(57)【要約】【課題】簡単な操作で且つ確実・大量に、目的とする細胞に形質転換又は形質導入等のために用意された遺伝子を導入する。【解決手段】標的とする細胞内に遺伝子を導入する遺伝子導入装置であって、電源１１２のカソードに接続された第１電極１４２と、第１電極１４２の前面に配置され、緩衝液が保持される第１緩衝液保持部１４３と、第１緩衝液保持部１４３の更に前面に配置される第１カチオン交換膜１４４と、第１カチオン交換膜１４４の更に前面に配置され、遺伝子が保持される遺伝子保持部１４５と、遺伝子保持部１４５の更に前面に配置される第１アニオン交換膜１４６とを少なくとも有して遺伝子導入装置を構成する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的とする細胞内に遺伝子を導入する遺伝子導入装置であって、
電源のカソードに接続された第１電極と、
該第１電極の前面に配置され、緩衝液が保持される第１緩衝液保持部と、
該第１緩衝液保持部の更に前面に配置される第１カチオン交換膜と、
該第１カチオン交換膜の更に前面に配置され、遺伝子が保持される遺伝子保持部と、
該遺伝子保持部の更に前面に配置される第１アニオン交換膜と、
を少なくとも有してなる遺伝子導入装置。
【請求項２】
請求項1において、更に、
前記第１アニオン交換膜の前面側表面に、ニードルが配置されている
ことを特徴とする遺伝子導入装置。
【請求項３】
請求項１又は２において、更に、
電源のアノードに接続された第２電極と、
該第２電極の前面に配置され、緩衝液が保持される第２緩衝液保持部と、
該第２緩衝液保持部の更に前面に配置される第２アニオン交換膜と、
該第２アニオン交換膜の更に前面に配置され、電解液が保持される電解液保持部と、
該電解液保持部の更に前面に配置される第２カチオン交換膜と、
を少なくとも有してなる遺伝子導入装置。
【請求項４】
請求項３において、更に、
前記第２カチオン交換膜の前面側表面に、ニードルが配置されている
ことを特徴とする遺伝子導入装置。
【請求項５】
請求項３又は４において、
前記電解液保持部に保持される電解液のカチオンは、標的細胞内に存在する代謝経路によって代謝され得る物質である
ことを特徴とする遺伝子導入装置。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかにおいて、更に、
前記第１アニオン交換膜と標的細胞の接触状態を観察可能な顕微鏡が備わっている
ことを特徴とする遺伝子導入装置。
【請求項７】
請求項６において、更に、
前記顕微鏡の観察画像を映し出すことが可能なモニタ装置が備わっている
ことを特徴とする遺伝子導入装置。
【請求項８】
標的とする細胞内に遺伝子を導入する遺伝子導入装置であって、
電源のアノードに接続された第１電極と、
該第１電極の前面に配置され、緩衝液が保持される第１緩衝液保持部と、
該第１緩衝液保持部の更に前面に配置される第１アニオン交換膜と、
該第１アニオン交換膜の更に前面に配置され、遺伝子が保持される遺伝子保持部と、
該遺伝子保持部の更に前面に配置される第１カチオン交換膜と、
を少なくとも有してなる遺伝子導入装置。
【請求項９】
標的とする細胞内に遺伝子を導入する遺伝子導入方法であって、
標的とする細胞の細胞膜に直接接触させたイオン交換膜を介して遺伝子を導入する
ことを特徴とする遺伝子導入方法。
【請求項１０】
標的とする細胞内に遺伝子を導入する遺伝子導入方法であって、
標的とする細胞の細胞壁に直接接触させたイオン交換膜を介して遺伝子を導入する
ことを特徴とする遺伝子導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入装置、更に詳しくは生物体の形質転換又は生物体への形質導入を目的とした遺伝子導入装置及び遺伝子導入方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、生物体へ新たな形質を導入するための形質導入又は生物体が本来有する形質を転換するための形質転換を目的として、外来遺伝子を細胞内に導入するための様々な遺伝子導入装置や遺伝子導入方法が知られている。
【０００３】
例えば、リン酸カルシウムを用いる方法（以下、単に「リン酸カルシウム法」という場合がある。）が知られている。この方法は、正の電荷を持つカルシウムイオンを負の電荷を持つ遺伝子に結合させ、そこにリン酸を加えることによって、カルシウムイオンとリン酸が結合して複合体の沈殿を生じさせる。このリン酸カルシウムと遺伝子の複合体が、細胞が本来有する機能であるエンドサイトーシスによって細胞内に取込まれることにより、外来遺伝子を細胞内へ導入する方法である。
【０００４】
又、陽性荷電脂質等からなる脂質二重膜小胞（リポソーム）と、導入しようとする遺伝子との電気的な相互作用により、複合体を形成させ、細胞の貧食作用や膜融合によって細胞に取込ませる方法（以下、単に「リポフェクション法」という場合がある。）もある。
【０００５】
又、高電圧のパルスを細胞に印加することにより、一時的に脂質二重層の細胞膜構造を不安定化させ、外来遺伝子を取込ませる方法（以下、単に「エレクトロポレーション法」という場合がある。）もある。
【０００６】
又、個々の細胞に、非常に微細なガラス注入針を使用して直接的に外来遺伝子を導入する方法（以下、単に「マイクロインジェクション法」という場合がある。）も知られている。
【０００７】
又、導入しようとする遺伝子を、弱毒化したウィルスに取込ませ、そのウィルスを標的細胞に感染させることによって目的とする遺伝子を標的細胞へと導入する方法（以下、単に「ウィルスベクター法」という場合がある。）もある。
【０００８】
更には、特許文献１に記載されるような装置も知られている。この特許文献１に記載される装置を図６に示す。
【０００９】
特許文献１に記載される遺伝子導入装置は、ピペット先端３４の内部に、導入しようとするプラスミド（遺伝子）を溶かし込んだＤＮＡ溶液を含んでおり、この溶液に電極３６によってマイナスの電気を印加している。遺伝子であるＤＮＡ（図６においては「プラスミド」がこの遺伝子に相当する。）は、自身が有するリン酸基によって遺伝子全体としてマイナスの電荷にチャージしている。このため、電極３６からマイナスの電荷が印加されることによって、細胞内あるいは核内側、即ちアノード側へと遺伝子を移動させて、導入しようとするものである。
【００１０】
【特許文献１】特開２００４−３２１１３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、前述したリン酸カルシウム法においては、特殊な装置や技術を必要とせずに比較的簡単に行なえるというメリットはあるものの、細胞がリン酸カルシウムと遺伝子の複合体をエンドサイトーシスによって取込むことを受動的に待っているものであり、必ずしも遺伝子の導入効率が高いとは言えない。
【００１２】
又、リポフェクション法においては、トランスフェクション効率が高く、オリゴヌクレオチドや高分子ＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ等、種々の遺伝子の導入が可能であり、操作が簡単且つ短時間で終了するため同時に多数のサンプル処理が可能であって、しかも、特別な装置や設備が不要というメリットがある。しかし、トランスフェクションの至適条件（細胞密度、遺伝子量、リポソーム量、培養時間、培地等）が非常に狭く、更に使用する試薬が非常に高価であるというデメリットがある。
【００１３】
又、エレクトロポレーション法によれば、簡単な操作で且つ高い確率で遺伝子を導入することが可能であるものの、装置自体が高価であり、特に、細胞の種類や導入しようとする遺伝子の種類毎に最適な電圧や電気パルスの長さ、温度、細胞及び遺伝子濃度、バッファー組成の条件等が異なるため、それらの条件を最適にするのが困難である。
【００１４】
又、マイクロインジェクション法によれば、希望する特定の細胞にのみ非常に高い確率で遺伝子を導入でき、更には、核と細胞質へ別々に遺伝子を導入したり、導入できる遺伝子の大きさが特に制限されない等のメリットがある。しかし、この方法によって遺伝子を導入するには特別な装置や技術が必要である。特に、非常に小さな細胞の１つ１つに微細なガラス管を差し込んで遺伝子を導入するのであるから、非常に高度な技術が必要であると共に、熟練者であっても導入できる細胞数に限りがある。
【００１５】
又、ウィルスベクター法は、導入できる遺伝子の大きさに制限がある他、いくら弱毒化したとしても、病原体であるウィルスを感染させることに変わりはなく、多少なりとも標的細胞に不具合が発生することも懸念される。
【００１６】
又、特許文献１記載の遺伝子導入装置においては、電圧を印加することによってマイナスに荷電している遺伝子を細胞内へと取込ませるという発想は優れているものの、細胞内に存在する細胞質、即ち、各種のイオンが存在して形成されている細胞内液の存在を見落としている欠点がある。
【００１７】
遺伝子の分画方法としてよく利用される電気泳動の例を考えれば容易に想像できるが、一般的に、電圧の印加による物質（イオン）の移動量は、分子量に反比例する。
【００１８】
例えば、前述した細胞内液には分子量の小さなカチオンとしてナトリウムイオンや、カリウムイオンが大量に存在している。この条件のもとで電極（カソード）からの電圧が印加されれば、分子量の大きな遺伝子よりも、分子量の小さなナトリウムイオンやカリウムイオンが対向して優先的に移動してしまい、せっかく印加した電気の力を効率良く目的とする遺伝子だけの移動に働かせることができていない。更に、アノード側では、細胞内に存在するアニオンである、例えば塩素イオンが電気分解されて塩素ガスとなって発生する可能性もある。
【００１９】
本発明は、前述した遺伝子導入装置及び遺伝子導入方法に加えて新たな遺伝子導入装置及び遺伝子導入方法を提供するものであって、簡単な操作で且つ確実・大量に、目的とする細胞に形質転換又は形質導入等のために用意された遺伝子を導入することをその課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
以下の実施形態で詳細に説明するように、標的とする細胞内に遺伝子を導入する遺伝子導入装置であって、電源のカソードに接続された第１電極と、該第１電極の前面に配置され、緩衝液が保持される第１緩衝液保持部と、該第１緩衝液保持部の更に前面に配置される第１カチオン交換膜と、該第１カチオン交換膜の更に前面に配置され、遺伝子が保持される遺伝子保持部と、該遺伝子保持部の更に前面に配置される第１アニオン交換膜とを少なくとも有して遺伝子導入装置を構成することにより、上記課題を解決するものである。
【００２１】
これにより、導入を目的とする遺伝子のみを確実に細胞内へと導入でき、又、細胞内からのカウンターイオン（カチオン）の放出によって、遺伝子の導入効率が低下することもない。
【００２２】
又、前記第１アニオン交換膜の前面側表面に、ニードルを配置してもよい。
【００２３】
これにより、細胞膜の外周に細胞壁を有するような植物細胞であっても、非常に効率良く遺伝子を導入することが可能となる。
【００２４】
又、電源のアノードに接続された第２電極と、該第２電極の前面に配置され、緩衝液が保持される第２緩衝液保持部と、該第２緩衝液保持部の更に前面に配置される第２アニオン交換膜と、該第２アニオン交換膜の更に前面に配置され、電解液が保持される電解液保持部と、該電解液保持部の更に前面に配置される第２カチオン交換膜とを少なくとも有して遺伝子導入装置を構成してもよい。
【００２５】
これにより、遺伝子を導入しようとする側の電極の対極の電極側へとアニオンが移動して、例えば、塩素ガス等の気体が発生することを防止できる。
【００２６】
又、更に、前記第２カチオン交換膜の前面側表面に、ニードルを配置してもよい。
【００２７】
これにより、細胞膜の外周に細胞壁を有するような植物細胞であっても、非常に効率良く遺伝子を導入することが可能となる。
【００２８】
又、電解液保持部に保持される電解液のカチオンを、標的細胞内に存在する代謝経路によって代謝され得る物質で構成してもよい。
【００２９】
これにより、細胞自身が本来的に有する恒常性（ホメオスタシス）により、遺伝子と共に導入されるカチオンが最適な条件に処理され、細胞に与える影響を抑えることが可能となる。
【００３０】
又、前記第１アニオン交換膜と標的細胞の接触状態を観察可能な顕微鏡を備えて構成してもよい。
【００３１】
これにより、遺伝子が通過する前記第１アニオン交換膜と標的細胞との接触状態を確認しつつ操作が行なえるため、より効率的な遺伝子の導入が可能となる。
【００３２】
又、前記顕微鏡の観察画像を映し出すことが可能なモニタ装置を備えて構成してもよい。
【００３３】
これにより、わざわざ顕微鏡をのぞきながらの操作から解放されるため、操作が容易に行なうことができるというメリットがある。
【００３４】
又、以下の実施形態で説明するように、標的とする細胞内に遺伝子を導入する遺伝子導入装置であって、電源のアノードに接続された第１電極と、該第１電極の前面に配置され、緩衝液が保持される第１緩衝液保持部と、該第１緩衝液保持部の更に前面に配置される第１アニオン交換膜と、該第１アニオン交換膜の更に前面に配置され、遺伝子が保持される遺伝子保持部と、該遺伝子保持部の更に前面に配置される第１カチオン交換膜とを少なくとも有して遺伝子導入装置を構成してもよい。
【００３５】
これにより、例えば、本来マイナスの電荷にチャージしている遺伝子を、例えば化学的な修飾を施すことによって、全体としてプラスの電荷にチャージするように構成した場合でも、遺伝子導入が可能となる。これは、遺伝子自体を修飾してもよいし、遺伝子を例えば脂質等の微小なカプセルに取り込んで、このカプセル自体を修飾してもよい。
【００３６】
又、以下の実施形態で詳細に説明するように、標的とする細胞内に遺伝子を導入する遺伝子導入方法であって、標的とする細胞の細胞膜に直接接触させたイオン交換膜を介して遺伝子を導入するものである。
【００３７】
これにより、導入しようとする遺伝子よりも分子量の小さなカチオンが細胞内から対向して移動してくることによる遺伝子導入効率の低下を防止することができる。
【００３８】
又、以下の実施形態で詳細に説明するように、標的とする細胞内に遺伝子を導入する遺伝子導入方法であって、標的とする細胞の細胞壁に直接接触させたイオン交換膜を介して遺伝子を導入するものである。
【００３９】
これにより、導入しようとする遺伝子よりも分子量の小さなカチオンが細胞内から対向して移動してくることによる遺伝子導入効率の低下を防止することができる。又、わざわざ細胞壁取り除く処理をせずに遺伝子を導入できる。
【発明の効果】
【００４０】
簡単な操作で且つ確実・大量に、目的とする細胞に形質転換又は形質導入等のために用意された遺伝子を導入することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
以下、添付図面を用いて本発明の実施形態の一例を詳細に説明する。
【００４２】
図１は、本発明に係る遺伝子導入装置１００を概念的に示した概念構成図である。
【００４３】
遺伝子導入装置１００は、遺伝子を導入しようとする標的細胞の置き皿となる下部プレート（非作用側電極構造体）１２０と、この下部プレートを支持する下部支持体１０４とを備えている。又、下部プレート１２０の上側には、導入しようとする遺伝子が封入される上部プレート（作用側電極構造体）１４０と、この上部プレートを支持する上部支持体１０６が対向して配置されている。上部支持体１０６には、上部プレート１４０の高さを調整可能な高さ調整機構１０８が備わっている。図１においては、この高さ調整機構１０８は必ずしも詳細に図示していないが、上部プレート１４０の高さ（下部プレート１２０との距離）をマイクロメートルの単位で確実に調整することが可能な機構となっている。この調整機構の調整は、例えばコントローラ１５２によって調整される。
【００４４】
又、下部プレート１２０と上部プレート１４０の接触面付近には、両プレートの接触状態（正確には上部プレート１４０と標的細胞との接触状態）を観察可能な顕微鏡１０２が配置されている。この顕微鏡に関しても、例えばコントローラ１５２によって操作され、撮影された画像は、モニタ１５０に映し出すことが可能となっている。
【００４５】
又、電源１１２は、遺伝子を導入するために印加される電圧を発生可能な電源であって、そのカソードが上部プレート側１４０側へと接続され、アノードが下部プレート１２０側へと接続されている。
【００４６】
なお、遺伝子導入装置１００の高さ調整機構１０８や顕微鏡１０２、コントローラ１５２、モニタ１５０等を駆動させるための電源は別途設けられている。
【００４７】
又、前述した下部プレート１２０及び上部プレート１４０は、それぞれ取り外し可能に設計されている。
【００４８】
次に、下部プレート１２０と、上部プレート１４０についてその構成をより詳細に説明する。
【００４９】
図２は、下部プレート１２０と上部プレート１４０とが標的細胞１６０を介して接触している状態の断面図である。
【００５０】
まず、上部プレート１４０側から説明する。
【００５１】
上部プレート１４０は、プレートの容器として機能している上部プレートケース１４１の内部に、電源のカソードと接続された第１電極１４２が備わっている。更に、第１電極１４２の前面に、緩衝液が保持される第１緩衝液保持部１４３が配置されている。更に、第１緩衝液保持部１４３の前面に第１カチオン交換膜１４４が配置されている。更に、第１カチオン交換膜１４４の前面に、遺伝子が保持される遺伝子保持部１４５が備わっている。更にこの遺伝子保持部１４５の前面に第１アニオン交換膜１４６が配置されている。この第１アニオン交換膜１４６は、直接標的細胞１６０の細胞膜又は細胞壁と接触可能とされている。
【００５２】
次に、下部プレート１２０の構成について詳細に説明する。
【００５３】
下部プレート１２０は、下部プレートの容器として機能する下部プレートケース１２１と、その下部プレートケース１２１の内部に、電源のアノードと接続された第２電極１２２が備わっている。更に、第２電極１２２の前面に、緩衝液が保持される第２緩衝液保持部１２３が配置されている。更にこの第２緩衝液保持部１２３の前面に第２アニオン交換膜１２４が配置されている。更にこの第２アニオン交換膜１２４の前面に、電解液が保持される電解液保持部１２５が配置されている。更に、この電解液保持部１２５の前面に第２カチオン交換膜１２６が配置されている。この第２カチオン交換膜１２６は、標的細胞１６０の細胞膜又は細胞壁と直接接触することが可能な構成とされている。
【００５４】
なお、ここでいう「前面」とは、遺伝子を導入しようとする標的細胞に近い側のことを意味している。
【００５５】
下部プレートケース１２１及び上部プレートケース１４１は、各緩衝液保持部１２３、１４３及び電解液保持部１２５及び遺伝子保持部１４５等に含まれることのある液体が漏れ出ずに、更にこれらの各液と反応しない（不活性な）材料で構成されている。
【００５６】
第１電極１４２及び第２電極１２２は、任意の導電性材料を用いることができるが、本実施形態のように後述する各緩衝液保持部１２３、１４３が存在するような場合には、炭素電極（カーボン電極）を用いるのが好ましい。
【００５７】
次に、各緩衝液保持部１２３、１４３には、長時間にわたって遺伝子導入装置の通電性を確保するための緩衝液が保持されており、この緩衝液としてはリン酸緩衝食塩水や有機酸類の水溶液を使用することが可能である。より好ましくは、水の電解反応（アノード電極における酸化反応及びカソード電極における還元反応）よりも酸化又は還元され易い電解質、例えば、リン酸第１鉄、リン酸第２鉄等の無機化合物、アスコルビン酸（ビタミンＣ）やアスコルビン酸ナトリウム等の物質、リン酸、シュウ酸、リンゴ酸、コハク酸、フマル酸の有機酸及び／又はその塩、又はこれらの混合物を使用することにより、水の電解によるガスの発生及びこれによる導電抵抗の増大あるいはｐＨ値の変動を防止することも可能である。勿論ここで説明した物質に限定される趣旨のものではない。
【００５８】
次に、各カチオン交換膜１２６、１４４は、カチオンを選択的に透過させる機能を有するイオン交換膜であり、例えば、株式会社トクヤマ製ネオセプタ（ＮＥＯＳＥＰＴＡ）ＣＭ−１、ＣＭ−２、ＣＭＸ、ＣＭＳ、ＣＭＢ等のカチオン交換膜を特に制限無く使用できる。又、ポリオレフィン樹脂、塩化ビニル系樹脂、フッ素系樹脂、ポリアミド樹脂、ポリイミド樹脂等からなる多孔質フィルムの孔の一部又は全部に、カチオン交換樹脂が充填されたタイプのカチオン交換膜を特に好ましく使用することができる。この場合のカチオン交換樹脂の充填は、例えば、スチレン−ジビニルベンゼン、クロロメチルスチレン−ジビニルベンゼン等の架橋性単量体に重合開始剤を配合した溶液を上記多孔質フィルムの孔中に含浸させた後に重合させ、この重合体にスルホン酸基、カルボン酸基、ホスホン酸基等のカチオン交換基を導入することにより行なうことができる。
【００５９】
次に、各アニオン交換膜１２４、１４６は、アニオンを選択的に透過させる機能を有するイオン交換膜であり、例えば、株式会社トクヤマ製ネオセプタ（ＮＥＯＳＥＰＴＡ）ＡＭ−１、ＡＭ−３、ＡＭＸ、ＡＨＡ、ＡＭＨ、ＡＣＳ等のアニオン交換膜を特に制限無く使用できる。又、ポリオレフィン樹脂、塩化ビニル系樹脂、フッ素系樹脂、ポリアミド樹脂、ポリイミド樹脂からなる多孔質フィルムの孔の一部又は全部に、アニオン交換樹脂が重合されたタイプのアニオン交換膜を特に好ましく使用することができる。この場合のアニオン交換樹脂の充填は、スチレン−ジビニルベンゼン、クロロメチルスチレン−ジビニルベンゼン等の架橋性単量体に重合開始剤を配合した溶液を、上記多孔質フィルムの孔中に含浸させた後に重合させ、この重合体に１乃至３級アミノ基、４級アンモニウム基、ピリジル基、イミダゾール基、４級ピリジニウム基、４級イミダゾリウム基等のアニオン交換基を導入することにより行なうことができる。
【００６０】
次に、遺伝子保持部１４５には、標的細胞１６０へと導入しようとする遺伝子が保持される。この遺伝子保持部１４５は例えば遺伝子を溶液として保持しても良いし、又、たとえばポリアクリルアミドゲルやアガロースゲル等に保持させるような形で備えていても良い。
【００６１】
又、本明細書における「遺伝子」とは、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ＲＮＡ（リボ核酸）、を含むことは勿論として、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリットも含む趣旨である。更に、２本鎖として存在するもののみならず１本鎖のものも含まれ、更には、プラスミドのように環状構造を有するものも含まれる。
【００６２】
次に、電解液保持部１２５には、そのカチオンが標的細胞１６０内にもともと存在する代謝経路によって代謝され得る物質である電解液が保持されている。例えば、カチオンとしてカリウムイオンやナトリウムイオンが存在している場合には、遺伝子導入装置１００の通電によってこのカチオンが標的細胞１６０内へと導入されることになるが、標的細胞１６０の細胞膜上に存在するナトリウムポンプやカリウムポンプ等によってその濃度は適宜調整される。具体的には、生理食塩水などを使用することが可能である。
【００６３】
続いて、遺伝子導入装置１００による遺伝子導入方法について説明する。
【００６４】
まず、遺伝子を導入しようとする標的細胞１６０を適宜調整し、下部プレート１２０の上面、即ち、第２カチオン交換膜１２６の上面に用意する必要がある。
【００６５】
続いて、上部プレート１４０を高さ調整機構１０８によって下部プレート１２０側へと移動させる。このとき、上部プレート１４０を下部プレート１２０側へ押し付けすぎることによって、標的細胞１６０を破壊することのないように、顕微鏡１０２の画像が映し出されたモニタ１５０を観察しながら調整する。但し、この調整作業は望ましい作業として示すものであり、必須の作業ではない。
【００６６】
この調整によって、標的細胞１６０は、下部プレート１２０における第２カチオン交換膜１２６と、上部プレート１４０における第１アニオン交換膜１４６の両方に接触するように配置するのが好ましい。なお、図２においては、標的細胞１６０がきれいに一列に（一層に）整列しているが、幾層に重なり合っていても本発明の効果を妨げるものではない。
【００６７】
この状態で、コントローラ１５２を操作することによって、電源１１２から上部プレート１４０及び下部プレート１２０へと電圧を印加する。この電源１１２からの電圧が各電極１２２、１４２へと伝わると、以下のような作用が起こる。
【００６８】
最初に、下部プレート１２０においては次のような作用が起こる。
【００６９】
電源１１２から第２電極１２２へと電流が伝えられると、第２緩衝液保持部１２３に備わる緩衝液を酸化させる。例えば、リン酸第１鉄の場合であればリン酸第２鉄へと変化する。そうすると、この第２緩衝液保持部１２３に備わるカチオンとアニオンのバランスが崩れる（カチオンが多くなる）こととなる。このバランスを補うために、第２緩衝液保持部１２３のカチオンは電解液保持部１２５の方向に移動してバランスを保とうとする。一方、電解液保持部１２５に備わるアニオンも、第２緩衝液保持部１２３側へと移動してバランスを保とうとする。しかしながら、第２緩衝液保持部１２３と電解液保持部１２５との間に位置する第２アニオン交換膜１２４の存在により、カチオンは通過できず、アニオンのみが選択的に通過されることになる。即ち、第２緩衝液保持部１２３から電解液保持部１２５へのカチオンの移動は認められず、電解液保持部１２５から第２緩衝液保持部１２３へのアニオンの移動のみが許容される。そうすると、今度は、電解液保持部１２５のカチオンとアニオンのバランスが崩れてしまう。更に、このバランスの崩れを補うために、電解液保持部１２５のカチオンは第２カチオン交換膜１２６を通過して下部プレート１２０の外部（標的細胞側）へと移動してバランスを保とうとする。一方、第２カチオン交換膜１２６が接触する標的細胞１６０の内部（細胞質）からも、このバランスの崩れを補うために、細胞質内のアニオンが電解液保持部１２５へと移動してバランスを保とうとする。しかしながら、電解液保持部１２５と標的細胞１６０との間に位置する第２カチオン交換膜１２６の存在により、アニオンは通過できず、カチオンのみが選択的に通過されることになる。即ち、標的細胞１６０の細胞質から電解液保持部１２５へのアニオンの移動は認められず、電解液保持部１２５から標的細胞１６０側へのカチオンの移動のみが許容される。このときのカチオンは第２カチオン交換膜１２６に選択的に透過されるため、標的細胞１６０側へと移動することが可能となっている。
【００７０】
次に、上部プレート１４０の内部の作用について説明する。
【００７１】
電源１１２から第１電極１４２へと電流が伝達されると、第１緩衝液保持部１４３に備わる緩衝液が還元される。例えばリン酸第２鉄の場合であればリン酸第１鉄へと変化する。そうすると、第１緩衝液保持部１４３に備わるカチオンとアニオンのバランスが崩れる（アニオンが多くなる）こととなる。このバランスを補うために、第１緩衝液保持部１４３のアニオンは遺伝子保持部１４５の方向に移動しようとする。一方、遺伝子保持部１４５に備わるカチオンも、第１緩衝液保持部１４３の方向に移動してバランスを保とうとする。しかしながら、第１緩衝液保持部１４３と遺伝子保持部１４５との間に位置する第１カチオン交換膜１４４の存在により、アニオンは通過できずにカチオンのみが選択的に透過されることになる。即ち、第１緩衝液保持部１４３から遺伝子保持部１４５へのアニオンの移動は認められず、遺伝子保持部１４５から第１緩衝液保持部１４３へのカチオンの移動のみが許容される。そうすると、今度は、遺伝子保持部１４５のカチオンとアニオンのバランスが崩れてしまう。更に、このバランスの崩れを補うために、遺伝子保持部１４５のアニオンは第２アニオン交換膜１４６を通過して上部プレート１４０の外部（標的細胞側）へと移動してバランスを保とうとする。一方、第２アニオン交換膜１４６が接触する標的細胞１６０の内部（細胞質）からも、このバランスの崩れを補うために、細胞質内のカチオンが遺伝子保持部１４５へと移動してバランスを保とうとする。しかしながら、遺伝子保持部１４５と標的細胞１６０との間に位置する第２アニオン交換膜１４６の存在により、カチオンは通過できず、アニオンのみが選択的に通過されることになる。即ち、標的細胞１６０の細胞質から遺伝子保持部１４５へのカチオンの移動は認められず、遺伝子保持部１４５から標的細胞１６０側へのアニオンの移動のみが許容される。このときのアニオン（遺伝子）は、第１アニオン交換膜１４６に選択的に透過されるため、標的細胞１６０側へと移動することが可能となっている。
【００７２】
このような下部プレート１２０及び上部プレート１４０内の作用を経て、上部プレート１４０内に備わる遺伝子が、標的細胞１６０内へと移動する。上記説明したのとは逆に、電源１１２からの電流が非通電とされれば、遺伝子の導入は直ちに停止される。即ち、電源１１２からの通電／非通電を適宜コントロールすることによって、導入しようとする遺伝子の導入量を適宜コントロールすることが可能になる。
【００７３】
又、図３に示すように、標的細胞１６０内には遺伝子保持部１４５からの遺伝子が第１アニオン交換膜１４６を介して細胞内に導入されると同時に、電解液保持部１２５に備わるカチオンが第２カチオン交換膜１２６を介してイオンとして等価な量だけ導入されることになる。このように、トータルで導入されるカチオンとアニオンの電荷量が相対的にコントロールされながら導入されるため、標的細胞１６０における細胞質内のｐＨ値が大きく変化してしまうこともない。更に、電解液保持部１２５に備わるカチオンを、例えば、ＮＡＤ＋（ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチドリン酸）等で構成しておくことにより、標的細胞１６０内に本来存在する代謝経路（例えばクエン酸回路や電子伝達系等）で適宜使用されることによって、消費されるため、導入されたカチオンが蓄積することによって、標的細胞１６０に不具合が生じることもない。
【００７４】
次に、遺伝子導入装置の他の実施形態について説明する。
【００７５】
図４は、本発明の他の実施形態を示すものであり、前述した遺伝子導入装置１００における図３に相当する図面である。
【００７６】
この実施形態の特徴は、標的細胞２６０が植物細胞の場合に適用すると効果的である。植物細胞は動物細胞と異なり、細胞膜２６０Ｍの更に外側にセルロース等で構成される細胞壁２６０Ｈが存在している。本発明を適用すれば、前述した遺伝子導入装置１００を利用することでこの細胞壁２６０Ｈの存在に影響されることなく遺伝子を導入することも可能である。しかし、図４に示すように、植物標的細胞２６０の細胞壁２６０Ｈに直接接触する第１アニオン交換膜２４６と、第２カチオン交換膜２２６の表面に、ナノレベルで作製した複数のニードル（中空であると更に望ましい）を設けることによって、植物標的細胞２６０が有する細胞壁２６０Ｈを部分的に貫通し、この貫通した隙間をぬって導入しようとする遺伝子が植物標的細胞２６０内へと移動する。このように、無数のニードルを設けることによって本発明の遺伝子導入効率をより高めることが可能となっている。
【００７７】
更に、本発明は、必ずしも遺伝子導入をしようとする標的細胞を細胞レベルで準備する必要は無く、図５に示すように直接生物体（図においては植物１９０の葉）に直接的に遺伝子を導入することも可能である。図５に示すように、植物１９０の葉の表面と裏面に、導入しようとする遺伝子が保持される上部プレートに相当する構造体（作用側電極構造体）と、その反対側に下部プレートに相当する構造体（非作用側電極構造体）を配置して電源からの電圧を印加することにより導入可能である。このとき、植物体の表面には、セルロースで構成される細胞壁や更にクチクラ層等が形成されているため、これらの層を薬品等によって取り除いた上で、当該装置を使用してもよい。
【００７８】
又、図示はしないが、遺伝子保持部を、アノードに接続された構造体側に設けることも可能である。本来マイナスの電荷にチャージしている遺伝子を、例えば化学的な修飾を施すことによって、全体としてプラスの電荷にチャージするように構成した場合には、このような構成であっても遺伝子導入が可能となる。これは、遺伝子自体を修飾してもよいし、遺伝子を例えば脂質等の微小なカプセルに取り込んで、このカプセル自体を修飾してもよい。更に、このような構成とすることで、いずれか一方が遺伝子を導入しない「非作用側構造体」として機能していたものを、両方共に、作用側構造体として機能させることができる。
【００７９】
なお、本明細書において、作用側構造体及び非作用側構造体という文言における「作用側」とは遺伝子保持部を備えており、遺伝子導入作用が起こる側のことを意味している。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明は、動物細胞、植物細胞に拘わらず、広く遺伝子導入するための遺伝子導入装置として適用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】本発明の実施形態の一例である遺伝子導入装置１００を概念的に構成した概念構成図
【図２】図１における上部プレートと下部プレートの断面構成図
【図３】遺伝子導入装置１００の印加時における標的細胞内のアニオンとカチオンの動きを示した図
【図４】イオン交換膜と標的細胞との接触面に無数のニードルを配置した構成例
【図５】植物体に直接遺伝子導入する場合の概念構成図
【図６】特許文献１に記載される遺伝子導入装置
【符号の説明】
【００８２】
１００…遺伝子導入装置
１０２…顕微鏡
１０４…下部支持体
１０６…上部支持体
１０８…高さ調整機構
１１２…電源
１２０…下部プレート
１２１…下部プレートケース
１２２…第２電極
１２３…第２緩衝液保持部
１２４…第２アニオン交換膜
１２５…電解液保持部
１２６…第２カチオン交換膜
１４０…上部プレート
１４１…上部プレートケース
１４２…第１電極
１４３…第１緩衝液保持部
１４４…第１カチオン交換膜
１４５…遺伝子保持部
１４６…第１アニオン交換膜
１５０…モニタ
１５２…コントローラ
１６０…標的細胞
１６０Ｃ…細胞核
１６０Ｍ…細胞膜
１９０…植物
２７０…ニードル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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