(57)【要約】      （修正有）【課題】創傷治癒過程で十分産生されないため、特に必要と考えられる１４型、１２型コラーゲンの新規な産生方法を提供する。【解決手段】筋分化誘導因子である、MyoDファミリー遺伝子、特にMyoD1，myogenin，myf5，またはMRF4を含むベクターを、動物細胞、特に哺乳動物または鳥類由来の細胞に導入する、コラーゲン、特に１４型、１２型コラーゲンの産生方法。細胞は、マウス中胚葉系幹細胞培養株、就中、MC3T3-E1，ATDC5，またはC3H10T1/2であることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋分化誘導因子を含むベクターが、細胞内に導入される、コラーゲンの産生方法。
【請求項２】
筋分化誘導因子が、MyoDファミリー遺伝子である、
請求項１記載のコラーゲンの産生方法。
【請求項３】
MyoDファミリー遺伝子が、MyoD1，myogenin，myf5，またはMRF4である、
請求項２記載のコラーゲンの産生方法。
【請求項４】
細胞が、動物由来の細胞である、
請求項１記載のコラーゲンの産生方法。
【請求項５】
細胞が、哺乳動物または鳥類由来の細胞である、
請求項４記載のコラーゲンの産生方法。
【請求項６】
細胞が、マウス中胚葉系幹細胞培養株である、
請求項５記載のコラーゲンの産生方法。
【請求項７】
マウス中胚葉系幹細胞培養株が、MC3T3-E1，ATDC5，またはC3H10T1/2である、
請求項６記載のコラーゲンの産生方法。
【請求項８】
コラーゲンが、14型コラーゲンまたは12型コラーゲンである
請求項１記載のコラーゲンの産生方法。
【請求項９】
ベクターを有する細胞において、
前記ベクターが、筋分化誘導因子を含む、
ことを特徴とする細胞。
【請求項１０】
筋分化誘導因子が、MyoDファミリー遺伝子である、
ことを特徴とする請求項９記載の細胞。
【請求項１１】
MyoDファミリー遺伝子が、MyoD1，myogenin，myf5，またはMRF4である、
ことを特徴とする請求項１０記載の細胞。
【請求項１２】
細胞が、動物由来の細胞である、
ことを特徴とする請求項９記載の細胞。
【請求項１３】
細胞が、哺乳動物または鳥類由来の細胞である、
ことを特徴とする請求項１２記載の細胞。
【請求項１４】
細胞が、マウス中胚葉系幹細胞培養株である、
ことを特徴とする請求項１３記載の細胞。
【請求項１５】
マウス中胚葉系幹細胞培養株が、MC3T3-E1，ATDC5，またはC3H10T1/2である、
ことを特徴とする請求項１４記載の細胞。
【請求項１６】
配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち、143〜651番目の間に分布し、CANNTG(NはA,C,G,Tのいずれか)あるいはそれに相同性の高い13箇所の特定の塩基配列を有し、コラーゲン産生のプロモーター活性を有するＤＮＡ。
【請求項１７】
プロモーター活性は、特定の塩基配列に筋分化誘導因子が結合することにより発生する、
請求項１６記載のＤＮＡ。
【請求項１８】
筋分化誘導因子が、MyoDファミリー遺伝子である、
請求項１７記載のＤＮＡ。
【請求項１９】
MyoDファミリー遺伝子が、MyoD1，myogenin，myf5，またはMRF4である、
請求項１８記載のＤＮＡ。
【請求項２０】
コラーゲンが、14型コラーゲンである
請求項１６記載のＤＮＡ。
【請求項２１】
配列表の配列番号２に示す塩基配列のうち、48〜1065番目の間に分布し、CANNTG(NはA,C,G,Tのいずれか)あるいはそれに相同性の高い30箇所の特定の塩基配列を有し、コラーゲン産生のプロモーター活性を有するＤＮＡ。
【請求項２２】
プロモーター活性は、特定の塩基配列に筋分化誘導因子が結合することにより発生する、
請求項２１記載のＤＮＡ。
【請求項２３】
筋分化誘導因子が、MyoDファミリー遺伝子である、
請求項２２記載のＤＮＡ。
【請求項２４】
MyoDファミリー遺伝子が、MyoD1，myogenin，myf5，またはMRF4である、
請求項２３記載のＤＮＡ。
【請求項２５】
コラーゲンが、12型コラーゲンである
請求項２１記載のＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲンの新規な産生方法に関する。また、本発明は、このコラーゲンの産生方法に用いられる、新規な細胞に関する。また、本発明は、この細胞に含まれる、新規なＤＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
14型コラーゲンは胎児組織に多く、成長に伴い減少する特徴を持ったコラーゲンである。しかし、その本質的な機能は十分解明されていない。老化に伴う皮膚の硬化や成人の創傷が瘢痕（傷跡）として長期間残存したり、また、腱損傷の後の可動性が減少したりするのは、14型コラーゲン等の胎児性コラーゲンが、創傷治癒過程で充分生産されないためであると考えられている。
【０００３】
12型コラーゲンは胎齢の早い時期より合成されはじめ、特に1型コラーゲンから形成される太い膠原線維線維束の表面に分布することから、より強靱なコラーゲン線維を形成するために重要と考えられているコラーゲン分子である。しかし、その本質的な機能は十分解明されていない。組織分布の検索より、12型コラーゲンは、腱、靱帯、真皮、角膜、骨膜並びに血管壁等の物理的強度を要求される組織中に多く見いだされる。アキレス腱等が一度切断されると、治癒後も創傷前の強度には復帰しないのは、12型コラーゲン等の線維調節コラーゲンが、創傷治癒過程で充分生産されないためであると考えられている。
【０００４】
14型コラーゲンを得る方法としては、つぎのような方法がある。
14型コラーゲンは、胎児皮膚および腱組織の微量成分であり、ウシ胎児皮膚および腱を液体窒素下で粉砕後、0.5モル酢酸溶液中に分散後、ペプシンにより消化することにより、14型コラーゲン分解物を含んだ成分が抽出される。
【０００５】
別法では、爪や内臓を取り除いたニワトリ胎児を粉砕後、4.5モル塩化ナトリウム溶液にて洗浄した後、0.5モル塩化ナトリウム溶液にて14型コラーゲンを含んだ成分を抽出する。その抽出液に最終濃度1.7モル塩化ナトリウムを加えた後の遠心上清に、さらに最終濃度2.6モル塩化ナトリウムを加えると、14型コラーゲンを含んだ成分が沈殿する。この沈殿を2モル尿素に再可溶化し、陰イオン交換カラムとゲル濾過カラムを組み合わせて精製を行う。しかし、1キログラムの出発材料から25〜35ミリグラムの純粋14型コラーゲンが得られるのみである（約４万分の１）。
【０００６】
12型コラーゲンを得る方法としては、つぎのような方法がある。
12型コラーゲンは、皮膚および腱組織の微量成分であり、ウシ胎児皮膚および腱を液体窒素下で粉砕後、0.5モル酢酸溶液中に分散後、ペプシンにより消化することにより、12型コラーゲン分解物を含んだ成分が抽出される。胎児組織を用いるのは、老化した組織よりコラーゲンが溶け出し易いためである。
【０００７】
別法では、ウシ胎児より採取した大腿骨頭軟骨（20g）を、液体窒素下で粉砕しパウダー状にする。この試料から、12型コラーゲンを含む成分を、タンパク分解酵素阻害剤を含んだ0.2 M 塩化ナトリウム緩衝液で抽出した後、塩化ナトリウムを4 Mに上昇させ、さらに、最終濃度 0.5 M の酢酸を加え、形成されたタンパク質沈殿を遠心分離により回収する。この沈殿を0.8 M 塩化ナトリウムを含む緩衝液に溶解した後、5〜20％ショ糖グラディエントを用いた超遠心により分離する（収量1 mg 程度、約２万分の１）。
【０００８】
近年、遺伝子組換え技術により、細胞へ外来遺伝子を導入することで、必要な蛋白質の大量生産が可能になった。
【０００９】
一方、「組換えＤＮＡ系におけるヒトプロコラーゲンおよびコラーゲンの合成」について、研究結果が報告されている（特許文献１参照。）。
【００１０】
コラーゲンは、分子構造としては３本鎖構造（トリプルへリックス）をとって生体内で機能することに注目し、特に、全く異なる３種類のポリペプチド鎖から成るヘテロトリマー構造を遺伝子工学的に合成する方法である。その合成方法は、細胞にそれぞれのサブユニットをコードする発現ベクターを導入させておき（最高で計３種類のベクター）、さらに、翻訳後に働く数種類の修飾酵素（コラーゲンの機能発現にはこの翻訳後修飾が重要）の発現ベクターをさらに細胞へ導入することで、遺伝子工学的に合成された分子は、より生体内の分子に近い機能を期待できる。
【００１１】
なお、発明者は、本発明に関連する技術内容を開示している（非特許文献１参照。）。
【００１２】
【特許文献１】特表２０００−５０８５４４
【非特許文献１】第140回日本獣医学会学術集会講演要旨集、金井美映、長嶋友子、木津雄介、新井克彦、「MyoDファミリーによるマウス14型コラーゲン遺伝子発現の制御」、2005年9月29日（木）、43ページ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上述したように、近年、遺伝子組換え技術により、細胞へ外来遺伝子を導入することで、必要な蛋白質の大量生産が可能になった。
【００１４】
しかし、14型コラーゲンは一本のサブユニット（α鎖）の分子量が21万ダルトンであり、分子構造としては３本鎖構造（トリプルへリックス）をとって生体内で機能するが、１分子の分子量としては63万ダルトンと巨大な分子を形成している。
【００１５】
12型コラーゲンは一本のサブユニット（α鎖）の分子量が19万ダルトンのショートフォーム並びに33万ダルトンのロングフォームの二種類が存在するが、これらは同一遺伝子に由来する（一つの遺伝子内において、転写開始点が２箇所存在するが、この理由は不明である）。分子構造としては３本鎖構造（トリプルへリックス）をとって生体内で機能するが、１分子の分子量としては57万ダルトン並びに99万ダルトンと巨大な分子を形成している。
【００１６】
これらのことから、分子の一部のペプチドを人工的に合成することは可能であるが、機能体分子としての14型コラーゲン、12型コラーゲンを現在の遺伝子工学的技術で合成することは不可能である。
【００１７】
一方、上述したように「組換えＤＮＡ系におけるヒトプロコラーゲンおよびコラーゲンの合成」について、研究結果が報告されている。しかし、この報告はあくまでもコラーゲンの遺伝子を細胞へ導入し合成させる方法をとっているので、上述した理由により、巨大な14型コラーゲン分子、12型コラーゲン分子の合成は不可能であろう。
【００１８】
このため、14型コラーゲン、12型コラーゲンをより容易にかつ大量に産生できる方法の開発が望まれている。
【００１９】
本発明は、このような課題に鑑みてなされたものであり、コラーゲンの新規な産生方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、このコラーゲンの産生方法に用いられる、新規な細胞を提供することを目的とする。
また、本発明は、この細胞に含まれる、新規なＤＮＡを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上記課題を解決し、本発明の目的を達成するため、本発明のコラーゲンの産生方法においては、筋分化誘導因子を含むベクターが細胞内に導入される。
【００２１】
ここで、限定されるわけではないが、筋分化誘導因子が、MyoDファミリー遺伝子であることが好ましい。また、限定されるわけではないが、MyoDファミリー遺伝子が、MyoD1，myogenin，myf5，またはMRF4であることが好ましい。また、限定されるわけではないが、細胞が動物由来の細胞であることが好ましい。また、限定されるわけではないが、細胞が哺乳動物または鳥類由来の細胞であることが好ましい。また、限定されるわけではないが、細胞がマウス中胚葉系幹細胞培養株であることが好ましい。また、限定されるわけではないが、マウス中胚葉系幹細胞培養株が、MC3T3-E1，ATDC5，またはC3H10T1/2であることが好ましい。また、限定されるわけではないが、コラーゲンが14型コラーゲンまたは12型コラーゲンであることが好ましい。
【００２２】
本発明の細胞は、ベクターを有する細胞において、前記ベクターが筋分化誘導因子を含むことを特徴とする。
【００２３】
ここで、限定されるわけではないが、筋分化誘導因子がMyoDファミリー遺伝子であることが好ましい。また、限定されるわけではないが、MyoDファミリー遺伝子が、MyoD1，myogenin，myf5，またはMRF4であることが好ましい。また、限定されるわけではないが、細胞が動物由来の細胞であることが好ましい。また、限定されるわけではないが、細胞が哺乳動物または鳥類由来の細胞であることが好ましい。また、限定されるわけではないが、細胞がマウス中胚葉系幹細胞培養株であることが好ましい。また、限定されるわけではないが、マウス中胚葉系幹細胞培養株が、MC3T3-E1，ATDC5，またはC3H10T1/2であることが好ましい。
【００２４】
本発明のＤＮＡは、配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち、143〜651番目の間に分布し、CANNTG(NはA,C,G,Tのいずれか)あるいはそれに相同性の高い13箇所の特定の塩基配列を有し、コラーゲン産生のプロモーター活性を有する。
【００２５】
ここで、限定されるわけではないが、プロモーター活性は、特定の塩基配列に筋分化誘導因子が結合することにより発生することが好ましい。また、限定されるわけではないが、筋分化誘導因子がMyoDファミリー遺伝子であることが好ましい。また、限定されるわけではないが、MyoDファミリー遺伝子が、MyoD1，myogenin，myf5，またはMRF4であることが好ましい。また、限定されるわけではないが、コラーゲンが14型コラーゲンであることが好ましい。
【００２６】
本発明のＤＮＡは、配列表の配列番号２に示す塩基配列のうち、48〜1065番目の間に分布し、CANNTG(NはA,C,G,Tのいずれか)あるいはそれに相同性の高い30箇所の特定の塩基配列を有し、コラーゲン産生のプロモーター活性を有する。
【００２７】
ここで、限定されるわけではないが、プロモーター活性は、特定の塩基配列に筋分化誘導因子が結合することにより発生することが好ましい。また、限定されるわけではないが、筋分化誘導因子がMyoDファミリー遺伝子であることが好ましい。また、限定されるわけではないが、MyoDファミリー遺伝子が、MyoD1，myogenin，myf5，またはMRF4であることが好ましい。また、限定されるわけではないが、コラーゲンが12型コラーゲンであることが好ましい。
【発明の効果】
【００２８】
本発明は、以下に記載されるような効果を奏する。
【００２９】
本発明は、筋分化誘導因子を含むベクターが細胞内に導入されるので、コラーゲンの新規な産生方法を提供することができる。
【００３０】
本発明は、ベクターを有する細胞において、前記ベクターが筋分化誘導因子を含むので、新規な細胞を提供することができる。
【００３１】
本発明は、配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち、143〜651番目の間に分布し、CANNTG(NはA,C,G,Tのいずれか)あるいはそれに相同性の高い13箇所の特定の塩基配列を有し、コラーゲン産生のプロモーター活性を有するので、新規なＤＮＡを提供することができる。
【００３２】
本発明は、配列表の配列番号２に示す塩基配列のうち、48〜1065番目の間に分布し、CANNTG(NはA,C,G,Tのいずれか)あるいはそれに相同性の高い30箇所の特定の塩基配列を有し、コラーゲン産生のプロモーター活性を有するので、新規なＤＮＡを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下、コラーゲンの産生方法、細胞、およびＤＮＡにかかる発明を実施するための最良の形態について説明する。
【００３４】
本発明の、コラーゲンの産生方法について説明する。
本発明の、コラーゲンの産生方法は、筋分化誘導因子を含むベクターが細胞内に導入される方法である。
【００３５】
細胞は、動物由来の細胞である。動物は、脊椎動物門、原索動物門、棘皮動物門、半索動物門、毛顎動物門、有鬚動物門 、触手動物門、節足動物門、舌形動物門、緩歩動物門、有爪動物門、星口動物門、ゆむし動物門、環形動物門、軟体動物門、曲形動物門、紐形動物門、扁形動物門、袋形動物門、有櫛動物門、刺胞動物門、または海綿動物門に属する。
【００３６】
細胞は、哺乳動物または鳥類由来の細胞である。
哺乳動物は、カモノハシ目、フクロネズミ目、アリクイ目、モグラ目、ツパイ目、ヒヨケザル目、コウモリ目、サル目、ネコ目、ゾウ目、ジュゴン目、ウマ目、イワダヌキ目、ツチブタ目、ウシ目、クジラ目、センザンコウ目、ネズミ目、ウサギ目、またはハネジネズミ目に属する。
【００３７】
鳥類は、ダチョウ目、シギダチョウ目、ホウカンチョウ目、キジ目 、カモ目、ミフウズラ目 、キツツキ目、キリハシ目、サイチョウ目、ヤツガシラ目、キヌバネドリ目、ブッポウソウ目、ネズミドリ目、カッコウ目、オウム目、アマツバメ目、ハチドリ目、エボシドリ目、フクロウ目、ハト目、ツル目、コウノトリ目、またはスズメ目に属する。
【００３８】
細胞は、マウス中胚葉系幹細胞培養株である。マウス中胚葉系幹細胞培養株としては、MC3T3-E1、ATDC5、C3H10T1/2、あるいは胚性腫瘍細胞P19または胚性幹細胞（ES細胞）などを採用することができる。
【００３９】
トランスフェクション（ＤＮＡ導入法）には、発現させたい遺伝子のクローニングされた環状プラスミドを導入する方法、発現させたい遺伝子のクローニングされた環状プラスミドを制限酵素で切断し線状化したものを導入する方法、または、ウイルスに発現させたい遺伝子を組み込んでそれを感染させる方法などを採用することができる。
【００４０】
発現させたい遺伝子のクローニングされた環状プラスミドを導入する方法は、遺伝子導入技法が簡便であるという利点がある。
【００４１】
発現させたい遺伝子のクローニングされた環状プラスミドを制限酵素で切断し線状化したものを導入する方法は、環状プラスミドを用いる方法と比較して、導入効率が高いという利点がある。
【００４２】
ウイルスに発現させたい遺伝子を組み込んでそれを感染させる方法は、簡便で、特殊な試薬・機器等は不要であるという利点がある。
【００４３】
トランスフェクションには、リポソーム法以外に、リン酸カルシウム法、および、電気穿孔法（エレクトロポレーション）などがある。リン酸カルシウム法は、ＤＮＡとリン酸カルシウムの共沈澱体を細胞に取り込ませる方法である。電気穿孔法（エレクトロポレーション）は、電気刺激で細胞に一過性に穴を開け、その間にＤＮＡを取り込ませる方法である。
【００４４】
筋分化誘導因子はMyoDファミリー遺伝子である。MyoDファミリー遺伝子は、MyoD1、myogenin、myf5、またはMRF4である。
【００４５】
MyoD1は、MyoDファミリー遺伝子のうち、C3H10T1/2を5’-アザシチジン（DNAメチル化阻害剤）で筋芽細胞へ分化させる過程において最も早く発見された因子であり、筋肉分化過程の極めて初期から発現する。
【００４６】
myogeninは、MyoDファミリー遺伝子のうち、ラット筋芽細胞株L6を分化させる過程において、MyoD1と相同性を有する因子として発見された。本因子は、筋芽細胞が増殖を停止し最終分化に入る際にその発現が誘導される。
【００４７】
myf5は、MyoD1と相同性を有する因子として発見された。筋肉分化過程の極めて初期から発現する。
【００４８】
MRF4は、MyoD1と相同性を有する因子として発見された。本因子は、筋芽細胞が増殖を停止し最終分化に入る際、あるいはさらに後期で発現し、筋管の成熟・維持に関与していると考えられている。
【００４９】
トランスフェクション後の細胞の培養法には、一過性発現型の培養法と安定発現型の培養法がある。一過性発現型の培養法は、トランスフェクション後の細胞を所定温度・所定時間培養する方法である。安定発現型の培養法は、トランスフェクション後の細胞を所定温度・所定時間培養したのち、細胞層をトリプシンにて分散・希釈し、ジェネティシン存在下で所定温度・所定時間培養する方法である。
【００５０】
トリプシンは、シャーレに接着した細胞を剥離させるための分解酵素である。細胞は、インテグリンという細胞接着蛋白質を介してシャーレに接着する。この蛋白質をトリプシンで分解することで細胞を剥離する。
【００５１】
一過性発現型の培養の場合は、トランスフェクション後に細胞を全部殺して、測定する。一方、安定発現型の培養の場合は、プラスミドが全ての細胞に入っているわけではないので、トランスフェクション後に、トランスフェクションされた細胞とされていない細胞とを分けて、トランスフェクションされている細胞のみを純化する必要がある。また、ここで用いた細胞に限らず多くの細胞は、シャーレに接着して増殖する性格を持っている。そこで、トランスフェクションして培養した後に、一度、トリプシンで細胞をシャーレより剥がして、その内の少量を再度シャーレにまき直し、そこにジェネティシンを加えることで、トランスフェクションされなかった細胞を死滅させる。
【００５２】
本発明では、すべてのプラスミドにネオマイシン耐性遺伝子を組み込んでいるため、ネオマイシン類似物質であるジェネティシンを使用する。なお、他の抗生物質耐性遺伝子を組み込んだプラスミドを使用する場合は、それに対応した抗生物質を使用する。
【００５３】
一過性発現型の培養法は、簡便であるという利点がある。
【００５４】
安定発現型の培養法は、遺伝子導入に使用するマウス中胚葉系幹細胞培養株が無限増殖系であるので、一度、遺伝子を導入してしまえば、同一細胞を永久に繰り返し使用できるという利点がある。
【００５５】
コラーゲンは、特に14型コラーゲンおよび12型コラーゲンである。14型コラーゲンは、生体内では胎児や子供の皮膚等に多く、加齢で減少する性質がある。14型コラーゲンが大量に産生できると、それを補う化粧品や補助食品等の添加剤として利用できるなどの利点がある。12型コラーゲンは、腱、靱帯、真皮、角膜、骨膜並びに血管壁等において物理的強度を付加し、より強靱な組織形成に寄与している。12型コラーゲンが大量に産生できると、それを補う化粧品や補助食品等の添加剤として利用できるほか、人工臓器作製時における物理的強度の調節因子として利用できるなどの利点がある。
【００５６】
本発明の細胞について説明する。本発明の細胞は、ベクターを有する細胞において、前記ベクターが筋分化誘導因子を含むものである。
【００５７】
本発明のＤＮＡについて説明する。
マウス14型コラーゲン遺伝子は15番染色体上に存在し、その全長は234,600塩基であることは、データベース上で公知となっている。配列表の配列番号１に示す塩基配列は、そのうち、9,328番目から10,494番目の1,167塩基である。
【００５８】
本発明のＤＮＡは、配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち、143〜651番目の間に分布し、CANNTG(NはA,C,G,Tのいずれか)あるいはそれに相同性の高い13箇所の特定の塩基配列を有し、コラーゲン産生のプロモーター活性を有するものである。以下の13の配列で、特定の塩基配列を下線で示す。左の数字は配列表の配列番号１に示された塩基配列の位置に対応する。
【００５９】
143 (+) GGAGATCTGCTG
144 (+) GAGATCTGCT
147 (-) ATCTGCTGGT
166 (+) TAAAACTGTC
345 (+) GGACGAGTGCTG
346 (-) GACGAGTGCT
464 (+) CCCGGCTGCC
477 (+) CGCACCTGGG
485 (+) GGTCGGCTGCCA
486 (-) GTCGGCTGCC
611 (-) CGCCACCACTTT
614 (-) CACCACTTTTGG
642 (+) CGCAGCGGTT
【００６０】
なお、特定の塩基配列は、これらにいろいろな塩基置換、欠損、付加、挿入が加わっても、コラーゲン産生のプロモーター活性を保持している限り、本発明に用いることができる。
【００６１】
特定の塩基配列は、MyoDファミリーが転写因子として結合する領域であり、その結合配列をE-box (Eボックス)と呼び、その塩基配列はCANNTGを含む。この領域にMyoDファミリーが結合し、その結果、14型コラーゲン遺伝子の発現を活性化しうる配列である。
【００６２】
マウス12型コラーゲン遺伝子は９番染色体上に存在し、その全長は117,706塩基であることは、データベース上で公知となっている。配列表の配列番号２に示す塩基配列は、そのうち、536番目から1,644番目までの1,109塩基である。
【００６３】
本発明のＤＮＡは、配列表の配列番号２に示す塩基配列のうち、48〜1065番目の間に分布し、CANNTG(NはA,C,G,Tのいずれか)あるいはそれに相同性の高い30箇所の特定の塩基配列を有し、コラーゲン産生のプロモーター活性を有するものである。以下の30の配列で、特定の塩基配列を下線で示す。左の数字は配列表の配列番号２に示された塩基配列の位置に対応する。
【００６４】
48(+) CCCATCTCTA
125(+) GGCGGCTGTC
130(-) GCCGCCTGCC
179(-) GGCCTCTGTC
190(-) TGCACGCGGC
202(-) ACTAACTGTC
250(-) CCCCTCTGTC
262(-) TCCACCTTCC
277(-) GCCACCGTCC
290(-) TGCATCTCCG
309(-) CCCCTTTGTC
318(+) TCCCGCTGCT
346(+) CCCACTTCTC
475(+) TGCGGCTGTC
540(+) GCCACCTCAC
571(+) TGCACACGTT
618(+) ATCACCCGTG
652(-) AACGCCTGAG
635(+) TCCACCTTCT
735(+) GGCCGCTGCA
757(+) CGCAGCTGCA
772(+) TCCCCCTGCC
804(+) CGCTGCTGCT
835(+) CACACCGGCG
848(+) GCCAGGTGCT
950(+) GGCTTCTGTT
973(+) CCCACCCCTC
1016(-) GCCACTTTCC
1025(+) TGCACCTTAA
1065(-) AGCCCCTGCT
【００６５】
なお、特定の塩基配列は、これらにいろいろな塩基置換、欠損、付加、挿入が加わっても、コラーゲン産生のプロモーター活性を保持している限り、本発明に用いることができる。
【００６６】
特定の塩基配列は、MyoDファミリーが転写因子として結合する領域であり、その結合配列をE-box (Eボックス)と呼び、その塩基配列はCANNTGを含む。この領域にMyoDファミリーが結合し、その結果、12型コラーゲン遺伝子の発現を活性化しうる配列である。
【００６７】
プロモーター活性は、特定の塩基配列に筋分化誘導因子が結合することにより発生する。コラーゲン遺伝子上において、蛋白質をコードする部分（エクソン）以外の塩基配列のうち、第１エクソンの上流域である5’-flanking領域および第１イントロン内には、当該遺伝子の転写を変化させうるある特定の塩基配列が一般に複数箇所にわたり存在する。その「特定の塩基配列」に、どの程度「当該遺伝子の転写を変化させうる」力価があるかを、プロモーター活性として評価する。一般には、その「特定の塩基配列」の下流に極めて高感度に検出できるホタルルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子をつなぎ、プロモーター活性をそのレポーター遺伝子の活性に置き換えて評価する。
【００６８】
部位特異的突然変異導入法とは、PCR法の応用技術であり、使用するPCRプライマーに意図的にミスマッチ（変異）を導入し、変異を導入したいプラスミドを鋳型としてPCRを行う。その結果、変異の導入されたプラスミドが増幅されるが、鋳型として用いたプラスミドも生成物中に残存している。鋳型として用いたプラスミドは大腸菌を用いて増やしたものであるが、この際、プラスミドの核酸はメチル化される。一方、PCRで新生されたプラスミドの核酸はメチル化されていない。この両者の違いを利用して、鋳型プラスミドを除去する。すなわち、メチル化されたプラスミドのみ切断しうるDNA制限酵素 DpnIで消化することで、PCRで新生されたプラスミド、すなわち、変異が導入されたプラスミドのみが残存する、これを再度大腸菌にて増やして実験に用いる（Kato T, Katabami K, Takatsuki H, Han SA, Takeuchi K, Irimura T, Tsuji T.Characterization of the promoter for the mouse alpha 3 integrin gene., Eur J Biochem. 2002 Sep;269(18):4524-4532.）。
【００６９】
以上のことから、本発明を実施するための最良の形態によれば、筋分化誘導因子を含むベクターが細胞内に導入されるので、コラーゲンの新規な産生方法を提供することができる。
【００７０】
また、本発明を実施するための最良の形態によれば、ベクターを有する細胞において、前記ベクターが筋分化誘導因子を含むので、新規な細胞を提供することができる。
【００７１】
また、本発明を実施するための最良の形態によれば、配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち、143〜651番目の間に分布し、CANNTG(NはA,C,G,Tのいずれか)あるいはそれに相同性の高い13箇所の特定の塩基配列を有し、コラーゲン産生のプロモーター活性を有するので、新規なＤＮＡを提供することができる。
【００７２】
また、本発明を実施するための最良の形態によれば、配列表の配列番号２に示す塩基配列のうち、48〜1065番目の間に分布し、CANNTG(NはA,C,G,Tのいずれか)あるいはそれに相同性の高い30箇所の特定の塩基配列を有し、コラーゲン産生のプロモーター活性を有するので、新規なＤＮＡを提供することができる。
【００７３】
なお、本発明は上述の発明を実施するための最良の形態に限らず本発明の要旨を逸脱することなくその他種々の構成を採り得ることはもちろんである。
【実施例】
【００７４】
つぎに、本発明にかかる実施例について具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではないことはもちろんである。
【００７５】
対象とする細胞としては、マウス中胚葉系幹細胞培養株を用いる。これは、正常組織由来初代培養系皮膚線維芽細胞である。具体的には、MC3T3-E1、ATDC5、およびC3H10T1/2を用いた。MC3T3-E1、ATDC5、およびC3H10T1/2は、理化学研究所・細胞開発銀行より入手した。
【００７６】
MC3T3-E1は、株化細胞であり、マウス頭蓋冠由来細胞で骨細胞への分化能を保持している。ATDC5は、株化細胞であり、マウス胚性腫瘍細胞（EC 細胞）由来で軟骨細胞への分化能を保持している。C3H10T1/2は、株化細胞であり、マウス胚由来細胞で骨格筋細胞、軟骨細胞および脂肪細胞への多分化能を保持している。
【００７７】
実施例１
14型コラーゲンの発現促進の実験（一過性発現型の培養法）
【００７８】
対象とする細胞としてはMC3T3-E1を用いた。
トランスフェクション前日に、細胞を、10%ウシ胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地を用いて、直径10cmシャーレ（5×105 cells）に播種した。翌日、培養液を、5%ウシ胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地に交換し、2〜3時間の前培養を行った。
【００７９】
MyoD ファミリー遺伝子（MyoD1）のクローニングされた環状プラスミドは、大腸菌へトランスフォームし、次いでコロニーをLB培地にて増殖させ、これよりプラスミドを市販キット（キアゲン製、Endofree Plasmid Maxi Kit）にて精製して作製した。
【００８０】
Opti-MEM（Gibco BRL、Grand Island, NY, USA）400μlに、FuGENE6（Roche Diagnostics K.K.）12μlを1滴ずつマイクロピペットで加えて軽く混ぜて混合溶液を作製した。MyoD ファミリー遺伝子（MyoD1）のクローニングされた環状プラスミド1μgに1滴ずつ上記混合溶液をマイクロピペットで加え、室温にて15分間静置した。このプラスミド溶液を各wellの細胞に1滴ずつ混ぜながら加え、均一に行きわたるようにシャーレを前後左右にゆっくり動かした。
【００８１】
37℃インキュベーターで20時間培養したのち、細胞層を可溶化してRNAを抽出し、14型コラーゲンmRNAを検出した。mRNAの検出方法は、以下のリボヌクレアーゼ・プロテクションアッセイによった。
【００８２】
(1)Total RNA の抽出
最初に、遊離した細胞の入った培養皿にTRIZOL Reagent（Invitrogen、Carlsbad、California、USA）を5 ml入れて細胞を回収し、10 mlポリプロピレンレンチューブに移した。つぎに、CIAAを1 ml加えてよく攪拌した後、8,000 rpm、4℃、1時間遠心分離した。つぎに、上清を新しい10 mlポリプロピレンチューブに回収し、イソプロパノール3 ml加えて転倒混和し10分間室温に静置した。つぎに、8,000 rpm、4℃、20分間遠心分離し、上清を除去した。つぎに、沈殿を80%エタノール洗浄して風乾させた後、dimethyl pyrocarbonate処理滅菌milli-Q （以下DEPCQ）300 μlで溶かし、1.5 mlマイクロチューブに移した。つぎに、エタノール1000 μlと3 M NaOAC 30 μl加えて転倒混和し、−80℃にて保存した。
【００８３】
(2)プローブ作製
DIG RNA LABELLING KIT（Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、Germany）を使用した。
最初に、プラスミドDNA濃度が3 μg/16 μlになるようサンプルをmilli-Qで調製した。つぎに、プラスミドを線状化するため、適当なDNA制限酵素で切断した。すなわち、アンチセンスRNA合成にSp6ポリメラーゼを使用する場合はNco I、T7ポリメラーゼを使用する場合はSal Iを使用し、37℃ にて一晩インキュベートした。つぎに、制限酵素処理後、フェノール/クロロフォルムにより除タンパクを行った。つぎに、エタノール沈殿後に、4℃、12,000 rpmで 20分間遠心分離して上清を除去し、80％エタノールで沈殿を洗浄して乾燥させ、滅菌milli-Q 13 μlにて溶解させた。つぎに、RNase阻害剤であるRNase OUT（Invitrogen）を1 μl、DIG KITのBuffer、DIG-UTP RNA LABLLING MIXをそれぞれ 2 μl入れてタッピングにより軽く混ぜた。つぎに、T7あるいは、Sp6 RNAポリメラーゼを 2 μl入れピペッティングし、37℃ にて1時間インキュベートした。つぎに、反応後、DIG KITのDNase 2 μlを入れて激しく攪拌混和して合成反応を停止させ、37℃にて20分間インキュベートした。つぎに、0.2 M EDTA 2 μlを入れてDNaseの反応を止め、DEPCQ 80 μl、エタノール300 μl、3 M NaOAC 10 μlを加え、−80℃ にて保存した。
【００８４】
(3)ハイブリダイゼーション
最初に、プローブと細胞由来RNAを適宜混合、エタノール沈殿し行った後、12,000 rpm、4℃、20分間遠心分離して上清を除去後、沈殿を80％エタノールにて洗浄した。つぎに、Hybridization Buffer（RPA KIT II）10 μlにて沈殿を溶解し、90℃にて4分間インキュベートした後、44.5℃にて1晩ハイブリダイゼーションを行った。
【００８５】
(4)RNase処理〜ナイロンメンブレンへのブロッティング
最初に、RPA KIT IIのRNase A/T1 MIXをglyco blueを添加したRNase Digestion Bufferで1 μl/100 μlになるよう調整し、1サンプルにつき100 μlずつ入れ、37℃にて30分間インキュベートした。つぎに、RNase Inactivation/Precipitation Mix（RPA KIT II）を150 μl入れ激しく攪拌し、−30℃ にて30 分間インキュベートした。つぎに、12,000 rpm、4℃、20分間遠心分離して上清を除去し、Gel Loading Solution（RPA KIT II）4 μlにて沈殿を溶解させた後、90℃にて4 分間熱変性させた。つぎに、泳動Bufferとして1×TBEを用いて、8 M 尿素変性ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行い、泳動終了後0.5×TBE Bufferにてゲルの平衡化を20分間行った。つぎに、平衡化終了後、7 cm×10 cmのナイロンメンブレンに75 ｍA/枚の定電流で45分間ブロッティングした。つぎに、ブロッティング終了後、ナイロンメンブレンを濾紙上に載せ、UV-crosslinker（Fs-1500、Funakoshi、Tokyo、Japan）にて1200 mJ/cm2の条件でメンブレン上に核酸を固定した。両面行った。つぎに、1×Dig Blocking soln 15 ml/枚に対し0.5 ml/枚の10% TWEEN20を入れた溶液をプラスチックバックにナイロンメンブレンと共に入れ、37℃にて30分間ブロッキングした。つぎに、Blocking solnを除去した後、1×Dig Blocking soln 10 ml/枚に対しAnti-digoxigenin（Roche Diagnostics GmbH）を0.5 μl/枚入れた溶液をバックに入れ、4℃にて1晩インキュベートし、抗体で標識した。
【００８６】
(5)洗浄〜現像
最初に、ナイロンメンブレンをDIG緩衝液（0.3% Tween-20、0.15 M NaCl／0.1 Mマレイン酸緩衝液、pH 8.0）にて洗浄し、アルカリフォスファターゼ緩衝液（100 mM NaCl、5 mM MgCl2、100 mM Tris-HCl、pH 9.6）にてナイロンメンブレンを平衡化させた。つぎに、アルカリフォスファターゼ緩衝液2 ml中に1% Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro) tri-cyclo[3.3.1.13,7]decan}-4-yl)phenyl phosphate（以下CSPD、Roche Diagnostics GmbH）を20 μl加え、vortexにて攪拌させた。つぎに、メンブレンをCSPD溶液に浸して遮光振とうした後、濾紙上にて乾燥させた。つぎに、メンブレンのシグナルはX-ray films（Hyperfilm ECL、Amersham Pharmacia Biotech UK、Amersham、Buckinghamshire、England）に露光させ、現像液にRENDOL（FUJI PHOTO FILM、Tokyo、Japan）、停止液に1.5％ 酢酸溶液、定着液にRENFIX（FUJI PHOTO FILM）をもちいてフィルムの現像をした。
【００８７】
実験結果について、図１を参照しながら説明する。細胞はMC3T3-E1を用い、MyoDファミリー遺伝子はMyoD1を用いた。図１において、「empty」は、MyoD ファミリー遺伝子を保持していない空のベクターであり、ベクター名がpcDNA3.1(Invitrogen社製)を細胞へトランスフェクションした実験結果である。「MyoD1」は、ベクターにクローニングされたMyoD1を細胞へトランスフェクションした実験結果である。「COL14」は、RPAにより検出された14型コラーゲンmRNAのバンドである。「RSP」は、S26リボソームタンパク質であり、常に一定に発現する内在性コントロール遺伝子である。
【００８８】
COL14/RSPは、「empty」で0.31、「MyoD1」で1.46であった。なお、「COL14/RSP」は、画像解析ソフトNIH Image1.63にて、「empty」および「MyoD1」のバンドの濃度を測定し、それぞれ、RSPを分母として数値化したものである。この実験結果から、MyoD1導入により14型コラーゲンmRNA量が5倍弱増加することが明らかとなった。
【００８９】
実施例２
14型コラーゲンの発現促進の実験（安定発現型の培養法）
【００９０】
対象とする細胞としてはMC3T3-E1を用いた。
トランスフェクション前日に、細胞を、10%ウシ胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地を用いて、直径10cmシャーレ（5×105 cells）に播種した。翌日、培養液を、5%ウシ胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地に交換し、2〜3時間の前培養を行った。
【００９１】
MyoD1がクローニングされたpcDNA3.1プラスミドベクターをDNA制限酵素HindIIIで切断し、その後市販キット（キアゲン製、QUIEX II）を用いて、制限酵素等の不純物を除去し、線状化プラスミドを精製した。
【００９２】
Opti-MEM（Gibco BRL、Grand Island, NY, USA）400μlに、FuGENE6（Roche Diagnostics K.K.）12μlを1滴ずつマイクロピペットで加えて軽く混ぜて混合溶液を作製した。MyoD ファミリー遺伝子（MyoD1）のクローニングされた環状プラスミドを制限酵素で切断し線状化したもの2μgに1滴ずつ上記混合溶液をマイクロピペットで加え、室温にて15分間静置した。このプラスミド溶液を各wellの細胞に1滴ずつ混ぜながら加え、均一に行きわたるようにシャーレを前後左右にゆっくり動かした。
【００９３】
37℃インキュベーターで48時間培養したのち、細胞層をトリプシンにて分散、細胞を1/10に希釈してまき直し、ジェネティシン存在下で2週間培養した。細胞層を可溶化してRNAを抽出し、14型コラーゲンmRNAを検出した。
【００９４】
実験結果について、図２を参照しながら説明する。細胞はMC3T3-E1を用い、MyoDファミリー遺伝子はMyoD1を用いた。図２において、MyoD1を安定的に発現するMC3T3-E1は、emptyと比較して非常に高い14型コラーゲン産生を示す。
【００９５】
COL14/RSPは、「empty」が検出限界以下で、「MyoD1」が0.99であった。この実験結果から、MyoD1を安定的に発現するMC3T3-E1は、emptyと比較して非常に高い14型コラーゲン産生を示すことが判明した。
【００９６】
持続的にMyoD ファミリー遺伝子を発現するため、高い14型コラーゲン合成能が持続する。MyoD1の一過性発現型の培養法に比較して、安定発現型の培養法にした場合、より強い14型コラーゲンmRNA発現が見られる。MC3T3-E1に対するMyoD1の安定型（恒常的）遺伝子導入により、14型コラーゲンmRNA発現量は増加した。クローンによっては、高い14型コラーゲン合成能が持続すると共に、筋肉特異的タンパク質も生産される。
【００９７】
実施例３
14型コラーゲン産生のプロモーター活性の測定
【００９８】
対象とする細胞としては、MC3T3-E1、ATDC5、およびC3H10T1/2を用いた。
トランスフェクション前日に、細胞を、10%ウシ胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地を用いて、12 wellプレート（5×104 cells/well）に播種した。翌日、培養液を、5%ウシ胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地に交換し、2〜3時間の前培養を行った。
【００９９】
14型コラーゲン遺伝子のプロモーターおよびエンハンサー領域がクローニングされたレポータープラスミドの作製方法を説明する。
【０１００】
最初に、全長14kbのクローンを制限酵素Bss H II（pBluescript内）とBam H I（147クローン内）によって酵素処理し、市販の精製キット（Invitrogen社製、SNAPゲル精製キット）を用いて7.5kbpのフラグメント（以下original frag.）を得た。つぎに、pGL3-Enhancer Vectorsのマルチクローニングサイト（MCS）内のMlu I、Bgl II部位を制限酵素処理した。つぎに、original frag.とpGL3-EnhancerVectors溶液とを、コンパチブル・サイト（Mlu IとBssH II、Bgl IIとBam H I）にてライゲーションした。つぎに、バックグラウンドを減らすためにNhe Iにて酵素処理を行い、エタノール沈殿にて精製後、ヒートショックを行ってサブクローン（Original）を得た。
【０１０１】
つぎに、original frag.クローンを元にして、以下のミュータントを作製した。
制限酵素マップ
制限酵素マップを参考にして、4種類の大小のプロモーター領域を持つミュータントを作製した。インサートが大きいものより、Spe frag、Sma frag、Sac frag、Xho fragとした。
【０１０２】
最初に、Originalを元に、以下のように制限酵素処理をした。
【０１０３】
Spe frag：Kpn I（MCS内）、Spe Iにて処理  インサート  3.8 kbp
Sma frag：Kpn I（MCS内）、Sma Iにて処理  インサート  1.7 kbp
Sac frag：Sac Iにて処理                  インサート  1.2 kbp
Xho frag：Kpn I（MCS内）、Xho Iにて処理  インサート  600 bp
【０１０４】
つぎに、酵素処理後、SNAPゲル精製キットを用いて各フラグメントを分離精製した。つぎに、Spe、Sma、Xho fragはライゲーションに先立って、末端を平滑化処理した。つぎに、各サンプルをライゲーション（Sac fragはセルフライゲーション）させ、大腸菌へのトランスフォームを行ってサブクローンを得た。
【０１０５】
Opti-MEM（Gibco BRL、Grand Island, NY, USA）400μlに、FuGENE6（Roche Diagnostics K.K.）12μlを1滴ずつマイクロピペットで加えて軽く混ぜて混合溶液を作製した。14型コラーゲン遺伝子の全長1167塩基のプロモーターおよびエンハンサー領域がクローニングされたレポータープラスミド（ホタル(Firefly)・ルシフェラーゼ）2μgとコントロールベクターであるpRL-TK Vector（ウミシイタケ(Renilla)・ルシフェラーゼ）125ngおよびMyoDファミリー遺伝子（MyoD1、myogenin、またはmyf5）のクローニングされた環状プラスミド1μgの３種類のプラスミド混合物に1滴ずつ上記混合溶液をマイクロピペットで加え、室温にて15分間静置した。このプラスミド溶液を各wellの細胞に1滴ずつ混ぜながら加え、均一に行きわたるようにシャーレを前後左右にゆっくり動かした。
【０１０６】
37℃インキュベーターで6時間培養した後、培地を、10%ウシ胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地に交換し、さらに20時間培養した。細胞層を可溶化した後、凍結・融解を2回繰り返した上清10μlを用いて、ホタルルシフェラーゼ活性をウミシイタケルシフェラーゼ活性で補正し、プロモーター活性とする。
【０１０７】
プロモーター活性の測定方法を説明する。
ルシフェラーゼアッセイは、Dual-Luciferase Reporter Assey System（Promega社製）を用いて行った。
【０１０８】
(1)試薬の調製
ホタルルシフェラーゼ基質の調製
Luciferase Assey SubstrateをLuciferase Assey Buffer II 10 mlで溶解した。
ウミシイタケルシフェラーゼ基質の調製
50×Stop＆Glo Substrate 200 μlをStop＆Glo Buffer 10 mlで希釈した。
細胞溶解剤の調製
5×Passive Lysis Bufferをmilli-Qにて5倍希釈した。
【０１０９】
(2)サンプルの調製
最初に、トランスフェクションした細胞から培養液を吸引除去し、PBS 1.5 mlで細胞表面を洗い、吸引除去した。つぎに、1×Passive Lysis Buffer 100 μlを加え、シャーレごと−80℃にて凍結させ、10分間インキュベートした。つぎに、解凍させた後、各々エッペンチューブに回収し、さらに凍結融解を行った。計2回凍結融解を行った。つぎに、5471-Cにて14,000 rpm、10分間遠心分離して上清を回収し、ルミノメーターのサンプルとした。
【０１１０】
(3)ルミノメーターにて測定
測定にはLuminescencer-JNR AB-2100（ATTO、Tokyo、Japan）デュアルポンプシステムを用いた。それぞれのルシフェラーゼ活性は瞬時発光測定プログラムを用い、基質注入後2秒間のプレインキュベーションを行った後の、10秒間の積算発光量を求めた。
また、プロモーター活性はRenilla（ウミシイタケルシフェラーゼ）あたりのFirefly（ホタルルシフェラーゼ）の発光量で表した。
【０１１１】
実験結果について、表１および図３を参照しながら説明する。細胞はMC3T3-E1、ATDC5、およびC3H10T1/2を用い、MyoDファミリー遺伝子はMyoD1、myogenin、およびmyf5を用いた。表１は「Firefly/Renilla」の値を示し、図３はこの値を図示したものである。「empty」は何もクローニングされていない環状プラスミドである。「Firefly/Renilla」は、内在性コントロールとしてウミシイタケルシフェラーゼ発現プラスミドpRL-TKを常にかつ同時に細胞へトランスフェクションしているため、トランスフェクションされた細胞では、常に一定量のウミシイタケルシフェラーゼ活性が存在する。一方、調べようとしている14型コラーゲンプロモーターはホタルルシフェラーゼを持つ別のプラスミドにクローニングしてあり、MyoDファミリーの存在下でホタルルシフェラーゼの活性は変化する。これらの２者の活性は同時に細胞に存在しており、これらを別々の方法で測定し、ウミシイタケルシフェラーゼ活性(Renilla)あたりのホタルルシフェラーゼ活性(Firefly)を算出し、その値を比較することにより、複数の実験におけるプロモーター活性の比較が可能となる。表１および図３から分かるように、MyoD ファミリー遺伝子（MyoD1、myogenin、myf5）を共トランスフェクションした実験系では、emptyと比較して、14型コラーゲン遺伝子のプロモーター活性が1.5倍以上上昇した。
【０１１２】
【表１】
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【０１１３】
実施例４
シスーエレメントの特定
【０１１４】
対象とする細胞としては、C3H10T1/2を用いた。
MyoDファミリーの結合する塩基配列は一般的にCANNTG(NはA,C,G,Tのいずれか)である。14型コラーゲン遺伝子のプロモーターおよびエンハンサー領域がクローニングされたレポータープラスミドにおいて、この塩基配列を検索する。
【０１１５】
部位特異的突然変異導入法（Site-directed mutagenesis）により、MyoDファミリーの結合する塩基配列をCANNTGからGTNNCAに変異させる。
【０１１６】
トランスフェクション前日に、細胞を、10%ウシ胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地を用いて、12wellプレート（5×104 cells/well）に播種した。翌日、培養液を、5%ウシ胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地に交換し、2〜3時間の前培養を行った。
【０１１７】
部位特異的突然変異導入法を用いて特定の塩基配列に変異を導入したプラスミドは、大腸菌へトランスフォームし、次いでコロニーをLB培地にて増殖させ、これよりプラスミドを市販キット（キアゲン製、Endofree Plasmid Maxi Kit）にて精製した。
【０１１８】
Opti-MEM（Gibco BRL、Grand Island, NY, USA）400μlに、FuGENE6（Roche Diagnostics K.K.）12μlを1滴ずつマイクロピペットで加えて軽く混ぜて混合溶液を作製した。変異が導入されたレポータープラスミド2μgとコントロールベクターであるpRL-TK Vector 125ngに加えて、MyoDファミリー遺伝子（MyoD1、myogenin、またはmyf5）のクローニングされた環状プラスミド1μgの混合物に1滴ずつ上記混合溶液をマイクロピペットで加え、室温にて15分間静置した。各wellの細胞に1滴ずつ混ぜながら加え、均一に行きわたるようにシャーレを前後左右にゆっくり動かした。
【０１１９】
37℃インキュベーターで6時間培養した後、培地を、10%ウシ胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地に交換し、さらに20時間培養した。細胞層を可溶化した後、凍結・融解を2回繰り返した上清10μlを用いて、ホタルルシフェラーゼ活性をウミシイタケルシフェラーゼ活性で補正し、プロモーター活性とする。
【０１２０】
実験結果について説明する。MyoDファミリーの結合する塩基配列をCANNTGからGTNNCAに変異させたレポータープラスミドでは、MyoD ファミリー遺伝子（MyoD1、myogenin、myf5）の共トランスフェクション実験系による14型コラーゲン遺伝子のプロモーター活性の上昇は起こらない。従って、変異を導入した部位が、14型コラーゲン遺伝子のMyoDファミリー結合領域であり、この部位へのMyoDファミリーの結合により14型コラーゲン遺伝子発現が上昇することが判明した。MyoDファミリーの結合する塩基配列は、配列表の配列番号１に示す143〜651番目の間に分布し、CANNTGあるいはそれに相同性の高い13箇所の特定の塩基配列を有し、コラーゲン産生のプロモーター活性を有するものである。以下の13の配列で、特定の塩基配列を下線で示す。左の数字は配列表の配列番号１に示された塩基配列の位置に対応する。
【０１２１】
143 (+) GGAGATCTGCTG
144 (+) GAGATCTGCT
147 (-) ATCTGCTGGT
166 (+) TAAAACTGTC
345 (+) GGACGAGTGCTG
346 (-) GACGAGTGCT
464 (+) CCCGGCTGCC
477 (+) CGCACCTGGG
485 (+) GGTCGGCTGCCA
486 (-) GTCGGCTGCC
611 (-) CGCCACCACTTT
614 (-) CACCACTTTTGG
642 (+) CGCAGCGGTT
【０１２２】
実施例５ 
12型コラーゲンの発現促進の実験（一過性発現型の培養法）
【０１２３】
対象とする細胞としてはMC3T3-E1を用いた。細胞の前処理等は実施例１と同様である。
MyoD ファミリー遺伝子（MyoD1）のクローニングされた環状プラスミドの調製は、実施例１と同様である。
細胞へのトランスフェクションの方法は実施例１と同様である。
【０１２４】
37℃インキュベーターで20時間培養したのち、細胞層を可溶化してRNAを抽出し、12型コラーゲンmRNAを検出した。mRNAの検出方法は、以下のリボヌクレアーゼ・プロテクションアッセイによった。
【０１２５】
(1)Total RNA の抽出、(2)プローブ作製、(3)ハイブリダイゼーション、(4)RNase処理〜ナイロンメンブレンへのブロッティング、および(5)洗浄〜現像は、実施例１と同様である。
【０１２６】
実験結果について、図５を参照しながら説明する。細胞はMC3T3-E1を用い、MyoDファミリー遺伝子はMyoD1を用いた。図５において、「empty」は、MyoD ファミリー遺伝子を保持していない空のベクターであり、ベクター名がpcDNA3.1(Invitrogen社製)を細胞へトランスフェクションした実験結果である。「MyoD1」は、ベクターにクローニングされたMyoD1を細胞へトランスフェクションした実験結果である。「COL12」は、RPAにより検出された12型コラーゲンmRNAのバンドである。「RSP」は、S26リボソームタンパク質であり、常に一定に発現する内在性コントロール遺伝子である。
【０１２７】
COL12/RSPは、「empty」で0.76、「MyoD1」で2.91であった。なお、「COL12/RSP」は、画像解析ソフトNIH Image1.63にて、「empty」および「MyoD1」のバンドの濃度を測定し、それぞれ、RSPを分母として数値化したものである。この実験結果から、MyoD1導入により12型コラーゲンmRNA量が3倍強増加することが明らかとなった。なお、MyoD1を遺伝子導入され、筋肉分化へ誘導のかかったMC3T3-E1では筋肉特異的タンパク質であるトロポニンT3(T3)も新たに検出される。
【０１２８】
実施例６
12型コラーゲンの発現促進の実験（安定発現型の培養法）
【０１２９】
対象とする細胞としてはMC3T3-E1を用いた。細胞の前処理等は実施例２と同様である。
MyoD1がクローニングされたpcDNA3.1プラスミドベクターをDNA制限酵素HindIIIで切断し、その後市販キット（キアゲン製、QUIEX II）を用いて、制限酵素等の不純物を除去し、実施例２と同様に線状化プラスミドを精製した。
細胞へのトランスフェクションの方法は、実施例２と同様である。
【０１３０】
37℃インキュベーターで48時間培養したのち、細胞層をトリプシンにて分散、細胞を1/10に希釈してまき直し、ジェネティシン存在下で2週間培養した。細胞層を可溶化してRNAを抽出し、12型コラーゲンmRNAを検出した。
【０１３１】
実験結果について、図６を参照しながら説明する。細胞はMC3T3-E1を用い、MyoDファミリー遺伝子はMyoD1を用いた。図６において、MyoD1を安定的に発現するMC3T3-E1は、emptyと比較して非常に高い12型コラーゲン産生を示す。
【０１３２】
COL12/RSPは、「empty」で0.09、「MyoD1」で1.1であった。この実験結果から、MyoD1導入により12型コラーゲンmRNA量が12倍強増加することが明らかとなった。
【０１３３】
持続的にMyoD ファミリー遺伝子を発現するため、高い12型コラーゲン合成能が持続する。MyoD1の一過性発現型の培養法に比較して、安定発現型の培養法にした場合、より強い12型コラーゲンmRNA発現が見られる。MC3T3-E1に対するMyoD1の安定型（恒常的）遺伝子導入により、12型コラーゲンmRNA発現量は増加した。
【０１３４】
実施例７
12型コラーゲン産生のプロモーター活性の測定
【０１３５】
対象とする細胞としては、MC3T3-E1、ATDC5、およびC3H10T1/2を用いた。細胞の前処理等は実施例３と同様である。
【０１３６】
12型コラーゲン遺伝子のプロモーターおよびエンハンサー領域がクローニングされたレポータープラスミドの作製方法を説明する。
【０１３７】
最初に、全長17kbのクローンを鋳型としてポリメラーゼ増幅反応(PCR)により4.37 kbの断片（12Ｂ）を得た。つぎに、pGL3-basic Vectorsのマルチクローニングサイト（MCS）内のNhe I、XhoI部位を制限酵素処理した。つぎに、それぞれの断片とpGL3-basic Vectors溶液とを、ライゲーションした後、大腸菌JM109へトランスフォームを行い、サブクローンを得た。さらに、それぞれのコンストラクトを制限酵素BglIIで切断し、第一イントロンのほとんどを除去した1.11 kb（12ＢΔ（デルタ））の断片を作製し、同様に大腸菌へトランスフォームを行い、サブクローンを得た（計２種類の断片）。
【０１３８】
つぎに、12ＢΔクローンを元にして、PCRにより以下のデリーションミュータントを作製した。「upper primer」においては、「Position」、「nucleotide sequence」、および「name」を示す。
【０１３９】
PCRプライマー
upper primer
-615    GATGCAATGGTGGGGGAC    -615/COL12-Luc
-374    ATTGCTACTACGGCGATC    -374/COL12-Luc
-335    GCTGCAAGTATGCACACG    -335/COL12-Luc
-285    AGCATACATCACCCGTGG    -285/COL12-Luc
common lower primer within pGL3    ATGTTCTGGCACCTGCAC
【０１４０】
最初に、12ＢΔを元に、以下のようにPCR産物を作製した（計４種類の断片）。
【０１４１】
-615/COL12-Luc    824 b
-374/COL12-Luc    587 b
-335/COL12-Luc    548 b
-285/COL12-Luc    498 b
【０１４２】
つぎに、PCR後、SNAPゲル精製キットを用いて各フラグメントを分離精製した。つぎに、それぞれの断片はライゲーションに先立って、末端を平滑化処理した。つぎに、各サンプルをライゲーションさせ、大腸菌へのトランスフォームを行ってサブクローンを得た。
【０１４３】
Opti-MEM（Gibco BRL、Grand Island, NY, USA）400μlに、FuGENE6（Roche Diagnostics K.K.）12μlを1滴ずつマイクロピペットで加えて軽く混ぜて混合溶液を作製した。上述した合計６種類の12型コラーゲン遺伝子のプロモーターおよびエンハンサー領域がクローニングされたレポータープラスミド（ホタル(Firefly)・ルシフェラーゼ）2μgとコントロールベクターであるpRL-TK Vector（ウミシイタケ(Renilla)・ルシフェラーゼ）125ngおよびMyoDファミリー遺伝子（MyoD1、myogenin、またはmyf5）のクローニングされた環状プラスミド1μgの３種類のプラスミド混合物に1滴ずつ上記混合溶液をマイクロピペットで加え、室温にて15分間静置した。このプラスミド溶液を各wellの細胞に1滴ずつ混ぜながら加え、均一に行きわたるようにシャーレを前後左右にゆっくり動かした。
【０１４４】
その後の細胞の処理並びにプロモーター活性の測定は実施例３と同様である。
(1)試薬の調製（ホタルルシフェラーゼ基質の調整、ウミシイタケルシフェラーゼ基質の調製、および細胞溶解剤の調製）、(2)サンプルの調製、および(3)ルミノメーターにて測定は、実施例３と同様である。
【０１４５】
実験結果について、表２および図7を参照しながら説明する。細胞はMC3T3-E1、ATDC5、およびC3H10T1/2を用い、MyoDファミリー遺伝子はMyoD1、myogenin、およびmyf5を用いた。表２は「Firefly/Renilla」の値を示し、図７はこの値を図示したものである。「empty」は何もクローニングされていない環状プラスミドである。「Firefly/Renilla」は、内在性コントロールとしてウミシイタケルシフェラーゼ発現プラスミドpRL-TKを常にかつ同時に細胞へトランスフェクションしているため、トランスフェクションされた細胞では、常に一定量のウミシイタケルシフェラーゼ活性が存在する。一方、調べようとしている12型コラーゲンプロモーターはホタルルシフェラーゼを持つ別のプラスミドにクローニングしてあり、MyoDファミリーの存在下でホタルルシフェラーゼの活性は変化する。これらの２者の活性は同時に細胞に存在しており、これらを別々の方法で測定し、ウミシイタケルシフェラーゼ活性(Renilla)あたりのホタルルシフェラーゼ活性(Firefly)を算出し、その値を比較することにより、複数の実験におけるプロモーター活性の比較が可能となる。表２および図７から分かるように、MyoD ファミリー遺伝子（MyoD1、myogenin、myf5）を共トランスフェクションした実験系では、emptyと比較して、12型コラーゲン遺伝子のプロモーター活性が２倍程度上昇した。
【０１４６】
【表２】
2007089575.tif 000003
【０１４７】
実施例８
シスーエレメントの特定
【０１４８】
対象とする細胞としては、C3H10T1/2あるいはMC3T3-E1を用いた。その他は、実施例４と同様である。
【０１４９】
部位特異的突然変異導入法（Site-directed mutagenesis）により、MyoDファミリーの結合する塩基配列をCANNTGからGTNNCAに変異させることは実施例４と同様である。
【０１５０】
細胞の前処理等は実施例４と同様である。
部位特異的突然変異導入法を用いて特定の塩基配列に変異を導入したプラスミドの精製法は実施例４と同様である。
細胞への遺伝子導入法は実施例４と同様である。  
プロモーター活性の測定法は実施例４と同様である。
【０１５１】
実験結果について説明する。MyoDファミリーの結合する塩基配列をCANNTGからGTNNCAに変異させたレポータープラスミドでは、MyoD ファミリー遺伝子（MyoD1、myogenin、myf5）の共トランスフェクション実験系による12型コラーゲン遺伝子のプロモーター活性の上昇は起こらない。従って、変異を導入した部位が、12型コラーゲン遺伝子のMyoDファミリー結合領域であり、この部位へのMyoDファミリーの結合により12型コラーゲン遺伝子発現が上昇することが判明した。MyoDファミリーの結合する塩基配列は、配列表の配列番号２に示す48〜1065番目の間に分布し、CANNTGあるいはそれに相同性の高い30箇所の特定の塩基配列を有し、コラーゲン産生のプロモーター活性を有するものである。以下の30の配列で、特定の塩基配列を下線で示す。左の数字は配列表の配列番号２に示された塩基配列の位置に対応する。
【０１５２】
48(+) CCCATCTCTA
125(+) GGCGGCTGTC
130(-) GCCGCCTGCC
179(-) GGCCTCTGTC
190(-) TGCACGCGGC
202(-) ACTAACTGTC
250(-) CCCCTCTGTC
262(-) TCCACCTTCC
277(-) GCCACCGTCC
290(-) TGCATCTCCG
309(-) CCCCTTTGTC
318(+) TCCCGCTGCT
346(+) CCCACTTCTC
475(+) TGCGGCTGTC
540(+) GCCACCTCAC
571(+) TGCACACGTT
618(+) ATCACCCGTG
652(-) AACGCCTGAG
635(+) TCCACCTTCT
735(+) GGCCGCTGCA
757(+) CGCAGCTGCA
772(+) TCCCCCTGCC
804(+) CGCTGCTGCT
835(+) CACACCGGCG
848(+) GCCAGGTGCT
950(+) GGCTTCTGTT
973(+) CCCACCCCTC
1016(-) GCCACTTTCC
1025(+) TGCACCTTAA
1065(-) AGCCCCTGCT
【０１５３】
以上のことから、本実施例によれば、14型コラーゲンが胎児発生過程で多量に生産されることに注目し、細胞を遺伝子工学的により胎児期の発生過程にある筋細胞に近づけることにより、14型コラーゲンを大量に合成することができる。これにより、14型コラーゲンをより容易にかつ大量に生産させ、その機能の解明や利用法の開発ができる。
【０１５４】
本発明は、コラーゲン遺伝子を細胞に導入するのではなく、細胞に分化誘導因子（MyoDファミリー）を導入することで、細胞をある方向へ分化誘導させ、14型コラーゲンを合成しやすくすることができる。
【０１５５】
また、12型コラーゲンが筋肉分化過程で多量に生産されることに注目し、細胞を遺伝子工学的により発生過程にある筋細胞に近づけることにより、12型コラーゲンを大量に合成することができる。これにより、12型コラーゲンをより容易にかつ大量に生産させ、その機能の解明や利用法の開発ができる。
【０１５６】
本発明は、コラーゲン遺伝子を細胞に導入するのではなく、細胞に分化誘導因子（MyoDファミリー）を導入することで、細胞をある方向へ分化誘導させ、12型コラーゲンを合成しやすくすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】14型コラーゲンの発現促進の実験結果（一過性）を示す図である。
【図２】14型コラーゲンの発現促進の実験結果（安定発現型）を示す図である。
【図３】プロモーター活性測定の実施結果を示す図である。
【図４】配列表の配列番号１で示される塩基配列である。
【図５】12型コラーゲンの発現促進の実験結果（一過性）を示す図である。
【図６】12型コラーゲンの発現促進の実験結果（安定発現型）を示す図である。
【図７】プロモーター活性測定の実施結果を示す図である。
【図８】配列表の配列番号２で示される塩基配列である。
【図１】
2007089575.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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