(57)【要約】      （修正有）【課題】  ＴＮＰ１遺伝子における変異を検出するための方法、キット、および核酸を提供する。【解決手段】  特定の塩基配列を有する配列の第４０位から第５５位から選択される連続する少なくとも３個の塩基配列を含むプローブの対象核酸とのハイブリダイゼーションによって行われ、該配列の第４０位から第５５位における欠失変異を検出する工程を含む、ヒトＴＮＰ１遺伝子における変異の検出方法、該方法に用いられるキット、および核酸を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３に示される配列から選択される連続する少なくとも１０個の塩基配列を含み、かつ配列番号３の第３９位および第４０位の塩基を含む、核酸。
【請求項２】
配列番号１の第４０位から第５５位における欠失変異を検出する工程を含む、ヒトＴＮＰ１遺伝子における変異の検出方法。
【請求項３】
検出が、配列番号１の第４０位から第５５位から選択される連続する少なくとも３個の塩基配列を含むプローブの対象核酸とのハイブリダイゼーションによって行われる、請求項２記載の検出方法。
【請求項４】
検出が、配列番号１の第４０位から第５５位から選択される連続する少なくとも３個の塩基配列を含むプライマーおよび鋳型として対象核酸を用いた増幅によって行われる、請求項２記載の検出方法。
【請求項５】
検出が、配列番号３に示される配列から選択される連続する少なくとも１０個の塩基配列を含み、かつ配列番号３の第３９位および第４０位の塩基を含むプローブの対象核酸とのハイブリダイゼーションによって行われる、請求項２記載の検出方法。
【請求項６】
検出が、配列番号３に示される配列から選択される連続する少なくとも１０個の塩基配列を含み、かつ配列番号３の第３９位および第４０位の塩基を含むプライマーおよび鋳型として対象核酸を用いた増幅によって行われる、請求項２記載の検出方法。
【請求項７】
検出が、配列番号１の第４０位から第５５位の塩基配列を含む領域を増幅するためのプライマーおよび鋳型として対象核酸を用いた増幅によって行われる、請求項２記載の検出方法。
【請求項８】
配列番号１の第１４６位から第７４７位から選択される連続する少なくとも１０個の塩基配列を含むｍＲＮＡを検出する工程をさらに含む、請求項２記載の方法。
【請求項９】
配列番号２に示されるアミノ酸配列から選択される連続する少なくとも４個のアミノ酸配列を含むタンパク質を検出する工程をさらに含む、請求項２記載の方法。
【請求項１０】
（ｉ）配列番号１の第４０位から第５５位から選択される連続する少なくとも３個の塩基配列を含むプローブ、
（ｉｉ）配列番号１の第４０位から第５５位から選択される連続する少なくとも３個の塩基配列を含むプライマー、
（ｉｉｉ）配列番号３に示される配列から選択される連続する少なくとも１０個の塩基配列を含み、かつ配列番号３の第３９位および第４０位の塩基を含むプローブ、
（ｉｖ）配列番号３に示される配列から選択される連続する少なくとも１０個の塩基配列を含み、かつ配列番号３の第３９位および第４０位の塩基を含むプライマー、および
（ｖ）配列番号１の第４０位から第５５位の塩基配列を含む領域を増幅するためのプライマー、
からなる群より選択される少なくとも１個のプローブまたはプライマーを含む、ヒトＴＮＰ１遺伝子における変異を検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転移核タンパク質（以下、ＴＮＰまたはＴＰともいう）１遺伝子における変異の検出方法、該方法に用いられるキット、核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
子供を望む夫婦のうち約１５％が２年たっても妊娠できないとされている（非特許文献１）。近年の体外受精（ＩＶＦ）の技術的発展により、精子活性が低い場合においても、妊娠・出産が可能である。不妊の背後にある分子メカニズムは依然として明らかになっていない。マウスを用いた雄性不妊研究により、多くの遺伝子の関与が示唆されており（非特許文献２）、これらの遺伝子の変異がヒトの不妊にも関与する可能性がある。
【０００３】
精子完成段階において、円形精子細胞が複雑な形態学的、生理学的、および生化学的修飾を受けて成熟精子が形成される。そしてこれらの特異的現象は、精子完成特異的遺伝子産物によって支持されている（非特許文献３）。具体的には、精子核において、ヒストンの除去、そして種々の核タンパク質によるその置換を含む著しい再編成が行われ、最終的に、ヒト精子のＤＮＡは、高度に正に荷電したプロタミン（ＰＲＭ）により精子頭部に高度に凝集される（非特許文献３）。ヒストンの置換、そしてプロタミンの沈着は、転移核タンパク質（ＴＰ）を含む、主要なクロマチンリモデリングのための異なる核タンパク質によって支持されている（非特許文献４）。ＰＲＭを含むこれらの核塩基性タンパク質のほとんど全てがヒストンＨ１に由来し、哺乳類において複雑な修飾過程を経る（非特許文献５）。これらの核タンパク質のうち、ＰＲＭ１、ＰＲＭ２、およびＴＮＰ２の遺伝子は、１６ｐ１３．１３上でクラスターを形成しており、精子完成の間に発現する（非特許文献６）。ＰＲＭは高度に荷電しており、アルギニンリッチであり、非特異的にＤＮＡと結合する。しかしながら、精子クロマチンの凝集メカニズムは、解明されていない。
【０００４】
一方、ノックアウト動物の作製を目的とするジーンターゲティングの技術により、インビボでの遺伝子機能解析が可能となった。マウスにおけるＰＲＭ１またはＰＲＭ２の破壊により、ＲＰＭ１およびＲＰＭ２タンパク質が妊よう性に重要であること、およびハプロ不全が１つのプロタミン対立遺伝子での変異により引き起こされることが示された（非特許文献７）。また、ＰＲＭ２が破壊されると、形成された精子核はＩＣＳＩを介しても受精できない（非特許文献８）。これらの結果は、ＰＲＭ２が精子完成における核の凝集化過程に重要であることを示している。本願発明者らは、１６ｐ１３．１３上のプロタミン遺伝子クラスターにある、ＰＲＭ１およびＰＲＭ２遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）における一塩基多型（ＳＮＰ）についての従前の研究において、一塩基の置換をもたらす変異が不妊患者群においてＰＲＭ２遺伝子にナンセンス変異を誘起することを見出している（非特許文献９）。ＰＲＭ１またはＰＲＭ２のいずれかのハプロ不全が雄マウスにおいてたとえ半数体精子細胞どうしが半接合状態であっても不妊を引き起こすことが知られていることから、この変異は、ヒトにおいても男性不妊を引き起こすと予測できる。
【０００５】
ＴＮＰ１またはＴＮＰ２のいずれかのマウスヌル変異体は低妊よう性であり（非特許文献１０および１１）、そしてこれらのＴＮＰの両方を欠くマウスは不妊である（非特許文献１２）。これらの結果は、塩基性タンパク質ＴＮＰ１、ＴＮＰ２が、精子完成における核形成において重要な役割を果たすことを示している。しかしながら、ヒトの男性不妊とＴＮＰ遺伝子との関連については知られていなかった。
【非特許文献１】de Kretser DM et al., J Clin Endocrinol Metab. 1999; 84:3443-3450
【非特許文献２】Matzuk MM et al., Nat Cell Biol 2002; 4(Suppl): S41-S49 / Nature Medicine 2002; 8 (Suppl): S33-S40
【非特許文献３】Tanaka H et al., Cell Mol Life Sci 2005; 62: 344-354
【非特許文献４】Meistrich ML et al., Chromosoma 2003;111: 483-488
【非特許文献５】Lewis JD et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2004; 101: 4148-4152
【非特許文献６】Martins RP et al., J Biol Chem 2004; 279: 51862-51868
【非特許文献７】Cho C et al., Nat Genet 2001; 28: 82-86
【非特許文献８】Cho C et al., Biol Reprod 2003; 69: 211-217
【非特許文献９】Tanaka H et al., Mol Hum Reprod 2003; 9: 69-73
【非特許文献１０】Yu YE et al., Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 4683-4688
【非特許文献１１】Zhao M et al., Mol Cell Biol 2001; 21: 7243-7255
【非特許文献１２】Zhao M et al., Genesis 2004; 38: 200-213
【非特許文献１３】Sassone-Corsi. Semin Cell Dev Biol 1998; 9: 475-482
【非特許文献１４】Nantel F et al., Nature 1996; 380: 159-162
【非特許文献１５】Kistler MK et al., Biol Reprod 1994; 51: 1322-1329
【非特許文献１６】Kremling H et al., Differentiation 1989; 40: 184-190
【非特許文献１７】Kistler WS et al., J Biol Chem 1975; 250: 1847-1853
【非特許文献１８】Heidaran MA et al., Gene 1989; 75: 39-46
【非特許文献１９】Akama K et al., Biochem Mol Biol Int 1998; 44:315-323
【非特許文献２０】Schlicker M et al., Hum Reprod 1994; 9:2313-2317
【非特許文献２１】Birmingham A. Fertil Steril 2004; 82 SYPPL. 1: S9-S12
【非特許文献２２】Sambrook J et al., Isolation of DNA from Mammalian Cells. New York: Cold Spring Harbor Press. 1989: pp. 9.16-9.21
【非特許文献２３】Luerssen H et al., Genomics 1990; 8: 324-330
【非特許文献２４】Keyeux G et al., Genomics 1989; 5: 431-441
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の主な目的は、ＴＮＰ１遺伝子における変異を検出するための方法、キット、および核酸を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、転移核タンパク質ＴＰ１の遺伝子における変化の保有率を検討した。５５２人の男性（妊よう性評価を受けた２８２人の不妊患者および２７０人の妊よう性確認ボランティア）からのＤＮＡサンプルを分析した。本発明者らは、ＴＮＰ１転写ユニットのプロモーター領域中のＣＲＥ転写因子の認識部位（非特許文献１３）の欠失変異を見出した。サイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）応答配列モジュレーター（ＣＲＥＭ）は、ＣＲＥ転写因子の認識部位に結合することによって精子完成の調節において重要な役割を担っている（非特許文献１４）。ＣＲＥＭ欠損マウスは精巣重量の減少および精液中成熟精子の完全な欠如を示す。精子完成の間に発現する多くの遺伝子のプロモーター領域は、精子完成において遺伝子発現を調節しているＣＲＥ転写因子の認識部位を含んでいる（非特許文献１３）。ＴＮＰ１中のＣＲＥ転写因子の認識部位の欠失はＴＮＰ１  ｍＲＮＡの発現を劇的に低下させる（非特許文献１５）。ＴＮＰ１はマウスにおける精子完成の間の核形成において重要な役割を担っている（非特許文献１０）。ＴＮＰ１およびＴＮＰ２についてのマウスヌル変異体は低妊よう性であるが（非特許文献１０）、この欠失がヒト男性不妊に関連している可能性がある。
【０００８】
すなわち、本発明は、
（１）配列番号３に示される配列から選択される連続する少なくとも１０個の塩基配列を含み、かつ配列番号３の第３９位および第４０位の塩基を含む、核酸、
（２）配列番号１の第４０位から第５５位における欠失変異を検出する工程を含む、ヒトＴＮＰ１遺伝子における変異の検出方法、
（３）検出が、配列番号１の第４０位から第５５位から選択される連続する少なくとも３個の塩基配列を含むプローブの対象核酸とのハイブリダイゼーションによって行われる、（２）記載の検出方法、
（４）検出が、配列番号１の第４０位から第５５位から選択される連続する少なくとも３個の塩基配列を含むプライマーおよび鋳型として対象核酸を用いた増幅によって行われる、（２）記載の検出方法、
（５）検出が、配列番号３に示される配列から選択される連続する少なくとも１０個の塩基配列を含み、かつ配列番号３の第３９位および第４０位の塩基を含むプローブの対象核酸とのハイブリダイゼーションによって行われる、（２）記載の検出方法、
（６）検出が、配列番号３に示される配列から選択される連続する少なくとも１０個の塩基配列を含み、かつ配列番号３の第３９位および第４０位の塩基を含むプライマーおよび鋳型として対象核酸を用いた増幅によって行われる、（２）記載の検出方法、
（７）検出が、配列番号１の第４０位から第５５位の塩基配列を含む領域を増幅するためのプライマーおよび鋳型として対象核酸を用いた増幅によって行われる、（２）記載の検出方法、
（８）配列番号１の第１４６位から第７４７位から選択される連続する少なくとも１０個の塩基配列を含むｍＲＮＡを検出する工程をさらに含む、（２）記載の方法、
（９）配列番号２に示されるアミノ酸配列から選択される連続する少なくとも４個のアミノ酸配列を含むタンパク質を検出する工程をさらに含む、（２）記載の方法、および
（１０）（ｉ）配列番号１の第４０位から第５５位から選択される連続する少なくとも３個の塩基配列を含むプローブ、
（ｉｉ）配列番号１の第４０位から第５５位から選択される連続する少なくとも３個の塩基配列を含むプライマー、
（ｉｉｉ）配列番号３に示される配列から選択される連続する少なくとも１０個の塩基配列を含み、かつ配列番号３の第３９位および第４０位の塩基を含むプローブ、
（ｉｖ）配列番号３に示される配列から選択される連続する少なくとも１０個の塩基配列を含み、かつ配列番号３の第３９位および第４０位の塩基を含むプライマー、および
（ｖ）配列番号１の第４０位から第５５位の塩基配列を含む領域を増幅するためのプライマー、
からなる群より選択される少なくとも１個のプローブまたはプライマーを含む、ヒトＴＮＰ１遺伝子における変異を検出するためのキット、
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、ＴＮＰ１遺伝子における変異を検出するための方法、キット、および核酸が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
精子完成の間での体細胞型ヒストンからプロタミンへの置換によるクロマチン凝集に関与する多量に発現する塩基性核タンパク質として、２つのＴＰが同定されている（非特許文献４）。ＴＰ１のアミノ酸配列は種々の哺乳動物間で高度に保存されている（非特許文献１６）。ＴＰ１の分子量は約６２００であり、約２０％のアルギニンおよび２０％のリジンが一様に分布しており、システイン残基は存在しない（非特許文献１７）。ＴＮＰ１は２つのＰＲＭ遺伝子やＴＮＰ２遺伝子とは別の染色体上に存在する（非特許文献１８）。生化学的分析により、ＴＰ１が二本鎖ＤＮＡのディネイチャリングの融点を低下させることが示されている（非特許文献１９）。２つのＴＰタンパク質が精子完成の間のクロマチンリモデリングにおいて異なる役割を担っていることが示唆されている。
【００１１】
一般にＴＮＰ１またはＴＮＰ２遺伝子の欠損はマウスにおいて不妊を導かないが、ＴＮＰ１欠損マウスの中に不妊の雄が複数見出される（非特許文献１０）。ＴＮＰ１およびＴＮＰ２両方の欠損は産仔数の減少を生じる（非特許文献１２）。これら２つの遺伝子が互いに機能的に補うという考えが、ＴＰ１およびＴＰ２の生化学的特徴付けおよび発現キネティクスから考えられる。しかし、おそらくなんらかの他のタンパク質の発現レベルの差に起因して、ＴＮＰ１ヌルマウスはＴＰ１欠損をＴＰ２で完全には補うことができない（非特許文献４）。ＴＰ（特にＴＰ１）がマウスの精子完成において重要な役割を担っていることは明らかである。しかし、ヒトの精子形成におけるＴＰの機能は完全には理解されていない。ヒトの精子形成におけるＴＰの役割を研究する必要がある。
【００１２】
ＴＰ１遺伝子周囲の領域（プロモーターユニットを含む）におけるＳＮＰを解析した。本発明者らは、不妊患者の１人のプロモーター領域中のＣＲＥ転写因子の認識部位の欠失に着目した。ＣＲＥ転写因子の認識部位はＴＮＰ１の転写において重要な役割を担っている（非特許文献１５）。ＴＮＰ１プロモーター領域はヒト、ラット、マウスで保存されており、哺乳動物において重要であると考えられている（非特許文献１５）。この変異はＴＮＰ１  ｍＲＮＡの発現を劇的に低下させるか、そうでなければＳｐ１転写因子の認識部位を含む変異プロモーターが精子完成の間のＴＮＰ１の発現時期を乱し得る。さらに、この変異が、体細胞（例えば、セルトリ細胞）におけるＴＮＰ１の発現を誘導、攪乱することによって精子完成に影響を及ぼす可能性がある。ヒトにおいて、ＴＰ１のアミノ酸配列は高度に保存されている。ＴＰ１はマウスにおけるよりもヒトにおいて精子完成に重要である可能性がある。ＴＮＰ１のプロモーター領域のＣＲＥ転写因子の認識部位における変異は男性不妊の原因であると考えられる。
【００１３】
ＴＮＰ１の転写開始部位の５’上流領域中の他のＳＮＰの保有率は不妊性集団と妊よう性コントロール集団について差がなかった。Ａ×５またはＡ×６ストレッチが転写開始部位の５’上流領域中に同定された。この領域は特定の機能を有していないかもしれず、容易に欠失するアデニンストレッチ、すなわちＡ×５およびＡ×６のＤＮＡ構造は互いに非常に類似している。ＮＣＢＩ  ｄｂＳＮＰｓに見られるＳＮＰの一部は本研究において見出されなかった。この同定されなかったＳＮＰはＮＣＢＩ  ｄｂＳＮＰｓに登録された遺伝子座の民族性を反映しているのかもしれない。
【００１４】
以前、Ｓｃｈｌｉｃｋｅｒら（非特許文献２０）は、精子核中のヒストンの存在を示した３６人の不妊男性中のＰＲＭ１、ＰＲＭ２またはＴＮＰ１の遺伝子を調べた結果、変異を検出しなかった。本発明者らによる合計５５２人の男性のＴＮＰ１  ＤＮＡ配列の解析において、２８２人の特発性不妊男性の中に、ＴＮＰ１プロモーター領域中のＣＲＥ転写因子の認識部位の欠失を検出した。ヒトＴＮＰ１遺伝子は、プロタミン遺伝子がそうであるように高度に保存されている。対照的に、プロタミン遺伝子クラスター中のＴＮＰ２遺伝子はプロタミン遺伝子よりも多くのＳＮＰを有しているようである。これらの結果は、ヒト精子核の形成においてＴＰ１がＴＰ２よりも重要な役割を有していることを示唆する。不妊症例のより大きな集団および規定されたＳＮＰ家系を使用したさらなる研究によって、ＴＮＰ遺伝子多形と男性不妊との間の因果関係が確認されるはずである。
【００１５】
本発明は、１の態様において、配列番号１の第４０位から第５５位における欠失変異を検出する工程を含む、ヒトＴＮＰ１遺伝子における変異の検出方法に関する。本発明の方法において配列番号１の第４０位から第５５位における欠失変異の検出は、いずれの手段によって行われてもよいが、例えば、以下によって行うことができる：（１）配列番号１の第４０位から第５５位から選択される連続する塩基配列を含むプローブの対象核酸とのハイブリダイゼーション；（２）配列番号１の第４０位から第５５位から選択される連続する塩基配列を含むプライマーおよび鋳型として対象核酸を用いた増幅；（３）配列番号３に示される配列から選択される連続する塩基配列を含み、かつ配列番号３の第３９位および第４０位の塩基を含むプローブの対象核酸とのハイブリダイゼーション；（４）配列番号３に示される配列から選択される連続する塩基配列を含み、かつ配列番号３の第３９位および第４０位の塩基を含むプライマーおよび鋳型として対象核酸を用いた増幅；または（５）配列番号１の第４０位から第５５位の塩基配列を含む領域を増幅するためのプライマーおよび鋳型として対象核酸を用いた増幅。ここで、配列番号３の塩基配列は、ヒトＴＮＰ１遺伝子における配列番号１の第４０位から第５５位の塩基配列を欠失した配列を示す。従って、配列番号３の第４０位の塩基は、配列番号１の第５６位の塩基に対応している。配列番号１の第１４６位は転写開始部位であり、転写されるｍＲＮＡにおいて配列番号１の第７４７位のヌクレオチドの後にポリＡが付加される。配列番号１の第１７５位〜第３１３位および第５１４位〜第５３９位にはＴＮＰ１タンパク質がコードされている。その推定アミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００１６】
本発明の検出方法において用いられるプローブまたはプライマーは、ＴＮＰ１遺伝子におけるプロモーター領域の欠失変異（配列番号１の第４０位から第５５位）の存在の有無を特異的に検出できるように適切に設計される。
【００１７】
例えば、（１）および（２）の場合、対象核酸に欠失変異が存在せず、対象核酸が野生型の配列を有する場合にはハイブリダイゼーションまたは増幅が生じ、一方、欠失変異が存在する場合にはハイブリダイゼーションまたは増幅が生じないようにプローブまたはプライマーが設計される。詳細には、例えば、配列番号１の第４０位から第５５位から選択した塩基配列のみからなるプローブまたはプライマーを、ハイブリダイゼーションまたは増幅におけるプローブまたはプライマーとして使用してもよく、あるいは配列番号１の第４０位から第５５位から、それだけでは十分なアニーリングが可能でない長さの塩基配列を選択し、さらにそれに隣接する欠失変異体と野生型とに共通の配列を有するプローブまたはプライマーを、ハイブリダイゼーションまたは増幅におけるプローブまたはプライマーとして使用することができる。
【００１８】
また、（３）および（４）の場合、対象核酸に欠失変異が存在せず、対象核酸が野生型の配列を有する場合にはハイブリダイゼーションまたは増幅が生じず、一方、欠失変異が存在する場合にはハイブリダイゼーションまたは増幅が生じるようにプローブまたはプライマーが設計される。詳細には、欠失変異の連結部に相当する配列番号３の第３９位および第４０位の塩基を含み、かつその両側に、片側の部分だけでは十分なアニーリングが可能ではないが、全体ではアニーリングが可能な長さの塩基配列を有するプローブまたはプライマーを、ハイブリダイゼーションまたは増幅におけるプローブまたはプライマーとして使用することができる。
【００１９】
例えば、プローブまたはプライマーは、少なくとも１０個、好ましくは、１２個以上、より好ましくは、１５個以上、最も好ましくは、２０個以上であって、１００個以下、好ましくは、５０個以下、より好ましくは、４０個以下、最も好ましくは、３０個以下の塩基配列を含む。十分なアニーリングを生じない長さとしては、上記より短い塩基配列、例えば、少なくとも３個、好ましくは、４個以上、より好ましくは５個以上、最も好ましくは、６個以上であって、１６個以下、好ましくは、１４個以下、より好ましくは、１２個以下、最も好ましくは、１０個以下の塩基配列が挙げられる。
【００２０】
さらに、（５）の場合、欠失変異の有無に応じて長さが識別可能な増幅産物を生じるようにプライマーを設計する。この場合、プライマーの配列は配列番号１に示される塩基配列から選択されるものに限定されず、公知のＴＮＰ１遺伝子周辺領域から選択することもできる。このような配列としては、例えばＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号Ｍ５９９２４の下に登録された配列が挙げられる。増幅産物の長さは例えば、アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認することができる。増幅産物の長さは、少なくとも５０塩基、好ましくは、６０塩基以上、より好ましくは、７０塩基以上、最も好ましくは、８０塩基以上であって、７００塩基以下、好ましくは、６００塩基以下、より好ましくは、５００塩基以下、最も好ましくは、４００塩基以下である。
【００２１】
対象核酸としては、ＴＮＰ１遺伝子の欠失を有する可能性のある任意の核酸が用いられる。例えば、男性不妊患者から得られた組織、血液、細胞などに由来するゲノムＤＮＡを対象核酸として使用することができる。
【００２２】
上記プローブおよびプライマーの設計方法は、例えば、対象核酸の塩基配列、目的とする特異的ハイブリダイゼーションあるいは増幅などの条件に応じて当業者は適宜選択できる。例えば、Ｏｌｉｇｏ［登録商標］（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．）、ＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発）などの市販のソフトウエアを用いて行ってもよい。本発明に用いられるプローブおよびプライマーの製造方法は、既知の方法、例えば、ホスホロアミダイト法の化学的合成方法などを用いることができる。
【００２３】
上記ハイブリダイゼーションは、例えば、ストリンジェントな条件下で行われる。ここで、ストリンジェントな条件とは、プローブと対象核酸との選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェントな条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、およびその他公知の条件によって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシーは増加する。例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、ＮａＣｌ約７５０ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約７５ｍＭ以下、より好ましくはＮａＣｌ約５００ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約５０ｍＭ以下、最も好ましくはＮａＣｌ約２５０ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約２５ｍＭ以下である。ストリンジェントな有機溶媒濃度は、ホルムアミド約３５％以上、最も好ましくは約５０％以上である。ストリンジェントな温度条件は、約３０℃以上、より好ましくは約３７℃以上、最も好ましくは約４２℃以上である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）の濃度、およびキャリアーＤＮＡの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。１つの好ましい態様としては、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、および１％  ＳＤＳの条件で、３０℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。より好ましい態様としては、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、１％  ＳＤＳ、３５％  ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌ  変性サケ精子ＤＮＡの条件で、３７℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。最も好ましい態様としては、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、１％  ＳＤＳ、５０％  ホルムアミド、２００μｇ／ｍｌ  変性サケ精子ＤＮＡの条件で、４２℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。また、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少および温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。例えば、洗浄のためのストリンジェントな塩条件は、好ましくはＮａＣｌ約３０ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約３ｍＭ以下、最も好ましくはＮａＣｌ約１５ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約１．５ｍＭ以下である。洗浄のためのストリンジェントな温度条件は、約２５℃以上、より好ましくは約４２℃以上、最も好ましくは約６８℃以上である。１つの好ましい態様としては、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、および０．１％  ＳＤＳの条件で、２５℃の温度により洗浄を行う。より好ましい態様としては、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、および０．１％  ＳＤＳの条件で、４２℃の温度により洗浄を行う。最も好ましい態様としては、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、および０．１％  ＳＤＳの条件で、６８℃の温度により洗浄を行うことである。
【００２４】
ハイブリダイゼーションの存在を検出する手段は、いずれのものであってもよく、当業者は適宜選択して用いることができる。かかる検出を容易にするために、上記プローブは、例えば、蛍光標識、酵素標識、放射性標識など検出可能な標識を有していてもよい。
【００２５】
上記増幅は、当業者に既知の方法、例えば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法、ＮＡＳＢＮ（Nucleic acid sequence based amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-mediated amplification）法、およびＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法などを用いて行うことができる。増幅産物は、例えば、電気泳動法を用いて直接的に検出されてもよいし、あるいは例えば、増幅産物に対するプローブなどを用いて間接的に検出されてもよい。
【００２６】
ＴＮＰ１中のＣＲＥ転写因子の認識部位の欠失はＴＮＰ１遺伝子の発現に影響を及ぼすと考えられるので、さらにＴＮＰ１の転写産物および／または翻訳産物を検出することによって、この変異の存在を確認することができる。従って、本発明の検出方法は、配列番号１の第１４６位から第７４７位から選択される連続する塩基配列を含むｍＲＮＡを検出する工程、および／または配列番号２に示されるアミノ酸配列から選択される連続するアミノ酸配列を含むタンパク質を検出する工程をさらに含んでいてもよい。例えば、上記ｍＲＮＡは、配列番号１の第１４６位から第７４７位から選択される連続する、少なくとも１０個、好ましくは、１２個以上、より好ましくは、１５個以上、最も好ましくは、２０個以上であって、１００個以下、好ましくは、５０個以下、より好ましくは、４０個以下、最も好ましくは、３０個以下の塩基配列を含む。例えば、上記タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列から選択される連続する、少なくとも４個、好ましくは、６個以上、より好ましくは、８個以上、最も好ましくは、１０個以上であって、５５個以下、好ましくは、４０個以下、より好ましくは、３０個以下、最も好ましくは、２０個以下のアミノ酸配列を含む。
【００２７】
配列番号１の第１４６位から第７４７位から選択される連続する塩基配列を含むｍＲＮＡの検出は、当業者に既知の手段、例えば、上記塩基配列に特異的なプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲなどの増幅法を用いて該ｍＲＮＡを増幅し、この増幅産物を確認することにより、あるいは上記塩基配列に特異的なプローブを使用するノーザンブロット法、ハイブリダイゼーション法などを用いることにより行うことができる。
【００２８】
配列番号２に示されるアミノ酸配列から選択される連続するアミノ酸配列を含むタンパク質の検出は、当業者に既知の手段、例えば、上記アミノ酸配列に特異的な抗体を用いるウエスタンブロット法、またはＥＬＩＳＡ法などによって行うことができる。抗体には、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、それらの全体分子、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片などが全て含まれる。このような抗体は、例えば、ポリクローナル抗体の場合には、抗原ペプチドまたはその一部断片を免疫原として動物を免疫した後、血清から得ることができる。あるいは、発現ベクターを注射または遺伝子銃によって、動物の筋肉または皮膚に導入した後、血清を採取することによって作成することができる。
【００２９】
本発明者らは、ヒト男性不妊患者のＴＮＰ１遺伝子において、プロモーター領域中のＣＲＥ転写因子の認識部位の欠失変異を見出した。この変異はＴＮＰ１  ｍＲＮＡの発現を劇的に低下させると考えられる。このように、本願によってヒトの男性不妊とＴＮＰ１遺伝子との関連が示された。本発明によれば、ＴＮＰ１遺伝子の転写産物および／または翻訳産物を検出することによるヒトの男性不妊の病因の同定・診断、効果的な治療方法の提示が可能となる。
【００３０】
本発明は、もう１つの態様において、
（ｉ）配列番号１の第４０位から第５５位から選択される連続する塩基配列を含むプローブ、
（ｉｉ）配列番号１の第４０位から第５５位から選択される連続する塩基配列を含むプライマー、
（ｉｉｉ）配列番号３に示される配列から選択される連続する塩基配列を含み、かつ配列番号３の第３９位および第４０位の塩基を含むプローブ、
（ｉｖ）配列番号３に示される配列から選択される連続する塩基配列を含み、かつ配列番号３の第３９位および第４０位の塩基を含むプライマー、および
（ｖ）配列番号１の第４０位から第５５位の塩基配列を含む領域を増幅するためのプライマー、
からなる群より選択される少なくとも１個のプローブまたはプライマーを含む、ヒトＴＮＰ１遺伝子における変異を検出するためのキットに関する。
【００３１】
本発明のキットは、例えば、上記の本発明の検出方法、すなわち配列番号１の第４０位から第５５位における欠失変異を検出する工程を含む、ヒトＴＮＰ１遺伝子における変異の検出方法に用いることができる。本発明のキットを用いることで、ヒトＴＮＰ１遺伝子における変異を容易かつ簡便に検出することができる。プローブおよびプライマーの設計方法、製造方法、および長さについては上述の通りである。本発明のキットにおいて、上記プローブ、プライマーは標識されたものであってもよい。本発明のキットは、上記プローブまたはプライマーのほかに、標識、反応容器、検出試薬を含んでいてもよい。一般的には、キットには取扱説明書を添付する。本発明のキットは、さらにＴＮＰ１  ｍＲＮＡを検出するためのプローブまたはプライマー、ＴＮＰ１タンパク質を認識する抗体を含んでもよい。
【００３２】
本発明は、さらにもう１つの態様において、配列番号３に示される配列から選択される連続する塩基配列を含み、かつ配列番号３の第３９位および第４０位の塩基を含む、核酸に関するものである。本発明の核酸は、ＴＮＰ１中のＣＲＥ転写因子の認識部位の欠失変異の５’側および３’側に隣接する塩基、すなわち配列番号３の第３９位および第４０位の塩基を含み、かつ配列番号３に示される配列から選択される連続する、例えば、少なくとも１０個、好ましくは、１２個以上、より好ましくは、１５個以上、最も好ましくは、２０個以上であって、１００個以下、好ましくは、５０個以下、より好ましくは、４０個以下、最も好ましくは、３０個以下の塩基配列を含むものである。本発明の核酸は、当業者に公知の手段・方法により得ることができる。
【００３３】
本発明の核酸は、例えば、上記検出方法、配列番号１の第４０位から第５５位における欠失変異を検出する工程を含む、ヒトＴＮＰ１遺伝子における変異の検出方法に用いることができる。ここで、本発明の核酸は、ＴＮＰ１遺伝子における変異を特異的に検出可能である限り、上記塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有する核酸、上記塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を示す塩基配列を有する核酸、上記塩基配列を有する核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を包含する。
【００３４】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例１】
【００３５】
材料および方法
参加者
日本人の不妊被験者（Ｎ＝２８２）を精子形成欠損の程度に従ってサブグループに分割した：これらの患者のうち１９２人（６８％）は非閉塞性無精子症であり、９０人（３２％）は重症精子過少症であった（＜５×１０６細胞／ｍＬ）。遺伝子研究に基づけば被験者は原発性特発性不妊症であった（非特許文献２１）。妊よう性男性のコントロールグループ（Ｎ＝２７０）は産婦人科医院にいる妊婦のもとに生まれた子供の父親である男性からなった。ドナーはその血液を本研究においてゲノムＤＮＡの解析に使用することに同意した。
【００３６】
ＰＣＲ増幅ＤＮＡのダイレクトシーケンシングによるＴＮＰ１遺伝子における変異の同定
ゲノムＤＮＡを、プロテアーゼ処理およびフェノール抽出を使用して血液サンプルから単離した（非特許文献２２）。２セットのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー、ＴＮＰ１Ａ−ＴＮＰ１ＢおよびＴＮＰ１Ｃ−ＴＮＰ１Ｄを、ＴＮＰ１遺伝子を増幅するために設計した。ＴＮＰ１Ａ−ＴＮＰ１Ｂプライマーセットは、転写開始部位（配列番号１の１４６位、非特許文献２３）の上流−７８５位から−７５７位までのＴＮＰ１Ａ（５’−ＣＡＣＡＧＴＡＴＣＴＡＣＧＴＧＴＧＴＴＴＡＴＣＣＴＣＣＡＣ−３’；配列番号４）および転写開始部位の上流−１５２位から−１７１位までのＴＮＰ１Ｂ（５’−ＧＴＧＣＡＧＣＴＣＡＡＧＧＧＣＴＧＣＣＣ−３’；配列番号５）を含んだ。ＴＮＰ１Ｃ−ＴＮＰ１Ｄプライマーセットは、転写開始部位の上流−２４４位から−２１７位までのＴＮＰ１Ｃ（５’−ＧＧＣＴＧＧＧＡＴＴＣＡＧＴＴＴＣＴＣＡＡＴＡＡＣＡＣＣ−３’；配列番号６）および下流７２４位から７４８位までのＴＮＰ１Ｄ（５’−ＴＡＣＧＧＴＧＧＴＧＧＧＡＧＧＧＡＡＴＴＧＧＡＧＧ−３’；配列番号７）を含んだ。以下のＰＣＲ条件を使用した：９８℃で１０秒間変性、６２℃で３０秒間アニーリング、および７２℃で１分間伸長を３５サイクル（ＴＮＰ１Ａ−ＴＮＰ１Ｂ）；および９８℃で１０秒間変性、６０℃で３０秒間アニーリング、および７２℃で６０秒間伸長を３５サイクル（ＴＮＰ１Ｃ−ＴＮＰ１Ｄ）。ＰＣＲ増幅フラグメントをＳＵＰＲＥＣ  ＰＣＲスピンカラム（タカラバイオ）を使用して精製した。ＴＮＰ１Ａ−ＴＮＰ１ＢおよびＴＮＰ１Ｃ−ＴＮＰ１Ｄ  ＤＮＡのフラグメントを、独立して両端から同じＰＣＲプライマーを使用し、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）から購入したサーマルサイクルシーケンシングキットを用いて配列決定した。両方向からの配列決定の結果に基づいてＴＮＰ１Ａ−ＴＮＰ１ＢおよびＴＮＰ１Ｃ−ＴＮＰ１ＤのＤＮＡ配列を比較した。反応産物をＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ）を使用して解析した。
【００３７】
統計解析
実験・コントロール状態間の差異をフィッシャーの有意差検定を用いた一元配置分散分析を使用して比較した。有意差（Ｐ＜  .０５）を本明細書において考察する。
【００３８】
結果
ＴＮＰ１遺伝子変異の解析
２セットのＰＣＲプライマーを使用して、不妊および妊よう性確認被験者のＴＮＰ１遺伝子配列（ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ２９７０４；非特許文献２４）を解析した。ＰＣＲ増幅ＤＮＡのダイレクトシーケンシングを血液サンプル由来のゲノムＤＮＡを使用して実施した。ＰＣＲ増幅した１５３３ｂｐのＤＮＡフラグメントには、ＴＮＰ１のプロモーター領域および２００ヌクレオチドのイントロンが含まれていた（図１）。従って、本発明者らはこの１５３３ｂｐのＤＮＡフラグメントのうち、プライマー間の１４８０ｂｐの配列内に位置する変異を同定することができた。ＳＮＰ保有率を不妊男性および妊よう性確認男性について比較した。
【００３９】
転写開始部位上流−９１位から−１０６位（配列番号１の第４０位から第５５位）におけるヘテロ接合型欠失が無精子症患者の１人においてのみ観察され、これは２７０人の妊よう性コントロールには存在しなかった。この変異は、ＴＮＰ１のハプロイド特異的発現のためのＣＲＥ転写因子の認識部位中に欠失を導入するものである。ＣＲＥ転写因子の認識部位はＴＮＰ１の発現に重要であるので、無精子症を引き起こし得る。
【００４０】
さらに、本発明者らは、転写開始部位上流領域中（−６９４〜−６９８（転写開始点を＋１とする、以下同様）Ａ×６＞Ａ×５、−３６４Ｃ＞Ｔ（ＮＣＢＩ  ｄｂＳＮＰｓ  ｒｓ番号ｒｓ１１７９７３４）、−２５８Ｇ＞Ａ、−２２２Ａ＞Ｇ）、ＴＮＰ１  ｍＲＮＡ中（５４Ａ＞Ｃ、５５Ｇ＞Ａ）、イントロン中（２４３Ｔ＞Ｃ）にＳＮＰを見出した。ＮＣＢＩ  ｄｂＳＮＰｓに登録されたＳＮＰの１つ、ｒｓ１１７９７３３（−６８７Ｃ＞Ｇ）は本研究においては見出されなかった。ＧｅｎＢａｎｋに登録された配列Ｍ５９９２４中の転写開始部位上流−２４５位から−２３９位の領域（ＧＧＧＣＴＧＧ）は本研究において見出されたものとは異なっていた。本研究において見出された３つのＳＮＰ（−２２２Ａ＞Ｇ、５４Ａ＞Ｃ、および５５Ｇ＞Ａ）は多数型のホモ接合型またはヘテロ接合型ＳＮＰのいずれかであり、少数型のホモ接合型ＳＮＰは見られなかった。ＳＮＰは妊よう性確認ボランティアに比較して不妊患者において有意に高い保有率を示さなかった。同様に、上流領域中のＳＮＰ（転写開始部位上流−６９４位から−６８９位におけるヌクレオチド配列ＡＡＡＡＡ（Ａ×５）またはＡＡＡＡＡＡ（Ａ×６）、−３６４Ｃ＞Ｔおよび−２５８Ｇ＞Ａ）は妊よう性確認ボランティアに比較して不妊患者において有意に高い保有率を示さなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明により、ＴＮＰ１遺伝子における変異を検出するための方法、キット、および核酸が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】転移核タンパク質遺伝子（ＴＮＰ１）のゲノムＤＮＡ配列を示す図である。ＴＮＰ１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の推定アミノ酸配列をＤＮＡ配列の下に示す（非特許文献２３）。ＣＲＥ、Ｓｐ１の認識部位およびＴＡＴＡヌクレオチド配列に下線を付している。一塩基多形（ＳＮＰ）を陰影を付した文字で示し、少数型の対立遺伝子をヌクレオチドの下方に示す。右側の数字は転写開始部位を＋１とした場合のヌクレオチドの位置を示し、ＤＮＡ配列の下の星印は転写開始部位（＊）およびポリＡ付加シグナル（＊＊＊＊＊＊）を示し、イントロンを四角で囲んでおり、−１０６位から−９１位の陰影を付した配列は不妊男性患者において見出された欠失領域を示す。
【図１】
2007089409.tif 000002
【配列表】
2007089409000001.app