ｃ）増幅したDNA断片の分子量または塩基配列を、請求項１（ａ）、（ｂ）または（ｅ）に記載のDNAのそれと比較する工程。
【請求項２１】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が一致するときに、オオムギが二条性であると判定する方法；
（ａ）オオムギからDNA試料を調製する工程、
（ｂ）該DNA試料から請求項１に記載のDNA領域を増幅する工程、
（ｃ）増幅した二本鎖のDNAを非変性ゲル上で分離する工程、
（ｄ）分離した二本鎖DNAのゲル上での移動度を、請求項１（ａ）、（ｂ）または（ｅ）に記載のDNAのそれと比較する工程。
【請求項２２】
以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が一致するときに、オオムギが二条性であると判定する方法；
（ａ）オオムギからDNA試料を調製する工程、
（ｂ）該DNA試料から請求項１に記載のDNA領域を増幅する工程、
（ｃ）増幅したDNAを一本鎖DNAに解離させる工程、
（ｄ）解離させた一本鎖DNAを非変性ゲル上で分離する工程、
（ｅ）分離した一本鎖DNAのゲル上での移動度を、請求項１（ａ）、（ｂ）または（ｅ）に記載のDNAのそれと比較する工程。
【請求項２３】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が一致するときに、オオムギが二条性であると判定する方法；
（ａ）オオムギからDNA試料を調製する工程、
（ｂ）該DNA試料から請求項１に記載のDNA領域を増幅する工程、
（ｃ）増幅したDNAを、DNA変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程、
（ｄ）分離したDNAのゲル上での移動度と、請求項１（ａ）、（ｂ）または（ｅ）に記載のDNAのそれと比較する工程。
【請求項２４】
以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、二条性オオムギを選抜する方法；
（ａ）二条性オオムギと、二条性ではないまたは条性が不明であるオオムギとが交配されたオオムギを作製する工程、
（ｂ）請求項２０〜２３のいずれかに記載の方法により、工程（ａ）で作製されたオオムギが二条性であるか否かを判定する工程。
【請求項２５】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、被検化合物のスクリーニング方法；
（ａ）請求項１に記載のDNAの転写産物に被検化合物を接触させる工程、
（ｂ）請求項１に記載のDNAの転写産物と被検化合物の結合を検出する工程、
（ｃ）請求項１に記載のDNAの転写産物と結合する被検化合物を選択する工程。
【請求項２６】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、被検化合物のスクリーニング方法；
（ａ）オオムギから採取した細胞に、被検化合物を接触させる工程、
（ｂ）請求項１に記載のDNAの転写産物の発現レベルを測定する工程、
（ｃ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、上記転写産物の発現レベルを変化させた被検化合物を選択する工程。
【請求項２７】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、被検化合物のスクリーニング方法；
（ａ）請求項１に記載のDNAのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程、
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程、
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（ｄ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを変化させた被検化合物を選択する工程。
【請求項２８】
被検ゲノム断片が請求項１に記載のDNAによりコードされるタンパク質の標的配列を有するか否かを判定する方法であって、以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含み、請求項１に記載のDNAによりコードされるタンパク質が、被検ゲノム断片と機能的に結合したレポーター遺伝子を発現させた場合に、該被検ゲノム断片が請求項１に記載のDNAによりコードされるタンパク質の標的配列を有するゲノム断片であると判定されることを特徴とする方法；
（ａ）細胞または細胞抽出液において、請求項１に記載のDNAによりコードされるタンパク質と、ゲノム断片と機能的に結合したレポーター遺伝子を有するDNAを接触させる工程、
（ｂ）レポーター遺伝子の発現の有無を測定する工程。
【請求項２９】
被検ゲノム断片が請求項１に記載のDNAによりコードされるタンパク質によって発現制御される遺伝子を有するか否かを判定する方法であって、以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含み、請求項１に記載のDNAによりコードされるタンパク質が被検ゲノム断片上に存在する遺伝子を発現させた場合に、該被検ゲノム断片が請求項１に記載のDNAによりコードされるタンパク質によって発現制御される遺伝子を有すると判定されることを特徴とする方法；
（ａ）細胞または細胞抽出液において、請求項１に記載のDNAによりコードされるタンパク質と、被検ゲノム断片を含むDNAを接触させる工程、
（ｂ）被検ゲノム断片からの遺伝子発現の有無を測定する工程。
【請求項３０】
請求項２５〜２９のいずれかに記載のスクリーニング方法に用いるためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オオムギ条性遺伝子Vrs1およびその変異体、ならびに該遺伝子を利用したオオムギの条性および穂の形態を改変する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界の重要穀物であるイネやコムギ、オオムギ、トウモロコシなどはいずれも、その種子（胚及び胚乳）を食用とする作物である。このうちオオムギには、二条性と六条性の品種が存在する（図１）。一つの穂軸に対し3個の一花小穂を形成し、この3個の小穂が全て種子を形成するものを六条オオムギ、中央の1個の小穂のみが種子を形成するものを二条オオムギと総称されている。六条性と二条性の違い（以下「条性」）は粒数、粒形、粒大の決定に大きな作用を及ぼすため、収量を直接的に左右する。また条性は麦芽生産、醸造、精麦、飼料などオオムギの利用形態を左右する重要形質である。さらに、条性は赤かび病抵抗性と深く関連することが遺伝的研究により明らかにされている。
【０００３】
六条性は単一劣性遺伝子vrs1に支配される形質で、二条オオムギの優性遺伝子Vrs1は側列小穂の発達を抑制する事が明らかになっている（図１）。しかしその遺伝子産物については全く明らかにされていない。また異なる穀物種間においては、ゲノム構造（すなわち相同な遺伝子の並び）は高度に保存されているものの、条性遺伝子と相同的な遺伝子の存在は知られておらず、存在するとすればどのような機能を持つのかも未知であった。
尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【非特許文献１】Congfen He, et.al. Genome 47: 1122-1129 （2004）
【非特許文献２】Komatsuda T, K. Tanno (2004) Comparative high resolution map of the six-rowed spike locus 1 (vrs1) in several populations of barley, Hordeum vulgare L. Hereditas 141: 68-73)
【特許文献１】特開2004-313062
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明はこのような状況を鑑みてなされたものであり、本発明が解決しようとする課題は、オオムギの条性遺伝子を単離・同定すること、ならびに該遺伝子を利用したオオムギの条性および穂の形態を改変する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、オオムギの条性決定に関する遺伝子を提供する。六条性は単一劣性遺伝子vrs1に支配される形質で、二条オオムギの優性遺伝子Vrs1は側列小穂の発達を抑制することが知られている。しかしその遺伝子産物については全く明らかにされていなかった。本発明者らは、その存在領域を解明し、単一の遺伝子として単離することを試みた。
【０００６】
本発明者らはまず、条性遺伝子vrs1の連鎖地図の作成を行った。そして、目的遺伝子と連鎖するPCRマーカーを用いたBACライブラリーのスクリーニング、PCRマーカーを用いた染色体歩行によって、条性遺伝子領域をカバーする整列化BACを作成した。結果、条性遺伝子vrs1は、AFLP1からMO53F18-T7に渡るマーカーと連鎖している可能性が高いことが突き止められた。
【０００７】
次に本発明者らは、二条性品種の突然変異体を利用し、条性を支配する遺伝子候補領域の欠損を調べた。条性を支配する遺伝子候補領域の塩基配列を、原品種と突然変異体の間で比較したところ、原品種には塩基配列の変異が全く認められなかったのに対し、突然変異体ではアミノ酸非同義置換や終止コドン形成をもたらす塩基置換が多数認められた。このことから、候補領域が目的遺伝子であることが証明された。すなわち、本発明は、オオムギの条性決定に関与する遺伝子に関し、具体的には以下の発明を提供するものである。
〔１〕以下（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のDNA；
（ａ）配列番号：3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
（ｂ）配列番号：1または2に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
（ｃ）配列番号：3に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が人工的に置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
（ｄ）配列番号：1または2に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオオムギ由来のDNA、
（ｅ）配列番号：1または2に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオオムギ由来のDNAであって、配列番号：3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNA。
〔２〕以下（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のDNA；
（ａ）〔１〕に記載のDNAの転写産物と相補的なRNAを発現するDNA、
（ｂ）〔１〕に記載のDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAを発現するDNA、
（ｃ）〔１〕に記載のDNAの発現を共抑制効果により阻害するRNAを発現するDNA、
（ｄ）〔１〕に記載のDNAの転写産物を特異的に切断するRNAi活性を有するRNAを発現するDNA。
〔３〕〔１〕または〔２〕に記載のDNAを含むベクター。
〔４〕〔１〕または〔２〕に記載のDNAを発現可能に保持する形質転換細胞。
〔５〕〔１〕または〔２〕に記載のDNAが導入された形質転換オオムギ細胞。
〔６〕〔５〕に記載の形質転換オオムギ細胞を含む形質転換オオムギ。
〔７〕〔６〕に記載の形質転換オオムギの子孫またはクローンである、形質転換オオムギ。
〔８〕〔６〕または〔７〕に記載の形質転換オオムギの繁殖材料。
〔９〕〔６〕または〔７〕に記載の形質転換オオムギの製造方法であって、〔１〕または〔２〕に記載のDNAをオオムギ細胞に導入し、該オオムギ細胞からオオムギを再生させる工程を含む方法。
〔１０〕〔１〕（ａ）、（ｂ）または（ｅ）に記載のDNAを二条性ではないオオムギの細胞内で発現させる工程を含む、オオムギの条性または穂の形態を改変する方法。
〔１１〕〔１〕（ｃ）または（ｄ）に記載のDNAを二条性オオムギの細胞内で発現させる工程を含む、オオムギの条性または穂の形態を改変する方法。
〔１２〕〔２〕に記載のDNAを二条性オオムギの細胞内で発現させる工程を含む、オオムギの条性または穂の形態を改変する方法。
〔１３〕〔１〕または〔２〕に記載のDNAをオオムギの細胞内で発現させる工程を含む、オオムギに赤かび病抵抗性を付与する方法。
〔１４〕〔１〕または〔２〕に記載のDNA、または〔３〕に記載のベクターのいずれか１つを含む、オオムギの赤かび病抵抗性を増加させる薬剤。
〔１５〕〔１〕に記載のDNAの部分配列からなるDNA。
〔１６〕配列番号：4〜29のいずれかに記載の塩基配列からなるDNA。
〔１７〕〔１〕に記載のDNAの全部または一部を増幅するプライマーセット。
〔１８〕以下（ａ）〜（ｒ）のいずれかに示す、少なくとも１つのプライマーセット；
（ａ）配列番号：30に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：31に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｂ）配列番号：32に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：33に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｃ）配列番号：34に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：35に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｄ）配列番号：36に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：37に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｅ）配列番号：38に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：39に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｆ）配列番号：40に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：41に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｇ）配列番号：42に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：43に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｈ）配列番号：44に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：45に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｉ）配列番号：46に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：47に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｊ）配列番号：48に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：49に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｋ）配列番号：50に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：51に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｌ）配列番号：52に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：53に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｍ）配列番号：54に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：55に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｎ）配列番号：56に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：57に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｏ）配列番号：58に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：59に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｐ）配列番号：60に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：61に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｑ）配列番号：62に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：63に記載の塩基配列からなるDNA、
（ｒ）配列番号：64に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：65に記載の塩基配列からなるDNA。
〔１９〕〔１〕に記載のDNAまたはその相補配列に相補的な少なくとも１５の連続する塩基を含むDNA。
〔２０〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む方法であって、分子量または塩基配列が一致するときに、オオムギが二条性であると判定する方法；
（ａ）オオムギからDNA試料を調製する工程、
（ｂ）該DNA試料から〔１〕に記載のDNA領域を増幅する工程、
（ｃ）増幅したDNA断片の分子量または塩基配列を、〔１〕（ａ）、（ｂ）または（ｅ）に記載のDNAのそれと比較する工程。
〔２１〕以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が一致するときに、オオムギが二条性であると判定する方法；
（ａ）オオムギからDNA試料を調製する工程、
（ｂ）該DNA試料から〔１〕に記載のDNA領域を増幅する工程、
（ｃ）増幅した二本鎖のDNAを非変性ゲル上で分離する工程、
（ｄ）分離した二本鎖DNAのゲル上での移動度を、〔１〕（ａ）、（ｂ）または（ｅ）に記載のDNAのそれと比較する工程。
〔２２〕以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が一致するときに、オオムギが二条性であると判定する方法；
（ａ）オオムギからDNA試料を調製する工程、
（ｂ）該DNA試料から〔１〕に記載のDNA領域を増幅する工程、
（ｃ）増幅したDNAを一本鎖DNAに解離させる工程、
（ｄ）解離させた一本鎖DNAを非変性ゲル上で分離する工程、
（ｅ）分離した一本鎖DNAのゲル上での移動度を、〔１〕（ａ）、（ｂ）または（ｅ）に記載のDNAのそれと比較する工程。
〔２３〕以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が一致するときに、オオムギが二条性であると判定する方法；
（ａ）オオムギからDNA試料を調製する工程、
（ｂ）該DNA試料から〔１〕に記載のDNA領域を増幅する工程、
（ｃ）増幅したDNAを、DNA変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程、
（ｄ）分離したDNAのゲル上での移動度と、〔１〕（ａ）、（ｂ）または（ｅ）に記載のDNAのそれと比較する工程。
〔２４〕以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、二条性オオムギを選抜する方法；
（ａ）二条性オオムギと、二条性ではないまたは条性が不明であるオオムギとが交配されたオオムギを作製する工程、
（ｂ）〔２０〕〜〔２３〕のいずれかに記載の方法により、工程（ａ）で作製されたオオムギが二条性であるか否かを判定する工程。
〔２５〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、被検化合物のスクリーニング方法；
（ａ）〔１〕に記載のDNAの転写産物に被検化合物を接触させる工程、
（ｂ）〔１〕に記載のDNAの転写産物と被検化合物の結合を検出する工程、
（ｃ）〔１〕に記載のDNAの転写産物と結合する被検化合物を選択する工程。
〔２６〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、被検化合物のスクリーニング方法；
（ａ）オオムギから採取した細胞に、被検化合物を接触させる工程、
（ｂ）〔１〕に記載のDNAの転写産物の発現レベルを測定する工程、
（ｃ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、上記転写産物の発現レベルを変化させた被検化合物を選択する工程。
〔２７〕以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、被検化合物のスクリーニング方法；
（ａ）〔１〕に記載のDNAのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程、
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程、
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（ｄ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを変化させた被検化合物を選択する工程。
〔２８〕被検ゲノム断片が〔１〕に記載のDNAによりコードされるタンパク質の標的配列を有するか否かを判定する方法であって、以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含み、〔１〕に記載のDNAによりコードされるタンパク質が、被検ゲノム断片と機能的に結合したレポーター遺伝子を発現させた場合に、該被検ゲノム断片が〔１〕に記載のDNAによりコードされるタンパク質の標的配列を有するゲノム断片であると判定されることを特徴とする方法；
（ａ）細胞または細胞抽出液において、〔１〕に記載のDNAによりコードされるタンパク質と、ゲノム断片と機能的に結合したレポーター遺伝子を有するDNAを接触させる工程、
（ｂ）レポーター遺伝子の発現の有無を測定する工程。
〔２９〕被検ゲノム断片が〔１〕に記載のDNAによりコードされるタンパク質によって発現制御される遺伝子を有するか否かを判定する方法であって、以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含み、〔１〕に記載のDNAによりコードされるタンパク質が被検ゲノム断片上に存在する遺伝子を発現させた場合に、該被検ゲノム断片が〔１〕に記載のDNAによりコードされるタンパク質によって発現制御される遺伝子を有すると判定されることを特徴とする方法；
（ａ）細胞または細胞抽出液において、〔１〕に記載のDNAによりコードされるタンパク質と、被検ゲノム断片を含むDNAを接触させる工程、
（ｂ）被検ゲノム断片からの遺伝子発現の有無を測定する工程。
〔３０〕〔２５〕〜〔２９〕のいずれかに記載のスクリーニング方法に用いるためのキット。
【発明の効果】
【０００８】
オオムギには二条性品種と六条性品種が知られている。そして条性は、粒数、粒形、粒大の決定に大きな作用を及ぼし、収量を直接的に左右する。例えば、六条オオムギは二条オオムギに比べて粒数が３倍になるため、高収量である。従って、六条オオムギは飼料などに有用である。一方、二条オオムギは粒大の「揃い」がよく、従って麦芽製造における発芽時均一性に優れる。今日二条オオムギは、その製造効率の良さから、日本やヨーロッパにおいてはもっぱらビール醸造に有用である。このように、六条オオムギと二条オオムギは、それぞれの適正や経済性、入手の困難性等に応じて、有用な用途を有している。
【０００９】
本発明によって、オオムギの条性や穂の形態の決定に関与する遺伝子の染色体上の位置および遺伝子の構造が提供された。本発明において提供されるVrs1遺伝子またはその変異体をオオムギに導入し、発現を制御することによって、オオムギの条性や穂の形態を改変し得る可能性が見出された。すなわち、本発明のVrs1遺伝子またはその変異体を利用し穂の主列・側列のバランスをアレンジすることにより、目的にあった形を作り出すことが可能となった。また、オオムギの赤かび病抵抗性を増加させうる可能性が見出された。
【００１０】
オオムギは生け花として流通している。従って、二条性に改変されたオオムギ、六条性に改変されたオオムギ、二条性と六条性の中間性に改変されたオオムギは、生け花に供することが可能であり、観賞用の植物として有用である。特に、二条性と六条性の中間性の形質に改変されたオオムギは変種としての価値が高く、有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、オオムギに二条性の形質を付与するVrs1遺伝子、二条性の形質を付与するVrs1遺伝子の変異体、六条性の形質を付与するVrs1遺伝子の変異体、および、二条性と六条性の中間性の形質を付与するVrs1遺伝子の変異体を提供する（表１）。
【００１２】
【表１】
2007159479.tif 000002
【００１３】
本発明のVrs1遺伝子には、
（ａ）配列番号：3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
（ｂ）配列番号：1または2に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
が含まれる。
また、オオムギに二条性の形質を付与するVrs1遺伝子の変異体（以下、本明細書において、「二条性であるVrs1遺伝子の変異体」と表記する場合あり）には、
（ｅ）配列番号：1または2に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオオムギ由来のDNAであって、配列番号：3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNA、
が含まれる。
【００１４】
本発明において二条性の形質（以下、本明細書において、単に「二条性」と表記する場合あり）とは、側列小穂が発達しない穂を持つ穂の形質をいう。具体例として図３−１の品種Bonus、Foma、Kristina（いずれも配列番号：１に記載の塩基配列を含む）が該当する。
【００１５】
本発明においては、遺伝子が配列番号：1または2に記載の塩基配列と完全には同一ではない塩基配列を有する場合でも、同一ではない程度がその遺伝子の機能を大きく変えるものでない場合には、該遺伝子が二条性の形質をあらわす場合がある。例えば、このような形質をあらわすオオムギの一例としては、表3および図4に記載のDebre ZeitやOUH602が挙げられる。Debre Zeitが有する条性決定遺伝子は、配列番号：1に記載の塩基配列において、694番目のAがGに、873番目のTがGに、1446番目のAがGに変異している。このように本発明においては、配列番号：1または2に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオオムギ由来のDNAであって、配列番号：3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAもまた、二条性の形質に関与する遺伝子に含まれる。なお本発明においては、上記「同等の機能」には、Vrs1と同一の機能に加えてVrs1遺伝子の類似の機能も含まれる。
【００１６】
また本発明は、オオムギに六条性の形質を付与するVrs1遺伝子の変異体（以下、本明細書において、「六条性であるVrs1遺伝子の変異体」と表記する場合あり）を提供する。このような変異体としては、
（ｃ）配列番号：3に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が人工的に置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
（ｄ）配列番号：1または2に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオオムギ由来のDNA、
が含まれる。
【００１７】
上記オオムギに六条性の形質を付与するVrs1遺伝子の変異体としては、表2および図4において、例えばhex-v.3、hex-v.10、hex-v.11、hex-v.18、hex-v.35、hex-v.41として示されているように、配列番号：1の塩基配列において、1番目の塩基から2147番目の塩基が欠失した塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。また、図4のhex-vとして記載された32個の突然変異系統やNatsudaikon Mugi、Morex、AZ、Soren Oomugi 19329、Caveda、Dissa、Hayakiso 2、Arlington Awnless、などの品種も、六条性の形質を有する。hex-vで始まる変異体を有するオオムギは、芒伸長、内頴外頴肥大、種子稔実等いずれの形質も発達程度が高い傾向を有する。これらの変異体においては、それぞれのDNAの変異がアミノ酸配列の変化にも反映され、六条性の形質への変化をもたらす。本発明において六条性の形質（以下、本明細書において、単に「六条性」と表記する場合あり）とは、側列小穂を主列小穂並に発達させた穂の形質をいう。
【００１８】
また本発明は、オオムギに二条性と六条性の中間性の形質を付与するVrs1遺伝子の変異体（以下、本明細書において、「中間性であるVrs1遺伝子の変異体」と表記する場合あり）提供する。このような変異体としては、
（ｃ）配列番号：3に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が人工的に置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
（ｄ）配列番号：1または2に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオオムギ由来のDNA、
が含まれる。
【００１９】
上記オオムギに二条性と六条性の中間性の形質を付与するVrs1の変異体としては、表2および図4に示されている変異体のうちInt-dとして記載された15個の突然変異系統が挙げられる。Int-dで始まる変異体は、芒伸長、内頴外頴肥大、種子稔実等いずれの形質も発達程度が低い傾向を有する。また、図4に記載されたPI284755、OUH743などの自然に存在する系統もまた、オオムギに二条性と六条性の中間性の形質を付与するVrs1の変異体に該当する。これらの変異体においては、それぞれのDNA変異がアミノ酸配列の変化にも反映され、条性の変化をもたらす。本発明において二条性と六条性の中間性の形質（以下、本明細書において、単に「中間性」と表記する場合あり）とは、側列小穂を部分的に発達させて二条性と六条性の中間性の穂を持つ形質をいう。
【００２０】
二条性と六条性の中間性の形質とは、さらに具体的には以下の形質を含む。すなわち、二条性オオムギにおいては側列小穂が芒が全く伸長しないのに対し、二条性から作出された変異体（二条性と六条性の中間性の形質を有する変異体）においては、側列外頴の芒が伸長する。この伸長の程度は、先端がトゲのようにとんがるだけでほとんど伸長しないものから、よく伸長して主列と同等程度にまで達し、穂の外見上通常の六条性品種と遜色ないものまで、いわば連続的な変異を示す。また、二条性の側列小穂の内頴外頴は肥大せず主列小穂に比べて著しく小さいのに対して、二条性から作出された変異体（二条性と六条性の中間性の形質を有する変異体）の小穂の内頴外頴が肥大する。この肥大の程度は、ごくわずかなもの、すなわち二条性にきわめて近いものから、よく発達して通常の六条性品種と遜色ないものまで、いわば連続的な変異を示す。二条性品種の側列小穂は全く種子稔性を持たないのに対し、二条性から作出された変異体（二条性と六条性の中間性の形質を有する変異体）の側列小穂は、全く種子稔性を持たないものから数十パーセントの種子が稔実するものまで、連続的な変異を示す。このように、変異による影響を受ける代表的な形質としては、側列小穂における芒伸長、内頴外頴肥大、種子稔実などが挙げられる。しかし本願の条性遺伝子は側列小穂の微細な器官のサイズを全体的に制御するため、変異によって影響を受ける形質はこれらに限られない。
【００２１】
なお、本明細書においては、二条性であるVrs1遺伝子の変異体、六条性であるVrs1遺伝子の変異体、二条性と六条性の中間性であるVrs1遺伝子の変異体を「Vrs1遺伝子の変異体」と総称する。
【００２２】
【表２】
2007159479.tif 000003
【００２３】
【表３】
2007159479.tif 000004
【００２４】
表2の例えばMutant lnt-d.12において、Event at DNAが「1049 G to A」とあるのは、「lnt-d.12という変異体では、配列番号：1の塩基配列の1049番目の塩基がGからAに置換されている」ことを意味する。ここで、配列番号：1の塩基配列の1049番目の塩基は、配列番号：2の塩基配列の406番目の塩基に相当する。また、この塩基の変異の結果、配列番号：3のアミノ酸配列の85番目のArgがHisに置換される。同様に、表2の例えばMutant hex-v.42のEvent at DNAが「1115 G to T」とあるのは、「hex-v.42という変異体では、配列番号：1の塩基配列の1115番目の塩基配列がGからTに置換されている」ことを意味する。ここで、配列番号：1の塩基配列の1115番目の塩基は、配列番号：2の塩基配列の472番目の塩基に相当する。また、この塩基の変異の結果、配列番号：3のアミノ酸配列の107番目のArgがLeuに置換される。表3についても、表2と同様に、各変異体について、配列番号：1の塩基配列における変異部位とそれに対応するアミノ酸の置換が記載されている。当業者であれば、これらの表を適宜参酌することによって、望みの変異体を作出することが可能である。なお、本発明のVrs1遺伝子の変異体は、Vrs1遺伝子において塩基の欠失、フレームシフト、終止コドンの出現等様々な配列変化が生じた変異体である。
【００２５】
オオムギは生け花として流通している。従って、二条性に改変されたオオムギ、六条性に改変されたオオムギ、二条性と六条性の中間性に改変されたオオムギは生け花に供することが可能であり、観賞用の植物として有用である。特に、二条性と六条性の中間性に改変されたオオムギは変種としての価値が高い。本発明のVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体を利用し穂の主列・側列のバランスをアレンジすることによって、目的にあった形を作り出すことが可能である。
【００２６】
本発明の「Vrs1遺伝子」は、「Vrs1タンパク質」をコードしうるものであれば、その形態に特に制限はなく、「Vrs1遺伝子」にはcDNAの他、ゲノムDNA、化学合成DNAなども含まれる。またVrs1遺伝子は、Vrs1タンパク質をコードするものであれば、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するDNAが含まれる。一方、本発明のVrs1遺伝子の変異体もまた、タンパク質をコードしうるものであれば、その形態に特に制限はなく、cDNAの他、ゲノムDNA、化学合成DNAなども含まれる。
【００２７】
ゲノムDNAおよびcDNAの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムDNAは、例えば、植物からゲノムDNAを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、BAC、PACなどが利用できる）を作成し、これを展開して、Vrs1遺伝子（例えば、配列番号：1または2に記載のDNA）またはVrs1遺伝子の変異体を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体に特異的なプライマーを作成し、これを利用したPCRを行うことによって調製することも可能である。また、cDNAは、例えば、植物から抽出したmRNAを基にcDNAを合成し、これをλZAP等のベクターに挿入してcDNAライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、PCRを行うことにより調製することが可能である。
【００２８】
Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体を単離するための当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Southern, E. M., Journal of Molecular Biology, Vol. 98, 503, 1975）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Saiki, R. K., et al. Science, vol. 230, 1350-1354, 1985, Saiki, R. K. et al. Science, vol.239, 487-491,1988）が挙げられる。即ち、当業者にとっては、例えば、配列番号：1または2に記載の塩基配列を含むDNAもしくはその一部をプローブとして、また配列番号：1または2に記載の塩基配列を含むDNAに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、オオムギからVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体を単離することは通常行いうることである。
【００２９】
このようなVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体をコードするDNAを単離するためには、通常ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、6M 尿素、0.4%SDS、0.5 x SSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を例示できる。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M 尿素、0.4%SDS、0.1 x SSCの条件を用いれば、より相同性の高いDNAの単離を期待することができる。単離したDNAの配列の決定は、公知の方法で行うことができる。単離されたDNAの相同性は、アミノ酸配列全体で、少なくとも50％以上、さらに好ましくは70％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95%、96%、97%、98%、99%以上）の配列の同一性を有する。配列の相同性は、BLASTN（核酸レベル）やBLASTX（アミノ酸レベル）のプログラム(Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990)を利用して決定することができる。該プログラムは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993) に基づいている。BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore = 100、wordlength =12とする。また、BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore = 50、wordlength = 3とする。また、Gapped BLASTプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Altschulら（Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997）に記載されているように行うことができる。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
【００３０】
また、本発明においては、野生のオオムギに中性子線、X線、ガンマ線等の電磁波を照射しVrs1遺伝子に突然変異を誘発することによって、Vrs1遺伝子の変異体を得ることも可能である。
【００３１】
本発明においてオオムギの種は特に限定されるものではなく、オオムギ属に含まれるものであればどのような種であってもよい。また、栽培品種と野生オオムギの交配・交雑品種であってもよい。野生オオムギとしては、これに限定されるものではないが、例えばHordeum vukgare ssp. Spontaneumが挙げられる。また栽培種としては、これに限定されるものではないが、例えばHordeum vukgare ssp. Vulgareが挙げられる。
【００３２】
また本発明は、オオムギの内因性のVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の発現を抑制するために用いるDNAであって、
（ａ）Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物と相補的なRNAをコードするDNA、
（ｂ）Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA、
（ｃ）Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の発現を共抑制効果により阻害するRNAをコードするDNA、
（ｄ）Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物を特異的に切断するRNAi活性を有するRNAをコードするDNA、
を提供する。
【００３３】
これらのDNAにより、オオムギの条性または穂の形態を改変することが可能である。一例としては、二条性オオムギの内因性のVrs1遺伝子の発現を抑制することによって、該オオムギの二条性としての形質や穂の形態を改変することが可能である。オオムギの条性や穂の形態を改変することは、望みの形質を有するオオムギを作出する際に有用である。条性や穂の形態が改変されたオオムギは、たとえば生け花などに供することが出来るため、観賞用植物の分野において有用である。
【００３４】
Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の発現を抑制するオオムギには特に制限はなく、穂の形態を改変させたい所望のオオムギを用いることができる。
【００３５】
本明細書における「Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の発現を抑制」には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、DNAの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。
【００３６】
「Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の発現を抑制するために用いるDNA」の一つの態様は、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNAである。植物細胞におけるアンチセンス効果は、一時的遺伝子発現法を用いて、電気穿孔法で導入したアンチセンスRNAが植物においてアンチセンス効果を発揮することにより、初めて実証された(Ecker and Davis, Proc. Natl. Acad. USA, 83: 5372, 1986)。その後、タバコやペチュニアにおいても、アンチセンスRNAの発現によって標的遺伝子の発現を低下させる例が報告されており(Krol et. al., Nature 333: 866, 1988)、現在では植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。
【００３７】
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ(Ａ)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する(平島および井上「新生化学実験講座2 核酸IV 遺伝子の複製と発現」,日本生化学会編,東京化学同人, pp.319-347, 1993)。
【００３８】
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むDNAも、本発明で利用されるアンチセンスDNAに含まれる。使用されるアンチセンスDNAは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。
【００３９】
アンチセンスDNAは、例えば、配列番号：1または2に記載のDNAの配列情報を基にホスホロチオネート法（Stein, Nucleic Acids Res., 16: 3209-3221, 1988）などにより調製することが可能である。調製されたDNAは、公知の方法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスDNAの配列は、形質転換する植物が持つ内因性遺伝子の転写産物と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上（例えば、95%、96%、97%、98%、99%以上）の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスDNAの長さは、少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスDNAの長さは5kbよりも短く、好ましくは2.5kbよりも短い。
【００４０】
内因性のVrs1遺伝子の発現の抑制は、リボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことをいう。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型や、RNasePに含まれるM1RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある(小泉誠および大塚栄子、蛋白質核酸酵素, 35: 2191, 1990)。
【００４１】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15のC15の3'側を切断するが、活性にはU14が９位のAと塩基対を形成することが重要とされ、15位の塩基はCの他にAまたはUでも切断されることが示されている(Koizumi et. al., FEBS Lett. 228: 225, 1988)。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のRNA配列と相補的になるように設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することが可能である(Koizumi et. al., FEBS Lett. 239: 285,1988、小泉誠および大塚栄子, 蛋白質核酸酵素,35: 2191, 1990、Koizumi et. al., Nucleic. Acids. Res. 17: 7059, 1989)。
【００４２】
また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される(Buzayan, Nature 323: 349,1986)。このリボザイムも、標的特異的なRNA切断を起こすように設計できることが示されている(Kikuchi and Sasaki, Nucleic Acids Res. 19: 6751, 1992, 及び菊池洋,化学と生物 30: 112, 1992)。
【００４３】
標的を切断できるよう設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写されたRNAの5'末端や3'末端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写されたリボザイムを含むRNAからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の5'側や3'側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である (Taira et. al., Protein Eng. 3: 733, 1990、Dzianott and Bujarski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 4823, 1989、Grosshans and Cech, Nucleic Acids Res. 19: 3875, 1991、Taira et. al., Nucleic Acids Res. 19: 5125, 1991)。
【００４４】
また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる(Yuyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186: 1271, 1992)。このようなリボザイムを用いて本発明で標的となる遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。
【００４５】
内在性遺伝子の発現の抑制はさらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するDNAの形質転換によってもたらされる「共抑制」によっても達成されうる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一若しくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入する外来遺伝子および標的内在性遺伝子の両方の発現が抑制される現象のことをいう。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、植物においてはしばしば観察される(Curr. Biol. 7: R793, 1997、Curr. Biol. 6: 810, 1996)。
【００４６】
例えば、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体が共抑制された植物体を得るためには、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体と同一若しくはこれらと類似した配列を有するDNAを発現できるように作製したベクターDNAを目的の植物へ形質転換し、得られた植物体からVrs1またはVrs1の変異体の機能が抑制された形質を有する植物を選択すればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95%、96%、97%、98%、99%以上）の配列の同一性を有する。
【００４７】
さらに、本発明における内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子のドミナントネガティブの形質を有する遺伝子を植物へ形質転換することによっても達成することができる。ドミナントネガティブの形質を有する遺伝子とは、該遺伝子を発現させることによって、植物体が本来持つ内在性の野生型遺伝子の活性を消失もしくは低下させる機能を有する遺伝子のことをいう。
【００４８】
「Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の発現を抑制するために用いるDNA」の他の一つの態様は、内因性のVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物と相補的なdsRNA（二重鎖RNA）をコードするDNAである。標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するdsRNAを細胞内に導入することにより、導入した外来遺伝子および標的内因性遺伝子の発現がいずれも抑制される、RNAi（RNA干渉、RNA interference）と呼ばれる現象を引き起こすことができる。細胞に約40〜数百塩基対のdsRNAが導入されると、ヘリカーゼドメインを持つダイサー(Dicer)と呼ばれるRNaseIII様のヌクレアーゼがATP存在下で、dsRNAを3'末端から約21〜23塩基対ずつ切り出し、siRNA（short interference RNA）を生じる。このsiRNAに特異的なタンパク質が結合して、ヌクレアーゼ複合体（RISC： RNA-induced silencing complex）が形成される。この複合体はsiRNAと同じ配列を認識して結合し、RNaseIII様の酵素活性によってsiRNAの中央部で標的遺伝子の転写産物（mRNA）を切断する。また、この経路とは別にsiRNAのアンチセンス鎖がmRNAに結合してRNA依存性RNAポリメラーゼ(RsRP)のプライマーとして作用し、dsRNAが合成される。このdsRNAが再びダイサーの基質となって、新たなsiRNAを生じて作用を増幅する経路も考えられている。
【００４９】
RNAiは当初、線虫において発見されたが（Fire, A. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811, 1998）、現在では、線虫のみならず、植物、線形動物、ショウジョウバエ、原生動物などの種々の生物において観察されている（Fire, A. RNA-triggered gene silencing. Trends Genet. 15, 358-363 (1999)、Sharp, P. A. RNA interference 2001. Genes Dev. 15, 485-490 (2001)、Hammond, S. M., Caudy, A. A. &amp; Hannon, G. J. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nature Rev. Genet. 2, 110-119 (2001)、Zamore, P. D. RNA interference: listening to the sound of silence. Nat Struct Biol. 8, 746-750 (2001)）。これら生物では、実際に外来よりdsRNAを導入することにより標的遺伝子の発現が抑制されることが確認され、さらにはノックアウト個体を創生する方法としても利用されつつある。
【００５０】
RNAiの登場当初は、dsRNAはある程度の長さ(40塩基)以上でなければ効果がないと考えられていたが、米ロックフェラー大のTuschlらは21塩基対前後の単鎖dsRNA(siRNA)を細胞に導入すれば、哺乳動物細胞においてもPKRによる抗ウイルス反応を起こさず、RNAiの効果があることを報告し（Tuschl, Nature, 411, 494-498 (2001)）、RNAiは分化したヒトなどの哺乳動物細胞に応用可能な技術として俄然注目を集めることになった。
【００５１】
本発明のDNAは、標的遺伝子の転写産物（mRNA）のいずれかの領域に対するアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、前記mRNAのいずれかの領域のセンスRNAをコードしたセンスコードDNAを含み、前記アンチセンスコードDNAおよび前記センスコードDNAより前記アンチセンスRNAおよび前記センスRNAを発現させることができる。また、これらのアンチセンスRNAおよびセンスRNAよりdsRNAを作成することもできる。本発明における標的配列は、標的配列と同一もしくは類似した配列を有するdsRNAを細胞内に導入した結果Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の発現が抑制されるものであれば特に制限されない。標的配列の一例としては、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の3'非翻訳領域配列が挙げられる。
【００５２】
本発明のdsRNAの発現システムをベクター等に保持させる場合の構成としては、同一のベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる場合と、異なるベクターからそれぞれアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる場合がある。例えば、同一のベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる構成としては、アンチセンスコードDNAおよびセンスコードDNAの上流にそれぞれpolIII系のような短いRNAを発現し得るプロモータを連結させたアンチセンスRNA発現カセット、センスRNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに挿入することにより構成することができる。
【００５３】
また、異なる鎖上に対向するように、アンチセンスコードDNAとセンスコードDNAとを逆向きに配置した発現システムを構成することもできる。この構成では、アンチセンスRNAコード鎖とセンスRNAコード鎖とが対となった一つの二本鎖DNA（siRNAコードDNA）が備えられ、その両側にそれぞれの鎖からアンチセンスRNA、センスRNAとを発現し得るようにプロモータを対向して備えられる。この場合には、センスRNA、アンチセンスRNAの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖（アンチセンスRNAコード鎖、センスRNAコード鎖）の3'末端にターミネーターをそれぞれ備えることが好ましい。このターミネーターは、A（アデニン）塩基を4つ以上連続させた配列などを用いることができる。また、このパリンドロームスタイルの発現システムでは、二つのプロモータの種類は異なっていることが好ましい。
【００５４】
また、異なるベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスコードDNAおよびセンスコードDNAの上流にそれぞれpolIII系のような短いRNAを発現し得るプロモータを連結させたアンチセンスRNA発現カセット、センスRNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを異なるベクターに保持させることにより構成することができる。
【００５５】
RNAiにおいては、dsRNAとしてsiRNAが使用されたものであってもよい。「siRNA」は、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖RNAを意味し、Tuschlら（前掲）により報告された全長21〜23塩基対に限定されるものではなく、毒性を示さない範囲の長さであれば特に限定はなく、例えば、15〜49塩基対と、好適には15〜35塩基対と、さらに好適には21〜30塩基対とすることができる。あるいは、発現されるsiRNAが転写され最終的な二重鎖RNA部分の長さが、例えば、15〜49塩基対、好適には15〜35塩基対、さらに好適には21〜30塩基対とすることができる。
【００５６】
本発明のDNAとしては、標的配列のインバーテッドリピートの間に適当な配列（イントロン配列が望ましい）を挿入し、ヘアピン構造を持つダブルストランドRNA(self-complementary 'hairpin' RNA(hpRNA))を作るようなコンストラクト（Smith, N.A., et al. Nature, 407: 319, 2000、Wesley, S. V. et al. Plant J. 27: 581, 2001、Piccin, A. et al. Nucleic Acids Res. 29:E55, 2001）を用いることもできる。
【００５７】
RNAiに用いるDNAは、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95%、96%、97%、98%、99%以上）の配列の同一性を有する。また、配列の同一性は上述した手法により決定できる。
【００５８】
dsRNAにおけるRNA同士が対合した二重鎖RNAの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などにより不対合部分が含まれていてもよい。本発明においては、dsRNAにおけるRNA同士が対合する二重鎖RNA領域中に、バルジおよびミスマッチの両方が含まれていてもよい。
【００５９】
また本発明は、Vrs1遺伝子、Vrs1遺伝子の変異体、またはVrs1遺伝子の発現を抑制するDNAのいずれか１つを含むベクター、形質転換細胞、ならびに形質転換オオムギ細胞を提供する。
【００６０】
上記ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、JM109、DH5α、HB101、XL1Blue）等で大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコールにより判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Script等が挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7等が挙げられる。Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体から生成されるタンパク質を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blue等の大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら, Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーター（Betterら, Science (1988) 240, 1041-1043 ）、またはT7プロモーター等を持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1（ファルマシア社製）、「QIAexpress system」（キアゲン社製）、pEGFP、またはpET等が挙げられる。
【００６１】
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
【００６２】
大腸菌以外にも、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体から生成されるタンパク質を製造するためのベクターとしては、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3 (インビトロゲン社製)や、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF 、pCDM8 ）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（ギブコBRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（インビトロゲン社製）、pNV11、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）等が挙げられる。
【００６３】
CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーター等を持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418等）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等が挙げられる。本発明のDNAの細胞への導入は、当業者においては、公知の方法、例えば電気穿孔法（エレクトロポーレーション法）などにより実施することができる。
【００６４】
さらに本発明は、Vrs1遺伝子、Vrs1遺伝子の変異体、またはVrs1遺伝子の発現を抑制するDNAが導入された形質転換オオムギ、該形質転換オオムギの子孫またはクローンである形質転換オオムギ、該形質転換オオムギの繁殖材料を提供する。また、上記形質転換オオムギとその繁殖材料の製造方法を提供する。上記の遺伝子が導入された結果、二条性の形質を有する形質転換オオムギは、例えばビール醸造に有用である。また、六条性の形質を有する形質転換オオムギは飼料として有用である。さらに、二条性、六条性、または二条性と六条性の中間性の形質を有する形質転換オオムギは、たとえば生け花などに供することが出来、観賞用植物の分野において有用である。ここで、Vrs1遺伝子、Vrs1遺伝子の変異体、またはVrs1遺伝子の発現を抑制するDNAとは、上述の通りである。
Vrs1遺伝子、Vrs1遺伝子の変異体、またはVrs1遺伝子の発現を抑制するDNAの植物細胞への導入は、上記の方法によって行うことが可能である。
【００６５】
オオムギの再生は、当業者に公知の方法で行うことが可能である（Toki et. al., Plant Physiol. 100: 1503-1507, 1995）。例えば、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Datta et. al., In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and Spangenberg Eds.) pp66-74, 1995）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Toki et. al., Plant Physiol. 100: 1503-1507, 1992）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Christou et. al., Bio/technology, 9: 957-962, 1991）およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Hiei et. al., Plant J. 6: 271-282, 1994）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００６６】
上記アグロバクテリウム法を用いる場合、例えばNagelらの方法（Microbiol. Lett. 67: 325, 1990）が用いられる。この方法によれば、組み換えベクターをアグロバクテリウム細菌中に形質転換して、次いで形質転換されたアグロバクテリウムを、リーフディスク法等の公知の方法により細胞に導入する。上記ベクターは、例えば植物体に導入した後、本発明のVrs1遺伝子、Vrs1遺伝子の変異体、またはVrs1遺伝子の発現を抑制するDNAが植物体中で発現するように、発現プロモーターを含む。一般に、該プロモーターの下流には本発明のVrs1遺伝子、Vrs1遺伝子の変異体またはVrs1遺伝子の発現を抑制するDNAが位置し、さらに該DNAの下流にはターミネーターが位置する。この目的に用いられる組み換えベクターは、植物への導入方法、または植物の種類に応じて、当業者によって適宜選択される。上記プロモーターとして、例えばカリフラワーモザイクウイルス由来のCaMV35S、トウモロコシのユビキチンプロモーター（特開平2-79983号公報）等を挙げることができる。
【００６７】
また、上記ターミネーターは、カリフラワーモザイクウイルス由来のターミネーター、あるいはノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーター等を例示することができるが、植物体中で機能するプロモーターやターミネーターであれば、これらに限定されない。
【００６８】
また、本発明のVrs1遺伝子、Vrs1遺伝子の変異体、またはVrs1遺伝子の発現を抑制するDNAを導入するオオムギは、外植片であってもよく、これらの植物から培養細胞を調製し、得られた培養細胞に導入してもよい。本発明の「オオムギ細胞」は、例えば葉、根、茎、花（とくに花粉小胞子）および未熟・成熟種子中の胚盤等の植物の細胞、カルス、懸濁培養細胞等が挙げられる。
【００６９】
また、本発明のVrs1遺伝子、Vrs1遺伝子の変異体、またはVrs1遺伝子の発現を抑制するDNAの導入により形質転換した細胞を効率的に選択するために、上記組み換えベクターは、適当な選抜マーカー遺伝子を含む、もしくは選抜マーカー遺伝子を含むプラスミドベクターと共にオオムギ細胞へ導入するのが好ましい。この目的に使用する選抜マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシンまたはゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、および除草剤ホスフィノスリシンに耐性であるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。
【００７０】
組み換えベクターを導入した細胞は、導入された選抜マーカー遺伝子の種類に従って適当な選抜用薬剤を含む公知の選抜用培地に置床し培養する。これにより形質転換された植物培養細胞を得ることができる。
【００７１】
形質転換細胞から再生させた植物体は、次いで順化用培地で培養する。その後、順化した再生植物体を、通常の栽培条件で栽培すると、植物体が得られ、成熟して結実して種子を得ることができる。
【００７２】
なお、このように再生され、かつ栽培した形質転換植物体中の導入された外来DNAの存在は、公知のPCR法やサザンハイブリダイゼーション法によって、または植物体中のDNAの塩基配列を解析することによって確認することができる。この場合、形質転換植物体からのDNAの抽出は、公知のJ.Sambrookらの方法（Molecular Cloning、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）に準じて実施することができる。
【００７３】
再生させた植物体中に存在する本発明のDNAよりなる外来遺伝子を、PCR法を用いて解析する場合には、上記のように再生植物体から抽出したDNAを鋳型として増幅反応を行う。また、本発明のDNA、あるいは本発明により改変されたDNAの塩基配列に従って適当に選択された塩基配列をもつ合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、これらを混合させた反応液中において増幅反応を行うこともできる。増幅反応においては、DNAの変性、アニーリング、伸張反応を数十回繰り返すと、本発明のDNA配列を含むDNA断片の増幅生成物を得ることができる。増幅生成物を含む反応液を例えばアガロース電気泳動にかけると、増幅された各種のDNA断片が分画されて、そのDNA断片が本発明のDNAに対応することを確認することが可能である。
【００７４】
一旦、染色体内に本発明のVrs1遺伝子、Vrs1遺伝子の変異体、またはVrs1遺伝子の発現を抑制するDNAが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、Vrs1遺伝子、Vrs1遺伝子の変異体、またはVrs1遺伝子の発現を抑制するDNAが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。これらの植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料は、植物（例えばオオムギ）の穂の形態を改変することに使用することが可能である。
【００７５】
本発明はさらに、Vrs1遺伝子を二条性ではないオオムギの細胞内で発現させる工程を含む、オオムギの条性または穂の形態を改変する方法を提供する。本発明はまた、Vrs1遺伝子の変異体を二条性オオムギの細胞内で発現させる工程を含む、オオムギの条性または穂の形態を改変する方法を提供する。本発明はさらに、Vrs1遺伝子の発現を抑制するDNAを二条性オオムギの細胞内で発現させる工程を含む、オオムギの条性または穂の形態を改変する方法を提供する。二条性に形質転換されたオオムギは、例えばビール醸造に有用である。また、六条性に形質転換されたオオムギは飼料として有用である。さらに、二条性、六条性、または二条性と六条性の中間性に形質転換された形質転換オオムギは、たとえば生け花などに供することが出来るため、観賞用植物の分野において有用である。オオムギの条性または穂の形態を改変することは、上述の方法を用いてVrs1遺伝子、Vrs1遺伝子の変異体、Vrs1遺伝子の発現を抑制するDNAを発現可能に含むベクターをオオムギの細胞に導入し、これを再生することにより可能である。
【００７６】
本明細書において「改変する」とは、例えば、六条性オオムギを二条性オオムギに完全に改変する（または六条性オオムギの穂の形態を二条性オオムギの穂の形態に完全に改変する）ことのみならず、六条性オオムギの形質の一部を二条性オオムギのそれに改変する（または六条性オオムギの穂の形態の一部を二条性オオムギの穂の形態に改変する）ことも意味する。また、二条性に改変される六条性オオムギには、その個体の全てに六条性の形質を有するオオムギのみならず、その個体の一部のみに六条性の形質を有するオオムギも含まれる。本発明における条性または穂の形態を改変する方法においては、上述の「改変する」の定義は、Vrs1遺伝子の変異体を二条性オオムギの細胞内で発現させる工程を含む、オオムギの条性または穂の形態を改変する方法や、Vrs1遺伝子の発現を抑制するDNAを二条性オオムギの細胞内で発現させる工程を含む、オオムギの条性または穂の形態を改変する方法においても、二条性と六条性の文言を読み替えることなどによって、同様に適用される。
【００７７】
二条オオムギは六条オオムギに比べて赤かび病抵抗性が大きい傾向にあることが報告されている（K. Takeda (1990) Selection response and parent-offspring correlation of the resistance to Fusarium Head Blight in barley. Japanese Journal of Breeding 40: 91-101.）。従って本発明は、Vrs1遺伝子をオオムギの細胞内で発現させる工程を含む、オオムギに赤かび病抵抗性を付与する方法を提供する。オオムギに赤かび病抵抗性を付与することは、上述の方法を用いて、Vrs1遺伝子を発現可能に含むベクターをオオムギの細胞に導入し、これを再生することにより可能である。
【００７８】
赤かび病はコムギ、オオムギ、エン麦等多くのムギ科作物を侵し、おもに穂に発生する。赤かび病菌に感染したオオムギでは、出穂から乳熟期にかけて、穂のー部あるいは全部が褐色になり、穎の合わせ目に鮭肉色のかび(分生胞子)ができる。赤かび病菌に感染した子実は稔実が悪く、多発の際の減収は60〜70%にも及ぶ。また、被害麦を食用、飼料にすると中毒症状をおこすことがある。
本発明において「赤かび病菌」とは、Fusarium属に含まれる菌を意味する。もっとも重要な種の一例としては、Fusarium graminearum菌があるが、これらに限定されるものではなく、上記の属に含まれる全ての菌が、本発明における赤かび病菌に含まれる。
【００７９】
本発明はまた、本発明のVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体から生成されるタンパク質、該タンパク質の製造方法、および該タンパク質に結合する抗体を提供する。
組み換えタンパク質を調製する場合には、通常、本発明のタンパク質をコードするDNAを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入し、形質転換細胞を培養して発現させたタンパク質を精製する。組み換えタンパク質は、精製を容易にするなどの目的で、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることも可能である。例えば、大腸菌を宿主としてマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として調製する方法（米国New England BioLabs社発売のベクターpMALシリーズ）、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として調製する方法（Amersham Pharmacia Biotech社発売のベクターpGEXシリーズ）、ヒスチジンタグを付加して調製する方法（Novagen社のpETシリーズ）などを利用することが可能である。宿主細胞としては、組み換えタンパク質の発現に適した細胞であれば特に制限はなく、上記の大腸菌の他、例えば、酵母、種々の動植物細胞、昆虫細胞などを用いることが可能である。宿主細胞へのベクターの導入には、当業者に公知の種々の方法を用いることが可能である。例えば、大腸菌への導入には、カルシウムイオンを利用した導入方法（Mandel, M. & Higa, A. Journal of Molecular Biology, Vol.53, 158-162,(1970)、Hanahan, D. Journal of Molecular Biology, Vol.166, 557-580,(1983)）を用いることができる。宿主細胞内で発現させた組み換えタンパク質は、該宿主細胞またはその培養上清から、当業者に公知の方法により精製し、回収することが可能である。組み換えタンパク質を上記したマルトース結合タンパク質などとの融合タンパク質として発現させた場合には、容易にアフィニティー精製を行うことが可能である。
【００８０】
得られた組換えタンパク質を用いれば、これに結合する抗体を調製することができる。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして取得することができる。Vrs1タンパク質（Vrs1遺伝子から生成されるタンパク質）またはVrs1遺伝子の変異体から生成されるタンパク質、あるいはこれらとGSTとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナントタンパク質、またはそれらの部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、Vrs1タンパク質またはVrs1遺伝子の変異体から生成されるタンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、Vrs1タンパク質またはVrs1遺伝子の変異体から生成されるタンパク質またはそれらの部分ペプチドをマウス等の小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、Vrs1タンパク質またはVrs1遺伝子の変異体から生成されるタンパク質に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、Vrs1タンパク質またはVrs1遺伝子の変異体から生成されるタンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。これにより得られた抗体は、本発明のタンパク質の精製や検出などに利用することが可能である。本発明には、本発明のタンパク質に結合する抗体が含まれる。
【００８１】
さらに本発明は、Vrs1遺伝子、該遺伝子を含むベクターの用途を提供するものである。すなわち本発明は、Vrs1遺伝子、該遺伝子を含むベクターのいずれか１つを有効成分として含む、オオムギの赤かび病抵抗性を増加させるための薬剤に関する。また本発明は、オオムギの赤かび病抵抗性を増加させるための薬剤の製造における、Vrs1遺伝子、該遺伝子を含むベクターの使用に関する。
【００８２】
本発明のオオムギの赤かび病抵抗性を増加させるための薬剤においては、有効成分であるオリゴヌクレオチド以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
【００８３】
本発明はまた、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体に連鎖する分子マーカーを提供する。本発明における「分子マーカー」とは、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体と遺伝的に連鎖するDNA領域であって、他のDNA領域と識別可能なDNA領域をいう。
【００８４】
一般に分子マーカーとは、単位cMで表す地図距離が短いほどその遺伝子の近傍に位置し、その遺伝子と同時に遺伝するため、有用性が高い。具体的には、本発明のプライマーセットとしては、配列番号：4〜29に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーが挙げられる。本発明の分子マーカーとしては、STS（Sequence Tagged Site）マーカー、AFLPマーカー、RFLPマーカー、SNPマーカー、SSRマーカーなどを挙げることが出来る。
【００８５】
STSマーカーとは、DNA上の配列タグ部位（STS）の多型の有無の判定に利用できるDNA領域をいい、STSとは、DNA上の特定位置に特異的な配列部位をいう。STSの多型は、該特定配列部位を含むDNA領域をPCR法等の核酸増幅法により増幅し、該増幅産物をアガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけることにより、バンドの有無や位置の違いとして検出することができる。また、AFLP法とは、制限酵素で切断されたDNA断片の長さの違いをPCRにより選択的に増幅させて検出する方法を言う。RFLPマーカーとは、染色体DNA配列の制限酵素断片長多型(RFLP)の存在の有無の判定に利用できるDNA領域を言う。RFLPとは、制限酵素で処理して得られるDNA断片の長さの違いによって見出される遺伝的変異（置換変異、挿入変異及び欠失変異等）を言い、この変異は、DNA断片をアガロース電気泳動により断片長の長さに基づき分離し、泳動距離の差をサザンブロットにより検出して確認できる。SSRマーカーとは、Simple Sequence Repeatsの略で、マイクロサテライトマーカーと同義である。SSRマーカーは、塩基配列中に存在する2あるいは3塩基の単位が数回から数百回反復する繰り返し配列の繰り返し回数の違いをDNA多型として利用したDNAマーカーである。繰り返し部分の塩基配列をPCRで増幅し、得られた増幅産物をアガロースゲル電気泳動あるいはDNAシーケンサーにかけることによって、DNA多型をバンドの位置の違いあるいは塩基配列数の違いとして検出する。また、SNPとはDNAの塩基配列中の塩基1個の置換によって生ずるDNA多型であり、これをDNAマーカーとして利用したものがSNPマーカーである。一塩基多型部分およびそれに隣接する塩基配列をPCRで増幅し、得られた増幅産物中の一塩基多型部分に取り込まれた塩基の種類を偏光蛍光分析器で解析することによって検出することが可能である。
【００８６】
当業者においては、各種分子マーカー（例えば上述のマーカー）についての配列情報を考慮して、最適なプライマーを適宜設計することが可能である。通常、上記プライマーとは、オオムギに特異的に存在し、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体と連鎖する塩基配列を挟み込むように設計された、該塩基配列を増幅するための一対のプライマーセットである。
【００８７】
具体的には、本発明のプライマーセットとしては、
（ａ）配列番号：30に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：31に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：4に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット）、
（ｂ）配列番号：32に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：33に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：5に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット）、
（ｃ）配列番号：34に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：35に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：6に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット）、
（ｄ）配列番号：36に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：37に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：7に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット）、
（ｅ）配列番号：38に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：39に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：8に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット）、
（ｆ）配列番号：40に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：41に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：9に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット）、
（ｇ）配列番号：42に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：43に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：10に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット）、
（ｈ）配列番号：44に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：45に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：11に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット）、
（ｉ）配列番号：46に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：47に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：12に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット）、
（ｊ）配列番号：48に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：49に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：13に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット）、
（ｋ）配列番号：50に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：51に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：14〜18に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット）、
（ｌ）配列番号：52に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：53に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：19〜23に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット）、
（ｍ）配列番号：54に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：55に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：24に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット）、
（ｎ）配列番号：56に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：57に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：25に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット）、
（ｏ）配列番号：58に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：59に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：26に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット）、
（ｐ）配列番号：60に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：61に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：27に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット）、
（ｑ）配列番号：62に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：63に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：28に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット）、
（ｒ）配列番号：64に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号：65に記載の塩基配列からなるDNA（配列番号：29に記載の塩基配列の全部または一部を含むマーカーを検出するプライマーセット）、
を例示することが出来る。これらのプライマーセットによって増幅されるDNA配列によって特徴付けられる情報を、本発明の分子マーカーと比較することによって、被検オオムギが二条性または六条性であることを判定することが可能である。
【００８８】
また上記のプライマー以外にも、当業者であれば、配列番号：1または2に記載の塩基配列、または、配列番号：1または2に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオオムギ由来のDNAを利用して、同様の機能を有するプライマーセットを作成することが可能である。本発明のプライマーには、このようなプライマーもまた含まれる。
【００８９】
本発明のPCRプライマーは、当業者においては、例えば、自動オリゴヌクレオチド合成機等を利用して作製することができる。また、当業者においては周知の多型検出方法、例えば、上記PCRプライマーを用いた後述のPCR-SSCP法等によっても本発明の方法を実施することが可能である。
【００９０】
また、本発明の分子マーカーがゲノムDNAのエクソン中に存在する場合には、mRNAを鋳型としたRT-PCRを利用することも可能である。また、Taqman（量的PCR検出）システム（Roche社）を利用すれば、蛍光により増幅産物の有無を検出することが可能である。このシステムによれば、電気泳動の手間も省けるため短時間で本発明の識別方法を行うことが可能である。
【００９１】
本発明はまた、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体からなるDNAまたはその相補鎖に相補的な少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを提供する。
【００９２】
本発明において「相補鎖」とは、A:T（ただしRNAの場合はU）、G:Cの塩基対からなる2本鎖核酸の一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも15個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは90%、さらに好ましくは95%以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同性を決定するためのアルゴリズムは当業者に周知のものを使用すればよい。
【００９３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号：1または2に記載の塩基配列からなるDNA、または、配列番号：1または2に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオオムギ由来のDNAの検出や増幅に用いるプローブやプライマーとして使用することができる。また、本発明のオリゴヌクレオチドは、DNAアレイの基板の形態で使用することができる。
【００９４】
該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常15bp〜100bpであり、好ましくは17bp〜30bpである。プライマーは、本発明のDNAまたはその相補鎖の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。また、プライマーとして用いる場合、3'側の領域は相補的とし、5'側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
【００９５】
また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、配列番号：1または2に記載の塩基配列からなるDNAまたはその相補鎖の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするものや、配列番号：1または2に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオオムギ由来のDNAまたはその相補鎖の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも15bp以上の鎖長を有する。
【００９６】
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの5'端を32Pでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のDNAポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
【００９７】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖DNA断片として作製することもできる。
【００９８】
さらに本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む方法であって、分子量または塩基配列が一致するときにオオムギが二条性であると判定される方法を提供する。
（ａ）オオムギからDNA試料を調製する工程
（ｂ）該DNA試料からVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
（ｃ）増幅したDNA断片の分子量または塩基配列を、Vrs1遺伝子または二条性であるVrs1遺伝子の変異体のそれと比較する工程
本発明の上記DNA試料の調製（抽出）は、当業者においては、公知の方法によって行うことができる。好ましい調製方法として、例えば、CTAB法を用いてDNAを抽出する方法を挙げることができる。
また、本発明の判定方法に供されるDNA試料は特に制限されるものではないが、通常、被検植物であるオオムギから抽出するゲノムDNAを用いる。また、ゲノムDNAの採取源としては特に限定されるものではなく、オオムギのいずれの組織からも抽出できる。例えば、穂、葉、根、茎、種子、胚乳部、フスマ、胚等から抽出することができる。
【００９９】
本発明の方法では、次に、調製したDNAを鋳型として、プライマーDNAを用いて核酸増幅反応（例えば、PCR法）を行う。増幅したDNA断片を制限酵素で切断し、切断されたDNA断片の大きさを、電気泳動等により被検オオムギと二条性オオムギとの間で比較し、分子量または塩基配列が一致する場合に、該被検オオムギは二条性オオムギであると判定される。「二条性オオムギ」としては、表1に記載のオオムギが挙げられるが、これに限定されない。
【０１００】
上記電気泳動分析は、常法にしたがって行えばよい。例えば、アガロースまたはポリアクリルアミドのゲル中で電圧をかけて電気泳動し、分離したDNAパターンを分析する。なお本発明の判定方法においては、上述したように、Vrs1遺伝子は配列番号：1または2に記載の塩基配列を含むDNAに限定されない。配列番号：1または2に記載の塩基配列を含むDNAに変異を有するものであっても、その遺伝子を有するオオムギが二条性の形質を有するものでありさえすれば、該配列番号：1または2に記載の塩基配列において変異を有するDNAは、本発明のVrs1遺伝子に含まれる。
【０１０１】
また本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む方法であって、分子量または塩基配列が一致するときにオオムギが六条性であると判定される方法を提供する。
（ａ）オオムギからDNA試料を調製する工程
（ｂ）該DNA試料からVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
（ｃ）増幅したDNA断片の分子量または塩基配列を、六条性であるVrs1遺伝子の変異体のそれと比較する工程
【０１０２】
さらに本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む方法であって、分子量または塩基配列が一致するときにオオムギが二条性と六条性の中間性であると判定される方法を提供する。
（ａ）オオムギからDNA試料を調製する工程
（ｂ）該DNA試料からVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
（ｃ）増幅したDNA断片の分子量または塩基配列を、二条性と六条性の中間性であるVrs1遺伝子の変異体のそれと比較する工程
【０１０３】
本発明の方法において六条性、二条性と六条性の中間性とは上述の通りである。本発明の方法においては、増幅したDNA断片を制限酵素で切断し、電気泳動等により、切断されたDNA断片の大きさを、電気泳動等により被検オオムギと六条性オオムギとの間で比較し、分子量または塩基配列が一致する場合に、該被検オオムギは六条性であると判定される。または、増幅したDNA断片を制限酵素で切断し、電気泳動等により、切断されたDNA断片の大きさを、電気泳動等により被検オオムギと二条性と六条性の中間性であるオオムギとの間で比較し、分子量または塩基配列が一致する場合に、該被検オオムギは二条性と六条性の中間性であると判定される。
【０１０４】
また本発明は、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が一致するときにオオムギが二条性であると判定される方法を提供する。
（ａ）オオムギからDNA試料を調製する工程
（ｂ）該DNA試料からVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
（ｃ）増幅した二本鎖のDNAを非変性ゲル上で分離する工程
（ｄ）分離した二本鎖DNAのゲル上での移動度を、Vrs1遺伝子または二条性であるVrs1遺伝子の変異体のそれと比較する工程
【０１０５】
さらに本発明は、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が一致するときにオオムギが六条性であると判定される方法を提供する。
（ａ）オオムギからDNA試料を調製する工程
（ｂ）該DNA試料からVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
（ｃ）増幅した二本鎖のDNAを非変性ゲル上で分離する工程
（ｄ）分離した二本鎖DNAのゲル上での移動度を、六条性であるVrs1遺伝子の変異体のそれと比較する工程
【０１０６】
さらに本発明は、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が一致するときにオオムギが二条性と六条性の中間性であると判定される方法を提供する。
（ａ）オオムギからDNA試料を調製する工程
（ｂ）該DNA試料からVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
（ｃ）増幅した二本鎖のDNAを非変性ゲル上で分離する工程
（ｄ）分離した二本鎖DNAのゲル上での移動度を、二条性と六条性の中間性であるVrs1遺伝子の変異体のそれと比較する工程
【０１０７】
また本発明は、以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が一致するときにオオムギが二条性であると判定される方法を提供する。
（ａ）オオムギからDNA試料を調製する工程
（ｂ）該DNA試料からVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
（ｃ）増幅したDNAを一本鎖DNAに解離させる工程
（ｄ）解離させた一本鎖DNAを非変性ゲル上で分離する工程
（ｅ）分離した一本鎖DNAのゲル上での移動度を、Vrs1遺伝子または二条性であるVrs1遺伝子の変異体のそれと比較する工程
【０１０８】
また本発明は、以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が一致するときオオムギが六条性であると判定される方法を提供する。
（ａ）オオムギからDNA試料を調製する工程
（ｂ）該DNA試料からVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
（ｃ）増幅したDNAを一本鎖DNAに解離させる工程
（ｄ）解離させた一本鎖DNAを非変性ゲル上で分離する工程
（ｅ）分離した一本鎖DNAのゲル上での移動度を、六条性であるVrs1遺伝子の変異体それと比較する工程
【０１０９】
また本発明は、以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が一致するときオオムギが二条性と六条性の中間性である判定される方法を提供する。
（ａ）オオムギからDNA試料を調製する工程
（ｂ）該DNA試料からVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
（ｃ）増幅したDNAを一本鎖DNAに解離させる工程
（ｄ）解離させた一本鎖DNAを非変性ゲル上で分離する工程
（ｅ）分離した一本鎖DNAのゲル上での移動度を、二条性と六条性の中間性であるVrs1遺伝子の変異体のそれと比較する工程
【０１１０】
このような方法として、PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism、一本鎖高次構造多型)法(Cloning and polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism analysis of anonymous Alu repeats on chromosome 11. Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.、Detection of p53 gene mutations in human brain tumors by single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products. Oncogene. 1991 Aug 1; 6(8): 1313-1318.、Multiple fluorescence-based PCR-SSCP analysis with postlabeling.、PCR Methods Appl. 1995 Apr 1; 4(5): 275-282.)が挙げられる。この方法は操作が比較的簡便であり、また試料の量も少なくて済むなどの利点を有するため、特に多数のDNAサンプルをスクリーニングするのに好適である。その原理は以下の如くである。二本鎖DNA断片を一本鎖に解離すると、各鎖はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。この解離したDNA鎖を変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、それぞれの高次構造の差に応じて、相補的な同じ鎖長の一本鎖DNAが異なる位置に移動する。一塩基の置換によってもこの一本鎖DNAの高次構造は変化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において異なる移動度を示す。従って、この移動度の変化を検出することによりDNA断片に点突然変異や欠失、あるいは挿入などによる変異が存在することを検出することができる。
【０１１１】
具体的には、まず、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の標的部位を含む領域をPCR法などによって増幅する。増幅される範囲としては、100〜600bp程度の長さが好ましい。PCRによる遺伝子断片増幅の際、32Pなどのアイソトープ、あるいは蛍光色素やビオチンなどによって標識したプライマーを用いるか、あるいはPCR反応液に32Pなどのアイソトープ、あるいは蛍光色素やビオチンなどによって標識した基質塩基を加えてPCRを行うことによって合成されるDNA断片を標識する。あるいはPCR反応後にクレノウ酵素などを用いて32Pなどのアイソトープ、あるいは蛍光色素やビオチンなどによって標識した基質塩基を合成されたDNA断片に付加することによっても標識を行うことができる。このようにして得られたDNA断片を2本鎖のまま、尿素などの変性剤を含まないポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。もしくは、このようなDNA断片に熱を加えることなどにより変性させてから、尿素などの変性剤を含まないポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行ってもよい。この際、ポリアクリルアミドゲルに適量（5から10％程度）のグリセロールを添加することにより、DNA断片の分離の条件を改善することができる。また、泳動条件は各DNA断片の性質により変動するが、通常、室温（20から25℃）で行い、好ましい分離が得られないときには4から30℃までの温度で最適の移動度を与える温度の検討を行う。電気泳動後、DNA断片の移動度を、X線フィルムを用いたオートラジオグラフィーや、蛍光を検出するスキャナー等で検出し、解析する。移動度に差があるバンドが検出された場合、このバンドを直接ゲルから切り出し、PCRによって再度増幅し、それを直接シークエンシングすることにより、変異の存在を確認することができる。また、標識したDNAを使わない場合においても、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドや銀染色法などによって染色することによって、バンドを検出することができる。
【０１１２】
さらに本発明は、以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む方法であって、検出されたDNA断片の大きさが一致するときにオオムギが二条性であると判定される方法を提供する。
（ａ）オオムギからDNA試料を調製する工程
（ｂ）該DNA試料からVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
（ｃ）調製したDNA試料を制限酵素により切断する工程
（ｄ）DNA断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｅ）検出されたDNA断片の大きさを、Vrs1遺伝子または二条性であるVrs1遺伝子の変異体のそれと比較する工程
【０１１３】
また本発明は、以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む方法であって、検出されたDNA断片の大きさが一致するときにオオムギが六条性であると判定される方法を提供する。
（ａ）オオムギからDNA試料を調製する工程
（ｂ）該DNA試料からVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
（ｃ）調製したDNA試料を制限酵素により切断する工程
（ｄ）DNA断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｅ）検出されたDNA断片の大きさを、六条性であるVrs1遺伝子の変異体のそれと比較する工程
【０１１４】
また本発明は、以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む方法であって、検出されたDNA断片の大きさが一致するときにオオムギが二条性と六条性の中間性であると判定される方法を提供する。
（ａ）オオムギからDNA試料を調製する工程
（ｂ）該DNA試料からVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の領域を増幅する工程
（ｃ）調製したDNA試料を制限酵素により切断する工程
（ｄ）DNA断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｅ）検出されたDNA断片の大きさを、二条性と六条性の中間性であるVrs1遺伝子の変異体のそれと比較する工程
【０１１５】
このような方法としては、制限酵素断片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphism／RFLP）を利用したRFLP法やPCR-RFLP法などが挙げられる。DNAを切断する酵素としては、通常、制限酵素を用いる。具体的には、制限酵素の認識部位に塩基の付加、欠失が存在する場合、あるいは制限酵素処理によって生じるDNA断片内に塩基挿入、または欠失がある場合、制限酵素処理後に生じる断片の大きさが、Vrs1遺伝子、二条性であるVrs1遺伝子の変異体、六条性であるVrs1遺伝子の変異体、二条性と六条性の中間性であるVrs1遺伝子の変異体との間で変化する。この変異部位を含む部分をPCR法によって増幅し、それぞれの制限酵素で処理することによって、これらの多型部位を電気泳動後のバンドの移動度の差として検出することができる。あるいは、染色体DNAをこれらの制限酵素によって処理し、電気泳動した後、プローブDNAを用いてサザンブロッティングを行うことにより、多型部位を検出することができる。用いられる制限酵素は、それぞれの変異部位に応じて適宜選択することができる。この方法では、ゲノムDNA以外にも被験オオムギから調製したRNAを逆転写酵素でcDNAにし、これをそのまま制限酵素で切断した後サザンブロッティングを行うこともできる。また、このcDNAを鋳型としてPCRでVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の一部、あるいは全部を増幅し、それを制限酵素で切断した後、移動度の差を調べることもできる。
【０１１６】
さらに本発明は、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が一致するときにオオムギが二条性であると判定される方法を提供する。
（ａ）オオムギからDNA試料を調製する工程
（ｂ）該DNA試料からVrs1遺伝子またはVrs1の変異体遺伝子の領域を増幅する工程
（ｃ）増幅したDNAを、DNA変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程
（ｄ）分離したDNAのゲル上での移動度と、Vrs1遺伝子または二条性であるVrs1遺伝子の変異体のそれと比較する工程
【０１１７】
また本発明は、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が一致するときにオオオムギが六条性であると判定される方法を提供する。
（ａ）オオムギからDNA試料を調製する工程
（ｂ）該DNA試料からVrs1遺伝子またはVrs1の変異体遺伝子の領域を増幅する工程
（ｃ）増幅したDNAを、DNA変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程
（ｄ）分離したDNAのゲル上での移動度と、六条性であるVrs1遺伝子の変異体のそれと比較する工程
【０１１８】
また本発明は、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む方法であって、ゲル上での移動度が一致するときにオオオムギが二条性と六条性の中間性であると判定される方法を提供する。
（ａ）オオムギからDNA試料を調製する工程
（ｂ）該DNA試料からVrs1遺伝子またはVrs1の変異体遺伝子の領域を増幅する工程
（ｃ）増幅したDNAを、DNA変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程
（ｄ）分離したDNAのゲル上での移動度と、二条性と六条性の中間性であるVrs1遺伝子の変異体のそれと比較する工程
【０１１９】
このような方法としては、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（denaturant gradient gel electrophoresis：DGGE）が挙げられる。Vrs1遺伝子または二条性であるVrs1遺伝子の変異体、六条性であるVrs1遺伝子の変異体、二条性と六条性の中間性であるVrs1遺伝子の変異体の標的部位を含む領域を本発明のプライマーなどを用いたPCR法などによって増幅し、これを尿素などの変性剤の濃度が移動するに従って徐々に高くなっているポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、健常者と比較する。変異が存在するDNA断片の場合、より低い変性剤濃度位置でDNA断片が一本鎖になり、極端に移動速度が遅くなるため、この移動度の差を検出することにより多型の存在を検出することができる。
【０１２０】
これら方法以外にも、アレル特異的オリゴヌクレオチド（Allele Specific Oligonucleotide／ASO）ハイブリダイゼーション法が利用できる。多型が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを作製し、これと試料DNAでハイブリダイゼーションを行わせると、該オリゴヌクレオチドと異なる多型塩基が、ハイブリダイズする試料DNAに存在する場合、ハイブリッド形成の効率が低下する。それをサザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法などにより検出できる。
【０１２１】
また、リボヌクレアーゼAミスマッチ切断法による検出も可能である。具体的には、MHC S遺伝子、SEEK1遺伝子あるいはHCR遺伝子の標的部位を含む領域をPCR法などによって増幅し、これに対し、プラスミドベクター等に組み込んだ健常者型のcDNA等から調製した標識RNAとハイブリダイゼーションを行わしめる。健常者型と異なる塩基が存在する部分においてはハイブリッドが一本鎖構造となるので、この部分をリボヌクレアーゼAによって切断し、これをオートラジオグラフィーなどで検出することによって多型の存在を検出することができる。
【０１２２】
本発明の判定方法を利用すれば、二条性、六条性、または二条性と六条性の中間性であるオオムギを早期に選抜することが可能となる。すなわち本発明は、以下の（ａ）および（ｂ）に記載の工程を含む、二条性オオムギを選抜する方法を提供する。
（ａ）二条性オオムギと、二条性ではないまたは条性が不明であるオオムギとが交配された品種を作製する工程
（ｂ）本明細書に記載の方法により、工程（ａ）で作製されたオオムギが二条性であるか否かを判定する工程
【０１２３】
さらに本発明は、以下の（ａ）および（ｂ）に記載の工程を含む、六条性オオムギを選抜する方法を提供する。
（ａ）六条性オオムギと、六条性ではないまたは条性が不明であるオオムギとが交配された品種を作製する工程
（ｂ）本明細書に記載の方法により、工程（ａ）で作製されたオオムギが六条性であるか否かを判定する工程
【０１２４】
さらに本発明は、以下の（ａ）および（ｂ）に記載の工程を含む、二条性と六条性の中間性であるオオムギを選抜する方法を提供する。
（ａ）二条性と六条性の中間性であるオオムギと、二条性と六条性の中間性ではないまたは条性が不明であるオオムギとが交配された品種を作製する工程
（ｂ）本明細書に記載の方法により、工程（ａ）で作製されたオオムギが二条性と六条性の中間性であるか否かを判定する工程
【０１２５】
上記選抜方法において、二条性、六条性、中間性とは、上述の通りである。また、「二条性ではない」とは六条性であるまたは中間性であることを意味し、「六条性ではない」とは二条性であるまたは中間性であることを意味し、「中間性ではない」とは二条性であるまたは六条性であることを意味する。
【０１２６】
このように本発明は、二条性と識別されるオオムギ、六条性と識別されるオオムギ、または二条性と六条性の中間性と識別されるオオムギを、早期に選抜する方法を提供する。ここでいう「早期」とは、例えば出穂より前の状態を指し、好ましくは発芽直後の状態を指す。またオオムギは重複受精するため、播種前に胚乳の一部を切り取って抽出したDNAで遺伝子判定を行うことが可能である。オオムギが二条性であるという判定、六条性であるという判定、または二条性と六条性の中間性であるという判定は、上述の方法によって行うことが可能である。また、本発明の選抜方法を利用すれば、二条性の形質を有する品種、六条性の形質を有する品種、または二条性と六条性の中間性の形質を有する品種の育成を、従来よりも短期間で成し遂げることが可能となる。
【０１２７】
本発明はまた、被験化合物のスクリーニング方法に関する。
本発明のスクリーニング方法の第一の態様としては、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、被験化合物のスクリーニング方法が挙げられる。
（ａ）Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物に被検化合物を接触させる工程
（ｂ）Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物と被検化合物の結合を検出する工程
（ｃ）Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物と結合する被検化合物を選択する工程
【０１２８】
第一の態様では、まず、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物に被検化合物を接触させる。本発明のスクリーニング方法における「Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物」としては、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物および該転写産物より翻訳される翻訳産物が含まれる。ここでVrs1遺伝子の変異体とは、二条性であるVrs1遺伝子の変異体、六条性であるVrs1遺伝子の変異体、二条性と六条性の中間性であるVrs1遺伝子の変異体が含まれる。
本発明の方法における「被検化合物」としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被検化合物は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。
【０１２９】
本発明において「接触」は、以下のようにして行う。例えば、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物が精製された状態であれば、精製標品に被検化合物を添加することにより行うことができる。また、細胞内に発現した状態または細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または該細胞抽出液に被検化合物を添加することにより行うことができる。本発明における細胞としては、特に制限されないが、オオムギを含む植物由来の細胞が好ましい。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするDNAを含むベクターを、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体が発現している細胞へ導入する、または該ベクターをVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体が発現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。また、例えば、酵母または動物細胞等を用いた2ハイブリッド法を利用することも可能である。
【０１３０】
第一の態様では、次いで、上記Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物と被検化合物の結合を検出する。タンパク質間の結合を検出または測定する手段は、例えばタンパク質に付した標識を利用することにより行うことができる。標識の種類は、例えば、蛍光標識、放射標識等が挙げられる。また、酵素ツーハイブリット法や、BIACOREを用いた測定方法等、公知の方法によって測定することもできる。本方法においては、ついで、上記rs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物と結合した被検化合物を選択する。選択された被検化合物の中には、オオムギの穂の形態を改変するための化合物が含まれる。例えば、Vrs1遺伝子または二条性であるVrs1遺伝子の変異体の転写産物と結合した被検化合物は、二条性オオムギの条性または穂の形態の改変に有用であると考えられる。一方、六条性であるVrs1遺伝子の変異体や二条性と六条性の中間性であるVrs1遺伝子の変異体の転写産物と結合した被検化合物は、六条性オオムギや二条性と六条性の中間性オオムギの穂の形態を改変することや、赤かび病抵抗性を増加させるために有用であると考えられる。条性や穂の形態が改変されたオオムギは、たとえば生け花などに供することが出来、観賞用植物の分野において有用である。また、選択された被検化合物を、以下のスクリーニングの被検化合物として用いてもよい。
【０１３１】
また、本発明のスクリーニング方法の第二の態様として、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、被検化合物のスクリーニング方法を提供する。
（ａ）オオムギから採取した細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、上記転写産物の発現レベルを変化させた被検化合物を選択する工程
【０１３２】
第二の態様では、まず、オオムギから採取した細胞に被検化合物を接触させる。ここで「オオムギから採取した細胞」は、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体を有することが明らかな任意のオオムギ細胞である。「被検化合物」、「接触」の記載に関しては上記の説明の通りである。
【０１３３】
第二の態様では、次いで、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物の発現レベルを測定する。Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物をコードするmRNAを定法に従って抽出し、このmRNAを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、またはRT-PCR法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。さらに、DNAアレイ技術を用いて、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物の発現レベルを測定することも可能である。
【０１３４】
また、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物を含む画分を定法に従って回収し、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物の発現をSDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。また、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実施し、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。
【０１３５】
Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。該抗体は、上述のように、当業者に公知の方法により調製することが可能である。
【０１３６】
第二の態様においては、ついで、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物の発現レベルが、被検化合物を接触させないときに比べ変化する場合に、被検化合物を、オオムギの穂の形態を改変するための化合物として選択する。具体的には、被検化合物がVrs1遺伝子または二条性であるVrs1遺伝子の変異体の発現を増加させた場合には、該被検化合物は側列小穂の発達をより強く抑制することに有用であると考え、Vrs1遺伝子または二条性であるVrs1遺伝子の変異体の発現を減少させた場合には側列小穂の発達をより大きく発達させることに有用であると考えられる。条性や穂の形態が改変されたオオムギは、たとえば生け花などに供することが出来、観賞用植物の分野において有用である。
【０１３７】
本発明のスクリーニング方法の第三の態様は、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、被検化合物のスクリーニング方法である。
（ａ）Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｄ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを変化させた被検化合物を選択する工程
【０１３８】
第三の態様では、まず、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体のプロモータ―領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したDNAを有する細胞または細胞抽出液を提供する。
第三の態様において、「機能的に結合した」とは、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体のプロモータ―領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体のプロモータ―領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体のプロモータ―領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。
上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるCAT遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）およびGFP遺伝子等を挙げることができる。
【０１３９】
第三の態様では、次いで、上記細胞または上記細胞抽出液に被検化合物を接触させる。次いで、該細胞または該細胞抽出液における上記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。「被検化合物」および「接触」の記載に関しては上記の説明の通りである。
【０１４０】
レポーター遺伝子の発現レベルは、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がCAT遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポーター遺伝子がlacZ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、β-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるGlucuron（ICN社）の発光や5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-グルクロニド（X-Gluc）の発色を検出することにより、さらに、GFP遺伝子である場合には、GFPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
【０１４１】
第三の態様においては、ついで、上記レポーター遺伝子の発現レベルが、被検化合物を接触させないときに比べ変化する被検化合物を選択する。具体的には、被検化合物がVrs1遺伝子または二条性であるVrs1遺伝子のプロモーター領域の下流に結合したレポーター遺伝子の発現を増加させた場合には、該被検化合物は側列小穂の発達をより強く抑制することに有用であると考えられる。一方、被検化合物がVrs1遺伝子または二条性であるVrs1遺伝子のプロモーター領域の下流に結合したレポーター遺伝子の発現を減少させた場合には、側列小穂の発達をより大きく発達させることに有用であると考えられる。条性や穂の形態が改変されたオオムギは、たとえば生け花などに供することが出来るため、観賞用植物の分野において有用である。
【０１４２】
本発明はまた、被検ゲノム断片がVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体によりコードされるタンパク質の標的配列を有するか否かを判定する方法であって、以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含み、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体によりコードされるタンパク質が、任意の被検ゲノム断片と機能的に結合したレポーター遺伝子を発現させた場合に、該任意の被検ゲノム断片がVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体によりコードされるタンパク質の標的配列を有するゲノム断片であると判定されることを特徴とする方法を提供する。
（ａ）細胞または細胞抽出液において、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体によりコードされるタンパク質と、任意のゲノム断片と機能的に結合したレポーター遺伝子を有するDNAを接触させる工程
（ｂ）レポーター遺伝子の発現の有無を測定する工程
【０１４３】
本発明のゲノム断片をスクリーニングする方法においてはまず、細胞または細胞抽出液において、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体によりコードされるタンパク質と、任意のゲノム断片と機能的に結合したレポーター遺伝子を有するDNAを接触させる。ここで「機能的に結合した」とは、上述の通りである。また、ゲノム断片の塩基配列および長さには制限はない。ここで「接触」は、例えば、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物が精製された状態であれば、該精製標品と、任意のゲノム断片と機能的に結合したレポーター遺伝子を有するDNAを、細胞抽出液中にて混合することにより行うことができる。また、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体の転写産物が細胞内に発現した状態または細胞抽出液内に含まれる状態であれば、それと、任意のゲノム断片と機能的に結合したレポーター遺伝子を有するDNAを混合することも可能である。ここで、任意のゲノム断片と機能的に結合したレポーター遺伝子を有するDNAは、それを発現可能に有するベクターの中に組み込まれたものであってもよい。
【０１４４】
本方法においては、次いで、レポーター遺伝子の発現の有無を測定する。レポーター遺伝子の発現もまた、該レポーター遺伝子の種類に応じて、前記の方法により測定することができる。
【０１４５】
本方法においては、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体によりコードされるタンパク質が、任意のゲノム断片と機能的に結合したレポーター遺伝子を発現させた場合に、該任意のゲノム断片がVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体によりコードされるタンパク質の標的配列（プロモーター配列、エンハンサー配列等が挙げられるが、これらに限定されない）を有するゲノム断片であると判定される。
【０１４６】
さらに本発明においては、被検ゲノム断片がVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体によりコードされるタンパク質によって発現制御される遺伝子を有するか否かを判定する方法であって、以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含み、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体によりコードされるタンパク質が任意の被検ゲノム断片上に存在する遺伝子を発現させた場合に、該任意の被検ゲノム断片がVrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体によりコードされるタンパク質によって発現制御される遺伝子を有すると判定されることを特徴とする方法を提供する。
（ａ）細胞または細胞抽出液において、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体によりコードされるタンパク質と、任意のゲノム断片を有するDNAを接触させる工程
（ｂ）任意のゲノム断片からの遺伝子発現の有無を測定する工程
【０１４７】
本発明の遺伝子のスクリーニング方法においては、まず、細胞または細胞抽出液において、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体によりコードされるタンパク質と、任意のゲノム断片を有するDNAを接触させる。ここで「接触」は上述の通りである。
【０１４８】
本発明の遺伝子のスクリーニング方法においては、次に、任意のゲノム断片からの遺伝子発現の有無を測定する。発現の有無は、上述の方法によって適宜測定することが可能である。ゲノム断片から発現した遺伝子は、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体によりコードされるタンパク質によってその発現が制御される遺伝子である。
【０１４９】
本発明はまた、上記に記載のスクリーニング方法に用いるためのキットに関する。このようなキットには、上記に記載のスクリーニング方法の検出工程や測定工程に使用されるものを含みうる。例えば、Vrs1遺伝子またはVrs1遺伝子の変異体、任意のゲノム断片の発現レベルの測定に必要とされるプローブ、プライマー、抗体、染色液等を挙げることができる。その他、蒸留水、塩、緩衝液、タンパク質安定剤、保存剤等が含まれていてもよい。
【実施例】
【０１５０】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕条性遺伝子vrs1の連鎖地図作成
二条性を示すオオムギ品種「DebreZeit29」と六条性を示す突然変異体「New GoldenM13」を交配し、464個体からなるF2集団を作成して連鎖地図を作成し、さらに二条性を示すオオムギ品種「Golden Promise」と六条性を示すオオムギ品種「アズマムギ」を交配して1106 個体からなるF2集団を作成して連鎖地図を作成した(Komatsuda T, K. Tanno (2004) Comparative high resolution map of the six-rowed spike locus 1 (vrs1) in several populations of barley, Hordeum vulgare L. Hereditas 141: 68-73)。また、二条性を示すオオムギ品種「Golden Promise」と六条性を示すオオムギ品種「アズマムギ」を交配して新たに1781のF2集団を分析に加え、高精度連鎖地図を作成した。
【０１５１】
〔実施例２〕整列化BAC作成
2.1 材料と方法
2.1.1 BACライブラリーのPCRスクリーニング
オオムギ品種Morexで作成されたBACライブラリーのDNAを使って、PCRスクリーニングを行った。スクリーニングは、合計816枚の384穴プレート、すなわち313344個のBACクローンから出発した。まず、プレート毎に培養した細胞を収集して一つにまとめ、BACのプールDNAを標準アルカリ法で抽出した。次に、プールDNAを10プレート分ずつまとめてスーパープールDNAを都合８２本作成した。
【０１５２】
目的遺伝子と連鎖するPCRマーカーを用いて、まず、スーパープールDNAのスクリーニングを試みた。すなわち、PCRマーカーとしてのDNAが増幅されたスーパープールDNAについてのみ、構成する10プールDNAをスクリーニングした。PCRマーカーとしてのDNAが増幅されたプールDNAについて、対応する384穴プレートの各大腸菌を直接PCRの鋳型としてスクリーニングした。PCRマーカーとしてのDNAが増幅された大腸菌を12.5μg/mlのchloramphenicolを含むLB 培地で 37 oCで培養した。
【０１５３】
PCR反応液は（10μl）、0.25 units ExTaq polymerase （Takara, Tokyo, Japan）、0.3μMの各プライマー、200μMの各dNTPs、1〜4 mM MgCl2、および 1x PCR緩衝液［Takara 1X: 25 mM TAPS（pH 9.3、25oC）、50 mM KCl、1 mM 2-mercaptoethanol］を含む。PCR 条件は、はじめに94℃で3分間加熱したのち、以下の反応を30回繰り返した：
変性反応：94℃にて30秒、
再会合反応：マーカーによって50℃〜68.5℃で30秒、
伸長反応：72℃で、マーカーによって0.5〜 2分、
最後に、72℃で7分間の反応を行った。増幅DNA は、0.5X TBE緩衝液［1X TBE: 89 mM Tris-borate、2mM EDTA（pH 8.0）］中にて、1-1.5% のアガロースゲル（Agarose ME、Iwai Kagaku、Tokyo、Japan）上で電気泳動により分離し、エチジウムブロミドで染色して観察した。
【０１５４】
2.1.2 コンティグの整列化
一つのPCRマーカーで選択された複数のBACのDNAをHindIIIで切断し、1%アガロースゲルで電気泳動してフィンガープリントを行ない、整列させた。この整列を確かめる目的で、BACの塩基配列をもとに作成されたPCRマーカーで増幅DNAの有無を確認した。ここで使用したPCRマーカーが第２染色体に座乗することは、オオムギーコムギ染色体添加系統並びに高密度連鎖地図解析によってあらかじめ確かめられた。
【０１５５】
2.2 結果と考察
条性遺伝子領域をカバーする整列化BACを作成するため、オオムギの染色体歩行を行った。染色体歩行は条性遺伝子vrs1と組み換えないPCRマーカーであるAFLP2と、vrs1と１個体のみ組み換えるマーカーであるAFLP1から同時に開始した。AFLP1ではBACクローンM102J11（I.D.以下同様）が単離された（以下では、単一のPCRマーカーで複数のBACがスクリーニングされても、BAC整列化に最低限必要なBACについてのみ記述する）。AFLP2ではM111L15とM351N10が単離された。M351N10 BACのT7側末端の塩基配列を決定してSTSマーカー（351N10-T7）を作成し、他のBACのDNAに対してPCR増幅を試みたところ、M102J11およびM111L15において共通に増幅が認められ、M102J11およびM111L15が部分的に重複していることが明らかになった。同時に連鎖地図との比較によってM102J11が染色体動原体側、M111L15が末端側に向いている事が明らかになり、vrs1はM102J11を起点に末端方向に存在すると判断された。そこでM111L15から末端方向に向けて染色体歩行を継続した。
【０１５６】
M111L15のHindIII断片（111L15-f1-F）をSTSマーカー化し、PCRスクリーニングでM669N11を単離した。M669N11のT7末端塩基配をもとにSTSマーカー（M669N11-T7）を作成し、PCRスクリーニングでM045M08とM572D24を単離した。M572D24のHindIII断片（M572D24-fC-R）をSTSマーカー化し、PCRスクリーニングでM185K11を単離した。M185K11の全長のDNA塩基配列を決定し、その配列をもとにSTSマーカー（E18）を作成し、PCRスクリーニングでM053F18を単離した。M053F18のT7末端塩基配をもとにSTSマーカー（M053F18-T7）を作成したところ、vrs1と6個体組み換え、かつAFLP1とは反対の染色体末端方向にマップされた。以上のことから、条性遺伝子vrs1がM102J11、M111L15、M045M08、M185K11、M053F18のいずれかに存在すると判断された。この５つのBACで形成されるコンティグは長さが推定453kbである。このうちAFLP1からE18の距離は353kbにわずかに１個体のみ組み換えが観察されたのに対し、E18からM053F18-T7の間は86kbしかないのに6個体の組み換えが観察され、組み換え頻度が不均一であることが示唆された。すなわち、AFLP1からM053F18-T7に渡るマーカーと条性遺伝子vrs1が連鎖している可能性が高いと示唆された（図３）。
【０１５７】
〔実施例3〕BACコンティグの塩基配列解析
3.1 材料と方法
3.1.1 BAC塩基配列決定
各BACクローンからQIAGEN Large-Construct Kit（QIAGEN GmbH, Hilden Germany）でBAC DNAを抽出した。DNAは超音波処理によってランダムに分断し、電気泳動でサイズを選択し、pUC18ベクターにライゲートした。大腸菌DH10B株をプラスミドで形質転換し、ショットガンライブラリーを作成した。平均挿入サイズが2kbと5kb二種類のショットガンライブラリーを作成した。ライブラリーあたり1000個のクローンの両側末端配列をDye-terminator法で決定しキャピラリーシーケンサーで解析した。合計4000個のショットガンシーケンスのベースコールを行い、Phred/phrap プログラム （http://www.phrap.org/phredphrapconsed.html）でアッセンブルした。アッセンブルされた塩基配列は、BACのクローニングサイトの塩基配列およびブリッジクローンの両末端塩基配列を用いて正しく順序付けして並べた。ギャップはブリッジクローン全体の塩基配列をプライマーウオーキングあるいはトランスポゾンシーケンシングで読むことによって解消した。
【０１５８】
3.1.2 塩基配列解析
得られたDNA塩基配列をGraingenes Blast against Triticeae repeat database （http://wheat.pw.usda.gov/GG2/blast.shtml）で解析した。反復配列領域を除いたDNA塩基配列をTIGR plant repeat and checked against Grameneae repeat database（http://tigrblast.tigr.org/euk-blast/index.cgi?project=plant.repeats）で解析した。以上の配列解析で既知の反復配列とヒットしない領域について、NCBI nucleotide-nucleotide blast （blastn） against ESTs database （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）で解析した。
【０１５９】
一方、得られたDNA塩基配列406kb上の遺伝子予測をするためにRiceGAAS （http://ricegaas.dna.affrc.go.jp/） および GeneMark.hmm （http://opal.biology.gatech.edu/GeneMark/eukhmm.cgi）による解析を行った。RiceGAAS は GENSCAN、RiceHMM、MZEFなど複数のプログラムによる遺伝子予測並びにBLASTX検索を同時に行う。GeneMark.hmmはオオムギを含むいくつかの真核生物のORFsを予測することが出来る。予測されたタンパク質のアミノ酸配列との類似性検索をBlastp検索で行った。
【０１６０】
3.2 結果と考察
3.2.1 BAC塩基配列決定
4個のBAC（M102J11、M111L15、M045M08、M185K11）の全塩基配列のうち重複部分を除き、406,323bpのバーチャルゲノムコンティグを得た。102J11の小さなギャップは解消しなかった。理由は、vrs1はこのギャップには存在せず、406,323bpのバーチャルゲノムコンティグに存在することが、後述するマーカー解析で明らかになったためである。重複部分において、双方の塩基配列が一致しない部分が５カ所だけあった。すなわち、３箇所の１塩基置換と１カ所の挿入・欠失（29 base）、および１カ所のTA反復配列の反復回数の違いである。後述するvrs1候補遺伝子領域ではこのような不一致は存在しなかった。
【０１６１】
3.2.2 vrs1候補遺伝子の同定
Blastn解析から406,323 bpの配列が麦類の19のESTs塩基配列と類似することが明らかになった。このうち4個のESTは406,323 bpの配列中での反復が確認された。残る15のESTのうち、12は反復配列であることがオオムギーコムギ染色体添加系統を使った解析で明らかになったが、それ以外の3 EST（E18、E30、E42）はユニークな配列であっため、これらを遺伝マーカー化した。すなわち、GeneMark.hmmを用いてE18、E30、E42の検索を試みたところ、44個の遺伝子が予測された。このうちの大多数はゲノムの高度反復配列であり、形態形成との関連を明確に示唆する遺伝子はhomeobox遺伝子（本発明者らが仮に命名）一個だけであった（領域は164217-165109）。
【０１６２】
〔実施例4〕変異体解析
4.1 材料と方法
4.1.1二条性品種の突然変異体系統
二条品種の'Bonus'、'Foma'、'Kristina'から誘発した41系統のhexastichon（hex-v）と16系統のIntermedium spike-d（Int-d）突然変異体を利用した。hex-v突然変異体は穂の側列小穂がよく発達し、芒が伸長し、通常の六条性品種の穂ときわめて近い形態を示す。Int-d突然変異体は穂の側列小穂の発達程度が二条性と六条性の中間で、芒の長さは変異体系統によって様々であり、環境による影響も受ける。hex-vとInt-dはいずれもvrs1の対立遺伝子である。
【０１６３】
4.1.2 突然変異体系統のマーカー解析による条性を支配する遺伝子領域欠損系統の検索
SDS法により、突然変異体およびその原品種からゲノムDNAを抽出した。条性を支配する遺伝子の欠損を調べる目的でvrs1遺伝子と密に連鎖する16の分子マーカーを使用してPCR解析を行った。
【０１６４】
4.1.3 突然変異体系統の条性を支配する遺伝子のDNA塩基配列変異解析
突然変異体および原品種のゲノムDNAからオリゴヌクレオチドプライマーM111L15F84204（5'- GAAAGATGATTGCCAACTACC -3'）（配列番号：66）および M111L15R86329（5'- GTCATAACTCGGCAAACATAG -3'）（配列番号：67）を用いて条性を支配する遺伝子を増幅した。増幅断片のプラス・マイナス鎖は以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて塩基配列の決定を行った。ABI3130 automated DNA sequencerを使用した。
M111L15F84204（5'- GAAAGATGATTGCCAACTACC -3'）（配列番号：68）
M111L15R84648（5'- ATAGGGCTTCAAGATCGGCAG -3'）（配列番号：69）
M111L15F84603（5'- ATAGAGGCGACTTTTCCGGAG -3'）（配列番号：70）
M111L15R85203（5'- ACAAGAACAAGACGCTCGAGG -3'）（配列番号：71）
M111L15F85106（5'- CCAGTGTGAGTGTATGCGAGC -3'）（配列番号：72）
M111L15R85696（5'- TCACGATCCCTTCTTTCCCTC -3'）（配列番号：73）
M111L15F85545（5'- CCGGTGAAACTGAAGCTACTG -3'）（配列番号：74）
M111L15R86124（5'- TCCGAATGAAATGAACTCTGC -3'）（配列番号：75）
M111L15F86010（5'- CCACATTAGCATTGACCTGAG -3'）（配列番号：76）
M111L15R86329（5'- GTCATAACTCGGCAAACATAG -3'）（配列番号：77）
【０１６５】
4.2 結果と考察
4.2.1 突然変異体に見られるゲノム一部欠損による遺伝子の絞り込み
原品種には欠損が全く見つからなかったのに対し、6系統のhex-v突然変異体（hex-v.3、hex-v.10、hex-v.11、hex-v.18、hex-v.35、hex-v.41）においては明らかなゲノムの一部分の欠損が見つかった（図３）。これらの欠損は突然変異体における表現型の変化の原因と考えられる。共通の欠損領域は最大E30と669N11-T7の間であり、これは253kbにわたり（8998-262406）、この領域には前述のhomeobox遺伝子が含まれる。さらに、一個の欠損突然変異体（hex-v.33）において、欠損領域が最大351N10-T7（203-392）からE42の間の81kb（83226-164320）にわたった。これはhomeobox遺伝子の3'非翻訳領域を含む。
【０１６６】
以上の結果はhomeobox遺伝子が条性を支配する遺伝子座の原因遺伝子であることを強く示唆する。これらの欠損突然変異体はいずれも中性子線、X線、ガンマ線で誘発されたものである。一方、Int-d突然変異体には、PCR解析結果を見る限り欠損突然変異体は見られなかった。Int-d突然変異はその表現型や遺伝様式から、完全な機能欠損ではなく機能を多少保持した突然変異と考えられる。今回の実験結果は、既往知見とよく一致する。
【０１６７】
4.2.2 突然変異体系統の条性を支配する遺伝子のDNA塩基配列変異
homeobox遺伝子を含むゲノム塩基配列を原品種と突然変異体の間で比較した（図４）。原品種（3品種）のhomeobox遺伝子には塩基配列変異が全く認められなかった。これに対し、突然変異体においては、上記6欠損系統（hex-v.3、hex-v.10、hex-v.11、hex-v.18、hex-v.35、hex-v.41）のhomeobox遺伝子欠損を別にすれば、アミノ酸非同義置換や終止コドン形成をもたらす塩基置換が最も多く認められ、次に、読み枠シフトをもたらす小数塩基の欠失が多く認められた。さらに、mRNAスプライシングの修飾をもたらすと考えられる塩基置換も認められた。以上のことから、homeobox遺伝子が条性を支配する遺伝子座の原因遺伝子であることが証明された。
【０１６８】
〔実施例5〕遺伝子発現解析
5.1 材料と方法
屋外で播種後約5ヶ月のオオムギ植物から葉身および幼穂（1-50mm）を実体顕微鏡下で摘出した。RNAをTrizol method （Invitrogene）で抽出した。First strand cDNAはSuperscript II キット（Invitrogene）を用いて合成した。RT-PCRによる増幅DNAはアガロースゲルで電気泳動して観察した。
【０１６９】
5.2 結果と考察
homeobox遺伝子の発現は幼穂組織で観察され、葉身では観察されなかった（図５）。幼穂では1〜5 mm の長さのdouble ridge stage からawn primordium stageで特に活発な発現が認められ、発達段階が進むにつれて発現量は低下した。対照として用いたアクチン遺伝子は組織、発達段階の別なく一定量の発現が観察された。このようにhomeobox遺伝子は確かに転写活性を持ち、オオムギの条性が決定される以前から穂において発現することから、条性遺伝子vrs1の原因遺伝子であると証明された。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】二条性（ａ）および六条性（ｂ）のオオムギの穂を示す写真である。二条性の穂は平面的だが六条性の穂は立体的である。二条性（ｃ）および六条性（ｄ）のオオムギの三小穂を示す写真である。二条性の側列小穂において内・外頴、雄蕊、雌蕊は分化するが十分発達せず、とくに雌蕊は完全に退化するため稔性を持たない。六条性の穂では三小穂とも稔実する。
【図２】条性遺伝子vrs1をふくむオオムギBACコンティグ作成を示す図である。イネ（上段）とオオムギ（中段）の分子連鎖地図は高い相同性を示す。オオムギBACコンティグを下段に示す。vrs1の候補遺伝子が予測された（下段中央部、短い矢印）。
【図３−１】突然変異体のPCR 解析結果（欠損の検出）を示す図である。
【図３−２】図３−１の続きを示す図である。
【図４−１】突然変異体を使用した表現型と遺伝子型との相関を示す図である。(a) Complete deletion、(b) Deletion 616-823 with a segmental 26 bp duplication and inversion、(c) One nucleotide after Exon 1、(d) Two nucleotide before start of Exon 2、(e) Six nucleotide before start of Exon 3、FS: Frameshift。本図の見方は以下の通りである。例えばhex-v.42の変異体においては、107番目のArgがLeuに置換されていることを説明している。またこの時、塩基が「cgc」から「ctc」に置換されていることを説明している。さらに、この置換は、Exon2のHomeodomainにおいて起こっていることを説明している。他の変異体につても同様である。
【図４−２】図４−１の続きを示す図である。
【図４−３】図４−２の続きを示す図である。
【図４−４】図４−３の続きを示す図である。
【図５】vrs1遺伝子の発現解析結果を示す写真である。幼穂では発現が見られるが、葉では発現しない。二条品種（Ｋ，Ｂ）、六条品種（Ａ）いずれにも転写産物が認められるが、六条品種には読み枠にずれが生じている。Ｈは二条品種（Ｂ）から作成した六条性突然変異体で、遺伝子を含む領域に大規模な欠損があるため、転写産物は全く認められない。二条品種は機能のある遺伝子Vrs1を持ち、二条品種間にはアミノ酸配列レベルで変異が全く認められない。
【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図１】
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【図５】
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【配列表】
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