(57)【要約】      （修正有）【課題】植物細胞へ直接導入した遺伝子の欠損や断片化を回避し、形質転換体の取得効率を向上させる植物細胞に対する遺伝子導入方法の提供。【解決手段】タバコのキチナーゼ遺伝子ＣＨＮ５０の上流領域より単離したＤＮＡを導入遺伝子の両端に配置したＤＮＡ構築物、このDNA構築物を含む組換えベクター、この組換えベクターからなる植物細胞に対する遺伝子導入用試薬、この組換えベクターを、アグロバクテリウム菌の感染を介さずに植物細胞へ導入する、植物細胞に対する遺伝子導入方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号1に示される塩基配列、または当該配列と91％以上の相同性を有し、且つ導入遺伝子の断片化を回避して形質転換効率を上昇させうる塩基配列を有するDNAからなることを特徴とする、植物細胞に対する遺伝子導入用試薬。
【請求項２】
植物細胞に導入する遺伝子の両端に、請求項1に記載のDNAが結合していることを特徴とする、DNA構築物。
【請求項３】
植物細胞に導入する遺伝子が、構造遺伝子の5´末端側にプロモーター、3´末端側にターミネターを有する遺伝子カセットであることを特徴とする、請求項2に記載のDNA構築物。
【請求項４】
遺伝子または遺伝子カセットを複数連結した構造物の両端に、請求項1に記載のDNAが結合していることを特徴とする、DNA構築物。
【請求項５】
遺伝子または遺伝子カセットを複数連結した構造物の少なくとも一端、および上記遺伝子または遺伝子カセットの間に請求項１に記載のDNAが配置されていることを特徴とする、DNA構築物。
【請求項６】
請求項２〜５のいずれかに記載のDNA構築物を含む組換えベクター。
【請求項７】
請求項２〜５のいずれかに記載のDNA構築物、あるいは請求項5に記載の組換えベクターが導入されていることを特徴とする植物細胞、または植物体。
【請求項８】
請求項1に記載のDNAが、制限酵素認識配列を有するDNAを介して連結していることを特徴とする、DNA。
【請求項９】
請求項８に記載のDNAを含有することを特徴とする、組換えベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載のDNA、あるいは請求項９に記載の組換えベクターからなることを特徴とする、植物細胞に対する遺伝子導入用試薬。
【請求項１１】
請求項２〜５のいずれかに記載のDNA構築物、または請求項６に記載の組換えベクターを、アグロバクテリウム菌の感染を介さずに植物細胞へ導入することを特徴とする、遺伝子導入法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アグロバクテリウム感染を介さない形質転換法において、形質転換体の取得効率を向上させるための手段、方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
任意の遺伝子を導入して細胞形質を変換する技術（形質転換技術）は、遺伝子機能の解析や分子育種を行う上で不可欠である。植物細胞へ遺伝子を導入する方法として、アグロバクテリウム法、プロトプラストへの直接導入法、パーティクルガンを用いたボンバードメント法などが挙げられる（非特許文献1）。
【０００３】
アグロバクテリウム法は、グラム陰性土壌細菌Agrobacterium tumefaciens が持つTiプラスミド上のT-DNA領域が植物ゲノムに組み込まれるシステムを利用した遺伝子導入法である（非特許文献2、3）。そのため、アグロバクテリウムによって細胞内に導入された遺伝子は、無傷でゲノムに組み込まれやすい（非特許文献4、5）。近年では、100 kb以上の長さのDNAフラグメントを導入し、形質転換体を得ることが可能である（非特許文献6、7）。しかしながら、宿主となる植物の種類や器官組織によっては、感染部位が壊死し形質転換体が得られない場合がある（非特許文献8）。
【０００４】
一方、プロトプラストやパーティクルガンを用いる導入法は、遺伝子を直接的に細胞内へ送り込むため、アグロバクテリウム法の適用が困難な植物材料からでも形質転換体を得ることが可能である。しかしながら、導入後の遺伝子は細胞内で断片化しやすいため（非特許文献9、10）、導入遺伝子のDNA鎖が長いほど、形質転換体の取得が困難となる。現在、プロトプラストやパーティクルガンなどを用いた直接導入法では、導入遺伝子を欠損させることなく、安定的にゲノムへ組み込む技術が必要とされている。
【０００５】
【非特許文献１】Newell C. A. (2000) Plant transformation technology: developments and applications. Mol. Biotechol. 16: 53-65.
【非特許文献２】Hooykaas P. J. J. and Schilperoort R. A. (1992) Agrobacterium and plant genetic engineering. Plant Mol. Biol. 19: 15-38.
【非特許文献３】Tzfira T., Li J., Lacroix B. and Citovsky V. (2004) Agrobacterium T-DNA integration: molecules and models. Trends Genet. 20: 375-383.
【非特許文献４】Dai S., Zheng P., Marmey P., Zhang S., Tian W., Chen S., Beachy R. N. and Fauquet C. (2001) Comparative analysis of transgenic rice plants obtained by Agrobacterium-mediated transformation and particle bombardment. Mol. Breed. 7: 25-33.
【非特許文献５】Travella S., Ross S. M., Harden J., Everett C., Snape J. W. and Harwood W. A. (2005) A comparison of transgenic barley lines produced by particle bombardment and Agrobacterium-mediated techniques. Plant Cell Rep. 23: 780-789.
【非特許文献６】Hamilton C. M., Frary A., Lewis C. and Tanksley S. D. (1996) Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 9975-9979.
【非特許文献７】Liu Y-G, Shirano Y., Fukai H., Yanai Y., Tasaka M., Tabata S. and Shibata D. (1999) Complementation of plant mutants with large genomic DNA fragments by a transformation-competent artificial chromosome vector accelerates positional cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 6535-6540.
【非特許文献８】Gelvin S. B. (2003) Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the “Gene-jockeying” tool. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67: 16-37.
【非特許文献９】Kohli A., Leech M., Vain P., Laurie D. A. and Christou P. (1998) Transgene organization in rice engineered through direct DNA transfer supports a two-phase integration mechanism mediated by the establishment of integration hot spots. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 7203-7208.
【非特許文献１０】Pawlowski W. P. and Somers D. A. (1998) Transgenic DNA integrated into the oat genome is frequently interspersed by host DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 12106-12110.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、アグロバクテリウム感染を介さずに植物細胞へ遺伝子を導入する方法、すなわち直接導入法において、従来技術の問題点である遺伝子の欠損や断片化を回避し、形質転換体の取得効率を向上させようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究の結果、タバコ（Nicotiana tabacum L.）キチナーゼ遺伝子CHN50の上流領域に存在するポリヌクレオチドCh5UTをハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（HPT）遺伝子の両端に付加し、それを植物細胞に直接導入した場合、該HPT遺伝子が欠損あるいは断片化することなくゲノムDNAに組み込まれ、形質転換体の収率が増大することを見出した。そして、さらなる研究を進めた結果、このようなCh5UTの機能は、遺伝子の種類に限定されず、また、遺伝子を複数連結させた場合であっても発揮されるという驚くべき知見を得た。
すなわち、本発明者らは、このCh5UTを使用する手段が植物の遺伝子導入技術として普遍性を有し、且つ従来技術の問題点を克服しうる極めて有効な手段であることを確認し、本発明を完成するに至ったものであり、その内容は、以下（1）〜（10）に示すとおりである。
【０００８】
（１）配列表の配列番号1に示される塩基配列、または当該配列と91％以上の相同性を有し、且つ導入遺伝子の断片化を回避して形質転換効率を上昇させうる塩基配列を有するDNAからなることを特徴とする、植物細胞に対する遺伝子導入用試薬。
（２）植物細胞に導入する遺伝子の両端に、上記（1）に記載のDNAが結合していることを特徴とする、DNA構築物。
（３）植物細胞に導入する遺伝子が、構造遺伝子の5´末端側にプロモーター、 3´末端側にターミネターを有する遺伝子カセットであることを特徴とする、上記（2）に記載のDNA構築物。
（４）遺伝子または遺伝子カセットを複数連結した構造物の両端に、上記（1）に記載のDNAが結合していることを特徴とする、DNA構築物。
（５）遺伝子または遺伝子カセットを複数連結した構造物の少なくとも一端、および上記遺伝子または遺伝子カセットの間に請求項１に記載のDNAが配置されていることを特徴とする、DNA構築物。
（６）上記（２）〜（５）のいずれかに記載のDNA構築物を含む組換えベクター。
（７）上記（２）〜（５）のいずれかに記載のDNA構築物、あるいは上記（６）に記載の組換えベクターが導入されていることを特徴とする植物細胞、または植物体。
（８）上記（１）に記載のDNAが、制限酵素認識配列を有するDNAを介して連結していることを特徴とする、DNA。
（９）上記（８）に記載のDNAを含有することを特徴とする、組換えベクター。
（１０）上記（８）に記載のDNA、あるいは上記（９）に記載の組換えベクターからなることを特徴とする、植物細胞に対する遺伝子導入用試薬。
（１１）上記（２）〜（５）のいずれかに記載のDNA構築物、または上記（６）に記載の組換えベクターを、アグロバクテリウム菌の感染を介さずに植物細胞へ導入することを特徴とする、遺伝子導入法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明におけるDNA構築物は、植物細胞へ直接的に導入された遺伝子が欠損もしくは断片化するのを回避し、形質転換体の取得効率を上昇させる機能を持つ。これにより、アグロバクテリウムによる遺伝子導入が困難な植物材料でも、多数の形質転換体を取得することが可能となる。
また、多重連結遺伝子の直接導入においては、目的とする複数の遺伝子を1つのDNAフラグメントとしてゲノムに組み込むことができるため、1回の導入操作で複数の形質を植物に付与することが可能となる。これにより、各遺伝子を個別に導入する従来技術に比べ、目的の形質転換体を取得するのに必要な労力や時間が大幅に削減される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明において、植物に対する遺伝子導入用試薬として使用するCh5UTは、タバコキチナーゼ遺伝子CHN50の上流領域から単離されたDNAであり、Ch5UTの塩基配列は、配列表の配列番号1に示されるとおりである。
このCh5UTの塩基配列には、2つの核マトリクス付着領域（Matrix Attachment Regions, MARs）が含まれることが知られている（Fukuda, Plant Mol. Biol. 39: 1051-1062, 1999）。
また、本発明においては、上記配列番号１に示される塩基配列を有するDNAのみにかぎらず、該塩基配列と91％以上の相同性を有するDNA、例えば配列番号１に示される塩基配列において、１乃至数個のヌクレオチドが、欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有するDNAであっても、導入遺伝子の断片化を回避して形質転換効率を上昇させる機能を有する限り、上記遺伝子導入試薬として使用できる。
【００１１】
本発明の遺伝子導入用試薬として使用するこれらDNA（以下、単にCh5UTと称する）は、植物に導入しようとする遺伝子の両端に配置する。なお、本明細書における遺伝子とは、植物細胞内において、1つの転写単位として機能しうるDNAを意味する。
植物細胞内で機能する遺伝子の例としては、シロイヌナズナの花弁形成遺伝子RABBIT EARS（Takedaら, Development 131: 425-434, 2004）、イネの矮性遺伝子GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1（Ueguchi-Tanakaら, Nature 437: 693-698, 2005），コムギのバーナリゼーション遺伝子VRN1（Yanら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 6263-6268, 2003）、トマトの耐病性遺伝子Ve（Kawchukら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6511-6515, 2001）、ビートのネマトーダ耐性遺伝子Hs1（Caiら, Science 275: 832-834, 1997）などが挙げられる。
植物に導入しようとする遺伝子が、蛋白質をコードする構造遺伝子である場合には、植物細胞あるいは植物体内で該構造遺伝子を機能させるために、その5´末端側にプロモーター、3´末端側にターミネーターを配置した遺伝子カセットとして使用する。この構造遺伝子としては、ポリシストロニックな転写物を介して2個以上の任意タンパク質を産出しうるポリヌクレオチド（特願2001-505725）も含まれる。
【００１２】
また、上記遺伝子カセットの構築に使用されるプロモーターおよびターミネーターは、植物細胞内で構造遺伝子の転写に機能するものであれば、特に制限はない。
植物細胞で機能するプロモーターの例としては、恒常的に機能するカリフラワーモザイクウイルスの35S RNAプロモーター（CaMV 35S; Odellら, Nature 313: 810-812, 1985）、組織特異的に機能するβ-Conglycinin遺伝子プロモーター（種子胚; Chenら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 8560-8564, 1986）、2A11遺伝子プロモーター（果実; Van HaarenとHouck, Plant Mol. Biol. 21: 625-640, 1993）、 Lhcb3遺伝子プロモーター（葉; AliとTaylor, Plant Mol. Biol. 46: 325-333, 2001）、lat52遺伝子プロモーター（花粉; BateとTwell, Plant Mol. Biol. 37: 859-869, 1998）、さらに,外的刺激による誘導が可能なIn2-2遺伝子プロモーター（benzenesulfonamide誘導性; De Veylderら, Plant Cell Physiol. 38: 568-577, 1997）、SpoAI遺伝子プロモーター（ショ糖誘導性; Morikami ら, Mol. Genet. Genomics 272: 690-699, 2005）、HSP18.2遺伝子プロモーター（熱ショック誘導性; Yoshidaら, Appl. Microbiol. Biotechnol. 44: 466-472, 1995）などが挙げられる。
【００１３】
植物に導入する遺伝子もしくは遺伝子カセットの両端に配置されるCh5UTの配列方向は限定されない。すなわち、配列表の配列番号1に記載される塩基配列1から1933の方向を正とした場合、以下に記載する4とおりのDNA構築物が使用可能である。
(1)  Ch5UT（正）−遺伝子（遺伝子カセット）−Ch5UT（正）
(2)  Ch5UT（正）−遺伝子（遺伝子カセット）−Ch5UT（逆）
(3)  Ch5UT（逆）−遺伝子（遺伝子カセット）−Ch5UT（正）
(4)  Ch5UT（逆）−遺伝子（遺伝子カセット）−Ch5UT（逆）
【００１４】
このDNA構築物では、Ch5UTで両端を挟まれる遺伝子は１個のみでなく複数個でもよく、例えば、任意の遺伝子または遺伝子カセットを2個以上連結したDNAの両端に、Ch5UTを配置して使用することが可能である。
また、2個以上の遺伝子（遺伝子カセット）を連結する際、Ch5UTを介在させることにより、形質転換体の取得効率を大幅に上昇させることが可能である。また、Ch5UTが介在する遺伝子（遺伝子カセット）連結物の一端または両端にさらなるCh5UTを配置すれば、その効果は増強される。すなわち、本発明のDNA構築物は、導入遺伝子が単独または連結された形態を問わず、それら両端にCh5UTが配置された構造を有すれば良い。
なお、本明細書におけるDNA構築物とは、植物細胞に導入する遺伝子（遺伝子カセットを含む）の両端、あるいは該遺伝子（遺伝子カセットを含む）を複数連結したものの両端に、Ch5UTを結合させた配列を少なくとも含む合成DNAを意味する。
【００１５】
本発明のDNA構築物を構成しうるDNA（Ch5UT、遺伝子および遺伝子カセット）を連結するために、該DNAの両端に制限酵素認識配列を導入することができる。このとき、切断後のDNA末端の形状が異なる制限酵素認識配列を組み合わせることにより、DNAフラグメントを目的とする順列で連結することが可能となる。得られたDNA構築物は、PCR（Polymerase Chain Reaction）、若しくは、任意ベクターに組み込んで適切な宿主に導入することにより、増幅することができる。
【００１６】
さらに、本発明のDNA構築物を作製するために、当業者に公知のあらゆるクローニング系を用いることができる。すなわち、任意ベクターのクローニング部位に対し、適切なリンカーを両端に持つCh5UTおよび遺伝子（遺伝子カセットを含む）を個別に挿入し、その都度、宿主に導入して増幅する。慣用の系としては、大腸菌を宿主としたプラスミドベクターによるクローニング系が挙げられる。また、導入遺伝子の大きさによっては、長鎖DNAの挿入が可能なベクターによるクローニング系、例えば,酵母人工染色体（Yeast Artificial Chromosome, YAC）によるクローニング系（Adamら, Plant J. 11: 1349-1358, 1997）などを使用することも可能である。  
【００１７】
一方、本発明においては、制限酵素認識配列を有するDNAを介してCh5UTが2個あるいはそれ以上連結したDNAも、遺伝子導入用試薬として有用である。なお、各Ch5UTの間を繋ぐDNAに含まれる制限酵素認識配列の種類や個数に制限はない。
このような試薬を使用する場合には、導入遺伝子（遺伝子カセットを含む）の両端に、上記試薬DNAのCh5UT間に含まれるものと同じ制限酵素認識配列をリンカーとして導入する。そして、上記試薬DNAと該導入遺伝子を、同じ制限酵素で消化した後、リガーゼで連結する。これにより、簡便に導入遺伝子の両端にCh5UTを配置することが可能である。こうして得られたDNA構築物は、PCR、若しくは、任意ベクターにクローニングすることにより、適宜、増幅させることができる。
さらに、上記試薬DNAを含有するベクターも、遺伝子導入用試薬として有用である。このようなベクターを使用すれば、ベクター上のCh5UT間に導入遺伝子（遺伝子カセットを含む）を挿入するだけで、本発明のDNA構築物を有する組換えベクターを得ることが可能である。この場合、導入遺伝子の両端に適切な制限酵素認識配列を設け、上記と同様に制限酵素による切断およびリガーゼによる連結を行う。
【００１８】
本発明のDNA構築物あるいはこれを含む組換えベクターは、アグロバクテリウム菌の感染を介さず、植物細胞へ直接導入できる。導入方法としては、プロトプラスト化した細胞にポリエチレングリコール（Polyethylene Glycol, PEG）や電気パルスを使って入れる方法（Daveyら, Plant Mol. Biol. 13: 273-285, 1989）、パーティクルガンによるボンバードメント法（Christou, Plant J. 2: 275-281, 1992）の他、本発明の技術分野で既に確立されている多くの方法を使用することができる。
なお、該組換えベクターに関しては、植物細胞へ導入する際、ベクター骨格を必ずしも含む必要はない。すなわち、制限酵素処理によってベクター骨格を除去したDNA構築物のみの形態で導入し、形質転換体を得ることが可能である（Breitlerら, Theor. Appl. Genet. 104: 709-719, 2002）。
【００１９】
本発明のDNA構築物、あるいはこれを含む組換えベクターを導入することで形質転換された植物細胞は、植物体に再分化させることができる。再分化の方法は、植物の種類や遺伝子導入法などによって様々であり、その詳細な手順は多くの優れた実験書（例えば、植物組織培養の技術, 竹内正幸 編, 朝倉書店, 1983; 植物組織培養アトラス, 鎌田博 編, R&Dプランニング, 1987; Plant Cell Culture Protocols, Hall R.D. 編, Humana Press, 1999）に紹介されるとおりである。
以下に、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２０】
以下の実施例において、導入遺伝子の構築に関する一連のDNA操作は、特に明記しない限り、試薬に添付された説明書および慣用のプロトコール（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd edition, Sambrook J.とRussell D. W. 共著, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）に従った。
【００２１】
［実施例1］
薬剤耐性マーカーの1つであるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（HPT）遺伝子カセットの両端にCh5UTを付加し、それをタバコBY-2細胞株に導入した例を示す。
（A. 導入遺伝子の構築）植物細胞へ導入するDNA構築物は、Enforcement Cloning System pKF3（タカラバイオ社）を用いて作製した。すなわち、HPT遺伝子の発現カセット（Hellensら, Plant Mol. Biol. 42: 819-832, 2000）およびCh5UTのDNAフラグメントをプラスミドpKF3のマルチクローニング部位に挿入することにより、7種類の組換えベクターを作製した。これらベクターに含まれるDNA構築物を図1に示す。
【００２２】
（B. 植物細胞への遺伝子導入）上記ベクターを導入する植物材料として、タバコ（Nicotiana tabacum L.）培養細胞のBY-2株を用いた。BY-2細胞株を維持するために、7日毎に培養液3 mlを新鮮な改変LS培地（Nagataら, Mol. Gen. Genet. 184: 161-165, 1981）100 mlに移植した。移植後の細胞は、26℃、暗所、110 rpmの条件下で振盪培養した。
プロトプラストの調製およびベクター導入は、Negrutiuら（Plant Mol. Biol. 8: 363-373, 1987）の方法を一部改変して行った。移植後4日目のBY-2細胞を0.4 M マンニトールを含む改変LS培地（以後、Man/LSと記載）に10分間浸漬することにより、原形質分離を促した。その後、1.0% (w/v) セルラーゼオノズカRS（ヤクルト本社）および0.1% (w/v) ペクトリアーゼY23（キッコーマン社）を含むMan/LSに70分間浸漬することで細胞壁を消化した。得られたプロトプラストをW5溶液（0.4 M マンニトール、154 mM NaCl、125 mM CaCl2・2H2O、5 mM KCl、5 mM グルコース、1.5 mM MES (2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid), pH 5.8）で洗浄し、氷中に1時間静置した後、遺伝子導入に用いた。
【００２３】
Man/Mg溶液（0.4 M マンニトール、15 mM MgCl2、5 mM MES, pH 5.8）100 μlに懸濁したプロトプラスト106個に対し、ベクターDNA 0.2 pmolを加え、穏やかに混和した。次に、この混和液と等量のPEG溶液（0.4 M マンニトール、0.1 M Ca(NO3)2、40% (w/v) PEG 6000（Calbiochem社））を加え、穏やかに混和した。これを室温で20分間静置した後、W5溶液で10倍に希釈した。1,000rpm、2分間の遠心分離によって回収したプロトプラストをMan/LS で1回洗浄した後、0.8% (w/v) 低融点アガロース（Invitrogen社）を含むMan/LS 2 mlに包埋した。その際、シリコンリングを使ってディスク状（直径40 mm、1.5 mm厚）に成型した。
【００２４】
ベクター導入後のプロトプラストの培養は、以下の手順で行った。すなわち、プロトプラストを含むアガロースディスクをMan/LS 10 mlに浸漬し、26℃、暗所に1週間静置した。次に、Man/LSの浸透価を0.2 Mに下げ、さらに1週間静置した。このとき、ハイグロマイシンを100 μg/ml になるよう添加した。その後、アガロースディスクを200 μg/mlのハイグロマイシンを含む固形改変LS 培地（0.1% ゲルライト含有）に置床し、2週間の培養後、直径1 mm以上に生育した細胞塊の個数を調査した。結果を表1に示す。
【００２５】
【表１】
2007159562.tif 000002
【００２６】
HPT遺伝子カセットの両端にCh5UTをそれぞれ正の配列方向で付加して導入た場合、ハイグロマイシン耐性株の収量は2.8倍増大した。一方、配列方向がそれぞれ異なるCh5UTや一部配列が欠失したCh5UTの付加によっても、2.7から3.1倍の収量増大が認められた。
この結果は、本発明のDNA構築物が、Ch5UTの配列方向や一部配列の欠失に制限されることなく、形質転換体の取得効率を向上させる効果を有することを示している。
【００２７】
［実施例2］
緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子カセット、β-グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子カセットおよびHPT遺伝子カセットを連結した6.6 kbのDNAフラグメントの両端にCh5UTをそれぞれ正の配列方向で付加し、タバコBY-2細胞株に導入した例を示す。
【００２８】
（A. 導入遺伝子の構築）実施例1で得たHPT遺伝子カセットのみを含むpKF3ベクターに対し、GFP遺伝子カセット、GUS遺伝子カセットおよびCh5UTを挿入して植物用ベクターを作製した。GFP遺伝子カセットには、sGFP(S65T)遺伝子（Chiuら, Current Biol. 6: 325-330, 1996）にCaMV 35SプロモーターとタバコCHN50のターミネーター（Fukudaら, Plant Mol. Biol. 16: 1-10, 1991）を付加したものを使用した。GUS遺伝子カセット（Jeffersonら,EMBO J. 6: 3901-3907,1987）については、プロモーターとGUS遺伝子の間に存在する制限酵素Xba I、BamH IおよびSma Iの認識配列を除去して使用した。作製したベクターに含まれるDNA構築物GfGuH（GFP-GUS-HPT）およびU/ GfGuH /Uを図2に模式的に示す。
【００２９】
（B. 植物細胞への遺伝子導入）上記プラスミドベクターを、PEG（Polyethylene Glycol）融合法およびパーティクルボンバードメント法によってタバコBY-2細胞株に導入した。
PEG融合法によるベクター導入は、実施例1に記載した手順に従った。なお、プロトプラスト106個に導入するベクターDNA量は1.2 pmolとした。ベクター導入から4週間後、200 μg/mlのハイグロマイシン存在下で生育した細胞塊について、GFPおよびGUSの発現を調査した。
パーティクルボンバードメント法では、パーティクルガンBiolistic PDS-1000/He Particle Delivery System（Bio-Rad社）を用いてベクター導入を行った。
【００３０】
金粒子へのDNAコーティングは、以下の手順で行った。すなわち、金粒子（直径1.0 μm、Bio-Rad社）30 mgに70% エタノール1 mlを加え、十分に懸濁した後、蒸留水で3回洗浄した。回収した金粒子を50% グリセロール500 μlに懸濁した後、このうちの50 μl（金粒子3 mgを含む）を新しいチューブに移し、1 μg/μl DNA溶液5 μl、2.5 mM CaCl2 50 μl、0.1 M スペルミジン 20 μlを添加して混和した。これを氷中に10分間静置した後、10,000rpm、2秒間の遠心分離で金粒子を回収し、エタノール48 μlに再懸濁した。PDS-1000/He用マイクロキャリア（Bio-Rad社）の中心に、この懸濁液6 μl（DNA 0.625 μgが付着した金粒子3.75 mgを含む）を直径1 cmの円状になるように塗布した後、これを粒状CaCl2を敷きつめたシャーレ中で急速乾燥させ、直ちに撃ち込みに使用した。
【００３１】
ターゲット細胞を調製するために、実施例1に記載する方法で維持したタバコBY-2細胞株（7日齢）の培養液10 mlを新鮮な改変LS培地100 mlに移植し、26℃、暗所、110 rpmの条件下で2日間振盪培養した。これを改変LS培地で5倍に希釈し、そのうちの10 mlをブフナー漏斗を用いて直径7 cmの濾紙（Whatman No.1）上に均一に広げた。余分な培地を除去した後、ターゲット細胞が乗った濾紙を直径9 cmのプラスチックシャーレに入れ、パーティクルガンのチャンバー内にセットした。
【００３２】
パーティクルガンPDS-1000/He（Bio-Rad社）による細胞への撃ち込み操作は、付属の取扱い説明書に従った。なお、ラプチャーディスクには、撃込み圧1,100 psi用（Bio-Rad社）のものを使用した。また、チャンバー内の真空度は25 inch Hg,マイクロキャリア発射アッセンブリからターゲット細胞までの距離は5.5 cmに設定した。
撃ち込み操作の終了後、濾紙上の細胞を回収し、改変LS培地10 mlに懸濁した。これを26℃、暗所で24時間保温した後、200 μg/mlのハイグロマイシンを含む固形改変LS 培地（0.1% ゲルライト含有）の上に展開した。26℃、暗所で20日間培養することで得られた細胞塊について、GFPおよびGUSの発現を調査した。
【００３３】
（C. GFPおよびGUS発現の評価）GFPの発現を評価するために、Semrock社のBright Lineフィルター（472.5〜520nm band-pass、GFP-3035A-L02）を装着した蛍光顕微鏡（DMIRBE、Leica社）を使って緑色蛍光の有無を観察した。GUSの発現は、X-Gluc（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide）を基質とするアッセイ法（Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387-405, 1987）によって評価した。結果を表2に示す。
【００３４】
【表２】
2007159562.tif 000003
【００３５】
GFP、GUSおよびHPT遺伝子カセットを連結したDNA構築物GfGuHの両端にCh5UTを付加して導入すると、ハイグロマイシン耐性かつGFPとGUSを共発現する細胞株（以下、3遺伝子発現株と称する）の取得効率が大幅に上昇した。PEG融合法による導入では、3遺伝子発現株の取得効率は3.8倍上昇した。パーティクルボンバードメント法においては、2.8倍の上昇が認められた。
この結果は、本発明が、多重連結遺伝子の形質転換効率を向上させる効果を有することを示している。
【００３６】
（D. 形質転換体ゲノムにおける導入遺伝子の解析）DNA構築物U/GfGuH/Uを導入して得られた3遺伝子発現株（GFP/GUS/HPT発現株）7株より、それぞれ抽出したDNA 0.2 μgを鋳型とし、GFP遺伝子発現カセット上流からHPT遺伝子発現カセット下流までの領域（5.6 kb）を、TaKaRa LA-Taq（タカラバイオ社）を使って増幅した。なお、各サンプル間で鋳型DNA量が等しいことを確認するために、タバコの内在遺伝子であるCHN50（Acc No. X51599）の一部領域（1251-1894、0.6 kb）も同時に増幅した。PCR産物は、アガロースゲル電気泳動で分離した後、エチヂウムブロマイドで染色した。
【００３７】
結果を図3に示す。3遺伝子発現株（GFP/GUS/HPT発現株）7株のいずれにおいても（レーン1〜7）、期待される5.6 kb の長さにDNAのバンドが検出された。これは、導入したGFP、GUSおよびHPTの遺伝子カセット連結物が、断片化することなくゲノムに存在していることを示している。
この結果から、Ch5UTを多重連結遺伝子の両端に配置することにより、複数の遺伝子を1つのDNAフラグメントとして植物ゲノムへ組み込むことができることが確認された。
【００３８】
［実施例3］
異なる4遺伝子カセット間にCh5UTが配置されたDNA構築物を、タバコBY-2細胞株に直接導入した例を示す。
【００３９】
（A. 導入遺伝子の構築）プラスミドpKF3（タカラバイオ社）のマルチクローニングサイトに対し、赤色蛍光タンパク質（DsRed）遺伝子カセット、GFP遺伝子カセット、GUS遺伝子カセット、HPT遺伝子カセットおよびCh5UTを挿入することにより、形質転換用ベクターを作製した。DsRed遺伝子カセットには、DsRed-Express構造遺伝子（Clontech社）にCaMV 35SプロモーターとタバコCHN50ターミネーターを付加したものを使用した。GFP遺伝子カセット、GUS遺伝子カセットおよびHPT遺伝子カセットについては、実施例2に記載されるものを使用した。なお、Ch5UTが介在する遺伝子カセット連結物には、配列表の配列番号1に記載される塩基配列1089-1933（845bp）がプロモーター上流に融合された遺伝子カセットを使用した。作製したベクタープラスミドに含まれるDNA構築物を図4に示す。
【００４０】
（B. 植物細胞への遺伝子導入）上記プラスミドベクターを、パーティクルボンバードメント法によってタバコBY-2細胞株に導入した。操作は、実施例2に記載する手順に従った。ベクター導入から4週間後、200 μg/mlのハイグロマイシン存在下で生育した細胞塊について、GFP、DsRedおよびGUSの発現を調査した。
【００４１】
（C. GFP、DsRedおよびGUS発現の評価）タバコ細胞のDsRed発現を評価するために、Chroma Technology社のDsRedフィルターセット（DsRed2, #42005）を装着した蛍光顕微鏡（DMIRBE、Leica社）を使って赤色蛍光の有無を観察した。GFPおよびGUSの発現は、実施例2に記載する方法で評価した。結果を表3に示す。
【００４２】
【表３】
2007159562.tif 000004
【００４３】
GFP、DsRed、GUSおよびHPT遺伝子カセットを連結したDNA構築物FDGHを導入した場合、ハイグロマイシン耐性かつGFP、DsRedおよびGUSを共発現する細胞株（以下、4遺伝子発現株と称する）の取得効率は5.5%であったのに対し、これら遺伝子カセット間にCh5UTを挿入することで（DNA構築物uFuDuGuHおよびuFuDuGH）、4遺伝子発現株の取得効率は68.6%および69.2%に上昇した。また、uFuDuGHの両端にCh5UTを付加すると（U/uFuDuGH/U）、4遺伝子発現株の取得効率はさらに上昇し、その値は87.5%に達した。
この結果は、多重遺伝子導入の際、個々の遺伝子もしくは遺伝子カセット間にCh5UTを挿入することで、形質転換効率が大幅に改善されることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】Ch5UTとHPT遺伝子カセットからなるDNA構築物の模式図である。
【図２】DNA構築物GfGuHおよびU/ GfGuH /Uの模式図である。
【図３】DNA構築物U/GfGuH/UをタバコBY-2細胞株に導入して得られた形質転換体のゲノムをPCR解析した結果を示す。
【図４】Ch5UT、GFP遺伝子カセット、DsRed遺伝子カセット、GUS遺伝子カセットおよびHPT遺伝子カセットからなるDNA構築物の模式図である。
【符号の説明】
【００４５】
CaT；CaMV 19Sターミネーター
Ch5UT；配列表の配列番号1に記載する塩基配列1-1933（1933 bp）
ΔCh5UT；配列表の配列番号1に記載する塩基配列1089-1933（845 bp）
C50T；タバコCHN50ターミネーター
DsR；DsRed-Express構造遺伝子
GFP；sGFP(S65T)構造遺伝子
GUS；β-グルクロニダーゼ構造遺伝子
HPT；ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ構造遺伝子
NoT；Nosターミネーター
35S；CaMV 35Sプロモーター
【図１】
2007159562.tif 000005
【図２】
2007159562.tif 000006
【図３】
2007159562.tif 000007
【図４】
2007159562.tif 000008
【配列表】
2007159562000001.app