(57)【要約】【課題】歯周病の予防又は治療のために有用なプロテアーゼ阻害剤及びバイオフィルム形成阻害剤を提供すること。【解決手段】本発明は、クランベリー抽出物を有効成分とする、ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)又はトレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）が産生するプロテアーゼの阻害剤である。プロテアーゼとは、例えばジンジパイン又はデンティリジンである。また、本発明はクランベリー抽出物を有効成分とする、ポルフィロモナス・ジンジバリスが関与するバイオフィルムの形成阻害剤である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
クランベリー抽出物を有効成分とする、Porphyromonas gingivalis又はTreponema denticolaが産生するプロテアーゼの阻害剤。
【請求項２】
クランベリー抽出物を有効成分とする、Porphyromonas gingivalisが産生するジンジパイン又はTreponema denticolaが産生するデンティリジンの阻害剤。
【請求項３】
クランベリー抽出物を有効成分とする、Porphyromonas gingivalisが関与するバイオフィルムの形成阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クランベリー抽出物を有効成分とする、プロテアーゼの阻害剤及びバイオフィルム形成阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物抽出物が、歯周病原因菌の産生するプロテアーゼに対する阻害作用を有し、抗歯周病剤として有用であることは公知である。（例えば、特許文献１、２参照）。また、植物抽出物が、歯周病の原因菌が口腔内で形成するバイオフィルムの形成阻害剤として有用であることも公知である（例えば、特許文献３参照）。
【０００３】
歯周病の原因菌の一種であるポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）やトレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）は、ジンジパイン（Gingipain）、デンティリジン（Dentilisin）等のプロテアーゼを産生し、また、Fusobacterium属の細菌などと共に口腔内でバイオフィルムを形成することが知られている。歯周病の原因菌が産生するプロテアーゼの阻害剤、及び歯周病の原因菌が関与するバイオフィルムの形成阻害剤は、抗歯周病剤として有用である。
【０００４】
コケモモ属抽出物が、細菌の身体組織への付着防止活性を有することは公知である（例えば、特許文献４参照）。また、高分子量ポリフェノールが、ポルフィロモナス・ジンジバリスのプロテアーゼ阻害活性を有することは公知である（例えば、特許文献５参照）。さらに、ツルコケモモ抽出物を含む抗歯周炎、抗歯肉炎のための口腔組成物は公知である（例えば、特許文献６参照）。
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−３３５６４８号公報
【特許文献２】特開２００５−０３５９０８号公報
【特許文献３】特開２００５−１６２６５４号公報
【特許文献４】特表平１１−５０２８４９号公報
【特許文献５】特開平８−８１３８０号公報
【特許文献６】特開平１１−５０２８４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、プロテアーゼ阻害剤及びバイオフィルム形成阻害剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、クランベリー抽出物が上記課題の解決のために有用であることを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下に係るものである。
１．クランベリー抽出物を有効成分とする、ポルフィロモナス・ジンジバリス又はトレポネーマ・デンティコラが産生するプロテアーゼの阻害剤。
２．クランベリー抽出物を有効成分とする、ポルフィロモナス・ジンジバリスが産生するジンジパイン（Gingipain）又はトレポネーマ・デンティコラが産生するデンティリジン（Dentilisin）の阻害剤。
３．クランベリー抽出物を有効成分とする、ポルフィロモナス・ジンジバリスが関与するバイオフィルムの形成阻害剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、プロテアーゼの阻害剤及びバイオフィルムの形成阻害剤が提供された。これらの剤は、飲食品、医薬品、動物用飼料等に添加して、歯周病の予防治療のために使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
１．プロテアーゼ阻害剤
本発明は、クランベリー抽出物を有効成分とする、ポルフィロモナス・ジンジバリス又はトレポネーマ・デンティコラが産生するプロテアーゼの阻害剤である。プロテアーゼとは、例えばシステインプロテアーゼやセリンプロテアーゼであり、具体的にはシステインプロテアーゼであるポルフィロモナス・ジンジバリスが産生するジンジパインであり、より具体的にはアルギニンジンジパイン、リジンジンジパインを意味し、又はトレポネーマ・デンティコラが産生するセリンプロテアーゼであるデンティリジンである。
【００１０】
クランベリー（Vaccinium macrocarpon Ait.）は、北アメリカなどの寒冷地に生育するツツジ科スノキ属ツルコケモモ節の植物であり、小果実を実らせる。アメリカでは品種改良が行われて大規模に栽培されている。クランベリー果実はそのままでも食せるが、これまでドライフルーツとして、またジュースなどの飲料用、料理用ソース、ジャム、ゼリー菓子などの原料として広く利用されている。またクランベリージュースの摂取が、尿路感染症に有効であることが知られている。
【００１１】
有効成分であるクランベリー抽出物とは、例えば、常法によりクランベリー果実から搾汁して得られた果汁もしくはその果汁を濃縮したもの、前記果汁もしくは濃縮果汁にデキストリンなどの賦形剤を添加混合し噴霧乾燥あるいは凍結乾燥するなどの手段で得られたクランベリー果汁中の固形分を含有するもの、またはクランベリーの果実や果皮・種子より適当な溶剤を用いて抽出された抽出物、クランベリー果汁からカラムクロマトグラフィー等の手法により抽出された抽出物などをいう。また、クランベリー果実の破砕物や、クランベリー果実をジャム状に煮詰めたものも、本発明のクランベリー抽出物として使用できる。
【００１２】
果実や果皮・種子より溶剤を用いてクランベリー抽出物を得る場合、用いる溶剤は特に限定されず、通常の極性溶媒、両極性溶媒等が使用できる。溶剤としては、例えば、水、有機溶媒またはそれを含む溶剤、水と有機溶媒との混合液等が使用できる。有機溶媒としては例えば、低級アルコール（具体的にはエタノール、メタノール、プロパノール、ブタノール）、エーテル類（具体的にはジエチルエーテル）、ハロゲン化炭化水素（具体的にはクロロホルム）、ニトリル類（具体的にはアセトニトリル）、エステル類（具体的には酢酸エチル）、ケトン類（具体的にはアセトン）などの他に、ヘキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等であるが、作業性の面から、エタノール、メタノール、または、酢酸エチルが好ましい。有機溶媒は２種以上を混合して使用しても良い。
【００１３】
カラムクロマトグラフィーを用いてクランベリー抽出物を得る場合は、まずクランベリー果実を搾汁して得られた果汁を濃縮したものを、樹脂を充填したカラムに供した後に溶剤で溶出し、活性成分を含む画分を調製すればよい。
【００１４】
クランベリー抽出物をカラムにより溶媒分画精製する場合、例えば以下（１）〜（４）の工程を含む方法が採用できる。
（１）クランベリー濃縮果汁をアンバーライトＸＡＤ７ＨＰ等を用いたカラムクロマトグラフィーに供する。
（２）水でカラムを洗浄する。
（３）吸着画分を７０％エタノール水溶液によりカラムから溶出する。
（４）７０％エタノール水溶液による溶出画分を、セファデックスＬＨ２０を用いたカラムクロマトグラフィーに供し、イオン交換水、５０％エタノール水溶液、エタノール、エタノールとメタノールの１：１混合溶液、メタノール、８０％アセトン水溶液の順に溶出した画分のうち、エタノール、エタノールとメタノールの１：１混合溶液、メタノール、若しくは８０％アセトン水溶液等の各種溶媒で溶出する。
【００１５】
実施例に示す通り、クランベリー抽出物は、ポルフィロモナス・ジンジバリス又はトレポネーマ・デンティコラが産生するプロテアーゼの阻害作用を示す。ポルフィロモナス・ジンジバリスが産生するプロテアーゼ（ジンジパイン）及びトレポネーマ・デンティコラが産生するプロテアーゼ（デンティリジン）は歯周組織の破壊などをひきおこし、歯周病の発症と密接に関係するといわれている。したがって、本発明のプロテアーゼ阻害剤は、歯周病の予防又は治療剤として有用である。
２．バイオフィルム形成阻害剤
また本発明は、クランベリー抽出物を有効成分とする、ポルフィロモナス・ジンジバリスが関与するバイオフィルムの形成阻害剤である。クランベリー抽出物の詳細については、上記１．と同様である。
【００１６】
多くの菌と共凝集能力がありバイオフィルム形成に大きな働きをしていると言われるフソバクテリウム・ヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum)は単独ではほとんどバイオフィルムを形成できないが、ポルフィロモナス・ジンジバリスと一緒に培養することによってバイオフィルム形成能が上がるといわれている。
【００１７】
実施例に示す通り、クランベリー抽出物は、ポルフィロモナス・ジンジバリスが関与するバイオフィルムの形成阻害作用を示す。
歯周病原因菌のバイオフィルムの形成を阻害することにより歯周病が抑制されるので、本発明のバイオフィルム形成阻害剤は、歯周病の予防又は治療剤として有用である。
【００１８】
３．本発明の剤の使用方法
本発明のプロテアーゼ阻害剤又はバイオフィルム形成阻害剤は、飲食品、医薬品、動物用飼料等に添加して使用することができる。飲食品、医薬品、動物用飼料等の種類、形態、及びその他の含有成分等に特に制約はなく、当業者に公知の任意の各種方法で容易に調製することができる。
【００１９】
飲食品、医薬品、動物用飼料等に有効成分として含まれるクランベリー抽出物の含有量は、本発明の作用、即ち、プロテアーゼ阻害作用又はバイオフィルム形成阻害作用を発揮する限り特に制限はなく、適宜決めることが出来る。クランベリー抽出物の含有量は、例えば、０．１〜５０重量％程度とすることができる。
【実施例】
【００２０】
１．クランベリー抽出物の調製
本発明のクランベリー抽出物として、以下９種の画分を調製した。
【００２１】
（１）濃縮果汁：
新鮮な生のクランベリー果実を、搾汁機にて搾汁した後、減圧下に濃縮し、濃縮果汁を得た。この濃縮果汁の固形分は３２．６％、固形分中の総ポリフェノール含量３．１％、総プロアントシアニジン含量１．５％、総アントシアニン含量０．４％であった。
【００２２】
（２）水溶出画分：
上記（１）の「濃縮果汁」４０ｇを、アンバーライトＸＡＤ７ＨＰ（５０ｍｌ）を用いたカラムクロマトグラフィーに供し。非吸着及びイオン交換水１００ｍｌで溶出した画分を、減圧下濃縮した後、凍結乾燥し、「水溶出画分」１０．０ｇの粉末を得た。該粉末中の総ポリフェノール含量は０．１％、総プロアントシアニジン含量０．０％、総アントシアニン含量０．０％であった。
【００２３】
（３）７０％エタノール溶出画分
上記（２）の「水溶出画分」を溶出した後のカラムから、７０％エタノール水溶液１００ｍｌで溶出した画分を減圧下濃縮した後、凍結乾燥し、「７０％エタノール溶出画分」０．５ｇの粉末を得た。該粉末中の総ポリフェノール含量は５９．０％、総プロアントシアニジン含量３３．１％、総アントシアニン含量７．３％であった。
【００２４】
（４）７０％エタノール溶出画分のカラムによる分画
上記の（３）の「７０％エタノール溶出画分」２ｇをセファデックスＬＨ２０（３００ｍｌ）を用いたカラムクロマトグラフィーに供し、イオン交換水、５０％エタノール水溶液、エタノール、エタノールとメタノールの１：１混合溶液、メタノール、８０％アセトン水溶液の６種類の溶液（各８００ｍｌ）で、順に溶出した画分を、それぞれＬＨ２０分画物１から６とした。それぞれの画分を減圧下濃縮した後、凍結乾燥し、それぞれ０．５１ｇ、０．４６ｇ、０．１２ｇ、０．１５ｇ、０．３２ｇ、０．２２ｇの粉末を得た。
【００２５】
２．プロテアーゼ阻害活性試験
上記１．で調製したクランベリー抽出物について、ポルフィロモナス・ジンジバリスが産生するアルギニンジンジパイン、リジンジンジパイン及びトレポネーマ・デンティコラが産生するデンティリジンに対する阻害活性を確認した。
【００２６】
（ジンジパインを含む粗酵素液の調製）
ポルフィロモナス・ジンジバリス（ATCC33277株、FDC381株）をイーストエクストラクト、ヘミン及びメナジオンを添加したブレインハートインフュージョン培地で２日間培養した。得られた上清に飽和硫酸アンモニウム（７０％）を加え、その沈査を採取した。ブリジ３５を含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に再懸濁して透析したものを、ジンジパインを含む粗酵素液とした。
【００２７】
（ジンジパイン活性測定）
基質溶液として、０．２ｍＭのベンゾイル−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド（アルギニンジンジパイン活性測定用として）又はトシル−グリシン−プロリン−リジン−ｐ−ニトロアニリド（リジンジンジパイン活性測定用として）を、１ｍＭのＤＴＴを含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液に溶解させたものを用いた。
この基質溶液８０μｌに上記の粗酵素液１０μｌ、及びクランベリー抽出物溶液１０μｌを加え、３７℃、１０分間反応させ、４０５ｎｍの波長の吸光度を測定した。クランベリー抽出物溶液の代わりに緩衝液を用いたものの酵素活性を１００％として、酵素活性の阻害を％で示した（図１及び図２）。
図１及び図２に示す通り、クランベリー抽出物のうち、濃縮果汁、及び７０％エタノール溶出画分には、ジンジパインに対する強い阻害活性があることが示された。さらにＬＨ２０−３、４、５、６画分により強い阻害活性があることが示された。
【００２８】
（デンティリジンを含む粗酵素液の調製）
トレポネーマ・デンティコラ（４０５株）をＴＹＧＶＳ培地で３日間培養した。培養液をＰＢＳで洗浄後、ＯＤ６６０を１．０に調整した物を、デンティリジンを含む粗酵素液とした。
【００２９】
（デンティリジン活性測定）
基質溶液として、スクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロピル−Ｌ−フェニルアラニド−ｐ−ニトロアニリドを、５ｍＭのＤＴＴを含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液に溶解させたものを用いた。
この基質溶液８０μｌに上記の粗酵素液１０μｌ、及びクランベリー抽出物溶液１０μｌを加え、３７℃、１５分間反応させ、４０５ｎｍの波長の吸光度を測定した。クランベリー抽出物溶液の代わりに緩衝液を用いたものの酵素活性を１００％として、酵素活性の阻害を％で示した（図３）。
図３に示す通り、クランベリー抽出物のうち、特に７０％エタノール溶出画分、ＬＨ２０−５、６画分にデンティリジンに対する強い阻害活性があることが示された。
【００３０】
３．バイオフィルム形成阻害試験
１００μｌのクランベリー抽出物溶液（５０％ＤＭＳＯ）を添加したトリプティックソイ培地（イーストエクストラクト、グルコース、システイン塩酸塩、ヘミン、メナジオンを含む）に、一晩培養した２種類の菌体〔ポルフィロモナス・ジンジバリス（ATCC33277株）とフソバクテリウム・ヌクレアタム（ATCC25586株）〕の培養液各１０μｌを加え、嫌気条件下、３７℃で、２４時間培養した。培地と非付着細胞を除いた後に、０．１％クリスタルバイオレット染色をし、洗浄後、エタノール抽出された色素の吸光度（５９５ｎｍ）を測定した。クランベリー抽出物溶液のかわりに５０％ＤＭＳＯを加えたものをコントロールとして比較した（図４）。
クランベリー抽出物のうち、濃縮果汁、及び７０％エタノール溶出画分には、バイオフィルム形成に対する強い阻害活性があることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
クランベリー抽出物を有効成分とするプロテアーゼ阻害剤及びバイオフィルム形成阻害剤は、飲食品、医薬品又は飼料として、歯周病の予防又は治療用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ポルフィロモナス・ジンジバリス（ATCC33277株）が産生するアルギニンジンジパインに対するクランベリー抽出物の阻害活性を示す図である。
【図２】ポルフィロモナス・ジンジバリス（ATCC33277株）が産生するリジンジンジパインに対するクランベリー抽出物の阻害活性を示す図である。
【図３】トレポネーマ・デンティコラ（Td405株）が産生するデンティリジンに対するクランベリー抽出物の阻害活性を示す図である。
【図４】ポルフィロモナス・ジンジバリス（ATCC33277株）とフソバクテリウム・ヌクレアタム（ATCC25586株）とのバイオフィルム形成に対するクランベリー抽出物の阻害活性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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