(57)【要約】【課題】ｐ５３由来ペプチドに対する液性免疫応答を利用して癌患者の予後の判定方法を提供すること。【解決手段】本発明は、癌患者より採取された血液試料における抗ｐ５３由来ペプチド抗体のレベルを測定する工程を含む癌患者の予後を判定する方法であって、該抗体のレベルが基準値を超える場合に予後が良好である可能性が高いと判定することを特徴とする方法を提供する。【選択図】なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌患者より採取された血液試料における抗ｐ５３由来ペプチド抗体のレベルを測定する工程を含む癌患者の予後を判定する方法であって、該抗体のレベルが基準値を超える場合に予後が良好である可能性が高いと判定することを特徴とする方法。
【請求項２】
ｐ５３由来ペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列に由来し、かつ配列番号３に示すアミノ酸配列から選択される連続する少なくとも４個のアミノ酸残基を含むアミノ酸残基数４〜９個のペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｐ５３由来ペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列に由来し、かつ配列番号３に示すアミノ酸配列を含むアミノ酸残基数５〜９個のペプチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ｐ５３由来ペプチドが配列番号１または２に示すアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
癌が乳癌である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ｐ５３由来ペプチドまたは同等の抗原性を有するその誘導体を含む、請求項１から５のいずれかに記載の癌患者の予後の判定方法に用いる試薬。
【請求項７】
請求項１から５までのいずれかに記載の方法において測定される抗体と同一のエピトープを認識する抗体。
【請求項８】
請求項６に記載の試薬を含む、癌を診断するためのキット。
【請求項９】
さらに請求項７に記載の抗体を含む、請求項８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な癌患者の予後判定方法に関する。詳細には、本発明は、癌患者より採取された血液試料における抗ｐ５３由来ペプチド抗体のレベルを測定する工程を含む癌患者の予後を判定する方法であって、該抗体のレベルが基準値を超える場合に予後が良好である可能性が高いと判定することを特徴とする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｐ５３は、細胞周期進行、アポトーシス誘導およびＤＮＡ修復に関与する遺伝子の転写を調節する、重要な腫瘍抑制タンパク質である（非特許文献１−４）。細胞ストレス、特にＤＮＡ損傷を受けた細胞において、ｐ５３タンパク質は、細胞周期調節に関与する一連の遺伝子の転写を活性化し、細胞周期の進行を停止させ、ＤＮＡの修復またはアポトーシスの誘導を可能とする。多くの癌細胞で本タンパク質の遺伝子に変異が観察されており、変異ｐ５３タンパク質が腫瘍細胞の悪性化と関係していることが示唆されている。
ｐ５３タンパク質に対する抗体は２０年前に発見された（非特許文献５）。これは主に、癌細胞におけるｐ５３遺伝子のミスセンス変異、およびそれにより癌細胞に蓄積した変異ｐ５３タンパク質に関連することが確認されており（非特許文献６、７）、これまでに抗ｐ５３タンパク質抗体を癌の危険因子として示す多くの報告が存在する（非特許文献７、１５−１８）。
【０００３】
ｐ５３タンパク質が免疫系に提示される機構はいまだ明らかではない。蓄積した変異ｐ５３タンパク質に対する免疫応答は、抗原提示細胞によるプロセッシングを介すると考えられる。例えば、乳癌患者におけるｐ５３タンパク質に対する液性免疫応答は、ｐ５３遺伝子の変異部位と関係のないエピトープに対するものであった（非特許文献８）。通常癌患者の血清中にはｐ５３タンパク質は検出されないことから（非特許文献５−８）、癌細胞が二次リンパ組織において抗原提示細胞にトラップされ、変異ｐ５３タンパク質がプロセッシングを受け、そして非変異部位に対する免疫応答が誘導されたと考えられる。さらに変異ｐ５３タンパク質を有さない健常人の１．５％においても抗ｐ５３タンパク質抗体が検出される（非特許文献７、９、１０）。これらの結果は、ｐ５３タンパク質がプロセッシングされ、生じたペプチドに対して液性免疫応答が誘導されることを示唆する。
【０００４】
生体は、出現した腫瘍細胞を排除する免疫機構を有する。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、主要組織適合遺伝子複合体（ヒトにおいてはＨＬＡ）により腫瘍細胞表面に提示された腫瘍抗原ペプチドを特異的に認識し、その細胞を傷害する。この免疫機構を利用し、腫瘍抗原のＣＴＬエピトープペプチドで生体を免疫するワクチン治療が試みられている。本発明者らは以前、ＨＬＡ−Ｂ＊４６０１分子に提示されＣＴＬを誘導し得る、ｐ５３タンパク質由来のペプチドを報告した（非特許文献１１）。別の研究において本発明者らは、ペプチドワクチン投与を受けた癌患者の一部において投与されたＣＴＬエピトープペプチドに反応する抗体レベルが上昇し、それがその患者の予後を予測するのに適したマーカーであることを示した（非特許文献１４）。一方、ある種のＣＴＬエピトープペプチドに反応する抗体はワクチン投与前の癌患者および健常人の血清中にも存在し、この抗体にはＨＬＡ拘束性が見られなかった（非特許文献１２、１３）。このことは、抗体エピトープペプチドはＨＬＡのタイプと関係なくプロセッシングされ、それに対する抗体もＨＬＡと関係なく産生されることを示唆する。
【０００５】
本発明者らの研究から、腫瘍抗原由来ペプチドに対する液性免疫応答は、腫瘍細胞に対する免疫応答と、ひいては患者の病状と、何らかの関係を示すことが期待された。癌患者の予後は、典型的には、臨床段階、再発、リンパ節における腫瘍転移、周辺組織に対する浸潤レベル、組織学的分類等の臨床学的および病理学的観点から判定される。かかる方法は非常に繁雑であり、簡便に予後を判定することができる方法が望まれる。
【非特許文献１】Benchimol, S., Pim, D., and Crawford, L. Radioimmunoassay of the cellular protein p53 in mouse and human cell lines. EMBO J., 1: 1055-1062, 1982.
【非特許文献２】Levine, A. J. p53, the cellular gatekeeper for growth and division. Cell, 88: 323-831, 1997.
【非特許文献３】Oren, M., and Rotter, V. Introduction: p53-the first twenty years. Cell Mol. Life Sci., 55: 9-11, 1999.
【非特許文献４】Caron de Fromentel, C., and Soussi, T. TP53 tumor suppressor gene: a model for investigating human mutagenesis. Genes Chromosomes Cancer., 4: 1-15, 1992.
【非特許文献５】Crawford, L. V., Pim, D. C., and Bulbrook, R. D. Detection of antibodies against the cellular protein p53 in sera from patients with breast cancer. Int. J. Cancer., 30: 403-408, 1982.
【非特許文献６】Caron de Fromentel, C., May-Levin, F., Mouriesse, H., Lemerle, J., Chandrasekaran, K., and May, P. Presence of circulating antibodies against cellular protein p53 in a notable proportion of children with B-cell lymphoma. Int. J. Cancer, 39: 185-189, 1987.
【非特許文献７】Soussi, T. p53 Antibodies in the sera of patients with various types of cancer: a review. Cancer Res., 60: 1777-1788, 2000.
【非特許文献８】Schlichtholz, B., Legros, Y., Gillet, D., Gaillard, C., Marty, M., Lane, D., Calvo, F., and Soussi, T. The immune response to p53 in breast cancer patients is directed against immunodominant epitopes unrelated to the mutational hot spot. Cancer Res., 52: 6380-6384, 1992.
【非特許文献９】Lenner, P., Wiklund, F., Emdin, S. O., Arnerlov, C., Eklund, C., Hallmans, G., Zentgraf, H., and Dillner, J. Serum antibodies against p53 in relation to cancer risk and prognosis in breast cancer: a population-based epidemiological study. Br. J. Cancer., 79: 927-932, 1999.
【非特許文献１０】Trivers, G. E., De Benedetti, V. M., Cawley, H. L., Caron, G., Harrington, A. M., Bennett, W. P., Jett, J. R., Colby, T. V., Tazelaar, H., Pairolero, P., Miller, R. D., and Harris, C. C. Anti-p53 antibodies in sera from patients with chronic obstructive pulmonary disease can predate a diagnosis of cancer. Clin. Can. Res., 2: 1767-1775, 1996.
【非特許文献１１】Azuma, K., Shichijo, S., Maeda, Y., Nonaka, Y., Fujii, T., Kenta, K., and Itoh, K. Mutated p53 gene encodes a non-mutated epitope recognized by HLA-B4601-restrited and tumor-reactive CTLs at tumor site. Cancer Res., 63: 854-858, 2003.
【非特許文献１２】Ohkouchi, S., Yamada, A., Imai, N., Mine, T., Harada, T., Shichijo, S., Maeda, Y., Saijo, Y., Nukiwa, T., and Itoh, K. Non-mutated tumor-rejection antigen peptides elicit type-I allergy in the majority of healthy individuals. Tissue Antigens, 59: 259-272, 2002.
【非特許文献１３】Kawamoto, N., Yamada, A., Ohkouchi, S., Maeda, T., Tanaka, S., Hashimoto, T., Saijo, Y., Saijo, S., Nukiwa, T., Shichijo, S., Aizawa, H., and Itoh, K. IgG reactive to CTL-directed epitopes of self-antigens is enter lacking or unbalanced in atopic dermatitis patients. Tissue Antigen, 61: 352-361, 2003.
【非特許文献１４】Mine T, Sato Y, Noguchi M, Sasatomi T, Gouhara R, Tsuda N, Tanaka S, Shomura H, Katagiri K, Rikimaru T, Shichijo S, Kamura T, Hashimoto T, Shirouzu K, Yamada A, Todo S, Itoh K, Yamana H. Humoral responses to peptides correlate with overall survival in advanced cancer patients vaccinated with peptides based on pre-existing peptide-specific cellular responses. Clin Cancer Res, in press, 2003.
【非特許文献１５】Schlichtholz, B., Legros, Y., Gillet, D., Gaillard, C., Marty, M., Lane, D., Calvo, F., and Soussi, T. The immune response to p53 in breast cancer patients is directed against immunodominant epitopes unrelated to the mutational hot spot. Cancer Res., 52: 6380-6384, 1992.
【非特許文献１６】Mudenda, B., Green, J. A., Green, B., Jenkins, J. R., Robertson, L., Tarunina, M., and Leinster, S. J. The relationship between serum p53 autoantibodies and characteristics of human breast cancer. Br. J. Cancer, 69: 1115-1119, 1994.
【非特許文献１７】Peyrat, J. P., Bonneterre, J., Lubin, R., Vanlemmens, L., Fournier, J., and Soussi, T. Prognostic significance of circulating P53 antibodies in patients undergoing surgery for locoregional breast cancer. Lancet, 345: 621-622, 1995.
【非特許文献１８】Green, J. A., Mudenda, B., Jenkins, J., Leinster, S. J., Tarunina, M., Green, B., and Robertson, L. Serum p53 auto-antibodies: incidence in familial breast cancer. Eur. J. Cancer, 30A:580-584, 1994.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ｐ５３由来ペプチドに対する液性免疫応答と癌患者の予後との関係を明らかにし、癌患者の予後を判定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、乳癌患者の血清中に特異的抗体が存在するｐ５３由来ペプチドを同定した。前記ペプチドに対する抗体のレベルと患者の臨床学的および病理学的所見との相関関係を検討した結果、抗ｐ５３由来ペプチド抗体のレベルに基づく癌患者の予後判定が可能となった。
【０００８】
すなわち、本発明は、癌患者より採取された血液試料における抗ｐ５３由来ペプチド抗体のレベルを測定する工程を含む癌患者の予後を判定する方法であって、該抗体のレベルが基準値を超える場合に予後が良好である可能性が高いと判定することを特徴とする方法を提供する。また、本発明は、前記方法に使用されるｐ５３由来ペプチドまたは同等の抗原性を有するその誘導体を含む試薬を提供する。さらに、本発明は、前記方法において測定される抗体と同一のエピトープを認識する抗体を提供する。加えて、本発明は、前記試薬および／または前記抗体を含む、癌を診断するためのキットを提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によって、癌患者の予後についての検査室レベルでの指標が提供される。かかる指標に基づき、適切な治療の選択や生存期間の予測が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、癌患者より採取された血液試料における抗ｐ５３由来ペプチド抗体のレベルを測定する工程を含む癌患者の予後を判定する方法であって、該抗体のレベルが基準値を超える場合に予後が良好である可能性が高いと判定することを特徴とする方法を提供する。
【００１１】
予後とは、何らかの治療を施した後の患者の癌の経過についての医学的見通しまたは患者の余命を意味する。治療としては、化学療法、放射線療法、外科的切除などが挙げられる。本発明の方法において、血液の採取時期は限定されず、治療前、治療後、または治療中のいずれであってもよく、また患者がうけた治療の種類も限定されない。予後が良好であるとは、例えば、治療後の臨床段階が悪化しないかまたは悪化するのが遅いこと、リンパ節への腫瘍転移が見られないかまたは少ないこと、周辺組織への腫瘍細胞の浸潤が起こらないかまたはそのレベルが低いこと、再発が起こらないかまたは再発までの期間が長いこと、などを意味する。
【００１２】
血液試料は、それが血液中の抗体レベルを調べるために使用できる限り、いずれの方法で調製されたものであってもよい。本発明においては、血清または血漿が好適に用いられる。
【００１３】
基準値は、使用するペプチドおよび癌の種類に依存し、本明細書の実施例に記載の方法に従い適宜決定される。例えば基準値は、健常人由来の血液試料における抗体レベルの測定値の平均値＋２ＳＤとすればよい。抗体のレベルは、既知のいずれの方法によっても測定可能であり、好適な測定方法として例えばＥＬＩＳＡ法が挙げられる。
【００１４】
本明細書および特許請求の範囲における「ｐ５３タンパク質」なる用語は、完全長ｐ５３タンパク質を意味し、天然に存在する個人差および人種差等に基づくアミノ酸の変異を含むものも包含する。ｐ５３タンパク質のアミノ酸配列は、例えばＧｅｎｅＢａｎｋのアクセション番号ＡＢ０８２９２３、ＡＦ１３６２７１、およびＡＦ３０７８５１に開示されている（配列番号４）。
【００１５】
本明細書および特許請求の範囲における「ｐ５３由来ペプチド」は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸配列の一部より成るアミノ酸残基数４〜５０個、好ましくは４、５、６、７、８、９、１０または１１個のペプチドである。本発明の方法を実施する場合、前記ペプチドと同等の抗原性を有するその誘導体を使用してもよい。ペプチドの誘導体とは、ペプチドのアミノ酸配列に１または数個、好ましくは１または２個のアミノ酸の欠失、置換、付加、挿入などを導入し、および／またはその構成アミノ酸またはカルボキシル基を修飾したペプチドを意味する。ペプチドの誘導体が「同等の抗原性を有する」とは、試料中のもとのペプチドに特異的な抗体をその誘導体が吸収できることを意味する。
【００１６】
本発明の方法に用いるｐ５３由来ペプチドは、癌患者由来の末梢血単核細胞からペプチド特異的なＣＴＬを誘導可能な、いわゆるＣＴＬエピトープペプチドおよびその一部よりなるペプチドの中から選択することが好ましい。候補となるＣＴＬエピトープペプチドは、既報の方法に従い決定することができる（特開２００３−１１１５９５号公報）。候補ペプチドは、ペプチド化学において一般的な公知方法によって合成可能である。ペプチドの選択のため、はじめに候補ペプチドの中から癌患者血中に特異的な抗体が存在するペプチドを同定する。次に、同定したｐ５３由来ペプチドに対する抗体のレベルを数十人、例えば５０人以上の癌患者で測定する。その抗体レベルと患者の臨床学的または病理学的特性とを対応させた場合に両者の間に相関関係がみられるペプチドが、本発明の方法に使用可能である。
【００１７】
本発明において「相関関係」とは、患者血中の抗ｐ５３由来ペプチド抗体のレベルが高い場合にその患者の臨床学的または病理学的所見が良好な傾向が認められる関係を意味する。本発明においては、複数の癌患者を臨床学的または病理学的特性に基づいて二群に分け、血中の抗ｐ５３由来ペプチド抗体のレベルを群間で比較した場合に、統計学的に有意な差が認められる場合に相関関係があるとする。統計学的解析は、常套的なノンパラメトリック解析、例えばMann-Whitney U 試験により行うことができる。
【００１８】
本発明の方法に特に好適に使用されるｐ５３由来ペプチドは、アミノ酸配列 Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met Phe（配列番号１）に由来し、かつ該配列の２〜６番目のアミノ酸配列（Ser Arg His Lys Lys：配列番号３）から選択される連続する少なくとも４個のアミノ酸残基を含むアミノ酸残基数４〜９個のペプチドであり、より好適には、配列番号１に示すアミノ酸配列に由来し、かつ配列番号３に示すアミノ酸配列を含むアミノ酸残基数５〜９個のペプチドである。なかでも、本明細書におけるｐ５３３７７−３８５（配列番号１）またはｐ５３３７８−３８３（Ser Arg His Lys Lys Leu：配列番号２）が特に好適に用いられる。
【００１９】
本発明の方法は各種の癌の患者の予後の判定に使用可能であるが、特に乳癌に好適に使用される。
【００２０】
本発明はまた、前述の手順に従い同定したｐ５３由来ペプチドまたは同等の抗原性を有するその誘導体を含む、本発明の癌患者の予後の判定方法に用いる試薬を提供する。ｐ５３由来ペプチドは、好ましくは配列番号１に示すアミノ酸配列に由来し、かつ配列番号３に示すアミノ酸配列から選択される連続する少なくとも４個のアミノ酸残基を含むアミノ酸残基数４〜９個のペプチド、より好ましくは配列番号１に示すアミノ酸配列に由来し、かつ配列番号３に示すアミノ酸配列を含むアミノ酸残基数５〜９個のペプチド、より一層好ましくは配列番号１または２に示すアミノ酸配列を有するペプチドである。本発明の試薬は、前記ペプチドまたは誘導体が適当な緩衝液に溶解された溶液形態であっても、使用時に溶解される凍結乾燥形態であってもよく、またこれらに限定されない。本試薬は、例えばＥＬＩＳＡ法に用いられる。
【００２１】
本発明はさらに、本発明の予後の判定方法において測定される抗体と同一のエピトープを認識する抗体を提供する。本発明の抗体は、癌患者の血液試料中のｐ５３由来ペプチドに対する抗体のレベルが癌患者の予後と相関関係を示す場合における、そのｐ５３由来ペプチドのエピトープを特異的に認識するものである。本発明の抗体は、好ましくは配列番号１に示すアミノ酸配列に由来し、かつ配列番号３に示すアミノ酸配列から選択される連続する少なくとも４個のアミノ酸残基を含むアミノ酸残基数４〜９個のペプチド、より好ましくは配列番号１に示すアミノ酸配列に由来し、かつ配列番号３に示すアミノ酸配列を含むアミノ酸残基数５〜９個のペプチド、より一層好ましくは配列番号１または２に示すアミノ酸配列を有するペプチドを認識する。本発明の抗体は、ｐ５３由来ペプチドまたはそのエピトープペプチドを単独で、または担体と結合した形で、アジュバントの存在または非存在下に免疫した動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ等）から回収した抗体産生細胞を、永久増殖性細胞と融合することで生産することができる。本方法は当業界において周知である（Antibodies: A Laboratory Manual, Lane, H. D. et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989）。本発明の抗体は、ヒト型化して本発明の方法の対照として使用できる他、精製用抗体、標識マーカー等として利用することもできる。また、治療用に供する場合もあり得る。
【００２２】
本発明は、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。本発明のキットは、前述の本発明の試薬を含み、また所望により本発明の抗体を含むことができる。キットはさらに、検出用試薬、反応用緩衝液、洗浄液、反応停止液、対照品等を含んでもよい。検出用試薬として、抗ｐ５３由来ペプチド抗体に特異的に反応する物質（例えば抗ヒトＩｇＧ抗体）を酵素、放射性物質、蛍光物質等で標識したものを用いることができる。本発明のキットは、配列番号１に示すアミノ酸配列に由来し、かつ配列番号３に示すアミノ酸配列から選択される連続する少なくとも４個のアミノ酸残基を含むアミノ酸残基数４〜９個のペプチド、好ましくは配列番号１に示すアミノ酸配列に由来し、かつ配列番号３に示すアミノ酸配列を含むアミノ酸残基数５〜９個のペプチド、なかでも配列番号１または２に示すアミノ酸配列を有するペプチドを特異的に認識する抗体を検出するものが好ましい。
【００２３】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は下記実施例によっていかなる意味においても制限されるものではない。
【実施例】
【００２４】
実施例１
１．材料
１−１．試料収集
乳癌患者（ＢＣ、ｎ＝１０４）から血清を収集した。病理学的検討のため、一部のＢＣ患者から癌組織を採取した。前立腺癌患者（ＰＣ、ｎ＝５０）を対照癌患者と、健常人（ＨＤ、ｎ＝８３、女性５８人、男性２５人）を対照非癌患者とした。被験者はすべて日本人であり、ＨＩＶ非感染であった。血清試料は、使用まで−８０℃で保存した。
【００２５】
１−２．ペプチド合成
スクリーニングのため、ｐ５３タンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）に基づきＨＬＡ−Ｂ４６結合モチーフを有する７つの異なるｐ５３由来ペプチド（純度＞７０％）（ｐ５３９９−１０７、ｐ５３１１８−１２６、ｐ５３１６１−１７０、ｐ５３２０４−２１２、ｐ５３２６４−２７２、ｐ５３３１９−３２７、およびｐ５３３７７−３８５）を合成した（非特許文献１１）。さらなる検討には純度＞９０％のｐ５３１１８−１２６およびｐ５３３７７−３８５を使用した。
【００２６】
２．統計学的解析
統計学的解析は、StatMate（Atoms, Tokyo, Japan）を用いて行った。ＥＬＩＳＡ法による抗ペプチド抗体アッセイの結果は、両側スチューデントｔ検定によって解析した。以下の４.および５.では、９５％信頼区間（ＣＩ）の中央値をデータとして示し、ノンパラメトリック（両側 Mann-Whitney U 試験）解析を用いて分布を比較した。
【００２７】
３．液性免疫に認識されるｐ５３由来ペプチドの同定
３−１．ｐ５３由来ペプチドに対する抗体の検出
はじめに、７つのｐ５３由来ペプチドの各々に反応するＩｇＧが、ＢＣ患者（ｎ＝１５）および女性ＨＤ（ｎ＝１５）の血清において検出されるかについて検討した。
血清中のペプチド特異的ＩｇＧのレベルは、ＥＬＩＳＡ法により測定した（非特許文献１２、１３）。簡単に説明すると、ｐ５３由来ペプチド（２００μｇ／ｍｌ）を１００μｌ／ウェルにて添加してコートしたプレート（Nunc #478042）をBlock Ace (MEGMILK, Hokkaido, Japan)でブロックし、０．０５％Tween 20-PBS（ＰＢＳＴ）で洗浄した。血清試料を０．０５％Tween 20- Block Aceで１：１００から１：８００まで段階的に希釈し、１００μｌ/ウェルでプレートに添加した。３７℃で２時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、ウサギ抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的、DAKO #A0423）（１：１０００）を添加してさらに３７℃で２時間インキュベートした。プレートを９回洗浄した後、ヤギ抗ウサギＩｇ結合西洋ワサビペルオキシダーゼ-デキストランポリマー（DAKO #K4003）（１：１００）１００μｌを各ウェルに添加し、プレートを室温で４０分間インキュベートした。ペプチド特異的ＩｇＧのレベルを評価するため、各試料のＡ４５０値を段階希釈標準試料と比較し、その値をＡ４５０として示した。ペプチド特異的ＩｇＧのＡ４５０値を、ＨＩＶペプチド（Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe：配列番号５）をコートした陰性対照と比較した。
【００２８】
少なくとも一つのペプチドに対して陽性応答が見られたＢＣ患者４人およびＨＤ１人の代表的結果を図１に示す。陰性対照（ＨＩＶペプチド）に対してＰ値＜０．０５（＊）を有意であると見なした。
陰性対照（ＨＩＶペプチド）と比較して、ｐ５３１１８−１５６およびｐ５３３７７−３８５に反応する有意なレベルのＩｇＧが、ＢＣ患者１５人のうちそれぞれ４および５人、およびＨＤ１５人のうち１人の血清中で検出された。これに対し、残り５つのペプチドに対するＩｇＧのは、試験した血清試料のいずれにおいても観察されなかった（図１）。
【００２９】
３−２．抗ｐ５３由来ペプチドＩｇＧの特異性
抗ｐ５３１１８−１２６および抗ｐ５３３７７−３８５ＩｇＧのペプチド特異性を吸収試験により検討した。
０．５％Tween 20 Block Aceで１：１００に希釈した血清試料１００μｌ/ウェルを、３７℃で２時間、ｐ５３由来ペプチド（ｐ５３１１８−１２６、ｐ５３３１９−３２７、またはｐ５３３７７−３８５、２０μｇ/ウェル）、組換え野生型ｐ５３タンパク質（BD Bioscience, San Diego, CA）、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、陰性対照として使用）（１５０ｎｇ／ウェル）により吸収した。吸収を３回繰り返し、得られた上清中のペプチド特異的ＩｇＧのレベルをＥＬＩＳＡ法によって測定した。血清中のＩｇＧのレベルはＡ４５０で表し、３回のアッセイの平均を示した。
【００３０】
図２に、ＢＣ患者２人（図２Ａ）およびＨＤ（図２Ｂ）における代表的結果を示す。これら血清（ＢＣ患者２人およびＨＤ１人）の抗ｐ５３３７７−３８５活性は、大部分が対応ペプチドでの吸収によって減少したが、他のｐ５３由来ペプチドであるｐ５３１１８−１２６およびｐ５３３１９−３２７、および陰性対照として使用したＨＩＶペプチドのいずれによっても減少しなかった。一方、これら血清試料の抗ｐ５３１１８−１２６活性は、対応ペプチドを含め、試験したいずれのペプチドを用いた吸収によっても減少しなかった。言い換えると、抗ｐ５３３７７−３８５ＩｇＧのペプチド特異性は本実施例で使用した条件下で確認されたが、抗ｐ５３１１８−１２６ＩｇＧのペプチド特異性は確認されなかった。次に、抗ｐ５３３７７−３８５活性が、組換えｐ５３タンパク質またはＢＳＡでの吸収によって減少するかについて検討した。ｐ５３３７７−３８５に対する抗ｐ５３３７７−３８５ＩｇＧの反応性は、これらのタンパク質での吸収によっては減少しなかった。このことは、抗ｐ５３３７７−３８５ＩｇＧが完全ｐ５３タンパク質と交差反応性を有さないことを示唆している。
以上より、乳癌患者において特異的液性免疫応答を誘導するｐ５３タンパク質由来ペプチド、ｐ５３３７７−３８５（配列番号１）が同定された。
【００３１】
４．各種疾患における抗ｐ５３３７７−３８５ＩｇＧの検出
ｐ５３３７７−３８５に焦点をしぼり、ＢＣ患者（ｎ＝１０４）、ＰＣ患者（ｎ＝５０）およびＨＤ（ｎ＝８３）から採取した血清中の特異的ＩｇＧの存在を検討した。ｐ５３３７７−３８５（黒丸）、ｐ５３３１９−３２７（白丸）、または無関係なペプチド（ＨＩＶペプチド）（白三角）に反応するＩｇＧを上記３．と同様にして測定した。カットオフ値は、血清希釈１：１００においてＡ４５０＝０．２３３（ＨＤの血清中における抗ｐ５３３７７−３８５ＩｇＧレベルの平均＋２ＳＤ）と定めた。
【００３２】
すべての陽性ケースの代表的結果を図３ＡおよびＢに示す。この条件下、ＢＣ患者１０４人のうち２４人（２３％）、ＰＣ患者５０人のうち０人、およびＨＤ８３人のうち４人（５％）の血清で、ｐ５３３７７−３８５に特異的なＩｇＧが有意なレベルで検出された。
【００３３】
血清希釈１：１００でのすべての試料のＡ４５０値の分布を図３Ｃに示す。本条件下において、ＢＣ患者の血清中の抗ｐ５３３７７−３８５ＩｇＧのＡ４５０値の中央値は、ＰＣ患者およびＨＤよりも高かった。陽性結果の頻度に関しては、信頼区間は＞９５％であり、以下の被験者が抗ｐ５３３７７−３８５ＩｇＧに陽性であった：ＢＣ患者１０４人のうち２７人（２６．０％）、ＰＣ患者５０人のうち０人（０％）、およびＨＤ８３人のうち５人（６．０％）。
以上の結果は、この抗ｐ５３由来ペプチド抗体がＢＣの発症、進行等に何らかの形で関与することを示唆している。
【００３４】
５．抗ｐ５３３７７−３８５ＩｇＧと患者予後との相関関係
抗ｐ５３３７７−３８５ＩｇＧのレベルとＢＣ患者の予後との関係を調べるため、以下の臨床学的および病理学的観点からＢＣ患者の予後を検討した：臨床段階、再発、リンパ節における腫瘍転移、周辺組織に対する浸潤レベル、組織学的分類（乳頭腺管癌、硬性癌および充実腺癌）。臨床学的および病理学的特性は、日本乳癌学会（General rules for clinical and pathological recording of breast cancer. The 14th Edition. The Japanese Breast Cancer Society, Kanehara publishing Co., Tokyo, 2000）および／または国際対癌連合（ＵＩＣＣ）（Breast tumours (ICD-O C50). Interbational Union Against Cancer (UICC), Fifth Edition. Sobin LH and Wittekind (eds.), rue du Conseil-General, Ch-1205, Geneva, Switzerland, 1997.）による分類に基づいて分類した。周辺組織への腫瘍の浸潤は、乳癌取扱規約（日本乳癌学会編、金原出版）を参考に以下のように分類した：ｇ：病巣が乳腺組織内のとどまるもの；ｆ：乳腺外脂肪に及ぶもの；ｓ：皮膚に及ぶもの；ｐ：筋肉（大胸筋）に及ぶもの；ｗ：胸郭に及ぶもの。抗ｐ５３３７７−３８５ＩｇＧのレベルは、上記３．記載の方法に従い、血清希釈１：１００、カットオフ値Ａ４５０＝０．２３３にて評価した。
【００３５】
血液採取後３年以内に再発しなかったＢＣ患者の血清の抗ｐ５３３７７−３８５ＩｇＧのレベル（血液採取の時点；ｎ＝１９）は、再発した患者（ｎ＝１０）におけるレベルよりも有意に高かった（Ｐ＝０．０１８１３、図４Ａ）。周辺組織への腫瘍の浸潤レベルが低いＢＣ患者（ｆ＋ｇ、ｎ＝３０）の血清における抗ｐ５３３７７−３８５ＩｇＧのレベルは、浸潤レベルが高い患者（ｓ＋ｐ、ｎ＝１２）より有意に高かった（Ｐ＝０．０１、図４Ｂ）。また、転移性腫瘍細胞が見られた前哨リンパ節が３未満だったＢＣ患者（ｎ＝４７）の血清における抗ｐ５３３７７−３８５ＩｇＧのレベルは、５以上のリンパ節で転移性腫瘍細胞が見られた患者（ｎ＝１２）のレベルより有意に高かった（Ｐ＝０．０３４１、図４Ｃ）。さらに初期段階疾患のＢＣ患者（段階０およびＩ、ｎ＝２４）の血清における抗ｐ５３３７７−３８５ＩｇＧのレベルは、後期段階疾患（段階ＩＩ、ＩＩＩ，およびＩＶ、ｎ＝３９）の患者のレベルより有意に高かった（Ｐ＝０．０１９５、図４Ｄ）。同様に、乳頭腺管腫瘍を有するＢＣ患者の血清における抗ｐ５３３７７−３８５ＩｇＧのレベルは、統計学的には有意な差ではないものの、硬性および充実腺腫瘍を有するもののレベルよりも高かった（データ非提示）。
また、上記観点から予後が良好であったＢＣ患者における抗ｐ５３３７７−３８５ＩｇＧのレベルは、ＨＤと比較して有意に高かった（Ｐ＜０．０１）が、予後不良のＢＣ患者とＨＤの間には有意差は見られなかった（データ非提示）。
以上より、抗ｐ５３３７７−３８５抗体は、臨床段階、リンパ節への転移、腫瘍細胞の浸潤、および再発に関して最適な予後因子であることが示唆される。
【００３６】
実施例２
抗ｐ５３３７７−３８５抗体の認識エプトープの同定（１）
Ｐ５３タンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）の３７７−３８５番目の領域（ｐ５３３７７−３８５（配列番号１）に相当）を基準として、６ｍｅｒのオーバーラッピングペプチドを１２種類合成した（ｐ５３３７２−３７７、ｐ５３３７３−３７８、ｐ５３３７４−３７９、ｐ５３３７５−３８０、ｐ５３３７６−３８１、ｐ５３３７７−３８２、ｐ５３３７８−３８３、ｐ５３３７９−３８４、ｐ５３３８０−３８５、ｐ５３３８１−３８６、ｐ５３３８２−３８７、ｐ５３３８３−３８８）。３年以内に再発が認められたＢＣ患者３人（＃１５０８、１５１１、１５１３）、３年以内に再発が認められなかった、予後が良好なＢＣ患者（＃９３４、９３５、９３６）３人、およびＨＤ３人（＃９７０、９７１、９７２）の血清において、これらペプチドに対する抗体のレベルを実施例１と同様に測定した。
実施例１で用いたｐ５３３７７−３８５を構成する４種類の６ｍｅｒペプチド（破線内、ｐ５３３７７−３８２、ｐ５３３７８−３８３、ｐ５３３７９−３８４、ｐ５３３８０−３８５）のうち、ＢＣ患者における抗体レベルがＨＤにおけるよりも高く、またその差が最も顕著だったのは、ｐ５３３７８−３８３（配列番号２）（実線内）であった（図５）。この結果は、ｐ５３３７８−３８３が、ｐ５３３７７−３８５と同様に本発明の方法に使用できることを示す。
【００３７】
実施例３
抗ｐ５３３７７−３８５抗体の認識エプトープの同定（２）
ｐ５３３７７−３８５（配列番号１）に基づき、６〜８ｍｅｒの６種類のペプチド（ｐ５３３７７−３８２（６ｍｅｒ）、ｐ５３３７７−３８３（７ｍｅｒ）、ｐ５３３７７−３８４（８ｍｅｒ）、ｐ５３３７８−３８５（８ｍｅｒ）、ｐ５３３７９−３８５（７ｍｅｒ）、ｐ５３３８０−３８５（６ｍｅｒ）、図６Ｄ）を合成し、３人のＢＣ患者の血清において抗ペプチド抗体のレベルを実施例１と同様に測定した。
ｐ５３３７７−３８５と比較して、Ｎ末のThr（Ｔ）を除いたペプチド（ｐ５３３７８−３８５）およびＣ末側のLeu（Ｌ）、Met（Ｍ）またはPhe（Ｆ）を除いたペプチドに対する抗体の反応が高かったことから、ｐ５３３７７−３８５のエピトープはその２〜６番目のアミノ酸残基（Ser Arg His Lys Lys：配列番号３）であると考えられた。このことは、Ser Arg His Lys Lys（配列番号３）を含むｐ５３３７７−３８５に由来するペプチドが、ｐ５３３７７−３８５と同様に本発明の方法に使用できることを示唆する。
【００３８】
参考例
ＢＣ患者の血清におけるｐ５３タンパク質に対する抗体の検出
ＢＣ患者１０４人の血清中のｐ５３タンパク質に対する抗体の存在をウェスタンブロッティングにより調べた（図７）。
組換えｐ５３タンパク質（BD Bioscience, San Diego, CA）を、緩衝液（尿素７．２ｍＭ、Triton X-100 １．６％、ジチオスレイトール０．８％およびリチウムドデシル硫酸塩２％）で濃度１５０ｎｇ／５μｌに希釈した。試料５μｌを各ウェルにロードし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。アクリルアミドゲル中のタンパク質を、HybondTM-ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）メンブラン（Amersham）上にブロットし、その後１００倍希釈血清と４℃で一晩インキュベートした。陽性対照として、ＤＯ−７マウスモノクローナル抗体（Dako, Glostrup, Denmark）を使用した。ウェスタンブロット解析の以降の手順は、以前に記載されている（Shichijo, S., Hayashi, A., Takaori, S., Tsunosue, R., Hoshino, T., Sakata, M., Kuramoto, T., Oizumi, K., and Itoh, K. Detection of MAGE-4 protein in lung cancer. Int. J. Cancer., 54: 158-165, 1995.）。
【００３９】
ｐ５３タンパク質に反応するＩｇＧが、試験した１０４人の患者のうち１２人（ＢＣＩ−１２、−１３、−２２、−２３、−３４、−３６、−４０、ＢＣＩＩ−２、−４８、−５４、−５６、および−５９）（１２％）から得た血清において検出された。これら１２人の陽性血清、および陽性対照（ＤＯ−７、マウスモノクローナル抗体）の結果を図７に示す。これらの患者なかで、陽性レベルの抗ｐ５３３７７−３８５ＩｇＧを有していたのは４人（ＢＣＩ−１２、ＢＣＩＩ−４８、−５６、および−５９）だけであった。
【００４０】
ＢＣ患者１０４人のうち、２９人の患者を血液試料採取後３年にわたり経過観察した。抗ｐ５３タンパク質抗体陽性患者７人（ＢＣＩ−１２、−１３、−２２、−２３、−３４、−３６、および−４０）のうち２人（ＢＣＩ−１３および２２）（２９％）が３年以内に癌で死亡した。一方、抗ｐ５３タンパク質抗体陰性の患者では、同期間内に癌で死亡したのは２２人のうち２人（ＢＣＩ−１７および２９）（１０％）であった。再発については、陽性患者７人のうち５人（ＢＣＩ−１３、−２２、−２３、−３４、−３６、および−４０）（７１％）が処置開始後３年以内に再発したが、陰性患者では２２人のうち再発したのは５人（ＢＣＩ−１７、−２６、−２９、−３７、および−４２）（２３％）であった。
【００４１】
これらの結果は、完全長ｐ５３タンパク質に対する抗体は、本発明で用いる抗ｐ５３由来ぺプチド抗体とは異なり、ＢＣ患者において予後不良の危険因子であることを示唆している。これは以前に他のグループによって報告された結果と一致する（非特許文献１５−１８）。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ｐ５３由来ペプチドに対する抗体の検出結果を示すグラフである。ｐ５３１１８−１２６およびｐ５３３７７−３８５に反応するＩｇＧが、ＢＣ患者およびＨＤ血清において検出された。
【図２Ａ】ＢＣ患者血清中の抗ｐ５３由来ペプチド抗体の特異性を示すグラフである。
【図２Ｂ】ＨＤ血清中の抗ｐ５３由来ペプチド抗体の特異性を示すグラフである。
【図３Ａ】血清中の抗ｐ５３３７７−３８５抗体の存在を検討した結果を示すグラフである（ＢＣ患者）。
【図３Ｂ】血清中の抗ｐ５３３７７−３８５抗体の存在を検討した結果を示すグラフである（ＢＣ患者およびＨＤ）。
【図３Ｃ】ＢＣ患者、ＰＣ患者およびＨＤにおける抗ｐ５３３７７−３８５抗体レベルを比較したグラフである。ＢＣ患者の血清中の抗ｐ５３３７７−３８５抗体レベルは、ＰＣ患者およびＨＤよりも高かった。
【図４】抗ｐ５３３７７−３８５抗体とＢＣ患者の予後との相関関係を示すグラフである。抗ｐ５３３７７−３８５抗体のレベルが高い場合に予後が良好であることが示された。
【図５】ＢＣ患者およびＨＤにおける１２種類のオーバーラッピングペプチドに対する抗体のレベルを示すグラフである。各ペプチドは、配列番号４に示すアミノ酸配列におけるそのＮ末アミノ酸の位置により表す。黒のカラムはＨＤ、斜線のカラムは３年以内に再発が認められたＢＣ患者、白のカラムは予後が良好なＢＣ患者の結果を示す。
【図６】ＢＣ患者の血清における、ｐ５３３７７−３８５に由来するペプチドに対する抗体のレベルを示すグラフである。各ペプチドは、配列番号４に示すアミノ酸配列におけるそのＮ末アミノ酸の位置およびアミノ酸残基数により表す。３種類のカラムは、異なる希釈倍率（１００、２００、および４００倍希釈）を表す。
【図７】ＢＣ患者の血清中に存在するｐ５３タンパク質に対する抗体を示す図面代用写真である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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