(57)【要約】      （修正有）【課題】エストロゲン作用を全く有しない、抗酸化活性を有するエストラジオールの新規誘導体を提供する。【解決手段】具体例を示すと１７α−４’−ヒドロキシ−フェニルメチル−４−メチル−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１，１７β−ジオール、１７α−４’−ヒドロキシ−フェノキシメチル−４−メチル−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１，１７β−ジオール、１７α−４’−ヒドロキシ−チオフェノキシメチル−４−メチル−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１，１７β−ジオール、等の抗酸化活性を有するエストラジオールの非エストロゲン誘導体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１〜２個の二重結合を含有していてよく、１〜２個のヒドロキシ基および０〜２個のメチル基で官能化されているか或いはジメチルアミノフェニル基および０〜２個のメチル基で官能化されているフェニル基を含有する１７α−置換基を有する一般式ＩＩ
【化１】
2007254476.tif 000009
〔式中、Ｒ1はＨ、ＯＨであり、Ｒ2、Ｒ3はＨ、ＣＨ3であり、Ｚは（ＣＨ2）nＡＰｈであり、この場合、ｎは、０、１であり、Ａは、ｎが０、１である場合に結合を表わし、ｎが１である場合にＯ、Ｓ、Ｓｅを表わす。点線で記載された結合は、１または２個の二重結合を示す。但し、２個の二重結合を示す場合、８,９二重結合、９,１１二重結合の両方を示す場合を除く。〕
で示される、抗酸化活性を有する１７β−エストラジオールの非エストロゲン誘導体、この場合１７β−エストラジオール誘導体のヒドロキシ基は、エーテル、エステルまたはスルファメートとして存在していてよい。
【請求項２】
請求項１に記載の１７β−エストラジオールの非エストロゲン誘導体、即ち１７α−４’−ヒドロキシ−フェニルメチル−４−メチル−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１，１７β−ジオール、１７α−４’−ヒドロキシ−フェノキシメチル−４−メチル−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１，１７β−ジオール、１７α−４’−ヒドロキシ−チオフェノキシメチル−４−メチル−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１，１７β−ジオール、１７α−４’−ジメチルアミノ−フェニルメチル−４−メチル−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１，１７β−ジオール、１７α−３
’，５’−ジメチル−４’−ヒドロキシ−フェニルメチル−４−メチル−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１，１７β−ジオール、１７α−３’，５’−ジメチル−４’−ヒドロキシ−フェニルメチル−４−メチル−エストラ−１，３，５（１０），６−テトラエン−１，１７β−ジオールまたは１７α−４’−ヒドロキシ−フェノキシメチル−４−メチル−エストラ−１，３，５（１０），６−テトラエン−１，１７β−ジオール。
【請求項３】
ラジカル媒介による細胞の損傷を予防しかつ治療する医薬品を製造するための、１７β−エストラジオールの非エストロゲン誘導体ならびに１〜２個の二重結合を含有していてよい一般式Ｉｂ
【化２】
2007254476.tif 000010
〔式中、Ｒ1はＨ、ＯＨであり、Ｒ2、Ｒ3はＨ、ＣＨ3である。点線で記載された結合は、１または２個の二重結合を示す。但し、２個の二重結合を示す場合、８,９二重結合、９,１１二重結合の両方を示す場合を除く〕で示される、
抗酸化活性を有するエストラジオールの非エストロゲン誘導体の使用、この場合エストラジオール誘導体のヒドロキシ基は、エーテル、エステルまたはスルファメートとして存在していてよい。
【請求項４】
エストラジオールの非エストロゲン誘導体として４−メチル−エストラ−１，３，５（１０），６−テトラエン−１，１７β−ジオールまたは４−メチル−エストラ−１，３，５（１０），６，８−ペンタエン−１，１７β−ジオールを使用する、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
請求項１または２に記載の抗酸化活性を有する１７β−エストラジオールの少なくとも１つの非エストロゲン誘導体を含有する医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
抗酸化活性を有するエストラジオール の非エストロゲン誘導体 本発明は、抗酸化活性を有するエストラジオール の新規の非エストロゲン誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ドイツ連邦共和国特許第４３３８３１４号明細書Ｃ１の記載から、フェノール性Ａ環および１７−ヒドロキシ基を有するエストラジオール およびその公知の誘導体が、原則的に抗酸化活性を有することは、公知である。この物質は、構造に依存してエストロゲン受容体に対して多少とも強力で顕著な結合親和力を示す。
【０００３】
天然の１７β−エストラジオール （１００％）の高い親和力は、構造の変化、例えば異性化または誘導体化の際に一般に低下する。
しかし、この親和力は、１７α−エストラジオール に対してなお２３％であり、天然のエストラジオール 、８α，９β，１４β−エストラ−１，３，５（１０）トリエン−３，１７α−ジオール（ｅｎｔ−エストラジオール ）のエナンチオマーに対してでさえなお８．６％である。
この程度の大きさは、身体に固有の抗酸化能力を上昇させる目的をもつ物質の投与の際に服用時間および適用時間ならびに性別に依存して必ずしも許容できるものではない。
ドイツ連邦共和国特許出願公開第４３３８３１６号明細書の記載に相応して１７位の炭素原子に大きな置換基を導入した場合には、結合親和力は、例えば１７α−４’−ジメチルアミノ−フェニルメチル−エストラ−１，３，５（１０），９（１１）−テトラエン−３，１７−ジオールの際に実際に抗酸化活性を上昇させながら、１％未満にまで低下しうるが、しかし、生体内で相応する３−メチルエーテル、３−メトキシ−１７α−４’−ジメチルアミノ−フェニルメチルエストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１７オールに対してでさえ、発情性（Estrogenitaet）が高いことが見い出された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、エストロゲン作用を全く有しない、抗酸化活性を有するエストラジオール の新規誘導体を見い出すことである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この課題は、本発明によれば、一般式Ｉａ、ＩｂおよびＩＩの抗酸化活性を有するエストラジオールの非エストロゲン誘導体が見い出されたことによって解決される。
【化３】
2007254476.tif 000002
〔式中、Ｒ1はＨ、ＯＨであり、Ｒ2、Ｒ3はＨ、ＣＨ3であり、点線で記載された結合は、１または２個の二重結合を示す。但し、２個の二重結合を示す場合、８,９二重結合、９,１１二重結合の両方を示す場合を除く〕
【化４】
2007254476.tif 000003
〔式中、Ｒ1はＨ、ＯＨであり、Ｒ2、Ｒ3はＨ、ＣＨ3である。点線で記載された結合は、１または２個の二重結合を示す。但し、２個の二重結合を示す場合、８,９二重結合、９,１１二重結合の両方を示す場合を除く〕
【化５】
2007254476.tif 000004
〔式中、Ｒ1はＨ、ＯＨであり、Ｒ2、Ｒ3はＨ、ＣＨ3であり、Ｚは（ＣＨ2）nＡＰｈであり、この場合、ｎは、０、１であり、Ａは、ｎが０、１である場合に結合を表わし、ｎが１である場合にＯ、Ｓ、Ｓｅを表わす。点線で記載された結合は、１または２個の二重結合を示す。但し、２個の二重結合を示す場合、８,９二重結合、９,１１二重結合の両方を示す場合を除く。〕
【０００６】
好ましい化合物は、次のものである：４−メチル−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１，１７α−ジオール４−メチル−エストラ−１，３，５（１０），６−テトラエン−１，１７α−ジオール４−メチル−エストラ−１，３，５（１０），６−テトラエン−１，１７β−ジオール４−メチル−エストラ−１，３，５（１０），６，８−ペンタエン−１，１７β−ジオール４−メチル−エストラ−１，３，５（１０），６，８−ペンタエン−１，１７α−ジオール１７α−４’−ヒドロキシ−フェニルメチル−４−メチル−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１，１７β−ジオール１７α−４’−ヒドロキシ−フェノキシメチル−４−メチル−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１，１７β−ジオール１７α−４’−ヒドロキシ−チオフェノキシメチル−４−メチル−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１，１７β−ジオール１７α−４’−ジメチルアミノ−フェニルメチル−４−メチル−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１，１７β−ジオール１７α−３’，５’−ジメチル−４’−ヒドロキシ−フェニルメチル−４−メチル−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１，１７β−ジオール１７α−３’，５’−ジメチル−４’−ヒドロキシ−フェニルメチル−４−メチル−エストラ−１，３，５（１０），６−テトラエン−１，１７β−ジオール１７α−４’−ヒドロキシ−フェノキシメチル−４−メチル−エストラ−１，３，５（１０），６−テトラエン−１，１７β−ジオール ところで、全く意外なことに、１位の炭素原子にフェノール性ヒドロキシ基を有しかつ１７位の炭素原子にヒドロキシ基を有する化合物、エストラジオール の領域異性体およびその誘導体は、試験管内でも生体内でもエストロゲンを有していないことが見い出された−第１表および第２表中に提示。
同時に、この化合物は、エストラジオール と比較して明らかに上昇された抗酸化活性を有する一種々の試験管内試験により第３表および第４表中に証明されている。
この物質は、無傷のステロイド骨格および天然のエストロゲンと比較可能な極性を有しているので、血脳関門を克服する能力および天然のエストロゲン中に存在するような膜−受容体交換作用のための能力は、そのままであることを期待することができる。
【発明の効果】
【０００７】
発情性が実際に完全に除去されて抗酸化活性が改善された本発明によるエストラジオール 誘導体は、非エストロゲン誘導体としての使用のために有用であり、殊に更年期後の婦人の場合および男性の場合に使用するのに適している。
また、欠如した発情性は、エストロゲンを発生させる酵素の抑制、例えばアロマターゼおよびスルファターゼの抑制が治療的戦略の目的である場合にも有利である。酵素アロマターゼおよびスルファターゼは、エストロンをエストロンスルフェートから遊離する。
これまでに公知のフェノール性ステロイドのスルファメートの中の１つは、リード（M.J.Reed）他、「ステロイドスルファターゼ阻害剤：新規の内分泌治療法（Steroid sulphatase inhibitor:a new endocrine therapy）」，Drug Future 19(1994),第６７３頁およびエルガー（W.Elger）他、「種々のエストロゲンのスルファメートは、経口投与での増加された体系的発情性および減少された肝臓発情性を有する前薬である（Sulfamates of various estrogens are prodrugs with increased systemic and reduced hepatic estrogenicity at oral application）」，J．Steroid Biochem．Biol.，55(1995),第３９５〜４０３頁によれば、スルファターゼを強力に阻害することが公知である。前記のスルファメートは、試験管内および生体内でエストロンスルフェートからのエストロンの遊離を阻害する。
従って、本発明による化合物は、アロマターゼおよびスルファターゼの潜在的な阻害剤でもある。
【０００８】
本発明による化合物の発情性については、第１表にエストロゲン−受容体結合の測定に関連して記載されている。
本発明による系との比較として、同様に第１表中に表わされかつ（ｘ）で示されている、１７β−エストラジオール 、１７α−エストラジオール 、ｅｎｔ−１７β−エストラジオール （Ｊ８５５）、３−メトキシ−１７α−４’−ジメチルアミノ−フェニルメチル−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１７オール（Ｊ８４８）および１７α−４’−ジメチルアミノ−フェニルメチル−エストラ−１，３，５（１０），９（１１）−テトラエン−３，１７−ジオール（Ｊ８４４）が使用された。
【０００９】
【表１】
2007254476.tif 000005
本発明による化合物の試験管内での非エストロゲン作用は、参照物質との比較で第１表から明らかである。
更に、発情性については、第２表に証明されている、卵胞ホルモンの生物学的定量法（アレン−ドイジ試験法）に相応して生体内での結果が記載されている。
【００１０】
第２表は、卵巣切除術を受けたラットについての発情性試験の結果を示す。
エストロゲンは、卵巣切除術を受けた齧歯類の場合に膣上皮の特有な変化を生じる。このエストロゲンは、上方の細胞部位の強力な増殖および角化を生じる。
この変化は、膣から試料を採取して塗抹標本を作製することにより細胞の形態から確認することができる。
核の失なわれた角質塊の発生は、エストロゲンに特異的な作用を表わすものである（アレン−ドイジ試験法）。
本発明による系との比較として、同様に第２表中に表わされかつ（ｘ）で示されている、１７β−エストラジオール 、１７α−エストラジオール 、ｅｎｔ−１７β−エストラジオール （Ｊ８５５）および３−メトキシ−１７α−４’−ジメチルアミノ−フェニルメチル−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１７オール（Ｊ８４８）が使用された。
【００１１】
【表２】
2007254476.tif 000006
第２表から、本発明による化合物は、参照物質との比較で高い投与量の場合であってもエストロゲン作用を全く発揮しないことが明らかである。
本発明による化合物の抗酸化活性は、第３表に示された、シナプトソームの膜画分（ラット）における硫酸鉄（II）により触媒された脂質過酸化阻害についての記載により証明されている。
ＩＣ50の阻害値についての記載により、それぞれの化合物の脂質過酸化阻害作用は、特性決定されている。ＩＣ50は、脂質過酸化の５０％の阻害を達成させるために、添加すべき物質の量を示す（第３表）。
本発明による化合物との比較として、同様に第３表中に表わされかつ（ｘ）で示されている、１７β−エストラジオール 、１７α−エストラジオール およびα−トコフェロール（ビタミンＥ）、標準としてのブチロヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）が使用された。
【００１２】
【表３】
2007254476.tif 000007
第３表は、チオバルビツール酸の反応性物質(TBARS)の形成に対する天然のエストロゲン作用する阻害剤がフェントン試薬（Fenton's Reagenz）で誘発された脂質過酸化のプロセス中に存在するものであることを明示する。それによれば、既に抗酸化作用する天然のエストロゲン１７β−エストラジオール および１７α−エストラジオール は、シナプトソームの膜／脂質画分における脂質過酸化を抑制し、その結果酸化還元プロセスの平衡を維持する能力を有している。
異性体４−メチル−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１，１７β−ジオール（Ｊ１１７８）および４−メチル−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１，１７α−ジオール（Ｊ１１７９）は、前記作用を著しく強力に示すことが見い出された。
更に、本発明による化合物の抗酸化活性は、第４表に示された、Ｆｅ(II)自動酸化の阻害およびＦｅ(III)還元の刺激についての記載により示されている。
本発明による化合物との比較として、同様に第４表中に表わされかつ（ｘ）で示されている、１７β−エストラジオール 、１７α−エストラジオール およびカテコールエストロゲンが使用された。
【００１３】
【表４】
2007254476.tif 000008
第４表は、“古典的な”エストロゲンの１７β−エストラジオール および１７α−エストラジオール が試験されたＦｅ(II)自動酸化のプロセスに影響を及ぼさないか或いは本質的にはあまり影響を及ぼさないことを明示する。
これと比較して、化合物、例えば非エストロゲン異性体の４−メチル−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１，１７β−ジオール−Ｊ１１７８および４−メチル−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１，１７β−ジオール−Ｊ１１７９は、Ｆｅ(II)自動酸化のプロセスを阻害する能力を有している。
【００１４】
更に、またＦｅ(II)へのＦｅ(III)還元の刺激が生じ、Ｆｅ(II)自動酸化の結果が補正されることは、明らかである。
約６０％の阻害作用で比較のために試験されたカテコールエストロゲンは、化合物の４−メチル−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１，１７β−ジオール−Ｊ１１７８および４−メチル−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１，１７β−ジオール−Ｊ１１７９が良好な抗酸化作用を有することを示す。
従って、天然のエストロゲンの１７β−エストラジオール および１７α−エストラジオール と比較して本質的に高い抗酸化活性を有する本発明による化合物は、次のモデルで証明された：− マクロファージ中の酸化変性されたＬＤＬ−コレステロールの吸収の阻害− 超酸化ラジカルの形成の阻害。
【００１５】
本発明による化合物のエストロゲン活性および抗酸化活性に対する生物学的試験方法アレン−ドイジ試験法目的の設定 エストロゲン活性に対する皮下試験。
原理 エストロゲンは、卵巣切除術を受けた齧歯類の場合に膣上皮に特有な変化をまねく。このエストロゲンは、上方の細胞部位の強力な増殖および角化を生じる。
この変化は、膣から試料を採取して塗抹標本を作製することにより細胞の形態から確認することができる。
核の失なわれた角質塊の発生は、エストロゲンに特異的な作用を表わすものである−Dorfman R.J.,(編),Methods in hormone research，第７２頁以降，Academic Press New York 1969による−アレン−ドイジ試験法。
動物 雌のウィスターラット(Wistarratte)（種族：Shoe：WIST≡Mol:WIST、ｎ＝４８）は、１８０〜２００ｇの体重で供給され、無作為的に試験群（ｎ＝３〜５動物／群）に分割され、約１週間に亘って保持条件下で最適化され、引続きウルソタミン(Ursotamin)麻酔法で卵巣切除術を行なう。
保持：露光制御された空間内でマクロロン（Makrolon）ケージ型MIV中（照明１２時間／暗時１２時間）。飼養：ラットおよびマウスのための標準の食餌；飲料水随意。
試験物質の処方および投与 ベンジルベンゾエート／ヒマシ油（１＋４）中もしくはミルジ（０．９％w/v ＮａＣｌ溶液１００ｍｌ中のミルジ８５ｍｇ）中の皮下投与および経口投与のための試験物質を処方する。
投与量は、０．２ｍｌ／動物である。
− 定量供給の後、ベンジルベンゾエート中のそれぞれの物質を超音波浴中での処理（水温約６０℃で３０分間）によって溶解し、引続き相応する量のヒマシ油を添加する。
− 定量供給の後、超音波浴（水温約６０℃で３０分間）中での処理によってミルジ中に懸濁させる（微少量のジルコニウム小球の添加下）。
試験の実施 約２００ｇの体重を有するラットをウルソタミン麻酔法で卵巣切除術を行ない、その約２週間後に、卵巣摘出膣細胞形態（発情間期）の存在について動物を検査する。その後に、１回皮下投与する（ｄ１）、投与量０．２ｍｌ／動物。１回物質投与してから２４時間、４８時間、５４時間および７８時間の後に、膣から試料を採取して塗抹標本を作製し、発情段階（発情間期＝１；発情前期＝２；発情期＝３；発情後期＝４）に関連して鏡検法で評価する。
【００１６】
標準化されたアレン−ドイジ(ALLEN-DOISY)試験法に相応する検査は、４日後に終結する。動物をエーテル麻酔法で頸部脊柱の脱臼によって死亡させ、子宮を解剖し、湿分重量（分泌液なしの子宮）を評価する。更に、副腎を解剖し、重量測定する。
評価 膣向性（kolpotrop）試験の結果−投与量当たりの試薬としての発情性膣細胞ビルダー（oestrischer Vaginalzellbilder）の発生ならびに子宮向性活性（uterotrope Aktivitaet）（子宮重量）を検出する。試験群の子宮重量の平均値は、賦形剤群の平均値と比較することができ、場合によってはスチューデント(STUDENT)によるｔ−試験との重要な差について試験することができる。全ての群の副腎の湿分重量を測定する。
シナプトソームの膜画分（ラット）における硫酸鉄による触媒された脂質過酸化阻害物質および方法 ブローラー(Braughler JM.)他，「２１−アミノステロイド：中枢神経系の外傷および虚血の治療ための脂質過酸化の潜在的な阻害剤（The 21-Aminosteroids :Potent inhibitors of lipid peroxidation for the treatment of central nervous system trauma and ischemia）」，Drugs Future 14(1989)，第１４１〜１５２頁およびビューゲ（Buege A.）他，「ミクロソームの脂質過酸化(Microsomal lipid peroxidation)」，Methods Enzymol 52(1972)，第３０２〜３１０頁による脂質過酸化阻害作用に関する物質の試験は、マロンジアルデヒド／チオバルビツール酸検定法により、以下のように実施される。
【００１７】
物質 １７β−エストラジオール （Jenapharm GmbH）、１７α−エストラジオール (Sigma Chemicals)、α−トコフェロール(Sigma Chemicals)、チオバルビツール酸(TBA;Fluka)、硫酸鉄（II）(Serva)。
全ての別の生物化学薬品は、最高の分析的純度を有している。
反応バッチ量 フェントン試薬および薬剤を含む生物学的試薬１ｍｌ（原形質膜０．１ｍｇを含有する）。１ｍｌの全容量は、次のものに分割される：シナプトソームの膜画分０．０１ｍｌ；硫酸鉄（II）０．１ｍｌ（２ｍＭ）；過酸化水素０．１ｍｌ（２ｍＭ）；試験物質溶液０．５ｍｌまでおよび１ｍｌの全容量を充たすまでの量の０．９％のＮａＣｌ溶液(非PBS)。試験物質を有する反応バッチ量および試験物質を有しない反応バッチ量は、それぞれの場合にエタノール１０％（全体量）を賦形剤として含有する。
方法 反応バッチ量を３７℃で３０分間恒温保持し、引続き試薬Ａ ２ｍｌで停止させ、かつ一定の８０℃で１０分間恒温保持する。氷浴中での冷却（１０分間）後、試料を冷却遠心分離器中で遠心分離する（１０００×ｇ；４℃）。上澄み液を（安定するまで２時間）５３５ｎｍで空試験値に対して測定し、この空試験値の場合には、膜画分上にまで全ての試薬が含有されている。
比較値としては、膜画分とともにフェントン試薬および賦形剤１０％を含有するバッチ量が使用される。
試薬Ａの組成： １５％（w/v）トリクロロ酢酸（１５ｇ）；０．３７５％（w/v）チオバルビツール酸（３７５ｍｇ）；水溶液１００ｍｌ中の０．２５Ｎ ＨＣｌ（濃厚なＨＣｌ２．１１ｍｌ）。試験物質を有利に９５％のエタノール中で２０ミリモルの母液（−２０℃での保持可能性、３ヶ月に亘って安定性）の形で配合し、試験開始の直前に相応して希釈する。０．１〜１５０μＭの投与量範囲内で試験する。
全ての試験バッチ量中に相応する標準物質を一緒に導入する。
評価パラメーター− 試験物質および標準物質の投与作用分析。
− 賦形剤（有利にエタノール）を有し、物質効果なしの試験値に対して３０〜７０％の阻害範囲内で少なくとも５つの物質濃度を有する脂質過酸化阻害値の測定。
− 物質の評価をＩＣ50値（鉄（II）で触媒された脂質過酸化の阻害５０％の際のμＭでの試験濃度）で証明する。
Ｆｅ(II)自動酸化の阻害およびＦｅ(III)還元の刺激１．Ｆｅ(II)酸化検定法物質および方法 Ｆｅ(II)自動酸化の阻害作用に対する物質の試験をRuiz-Larrea B.他，ラット肝臓ミクロソームの鉄により誘発される脂質過酸化に対するエストラジオール および２−ヒドロキシエストラジオール の抗酸化効果。ステロイド(Antioxidant effects of estradiol and 2-hydroxyestradiol on iron-induced lipid peroxidation of rat liver microsomes．Steroids)39(1994)，第３８３〜３８８頁およびRuiz-Larrea B.他，鉄の酸化還元化学に関するエストロゲンの効果：エストロゲンの抗酸化活性の１つの可能な機作、ステロイド（Effects of estrogens on the redox chemistry of iron:A possible mechanism of the antioxidant action of estrogens，Steroids）60(1995),第７８０〜７８３頁により行なう。
Ｆｅ（II）イオンの全ての自動酸化実験をシナプトソームの膜／脂質画分を含有する水溶液中で実施した。硫酸Ｆｅ（II）５０μＭ、トリス−ＨＣｌ緩衝液４５ｍＭ（ｐＨ７．４）およびシナプトソームの蛋白質０．０８ｍｇを含有する生物学的試料１．０ｍｌをエタノール（１０％v/v）中に溶解した試験物質と一緒に水浴中で３７℃で１０分間恒温保持し、引続き０．３２Ｍの、１，１０−フェナントロリン溶液５０μＬの添加によって停止させ、Ｆｅ（II）−フェナントロリン複合体の吸光を５１０ｎｍで測定する。
物質 １７β−エストラジオール （Jenapharm GmbH）、１７α−エストラジオール （Sigma Chemicals）、２−ヒドロキシ−１７β−エストラジオール および４−ヒドロキシ−１７β−エストラジオール （Sigma Chemicals）、チオバルビツール酸（TBA;Fluka）、硫酸鉄（II）(Serva)。
全ての別の生物化学薬品は、最高の分析的純度を有している。
試験物質を有利に９５％のエタノール中で２０ミリモルの母液の形で配合し、試験開始の直前に相応して希釈する。０．１〜１５０μＭの投与量範囲内で試験する。
全ての試験バッチ量中に相応する標準物質を一緒に導入する。
【００１８】
評価パラメーター− 試験物質および標準物質の投与作用分析。
２．Ｆｅ(III)還元検定法 Ｆｅ(III)還元の刺激に対する物質の試験をRuiz-Larrea B.他，ラット肝臓ミクロソームの鉄により誘発される脂質過酸化に対するエストラジオール および２−ヒドロキシエストラジオール の抗酸化効果。ステロイド(Antioxidant effects of estradiol and 2-hydroxyestradiol on iron-induced lipid peroxidation of rat liver microsomes．Steroids)39(1994)，第３８３〜３８８頁およびRuiz-Larrea B.他，鉄の酸化還元化学に関するエストロゲンの効果：エストロゲンの抗酸化活性の１つの可能な機作、ステロイド（Effects of estrogens on the redox chemistry of iron:A possible mechanism of the antioxidant action of estrogens，Steroids）60(1995),第７８０〜７８３頁により行なう。
生物学的試料は、次の成分を含有している：トリス−ＨＣｌ １５０ｍＭ（ｐＨ７．４）中の塩化鉄（III）２５μＭ、１，１０−フェナントロリン１５ｍＭおよび賦形剤エタノール中に溶解された試験すべき試験物質。
【００１９】
Ｆｅ（II）−フェナントロリン複合体の形成を分光測光により５１０ｎｍで記録する。
マクロファージ中の酸化変性されたＬＤＬ−コレステロール吸収の阻害 マウスマクロファージおよびヒトに由来する血液マクロファージ中の酸化変性されたＬＤＬ吸収の測定を、フィッシャー（Fisher M．）他，「２１−アミノステロイドは、ヒトの単核細胞および銅によってヒトの低い密度のリポ蛋白質の酸化を阻害する(A 21-aminosteroid inhibits oxidation of human low density lipoprotein by human monocytes and copper)」，Atherosclerosis 90(1991)，第１９７〜２０２頁もしくはリーク（Leake D.S.）およびランキン（Rankin，S．M.），「マクロファージによる低密度リポ蛋白質の酸化修飾、（The oxidativemodification of Low-Density Lipo-protein by macrophages）」，Biochem J．
270(1990),第７４１〜７４８頁による細胞培養法により測定する。
【００２０】
超酸化ラジカル形成の阻害 超酸化ラジカルに対する形成体としてのリノール酸を使用した際のキサンチンオキシダーゼ阻害作用の測定を、ライヒア（Laihia J.K．）他，「超酸化物不均化酵素に対するルシゲニンおよびリノレートにより増強された化学発光検定法（Lucigenin and linoleate enhanced chemiluminescent assay for superoxide dismutase activity）」，Free Rad．Biol．Med．14（1993）第４５７〜４６１頁によりルシゲニン（Lucigenin）／ルミノール（Luminol）強化されたキサンチン／キサンチンオキシダーゼに依存する化学発光反応により行なう。