(57)【要約】      （修正有）【課題】癌の治療または予防用のワクチンとして用いるための組成物を生産する方法の提供。【解決手段】哺乳動物細胞の生存および成長に適した栄養素を含有する培地および環境条件下で、患者から単離された樹状細胞を培養するステップと、癌細胞系からの溶解物または種規定抗原、およびトコトリエノールで前記樹状細胞をパルス処理するステップと、次いで、パルス処理された前記樹状細胞を、癌患者への投与に適した固体または液体の状態で含有させるステップとを含む癌の治療または予防用の薬剤として用いる組成物の製造方法および癌ワクチンとしての使用方法。【選択図】図２
2007254458.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）  哺乳動物細胞の生存および成長に適した栄養素を含有する栄養分に富んだ培地上または中で、該哺乳動物細胞の成長および生存に適した条件のような、その成長および増殖を誘導する条件下で、患者から単離された樹状細胞を培養するステップと；
（ｂ）  前記哺乳動物細胞の生存および成長に適した培養および環境条件下で、癌細胞系からの溶解物または種規定抗原、およびトコトリエノールで前記樹状細胞をパルス処理するステップと；次いで、
（ｃ）  パルス処理された前記樹状細胞を、それを必要とする患者への投与に適した固体または液体の状態で含有させるステップと；
を含むことを特徴とする、癌の治療または予防用の薬剤として用いる組成物の製造方法。
【請求項２】
前記樹状細胞は３６ないし３８℃、好ましくは３７℃で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
用いる培養基は、１０％加熱不活化ＦＢＳ、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１μＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００ユニット／ｍｌペニシリン、０．５μｇ／ｍｌファンギゾン、および５×１０−５Ｍ  ２−メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ  １６４０である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記樹状細胞は、無菌条件下でフラッシュされた大腿骨および脛骨の骨髄腔から採取され、完全培地（１０％加熱不活化ＦＢＳ、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１μＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００ユニット／ｍｌペニシリン、０．５μｇ／ｍｌファンギゾン、および５×１０−５Ｍ  ２−メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ  １６４０）中で、１０６細胞／ｍｌにて、１００ユニット／ｍｌ顆粒球マクロファージコロニー刺激因子および１００ユニット／ｍｌインターロイキン４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，  Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，  ＮＪ）とともにＴ２５フラスコ中で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記樹状細胞は、ＴＲＦへの暴露に先立って２００ユニット／ｍｌのＴＮＦ−α（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）とともに４８時間成熟される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記トコトリエノールはヤシ油果実から得られたトコトリエノールに富む画分（ＴＲＦ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＴＲＦがアジュバントに作用して、癌を患っている患者におけるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）の血清レベルを上昇させる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記癌細胞の溶解物が乳癌細胞系、メラノーマ細胞系、肺癌細胞系、前立腺癌細胞系、結腸癌細胞系、卵巣癌細胞系または他の組織学的タイプの細胞系から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記癌細胞の溶解物が乳癌細胞系から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
患者の癌の予防または治療のための薬剤の製造における、請求項１に従って作製される有効量のワクチンの使用。
【請求項１１】
前記癌が腫瘍であり、請求項１０により作製される有効量のワクチンの使用。
【請求項１２】
前記樹状細胞が腫瘍抗原を免疫系に提示する、請求項１に記載の有効量のトコトリエノールの使用。
【請求項１３】
癌を患っている患者におけるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）の血清中レベルを上昇させるためのアジュバントとしての、請求項１に従って作製される有効量のワクチンの使用。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法に従って作製される組成物を薬学上許容される賦形剤内に含む、患者における癌の治療または予防のためのワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
弱毒化微生物、組換えタンパク質およびＤＮＡワクチンを含む、いくつかのタイプのワクチンが、ある種の腫瘍のような感染症の予防のために用いられる。免疫機構における細胞媒介部門は、ウイルス感染から防御し、回復させ、および同一ウイルスによるさらなる感染を予防する能力を宿主に与えることに関与する主な部門である。このタイプの免疫応答は、宿主を腫瘍の開始、発達および拡大から保護することにおいて非常に重要である。
【０００３】
最近、治療様式を改良するために、癌患者のためのワクチン免疫療法の開発に対して研究が行われてきた。この形態の免疫療法は、優れた抗原提示細胞であることが示されている樹状細胞の使用を含む。これらの細胞は、それらが一次およびブースト二次免疫応答を誘導させ、ならびに誘導されるＴ細胞媒介免疫応答のタイプを調節するのを可能とするユニークな特性を保有する。近年、いくつかの研究は、腫瘍抗原パルス処理樹状細胞が、各々、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスIおよびクラスII分子による抗原提示を介してＴヘルパーおよび細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）細胞の創製および増殖双方を誘導できることを示している。
【発明の詳細な説明】
【０００４】
従って、癌の治療または予防用の薬剤として用いられる組成物を生産する方法が提供され、該方法は、（ａ）哺乳動物細胞の生存および成長に適した栄養素を含有する栄養分に富んだ培地上または中で、該哺乳動物細胞の成長および生存に適した条件のような、その成長および増殖を誘導する条件下で、患者から単離された樹状細胞を培養するステップと；
（ｂ）  前記哺乳動物細胞の生存および成長に適した培養および環境条件下で、癌細胞系からの溶解物または種規定抗原、およびトコトリエノールで前記樹状細胞をパルス処理するステップと、次いで、（ｃ）パルス処理された前記樹状細胞を、それを必要とする患者への投与に適した固体または液体の状態で含有させるステップと、を含む。
【０００５】
本発明は、添付の図面において後に十分に記載され説明されるいくつかの新規な特徴および部分の組合せよりなり、発明の範囲を逸脱することなく、または本発明の利点のいずれかを犠牲とすることなく、詳細における種々の変形をなすことができると理解される。
【０００６】
好ましい具体例の詳細な記載
本発明は、概して、癌ワクチンに関する。以下、本明細書は本発明の好ましい具体例に従って本発明を記載する。しかしながら、発明の好ましい具体例に対する記載の限定は、単に本発明の議論を容易とするものであって、当業者であれば、添付の請求の範囲を逸脱することなく種々の修飾および等価物を工夫することができると考えられる。
【０００７】
癌、特に腫瘍の治療または予防用のワクチンとして用いられる組成物は、以下に記載する方法によって作製される。
【０００８】
本発明の好ましい具体例において、腫瘍細胞溶解物は乳癌細胞系、メラノーマ細胞系、肺癌細胞系、前立腺癌細胞系、結腸癌細胞系、卵巣癌細胞系または他の組織学的タイプの細胞系から得られる。腫瘍細胞溶解物は、ワクチン製剤において腫瘍抗原のスペクトルを広げるように、異なるが補い合うパターンの腫瘍抗原を放出する腫瘍細胞のいくつかの異なる系から収集することもできる。
【０００９】
油ヤシ樹木果実からの、特に、油ヤシ樹木果実のＴｅｎｅｒａ種からの非毒性天然抽出物である、ＴＲＦは好ましいトコトリエノールとして用いられる。ＴＲＦは、マウスモデルへ添加された後にＩＦＮ−γの血清中レベルを増強させ、それにより、マウス乳癌の治療において樹状細胞の効率を増加させるためのアジュバントとして非常に効果的であることが判明した。ＴＲＦは単離するのが容易であり、かくして、種々のタイプの癌の治療における樹状細胞の効率をかなり増強させるための、低コストのアジュバントを提供することができる。ＴＲＦは好ましいトコトリエノールであるが、純粋なトコトリエノールを用いることもできることは認識されなければならない。
【００１０】
インターフェロンは、ウイルス、細菌、寄生虫および腫瘍細胞のような外来因子による攻撃に対する応答として、ほとんどの動物の免疫系の細胞によって生産される天然タンパク質である。インターフェロンは、サイトカインとして知られた糖タンパク質の大きなクラスに属する。
【００１１】
特に、ＩＦＮ−γは活性化されたＴ細胞で生産されるタイプＩＩのサブクラスである。ＩＦＮ−γは、哺乳動物の免疫および炎症応答の調節に密接に関与する。それは、３０までの遺伝子における転写を改変し、種々の生理学的および細胞の応答を生じさせることもできる。この結果、インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）およびインターフェロンベータ（ＩＦＮ−β）の効果を増強するように作用しつつ、抗ウイルスおよび抗−腫瘍効果をもたらす。ＩＦＮ−γはＴｈ１細胞によっても放出され、白血球を感染の部位に動員させ、その結果、炎症が増大する。それは、また、マクロファージを刺激して、飲み込まれた細菌を殺傷させる。Ｔｈ１細胞によって放出されたＩＦＮ−γは、Ｔｈ２応答を調節することにおいても重要である。
【００１２】
いくつかの異なるタイプのインターフェロンが今日ヒトに用いるために認可されており、インターフェロン療法は、多くのタイプの全身性癌に対する治療として、（化学療法および放射線療法と組み合わせて）用いられる。全身療法で用いる場合、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γは筋肉内注射によって主として投与される。筋肉における、静脈におけるまたは皮膚下へのインターフェロンの注射は一般によく許容されている。驚くべきことに、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）の血清中濃度は、我々のマウスモデルにおいてトコトリエノール添加後にかなり増大することが判明した。
【００１３】
樹状細胞、または特定の腫瘍タイプに向けられた抗原を提示することができる他のタイプの細胞を含有するワクチンは、１または２ヶ月の間、数回、次いで、治療すべき特定の病気に応じて、１ないし３ヶ月（またはそれ未満）ごとに１回、患者にワクチンを長期間投与することによって、ヒトでの癌の予防または治療に用いることができる。
【００１４】
しかしながら、該ワクチンは乳癌抗原ワクチンの生産のために主として研究されているが、本発明は、ヒト肺癌ワクチン、ヒトメラノーマワクチン、ヒト結腸癌ワクチンおよび他のヒト癌ワクチンの生産に適応することもできる。
【００１５】
以下の実施例は、本発明をここに記載する特定の具体例に限定する意図を含まず、本発明をさらに説明することを意図する。
【００１６】
細胞の調製
５ないし６週齢のＢＡＬＢ／cマウスを、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＩＭＲ）ＫｕａｒａＬｕｍｐｕｒから購入した。マウスを犠牲にし、筋肉組織をガーゼで大腿骨および脛骨から除去した。次いで、骨を７０％エタノールを含む６０ｍｍ皿に１分間入れ、新鮮な培地に移す前にＲＰＭＩ  １６４０培地で洗浄した。シリンジを用いて大腿骨および脛骨を５ｍｌの同培地でフラッシュすることによって骨髄細胞を単離した。細胞を遠心分離し、完全培地（１０％ウシ胎児血清、１％グルタミンおよび１％ペニシリンまたはストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ  １６４０）に再懸濁させて、細胞を培養した。
【００１７】
樹状細胞の生成
骨髄細胞は無菌条件下で大腿骨および脛骨のフラッシュされた骨髄腔から採取し、完全培地（１０％加熱不活化ＦＢＳ、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１μＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００ユニット／ｍｌペニシリン、０．５μｇ／ｍｌファンギゾン、および５×１０−５Ｍ  ２−メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ  １６４０）中で、１０６細胞／ｍｌにて、１００ユニット／ｍｌ顆粒球マクロファージコロニー刺激因子および１００ユニット／ｍｌインターロイキン４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）を含むＴ２５フラスコ中で培養した。サイトカインを４日目に添加した。培養の６日目に、樹状細胞を収集し、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＬ）を添加し、または添加することなく顆粒球マクロファージコロニー刺激因子およびインターロイキン４とともに１０６細胞／ｍｌにて６日間培養した。樹状細胞を２００ユニット／ｍｌのＴＮＦ−α（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）とともに４８時間成熟させた。
【００１８】
ＦＡＣＳ分析
用いた全ての抗体はＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから購入した。樹状細胞の分析のために、試料をＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１１ｃで染色した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて細胞を分析した。
【００１９】
腫瘍溶解物の調製
マウス乳癌細胞系である４Ｔ１を、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシンおよび１％グルタミンが添加されたＲＰＭＩ  １６４０培地を含むＴ２５ｃｍ２フラスコ中で培養した。細胞を５％ＣＯ２インキュベータ中で３７℃にてインキュベートした。ＴＲＦ処理のために、密集した細胞を８ｕｇ／ｍｌのＴＲＦ（トコトリエノールに富む画分、Ｃａｒｏｔｅｃｈ）で３日間処理した。腫瘍溶解物は、細胞を−８０℃から２５℃への２回の凍結／解凍サイクルに付すことによって作製した。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αを樹状細胞培養の濃度と同一濃度で溶解物に加えた。溶解物を平板培養した樹状細胞に加え、３７℃にて一晩パルス処理した。腫瘍溶解物とともにパルス処理された樹状細胞を次いで収集し、２０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、１％ＰＢＳ溶液で３回洗浄し、マウスに注射する前に完全培地に再懸濁した。
【００２０】
マウスの処理
６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスの乳腺に１０４  ４Ｔ１腫瘍細胞を局所注射した。樹状細胞を、１：１の腫瘍細胞同等物／樹状細胞の比率にて４Ｔ１腫瘍細胞溶解物とともに２４時間パルス処理した。パルス処理の後、樹状細胞を２００ユニット／ｍｌのＴＮＦ−αとともに４８時間成熟させた。マウスに、腫瘍を触知できる１５日目に５０μｌのＰＢＳ中の１．５×１０６腫瘍細胞溶解物パルス処理成熟樹状細胞を局所注射（ｉ．ｔ．）した。ワクチン接種を２０日目と２５日目に繰り返し行った。一次腫瘍を、ノギスを用いて測定した。
【００２１】
実験設計
各バッチは４群のマウスよりなる：
グループ１：４Ｔ１のみを注射
グループ２：４Ｔ１＋腫瘍溶解物とともにパルス処理された樹状細胞
グループ３：４Ｔ１＋腫瘍溶解物とともにパルス処理された樹状細胞＋ＴＲＦ
グループ４：樹状細胞を注射
【００２２】
【表１】
2007254458.tif 000003
【表２】
2007254458.tif 000004
【００２３】
Ｍｉｎｉ  Ｍａｃｓ磁性ビーズを用いる樹状細胞の精製
樹状細胞を穏やか掻き取り、室温において１０００ｇで１０分間遠心し、９０μＬの緩衝液（２ｍＭ  ＥＤＴＡ１５および０．５％ＢＳＡを補足したＰＢＳ  ｐＨ７．２）に再懸濁させた。１０μＬのＣＤ  １１ｃマイクロビーズを樹状細胞に加え、４℃にて１５分間インキュベートした。樹状細胞分離の前に、カラムを５００μＬの緩衝液で洗浄した。カラムを緩衝液で３回洗浄して、陰性画分を除去した。カラムを磁石から外し、樹状細胞を１ｍｌの緩衝液で溶出させた。
【００２４】
結果
１）樹状細胞は首尾よく得られ、マウス骨髄から成長した。
２）Ｍｉｎｉ  ｍａｃｓキットを用いて純粋な樹状細胞を単離した。
３）サイトカインを、ＴＲＦと共にインキュベートした樹状細胞において測定した。テストした濃度（１ないし５μｇ／ｍｌ）において、対照細胞と比較してＩＦＮ−γの直線的な増加があった。
４）４Ｔ１乳腺腫瘍溶解物でパルス処理されたトコトリエノール補足樹状細胞は、マウスモデルにおいて広がった転移性乳癌の成長を阻害した。
５）対照マウスで発生した腫瘍は、樹状１５細胞を注射したマウスにおけるよりも大きかった。
結果を添付の図面の図１ないし４に示す。
【００２５】
【表３】
2007254458.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００２６】
本発明の容易化および理解の目的で、添付の図面を説明するが、それを精査すると、以下の説明と組み合わせて考慮した場合、その構成および操作、およびその利点の多くは容易に理解され認識されるであろう。
【図１】ヤシ油果実から得られたトコトリエノールに富む画分（ＴＲＦ）で処理された樹状細胞におけるインターフェロンガンマ濃度を示すチャートである。
【図２】樹状細胞でパルス処理され、かつＴＲＦで処理されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける腫瘍発生率を示すチャートである。
【図３】ＢＡＬＢ／ｃマウスの体重対週を示すチャートである。
【図４】４Ｔ１を注射し、かつパルス処理された樹状細胞で処理されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるインターフェロンガンマ（ＩＮＦ−γ）濃度を示すチャートである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【外国語明細書】
Title of Invetion 
A CANCER VACCINE 
【０００１】
FIELD OF INVENTION 
The present invention relates to a cancer vaccine. 
【０００２】
BACKGROUND OF INVENTION 
Several types of vaccines are used for the prevention of infectious diseases such as certain tumours, including attenuated microorganisms, recombinant proteins and DNA vaccines. The cell-mediated arm of the immune system is the main arm involved in providing the host with the ability to defend, recover from viral infections and to prevent further infections by the same virus. This type of immune response is also crucial in protecting the host against the onset, development and spread of tumour.
【０００３】
Recently, research has been carried out on the development of vaccine immunotherapy for cancer patients in order to improve the treatment modalities. This form of immunotherapy involves the use of dendritic cells, which are shown to be potent antigen presenting cells. These cells possess unique properties that allow them to elicit primary and boost secondary immune responses as well as regulate the type of T-cell mediated immune response that is induced. In recent years, several studies have demonstrated that tumour antigen-pulsed dendritic cells are capable of inducing both the generation and proliferation of T-helper and cytotoxic T lymphocyte (CTL) cells via antigen presentation by major histocompatibility complex (MHC) class I and class II molecules respectively to mediate tumour immunity. 
【０００４】
DETAILED OF DESCRIPTION OF INVENTION
Accordingly, there is provided a method for producing a composition for use as a medicament for treatment or prevention of cancer, the method including the steps of (a) 5 culturing dendritic cells isolated from a patient, under conditions conducive for their growth and proliferation such as conditions suitable for the growth and survival of mammalian cells, on or in a nutrient-rich medium which contains nutrients suitable for the survival and growth of mammalian cells, (b) pulsing said dendritic cells with lysate or a species-defining antigen from a cancerous cell line, and a tocotrienol, under culture and environmental conditions suitable for the survival and growth of the mammalian cells and (c) containing the pulsed dendritic cells in a solid or liquid form suitable for administration to a patient in need thereof. 
【０００５】
The present invention consists of several novel features and a combination of parts hereinafter fully described and illustrated in the accompanying drawings, it being understood 15 that various changes in the details may be made without departing from the scope of the invention or sacrificing any of the advantages of the present invention. 
【０００６】
DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS 
The present invention relates generally to a cancer vaccine. Hereinafter, this specification will describe the present invention according to the preferred embodiments of the present invention. However, it is to be understood that limiting the description to the preferred embodiments of the invention is merely to facilitate discussion of the present invention and it is envisioned that those skilled in the art may devise various modifications and equivalents without departing from the scope of the appended claims.
【０００７】
The composition for use as a vaccine for treatment or prevention of cancer, particularly tumour, is made by a method described hereinafter. 
【０００８】
In the preferred embodiment of the present invention, the tumour cell lysate is obtained from a breast cancer cell line, melanoma cell line, lung cancer cell line, prostate cancer cell line, colon cancer cell line, ovarian cancer cell line or a cell line of other histological type. The tumour cell lysate can also be collected from several different lines of tumour cells which shed different but complimentary patterns of tumour antigens so as to broaden the spectrum of tumour antigens in the vaccine preparation. 
【０００９】
TRF, a non-toxic natural extract from the oil palm tree fruit, particularly from Tenera species of oil palm tree fruit is used as the preferred tocotrienol. The TRF is found to be highly effective as an adjuvant for enhancing the serum levels of IFN-γ following supplementation in mouse models, and thereby increasing the effectiveness of the dendritic cells in treating mouse mammary cancers. The TRF is simple to isolate and thus can provide a low cost adjuvant to significantly enhance the efficacy of the dendritic cells in treating various types of cancer. It must be appreciated that although the TRF is a preferred tocotrienol, pure tocotrienol can also be used. 
【００１０】
Interferons are natural proteins produced by the cells of the immune systems of most animals as a response to challenges by foreign agents such as viruses, bacteria, parasites and tumour cells. Interferons belong to the large class of glycoproteins known as cytokines.
【００１１】
In particular, IFN-γ is a type II subclass produced in activated T cells. IFN-γ is intimately involved in the regulation of mammalian immune and inflammatory responses. It is able to alter transcription in up to 30 genes producing a variety of physiological and cellular responses. This results in anti-viral and anti-tumour effects whilst also acting to potentiate the effects of interferon-alpha (IFN-α) and interferon-beta (IFN-β). IFN-γ is also released by Th1 cells, and recruits leukocytes to a site of infection, resulting in increased inflammation. It also stimulates macrophages to kill bacteria that have been engulfed. The IFN-γ released by Th1 cells is also important in regulating the Th2 response.
【００１２】
Several different types of interferon are now approved for use in humans, and interferon therapy is used (in combination with chemotherapy and radiation) as a treatment for many types of systemic cancer. When used in the systemic therapy, IFN-α and IFN-γare mostly administered by an intramuscular injection. The injection of interferons in the muscle, in the vein or under skin is generally well tolerated. It was surprisingly found that serum levels of interferon-gamma (IFN-γ) significantly increased following tocotrienol supplementation in our mouse models.
【００１３】
The vaccine containing dendritic cells or other types of cells able to present antigens directed to a particular tumour type may be used for the prevention or treatment of cancer in humans by administering the vaccine to a patient several times for one or two months, and then once every one to three months (or less) depending on the particular disease being treated, for an extended period of time. 
【００１４】
Although, the vaccine is primarily researched for the production of a breast cancer antigen vaccine, however, this invention is also applicable to the production of a human lung cancer vaccine, a human melanoma vaccine, a human colon cancer vaccine and other human cancer vaccines. 
【００１５】
The following example is intended to further illustrate the invention, without any intent for the invention to be limited to the specific embodiment described therein. 
【００１６】
Cell Preparation
BALB/c mice aged 5-6 weeks old were purchased from the Institute for Medical Research (IMR), Kuala Lumpur. Mice were sacrificed and muscle tissues removed with gauze from the femur and tibias. Then, bones were placed in 60 mm dish with 70% ethanol for 1 minute, washed with RPMI 1640 medium before transferring into fresh medium. Bone marrow cells were isolated by flushing femurs and tibias with 5ml of same medium by using a syringe. The cells were centrifuged and re-suspended in complete medium (RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum, 1% glutamine and 1% penicillin or streptomycin) to culture the cells. 
【００１７】
Generation of dendritic cells 
Bone marrow cells were harvested from flushed marrow cavities of femurs and tibiae under aseptic conditions and cultured in T25 flasks with 100 units/ml granulocyte macrophage 5 colony-stimulating factor and 100 units/ml interleukin 4 (Peprotech, Rocky Hill, NJ) at 106cells/ml in complete media (RPMI 1640 containing 10% heat-inactivated FBS, 0.1 mM nonessential amino acids, 1 μM sodium pyruvate, 2 mM L-glutamine, 100 μg/ml streptomycin, 100 units/ml penicillin, 0.5 μg/ml fungizone, and 5 x 10-5 M 2-mercaptoethanol). Cytokines were replenished on day 4. On day 6 of culture, dendritic cells were collected and cultured at 106 cells/ml with granulocyte macrophage colony-stimulating factor and interleukin 4 with or without the addition of 10 ng/ml of recombinant human TGF-s1 (R&D Systems, Minneapolis, MN) for 6 days. Dendritic cells were matured with 200 units/ml of TNF-α (Peprotech) for 48 hours. 
【００１８】
FACS Analysis 
All antibodies used were purchased from Becton Dickinson. For analysis of dendritic cells, samples were stained with FITC-conjugated anti-CD11c. Cells were analyzed using a FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA). 
【００１９】
Preparation of Tumour Lysate 
The mouse mammary breast cancer cell line, 4T1 was cultured in a T25cm2 flask with RPMI 1640 medium supplemented 10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin and 1% glutamine. The cells were incubated at 37℃ in a 5% CO2 incubator. For TRF treatment, confluent cells were treated with 8ug/ml of TRF (Tocotrienol Rich Fraction, Carotech) for 3 days. A tumour lysate was made by subjecting the cells to two freeze/thaw cycles from -80℃ to 25℃. GM-CSF, IL-4 and TNF-α were added to the lysate at the same concentration as that of dendritic cells culture. The lysate was added to plated dendritic cells and pulsed overnight at 37℃. The dendritic cells were pulsed with tumour lysate were then collected and centrifuged at 2000rpm for 5 minutes, washed three times with 1x PBS solution and resuspended in complete medium before injecting into mice. 
【００２０】
Treatment of Mice 
Six-week-old BALB/c mice were orthotopically injected with 104 4T1 tumour cells into the mammary gland. The dendritic cells were pulsed with 4T1 tumour cell lysate at a ratio of 1:1 10 tumour cell equivalents/dendritic cell for 24 hours. After pulsing, the dendritic cells were matured with 200 units/ml of TNF-α for 48 hours. Mice were injected locally (i.t.) with 1.5 x 106 tumour cell lysate-pulsed, matured dendritic cells in 50 μl of PBS on day 15 when tumours were palpable. Vaccination was repeated on days 20 and 25. Primary tumours were measured using vernier calipers. 
【００２１】
Experimental Design 
Each Batch consists of 4 groups of mice:
Group 1: Only injected with 4T1
Group 2: 4T1 + Dendritic Cells pulsed with tumour lysate
Group 3: 4T1 + Dendritic cells pulsed with tumour lysate + TRF
Group 4: Injected with dendritic cells 
【００２２】
I) 1st Batch (Immunisation)
2007254458.tif 000010
II) 2nd Batch (Treatment)
2007254458.tif 000011
【００２３】
Purification of Dendritic Cells using Mini Macs Magnetic Beads 
Dendritic cells were gently scrapped and centrifuged at 1000g for 10 minutes at room temperature and re-suspended into 90μL buffer (PBS pH 7.2 supplemented with 2mM EDTA 15 and 0.5% BSA). 10μL of CD 11c microbeads were added to the dendritic cells and incubated for 15 minutes at 4℃. The column was washed with 500μL of buffer before dendritic cells separation. Column was washed three times with buffer to remove the negative fractions. The column was removed from the magnet and dendritic cells were eluted with 1 ml of buffer. 
【００２４】
Results 
1) Dendritic cells were successfully obtained and grown from mouse bone marrow. 
2) Pure dendritic cells were isolated using the mini macs kit. 
3) Cytokines were measured in dendritic cells incubated with TRF. There was a linear increase in IFN-γcompared to control cells at the concentrations tested (1-5μg/ml). 
4) Tocotrienol - supplemented dendritic cells that are pulsed with 4T1 mammary gland tumour lysate inhibited the growth of widespread and metastatic breast tumour in mouse models. 
5) Tumours that developed in control mice were bigger than in mice injected with dendritic 15 cells. 
The results are shown in the accompanying drawings FIGS. 1 to 4. 
【００２５】
Characterisation of dendritic cells 
2007254458.tif 000012
【００２６】
Brief Description of Drawings
For the purpose of facilitating and understanding of the present invention, there is illustrated in the accompanying drawings, from an inspection of which, when considered in connection 5 with the following description, the invention, its construction and operation and many of its advantages would be readily understood and appreciated. 
FIG. 1 is a chart showing interferon gamma levels in dendritic cells treated with a tocotrienol-rich fraction (TRF) obtained from a palm oil fruit; 
FIG. 2 is a chart showing tumour incidence in BALB/c mice pulsed with dendritic cells and treated with the TRF;
FIG. 3 is a chart showing weight of BALB/c mice versus weeks; 
FIG. 4 is a chart showing interferon-gamma (IFN-γ) levels in BALB/c mice injected with 4T1 and treated with pulsed dendritic cells. 
CLAIMS 
1. A method for producing a composition for use as a medicament for treatment or prevention of cancer, the method including the steps of: 
(a) culturing dendritic cells isolated from a patient, under conditions conducive for their growth and proliferation such as conditions suitable for the growth and survival of mammalian cells, on or in a nutrient-rich medium which contains nutrients suitable for the survival and growth of mammalian cells; 
(b) pulsing said dendritic cells with lysate or a species-defining antigen from a cancerous cell line, and a tocotrienol, under culture and environmental conditions suitable for the survival and growth of the mammalian cells; and 
(c) containing the pulsed dendritic cells in a solid or liquid form suitable for administration to a patient in need thereof.
2. A method in accordance with claim 1, wherein the dendritic cells are cultured at 36-38℃, preferably 37℃.
3. A method in accordance with claim 2, wherein the culture medium used is RPMI 1640 containing 10% heat-inactivated FBS, 0.1 mM nonessential amino acids, 1 μM sodium pyruvate, 2 mM L-glutamine, 100 μg/ml streptomycin, 100 units/ml penicillin, 0.5 μg/ml fungizone, and 5 x 10-5 M 2-mercaptoethanol.
4. A method in accordance with claim 1 wherein the dendritic cells were harvested from flushed marrow cavities of femurs and tibiae under aseptic conditions and cultured in T25 flasks with 100 units/ml granulocyte macrophage colony-stimulating factor and 100 units/ml interleukin 4 (Peprotech, Rocky Hill, NJ) at 106 cells/ml in complete media (RPMI 1640 containing 10% heat-inactivated FBS, 0.1 mM nonessential amino acids, 1 μM sodium pyruvate, 2 mM L-glutamine, 100 μg/ml streptomycin, 100 units/ml penicillin, 0.5 μg/ml fungizone, and 5 x 10-5 M 2-mercaptoethanol).
5. A method in accordance with claim 1 wherein the dendritic cells are matured with 200 units/ml of TNF-α (Peprotech) for 48 hours prior to exposure to the TRF.
6. A method in accordance with claim 1, wherein the tocotrienol is tocotrienol-rich fraction (TRF) obtained from palm oil fruit.
7. A method in accordance with claim 6, wherein the TRF acts an adjuvant to enhance serum levels of interferon-gamma (IFN-γ) in a patient suffering from cancer.
8. A method in accordance with claim 1, wherein the cancerous cell lysate is obtained from a breast cancer cell line, melanoma cell line, lung cancer cell line, prostate cancer cell line, colon cancer cell line, ovarian cancer cell line or a cell line of other histological type.
9. A method in accordance with claim 1, wherein the cancer cell lysate is obtained from a breast cancer cell line.
10. A use of an effective amount of a vaccine made in accordance with claim 1 in the manufacture of a medicament for preventing or treating cancer in a patient.
11. A use of an effective amount of a vaccine made in accordance with claim 10, wherein the cancer is a tumour.
12. A use of an effective amount of the tocotrienol in accordance with claim 1, wherein the 5 dendritic cells present tumour antigens to the immune system.
13. A use of an effective amount of a vaccine made in accordance with claim 1 as an adjuvant for enhancing serum levels of interferon-gamma (IFN-γ) in a patient suffering from cancer.
14. A vaccine for the treatment or prevention of cancer in a patient, comprising a composition made in accordance with the method of claim 1 in a pharmaceutically acceptable vehicle.
Abstract
The present invention relates to a method for producing a composition for use as a vaccine for treatment or prevention of cancer. The method includes the steps of isolating dendritic cells from a blood, bone marrow or other tissue sample of a patient suffering from cancer or from an unrelated donor, culturing the dendritic cells under conditions and pulsing the dendritic cells with tumour cell lysate or an antigen released by the type of tumour cell and a tocotrienol. 
Representative Drawing FIG.2
【図１】
2007254458.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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