(57)【要約】  【課題】飲食物や医薬品などに含有するマツタケ由来成分を、簡易、定量的かつ高精度に検出する手段を提供すること。  【解決手段】マツタケ由来のαグルカン−タンパク質複合体に対して特異的に結合する抗体を用いて、マツタケ由来成分を検出するマツタケ由来成分検出方法を提供する。例えば、マツタケに固有のαグルカン−タンパク質複合体であるＭＰＧ−１に対する抗体（抗ＭＰＧ−１抗体）を用いてＥＬＩＳＡ法を行うことにより、マツタケ由来成分を、定量的かつ高精度に検出することができる。従って、例えば、飲食物などにおける特定のαグルカン−タンパク質複合体の含有量を定量的に検出でき、また、その飲食物に、実際にマツタケ由来成分が含有しているかを、簡易かつ高精度に判別できる。  【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マツタケ由来のαグルカン−タンパク質複合体に対して特異的に結合する抗体。
【請求項２】
マツタケに固有の成分であるＭＰＧ−１に対して特異的に結合する抗ＭＰＧ−１抗体であることを特徴とする請求項１記載の抗体。
【請求項３】
請求項１又は請求項２記載の抗体を用いてマツタケ由来成分を検出するマツタケ由来成分検出方法。
【請求項４】
前記抗体を、ＥＬＩＳＡ法における捕捉用抗体及び／又は検出用抗体に用いることを特徴とする請求項３記載のマツタケ由来成分検出方法。
【請求項５】
前記抗体を、反応場の所定表面に固相化させる捕捉用抗体固相化手順と、
目的の試料を前記反応場に供給する抗原供給手順と、
検出用酵素と結合できるように修飾された前記抗体を前記反応場に供給する検出用抗体供給手順と、
前記反応場に前記検出用酵素の発色基質を供給する発色基質供給手順と、
前記検出用酵素と前記発色基質との反応を検出する発色反応検出手順と、
を少なくとも含む請求項３又は請求項４記載のマツタケ由来成分検出方法。
【請求項６】
請求項１又は請求項２記載の抗体を少なくとも含むマツタケ由来成分検出用キット。
【請求項７】
前記抗体が捕捉用抗体として所定表面に固相化された反応場を備えていることを特徴とする請求項６記載のマツタケ由来成分検出用キット。
【請求項８】
検出用抗体として、検出用酵素と結合できるように修飾された前記抗体を備えることを特徴とする請求項６又は請求項７記載のマツタケ由来成分検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体、マツタケ由来成分検出方法、並びにキットなどに関する。より詳細には、マツタケ由来のαグルカン−タンパク質複合体に対して、特異的に結合する抗体（抗ＭＰＧ−１抗体など）、該抗体をＥＬＩＳＡ法などに適用したマツタケ由来成分検出方法、並びにそれらの抗体や試薬などをキット化したマツタケ由来成分検出用キットなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
マツタケ（学名「Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ  ｍａｔｓｕｔａｋｅ」）は、ハラタケ目キシメジ科のキノコであり、温帯地方に分布する。マツタケの菌糸体は、アカマツの根などに菌糸を張って成長し、秋頃、地上に子実体を出す。
【０００３】
マツタケは、日本では、高級食材として親しまれている。マツタケを用いた飲食物として、炊き込みご飯、お吸い物などが特に好まれている。また、マツタケの風味を有したインスタント食品（炊き込みご飯の素、お吸い物粉末など）も広く流通している。その他、味噌汁、お茶、ヨーグルトなどにマツタケ（又はその乾燥粉末など）を入れる場合もある。
【０００４】
加えて、近年、マツタケ由来成分の各種生理活性が明らかになっており、マツタケ由来成分を含有する医薬品や健康飲食物なども増加している。例えば、特許文献１には、マツタケ又はその抽出物を含む血圧降下剤が、特許文献２には、同じく糖尿病治療剤が、特許文献３には、同じくがん予防剤が、それぞれ開示されている。
【０００５】
その他、本発明に関連のある先行技術として、例えば、特許文献４には、アルファ２−マクログロブリンに対するモノクローナル抗体を用いて試験試料中のグルカンを特異的に検出する方法が、特許文献５には、食品に含まれる有用物質やアレルギー物質を、抗原抗体反応により生じる凝集の程度を指標として定量する方法が、それぞれ開示されている。
【特許文献１】特開２００５−２２５８０３号公報
【特許文献２】特開２００５−２２５８０１号公報
【特許文献３】特開２００４−２１０６９５号公報
【特許文献４】特表２００１−５１９１８３号公報
【特許文献５】特開２００４−３３３１７１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
飲食物や医薬品などに含有するマツタケ由来成分を、定量的かつ高精度に検出することは難しかった。特に、マツタケ由来の生理活性物質には、グルカンなどのように、高分子の物質が多いため、有効な定量手段がほとんど知られていなかった。そこで、本発明は、飲食物や医薬品などに含有するマツタケ由来成分を、簡易、定量的かつ高精度に検出する手段を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明では、マツタケ由来のαグルカン−タンパク質複合体に対して特異的に結合する抗体を用いて、マツタケ由来成分を検出するマツタケ由来成分検出方法を提供する。
【０００８】
前記抗体には、例えば、マツタケに固有のαグルカン−タンパク質複合体であるＭＰＧ−１に対して特異的に結合する抗体（抗ＭＰＧ−１抗体）を用いる。それらの抗体をＥＬＩＳＡ法における捕捉用抗体及び／又は検出用抗体に用いることにより、マツタケ由来成分を、定量的かつ高精度に検出することができる。
【０００９】
具体的な手順としては、公知のＥＬＩＳＡ法などを適用できる。その場合、例えば、抗体を反応場の所定表面に固相化させる捕捉用抗体固相化手順、目的の試料を反応場に供給する抗原供給手順、検出用酵素と結合できるように修飾された抗体を反応場に供給する検出用抗体供給手順、反応場に検出用酵素の発色基質を供給する発色基質供給手順、検出用酵素と発色基質との反応を検出する発色反応検出手順、などを含む。
【００１０】
本発明に係るマツタケ由来成分検出方法を用いることにより、飲食物や医薬品などにおける特定のαグルカン−タンパク質複合体の含有量を定量的に検出できる。従って、特定の生理活性物質の摂取量（投与量）を把握できるため、日常のヘルスケアの観点などから有用である。
【００１１】
また、例えば、抗ＭＰＧ−１抗体を用いる場合、ＭＰＧ−１はマツタケに固有の成分であるため、マツタケ由来成分がその飲食物に実際に含有しているかを、簡易かつ高精度に判別できる。従って、その製品の品質を簡易かつ高精度に評価できる。
【００１２】
その他、本発明に係るマツタケ由来成分検出方法は、例えば、血中における特定のαグルカン−タンパク質複合体の濃度を定量的に検出する際にも用いることができる。これにより、特定の生理活性物質を摂取した際に、その体内動態を把握できる。
【００１３】
なお、本発明に係るマツタケ由来成分検出方法は、キット化が可能である。その場合、キットは、例えば、前記抗体が捕捉用抗体として所定表面に固相化された反応場（マイクロプレート、マイクロチューブなど）、検出用抗体として検出用酵素と結合できるように修飾された前記抗体、検出用酵素とその基質（発色基質）、その他のＥＬＩＳＡ試薬などを適宜組み合わせた構成にする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、マツタケ由来成分を定量的かつ高精度に検出できる。本発明は、例えば、飲食物・医薬品・その他の試料中などに含有するマツタケ由来成分の検出・定量などに有用である。
【実施例１】
【００１５】
実施例１では、マツタケ由来のαグルカン−タンパク質複合体に対して特異的に結合する抗体の例として、抗ＭＰＧ−１抗体を作製した。
【００１６】
抗体の作製は、（１）抗原の調製、（２）抗血清（免疫血清）の作製、（３）抗血清の抗体価の測定、（４）抗血清の精製の順に行った。以下、順に、手順の概要を説明する。
【００１７】
（１）抗原の調製：
抗原の調製を、以下の手順で行った（図１参照）。
【００１８】
まず、１００ｇのマツタケ菌糸体製剤ＣＭ６２７１（株式会社クレハ製、以下同じ）に、０．２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液５Ｌを加え、２５℃で１時間撹拌して成分を溶液中に抽出した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０分、４℃）して上清（「Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｅ）」）を回収した。
【００１９】
次に、この上清（「Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｅ）」）を塩酸で中和し、この溶液と等量のクロロホルム・メタノール混合溶媒（２：１）を加えて振盪混和した後、静置して水層（「Ｗａｔｅｒ  Ｐｈａｓｅ（ＥＷ）」）と有機溶媒層（「Ｃｈ・Ｍｅ  Ｐｈａｓｅ」）とに分け、それぞれ分取した。そして、セルロース透析膜（分子量８，０００Ｄａ）を用いて、水層（「Ｗａｔｅｒ  Ｐｈａｓｅ（ＥＷ）」）を純水に対して３日間透析した後、凍結乾燥した。
【００２０】
次に、水層（「Ｗａｔｅｒ  Ｐｈａｓｅ（ＥＷ）」）を、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。水層（「Ｗａｔｅｒ  Ｐｈａｓｅ（ＥＷ）」）から得られた凍結乾燥粉末を、５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、以下、「Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ」とする）に溶解した後、ＤＥＡＥ  ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＰＡＫ  ６５０Ｍ充填カラム（孔径２２ｍｍ、長さ２０ｃｍ）にその溶液をアプライし、溶出液Ａ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）と溶出液Ｂ（１Ｍ塩化ナトリウム含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）とを用いてリニアグラジエント溶出し、２８０ｎｍにおける吸光度を測定して、図１右側の（Ａ）に示す溶出パターンを取得した。溶出液の流速は５ｍＬ／ｍｉｎに設定した。
【００２１】
そして、取得した溶出パターンに基づき、水層（「Ｗａｔｅｒ  Ｐｈａｓｅ（ＥＷ）」）を５つの画分（「ＥＷ−１」〜「ＥＷ−５」）に分画し、そのうちのＥＷ−２画分を、透析膜（分子量１３，０００Ｄａ）を用いて、蒸留水に対して２０日間透析した後、凍結乾燥した。
【００２２】
次に、ＥＷ−２画分のゲルろ過を行った。ＥＷ−２画分から得られた凍結乾燥粉末を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに溶解した後、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００（アマシャム  バイオサイエンス社製）充填カラム（径１６ｍｍ、長さ３０ｃｍ）にアプライし、２８０ｎｍにおける吸光度を測定して、図１右側の（Ｂ）に示す溶出パターンを取得した。カラムの平衡化にはＴｒｉｓ−ＨＣｌを用いた。
【００２３】
そして、取得した溶出パターンに基づき、ＥＷ−２画分をさらに３つの画分（「ＥＷ−２１」〜「ＥＷ−２３」）に分画した。
【００２４】
次に、そのうちのＥＷ−２１画分について、より高精度にゲルろ過を行った。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−５００（アマシャム  バイオサイエンス社製）充填カラム（径１６ｍｍ、長さ６０ｃｍ）にその溶液をアプライし、２８０ｎｍにおける吸光度を測定して、図１右側の（Ｃ）に示す溶出パターンを取得した。カラムの平衡化には、前記と同様、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを用いた。
【００２５】
そして、取得した溶出パターンに基づき、ＥＷ−２１画分をさらに３つの画分（「ＥＷ−２１１」〜「ＥＷ−２１３」）に分画した。そのうち、ＥＷ２１２画分（以下、「ＭＰＧ−１」とする。）を、抗原として用いた。
【００２６】
（２）抗血清の作製：
抗血清の作製を、以下の手順で行った。
【００２７】
まず、第一回目の免疫賦与を行った。目的の抗原であるＭＰＧ−１のリン酸緩衝化生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ；以下、「ＰＢＳ」とする。）溶液とＦｒｅｕｎｄ’ｓ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（シグマ−アルドリッチ社製）とを等量混合し、超音波発生器を用いて高粘性のエマルジョン液を調製した。そして、４週齢の雌ニュージーランドホワイトウサギ２羽（オリエンタル酵母株式会社から購入）のそれぞれの後背部に、このエマルジョン液を、ＭＰＧ−１量が０．５ｍｇ／羽となるように、皮下注射した。
【００２８】
次に、第二回目から第五回目の免疫賦与を行った。抗原ＭＰＧ−１のＰＢＳ溶液とＦｒｅｕｎｄ’ｓ  Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（シグマ−アルドリッチ社製）とを混合してエマルジョン液を調製した。そして、第一回目の注射の２週後から２週間おきに計４回、各ニュージーランドホワイトウサギの後背部に、このエマルジョン液を、ＭＰＧ−１量が０．５ｍｇ／羽となるように、皮下注射した。
【００２９】
次に、第六回目から第九回目の免疫賦与を行った。抗原ＭＰＧ−１のＰＢＳ溶液とＴｉｔｅｒＭａｘ  ｇｏｌｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ（「ＴＩＴＥＲＭＡＸ」はタイターマックス  インコーポレーテッドの登録商標、ＵＰＴＩＭＡ  ＩＮＴＥＲＣＨＩＭ社より購入）とを混合してエマルジョン液を調製した。そして、第五回目の注射の２週後から２週間おきに計４回、各ニュージーランドホワイトウサギの後背部に、このエマルジョン液を、ＭＰＧ−１量が０．５ｍｇ／羽となるように、皮下注射した。
【００３０】
第三回目から第八回目の免疫賦与において、各エマルジョン液注射の１週間後に、耳動脈より、０．５〜１．０ｍＬ、採血を行った。また、第九回目の免疫付与において、エマルジョン液注射の１週間後に、ケタミン・キシラジン麻酔下で、頚動脈より全採血を行った。そして、採取した各血液を、室温で１時間静置し、４℃条件下で一昼夜保存した後、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分間）を行い、血清を得た。
【００３１】
（３）抗血清の抗体価の測定：
ＥＬＩＳＡ法及びドットブロット法により、２羽のウサギから得られたそれぞれの血清（抗血清）の抗体価測定を行った。
【００３２】
はじめに、ＥＬＩＳＡ法により抗体価測定を行った場合について、その手順の概要を以下に示す。
【００３３】
まず、９６ウエルのプレートに、ＭＰＧ−１溶液を５０ｎｇ／ウエル分注し、各ウエルをＭＰＧ−１でコートした。次に、得られた血清の１００〜２４，３００倍希釈液を各ウエルに１００μＬずつ分注し、２５℃、３時間反応させた。
【００３４】
次に、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０添加ＰＢＳ（以下、「ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ」とする。）で各ウエルを３回洗浄した後、アルカリフォスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体溶液（「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ，  Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ，  ＡＰ」、フナコシ株式会社より購入、以下同じ）を各ウエルに分注し、２５℃、１時間反応させた。
【００３５】
次に、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで各ウエルを３回洗浄した後、キット付属の基質を加え、１５分間静置し、発色させた。そして、プレートリーダーを用いて、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００３６】
結果を図２に示す。
【００３７】
図２は、ＥＬＩＳＡ法による抗体価測定の結果を示すグラフである。図中のグラフの横軸は、血清の希釈倍率を、縦軸は吸光度を表す。グラフ中、「１−０」で示す折れ線は、１羽目の個体から免疫賦与前に得た血清を用いた場合の吸光度を、「１−７」で示す折れ線は、１羽目の個体から第７回目の免疫賦与の際に得た血清を用いた場合の吸光度を、「１−８」で示す折れ線は、１羽目の個体から第８回目の免疫賦与の際に得た血清を用いた場合の吸光度を、「１−９」で示す折れ線は、１羽目の個体から第９回目の免疫賦与の際に得た血清を用いた場合の吸光度を、それぞれ表す。同様に、「２−０」で示す折れ線は、２羽目の個体から免疫賦与前に得た血清を用いた場合の吸光度を、「２−８」で示す折れ線は、２羽目の個体から第８回目の免疫賦与の際に得た血清を用いた場合の吸光度を、「２−９」で示す折れ線は、２羽目の個体から第９回目の免疫賦与の際に得た血清を用いた場合の吸光度を、それぞれ表す。
【００３８】
図２に示す通り、両個体において、第７回目以降の免疫賦与の際に得た血清を用いた場合、免疫賦与前に得た血清を用いた場合と比較して、吸光度（抗体価）が大幅に上昇した。例えば、第７回目以降の免疫賦与の際に得た血清を用いた場合の１００倍希釈時における吸光度は、免疫賦与前の０．５以下の数値から、２．０〜２．５の数値にまで上昇した。この結果は、第７回目以降の免疫賦与の際に得た血清が、高い血清抗体価を有することを示す。
【００３９】
続いて、ドットブロット法により抗体価測定を行った場合について、その概要を以下に示す。
【００４０】
まず、ＰＶＤＦ（「ポリビニリデンジフライド」、以下同じ）膜に、抗原ＭＰＧ−１の溶液（それぞれ、１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ）を滴下し固着させた。次に、固着させたＭＰＧ−１に、血清の１，０００倍希釈液を滴下し、２５℃、１時間、反応させた。
【００４１】
次に、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで充分に洗浄した後、アルカリフォスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体溶液を滴下し、２５℃、１時間反応させた。次に、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、キット付属の基質を加え、発色させた。
【００４２】
結果を図３に示す。
【００４３】
図３は、ドットブロット法による抗体価測定の結果を示す免疫ブロット写真である。図中、「ＭＰＧ−１濃度（ｎｇ）」は、ＰＶＤＦ膜へのＭＰＧ−１滴下量を表す。「個体１」及び「個体２」は、本実施例に用いた２羽のウサギを表す。「免疫前」は免疫賦与前に得た血清を用いた場合であることを、「５回目」〜「９回目」は、その回数の免疫賦与を行った後に得た血清を用いた場合であることを、それぞれ表す。
【００４４】
図３に示す通り、両個体において、免疫賦与前の血清を用いた場合は、スポットはほとんど検出されなかったのに対し、免疫賦与を行った後に得た血清を用いた場合は、抗ＩｇＧ抗体によるスポットが検出できた。また、免疫賦与回数の増加に伴い、抗ＩｇＧ抗体によるスポットが鮮明になり、ＭＰＧ−１濃度が低い時でもスポットを検出できた。これらの結果は、免疫賦与して得た血清が高い血清抗体価を有することを示し、また、免疫賦与回数の増加に伴い、血清抗体価が上昇したことを示す。
【００４５】
（４）抗血清の精製：
免疫賦与により得られた血清（抗血清）の精製を、以下の手順で行い、抗ＭＰＧ−１抗体液を調製した。
【００４６】
まず、得られた抗血清５ｍＬを、０．４５μｍのフィルターに通過させた後、その抗血清に０．０２Ｍリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）を等量加えた。次に、この抗血清溶液を、１ｍＬ容のＨｉＴｒａｐ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦ  Ｃｏｌｕｍｎ（抗体精製用カラム、アマシャム  バイオサイエンス社製）に通過させた。なお、このカラムは、予め、０．０２Ｍリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）で平衡化させた。
【００４７】
次に、このカラムに１０ｍＬの０．２Ｍリン酸ナトリウム溶液をアプライし、カラムを洗浄した後、溶出液として０．１Ｍクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ３．０）をアプライし、抗体含有溶液を回収した。
【００４８】
次に、得られた抗体含有溶液に水酸化ナトリウム溶液を加え、中和した後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ  Ｃｏｌｕｍｕｎ（アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いて溶媒をＰＢＳに交換し、抗ＭＰＧ−１抗体液を得た。
【実施例２】
【００４９】
以下、実施例２から実施例４では、実施例１で作製した抗ＭＰＧ−１抗体に、ＭＰＧ−１の生理活性を抑制する作用があるかどうかについて検討した。
【００５０】
本発明者らによる従前の研究において、実施例１で調製したＭＰＧ−１には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、マウスＣＤ１１ｃ陽性細胞に結合し、サイトカイン産生を促進する生理活性があることが分かった。そこで、実施例２では、実施例１で作製した抗ＭＰＧ−１抗体に、ＭＰＧ−１のＣＤ１１ｃ陽性細胞への結合を抑制する作用があるかどうかについて検討した。
【００５１】
はじめに、マウスＣＤ１１ｃ陽性細胞の分離を以下の手順で行った。
【００５２】
８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（日本チャ−ルス・リバー株式会社より購入）をと殺し、腸間膜リンパ節を摘出し、ピンセットを用いて組織をほぐし、２００メッシュのふるいにかけ、単細胞懸濁液を調製した。次に、その単細胞懸濁液を、遠心分離によりＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄した後、１０％ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ加ＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁した。
【００５３】
次に、マウス抗ＣＤ１１ｃ抗体付属ビーズ（「ＣＤ１１ｃ  ｍｉｃｒｏ  ｂｅａｄｓ」、ドイツ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ社製）とマグネティックセルソーター（「ＭｉｎｉＭＡＣＳ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ」、ドイツ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ社製）を用いて、懸濁液からＣＤ１１ｃ陽性細胞を分離・回収した。手順は、付属のプロトコルに従った。なお、フローサイトメトリーにより純度検定を行った結果、回収した細胞懸濁液のうち、約８０％がＣＤ１１ｃ陽性細胞だった。
【００５４】
続いて、ＭＰＧ−１の１２５Ｉ標識を以下の手順で行った。
【００５５】
ＭＰＧ−１の１２５Ｉ標識は、Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｙｄｙｌ  ３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−［１２５Ｉ］ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ、アマシャム  バイオサイエンス社製、以下同じ）を用いて、付属のプロトコルに従い行った。
【００５６】
まず、小ガラス管に入れられたＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬のベンゼン溶解液を窒素気流中で乾固した。次に、氷冷下、その小ガラス管に、ＭＰＧ−１溶液１００μｇ／５０μＬを加え、１０分間反応させた後、１Ｍのグリシン水溶液を０．５ｍＬ加え、反応を停止させた。
【００５７】
次に、反応液を２．５ｍＬにメスアップした後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５を充填したゲルろ過カラム（製品名「ＰＤ−１０」、アマシャム  バイオサイエンス社製）にアプライし、素通りした画分（１２５Ｉ標識ＭＰＧ−１）を回収した。得られた画分の放射線測定値は、１．９９×１０９ｃｐｍ／１００μｇだった。
【００５８】
続いて、アッセイを行った。
【００５９】
まず、エッペンドルフチューブ（エッペンドルフ株式会社製）にＣＤ１１ｃ陽性細胞懸濁液を入れ、その中に、１２５Ｉ標識ＭＰＧ−１、及び、実施例１で作製した抗ＭＰＧ−１抗体溶液を所定量ずつ添加・混合し、４℃で１時間反応させた。
【００６０】
次に、各反応液を遠心分離し、上清を除去し、細胞ペレットをＰＢＳで３回洗浄した後、γカウンターを用いて、細胞に結合した１２５Ｉ標識ＭＰＧ−１の放射線測定値を得た。
【００６１】
結果を表１に示す。
【表１】
2007169207.tif 000002
【００６２】
表中、サンプル３は、ＣＤ１１ｃ陽性細胞懸濁液に、１２５Ｉ標識ＭＰＧ−１、及び、実施例１で作製した抗ＭＰＧ−１抗体溶液を添加した場合の結果を表す。
【００６３】
なお、サンプル１、サンプル２、サンプル４はコントロールである。表中、サンプル１は、ＣＤ１１ｃ陽性細胞懸濁液に、１２５Ｉ標識ＭＰＧ−１のみを添加した場合の結果を、サンプル２は、同じく、１２５Ｉ標識ＭＰＧ−１、及び、過剰量（５０倍濃度）の非標識ＭＰＧ−１を添加した場合の結果を、サンプル４は、実施例１で作製した抗ＭＰＧ−１抗体の替わりに標品の抗体を用いた場合の結果を、それぞれ表す。各実験手順はサンプル３の場合と同様である。
【００６４】
表１に示す通り、実施例１で作製した抗ＭＰＧ−１抗体溶液を添加した場合（サンプル３）、添加しない場合（サンプル１）と比較して、細胞に結合したＭＰＧ−１量が減少した。この結果は、本発明に係る抗体が、ＭＰＧ−１のＣＤ１１ｃ陽性細胞への結合を抑制することを示す。
【００６５】
なお、サンプル２では、非標識ＭＰＧ−１を過剰量添加することにより、細胞に結合したＭＰＧ−１量が大幅に減少した。この結果は、サンプル３におけるＣＤ１１ｃ陽性細胞懸濁液と１２５Ｉ標識ＭＰＧ−１の結合が、非特異的なものではなく特異的なものであることを示す。
【実施例３】
【００６６】
本発明者らによる従前の研究において、実施例１で調製したＭＰＧ−１には、ＴＧＦ−β１と直接結合し、ＴＧＦ−β１の活性を抑制する生理活性があることが分かった。そこで、実施例３では、実施例１で調製した抗ＭＰＧ−１抗体に、ＭＰＧ−１とＴＧＦ−β１の結合を抑制する作用があるかどうかについて検討した。
【００６７】
まず、エッペンドルフチューブに、（１）１２５Ｉ標識ｒｈＴＧＦ−β１（以下「１２５Ｉ標識ＴＧＦ」とする。）溶液（アマシャム  バイオサイエンス社製）２μＬ（０．２４μｇ／ｍＬ相当）、（２）ＭＰＧ−１の５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶解液２００μＬ（５０μｇ）、（３）実施例１で作製した抗体液１０μｇ又は５０μｇ、を入れて混合し、３７℃、３時間反応させた。
【００６８】
次に、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーにより、その反応液から、１２５Ｉ標識ＴＧＦとＭＰＧ−１の結合体及び非結合体をそれぞれ回収した。ＨＰＬＣ装置にはＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ（アマシャム  バイオサイエンス社製）を、イオン交換樹脂カラムにはＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（１ｍＬ）を用いた。検出波長は２８０ｎｍに設定した。
【００６９】
クロマトグラフィーの具体的な手順は以下の通りである。まず、２００μＬの反応液をこのカラムにアプライし、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液１０ｍＬで洗浄し、非吸着画分（１２５Ｉ標識ＴＧＦとＭＰＧ−１の結合体）を回収した。次に、溶出液Ａ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）と溶出液Ｂ（１Ｍ塩化ナトリウム含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）とを用いてリニアグラジエント溶出し（溶出量：２０ｍＬ）、吸着画分（非結合の１２５Ｉ標識ＴＧＦ）を回収した。溶出液は、フラクションコレクターで、１ｍＬごとに回収した。
【００７０】
次に、回収した非吸着画分（１２５Ｉ標識ＴＧＦとＭＰＧ−１の結合体）及び吸着画分（非結合の１２５Ｉ標識ＴＧＦ）のそれぞれについて、γカウンターを用いて、放射線測定値を得た。
【００７１】
結果を表２に示す。
【表２】
2007169207.tif 000003
【００７２】
表中、サンプル３は、実施例１で作製した抗体を１０μｇ添加した場合の結果を、サンプル４は、同じく５０μｇ添加した場合の結果を、それぞれ表す。
【００７３】
なお、サンプル１及びサンプル２はコントロールである。表中、サンプル１は、ＭＰＧ−１及び実施例１で作製した抗体の両者を添加しない場合の結果を、サンプル２は、ＭＰＧ−１を添加した場合（実施例１で作製した抗体を添加しない場合）の結果を、それぞれ表す。各実験手順はサンプル３又はサンプル４の場合と同様である。
【００７４】
表２に示す通り、ＭＰＧ−１を添加した場合（サンプル２）、添加しなかった場合（サンプル１）と比較して、１２５Ｉ標識ＴＧＦとＭＰＧ−１の結合体の放射線測定値が大幅に増加し、全放射線測定値に対する結合体の割合も大幅に増加した。
【００７５】
それに対し、実施例１で作製した抗体を１０μｇ添加した場合（サンプル３）、全放射線測定値に対する結合体の割合は６７．２％に、同じく５０μｇ添加した場合（サンプル４）、その割合は４０．８％に、それぞれ減少した。
【００７６】
これらの結果は、本発明に係る抗体が、ＭＰＧ−１とＴＧＦ−βの結合を抑制することを示唆する。
【実施例４】
【００７７】
本発明者らによる従前の研究において、実施例１で調製したＭＰＧ−１には、サルコーマ  １８０細胞（固形がん細胞）の増殖を抑制する生理活性があることが分かった。そこで、実施例４では、実施例１で作製した抗ＭＰＧ−１抗体に、ＭＰＧ−１によるサルコーマ  １８０細胞の増殖抑制を抑制する作用があるかどうかについて検討した。
【００７８】
まず、５週齢の雌性ＩＣＲマウス（日本クレア株式会社より購入）の腋下部皮下に、サルコーマ１８０細胞を、１×１０６個移植した。サルコーマ１８０細胞には、株式会社クレハ・生物医学研究所で雌性ＩＣＲマウスの腹腔内で継代維持しているものを用いた。本実験では、各群８匹ずつ、マウスを用いた。
【００７９】
次に、サルコーマ１８０細胞移植の翌日から、隔日に、ＭＰＧ−１を１００ｍｇ／ｋｇ／回、腹腔内投与した。また、移植から２週間、週２回、実施例１で調製した抗ＭＰＧ−１抗体液を、５０μｇ／匹、静脈内注射した。
【００８０】
そして、移植から２５日目に、マウスをと殺して腫瘍結節を摘出し、その重量を測定した。
【００８１】
結果を表３に示す。
【表３】
2007169207.tif 000004
【００８２】
表中、サンプル３は、ＭＰＧ−１と抗ＭＰＧ−１抗体の両者を投与した場合の結果を表す。
【００８３】
なお、サンプル１、サンプル２、サンプル４はコントロールである。表中、サンプル１は、ＭＰＧ−１の替わりに生理食塩水を投与した場合の結果を、サンプル２は、ＭＰＧ−１を投与した場合の結果を、サンプル４は、実施例１で作製した抗ＭＰＧ−１抗体の替わりに標品の抗体を用いた場合の結果を、それぞれ表す。各実験手順はサンプル３の場合と同様である。
【００８４】
表中、「抑制率」は、腫瘍細胞増殖抑制率を示し、サンプル１の平均腫瘍重量から各サンプルの平均腫瘍重量を減じて得た値を、サンプル１の平均腫瘍重量で除して１００を乗じることにより算出した。
【００８５】
表３に示す通り、抗ＭＰＧ−１抗体を投与した場合（サンプル３）、ＭＰＧ−１のみを投与した場合（サンプル２）と比較して、腫瘍細胞増殖抑制率が９６％から８４％に減少した。この結果は、本発明に係る抗体が、ＭＰＧ−１によるサルコーマ  １８０細胞の増殖抑制を抑制する作用を有することを示唆する。
【００８６】
以上、実施例２から実施例４の結果は、実施例１で作製した抗体に、ＭＰＧ−１の生理活性を抑制する作用があることを示す。
【実施例５】
【００８７】
実施例５では、実施例１で作製した抗ＭＰＧ−１抗体を用いて、ＥＬＩＳＡシステムの構築を試みた。
【００８８】
はじめに、捕捉用抗体の固相化を、以下の手順で行った。まず、実施例１で調製した抗ＭＰＧ−１抗体液を０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈し、１０μｇ／Ｌになるようにした。次に、マイクロＥＬＩＳＡ用プレート（製品名「Ｃｏｓｔｅｒ  ＥＩＡ／ＲＩＡ  ８ｗｅｌｌ  ＳＴＩＲＩＰ」、アメリカ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の各ウエルに、調製した抗体液を２００μＬずつ分注し、４℃の湿潤箱中で３時間静置して、抗体の固相化を行った。そして、抗体の固相化を行った後、抗体液を除去し、各ウエルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いて３回洗浄した。洗浄は、各ウエルにＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを入れ、マイクロミキサー上で、２５℃、３分間浸透した後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを除去することにより行った。
【００８９】
続いて、検出用抗体のビオチン標識を行った。ビオチン標識は、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ、株式会社同仁化学研究所製）を用いた。手順は付属のプロトコルに従った。
【００９０】
まず、サンプルチューブに、前記手順において調製した抗体液を入れ、炭酸水素ナトリウム緩衝液を加え、塩濃度が５０ｍＭ、タンパク質濃度が５．０ｍｇ／０．５ｍＬになるように調製した後、ボルテックミキサーを用いてよく混和した。次に、Ｂｉｏｔｉｎ−（ＡＣ５）２Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕを１０ｍｇ／７５０μＬに調製し、その溶液１７．５μＬを抗体溶液に添加し、ボルテックスミキサーを用いてよく混和した後、２５℃、２時間、反応させた。次に、ゲルろ過カラムにその反応液をアプライし、ビオチン標識抗体溶液を回収した。なお、ゲルろ過カラムの平衡化は、ＰＢＳで行った。
【００９１】
続いて、ＥＬＩＳＡ法によるアッセイを行った。
【００９２】
まず、捕捉用抗体を固相化したプレートの各ウエルに、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、以下同じ）溶液３００μＬを分注して、抗原タンパク質の非特異的反応をブロッキングした（ブロッキング処理）。次に、ブロッキング溶液を除去した後、所定濃度（１０ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／Ｌ）のＭＰＧ−１溶液１００μＬを分注し、室温で１時間静置した（捕捉用抗体と抗原の結合）。
【００９３】
次に、プレートの各ウエルに、所定濃度のビオチン標識抗体溶液１００μＬを分注し、室温で１時間静置した（補足用抗体−抗原−検出用抗体の結合）。次に、ビオチン標識抗体溶液を除去し、各ウエルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いて５回洗浄した。
【００９４】
次に、プレートの各ウエルに、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ＨＲＰ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＺＹＭＥＤ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）１００μＬを分注し、室温に１時間静置した（補足用抗体−抗原−検出用抗体−ＨＲＰの結合）。次に、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを除去し、各ウエルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いて３回洗浄した。なお、「ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）」は、ＥＬＩＳＡ法などで、抗原の検出に用いる酵素（ペルオキシダーゼ）であり、発色基質を加えた場合、発色反応を触媒する。
【００９５】
次に、ＨＲＰによる発色反応により、ＭＰＧ−１を検出した。発色反応の検出は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（このキットは、「ＡＢＴＳ（ペルオキシダーゼの発色基質）」を含有する。ＫＰＬ社製）を用いて行った。
【００９６】
キットに含まれる試薬「ＡＢＴＳ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」及び「Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂ」を等量混合し、プレート上の各ウエルに、その溶液を２００μＬずつ分注し、５〜１５分間、静置して反応させた。次に、キットに含まれる試薬「Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」を１００μＬずつ分注し、発色を停止させた。次に、プレートリーダーを用いて、４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、その測定値に基づき、標準線を作成した。
【００９７】
結果を図４に示す。図４中、横軸はＭＰＧ−１の濃度（対数）を、縦軸は吸光度（対数）を、それぞれ表す。
【００９８】
その結果、図４に示す通り、ＭＰＧ−１溶液の濃度（１０ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／Ｌ）と吸光度との間に、直線関係が得られた。このことは、本発明に係るＥＬＩＳＡシステムにより、ＭＰＧ−１を検出できること、及び、ＭＰＧ−１の定量的な検出が可能であることを示す。
【実施例６】
【００９９】
実施例６では、実施例５で構築したＥＬＩＳＡシステムを用いて、各種キノコ類の子実体にＭＰＧ−１が含有するかどうかを調べた。
【０１００】
まず、下記表４に示す各種キノコの子実体を、通信販売・百貨店などから購入した。購入したキノコ類の同定・確認は、「原色日本新菌類図鑑（Ｉ）」及び「原色日本新菌類図鑑（ＩＩ）」（ともに、保育社、昭和６２年発行）を参照して、キノコ子実体の形態を観察することにより行った。
【０１０１】
次に、購入した子実体を、生の状態のまま凍結乾燥し、粉砕してキノコ粉末を得た。次に、各キノコ粉末２０ｇに純水１．０Ｌを加え、９８℃、１時間、撹拌抽出し、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）を行い、上清を回収した。また、上清回収後に残った残渣に純水１．０Ｌを加え、前記と同様の操作を行い、再び上清を回収し、前回回収した上清と併せた。そして、透析膜（「Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ３  ｍｅｍｂｒａｎｅ」、分画分子量３，５００Ｄ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社製）を用いて、全上清を純水に対して３日間透析した後、凍結乾燥し、「キノコ熱水抽出画分」を調製した。
【０１０２】
次に、調製したキノコ熱水抽出画分を純水に溶解し、濃度を１０ｍｇ／ｍＬにした後、実施例５で構築したＥＬＩＳＡシステムを用いて、各キノコにＭＰＧ−１が含有しているかどうか、調べた。ＭＰＧ−１の含有量は、図４の標準線を用いて、吸光度の測定値から取得した。
【０１０３】
結果を表４に示す。なお、検出限界は１μｇ／ｇとした。
【表４】
2007169207.tif 000005
【０１０４】
表４に示す通り、実施例５で構築したＥＬＩＳＡシステムを用いることにより、ＭＰＧ−１を定量的に検出することができた。また、ＭＰＧ−１がマツタケに特異的な成分であり、他のキノコからはほとんど検出されないことが確認できた。その他、ＭＰＧ−１は京都産のマツタケに最も多く含有することが判明した。
【実施例７】
【０１０５】
実施例７では、実施例５で構築したＥＬＩＳＡシステムを用いて、マツタケ菌糸体にＭＰＧ−１が含有するかどうかを調べた。
【０１０６】
本実施例では、財団法人発酵研究所より譲渡され、株式会社クレハ・生物医学研究所で維持しているマツタケ菌株８種（ＩＦＯ０６９１５、ＩＦＯ０６９２５、ＩＦＯ０６９３０、ＩＦＯ０６９３５、ＩＦＯ３０６０４、ＩＦＯ３０６０５、ＩＦＯ３０６０６、ＩＦＯ４６００３８）、及び、昭和４１年に栃木県で採取したスエヒロタケの子実体から分離した分離した菌糸を株式会社クレハ・生物医学研究所で継代・維持しているスエヒロタケ菌株（株式会社クレハ内保管番号ＣＭ５５６）を用いた。
【０１０７】
まず、５００ｍＬ容三角フラスコに、滅菌済み培地（３％グルコース、０．３％酵母エキス含有、ｐＨ６．０）を入れ、その中に、これらの菌株をそれぞれ接種し、２４℃、１０週間、培養した。
【０１０８】
次に、１０週間の培養後、培養物（培地及び菌体塊）をホモジナイザーにかけて分散・破砕し、それらを９３〜９８℃のウオーターバスに入れ、３時間、スターラーを用いて撹拌した。そして、室温まで冷却した後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）を行い、上清を回収した。また、上清回収後に残った残渣について、前記と同様の操作を行い、再び上清を回収した。この操作を計３回繰り返し、回収した全上清を併せた。そして、透析膜（「Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ３  ｍｅｍｂｒａｎｅ」、分画分子量３，５００Ｄ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社製）を用いて、全上清を純水に対して３日間透析し、透析膜内液をロータリーエバポレーターで濃縮した後、凍結乾燥し、「菌糸体熱水抽出画分」を調製した。
【０１０９】
次に、調製した菌糸体熱水抽出画分を純水に溶解し、濃度を１０ｍｇ／ｍＬにした後、実施例５で構築したＥＬＩＳＡシステムを用いて、各菌糸体にＭＰＧ−１が含有しているかどうか、調べた。ＭＰＧ−１の含有量は、図４の標準線を用いて、吸光度の測定値から取得した。
【０１１０】
結果を表５に示す。なお、検出限界は１μｇ／ｇとした。
【表５】
2007169207.tif 000006
【０１１１】
表５に示す通り、マツタケ菌糸体からも、ＭＰＧ−１を検出できた。即ち、本実験結果は、本発明に係るＥＬＩＳＡシステムを用いることにより、マツタケ子実体由来成分の含有だけでなく、マツタケ菌糸体由来成分の含有をも検出できることを示す。
【実施例８】
【０１１２】
実施例８では、実施例５で構築したＥＬＩＳＡシステムと多糖体標品との反応性について、検討した。
【０１１３】
本実施例に用いた多糖体のうち、グリコーゲンＩＩ、グリコーゲンＩＸ、デキストリン、コーンスターチ、ライススターチ、アミロース、アミロペクチン、プルラン、ラミナリン、酵母グルカン、大麦グルカン及びイヌリンはシグマ−アルドリッチ社から購入した。また、レンチナンは味の素株式会社から、ソニフィランは科研製薬株式会社から、それぞれ購入した。
【０１１４】
アガリクス茸子実体（学名「Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｌａｚｅｉ  Ｍｕｒｉｌｌ」）由来の標品は、市販のブラジル産乾燥アガリクス製品（内田商事より購入）を原料とし、Ｍｉｚｕｎｏらの方法（Takashi Mizuno et al, “Antitumor fruiting body of Agaricus blazei Murill” Agric Biol Chem, 54: 2889-2896, 1990）に準じて調製し、得た。
【０１１５】
具体的な手順は以下の通りである。
【０１１６】
アガリクス茸乾燥子実体を微粉砕化し、そのうち１００ｇに８０％エタノール１Ｌを加え、８５℃、３時間、撹拌抽出操作を行い、その操作を３回繰り返し、抽出残渣を得た。次に、この抽出残渣に純水１Ｌを加え、９８℃、３時間、撹拌抽出操作を行い、その操作を３回繰り返し、抽出液を得た。次に、ロータリーエバポレーターを用いてその抽出液を５００ｍＬにまで減圧濃縮した後、４倍容量のエタノールを加え、３時間静置し、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、３０分間、４℃）を行い、沈澱画分を回収した。
【０１１７】
次に、その沈澱画分を、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。まず、沈澱画分を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、次に、ＤＥＡＥイオン交換カラムにその溶解液をアプライし、溶出液Ａ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）と溶出液Ｂ（１Ｍ塩化ナトリウム含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）とを用いてリニアグラジエント溶出し、ＦＡ−１画分とＦＡ−２画分を回収した。なお、カラムの平衡化は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で行った。
【０１１８】
次に、それらの画分のゲルろ過を行った。ＦＡ−１画分及びＦＡ−２画分を、それぞれ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００（ファルマシア社製）充填カラム（径１６ｍｍ、長さ３０ｃｍ）にアプライし、ＦＡ−１−ａ及びＦＡ−２−ｂに相当する画分を得た。さらに、これらの画分について、クロマトグラフィーを行い、それぞれ、ＦＡ−１−ａ−β、ＦＡ−１−ａ−α、ＦＡ−２−ａ−β、ＦＡ−２−ａ−αに相当する画分を得た。
【０１１９】
得られた各画分について、比色法により糖：タンパク質比を測定した結果、その比は、それぞれ、９８：２、９９：１、９９：１、９９：１であった。また、ＨＰＬＣを用いて構成糖を分析した結果、いずれの画分も、大部分がグルコースであり、その他、ガラクトース、フコース、リボース、マンノースなどが検出された。得られた各画分について、１Ｈ−ＮＭＲ分析を行った結果、ＦＡ−１−ａ−β画分では、４．６ｐｐｍ（β−１，４又はβ−１，６結合）及び５．４ｐｐｍ（α−１，４又はα−１，３結合）のピークを、ＦＡ−１−ａ−α画分では、（α−１，４又はα−１，３結合）のピークを、ＦＡ−２−ａ−β画分では、４．６ｐｐｍ（β−１，４又はβ−１，６結合）のピークを、それぞれ認めた。
【０１２０】
乾燥メシマコブ（学名「Ｐｈｅｌｌｉｎｕｓ  ｌｉｎｔｅｕｓ」）子実体由来の標本は、市販メシマコブ子実体を原料とし、Ｋｉｍらの方法（G.Y. Kim et al, “Purification and characterization from the fruiting body of Phellinus liteus (Berk and M.A. Curtis) Teng.” Biosour. Technol. 89: 81-87, 2003）に準じて調製し、得た。
【０１２１】
具体的な手順は以下の通りである。
【０１２２】
メシマコブ乾燥子実体微粉砕品（「天然メシマコブ  １００％粉末」、日本生薬株式会社製）１００ｇに、８０％エタノール１Ｌを加え、８５℃、３時間、撹拌抽出操作を行い、その操作を３回繰り返し、抽出残渣を得た。次に、この抽出残渣に純水１Ｌを加え、９８℃、３時間、撹拌抽出操作を行い、その操作を３回繰り返し、抽出液を得た。次に、ロータリーエバポレーターを用いてその抽出液を５００ｍＬにまで減圧濃縮した後、４倍容量のエタノールを加え、３時間静置し、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、３０分間、４℃）を行い、沈澱画分を回収した。
【０１２３】
次に、その沈澱画分を、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。まず、沈澱画分を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、次に、ＤＥＡＥイオン交換カラムにその溶解液をアプライし、溶出液Ａ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）と溶出液Ｂ（１Ｍ塩化ナトリウム含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）とを用いてリニアグラジエント溶出し、ＰＬに相当する画分を回収した。なお、カラムの平衡化は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で行った。
【０１２４】
得られたＰＬ画分について、比色法により糖：タンパク質比を測定した結果、その比は、９９：１であった。また、ＨＰＬＣを用いて構成糖を分析した結果、いずれの画分も、大部分がグルコースであり、その他、マンノース、ガラクトース、リボースなどが検出された。
【０１２５】
以上の多糖類標品を純水に溶解し、濃度を１０ｍｇ／ｍＬにした後、実施例５で構築したＥＬＩＳＡシステムを用いて、各標品にＭＰＧ−１が含有しているかどうか、調べた。ＭＰＧ−１の含有量は、図４の標準線を用いて、吸光度の測定値から取得した。
【０１２６】
結果を表６に示す。なお、検出限界は１μｇ／ｇとした。
【表６】
2007169207.tif 000007
【０１２７】
表６に示す通り、１９種類の多糖類標品は、全て反応陰性であった。
【実施例９】
【０１２８】
実施例９では、薬局などで市販されているキノコ健康食品について、実施例５で構築したＥＬＩＳＡシステムを用いて、マツタケ由来成分が含有しているかどうかを調べた。
【０１２９】
用いたキノコ健康食品は、マツマックス６００（「マツマックス」は登録商標、販売元：三共株式会社）、マツマックス２００（（「マツマックス」は登録商標、販売元：三共株式会社）、仙生露（登録商標、販売元：株式会社サンドリー）、万寿丹（販売元：カネボウ薬品株式会社）、アガリクス・ブラゼイ（販売元：株式会社ファンケル）、アガリクス茸濃縮液（販売元：サンウエル株式会社）、姫マツタケ（販売元：日本ケミファ株式会社）、メシマコブ（販売元：株式会社ファンケル）、メシマセルダイレクト（登録商標、販売元：株式会社ライフニックス）、キングメシマコブ（株式会社スペース・スリー）、内田の霊芝（販売元：内田商事）、マイタケエキス（販売元：株式会社ファンケル）、六角霊芝（販売元：サントリー健研）、ハタケシメジ（販売元：株式会社永昌源）、キノコパワー（登録商標、販売元：タカラアグリ株式会社）、以上１５品である。
【０１３０】
それらの製品に純水を添加して懸濁し、濃度を１ｇ／１００ｍＬにした後、ホモジナイザーにかけて分散・破砕し、それらを９３〜９８℃のウオーターバスに入れ、３時間、スターラーを用いて撹拌した。そして、室温まで冷却した後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）を行い、上清を回収した。
【０１３１】
そして、その上清について、実施例５で構築したＥＬＩＳＡシステムを用いて、各製品にＭＰＧ−１が含有しているかどうかを調べた。ＭＰＧ−１の含有量は、図４の標準線を用いて、吸光度の測定値から取得した。
【０１３２】
結果を表７に示す。なお、検出限界は１μｇ／ｇとした。
【表７】
2007169207.tif 000008
【０１３３】
表７に示す通り、本発明に係るＥＬＩＳＡシステムを用いて、マツタケ由来の製品のみを検出できた。
【実施例１０】
【０１３４】
実施例１０では、実施例５で構築したＥＬＩＳＡシステムを用いることにより、飲食物中に含有するマツタケ由来成分を、定量的に検出できるかどうかを検討した。
【０１３５】
マツタケ由来成分を含有する飲食物として、マツタケ入りご飯、マツタケ菌糸体入りパン、マツタケ風味のお吸い物、マツタケ菌糸体入り味噌汁、マツタケ菌糸体入りお茶、マツタケ菌糸体入りヨーグルトを作製した。
【０１３６】
マツタケ入りご飯の作製は、以下の手順で行った。
【０１３７】
まず、米３合（４２０ｇ）を洗米した後、ざるで水切りをし、次に、水切り後の米の重量の１．５倍になるように水を加え、３０分間、浸漬給水させた。総重量は１，０５０ｇになった。次に、マツタケ菌糸体乾燥粉末１．８ｇを加え、炊飯器（製品名「ＳＲ−ＶＴＭ１０」、ナショナル株式会社製）で炊飯した。そして、炊き上がり後、飯台に移し、濡れ布巾をかけ、放冷した。なお、対照では、マツタケ菌糸体の替わりに小麦粉１．８ｇを用いた。
【０１３８】
また、別途、レトルト製品を用いて、マツタケ入りご飯を作製した。「炊き込み御膳  マツタケご飯（江崎グリコ株式会社製）」を用いて、記載された調理手順に従って加熱し、マツタケ入りご飯を作製した。
【０１３９】
次に、各マツタケ入りご飯について、ご飯１００ｇに純水３Ｌを加え、ホモジナイザーにかけて分散・破砕し、それらを９８℃のウオーターバスに入れ、３時間、スターラーを用いて撹拌した。そして、室温まで冷却した後、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、３０分間、４℃）を行い、上清を回収し、その上清を家庭用冷蔵庫で冷凍保存した。
【０１４０】
マツタケ菌糸体入りパンの作製は、以下の手順で行った。
【０１４１】
ホームベーカリー（自動ホームベーカリー  パンクラブＢＢ−ＨＡ１０、象印マホービン株式会社製）付属のパンケースに、飲料水２１０ｍＬ、パン粉（ベーカリーパンクラブミックスパンＢＢ−ＭＪ１０−Ｊ１用）３３０ｇ、ドライイースト３ｇ、マツタケ菌糸体乾燥粉末１．８ｇを加え、記載された調理手順に従って、食パンを作製した。なお、対照では、マツタケ菌糸体の替わりに小麦粉１．８ｇを用いた。
【０１４２】
次に、作製した食パンを３分割し、そのうちの一切れに純水３Ｌを加え、ホモジナイザーにかけて分散・破砕し、それらを９８℃のウオーターバスに入れ、３時間、スターラーを用いて撹拌した。そして、室温まで冷却した後、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、３０分間、４℃）を行い、上清を回収し、その上清を家庭用冷蔵庫で冷凍保存した。
【０１４３】
マツタケ風味のお吸い物、マツタケ菌糸体入り味噌汁、マツタケ菌糸体入りお茶の作製は、以下の手順で行った。
【０１４４】
お吸い物は、「料亭のお吸い物  松茸（丸味屋食品工業株式会社製）」、及び、マツタケ風味を有すると記載されたお吸い物のインスタント製品について、記載された調理手順に従って熱湯を注ぎ、作製した。味噌汁は、市販のインスタント味噌汁に、マツタケ菌糸体乾燥粉末１．８ｇを加え、熱湯を注ぎ、作製した。お茶は、所定量のお茶葉にマツタケ菌糸体乾燥粉末１．８ｇを加え、熱湯を注ぎ、作製した。
【０１４５】
次に、それらの飲食物を室温まで冷却した後、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、３０分間、４℃）を行い、上清を回収し、その上清を家庭用冷蔵庫で冷凍保存した。
【０１４６】
マツタケ菌糸体入りヨーグルトの作成は、以下の手順で行った。
【０１４７】
まず、紙パック容器に入った市販の牛乳４００ｍＬに、マツタケ菌糸体乾燥粉末１．８ｇと市販のプレーンヨーグルト（スターター）６０ｍＬを加え、よく攪拌し、紙パック容器の開口部を閉じた。なお、対照では、マツタケ菌糸体の替わりに小麦粉１．８ｇを用いた。
【０１４８】
次に、ヨーグルトメーカー（製品名「ＭＭ−ＡＶ０５Ｄ」、象印マホービン株式会社製）内に熱湯を注ぎ、その中に紙パック容器を浸け、蓋を閉じて、約８時間発酵させた。そして、発酵後、紙パック容器ごと、家庭用冷蔵庫に入れ、冷蔵保存した。
【０１４９】
次に、紙パック容器からヨーグルト５０ｇを取り出し、純水２００ｍＬを加え、ホモジナイザーにかけて分散・破砕し、それらを９８℃のウオーターバスに入れ、３時間、スターラーを用いて撹拌した。そして、室温まで冷却した後、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、３０分間、４℃）を行い、上清を回収し、その上清を家庭用冷蔵庫で再び冷凍保存した。
【０１５０】
以上、各食品から回収した上清について、それぞれ、実施例５で構築したＥＬＩＳＡシステムを用いて、ＭＰＧ−１含有量の定量を行った。ＭＰＧ−１の含有量は、図４の標準曲線を用いて、吸光度の測定値から取得した。
【０１５１】
結果を表８に示す。なお、検出限界は１μｇ／ｇとした。
【表８】
2007169207.tif 000009
【０１５２】
表８に示す通り、実施例５で構築したＥＬＩＳＡシステムを用いることにより、飲食物中に含有するマツタケ由来成分を、定量的に検出できた。また、サンプル７の結果が示す通り、本発明に係るＥＬＩＳＡシステムを用いることにより、実際にはマツタケ由来成分を含有しない飲食物を簡易かつ高精度に判別できることが分かった。
【実施例１１】
【０１５３】
実施例１１では、実施例１で作製した抗ＭＰＧ−１抗体を用いて、免疫染色を試みた。
【０１５４】
まず、８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、マツタケ菌糸体製剤ＣＭ６２７１を１５０ｍｇ／ｋｇ又は実施例１で調製したＭＰＧ−１を、２５ｍｇ／ｋｇ経口投与した。次に、経口投与の１時間後又は５時間後にと殺し、腸管免疫組織のパイエル板を摘出し、ホルマリン固定した。
【０１５５】
次に、所定の方法により、その組織のプレパラート標本を作製し、実施例１で作製した抗ＭＰＧ−１抗体を用いて、免疫染色を施した。
【０１５６】
結果を図５に示す。図５は、マツタケ菌糸体製剤経口投与後のマウス腸管パイエル板におけるＭＰＧ−１の動態を示す顕微鏡写真である。
【０１５７】
図中、左側の写真（Ａ）はマツタケ菌糸体製剤非投与時のもの、中央の写真（Ｂ）はマツタケ菌糸体製剤投与の１時間後にと殺した場合のもの、右側の写真（Ｃ）は同じく５時間後にと殺した場合のものである。楕円で囲まれた部分が、免疫染色により染色された部分である。なお、各顕微鏡写真の倍率は、１０倍である。
【０１５８】
図５より、ＭＰＧ−１は、経口投与の１時間後には、腸管パイエル板のＭ細胞領域に局在し、経口投与の５時間後には、Ｍ細胞領域に加えて、傍濾胞領域にも局在することが分かった。また、本実験結果より、ＭＰＧ−１は、その抗原構造を保ったまま、腸管免疫組織まで到達し、その組織の細胞と結合することが分かった。
【実施例１２】
【０１５９】
実施例１２では、実施例５で構築したＥＬＩＳＡシステムを用いて、マツタケ菌糸体製剤を投与した場合における、血中のＭＰＧ−１濃度の経過を調べた。
【０１６０】
まず、マツタケ菌糸体製剤ＣＭ６２７１を、０．５％メチルセルロース４００ＣＰ（信越化学工業株式会社製）溶液に、２００ｍｇ／ｋｇの割合で懸濁した後、７週齢のＳＤ系雄性ラット（日本チャールズ・リバー株式会社より購入）に、１０ｍＬ／ｋｇ経口投与した。
【０１６１】
次に、ＣＭ６２７１投与の１、４、８、２４、１６８時間後に採血した。次に、採取した血液を、室温で１時間静置した後、一昼夜、４℃で保存した。そして、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分間）を行い、血清を得た。
【０１６２】
次に、実施例５で構築したＥＬＩＳＡシステムを用いて、得られた各血清における、ＭＰＧ−１含有量の定量を行った。ＭＰＧ−１の含有量は、図４の標準曲線を用いて、吸光度の測定値から取得した。
【０１６３】
結果を図６に示す。図６は、マツタケ菌糸体製剤経口投与後における血清中のＭＰＧ−１の濃度の経過を示すグラフである。
【０１６４】
図中のグラフの横軸は、マツタケ菌糸体製剤経口投与からの経過時間（ｈｒ）を、縦軸は、血清中におけるＭＰＧ−１の含有量（ｎｇ／ｍＬ）を、それぞれ表す。
【０１６５】
図６より、マツタケ菌糸体製剤を経口投与した場合、投与の４時間後位より、ＭＰＧ−１の血中濃度が上昇し、投与の８〜２４時間後位に最高濃度に達し、１６８時間経過後には、血中濃度が大幅に減少していることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０１６６】
本発明により、飲食物や医薬品、特に、日常摂取する健康食品やサプリメントなどに含有するαグルカン−タンパク質複合体量を正確に検出できる。従って、それらの製品の品質保証度を高めることができる点で有用である。また、本発明により、特定の生理活性物質の摂取量（投与量）を正確に把握できるため、ヘルスケア（健康管理）の観点からも有用である。
【０１６７】
その他、本発明により、特定の生理活性物質の血中濃度などについても正確に把握できるため、飲食物などの摂取後における体内動態も把握でき、ヘルスケア（健康管理）の観点から有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】実施例１において、抗原調製手順及び用いた画分を示す図。
【図２】実施例１において、ＥＬＩＳＡ法により測定した抗体価を示すグラフ。
【図３】実施例１において、ドットブロット法による抗体価測定の結果を示す免疫ブロット写真。
【図４】実施例５において、ＭＰＧ−１濃度と吸光度との関係を表す標準線を示すグラフ。
【図５】実施例１１において、マツタケ菌糸体製剤経口投与後のマウスパイエル板におけるＭＰＧ−１の動態を示す顕微鏡写真。
【図６】実施例１２において、マツタケ菌糸体製剤経口投与後における血清中のＭＰＧ−１の濃度の経過を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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