(57)【要約】【課題】  基板上でＤＮＡ鎖の伸長反応効率が高いＤＮＡ鎖伸長方法を提供すること。【解決手段】親水性ポリマー成分及びＤＮＡ鎖を固定化する官能基を表面に有する基体表面に、ＤＮＡ伸長用のプライマーを固定化し、所望する配列を有する鋳型となる核酸鎖、ヌクレオチドモノマー、及びＤＮＡ伸長酵素を含む溶液を前記基体表面に供給し、必要に応じてＤＮＡ鎖を熱変性する温度で処理を行った後、アニール処理する温度で、プライマーＤＮＡ鎖の伸長反応を行うことを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性ポリマー成分及びＤＮＡ鎖を固定化する官能基を表面に有する基体表面に、ＤＮＡ伸長用のプライマーを固定化し、所望する配列を有する鋳型となる核酸鎖、ヌクレオチドモノマー、及びＤＮＡ伸長酵素を含む溶液を前記基体表面に供給し、必要に応じてＤＮＡ鎖を熱変性する温度で処理を行った後、アニール処理する温度で、プライマーＤＮＡ鎖の伸長反応を行うことを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
【請求項２】
前記親水性ポリマー及びＤＮＡ鎖を固定する官能基が、網の目状に絡み合ったマトリックスを構成していることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ鎖伸長方法。
【請求項３】
請求項１記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、ＤＮＡ鎖を固定化する官能基がアミノ基と反応する官能基であり、プライマーＤＮＡ鎖の５’末端にアミノ基を導入し、該アミノ基と官能基とが反応し結合することによってプライマーが固定化されていることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
【請求項４】
請求項３記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、アミノ基と反応する官能基が活性エステル基であるＤＮＡ鎖伸長方法。
【請求項５】
請求項１記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、前記鋳型となる核酸鎖が、ＤＮＡ又は
ＲＮＡであるＤＮＡ鎖伸長方法。
【請求項６】
請求項１に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、前記鋳型となる核酸鎖は、所定のＲＮＡを逆転写酵素で処理して得られるｃＤＮＡ断片であることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
【請求項７】
請求項１記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、所望する配列を有する鋳型となる核酸鎖、ヌクレオチドモノマー、及びＤＮＡ伸長酵素を含む溶液を、予めＤＮＡ鎖を熱変性する温度まで引き上げる処理を行うことを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
【請求項８】
請求項１に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、前記ＤＮＡ鎖伸長反応は、前記反応系の温度を、前記アニール処理温度から前記熱変性処理温度まで徐々に上昇させて行われることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
【請求項９】
請求項１に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、前記ＤＮＡ鎖伸長反応は、前記反応系の温度を、前記アニール処理温度と前記熱変性処理温度との間の所定の温度に変化させて行われることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
【請求項１０】
請求項１に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、前記プライマーは、所定の着目遺伝子の特徴配列を含む塩基配列の一塩基を他の塩基に置き換えたＤＮＡ断片鎖であることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、前記プライマーは所定数の塩基配列からなり、各々のプライマーは全組合せのそれぞれの配列を有するＤＮＡ断片であることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
【請求項１２】
請求項１に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、前記ヌクレオチドモノマーの少なくとも一種がラベルされたものであることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
【請求項１３】
請求項１に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、前記基体が、シリコン、ガラス、金属、グラファイト、又はプラスチック材料からなることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法。
【請求項１４】
請求項１に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、基体形状がスライドガラス状、マイクロタイタープレート状又は容器状であるＤＮＡ鎖の伸長方法。
【請求項１５】
親水性ポリマー成分及びＤＮＡ鎖を固定化する官能基を表面に有する基体表面に、ＤＮＡ伸長用のプライマーを固定化したＤＮＡ鎖伸長用アレイ。
【請求項１６】
請求項１５に記載のＤＮＡ鎖伸長用アレイにおいて、前記親水性ポリマー及びＤＮＡ鎖を固定する官能基が、網の目状に絡み合ったマトリックスを構成していることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長用アレイ。
【請求項１７】
請求項１５に記載のＤＮＡ鎖伸長用アレイにおいて、前記基板が、シリコン、ガラス、金属、グラファイト、又はプラスチック材料からなることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長用アレイ。
【請求項１８】
請求項１５に記載のＤＮＡ鎖伸長用アレイにおいて、前記プライマーは、５〜５０個の塩基配列からなることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長用マイクロアレイ。
【請求項１９】
請求項１５に記載のＤＮＡ鎖伸長用アレイにおいて、前記プライマーが、前記基体表面のＤＮＡ鎖を固定化する官能基と共有結合して、基体表面に固定化されることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長用アレイ。
【請求項２０】
請求項１５に記載のＤＮＡ鎖伸長用アレイにおいて、前記基体が基板であり、基板には一定の区画内に複数のスポットが設けられており、各スポットにプライマーが固定化されていることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長用アレイ。
【請求項２１】
請求項１５に記載のＤＮＡ鎖伸長用アレイにおいて、前記基体が複数のウェルを有するマイクロタイタープレート状基板であり、ウェル表面にプライマーが固定化されていることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長用アレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プライマーＤＮＡ鎖を所定の基体表面に固定化してＤＮＡ鎖を伸長するＤＮＡ鎖伸長方法およびＤＮＡ鎖伸長用アレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
非特許文献１には、所定のアミノ−シラン試薬を用いて修飾されたガラス基板の表面に、プライマーとなるＤＮＡ鎖を共有結合させたＤＮＡマイクロアレイにて固相ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）によるＤＮＡ増幅を行う技術が開示されている。
【０００３】
また、非特許文献２には、ガラス基板の代わりにポリ（メチルメタクリレート）を用いて、表面にＤＮＡ断片を固定化させたＤＮＡマイクロアレイを用いて、所定のＤＮＡ鎖とのハイブリッド特性およびＰＣＲ様環境下における熱安定性が評価されており、新規のＰＣＲ技術に適用できるデバイスの可能性を示唆する記載がなされている。
【非特許文献１】Adessi, Celine et al, “Solid phase DNA amplification: Characterisation of primer attachment and amplification mechanisms”, Nucleic Acids Research, 2000, Vol. 20, No. 20, e87
【非特許文献２】Fixe, F. et al, “Functionalization of poly(methyl methacrylate) (PMMA) as a substrate for DNA microarrays”, Nucleic Acids Research, 2004, January 12, Vol. 32, No.1, e9
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者等は、非特許文献１，２などに代表される様々なＤＮＡマイクロアレイを用いてＭＰＥＣ法（Multiple Primer Extension on a Chip）によるＤＮＡ鎖伸長反応を行ったところ、ＤＮＡの伸長反応効率が低いこと、ＤＮＡ鎖を伸長させた後に、熱変性処理を行うと鋳型ＤＮＡと共にDNAマイクロアレイ基板に固定したプライマーが脱落するという問題点を見出し、表面に親水性の高分子物質を配した基体を用いることでこの問題を解決して本発明の完成に至った。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明に係るＤＮＡ鎖伸長方法は、親水性ポリマー及びＤＮＡを固定する官能基を表面に有する基体に、ＤＮＡ伸長用のプライマーを固定化させ、所望する配列を有する鋳型ＤＮＡ断片を含む試料が導入された反応系を、必要に応じてＤＮＡ鎖を熱変性する温度まで引き上げた後、アニール処理温度にてＤＮＡ鎖の伸長反応を行うことを特徴としている。
【０００６】
即ち、本発明は、
（１）親水性ポリマー成分及びＤＮＡ鎖を固定化する官能基を表面に有する基体表面に、ＤＮＡ伸長用のプライマーを固定化し、所望する配列を有する鋳型となる核酸鎖、ヌクレオチドモノマー、およびＤＮＡ伸長酵素を含む溶液を上記基体表面に供給し、必要に応じてＤＮＡ鎖を熱変性する温度まで引き上げる処理を行った後、アニール処理する温度で、プライマーＤＮＡ鎖の伸長反応を行うことを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法、
（２）前期親水性ポリマー及びＤＮＡ鎖を固定する官能基が、網の目状に絡み合ったマトリックスを構成していることを特徴とする（１）のＤＮＡ鎖伸長方法、
（３）（１）記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、ＤＮＡ鎖を固定化する官能基がアミノ基と反応する官能基であり、プライマーＤＮＡ鎖の５’末端にアミノ基を導入し、該アミノ基と官能基が反応し結合することによってプライマーが固定化されていることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法、
（４）（３）記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、アミノ基と反応する官能基が活性エステル基であるＤＮＡ鎖伸長方法、
（５）（１）記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、前記鋳型となる核酸鎖が、ＤＮＡ又は
ＲＮＡであるＤＮＡ鎖の伸長方法、
（６）（１）に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、前記鋳型となる核酸鎖は、所定のＲＮＡを逆転写酵素で処理して得られるｃＤＮＡ断片であることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法、
（７）（１）記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、所望する配列を有する鋳型となる核酸鎖、ヌクレオチドモノマー、及びＤＮＡ伸長酵素を含む溶液を、予めＤＮＡ鎖を熱変性する温度まで引き上げる処理を行うことを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法、
（８）（１）に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、前記ＤＮＡ鎖伸長反応は、前記反応系の温度を、前記アニール処理温度から前記熱変性処理温度まで徐々に上昇させて行われることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法、
（９）（１）に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、前記ＤＮＡ鎖伸長反応は、前記反応系の温度を、前記アニール処理温度と前記熱変性処理温度との間の所定の温度に変化させて行われることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法、
（１０）（１）に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、前記プライマーは、所定の着目遺伝子の特徴配列を含む塩基配列の一塩基を他の塩基に置き換えたＤＮＡ断片鎖であることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法、
（１１）（１）に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、前記プライマーは所定数の塩基配列からなり、各々のプライマーは全組合せのそれぞれの配列を有するＤＮＡ断片であることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法、
（１２）（１）に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、前記ヌクレオチドモノマーの少なくとも一種がラベルされたものであることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法、
（１３）（１）に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、前記基体が、シリコン、ガラス、金属、グラファイト、又はプラスチック材料からなることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長方法、
（１４）（１）に記載のＤＮＡ鎖伸長方法において、基体形状がスライドガラス状、マイクロタイタープレート状又は容器状であるＤＮＡ鎖の伸長方法、
（１５）親水性ポリマー成分及びＤＮＡ鎖を固定化する官能基を表面に有する基体表面に、ＤＮＡ伸長用のプライマーを固定化したＤＮＡ鎖伸長用アレイ、
（１６）（１５）に記載のＤＮＡ鎖伸長用アレイにおいて、上記親水性ポリマーおよびＤＮＡ鎖を固定する官能基が、網の目状に絡み合ったマトリックスを構成していることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長用アレイ、
（１７）（１５）に記載のＤＮＡ鎖伸長用アレイにおいて、前記基体が、シリコン、ガラス、金属、グラファイト、又はプラスチック材料からなることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長用アレイ、
（１８）（１５）に記載のＤＮＡ鎖伸長用アレイにおいて、前記プライマーは、５〜５０個の塩基配列からなることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長用マイクロアレイ、
（１９）（１５）に記載のＤＮＡ鎖伸長用アレイにおいて、前記プライマーが、前記基体表面のＤＮＡ鎖を固定化する官能基と共有結合して、基体表面に固定化されることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長用アレイ、
（２０）（１５）に記載のＤＮＡ鎖伸長用アレイにおいて、前記基体が基板であり、基板には一定の区画内に複数のスポットが設けられており、各スポットにプライマーが固定化されていることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長用アレイ、
（２１）（１５）に記載のＤＮＡ鎖伸長用アレイにおいて、前記基体が複数のウェルを有するマイクロタイタープレート状基板であり、ウェル表面にプライマーが固定化されていることを特徴とするＤＮＡ鎖伸長用アレイ、
である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、ＤＮＡマイクロアレイ上でＤＮＡ鎖の伸長反応効率が高く、かつ反応を行って二本鎖にした後に、熱変性処理にてＤＮＡマイクロアレイの基板上で一本鎖ＤＮＡを残すことができるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【０００９】
（第一の実施形態）
図１は、第一の実施形態としてのＤＮＡ鎖増幅方法の手順を示すフローチャートである。このＤＮＡ鎖増幅方法は、親水性ポリマー及びＤＮＡを固定化する官能基を表面に有する基体に、ＤＮＡ伸長用のプライマー（以下、「プライマー」という）を固定化させ（ステップＳ１０）、所望する配列を有する鋳型となる核酸鎖、ヌクレオチドモノマー、およびＤＮＡ伸長酵素を含む試料が導入された反応系を、ＤＮＡ鎖を必要に応じて熱変性する温度まで引き上げ（ステップＳ３０）、この反応系の温度をアニール処理する温度まで下げ（ステップＳ４０）、当該反応系でＤＮＡ鎖の伸長反応を行い（ステップＳ５０）、ＤＮＡ鎖の熱変性処理を行って（ステップＳ６０）、必要に応じてＤＮＡ鎖のアニール処理、伸長反応および熱変性処理を行う（ステップＳ４０〜ステップＳ６０の繰り返し）ものである。
鋳型となる核酸鎖、ヌクレオチドモノマーおよびＤＮＡ伸長酵素を含む溶液を調製後、熱変性処理まで加温してから基体表面に溶液を供給しても良く、この場合は、溶液を基体表面に供給したすぐ後の熱変性温度までの温度の引き上げは不要となる。
ステップＳ１０では、図２に示したように、基板１２の表面にＤＮＡ伸長用のプライマー１４を固定させる。
【００１０】
ここで使用される基体に表面には、親水性ポリマー成分、及びＤＮＡ鎖を固定化させるための官能基が存在するようになっている。親水性ポリマー成分およびＤＮＡ鎖を固定化させる官能基は、親水性ポリマー成分が互いに架橋しあうことにより、渾然一体となるマトリックスを形成し、マトリックス内にＤＮＡ鎖を固定化する官能基が一様に導入されている構造をとることが望ましい。マトリックスを形成することにより、基体表面の親水性環境を一様に保つことが出来、ＤＮＡ伸長反応環境バラつきを抑制することが出来る。
【００１１】
親水性ポリマー成分はＤＮＡ鎖の非特異的吸着の抑制および、ＤＮＡ鎖伸長反応におけるＤＮＡ伸長酵素の吸着を抑制することにより、ＤＮＡ伸長酵素のＤＮＡ鎖伸長反応に適した環境を提供する役割を果たす。
【００１２】
次に、ＤＮＡ鎖を固定化する官能基について記載する。
【００１３】
本発明のＤＮＡ鎖伸長方法におけるプライマーの固定化は、プライマーＤＮＡ鎖の５’末端に固定化のための官能基を導入し、上記ＤＮＡ鎖を固定化する官能基と結合させ固定化する。その際、ＤＮＡ鎖の末端に導入する官能基としては、アミノ基、チオール基、活性エステル基、ビオチン等が挙げられるが、導入のし易さおよび結合の安定性からアミノ基の導入が好適であり、ＤＮＡ鎖を固定化する官能基としてアミノ基と反応する官能基が好適となる。アミノ基と反応する官能基としては、アルデヒド基、活性エステル基等が挙げられるが、活性エステル基が好ましい。活性エステル基は、カルボン酸のカルボキシル基が活性化されたものであり、Ｃ＝Ｏを介して脱離基を有するカルボン酸である。活性化されたカルボン酸誘導体としては、たとえば、カルボン酸であるアクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸などのカルボキシル基が、酸無水物、酸ハロゲン化物、活性エステル、活性化アミドに変換された化合物が挙げられる。カルボン酸誘導基は、こうした化合物に由来する活性化された基であり、たとえば、ｐ−ニトロフェニル基やＮ−ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基、−Ｃｌ、−Ｆ等のハロゲン等の基を有するものが挙げられる。
【００１４】
ＤＮＡ鎖を固定化する官能基は、親水性ポリマー構造の主鎖又は側鎖に有していても良い。
【００１５】
本発明に使用する親水性ポリマーとしては、親水性基を主鎖又は側鎖に有する高分子物質が挙げられ、ポリアルキレンオキシド、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポリアクリルアミド、及びこれらの共重合体のいずれかを構造中に含むものであることが好ましい。特にポリアクリルアミドは、ＮＮ‘―メチレンビスアクリルアミド等の架橋成分の添加や光架橋性化合物等で３次元架橋することにより、網目構造形成させマトリックスを有するポリアクリルアミドゲルを形成することが出来る。
【００１６】
基体の形状は、特に制限はいが、スライドガラスに代表される基板、複数のウェルを有するマイクロタイタープレート、ＰＣＲに使用する容器等が上げられる。アレイの作製においては、スライドガラス状の基板やマイクロタイタープレートが好適である。
【００１７】
次に、基体の表面へのプライマーの固定化方法について、基体形状が基板であり、ＤＮＡ鎖を固定化する官能基がアミノ基と反応する官能基の場合を例に説明する。
例えば、（ｉ）基板上の表面に存在する、又は親水性ポリマーに含まれるアミノ基と反応する官能基のうち、少なくとも一部のアミノ基と反応する官能基とプライマーとを反応させて共有結合を形成させることにより、基体表面でプライマーを固定化し、続いて（ｉｉ）プライマーを固定化した以外の基板表面のアミノ基と反応する官能基を不活性化する、すなわち残りのアミノ基と反応する官能基を不活性化することにより、プライマーを基体の表面に固定することができる。以下、それぞれの工程について説明する。
【００１８】
上記工程（ｉ）において、鋳型ＤＮＡ断片とアニールするプライマーを基体上に固定化する際には、プライマーを溶解または分散した液体を点着する方法が好ましい。基板上の表面に存在する、又は親水性ポリマーに含まれるアミノ基と反応する官能基の一部がプライマーと反応して、プライマーの間で共有結合が形成される。
【００１９】
このプライマーを溶解または分散した液体は、例えば中性からアルカリ性、例えばｐＨが７．６以上とすることができる。
【００２０】
また、点着後、基板表面に固定化されなかったプライマーを除去するため、純水や緩衝液で洗浄してもよい。
【００２１】
また、上記工程（ｉｉ）に示したように、洗浄後はプライマーを固定化した以外の基板表面のアミノ基と反応する官能基の不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行うことができる。
【００２２】
以上により、図２に示したような基板１２の表面上にプライマー１４が固定化されたＤＮＡマイクロアレイ１０が得られる。
【００２３】
図１に戻り、ステップＳ２０では、ステップＳ１０で得られるＤＮＡマイクロアレイ１０の基板１２の表面に固定化されたプライマー１４にアニールさせるＤＮＡ伸長用の鋳型ＤＮＡ断片１６及びヌクレオチドモノマーを含むサンプルが導入される。
【００２４】
この導入されたサンプルからなる反応系としては、耐熱性細菌に由来するＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡ伸長酵素存在下で、ヌクレオチドモノマー（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰなど）を含有するＭＰＥＣ用バッファが挙げられる。
【００２５】
また、これらヌクレオチドモノマーの少なくとも一種をラベルしておくことができる。例えば、ｄＴＴＰの塩基の３位を蛍光ラベルしたＣｙ３−ｄＵＴＰをヌクレオチドモノマーとして用いることで、鋳型ＤＮＡ断片のアデニン（Ａ）に対応する伸長（プライマー）側の位置にＣｙ３−ｄＵＴＰが挿入される。これにより、伸長反応が生じたプライマーから形成されるＤＮＡ断片がＣｙ３−ｄＵＴＰで蛍光染色されて、このＤＮＡ断片の検出を行うことができるようになる。
【００２６】
なお、他のヌクレオチドモノマーをラベルしてもよく、また複数の種類のヌクレオチドモノマーをラベルしてもよい。また、ラベル方法も蛍光体の導入の他に、光吸収体の導入の方法、放射線ラベルの方法（P32-ATP、P32-ｄATP）、酵素標識などの非放射性ラベルの方法などによってもＤＮＡ鎖を検出することができる。
【００２７】
この酵素標識の方法においては、ビオチン（biotin）化またはジゴキシゲニン（ＤＩＧ：ステロイド系天然物）を結合した核酸（例えば、biotin-dUTP、DIG-dUTP）を使用してプライマーを伸張させた後、蛍光標識化したアルカリフォスファターゼまたはアルカリフォスファターゼ処理しニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）液中で数時間反応させることによってＤＮＡを検出することができる。
【００２８】
ステップＳ３０では、サンプルが導入された反応系の温度を、ＤＮＡ鎖の熱変性温度（melting temperature：Ｔｍ）以上、例えば９０℃〜９５℃まで上昇させる。この熱変性処理により、自己相補鎖などで見られる折れたたみ構造を有する鋳型ＤＮＡ断片やプライマーが直鎖状の一本鎖になる。
【００２９】
続いて、ステップＳ４０では、反応系の温度をプライマーと鋳型ＤＮＡ断片とがアニールする温度（アニール温度）、例えば４℃〜６５℃、好ましくは５０℃〜６５℃まで下降させる。このアニール処理により、鋳型ＤＮＡ断片の一部と相補的な配列を有するプライマーと、この鋳型ＤＮＡ断片とが二本鎖になる（図３）。
【００３０】
ステップＳ５０では、アニール処理を行った反応系の温度を、前記アニール処理温度から前記熱変性処理温度まで徐々に上昇させるよう制御する。あるいは、当該反応系の温度を、前記アニール処理温度と前記熱変性処理温度との間の所定の温度、例えば６５℃〜７５℃に変化させるように制御する。このように反応系の温度を制御することにより、ＭＰＥＣ法によるＤＮＡ鎖の伸長反応が起こる、すなわち鋳型ＤＮＡ断片１６に相補的なＤＮＡ断片が、基板上に形成され、ＤＮＡの二本鎖が得られるようになる（図４）。
【００３１】
図１に戻り、ステップＳ６０では、伸長反応後の反応系を、ＤＮＡ鎖の熱変性温度、例えば９０℃〜９５℃で維持する。この熱変性処理により、基板１２の表面では二本鎖ＤＮＡから鋳型ＤＮＡ断片１６（図４）が脱離して、一本鎖ＤＮＡ断片１８が残された状態になる（図５）。
【００３２】
ステップＳ７０では、次の伸長反応を行うか否かが判別される。この判別は、温度調整装置（サーモサイクラー）などを用いて反応回数を指定してその回数に達したか否かを自動で行ってもよいし、毎回操作者の判断によって行ってもよい。
【００３３】
この判別結果がＹＥＳ、すなわち次の伸長反応を行う場合にはステップＳ４０に戻り、アニール処理（ステップＳ４０）−伸長反応（ステップＳ５０）−熱変性処理（ステップＳ６０）が繰り返され、未反応のプライマーでＤＮＡ伸長反応が行われる。このサイクルを１〜５０回繰り返す結果、基板上でＭＰＥＣ法によるＤＮＡ鎖増幅が行われる。
【００３４】
また、ステップＳ７０での判別結果がＮＯ、すなわち次の伸長反応を行わない場合には、ステップＳ８０に進み、反応液を捨てて、ＤＮＡマイクロアレイを、例えば０．１ｗｔ％のＳＤＳ溶液を用いて洗浄して、終了する。
【００３５】
このＤＮＡ鎖増幅のためには、基板上の一定の区画内に複数のスポットを設けておき、各スポットにプライマーを固定化しておき、マイクロアレイを形成しておくことが好ましい。
【００３６】
また、基板の表面に固定化させるＤＮＡ増幅用プライマーの長さを目的や用途に応じて任意に決定することができ、例えば５〜５０塩基とすることができる。
【００３７】
（第二の実施形態）
図６は、第二の実施形態としてのＤＮＡ鎖伸長方法の手順を示すフローチャートである。図６において、図１と手順が同様な部分については、図１と同様の符号を付して、説明を省略する。
【００３８】
このＤＮＡ鎖伸長方法は、親水性ポリマー成分、及びアミノ基と反応する官能基を表面に有する基板に、ＤＮＡ伸長用のプライマー（以下、「プライマー」という）を固定化させ（ステップＳ１０）、所望する配列を有する鋳型となる核酸鎖、ＤＮＡ又はＲＮＡ断片、ヌクレオチドモノマーおよびＤＮＡ伸長酵素を含む試料が導入された反応系を、ＤＮＡ鎖を熱変性する温度まで引き上げ（ステップＳ３０）、この反応系の温度をアニール処理する温度まで下げ（ステップＳ４０）、この反応系でＤＮＡ鎖の伸長反応を行う（ステップＳ５０）ものである。
【００３９】
ステップ３０の熱変性処理は、サンプル導入（ステップ２０）前に、予め鋳型となるＤＮＡ又はＲＮＡ断片、ヌクレオチドモノマーおよびＤＮＡ伸長酵素を含む試料溶液を、熱変性処理温度で加温した場合、ステップ３０の熱変性処理は省略することが出来る。
【００４０】
前述したように、ステップＳ２０では、基板の表面に固定化されたプライマーにアニールさせるＤＮＡ伸長用の鋳型となる核酸鎖を含むサンプルを導入し、このサンプルおよびこのサンプルが導入されてなる反応系は、前述したのと同様のものを適用することができる。
【００４１】
また、ステップＳ５０での伸長反応の後に、ステップＳ５５にて反応液を捨てて、ＤＮＡマイクロアレイを、例えば０．１ｗｔ％のＳＤＳ溶液を用いて洗浄して、終了する。
【００４２】
以下に、本実施形態のＤＮＡ鎖伸長方法の適用例について説明する。
【００４３】
（ＳＮＰ解析）
所定の着目遺伝子の特徴配列を含む塩基配列と相補的な配列を完全マッチ配列とするとき、プライマーをこの完全マッチ配列の一塩基を他の塩基に置き換えることで、ＳＮＰ解析を行うことが可能になる。なお、プライマーは２５塩基以内の長さを有するものを用いることが好ましい。
【００４４】
すなわち、ステップＳ１０にて、ある着目遺伝子の特徴配列と一塩基だけミスマッチとなるＤＮＡ断片をプライマーとして基板の表面に固定化する。このとき、例えば３８４穴（各穴２５６スポット）、９６穴（各穴１０２４スポット）のマイクロアレイを用いて、各スポットに固定化されたプライマーの配列を把握しておくようにする。ステップＳ２０にて、この特徴配列を含むＤＮＡ鎖を鋳型ＤＮＡ断片として用いてサンプル導入を行い、ステップＳ３０にて熱変性処理を行って、ステップＳ４０ではアニール処理を行う。ステップＳ５０では、アニール処理により鋳型ＤＮＡ鎖断片と二本鎖を形成したプライマーにだけ伸長反応が起こる。
【００４５】
また、前述したようにステップＳ２０にて導入されるサンプル中にラベルされたヌクレオチドモノマーを含めておくことで、プライマーから伸長反応により得られるＤＮＡ断片がラベルされ、ステップＳ５５で洗浄後の基板に残った蛍光ＤＮＡ断片を含むスポットの検出を行い、各アレイに固定化されたプライマーの配列が把握されていることから、検出されたスポットに固定化されたプライマーの配列を知ることができる。これにより、伸長反応が起こったプライマーの塩基配列がわかり、前記着目遺伝子の特徴配列を含む鋳型ＤＮＡ断片に対する一塩基多型を解析することが可能になる。
【００４６】
すなわち、ステップＳ１０にて前記の各プライマーをマイクロアレイの各スポットにそれぞれ固定化する。このとき、各スポットに固定化されたプライマーの配列を把握しておくようにする。ステップＳ２０にて、未知の塩基配列のＤＮＡ断片を鋳型ＤＮＡ断片として用いてサンプル導入を行い、ステップＳ３０にて熱変性処理を行って、ステップＳ４０ではアニール処理を行う。ステップＳ５０では、アニール処理により鋳型ＤＮＡ鎖断片と二本鎖を形成したプライマーにだけ伸長反応が起こる。
【００４７】
また、前述したようにステップＳ２０にて導入されるサンプル中にラベルされたヌクレオチドモノマーを含めておくことで、プライマーから伸長反応により得られるＤＮＡ断片がラベルされ、ステップＳ５５で洗浄後の基板に残った蛍光ＤＮＡ断片を含むスポットの検出を行い、各アレイに固定化されたプライマーの配列が把握されていることから、検出されたスポットに固定化されたプライマーの配列を知ることができる。これにより、伸長反応が起こったプライマーの塩基配列がわかる。
【００４８】
ここで、図７に示したように、基板４１上で伸長反応が起こったスポットを検出した後、検出されたスポットに固定化されているプライマーのランダム配列群４５の各配列を取り出し、配列の前後で一塩基ずらしてオーバーラップするように順番付けして順番付け配列群４７が得られる。この順番付け配列群４７に示された順番にしたがって、各プライマーの先頭の塩基を読んで行き、最後のプライマーについては全塩基配列を読んで得られる塩基配列に基づいて、未知の塩基配列４３を有する鋳型ＤＮＡ断片の塩基配列４９を決定することができる。
【００４９】
なお、プライマーが６塩基長の場合は４０９６種類のプライマーを用意する必要があり、プライマーが７塩基長の場合は１６３８４種類のプライマーを用意する必要がある。これらのプライマーは、機能未知（ｎｃ）ＲＮＡおよびマイクロ（ｍｉ）ＲＮＡなどの２０ｍｅｒ〜５０ｍｅｒの比較的小分子の探索、遺伝子配列解析に用いることができる。
【００５０】
また、プライマーが８塩基長の場合は６５５３６種類のプライマーを用意する必要があり、プライマーが９塩基長の場合および１０塩基長の場合は、それぞれ２６２１４４および１０４８５７６種類のプライマーを用意する必要がある。これらのプライマーは、通常の遺伝子配列解析に用いることができる。
【００５１】
（遺伝子発現プロファイル解析）
図８は、遺伝子発現プロファイル用サンプルとして、ラベルを導入したサンプルを調整および発現プロファイル解析するための従来の方法を示す。
【００５２】
目的に応じた生体組織から全ＲＮＡ（totalＲＮＡ）を抽出する。さらに全ＲＮＡからは逆転写反応によって、ｃＤＮＡを合成する（第一鎖合成）。逆転写反応の際にはｄＮＴＰとアミノアリルｄＵＴＰを一定の割合で混合したものを加えて、アミノアリルｄＵＴＰを取り込んだｃＤＮＡを合成する。
【００５３】
なお、組織から得た全RNA量が少ない場合は、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した後、2本鎖のｃＤＮＡ（転写鋳型ＤＮＡ断片）を合成し（第二鎖合成）、それを鋳型としてアンチセンス鎖のＲＮＡ（ａＲＮＡ）を増幅する。このＲＮＡ増幅の際にｄＮＴＰとアミノアリルｄＵＴＰとを一定の割合で混合したものを加えることで、アミノアリルｄＵＴＰを取り込んだａＲＮＡを合成することができる。
【００５４】
続いて、上記のｃＤＮＡまたはアンチセンスアミノアリルＲＮＡ（ａＲＮＡ）をエタノール沈殿した後、０．２Ｍ炭酸ナトリウムバッファー（NaHCO3?Na2CO3（pH9．0））に溶解する。ＤＭＳＯに溶解しておいた蛍光色素（Ｃｙ３またはＣｙ５）を加えて、常法に従い、ｃＤＮＡまたはａＲＮＡに取り込ませておいたアミノアリルｄＵＴＰとカップリング反応させ、ｃＤＮＡまたはａＲＮＡを蛍光標識する。遊離の蛍光色素をゲルろ過カラムまたはフィルターなどを用い常法の精製により除去した後、ａＲＮＡについてはさらにフラグメンテーションバッファー（終濃度０．０４Ｍ酢酸トリアミノメタン（ｐＨ８．１）、０．１Ｍ酢酸カリウム、０．０３Ｍ酢酸マグネシウム）を加えて９５℃で１５分間反応後、クラッシュアイスで急冷してａＲＮＡを断片化する。ゲル電気泳動などの方法によりフラグメント化を確認した後、ゲルろ過フィルターで精製・濃縮する。
【００５５】
次に、調製したｃＤＮＡまたはａＲＮＡとマイクロアレイのプライマーとのハイブリダイゼーションを行う。ｃＤＮＡまたはａＲＮＡにハイブリダイゼーションバッファー（最終濃度５×ＳＳＣ、０．５（ｖ／ｖ）％ＳＤＳ、４×Denhardt’s solution）及びホルムアミド（Formamide）を適宜混合し、ＤＮＡマイクロアレイと４５℃〜６０℃で一晩ハイブリダイゼーションする。ハイブリダイゼーション後、２×ＳＳＣ?０．１（ｖ／ｖ）％ＳＤＳ溶液、２×ＳＳＣ溶液、１×ＳＳＣ溶液で５分間ずつ洗浄したのち、蛍光読取装置(例えば、CRBIO(R) IIe；日立ソフトウエアーエンジニアリング製)を用いて画像をスキャンし、解析ソフト（例えば、DNASIS(R)Array；日立ソフトウエアーエンジニアリング製）を用いてシグナル強度を定量化する。
なお、図８においては、ａＲＮＡの合成を示しているが、途中の工程で得られるｃＤＮＡが解析に十分な量であれば、このｃＤＮＡを直接解析してもよい。
【００５６】
この方法では、複雑な前処理工程を行うため、それぞれの試料で条件選定など設定条件が多くなる上に、全工程で少なくとも５日〜一週間はかかってしまうのが迅速な遺伝子検査の上で問題であった。
【００５７】
そこで、本実施形態では、全ＲＮＡからｃＤＮＡを得る第一鎖合成を行った後に、図１のステップＳ１０と同様の方法にて基板の表面に、解析対象となる遺伝子の特徴配列に相当する塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いて、各々のプライマーをマイクロアレイのひとつのスポットに固定化させ、第一鎖合成により得られるｃＤＮＡ（または必要に応じて増幅させて得られるａＲＮＡ）を鋳型ＤＮＡ断片として用いて、発現遺伝子を特定することが可能になる。
【００５８】
すなわち、既知の遺伝子が有する特徴配列と相補的な塩基配列を有するプローブが、特定の細胞由来の全ＲＮＡから得られる鋳型ＤＮＡ断片中に存在するか否かが分かる。
【００５９】
すなわち、ステップＳ１０にて前記の各プライマーをマイクロアレイの各スポットにそれぞれ固定化する。このとき、各スポットに固定化されたプライマーの配列を把握しておくようにする。ステップＳ２０にて、前述したようにして得られる所定の全ＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡ断片として用いてサンプル導入を行い、ステップＳ３０にて熱変性処理を行って、ステップＳ４０ではアニール処理を行う。ステップＳ５０では、アニール処理により鋳型ＤＮＡ鎖断片と二本鎖を形成したプライマーにだけ伸長反応が起こる。
【００６０】
また、前述したようにステップＳ２０にて導入されるサンプル中にラベルされたヌクレオチドモノマーを含めておくことで、プライマーから伸長反応により得られるＤＮＡ断片がラベルされ、ステップＳ５５で洗浄後の基板に残った蛍光ＤＮＡ断片を含むスポットの検出を行い、各アレイに固定化されたプライマーの配列が把握されていることから、検出されたスポットに固定化されたプライマーの配列を知ることができる。これにより、伸長反応が起こったプライマーの塩基配列がわかり、全ＲＮＡがどの遺伝子から発現されて得られたものであるか、すなわち遺伝子発現プロファイルを解析することが可能になる。
【００６１】
この方法によれば、遺伝子発現プロファイル（gene expression profile）解析を、通常の解析において手間と時間がかかるサンプル調製をほとんど行うことなく、ゲノムＤＮＡ又は全ＲＮＡからの逆転写産物ｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡ断片として用い簡便な操作で行うことができるようになる。
【００６２】
以上の用途のほかには、
マイクロサテライト解析、染色体異常解析（ＣＧＨ：Comparative Genomic Hybridization）、機能未知（ｎｃ）ＲＮＡ探索などの遺伝子解析用基本ツールへの適用；
これらツールを使用した臓器・疾患別遺伝子発現解析チップ、変異原性試験キット（環境ホルモン）、遺伝子組換え食品検査キット、ミトコンドリア遺伝子配列解析キット、親子鑑定・犯罪捜査のための解析キット、先天性疾患解析キット、染色体・遺伝子異常解析キット、遺伝子診断（着床前・出生前）キット、薬物反応関連遺伝子多型解析キット、脂質代謝関連遺伝子多型解析キット、耳鼻科・眼科領域遺伝子多型解析キットなどの用途別カスタムチップへの適用；
ガン予後予測チップ、医薬品開発（臨床・創薬）用チップ、健康食品開発用チップなどの診断・臨床用カスタムチップへの適用；
【００６３】
微生物限度試験や食品飲料水中の微生物検査などの薬品・食品製造工程、およびう蝕・歯周病関連菌の検出、日和見感染菌の検出などの歯科領域の臨床検査、および食品工場・厨房施設環境検査、飲料・公衆浴場、井戸水などの水質検査における環境検査、および感染症・食中毒の予防、会社従業員の衛生管理などの保健衛生、および耐性菌を含む一般細菌同定、肝炎ウイルス、ヘリコバクターピロリ、肝炎クラミジア菌、エイズウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ウエストナイルウイルス、ノロウイルス（生カキ由来の食中毒）、インフルエンザウイルス、真菌・カビなどの臨床検査などの微生物同定検査キットへの適用などが挙げられる。
【実施例】
【００６４】
（実験例１）
以下の手法にて、プライマーを、本実施形態に対応するガラス基板、および従来の基板に対応するアルデヒド基板の各基板の表面に固定化して、各基板上でＤＮＡ鎖伸長反応を行って、プライマーのＤＮＡ鎖伸長反応を検出した。
【００６５】
（ガラス基板の作成）
市販のCodeLinkTM Activated Slides(Amersham Bioscience, GE Healthcare) を用いた。本基板は、ガラス基板表面に親水性ポリマーとしてポリアクリルアミドの３次元構造を有する層、及び活性エステル基を有しているものである。
【００６６】
（アルデヒド基板の作成）
市販のスライドガラス基板に、アミノアルキルシランとしてγ−アミノプロピルトリエトキシシランをメタノール中に５容量％（Ｖ／Ｖ％）の濃度で溶解させたものをアミノ基導入処理液として調製し、この溶液の中に２時間浸漬の後、基板を溶液から取り出し、超純水中に浸漬し放置後基板を取り出し乾燥した。グルタルアルデヒドをＰＢＳ（−）中に２容量％（Ｖ／Ｖ％）の濃度で溶解させてグルタルアルデヒド溶液を調製し、アミノアルキルシラン処理を行った基板をグルタルアルデヒド溶液中に浸漬し、４時間放置した後、基板を取り出して超純水中に浸漬し、洗浄乾燥した。これにより、表面にアルデヒド基を有するアルデヒド基板が得られた。
【００６７】
（プライマー固定）
５’末端がアミノ基で修飾されたオリゴＤＮＡ（２０塩基鎖）を０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）を用いて溶解し、１０μＭのオリゴＤＮＡ溶液を調製した。この溶液をスポッタ（日立ソフトウェアーエンジニアリング製Marks-I）を用い、１００μｍ径クロスカットピンでガラス基板、およびアルデヒド基板の表面上に、それぞれスポットした。オリゴＤＮＡをスポットした各基板を、２００μｌの０．２５Ｍリン酸バッファ（ｐＨ８．５）で内部を湿らせた密閉容器（１０ｃｍ×１５ｃｍ×３ｃｍ）中で一昼夜浸して、オリゴＤＮＡ（プライマー）を固定化させた。
【００６８】
（ＤＮＡ鎖伸長反応）
図６のステップＳ２０で導入する鋳型ＤＮＡ断片として、所定の５０ｍｅｒの、予め５’末端をＣｙ５にて標識したＤＮＡ断片を用いて、鋳型ＤＮＡ断片の濃度が１００ｐＭとなるような反応系とした。
【００６９】
続いて、図６のステップＳ３０の熱変性処理、ステップＳ４０のアニール処理、ステップＳ５０の伸長反応をそれぞれ９５℃５分（変性）−９５℃１分（変性）−５０℃３分（アニール）−９５℃１分（変性）とした。
【００７０】
以下、サンプル中にＣｙ３−ｄＵＴＰを含めておいて各基板において行ったＤＮＡ鎖伸長反応検出におけるＣｙ３−ｄＵＴＰ由来の蛍光強度を測定した結果を以下に示す。
【００７１】
【表１】
2007330104.tif 000003
【００７２】
本実施形態に対応するガラス基板では、基板上でのＤＮＡ鎖伸長が検出された一方で、従来の基板に対応するアルデヒド基板ではＤＮＡ鎖伸長は検出されていないと考えられる。
【００７３】
（実験例２）
実験例１でＤＮＡ鎖伸長が検出されたガラス基板を用いて、２０ｍｅｒ、２５ｍｅｒ、３０ｍｅｒの各プローブについてＭＰＥＣ法によるＤＮＡ鎖伸長を１サイクル、５サイクル、１０サイクル、２０サイクルで行って、ＤＮＡ鎖増幅反応を行って、各区切りのサイクル終了後に蛍光強度を測定した。
【００７４】
なお、図１のステップＳ３０の熱変性処理、ステップＳ４０のアニール処理、ステップＳ５０の伸長反応、ステップＳ６０の熱変性処理をそれぞれ９５℃５分（変性；初回のみ）−９５℃１分（変性）−５０℃３分（アニール）−９５℃１分（変性）とした。
以下に、結果を示す。
【００７５】
【表２】
2007330104.tif 000004
【００７６】
コントロール実験としての「blank」（プローブを使用しない場合）と比較して、いずれの長さのプローブであってもＤＮＡ鎖増幅が検出された。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】本発明の第一の実施形態に係るＤＮＡ鎖増幅方法を示すフローチャートである。
【図２】前記第一の実施形態で用いるＤＮＡマイクロアレイの一部を模式的に示す図である。
【図３】前記ＤＮＡマイクロアレイのプライマーに鋳型ＤＮＡをアニールさせた状態を示す図である。
【図４】前記プライマー上でＤＮＡ鎖の伸長反応を行った状態を示す図である。
【図５】前記伸長反応後得られた二本鎖を変性した状態を示す図である。
【図６】本発明の第二の実施形態に係るＤＮＡ鎖伸長方法を示すフローチャートである。
【図７】前記第二の実施形態の一適用例を示す図である。
【図８】従来の遺伝子発現プロファイル用サンプルを調製する例を示す図である。
【符号の説明】
【００７８】
１０  ＤＮＡマイクロアレイ
１２  基板
１４  プライマー
１６  鋳型ＤＮＡ断片
１８  一本鎖ＤＮＡ断片
４１  基板
４３  未知の塩基配列
４５  プライマーのランダム配列群
４７  順番付け配列群
４９  ＤＮＡ断片の塩基配列
【図１】
2007330104.tif 000005
【図２】
2007330104.tif 000006
【図３】
2007330104.tif 000007
【図４】
2007330104.tif 000008
【図５】
2007330104.tif 000009
【図６】
2007330104.tif 000010
【図７】
2007330104.tif 000011
【図８】
2007330104.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成19年2月20日(2007.2.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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