(57)【要約】【課題】  付着しているＡＴＰが十分に少なく、検出対象のＡＴＰを十分に高い精度で検出することを可能にする精製ルシフェラーゼ、及びそのような精製ルシフェラーゼを含有するＡＴＰ検出試薬を提供すること。【解決手段】  ＡＴＰが付着している粗ルシフェラーゼを液体中でポリリン酸化合物と共存させることにより、ＡＴＰを液体中に遊離させて、中間ルシフェラーゼを得る遊離ステップと、遊離したＡＴＰを液体中から除去し、又は中間ルシフェラーゼと液体とを分離して、精製ルシフェラーゼを得る除去／分離ステップとを備える、精製ルシフェラーゼの製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＰが付着している粗ルシフェラーゼを液体中でポリリン酸化合物と共存させることにより、前記ＡＴＰを前記液体中に遊離させて、中間ルシフェラーゼを得る遊離ステップと、
遊離した前記ＡＴＰを前記液体中から除去し、又は前記中間ルシフェラーゼと前記液体とを分離して、精製ルシフェラーゼを得る除去／分離ステップと、
を備えることを特徴とする、精製ルシフェラーゼの製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の精製ルシフェラーゼの製造方法によって得ることができる精製ルシフェラーゼ。
【請求項３】
付着しているＡＴＰの量が１×１０−１4 mol／ｍｇタンパク質未満である精製ルシフェラーゼ。
【請求項４】
ルシフェラーゼ、ルシフェリン及び２価金属イオンからなるＡＴＰ検出試薬であって、
前記ルシフェラーゼが、請求項２又は３に記載の精製ルシフェラーゼであることを特徴とするＡＴＰ検出試薬。
【請求項５】
凍結乾燥された固体の状態で存在していることを特徴とする、請求項４に記載のＡＴＰ検出試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精製ルシフェラーゼの製造方法、精製ルシフェラーゼ、及びＡＴＰ検出試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、飲食料中の微生物（細菌、真菌等）を検出するために、微生物中に存在するアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に基づく発光を利用して検出することが行われている。しかしながら、検体液（検体を含有する液体）中には微生物中のＡＴＰ以外のＡＴＰ（以下、「バックグラウンドＡＴＰ」という。）が混入していることが多く、必ずしも、高い精度で微生物中のＡＴＰを検出することはできなかった。
【０００３】
そのようなバックグラウンドＡＴＰを除去し、微生物中のＡＴＰの検出精度を高める方法として、下記特許文献１及び２では、検体液中にＡＴＰ分解酵素（アデノシンリン酸デアミナーゼ又はルシフェラーゼ）を添加してバックグラウンドＡＴＰを分解するという方法が開示されている。また、下記特許文献３では、半透膜からなるチューブにＡＴＰ分解酵素（アピラーゼ）を封入し、このチューブを検体液中に浸すことにより、バックグラウンドＡＴＰを分解するという方法が開示されている。
【特許文献１】特開平１１−５６３９３号公報
【特許文献２】特開２０００−１８９１９７号公報
【特許文献３】特開２００３−２１０１９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記特許文献１〜３の方法では、微生物中のＡＴＰに関して、検出精度がある程度は向上したものの、十分に高い精度の検出が可能になったわけではなかった。具体的には、検体中に微生物が微量しか存在しない場合は、上記特許文献１〜３の方法を実施したとしても、必ずしも、ＡＴＰを指標として微生物を検出することはできなかった。
【０００５】
本発明者らは、上述の従来の方法でバックグラウンドＡＴＰを除去しても、検出対象のＡＴＰが十分に高い精度で検出されない原因について検討を重ねたところ、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応で用いるルシフェラーゼにはＡＴＰが付着しており、ルシフェラーゼに付着した状態のＡＴＰは従来の方法では除去されないこと、及び、ルシフェラーゼに付着しているＡＴＰは徐々に検体液中に遊離し、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に関与して、その分だけ検出対象のＡＴＰの検出精度を低下させることを見出した。
【０００６】
そこで、本発明は、付着しているＡＴＰが十分に少なく、検出対象のＡＴＰを十分に高い精度で検出することを可能にする精製ルシフェラーゼ、及びそのような精製ルシフェラーゼを含有するＡＴＰ検出試薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は、ＡＴＰが付着している粗ルシフェラーゼを液体中でポリリン酸化合物と共存させることにより、前記ＡＴＰを前記液体中に遊離させて、中間ルシフェラーゼを得る遊離ステップと、遊離した前記ＡＴＰを前記液体中から除去し、又は前記中間ルシフェラーゼと前記液体とを分離して、精製ルシフェラーゼを得る除去／分離ステップと、を備えることを特徴とする、精製ルシフェラーゼの製造方法を提供する。
【０００８】
ここで、「ポリリン酸化合物」とは、少なくとも２つのリン酸が重合した化合物又はその塩を意味する。また、ＡＴＰを「液体中から除去」することには、ＡＴＰを液体中から物理的に除去することだけでなく、液体中でＡＴＰを化学的に他の物質に変換することも含まれる。
【０００９】
上記の精製ルシフェラーゼの製造方法のように、粗ルシフェラーゼを液体中でポリリン酸化合物と共存させると、粗ルシフェラーゼからのＡＴＰの遊離が促進され、付着しているＡＴＰが粗ルシフェラーゼから液体中に迅速に遊離する。従って、上記の精製ルシフェラーゼの製造方法によれば、ＡＴＰが付着している粗ルシフェラーゼから、ＡＴＰを迅速、容易、かつほぼ完全に除去することができる。すなわち、付着しているＡＴＰが十分に少なく、検出対象のＡＴＰを十分に高い精度で検出することを可能にする精製ルシフェラーゼを迅速かつ容易に製造することができる。
【００１０】
本発明はまた、上記の精製ルシフェラーゼの製造方法によって得ることができる精製ルシフェラーゼを提供する。この精製ルシフェラーゼは、具体的には、付着しているＡＴＰの量が、例えば１×１０−１4 mol／ｍｇタンパク質未満である精製ルシフェラーゼである。なお、ここで、精製ルシフェラーゼに「付着しているＡＴＰの量」とは、次のようにして求められたＡＴＰ量をいうものとする。すなわち、まず、１０ｍＭ塩化マグネシウム及び５％トレハロースを含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を溶媒として、所定濃度の精製ルシフェラーゼ溶液を調製し、この溶液を９５℃で１０分間加熱する。次に、精製ルシフェラーゼ溶液１００μＬとルシフェール２５０（キッコーマン社製）１００μＬとを混和し、発光量を ARVO Light（PerkinElmer 社製）で測定する。最後に、発光量と溶液中の精製ルシフェラーゼの濃度とからＡＴＰ量（mol／ｍｇタンパク質）を求める。
【００１１】
このような精製ルシフェラーゼでは、付着しているＡＴＰが十分に少ない。従って、上記精製ルシフェラーゼを、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に基づくＡＴＰの検出に用いれば、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の際に検体液中に遊離するＡＴＰが十分に少なくなり、検出対象のＡＴＰを十分に高い精度で検出することができる。そして、上記精製ルシフェラーゼを、ＡＴＰを指標とする微生物の検出に用いれば、極微量の微生物を検出することができる。
【００１２】
なお、付着しているＡＴＰが液体中に自然に遊離するのを待って、これを除去することによっても、ルシフェラーゼに付着したＡＴＰに起因する検出精度の低下を防ぐことができるが、そのような方法は長時間を要し、実用に適さない。
【００１３】
本発明はまた、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及び２価金属イオンからなるＡＴＰ検出試薬であって、ルシフェラーゼが上記精製ルシフェラーゼであることを特徴とするＡＴＰ検出試薬を提供する。
【００１４】
このようなＡＴＰ検出試薬では、ルシフェラーゼとして、付着しているＡＴＰが十分に少ない精製ルシフェラーゼが用いられている。従って、上記ＡＴＰ検出試薬を用いれば、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の際にルシフェラーゼから検体液中に遊離するＡＴＰが十分に少なく、検出対象のＡＴＰを十分に高い精度で検出することができる。そして、上記ＡＴＰ検出試薬を、ＡＴＰを指標とする微生物の検出に用いれば、極微量の微生物を検出することができる。
【００１５】
上記ＡＴＰ検出試薬は、凍結乾燥された固体の状態で存在していることが好ましい。凍結乾燥された固体の状態で存在していれば、長期に渡って、試薬（特に、タンパク質であるルシフェラーゼ）の本来の活性が維持される。
【００１６】
なお、特開平８−４７３９９号公報には、ポリリン酸化合物をルシフェリン及びルシフェラーゼと共存させることにより、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応における発光強度の増強及び発光時間の延長が可能になることが記載されている。しかしながら、本発明におけるように、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を行う前にルシフェラーゼをポリリン酸化合物で処理することにより、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応によるＡＴＰ検出の精度を顕著に高くすることができることは、本発明者らが初めて見出した知見であり、この知見について、上記公報（特開平８−４７３９９号公報）には記載も示唆もない。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、付着しているＡＴＰが十分に少なく、検出対象のＡＴＰを十分に高い精度で検出することを可能にする精製ルシフェラーゼ、及びそのような精製ルシフェラーゼを含有するＡＴＰ検出試薬が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。
【００１９】
（精製ルシフェラーゼの製造方法）
本発明の精製ルシフェラーゼの製造方法は、ＡＴＰが付着している粗ルシフェラーゼを液体中でポリリン酸化合物と共存させることにより、前記ＡＴＰを前記液体中に遊離させて、中間ルシフェラーゼを得る遊離ステップと、遊離した前記ＡＴＰを前記液体中から除去し、又は前記中間ルシフェラーゼと前記液体とを分離して、精製ルシフェラーゼを得る除去／分離ステップと、を備えるものである。
【００２０】
遊離ステップでは、ＡＴＰが付着している粗ルシフェラーゼを液体中でポリリン酸化合物と共存させることにより、付着しているＡＴＰを粗ルシフェラーゼから液体中に遊離させる。粗ルシフェラーゼを液体中でポリリン酸化合物と共存させると、粗ルシフェラーゼからのＡＴＰの遊離が促進され、付着しているＡＴＰが迅速に遊離する。
【００２１】
ここで、粗ルシフェラーゼを液体中でポリリン酸化合物と共存させる方法としては、粗ルシフェラーゼを含有する液体と、ポリリン酸化合物を含有する液体とを混合すること、粗ルシフェラーゼを含有する液体と、固体状のポリリン酸化合物とを混合すること、固体状の粗ルシフェラーゼと、ポリリン酸化合物を含有する液体とを混合すること、等が挙げられる。
【００２２】
また、粗ルシフェラーゼは、ＡＴＰが付着しているルシフェラーゼであれば、未精製のものであっても、精製されたものであってもよい。また、粗ルシフェラーゼは、ルシフェラーゼ活性を有するものであれば、野生型であっても、変異型であってもよい。
【００２３】
また、ポリリン酸化合物は、少なくとも２つのリン酸が重合した化合物又はその塩であればよいが、入手が容易であることから、ピロリン酸、トリリン酸、ヘキサメタリン酸、又はこれらの塩が好ましい。
【００２４】
また、液体に添加するポリリン酸化合物の量は、粗ルシフェラーゼ１ｍｇ／ｍＬ当たり、好ましくは０．０１〜１００ｍＭである。ポリリン酸化合物の量が、粗ルシフェラーゼ１ｍｇ／ｍＬ当たり、０．０１ｍＭ未満であると、０．０１ｍＭ以上の場合と比較して、粗ルシフェラーゼからのＡＴＰの遊離に要する時間が長くなる傾向がある。他方、１００ｍＭを超えると、１００ｍＭ以下の場合と比較して、精製ルシフェラーゼとポリリン酸化合物との分離が困難となり、精製ルシフェラーゼの活性が低下する傾向がある。
【００２５】
除去／分離ステップでは、遊離ステップで液体中に遊離したＡＴＰを液体中から除去し、又は遊離ステップで得られた中間ルシフェラーゼと液体とを分離する。ＡＴＰを液体中から除去する操作、及び中間ルシフェラーゼと液体とを分離する操作は、いずれか一方のみを単独で、又は両者を組み合わせて行うことができる。
【００２６】
ここで、ＡＴＰを液体中から除去する方法としては、ＡＴＰ分解酵素（アピラーゼ等）により、液体中でＡＴＰを分解すること、液体にルシフェリン及び２価金属イオン（Ｍｇ２＋等）を加えて、ＡＴＰを消費させること、等が挙げられる。また、中間ルシフェラーゼと液体とを分離する方法としては、濾過により、ＡＴＰを含有する液体から中間ルシフェラーゼを物理的に分離すること、等が挙げられる。
【００２７】
上述の遊離ステップ及び除去／分離ステップは連続的に行ってもよい。すなわち、例えば、粗ルシフェラーゼを含有する液体をカラムに流通させて、粗ルシフェラーゼのみをカラムの担体に吸着させた後、ポリリン酸化合物を含有する液体を更にカラムに流通させて、付着しているＡＴＰを粗ルシフェラーゼから遊離させ、遊離したそのＡＴＰをカラムから洗い流すという操作を行ってもよい。
【００２８】
上述のような遊離ステップ及び除去／分離ステップを備える本発明の精製ルシフェラーゼの製造方法によれば、ＡＴＰが付着している粗ルシフェラーゼから、ＡＴＰを迅速、容易、かつほぼ完全に除去することができる。すなわち、付着しているＡＴＰが十分に少なく、検出対象のＡＴＰを十分に高い精度で検出することを可能にする精製ルシフェラーゼを迅速かつ容易に製造することができる。
【００２９】
（精製ルシフェラーゼ）
本発明の精製ルシフェラーゼは、上記の精製ルシフェラーゼの製造方法により得ることができる精製ルシフェラーゼである。具体的には、付着しているＡＴＰの量が、例えば１×１０−１4 mol／ｍｇタンパク質未満である精製ルシフェラーゼである。なお、ここで、精製ルシフェラーゼに「付着しているＡＴＰの量」とは、次のようにして求められたＡＴＰ量をいうものとする。まず、１０ｍＭ塩化マグネシウム及び５％トレハロースを含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を溶媒として、所定濃度の精製ルシフェラーゼ溶液を調製し、この溶液を９５℃で１０分間加熱する。次に、精製ルシフェラーゼ溶液１００μＬとルシフェール２５０（キッコーマン社製）１００μＬとを混和し、発光量を ARVO Light（PerkinElmer 社製）で測定する。最後に、発光量と溶液中の精製ルシフェラーゼの濃度とからＡＴＰ量（mol／ｍｇタンパク質）を求める。
【００３０】
このように、本発明の精製ルシフェラーゼでは、付着しているＡＴＰが十分に少ない。従って、本発明の精製ルシフェラーゼを、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に基づくＡＴＰの検出に用いれば、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の際に検体液中に遊離するＡＴＰが十分に少なくなり、検出対象のＡＴＰを十分に高い精度で検出することができる。そして、ＡＴＰを指標とする微生物の検出に用いれば、極微量の微生物（例えば、１個の細菌）を検出することができる。
【００３１】
本発明の精製ルシフェラーゼは、液体外に存在していても、液体中に存在していてもよいが、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に供する前は、凍結乾燥された固体の状態で液体外に存在していることが好ましい。凍結乾燥された固体の状態で存在していれば、長期（例えば、半年以上）に渡って、その本来の活性が維持される。
【００３２】
（ＡＴＰ検出試薬）
本発明のＡＴＰ検出試薬は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及び２価金属イオンからなるＡＴＰ検出試薬であって、ルシフェラーゼが上記精製ルシフェラーゼであることを特徴とするものである。
【００３３】
ＡＴＰは、酸素存在下でルシフェラーゼ、ルシフェリン及び２価金属イオンと反応して、ルシフェリンによる発光を生じさせる。従って、本発明のＡＴＰ検出試薬は、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に基づくＡＴＰの検出、及びＡＴＰを指標とする微生物等の検出に利用することができる。
【００３４】
また、上述のように、本発明のＡＴＰ検出試薬では、ルシフェラーゼとして、付着しているＡＴＰが十分に少ない精製ルシフェラーゼが用いられている。従って、本発明のＡＴＰ検出試薬を用いれば、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の際に検体液中に遊離するＡＴＰが十分に少なくなり、検出対象のＡＴＰを十分に高い精度で検出することができる。そして、本発明のＡＴＰ検出試薬を、ＡＴＰを指標とする微生物の検出に用いれば、極微量の微生物（例えば、１個の細菌）を検出することができる。
【００３５】
本発明のＡＴＰ検出試薬において、ルシフェラーゼ及びルシフェリンとしては、例えば、ホタルルシフェリン及びホタルルシフェラーゼ、すなわちホタル（ゲンジボタル、ヘイケボタル、アメリカホタル等）に由来するルシフェリン及びルシフェラーゼが挙げられる。
【００３６】
また、２価金属イオンとしては、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋等が挙げられるが、高いルシフェラーゼ活性が得られることや、比較的安価であることから、Ｍｇ２＋が好ましい。なお、２価金属イオンは、液体中でイオンとして解離するならば、液体外では陰イオン（Ｃｌ−等）と結合した状態で存在していてもよい。
【００３７】
本発明のＡＴＰ検出試薬は、液体外に存在していても、液体中に存在していてもよいが、ＡＴＰ検出のために使用する前は、凍結乾燥された固体の状態で液体外に存在していることが好ましい。凍結乾燥された固体の状態で存在していれば、長期（例えば、半年以上）に渡って、試薬（特に、タンパク質であるルシフェラーゼ）の本来の活性が維持される。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例、比較例及び参考例に基づいて本発明をより具体的に説明する。但し、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００３９】
〔実施例１〕
野生型北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２３位のイソロイシンがロイシンに置換され、かつ５３０位のロイシンがアルギニンに置換されているアミノ酸配列からなる変異型ホタルルシフェラーゼを用いて、精製ルシフェラーゼを製造した。なお、用いた変異型ホタルルシフェラーゼは、野生型北米ホタルルシフェラーゼと比較して、発光強度が増大されたものである。
【００４０】
（粗ルシフェラーゼの調製）
粗ルシフェラーゼの調製（変異型ホタルルシフェラーゼの作製）を次のように行った。
【００４１】
まず、野生型北米ホタル（Photinus pyralis）ルシフェラーゼ遺伝子（ＤＮＡ）（塩基配列は配列番号１に示すとおりである。）を含むプラスミド（pGL2-Basic Vector、Promega 社製）を鋳型とし、プライマーとして、制限酵素 NcoI 認識配列が付加された塩基配列：5'-gactccatggaagacgccaaaaac-3'（配列番号２）からなるＤＮＡ、及び制限酵素 XhoI 認識配列が付加された塩基配列：5'-gacactcgagcaatttggactttccgcc-3'（配列番号３）からなるＤＮＡを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液としては、Diversify PCR Random Mutagenesis Kit（Clontech 社製）添付の TITANIUM Taq ＤＮＡ ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ Mix 及び TITANIUM Taq バッファーに、各プライマーＤＮＡを０．２μＭ、鋳型ＤＮＡを５０ｎｇ／５０μＬとなるように加えて調製した溶液を用いた。GeneAmp PCR System 2700（Applied Biosystems 社製）を用いて、「９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１２０秒」のサイクルを２５回繰り返して反応を行い、野生型北米ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を得た。塩基配列は、DTCS Quick Start Master Mix キット及び泳動解析装置 CEQ8000（いずれも Beckman Coulter 社製）を用いて決定した。上記の二つの制限酵素認識配列が付加されている上記ＤＮＡ断片を NcoI 及び XhoI（いずれも New England Biolabs 社製）で切断し、これを、予め NcoI 及び XhoI で切断したプラスミド（pET-28a(+) plasmid DNA、Novagen 社製）に、DNA Ligation Kit（BioDynamics Laboratory 社製）を用いて組み込んだ。なお、pET-28a(+)は、Ｔ７プロモーター及びＴ７ターミネーターを含有している。また、発現する目的タンパク質のＣ末端側にヒスチジンタグが付加されるように、クローニング部位の近傍に、ヒスチジン（His）タグをコードする遺伝子を含有している。また、pET-28a(+)はカナマイシン耐性を有する。
【００４２】
次に、得られた組換えプラスミドを鋳型として、Transformer 部位特異的突然変異誘発キット（Clontech 社製）を用いて部位特異的変異導入を行った。選択プライマーとしては、pET-28a(+)中の制限酵素 FspI 認識配列と一塩基異なる配列を含む塩基配列：5'-cacgatcatgagcacccgtgg-3'（配列番号４）からなるＤＮＡを用いた。また、変異誘発プライマーとしては、塩基配列：5'-ccggaaaacgcgacgcaag-3'（配列番号５）からなるＤＮＡを用いた。いずれのプライマーも、予めＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（TOYOBO 社）で５’末端をリン酸化した。Transformer 部位特異的突然変異誘発キット添付のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて、組換えプラスミドを合成した。FspI で切断処理した後、FspI で切断されなかった組換えプラスミドを大腸菌のミスマッチ修復欠損株 BMH71-18mutS に導入し、大腸菌を培養した。得られた組換えプラスミドを更に FspI で切断処理し、FspI で切断されなかった組換えプラスミドを、変異が導入された組換えプラスミド（５３０位のロイシンがアルギニンに置換された変異型北米ホタルルシフェラーゼの遺伝子を含有する組換えプラスミド）として選択した。
【００４３】
次に、選択した組換えプラスミドを、制限酵素 NcoI 及び XhoI（いずれも New England Biolabs 社製）で切断し、アガロースゲル電気泳動により分離後、５３０位のロイシンがアルギニンに置換された変異型北米ホタルルシフェラーゼの遺伝子を含有するＤＮＡ断片のみを回収した。NcoI 認識配列及び XhoI 認識配列が付加されている上記ＤＮＡ断片を、予め NcoI 及び XhoI で切断したプラスミド（pET-28a(+) plasmid DNA、Novagen 社製）に、DNA Ligation Kit（BioDynamics Laboratory 社製）を用いて組み込んだ。このようにして得られた組換えプラスミドを部位特異的変異導入における鋳型として用い、変異誘発プライマーとして、塩基配列：5'-ggctacattctggagacttagcttactgggacg-3'（配列番号６）からなるＤＮＡを用いたこと以外は、上述したのと同様にして、更に部位特異的変異導入を行った。
【００４４】
変異が導入された組換えプラスミド中の変異型北米ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ＤＮＡ）の塩基配列は、DTCS Quick Start Master Mix キット及び泳動解析装置 CEQ8000（いずれも Beckman Coulter社製）を用いて決定した。塩基配列は、配列番号７に示すとおりであった。これにより、組換えプラスミド中の変異型北米ホタルルシフェラーゼ遺伝子が、４２３位のイソロイシンがロイシンに置換され、かつ５３０位のロイシンがアルギニンに置換されている変異型北米ホタルルシフェラーゼをコードしていることが確認された。
【００４５】
次に、変異型北米ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有する組換えプラスミドを、塩化カルシウム法により、ゲノムＤＮＡ中にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子が組み込まれている大腸菌（HMS174(DE3)、Novagen 社製）に導入し、この大腸菌を、カナマイシン３０μｇ／ｍＬを含有する選択寒天培地上で平板培養し、形質転換大腸菌を選択した。
【００４６】
次に、選択した形質転換大腸菌を、振盪培養機（高崎科学器械社製）を用いて、３７℃の下、２×ＹＴ培地（カナマイシン３０μｇ／ｍＬを含有する。）２００ｍＬ中で２．５時間振盪培養した後、培地中のイソプロピルβ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）濃度が０．１ｍＭになるように１００ｍＭ ＩＰＴＧを２００μＬ加え、２５℃で６時間発現誘導を行った。なお、ＩＰＴＧは、lac リプレッサーによる発現抑制を解除し、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを誘導する発現誘導物質である。
【００４７】
最後に、培養液１９０ｍＬを８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することにより大腸菌の菌体２．２１ｇを回収し、これを、ピロリン酸５０ｍＭ及び塩化ナトリウム５００ｍＭが２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した溶液２０ｍＬに懸濁した後、菌体を超音波破砕した（２分間×４回）。そして、菌体破砕液を４℃の下、９０００ｒｐｍで遠心分離して（３０分間×２回）、変異型北米ホタルルシフェラーゼを含有する上清を得た。更に、得られた上清をフィルターで２回濾過して（フィルター孔径：１回目：０．４５μｍ；２回目：０．２２μｍ）、上清中の不溶性の菌体破砕残渣を除去した。こうして粗ルシフェラーゼ溶液を得た。
【００４８】
（精製ルシフェラーゼの製造）
調製した粗ルシフェラーゼから精製ルシフェラーゼを次のように製造した。
【００４９】
まず、得られた粗ルシフェラーゼ溶液をカラム（1mL His Trap、Amersham Biosciences 社製）にチャージした後、カラムを高速液体クロマトグラフィー装置（AKTA、Amersham Biosciences 社製）に接続した。そして、ピロリン酸５０ｍＭ及び塩化ナトリウム５００ｍＭが２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した溶液１０ｍＬでカラムを洗浄した。なお、作製した変異型北米ホタルルシフェラーゼは、Ｃ末端側にヒスチジン（His）タグが付加されていることから、上記カラムの担体に吸着する。
【００５０】
そして、イミダゾール２０ｍＭ及び塩化ナトリウム５００ｍＭが２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した溶液でカラムを平衡化した後、その溶液をカラムに流通させながら、１２分で溶液中のイミダゾール濃度を５００ｍＭまで上げ、更にその溶液（イミダゾール濃度：５００ｍＭ）をカラムに流通させて、変異型北米ホタルルシフェラーゼを溶出させた。更に、得られた変異型北米ホタルルシフェラーゼ溶液（変異型北米ホタルルシフェラーゼを含有する画分）６ｍＬを脱塩カラム（PC-10、Amersham Biosciences 社製）にチャージした後、塩化マグネシウム１０ｍＭ及びトレハロース５％が５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した溶液を脱塩カラムに流通させて、変異型北米ホタルルシフェラーゼ溶液の溶媒を置換した。こうして精製ルシフェラーゼ溶液（１１．５ｍｇ／ｍＬ変異型北米ホタルルシフェラーゼ溶液１０．５ｍＬ）を得た。
【００５１】
（付着ＡＴＰの定量）
製造した精製ルシフェラーゼに付着しているＡＴＰを次のように定量した。
【００５２】
得られた精製ルシフェラーゼ溶液を９５℃で１０分間加熱した後、溶液１００μＬとルシフェール２５０（キッコーマン社製）１００μＬとを混和し、発光量を ARVO Light（PerkinElmer 社製）で測定した。そして、発光量と溶液中の変異型北米ホタルルシフェラーゼの濃度とから精製ルシフェラーゼ（変異型北米ホタルルシフェラーゼ）１ｍｇ当たりのＡＴＰ量を求めた。
【００５３】
〔比較例１〕
精製ルシフェラーゼの製造において、カラム（1mL His Trap）の洗浄を、塩化ナトリウム５００ｍＭが２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した溶液（ピロリン酸を含有しない。）１０ｍＬで行ったこと以外は、実施例１と同様にして、粗ルシフェラーゼの調製、精製ルシフェラーゼの製造、及び付着ＡＴＰの定量を行った。
【００５４】
実施例１及び比較例１の結果を表１及び図１に示す。図１は、実施例１及び比較例１において測定された、精製ルシフェラーゼ１ｍｇ当たりのＡＴＰ量を示す棒グラフである。表１及び図１に示されるように、付着しているＡＴＰの量は、実施例１の精製ルシフェラーゼの方が、比較例１の精製ルシフェラーゼよりもはるかに少なかった。また、実施例１の精製ルシフェラーゼでは、付着しているＡＴＰの量が１×１０−１4 mol／ｍｇタンパク質未満であり、十分に少なかった。
【００５５】
【表１】
2007159449.tif 000002
【００５６】
実施例１及び比較例１により、本発明の精製ルシフェラーゼの製造方法を用いれば、付着しているＡＴＰが十分に少なく、検出対象のＡＴＰを十分に高い精度で検出することを可能にする精製ルシフェラーゼを迅速かつ容易に製造することができることが示された。
【００５７】
〔実施例２〕
（ＡＴＰ検出試薬の調製）
実施例１と同様の方法で得た精製ルシフェラーゼ溶液（変異型北米ホタルルシフェラーゼ溶液）を用いて、精製ルシフェラーゼ０．２５ｍｇ／ｍＬ、ルシフェリン（和光純薬工業社製）１．５ｍＭ及び塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）１０ｍＭ及びトレハロース５％が５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解したＡＴＰ検出試薬溶液（ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びＭｇ２＋からなるＡＴＰ検出試薬の溶液）を調製した。
【００５８】
（ＡＴＰの検出）
検体液として、５種のＡＴＰ水溶液（ＡＴＰ濃度：２．０×１０−１０Ｍ，２．０×１０−１１Ｍ，２．０×１０−１２Ｍ，２．０×１０−１３Ｍ，２．０×１０−１４Ｍ）を調製した後、各検体液（ＡＴＰ水溶液）１００μＬと上記ＡＴＰ検出試薬溶液１００μＬとを混和し（混和後のＡＴＰ濃度：１．０×１０−１０Ｍ，１．０×１０−１１Ｍ，１．０×１０−１２Ｍ，１．０×１０−１３Ｍ，１．０×１０−１４Ｍ）、発光量をルミテスター C-1000（キッコーマン社製）で測定した。
【００５９】
〔比較例２〕
ＡＴＰ検出試薬の調製に、比較例１と同様の方法で得た精製ルシフェラーゼ溶液（変異型北米ホタルルシフェラーゼ溶液）を用いたこと以外は実施例２と同様にして、ＡＴＰ検出試薬の調製、及びＡＴＰの検出を行った。
【００６０】
実施例２及び比較例２の結果を図２に示す。図２は、実施例２及び比較例２において得られた、検体液中のＡＴＰ濃度（検出対象のＡＴＰの濃度）と発光量との関係を示すグラフである。図２に示されるように、高いＡＴＰ濃度（１．０×１０−１０Ｍ，１．０×１０−１１Ｍ，１．０×１０−１２Ｍ）の範囲においては、実施例２及び比較例２のいずれでも、ＡＴＰ濃度と発光量との間に強い相関関係が認められた。しかし、低いＡＴＰ濃度（１．０×１０−１３Ｍ，１．０×１０−１４Ｍ）の範囲においては、実施例２では、ＡＴＰ濃度と発光量との間に強い相関関係が認められたのに対して、比較例２では、ＡＴＰ濃度と発光量との間に強い相関関係が認められなかった。これは、次の理由によるものと推察される。すなわち、実施例２では、精製ルシフェラーゼに付着していたＡＴＰが極めて少ないので、検体液中の検出対象のＡＴＰが微量であっても、精製ルシフェラーゼに付着していたＡＴＰに起因する発光量が、検出対象のＡＴＰに起因する発光量に対して、無視しうる程度に小さい。これに対して、比較例２では、精製ルシフェラーゼに付着していたＡＴＰが多いので、検体液中の検出対象のＡＴＰが微量の場合、精製ルシフェラーゼに付着していたＡＴＰに起因する発光量が、検出対象のＡＴＰに起因する発光量に対して、無視しえない程度に大きくなる。
【００６１】
実施例２及び比較例２により、本発明の精製ルシフェラーゼ又はＡＴＰ検出試薬を用いれば、検出対象のＡＴＰを十分に高い精度で検出することができることが示された。
【００６２】
〔参考例１〕
まず、実施例１と同様にして、粗ルシフェラーゼの調製（変異型ホタルルシフェラーゼの作製）を行い、粗ルシフェラーゼ溶液を得た。そして、得られた粗ルシフェラーゼ溶液を用いて、粗ルシフェラーゼ０．２５ｍｇ／ｍＬ、ルシフェリン（和光純薬工業社製）１．５ｍＭ、トレハロース５％及び塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）１０ｍＭが５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した発光試薬溶液を２ｍＬ調製した。調製後直ちに、発光試薬溶液１００μＬを９６穴マイクロプレートの各ウェルに入れ、発光量を ARVO Light（PerkinElmer 社製）で経時的に測定した。測定開始後１５０分の時点で、上記発光試薬溶液１００μＬに１０ｍＭピロリン酸ナトリウム水溶液１μＬを添加し、引き続き発光量を測定した。
【００６３】
図３は、参考例１において測定された発光量の時間変化を示すグラフである。図３に示されるように、１０ｍＭピロリン酸ナトリウム水溶液の添加により発光量が顕著に増大した。上記ピロリン酸ナトリウム水溶液にはＡＴＰが含有されていないことから、発光量の増大は、上記発光試薬溶液中に存在していたＡＴＰ、すなわち粗ルシフェラーゼに付着していたＡＴＰに起因するものと推察される。
【００６４】
参考例１により、粗ルシフェラーゼに多量のＡＴＰが付着していること、及び、粗ルシフェラーゼを液体中でポリリン酸化合物と共存させると、粗ルシフェラーゼからのＡＴＰの遊離が促進され、付着しているＡＴＰが迅速に遊離することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明の精製ルシフェラーゼの製造方法、精製ルシフェラーゼ、及びＡＴＰ検出試薬は、ＡＴＰを指標とする飲食料中の微生物（細菌、真菌等）の検出に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】実施例１及び比較例１において測定された、精製ルシフェラーゼ１ｍｇ当たりのＡＴＰ量を示す棒グラフである。
【図２】実施例２及び比較例２において得られた、検体液中のＡＴＰ濃度と発光量との関係を示すグラフである。
【図３】参考例１において測定された発光量の時間変化を示すグラフである。
【図１】
2007159449.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【配列表】
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