(57)【要約】【課題】本発明は、ゲノムDNAに相補的なプローブを用いて測定した染色体のゲノムDNA量を補正する方法を提供することを目的とする。【解決手段】染色体ゲノムDNA量の測定における複数の実験工程に係る補正傾向値、当該傾向値から算出した補正因子を用いて、実験で得られたゲノムDNA量を補正することを特徴とする。【選択図】  図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子コピーの解析方法において、
染色体のゲノムDNA量（以下、ゲノムDNA量と呼ぶ。）、又は２つの異なる若しくは同一の細胞の染色体のゲノムDNA量の比（以下、ゲノムDNA量比と呼ぶ。）、のいずれかの値（以下、測定値と呼ぶ。）を補正する方法が、
所定のゲノムDNA量、又はゲノムDNA量比を測定する測定値測定工程に続いて、
補正傾向値算出手段により、各補正パラメータ値に対するゲノム量若しくはゲノム量比の測定値を座標系にプロットし、そのプロット値をスムージングすることにより、測定値に関する所定の補正パラメータに係る補正傾向値を算出する補正傾向値算出工程と、
補正因子算出手段により、補正傾向値から補正因子を算出する補正因子算出工程と、
測定値補正演算手段により、測定値を当該補正因子で補正演算する測定値補正演算工程と
を含むことを特徴とする遺伝子コピーの解析方法。
【請求項２】
前記測定値が、ゲノムDNAに相補的な複数のプローブ（以下、プローブと呼ぶ）を用いて測定されたゲノムDNA量、又はゲノムDNA量比であって、
補正因子算出工程において、補正傾向値から各補正基準値における補正因子を算出することを特徴とする請求項１に記載の遺伝子コピーの解析方法。
【請求項３】
前記遺伝子コピーの解析方法における前記補正傾向値算出工程において、
染色体の遺伝子を特定の制限酵素で切断した各々の遺伝子断片の長さに対する測定値を座標系にプロットして、そのプロット値をスムージングすることによって、遺伝子断片の長さに係る補正傾向値を算出する
ことを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載の遺伝子コピーの解析方法。
【請求項４】
前記遺伝子コピーの解析方法における前記補正傾向値算出工程において、
染色体の遺伝子を特定の制限酵素で切断した各々の遺伝子断片に含まれるG及びC塩基の比率に対する測定値を座標系にプロットして、そのプロット値をスムージングすることによって、GC塩基含有率に係る補正傾向値を算出する
ことを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の遺伝子コピーの解析方法。
【請求項５】
前記遺伝子コピーの解析方法における前記補正傾向値算出工程において、
染色体の遺伝子を特定の制限酵素で切断した各々の遺伝断片に対して、連続する20塩基乃至220塩基の範囲から選ばれる特定の長さを有する固定枠を前記遺伝子の端から１塩基ごとに移動させながら得られる、当該固定枠に対応する遺伝子断片に含まれるG及びC塩基の比率の最大値に対する測定値を座標系にプロットして、そのプロット値をスムージングすることによって、当該固定枠のGC塩基含有率に係る補正傾向値を算出する
ことを特徴とする請求項１ないし４いずれかに記載の遺伝子コピーの解析方法。
【請求項６】
前記遺伝子コピーの解析方法における前記補正傾向値算出工程において、
ゲノムDNAに相補的なプローブの塩基配列の有するG及びC塩基の比率もしくはハイブリダイゼーション・フリーエネルギーに対する測定値を座標系にプロットして、そのプロット値をスムージングすることによって、ハイブリダイゼーションに係る補正傾向値を算出することを特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載の遺伝子コピーの解析方法。
【請求項７】
前記遺伝子コピーの解析方法において、
前記補正傾向値算出工程において、
各々の染色体の特定部位を検出するプローブセット中のゲノムDNAに完全に相補的なプローブセットのシグナル強度の中間値に対する測定値を座標系にプロットして、そのプロット値をスムージングすることによって、対照サンプルのシグナル強度に係る補正傾向値を算出することを特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載の遺伝子コピーの解析方法。
【請求項８】
前記遺伝子コピーの解析方法において、
前記補正傾向値算出工程が、少なくとも最小二乗平均法を用いて各プロットの平均曲線を求め、当該平均曲線について、多項式を用いて近似することにより、各補正傾向値を算出する工程を含むことを特徴とする請求項１ないし７のいずれかに記載の遺伝子コピーの解析方法。
【請求項９】
前記遺伝子コピーの解析方法における前記補正因子算出工程が、
前記各補正傾向値から対応する各プローブにおける補正因子を算出する方法が、下記式、
（式）補正因子 =  A+ Σ（BkXk+CkXk2+DkXk3・・・）
（上記多項式において１次項以上の任意の項数が利用できる。式中のA〜D・・は平均曲線の係数、Xkはk＝１〜５がそれぞれ請求項３ないし７に係る補正パラメータ値）
に基づいて算出される工程を含むことを特徴とする請求項８に記載の遺伝子コピーの解析方法。
【請求項１０】
前記遺伝子コピーの解析方法における測定値測定工程において、
プローブがSNPsを識別することができるゲノムタイピングマイクロアレイであり、染色体アレルごとに染色体のゲノムDNA量を測定することを特徴とする請求項１ないし９のいずれかに記載の遺伝子コピーの解析方法。
【請求項１１】
遺伝子コピーの解析方法において、
染色体の遺伝子コピー数を同定する方法が、請求項１ないし９に係る測定値の補正演算結果値を用い、
プロット手段により、物理的な順で並べた染色体の位置に対する補正演算結果値を座標系にプロットした場合に階段状に示されるデータを、抽出手段が抽出する工程、
遺伝子コピー数同定手段が、該補正演算結果値が同一階位に属する２以上の連続する染色体の位置における当該補正演算結果値の平均値が最低である領域を遺伝子コピー数０の領域とする工程、
遺伝子コピー数同定手段が、前記平均値の次に低い領域を遺伝子コピー数１の領域とする工程を含み、染色体の遺伝子コピー数を同定することを特徴とする遺伝子コピーの解析方法。
【請求項１２】
前記遺伝子コピーの解析方法における染色体の遺伝子コピー数を同定した結果を表示する方法が、
画像処理手段により、第1染色体から第２２染色体、X染色体及びY染色体の全部又はその一部について染色体形状様の再現画像を画像表示手段に表示すると共に、
該再現画像上に、染色体の遺伝子コピー数が増減している領域を対応づけて視覚的に遺伝子コピー数が当該領域で増減していることを表示することを特徴とする請求項１０に記載の遺伝子コピーの解析方法。
【請求項１３】
前記遺伝子コピーの解析方法において、
ハプロタイプを同定する方法が、請求項１ないし１３に係る測定値の補正演算  結果値を用い、
プロット手段により、物理的な順で並べた染色体の位置に対する補正演算結果値を座標系にプロットした場合に階段状に示されるデータを、抽出手段が抽出する工程、
ハプロタイプ同定手段が、該補正演算結果値が同一階位に属する２以上の連続する複数の染色体の位置をハプロタイプと同定する工程を含みハプロタイプを同定する
ことを特徴とする遺伝子コピーの解析方法。
【請求項１４】
前記遺伝子コピーの解析方法におけるハプロタイプを同定した結果を表示する方法が、
画像処理手段により、第1染色体から第２２染色体、X染色体及びY染色体の全部又はその一部について染色体形状様の再現画像を画像表示手段に表示すると共に、
該再現画像上に、特定のハプロタイプが存する領域を対応づけて視覚的に当該特定ハプロタイプが当該領域に存することを表示することを特徴とする請求項１２に記載の遺伝子コピーの解析方法。
【請求項１５】
前記遺伝子コピーの解析方法において、
前記測定値が、遺伝子を増幅することにより測定されたゲノムDNA量であって、
補正因子算出工程において、複数のパラメータに係る補正傾向値がある場合にはこれらを合算して補正因子を算出する請求項１、３、４、５又は８のいずれかに記載の遺伝子コピーの解析方法。
【請求項１６】
染色体のゲノムDNA量、又は２つの異なる若しくは同一の細胞の染色体のゲノムDNA量の比のいずれかの値（以下、測定値と呼ぶ。）を測定した結果を入力する入力手段と、
該測定値を座標系にプロットし、そのプロット値をスムージングすることにより、所定のパラメータに係る補正傾向値を算出する補正傾向値算出手段と、
補正傾向値から補正因子を算出する補正因子算出手段と、
測定値を当該補正因子で補正演算する測定値補正演算手段と
を備えることにより、測定値を補正することを特徴とする遺伝子コピーの解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子コピーの解析方法及び装置に関し、特に細胞の染色体のゲノムDNA量及びゲノムDNA量比の測定値の補正、染色体の遺伝子コピー数の同定、同補正及び検出方法によるハプロタイプの同定、並びに染色体の遺伝子欠損及び異常増幅に関する測定結果を視覚的に理解し易く表示する技術に係るものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、DNAマイクロアレイ技術は、主に癌診断を目的として、染色体の任意の部位でのゲノムDNA量を分析するのに広く利用されており、例えば非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４などに記載されている。
ここで、染色体のゲノムDNA量とは、染色体遺伝子のなかの特定部位のゲノムDNA量をいい、遺伝子コピー数に依存するものである。正常細胞では、通常ゲノムDNAは両親由来のアレルが１コピーずつで計２コピーであるが、癌などの疾患においてはゲノムのなかの、遺伝子コピー数の増減が認められる。
【０００３】
正常細胞と疾患細胞における染色体のゲノムDNA量や遺伝子コピー数の検出には、BAC（Bacterial Artificial Chromosome）を利用したCGH（Comparative genome hybridization）マイクロアレイ法を始め、様々なマイクロアレイを用いた方法が開発されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。癌などの疾患における染色体遺伝子に対する変異をより詳細に分析するには、染色体のアレルごとのゲノムDNA量の変化を検出しなければならない。
特に、LOH（loss of heterozygosity）の分析では、染色体のいずれのアレル、すなわち母方または父方由来のものであるかを理解することができる（非特許文献５、非特許文献６）。
さらに、染色体のゲノムDNA量の分析では、オリゴヌクレオチドを用いたゲノムタイピングマイクロアレイを利用した方法も報告されている（非特許文献７）。
【０００４】
しかしながら、従来の方法において、全ゲノムの一部をPCRで増幅したものを分析する工程（Representational analysis）は、多くの実験条件や個々の実験状況によって、無視できないノイズデータを含んでしまうという欠点がある。
したがって、染色体のゲノムDNA量や遺伝子コピー数の検出方法においては、より精度の高いデータを得るためにこれらのノイズデータの補正が必要となる。また、これまでの染色体のゲノムDNA量の検出方法において、染色体のアレルごとのゲノムDNA量を分析した報告はなく、アレルごとのゲノムDNA量や遺伝子コピー数を検出することで、より精度の高いデータが得られるとともに、当該データからハプロタイプの検出が可能となる。
【０００５】
【非特許文献１】Ishkanian,A.S. et al Nat Genet, 36, 299-303 (2004)
【非特許文献２】Pinkel, D. et al. Nature Genetic 20, 207-211(1998)
【非特許文献３】Pollack, J.R. et al Nature Genetic 23 ,41-46(1999)
【非特許文献４】Lucito,R. et al. Genome Research 13, 2291-2305 (2003)
【非特許文献５】Robinson, W.P. Bioessays. 22, 452-9 (2000)
【非特許文献６】Murthy, S.K. Mod Pathol. 15, 1241-50 (2002)
【非特許文献７】Bignell, G.R. et al. Genome Resesrch 14, 287-295(2004)
【非特許文献８】Kennedy, G.C. Nature Biotechnology 21, 1233-7（2003）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記の背景技術に鑑みて創出されたものであり、染色体のゲノムDNA量やゲノムDNA量比に係る測定値を好適な方法により補正し、これらの精度を高めることを目的とし、ひいてはアレル毎のゲノムDNA量や遺伝子コピー数の同定、ハプロタイプの同定等の遺伝子コピー数の解析に寄与する技術を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、マイクロアレイなどを利用した染色体のゲノムDNA量を測定する方法において、測定結果を不安定にする要因として、染色体の遺伝子を増幅する工程、増幅したPCR産物をアレイ上のプローブにハイブリダイゼーションを行う工程、及び蛍光シグナルをスキャニングする工程といった特定実験条件であることを見出した。
これらの実験条件に対する補正を行うことで、染色体のゲノムDNA量を測定する方法における補正方法を完成した。また、染色体のゲノムDNA量を補正することにより、当該測定結果を染色体の遺伝子コピー数に変換できることを見出した。本発明はこの知見を基にして完成されたものである。すなわち本発明は、以下のとおりである。
【０００８】
請求項１に記載の発明は、遺伝子コピーの解析方法において、染色体のゲノムDNA量（以下、ゲノムDNA量と呼ぶ。）、又は２つの異なる若しくは同一の細胞の染色体のゲノムDNA量の比（以下、ゲノムDNA量比と呼ぶ。）、のいずれかの値（以下、測定値と呼ぶ。）を補正する方法を提供する。該方法において、所定のゲノムDNA量、又はゲノムDNA量比を測定する測定値測定工程に続いて、補正傾向値算出手段により、各補正パラメータ値に対するゲノム量若しくはゲノム量比の測定値を座標系にプロットし、そのプロット値をスムージングすることにより、測定値に関する所定のパラメータに係る補正傾向値を算出する補正傾向値算出工程と、補正因子算出手段により、補正傾向値から補正因子を算出する補正因子算出工程と、測定値補正演算手段により、測定値を当該補正因子で補正演算する測定値補正演算工程とを含むことを特徴とする。
【０００９】
請求項２に記載の発明は、前記測定値が、ゲノムDNAに相補的なプローブ（以下、プローブと呼ぶ）を用いて測定されたゲノムDNA量、又はゲノムDNA量比であって、補正因子算出工程において、補正傾向値から各補正基準値における補正因子を算出することを特徴とするものである。補正基準値とは、各補正パラメータ値のうち、任意のプローブに対応する各補正パラメータ値をいい、同補正基準値での補正傾向値から補正因子を算出することができる。補正因子とは、測定されたゲノムＤＮＡ量のデータを補正するための値である。
【００１０】
請求項３に記載の発明は、遺伝子コピーの解析方法における前記補正傾向値算出工程において、染色体の遺伝子を特定の制限酵素で切断した各々の遺伝子断片の長さに対する測定値を座標系に各補正パラメータ値に対してプロットして、そのプロット値をスムージングすることによって、遺伝子断片の長さに係る補正傾向値を算出することを特徴とするものである。
【００１１】
請求項４に記載の発明は、前記遺伝子コピーの解析方法における前記補正傾向値算出工程において、染色体の遺伝子を特定の制限酵素で切断した各々の遺伝子断片に含まれるG及びC塩基の比率に対する測定値を座標系に各補正パラメータ値に対してプロットして、そのプロット値をスムージングすることによって、GC塩基含有率に係る補正傾向値を算出することを特徴とする。
【００１２】
請求項５に記載の発明は、前記遺伝子コピーの解析方法における前記補正傾向値算出工程において、染色体の遺伝子を特定の制限酵素で切断した各々の遺伝断片に対して、連続する20塩基乃至220塩基の範囲から選ばれる特定の長さを有する固定枠を前記遺伝子の端から１塩基ごとに移動させながら得られる、当該固定枠に対応する遺伝子断片に含まれるG及びC塩基の比率の最大値に対する測定値を座標系に各補正パラメータ値に対してプロットして、そのプロット値をスムージングすることによって、当該固定枠のGC塩基含有率に係る補正傾向値を算出することを特徴とするものである。
【００１３】
請求項６に記載の発明は、前記遺伝子コピーの解析方法における前記補正傾向値算出工程において、プローブの塩基配列の有するハイブリダイゼーション・フリーエネルギーに対する測定値を座標系に各補正パラメータ値に対してプロットして、そのプロット値をスムージングすることによって、ハイブリダイゼーションに係る補正傾向値を算出することを特徴とするものである。
【００１４】
請求項７に記載の発明は、前記遺伝子コピーの解析方法において、前記補正傾向値算出工程において、各々の染色体の特定部位を検出する完全に相補的なゲノムDNAに相補的なプローブセットのシグナル強度の中間値に対する測定値を座標系に各補正パラメータ値に対してプロットして、そのプロット値をスムージングすることによって、対照サンプルのシグナル強度に係る補正傾向値を算出することを特徴とする。
【００１５】
請求項８に記載の発明は、前記遺伝子コピーの解析方法において、前記補正傾向値算出工程が、最小二乗平均法を用いて各プロットの平均曲線を求め、当該平均曲線について、多項式を用いて近似することにより、各補正傾向値を算出する工程を含むことを特徴とする。
【００１６】
請求項９に記載の発明は、前記遺伝子コピーの解析方法における前記補正因子算出工程が、前記各補正傾向値から対応する各プローブにおける補正因子を算出する方法が、下記式に基づいて算出される工程を含むことを特徴とする。
（式）補正因子 =  A+ Σ（BkXk+CkXk2+DkXk3・・・）
ここで、上記多項式は３次項まで記載しているが、１次項（BkXk）以上の任意の項数が利用でき、たとえば補正因子=A+ΣBkXkでもよい。また、式中
のA〜D・・は平均曲線の係数（補正傾向）値、Xkはk＝１〜５がそれぞれ請求項３ないし７に係る補正パラメータ値である。
【００１７】
請求項１０に記載の発明は、遺伝子コピーの解析方法において、染色体の遺伝子コピー数を同定する方法が、請求項１ないし９に係る測定値の補正演算結果値を用い、プロット手段により、物理的な順で並べた染色体の位置に対する補正演算結果値を座標系にプロットした場合に階段状に示されるデータを、抽出手段が抽出する工程、遺伝子コピー数同定手段が、該補正演算結果値が同一階位に属する２以上の連続する染色体の位置における当該補正演算結果値の平均値が最低である領域を遺伝子コピー数０の領域とする工程、遺伝子コピー数同定手段が、前記平均値の次に低い領域を遺伝子コピー数１の領域とする工程を含み、染色体の遺伝子コピー数を同定することを特徴とする遺伝子コピーの解析方法を提供する。
【００１８】
請求項１１に記載の発明は、前記遺伝子コピーの解析方法における染色体の遺伝子コピー数を同定した結果を表示する方法が、画像処理手段により、第1染色体から第２２染色体、X染色体及びY染色体の全部又はその一部について染色体形状様の再現画像を画像表示手段に表示すると共に、該再現画像上に、染色体の遺伝子コピー数が増減している領域を対応づけて視覚的に遺伝子コピー数が当該領域で増減していることを表示することを特徴とする。
【００１９】
請求項１２に記載の発明は、前記遺伝子コピーの解析方法において、ハプロタイプを同定する方法が、請求項１ないし９に係る測定値の補正演算結果値を用い、プロット手段により、物理的な順で並べた染色体の位置に対する補正演算結果値を座標系にプロットした場合に階段状に示されるデータを、抽出手段が抽出する工程、ハプロタイプ同定手段が、該補正演算結果値が同一階位に属する２以上の連続する複数の染色体の位置をハプロタイプと同定する工程を含みハプロタイプを同定することを特徴とする。
【００２０】
請求項１３に記載の発明は、前記遺伝子コピーの解析方法におけるハプロタイプを同定した結果を表示する方法が、画像処理手段により、第1染色体から第２２染色体、X染色体及びY染色体の全部又はその一部について染色体形状様の再現画像を画像表示手段に表示すると共に、該再現画像上に、特定のハプロタイプが存する領域を対応づけて視覚的に当該特定ハプロタイプが当該領域に存することを表示することを特徴とするものである。
【００２１】
請求項１４に記載の発明は、前記遺伝子コピーの解析方法における測定値測定工程において、プローブがSNPsを識別することができるゲノムタイピングマイクロアレイであり、染色体アレルごとに染色体のゲノムDNA量を測定することを特徴とする。
【００２２】
請求項１５に記載の発明は、前記遺伝子コピーの解析方法において、前記測定値が、遺伝子を増幅することにより測定されたゲノムDNA量であって、補正因子算出工程において、複数のパラメータに係る補正傾向値がある場合にはこれらを合算して補正因子を算出することを特徴とする。
【００２３】
請求項１６に記載の発明は、染色体のゲノムDNA量、又は２つの異なる若しくは同一の細胞の染色体のゲノムDNA量の比のいずれかの値（以下、測定値と呼ぶ。）を測定した結果を入力する入力手段と、該測定値を各補正パラメータ値に対して、座標系にプロットし、そのプロット値をスムージングすることにより、所定のパラメータに係る補正傾向値を算出する補正傾向値算出手段と、補正傾向値から補正因子を算出する補正因子算出手段と、測定値を当該補正因子で補正演算する測定値補正演算手段とを備えることにより、測定値を補正する遺伝子コピーの解析装置を提供する。
【００２４】
本発明は遺伝子コピーの解析装置を提供することもできる。すなわち、請求項１６に記載の発明は、遺伝子コピーの解析装置であって、染色体のゲノムDNA量、又は２つの異なる若しくは同一の細胞の染色体のゲノムDNA量の比、のいずれかの値（以下、測定値と呼ぶ。）を測定した結果を入力する入力手段と、該測定値を座標系にプロットし、そのプロット値をスムージングすることにより、所定のパラメータに係る補正傾向値を算出する補正傾向値算出手段と、補正傾向値から補正因子を算出する補正因子算出手段と、測定値を当該補正因子で補正演算する測定値補正演算手段とを備えることにより、測定値を補正することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２５】
本発明により、遺伝子コピーの解析方法、特にマイクロアレイなどを利用した染色体のゲノムDNA量を測定する方法における測定結果の補正方法、当該補正処理後の測定結果により染色体の遺伝子コピー数を検出方法、及び染色体の遺伝子の欠損または異常増幅を視覚的に理解され易く表示する方法が提供される。
本発明に係る補正方法は、マイクロアレイなどを利用した染色体のゲノムDNA量の測定結果のバイアスを著しく減少させ、測定結果の安定性・信頼性を増すことを示す。
また、当該補正方法による染色体のゲノムDNA量を、遺伝子コピー数に変換することにより、初めて染色体の遺伝子コピー数の絶対値を検出できることが示された。当該補正方法による結果から、ハプロタイプの新しい同定方法をも提供することができる。
さらに、本発明の表示方法を提供することで、それぞれの染色体上における特定の遺伝子の欠損及び異常増幅を、視覚的に理解し易いように伝えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明を詳細に説明する。図１は本発明による遺伝子コピーの解析方法のうち、染色体のゲノムDNA量又は２つの異なる若しくは同一の細胞の染色体のゲノムDNA量の比を補正する方法についての処理図である。また、図２は本発明に係る遺伝子コピーの解析装置（１）の構成図である。本装置（１）は汎用のパーソナルコンピュータ等によって実現されるものであり、中央演算処理装置（ＣＰＵ）（２）と連動動作するメモリ（３）、ハードディスク（４）、表示画面を備えた表示装置（５）等から成る。
【００２７】
１．マイクロアレイを用いた染色体のゲノムDNA量の測定（測定値測定工程）
最初に、本装置（１）に入力するためのゲノムDNA量の測定を行う。マイクロアレイを用いた染色体のゲノムDNA量の測定について説明する。第一に、サンプルの調整方法について説明するが、以下の方法や手順、材料や容量などは特に限定されるものではない。
まず、任意の細胞や組織から染色体遺伝子を抽出する。染色体遺伝子の抽出方法は、細胞抽出液をタンパク質分解酵素で処理して、細胞内のタンパク質や染色体を構成するタンパク質を分解した後に、フェノール・クロロホルム処理をして、タンパク質を分離し、水層にある部分（DNAを含む部分）を取り出すことが挙げられる。次いで、抽出された染色体遺伝子を任意の制限酵素で切断する。制限酵素の処理方法は、特に限定されないが、ここでは、染色体遺伝子を制限酵素XbaIで切断した。
【００２８】
次いで、制限酵素XbaIで切断された遺伝子フラグメント（断片）のそれぞれに対して、アダプター分子を結合させる。アダプター分子は、制限酵素の切断部位を含み、さらに任意の遺伝子配列を有するオリゴヌクレオチドである。このアダプター分子と遺伝子フラグメントのLigation反応を行い、遺伝子フラグメントにアダプター分子を結合させる。次いで、アダプター分子に対応する特異的なプライマーを使用して、PCR法により遺伝子を増幅させる。PCR反応で増幅した遺伝子断片は、全ゲノムDNAの約2％程度の遺伝子に対応する。前記のPCR法で増幅した遺伝子フラグメントの量は、ゲノムDNAの遺伝子コピー数に応じて変化する。PCR法で増殖するゲノムDNAの遺伝子コピー数が多ければ、それに応じて増幅された遺伝子フラグメントの量も多くなる。
【００２９】
次いで、PCRで増幅した遺伝子フラグメントに対して、蛍光ラベルを行う。蛍光ラベルに用いる蛍光物質は特に限定されず、また蛍光ラベルの代わりに放射性物質でラベルすることなどが挙げられる。
【００３０】
第二に、蛍光ラベルしたPCR産物と、オリゴヌクレオチドのプローブからなるアレイとハイブリダイゼーションを行う。オリゴヌクレオチドマイクロアレイは、特に種類は限定されない。ゲノムタイピングすることができるアレイを利用した場合には、染色体のアレルごとに分けて、染色体遺伝子の欠損や異常増幅を検出することができる。さらに、特定のアレルが父方又は母方由来であるかの情報を考慮することで、染色体遺伝子の欠損等がいずれの由来のものであるかを検出することができる。プローブごとのシグナル強度を定量的に測定することで、特定のプローブに対応する遺伝子領域のゲノムDNA量を検出することができる。
【００３１】
また、特定の遺伝子のみのゲノムDNA量を測定する場合には、アダプター分子の代わりに測定したい遺伝子に対する特異的なプライマー遺伝子を用いて、PCR法などで増幅させてもよく、RT−PCR法やLAMP法など特定遺伝子を増幅し、この遺伝子産物の量を定量的に測定することで、染色体のゲノムDNA量を測定する方法も挙げられる。この場合には、以下で述べるプローブとのハイブリダイゼーションの工程を必要としない。
【００３２】
測定値としては、ゲノムDNA量でもよいし、２つの異なる若しくは同一の細胞の染色体のゲノムDNA量の比（ゲノムDNA量比）でもよい。ゲノムDNA量比もそれぞれのゲノムDNA量は上記と同様の方法により測定を行う。以下、ゲノムDNA量比を中心に説述するが、ゲノムDNA量についても同様に本発明を適用することができる。
【００３３】
２．測定値を補正する方法（補正傾向値の算出工程）
本願発明は、染色体ゲノムDNA量を求める測定工程で生じるバイアスの傾向を数値化した補正因子を利用して、得られた測定値の生データ（一次データ）におけるバイアスを減少させる補正方法を提供する。すなわち、同補正方法は、染色体のゲノムDNA量又はゲノムDNA量比を求める測定工程における各種の測定条件または測定結果を用いる。補正は、各染色体位置に対するプローブごとのデータ値で行う。
【００３４】
一次データは真に染色体のゲノムDNA量を反映させる成分と、PCR工程など測定条件で影響されるノイズ成分とから成るが、本補正方法では、このノイズ成分を除去することを特徴とする。ノイズ成分の除去は、一次データを「補正基準値」及び「補正傾向値」から計算された「補正因子」で除する、又は一次データから「ノイズ成分」を減じることなどが挙げられる。
【００３５】
また、補正因子やノイズ成分は、以下に説明する５つの補正パラメータに係る「補正基準値」及び「補正傾向値」の全部または一部を用いて算出することが挙げられる。「補正傾向値」については、ゲノムDNA量の測定値に関する所定のパラメータに係る補正傾向値をいい、各補正パラメータにおける測定値を座標系にプロットし、そのプロット値から平均化曲線にスムージングさせ、その平均化曲線の係数から求めることが挙げられる。「補正傾向値」は、なるべく広範囲な染色体の部位を測定できる複数のプローブから求めることが望ましい（図３などを参照）。
【００３６】
「補正基準値」とは、各補正パラメータ値のうち、任意のプローブに対応する各補正パラメータ値をいい、同補正基準値での補正傾向値から補正因子を算出することができる。「補正因子」とは、測定されたゲノムＤＮＡ量のデータを補正するための値であり、補正パラメータの１または１以上から算出することのできる、プローブごとに対応する値である。
【００３７】
ここで補正傾向値は、一次データを最小二乗平均法（least square method）やその他の平均化曲線を求める周知の方法で同曲線にスムージングさせ、その曲線を任意の関数（多項式（polynomial approximation）に当てはめることで求める。平均化曲線へのスムージング時には、一次データの異常値（他の一次データと比して平均化曲線から特に離れているもの）を除外して求めてもよい。
【００３８】
バイアスを生じさせる「補正パラメータ」とは以下の５つである。ここで、バイアスとは、測定値に「バラツキ」や「ゆらぎ」を生じさせ、測定値を不安定にするものをいう。第１のパラメータはXbaIで切断した遺伝子断片の長さである。本実施工程では、まず細胞の染色体を抽出・精製した後に制限酵素XbaIで染色体を切断するが、その際に切断された遺伝子断片の長さをいう。ここで、代表的な制限酵素としてXbaIを挙げたが、BamI、XhoIなど制限酵素の種類は制限されない。同パラメータは、PCR法で遺伝子を増幅する過程でバイアスを生じさせるものであると予想される。
【００３９】
これを示す例として、図３又は図４を示す。これらは、遺伝子断片の長さに対するシグナル強度比を示したグラフである。遺伝子断片は、染色体遺伝子を制限酵素XbaIで切断したそれぞれの遺伝子断片である。図３の縦軸は、シグナル強度比を示し、ダウン症候群の染色体の遺伝子増幅量／健常人の染色体の遺伝子増幅量の比である。横軸は、遺伝子断片の長さを示す。図４は、同一のH1437細胞から得たものを用いている。測定値は、同一の細胞を別々に実験したデータを比較した。シグナル強度比は、H1437細胞の遺伝子増幅量／H1437細胞の遺伝子増幅量である。横軸は、制限酵素で切断した遺伝子断片の長さを示し、縦軸は、シグナル強度比を示している。
【００４０】
図３又は図４の座標系の各プロット値から平均化曲線にスムージングさせ、遺伝子断片の長さに係る平均化曲線の係数から求めることが挙げられる。ここでの「補正基準値」は、横軸の各遺伝子断片の長さをいい、この補正基準値及び補正傾向値から任意の遺伝子断片に係る補正因子データを導出することができる。
【００４１】
遺伝子断片の長さによるバイアスは、固定的なバイアス値が見られるものとして、補正因子を固定値としてもよいし、また実験ごとにバイアス値が変動するものとして、個々にバイアス値を測定して決定してもよい。ここで、同バイアスは、遺伝子断片の長さに完全に依存するものでなく、僅かに他の理由に起因するバイアスも含まれると考えられるからである。
【００４２】
第２のパラメータは、前記制限酵素で切断された遺伝子断片に含まれるGC塩基対含有量の比率（％）である。上記第１のパラメータにいう制限酵素で切断した遺伝子断片の塩基数を、当該遺伝子断片に含まれるGCの塩基対ペア数で除して、100を乗じることで算出する。遺伝子断片は２本鎖となっているので、どちらかの遺伝子鎖に注目して、塩基G（グアニン）及び塩基C（シトシン）の数を算出してもよいし、逆に塩基A（アデニン）及び塩基T（チミン）の数を算出から、遺伝子断片全体の塩基数からACの塩基数を減じて求めてもよい。
【００４３】
これを示す例として、図５及び図６を示す。図５は制限酵素XbaIで切断した遺伝子フラグメントにおけるGC含有量とシグナル強度比の関係を示したグラフである。シグナル強度比は、ダウン症候群の染色体の遺伝子増幅量／健常人の染色体の遺伝子増幅量である。横軸は、遺伝子断片におけるGC塩基含有量を示し、縦軸は、シグナル強度比を示している。また、図６は、同一のH1437細胞の染色体のゲノムDNA量を示すグラフである。測定値は、同一の細胞を別々に実験したデータを比較して得た。シグナル強度比は、H1437細胞の遺伝子増幅量／H1437細胞の遺伝子増幅量である。横軸は、染色体位置に対するプローブの一部を示し、縦軸は、シグナル強度比を示している。
【００４４】
図５及び図６の座標系の各プロット値から平均化曲線にスムージングさせ、GC含有量に係る平均化曲線の係数から求めることが挙げられる。ここでの「補正基準値」は、遺伝子断片のGC含有量をいい、この補正基準値及び補正傾向値から任意のGC含有量での補正因子データを導出することができる。
【００４５】
第一及び第二のパラメータは、PCR法で遺伝子を増幅する過程でバイアスを生じさせるものと予想される。遺伝子断片に含まれるGC塩基対含有量の比率によるバイアスは、固定的なバイアス値が見られるものとして、補正因子を固定値としてもよいし、また測定ごとにバイアス値が変動するとして、個々にバイアス値を測定して決定してもよい。同バイアスは、GC塩基対含有量の比率に依存するものでなく、僅かに他の理由のよるバイアスも含まれると考えられるからである。なお、ここでは、全ての遺伝子配列情報は、Human Genome Build 34(from July 2003 UCSC genome build)（非特許文献９に記載）から得ているが、遺伝子配列情報は、その他の遺伝子配列データベースを利用してもよく、また、ゲノムの遺伝子配列を独自で決定してもよい。
【００４６】
【非特許文献９】HYPERLINK "http://genome.ucsc.edu/" http://genome.ucsc.edu/
【００４７】
第３のパラメータは、特定領域におけるGC塩基対含有量の比率（％）である。ここで、特定領域とは、制限酵素で切断した遺伝子断片のなかで、GC塩基対含有量の比率が最も高い100bp（base pair）の連続領域をいう。特定領域におけるGC塩基対含有量の比率（％）とは、100bpの固定枠を任意の制限酵素断片の遺伝子に対して、同遺伝子断片の端から１塩基毎にずらして、その中に含まれるGC含有量をそれぞれ求めて、最もGC塩基対含有量の高い特定領域おける、GC塩基対含有量（％）を算出する。
【００４８】
算出方法は、第２のパラメータで記載した方法により求める。また、この特定領域は、必ずしも100bpに限定されることなく、20bp乃至220bpの範囲での塩基数としてもよい。同因子は、PCR法で遺伝子を増幅する過程でバイアスを生じさせるものと予想される（図７、図８）。
【００４９】
これを示す例として、図７及び図８を示す。図７は、遺伝子断片の特定領域におけるCG含有量に対するシグナル強度比を示したグラフである。縦軸は、シグナル強度比を示し、ダウン症候群の染色体の遺伝子増幅量／健常人の染色体の遺伝子増幅量である。横軸は、同断片に対して、特定領域における100bp内のGC含有量の最大値を百分率で示した。矢印に示す部位よりもGC含有量の高い領域は、ランダムなデータが見られる。このような当該ランダムなシグナル強度比が示される領域は、データ取得の過程で排除してもよい。また、図８は、同一の細胞（H1437細胞）を別々に実験したデータを比較して得た。縦軸は、図７と同様にシグナル強度比を示し、H1437細胞の遺伝子増幅量／H1437細胞の遺伝子増幅量である。横軸は、図７と同様に特定領域のGC含有量を百分率で示した。
【００５０】
図７又は８の座標系の各プロット値から平均化曲線にスムージングさせ、特定領域のGC含有量に係る平均化曲線の係数から求めることが挙げられる。ここでの「補正基準値」は、特定領域のGC含有量をいい、この補正基準値及び補正傾向値から任意のGC含有量での補正因子データを導出することができる。
【００５１】
特定領域に含まれるGC塩基対含有量の比率によるバイアスは、固定的なバイアス値として、補正因子を固定値としてもよいし、また実験ごとにバイアス値が変動するとして、個々にバイアス値を測定して決定してもよい。ここで、同バイアスは、GC塩基対含有量の比率に依存するものでなく、僅かに他の理由のよるバイアスも含まれると考えられる。GC塩基対含有量の比率（％）が高い部分（６）は、測定値が近似式の曲線から大幅に離れるので除外してもよい（図７）。
【００５２】
第４のパラメータは、プローブの塩基配列自体の有するハイブリダイゼーション・フリーエネルギー（Kcal/mol）である。このハイブリダイゼーション・フリーエネルギーの算出方法は、特に限定されないが、ここではOligoScreenTMを用いて算出した。また、GC塩基含有量を指標とした計算方法を用いて、ハイブリダイゼーション・フリーエネルギーを算出してもよい。ハイブリダイゼーション・フリーエネルギーは、プローブと相補的な遺伝子のハイブリダイゼーションやその洗浄の工程にバイアスを生じさせるものと予想されている。
【００５３】
これを示す例として図９及び図１０を挙げる。図９は、プローブの遺伝子配列自体の有するハイブリダイゼーション・フリーエネルギー（Kcal/mol）に対するに対するシグナル強度比を示すグラフである。シグナル強度比は、ダウン症候群の染色体の遺伝子増幅量／健常人の染色体の遺伝子増幅量である。横軸は、プローブの遺伝子配列自体の有するハイブリダイゼーション・フリーエネルギー（Kcal/mol）を示し、縦軸は、シグナル強度比を示している。また、図１０は、同一の細胞（H1437細胞）を別々に実験したデータを比較して得た。縦軸は、シグナル強度比を示し、H1437細胞の遺伝子増幅量／H1437細胞の遺伝子増幅量である。横軸は、プローブの遺伝子配列自体の有するハイブリダイゼーション・フリーエネルギー（Kcal/mol）を示す。
【００５４】
図９又は１０の座標系の各プロット値から平均化曲線にスムージングさせ、ハイブリダイゼーション・フリーエネルギーに係る平均化曲線の係数から求めることが挙げられる。ここでの「補正基準値」は、各ハイブリダイゼーション・フリーエネルギー値をいい、この補正基準値及び補正傾向値から任意のハイブリダイゼーション・フリーエネルギー値での補正因子データを導出することができる。
【００５５】
第５のパラメータは、Prefect Match(PM)のプローブセットのシグナル強度の中間値（log scaled）である。対照サンプルのシグナル強度を意味し、特定の染色体部位（特定のSNP部位）を検出する複数のプローブのシグナル強度の中間値をいう。この中間値は、最高値の値及び最低値の値を排除した後に求めても良い。
【００５６】
これを示す例として図１１を挙げる。図１１は、Prefect Match(PM)であるプローブセットのシグナル強度の中間値に対するシグナル強度を示すグラフである。この中間値とは、特定の染色体部位（特定のSNP部位）を検出する複数のプローブのシグナル強度の中間値をいう。縦軸は、シグナル強度比を示し、ダウン症候群の染色体の遺伝子増幅量／健常人の染色体の遺伝子増幅量である。横軸は、Prefect Match(PM)であるプローブセットのシグナル強度の中間値を示す。
【００５７】
図１１の座標系の各プロット値から平均化曲線にスムージングさせ、プローブセットのシグナル強度の中間値に係る平均化曲線の係数から求めることが挙げられる。ここでの「補正基準値」は、各プローブセットのシグナル強度の中間値をいい、この補正基準値及び補正傾向値から任意のプローブセットのシグナル強度の中間値での補正因子データを導出することができる。
【００５８】
３．染色体のゲノムDNA量の測定結果を補正する方法（補正因子の算出工程）
本発明における遺伝子コピー数の解析方法における計測値の補正にあたっては以上の５つの補正パラメータに係る「補正基準値」及び「補正傾向値」の全部又は一部のデータを用いて、プローブごとの「補正因子」を算出する。後述するように、各プローブにおける複数の補正パラメータに係る「補正傾向値」及び「補正基準値」から、プローブにおける「補正因子」を導出することができる。
【００５９】
次いで、あるプローブにおける一次データについて、同プローブでの補正因子を用いて補正することにより、一次データについて補正をすることができる。この補正因子を用いて一次データを補正するには、以下で説明するように、一次データを補正因子で除する方法、一次データを補正因子で減じる方法など挙げられる。
【００６０】
以下、複数の測定工程における補正傾向値及び補正基準値から総合的な補正因子を求める方法について説明する。複数の測定工程とは、上述の５つの補正パラメータに関する全部又は一部をいう。ここでは例示的に、三次関数の多項式で上記の５つの補正因子を用いて総合的な補正因子（５つの補正要件に係るバイアス予想値・Expected data）示した。ここで、多項式は、一次関数など他の次数の関数で求めても良い。また、補正パラメータもX１からX５の全てを用いることが望ましいが、任意の補正パラメータのみを用いても良い。
【００６１】
（数１）  Expected data =   A+ Σ（BkXk+CkXk2+DkXk3）
数１において、Kは、補正要件の１から５でそれぞれ以下の値を取る。また、B、C及びDは、三次関数の係数を示し、Aは同関数の切片を示す。
X１とは、XbaIで切断した遺伝子断片の長さ（bp）、
X2とは、前記制限酵素で切断された遺伝子断片に含まれるGC塩基対含有量の比率（％）、ここで高いGC含有量を示す領域は、データを除外して、曲線にスムージングしてもよい。
X３とは、特定領域におけるGC塩基対含有量の比率（％）
X４とは、プローブの遺伝子配列自体の有するハイブリダイゼーション・フリーエネルギー（Kcal/mol）。
X５とは、Prefect Match(PM)のプローブセットのシグナル強度の中間値（log scaled）。対照サンプルのシグナル強度を意味し、特定の染色体部位（特定のSNP部位）を検出する複数のプローブのシグナル強度の中間値をいう。この中間値は、最高値の値及び最低値の値を排除した後に求めても良い。
【００６２】
なお、使用するマイクロアレイに応じて、X1、X2、X3、X4は固定する値を取るが、X5、A、B、C、Dは測定ごとに変動する値であり、一回の測定ごとに特異的なもので、測定ごとに個別に計算することが望ましい。ただし、X５以外の値については、各プローブに固定的なものとしてもよい。
【００６３】
本発明に係る測定値と補正の結果を示す図を図１２及び図１３に示す。図１２は、ダウン症候群の染色体の健常人の染色体に対する本願の補正前のシグナル強度比を示すグラフである。ここで、シグナル強度比は、ダウン症候群の染色体の遺伝子増幅量／健常人の染色体の遺伝子増幅量である。第21番染色体を中心とした物理的な遺伝子位置ごとの順に、10Kのマッピングを可能とするプローブセットのアレイを使用した。縦軸が、補正前のシグナル強度比を示し、横軸が第21番染色体の周辺における物理的な遺伝子位置を示している。
【００６４】
図１３は、図１２に示されるグラフを本願の補正方法で処理したグラフである。当該補正処理により、シグナル強度比のデータのバラツキ及びゆらぎ（fluctuations）が著しく減少し、ダウン症候群の患者の第21番染色体領域でシグナル強度比が明確に増大していることが示されている（矢印で示した領域）。シグナル強度比は、ダウン症候群の染色体の遺伝子増幅量／健常人の染色体の遺伝子増幅量である。縦軸が、シグナル強度比を示し、横軸が第21番染色体の周辺における物理的な遺伝子位置を示している。
【００６５】
４．染色体の遺伝子コピー数を同定する方法
また、本願発明における補正方法に特定工程を追加することによる、染色体の遺伝子コピー数の絶対値を求める方法を提供する。本発明の補正方法で、ゲノムDNA量の強度比を補正すると、測定値のバイアスが減少して、明瞭な階段状の測定値となることが示される。この階段状の連続した測定値のうち、最小のシグナル強度比の平均値を「０」と定めることで、シグナル強度比と各染色体の領域における遺伝子コピー数の絶対値に変換することができる。
【００６６】
図１４は、アレル別のゲノムDNA量及び遺伝子コピー数分析（Allelic dosage analysis）をした結果のグラフである。図は、各プローブに対する癌患者の染色体の遺伝子増幅量／健常人の染色体の遺伝子増幅量を示した。いずれかのアレルでの最小のシグナル強度比を、１細胞当たりの遺伝子コピー数を「０」と定義することにより、個々の染色体領域における遺伝子コピー数の絶対数を算出することができる。縦軸（左側）は、シグナル強度比を示し、縦軸（右側）は、本発明で定義した１細胞当たりの遺伝子コピー数の絶対値を表した。遺伝子コピー数の高いアレルは、太線（７）で示し、遺伝子コピー数の低いアレルは、細線（８）で示している。
【００６７】
図１５は、図１４と同条件での全ゲノムにおけるアレルごとのゲノムDNA量を分析した結果を示すグラフである。このグラフは、アレルごとのシグナル強度比を示している。いずれかのアレルでの最小のシグナル強度比を、１細胞当たりの遺伝子コピー数を「０」と定義することにより、個々の染色体領域における遺伝子コピー数の絶対数を算出することができる。縦軸（左側）は、シグナル強度比を示し、縦軸（右側）は、本発明で定義した細胞当たりの遺伝子コピー数の絶対値を表した。横軸は、全ゲノムの物理的な遺伝子位置を順に示したものである。遺伝子コピー数の高いアレルは、太線（７）で示し、遺伝子コピー数の低いアレルは、細線（８）で示している。X染色体におけるLOHが片方のアレルで明確に示されている（矢印）。
【００６８】
この処理をまとめると次の通りである。すなわち、階段状の連続した測定値のうち、最小のシグナル強度比の平均値を「０」とし、この「０」に比較して次に高い連続したシグナル強度の平均値を「１」として、次いで、「２」「３」と求めていく。これにより、シグナル強度比の値から、遺伝子コピー数の絶対値を検出することができる。
【００６９】
染色体での最小のシグナル強度比を求めるには、比較対照の一方が、健常人であることが望ましい。 ほぼ全領域の染色体でシグナル強度比を求めると、ほとんどの染色体の遺伝子コピー数は、０、１、２または３のいずれかの値となることが示された。
また、染色体の遺伝子コピー数の検出をする場合には、本願発明による補正方法の他に、アレルごとのゲノムDNA量の測定をすることができるゲノムタイピングマイクロアレイを用いることが必要である。
【００７０】
５．染色体上のハプロタイプの同定方法
さらには、本発明により、染色体のハプロタイプの検出する方法にも利用することができる。ここで、ハプロタイプとは、親から遺伝する際に染色体の遺伝子は適当なブロック単位で遺伝するが、その際の連続した遺伝子のブロックのことをハプロタイプと呼んでいる。このハプロタイプには、複数のSNPsが含まれていることが一般的である。
【００７１】
染色体のゲノムDNA量を測定する際に、マイクロアレイをアレルごとの測定を可能とするゲノムタイピングマイクロアレイとすることで、染色体のハプロタイプの検出ができる。同マイクロアレイでは、アレイ上に通常１つのSNPを有するプローブが配置されており、ハプロタイプの最小の構成成分を有しているからである。また、本発明の補正方法により測定値で処理することにより、信頼性の高い検出ができる。
【００７２】
本発明の補正方法で、染色体のゲノムDNA量のデータを補正することで、上述したように明瞭な階段状の染色体ゲノムDNA量または遺伝子コピー数が求められ、同じシグナル強度比である連続した染色体上のセグメントを見出すことができ、より信頼性の高いハプロタイプの検出ができる。同じシグナル強度比である連続した染色体（アレル）上のセグメント（ブロック）は、単一のハプロタイプであると定義される（図１４、図１５）。例えば、図１４に示されるシグナル強度比が２つのアレルが異なる連続している領域（９）は、遺伝子のハプロタイプを示していると予測される。横軸は、染色体遺伝子の物理的な遺伝子位置を示している。縦軸は、シグナル強度比を示している。
【００７３】
６．染色体の遺伝子の欠損及び異常増幅を表示する方法
本発明により、染色体の位置ごとの染色体の遺伝子コピー数を求めることができる。その表示方法としては、図１４及び図１５に示すように、縦軸に染色体のゲノムDNA量（シグナル強度比）または遺伝子コピー数をとり、横軸に染色体の位置（Locus）に対応するプローブを染色体の物理的順序で表すことが一般的であった。
【００７４】
本発明では、染色体をその長さなどの染色体形状様に応じて第1染色体から第２２染色体、X染色体及びY染色体の全部又はその一部を画面等に表示して、染色体の遺伝子コピー数が欠損している領域を対応づけて欠損させ、また遺伝子コピー数の異常増幅は、当該領域に対応づけて、その遺伝子コピー数に応じて増幅があることを示す表示方法が挙げられる（図１６）。また、遺伝子コピー数の数に応じて、染色体の対応する領域の色彩を濃くするなどの変調をつけることも挙げられる。図16に示される長い染色体は、第４番染色体を示し、短い染色体は、第18番染色体を示す。
【００７５】
７．染色体上のハプロタイプを表示する方法
上述したように、本発明により染色体上にあるハプロタイプをも検出することができる。このハプロタイプの表示についても、遺伝子コピー数のグラフで示すことが挙げられるが、また、染色体をその長さなどの染色体形状様に応じて第1染色体から第23染色体、X染色体及びY染色体の全部又はその一部を画面等に表示して、染色体のハプロタイプごと領域を対応づけて当該領域ごとに異なる着色をすることにより、空間情報として第三者に伝えるように表示する方法が挙げられる。
【実験例１】
【００７６】
以下、本発明を以下の実験例１を用いてさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実験例に限定されることはない。
本実験例では、ダウン症候群の責任遺伝子である第21番染色体を用いて実験した。ダウン症候群の患者の第21番染色体は、健常人の同染色体と比較して遺伝子コピー数が増加していることが知られている。
【００７７】
ダウン症候群の患者の第21番染色体と健常人の同染色体と比較した。図１２は、健常人及びダウン症候群の患者のゲノムを上述した方法で、アレイ上にあるプローブごとのシグナル強度をそれぞれ求め、ダウン症候群の患者におけるシグナル強度を健常人におけるシグナル強度で除した比率を算出したものである。図１２に示したグラフでは、染色体の特定の部位ごとに、染色体の遺伝子コピー数に依存するシグナル強度比を表しているが、シグナルノイズが多いため、必ずしもシグナル強度比が染色体の遺伝子コピー数に依存しているデータではないことが示される。
【００７８】
一次データを本願発明に係る補正方法で処理すると、図１３に示すように、一次データの有するデータの「ゆらぎ」や「バラツキ」が著しく減少することが示された。また、補正前の一次データの表す平均値データと、本願補正方法で補正した二次データの表す平均値データには、ほとんど差異がないことが示された（図１２と図１３）。第21番染色体及びその他の染色体における、一次データのシグナル強度比のメディアン及びSDは、それぞれ1.30±0.39及び1.00±0.28であった。一方、本願補正方法による補正処理後の第21番染色体及びその他の染色体における二次データは、それぞれ1.29±0.18 及び0.99±0.09であった。
【００７９】
他の実験例では、同一のH1437細胞を用いて、別々に実験したデータから染色体のゲノムDNA量比を測定する実験を行った。補正前の測定データ（図１７）と補正後の測定データ（図１８）を示した。これらの図の縦軸はシグナル強度比を示し、H1437細胞の遺伝子増幅量／H1437細胞の遺伝子増幅量であり、横軸は、染色体位置に対するプローブの一部を示す。  図１７と図１８は、中間値及びそのSD値は、1.00±0.08と1.00±0.06となり、シグナル強度の値は変えず、そのデータのバラツキのみを減少させることが示された。
【実験例２】
【００８０】
次に、本願での補正方法（GIM; Genome Imbalance Map）による結果と、従来から利用されているBAC（Bacterial artificial chromosome）をスポットしたCGH（Comparative genomic hybridization）アレイ（Genosensor array 300, Vysis）の結果を比較した。実験例２として以下に示す。２つの方法で、高いコピーレンジから低いコピーレンジにかけて良好な相関関係が見られたが、相関関係のない部位も、一部の染色体の部位で見られた（図１９）。この理由は、本願補正方法で用いるSNPタイピングアレイと比較して、BACプローブが約200Kbと長いため、この距離のなかで、遺伝子コピー数が異なっていても、遺伝子コピー数が平均化されてしまい、異なる遺伝子コピー数が算出されたと考えられる。
【００８１】
また、男性と女性の染色体の遺伝子コピー数を比較する実験を行ったところ、X染色体における１つの遺伝子コピー数の差異については、本願補正方法（GIM）によるデータがBACをスポットしたCGHアレイと比較してより明確に区別できることが示された。X染色体とそれ以外の常染色体でのシグナル強度比(アジアン±SD)を求めると、GIM法では、0.99±0.09/0.63±0.08であるのに対して、BACアレイでの測定では、1.00±0.09/0.71±0.14になる。X染色体の遺伝子コピー数のアジアンは、0.71で、常染色体のものと、0.29の差のみであり（GIM法の場合には、0.36の差がある）、SD値も0.14と、GIM法の0.08に比して大きい。したがって、本願のGIM法は、X染色体では、BAXでスポットしたCGH法よりも、明確に遺伝子コピー数を区別することができる（図２０）。
【実験例３】
【００８２】
実験例３として、癌細胞における遺伝子コピー数の検出を挙げる。すなわち、本発明の補正方法を癌細胞のゲノムDNA量及び遺伝子コピー数を求めることを適用した。細胞は、H1395肺がん細胞株と正常細胞から得た染色体を用いて、全染色体遺伝子のゲノムDNA量を測定した。図２１は、第８染色体及び第９ｐ染色体における癌細胞と正常細胞の染色体遺伝子のシグナル強度比を示している。シグナル強度比は、癌患者の染色体の遺伝子増幅量／健常人の染色体の遺伝子増幅量である。すなわちゲノムDNA量の比を表している。図中左側の矢印の８q24は、c-myc癌遺伝子の増幅が見とれられる部位を示し、同右側の矢印は未知のゲノム増殖領域を示している。縦軸の右側の目盛りは、遺伝子コピー数を算出した結果を示す。（図１５を参照）
【００８３】
正常細胞と特定の癌細胞から得た染色体のゲノムDNA量の比を求め、これを本発明の補正方法で補正することにより、特定の染色体領域で遺伝子が欠損または異常増幅している遺伝子コピー数を示すことができる。これにより、癌やその他の遺伝子疾患の診断方法に応用できるほか、疾患細胞の遺伝子コピー数を特定することにより、疾患関連遺伝子の同定をすることができる。また、アレル別に染色体のゲノムDNA量を求めることにより、染色体の遺伝子コピー数の異常が、父方また母方のいずれかの由来であるかも同定することができる（図３、図７）。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】本発明による遺伝子コピーの解析方法における測定値の補正の処理図である。
【図２】本発明による遺伝子コピーの解析装置の構成図である。
【図３】遺伝子断片の長さに対するシグナル強度比（ダウン症の染色体ゲノムDNA量/正常の染色体ゲノムDNA量）を示したグラフである。
【図４】遺伝子断片の長さに対するシグナル強度比（同一のH1437細胞の染色体のゲノムDNA量）を示したグラフである。
【図５】遺伝子断片に含まれるGC含有量とシグナル強度比（ダウン症の染色体ゲノムDNA量/正常の染色体ゲノムDNA量）の関係を示したグラフである。
【図６】遺伝子断片に含まれるGC含有量とシグナル強度比（同一のH1437細胞の染色体のゲノムDNA量）の関係を示したグラフである。
【図７】遺伝子断片の特定領域におけるCG含有量に対するシグナル強度比（ダウン症の染色体ゲノムDNA量/正常の染色体ゲノムDNA量）を示したグラフである。
【図８】遺伝子断片の特定領域におけるCG含有量に対するシグナル強度比（同一のH1437細胞の染色体のゲノムDNA量）を示したグラフである。
【図９】プローブの遺伝子配列自体の有するハイブリダイゼーション・フリーエネルギー（Kcal/mol）に対するに対するシグナル強度比（ダウン症の染色体ゲノムDNA量/正常の染色体ゲノムDNA量）を示すグラフである。
【図１０】プローブの遺伝子配列自体の有するハイブリダイゼーション・フリーエネルギー（Kcal/mol）に対するに対するシグナル強度比（同一のH1437細胞の染色体のゲノムDNA量）を示すグラフである。
【図１１】Prefect Match(PM)のプローブセットのシグナル強度の中間値（log scaled）に対するシグナル強度比（ダウン症の染色体ゲノムDNA量/正常の染色体ゲノムDNA量）を示すグラフである。
【図１２】本願の補正前の染色体位置ごとのシグナル強度比（ダウン症の染色体ゲノムDNA量/正常の染色体ゲノムDNA量）を示すグラフである。
【図１３】図１２に示されるグラフを本願の補正方法で処理したグラフである。
【図１４】染色体のアレル別のゲノムDNA量及び遺伝子コピー数分析（Allelic dosage analysis）をした結果のグラフである。
【図１５】全ゲノムにおけるアレルごとのゲノムDNA量及び遺伝子コピー数を分析した結果を示すグラフである。
【図１６】本発明の表示方法による染色体遺伝子の欠損及び異常増幅の表示を示す図である。
【図１７】本願の補正前の染色体位置ごとのシグナル強度比（同一のH1437細胞の染色体のゲノムDNA量）を示すグラフである。
【図１８】図１７に示されるグラフを本願の補正方法で処理したグラフである。
【図１９】本願補正方法による結果と、BACをスポットしたCGHアレイの結果の比較を示すグラフである。
【図２０】本願補正方法による結果と、BACをスポットしたCGHアレイの結果の比較を、染色体の位置の順ごとに示すグラフである。
【図２１】第８染色体及び第９ｐ染色体における癌細胞と正常細胞の染色体遺伝子のシグナル強度比を示すグラフである。
【符号の説明】
【００８５】
１  遺伝子コピーの解析装置
２  中央演算処理装置（CPU）
３  メモリ
４  ハードディスク
５  表示装置
６  GC塩基対含有量の比率の高い部分
７  遺伝子コピー数の高いアレル
８  遺伝子コピー数の低いアレル
９  ハプロタイプを示す領域
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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