(57)【要約】【課題】ＮＢＳ修飾ペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、及びそれらの製造方法と、該モノクローナル抗体を用いた抗体カラム、及び該抗体カラムによりＮＢＳ修飾ペプチドを選択的に分離する方法を提供する。【解決手段】ＮＢＳ基を有するトリプトファンを認識するモノクローナル抗体。ＮＢＳ基を有するトリプトファンを認識するモノクローナル抗体の産生能を有するハイブリドーマ細胞。アミノ酸残基を含まないＮＢＳ基含有トリプトファン誘導体を免疫抗原として用いることにより、ハイブリドーマ細胞を作製する方法。前記ハイブリドーマ細胞にモノクローナル抗体を産生させ、モノクローナル抗体を作製する方法。前記モノクローナル抗体を有する抗体カラム。前記抗体カラムを用いてＮＢＳ基を有するトリプトファンを含むペプチドを分離する方法。【選択図】図１１
2007063179.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトロベンゼンスルフェニル基を有するトリプトファンを認識するモノクローナル抗体。
【請求項２】
受託番号FERM P-20495として寄託されているハイブリドーマ細胞によって産生される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
受託番号FERM P-20496として寄託されているハイブリドーマ細胞によって産生される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
ニトロベンゼンスルフェニル基を有するトリプトファンを認識するモノクローナル抗体の産生能を有するハイブリドーマ細胞。
【請求項５】
受託番号FERM P-20495として寄託されている、請求項４に記載のハイブリドーマ細胞。
【請求項６】
受託番号FERM P-20496として寄託されている、請求項４に記載のハイブリドーマ細胞。
【請求項７】
下記式（１）：
【化１】
2007063179.tif 000012
（式中、Ｙ１はアミノ基の保護基、Ｙ２は、アミノ酸残基を含まない鎖状構造を表す）で表されるニトロベンゼンスルフェニル基含有トリプトファン誘導体。
【請求項８】
前記保護基Ｙ１が、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジルオキシカルボニル基、メチル基、及びエチル基から選ばれる、請求項７に記載のトリプトファン誘導体。
【請求項９】
前記鎖状構造Ｙ２が、下記式（２）：
【化２】
2007063179.tif 000013
（式中、ｎは１〜１０の整数である）で表される、請求項７又は８に記載のトリプトファン誘導体。
【請求項１０】
前記鎖状構造Ｙ２が、下記式（３）：
【化３】
2007063179.tif 000014
（式中、Ｚ１は直接結合又は二価の結合基、Ｚ２は直接結合又は二価の結合基、ｍは３〜３０の整数である）で表される、請求項７又は８に記載のトリプトファン誘導体。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれか１項に記載のトリプトファン誘導体と、キャリア高分子化合物との、トリプトファン誘導体−キャリア高分子化合物結合体。
【請求項１２】
請求項７〜１０のいずれか１項に記載のトリプトファン誘導体、又は請求項１１に記載のトリプトファン誘導体−キャリア高分子化合物結合体を免疫抗原として用いる、ニトロベンゼンスルフェニル基を有するトリプトファンを認識するモノクローナル抗体の産生能を有するハイブリドーマ細胞を作製する方法。
【請求項１３】
請求項７〜１０のいずれか１項に記載のトリプトファン誘導体、又は請求項１１に記載のトリプトファン誘導体−キャリア高分子化合物結合体を免疫抗原として用い、ニトロベンゼンスルフェニル基を有するトリプトファンを認識するモノクローナル抗体の産生能を有するハイブリドーマ細胞を作製し、前記ハイブリドーマ細胞に前記モノクローナル抗体を産生させる、ニトロベンゼンスルフェニル基を有するトリプトファンを認識するモノクローナル抗体を作製する方法。
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を有する抗体カラム。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を支持体に固定させることによって抗体カラムを作製する方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の抗体カラムを用いて、ニトロベンゼンスルフェニル基を有するトリプトファンを含むペプチドを分離する方法。
【請求項１７】
前記ニトロベンゼンスルフェニル基を有するトリプトファンを含むペプチドは、トリプトファンを含むペプチドを、ニトロベンゼンスルフェニルクロリドを用いて修飾を行うことによって得られる、請求項１６に記載のペプチドを分離する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテオーム解析（タンパク質の網羅的解析）に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテオーム解析（タンパク質の網羅的解析）分野においては、これまで二次元電気泳動と質量分析装置とを組み合わせたPMF（ペプチドマスフィンガープリンティング）解析法が主流であった。これに代わる次世代のプロテオーム解析法として、例えば、Nature Biotechnology, 994-999, 17, 1999、Molecular & Cellular PROTEOMICS, 299-314, 2, 2003 、及びCurrent Opinion in Chemical Biology, 70-77, 7, 2003に記載されているような、安定同位体を用いた手法が考案されている。
【０００３】
トリプトファンは、タンパク質を構成する２０種類のアミノ酸の中で、タンパク質の機能面或いは活性面で非常に重要な役割を有するアミノ酸である。このため、トリプトファンをターゲットとした解析は、タンパク質の機能解析を行うために非常に有効な手段である。また、トリプトファンは、９０％以上のタンパク質中に構成アミノ酸残基として含まれている。このため、トリプトファンをターゲットとした解析は、タンパク質の網羅的解析を行うために非常に有効な手段である。  
【０００４】
ここで、スルフェニル化合物が、トリプトファン残基の選択的ラベル化試薬として知られている。その中でも、酸性溶液中でトリプトファン残基を選択的に化学修飾する試薬としてＮＢＳＣｌ（２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリド）試薬が、Scoffone E, Fontana A, Rocchi R., Biochem, Biophys. Res. Commu., 1966, 25, 170及びScoffone E, Fontana A, Rocchi R., Biochemistry, 1968, 7, 971によって報告されている。
【０００５】
そして、Rapid Communications in Mass Spectrometry, 1642-1650, 17, 2003及び国際公報第２００４／００２９５０号パンフレットには、本発明者らによって開発された手法（NBS法）が記載されている。NBS法においては、２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリド(NBSCl)の安定同位体標識体（２−ニトロ［13Ｃ6］ベンゼンスルフェニルクロリド）及びその非標識体（２−ニトロ［12Ｃ6］ベンゼンスルフェニルクロリド）を用いる。すなわち、(1)解析すべきタンパク質試料Iとその対照タンパク質試料IIとの２種類の状態のタンパク質試料を用意し、(2)前記タンパク質試料Iを、２−ニトロ［13Ｃ6］ベンゼンスルフェニルクロリド及び２−ニトロ［12Ｃ6］ベンゼンスルフェニルクロリドのいずれか一方を用いて修飾し、別途、前記タンパク質試料IIを、２−ニトロ［13Ｃ6］ベンゼンスルフェニルクロリド及び２−ニトロ［12Ｃ6］ベンゼンスルフェニルクロリドのいずれか他方を用いて修飾し、(3) 修飾されたタンパク質試料I及び修飾されたタンパク質試料IIを混合し、(4)得られた修飾タンパク質混合物を還元・アルキル化した後、修飾ペプチド断片と非修飾ペプチド断片とを含むペプチド混合物へ消化し、(5)ペプチド混合物から修飾ペプチド断片を、疎水クロマトグラフィーカラムを用いて濃縮分離し、(6)質量分析を行う。
【０００６】
【非特許文献１】スティーブン・Ｐ・ギジ（Steven P. Gygi）、ビート・リスト（Beate Rist）、スコット・Ａ・ゲーバー（Scott A. Gerber）、フランチシェク・タレチェク（Frantisek Turecek）、ミヒャエル・Ｈ・ゲルブ（Michael H. Gelb）、及びルディー・エバーソルド（Ruedi Aebersold）著、同位体コードしたアフィニティータグを用いた複雑なタンパク質混合物の定量解析（Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags）、「ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）」、１９９９年、第１７巻、ｐ．９９４−９９９
【非特許文献２】カーク・Ｃ・ハンセン（Kirk C. Hansen）、ジェロルド・シュミット−ウルムス（Gerold Schmitt-Ulms）、ロバート・Ｊ・チョークレー（Robert J. Chalkley）、ヤン・ヒルシュ（Jan Hirsch）、ミヒャエル・Ａ・ボールドウィン（Michael A. Baldwin）、及びＡ・Ｌ・バーリンガム（A. L. Burlingame）著、開裂可能な13Ｃ同位体コードされたアフィニティータグと多次元クロマトグラフィーとを用いた質量分析による低レベルタンパク質混合物の解析（Mass Spectrometric Analysis of Protein Mixtures at Low Levels Using Cleavable 13C-Isotope-coded Affinity Tag and Multidimensional Chromatography）、「モレキュラー・アンド・セルラー・プロテオミクス（Molecular & Cellular PROTEOMICS）」、２００３年、第２巻、ｐ．２９９−３１４
【非特許文献３】スコフォン・Ｅ（Scoffone E）、フォンタナ・Ａ（Fontana A）及びロッチ・Ｒ（Rocchi R）著、「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochemical and Biophysical Research Communications）」、１９６６年、第２５巻、ｐ．１７０
【非特許文献４】スコフォン・Ｅ（Scoffone E）、フォンタナ・Ａ（Fontana A）及びロッチ・Ｒ（Rocchi R）著、「バイオケミストリー（Biochemistry）」、１９６８年、第７巻、ｐ．９７１
【非特許文献５】サルバトーレ・セチ（Salvatore Sechi）及びヨシヤ・オダ（Yoshiya Oda）著、マススペクトロメトリーを用いた定量的プロテオミクス（Quantitative proteomics using mass spectrometry ）、「カレント・オピニオン・イン・ケミカル・バイオロジー（Current Opinion in Chemical Biology）」、（英国）、２００３年、第７巻、ｐ．７０−７７
【非特許文献６】九山浩樹（Hiroki Kuyama）、渡辺真（Makoto Watanabe）、戸田千香子（Chikako Toda）、安藤英治（Eiji Ando）、田中耕一（Koichi Tanaka）及び西村紀（Osamu Nishimura）著、トリプトファン残基のラベル化による定量的プロテオーム解析法（An Approach to Quantitative Proteome Analysis by Labeling Tryptophan Residues）「ラピッド・コミュニケーションズ・イン・マス・スペクトロメトリー（Rapid Communications in Mass Spectrometry）」、２００３年、第１７巻、ｐ．１６４２−１６５０
【特許文献１】国際公報第２００４／００２９５０号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来法では、ＮＢＳＣｌ試薬で修飾されたトリプトファン含有ペプチド（ＮＢＳ修飾ペプチド）を濃縮（精製）するために、担体としてC18(ODS)又はSephadex LH-20を用いて逆相分離を行っている。しかしながら、これらの方法は、当該ペプチドの分離能・再現性にばらつきが見られ、測定結果において不安定性などの種々の影響が生じることがある。したがって、目的分子である当該ペプチドを特異的に濃縮することは困難となることがあった。
【０００８】
そこで本発明の目的は、ＮＢＳ修飾ペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、及びそれらの製造方法と、該モノクローナル抗体を用いた抗体カラム、及び該抗体カラムによりＮＢＳ修飾ペプチドを選択的に分離する方法を提供することにある。  
【０００９】
本発明は、以下の発明を含む。
下記＜１＞〜＜３＞は、モノクローナル抗体に関する。
【００１０】
＜１＞  ニトロベンゼンスルフェニル基を有するトリプトファンを認識するモノクローナル抗体。
＜２＞  受託番号FERM P-20495として寄託されているハイブリドーマ細胞によって産生される、＜１＞に記載のモノクローナル抗体。
＜３＞  受託番号FERM P-20496として寄託されているハイブリドーマ細胞によって産生される、＜１＞に記載のモノクローナル抗体。
【００１１】
下記＜４＞〜＜６＞は、ハイブリドーマ細胞に関する。
＜４＞  ニトロベンゼンスルフェニル基を有するトリプトファンを認識するモノクローナル抗体の産生能を有するハイブリドーマ細胞。
＜５＞  受託番号FERM P-20495として寄託されている、＜４＞に記載のハイブリドーマ細胞。
＜６＞  受託番号FERM P-20496として寄託されている、＜４＞に記載のハイブリドーマ細胞。
【００１２】
下記＜７＞〜＜１３＞は、免疫抗原として用いることができる化合物に関する。
【００１３】
＜７＞  下記式（１）：
【００１４】
【化４】
2007063179.tif 000003
【００１５】
（式中、Ｙ１はアミノ基の保護基、Ｙ２は、アミノ酸残基を含まない鎖状構造を表す）で表されるニトロベンゼンスルフェニル基含有トリプトファン誘導体。
【００１６】
＜８＞  前記保護基Ｙ１が、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジルオキシカルボニル基、メチル基、及びエチル基から選ばれる、＜７＞に記載のトリプトファン誘導体。
【００１７】
＜９＞  前記鎖状構造Ｙ２が、下記式（２）：
【００１８】
【化５】
2007063179.tif 000004
【００１９】
（式中、ｎは１〜１０の整数である）で表される、＜７＞又は＜８＞に記載のトリプトファン誘導体。
【００２０】
＜１０＞  前記鎖状構造Ｙ２が、下記式（３）：
【００２１】
【化６】
2007063179.tif 000005
【００２２】
（式中、Ｚ１は直接結合又は二価の結合基、Ｚ２は直接結合又は二価の結合基、ｍは３〜３０の整数である）で表される、＜７＞又は＜８＞に記載のトリプトファン誘導体。
【００２３】
＜１１＞  ＜７＞〜＜１０＞のいずれかに記載のトリプトファン誘導体と、キャリア高分子化合物との、トリプトファン誘導体−キャリア高分子化合物結合体。
【００２４】
下記＜１２＞は、ハイブリドーマ細胞の作製法に関する。
＜１２＞  ＜７＞〜＜１０＞のいずれかに記載のトリプトファン誘導体、又は＜１１＞に記載のトリプトファン誘導体−キャリア高分子化合物結合体を免疫抗原として用いる、ニトロベンゼンスルフェニル基を有するトリプトファンを認識するモノクローナル抗体の産生能を有するハイブリドーマ細胞を作製する方法。
【００２５】
下記＜１３＞は、モノクローナル抗体の作製法に関する。
＜１３＞  ＜７＞〜＜１０＞のいずれかに記載のトリプトファン誘導体、又は＜１１＞に記載のトリプトファン誘導体−キャリア高分子化合物結合体を免疫抗原として用い、ニトロベンゼンスルフェニル基を有するトリプトファンを認識するモノクローナル抗体の産生能を有するハイブリドーマ細胞を作製し、前記ハイブリドーマ細胞に前記モノクローナル抗体を産生させる、ニトロベンゼンスルフェニル基を有するトリプトファンを認識するモノクローナル抗体を作製する方法。
【００２６】
下記＜１４＞〜＜１７＞は、抗体カラム、その作製法、及びそれを用いたペプチド分離法に関する。
＜１４＞  ＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載のモノクローナル抗体を有する抗体カラム。
＜１５＞  ＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載のモノクローナル抗体を支持体に固定させることによって抗体カラムを作製する方法。
【００２７】
＜１６＞  ＜１４＞に記載の抗体カラムを用いて、ニトロベンゼンスルフェニル基を有するトリプトファンを含むペプチドを分離する方法。
＜１７＞  前記ニトロベンゼンスルフェニル基を有するトリプトファンを含むペプチドは、トリプトファンを含むペプチドを、ニトロベンゼンスルフェニルクロリドを用いて修飾を行うことによって得られる、＜１６＞に記載のペプチドを分離する方法。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によると、ＮＢＳ修飾ペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、及びそれらの製造方法と、該モノクローナル抗体を用いた抗体カラム、及び該抗体カラムによりＮＢＳ修飾ペプチドを選択的に分離する方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明は、ニトロベンゼンスルフェニル基を有するトリプトファンを認識するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体の産生能を有するハイブリドーマ、該モノクローナル抗体及び該ハイブリドーマの作製において免疫抗原として用いることができる化合物、該化合物を用いた該モノクローナル抗体及び該ハイブリドーマの作製方法、該モノクローナル抗体を有する抗体カラム、該抗体カラムの作製方法、及び、該抗体カラムを用いたペプチドの分離方法を提供する。
【００３０】
本発明のモノクローナル抗体の認識構造、すなわちニトロベンゼンスルフェニル基（ＮＢＳ基）を有するトリプトファンの構造は、下記式のとおりである。下記式に示す認識構造においては、トリプトファンのインドール環にＮＢＳ基が結合している。式中、Ｘ１及びＸ２は任意の基である。例えば、ペプチド中の認識構造である場合、Ｘ１としては、水素原子、アミノ基の保護基、アミノ酸、ペプチド鎖などが挙げられる。また、同様の場合、Ｘ２としては、水酸基、カルボキシル基の保護基、アミノ酸、ペプチド鎖等が挙げられる。ベンゼン環上のニトロ基の置換位置は任意であるが、例えば２−ニトロ置換体などが挙げられる。
【００３１】
本発明におけるモノクローナル抗体は、例えば、この構造が構成要素として含まれるペプチド鎖などを特異的に認識することができる。本発明のモノクローナル抗体の具体例としては、免疫グロブリンクラスとしてＩｇＧ１に属し、軽鎖としてκ鎖を保有するものである。
【００３２】
【化７】
2007063179.tif 000006
【００３３】
本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなモノクローナル抗体の産生能を有するものである。本発明のハイブリドーマ細胞の一例としては、平成１７年４月８日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、受託番号FERM P-20495として寄託されたもの、及び、平成１７年４月８日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、受託番号FERM P-20496として寄託されたものが挙げられる。
【００３４】
本発明のモノクローナル抗体又はハイブリドーマ細胞は、適当な化合物を免疫抗原として用い、通常のモノクローナル抗体の作製法又はハイブリドーマ細胞作製法に基づいて作製することができる。
免疫抗原として用いる化合物は、通常のモノクローナル抗体の作製に用いられる免疫抗原のように、１０〜２０アミノ酸の合成ペプチドを免疫抗原とすることができるが、本発明では、抗原部位をニトロベンゼンスルフェニル基（ＮＢＳ基）含有トリプトファン残基に絞りこむため、下記式（１）のようなトリプトファン誘導体を免疫抗原として用いることが好ましい。
【００３５】
【化８】
2007063179.tif 000007
【００３６】
式（１）に示す化合物は、ＮＢＳ基含有トリプトファンを有し、その他のアミノ酸残基を含まないものである。ＮＢＳ基は、トリプトファンのインドール環に結合している。また、式中、Ｙ１はアミノ基の保護基、Ｙ２はアミノ酸残基を含まない鎖状構造を表す。
【００３７】
ベンゼン環上のニトロ基の置換位置は任意であるが、例えば２−ニトロ置換体などが挙げられる。たとえば、上記認識構造を、２−ニトロ置換体とする場合は、免疫抗原として用いる化合物も２−ニトロ置換体とする。その他の位置異性体についても同様に、認識構造と免疫抗原とは、同じ位置異性体とする。
【００３８】
式（１）の化合物は、トリプトファンのアミノ基が適当な保護基Ｙ１で保護されている。保護基Ｙ１は、Ｎ末端の電荷に対して特異的な抗体ができることを防ぐ。従って、保護基Ｙ１としては特に限定されることはない。例えば、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジルオキシカルボニル基、メチル基、エチル基などを挙げることができ、好ましくは、アセチル基が挙げられる。
【００３９】
式（１）の化合物においては、トリプトファンのカルボキシル基に、アミノ酸残基を含まない鎖状構造Ｙ２が結合している。鎖状構造Ｙ２とカルボキシル基との結合様式としては、エステル結合やペプチド結合などが挙げられる。また、式（１）のトリプトファン誘導体が、キャリアタンパク質などのキャリア高分子化合物と結合した結合体の状態で免疫抗原として用いられる場合、鎖状構造Ｙ２は、トリプトファンのカルボキシル基と結合している方の末端とは反対側の末端に、キャリア高分子化合物と結合することができる基を有する。鎖状構造は、炭素数を例えば６〜９０とすることができる。
【００４０】
鎖状構造Ｙ２の具体例としては、下記式（２）に示すように、ε−アミノカプロン酸（εＡｈｘ）をモノマー単位とした鎖状構造が挙げられる。式中、ｎは、１〜１０、好ましくは２〜５の整数であり、例えば２とすることができる。
【００４１】
【化９】
2007063179.tif 000008
【００４２】
また、鎖状構造Ｙ２の他の具体例としては、下記式（３）に示すように、エチレングリコールをモノマー単位とした鎖状構造（ポリエチレングリコール(PEG)構造）やそれを含む構造が挙げられる。式中、Ｚ１は直接結合又は二価の結合基、Ｚ２は直接結合又は二価の結合基である。Ｚ１及びＺ２において、二価の結合基としては、アミノエチル基（例えば、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−）、ジグリコリルアミノエチルオキシ基（例えば、−ＯＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２ＯＣＨ２ＣＯ−）などが挙げられる。また、このような構造はアミノ酸１０〜１５残基程度の大きさに相当する大きさ程度とすることができる。例えば、式中のｍは、３〜３０、好ましくは５〜２０の整数であり、特に６であることが好ましい。
【００４３】
【化１０】
2007063179.tif 000009
【００４４】
さらに、このほかにもε−アミノカプロン酸とエチレングリコールの両方がモノマー単位として含まれる鎖状構造であっても良い。
【００４５】
鎖状構造が上述の長さより短い場合、例えば以下の可能性が考えられる。本発明では、抗原部分はキャリア高分子化合物に比べて非常に低分子である。キャリア高分子化合物と結合させて免疫抗原を用いる場合、鎖状構造が上述の長さより短いと、抗原部位の分子の自由度が制限されやすくなる傾向を示す可能性が考えられる。
【００４６】
反対に、鎖状構造が上述の長さより長い場合、例えば以下のことが考えられる。本発明では、ＮＢＳ基の存在により、ＮＢＳ基がない場合よりも抗原部分の疎水性が増している。この上に、例えば、ε−アミノカプロン酸をモノマー単位とする鎖状構造のように、長さが伸長するほど疎水性が増すような鎖状構造を採用する場合、鎖状構造が上述の長さより長いと、疎水性が増すために、次のような傾向を示す可能性が考えられる。すなわち、キャリア高分子化合物との結合の際、溶解性が落ち、反応効率が悪くなる傾向を示すことが考えられる。また、鎖状構造が例えばポリエチレングリコール構造を含む場合など、鎖状構造の伸長によって粘性が極めて増大することがあり、操作性が悪くなる傾向を示す可能性が考えられる。
【００４７】
トリプトファンにこのような鎖状構造を導入するためには、対応する適当な鎖状分子又はそのような分子の鎖状骨格を形成することができるモノマーを用い、例えば通常のエステル合成法やペプチド合成法などを用いて結合させると良い。鎖状分子としては、トリプトファンのカルボキシル基と結合することができる基と、上記鎖状構造Ｙ２に相当する適当な長さの有機基とを有しているものであれば特に限定されない。式（１）のトリプトファン誘導体が、キャリアタンパク質などのキャリア高分子化合物と結合した状態で免疫抗原として用いられる場合、カルボキシル基と結合することができる基を有する末端とは反対側の末端に、キャリア高分子化合物と結合することができる基を有しているものが用いられる。例えば、６−アミノカプロン酸や、Ｏ−［２−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ）エチル］−Ｏ’−［２−（ジグリコリルアミノ）エチル］ヘキサエチレングリコール等のポリエチレングリコール誘導体等の化合物を用いることができる。
【００４８】
ＮＢＳ基は、トリプトファンに対し、適当な修飾試薬を作用させることにより導入することができる。例えば、ニトロベンゼンスルフェニル化合物を修飾試薬として用いることができる。ニトロベンゼンスルフェニル化合物としてはハロゲン化物が挙げられ、具体的には、２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリドなどのニトロベンゼンスルフェニルクロリド（ＮＢＳＣｌ）を用いることが好ましい。これら修飾試薬は、安定同位体を構成原子として含んでいても良い。２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリドを用いたトリプトファン残基の修飾方法としては、Rapid Communications in Mass Spectrometry, 1642-1650, 17, 2003及び国際公報第２００４／００２９５０号パンフレットなどに記載の方法が挙げられる。
【００４９】
式（１）のトリプトファン誘導体は、トリプトファンを、保護の工程、鎖状化合物を結合させる工程、及びＮＢＳ基を導入する工程に供することによって調製することができる。トリプトファンが供される工程の順番は特に限定されないが、例えば、上記保護及び鎖状化合物の結合を行った後に、ＮＢＳ基を導入することができる。
【００５０】
式（１）のトリプトファン誘導体は、免疫抗原としては抗原決定基が短いため、抗体価を挙げる手段を用いることが好ましい。そのような手段としては、通常、免疫原性を有するキャリア高分子化合物と結合させる手段が用いられる。このような高分子化合物としては、タンパク質（キャリアタンパク質）がよく用いられる。キャリアタンパク質としては、公知のものを特に限定することなく用いることができる。例えば、アルブミン、ミオグロビン、ヘモシアニンなどが挙げられる。  
【００５１】
キャリア高分子化合物の結合は、保護、鎖状化合物の結合、及びＮＢＳ基の導入を全て行った後に行うことが好ましい。キャリア高分子化合物の結合方法としては、公知の方法を特に限定することなく用いることができる。例えばキャリアタンパク質を結合させる場合、架橋剤或いは結合剤を用いる方法が挙げられる。より具体的には、架橋剤としてm−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル（m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester; MBS）を用い、抗原側に付加しておいたシステイン残基のＳＨ基とキャリアタンパク質側のアミノ基とを反応させ、共有結合を形成させるＭＢＳ法や、縮合剤として１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide; EDC）、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）−カルボジイミド  メチル−ｐ−トルエンスルホネート（N-cyclohexyl-N-(2-morpholinoethyl)carbodiimide methyl-p-toluenesulfonate; CMC）などを用い、カルボジイミドにより活性化された抗原側のＣ末端のカルボキシル基とキャリアタンパク質側のアミノ基とを反応させ、共有結合を形成させるＥＤＣ法などが挙げられる。
【００５２】
このように、トリプトファン誘導体や、適当なキャリア高分子化合物に結合させたトリプトファン誘導体−キャリア高分子化合物結合体は、免疫抗原や固相化抗原として用いることができる。
【００５３】
免疫抗原は、哺乳動物に投与して免疫する。免疫される哺乳動物としては、マウス、ラット、及びその他通常法において用いられる動物を特に限定することなく用いることができる。投与法についても、腹腔内注射、皮下注射、静脈内注射など、通常用いられる方法を特に限定することなく用いることができる。その他、免疫の際の具体的な条件も、当業者が適宜決定することができる。
【００５４】
最終免疫後、抗体産生が確認された動物から、抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞は形質細胞腫の細胞と融合され、ハイブリドーマが得られる。抗体産生細胞としては、脾臓細胞を用いるのが一般的であるが、これに限定されない。形質細胞腫の細胞としては、一般的に入手可能な骨髄腫細胞（ミエローマ）を用いることができる。抗体産生細胞と形質細胞腫細胞との融合反応は、特に限定されることなく、公知の方法によって行うことができる。融合反応は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの融合促進剤を用いて行うと良い。また、電気処理（電気融合）による方法を用いることもできる。その他、細胞融合における諸条件は、当業者が適宜決定することができる。
【００５５】
得られたハイブリドーマは、所望の抗体の産生能を確認するためスクリーニングに供される。スクリーニング法としては、通常の方法を特に限定することなく用いることができる。例えば、上記の免疫抗原を用いて酵素免疫測定法により行うことができる。
【００５６】
ハイブリドーマのクローニングは、通常の方法により行うことができる。例えば、限界希釈法、軟寒天法、ソータークローン法などを用いることができる。
【００５７】
クローニングされたハイブリドーマは大量培養される。これにより、モノクローナル抗体を得ることができる。例えば、通常の細胞培養法によって培養上清として得ることができる。また、腹水形成法によって腹水又は血清として得ることができる。
【００５８】
本発明のモノクローナル抗体は、トリプトファンを含有するタンパク質の細胞や組織レベルでの発現、局在に関する知見などが得られる非常に広い分野で利用することができる。例えば、本発明のモノクローナル抗体は抗体カラムに用いることができる。  
【００５９】
本発明の抗体カラムは、ＮＢＳ基含有トリプトファンを特異的に認識するモノクローナル抗体をリガンドとしたアフィニティーカラムである。モノクローナル抗体は抗原認識が一つであることから、非常に高い特異性を発揮する。抗体カラムの作製法としては、特に限定されず、通常の方法によって、本発明のモノクローナル抗体を直接的又は間接的に固相支持体へ固定化させれば良い。このようにして得られた抗体カラムにより、例えばＮＢＳ基含有トリプトファン残基を含むペプチドの分離精製を行うことができる。この場合、ＮＢＳ基含有トリプトファン残基を含むペプチドは、通常、トリプトファン残基を含むペプチドにＮＢＳ基を導入するための修飾を行うことによって得たものである。
【００６０】
ＮＢＳ基は、トリプトファンに対し、適当な修飾試薬を作用させることにより導入することができる。例えば、ニトロベンゼンスルフェニル化合物を修飾試薬として用いることができる。ニトロベンゼンスルフェニル化合物としてはハロゲン化物が挙げられ、具体的には、２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリド（２−ＮＢＳＣｌ）を用いることが好ましい。これら修飾試薬は、安定同位体を構成原子として含んでいても良い。２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリドを用いたトリプトファン残基の修飾方法としては、Rapid Communications in Mass Spectrometry, 1642-1650, 17, 2003及び国際公報第２００４／００２９５０号パンフレットなどに記載の方法が挙げられる。
【００６１】
本発明の抗体カラムは、トリプトファンをターゲットとしたタンパク質解析において、例えばペプチド中のトリプトファンを予めＮＢＳＣｌなどの修飾試薬を用いて修飾することによって、トリプトファンを含有するペプチドの効率的且つ安定的な精製を可能にする。このため、本発明の抗体カラムは、タンパク質の機能解析やタンパク質の網羅的解析に大きく貢献することができる。
【実施例】
【００６２】
［実験例１］  
＜抗原ペプチド様分子の合成＞
島津製作所製ペプチド合成機・PSSM-8を用いてＡｃ−Ｔｒｐ−εＡｈｘ−εＡｈｘ−ＯＨ及びＡｃ−Ｔｒｐ−ＰＥＧ−ＯＨの２種類のペプチド様分子を合成した。Ａｃ−Ｔｒｐ−εＡｈｘ−εＡｈｘ−ＯＨは、鎖状分子として６−アミノカプロン酸を用いて合成し、Ａｃ−Ｔｒｐ−ＰＥＧ−ＯＨは、鎖状分子としてＯ−［２−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ）エチル］−Ｏ’−［２−（ジグリコリルアミノ）エチル］ヘキサエチレングリコール（O-[2-(9-fluorenylmethyloxycarbonylamino)ethyl]-O’-[2-(diglycolylamino)ethyl]hexaethylene glycol）を用い、Fmoc法によって合成した。
【００６３】
合成したＡｃ−Ｔｒｐ−εＡｈｘ−εＡｈｘ−ＯＨ  １２ｍｇと２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリド（２−ＮＢＳＣｌ）試薬９２ｍｇとを、７０％酢酸水溶液（v/v）中において室温で一晩反応させた。反応後、高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、前記ペプチド様分子のＮＢＳラベル化体（Ａｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−εＡｈｘ−εＡｈｘ−ＯＨ；下記式４）の精製物７ｍｇを得た。同様に、合成したＡｃ−Ｔｒｐ−ＰＥＧ−ＯＨ  １７ｍｇとＮＢＳＣｌ試薬９０ｍｇとの反応及び精製を行い、１０．７ｍｇのＮＢＳラベル化ペプチドの精製物（Ａｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−ＰＥＧ−ＯＨ；下記式５）を得た。
【００６４】
【化１１】
2007063179.tif 000010
【００６５】
【化１２】
2007063179.tif 000011
【００６６】
＜キャリアタンパク質との結合＞
精製した２種のＮＢＳラベル化ペプチドの各々について、カルボジイミド法により、２種類のキャリアタンパク質、ＢＳＡ及びThyroglobulin（以下、ThyroglobulinをＴＧと略す）のいずれかと結合させることによって、４種類の免疫用抗原、Ａｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−εＡｈｘ−εＡｈｘ−ＢＳＡ、Ａｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−εＡｈｘ−εＡｈｘ−ＴＧ、Ａｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−ＰＥＧ−ＢＳＡ、及びＡｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−ＰＥＧ−ＴＧを得た。ここで、免疫用抗原を得るために用いたカルボジイミドは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）である。
【００６７】
別途、精製した２種ＮＢＳラベル化ペプチドの各々について、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）−カルボジイミド  メチル−ｐ−トルエンスルホネート（CMC）を用いたカルボジイミド法によって、前記２種類のタンパク質のいずれかに結合させ、４種のＥＬＩＳＡ用抗原を得た。
【００６８】
＜免疫・抗体価測定・特異性確認＞
ＢＡＬＢ／ｃマウス（Charles River Japan、雌・４週齢）を、一週間以上予備飼育を行った。免疫用抗原のＰＢＳ溶液（１ｍｇ/ｍｌ）と、ＦＣＡ（完全フロイントアジュバント）（Cappel社製）とを等量混合してエマルジョンを調製した。エマルジョンを、マウスの皮下数箇所に０．２ｍｌずつ投与することにより免疫を行った。追加免疫は、２週間間隔で実施し、抗体価が上昇したと判断されるまで実施した。なお、２回目以降の抗原投与においては、不完全フロイントアジュバントを使用した。
【００６９】
眼叢静脈より毛細管を用いて試採血を行い、採取した血液は室温下で数時間静置した後、３０００×ｇで３０分間遠心分離を行った。得られた血清画分に、０．１％ＮａＮ３水溶液（w/v）を添加し、４℃で保存を行った。
【００７０】
抗体価測定は、免疫用抗原に対応したＥＬＩＳＡ用抗原を固相化し、免疫前血清及び試採血血清の希釈系列（１０００倍からの２倍希釈系列）についてＥＬＩＳＡで測定を行った。その結果を図１〜４に示す。
【００７１】
図１は、免疫抗原としてＡｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−εＡｈｘ−εＡｈｘ−ＴＧを、固相化抗原としてＡｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−εＡｈｘ−εＡｈｘ−ＢＳＡを用いた場合の結果（横軸：抗血清の希釈倍率(Dilution of Anti Serum)（×１，０００）、縦軸：４５０ｎｍにおける吸光度(ABS at 450nm)）である。図２は、免疫抗原としてＡｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−ＰＥＧ−ＴＧを、固相化抗原としてＡｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−ＰＥＧ−ＢＳＡを用いた場合の結果（横軸：抗血清の希釈倍率(Dilution of Anti Serum)（×１，０００）、縦軸：４５０ｎｍにおける吸光度(ABS at 450nm)）である。図３は、免疫抗原としてＡｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−εＡｈｘ−εＡｈｘ−ＢＳＡを、固相化抗原としてＡｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−εＡｈｘ−εＡｈｘ−ＴＧを用いた場合の結果（横軸：抗血清の希釈倍率(Dilution of Anti Serum)（×１，０００）、縦軸：４５０ｎｍにおける吸光度(ABS at 450nm)）である。図４は、免疫抗原としてＡｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−ＰＥＧ−ＢＳＡを、固相化抗原としてＡｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−ＰＥＧ−ＴＧを用いた場合の結果（横軸：抗血清の希釈倍率(Dilution of Anti Serum)（×１，０００）、縦軸：４５０ｎｍにおける吸光度(ABS at 450nm)）である。
【００７２】
ＢＳＡをキャリアタンパク質に用いた２つの免疫用抗原（図３及び４）は、ＴＧをキャリアタンパク質に用いた２つの免疫用抗原（図１及び図２）よりも明らかに抗体価が低い結果となった。
【００７３】
また、特異性の確認のために、ＷＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨ（配列番号１）及びＷ(ＮＢＳ)ＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨ（配列番号２）をそれぞれ阻害剤として用いた間接競合阻害ＥＬＩＳＡを行った。ここでは、図１〜図４の結果から抗体価が高いと判断した、ＴＧをキャリアタンパク質に用いた２つの免疫用抗原に関して行った。
【００７４】
阻害剤を用いた間接競合阻害ＥＬＩＳＡは、以下のように行った。免疫用抗原に対応したＥＬＩＳＡ用抗原を固相化し、試採血血清の希釈液と阻害剤の多段階希釈液との１：１（v/v）混合液を一次抗体の反応に用いた。なお、希釈倍率は、抗体価測定時の最大吸光度の１/２となる倍率を目安にした。
【００７５】
間接競合阻害ＥＬＩＳＡの結果を図５及び図６に示す。
図５は、免疫抗原にＡｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−εＡｈｘ−εＡｈｘ−ＴＧを、固相化抗原にＡｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−εＡｈｘ−εＡｈｘ−ＢＳＡを用いた場合の結果（横軸：阻害剤の濃度(Conc. of Inhibitor)（ｎｇ/ｍｌ）、縦軸：４０５ｎｍにおける吸光度(Abs. at 405 nm)）である。図５の試採血血清の希釈倍率は、Ｎｏ．１及びＮｏ．３が×１００００、Ｎｏ．２が×５０００、Ｎｏ．５が×２００００である。図５中、白の（Open）ドットは、阻害剤としてＷＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨを、黒の（Closed）ドットは、阻害剤としてＷ（ＮＢＳ）ＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨを用いた場合の結果である。
【００７６】
図６は、免疫抗原にＡｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−ＰＥＧ−ＴＧを、固相化抗原にＡｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−ＰＥＧ−ＢＳＡを用いた場合の結果（横軸：阻害剤の濃度(Conc. of Inhibitor)（ｎｇ/ｍｌ）、縦軸：４０５ｎｍにおける吸光度(Abs. at 405 nm)）である。図６の試採血血清の希釈倍率は、Ｎｏ．１が×４００００、Ｎｏ．２が×１５０００、Ｎｏ．３が×２００００、Ｎｏ．４が×１００００、Ｎｏ．５が×３００００である。図６中、白の（Open）ドットは、阻害剤としてＷＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨを、黒の（Closed）ドットは、阻害剤としてＷ（ＮＢＳ）ＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨを用いた場合の結果である。
【００７７】
試採血血清中に阻害剤と反応する抗体が含まれていれば、阻害剤の濃度が高いほど、阻害剤と反応する抗体が増え、ＥＬＩＳＡプレートに固相化された抗原と反応できる抗体量が減少し、吸光度が低下する。すなわち、Ｗ(ＮＢＳ)ＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨを阻害剤に用いた場合に、濃度依存的に吸光度が変化する一方で、ＷＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨを阻害剤に用いた場合に、吸光度の変化がなければ、ＮＢＳ基含有トリプトファンに対する特異的な抗体の存在を確認することができる。
【００７８】
抗体価の試験結果（図１〜図４）及び特異性確認の試験結果（図５及び図６）から、Ａｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−εＡｈｘ−εＡｈｘ−ＴＧを免疫した図５のＮｏ．５のマウス（「ＡＴ５」とする）と、Ａｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−ＰＥＧ−ＴＧを免疫した図６のＮｏ．１及び図６のＮｏ．５のマウス（それぞれ「ＢＴ１」及び「ＢＴ５」とする）とを、細胞融合に供するマウスに選定した。
【００７９】
＜細胞融合＞
ＡＴ５、ＢＴ１及びＢＴ５のそれぞれのマウスについて、以下のように細胞融合を行った。
ミエローマを、１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含有するＩＭＤＭ培地（v/v）にて対数増殖期（５×１０5/ｍｌ前後）に保ちながら培養を開始した。
細胞融合３日前に、免疫用抗原（５０μｇ/０．２ｍｌＰＢＳ）をマウスの尾静脈に投与した。最終免疫３日後のマウスについて断頭全採血を行った。そして、無菌下での脾臓の摘出及び脾細胞の単離を行い、単離した脾細胞を遠沈管に回収した。
また、予め培養していたミエローマも同様に遠沈管に回収した。
【００８０】
遠沈管に回収したマウス脾細胞及びミエローマ細胞それぞれについて、１４００ｒｐｍで６分間の遠心分離、上清の吸引除去、及び無血清ＩＭＤＭへの再懸濁の一連の操作を３回繰り返し、その後、洗浄を行った。洗浄後、それぞれの細胞を１０ｍｌの無血清培地に再懸濁し、トリパンブルー染色法により生細胞数を計測した。細胞数が５：１（脾細胞：ミエローマ細胞）となるように混合し、８００ｒｐｍで６分間の遠心分離及び上清の吸引除去を行った。ＰＥＧを用いた定法により細胞融合を実施し、無血清培地で希釈し、８００ｒｐｍで６分間の遠心分離及び上清の吸引除去を行った。その後、ＨＡＴ培地に脾細胞数として２．５×１０6cells/mlとなるように再懸濁し、９６ウェルプレートに１００μｌ/wellずつ播いた。７％ＣＯ2雰囲気（v/v）下、３７℃で培養を行い、週２回、半分の体積量の培地を新鮮なＨＡＴ培地で交換した。
【００８１】
＜一次スクリーニング・二次スクリーニング＞  
一次スクリーニングとしては、免疫抗原に対応したＥＬＩＳＡ用抗原を固相化し、細胞の増殖しているウェルの培養上清についてＥＬＩＳＡを行った。全ウェルのうち、抗体産生が確認されたウェル：ＡＴ５マウス由来−ウェル番号２Ｇ１０；及び、ＢＴ５マウス由来−ウェル番号１Ｄ１１、１Ｆ７、１Ｆ１２、２Ｅ１、３Ｄ６、３Ｇ２、３Ｈ５、４Ｂ１１、４Ｃ１２、４Ｅ１２、５Ａ１、５Ａ３、５Ｆ２、６Ｃ５、６Ｅ２、６Ｇ１１、及び７Ｅ１１についての結果を図７及び図８に示す。図７においては、ウェル中の試料(sample)について、希釈倍率(Dilution)ごとの吸光度（４５０ｎｍ）を表に示している。図８は、図７をグラフ化したものであり、横軸に希釈倍率(Dilution)、縦軸に４５０ｎｍにおける吸光度(Abs. (450nm))を示す。
【００８２】
二次スクリーニングとしては、抗体産生が確認された上記ウェルについて間接競合阻害ＥＬＩＳＡを実施し、特異性を確認した。この結果を図９及び図１０に示す。図９においては、ウェル中の試料について、阻害剤の濃度ごとの吸光度（４５０ｎｍ）を表に示している。図１０は、図９において阻害剤Ｗ（ＮＢＳ）ＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨ用いた場合をグラフ化したものであり、横軸に阻害剤(Inhibitor)の濃度（ｎｇ/ｍｌ）、縦軸に４５０ｎｍにおける吸光度(Abs. (450nm))を示す。
なお、図９及び図１０に記載されている希釈倍率は、一次スクリーニングにおける吸光度が０．７程度になる希釈倍数の１/２を目安にしたものであり、二次スクリーニングはこの希釈倍率で行った。
【００８３】
この結果、ＡＴ５マウス由来−ウェル番号２Ｇ１０（ＡＴ５−２Ｇ１０）、ＢＴ５マウス由来−ウェル番号１Ｆ７（ＢＴ５−１Ｆ７）、及びＢＴ５マウス由来−ウェル番号７Ｅ１１（ＢＴ５−７Ｅ１１）における３つの抗体が、低い濃度で阻害されており、特異性が確認された。
交差反応性の観点からの間接競合阻害ＥＬＩＳＡの評価は、以下の４とおり（すなわち、ウェル番号２Ｇ１０、１Ｆ７及び７Ｅ１１における抗体、ウェル番号５Ａ３及び５Ｆ２における抗体、ウェル番号６Ｃ５における抗体、及び、その他のウェル番号における抗体のそれぞれについて）に分かれる。
【００８４】
＜ウェル番号２Ｇ１０、１Ｆ７及び７Ｅ１１における抗体＞
ウェル番号２Ｇ１０、１Ｆ７及び７Ｅ１１では、阻害剤ＷＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨを用いた場合、阻害剤の濃度が１ｎｇ/ｍｌでは吸光度に変化がないが、１０ｎｇ/ｍｌでは顕著に低下している。一方、阻害剤Ｗ（ＮＢＳ）ＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨを用いた場合、阻害剤の濃度が１０μｇ/ｍｌ及び１００μｇ/ｍｌではいずれも吸光度に変化はない。この阻害剤の濃度が１ｍｇ/ｍｌで吸光度が低下すると考えると、これらの抗体と、阻害剤ＷＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨ及びＷ（ＮＢＳ）ＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨとの間の交差反応性については、以下のように評価することができる。
【００８５】
吸光度の変化のない濃度範囲における最大濃度は、実際に詳細な測定はされていないが、図中の濃度を参照すると、阻害剤ＷＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨの場合は１ｎｇ/ｍｌより大きい濃度、阻害剤Ｗ（ＮＢＳ）ＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨの場合は１００μｇ/ｍｌより大きい濃度であるといえる。これら図９中の濃度に基づいて算出される商は、１００μｇ/ｍｌ÷１ｎｇ/ｍｌ＝１００，０００である。濃度に対する吸光度の変化の傾向を考慮すると、実際の最大濃度から導き出される商は、１００，０００よりも大きい値になることがわかる。このことから、これらの抗体と阻害剤ＷＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨとの交差反応性は、これらの抗体と阻害剤Ｗ（ＮＢＳ）ＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨとの交差反応性よりも１０万倍以上強いということがいえる。
【００８６】
＜ウェル番号５Ａ３及び５Ｆ２における抗体＞
ウェル番号５Ａ３及び５Ｆ２では、阻害剤ＷＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨを用いた場合、阻害剤の濃度が１００ｎｇ/ｍｌでは吸光度に変化がないが、１μｇ/ｍｌでは顕著に低下している。一方、阻害剤Ｗ（ＮＢＳ）ＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨを用いた場合、阻害剤の濃度が１０μｇ/ｍｌ及び１００μｇ/ｍｌではいずれも吸光度に変化はない。この阻害剤の濃度が１ｍｇ/ｍｌで吸光度が低下すると考えると、これらの抗体と、阻害剤ＷＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨ及びＷ（ＮＢＳ）ＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨとの間の交差反応性については、上記と同様、以下のように評価することができる。図９中の濃度に基づいて算出される商は、１００μｇ/ｍｌ÷１００ｎｇ/ｍｌ＝１，０００であるから、これらの抗体と阻害剤ＷＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨとの交差反応性は、これらの抗体と阻害剤Ｗ（ＮＢＳ）ＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨとの交差反応性よりも千倍以上強いということがいえる。
【００８７】
＜ウェル番号６Ｃ５における抗体＞
ウェル番号６Ｃ５では、阻害剤ＷＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨを用いた場合、阻害剤の濃度が１００ｎｇ/ｍｌで吸光度が低下している。一方、阻害剤Ｗ（ＮＢＳ）ＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨを用いた場合、阻害剤の濃度が１０μｇ/ｍｌと１００μｇ/ｍｌとで吸光度に変化が生じている。図においては阻害剤の有無により吸光度が変化しているという傾向に基づくと、１００μｇ/ｍｌで始めて吸光度が低下したと考えられる。そこでこの抗体と、阻害剤ＷＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨ及びＷ（ＮＢＳ）ＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨとの間の交差反応性については、上記と同様、以下のように評価することができる。図９中の濃度に基づいて算出される商は、１０μｇ/ｍｌ÷１０ｎｇ/ｍｌ＝１，０００であるから、この抗体と阻害剤ＷＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨとの交差反応性は、この抗体と阻害剤Ｗ（ＮＢＳ）ＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨとの交差反応性よりも約千倍強いということがいえる。
【００８８】
＜その他のウェル番号における抗体＞
その他のウェル番号では、阻害剤ＷＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨを用いた場合、阻害剤の濃度が１０ｎｇ/ｍｌでは吸光度に変化がないが、１００ｎｇ/ｍｌでは顕著に低下している。一方、阻害剤Ｗ（ＮＢＳ）ＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨを用いた場合、阻害剤の濃度が１０μｇ/ｍｌ及び１００μｇ/ｍｌではいずれも吸光度に変化はない。この阻害剤の濃度が１ｍｇ/ｍｌで吸光度が低下すると考えると、これらの抗体と、阻害剤ＷＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨ及びＷ（ＮＢＳ）ＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨとの間の交差反応性については、上記と同様、以下のように評価することができる。図９中の濃度に基づいて算出される商は、１００μｇ/ｍｌ÷１０ｎｇ/ｍｌ＝１０，０００であるから、これらの抗体と阻害剤ＷＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨとの交差反応性は、これらの抗体と阻害剤Ｗ（ＮＢＳ）ＡＧＧＤＡＳＧ−ＯＨとの交差反応性よりも１万倍以上強いということがいえる。
【００８９】
ＥＬＩＳＡ及び間接競合阻害ＥＬＩＳＡの結果から、ＡＴ５−２Ｇ１０、ＢＴ５−１Ｆ７及びＢＴ５−７Ｅ１１に関してクローニングを実施した。
【００９０】
＜ハイブリドーマ細胞のクローニング＞
ＡＴ５−２Ｇ１０、ＢＴ５−１Ｆ７及びＢＴ５−７Ｅ１１中の細胞を、限界希釈法でクローニングした。培地は、増殖因子（Briclone等）を添加したＨＴ培地を用い、細胞濃度は５０cells/mlと１００cells/mlとの２種とし、９６ウェルプレートへ、１００μｌ/well量でそれぞれ４８ウェルずつ播いた。1週間後に培地を２滴ずつ添加した。細胞の増殖しているウェル（なるべく１コロニーのもの）の培養上清について、ＥＬＩＳＡによりアッセイを行った。２回連続してアッセイした全てのウェルで抗体を産生するまでクローニングとアッセイとを繰り返し行った。その結果、ＮＢＳ基含有トリプトファンを特異的に認識するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマＢＴ５−１Ｆ７及びＢＴ５−７Ｅ１１を得た。
【００９１】
＜抗体のキャラクタライゼーション＞
クローン化した抗体を、Mouse monoclonal antibody isotyping Kit（Amersham社製）を用いて、サブクラスの同定を行った。その結果、いずれもＩｇＧ1(κ)に属する抗体であることが確認された。
【００９２】
なお、本実施例で得られたハイブリドーマ細胞ＢＴ５−１Ｆ７は、受託番号FERM P-20496として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１７年４月８日付で寄託されている。また、本実施例で得られたハイブリドーマ細胞ＢＴ５−７Ｅ１１は、受託番号FERM P-20495として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１７年４月８日付で寄託されている。
【００９３】
＜抗体の大量作製と精製＞
それぞれのハイブリドーマ細胞から、以下のように抗体の大量作製と精製とを行った。
ＢＡＬＢ/ｃマウスに細胞投与１−４週間前にプリスタンを０．５ｍｌ/匹、腹腔内投与しておいた。培養細胞を回収し、２−４×１０6cell/mlになるように無血清培地又はＰＢＳに再懸濁し、１匹につき１−２×１０6個の細胞を腹腔内に投与した。
投与後１０日目から腹水がたまり採取可能となったマウス腹部に、１８Ｇの注射針を指し、滴下してくる腹水を採取した。この操作を、腹水が採取できなくなるまで１−２日おきに繰り返した。採取した腹水は、３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行い、上清を採取し、０．４５μｍφのフィルターで濾過した。そして、飽和度５０％の硫安で塩析し、その後、透析したものをProtein Gカラムを用いて精製した。
【００９４】
＜抗体カラムの作製＞
それぞれの抗体について、以下のように抗体カラムを作製した。
精製抗体溶液（４．４ｍｇ/ｍｌ）３ｍｌを、カップリングバッファー（０．１Ｍ ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．５、１Ｍ ＮａＣｌ）に対して透析を行った。透析後の抗体溶液に１/１０体積量の過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（２０．８ｍｇ/ｍｌ）を添加し、室温・遮光下で１時間転倒混和を行って反応させた。次いで、反応させた抗体溶液をイオン交換水及びカップリングバッファーで透析し、脱塩を行った。Affi-Gel HZ（BIO RAD社製）５ｍｌを、１０ｍｌのカップリングバッファーで洗浄し、その上清を除去後、ゲルと等量のカップリングバッファーを添加した。ここに抗体溶液を加え、室温で１０−２４時間転倒混和することにより反応を行い、反応後のゲルをカラムに充填し、抗体カラムとした。抗体カラムは、使用するまで０．０２％ＮａＮ３含有ＰＢＳで充填し４℃で保存した。
【００９５】
＜抗体カラムによるＮＢＳラベル化ペプチドの濃縮＞
精製タンパク質４種類（Ovalbumin、Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、Lysozyme、及びα-lactalbumin；全てSIGMA社より購入）を２５μｇずつ混合し合計１００μｇとした混合試料を２つ用意し、島津製作所から発売されている「13CNBS Isotope Labeling Kit」のプロトコルに準じて、一方の混合試料についてはNBS Reagent Heavyによるラベル化、他方の混合試料についてはNBS Reagent Lightによるラベル化を行った。具体的には、試料の可溶化を、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む６Ｍグアニジン塩酸塩水溶液を用いて行い、ラベル化は、５０％酢酸水溶液（v/v；終濃度）を用いて反応時間を１時間としたこと以外は、前記プロトコルに従った。ラベル化された２つの試料を混合し、５０ｍＭ Tris-HClバッファー（ｐＨ８．８）を含む８Ｍ尿素水溶液で再溶解後、還元・アルキル化及びトリプシン消化を行った。抗体カラムは、保存溶液を流出後、カラム体積の５倍量の５０ｍＭTris-HClバッファー（ｐＨ７．８）で平衡化を行った。その後、トリプシン消化を行った試料をアプライした。５０ｍＭTris-HClバッファー（ｐＨ７．８）で２カラム分、非ラベル化ペプチドの洗浄を行った。ラベル化ペプチドの溶出は、０．１％ＴＦＡ−４０％アセトニトリル水溶液（v/v/v）で５カラム分行った。溶出したラベル化ペプチドを、ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ（島津製作所製）を用いてＭＳ測定を行った。
【００９６】
得られたマススペクトルを、抗体カラムによる濃縮前のマススペクトルとともに図９に示す（横軸：質量/電荷（Mass/Charge）、縦軸：イオンの相対強度）。なお図９には、ＢＴ５−１Ｆ７を用いた抗体カラムによる結果を示した。図９（Ａ）は、抗体カラムによる濃縮前のマススペクトル；図９（Ｂ）は、抗体カラムによる溶出画分２（Fraction 2）のマススペクトル（図９（Ｂ´）は、図９（Ｂ）のMass/Charge 760-805部分に相当し、溶出画分２をさらにＣ１８カラムを用いて分画した場合に得られたマススペクトルである。）；図９（Ｃ）は、抗体カラムによる溶出画分３（Fraction 3）のマススペクトルである。また、楕円で囲ったピークは、ＮＢＳラベル化ペプチドのペアピーク（すなわち、互いに対応するNBSCl Reagent Lightによるラベル化を受けたペプチドと、NBSCl Reagent Heavyによるラベル化を受けたペプチドとに相当する、質量数６の差を有するペアピーク）を示す。
【００９７】
以下に、600-2400(m/z)で検出されたＮＢＳラベル化ペプチドのペアピーク（すなわちトリプトファン含有ペプチドのペアピーク）について、m/z値とそのペアピークの由来するペプチドとを、以下に示す。
1：627.3, 633.3（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）
2：759.3, 765.3（α-lactalbumin）
3：785.3, 791.3（Ovalbumin）
4：1198.5, 1204.5（Lysozyme）
5：1244.5, 1250.5（α-lactalbumin）
6：1299.4, 1311.4（Lysozyme）
7：1353.6, 1359.6（α-lactalbumin）
8：1478.6, 1484.6（Lysozyme）
9：1734.7, 1740.7（Ovalbumin）
10：1916.8, 1922.8（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）
11：1981.8, 1993.8（Lysozyme）
12：2012.0, 2018.0（Ovalbumin）
【００９８】
このように、溶出画分２及び３に、理論断片が検出された。
なお、溶出バッファーとして、上記バッファー以外に、０．１Ｍ Glycine-HCl（ｐＨ２．５）など定法で用いられるバッファーによってラベル化ペプチドの溶出を行った。その結果、特定の溶出画分についてのマススペクトルにおいて上記の各ピークが検出された（データ示さず）。
また、ＢＴ５−７Ｅ１１を用いた抗体カラムを用いても同様の結果が得られた（データ示さず）。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】実験例１において、抗体価の試験のため、免疫抗原としてＡｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−εＡｈｘ−εＡｈｘ−ＴＧを、固相化抗原としてＡｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−εＡｈｘ−εＡｈｘ−ＢＳＡを用いてＥＬＩＳＡを行った結果を表すグラフである。
【図２】実験例１において、抗体価の試験のため、免疫抗原としてＡｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−ＰＥＧ−ＴＧを、固相化抗原としてＡｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−ＰＥＧ−ＢＳＡを用いてＥＬＩＳＡを行った結果を表すグラフ結果である。
【図３】実験例１において、抗体価の試験のため、免疫抗原としてＡｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−εＡｈｘ−εＡｈｘ−ＢＳＡを、固相化抗原としてＡｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−εＡｈｘ−εＡｈｘ−ＴＧを用いてＥＬＩＳＡを行った結果を表すグラフ結果である。
【図４】実験例１において、抗体価の試験のため、免疫抗原としてＡｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−ＰＥＧ−ＢＳＡを、固相化抗原としてＡｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−ＰＥＧ−ＴＧを用いてＥＬＩＳＡを行った結果を表すグラフである。
【図５】実験例１において、特異性確認のため、免疫抗原にＡｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−εＡｈｘ−εＡｈｘ−ＴＧを、固相化抗原にＡｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−εＡｈｘ−εＡｈｘ−ＢＳＡを用いて間接競合阻害ＥＬＩＳＡを行った結果を表すグラフである。
【図６】実験例１において、特異性確認のため、免疫抗原にＡｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−ＰＥＧ−ＴＧを、固相化抗原にＡｃ−Ｔｒｐ(ＮＢＳ)−ＰＥＧ−ＢＳＡを用いて間接競合阻害ＥＬＩＳＡを行った結果を表すグラフである。
【図７】実験例１において、一次スクリーニングとしてＥＬＩＳＡを行った結果を表す表である。
【図８】実験例１において、一次スクリーニングとしてＥＬＩＳＡを行った結果を表すグラフである。
【図９】実験例１において、二次スクリーニングとして間接競合阻害ＥＬＩＳＡを行った結果を表す表である。
【図１０】実験例１において、二次スクリーニングとして間接競合阻害ＥＬＩＳＡを行った結果を表すグラフである。
【図１１】実験例１によって得られた、抗体カラムによる濃縮前のマススペクトル（Ａ）；抗体カラムによる溶出画分２（Fraction 2）のマススペクトル（Ｂ）；（Ｂ）のMass/Charge 760-805部分に相当し、溶出画分２をさらにＣ１８カラムを用いて分画した場合に得られたマススペクトル（Ｂ´）；及び、抗体カラムによる溶出画分３（Fraction 3）のマススペクトル（Ｃ）である。
【配列表フリーテキスト】
【０１００】
配列番号１は、合成ペプチドである。
配列番号２は、合成ペプチドである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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