(57)【要約】【課題】癌抑制遺伝子を新たに見出してこれを含有する癌抑制剤ならびに該癌抑制遺伝子を用いる癌の診断方法を提供する。【解決手段】ＰＣＤＨ２０遺伝子又はその相同遺伝子を含有する癌抑制剤；ＰＣＤＨ２０タンパク質又はその相同タンパク質を含有する癌抑制剤。ＰＣＤＨ２０遺伝子の全部又はその一部を含むＤＮＡ又はＲＮＡを用いて検体試料中のＰＣＤＨ２０遺伝子を解析する工程を含む癌の診断方法；ならびにＰＣＤＨ２０タンパク質に対する抗体又はその断片を用いて検体試料中のＰＣＤＨ２０タンパク質を解析する工程を含む癌の診断方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＤＨ２０遺伝子又はその相同遺伝子を含有する癌抑制剤。
【請求項２】
前記遺伝子又はその相同遺伝子がベクターに組み込まれている、請求項１に記載の癌抑制剤。
【請求項３】
前記ベクターがウイルスベクター又は動物細胞発現用プラスミドベクターである、請求項２に記載の癌抑制剤。
【請求項４】
前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである、請求項３に記載の癌抑制剤。
【請求項５】
前記遺伝子又はその相同遺伝子がリポソームに封入されている、請求項１に記載の癌抑制剤。
【請求項６】
ＰＣＤＨ２０タンパク質又はその相同タンパク質を含有する癌抑制剤。
【請求項７】
ＰＣＤＨ２０遺伝子の全部又はその一部を含むＤＮＡ又はＲＮＡを用いて検体試料中のＰＣＤＨ２０遺伝子を解析する工程を含む、癌の診断方法。
【請求項８】
前記解析が遺伝子の変異の検出又は遺伝子の発現量の異常の検出である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＰＣＤＨ２０遺伝子の全部又はその一部を含むＤＮＡを用いて検体試料中のＰＣＤＨ２０遺伝子のメチル化を解析する工程を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ＰＣＤＨ２０タンパク質に対する抗体又はその断片を用いて検体試料中のＰＣＤＨ２０タンパク質を解析する工程を含む、癌の診断方法。
【請求項１１】
前記解析がタンパク質の発現量の異常の検出である、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌抑制遺伝子及び該遺伝子がコードするタンパク質の医薬用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の発症は細胞のタンパク質の変異や量的変化に起因することは古くから知られている。近年の遺伝子工学の発達は特定タンパク質をコードする遺伝子の増幅や癌細胞における遺伝子変異の解析を可能にし、癌研究の分野においても飛躍的な発展をもたらした。これまでに細胞の癌化や癌細胞の異常増殖に関与するいわゆる癌遺伝子の解析及び同定が進んでいる。一方、変異あるいは発現低下により癌化につながる癌抑制遺伝子がここ数年脚光を浴びている。これまでに癌抑制遺伝子として網膜芽細胞腫のＲｂ遺伝子、大腸癌のｐ５３遺伝子及びＡＰＣ遺伝子、Ｗｉｌｍｓ腫瘍のＷＴ１遺伝子などが発見されている。ＷＴ１遺伝子を活用した癌抑制剤の例も報告されている（特許文献１）。
【０００３】
また、癌の発生、進展悪性化、転移などには一つの遺伝子の異常だけでなく複数の遺伝子の異常が関与していることが次第に明らかになりつつあり、さらに多くの未同定の癌遺伝子及び癌抑制遺伝子が存在するものと考えられている。癌抑制効果を有する遺伝子は数多く知られているが、多くの場合、その選別には患者の遺伝子の変異を、染色体ＤＮＡを染色することにより視覚化して見つけ出すアプローチ（非特許文献１）や、遺伝子の欠失をＬＯＨ（Ｌｏｓｓ  Ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）解析で大まかな範囲を選定した後、重要な遺伝子領域を絞り込むという方法がこれまで行われてきた（特許文献２）。しかし、これらの方法では、判別できるＤＮＡ欠失領域が莫大なものとなり、重要な遺伝子領域を絞り込む作業に大量の時間と手間を必要とする欠点を持っており、癌抑制遺伝子を探し出す手段としては限界があった。また、従来の癌病態の分離・識別法では悪性度の判定は困難であった。
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２００３／００２１４２号公報
【特許文献２】ＷＯ０１／０３２８５９号公報
【非特許文献１】Ｙａｓｕｈｉｄｅ  Ｙａｍａｓｈｉｔａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ，１１（３３）：５１２９−５１３５，２００５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、癌抑制遺伝子を新たに見出してこれを含有する癌抑制剤を提供することを課題とする。本発明はまた、該癌抑制遺伝子がコードするタンパク質を含有する癌抑制剤を提供することを課題とする。本発明はさらに、該癌抑制遺伝子の発現量、ゲノムＤＮＡのメチル化を計測することによる癌患者の病態の悪性度を診断する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決すべく非小細胞肺癌症例のＤＮＡの部分欠失領域の探索やメチル化度の異なる遺伝子を同定することを精力的に行ってきた。非小細胞肺癌は、さらに腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、腺扁平上皮癌などの組織型に分類され、肺癌の８割以上を占める。癌細胞の場合、大半はメチル化されていないはずの癌の発生を抑える遺伝子（癌抑制遺伝子）の５’領域に存在するＣｐＧ部位が密集したゲノム領域（ＣｐＧアイランド）が異常にメチル化され、メッセンジャーＲＮＡへの発現が抑制されていることがある。近年、遺伝子の突然変異と並ぶ、重要な発癌機構として認知されている。本発明は、非小細胞肺癌におけるメチル化ＤＮＡを特定するため、新規に開発されたアレイＣＧＨ法Ｉｎａｚａｗａ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．  ９５（７）  ，５５９，２００４）により癌で高頻度に欠失した遺伝子をスクリーニングした。さらに、本発明者らは、ＣＯＢＲＡ（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）法（Ｔｏｙｏｔａ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９，２３０７，１９９９）とＲＴ−ＰＣＲ法を組み合わせ、非小細胞肺癌でＤＮＡのメチル化度が高く、発現が著しく抑制されている遺伝子を同定することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち本発明によれば、ＰＣＤＨ２０遺伝子（Ｐｒｏｔｏｃａｄｈｅｒｉｎ  ２０；  ＰＣＤＨ２０、  別名  Ｐｒｏｔｏｃａｄｈｅｒｉｎ  １３）又はその相同遺伝子を含有する癌抑制剤が提供される。
【０００８】
好ましくは、前記遺伝子又はその相同遺伝子はベクターに組み込まれている。
好ましくは、前記ベクターはウイルスベクター又は動物細胞発現用プラスミドベクターである。
好ましくは、前記ウイルスベクターはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである。
好ましくは、前記遺伝子又はその相同遺伝子はリポソームに封入されている。
【０００９】
本発明の別の態様によれば、ＰＣＤＨ２０タンパク質又はその相同タンパク質を含有する癌抑制剤が提供される。
【００１０】
本発明のさらに別の態様によれば、ＰＣＤＨ２０遺伝子の全部又はその一部を含むＤＮＡ又はＲＮＡを用いて検体試料中のＰＣＤＨ２０遺伝子を解析する工程を含む、癌の診断方法が提供される。
【００１１】
好ましくは、前記解析は遺伝子の変異の検出又は遺伝子の発現量の異常の検出である。
好ましくは、本発明の上記の診断方法は、ＰＣＤＨ２０遺伝子の全部又はその一部を含むＤＮＡを用いて検体試料中のＰＣＤＨ２０遺伝子のメチル化を解析する工程を含む。
【００１２】
本発明のさらに別の態様によれば、ＰＣＤＨ２０タンパク質に対する抗体又はその断片を用いて検体試料中のＰＣＤＨ２０タンパク質を解析する工程を含む、癌の診断方法が提供される。
【００１３】
好ましくは、前記解析はタンパク質の発現量の異常の検出である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、新たに癌抑制機能を見出したＰＣＤＨ２０遺伝子又は該遺伝子がコードするＰＣＤＨ２０タンパク質を含有する癌抑制剤が提供される。これらの薬剤は癌の個別性に基づく治療や癌の予後の改善などの臨床上の観点から、あるいは癌の基礎的研究の観点から非常に有用である。また、ＰＣＤＨ２０遺伝子プロモーター領域のメチル化もしくはそのメッセンジャーＲＮＡの発現量を測定することで、非小細胞肺癌患者の悪性度（余命）を予測することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の実施態様及び実施方法について詳細に説明する。
（１）癌抑制剤
本発明の一態様によれば、本発明の癌抑制剤は有効成分としてＰＣＤＨ２０（Ｐｒｏｔｏｃａｄｈｅｒｉｎ  ２０；  ＰＣＤＨ２０、  別名  Ｐｒｏｔｏｃａｄｈｅｒｉｎ  １３）遺伝子又はその相同遺伝子を含む。本発明のもう一つの態様によれば、本発明の癌抑制剤は有効成分としてＰＣＤＨ２０タンパク質又はその相同タンパク質を含む。
【００１６】
ＰＣＤＨ２０遺伝子の塩基配列及びＰＣＤＨ２０タンパク質のアミノ酸配列は既に知られており（Ｋｏｏｌｓ，Ｐ．Ｆ．Ｊ．，  Ｖａｎ  Ｒｏｙ，Ｆ．，  １９９９）、ＰＣＤＨ２０遺伝子の塩基配列はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  のデータベースにＡＦ１６９６３番にて、またＰＣＤＨ２０タンパク質のアミノ酸配列は同データベースにＮＰ０７３７５４番にて登録されている。ＰＣＤＨ２０遺伝子の塩基配列は配列番号１に記載する通りであり、ＰＣＤＨ２０タンパク質は配列番号１の塩基配列の７２番目から２８４６番目までの領域をコードし、そのアミノ酸配列は配列番号２に示される通りである。
【００１７】
本明細書において「ＰＣＤＨ２０遺伝子」というのは、上記塩基配列で特定されるヒト由来の遺伝子をいい、「ＰＣＤＨ２０タンパク質」というのは、該ＰＣＤＨ２０遺伝子がコードし、上記アミノ酸配列で特定されるタンパク質をいう。
【００１８】
ＰＣＤＨ２０遺伝子は、当業者に公知の技術を用いて培養細胞などから取得したｃＤＮＡであってもよいし、又は本明細書の配列番号１に記載の塩基配列に基づいてＰＣＲ法などにより化学的に合成したものでもよい。ＰＣＲ法により配列番号１に記載した塩基配列を有するＤＮＡを取得する場合、ヒトの染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを使用してＰＣＲを行う。ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片は大腸菌などの宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００１９】
上記のブローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，  ２nd  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ．，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）などに記載された方法に準じて行うことができる。
【００２０】
本発明において、「ＰＣＤＨ２０遺伝子の相同遺伝子」とは、配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加又は置換されている塩基配列であって、癌抑制活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子；又は配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、癌抑制活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子いう。また、ＰＣＤＨ２０遺伝子の相同遺伝子にはＰＣＤＨ２０遺伝子の断片も含まれる。
【００２１】
上記の「配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加又は置換されている塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から６０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個程度を意味する。
【００２２】
上記の「癌抑制活性」の程度は特に限定はされないが、好ましくはＰＣＤＨ２０タンパク質が有する癌抑制活性と実質的に同等又はそれ以上の癌抑制活性をいう（以下、本明細書における「癌抑制活性」は同じ意味を示す）。
【００２３】
従って、「ＰＣＤＨ２０遺伝子の相同遺伝子」は上記に定義される構造と機能を有する限り、由来は問わず、ヒト以外の哺乳動物由来であってもよいし、ヒトなどの哺乳動物由来の遺伝子に対して人工的に変異を導入したものであってもよい。ただし、該遺伝子を後記のごとく癌抑制剤に使用する場合は臨床上の安全性の観点からヒト由来のものが好ましい。
【００２４】
上記の「配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基が欠失、付加又は置換されている塩基配列であって、癌抑制活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子」は、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。具体的には、上記遺伝子は配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡを利用し、これらＤＮＡに変異を導入することにより取得することができる。例えば、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法などを用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，  ２nd  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ．，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆Ｓｏｎｓ  （１９８７−１９９７）などに記載の方法に準じて行うことができる。
【００２５】
上記の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニー又はプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡなどを挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，  ２nd  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ．，１９８９などに記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２６】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００２７】
上記の「配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、癌抑制活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子」は、上述の通り、一定のハイブリダイゼーション条件下でコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法などを行うことにより得ることができる。
【００２８】
本発明において、「ＰＣＤＨ２０タンパク質の相同タンパク質」とは、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は挿入したアミノ酸配列であって、癌抑制活性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質；又は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、癌抑制活性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をいう。
【００２９】
上記した「配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は挿入したアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００３０】
上記した「配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、該アミノ酸配列と配列番号２に記載のアミノ酸配列との相同性が少なくとも７０％以上であり、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上であることを意味する。
【００３１】
ＰＣＤＨ２０タンパク質は、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。比較的容易な操作でかつ大量に製造できるという点では、組み換えタンパク質が好ましい。
【００３２】
天然由来のタンパク質は、該タンパク質を発現している細胞又は組織からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせて単離することができる。化学合成タンパク質は、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法に従って合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。組み換えタンパク質は、該タンパク質をコードする塩基配列（例えば、配列番号１に記載の塩基配列）を有するＤＮＡを好適な発現系に導入することにより生産することができる。
【００３３】
なお、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換又は挿入したアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の一例を示す配列番号１に記載の塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜製造又は入手することができる。
【００３４】
本発明の癌抑制剤の好ましい態様としては、有効成分として上記のＰＣＤＨ２０遺伝子又はその相同遺伝子をベクターに組み込んだ組換えベクターを含む。ベクターとしてはウイルスベクター又は動物細胞発現用ベクター、好ましくはウイルスベクターが用いられる。
【００３５】
ウイルスベクターとしてはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。中でも、レトロウイルスベクターは、細胞に感染後、ウイルスゲノムが宿主染色体に組み込まれ、ベクターに組み込んだ外来遺伝子を安定にかつ長期的に発現させる可能であるからレトロウイルスベクターを使用することが特に望ましい。
【００３６】
動物細胞発現用ベクターとしては例えばｐＣＸＮ２（Ｇｅｎｅ，  １０８，  １９３−２００，  １９９１）、ＰＡＧＥ２０７（特開平６−４６８４１号公報）又はその改変体などを用いることができる。
【００３７】
上記組換えベクターは適当な宿主に導入して形質転換し、得られた形質転換体を培養することによって生産することができる。組換えベクターがウイルスベクターの場合、これを導入する宿主としてはウイルス生産能を有する動物細胞が用いられ、例えば、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞などが挙げられる。レトロウイルスベクターの宿主としては、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、ＭＬＶなどが、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターの宿主としては、ヒト胎児腎臓由来の２９３細胞などが用いられる。ウイルスベクターの動物細胞への導入はリン酸カルシウム法などで行うことができる。また、組換えベクターが動物細胞発現用ベクターの場合、これを導入する宿主としては大腸菌Ｋ１２株、ＨＢ１０１株、ＤＨ５α株などを使用でき、大腸菌の形質転換は当業者に公知である。
【００３８】
得られた形質転換体はそれぞれに適した培地、培養条件により培養する。例えば、大腸菌の形質転換体の培養は、生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他を含有するｐＨ５〜８程度の液体培地を用いて行うことができる。培養は通常１５〜４３℃で約８〜２４時間程度行う。この場合、目的とする組み換えベクターは、培養終了後、通常のＤＮＡ単離精製法により得ることができる。
【００３９】
また、動物細胞の形質転換体の培養は、例えば約５〜２０％のウシ胎児血清を含む１９９培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地などの培地を用いて行うことができる。培地のｐＨは約６〜８が好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１８〜６０時間行う。この場合、目的とする組み換えベクターは、それを含有するウイルス粒子が培養上清中に放出されるので、ウイルス粒子の濃縮、精製を塩化セシウム遠心法、ポリエチレングリコール沈澱法、フィルター濃縮法などにより得ることができる。
【００４０】
本発明の癌抑制剤のうち、有効成分としてＰＣＤＨ２０遺伝子又はその相同遺伝子を含む癌抑制剤（以下、遺伝子治療剤という）は、有効成分であるＰＣＤＨ２０遺伝子又はその相同遺伝子を遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合することにより製造することができる。また、ＰＣＤＨ２０遺伝子又はその相同遺伝子をウイルスベクターに組み込んだ場合は、組換えベクターを含有するウイルス粒子を調製し、これを遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合する。
【００４１】
上記基剤としては、通常注射剤に用いる基剤を使用することができ、例えば、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物などの塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコースなどの溶液、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液などが挙げられる。あるいはまた、当業者に既知の常法に従って、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、植物油、界面活性剤などの助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製することもできる。これらの注射剤は、粉末化、凍結乾燥などの操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。
【００４２】
また、本発明の遺伝子治療剤は、常法により調製されたリポソームの懸濁液にＰＣＤＨ２０遺伝子を添加し凍結した後融解することにより製造することもできる。リポソームを調製する方法は、薄膜振とう法、超音波法、逆相蒸発法、界面活性剤除去法などがある。リポソームの懸濁液は超音波処理した後、遺伝子を添加するのが遺伝子の封入効率を向上させる上で好ましい。遺伝子を封入したリポソームはそのまま、又は水、生理食塩水などに懸濁して静脈投与することができる。
【００４３】
上記遺伝子治療剤の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内などの全身投与でもよいし、あるいは癌原病巣又は予想転移部位に対して、局所注射又は経口投与などの局所投与を行ってもよい。さらに、遺伝子治療剤の投与にあたっては、カテーテル技術、遺伝子導入技術、又は外科的手術などと組み合わせた投与形態をとることもできる。
【００４４】
上記遺伝子治療剤の投与量は、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日当たり組み換え遺伝子の重量として１μｇ／ｋｇ体重から１０００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。
【００４５】
また、本発明の癌抑制剤のうち、有効成分としてＰＣＤＨ２０タンパク質又はその相同タンパク質を含む癌抑制剤（以下、タンパク質製剤という）は、有効成分であるＰＣＤＨ２０タンパク質又はその相同タンパク質に製剤用添加物（例えば、担体、賦形剤など）を含む医薬組成物の形態で提供される。
【００４６】
上記タンパク質製剤の形態は特に限定されず、経口投与のための製剤としては例えば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤などが挙げられ、非経口投与のための製剤としては例えば、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、経粘膜吸収剤、経皮吸収剤などが挙げられる。
【００４７】
上記タンパク質製剤の投与経路は特に限定されず、経口投与又は非経口投与（例えば、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与などへの粘膜投与、又は吸入投与など）の何れでもよい。
【００４８】
上記タンパク質治療剤の投与量は、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日あたり０．００１μｇ／ｋｇ体重から１０００μｇ／ｋｇ体重程度の範囲であり、好ましくは０．００１μｇ／ｋｇ体重から１００μｇ／ｋｇ体重程度の範囲である。投与回数は特に限定されない。
【００４９】
上記癌抑制剤（遺伝子治療剤及びタンパク質製剤の両形態を含む）は、その有効量をヒトを含む哺乳動物に投与することによって癌を抑制するのに使用することができる。上記癌抑制剤はまたその予防及び／又は治療有効量をヒトを含む哺乳動物に投与することによって癌の予防及び／又は治療をするのに使用することができる。
【００５０】
本明細書でいう「癌抑制」とは、癌の発生又は転移・着床を防止するという予防的作用、ならびに癌細胞の増殖を抑制したり、癌を縮小することによって癌の進行を阻止したり、症状を改善させるという治療的作用の両方を含む最も広い意味を有し、いかなる場合においても限定的に解釈されるものではない。
【００５１】
本発明の癌抑制剤の適用対象となる癌の具体例としては、例えば悪性黒色腫、悪性リンパ腫、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、尿管腫瘍、胆嚢癌、胆管癌、胆道癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、睾丸腫瘍、上顎癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、甲状腺癌、脳腫瘍、カポジ肉腫、血管腫、白血病、真性多血症、神経芽細胞腫、網膜芽腫、骨髄腫、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚癌、基底細胞癌、皮膚付属器癌、皮膚転移癌、皮膚黒色腫などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、上記のうち特に好ましい適用対象となる癌は、非小細胞肺癌である。
【００５２】
（２）ＰＣＤＨ２０遺伝子を用いた癌の診断方法
本発明の癌の診断方法としては、癌の悪性度の診断方法、本発明の癌抑制剤の適用対象となる癌を選別するための診断方法などを挙げることができる。本発明の癌の診断方法は、ＰＣＤＨ２０遺伝子の全部又はその一部を含むＤＮＡ又はＲＮＡを用いて検体試料中のＰＣＤＨ２０遺伝子を解析する工程を含む。
【００５３】
ここで、ＰＣＤＨ２０遺伝子の一部とは、配列番号１に記載するＰＣＤＨ２０遺伝子の塩基配列のうち、例えば約１０〜３０個の連続する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを意味する。検体試料としては、腫瘍が疑われる組織切片、血液、リンパ液、喀痰、肺洗浄液、尿、便、組織培養上清などを用いることができる。
【００５４】
上記の「癌抑制剤の適用対象となる癌を選別するための検出」とは組織等における本発明における癌抑制剤が有効に作用する癌の存在の有無を知ることをいう。
【００５５】
癌の診断は、ＰＣＤＨ２０遺伝子の全部又はその一部を含むＤＮＡ又はＲＮＡをプライマー又はプローブとして用いて検体試料中のＰＣＤＨ２０遺伝子を解析することにより行う。ここで「ＰＣＤＨ２０遺伝子を解析する」とは、具体的にはゲノムＤＮＡのメチル化の検出又は遺伝子の発現量の異常を検出することをいう。
【００５６】
遺伝子の変異の検出は、上記ＤＮＡ又はＲＮＡをプライマーとして用いる場合では、例えば選択した２種の配列のプライマーによりＰＣＲ法で検体試料より調製したＤＮＡの部分配列を増幅させ、亜硫酸水素ナトリウムを処理することで、ゲノムＤＮＡ中の非メチル化シトシン（Ｃ）を、ウラシル（Ｕ）に変換する。メチル化されているシトシンは構造上安定であるために、この反応を受けず、ウラシルに変換されない。メチル化の影響を受ける制限酵素と組み合わせて変化したシトシンと非メチル化シトシンを制限酵素切断により解析することにより、メチル化ＤＮＡの存在を特定できる（ＣＯＢＲＡ法）。またＰＣＲ法で検体試料より調製したＤＮＡの部分配列を増幅させ、亜硫酸水素ナトリウムを処理後、この増幅産物をプラスミドに組み込み、宿主細胞を形質転換させて培養し、得られるクローンの塩基配列を解析することにより行うことも可能である。
【００５７】
一方、遺伝子の発現量の異常の検出は、上記ＲＮＡ配列を含むプローブを用いてノーザンハイブリダイゼーション法又はＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によって行うことができる。
【００５８】
（３）ＰＣＤＨ２０タンパク質抗体又はその断片を用いた癌の診断方法
本発明の癌の診断方法は、ＰＣＤＨ２０タンパク質に対する抗体又はその断片を用いて検体試料中のＰＣＤＨ２０タンパク質の量を解析する工程を含む。
【００５９】
本方法に用いるＰＣＤＨ２０タンパク質に対する抗体（以下、ＰＣＤＨ２０抗体という）は、ＰＣＤＨ２０タンパク質の全部又は一部を抗原として、通常の方法で作成することができる。ＰＣＤＨ２０タンパク質の一部とは、配列番号２に記載するＰＣＤＨ２０タンパク質のアミノ酸配列のうち、例えば連続する少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは、少なくとも約１１〜２０個のアミノ酸からなるポリペプチドをいう。抗原とするＰＣＤＨ２０タンパク質の全部又は一部の調製法は生物学的手法、化学合成手法いずれでもよい。
【００６０】
ポリクローナル抗体は、例えば上記抗原をマウス、モルモット、ウサギなどの動物の皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内などに複数回接種し十分に免疫した後、該動物から採血、血清分離して作製することができる。モノクローナル抗体は、例えば上記抗原で免疫したマウスの脾細胞と市販のマウスミエローマ細胞との細胞融合により得られるハイブリドーマを作成後、該ハイブリドーマ培養上清、又は該ハイブリドーマ投与マウス腹水から作成することができる。
【００６１】
上記のようにして調製したＰＣＤＨ２０タンパク質抗体又はその断片を用いることによって検体試料中のＰＣＤＨ２０タンパク質の発現量を知ることができる。測定には、例えばイムノブロット法、酵素抗体法（ＥＩＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光抗体法、免疫細胞染色などの免疫学的方法、又はウェスタンブロット法などが利用できる。ここで、ＰＣＤＨ２０タンパク質抗体の断片とは当該抗体の一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）などをいう。また、検体試料としては、腫瘍が疑われる組織切片、血液、リンパ液、喀痰、肺洗浄液、尿、便、組織培養上清などを用いることができる。測定した検体試料中のＰＣＤＨ２０タンパク質の発現量が低い場合は、検体とした組織や細胞においてＰＣＤＨ２０遺伝子の発現が抑制されていることになり、本発明の癌抑制剤の適用対象となる癌を選別することができる。
【００６２】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
【実施例】
【００６３】
（１）実験材料
用いた細胞株は扁平上皮細胞株ＥＢＣ−１，ＬＫ−２，ＰＣ１０，ＶＭＲＣ−ＬＣＰ，ＬＣ−１ｓｑ，ＡＣＣ−ＬＣ−７３、腺癌細胞株１１−１８，Ａ５４９，ＡＢＣ−１，ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＯＫ，ＶＭＲＣ−ＬＣＤ，ＳＫ−ＬＣ−３，ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＫＪ、大細胞癌細胞株ＫＮＳ−６２，８６−２，ＬＵ６５，ＰＣ−１３，ＡＣＣ−ＬＣ−３３，ＮＣＩ−Ｈ４６０，ＬＵ９９Ａを用いた。臨床検体由来の肺癌サンプルに関し、５３種の腺癌のパラフィン包埋サンプル、５９種の隣接正常部位を含む急速凍結サンプルを使用した。臨床検体由来の癌サンプルは国立がんセンター、長野北信総合病院から入手し、各患者の同意をもってかつ各組織の倫理委員会の承認を得て使用した。また臨床検体供与者は、採取前に放射線、化学療法、免疫療法は施されていない。また、ＤＮＡとしてメチル化を阻害した材料を得るため、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの阻害剤である５−アザ−デオキシシチジン（５−ａｚａ−ｄＣｙｄ）を各種細胞に５ｍＭの濃度で５日間添加して培養を行った。ヒストン脱アセチル化効果を観察するため、ヒストン脱アセチル化酵素の非特異的阻害物質であるトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）を１００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞回収前１２時間添加し培養を行った。
【００６４】
（２）アレイＣＧＨ法による非小細胞肺癌細胞での欠失ＤＮＡの分離
アレイＣＧＨ法にて、ＭＣＧ  Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｒｒａｙ−４５００（Ｉｎａｚａｗａ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．９５（７），５５９，２００４）を用いて非小細胞肺癌細胞株におけるホモ欠失遺伝子のスクリーニングを行った。癌細胞由来ＤＮＡをＣｙ３で標識し、健常人コントロールサンプルのＣｙ５で標識された標識体と混合しハイブリダイゼーション後両者の蛍光シグナルを除した値が、２を底とする対数値で−２．０以下の値を示したＢＡＣクローンとその中に含まれる遺伝子を示している（表１）。各種肺癌細胞で欠失領域が見出され癌抑制遺伝子ＣＤＫＮ２を代表とする遺伝子欠失が検出されたが、我々はこれまで癌との関係が論じられていなかったＰＣＤＨ２０遺伝子に着目した。ＰＣＤＨ２０遺伝子はＢＡＣクローンの番号ＲＰ１１−３０７Ｄ１７の近傍に含まれる遺伝子であり、１３番染色体のｑ２１．２領域に存在する。ＶＭＲＣ−ＬＣＤ細胞株でこの領域の欠失が確認された。
【００６５】
【表１】
2007254318.tif 000002
【００６６】
（３）ＰＣＤＨ２０遺伝子を含むＢＡＣクローンＲＰ１１−３０７Ｄ１７近傍の構造
ＶＭＲＣ−ＬＣＤ細胞株で欠失が確認された１３番染色体のｑ２１．２近傍のＰＣＤＨ２０遺伝子を含む構造を図１に示す。白抜き矢印で示す欠失領域（Ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を含む２．５メガベース（Ｍｂ）中のＰＣＤＨ２０遺伝子近傍のゲノムＤＮＡ構造中には、２個の遺伝子、ＴＤＲＤ３、ＰＣＤＨ２０が含まれていた。
【００６７】
（４）各種細胞のゲノムにおけるＴＤＲＤ３およびＰＣＤＨ２０遺伝子の存在
腺癌細胞株（Ａｄｅｎｏ）１１−１８，  Ａ５４９，ＶＭＲＣ−ＬＣＤ，ＳＫ−ＬＣ−３，  ＡＢＣ−１，  ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＯＫ，  ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＫＪ、扁平上皮細胞株（ＳＣＣ）ＥＢＣ−１，  ＬＫ−２，  ＰＣ１０，  ＶＭＲＣ−ＬＣＰ，  ＬＣ−１  ｓｑ，  ＡＣＣ−ＬＣ−７３，大細胞癌細胞株（Ｌａｒｇｅ）  ＫＮＳ−６２，８６−２，  ＬＵ６５，  ＰＣ−１３，ＮＣＩ−Ｈ４６０，  ＡＣＣ−ＬＣ−３３，ＬＵ９９Ａ各細胞株から、ＤＮＡを抽出しＴＤＲＤ３（Ｔｕｄｏｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３）およびＰＣＤＨ２０遺伝子領域のゲノムの存在についてＰＣＲ検出を行った結果を図２に示す。ＶＭＲＣ−ＬＣＤ細胞株でＴＤＲＤ３およびＰＣＤＨ２０遺伝子が欠失していることが検出されたが他の細胞株ではゲノムＤＮＡレベルでの欠失が見られなかった。陽性コントロールとしてＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３燐酸−デヒドロゲナーゼ）遺伝子を用いた。
【００６８】
（５）ＰＣＤＨ２０遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現
ＰＣＤＨ２０遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現量を測定するため正常肺（Ｎｏｒｍａｌ−ｌｕｎｇ）をコントロールとし、非小細胞肺癌細胞株２０株についてＲＴ−ＰＣＲを行った（図３）。ＲＴ−ＰＣＲの発現量のコントロールとして発現量が細胞種、条件で変化しにくいことで知られるＧＡＰＤＨを用いた。予想通り、ＴＤＲＤ３およびＰＣＤＨ２０遺伝子がＤＮＡ上欠失しているＶＭＲＣ−ＬＣＤ細胞株で両者ともメッセンジャーＲＮＡの発現が観られないことが観察された。また、多くの細胞株でＤＮＡは存在するものの、ＰＣＤＨ２０遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ量が低いもしくは全く発現されていない細胞種が存在した（１１−１８，  Ａ５４９，ＶＭＲＣ−ＬＣＤ，  ＡＢＣ−１，  ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＯＫ，  ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＫＪ、ＥＢＣ−１，  ＰＣ１０，  ＬＣ−１  ｓｑ，  ＫＮＳ−６２，８６−２，  ＬＵ６５，  ＰＣ−１３，  ＡＣＣ−ＬＣ−３３）。この事象はゲノムレベルの変異ではなくエピジェネティックな機構が遺伝子発現に関与していることを意味する。
【００６９】
（６）ＰＣＤＨ２０遺伝子のメチル化、脱メチル化状態でのメッセンジャーＲＮＡの発現比較
通常培養条件下、ＰＣＤＨ２０遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現をＡＢＣ−１とＬＵ６５の２細胞株について、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの阻害剤である５−アザ−デオキシシチジン（５−ａｚａ−ｄＣｙｄ）を各種細胞に５，１０μＭの濃度で５日間添加および、ヒストン脱アセチル化酵素の非特異的阻害物質であるトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）を１００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞回収前１２時間添加する培養を単独あるいは組み合わせて行った。その後、ＰＣＤＨ２０遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現量をＲＴ−ＰＣＲで比較した（図４）。ＲＴ−ＰＣＲの発現量のコントロールとしてＧＡＰＤＨを用いた。両細胞株共に、ＤＮＡのメチル化阻害剤で転写抑制が解除され、ヒストンの脱アセチル化と相乗的に転写量が上昇することが確認された。
【００７０】
（７）ＰＣＤＨ２０遺伝子のプロモーター構造とメチル化について
ＰＣＤＨ２０遺伝子のエクソン１近傍のＤＮＡ配列には典型的なＣｐＧアイランド構造はないが、４４６塩基（−２９０塩基から＋１５６塩基：＋１は転写開始点）に渡り２５個のＣｐＧサイトが存在し、比較的ＣｐＧが多いことが示された（図５Ａ）。遺伝子の変異の検出は、選択した２種の配列のプライマーによりＰＣＲ法で検体試料より調製したＤＮＡの部分配列を増幅させ、亜硫酸水素ナトリウムを処理することで、ゲノムＤＮＡ中の非メチル化シトシン（Ｃ）を、ウラシル（Ｕ）に変換する。メチル化されているシトシンは構造上安定であるために、この反応を受けず、ウラシルに変換されない。ＰＣＲ法で検体試料より調製したＤＮＡの部分配列を増幅させ、亜硫酸水素ナトリウムを処理後、この増幅産物をプラスミドに組み込み、宿主細胞を形質転換させて培養し、得られるクローンの塩基配列を解析することによりメチル化を検出することが可能である（Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ法）。この方法によりＰＣＤＨ２０遺伝子エクソン１近傍４９４塩基の範囲（−３１４から＋１８０領域）についてメチル化を解析した（図５Ｂ）。ＰＣＤＨ２０遺伝子の発現が観察されないＬＵ６５，ＡＢＣ−１，１１−１８，ＥＢＣ−１およびＰＣＤＨ２０遺伝子が発現しているＬＵ９９Ａをその解析対象とし、２５ヶ所存在するＣｐＧサイトについてメチル化している部位は黒で表示し、正常肺組織（Ｎｏｒｍａｌ−ｌｕｎｇ）由来ＤＮＡと比較した。プロモーター領域のメチル化度とＰＣＤＨ２０遺伝子発現は逆相関し、その高頻度メチル化部位は２５ヶ所あるＣｐＧサイトの内、ＣｐＧ１０からＣｐＧ１５を概ね含んでいることが明らかとなった。
【００７１】
遺伝子変異の検出法として亜硫酸水素ナトリウムの処理の有無で、ゲノムＤＮＡ中の非メチル化シトシン（Ｃ）を、ウラシル（Ｕ）に変換するがメチル化されているシトシンは構造上安定であるために、この反応を受けず、ウラシルに変換されない。これを鋳型としたＰＣＲ検出を行いメチル化の影響を受ける制限酵素と組み合わせて変化したシトシンと非メチル化シトシン由来増幅ＤＮＡ産物を制限酵素切断により解析することにより、メチル化ＤＮＡの存在を特定できる（ＣＯＢＲＡ法：Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＰＣＲ法と制限酵素切断法を組み合わせた実験法）。そこで、ＰＣＤＨ２０遺伝子のエクソン１近傍のメチル化をＣＯＢＲＡ法により検出した（図５Ｃ）。ＰＣＤＨ２０遺伝子の発現の低い１１−１８，ＡＢＣ−１，ＥＢＣ−１，ＬＵ６５，  ＰＣ−１３，  ＡＣＣ−ＬＣ−３３細胞株では制限酵素ＴａｑＩおよびＨｈａＩの切断部位が存在することによりそれぞれ２本、６本の切断ＤＮＡが電気泳動上観察された（矢印）。一方、ＰＣＤＨ２０遺伝子の発現がみられるＳＫ−ＬＣ−３，ＬＫ−２，ＬＵ９９Ａおよび正常肺では両制限酵素とも、メチル化に依存した制限酵素切断点が発生しないため、電気泳動上単一バンドを示した（楔印）。
【００７２】
（８）レポーターアッセイによるＰＣＤＨ２０遺伝子のプロモーター領域の転写促進効果の測定
ＰＣＤＨ２０遺伝子のエクソン１の近傍４９４塩基の範囲（−３１４から＋１８０領域）からなる領域およびその断片（図５Ａ）を用いて転写促進活性の有無をレポーターアッセイにより検証した。用いたレポーターアッセイ系は、ホタルルシフェラーゼ酵素のメッセンジャーＲＮＡが発現し、タンパクに変換されて活性のある酵素として働くことによる発光物を測定する方法によった。ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ）を用いルシフェラーゼ遺伝子を下流域に配置しＰＣＤＨ２０遺伝子領域１から４をプロモーター解析領域として含むコンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）についてＰＣＤＨ２０遺伝子の発現がみられないＡＢＣ−１、ＬＵ６５細胞に導入しその酵素活性を測定した（図６）。４９４塩基全領域および領域３が両細胞共に高いルシフェラーゼ酵素活性を示したことから、ＰＣＤＨ２０遺伝子の転写活性化領域の基本単位は、領域３にあることが判明した。
【００７３】
プロモーター領域のメチル化検出法について、亜硫酸水素ナトリウムを処理することで、ゲノムＤＮＡ中の非メチル化シトシン（Ｃ）を、ウラシル（Ｕ）に変換することが可能であるが、この被検ＤＮＡに対し亜硫酸水素ナトリウムの処理後変化した部位のウラシルに対応するプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより、特定部位のメチル化の検出を行うことが可能である（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ法：  ＭＳＰ）。この方法を利用して肺癌細胞株ＬＵ９９Ａ，ＬＵ６５，ＥＢＣ１およびＤＮＡ中にＰＣＤＨ２０遺伝子が存在しないＶＭＲＣ−ＬＣＤ株、さらに臨床サンプル由来の隣接正常組織、癌組織から得られたサンプルについて図５Ａに表示したＭＳＰプライマーを用いて解析した（図７Ａ；  Ｕ：非メチル化、Ｍ：メチル化、Ｎ：正常部位、Ｔ：腫瘍部位）。肺癌細胞株ではＰＣＤＨ２０遺伝子の発現のないＥＢＣ１，ＬＵ６５両株のプロモーター部位がメチル化したＭＳＰ法での結果となり、ＰＣＤＨ２０遺伝子が発現するＬＵ９９Ａ細胞ではメチル化されていないという予想通りの結果が得られた。臨床からの非小細胞癌からのＭＳＰ法によるメチル化解析では、５９サンプル中３２サンプルに関して解析が可能であった。また癌組織ならびに隣接正常部位が解析可能であったもの（１２サンプル中７サンプル）については７サンプル中４サンプルが癌部位でメチル化が検出され、隣接正常部位ではメチル化が検出されない結果となった（図７Ａ：電気泳動３−４列）。このメチル化の差異が検出されたもの差異がなかったもの（４２０，４２５，４３４）を用いて、さらにＰＣＤＨ２０遺伝子エクソン１近傍４９４塩基の範囲（−３１４から＋１８０領域）についてＢｉｓｕｌｆｉｔｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ法にてメチル化を解析した（図７Ｂ）。メチル化の差異が検出された癌４２０，４２５では予想通りＣｐＧ１０からＣｐＧ１５領域にメチル化が観察され、その隣接正常部位ではメチル化が非常に少ない結果となった。（メチル化している部位は黒で表示した。）一方、ＭＳＰ法にてメチル化が観察されなかった４３４では癌部、隣接正常部位ともに高頻度メチル化は観察されなかった。さらに同サンプルのＰＣＤＨ２０遺伝子のメッセンジャーＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより検出した（図７Ｃ）。メチル化の差異が検出されなかった癌４３４に比べメチル化の差異が検出された癌４２０，４２５では予想通りＰＣＤＨ２０遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現が低下していることが確認された。
【００７４】
（９）肺癌細胞へのＰＣＤＨ２０遺伝子導入による癌原性の低下
培養条件下において、正常細胞と癌細胞の性質の違いの一つとして、固形物への付着性が知られている。すなわち、正常細胞が増殖するためには固形物に付着することが必要である（足場依存性）。正常細胞は、０．３３％前後の軟らかい寒天培地中で培養した場合、浮遊状態では増殖できないが、多くの癌細胞では、足場依存性の性質は失われ、軟寒天培地中でも増殖可能となる。癌細胞は浮遊しているが、軟寒天培地の中を移動できないので、１個の細胞から次々に分裂を繰り返し、１〜３週間の後には細胞塊（コロニー）を形成する。この細胞の軟寒天コロニー形成能は、移植腫瘍形成能と相関することから、悪性度の指標として広く利用されている（Ｓｈｉｎ，Ｓ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７２，  ４４３５，  １９７５）。挿入遺伝子のアミノＣ末端にｍｙｃペプチドを付加可能なｐＣＭＶ３．１ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にＰＣＤＨ２０完全長ｃＤＮＡを挿入したものを作成した（ｐＣＭＶ３．１−ＰＣＤＨ２０−Ｍｙｃ）。ＰＣＤＨ２０遺伝子の発現がみられないＡＢＣ−１、Ａ５４９細胞に導入にＦｕＧＥＮＥ６（ロシュダイアグノスティクス）を用い遺伝子導入した。５００mｇ／ｍｌのＧ４１８（ジェネテシン）存在下、軟寒天培地中で３週間培養を行った後、クリスタルバイオレット染色後コロニー数を計測した（図８Ｂ）。同時に陰性コントロールのＥｍｐｔｙ（ｐＣＭＶ３．１）を導入した実験も行った。上記４種の遺伝子導入した細胞について、遺伝子導入４８時間後その細胞溶解液１０μｇを用いＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔ法にてｍｙｃ蛋白質の発現と陽性コントロールとしてβ−アクチン蛋白質の発現を観察したところ、予想どうりｐＣＭＶ３．１−ＰＣＤＨ２０−Ｍｙｃを導入した細胞種にのみｐＰＣＤＨ２０−Ｍｙｃ融合蛋白質の存在を確認した（図８Ａ）。ＡＢＣ−１、Ａ５４９細胞共に、Ｅｍｐｔｙに比べ、ＰＣＤＨ２０遺伝子を発現させることで有意にコロニー数を低下させることが確認された。この事象は、ＰＣＤＨ２０遺伝子が癌細胞の増殖を抑制する機能を有することを示しており、この遺伝子が肺癌細胞で癌抑制遺伝子として機能していることが明らかとなった。
【００７５】
（１０）ＰＣＤＨ２０遺伝子プロモーター領域のメチル化と肺癌患者の生存との関連
用いた非小細胞肺癌患者由来の臨床サンプル５９サンプルについてＭＳＰ解析を基にサンプル採取時以降の生存情報をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法にて解析した。縦軸に生存率、横軸に生存期間、細線はＰＣＤＨ２０遺伝子プロモーター領域のメチル化が無かった患者、太線はＰＣＤＨ２０遺伝子プロモーター領域のメチル化が検出された患者を示した（図９Ａ）。Ｌｏｇｒａｎｋ検定によりＰ値が０．０１４０を示し両者に有意な相関が観られることが確認された。さらにこれらサンプル中のステージＩ患者だけの生存情報に関して同様な解析を行った際にもＰ値が０．０２１１を示し早期癌でもメチル化と生存期間に有意な相関が観られることが確認された（図９Ｂ）。この事実は、ＰＣＤＨ２０遺伝子プロモーター領域のメチル化もしくはそのメッセンジャーＲＮＡの発現量を測定することで、非小細胞肺癌患者の悪性度（余命）を予測することが可能であることを意味する。
【００７６】
（１１）結論
（ａ）アレイＣＧＨ法によるスクリーニングから、そのゲノムＤＮＡ中に高頻度メチル化部位を有し、非小細胞肺癌でメッセンジャーＲＮＡの発現が低下するＰＣＤＨ２０遺伝子を単離した。さらに臨床サンプル由来の細胞を用いた実験から、ＰＣＤＨ２０遺伝子の発現低下はゲノムＤＮＡ中のメチル化を解除することにより回復することも示された。
（ｂ）ＰＣＤＨ２０遺伝子のゲノムＤＮＡ中の領域（エクソン１近傍）が転写活性化能力を持ち、そのメチル化がそのメッセンジャーＲＮＡレベルでの発現低下に寄与していることが判明した。臨床サンプルの解析からこの領域のメチル化は非小細胞肺癌の進行度のみでは予測できない悪性度（余命）と相関することが明らかとなった。さらに、ＰＣＤＨ２０遺伝子の発現が高いことと、この領域のメチル化が逆相関することも判明した。
（ｃ）ＰＣＤＨ２０遺伝子を発現していない非小細胞肺癌細胞株へのＰＣＤＨ２０遺伝子移入後の足場依存性実験における細胞増殖能力の低下から、ＰＣＤＨ２０遺伝子がタンパクとして発現することが癌細胞としての性質を失う、即ちＰＣＤＨ２０遺伝子は癌抑制遺伝子として機能することが明らかとなった。
【配列表フリーテキスト】
【００７７】
SEQUENCE LISTING
<110>  Fuji Photo Film Co.
<120>  Cancer suppressing agent
<130>  A61197A
<160>  2
<210>  1
<211>  4412
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  1
gagggaatgc gcgcagctca caggccctgg gagtgagctg gtgcccggcg acctggcacc 60
cgcgcctgga tatggggcgt ctacatcgtc ccaggagcag caccagctac aggaacctgc 120
cgcatctgtt tctgtttttc ctcttcgtgg gacccttcag ctgcctcggg agttacagcc 180
gggccaccga gcttctgtac agcctaaacg agggactacc cgcgggggtg ctcatcggca 240
gcctggccga ggacctgcgg ctgctgccca ggtctgcagg gaggccggac ccgcagtcgc 300
agctgccaga gcgcaccggt gctgagtgga acccccctct ctccttcagc ctggcctccc 360
ggggactgag tggccagtac gtgaccctag acaaccgctc tggggagctg cacacttcag 420
ctcaggagat cgacagggag gccctgtgtg ttgaaggggg tggagggact gcgtggagcg 480
gcagcgtttc catctcctcc tctccttctg actcttgtct tttgctgctg gatgtgcttg 540
tcctgcctca ggaatacttc aggtttgtga aggtgaagat cgccatcaga gacatcaatg 600
acaacgcccc gcagttccct gtttcccaga tctcggtgtg ggtcccggaa aatgcacctg 660
taaacacccg actggccata gagcatcctg ctgtggaccc agatgttggc attaatgggg 720
ttcagaccta tcgcttactg gactaccatg gtatgttcac cctggacgtg gaggagaatg 780
agaatgggga gcgcaccccc tacctaattg tcatgggtgc tttggacagg gaaacccagg 840
accagtatgt gagcatcatc acagctgagg atggtgggtc tccaccactt ttgggcagtg 900
ccactctcac cattggcatc agtgacatta atgacaattg ccctctcttc acagactcac 960
aaatcaatgt cactgtgtat gggaatgcta cagtgggcac cccaattgca gctgtccagg 1020
ctgtggataa agacttgggg accaatgctc aaattactta ttcttacagt cagaaagttc 1080
cacaagcatc taaggattta tttcacctgg atgaaaacac tggagtcatt aaacttttca 1140
gtaagattgg aggaagtgtt ctggagtccc acaagctcac catccttgct aatggaccag 1200
gctgcatccc tgctgtaatc actgctcttg tgtccattat taaagttatt ttcagacccc 1260
ctgaaattgt ccctcgttac atagcaaacg agatagatgg tgttgtttat ctgaaagaac 1320
tggaacccgt taacactccc attgcgtttt tcaccataag agatccagaa ggtaaataca 1380
aggttaactg ctacctggat ggtgaagggc cgtttaggtt atcaccttac aaaccataca 1440
ataatgaata tttactagag accacaaaac ctatggacta tgagctacag cagttctatg 1500
aagtagctgt ggtggcttgg aactctgagg gatttcatgt caaaagggtc attaaagtgc 1560
aacttttaga tgacaatgat aatgctccaa ttttccttca acccttaata gaactaacca 1620
tcgaagagaa caactcaccc aatgcctttt tgactaagct gtatgctaca gatgccgaca 1680
gcgaggagag aggccaagtt tcatattttc tgggacctga tgctccatca tatttttcct 1740
tagacagtgt cacaggaatt ctgacagttt ctactcagct ggaccgagaa gagaaagaaa 1800
agtacagata cactgtcaga gctgttgact gtgggaagcc acccagagaa tcagtagcca 1860
ctgtggccct cacagtgttg gataaaaatg acaacagtcc tcggtttatc aacaaggact 1920
tcagcttttt tgtgcctgaa aactttccag gctatggtga gattggagta attagtgtaa 1980
cagatgctga cgctggacga aatggatggg tcgccctctc tgtggtgaac cagagtgata 2040
tttttgtcat agatacagga aagggtatgc tgagggctaa agtctctttg gacagagagc 2100
agcaaagctc ctatactttg tgggttgaag ctgttgatgg gggtgagcct gccctctcct 2160
ctacagcaaa aatcacaatt ctccttctag atatcaatga caaccctcct cttgttttgt 2220
ttcctcagtc taatatgtct tatctgttag tactgccttc tactctgcca ggctccccgg 2280
ttacagaagt ctatgctgtc gacaaagaca caggcatgaa tgctgtcata gcttacagca 2340
tcatagggag aagaggtcct aggcctgagt ccttcaggat tgaccctaaa actggcaaca 2400
ttactttgga agaggcattg ctgcagacag attatgggct ccatcgctta ctggtgaaag 2460
tgagtgatca tggttatccc gagcctctcc actccacagt catggtgaac ctatttgtca 2520
atgacactgt cagtaatgag agttacattg agagtctttt aagaaaagaa ccagagatta 2580
atatagagga gaaagaacca caaatctcaa tagaaccgac tcataggaag gtagaatctg 2640
tgtcttgtat gcccacctta gtagctctgt ctgtaataag cttgggttcc atcacactgg 2700
tcacagggat gggcatatac atctgtttaa ggaaagggga aaagcatccc agggaagatg 2760
aaaatttgga agtacagatt ccactgaaag gaaaaattga cttgcatatg cgagagagaa 2820
agccaatgga tatttctaat atttgatatt tcatggtgga ataacacaga gaaatgtttt 2880
aactgacttt ggatcttcat cacctaaaaa agagtgtgtt gatggcagtt ccaatgaagg 2940
acaactaatt tataacttgt tctatattgt aaatagctgt ttacaggttt ttaaatttaa 3000
attcagaggt tataaaatgt gtacagcatt tttaagtgaa aattagtact aacagctata 3060
ggacttgtat ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa agcttggaca tggtttgcag ctttcataca 3120
ccaagcagtt gattgataaa acctgggagt aaggtaagaa aaatggaaca aatttttatc 3180
taaaaattcc tgtcaccaca agagggcatc agctgctcct ttgcaggaaa ctggggtatt 3240
gtacttggca gttgtacatg aaattaatga aagagtatat tttaaatata ttgtttttaa 3300
cattaaacaa atatgaaatt aaagtaaatt aaatttcacc ctatttaaac atatgataaa 3360
aaaagaaatg cacttgtaaa cagaatgttt attacctcat aagtgcatat atagtttgaa 3420
agagaaggca ttaaaaagaa gtgcgattcc tttttagcaa ggataaaatc attgccttgt 3480
gttacagatt cagcctgctg aagagtattc cactttctgt gtactcgaat tgctttctgt 3540
ttgctttacc actgcacttg ttattattac aagggaaata gatatataca tacatatata 3600
tattcttcat tacaggaaat gtaactagat attgtgccca agaaaaacag ccagaagcaa 3660
agaaatgctt caatctttag ttgcttcata ggcattcatg acattttagt gctttcacaa 3720
cttgttggtc gtactttata cttgggttat atattagact tttataggct tgaaatcatc 3780
catcacataa gaaaatagaa atcatattaa aagtgaattc ttctagaggc ttgtgtacac 3840
tactggttgt tttagttggg ccttttatat gaaagttata ctgtacttat ctttttgttg 3900
ttgtttaggt ttgttgacta ccatttctgg cttcctttct ttggttttgg attaaatcca 3960
acagtttatt tgtaagccct gcagcagatt tctttgataa tttagctttt actgaatctc 4020
ttgcaatgaa gaaagctatt tcatcagtga tttatcactt tcaattcatt gtgtgagctg 4080
gaaatattat tttatatgag agctatagca aaataatctg tataaacaag gaatgtgtta 4140
gcttaaactg gatcatttta ctttttggca tcatgcatct gtactgtacc aaaagtgttt 4200
atatgtctgc aaattaaagg tatatatttt cataatttct ttctcacttt tagcatttta 4260
tatttgaaca tgggcttgtt atttcactga agtgcctgtc atttgtttgt ttttagggtt 4320
aaatgtgggt aacctgtagt attctgctat actaaagttt atattaaatg aattcattac 4380
tcaattaaac attgggtaaa ttattaaaaa aa                               4412
<210>  2
<211>  924
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  2
Met Gly Arg Leu His Arg Pro Arg Ser Ser Thr Ser Tyr Arg Asn Leu 
1               5                   10                  15
Pro His Leu Phe Leu Phe Phe Leu Phe Val Gly Pro Phe Ser Cys Leu 
20                  25                  30
Gly Ser Tyr Ser Arg Ala Thr Glu Leu Leu Tyr Ser Leu Asn Glu Gly 
35                  40                  45
Leu Pro Ala Gly Val Leu Ile Gly Ser Leu Ala Glu Asp Leu Arg Leu 
50                  55                  60
Leu Pro Arg Ser Ala Gly Arg Pro Asp Pro Gln Ser Gln Leu Pro Glu 
65                  70                  75                  80
Arg Thr Gly Ala Glu Trp Asn Pro Pro Leu Ser Phe Ser Leu Ala Ser 
85                  90                  95
Arg Gly Leu Ser Gly Gln Tyr Val Thr Leu Asp Asn Arg Ser Gly Glu 
100                 105                 110 
Leu His Thr Ser Ala Gln Glu Ile Asp Arg Glu Ala Leu Cys Val Glu 
115                 120                 125 
Gly Gly Gly Gly Thr Ala Trp Ser Gly Ser Val Ser Ile Ser Ser Ser 
130                 135                 140 
Pro Ser Asp Ser Cys Leu Leu Leu Leu Asp Val Leu Val Leu Pro Gln 
145                 150                 155                 160 
Glu Tyr Phe Arg Phe Val Lys Val Lys Ile Ala Ile Arg Asp Ile Asn 
165                 170                 175 
Asp Asn Ala Pro Gln Phe Pro Val Ser Gln Ile Ser Val Trp Val Pro 
180                 185                 190 
Glu Asn Ala Pro Val Asn Thr Arg Leu Ala Ile Glu His Pro Ala Val 
195                 200                 205 
Asp Pro Asp Val Gly Ile Asn Gly Val Gln Thr Tyr Arg Leu Leu Asp 
210                 215                 220 
Tyr His Gly Met Phe Thr Leu Asp Val Glu Glu Asn Glu Asn Gly Glu 
225                 230                 235                 240 
Arg Thr Pro Tyr Leu Ile Val Met Gly Ala Leu Asp Arg Glu Thr Gln 
245                 250                 255 
Asp Gln Tyr Val Ser Ile Ile Thr Ala Glu Asp Gly Gly Ser Pro Pro 
260                 265                 270 
Leu Leu Gly Ser Ala Thr Leu Thr Ile Gly Ile Ser Asp Ile Asn Asp 
275                 280                 285 
Asn Cys Pro Leu Phe Thr Asp Ser Gln Ile Asn Val Thr Val Tyr Gly 
290                 295                 300 
Asn Ala Thr Val Gly Thr Pro Ile Ala Ala Val Gln Ala Val Asp Lys 
305                 310                 315                 320 
Asp Leu Gly Thr Asn Ala Gln Ile Thr Tyr Ser Tyr Ser Gln Lys Val 
325                 330                 335 
Pro Gln Ala Ser Lys Asp Leu Phe His Leu Asp Glu Asn Thr Gly Val 
340                 345                 350 
Ile Lys Leu Phe Ser Lys Ile Gly Gly Ser Val Leu Glu Ser His Lys 
355                 360                 365 
Leu Thr Ile Leu Ala Asn Gly Pro Gly Cys Ile Pro Ala Val Ile Thr 
370                 375                 380 
Ala Leu Val Ser Ile Ile Lys Val Ile Phe Arg Pro Pro Glu Ile Val 
385                 390                 395                 400 
Pro Arg Tyr Ile Ala Asn Glu Ile Asp Gly Val Val Tyr Leu Lys Glu 
405                 410                 415 
Leu Glu Pro Val Asn Thr Pro Ile Ala Phe Phe Thr Ile Arg Asp Pro 
420                 425                 430 
Glu Gly Lys Tyr Lys Val Asn Cys Tyr Leu Asp Gly Glu Gly Pro Phe 
435                 440                 445 
Arg Leu Ser Pro Tyr Lys Pro Tyr Asn Asn Glu Tyr Leu Leu Glu Thr 
450                 455                 460 
Thr Lys Pro Met Asp Tyr Glu Leu Gln Gln Phe Tyr Glu Val Ala Val 
465                 470                 475                 480 
Val Ala Trp Asn Ser Glu Gly Phe His Val Lys Arg Val Ile Lys Val 
485                 490                 495 
Gln Leu Leu Asp Asp Asn Asp Asn Ala Pro Ile Phe Leu Gln Pro Leu 
500                 505                 510 
Ile Glu Leu Thr Ile Glu Glu Asn Asn Ser Pro Asn Ala Phe Leu Thr 
515                 520                 525 
Lys Leu Tyr Ala Thr Asp Ala Asp Ser Glu Glu Arg Gly Gln Val Ser 
530                 535                 540 
Tyr Phe Leu Gly Pro Asp Ala Pro Ser Tyr Phe Ser Leu Asp Ser Val 
545                 550                 555                 560 
Thr Gly Ile Leu Thr Val Ser Thr Gln Leu Asp Arg Glu Glu Lys Glu 
565                 570                 575 
Lys Tyr Arg Tyr Thr Val Arg Ala Val Asp Cys Gly Lys Pro Pro Arg 
580                 585                 590 
Glu Ser Val Ala Thr Val Ala Leu Thr Val Leu Asp Lys Asn Asp Asn 
595                 600                 605 
Ser Pro Arg Phe Ile Asn Lys Asp Phe Ser Phe Phe Val Pro Glu Asn 
610                 615                 620 
Phe Pro Gly Tyr Gly Glu Ile Gly Val Ile Ser Val Thr Asp Ala Asp 
625                 630                 635                 640 
Ala Gly Arg Asn Gly Trp Val Ala Leu Ser Val Val Asn Gln Ser Asp 
645                 650                 655 
Ile Phe Val Ile Asp Thr Gly Lys Gly Met Leu Arg Ala Lys Val Ser 
660                 665                 670 
Leu Asp Arg Glu Gln Gln Ser Ser Tyr Thr Leu Trp Val Glu Ala Val 
675                 680                 685 
Asp Gly Gly Glu Pro Ala Leu Ser Ser Thr Ala Lys Ile Thr Ile Leu 
690                 695                 700 
Leu Leu Asp Ile Asn Asp Asn Pro Pro Leu Val Leu Phe Pro Gln Ser 
705                 710                 715                 720 
Asn Met Ser Tyr Leu Leu Val Leu Pro Ser Thr Leu Pro Gly Ser Pro 
725                 730                 735 
Val Thr Glu Val Tyr Ala Val Asp Lys Asp Thr Gly Met Asn Ala Val 
740                 745                 750 
Ile Ala Tyr Ser Ile Ile Gly Arg Arg Gly Pro Arg Pro Glu Ser Phe 
755                 760                 765 
Arg Ile Asp Pro Lys Thr Gly Asn Ile Thr Leu Glu Glu Ala Leu Leu 
770                 775                 780 
Gln Thr Asp Tyr Gly Leu His Arg Leu Leu Val Lys Val Ser Asp His 
785                 790                 795                 800 
Gly Tyr Pro Glu Pro Leu His Ser Thr Val Met Val Asn Leu Phe Val 
805                 810                 815 
Asn Asp Thr Val Ser Asn Glu Ser Tyr Ile Glu Ser Leu Leu Arg Lys 
820                 825                 830 
Glu Pro Glu Ile Asn Ile Glu Glu Lys Glu Pro Gln Ile Ser Ile Glu 
835                 840                 845 
Pro Thr His Arg Lys Val Glu Ser Val Ser Cys Met Pro Thr Leu Val 
850                 855                 860 
Ala Leu Ser Val Ile Ser Leu Gly Ser Ile Thr Leu Val Thr Gly Met 
865                 870                 875                 880 
Gly Ile Tyr Ile Cys Leu Arg Lys Gly Glu Lys His Pro Arg Glu Asp 
885                 890                 895 
Glu Asn Leu Glu Val Gln Ile Pro Leu Lys Gly Lys Ile Asp Leu His 
900                 905                 910 
Met Arg Glu Arg Lys Pro Met Asp Ile Ser Asn Ile 
915                 920 
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、アレイCGH法で得られた非小細胞肺癌細胞株ＶＭＲＣ−ＬＣＤで欠失している染色体１３番２１．２から２１．３１領域の遺伝子構造、ならびにこの遺伝子領域に存在するＲＰ−１１  ＢＡＣクローン、および遺伝子を示す。
【図２】図２は、腺癌細胞株（Ａｄｅｎｏ）１１−１８，  Ａ５４９，ＶＭＲＣ−ＬＣＤ，ＳＫ−ＬＣ−３，  ＡＢＣ−１，  ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＯＫ，  ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＫＪ、扁平上皮細胞株（ＳＣＣ）ＥＢＣ−１，  ＬＫ−２，  ＰＣ１０，  ＶＭＲＣ−ＬＣＰ，  ＬＣ−１  ｓｑ，  ＡＣＣ−ＬＣ−７３，大細胞癌細胞株（Ｌａｒｇｅ）  ＫＮＳ−６２，８６−２，  ＬＵ６５，  ＰＣ−１３，ＮＣＩ−Ｈ４６０，  ＡＣＣ−ＬＣ−３３，ＬＵ９９Ａ各細胞株から、ＤＮＡを抽出しＴＤＲＤ３およびＰＣＤＨ２０遺伝子領域の特異的プライマーにてＰＣＲを行い電気泳動にてゲノム中の各遺伝子の存在について検出を行った結果を示す。下段に陽性コントロールとしてＧＡＰＤＨによる検出を行った。
【図３】図３は、ＰＣＤＨ２０遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現を測定するため正常肺（Ｎｏｒｍａｌ−ｌｕｎｇ）をコントロールとし、非小細胞肺癌細胞株２０株（１１−１８，  Ａ５４９，ＶＭＲＣ−ＬＣＤ，ＳＫ−ＬＣ３，ＡＢＣ−１，  ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＯＫ，  ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＫＪ、ＥＢＣ−１，ＬＫ２，  ＰＣ１０，ＶＭＲＣ−ＬＣＰ，  ＬＣ−１  ｓｑ，ＡＣＣ−ＬＣ−７３，  ＫＮＳ−６２，８６−２，  ＬＵ６５，  ＰＣ−１３，ＮＣＩ−Ｈ４６０，ＡＣＣ−ＬＣ−３３，ＬＵ９９Ａ）についてＴＤＲＤ３およびＰＣＤＨ２０遺伝子のＲＴ−ＰＣＲを行った電気泳動像を示す。ＲＴ−ＰＣＲの発現量のコントロールとしてＧＡＰＤＨを用いた。
【図４】図４は、ＰＣＤＨ２０遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現をＡＢＣ−１とＬＵ６５の２細胞株について、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの阻害剤である５−アザ−デオキシシチジン（５−ａｚａ−ｄＣｙｄ）を各種細胞に５，１０μＭの濃度で５日間添加および、ヒストン脱アセチル化酵素の非特異的阻害物質であるトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）を１００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞回収前１２時間添加する培養を単独あるいは組み合わせて行った後、ＰＣＤＨ２０遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現量をＲＴ−ＰＣＲ後電気泳動で比較した結果を示す。ＲＴ−ＰＣＲの発現量のコントロールとしてＧＡＰＤＨを用いた。
【図５】図５のＡは、ＰＣＤＨ２０遺伝子のエクソン１近傍のＤＮＡ構造を示す。ＣＧ  ｓｉｔｅｓとはこの遺伝子領域でのＣｐＧ配列が存在する部位を示す。Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅは癌細胞のＰＣＤＨ２０遺伝子のエクソン１近傍のＤＮＡ領域中の４９４塩基の範囲（−３１４から＋１８０領域）についてＣｐＧサイトでのメチル化を亜硫酸水素ナトリウム処理後に塩基配列変化を解析した領域を示す。Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＰＣＲ  ａｓｓａｙはＣｐＧサイトでのメチル化を亜硫酸水素ナトリウム処理後にシトシン（Ｃ）からウラシル（Ｕ）に変化したものを認識可能な制限酵素ＴａｑＩとＨｈａＩで切断解析した領域と各々の制限酵素の切断部位を示す。ＭＳＰはＣｐＧ１０からＣｐＧ１５の位置で亜硫酸水素ナトリウム処理前後での塩基変異を正確に認識可能なフォーワードプライマー位置と、リバースプライマー位置を示している。Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｓｓａｙ  ｒｅｇｉｏｎはＰＣＤＨ２０遺伝子の転写開始点近傍のレポーターアッセイ用に使用した、４種の遺伝子領域を示す。図５のＢは、ＰＣＤＨ２０遺伝子の発現が観察されないＬＵ６５，ＡＢＣ−１，１１−１８，ＥＢＣ−１およびＰＣＤＨ２０遺伝子が発現しているＬＵ９９Ａ、正常肺組織（Ｎｏｒｍａｌ−ｌｕｎｇ）由来ＤＮＡを用い、ＰＣＤＨ２０遺伝子のエクソン１近傍のＤＮＡ領域中の２５ヶ所存在するＣｐＧサイトでのメチル化を亜硫酸水素ナトリウム処理後に塩基配列解析し、メチル化のあった領域を黒く示した。図５のＣは、ＰＣＤＨ２０遺伝子の発現の低い（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（−））１１−１８，ＡＢＣ−１，ＥＢＣ−１，ＬＵ６５，  ＰＣ−１３，  ＡＣＣ−ＬＣ−３３細胞株、ＰＣＤＨ２０遺伝子の発現がみられる（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（＋））ＳＫ−ＬＣ−３，ＬＫ−２，ＬＵ９９Ａおよび正常肺について制限酵素ＴａｑＩおよびＨｈａＩの切断パターンをＣＯＢＲＡ法により解析した電気泳動像を示す。ＣｐＧのＣからＵへの変異により制限酵素切断され、発生するフラグメント位置を矢印で、切断点がない場合のフラグメント位置を楔形で示した。
【図６】図６Ａは、ＰＣＤＨ２０遺伝子のエクソン１の近傍４９４塩基の範囲（−３１４から＋１８０領域）からなる領域およびその断片（図５．Ａ）を用いてＰＣＤＨ２０遺伝子の発現がみられないＡＢＣ−１、ＬＵ６５細胞に導入し転写促進活性の有無をルシフェラーゼ酵素活性によるレポーターアッセイ結果を示す。
【図７】図７Ａは、ＭＳＰ法による肺癌細胞株ＬＵ９９Ａ，ＬＵ６５，ＥＢＣ１，ＶＭＲＣ−ＬＣＤ株、臨床サンプル由来の隣接正常組織、癌組織両者が解析可能であった６サンプル、癌組織のみ１６サンプルについて図．５Ａに表示したＭＳＰプライマーを用いて解析した結果を示す（Ｕ：非メチル化、Ｍ：メチル化、Ｎ：正常部位、Ｔ：腫瘍部位）。図７Ｂは、メチル化の差異が検出された４２０，４２５、差異がなかった４３４を用いて、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ法にてメチル化を解析した結果を示す。メチル化している部位は黒で表示した。図７Ｃは、４２０，４２５、４３４のＰＣＤＨ２０遺伝子のメッセンジャーＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより検出した結果を示す。発現量のコントロールとしてＧＡＰＤＨを下段に示した。
【図８】図８Ａは、ｐＣＭＶ３．１、ｐＣＭＶ３．１−ＰＣＤＨ２０−ＭｙｃをＡＢＣ−１、Ａ５４９細胞に導入４８時間後の細胞溶解液１０μｇを用いＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔ法にてｍｙｃ蛋白質の発現と陽性コントロールとしてβ−アクチン蛋白質の発現を観察した結果を示す。図８Ｂは、上記４種の組み合わせで、軟寒天培地中で３週間培養を行った後、クリスタルバイオレット染色後コロニー数を計測した結果を示す。
【図９】図９Ａは、非小細胞肺癌患者由来の臨床サンプル５９サンプルについてＭＳＰ解析を基にサンプル採取時以降の生存情報をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法にて表示した。縦軸に生存率、横軸に生存期間、細線はＰＣＤＨ２０遺伝子プロモーター領域のメチル化が無かった患者、太線はＰＣＤＨ２０遺伝子プロモーター領域のメチル化が検出された患者を示す。図９Ｂは、ステージＩ患者３９サンプルについてだけの生存情報に関して図９Ａと同様な解析を行った結果を示す。
【図１】
2007254318.tif 000003
【図２】
2007254318.tif 000004
【図３】
2007254318.tif 000005
【図４】
2007254318.tif 000006
【図５】
2007254318.tif 000007
【図６】
2007254318.tif 000008
【図７】
2007254318.tif 000009
【図８】
2007254318.tif 000010
【図９】
2007254318.tif 000011