(57)【要約】      （修正有）【課題】より活性の強い新規クマリン化合物を提供すること。【解決手段】下記式（１）で示される誘導型一酸化窒素合成酵素を阻害するクマリン化合物。2007290981.tif 000014  （ここでＸは水素原子、置換基を有してよい炭化水素基又は置換基を有してよいアリール基であり、Ｒ１及びＲ２は、置換基を有していてもよい炭化水素基であり、Ｙ及びＺは、水素原子又は置換基を有してもよい炭化水素基である。Ｒ１、Ｒ２、Ｙ及びＺは、それぞれ同じであっても良いし異なっていてもよい。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で示される誘導型一酸化窒素合成酵素を阻害するクマリン化合物。
【化１】
2007290981.tif 000011
（ここでＸは水素原子、置換基を有してよい炭化水素基又は置換基を有してよいアリール基であり、Ｒ１及びＲ２は、置換基を有していてもよい炭化水素基であり、Ｙ及びＺは、水素原子又は置換基を有してもよい炭化水素基である。Ｒ１、Ｒ２、Ｙ及びＺは、それぞれ同じであっても良いし異なっていてもよい。）
【請求項２】
下記式（２）又は（３）で示される誘導型一酸化窒素合成酵素を阻害するクマリン化合物。
【化２】
2007290981.tif 000012
【化３】
2007290981.tif 000013
【請求項３】
請求項１又は２に記載のクマリン化合物を有効成分とするｉＮＯＳ阻害剤。
【請求項４】
前記クマリン化合物を２０μＭ以上１００μＭ以下含む請求項１又は２記載のｉＮＯＳ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クマリン化合物に関するものであり、さらに詳しくは、アレルギー性気道炎、肺炎、関節炎、血管炎、膵β細胞の自己破壊、臓器移植時の同種移植片急性拒絶反応など数々の炎症疾患を抑制することを可能とするｉＮＯＳ阻害活性を有するものに関する。
【背景技術】
【０００２】
一酸化窒素（ＮＯ）は、各種生体維持機構に関わる必須な内因性物質である一方、炎症等の原因物質にもなるというマイナス面を併せもつ。このマイナス面に働くＮＯの産生には誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）が関わっていると考えられており、ｉＮＯＳを阻害する化合物を見出すことは、新規抗炎症薬の創製につながると考えられている。
【０００３】
ｉＮＯＳ阻害活性を示す天然化合物としてはショウガ科ウコンから単離されたクルクミンや大豆のイソフラボンが有名であるが、クマリン化合物においてもその報告例が数例見られる（下記非特許文献公知文献 １乃至５参照）。
【０００４】
【非特許文献１】Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．、１９９９年、４７巻、３３３〜３３９頁
【非特許文献２】Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２０００年、８巻、２７０１〜２７０７頁
【非特許文献３】Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、２００４年、５２巻、１２１５〜１２１８頁
【非特許文献４】Ｊ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．、２００４年、６７巻、４３２〜４３６頁
【非特許文献５】Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２００５年、１３巻、２７２３〜２７３９頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記各文献に記載のｉＮＯＳ阻害活性を示す物質は、その作用の強さに関し解決すべき問題点を残しており、さらに活性が強い新規クマリン化合物の出現が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、熱帯産植物についてｉＮＯＳ阻害活性を指標にしたスクリーング試験を行ったところ、ミカン科 Ｃｌａｕｓｅｎａ植物に強い阻害活性を認め、その活性本体がクマリン化合物であることを解明し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明の一形態に係る誘導型一酸化窒素合成酵素を阻害するクマリン化合物は、下記式（１）で示される。
【化１】
2007290981.tif 000002
（ここでＸは水素原子、置換基を有してよい炭化水素基又は置換基を有してよいアリール基であり、Ｒ１及びＲ２は、置換基を有していてもよい炭化水素基であり、Ｙ及びＺは、水素原子又は置換基を有してもよい炭化水素基である。Ｒ１、Ｒ２、Ｙ及びＺは、それぞれ同じであっても良いし異なっていてもよい。）
【０００８】
また本発明の他の一形態に係る誘導型一酸化窒素合成酵素を阻害するクマリン化合物は、下記式（２）又は（３）で示される。
【化２】
2007290981.tif 000003
【化３】
2007290981.tif 000004
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、よりｉＮＯＳ阻害活性の強い新規クマリン化合物を提供することができ、更に、それを用いたｉＮＯＳ阻害剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を実施するための最良の形態について、図面及び表を用いて説明する。ただし、本発明は多くの異なる態様による実施が可能であって、以下に示す実施形態、実施例に狭く限定されるものではない。
【００１１】
実施形態に係るクマリン化合物は、下記式（１）で表わされる５，７−ジオキシクマリン化合物となっている。
【化４】
2007290981.tif 000005
【００１２】
なお、上記式（１）中、Ｘは水素原子、置換基を有してよい炭化水素基又は置換基を有してよいアリール基である。炭化水素基の場合、炭素の数は限定されるわけではないが１〜４の範囲にあることが好ましい。なおここで置換基としては限定されるわけではないが、例えばアルデヒド基、ケトン基、ヒドロキシル基、アミノ基、アルコキシ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルボニルオキシ基、ハロゲン原子をあげることができる。
【００１３】
また、上記式（１）中、Ｒ１及びＲ２は、置換基を有していてもよい炭化水素基であり、炭素の数は限定されるわけではないが１〜４の範囲が好ましい。なおここで炭化水素基の例としては限定されるわけではないが例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチルをあげることができる。なおここで置換基としては限定されるわけではないが、例えばアルデヒド基、ケトン基、ヒドロキシル基、アミノ基、アルコキシ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルボニルオキシ基、ハロゲン原子をあげることができる。
【００１４】
また、上記式（１）中、Ｙ及びＺは、水素原子又は置換基を有してもよい炭化水素基であり、ＹとＺは同じであっても異なっていてもよい。Ｙ及びＺが炭化水素である場合、炭化水素基の炭素の数は限定されるわけではないが２〜５の範囲が好ましく、炭化水素基中に二重結合を含んでいてもよい。なお、ここで置換基としては限定されるわけではないが、例えばアルデヒド基、ケトン基、ヒドロキシル基、アミノ基、アルコキシ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルボニルオキシ基、ハロゲン原子をあげることができる。
【００１５】
また、上記式（１）で示される５，７−ジオキシクマリン化合物を入手する方法としては、限定されることなく種々の方法で入手可能であり、例えば天然の植物、より望ましくはミカン科Ｔｏｄｄａｌｉａ属植物から抽出することができるし、“Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、１９８年、３１巻、３３３０〜３３３３頁”、“薬学雑誌、１９９１年、１１１巻、３６５〜３７５頁”や“Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００４年、６９巻、２７６０〜２７６７頁”等に記載の方法を適用することによっても製造することができる。
【００１６】
以上、本実施形態により新規なｉＮＯＳ阻害活性を有するクマリン化合物を提供することができる。
【００１７】
また、本実施形態のクマリン化合物はｉＮＯＳ阻害剤に用いることができる。ｉＮＯＳ阻害剤は、上記クマリン化合物の他、薬学的に許容しうる通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤等の各種調剤用配合成分を添加することができる。またこのｉＮＯＳ阻害剤を用いる予防若しくは治療方法としては、患者の性別・体重・症状に見合った適切な投与量を経口的又は非経口的に投与することができる。即ち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、又は例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻腔内投与することもできる。
【実施例】
【００１８】
ここで、上記実施形態に係るクマリン化合物について効果について説明する。もちろん、以下の例によって発明が限定されることがないのはいうまでもない。
【００１９】
（被験サンプルの調製）
本発明者らは、熱帯産植物についてエタノールエキスをジメチルスルホキシドに溶解して濃厚溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を調製し、５μｇ／ｍｌに希釈してｉＮＯＳ阻害活性を指標にしたスクリーング試験を行ったところ、ミカン科 Ｃｌａｕｓｅｎａ植物に強い阻害活性を認め、その活性本体がクマリン化合物であることを解明した。そこで、複数のクマリン化合物を用意し、そのそれぞれをジメチルスルホキシドに溶解して濃厚溶液（１μＭ）として調製し、適宜希釈（１〜１００ｎＭ）し被験サンプルとした。
【００２０】
（１）Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ
マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞を２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播種し、セミコンフルエントになるまで培養後、無血清培地に変え、ＬＰＳ（５０ｎｇ／ｍｌ）及び上記被験サンプルの添加を行った。１６時間のインキュベート後、細胞をホモジナイズしタンパク定量の後ウエスタンブロットを行い、ｉＮＯＳおよびＴＮＦ−αタンパクの発現量を測定した。
（２）ＮＯ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ
ＬＰＳ刺激によるＮＯ発生（ｉＮＯＳ酵素活性）に対する影響についてはグリース−ロメン法（Ｇｒｉｅｓｓ−Ｒｏｍｉｊｎ’ｓ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて測定した。すなわち、１６時間培養後の各ｗｅｌｌの培養液を１００μｌずつ９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに移し、公定法に従いグリースロミイン亜硝酸試薬（４０ｍｇ／ｍｌ）を１００μｌずつ添加し、よく撹拌して室温下で１５分間静置した。その後、マイクロプレートリーダーを用いて５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、標準液として亜硝酸ナトリウム溶液を用い、培地で希釈して検量線を作成し、サンプルのＮＯ濃度を算出した。
（結果、考察）
ＬＰＳ刺激により過剰発現したｉＮＯＳは、Ｃｌａｕｓｅｎａ  ｇｌａｕｉｌｌａｕｍｉｎｉｉの由来のｘａｎｔｈｏｘｙｌｅｔｉｎ（下記式（Ａ）に示される化合物参照）により、濃度依存的に有意に抑制されることを確認した。またこのｘａｔｈｏｘｙｌｅｔｉｎは他の炎症関連因子であるＴＮＦ−α発現、ＮＯ産生も濃度依存的に抑制した。なお式（Ａ）で示されるｘａｎｔｈｏｘｙｌｅｔｉｎは構造にクマリン骨格を含む化合物であって、クマリン類に関しては、抗腫瘍活性、感作促進、冠状血管拡張、抗菌作用、そして抗炎症などの生理・薬理作用が報告されている。
【化５】
2007290981.tif 000006
【００２１】
そこで、クマリン系化合物１５０種についてｉＮＯＳ発現抑制に対するスクリーニングを行ったところ、少なくとも下記（２）、（３）で示される２種類のクマリン化合物（以下、それぞれを化合物（２）、化合物（３）という。）がｘａｎｔｈｏｘｙｌｅｔｉｎよりも強いｉＮＯＳ発現抑制作用を示すことを確認した。この結果を下記表１に示す。なお、表１は、クマリン化合物をジメチルスルホキシドに溶解した濃厚溶液（１μＭ）を１ｎＭまで希釈したものの結果である。
【化６】
2007290981.tif 000007
【化７】
2007290981.tif 000008
【表１】
2007290981.tif 000009
【００２２】
また、上記化合物（２）、化合物（３）は、炎症性サイトカインの１種であるＴＮＦ−αのタンパク発現も比較的強く抑制することも分かった。この結果を下記表２に示しておく。なお、表２は、クマリン化合物をジメチルスルホキシドに溶解した濃厚溶液（１μＭ）を１ｎＭまで希釈したものの結果である。
【表２】
2007290981.tif 000010
【００２３】
また、上記ｉＮＯＳのタンパク発現抑制の結果を受け、上記化合物（２）、（３）についてＮＯの発生量（ｉＮＯＳ酵素活性）に対する作用を検討したところ、ｉＮＯＳ発現抑制活性の強度を反映するＮＯ発生抑制作用を観察することができた。この結果を図１に示す。この結果によると、クマリン化合物の濃度が３０μＭ以上であると顕著にＮＯ発生抑制を抑制できることがわかる。一方、細胞への毒性を考慮すると１００μＭ以下であることが望ましく、上記の結果から、狭く限定されるわけではないが、クマリン化合物の濃度としては２０μＭ以上１００μＭ以下の範囲にあることが望ましく、更に望ましくは３０μＭ以上５０μＭ以下の範囲内であると考えられる。
【００２４】
以上により、活性が強い新規クマリン化合物を提供することができることが確認でき、特に、上記化合物の相関性から、上記式（１）で示されるクマリン化合物が有用であると結論付けることができた。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
以上の通り、本発明に係るクマリン化合物は、抗アレルギー性気道炎活性、抗肺炎活性、抗関節炎活性、抗血管炎活性、膵細胞の自己破壊阻害、同種移植片急性拒絶反応阻害を有すると期待され、数々の炎症疾患を抑制する薬（抗炎症薬）として産業上の利用可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】実施例に係るクマリン化合物のｉＮＯＳ酵素活性を示す図。
【図１】
2007290981.tif 000015