(57)【要約】      （修正有）【課題】動植物細胞や生物個体における遺伝子マーカーとして、あるいは細胞内オルガネラの可視化及びタンパク質間の相互作用の可視化のための、単量体で、かつ分子量が小さく、凝集が起こり難い、ウナギ由来の低分子量の蛍光タンパク質の提供。【解決手段】ウナギから水性抽出物を得て、この抽出物から蛍光タンパク質を硫安塩析とカラムクロマトグラフィーとの組合わせにより精製し、分子量が１６ｋＤａ〜１７ｋＤａであり、且つ蛍光波長４８０ｎｍ〜６００ｎｍ、及び励起波長４００ｎｍ〜５４０ｎｍのウナギ蛍光タンパク質を単離する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウナギから水性抽出物を得る工程と、
前記抽出物から蛍光タンパク質を精製する工程と、
を含み、前記蛍光タンパク質が分子量16kDa〜17kDaであり、且つ蛍光波長480nm〜600nm及び励起波長400nm〜540nmであることを特徴とするウナギ蛍光タンパク質の単離方法。
【請求項２】
上記水性抽出物はウナギの筋肉から得られるものであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記精製が硫安塩析とカラムクロマトグラフィーとの組合せにより行われることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
上記分子量が16.5kDaであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
上記蛍光タンパク質の蛍光最大波長が527nmであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項６】
上記蛍光タンパク質の励起最大波長が493nmであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項７】
分子量16kDa〜17kDaで、且つ蛍光波長480nm〜600nm及び励起波長400nm〜540nmであることを特徴とするウナギ蛍光タンパク質。
【請求項８】
上記分子量が16.5kDaであることを特徴とする、請求項７記載のウナギ蛍光タンパク質。
【請求項９】
蛍光最大波長が527nmであることを特徴とする、請求項７記載のウナギ蛍光タンパク質。
【請求項１０】
励起最大波長が493nmであることを特徴とする、請求項７記載のウナギ蛍光タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、ウナギ由来の蛍光タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
オワンクラゲ(Aequorea victorea)から得られた緑色蛍光タンパク質(green fluorescent protein :GFP)は、動植物細胞や生物個体における遺伝子マーカーとして、あるいは細胞内オルガネラの可視化、タンパク質の局在の可視化及びタンパク質間の相互作用の可視化に活発に利用されている（非特許文献１〜３）。
【０００３】
非特許文献１には、例えば、オワンクラゲ由来GFP等の蛍光タンパク質やその変異体を目的のタンパク質と融合させることで、生細胞中でのタンパク質の配置、移動又は化学現象の分析を行うことができることが開示されている。
【０００４】
非特許文献２には、様々な花中類(Anthozoa)由来のGFP様タンパク質について開示されている。
さらに、非特許文献３には、光活性化可能な蛍光タンパク質の特性及びその用途について記載されている。
現在市販されているオワンクラゲあるいは花虫類由来GFPの分子量は、26kDa程である。また、これらのGFPの中には、2量体や4量体を形成するものがある。
【０００５】
一般的に、外来遺伝子を細胞に導入し、外来遺伝子からコードされるタンパク質を当該細胞内で発現させる場合には、凝集が起こり難い点から、単量体で、且つ分子量の小さなタンパク質が有利であるといえる。このような理由から、上述した様々な用途でGFP等の蛍光タンパク質を使用する場合には、単量体で、且つ分子量の小さな蛍光タンパク質が有利である。そこで、単量体で、且つ分子量のより小さな蛍光タンパク質が見出されることが期待されている。
また、脊椎動物由来の蛍光タンパク質については、従来知られていなかった。
【０００６】
【非特許文献１】Jennifer Lippincott-Schwartz及びGeorge H. Patterson, 「Science」, 2003年, 第300巻, p.87-91
【非特許文献２】Vladislav V Verkhusha及びKonstantin A Lukyanov, 「Nature Biotechnology」, 2004年, 第22巻, p.289-296
【非特許文献３】Konstantin A. Lukyanov, Dmitry M. Chudakov, Sergey Lukyanov及びVladislav V. Verkhusha, 「Nature Reviews/Molecular Cell Biology」, 2005年, 第6巻, p.885-891
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上述した実情に鑑み、ウナギ由来の蛍光タンパク質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ウナギから水性抽出物を得て、該抽出物から蛍光タンパク質を精製することで、分子量16kDa〜17kDaで、且つ蛍光波長480nm〜600nm及び励起波長400nm〜540nmのウナギ蛍光タンパク質を単離できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明は以下を包含する。
【００１０】
（１）ウナギから水性抽出物を得る工程と前記抽出物から蛍光タンパク質を精製する工程とを含み、前記蛍光タンパク質が分子量16kDa〜17kDaであり、且つ蛍光波長480nm〜600nm及び励起波長400nm〜540nmであることを特徴とするウナギ蛍光タンパク質の単離方法。
（２）上記水性抽出物はウナギの筋肉から得られるものであることを特徴とする、（１）記載の方法。
（３）上記精製が硫安塩析とカラムクロマトグラフィーとの組合せにより行われることを特徴とする、（１）記載の方法。
（４）上記分子量が16.5kDaであることを特徴とする、（１）記載の方法。
（５）上記蛍光タンパク質の蛍光最大波長が527nmであることを特徴とする、（１）記載の方法。
（６）上記蛍光タンパク質の励起最大波長が493nmであることを特徴とする、（１）記載の方法。
（７）分子量16kDa〜17kDaで、且つ蛍光波長480nm〜600nm及び励起波長400nm〜540nmであることを特徴とするウナギ蛍光タンパク質。
（８）上記分子量が16.5kDaであることを特徴とする、（７）記載のウナギ蛍光タンパク質。
（９）蛍光最大波長が527nmであることを特徴とする、（７）記載のウナギ蛍光タンパク質。
（１０）励起最大波長が493nmであることを特徴とする、（７）記載のウナギ蛍光タンパク質。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、分子生物学分野等で有用な蛍光タンパク質が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明に係るウナギ蛍光タンパク質(以下、「ウナギ蛍光タンパク質」という)の単離方法は、ウナギから水性抽出物を得て、該抽出物からウナギ蛍光タンパク質を精製する方法である。本方法で得られるウナギ蛍光タンパク質の分子量は16kDa〜17kDa(特に16.5kDa)である。また本方法で得られるウナギ蛍光タンパク質の蛍光波長は480nm〜600nmであり、特に、蛍光最大波長は527nmである。また、励起波長は400nm〜540nmであり、特に励起最大波長は493nmである。さらに、ウナギ蛍光タンパク質は自己完結的に黄緑色に発光する。ここで、「自己完結的」とは、ウナギ蛍光タンパク質中の発色団形成に酸素以外の物質(例えば、酵素など)を必要としないことを意味する。
【００１４】
本発明に係るウナギ蛍光タンパク質の単離方法(以下、「本方法」という)では、先ずウナギから水性抽出物を得る。ウナギは、いずれの種類であってもよいが、例えば、日本ウナギ（Anguilla japonica）、ヨーロッパウナギ(Anguilla anguilla)、及びアメリカウナギ(Anguilla rostrata)等が挙げられるが、日本ウナギが好ましい。水性抽出物は、ウナギ全体から、あるいはウナギの臓器(例えば、肝臓)、組織(例えば、筋肉)、細胞等から得ることができる。
【００１５】
本方法における抽出方法として、ウナギの筋肉から水性抽出物を得る方法を以下に具体的に説明する。
【００１６】
先ず、ウナギから皮膚や骨を除いた筋肉を取り出し、肉挽き器で細切りする。次いで、細切した筋肉に、例えば抽出溶媒を加えてホモジナイズし、超音波処理を行い、遠心分離に供することで得られた上清を水性抽出物とする。抽出溶媒としては、例えば、グリシン-塩酸バッファー、酢酸ナトリウムバッファー、リン酸ナトリウムバッファー(Na-リン酸バッファー)、トリス-塩酸バッファー(Tris-HClバッファー)、グリシン-水酸化ナトリウムバッファー、生理食塩水及び水等が挙げられるが、好ましくはNa-リン酸バッファーである。例えば、抽出溶媒としてNa-リン酸バッファーを使用する場合には、10〜50mM、好ましくは20mMの濃度とする。なお、抽出溶媒には、EDTA(例えば、0.5〜2.0mM濃度)等を含有していてもよい。
【００１７】
なお、筋肉以外の臓器、組織又は細胞あるいはウナギ全体から水性抽出物を得る方法は、筋肉からの抽出方法に準じて行うことができる。
【００１８】
次いで、本方法では水性抽出物からウナギ蛍光タンパク質を精製する。精製方法としては、例えば、硫安塩析、カラムクロマトグラフィー、透析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及び液体クロマトグラフィーが挙げられるが、特に硫安塩析と少なくとも1つのカラムクロマトグラフィーとの組合せが好ましい。例えば、カラムクロマトグラフィーに使用するカラムとしては、SephadexG50カラム、SephadexG75カラム、Source15Q PE4.5/100カラム、Superdex75 HR10/30カラム(いずれもGEヘルスケアバイオサイエンス株式会社(旧社名：アマシャムバイオサイエンス株式会社)製)及びヒドロキシアパタイトカラムが挙げられる。
【００１９】
具体的に、硫安塩析とカラムクロマトグラフィーとを組合わせて、水性抽出物からウナギ蛍光タンパク質を精製する方法を説明する。
【００２０】
先ず、硫安塩析では、上述の水性抽出物に硫酸アンモニウム(以下、「硫安」という)を添加する。硫安は、60％の飽和硫安溶液となるように添加する。次いで、pHを適宜(例えば、pH7.5)調整し、低温(例えば、2〜10℃、好ましくは5℃)下で2〜5時間(好ましくは3〜4時間)撹拌した後、遠心分離を行い、上清を取り出す。得られた上清に、さらに硫安を、90％の飽和硫安溶液となるように添加する。さらに、pHを適宜(例えば、pH7.6)調整し、例えば8〜20時間(好ましくは10〜14時間)撹拌する。撹拌後、低温(例えば、2〜10℃、好ましくは5℃)下で、20時間〜48時間(好ましくは24時間)静置させる。次いで、遠心分離に供することで、回収した沈殿を次のステップのカラムクロマトグラフィーに使用する画分とする。
【００２１】
次に、硫安塩析で得られた画分を、透析後、カラムクロマトグラフィーに供する。例えば、SephadexG75カラム(カラムサイズ26 x 400mm)、ヒドロキシアパタイトカラム(カラムサイズ36 x 48mm、Tiselius等(A. Tiselius, S. Hjerten, and O. Levin (1956): Protein chromatography on calcium phosphate columns. Arch. Biochem. Biophys., 65, 132-155)の方法に従って調製したヒドロキシアパタイトを使用)、SephadexG50カラム(カラムサイズ26 x 970mm)、ヒドロキシアパタイトカラム(カラムサイズ10 x 125mm、上述のヒドロキシアパタイトを使用)及びSource15Q PE 4.6/100カラム(カラムサイズ：4.6 x 100mm)を順次使用したカラムクロマトグラフィーによって、最終的にウナギ蛍光タンパク質を含有する画分を精製することができる。使用する溶出溶媒及びその濃度はカラムに応じて適宜選択できるが、溶出溶媒としては、例えばNa-リン酸バッファー、リン酸カリウムバッファー(K-リン酸バッファー)、Tris-HClバッファー等が挙げられる。Na-リン酸バッファーを使用する場合には、濃度は、例えば10〜50mM、好ましくは20mMとする。K-リン酸バッファーを使用する場合には、濃度は例えば200〜300mM、好ましくは250mMとする。Tris-HClバッファーを使用する場合には、濃度は、例えば15〜50mM、好ましくは20mMとする。なお、必要に応じて、EDTA(例えば、0.5〜2.0mM)、グリセロール(例えば、10〜20％)や塩化ナトリウム(NaCl)(例えば、100〜300mM)を溶出溶媒に含有させることができる。また、流速及び分画は使用するカラムに応じて適宜設定することができるが、流速は、例えば0.1〜1.5ml/分、好ましくは0.2〜0.5ml/分、特に好ましくは0.2〜0.4ml/分に設定する。また、分画は、例えば、0.5〜5.0ml/画分、好ましくは1.0〜2.0ml/画分、特に好ましくは1.0〜1.5ml/画分に設定する。
【００２２】
なお、各カラムクロマトグラフィーにおいて、ウナギ蛍光タンパク質を含有する画分を、例えばNa-リン酸バッファーや炭酸水素アンモニウム溶液を用いた透析又は凍結乾燥に供してもよい。
【００２３】
以上のように、本方法によれば、ウナギ蛍光タンパク質を抽出・精製することができる。精製したウナギ蛍光タンパク質の分子量や精製度は、例えばSDS-PAGEやウエスタンブロッティング等によって確認することができる。あるいは、精製したウナギ蛍光タンパク質の蛍光波長及び励起波長は、例えばスペクトル測定によって確認することができる。
【００２４】
さらに、本方法によって得られた精製ウナギ蛍光タンパク質を用いて、例えば部分アミノ酸配列を決定する。次いで、その部分アミノ酸配列に基づいて設計したプローブやプライマーを用いるハイブリダイゼーションやPCRによって、ウナギゲノムDNAからウナギ蛍光タンパク質をコードする遺伝子(以下、「ウナギ蛍光タンパク質遺伝子」という)を単離することができる。さらに、得られたウナギ蛍光タンパク質遺伝子を用いて、塩基配列を決定することで、ウナギ蛍光タンパク質遺伝子の塩基配列及びウナギ蛍光タンパク質のアミノ酸配列を決定することができる。
【００２５】
このようにして、得られたウナギ蛍光タンパク質又はウナギ蛍光タンパク質遺伝子は、他のGFP等の蛍光タンパク質と同様に、例えば、動植物細胞や生物個体における遺伝子マーカーとして、あるいは細胞内オルガネラの可視化、タンパク質の局在の可視化及びタンパク質間の相互作用の可視化に利用できる。
【００２６】
本方法で得られるウナギ蛍光タンパク質は分子量16kDa〜17kDaであり、例えば、従来より使用されているオワンクラゲ由来GFP(26kDa)に比べて約10kDa小さい。低分子量であることは、蛍光タンパク質と融合したタンパク質の機能が損なわれないこと、凝集し難いこと、タンパク質合成が速やかに完了すること、の点から有利である。
【００２７】
また、ウナギ蛍光タンパク質は単量体である。一方、オワンクラゲあるいは花中類由来GFPの中には2量体や4量体を形成するGFPが存在する。従って、本発明で得られるウナギ蛍光タンパク質は取り扱いの点で従来のGFPと比べて容易である。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２９】
〔実施例１〕  ウナギ蛍光タンパク質の抽出及び精製
1. 材料及び方法
1-1. 実験材料
養殖された日本ウナギ（Anguilla japonica）を使用した。
【００３０】
1-2. 試薬等
コラゲナーゼは、新田ゼラチン株式会社製のものを使用した。
また、SephadexG50、SephadexG75、Source15Q PE4.5/100カラム及びSuperdex75 HR10/30カラムは、GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社(旧社名：アマシャムバイオサイエンス株式会社)より入手した。
【００３１】
1-3. ウナギ蛍光タンパク質の抽出方法
0.25％ 2-フェノキシエタノール水中で麻酔したウナギから皮膚及び骨を除いた筋肉を肉挽き器で細切した。
次いで、細切した筋肉100gに対して以下の操作を行った。
まず、細切した筋肉100gをミキサーにとり、これに500mlの20mM Na-リン酸バッファー(pH7.5)-1mM EDTAを加え、ホモジナイズした。得られたホモジネートを1Lビーカーにとり、一方、ミキサーを同バッファー100mlで洗浄し、得られた洗浄液もホモジネートに合わせた。
【００３２】
次いで、ホモジネートを、約200mlずつ超音波(Ultrasonic Generator 4280, KAIJO DENKI)処理に供した。超音波処理後、ホモジネートのpHを7.5に調整した後、6,000xg、5℃で30分間、遠心分離を行った。
【００３３】
遠心分離後、上清を2Lビーカーにとり、一方、沈殿を300mlの20mM Na-リン酸バッファー(pH7.5)-1mM EDTAに懸濁し、ミキサーで再度ホモジナイズした。再度遠心分離後、得られた上清を先の遠心分離で得られた上清と合わせ、これを抽出液(水性抽出物)とした。
【００３４】
1-4. ウナギ蛍光タンパク質の精製方法
ウナギ蛍光タンパク質の精製を以下の手順に従って行った。
(1) 硫安塩析
上記1-3で得られた抽出液に、60％飽和硫安溶液となるように硫安を加えた。硫安添加後の溶液のpHを7.5に合わせた。
次いで、溶液を低温室(5℃)において150〜250rpmで3時間撹拌した後、6,000xg、5℃で30分間、遠心分離を行った。遠心分離後、得られた上清に90％飽和硫安溶液となるように硫安を添加し、pHを7.6に調整した後、一晩150〜250rpmで撹拌した。その後、撹拌を止め、溶液を24時間低温室に静置した。24時間の静置後、溶液を6,000xg、5℃で60分間遠心分離し、集めた沈殿を60〜90％飽和硫安画分とした。
【００３５】
(2) SephadexG75カラム(カラムサイズ26 x 400mm)を用いたカラムクロマトグラフィー
上記(1)で得られた60〜90％飽和硫安画分を、20mM Na-リン酸バッファー(pH7.5)-1mM EDTA-10％グリセロール-0.15M NaClに溶解した後、同バッファー中で透析を行った。透析した試料を、同バッファーで平衡化したSephadexG75カラムに添加し、流速0.36ml/分で3mlずつ分画を行った。
【００３６】
(3) ヒドロキシアパタイトカラム(カラムサイズ36 x 48mm)を用いたカラムクロマトグラフィー
ヒドロキシアパタイトは、Tiselius等(A. Tiselius, S. Hjerten, and O. Levin (1956): Protein chromatography on calcium phosphate columns. Arch. Biochem. Biophys., 65, 132-155)の方法に従って調製したものを用いた。具体的には、以下の操作によりヒドロキシアパタイトを調製した。
【００３７】
先ず、2Lビーカーに水を約150ml入れた。次いで、スターラーで撹拌しながら、0.5M Na2HPO4500mlと0.5M CaCl2 500mlとを上記ビーカーに滴下添加し、その後、約20分間静置した。静置後、上清を吸引除去した。
【００３８】
次いで水を約1L添加し、ガラス棒でゆっくり撹拌した後、約3分間静置した。静置後、上清を吸引除去した。この約1Lの水の添加から上清の吸引除去までの操作を計4回繰り返した。
【００３９】
その後、水を約1L添加した後、撹拌機で撹拌しながら40％(w/w)NaOH 25mlを添加した。次いで、撹拌機で撹拌しながら、ガスバーナーで加熱し、1時間煮沸した。煮沸後、火を消し、さらに約5分間撹拌し続け、その後約3分間静置した。静置後、上清を吸引除去した。
【００４０】
次いで、水を約1L添加し、ガラス棒でゆっくり撹拌した後、約3分間静置した。静置後、上清を吸引除去した。この約1Lの水の添加から上清の吸引除去までの操作を計4回繰り返した。
【００４１】
その後、1Lビーカー中で0.01M Na2HPO4 500mlと0.01M NaH2PO4500mlとを混合した混合液を、上記2Lビーカーに加え、撹拌機で撹拌しながら、ガスバーナーで加熱し、沸騰直前で火を消した。なお、撹拌は火を消した後、さらに5分間行い、その後約3分間静置した。
【００４２】
次いで、静置後、上清を吸引除去し、0.01M Na2HPO4 500mlと0.01M NaH2PO4500mlとを混合した混合液を加え、撹拌しながら5分間煮沸した後、火を消した。火を消してから更に5分間撹拌した後、約3分間静置した。
【００４３】
静置後、上清を吸引除去し、0.01M Na2HPO4 500mlと0.01M NaH2PO4500mlとを混合した混合液を加え、撹拌しながら15分間煮沸した後、火を消した。火を消してから更に5分間撹拌した後、約3分間静置した。
【００４４】
さらに、静置後、上清を吸引除去し、0.001M Na2HPO4 500mlと0.001M NaH2PO4500mlとを混合した混合液を加え、撹拌しながら15分間煮沸した後、火を消した。火を消してから更に5分間撹拌した後、約3分間静置した。静置後、上清を吸引除去した。この0.001M Na2HPO4 500mlと0.001M NaH2PO4 500mlとを混合した混合液の添加から上清の吸引除去までの操作を計2回繰り返した。
【００４５】
次いで、0.5mM Na2HPO4 350mlと0.5mM NaH2PO4350mlとを混合した混合液を加え、撹拌した後、500mlメスシリンダーに移し、一晩静置した。
一晩の静置後、上清を除き、得られたゲル(ヒドロキシアパタイト)を0.02％NaN3溶液中で保存した。
【００４６】
このようにして調製したヒドロキシアパタイトを用いて、以下で使用するヒドロキシアパタイトカラムを作製した。
上記(2)により得られたウナギ蛍光タンパク質画分を、20mM Na-リン酸バッファー(pH7.0)中で透析した後、同バッファーで平衡化したヒドロキシアパタイトカラムに添加した。
【００４７】
ヒドロキシアパタイトカラムからのウナギ蛍光タンパク質の溶出は、20mM Na-リン酸バッファー(pH7.0) 300ml、0.25M K-リン酸バッファー(pH7.0) 300mlの直線濃度勾配により行った。流速を1.16ml/分とし、5mlずつ分画を行った。ウナギ蛍光タンパク質画分を集め、10mM NH4HCO3中で透析した後、真空凍結乾燥を行うことで凍結乾燥させた。
【００４８】
(4) SephadexG50カラム(カラムサイズ26 x 970mm)を用いたカラムクロマトグラフィー
上記(3)で得られた凍結乾燥試料を、20mM Tris-HCl(pH7.5)-1mM EDTA-0.15M NaClに溶解した後、18,000xg、5℃で30分間、遠心分離した。遠心分離後、得られた上清を、同バッファーで平衡化したSephadexG50カラムに添加した。流速を0.21ml/分とし、3mlずつ分画を行った。
分画後、ウナギ蛍光タンパク質画分を集め、10mM NH4HCO3中で透析し、真空凍結乾燥に供した。
【００４９】
(5) ヒドロキシアパタイトカラム(カラムサイズ10 x 125mm)を用いたカラムクロマトグラフィー
上記(4)で得られた凍結乾燥試料を、少量の20mM Na-リン酸バッファー(pH7.0)に溶解し、再度ヒドロキシアパタイトカラム(10 x 125mm)に添加した。なお、ヒドロキシアパタイトは上記(3)で調製したものと同様であった。
【００５０】
ヒドロキシアパタイトカラムからのウナギ蛍光タンパク質の溶出は、0.25M K-リン酸バッファー(pH7.0)の直線濃度勾配により行った。流速を0.3ml/分とし、1.5mlずつ分画を行った。溶出後、ウナギ蛍光タンパク質画分を集め、10mM NH4HCO3中で透析し、真空凍結乾燥を行うことで凍結乾燥させた。
【００５１】
(6) Source15Q PE 4.6/100カラム(カラムサイズ4.6 x 100mm)を用いたカラムクロマトグラフィー
上記(5)で得られた凍結乾燥試料を、少量の20mM Tris-HCl(pH7.5)に溶解し、15,000xgで2分間遠心分離した。遠心分離後、得られた上清をSource15Q PE 4.6/100カラムに添加した。なお、Source15Q PE 4.6/100カラムは、予め同バッファーで平衡化した。流速を1ml/分とし、溶出を20mM Tris-HCl(pH7.5)-0.25M NaClの直線濃度勾配により行い、1mlずつ分画した。
【００５２】
なお、上記(5)及び(6)の操作では、AKTApurifier(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社)の装置にカラムをセットし、UNICORN(V. 3.00)のソフトウェアを用いて行った。
【００５３】
1-5. 蛍光測定
蛍光測定は、日立分光蛍光光度計(F-2000)により行った。
【００５４】
1-6. SDS-PAGE
SDS-PAGEは、Laemmliの方法(U. K. Laemmli (1970): Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227,680-685)に従って行った。
【００５５】
1-7. タンパク質定量
タンパク質定量は、Smith等の方法(P. K. Smith, R. I. Krohn, G. T. Hermanson, A. K. Mallia, F. H. Gartner, M. D. Provenzano, E. K. Fujita, N. M. Goeke, B. J. Olson, and D. C. Klank (1985): Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem., 150, 76-85)に従って測定した。なお、標準タンパク質にはウシ血清アルブミンを用いた。測定には日立分光光度計(U-2001)を用いた。
【００５６】
1-8. ウナギ筋肉及び筋細胞の蛍光観察
ウナギ遊離筋細胞の調製は、Alam等の方法(N. Alam, K. Nakamura, and S. Hayashi (2004): Lipoprotein metabolism in a coculture system with eel skeletal muscle cells and hepatocytes. Fisheries Science, 70, 326-335)に従って、コラゲナーゼを用いて調製した。ウナギ筋肉断面、遊離筋細胞の蛍光観察は、蛍光実体顕微鏡(Leika MZ FLIII)を用いて行った。
【００５７】
2. 結果
2-1. ウナギ筋肉及びウナギ筋細胞の蛍光観察
ウナギ筋肉横断面の白色光による写真(上の写真)及び蛍光写真(下の写真)を図１Ａに示す。下の蛍光写真は、励起フィルター(450〜490nm)及び蛍光フィルター(500〜550nm)で観察した蛍光写真である。図１Ａに示すように、背骨の周辺に黄緑色の蛍光が見られた。
【００５８】
一方、ウナギ遊離筋細胞の白色光による写真（上の写真）及び蛍光写真(下の写真)を図１Ｂに示す。下の蛍光写真は、上述した励起フィルター及び蛍光フィルターで観察したものである。筋細胞のサイズは、長さ2.5〜3.0mm及び幅15〜25μmであった。図１Ｂに示すように、筋細胞の中には、蛍光を持つ筋細胞と持たない筋細胞とが存在することが分かった。このことは、図１Ａに示す筋肉横断面の蛍光写真が蛍光を持つ部分と持たない部分とが存在することと一致している。
【００５９】
2-2. ウナギ筋肉からのウナギ蛍光タンパク質の精製
下記の表１は、400gの筋肉からウナギ蛍光タンパク質を精製した結果をまとめたものである。具体的には、上記1-3及び1-4の各ステップ後に得られた試料についての結果を要約している。
【００６０】
【表１】
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【００６１】
表１中、「容量(ml)」は各ステップ後に得られた試料容量(ml)である。「タンパク質(mg/ml)」は各ステップ後に得られた試料中のタンパク質濃度(mg/ml)である。「全タンパク質(mg)」は各ステップ後に得られた試料中の全タンパク質量(mg)である。「Em/ml」は溶液1ml当たりの527nmでの蛍光強度である。「Em/mg」はタンパク質1mg当たりの527nmでの蛍光強度である。「全Em」はEm/ml × 全容量(ml)又はEm/mg × 全タンパク質(mg)である。「％」はホモジネートの総蛍光強度(全Em)に対する各ステップの総蛍光強度の割合である。
【００６２】
表１に示すように、Source15Q PE 4.6/100カラムを用いた最終精製後のウナギ蛍光タンパク質の比蛍光強度(Em/mg タンパク質)は、抽出液の約3200倍となった。抽出の際、超音波処理を行うことにより、60〜90％飽和硫安画分へのウナギ蛍光タンパク質の回収率を高くすることができた。なお、硫安塩析におけるウナギ蛍光タンパク質の回収率を上げるために、60％以下の飽和硫安画分を加えると、SephadexG75カラムによる精製効率を著しく低下させた。
【００６３】
図２に、SephadexG75カラムによるウナギ蛍光タンパク質精製時の吸光度(A 280 nm)又は蛍光強度(Em 527 nm)を各画分毎に示した。図２に示すように、60〜90％飽和硫安画分をSephadexG75カラムにより精製した場合、ウナギ蛍光タンパク質(画分番号43〜54)と他の大半のタンパク質とを効率良く分離することができた。しかし、60％以下の飽和硫安画分を加えるとウナギ蛍光タンパク質がかなりの割合で前の大きなピークに重なって現れ、図２に示すように分離することができなかった。SephadexG75カラムによる精製に用いたバッファー中にはグリセロールを10％加えた。10％グリセロールを添加しなかった場合は、カラム操作中に不溶性タンパク質が生じ、以後のカラム操作を不可能にした。SephadexG75カラムにより分離されたウナギ蛍光タンパク質は不溶化することはなかった。
【００６４】
一方、図３には、1度目のヒドロキシアパタイトカラムによるウナギ蛍光タンパク質精製時の吸光度(A 280 nm)又は蛍光強度(Em 527 nm)を各画分毎に示した。図３において、斜線はK-リン酸バッファーの直線濃度勾配を示す。また、図４にはSephadexG50カラムによるウナギ蛍光タンパク質精製時の吸光度(A 280 nm)又は蛍光強度(Em 527 nm)を各画分毎に示した。さらに、図５には、Source15Q PE 4.6/100カラムによるウナギ蛍光タンパク質精製時の280nmにおける吸光度(上のパネル)及び蛍光強度(Em 527 nm)(下のパネル)を各画分毎に示した。図５の上のパネルにおける左の縦軸は280nmにおける吸光度、右の縦軸はNaClのモル濃度(0.25M(100％)に対する割合(％))を示し、また、横軸は溶出開始後の溶出位置(ml)を示す。さらに、図５の上のパネルにおける斜線はNaClの直線濃度勾配を示す。
【００６５】
図６Ａ及びＢは、抽出及び精製の各ステップ後に得られた精製ウナギ蛍光タンパク質のSDS-PAGEの写真を示す。ポリアクリルアミドゲル濃度は17％均一であった。各レーンは、以下の通りである。
a: SephadexG75カラムにより精製したウナギ蛍光タンパク質(10μg)
b: 1度目のヒドロキシアパタイトカラムにより精製したウナギ蛍光タンパク質(2μg)
c: SephadexG50カラムにより精製したウナギ蛍光タンパク質(2μg)
d: Source15Q PE 4.6/100カラムにより精製したウナギ蛍光タンパク質(1.5μg)
マーカー： phosphorylase b 94kDa、albumin 67kDa、ovalbumin 43kDa、carbonic anhydrase 30kDa、trypsin inhibitor 20.1kDa、α-lactalbumin 14.4kDa
【００６６】
ヒドロキシアパタイトカラム及びSephadexG50カラムのいずれも効率よくウナギ蛍光タンパク質(ヒドロキシアパタイトカラムでは画分番号50〜67、SephadexG50カラムでは画分番号87〜96)を精製することができた(図３及び４並びに表１)。しかし、この段階ではなお数種のタンパク質を含んでいた(図６Ａ)。ヒドロキシアパタイトカラムによる精製を再度行った後、Source15Q PE 4.6/100カラムで精製されたウナギ蛍光タンパク質(画分番号7)は、SDS-PAGE上均一なタンパク質として精製された(図５及び６Ｂ)。
【００６７】
2-3. 精製ウナギ蛍光タンパク質の性質
(1) 分子量
図７には、SDS-PAGEによるウナギ蛍光タンパク質の分子量測定結果を示す。各記号は以下の通りである。a) phosphorylase b 94kDa、b) albumin 67kDa、c) ovalbumin 43kDa、d) carbonic anhydrase 30kDa、e) trypsin inhibitor 20.1kDa、f) α-lactalbumin 14.4kDa。縦軸のMWは分子量(kDa)を示し、横軸のRfは、泳動中のゲルの最先端の距離に対する各タンパク質の泳動距離の比を示す。
【００６８】
還元剤(DTT)存在下で17％均一濃度のポリアクリルアミドゲル上でのSDS-PAGEから、ウナギ蛍光タンパク質の分子量を測定したところ、16.5kDaであった(図７中矢印の箇所)。
【００６９】
また、未変性のウナギ蛍光タンパク質の分子量を測定するために、Superdex75カラムを用いた。図８は、Superdex75カラムによる未変性ウナギ蛍光タンパク質の分子量測定の結果を示す。バッファーには50mM Tris-HCl(pH7.5)-0.15M NaClを用い、流速は0.5ml/分であった。標準タンパク質は、Transferin(75kDa)、Ovalbumin(43kDa)、Myoglobin(17.6kDa)及びRibonuclease(13.7kDa)であった。上のパネルは、ウナギ蛍光タンパク質の溶出位置(ml)を示し、一方、下のパネルは、各標準タンパク質の溶出位置(ml)を横軸に、分子量を縦軸にとり作製した検量線を示す。
【００７０】
図８に示すように、未変性ウナギ蛍光タンパク質の分子量は16.5〜17kDaであった(下のパネル中、矢印の箇所)。これらの結果からウナギ蛍光タンパク質は単量体であり、且つその分子量は約16.5kDaであることが分かった。
【００７１】
(2) 励起・蛍光スペクトル及び吸収スペクトル
SephadexG50カラムにより精製したウナギ蛍光タンパク質を20mM Tris-HCl(pH7.5)-1mM EDTA-0.15M NaClに溶解し、スペクトル測定を行った。スペクトル測定結果として、ウナギ蛍光タンパク質の蛍光スペクトル(EM：上のパネル)及び励起スペクトル(EX:下のパネル)を図９に示す。図９に示すように、蛍光最大波長は527nm、励起最大波長は493nmであった。この特性はオワンクラゲGFPの改変体であるEYFPによく類似している。EYFPの蛍光最大波長はウナギ蛍光タンパク質と同じ527nmであり、励起最大波長は513nmである。
【００７２】
さらに、Source15Q PE 4.6/100カラムにより精製したウナギ蛍光タンパク質(20mM Tris-HCl(pH7.5)中)を用いて吸収スペクトルの測定を行った。220nm〜550nmにおけるウナギ蛍光タンパク質の吸収スペクトルを図１０に示す。図１０に示すように、極大吸収波長は280nm及び500nmであった。前者は全てのタンパク質に共通にみられるものであるが、後者はGFP特有の吸収と考えられる。すなわち、オワンクラゲ由来GFPでは、蛍光を示す発色団が明らかにされ、-X(65)-Tyr(66)-Gly(67)-が環状構造をとることにより発色団が形成されることが分かっている。環状構造中のTyr由来のフェノール基の水酸基がイオン化された状態の時、500nm付近に吸収が現れることが知られている(宮脇敦史、安藤亮子 (2003): 新規蛍光タンパク質Kaedeを用いた光技術。細胞工学、22, 316-326)。ウナギ蛍光タンパク質の吸収スペクトルにおける500nmの吸収は、オワンクラゲ由来GFPと同じような発色団を持つことによると考えられた。
【００７３】
(3) 加熱、90％アセトン又は5％トリクロロ酢酸(TCA)による処理
下記の表２には、SephadexG50カラムにより精製したウナギ蛍光タンパク質を95℃、5分間の加熱処理、90％アセトン処理又は5％TCA処理に供した後の上清の残存蛍光強度を求めた結果を示す。残存蛍光強度は、未処理(対照)に対する相対的な蛍光強度(％)として表す。
【００７４】
【表２】
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【００７５】
表２に示すように、処理後の上清に残った蛍光強度は、いずれの処理の場合も消失していた。表２の結果はウナギ蛍光タンパク質自体が蛍光を持つことを示している。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１Ａ】図１Ａは、ウナギ筋肉横断面の白色光による写真(上の写真)及び蛍光写真(下の写真)を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ウナギ遊離筋細胞の白色光による写真（上の写真）及び蛍光写真(下の写真)を示す。
【図２】図２は、SephadexG75カラムによるウナギ蛍光タンパク質精製時の吸光度(A 280 nm)又は蛍光強度(Em 527 nm)を各画分毎に示した図である。
【図３】図３は、1度目のヒドロキシアパタイトカラムによるウナギ蛍光タンパク質精製時の吸光度(A 280 nm)又は蛍光強度(Em 527 nm)を各画分毎に示した図である。
【図４】図４は、SephadexG50カラムによるウナギ蛍光タンパク質精製時の吸光度(A 280 nm)又は蛍光強度(Em 527 nm)を各画分毎に示した図である。
【図５】図５は、Source15Q PE 4.6/100カラムによるウナギ蛍光タンパク質精製時の280nmにおける吸光度(上のパネル)及び蛍光強度(Em 527 nm)(下のパネル)を各画分毎に示した図である。
【図６Ａ】図６Ａは、抽出及び精製の各ステップ後に得られた精製ウナギ蛍光タンパク質のSDS-PAGEの写真を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、抽出及び精製の各ステップ後に得られた精製ウナギ蛍光タンパク質のSDS-PAGEの写真を示す。
【図７】図７は、SDS-PAGEによるウナギ蛍光タンパク質の分子量測定結果を示す。
【図８】図８は、Superdex75カラムによる未変性ウナギ蛍光タンパク質の分子量測定の結果を示す。
【図９】図９は、ウナギ蛍光タンパク質の蛍光スペクトル(EM：上のパネル)及び励起スペクトル(EX:下のパネル)を示す。
【図１０】図１０は、220nm〜550nmにおけるウナギ蛍光タンパク質の吸収スペクトルを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2007254371.tif 000009
【図６Ａ】
2007254371.tif 000010
【図６Ｂ】
2007254371.tif 000011
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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