(57)【要約】【課題】本発明は、マハタ親魚の成熟・排卵誘導ホルモン剤にLHRHaを採用し、また、その持続性を高め、徐放投与を可能にする徐放性製剤を使用し、ホルモン剤の投与には簡便な手法を用いることで、安定的、効率的かつ簡便な採卵方法を提供する。【解決手段】合成黄体形成ホルモン放出ホルモン（LHRHa：des-Gly10,[D-Ala6]-LHRH ethylamide）の徐放投与を可能にする徐放性製剤にカカオバター油性製剤を使用し、LHRHaを含む油性製剤は注射投与を行い、LHRHaの投与量は20〜100μg/kg BWとし、マハタ親魚は人為的環境下で養殖した養成親魚を用い、その卵巣卵の卵径が420〜550μmの個体を使用し、ホルモン処理後の採卵は人工授精により行うことにより、マハタ親魚から安定的、効率的かつ簡便に良質な受精卵を得ることを可能にした。【選択図】図3
2007254434.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成黄体形成ホルモン放出ホルモン（LHRHa：des-Gly10,[D-Ala6]-LHRH ethylamide）の徐放投与を可能にする徐放性製剤にカカオバター油性製剤を使用し、LHRHaを含む油性製剤は注射投与を行い、LHRHaの投与量は20〜100μg/kg BWとし、マハタ親魚は人為的環境下で養殖した養成親魚を用い、その卵巣卵の卵径が420〜550μmの個体を使用し、ホルモン処理後の採卵は人工授精により行うことにより、マハタ親魚から安定的、効率的かつ簡便に良質な受精卵を得ることを特徴としたカカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導法。
【請求項２】
LHRHaカカオバター油性製剤は、LHRHaを50％エチルアルコールに溶解させ、カカオバターとLHRHa溶液との質量比が95：5 〜70：30のものである請求項1記載のカカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導法。
【請求項３】
LHRHaカカオバター油性製剤は、0.1 mlあたりLHRHaを50〜200μg含むものである請求項1記載のカカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導法。
【請求項４】
LHRHaカカオバター油性製剤は、サンプル瓶等に収容後、-20℃以下で保存可能であり、再び使用する際には、湯煎等により溶解させることで使用可能である請求項1記載のカカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導法。
【請求項５】
LHRHaカカオバター油性製剤は、マハタ親魚の筋肉内または腹腔内に注射投与することを特徴とした請求項1記載のカカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導法。
【請求項６】
LHRHaカカオバター油性製剤は、マハタ親魚の筋肉内または腹腔内に注射投与された後、マハタ親魚の産卵期成熟水温の17〜23℃で凝固し、LHRHaを長期間持続的に溶出させる徐放性製剤となることを特徴とした請求項1記載のカカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導法。
【請求項７】
LHRHaカカオバター油性製剤の注射投与に使用する針は、目詰まりを防止するために18〜21Gの比較的針穴が大きいものを使用する請求項1記載のカカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導法。
【請求項８】
LHRHaカカオバター油性製剤のマハタ親魚への注射投与回数は1回である請求項1記載のカカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導法。
【請求項９】
マハタ親魚は、当該産卵期において、自然環境下で未だ排卵していない個体を用いる請求項1記載のカカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導法。
【請求項１０】
マハタ親魚は、成熟・排卵誘導が可能な5歳魚以上かつ魚体重2 kg以上の個体を用いる請求項1記載のカカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マハタ親魚からのホルモン処理採卵において、安定的、効率的かつ簡便に種苗生産用の良質な受精卵を得ることを目的とした新規の成熟・排卵誘導方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでのマハタを対象にしたホルモン投与による成熟・排卵誘導では、HCG（ヒト胎盤性生殖腺刺激ホルモン）溶液やSP（シロザケ脳下垂体）溶液およびHCG・SP混合液の注射投与が主に行われ、種苗生産用の受精卵を得ていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、HCG溶液、SP溶液およびHCG・SP混合液の注射を行っても、安定的かつ効率的に良質な受精卵を得ることは難しく、たとえ良質な受精卵を得たとしてもその再現性が低かった。
【０００４】
一般に魚類へのホルモン剤の水溶液による注射法では、その体内濃度は吸収後急速に増加するものの、その後は速やかに分解されるため、ホルモンの持続効果が短い。マハタでは、ホルモン処理後42-48時間経過しないと排卵しないが、それまでの間、ホルモンの処理効果が持続する手法を用いることで、採卵成績が向上する可能性がある。
【０００５】
一方、近年では、魚類の成熟・排卵促進に合成黄体形成ホルモン放出ホルモン（LHRHa：des-Gly10,[D-Ala6]-LHRH ethylamide）が使用されはじめ、その成熟・排卵誘導効果が高いことが明らかとなってきている。
【０００６】
そこで、本発明は、マハタ親魚の成熟・排卵誘導ホルモン剤にLHRHaを採用し、また、その持続性を高め、徐放投与を可能にし、かつホルモン投与法や徐放性製剤の作製が容易である新規の安定的，効率的かつ簡便な採卵方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、発明者らは、LHRHaの徐放性製剤として、カカオバター溶液を作製し、マハタ親魚に対するその成熟・排卵誘導効果を各種試験により、明らかとした結果、本発明のカカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導法を見出すに至った。
【０００８】
請求項１の発明は、合成黄体形成ホルモン放出ホルモン（LHRHa：des-Gly10,[D-Ala6]-LHRH ethylamide）の徐放投与を可能にする徐放性製剤にカカオバター油性製剤を使用し、LHRHaを含む油性製剤は注射投与を行い、LHRHaの投与量は20〜100μg/kg BWとし、マハタ親魚は人為的環境下で養殖した養成親魚を用い、その卵巣卵の卵径が420〜550μmの個体を使用し、ホルモン処理後の採卵は人工授精により行うことにより、マハタ親魚から安定的、効率的かつ簡便に良質な受精卵を得ることを特徴とする。
【０００９】
請求項２の発明は、請求項１において、LHRHaカカオバター油性製剤は、LHRHaを50％エチルアルコールに溶解させ、カカオバターとLHRHa溶液との質量比が95：5 〜70：30のものである。
【００１０】
請求項３の発明は、請求項１において、LHRHaカカオバター油性製剤は、0.1 mlあたりLHRHaを50〜200μg含むものである。
【００１１】
請求項４の発明は、請求項１において、LHRHaカカオバター油性製剤は、サンプル瓶等に収容後、-20℃以下で保存可能であり、再び使用する際には、湯煎等により溶解させることで使用可能である。
【００１２】
請求項５の発明は、請求項１において、LHRHaカカオバター油性製剤は、マハタ親魚の筋肉内または腹腔内に注射投与することを特徴とする。
【００１３】
請求項６の発明は、請求項１において、LHRHaカカオバター油性製剤は、マハタ親魚の筋肉内または腹腔内に注射投与された後、マハタ親魚の産卵期成熟水温の17〜23℃で凝固し、LHRHaを長期間持続的に溶出させる徐放性製剤となることを特徴とする。
【００１４】
請求項７の発明は、請求項１において、LHRHaカカオバター油性製剤の注射投与に使用する針は、目詰まりを防止するために18〜21Gの比較的針穴が大きいものを使用する。
【００１５】
請求項８の発明は、請求項１において、LHRHaカカオバター油性製剤のマハタ親魚への注射投与回数は1回である。
【００１６】
請求項９の発明は、請求項１において、マハタ親魚は、当該産卵期において、自然環境下で未だ排卵していない個体を用いる。
【００１７】
請求項１０の発明は、請求項１において、マハタ親魚は、成熟・排卵誘導が可能な5歳魚以上かつ魚体重2 kg以上の個体を用いる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のカカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導法によれば、これまで良質な受精卵の確保が困難であったマハタおいて、従来法（HCG・SP混合液等の注射法）と比較して、より安定的に種苗生産用の受精卵が確保できるという有利な効果を奏する。
【００１９】
本発明のカカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導法によれば、LHRHaペレット埋め込み投与法と比較して、そのホルモン投与作業が容易であり、また、その徐放性製剤の作製が簡便で、かつ経費の負担も少ないことから、現在、事業ベースで生産を行っている種苗生産機関に対して、広く技術普及できるという有利な効果を奏する。
【００２０】
また、本発明のカカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導法によれば、安定的、効率的かつ簡便に良質な受精卵を得ることが可能となることから、それに伴うマハタ人工種苗の大量生産が実現し、養殖生産用のマハタ種苗を切望している魚類養殖業の発展が期待されるという有利な効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明のマハタ親魚の成熟・排卵誘導法では、LHRHaの徐放投与を可能にするカカオバター油性製剤を作製し、使用する。
【００２２】
LHRHaカカオバター油性製剤の作製方法（図１）は、まず、LHRHaを50％エチルアルコールに溶解させる。
【００２３】
また、カカオバターは、サンプル瓶等の容器に入れ、湯煎（約60℃）により溶解させる。
【００２４】
溶解したカカオバターは40℃程度に冷ました後、すでに作製していたLHRHa溶液と混合、攪拌し、均一化させる。
【００２５】
完成したLHRHaカカオバター油性製剤は、直ちに使用することも可能だが、-20℃以下の冷凍庫にて保存しておくことも可能である。冷凍保管しておいたLHRHaカカオバター油性製剤は、湯煎等により再び溶解させることで使用可能であり、冷凍前と同等の成熟・排卵誘導効果を示す。
【００２６】
LHRHaカカオバター油性製剤は、カカオバターとLHRHaエチルアルコール溶液との質量比が95:5〜70:30のものが考えられるが、その中でも魚体内へ投与後の固形化状況を考慮すると、質量比は90:10が良い。あまりにもLHRHaエチルアルコール溶液の質量比が大きいと魚体内での固形化に時間を要し、予想外のLHRHaの溶出量を示すことが考えられる。
【００２７】
また、LHRHaカカオバター油性製剤の0.1 mlあたりのLHRHa含有量は、マハタ親魚に使用する場合、50〜200μg が考えられるが、その中でも50〜100μgが良い。仮にLHRHaのマハタ親魚への投与量を50μg/kg BWとすると、親魚の体重が6 kgの場合はLHRHaが300μg必要となる。カカオバター0.1 mlあたりのLHRHa含有量が50μgの場合は0.6 ml、100μgの場合は0.3 ml注射投与することとなる。また、仮に、カカオバター0.1 mlあたりのLHRHa含有量を10μgと少なくした場合には、LHRHaカカオバターの注射投与量が3 mlとなり、親魚へのストレスが大きくなる。逆に、カカオバター0.1 mlあたりのLHRHa含有量を600μgと多くした場合には、注射投与量が0.05 mlとなり、油性製剤の取り扱いや正確な注射投与作業が困難となる。もちろん、LHRHaがカカオバター油性製剤から溶出する条件も極端に変わり、期待した徐放量、徐放期間が実現しない可能性がある。
【００２８】
LHRHaカカオバター油性製剤の注射投与には、比較的針穴が大きい18〜21Gの注射針と1〜5 mlのシリンジを使用した注射投与器（図２）を使用すると良い。LHRHaカカオバター油性製剤は、17〜23℃で凝固するので速やかに注射投与を行うためには、比較的針穴が大きい注射針を用いないと投与作業中にカカオバターが針穴内で凝固し、投与できなくなる。
【００２９】
LHRHaカカオバター油性製剤の注射投与部分は、マハタ親魚の筋肉内および腹腔内が考えられるが、特に背筋部の肉厚な部分に皮下1〜2cm程度の深さで実施するのが良い（図３）。
【００３０】
LHRHaカカオバター油性製剤は、腹腔内にも注射投与可能だが、内臓等を傷つける可能性がある。したがって、よりマハタ親魚へのストレスを軽減し、迅速に注射投与を行うためには、その投与部分は、魚体背筋部の肉厚な部分が適していると考えられる。
【００３１】
LHRHaカカオバター油性製剤の注射投与の際は、まず、マハタ親魚を麻酔後、注射投与を行うが、シリンジ内のカカオバター油性製剤は粘性が高く、筋肉内に浸透しにくいため、魚体の注射部からもれないように注意する。カカオバター油性製剤の注入はゆっくり行い、予定量を注射後は必要であれば指等で抑え、カカオバター油性製剤の逆流を防ぎながら速やかに注射器を引き抜く。
【００３２】
LHRHaカカオバター油性製剤は、注射投与後、マハタ親魚の産卵期成熟水温の17〜23℃で凝固し、魚体内部でLHRHaを長時間持続的に溶出させる徐放性製剤となる（図４）。
【００３３】
LHRHaカカオバター油性製剤のマハタ親魚への注射投与回数は1回で十分である。カカオバターが固形化後、LHRHaが高いレベルで溶出し続ける期間は、概ね5日間であるが、マハタ親魚がLHRHaの注射投与により排卵するまでの時間は42〜48時間であるので、1回の注射投与で十分だと考えられる。仮に、1回の注射投与で親魚の排卵が行われなかった場合は、親魚の成熟状態が未熟であった可能性が高い。
【００３４】
カカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導において、マハタ親魚へのLHRHa投与量は、20〜100μg/kg BWが考えられるが、その中でも50μg/kg BWで、安定的かつ効率的に成熟・排卵が誘導でき、良質な受精卵が得られる。
【００３５】
採卵に使用する親魚は、天然由来および養殖由来が考えられるが、安定的かつ効率的に良質な受精卵を得たい場合は、人為的環境下で養殖した養成親魚を使用する方が良い。
【００３６】
自然界に生息するマハタの親魚は貴重で、生息数も少ない。また、産卵期に漁獲できたとしても、その卵巣卵の成熟状態は様々であり、かつ漁獲によるスレやストレス等の悪影響により、それらの個体から良質な受精卵を得ることは非常に困難である。
【００３７】
一方、養殖された養成親魚は、人為的環境下に慣れ、人のハンドリングにも慣れていることから、卵巣卵の成熟状態も個体間で同調性が高く、ある程度のストレスにも強い。これらのことから、養成親魚を使用した方が、採卵用として適した個体を多数確保でき、良質な受精卵を得ることができる。
【００３８】
カカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導において、LHRHaの注射投与時の親魚は、卵巣卵の卵径が420〜550μmの個体で排卵誘導が可能だが、その中でも卵巣卵の卵径が460〜520μmの個体を使用する方が良い。
【００３９】
卵巣卵の卵径が420μm未満の個体は、LHRHaの注射投与で成熟・排卵が誘導されない未熟な個体で、また420〜460μmの個体は、まだすべての卵がホルモンに対する感受性を持っていないため、成熟・排卵卵数が少ない個体である。
【００４０】
一方、卵巣卵の卵径が550μm以上の個体は、卵巣卵の中に退行卵や排卵卵が多く見られることから、良質な受精卵を得ることが期待できない個体で、また520〜550μmの個体は、卵巣卵の中に退行卵や排卵卵が一部見られ、卵質が悪くなりつつある個体である。これらのことから、採卵に使用する親魚は卵巣卵の卵径が460〜520μmの個体を選定して用いることが望ましい。
【００４１】
マハタ親魚は、人為的環境下において、自然に成熟が進み、6月の産卵後期になると、卵巣卵の一部が排卵した状態となる。このような産卵後期に見られる一部排卵個体では、仮にLHRHaの注射投与を行ったとしても、得られる卵の卵質が安定しない。安定的かつ効率的に良質な受精卵を得たい場合には、当該産卵期において、産卵前期の自然環境下で未だ排卵していない個体を選定して用いることが望ましい。
【００４２】
マハタ親魚の年齢と体重は、雌個体の卵巣が発達する5歳以上、魚体重は2kg以上が良い。その中でも、個体間の成熟が同調し、卵量も多く確保することができる7〜10歳かつ4〜6 kgの個体を選定して用いることが望ましい。
【００４３】
また、カカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導において、LHRHaの注射投与後の採卵は人工授精により行う必要がある。マハタ親魚は、人為的環境下では産卵行動を行わず、仮に雌個体が放卵した場合にも卵は受精しない。水槽内において、完全に自然環境を再現できれば、自然産卵を誘発させることも不可能ではないかもしれないが、現在の親魚養成技術では困難である。これらのことから、マハタ親魚から受精卵を得る場合は、各種ホルモン処理技術を駆使して、人工授精により採卵を行う必要がある。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は、下記実施例に限定して解釈される意図ではない。
【００４５】
実施例１
マハタ親魚の成熟・排卵誘導法において、LHRHaの徐放投与を可能にするカカオバター油性製剤の具体的な作製法を次に示す。
【００４６】
0.1 mlあたりLHRHaを100μg含むカカオバター油性製剤を作製する場合、まず、LHRHa 10 mgを50％エチルアルコール1mlに溶解させる。
【００４７】
カカオバターは湯煎等（約60℃）で溶解し、9 mlを20〜30 ml容量のサンプル瓶等に収容する。溶解したカカオバターは40℃程度に冷ました後、その容器内に先に作製していたLHRHa溶液を添加し、キャップをしめ、上下に振ることで、攪拌、均一化させる。この場合、カカオバターとLHRHa溶液との質量比は90:10である。
【００４８】
このようにして作製したLHRHaカカオバター油性製剤（LHRHa：100μg/0.1 ml）は、10 ml投与分完成する。マハタ親魚に対して、LHRHaを50μg/kg BWの投与量で処理する場合、親魚体重200 kg分の処理量に相当する。
【００４９】
また、0.1 mlあたりLHRHaを50μg含むカカオバター油性製剤を作製する場合は、前出作製方法の中で、LHRHaの添加量を5 mgとすれば良い。このようにして作製したLHRHaカカオバター油性製剤（LHRHa：50μg/0.1 ml ）は、マハタ親魚に対して、LHRHaを50μg/kg BWの投与量で処理する場合、親魚体重100 kg分の処理量が完成することになる。
【００５０】
実施例２
コレステロールペレット固形製剤およびカカオバター油性製剤を用いたLHRHa投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導において、両手法による魚体内血中でのLHRHa溶出量の変化を把握することを目的として、当研究グループが現時点で測定系を確立しているテストステロンを用いて、両手法で投与実験を行い、血中の溶出量の変化を調べた。
【００５１】
本実験には、本来マハタを用いるべきであるが、必要な実験魚の確保が難しかったため、入手が容易であるマゴイを用いた。また、テストステロンは成熟した魚では多量に産生されるため、実験にはテストステロン産生能力の低い魚体重が100g程度の未熟な魚を使用した。
【００５２】
まず、テストステロンを含んだコレステロールペレット固形製剤およびカカオバター油性製剤作製し、テストステロンの埋め込み投与および注射投与を行った。テストステロン投与量は、1尾につき テストステロン濃度が 100μgとした。また、供試魚は実験期間中、水温は20℃で飼育管理した。
【００５３】
テストステロン投与後、 12時間、1日、2日、4日および7日目に採血を行った。採取した血液は、遠心分離により血清を分離後、テストステロン血中溶出量の測定をELISA 法により行った。
【００５４】
テストステロンの血中溶出量の変化を図５に示した。テストステロンの埋め込み投与および注射投与から12時間後のテストステロンの血中溶出量は、コレステロールペレット法で3.4 ng/ml、カカオバター法で 12.3 ng/mlであった。その後は時間の経過とともに減少し、1 週間後の血中溶出量は、コレステロールペレット法で0.4 ng/ml、カカオバター法で1.8 ng/mlであった。カカオバター法は、コレステロールペレット法と比較して常に高い溶出量（約3倍）を示した。
【００５５】
コレステロールペレット固形製剤による埋め込み投与法およびカカオバター油性製剤による注射投与法により、テストステロンを投与した結果、両手法でのテストステロンの血中溶出量に違いが認められた。テストステロンの溶出量は、1週間後まで、カカオバター法がコレステロールペレット法と比較して高い溶出量を示した。マハタがホルモン処理後排卵するまでの時間は、42〜48時間を必要とする。この期間中、排卵に必要なホルモンが徐放性製剤から溶出されれば十分である。したがって、両手法ともホルモンの溶出期間は十分で、有効な徐放性製剤であると考えられた。また、カカオバター油性製剤においてはコレステロールペレット固形製剤よりも約3倍量の溶出量であったことから、ホルモン投与量を1/3程度に削減してもコレステロールペレット法と同等の成熟・排卵誘導効果を得られる可能性がある。
【００５６】
実施例３
カカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導において、本願発明と同時期に開発されたコレステロールペレット固形製剤を用いたLHRHaの埋め込み投与法と本法とのマハタ親魚における成熟・排卵誘導効果を採卵試験により、比較検討した。
【００５７】
比較検討したLHRHa投与による成熟・排卵誘導法は、コレステロールペレット固形製剤の埋め込み投与法およびカカオバター油性製剤を用いた注射投与法である。
【００５８】
コレステロールペレット固形製剤の埋め込み投与法では、ペレット１個につきLHRHaを100 μg/kg含む長さ6 mm、直径2 mmの円柱状のコレステロールペレット固形製剤を作製した。LHRHaコレステロ−ルペレット固形製剤は、親魚を麻酔後、メスで背筋部表皮に切れ込みを入れ、ペレット埋め込み器を用いて背筋部筋肉中に埋め込み投与を行った。
【００５９】
カカオバター油性製剤を用いた注射投与法では、0.1 mlあたりLHRHaを50μg含むカカオバター油性製剤を作製した。LHRHaカカオバター油性製剤は、親魚を麻酔後、注射器を用いて背筋部筋肉中に注射投与を行った。
【００６０】
LHRHaの投与量は、いずれの投与法においても50μg/kg BWとした。
【００６１】
供試魚には、人為的環境下で養殖した養成７歳魚を40個体使用した。供試魚は、麻酔を施し、予めカニューラにより卵巣卵を採取し大型卵30個の卵径を測定した結果、卵径は、415〜544μmであった。
【００６２】
排卵の確認は、HCGおよびLHRHa投与から42時間後に腹部の触診を行い、排卵が確認された個体については、腹部の圧迫による卵の搾出を行い、直ちに乾導法により人工授精を行った。
【００６３】
人工授精により得られた卵は、洗卵した後、浮上卵と沈下卵に分離して容積法（2,200粒/ml）により、浮上卵量を算出した。また、受精率は、浮上卵約100粒のうち発生が進んでいる個体の割合で算出した。ふ化率は、別途200粒を20℃のインキュベーター内の1L容器に収容し、200粒のうちふ化した個体の割合で算出した。
【００６４】
図６にLHRHaのコレステロールペレット固形製剤を用いた埋め込み投与およびカカオバター油性製剤を用いた注射投与による成熟・排卵誘導結果を示す。コレステロールペレット埋め込み投与法では、親魚26尾のうち20尾が排卵し、排卵個体率は76.9％、浮上卵量は63.6万粒、受精率は77.4％およびふ化率は54.8％であった。一方、カカオバター注射投与法では、親魚14尾のうち10尾が排卵し、排卵個体率は71.4％、浮上卵量は60.5万粒、受精率は72.9％およびふ化率は50.4％であった。
【００６５】
これらの結果から、マハタ親魚の成熟・排卵誘導においては、両手法で良好な採卵結果が得られ、マハタ親魚から安定的かつ効率的に良質な受精卵が得られることが明らかとなった。
【００６６】
カカオバター油性製剤を用いた注射投与法においては、LHRHa溶剤を、投与の数十分前に簡単に作製でき、特に道具や設備も必要ない。また、マハタ親魚への投与方法も簡単である。さらに、特別な埋め込み操作を必要としないことから、親魚の負荷も小さく、かつ種苗生産の現場では、作業が容易なため、広く普及しやすく、実用的な方法である。
【００６７】
また、カカオバター油性製剤を用いた注射投与法では、コレステロールペレット固形製剤を用いた埋め込み投与法と同様に高い成熟・排卵誘導効果が確認された。さらに、得られた卵の受精率やふ化率も良好であり、種苗生産用として十分に利用可能であると判断された。
【００６８】
以上のように、カカオバター油性製剤を用いた注射投与法は、本願発明と同時期に開発されたコレステロールペレット埋め込み法の優れた点はそのままに、問題点を解決した画期的な方法であると評価された。
【００６９】
実施例４
カカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導において、親魚へのLHRHa投与量違いによる成熟・排卵誘導効果を調査し、適正なLHRHa投与量の検討を行った。
【００７０】
比較検討したLHRHa投与量は、50および10μg/kg BWである。
【００７１】
カカオバター油性製剤を用いた注射投与法では、0.1 mlあたりLHRHaを50μg含むカカオバター油性製剤を作製した。LHRHaカカオバター油性製剤は、親魚を麻酔後、注射器を用いて背筋部筋肉中に注射投与を行った。
【００７２】
供試魚には、人為的環境下で養殖した養成７歳魚を13個体使用した。供試魚は、麻酔を施し、予めカニューラにより卵巣卵を採取し大型卵30個の卵径を測定した結果、卵径は、422〜507μmであった。
【００７３】
排卵の確認は、HCGおよびLHRHa投与から42時間後に腹部の触診を行い、排卵が確認された個体については、腹部の圧迫による卵の搾出を行い、直ちに乾導法により人工授精を行った。
【００７４】
人工授精により得られた卵は、洗卵した後、浮上卵と沈下卵に分離して容積法（2,200粒/ml）により、浮上卵率、浮上卵量を算出した。また、受精率は、浮上卵約100粒のうち発生が進んでいる個体の割合で算出した。
【００７５】
図７にカカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与において、投与量が50および10μg/kg BWの場合のマハタ親魚の成熟・排卵誘導結果を示す。投与量が50μg/kg BWの場合では、親魚6尾のうち5尾が排卵し、排卵個体率は83.3％、浮上卵率は71.2％、浮上卵量は130.8万粒、および受精率は65.5％であった。一方、投与量が10μg/kg BWの場合では、親魚7尾のうち4尾が排卵し、排卵個体率は57.1％、浮上卵率は58.2％、浮上卵量は42.3万粒、および受精率は60.1％であった。
【００７６】
これらの結果から、カカオバター油性製剤を用いたLHRHaの注射投与法におけるLHRHaの投与量は、10μg/kg BWと比較して50μg/kg BWの方がマハタ親魚の成熟・排卵誘導効果が高く、安定的、効率的かつ簡便に良質な受精卵が得られることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明は、マハタ親魚からの採卵技術の高度化および本種の人工種苗の安定生産を可能とし、水産業における増養殖分野（養殖業および栽培漁業）において、貢献度が極めて高い。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】LHRHaカカオバター油性製剤の作製方法を示す図である。
【図２】LHRHaの徐放投与を可能にするカカオバター油性製剤と注射投与器を示す図である。
【図３】マハタの採卵用親魚およびLHRHaカカオバター油性製剤の注射投与状況を示す図である。
【図４】LHRHaカカオバター油性製剤の注射投与後の魚体内での固形化状況を示す図である。
【図５】カカオバター油性製剤の注射投与法およびコレステロールペレット固形製剤の埋め込み投与法により投与したテストステロンのマゴイ体内における血中溶出量の変化を示す図である。
【図６】LHRHaコレステロールペレット埋め込み投与法およびLHRHaカカオバター注射投与法によるマハタ親魚の成熟・排卵誘導効果を示す図である。
【図７】LHRHaカカオバター注射投与法におけるLHRHa投与量の違いとその成熟・排卵誘導効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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