(57)【要約】【課題】検出対象物中の複数の遺伝子の存在比を簡便に検出する手段を提供し、例えば、これを嫌気的バイオレメディエーションの分野において活用する途を提供すること。【解決手段】特定の一塩基置換の関係を有する複数の検出対象遺伝子、を含有する可能性のある試料に対して、当該一塩基置換が認められる遺伝子領域の増幅反応産物を調製し、（Ａ）当該増幅反応産物において、一塩基伸長反応を行い、（Ｂ）反応系（Ａ）に、アビジン化磁気ビーズを共存させて、当該磁気ビーズ上のアビジンと、上記増幅反応産物とビオチン化プライマーのハイブリダイズ鎖におけるビオチンとを結合させた後、（Ｃ）反応系における１種又は２種以上の標識をカウントし、カウントした標識同士における強度の比を、試料中の検出対象遺伝子の存在比として表すことを特徴とする、遺伝子の検出方法、を提供することにより、上記の課題を解決し得ることを見いだした。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の一塩基置換の関係を有する複数の検出対象遺伝子、を含有する可能性のある試料に対して、当該一塩基置換が認められる遺伝子領域の増幅反応産物を調製し、
（Ａ）  （１）当該増幅反応産物、（２）一塩基置換対象塩基から一塩基分３’側の塩基から３’側に向かうＤＮＡ鎖に対して相補的な、５’末端にビオチンを結合させたビオチン化プライマー、（３）一塩基置換対象塩基に相補的な塩基を有する標識されたジデオキシリボヌクレオチド３リン酸、を共存させて一塩基伸長反応を行い、
（Ｂ）  （Ａ）の反応系に、アビジン化磁気ビーズを共存させて、当該磁気ビーズ上のアビジンと、上記増幅反応産物とビオチン化プライマーのハイブリダイズ鎖におけるビオチンとを結合させた後、余剰の標識されたジデオキシリボヌクレオチド３リン酸を反応系から除去して、
（Ｃ）反応系における１種又は２種以上の標識をカウントし、カウントした標識同士における強度の比を、試料中の検出対象遺伝子の存在比として表すことを特徴とする、遺伝子の検出方法。
【請求項２】
検出対象遺伝子が、微生物の16S rＲＮＡをコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項１記載の遺伝子検出方法。
【請求項３】
検出対象試料が、土壌試料であり、かつ、検出対象遺伝子が、Dehalococcoides属に属する微生物の遺伝子であることを特徴とする、請求項１又は２記載の遺伝子の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出対象物における異なる遺伝子の存在比を簡便に検出することを可能とする、遺伝子の検出方法に関する発明である。特に、本発明は、嫌気的バイオレメディエーションが行われている場所の汚染物質の浄化状況を、当該場所における汚染物質を分解する微生物の存在比として検出する場合等に有用である。
【背景技術】
【０００２】
特定の遺伝子を検出することは、医療、衛生、食品、犯罪捜査等の分野において、種々の目的に応じて行われている。これらの大部分は、特定の遺伝子が、検出対象物中に存在するか否かを検出する定性分析か、その存在量を検出する定量分析に大別される。しかしながら、検出対象物中に、近縁の複数の微生物の遺伝子の存在比を簡便に明らかにする方法については、それほど着目されているとはいえない。このような、遺伝子の存在比を簡便に検出することが求められる分野として、土壌におけるバイオレメディエーションが挙げられる。
【０００３】
すなわち、テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）やトリクロロエチレン（ＴＣＥ）といった揮発性有機塩素化合物は、土壌・地下水汚染の原因となっているが、有効な浄化方法がないことから大きな問題となっている。最近、その効率的な浄化技術として、水素供与体であるHRC（登録商標）（Hydrogen Release Compound）を注入し嫌気的微生物による脱塩素化を促進する嫌気的バイオレメディエーションが注目されている。
【非特許文献１】Kakihara F., et al. (2005) Anal Biochem. 341: 77-82
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、嫌気的脱塩素化は全ての汚染された土壌に有効ではなく、その効果の解析も困難である。その大きな原因の１つが、嫌気微生物の分解能を定性的、定量的に把握する方法が確立されていないことである。
【０００５】
嫌気的脱塩素化を行う代表的な微生物であるDehalococcoides（ Dhc．）属には様々な種類のものがあり、それらが協調して脱塩素化を行っている。そのため、これらの微生物の種類や量をモニタリングすることがＰＣＥやＴＣＥの嫌気的バイオレメディエーションには重要である。
【０００６】
検出対象物中に存在する特定の微生物を、属レベルで検出するための遺伝子として、属間において高度に保存されている16S rＲＮＡをコードする遺伝子の塩基配列が、しばしば選択されている。
【０００７】
しかしながら、Dhc．属内の16S rＲＮＡをコードする遺伝子の配列は、互いに極めて類似しており、当該遺伝子自体の存在を指標に、Dhc．属内における定量を行うことは容易ではない。また、おそらく、他のマーカー遺伝子についても同様の傾向が認められ、16S rＲＮＡをコードする遺伝子をマーカーとした場合と同様に、Dhc．属内の定量は難しいと思われる。
【０００８】
嫌気的バイオレメディエーションにおいて重要なことは、地下水を含む土壌試料中のDhc．属に属する微生物の存在比を迅速・簡便に検出して、微生物による土壌の浄化の進捗状況を容易に把握し、その進捗状況に応じた対策を迅速に講ずることにある。
【０００９】
よって、本発明の課題は、検出対象物中の複数の遺伝子（多くは微生物由来）の存在比を簡便に検出する手段を提供し、例えば、これを嫌気的バイオレメディエーションの分野において活用する途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、以前、一塩基伸長反応を表す標識の検出と磁気分離を用いた、ＳＮＰｓ（一塩基置換多型）タイピング技術であるMagSNiPer法を開発した（図１、非特許文献１）。MagSNiPer法は、下記の（ａ）〜（ｃ）のプロセスを経て、ＳＮＰｓをタイピングする技術である。
【００１１】
（ａ）  （１）一塩基置換対象塩基を含む遺伝子領域、（２）一塩基置換対象塩基から一塩基分３’側の塩基から３’側に向かうＤＮＡ鎖に対して相補的な、５’末端にビオチンを結合させたビオチン化プライマー、（３）一塩基置換対象塩基に相補的な塩基を有する標識されたジデオキシリボヌクレオチド３リン酸、を共存させて一塩基伸長反応を行い、
【００１２】
（ｂ）  （Ａ）の反応系に、アビジン化磁気ビーズを共存させて、当該磁気ビーズ上のアビジンと、上記増幅反応産物とビオチン化プライマーのハイブリダイズ鎖におけるビオチンとを結合させた後、余剰のジデオキシリボヌクレオチド３リン酸を反応系から除去して、
【００１３】
（ｃ）  反応系における標識をカウントし、当該標識の有無により、検出対象遺伝子における一塩基多型についての判定を行う。これは、具体的には、上記のジデオキシリボヌクレオチド３リン酸の標識をＴａｇ標識として、これに結合する標識抗体（酵素標識が結合したもの）を結合させて、この結合した標識抗体の標識をカウントすることによる判定として開示されている。
【００１４】
このMagSNiPer法は、高い感度と定量性を特徴としていることが明らかになっている。
【００１５】
本発明者は、上述した嫌気的バイオレメディエーションにおける浄化状況のモニタリング手段として、このMagSNiPer法を活用することができるのではないかと考え、検討を重ねた。その結果、MagSNiPer法は、一塩基置換の関係で異なる近縁の遺伝子同士の存在割合を、簡便かつ正確に把握することが可能であることを見出し、本発明を完成した。
【００１６】
すなわち、本発明は、特定の一塩基置換の関係を有する複数の検出対象遺伝子を含有する可能性のある試料に対して、当該一塩基置換が認められる遺伝子領域の増幅反応産物を調製し、
【００１７】
（Ａ）  （１）当該増幅反応産物、（２）一塩基置換対象塩基から一塩基分３’側の塩基から３’側に向かうＤＮＡ鎖に対して相補的な、５’末端にビオチンを結合させたビオチン化プライマー、（３）一塩基置換対象塩基に相補的な塩基を有する標識されたジデオキシリボヌクレオチド３リン酸、を共存させて一塩基伸長反応を行い、
【００１８】
（Ｂ）  （Ａ）の反応系に、アビジン化磁気ビーズを共存させて、当該磁気ビーズ上のアビジンと、上記増幅反応産物とビオチン化プライマーのハイブリダイズ鎖におけるビオチンとを結合させた後、余剰の標識されたジデオキシリボヌクレオチド３リン酸を反応系から除去して、
【００１９】
（Ｃ）  反応系における１種又は２種以上の標識をカウントし、カウントした標識同士における強度の比を、試料中の検出対象遺伝子の存在比として表す、
ことを特徴とする遺伝子の検出方法（以下、本検出方法ともいう）、を提供する発明である。
【００２０】
本検出方法においては、検出対象遺伝子として、微生物の16S rＲＮＡをコードする遺伝子を選択することは好適な態様の一つである。また、本検出方法は、上述したように、嫌気的バイオレメディエーションの分野における、浄化の進捗状況の把握を目的としての使用に非常に適している。この場合、検出対象試料が、土壌試料（地下水を含む）であり、かつ、検出対象遺伝子が、Dehalococcoides属に属する微生物の遺伝子、典型的には、16S rＲＮＡをコードする遺伝子であることが、好適な態様として挙げられる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、検出対象における近縁の遺伝子同士の存在割合を簡便に、かつ、正確に把握可能な手段が提供される。この検出手段は、嫌気的バイオレメディエーションが行われている場所の汚染物質の浄化状況のモニタリングを行う上で、非常に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本検出方法においては、原則として、未知の一塩基置換多型を改めて見出すのではなく、既知の一塩基置換多型をマーカーとして、近縁の遺伝子同士の存在割合を把握することを目的とする遺伝子の検出方法である。よって、検出を行う大前提として、検出対象の一塩基多型が目的とする近縁の遺伝子同士において既知であることが挙げられる。例えば、Dehalococcoides属に属する２種の微生物における、16S rＲＮＡをコードする遺伝子の塩基配列は、図２に示すものであり、すでに既知の塩基配列である（図２は、Dehalococcoides strain  195と、Dehalococcoides strain BAV1の16S rＲＮＡをコードする遺伝子の塩基配列を比較した図面である）。このような既知の遺伝子の塩基配列のうち、特定の一塩基置換多型を示す塩基（図２であれば、印１で示す塩基：Dehalococcoides strain  195がＧ（グアニン）であり、Dehalococcoides strain BAV1がＡ（アデニン）である）に着目して、相互の遺伝子の存在割合を検出することが本検出方法の特徴である。
【００２３】
本検出方法では、一塩基置換多型が認められる遺伝子領域の遺伝子増幅処理を、１回以上行うことが必要である。かかる遺伝子増幅法は、ＰＣＲ法を基本とする遺伝子増幅法を行うことが好適である。この場合の遺伝子増幅用プライマーは、一塩基置換多型が認められる検出対象遺伝子同士に共通する既知の遺伝子配列の一部に準じて設計を行い、用いることができる。また、例えば、細菌同士で保存されている遺伝子配列(例えば、１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の一部）に基づいて遺伝子増幅用プライマーを設計して、第一次的な遺伝子増幅法を行った後、特定の近縁種間に絞った遺伝子増幅法を行うことも可能である。遺伝子増幅法の具体的な実施手順は、既知の方法に準じて行うことができる。
【００２４】
例えば、嫌気的バイオレメディエーションを行っている地下水中のDehalococcoides属の特定株間の存在割合を検出する場合には、地下水中の微生物のＤＮＡの精製を常法に従い行い、Dehalococcoides属に共通のプライマーにて、１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子を増幅することにより、Dehalococcoides属の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子のみを特異的に遺伝子増幅産物として得ることが可能である。１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子は、リボゾームという生物の本質に関わる機能を有するＲＮＡをコードする遺伝子であるので、遺伝子の保存性が高く、極めて関係の遠い生物同士でも配列の比較が可能であると同時に、比較的変異しやすい部位も存在し、例えば、Dehalococcoides属のような特定の範疇の微生物の遺伝子のみを選択して増幅することも可能である。また、微生物株同士を区別することが可能な一塩基置換多型も安定して存在するので、本検出方法における検出対象遺伝子としては非常に優れている。また、遺伝子の長さが程よい（１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子は、１６００塩基対程度）ことも、本検出方法で用いるのに好適である理由の一つとして挙げられる。
【００２５】
遺伝子増幅法を行うことにより得られる遺伝子増幅産物に対して、MagSNiPer法を行うことにより、検出対象遺伝子同士において認められる一塩基置換対象塩基を、標識の強度の相対的な比率として明らかにして、かかる標識の強度の比率を基に、検出対象遺伝子同士の検出対象物における存在比率を求めることが可能となる。
【００２６】
このようにして得られた遺伝子増幅産物を鋳型ＤＮＡとして、MagSNiPer法に準じた方法を行うことにより、本検出方法を行うことができる。
【００２７】
具体的には、プロセス（Ａ）〜（Ｃ）として示したように：
プロセス（Ａ）は、（１）上記の鋳型となる遺伝子増幅産物と、（２）一塩基置換対象塩基から一塩基分３’側の塩基から３’側に向かうＤＮＡ鎖に対して相補的な、５’末端にビオチンを結合させたビオチン化プライマーと、（３）一塩基置換対象塩基に相補的な塩基を有する標識されたジデオキシリボヌクレオチド３リン酸を共存させて、一塩基伸長反応を行うプロセスである。
【００２８】
上記（２）のビオチン化プライマー１２は、図１に示したように、鋳型ＤＮＡ（遺伝子増幅産物）１１において、一塩基置換対象塩基１１１（Ｃ）から、一塩基分３’側の塩基から３’側に向かうＤＮＡ鎖部分、に対して相補的なＤＮＡ鎖１２１の５’末端にビオチン１２２を結合させたプライマーである。ビオチン化プライマーは、既知の鋳型ＤＮＡの塩基配列に準じて設計され、当該プライマーの塩基長は限定されるものではないが、概ね
２０〜３０塩基程度が好適である。また、５’末端のビオチン化は、常法に従い行うことができる。
【００２９】
さらに上記（３）のジデオキシリボヌクレオチド３リン酸（ddＮＴＰ）における塩基は、通常は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、及び、シトシン（Ｃ）から選ばれる１〜４種であり、当該塩基は、検出対象となる一塩基置換対象塩基に応じて、さらには、具体的な検出態様に応じて選択することができるが、少なくとも検出対象となる一塩基置換対象塩基に対して相補的な塩基の一方が選択される。例えば、図１に示すように、検出対象となる一塩基置換対象塩基（鋳型ＤＮＡの一塩基置換対象塩基）の一方がＣである場合には、少なくとも、標識ddＮＴＰ１１２として、相補的な塩基がＧ（１１３）となるように、標識ddＧＴＰを選択することが必要である。そして、仮に、他方の一塩基置換対象塩基がＡの場合には、これに対して標識ddＴＴＰを、上記標識ddＧＴＰと共に、あるいは、別個に選択する必要がある。ここで用いる標識１１２１は特に限定されず、酵素標識、蛍光標識、ラジオアイソトープ等を例示することができるが、少なくとも、２種以上のddＮＴＰについては、少なくとも同一カテゴリーの標識であることが、遺伝子の存在比率を標識の強度に応じて求める上で好適である。具体的には、２種以上の標識ddＮＴＰを同一の試験系において共存させる場合は、同一カテゴリーの異なる標識であることが、互いの遺伝子を峻別する上で好適であるが、共存させずに別個に検出系を構築する場合には、同一カテゴリーの、同一若しくは異なる標識であってもよい。さらに具体的には、蛍光標識としては、FITC、Cy5、Cy3、TAMRA、TexasRed等、酵素標識としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等、ラジオアイソトープとしては、32Ｐ、33Ｐ、35Ｓ等が挙げられる。また、特に好適な例として、例えば、蛍光標識等をTagとして用いて、これに対して特異的な標識抗体を結合させて、当該標識抗体の標識をカウントする態様を挙げることができる。
【００３０】
プロセス（Ａ）において、上記のような条件とすることにより、鋳型ＤＮＡの一塩基置換塩基に相補的な塩基が一塩基分、鋳型ＤＮＡ上で伸長し、当該塩基の標識にて標識がなされたハイブリダイズ鎖が作出される。
【００３１】
プロセス（Ｂ）は、プロセス（Ａ）の反応系に、アビジン化磁気ビーズ１３を共存させて、当該磁気ビーズ上のアビジン１３１と、上記増幅反応産物とビオチン化プライマー１２のハイブリダイズ鎖におけるビオチン１２２とを結合させた後、余剰の標識されたジデオキシリボヌクレオチド３リン酸を反応系から除去するプロセスである。
【００３２】
アビジン化磁気ビーズは、例えば、市販の磁気ビーズをアビジン（又はストレプトアビジン）水溶液中に浸漬することにより、容易に調製することができる。
【００３３】
かかるアビジン化磁気ビーズを、プロセス（Ａ）で得られた試験系に十分量共存させることにより、ビオチン化プライマー、並びに、ビオチン化プライマーと鋳型ＤＮＡとが、ハイブリダイズした部分二本鎖（標識あり、又は、なし）の、ビオチン化部分がビーズ上のアビジン残基部分が結合反応し、ビーズ上に固定化される。ビーズは十分量共存させているために、余分の標識ddＮＴＰを反応系から除去することにより、ビーズにおける標識量が、特定の一塩基置換対象塩基を有する遺伝子のシグナルとして把握される。
【００３４】
プロセス（Ｃ）は、反応系における１種又は２種以上の標識１１２１をカウントし、カウントした標識同士における強度の比を、試料中の検出対象遺伝子の存在比として表すプロセスである。標識のカウントの方法は、用いた標識の種類に応じて適宜選択することが  できる。反応系における一塩基置換多型塩基を同一の標識でカウントする場合には、一方の本検出方法の実施により判明した一方の多型遺伝子の存在を表す標識のカウント量と、他方の同実施により判明した他方の多型遺伝子の存在を表す標識のカウント量を、相対比として求めることにより、検出対象とする両遺伝子の存在量を把握することができる。
【００３５】
反応系における一塩基置換多型塩基を異なる標識でカウントする場合には、これらの異なる標識を同一の反応系においてカウントすることが効率的である。本検出方法の実施により判明した一方の多型遺伝子の存在を表す一方標識のカウント量と、他方の多型遺伝子の存在を表す他方の標識のカウント量を、相対比として求めることにより、検出対象とする両遺伝子の存在量を把握することができる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。
〔実施例１〕規定量の遺伝子を用いた場合の実施例
Dhc. ethenogenes strain 195（以下、DHC195ともいう）の16S rRNAをコードする遺伝子（以下、１６ＳｒＤＮＡ又は１６Ｓｒ遺伝子ともいう）の塩基配列（配列番号１）及びDhc. sp. strain BAV1（以下、ＢＡＶ１ともいう）の16S rRNAをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号２）を比較し、一塩基の違いのある部分（図２：印１→配列番号１の９７０番目の塩基と配列番号２の９７０番目の塩基に該当）をターゲットとした本検出方法を、以下の要領にて行った。
【００３７】
（１）遺伝子増幅とサンプルの調製
それぞれの菌株に由来する１６Ｓｒ遺伝子の増幅産物を得るために、それぞれの菌株のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行うことにより、当該遺伝子の増幅を行った。
【００３８】
用いた遺伝子増幅用プライマーは：
Ｆｗ：５’−ＡＡＧＴＣＧＡＡＣＧＧＴＣＴＴＡＡＧＣＡ−３’（配列番号３）
Ｒｖ：５’−ＧＣＧＧＴＴＡＣＴＡＧＣＡＡＣＴＣＣＡＡ−３’（配列番号４）
【００３９】
また、熱サイクルは、９５℃・５分→３０×（９５℃・３０秒→５５℃・３０秒→７２℃・２分）→７２℃・２分、にて行った。
【００４０】
それぞれの遺伝子増幅産物の規定量を混合したサンプルで、それぞれの菌株についての独自の検量線が作成可能であることを実証するために、（ａ）ＢＡＶ１由来の増幅産物の濃度を一定（3.6ng/μl）にして、ＤＨＣ１９５由来の増幅産物の濃度を変化させる系と、（ｂ）ＤＨＣ１９５由来の増幅産物の濃度を一定（3.6ng/μlwater）にして、ＢＡＶ１由来の増幅産物の濃度を変化させる系、を設けた。
【００４１】
（２）MagSNiPer法
上記の遺伝子増幅により得られた、それぞれの菌株の１６Ｓｒ遺伝子の遺伝子増幅産物における、図２の印１に示す一塩基置換塩基（ＤＨＣ１９５：Ｇ、ＢＡＶ１：Ａ）を、それぞれターゲットにして、上述したMagSNiPer法を行った。
【００４２】
（ａ）ビオチン化プライマー
下記の塩基配列を有する５’ビオチン化プライマーを、ＤＮＡ合成機を用いて常法により合成した。
【００４３】
５’(biotin)−ＣＧＡＣＣＴＧＴＴＡＡＧＴＣＡＧＧＡＡ−３’（配列番号５）
【００４４】
（ｂ）標識ｄｄＮＴＰ
標識ｄｄＮＴＰは、Ｔａｇ標識として、蛍光物質であるフルオレセインが標識されている市販品を、滅菌水で希釈して用いた（Perkin Elmer社製）。
【００４５】
（ｃ）上記のように調製した遺伝子サンプルにおいて、ビオチン化プライマー、並びに、フルオレセインで標識されたddNTP及び非標識のddNTP（一塩基伸長反応の目的の塩基についてのみ標識ddNTPとし、それ以外は非標識のddNTPである）を混合し、一塩基伸長反応を行った。次いで、その反応産物とアビジン化磁気ビーズ（Dynabeads M-280 Streptavidin：Dynalbiotech社製）と共存させて、アビジン−ビオチン結合により、当該磁気ビーズに対する結合反応を行い、常法により、余剰のddNTPを除去した。その後、抗フルオレセイン抗体アルカリホスファターゼConjugate（ANTI-FLUORESCEIN-AP CONJUGATE:Perkin Elmer社製）を結合させ、同様に、過剰なConjugateを除去し、アルカリフォスファターゼの基質であり、分解されると発光するCDPstar（Amersham Biosciences社製）を加えて発光強度を測定した。その結果を、図３に示す。図３（１）は、ＤＨＣ１９５に関する検量線であり、（２）は、ＢＡＶ１に関する検量線である。
【００４６】
このようにして、本検出方法では、標識の強度を基に、目的とする遺伝子の存在比を求めることが可能であることが判明した。
【００４７】
〔実施例２〕  嫌気的バイオレメディエーション領域の地下水における検出
愛知県下の機械工場の揮発性有機塩素化合物により汚染された領域において、ＨＲＣ（登録商標：粘性のある液体状のポリ乳酸エステル）を用いた嫌気的バイオレメディエーションが行われた領域の地下水におけるＤＨＣ１９５とＢＡＶ１の存在割合について、本検出方法によるモニタリングを行った。ＨＲＣ（登録商標）は、水と反応して徐々に乳酸を放出し、乳酸は微生物の働きで分解して水素が生成し、その水素が微生物（主にDehalococcoides属）による還元的脱塩素化に利用されて、有機塩素化合物が段階的に分解され、最終的には、エチレンやエタンのような無害な化合物に転換されることが知られている。
【００４８】
この嫌気的バイオレメディエーション開始６ヶ月後に、注入井戸に対して地下水下流の観測井戸から地下水をサンプリングし、このサンプリング水におけるDehalococcoides属に属する微生物の１６Ｓｒ遺伝子の塩基配列の解析を、常法により行った。その結果、ＤＨＣ１９５が55％、ＢＡＶ１が32％の割合で、地下水中に存在することが判明した（残りはその他のDehalococcoides属に属する微生物等）。この結果と実質的に同様の結果が本検出方法により導き出されるか否かについて検討を行った。
【００４９】
実施例１と同様の要領で、この観測井戸の地下水（嫌気的バイオレメディエーション開始３ヵ月後と６ヶ月後）を、サンプルとして、本検出方法を行った。
【００５０】
その結果、図４（１）に示すように、試験開始３ヵ月後では、ＢＡＶ１：ＤＨＣ１９５＝１０：９程度、（２）に示すように、試験開始６ヵ月後では、同＝３：５程度の存在比であることが判明した。この試験開始６ヵ月後の結果は、先に行った塩基配列解析の結果と実質的に一致している。
【００５１】
これらの結果から、本検出方法を行うことにより、検出対象物における一塩基置換多型で区別される近縁の遺伝子の存在割合を、簡便に、かつ、正確に把握可能であり、特に、本実施例のような嫌気的バイオレメディエーションの進捗状況のモニタリングには極めて有用であることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】MagSNiPer法の原理を図式化して示した図面である。
【図２】Dehalococcoides属に属する微生物のうち、ＤＨＣ１９５とＢＡＶ１の１６Ｓｒ遺伝子の配列を比較し、その一塩基置換多型部分を示した図面である。
【図３】混合試料に対して本検出方法を行って得られた、ＤＨＣ１９５とＢＡＶ１の検量線を示した図面である。
【図４】嫌気的バイオレメディエーションが行われている領域の地下水を試料として、ＤＨＣ１９５とＢＡＶ１の存在比を、本検出方法により明らかにした図面である。
【図１】
2007089567.tif 000002
【図２】
2007089567.tif 000003
【図３】
2007089567.tif 000004
【図４】
2007089567.tif 000005
【配列表】
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