(57)【要約】  【課題】  新たなアポトーシス促進剤の提供を目的とする。  【解決手段】  下記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子を含むアポトーシス誘導剤とする。（Ａ）  配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ（Ｂ）  前記（Ａ）において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、カスパーゼの活性を誘導する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（Ｃ）  配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（Ｄ）  配列番号２において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、カスパーゼの活性を誘導する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ【選択図】  図１
2007169223.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子を含むアポトーシス促進剤。
（Ａ）  配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｂ）  前記（Ａ）において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、カスパーゼの活性を誘導する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（Ｃ）  配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（Ｄ）  配列番号２において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、カスパーゼの活性を誘導する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項２】
前記カスパーゼが、カスパーゼ−３である、請求項１記載のアポトーシス促進剤。
【請求項３】
前記カスパーゼ活性の誘導が、プロカスパーゼからカスパーゼへの変換である、請求項１または２記載のアポトーシス促進剤。
【請求項４】
前記遺伝子が挿入されたベクターを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアポトーシス促進剤。
【請求項５】
前記ベクターが、ウィルスベクター、リポソームベクターおよびプラスミドベクターからなる群から選択された少なくとも一つである、請求項４記載のアポトーシス促進剤。
【請求項６】
がん細胞のアポトーシスを促進する促進剤である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアポトーシス促進剤。
【請求項７】
アポトーシス促進剤を含む医薬製剤であって、前記アポトーシス促進剤が、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアポトーシス促進剤である医薬製剤。
【請求項８】
医薬製剤が抗がん剤である、請求項７記載の医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポトーシス促進剤およびそれを用いた医薬製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスは、生理的条件下で細胞自らが積極的に引き起こす細胞死である。このアポトーシスを、所望の細胞で誘導または促進できれば、例えば、がん化した細胞や異常細胞等の病原細胞を生体から排除することが可能となる。このため、アポトーシスを誘導・促進するメカニズムについての研究が活発に行われている。
【０００３】
アポトーシスは、通常、プロテアーゼのカスケード（連鎖）系を介して行われる。細胞内からのアポトーシス誘導としては、例えば、（１）細胞ストレス等の様々な刺激やシグナルがミトコンドリアに伝達され、（２）この刺激によって、ミトコンドリアからチトクロームｃが放出され、（３）放出されたチトクロームｃにより不活性型プロカスパーゼ−９が切断により活性化され、（４）さらに、活性化されたカスパーゼ−９により、不活性型プロカスパーゼ‐３が切断により活性化され、（５）活性化されたカスパーゼ‐３によって細胞内構造が破壊されるという経路が知られている。このようなカスケード系では、チトクロームｃの放出がアポトーシス誘導のキーとなることから、医療や医薬の分野において、チトクロームｃをがん細胞のアポトーシス誘導に応用する研究が行われている（非特許文献１および２）。
【非特許文献１】I. N. Lavrik, A. Golks, and P. H. Krammer, Caspases: pharmacological manipulation of cell death. J. Clin. Invest. (2005) 115: 2665-2672
【非特許文献２】U. Fischer and K. Schulze-Osthoff, New Approaches and Therapeutics Targeting Apoptosis in Disease. Pharmacol. Rev. (2005) 57: 187-215
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、チトクロームｃとアポトーシス誘導との関係については、研究がなされているものの、いまだ臨床において有用な製剤の開発には至っていない。
【０００５】
そこで、本発明は、新たなアポトーシス促進剤およびそれを用いた医薬製剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するため、本発明のアポトーシス促進剤は、下記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子を含む。以下、本発明における遺伝子を、「Ｍｏｎａｄ遺伝子」といい、その遺伝子産物を「Ｍｏｎａｄ」という。
（Ａ）  配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｂ）  前記（Ａ）において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、カスパーゼの活性を誘導する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（Ｃ）  配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（Ｄ）  配列番号２において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、カスパーゼの活性を誘導する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
本発明の医薬製剤は、本発明のアポトーシス促進剤を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のアポトーシス促進剤によれば、従来のようにチトクロームｃに依存することなく、例えば、がん細胞等の生体に悪影響を及ぼす細胞におけるアポトーシスを促進することができる。このため、本発明のアポトーシス促進剤は、例えば、新たな抗がん剤等の医薬製剤として有用である。
【０００８】
前記カスケード系の酵素であるカスパーゼ−３は、前述のような細胞ストレスがかからない状態では、正常細胞において不活性型（プロカスパーゼ−３）をとっている。これに対して、がん細胞においては、細胞の種類によって程度の違いはあるものの、カスパーゼ‐３が活性型をとっていることが知られている。そして、このように活性型カスパーゼ−３が確認されているにもかかわらず、がん細胞でアポトーシスが誘導されないのは、アポトーシス阻害因子（ＩＡＰ）が活性型カスパーゼに結合し、必要となるまでカスパーゼ活性を抑制（カスパーゼを不活性化）しているためであることが明らかになっている。そこで、本発明者らは、ＩＡＰにより活性型カスパーゼが不活性化されているものの、正常細胞とは異なり、がん細胞において、カスパーゼが不活性型（プロカスパーゼ）から活性型（カスパーゼ）になっていることに着目した。つまり、カスパーゼが不活性型から活性型になっている以上、がん細胞は、カスパーゼを不活性型から活性型に変換する誘導物質を有しているであろうとの知見を得たのである。そして、鋭意研究の結果、前記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのＤＮＡからなるＭｏｎａｄ遺伝子を、例えば、目的の細胞内で発現させることによって、カスパーゼの活性化（例えば、不活性型プロカスパーゼから活性型カスパーゼへの変換）が可能となることを見出し、本発明に至った。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のアポトーシス促進剤は、前述のように、下記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのＤＮＡからなるＭｏｎａｄ遺伝子を含む。
（Ａ）  配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｂ）  前記（Ａ）において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、カスパーゼの活性を誘導する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（Ｃ）  配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（Ｄ）  配列番号２において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、カスパーゼの活性を誘導する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
前記（Ｂ）において、欠失、置換または付加が可能な塩基数は、カスパーゼの活性を誘導する機能を喪失しない範囲であれば特に制限されない。例えば、５０塩基に対して、１〜６個が好ましく、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜３個である。。
【００１０】
前記（Ｄ）において、欠失、置換または付加が可能なアミノ酸残基数は、カスパーゼの活性を誘導する機能を喪失しない範囲であれば特に制限されない。例えば、５０アミノ酸残基に対して、１〜４個が好ましく、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個である。また、配列番号２のアミノ酸配列に対する相同性は、例えば、７０％以上である。
【００１１】
また、本発明におけるＭｏｎａｄ遺伝子は、カスパーゼの活性を誘導する機能を奏するタンパク質をコードするＤＮＡであれば、例えば、前記（Ａ）または（Ｃ）のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであってもよいし、前記（Ａ）または（Ｃ）のＤＮＡとの相同性が９０％以上のＤＮＡでもよい。
【００１２】
ハイブリダイズのストリンジェントな条件とは、例えば、当該技術分野における標準の条件があげられるが、例えば、温度条件は、各配列番号で示された塩基配列のＴｍ値の±５℃、好ましくは±２℃、より好ましくは±１℃である。条件の具体例として、５×ＳＳＣ溶液、１０×Denhardt溶液、１００μｇ/ｍｌサケ精子ＤＮＡおよび１％ＳＤＳ中、６５℃でのハイブリダイゼーション、０．２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、６５℃、１０分の洗浄（２回）があげられる。また、相同性は、例えば、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７．５％以上である。
【００１３】
本発明において、前記カスパーゼ活性を誘導する機能とは、表現型としてカスパーゼ活性を発現させる機能であればよく、例えば、不活性型プロカスパーゼから活性型カスパーゼへの変換を行う機能であってもよいし、活性型カスパーゼに対する活性の抑制を解除する機能であってもよい。前記カスパーゼとは、例えば、カスパーゼ‐３である。
【００１４】
本発明のアポトーシス促進剤の形態としては、特に制限されないが、前記Ｍｏｎａｄ遺伝子が挿入されたベクターを含むことが好ましい。前記Ｍｏｎａｄ遺伝子のベクターへの挿入は、従来公知の方法によって行うことができる。
【００１５】
前記ベクターとしては、特に制限されないが、例えば、本発明のアポトーシス促進剤を導入する対象細胞や対象組織、導入方法に応じて適宜決定できる。具体例としては、レトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶベクター；adeno associated virus）等のウィルスベクター；プラスミドベクター；リポソーム、HIV Envelope Vector（商品名Genome One；石原産業）等の非ウィルスベクター等があげられる。
【００１６】
本発明のアポトーシス促進剤は、例えば、その投与方法や対象細胞の種類等に応じて、遺伝子や組換えベクターの細胞への導入を補助する物質をさらに含んでもよい。このような導入補助剤としては、例えば、市販のリポフェクタミン（商品名、invitrogen社製）、Protein Derivery Reagent(商品名、BioPORTER社製)等があげられ、従来公知の方法によって使用することができる。
【００１７】
また、本発明のアポトーシス促進誘導剤を投与する際には、例えば、ＩＡＰのカスパーゼへの結合を阻害する物質として、例えば、タンパク質であるＳＭＡＣ（ＤＩＡＢＬＯ）、ＳＭＡＣのＩＡＰ結合モチーフに由来するペプチドやその他の公知の物質（A Small Molecule Smac Mimic Potentiates TRAIL- and TNFα-Mediated Cell Death Lin Li, Ranny Mathew Thomas, Hidetaka Suzuki, Jef K. De Brabander, Xiaodong Wang, and Patrick G. Harran Science 3 September 2004: 1471-1474 ）等を併用することが好ましい。前記結合阻害物質の併用によって、本発明のアポトーシス促進剤によって活性化されたカスパーゼが、ＩＡＰとの結合によって不活性されることを防止でき、より効率良くアポトーシスを促進できる。なお、前記結合阻害物質は、本発明のアポトーシス促進剤とは別個に投与してもよいし、同時に投与してもよい。また、前記結合阻害物質を発現する組換えベクターを投与し、患部において前記結合阻害物質を発現させてもよいし、本発明のアポトーシス促進剤が、前記結合阻害物質の組換えベクターをさらに含んでもよい。
【００１８】
本発明のアポトーシス促進剤の使用方法は、特に制限されず、例えば、導入する対象細胞や組織等に応じて適宜決定できる。アポトーシス促進剤の対象細胞への投与方法としては、例えば、注射、錠剤、坐剤等があげられ、投与経路としては、例えば、患部への直接投与、筋肉内投与、動静脈内投与、皮下組織投与、経口投与、経直腸投与等があげられる。
【００１９】
本発明のアポトーシス促進剤の投与量は、特に制限されず、例えば、がんの進行状態や対象細胞の種類等に応じて適宜決定できる。本発明のアポトーシス促進剤の投与対象は、特に制限されず、アポトーシスの促進によって細胞を排除できることから、生体に影響をおよぼす細胞や組織等であり、特にがん細胞に有用である。具体例としては、例えば、大腸がん等の細胞や組織があげられる。また、がん等の治療等において、前述のＳＭＡＣ等の結合阻害物質を使用する場合、Ｍｏｎａｄ遺伝子の発現が少ない患者は、前記結合阻害物質の効果が期待し難いと考えられる。したがって、このようにＭｏｎａｄ遺伝子の発現が少ない細胞や組織には、本発明のアポトーシス促進剤を投与することが特に有用と解される。
【００２０】
つぎに、本発明の医薬製剤は、前述のように、本発明のアポトーシス促進剤を含むことを特徴とし、例えば、抗がん剤として有用である。本発明の医薬製剤の構成や、使用方法は、例えば、前述のアポトーシス促進剤と同様である。
【００２１】
このように、本発明のアポトーシス促進剤および医薬製剤は、がん等の生体に影響をおよぼす細胞や組織を排除できることから、ヒトやヒトを除く哺乳類に投与することによって、例えば、がんの治療を行うことができる。
【００２２】
以下に、本発明の実施例について説明するが、本発明は、これらに制限されるものではない。なお、特に示さない限り、使用した製品はinvitrogen社製である。
【実施例１】
【００２３】
Ｍｏｎａｄによるアポトーシス促進の確認
Ｍｏｎａｄ遺伝子の導入による、アポトーシスの促進を確認した。
【００２４】
（Ｍｏｎａｄ遺伝子のクローニング）
鋳型としてIMAGE clone 6164689を使用して、下記プライマーを用いたＰＣＲによりＭｏｎａｄ遺伝子のｃＤＮＡを増幅させた。得られたＰＣＲ産物を、pENTR Directional TOPO cloning kit（商品名）を用いてpENTR/D TOPO vectorにクローニングし（pENTR/D-CnB）、さらに、pcDNA5/FRT/V5-His TOPO TA 発現キット（商品名）を用いて、pcDNA5/FRT/V5-His-TOPO TA cloning vectorにサブクローニングした（pcDNA5/FRT-Monad）。ベクターの挿入断片（ＯＲＦ：１０７４ｂｐ）の配列は、自動ＤＮＡ配列解析装置により確認した。
Forward primer（配列番号３）
5’- CACCATGTCGGCCTTCGAGAAG -3’
Reverse primer（配列番号４）
5’- AATTTTATTGAGCTTTGTAACGATC -3’
【００２５】
（Ｍｏｎａｄを発現する安定なセルラインの調製）
同じ遺伝子座からＭｏｎａｄ遺伝子を発現するFlp-In 293 セルラインを、Flp-In Systemに従って作製した。具体的には、Flp-In 293細胞に、リポフェクタミン2000（商品名）を用いて、前述の組換えベクターpcDNA5/FRT-Monadを導入した。他方、コントロールとして、pcDNA5/FRT-Monadに代えて、コントロールベクターpcDNA5/FRT/V5-His-CAT（invitrogen社製）を導入した。そして、組換えベクターを導入した組換え体を、ハイグロマイシン（100μｇ／ｍｌ）含有ＤＭＥＭ培地で生育させ、生育したハイグロマイシン耐性株を、前記組換えベクターを安定に発現するクローンとして選択した。このハイグロマイシン耐性株におけるＭｏｎａｄの発現は、抗Ｍｏｎａｄ抗体とのイムノブロッティングにより確認した。なお、抗Ｍｏｎａｄ抗体は、大腸菌で発現させたヒスチジンタグが付加されたＭｏｎａｄタンパク質を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（商品名TALON His-タグ精製レジン；クローンテック社製）で精製した後、ウサギに免疫して抗血清を得ることによって調製した。
【００２６】
（アポトーシス促進の確認１）
pcDNA5/FRT-Monadを導入したハイグロマイシン耐性株（以下、「Ｍｏｎａｄ株」という）と、コントロールベクターを導入したハイグロマイシン耐性株（以下、「コントロール株」）とをそれぞれ培養し、アポトーシス誘導の程度を測定した。培養には、下記（１）〜（３）の培地を使用し、３７℃で２４時間行った。そして、培養後のＭｏｎａｄ株およびコントロール株について、ＥＬＩＳＡ法に基づくアポトーシス検出キット（商品名Cell Death Detection ELISA；ロシュ社製）を用いて、そのマニュアルに従ってアポトーシスの測定を行った。
（１）ＴＮＦ-α無添加ＤＭＥＭ培地
（２）ＴＮＦ‐α（１０ｎｇ／ｍｌ）添加ＤＭＥＭ培地
（３）ＴＮＦ‐α（１０ｎｇ／ｍｌ）およびカスパーゼインヒビター（２５μｇ      ／ｍｌ ｚＶＡＤ-ＦＭＫ）添加ＤＭＥＭ培地
【００２７】
この結果を図１に示す。なお、同図において縦軸はアポトーシスの程度を示す。同図に示すように、ＴＮＦ-α無添加培地（ＴＮＦ-α（‐））では、Ｍｏｎａｄ株およびコントロール株は、同程度の低いアポトーシス誘導を示した。そして、ＴＮＦ-α添加培地（ＴＮＦ-α（＋））では、コントロール株と比較して、Ｍｏｎａｄ株は、著しいアポトーシスの誘導が見られた。この結果より、Ｍｏｎａｄ遺伝子の導入によって、アポトーシスの誘導が増強されたと言える。また、培地にさらにカスパーゼインヒビターを添加することによって、Ｍｏｎａｄ株のアポトーシス誘導の増強が抑制された。この結果より、Ｍｏｎａｄ遺伝子の導入によるアポトーシス促進は、カスパーゼを介して起こっていることがわかる。
【００２８】
（アポトーシス促進の確認２）
前述と同様にして、ＴＮＦ-α（１０ｎｇ／ｍｌ）添加培地を用いて、Ｍｏｎａｄ株およびコントロール株の培養を行った。そして、所定時間（０、１、３、９、２４時間）の培養を行った細胞株を溶解させ、抗プロカスパーゼ‐３抗体（商品名anti-caspase 3 antibody：トランスダクション社製）および抗断片化ＰＡＲＰ抗体（商品名anti-PARP antibody：カルビオケム社製）を用いて、ウェスタンブロット分析を行った。また、Ｍｏｎａｄ（Ｖ５タグが付加されたＭｏｎａｄ）の発現を確認するために、抗Ｖ５抗体（商品名antibody-V5-HRP antibody：invitrogen社製）とのウェスタンブロット分析をあわせて行った。
【００２９】
この結果を、図２に示す。まず、同図に示すように抗Ｖ５抗体とのウェスタンブロットによると、コントロール株ではバンドが確認されず、一方、Ｍｏｎａｄ株でバンドが検出された。この結果から、Ｍｏｎａｄ株におけるＭｏｎａｄの発現が確認された。つぎに、抗プロカスパーゼ‐３抗体とのウェスタンブロットによると、コントロール株ではバンドが確認され、一方、Ｍｏｎａｄ株では、培養時間の経過に伴ってバンドが消失した。これは、Ｍｏｎａｄ株における経時的なプロカスパーゼ‐３の減少を示し、この結果から、Ｍｏｎａｄ株では、Ｍｏｎａｄの発現によってプロカスパーゼ‐３がカスパーゼ‐３に活性化されたといえる。また、抗断片化ＰＡＲＰ抗体とのウェスタンブロットによると、コントロール株ではバンドが確認されず、Ｍｏｎａｄ株では、培養時間の経過に伴ってバンドが確認された。ＰＡＲＰは、カスパーゼ‐３の基質であり、カスパーゼ‐３によって切断される。したがって、ウェスタンブロットにより抗断片化ＰＡＲＰ抗体との反応が確認されたことから、Ｍｏｎａｄの発現に伴ってカスパーゼ‐３が活性化されたといえる。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
以上のように、本発明によれば、例えば、がん細胞等の生体に悪影響を及ぼす細胞におけるアポトーシスを促進することができる。このため、本発明のアポトーシス促進剤は、例えば、抗がん剤等の医薬製剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、本発明の一実施例において、Ｍｏｎａｄ遺伝子を導入した細胞でのアポトーシスの誘導を示すグラフである。
【図２】本発明の他の実施例において、Ｍｏｎａｄ遺伝子を導入した細胞でのカスパーゼ‐３の活性化およびカスパーゼ‐３によるＰＡＲＰ切断の有無を確認したウェスタンブロットのオートラジオグラフィーである。
【配列表フリーテキスト】
【００３２】
配列番号３  フォワードプライマー
配列番号４  リバースプライマー
【図１】
2007169223.tif 000003
【図２】
2007169223.tif 000004
【配列表】
2007169223000001.app