(57)【要約】【課題】  止血剤等として有用な血液凝固反応促進剤を提供する。【解決手段】  ホスファチジルセリンを含有し、ホスファチジルコリンを実質的に含有しない血液凝固反応促進剤；ホスファチジルセリンと、ミセル、二重層、逆ヘキサゴナル又はリポソームの構造を取るホスファチジルコリンを含有する血液凝固反応促進剤；止血剤、又は血液凝固線溶系に関する臨床検査薬として用いられる前記血液凝固反応促進剤。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスファチジルセリンを含有し、ホスファチジルコリンを実質的に含有しない血液凝固反応促進剤。
【請求項２】
ホスファチジルセリンを唯一のリン脂質として含有する請求項１記載の血液凝固反応促進剤。
【請求項３】
ホスファチジルセリンと、ミセル、二重層、逆ヘキサゴナル又はリポソームの構造を取るホスファチジルコリンを含有する血液凝固反応促進剤。
【請求項４】
止血剤として用いられる請求項１〜３のいずれか１項に記載の血液凝固反応促進剤。
【請求項５】
血液凝固線溶系に関する臨床検査薬として用いられる請求項１〜３のいずれか１項に記載の血液凝固反応促進剤。
【請求項６】
ホスファチジルセリンを含有し、ホスファチジルコリンを実質的に含有しないトロンビン生成促進剤。
【請求項７】
ホスファチジルセリンと、ミセル、二重層、逆ヘキサゴナル又はリポソームの構造を取るホスファチジルコリンを含有するトロンビン生成促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスファチジルセリンを含有する血液凝固反応促進剤及びトロンビン生成促進剤に関するものであり、疾患や外傷の治療における止血剤や血液凝固線溶系に関する臨床検査等において有用なものである。
【背景技術】
【０００２】
リン脂質は、生物を構成する細胞の種々の膜系、例えば原形質膜、核膜、小胞体膜、ミトコンドリア膜、葉緑体膜、細菌細胞膜等を構成する主要な脂質である。また、血清脂質や卵黄などにも含まれている。
【０００３】
リン脂質は、その構成成分によりグリセロリン脂質とスフィンゴリン脂質に分類される。グリセロリン脂質としては、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン（レシチン）、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール（カルジオリピン）等が知られている。また、スフィンゴリン脂質としては、スフィンゴミエリン等が知られている。
【０００４】
血管が損傷を受けて出血が起こると、その出血を止めるために血管傷害部を塞ぐ止血血栓が形成されるが、この反応は血小板が主役をなす一次血栓形式と凝固因子の活性化の結果起こる二次血栓形式よりなっている。これらの２つの反応系は、全く独立して進行するものではなく、互いに影響を与えあって傷害部局所のみで加速度的に進行するものである。古くから、血液凝固反応のいくつかのステップが、リン脂質の存在下において促進されることが知られていた。
【０００５】
Ｈｅｍｋｅｒらは、活性化第Ｘ因子によるプロトロンビンからのトロンビンの生成、及び活性化第ＩＸ因子による第Ｘ因子からの活性化第Ｘ因子の生成の反応において、ホスファチジルセリンとホスファチジルコリンの混合物が、それぞれの反応の基質（プロトロンビン及び第Ｘ因子）に対するＫｍ値を著しく低下させることを報告した。すなわち、ホスファチジルセリンとホスファチジルコリンの混合物が、血液凝固反応を促進する効果を有することを報告した。そして、リン脂質を含む生体膜が、活性化凝固因子（活性化第ＶＩＩＩ因子及び活性化第Ｖ因子）、基質及び補因子を結合し、それらの局所濃度を高めるという役割を明らかにした。〔非特許文献１参照〕
しかしながら、ホスファチジルセリン単独で、血液凝固線溶系に対して如何なる作用を及ぼすかについては報告されていない。
【０００６】
【非特許文献１】松本豊，池田康夫、「Ｍｅｂｉｏ」第１１巻第３号、第２６頁〜第３１頁、メジカルビュー社、１９９４年発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、血液凝固反応とリン脂質との関係を検討する中で、ホスファチジルセリン単独でトロンビンの生成を促進する効果が認められ、その効果はホスファチジルコリンが共存する場合よりも、共存しない方が優れていることを見出して、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、止血剤等として有用な血液凝固反応促進剤及びトロンビン生成促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下の発明を包含する。
（１）ホスファチジルセリンを含有し、ホスファチジルコリンを実質的に含有しない血液凝固反応促進剤。
（２）ホスファチジルセリンを唯一のリン脂質として含有する前記（１）に記載の血液凝固反応促進剤。
（３）ホスファチジルセリンと、ミセル、二重層、逆ヘキサゴナル又はリポソームの構造を取るホスファチジルコリンを含有する血液凝固反応促進剤。
（４）止血剤として用いられる前記（１）〜（３）のいずれかに記載の血液凝固反応促進剤。
（５）血液凝固線溶系に関する臨床検査薬として用いられる前記（１）〜（３）のいずれかに記載の血液凝固反応促進剤。
（６）ホスファチジルセリンを含有し、ホスファチジルコリンを実質的に含有しないトロンビン生成促進剤。
（７）ホスファチジルセリンと、ミセル、二重層、逆ヘキサゴナル又はリポソームの構造を取るホスファチジルコリンを含有するトロンビン生成促進剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の血液凝固反応促進剤及びトロンビン生成促進剤はホスファチジルコリンが共存する場合よりも優れた効果を有し、止血剤、血液凝固線溶系に関する臨床検査薬等として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明に用いるホスファチジルセリンとは、Ｌ−セリンリン酸を極性基とするグリセロリン脂質の総称であり、グリセロール１位に結合する疎水基として、例えば、炭素数４〜２５の飽和脂肪酸残基又は不飽和脂肪酸残基等を挙げることができ、より具体的にはアシル基等を挙げることができ、更に具体的には、これに対応する脂肪酸として、例えば、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、エルカ酸、リノール酸、リノレン酸、又はアラキドン酸等を挙げることができる。
【００１２】
また、グリセロール２位に結合する疎水基として、例えば、炭素数４〜２５の飽和脂肪酸残基又は不飽和脂肪酸残基等を挙げることができ、より具体的にはアシル基等を挙げることができ、更に具体的には、これに対応する脂肪酸として、例えば、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、エルカ酸、リノール酸、リノレン酸、又はアラキドン酸等を挙げることができる。
【００１３】
本発明に用いるホスファチジルセリンは、動物、植物、若しくは細菌などから単離精製されたもの、化学的に合成されたもの、又はバイオテクノロジー技術により調製されたもの等、特に制限なく用いることができる。そして、本発明に用いるホスファチジルセリンは、これを医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、特に制限なく用いることができる。
【００１４】
本発明の血液凝固反応促進剤及びトロンビン生成促進剤は、ミセル、二重層、逆ヘキサゴナル又はリポソーム以外の構造、すなわち単量体構造を取るホスファチジルコリンが共存する場合よりも優れた効果を有するものであり、ホスファチジルコリンを実質的に含有しないものでも、あるいはミセル、二重層、逆ヘキサゴナル又はリポソームの構造を取るホスファチジルコリンを含有するものでもよい。ここで、「実質的に含有しない」とは、全く含有しない場合のほか、夾雑物として含有するだけで、本発明の効果が損なわれない場合（例えば、ホスファチジルセリンに対するホスファチジルコリンの質量比が０．１未満の場合）を包含する。
【００１５】
以下、リン脂質（ホスファチジルコリン等）の各構造について説明する。
【００１６】
１．単量体構造
リン脂質の単量体構造とは、リン脂質が集合体を形成せずに存在しているものである。リン脂質は、その濃度が低い場合、通常、単量体構造を取る。なお、特に、親水基が疎水基に比べて大きな容積を占める逆コーン型脂質（逆コーン型分子）〔例えば、リゾホスファチジルコリン等〕においては、単量体構造を取りやすい。
【００１７】
２．ミセル構造
両親媒性分子であるリン脂質において、水に易溶の親水基を水相側に向けて配向し、水に難溶の疎水基部分を内側に向けて配向することによって、リン脂質分子が一定数集まった集合体をつくる場合がミセル構造である。リン脂質が一定濃度以上となることにより、ミセル構造を形成する。ミセル構造としては、球状ミセル構造、層状ミセル構造又は棒状ミセル構造等が知られている。ミセル構造の大きさは、光散乱法、Ｘ線回折法、拡散法、浸透圧法、超遠心法、ゲルろ過法、ＮＭＲ又は電子顕微鏡等を用いて測定される。また、ミセル構造の形は、光散乱、流動複屈折、拡散、粘度、ＮＭＲ又は電子顕微鏡等を用いて測定される。なお、特に、親水基が疎水基に比べて大きな容積を占める逆コーン型脂質（逆コーン型分子）〔例えば、リゾホスファチジルコリン等〕においては、ミセル構造を取りやすい。
【００１８】
３．二重層構造
リン脂質のような両親媒性分子は、水溶液中では親水基を水相に接し、疎水基（脂肪酸部分）が互いに疎水性相互作用によって並んだ平面構造を取る。この平面構造が疎水性面を接する形で二重層構造を形成する。特に、疎水基と親水基の容積のバランスが取れたシリンダー型脂質（シリンダー型分子）〔例えば、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン等〕においては、二重層（ラメラ）構造を取りやすい。
【００１９】
４．逆ヘキサゴナル構造
逆ヘキサゴナル構造は、ヘキサゴナルII構造ともいい、両親媒性分子であるリン脂質において、親水基を内側に向けて配向し、疎水基部分を外側に向けて配向することによって、リン脂質分子が一定数集まった集合体をつくるものである。特に、疎水基が親水基に比べて大きな容積を占めるコーン型脂質（コーン型分子）〔例えば、ホスファチジルエタノールアミン等〕においては、一定温度以下では二重層になるものの、一定温度を越えると脂肪酸鎖の動きが更に大きくなり、疎水基の容積を増すために二重層となれず、逆ヘキサゴナル構造となりやすい。
【００２０】
５．リポソーム構造
リン脂質による脂質二重層からなり、その内部に水相を有する閉鎖小胞をリポソーム構造という。二分子膜が何枚もタマネギ状に重なった多重膜リポソーム（ＭＬＶ）と、膜が１枚の単膜リポソームとが存在する。粒子径が小さな多重膜リポソーム（ＭＬＶ）は、リン脂質よりなる薄膜に水を加えて機械的振動を与えることにより調製される。粒子径が小さな単膜リポソーム（ＳＵＶ）は、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）を超音波処理したり、脂質と界面活性剤の混合水溶液から界面活性剤を透析等で除去したりするなどして調製される。また、粒子径が大きな単膜リポソーム（ＬＵＶ）は、粒子径が小さな単膜リポソーム（ＳＵＶ）の凍結融解を繰り返したり、酸性リン脂質でできた粒子径が小さな単膜リポソーム（ＳＵＶ）をＣａ２＋の存在下で融合させた後、このＣａ２＋をＥＤＴＡで除去したりするなどして調製される。
【００２１】
本発明において、ホスファチジルコリンとは、コリンリン酸を極性基とするグリセロリン脂質の総称であり、グリセロール１位に結合する疎水基として、例えば、炭素数４〜２５の飽和脂肪酸残基又は不飽和脂肪酸残基等を挙げることができ、より具体的にはアシル基等を挙げることができ、更に具体的には、これに対応する脂肪酸として、例えば、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、エルカ酸、リノール酸、リノレン酸、又はアラキドン酸等を挙げることができる。
【００２２】
また、グリセロール２位に結合する疎水基として、例えば、炭素数４〜２５の飽和脂肪酸残基又は不飽和脂肪酸残基等を挙げることができ、より具体的にはアシル基等を挙げることができ、更に具体的には、これに対応する脂肪酸として、例えば、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、エルカ酸、リノール酸、リノレン酸、又はアラキドン酸等を挙げることができる。
【００２３】
前記ホスファチジルコリンとしては、動物、植物、若しくは細菌などから単離精製されたもの、化学的に合成されたもの、又はバイオテクノロジー技術により調製されたもの等、特に制限はない。
【００２４】
本発明の血液凝固反応促進剤及びトロンビン生成促進剤は、止血剤、又は血液凝固線溶系に関する臨床検査薬の成分等として用いることができる。
【００２５】
本発明の血液凝固反応促進剤及びトロンビン生成促進剤は、種々の剤形とすることができる。この剤形としては、例えば、リポソーム製剤又は脂肪乳剤製剤等とすることが好ましい。
【００２６】
リポソーム製剤は、常法に準じて調製することができ、例えば、ホスファチジルセリンをクロロホルムなどの有機溶媒に溶解した後、溶媒を留去して乾固し、次いで必要に応じて安定化剤等の慣用の添加剤と共に精製水又は適当な緩衝液を加えて、超音波処理を行うことにより調製することができる。
【００２７】
また、脂肪乳剤製剤も常法に準じて調製することができる。例えば、水に油脂及び乳化剤を加えると共にホスファチジルセリンを添加し、更に必要に応じて安定化剤等の慣用の添加剤を加えた後、乳化することにより調製することができる。
【００２８】
本発明の血液凝固反応促進剤又はトロンビン生成促進剤を、止血剤等の治療剤（薬剤）として用いる場合、効果がある限り、その用法は問わない。この用法としては、特に外傷部分への塗布、経皮吸収、及び静脈内投与等が好ましい。この投与量であるが、これは患者の体重、年齢、疾患の程度等に応じて適宜調整することができるが、通常、ホスファチジルセリンとして、０．０００１〜０．１ｇ／Ｋｇ体重／日を、好ましくは０．００１〜０．０１ｇ／Ｋｇ体重／日を、１日に１回〜数回に分けて投与すればよい。
【００２９】
本発明の血液凝固反応促進剤及びトロンビン生成促進剤は、血液凝固反応系に関わる因子である活性化第Ｘ因子、活性化第Ｖ因子、又はプロトロンビン等の測定試薬に含有させることにより、測定反応を促進させることができ、迅速かつ高感度に測定を行うことができる。
【実施例】
【００３０】
〔実施例１〕ホスファチジルセリンによる血液凝固反応促進
生体内の血液凝固因子を再構成した「活性化第Ｘ因子−プロトロンビン反応系」を構築し、ホスファチジルセリンによる血液凝固反応促進効果を確かめた。
【００３１】
本実施例においては、ホスファチジルセリン及びホスファチジルコリンとしては、以下のものを用いた。
（ホスファチジルセリン）
L-α-Phosphatidylserine, Bovine Brain、フナコシ試薬総合カタログ2004 Part II P.919、メーカー：DOOSAN Serdary Research Laboratories、商品コード：A-37
（ホスファチジルコリン）
L-α-Phosphatidylcholine, Porcine Liver、フナコシ試薬総合カタログ2004 Part II P.907、メーカー：DOOSAN Serdary Research Laboratories、商品コード：A-29、純度：98〜99％
【００３２】
１．試薬
（１）第１試薬
下記のリン脂質組成物溶液を０．５％（ｖ／ｖ）、３０ｐＭの活性化第Ｖ因子、７００ｎＭのプロトロンビン、７５０μＭのＳ−２２３８〔トロンビンの基質（色素結合合成基質）；第一化学薬品〕、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カルシウム、及び０．１％ウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液〔ｐＨ７．５（２０℃）〕を調製し、これを第１試薬とした。
【００３３】
なお、前記のリン脂質組成物溶液の組成を下に示した。
（ａ）０．４ｍｇ／ｍＬホスファチジルセリン水溶液
（ｂ）０．４ｍｇ／ｍＬホスファチジルセリン及び０．０４ｍｇ／ｍＬホスファチジルコリンを含む水溶液
（ｃ）０．４ｍｇ／ｍＬホスファチジルセリン及び０．１ｍｇ／ｍＬホスファチジルコリンを含む水溶液
（ｄ）０．４ｍｇ／ｍＬホスファチジルセリン及び０．２ｍｇ／ｍＬホスファチジルコリンを含む水溶液
（ｅ）０．４ｍｇ／ｍＬホスファチジルセリン及び０．４ｍｇ／ｍＬホスファチジルコリンを含む水溶液
（ｆ）０．４ｍｇ／ｍＬホスファチジルセリン及び０．６ｍｇ／ｍＬホスファチジルコリンを含む水溶液
（ｇ）０．４ｍｇ／ｍＬホスファチジルセリン及び０．８ｍｇ／ｍＬホスファチジルコリンを含む水溶液
【００３４】
（２）第２試薬
下記のリン脂質組成物溶液を０．５％（ｖ／ｖ）、１００ｐＭの活性化第Ｘ因子、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カルシウム、及び０．１％ウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液〔ｐＨ７．５（２０℃）〕を調製し、これを第２試薬とした。
【００３５】
なお、前記のリン脂質組成物溶液の組成を下に示した。
（ａ）０．４ｍｇ／ｍＬホスファチジルセリン水溶液
（ｂ）０．４ｍｇ／ｍＬホスファチジルセリン及び０．０４ｍｇ／ｍＬホスファチジルコリンを含む水溶液
（ｃ）０．４ｍｇ／ｍＬホスファチジルセリン及び０．１ｍｇ／ｍＬホスファチジルコリンを含む水溶液
（ｄ）０．４ｍｇ／ｍＬホスファチジルセリン及び０．２ｍｇ／ｍＬホスファチジルコリンを含む水溶液
（ｅ）０．４ｍｇ／ｍＬホスファチジルセリン及び０．４ｍｇ／ｍＬホスファチジルコリンを含む水溶液
（ｆ）０．４ｍｇ／ｍＬホスファチジルセリン及び０．６ｍｇ／ｍＬホスファチジルコリンを含む水溶液
（ｇ）０．４ｍｇ／ｍＬホスファチジルセリン及び０．８ｍｇ／ｍＬホスファチジルコリンを含む水溶液
【００３６】
２．操作手順
分光光度計のキュベット内に第１試薬の３６０μＬを添加し、３７℃で５分間加温した後、予め３７℃で加温しておいた第２試薬の１８０μＬをここに添加し、３７℃で加温して反応させた。
【００３７】
ここで、活性化第Ｖ因子の存在下、活性化第Ｘ因子は、プロトロンビンをトロンビンに変換する。そして、生成したトロンビンは、色素結合合成基質Ｓ−２２３８を分解し、ｐ−ニトロアニリンを遊離させる。このｐ−ニトロアニリンは、波長４０５ｎｍ近辺に吸収極大を持つ。
【００３８】
キュベット内の溶液の波長４０５ｎｍにおける吸光度の測定及び記録を、第２試薬添加の５分前から３０分後まで１分毎に行った。
【００３９】
なお、既知濃度のトロンビンと色素結合合成基質Ｓ−２２３８とを反応させ、このトロンビン濃度とｐ−ニトロアニリンの生成速度との関係より検量線を作成した。
【００４０】
そして、各々の組成のリン脂質組成物を用いた場合の波長４０５ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化量をこの検量線に当てはめ、トロンビンの生成速度（ｎＭ／ｍｉｎ）、すなわち血液凝固反応の速度を求めた。
【００４１】
３．測定結果
測定結果を図１に示した。
なお、この図において、横軸はリン脂質組成物におけるホスファチジルコリンの濃度（ｍｇ／ｍＬ）を示し、縦軸はトロンビンの生成速度（ｎＭ／ｍｉｎ）を示す。
【００４２】
この結果より、前記リン脂質組成物としてホスファチジルセリンのみを用いた場合には、前記反応が進行し、トロンビン生成が促進される、すなわち、ホスファチジルセリンは血液凝固反応の促進作用を有することが確かめられた。また、ホスファチジルセリンとホスファチジルコリンよりなるリン脂質組成物中のホスファチジルコリンの濃度が増すにつれ、トロンビンの生成速度が下がること、すなわち血液凝固反応の速度が下がることが分かる。
【００４３】
なお、前記第１試薬及び前記第２試薬のいずれにもホスファチジルセリンを含有させない場合は、前記反応は進行せず、トロンビンは生成しない。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ホスファチジルセリン及びホスファチジルコリンよりなるリン脂質組成物におけるホスファチジルコリン量と血液凝固反応におけるトロンビン生成量との関係を示した図である。
【図１】
2007091599.tif 000002