(57)【要約】【課題】アルコール中毒患者を同定することができる抗体、該抗体の製造方法、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体を用いた簡易な免疫測定方法を提供する。【解決手段】提供する抗体は、未変性で天然の炭水化物欠失トランスフェリン（ＣＤＴ）に選択的に反応する抗体である。該抗体を用いることにより、体液を変性処理する必要がなく直接ＣＤＴ濃度を測定することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
未変性で天然のＣＤＴ抗原に選択的に反応し、グリコシダーゼ消化トランスフェリンに反応しない又は実質的に反応しない抗ＣＤＴ抗体。
【請求項２】
前記抗体が立体構造を認識する請求項１記載の抗ＣＤＴ抗体。
【請求項３】
未変性で天然のＣＤＴ抗原を免疫原として動物に免疫し、該動物から採取された請求項１又は２記載の抗ＣＤＴ抗体。
【請求項４】
アルコール中毒患者の体液を用い、非変性条件下にＣＤＴ抗原を精製又は部分的精製して得た、未変性で天然のＣＤＴ抗原を免疫原として動物に免疫し、該動物から採取された請求項１又は２記載の抗ＣＤＴ抗体。
【請求項５】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１−４の何れか１項に記載の抗ＣＤＴ抗体。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体がハイブリドーマＮＣＤＴ５０３（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０８４４）から産生される請求項５記載の抗ＣＤＴ抗体。
【請求項７】
前記モノクローナル抗体が次のＰ１−Ｐ６のペプチド領域に対して反応性を有しないか又は実質的に反応性を有しない請求項５又は６記載の抗ＣＤＴ抗体。
Ｐ１：  ＶＬＡＥＮＹＮＫＳＤＮＣＥ  
Ｐ２：  ＱＨＬＦＧＳＮＶＴＤＣＳＧ  
Ｐ３：  ＶＶＡＲＳＭＧＧＫＥＤＬＩＷＥＬＬ
Ｐ４：  ＩＡＫＩＭＮＧＥＡＤＡＭＳＬ  
Ｐ５：  ＹＥＫＹＬＧＥＥＹＶＫＡＶ    
Ｐ６：  ＳＫＬＳＭＧＳＧＬＮＬＳＥＰＮ
【請求項８】
前記抗体がポリクローナル抗体である請求項１−４の何れか１項に記載の抗ＣＤＴ抗体。
【請求項９】
未変性で天然のＣＤＴに選択的に反応し、グリコシダーゼ消化トランスフェリンに反応しない又は実質的に反応しないモノクローナル抗体を産生する能力を有するハイブリドーマＮＣＤＴ５０３（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０８４４）。
【請求項１０】
アルコール中毒患者の体液を用い、非変性条件下にＣＤＴ抗原を精製又は部分的精製して、ＣＤＴ抗原を取得することを特徴とするＣＤＴ抗原の調製方法。
【請求項１１】
アルコール中毒患者の体液を鉄飽和溶液と接触させ、次いで、非変性条件下で夾雑タンパク質を除去し、次いで、非変性条件下で分画してＣＤＴ抗原を取得することを特徴とするＣＤＴ抗原の調製方法。
【請求項１２】
請求項１０又は１１記載のＣＤＴ抗原の調製方法により得たＣＤＴ抗原を免疫原として動物に免疫することにより、該動物の体内に、ＣＤＴ抗原に対して選択的に反応し、Ｎ−グリコシダーゼ消化トランスフェリンに反応しない又は実質的に反応しない抗ＣＤＴ抗体を産生させ、
該動物から該抗ＣＤＴ抗体を採取することを特徴とする抗ＣＤＴ抗体の製造方法。
【請求項１３】
体液に、請求項１−８の何れか１項に記載の抗ＣＤＴ抗体を接触させ、該抗体に選択的に反応するＣＤＴを検出、又は定量化することを特徴とする免疫測定方法。
【請求項１４】
体液に、請求項１−８の何れか１項に記載の抗ＣＤＴ抗体を接触させ、反応させてなる反応液の吸光度を計測することにより、該抗体に選択的に反応するＣＤＴを検出又は定量化することを特徴とする免疫測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアルコール中毒患者を同定することができる抗体、該抗体の製造方法、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体を用いた簡易な免疫測定方法に関する。該抗体は、未変性で天然の炭水化物欠失トランスフェリン（ＣＤＴ）に選択的に反応する抗体であって、該抗体を用いて、体液を変性処理する必要がなく直接ＣＤＴ濃度を測定することができる。
【背景技術】
【０００２】
アルコール中毒は、アルコール中毒患者とかれらの関係者に多大の損害をもたらすばかりか、アルコール中毒に関連する生産性の損失及び莫大な年間健康管理費用をもたらす。従って、アルコール中毒への早期認識と治療とが個人及び社会にとって最善且つ費用効果的である。このような状況下において、高感度で特異的、しかも迅速で費用のかからない検査方法が必要である。
【０００３】
例えば、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ）、平均血球容積(mean corpuscular volume) （ＭＣＶ）、アスパラギン酸アミノトランスアミナーゼ（ＡＳＴ）又はアラニンアミノトランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、α−リポタンパク質及びフェリチンのような臨床検査項目が、アルコール乱用の生化学的マーカーとして多年にわたって用いられてきたが、これらの検査の診断的感度及び特異性は満足のいくものではなかった。
【０００４】
Stibler らは、トランスフェリンの中で高い等電点を持つアイソフォームが１週間以上にわたって毎日６０ｇ以上のエタノールを摂取した者の８１％で増加し、１０日以上にわたって禁酒する場合に高い等電点を持つアイソフォームが正常レベルに戻ることを報告している(Acta Med Scan, 206, 275-281,(1979) ：非特許文献１）。
【０００５】
血清トランスフェリンは、７９．５ｋＤの分子量を有し、二つのＮ−連結の多糖鎖を有する一本のポリペプチド鎖から成る糖タンパクである。これらの多糖鎖は、分岐状であり、かつ末端シアル酸残基を有している。Wongおよび Regoeczi は、Int.J.Peptide Res. 9, 241-248, (1977) （非特許文献２）において、ヒトトランスフェリンは天然ではシアル化のレベルにより種々のアイソフォームが存在すると述べている。事実、6 種のアイソフォームとしてペンタシアロ、テトラシアロ、トリシアロ、ジシアロ、モノシアロおよびアシアロトランスフェリンが存在する。
【０００６】
正常な健康個体に比べて、アルコール中毒患者の血液中には、アシアロ、モノシアロ、ジシアロトランスフェリンが上昇したレベルで存在することが見出されている (van Eijk et al, Clin Chim Acta 132, 167-171, (1983) ：非特許文献３、Stibler, Clin Chem, 37, 2029-2037, (1991) ：非特許文献４、および Stibler et al, "Carbohydrate-deficient transferrin (CDT) in serum as a marker of high alcohol consumption", Advances in the Biosciences, (Ed Nordmann et al), Pergamon, 1988, Vol.71, pages 353-357 )：非特許文献５）。
【０００７】
アシアロ、モノシアロ及びジシアロトランスフェリンは、炭水化物（糖鎖）欠失トランスフェリン（略語：ＣＤＴ）と呼ばれている。ＣＤＴは、アルコール消費、特に慢性アルコール消費を検出およびモニターするための有効なマーカーであることが見出されている。ＣＤＴの免疫学的検査法としてＷＯ９６／２６４４４（特許文献１）および Heil et al, Anaesthesist, 43, 447-453, (1994)（非特許文献６）等が報告されている。これらの手法では、希釈血清サンプルをアニオン性イオン交換樹脂に通し、正常なトランスフェリンイソ型を樹脂に保持させる一方、ＣＤＴ分画の通過を可能にしている。この溶出液のＣＤＴ含量は、免疫比濁法 (immunoturbidimetric assay)等によって測定される。その他、高速液体クロマト法によりＣＤＴを定量する方法もＷＯ９５／０４９３２（特許文献２）により知られている。
【０００８】
前記アルコール中毒患者の従来の検査手法の全ては、イオン交換樹脂或いは高速液体クロマト法を適用する等比較的複雑な手順に基づくものであった。
【０００９】
一方、Makhloufらは、ＣＤＴのみを直接測定するために、ＣＤＴに対するモノクローナル抗体の作製を試みた。彼らは、トランスフェリンの糖鎖が結合している４１３番目と６１１番目のアスパラギンを中心として前後６個のアミノ酸の合成ペプチドを免疫原として抗体を作製し、その抗体をＣＤＴ測定のための免疫測定法に応用することを考えた（ＷＯ９３／０６１３３：特許文献３）。
【００１０】
これに対して、ER.Trimbleらは、Makhloufらの手法による、合成ペプチドを免疫原として作製したモノクローナル抗体はＣＤＴには反応しなかったことからそのエピトープはトランスフェリン分子内に隠匿されており検出に応用できないと述べた（Biochem Soc Trans, 26(1), S48(1998) ：非特許文献７）。
【００１１】
一方、特開２００４−０５１６３３（特許文献４）には、ＣＤＴと水溶液中で選択的に結合し、ＣＤＴを固相に結合させる必要がない抗体に関して記載されている。該抗体は、遺伝子組み換え手法により得たリコンビナント非糖化トランスフェリンを免疫原に使用し、或いは、酵素による脱糖化反応して非糖化トランスフェリンとしたものを免疫原として使用して、得た抗体である。即ち、人為的に作製したＣＤＴを免疫原に使用して得られた抗体である。
【特許文献１】ＷＯ９６／２６４４４
【特許文献２】ＷＯ９５／０４９３２
【特許文献３】ＷＯ９３／０６１３３
【特許文献４】特開２００４−０５１６３３
【非特許文献１】Acta Med Scan, 206, 275-281,(1979 ）
【非特許文献２】Int.J.Peptide Res. 9, 241-248, (1977)
【非特許文献３】Clin Chim Acta 132, 167-171, (1983)
【非特許文献４】Clin Chem, 37, 2029-2037, (1991)
【非特許文献５】Advances in the Biosciences, Pergamon, 1988, Vol.71, pages 353-357
【非特許文献６】Anaesthetist, 43, 447-453, (1994)
【非特許文献７】Biochem Soc Trans, 26(1), S48(1998)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
体液中のＣＤＴを簡易に検出するために、体液中のＣＤＴを前処理することなく測定できることが望ましく、そのためには天然のＣＤＴの構造を認識する抗体を取得する必要がある。
【００１３】
一方、上述したように糖鎖欠失部位の近傍の領域は、ER.Trimbleらの報告（非特許文献７）からも理解されるように、ＣＤＴ分子内に隠匿されている可能性があり、トランスフェリン分子内のジスルフィド結合数の多さからも強固な立体構造を形成しており、糖鎖欠失部位の近傍のエピトープを認識する抗体の取得は困難であると想定される。
【００１４】
また、免疫抗原として人為的に作製したＣＤＴは、天然のＣＤＴとは大きく異なるという問題がある。例えば、前記特許文献４の遺伝子組換え体の場合、ジスルフィド結合を含むためタンパク質の立体構造が不完全になり易く、また、酵素による脱糖化物の場合、調製の際に変性処理が必要である。さらに遺伝子組換え体と脱糖化物はアミノ酸の置換を生じるという問題がある。
【００１５】
また、体液中から天然のＣＤＴを精製するための方法として、一般的には抗トランスフェリン抗体が結合したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーが使用される。しかしながら、この方法はカラム中の抗トランスフェリン抗体にトランスフェリンを結合させた後に、この抗原抗体複合体を酸性条件で変性させることによりＣＤＴを含むトランスフェリンを溶出させて精製する方法がある。しかしながら、該方法により得られるＣＤＴは変性している可能性が高いので、免疫原としては好ましくない。
【００１６】
本発明はかかる問題点を鑑みて、体液中のＣＤＴに対して反応しないような抗体を生ずる恐れのある、人為的に作製したＣＤＴを免疫原に使用することなく、天然のＣＤＴと選択的に結合し、既存の方法で測定したＣＤＴ濃度と相関性が高いアルコール中毒患者を同定するための抗体、該抗体の製造方法、ハイブリドーマ及び該抗体を用いた簡便な免疫測定法を提供することを目的とする。
【００１７】
さらに、前記した目的に加えて、本発明は、前記変性が行われることがない、未変性で天然のＣＤＴ調製法を構築し、未変性で天然のＣＤＴの構造を認識する抗ＣＤＴ抗体を取得することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者は鋭意研究の結果、変性が行われることがない、未変性で天然のＣＤＴ調製法を構築し、未変性で天然のＣＤＴの構造を認識する抗ＣＤＴ抗体を取得した。
【００１９】
即ち、本発明の抗ＣＤＴ抗体は、未変性で天然のＣＤＴに選択的に反応し、グリコシダーゼ消化トランスフェリンに反応しない又は実質的に反応しない抗ＣＤＴ抗体である。本発明の抗ＣＤＴ抗体は、未変性で天然のＣＤＴの一次構造を認識せず、立体構造を認識する抗体である。
【００２０】
本明細書において使用する用語「天然」とは、合成ペプチド、遺伝子組換体或いは酵素消化物という人工的に作製したＣＤＴを免疫原に使用したものではないという意味で使用しており、また、「未変性」とは、天然（生体由来）の抗原も精製方法等で、ｐＨの変動、熱、有機溶媒、界面活性剤（可溶化剤）等により変性させることも可能であることから、このような変性が無い意味で使用している。また、「非変性条件下」とは、未変性の状態を維持し変性させることのない条件下という意味で使用している。本明細書中に単に「天然のＣＤＴ」という場合は、未変性の生体由来のＣＤＴを一般的に意味する。
【００２１】
本発明の抗ＣＤＴ抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。
【００２２】
特に好ましいモノクローナル抗体は、特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に寄託したハイブリドーマＮＣＤＴ５０３（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０８４４）から産生される抗体である。
【００２３】
本発明の抗ＣＤＴモノクローナル抗体は次のＰ１−Ｐ６のペプチド領域に対して反応性を有しないか又は実質的に反応性を有しない。Ｐ１及びＰ２は、本発明者が作製したものであるが、特許文献３（ＷＯ９３／０６１３３の請求項３）に示されたペプチド配列に含まれる抗体認識部位に対応する。Ｐ３−Ｐ６は、本発明者が作製したものであるが、特許文献４（特開２００４−０５１６３３の請求項４）に示されたペプチド配列に含まれる抗体認識部位に対応する。Ｐ１−Ｐ６のペプチド配列において下線部は、特許文献３又は特許文献４の抗体認識部位を示す。
P1:  VLAENYNKSDNCE（配列番号１）
P2:  QHLFGSNVTDCSG（配列番号２）
P3:  VVARSMGGKEDLIWELL（配列番号３）
P4:  IAKIMNGEADAMSL （配列番号４）
P5:  YEKYLGEEYVKAV（配列番号５）
P6:  SKLSMGSGLNLSEPN（配列番号６）
本発明の抗体は、未変性で天然のＣＤＴ抗原を免疫原として動物に免疫し、該動物から採取する方法により得ることができる。
【００２４】
好ましくは、本発明の抗体は、アルコール中毒患者の体液を用い、非変性条件下にＣＤＴ抗原を精製又は部分的精製して得た、未変性で天然のＣＤＴ抗原を免疫原として動物に免疫し、該動物から採取して得ることができる。
【００２５】
本発明の抗体生産方法に用いる免疫原は、例えば、非変性条件下でアルコール中毒患者等の血清等の体液から精製又は部分的に精製したものを用いることができ、好ましくは、体液を鉄飽和溶液と接触させ、その後、イオン交換クロマトグラフィー等の非変性条件下により調製したＣＤＴを免疫原とすることができる。さらに好ましくは、体液を鉄飽和溶液と接触させ、その後、アルブミン、グロブリン等の夾雑タンパク質を除去し、次いで、イオン交換クロマトグラフィー等の非変性条件下により分画調製したＣＤＴを免疫原とすることができる。前記アルブミンを除去するためにはブルーセファロースカラムを用いて除去することができ、前記グロブリンを除去するためにはProtein G カラムを用いて除去することができる。これらの夾雑タンパク質除去の手段、及び分画調製手段は、ＣＤＴを非変性条件下で精製する手段として有用である。
【００２６】
本発明のポリクローナル抗体、ハイブリドーマ、及びモノクローナル抗体は、上記免疫原を動物に免疫することにより、該動物から採取することができる。動物を免疫する方法は公知の手法が適用でき、それに必要な免疫プロトコールは当業者にとって容易に決定し得る。例えば、本発明の抗体は、アジュバントと混合した免疫原を適当な宿主動物（ウサギ、ヤギ、ウマまたはその他の哺乳類）に注射することにより、作製し得る。免疫原の注射は、適当な力価の抗血清が得られるまで続けられる。抗血清は回収後、必要に応じてアフィニティークロマトやイオン交換クロマト法等の既知技術を用いて更に精製されることが好ましい。
【００２７】
また、本発明の抗体は、免疫された動物（例えば、ラット、ハムスター、マウスまたはその他の哺乳類）から得た細胞と不死化細胞とを融合することによって得られる融合細胞（ハイブリドーマ）から得ることができる。例えばマウスを使用することが可能である。この場合、免疫原を既知技術により免疫した後、免疫したマウスから回収した脾臓細胞とマウスミエローマ細胞を用いてケーラーとミルシュタインの方法（ネイチャー２５６巻４９５頁１９７５年）により目的のハイブリドーマを得ることが可能である。目的とする抗体を産生するハイブリドーマの選択は、免疫原として用いたＣＤＴやＣＤＴ以外のトランスフェリンを固相化した酵素免疫測定法或いは抗マウスＩｇＧ抗体を固相化し、上記ハイブリドーマの培養上清を反応させ、更に溶液状態のＣＤＴやＣＤＴ以外のトランスフェリンを反応後、抗トランスフェリン抗体で検出するサンドイッチＥＬＩＳＡでなされ、ＣＤＴ以外のトランスフェリンには反応せず、ＣＤＴのみに強く反応するものを選択する。最終的には限界希釈法にてクローニングを施し、目的とするハイブリドーマを得る。モノクローナル抗体は、得られたハイブリドーマから既知技術である培養系またはマウス腹腔内で作製し、前記抗血清の場合と同様に、アフィニティークロマトやイオン交換クロマト法等の既知技術により精製することができる。
【００２８】
本発明はまた、体液に、前記した本発明の抗体を接触させ、該抗体に選択的に反応するＣＤＴを検出、又は定量化することを特徴とする免疫測定方法である。例えば、体液に、抗ＣＤＴ抗体と抗トランスフェリン抗体を接触させ、ＣＤＴを検出または、定量化する方法である。本発明のＣＤＴを検出又は、定量化する方法において、体液に、認識部位の異なる複数の抗ＣＤＴ抗体を接触させ、検体中に含まれるＣＤＴを検出または、定量化してもよい。
【００２９】
本発明の免疫測定法に用いるのに適した抗ＣＤＴ抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよく、抗血清またはその精製分画、あるいは既知のイソタイプまたはサブクラスでもよい。更には、必要に応じて抗原と結合できる抗体フラグメントであってもよい。即ち、抗体に関する唯一の条件は、それが少なくともアルコール中毒患者に多く、非アルコール中毒患者に少ないことが有意な差異で測定されるＣＤＴに対して選択的に反応し得ることである。
【００３０】
本発明の免疫測定方法に適用可能な方法には、不均一系測定方法としては、放射性同位体元素標識免疫測定法、酵素標識免疫測定法、蛍光標識免疫測定法等が挙げられる。均一系としては蛍光消光法、蛍光増強法、エネルギートランスファー法、凝集法、比濁法等が挙げられる。本発明の免疫測定方法は如何なる反応形式で行われてもよく、均一系でも不均一系でも何れであってもよい。これらの免疫測定法は用手法あるいは自動化されてもよい。
【００３１】
前記免疫測定方法において、放射性同位体元素標識免疫測定法、酵素標識免疫測定法、蛍光標識免疫測定法に用いられる試薬の一つは、体液中のＣＤＴの検出または定量化を可能にするために、標識される必要があるが、それらの標識物質については公知のものを使用してもよく、例えば、以下のものが挙げられる。
【００３２】
１）酵素：アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−フォスフェートデヒドロゲナーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等
２）蛍光体：フルオレセインイソシアネート、ローダミン、テキサスレッド等
３）放射性同位体元素：Ｉ125 、Ｉ131 等
４）生物発光体：ルシフェリン、エクオリン等
５）化学発光体：イソルミノール、アクリジニウムエステル、オキサレートエステル等  所望の試薬へのこれらの標識体の結合は、公知の技術を用いて行うことができる。
【００３３】
前記免疫測定方法において、不均一系測定方法である放射性同位体元素標識免疫測定法、酵素標識免疫測定法、蛍光標識免疫測定法、ならびに均一系の中で担体を必要とする凝集法等に用いられる試薬の一つは、抗体を固相化する必要がある。抗体の固相化に用いる担体の材質及び形状は、測定用途によって公知のものから選択できる。例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド、ガラス、アガロース、ニトロセルロース等が挙げられる。形状としては、マイクロタイタープレート、バイアル、ラテックスビーズ、ディップストリップ等が挙げられる。
【００３４】
本発明の免疫測定方法の対象となる体液は、血清、血漿、唾液またはその他の体液であってもよいが、血清であることが好ましい。
【発明の効果】
【００３５】
本発明によれば、未変性で天然のＣＤＴに選択的に反応し、グリコシダーゼ消化トランスフェリンに反応しない又は実質的に反応しない抗ＣＤＴ抗体を提供できるので、体液、特に、アルコール中毒患者から得られた、未変性で天然のＣＤＴが含まれる体液に対して、簡単な手法で、精度よく検出又は定量することが可能となる。該抗体を用いることにより、体液を変性処理する必要がなく直接ＣＤＴ濃度を測定することができる。
【実施例】
【００３６】
以下に、本発明を実施例及び添付した図を参照して詳述する。
【００３７】
［実施例１］：未変性で天然のＣＤＴ分画の調製
ＣＤＴ高値ヒト血清１０ｍｌに鉄飽和溶液（０．５Ｍ  ＮａＨＣＯ3   ２５０μｌと１０ｍＭ  ＦｅＣｌ3   １８０μｌ）を加え、４℃で一時間インキュベート後、脱脂溶液（１００ｇ／ｌ  デキストラン硫酸  １００μｌと１Ｍ  ＣａＣｌ2   ５００μｌ）を加えた溶液の上清を回収した。さらにブルーセファロースカラム（Blue Sepharose 6 Fast Flow：商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を用いてアルブミンを除去し、次いで、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラム（Hi Trap Protein G HP：商品名：ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を用いてグロブリンを除去することにより、トランスフェリン以外のタンパク質を除去した後、陰イオン交換カラム（ＭｏｎｏＱ  ＨＲ  ５／５：商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を用いて未変性のジシアロトランスフェリンとアシアロトランスフェリンを含むＣＤＴ分画を調製した。
【００３８】
図１は陰イオン交換クロマトグラフィーによるＣＤＴ分画溶出プロファイルを示すグラフである。図１における矢印Ａは波長２８０の吸光度曲線を示す。矢印Ｂは波長４６０の吸光度曲線を示す。図１の溶出プロファイルに示した各分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（NuPAGE gel：商品名、インビトロジェン株式会社製）及び等電点電気泳動についての銀染色とウエスタンブロットの写真を図２に示す。図２に示すようにトランスフェリンの糖鎖の量に応じた５種のアイソフォームとしてテトラシアロ、トリシアロ、ジシアロ、モノシアロおよびアシアロトランスフェリンを未変性で高純度に調製することができたことがわかる。
【００３９】
［実施例２］：変性条件下におけるグリコシダーゼ消化トランスフェリンの調製
ヒトトランスフェリン（ＰＥＮＴＥＸ  ＨＵＭＡＮ  ＴＲＡＮＳＦＥＲＲＩＮ：商品名、ＭＩＬＥＳ  ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ社製）２０ｍｇを１０％ドデシル硫酸ナトリウム（略語：ＳＤＳ）１０μｌと１０ｍＭリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７．２）（略語：ＰＢＳ）９０μｌを加え、３７℃で１時間変性させた。この溶液に１０％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴｗｅｅｎはICI Chemicals & Polymers社の登録商標、和光純薬工業株式会社製、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）を５０μｌと０．１Ｍ  ＥＤＴＡ１０μｌとＰＢＳ  ９００μｌと１０単位のグリコシダーゼ（Ｎ−グリコシダーゼＦ、リコンビナント：商品名、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を加えて３７℃で２４時間反応させた。反応後の溶液はトリクロロ酢酸とアセトンを用いたタンパク質の沈殿を行い、ＳＤＳを除去した後、レクチン（ＣｏｎＡ）アフィニティークロマトカラム（ＣｏｎＡ−Ａｇａｒｏｓｅ：商品名、株式会社ホーネンコーポレーション製）を通過させることにより、グリコシダーゼで未消化のトランスフェリンを吸着除去し、且つグリコシダーゼ消化トランスフェリン粗分画を得る。次いで、該分画に対して陰イオン交換カラム（ＭｏｎｏＱ  ＨＲ  ５／５：商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を用いたクロマトグラフィーを実施することにより純度が高められたグリコシダーゼ消化トランスフェリンを調製した。
【００４０】
また、グリコシダーゼを添加しない以外は同様にして対照となる変性トランスフェリンを調製した。
【００４１】
図３はレクチン（ＣｏｎＡ）アフィニティークロマトグラフィーにおけるグリコシダーゼ消化トランスフェリンの溶出プロファイルを示すグラフである。続いて実施した陰イオン交換カラム（ＭｏｎｏＱ  ＨＲ  ５／５：商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を用いたクロマトグラフィーで分離したプロファイルのグラフを図４に示す。得られた分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び等電点電気泳動の写真を図５に示す。図５に示したようにグリコシダーゼ消化によりトランスフェリンの糖鎖が除去されていることがわかる。
【００４２】
［実施例３］：ハイブリドーマの調製
前記実施例１で得られたジシアロトランスフェリンとアシアロトランスフェリンを含む分画をＣＤＴ抗原として用いた。該抗原を濃度０．５ｍｇ／ｍｌの抗原溶液に調製した。該抗原溶液５００μｌにアジュバンド５００μｌ（ＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄ：商品名、  ＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｃｏ．製）を混和して乳化させ、５週令のＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に免疫した。追加免疫として同様に調製したものを２週おきに３回繰り返した。その間免疫時に採血をして抗原に対する血中の抗体活性を測定した。最終免疫から１４日後に１００μｌの抗原溶液を腹腔内に投与し、３日後、脾臓を摘出した。脾細胞はマウスミエローマ細胞（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）とポリエチレングリコール４０００（商品名、メルク社製）の存在下で２分間反応させることにより融合させた。融合後、ＨＡＴ選択培地に懸濁して９６ウェルの培養プレートに分注し、３７℃のＣＯ2 インキュベーターで培養し、ハイブリドーマを調製した。また、比較のために前記実施例２で調製したグリコシダーゼ消化トランスフェリンを免疫抗原として用い、前記と同様にハイブリドーマを調製した。
【００４３】
［実施例４］：ＣＤＴ分画に対する抗体産生ハイブリドーマの選抜
前記実施例３で得られた各ハイブリドーマについて、本発明の抗体産生ハイブリドーマの選抜はサンドイッチＥＬＩＳＡにより行った。９６ウェルのマイクロプレートにＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに調製した抗マウス抗体を１ウェル当たりそれぞれ５０μｌ加え、４℃で一昼夜反応させた。その後ＰＢＳで１回洗浄し、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングを行いスクリーニング用のプレートとした。ハイブリドーマの増殖の認められたウェルの培養上清５０μｌをウェルに加え、室温で１時間反応させた。引き続き洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）で洗浄後、前記実施例１に記載したＣＤＴ分画を室温で１時間反応させ、同様に洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗トランスフェリンポリクローナル抗体５０μｌを加え、室温で１時間反応させた。なお、該アルカリフォスファターゼ標識抗トランスフェリンポリクローナル抗体は、抗トランスフェリンポリクローナル抗体（株式会社シバヤギ製）にアルカリフォスファターゼ（ロシュ社製）を過ヨウ素酸法で結合させることにより調製したものを使用した。再び洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性をＫｉｎｄ−Ｋｉｎｇ法にて発色させ、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定し、該ＣＤＴ分画に対する抗体活性を持つモノクローナル抗体産生ハイブリドーマＮＣＤＴ５０３を選抜した。比較のために実施したグリコーダーゼ消化トランスフェリンを免疫原として得られたハイブリドーマの中からモノクローナル抗体産生ハイブリドーマＴＦＮＧ４０５を選抜した。
【００４４】
［実施例５］：ＣＤＴ分画に対する抗体産生ハイブリドーマのクローニング
前記実施例４で選抜した各ハイブリドーマを限界希釈法により、クローニングを二回実施し、樹立株を各々得た。得られたハイブリドーマＮＣＤＴ５０３は特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に寄託した（受領日：平成１８年３月１４日、受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０８４４）。比較のためにグリコシダーゼ消化トランスフェリンを免疫抗原として用いて調製し、前記実施例４で選抜したハイブリドーマＴＦＮＧ４０５についても、同様にして樹立株を得た。
【００４５】
［実施例６］：抗体の調製
前記実施例５で得られた各樹立株について、ＣＤＴ分画に対する抗体活性を持つモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、モノクローナル抗体の大量産生のためマウス腹腔内にて増殖させた。こうして得られた各マウス腹水中のモノクローナル抗体は、プロテインＧカラム（ＧＥ社製）を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製した。
【００４６】
［実施例７］：  抗体のサブクラスの決定
前記実施例６で得られた各モノクローナル抗ＣＤＴ抗体のサブクラスはＩｓｏｓｔｒｉｐ（登録商標、ロシュ社製）を使用して決定した。
【００４７】
各抗体のサブクラスを下記の表１に示す。
【００４８】
【表１】
2007254428.tif 000002
【００４９】
［実施例８］：サンドイッチＥＬＩＳＡを用いた抗体の特異性の確認
前記実施例６で調製した各モノクローナル抗体（ハイブリドーマＮＣＤＴ５０３産生抗体、ハイブリドーマＴＦＮＧ４０５産生抗体）についてサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、前記実施例１で調製したトランスフェリンアイソフォームに対する特異性の確認を行った。９６ウェルのマイクロプレートにＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに調製した抗体を１ウェル当たりそれぞれ５０μｌ加え、４℃で一昼夜反応させた。その後ＰＢＳで１回洗浄し、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングを行った。その後、前記実施例１で調製したトランスフェリンアイソフォーム５０μｌをウェルに加え、室温で１時間反応させた。引き続き洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）で洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗トランスフェリンポリクローナル抗体（前記実施例４で調製したものと同じ）５０μｌを加え、室温で１時間反応させた。再び洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性をＫｉｎｄ−Ｋｉｎｇ法にて発色させ、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定し、トランスフェリンアイソフォームに対する反応の強さを比較することで各抗体の特異性を確認した。その結果を下記の表２に示す。
【００５０】
【表２】
2007254428.tif 000003
【００５１】
表２に示すように本発明のモノクローナル抗体（ハイブリドーマＮＣＤＴ５０３産生抗体）は溶液中の天然のＣＤＴ分画（アシアロトランスフェリンとジシアロトランスフェリン）に対して特異的に反応したが、ＣＤＴ以外のトランスフェリンであるテトラシアロトランスフェリンと人工的に作製したＣＤＴであるグリコシダーゼ消化トランスフェリンに対して反応しなかった。一方、Ｎ−グリコシダーゼＦ消化トランスフェリンを免疫して得られた比較のためのハイブリドーマＴＦＮＧ４０５産生抗体は、表２に示すように天然のＣＤＴ分画（アシアロトランスフェリンとジシアロトランスフェリン）と人工的に作製したＣＤＴ（グリコシダーゼ消化トランスフェリン）の両方に反応した。
【００５２】
［実施例９］：ウエスタンブロットを用いた抗体の特異性の確認
前記実施例６で調製したモノクローナル抗体（ハイブリドーマＮＣＤＴ５０３産生抗体）について、ウエスタンブロットを用いて、前記実施例１で調製したトランスフェリンアイソフォームに対する特異性の確認を行った。等電点電気泳動用ゲル（Ｎｏｖｅｘ  ＩＥＦゲル：商品名、インビトロジェン株式会社製、ｐＨ３−７）にＣＤＴ分画およびＣＤＴ以外のトランスフェリンを１レーンあたり各５μｇになるように専用のサンプルバッファーで希釈後に添加し、専用の泳動バッファーで泳動後、専用のバッファーでＰＶＤＦ膜に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜はブロックエース（商品名、大日本製薬株式会社製）でブロッキング後、ＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに調製した抗体と室温で１時間反応させた。さらにＰＢＳで３回洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Goat F(ab') Anti-Mouse Ig' s, Alkaline Phosphatase Conjugate AMI4405: 商品名、BIOSOURCE 社製）と室温で１時間反応させた。再び洗浄後、ＢＣＩＰ  ＮＢＴ試薬（商品名、日本バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社製）で発色させた。その結果をウエスタンブロット法による抗体の特異性（トランスフェリンアイソフォームに対する反応の強さ）を示す写真として図６に示す。
【００５３】
図６に示したように本発明のモノクローナル抗体（ハイブリドーマＮＣＤＴ５０３産生抗体）はウエスタンブロットにおいて天然のＣＤＴ分画（アシアロトランスフェリンとジシアロトランスフェリン）と特異的に反応したことがわかる。
【００５４】
［実施例１０］：抗トランスフェリンポリクローナル抗体と組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡを用いた相関性試験
前記実施例６で調製したモノクローナル抗体（ハイブリドーマＮＣＤＴ５０３産生抗体）を用い、サンドイッチＥＬＩＳＡ法で、健常者とアルコール中毒患者の血清合計３２検体を測定した。対照試験としてバイオラッド社製の試薬を用いて測定した。該対照試験は、カラムを用いたトランスフェリン中の％ＣＤＴを測定する方法であり、カラムでの分離前の総トランスフェリンの量と、分離後のＣＤＴの量を測定し、検体中のＣＤＴ濃度と％ＣＤＴ（総トランスフェリンに対するＣＤＴの割合）を算出した。
【００５５】
前記サンドイッチＥＬＩＳＡによる測定は９６ウェルのマイクロプレートにＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに調製した抗体を１ウェル当たりそれぞれ５０μｌ加え、４℃で一昼夜反応させた。その後ＰＢＳで１回洗浄し、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングを行った。その後、健常者とアルコール中毒患者の各血清５０μｌをウェルに加え、室温で１時間反応させた。引き続き洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）で洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗トランスフェリンポリクローナル抗体（前記実施例４で調製したものと同じ）５０μｌを加え、室温で１時間反応させた。再び洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性をＫｉｎｄ−Ｋｉｎｇ法にて発色させ、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定し、対照試験測定値との相関性を確認した。その結果を図７に示す。
【００５６】
図７に示したように未変性で天然のＣＤＴ分画を免疫原にして得られた本発明の抗体は対照試験ＣＤＴ濃度と良好な相関を示した。一方、比較のために用いたグリコシダーゼ消化トランスフェリンを免疫原にして得られたモノクローナル抗体（ハイブリドーマＴＦＮＧ４０５産生抗体）は対照試験ＣＤＴ濃度と良い相関を示さなかった。したがって、本発明のハイブリドーマＮＣＤＴ５０３産生抗体は、検体中のＣＤＴ濃度に応じて吸光度が相関しているので、吸光度の値を測定することにより、検体中のＣＤＴ濃度を定量することができる。
【００５７】
［実施例１１］：抗体の抗原認識部位の確認
前記実施例６で調製したモノクローナル抗体（ハイブリドーマＮＣＤＴ５０３産生抗体）の反応性を次のようにして調べた。下記のＰ１−Ｐ６に示す６種類のアミノ酸配列のペプチドをＥＬＩＳＡプレートに結合させた後、１０μｇ／ｍｌに調製した抗体を１ウェル当たりそれぞれ５０μｌ加え、室温で１時間反応させた。引き続き洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）で洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Goat F(ab') Anti-Mouse Ig' s, Alkaline Phosphatase Conjugate AMI4405: 商品名、BIOSOURCE 社製）５０μｌを加え、室温で１時間反応させた。再び洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性をＫｉｎｄ−Ｋｉｎｇ法にて発色させ、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定した。
【００５８】
Ｐ１−Ｐ６のペプチド配列において下線部は、特許文献３又は特許文献４の抗体認識部位を示す。その結果を下記の表３に示す。
Ｐ１    ＶＬＡＥＮＹＮＫＳＤＮＣＥ  （配列番号１）
Ｐ２    ＱＨＬＦＧＳＮＶＴＤＣＳＧ  （配列番号２）
Ｐ３    ＶＶＡＲＳＭＧＧＫＥＤＬＩＷＥＬＬ  （配列番号３）
Ｐ４    ＩＡＫＩＭＮＧＥＡＤＡＭＳＬ  （配列番号４）
Ｐ５    ＹＥＫＹＬＧＥＥＹＶＫＡＶ    （配列番号５）
Ｐ６    ＳＫＬＳＭＧＳＧＬＮＬＳＥＰＮ  （配列番号６）
【００５９】
【表３】
2007254428.tif 000004
【００６０】
表３によれば、モノクローナル抗体（ハイブリドーマＮＣＤＴ５０３産生抗体）は、Ｐ１−Ｐ６（特許文献３又は特許文献４の抗体の認識部位を含むペプチド）に対して認識しないことがわかる。
【００６１】
次に前記実施例６で調製した抗体の抗原認識部位を調べるために、最初に抗原タンパク質の一次構造への反応性について次のようにして確認した。即ち、ＣＤＴ抗原をＥＬＩＳＡプレート（イモビライザーアミノ：商品名、ヌンク社製）に共有結合させた後、４Ｍ尿素による変性、０．１Ｍ  ＤＴＴで還元処理を行ったウェルに１０μｇ／ｍｌに調製した抗体を１ウェル当たりそれぞれ５０μｌ加え、室温で１時間反応させた。引き続き洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）で洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗トランスフェリンポリクローナル抗体（前記実施例４で調製したものと同じ）５０μｌを加え、室温で１時間反応させた。再び洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性をＫｉｎｄ−Ｋｉｎｇ法にて発色させ、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定し、タンパク質の一次構造を認識するかを確認した。その結果を下記の表４に示す。
【００６２】
【表４】
2007254428.tif 000005
【００６３】
表４に示すように本発明の抗体（ハイブリドーマＮＣＤＴ５０３産生抗体）は、グリコシダーゼ消化トランスフェリンを免疫して得られた抗体（ハイブリドーマＴＦＮＧ４０５産生抗体）が認識するＣＤＴ抗原を変性・還元処理した一次構造に対して反応しないことがわかる。また、本発明の抗体はＣＤＴ抗原の一次構造を認識しておらず、立体構造を認識していることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の抗ＣＤＴ抗体は、体液を変性処理することなく直接ＣＤＴ濃度を測定する方法に用いることができる。
【００６５】
本発明の抗ＣＤＴ抗体は、天然のＣＤＴと選択的に結合し、既存の方法で測定したＣＤＴ濃度と相関性が高いアルコール中毒患者を同定するための簡便な免疫測定法に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによるＣＤＴ分画溶出プロファイルを示すグラフである。
【図２】図１の溶出プロファイルに示した各分画のSDS-PAGE及び等電点電気泳動の写真を示す。
【図３】レクチン（ＣｏｎＡ）アフィニティークロマトグラフィーにおけるＮ−グリコシダーゼＦ消化トランスフェリンの溶出プロファイルを示すグラフである。
【図４】レクチン（ＣｏｎＡ）アフィニティークロマトグラフィー後の陰イオン交換クロマトグラフィーで分離したプロファイルを示すグラフである。
【図５】図４で得られた分画のSDS-PAGE及び等電点電気泳動を示す写真である。
【図６】ウエスタンブロット法による抗体の特異性（トランスフェリンアイソフォームに対する反応の強さ）を示す写真である。
【図７】抗トランスフェリンポリクローナル抗体と組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡによる相関性試験を示すグラフである。
【図１】
2007254428.tif 000006
【図３】
2007254428.tif 000007
【図４】
2007254428.tif 000008
【図７】
2007254428.tif 000009
【図２】
2007254428.tif 000010
【図５】
2007254428.tif 000011
【図６】
2007254428.tif 000012
【配列表】
2007254428000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年4月20日(2006.4.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
特に好ましいモノクローナル抗体は、特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に寄託したハイブリドーマＮＣＤＴ５０３（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８４４）から産生される抗体である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
［実施例５］：ＣＤＴ分画に対する抗体産生ハイブリドーマのクローニング
前記実施例４で選抜した各ハイブリドーマを限界希釈法により、クローニングを二回実施し、樹立株を各々得た。得られたハイブリドーマＮＣＤＴ５０３は特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に寄託した（受託日：平成１８年３月１４日、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８４４）。比較のためにグリコシダーゼ消化トランスフェリンを免疫抗原として用いて調製し、前記実施例４で選抜したハイブリドーマＴＦＮＧ４０５についても、同様にして樹立株を得た。