(57)【要約】【課題】試料水から対象微生物を選択的に精度良く分離して回収することができる微生物分離装置を提供する。【解決手段】微生物分離装置は試料水中に含まれる対象微生物を捕捉するマイクロチップ２０と、マイクロチップ２０に試料水を供給する試料水供給手段１９と、マイクロチップ２０から試料水を吸引する試料水吸引手段２１とを備えている。マイクロチップ２０は流体供給口１３と流体吸引口１５と流体排出口１４とを有するフロー流路１１が形成された平板基板１０と、平板基板１０の流体吸引口１５に設けられた捕捉部１２とを有している。マイクロチップ２０の捕捉部１２は、対象微生物の最小径より小さな径をもつ複数の貫通孔１２ａを有している。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料水中に含まれる対象微生物を分離して回収する微生物分離装置において、
流体供給口および流体吸引口を含むフロー流路が内部に形成された平板基板と、平板基板の流体吸引口に設けられ対象微生物の最小径より小さい径の複数の貫通孔からなる捕捉部とを有するマイクロチップと、
マイクロチップの捕捉部に接続され試料水を吸引する試料水吸引手段と、
マイクロチップの平板基板の流体供給口に接続され試料水を供給する試料水供給手段と、
を備えたことを特徴とする微生物分離装置。
【請求項２】
平板基板の貫通孔内に、対象微生物の抗原を特異的に認識する抗体を設けたことを特徴とする請求項１記載の微生物分離装置。
【請求項３】
対象微生物の抗原を特異的に認識するとともに磁性物質で標識した抗体を試料水に供給するための磁性物質標識抗体供給手段と、
この磁性物質標識抗体供給手段から供給された磁性物質標識抗体と微生物の抗原との反応を行う反応部とを更に備え、
平板基板の貫通孔内に、磁性物質を引力する材料を設けたことを特徴とする請求項１記載の微生物分離装置。
【請求項４】
対象微生物の抗原を特異的に認識するとともに磁性物質で標識した抗体を試料水に供給するための磁性物質標識抗体供給手段と、
この磁性物質標識抗体供給手段から供給された磁性物質標識抗体と微生物の抗原との反応を行う反応部とを更に備え、
平板基板の貫通孔内に、磁性物質を吸引する磁気を発生させる磁気印加手段を設けたことを特徴とする請求項１記載の微生物分離装置。
【請求項５】
試料水中に含まれる対象微生物を分離して回収する微生物分離装置において、
流体供給口および流体吸引口を含むフロー流路が内部に形成された平板基板と、平板基板の流体吸引口に設けられた複数の貫通孔からなる捕捉部とを有するマイクロチップと、  マイクロチップの流体吸引口側の面に設けられたメンブレンフィルタと、
メンブレンフィルタのマイクロチップと反対側の面に設けられ、試料水を吸引する試料水吸引手段と、
平板基板の流体供給口に接続され試料水を供給する試料水供給手段と、
を備えたことを特徴とする微生物分離装置。
【請求項６】
マイクロチップの平板基板のフロー流路は流体排出口を有し、流体排出口にフロー流路を通過した試料水を回収し、再び試料水供給手段に戻す循環手段を接続したことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか記載の微生物分離装置。
【請求項７】
マイクロチップにエネルギーを印加する物理的印加手段を更に備えたことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか記載の微生物分離装置。
【請求項８】
マイクロチップのフロー流路に洗浄液を流すための洗浄液供給手段を更に備えたことを特徴とする請求項１乃至７のいずれか記載の微生物分離装置。
【請求項９】
試料水供給手段の前段に、マイクロチップに供給する試料水中に含まれる対象微生物及びその他の粒子を大きさで分画する分画処理手段を設けたことを特徴とする請求項１乃至８のいずれか記載の微生物分離装置。
【請求項１０】
サンプル水中の特定の対象微生物を分離・回収する微生物分離装置において、
対象微生物より小さな孔径をもつ貫通孔が形成された板状のマイクロチップと、
このマイクロチップの上面に配置され第１のフロー流路を有する第１の支持体と、マイクロチップの下面に配置され第２のフロー流路を有する第２の支持体とを備え、第１の支持体の第１のフロー流路と第２の支持体の第２のフロー流路はマイクロチップの貫通孔を介して互いに連通自在となっていることを特徴とする微生物分離装置。
【請求項１１】
第１の支持体の第１のフロー流路は外方へ開口する供給口を有し、第２の支持体の第２のフロー流路は外方へ開口する排出口を有することを特徴とする請求項１０記載の微生物分離装置。
【請求項１２】
マイクロチップの貫通孔はレーザー加工により形成されることを特徴とする請求項１０または１１記載の微生物分離装置。
【請求項１３】
第１および第２の支持体は、透明体から構成されることを特徴とする請求項１０乃至１２のいずれか記載の微生物分離装置。
【請求項１４】
対象微生物はクリプトスポリジウムであることを特徴とする請求項１０乃至１３のいずれか記載の微生物分離装置。
【請求項１５】
貫通孔の最狭部の孔径は２〜３μｍとなることを特徴とする請求項１０乃至１４のいずれか記載の微生物分離装置。
【請求項１６】
マイクロチップの厚さは５〜５０μｍとなることを特徴とする請求項１０乃至１５のいずれか記載の微生物分離装置。
【請求項１７】
マイクロチップに、マイクロチップを洗浄する物理的洗浄手段を設けたことを特徴とする請求項１０乃至１６のいずれか記載の微生物分離装置。
【請求項１８】
マイクロチップに、マイクロチップに対して洗浄液を流すための洗浄液供給手段を接続したことを特徴とする請求項１０乃至１７のいずれか記載の微生物分離装置。
【請求項１９】
第１のフロー流路内面に親水化処理を施したことを特徴とする請求項１０記載の微生物分離装置。
【請求項２０】
第１の支持体の第１のフロー流路内面に対する親水化処理は、プラズマ処理を含むことを特徴とする、請求項１９記載の微生物分離装置。
【請求項２１】
第１の支持体の第１のフロー流路内面に対する親水化処理は、プラズマ処理と、プラズマ処理を施した後の陰イオン界面活性剤によるコーティング処理とを含むことを特徴とする、請求項２０記載の微生物分離装置。
【請求項２２】
第１の支持体および第２の支持体は、ポリジメチルシロキサン（PDMS）からなることを特徴とした、請求項１９記載の微生物分離装置。
【請求項２３】
藻類を除去する手段を更に備えたことを特徴とする請求項１０記載の微生物分離装置。
【請求項２４】
藻類を除去する手段は、酵素による溶解処理手段からなることを特徴とする、請求項２３記載の微生物分離装置。
【請求項２５】
藻類を除去する手段は、酵素としてリゾチームを使用することを特徴とする、請求項２４記載の微生物分離装置。
【請求項２６】
藻類を除去する手段は、酵素としてプロテアーゼを使用することを特徴とする、請求項２４記載の微生物分離装置。
【請求項２７】
藻類を除去する手段の酵素による溶解処理は、リゾチームとプロテアーゼの混合溶液による処理からなることを特徴とする、請求項２４記載の微生物分離装置。
【請求項２８】
マイクロチップに酵素液を供給するための酵素液供給手段を接続したことを特徴とする、請求項２４記載の微生物分離装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上水道原水水質管理、浄水水質管理、その他水処理水質管理、環境水質管理、食品衛生管理、養殖施設管理等において、微生物を含む試料水中から、特定の微生物を選択的に捕捉し、分離・回収するための微生物分離装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
上水道の浄水水質の検査、食品検査、食品加工施設の工程管理、養殖漁業施設の水質検査等において、微生物の検出が行われている。これらの各検査において、特に病原性微生物はその影響力が大きく、病原性微生物は処理水や製品を通じて拡散することにより人に対して健康被害を及ぼす可能性がある。そのため、検出対象となる病原性微生物もしくは病原性微生物発生の指標となる微生物の検出が求められている。それに付随して、検出の前段階として、微生物の分離回収プロセスが必要となる。
【０００３】
従来の微生物の検出技術は、培養によるコロニー形成を観察する方法が一般的である。
【０００４】
この方法は簡便に行えるという利点はあるものの、結果が得られるまでに時間がかかり、また、操作に熟練を要するといった問題点がある。また、浄水場で問題となっているクリプトスポリジウムやジアルジア等の原虫類は、上記の様な培養による方法では検出が難しい。
【０００５】
近年、生物がもつ遺伝子・ＤＮＡ・抗原などを用いた、分子生物学的な手法による微生物の検知・同定方法が提案されている。これら手法は対象生物に固有の塩基配列や抗原を対象としており、対象生物を選択的に識別して特異的に対象生物を検知することが可能である。しかし、これら手法で用いるＤＮＡ断片・抗体等は、対象とする微生物以外の微生物や濁質等の夾雑物を非特異的に吸着することがあり、誤認識の原因となる。実際には、試料水中に対象微生物が純粋な状態で存在しているわけでは無く、他の多くの微生物および懸濁物質と共存している。そのため、誤認識を完全に排除するのは困難である。
【０００６】
前述したように、対象微生物は試料水中に純粋な状態で存在しているわけでは無く、他の多くの微生物および懸濁物質と共存している。そのため、検出精度を向上させるには、試料水中から対象の微生物を選択的に分離・回収することが必要である。また、前記したクリプトスポリジウムやジアルジア等の原虫類は、微生物量が少量であっても大きな人的被害となる可能性がある。そのため、試料水中に存在する、希薄な当該微生物のみを分離・回収することが求められる。
【０００７】
また、従来より微生物検出に際し、顕微鏡を用いて観察が行われている。顕微鏡観察をするために、固定化プレートとしては、スライドガラスやメンブレンディスクフィルタなどが用いられており、このため対象となる観察部面積が比較的大きくなることがある（特許文献１および２）。
【特許文献１】特公平５−８８４１７号公報
【特許文献２】特許第３４２２４０２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
この場合作業の効率化を図るために、観察する際画像処理技術が適用されているが、画像処理技術を適用する上で、顕微鏡視野の移動のためのステージ走査機構、もしくは励起レーザー光の走査機構が必要となる。そのため、装置の大型化、高コスト化がすすみ、かつ走査に要する時間だけ応答が遅れるといった問題がある。
【０００９】
本発明はこのような点を考慮してなされたものであり、微細加工技術を応用したマイクロチップを利用することにより、検出対象とする微生物を、微小領域でかつ特定位置に選択的に捕捉し分離することができる微生物分離装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、試料水中に含まれる対象微生物を分離して回収する微生物分離装置において、流体供給口および流体吸引口を含むフロー流路が内部に形成された平板基板と、平板基板の流体吸引口に設けられ対象微生物の最小径より小さい径の複数の貫通孔からなる捕捉部とを有するマイクロチップと、マイクロチップの捕捉部に接続され試料水を吸引する試料水吸引手段と、マイクロチップの平板基板の流体供給口に接続され試料水を供給する試料水供給手段と、を備えたことを特徴とする微生物分離装置である。
【００１１】
本発明によれば、対象微生物をマイクロチップの捕捉部に効果的に導くことが可能である。また連続流通する試料水から、短時間で対象微生物を捕捉部により分離・回収することが可能であり、かつ特定位置に対象微生物を保持することが可能となる。
【００１２】
本発明は、平板基板の貫通孔内に、対象微生物の抗原を特異的に認識する抗体を設けたことを特徴とする微生物分離装置である。
【００１３】
本発明によれば、効果的に捕捉部の貫通孔に対象微生物を分離・回収・保持することができる。
【００１４】
本発明は、対象微生物の抗原を特異的に認識するとともに磁性物質で標識した抗体を試料水に供給するための磁性物質標識抗体供給手段と、この磁性物質標識抗体供給手段から供給された磁性物質標識抗体と微生物の抗原との反応を行う反応部とを更に備え、平板基板の貫通孔内に、磁性物質を引力する材料を設けたことを特徴とする微生物分離装置である。
【００１５】
本発明は、対象微生物の抗原を特異的に認識するとともに磁性物質で標識した抗体を試料水に供給するための磁性物質標識抗体供給手段と、この磁性物質標識抗体供給手段から供給された磁性物質標識抗体と微生物の抗原との反応を行う反応部とを更に備え、平板基板の貫通孔内に、磁性物質を吸引する磁気を発生させる磁気印加手段を設けたことを特徴とする微生物分離装置である。
【００１６】
本発明は、試料水中に含まれる対象微生物を分離して回収する微生物分離装置において、流体供給口および流体吸引口を含むフロー流路が内部に形成された平板基板と、平板基板の流体吸引口に設けられた複数の貫通孔からなる捕捉部とを有するマイクロチップと、マイクロチップの流体吸引口側の面に設けられたメンブレンフィルタと、メンブレンフィルタのマイクロチップと反対側の面に設けられ、試料水を吸引する試料水吸引手段と、平板基板の流体供給口に接続され試料水を供給する試料水供給手段と、を備えたことを特徴とする微生物分離装置である。
【００１７】
本発明によれば、メンブレンフィルタ上の貫通孔に対応する特定位置に対象微生物を固定でき、また、マイクロチップを繰り返し使用することが可能であり、低コスト化が図れる。
【００１８】
本発明は、マイクロチップの平板基板のフロー流路は流体排出口を有し、流体排出口にフロー流路を通過した試料水を回収し、再び試料水供給手段に戻す循環手段を接続したことを特徴とする微生物分離装置である。
【００１９】
本発明によれば、一度マイクロチップを通過した試料水を回収し、再び試料水供給手段に戻すことができ、マイクロチップの捕捉部で捕捉されずに通過した対象微生物を再び捕捉部に供給することが可能となり、回収率の向上を図ることができる。
【００２０】
本発明は、マイクロチップにエネルギーを印加する物理的印加手段を更に備えたことを特徴とする微生物分離装置である。
【００２１】
本発明によれば、マイクロチップの貫通孔内に残留している対象微生物以外の微生物や粒子状物質を効率的に除去することが可能となり、対象微生物を効果的に分離・回収することができる。
【００２２】
本発明は、マイクロチップのフロー流路に洗浄液を流すための洗浄液供給手段を更に備えたことを特徴とする微生物分離装置である。
【００２３】
本発明によれば、貫通孔内に残留している対象微生物以外の微生物や粒子状物質を、洗浄液により効率的に除去することが可能となる。
【００２４】
本発明は、試料水供給手段の前段に、マイクロチップに供給する試料水中に含まれる対象微生物及びその他の粒子を大きさで分画する分画処理手段を設けたことを特徴とする微生物分離装置である。
【００２５】
本発明によれば、予め試料水中に含まれる対象微生物およびその他の粒子を粒子径により分画処理することにより、マイクロチップに供給する試料水中の対象微生物濃度を高めることができ、また、対象微生物より小さい粒子径を有するものを予め除去することにより、貫通孔の閉塞などを軽減でき、効率よい回収が可能となる。
【００２６】
本発明は、サンプル水中の特定の対象微生物を分離・回収する微生物分離装置において、対象微生物より小さな孔径をもつ貫通孔が形成された板状のマイクロチップと、このマイクロチップの上面に配置され第１のフロー流路を有する第１の支持体と、マイクロチップの下面に配置され第２のフロー流路を有する第２の支持体とを備え、第１の支持体の第１のフロー流路と第２の支持体の第２のフロー流路はマイクロチップの貫通孔を介して互いに連通自在となっていることを特徴とする微生物分離装置である。
【００２７】
本発明は、第１の支持体の第１のフロー流路は外方へ開口する供給口を有し、第２の支持体の第２のフロー流路は外方へ開口する排出口を有することを特徴とする微生物分離装置である。
【００２８】
本発明は、マイクロチップの貫通孔はレーザー加工により形成されることを特徴とする微生物分離装置である。
【００２９】
本発明は、第１および第２の支持体は、透明体から構成されることを特徴とする微生物分離装置である。
【００３０】
本発明は、対象微生物はクリプトスポリジウムであることを特徴とする微生物分離装置である。
【００３１】
本発明は、貫通孔の最狭部の孔径は２〜３μｍとなることを特徴とする微生物分離装置である。
【００３２】
本発明は、マイクロチップの厚さは５〜５０μｍとなることを特徴とする微生物分離装置である。
【００３３】
本発明は、マイクロチップに、マイクロチップを洗浄する物理的洗浄手段を設けたことを特徴とする微生物分離装置である。
【００３４】
本発明は、マイクロチップに、マイクロチップに対して洗浄液を流すための洗浄液供給手段を接続したことを特徴とする微生物分離装置である。
【００３５】
本発明は、第１のフロー流路内面に親水化処理を施したことを特徴とする微生物分離装置である。
【００３６】
本発明によれば、試料水に含まれる微生物が第１のフロー流路に付着することを防止することが可能となる。
【００３７】
本発明は、第１の支持体の第１のフロー流路内面に対する親水化処理は、プラズマ処理を含むことを特徴とする微生物分離装置である。
【００３８】
本発明によれば、プラズマ処理することにより、フロー流路部の表面に親水基が導入され、試料水の流通性が改善されるとともに、微生物の吸着が低減される。
【００３９】
本発明は、第１の支持体の第１のフロー流路内面に対する親水化処理は、プラズマ処理と、プラズマ処理を施した後の陰イオン界面活性剤によるコーティング処理とを含むことを特徴とする微生物分離装置である。
【００４０】
本発明によれば、プラズマ処理することにより、流路の親水性が向上することによって流通性が改善され、また陰イオン界面活性剤を用いて表面を被覆することにより、表面電位が負に帯電している、クリプトスポリジウム等の微生物の吸着を低減することができる。
【００４１】
本発明は、第１の支持体および第２の支持体は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）からなることを特徴とした微生物分離装置である。
【００４２】
本発明によれば、透明で成形性の良好なポリジメチルシロキサンを用いることにより、複雑な形状の流路を簡易に製作可能であり、プラズマ処理および界面活性剤コーティングにより、微生物の付着防止効果を得ることができる。
【００４３】
本発明は、藻類を除去する手段を更に備えたことを特徴とする微生物分離装置である。
【００４４】
本発明によれば、クリプトスポリジウムと同等の粒子径を持ち、かつ自家蛍光を発することから、クリプトスポリジウムの蛍光観察の妨害となる藻類を除去することにより、観察精度の向上を図ることができる。
【００４５】
本発明は、藻類を除去する手段は、酵素による溶解処理手段からなることを特徴とする微生物分離装置である。
【００４６】
本発明は、藻類を除去する手段は、酵素としてリゾチームを使用することを特徴とする微生物分離装置である。
【００４７】
本発明によれば、溶菌作用のあるリゾチームを使用し、細胞壁を構成している糖鎖を切断することにより、藻類の細胞を破壊することができる。この際、リゾチームはクリプトスポリジウムのオーシスト壁を破壊しないことから、クリプトスポリジウムの蛍光観察の妨害にはならない。
【００４８】
本発明は、藻類を除去する手段は、酵素としてプロテアーゼを使用することを特徴とする微生物分離装置である。
【００４９】
本発明によれば、タンパク質分解酵素であるプロテアーゼを使用し、細胞壁を構成しているタンパク質を分解することにより、藻類の細胞を破壊することができる。この際、プロテアーゼはクリプトスポリジウムのオーシスト壁を破壊しないことから、クリプトスポリジウムの蛍光観察の妨害にはならない。
【００５０】
本発明は、藻類を除去する手段の酵素による溶解処理は、リゾチームとプロテアーゼの混合溶液による処理からなることを特徴とする微生物分離装置である。
【００５１】
本発明によれば、作用の異なる２種類の酵素を利用することにより、より効果的に藻類の細胞を破壊することができる。
【００５２】
本発明は、マイクロチップに酵素液を供給するための酵素液供給手段を接続したことを特徴とする微生物分離装置である。
【００５３】
本発明によれば、酵素液を自動的にマイクロチップに供給することが可能となり、連続自動装置化を図ることができる。
【発明の効果】
【００５４】
以上説明したように、本発明による微生物分離装置によれば、試料水から選択的に対象微生物をパターン化された位置に精度良く分離回収できる。
【００５５】
また、本発明によれば、サンプル水中から特定の対象微生物のみを迅速且つ確実に分離して回収することができる。
【００５６】
本発明によれば、試料水中の微生物を、フロー流路に付着させること無く、マイクロチップ部に回収することが可能となる。また、本発明によれば、藻類を除去することにより、蛍光染色したクリプトスポリジウムの観察精度を向上させることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５７】
第１−１の実施の形態
図１乃至図３により本発明による微生物分離装置の第１−１の実施の形態について説明する。
【００５８】
ここで図１（ａ）はマイクロチップを示す平面図であり、図１（ｂ）は図１（ａ）のＸ−Ｘ’線断面図であり、図２はマイクロチップの捕捉部を示す斜視図であり、図３は微生物分離装置を示す全体概略図である。
【００５９】
本発明による微生物分離装置は試料水中に含まれる対象微生物を分離して回収するものである。
【００６０】
図３に示すように微生物分離装置は、流体供給口１３と、流体吸引口１５と、流体排出口１４とを含むフロー流路１１が内部に形成された平板基板１０と、平板基板１０の流体吸引口１５に設けられ対象微生物の最小径より小さい複数の貫通孔１２ａを有する微生物捕捉部１２とを備えている。
【００６１】
このうち、平板基板１０と微生物捕捉部１２とによってマイクロチップ２０が構成されている。
【００６２】
また、マイクロチップ２０の微生物捕捉部１２に、試料水を吸引する流体吸引装置（試料水吸引手段）２１が接続され、さらにマイクロチップ２０の流体供給口１３に試料水をマイクロチップ２０側へ供給する試料水供給ポンプ（試料水供給手段）１９が試料水供給ライン１６を介して接続されている。さらに試料水供給ライン１６のうち試料水供給ポンプ１９の前段には、試料水供給バルブ１７および試料水リザーバタンク１８が上流側から下流側に向って順次接続されている。
【００６３】
またマイクロチップ２０の流体排出口１４には、試料水排出バルブ２２が取付けられている。
【００６４】
次にマイクロチップ２０の構成について、図１および図２により更に詳述する。
【００６５】
図１および図２に示すように、マイクロチップ２０は主に、流体供給口１３、流体排出口１４、および流体吸引口１５を有するフロー流路１１が形成された平板基板１０と、微生物捕捉部１２とを備え、このうち微生物捕捉部１２には多数の微生物捕捉孔（貫通孔）１２ａが形成されている。
【００６６】
図１において、対象微生物を含有した試料水は外部の試料水供給ポンプ１９により、流体供給口１３からフロー流路１１に導入される。このための試料水供給ポンプ１９としては、チューブポンプもしくはプランジャポンプ等の微小流量を制御可能なマイクロポンプが適用可能である。特に、微生物を含む粒子状物質が試料水には含まれることから、濁質を送液するのにも適した上記ポンプを適用することが望ましい。
【００６７】
マイクロチップ２０を構成する平板基板１０および微生物捕捉部１２の材質としては、シリコン、金属、プラスチック、ガラス、セラミック基板等が使用可能である。平板基板１０のフロー流路１１、および微生物捕捉孔１２ａは、フォトリソグラフィと化学的エッチング処理を組み合わした方法や、レーザー加工、マイクロ機械加工技術等により作製される。
【００６８】
また、対象微生物を含有した試料水は、フロー流路１１を流通し、微生物捕捉部１２に導入され、微生物捕捉部１２において、流体吸引装置２１により吸引される流体吸引口１５によって吸引される。その際、対象微生物は捕捉孔１２ａに捕捉される。なお、微生物捕捉部１２以降の流体排出口１４側のフロー流路１１は塞いでも構わない。
【００６９】
図２においては、クリプトスポリジウムを選択的に捕捉することを目的に作製されたマイクロチップ２０の微生物捕捉部１２、および微生物捕捉孔１２ａの形状を一例として示す。微生物捕捉孔１２ａは微生物捕捉部１２のパターン化された位置に加工されている。
【００７０】
クリプトスポリジウムは直径約５μｍの球形状微生物であり、これを捕捉するために微生物捕捉孔１２ａの入口開口部の孔径は直径１０〜３０μｍとなっている。微生物捕捉孔１２ａの孔径は試料水と接する部分の入口開口部から深さ方向に行くに従って小さくなり、最小直径は１μｍとなっている。これ以上の深さ方向においては微生物捕捉孔１２ａの孔径は１μｍとなっており、貫通孔として加工されている。微生物捕捉孔１２ａの深さ方向の長さについて、入口開口部から最小直径の位置まで１０μｍとなっている。クリプトスポリジウムの大きさは直径約５μｍであることから、微生物捕捉孔１２ａの入口開口部から最小径の位置まで深さは５μｍ以上必要であり、１０μｍ以上が望ましい。それより深い位置の出口開口部までの深さは１０μｍとなっているが、特に限定されない。
【００７１】
微生物捕捉孔１２ａはそれぞれ３０μｍ間隔で配置され、微生物捕捉部１２の材質はＳＵＳ基板からなっている。また、微生物捕捉孔１２ａの入口開口部および出口開口部の形状について、図２では円形を設定したが、形状は特に問わず、多角形としてもよい。最小直径の部分の形状も特に問わないが、最小直径は１μｍとなるように形成されている。
【００７２】
また、図２においては、微生物捕捉孔１２ａのうち最小直径の部分より出口開口部に向う深い位置の貫通孔部において、最小径と同一径で加工しているが、特に限定する必要はなく、例えば、最小直径の部分から出口開口部まで径を広げても構わない。
【００７３】
次にこのような構成からなる本実施の形態の作用について説明する。試料水は試料水供給ライン１６を通じて、試料水供給バルブ１７を介して、試料水リザーバタンク１８に導入される。所定量の試料水を試料水リザーバタンク１８に導入した後、試料水供給バルブ１７を閉じ、試料水供給ポンプ１９により試料水リザーバタンク１８からマイクロチップ２０のフロー流路１１に試料水を供給する。
【００７４】
試料水はマイクロチップ２０のフロー流路１１から微生物捕捉部１２に導入され、微生物捕捉部１２に導入された試料水は流体吸引装置２１により微生物捕捉孔１２ａを通じて吸引される。このとき試料水に含まれていた対象微生物は微生物捕捉孔１２ａに捕捉され、微生物捕捉孔１２ａの最小直径部の径より小さい微生物や物質はこの微生物捕捉孔１２ａを通過して、吸引、排出される。この過程において、対象微生物を含む粒子状物質は微生物捕捉孔に捕捉される。
【００７５】
この場合、実際に対象微生物が捕捉されているかどうかをマイクロチップ２０上で確認することも可能である。すなわち対象微生物を含む粒子状物質はマイクロチップ２０のパターン化された位置に捕捉されることになり、例えば、マイクロチップ２０の平板基板１０が透明材質からなる場合、顕微鏡による観察も実施可能であり、特定位置のみの観察が可能となる。
【００７６】
さらに、対象微生物を検出もしくは生物の種類を特定する場合、抗原・抗体の結合反応や、ＤＮＡのハイブリダイゼーション反応を利用した生物的な情報に基づく検出法をマイクロチップ２０上で実施することも可能である。例えば、対象微生物を抗原として認識する抗体に蛍光もしくは発光色素で標識した標識抗体や、対象生物に含まれるＤＮＡもしくはＲＮＡと特異的に結合するＤＮＡプローブに蛍光もしくは発光色素で標識した標識ＤＮＡプローブを供給する手段を設け、この供給手段がマイクロチップ２０に標識抗体、標識ＤＮＡプローブをマイクロチップ捕捉部に供給してもよい。その結果、対象微生物を選択的に染色でき、それらを蛍光顕微鏡を用いて観察することが可能となる。
【００７７】
第１−２の実施の形態
次に、図４により本発明の第１−２の実施の形態について説明する。図４に示す第１−２の実施の形態において、図１乃至図３に示す第１−１の実施の形態と同一部分には同一符号を符して詳細な説明は省略する。図４に、マイクロチップに試料水の循環機構を取り入れる場合の構成例を示す。
【００７８】
図４に示すように、流体排出口１４の出口側に試料水循環バルブ２３が取付けられた循環ライン２３ａが接続され、循環ライン２３ａは試料水リザーバタンク１８に連通している。なお、これら循環ライン２３ａと試料水循環バルブ２３とによって循環手段が構成されている。試料水は試料水供給ライン１６を通じて、試料水供給バルブ１７を介して、試料水リザーバタンク１８に導入される。
【００７９】
所定量の試料水を試料水リザーバタンク１８に導入した後、試料水供給バルブ１７を閉じ、試料水供給ポンプ１９により試料水リザーバタンク１８からマイクロチップ２０に試料水を供給する。マイクロチップ２０の微生物捕捉部１２に導入された試料水は、流体吸引装置２１により微生物捕捉孔１２ａを通じて吸引される。試料水に含まれていた対象微生物は微生物捕捉孔１２ａに捕捉される。微生物捕捉孔１２ａの最小直径部の径より小さい微生物や物質はこの微生物捕捉孔１２ａを通過して、吸引されて排出される。微生物捕捉孔１２ａ側で吸引されずに、微生物捕捉部１２を通過した試料水は、流体排水口１４より排出される。
【００８０】
図４に示すように、この排出液は再度試料水リザーバタンク１８に戻され、再びマイクロチップ２０へ供給される。この循環工程においては、試料水循環バルブ２３を開、試料水排出バルブ２２は閉の状態にしておく。所定の時間循環を繰り返した後、試料水循環バルブ２３および試料水排出バルブ２２を閉じ、試料水全てを吸引装置２１により微生物捕捉孔１２ａを通じて吸引する。または、所定の時間循環を繰り返した後、試料水循環バルブ２２を閉じ、試料水排出バルブ２２を開き、残液を排出する。この循環過程において微生物を含む粒子状物質は複数回マイクロチップの微生物捕捉部１２を通過することになり、捕捉効率が向上する。
【００８１】
第１−３の実施の形態
次に、図５により本発明の第１−３の実施の形態について説明する。図５に示す第１−３の実施の形態は、微生物捕捉部１２の構成が異なるのみであり、他は図１乃至図３に示す第１−１の実施の形態と略同一である。図５に示す第１−３の実施の形態において、図１乃至図３に示す第１−１の実施の形態と同一部分には同一符号を符して詳細な説明は省略する。
【００８２】
図５は微生物捕捉孔の概念図を示す。マイクロチップ２０に設けられた微生物捕捉部１２の微生物捕捉孔１２ａの孔内入口部に対象微生物の抗原を特異的に認識する微生物捕捉用抗体２４が固定化されている。マイクロチップ２０内では、流体吸引装置２１により対象微生物を含有する試料水が微生物捕捉部１２の微生物捕捉孔１２ａを介して吸引される。その際、対象微生物２５は特異的に微生物捕捉孔１２ａの入口開口部に固定化された微生物捕捉用抗体２４に捕捉される。
【００８３】
一般に生物に対する選択性を向上させるために抗体を利用することは、最も効果的な手法である。微生物捕捉孔１２ａの入口開口部に抗体を固定化しておくことにより、微生物捕捉孔に到達した対象微生物を強固に捕捉・保持することが可能となる。例えば、対象微生物をクリプトスポリジウムとした場合、シリコン基板上への抗クリプトスポリジウム抗体の固定化については、下記の例に示す手法にて実現可能である。
【００８４】
まず微生物捕捉孔を作製したシリコン基板の微生物捕捉部に１０％ＫＯＨ−エタノール溶液を滴下し３０分間放置・洗浄した後、アルゴンガスで乾燥、２％−ＭＥＰＴＥＳ（３−ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｙｌ  ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）トルエン溶液に６０分間浸漬する。洗浄・アルゴンガスで乾燥後、１ｍＭ−ＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ）エタノール溶液に３０分間浸漬する。
【００８５】
洗浄後、０．５ｍｇ／ｍｌ−Ｓｔｒｐｔａｖｉｄｉｎを滴下し、一晩インキュベートする。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（１％−ＢＳＡ，０．０１％−ＮａＮ３）に２０分間以上浸漬後、Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ−ＰＢＳ＋１０ｍＭ−ＮａＣｌ＋１０ｍＭ−Ｓｕｃｒｏｓｅ，０．１％ＢＳＡ）中に混合したＢｉｏｔｉｎ標識抗クリプトスポリジウム抗体を捕捉孔部にスポッティングすることにより、捕捉孔内部に抗クリプトスポリジウム抗体を導入する。
【００８６】
抗体と生物との結合は強固であるため、抗体の固定部位は可能な限り微生物捕捉孔１２ａ内に限定することが望ましい。しかし、微生物捕捉孔１２ａ外部に抗体が固定されている場合でも、微生物捕捉孔１２ａ外部と微生物捕捉孔１２ａ内部とでは脱離に必要とするエネルギーが異なることから、適切な洗浄条件を設定すれば、微生物捕捉孔１２ａ内部に優先的に対象微生物を捕集することが可能となる。
【００８７】
第１−４の実施の形態
次に、図６および図７により本発明の第１−４の実施の形態について説明する。図６および図７に示す第１−４の実施の形態において、図１乃至図３に示す第１−１の実施の形態と同一部分には同一符号を符して詳細な説明は省略する。図６は磁性物質標識反応部と、磁気印加手段を備えた微生物分離装置の装置構成例を示し、図７（ａ）（ｂ）は微生物捕捉孔の概念図を示す。
【００８８】
図６および図７に示すように、マイクロチップ２０の前段に試料水リザーバタンク兼磁性物質標識反応槽２６が設置され、またマイクロチップ２０の後段に試料水循環バルブ２３を有する循環ライン２３ａが接続され、この循環ライン２３ａは試料水リザーバタンク兼磁性物質標識反応槽２６に接続されている。
【００８９】
図６および図７において、試料水は試料水供給ライン１６を通じて、試料水供給バルブ１７を介して、試料水リザーバタンク兼磁性物質標識反応槽２６に導入される。試料水リザーバタンク兼磁性物質標識反応槽２６に試料水が所定量導入されると、試料水供給バルブ１７が閉じられる。他方、対象微生物の抗原と特異的に反応する磁性物質を標識した抗体が、磁性物質標識抗体保存容器２７から磁性物質標識抗体供給ライン２８および磁性物質標識抗体供給バルブ２９を介して、磁性物質標識抗体供給ポンプ３０により試料水リザーバタンク兼磁性物質標識反応槽２６に一定量導入される。
【００９０】
試料水リザーバタンク兼磁性物質標識反応槽２６内では、磁性物質標識抗体が所定の条件下で所定の時間インキュベートされて、対象微生物と磁性物質標識抗体とが反応する。
【００９１】
その後、試料水供給ポンプ１９によりマイクロチップ２０側に磁性物質標識抗体と反応した対象微生物を含有する試料水を供給する。マイクロチップ２０の微生物捕捉部１２に導入された試料水は流体吸引装置２１により微生物捕捉孔１２ａを通じて吸引される。
【００９２】
試料水を吸引する際、磁気印加装置３１により微生物捕捉孔１２ａの内表面に設けられた磁気材料３３に対して磁気を印加することで、試料水に含まれている、磁性物質標識抗体３２と反応した対象微生物２５が微生物捕捉孔１２ａ内に捕捉される（図７（ａ））。
【００９３】
微生物捕捉孔１２ａの最小直径部の径より小さい微生物や物質は、この微生物捕捉孔１２ａを通過して、吸引、排出される。
【００９４】
また、磁気印加装置３１により微生物捕捉孔１２ａの内表面の磁気材料３３に磁気を印加するのではなく、予め、標識用磁性物質と引力関係を有する磁性材料３４を微生物捕捉孔１２ａの内側表面に設けておいてもよい（図７（ｂ））。図７（ａ）（ｂ）に示すように試料水を吸引する際、特異的に磁気標識された対象微生物は、微生物捕捉孔１２ａの内側表面に設置した磁気材料３３もしくは磁性材料３４に吸着され、微生物捕捉孔１２ａの入口開口部に対象微生物が捕捉・回収される。
【００９５】
第１−５の実施の形態
次に、図８により本発明の第１−５の実施の形態について説明する。図８に示す第１−５の実施の形態において、図１乃至図３に示す第１−１の実施の形態と同一部分には同一符号を符して詳細な説明は省略する。ここで図８は洗浄機構を備えた場合の微生物分離装置の構成例を示す。
【００９６】
図８において、マイクロチップ２０の後段に試料水循環バルブ２３を有する循環ライン２３ａが接続され、この循環ライン２３ａは試料水リザーバタンク１８に接続されている。また試料水供給ポンプ１９の前段には、洗浄液供給ラインバルブ３６を介して洗浄液保存容器３５が接続されている。図８において、マイクロチップ２０により対象微生物を分離した後、洗浄液保存容器３５より、試料水供給ポンプ１９により洗浄液がマイクロチップ２０側に供給される。洗浄液は次に微生物捕捉部１２に導入され、微生物捕捉孔１２ａを洗浄し、排出される。
【００９７】
洗浄液としては界面活性剤、アルコール、有機溶剤、酸、アルカリ等が使用される。ただし、洗浄液によりマイクロチップ２０及び対象微生物がダメージを受けないものを選定することが必要である。例えば、界面活性剤を洗浄液として適用した場合、界面活性剤の効果としては、マイクロチップ２０の表面と粒子との界面に洗浄液が浸透し、マイクロチップ２０の表面と粒子との距離を離すことにより、表面から粒子が引き離されるのに必要なポテンシャルエネルギーが低減する。その結果、対象微生物は微生物捕捉孔１２ａの内面との相互作用が大きいのに対し、それ以外の粒子の相互作用は小さいことから脱離しやすくなり、対象微生物のみが微生物捕捉孔１２ａに捕捉されることになり、このため微生物の捕捉回収効率が向上する。
【００９８】
また、このとき、微生物捕捉孔１２ａからの対象微生物以外の粒子状物質のマイクロチップ２０からの脱離を促進するために、マイクロチップ２０に物理的印加手段３７が設けられている。例えば、物理的印加手段３７は、超音波や機械的振動、電気的振動、熱供給などのエネルギーをマイクロチップ２０に対して印加するものである。
【００９９】
物理的印加手段３７をマイクロチップ２０に設置し、振動による機械的エネルギーを粒子状物質に与えることにより、マイクロチップ２０から脱離に必要なエネルギーを供給することができる。同様に、物理的印加手段３７から加熱エネルギーをマイクロチップ２０に供給することによっても、脱離を促進することが可能となる。
【０１００】
ただし、過剰の振動・過熱によって対象微生物も脱離してしまう可能性もある。これを防止し、かつ他の粒子状物質を効果的に除去するために、最適な洗浄条件を設定する必要がある。なお、上記の洗浄液による洗浄作用、及び物理的印加手段３７によるエネルギーの印加作用はそれぞれ単独で使用しても良いし、組み合わせて使用することも効果的である。
【０１０１】
第１−６の実施の形態
次に、図９により本発明の第１−６の実施の形態について説明する。図９に示す第１−６の実施の形態において、図１乃至図３に示す第１−１の実施の形態と同一部分には同一符号を符して詳細な説明は省略する。ここで図９は分画処理機構を備えた微生物分離装置の構成例を示す。
【０１０２】
図９において、マイクロチップ２０の後段に試料水循環ポンプ２３を有する循環ライン２３ａが接続され、この循環ライン２３ａは試料水リザーバタンク１８に接続されている。また試料水リザーバタンク１８の前段に分画処理手段３８が設置されている。マイクロチップ２０に導入する試料水に対して、物質の大きさを利用した分画処理がマイクロチップ２０に導入される前段階として分画処理手段３８により実施される。例えば、クリプトスポリジウムを対象微生物とする場合、クリプトスポリジウムは直径約５μｍであることから、例えば１０μｍ以上の孔径を持つものを除去する分画処理手段３８が、試料水リザーバタンク１８の前段に設置されている。
【０１０３】
これにより、対象微生物より大きい１０μｍ以上の径を有する夾雑物等を除去することができ、不純物の割合を低減することが可能となる。この場合、分画処理手段３８の種類としては、中空糸膜フィルタ、メンブレンフィルタ、セラミックフィルタ、プランクトンネットなどが挙げられるが、特にその種類は問わない。
【０１０４】
また、例えば、上記とは逆に、直径１μｍ以下ものを除去する分画処理手段３８を、試料水リザーバタンク１８の前段に設置してもよい。微生物捕捉孔１２ａの最小直径を１μｍとした場合、試料水中の１μｍ以下の粒子は予め除去されているので、微生物捕捉孔１２ａの閉塞などの問題が軽減される。この場合、分画処理手段３８の種類も、特に限定されない。
【０１０５】
第１−７の実施の形態
次に、図１０および図１１により本発明の第１−７の実施の形態について説明する。図１０および図１１に示す第１−７の実施の形態は、マイクロチップ２０の下面（流体吸引口側の面）にメンブレンフィルタ３９を設けた点が異なるのみであり、他は図１乃至図３に示す第１−１の実施の形態と略同一である。図１０および図１１において、図１乃至図３に示す第１−１の実施の形態と同一部分には同一符号を符して詳細な説明は省略する。
【０１０６】
図１０にマイクロチップとメンブレンフィルタとを組み合せた構造概念図を、図１１にマイクロチップの構造概念図を示す。微生物捕捉部１２と、平板基板１０とを有するマイクロチップ２０の下面に、メンブレンフィルタ３９が設置されている。マイクロチップ２０の微生物捕捉部１２に導入された試料水は、微生物捕捉孔１２ａの内部に入り込み、メンブレンフィルタ３９を介してメンブレンフィルタ３９のマイクロチップ２０と反対側の面に設けられた流体吸引装置２１（図３参照）により吸引される。この際、対象微生物はメンブレンフィルタ３９上に捕捉・固定される。
【０１０７】
メンブレンフィルタ３９の孔径については、対象微生物によるが、クリプトスポリジウムを対象微生物とした場合、１μｍ程度が望ましい。メンブレンフィルタ３９の材質に関しては特に限定されないが、マイクロチップ２０との密着が良好であることが必要である。マイクロチップ２０は微生物捕捉孔１２ａの開口部の形状は特に問わず、円形でも多角形でもよい。微生物捕捉孔１２ａの深さ方向の形状に関しても特に限定されることはなく、例えば円柱状でもよい。微生物捕捉孔１２ａの開口部の寸法について、最小でも対象微生物の大きさより大きいことが必須であるが、最大値に関しては適度な寸法を設定する。
【０１０８】
微生物捕捉孔１２ａの深さ寸法についても特に限定されない。
【０１０９】
図１０および図１１において、メンブレンフィルタ３９は固定プレート媒体として機能し、マイクロチップ２０は分画機能、および微生物をメンブレンフィルタ３９表面上の一定位置へ捕捉固定する機能をもつ。そのため、マイクロチップ２０は繰返し使用することが可能である。また、メンブレンフィルタ３９上に、例えば、対象微生物の抗原に特異的に反応する抗体を固定化しておけば、対象微生物を効率よく捕捉可能となる。
【０１１０】
第２−１の実施の形態
以下、図面を参照して本発明の第２−１の実施の形態について説明する。
【０１１１】
図１２乃至図１４は本発明による微生物分離装置の第２−１の実施の形態を示す図である。ここで図１２（ａ）は微生物分離装置の平面図、図１２（ｂ）は図１２（ａ）のＸ−Ｘ′線断面図、図１３（ａ）はマイクロチップの斜視図、図１３（ｂ）はその拡大図である。
【０１１２】
図１２（ａ）（ｂ）、図１３（ａ）（ｂ）および図１４に示すように、微生物分離装置１１０は、特定の対象微生物を分離・回収するものであり、対象微生物より小さな孔径をもつ貫通孔１１１が形成された板状のマイクロチップ（金属板ともいう）１０１と、このマイクロチップ１０１の上面に配置された第１の支持体１０２ａ、１０２ｂと、マイクロチップ１０１の下面に配置された第２の支持体１０２ｃとを備えている。
【０１１３】
このうち第１の支持体１０２ａ、１０２ｂは、上部支持体１０２ａと中間支持体１０２ｂとからなり、また第２の支持体１０２ｃは下部支持体１０２ｃからなっており、第１の支持体１０２ａ、１０２ｂおよび第２の支持体１０２ｃにより支持体１０２が構成される。
【０１１４】
このように第１の支持体１０２ａ、１０２ｂが上部支持体１０２ａと中間支持体１０２ｂとからなる２層構造を有しているが、上部支持体１０２ａと中間支持体１０２ｂを一体構造に形成してもよい。
【０１１５】
なお、マイクロチップ１０１は、第１の支持体１０２ｂ（１０２ａ）と第２の支持体１０２ｃ間に配置されているが、単に積層するのみでも、第１の支持体１０２ａ（１０２ｂ）と第２の支持体１０２ｃとによりマイクロチップ１０１を圧着するなど種々の手段が採用できる。
【０１１６】
また上部支持体１０２ａには、その表面に沿って水平方向に延び、かつ上部支持体１０２ａを貫通するフロー流路１０４ａと、フロー流路１０４ａに連通し、かつ外方に開口する供給口１０３とが形成されている。さらに中間支持体１０２ｂには、中間支持体１０２ｂを貫通するフロー流路１０４ｂが形成されている。このうち上部支持体１０２ａのフロー流路１０４ａと中間支持体１０２ｂのフロー流路１０４ｂとによって第１のフロー流路が構成される。
【０１１７】
また下部支持体１０２ｃには、その表面に沿って水平方向に延び、かつ下部支持体１０２ｃを貫通するフロー流路１０４ｃが形成され、このフロー流路１０４ｃには外方へ開口する排出口１０５が連通している。このフロー流路１０４ｃは第２のフロー流路となる。
【０１１８】
中間支持体１０２ｂのフロー流路１０４ｂと、下部支持体１０２ｃのフロー流路１０４ｃは互いにマイクロチップ１０１の貫通孔（微生物捕捉孔ともいう）１１１を介して連通している。なお、図示を省略するが、第２の支持体（下部支持体）１０２ｃは、第１の支持体を上部支持体１０２ａと中間支持体１０２ｂとからなる２層構造で形成したと同様に、２層構造で形成するようにしてもよい。また、第２の支持体を２層構造で形成した場合、上層に排出口１０５を設けてもよい。
【０１１９】
このように構成された本実施の形態において、微生物分離装置１１０に導入されたサンプル水は供給口１０３から導入され、フロー流路１０４ａ、１０４ｂを通り、金属板１０１に到達する。このとき、金属板１０１の貫通孔１１１の孔径より小さな物質、及び溶解成分はフロー流路１０４ｃを通って、排水口１０５から排出され、孔径より大きな物質が金属板１０１に捕捉される。
【０１２０】
ここで、金属板１０１は、微生物の寸法より小さい貫通孔１１１を有している。一般的に細菌類や原虫類の大きさは１〜数μｍであり、それ以下の寸法の貫通孔１１１を形成する。しかし、その様な微小孔を加工する場合、レーザー加工にしても、化学的・物理的なエッチング加工にしても、貫通孔１１１の加工寸法と比較して厚さが厚いと、孔径が大きくなってしまい、加工が不可能であった。厚さを薄くすれば加工は可能であるが、プラスチック等では強度が弱くなり、サンプル水の吸引ろ過、及び加圧送液に耐えられない可能性がある。そこで、比較的薄くても強度が維持できる金属を使用することにより、微小な貫通孔１１１の実現と、吸引・加圧による実用的な処理速度の実現を両立可能となる。
【０１２１】
第１および第２の支持体１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃは、薄い金属板１０１を上下からサポートし、吸引・加圧による送液が可能となる様にするためのものである。同時にサンプル水送液のための供給孔１０３、フロー流路１０４ａ、１０４ｂ、１０４ｃ、排水口１０５を設けることにより、金属板１０１上に微小流路を形成することができる。このような構成とすることにより、一部の配管類が省略可能となり、部品点数の低減につながる。また流路を微小化することにより、対象微生物の流路への堆積の防止という効果も期待できる。
【０１２２】
この貫通孔１１１の加工方法としては、レーザー加工を適用することが有効である。機械加工や物理的・化学的なエッチング方法では、貫通孔１１１を形成する場合には、概ね孔径数十μｍのオーダーが加工精度の限界である。上述のように細菌、原虫等検査対象となる微生物の寸法はμｍオーダーであり、数十μｍの貫通孔１１１では透過してしまい、捕捉することが不可能である。
【０１２３】
レーザー加工においても、加工厚さが厚くなると、孔径が大きくなるという点は同様であるが、加工厚さを低減することにより、かなり小径の微生物捕捉用貫通孔１１１を作製することができる。そこで、薄板の金属板１０１にレーザー加工を行うことにより、μｍオーダーの貫通孔１１１を形成することが可能となり、細菌・原虫等の微生物を確実に貫通孔１１１により捕捉することができる。
【０１２４】
金属板１０１の材質としては、各種の金属が使用可能であるが、河川水等各種イオン成分を含んだ水が流れること、反応液や洗浄液として、酸、アルカリ、有機溶媒等の腐食性液体が流れる事などを考慮すると、ステンレス鋼を使用することが望ましい。
【０１２５】
第１および第２の支持体１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃの材質としては、プラスチック、ガラス、シリコン、金属、セラミック等が適用可能である。このとき金属板１０１の貫通孔１１１に捕捉された対象微生物を検出するため、蛍光発光の観察等の光学的手法が用いられる。この場合、第１および第２の支持体１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃを光を透過する材質から作製する必要がある。特に上部支持体１０２ａを透明体とすることにより、上部から励起光を照射し、貫通孔１１１に捕捉された対象微生物からの蛍光を検出することが可能となる。好適には、第１および第２の支持体１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃには安価で透明性が高く、かつ接着も容易なアクリル樹脂から構成することが望ましい。
【０１２６】
次に金属板１０１の微生物捕捉用貫通孔１１１の形状について、図１３および図１４により詳述する。
【０１２７】
図１３は、耐塩素性微生物クリプトスポリジウムを選択的に捕捉することを目的にデザインした金属板１０１の貫通孔１１１の形状の一例を示す。
【０１２８】
貫通孔１１１は金属板１０１の、パターン化された位置に加工されている。貫通孔１１１を形成するとき、レーザー加工を利用する。この場合、加工領域の先端部にレーザーの焦点を絞って加工を施すため、微生物捕捉用貫通孔１１１の形状はテーパーを有し、レーザー照射面側の上部開口１１１ａの孔径が大きくなる。そのため、照射面と反対側の下部開口１１１ｂの寸法を、対象微生物の大きさより小さくすることにより微生物の捕捉が可能となる。
【０１２９】
クリプトスポリジウムは直径約５μｍの球形状微生物であり、これを捕捉するためにサンプル水導入側の微生物捕捉用貫通孔１１１の上部開口１１１ａの孔径を直径３〜５μｍとした。レーザー加工を施した際、この貫通孔１１１の孔径は試料水と接する部分の上部開口部１１１ａから深さ方向に行くに従って小さくなる。金属板１０１の厚さを５μｍとした場合、レーザー照射面の反対側の下部開口１１１ｂの孔径は約２〜３μｍとなり、クリプトスポリジウムの直径より小さいことから捕捉することが可能となる。
【０１３０】
図１４（ａ）（ｂ）は実際に金属板１０１として、厚さ５μｍのＳＵＳ３０４の薄板を用い、この金属板１０１にレーザー加工を施した場合の微生物捕捉状況を示したものである。
【０１３１】
ここで図１４（ａ）は、金属板１０１上に設けた微生物捕捉用貫通孔１１１の配置位置を示し、図１４（ｂ）は貫通孔１１１に捕捉されたクリプトスポリジウム模擬粒子の捕捉状況を示す図である。
【０１３２】
貫通孔１１１の孔径を実測した結果、上部開口１１１ａが３．１±０．６μｍ、下部開口１１１ｂが２．５±０．６μｍであった。
【０１３３】
実際にクリプトスポリジウム模擬粒子（クリプトレーサー１号：（財）水適技術研究センター）を使用して捕捉実験を行ったところ、クリプトが微生物捕捉用貫通孔１１１の部位に捕捉されていることが確認できた。また、下部開口１１１ｂ側を減圧することにより、流速を向上させることが可能となり、圧力差４０ｋＰａでは約１００μＬ／ｍｉｎ、８８ｋＰａでは３５０μＬ／ｍｉｎとの実用的なろ過性能が得られた。
【０１３４】
この場合、レーザー加工の制限から、微生物捕捉用貫通孔１１１にテーパー角がある程度存在するため、金属板１０１が厚くなると、上部開口１１１ａの孔径が大きくなり、隣接する貫通孔１１１との間隔が広くなる。このため、一定面積内に多数の貫通孔１１１を配置するのが困難になるという問題点がある。そのため、金属板１０１の厚さは、できる限り薄いことが望ましい。しかし、ある程度の厚さがないと強度が不足する。
【０１３５】
今回の加工実績から計算すると、隣接する微生物捕捉用貫通孔１１１の間隔の上限を３０μｍに設定すると、金属板１０１の厚さは５０μｍ以下にする必要がある。以上のことから、金属板１０１の膜厚は、５〜５０μｍ以下とすることが望ましい。
【０１３６】
また、微生物捕捉用貫通孔１１１の開口部の形状について、図１３では円形を設定したが、形状は特に問わず、多角形としてもよい。最小直径の部分の形状も特に指定はなく、微生物の寸法より小さいことが重要である。
【０１３７】
第２−２の実施の形態
次に本発明の第２−２の実施の形態について図１５により説明する。
【０１３８】
図１５は、図１２乃至図１４に示す第２−２の実施の形態における微生物分離装置を組込んだ微生物分離システムを示す。
【０１３９】
図１５において、サンプル水は試料水供給バルブ１２２を介して試料水供給ライン１２１に流れ、試料水リザーバタンク１２３に導入される。所定量のサンプル水を導入後、試料水供給バルブ１２２を閉じ、試料水供給ポンプ１２４により供給口１０３から微生物分離装置１１０へサンプル水が供給され、微生物分離装置１１０の金属板１１０１においてサンプル中の特定の対象微生物が捕捉される。その後、サンプル水は、微生物分離装置１１０の排出口１０５から排出されて流体吸引装置１２６により吸引される。
【０１４０】
この間、サンプル中に含まれていた対象微生物は微生物捕捉用貫通孔１１１に捕捉される。微生物捕捉用貫通孔１１１の最小直径部の径より小さい微生物や物質はこの微生物捕捉用貫通孔１１１を通過して吸引され、流体吸引装置１２６側へ排出される。
【０１４１】
この過程において、対象微生物を含む粒子状物質は微生物捕捉用貫通孔に捕捉される。
【０１４２】
サンプル水は試料水の供給ポンプ１２４と流体吸引装置１２６の双方により微生物分離装置１１０内へ導入されるが、供給ポンプ１２４と液体吸引装置１２６のうちいずれか一方のみを設けてもよい。
【０１４３】
また、実際に対象微生物が捕捉されているかどうかを金属板１０１上で確認することも可能である。対象微生物を検出もしくは生物の種類を特定する場合、抗原・抗体の結合反応や、ＤＮＡのハイブリダイゼーション反応を利用した生物的な情報に基づく検出法を金属板１０１上で実施することが可能である。対象微生物を抗原として認識する抗体に蛍光もしくは発光色素で標識した標識抗体や、対象生物に含まれるＤＮＡもしくはＲＮＡと特異的に結合するＤＮＡプローブに蛍光もしくは発光色素で標識した標識ＤＮＡプローブを供給する手段を金属板１０１に設け、標識抗体、標識ＤＮＡプローブを金属板１０１側に供給する。その結果、対象微生物を選択的に染色でき、それらを蛍光顕微鏡を用いて観察することが可能となる。
【０１４４】
第２−３の実施の形態
次に本発明の第２−３の実施の形態について図１６により説明する。
【０１４５】
図１６は洗浄機構を備えた微生物分離装置の構成例を示す図である。
【０１４６】
なお、図１６において、図１５に示す実施の形態と同一部分には同一符号を付して詳細な説明は省略する。図１６において、洗浄液保存容器１３１から洗浄液切換バルブ１３２を通じ、試料供給ポンプ１２４により洗浄液が金属板１０１に供給され、その後金属板１０１の貫通孔１１１に導入される。洗浄水は微生物捕捉用貫通孔１１１を洗浄し、洗浄液排出バルブ１３３を通じて排出される。
【０１４７】
洗浄液としては界面活性剤、アルコール、有機溶剤、酸、アルカリ等が使用される。ただし、洗浄液により金属板１０１及び対象微生物がダメージを受けないものを選定することが必要である。例えば、界面活性剤を洗浄液として適用した場合、金属板１０１表面と粒子との界面に、洗浄液が浸透し、表面と粒子との距離を離すことにより、表面から粒子が引き離されるのに必要なポテンシャルエネルギーを低減させる。その結果、対象微生物は孔内面との相互作用が大きいのに対し、それ以外の粒子の相互作用は小さいことから脱離しやすくなり、対象微生物のみが微生物捕捉孔に捕捉されることになる。このため、微生物の捕捉回収効率が向上する。
【０１４８】
また、微生物捕捉用貫通孔１１１からの対象微生物以外の粒子状物質の脱離を促進するために、物理的洗浄手段１３４を設けてもよい（図１６）。例えば、物理的洗浄手段１３４としては、超音波や機械的振動、電気的振動、熱供給などを利用する。物理的洗浄手段１３４を金属板１０１に設置し、振動による機械的エネルギーを粒子状物質に与えることにより、脱離に必要なエネルギーを供給する。
【０１４９】
同様に、加熱によりエネルギーを供給することによっても、脱離を促進することが可能となる。ただし、過剰の振動・過熱によって対象微生物も脱離してしまう可能性もある。
【０１５０】
これを防止し、かつ他の粒子状物質を効果的に除去するために、最適な洗浄条件を設定する必要がある。なお、上記の洗浄液による洗浄、及び物理的洗浄手段はそれぞれ単独で使用しても良いし、組み合わせて使用することもできる。
【０１５１】
第３−１の実施の形態
以下、図面を参照して本発明の第３−１の実施の形態について説明する。
【０１５２】
図１７乃至図１８は本発明による微生物分離装置の第３−１の実施の形態を示す図である。ここで図１７（ａ）は微生物分離装置の平面図、図１７（ｂ）は図１７（ａ）のＸ−Ｘ′線断面図、図１８（ａ）はマイクロチップの斜視図、図１８（ｂ）はその拡大図である。
【０１５３】
図１７（ａ）（ｂ）、図１８（ａ）（ｂ）に示すように、微生物分離装置１１０は、特定の対象微生物を分離・回収するものであり、対象微生物より小さな孔径をもつ貫通孔１１１１が形成された板状のマイクロチップ（金属板ともいう）１０１と、このマイクロチップ１０１の上面に配置された第１の支持体１０２ａと、マイクロチップ１０１の下面に配置された第２の支持体１０２ｂ，１０２ｃとを備えている。
【０１５４】
このうち第１の支持体１０２ａは上部支持体１０２ａからなり、また第２の支持体１０２ｂ，１０２ｃは中間支持体１０２ｂと下部支持体１０２ｃからなっている。さらに第１の支持体１０２ａ、第２の支持体１０２ｂ、１０２ｃにより支持体１０２が構成される。
【０１５５】
なお、マイクロチップ１０１は、第１の支持体１０２ａと第２の支持体１０２ｂ間に配置されているが、単に積層するのみでも、第１の支持体１０２ａと第２の支持体１０２ｂとによりマイクロチップ１を圧着するなど種々の手段が採用できる。
【０１５６】
このとき支持体１０２ａ、１０２ｂ、１０２ｃの材質としては、各種のプラスチック材料、金属材料、ガラス等が使用できるが、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ），ＰＭＭＡ，ガラス等の透明材料を使用することが望ましい。本実施の形態では、支持体１０２ａ、１０２ｃをＰＤＭＳで構成し、支持体１０２ｂをスライドガラスで構成している。
【０１５７】
また上部支持体１０２ａには、その表面に沿って水平方向に延び、かつ上部支持体１０２ａを貫通するフロー流路１０４ａと、微生物を捕捉孔に連なるフロー流路１０４ｂと、フロー流路１０４ａに連通し、かつ外方に開口する供給口１０３とが形成されている。さらに、上部支持体１０２ａに洗浄液や、対象微生物以外の粒子状物質の排出口として作用する、洗浄排水口１０６が形成されている。この上部支持体１０２ａのフロー流路１０４ａとフロー流路１０４ｂとによって第１のフロー流路が構成される。
【０１５８】
中間支持体１０２ｂには、中間支持体１０２ｂを貫通するフロー流路１０４ｃが形成されている。
【０１５９】
また下部支持体１０２ｃには、その表面に沿って水平方向に延び、かつ下部支持体１０２ｃを貫通するフロー流路１０４ｄが形成され、このフロー流路１０４ｄには外方へ開口する排出口１０５が連通している。この中間支持体１０２ｂのフロー流路１０４ｃ、および下部支持体１０２ｃのフロー流路１０４ｃによって第２のフロー流路が形成されている。
【０１６０】
中間支持体１０２ｂのフロー流路１０４ｂと、下部支持体１０２ｃのフロー流路１０４ｃは互いにマイクロチップ１０１の貫通孔（微生物捕捉孔ともいう）１１１を介して連通している。ここで、フロー流路１０４ａ、１０４ｂを親水化処理することにより、水との親和性が強くなることから、付着した微生物が流水で容易に剥離するようになる。その結果、微生物の流路への付着が抑制される。
【０１６１】
このように構成された本実施の形態において、微生物分離装置１１０に導入されたサンプル水は供給口１０３から導入され、フロー流路１０４ａ、１０４ｂを通り、金属板１０１に到達する。このとき、金属板１０１の貫通孔１１１の孔径より小さな物質、及び溶解成分はフロー流路１０４ｃを通って、排水口１０５から排出され、孔径より大きな物質が金属板１０１に捕捉される。フロー流路１０４ａ、１０４ｂは前記の通り、親水化処理されているため、微生物の付着が抑制され、試料水中に含まれる微生物は、ほぼ全てが金属板１０１に到達するようになる。
【０１６２】
ここで、金属板１０１は、微生物の寸法より小さい貫通孔１１１を有している。一般的に細菌類や原虫類の大きさは１〜数μｍであり、それ以下の寸法の貫通孔１１１を形成する。金属板１０１に到達した微生物は、貫通孔１１１に捕捉される。本実施の形態によれば、流路への微生物の付着を防止し、精度の向上を図ることができる。
【０１６３】
貫通孔１１１はレーザー加工や機械加工等の方法により形成されるが、加工方法によっては両面で、貫通孔の孔径が異なる。図１８は金属板１０１（ＳＵＳ３０４製）をレーザー加工によって加工して貫通孔を製作した例を示したものであるが、厚さ５μｍの金属板１０１に孔径２〜３μｍの孔を開けた場合、反対側の面の開口部は３〜５μｍの孔径となる。この金属板は、どちらを上面にしても微生物分離に適用することは可能である。図１８では、孔径の小さい面をフロー流路１０４ｂ側（供給側）とした例を図示している。この構成を利用して、微生物模擬粒子を捕捉した例を図１９に示す。ここではクリプトスポリジウム模擬粒子（クリプトレーサー１号：（財）水適技術研究センター）を使用した。１つの輝点が粒子１つに対応しており、ほぼ１つの孔に１つの粒子が捕捉されていることがわかる。
【０１６４】
実際のサンプル水では、微生物以外の非生物性の粒子も多く含まれている。分子生物学的手法を用いることにより、対象とする微生物以外は染色されないことから、誤認識の面ではそれほど問題は無いが、貫通孔を閉塞させてしまう恐れがある。これを防止するために、酸・アルカリ等の薬品をマイクロチップ１０１に供給し、流路や貫通孔に付着した非生物性の粒子を除去することが可能である。
【０１６５】
非生物性の粒子としては、カルシウム，鉄，シリカ等の鉱物性の成分が挙げられる。表１に、実際に水道水中に含まれていた鉱物系の元素の重量比，原子量比の例を示す。
【表１】
2007089566.tif 000003
【０１６６】
通常、これら鉱物性の粒子を溶解させるためには、塩酸洗浄が有効である。例えば、１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌを１０分間作用させることにより、クリプトスポリジウムを溶解させること無く、酸化鉄（Ｆｅ２Ｏ３），炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３），水酸化亜鉛（Ｚｎ（ＯＨ２））酸化銅（ＣｕＯ，Ｃｕ２Ｏ）を溶解除去することが可能である。その他の酸では、硝酸，スルファミン酸，クエン酸等の、スケール洗浄に使用される酸類の適用が可能である。塩酸処理だけで十分に粒子を除去できない場合は、シリカ（ＳｉＯ２）が含まれていることが考えられる。この場合には、助剤として、フッ酸を添加することで、溶解性を向上させることができる。
【０１６７】
図２０は支持体１０２ａ、１０２ｃを構成するＰＤＭＳ素材に各種処理を施した際の、接触角の変化を示したものである。処理前は１００°以上の接触角となっているが、プラズマ処理を施したものは、いずれも大きく接触角が低下していることがわかる。
【０１６８】
プラズマ処理後に純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）で処理を行った場合は、処理直後は接触角が大きく低下するものの、５時間後には再び増加する傾向にある。これは、プラズマ処理によって表面に形成された親水基が徐々に消失することに起因するものと考えられる。プラズマ処理後に界面活性剤（１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム））で処理した場合は、純水で処理したものに比較すると、接触角の増加は抑えられる傾向にあり、より親水化の効果を発揮させることができる。
【０１６９】
また、陰イオン界面活性剤を用いて表面を被覆することにより、表面電位が負に帯電しているクリプトスポリジウムオーシストの吸着を阻害すると考えられる。今回の試験では、流路の材質として、ＰＤＭＳを用いたが、他の材質についても、処理方法を工夫することによって、導入流路におけるクリプトスポリジウムオーシストの吸着は抑制できると考えられる。
【０１７０】
図２１は、微小流路内への微生物模擬粒子の付着状況を比較したものである。ＰＤＭＳを使用して、幅２００μｍ、深さ２００μｍ、長さ１ｃｍの流路を作製し、シリンジポンプを用いて流速１００μＬ／ｍｉｎでクリプトスポリジウム模擬粒子の懸濁液（１００個／１０μＬ）を導入した。クリプトスポリジウム模擬粒子は、クリプトレーサー１号：（財）水適技術研究センターを使用した。この模擬粒子は比重、表面電位が実際のクリプトスポリジウムと同様になっており、蛍光色素を予め含んでいる。５分間各溶媒で粒子を導入後、流路内の溶液を空気で押し出した後に、Ｕ励起下で蛍光顕微鏡観察した。無処理の流路Ａの場合、非常に多くの粒子が流路内に残存していることが分かる。
【０１７１】
それに対し、プラズマ処理および界面活性剤として１％ＳＤＳ処理を施した流路Ｂの場合、ほとんど流路内に蛍光発光による輝点は見られず、模擬粒子の吸着は見られない。
【０１７２】
図２２は各種処理を施した場合の、流路内への微生物模擬粒子の付着数を比較したものである。試験条件は図４の場合と同様である。プラズマ処理を施した流路では、無処理のものに比較して付着粒子数が低減している。特に、プラズマ処理＋ＳＤＳの処理を行った流路では顕著に付着粒子が低下している。
【０１７３】
この様に、プラズマ処理、さらに陰イオン界面活性剤による表面処理を行うことにより、クリプトスポリジウムの吸着を有効に防止することができる。
【０１７４】
第３−２の実施の形態
次に本発明の第３−２の実施の形態について図２３により説明する。
【０１７５】
図２３は、図１７乃至図２０に示す第３−１の実施の形態における微生物分離装置を組込んだ微生物分離システムを示す。
【０１７６】
図２３において、サンプル水は試料水供給バルブ１２２を介して試料水供給ライン１２１に流れ、試料水リザーバタンク１２３に導入される。所定量のサンプル水を導入後、試料水供給バルブ１２２を閉じ、試料水供給ポンプ１２４により供給口１０３から微生物分離装置１１０へサンプル水が供給され、微生物分離装置１１０の金属板１０１においてサンプル中の特定の対象微生物が捕捉される。その後、サンプル水は、微生物分離装置１１０の排出口１０５から排出されて流体吸引装置１２６により吸引される。
【０１７７】
この間、サンプル水中に含まれていた対象微生物は、第１の支持体１０２ａの第１の流路１０４ａ、１０４ｂを通過して微生物捕捉用貫通孔１１に捕捉される。ここで、第１の流路１０４ａ、１０４ｂでの微生物吸着が多いと、金属板１０１に到達する微生物の割合が低下し、検出率の低下につながる。しかしながら、第３−１の実施の形態に示すように第１の流路１０４ａ、１０４ｂ内面を親水化することにより、より高い確率で微生物が金属板１０１に到達することになる。こうして第１の流路１０４ａ、１０４ｂを通過した、微生物捕捉用貫通孔１１１の最小直径部の径より小さい微生物や物質はこの微生物捕捉用貫通孔１１１を通過して吸引され、流体吸引装置１２６側へ排出される。
【０１７８】
この過程において、対象微生物を含む粒子状物質は微生物捕捉用貫通孔１１１により捕捉される。
【０１７９】
サンプル水は試料水の供給ポンプ１２４と流体吸引装置１２６の双方により微生物分離装置１１０内へ導入されるが、供給ポンプ１２４と液体吸引装置１２６のうちいずれか一方のみを設けてもよい。
【０１８０】
また、実際に対象微生物が捕捉されているかどうかを金属板１０１上で確認することも可能である。対象微生物を検出もしくは生物の種類を特定する場合、抗原・抗体の結合反応や、ＤＮＡのハイブリダイゼーション反応を利用した生物的な情報に基づく検出法を金属板１０１上で実施することが可能である。対象微生物を抗原として認識する抗体に蛍光もしくは発光色素で標識した標識抗体や、対象生物に含まれるＤＮＡもしくはＲＮＡと特異的に結合するＤＮＡプローブに蛍光もしくは発光色素で標識した標識ＤＮＡプローブを供給する手段を金属板１０１に設け、標識抗体、標識ＤＮＡプローブを金属板１０１側に供給する。その結果、対象微生物を選択的に染色でき、それらを蛍光顕微鏡を用いて観察することが可能となる。
【０１８１】
第３−３の実施の形態
次に本発明の第３−３の実施の形態について、図２４乃至図２６により説明する。
【０１８２】
ここでは、蛍光顕微鏡像による微生物検出の妨害となる、藻類の除去に関する効果について説明する。サンプル中に藻類が含まれる場合、藻類は細胞内にクロロフィル、フィコシアニンといった、蛍光性の物質を含んでおり、自ら蛍光発光する性質がある（以下、自家蛍光とする）。そのため蛍光染色を利用した検出法を採る場合、誤認識の原因となりうるため、除去することが望ましい。特に耐塩素性の病原性微生物である、クリプトスポリジウムを検出対象とする場合、クリプトスポリジウムの直径が約５μｍであることから、藻類と同等の大きさであり、微生物捕捉用貫通孔１１１の分画精度だけでは、十分に分離することが困難である。
【０１８３】
図２４は藻類除去機能を更に備えた微生物分離システムを示す。なお、図２４において、図２３に示す第３−２の実施の形態と同一部分には同一符号を付して詳細な説明は省略する。
【０１８４】
まず、上述した第３−２の実施の形態で示したように、サンプル水が金属板１０１に到達して、サンプル水中の微生物が金属板１０１の微生物捕捉用貫通孔１１により捕捉される。
【０１８５】
次に図２４において、藻類溶解酵素液保存容器１３１から溶解液切換バルブ１３２を通じ、試料供給ポンプ１２４により溶解液が金属板１０１に供給され、その後金属板１０１の貫通孔１１１に導入される。溶解水は微生物捕捉用貫通孔１１１を洗浄し、排出バルブ１３３を通じて排出される。
【０１８６】
次に、蛍光染色液保存容器１３４から、蛍光染色液切換バルブ１３５を通じ、試料供給ポンプ１２４により、蛍光染色液が金属板１０１に供給される。この蛍光染色液は、蛍光標識された、対象微生物を特異的に認識・結合する抗体、ＤＮＡプローブからなる。金属板１０１の微生物捕捉用貫通孔１１１に捕捉された粒子のうち、対象微生物を抗体、ＤＮＡプローブが認識、選択的に結合することにより、対象微生物のみが染色される。この構成とすることにより、藻類を除去した後、対象微生物を染色することが可能となる。
【０１８７】
本発明では、藻類溶解酵素を使用して藻類を除去する。図２５には、各種の細胞溶解処理方法に対する、藻類の自家蛍光強度特性を示す。細胞溶解処理方法として、リゾチーム（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）や、プロテアーゼの一つであるプロテイナーゼＫ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ）等を用いた酵素処理を検証した。ここでは試験サンプルの藻類として、ＢＧ−１１培地で振とう培養し、８０μＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．５）に懸濁したＳｙｎｅｃｈｏｃｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＮＫＢＧ  ０４２９０２（６×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を用いた。この藻類懸濁液中に、５０ｍｇ／ｍＬ−リゾチーム２０μＬを添加し、室温で２０分間インキュベートした。さらに、１ｍｇ／ｍＬ−プロテイナーゼＫを１０μＬ加え、各条件下でインキュベートした。遠心回収、洗浄後Ｇ励起下で蛍光顕微鏡観察を行い、蛍光強度を測定した。
【０１８８】
その結果、どちらの酵素を使用しても、藻類による自家蛍光の減少が観察されており、藻類除去効果が得られる。特に、リゾチーム＋プロテイナーゼＫの連続処理による溶解が効果的であり、藻類の自家蛍光強度の大きな減少が見られている。
【０１８９】
クリプトスポリジウムのオーシストに対して、同様の処理を実施した結果を図２６に示す。クリプトスポリジウムに関しては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に比較して、酵素処理を行った場合でも蛍光強度の低下は見られず、クリプトスポリジウムは藻類溶解処理を行っても溶解されずに、免疫染色が可能であることが分かる。この結果から、藻類とクリプトスポリジウムの混合物をマイクロチップ上に補足した後、藻類のみを選択的に除去できるといえる。
【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１】本発明による微生物分離装置の第１−１の実施の形態を示すマイクロチップの構造概念図。
【図２】微生物分離装置のマイクロチップの微生物捕捉部および微生物捕捉孔を示す構造概念図。
【図３】本発明による微生物分離装置の第１−１の実施の形態を示す全体概略図。
【図４】本発明による微生物分離装置の第１−２の実施の形態を示す全体概略図。
【図５】本発明による微生物分離装置の第１−３の実施の形態を示す微生物捕捉孔の概念図。
【図６】本発明による微生物分離装置の第１−４の実施の形態を示す全体概略図。
【図７】本発明による微生物分離装置の第１−４の実施の形態の微生物捕捉孔を示す概念図。
【図８】本発明による微生物分離装置の第１−５の実施の形態を示す全体概略図。
【図９】本発明による微生物分離装置の第１−６の実施の形態を示す全体概略図。
【図１０】本発明による微生物分離装置の第１−７の実施の形態を示すマイクロチップとメンブレンフィルタの構造概念図。
【図１１】本発明による微生物分離装置の第１−７の実施の形態を示すマイクロチップの微生物捕捉部および微生物捕捉孔とメンブレンフィルタの構造概念図。
【図１２】本発明による微生物分離装置の第２−１の実施の形態を示す構成図。
【図１３】金属板の微生物捕捉用貫通孔を示す図。
【図１４】微生物捕捉用貫通孔の位置とクリプトスポリジウム模擬粒子の捕捉状況を示す図。
【図１５】本発明による微生物分離装置の第２−２の実施の形態を示す構成図。
【図１６】本発明による微生物分離装置の第２−３の実施の形態を示す構成図。
【図１７】本発明による微生物分離装置の第３−１の実施の形態を示すマイクロチップの構造概念図。
【図１８】微生物分離装置のマイクロチップの微生物捕捉部および微生物捕捉孔を示す構造概念図。
【図１９】マイクロチップへの粒子捕捉例を示す図。
【図２０】ＰＤＭＳにプラズマ＋各種界面活性剤処理を施した際の接触角を示す図。
【図２１】微小流路内への微生物模擬粒子の付着状況を示す図。
【図２２】ＰＤＭＳにプラズマ＋各種界面活性剤処理を施した際の残留粒子数を示す図。
【図２３】本発明による微生物分離装置の第３−２の実施の形態を示す全体概略図。
【図２４】本発明による微生物分離装置の第３−３の実施の形態を示す全体概略図。
【図２５】各種の細胞溶解処理方法に対する、藻類の自家蛍光強度の減少特性を示す図。
【図２６】各種の細胞溶解処理方法に対する、Ｃ．ｐａｒｖｕｍオーシスト蛍光染色強度測定結果を示す図。
【符号の説明】
【０１９１】
１０  平板基板
１１  フロー流路
１２  微生物捕捉部
１２ａ  微生物捕捉孔
１３  流体供給口
１４  流体排出口
１５  流体吸引口
１６  試料水供給ライン
１７  試料水供給バルブ
１８  試料水リザーバタンク
１９  試料水供給ポンプ
２０  マイクロチップ
２１  流体吸引装置
２２  試料水排出バルブ
２３  試料水循環バルブ
２４  微生物捕捉用抗体
２５  対象微生物
２６  試料水リザーバタンク兼磁性物質標識反応槽
２７  磁性物質標識抗体保存容器
２８  磁性物質標識抗体供給ライン
２９  磁性物質標識抗体供給バルブ
３０  磁性物質標識抗体供給ポンプ
３１  磁気印加装置
３２  磁性材料物質標識抗体
３３  磁気材料
３４  磁性材料
３５  洗浄液保存容器
３６  洗浄液供給ラインバルブ
３７  物理的印加手段
３８  分画処理手段
３９  メンブレンフィルタ
１０１  金属板
１０２ａ  上部支持体
１０２ｂ  中間支持体
１０２ｃ  下部支持体
１０３  供給口
１０４ａ  フロー流路
１０４ｂ  フロー流路
１０４ｃ  フロー流路
１０５  排水口
１１１  微生物捕捉用貫通孔
１２１  試料水供給ライン
１２２  試料水供給バルブ
１２３  試料水リザーバタンク
１２４  試料水供給ポンプ
１２６  流体吸引装置
１３１  洗浄液保存容器
１３２  洗浄液切換バルブ
１３３  洗浄液排出バルブ
１３４  物理的洗浄手段
【図１】
2007089566.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2007089566.tif 000011
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2007089566.tif 000019
【図１８】
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【図２０】
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【図２２】
2007089566.tif 000022
【図２３】
2007089566.tif 000023
【図２４】
2007089566.tif 000024
【図２５】
2007089566.tif 000025
【図２６】
2007089566.tif 000026
【図１４】
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【図１９】
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【図２１】
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