(57)【要約】      （修正有）【課題】インターフェロン様生物活性を高く発現し、低分子ウイルス疾患治療剤をはじめとする医薬品に利用され得る新規な低分子ペプチドを提供する。【解決手段】アミノ酸残基が２１の特定の配列からなるペプチドもしくは該ペプチドにおいて１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつインターフェロン様生物学的活性を発現するペプチドを創出した。これらの新規ペプチドは従来のペプチド、例えばＳｙｒ６に比較してインターフェロン活性が高く、医薬品への応用が期待される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）または（Ｂ）に示すペプチド。
（Ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列を含むペプチド
（Ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつインターフェロン様生物学的活性を発現するペプチド
【請求項２】
配列番号２〜１１のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む請求項１記載のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターフェロン様生物活性を発現するペプチドに関し、詳しくは、インターフェロン様生物活性を顕著に発現し得る新規ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
動物細胞の増殖と分化は、いわゆる増殖因子、リンホカイン、モノカイン、インターフェロン、ケモカイン、造血因子、神経栄養因子等サイトカインと呼ばれる細胞間シグナル伝達分子が、極微量で細胞表面の特異的な受容体を介して生物的な活性を示すことにより制御されている。例えばインターフェロンの抗ウイルス活性や抗腫瘍活性、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の顆粒球コロニーの形成、エリスロポエチン（ＥＰＯ）の赤血球の産生、トロンボポエチン（ＴＰＯ）の巨核球の増殖等であり、その多くは実際の疾患治療に用いられている。
【０００３】
このうちインターフェロンは、その抗原性の違いから主に、インターフェロン−α、インターフェロン−βおよびインターフェロン−γの３種に分類され、インターフェロン−αについては２０種を越える亜種の存在が確認されている。一方、インターフェロンは受容体への結合様式からＩ型及びＩＩ型に分類され、インターフェロン−αおよびインターフェロン−βはＩ型インターフェロンに、インターフェロン−γはＩＩ型インターフェロンに分類される。更にインターフェロン−αおよびインターフェロン−βは、ともに同じ受容体に結合すると考えられている。Ｉ型インターフェロン受容体としてインターフェロン類に対する親和性の異なる２種のサブタイプ、ＡＲ−１、ＡＲ−２が知られている。前者は一次構造は明らかになっているものの、その高次構造は明らかにされていない。後者はＮＭＲによりその高次構造が明らかにされている（非特許文献４を参照、プロテイン・データ・バンクの登録番号：１ｎｕ６）。また、ヒトインターフェロン−βの３次元構造座標は既に明らかにされている（非特許文献５を参照、プロテイン・データ・バンクの登録番号：１ａｕ１）。
【０００４】
サイトカインの生産は、サイトカイン産生能を有する天然或いは遺伝子組み換え細胞や微生物を大量に培養することにより行われている。しかしこの場合、単一分子種のサイトカインを得るためには、更に細胞あるいは微生物の培養上清や破砕液からの精製という煩雑な操作が必要である。さらに、このようにして得られるサイトカインは高分子の蛋白質であるため、患者への投与は蛋白製剤として静脈内、筋肉あるいは皮下への注射による必要があり、一般的に患者自身で行うことは困難であり医師などの医療従事者による必要があった。注射に代わるより簡便な投与方法、例えば鼻腔的投与、または直腸投与、または局所投与などの可能なサイトカイン活性を持つ低分子作動薬が望まれている。
【０００５】
その試みとしては、例えば、分子量の小さなペプチドでサイトカイン活性をミミックする方法が挙げられる。低分子ペプチドなら化学合成で調製することができ、安定性も優れている。このような例としては、ファージペプチドライブラリー法を用いたＥＰＯ（非特許文献１を参照）やＴＰＯ（非特許文献２，３を参照）をミミックする低分子ペプチドの調製に関する報告がある。
【０００６】
しかし、インターフェロン−βは１６６アミノ酸残基からなる高分子蛋白であるために、この立体構造から非ペプチド性の低分子化合物を直接デザインすることはなお容易なことではなく、未だにインターフェロン−βの論理的な低分子化の理解は得られていない。このため、インターフェロンの低分子作動薬や拮抗薬を設計することは不可能とされてきた。その後、サイトカインに対する中和抗体に結合する配列をランダムなアミノ酸配列から選択することによりインターフェロン活性をミミックするペプチドの取得が検討されその結果、１５アミノ酸残基のペプチド・Ｓｙｒ６（本願の配列表の配列番号１２に示されている。）をはじめとする１３個のペプチド（特許文献１を参照）が取得されている。Ｓｙｒ６については３次元構造座標およびその立体構造モチーフも推定されている（特許文献２を参照）。
しかしＳｙｒ６はインターフェロン活性が不十分であるためにウイルス疾患治療剤等の医薬品への応用は現実的には困難であった。
【０００７】
【非特許文献１】Ｗｒｉｇｈｔｏｎ，Ｎ．Ｃ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３：４５８−４６３（１９９６）
【非特許文献２】Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１６９６−１６９９（１９９７）
【非特許文献３】Ｋｉｍｕｒａ，Ｔ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２２：１０４６−１０５１（１９９７）
【非特許文献４】Ａｎｇｌｉｓｔｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｖ１１  ｐｐ．７９１−８０２（２００３）
【非特許文献５】Ｋａｒｐｕｓａｓ，Ｍ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：１１８１３−１１８１８（１９９７）
【特許文献１】国際公開第ＷＯ０１／０４８４７８号パンフレット
【特許文献２】特開２００５−２９４７１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、インターフェロン様生物活性を顕著に発現し、ウイルス疾患治療剤など医薬品への応用が可能なペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の問題点を解決するために鋭意検討を重ねた結果、従来のペプチド、例えばＳｙｒ６に比較してインターフェロン活性が高く医薬品への応用が期待される新たなペプチドを創出することに初めて成功した。すなわち、本発明は以下の通りである。
【００１０】
〔１〕  下記（Ａ）または（Ｂ）に示すペプチド。
（Ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列を含むペプチド
（Ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつインターフェロン様生物学的活性を発現するペプチド
〔２〕  配列番号２〜１１のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む前記〔１〕記載のペプチド。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によりインターフェロン様生物活性を高く発現し得る新規な低分子のペプチドを提供することができる。また、当該ペプチドは従来報告されているペプチドよりも高いインターフェロン様生物活性を発現し得るため、従来技術では困難であった低分子ウイルス疾患治療剤への応用が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書において、アミノ酸、ペプチドは下記に示すＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略号を用いて表される。また、特に明示しない限りペプチドのアミノ酸残基の配列は、左端から右端にかけてＮ末端からＣ末端となるように、またＮ末端のアミノ酸が１番になるように表される。
【００１３】
ＡまたはＡｌａ：アラニン残基、ＤまたはＡｓｐ：アスパラギン酸残基、ＥまたはＧｌｕ：グルタミン酸残基、ＦまたはＰｈｅ：フェニルアラニン残基、ＧまたはＧｌｙ：グリシン残基、ＨまたはＨｉｓ：ヒスチジン残基、ＩまたはＩｌｅ：イソロイシン残基、ＫまたはＬｙｓ：リジン残基、ＬまたはＬｅｕ：ロイシン残基、ＭまたはＭｅｔ：メチオニン残基、ＮまたはＡｓｎ：アスパラギン残基、ＰまたはＰｒｏ：プロリン残基、ＱまたはＧｌｎ：グルタミン残基、ＲまたはＡｒｇ：アルギニン残基、ＳまたはＳｅｒ：セリン残基、ＴまたはＴｈｒ：スレオニン残基、ＶまたはＶａｌ：バリン残基、ＷまたはＴｒｐ：トリプトファン残基、ＹまたはＴｙｒ：チロシン残基、ＣまたはＣｙｓ：システイン残基。
【００１４】
本発明の実施態様を以下に記載するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（１）ペプチド
本発明のペプチドは、インターフェロン様生物学的活性を発現するペプチドであり、具体的にはまず、（Ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列を含むペプチド（以下、ペプチド（Ａ）という。）を挙げることができる。
配列番号１記載のアミノ酸配列（ＫＲＲＳＶＱＡＲＷＸ1ＡＡＦＸ2ＬＸ3ＬＹＲＲＲ）中、１０番目のアミノ酸残基（Ｘ1）はグルタミン酸（Ｅ）を除くアミノ酸残基である。中でもグルタミン（Ｑ）またはアラニン（Ａ）が好ましい。そして１４番目及び１６番目のアミノ酸残基（それぞれＸ2及びＸ3）はアスパラギン酸残基（Ｄ）を除くアミノ酸残基である。中でもアスパラギン（Ｎ）、アラニン（Ａ）が好ましい。Ｘ1、Ｘ2及びＸ3は、同じ塩基であっても良いし、異なる塩基であっても良い。このような配列番号１記載のアミノ酸配列としては、配列番号２、７及び８のそれぞれに記載のアミノ酸配列が最も好ましい。
【００１５】
ペプチド（Ａ）は、配列番号１記載のアミノ酸配列をその一部に含むペプチドであれば良いが、特に配列番号１記載のアミノ酸配列からなるペプチドが最も好ましい。このようなペプチド（Ａ）の具体例としては、配列表の配列番号２、７及び８記載のアミノ酸配列からなるペプチド（実施例１のＫＲ２ＱＮＮＮＲ３、ＫＲ２ＱＮＮＮＲ３−Ａ１１、及びＫＲ２ＱＮＮＮＲ３−Ａ１３）を挙げることができる。
【００１６】
一方、本発明のペプチドは、インターフェロン様生物学的活性を発現することを条件として、上述のアミノ酸配列中のＸ1、Ｘ2及びＸ3以外のアミノ酸変異を含む場合も含まれる。すなわち、（Ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつインターフェロン様生物学的活性を発現するペプチド（以下、ペプチド（Ｂ）という。）は、本発明の範囲に含まれる。配列番号１記載のアミノ酸配列については、上記（Ａ）のペプチドの説明において述べたとおりである。
【００１７】
配列番号１記載のアミノ酸配列中置換、欠失もしくは付加のアミノ酸の数は、１個であっても良いし複数であっても良く、アミノ酸残基のペプチドの立体構造における位置や種類によって定めることができる。具体的には、インターフェロン様生物学的活性を大きく損なわない範囲とすることができ、好ましくは１２個以下、さらに好ましくは９個以下とすることができ、さらに中でも５個以下、特に３個以下であることが望ましい。
【００１８】
置換、欠失もしくは付加するアミノ酸の部位は特に限定されない。置換の場合の好ましい部位としては、１番目、２番目、３番目、４番目、６番目、８番目、及び１８番目のアミノ酸を挙げることができる。欠失の場合は、１９番目、２０番目、及び２１番目のアミノ酸を挙げることができる。付加の場合は、１番目のアミノ酸のＮ末端側への付加が好ましい。
【００１９】
置換後や付加の場合、置換または付加後のアミノ酸の種類についても特に限定されない。置換後のアミノ酸は、アラニン、ヒスチジン及びアルギニンが好ましく、１部位のみの置換の場合、アラニンが好ましい。付加後のアミノ酸はヒスチジン及びアルギニンが好ましい。
【００２０】
ペプチド（Ｂ）は、上述した置換、欠失及び付加のうちから選ばれる１種類の変異、もしくは２種類以上の変異の組み合わせが配列番号２記載のアミノ酸配列の任意の部位に挿入されたアミノ酸配列を含むものであるが、特に、置換のみ、或いは、置換、欠失および付加の組み合わせを有するものが好ましい。置換の挿入されたアミノ酸配列としては、配列番号３〜６及び９〜１１のそれぞれに記載のアミノ酸配列を挙げることができる。置換、欠失および付加の組み合わせを有するアミノ酸配列としては、配列番号１０及び１１記載のアミノ酸配列を挙げることができる。
また、ペプチド（Ｂ）は、上述のような変異を含むアミノ酸配列を少なくとも一部に含むペプチドであれば良いが、特に変異を含むアミノ酸配列からなるペプチドが最も好ましい。このようなペプチド（Ａ）の具体例としては、配列表の配列番号３〜６及び９〜１１のそれぞれに記載のアミノ酸配列からなるペプチド（実施例１のＫＲ２ＱＮＮＮＲ３−Ａ１、ＫＲ２ＱＮＮＮＲ３−Ａ３、ＫＲ２ＱＮＮＮＲ３−Ａ５、ＫＲ２ＱＮＮＮＲ３−Ａ７、ＫＲ２ＱＮＮＮＲ３−Ａ１５、ＨｉｓＱＮＮ、及びＲ５ＱＮＮ）を挙げることができる。
【００２１】
ペプチド（Ｂ）は、さらに、インターフェロン様生物学的活性（インターフェロン様生物活性）を発現するものであることが必要である。インターフェロン様生物学的活性とは、インターフェロンの生物学的活性と同様の活性を意味する。ここで、インターフェロンとは、抗原性や受容体への結合様式を問わずインターフェロン全般を含む意味であり、例えば、インターフェロン−α、β、γ、Ｉ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロンなどのすべてを含む。このようなインターフェロンの生物学的活性としては、インターフェロン受容体（ＡＲ−１，ＡＲ−２など）との結合活性、インターフェロンのインターフェロン受容体への結合を阻害する活性、抗ウイルス活性などである。
以上説明したペプチド（Ｂ）の代表的なものは、好ましくは配列番号４から１１のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むペプチドであり、特に好ましくは配列番号４から１１のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドからなるペプチドを挙げることができる。
後述の実施例５においては、上記本発明のペプチド（Ａ）及びペプチド（Ｂ）の具体例としての配列表中の配列番号２から１１で示される配列からなるペプチドがインターフェロン様生物学的活性のうち、特に抗ウイルス活性を発現することが示された。特に、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるペプチドについては、後述の実施例２から４において、インターフェロン受容体との結合活性やインターフェロンのインターフェロン受容体への結合を阻害する活性を示すことも証明されている。
【００２２】
（２）ペプチドの合成
本発明のペプチドは、ペプチド合成の分野における当業者にとって通常知られる方法に従って製造することができる。特に、ペプチド合成における固相合成法（例えばＲ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５，２１４９（１９６３）を挙げることができる。）によることができる。該合成の際には、オートペプチドシンセサイザ（Ｍｏｄｅｌ  ４３３Ａ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いることができる。また、目的とするペプチドがアミノ酸の置換・欠失・付加を有するペプチドであっても、以下に示す方法で合成することができる。合成の手順は、商業的なマニュアルにしたがって行なう。以下に、合成法を例示するが、該方法は例示するものであって、これらに限定されるものではない。
【００２３】
合成においては、上記のペプチド合成の分野における当業者にとって通常知られる保護基、試薬および樹脂を使用することができる。保護基としては、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）基または９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基などを使用することができ、Ｆｍｏｃ基が好ましい。カップリング試薬としては、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、対称混合酸無水物法などを用いることができ、ＨＢＴＵが好ましい。また、固相の樹脂は、Ｆｍｏｃ基を使用する場合には、ＨＭＰ樹脂、アミド樹脂、ＭＡＰ樹脂などを使用することができ、Ｂｏｃ基を使用する場合には、ＰＡＭ樹脂、ＭＢＨＡ樹脂などを使用することができる。
【００２４】
装置としてオートペプチドシンセサイザを用いる場合には、Ｃ末端アミノ酸から順番に結合させて、目的のペプチドを製造することができる。合成スケールは、各々のペプチドの０．１ｍｍｏｌ〜２．０ｍｍｏｌとすることができ、１．０ｍｍｏｌとすることが好ましい。合成後にペプチドを該樹脂からクリーベッジする。この際、上述の保護基としてＦｍｏｃ基を使用した場合には、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）またはトリメチルシリルブロミド（ＴＭＳＢｒ）を用いることができ、一方、Ｂｏｃ基を使用した場合には、フッ化水素酸（ＨＦ）、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳＡ）またはトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（ＴＭＳＯＴＦ）を用いることができる。
【００２５】
得られるペプチドを更に分離精製することにより、純度の高いものを用いることができる。分離精製は、各種クロマトグラフィーを利用して行うことができる。例えば、該ペプチドを凍結乾燥後に水で希釈して水溶液を調製し、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略す）により行なうことができる。該ＨＰＬＣよる分離精製は、逆相液体クロマトグラフィーにより行なうことが好ましい。溶出液としては、水（これは、例えばトリフルオロ酢酸などの有機酸を含み得る）と有機溶媒（これは、水と混和性の有機溶媒が好ましく、アセトニトリルが特に好ましい）の混合溶液を用いることができる。次いで、純度の高いペプチドが得られたかどうかについては、以下のようにして確認することができる。まず、分取したピークに含まれるペプチドの分子量を質量分析計を用いて測定する。そして、構造式から推定される予想分子量と合致するペプチドを含有する画分を集める。最後に、得られたペプチドの純度を複数の溶出系を用いるＨＰＬＣ法により測定し、得られるペプチドが単一のものであることを確認する。
尚、ペプチドを人工的に合成する方法について以上述べたが、遺伝子組み換え技術を利用して各種微生物、細胞等で発現させる方法によることもできる。
【００２６】
（３）ペプチドとインターフェロン受容体との分子間相互作用の測定
本発明のペプチドがインターフェロン様生物活性を有することの証明は、インターフェロン受容体との分子間相互作用の有無について調べることによることができる。インターフェロン受容体としては、各種インターフェロンの受容体を用いることができ、代表的なものとしては、インターフェロン−αやインターフェロン−βなどのＩ型インターフェロンの受容体を用いることができる。Ｉ型インターフェロン受容体には、親和性の異なる２種のサブタイプ、ＡＲ−１（ＡＲ１）、ＡＲ−２（ＡＲ２）が存在し、これらのいずれも利用することができる。また、ＡＲ−１、ＡＲ−２の代わりに、細胞膜外領域の可溶化受容体を用いることもできる。可溶化インターフェロン受容体は以下のように調製される。
【００２７】
２×１０6個のヒトＦＬ細胞より、Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社製）を用いてＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出する。１μｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡと、以下のプライマーを用いたＰＣＲ法で、インターフェロン受容体ＡＲ１、ＡＲ２鎖の細胞膜外領域の遺伝子を単離する。
【００２８】
ＡＲ１センス        5'-ggg gaa ttc gta act ggt ggg atc tgc ggc-3'（配列番号１３）
ＡＲ１アンチセンス  5'-ccc gga tcc tta gag gta ttt cct ggt tt-3'（配列番号１４）
ＡＲ２センス        5'-ggg gaa ttc gag aag act cta aaa ata gc-3'（配列番号１５）
ＡＲ２アンチセンス  5'-ccc gga tcc ttg gca gat tct gct gat tc-3'（配列番号１６）
【００２９】
上記プライマーペアＡＲ１はアミノ酸残基１から４３６番目（Ｕｚｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６０，２２５−２３４（１９９０））、プライマーペアＡＲ２はアミノ酸残基１から２４３番目（Ｄｏｍａｎｓｋｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２１６０６−２１６１１（１９９５））までの細胞膜外領域をコードするようにデザインされている。得られたそれぞれのＰＣＲ断片は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域との融合蛋白を発現するためのベクターＨｕＩｇＧ１／ＳＲαのＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩサイトに連結する。構築した発現ベクターはＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法を用いてＣＯＳ−１細胞にｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎして、一過性に蛋白発現を行う。培養液中に産生される可溶性インターフェロン受容体は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて精製する。これにより、可溶化インターフェロン受容体（ＡＲ１）2Ｆｃ及び（ＡＲ２）2Ｆｃが取得される。
【００３０】
ペプチドと（ＡＲ１）2Ｆｃ及び（ＡＲ２）2Ｆｃの分子間相互作用の測定は、表面プラズモン共鳴（以下、ＳＰＲ）法を用いるＢＩＡｃｏｒｅシステムを用いて行うことができる。ここで、ＢＩＡｃｏｒｅシステムとは、物質間の相互作用の程度を検出することができる測定装置であって、溶液内の物質間の相互作用による溶液の屈折率の変化を反射光の強さの変化として検出する装置である。また、表面プラズモン共鳴（以下、ＳＰＲ）法とは、金属表面（具体的には、センサーチップ）の励起状態である表面プラズモン波を光で共鳴励起する現象が金属表面の屈折率の変化に対して高感度に応答するために、ＤＮＡやタンパク質などの生体高分子の金属表面への特異的な吸着によって起こる微小な屈折率の変化を観測するのに用いられる、ＢＩＡｃｏｒｅシステムの検出法である。該ＳＰＲ法を用いるＢＩＡｃｏｒｅシステムを用いる測定により、生体分子間の反応、結合量の測定および速度論的解析がノンラベル且つリアルタイムで可能となる。
【００３１】
当該測定方法の具体例として、測定装置に付属の測定マニュアルに従って行なう場合を以下に記載する。まず、センサーチップ上の官能基を活性化する。次に、可溶化インターフェロン受容体を適当なバッファー（例えば、酢酸バッファー）を用いて調製する。該可溶化インターフェロン受容体溶液を活性化したチップにスポッティングして固定化する。対照液は、可溶化インターフェロン受容体溶液を固定化しないものを用いる。反応終了後のチップの活性基を、ブロッキングする。次に、適当な濃度（Ｃ）の合成ペプチドの試料を、適当なランニングバッファー（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、ＮａＣｌを含むＨＥＰＥＳバッファー）を用いて調製する。そして、該合成ペプチド試料を可溶化インターフェロン受容体を固定化したチップに加える。該試料の濃度を段階的に増大させ、各々の濃度における平衡時のシグナル（Ｒｅｑ）（結合量：ＲＵ）を時間経過で追跡する。最後に、得られる濃度依存的なシグナルについて、Ｒｅｑ／ＣとＲｅｑとをスキャッチャードプロットを行ない、その直線の傾きから解離定数（ＫＤ）を算出する。得られた結果より、本発明の合成ペプチドが可溶化インターフェロン受容体と結合することを確認する。
【００３２】
（４）ペプチドによるインターフェロン−βとインターフェロン受容体との結合の阻害作用の測定
本発明のペプチドがインターフェロン様生物活性を有することは、インターフェロンとインターフェロン受容体との結合の阻害作用の有無について調べることによっても証明することができる。インターフェロン受容体については、前述の（３）項において述べたとおりである。インターフェロンは、各種インターフェロンを用いることができるが、前記受容体に対応するインターフェロンを用いる必要がある。
このような阻害活性の測定は、表面プラズモン共鳴（以下、ＳＰＲ）法を用いるＢＩＡｃｏｒｅシステムを用いて行うことができる。当該測定方法の具体例として、測定装置に付属の測定マニュアルに従って行なう場合を以下に記載する。まず、センサーチップ上の官能基を活性化する。次に、インターフェロン−β（例えば、フエロン（東レ株式会社製）など）等のインターフェロンを適当なバッファー（例えば、酢酸バッファー）を用いて調製する。該インターフェロン−β溶液を活性化したチップにスポッティングして固定化する。対照液は、インターフェロン−β溶液を固定化しないものを用いる。反応終了後のチップの活性基を、ブロッキングする。次に、適当な濃度比のペプチドと可溶化インターフェロン受容体（ＡＲ２）2Ｆｃ、または（ＡＲ１）2Ｆｃを混和した試料を、適当なランニングバッファー（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、ＮａＣｌを含むＨＥＰＥＳバッファー）を用いて調製する。そして該混和試料をインターフェロン−βを固定化したチップに加える。該混和試料中のペプチド／可溶化受容体の濃度比を段階的に変化させ、各々の濃度比における平衡時のシグナル（Ｒｅｑ）（結合量：ＲＵ）を時間経過で追跡する。得られた結果をペプチドを含まないインターフェロン可溶化受容体のみをチップに加えたときのＲｅｑの値に対する比（コントロール比）で表す。ここで比の減少は本発明のペプチドにより、インターフェロン−βと可溶化インターフェロン受容体との結合が阻害されたことを意味する。
【００３３】
（５）ペプチドの抗ウイルス活性の測定
本発明のペプチドのインターフェロン活性、すなわち抗ウイルス活性は、ヒト羊膜細胞であるＦＬ細胞とシンドビス（ｓｉｎｄｂｉｓ）ウイルスを用いたバイオアッセイ法（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｊ．Ａ．，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７８，３８１−３８７（１９８１））により測定することができる。
【００３４】
抗ウイルス活性の測定方法を、以下に一例を挙げて説明する。まず、９６穴マイクロタイタープレート（岩城硝子社製）のウェルに、ＦＬ細胞を４．０ｘ１０4／ｗｅｌｌを細胞播種し２４時間培養する。その後、ペプチドを適当な希釈列で加えて２４時間培養する。コントロールとしては、インターフェロン−β（例えば、フエロン（東レ株式会社製）など）等のインターフェロンを適切な希釈列で加えて約２４時間培養する。その後、シンドビス（ｓｉｎｄｂｉｓ）ウイルスを各ウェルに加えて約２４時間培養する。培養液を捨て、プレートをホルマリンを含むクリスタルバイオレット液に１５分ほど浸し、生存している細胞を固定染色する。生存している細胞は染色されるので、各ウェルの吸光度を測定することにより抗ウイルス活性を発現する濃度が分かる。本検討により本発明のペプチドがインターフェロン活性を有することが確認できる。
【００３５】
上述した本発明のペプチドは、医薬製剤の分野においてよく知られる方法に従って、例えば通常の固体もしくは液体のビヒクルもしくは希釈剤、並びに所望の投与様式に適当な種類の医薬的な添加剤（例えば、担体、賦形剤、結合剤、保存剤、安定剤、芳香剤など）を用いることによって製剤化することができる。減菌非毒性で医薬的に許容し得る該ビヒクルまたは希釈剤などを含有する用量単位製剤が許容され得る。
【００３６】
本発明のペプチドは、処置する疾患に適当ないずれかの方法によって投与することができ、該方法は部位特異的な処置または運搬される薬物の量についての要求に依存し得る。投与は、通常の方法で行なうことができ、例えば局所的に（例えば、液剤、懸濁剤、ゲル剤、クリーム剤または軟膏の形態を含む）、非経口的に（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、または胸骨非連結内注射もしくは注入法（例えば、減菌注入可能な水性または非水性液剤または懸濁剤）を含む）、鼻腔的に（例えば、吸入スプレーの形態を含む）または直腸的に（例えば、坐剤の形態を含む）行なうことができる。本発明のペプチドはまた、速効性放出または徐放性放出に適当な形態で投与することもできる。速効性放出または徐放性放出は、適当な医薬組成物を用いて達成することができ、または特に徐放性放出の場合には、皮下インプラントまたは浸透圧ポンプなどの装置を用いて達成することができる。
【００３７】
本発明のペプチドの有効な量は、当該分野の当業者によって決定することができる。例えば局所的に、非経口的に、鼻腔的にまたは直腸的に投与する場合には、用量を０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇで、好ましくは０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇを１日あたり、１回投与または別個に分けた投与形態で使用することができる。被験者にとっての具体的な用量レベルおよび投与回数は様々な因子によって変えることができ、またそれに依存して定めることができる。該因子としては、例えば使用する具体的な合成ペプチドの活性、該ペプチドの代謝安定性および作用期間；被験者の種、年齢、体重、通常の健康、性別および食餌；投与の方法および時間；分泌速度；薬物の組み合わせおよび特定の疾患の激しさが挙げられる。
本発明のペプチドは、インターフェロン様生物学的活性を発現し、ウイルス疾患などの治療に用いることができる。
【実施例】
【００３８】
以下に実施例をもって本発明を説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
【００３９】
実施例１
本発明のペプチドの合成
ペプチドは、ペプチドシンセサイザー４３３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用い、固相法で合成した。試薬はすべてペプチド合成のグレードのものを用いた。合成には、保護基として９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）基を、カップリング試薬としてＯ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）を、および樹脂としてアミド樹脂（例えば、リンクアミド樹脂）を用いて、これらをＣ末端アミノ酸から順番にオートペプチドシンセサイザによって結合させた。合成スケールは、各々のペプチドの１．０ｍｍｏｌを用いた。合成終了後、ＴＦＡを用いてＦｍｏｃ基を樹脂からクリーベッジすることにより、ペプチドを該樹脂からクリーベッジし、凍結乾燥した後に蒸留水に溶解した。このものを、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（日本ウォーターズ、東京）を用いて分離精製した。該ＨＰＬＣは、ＯＤＳカラムを用いる逆相クロマトグラフィーで行ない、０．１％ＴＦＡを含む蒸留水（Ａ）および５〜６５％グラジエントのアセトニトリル（Ｂ）を用いて３０分間かけて溶出した。検出波長は２２０ｎｍとした。次いで、分取したピークに含まれるペプチドの分子量を質量分析計（Ｖｏｙａｇｅｒ（登録商標）Ｅｌｉｔｅ，Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）で測定し、構造式から推定される分子量と合致する画分を集め、ＨＰＬＣで純度を確認した。純度は、０．１％ＴＦＡを含む蒸留水（Ａ）および５〜６５％グラジエントのアセトニトリル（Ｂ）で調べ、得られたペプチドが単一のピークであることを確認した。ペプチドは配列表にある配列番号２及び３〜１１の１０種のペプチドを合成した。各配列からなるペプチドを、それぞれ、ＫＲ２ＱＮＮＲ３、ＫＲ２ＱＮＮＲ３−Ａ１、ＫＲ２ＱＮＮＲ３−Ａ３、ＫＲ２ＱＮＮＲ３−Ａ５、ＫＲ２ＱＮＮＲ３−Ａ７、ＫＲ２ＱＮＮＲ３−Ａ１１、ＫＲ２ＱＮＮＲ３−Ａ１３、ＫＲ２ＱＮＮＲ３−Ａ１５、ＨｉｓＱＮＮ、Ｒ５ＱＮＮと命名した。
【００４０】
実施例２
配列番号２記載のアミノ酸配列からなるペプチドと可溶化インターフェロン受容体（（ＡＲ１）2Ｆｃ及び（ＡＲ２）2Ｆｃ）との分子間相互作用の測定
本発明のペプチドと可溶化インターフェロン受容体との結合の測定は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を用いたＢＩＡｃｏｒｅシステムであるＢＩＡｃｏｒｅ３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して行なった。まず、センサーチップＣＭ５上の官能基であるカルボキシル基を、Ｎ−メチル−Ｎ'−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の混合液を用いてセンサーチップＣＭ５を洗浄することにより、活性化した。
【００４１】
（ＡＲ１）2Ｆｃ溶液及び（ＡＲ２）2Ｆｃ溶液はそれぞれ（ＡＲ１）2Ｆｃ、（ＡＲ２）2Ｆｃを酢酸バッファー（ｐＨ４．５）を用いて３０μｇ／ｍｌの濃度になるように調製した。次いで、それぞれの溶液を、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００に付属のマニュアルにしたがって、（ＡＲ１）2Ｆｃはフローセル２に、（ＡＲ２）2Ｆｃはフローセル３にそれぞれ約２０００結合量（ＲＵ：リゾナンスユニット）となるようにセンサーチップＣＭ５に固定化した。フローセル１を対照とし、対照には何も固定化しなかった。
【００４２】
次に、該チップ上の余剰のカルボキシル基を１Ｍ  エタノールアミン溶液（ｐＨ８．５）と反応させることにより、ブロッキングした。配列番号２記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、ランニングバッファー（０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４））を用いて適当な濃度に調製して用いた。濃度の算出には、２８０ｎｍにおける吸光係数として６９９０値を用いた（Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ  Ｅ．，ｅｔ．ａｌ．，ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００５）．）。ペプチドと（ＡＲ１）2Ｆｃ及び（ＡＲ２）2Ｆｃとの分子間相互作用の測定は、流速２０μｌ／分、試料添加時間が３００秒でマニュアルにしたがって行った。すなわち、各溶液中のペプチドの濃度を段階的に増大させて、おのおのの濃度（０ｎＭ、２５ｎＭ、５００ｎＭ及び１０００ＮＭ、図１及び図３参照）における平衡時のシグナルを得た。
【００４３】
得られた測定結果に基づいて、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００付属の解析ソフト（ＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）を用いて結合の時間経過を作図した。その結果、フローセル２上の（ＡＲ１）2Ｆｃ、フローセル３上の（ＡＲ２）2Ｆｃのいずれの場合も濃度に依存して、固定化した可溶化受容体への結合量の増加が見られた（図１及び図３）。ペプチド添加終了後は速やかに解離した。さらに（ＡＲ２）2ＦｃについてはＢＩＡＣｏｒｅで得られたデータを基に、Ｓｃａｔｈａｒｄ  Ｐｌｏｔ解析を行った（図２）。その結果、０．９以上の相関係数をもって結合量とｂｏｕｎｄ／ｆｒｅｅ比との間に負の直線性が見られ、（ＡＲ２）2Ｆｃに対してペプチドは特異的に結合していることが示唆された。さらにこの結果から、ペプチドの（ＡＲ２）2Ｆｃに対する解離定数（ＫD）は約１．１μＭであることが算出された。
また、（ＡＲ１）2Ｆｃについては、ＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎを用いてＳｔｅａｄｙ  ｓｔａｔｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ解析を行った（図４）。その結果、ペプチドの（ＡＲ１）2Ｆｃに対する解離定数（ＫD）は１．９ｍＭであることが分かった。またχ2値が７．６×１０-4であり、上記解析は統計的に信頼性が高いこともわかった。なお、対照のシグナルはサンプル測定時のシグナルの較正に使用した。
【００４４】
実施例３
配列番号２記載のアミノ酸配列からなるペプチドによるインターフェロン−βと可溶化インターフェロン受容体（ＡＲ２）2Ｆｃとの結合の阻害作用の測定
本発明の配列番号２記載のアミノ酸配列からなるペプチドによるインターフェロン−βと可溶化インターフェロン受容体（ＡＲ２）2Ｆｃとの結合の阻害作用の測定は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を用いたＢＩＡｃｏｒｅシステムであるＢＩＡｃｏｒｅ３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して行なった。まず、センサーチップＣＭ５を、Ｎ−メチル−Ｎ'−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の混合液を用いて洗浄することにより、センサーチップＣＭ５上の官能基であるカルボキシル基を活性化した。
【００４５】
インターフェロン−β溶液は、インターフェロン−β（フエロン、東レ株式会社製）を酢酸バッファー（ｐＨ４．５）を用いて３０μｇ／ｍｌの濃度になるように調製したものを用いた。次いで、その溶液を、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００に付属のマニュアルにしたがって、約２０００結合量（ＲＵ）となるようにセンサーチップＣＭ５に固定化した。一方、フローセル１を対照とし、対照には何も固定化しなかった。次に、該チップ上の余剰のカルボキシル基を１Ｍ  エタノールアミン溶液（ｐＨ８．５）と反応させることにより、ブロッキングした。
【００４６】
ペプチドと（ＡＲ２）2Ｆｃの混合溶液として、１００ｎＭの（ＡＲ２）2Ｆｃを含むランニングバッファー（０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４））を用いて適当な濃度に調製したものを用いた。濃度の算出には、２８０ｎｍにおける吸光係数として６９９０値用いた（Ｊｏｈｎ  Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ（ｅｄ）：Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００５）．ｐｐ．５７１−６０７参照）。ペプチドによるインターフェロン−βと（ＡＲ２）2Ｆｃとの結合の阻害作用の測定は、流速２０μｌ／分、試料添加時間が３００秒でマニュアルにしたがって行った。すなわち、ペプチドと（ＡＲ２）2Ｆｃの混合溶液におけるペプチドの濃度比を段階的に増大させて（０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、５００ｎＭ）、各々の濃度における平衡時のシグナルを得た。一方、対照として、上記ランニングバッファーにおいて（ＡＲ２）2Ｆｃ無添加の他は同じものにペプチド５００ｎＭを添加して調製したものについて同様に測定を行った。
【００４７】
得られた測定結果に基づいて、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００付属の解析ソフト（ＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）を用いて結合の時間経過を作図した。その結果、ペプチドの濃度比の増加に伴い、固定化したインターフェロン−βへの（ＡＲ２）2Ｆｃの結合の阻害が見られた（図５）。なお、対照のシグナルはサンプル測定時のシグナルの較正に使用した。この結果から、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、（ＡＲ２）2Ｆｃにおける相互作用部位がインターフェロン−βと共通であることが分かった。
【００４８】
実施例４
〔配列番号２のペプチドによるインターフェロン−βと可溶化インターフェロン受容体（ＡＲ１）2Ｆｃとの結合の阻害作用の測定〕
配列番号２記載のアミノ酸配列からなるペプチドによるインターフェロン−βと可溶化インターフェロン受容体（ＡＲ１）2Ｆｃとの結合の阻害作用の測定は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を用いたＢＩＡｃｏｒｅシステムであるＢＩＡｃｏｒｅ３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して行なった。まず、センサーチップＣＭ５をＮ−メチル−Ｎ'−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の混合液用いて洗浄することにより、センサーチップＣＭ５上の官能基であるカルボキシル基を活性化した。
【００４９】
インターフェロン−β溶液は、インターフェロン−β（東レ株式会社製）を酢酸バッファー（ｐＨ４．５）を用いて３０μｇ／ｍｌの濃度になるように調製したものを用いた。次いで、その溶液を、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００に付属のマニュアルにしたがって、約２０００結合量（ＲＵ）となるようにセンサーチップＣＭ５に固定化した。一方、フローセル１を対照とし、対照には何も固定化しなかった。次に、該チップ上の余剰のカルボキシル基を１Ｍ  エタノールアミン溶液（ｐＨ８．５）と反応させることにより、ブロッキングした。
【００５０】
ペプチドと（ＡＲ１）2Ｆｃの混合溶液として、１００ｎＭの（ＡＲ２）2Ｆｃを含むランニングバッファー（０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４））を用いて適当な濃度に調製したものを用いた。濃度の算出には、２８０ｎｍにおける吸光係数として６９９０値用いた（Ｊｏｈｎ  Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ（ｅｄ）：Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００５）ｐｐ．５７１−６０７参照）。配列番号２のペプチドによるインターフェロン−βと（ＡＲ１）2Ｆｃとの結合の阻害作用の測定は、流速２０μｌ／分、試料添加時間が３００秒でマニュアルにしたがって行った。すなわち、ペプチドと（ＡＲ１）2Ｆｃの混合溶液におけるペプチドの濃度比を段階的に増大させて（０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ）、各々の濃度における平衡時のシグナルを得た。一方、対照として、上記ランニングバッファーにおいて（ＡＲ１）2Ｆｃ無添加の他は同じものにペプチド５００ｎＭを添加して調製したものについて同様に測定を行った。
【００５１】
得られた測定結果に基づいて、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００付属の解析ソフト（ＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）を用いて結合の時間経過を作図した。その結果、ペプチドの濃度比の増加に伴い、固定化したインターフェロン−βへの（ＡＲ１）2Ｆｃの結合の阻害が見られた（図６）。なお、対照のシグナルはサンプル測定時のシグナルの較正に使用した。この結果から、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、（ＡＲ１）2Ｆｃにおける相互作用部位がインターフェロン−βと共通であることが分かった。
【００５２】
実施例５
〔ペプチドの抗ウイルス活性の測定〕
ペプチド（配列表の配列番号２〜１１の各アミノ酸配列からなるペプチド）、及びペプチドＳＹ６（配列番号１２記載のアミノ酸配列参照）のインターフェロン活性、すなわち抗ウイルス活性は、ヒト羊膜細胞であるＦＬ細胞とシンドビス（ｓｉｎｄｂｉｓ）ウイルスを用いたバイオアッセイ法（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｊ．Ａ．，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７８，３８１−３８７（１９８１）により測定した。
【００５３】
９６穴マイクロタイタープレート（岩城硝子社製）のウェルに、ＦＬ細胞を４．０ｘ１０4／ｗｅｌｌを細胞播種し２４時間培養した。その後、各ペプチドを０．６５μＭ〜８３．３μＭの希釈列で加えて２４時間培養した。コントロールとしては、インターフェロン−β（フエロン、東レ株式会社製）を０．５２ＩＵ／ｍｌ〜６６．７ＩＵ／ｍｌの希釈列で加えて約２４時間培養した。その後、シンドビス（ｓｉｎｄｂｉｓ）ウイルスを各ウェルに加えて約２４時間培養した。培養液を捨て、プレートをホルマリンを含むクリスタルバイオレット液に１５分ほど浸し、生存している細胞を固定染色した。生存している細胞は染色されるので、各ウェルの吸光度を測定することにより抗ウイルス活性を発現する濃度が分かる。
【００５４】
力価の算出は、細胞コントロール（インターフェロン非処理かつウイルス非処理）のＯＤ値（ＣOD）を１００％、ウィルスコントロール（インターフェロン非処理かつウイルス処理）のＯＤ値（ＶOD）を０％としてプレートのＯＤ値を％値に変換し、ＯＤ％とした。また、（ＣOD＋ＶOD）／２をＯＤ５０％とした。ＯＤ％をＹ軸に、希釈倍数の常用対数（ＬｏｇＸ）をＸ軸としたときの希釈曲線より、５０％を挟む２点の希釈倍数から一次式（ｙ＝Ａ×ＬｏｇＸ＋Ｂ）を算出した。尚、式中のＡ及びＢは、以下の各式により算出した。
【００５５】
Ａ＝｛（ＬのＯＤ％）−（ＨのＯＤ％）｝／｛（ＬｏｇＬ）−（ＬｏｇＨ）｝
Ｂ＝（ＨのＯＤ％）−Ａ×（ＬｏｇＨ）
Ｈ：ＯＤ５０％を挟む２点のうち低希釈側の希釈倍数
Ｌ：ＯＤ５０％を挟む２点のうち高希釈側の希釈倍数
【００５６】
作成した一次式からＯＤ５０％におけるＬｏｇＸ、さらにＯＤ５０％における希釈倍数Ｘ（ＥＸＰ．ＴＩＴＥＲ）を算出した。
ＯＤ５０％におけるＬｏｇＸ＝（５０−Ｂ）／Ａ
ＥＸＰ．ＴＩＴＥＲ＝１０(OD50%におけるLogX)
プレートスタンダードについて、プレートスタンダードの力価（４００ＩＵ／ｍｌ）をＥＸＰ．ＴＩＴＥＲで除しＦａｃｔｏｒを算出した。
Ｆａｃｔｏｒ＝（４００）／（ＥＸＰ．ＴＩＴＥＲ）
測定試料のレーンごとのＥＸＰ．ＴＩＴＥＲにＦａｃｔｏｒ及び前希釈倍数を乗じ、抗ウイルス活性値とした（図７）。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】配列番号２で表されるペプチドと（ＡＲ２）2Ｆｃとの分子間相互作用の測定結果を示す図面である。
【図２】配列番号２で表されるペプチドと（ＡＲ２）2Ｆｃとの分子間相互作用の測定結果から算出したＳｃａｔｃｈａｒｄ  Ｐｌｏｔを示す図面である。
【図３】配列番号２で表されるペプチドと（ＡＲ１）2Ｆｃとの分子間相互作用の測定結果を示す図面である。
【図４】配列番号２で表されるペプチドと（ＡＲ１）2Ｆｃとの分子間相互作用の測定結果から算出したＳｔｅａｄｙｓｔａｔｅ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ解析結果を示す図面である。
【図５】配列番号２で表されるペプチドと可溶化インターフェロン受容体（ＡＲ２）2Ｆｃとの結合の阻害作用の測定結果を示す図面である。
【図６】配列番号２で表されるペプチドと可溶化インターフェロン受容体（ＡＲ１）2Ｆｃとの結合の阻害作用の測定結果を示す図面である。
【図７】配列番号２〜１２で表されるペプチドの抗ウイルス活性の測定結果を示す図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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