(57)【要約】【課題】外因性ヌクレオチド配列を挿入することができ、哺乳類の宿主細胞に容易に導入することができ、外因性ヌクレオチド配列にコードされた遺伝子を宿主細胞内で発現させることができ、病原性を有する危険性が低く、哺乳類の遺伝子治療に好適に用いることができる、ウイルスベクターを提供する。【解決手段】ＨＨＶ−７由来の組換ウイルスベクターであって、ＨＨＶ−７のＵ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ２４、Ｕ２４aおよびＵ２５領域からなる群より選ばれる少なくとも１領域に相当する部位に、外因性ヌクレオチド配列を備える、組換ウイルスベクターである。【選択図】図１４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＨＶ−７由来の組換ウイルスベクターであって、ＨＨＶ−７のＵ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ２４、Ｕ２４aおよびＵ２５領域からなる群より選ばれる少なくとも１領域に相当する部位に、外因性ヌクレオチド配列を備える、組換ウイルスベクター。
【請求項２】
前記部位は、配列番号２で表されるＨＨＶ−７のＤＮＡ配列におけるヌクレオチド番号１０５５８〜１８４８３または３４７４４〜３６１１８の範囲に存在する、請求項１に記載の組換ウイルスベクター。
【請求項３】
組換ウイルスＨ７Ｒ２８またはＨ７Ｒ２４−２５からなる、請求項１に記載の組換ウイルスベクター。
【請求項４】
前記外因性ヌクレオチド配列が、ＤＮＡ配列および／またはＲＮＡ配列である、請求項１に記載の組換ウイルスベクター。
【請求項５】
前記外因性ヌクレオチド配列が、ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  （ＢＡＣ）、サイトカイン遺伝子、リボザイム、ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ、免疫学的補助刺激分子、シグナル伝達分子、酵素および化学誘引物質からなる群より選ばれる１種以上をコードするヌクレオチド配列である、請求項４に記載の組換ウイルスベクター。
【請求項６】
前記外因性ヌクレオチド配列が、哺乳類の遺伝子治療に用いられるための配列である、請求項４に記載の組換ウイルスベクター。
【請求項７】
前記外因性ヌクレオチド配列が、マーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載の組換ウイルスベクター。
【請求項８】
ＨＨＶ−７由来の組換ウイルスベクターの製造方法であって、ＨＨＶ−７のＵ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ２４、Ｕ２４aおよびＵ２５領域からなる群より選ばれる少なくとも１領域に相当する部位に、外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップを備える、組換ウイルスベクターの製造方法。
【請求項９】
前記外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップは、配列番号２で表されるＨＨＶ−７のＤＮＡ配列におけるヌクレオチド番号１０５５８〜１８４８３または３４７４４〜３６１１８の範囲に外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップを含む、請求項８に記載の組換ウイルスベクターの製造方法。
【請求項１０】
前記外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップは、それぞれ配列番号３０−３１および３４−３５に示す配列のプライマーの組合せまたは配列番号４０−４１および４２−４３に示す配列のプライマーの組合せを用いて増幅されるＤＮＡ配列と、ＨＨＶ−７のＤＮＡ配列との相同組換を行なうステップを含む、請求項８に記載の組換ウイルスベクターの製造方法。
【請求項１１】
前記外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップは、正常かつ／または臍帯血由来の細胞内において前記外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップを含む、請求項８に記載の組換ウイルスベクターの製造方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の組換ウイルスベクターによる哺乳類の宿主細胞の形質転換方法であって、前記組換ウイルスベクターにより、ヒト、ヒト以外の霊長類およびＨＨＶ−７の感染可能な宿主からなる群より選ばれる１種以上の哺乳類由来の前記宿主細胞を形質転換するステップを備える、宿主細胞の形質転換方法。
【請求項１３】
前記形質転換するステップは、前記組換ウイルスベクターにより、Ｔ細胞、マクロファージ、末梢血単核球細胞、血液幹細胞、肝細胞、血管内皮細胞、繊維芽細胞、グリア細胞、アストロサイト、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、樹状細胞およびナチュラルキラー細胞からなる群より選ばれる１種以上の前記宿主細胞を形質転換するステップを含む、請求項１２に記載の宿主細胞の形質転換方法。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の宿主細胞の形質転換方法により得られる、形質転換宿主細胞。
【請求項１５】
哺乳類の遺伝子治療方法に用いられる、請求項１４に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１６】
前記遺伝子治療は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する易感染性細胞内におけるＨＩＶウイルス感染を予防するための遺伝子治療および／または癌の免疫治療のための遺伝子治療である、請求項１５に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１７】
前記宿主細胞は、前記遺伝子治療を行なう対象となる種類の哺乳類と同種の哺乳類由来の宿主細胞である、請求項１５に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１８】
ヒト以外の哺乳類の遺伝子治療方法であって、請求項１４〜１７のいずれかに記載の形質転換細胞を前記哺乳類へ投与するステップを備える、遺伝子治療方法。
【請求項１９】
ヒト以外の哺乳類の遺伝子治療方法であって、請求項１に記載の組換ウイルスベクターにより、前記哺乳類の体内の宿主細胞を０．０１〜２０の感染多重度（ＭＯＩ）で形質転換するステップを備える、遺伝子治療方法。
【請求項２０】
さらに前記組換ウイルスベクターに備わる外因性ヌクレオチド配列にコードされる遺伝子を発現させるステップを備える、請求項１８または１９に記載の遺伝子治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換ウイルスおよび組換ウイルスベクターに関する。さらに詳しくは、本発明は、ヘルペスウイルスに属するＨＨＶ−７ウイルス由来の組換ウイルスおよび組換ウイルスベクターに関する。
【０００２】
また、本発明は、上記の組換ウイルスおよび組換ウイルスベクターの製造方法に関する。さらに、本発明は、上記の組換ウイルスおよび組換ウイルスベクターを用いた宿主細胞の形質転換方法に関する。そして、本発明は、上記の組換ウイルスおよび組換ウイルスベクターにより形質転換された宿主細胞に関する。加えて、本発明は、上記の組換ウイルスおよび組換ウイルスベクターを用いた遺伝子治療方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
近年、分子生物学や分子遺伝学などにおける知識の蓄積やさまざまな技術開発により生命科学は大きく発展し、生命現象に関して多くの情報が得られるようになってきている。
【０００４】
そのため、現在、生命科学の種々の分野において活発な研究開発が行われている。これらの中でも、遺伝子機能の解析は大きな比重を占めており、単離した遺伝子を細胞や生物個体に導入するためのさまざまな技術やそのためのベクターが開発されている。
【０００５】
医療などへの応用を目的として、哺乳類の細胞への遺伝子導入に用いられるベクターも数多く開発されている。これらのベクターの中でも、最近はウイルスを利用したベクター（ウイルスベクター）が注目されている。
【０００６】
ウイルスベクターは、いくつかの公知のベクターの中でも、外来遺伝子をタンパク質として発現され得るように細胞に導入するのに有用なものである。ウイルスベクターの中心要素は、ウイルスが本来持っている感染（増殖感染、潜伏感染、流産感染を含む）という性質を利用して、外来遺伝子を感染細胞に導入し、プロモーター配列のコントロール下である外来遺伝子により、形質を導入することにある。
【０００７】
既知の形質導入技術としては、非ウイルス的な方法も用いられている。たとえば、遊離ＤＮＡとしての標的遺伝子構築体の単なる添加、標的ＤＮＡと標的細胞へのＤＮＡの取込みのためにデザインされた特異的なタンパク質との複合体とのインキュベーション、ならびにリポソームまたはその他の脂質を基礎とする感染遺伝子の中に封入された標的ＤＮＡとのインキュベーションなどの技術が用いられている。しかし、これらの非ウイルス的な形質導入技術は、導入効率が低い傾向があり、導入された遺伝子の発現効率も低い場合が多い。
【０００８】
さらに、既知の形質導入技術としては、必須の標的遺伝子を含むように操作され、かつ標的細胞に感染でき、それゆえ細胞の中に標的遺伝子を発現できる状態で運び込む組換ウイルスおよび組換ウイルスベクターの利用が実施されている。多種多様なウイルス、たとえばレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスがこの目的のために利用されている。しかし、これらのウイルスには以下の欠点が認められる。
【０００９】
たとえば、レトロウイルスは本来発癌ウイルスであり、実際に遺伝子治療にともなう発癌性が指摘されている。さらに、導入できる遺伝子が小さく、また遺伝子を発現することができる細胞の種類が限られる点が挙げられる。
【００１０】
アデノウイルスは、遺伝子治療などで使用した場合、アデノウイルスに対する強いアレルギー反応が起きる場合があり、実際に遺伝子治療にともなう死亡例が確認されている。さらに、血液細胞に対する遺伝子導入の効率が悪く、ベクターとして用いることが困難であることが挙げられる。
【００１１】
アデノ随伴ウイルスは、形質導入できる遺伝子の大きさが小さく、さらに遺伝子の発現効率が悪い欠点をもつ。また、アデノ随伴ウイルスのベクター作製は困難であり、宿主の遺伝子に組み込まれるので発癌性が否定できない点が挙げられる。
【００１２】
ヘルペスウイルス科のウイルスは、主としてヒトに感染するものだけで、現在８種類同定されている。ヘルペスウイルスは大型のＤＮＡウイルスで、主としてその進化の系統樹に従って、α、β、γの３亜科に分類され、亜科ごとに共通した生物学的性質を持つ。たとえば、α−ヘルペスウイルスは神経細胞で潜伏感染、再活性化を生じる神経向性のウイルスで、γ−ヘルペスウイルスは腫瘍原性を持つ。
【００１３】
ヒトのβヘルペスウイルスには、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ：ヒトヘルペスウイルス５、ＨＨＶ−５）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）およびヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ−７）が属している。
【００１４】
特にＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７は、発現する疾患の症状が穏やかであり（たとえば、非特許文献１参照。）、遺伝子治療に用いるウイルスベクターの候補として注目されている（たとえば、非特許文献２参照。）。
【００１５】
ヘルペスウイルス、特にＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７を組換ウイルスまたは組換ウイルスベクターとして用いた場合、病原性が低いことをはじめ、Ｔ細胞やマクロファージなどの血液細胞に遺伝子を形質導入しやすい、比較的大きな遺伝子を形質導入できる、といった利点が考えられる。
【００１６】
さらに、ＨＨＶ−６を利用した組換ウイルスまたは組換ウイルスベクターを利用した場合、他のベクターでは難しいマクロファージへの遺伝子の形質導入が可能であること、マクロファージに潜伏感染状態で遺伝子を導入できるため、アデノウイルスに見られるアレルギー症状を引き起こさないこと、といった利点が考えられる。
【００１７】
しかし、ＨＨＶ−６またはＨＨＶ−７由来の組換ウイルスおよび組換ウイルスベクターの作製は困難であり、従来の技術では作製することができなかった。ＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７の組換が困難であった原因としては、技術的な要因に加え、ＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７に備わる遺伝子の性質に由来すると考えられる。
【００１８】
ＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７の遺伝子の大きさはＨＣＭＶよりも小さく、ＨＣＭＶで知られているウイルス増殖に不必要な遺伝子がほとんど含まれていないことが知られている（たとえば、非特許文献３および非特許文献４参照。）。
【００１９】
通常、相同組換法を用いてヘルペスウイルスの組換ウイルスおよび組換ウイルスベクターを作製する場合、１つ以上の部位を一旦破壊しなければならない。しかし、ＨＣＭＶの組換ウイルスの作製過程で従来使用されてきた組換可能な部位は、ＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７に必ずしも含まれないため、ＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７の組換ウイルスおよび組換ウイルスベクターを作製するためには、新しい作製方法の開発が必要である。
【００２０】
ヘルペスウイルス由来のウイルスベクターとしては、ゲノムのプロモーター調節領域のコントロール下で単純ヘルペスウイルスゲノムの中に挿入され、それゆえ外来遺伝子の発現のためのベクターを担う外来遺伝子が開示されている（たとえば、特許文献１参照。）。さらに、ＤＮＡ構築体、外来遺伝子の発現のために有用な構築体を含むプラスミドベクター、このベクターにより製造された組換ウイルスおよび関連の方法が開示されている。しかしながら、これらの文献には、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）ベクターおよびその作製方法についての記載しかなく、ＨＨＶ−６由来あるいはＨＨＶ−７由来のウイルスベクターに関する記載はない。
【００２１】
単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）とＨＨＶ−６またはＨＨＶ−７は、進化的には同じ祖先から発生しているが、遺伝子の構造が全く異なり、互いの遺伝子配列の相同性が低く、ベクターの作成や遺伝子治療を行なう際に重要である細胞指向性(cellular tropism)が全く異なる。このため、ＨＨＶ−６またはＨＨＶ−７由来ベクターの作成には、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）ベクターとは異なった技術開発が必要である。
【００２２】
また、ヘルペスウイルスベクターを利用した結果、たとえば造血細胞系の悪性細胞を形質転換し、かかる細胞における外来性遺伝子材料の発現と誘導するための方法も開示されている（たとえば、特許文献２参照）。しかし、単純ヘルペスウイルス１型に関する記述しかなく、ＨＨＶ−６またはＨＨＶ−７由来のベクターまたは作製方法は開示されておらず、遺伝子治療に伴う副作用についての記載もない。
【特許文献１】欧州特許第１７６１７０号明細書
【特許文献２】特表平１１−５１３５６５号公報
【非特許文献１】Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．，１９９７年７月，第１０巻，第３号，ｐ．５２１−５６７
【非特許文献２】Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｍｅｔｈ．，２００２年９月，第１０５巻，第２号，ｐ．３３１−３４１
【非特許文献３】Ｙｕｊｉ  Ｉｓｅｇａｗａ  ｅｔ．  ａｌ，Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，１９９９年１０月，第７３巻，第１０号，ｐ．８０５３−８０６３
【非特許文献４】Ａ．  Ｇｅｏｒｇｅ  Ｍｅｇａｗ  ｅｔ．  ａｌ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９８年，第２４４号，ｐ．１１９−１３２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明の課題は、外因性ヌクレオチド配列を挿入することができ、哺乳類の宿主細胞に容易に導入することができ、外因性ヌクレオチド配列にコードされた遺伝子を宿主細胞内で発現させることができ、病原性を有する危険性が低く、哺乳類の遺伝子治療に好適に用いることができる、ウイルスベクターを提供することである。
【００２４】
本発明の他の課題は、外因性ヌクレオチド配列を挿入することができ、哺乳類の宿主細胞に容易に導入することができ、外因性ヌクレオチド配列にコードされた遺伝子を宿主細胞内で発現させることができ、病原性を有する危険性が低く、哺乳類の遺伝子治療に好適に用いることができる、ウイルスベクターを容易かつ安全に製造可能な製造方法を提供することである。
【００２５】
本発明の別の課題は、哺乳類の宿主細胞に容易に外因性ヌクレオチド配列が導入でき、外因性ヌクレオチド配列にコードされた遺伝子を宿主細胞内で発現させることができ、病原性を有する危険性を低く抑えることができ、哺乳類の遺伝子治療に好適に用いることができる、ウイルスベクターによる宿主細胞の形質転換方法を提供することである。
【００２６】
本発明のさらに別の課題は、ウイルスベクターにより形質転換されて外因性ヌクレオチド配列が挿入されており、外因性ヌクレオチド配列にコードされた遺伝子を宿主細胞内で発現させることができ、病原性を有する危険性が低く、遺伝子治療および細胞治療に好適に用いることのできる、形質転換宿主細胞を提供することである。
【００２７】
本発明のもう一つの課題は、哺乳類の宿主細胞に容易に外因性ヌクレオチド配列が導入でき、外因性ヌクレオチド配列にコードされた遺伝子を宿主細胞内で発現させることができ、病原性を有する危険性を低く抑えることができる、ウイルスベクターを用いた哺乳類の遺伝子治療方法を提供することである。
【００２８】
本発明のさらにもう１つの課題は、従来の方法では効率よく遺伝子導入できなかった場合や安定な遺伝子発現を得ることができなかった場合および発癌が引き起こる危険性が高かった場合に対して、これまでに使用されてなかったウイルスを利用した遺伝子治療法、組換えウイルスおよび組換えウイルスベクターを開発することである。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明者は、上記の課題を解決するためには、発現する疾患の症状が非常に穏やかであり、健康な成人の体内にほぼ１００％の割合で感染・潜伏しているＨＨＶ−６またはＨＨＶ−７を、遺伝子治療に用いるウイルスベクターとして好適に用いることができるようにすればよいとの着想を得、鋭意研究に励んだ。
【００３０】
具体的には、本発明者は、相同組換技術によって組換ウイルスを作るために、薬剤耐性遺伝子に置換することができる欠失可能領域を見出すべく、後述する実施例に示す実験を試行錯誤のもと実施した。
【００３１】
その結果、本発明者は、下記の実施例に記載するように、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）およびヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ−７）の複製と潜伏感染のために必須ではないため欠失可能な遺伝子クラスターを発見した。
【００３２】
この発見に基づき、本発明者は、ＨＨＶ−６またはＨＨＶ−７の特定領域に外来ヌクレオチド配列を挿入しても、ＨＨＶ−６またはＨＨＶ−７のウイルスベクターとしての機能は失われないことを見出し、従来の技術では作製が非常に困難であったＨＨＶ−６またはＨＨＶ−７由来の組換ウイルスおよび組換ウイルスベクターの作製を可能にし、本発明を完成した。
【００３３】
すなわち、本発明の組換ウイルスベクターは、ＨＨＶ−６由来の組換ウイルスベクターであって、ＨＨＶ−６のＵ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ２４およびＵ２５領域からなる群より選ばれる少なくとも１領域に相当する部位に、外因性ヌクレオチド配列を備える、組換ウイルスベクターである。
【００３４】
ここで、この部位は、配列番号１で表されるＨＨＶ−６のＤＮＡ配列におけるヌクレオチド番号９０４１〜１７４４６または３６２５０〜３７７７５の範囲に存在することが好ましい。また、本発明の組換ウイルスベクターは、組換ウイルスＨ６Ｒ２８またはＨ６Ｒ２４−２５からなることが望ましい。
【００３５】
そして、本発明の組換ウイルスベクターは、ＨＨＶ−７由来の組換ウイルスベクターであって、ＨＨＶ−７のＵ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ２４、Ｕ２４aまたはＵ２５領域からなる群より選ばれる少なくとも１領域に相当する部位に、外因性ヌクレオチド配列を備える、組換ウイルスベクターであってもよい。
【００３６】
ここで、この部位は、配列番号２で表されるＨＨＶ−７のＤＮＡ配列におけるヌクレオチド番号１０５５８〜１８４８３または３４７４４〜３６１１８の範囲に存在することが好ましい。また、本発明の組換ウイルスベクターは、組換ウイルスＨ７Ｒ２８またはＨ７Ｒ２４−２５からなることが望ましい。
【００３７】
そして、この外因性ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列および／またはＲＮＡ配列であってもよい。
【００３８】
また、この外因性ヌクレオチド配列は、ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  （ＢＡＣ）、サイトカイン遺伝子、リボザイム、ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ、免疫学的補助刺激分子、シグナル伝達分子、酵素および化学誘引物質からなる群より選ばれる１種以上をコードするヌクレオチド配列であってもよい。
【００３９】
さらに、この外因性ヌクレオチド配列は、哺乳類の遺伝子治療に用いられるための配列であってもよい。そして、この外因性ヌクレオチド配列は、マーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。
【００４０】
本発明の組換ウイルスベクターの製造方法は、ＨＨＶ−６由来の組換ウイルスベクターの製造方法であって、ＨＨＶ−６のＵ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ２４およびＵ２５領域からなる群より選ばれる少なくとも１領域に相当する部位に、外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップを備える、組換ウイルスベクターの製造方法である。
【００４１】
ここで、この外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップは、配列番号１で表されるＨＨＶ−６のＤＮＡ配列におけるヌクレオチド番号９０４１〜１７４４６または３６２５０〜３７７７５の範囲に外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップを含むことが好ましい。
【００４２】
また、この外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップは、それぞれ配列番号３−４および５−６に示す配列のプライマーの組合せまたは配列番号３６−３７および３８−３９に示す配列のプライマーの組合せを用いて増幅されるＤＮＡ配列と、ＨＨＶ−６のＤＮＡ配列との相同組換を行なうステップを含んでもよい。
【００４３】
そして、本発明の組換ウイルスベクターの製造方法は、ＨＨＶ−７由来の組換ウイルスベクターの製造方法であって、ＨＨＶ−７のＵ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ２４、Ｕ２４aまたはＵ２５領域からなる群より選ばれる少なくとも１領域に相当する部位に、外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップを備える、組換ウイルスベクターの製造方法であってもよい。
【００４４】
ここで、この外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップは、配列番号２で表されるＨＨＶ−７のＤＮＡ配列におけるヌクレオチド番号１０５５８〜１８４８３または３４７４４〜３６１１８の範囲に外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップを含んでもよい。
【００４５】
また、この外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップは、それぞれ配列番号３０−３１および３４−３５に示す配列のプライマーの組合せまたは配列番号４０−４１および４２−４３に示す配列のプライマーの組合せを用いて増幅されるＤＮＡ配列と、ＨＨＶ−７のＤＮＡ配列との相同組換を行なうステップを含んでもよい。
【００４６】
また、この外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップは、正常かつ／または臍帯血由来の細胞内においてこの外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップを含んでもよい。
【００４７】
そして、本発明の宿主細胞の形質転換方法は、上記の組換ウイルスベクターによる哺乳類の宿主細胞の形質転換方法であって、この組換ウイルスベクターにより、ヒト、ヒト以外の霊長類およびＨＨＶ−６またはＨＨＶ−７の感染可能な宿主からなる群より選ばれる１種以上の哺乳類由来のこの宿主細胞を形質転換するステップを備える、宿主細胞の形質転換方法である。
【００４８】
ここで、この形質転換するステップは、この組換ウイルスベクターにより、Ｔ細胞、マクロファージ、末梢血単核球細胞、血液幹細胞、肝細胞、血管内皮細胞、繊維芽細胞、グリア細胞、アストロサイト、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、樹状細胞およびナチュラルキラー細胞からなる群より選ばれる１種以上のこの宿主細胞を形質転換するステップを含んでもよい。
【００４９】
そして、本発明の形質転換宿主細胞は、上記の宿主細胞の形質転換方法により得られる、形質転換宿主細胞である。また、本発明の形質転換宿主細胞は、哺乳類の遺伝子治療方法に用いられてもよい。
【００５０】
さらに、この遺伝子治療は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する易感染性細胞内におけるＨＩＶウイルス感染を予防するための遺伝子治療および／または癌の免疫治療のための遺伝子治療であってもよい。また、この宿主細胞は、この遺伝子治療を行なう対象となる種類の哺乳類と同種の哺乳類由来の宿主細胞であってもよい。
【００５１】
そして、本発明の遺伝子治療方法は、ヒト以外の哺乳類の遺伝子治療方法であって、上記の形質転換細胞をこの哺乳類へ投与するステップを備える、遺伝子治療方法である。
【００５２】
あるいは、本発明の遺伝子治療方法は、ヒト以外の哺乳類の遺伝子治療方法であって、上記の組換ウイルスベクターにより、この哺乳類の体内の宿主細胞を０．０１〜２０の感染多重度（ＭＯＩ）で形質転換するステップを備える、遺伝子治療方法であってもよい。
【００５３】
また、本発明の遺伝子治療方法は、さらにこの組換ウイルスベクターに備わる外因性ヌクレオチド配列にコードされる遺伝子を発現させるステップを備えてもよい。
【００５４】
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
以下、実施の形態を示して本発明をより詳細に説明する。
【００５６】
＜定義＞
本明細書において、ＨＨＶ−６とは、ヒトヘルペスウイルス６（Ｈｕｍａｎ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ６）のｖａｒｉａｎｔ  ＡおよびＢを意味するものとする。
【００５７】
本明細書において、ＨＨＶ−７とは、ヒトヘルペスウイルス７（Ｈｕｍａｎ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ７）を意味するものとする。
【００５８】
本明細書において、組換ウイルスおよび組換ウイルスベクターとは、ウイルス遺伝子に外来遺伝子を組み込んだもので、宿主細胞に感染させた時に、増殖性感染、潜伏感染及び/または再活性化、流産感染のいずれかの状態をとるものとする。
【００５９】
本明細書において、欠失可能領域とは、欠失してもウイルスの増殖性が完全には失われないウイルス遺伝子上の領域を意味するものとする。
【００６０】
本明細書において、外因性ヌクレオチド配列とは、本来そこに存在するべきウイルス遺伝子以外の核酸の配列を意味するものとする。
【００６１】
本明細書において、潜伏感染とは、ウイルスがウイルス遺伝子を保持したまま、感染性のウイルスの産生を停止することを意味するものとする。
【００６２】
本明細書において、感染とは、ウイルスが細胞内に進入することを指し、増殖感染、潜伏感染、流産感染を含むことを意味する。
【００６３】
本明細書において、流産感染とは、細胞内に進入したウイルスが、感染性のウイルスを産生しない状態で、ウイルス遺伝子を積極的には保持しない状態を意味する。
【００６４】
本明細書において、遺伝子治療とは、外来遺伝子を細胞内に導入することによって、細胞の形質を転換することによる治療を指し、体外に取出した細胞を遺伝子導入によって形質転換した後に、生体に戻す狭義の細胞治療や、感染性のウイルスを体内の細胞に感染させて、産生されたウイルスによる宿主細胞の修飾を期待する狭義のウイルス治療を含むことを意味する。
【００６５】
＜ＨＨＶ−６由来の組換ウイルスおよび組換ウイルスベクター＞
本発明の組換ウイルスおよび組換ウイルスベクターは、ＨＨＶ−６由来の組換ウイルスおよび組換ウイルスベクターであって、ＨＨＶ−６のＵ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ２４およびＵ２５領域からなる群より選ばれる少なくとも１領域に相当する部位に、外因性ヌクレオチド配列を備える、組換ウイルスおよび組換ウイルスベクターである。
【００６６】
ＨＨＶ−６のＵ２は、配列番号１に示すＨＨＶ−６のヌクレオチド番号１０７６８（開始）〜９４６７（終了）にコードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、ＨＣＭＶのＵＳ２２遺伝子ファミリーと共通のモチーフをもつ。
【００６７】
ＨＨＶ−６のＵ３は、配列番号１に示すＨＨＶ−６のヌクレオチド番号１２０５１（開始）〜１０８９１（終了）にコードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、ＨＣＭＶのＵＳ２２遺伝子ファミリーと共通のモチーフをもつ。
【００６８】
ＨＨＶ−６のＵ４は、配列番号１に示すＨＨＶ−６のヌクレオチド番号１３８８３（開始）〜１２２７６（終了）にコードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、機能は未知である。
【００６９】
ＨＨＶ−６のＵ５は、配列番号１に示すＨＨＶ−６のヌクレオチド番号１５３３３（開始）〜１４００２（終了）にコードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、機能は未知である。
【００７０】
ＨＨＶ−６のＵ６は、配列番号１に示すＨＨＶ−６のヌクレオチド番号１５３９５（開始）〜１５６５２（終了）にコードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、機能は未知である。
【００７１】
ＨＨＶ−６のＵ７は、配列番号１に示すＨＨＶ−６のヌクレオチド番号１６８０２（開始）〜１５６７８（終了）にコードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、ＨＣＭＶのＵＳ２２遺伝子ファミリーと共通のモチーフをもつ。
【００７２】
ＨＨＶ−６のＵ８は、配列番号１に示すＨＨＶ−６のヌクレオチド番号１８０４１（開始）〜１６８０６（終了）にコードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、ＨＣＭＶのＵＳ２２遺伝子ファミリーと共通のモチーフをもつ。
【００７３】
ＨＨＶ−６のＵ２４は、配列番号１に示すＨＨＶ−６のヌクレオチド番号３６６１６（開始）〜３６３５０（終了）にコードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、機能は未知である。
【００７４】
ＨＨＶ−６のＵ２５は、配列番号１に示すＨＨＶ−６のヌクレオチド番号３８７７０（開始）〜３７８８３（終了）にコードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、ＨＣＭＶのＵＳ２２遺伝子ファミリーと共通のモチーフをもつ。
【００７５】
ここで、ＨＨＶ−６の上記の部位は、配列番号１で表されるＨＨＶ−６のＤＮＡ配列におけるヌクレオチド番号９０４１〜１７４４６または３６２５０〜３７７７の範囲に存在する部位であってもよい。後述する実施例において欠失可能であることが示唆されているＨＨＶ−６のＵ２〜Ｕ８がヌクレオチド番号９０４１〜１７４４６の範囲に含まれ、Ｕ２４〜Ｕ２５がヌクレオチド番号３６２５０〜３７７７の範囲に含まれるからである。
【００７６】
また、ＨＨＶ−６の上記の部位は、配列番号１で表されるＨＨＶ−６のＤＮＡ配列におけるヌクレオチド番号１０２１６〜１６５４７または３６２５０〜３７７７５の範囲に存在する部位であってもよい。この範囲については、後述する実施例において前者は欠失可能である事が、後者は組み換え可能であることが実験的に確認されているからである。
【００７７】
これらの部位に存在する制限酵素切断部位を適当な条件のもと市販の制限酵素にて切断し、相補的な末端配列を有する外因性ヌクレオチドと混合して市販のリガーゼにより適当な条件でライゲーションすることにより、これらの部位に容易に所望の外因性ヌクレオチドを挿入することができる。
【００７８】
なお、ＵＳ２２ファミリー遺伝子の機能は、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７と同じβ−ヘルペスウイルスに属するヒトサイトメガロウイルスやマウスサイトメガロウイルスに関しては、少し判っているが、ＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７に関しては全く未知である。このため、ＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７のＵＳ２２ファミリー遺伝子についての増殖や潜伏に関する機能は本発明においてはじめて機能解析が試みられたものである。
【００７９】
また、ＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７のＵＳ２２ファミリー遺伝子は、機能などが確定していないアミノ酸配列上の仮想的なモチーフを用いた分類に過ぎず、このファミリーに属することから、何らかの機能が予測されるわけではない。さらに、ＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７とサイトメガロウイルスなどの相同するタンパク質に高いアミノ酸ホモロジーの存在も認められない。
【００８０】
＜ＨＨＶ−７由来の組換ウイルスおよび組換ウイルスベクター＞
本発明の組換ウイルスおよび組換ウイルスベクターは、ＨＨＶ−７由来の組換ウイルスおよび組換ウイルスベクターであって、ＨＨＶ−７のＵ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ２４、Ｕ２４ａおよびＵ２５領域からなる群より選ばれる少なくとも１領域に相当する部位に、外因性ヌクレオチド配列を備える、組換ウイルスおよび組換ウイルスベクターであってもよい。
【００８１】
ＨＨＶ−７のＵ２は、配列番号２に示すＨＨＶ−７のヌクレオチド番号１１６３７（開始）〜１０５５８（終了）にコードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、ＨＣＭＶのＵＳ２２遺伝子ファミリーである。
【００８２】
ＨＨＶ−７のＵ３は、配列番号２に示すＨＨＶ−７のヌクレオチド番号１２９５３（開始）〜１１７９９（終了）にコードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、ＨＣＭＶのＵＳ２２遺伝子ファミリーである。
【００８３】
ＨＨＶ−７のＵ４は、配列番号２に示すＨＨＶ−７のヌクレオチド番号１４６０３（開始）〜１２９７５（終了）にコードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、Ｕ７のエキソン２と関連のある遺伝子である。
【００８４】
ＨＨＶ−７のＵ７のエキソン１（別名Ｕ５）は、配列番号２に示すＨＨＶ−７のヌクレオチド番号１７３２４（開始）〜１６３４８（終了）にコードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、ＨＣＭＶのＵＳ２２遺伝子ファミリーと共通のモチーフをもつ。
【００８５】
ＨＨＶ−７のＵ７のエキソン２（別名Ｕ７）は、配列番号２に示すＨＨＶ−７のヌクレオチド番号１６２６６（開始）〜１４６２８（終了）にコードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、Ｕ４と関連のある遺伝子である。
【００８６】
ＨＨＶ−７のＵ２４は、配列番号２に示すＨＨＶ−７のヌクレオチド番号３４９９２（開始）〜３４７４４（終了）にコードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、機能不明である。
【００８７】
ＨＨＶ−７のＵ２４ａは、配列番号２に示すＨＨＶ−７のヌクレオチド番号３５１６６（開始）〜３４９９６（終了）にコードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、機能不明である。
【００８８】
ＨＨＶ−６のＵ２５は、配列番号２に示すＨＨＶ−７のヌクレオチド番号３６１１８（開始）〜３５１５６（終了）にコードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、ＨＣＭＶのＵＳ２２遺伝子と共通のモチーフをもつ。
【００８９】
ここで、ＨＨＶ−７の上記の部位は、配列番号２で表されるＨＨＶ−７のＤＮＡ配列におけるヌクレオチド番号１０５５８〜１８４８３または３４７４４〜３６１１８の範囲に存在する部位であってもよい。後述する実施例において欠失可能であることが示唆されているＨＨＶ−７のＵ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ７およびＵ８がヌクレオチド番号１０５５８〜１８４８３の範囲に含まれ、Ｕ２４、Ｕ２４ａおよびＵ２５がヌクレオチド番号３４７４４〜３６１１８の範囲に含まれるからである。
また、ＨＨＶ−７の上記の部位は、配列番号２で表されるＨＨＶ−７のＤＮＡ配列におけるヌクレオチド番号１１６３１〜１７２２１または３４７４４〜３６１１８の範囲に存在する部位であってもよい。この範囲については、後述する実施例において前者は欠失可能である事が、後者は組み換え可能であることが実験的に確認されているからである。
【００９０】
これらの部位に存在する制限酵素切断部位を適当な条件のもと市販の制限酵素にて切断し、相補的な末端配列を有する外因性ヌクレオチドと混合して市販のリガーゼにより適当な条件でライゲーションすることにより、これらの部位に容易に所望の外因性ヌクレオチドを挿入することができる。
【００９１】
＜外因性ヌクレオチド配列＞
上記の外因性ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列および／またはＲＮＡ配列であってもよい。ＤＮＡ配列はゲノムＤＮＡ配列であってもよく、ｃＤＮＡ配列であってもよい。
【００９２】
さらに、この外因性ヌクレオチド配列は、ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  （ＢＡＣ）、サイトカイン遺伝子、リボザイム、ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ、免疫学的補助刺激分子および化学誘引物質からなる群より選ばれる１種以上をコードするヌクレオチド配列であってもよい。
【００９３】
そして、この外因性ヌクレオチド配列は、哺乳類の遺伝子治療に用いられるための配列であってもよい。また、この外因性ヌクレオチド配列は、哺乳類の腫瘍治療および／または免疫治療において有用な免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列であってもよい。
【００９４】
さらに、この外因性ヌクレオチド配列は、マーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。そして、このマーカー遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子であってもよい。
【００９５】
＜組換ウイルスおよび組換ウイルスベクターの製造方法＞
本発明の組換ウイルスおよび組換ウイルスベクターの製造方法は、ＨＨＶ−６由来の組換ウイルスおよび組換ウイルスベクターの製造方法であって、ＨＨＶ−６のＵ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ２４およびＵ２５領域からなる群より選ばれる少なくとも１領域に相当する部位に、外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップを備える、組換ウイルスおよび組換ウイルスベクターの製造方法である。
【００９６】
ここで、上記の外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップは、上記の部位に存在する制限酵素切断部位を適当な条件のもと市販の制限酵素にて切断するステップと、上記のようにして切断されたウイルスベクターを相補的な末端配列を有する外因性ヌクレオチドと混合して市販のリガーゼにより適当な条件でライゲーションするステップと、を含むことが好ましい。このようにして市販の制限酵素およびリガーゼにより、これらの部位に容易に所望の外因性ヌクレオチドを挿入することができるからである。
【００９７】
ここで、この外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップは、配列番号１で表されるＨＨＶ−６のＤＮＡ配列におけるヌクレオチド番号９０４１〜１７４４６または３６２５０〜３７７７５の範囲にこの外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップを含んでもよい。後述する実施例において欠失可能であることが示唆されているＨＨＶ−６のＵ２〜Ｕ８がヌクレオチド番号９０４１〜１７４４６の範囲に含まれ、Ｕ２４〜Ｕ２５がヌクレオチド番号３６２５０〜３７７７５の範囲に含まれるからである。
【００９８】
また、この外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップは、配列番号１で表されるＨＨＶ−６のＤＮＡ配列におけるヌクレオチド番号１０２１６〜１６５４７または３６２５０〜３７７７５の範囲にこの外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップを含んでもよい。この範囲については、後述する実施例において前者が欠失可能で後者が組み換え可能であることが実験的に確認されているからである。
【００９９】
また、この外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップは、それぞれ表１に示す配列番号３−４および５−６に示す配列のプライマーの組合せまたは配列番号３６−３７および３８−３９に示す配列のプライマーの組合せを用いて増幅されるＤＮＡ配列と、ＨＨＶ−６のＤＮＡ配列との相同組換を行なうステップを含んでもよい。
【０１００】
【表１】
2007159586.tif 000003
【０１０１】
本発明の組換ウイルスおよび組換ウイルスベクターの製造方法は、ＨＨＶ−７由来の組換ウイルスおよび組換ウイルスベクターの製造方法であって、ＨＨＶ−７のＵ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ２４、Ｕ２４ａおよびＵ２５領域からなる群より選ばれる少なくとも１領域に相当する部位に、外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップを備える、組換ウイルスおよび組換ウイルスベクターの製造方法であってもよい。
【０１０２】
ここで、上記の外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップは、上記の部位に存在する制限酵素切断部位を適当な条件のもと市販の制限酵素にて切断するステップと、上記のようにして切断されたウイルスベクターを相補的な末端配列を有する外因性ヌクレオチドと混合して市販のリガーゼにより適当な条件でライゲーションするステップと、を含むことが好ましい。このようにして市販の制限酵素およびリガーゼにより、これらの部位に容易に所望の外因性ヌクレオチドを挿入することができるからである。
【０１０３】
ここで、この外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップは、配列番号２で表されるＨＨＶ−７のＤＮＡ配列におけるヌクレオチド番号１０５５８〜１８４８３または３４７４４〜３６１１８の範囲に外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップを含んでもよい。後述する実施例において欠失可能であることが示唆されているＨＨＶ−７のＵ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ７およびＵ８がヌクレオチド番号１０５５８〜１８４８３の範囲に含まれ、Ｕ２４、Ｕ２４ａおよびＵ２５がヌクレオチド番号３４７４４〜３６１１８の範囲に含まれるからである。
【０１０４】
また、この外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップは、配列番号２で表されるＨＨＶ−７のＤＮＡ配列におけるヌクレオチド番号１１６３〜１７２２１または３４７４４〜３６１１８の範囲にこの外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップを含んでもよい。この範囲については、後述する実施例において前者が欠失可能で後者が組み換え可能であることが実験的に確認されているからである。
【０１０５】
なお、この外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップは、正常かつ／または臍帯血由来の細胞内において前記外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップを含んでもよい。ここで、従来公知の組換ウイルスベクターの構築に用いられるアデノウイルスは、腎臓の癌細胞由来のＨＥＫ２９３という細胞株内でなければ組換ウイルスの構築が困難であるという欠点を有するが、本発明の組換ウイルスベクターは、正常細胞内において、好ましくは正常な臍帯血由来の細胞内において構築することができるという利点がある。
【０１０６】
＜宿主細胞の形質転換方法＞
本発明の宿主細胞の形質転換方法は、上記の組換ウイルスおよび組換ウイルスベクターによる哺乳類の宿主細胞の形質転換方法であって、上記の組換ウイルスおよび組換ウイルスベクターにより上記の宿主細胞を０．０１〜２０の感染多重度（ＭＯＩ）で形質転換するステップを備える、宿主細胞の形質転換方法である。
【０１０７】
ここで、この形質転換するステップは、上記の組換ウイルスおよび組換ウイルスベクターにより、ヒト、ヒト以外の霊長類およびＨＨＶ−６またはＨＨＶ−７の感染可能な宿主からなる群より選ばれる１種以上の哺乳類由来の宿主細胞を形質転換するステップを含んでもよい。
【０１０８】
また、この形質転換するステップは、上記の組換ウイルスおよび組換ウイルスベクターにより、Ｔ細胞、マクロファージ、末梢血単核球細胞、血液幹細胞、肝細胞、血管内皮細胞、繊維芽細胞、グリア細胞、アストロサイト、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、樹状細胞およびナチュラルキラー細胞からなる群より選ばれる１種以上のこの宿主細胞を形質転換するステップを含んでもよい。
ここで、これらの細胞は、従来のベクターでは導入効率や発現などに問題があったが、本発明の組換ウイルスベクターを用いることにより、これらの細胞にも外来遺伝子を導入して発現させることが可能になる利点がある。
【０１０９】
さらに、この形質転換するステップは、宿主の体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）または体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）であってもよい。
【０１１０】
＜形質転換宿主細胞＞
本発明の形質転換宿主細胞は、上記の宿主細胞の形質転換方法により得られる形質転換宿主細胞である。
【０１１１】
ここで、本発明の形質転換宿主細胞は、哺乳類の遺伝子治療方法に用いられてもよい。また、この遺伝子治療は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する易感染性細胞内におけるＨＩＶウイルス感染を予防するための遺伝子治療および／または癌の免疫治療のための遺伝子治療であってもよい。
【０１１２】
さらに、この宿主細胞は、この遺伝子治療を行なう対象となる種類の哺乳類と同種の哺乳類由来の宿主細胞であってもよい。
【０１１３】
＜遺伝子治療方法＞
本発明の遺伝子治療方法は、ヒト以外の哺乳類の遺伝子治療方法であって、上記の形質転換細胞をこの哺乳類へ投与するステップを備える、遺伝子治療方法である。
【０１１４】
本発明の遺伝子治療方法は、遺伝子治療をはじめウイルス治療および細胞治療方法であってもよい。細胞治療とは、遺伝子導入によって形質転換した細胞を患者に投与する治療方法である。ウイルス治療とは、感染性があって、ヒトの体内で増殖することを前提としたウイルスを患者に投与する治療方法である。
【０１１５】
本発明の遺伝子治療方法は、ヒト以外の哺乳類の遺伝子治療方法であって、上記の組換ウイルスおよび組換ウイルスベクターにより、この哺乳類の体内の宿主細胞を０．０１〜２０の感染多重度（ＭＯＩ）で形質転換するステップを備える、遺伝子治療方法であってもよい。
【０１１６】
本発明の遺伝子治療方法は、さらにこの組換ウイルスおよび組換ウイルスベクターに備わる外因性ヌクレオチド配列にコードされる遺伝子を発現させるステップを備えてもよい。
【０１１７】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１１８】
なお、下記の実施例は、インフォームド・コンセントの条件を満たした上で、本研究に参加している献血者から得られた試料を用いて実施した。
【０１１９】
＜ＨＨＶ−６の組換ウイルスベクターＨ６Ｒ２８の構築＞
ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）のＵ３−Ｕ７遺伝子クラスターを、ヒトサイトメガロウイルスの主要な即時型エンハンサー−プロモーター（ＭＩＥＰ）の制御下にある増強された緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＥＧＦＰ）と、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下にあるピューロマイシン耐性遺伝子と、を含む遺伝子カセット（ＥＧＦＰ−ｐｕｒｏカセット）に置換した、組換えウイルスＨ６Ｒ２８を構築した。相同組換によってＥＧＦＰ−ｐｕｒｏカセットをＨＨＶ−６ゲノムに挿入するために、ウイルスのゲノムの約１キロベース（ｋｂ）の部分がカセット（図１）のそれぞれの末端に挿入された。
【０１２０】
続いて、次の遺伝子クラスターについて調査した：ウイルスのゲノムで繰返し存在するＤＲ２−ＤＲ７遺伝子、Ｕ９５、ウイルスの複製において欠失可能であることが知られているｍｕｒｉｎｅサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）の即時型（ＩＥ）２遺伝子の位置の同族体およびＵ３−Ｕ７遺伝子である。それらの遺伝子について、本発明者は、Ｕ３−Ｕ７遺伝子をＥＧＦＰ−ｐｕｒｏに置換しても複製能を有するウイルスが得られることに気付いた。
【０１２１】
以下に具体的な構築手順を説明する。
【０１２２】
図１は、組換えウイルスＨ６Ｒ２８の構造を表わす模式図である。
【０１２３】
図１においては、最上部にＨＨＶ−６Ｂ  ＨＳＴ株ゲノムの地図を示し、その下（中段）にＵ１−Ｕ９領域を拡大して示している。
【０１２４】
中段に灰色三角印で示されたＵ３−Ｕ７のＯＲＦをＥＧＦＰ−ｐｕｒｏカセットによって置換したものがＨ６Ｒ２８である。
【０１２５】
下段は、ＥＧＦＰ−ｐｕｒｏカセットの両端に相同組換えに利用するＵ２ＤＮＡ断片およびＵ８ＤＮＡ断片を挿入した相同組換え用プラスミドｐＵ２−Ｕ８  ＥＧＦＰ−ｐｕｒｏを表す。
【０１２６】
左右向きの短い矢印はプライマーのアニーリング位置を示し、上下向きの短い矢印は制限酵素認識部位を示す。破線の矢印は増幅断片または消化された断片の大きさを表す。
【０１２７】
ＥＧＦＰ−ｐｕｒｏカセットのＥＧＦＰ遺伝子およびＭＩＥＰは、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）のヌクレオチド番号８〜１６４０に由来する。ＰｓｔＩサイトを含むｐＥＧＦＰ−Ｃ１のマルチクローニングサイトは除去されている。
【０１２８】
ＥＧＦＰ−ｐｕｒｏカセットのピューロマイシン−Ｎ−アセチル−転移酵素遺伝子（ｐａｃ）とＳＶ４０即時型プロモーター遺伝子は、ｐＰＵＲ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）のヌクレオチド番号−４０８〜１３９２に由来する。
【０１２９】
まず、プライマーＵ２  ＸｂａＩとＵ２  ＡｆｌＩＩとを用いたＰＣＲによりＵ２遺伝子を増幅し、プライマーＵ８  ＢａｍＨＩとＵ８  ＥｃｏＲＩとを用いたＰＣＲによりＵ８遺伝子を増幅した。増幅断片を制限酵素処理した後、それぞれＥＧＦＰ−ｐｕｒｏカセットの両端に挿入し、ｐＵ２−Ｕ８  ＥＧＦＰ−ｐｕｒｏを構築した。
【０１３０】
上記ｐＵ２−Ｕ８  ＥＧＦＰ−ｐｕｒｏをフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）で刺激した末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣｓ）中に導入した。プラスミドの導入は、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＴＭ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ）を用い、推奨されるプロトコールにしたがって行った。
【０１３１】
すなわち、５×１０6個の細胞を、プラスミド５μｇおよびＴ細胞用Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ＴＭ）溶液１００μｌと混和し、プログラムＵ−１４を用いたＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ＴＭ）によりエレクトロポレーションを行った。
【０１３２】
同時に、従来のエレクトロポレーション法も実施した。すなわち、１×１０7個の細胞と５００μｌのＫ−ＰＢＳ溶液（３０．８ｍＭのＮａＣｌ、１２０．７ｍＭのＫＣｌ、８．１ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、１．４６ｍＭのＫＨ2ＰＯ4および２５ｍＭのＭｇＣｌ2）中に懸濁した５０μｇのプラスミドと混合し、混合液をエレクトロポレーションキュベット（ジーンパルサーキュベット  ０．４ｃｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）内に入れた。
【０１３３】
エレクトロポレーションは、ジーンパルサーＩＩ  エレクトロポレーションシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、抵抗無限大、電圧３００Ｖ、キャパシタンス９６０μＦ以下の条件下で行った。６時間後に、ＨＳＴ株のＨＨＶ−６ｖａｒｉａｎｔＢを、染多重度（ＭＯＩ）０．５で遠心法により細胞に感染させた。
【０１３４】
１０％牛胎児血清を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地で、３日間、細胞を培養し、ウイルスストックとして凍結した。組換ウイルスを増やすために、ＰＨＡで刺激した臍帯血単核細胞（ＣＢＭＣｓ）に上記ウイルスストックを感染させて１日間培養し、７．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンで１日間処理し、培地で洗浄し、３日間ＣＢＭＣｓと一緒に培養した。感染細胞を新たなウイルスストックとして凍結した。
【０１３５】
この選択処理を５回繰り返し、その後、９６穴のプレートで培養されたＣＢＭＣｓを使って、限界希釈培養法により組換ウイルス（Ｈ６Ｒ２８）をクローン化した。
【０１３６】
＜ＨＨＶ−６の組換えウイルスベクターＨ６Ｒ２８構築の確認＞
予想される領域の中にＥＧＦＰ−ｐｕｒｏカセットが挿入されたことを確認するために、相同ヒンジ領域の外側の領域に設計されたプライマー（外側のプライマーセット：Ｕ２Ｒ２−Ｕ８Ｆ２、内側のプライマーセット：Ｕ２Ｒ１−Ｕ８Ｆ１、図１参照）を用いて、二重ネストＰＣＲによりウイルスのＤＮＡを増幅した。ＰＣＲにはＫＯＤプラスＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）を用いた。
【０１３７】
増幅産物を電気泳動に供した。ゲルは０．６％アガロースゲルを用いた。結果を図２（Ａ）に示した。野生型ウイルス（ｗｔ）の増幅産物は約８．５ｋｂであり（レーン１）、期待値（図中の白色矢印）と一致した。また、Ｈ６Ｒ２８の増幅産物は約５．０ｋｂであり（レーン２）、期待値（図中の黒色矢印）と一致した。なお、Ｈ６Ｒ２８の３つのクローンにおいて約５．０ｋｂの増幅産物が観察された。
【０１３８】
増幅断片は、部分的な配列決定によって確認された（資料を示さない）。組換ウイルス（Ｈ６Ｒ２８）において８．５ｋｂの増幅産物が検出されなかったことから、組換ウイルス（Ｈ６Ｒ２８）に野生型ウイルスが混入していないことが示された。
【０１３９】
上記増幅産物を制限酵素（ＰｓｔＩ、ＡｆｌＩＩおよびＢａｍＨＩ、図１参照）で消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動に供した。結果を図２（Ｂ）に示した。図中左端の白色矢印は野生型ウイルスの消化断片の期待されるサイズを示す。図中右端の黒色矢印はＨ６Ｒ２８の消化断片の期待されるサイズを示す。図２（Ｂ）から明らかなように野生型ウイルス（レーン３）およびＨ６Ｒ２８（レーン４〜６）のいずれも期待されるサイズのバンドが検出された。
【０１４０】
次に、ＥＧＦＰ−ｐｕｒｏカセットの挿入部位を確認した。すなわち、Ｈ６Ｒ２８のＤＮＡを鋳型としてプライマーＵ２Ｒ１−ＥＧＦＰｐｒｉｍおよびプライマーＵ８Ｆ１−ＰＡＣｐｒｉｍを用いてそれぞれＰＣＲを行い、増幅産物を１．０％アガロースゲル電気泳動に供した。
【０１４１】
結果を図２（Ｃ）に示した。図中右端の黒色矢印は、プライマーＵ２Ｒ１−ＥＧＦＰｐｒｉｍにより増幅される断片の期待されるサイズ（１５８２ｂｐ）およびプライマーＵ８Ｆ１−ＰＡＣｐｒｉｍにより増幅される断片の期待されるサイズ（１７６０ｂｐ）を示す。図２（Ｃ）から明らかなように、プライマーＵ２Ｒ１−ＥＧＦＰｐｒｉｍにより増幅された断片（レーン１）およびプライマーＵ８Ｆ１−ＰＡＣｐｒｉｍにより増幅された断片（レーン２）とも期待されるサイズのバンドが検出された。
【０１４２】
さらに、Ｕ３〜Ｕ７遺伝子の異所性の発現の可能性を検討した。すなわち、ＥＧＦＰ−ｐｕｒｏカセットと置換されて欠失していると考えられるＵ３〜Ｕ７遺伝子のそれぞれのＯＲＦの増幅を試みた。Ｕ３の増幅にはプライマーペアＵ３Ｆ１−Ｕ３Ｒ１、Ｕ４の増幅にはプライマーペアＵ４Ｆ１−Ｕ４Ｒ１、Ｕ５の増幅にはプライマーペアＵ５Ｆ１−Ｕ５Ｒ１、Ｕ６の増幅にはプライマーペアＵ６Ｆ１−Ｕ６Ｒ１、Ｕ７の増幅にはプライマーペアＵ７Ｆ１−Ｕ７Ｒ１をそれぞれ用いて、野生型ウイルスのＤＮＡまたはＨ６Ｒ２８のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、１．０％アガロースゲル電気泳動に供した。
【０１４３】
結果を図２（Ｄ）に示した。図中左右端の黒色矢印は、各プライマーペアにより増幅される断片の期待されるサイズを示す。Ｕ３Ｆ−Ｕ３Ｒの大きさは、１１６１ｂｐであり、Ｕ４Ｆ−Ｕ４Ｒの大きさは、１３３８ｂｐであり、Ｕ５Ｆ−Ｕ５Ｒの大きさは、１２７５ｂｐであり、Ｕ６Ｆ−Ｕ６Ｒの大きさは、１７１ｂｐであり、Ｕ７Ｆ−Ｕ７Ｒの大きさは、１０９４ｂｐである。
【０１４４】
図２（Ｄ）から明らかなように、野生型ウイルス（レーン１〜５）では、各プライマーペアによりそれぞれ期待されるサイズの断片が増幅されたが、Ｈ６Ｒ２８（レーン６〜１０）では、増幅断片が検出されなかった。
【０１４５】
＜ＨＨＶ−６の組換えウイルスベクターＨ６Ｒ２８の増殖感染＞
本発明者は、独立した３つの個別のエレクトロポレーションにより３つの個別のＨ６Ｒ２８を作出して、ＣＢＭＣｓで複製の動態を調べた。前述のように、ウイルス力価の測定はＣＢＭＣｓを用いてＡｓａｄａらの方法（H. Asada, et. al, J. Clin. Microbiol. 27:2204-2207, 1989）により行われた。ＣＢＭＣｓにＭＯＩ０．０５の条件で感染させると、３つのＨ６Ｒ２８クローンとｗｔウイルスとはウイルスの感染の拡大（図３（Ａ））およびウイルス生産（図３（Ｂ））が、長い時間にわたって類似の水準であった。
【０１４６】
図３は、Ｈ６Ｒ２８の生産的感染を表わすグラフ図である。
【０１４７】
図３（Ａ）は、ｗｔウイルスとＨ６Ｒ２８に感染している細胞の増殖速度を示す。ＣＢＭＣ細胞は、感染多重度（ＭＯＩ）０．０５において、ｗｔウイルスまたはＨ６Ｒ２８の３つの独立したクローンに、組織培養感染投与量５０（ＴＣＩＤ５０）／細胞の量で投与されて感染した。そして、糖タンパク質Ｂと糖タンパク質Ｈに対するモノクローナル抗体の混合液に反応している細胞の存在割合は、モノクローナル抗体を使って免疫蛍光抗体（ＩＦＡ）染色によって決定された。ｗｔ（○）、Ｈ６Ｒ２８クローン１（黒三角印）、クローン２（●）、クローン３（黒四角印）に感染している細胞の存在割合を示す。３回の繰返し培養の平均値が示される。
【０１４８】
図３（Ｂ）は、ｗｔウイルスとＨ６Ｒ２８の増殖曲線を示す。
【０１４９】
ＣＢＭＣｓは、上述のように感染させられ、感染細胞が示された時間に回収されて−８０℃で凍結された。子孫ウイルスは、ＣＢＭＣｓにおいてＩＦＡ染色を使って力価測定した。ウイルス力価は、１ミリリットルあたりのＴＣＩＤ５０として示された。ｗｔ（□）、Ｈ６Ｒ２８クローン１（黒三角印）、クローン２（●）およびクローン３（黒四角印）で感染した細胞における力価を示す。０日目における値が投与されたウイルスの力価を表す。３回の繰返し培養の平均値が示される。
【０１５０】
図３（Ａ）および図３（Ｂ）に示した結果から、Ｈ６Ｒ２８は野生型ウイルスと同等の増殖能力を保持していることが明らかとなった。すなわち、Ｕ２〜Ｕ８の部位に外来遺伝子を挿入してもウイルスの増殖に影響を及ぼさないことが示された。
【０１５１】
＜ＨＨＶ−６の組換ウイルスベクターＨ６Ｒ２４−２５の構築＞
ＨＨＶ−６のＵ２４とＵ２５を組み換え部位に使用した組み換えウイルスＨ６Ｒ２４−２５を構築した。
【０１５２】
図４は、組換えウイルスＨ６Ｒ２４−２５の構造を表わす模式図である。
【０１５３】
図４においては、最上部にＨＨＶ−６ＢＨＳＴゲノムの地図を示し、その下（中段）にＵ２４−Ｕ２５領域を拡大して示している。
【０１５４】
下段は、ＥＧＦＰ−ｐｕｒｏカセットの両端に相同組換えに利用するＵ２４ＤＮＡ断片およびＵ２５ＤＮＡ断片を挿入した相同組換え用プラスミドｐＨＨＶ−６  Ｕ２４−Ｕ２５  ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏを表す。
【０１５５】
左右向きの短い矢印はプライマーのアニーリング位置を示す。
【０１５６】
図中の数字36250, 36980, 37775は、ＨＨＶ−６ＨＳＴ株の塩基の番号を示す。
【０１５７】
前記の組換ウイルスＨ６Ｒ２８よりも短い組換え部位に遺伝子を挿入するために、ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ）を用いて挿入遺伝子を小型化した。
【０１５８】
構築手順は、相同組換えに利用するＵ２４−Ｕ２５遺伝子の増幅にプライマーＵ２４  ＳｐｅＩとＵ２５  ＥｃｏＲＩおよびプライマーＵ２５  ＭｌｕＩとＵ２５  ＫｐｎＩを用いたことを除いて、上記Ｈ６Ｒ２８の構築手順と同様である。
【０１５９】
また、Ｈ６Ｒ２４−２５構築の確認は、上記Ｈ６Ｒ２８構築の確認と同様に行い、同様の結果を得た。なお、重複記載を避けるため、説明を繰返さない。
【０１６０】
さらに、上記Ｈ６Ｒ２８と同様に、Ｈ６Ｒ２４−２５の細胞から細胞への広がりの効率および感染細胞でのウイルス産生の効率を検討した。なお、実験方法は上記Ｈ６Ｒ２８と同じである。
【０１６１】
図５（Ａ）にウイルス抗原陽性細胞の増加を示した。また、図５（Ｂ）にウイルスの増殖曲線を示した。図中○が野生型ウイルス、■がＨ６Ｒ２４−２５を表す。
【０１６２】
図５（Ａ）および図５（Ｂ）に示した結果から、Ｈ６Ｒ２４−２５は野生型ウイルスと同等の増殖能力を保持していることが明らかとなった。すなわち、Ｕ２４〜Ｕ２５の部位に外来遺伝子を挿入してもウイルスの増殖に影響を及ぼさないことが示された。
【０１６３】
以上、Ｈ６Ｒ２８およびＨ６Ｒ２４−２５のデータより、ＨＨＶ−６では、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ２４、Ｕ２５が外来遺伝子の挿入部位として使用可能である事が判明した。
【０１６４】
＜ＨＨＶ−６の組換ウイルスベクターの潜伏感染能力および再活性化効率＞
本発明者は次に潜伏感染を確立する能力、再活性化の効率に関しＨ６Ｒ２８を用いて実験した。
【０１６５】
潜伏感染の確立を評価するために、末梢血液マクロファージにｗｔウイルスとＨ６Ｒ２８を感染させた。ＨＨＶ−６ＤＮＡ陽性細胞の存在割合はＫｏｎｄｏらの方法（J. Gen. Virol.72:1401-1408, 1991、J. Virol.77:2258-2264, 2003、J. Virol.76:4145-4151, 2002）によりモニターされた。
【０１６６】
手短かに言えば、末梢血液マクロファージは、コラーゲンコートしたプラスチックプレート（住友ベークライト社  日本）で、２５％の馬血清を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地を用いて培養した。培養７日目にＨＨＶ−６をマクロファージに感染させ、さらに４〜６週の間培養した。感染しているマクロファージをプレートから剥がし、糖タンパク質Ｂと糖タンパク質Ｈに対するモノクローナル抗体を使って、免疫蛍光抗体（ＩＦＡ）染色によって、ウイルスが複製をしていないことを確認した。
【０１６７】
細胞を段階希釈し（１０4〜１cell/tube）、各チューブごとにＤＮＡを分離した。なお、１希釈段階あたり４本のチューブを使用した。ウイルスＤＮＡは二重ネストＰＣＲによって検出し（K Kondo, et. al, J. Infect. Dis. 167:1197-1200, 1993）、ＨＨＶ−６ＤＮＡ陽性細胞の数は、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法（Reed, L. J., and H. Muench, Am. J. Hyg. 27:493, 1938）によって計算した。
【０１６８】
再活性化効率を検討するために、Ｋｏｎｄｏらの方法（J. Gen. Virol.72:1401-1408, 1991、J. Virol.76:4145-4151, 2002）にしたがって、テトラデカノイルホルボール酢酸塩（ＴＰＡ）処理によりウイルスの再活性化が誘導された。手短かに言えば、潜伏感染細胞を培養皿から剥がし、段階希釈し、未感染のマクロファージをフィーダーレイヤーとして共培養した。その後、細胞はＴＰＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）で７日間処理されて、ＣＢＭＣｓと一緒に７日間共培養された。ウイルスの再活性化の効率はＲｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法（Reed, L. J., and H. Muench, Am. J. Hyg. 27:493, 1938）によって計算した。
【０１６９】
結果を図６（Ａ）および図６（Ｂ）に示した。
【０１７０】
図６（Ａ）は、ＨＨＶ−６のＤＮＡ陽性細胞の存在割合を示す。ＨＨＶ−６のＤＮＡが検出される細胞の存在割合は、感染後４週目と６週目に調べられた。ｗｔウイルスとＨ６Ｒ２８の３つのクローンの３回の繰返し培養の平均値と標準偏差が示される。白色柱は、野生型ウイルスを示し；灰色柱は、Ｈ６Ｒ２８を示す。
【０１７１】
図６（Ｂ）は、再活性化陽性細胞の存在割合を示す。ウイルスの再活性化が誘導され、そして再活性化陽性細胞の存在割合が計算された。ｗｔウイルスとＨ６Ｒ２８の３つのクローンの３回の繰返し培養の平均値と標準偏差が示される。白色柱は、野生型ウイルスを示し、灰色柱は、Ｈ６Ｒ２８を示す。
【０１７２】
図６（Ａ）および図６（Ｂ）から明らかなように、ＨＨＶ−６のＤＮＡ陽性細胞および再活性化陽性細胞の割合は野生型ウイルスとＨ６Ｒ２８との間に差は認められなかった。したがって、潜伏感染の確立と再活性化プロセスがＵ３−Ｕ７遺伝子の削除によって失われないことが明らかとなった。
【０１７３】
＜ＨＨＶ−６組換ウイルスベクターの様々な細胞への導入＞
（１）マクロファージ、ＣＢＭＣｓ、Ｍｏｌｔ−３、ＨｅＬａ
興味深いことに、ＨＨＶ−６の潜伏感染の間に、本発明者はＨＣＭＶの主要な即時型エンハンサーとプロモーター遺伝子（ＭＩＥＰ）によって促進されるＥＧＦＰの発現を認めることができなかった（図７（Ａ））。他方、ＥＧＦＰの発現が、図１に示したプラスミドｐＵ２−Ｕ８ＥＧＦＰ−ｐｕｒｏをトランスフェクトされた、潜伏感染しているマクロファージ（図７（Ｂ））、再活性化−誘導マクロファージ（図７（Ｃ））、生産的感染したＣＢＭＣ細胞とＭｏｌｔ−３細胞（図７（Ｄ）と７（Ｅ））、流産感染したＨｅｌａ細胞（図７（Ｆ））で観察された。
【０１７４】
図７は、種々のタイプの細胞の中のＥＧＦＰ発現を表わす蛍光顕微鏡写真の図である。図７においては、これらの写真は、培養生細胞が螢光性の照明の下で観察された。
【０１７５】
図７（Ａ）においては、Ｈ６Ｒ２８に潜在的に感染したマクロファージが示される。図７（Ｂ）においては、図１に示されるプラスミドｐＵ２−Ｕ８  ＥＧＦＰ−ｐｕｒｏがトランスフェクトされた、潜在感染しているマクロファージが示される（トランスフェクションは、Ｋｏｎｄｏらの方法（J. Virol.77:2258-2264, 2003）でおこなった。）。図７（Ｃ）においては、７日間にわたり２０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡ処理をして、再活性化を誘導されたマクロファージが示される。
【０１７６】
図７（Ｄ）においては、Ｈ６Ｒ２８で処理して感染させたＣＢＭＣ細胞が示される。図７（Ｅ）においては、Ｈ６Ｒ２８に感染しているＭｏｌｔ−３細胞が示される。図７（Ｆ）においては、Ｈ６Ｒ２８に感染しているＨｅｌａ細胞が示される。
【０１７７】
これらの細胞は感染後４週目（Ａ−Ｃ）、感染後２日目（Ｅ‐Ｆ）に観察された。形質導入された細胞は、形質移入後１日目（Ｂ）に観察された。
【０１７８】
（２）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞
Ｈ６Ｒ２８のfree virusを、interleukin-2 (IL-2)存在下で培養した成人末梢血由来単核球にmultiplicity of infection (MOI)１で感染させた。ＣＤ５６陽性細胞(NK細胞)への遺伝子導入を、感染３日後にＦＡＣＳを用いてＥＧＦＰ発現で確認した。
【０１７９】
結果を図８（Ａ）、図８（Ｂ）および図８（Ｃ）に示した。図８（Ａ）はＨ６Ｒ２８を感染させていない細胞の結果を示し、図８（Ｂ）はＨ６Ｒ２８を感染させた細胞の結果を示している。また、図８（Ｃ）は上記図８（Ａ）および図８（Ｂ）の結果をまとめたグラフである。
【０１８０】
図８（Ａ）、図８（Ｂ）および図８（Ｃ）から明らかなように、ＨＨＶ−６は高率に外来遺伝子ＥＧＦＰをＮＫ細胞に導入可能であることが判明した。導入率は、88% [39.8%÷(5.5%＋39.8%)]であった。
【０１８１】
（３）アストロサイト
Ｈ６Ｒ２８のfree virusを、basic fibroblast growth factor (bFGF)存在下で培養したヒト初代培養アストロサイトにmultiplicity of infection (MOI)１で感染させた。遺伝子導入は２日後に蛍光顕微鏡を用いてＥＧＦＰの発現で確認した。
【０１８２】
図９に蛍光顕微鏡写真を示した。ＨＨＶ−６は、約４０％のヒト初代培養アストロサイトに、外来遺伝子ＥＧＦＰを導入可能であった。
【０１８３】
（４）ＣＤ４陽性Ｔ細胞
Ｈ６Ｒ２８のfree virusを、phytohemagglutinin (PHA)存在下で培養した成人末梢血由来単核球にmultiplicity of infection (MOI)１で感染させた。ＣＤ４陽性Ｔ細胞への遺伝子導入を、感染１日後にＦＡＣＳを用いてＥＧＦＰ発現で確認した。
【０１８４】
結果を図１０に示した。ＨＨＶ−６は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の内、約３０％[19.6%÷(50.8%＋19.6%)] に、外来遺伝子ＥＧＦＰを導入可能であった。
【０１８５】
（５）ＣＤ８陽性Ｔ細胞
Ｈ６Ｒ２８のfree virusを、phytohemagglutinin (PHA)存在下で培養した成人末梢血由来単核球にmultiplicity of infection (MOI)１で感染させた。ＣＤ８陽性Ｔ細胞への遺伝子導入を、感染３日後にＦＡＣＳを用いてＥＧＦＰ発現で確認した。
【０１８６】
結果を図１１に示した。ＨＨＶ−６は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の内、約４０％[30.1%÷(38.3%＋30.1%)] に、外来遺伝子ＥＧＦＰを導入可能であった。
【０１８７】
（６）樹状細胞
Ｈ６Ｒ２８のfree virusを、interleukin-4 (IL-4)とgranulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)存在下で培養した成人末梢血由来単球にmultiplicity of infection (MOI)１で感染させた。ＣＤ８３陽性細胞(樹状細胞)への遺伝子導入を、感染３日後にＦＡＣＳを用いてＥＧＦＰ発現で確認した。
【０１８８】
結果を図１２に示した。ＨＨＶ−６は、ＣＤ８３陽性の樹状細胞の内、約６０％[43.2%÷(26.6%＋43.2%)]に、外来遺伝子ＥＧＦＰを導入可能であった。
【０１８９】
なお、実施例には記載しないが、血液幹細胞、肝細胞、血管内皮細胞、繊維芽細胞においても、野生株のＨＨＶ−６が感染することは報告されており（参考文献１〜５参照）、Ｈ６Ｒ２８のfree virusが上記細胞に感染することが示唆される。
（参考文献１）
Luppi M, Barozzi P, et. al, J Virol.,  1999年 1月第73巻、  第1号、Ｐ．754-9. 「Human herpesvirus 6 latently infects early bone marrow progenitors in vivo.」
（参考文献２）
Tajiri H, Tanaka-Taya K, et. al, Pediatr.,  1997年 9月、第131巻、  第3号、Ｐ．473-5. 「Chronic hepatitis in an infant, in association with human herpesvirus-6 infection.」
（参考文献３）
Wu CA, Shanley JD.   1998年 3月、第79巻、  第5号、Ｐ．1247-56. 
「Chronic infection of human umbilical vein endothelial cells by human herpesvirus-6.」
（参考文献４）
Rotola A, Di Luca D, et. al, J Clin Microbiol.,  2000年 8月、第38巻、  第8号、Ｐ．3135-6 「Human herpesvirus 6 infects and replicates in aortic endothelium.」
（参考文献５）
Luka J, Okano M, Thiele G., J Clin Lab Anal. 1990年、第4巻、  第6号、Ｐ．483-6. 「Isolation of human herpesvirus-6 from clinical specimens using human fibroblast cultures.」
＜潜伏感染ＨＨＶ−６におけるＨＣＭＶプロモーターの機能＞
ＩＥ１／ＩＥ２プロモーター遺伝子からの遺伝子発現を検討するために、５’ＲＡＣＥを行なった（J. Virol.77:2258-2264, 2003、J. Virol.76:4145-4151, 2002、Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 93:11137-11142, 1996）。手短かに言えば、ｃＤＮＡの５′末端はｄＡ−ｔａｉｌが付加されて、そしてアンカープライマー、ＲＬ−１と一緒にアニーリングされた。ＰＣＲの最初の１０のサイクルは、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて以下の条件で行なった。変性は９４°Ｃにおいて１分間、アニーリングは５５°Ｃにおいて１分間、伸長は７２°Ｃにおいて１分間の条件で行なった。
【０１９０】
ＰＣＲ増幅は、ＫＯＤプラスＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡、大津、日本）を用いたＰＣＲにより、プライマーＮ１とＥＧＦＰ−Ｒ１を用いて、続いてプライマーＮ２とＥＧＦＰ−Ｒ２を用いて、次の条件の下で行なった（図１３（Ａ）参照）。変性は９４°Ｃにおいて１分間、アニーリングは６５°Ｃにおいて３０秒間、伸長は６８°Ｃにおいて１分間（増幅毎に１５サイクル）の条件で行なった。増幅断片は配列決定した。
【０１９１】
上記の潜伏感染した細胞では、通常の転写開始部位（生産的感染の転写開始部位：ＰＳＳ）からのｍＲＮＡの転写が検出されなかった（図１３（Ｂ））。しかし、ＨＣＭＶの潜伏感染に関する転写物を発現させるために使われる、ＨＣＭＶの潜伏感染の転写開始部位（ＬＳＳｓ）１と２から少量のｍＲＮＡが転写された。
【０１９２】
それと対照的に、ＰＳＳは、プラスミドｐＵ２−Ｕ８  ＥＧＦＰ−ｐｕｒｏが形質導入された潜伏感染マクロファージ、再活性化が誘導されたマクロファージ、生産的感染したＭｏｌｔ−３細胞、流産感染ＨｅＬａ細胞において使われた（図１３（Ｂ））。ＨＣＭＶ  ＭＩＥＰがＨＨＶ−６潜伏感染条件で潜伏感染と関係のある性質を示したので、ＨＨＶ−６潜伏感染の転写調節がＨＣＭＶ潜伏感染と若干の共通の機構を共有するかもしれないことが示唆される。これらの知見は、潜伏感染の部位の場合のように、ＨＨＶ−６とＨＣＭＶとが比較的共通した性質を示すという事実と関係があるかもしれない。
【０１９３】
図１３は、潜在感染しているＨＨＶ−６でのＨＣＭＶプロモーター遺伝子の機能を表わす模式図および電気泳動写真の図である。
【０１９４】
図６（Ａ）は、ＨＣＭＶ  ＩＥ１／ＩＥ２プロモーター遺伝子とＰＣＲプライマーを示す。ＥＧＦＰ遺伝子と転写開始部位は一定の比率で縮尺して描かれている。生産的感染による転写のＩＥ１／ＩＥ２のｍＲＮＡ（ＰＳＳは＋１として示されている）の開始部位と、２つの潜伏感染の転写開始部位（ＬＳＳ１とＬＳＳ２）が示される。ＰＣＲプライマーの位置も描写されている。そして、模式図はアンカープライマーＲＬ−１の使用法を示している。なお、プライマー配列は表１に示される。
【０１９５】
図６（Ｂ）は、ＥＧＦＰの転写物の５’ＲＡＣＥ法による増幅を示す。
【０１９６】
１×１０5個の潜在的に感染したマクロファージ（Ｍφ）から得られるＲＮＡを示す（レーン１）。図１に示すプラスミドｐＵ２−Ｕ８  ＥＧＦＰ−ｐｕｒｏを形質導入した１×１０5個の潜在的に感染したマクロファージを示す（レーン２）。１×１０5個の再活性化を誘導されたマクロファージを示す（レーン３）。１×１０2個の生産的に感染したＭｏｌｔ−３細胞を示す（レーン４）。１×１０3個の未感染Ｈｅｌａ細胞を示す（レーン５）。
【０１９７】
これらは、５’ＲＡＣＥ法によって分析された。使われたＲＡＣＥ法としては通常に用いられる方法を採用した。転写物の５′末端はｄＡテイルであって、そしてアンカープライマーＲＬ−１とともにアニーリングした（図６（Ａ））。そして最初にプライマーＮ２−ＥＧＦＰ  Ｒ２と共に、それからプライマーＮ１−ＥＧＦＰ  Ｒ１と共に増幅した。ＰＳＳ（〜３６０ｂｐ）、ＬＳＳ１（〜７２０ｂｐ）、そして／あるいはＬＳＳ２（〜６５０ｂｐ）で始まる転写物の５′末端が検出された。Ｈａｅ  ＩＩＩによって切断されたΦ  Ｘ１７４  ＤＮＡ断片がサイズマーカー（ΦＸ）として用いられた。
【０１９８】
＜ＨＨＶ−７の組換ウイルスベクターＨ７Ｒ２８の構築＞
ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ−７）のＵ２−Ｕ８遺伝子クラスターを、ヒトサイトメガロウイルスの主要な即時型エンハンサー−プロモーター（ＭＩＥＰ）の制御下にある増強された緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＥＧＦＰ）と、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下にあるピューロマイシン耐性遺伝子と、を含む遺伝子カセット（ＥＧＦＰ−ｐｕｒｏカセット）に置換した組換えウイルスＨ７Ｒ２８を構築した。相同組換によってＥＧＦＰ−ｐｕｒｏカセットをＨＨＶ−７ゲノムに挿入するために、ウイルスのゲノムの約１キロベース（ｋｂ）の部分がカセット（図１４）のそれぞれの末端に挿入された。
【０１９９】
続いて、次の遺伝子クラスターについて調査した：Ｕ２−Ｕ８遺伝子である。それらの遺伝子について、本発明者は、Ｕ２−Ｕ８遺伝子をＥＧＦＰ−ｐｕｒｏに置換しても複製能を有するウイルスが得られることに気付いた。
【０２００】
以下に具体的な構築手順を説明する。
【０２０１】
図１４は、組換えウイルスＨ７Ｒ２８の構造を表わす模式図である。
【０２０２】
図１４においては、最上部にＨＨＶ−７ＲＫゲノムの地図を示し、その下（中段）にＵ２−Ｕ８領域を拡大して示している。
【０２０３】
下段は、ＥＧＦＰ−ｐｕｒｏカセットの両端に相同組換えに利用するＤＮＡ断片を挿入した相同組換え用プラスミドＨＨＶ−７ｐＵ２−Ｕ８  ＥＧＦＰ−ｐｕｒｏを表す。
【０２０４】
左右向きの短い矢印はプライマーのアニーリング位置を示す。
【０２０５】
図中の数字10558, 11637, 17395, 18483は、ＨＨＶ−７ＲＫ株の塩基の番号を示す。
【０２０６】
プライマー配列は、下記の表２で示す。
【０２０７】
【表２】
2007159586.tif 000004
【０２０８】
まず、プライマー７Ｕ２ＦＢａｍ−７Ｕ２ＲＳｐｅとを用いたＰＣＲによりＵ２遺伝子を増幅し、プライマー７Ｕ８ＦＳａｌ−７Ｕ７ＲＢａｍとを用いたＰＣＲによりＵ７−Ｕ８遺伝子を増幅した。
【０２０９】
増幅されたＵ２遺伝子産物はＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩで、Ｕ７Ｕ８遺伝子産物はＳａｌＩ−ＢａｍＨＩでそれぞれ消化され、ｐＥＧＦＰ−ｐｕｒｏ（図１４でのＨＨＶ−７ｐＵ２−Ｕ８  ＥＧＦＰ−ｐｕｒｏ）のそれぞれの末端に挿入された。
【０２１０】
上記ＨＨＶ−７ｐＵ２−Ｕ８  ＥＧＦＰ−ｐｕｒｏをフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）で刺激した末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣｓ）中に導入した。プラスミドの導入は、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＴＭ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ）を用い、推奨されるプロトコールにしたがって行った。
【０２１１】
すなわち、５×１０6個の細胞を、プラスミド５μｇおよびＴ細胞用Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ＴＭ）溶液１００μｌと混和し、プログラムＵ−１４を用いたＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ＴＭ）によりエレクトロポレーションを行った。
【０２１２】
同時に、従来のエレクトロポレーション法も実施した。すなわち、１×１０7個の細胞と５００μｌのＫ−ＰＢＳ溶液（３０．８ｍＭのＮａＣｌ、１２０．７ｍＭのＫＣｌ、８．１ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、１．４６ｍＭのＫＨ2ＰＯ4および２５ｍＭのＭｇＣｌ2）中に懸濁した５０μｇのプラスミドと混合し、混合液をエレクトロポレーションキュベット（ジーンパルサーキュベット  ０．４ｃｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）内に入れた。
【０２１３】
エレクトロポレーションは、ジーンパルサーＩＩ  エレクトロポレーションシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、抵抗無限大、電圧３００Ｖ、キャパシタンス９６０μＦ以下の条件下で行った。６時間後に、ＨＨＶ−７  ＫＨＲ株を染多重度（ＭＯＩ）０．５で遠心法により細胞に感染させた。
【０２１４】
１０％牛胎児血清を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地で、３日間、細胞を培養し、ウイルスストックとして凍結した。組換ウイルスを増やすために、ＰＨＡで刺激した臍帯血単核細胞（ＣＢＭＣｓ）に上記ウイルスストックを感染させて１日間培養し、７．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンで１日間処理し、培地で洗浄し、３日間ＣＢＭＣｓと一緒に培養した。感染細胞を新たなウイルスストックとして凍結した。
【０２１５】
この選択処理を５回繰り返し、その後、９６穴のプレートで培養されたＣＢＭＣｓを使って、限界希釈培養法により組換ウイルス（Ｈ７Ｒ２８）をクローン化した。
【０２１６】
＜ＨＨＶ−７の組換えウイルスベクターＨ７Ｒ２８構築の確認＞
ＨＨＶ−７の組換えウイルスベクター構築の確認は、ＨＨＶ−６の組換えウイルスベクターＨ６Ｒ２８構築の確認の方法と同様の方法により行われ、同様の結果を得た。なお、重複記載を避けるため、説明を繰返さない。
【０２１７】
＜ＨＨＶ−７の組換えウイルスベクターＨ７Ｒ２８の増殖感染＞
Ｈ７Ｒ２８の細胞から細胞への広がりの効率および感染細胞でのウイルス産生の効率を検討した。なお、実験方法は、抗ＨＨＶ−６モノクローナル抗体の代わりに、抗ＨＨＶ−７モノクローナル抗体（ＫＲ４）を使用したこと以外は、前記Ｈ６Ｒ２８と同じである。
【０２１８】
図１５（Ａ）にウイルス抗原陽性細胞の増加を示した。また、図１５（Ｂ）にウイルスの増殖曲線を示した。図中○が野生型ウイルス、■がＨ７Ｒ２８を表す。
【０２１９】
図１５（Ａ）および図１５（Ｂ）に示した結果から、Ｈ７Ｒ２８は野生型ウイルスと同等の増殖能力を保持していることが明らかとなった。すなわち、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ７、Ｕ８の部位に外来遺伝子を挿入してもウイルスの増殖に影響を及ぼさないことが示された。
【０２２０】
＜ＨＨＶ−７の組換ウイルスベクターＨ７Ｒ２４−２５の構築＞
ＨＨＶ−７のＵ２４とＵ２５を組み換え部位に使用した組み換えウイルスＨ７Ｒ２４−２５を構築した。
【０２２１】
図１６は、組換えウイルスＨ７Ｒ２４−２５の構造を表わす模式図である。
【０２２２】
図１６においては、最上部にＨＨＶ−７ＲＫゲノムの地図を示し、その下（中段）にＵ２４−Ｕ２５領域を拡大して示している。
【０２２３】
下段は、ＥＧＦＰ−ｐｕｒｏカセットの両端に相同組換えに利用するＤＮＡ断片を挿入した相同組換え用プラスミドｐＨＨＶ−７Ｕ２４−Ｕ２５  ＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏを表す。
【０２２４】
左右向きの短い矢印はプライマーのアニーリング位置を示す。
【０２２５】
図中の数字34744, 35420, 36118は、ＨＨＶ−７ＲＫ株の塩基の番号を示す。
【０２２６】
前記の組換ウイルスＨ７Ｒ２８よりも短い組換え部位に遺伝子を挿入するために、ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ）を用いて挿入遺伝子を小型化した。
【０２２７】
構築手順は、相同組換えに利用するＵ２４−Ｕ２５遺伝子の増幅にプライマー７Ｕ２４  ＳｐｅＩと７Ｕ２５  ＥｃｏＲＩおよびプライマー７Ｕ２５  ＭｌｕＩと７Ｕ２５  ＫｐｎＩを用いたことを除いて、上記Ｈ７Ｒ２８の構築手順と同様である。
【０２２８】
また、Ｈ７Ｒ２４−２５構築の確認は、前記Ｈ６Ｒ２８構築の確認と同様に行い、同様の結果を得た。なお、重複記載を避けるため、説明を繰返さない。
【０２２９】
さらに、前記Ｈ６Ｒ２８と同様に、Ｈ７Ｒ２４−２５の細胞から細胞への広がりの効率および感染細胞でのウイルス産生の効率を検討した。なお、実験方法は、抗ＨＨＶ−６モノクローナル抗体の代わりに、抗ＨＨＶ−７モノクローナル抗体（ＫＲ４）を使用したこと以外は、前記Ｈ６Ｒ２８と同じである。
【０２３０】
図１７（Ａ）にウイルス抗原陽性細胞の増加を示した。また、図１７（Ｂ）にウイルスの増殖曲線を示した。図中○が野生型ウイルス、■がＨ７Ｒ２４−２５を表す。
【０２３１】
図１７（Ａ）および図１７（Ｂ）に示した結果から、Ｈ７Ｒ２４−２５は野生型ウイルスと同等の増殖能力を保持していることが明らかとなった。すなわち、Ｕ２４〜Ｕ２５の部位に外来遺伝子を挿入してもウイルスの増殖に影響を及ぼさないことが示された。
【０２３２】
以上、Ｈ７Ｒ２８およびＨ７Ｒ２４−２５のデータより、ＨＨＶ−７では、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ２４、Ｕ２４ａ、Ｕ２５が外来遺伝子の挿入部位として使用可能である事が判明した。
【０２３３】
＜ＨＨＶ−７の組換ウイルスベクターの潜伏感染能力および再活性化効率＞
ＨＨＶ−７の組換えウイルスベクターの潜伏感染能力および再活性化効率は、ＨＨＶ−６の組換えウイルスベクターの潜伏感染能力および再活性化効率の確認の方法と同様の方法により行われ、同様の結果を得た。なお、重複記載を避けるため、説明を繰返さない。
【０２３４】
＜ＨＨＶ−７組換ウイルスベクターの様々な細胞への導入＞
（１）マクロファージ
Ｈ７Ｒ２８のfree virusを、コラーゲンコートディッシュで培養した成人末梢血由来単球にmultiplicity of infection (MOI)１で感染させた。接着細胞でかつＣＤ１１ｃ陽性の細胞(マクロファージ)への遺伝子導入を、感染３日後にＦＡＣＳを用いてＥＧＦＰ発現で確認した。
【０２３５】
結果を図１８に示した。ＨＨＶ−７は、マクロファージの約８０％[45.7%÷(12.1%＋45.7%)]に、外来遺伝子ＥＧＦＰを導入可能であった。
【０２３６】
（２）ＣＤ４陽性Ｔ細胞
Ｈ７Ｒ２８のfree virusを、phytohemagglutinin (PHA)存在下で培養した成人末梢血由来単核球にmultiplicity of infection (MOI)１で感染させた。ＣＤ４陽性Ｔ細胞への遺伝子導入を、感染３日後にＦＡＣＳを用いてＥＧＦＰ発現で確認した。
【０２３７】
結果を図１９に示した。ＨＨＶ−７は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の約４８％[34.8%÷(6.8%＋34.8%)]  に、外来遺伝子ＥＧＦＰを導入可能であった。
【０２３８】
（３）樹状細胞
Ｈ７Ｒ２８のfree virusを、interleukin-4 (IL-4)とgranulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)存在下で培養した成人末梢血由来単球にmultiplicity of infection (MOI)１で感染させた。ＣＤ８３陽性細胞(樹状細胞)への遺伝子導入を、感染３日後にＦＡＣＳを用いてＥＧＦＰ発現で確認した。
【０２３９】
結果を図２０に示した。ＨＨＶ−７は、ＣＤ８３陽性の樹状細胞の内、約７０％[46.4%÷(17.9%＋46.4%)]に、外来遺伝子ＥＧＦＰを導入可能であった。
【０２４０】
＜ＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７における、ＢＡＣ（Bacterial artificial chromosome）の複製開始点の導入＞
ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７ともに、Ｕ２〜Ｕ８の外来遺伝子挿入可能部位が大きいので、比較的大きな遺伝子の導入が可能である。特にBacterial artificial chromosome（ＢＡＣ）の複製開始点を挿入できれば、所謂ＢＡＣシステムによるベクター産生が可能となる。ＢＡＣシステムによる組み換えウイルス作製は、他のヘルペスウイルスなど、多くのウイルスで確立しているが、ＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７においては未だ確立されていない。
【０２４１】
（１）ＢＡＣの複製開始点を挿入した組換えＨＨＶ−６の作製:（Ｈ６Ｒ２８  ＢＡＣ）
図２１は、Ｈ６Ｒ２８  ＢＡＣの構造を表す模式図である。
【０２４２】
前記Ｈ６Ｒ２８と同様に、Ｕ２とＵ８の配列を相同組み換えに使用した。ＥＧＦＰとpuromycin耐性遺伝子(pac)をinternal ribosomal entry site (IRES)でつないだものを組換えウイルスの選択マーカーとし、ＢＡＣ複製開始点[クロラムフェニコール耐性遺伝子(CMR)、BAC複製開始点(Ori S, rep E, par A, par B, par C) を相同組み換え部位の内側に配したプラスミド(pHHV-6 U2-8 EGFP-puro BAC)を作製した。
【０２４３】
相同組み換えによるウイルス作製法は、前記Ｈ６Ｒ２８構築の項に記載した方法と同様であるので、重複記載を避けるため、説明を繰返さない。
【０２４４】
次に、相同組み換え後、６回のpuromycin選択により、ＢＡＣ複製開始点をもった組み換えウイルスを作製した。
【０２４５】
組み換えウイルスは、安定に増殖し、６回のpuromycin選択で全体の約９０％に達した。図２２は、Ｈ６Ｒ２８  ＢＡＣ感染Ｍｏｌｔ−３細胞の蛍光顕微鏡写真である。この結果は、上記の方法で、ＢＡＣ複製開始点を持つＨＨＶ−６を作製できたことを示す。
【０２４６】
（２）ＢＡＣの複製開始点を挿入した組換えＨＨＶ−７の作製:（Ｈ７Ｒ２８  ＢＡＣ）
図２３は、Ｈ７Ｒ２８  ＢＡＣの構造を表す模式図である。
【０２４７】
前記Ｈ７Ｒ２８と同様Ｕ２とＵ８の配列を相同組み換えに使用した。ＥＧＦＰとpuromycin耐性遺伝子(pac)をinternal ribosomal entry site (IRES)でつないだものを組み換えウイルスの選択マーカーとし、ＢＡＣ複製開始点[クロラムフェニコール耐性遺伝子(CMR)、BAC複製開始点(Ori S, rep E, par A, par B, par C) を相同組み換え部位の内側に配したプラスミド(pHHV-7 U2-8 EGFP-puro BAC)を作製した。
【０２４８】
相同組み換えによるウイルス作製法は、前記Ｈ７Ｒ２８構築の項に記載した方法と同様であるので、重複記載を避けるため、説明を繰返さない。
【０２４９】
次に、相同組み換え後、６回のpuromycin選択により、ＢＡＣ複製開始点をもった組み換えウイルスを作製した。
【０２５０】
組み換えウイルスは、安定に増殖し、６回のpuromycin選択で全体の約９０％に達した。図２４は、Ｈ７Ｒ２８  ＢＡＣが感染したＳｕｐＴ１細胞の蛍光顕微鏡写真である。この結果は、上記の方法で、ＢＡＣ複製開始点を持つＨＨＶ−７を作製できたことを示す。
【０２５１】
＜評価結果のまとめ＞
上記のように、全体的に、組換ウイルスＨ６Ｒ２８により、ＨＨＶ−６のかなり大きい遺伝子クラスターＵ３−Ｕ７がウイルスの複製、潜伏感染と再活性化のために欠失可能であることが明らかとなった。削除された遺伝子について、Ｕ４とＵ６の機能は報告されていない。
【０２５２】
また、Ｈ７Ｒ２８によりＨＨＶ−７のかなり大きい遺伝子クラスターＵ３−Ｕ７がウイルスの複製、潜伏感染と再活性化のために欠失可能であることが明らかとなった。
【０２５３】
ここで、ＨＨＶ−６の遺伝子Ｕ３、Ｕ５、Ｕ７とＵ２５は、ＨＨＶ−７の遺伝子Ｕ３、Ｕ７とＵ２５は、ＨＣＭＶ  ＵＳ２２遺伝子と機能不明の共通のモチーフを持ち、ＵＳ２２遺伝子系統群に属する。すべてのβヘルペスウイルスが４つの保存されたモチーフの少なくとも１をコードするいくつかのＵＳ２２系統群遺伝子をコードする。ＵＳ２２系統群遺伝子の大部分の機能が未知であるけれども、ｍｕｒｉｎｅサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）の即時型２（ＩＥ２）遺伝子、ＨＣＭＶ  ＵＬ３６−３８遺伝子などは、ともにトランス活性化機能を有するタンパク質をコードする。
【０２５４】
しかしながら、ＭＣＭＶ  ＩＥ２はウイルスの複製と潜伏感染／再活性化のために欠失可能であることを知られている。Ｈ６Ｒ２８のＵＳ２２系統群遺伝子の削除により、それらと類似の特性を持っていることが示された。ＨＨＶ−６  Ｕ３は弱い再活性化機能を有するタンパク質をコードする。そして本発明者はｗｔと組換体ウイルスの間において、どのようなウイルス複製あるいは潜伏感染／再活性化においても、相違を見出すことができなかった。
【０２５５】
ＨＣＭＶのＵＳ２２系統群遺伝子ＵＬ３６とＵＬ３７は抗アポトーシス機能を持っている。しかしながら、本発明者は、本研究において、Ｈ６Ｒ２８またはＨ７Ｒ２８に感染した細胞で細胞自滅の増加を観察しなかった。
【０２５６】
ＭＣＭＶ  Ｍ１４０とＭ１４１遺伝子のような、他のＵＳ２２系統群の遺伝子は、細胞と組織の向性を変化させる。ＨＨＶ−６は、生体上の宿主組織の適合範囲が広く、種々のタイプの細胞に感染するので、ＨＨＶ−６  ＵＳ２２系統群遺伝子がこのウイルスの幅広い臓器への向性の一因になることは可能であると考えられる。
【０２５７】
Ｈ６Ｒ２８は、ＨＨＶ−６潜伏感染と再活性化の研究のために有用な材料であるように思われる。また、Ｈ７Ｒ２８もＨＨＶ−７の潜伏感染と再活性化の研究に有用と思われる。さらに、両ウイルスにおいて、バクテリアの人工染色体（ＢＡＣ）ベクターのように、大きい遺伝子を挿入するために、この大きい欠失可能位置は有用な部位であり得るし、実際にＢＡＣ遺伝子が安定して挿入可能である事を示した。
【０２５８】
本発明者は、これがＨＨＶ−６組換ウイルスベクターおよびＨＨＶ−７組み換えベクターと、それをなし得るための詳細なプロトコールをＨＨＶ−６とＨＨＶ−７の研究者に提供することができる、成功した最初の報告であると信じる。
【０２５９】
なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用可能性】
【０２６０】
本発明のウイルスベクターは、外因性ヌクレオチド配列を挿入することができ、哺乳類の宿主細胞に容易に導入することができ、外因性ヌクレオチド配列にコードされた遺伝子を宿主細胞内で発現させることができ、病原性を有する危険性が低く、哺乳類の遺伝子治療に好適に用いることができる、ウイルスベクターである。
【０２６１】
さらに、本発明のウイルスベクターの製造方法は、外因性ヌクレオチド配列を挿入することができ、哺乳類の宿主細胞に容易に導入することができ、外因性ヌクレオチド配列にコードされた遺伝子を宿主細胞内で発現させることができ、病原性を有する危険性が低く、哺乳類の遺伝子治療に好適に用いることができる、ウイルスベクターを容易に製造可能な、ウイルスベクターの製造方法である。
【０２６２】
さらに、本発明のウイルスベクターの製造方法で使用されたウイルスの組み換え方法は、他のベクター開発技術であるＢＡＣシステムやアンプリコンシステムをＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７に応用しようとする際に、必要不可欠な技術である。
【０２６３】
また、本発明の宿主細胞の形質転換方法は、哺乳類の宿主細胞に容易に外因性ヌクレオチド配列が導入でき、外因性ヌクレオチド配列にコードされた遺伝子を宿主細胞内で発現させることができ、病原性を有する危険性を低く抑えることができ、哺乳類の遺伝子治療に好適に用いることができる、ウイルスベクターによる宿主細胞の形質転換方法である。
【０２６４】
そして、本発明の形質転換宿主細胞は、ウイルスベクターにより形質転換されて外因性ヌクレオチド配列が挿入されており、外因性ヌクレオチド配列にコードされた遺伝子を宿主細胞内で発現させることができ、病原性を有する危険性が低く、遺伝子治療に好適に用いることのできる、形質転換宿主細胞である。
【０２６５】
また、本発明の遺伝子治療方法は、哺乳類の宿主細胞に容易に外因性ヌクレオチド配列が導入でき、外因性ヌクレオチド配列にコードされた遺伝子を宿主細胞内で発現させることができ、病原性を有する危険性を低く抑えることができる、ウイルスベクターを用いた哺乳類の遺伝子治療方法である。
【０２６６】
よって、本発明のウイルスベクターは、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７がともに、ＨＩＶと同じＣＤ４陽性Ｔ細胞に感染することを利用して、ＡＩＤＳ治療に利用可能である。この場合、本発明のウイルスベクターには、リボザイム、干渉ＲＮＡなどの抗ＨＩＶ遺伝子を挿入することが好ましい。
【０２６７】
また、本発明のウイルスベクターは、ＨＨＶ−６がＨＩＶと同じくマクロファージで潜伏感染を成立させることを利用して、ＡＩＤＳ治療に利用可能である。この場合も、本発明のウイルスベクターには、リボザイム、干渉ＲＮＡなどの抗ＨＩＶ遺伝子を挿入することが好ましい。
【０２６８】
さらに、本発明のウイルスベクターは、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７がＣＤ４陽性Ｔ細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ  （ＬＡＫ）細胞などの免疫担当細胞に感染することを利用して、これらの細胞にサイトカインを導入するために利用可能である。このことにより、本発明のウイルスベクターは、癌の免疫療法への応用が可能となる。
【０２６９】
そして、本発明のウイルスベクターは、ＨＨＶ−６が膵癌などの難治性の消化器系腫瘍に大量に発現しているＣＤ４６分子を受容体として細胞に侵入することを利用して、膵癌にＨＨＶ−６を感染させ、癌を死滅させるなどの抗腫瘍治療にも応用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０２７０】
【図１】Ｈ６Ｒ２８のゲノムの構造を表わす模式図である。
【図２】（Ａ）は、野生型（ｗｔ）ウイルスＤＮＡとＨ６Ｒ２８ウイルスＤＮＡのＵ２領域とＵ８領域を挟むＰＣＲ増幅を表わす電気泳動写真の図であり、（Ｂ）は、（Ａ）の増幅産物を制限酵素で消化した断片の電気泳動写真の図であり、（Ｃ）は、Ｈ６Ｒ２８ウイルスＤＮＡのＥＧＦＰ−ｐｕｒｏカセットの挿入位置を確認するためのＰＣＲ増幅を表わす電気泳動写真の図であり、（Ｄ）は、野生型（ｗｔ）ウイルスＤＮＡとＨ６Ｒ２８ウイルスＤＮＡのＵ３〜Ｕ７領域をそれぞれ増幅するＰＣＲ増幅を表わす電気泳動写真の図である。
【図３】（Ａ）は、Ｈ６Ｒ２８を感染させた細胞における抗ＨＨＶ−６モノクローナル抗体陽性細胞の増加を示すグラフ図であり、（Ｂ）は、Ｈ６Ｒ２８を感染させた細胞の培養上清中のウイルス活性（生存ウイルスの個数）の変化を示すグラフ図である。
【図４】Ｈ６Ｒ２４−２５のゲノムの構造を表わす模式図である。
【図５】（Ａ）は、Ｈ６Ｒ２４−２５を感染させた細胞における抗ＨＨＶ−６モノクローナル抗体陽性細胞の増加を示すグラフ図であり、（Ｂ）は、Ｈ６Ｒ２４−２５を感染させた細胞の培養上清中のウイルス活性（生存ウイルスの個数）の変化を示すグラフ図である。
【図６】（Ａ）は、Ｈ６Ｒ２８を潜伏感染させた細胞におけるＨＨＶ−６ＤＮＡ陽性細胞の割合を示すグラフ図であり、（Ｂ）は、Ｈ６Ｒ２８を潜伏感染させた細胞における再活性化細胞の割合を示すグラフ図である。
【図７】（Ａ）は、Ｈ６Ｒ２８を潜伏感染させたマクロファージの蛍光顕微鏡像を表す画像であり、（Ｂ）は、プラスミドｐＵ２−Ｕ８ＥＧＦＰ−ｐｕｒｏをトランスフェクトした潜伏感染マクロファージの蛍光顕微鏡像を表す画像であり、（Ｃ）は、再活性化誘導したマクロファージの蛍光顕微鏡像を表す画像であり、（Ｄ）は、Ｈ６Ｒ２８を感染させたＣＢＭＣｓの蛍光顕微鏡像を表す画像であり、（Ｅ）は、Ｈ６Ｒ２８を感染させたＭｏｌｔ−３細胞の蛍光顕微鏡像を表す画像であり、（Ｆ）は、Ｈ６Ｒ２８を感染させたＨｅＬａ細胞の蛍光顕微鏡像を表す画像である。
【図８】（Ａ）は、Ｈ６Ｒ２８を感染させていないナチュラルキラー細胞のＥＧＦＰ発現をＦＡＣＳで調べた結果を示す図であり、（Ｂ）は、Ｈ６Ｒ２８を感染させたナチュラルキラー細胞のＥＧＦＰ発現をＦＡＣＳで調べた結果を示す図であり、（Ｃ）は、（Ａ）および（Ｂ）の結果をまとめた図である。
【図９】Ｈ６Ｒ２８を感染させた感染させたアストロサイトのＥＧＦＰの発現を蛍光顕微鏡像で観察した画像である。
【図１０】Ｈ６Ｒ２８を感染させたＣＤ４陽性Ｔ細胞のＥＧＦＰ発現をＦＡＣＳで調べた結果を示す図である。
【図１１】図１１は、Ｈ６Ｒ２８を感染させたＣＤ８陽性Ｔ細胞のＥＧＦＰ発現をＦＡＣＳで調べた結果を示す図である。
【図１２】Ｈ６Ｒ２８を感染させた樹状細胞のＥＧＦＰ発現をＦＡＣＳで調べた結果を示す図である。
【図１３】（Ａ）は、Ｈ６Ｒ２８潜伏感染時のＨＣＭＶプロモーターの機能を調べるための５’ＲＡＣＥの方法を示す模式図であり、（Ｂ）は、５’ＲＡＣＥにより増幅された断片の電気泳動写真の図である。
【図１４】Ｈ７Ｒ２８のゲノムの構造を表わす模式図である。
【図１５】（Ａ）は、Ｈ７Ｒ２８を感染させた細胞における抗ＨＨＶ−７モノクローナル抗体陽性細胞の増加を示すグラフ図であり、（Ｂ）は、Ｈ７Ｒ２８を感染させた細胞の培養上清中のウイルス活性（生存ウイルスの個数）の変化を示すグラフ図である。
【図１６】Ｈ７Ｒ２４−２５のゲノムの構造を表わす模式図である。
【図１７】（Ａ）は、Ｈ７Ｒ２４−２５を感染させた細胞における抗ＨＨＶ−７モノクローナル抗体陽性細胞の増加を示すグラフ図であり、（Ｂ）は、Ｈ７Ｒ２４−２５を感染させた細胞の培養上清中のウイルス活性（生存ウイルスの個数）の変化を示すグラフ図である。
【図１８】Ｈ７Ｒ２８を感染させたマクロファージのＥＧＦＰ発現をＦＡＣＳで調べた結果を示す図である。
【図１９】Ｈ７Ｒ２８を感染させたＣＤ４陽性Ｔ細胞のＥＧＦＰ発現をＦＡＣＳで調べた結果を示す図である。
【図２０】Ｈ７Ｒ２８を感染させた樹状細胞のＥＧＦＰ発現をＦＡＣＳで調べた結果を示す図である。
【図２１】Ｈ６Ｒ２８  ＢＡＣのゲノムの構造を表わす模式図である。
【図２２】Ｈ６Ｒ２８  ＢＡＣを感染させたＭｏｌｔ−３細胞の蛍光顕微鏡像を表す画像である。
【図２３】Ｈ７Ｒ２８  ＢＡＣのゲノムの構造を表わす模式図である。
【図２４】Ｈ７Ｒ２８  ＢＡＣを感染させたＳｕｐＴ１細胞の蛍光顕微鏡像を表す画像である。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２３】
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【図２】
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【図７】
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【図９】
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【図１３】
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【図２２】
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【図２４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年4月11日(2007.4.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＨＶ−７由来の組換ウイルスベクターであって、ＨＨＶ−７のＵ２〜Ｕ８領域またはＵ２４〜Ｕ２５領域に相当する部位に、外因性ヌクレオチド配列を備える、組換ウイルスベクター。
【請求項２】
前記部位は、配列番号２で表されるＨＨＶ−７のＤＮＡ配列におけるヌクレオチド番号１０５５８〜１８４８３または３４７４４〜３６１１８の範囲に存在する、請求項１に記載の組換ウイルスベクター。
【請求項３】
前記外因性ヌクレオチド配列が、ＤＮＡ配列および／またはＲＮＡ配列である、請求項１に記載の組換ウイルスベクター。
【請求項４】
前記外因性ヌクレオチド配列が、ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  （ＢＡＣ）、サイトカイン遺伝子、リボザイム、ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ、免疫学的補助刺激分子、シグナル伝達分子、酵素および化学誘引物質からなる群より選ばれる１種以上をコードするヌクレオチド配列である、請求項３に記載の組換ウイルスベクター。
【請求項５】
前記外因性ヌクレオチド配列が、哺乳類の遺伝子治療に用いられるための配列である、請求項３に記載の組換ウイルスベクター。
【請求項６】
前記外因性ヌクレオチド配列が、マーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の組換ウイルスベクター。
【請求項７】
請求項１に記載の組換ウイルスベクターの製造方法であって、ＨＨＶ−７のＵ２〜Ｕ８またはＵ２４〜Ｕ２５領域に相当する部位に、外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップを備える、組換ウイルスベクターの製造方法。
【請求項８】
前記外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップは、配列番号２で表されるＨＨＶ−７のＤＮＡ配列におけるヌクレオチド番号１０５５８〜１８４８３または３４７４４〜３６１１８の範囲に外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップを含む、請求項７に記載の組換ウイルスベクターの製造方法。
【請求項９】
前記外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップは、それぞれ配列番号３０−３１および３４−３５に示す配列のプライマーの組合せまたは配列番号４０−４１および４２−４３に示す配列のプライマーの組合せを用いて増幅されるＤＮＡ配列と、ＨＨＶ−７のＤＮＡ配列との相同組換を行なうステップを含む、請求項７に記載の組換ウイルスベクターの製造方法。
【請求項１０】
前記外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップは、正常かつ／または臍帯血由来の細胞内において前記外因性ヌクレオチド配列を挿入するステップを含む、請求項７に記載の組換ウイルスベクターの製造方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の組換ウイルスベクターによる哺乳類の宿主細胞の形質転換方法であって、前記組換ウイルスベクターにより、ヒト、ヒト以外の霊長類およびＨＨＶ−７の感染可能な宿主からなる群より選ばれる１種以上の哺乳類由来の前記宿主細胞を形質転換するステップを備える、宿主細胞の形質転換方法。
【請求項１２】
前記形質転換するステップは、前記組換ウイルスベクターにより、Ｔ細胞、マクロファージ、末梢血単核球細胞、血液幹細胞、肝細胞、血管内皮細胞、繊維芽細胞、グリア細胞、アストロサイト、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、樹状細胞およびナチュラルキラー細胞からなる群より選ばれる１種以上の前記宿主細胞を形質転換するステップを含む、請求項１１に記載の宿主細胞の形質転換方法。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の宿主細胞の形質転換方法により得られる、形質転換宿主細胞。
【請求項１４】
哺乳類の遺伝子治療方法に用いられる、請求項１３に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１５】
前記遺伝子治療は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する易感染性細胞内におけるＨＩＶウイルス感染を予防するための遺伝子治療および／または癌の免疫治療のための遺伝子治療である、請求項１４に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１６】
前記宿主細胞は、前記遺伝子治療を行なう対象となる種類の哺乳類と同種の哺乳類由来の宿主細胞である、請求項１４に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１７】
ヒト以外の哺乳類の遺伝子治療方法であって、請求項１３〜１６のいずれかに記載の形質転換細胞を前記哺乳類へ投与するステップを備える、遺伝子治療方法。
【請求項１８】
ヒト以外の哺乳類の遺伝子治療方法であって、請求項１に記載の組換ウイルスベクターにより、前記哺乳類の体内の宿主細胞を０．０１〜２０の感染多重度（ＭＯＩ）で形質転換するステップを備える、遺伝子治療方法。
【請求項１９】
さらに前記組換ウイルスベクターに備わる外因性ヌクレオチド配列にコードされる遺伝子を発現させるステップを備える、請求項１７または１８に記載の遺伝子治療方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
ＨＨＶ−７のＵ２５は、配列番号２に示すＨＨＶ−７のヌクレオチド番号３６１１８（開始）〜３５１５６（終了）にコードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、ＨＣＭＶのＵＳ２２遺伝子と共通のモチーフをもつ。