(57)【要約】      （修正有）【課題】空中浮遊菌の捕集・計数を比較的短時間で経済的に行うことができるように、空気の吹き付けにより飛び散らない程度の粘性と不揮発性を有する水溶性有機溶媒を容器体の内面に塗着してなる捕集容器と、この捕集容器を用いた細菌類の捕集・計数方法とを提供する。【解決手段】空気吹込み口を兼ねた開口部６を有する容器体４の内面に、空気の吹込みにより飛散しない程度の粘性と非揮発性とを有する水溶性有機溶媒を塗着させることで捕菌層８を形成している、細菌類を含む空気を内部に吹き込んで細菌類を捕捉するための捕集容器２の提供。【選択図】図１
2007159520.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌類を含む空気を内部に吹き込んで細菌類を捕捉するための捕集容器において、
空気吹込み口を兼ねた開口部を有する容器体４の内面に、空気の吹込みにより飛散しない程度の粘性と非揮発性とを有する水溶性有機溶媒を塗着させることで捕菌層８を形成したことを特徴とする、浮遊細菌類捕集容器。
【請求項２】
上記容器体４の底壁５上面の全体を水平な平坦面とし、
上記捕菌層８は、上記不揮発性の水溶性有機溶媒を残留性の少ない揮発性の有機溶媒に混合したものを、上記容器体４内に入れるとともに、上記揮発性有機溶媒を気化させることで、上記底壁５の上面全部に亘って均等な厚さに形成したことを特徴とする、請求項１記載の浮遊細菌類捕集容器。
【請求項３】
上記容器体４を合成樹脂材で形成し、更に、
上記捕菌層８は、上記不揮発性の水溶性有機溶媒に少量の非イオン性界面活性剤を添加したものを、容器体４内面に塗布することで形成したことを特徴とする、請求項１又は請求項２記載の浮遊細菌類捕集容器。
【請求項４】
浮遊細菌類を含む空気を吸引して請求項１乃至請求項３の何れかに記載の捕集容器２内に吹込み、有機溶媒に細菌類を付着させて捕捉する過程と、
この捕集容器２内に滅菌洗浄水を入れて、捕えた細菌類を有機溶媒ごと流し出して回収する過程とを具備することを特徴とする、空中浮遊細菌類の捕集方法。
【請求項５】
浮遊細菌類を含む空気を吸引して請求項１乃至請求項３の何れかに記載の捕集容器２内に吹込み、有機溶媒に細菌類を付着させて捕捉する過程と、
この捕集容器２内に滅菌洗浄水を入れて、捕えた細菌類を有機溶媒ごと流し出して回収する過程と、
この捕集した細菌類を含む洗浄水をフィルターに透過させる過程と、
このフィルター表面に移動した細菌類を蛍光染色して計数する過程とを含むことを特徴とする、空中浮遊細菌類の計数方法。
【請求項６】
浮遊細菌類を含む空気を吸引して請求項１乃至請求項３の何れかに記載の捕集容器２内に吹込み、有機溶媒に細菌類を付着させて捕捉する過程と、
細菌類を捕捉した捕集容器２内に栄養物質を含んだ滅菌水を添加する過程と、
この添加後に、その捕集容器２を、細菌類が休眠状態から覚めるまで恒温槽18内に入れる過程と、
恒温荘槽18から取り出した捕集容器２内の液体を集めて、捕集した細菌類を有機溶媒ごと流し出して回収する過程と、
この捕集した細菌類を含む液体をフィルターに透過させる過程と、
このフィルター表面に移動した細菌類を蛍光染色して計数する過程とを含むことを特徴とする、空中浮遊細菌類の計数方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、空中浮遊菌の捕集容器、及びこの容器を用いた宮中浮遊細菌類の捕集及び計数方法に関する。尚、本明細書において、「細菌類」とは細菌の他にカビなどを含むものとする。
【背景技術】
【０００２】
食品工場などにおいては、製品の品質管理のために空気を清浄に保つことが必要であり、清浄空気中の細菌類の数を把握することが重要である。
【０００３】
そうした細菌類を捕集して計数する方法として、従来、エアサンプラーを用いて浮遊細菌類を含む大量の空気を捕集板に吹き付けて、捕集板の上面に形成する培地に細菌類を慣性衝突させ、そのまま培養して菌のコロニーを計数することが行われていた（特許文献１）。
【０００４】
又、空中微生物をフィルターを用いて捕捉し、微生物の細胞膜を溶解させて細胞中のＡＴＰ（アデノシン−３−リン酸）を抽出し、生物発光現象を用いて定量する方法も知られている（特許文献２）。
【０００５】
他方、既にフィルターの上に捕集された細菌類を迅速に測定する方法として、菌を蛍光染色する方法が知られている（特許文献３）。
【０００６】
更に又、浮遊細菌の捕集装置としては、寒天培地を形成したシャーレを外気吸込み口の内側に設置し、外気を吸引して寒天培地に吹き付けるようにした携帯型の装置が知られている（特許文献４）。
【特許文献１】特開2000−300246号
【特許文献２】特開平３−112495号
【特許文献３】特開平10−323197号
【特許文献４】特開2002−153259号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１の方法は、上述の３つの方法の中で最も安価に行うことができるが、細菌類の培養に４８時間程度の時間を必要とする。従って菌を捕集してから４８時間後に空気が汚染していることが判ると、その間に生産された製品は品質不良ということになり、損失が大きい。
【０００８】
他方、特許文献２の方法（ＡＴＰ生物発光法）は、計数までにかかる時間は数時間であり、比較的早いが、測定装置が高価である。
【０００９】
特許文献３の方法は、フィルターの上に捕集した細菌類を合理的な時間とコストとの範囲で計数することに適しているが、空気浮遊細菌をどのようにフィルターの上に捕集するかが問題となる。室内環境での空中浮遊菌を捕集・計数する際に、そのような空気では菌数が少ないので（１Ｌ当たり１個以下）、培養過程を経ずに信頼できる菌の実数値を測定するには、100Ｌ〜1,000Ｌ以上の大容量の空気から菌を捕集する必要がある。しかしながら、捕集・回収から計数につなげるような一般的な手段がこれまでになかった。
【００１０】
そこで本出願人は、エアサンプラーで吸い込んだ浮遊細菌を捕集して、回収できる手段を見出すべく鋭意研究を行った。上記特許文献４の段落０００４には、捕集装置の使用法として、菌が植え付けられた寒天を洗浄し、この液体をＡＴＰ生物発光装置に入れるという用法が紹介されている。
【００１１】
そこで出願人は、シャーレの中に形成した寒天培地にエアサンプラーで100Ｌの空気を吹き付けた試験体を２組製作し、一番目の試験体は５ｍＬの水で一回洗浄し、二番目の試験体は５ｍＬの水で一回洗浄して、そのまま培養を行った。洗浄により全ての菌を回収できるのであれば、その後に培養しても菌は計測されない筈であるが、細菌に関しては、１番目の試験体で16〜19個のコロニーが、また２番目の試験体で４〜５個のコロニーが観測された。また、真菌に関しても、１番目の試験体で16〜20個のコロニーが、また２番目の試験体で５〜９個のコロニーが観測された。これらの試験結果から、寒天培地の上に菌を捕集した場合には、捕集した菌の全てを蛍光染色用のフィルターに移し替えることが困難であることが判った。
【００１２】
移し替えが容易という点では、シャーレ内に水などの液体を入れて空気を吹き付けることも考えられるが、大量の空気を吹き付けることで、捕集液体が蒸発したり、或いは菌を含んだ飛沫が飛び散るなどして細菌類の捕集効率が悪くなる。また、寒天培地の代わりにゼラチンで固めた固形物で菌を捕集し、その後に加熱して液状化することで菌を回収することも可能であるが、この場合には、ゼラチンを含んだ液体はメンブレンフィルターに透過させることができず、菌の計数が困難であることが判った。
【００１３】
そこで本発明は、空中浮遊菌の捕集・計数を比較的短時間で経済的に行うことができるように、空気の吹き付けにより飛び散らない程度の粘性と不揮発性を有する水溶性有機溶媒を容器体の内面に塗着してなる捕集容器と、この捕集容器を用いた細菌類の捕集・計数方法とを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
第１の手段は、細菌類を含む空気を内部に吹き込んで細菌類を捕捉するための捕集容器において、
空気吹込み口を兼ねた開口部を有する容器体４の内面に、空気の吹込みにより飛散しない程度の粘性と非揮発性とを有する水溶性有機溶媒を塗着させることで捕菌層８を形成している。
【００１５】
本手段は、浮遊細菌類を捕集して回収するための器具である捕集容器を提案している。捕菌材としては、上述の寒天のような非溶性の固体であると、その表面から細菌類を洗い流して回収することが困難となり、他方、単に容器内に充填した液体であるとすると、容器の外にこぼれる可能性がある。そこで本発明では、まず水溶性有機溶媒を容器体内面に塗着させることで、回収効率が良く取り扱い易い捕集容器を提供している。
【００１６】
「容器体」は、シャーレやビーカーなど、広口の開口部を有する容器とすることが望ましい。
【００１７】
「捕菌層」は、容器体内面全体に形成しても良いが、細菌類を回収する際の洗い残しを防止するために、容器体の底部内面にのみ形成しても良い。また、捕菌層は、容器体内面に有機溶媒を塗着することで形成される。「塗着」とは、容器体の内面に有機溶媒を塗るように層状に付着させることをいい、実際に溶媒を塗る場合に限らない。
【００１８】
「有機溶媒」は、捕集した細菌類を洗浄水で流し出すことができるように水溶性の溶媒とする。この有機溶媒は、特に常温で蛍光染色などに用いられるフィルターを容易に透過することが望ましい。フィルター透過性を確保するため、予め当該フィルターを透過させた有機溶媒を用いても良い。又、空中浮遊細菌類の育成を阻害したり、殺菌作用を有する有機溶媒は避ける必要がある。更に大量の空気を吹き込んでも飛散しないように粘性液体を用いる必要がある。そうした溶媒の例としては、グリセリンや乳酸、ポリエチレングリコールなどがある。特にグリセリンはほぼ中性であるため、菌の捕集材料として好適である。更に有機溶媒は不揮発性であることが必要である。
【００１９】
第２の手段は、第1の手段を有し、かつ、
上記容器体４の底壁５上面の全体を水平な平坦面とし、
上記捕菌層８は、上記不揮発性の水溶性有機溶媒を残留性の少ない揮発性の有機溶媒に混合したものを、上記容器体４内に入れるとともに、上記揮発性有機溶媒を気化させることで、上記底壁５の上面全部に亘って均等な厚さに形成している。
【００２０】
本手段では、容器体内に、不揮発性の有機溶媒と揮発性の有機溶媒との混合液を入れた後に、後者を蒸発させるようにしており、重力の作用で、容器体の平坦な底壁上面に薄く均一な厚さの塗膜が満遍なく形成されるようにしている。揮発性溶媒を気化させるときには、底壁上面が水平となるように容器体を支持するものとする。残留性の少ない揮発性有機溶媒としては、例えばエタノールやメタノールなどが挙げられる。例えばシャーレの底壁に、グリセリンとエタノールとを１：９の割合（体積比）で混合させたものを１ｍＬ程度塗布すれば良好な捕菌層が得られる。純グリセリン液を同量塗布するとすれば、洗浄の際に洗い流すことが大変である。また、０．１ｍＬの純グリセリン液を塗布しようとすると、液を目的面に薄く塗り広げるのが大変であるとともに、塗り残しを生じると捕集容器の品質（捕集能力）にばらつきを生ずる。本手段ではこうした不都合を回避できる。
【００２１】
第３の手段は、第1の手段又は第２の手段を有し、
かつ上記容器体４を合成樹脂材で形成し、更に、
上記捕菌層８は、上記不揮発性の水溶性有機溶媒に少量の非イオン性界面活性剤を添加したものを、容器体４内面に塗布することで形成している。
【００２２】
本手段では、界面活性剤を用いて、有機媒体が合成樹脂材に馴染み易くしている。界面活性剤としては、微生物に対する毒性の少ない非イオン性界面活性剤を用いる。好適な界面活性剤の例としては、ポリソルベート20やポリソルベート80などがある。
【００２３】
第４の手段は、空中浮遊細菌類の捕集方法であり、
浮遊細菌類を含む空気を吸引して第１の手段乃至第３の手段の何れかである捕集容器２内に吹込み、有機溶媒に細菌類を付着させて捕捉する過程と、
この捕集容器２内に滅菌洗浄水を入れて、捕えた細菌類を有機溶媒ごと流し出して回収する過程とを具備することを特徴とする。
【００２４】
このように構成することで、捕集容器内に捕集した菌を培養せずに直ちに回収して、計数作業に着手することができる。空気の吸引には従来公知のエアサンプラーを用いることができる。この構成によれば浮遊細菌類を空気とともにフィルタに衝突させて捕菌し、培養する従来の方法と比べて、培養する必要がないので、計数を開始するまでに時間がかからない。尚、本明細書において、「滅菌洗浄水」（或いは滅菌水）とは、単なる水に対して滅菌処理を施した水のほか、0.85％程度の塩化ナトリウムを含んだ生理食塩水に対して滅菌処理を施した滅菌生理食塩水などを含むものとする。また、「流し出して」とは、広く流動状態で取り出すことをいい、スポイトなどで吸い上げることを含む。
【００２５】
本手段により、空気浮遊細菌類を捕捉・回収した後には、従来公知の適当な方法で計数を行うと良い。コスト面で好適な方法は、前述の蛍光染色法であるが、例えば菌に由来する前述のアデノシン３リン酸（ＡＰＴ）、フィルエンドトキシン、ペプチドグリカンなどを定量する方法が知られている。又、通常の計数作業の他に、回収した空中浮遊菌からＤＮＡを抽出して、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションを行い、特定種の菌の検出・計数を行うこともできる。
【００２６】
第５の手段は、空中浮遊細菌類の計数方法であり、
浮遊細菌類を含む空気を吸引して第1の手段乃至第３の手段の何れかである捕集容器２内に吹込み、有機溶媒に細菌類を付着させて捕捉する過程と、
この捕集容器２内に滅菌洗浄水を入れて、捕えた細菌類を有機溶媒ごと流し出して回収する過程と、
この捕集した細菌類を含む洗浄水をフィルターに透過させる過程と、
このフィルター表面に移動した細菌類を蛍光染色して計数する過程とを含む。
【００２７】
本手段では、前述の細菌類の捕集方法に従来公知の蛍光染色法を組み合わせて、捕集から計数まで約30分程度で作業を完了することができ、計数施設のない工場に計測装置を持ち込んで現場で測定結果を出すことができる。
【００２８】
第６の手段に係る方法は、空中浮遊細菌類の計数方法であり、
浮遊細菌類を含む空気を吸引して請求項１乃至請求項３の何れかに記載の捕集容器２内に吹込み、有機溶媒に細菌類を付着させて捕捉する過程と、
細菌類を捕捉した捕集容器２内に栄養物質を含んだ滅菌水を注入する過程と、
この添加後に、その捕集容器２を、細菌類が休眠状態から覚めるまで恒温槽18内に入れる過程と、
恒温荘槽18から取り出した捕集容器２内の液体を集めて、捕集した細菌類を有機溶媒ごと流し出して回収する過程と、
この捕集した細菌類を含む液体をフィルターに透過させる過程と、
このフィルター表面に移動した細菌類を蛍光染色して計数する過程とを含む。
【００２９】
上述の蛍光染色法では、休眠状態にある菌体、即ち、胞子状態である細菌やカビを検出することが困難である。そこで本発明では、回収過程前に、捕集容器を恒温槽18内に入れ、休眠状態から覚まさせてから回収・計数するようにしている。「栄養物質」としては、グルコースやシュークロースなどがある。
【発明の効果】
【００３０】
第１の手段に係る捕集容器によれば次の効果を奏する。
○捕菌層８は容器体４の内面に有機溶媒を塗着してなるから、溶媒が流れ出したり、空気の吹き込みにより飛び散ることがなく、取扱いや持ち運びが容易であり、作製も簡単である。
○上記有機溶媒は水溶性であるから、水に溶けない寒天等を捕集材とした場合に比べて捕集容器から取出し易く、又フィルタ透過性も良いので、細菌類の回収効率が良い。
○捕菌部分を層状にしたから、少量の有機溶媒で形成でき、これを溶解するのに必要な水量も少なくて良いので、捕菌した細菌類の殆どを捕集容器から取り出しできる。
【００３１】
第２の手段に係る方法によれば、次の効果を奏する。
○不揮発性の有機溶媒を揮発性の有機溶媒に溶かした溶液を目的面に塗布した後に後者を蒸発させるから、目的面に塗残しなく満遍なく塗膜を形成することができる。
○塗膜を均等に薄くできるから、塗膜を残らず溶かし出すことが容易で回収効率が上がるとともに、有機溶媒を節約することができ、更にこれを溶かすための洗浄水も少なくてよい。
【００３２】
第３の手段に係る方法によれば、次の効果を奏する。
○非イオン性界面活性剤を用いて、有機媒体が合成樹脂材に馴染み易くしたから、ガラス容器などに比べて廉価な合成樹脂製容器を使うことができ、経済的である。
○合成樹脂製容器は使い捨てできるので、作業効率も良い。
○合成樹脂製容器の内面に有機溶媒を薄く塗布することができるので、有機溶媒の全てを洗い流すことができ、細菌類の回収率が良い。
【００３３】
第４の手段に係る浮遊細菌類の捕集方法によれば、エアサンプラーで浮遊細菌類を空気とともにフィルタに衝突させて捕菌し、培養する従来の方法と比べて、培養する必要がないので、計数を開始するまでに時間がかからない。
【００３４】
第５の手段に係る細菌類の計数方法によれば、次の効果を奏する。
○蛍光染色法を用いるので、ＡＴＰ法に比べて廉価であり、また迅速に結果が得られる。
○使用する機器としては、捕集容器やエアサンプラー、蛍光検出器程度であり、これらは持ち運ぶことができる程度の大きさなので、こうした浮遊菌計数計測の設備を持たない複数の食品工場などに対して蛍光検査器などを持ち込み、その場で計測を行うサービスを提供することができる。
【００３５】
第６の手段に係る方法によれば、細菌類を捕捉した捕集容器を恒温層に入れるから、休眠中の菌体を発芽させて計数することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
図１は本発明に係る捕集容器２を示している。
【００３７】
この捕集容器２は、容器体４と、捕菌層８とで形成されている。
【００３８】
容器体４は、平坦な底壁５の周縁から周壁を起立するシャーレ型であり、空気吹込み口である開口部６を有している。この容器体は、プラスチック製の使い捨て容器としている。
【００３９】
捕菌層８は、容器体４底壁の上面に形成されている。この捕菌層は、粘性及び不揮発性を有する水溶性の有機溶媒を底壁上面に塗布することで形成する。
【００４０】
好適な例としては、体積比にて0.1％のポリソルベート80、9.9％のグリセリン、90％のエタノールを混合して混合液を調製する。このエタノール混合液は、予めメンブレンフィルターで濾過させておくことが望ましい。この混合液１ｍＬを図２に示す如くピペッタ10に採って、水平な載置面（図示せず）の上に置かれた容器体４内に注入し、エタノールを蒸発させて、容器体の底壁５上面全体に亘って、均等な厚さの捕菌層８を形成する。
【００４１】
次に一般の空中浮遊細菌の計数方法を、図面に沿って説明する（図５参照）。
【００４２】
まず、図３に示す如く図１の捕集容器２をエアサンプラー12にセットする。そして空気を吸引して、捕集容器２の捕菌層８に細菌類を捕集する。
【００４３】
次に図４に示す如く捕集容器２を取り出し、滅菌生理食塩水などを容器体４に注入するとともに、捕捉した菌ごと有機溶媒を全て食塩水に溶解させる。この溶解水を、図示しないホルダーで固定したメンブレンフィルター14で濾過すると、溶媒はフィルターを通過するが、細菌はフィルターの上に残る。このメンブレンフィルターを蛍光検出器16にセットして計数すれば良い。
【００４４】
【表１】
2007159520.tif 000003
表１は本実施形態の方法と通常の培養法とで、同一場所から採取した空気内の細菌を計数した結果を示している。第１回、第２回の結果ともに、通常の培養法よりも本発明の方法の方が検出した菌数が大きい。このことから、本発明では従来の方法で検出されていない菌まで計数しているものと考えられる。
【００４５】
次に、胞子状態の細菌又はカビについて計数するときには、図３の如く細菌を捕集容器２内に捕集した後に、この捕集容器２内に、グルコースなど菌にとって栄養となる物質を含む滅菌水を添加する。そして図６に示す如く細菌を捕集した捕集容器を恒温槽18を入れて、発芽状態となるまで数時間保温する（図５参照）。そして恒温槽から捕集容器２を取り出し、この捕集容器内の液体を流し出して、この液体に含まれる細菌をメンブレンフィルターの上に回収し、蛍光検出器に入れれば良い。本実施形態では、菌が発芽するまで保温するため、第1実施形態よりは時間がかかるが、菌がコロニーを形成するまで培養する通常の方法に比べれば迅速に測定結果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明に係る捕集容器の断面図である。
【図２】図１の容器の製作工程を示す図である。
【図３】本発明に係る浮遊細菌類の計数方法の第１の過程を示す図である。
【図４】同方法の第２の過程を示す図である。
【図５】本発明に係る方法のフローチャートである。
【図６】同方法の変形例の過程を示す図である。
【符号の説明】
【００４７】
２…捕集容器  ４…容器体  ６…開口部  ８…捕菌層  
10…ピペッタ  12…エアサンプラー  14…メンブレンフィルター
16…蛍光検出器  18…恒温槽
【図１】
2007159520.tif 000004
【図２】
2007159520.tif 000005
【図３】
2007159520.tif 000006
【図４】
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【図５】
2007159520.tif 000008
【図６】
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