(57)【要約】【課題】従来の結晶の製造方法（結晶化方法）に見られる欠点を解消して、簡便に、再現性良く、汎用的に、巨大分子結晶を製造できる新規な方法及びその製造装置を提供すること。さらに、前記の方法により巨大分子結晶を提供すること。【解決手段】巨大分子及び非電解質ポリマーを含む溶液に紫外光を照射することにより、巨大分子結晶の核形成及び／又は結晶成長をさせる工程を含むことを特徴とする巨大分子結晶の製造方法。巨大分子の溶液に多光子励起が可能な強度の可視光を照射することにより、巨大分子結晶の核形成及び／又は結晶成長をさせる工程を含むことを特徴とする巨大分子結晶の製造方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
巨大分子及び非電解質ポリマーを含む溶液に紫外光を照射することにより、巨大分子結晶の核形成及び／又は結晶成長をさせる工程を含むことを特徴とする巨大分子結晶の製造方法。
【請求項２】
水銀灯、キセノンランプ、レーザー光源又はエキシマーレーザー光源を用いて光を照射する請求項１に記載の巨大分子結晶の製造方法。
【請求項３】
巨大分子の溶液に多光子励起が可能な強度の可視光を照射することにより、巨大分子結晶の核形成及び／又は結晶成長をさせる工程を含むことを特徴とする巨大分子結晶の製造方法。
【請求項４】
巨大分子の溶液がさらに非電解質ポリマーを含む請求項３に記載の巨大分子結晶の製造方法。
【請求項５】
可視光の強度が１０6Ｗ以上である請求項３又は４に記載の巨大分子結晶の製造方法。
【請求項６】
巨大分子がタンパク質、ポリペプチド、糖タンパク質、及び核酸よりなる群から選ばれた請求項１〜５いずれか１つに記載の巨大分子結晶の製造方法。
【請求項７】
照射する紫外光又は可視光の多光子励起が巨大分子の電子遷移を起こさせる請求項１〜６いずれか１つに記載の巨大分子結晶の製造方法。
【請求項８】
巨大分子の溶液が核生成及び／又は結晶成長を促進する沈殿剤又はｐＨ調節剤を含有する請求項１〜７いずれか１つに記載の巨大分子結晶の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜８いずれか１つに記載の巨大分子結晶の製造方法により得られた巨大分子結晶。
【請求項１０】
巨大分子結晶の核形成及び／又は結晶成長をさせるための光照射部を有することを特徴とする巨大分子結晶の製造装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は巨大分子結晶の製造方法、この方法を用いて調製された巨大分子結晶、及び巨大分子結晶の製造装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質等の巨大分子を結晶化させるには、バッチ法、透析法、液相間拡散法、気液相関拡散法等の方法が用いられている（非特許文献１参照）。
例えば、バッチ法によれば、タンパク質溶液に硫酸アンモニウム等の沈殿剤を結晶化濃度まで直接加える。一般には、巨大分子溶液の入った容器に沈殿剤を加え巨大分子が過飽和となるように制御し、巨大分子の結晶を作成していた。このバッチ法では、高濃度の巨大分子試料を大量に必要とすること、操作に熟練を要し再現性が低いこと、結晶化条件のスクリーニングが困難であること、等の欠点がある。また、従来の上記結晶化方法は、特定の巨大分子に比較的特異な結晶化条件を要し、汎用的な条件がないという欠点を有している。
【０００３】
特許文献１にはタンパク質結晶の核形成に適した温度条件に設定したタンパク質溶液に可視域と思われるレーザー光を照射し、このレーザー光の散乱状況を解析することによりタンパク質結晶の核形成の開始を検出し、核形成の開始を検出した時点でタンパク質溶液を結晶成長に適した温度条件に制御するようにした技術が開示されている。この例にあるように、巨大分子溶液から結晶を得る過程で溶液に光を作用させる従来の例は、光が巨大分子あるいは発生した結晶の検出を行うのみであり、結晶の核形成ないしは結晶成長に光照射は何らの積極的な作用をもたらしてはいなかった。
【０００４】
特許文献２には過飽和状態であるがタンパク質結晶の核形成に適さない低過飽和度の溶液（準安定溶液）にネオジウムＹＡＧレーザーの第四高調波２６６ｎｍ光、あるいは５００Ｗキセノンランプ光を照射することにより、ニワトリ卵白リゾチームの結晶を出現させる方法が開示されている。また、非特許文献２には、タンパク質の電子遷移を伴う波長の光で結晶核の形成が促進される機構は、タンパク質の光化学反応中間体が、他のタンパク分子を引き寄せる効果が大きいためであると推測されている。しかしながら、タンパク質の電子遷移を誘起させる波長の光を長時間照射すると、特にタンパク質として酵素を使用した場合には、酵素活性が低下するという問題があった。
【０００５】
【特許文献１】特開平６−１１６０９８号公報
【特許文献２】特開２００３−３０６４９７号公報
【非特許文献１】日本生化学会編、新生化学実験講座１「タンパク質Ｉ−分離・精製・性質−」、１９９０年、東京化学同人発行、高野常弘氏執筆、第１４章「結晶化」
【非特許文献２】Tetsuo Okutsu, Kenji Furuta, Motoaki Terao, Hiroshi Hiratsuka, Akihito Yamano, Natalie Ferte and Stephane Veesler, Light-induced nucleation of metastable hen-egg white lysozyme solutions, Crystal Growth & Design, 5, 1393-1398 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明が解決しようとする課題は、従来の結晶の製造方法（結晶化方法）に見られる欠点を解消して、簡便に、再現性良く、汎用的に、巨大分子結晶を製造できる新規な方法及びその製造装置を提供することである。さらに、本発明は、前記の方法により巨大分子結晶を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の課題は、以下の＜１＞、＜３＞、＜９＞又は＜１０＞に記載の解決手段により達成された。好ましい実施態様である＜２＞、＜４＞〜＜８＞と共に以下に記載する。
＜１＞  巨大分子及び非電解質ポリマーを含む溶液に紫外光を照射することにより、巨大分子結晶の核形成及び／又は結晶成長をさせる工程を含むことを特徴とする巨大分子結晶の製造方法、
＜２＞  水銀灯、キセノンランプ、レーザー光源又はエキシマーレーザー光源を用いて光を照射する＜１＞に記載の巨大分子結晶の製造方法、
＜３＞  巨大分子の溶液に多光子励起が可能な強度の可視光を照射することにより、巨大分子結晶の核形成及び／又は結晶成長をさせる工程を含むことを特徴とする巨大分子結晶の製造方法、
＜４＞  巨大分子の溶液がさらに非電解質ポリマーを含む＜３＞に記載の巨大分子結晶の製造方法、
＜５＞  可視光の強度が１０6Ｗ以上である＜３＞又は＜４＞に記載の巨大分子結晶の製造方法、
＜６＞  巨大分子がタンパク質、ポリペプチド、糖タンパク質、及び核酸よりなる群から選ばれた＜１＞〜＜５＞いずれか１つに記載の巨大分子結晶の製造方法、
＜７＞  照射する紫外光又は可視光の多光子励起が巨大分子の電子遷移を起こさせる＜１＞〜＜６＞いずれか１つに記載の巨大分子結晶の製造方法、
＜８＞  巨大分子の溶液が核生成及び／又は結晶成長を促進する沈殿剤又はｐＨ調節剤を含有する＜１＞〜＜７＞いずれか１つに記載の巨大分子結晶の製造方法、
＜９＞  ＜１＞〜＜８＞いずれか１つに記載の巨大分子結晶の製造方法により得られた巨大分子結晶、
＜１０＞  巨大分子結晶の核形成及び／又は結晶成長をさせるための光照射部を有することを特徴とする巨大分子結晶の製造装置。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、従来の巨大分子結晶の製造方法（結晶化方法）に見られる欠点を解消して簡便に、再現性良く、汎用的に、巨大分子結晶を製造できる新規な方法及びその製造装置を提供することができる。さらに、本発明によれば、前記の方法により得られた巨大分子結晶を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の巨大分子の結晶化方法の第一の実施態様は、巨大分子及び非電解質ポリマーを含む溶液に紫外光を照射することにより、巨大分子結晶の核形成及び／又は結晶成長をさせる工程を含むことを特徴とする。
また、本発明の巨大分子の結晶化方法の第二の実施態様は、巨大分子の溶液に多光子励起が可能な強度の可視光を照射することにより、巨大分子結晶の核形成及び／又は結晶成長をさせる工程を含むことを特徴とする。
【００１０】
本発明において、「巨大分子」とは、分子量が１万以上の典型的な高分子以外に分子量が約千以上１万未満のオリゴマー領域の分子をいう。
本発明の方法は、種々の巨大分子の結晶化に適用することができるが、特にポリペプチド、タンパク質、および核酸例えばＤＮＡ、ならびにそれらの誘導体の結晶化に適している。ここで、誘導体には糖タンパク質、ＤＮＡコンジュゲート等が含まれる。
これらの中でも、本発明はポリペプチド、タンパク質及びこれらの誘導体の結晶化に好適であり、特にタンパク質及びその誘導体の結晶化に好適である。本発明の巨大分子結晶の製造方法によれば、巨大分子の変性を抑制することができるので、特に酵素などの生理活性を有するタンパク質及びその誘導体の結晶化に好適に使用できる。
【００１１】
以下、本発明の製造方法及び製造装置を巨大分子について説明する。
本発明において、「核形成」とは、巨大分子の溶液中から巨大分子の結晶が出現する初期の段階をいい、形成される核を「結晶核」ともいう。結晶核は、安定に存在しうる巨大分子の規則的凝集体であって、結晶成長を引き起こすことのできる巨大分子の集合体である。
「結晶成長」とは、上記の結晶核の表面に溶質分子である巨大分子が取り込まれて、結晶が大きくなることをいう。
本発明の巨大分子結晶の製造方法は、結晶核の形成段階のみに使用しても良く、また予め別の方法で形成された核を成長させる結晶成長の段階にのみ使用しても良く、核形成とそれに続く結晶成長の両段階を連続して、又は、途中で中断して逐次的に、実施しても良い。
【００１２】
巨大分子の溶液は、必須成分として、巨大分子とこれを溶解する溶媒とを含む。溶媒は、巨大分子に応じて選択でき、水、有機溶媒、又は、水及び水と混合する有機溶媒（水性有機溶媒）との混合物であることができる。
【００１３】
本発明の巨大分子結晶の製造方法において、巨大分子の溶液中における濃度は、光照射する条件下における飽和濃度の８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、飽和濃度であるか過飽和であることが特に好ましい。核形成及び／又は結晶成長に伴い、溶液濃度を上記の範囲内に維持することが好ましい。この溶液濃度を維持するためには、溶質の補充、温度の低下、沈殿剤の追加等の少なくとも１つを実施することが好ましい。
【００１４】
本発明において、結晶化に供する巨大分子は、その純度および均質性が高い方が容易に結晶を作製することができる。このために本発明による結晶製造に先立って、結晶化させる巨大分子に適当な精製を行うことが好ましい。
ポリペプチドとしては、大腸菌、酵母または動物細胞における発現によって得た後、慣用方法で単離されたポリペプチド、または合成ポリペプチドを挙げることができる。結晶化前の精製を、アフィニティークロマトグラフィー、慣用のクロマトグラフィー、ｒｐＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等によって行なうことが好ましい。核酸は、慣用の単離法により得た後、精製により純度を高めた後に結晶化させることが好ましい。タンパク質は慣用の方法により純度を高め、等電点電気泳動法あるいは光散乱法等により純度を確認した後結晶化させることが好ましい。
【００１５】
次に、本発明の第一の実施態様について説明する。
本発明の第一の実施態様において、巨大分子の溶液は、非電解質ポリマーを含有する。
非電解質ポリマーとは、イオン性基を有しない高分子であり、分子量は、４００〜１００，０００であることが好ましい。非電解質ポリマーは水溶性の非電解質ポリマーであることが好ましい。
非電解質ポリマーとしては、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコールが例示できる。これらの中でも、非電解質ポリマーとしては、ポリアルキレングリコールが好ましい。ポリアルキレングリコールとしては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等が例示でき、これらの中でもポリエチレングリコールが好ましい。
本発明において使用されるポリアルキレングリコールは分子量が４００〜２０，０００であることが好ましく、８００〜１０，０００であることがより好ましく、１，０００〜８，０００であることがさらに好ましい。従って、本発明において、非電解質ポリマーは分子量が１，０００〜８，０００のポリエチレングリコールであることが特に好ましい。
【００１６】
本発明において、非電解質ポリマーの存在下で光照射を行うと、結晶化が著しく促進される。同じ濃度の過飽和溶液を使用した場合であっても、非電解質ポリマーの存在下で光照射することによって、光誘起結晶化が促進される。従って、非電解質ポリマーの存在下で光照射を行った場合、非電解質ポリマーは単に沈殿剤として機能するものではないと考えられる。
このような機構の理由は明確でないが、非電解質ポリマーを添加することにより、光励起された単量体の反応速度定数が速くなり、二量体の形成を促進していると考えられる。
【００１７】
本発明において、非電解質ポリマーの添加量は、０．１〜１００ｍｇ／ｍＬであることが好ましく、０．５〜１０ｍｇ／ｍＬであることがより好ましい。非電荷ポリマーの添加量が上記範囲内であると、光照射による結晶化が効果的に促進されるので好ましい。
【００１８】
本発明の第一の実施態様において、巨大分子結晶の核形成あるいは結晶成長を起こさせるために用いられる光としては、巨大分子の電子遷移を起こさせる（巨大分子を電子的に励起させる）波長を含む単色光又は連続光を使用することが好ましい。電子遷移を起こさせる波長とは、分子吸光係数が１０以上である波長をいい、本発明の第一の実施形態では紫外光（波長３９０ｎｍ未満、好ましくは３８０ｎｍ未満、より好ましくは３５０ｎｍ未満）を使用する。
本発明に使用できる紫外光には、波長１８０〜３００ｎｍのｄｅｅｐ  ＵＶ、波長３００〜３５０のｍｉｄ  ＵＶ、及び波長３５０〜３９０ｎｍのｎｅａｒ  ＵＶが含まれる。溶質が一般的なタンパク質の場合には、１８０〜３２０ｎｍの紫外線が好ましく使用できる。
【００１９】
巨大分子の結晶化のために用いることのできる光は、タングステンランプ、水銀灯、キセノンランプなどの定常点灯光源の他に、固体レーザー、気体レーザー、半導体レーザー、エキシマーレーザーなどのレーザー光源を使用することもできる。パルスキセノン光源、マイクロ波励起ランプ、ＫｒＦ（２４９ｎｍ）、ＡｒＦ（１９３ｎｍ）、ＸｅＣｌ（３０８ｎｍ）、ＫｒＣｌ（２２２ｎｍ）及びＦ2（１５７ｎｍ）等のエキシマーレーザーによれば、効率よくパルス状に紫外光を発生することができるので好ましい。
照射する光の強度は、適宜選択できるが、通常は、数μＷないし数１００Ｗの範囲にある強度の光を用いることができる。
光照射は、定常光でも良く、パルス光でも良い。必要に応じて、照射強度、１パルス当たりのエネルギー、パルス間隔等を変化させることもできる。
【００２０】
本発明の第一の実施態様において、紫外線等の光の照射時間は５秒〜３０分であることが好ましく、５秒〜１５分であることがより好ましい。
また、光を照射した後、静置することで、巨大分子の結晶成長をさらに進行させることも好ましい。照射後の静置は４〜２５℃で行うことが好ましく、４〜２０℃で行うことがより好ましい。また、静置する時間は、巨大分子結晶の成長が十分に行われる範囲で適宜選択することができる。
本発明の第一の実施態様において、非電解質ポリマーを併存させることにより結晶化が促進されるので、従来の方法と比較して光の照射時間を短くすることができ、巨大分子の変性や酵素活性低下等を抑制することができる。
【００２１】
次に、本発明の第二の実施態様について述べる。
本発明の第二の実施態様において、巨大分子結晶の製造方法は、多光子励起が可能な強度の可視光を巨大分子の溶液に照射することを特徴とする。
多光子励起とは、物質（分子）が２つ以上の光子を吸収（多光子吸収）して励起される現象である。多光子励起では２つ以上の光子を吸収するが、２光子吸収が好ましい。また、２光子吸収には段階的２光子吸収及び同時２光子吸収が存在するが、同時２光子吸収であることが好ましい。
従来は、紫外光を用いて巨大分子結晶の核形成及び／又は結晶成長を行っていたが、紫外線を照射することによって、特に巨大分子としてタンパク質を使用した場合には、タンパク質が変性するという問題が生じることがあった。
本発明においては、可視光を照射するので、上述のような巨大分子の変性を抑制することができる。
【００２２】
多光子励起（多光子吸収）の起こる確率は、二光子励起の場合、加えた光電場（入射光強度）の二乗に比例するため、入射光エネルギーが集中している領域でのみ多光子吸収が誘起される。従って、照射する可視光をレンズで集光すれば、焦点付近でのみ多光子吸収が生じ、その他の部分では吸収が生じないという状況を作製することが可能である。このように焦点付近の限られた空間でのみ巨大分子の電子遷移を生じさせることにより、結晶化されたタンパク質等の巨大分子に損傷を与えることなく、巨大分子の結晶を製造することができる。
【００２３】
多光子励起が可能な可視光の照射方法としては、可視光（波長３８０〜７８０ｎｍ、好ましくは３９０ｎｍ〜７８０ｎｍ、より好ましくは４００ｎｍ〜７８０ｎｍ）を用い、これを集光して照射する方法が例示できる。
可視光としては、５００〜８００ｎｍの波長であることが好ましく、５５０〜６４０ｎｍの波長であることがより好ましい。使用する波長が上記範囲内であると、集光部以外の巨大分子に変性を生じることがないので好ましい。光源としては連続光のレーザーからフェムト秒レーザーまで用いることができる。エキシマーレーザー励起の色素レーザー、チタンサファイアレーザー励起の色素レーザー、あるいはＹＡＧレーザー励起の色素レーザー、ＯＰＯレーザー、ダイオードレーザーが例示できる。パルス励起された色素レーザー、ＯＰＯレーザーが好ましく、数十〜数百ピコ秒のパルス幅を有する色素レーザー、あるいはＯＰＯレーザーが特に好ましい。
【００２４】
可視光のエネルギーは、集光後の光が多光子吸収を起こすエネルギーを有する範囲で適宜選択することができるが、１０6Ｗ以上であることが好ましく、１０7〜１０10Ｗであることが好ましく、１０8〜１０9Ｗであることがより好ましい。照射する可視光のエネルギーが上記範囲内であると、集光された光が巨大分子結晶の核形成及び／又は核成長を促進することができるので好ましい。
可視光は連続的に照射しても良く、また、パルス照射しても良いが、パルス照射することが好ましい。
【００２５】
集光した可視光は１秒〜１時間照射することが好ましく、１秒〜３０分照射することがより好ましい。照射時間が上記範囲内であると、タンパク質等の巨大分子の変質を起こすことなく巨大分子結晶の核形成及び／又は結晶成長を促進することができるので好ましい。
また、光を照射した後、静置することで、巨大分子結晶の成長をさらに進行させることも好ましい。照射後の静置は４〜２５℃で行うことが好ましく、４〜２０℃で行うことがより好ましい。また、静置する時間は、巨大分子結晶の成長が十分に行われる範囲で適宜選択することができる。
【００２６】
本発明の第二の実施態様において、上述した非電解質ポリマーを添加することも好ましい。このとき、好ましい非電解質ポリマー及びその添加量は第一の実施態様と同様である。
【００２７】
本発明の第一及び第二の実施態様において、核形成／結晶化方法において、光を照射する巨大分子の溶液には、結晶化を促進する沈殿剤、ｐＨ調節剤、その他タンパク質の結晶化に使用される添加剤を加えることができる。
核形成／結晶化に使用する溶液の最適条件は、結晶化させる巨大分子ごとに、ｐＨ、沈殿剤の種類と濃度、温度ならびにその他の因子を選択する。結晶化させる巨大分子に対する至適条件（溶質濃度、溶媒組成、温度、沈殿剤の種類と濃度、及びこれらの時間変化を含む。）は実験室的定常作業の一部であり、当該分野に従事する技術者により容易に決定できる。
【００２８】
結晶化に用いることのできる沈殿剤として塩類、有機溶媒、水溶性高分子等を用いることができる。塩類としては、硫酸アンモニウムが最もよく用いられているが、塩化ナトリウム、リン酸塩、クエン酸ナトリウム、硫酸塩、硝酸塩などを用いることができる。有機溶媒も水溶性のものは沈殿剤として用いることができる。例えば、２−メチル−２，４−ペンタジオール（ＭＰＤ）やエタノール、プロパノールジオキサンなどを用いることができる。
結晶化の方法として、ハンギングドロップ蒸気拡散法、シッティングドロップ蒸気拡散法、ミクロ透析法、自由界面拡散法、静置バッチ法を用いることができる。
その他の結晶化を促進する条件は、前掲の日本生化学会編、新生化学実験講座１「タンパク質Ｉ−分離・精製・性質−」、高野常弘氏執筆、第１４章「結晶化」、及びＡ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ著、”Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｓ”（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎ，  Ｉｎｃ．）に記載されている。
【００２９】
本発明の第一及び第二の実施形態で得られる巨大分子結晶の結晶形は、従来の沈殿剤によるバッチ法により得られる結晶の結晶形と異なる場合がある。実施例に示すように、光照射により正方晶のリゾチーム結晶を得ることができる。又、本発明において使用する光源を変えことにより、その照射される光の分光エネルギー分布、パルス光・定常光の相違等に基づき、生成する結晶の形を変化させることもできる。
本発明によれば、Ｘ線結晶解析に適した大型の結晶を得ることができる。
【００３０】
本発明により結晶化された巨大分子は、Ｘ線結晶構造解析のための試料に供されるばかりでなく、一般に保存安定性が極めて高いので、予防用または治療用剤形として医薬組成物に使用することが可能であり、巨大分子が結晶型であることにより特に有利な投与が可能になる。結晶は、例えば経口、皮下、皮内、腹腔内、静脈内、筋肉内等の投与に適当である。本発明はしたがって、同様に、活性物質として本発明により結晶化された巨大分子の薬理学的有効量および、必要に応じて１種または２種以上の慣用の医薬的に許容される担体からなる医薬組成物を包含する。
【００３１】
本発明によって結晶化された巨大分子は、原理的に、多くの巨大分子について知られているのと同じ方法で、医薬製剤中に、例えば薬理学的に有効な巨大分子０.００１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の１日用量を投与するためのデポ製剤として使用することができる。したがって、広範囲の様々な巨大分子が本発明によって結晶化された形態で、例えば治療剤デポ製剤、抗原デポ製剤、ＤＮＡデポ製剤または糖デポ製剤として使用できる。結晶中に含有される結晶化補助剤はしかも、アジュバント（ワクチン接種において）として使用される。
【００３２】
本発明に用いる巨大分子結晶の製造装置は、光源、光を巨大分子が含まれる溶液まで導くための光学系、巨大分子を含む溶液セル、セルの温度を制御するための温度コントローラー、および結晶を観察するための拡大鏡より構成することができる。巨大分子の電子遷移が紫外光で起こる場合は、光源から照射試料まで光を導く光路に用いられる、レンズ、ミラー等の光学部品が紫外線を効率よく透過あるいは反射するものを用いることが好ましい。
上記の光学系には、適宜、反射鏡、集光レンズ、光フィルター、赤外線遮断フィルター、光ファイバー、非線形光学素子等の光学部材を使用することができる。
特に、多光子励起が可能な強度の可視光を照射する場合には、集光レンズを使用することが好ましい。
本発明の結晶製造装置における溶液セルの容量は適宜選択できる。１ｍｌ以下（例えば数μｌ）から数１００ｌの範囲に及ぶ。溶液である巨大分子の溶解量も数ｍｇから数Ｋｇ又はこれ以上に及ぶことができる。
【００３３】
本発明の結晶化装置において温度コントローラーは、巨大分子を含む溶液セルの内部温度を、一定温度に保っても良く、必要な温度変化をさせるプログラム回路を備えていても良い。また、必要に応じて、巨大分子溶液中における結晶核の生成、沈殿剤濃度、ｐＨ等を検出し、またこれらを制御するための装置、回路、プログラムを具備していても良い。結晶条件の検出及び制御のためには、複数の結晶条件検出用セルを１チップ化した装置とすることが好ましい。このような検出チップは、特開２００１−２１３６９９号公報に記載されたように、半導体装置の一般的な製造プロセスにより製造することができる。
本発明の結晶製造装置に、特開平６−１１６０９８に記載されたような、結晶核の生成又は結晶成長には寄与しないが、結晶核の生成状況を検出するための巨大分子が吸収しない長波のレーザー光を使用することもできる。
【００３４】
本発明の作用機構は未だ解明されていない。一つの可能性としては、巨大分子の溶液中において巨大分子を取り囲む溶媒（水溶液の場合には水和水となる）が光照射により離脱しやすくなるために、巨大分子の核形成及び結晶成長が促進されるという機構が考えられる。ただし、この機構の当否は、本発明の特許性又は有効性に何ら影響を及ぼすものではない。
【実施例】
【００３５】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
尚、以下の実験は全て室温が２０℃に保たれた部屋で行った。
（実施例１）
リゾチーム２０ｍｇ／ｍｌおよび塩化ナトリウム０．７Ｍを含み、酢酸ナトリウム緩衝溶液でｐＨ４．３に保たれた溶液Ａを調製した。この溶液をパラフィンオイルで１ｍｍの厚さで覆ったマイクロバッチプレート上のウェルに５マイクロリットル滴下した。ネオジウムＹＡＧレーザーの第二高調波５３２ｎｍのパルスレーザー光を用いて、ローダミン６Ｇを用いた色素レーザー光を発振させた。発振波長は５９０ｎｍに調整した。色素レーザーのエネルギーは１０ｍＪ／ｐｕｌｓｅであった。レーザー光のパルス幅は１００ｐｓで繰り返し周波数は１０Ｈｚで行った。
このレーザー光を、集光せずに鉛直方向から、マイクロバッチプレート上の液滴に１０Ｈｚで０、１０秒、３０秒、６０秒間照射した。この液滴をＢとした。
レーザー光を焦点距離２０ｍｍのレンズで集光し、鉛直方向からタンパク質の液滴に向かって照射し、焦点をマイクロバッチプレート上の液滴中に結んだ。光照射は１０Ｈｚで０、１０秒、３０秒、６０秒間行った。この液滴をＣとした。
マイクロバッチプレートに蓋をして２０℃に保たれた恒温室で一日保管した。
【００３６】
溶液Ａを滴下しただけの液滴には、何も変化が見られなかった。集光しないレーザー光を照射した液滴Ｂではいずれの照射時間においても変化が見られなかった。集光したレーザー光を照射した液滴Ｃには、正方晶のリゾチームの結晶が出現した。レーザー光を集光すると同時に多光子吸収が起こり、紫外光しか吸収しないリゾチームを励起できたため、光誘起結晶化を起こすことができたものと考えられる。
【００３７】
（比較例１）
実施例１で用いたリゾチームの準安定溶液に１５０Ｗキセノンランプ光（ＵＳＨＩＯ  ＵＸＬ−１５０）を照射して、光誘起核形成を行った。用いた実験器具はレーザーの代わりにキセノンランプを用いる以外は同一である。照射時間は、０秒（照射無し）、１０秒、３０秒、６０秒、１２０、１８０、３００秒間とした。照射時間と液滴中に出現したリゾチーム正方晶の数を表１に示した。この実験は既に特開２００３−３０６４９７に開示した方法で行ったものである。
このとき光照射を行った溶液を１マイクロリットル採取し、酵素活性を測定した。酵素活性はミクロコッカス・ルテウス法で行った。酵素活性の変化は、光照射しない溶液に対する相対値として表示した。結果を表１に示す。
照射時間の増加に伴い、出現する結晶数は増加した。このとき酵素活性は時間とともに低下した。３００秒間の照射を行ったときは、出現する結晶数も減少した。
【００３８】
【表１】
2007254415.tif 000003
【００３９】
次に実施例１で用いた集光したレーザー光を照射した溶液Ｃの酵素活性を同様の方法でミクロコッカス・ルテウス法により測定した。結果を表２に示す。
【００４０】
【表２】
2007254415.tif 000004
【００４１】
集光したレーザー光を照射する方法では、結晶が効率よく出現するにも関わらず、酵素活性の低下はほとんど起こらないことがわかる。この事実から、同時多光子励起により光誘起核形成を行う方法は、タンパク質を損傷せずに結晶化できる優れた方法であることが明らかとなった。
【００４２】
（実施例２、比較例２）
１．４Ｍの塩化ナトリウムを含有しかつポリエチレングリコール４０００（ＰＥＧ）を０．２重量％含有するリゾチーム溶液を、過飽和度が３．５になるように調整した。このとき、リゾチーム濃度は１．３０ｍｇ／ｍｌとした。
また、比較のためにポリエチレングリコール４０００を含まずに過飽和度を３．５とする溶液を調製した。このときはリゾチーム濃度を３．７１ｍｇ／ｍｌとした。
これらのリゾチーム濃度は、溶解度曲線を作製して決定した。
この溶液にキセノンランプ光を０、３０、１２０、１８０秒間照射した。照射後の溶液から５マイクロリットル取り出し、２０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム溶液５マイクロリットルとパラフィンオイルで覆われたマイクロバッチ上で混合した。混合後２日後に顕微鏡で観察した。
結果を図２に示す。
【００４３】
ＰＥＧを含まない溶液を混合した液滴からは、光照射を行っても結晶の出現は観察されず、過飽和度３．５では光誘起核形成の効果が現れなかった。一方、ＰＥＧを含む溶液に光照射を行い、混合した液滴からは結晶が出現した。その数は照射時間に伴い増加した。このことから同じ過飽和度の溶液でありながら、ＰＥＧを加えると光誘起結晶化が促進されることが示された。
ＰＥＧを加えることにより結晶化が促進される、あるいは溶解度を低下させる効果があることは知られているが、同じ溶解度に調整した溶液に光を当てると、その効果に違いが見られたのは初めてのことである。その機構は明らかではないが、光照射が短時間であっても巨大分子結晶が生じることから、タンパク質を損傷せずに結晶化を行うことのできる優れた方法であるといえる。
【００４４】
（実施例４）
リゾチーム２０ｍｇ／ｍｌおよび塩化ナトリウム０．７Ｍを含み、さらにポリエチレングリコール４０００を０．２ｗｔ％含有し、酢酸ナトリウム緩衝溶液でｐＨ４．３に保たれた溶液Ａを調製した。この溶液をパラフィンオイルで１ｍｍの厚さで覆ったマイクロバッチプレート上のウェルに５マイクロリットル滴下した。
ネオジウムＹＡＧレーザーの第二高調波５３２ｎｍのパルスレーザー光を用いて、ローダミン６Ｇを用いた色素レーザー光を発振させた。発振波長は５９０ｎｍに調整した。色素レーザーのエネルギーは１０ｍＪ／ｐｕｌｓｅであった。レーザー光のパルス幅は１００ｐｓであり、繰り返し周波数は１０Ｈｚであった。
このレーザー光を、集光せずに鉛直方向から、マイクロバッチプレート上の液滴に１０Ｈｚで０、１０秒、３０秒、６０秒間照射した。この液滴をＢとした。
レーザー光を焦点距離２０ｍｍのレンズで集光し、鉛直方向からタンパク質の液滴に向かって照射し、焦点をマイクロバッチプレート上の液滴中に結んだ。光照射は１０Ｈｚで０、１０秒、３０秒、６０秒間行った。この液滴をＣとした。
マイクロバッチプレートに蓋をして２０℃に保たれた恒温室で一日保管した。
【００４５】
溶液Ａを滴下しただけの液滴には、何も変化が見られなかった。また、集光しないレーザー光を照射した液滴Ｂではいずれの照射時間においても変化が見られなかった。これに対し、集光したレーザー光を照射した液滴Ｃには、正方晶のリゾチームの結晶が出現した。出現した結晶の数は、ポリエチレングリコールを含まない溶液に集光したレーザーを照射したときのおよそ２倍になった。レーザー光を集光すると同時に多光子吸収が起こり、紫外光しか吸収しないリゾチームを励起できたため、光誘起結晶化を起こすことができたものと考えられ、さらに非電解質ポリマーを添加した効果は、レーザー多光子吸収による実施例においても効果が認められた。
下記の表に液滴Ｃに対する可視光の照射時間、結晶数及び酵素活性を示す。尚、測定方法は実施例１と同様である。
【００４６】
【表３】
2007254415.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、本発明の結晶製造装置の一実施態様を示す概念図である。
【図２】図２は、本発明により得られたタンパク質結晶の一例についてその結晶構造を示す光学顕微鏡写真である。（Ａ）ポリエチレングリコールを含まない過飽和度３．５の溶液にキセノンランプ照射を行った液滴。（Ｂ）ポリエチレングリコールを含む過飽和度３．５の溶液にキセノンランプ照射を行った液滴。
【符号の説明】
【００４８】
１：パルスレーザー光源
２：光ファイバー
３：巨大分子溶液
４：光学顕微鏡
【図１】
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【図２】
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