(57)【要約】      （修正有）【課題】イネ株開帳性関与遺伝子Ｓｐｋ（ｔ）、および該Ｓｐｋ（ｔ）遺伝子を利用したイネの受光態勢または草型を改良する方法の提供。【解決手段】Ｓｐｋ（ｔ）座を含むゲノム配列を有する核酸、ならびに、Ｓｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡ、およびＳｐｋ（ｔ）タンパク質。当該Ｓｐｋ（ｔ）座を含むゲノム配列を含む核酸またはＳｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡを含む核酸を利用した、イネの受光態勢または草型を遺伝子工学的に改良する方法。その方法により得られる、株開帳性の草型を有する形質転換植物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸であって、以下：
ａ）配列番号１の塩基２７３５６−３１１０７で示される塩基配列を含む核酸；
ｂ）上記ａ）の核酸の一部であって、イネ株開帳性に関与する核酸；
ｃ）上記ａ）またはｂ）の核酸と少なくとも７０％の同一性を有し、かつイネ株開帳性に関与する核酸；
ｄ）上記ａ）またはｂ）の核酸の塩基配列において、１ないし複数の塩基が欠失、置換、挿入または付加しており、かつイネ株開帳性に関与する核酸；
ｅ）上記ａ）またはｂ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、イネ株開帳性に関与する核酸；および
ｆ）上記ａ）−ｅ）のいずれかの核酸に相補的な核酸；
からなる群より選択される、前記核酸。
【請求項２】
配列番号１の塩基２７３５６−３１１０７で示される塩基配列を含む核酸が、以下：
配列番号１の塩基２５５９１−３１６４４で示される塩基配列；
配列番号１の塩基２４５６７−３５３８９で示される塩基配列；
配列番号１の塩基１９８８８−３４８９４で示される塩基配列；
配列番号１の塩基１３２３０−３５２０５で示される塩基配列；および
配列番号１で示される塩基配列；
からなる群より選択される塩基配列を含む核酸である、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
配列番号１の塩基２７３５６−３１１０７で示される塩基配列を含む核酸の一部であって、イネ株開帳性に関与する核酸が、少なくとも配列番号１の塩基２７４１２−２８６８７で示される塩基配列を含む核酸である、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
イネの受光態勢または草型を改良する方法であって、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の核酸をイネに導入することを含む、前記方法。
【請求項５】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の核酸をイネに導入することにより得られる、株開帳性の草型を有するイネ。
【請求項６】
ａ）配列番号２の塩基３９−８１８で示される塩基配列を含む核酸；
ｂ）配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードする核酸；
ｃ）上記ａ）の核酸と少なくとも７０％の同一性を有し、かつイネ株開帳性に関与する核酸；
ｄ）上記ａ）の核酸の塩基配列において、１ないし複数の塩基が欠失、置換、挿入または付加しており、かつイネ株開帳性に関与する核酸；
ｅ）上記ａ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、イネ株開帳性に関与する核酸；および、
ｆ）上記ａ）−ｅ）のいずれかの核酸に相補的な核酸；
からなる群より選択される、核酸。
【請求項７】
イネの受光態勢または草型を改良する方法であって、請求項６に記載の核酸をイネに導入することを含む、前記方法。
【請求項８】
請求項６に記載の核酸をイネに導入することにより得られる、株開帳性の草型を有するイネ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イネ株開帳性関与遺伝子Ｓｐｋ（ｔ）に関する。本発明はまた、当該Ｓｐｋ（ｔ）遺伝子を利用したイネの受光態勢または草型を改良する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イネにおける草型の改良は、栽培適性や収量に直接影響を与えるため、重要な育種目標である。株の開帳性は、受光態勢に大きく関係することから、草型改良育種の重要な構成要素のひとつである。
【０００３】
従来の草型育種は、圃場における育種家の選抜により行われてきた。しかし、草型は多数の遺伝子座の作用により決定されているため、表現型による選抜は多大な労力と年月を要する。また、草型関与遺伝子の発現様式を変更するなど、遺伝子工学的手法により草型を人為的に改変することは、従来育種では不可能であった。
【０００４】
イネ株開帳性関与遺伝子Ｓｐｋ（ｔ）（インディカ品種Ｋａｓａｌａｔｈに由来）に関しては、第９染色体上のＣ６２１６３座とＥ４０５５座との間に座乗することが報告されている（Yamamoto, T., et al., Breeding Science, 47:141-144 (1997)；Miyata, M., et al., Ikushugakukenkyu, 4 (suppl.1):69 (2002)；および、Miyata, M., et al., Breeding Science, 55: 237-239 (2005)；を参照）。しかしながら、遺伝子配列の特定にまでは至っていなかった。また、ジャポニカ品種Ｌｅｍｏｎｔとインディカ品種Ｔｅｑｉｎｇとの交雑後代を用いたＱＴＬ解析（Li, Z., et al., Euphytica, 109:79-84 (1999)を参照）により、第９染色体に分げつ角度に関与する座が存在することが示されており、Ｓｐｋ（ｔ）座と同一座である可能性も考えられるが、遺伝子配列は特定されていない。
【非特許文献１】Yamamoto, T., et al., Breeding Science, 47:141-144 (1997)
【非特許文献２】Miyata, M., et al., Ikushugakukenkyu, 4 (suppl.1):69 (2002)
【非特許文献３】Miyata, M., et al., Breeding Science, 55: 237-239 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、インディカ品種Ｋａｓａｌａｔｈの第９染色体上のＣ６２１６３座とＥ４０５５座との間に座乗することが知られるイネ株開帳性関与遺伝子Ｓｐｋ（ｔ）に関して、当該Ｓｐｋ（ｔ）遺伝子が座乗する遺伝子座を、遺伝子組換え技術が適用できる、より狭い範囲で特定し、さらに、Ｓｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡを特定し、これを提供することを目的とする。
【０００６】
本発明はまた、本発明が提供するＳｐｋ（ｔ）遺伝子が座乗する遺伝子座のゲノム配列を含む核酸、またはＳｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡを含む核酸を遺伝子組換え技術によりイネに導入することにより、イネの受光態勢または草型を改良する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究の結果、Ｓｐｋ（ｔ）遺伝子が座乗する遺伝子座をインディカ品種Ｋａｓａｌａｔｈの第９染色体上の極めて狭い範囲に特定するとともに、Ｓｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡの同定にも成功し、本発明を完成させた。
【０００８】
よって本発明は、Ｓｐｋ（ｔ）座のゲノム配列を含む核酸であって、以下：
ａ）配列番号１の塩基２７３５６−３１１０７（３．８ｋｂ断片）で示される塩基配列を含む核酸；
ｂ）上記ａ）の核酸の一部であって、イネ株開帳性に関与する核酸；
ｃ）上記ａ）またはｂ）の核酸と少なくとも７０％の同一性を有し、かつイネ株開帳性に関与する核酸；
ｄ）上記ａ）またはｂ）の核酸の塩基配列において、１ないし複数の塩基が欠失、置換、挿入または付加しており、かつイネ株開帳性に関与する核酸；
ｅ）上記ａ）またはｂ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、イネ株開帳性に関与する核酸；および
ｆ）上記ａ）−ｅ）のいずれかの核酸に相補的な核酸；
からなる群より選択される、前記核酸を提供する。
【０００９】
また、本発明は、Ｓｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡを含む核酸であって、以下：
ａ）配列番号２の塩基３９−８１８で示される塩基配列を含む核酸；
ｂ）配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードする核酸；
ｃ）上記ａ）の核酸と少なくとも７０％の同一性を有し、かつイネ株開帳性に関与する核酸；
ｄ）上記ａ）の核酸の塩基配列において、１ないし複数の塩基が欠失、置換、挿入または付加しており、かつイネ株開帳性に関与する核酸；
ｅ）上記ａ）の核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、イネ株開帳性に関与する核酸；および、
ｆ）上記ａ）−ｅ）のいずれかの核酸に相補的な核酸；
からなる群より選択される、前記核酸を提供する。
【００１０】
別の態様において本発明は、本発明のＳｐｋ（ｔ）座を含む核酸またはＳｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡを含む核酸をイネに導入することを含む、イネの受光態勢または草型を改良する方法を提供する。
【００１１】
本発明はまた、本発明の方法により得られる株開帳性の草型を有するイネを提供する。
【００１２】
本発明はさらに、Ｓｐｋ（ｔ）タンパク質であって、以下：
ａ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質；
ｂ）配列番号３で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有し、かつイネ株開帳性に関与するタンパク質；および
ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において、１ないし複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加しており、かつイネ株開帳性に関与するタンパク質；
からなる群より選択される、前記タンパク質を提供する。
【００１３】
本発明はさらにまた、本発明のアミノ酸に対する抗体を提供する。
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
Ｓｐｋ（ｔ）座を含む核酸
本発明は、イネ株開帳性関与遺伝子（Ｓｐｋ（ｔ））座のゲノム配列を含む核酸を提供する。
【００１６】
Ｓｐｋ（ｔ）遺伝子はインディカ品種Ｋａｓａｌａｔｈの第９染色体上のＣ６２１６３座とＥ４０５５座との間に座乗することがこれまでに明らかになっていたが、この領域は約１２０ｋｂと非常に広く、遺伝子工学的手法による草型の改変に用いるには適していなかった。
【００１７】
本発明者らは、実施例２に記載するように、Ｓｐｋ（ｔ）遺伝子が座乗するゲノム配列として、先ず、従来特定されていた範囲よりも狭い、配列番号１の塩基配列を同定した。さらに、実施例３および５に記載するように、配列番号１の塩基配列のうち、Ｓｐｋ（ｔ）遺伝子を含む領域は、配列番号１の塩基１３２３０−３５２０５（２２．０ｋｂ断片）、塩基１９８８８−３４８９４（１５．０ｋｂ断片）、塩基２４５６７−３５３８９（１０．８ｋｂ断片）、塩基２５５９１−３１６４４（６．１ｋｂ断片）、そして塩基２７３５６−３１１０７（３．８ｋｂ断片）であることを同定した。
【００１８】
本発明者らはさらに、実施例４に記載するように、Ｓｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡを同定し、Ｓｐｋ（ｔ）遺伝子は、配列番号１の塩基２７４１２−２８６８７で示される領域に座乗することを明らかにした。
【００１９】
したがって、本発明のＳｐｋ（ｔ）座のゲノム配列を含む核酸は、配列番号１の塩基２７３５６−３１１０７（３．８ｋｂ断片）で示される塩基配列、あるいは、その一部であってイネ株開帳性に関与する塩基配列、を含む核酸である。
【００２０】
ここで、配列番号１の塩基２７３５６−３１１０７（３．８ｋｂ断片）で示される塩基配列を含む核酸は、配列番号１の塩基２７３５６−３１１０７（３．８ｋｂ断片）で示される塩基配列の他、配列番号１の塩基２５５９１−３１６４４（６．１ｋｂ断片）で示される塩基配列；配列番号１の塩基２４５６７−３５３８９（１０．８ｋｂ断片）で示される塩基配列；配列番号１の塩基１９８８８−３４８９４（１５．０ｋｂ断片）で示される塩基配列；配列番号１の塩基１３２３０−３５２０５（２２．０ｋｂ断片）で示される塩基配列；および、配列番号１で示される塩基配列；からなる群より選択される塩基配列を含む核酸であってもよく、また当該塩基配列からなる核酸であってもよい。
【００２１】
また、配列番号１の塩基２７３５６−３１１０７（３．８ｋｂ断片）で示される塩基配列の一部であってイネ株開帳性に関与する塩基配列を含む核酸、とは、少なくとも配列番号１の塩基２７４１２−２８６８７で示される塩基配列を含む核酸である。Ｓｐｋ（ｔ）遺伝子は、配列番号１の塩基２７４１２−２８６８７で示される領域に座乗することが本明細書の実施例４に記載のように示されているので、少なくともこの配列を有する核酸は、イネ株開帳性に関与すると考えられる。
【００２２】
ただし、本発明のＳｐｋ（ｔ）座のゲノム配列を含む核酸は、インディカ品種Ｋａｓａｌａｔｈの第９染色体上のＣ６２１６３座とＥ４０５５座との間のゲノム配列よりは短いものとする。
【００２３】
以下、本明細書中、上述した本発明のＳｐｋ（ｔ）座のゲノム配列を含む核酸は、「Ｓｐｋ（ｔ）座を含む核酸」という用語により表される。また、本発明には、Ｓｐｋ（ｔ）座を含む核酸の変異体も含まれる。よって、本明細書において、「Ｓｐｋ（ｔ）座を含む核酸」という用語は、特に言及がなければ、広くＳｐｋ（ｔ）座を含む核酸の変異体をも含む意図で用いられる。
【００２４】
本発明のＳｐｋ（ｔ）座を含む核酸の変異体は、イネ株開帳性に関与する。核酸がイネ株開帳性に関与するとは、当該核酸を導入した植物が株開帳性の形質を発現する活性があることをいう。または、核酸がイネ株開帳性に関与するとは、当該核酸が、配列番号３に示すＳｐｋ（ｔ）タンパク質と同様の、株開帳性の表現型を植物に与える活性を有するタンパク質をコードすることをいう。
【００２５】
本発明のＳｐｋ（ｔ）座を含む核酸の変異体は、Ｓｐｋ（ｔ）座を含む核酸について上述した塩基配列において、１または複数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加を含む塩基配列を含んでなる核酸であって、イネ株開帳性に関与する核酸であってよい。本発明のＳｐｋ（ｔ）座を含む核酸の変異体について、「１または複数のヌクレオチド」とは、イネ株開帳性に関与する核酸である限り、１以上のヌクレオチドであれば特に制限されない。「１または複数のヌクレオチド」は、１または数個のヌクレオチドと記載してもよい。「１または複数のヌクレオチド」の具体的な範囲は、１ないし数千個、１ないし千個、１ないし５００個、１ないし１００個、１ないし５０個、１ないし２０個、１ないし１０個、または、１ないし５個のヌクレオチドであってよい。
【００２６】
本発明のＳｐｋ（ｔ）座を含む核酸の変異体はまた、Ｓｐｋ（ｔ）座を含む核酸について上述した塩基配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有する核酸であって、イネ株開帳性に関与する核酸であってよい。
【００２７】
ここで、２つの核酸配列の同一性％は、視覚的検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Devereux, et al., 1984, Nucl. Acids Res., 12: 387）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの核酸配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、および非同一物について０の値を含む）一元（unary）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、SchwartzおよびDayhoff監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Atlas of Polypeptide Sequence and Structure）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、GribskovおよびBurgess, Nucl. Acids Res., 14: 6745, 1986 の加重アミノ酸比較マトリックス；または他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；またはヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：および（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：http://blast.wustl.eduに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（WoottonおよびFederhenのＳＥＧプログラム（Computers and Chemistry, 1993）により決定される；WoottonおよびFederhen, 1996 「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Analysis of compositionally biased regions in sequence databases)」Methods Enzymol., 266: 544-71も参照されたい）、または、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ClaverieおよびStates（Computers and Chemistry, 1993）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、および（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ−スコア（KarlinおよびAltschul, 1990）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。
【００２８】
本発明のＳｐｋ（ｔ）座を含む核酸の変異体はさらに、Ｓｐｋ（ｔ）座を含む核酸について上述した塩基配列の相補鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、イネ株開帳性に関与する核酸であってよい。
【００２９】
ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第３版，第６−７章，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、および／または、約４０−５０℃、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣを含み、そして約５０％ホルムアミドを含んでも含まなくてもよいハイブリダイゼーション溶液（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Stark’s solution）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、ならびに、例えば、約４０℃−６０℃、０．５−６×ＳＳＣを含み、そして０．１％  ＳＤＳを含んでも含まなくてもよい洗浄溶液、の洗浄条件の使用が含まれる。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃、６×ＳＳＣないし２×ＳＳＣ、好ましくは約５０℃、６×ＳＳＣ、さらに好ましくは約５０℃、２×ＳＳＣ、のハイブリダイゼーション条件（及び洗浄条件）を含む。高程度にストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般に、高程度にストリンジェントな条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度および／または低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、約６５℃、６×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣ、好ましくは６×ＳＳＣ、より好ましくは２×ＳＳＣ、最も好ましくは０．２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション）および／または洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、およびおよそ６５℃−６８℃、０．２×ＳＳＣを含み、そして０．１％  ＳＤＳを含んでも含まなくてもよい洗浄溶液での洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間行う。
【００３０】
当業者に知られていて、以下にさらに記載したように、ハイブリダイゼーション反応と二本鎖の安定性を支配する基本原理を適用することによって望ましい度合いのストリンジェンシーを達成するためには、洗浄温度と洗浄塩濃度を必要に応じて調整することが可能であると理解すべきである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１を参照されたい）。核酸を未知配列の標的核酸へハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さはハイブリダイズする核酸のそれであると仮定される。既知配列の核酸をハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さは核酸の配列を並列させ、最適な配列相補性をもつ単数または複数の領域を同定することによって決定可能である。５０塩基対未満の長さであることが予測されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５−２５℃低くなければならず、Ｔｍは、以下の等式により決定される。長さ１８塩基対未満のハイブリッドに関して、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基数）。１８塩基対を超える長さのハイブリッドに関しては、Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋４１（モル分率［Ｇ＋Ｃ］）−０．６３（％ホルムアミド）−５００／ｎであり、ここで、Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、そして［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度である（１×ＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。好ましくは、こうしたハイブリダイズする核酸は各々、少なくとも８ヌクレオチド（または、より好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチド、または少なくとも２０ヌクレオチド、または少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも３０ヌクレオチド、または少なくとも４０ヌクレオチド、または最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド）、またはそれがハイブリダイズする核酸の長さの少なくとも１％（より好ましくは少なくとも２５％、または少なくとも５０％、または少なくとも７０％、そして最も好ましくは少なくとも８０）である長さを有し、それがハイブリダイズする核酸と少なくとも７０％（より好ましくは少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、そして最も好ましくは少なくとも９９．５％）の配列同一性を有する。ここで配列同一性は、上記により詳しく記載されるように、重複部分と同一性を最大化する一方、配列ギャップを最小化するように並列された、ハイブリダイズする核酸の配列を比較することによって決定される。
【００３１】
本発明のＳｐｋ（ｔ）座を含む核酸には、上述した核酸の相補鎖も含まれてよい。また、本発明の核酸は一本鎖および二本鎖型の核酸を含む。本明細書において、核酸とは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む意図で用いられてよい。
【００３２】
本発明のＳｐｋ（ｔ）座を含む核酸は、植物から得られるゲノムＤＮＡ、当業者に公知の手法により化学的に合成されたＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼや逆転写酵素などにより（ＰＣＲ法などにより）合成されたＤＮＡ、あるいはそれらの組み合わせが含まれる。
【００３３】
Ｓｐｋ（ｔ）座を含む核酸の変異体がイネ株開帳性に関与するか否かは、限定されるわけではないが、例えば以下のように調べることが可能である。Ｈｉｅｉら（Plant J., 6:271-82, (1994)）の方法に従い、日本晴に被検定核酸断片を導入する。形質転換植物を移植適期まで育成した後、ＰＣＲ検定を行い、完全な形で導入断片を保有すると考えられる個体を選抜し、慣行法に従って栽培する。そして、栽培した形質転換植物の表現型を、Ｓｐｋ系統（日本晴の遺伝的背景でＫａｓａｌａｔｈ由来のＳｐｋ（ｔ）領域を持つ系統）の表現型と比較する。形質転換植物の表現型がＳｐｋ系統と同様の株開帳性草型を示した場合は、当該被検定核酸断片はイネ株開帳性に関与する核酸である一方、日本晴と同様の閉鎖性草型を示す場合は、当該被検定核酸断片はイネ株開帳性に関与しない、と判断する。
【００３４】
Ｓｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡを含む核酸
本発明は、Ｓｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡを含む核酸を提供する。
【００３５】
本発明のＳｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡを含む核酸は、配列番号２の塩基３９−８１８で示される塩基配列を含む核酸である。
【００３６】
また、本発明のＳｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡを含む核酸には、Ｓｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡを含む核酸の変異体も含まれる。本明細書において、「Ｓｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡを含む核酸」という用語は、特に言及がなければ、Ｓｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡを含む核酸の変異体をも含む意図で用いられる。
【００３７】
本発明のＳｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡを含む核酸の変異体は、イネ株開帳性に関与する。核酸がイネ株開帳性に関与するとは、当該核酸を導入した植物が株開帳性の形質を発現する活性があることをいう。または、核酸がイネ株開帳性に関与するとは、当該核酸が、配列番号３に示すＳｐｋ（ｔ）タンパク質と同様の、株開帳性の表現型を植物に与える活性を有するタンパク質をコードすることをいう。
【００３８】
本発明のＳｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡを含む核酸の変異体は、配列番号２の塩基３９−８１８で示される塩基配列とは完全に一致しないが、配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードする核酸であってよい。配列番号３で示されるアミノ酸配列は、配列番号２の塩基３９−８１８で示される核酸がコードするアミノ酸配列である。１つ以上のコドンが同一のアミノ酸をコードする場合があり、遺伝暗号の縮重と呼ばれている。このため、配列番号２の塩基３９−８１８で示される塩基配列とは完全には一致していない配列が、配列番号２の塩基３９−８１８で示される塩基配列と全く同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードすることがあり得る。こうした変異体の塩基配列は、サイレント突然変異（例えば、ＰＣＲ増幅中に発生する）から生じてもよいし、または天然配列の意図的な突然変異誘発の産物であってもよい。
【００３９】
また、本発明のＳｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡを含む核酸の変異体は、Ｓｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡについて上述した塩基配列において、１または複数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加を含む塩基配列を含んでなる核酸であって、イネ株開帳性に関与する核酸であってもよい。本発明のＳｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡを含む核酸の変異体について、「１または複数のヌクレオチド」とは、イネ株開帳性に関与する核酸である限り、１以上のヌクレオチドであれば特に制限されない。「１または複数のヌクレオチド」は、１または数個のヌクレオチドと記載してもよい。「１または複数のヌクレオチド」の具体的な範囲は、１ないし２５０個、１ないし２００個、１ないし１５０個、１ないし１００個、１ないし５０個、１ないし２０個、１ないし１０個、または１ないし５個のヌクレオチドであってよい。
【００４０】
本発明のＳｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡを含む核酸の変異体はまた、Ｓｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡについて上述した塩基配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有する核酸であって、イネ株開帳性に関与する核酸であってもよい。２つの塩基配列の同一性％は上述した方法により決定することができる。
【００４１】
本発明のＳｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡを含む核酸の変異体はさらに、Ｓｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡについて上述した塩基配列の相補鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、イネ株開帳性に関与する核酸であってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、先に定義した条件下であることを意味する。
【００４２】
本発明のＳｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡを含む核酸には、その相補鎖も含まれてよい。
【００４３】
本発明のＳｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡを含む核酸は、植物から得られるｃＤＮＡ、当業者に公知の手法により化学的に合成されたＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼや逆転写酵素などにより（ＰＣＲ法などにより）合成されたＤＮＡ、あるいはそれらの組み合わせが含まれる。
【００４４】
本発明のＳｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡを含む核酸の変異体がイネ株開帳性に関与するか否かは、限定されるわけではないが、Ｓｐｋ（ｔ）座を含む核酸について上述したように形質転換植物を作成し、Ｓｐｋ（ｔ）系統と日本晴の表現型とそれぞれ比較することにより調べることが可能である。
【００４５】
イネの受光態勢または草型を改良する方法
本発明は、本発明のＳｐｋ（ｔ）座を含む核酸、または、本発明のＳｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡを含む核酸をイネに導入することにより、イネの受光態勢または草型を改良する方法を提供する。ここで、本発明のＳｐｋ（ｔ）座を含む核酸、または本発明のＳｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡを含む核酸は、先に定義した通りである。
【００４６】
別の態様において、本発明の方法は、以下の工程：
（１）本発明のＳｐｋ（ｔ）座を含む核酸、または、本発明のＳｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡを含む核酸、を含む組換えベクターを構築し；
（２）当該組換えベクターをイネに導入し；
（３）形質転換された植物材料を選抜し；そして、
（４）選抜された形質転換体を再分化し、形質転換イネを得る；
を含む、イネの受光態勢または草型を改良する方法である。
【００４７】
本発明の方法における核酸のイネへの導入方法は特に限定されず、公知の方法を使用することが可能である。本発明の核酸は、公知の遺伝子工学的な方法によって導入してよい。
【００４８】
遺伝子工学的手法による形質導入のためにはいかなる適切な組換えベクターを使用してもよい。そのような本発明の核酸を含む組換えベクターもまた、本発明の範囲内である。
本発明の組換えベクターは、本発明の核酸を含むベクターであれば特に限定されないが、当該核酸がコードするタンパク質の発現を制御する、プロモーターやターミネーターなどの配列を伴う組換え発現ベクターとしてもよい。
【００４９】
プラスミドなどのベクターに本発明の核酸のＤＮＡ断片を組み込む方法としては、例えば、Sambrook,J.ら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, 1.53 (1989) に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えベクター（例えば、組換えプラスミド）は、宿主細胞であるイネに導入される。
【００５０】
べクターは、簡便には当該技術分野において入手可能な組換え用ベクター（例えば、プラスミドＤＮＡなど）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。本発明の核酸断片を用いてイネに株開帳性の形質を付与する場合には、特に、植物形質転換用ベクターが有用である。植物用ベクターとしては、植物細胞中で当該核酸に含まれる遺伝子を発現し、当該遺伝子にコードされるタンパク質を生産する能力を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ１２１（以上Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、及びこれらから派生したベクターが挙げられる。また、特に単子葉植物であるイネの形質転換には、ｐＩＧ１２１Ｈｍ、ｐＴＯＫ２３３（以上Hieiら、Plant J., 6,  271-282(1994)）、ｐＳＢ４２４（Komariら、Plant J., 10, 165-174(1996)）などが例示される。
【００５１】
形質転換植物は、上述のベクターのβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子の部位に本発明の核酸断片を入れ替えて植物形質転換用ベクターを構築し、これを植物に導入することで調製することができる。植物形質転換用ベクターは、少なくともプロモーター、翻訳開始コドン、所望の遺伝子（本発明の核酸またはその一部）、翻訳終始コドンおよびターミネーターを含んでいることが好ましい。また、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、選抜マーカー領域などを適宜含んでいてもよい。プロモーター、ターミネーターは植物細胞で機能するものであれば特に限定されない。Ｋａｓａｌａｔｈ由来のＳｐｋ（ｔ）ゲノム配列に含まれるプロモーターおよびターミネーターをそのまま使用してもよく、また、他の由来のものを組み込んで用いてもよい。他の由来のものを組み込んで用いる場合、構成的発現をするプロモーターを用いてもよく、また誘導可能なプロモーターを用いてもよい。構成的発現をするプロモーターとしては、上記ベクターに予め組み込まれている３５Ｓプロモーターの他に、アクチン、ユビキチン遺伝子のプロモーターなどが例示される。プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列は、機能可能であるように連結されており、よってこれらの制御配列は導入される核酸断片に対して機能的に関連している。
【００５２】
本発明のＳｐｋ（ｔ）座を含む核酸のうち、配列番号１の塩基２５５９１−３１６４４（６．１ｋｂ断片）を少なくとも有する核酸を導入遺伝子として組換え発現ベクターに組み込む場合、当該核酸はプロモーター、翻訳開始コドン、所望の遺伝子、翻訳終始コドンおよびターミネーターを含むため、特に必要なければ、当該発現ベクターに別のプロモーターやターミネーター等の制御配列を組み込まなくてもよい。
【００５３】
本発明のＳｐｋ（ｔ）座を含む核酸のうち、配列番号１の塩基２７３５６−３１１０７（３．８ｋｂ断片）を少なくとも有し、配列番号１の塩基２５５９１−３１６４４(６．１ｋｂ断片）よりは長くない核酸を導入遺伝子として組換え発現ベクターに組み込む場合、適切なプロモーターを別途組換え発現ベクターに組み込むことが好ましい。これは、当該導入遺伝子は、翻訳開始コドン、所望の遺伝子、翻訳終始コドンおよびターミネーターを含んでいるがプロモーターを含まない可能性があるためである。
【００５４】
本発明のＳｐｋ（ｔ）座を含む核酸のうち、配列番号１の塩基２７３５６−３１１０７（３．８ｋｂ断片）の一部、例えば配列番号１の塩基２７４１２−２８６８７、および、本発明のＳｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡを含む核酸を導入遺伝子として組換え発現ベクターに組み込む場合、適切なプロモーターおよびターミネーターを別途組換え発現ベクターに組み込むことが好ましい。これは、当該導入遺伝子は、翻訳開始コドン、所望の遺伝子、および翻訳終始コドンを含むが、プロモーターおよびターミネーターを含まない可能性があるためである。
【００５５】
また、一般的に組換えベクターには、形質転換体を同定する選択マーカー遺伝子が含まれている。選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。
【００５６】
プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、一般に、Sambrook, J.ら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, 1.74(1989)に記載のリン酸カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法（Science, 227, 129 (1985)）、エレクトロポレ−ション法（Nature, 319, 791 (1986)）によって形質転換することができる。
【００５７】
特に植物への遺伝子導入法としては、アグロバクテリウムを用いる方法（Horsch, et al., Science, 227, 129 (1985)、Hiei, et al., Plant J., 6, 271-282(1994)）、エレクトロポレーション法（Fromm, et al., Nature, 319, 791 (1986)）、ＰＥＧ法（Paszkowski et al., EMBO J., 3, 2717 (1984)）、マイクロインジェクション法（Crossway, et al., Mol. Gen. Genet., 202, 179 (1986））、微小物衝突法（McCabe et al., Bio/Technology, 6, 923 (1988))などが挙げられる。所望の植物に核酸を導入する方法であれば特に限定されない。
【００５８】
限定されるわけではないが、アグロバクテリウムを用いるイネへの形質導入方法は、例えば、Hiei, et al., Plant J., 6, p.271-282 (1994)、Komari, et al., Plant J., 10, p.165-174 (1996)、Ditta, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: p.7347-7351 (1980)等に記載されている。
【００５９】
限定されるわけではないが、本発明の核酸のイネへの導入は、具体的には次のように行うことができる。先ず、所期の導入したい核酸断片を含むプラスミドベクターを作成する。プラスミドベクターは、例えば、前記Komari, et al., Plant J., 10, p.165-174 (1996)らにプラスミドマップが記載されている、ｐＳＢ１１、ｐＳＢ２２等が使用可能である。あるいは、当業者は例えば前記ｐＳＢ１１、ｐＳＢ２２等のプラスミドベクターを基に、自ら適当なベクターを構築する事も可能である。本明細書後述する実施例では、ｐＳＢ１１を基に、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを持つ中間ベクターｐＳＢ２００を作成して使用した。具体的には、先ず、ユビキチンプロモーターとユビキチンイントロン（Ｐｕｂｉ−ｕｂｉＩ）に、ノパリン合成酵素のターミネーター（Ｔｎｏｓ）を接続した。これより得られたＰｕｂｉ−ｕｂｉＩ−Ｔｎｏｓ接続体のｕｂｉＩ−Ｔｎｏｓ間に、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ＨＹＧ（Ｒ））を挿入することにより、Ｐｕｂｉ−ｕｂｉＩ−ＨＹＧ（Ｒ）−Ｔｎｏｓからなる接続体を得た。この接続体を、ｐＳＢ１１（Ｋｏｍａｒｉら、上述）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片に接続することにより、ｐＫＹ２０５を得た。このｐＫＹ２０５のＰｕｂｉ上流に存在するＨｉｎｄＩＩＩ部位にＮｏｔＩ、ＮｓｐＶ、ＥｃｏＲＶ、ＫｐｎＩ、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩの制限酵素部位を追加するためのリンカー配列を挿入することにより、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを有するｐＳＢ２００を得た。
【００６０】
次いで、挿入核酸を含む組換えベクターを用いて大腸菌（例えばＤＨ５α、ＪＭ１０９、ＭＶ１１８４等、いずれも例えばＴＡＫＡＲＡ社より購入可能）を形質転換する。
【００６１】
さらに、形質転換された大腸菌を用いて、アグロバクテリウム菌株を好ましくはヘルパー大腸菌株とともに、例えば、Ｄｉｔｔａら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: p.7347-7351 (1980)）の方法に従い、三菌系交雑（triparential mating）を行う。限定されるわけではないが、アグロバクテリウムは例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株ＬＢＡ４４０４／ｐＳＢ１、ＬＢＡ４４０４／ｐＮＢ１、ＬＢＡ４４０４／ｐＳＢ３等を使用することが可能である。いずれも前述のKomari, et al., Plant J., 10, p.165-174 (1996)にプラスミドマップが記載されており、当業者は例えば自らベクター構築を行うことにより使用可能である。限定されるわけではないが、ヘルパー大腸菌は、例えばＨＢ１０１／ｐＲＫ２０１３（クローンテック社より入手可能）等が使用可能である。また、より一般的ではないがｐＲＫ２０７３を保有する大腸菌もヘルパー大腸菌として使用可能との報告がある（Lemas, et al., Plasmid, 1992, 27, p.161-163）。
【００６２】
次いで、所期の交雑が生じたアグロバクテリウムを用いて、例えば、Ｈｉｅｉら（Plant J., 6, p.271-282 (1994)）の方法に準拠し、イネの形質転換を行い、所期の導入核酸断片をイネに導入する。
【００６３】
本発明の方法において、本発明の核酸が導入されるイネは、イネであれば特に限定されないが、株閉鎖性の草型を有するイネであることが好ましい。株閉鎖性の草型を有するイネにはジャポニカイネが挙げられ、好ましくは日本晴、あそみのり、コシヒカリ、キヌヒカリ、どんとこい、いただき、ヒノヒカリなどが挙げられる。
【００６４】
また、本発明の方法において、本発明の核酸が導入されるイネの形態は特に限定されず、例えば、細胞、葉、根、茎、芽、花（雄蕊、雌蕊等含む）、実、種子、発芽種子もしくはその他いずれかの部位の植物組織、成長点、外植片、未熟胚、カルスもしくは不定胚様組織（以下、本明細書においてカルス等、または単にカルスという）、または完全な植物体、などのイネのあらゆる態様の形態が含まれる。本発明の核酸が導入されるイネの形態として好ましいのは未熟胚またはカルスであり、最も好ましいのは未熟胚である。
【００６５】
本発明の方法においてはさらに、所期の導入核酸断片をイネに導入した後、慣行法に従って栽培することにより、株開帳性の草型を有する形質転換イネを得ることができる。必要に応じ、ＰＣＲ検定などを行うことにより、当該導入核酸断片を完全な形で保有する個体を選抜することもできる。
【００６６】
本発明の方法により得られた形質転換イネもまた、本発明の範囲内である。本発明の形質転換イネは、株開帳性の草型を有する。
【００６７】
Ｓｐｋ（ｔ）タンパク質
本発明は、Ｓｐｋ（ｔ）タンパク質を提供する。
【００６８】
本発明のＳｐｋ（ｔ）タンパク質は、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質である。また、本発明のＳｐｋ（ｔ）タンパク質には、Ｓｐｋ（ｔ）タンパク質の変異体も含まれる。本明細書において、「Ｓｐｋ（ｔ）タンパク質」という用語は、特に言及がなければ、Ｓｐｋ（ｔ）タンパク質の変異体をも含む意図で用いられる。
【００６９】
Ｓｐｋ（ｔ）タンパク質の変異体は、配列番号３のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質であって、イネ株開帳性に関与するタンパク質であってもよい。イネ株開帳性に関与するタンパク質とは、当該タンパク質が、配列番号３に示すＳｐｋ（ｔ）タンパク質と同様の、株開帳性の表現型を植物に与える活性を有するタンパク質であることをいう。
【００７０】
置換は、保存的置換であってもよく、これは特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることである。保存的置換の非限定的な例には、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａ相互の置換の様な脂肪族基含有アミノ酸残基の間の置換、ＬｙｓおよびＡｒｇ、ＧｌｕおよびＡｓｐ、ＧｌｎおよびＡｓｎ相互の置換のような極性残基の間での置換などが含まれる。
【００７１】
アミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加による変異体は、野生型タンパク質をコードするＤＮＡに、例えば周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、Nucleic Acid Research, Vol.10, No. 20, p.6487-6500, 1982参照、引用によりその全体を本明細書に援用する）を施すことにより作成することができる。本明細書において、「１または複数のアミノ酸」とは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換、挿入および／または付加できる程度のアミノ酸を意味する。「１または複数のアミノ酸」は、１または数個のアミノ酸と記載してもよい。「１または複数のアミノ酸」の具体的な範囲は、１ないし８０個、１ないし５０個、１ないし２５個、１ないし１５個、１ないし１０個、または１ないし５個であってよい。
【００７２】
部位特異的変異誘発法は、例えば、所望の変異である特定の不一致の他は、変異を受けるべき一本鎖ファージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて次のように行うことができる。即ち、プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いてファージに相補的な鎖を合成させ、得られた二重鎖ＤＮＡで宿主細胞を形質転換する。形質転換された細菌の培養物を寒天にプレーティングし、ファージを含有する単一細胞からプラークを形成させる。そうすると、理論的には５０％の新コロニーが一本鎖として変異を有するファージを含有し、残りの５０％が元の配列を有する。上記所望の変異を有するＤＮＡと完全に一致するものとはハイブリダイズするが、元の鎖を有するものとはハイブリダイズしない温度において、得られたプラークをキナーゼ処理により標識した合成プローブとハイブリダイズさせる。次に該プローブとハイブリダイズするプラークを拾い、培養してＤＮＡを回収する。
【００７３】
なお、生物活性ペプチドのアミノ酸配列にその活性を保持しつつ１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を施す方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法、および遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌクレオチドを除去、置換、挿入または付加し、次いで連結する方法もある。
【００７４】
また、Ｓｐｋ（ｔ）タンパク質の変異体は、配列番号３のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有すアミノ酸配列を含むタンパク質であって、イネ株開帳性に関与するタンパク質であってもよい。
【００７５】
２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査および数学的計算によって決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Needleman, S. B. 及びWunsch, C. D. （J. Mol. Biol., 48: 443-453, 1970）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Henikoff, S. 及びHenikoff, J. G. （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919, 1992）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
【００７６】
当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えばAltschulら(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でNational Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）、あるいはDNA Data Bank of Japan（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。または、２つのアミノ酸配列の同一性％は、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．７（ゼネティックス製）などのプログラム、または、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなどを用いて決定してもよい。その際、検索はデフォルト値を用いてよい。
【００７７】
また、本発明のＳｐｋ（ｔ）タンパク質は、本発明のＳｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡを含む核酸によりコードされるタンパク質であってもよい。
【００７８】
本発明のＳｐｋ（ｔ）タンパク質は、当業者に公知の組換えタンパク質の製造方法、すなわち当該タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを宿主細胞に導入し、当該宿主細胞を組換えタンパク質の発現に適する条件下で培養して、発現された組換えタンパク質を回収すること、により得ることができる。
【００７９】
本発明のＳｐｋ（ｔ）タンパク質がイネ株開帳性に関与するか否かは、限定されるわけではないが、本発明のＳｐｋ（ｔ）タンパク質をコードする遺伝子を用いて、上述したように形質転換植物を作成し、Ｓｐｋ（ｔ）系統と日本晴の表現型とそれぞれ比較することにより調べることが可能である。
【００８０】
抗体
本発明は、本発明のＳｐｋ（ｔ）タンパク質に対する抗体を提供する。
【００８１】
本発明の抗体は、本発明のＳｐｋ（ｔ）タンパク質またはそのフラグメントに対して作成してもよい。ここで、本発明のＳｐｋ（ｔ）タンパク質のフラグメントは、当該タンパク質のアミノ酸配列中、少なくとも６アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、または少なくとも３０アミノ酸を含む配列を有するフラグメントである。
【００８２】
抗体は、本発明のＳｐｋ（ｔ）タンパク質またはそのフラグメントを、当該技術分野において抗体作成のために用いられる動物、例えば、限定されるわけではないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギなどに免疫して作製してもよい。抗体は、ポリクローナル抗体であっても、またはモノクローナル抗体であってもよい。抗体は、当業者に周知の抗体作製方法に基づいて作成することができる。
【００８３】
本発明の抗体は、本発明のＳｐｋ（ｔ）タンパク質をウエスタンブロッティングやＥＬＩＳＡなどのアッセイにおいて検出するのに用いることもできる。本発明の抗体はまた、本発明のＳｐｋ（ｔ）タンパク質をアフィニティー精製により回収するのに用いることもできる。
【発明の効果】
【００８４】
本発明は、本発明のＳｐｋ（ｔ）座を含む核酸、およびＳｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡを提供することより、受光態勢に大きく関係する草型である株開帳性を、遺伝子工学的手法により付与する方法を提供するという観点において貢献する。
【実施例】
【００８５】
実施例１  連鎖分析によるＳｐｋ（ｔ）領域の同定
（材料および方法）
日本晴とＫａｓａｌａｔｈとのＢＣ３Ｆ３集団のなかからＳｐｋ（ｔ）領域（Ｃ６２１６３からＥ４０５５）がヘテロであった６個体の自殖次代（３８４０個体）を供試して、Ｃ６２１６３座およびＥ４０５５座の遺伝子型を調査し、両座間での組換え型個体を探索した。得られた組換え型個体については、自殖次代系統（各系統６０個体）を圃場で栽培し、株開帳性に関する表現型を観察することにより、Ｓｐｋ（ｔ）座遺伝子型を推定した。
【００８６】
連鎖分析に用いるマーカーは、以下のようにして作成した。日本晴ＰＡＣクローンＰ００１２Ｂ６の塩基配列情報（独立行政法人農業生物資源研究所より入手）を利用して、Ｃ６２１６３−Ｅ４０５５間のゲノム断片の一部を増幅するＰＣＲプライマーを設計した。ＫａｓａｌａｔｈのトータルＤＮＡまたはＢＡＣクローンＢ１０４Ｄ１１（Ｐ００１２Ｂ６と類似位置にあるＫａｓａｌａｔｈ由来ＢＡＣ、独立行政法人農業生物資源研究所より入手）のＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物の塩基配列をダイレクトシークエンス法により解読した。解読したＫａｓａｌａｔｈ塩基配列を日本晴塩基配列（Ｐ００１２Ｂ６）と比較し、多型を探索した。
（結果および考察）
Ｃ６２１６３座およびＥ４０５５座の遺伝子型を調査した結果、３８４０個体のなかの１６個体が両座間の組換え型個体であることが分かった。以前行った１３１６個体の解析（Miyata, M., et al., Ikushugakukenkyu, 4 (suppl.1):69 (2002)；および、Miyata, M., et al., Breeding Science, 55: 237-239 (2005)；を参照）から、両座間の組換え型個体が６個体得られているので、合計２２個体を連鎖分析に供試することにした。
【００８７】
Ｃ６２１６３−Ｅ４０５５間のＫａｓａｌａｔｈゲノム配列を部分的に解読し、日本晴配列と比較することにより、この領域に１０個のＰＣＲマーカーを作出した。上記２２個体について、各マーカー座の遺伝子型を調査した結果、Ｓｐｋ（ｔ）座は１１２８６０ＭｓｅＩ座と１４３９７６ＡＬＰ座との間に座乗することが明らかになった（図１）。
実施例２  候補領域のＫａｓａｌａｔｈ塩基配列の完全解読
（材料および方法）
実施例１で明らかになったＳｐｋ（ｔ）候補領域のＫａｓａｌａｔｈ塩基配列を明らかにするために、対応する日本晴配列（Ｐ００１２Ｂ６）に基づいて設計したプライマー（３３対）を用いて、ＫａｓａｌａｔｈのトータルＤＮＡまたはＢＡＣ（Ｂ１０４Ｄ１１）ＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを行い、産物の塩基配列を解読した。
（結果および考察）
解読した３３個の塩基配列を繋ぎ合わせることにより、Ｓｐｋ（ｔ）を包含すると考えられる４０．８ｋｂ領域の塩基配列（配列番号１）が明らかになった。
実施例３  相補性試験
（材料および方法）
（１）１５．９ｋｂ断片（配列番号１の塩基５３−１５９２６）
ＫａｓａｌａｔｈのＢＡＣクローンＢ１０４Ｄ１１をＰａｃＩおよびＢｇｌＩＩで完全消化後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＴＥ溶液に溶解後、DNA Blunting Kit（ＴＡＫＡＲＡ社）により平滑化した。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけ、分離された１５．９ｋｂの断片を、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。
【００８８】
プラスミドベクターｐＳＢ２００（ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを持つ中間ベクター）をＥｃｏＲＶで完全消化後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＴＥ溶液に溶解後、ＣＩＡＰ（ＴＡＫＡＲＡ社）により脱リン酸化した。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけた後、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてゲルからベクター断片を精製した。
【００８９】
上記により準備したふたつの断片を供試して、DNA Ligation Kit Ver.1（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いてライゲーション反応を行った。反応後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡを純水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製装置により作成）に溶解後、大腸菌ＤＨ５αと混合し、エレクトロポレーションに供試した。エレクトロポレーション後の溶液を、ＬＢ培地で振とう培養（３７°Ｃ、１時間）した後、スペクチノマイシンを含むＬＢプレートに広げ、保温（３７°Ｃ、１６時間）した。生じたコロニーのなかの１２個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンおよび境界部塩基配列を調査することにより、所望の大腸菌を選抜した。
【００９０】
（２）１９．３ｋｂ断片（配列番号１の塩基５６３７−２４９３０）
ＫａｓａｌａｔｈのＢＡＣクローンＢ１０４Ｄ１１をＰａｃＩ、ＳｗａＩおよびＰｆｌＭＩで完全消化後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＴＥ溶液に溶解後、DNA Blunting Kit（ＴＡＫＡＲＡ社）により平滑化した。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけ、分離された１９．３ｋｂの断片を、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。
【００９１】
この断片を、（１）で用いたＥｃｏＲＶ−ＣＩＡＰ処理済みのｐＳＢ２００断片とともに供試して、DNA Ligation Kit Ver. 1（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いてライゲーション反応を行った。以後、（１）に記載の方法に準拠して、所望の大腸菌を選抜した。
【００９２】
（３）２２．０ｋｂ断片（配列番号１の塩基１３２３０−３５２０５）
ＫａｓａｌａｔｈのＢＡＣクローンＢ１０４Ｄ１１をＫｐｎＩで完全消化し、アガロースゲルによる電気泳動を行った。分離された２２．０ｋｂの断片を、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。
【００９３】
プラスミドベクターｐＳＢ２００をＫｐｎＩで完全消化後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＴＥ溶液に溶解後、ＣＩＡＰ（ＴＡＫＡＲＡ社）により脱リン酸化した。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけた後、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてゲルからベクター断片を精製した。
【００９４】
上記により準備したふたつの断片を供試して、DNA Ligation Kit Ver. 1（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いてライゲーション反応を行った。以後、（１）に記載の方法に準拠して、所望の大腸菌を選抜した。
【００９５】
（４）１５．０ｋｂ断片（配列番号１の塩基１９８８８−３４８９４）
ＫａｓａｌａｔｈのＢＡＣクローンＢ１０４Ｄ１１をＳｍａＩ、ＨｐａＩおよびＰａｃＩで完全消化し、アガロースゲルによる電気泳動を行った。分離された１５．０ｋｂの断片を、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。
【００９６】
この断片を、（１）で用いたＥｃｏＲＶ−ＣＩＡＰ処理済みのｐＳＢ２００断片とともに供試して、DNA Ligation Kit Ver. 1（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いてライゲーション反応を行った。以後、（１）に記載の方法に準拠して、所望の大腸菌を選抜した。
【００９７】
（５）１０．８ｋｂ断片（配列番号１の塩基２４５６７−３５３８９）
ＫａｓａｌａｔｈのＢＡＣクローンＢ１０４Ｄ１１をＢｇｌＩＩおよびＳｃａＩで完全消化後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＴＥ溶液に溶解後、DNA Blunting Kit（ＴＡＫＡＲＡ社）により平滑化した。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけ、分離された１０．８ｋｂの断片を、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。
【００９８】
この断片を、（１）で用いたＥｃｏＲＶ−ＣＩＡＰ処理済みのｐＳＢ２００断片とともに供試して、DNA Ligation Kit Ver. 1（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いてライゲーション反応を行った。以後、（１）に記載の方法に準拠して、所望の大腸菌を選抜した。
【００９９】
（６）１１．４ｋｂ断片（配列番号１の塩基２９１５６−４０６００）
ＫａｓａｌａｔｈのＢＡＣクローンＢ１０４Ｄ１１をＳｐｈＩおよびＢｓｔＸＩで完全消化後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＴＥ溶液に溶解後、DNA Blunting Kit（ＴＡＫＡＲＡ社）により平滑化した。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけ、分離された１１．４ｋｂの断片を、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。
【０１００】
この断片を、（１）で用いたＥｃｏＲＶ−ＣＩＡＰ処理済みのｐＳＢ２００断片とともに供試して、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．  １（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いてライゲーション反応を行った。以後、（１）に記載の方法に準拠して、所望の大腸菌を選抜した。
【０１０１】
（７）形質転換植物（Ｔ０世代）の作出
（１）から（６）により選抜した６種類の大腸菌を、Agrobacterium tumefaciens菌株ＬＢ４４０４／ｐＳＢ１（Komari, T., et al., Plant J., 10:165-174 (1996)を参照）およびヘルパー大腸菌ＨＢ１０１／ｐＲＫ２０１３（Ditta, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:7347-7351 (1980)を参照）とともに供試して、Ｄｉｔｔａらの方法に従いｔｒｉｐａｒｅｎｔｉａｌ  ｍａｔｉｎｇを行った。スペクチノマイシンを含むＡＢプレートに生じたコロニーのなかの６個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンを調査することにより、各コンストラクトの所望のアグロバクテリウムを選抜した。
【０１０２】
上記により選抜したアグロバクテリウムを用いて、Ｈｉｅｉら（Plant J., 6:271-282 (1994)）の方法に準拠し、日本晴の形質転換を行った。形質転換植物は、馴化後、温室に移した。移植適期まで育成した後、各コンストラクトにつき２０個体の植物を、１／５０００アールのワグネルポットに移植し（１〜４個体／ポット）、慣行法に従い栽培した。
【０１０３】
（８）Ｔ１世代検定
（７）で作出した形質転換植物（Ｔ０）についてＰＣＲ検定を行い、完全な形で導入断片を保有すると考えられる個体を各コンストラクトあたり４個体選抜し、各次代系統（２０個体／系統）を１／５０００アールのワグネルポットに移植し（１〜４個体／ポット）、慣行法に従い栽培した。
（結果および考察）
各コンストラクトのＴ０世代における表現型を観察した結果、２２．０ｋｂ断片、１５．０ｋｂ断片または１０．８ｋｂ断片を導入した場合には、Ｓｐｋ系統（日本晴の遺伝的背景でＫａｓａｌａｔｈ由来のＳｐｋ（ｔ）領域を持つ系統）と同様の株開帳性草型を示す個体が見出された。一方、１５．９ｋｂ断片、１９．３ｋｂ断片または１１．４ｋｂ断片を導入した個体は、すべて日本晴と同様の閉鎖性草型を示した。
【０１０４】
Ｔ１世代においても、２２．０ｋｂ断片、１５．０ｋｂ断片または１０．８ｋｂ断片を導入した場合にのみ、Ｓｐｋ系統型の草型を示す個体が見出された。
【０１０５】
以上の結果を、各断片の位置関係（図２）を考慮して解釈すると、Ｓｐｋ（ｔ）遺伝子は１０．８ｋｂ断片内に存在すると考えられた。そこで、１０．８ｋｂ断片のＴ１系統（単一Ｔ０個体由来）を供試して、導入遺伝子と表現型との関連を調査した。その結果、ＰＣＲ検定により導入断片を保有すると判定された個体群は株開帳性草型を示し、導入断片を保有しないと判定された個体群は閉鎖性草型を示した（図３）。これにより、Ｓｐｋ（ｔ）遺伝子が１０．８ｋｂ断片内に存在することが確認された。
実施例４  ｃＤＮＡスクリーニング
（材料および方法）
Ｋａｓａｌａｔｈに日本晴を連続戻し交雑することにより得たＳｐｋ系統（日本晴の遺伝的背景でＫａｓａｌａｔｈ由来のＳｐｋ（ｔ）領域を持つ系統）を、慣行法に従い温室で栽培し、出穂前の葉鞘基部をサンプリングした。ＳＤＳ−フェノール法(Watanabe, A., and Price, C. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:6304-6308 (1982）でトータルＲＮＡを抽出した後、QuickPrep mRNA Purification Kit（Amersham Pharmacia Biotech）によりｐｏｌｙ（Ａ）＋  ＲＮＡ  を精製した。精製したｐｏｌｙ（Ａ）＋  ＲＮＡ  を供試して、ZAP-cDNA Synthesis Kit（Stratagene）によりｃＤＮＡライブラリーを作成した。
【０１０６】
このｃＤＮＡライブラリーから、日本晴完全長ｃＤＮＡであるＩＤ１３６７に対応するｃＤＮＡをスクリーニングするために（図２）、以下の２種類のプライマー、
５'−ＧＡＡＣＣＡＡＡＧＴＣＧＡＴＣＴＣＴＴＧＡＴＧＣ−３'（配列番号４）
５’−ＡＣＡＴＡＣＴＣＴＴＧＴＣＡＧＴＴＡＴＣＡＣＴＧ−３’（配列番号５）
を設計し、これを用いて、ＫａｓａｌａｔｈのＢＡＣクローンＢ１０４Ｄ１１をテンプレートにＰＣＲを行った。電気泳動後、約１１００ｂｐの増幅産物をQIAEX II Gel Extraction Kit（ＱＩＡＧＥＮ）によりアガロースゲルから回収した。回収した断片を、Rediprime II DNA labelling system（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて３２Ｐ−ラベルした（プローブＡ）。
【０１０７】
また、ｃＤＮＡライブラリーから、１０．８ｋｂ断片上にあり、かつ、ＩＤ１３６７より上流のものをスクリーニングするために（図２）、以下の２種類のプライマー、
５’−ＴＣＣＴＴＣＡＡＴＡＴＡＣＡＴＧＧＧＡＡＧＧＡＣ−３’（配列番号６）
５’−ＡＡＴＧＴＴＣＴＣＡＡＣＣＡＣＡＣＴＡＡＣＴＧＣ−３’（配列番号７）
を設計し、これを用いて、ＫａｓａｌａｔｈのＢＡＣクローンＢ１０４Ｄ１１をテンプレートにＰＣＲを行った。電気泳動後、約７００ｂｐの増幅産物を上述の方法によりアガロースゲルから回収した。回収した断片を、上述の方法で３２Ｐ−ラベルした（プローブＢ）。
【０１０８】
上記により作成したｃＤＮＡライブラリーを供試して、約１５０００プラークが出現した寒天培地を１０枚作成した。各寒天培地について２回ずつプラークリフトを行い、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Amersham Pharmacia Biotech）に転写した。一方のメンブレンをプローブＡとのハイブリダイゼーションに、もう一方のメンブレンをプローブＢとのハイブリダイゼーションに用いた。一連の作業は、製造者の手引書に従って行った。陽性プラークについては、製造者（Stratagene）の手引書に従いpBluescriptにサブクローニングした後、塩基配列を解読した。
（結果および考察）
Ａ断片をプローブにしたスクリーニングの結果、７個のｃＤＮＡクローンが単離された。各クローンの塩基配列を解読したところ、いずれも同一遺伝子のクローンであることがわかった。最長クローンの塩基配列（配列番号２）をＳｐｋ（ｔ）候補領域のＫａｓａｌａｔｈゲノム塩基配列（配列番号１）と比較することにより、その遺伝子構造が明らかとなった（図４）。具体的には、配列番号２に示されるＳｐｋ（ｔ）  ｃＤＮＡは、配列番号１における塩基２７３７４−２７４２３、塩基２７５８７−２７６５３、塩基２７７５７−２８３７３、塩基２８６０４−２８６９３、および塩基３０２４５−３０５５０に相当するエキソンが連なった配列であった。また、配列番号２の塩基３９−４１が開始コドン、配列番号２の塩基８１６−８１８が終止コドンであると推定された。これらはゲノム配列上では、それぞれ、配列番号１の塩基２７４１２−２７４１４（開始コドン）および塩基２８６８５−２８６８７（終止コドン）に対応する。したがって、Ｓｐｋ（ｔ）遺伝子は、Ｋａｓａｌａｔｈゲノム配列中、配列番号１の塩基２７４１２−２８６８７に対応する遺伝子座に座乗することが推定された。
【０１０９】
また、本発明のＳｐｋ（ｔ）遺伝子は、日本晴完全長ｃＤＮＡデータベースに登録されている遺伝子ＩＤ１３６７に対応するものの、スプライシングパターンに差異が認められた。その結果、Ｋａｓａｌａｔｈの推定アミノ酸（配列番号３）と比較して、日本晴は不完全なアミノ酸をコードするものと考えられた。タンパク質データベースの検索を行ったが、本遺伝子産物と高い相同性を示す機能既知のタンパク質は見出されなかった。
【０１１０】
Ｂ断片をプローブにした場合には、陽性クローンは出現しなかった。
実施例５  追加の相補性試験
（材料および方法）
実施例３、４の結果を踏まえ、Ｓｐｋ（ｔ）遺伝子を含む断片領域を更に限定し、相補性試験を行った。
【０１１１】
（１）６．１ｋｂ断片（配列番号１の塩基２５５９１−３１６４４）
実施例３の（５）におけるライゲーションによって得られた所望の大腸菌から単離したプラスミドクローンをＢｓａＷＩおよびＲｓｒＩＩで完全消化後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＴＥ溶液に溶解後、DNA Blunting Kit（ＴＡＫＡＲＡ社）により平滑化した。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけ、分離された６．１ｋｂ（図２）の断片を、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。
【０１１２】
この断片を、実施例３の（１）で用いたＥｃｏＲＶ−ＣＩＡＰ処理済みのｐＳＢ２００断片とともに供試して、DNA Ligation Kit Ver. 1（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いてライゲーション反応を行った。以後、実施例３の（１）に記載の方法に準拠して、所望の大腸菌を選抜した。
【０１１３】
（２）３．８ｋｂ断片（配列番号１の塩基２７３５６−３１１０７）の恒常発現
ＫａｓａｌａｔｈのＢＡＣクローンＢ１０４Ｄ１１をテンプレートにして、以下の２種類のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
５’−ＴＧＣＣＡＴＧＣＡＴＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＴＡＣＴＧＴ−３’（配列番号８）
５’−ＴＣＡＡＧＣＧＧＡＧＣＴＣＡＡＣＴＧＡＡＡＴＴＣＴＣＣＡＴＣ−３’（配列番号９）
ＰＣＲには、Pyrobest DNA polymerase（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いて、熱変性（９４℃、１分間）、アニ−リング（５８℃、１分間）および伸長反応（７２℃、３分間）からなるサイクルを３０回繰り返した。ＰＣＲ反応液をＢｇｌＩＩおよびＳａｃＩで完全消化し、アガロースゲルによる電気泳動を行った。分離された３．８ｋｂの断片を、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。
【０１１４】
次に、この断片を恒常発現させるためのユビキチン遺伝子のプロモーターおよびイントロンを含む断片を得るために、ｐＳＢ２００をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで完全消化し、アガロースゲルによる電気泳動を行った。分離された２．１ｋｂの断片（ユビキチン遺伝子のプロモーターおよびイントロンを含む）を、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。
【０１１５】
プラスミドベクターｐＳＢ２００をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩで完全消化後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＴＥ溶液に溶解後、ＣＩＡＰ（ＴＡＫＡＲＡ社）により脱リン酸化した。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけた後、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてゲルから９．６ｋｂのベクター断片を精製した。
【０１１６】
上記により準備した３個の断片を供試して、DNA Ligation Kit Ver. 1（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いてライゲーション反応を行った。以後、実施例３の（１）に記載の方法に準拠して、所望の大腸菌を選抜した。
【０１１７】
（３）形質転換体植物（Ｔ０世代）の作出
上記により選抜したアグロバクテリウムを用いて、Ｈｉｅｉら（Hiei, Y., et al., Plant J., 6:271-282 (1994)）の方法に準拠し、日本晴の形質転換を行った。形質転換植物は、馴化後、温室に移した。移植適期まで育成した後、ＰＣＲ検定により完全長の導入遺伝子を保有すると考えられる個体を各コンストラクトあたり１２個体選抜し、１／５０００アールのワグネルポットに移植し（１〜４個体／ポット）、慣行法に従い栽培した。
【０１１８】
（４）Ｔ１世代検定
（３）で作出した形質転換植物（Ｔ０）の個体別次代系統のなかから、ＰＣＲ検定により導入遺伝子の有無が３：１分離する系統を各コンストラクトにつき２系統選抜した。選抜した系統について、導入遺伝子を保有する個体と保有しない個体をそれぞれ６個体選抜し、１／５０００アールのワグネルポットに移植し（１個体／ポット）、慣行法に従い栽培した。
（結果および考察）
両コンストラクトのＴ０世代における表現型を観察した結果、６．１ｋｂ断片を導入した場合には、Ｓｐｋ系統（日本晴の遺伝的背景でＫａｓａｌａｔｈ由来のＳｐｋ（ｔ）領域を持つ系統）と同様の株開帳性草型を示し、３．８ｋｂ断片を恒常発現した場合には、Ｓｐｋ系統よりも強烈な株開帳性草型を示した（図３）。
【０１１９】
６．１ｋｂ断片コンストラクトのＴ１世代の表現型に関しては、導入遺伝子を保有する個体群はＳｐｋ系統と同様の株開帳性草型を示したのに対し、導入遺伝子を保有しない個体群は日本晴と同様の閉鎖性草型を示した。また、３．８ｋｂ断片恒常発現コンストラクトのＴ１世代の表現型に関しては、導入遺伝子を保有する個体群はＳｐｋ系統よりも強烈な株開帳性草型を示したのに対し、導入遺伝子を保有しない個体群は日本晴と同様の閉鎖性草型を示した。
【０１２０】
以上の結果から、Ｓｐｋ（ｔ）遺伝子はＩＤ１３６７遺伝子座の対立遺伝子であることが明らかになった。また、遺伝子工学的手法を用いて、Ｓｐｋ（ｔ）遺伝子の発現様式を変更することにより、株開帳性を操作できることが示された。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】図１は、Ｓｐｋ（ｔ）座のマッピングを示す模式図である。模式図の下の数字は、各マーカー座とＳｐｋ（ｔ）座との間での組換え型個体の数を示す。
【図２】図２は、相補性試験で検討した断片の位置づけを示す模式図である。ＩＤ２８０２、ＩＤ４５５７、ＩＤ１３６７およびＩＤ４８９８は、公開データベースに登録されている日本晴完全長ｃＤＮＡである。
【図３】図３は、草型の比較を示す写真である。
【図４】図４は、Ｓｐｋ（ｔ）遺伝子の構造を示す模式図である。灰色のボックスはエキソンを示し、その塩基数がそれぞれ下に記載されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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