(57)【要約】      （修正有）【課題】化学反応、増幅および検出のための装置、特にポリメラーゼ連鎖反応、増幅および検出を行なうためのシステムの提供。【解決手段】１または複数のチャンバモジュールを含み、各モジュールでは生物学的試料の二重検定が実施可能である携帯型ポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システム。各モジュールは、線形光学システムを備えた２つの平行に設けられた検査用ポートを有し、スリーブ型反応チャンバを通して冷却用空気を強制的に通気させ前記生物学的試料を冷却することを含ポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出方法。【選択図】図１
2007089591.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重検定を行ない得る試料チャンバモジュール内に生物学的試料を挿入するステップ、および前記試料チャンバモジュールに動作可能に結合した平行に設けられた検査用ポートを通して前記生物学的試料に光エネルギーを向けるステップを含むポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出方法。
【請求項２】
前記試料をシリコンベース内の加熱ユニットを用いて加熱するステップ、および前記試料を冷却するステップを含む、請求項１に記載のポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出方法。
【請求項３】
スリーブ型反応チャンバを通して冷却用空気を強制的に通気させ前記生物学的試料を冷却することを含む、請求項２に記載のポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出方法。
【請求項４】
前記試料チャンバモジュールが個別の試料チャンバを含み、さらに試料チャンバを前記生物学的試料が可及的速やかに所望の温度に達してそれを維持するように一時的に過熱するステップを含む、請求項１に記載のポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
米国政府は、米国エネルギー省とカリフォルニア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）との間でローレンスリバモア国立研究所（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の運営のために締結された契約番号Ｗ−７４０５−ＥＮＧ−４８に従って本発明に権利を有する。
【０００２】
（関連出願との相互参照）
本願は２０００年１月４日に出願された“Ｈａｎｄｈｅｌｄ  ＰＣＲ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ”と題する米国仮出願第６０／１７４，４１６号の特典を主張するものであり、これは参照により本願に組み入れられる。
【０００３】
本発明は化学反応、増幅および検出のための装置、特にポリメラーゼ連鎖反応、増幅および検出を行なうためのシステムに関する。
【背景技術】
【０００４】
Ｎｏｒｔｈｒｕｐ等に付与された化学反応用のシリコンベーススリーブ装置についての米国特許第５，５８９，１３６号（１９９６年１２月３１日発行）には、「ドープされた加熱用ポリシリコンのようなヒータと対流型冷却用のバルクシリコンを組み合わせたシリコンベースのスリーブ型化学反応チャンバ。この反応チャンバは、均一加熱を行ないつつ消費電力が小さくなるように、臨界比のシリコンと窒化シリコンを加熱材料（例えば液体）のボリュームと組み合わせる。この反応チャンバは、反応混合物を収容した反応スリーブに２次チューブ（例えばプラスチック）を導入でき、これにより、材料不適合の問題の可能性も軽減する。この反応チャンバは、有機、無機、または生化学的反応、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および／または他のＤＮＡ反応（例えば、リガーゼチェーンリアクションなど）――これらは合成的、熱的サイクルを用いた反応の例である――などの合成または処理のための任意の化学反応システムに利用することができる。この反応チャンバは、合成装置、特にＤＮＡ増幅およびＤＮＡ合成のための合成装置において利用することができる。」なる記載がある。
【０００５】
“Ｈａｎｄｈｅｌｄ  ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｙｚｅｒ”と題する論文が、Ｗ．Ｊ．Ｂｅｎｅｔｔ、Ｊ．Ｂ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ、Ｐ．Ｓｔｒａｔｔｏｎ、Ｄ．Ｒ．Ｈａｄｌｅｙ、Ｂ．Ｈ．Ｂｏｄｔｋｅｒ、Ｓ．Ｌ．Ｎａｓａｒａｂａｄｉ、Ｆ．Ｐ．Ｍｉｌａｎｏｖｉｃｈ、Ｒ．Ｐ．Ｍａｒｉｅｌｌａ、Ｒ．Ｐ．ＫｏｏｐｍａｎおよびＰ．Ｂｅｌｇｒａｄｅｒによって、２０００年１１月５〜８日、マサチューセッツ州、ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ）で開かれたＳｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｐｈｏｔｏ−Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｓｅｎｓｉｎｇで提出された。この論文は、参照として本願に組み入れられる。
【０００６】
また、“Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｈａｎｄｈｅｌｄ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙｓ”と題する論文が、Ｊ．Ｂ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ、Ｗ．Ｊ．Ｂｅｎｅｔｔ、Ｐ．Ｓｔｒａｔｔｏｎ、Ｄ．Ｒ．Ｈａｄｌｅｙ、Ｓ．Ｌ．ＮａｓａｒａｂａｄｉおよびＦ．Ｐ．Ｍｉｌａｎｏｖｉｃｈによって、２０００年１１月５〜８日、マサチューセッツ州、ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ）で開かれたＳｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｐｈｏｔｏ−Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｓｅｎｓｉｎｇで提出された。この論文は、参照として本願に組み入れられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、生物学的有機体の同定のための最良の標準手法（ｇｏｌｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）として広く受け入れられている。ＰＣＲは、溶液中のＤＮＡセグメント濃度を経時的に指数関数的割合で増大させる生化学的方法である。これは、同一種有機体の株間の識別が可能である。ＰＣＲでは、典型的には、試料を９５℃近くの温度と６０℃以下の温度に繰り返し循環させる必要がある。理論的には、ＤＮＡセグメントの濃度は周期ごとに倍増する。本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅および検出用システムの様々な実施形態を提供する。本発明のシステムは、軽量でコンパクトであり、電力効率が良い。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システムを提供する。このシステムの実施形態は、生物学的試料ボリュームを含むようにされた１または複数の試料チャンバモジュールを含む。各試料チャンバモジュールは、二重検定を行なう機能を有し、試料チャンバモジュールに動作可能に結合した平行な検査用ポートを有する。各ポートは、光学的蛍光検出システムを有する。本発明のさらなる実施形態、利点および特徴は、そのすべてではないが、以下に記載するとおりである。本発明の様々な実施形態、利点および特徴は、この記載を検討し、本発明の実行により当業者には明確なものとなるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
添付図面は本願の開示に組み入れられ、その一部をなすが、これらは本発明の実施形態を例示し、発明の説明とともに、本発明の原理を説明するためのものである。
【００１０】
本発明の１つの実施形態は、本体、および生物学的試料ボリュームを含み得るように形成された１または複数の試料チャンバモジュールを含むようになされたポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システムを提供する。各試料チャンバモジュールは二重検定をサポートする機能を有する。試料チャンバモジュールには、平行に設けられた検査用ポートが動作可能に接続されている。ポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出の別の実施形態は、各検査用ポートに動作可能に接続された線形検出システムを含む。試料チャンバモジュールは、多重検査用ポートを有し、これらは試料ボリューム中の異なる領域を検査する。平行に設けられた検査用ポートは、それぞれ光学的蛍光検出システムを有する。本発明のシステムの別の実施形態は、平行に設けられた検査用ポート内に直接に光エネルギーを向けるＬＥＤを含む。ポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システムの別の実施形態はポジティブコーリングアルゴリズム（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃａｌｌｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を含む。このシステムの様々な実施形態において、試料は複数の試料チャンバモジュールの少なくとも１つに装入される。試料はシリコンベース内の加熱ユニットを用いることにより加熱され、また、試料は冷却される。光エネルギーが平行検査用ポートを通して試料内に向けられ、試料の特性が検出される。
【００１１】
−（携帯型高度核酸分析器（ＨＡＮＡＡ：Ｈａｎｄｈｅｌｄ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｙｚｅｒ））−
図面を参照すると、特に図１に、本発明の実施形態の一例が示されている。システム１０を「ＨＡＮＡＡ（Ｈａｎｄｈｅｌｄ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）」と呼ぶ。システム１０は４つのチャンバを有する電池駆動の携帯型装置である。システム１０は２つの基本構成部分１１と１２からなる。一方の構成部分は本体１１であり、電子回路（検出器を含む。）、電池および操作用インタフェースを含む。第２の構成部分は試料モジュール１２である。試料モジュール１２は、本体１１の端に設けられたドッキングシステムに滑入する。装置の大きさは、およそ長さ１０インチ（２５．４センチ）×幅４インチ（１０センチ）×深さ２インチ（５．１センチ）である。ＨＡＮＡＡシステム１０のさらなる特徴を次に述べる。
【００１２】
ＨＡＮＡＡの実施形態は、任意の所望の場所において使用できるように設計されており、軍や警察関係者などによる使用を含む。これはまた医療現場での医療関係者による使用にも適している。ＨＡＮＡＡの応用は、ＤＮＡまたはＲＮＡをベースとする任意の有機体やこうした有機体から得られる試料の検出を含む。例としては、病理学、法医学、生物化学兵器薬剤の検出、感染病の診断、遺伝子テスト、環境テストなどが含まれる。
【００１３】
本発明によるＨＡＮＡＡの実施形態は、４つのチャンバモジュール１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃおよび１４Ｄを含み、これらは同時にまたは独立に熱上下サイクルを経る。このため、様々な試料濃度で陽性対照や陰性対照が可能になる。４つのチャンバモジュールのそれぞれは、１つの試料に対して２つの独立の測定を行なう二重検定を行なう機能を有する。熱サイクラー（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ）の構造は、非常に小さな機械的外形を保持しつつ、２つの平行に設けられた検査用ポートを受け入れる。各ポートは、チャンバモジュールのコンパクトな平面形状を維持しつつユニークに特化された光学的検出システムを有する。検出システムの出力はアルゴリズムによって分析されるが、このアルゴリズムは、試料が陽性である場合を自動的に判定し、検定結果情報をリアルタイムでユニークで融通の利くフォーマットで提示する。
【００１４】
ＨＡＮＡＡは、試料モジュールを含み、これは高度なシリコン熱サイクラーを一体として含む。高度なシリコン熱サイクラーはＮｏｒｔｈｒｕｐ等に付与された  “Ｓｉｌｉｃｏｎ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｌｅｅｖｅ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ”と題する米国特許第５，５８９，１３６号（１９９６年１２月３１日発行）に示されており、これは本願出願人に譲渡されている。米国特許第５，５８９，１３６号の図面および明細書は、本願に参照によって組み込まれる。ＨＡＮＡＡの熱サイクラーは、非等方的なエッチング構造を取っており、これによりヒートマスを減少させるとともに冷却効率を増す。これは薄膜ヒーター／温度センサと組み合わされ、非常に迅速で効率的な熱サイクルを可能にする。ＨＡＮＡＡ熱サイクラーは２つの窓を有しており、これによって、非常に小さな機械的外形を維持しつつ励起と検出を行なう２つの独立な光学路を実現している。各ポートは、それぞれ発光ダイオード（ＬＥＤ）を有しており、非常に単純で直接的な光学システムを有し、これにより、信頼性と性能を高めつつ、複雑さ、大きさやコストを低減している。
【００１５】
ＨＡＮＡＡでは、試料溶液中に光学プローブを含有させて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスをＴａｑＭａｎ（登録商標）ベースの蛍光検定によって監視している。ＰＣＲ操作手順は１）試料を処理してターゲットとなるＤＮＡ分子を粗抽出物中に放出させること、２）酵素、バッファ、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰＳ）およびオリゴヌクレオチドプライマーを含む水溶液を添加すること、３）反応混合物を２または３つの温度（例えば、９０〜９６℃、７２℃、および３７〜５５℃）の間で熱循環させること、および４）増幅されたＤＮＡを検出することを含む。中間的なステップ、例えば、反応生成物を精製したり、表面屈折プライマーを組み込むことなどを、ＰＣＲ操作手順に組み込んでも良い。
【００１６】
光学プローブを試料溶液中に含有させれば、ＰＣＲ濃度のリアルタイム光学検出が可能となる。プローブは、例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブでもよい。これは、コネチカット州（Ｃｏｎｎｅｔｉｃｕｔ）０６８５９−０００１、ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）、メインアベニュー（Ｍａｉｎ  Ａｖｅｎｕｅ）７６１所在の、ＰＥ社（ＰＥ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の事業単位であるアプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から入手可能である。こうしたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、フォースター（Ｆｏｒｓｔｅｒ）エネルギー転移によって当初は消光されている染料分子を含む。増幅プロセスにおいて、酵素（Ｔａｑポリメラーゼ）がプローブ複合体を切り取る。この結果、染料が消光剤から分離して、その場所でレポータ染料はそれに特有な発光ができるようになる。リアルタイム検出では、試料は、陽性を検出するためにサイクルの完了を必要としないため、検定時間が減少する。また、ゲル電気泳動のようなフォローオン処理ステップを必要としない。リアルタイム検出は、サイクル速度を犠牲とすることなく、また、大きさや電力消費を著しく増大させることなく提供される。本発明のこの実施形態は、リアルタイム検出機能を備えた汎用携帯型ＰＣＲ熱サイクラーを提供する。
【００１７】
−ＨＡＮＡＡヒーターの制御−
図２および３に示すように、ＨＡＮＡＡヒーターおよびスリーブ型反応チャンバは、概ね２０で示される。スリーブ型反応チャンバは、米国特許第５，５８９，１３６号（１９９６年１２月３１日発行）およびこれと同時係属の  “Ａｎ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ”と題する米国特許出願第０９／２００３０９（９８年１１月２５日出願）に示されており、これらはいずれも本願出願人に譲渡されている。米国特許第５，５８９，１３６号およびこれと同時係属の米国特許出願第０９／２００３０９（９８年１１月２５日出願）の開示は本願に参照により組み込まれる。
【００１８】
ＨＡＮＡＡヒーターおよびスリーブ型反応チャンバ２０は、２つのシリコンボディ部材または部分２１と２２からなっている。各ボディ部材２１と２２は、全長に沿って縦長に延びたカッタウェイ２３と２４を有し、これらはボディ部分２１と２２が結合されているときは、挿入物のための開口部２５（反応チャンバ２５ともいう）を形成する。ボディ部分２１と２２それぞれの外面および側面には、間を隔てて縦長に延びたＶ字型溝２６と２７が形成される。Ｖ字型溝２６と２７は、ボディ部分２１と２２の外側面の内面上に形成されている。縦長に延びたＶ字型溝２６と２７は、矢印３０で示すように、空気の流通路２８と２９を形成する。
【００１９】
流通路２８と２９を形成する互いに結合した溝２６と２７によって形成された空気の流通路を通って空気が流れると、チャンバ２５の表面から熱が取り除かれ、これにより、スリーブ型反応チャンバすなわちＰＣＲ熱サイクラー２０の速度と効率が増す。ボディ部分２１と２２のヒートマスの減少およびこれらの表面積の増大により、熱効率が改善される。
【００２０】
溝２６と２７および流通路２８と２９は、ボディ部分すなわち部材２１と２２を形成する際、シリコンウエーハ内に非等方的にエッチングされる。ボディ部材２１と２２をエッチングしてカッタウェイ２３と２４（これは反応チャンバ２５を画定する）を形成し、ボディ部材をエッチングして縦方向に延びる溝２６と２７（これらは空気の流通路２８および２９を形成する）を形成した後、ボディ部材２１と２２を、接着剤や糊やバネ荷重などにより互いに結合する。
【００２１】
ヒーターストリップ３１は中央の加熱素子となる。ヒーターストリップ３１はプラチナ製で抵抗型ヒーターとしても使用される。プラチナは比較的高い抵抗温度係数を有するため、ヒーター３１は温度センサーとしても機能する。このため、温度の制御がより正確となり全体の設計が大幅に簡略化される。
【００２２】
熱的プロファイル（温度対時間）は、高温と低温との間の遷移時間が最小になったときに最も効率的である。これは加熱および冷却速度を迅速にすることにより実現できる。さらに、プロファイルの「角」（短い時間で温度変化が終わり、ヒーターは所定の設定温度、（保存温度）を維持することになる）は、なるべく鋭いことが必要である。ＨＡＮＡＡではこれを、加熱サイクルにおいてチャンバを過加熱する（また、冷却サイクルにおいては過冷却する）ことにより実現する。液体が所望のホールド温度に極めて近くなると、ヒーター電流は瞬間的に低下して徐熱のレベル（ｓｉｍｍｅｒ  ｌｅｖｅｌ）に達する。チャンバのヒートマスが低いので、電流低下時を越えて実質的に温度がオーバーシュートすることはない。これにより、従来の方法と比べ鋭い角がもたらされる。従来の方法では、温度が設定ポイントに近づいたときに、加熱速度が低下して、温度振動により設定温度をオーバーシュートし、または反応が非常に遅れるため、そもそも適用できない方法である。
【００２３】
チャンバを冷却するにはブロアーと通気システム（これは、装置外から空気を引き込み加熱した表面のなるべく近くに循環させチャンバからそれを外に戻すものである）が必要である。空気は、両側のモジュール分割壁の上部に設けられた２つのプレナム（ｐｌｅｎｕｍ）を通して入ってくる。空気は、チャンバ上の冷却ポートに沿って一列に設けられた壁面の開口部を通して導入され、導入用開口部の中間にある壁面開口部を通ってチャンバ外に出て行く。この点から、空気はモジュール下のプレナム内に引き込まれ、さらにブロア内、本体内に引き込まれ、その後、本体ハウジング側面の吐出口から出て行く。
【００２４】
−ＨＡＮＡＡ検定の構成−
各チャンバでは、２つの測定波長を用いる。試料容器は細長く、シリコンが融通性のあるものとして、ＨＡＮＡＡは物理的に分離された２つの窓３２と３３（図４によって最もよく示されている）を任意に備えており、これを通して試料のプローブが行われる。これにより、システムは２つの平行かつ直線状の光学路に還元されるため、システムが簡単になるという大きな利点が得られる。すなわち、これによりビームスプリッタやダイクロイックフィルタが不要になり、パッケージサイズが劇的に小さくなる。図５には、フィルタホルダー３４と３５を除いた状態で、試料モジュールの一方１４Ａを示す。
【００２５】
−ＨＡＮＡＡ光学システム−
図６に光学システムを示す。この図では、光は右から左に２つの平行行路を進む。ＬＥＤ３６と３７は、大きさ、電力消費およびコストの点でＨＡＮＡＡに適合する基準を満たす。入手の容易さと比較的低い分散角のために標準的な５ｍｍＬＥＤパッケージが使用される。青色ＬＥＤ３７は非常に低い分散半角（１０°）を有する。光学路が非常に短く、集束要件を大目に見、モジュールを通る開口径が大きいとすると、この分散特性は好都合である。緑色ＬＥＤ３６は１５°の分散角を有するものであって、この値はかなり大きいが、ＨＡＮＡＡシステムでは十分に狭いので、帯域クリーンアップフィルタの前にコリメートレンズが必要になることはない。
【００２６】
ＬＥＤスペクトラムの長波長ショルダを除くために、ＬＥＤの前には帯域フィルタ３８と３９が必要である。これらの波長は発光波長と直接に重なるため、強く減衰しておかなければならない。ＬＥＤからの光学ビームは分散性であるとすると、光はフィルタにある角度範囲で当たり、このため、低波長側に透過シフトする。ＨＡＮＡＡチャンバモジュール内のすべてのフィルタはこの傾斜角の効果を許容し得るように、概ね、用心深く決められた。特に発光フィルタは、通常よりも少しだけ長波長の帯域エッジを有するようにして、浅い角円錐に対するより短波長の入射波長分を透過させるようにした。干渉励起フィルタは、吸収ガラスによってバックアップされており、これにより発光帯域を超える長波長の放射を取り除く。
【００２７】
シリコンチャンバ内の窓側開口部３２、３３は比較的大きい（１．４×１．４ｍｍ）。こうすることで、ＬＥＤレンズの焦点に必要な条件は最小限となり、標準的な平凸レンズが使用できる。各ウィンドウ内での試料の励起ボリュームは約１ｍｍ３である。
【００２８】
加熱チャンバを出た光は、励起光も発光光も、別の平凸レンズによって集光され、再度平行な光になる。すべての発光光は、レンズの焦点約０．５ｍｍ内に入るため、回収効率は非常に効率的である。集光部の立体角は実質的に励起されたボリューム全体について等しく、全試料ボリュームが均一に励起される。試料モジュールの大きさをかなり大きくすることなく励起光を検出パスから分離する方法がないため、信頼性の置ける測定を行なうためには、発光フィルタで励起光を効率的に排除する必要がある。実際的にはフィルタは非常によく機能する。励起源からの検出器への漏洩光は一定の信号とみなされる。ＰＣＲ生成物の増加により増大した信号は、漏洩光に加えて現れる。この結果、漏洩光により信号対雑音比の減少はない。
【００２９】
発光フィルタ上への入射角を制限するためには機械的手段も用いられる。コリメートレンズとフィルタ間の領域には、内部バッフルを備えた４ｍｍの光学路が存在する。熱溶解積層法（ｆｕｓｅｄ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ）マシンを用いて黒色ＡＢＳプラスチックでバッフル構造を形成する。光学チャンネルは実質的に直径４ｍｍで、その側方には一連の４個の環状で鋸歯状の溝を設け、これらは分散光をトラップしてそれらが壁面で偏向してフィルタに戻るのを防ぐ。
【００３０】
標準的なシリコンホトダイオードを検出に用い、その後に電荷積分回路を設ける。積分時間は検定に応じて変えることができる。ＨＡＮＡＡの場合、試料内の異なる２つのボリュームをわずかに異なる時間において検査する２つの分離された励起源が存在する。ＨＡＮＡＡのＬＥＤ源は波長において分離されているため、単一光源装置と比べて、発光帯域は波長においても分離することができ、これにより、隣接する検出器によって集光される発光光は少なくなる。
【００３１】
最終的には、ＨＡＮＡＡにおいて信号を分離する鍵となるのは、発光源間の波長の分離だけではなく、時間的な分離である。陽性検定ＬＥＤが照射される際には、陰性検定用の検出回路はオフにされる。このように、陰性検定を行なう際には、そのＬＥＤは、陽性検定用蛍光の励起ではるかに効率が小さくなる。励起の効率を小さくしかつ集光の効率を小さくすることにより、ＨＡＮＡＡでは、補償アルゴリズムなしで検定間の識別をすることができる。
【００３２】
−ポジティブコーリングアルゴリズム−
検定の識別は、実際には、光学検出システムで得られた生データの処理を行なうポジティブコーリングアルゴリズムの一部として行われる。このアルゴリズムは、高い信頼性で真の陽性を見極めつつ、偽陽性を排除するように設計される。単一検定による偽陽性は、信号雑音や線形的に増大する信号によりもたらされる可能性がある。二重検定を用いた場合、上述のように隣接する検定間のクロストークの結果として偽陽性が生じる可能性もある。ＨＡＮＡＡで用いるアルゴリズムは、改変型傾斜検出プロセッサである。これは絶対レベルではなく、信号レベルの増加率に依拠している。絶対レベルは、当初の化学的状態や、システム雑音および指数的な増大に対する線形的な信号のドリフトに関係する。
【００３３】
すべての生信号は、実質的には第１０サイクル後の信号に対して正規化される。すなわち、処理後の信号データは、常に第１０サイクルにおいて１．０の値を有する。第１０サイクルは、試料溶液の混合が不十分であるなどの効果による何らかの初期の信号変化を回避するために用いられる。また、これは十分である程度に早期に行って真の陽性との干渉を避けるものとする。正規化前にはすべての生信号は、２００カウントと第１０サイクルで記録されたカウント数との差に等しくなる値からオフセットされる。これは、検定ごとまたはチャンバごとのバックグラウンド信号の差を補償するために行われる。これはまた非常に微弱な信号を希釈化する効果もある。
【００３４】
正規化により、典型的なＰＣＲでは、処理された信号は１．０程度を前後し、（濃度に応じて、通常は２０サイクル前後で）指数関数的増加が観察される。擬陽性を招く危険を最小限にするため、ポジティブコーリングアルゴリズムでは、１２サイクルに至るまでデータの分析は開始しない。この１２サイクルの時点で、アルゴリズムは、正規化された信号における以前のサイクルから現サイクルまでの増加分を比較する。もし、増加分が予め設定された閾値（典型的には０．０２）を超えたとき、そのサイクルに対してヒットが記録される。もし、４つの連続サイクル中、３つのサイクルヒットが記録されればその検定は陽性と宣言され、ユーザは警報を受ける。アルゴリズムは図７に模式的に描かれており、これは以下の表１に示す分析データに対応するものである。
【００３５】
【表１】
2007089591.tif 000003
【００３６】
表１はアルゴリズムの分析を説明するためのものである（信号増加が０．０２以上のときにヒットが記録される。）
【００３７】
上述のように、ＨＡＮＡＡは一つのランでは信号対サイクル結果を表示しない（部分的には、これは、モノクロディスプレイの解像度が６４×１２８しかなく、８個までの個別検定を同時に行なうという事実によるものである。）。むしろ、表示は検定の堅牢さに関する情報、およびそれがポジティブであるか否かの情報を提示するために用いる。このようにすることにより、表示は、８つの検定のそれぞれについての単純な棒グラフを示すことになり、棒グラフのレベルが最新の４サイクルにおけるヒット数に対応して０から最大４までの値を示す。レベルが整数値をわずかに下回ることによりミスが表示される。不十分な検定では、グラフは実行中に１〜１弱から０との間で、上下し、ときたまレベル２直下まで上がるかもしれない。レベル２には、２回の連続ヒットがあったときにのみ到達することになる。４サイクルのうち３回ヒットしたときには、グラフは影付けされ、（オプションではあるが、）ビープ音を鳴らして装置は陽性を知らせる。当該ランの間、影付きの最大レベルはラッチされる。標準的なポジティグ検定では、１から２、３（影付）、４（影付）と棒グラフが徐々に上昇する。４レベルは良好な検定であることをさらに示す。もし、棒グラフレベル４に達しない場合は、検定は弱く、ほとんど陽性とは呼べない。もし、検定が弱いと見られた場合は、ユーザは傾斜閾値を減らすことを考慮するべきである。
【００３８】
−ＨＡＮＡＡ電子回路／コントロールシステム−
コントロールシステムは、１または２以上のマスターマイクロプロセッサおよび１または２以上のスレーブマイクロコントローラからなる。どちらのプロセッサもプログラム可能なタイプであり、このため、システムケースを開けることなく、回路中のコードの変更／修正を行なうことができる。マスタープロセッサはＤＯＳを実行インテル（Ｉｎｔｅｌ）の８０３８６ＥＸである。これは５００ｋＲＡＭ、クロック／カレンダー、６個のシリアルポートおよび２Ｍｂフラッシュディスクを有する。このプロセッサは、ユーザインターフェースを有し、ログデータのディスク記録、熱プロファイルの編集、チャンバごとの校正ルーチンの実行、およびデータ分析（有機体のリアルタイム検出）を行なう。
【００３９】
スレーブマイクロコントローラは、インテル（Ｉｎｔｅｌ）８０５１シリーズとコンパチブルな８ビットデバイスである。各コントローラは、３２ｋＲＡＭ、および３２ｋＥＥＰＲＯＭを有し、また、反応チャンバヒーターを駆動する２個のパルス幅変調出力、冷却ファン、ＬＥＤ、およびコントロール信号用のバイナリＩ／Ｏ、並びにチャンバ温度、電池電圧および電流を測定し、ＰＣＲプロセスで得られたＤＮＡ信号を記録するためのアナログ入力を有する。
【００４０】
以上述べてきたように、本発明の様々な実施形態を記載し、構造的詳細を図に示した。様々な実施形態の詳細な説明は、本発明の一般的説明とともに、本発明の原理を説明するためのものである。１つの実施形態は、本体、ならびに、生物学的試料ボリュームを含むようにされた１または複数の試料チャンバモジュールを含むポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システムを提供する。各試料チャンバモジュールは二重検定を実施する機能を有する。並行になった検査用ポートが試料チャンバモジュールに動作可能に接続されている。
【００４１】
ポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出の別の実施形態は、各検査用ポートに動作可能に接続された線形検出システムを含む。線形検出システムは、実質的に互いに平行に配置されている。試料チャンバモジュールは、本体に分離可能に接続される。ポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システムの別の実施形態は携帯可能である。本体は、長さが約１０インチ（２５．４センチ）以下、幅が約４インチ（１０センチ）以下、奥行が約２インチ（５．１センチ）以下であり、重さが約２ポンド（０．９ｋｇ）以下である。ポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システムの別の実施形態は電池駆動である。各試料チャンバモジュールは、複数のポートを有し、これらは試料ボリューム中の異なる領域を検査する。平行に設けられた各検査用ポートは、それぞれ光学的蛍光検出システムを有する。
【００４２】
ポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システムの別の実施形態は、スリーブ内に複数の溝を有し、これによってスリーブのヒートマスを減少させ表面積を増大させたスリーブ型反応チャンバを含む。複数の溝は、少なくとも１本の縦方向に延びる溝、少なくとも１本の半径方向に延びる溝、および縦方向に延びる溝と接続する少なくとも１本の半径方向に延びる溝を有し、これらはこれらを通る流通路を形成する。
【００４３】
システムの別の実施形態は、平行に設けられた各検査用ポート内に光エネルギーを導入するＬＥＤを有し、平行に設けられた各検査用ポートには帯域フィルタが設けられている。ポリメラーゼ連鎖反応ＤＮＡ増幅および検出システムの別の実施形態は、ポジティブコーリングアルゴリズム、検定状態を示すユーザインタフェース、１または複数のマスターマイクロプロセッサ、および１または複数のスレーブマイクロコントローラを含む。
【００４４】
このシステムの様々な実施形態において、試料は少なくとも１つの多重的試料チャンバモジュールに装入される。試料はシリコンベース内の加熱ユニットを用いることにより加熱され、また、試料は冷却される。光エネルギーが平行検査用ポートを通して試料内に導入され、試料の特性が検出される。
【００４５】
本発明は様々な修正や異なる形とすることが可能であり、具体的な実施形態を図面に例として挙げここで記載した。しかし、本発明は、具体的に開示したかたちに限定されるものと理解してはならない。そうではなくて、本発明は、請求の範囲に規定するように、本発明の思想および範囲内に含まれるすべての修正、等価な構成および変形を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の一実施形態を説明する図である。
【図２】マイクロ加工された、シリコンＰＣＲヒーターチャンバの等角投影図である。
【図３】ＰＣＲヒーターチャンバの空冷法を示す断面図である。
【図４】上部チャンネルが内部的なポジティブコントロール用に使用されるＨＡＮＡＡの標準的な検定の構成を示す図である。
【図５】フィルタホルダーを除いたＨＡＮＡＡチャンバモジュールを示す図である。
【図６】ＨＡＮＡＡの光学路を示す概略図である。
【図７】ＨＡＮＡＡで用いるポジティブコーリングアルゴリズムを図解したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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