(57)【要約】【課題】本発明は癌細胞に選択的に作用することができる抗癌剤または癌治療薬を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は第一に、癌細胞のDNAに鎖内架橋の形成による損傷を与え、該損傷を受けた癌細胞における損傷バイパス複製を阻害することにより癌を治療する方法に用いるための、プロテアソーム阻害剤を含有する抗癌剤に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌細胞のDNAに鎖内架橋の形成による損傷を与え、該損傷を受けた癌細胞における損傷バイパス複製を、プロテアソーム阻害剤により阻害することにより癌を治療する方法に用いるための、プロテアソーム阻害剤を含有する抗癌剤。
【請求項２】
プロテアソーム阻害剤が、DNAが鎖内架橋の形成による損傷を受けた癌細胞における損傷バイパス複製を阻害するために効果的な量で含有される、請求項１記載の抗癌剤。
【請求項３】
DNAが鎖内架橋の形成による損傷を受けた癌細胞における損傷バイパス複製を阻害するために効果的な量にて投与される、請求項１または２記載の抗癌剤。
【請求項４】
癌細胞のDNAに鎖内架橋の形成による損傷を与えることができる化合物と、プロテアソーム阻害剤とを組合せてなる癌治療薬。
【請求項５】
癌治療薬が配合薬である、請求項４記載の癌治療薬。
【請求項６】
癌治療薬が、癌細胞のDNAに鎖内架橋の形成による損傷を与えることができる化合物を含有する薬剤と、プロテアソーム阻害剤を含有する薬剤とを含むキットである、請求項４記載の癌治療薬。
【請求項７】
癌細胞のDNAに鎖内架橋の形成による損傷を与えることができる化合物が、癌細胞のDNAに損傷を与えたるために効果的な量にて投与され、プロテアソーム阻害剤が、DNAが損傷を受けた癌細胞における損傷バイパス複製を阻害するために効果的な量にて投与される、請求項４記載の癌治療薬。
【請求項８】
癌細胞のDNAに鎖内架橋の形成による損傷を与えることができる化合物がシスプラチンである、請求項４〜７のいずれか１項記載の癌治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はDNAに損傷を受けた癌細胞における損傷バイパス複製を標的にした抗癌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
複製を担うDNAポリメラーゼ (PolδまたはPolε)が鋳型鎖上の損傷 (例えばT-Tダイマー等)に遭遇してそれ以上は複製を行うことができない場合は、それらのDNAポリメラーゼが、損傷を乗り越える(バイパスする)ことができる他のポリメラーゼと置き換わりDNA合成が続行される。この現象は損傷バイパス複製と呼ばれる。損傷バイパス複製が阻害されれば、細胞はアポトーシス死に至るものと考えられる。
【０００３】
癌細胞における損傷バイパス複製を選択的に阻害することができれば癌治療に利用できるものと考えられる。しかしながら、これまでに損傷バイパス複製を標的とした癌治療は行われていない。
【０００４】
プロテアソーム阻害剤としてはペプチドアルデヒド類（Cbz-LLL-H (MG-132)）、ペプチドボロネート類（Cbz-LLL-B(OH)2 (MG-262)、ボルテゾミブ）、ビニルスルホン類（Cbz-LLL-VS）、ラクタシスチン、β−ラクトン等が知られている（非特許文献１および２）。プロテアソーム阻害剤と損傷バイパス複製との関係は従来検討されていない。
【０００５】
【非特許文献１】Lee, D.H. & Goldberg, A.L. Proteasome inhibitors: valuable new tools for cell biologists. Trends Cell Biol. 8, 397-403 (1998).
【非特許文献２】Richardson, P.G., Hideshima, T. & Anderson, K.C. Bortezomib (PS-341): A novel, first-in-class proteasome inhibitor for the treatment of multiple myeloma and other cancers. Cancer Control 10, 361-369 (2003).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は癌細胞に選択的に作用することができる抗癌剤または癌治療薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは驚くべきことにプロテアソーム阻害剤が、DNAが鎖内架橋の形成による損傷を受けたヒト由来癌細胞における損傷バイパス複製を阻害するが、正常細胞におけるそれは阻害しないことを見出した。すなわち本発明は以下の発明を包含する。
(1) 癌細胞のDNAに鎖内架橋の形成による損傷を与え、該損傷を受けた癌細胞における損傷バイパス複製を、プロテアソーム阻害剤により阻害することにより癌を治療する方法に用いるための、プロテアソーム阻害剤を含有する抗癌剤。
(2) プロテアソーム阻害剤が、DNAが鎖内架橋の形成による損傷を受けた癌細胞における損傷バイパス複製を阻害するために効果的な量で含有される、(1) 記載の抗癌剤。
(3) DNAが鎖内架橋の形成による損傷を受けた癌細胞における損傷バイパス複製を阻害するために効果的な量にて投与される、(1)または(2)記載の抗癌剤。
(4) 癌細胞のDNAに鎖内架橋の形成による損傷を与えることができる化合物と、プロテアソーム阻害剤とを組合せてなる癌治療薬。
(5) 癌治療薬が配合薬である、(4)記載の癌治療薬。
(6) 癌治療薬が、癌細胞のDNAに鎖内架橋の形成による損傷を与えることができる化合物を含有する薬剤と、プロテアソーム阻害剤を含有する薬剤とを含むキットである、(4)記載の癌治療薬。
(7) 癌細胞のDNAに鎖内架橋の形成による損傷を与えることができる化合物が、癌細胞のDNAに損傷を与えたるために効果的な量にて投与され、プロテアソーム阻害剤が、DNAが損傷を受けた癌細胞における損傷バイパス複製を阻害するために効果的な量にて投与される、(4)記載の癌治療薬。
(8) 癌細胞のDNAに鎖内架橋の形成による損傷を与えることができる化合物がシスプラチンである、(4)〜(7)のいずれかに記載の癌治療薬。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、癌細胞に対して選択的に作用することができる抗癌剤または癌治療薬が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下本発明の構成を具体的に説明する。
【００１０】
（プロテアソーム阻害剤）
本発明において「プロテアソーム阻害剤」とは、プロテアソーム阻害活性を有する化合物であれば特に限定されず、典型的にはペプチドアルデヒド類、ペプチドボロネート類、ビニルスルホン類、ラクタシスチン、β−ラクトンが挙げられる。
【００１１】
ペプチドアルデヒド類としてはCbz-LLL-H (MG-132)：
【化１】
2007254320.tif 000002
が好ましい。
【００１２】
ペプチドボロネート類としては、Cbz-LLL-B(OH)2(MG-262)：
【化２】
2007254320.tif 000003
またはボルテゾミブ：
【化３】
2007254320.tif 000004
が好ましい。
【００１３】
ビニルスルホン類としては Cbz-LLL-VS:
【化４】
2007254320.tif 000005
が好ましい。
【００１４】
なお、ラクタシスチンは
【化５】
2007254320.tif 000006
で表される化合物であり、β−ラクトンは
【化６】
2007254320.tif 000007
で表される化合物である。これらも好適に使用できる。
【００１５】
また、DNAが鎖内架橋の形成による損傷を受けた癌細胞における損傷バイパス複製を阻害する能力を有する化合物である限り、上記各構造を有する化合物の誘導体化合物もまた本発明におけるプロテアソーム阻害剤として好適に使用できる。
【００１６】
（DNAの損傷）
本発明においてDNAの「鎖内架橋の形成による損傷」とは、同一のDNA鎖上において互いに隣接して存在する2つのヌクレオチドの塩基間で架橋構造 (intrastrand crosslink) が形成されることにより生じるDNAの損傷を意味する。架橋構造としては種々の形態があり限定されるものではないが、例えば、隣接する2つのヌクレオチドの塩基間に付加物 (adduct) が付加されることにより生じる架橋構造や、隣接する2つのヌクレオチドが二両体を形成することにより生じる架橋構造がある。付加物を介した架橋構造としては、具体的には、シスプラチンの添加により生じる白金を介した架橋構造が挙げられる。二両体の形成による架橋構造としては、具体的には、紫外線照射によって生じるピリミジン塩基間での二両体の形成による架橋構造（cis-syn 型シクロブタン・ピリミジン・ダイマー）が挙げられる。
【００１７】
なお本発明において癌細胞または正常細胞の「DNA」とは、典型的には核に存在するDNAを意味する。
【００１８】
（DNAに損傷を与える手段）
癌細胞のDNAに対して、鎖内架橋の形成による損傷を与える手段は特に限定されないが、典型的には紫外線（UV）照射や、DNAに所定の損傷を与える活性を有する化合物が挙げられる。かかる化合物としてはシスプラチンが特に好ましい。
【００１９】
（対象となる癌）
実施例に示す通りプロテアソーム阻害剤は癌細胞の起源、組織学的分類およびp53状態に関係なく、種々の癌細胞株においてUV照射後の損傷バイパス複製を阻害することが可能であった。
【００２０】
すなわち本発明の抗癌剤または癌治療薬は、癌細胞の起源、組織学的分類およびp53状態に関係なく、種々の癌に対して治療効果を有する。具体的な癌としては、子宮頚部癌、胃癌（特に未分化型）、大腸癌、乳癌、肝臓癌、悪性黒色腫、急性Tリンパ球白血病、多発性骨髄腫などが挙げられるが、これらには限定されない。
【００２１】
（抗癌剤としての形態）
本発明の第一の実施形態は、癌細胞のDNAに鎖内架橋の形成による損傷を与え、該損傷を受けた癌細胞における損傷バイパス複製を、プロテアソーム阻害剤により阻害することにより癌細胞の増殖を抑制して癌を治療する方法に用いるための、プロテアソーム阻害剤を含有する抗癌剤である。
【００２２】
このときプロテアソーム阻害剤は、DNAが鎖内架橋の形成による損傷を受けた癌細胞における損傷バイパス複製を阻害するために効果的な量で含有されることが好ましい。ここで、「DNAが鎖内架橋の形成による損傷を受けた癌細胞における損傷バイパス複製を阻害するために効果的な量」とは、投与時に、所定の癌細胞における損傷バイパス複製を阻害することが可能な量であれば特に限定されない。
【００２３】
本発明に係る抗癌剤は、そのDNAが鎖内架橋の形成による損傷を受けた癌細胞に対して、該癌細胞における損傷バイパス複製を阻害するために効果的な量で投与されることができる。
【００２４】
本発明に係る抗癌剤は、UV照射または化合物投与によって治療対象の癌細胞のDNAに対して鎖内架橋の形成による損傷を与える前後のいずれの段階において投与してもよく、DNA損傷処理と同時に投与してもよい。
【００２５】
投与形態は特に限定されず経口投与、非経口投与のいずれであってもよい。
製剤形態への調製は、常法に従って行うことができ、その際に利用できる担体や賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤、希釈剤も、慣用されている各種のものから適宜選択することができる。形態には、特に制限はなく、必要に応じ適宜選択されるが、一般には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、丸剤、液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤等の経口剤、又は注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、経鼻剤、経腸剤、貼付剤、軟膏剤等の非経口剤として製剤化される。
【００２６】
（癌治療薬）
本発明の第二の実施形態は、癌細胞のDNAに鎖内架橋の形成による損傷を与えることができる化合物と、プロテアソーム阻害剤とを組合せてなる癌治療薬である。
【００２７】
ここで「癌細胞のDNAに鎖内架橋の形成による損傷を与えることができる化合物」としては例えばシスプラチンを用いることができる。
【００２８】
本発明の癌治療薬は配合薬であってよい。ここで「配合薬」とは、2種の必須成分である、癌細胞のDNAに鎖内架橋の形成による損傷を与えることができる化合物とプロテアソーム阻害剤とが混合されて単一の薬剤に製剤化されたものを意味する。
【００２９】
本発明の癌治療薬はまた、癌細胞のDNAに鎖内架橋の形成による損傷を与えることができる化合物を含有する薬剤(1)と、プロテアソーム阻害剤を含有する薬剤(2)とを含むキットとして提供されてもよい。当該キットでは2種類の成分が別個の薬剤として製剤化されている。当該キットは、2種類の薬剤の外に、必要な緩衝液や希釈液、取扱説明書、注射器等を更に含んでもよい。
【００３０】
2種類の薬剤は同時に投与されてもよいし、時間的に前後して投与されてもよい。時間的に前後して投与する場合は薬剤(1)および(2)のいずれが先に投与されてもよい。プロテアソーム阻害剤が投与されてから治療対象の癌細胞に送達されるまでに要する期間と、DNAを損傷させるための化合物が投与されてから治療対象の癌細胞に送達されるまでに要する期間とが異なる場合には、その期間の相違を考慮して薬剤(1)および(2)の投与順序を適宜決定することができる。
【００３１】
2種類の薬剤の投与形態および製剤形態は上記第一の実施形態におけるのと同様に選択することが可能である。
【実施例】
【００３２】
1. 材料および方法
1.1. 癌細胞株
NB1RGB細胞 および HGC-27細胞は理化学研究所ジーンバンクより購入した。
TIG-1, LI90, WiDr, HepG2, MCF-7, CCRF-CEM, Mewo および RPMI8226の各細胞はヒューマンサイエンス研究資源バンクから入手した。CCRF-CEM細胞およびRPMI8226細胞は１０％のウシ胎仔血清（FCS）を添加したPRMI培地中で培養した。その他の細胞株は１０％のウシ胎仔血清（FCS）を添加したDulbecco改変Eagle培地(D'MEM)(以下「通常培地」と称する)にて単層に維持して培養した。
使用した細胞株の一覧を表１に示す。
【００３３】
【表１】
2007254320.tif 000008
【００３４】
1.2. UV照射および損傷バイパス複製
対数増殖期の接着細胞をトリプシン処理し、培養皿に接種した（1.3〜3 x 105個細胞/φ60mm皿）。翌日に細胞を1mM ヒドロキシウレアで16時間同調培養した。次いで、培地を通常培地と交換し、細胞を更に3時間インキュベートした。こうした処理を施したS期中期の細胞を殺菌灯 (Toshiba CL15) からのUV光 (10 J/m2) に毎秒0.5 J/m2にて暴露した。30分間の培養後、培地を、10% FCS および10 μCi/mlの[U-14C]チミジン (Moravek MC267, 470 mCi/mmol) を添加した D’MEM からなるラベル用培地と交換した。UV-照射した細胞は1時間パルスラベルした。UV-照射をしていない細胞は30分間ラベルした。次いで、培地を、プロテアソーム阻害剤（またはカフェイン）を含む、あるいは含まない通常培地に交換し、１〜５時間チェイスした。プロテアソーム阻害剤としてはMG-132 (SIGMA製)、ラクタシスチン (和光製)、またはMG-262 (Calbiochem製、または和光製)を用いた。カフェインとしてはSigma製のものを用いた。これらの細胞をトリプシン処理して回収し、アルカリ性ショ糖密度勾配遠心法（ASDG）により評価した。
【００３５】
懸濁培養により培養する細胞は、1% FCSを含有する少量のCa2+, Mg2+-不含リン酸緩衝食塩水(PBS)中で再懸濁し、φ100mmの培養皿の中心に置き、上記と同様にUV光 (10 J/m2) に暴露した後、通常培地をその培養皿中に添加した。20分間の培養後、培地を、10% FCS および10 μCi/mlの[U-14C]チミジンを添加した RPMIからなるラベル用培地に交換した (<3.2 x 106 個細胞/ml)。パルスラベリングは30分間行った。このラベル用培地をプロテアソーム阻害剤（またはカフェイン）を含む、あるいは含まない通常培地に交換し、１〜５時間更に培養を行った。これらの細胞を回収し、ASDGにより評価した。
【００３６】
1.3. シスプラチン処理またはメチルメタンスルフォネート(MMS)処理
シスプラチン(Sigma)をジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し20mMとしたものを、培養培地に添加した（終濃度 200μM）。培養１時間後、シスプラチン含有培地を通常培地と交換し、細胞を更に30分間インキュベートした。次いで、培地を上記のD’MEMに基づくラベル用培地に交換した。この実験操作におけるその他の手順はUV照射処理におけるのと同様である。
【００３７】
MMS (Aldrich)を２回蒸留水で 4mg/mlに希釈したものを培地に添加した (終濃度75μg/ml)。培養30分後、MMS-培地を通常培地と交換し、細胞を更に40分間培養した。次いで培地をD’MEMに基づくラベル用培地に交換した。この実験操作におけるその他の手順はUV照射処理におけるのと同様である。
【００３８】
1.4. カンプトテシン処理およびX線照射
進行中の複製フォークの直ぐ前にカンプトテシンによる損傷を引起こすために、カンプトテシン処理に先立ってD’MEMに基づくラベル用培地中で30分間パルスラベリングを行なった。カンプトテシン (Sigma) をDMSOに溶解して0.1mMとし、培地に添加した(0.4μM)。培養15分後、カンプトテシン含有培地を、プロテアソーム阻害剤（またはカフェイン）を含む、あるいは含まない通常培地に交換し、細胞を更に1.5時間インキュベートした。これらの細胞を回収し、ASDGにより評価した。
【００３９】
X線照射を行う場合には、培養培地を除去し、培養皿を氷水中に浮かせ、軟X線発生装置 OM-150R (Ohmic) を用いて、3.6 Gy/min (100 kV, 10 mA, 0.2 mm Alフィルター使用)にて照射を行った。この実験操作のその他の手順はUV照射処理におけるのと同様である。
【００４０】
1.5. アルカリ性ショ糖密度勾配遠心法（ASDG）
細胞 (PBS50μl中に約1 x 105個を含む)を50μlの1%蔗糖含有PBS上に穏やかに載せた。前記PBS層は、100μlの溶解溶液 (0.6 M KOH, 2.0 M KCl, 10 mM EDTA, および 1% N-ラウロイルサルコシン)上に重層されている。前記溶解溶液層は4.35mlのアルカリ性5-20%蔗糖勾配層(0.3 M KOH, 2.0 M KCl, 1 mM EDTA, および 0.1% N-ラウロイルサルコシン)の上に重層されている。底部にはクッションとして0.4mlのアルカリ性80%蔗糖層を設けられている。これをBeckman SW 50.1 ローターを用いて6,000 rpm (4,320 x g)で15℃にて15.6時間遠心した。遠心後、30枚の円形No.17ろ紙(Whatman)に分画した。各ろ紙を乾燥させ、冷5%トリクロロ酢酸中に10分間浸漬し、エタノールで3回洗浄し、アセトンで1回洗浄し、乾燥させ、放射能を測定した。分子量マーカーとして[14C]標識ファージT4 DNAをファージ粒子の形態で前記溶解溶液層上に載せ、同様の手順で沈降させた。
【００４１】
2. 結果
2.1. UV照射HeLa細胞における複製産物のASDGプロフィール (図1)
aには、プロテアソーム阻害剤を添加しない場合の、複製産物の伸長反応 (elongation)の経時変化を示す。bには、MG-132を添加した場合の効果を示す。cには、ラクタシスチン (Lactacystin) を添加した場合の効果を示す。dには、MG-262を添加した場合の効果を示す。
【００４２】
S期中期に同調された細胞にUV (10J/m2)を照射し、通常培地で30分間インキュベートし、10μCi/mlの[14C]チミジンで1時間パルスラベルし、次いで、PBSで2回洗浄し、1.0〜50μMのMG-132 (b)、2.0〜200μMのラクタシスチン (c)、0.1〜5.0μMのMG-262 (d)、あるいは阻害剤なし (a)を含有する通常培地中で37℃にて1, 3, または5時間インキュベートした。右(上部)から左(底部)にかけてより大きなDNA断片が沈降する。矢印はT4ファージDNA (166 kb, 即ち約5.5 x 107 ダルトン/一本鎖)の位置を示す。標識された大腸菌 DNA (約4メガベース) は底部付近 (画分No. 3-6) に沈降した。
【００４３】
2.2. NB1RGB細胞(正常細胞)(図2a)、LI90細胞(正常細胞)(図2b)、HeLa細胞(図2c)、およびHGC-27細胞(図2d)における複製産物のASDGプロフィール
各細胞においてプロテアソーム阻害剤またはカフェインの効果を観察した。
S期中期に同調された細胞にUV照射を行わず、10μCi/mlの[14C]チミジンで30分間パルスラベルし、PBSで2回洗浄し、50μMのMG-132、200μMのラクタシスチン、5.0μMのMG-262、あるいは5mMのカフェインを含有する通常培地中で37℃にて1, または3時間インキュベートした（図2a,b,c,dの上図）。
【００４４】
同様にして同調した細胞にUV (10J/m2)を照射し、通常培地で30分間インキュベートし、同濃度の[14C]チミジンで1時間パルスラベルし、次いで、PBSで2回洗浄し、50μMのMG-132、200μMのラクタシスチン、5.0μMのMG-262、あるいは5mMのカフェインを含有する通常培地中で37℃にて1, 2 または5時間インキュベートした（図2a,b,c,dの下図）。右(上部)から左(底部)にかけてより大きなDNA断片が沈降する。
【００４５】
2.3. MCF-7細胞(図3a)、HepG2細胞(図3b)、 WiDr細胞(=HT29細胞)(図3c)、CCRF-CEM細胞(図3d)、Mewo細胞(図3e)、およびRPMI8226細胞(図3f)における複製産物のASDGプロフィール
各細胞におけるプロテアソーム阻害剤またはカフェインの効果を確認した。
S期中期に同調された細胞にUV (10J/m2)を照射し、通常培地で30分間インキュベートし、10μCi/mlの[14C]チミジンで1時間パルスラベルし、次いで、PBSで2回洗浄し、50μMのMG-132、200μMのラクタシスチン、5.0μMのMG-262、あるいは5mMのカフェインを含有する通常培地中で37℃にて3, 4, 5, または8時間インキュベートした。CCRF-CEM細胞およびRPMI8226細胞は同調培養していない。右(上部)から左(底部)にかけてより大きなDNA断片が沈降する。
【００４６】
2.4. シスプラチン処理(図4a, b)、カンプトテシン処理(図4c,d)、メチルメタンスルホネート処理(図4e,f)、またはX線照射(図4g,h)を施したNB1RGB細胞(正常細胞) (a,c,e,g)またはHeLa細胞(b,d,f,h)における複製産物のASDGプロフィール
各細胞および各処理におけるプロテアソーム阻害剤またはカフェインの効果を観察した。
S期中期に同調された細胞にシスプラチン処理(cisPt)(150μM、1時間)、メチルメタンスルホネート処理(MMS)(75μg/ml, 30分間)、またはX線照射処理(X-ray)(10Gy)を施し、通常培地で30分間インキュベートし、10μCi/mlの[14C]チミジンで0.5時間または1時間パルスラベルした。カンプトテシン処理(CPT)(0.4μM、15分間)を施す細胞は、予め30分間パルスラベリングを行った。次いで、パルスラベルされた細胞をPBSで2回洗浄し、50μMのMG-132、200μMのラクタシスチン、5.0μMのMG-262、あるいは5mMのカフェインを含有する通常培地中で37℃にて1.5 または3時間インキュベートした。右(上部)から左(底部)にかけてより大きなDNA断片が沈降する。
【００４７】
3.考察
S期中期に同調されたHeLa細胞にUV照射を行い、更に30分間インキュベートした。こうして得られた細胞を更に1時間[14C]チミジンでパルスラベルした。UV照射直後の複製産物は、T4ファージDNA（マーカー）よりもわずかに大きい位置に鋭いピークとして沈降した（図1a）。細胞を通常培地中で1, 3または5時間「チェイス」すると、複製産物は徐々に連結して、100万塩基（メガベース）の単位の長さを有するより大きなDNAに変化した。癌細胞におけるこの伸長反応（複製産物断片が連結されて染色体レベルのサイズになること）は、正常細胞であるNB1RGB細胞におけるそれと比較して、非常に遅い（図2a下図）。UY照射後の伸長は他の癌細胞においても非常に遅い（図2d下図および図3）。
【００４８】
カフェインはDNA代謝および細胞周期に対して種々の影響を与えることが知られている（Kaufmann, W.K. et al. Caffeine and human DNA metabolism: the magic and the mystery. Mutat. Res. 532, 85-102 (2003).）。図2cおよび2dに示す通りカフェインはUV照射されたHeLa細胞およびHGC-27細胞において複製産物の伸長を阻害するだけでなく、他の種々の癌細胞株においても同様の作用を示す(図3)。一方、カフェインは正常細胞であるNB1RGB細胞(図2a)またはLI90細胞（図2b）においては作用を示さない、また、UV照射を受けていないHeLa細胞(図2c上図)またはHGC-27細胞(図2d上図)に対しても作用を示さない。
【００４９】
MG-132は、3.3μMという低濃度においても、UV照射されたHeLa細胞における複製産物の伸長を遅延（部分的に阻害）する(図1b)。この効果は濃度を高めるほど顕著になり、50μMではMG-132は伸長を完全に阻害する。同様に、ラクタシスチンは、20μM濃度でUV照射されたHeLa細胞における複製産物の伸長を部分的に阻害し、66μMで更に阻害し、180μMまたは200μMにおいて最も強く阻害する(図1c)。またMG-262は0.1μM濃度でUV照射されたHeLa細胞における複製産物の伸長を部分的に阻害することができ、0.33〜5μMの濃度にて完全に阻害する(図1d)。これらの結果から、各プロテアソーム阻害剤の投与量を決定した(MG-132: 50μM、ラクタシスチン: 200μM、MG-262: 5μM)。
【００５０】
3つのプロテアソーム阻害剤は、UV照射後のHeLaまたはHGC-27における複製産物の伸長を阻害した（図2c、2dの下図）。しかしながらUV照射による損傷を与えていない細胞に対しては同様の作用は見られなかった（各上図）。また、3つのプロテアソーム阻害剤は、UV照射の有無に関係なく、NB1RGB（図2a）、TIG-1（図示せず）およびLI90（図2b）等の正常細胞に対しては作用しなかった。
【００５１】
プロテアソーム阻害剤は、細胞の起源、組織学的分類およびp53状態に関係なく、種々の癌細胞株においてUV照射後の損傷バイパス複製を阻害することが可能であった (図2および3、表１)。このように、プロテアソーム阻害剤はUV照射後の読み誤りの多いバイパス (error-prone bypass)を顕著に阻害するが、正常細胞における損傷バイパスは阻害しないことが示された。
【００５２】
未分化型胃癌（HGC-27）、悪性黒色腫（Mewo）、および多発性骨髄腫（RPMI8226）はいずれも治癒が非常に難しいとされてきたが、プロテアソーム阻害剤はこれらの細胞株においても損傷バイパス複製を阻害することが可能であった。
【００５３】
また本発明者はASDG法を用いて、ヌクレオチド除去修復に対するプロテアソーム阻害剤の作用を検討した。MG-132は、UV照射されたHeLa細胞において、傷害部位のDNA鎖を切断、除去する反応、及び、それに引き続く修復合成には影響を与えなかった。また、プロテアソーム阻害剤は単独で与えた場合にも細胞DNAを損傷することもなかった。
【００５４】
シスプラチン処理後の複製産物の伸長は、カフェインおよび３つのプロテアソーム阻害剤により、HeLa（図4b）およびHGC-27（図示せず）において阻害されたが、NB1RGB細胞(図4a)においては僅かしか阻害されなかった。シスプラチンはDNAに作用して3種類の付加体 (diadduct)を形成することが知られている（Dronkert, M.L.G. & Kanaar, R. Repair of DNA interstrand cross-links, Mutat. Res. 486, 217-247 (2001).）。3種類のジアダクトとは、d(GpG) またはd(ApG)の配列に生ずる一本鎖内架橋（それぞれ65%、25%）、およびのd(GpC)の配列に生じる二本鎖間架橋（5〜8%）である。UV照射およびシスプラチン処理はともにDNAに対して一本鎖内架橋によるジヌクレオチド損傷を与えるという点で共通している。そして、プロテアソーム阻害剤はかかる損傷を受けた癌細胞における損傷バイパス複製を阻害するものと考えられる。
【００５５】
一方、カフェインおよび３つのプロテアソーム阻害剤はいずれも、カンプトテシン処理（図4cおよび4d）、メチルメタンスルホネート(MMS)処理（図4eおよび4f）、またはX線照射（図4gおよび4h）を受けたNB1RGB細胞またはHeLa細胞において、複製産物の伸長を阻害する作用を示さなかった。
【００５６】
ボルテゾミブ(Velcade)は抗新生物用途が見出された最初のプロテアソーム阻害剤である（Richardson, P.G., Hideshima, T. & Anderson, K.C. Bortezomib (PS-341): A novel, first-in-class proteasome inhibitor for the treatment of multiple myeloma and other cancers. Cancer Control 10, 361-369 (2003)）。ボルテゾミブは、MG-262と似た、修飾されたペプチジルボロン酸構造を有している。よって、本実施例で得られた知見はボルテゾミブにも適用されるものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】UV照射HeLa細胞における複製産物のASDGプロフィールを示す図である。aには、プロテアソーム阻害剤を添加しない場合の、伸長 (elongation)の経時変化を示す。bには、MG-132を添加した場合の効果を示す。cには、ラクタシスチン (Lactacystin) を添加した場合の効果を示す。dには、MG-262を添加した場合の効果を示す。
【図２】NB1RGB細胞(正常細胞)(a)、LI90細胞(正常細胞)(b)、HeLa細胞(c)、およびHGC-27細胞(d)における複製産物のASDGプロフィールを示す図である。
【図３】MCF-7細胞(a)、HepG2細胞(b)、 WiDr細胞(=HT29細胞)(c)、CCRF-CEM細胞(d)、Mewo細胞(e)、およびRPMI8226細胞(f)における複製産物のASDGプロフィールを示す図である。
【図４】シスプラチン処理(a, b)、カンプトテシン処理(c,d)、メチルメタンスルホネート処理(e,f)、またはX線照射(g,h)を施したNB1RGB細胞(正常細胞) (a,c,e,g)またはHeLa細胞(b,d,f,h)における複製産物のASDGプロフィールを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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