(57)【要約】【課題】水系媒体中での膨潤を抑制しかつタンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制できるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤、及び、該イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた糖化ヘモグロビンの分析方法を提供する。【解決手段】基材微粒子と、前記基材微粒子の表面に存在するイオン交換基とからなるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤であって、水及びアセトンにそれぞれ分散させ、超音波を１５分間照射し、２５℃で２４０時間放置して平衡化させた後、粒度分布測定機により粒子径をそれぞれ測定したとき、水に分散させたときの粒子径ＤＷとアセトンに分散させたときの粒子径ＤＡとの比ＤＷ／ＤＡが２．０以下、かつ、該イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を単層に隙間なく並べた上に純水の液滴を形成させ、２５℃の条件下で接触角計により測定した水の接触角が６０°以下であるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材微粒子と、前記基材微粒子の表面に存在するイオン交換基とからなるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤であって、
水及びアセトンにそれぞれ分散させ、超音波を１５分間照射し、２５℃で２４０時間放置して平衡化させた後、粒度分布測定機により粒子径をそれぞれ測定したとき、水に分散させたときの粒子径ＤＷとアセトンに分散させたときの粒子径ＤＡとの比ＤＷ／ＤＡが２．０以下であり、かつ、該イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を単層に隙間なく並べた上に純水の液滴を形成させ、２５℃の条件下で接触角計により測定した水の接触角が６０°以下である
ことを特徴とするイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項２】
イオン交換基は、スルホン酸基であることを特徴とする請求項１記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いることを特徴とする糖化ヘモグロビンの分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水系媒体中での膨潤を抑制し、かつ、タンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤、及び、該イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた糖化ヘモグロビンの分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いたイオン交換液体クロマトグラフィー法は、イオン性を有する物質の分離に汎用されており、なかでも、糖化ヘモグロビンをはじめ、各種生体関連物質の分離分析に極めて有効な方法として知られている。
【０００３】
イオン交換液体クロマトグラフィー法では、カラム内の圧力変動を小さくし平衡化を早くする目的で、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の水系溶媒に対する膨潤が小さいことが要求される。
水系媒体における膨潤を小さくするためには、従来公知の方法として、疎水性架橋性単量体を多く用い、架橋度を高めることで対応できる。
しかしながら、疎水性架橋性単量体を用いてなるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤は、タンパク質等の生体試料を接触させることにより、非特異的な吸着が起こり、測定精度が低下することがあるという問題もあった。
近年、イオン交換液体クロマトグラフィー法が臨床検査等にも用いられているため、高い測定精度が求められており、この非特異吸着を抑制する必要がある。
【０００４】
この非特異吸着は、疎水性相互作用によって引き起こされると考えられるため、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の表面の親水性をできるだけ高める必要がある。
イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の親水性を高める方法としては、例えば、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の基材微粒子部分に親水性単量体を多く含有させる方法等が挙げられる。
しかしながら、親水性単量体の含量を多くすると、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤内部の親水性も高まってしまい、結果としてイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の機械的強度が弱くなってしまうため、高速分離ができなくなったり、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤自体が膨潤を起こし、測定精度の低下を招いたりするといった問題が生じる。
【０００５】
このような問題を解決する方法として、例えば、特許文献１には、疎水性架橋重合体微粒子の表面に、親水性重合体の層が形成された被覆重合体微粒子を用いる方法が開示されている。疎水性架橋重合体微粒子は、構成する疎水性架橋性単量体によって強度に架橋されているため、機械的強度が高く、膨潤を防ぐことができる。また、被覆される親水性重合体の層の厚みを１〜３０ｎｍとすることで、分析対象物質等の非特異吸着の防止、及び、親水性重合体の層による膨潤の抑制を実現できるとしている。
【０００６】
しかしながら、現実的には、このような親水性重合体の層の厚みの範囲で、疎水性架橋重合体微粒子の露出を防ぐことは難しく、結果的に疎水性相互作用に起因する非特異吸着を充分に防ぐことができなかった。
特に、糖化ヘモグロビンのように臨床検査等に用いられる物質を測定する場合には、一段と高いレベルで測定精度が要求されるため、疎水性相互作用に起因する非特異吸着を可能な限り防止する必要がある。
【特許文献１】特公平８−７１９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記現状に鑑み、水系媒体中での膨潤を抑制し、かつ、タンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤、及び、該イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた糖化ヘモグロビンの分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、基材微粒子と、上記基材微粒子の表面に存在するイオン交換基とからなるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤であって、水及びアセトンにそれぞれ分散させ、超音波を１５分間照射し、２５℃で２４０時間放置して平衡化させた後、粒度分布測定機により粒子径をそれぞれ測定したとき、水に分散させたときの粒子径ＤＷとアセトンに分散させたときの粒子径ＤＡとの比ＤＷ／ＤＡが２．０以下であり、かつ、該イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を単層に隙間なく並べた上に純水の液滴を形成させ、２５℃の条件下で接触角計により測定した水の接触角が６０°以下であるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤である。
以下に本発明を詳述する。
【０００９】
本発明者らは、鋭意検討の結果、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤のＤＷ／ＤＡ（以下、膨潤度ともいう）及び表面に対する水の接触角を一定の範囲とすることにより、水系媒体中での膨潤を抑制し、かつ、タンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することができるということを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤は、水及びアセトンにそれぞれ分散させ、超音波を１５分間照射し、２５℃で２４０時間放置して平衡化させた後、粒度分布測定機により粒子径をそれぞれ測定したとき、水に分散させたときの粒子径ＤＷとアセトンに分散させたときの粒子径ＤＡとの比ＤＷ／ＤＡの上限が２．０である。
一般に、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤は、有機溶媒中では収縮し、水系媒体では程度によらず膨潤する傾向にある。ゆえに、水系媒体での膨潤の程度が大きいと、ＤＷ／ＤＡが大きくなり、逆に、水系媒体での膨潤の程度が小さいと、ＤＷ／ＤＡが小さくなる。
ＤＷ／ＤＡが２．０を超えると、水系媒体での膨潤の程度が大きすぎるため、カラム内の圧力変動が大きくなり、平衡化に時間がかかるため実用的ではない。好ましい下限は１．０、好ましい上限は１．８である。
【００１１】
上記粒度分布測定機としては特に限定されず、例えば、Ａｃｃｕｓｉｚｅｒ７８０（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）等が挙げられる。
【００１２】
また、本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤は、該イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を単層に隙間なく並べた上に純水の液滴を形成させ、２５℃の条件下で接触角計により測定した水の接触角の上限が６０°である。
接触角測定は、高分子材料をはじめ、表面の親水性、疎水性を評価する方法として用いられる。水の接触角が小さいほど親水性が高いと判断され、本発明においては、上限を６０°とすることで、親水性が大幅に向上し、タンパク質等の生体試料を接触させた場合の非特異的吸着が少ない。より好ましい上限は５０°である。
【００１３】
上記接触角計としては、例えば、協和界面科学社製、Ｄｒｏｐｍａｓｔｅｒ５００等の自動接触角計を用いることができる。
上記水の接触角は、上述したような接触角計を用い、液滴の左右端点と頂点とを結ぶ直線の固体表面に対する角度から接触角を求める方法（θ／２法）等によって測定することができ、具体的には、以下のような方法が挙げられる。
マイクロスコープで確認しながら、乾燥させたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤をスライドガラス上に貼付した両面テープ上に単層に隙間なく並べ、その後エアースプレーで余分なイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を除去し、両面テープ上にイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を固定化する。
２５℃の純水１μＬの液滴を作製し、スライドガラス上に固定化したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤に着液させ、接触角計を用いて接触角をθ／２法により算出する。なお、接触角が９０°より小さい場合、着液後の水滴は濡れ広がろうとするため、着液後の接触角は経時的に小さくなる。そこで、着液後０．５秒後の接触角値を用いて評価を行う。
【００１４】
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤は、膨潤度が上記範囲を満たすことにより水系媒体でもほとんど膨潤しないものとなり、水の接触角が上記範囲を満たすことにより、タンパク質等の生体試料を接触させても、非特異的な吸着が起こり測定精度が低下することがない。
【００１５】
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤は、従来公知のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤と同様に、基材微粒子と、上記基材微粒子の表面に存在するイオン交換基とからなるものである。
上記膨潤度の範囲と上記水の接触角の範囲とを満たすイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤としては、具体的には、例えば、水溶解度が５重量％以下の疎水性架橋性単量体及び／又は疎水性非架橋性単量体からなる疎水性架橋重合体からなる基材微粒子と、上記基材微粒子の表面に存在するイオン交換基とからなり、最表面に親水化処理が施されているものを挙げることができる。
【００１６】
上記疎水性架橋重合体は、１種の水溶解度が５重量％以下である疎水性架橋性単量体を単独重合して得られる疎水性架橋重合体；２種以上の水溶解度が５重量％以下である疎水性架橋性単量体を共重合して得られる疎水性架橋重合体；少なくとも１種の水溶解度が５重量％以下である疎水性架橋性単量体と、少なくとも１種の水溶解度が５重量％以下である疎水性非架橋性単量体とを共重合して得られる疎水性架橋重合体のいずれであってもよい。
【００１７】
上記水溶解度が５重量％以下である疎水性架橋性単量体としては、単量体１分子中にビニル基を２個以上有するものであれば特に限定されず、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート等のジ（メタ）アクリル酸エステル；テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリレート等のトリ（メタ）アクリル酸エステル又はテトラ（メタ）アクリル酸エステル；ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルナフタレン等の芳香族系化合物等が挙げられる。
ここで、水溶解度とは、水１００ｍＬに単量体２０ｍＬを加え、室温で１０分間×３回攪拌し２０℃の保温器で一晩放置し、その後、水に溶解した単量体量を水素炎ガスクロマトグラフィーで二重結合（ＰＳＤＢ）法により測定し、算出した値である。
【００１８】
上記水溶解度が５重量％以下である疎水性非架橋性単量体としては、疎水性の性質を有する非架橋性の重合性有機単量体であれば特に限定されず、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、イソプロピル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステル；スチレン、メチルスチレン等のスチレン系単量体等が挙げられる。
【００１９】
上記疎水性架橋重合体が、上記水溶解度が５重量％以下である疎水性架橋性単量体と上記水溶解度が５重量％以下である疎水性非架橋性単量体との共重合からなる場合には、水溶解度が５重量％以下である疎水性非架橋性単量体の使用量は、水溶解度が５重量％以下である疎水性架橋性単量体１００重量部に対して、５０重量部以下であることが好ましい。
【００２０】
最表面を親水化処理する方法としては特に限定されず、例えば、基材微粒子の表面にオゾン水処理、オゾンガス処理、プラズマ処理、コロナ処理、過酸化水素水、次亜塩素酸ナトリウム等による表面酸化処理等を施す方法やタンパク質や多糖類をはじめとする生体由来の親水性化合物やポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、リン脂質ポリマー等の親水性高分子化合物を、基材微粒子の表面に対して物理吸着、又は、化学結合させる方法等が挙げられる。
なかでも、調製時の作業性、Ｌｏｔ管理のしやすさ、経時的な性能維持等を考慮すると、オゾン水処理が好ましい。
なお、上記親水化処理は、基材微粒子の表面にイオン交換基を導入する前に行ってもよいし、基材微粒子の表面にイオン交換基を導入した後に行ってもよい。
【００２１】
上記オゾン水とは、オゾンガスが水に溶解したものを意味する。
オゾンには強力な酸化作用があるが、オゾンガスでは、基材微粒子表面を均一に酸化することにより親水化処理を施すことが非常に難しい。
しかし、オゾン水を用いることにより、オゾン水中に基材微粒子を分散させるだけで疎水性架橋重合体表面を簡便に酸化させ親水化処理を施すことができる。親水化処理の結果、疎水性の構造部分が酸化され、親水性基（−ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨ等）が生成すると考えられる。
【００２２】
上記オゾン水における溶存オゾンガスの濃度としては特に限定されないが、好ましい下限は２０ｐｐｍである。２０ｐｐｍ未満であると、親水化処理に時間がかかったり、充分な親水化処理を施せずに測定対象物質等の非特異吸着を充分に抑制することができなかったりする。より好ましい下限は５０ｐｐｍである。なお、濃度の好ましい上限は特にない。
【００２３】
上記オゾン水の調製方法としては特に限定されず、例えば、特開２００１−３３０９６９号公報等に記載されているように、原料水とオゾンガスとを、気体のみを透過し液体の透過を阻止するオゾンガス透過膜を介して接触させる方法等により調製することができる。
【００２４】
さらに、上記オゾン水処理を行う際には促進酸化処理法を用いることが好ましい。促進酸化処理法とは、オゾン水の酸化作用を増強させる方法のことをいい、紫外線照射、超音波照射、アルカリ水添加等の溶存オゾンの分解を促進する方法を単独で用いるか又は２種以上を併用することをいう。
このような促進酸化処理法による処理を行うことで、溶存オゾンの分解が促進され、オゾンの分解によって生じるヒドロキシラジカルの生成量を増加する。このようにして生成したヒドロキシラジカルは、オゾンよりも更に高い酸化力を有するため、親水化処理の効果を更に高めることが可能になるものと考えられる。上記促進酸化処理法を利用した場合、基材微粒子の表面における親水基（−ＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨ等）の生成を更に促進することが可能となる。
【００２５】
なお、親水化処理を行わなくても表面に対する水の接触角が６０°以下である場合には、特に親水化処理を行う必要がない。
【００２６】
上記イオン交換基としては特に限定されず、例えば、スルホン酸基、カルボキシル基、リン酸基等が挙げられる。なかでも、スルホン酸基を用いる場合には、長期間にわたって性能を維持することができ、また、ヘモグロビンＡ１ｃ等の分析にも高い効果が得られることから好適である。
【００２７】
上記イオン交換基の導入方法としては特に限定されず、例えば、特公平８−７１９７号公報に記載されているように基材微粒子表面にイオン交換基を有する単量体を共重合させる方法等が挙げられる。
上記イオン交換基を有する親水性単量体としては特に限定されず、水系媒体中に溶解可能な重合性単量体の中から本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の使用目的に応じて選択すればよく、カチオン交換液体クロマトグラフィーに用いる場合には、例えば、アクリル酸、メタクリル酸等のカルボキシル基を有する単量体、スチレンスルホン酸、アリルスルホン酸、２−（メタ）アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸等のスルホン酸基を有する単量体、（（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（２−（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート等のリン酸基を有する単量体等が挙げられ、なかでも、スルホン酸基を有する単量体が好適に用いられ、アニオン交換液体クロマトグラフィーに用いる場合には、例えば、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、アリルアミン等のアミノ基を有する単量体等が用いられる。
【００２８】
なお、イオン交換基を含む単量体を１種以上含めば、親水性を高める目的でイオン交換基を含まない親水性単量体と共重合させてもよい。
また、官能基を有する単量体を基材微粒子表面で共重合させ、その官能基にイオン交換基を有する化合物を反応させて基材微粒子表面にイオン交換基を導入する方法を用いることもできる。
【００２９】
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の平均粒子径としては特に限定されないが、好ましい下限は０．１μｍ、好ましい上限は２０μｍである。０．１μｍ未満であると、カラム内が高圧になりすぎて分離不良を起こすことがあり、２０μｍを超えると、カラム内のデッドボリュームが大きくなり過ぎて分離不良を起こすことがある。
【００３０】
本発明の親水性高分子微粒子の粒度分布（ＣＶ値）としては特に限定されないが、好ましい上限は４０％である。４０％を超えると、カラム内のデッドボリュームが大きくなりすぎ、分離不良を起こすことがある。より好ましい上限は１５％である。
【００３１】
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤は、糖化ヘモグロビン等のヘモグロビン類（Ｈｂ）の測定に用いることができる。このような糖化ヘモグロビン類の測定方法もまた、本発明の１つである。
具体的には、例えば、本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を公知のカラムに充填した後、得られたカラムに所定の条件で溶離液及び測定試料を送液することにより、ヘモグロビン類を測定することができる。
上記溶離液としては、従来公知のものを使用することができ、例えば、有機酸、無機酸、又は、これらの塩類を成分とする液等を用いることができる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明によれば、水系媒体中での膨潤を抑制し、かつ、タンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤、及び、該イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた糖化ヘモグロビンの分析方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００３４】
（実施例１）
攪拌機付き反応器に、３％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液に、テトラエチレングリコールジメタアクリレート（新中村化学社製）３００ｇ、トリエチレングリコールジメタアクリレート（新中村化学社製）１００ｇ及び過酸化ベンゾイル（キシダ化学社製）１．０ｇの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素雰囲気下にて８０℃１時間重合した。次に、イオン交換基を有する単量体として、２−メタアクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東亜合成化学社製）１００ｇ、ポリエチレングリコールメタアクリレート（日本油脂社製、エチレングリコール鎖ｎ＝４）１００ｇをイオン交換水に溶解した。この混合物を同じ反応器に添加して、同様にして、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃で２時間重合した。得られた重合組成物を水及びアセトンで洗浄することにより、イオン交換基を有する親水性の被覆重合体粒子（イオン交換基を有する基材微粒子）を得た。
得られた被覆重合体粒子について、レーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測定したところ、平均粒子径は８μｍ、ＣＶ値は１４％であった。
【００３５】
得られた被覆重合体粒子１０ｇを溶存オゾンガス濃度１００ｐｐｍのオゾン水３００ｍＬに浸漬し、３０分間攪拌した。攪拌終了後、遠心分離機（日立製作所社製Ｈｉｍａｃ  ＣＲ２０Ｇ）を用いて遠心分離し、上澄みを除去した。この操作を２回繰り返し、親水化処理を施し、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
なお、オゾン水は、内径１５ｃｍ×長さ２０ｃｍの円柱形を有する外套内に、パーフルオロアルコキシ樹脂からなる内径０．５ｍｍ×厚さ０．０４ｍｍ×長さ３５０ｃｍの中空管状のオゾンガス透過膜４００本収容されたオゾン溶解モジュールを含むオゾン水製造システム（積水化学工業社製）を用いて調製した。
【００３６】
（比較例１）
攪拌機付き反応器に、３％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液に、エチレングリコールジメタアクリレート（新中村化学社製）２４０ｇ、ｎ−ブチルメタアクリレート（共栄社化学社製）１６０ｇ及び過酸化ベンゾイル（キシダ化学社製）１．０ｇの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素雰囲気下にて８０℃１時間重合した。次に、イオン交換基を有する単量体として、２−メタアクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東亜合成化学社製）１００ｇ、ポリエチレングリコールメタアクリレート（日本油脂社製、エチレングリコール鎖ｎ＝４）１００ｇをイオン交換水に溶解した。この混合物を同じ反応器に添加して、同様にして、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃で２時間重合した。得られた重合組成物を水及びアセトンで洗浄することにより、イオン交換基を有する親水性の被覆重合体粒子（イオン交換基を有する基材微粒子）を得た。
得られた被覆重合体粒子について、レーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測定したところ、平均粒子径は８μｍ、ＣＶ値は１６％であった。
得られた被覆重合体粒子１０ｇを実施例１と同様にして、オゾン水処理を行い、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
【００３７】
（比較例２）
オゾン水処理を行わなかったこと以外は、実施例１と同様にして被覆重合体粒子、及び、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
【００３８】
＜評価＞
実施例１及び比較例１〜２で得られたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤について以下の評価を行った。結果を表１、図１に示した。
【００３９】
（１）膨潤度測定
実施例１及び比較例１〜２で得られたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤について、膨潤度測定を行った。測定は、粒度分布計Ａｃｃｕｓｉｚｅｒ７８０（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。乾燥させたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤１ｇに純水又はアセトン３０ｍＬを入れた後、よく撹拌し、超音波を１５分照射し、分散液を得た。分散後、平衡膨潤に達するまで２５℃で２４０時間放置し、水中における粒子径ＤＷとアセトン中における粒子径ＤＡとを測定し、ＤＷ／ＤＡを膨潤度とした。
【００４０】
（２）接触角測定
実施例１及び比較例１〜２で得られたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤について、接触角測定を行った。測定は、自動接触角計（協和界面科学社製、Ｄｒｏｐｍａｓｔｅｒ５００）を用いて行った。乾燥させたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を２５ｍｍ×７５ｍｍのスライドガラス上に貼付した両面テープ上に隙間なく並べ、その後エアースプレーで余分な粒子を除去した。これにより、両面テープ上にイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を固定化した。この様子は、マイクロスコープで確認した。
２５℃の条件下、純水１μＬの液滴を作製し、スライドガラス上に固定化したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤に着液させ、接触角をθ／２法により算出した。なお、接触角が９０°より小さい場合、着液後の水滴は濡れ広がろうとする。従って、着液後の接触角は、経時的に小さくなる。そこで、着液後０．５秒後の接触角値を用いて評価を行った。
【００４１】
（３）圧力変動評価
実施例１及び比較例１〜２で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を液体クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を充填したカラムにｐＨの異なる溶離液を通液して、その際のカラム圧力変動、及びカラム圧力が安定するまでに要した時間（平衡化時間）を測定した。具体的には、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７：Ａ液）を３０分間通液した。カラム圧力が一定になった後、３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５：Ｂ液）を通液し、カラム圧力の変動を確認した。
【００４２】
（４）ヘモグロビンＡ１ｃ測定によるＨｂ回収率の評価
実施例１及び比較例２で作製したイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を液体クロマトグラフィーシステムのカラムに充填した。一方、グリコＨｂコントロールレベル２（国際試薬製、参考数値１０．４±０．５％）を２００μＬの注射用水で溶解した後、希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを調製し、測定試料とした。
得られたカラムを用いて、下記の条件により測定試料中のヘモグロビンＡ１ｃ量及びヘモグロビンＡ１ｃと非糖化ヘモグロビンとの合計量をクロマトグラムのピーク面積で評価した。測定は１０検体連続で行い、その後半５検体のヘモグロビンＡ１ｃピークの面積値及びヘモグロビンＡ１ｃピークと非糖化ヘモグロビンピークとの面積値の平均値を測定値とした。
図１は、実施例１で得られたヘモグロビンＡ１ｃピーク面積値及びヘモグロビンＡ１ｃと非糖化ヘモグロビンピークの面積値合計を１００％とし、実施例１、比較例２で得られた各ピーク面積を比較した。
システム：送液ポンプ  ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラー  ＡＳＵ―４２０（積水化学工業社製）
検出器  ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：第１液  １７０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
第２液  ３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
溶出法：０〜３分は第１液を、３〜３．２分は第２液を、３．２〜４分は第１液にて溶出
流速：１．０ｍＬ／分
検出波長：４１５ｎｍ
資料注入量：１０μＬ
【００４３】
【表１】
2007327821.tif 000002
【００４４】
実施例１は膨潤度、接触角ともに小さく、結果として、カラム内圧力変動が小さく、また、ヘモグロビン成分の非特異吸着も全くない。
比較例１は、架橋度の低い充填剤であるため、膨潤度が大きく、カラム内の圧力変動が非常に大きい。接触角は小さくことから、ヘモグロビンの非特異吸着は抑制されるものと考えられるが、カラム内の圧力変動が大きすぎて評価（４）を実施できない。従って、膨潤度を一定の範囲内におさめることは非常に重要である。
比較例２は、充填剤の架橋度は実施例１と同様であるため、膨潤度は小さく、カラム内の圧力変動も小さい。しかし、接触角が大きいため、ヘモグロビン成分の非特異吸着が起こりやすい。従って、接触角を一定の範囲内におさめることは、膨潤度と同様、非常に重要である。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明によれば、水系媒体中での膨潤を抑制し、かつ、タンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することができるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤、及び、該イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた糖化ヘモグロビンの分析方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】評価（４）における、ヘモグロビンＡ１ｃ測定によるヘモグロビン類（Ｈｂ）回収率の結果をグラフで示した図である。
【図１】
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