(57)【要約】【課題】炎症反応の程度を検知するのに適したマーカーを提供する。【解決手段】８−ブロモデオキシグアノシンを炎症反応に特異的なＤＮＡの酸化的損傷のマーカーとして利用する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
８−ブロモデオキシグアノシンを特異的に認識する抗体。
【請求項２】
モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の抗体を備える、８−ブロモデオキシグアノシンの測定キット。
【請求項４】
前記測定キットは、動物から採取される被験試料中の８−ブロモデオキシグアノシン量を測定することにより前記動物における炎症反応の程度を判定する、請求項３に記載の測定キット。
【請求項５】
前記測定キットは、動物から採取される被験試料中の８−ブロモデオキシグアノシン量を測定することにより前記動物における炎症反応に由来するＤＮＡ損傷の程度を判定する、請求項４に記載の測定キット。
【請求項６】
固相担体と、
該固相担体に固定化される請求項１又は２に記載の抗体と、
を備える、固定化体。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項８】
生体における酸化的損傷の測定方法であって、
動物から採取される被験試料中の８−ブロモデオキシグアノシン量を測定する工程を備える、測定方法。
【請求項９】
前記測定工程は、８−ブロモデオキシグアノシン量を請求項１又は２のいずれかに記載の抗体を用いて測定する工程、
を備える、測定方法。
【請求項１０】
前記測定工程は、ＥＬＩＳＡ法によって実施する、請求項９に記載の測定方法。
【請求項１１】
前記測定工程の測定結果に基づいて前記動物における炎症反応の程度を判定する判定工程を備える、請求項８〜１０のいずれかに記載の測定方法。
【請求項１２】
前記測定工程の測定結果に基づいて前記動物における炎症反応によるＤＮＡ損傷の程度を判定する判定工程を備える、請求項８〜１０のいずれかに記載の測定方法。
【請求項１３】
前記測定工程の測定結果に基づいて前記動物における８−ブロモデオキシグアノシンが関連する疾患を診断する診断工程を備える、請求項８〜１０のいずれかに記載の測定方法。
【請求項１４】
炎症反応に関連する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）１種又は２種以上の試験化合物と活性化された好中球とを臭素イオンの存在下に接触させる工程と、
（ｂ）前記（ａ）工程で得られた好中球培養液の８−ブロモデオキシグアノシン量を測定する測定工程と、を備える、スクリーニング方法。
【請求項１５】
前記測定工程は、８−ブロモデオキシグアノシン量を請求項１又は２に記載の抗体を用いて測定する工程である、請求項１４に記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
前記炎症反応に関連する化合物は、炎症反応を調節する化合物である、請求項１４又は１５に記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】
前記炎症反応に関連する化合物は、炎症反応に由来するＤＮＡ損傷を抑制する化合物である、請求項１４又は１５に記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
前記炎症反応に関連する化合物は、ＤＮＡ損傷が関連する疾患の予防用又は治療用の薬剤である、請求項１４又は１５に記載のスクリーニング方法。
【請求項１９】
８−ブロモデオキシグアノシンを含有する、炎症反応関連酸化的損傷マーカー化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症反応に関連する酸化的損傷の程度を検出することのできるマーカー及びその利用に関し、詳しくは、該マーカーを特異的に認識する抗体、測定キット、酸化的損傷の測定方法、炎症反応に関連する化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡの酸化的損傷はガンを含めて各種の疾患との関連が示唆されている。各種の酸化ストレスによって生体内で生じた活性酸素種により、ＤＮＡ中の塩基のうち最も酸化されやすいグアニン（Ｇ）がその８位の炭素が酸化されて８−ヒドロキシデオキシグアノシンが生成することがわかっている。８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）については、モノクローナル抗体をはじめ（特許文献１）、各種の検査方法が開発されている。
【０００３】
近年、発ガン因子の一つに慢性炎症の関与が示唆されている。図９に示すように、免疫担当細胞である好中球は、それ自身が有するミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）により、生体内で生成した過酸化水素からＨＯＢｒやＨＯＣｌなどのハロゲン化活性酸素種を生成して、こうした活性酸素種を用いて生体防御を行っている。一方、こうしたハロゲン化活性酸素種は強力な細胞毒性を備えている。したがって、過剰な炎症反応や慢性の炎症反応によって、こうした活性酸素種が過剰又は恒常的に存在するときなどには、生体成分を傷害する可能性がある。近年、ハロゲン化活性酸素種は、核酸を構成するシトシンやウラシルをハロゲン化することが試験管内において確認されている（非特許文献１）。また、最近、クロル化されたデオキシシチジンが生体内の炎症部位で見出されている（非特許文献２）。
【特許文献１】特許公報第３０９１９７４号公報
【非特許文献１】Yoshichika et al., J. Biol. Chem. 276、7867-7875
【非特許文献２】J. P. Henderson et al., J. Biol. Chem. 279、51241-51249
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
炎症反応、特に、過剰な又は慢性的な炎症反応による生体成分の酸化的損傷の程度を検知することは、そうした炎症反応の存在を知ることができるとともに、こうした生体状況に対する予防又は治療的処置が可能となる点において有用である。
【０００５】
しかしながら、こうしたハロゲン化塩基あるいは当該塩基を含むヌクレオチドなどの生体における生成機構は明らかになっているわけではない。したがって、上記したハロゲン化修飾塩基がマーカーとして有用であるとは限らない。また、８−ＯＨｄＧは有用なマーカーではあるが、炎症反応あるいは炎症反応によるＤＮＡ損傷のマーカーについて有用であるというわけではない。
【０００６】
そこで、本発明は、炎症反応の程度を検知するのに適したマーカー及び当該マーカーを利用した診断方法、抗体及びスクリーニング方法を提供することを一つの目的とする。また、本発明は、炎症反応による酸化的損傷の程度を検知するのに適したマーカー、当該マーカーを利用した診断方法、当該マーカーに特異的な抗体、及び当該マーカーを利用したスクリーニング方法を提供することを他の一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、好中球内に多量に存在するアミノ酸様化合物であってハロゲン化過酸化水素の消去剤ともされているタウリンに着目し、好中球の過剰発現により、タウリン由来のブロマミンが８−ＢｒｄＧの生成を特異的に促進するという知見を得、８−ＢｒｄＧが炎症反応や炎症反応によるＤＮＡの酸化的損傷を検知するための有用なマーカーとなりえることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明によれば、以下の手段が提供される。
【０００８】
本発明の一つの形態によれば、８−ブロモデオキシグアノシンを特異的に認識する抗体が提供される。この抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【０００９】
さらに、本発明の他の一つの形態によれば、上記いずれかの抗体を備える、８−ブロモデオキシグアノシン量の測定キットが提供される。この測定キットは、動物から採取される被験試料中の８−ブロモデオキシグアノシン量を測定することにより前記動物における炎症反応の程度を判定するためのキットであることが好ましい。また、この測定キットは、８−ブロモデオキシグアノシン量を測定することにより前記動物における炎症反応に由来するＤＮＡ損傷の程度を判定するためのキットであることも好ましい。
【００１０】
また、本発明の他の一つの形態によれば、固相担体と、該固相担体に固定化される上記抗体と、を備える、固定化体が提供される。
【００１１】
また、本発明の他の一つの形態によれば、上記いずれかに記載の抗体を産生するハイブリドーマも提供される。
【００１２】
また、本発明の他の一つの形態によれば、生体における酸化的損傷の測定方法であって、動物から採取される被験試料中の８−ブロモデオキシグアノシン量を測定する工程を備える、測定方法が提供される。
【００１３】
この形態において、前記測定工程は、８−ブロモデオキシグアノシン量を上記いずれかに記載の抗体を用いて測定する工程であることが好ましく、より好ましくは、前記測定工程はＥＬＩＳＡ法によって実施する。
【００１４】
また、この形態において、前記測定工程の測定結果に基づいて前記動物における炎症反応の程度を判定する判定工程を備えることができ、また、前記測定工程の測定結果に基づいて前記動物における炎症反応によるＤＮＡ損傷の程度を判定する判定工程を備えることができる。さらに、前記測定工程の測定結果に基づいて前記動物における８−ブロモデオキシグアノシンが関連する疾患を診断する診断工程を備えることができる。
【００１５】
また、本発明の他の一つの形態によれば、炎症反応に関連する化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）１種又は２種以上の試験化合物と活性化された好中球とを臭素イオンの存在下に接触させる工程と、（ｂ）前記（ａ）工程で得られた好中球培養液の８−ブロモデオキシグアノシンを測定する測定工程と、を備える、スクリーニング方法が提供される。
【００１６】
この形態において、前記測定工程は、８−ブロモデオキシグアノシン量を上記いずれかに記載の抗体を用いて測定する工程であることが好ましい。
【００１７】
また、この形態において、前記炎症反応に関連する化合物は、炎症反応を調節する化合物とすることができる。また、前記炎症反応に関連する化合物は、炎症反応に由来するＤＮＡ損傷を抑制する化合物とすることができる。さらに、前記炎症反応に関連する化合物は、ＤＮＡ損傷が関連する疾患の予防用又は治療用の薬剤とすることができる。
【００１８】
また、本発明の一つの形態によれば、８−ブロモデオキシグアノシンを含有する、炎症反応関連酸化的損傷マーカー化合物が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、図１に示すように、好中球において生成した次亜臭素酸がグアニンを攻撃して生成する８−ブロモデオキシグアノシンの検出に関し、特に、８−ブロモデオキシグアノシン（８−ＢｒｄＧ）を特異的に認識する抗体及びその利用に関する。本発明の抗体は、８−ＢｒｄＧに対して高い結合能を有しており、被験試料中の８−ＢｒｄＧを感度よく特異的に定量することができる。このため、慢性の炎症反応や過剰の炎症反応などの炎症反応の程度又はこうした炎症反応によるＤＮＡ損傷程度を容易に判定することができる。また、こうしたＤＮＡ損傷が関連する疾患や生理的状況などの診断が可能である。また、本発明の抗体によれば、炎症反応によるＤＮＡ傷害を抑制することのできる化合物のスクリーニングや炎症反応を調節する化合物のスクリーニングが可能となる。
【００２０】
以下、本発明の一つの実施形態である抗体について説明するとともに、他の実施形態について説明する。
【００２１】
（抗体）
本発明において、８−ＢｒｄＧは、ヌクレオシド誘導体の一部又は全部であって、以下の式（１）で表される。
【化１】
2007091622.tif 000002
（ただし、Ｘ１は、水素原子、３’→５’ホスホジエステル結合で連結される１又は２以上のヌクレオチド残基のＣ５位リン酸モノエステル基のリン原子を表し、Ｘ２は、水素原子、一リン酸エステル基、二リン酸エステル基若しくは三リン酸エステル基又は３’→５’ホスホジエステル結合で連結される１又は２以上のヌクレオチド残基のＣ３位のリン酸モノエステル基のリン原子を表す。ただし、Ｘ１が３’→５’ホスホジエステル結合で連結される１又は２以上のヌクレオチド残基のＣ５位リン酸モノエステル基のリン原子であるとき、Ｘ２は、一リン酸エステル基を表す。）
【００２２】
式（１）において、Ｘ１がＨであり、Ｘ２がＨのとき、ヌクレオシド誘導体は、８−ブロモデオキシグアノシンであり、Ｘ１がＨであり、Ｘ２が一、二及び三リン酸エステルのとき、同誘導体は、８−ブロモデオキシグアノシン一リン酸、同二リン酸、及び同三酸リン酸である。
【００２３】
また、式（１）においてＸ１が他のヌクレオチド残基のリン原子であるか又はＸ２がヌクレオチド残基のリン原子である場合には、本発明のヌクレオシド誘導体は、２以上のヌクレオチド残基を有するヌクレオチドのポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドとしては、オリゴヌクレオチドも含んでいる。ポリヌクレオチドは、デオキシリボースを構成単糖とすることが好ましく、一重鎖であっても二重鎖であってもよい。
【００２４】
本発明の抗体は、こうしたヌクレオシド誘導体（以下、８−ＢｒｄＧ誘導体ともいう。）の８−ＢｒｄＧ部位を特異的に認識することができる。したがって、本発明の抗体は、ヌクレオシドである８−ＢｒｄＧ、ヌクレオチドにおける８−ＢｒｄＧ、ポリヌクレオチド中のヌクレオチド残基における８−ＢｒｄＧを特異的に認識することができる。好ましくは、ヌクレオシドとしての８−ＢｒｄＧを高い感度で特異的に認識する。
【００２５】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００２６】
（抗体の作製）
次に、本発明の抗体の抗原の調製及び抗体の作製方法について説明する。
（１）抗原の調製
本発明の抗体を作製するための抗原としては、８−ＢｒｄＧ誘導体とタンパク質などの適当なキャリアとを結合させた結合体を用いることが好ましい。こうした結合体としては、例えば、８−ＢｒｄＧのデオキシリボースの５位の炭素原子に適当なリンカーを介してキャリアタンパク質を備える結合体が挙げられる。
【００２７】
抗原材料として用いる８−ＢｒｄＧ誘導体としては、ヌクレオシド、ヌクレオチドを用いることが好ましいが、より好ましくはヌクレオシド（８−ＢｒｄＧ）を用いる。８−ＢｒｄＧは化学的に合成することもできるが、ｄＧ等を酵素的に修飾することにより得ることもできる。すなわち、次亜臭素酸：ＨＯＢｒの存在下、ｄＧをインキュベーションすることにより、ｄＧにＢｒを導入することが可能である。反応条件としては、ｐＨ２〜９のリン酸緩衝液中で、０．５〜２ｍＭのｄＧと０．０５〜１ｍＭのＨＯＢｒとをインキュベートすることにより得ることができる。インキュベートは３０〜４０℃程度で、１時間程度とすることができる。反応を、４〜１０ｍＭ程度のメチオニンを添加することにより停止させ、その後、ＨＰＬＣ等により８−ＢｒｄＧを精製することができる。なお、Ｈ２Ｏ２、塩素イオン及び臭素イオンの存在下、ＭＰＯとともにインキュベートすることによって酵素反応によっても８−ＢｒｄＧを合成可能である。
【００２８】
キャリアタンパク質としては、従来公知のキャリアタンパク質が用いられるが、なかでもウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン、リポプロテイン、ヘモシアニンなどが好ましく用いられる。より好ましくは、カギアナカサガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）である。こうしたキャリアタンパク質は、商業的に容易に入手可能である。なお、キャリアとしては、ポリアミノ酸、ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリビニルなどの重合体又は共重合体等の合成高分子を用いることができる。
【００２９】
８−ＢｒｄＧとキャリアタンパク質との結合体を得る方法としては、特に限定しないが、適当な溶媒中で、８−ＢｒｄＧにカルボキシル基を導入したカルボキシル基付加体とキャリアタンパク質とを適用な架橋剤の存在下で反応させて酸アミド結合を形成させる方法が挙げられる。カルボキシル基付加体は、８−ＢｒｄＧのデオキシリボ−スの５位の炭素原子にカルボキシル基を有していることが好ましい。こうしたカルボキシル基付加体は、８−ＢｒｄＧとジカルボン酸やその酸無水物及び酸クロリドなどと反応させることにより得ることができる。なお、ジカルボン酸としては、コハク酸、フタル酸、マレイン酸、アジピン酸などが挙げられる。
【００３０】
カルボキシル基付加体とキャリアタンパク質との結合反応は、架橋剤としてＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド）などの水溶性カルボジイミドを使用することができる。なお、他の架橋剤を用いてもよい。結合反応のための溶媒としては、トリス（Ｔｒｉｓ）、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩等の緩衝液を用いることができ、例えば、１ｍＭ〜０．５Ｍ、より好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭのリン酸緩衝液が挙げられる。ｐＨは、結合反応が進行する限り限定しないが、好ましくはｐＨ６〜１１、より好ましくはｐＨ７〜９である。反応時間は、例えば、２５〜６０℃で１時間以上、好ましくは３０〜４０℃で５〜４０時間である。得られた結合体は、最終的にはカラムによる分離精製、透析などの一般的なタンパク質の分離精製方法を単独であるいは組み合わせて採用して抗原として用いることができる。
【００３１】
効率的に結合体を得るには、カルボキシル付加体をＥＤＣなどの水溶性カルボジイミドと反応させた後、さらにｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）と反応させてアミン反応性スルホ−ＮＨＳエステルとした上で、スルホ−ＮＨＳエステルとキャリアタンパク質と反応させることができる。この場合、スルホ−ＮＨＳエステルを得るための反応溶媒としては、水と混和可能な有機溶媒であれば特に限定されないが、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及びエタノールを単独であるいは組み合わせて用いることができる。反応条件は、２０〜６０℃で５〜４０時間、好ましくは、２０〜４０℃で２０〜３０時間程度である。次に、スルホ−ＮＨＳエステルを含む反応液をキャリアタンパク質溶液と混合して結合反応を進行させる。キャリアタンパク質を溶解する溶液としては、既に説明した結合反応のための溶媒を好ましく用いることができ、ｐＨも同様である。また、反応時間は、１時間以上、好ましくは２〜１０時間程度とすることができる。
【００３２】
また、この他、キャリアタンパク質と８−ＢｒｄＧとを、グルタルアルデヒド等のジアルデヒドや、ヘキサメチレンジイソシアネート等のジイソシアネートとによって反応させてもよい。
【００３３】
本発明の抗体を得るのに好ましい抗原としては、例えば、図２に示すように、８−ＢｒｄＧのスクシニル化物を、ＥＤＣ及びスルホ−ＮＨＳとＤＭＦ中、室温（２５〜３５℃）で２４時間反応させた後、ＫＬＨを加えて室温で４時間反応させることにより得られる化合物（８−ＢｒｄＧ−ＫＬＨ）が挙げられる。
【００３４】
（２）抗体の作製
こうして調製した抗原で温血動物を免疫し、最終的に、目的とする抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングし、このハイブリドーマの産生する抗体を精製することにより本発明の抗体を得ることができる。温血動物としては、特に、限定しないで、マウス、ハムスター、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ニワトリ等を用いることができる。ハイブリドーマとして用いる細胞が限定されている場合、当該ミエローマの由来動物と同一の動物を用いることが好ましく、通常用いられるミエローマはマウス由来であることから、温血動物としてはマウスを用いることが好ましい。
【００３５】
抗原で温血動物を免疫するには、従来公知の方法を採用できる。例えば、抗原を、温血動物に対して皮下注射、皮内注射、腹膜腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射等から選択される１又は２以上の投与経路で、７〜３０日、好ましくは１２〜１６日間間隔で合計２〜１０回程度投与する。
【００３６】
なお、抗原は適当な緩衝液、例えばフロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントのうちの１種を含有するリン酸緩衝液、生理食塩水等に溶解して用いることができるが、こうしたアジュバントを必ずしも使用する必要はない。ここで、アジュバントとは抗原と共に投与したとき、非特異的に抗原に対する免疫反応を増強する物質を意味する。
【００３７】
抗原を免疫した温血動物を７〜３０日間処置せずに放置した後、該温血動物の血清を少量採取し、抗体価を測定する。抗体価の上昇に応じて、抗原の追加投与を適当回数行うこともできる。例えば、０．０１〜１ｍｇ、特に、０．０５〜０．５ｍｇの投与量で１回もしくは２回の追加投与が行われる。なお、抗体価の測定方法としては、酵素免疫測定法、ウエスタンブロット法、凝集法、一元放射状免疫拡散法等から選ばれた測定法を用いることができるが、酵素免疫測定法が好ましい。
【００３８】
抗体価が認められた温血合物への最後の投与の１〜３０日後、特に好ましくは１〜７日後に免疫した温血動物から脾臓又はリンパ節を摘出し、この組織から抗体産生細胞を採取し、継代培養可能な骨髄腫由来細胞（ミエローマ）と融合させることにより、抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。
【００３９】
ハイブリドーマは、例えば、「単クローン抗体実験操作入門」（講談社サイエンティフィック 安藤民衛ら １９９１）等に記載されている方法を用いることができる。すなわち、抗体産生細胞とミエローマとを融合させる。誘導促進剤としては、センダイウイルスやポリエチレングリコールが用いられる。ミエローマとしては、抗体産生細胞の由来動物と同一の動物とすることが好ましい。
【００４０】
実際に用いられる細胞融合の方法としては、公知の技術（Ｊ ＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄ ３９：２８５−３０８，１９８０）を用いることができる。例えば、免疫されたマウスから得られた脾臓細胞等とマウスミエローマ細胞をポリエチレングリコール存在下で融合させ、ハイブリッド細胞のみが生育可能であるＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン添加培地）により選択的にハイブリッド細胞を増殖させ、ハイブリッド細胞がコロニーを形成した後、培養上清中の抗体をスクリーニングすることで目的の抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。本発明によれば、こうした抗体を産生するハイブリドーマも提供される。
【００４１】
８−ＢｒｄＧ抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング方法としては、種々の方法が採用できる。抗体価の測定には、例えば、上記した抗体価の測定と同様の方法を採用できる。好ましくは酵素免疫測定法である。具体的には、８−ＢｒｄＧを含むヌクレオシド誘導体を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合した抗８−ＢｒｄＧモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識した８−ＢｒｄＧヌクレオシド誘導体を加え、固相に結合した８−ＢｒｄＧモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。また、限界希釈法を繰り返すことにより、８−ＢｒｄＧを産生する単一のハイブリドーマを得ることができる。
【００４２】
こうしてスクリーニングされたハイブリドーマをモノクローナル抗体を産生する環境下（温血動物の生体外又は生体内）で培養して、体液又は培養液から抗体を採取することにより、本発明の抗体を製造することができる。本発明の抗体は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に行うことができる。すなわち、免疫グロブリンの分離精製法、例えば、塩析法、アルコール沈澱法、等電点沈澱法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法などに従って行われる。
【００４３】
なお、８−ＢｒｄＧに対する高い反応特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングするには、間接競合ＥＬＩＳＡ又は直接競合ＥＬＩＳＡによって８−ＢｒｄＧに対する特異性と類似化合物に対する交差反応性を調べることが好ましい。類似化合物としては、ｄＧ（デオキシグアノシン）、Ｇ（グアニン）、８−ＢｒＧ（８−ブロモグアニン）、８−ＣｌｄＧ（８−クロロデオキシグアノシン）などが挙げられる。本発明のモノクローナル抗体は、８−ＢｒｄＧに対するＩＣ５０（間接競合ＥＬＩＳＡによる）が、５０μｇ／ｍｌ以下であることが好ましく、より好ましくは、２０μｇ／ｍｌ以下である。また、本発明のモノクローナル抗体の８−ＢｒｄＧに対するＩＣ５０（間接競合ＥＬＩＳＡ）は、１００μｇ／ｍｌ以上であることが好ましく、より好ましくは、２００μｇ／ｍｌ以上である。なお、ここで、ＩＣ５０とは、間接競合ＥＬＩＳＡまたは直接競合ＥＬＩＳＡによる標準阻害曲線において５０％阻害を示す濃度である。
【００４４】
本発明のモノクローナル抗体はヒトの８−ＢｒｄＧの検出だけでなく、ヒト以外の異種の温血動物マウス、ハムスター、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ等の生体中に存在する８−ＢｒｄＧ誘導体の検出にも応用することができる。
【００４５】
（測定キット）
本発明の測定キットは、ヌクレオシド誘導体における８−ＢｒｄＧを特異的に認識する抗体を含むため、被験試料中の８−ＢｒｄＧを簡便に測定することができ、後述する８−ＢｒｄＧの測定方法に好適に使用することができる。本測定キットは、さらに、測定法に応じて、標識された二次抗体もしくは標識された８−ＢｒｄＧハプテン（抗原）、緩衝液、検出試薬および／または８−ＢｒｄＧ標準溶液等を含む。好ましいキットは、ＥＬＩＳＡ法に用いられうるものであり、固相化抗原を保持する担体、本発明の抗体、酵素標識された二次抗体および検出試薬などを含むことができる。
【００４６】
本発明の抗体が特異的に認識する８−ＢｒｄＧは、炎症反応により生体内で生成されるものであるので、本測定キットによれば、被験試料中の８−ＢｒｄＧを測定することで被験試料の採取部位又は採取個体における炎症反応の程度を検出することができる。また、８−ＢｒｄＧは、傷害を受けたＤＮＡであることから、本測定キットによれば、被験試料中の８−ＢｒｄＧを測定することで、被験試料の採取部位又は採取個体における炎症反応程度や炎症反応によるＤＮＡ傷害の程度など生体における酸化的損傷程度を判定することができる。
【００４７】
（固定化体）
本発明の固定化体は、固相担体と、該固相担体に固定化される本発明の抗体とを備えている。固相担体は、基板状、ビーズ状等特に形態を限定しないし、その材質も、ガラス、セラミックス、プラスチック、金属など従来公知の材料を用いることができる。さらに、多孔質であっても緻密質であってもよい。本発明の抗体の固相担体への固定化形態は特に限定しないで共有結合、静電的結合など、抗体などのタンパク質を固相に保持できる従来公知の手法で固定化されていればよい。本発明の固定化体は、本発明の抗体が、基板状の固相担体上に他の抗体とともに予め位置情報を伴って固定化されていることが好ましい。こうした本発明の固定化体は、複数個の抗体が一つの基板状の固相担体に固定化された抗体チップの形態を採ることができる。
【００４８】
（炎症反応関連酸化的損傷マーカー化合物）
本発明によれば、８−ＢｒｄＧは炎症反応関連酸化的損傷マーカー化合物として利用することができる。８−ＢｒｄＧは、好中球の炎症反応に伴って生じるグアノシンの酸化損傷物であることから、８−ＢｒｄＧは慢性的又は過剰な炎症反応やそれによるＤＮＡ損傷が生じている生理的状態を検出し、生体における酸化的損傷程度を判定するためのマーカーとして利用できる。さらに、個体のエージング状態を診断するマーカーとしても利用できる。
【００４９】
（生体における酸化的損傷の測定方法：８−ＢｒｄＧの測定方法）
本発明の測定方法は、動物から採取される被験試料中の８−ＢｒｄＧを測定する方法である。８−ＢｒｄＧは、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ等により測定することができるが、好ましくは、本発明の抗体、より好ましくはモノクローナル抗体を用いて測定する。測定方法としては、通常の抗原−抗体反応を利用する方法であれば特に制限されず、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学法、蛍光もしくは発光測定法、凝集法、イムノブロット法、イムノクロマト法等（Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ９２， １４７−５２３ （１９８３）， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｖｏｌ．ＩＩ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｏｘｆｏｒｄ （１９８９）） が挙げられるが、感度や簡便性等の点からＥＬＩＳＡが好ましい。ＥＬＩＳＡに用いる酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等が挙げられる。
【００５０】
動物としては、ヒトの他、ヒト以外の異種の温血動物マウス、ハムスター、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリが挙げられる。また、被験試料は、動物から採取される血液、血漿、血清、尿、卵胞液、脊髄液、脳髄液、精液などの液体試料や、動物の炎症部位等から採取される細胞や組織等の固形試料が挙げられる。細胞や組織などの固形試料に対しては免疫組織化学染色法により、細胞内又は組織における８−ＢｒｄＧの局在を検出することができる。組織やこうした被験試料は、その種類及び必要に応じて適宜前処理がなされる。
【００５１】
ＥＬＩＳＡによる測定法は、間接競合ＥＬＩＳＡまたは直接競合ＥＬＩＳＡなどがあげられる。例えば、間接競合ＥＬＩＳＡは、以下のような手順により行うことができる。
【００５２】
（１）固相化用抗原である８−ＢｒｄＧとキャリアとの結合体を担体に固相化する。用いる担体は、９６穴、４８穴、１９２穴等のマイクロタイタープレートが好ましい。固相化は、例えば、固相化用抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーションすればよい。緩衝液中の抗原の濃度は、通常０．０１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程度である。緩衝液としては、検出手段に応じて公知のものを使用することができる。
【００５３】
（２）担体の固相表面へのタンパク質の非特異的吸着を防止するため、固相化用抗原が吸着していない固相表面部分を、抗原と無関係なタンパク質等によりブロッキングする。ブロッキング剤としては、ＢＳＡもしくはスキムミルク溶液、または市販のブロックエース（大日本製薬社製）等を使用することができる。ブロッキングは、前記ブロッキング剤を担体に添加し、例えば、約４℃で一晩インキュベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液としては特に制限はないが、前記（１）と同じ緩衝液を使用することができる。
【００５４】
（３）前記（１）および（２）で処理された固相表面に各種濃度の８−ＢｒｄＧ誘導体を含む被験試料および本発明の抗体溶液を加え、該抗体を前記固相化抗原および被験試料中の８−ＢｒｄＧに競合的に反応させて、固相化抗原−抗体複合体および８−ＢｒｄＧ−抗体複合体を生成させる。反応は、１０℃〜４０℃、好ましくは２５℃〜３７℃で０．５〜数時間程度で行うことができる。
【００５５】
（４）固相化抗原−抗体複合体の量を測定することにより、予め作成した検量線から試料中の８−ＢｒｄＧ量を決定することができる。固相化抗原−抗体複合体の量は、酵素標識した二次抗体（８−ＢｒｄＧ抗体を認識する抗体）を添加して測定することができる。例えば８−ＢｒｄＧ抗体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素標識（例えば、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ等）した抗マウスーヤギ抗体を用いて、担体に結合した８−ＢｒｄＧ抗体と反応させるのが望ましい。反応は、前記（３）と同様の条件下で行えばよい。反応後、緩衝液で洗浄する。
【００５６】
（５）担体に結合した二次抗体の標識酵素と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を測定することによって検量線から８−ＢｒｄＧの量を算出することができる。二次抗体に結合する酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素と、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンまたはｏ−フェニレンジアミンを含む発色基質溶液を使用することができる。通常、発色基質溶液を加えて室温で約１０分程度反応させた後、硫酸を加えることにより酵素反応を停止させる。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度を測定する。ｏ−フェニレンジアミンを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度を測定する。なお、バックグランド値を補正するため、６３０ｎｍの吸光度も同時に測定することが望ましい。二次抗体に結合する酵素としてアルカリホスファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、ＮａＯＨ溶液を加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法があげられる。
【００５７】
８−ＢｒｄＧを添加しない反応溶液の吸光度に対して、８−ＢｒｄＧを添加して抗体と反応させた溶液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃度のアラクロールを添加した反応液の阻害率により予め作成しておいた検量線を用いて、試料中の８−ＢｒｄＧ濃度を算出することができる。
【００５８】
また、８−ＢｒｄＧは、以下のようにして直接競合ＥＬＩＳＡにより測定できる。すなわち、固相化抗原に替えて、８−ＢｒｄＧ抗体を担体に固相化し、被験試料と混合する抗体に替えて８−ＢｒｄＧと酵素を結合させた酵素結合ハプテンを用い、二次抗体を用いないで固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプテンを除去した上、固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を間接競合ＥＬＩＳＡと同様の方法により発色させて吸光度を測定することにより、予め作成した検量線から被験試料中の８−ＢｒｄＧの量を決定することができる。
【００５９】
なお、本発明の測定方法においては、被験試料に応じた前処理をして試料とした後、間接競合ＥＬＩＳＡ、直接競合ＥＬＩＳＡやその他の測定方法に供せられる。
【００６０】
本発明の測定方法は、８−ＢｒｄＧを感度よく定量できるため、炎症反応の際の酸化ストレス及び該酸化ストレスに基づくＤＮＡ損傷に関する研究用途、炎症反応の程度の判定、炎症反応によるＤＮＡ損傷の程度の判定などの酸化的損傷程度の判定、及びこうしたＤＮＡ損傷が関連する疾患の診断等に用いることができる。
【００６１】
すなわち、本発明の測定方法は、炎症反応に伴って８−ＢｒｄＧが増加するため、８−ＢｒｄＧ含有量を測定することにより、被験試料の採取部位又は採取個体における炎症反応の程度を判定できる。また、本測定方法は、８−ＢｒｄＧはＤＮＡの酸化的損傷の結果物であるから、８−ＢｒｄＧを測定することにより、被験試料の採取部位又は採取個体における炎症反応によるＤＮＡ損傷の程度を判定できる。特に、８−ＢｒｄＧは慢性的な炎症反応や過剰な炎症反応が生体において生じている場合に生成されると考えられるため、８−ＢｒｄＧを測定することで慢性的又は過剰な炎症反応やそれによるＤＮＡ損傷が生じている生理的状態を検出し、生体における酸化的損傷程度を判定することができる。さらに、酸化的損傷の程度を判定することで、個体のエージング状態を診断し、酸化的損傷の生じている生理的状態を改善し又は予防するアンチエージング的な措置や治療が可能となる。
【００６２】
本発明の測定方法によれば、８−ＢｒｄＧ含有量を測定することにより、炎症反応やＤＮＡ損傷が関連する疾患の診断ができる。すなわち、本発明の測定方法によればこうした疾患に罹患しているかどうか又は将来罹患する可能性が高いかどうかを診断することができる。疾患としては、ＤＮＡの酸化的損傷は発癌に関連していることから、例えば、各種の癌（例、大腸癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、子宮頸部癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）が挙げられる。
【００６３】
（スクリーニング方法）
本発明のスクリーニング方法は、炎症反応に関連する化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）１種又は２種以上の試験化合物と活性化された好中球とを臭素イオンの存在下に接触させる工程と、（ｂ）前記（ａ）工程で得られた好中球培養液の８−ＢｒｄＧを測定する測定工程と、を備えている。この方法によれば、ＤＮＡ損傷物である８−ＢｒｄＧは好中球による炎症反応に伴って増加するため、試験化合物の添加により８−ＢｒｄＧ量の増大又は減少を検出することにより、試験化合物が炎症反応を促進するのか又は抑制するのかを評価することができる。この結果、本発明のスクリーニング方法によれば、炎症反応に関連する化合物として、炎症反応を調節する（促進又は抑制する）化合物をスクリーニングすることができる。
【００６４】
また、本発明のスクリーニング方法によれば、前記化合物として、炎症反応に由来するＤＮＡ損傷を抑制する化合物をスクリーニングすることができる。この方法によれば、ＤＮＡ損傷物である８−ＢｒｄＧは好中球による炎症反応に伴って増加するため、試験化合物の添加により８−ＢｒｄＧ量の増大又は減少を検出することにより、試験化合物が炎症反応によるＤＮＡ損傷を促進するのか又は抑制するのかを判定することができる。この結果、本発明のスクリーニング方法によれば、炎症反応に由来するＤＮＡ損傷を抑制する化合物をスクリーニングすることができる。
【００６５】
本発明のスクリーニング方法によれば、前記化合物としてＤＮＡ損傷が関連する疾患の予防用又は治療用の薬剤をスクリーニングできる。炎症反応による酸化ストレスやＤＮＡ損傷は、老化の指標であるとともに癌などＤＮＡ損傷が関連する疾患の要因となる。したがって、本発明のスクリーニング方法によれば、ＤＮＡ損傷が関連する疾患の予防用又は治療用の医薬として用いることができる。また、本発明のスクリーニング方法によれば、炎症反応に由来するＤＮＡ損傷によって引き起こされる生理的状態を予防し又は改善する食品のスクリーニングも可能である。
【００６６】
本発明のスクリーニング方法における８−ＢｒｄＧ含有量の測定工程は、本発明の抗体を用いることが好ましい。抗体を用いた測定方法としては、既に説明した各種方法を用いることができ、好ましくはＥＬＩＳＡ法を用いることができる。好中球は、例えば、カゼイン等を腹腔内投与した動物の腹腔から回収できる。好中球内のタウリン量は、培地の浸透圧やタウリン量を調整することで必要に応じて調節することができる。また、培地中に、ＬＰＳなどの免疫応答を誘導する物質を添加することで、好中球を活性化させることができる。
【実施例】
【００６７】
以下、本発明の具体例を実施例として説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
（１）ｄＧ濃度が２ｍＭ、ＨＯＢｒ濃度が１ｍＭ及び各種アミノ酸濃度が１ｍＭとなるように、ｄＧとＨＯＢｒとの５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）溶液に各種アミノ酸の５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）溶液を添加して、３７℃で６０分間インキュベートし、メチオニンを１０ｍＭとなるように添加して反応を停止し、８−ＢｒｄＧの生成量を、ＨＰＬＣにて測定した。結果を図３に示す。
【００６８】
（２）ｄＧ濃度が２ｍＭ及びタウリン濃度が０，５０，１００，３００，５００及び１０００μＭの５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）溶液を調製し、ＨＯＢｒ又はＨＯＣｌを１ｍＭとなるように添加し、１時間、３７℃でインキュベートし、メチオニンを１０ｍＭとなるように添加して反応を停止し、８−ＢｒｄＧの生成量を、ＨＰＬＣにて測定した。結果を図４に示す。
なお、ＨＰＬＣは以下の条件で行った。
ＨＰＬＣ条件
カラム：ＯＤＳ−ＨＧ−５（直径４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）
流速：１．０ｍｌ／分
移動相Ａ：Ｈ２Ｏ／０．１％酢酸
移動相Ｂ：メタノール／０．１％酢酸
グラジエント（移動相Ｂ濃度）：０〜５分、Ｂ１０％
５〜１５分、２０％
１５〜２０分、１００％
２０〜２８分、１００％
２９〜３９分、１０％
【００６９】
図３に示すように、タウリン由来のブロマミンは８−ＢｒｄＧの生成を促進していることがわかった。また、図４に示すように、タウリン濃度に応じて８−ＢｒｄＧの生成量が増大していた。これに対して、８−ＣｌｄＧ濃度とタウリン濃度にはこうした関係は認められなかった。以上のことから、タウリンが濃度依存的に８−ＢｒｄＧの生成量を増大させることがわかった。
【００７０】
（実施例２）
（２−デオキシグアノシン（ｄＧ）と次亜臭素酸（ＨＯＢｒ）との反応）
５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）中、２ｍＭのｄＧと１ｍＭのＨＯＢｒとを３７℃で１時間インキュベートし、１０ｍＭとなるようにメチオニンを添加して反応を停止させた。反応液をＬＣ／ＭＳに供して８−ＢｒｄＧが合成されたことを確認した。８−ＢｒｄＧはＬＣにより保持時間約１５分程度に溶出し、ＭＳにて８−ＢｒｄＧに特異的なｍ／ｚ３４５．９、３４７．９を確認した。ＨＰＬＣ条件を以下に示す。
ＨＰＬＣ条件
カラム：ＯＤＳ−ＨＧ−５（直径４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）
流速：１．０ｍｌ／分
移動相Ａ：Ｈ２Ｏ／０．１％酢酸
移動相Ｂ：メタノール／０．１％酢酸
グラジエント：０〜５分、１０％
５〜１５分、２０％
１５〜２０分、１００％
２０〜２８分、１００％
２９〜３９分、１０％
【００７１】
（実施例３）
（１）抗原の調製
８−ＢｒｄＧのスクシニル化物４．０ｍｇ、ＥＤＣ（ピアス社製）２．０ｍｇ及びｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（ピアス社製）２．０ｍｇをＤＭＦ１６０μｌに溶解し、室温で２４時間攪拌しながらインキュベートした。この液の半量を、ＫＬＨ溶液（１５．７ｍｇを１．８９ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解したもの）に加えて、室温で４時間インキュベートした。さらに、この反応液を、リン酸緩衝生理食塩水に対し、透析外溶液を適時に交換しながら４℃で３日間透析し、８−ＢｒｄＧ−ＫＬＨを得、これを抗原とした。なお、上記２４時間インキュベーションした反応液の半量について、ＫＬＨに替えてＢＳＡを用いる以外は同様の操作を行い、８−ＢｒｄＧ−ＢＳＡを得た。
【００７２】
（２）免疫方法
上記抗原（０．２〜０．６ｍｇ／ｍＬ）は等量のフロイントの完全アジュバントとよく混合してエマルジョンとし、これをマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、オス、６〜８週齢）の腹腔内に１００μｌ免疫した。初回免疫から１０〜１４日後、抗原と等量のフロイントの不完全アジュバントをよく混合してエマルジョンとして、追加免疫を行った。追加免疫から３週間後、抗原とリン酸緩衝生理食塩水（略号：ＰＢＳ）を混合して最終免疫を行った。なお、抗体価は、追加免疫の１週間後、マウス尾静脈から血液を採取し、１時間室温で静置して凝固させた後、３５００ｒｐｍで１０分間遠心し上清（血清）を用いて酵素免疫化学的方法で抗原に対する抗体が産生していることを確認した。
【００７３】
抗体価の確認は以下のようにして行った。（１）で得た８−ＢｒｄＧ−ＢＳＡを５μｇ／ｍｌとなるように、ＰＢＳで希釈して１００μｌずつを、９６穴イムノプレートのウェルに分注し、４℃で一晩静置して物理吸着させた。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）（以下、「ＴＰＢＳ」と略す。）２００μｌで３回洗浄した後、ブロックエース（雪印乳業（株）社製）０．４ｍｇを水１０ｍｌに溶解させたもの（以下、「ブロッキング液」と略す。）２００μｌをウェルに分注し、３７℃で一時間放置してブロッキングを行った。
【００７４】
上記と同様にして各ウェルを洗浄後、このプレートのウエルにマウスから得られた血清（緩衝液で希釈した血清を含む。）（１００μＬ／ウエル）を入れて、３７℃で２時間反応させた。
【００７５】
ウェルを洗浄後、ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識されているマウス抗体に反応するウサギ抗体をＴＰＢＳで５０００倍希釈した液１００μｌを各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。ウエルを洗浄後、発色バッファー（４０ｍＭクエン酸と４０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４とを混合してpH５．０に合せたもの）：テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）のＤＭＦ溶液（ＴＭＢ１０ｍｇをＤＭＦ１ｍｌに溶解したもの）：３０％Ｈ２Ｏ２混液（５０００：５０：２）（以下、これを発色液という。）１００μｌを添加しアルミホイルで遮光して１０分間反応させ、発色反応を１Ｎリン酸を１００μｌづつ加えて停止させ、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定して抗体価の確認を行った。
【００７６】
（３）細胞融合
免疫したマウスからマウス脾臓を摘出し、よくほぐして脾細胞を得た。得られた脾細胞はＦＢＳ−ＦＲＥＥ／ＤＭＥＭで洗浄した。この洗浄した脾細胞と同様にＦＢＳ−ＦＲＥＥ／ＤＭＥＭでよく洗浄したミエローマ細胞であるマウス脾細胞（Ｐ３Ｕ１）との細胞数が１０：１の割合になるように混和し、遠心して上清を捨てたあと、ポリエチレングリコール１５００の７５ｍＭＨＥＰＥＳ溶液（ＰＥＧ１５００ ５０ｗ／ｖ％溶液）１ｍｌを１分間かけて添加して緩やかに攪拌した。これに、ＦＢＳ−ＦＲＥＥ／ＤＭＥＭ培地計１０ｍｌを数回に分けて徐々に添加した後、５分間遠心分離して上清を除去、ハイブリッド細胞を調製した。
【００７７】
（５）クローニング
得られたハイブリドーマに８０ｍＬのＨＡＴ培地を加えて細胞を懸濁し、９６穴マイクロプレートの各ウエルに１滴ずつ分注し、ＨＡＴ培地により選択的にハイブリッド細胞を増殖させた。融合から１０日後、培養上清を用いて酵素免疫化学的方法によりスクリーニングを行った。なお、抗体価の確認方法は、前述の抗体価の確認方法と同様であるが、試験に用いる試料として血清の代わりに得られた培養上清を用いた。このスクリーニングにより抗体活性の確認されたウエルの細胞について再び限界希釈を行いＨＴ（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたもの）培地で培養し、最終的にはスクリーニングと限界希釈を繰り返すことにより８−ＢｒｄＧに対して高い抗体活性を有し、且つ単一の細胞からなるクローン１株（８Ｂ３株）を得た。
なお、以上の操作において用いた培地等は以下の表１に示す組成であった。
【表１】
2007091622.tif 000003
【００７８】
（実施例３）
実施例２で得られたクローンから得られた抗体の反応特異性について確認を行った。なお、検討に用いるモノクローナル抗体（ｍＡｂ８Ｂ３）は、培養上清を希釈してそのまま用いた。
【００７９】
（１）モノクローナル抗体の反応特異性の評価
本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ８Ｂ３）の反応特異性を酵素免疫測定法にて評価した。すなわち、９６穴イムノプレート（Ｎｕｎｃ社製、マキシソープ）にウエル当たり１００μｌのタンパク質あるいは修飾タンパク質（４μｇタンパク質／ｍｌ）を加え、４℃で一昼夜静置してプレートに物理吸着させ、ウエル当たり３００μｌのＴＰＢＳで３回洗浄した後、１％ＢＳＡ含有ＴＰＢＳもしくは蒸留水で４倍希釈したブロックエース（雪印乳業（株）社製）をウエル当たり３００μｌ加えてブロッキングした。このプレートを上記と同様にＴＰＢＳで３回洗浄した後、ウエル当たり１００μｌのＴＰＢＳで希釈した本モノクローナル抗体溶液（１μｇ／ｍｌ）を加えて、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート後、上記と同様にＴＰＢＳで３回洗浄した後、ウエル当たり１００μｌの酵素標識抗体溶液を加えて、３７℃で１時間インキュベートした。このプレートをＴＰＢＳで３回洗浄した後、ウエル当たり１００μｌの発色液を加えて室温で１５−２０分間インキュベートした。ウエル当たり１００μｌの反応停止液を加えた後、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定し、本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を評価した。なお、タンパク質としては、ＢＳＡを用い、修飾タンパク質としては、８−ＢｒｄＧと同様にしてＢＳＡを修飾した８−ＢｒｄＧ−ＢＳＡを用いた。結果を図５に示す。図５に示すように、ｍＡｂ８Ｂは、遊離の８−ＢｒｄＧを認識することが明らかとなった。
【００８０】
（２）モノクローナル抗体の反応特異性の解析
本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ８Ｂ３）の反応特異性を酵素免疫測定法にて評価した。すなわち、９６穴イムノプレートに抗原の調製法に準じて調製した８−ＢｒｄＧ−ＢＳＡを加えてプレートに物理吸着させたプレートのウエルに、本発明によるモノクローナル抗体のかわりに、本発明によるモノクローナル抗体（１μｇ／ｍＬ）に各種濃度の競合物質を添加したものを試料とする以外は前記の（１）のモノクローナル抗体の反応特異性の評価に記載の方法と同様にして吸光度を測定し、本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を評価した。
【００８１】
（１）糖の影響
競合物質として、Ｇ、ｄＧ、８−ＢｒＧ、８−ＢｒｄＧを用い、競合酵素免疫測定法により糖の影響を評価した。結果を図６に示す。図６に示すグラフにおいて、縦軸はそれぞれ競合物質の存在下における吸光度、横軸は競合物質の濃度を示している。図６に示すように、ｍＡｂ８Ｂは、８−ＢｒｄＧに対してのみ高い反応性を示したことから、糖を含んだ構造を認識すること及び８−ＢｒｄＧを特異的に認識することが明らかであった。
【００８２】
（２）塩基及びハロゲンの影響
競合物質として、ＨＯＢｒ及びＨＯＣｌで修飾ｄＧ、ｄＣ、ｄＴ、ｄＡを用い競合酵素免疫測定法により他の塩基及びハロゲンの影響を評価した。結果を図７に示す。図７に示すように、ｍＡｂ８Ｂは、８−ＢｒｄＧのほか８−ＣｌｄＧを認識することが明らかとなった。
【００８３】
（３）ｄＧの８位における置換基の影響
競合物資として、ｄＧ、８−ＢｒｄＧ、８−ＣｌｄＧ、８−ＯＨｄＧを用い競合酵素免疫測定法により、ｄＧの８位における置換基の影響を評価した。結果を図８に示す。図８に示すように、ｍＡｂ８Ｂは、８−ＢｒｄＧに対して最も高い反応性を有していることが明らかであった。
【００８４】
なお、実施例３によれば、８−ＢｒｄＧのＩＣ５０は１２μｇ／ｍｌであり、８−ＣｌｄＧのＩＣ５０は２３８μｇ／ｍｌであった。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】８−ＢｒｄＧの生成反応を示す図である。
【図２】８−ＢｒｄＧ−ＫＬＨの合成の概要を示す図である。
【図３】各種アミノ酸のブロマミンと８−ＢｒｄＧの生成量との関係を示す図である。
【図４】タウリン濃度と８−ＢｒｄＧ生成量との関係を示す図である。
【図５】実施例２で得られたモノクローナル抗体（ｍＡｂ８Ｂ３）の反応性を示す図である。
【図６】実施例２で得られたモノクローナル抗体（ｍＡｂ８Ｂ３）のエピトープの解析結果を示すグラフである。
【図７】実施例２で得られたモノクローナル抗体（ｍＡｂ８Ｂ３）のエピトープの解析結果を示すグラフである。
【図８】実施例２で得られたモノクローナル抗体（ｍＡｂ８Ｂ３）のエプトープの解析結果を示すグラフである。
【図９】好中球を介してハロゲン化過酸化種の生成による生体防御機構の概要を示す図である。
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図９】
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