(57)【要約】【課題】  ＤＮＡを正確、迅速かつ簡便に切断することができ、実用的なＤＮＡの切断方法を提供すること。【解決手段】  一般式（Ｉ）で表されるＣｅ４＋配位子；ＤＮＡの５´末端のリン酸基に、前記Ｃｅ４＋配位子を結合させて、前記ＤＮＡの５´末端の塩基と該塩基に隣接する塩基との間のホスホジエステル結合を切断することを特徴とするＤＮＡの切断方法；ＤＮＡの５´末端のリン酸基に、前記Ｃｅ４＋配位子を結合させて、前記ＤＮＡの５´末端の塩基と該塩基に隣接する塩基との間のホスホジエステル結合を切断し、続いて切断されたＤＮＡの５´末端に上記Ｃｅ４＋配位子を結合させて、前記切断されたＤＮＡの５´末端の塩基と該塩基に隣接する塩基との間のホスホジエステル結合を切断し、この操作を、ＤＮＡの所定の塩基と該塩基に隣接する３´末端の塩基との間が切断されるまで順次続けることを特徴とするＤＮＡの切断方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡの５´末端のリン酸基に結合させて前記ＤＮＡの５´末端の塩基と該塩基に隣接する塩基との間のホスホジエステル結合切断するために用いられるＣｅ４＋配位子であって、下記の一般式（Ｉ）
【化１】
2007063174.tif 000004
で表されるＣｅ４＋配位子。
【請求項２】
ＤＮＡの５´末端のリン酸基に、一般式（Ｉ）
【化２】
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で表されるＣｅ４＋配位子を結合させて、前記ＤＮＡの５´末端の塩基と該塩基に隣接する塩基との間のホスホジエステル結合を切断することを特徴とするＤＮＡの切断方法。
【請求項３】
ＤＮＡの５´末端のリン酸基に、一般式（Ｉ）
【化３】
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で表されるＣｅ４＋配位子を結合させて、前記ＤＮＡの５´末端の塩基と該塩基に隣接する塩基との間のホスホジエステル結合を切断し、続いて切断されたＤＮＡの５´末端に上記Ｃｅ４＋配位子を結合させて、前記切断されたＤＮＡの５´末端の塩基と該塩基に隣接する塩基との間のホスホジエステル結合を切断し、この操作を、ＤＮＡの所定の塩基と該塩基に隣接する３´末端の塩基との間が切断されるまで順次続けることを特徴とするＤＮＡの切断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ））を正確、迅速かつ簡便に切断することができ、実用的なＤＮＡの切断方法及びそれに用いられる配位子に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡをＰＣＲ増幅用のプライマーやプローブとして利用する場合、ＤＮＡを特定の箇所で切断する技術が有用である。
ＤＮＡの切断は、従来は特定の塩基配列を認識する酵素が使われてきたが、認識する塩基配列が限られた４〜６塩基のみであるなどの限界があり、正確に特定の部位でＤＮＡを切断する方法が必要とされていた。
【０００３】
酵素を使わずにＤＮＡを切断する方法としては、加水分解による方法が提案されている。例えば、特許文献１には、１本鎖ＤＮＡの塩基配列認識部位にＤＮＡ断片（末端に切断反応の触媒が結合）を結合させ、該触媒部位で１本鎖ＤＮＡを切断のセリウム（Ｃｅ，ＩＶ）と、ポリアミン−Ｎ−ポリカルボン酸あるいはその誘導体よりなる錯体を用いた加水分解による切断方法が提案されている。
また、非特許文献１には、１本鎖ＤＮＡの塩基配列認識部位にＤＮＡ断片を２つ結合させ、Ｃｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡを作用させて該ＤＮＡ断片の間部分で１本鎖ＤＮＡを切断する方法が提案されている。
しかし、これらの方法は、いずれも加水分解による切断のみに対応したものであり、他の切断方法が想定されたものではなかった。また、加水分解反応に多大な時間がかかるなどの問題点があった。
このような状況下、ＤＮＡをより正確、迅速、かつ簡便に切断する方法の開発が望まれていた。
【特許文献１】特開２００１−８９４３０号公報
【非特許文献１】Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ：２００４；３３，３００−３０１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、従来の問題点に鑑み、ＤＮＡを正確、迅速かつ簡便に切断することができ、実用的なＤＮＡの切断方法、及びそれに用いられる配位子を提供することを目的とする。
また、本発明では、加水分解による切断のみに対応したものではなく、ＤＮＡの切断方法、及びそれに用いられる配位子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、Ｃｅ４＋配位子として特定の構造を有するものは、５´末端のリン酸基に結合すると、５´末端塩基と隣接する塩基との間のホスホジエステル結合の切断が容易になり、自己切断用分子はさみとして有用であることを見出した。
【０００６】
本発明の請求項１に記載のＣｅ４＋配位子は、ＤＮＡの５´末端のリン酸基に結合させて前記ＤＮＡの５´末端の塩基と該塩基に隣接する塩基との間のホスホジエステル結合切断するために用いられるＣｅ４＋配位子であって、下記の一般式（Ｉ）
【化４】
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で表されるものであることを特徴とする。
【０００７】
請求項２に記載のＤＮＡの切断方法は、ＤＮＡの５´末端のリン酸基に、前記一般式（Ｉ）で表されるＣｅ４＋配位子を結合させて、前記ＤＮＡの５´末端の塩基と該塩基に隣接する塩基との間のホスホジエステル結合を切断することを特徴とする。
請求項３に記載のＤＮＡの切断方法は、ＤＮＡの５´末端のリン酸基に、前記一般式（Ｉ）で表されるＣｅ４＋配位子を結合させて、前記ＤＮＡの５´末端の塩基と該塩基に隣接する塩基との間のホスホジエステル結合を切断し、続いて切断されたＤＮＡの５´末端に上記Ｃｅ４＋配位子を結合させて、前記切断されたＤＮＡの５´末端の塩基と該塩基に隣接する塩基との間のホスホジエステル結合を切断し、この操作を、ＤＮＡの所定の塩基と該塩基に隣接する３´末端の塩基との間が切断されるまで順次続けることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明においては、ＤＮＡの切断を特定の部位まで続けることにより、所望のＤＮＡを得ることができる。すなわち、本発明の方法により、所定の塩基と該塩基に隣接する３’末端の塩基との間が切断されるまで順次繰り返すことにより、元のＤＮＡから、５’末端から何塩基かが切り離されたＤＮＡを得ることができる。
本発明のこのような切断方法は、例えば、ＰＣＲなどに用いられるプライマーやプローブなどの塩基配列を一部に含むＤＮＡに適用することにより、その塩基配列部分のみを正確に切り出すことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のＤＮＡの切断方法は、ＤＮＡの５´末端のリン酸基に、一般式（Ｉ）で表されるＣｅ４＋配位子を結合させて、前記ＤＮＡの５´末端の塩基と該塩基に隣接する塩基との間のホスホジエステル結合を切断することを特徴とする。
一般式（Ｉ）で表されるＣｅ４＋配位子は、図１に示すように、ＤＮＡの５´末端のリン酸基に特異的に結合する。
一般式（Ｉ）で表されるＣｅ４＋配位子の基本骨格は、後述の実施例１で記載するように、m−キシレンα，α´−ジアミンを原料とする有機合成反応を進めることにより得ることができる。
一般式（Ｉ）で表されるＣｅ４＋配位子は、Ｃｅを保持するサイトを有しているので、機能的蛍光色素として有用である。
【００１０】
本発明の切断方法においては、上記したようなＤＮＡの５´末端のリン酸基に、一般式（Ｉ）で表されるＣｅ４＋配位子を結合させる。
一般式（Ｉ）で表されるＣｅ４＋配位子の結合は、例えば、ＤＮＡ断片を、ｄＨ２Ｏ等に溶かした溶液と、これに適当な緩衝液と共にＣｅ４＋配位子をＤＭＳＯ等の溶媒で濃度を１〜１００ｍＭに適宜調製した後、ｄＨ２Ｏ等と混合し、２０〜３５℃で一晩穏やかに振盪反応後、エタノール沈殿等により精製する。
ＤＮＡ断片は、予めエタノール沈殿、ＲＰＣカラム、ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ等により精製しておくことが好ましい。
ＤＮＡの５´末端のリン酸基と、一般式（Ｉ）で表されるＣｅ４＋配位子色素との結合率は、９０％以上となることが好ましい。
【００１１】
本発明の切断方法においては、前記ＤＮＡの５´末端の塩基と該塩基に隣接する塩基との間のホスホジエステル結合を切断する。図２を用いて切断方法の一例を模式的に説明する。
切断方法については特に限定されないが、好ましくは、加水分解やレーザーによる切断を挙げることができる。例えば、加水分解により切断する場合には、一般式（Ｉ）で表されるＣｅ４＋配位子とＤＮＡとを反応させた後は、ＤＮＡにＣｅ４＋を導入して金属錯体化すると共に加水分解する。具体的には例えば、反応後の試料をｄＨ２Ｏ等に溶解させた後、（ＮＯ２）２Ｃｅ（ＮＨ４）２水溶液を加え、２０〜３５℃で６〜２４時間穏やかに振盪反応を行うことができる。振盪反応終了後、必要に応じて、エタノール沈殿等により精製させ、ｄＨ２Ｏに溶解させておくことができる。
一方、レーザー照射により切断する場合には、例えば、一般式（Ｉ）で表されるＣｅ４＋配位子とＤＮＡとを反応させた後は、ＤＮＡにＣｅ４＋を導入してレーザー照射する。具体的には例えば、反応後の試料をｄＨ２Ｏ等に溶解させた後、（ＮＯ２）２Ｃｅ（ＮＨ４）２水溶液を加え、レーザー照射後、必要に応じて、エタノール沈殿等により精製させ、ｄＨ２Ｏに溶解させておくことができる。ここで、レーザーとしてはＹＡＧレーザー、色素レーザー等を用いて、照射量を１〜１００ｍＷで１０〜６０秒の照射条件とすることができる。
【００１２】
本発明の切断方法においては、上記切断反応により５´末端の塩基と該塩基に隣接する塩基との間のホスホジエステル結合が切断されたかどうかを質量分析により確認することが好ましい。
質量分析は、ＴＯＦ／ＭＳ、電気泳動，ＨＰＬＣ等質量分析に通常用いられる方法を用いることができるが、このうち正確さ、簡便さ等の点、さらには測定にかかる時間の短縮という点でＴＯＦ／ＭＳが好ましい。ＴＯＦ／ＭＳの場合、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ装置などを用いることができる。
ＴＯＦ／ＭＳによる測定は、例えば、以下のようにして行うことができる。マトリックスとして３−ヒドロキシピコリン酸（３−ＨＰＡと略す）溶液を、切断確認の対象たるＤＮＡとマイクロプレート上で混合し、真空中徐々に溶媒除去し、混晶を形成させる。この混晶に、レーザーを照射しマトリックス援用レーザー脱離質量分析により分子量分析し、ピークどうしの質量差から配列決定し、当初のＤＮＡよりも５´末端の一塩基が少ないことを確認する。
【００１３】
本発明のＤＮＡの切断方法は、上記の操作を特定の部位まで続けることにより、所望のＤＮＡを得ることができる。すなわち、ＤＮＡの５´末端のリン酸基に、上記一般式（Ｉ）で表されるＣｅ４＋配位子を結合させて、前記ＤＮＡの５´末端の塩基と該塩基に隣接する塩基との間のホスホジエステル結合を切断し、続いて切断されたＤＮＡの５´末端に上記Ｃｅ４＋配位子を結合させて、前記切断されたＤＮＡの５´末端の塩基と該塩基に隣接する塩基との間のホスホジエステル結合を切断し、この操作を、所定の塩基と該塩基に隣接する３´末端の塩基との間が切断されるまで順次続けることにより、もとのＤＮＡから、５´末端から何塩基かが切り離されたＤＮＡを得ることができる。
本発明のこのような切断方法は、例えば、ＰＣＲなどに用いられるプライマーやプローブなどの塩基配列を一部に含むＤＮＡに適用することにより、その塩基配列部分のみを正確に切り出すことができる。
【実施例】
【００１４】
以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明する。
［実施例１］（Ｃｅ４＋配位子の基本骨格の合成）
出発原料として、m−キシレンα，α´−ジアミン及びジ−ｔｅｒｔ−ブチルカルボン酸を用いて、図４に示すような合成経路にて、下記に説明するようにＣｅ４＋配位子の基本骨格の合成を行った。
【００１５】
（１）出発原料から化合物２の合成
m−キシレンα，α´−ジアミン（和光純薬製）０．５０００ｍｌ（３．７９ｍｍｏｌ）を２０ｍｌのｄｒｙＴＨＦに溶かし、これにジ−ｔｅｒｔ−ブチルカルボン酸（和光純薬製）０．４２５ｍｌ（１．８５ｍｍｏｌ）の、２０ｍｌ  ｄｒｙＴＨＦ溶液を氷水浴上で４０分かけてゆっくり滴下した。
室温で約１５時間攪拌した後、反応液にｄｉｌ  ＮａＯＨａｑ．を加えて、酢酸エチルで抽出した。有機層は飽和食塩水で洗った後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。
得られた粗生成物（４１０ｍｇ）を５ｍｌのｄｒｙＴＨＦに溶かし、これに１，１´−カルボニルジイミダゾール３９１ｍｇ（２．４７ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２時間攪拌した後、溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、Ｍｅｒｋ７０−２３０ｍｅｓｈ、３０ｇ、酢酸エチル、Ｒｆ＝０．４）で精製したところ、化合物２が３１７ｍｇ（５２％、２ｓｔｅｐｓ）得られた。
【００１６】
（化合物２のＮＭＲ結果）
化合物２をＮＭＲで構造解析したところ、以下のとおりであった。すなわち、ＮＭＲ（６０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１．３９（ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ），４．０−４．５（ｔｗｏ  ｂｄ，４Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２−），５．７（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−），６．９１，７．５８，８．０３（ｅａｃｈ  ｓ，３ＩＩ，ｉｍｉｄａｚｏｌｅ−Ｈ）、７．１９（ｓ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ），８．７１（ｂｔ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−）
【００１７】
（２）化合物３の合成
次に、ジアミド（図４に示す化合物２参照）３１７ｍｇ（０．９６ｍｍｏｌ）を３ｍｌのＴＨＦに溶かし、これにｄｉｅｔｈｙｌｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔａｔｅ  ０．１８０ｍｌ（１．００ｍｍｏｌ）を加えた。室温で４０時間（又は５０−６０℃で２時間）後、溶媒を減圧留去し、粗生成物５５０ｍｇを得た。得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、Ｍｅｒｃｋ７０−２３０ｍｅｓｈ、２５ｇ、酢酸エチル、Ｒｆ＝０．６）で精製したところ、化合物３（図４に示す化合物３参照）が３９６ｍｇ（９１％）得られた。
【００１８】
（化合物３のＮＭＲ結果）
化合物３をＮＭＲで構造解析したところ、以下のとおりであった。すなわち、ＮＭＲ（６０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１．２４（ｔ，Ｊ＝７  Ｈｚ，６Ｈ，−ＣＨ３），１．４４（ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ），４．１０（ｓ，４Ｈ，−ＣＨ２ＣＯ２−），４．０−４．４（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２−，−ＣＯ２−ＣＨ２−），５．３（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−），５．９（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−ＣＯ−），７．１９（ｓ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）
【００１９】
（３）化合物４の合成
前記化合物（図４に示す化合物３参照）３９６ｍｇ（０．８８ｍｍｏｌ）に、ＣＦ３ＣＯＯＨを０．５００ｍｌ加えて、室温で２時間攪拌したところ、直ちに発泡した。過剰のＣＦ３ＣＯＯＨを減圧留去し、粗生成物として化合物４（図４に示す化合物４参照）を得た。化合物４をＮＭＲで構造解析したところ、以下のとおりであった。
【００２０】
（化合物４のＮＭＲ結果）
ＮＭＲ（６０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１．２５（ｔ，Ｊ＝７  Ｈｚ，６Ｈ，−ＣＨ３），４．０−４．４（ｍ，１０Ｈ，−ＣＨ２−），４．６３（ｂｓ，２Ｈ，−ＣＨ２−），７．３２（ｓ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ），７．６（ｍ，３Ｈ，−ＮＨ３＋）
【００２１】
（４）化合物６の合成
前記化合物４（図４に示す化合物４参照）の一部を酢酸エチルに溶かして分液漏斗に移し、ｄｉｌＮａＯＨａｑ、次いで飽和食塩水で洗い、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去すると化合物６が得られた。尚、化合物５（図４に示す化合物５参照）は容易に分子内環化して化合物６（図４に示す化合物６参照）に変化するように思われた。
【００２２】
化合物６をＮＭＲで構造解析したところ、以下のとおりであった。すなわち、ＮＭＲ（６０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１．２７（ｔ，Ｊ＝７  Ｈｚ，３Ｈ，−ＣＨ３），１．７５（ｂｓ，２Ｈ，−ＮＨ２），３．８４−４．４１（ｍ，８Ｈｒ，−ＣＨ２−），４．９６（ｓ，２Ｈ，−ＣＨ２−），７．３０（ｓ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）
【００２３】
（５）化合物８の合成
以下の図５に示す経路にて、化合物６を環化しない方向に変換させた。即ち、下記の実施例２の（１）に従って、ＤＮＡ断片（実施例２で用いたものと同じもの）の５´リン酸基に化合物６を結合させた後、０．５ＭのＮａＯＨを用いて加水分解を行って開環し、次いで実施例２の（２）に従ってＣｅ錯体として、環化させない化合物８を得た。
【００２４】
実施例２（ＤＮＡ試料との結合、切断）
（１）ＤＮＡ試料との結合
配列表の配列番号１記載の塩基配列（ggttatcgaa atcagccaca gcgcg）からなる１本鎖ＤＮＡ断片（５´リン酸化プライマー）を、ｄＨ２Ｏに溶かし１００μＭとして、ＤＮＡ試料とした。このＤＮＡ試料１０μＬを、２×Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（０．２４Ｍ  １−メチルイミダゾール（０．３２Ｍ  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを含む。）水溶液をｐＨ９．０に調整したもの）５０μＬ、機能的蛍光色素、すなわち、実施例１で得た化合物６をＤＭＳＯにて５０ｍＭに調製したもの（５０ｍＭ配位子）２０μＬ、及びｄＨ２Ｏ２０μＬとを混合し、室温で一晩穏やかに振盪反応後、エタノール沈殿により精製した。色素との結合率は９０％以上であった。
【００２５】
（２）ＤＮＡ試料の金属錯体化（Ｃｅ４＋配位子の導入）及び特異的部位切断
上記（１）にて機能的蛍光色素と反応し、精製処理のなされたＤＮＡ試料をｄＨ２Ｏ１０μＬに溶解させた。このＤＮＡ試料に、１ｍＭ（ＮＯ２）２Ｃｅ（ＮＨ４）２水溶液１０μＬを加え、室温で一晩穏やかに振盪反応後、エタノール沈殿により精製し、ｄＨ２Ｏ１０μＬに溶解した。
【００２６】
（３）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによる測定
上記（２）にて切断後のＤＮＡ試料１μＬについて、切断状況の確認を行った。マトリックスとして３−ヒドロキシピコリン酸（３−ＨＰＡと略す）３０ｍｇを水１００μＬ、０．１Ｍ二水素クエン酸アンモニウム水溶液に溶解させた。そのうちの１μＬを、ＤＮＡ試料１μＬと共に、マイクロプレート上で直接混合した。真空中徐々に溶媒除去し、混晶を形成させた。この混晶に、波長３３７ｎｍのレーザーを照射しマトリックス援用レーザー脱離質量分析により解析した。分子量比較用の試料として、未反応のＤＮＡ試料と蛍光色素を結合させたＤＮＡ試料を同様に測定した。解析の結果検出されたピークどうしの質量差から配列決定した。結果を、図３に示す。
【００２７】
その結果、図３から明らかなように、５´側のグアニンが切断されたと考えられるピーク（７３８９．５）をメインに、リン酸基のみが切断されたピーク（７６３６．９）、さらにはもう一つのグアニンも切断されたと考えられるピーク（７０６２．２）等が検出された。
このことから、本発明のＣｅ４＋配位子は、完全に特異的ではないが、ある程度の特異性を持った機能的蛍光色素として用いることが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明は、より精密な遺伝子操作や遺伝子の解明への応用に寄与できる。また、医学分野においては、テーラーメイド医療の確立に貢献でき、農水畜産分野においては、より良い形質を持ち合わせた品種を作り出すことに貢献することができる。
【００２９】
（配列表）
SEQUENCE LISTING
<110>  株式会社日本パーカーライジング広島工場
<110>  独立行政法人科学技術振興機構
<120>  ＤＮＡの切断方法
<160>  1
<210>  1
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<400>  ggttatcgaa atcagccaca gcgcg
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】Ｃｅ４＋配位子がＤＮＡに結合した状態の模式図である。
【図２】本発明の切断方法によるＤＮＡの切断の模式図である。
【図３】本発明の切断方法の結果切断されたＤＮＡの質量分析結果の一例である。
【図４】Ｃｅ４＋配位子の基本骨格の合成経路を示す概略説明図である。
【図５】化合物８の合成経路を示す概略説明図である。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図２】
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