(57)【要約】【課題】  水虫の治療には、長期薬を塗布しなければならず、また、その再発が多いことが永年問題になっている。水虫のより根本的な治療には、菌の活動を抑制するだけでなく、治療効果の高い薬剤の開発が望まれている。水虫症状の原因が、白癬菌属かカンジダ属かという区別無く治療効果の高い薬剤を提供する。【解決手段】  ラノコナゾール又はその塩類と、トルナフタート、ウンデシレン酸亜鉛、シクロピロクスオラミン、ハロプロジン、塩化ベンゼトニウム、クレゾール及び塩酸クロルヘキシジから選択される１又は２以上の抗真菌剤とを特定の割合に配合することを特徴とする相乗効果を有する抗真菌外用剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ラノコナゾール又はその塩類と（２）トルナフタート、ウンデシレン酸亜鉛、シクロピロクスオラミン、ハロプロジン、塩化ベンゼトニウム、クレゾール及びクロルヘキシジンから選択される１又は２以上の抗真菌剤とを相乗効果を有する量を含有することを特徴とする抗真菌外用剤。
【請求項２】
（１）ラノコナゾールと（２）抗真菌剤の比率が１：３２００００〜３３：１である請求項１に記載の抗真菌外用剤。
【請求項３】
（１）ラノコナゾールと（２）抗真菌剤の比率が１：３５０〜３３：１であり、相乗効果を有する量がカンジダ症に相乗効果を有する量である請求項１に記載の抗真菌外用剤。
【請求項４】
ラノコナゾール０.００００５〜１０重量％と抗真菌剤０.０１〜２０重量％を含有することを特徴とする請求項１乃至３に記載の抗真菌外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラノコナゾールと、トルナフタート、ウンデシレン酸亜鉛、シクロピロクスオラミン、ハロプロジン、塩化ベンゼトニウム、クレゾール及びクロルヘキシジンから選択される１又は２以上の抗真菌剤とを有効成分として含有することを特徴とする相乗効果を有する抗真菌外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の有効成分のひとつのラノコナゾールは公知の化合物であり、農園芸用殺菌剤として有用であること（例えば、特許文献１を参照）、抗真菌剤として有用であること（例えば、特許文献２を参照）、また、その光学活性体についての記載（例えば、特許文献３を参照）がある。
【０００３】
〔４−（２，４−ジクロロフェニル）１，３−ジチオラン−２−イリデン〕−１−アゾリルアセトニトリル化合物とピロールニトリンをはじめとする抗真菌活性化合物との組合せにより白癬菌及びカンジダ菌に対し相乗効果を有することが開示されている（例えば、特許文献４を参照）。
【０００４】
本発明の抗真菌外用剤の他の有効成分として用いられる抗真菌剤はいずれも公知の化合物である（特許文献５を参照）。抗真菌剤組成物として、（Ａ）シクロピロクスオラミン、トルナフタート、ハロプロジン、ウンデシレン酸、塩酸クロルヘキシジン等の化合物と（Ｂ）ミコナゾール等のイミダゾール系抗真菌剤を含んでなる抗真菌剤に関する記載があるが、実施例における（Ｂ）は硝酸ミコナゾールのみである。
【０００５】
【特許文献１】特開昭６０−２１８３８７号公報
【特許文献２】特開昭６２−９３２２７号公報
【特許文献３】特開平２−２７５８７７号公報
【特許文献４】特開２００２−１１４６８０号公報
【特許文献５】特開平９−１１０６９３公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一般に治りにくいと言われている水虫の治療には、長期間に亘り薬を塗布しなければならず、また、その再発が多いことが永年問題になっている。水虫のより根本的な治療には、菌の活動を抑制するだけでなく、治療効果の高い薬剤の開発が望まれている。さらに、水虫症状の原因が、白癬菌属かカンジダ属かという区別は専門医が顕微鏡で見るか、菌を培養することによってのみ判別できるものであり、判別が難しいことから双方に効く薬剤が重要である。また、同属菌の中でも菌株によりアゾール系抗真菌剤に対し感受性の低下しているものもあり、これらの菌株に対しできるだけ効果濃度差の少ない抗真菌剤組成物が望まれている。
本発明の抗真菌外用剤は、白癬菌属及びカンジダ属の双方に高い効力を有し、更には各種菌株の違いによらず高い効果を有する治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、白癬菌属及びカンジダ属の双方に効力を有する治療剤を見出すべく（１）〔４−（２−クロロフェニル）−１，３−ジチオラン−２−イリデン〕−１−イミダゾリルアセトニトリル（一般名：ラノコナゾール）の効力を増強できる種々の添加物を検討した結果、（２）トルナフタート、ウンデシレン酸亜鉛、シクロピロクスオラミン、ハロプロジン、塩化ベンゼトニウム、クレゾール及びクロルヘキシジンから選択される１又は２以上の抗真菌剤（以下、省略時には「（２）化合物」という。）が白癬菌属及びカンジダ属の双方の各種菌株に対して効力を相乗的に増強することを見出し、更に相乗効果を示す混合比率の詳細を調べて本発明を完成させた。
【０００８】
即ち、本発明は、
ラノコナゾール又はその塩と、トルナフタート、ウンデシレン酸亜鉛、シクロピロクスオラミン、ハロプロジン、塩化ベンゼトニウム、クレゾール及び塩酸クロルヘキシジから選択される１又は２以上の抗真菌剤とを特定の割合に配合することを特徴とする相乗効果を有する抗真菌外用剤に関するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の抗真菌外用剤は、トルナフタート、ウンデシレン酸亜鉛、シクロピロクスオラミン、ハロプロジン、塩化ベンゼトニウム、クレゾール及びクロルヘキシジから選択される１又は２以上の抗真菌剤及びラノコナゾールの組み合わせにより作用が相乗的に増強され、白癬菌及びカンジダに対してそれらの菌株の違いによらず強い効力が得られ、短期間に治療効果をあげることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
塩類とは特に限定されるものではないが、薬理学的に許容される塩類であれば良く、例えば、蓚酸、琥珀酸、メタンスルホン酸等の有機酸との塩、銅、亜鉛等の金属類との塩、塩酸、硫酸等の鉱酸類との塩などが挙げられる。
【００１１】
各成分の配合量は用途や製剤剤型等により異なるため特に制限はないが、通常は、ラノコナゾールの有効配合量は０.００００５〜１０重量％程度であり、好ましくは０．００５〜５重量％であり、特に好ましくは０．０２〜２重量％である。
トルナフタート、ウンデシレン酸亜鉛、シクロピロクスオラミン、ハロプロジン、塩化ベンゼトニウム、クレゾール及びクロルヘキシジンから選択される１又は２以上の抗真菌剤の配合量は、上限２０重量％程度、下限０．０１重量％程度である。好ましくは、０.０２５〜１重量％程度である。特に好ましくは、０．０５から０．５重量％程度である。
また配合比については、ラノコナゾールとトルナフタートとの配合又は使用比率は、通常１００：１〜１：５００であり、好ましくは２：１〜１：６５である。
【００１２】
ラノコナゾールとウンデシレン酸亜鉛との配合又は使用比率は、通常１０：１〜１：１０００００であり、好ましくは２：１〜１：６７０００である。また、カンジダ症への相乗効果を重視して、１：１〜１：２０の範囲も好ましい。
ラノコナゾールとシクロプロクスオラミンとの配合又は使用比率は、通常１００：１〜１：１０００であり、好ましくは８：１〜１：５００である。また、カンジダ症への相乗効果を重視して、８：１〜１：４の範囲も好ましい。
ラノコナゾールとハロプロジンとの配合又は使用比率は、通常１００：１〜１：１０００であり、好ましくは４：１〜１：２５０である。また、カンジダ症への相乗効果を重視して、４：１〜１：１の範囲も好ましい。
【００１３】
ラノコナゾールと塩化ベンゼトニウムとの配合又は使用比率は、通常１００：１〜１：１０００００であり、好ましくは３２：１〜１：３２０００である。また、カンジダ症への相乗効果を重視して、３２：１〜１：４の範囲も好ましい。
ラノコナゾールとクレゾールとの配合又は使用比率は、通常１：１〜１：３２００００であり、好ましくは１：１６０〜１：３２０００である。また、カンジダ症への相乗効果を重視して、１：８０〜１：３１０の範囲も好ましい。
ラノコナゾールと塩酸クロルヘキシジンとの配合又は使用比率は、通常１０：１〜１：１００００であり、好ましくは１：１〜１：４０００である。また、カンジダ症への相乗効果を重視して、１：１〜１：４の範囲も好ましい。
【００１４】
本発明の有効成分は、必要に応じて公知の添加剤などを混合して常法により、錠剤、クリーム剤、液剤、ローション剤、乳剤、チンキ剤、軟膏剤、水性ゲル剤、油性ゲル剤、エアゾール剤、スプレー剤、パウダー剤、シャンプー、石鹸、爪塗布用エナメル剤、パップ剤等とすることができる。
【００１５】
本発明の抗真菌外用剤には、上記成分の他に水溶性成分、油性成分、粉末成分、界面活性剤、高分子成分、粘着性改良剤、被膜形成剤、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、防腐剤、保存剤、保型剤、保湿剤、皮膚保護剤、清涼化剤、香料、キレート剤、潤沢剤、増粘剤、抗炎症剤、鎮痒剤、血行促進剤、収斂剤、組織修復促進剤、制汗剤、植物抽出成分、動物抽出成分、着色剤等を必要に応じて配合することができる。
【００１６】
水溶性成分としては、例えばプロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等のポリエチレングリコール類等のグリコール系溶剤、グリセリン等の多価アルコール類、エタノール等の低級アルコール類、マクロゴール類、メチルエチルケトン、シクロヘキサノン等の低分子ケトン類等が挙げられる。
【００１７】
油性成分としては、例えばオレイルアルコール、ステアリルアルコール、セトステアリルアルコール、セタノール、ベンジルアルコール等の高級アルコール類、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、アジピン酸ジイソプロピル、セバシン酸ジエチル、ミリスチン酸イソプロピル、オレイン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソステアリル等の脂肪酸エステル類、牛脂、オリーブ油等の中鎖脂肪酸トリグリセリド類、スクワレン、スクワラン、ホホバ油、ゲイロウ、白色ワセリン、流動パラフィン、ラノリン、ｌ−メントール、ｄ−カンファー、クロタミトン、ジエチルエーテル、イソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、２−メトキシエタノール、1,２−ジメトキシエタンなどのエーテル類などが挙げられる。
【００１８】
有機、無機粉末成分としては、例えば酸化亜鉛、酸化チタン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、無水ケイ酸、含水ケイ酸、ケイ酸マグネシウム、カオリン、アエロジル、酸性白土、マイカ、トウモロコシデンプン、メタケイ酸アルミニウム等が挙げられる。
【００１９】
界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノパルミテート、グリセリンモノステアレート、ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー、ポリソルベート類、ラウリル硫酸ナトリウム、ショ糖脂肪酸エステル、レシチン等が挙げられる。
【００２０】
増粘、被膜形成、接着性改良、その他を目的とする高分子成分としてはアクリル酸ポリマー、カルボキシビニルポリマー、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ニトロセルロース等のセルロースエーテル類、キサンタンガム等の多糖類などが挙げられる。
【００２１】
ｐＨ調製剤としては、例えばクエン酸、乳酸、酒石酸、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸等の有機酸類、ピロリン酸ナトリウム等の有機酸塩類、水酸化ナトリウム等の無機塩基類、ジイソプロパノールアミン、トリエタノールアミンなどの有機アミン類などが挙げられる。
【００２２】
抗酸化剤としては、例えばジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、α−トコフェロール、エリソルビン酸、ピロ亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００２３】
防腐剤又は保存剤としてはベンジルアルコール、デヒドロ酢酸ナトリウム、ソルビン酸等が挙げられる。保型剤としては、例えば植物性テキシトリン・蔗糖エステル等が挙げられる。保湿剤としては、例えばヒアルロン酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸ナトリウム、グリコシルトレハロース、キシリトール、ソルビトール等の糖類、コラーゲン、アルギニン、加水分解シルク、セリシン等の蛋白質やアミノ酸類、乳酸ナトリウム、後述植物抽出成分等が挙げられる。皮膚保護剤としては、例えばリボフラビンリン酸ナトリウム、リン酸アスコルビルマグネシウム、シアノコバラミン等のビタミン誘導体類、グリコシルルチン等のポリフェノール類、ヒドロキシプロリン、ジパルミトイルヒドロキシプロリン等のヒドロキシプロリン又はその誘導体、セラミド、アミノカプロン酸、ステアロキシメチルポリシロキサン、トリメチルシロキシケイ酸等のシロキサン誘導体、セレブロシド等の糖脂質類等が挙げられる。
【００２４】
清涼化剤としてはハッカ（ｌ−メントール）、カンフル、エタノール、ユーカリ油等が、香料としては、例えば、着色剤としては、特に限定は無いが例えば赤色２０２号、酸化鉄等が、キレート剤としては、例えばＥＤＴＡ−２Ｎａ（エデト酸ナトリウム塩）、エチドロン酸４Ｎａ、三リン酸５Ｎａ、ペンテト酸５Ｎａ等が、潤沢剤としては、例えばシリカ、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等が挙げられる。
【００２５】
抗炎症剤、鎮痒剤としては、クロタミトン、グリチルリチン酸塩、オレアノール酸等のサポゲニン類、ジフェンヒドラミン、クロルフェニラミン、マレイン酸クロルフェニラミン、ジメンヒドリナート、プロメタジン等の抗ヒスタミン剤、リドカイン、ジブカイン、プロカイン、アミノ安息香酸エチル及びこれらの塩等の局所麻酔剤、アラントイン、オキシポリエントキシドデカン、アミノ安息香酸エチル等が挙げられる。尿素、フタル酸ジエチル等の有機酸エステル類、乳酸等の有機酸類、鯨蝋、コレステロール等の油脂類等の角質軟化剤を添加することもできる。
【００２６】
血行促進剤としては、例えばニコチン酸ベンジル、ヘパリン類似物質、トウガラシ等が、収斂剤としては、例えば塩化アルミニウム、アルジオキサ等が挙げられる。組織修復促進剤としては、例えばアルミニウムクロロヒドロキシアラントイネート、塩化リゾチーム等が、制汗剤としては、例えばハロゲン化アルミニウム、ヒドロキシハロゲン化アルミニウム、オキシハロゲン化ジルコニウム、ヒドロキシハロゲン化ジルコニウム、及びそれらの混合物のようなアルミニウム塩及びジルコニウム塩等のアルミニウム、ジルコニウムおよび亜鉛の無機塩および有機塩若しくは錯体及びそれらの混合物等、クエン酸、乳酸、こうじ酸、メントール等が挙げられる。
【００２７】
植物抽出成分としては、例えばアロエエキス、オウゴンエキス、ソウハクヒエキス、モモ葉エキス、クチナシ葉エキス、オウバクエキス、オトギリソウエキス、米糠エキス、緑茶エキス、甘草エキス、紅藻エキス、チョウジエキス、トウキエキス、トウガラシエキス、ローズマリー油等を例示することができる。
動物抽出成分等としては、例えば冬虫夏草エキス、ローヤルゼリーエキス等が挙げられる。
これらの医薬品又は化粧品等として許容される添加物はいずれも、一般に製剤に用いられるものが使用できる。
【００２８】
本発明の抗真菌外用剤は、各種白癬菌、カンジダ菌に有効である。
【実施例】
【００２９】
以下に、実施例及び試験例を挙げ、本発明を具体的に説明するが本発明はこれらに限定されるものではない。
製剤処方例１（クリーム処方例）
ラノコナゾール                  ５０ｇ
（２）化合物                    ５０ｇ
セトステアリルアルコール  １，０００ｇ
セバシン酸ジエチル            ６００ｇ
中鎖脂肪酸トリグリセリド      ８００ｇ
ポリソルベート６０            ４００ｇ
ソルビタンモノステアレート    ２００ｇ
メチルパラベン                  １５ｇ
プロピルパラベン                  ５ｇ
ベンジルアルコール            １００ｇ
ジブチルヒドロキシトルエン        ２ｇ
精製水                            残量
全１０，０００ｇ
【００３０】
製造例１  油相成分（ラノコナゾール、          、セトステアリルアルコール、セバシン酸ジエチル、中鎖脂肪酸トリグリセリド、ポリソルベート６０、ソルビタンモノステアレート、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、ジブチルヒドロキシトルエン）を加温混合後、冷却し攪拌しながら水相成分（メチルパラベン、精製水）を加えクリーム１０，０００gを製造する。
【００３１】
製剤処方例２（液剤処方例）
ラノコナゾール                １００ｇ
（２）化合物                    ２５ｇ
マクロゴール４００        ３，３００ｇ
メチルエチルケトン        １，０００ｍｌ
エタノール                ４，５００ｍｌ
精製水                            残量
全１０，０００ｍｌ
製造例２  上記各成分を混合溶解して液剤１０，０００ｍＬを製造する。
【００３２】
試験例１
（被験物質）各化合物をジメチルスルホキシドに溶解し、溶媒で２倍希釈系列を作成した。各化合物の混合液を調製し、抗菌活性測定の際、薬剤と培地を１：９９の割合で混合した。
（試験方法）感受性測定用培地としてサブロー寒天培地（ＤＩＦＣＯ）を用いた。薬剤を含むサブロー寒天培地上に白癬菌は１０６分生子／ｍｌに調製した菌液を接種し、２７℃で７日間培養した。カンジダは１０６細胞／ｍｌに調製した菌液を接種し、３５℃で２日間培養した。抗菌活性は培養終了時に菌の発育が認められない最小の薬剤濃度（ＭＩＣ：最小発育阻止濃度）からＦＩＣインデックス（Ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）を算出した。
【００３３】
計算式；
ＦＩＣ  ｉｎｄｅｘ＝ａ／ａ０＋ｂ／ｂ０
ａ：併用時のラノコナゾールのＭＩＣ
ａ０：ラノコナゾール単独のＭＩＣ
ｂ：併用時の各化合物のＭＩＣ
ｂ０：各化合物単独のＭＩＣ
併用による相乗効果の有無を判定するための基準；
ＦＩＣ  ｉｎｄｅｘ≧２：拮抗作用
２＞ＦＩＣ  ｉｎｄｅｘ≧１：相加作用
ＦＩＣ  ｉｎｄｅｘ＜１：相乗作用
【００３４】
（結果）
表１にＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓに対する併用効果結果を示す。ラノコナゾール０．００４μｇ／ｍｌに対しトルナフタートを０．１３μｇ／ｍｌの濃度で併用した場合に相乗効果が認められ、ＦＩＣ  ｉｎｄｅｘは０．５〜０．７５であった。
表２にＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍに対する併用効果結果を示す。
ラノコナゾール0.002〜0.004μg/mlに対しトルナフタートを0.0002〜0.031μg/mlの濃度で併用した場合に相乗効果が認められ、FIC indexは0.625〜0.75であった。
【００３５】
【表１】
2007091661.tif 000002
【００３６】
【表２】
2007091661.tif 000003
【００３７】
表３及び表４に白癬菌に対する併用効果結果を示す。
ラノコナゾールとウンデシレン酸亜鉛を併用した場合、Trichophyton mentagrophytes及びTrichophyton rubrumに対するFIC
index はそれぞれ0.516及び0.531であり、両化合物の組み合わせは白癬菌に対して相乗効果を示した。
ラノコナゾールとシクロピロクスオラミンを併用した場合、Trichophyton mentagrophytes及びTrichophyton rubrumに対するFIC
index はいずれも0.625であり、両化合物は白癬菌に対して相乗効果を示した。
ラノコナゾールとハロプロジンを併用した場合、Trichophyton mentagrophytes及びTrichophyton rubrumに対するFIC
index はそれぞれ0.75及び0.625であり、両化合物の組み合わせは白癬菌に対して相乗効果を示した。
ラノコナゾールと塩化ベンゼトニウムを併用した場合、Trichophyton mentagrophytes及びTrichophyton rubrumに対するFIC
index はそれぞれ＜0.375〜＜0.563及び＜0.5であり、両化合物の組み合わせは白癬菌に対して相乗効果を示した。
ラノコナゾールとクレゾールを併用した場合、Trichophyton mentagrophytes及びTrichophyton rubrumに対するFIC
index はそれぞれ0.375及び0.5〜0.625であり、両化合物の組み合わせは白癬菌に対して相乗効果を示した。
ラノコナゾールと塩酸クロルヘキシジンを併用した場合、Trichophyton mentagrophytes及びTrichophyton rubrumに対するFIC
index はそれぞれ0.313〜0.75及び0.375〜0.625であり、両化合物の組み合わせは白癬菌に対して相乗効果を示した。
【００３８】
表５にカンジダに対する併用効果結果を示す。
ラノコナゾールとウンデシレン酸亜鉛を併用した場合、Candida albicansに対するFIC index は＜0.375〜＜0.5であり、両薬剤の組み合わせは明らかに相乗効果を示した。
ラノコナゾールとシクロピロクスオラミンを併用した場合、Candida albicansに対するFIC index は0.563〜0.625であり、両薬剤の組み合わせは相乗効果を示した。
ラノコナゾールとハロプロジンを併用した場合、Candida albicansに対するFIC index は0.5〜0.75であり、両薬剤の組み合わせは相乗効果を示した。
ラノコナゾールと塩化ベンゼトニウムを併用した場合、Candida albicansに対するFIC index は0.188〜0.563であり、両薬剤の組み合わせは相乗効果を示した。
ラノコナゾールとクレゾールを併用した場合、Candida albicansに対するFIC index は0.25〜0.375であり、両薬剤の組み合わせは明らかに相乗効果を示した。
ラノコナゾールと塩酸クロルヘキシジンを併用した場合、Candida albicansに対するFIC index は0.125〜0.188であり、両薬剤の組み合わせは著しい相乗効果を示した。
【００３９】
【表３】
2007091661.tif 000004
【００４０】
【表４】
2007091661.tif 000005
【００４１】
【表５】
2007091661.tif 000006
【００４２】
効果試験例２  モルモット足白癬モデルにおける治療試験
片面をアルミホイルで覆ったペーパーディスク（厚さ１．５ｍｍ、直径８ｍｍ）に接種菌液（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ  ＴＩＭＭ  ２７８９、１×１０８
分生子／ｍｌ）をしみ込ませ、モルモット（雄Ｈａｒｔｌｅｙ系、体重４００から６００ｇ、日本エスエルシー（株））後肢足底部に伸縮性粘着テープで７日間固定感染する。供試薬剤を菌接種開始１０日後から１日１回０．１ｍｌずつ足底全体に塗布し、塗布期間は３日間とする。薬剤最終塗布後５日目に局所皮膚の培養試験を以下のとおり行う。足底部及び足踵部の皮膚を摘出し、両部位より各１０個の皮膚小片（約２ｍｍ角）を切り出す。各小片を抗生物質を含有するＳａｂｏｕｒａｕｄ'ｓ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｇａｒ培地上に埋め込み、２７℃で１４日間培養し、菌のコロニーが発育したものを菌陽性小片とする。菌陽性小片を１個でも含む感染局所（足底部及び足踵部を合わせた部位）を菌陽性と判定する。さらに、感染局所の足底部及び足踵部ごとに、菌陽性小片数に基づいて次のとおりスコアー化し、感染強度とする。すなわち、菌陽性小片中、菌陽性小片の個数が１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０の場合をそれぞれ＋１０、＋９、＋８、＋７、＋６、＋５、＋４、＋３、＋２、＋１、０とする。得られた菌陽性率及び平均感染強度について、それぞれＦｉｓｈｅｒの正確確率検定法及びＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定法により解析する。