(57)【要約】【課題】アルギン酸の構成成分である高純度のＬ−グルロン酸またはＤ−マンヌロン酸の金属塩の製造方法を提供することを課題とする。【解決手段】アルギン酸又はその塩を酸加水分解し、加水分解物を陰イオン交換樹脂処理して遊離のＬ−グルロン酸とＤ−マンヌロン酸の混合物を得、この混合物にシンコニンを反応させ、反応混合物からＬ−グルロン酸シンコニン塩とＤ−マンヌロン酸シンコニン塩を分別晶析させ、Ｌ−グルロン酸シンコニン塩とＤ−マンヌロン酸シンコニン塩のそれぞれを再結晶し、得られるＬ−グルロン酸シンコニン塩またはＤ−マンヌロン酸シンコニン塩と金属塩又は金属水酸化物とを反応させることを特徴とするＬ−グルロン酸金属塩またはＤ−マンヌロン酸金属塩の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギン酸又はその塩を酸加水分解し、加水分解物を陰イオン交換樹脂処理して遊離のＬ−グルロン酸とＤ−マンヌロン酸の混合物を得、この混合物にシンコニンを反応させ、反応混合物からＬ−グルロン酸シンコニン塩とＤ−マンヌロン酸シンコニン塩を分別晶析させ、Ｌ−グルロン酸シンコニン塩とＤ−マンヌロン酸シンコニン塩のそれぞれを再結晶し、得られるＬ−グルロン酸シンコニン塩またはＤ−マンヌロン酸シンコニン塩と金属塩又は金属水酸化物とを反応させることを特徴とするＬ−グルロン酸金属塩またはＤ−マンヌロン酸金属塩の製造方法。
【請求項２】
金属がアルカリ金属であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
アルカリ金属が、ナトリウムまたはカリウムであることを特徴とする請求項２に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、海藻、特に褐藻類に含まれるアルギン酸の構成成分であるＬ−グルロン酸またはＤ−マンヌロン酸の高純度金属塩を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルギン酸はコンブやワカメ等の褐藻類に特有な多糖類であり、その含有量は海藻の種類や部位、あるいは収穫時期によって異なるが、一般に海藻の乾燥重量の２５〜３５質量％である。また、アルギン酸はＬ−グルロン酸とＤ−マンヌロン酸という２種類のウロン酸が１，４結合した酸性多糖類である。アルギン酸の分子量およびＤ−マンヌロン酸とＬ−グルロン酸との比は一定ではなく、これらも海藻の種類や部位または収穫時期によって異なる。アルギン酸は水に不溶であるが、アルギン酸のナトリウム塩またはカリウム塩は水に溶けて高粘度の水溶液になり、この水溶液に２価以上の金属イオンを添加するとゲル化する。アルギン酸ナトリウムおよびその誘導体は食品添加物として使用されている。
【０００３】
近年、食品に含まれる多糖類の機能性が種々明らかになり、その定量方法の確立が求められている。ところがアルギン酸の定量においては、アルギン酸の分子量およびその構成成分であるＤ−マンヌロン酸とＬ−グルロン酸との比が一定ではないため、一般にウロン酸の定量法であるカルバゾール−硫酸法（例えば、非特許文献１参照）などの比色法が用いられている。
【０００４】
しかしこの比色法は、ウロン酸類全般の定量法であるためアルギン酸に特異的な定量法ではない。例えばアルギン酸の他に、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−ガラクツロン酸またはＬ−イズロン酸等を含む多糖（フコイダン、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ペクチンなど）が共存した場合や、更にはポリフェノール類のように、硫酸による加熱条件で発色しやすい物質が共存した場合は、アルギン酸の定量が妨害される恐れがある。  
【０００５】
そこで、アルギン酸をその構成糖であるＬ−グルロン酸とＤ−マンヌロン酸にまで加水分解し、それぞれを個別にＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）等で定量し、それらの合計としてアルギン酸量を求める方法が考えられる。
【０００６】
ところが、Ｌ−グルロン酸とＤ−マンヌロン酸をＨＰＬＣ等で定量しようとした場合、標準品となる高純度のＤ−マンヌロン酸およびＬ−グルロン酸が必要であるが、現在のところ両者とも市販されていない。
【０００７】
Ｌ−グルロン酸とＤ−マンヌロン酸を得るためには、アルギン酸を酸加水分解後、陰イオン交換樹脂で精製する方法（例えば、非特許文献２参照）が知られているが、Ｌ−グルロン酸およびＤ−マンヌロン酸はともに結晶化し難いこと、濃縮により容易に分子内でラクトン化すること、更に酸性条件下では容易に分解すること等、安定性の問題があるため、Ｌ−グルロン酸およびＤ−マンヌロン酸の高純度品を得ることは容易ではない。
【０００８】
ウロン酸類の高純度の結晶を得るためには有機塩基であるブルシンと塩を形成させれば良いが、ブルシンは比色法およびＨＰＬＣ法において妨害物質となるので、Ｌ−グルロン酸とＤ−マンヌロン酸のブルシン塩はアルギン酸定量用の標準品として好ましくない。
【０００９】
そこでアルギン酸定量の標準品としてはＬ−グルロン酸およびＤ−マンヌロン酸の金属塩が望ましいのであるが、Ｌ−グルロン酸ナトリウムの調製法としては、Ｌ−グルロン酸ブルシン塩を精製後、陽イオン交換樹脂によりブルシンを除去しながら遊離のＬ−グルロン酸を得、これを炭酸水素ナトリウムで中和する方法（例えば、非特許文献３参照）が知られている。しかしこの方法では、毒性の強いブルシンを使用していること、陽イオン交換樹脂によりブルシンを除去する工程が必要でありそれが煩雑なこと、遊離のＬ−グルロン酸を濃縮する工程が含まれＬ−グルロン酸のラクトン化と分解が懸念されること等の問題がある。
【非特許文献１】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２４巻，第４７０〜４８１頁（１９６８）
【非特許文献２】Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．，第１５巻，第１３９７〜１３９８頁（１９６１）
【非特許文献３】Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，第８０巻，３４３〜３４５頁（１９８０）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、アルギン酸の構成成分であるＬ−グルロン酸およびＤ−マンヌロン酸を高純度の金属塩として得ることを課題とする．
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究をし、下記構成の手段にて解決することを見出した。即ち本発明は下記構成からなる。
【００１２】
（１）アルギン酸又はその塩を酸加水分解し、加水分解物を陰イオン交換樹脂処理して遊離のＬ−グルロン酸とＤ−マンヌロン酸の混合物を得、この混合物にシンコニンを反応させ、反応混合物からＬ−グルロン酸シンコニン塩とＤ−マンヌロン酸シンコニン塩を分別晶析させ、Ｌ−グルロン酸シンコニン塩とＤ−マンヌロン酸シンコニン塩のそれぞれを再結晶し、得られるＬ−グルロン酸シンコニン塩またはＤ−マンヌロン酸シンコニン塩と金属塩又は金属水酸化物とを反応させることを特徴とするＬ−グルロン酸金属塩またはＤ−マンヌロン酸金属塩の製造方法。
（２）金属がアルカリ金属であることを特徴とする前記（１）に記載の製造方法。
（３）アルカリ金属が、ナトリウムまたはカリウムであることを特徴とする前記（２）に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、アルギン酸の構成成分であるＬ−グルロン酸とＤ−マンヌロン酸の高純度金属塩が得られる。得られるＬ−グルロン酸またはＤ−マンヌロン酸の高純度金属塩は、純度が高いためＨＰＬＣによるＬ−グルロン酸またはＤ−マンヌロン酸測定において、ＨＰＬＣ用標準物質となり得る。したがって、それらを標準物質とした正しい海藻中のアルギン酸含量の測定が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明に用いるアルギン酸又はその塩としては、コンブ、ワカメ等の褐藻類の海藻から抽出されたアルギン酸又はその塩を用いることができるが、既に調製された市販のアルギン酸又はその塩を用いることもできる。アルギン酸の塩としては、例えば、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム又はアルギン酸マグネシウム等が挙げられる。
【００１５】
アルギン酸又はその塩の酸加水分解に用いる酸としては、例えば硫酸または塩酸などの鉱酸、あるいはトリフルオロ酢酸などの有機酸などが挙げられ、いずれでも良いが、好ましくは、加水分解後における酸の過剰分をカルシウム塩として沈殿除去できる硫酸が良い。酸加水分解の方法は特に限定されず公知の方法を用いてよい。酸加水分解の具体的な方法としては、例えばアルギン酸又はその塩に対して約５〜１００倍量（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約１０〜３０倍量（Ｗ／Ｗ）の硫酸水溶液［硫酸濃度は約６０〜９８%（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約７０〜８０％（Ｗ／Ｗ）］に、約１〜１２０分間でアルギン酸又はその塩を少量ずつ加える。次いで前記混合液を約５〜５０℃にて約１〜２４時間撹拌する。次いで、硫酸濃度が約０．１から２．０モル／Ｌになるように水（例えば、蒸留水、精製水など；以下同じ。）を添加し、約２０〜１２０℃に加熱し、約１〜２４時間撹拌あるいは放置することにより、アルギン酸またはその塩を酸加水分解できる。酸加水分解後の反応液を約５〜３０℃に冷却し、硫酸の前記モル数に対して約１．０〜２．０倍モルの炭酸カルシウムを添加し、生成する沈殿物を吸引濾過にて除去し濾液を得る。濾別した沈殿物を適当量の水で数回（約２〜５回）洗浄し、該洗浄液と先の濾液とを合わせて減圧濃縮し、濃縮液とする。該濃縮液には、アルギン酸又はその塩を酸加水分解して生成されたＬ−グルロン酸とＤ−マンヌロン酸が含まれる。
【００１６】
次いで、酸加水分解後の前記濃縮液を陰イオン交換樹脂で処理する。陰イオン交換樹脂としては塩基性陰イオン交換樹脂であれば特に限定されず、弱塩基性陰イオン交換樹脂または強塩基性陰イオン交換樹脂が挙げられるが、好ましくは強塩基性陰イオン交換樹脂である。強塩基性陰イオン交換樹脂としては、市販品を例に挙げて示すと、例えば酢酸イオン型に調整したダウエックス１（ダウケミカル社製）またはアンバーライトＩＲＡ（ローム・アンド・ハース社製）などが挙げられる。濃縮液の陰イオン交換樹脂での処理の方法は特に限定されず、例えばバッチ法またはカラム法などが挙げられるが、カラム法が好ましい。カラム法は、陰イオン交換樹脂をカラム（例えばガラスカラム、ポリエチレンカラム等）に充填する。該充填の方法は特に限定されないが、陰イオン交換樹脂を水で膨潤させた後に、膨潤した陰イオン交換樹脂をカラムに流し込み充填する方法が好ましい。陰イオン交換樹脂の量は、使用するアルギン酸又はその塩の約２５〜５０倍量（Ｖ／Ｗ）が好ましい。次いで、陰イオン交換樹脂を充填したカラムに濃縮液を注入し、濃縮液に含まれるＬ−グルロン酸とＤ−マンヌロン酸を陰イオン交換樹脂に吸着させる。陰イオン交換樹脂の約２〜１０倍量（Ｖ／Ｖ）の水を通して陰イオン交換樹脂に吸着しない成分を洗浄する。その後、陰イオン交換樹脂の約５〜２０倍量（Ｖ／Ｖ）の溶出液でＬ−グルロン酸とＤ−マンヌロン酸混合液を溶出させる。溶出液としては、Ｌ−グルロン酸とＤ−マンヌロン酸をイオン交換樹脂から溶出し得る溶液であればいずれでもよく、例えば約１．０ｍｏｌ／Ｌ酢酸水溶液などが挙げられる。
【００１７】
溶出したＬ−グルロン酸とＤ−マンヌロン酸混合液は濃縮される。該濃縮は、溶出したＬ−グルロン酸とＤ−マンヌロン酸混合液に、例えばノルマルプロパノールなどのアルコールを加えて溶出液と共沸させるのが好ましい。ノルマルプロパノールなどのアルコールを加えずに濃縮を行うとＬ−グルロン酸とＤ−マンヌロン酸の分解及び／又はラクトン化が著しく、Ｌ−グルロン酸またはＤ−マンヌロン酸の収率が低下する。
前記濃縮の具体的方法としては、例えば以下の工程による方法が挙げられる。
工程：
（１）溶出したＬ−グルロン酸とＤ−マンヌロン酸混合液にその約０．０１〜１０倍量（Ｖ／Ｖ）のノルマルプロパノールを添加し約３５〜４５℃で体積が約1／（１５〜２５）になるまで減圧濃縮する。
（２）（１）で得た濃縮液に、その濃縮液の約０．１〜１０倍量（Ｖ／Ｖ）のノルマルプロパノールを再度添加して、約３５〜４５℃で乾固直前または乾固まで減圧濃縮（以下、Ｌ−グルロン酸とＤ−マンヌロン酸混合物という。）する。
【００１８】
次いで、Ｌ−グルロン酸とＤ−マンヌロン酸混合物に約１〜３０倍（Ｖ／Ｖ）の水を加え、約２０〜３０℃で撹拌下、過剰量のシンコニンを添加し、約２０〜３０℃で約１〜２４時間撹拌しＬ−グルロン酸およびＤ−マンヌロン酸をシンコニン塩化する。この場合、シンコニンは中性の水には不溶であるが、遊離のＬ−グルロン酸またはＤ−マンヌロン酸が溶解している水溶液はｐＨ約１．９程度であるので、シンコニンを添加すると、それらの塩（Ｌ−グルロン酸シンコニン塩またはＤ−マンヌロン酸シンコニン塩）となって溶解する。シンコニンがＬ−グルロン酸またはＤ−マンヌロン酸に対して当量以下の時点では、クリアーな溶液であるが、シンコニンが過剰になると、過剰分のシンコニンが溶けずに懸濁液になる。シンコニンの添加量としては、使用したアルギン酸またはその塩の約０．２〜２．０倍（Ｗ／Ｗ）量が挙げられる。
次いで、過剰のシンコニンを吸引濾過にて濾取回収し、続いて水層に残存するシンコニンをクロロホルム、酢酸エチル、酢酸ブチル、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ヘキサン、トルエン等の有機溶媒、好ましくはクロロホルムで抽出回収する。これにより、水層のシンコニンを除去し得る。
【００１９】
次いで、過剰のシンコニンを除去した水層に存在するＬ−グルロン酸シンコニン塩またはＤ−マンヌロン酸シンコニン塩を晶析することにより分別する。この工程は、好ましくは、以下の工程（１）乃至（５）により実施する。
工程：
（１）まず過剰のシンコニンを除去した水層を約３５〜４５℃で減圧濃縮する。
（２）（１）で得られた濃縮液に、ノルマルプロパノール、イソプロパノール、メタノール、エタノール、アセトン、テトロヒドロフラン、酢酸エチル等の有機溶媒を単独であるいはそれらの混合溶媒として添加する。有機溶媒の添加量は、（１）で得られた濃縮液の約０．１〜５０倍量（Ｖ／Ｖ）が好ましい。
（３）有機溶媒を添加後、約−２０〜２０℃で、約１〜４８時間放置することにより、Ｌ−グルロン酸シンコニン塩あるいはＤ−マンヌロン酸シンコニン塩の一方を優先的に結晶化させることができる。この場合において、Ｌ−グルロン酸含有量が多い原料からはＬ−グルロン酸シンコニン塩を、またＤ−マンヌロン酸含有量が多い原料からはＤ−マンヌロン酸シンコニン塩を先に結晶化させることができる。
（４）次いで、結晶化した沈殿（Ｌ−グルロン酸シンコニン塩またはＤ−マンヌロン酸シンコニン塩）を分離する。沈殿の分離は、公知の方法、例えば自然ろ過、吸引ろ過、または遠心分離等により実施できる。
（５）結晶化しない他方のシンコニン塩は母液（上記（４）のろ液または遠心分離上清）を減圧濃縮後、上記（２）乃至（４）の工程にて結晶化させ分離できる。この場合、上記（２）で添加する有機溶媒は、先に添加する有機溶媒の極性より低くすることが好ましい。例えば先の晶析に添加される有機溶媒が、例えば、メタノール、エタノールまたはイソプロパノール等のアルコールである場合、後の晶析に添加される有機溶媒としては、例えば、メタノール−アセトン［例えば、約１：（１．５〜９９）（Ｖ／Ｖ）］混液、メタノール−酢酸エチル［例えば約１：（１．５〜９９）（Ｖ／Ｖ）］混液、アセトン、テトラヒドロフランまたは酢酸エチル等とする等が挙げられる。
【００２０】
得られたＬ−グルロン酸シンコニン塩またはＤ−マンヌロン酸シンコニン塩は再結晶を行うのが良い。再結晶は、通常、得られたＬ−グルロン酸シンコニン塩またはＤ−マンヌロン酸シンコニン塩を水、メタノール、エタノール、ノルマルプロパノール、イソプロパノール、アセトン、テトロヒドロフラン、酢酸エチル等の単独あるいはそれらの混合溶媒に溶解後、約−２０〜２０℃で、約１〜４８時間放置することにより実施し得る。このような再結晶により高純度のＬ−グルロン酸シンコニン塩またはＤ−マンヌロン酸シンコニン塩を得ることができる。
【００２１】
次いで、再結晶で得られたＬ−グルロン酸シンコニン塩またはＤ−マンヌロン酸シンコニン塩の水溶液に金属塩又は金属水酸化物を添加して、Ｌ−グルロン酸金属塩またはＤ−マンヌロン酸金属塩を得る。水溶液中におけるＬ−グルロン酸シンコニン塩またはＤ−マンヌロン酸シンコニン塩の濃度は好ましくは約１〜５０％（Ｗ／Ｖ）、より好ましくは約１〜２０％（Ｗ／Ｖ）である。金属としては、アルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウムなど）またはアルカリ土塁金属（例えば、カルシウム、マグネシウムなど）が好ましい。金属塩としては、例えば炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウムまたは炭酸水素カリウム等が挙げられ、金属水酸化物としては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウムまたは水酸化マグネシウム等が挙げられる。このうち、好ましくは炭酸水素ナトリウムである。金属塩又は金属水酸化物の添加量は、シンコニン塩に対して通常約１．０〜２．０モル当量、好ましくは約１．００〜１．０５モル当量である。Ｌ−グルロン酸金属塩またはＤ−マンヌロン酸金属塩の生成は、通常約５〜５０℃、好ましくは約２０℃〜３０℃で、約１〜２４時間撹拌下に行なわれ得る。
【００２２】
続いて、得られたＬ−グルロン酸金属塩あるいはＤ−マンヌロン酸金属塩の水溶液を減圧濃縮する。濃縮前または濃縮の途中で水溶液を０．２〜０．４５μｍのメンブランフィルターで濾過することが好ましい。濾過によりで残存するシンコニン等の不純物等を除去し得る。
【００２３】
得られたＬ−グルロン酸金属塩あるいはＤ−マンヌロン酸金属塩の濃縮液に、水、メタノール、エタノール、ノルマルプロパノール、イソプロパノール、ターシャリーブタノール、アセトンまたはテトラヒドロフラン等を単独あるいはそれらの混合溶媒、好ましくはメタノールを添加後、約−２０〜２０℃で、約１〜４８時間放置してＬ−グルロン酸金属塩またはＤ−マンヌロン酸金属塩を得ることが好ましい。溶媒の添加量は、Ｌ−グルロン酸金属塩あるいはＤ−マンヌロン酸金属塩の濃縮液の約０．１〜５０倍量（Ｖ／Ｖ）が好ましい。
【００２４】
さらに、得られたＬ−グルロン酸金属塩あるいはＤ−マンヌロン酸金属塩の結晶を、水、メタノール、エタノール、ノルマルプロパノール、イソプロパノールまたはターシャリーブタノール、アセトン、テトラヒドロフラン等を単独あるいはそれらの混合溶媒、好ましくはメタノールに溶解し、これら溶媒から再結晶することが好ましい。溶媒の添加量は、Ｌ−グルロン酸金属塩あるいはＤ−マンヌロン酸金属塩の結晶の約０．１〜５０倍量（Ｗ／Ｗ）が好ましい。再結晶は、Ｌ−グルロン酸金属塩あるいはＤ−マンヌロン酸金属塩を前記溶媒に溶解した溶解液を約−２０〜２０℃で、約１〜１０日間、好ましくは約１〜５日間放置することにより実施できる。このようにして高純度のＬ−グルロン酸金属塩またはＤ―マンヌロン酸金属塩を得ることができる。
【００２５】
これらの純度は、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、1Ｈ−ＮＭＲ（核磁気共鳴）、13Ｃ−ＮＭＲ、ＭＳ（質量分析法）、元素分析によって確認できる。
【００２６】
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。なお、実施例中のＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）、ＨＰＬＣおよび物理データは以下の条件および測定機器で測定したものである。
【００２７】
（１）ＴＬＣ条件：
メルク社製シリカゲル６０  Ｆ254ガラスプレート
展開溶媒：ＥｔＯＨ／Ｅｔ3Ｎ／Ｈ2Ｏ＝８０／５／１５（Ｖ／Ｖ）
検出方法：ＵＶ２５４ｎｍ吸収および硫酸発色（１．０ｍｏｌ／Ｌ硫酸，１１０℃，１分）
【００２８】
（２）ＨＰＬＣ：
本田らの方法〔Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第１８０巻，３５１〜３５７頁（１９８９）〕に従い，下記条件でＬ−グルロン酸ナトリウムまたはＤ−マンヌロン酸ナトリウムをＰＭＰ化（フェニルメチルピラゾロン化）した後，下記ＨＰＬＣ条件で分析した。
（２−１）ＰＭＰ化条件：Ｌ−グルロン酸ナトリウムまたはＤ−マンヌロン酸ナトリウムの０．２ｍｇ／ｍＬ水溶液２０μＬに０．５ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム８０μＬおよび０．５ｍｏｌ／ＬのＰＭＰメタノール溶液１００μＬを添加し、６０℃で３０分間反応させた。反応溶液を２０℃に冷却した後、蒸留水７５０μＬおよび０．５ｍｏｌ／Ｌの硫酸水溶液４５μＬを添加し、クロロホルム７５０μＬで４回洗浄した。得られた水層を遠心分離（６２００ｒｐｍ、１分）後、０．４５μｍのメンブランフィルターで濾過し、得られた液体１５μＬをＨＰＬＣに注入した。
（２−２）ＨＰＬＣ測定条件：
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ（４．６ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ）
移動相：Ａ：Ｈ2Ｏ，
Ｂ：１２０ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．０）／ＣＨ3ＣＮ／ＭｅＯＨ＝６０／３０／１０（Ｖ／Ｖ）
グラジェント溶出（グラジェント条件は下記表１の通り）：
【００２９】
【表１】
2007230902.tif 000002
流速：０．７５ｍＬ／ｍｉｎ
温度：４５℃
検出：ＵＶ２４５ｎｍ．
【００３０】
（３）核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ−ＮＭＲ，13Ｃ−ＮＭＲ）：
ＴＰＳ−ｄ4を基準物質とし、Ｄ2Ｏ中、Ｖａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ  Ｉｎｏｖａ  ５００  （５００ＭＨｚ）で測定した。
（４）質量スペクトル：Ｊｅｏｌ  ＪＭＳ−７００（グリセロールマトリクス、ＦＡＢ＋  イオンモード）で測定した。
（５）元素分析：（株）柳本製作所  ＣＨＮコーダー  ＭＴ−５型で測定した。
【００３１】
なお、実施例における略語は以下を示す。
ＥｔＯＨ：エタノール
Ｅｔ3Ｎ：トリエチルアミン
Ｈ2Ｏ：水
ＵＶ：紫外線
ＫＨ2ＰＯ4：リン酸二水素カリウム
Ｎａ2ＨＰＯ4：リン酸水素二ナトリウム
ＣＨ3ＣＮ：アセトニトリル
ＭｅＯＨ：メタノール
ＴＰＳ−ｄ4：3-Trimethylsilylpropionic  Acid  Na  Salt-D4
Ｄ2Ｏ：重水
【実施例１】
【００３２】
Ｌ−グルロン酸シンコニンの調製
７６％硫酸１００ｍＬ（１．３１ｍｏｌ）に、室温撹拌下キミカアルギンＩ−１Ｇ（キミカ社製  アルギン酸ナトリウム）９．９８ｇ（ウロン酸ナトリウムに換算して０．０５ｍｏｌ）を３０分間にわたって徐々に添加した。この混合液を室温で２時間撹拌後、蒸留水１３００ｍＬを加え，沸騰水浴中で３時間撹拌した。冷却後蒸留水１２００ｍＬを加え、炭酸カルシウム１６０ｇ（１．６０ｍｏｌ）で中和した。濾過後残渣を蒸留水で洗浄（５００ｍＬ×２）し、濾液と洗浄液を合わせて減圧濃縮し黒茶色溶液９８．７ｇを得た。これを酢酸イオン型に調整したアンバーライトＩＲＡ４０２ＢＬ（３００ｍＬ）のカラム（４０ｍｍφ×３５０ｍｍ）に吸着させ、蒸留水１０００ｍＬ（流速１０ｍＬ／分）を通して脱塩後、１０ｍｏｌ／Ｌ酢酸水溶液３０００ｍＬでＬ−グルロン酸およびＤ−マンヌロン酸を溶出させた。溶出液にノルマルプロパノール４００ｍＬを添加し４０℃で６６１．０ｇまで減圧濃縮後、再度ノルマルプロパノール８０ｍＬを添加して減圧濃縮し茶黄色液４．１３ｇを得た。このものに蒸留水５５ｍＬを加え、室温撹拌下シンコニン（和光純薬社製）５．４ｇ（０．０１８ｍｏｌ）を添加した。室温で２時間撹拌後、過剰のシンコニンを濾別しクロロホルムで洗浄（１５ｍＬ×３）し、４０℃で１２．５ｇまで減圧濃縮した。濃縮液にノルマルプロパノール８３ｍＬを添加後−２０℃で一晩放置し、析出した結晶を吸引濾取した。これをアセトンで洗浄（１０ｍＬ×３）して淡黄色結晶２．８９ｇを得た。このものをメタノール−イソプロパノール（＝１：４（Ｖ／Ｖ）２０ｍＬ）で再結晶（−２０℃、１７時間）してＬ−グルロン酸シンコニン２．５１ｇを得た。このものは前記ＴＬＣ条件でＲｆ値＝０．５４にＵＶ吸収スポット（シンコニン）と、Ｒｆ値＝０．３８に硫酸で発色するスポット（Ｌ−グルロン酸）を与えた。このものの物性値は以下の通りであり高純度のＬ−グルロン酸シンコニンであることを確認した。
【００３３】
1H-NMR(D2O,TPS-d4)：
δ=8.91（1H，d，J=4.40Hz，cinchonine  H-2’），8.15（2H，m，cinchonine  H-5’，8’），7.90（1H，dd，J=8.30，6.84Hz，cinchonine  H-7’），7.82（1H，d，J=4.88Hz，cinchonine  H-3’），7.77（1H，dd，J=7.81，7.33Hz，cinchonine  H-6’），6.12（1H，d，J=2.93Hz，cinchonine  H-9），6.05（1H，m，cinchonine  H-10），5.28-5.22（m，cinchonine  H-11，α-GulU  H-1），4.88（d，J=8.30Hz，β-GulU  H-1），4.58（d，J=1.47Hz，α-GulU  H-5），4.35（s，β-GulU  H-5），4.20（m，α-GulU  H-4），4.10（m，β-GulU  H-3，4），4.02（m，α-GulU  H-3），3.97（m，cinchonine  H-2，α-GulU  H-2），3.83（1H，m，cinchonine  H-8），3.66（dd，J=8.30，2.44Hz，β-GulU  H-2），3.50（2H，m，cinchonine  H-2，6），3.31（1H，m，cinchonine  H-6），2.79（1H，m，cinchonine  H-3），2.28（1H，m，cinchonine  H-7），2.13（1H，m，cinchonine  H-4），2.00（1H，m，cinchonine  H-5），1.85（1H，m，cinchonine  H-5），1.46（1H，m，cinchonine  H-7）.
【００３４】
13C-NMR(D2O,TPS-d4)：
δ=178.79（β-GulU  C-6），152.90（cinchonine  C-2’），149.67，148.98，139.67（cinchonine  C-10），133.31（cinchonine  C-7’），131.52，130.71（cinchonine  C-6’），127.72，125.53，122.04（cinchonine  C-3’），119.60（cinchonine  C-11），96.41（β-GulU  C-1），95.84（α-GulU  C-1），77.23（β-GulU  C-5），74.18，74.12，74.00，73.79（α-GulU  C-4），71.65（β-GulU  C-2），70.79（cinchonine  C-9），63.15（cinchonine  C-8），52.40（cinchonine  C-6），51.44（cinchonine  C-2），38.99（cinchonine  C-3），29.34（cinchonine  C-4），25.25（cinchonine  C-5），21.83（cinchonine  C-7）.
HR-FABMS（グリセロールマトリクス，FAB+）m/z［M+H]+：489.2240.
Anal.Calcd．for  C25H32N2O8：C，61.46；H，6.60．Found：C，60.90；H，6.53
【実施例２】
【００３５】
Ｄ−マンヌロン酸シンコニンの調製
実施例１でＬ−グルロン酸シンコニンを析出させた母液を減圧濃縮し，メタノール−アセトン（＝１：３（Ｖ／Ｖ）、  ３０ｍＬ）を添加して１℃で一晩放置することにより淡黄色結晶１．２２ｇを得た。このものをメタノール−アセトン（＝１：２（Ｖ／Ｖ）、１０ｍＬ）で再結晶（−２０℃、一晩放置）してＤ−マンヌロン酸シンコニン０．９５ｇを得た。このものは、前記ＴＬＣ条件でＲｆ値＝０．５４にＵＶ吸収スポット（シンコニン）と、Ｒｆ値＝０．４８に硫酸で発色するスポット（Ｄ−マンヌロン酸）を与えた。このものの物性値は以下の通りであり、高純度のＤ−マンヌロン酸シンコニンであることを確認した。
1H-NMR(D2O,  TPS-d4):
δ=8.91（1H，d，J=4.40Hz，cinchonine  H-2’），8.15（2H，m，cinchonine  H-5’,8’），7.90（1H，dd，J=8.30，6.84Hz，cinchonine  H-7’），7.82（1H，d，J=4.88Hz，cinchonine  H-3’），7.77（1H，dd，J=7.81，7.33Hz，cinchonine  H-6’），6.12（1H，d，J=2.93Hz，cinchonine  H-9），6.05（1H，m，cinchonine  H-10），5.28-5.22（m，cinchonine  H-11，α-ManU  H-1），4.91（s，β-ManU  H-1），4.09（d，J=8.80Hz，α-ManU  H-5），3.97（1H，m，cinchonine  H-2），3.93（d，J=2.93  Hz，β-ManU  H-2）,3.91（m，α-ManU  H-2），3.89（dd，J=9.09，2.93Hz，α-ManU  H-3），3.87-3.81（m，α-ManU  H-4，cinchonine  H-8）,．3.75（t，J=9.68Hz，β-ManU  H-4）,3.69-3.65（m，β-ManU  H-3,5），3.50（2H，m，cinchonine  H-2,6），3.31（1H，m，cinchonine  H-6），2.79（1H，m，cinchonine  H-3），2.28（1H，m，cinchonine  H-7），2.13（1H，m，cinchonine  H-4），2.00（1H，m，cinchonine  H-5），1.85（1H，m，cinchonine  H-5），1.46（1H，m，cinchonine  H-7）．
13C-NMR（D2O，TPS-d4）:
δ=179.96（α-ManU  C-6），179.20（β-ManU  C-6），152.88（cinchonine  C-2’），149.65，148.99，139.66（cinchonine  C-10），133.31（cinchonine  C-7’），131.50，130.71（cinchonine  C-6’），127.71，125.52，122.03（cinchonine  C-3’），119.61（cinchonine  C-11），96.80（α-ManU  C-1），95.55（β-ManU  C-1），79.37（β-ManU  C-5），75.86（α-ManU  C-5），75.81（β-ManU  C-3），74.05（β-ManU  C-2），73.35（α-ManU  C-2），73.00（α-ManU  C-3），71.89（α-ManU  C-4），71.47（β-ManU  C-4），70.79（cinchonine  C-9），63.14（cinchonine  C-8），52.39（cinchonine  C-6），51.44（cinchonine  C-2），39.00（cinchonine  C-3），29.35（cinchonine  C-4），25.25（cinchonine  C-5），21.81（cinchonine  C-7）．
HR-FABMS（グリセロールマトリクス，FAB+）m/z［M+H]+:489.2239．
【実施例３】
【００３６】
Ｌ−グルロン酸ナトリウムの調製
Ｌ−グルロン酸シンコニン４．６７ｇ（９．５６ｍｍｏｌ）を蒸留水  ２００ｍＬに溶解後、室温撹拌下に炭酸水素ナトリウム０．８１３ｇ（９．６８ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１７時間撹拌後、析出したシンコニンを濾別し、クロロホルムで洗浄（５０ｍＬ×３）後減圧濃縮した。７．４５ｇまで濃縮後メンブランフィルター（０．４５μｍ、ＰＴＦＥ）で濾過し、メタノール６０ｍＬを添加し１℃で一晩放置後析出した白色結晶を吸引濾取しアセトンで洗浄した。このものを水−メタノール（＝１４：１０（Ｖ／Ｖ）、２０ｍＬ）で再結晶し（１℃で２４時間、−２０℃で４日間）、Ｌ−グルロン酸ナトリウム１水和物１．９５ｇを得た。このものは前記ＴＬＣ条件でＲｆ値＝０．３８に硫酸で発色するスポットを与えた。また、このものを前記ＨＰＬＣ条件で分析したところ、保持時間１４．０分にピークを与えた。このものの物性値は以下の通りであり高純度のＬ−グルロン酸ナトリウム１水和物であることを確認した。
1H-NMR（D2O,  TPS-d4）:
β体，δ=4.87（1H，d，J=8.25Hz，H-1），4.35（1H，s，H-5），4.10-4.08（2H，m，H-3,4），3.65（1H，dd，J=8.70，2.75Hz，H-2）；
α体,δ=5.21（1H，d，J=3.66Hz，H-1），4.58（1H，d，J=1.83Hz，H-5），4.19（1H，dd，J=4.12，1.83Hz，H-4），4.02（1H，dd，J=4.12，3.21Hz，H-3），3.94（1H，t，J=3.66Hz，H-2）．
13C-NMR（D2O，TPS-d4）:
β体,δ=178.78（C-6），96.37（C-1），77.21（C-5），74.14，73.96（C-3，4），71.61（C-2）；
α体，δ=179.47（C-6），95.78（C-1），74.04（C-3），73.79（C-4），70.20（C-5），67.33（C-2）.
HR-FABMS（グリセロールマトリクス，FAB+）m/z［M+H]+：217.0324．
Anal．Calcd．for  C6H9NaO7・H2O：C，30.78；H，4.74．Found：C，29.89；H，4.68．
【実施例４】
【００３７】
Ｄ−マンヌロン酸ナトリウムの調製
Ｄ−マンヌロン酸シンコニン４．７１ｇ（９．６４ｍｍｏｌ）を蒸留水２００ｍＬに溶解後、室温撹拌下に重炭酸水素ナトリウム０．８２４ｇ（９．８１ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１７時間撹拌後、析出したシンコニンを濾別し、クロロホルムで洗浄（５０ｍＬ×３）後減圧濃縮した。８．７２ｇまで濃縮後メンブランフィルター（０．４５μｍ、ＰＴＦＥ）で濾過し、メタノール７０ｍＬを添加して１℃で一晩放置し、析出した白色結晶を吸引濾取しアセトンで洗浄した。このものを水−メタノール（＝１：１（Ｖ／Ｖ）、２０ｍＬ）で再結晶し（１℃で２４時間、−２０℃で４日間）し、Ｄ−マンヌロン酸ナトリウム１．２５ｇを得た。このものは前記ＴＬＣ条件でＲｆ値＝０．４８に硫酸で発色するスポットを与えた。また、このものを前記ＨＰＬＣ条件で分析したところ、保持時間１４．９分にピークを与えた。このものの物性値は以下の通りであり高純度のＤ−マンヌロン酸ナトリウム無水物であることを確認した。
【００３８】
1H-NMR（D2O，TPS-d4）：
α体，δ=5.22（1H，d，J=1.83Hz，H-1），4.08（1H，d，J=9.16Hz，H-5），3.90（1H，dd，J=3.21，2.29Hz，H-2），3.87（1H，dd，J=9.16，3.21Hz，H-3），3.84（1H，t，J=9.16Hz，H-4）；
β体，δ=4.91（1H，s，H-1），3.92（1H，d，J=3.21Hz，H-2），3.74（1H，t，J=9.62Hz，H-4），3.67（1H，dd，J=9.62，3.21Hz，H-3），3.65（1H，d，J=9.62Hz，H-5）．
【００３９】
13C-NMR（D2O，TPS-d4）：
α体，δ=179.94（C-6），96.79（C-1），75.84（C-5），73.33（C-2），72.98（C-3），71.78（C-4）；
β体，δ=179.19（C-6），96.52（C-1），79.33（C-5），75.78（C-3），74.03（C-2），71.45（C-4）．
HR-FABMS（グリセロールマトリクス，FAB+）m/z［M+H]+：217.0327．
Anal．Calcd．for  C6H9NaO7：C，33.34；H，4.20.Found：C，32.64；H，4.37．
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明の製造方法により製造された高純度のＬ−グルロン酸またはＤ−マンヌロン酸の金属塩は、ＨＰＬＣ等に使用される標準物質として用いることができる。これによって、例えば海藻中の正確なアルギン酸含有量を測定することができる。