(57)【要約】      （修正有）【課題】脳腫瘍患者の予後を予測するための脳腫瘍マーカーおよびその用途を提供する。【解決手段】特定の塩基配列を有する配列群のいずれか１記載の塩基配列を有する脳腫瘍患者の予後を予測するための脳腫瘍マーカー遺伝子、及び／又は、特定のアミノ酸配列を有する配列群のいずれか１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを有する脳腫瘍患者の予後を予測するための脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を測定することにより、脳腫瘍患者の予後を予測する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜９のいずれか１記載の塩基配列を有することを特徴とする脳腫瘍患者の予後を予測するための脳腫瘍マーカー遺伝子。
【請求項２】
請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれか１とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有することを特徴とする脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブ。
【請求項３】
請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれか１を特異的に増幅するのに利用されることを特徴とする脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマー。
【請求項４】
請求項２記載の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブの少なくとも１を基板上に固定化させたことを特徴とするＤＮＡチップ。
【請求項５】
下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とする脳腫瘍患者の予後を予測するための方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドにおける、請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の全部又は一部の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定する工程、
（ｂ）前記発現量が健常者のそれと比較して多い被験者を予後不良として予測する工程。
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれる少なくとも１以上を含むことを特徴とする脳腫瘍患者の予後予測用キット：
（ａ）請求項２記載の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブ、
（ｂ）請求項３記載の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマー、
（ｃ）請求項４記載のＤＮＡチップ。
【請求項７】
下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むことを特徴とする請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現を抑制する物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質と、請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の少なくとも１を発現している細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞における前記脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定し、被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応する脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【請求項８】
配列番号１０〜１８のいずれか１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを有することを特徴とする脳腫瘍患者の予後を予測するための脳腫瘍マーカータンパク質。
【請求項９】
請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質を特異的に認識することを特徴とする脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体。
【請求項１０】
請求項９記載の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体から選択された少なくとも１の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体を基板上に固定化させたことを特徴とするプロテインチップ。
【請求項１１】
下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とする脳腫瘍患者の予後を予測するための方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されるタンパク質における、請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質の全部又は一部の脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を測定する工程、
（ｂ）前記発現量が健常者のそれと比較して多い被験者を予後不良として予測する工程。
【請求項１２】
以下の（ａ）〜（ｂ）からなる群から選ばれる少なくとも１以上を含むことを特徴とする脳腫瘍患者の予後予測用キット：
（ａ）請求項９記載の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体の少なくとも１、
（ｂ）請求項１０記載のプロテインチップ。
【請求項１３】
下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むことを特徴とする請求項７記載の脳腫瘍マーカータンパク質の発現を抑制する物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質と、請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質の少なくとも１を発現している細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞における前記脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を測定し、被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応する脳腫瘍マーカータンパク質の発現量と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳腫瘍患者の予後を予測するための脳腫瘍マーカーおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍細胞は自己の遺伝子異常により厳密なプログラムが破綻し、秩序を失って増殖するものであり、本来これらの細胞の分子生物学的特性に基づいて治療法が選択されるのが理想である。しかし、従来から脳腫瘍の予後を予測する因子の一つとして例えば組織学的グレード（細胞分裂の数や腫瘍細胞の形態によって決められる悪性度の指標）が用いられているが、腫瘍細胞の病理学的な特徴が同じでも、患者によってその進展形態、治療に関する感受性、予後などが大きく異なることから病理学的分類で脳腫瘍の予後を予測することは困難であった。一方、腫瘍細胞の遺伝子異常は複数の遺伝子の異常が関与していることは言うまでもなく、それぞれの腫瘍細胞の分子生物学的特長を把握するには、多くの遺伝子の変化を同時に観察することが不可欠である。
【０００３】
これまで、さまざまなヒト癌種において、治療の選択を行うのに有用な分子マーカーを得るため、マイクロアレイを用いた分子発現プロファイルが用いられてきた。マイクロアレイ技術は腫瘍細胞の転写レベルでの変化を同時にかつ大量にとらえるアプローチであり、腫瘍細胞の個性診断、治療に対する感受性、薬剤に対する耐性、副作用予測、新規標的分子同定などに応用可能な技術である。このマイクロアレイ技術を用いて遺伝子発現プロファイルを調べることにより、多くの遺伝子が腫瘍の組織学的な型およびグレードにおいて、異なって発現されていることが確認されている。
【０００４】
脳腫瘍についてもある遺伝子の発現情報をもとにしたマーカー遺伝子などが報告されているが（例えば、非特許文献１〜６）、悪性脳腫瘍の発現に強く関連し、且つ悪性脳腫瘍の予後の予測に使用することができるマーカー遺伝子はほとんど知られていなかった。
【非特許文献１】Freije WA, Castro-Vargas FE, Fang Z, Horvath S, Cloughesy T, Liau LM, Mischel PS, Nelson SF.  Cancer Res. 2004 Sep 15;64(18):6503-10.
【非特許文献２】Rickman DS, Bobek MP, Misek DE, Kuick R, Blaivas M, Kurnit DM, Taylor J, Hanash SM.  Cancer Res. 2001 Sep 15;61(18):6885-91.
【非特許文献３】Sallinen SL, Sallinen PK, Haapasalo HK, Helin HJ, Helen PT, Schraml P, Kallioniemi OP, Kononen J.  Cancer Res. 2000 Dec 1;60(23):6617-22.
【非特許文献４】Kim S, Dougherty ER, Shmulevich I, Hess KR, Hamilton SR, Trent JM, Fuller GN, Zhang W.       Mol Cancer Ther. 2002 Nov;1(13):1229-36.
【非特許文献５】van den Boom J, Wolter M, Kuick R, Misek DE, Youkilis AS, Wechsler DS, Sommer C, Reifenberger G, Hanash SM.  Am J Pathol. 2003 Sep;163(3):1033-43.
【非特許文献６】Weiner, H.L., Huang H. et al., Neurosurgery. 2000 Dec. 47(6):1400-1409.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
悪性脳腫瘍は有効な治療スケジュールが確立しておらず、非常に予後不良でありその病態の解析と新たな治療法の開発が望まれていた。特に、脳腫瘍患者の治療の個別化などを可能とするためには、脳腫瘍患者の予後予測に有効な新規マーカーの開発が望まれていた。また、脳腫瘍患者の予後予測の精度を向上させるためには、脳腫瘍の生物学的特性等に対応する複数のマーカーを組み合わせて使用することが必要であった。
【０００６】
本発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、脳腫瘍患者の予後を予測するための脳腫瘍マーカーおよびその用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を鑑みて鋭意検討した結果、脳腫瘍組織と正常脳組織の遺伝子発現プロファイルを比較することにより、脳腫瘍組織に高発現する遺伝子を抽出し、さらに脳腫瘍組織である神経膠芽腫組織と退形成性神経膠腫組織の間で生存解析を行い、脳腫瘍組織に高発現する遺伝子から生存期間を分ける遺伝子として以下の表１に示す９遺伝子を同定して、本発明を完成するに至った。
【０００８】
【表１】
2007089547.tif 000002
【０００９】
本発明は、以下の通りである。
【００１０】
本発明の請求項１は、配列番号１〜９のいずれか１記載の塩基配列を有することを特徴とする脳腫瘍患者の予後を予測するための脳腫瘍マーカー遺伝子である。
【００１１】
本発明の請求項２は、請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれか１とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有することを特徴とする脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブである。
【００１２】
本発明の請求項３は、請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれか１を特異的に増幅するのに利用されることを特徴とする脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマーである。
【００１３】
本発明の請求項４は、請求項２記載の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブの少なくとも１を基板上に固定化させたことを特徴とするＤＮＡチップである。
【００１４】
本発明の請求項５は、下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とする脳腫瘍患者の予後を予測するための方法である：（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドにおける、請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の全部又は一部の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定する工程、（ｂ）前記発現量が健常者のそれと比較して多い被験者を予後不良として予測する工程。
【００１５】
本発明の請求項６は、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれる少なくとも１以上を含むことを特徴とする脳腫瘍患者の予後予測用キットである：（ａ）請求項２記載の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブ、（ｂ）請求項３記載の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマー、（ｃ）請求項４記載のＤＮＡチップ。
【００１６】
本発明の請求項７は、下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むことを特徴とする請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現を抑制する物質のスクリーニング方法である：（ａ）被験物質と、請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の少なくとも１を発現している細胞とを接触させる工程、（ｂ）被験物質を接触させた細胞における前記脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定し、被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応する脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量と比較する工程、（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【００１７】
本発明の請求項８は、配列番号１０〜１８のいずれか１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを有することを特徴とする脳腫瘍患者の予後を予測するための脳腫瘍マーカータンパク質である。
【００１８】
本発明の請求項９は、請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質を特異的に認識することを特徴とする脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体である。
【００１９】
本発明の請求項１０は、請求項９記載の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体から選択された少なくとも１の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体を基板上に固定化させたことを特徴とするプロテインチップである。
【００２０】
本発明の請求項１１は、下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とする脳腫瘍患者の予後を予測するための方法である：（ａ）被験者の生体試料から調製されるタンパク質における、請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質の全部又は一部の脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を測定する工程、（ｂ）前記発現量が健常者のそれと比較して多い被験者を予後不良として予測する工程。
【００２１】
本発明の請求項１２は、以下の（ａ）〜（ｂ）からなる群から選ばれる少なくとも１以上を含むことを特徴とする脳腫瘍患者の予後予測用キットである：（ａ）請求項９記載の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体の少なくとも１、（ｂ）請求項１０記載のプロテインチップ。
【００２２】
本発明の請求項１３は、下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むことを特徴とする請求項７記載の脳腫瘍マーカータンパク質の発現を抑制する物質のスクリーニング方法である：（ａ）被験物質と、請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質の少なくとも１を発現している細胞とを接触させる工程、（ｂ）被験物質を接触させた細胞における前記脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を測定し、被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応する脳腫瘍マーカータンパク質の発現量と比較する工程、（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、脳腫瘍患者の予後を予測するための脳腫瘍マーカーが提供される。また、この脳腫瘍マーカー遺伝子に関わる各種の分子生物学的材料が提供され、これらを使用することによって、脳腫瘍患者の予後を予測することが可能である。また、予後予測の判定結果に基づいて、生存期間や再発や死亡など疾病の経過を予測することが可能であり、且つ、治療方針決定において有用である。さらに、脳腫瘍患者の予後を予測する他に、腫瘍マーカーとしての診断応用や、新規抗癌剤など創薬への応用が可能となる。また、脳腫瘍を抑制する物質のスクリーニングを行い、新規抗癌剤の開発を進展させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明の「脳腫瘍」は、頭蓋内に発生するすべての腫瘍をいう。このような脳腫瘍の中でも、発生頻度の高い代表的なものが神経膠腫であり、これはさらに、星細胞腫、神経膠芽腫等を含む。脳腫瘍には、この他、下垂体腺腫、神経鞘腫などがある。
【００２５】
本発明における「遺伝子」は、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ＤＮＡには、例えば、クローニング、化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖ＤＮＡは、センス鎖となるコードＤＮＡであっても、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖であってもよい。
【００２６】
本明細書における「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡおよびＤＮＡのいずれをも包含する趣旨で用いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡおよび合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。
【００２７】
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
【００２８】
本発明者らは、脳腫瘍組織と正常脳組織の遺伝子発現プロファイルを比較することにより、脳腫瘍組織に高発現する遺伝子を抽出し、さらに脳腫瘍組織である神経膠芽腫組織と退形成性神経膠腫組織の間で生存解析を行い、脳腫瘍組織に高発現する遺伝子から生存期間を分ける遺伝子として上記の表１に示す９の脳腫瘍患者の予後を予測するための脳腫瘍マーカーを同定した。
【００２９】
本発明の脳腫瘍患者の予後を予測するための脳腫瘍マーカー遺伝子とは、良性脳腫瘍若しくは正常脳組織ではほとんど又は全く発現せず、悪性脳腫瘍のみに高発現する遺伝子であって、前記悪性脳腫瘍に高発現する遺伝子が脳腫瘍患者の生存予後と相関する遺伝子を言う。従って、本発明の脳腫瘍患者の予後を予測するための脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定することにより、脳腫瘍患者の予後を予測することが可能である。本発明の脳腫瘍患者の予後を予測するための脳腫瘍マーカー遺伝子は、配列番号１〜９のいずれか１記載の塩基配列を有することを特徴とする。また、ＮＣＢＩの遺伝子データーベースにおいて、表１のＧｅｎｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒによりアプローチすることができる。本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子は、公知の遺伝子操作の手法により、取得することができる。
【００３０】
本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブは、請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれか１とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有することを特徴とする。これらの脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブは、脳腫瘍マーカー遺伝子の塩基配列の全体又は部分配列を選択することによって、公知の方法を用いて適宜作製することができる。選択される部分配列はどの部分であってもよいが、脳腫瘍マーカー遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であることを特徴とする。また、脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブは、放射標識、蛍光標識等で標識してもよい。上記脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブは、選択された部分配列に基づいて、その配列に相補的なＤＮＡ又はＲＮＡとすることができる。例えば、本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子の塩基配列から適宜の長さのＤＮＡプローブを作成し、適宜蛍光標識等の標識を付与しておき、これを被検体とハイブリダイズすることにより、脳腫瘍マーカー遺伝子の発現の多寡を検出し、脳腫瘍患者の予後を予測する。さらに、脳腫瘍マーカー遺伝子の発現の多寡を検出し、脳腫瘍の検出も行ってもよい。
【００３１】
なお、上記脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブの作製に際して、本発明の塩基配列において、「脳腫瘍マーカー遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム）、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。
【００３２】
本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマーは、請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれか１を特異的に増幅するのに利用されることを特徴とする。脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマーを用いることにより、ＰＣＲ等の公知の方法に基づいて目的の脳腫瘍マーカー遺伝子を増幅できる。プライマーは、本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子の塩基配列（配列番号１〜９）に基づき、市販のプライマー設計ソフトを用いる等、常法により容易に設計し、増幅することができる。また、プライマーは、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよく、また、ビオチン、リン酸、アミン等により修飾されていてもよい。
【００３３】
本発明のＤＮＡチップは、請求項２記載の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブの少なくとも１を例えばガラス板等の基板上に固定化させたことを特徴とする。ＤＮＡチップの作製は、当業者に既知の作製方法などに準じて行うことができる。ＤＮＡチップを用いることにより、本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現レベルを検出、測定することができる。
【００３４】
本発明の脳腫瘍患者の予後を予測するための方法は、下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とする：（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドにおける、請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の全部又は一部の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定する工程、（ｂ）前記発現量が健常者のそれと比較して多い被験者を予後不良として予測する工程。
【００３５】
本発明の脳腫瘍患者の予後を予測するための方法において、「被験者」は、例えばＭＲＩ検査等によって脳腫瘍を有すると診断された患者であり、その「生体試料」とは患者脳からの切除組織あるいは血液等である。評価対象の生体試料は、マーカー遺伝子を含む任意の試料であり得る。患者脳からの切除組織あるいは血液等から常法に従って、生体試料からＲＮＡを調製することができる。また、患者脳からの切除組織あるいは血液等から常法に従って、該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを調製することができる。例えば、被験者の細胞から単離したｍＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅する。その際に、標識ｄＮＴＰを取り込ませて標識ｃＤＮＡとすることができる。
【００３６】
本発明の脳腫瘍患者の予後を予測するための方法は、前記生体試料における本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれかの発現レベルを検出し、測定することによって実施される。健常者の生体試料における請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を基準とし、被験者の生体試料における請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量が前記基準より高いと予後不良として予測する。具体的には、本発明の検出方法は、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ解析法、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション解析法などの公知の方法により前記脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定する。このとき、本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブや脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマーを適宜用いることができる。また、本発明のＤＮＡチップを用いてもよい。
【００３７】
本発明の脳腫瘍患者の予後予測用キットは、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれる少なくとも１以上を含むことを特徴とする：（ａ）請求項２記載の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブ、（ｂ）請求項３記載の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマー、（ｃ）請求項４記載のＤＮＡチップ。脳腫瘍患者の予後予測用キットを構成する（ａ）〜（ｃ）を上記のように用いることにより、脳腫瘍患者の予後予測が可能となる。
【００３８】
本発明の請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現を抑制する物質のスクリーニング方法は、下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むことを特徴とする：（ａ）被験物質と、請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子の少なくとも１を発現している細胞とを接触させる工程、（ｂ）被験物質を接触させた細胞における前記脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定し、被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応する脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量と比較する工程、（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【００３９】
本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子の発現を抑制する物質のスクリーニング方法は、脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を低下させる物質を探索することによって、悪性脳腫瘍を抑制する候補物質を提供するものである。
【００４０】
本発明のスクリーニングに用いられる細胞としては、請求項１記載の脳腫瘍マーカー遺伝子を発現する培養細胞全般を挙げることができる。培養細胞においてこれら脳腫瘍マーカー遺伝子が発現しているか否かは、公知のウェスタンブロット法などにて検出することにより、容易に確認することができる。培養細胞としては、具体的には、例えば癌患者より単離、調製した生体組織や血球由来の細胞、または本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれかを導入した細胞等を挙げることができる。
【００４１】
また、本発明のスクリーニング方法に際して、被験物質と細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該細胞が死滅せず且つ本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子を発現できる培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を選択するのが好ましい。
【００４２】
脳腫瘍マーカー遺伝子の少なくとも１を発現している細胞からＲＮＡを調製して、脳腫瘍マーカー遺伝子を測定する。また、該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを調製して、脳腫瘍マーカー遺伝子を測定してもよい。具体的には、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ解析法、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション解析法などの公知の方法により前記脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定する。このとき、本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プローブや脳腫瘍マーカー遺伝子検出用プライマーを適宜用いることができる。また、本発明のＤＮＡチップを用いてもよい。
【００４３】
本発明の脳腫瘍患者の予後を予測するための脳腫瘍マーカータンパク質とは、良性脳腫瘍若しくは正常脳組織ではほとんど又は全く発現せず、悪性脳腫瘍のみに高発現するタンパク質であって、前記悪性脳腫瘍に高発現するタンパク質が脳腫瘍患者の生存予後と相関するタンパク質を言う。本発明の脳腫瘍患者の予後を予測するための脳腫瘍マーカータンパク質は、配列番号１０〜１８のいずれか１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを有することを特徴とする。また、ＮＣＢＩの遺伝子データーベースにおいて、表１のＧｅｎｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒによりアプローチすることができる。
【００４４】
本発明の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体は、請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質を特異的に認識することを特徴とする。本発明の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体は前記脳腫瘍マーカータンパク質に特異的に結合する性質を有することから、前記脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体を利用することによって、被験者の組織内に発現した上記脳腫瘍マーカータンパク質を特異的に検出することができる。
【００４５】
抗体の製造方法は公知であり、本発明の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体も常法に従って製造することができる。具体的には、本発明の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した本発明の脳腫瘍マーカータンパク質を用いて、あるいは常法に従ってこれら本発明の脳腫瘍マーカータンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した本発明の脳腫瘍マーカータンパク質またはこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる。該抗体は、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよいし、ビオチン等により適当に修飾されていてもよい。
【００４６】
脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体の作製に免疫抗原として使用される脳腫瘍マーカータンパク質は、本発明により提供される遺伝子の配列情報（配列番号１〜９）に基づいて、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法に準じて行うことができる。
【００４７】
本発明のプロテインチップは、請求項９記載の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体の少なくとも１を基板上に固定化させたことを特徴とする。プロテインチップの作製は、当業者に既知の作製方法などに準じて行うことができる。
【００４８】
本発明の脳腫瘍患者の予後を予測するための方法は、下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とする：（ａ）被験者の生体試料から調製されるタンパク質における、請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質の全部又は一部の脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を測定する工程、（ｂ）前記発現量が健常者のそれと比較して多い被験者を予後不良として予測する工程。
【００４９】
本発明の脳腫瘍患者の予後を予測するための方法において、「被験者」は、例えばＭＲＩ検査等によって脳腫瘍を有すると診断された患者であり、その「生体試料」とは患者脳からの切除組織あるいは血液等である。患者脳からの切除組織あるいは血液等から常法に従って、生体試料からタンパク質を調製することができる。
【００５０】
本発明の脳腫瘍患者の予後を予測するための方法は、前記生体試料における脳腫瘍マーカータンパク質のいずれかの発現レベルを検出し、測定することによって実施される。健常者の生体試料における請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を基準とし、被験者の生体試料における請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質の発現量が前記基準より高いと悪性脳腫瘍とする。具体的には、公知の方法に基づいて、患者の組織の一部を採取し、そこから常法に従ってタンパク質を調製する。その後、例えば、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法など公知の検出方法に基づいて、脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を検出することができる。このとき、上記脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体を適宜用いることができる。また、上記プロテインチップを用いることにより、脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を検出してもよい。
【００５１】
脳腫瘍マーカータンパク質の少なくとも１を発現している細胞からタンパク質を調製して、脳腫瘍マーカー遺伝子を測定する。具体的には、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、タンパク質マイクロアレイ解析法などの公知の方法により前記脳腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定する。このとき、上記脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体を適宜用いることができる。また、上記プロテインチップを用いることにより、脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を検出してもよい。
【００５２】
本発明の脳腫瘍患者の予後予測用キットは、以下の（ａ）〜（ｂ）からなる群から選ばれる少なくとも１以上を含むことを特徴とする：（ａ）請求項９記載の脳腫瘍マーカータンパク質検出用抗体の少なくとも１、（ｂ）請求項１０記載のプロテインチップ。脳腫瘍患者の予後予測用キットを構成する（ａ）〜（ｂ）を上記のように用いることにより、脳腫瘍患者の予後予測が可能となる。
【００５３】
本発明の請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質の発現を抑制する物質のスクリーニング方法は、下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むことを特徴とする：（ａ）被験物質と、請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質の少なくとも１を発現している細胞とを接触させる工程、（ｂ）被験物質を接触させた細胞における前記脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を測定し、被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応する脳腫瘍マーカータンパク質の発現量と比較する工程、（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【００５４】
本発明の脳腫瘍マーカータンパク質の発現を抑制する物質のスクリーニング方法は、脳腫瘍マーカータンパク質の発現量を低下させる物質を探索することによって、悪性脳腫瘍を抑制する候補物質を提供するものである。
【００５５】
本発明のスクリーニングに用いられる細胞としては、請求項８記載の脳腫瘍マーカータンパク質を発現する培養細胞全般を挙げることができる。培養細胞においてこれら脳腫瘍マーカータンパク質が発現しているか否かは、公知のウェスタンブロット法などにて検出することにより、容易に確認することができる。培養細胞としては、具体的には、例えば癌患者より単離、調製した生体組織や血球由来の細胞、または本発明の脳腫瘍マーカー遺伝子のいずれかを導入した細胞等を挙げることができる。
【００５６】
また、本発明のスクリーニング方法に際して、被験物質と細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該細胞が死滅せず且つ本発明の脳腫瘍マーカータンパク質を発現できる培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を選択するのが好ましい。
【００５７】
以下、具体的な実施例について説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５８】
１．  対象症例
新潟大学脳研究所脳神経外科にて手術摘出された神経膠腫３１例  （ＷＨＯ  ｇｒａｄｅＩＩＩ：１０例、ＩＶ：２１例）を対象とした。表２に、対象症例の病理組織学的診断名（Histological  diagnosis）、ＷＨＯ  ｇｒａｄｅ、生存期間（Survival  Time）、転帰（Outcome）を示す。これらの症例は術後、放射線治療（腫瘍局所４０Ｇｙ、全脳照射２０Ｇｙ）ならびにニトロソウレアを中心とした化学療法を施行した。生存期間は診断確定日より患者の死亡日、もしくは最終受診日とした。組織診断はＷＨＯ脳腫瘍組織分類に基づいて行った。なお、本明細書に記載の実験は、新潟大学倫理委員会の規定に則り、全ての対象患者からインフォームドコンセントを得ている。
【００５９】
【表２】
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【００６０】
２．  ＲＮＡの抽出
凍結組織片はＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）中でポリトロンにより破砕された（最高速度で５秒間×２回）。クロロホルムを添加後、１５，０００×ｇで１０分間遠心し、ＲＮＡを含んだ水層を採取した。イソプロピルアルコールを用いトータルＲＮＡを沈殿させ、７０％エタノールで１度洗浄し、それをＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに溶解した。トータルＲＮＡは１．５ユニットのＤNａｓｅ  Ｉで処理し、再度、クロロホルム抽出を行った後に、エタノール沈殿し、ＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに懸濁した。その後、Ｒｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使い、低分子の核酸を除去した。トータルＲＮＡの質はＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ）にてｒＲＮＡ比率［２８ｓ／１８ｓ］を計測した。精製したトータルＲＮＡは７０％エタノール中で−８０℃に使用まで保存した。
３．  Ｃｙ３−、Ｃｙ５−標識化ｃＤＮＡの合成
ｃＤＮＡの合成はａｇｉｌｅｎｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｉｒｅｃｔ  ｌａｂｅｌ  ｋｉｔを用いて行った。１０μｇの精製したトータルＲＮＡとＴ７プロモーター配列を有するオリゴｄＴプライマーを用いて、１．２５μｌの１ｍＭのＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ  ｄＣＴＰ（Ｃｙ3−ｄＣＴＰ又はＣｙ５−ｄＣＴＰ）、２００ユニットのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素で４２℃１時間反応させ、第一鎖ｃＤＮＡを合成した後に第二鎖ｃＤＮＡを合成し、フェノール／クロロホルムで抽出し、Ｐｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  Ｇｅｌにて精製した。なお、腫瘍のＲＮＡはＣｙ５、正常脳組織のＲＮＡはＣｙ３を用いて標識した。得られたｃDＮＡはエタノール沈殿により回収し、使用まで７０％エタノール中で、−８０℃で保存した。正常脳組織のＲＮＡはＣｌｏｎｔｅｃｈ社より購入したものを用いた。
４．  ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイ解析
脳腫瘍患者の原発癌の遺伝子発現はａｇｉｌｅｎｔ社製のマイクロアレイを用いて試験した。ハイブリダイゼーションは、２×デポジションコントロールバッファー  １２．５μｌ、Ｃｏｔ−１ＤＮＡ  ２．５μｌ、ヌクレアーゼフリーの水  ７．５μｌ、ｃＤＮＡ  ２．５μｌを含む２５μｌの溶液中で６５℃、１７時間行った。チップを０．5％ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液で洗浄後、各ピクセルの蛍光強度はＨＰ社製レーザースキャナーにて測定し、画像化、さらに各遺伝子の正常脳組織に対する腫瘍組織での発現比に関して数値化を行った。この実験により、ヒト脳腫瘍患者の約１２７２９遺伝子の発現を測定した。
・  統計解析
悪性神経膠腫患者の予後と相関する遺伝子群を同定するため、ａｇｉｌｅｎｔ社製のマイクロアレイを用いて解析を行った。Cox proportional hazards model, Wald statistic multivariate permutations test を用いて予後と相関する遺伝子を９種類抽出した。その結果、表３に示すように、Translocase of outer mitochondrial membrane 40 homology（ＴＯＭＭ４０），Sarcolipin（ＳＬＮ），Ring finger protein 2（ＲＮＦ２）, Latate dehydrogenase C（ＬＤＨＣ）, Echinoderm microtubule associated protein like 4（ＥＭＬ４）, discoidin domain receptor family member 1（ＤＤＲ１）, Ksp37 protein（Ｋｓｐ３７），Dual-specificity tyrosine-(Y)-phosphorylation regulated kinase 3（ＤＹＲＫ３）, Heparan sulfate 6-O-sulfotransferase 1 （ＨＳ６ＳＴ１）の９個の遺伝子を選び出した。各遺伝子のｐ値（p-value），ハザード比（Hazard ratio）, Ｌｏｇ（発現比）の標準偏差（ＳＤ） が示されている。さらに、各遺伝子の発現値の中央値で２群間に分け生存期間との相関を検討したところ、ＴＯＭＭ４０, ＳＬＮ, ＲＮＦ２, ＬＤＨＣ, ＤＤＲ１, Ｋｓｐ３７，ＨＳ６ＳＴ１の７種の遺伝子のＬｏｇｒａｎｋ検定値が０．０５以下であり、発現の多寡と予後が有意に相関した（図１）。更に、各遺伝子について４分位点で層別化し４群間比較を検討したところ、９種類全ての遺伝子のＬｏｇｒａｎｋ検定値が０．０５以下であり、発現の多寡と予後が有意に相関した（図２）。従って、上記９種の遺伝子の発現レベルを調べることにより脳腫瘍患者の予後を予測することが示唆された。
【００６１】
【表３】
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【００６２】
６．  免疫組織化学的解析
ＷＨＯ Ｇｒａｄｅ IIIまたはIVの悪性神経膠腫３６例症例について、ＤＤＲ１遺伝子の免疫組織化学的解析を行った。５ミクロン切片を作成し、脱パラフィン化の後に１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ  ６．０）中にて１２１℃、１０分間加温した。０．３％Ｈ２Ｏ２にて内因性ペルオキシダーゼ活性の阻害を行った。１０％ウサギ血清にてブロッキング後、抗体（ＤＤＲ１ウサギポリクローナル抗体、１：５０希釈）(Santa Cruz Biotechnology社)と４℃１２時間反応させた。洗浄後Ａｖｉｄｉｎｅ−ｂｉｏｔｉｎ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ(Vectasin elite ABC kit, Vector Labs, Burlingame, CA)を反応させ、０．０１％３，３−ジアミノベンジジン(ＤＡＢ)(Ｓｉｇｍａ)とＰＢＳ ０．０１％過酸化水素にて発色させた。ＤＤＲ１遺伝子の神経膠腫組織におけるタンパク質レベルでの発現を免疫組織化学的に解析した結果を図３に示す。
【００６３】
図３に示すようにＤＤＲ１遺伝子産物は症例によって様々な程度に染色された。任意の３視野でのタンパクの発現強度を０〜３、および発現面積を０，０．２５，０．５，０．７５，１．０と表示し、それらの積の平均値を求め発現レベルとした。発現レベル値が１以下の低発現症例（Ａ）と１以上の高発現症例（Ｂ）との２群に分け（図３に具体例を示す）、各群の生存曲線を描き、Ｌｏｇｒａｎｋ検定にて２群間の有為差を検討した。結果を図４に示す。Ｐ値が０．０１７であり、ＤＤＲ１のタンパク質が高発現すると予後が悪い結果であつた。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】各遺伝子の発現レベルの中央値で２群に分け、それぞれの遺伝子の発現が異なる２群の間で生存曲線を比較した結果を示す図である。
【図２】各遺伝子について４分位点で層別化し４群間比較した結果を示す図である。
【図３】ＤＤＲ１遺伝子の神経膠腫組織におけるタンパク質レベルでの発現を免疫組織化学的に解析した結果を示す図である。
【図４】ＤＤＲ１タンパク質発現レベルと患者の生存期間との相関を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図３】
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【配列表】
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