(57)【要約】      （修正有）【課題】肝臓疾患を高感度に検出し、応用治療可能な技術を提供する。【解決手段】肝障害時に増減が見られるＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅおよび抗コネキシン３２自己抗体を利用して肝臓疾患の診断、治療に用いることができる。Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅは、正常肝臓組織より障害時において極早期にその発現量が低くなった後一過性に上昇する。また、抗コネキシン３２自己抗体は障害が大きく、長くなるほど発現が大きくなる。それ故、Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅおよび抗コネキシン３２自己抗体の発現を同時に確認することは、より疾患の状況を的確に把握し、治療、再生に役立てることにつながる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質もしくはその変異体からなる肝臓疾患診断用マーカーならびに肝疾患に対する再生医療的応用可能な蛋白質。
【請求項２】
Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質が配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質であり、その変異体が配列番号１のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有しかつ肝臓疾患診断マーカーならびに肝疾患に対する再生医療的応用可能な機能を有する蛋白質であり、請求項１の肝臓疾患診断用マーカーならびに肝疾患に対する医療効果を有する遺伝子もしくはそれに基づく構造を有する蛋白質。
【請求項３】
Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質が配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質であり、その分子量が約１万２千、ｐＩが４．７５の蛋白質で、かつ肝臓疾患診断マーカーならびに肝疾患に対する医療効果を示す機能を有する蛋白質であり、請求項１の肝臓疾患診断用マーカーならびに肝疾患に対する医療効果を示す蛋白質。
【請求項４】
検体中のＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質もしくはその変異体の有無もしくは量を調べて、肝臓疾患を診断する診断方法。
【請求項５】
検体中のＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質もしくはその変異体を、Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質もしくはその変異体に対する抗体と反応させ、該抗体と抗原抗体反応した検体中のＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質もしくはその変異体の有無もしくは量から肝臓疾患を診断する請求項４の診断方法。
【請求項６】
組織免疫染色法または酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ）により、抗体と抗原抗体反応した検体中のＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質の有無もしくは量を調べる請求項５の診断方法。
【請求項７】
組織免疫染色法または酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ）により、抗体と抗原抗体反応した検体中のＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質もしくはその変異体の有無もしくは量を調べる請求項５の診断方法。
【請求項８】
請求項４〜６の診断方法のための診断用キットであって、Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質もしくはその変異体に対する抗体を含む上記診断用キット。
【請求項９】
コネキシン蛋白質もしくはその変異体を認識する自己抗体。
【請求項１０】
コネキシン３２蛋白質もしくはその変異体を認識する自己抗体。
【請求項１１】
請求項５から６のいずれかの自己抗体を利用した診断用キットであって、コネキシン３２蛋白質もしくはその変異体またはその一部と結合することができる抗コネキシン３２自己抗体を成分として含む上記診断用キット。
【請求項１２】
検体中の抗コネキシン３２自己抗体を、コネキシン蛋白質もしくはその変異体と反応させ、コネキシン蛋白質と抗原抗体反応した検体中の抗コネキシン３２自己抗体もしくはその変異体の有無もしくは量から肝臓疾患を診断する請求項１１の診断方法。
【請求項１３】
組織免疫染色法または酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ）により、抗体と抗原抗体反応した検体中の抗コネキシン３２自己抗体の有無もしくは量を調べる請求項１２の診断方法。
【請求項１４】
請求項１２または１３の診断方法のための診断用キットであって、抗コネキシン３２自己抗体もしくはその変異体を含む上記診断用キット。
【請求項１５】
請求項６〜７及び、請求項１２〜１３を同時に利用して肝臓疾患の状態をより正確に判断する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、アポトーシスならびに他の要因による哺乳動物小腸上皮粘膜組織細胞の崩壊に由来する新規蛋白質に関する。更には、アポトーシスその他の要因に基づく本物質濃度、コネキシン３２自己抗体血清中濃度の変化を測定することにより生体内の変化に関する情報を認識・解析することで、本新規蛋白質は病理診断ならびに治療にも利用することが出来ると判断される。したがって、本発明者は、これまでの検索により肝臓に外科的損傷ならびに病理的障害を受けたラットに、ウシ、メンヨウなどの小腸上皮組織ホモジネートエキスを投与した結果、損傷を受けた肝組織ならびに肝細胞に対し顕著な修飾効果を及ぼす多くの事実を測定、観察し、その効果の本質は主として本発明者が今回、発見分離したＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ群の新規蛋白質に基づく結果と判断した。本新規蛋白質は肝実質細胞その他の臓器細胞の増殖・新生・機能促進などにも効力を有し、再生医療の立場からも利用可能な物質と考える。
【背景技術】
【０００２】  本発明を説明するに当たり、はじめにアポトーシス、次に小腸、肝臓について説明したい。
１９９０年代後半以降、“アポトーシス”（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）という細胞死のメカニズムが、生物学の様々な分野で脚光をあびた後、この分野は現在まで急速な研究の進展を見せている。歴史的には従来、細胞死とは、外傷その他の要因などにより一群の細胞集団が死ぬ“病理的細胞死”である“ネクローシス（Ｎｅｃｒｏｓｉｓ）（壊死）”のみが知られていた。アポトーシスは、１９７２年、Ｋｅｒｒ、Ｗｙｌｌｉｅ及びＣｕｒｒｉｅという３人の病理学者達によって、壊死と形態学的違いから見出され、名付けられたプログラム細胞死である。アポトーシスは、その形態のみならず、機能においてもネクローシスと異なり、細胞分裂ならびに新生・増殖などと表裏一体となって組織の細胞動態に深く関わっているものとして提起された。アポトーシスは、多くの病理的要因によっても生じるが、発生、免疫、ホルモン作用など生理的現象の発現に必須な“生理的細胞死”としても重要な役割を果たし、しかも生体内臓器の種類及びそれらの機能の相違などにより、それぞれのプログラムの速度経過が異なることが知られている。【０００３】  アポトーシスという名称は、ギリシャ語のａｐｏ（離れて）、ｐｔｏｓｉｓ（落ちること）からとられた。細胞分裂（ｍｉｔｏｓｉｓ）に匹敵する重要な細胞機能を、語感の上からもわからせる造語である。
アポトーシスの形態的特色として、細胞膜と細胞核の内部構造の変化を伴う急速な細胞縮小が上げられる。まず、クロマチンが正常の網状構造を失い、核膜辺縁に凝集し、細胞核を含め細胞質全体が縮小する。細胞表面に大小の突起が多数出現し、やがてちぎれて多くの粒子に断片化する。この様に断片化した細胞をアポトーシス小体という。アポトーシス小体は、次いで、周りの他の貪食細胞やマクロファージ細胞に取り込まれ、貪食除去される。アポトーシスの大きな特徴は、ネクローシスと異なり組織内で散発的に生じ、一旦開始すると速やかに進行し、さらには死に至った細胞が炎症を伴わず急速に除去される点にある。アポトーシスの過程では、細胞内外の多様な生理的及び病理的因子が細胞死の開始のシグナルとして働き、多様な経路を辿って細胞中に情報伝達され、細胞死に関する遺伝子の発現などを介して死の決定がなされ、特徴的な細胞学的、生化学的変化を誘発する細胞死の実行過程へと進行する。【０００４】  アポトーシスに伴う生化学的変化として、クロマチンＤＮＡが１８０−２００塩基対の整数倍のオリゴヌクレオゾーム単位に断片化する現象が観察されている。このＤＮＡ断片は、アガロースゲル電気泳動により梯子状の“ｌａｄｄｅｒ”として検出され、これがアポトーシスの重要な指標のひとつとされている。【０００５】  ヒト生体内においては発生期において男女関係なく、将来女性生殖器になるミュラー管と男性生殖器になるウオルフ管という２つの管が両方つくられるが、ある段階で男性ではミュラー管が、女性ではウオルフ管が消えて性分化を行う。また、指間細胞の脱落により五指を形成することも有名である。【０００６】  そして、最も大切なことは消化管上皮細胞のＴｕｒｎ  Ｏｖｅｒもまた、アポトーシスの一部であることである。胃、大腸、小腸などの消化管上皮細胞は常に外部環境との接点にありながら、特殊な機能を求められている。そのため、パイエル板のような特殊な免疫構造によって消化管免疫を発達させ、上皮細胞の生まれ変わり自体が非常に速やかで激しいアポトーシスを起こし、崩壊した死細胞群は直ちに速やかに管内へ脱落してゆくことになる。これらの全ての脱落細胞の殆どは消化管内で消化分解されたり微生物分解を受けるものと考えられるが、その量は単位時間当たりでも他臓器に較べても極めて多量に達する。この分解物、即ちアポトーシス関連物質はどう利用されるのかこれまでに論じた報告は殆どなかった。【０００７】  ここで小腸について考えてみると、小腸（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）とは消化管の一部で消化と吸収を行う器官である。それは胃と大腸の間にあり、動物の種類によって長さはそれぞれ異なり、例えばヒトでは十二指腸（約３０ｃｍ）、空腸（約２５０ｃｍ）、回腸（約３５０ｃｍ）からなり、全長は６ｍ以上に達する。肝臓からの胆汁やすい臓からの酵素は十二指腸へ分泌され、消化反応のかなりの部分がここで行われる。小腸の壁面には数百万もの柔毛と呼ばれる指状の突起があり、これが小腸の表面積を増大させている。さらに、柔毛の表面には数千の微柔毛があり、さらに表面積を増やしている。一つの細胞からおよそ６００の微柔毛が突き出している。小腸で吸収された成分は栄養血管である門脈を通って肝臓に達し、同化、異化をうながす。【０００８】  一方、肝臓は非常に多様で複雑な機能と構造から成り、これを人為的に再構築することは困難と考えられている。しかし、実際には生体肝移植や肝部分切除手術後の過程で示されるように非常に強い再生能力を有しており、そのメカニズムの解明こそが難しかった。実験動物を例にとっても、ラットでは７０％の肝部分切除を行っても、わずか２週間程度の時間で湿重量が９０％以上にまで回復することはよく知られた事実である。最近、国内外で「再構成肝組繊（ミニ肝臓）」に関する報告がなされ、その構築の可能性が見えてきた。「ミニ肝臓」とは、体外あるいは体内で異所性に作った類似肝組織をさす。実際分離したラット肝細胞をマイクロキャリアビーズに張り付かせ、回転培養することで肝細胞塊を作ったり、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌ−ａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｒｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）遺伝子導入マウス肝細胞をマウス体内に移植し、細胞塊に血管を誘導することで肝組織を作ろうという試みがなされている。しかしいまだに肝臓の再生を制御することは難しい。【０００９】  非常によく知られている事実は、肝臓が増殖を行う際には肝実質細胞が脱分化とも考えられる状態になり、その細胞周期はＧ０期からＧ１期にシフトすると考えられていることである。この際にアルブミンなどの合成能力が低下する一方で、腫瘍マーカーでもあるアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）や急性期反応蛋白質（ＡＰＰ）が合成されることは有名である。【００１０】  しかし変化するのは蛋白質合成だけではない。この肝実質細胞増殖期には蛋白質合成だけではなく細胞の接着様式も変化する。ギャップ結合は細胞間結合の一つであり細胞膜に存在し、細胞間シグナル伝達に直接的に関与する。ギャップ結合を構成する半チャンネルをコネクソンといい、コネクソンはコネキシン蛋白によって構成されている。【００１１】  ギャップ結合の機能としては１．２ＫＤａ以下の細胞内シグナル伝達物質を隣り合う細胞へ直接輸送する機能を持ち、細胞分化・増殖やホメオスタシスの維持に役立つことがわかっている。マウス肝臓においてはコネキシン２６（Ｃｘ−２６）とコネキシン３２（Ｃｘ−３２）の発現が報告されており、平常時には隣接する肝実質細胞同士の情報伝達を司っているが、肝実質細胞増殖期には結合が解除されたり、コネキシンの発現が低下したりしていることが報告されている（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．２０００  Ａｐｒ；３００（１）：１１１−７．）。【００１２】  このコネキシンは細胞膜上にあるため抽出して研究することは難しく、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００などの界面活性剤を利用して分解後に研究を行ってきた（ＥＭＢＯ  Ｊ．１９８３；２（９）：１４７９−８６．）。その一方で免疫組織学的、遺伝子工学的な研究は進んでおり、発癌により蛋白質発現レベルが低下することや（Ｃ  Ｒ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＩＩＩ．１９９９  Ｆｅｂ−Ｍａｒ；３２２（２−３）：１５１−９．）肝炎時にはＬＰＳ（リポポリサッカライド）が翻訳後転写調節に関与することが報告されている（Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９６  Ｆｅｂ；１６６（２）：４６１−７．）。更にはＣｘ−３２のＣ末端アミノ酸を合成蛋白質抗��としてポリクローナル抗体を作製し、定量的にＣｘ−３２が肝再生時にいったん減少した後に再合成されることを示している（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｅｌｌ．１９９２；２４（１）：６１−７３．）。また、コネキシン２６の発現レベルを指標として癌転移能の検査ができ、治療にも応用できる可能性があるという報告がされている（特願平１１−１９８０３２）。【００１３】  本発明者はラットを用いて慢性肝炎や複数回に及ぶ肝疾患モデルを作製した場合、その血清中に抗コネキシン３２自己抗体が現れることを確認した。これによって炎症が長期にわたる場合などは自己抗体の肝実質細胞結合により細胞障害性を現すことがわかる。また、この自己抗体の血清中濃度測定によって肝疾患の予後を判定できることができることがわかった。【００１４】  更に本発明者はこれまでに明らかに種類の異なる様々な動物の小腸上皮粘膜より肝実質細胞増殖能を有する因子群を単離精製し、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏにおける初代培養肝細胞系で有効であることを報告した。以下に述べる。【００１５】  当初この研究における有効な因子群が外部からの刺激によって生産されるものなのか、内在性のものなのか何れかという大きい問題があった。外因性の吸収される物質で一番刺激となるもののひとつは前出したＬＰＳ（リポポリサッカライド）である。通常、小腸上皮細胞から進入するＬＰＳは血液中に入り、殆どが肝臓で代謝される。ＬＰＳは低濃度では免疫賦活物質であり、免疫担当細胞の活性化に働く。しかし肝炎などの疾患になるとＬＰＳの血中濃度が高くなってＬＰＳがＨｅａｔ  ｓｃｈｏｃｋ反応やＡｃｕｔｅ  ｐｈａｓｅ反応、免疫反応を通してのＴＮＦ−αからアポトーシスを引き起こす可能性があることが報告されている（Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１９９８  Ｊｕｌ；２６（７）：１２１３−７．）。しかし本発明者は既に１９８８年にはＬＰＳの濃度が上昇している門脈血中にリンパ球を刺激する因子が存在することを報告している。（Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ．１９８８  ７５：５１９−２１）。【００１６】  また、これまでにも他の要因による小腸のアポトーシスについて全く報告が無いわけではない。たとえばＩｎ  Ｖｉｔｒｏの実験系でもラット小腸上皮細胞を使用した実験において細胞株ＩＥＣ−６がＰｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ２Ａ（ＰＰ２Ａ）によってアポトーシスの調整を受けているとか（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００５  Ｊｕｌ  １）、Ｂｏｖｉｎｅ  Ｍｉｌｋ  ａｌｐｈａ−Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎが細胞死を誘導するという報告はあった（Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００５  Ｊｕｎ；６９（６）：１０８２−９．）。また、ガンマ線による細胞死が生じた際にどのような蛋白質発現差ができるかということについてもＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−Ｍａｓｓと二次元電気泳動を使用して比較した報告がある（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２００５  Ｆｅｂ；５（２）：４２６−３２．）。【００１７】  こうして、日常小腸上皮細胞でＴｕｒｎ  Ｏｖｅｒが原因で起こるアポトーシスから複数の蛋白質が発現することは確かである。発明者ははじめこの小腸上皮粘膜由来の有効因子群を包括的にＳＩＭＦｓ（Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｆａｃｔｏｒｓ）と命名した。例えば本発明者は１９８９年に既にウシの小腸上皮粘膜由来の物質がＩｎ  Ｖｉｔｒｏにおいてラットの肝実質細胞を刺激して増殖させることを報告している（ＩＮＴ．Ｊ．ＴＩＳＳ．ＲＥＡＣ．１９８９  １１（１）：７−１３）。更に本発明者は１９８９年当時にウシの小腸上皮因子を用いたラット肝実質細胞の長期培養によってＭｉｃｒｏ  ＯｒｇａｎともいえるＩｎ  Ｖｉｔｒｏにおける細胞塊（クラスター）の作製に成功していた（ＩＮ  ＶＩＴＲＯ  ＣＥＬＬＵＲＡＲ  ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴＡＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ．１９８９．ＡＰＲＩＬ  ２５（４）：３６５−３７２）。この時Ｉｎ  ＶｉｔｒｏでのＳＩＭＦｓを初代培養肝実質細胞に添加すると容易に細胞分裂、細胞増殖を進行させ、コロニーを形成する。Ｓｐｈｅｒｏｉｄを形成した細胞群間にはＢｉｌｅ  Ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓ−Ｉｉｋｅ  Ｄｕｃｔｓが確認され、培養１０数日になるとビリルビン、中性脂肪、コレステロール等の肝特有物質を生成するなど形態的、機能的分化を促進することが確認された（図１）。更に驚くべきことに９０日にも及ぶ長期培養の結果Ｍｉｃｒｏ  Ｌｉｖｅｒが観察されている（図２）。これは先に述べたように、現在でも非常に難しいとされる技術であり他に報告例がない。ＳＩＭＦｓを使用した場合には肝組織形成機構の機能的解析と人工培養過程における肝特有の分泌生成の過程と機構が明らかにされたことが大きな特徴と言える。今回、先のアポトーシス関連物質がＳＩＭＦｓに含まれる物質であるのかどうか、またどのような物質で、どのような機能を有しているのかという点について研究を行った。その結果、本発明の物質はＳＭＩＦｓに含まれていた物質であり、小腸から再吸収されて生体のホメオスタシスに役立っている新規生体物質であることがわかった。【００１８】  更に本発明者は、これまでの研究によって、ラットのＳＩＭＦｓを含めてウシ、メンヨウ、ヤギ、ウサギなどのＳＩＭＦｓはいずれも同様にラットの肝実質細胞の増殖を促進することを培養実験によって確認し、このＳＩＭＦｓは哺乳動物の種類の相違にもかかわらず何れも等しくラットの肝実質細胞の増殖に有効な共通因子群に属することも明らかにした（Ｂｕｌｌ．Ｆａｃｕｌｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒ．Ｍｅｉｊｉ  Ｕｎｉｖ．１９８４．６５：１−１３）（Ｂｕｌｌ．Ｆａｃｕｌｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒ．Ｍｅｉｊｉ  Ｕｎｉｖ．１９９２．１９：２１−４４）。これら哺乳動物の種類の相違にかかわらず共通に作用する事実は、その構造が比較的共通である一連の因子群の存在を裏づけしている。【００１９】  この事実は何れ医薬品として製品化する場合材料資源として世界各地に豊富に存在することの有用性のみならず、今回のようにその化学構造が明らかにされた以上、今後は合成有機化学に基づく製造法、更にこの因子を精製する遺伝子の発現と採取、生体内導入による遺伝子治療法の開発など、今世紀の人類の健康維持・寿命の更なる延長に対して極めて意義ある発見であるといえる。【００２０】  本発見を総括すると、はじめにアポトーシスによる小腸上皮粘膜組織細胞崩壊によって腸管内に放出される物質中には、肝実質細胞の維持増殖や肝機能の保持ならびに他臓器機能の維持・促進な��の広範囲な生体全般に関するホメオスタシス（Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）の保持に役立っている成分が含まれ、しかもそれは、各種哺乳動物の小腸上皮粘膜組織のホモジネートより得られてきた有効因子と同様か、かなり類似の構造を有する一群の新規蛋白質集団に属する物質と判断した。この物質を測定することは肝疾患の予後判定に役立つ。【００２１】  そこで本発明者はこのアポトーシスによって小腸上皮粘膜組織より現れ、肝実質細胞増殖能を有し、更には臨床検査上有効な情報を与えるこの一連の物質群に対して、小腸（Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）と肝実質細胞（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）よりヘパテスチン・グループ（Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ  Ｇｒｏｕｐ）と命名した。また抗コネキシン３２自己抗体の存在確認もまた肝疾患の予後判定に役立ち、更に同時に測定すればより効果的であった。したがって、本発明者は今回の研究において、まずアポトーシス関連物質がどのような物質で、どのような機能を有しているのかということから解析を試みた結果、幾つかの新しい知見が得られた。更に疾患の診断に使用できるマーカー２種類を発見した。
【非特許文献１】Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．２０００  Ａｐｒ；３００（１）：１１１−７．
【非特許文献２】ＥＭＢＯ  Ｊ．１９８３；２（９）：１４７９−８６．
【非特許文献３】Ｃ  Ｒ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＩＩＩ．１９９９  Ｆｅｂ−Ｍａｒ；３２２（２−３）：１５１−９．
【非特許文献４】Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９６  Ｆｅｂ；１６６（２）：４６１−７．
【非特許文献５】Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｅｌｌ．１９９２；２４（１）：６１−７３．
【非特許文献６】Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１９９８  Ｊｕｌ；２６（７）：１２１３−７．
【非特許文献７】Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃａｆｔｅｎ．１９８８  ７５：５１９−２１
【非特許文献８】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００５  Ｊｕｌ  １
【非特許文献９】Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００５  Ｊｕｎ；６９（６）：１０８２−９．
【非特許文献１０】Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２００５  Ｆｅｂ；５（２）：４２６−３２．
【非特許文献１１】ＩＮＴ．Ｊ．ＴＩＳＳ．ＲＥＡＣ．１９８９  １１（１）：７−１３
【非特許文献１２】ＩＮ  ＶＩＴＲＯ  ＣＥＬＬＵＲＡＲ  ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴＡＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ．１９８９．ＡＰＲＩＬ  ２５（４）：３６５−３７２
【非特許文献１３】Ｂｕｌｌ．Ｆａｃｕｌｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒ．  Ｍｅｉｊｉ  Ｕｎｉｖ．１９８４．６５：１−１３
【非特許文献１４】Ｂｕｌｌ．Ｆａｃｕｌｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒ．Ｍｅｉｊｉ  Ｕｎｉｖ．１９９２．１９：２１−４４
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】  従って、本発明は肝臓疾患時に現れるコネキシン３２（Ｃｘ−３２）に対する自己抗体、及び小腸細胞のアポトーシスにより発見された新規蛋白質を測定して疾患診断用マーカーとして利用すること、もしくは新規蛋白質が有する細胞増殖能およびそれを利用した再生医療的使用法、治療法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】  本発明者は、小腸細胞株ＩＥＣ−６にアポトーシスを発生させ、２次元電気泳動法によってアポトーシス特異的蛋白質を解析し、アポトーシス特異的蛋白質に対するモノクローナル抗体作製に成功した。また、本発明者らは目的蛋白質に対する測定系を構築し、さまざまなラット疾患モデルで目的蛋白質が検出、評価できることを見出した。また同時にラット疾患モデルで血清中にコネキシン３２（Ｃｘ−３２）に対する自己抗体が存在し、これを測定することで疾患の状況や予後が判定できることがわかった。更に抗Ｃｘ−３２自己抗体を新規物質とともに測定することで更に感度が向上し、より正確に予後を推定できることがわかった。更には、この新規蛋白質が肝実質細胞増殖誘導物質として有用であることを確認し、この一連の有効新規蛋白質群をヘパテスチン・グループ（Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ  Ｇｒｏｕｐ）と命名した。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。
【００２４】  従って、本発明は、Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質もしくはその変異体、コネキシン３２からなる肝臓疾患、炎症性腸疾患診断用マーカー蛋白質である。
更に、本発明は検体中のＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質もしくはその変異体、コネキシン３２自己抗体の有無もしくは量を調べて、肝臓疾患、炎症性疾患を診断する診断方法である。
更に、本発明は、検体中のＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質もしくはその変異体を、Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質もしくはその変異体に対する抗体と反応させ、該抗体と抗原抗体反応した検体中のＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質もしくはその変異体の有無もしくは量から肝臓疾患、炎症性疾患を診断する診断方法である。
【００２５】  更に、本発明は、検体中のコネキシン３２自己抗体もしくはその変異体自己抗体を、コネキシン３２蛋白質もしくはその変異体と反応させ、該抗体と抗原抗体反応した検体中の自己抗体もしくはその変異自己抗体の有無もしくは量から肝臓疾患、炎症性疾患を診断する診断方法である。
【００２６】  更に、本発明は、上記診断方法のための診断用キットであって、Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質もしくはその変異体、コネキシン３２自己抗体に対する抗体を含む、上記診断用キットである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】  本発明者らは、通常状態で培養した小腸上皮細胞株ＩＥＣ−６と、アポトーシス誘導状態で培養した小腸上皮細胞株との間で培養上清中に現れる蛋白質の発現状態を比較することによって、アポトーシスに関連して誘導される蛋白質を見出すことができると考えた。具体的には、化学物質で誘導したアポトーシス小腸上皮細胞の培養上清と通常培養した小腸上皮細胞上清の蛋白質発現レベルを質量分析法、２次元電気泳動法で解析することで比較した。【００２８】質量分析法には、表面増強レーザー脱離イオン化（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）飛行時間型質量分析計（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ法）、マトリックス支援レーザーイオン化（Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ法）、ＥＳＩ法（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）を用いる方法を例示できる。【００２９】ＳＥＬＤＩ型は、チップ表面の官能基に目的物質を均一に捕捉したまま不純物を除去し、レーザー光でイオン化するため、再現性のあるＳＮ比の高いイオンスペクトルが得られるので好ましい。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ法の場合、通常、検体を、前処理した後、チップに吸着させて、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ質量計に付す。検体が血清の場合、アルブミンの吸着剤を用いるか、イオン交換チップでアルブミンが電荷をもたなくなるまでバッファーで洗浄してアルブミンを系から除去することが好ましい。【００３０】  等電点電気泳動（１次元目）と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２次元目）を組み合わせた電気泳動を、通常２次元電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）と呼ぶ。等電点電気泳動とはアミノ酸がそれぞれに等電点（ｐＩ）を持っており、アミノ酸からなるタンパク質もまたそれぞれ固有のｐＩを持っていることを利用する方法である。以下簡単に説明する。等電点電気泳動は細長いゲル等を用いる。このゲルは一定の範囲でｐＨがグラジェントになっており、このゲルにサンプルをアプライする。そうすると、タンパク質を構成するアミノ酸のアミノ残基と呼ばれる部分でそのｐＨに応じて電子が遊離したりくっついたりして電荷が発生し、それはタンパク質を一つの分子として見た場合でも同じ事が起きる。そのようにして個々のタンパク質はそれぞれ固有のｐＨへ次第に収束する。これによって蛋白質を分離する方法である。次に２次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥである。タンパク質は、多数のアミノ酸がペプチド結合したもので、そのアミノ酸の数（アミノ酸の種類は２０種）や組み合わせはタンパク質によって異なっている。蛋白質を分離する方法の一つにＳＤＳ−ＰＡＧＥがある。これはアクリルアミドと呼ばれる化合物で出来たゲル中にタンパク質を通過させることで、一定時間での移動度と蛋白質を構成するアミノ酸の数が比例することから、蛋白質を分類する方法である。つまり、２次元電気泳動法は同じ条件で２種類のサンプルを処理し、一次元目として等電点電気泳動を、二次元目として分子量依存的なＰＡＧＥを行うことでスポットとして蛋白質を分離する方法といえる。【００３１】  このような２次元電気泳動法を用いた解析に���り、通常状態で培養した小腸株細胞とアポトーシス誘導状態で培養した小腸上皮細胞との間で蛋白質の発現レベルを比較し、発現パターンの違っているスポットを選択した。選択されたスポットを蛋白質の銀染色をもとに複数個選択して、選択されたスポットは切り出してトリプシン消化をさせ、Ｎ−末端解析を行うことで蛋白質の同定を行うことに成功した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの結果より、すべてのプリカーサーイオンについて得られたプロダクトイオンの数値をＭａｓｃｏｔを利用して全ての生物種（Ａｌｌ  Ｅｎｔｒｉｅｓ）を対照にデータベース（ＮＣＢＩｎｒ）探索を行い、ｓｃｏｒｅ  ４５を超える場合に有意とした。結果としてこれまでに報告の無い新規蛋白質であることがわかった。かくして、新規発見された本物質をＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅと命名し肝臓疾患、炎症性疾患診断用マーカーならびに肝疾患への再生医療的治療効果を有する機能的蛋白質となり得ることが明らかになった。より具体的には、Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅは、配列表の配列番号１に示されるＮ末端アミノ酸配列を有し、分子量約１万２千、等電点４．７５の蛋白質である。【００３２】  本発明においては、Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質の変異体も肝臓疾患診断用マーカーならびに肝疾患に対する治療効果を有する蛋白質となり得る。かかる変異体は、Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ遺伝子の突然変異やＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ遺伝子の翻訳後の修飾、Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質の発現後のプロテアーゼなどによる分解などにより生じ得ると考えられるものである。変異体としては、より具体的には、例えば、Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質のアミノ酸配列である配列番号１３のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有し、かつ炎症性腸疾患診断マーカーとしての機能を有する蛋白質が挙げられる。また、コネキシン３２自己抗体の認識するコネキシン３２蛋白質にもＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ同様に変異が考えられることはいうまでもない。【００３３】  本発明では、このような肝臓疾患診断マーカー蛋白質、コネキシン３２自己抗体に基づいて、肝臓疾患の診断を行うことができる。即ち、検体中のＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質もしくはその変異体の有無もしくは量、またはコネキシン３２自己抗体、またその変異体認識自己抗体を調べて、肝臓疾患を診断することができる。検体としては、肝臓疾患が疑われる患者からの血液、血清、リンパ球、組織、細胞、リンパ節、尿などの生物学的試料が挙げられる。【００３４】  本発明においては、検体中のＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質もしくは変異体の有無もしくは量を測定することによっても肝臓疾患の診断を行うことができる。この場合、Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質もしくは変異体に対する抗体を用いるのが好ましい。Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質またはそのアミノ酸配列の一部を有するポリペプチドを、Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質もしくは変異体に対する特異抗体を作成するための免疫抗原として好適に利用できる。この抗原を利用することにより、所望の抗血清、ポリクローナル抗体、及びモノクローナル抗体を取得することができる。【００３５】Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質またはそのアミノ酸配列の一部を有するポリペプチドは、それらをコードする遺伝子が宿主細胞中で発現できる組換えＤＮＡ（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から回収することにより得ることができる。発現ベクターとしては、通常の融合蛋白発現ベクターを利用でき、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白として発現させるためのｐＧＥＸ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）などを例示できる。これらの発現ベクターを用いた組換えＤＮＡによる蛋白質もしくはポリペプチドの調製法は、既に当業者に周知の技術であり、それらの技術をそのまま採用できる。また、Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質またはその一部のポリペプチドは、一般的な化学合成法により製造することもでき、化学的合成方法には、通常の液相法及び固相法によるペプチド合成法が採用できる。【００３６】  これら蛋白質もしくはポリペプチドを抗原とする抗体の製造法自体は、当業者によく理解されているところであり〔例えば、続生化学実験講座「免疫生化学研究法」、日本生化学会編（１９８６）など参照〕、本発明においてもこれら常法に従うことができる。例えば、Ｈｅｐ−ａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質もしくはその一部のポリペプチドを動物に免疫し、その動物から抗血清を採取することにより、また更に抗血清を精製することによりポリクローナル抗体を得ることができる。【００３７】  モノクローナル抗体を得るには次の方法が採用できる。即ち、上記のＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質もしくはその一部のポリペプチドを、公知のアジュバントと共に数回に分けてマウス、ラット等の動物にすることによって免疫する。次いで免疫された動物からの脾臓等に由来する抗体産生細胞と骨髄腫瘍細胞（ミエローマ細胞）等の試験管内で増殖能力を有する細胞とを融合する。融合法としては、既にそれ自体公知であるケーラーとミルスタインの定法（Ｎａｔｕｒｅ．２５６，４９５．１９７５）によってポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いることで融合できる。センダイウィルス、電気融合法によっても融合を行うことができる。融合した細胞からＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質もしくはその一部のポリペプチドを認識する抗体を産生するハイブリドーマを、Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質もしくはその一部のポリペプチドを固定化したアッセイプレートを用いた酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ）によりスクリーニングして選択できる。【００３８】  かくして得られるモノクローナル抗体としては、配列番号１に示すＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質のアミノ酸配列中１〜９番目に相当する領域（以下、Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ１−９と記載することもある）のポリペプチドを抗原として得られたハイブリドーマＮＴｈｅｐ−１が産生するモノクローナル抗体が挙げられる。ハイブリドーマ  ＮＴｈｅｐ−１は、平成１７年８月２３日に独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託され、受託番号としてＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０４０６が付与されている。【００３９】  かくして得られる抗体を用いて検体中のＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質もしくはその変異体の有無もしくは量を測定し、その結果から、肝臓疾患の診断を���うことができる。
Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質もしくはその変異体を測定する方法としては、組織免疫染色法やサンドイッチ法を含む、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）、免疫放射線検定法（ＩＲＭＡ）、免疫酵素法（ＩＥＭＡ）等が挙げられる。【００４０】  組織免疫染色法によるＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質もしくはその変異体を検出するときの具体例を以下に示す。例えば、大腸由来の組織細胞を検体とし、その検体を常法によりホルマリン固定をした後、パラフィンに抱埋をしてミクロトームにて薄切し、組織検体として使用する。組織切片はキシレンの処理で完全にパラフィンを除き、アルコール溶液をくぐらせた後、水洗する。続いて、緩衝液中、１２１℃等の高温で処理し、抗原を賦活化する。その後室温程度まで冷却し、流水にて水洗を行い、正常ヤギ血清にてブロッキングする。ブロッキング終了後の組織に、１次抗体溶液を反応させ、次いで、その組織をＴＢＳにて洗浄した後、ビオチン標識２次抗体を室温３０分間反応させる。反応終了後ＴＢＳにて洗浄し、更に、３％過酸化水素加ＴＢＳに浸漬し、内因性ペルオキシダーゼ活性を失活させる。続いて、ＡＢＣ試薬（和光純薬工業社）に浸漬させ、ＴＢＳ洗浄した後、ＤＡＢ試薬にて発色を行なう。このとき、対比染色としてヘマトキシリン核染色を行なう。次いでこれらの組織を水洗し、アルコール溶液、ついで、キシレン槽をくぐらせた後に染色後の組織に封入剤を滴下し、カバーグラスをかぶせて顕微鏡にて観察し、染色度を観察することにより、検体中のＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質もしくはその変異体を検出できる。それにより、肝臓疾患の診断、発見または臨床的重症度の判定に利用することができる。【００４１】  本発明においては、ＥＬＩＳＡ法によりＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質もしくはその変異体を測定するには、一次抗体でプレートをコートし、検体中に存在するＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質もしくはその変異体を結合させた後、二次抗体と反応させることにより、Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質もしくはその変異体を測定することが簡便である。また、抗体が認識するエピトープに対するポリペプチドまたはオリゴペプチドを用いた競争阻害による測定も可能である。ＥＬＩＳＡ法によるＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質もしくはその変異体を検出するときの具体例を以下に示す。
初めにポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、マイロン、ポリメタクリレートなどのそれ自体公知である固相に直接または間接的に物理結合や化学結合、アフィニティーを利用して抗Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ抗体（例えばモノクローナル抗体ＮＴｈｅｐ−１）を一次抗体として結合させる。感作抗体量は、通常、１ｎｇ〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲である。物理結合や化学結合、アフィニティーなどによって固相に結合した一次抗体に、検体を加えて一次反応させる。一定時間反応させた後、固相を洗浄し、二次標識抗体（例えばＨＲＰ標識モノクローナル抗体ＮＴｈｅｐ−１）を加えて二次反応させる。固相を再度洗浄し、固相に結合した標識部分を測定する。標識物質にＨＲＰを用いた場合、基質には既知のＤＡＢ、ＴＭＢ、ＯＰＤなどを用いることができる。また、標識物質には、ＨＲＰのような酵素だけではなく、金コロイド、ユーロピウムなどの標識金属やＦＩＴＣ、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ、ＧＦＰなどの化学的、生物的各種蛍光物質、３２Ｐ、５１Ｃｒなどの放射性物質など標識可能なあらゆる物質が挙げられる。【００４２】  また、以下の方法でもＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅは測定できる。まず、一次抗体として、抗Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅモノクローナル抗体、例えば、上記したハイブリドーマＮＴｈｅｐ−１が産生するモノクローナル抗体をプレートに吸着させ、次いで、検体中のＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質もしくはその変異体を上記モノクローナル抗体と反応させる。その際、陽性及び陰性対照についても同様の処理を施す。次いでビオチン化した２次抗体、例えば、Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質に対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を反応させ、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンと反応させた後、発色反応を行うことにより、Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質もしくはその変異体を検出することができる。
本発明では、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）、免疫放射線検定法（ＩＲＭＡ）、免疫酵素法（ＩＥＭＡ）等の免疫測定法を採用することもでき、これらの測定法はそれ自体周知であり、周知の方法をそのまま適用することができる。【００４３】  上記した本発明の測定は、検体中のＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質を検出する診断用キットを利用することによって、簡便に実施することができる。キットは、例えば、Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質またはその一部のポリペプチドに対する抗体を必須構成成分として含んでいればよく、他の成分として、標識剤などが含まれていてもよい。標識剤としては、放射性同位元素又は蛍光物質などの化学修飾物質などが挙げられる。更にキットには、測定の実施の便益のために適当な、発色試薬、反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤、反応停止液などが含まれていてもよい。【００４４】  本発明においては、ＥＬＩＳＡ法によりコネキシン３２自己抗体もしくはその変異体認識抗体を測定するには、精製コネキシン３２でプレートをコートし、検体中に存在するコネキシン３２自己抗体もしくはその変異体認識抗体を結合させた後、二次抗体である抗ヒトイムノグロブリン標識抗体と反応させることにより、コネキシン３２自己抗体もしくはその変異体認識抗体を測定することが簡便である。また、抗体が認識するエピトープに対するポリペプチドまたはオリゴペプチドを用いた競争阻害による測定も可能である。ＥＬＩＳＡ法によるコネキシン３２自己抗体もしくはその変異体認識抗体を検出するときの具体例を以下に示す。【００４５】  初めにポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、マイロン、ポリメタクリレートなどのそれ自体公知である固相に直接または間接的に物理結合や化学結合、アフィニティーを利用してコネキシン３２を抗原として結合させる。感作抗体量は、通常、１ｎｇ〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲である。物理結合や化学結合、アフィニティーなどによって固相に結合した一次抗体に、検体を加えて一次反応させる。この時に合成ペプチドや遺伝子組換え体、変異体を利用することもできる。一定時間反応させた後、固相を洗浄し、標識抗体（例えばＨＲＰ標識抗ヒトイムノグロブリンポリクローナル抗体）を加えて二次反応させる。固相を再度洗浄し、固相に結合した標識部分を測定する。標識物質にＨＲＰを用いた場合、基質には既知のＤＡＢ、ＴＭＢ、ＯＰＤなどを用いることができる。また、標識物質には、ＨＲＰのような酵素だけではなく、金コロイド、ユーロピウムなどの標識金属やＦＩＴＣ、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ、ＧＦＰなどの化学的、生物的各種蛍光物質、３２Ｐ、５１Ｃｒなどの放射性物質など標識可能なあらゆる物質が挙げられる。
本発明では、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）、免疫放射線検定法（ＩＲＭＡ）、免疫酵素法（ＩＥＭＡ）等の免疫測定法を採用することもでき、これらの測定法はそれ自体周知であり、周知の方法をそのまま適用することができる。
【実施例】
【００４６】  以下本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４７】Ｉｎ  ＶｉｖｏにおけるＳＩＭＦｓ存在の確認
肝炎モデルを作製するためにＳＤ系雄性ラット６週齢３匹に対して四塩化炭素：オリーブオイルが１：１に混合されたものを１ｍＬ／Ｒａｔ・ｋｇとなるように投与して実験急性肝炎ラットを作製した。四塩化炭素投与後２週間間隔で６週間ウシＳＩＭＦｓを腹腔内投与した（図３  実験区２）。コントロールとして生理食塩水を投与した実験区を準備している（図３  実験区１）。このラットの血清中肝疾患マーカー（ＧＯＴ，ＧＰＴ，Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｄ，ＡＬＰ）を測定すると、健常ラット区に比して生理食塩水だけを投与した実験区２では各肝疾患マーカーは高値を示した。しかし、ＳＩＭＦｓを投与した実験区１では実験区２に比して有意にマーカー群は低値を示した（図３）。これはＳＩＭＦｓ中に肝障害進行を抑止、修飾する効果のあることが生体内直接投与によって立証されたことを示す。更に四塩化炭素以外にも肝臓に対する物理的外科障害、化学発癌誘導物質（ジアミノアゾベンゼン）、薬物肝炎誘導物質（ガラクトサミン、アセトアミノフェン）による肝障害でも同様の進行抑制と修飾効果が認められることがわかった。【００４８】Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏにおけるアポトーシスサンプルの作製
次にこのＩｎ  Ｖｉｖｏにおける効果がＩｎ  Ｖｉｔｒｏにおけるアポトーシス実験でも認められるかを確認した。そのために小腸上皮細胞株を培養し、アポトーシスを起こさせて増殖能効果を判定した。ラット小腸上皮細胞株ＩＥＣ−６（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５９２）は１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｊａｐａｎ）を含むＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．Ｊａｐａｎ）で３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養し、徐々に血清濃度を下げ最終的には無血清培地ＡＳＦ３０１（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）に置き換えて馴化させた。アポトーシスを誘導するために無血清培地に馴化したＩＥＣ−６にアポトーシス誘導試薬（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  １７８４８６）を添加して６０分間刺激を行い、４時間、６時間、１２時間、２４時間後に培養上清を回収した。細胞は１２、２４時間を経ると既にほぼアポトシースにより完全に剥離していた。回収したサンプルは細胞片を遠心除去した後に硫安、スピンカラムによる濃縮後、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）に透析した。【００４９】培養ラット肝実質細胞による増殖能検定
発明者はラット小腸上皮細胞株ＩＥＣ−６（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５９２）のアポトーシスによって産生された蛋白質群の細胞増殖能をラット肝実質細胞の培養細胞法を利用して確認した。ラット肝実質細胞は灌流法により行った。ラットはＷｉｓｔｅｒ系雄性、６週齢を使用し、ノーマルの他にＨｉｇｇｉｎｓ＆Ａｎｄｅｒｓｏｎの方法により肝臓を７０％部分切除し、４８時間後の残存肝からの肝実質細胞から成る実験区を作成して培養をおこなった。細胞増殖活性はＭＴＴ法によって確認した。添加した培養上清蛋白質はコントロールとして非誘導ＩＥＣ−６培養上清、実験区としてアポトーシス上清を使用した。以下実験結果を示す（図４）。実験結果として、正常ＩＥＣ−６上清蛋白質添加実験では全ての実験区で細胞の増殖能は全く確認されなかった（図４Ａ）。一方、アポトーシス上清を添加した実験区では肝部分切除後４８時間後の培養細胞で添加３日後に添加蛋白質濃度０．１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬの両方の濃度で増殖能力が確認された（図４Ｂ）。アポトーシス誘導時間としては１２時間までは弱かったが、１２時間、２４時間誘導ではほぼ同様の結果が得られた。ところが同量のアポトーシス上清蛋白質を添加した実験区でも正常肝実質細胞培養区では増殖能は確認されなかった。この結果よりアポトシース誘導ＩＥＣ−６上清には誘導１２時間以降に細胞増殖能が存在するがそのレセプターは部分切除後４８時間後の細胞に発現していることがわかったのである。つまり肝実質細胞は正常時には増殖に関するレセプターは殆ど発現しておらず、障害などによってそのレセプターが誘導された時に増殖に転じることが予想された。そこで本発明者はこのアポトーシスによって小腸上皮粘膜組織より現れ、肝実質細胞増殖能を有する一連の物質群は広義のＳＩＭＦｓに含まれる物質群であるが、アポトーシスに起因することが新規グループであるもと考えて、この物質群に対して小腸（Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）と肝実質細胞（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）よりヘパテスチン・グループ（Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ  Ｇｒｏｕｐ）と命名したのである。【００５０】  ＳＡＸＩＩプロテインチップアレイを用いるマーカーの同定
既にｓｕｒｆａｃｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＳＥＬＤＩ）と飛行型質量分析計を組み合わせたプロテインチップテクノロジーが米国Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ社により開発され、新規マーカーの検出など臨床応用が始まっている。本発明者は本テクノロジーを応用し、各種ラット血清とアポトーシス培養上清を使用し新規の血清タンパクまたはペプチドを同定することに成功した。以下、本発明をさらに詳細に説明する。
各種ラット血清とアポトーシス培養上清を使用し、ＳＡＸＩＩプロテインチップアレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）を用いてを用いてＳＩＭＦｓを検索した。ＳＡＸＩＩチップとはＳｔｒｏｎｇ  Ａｎｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｃｈｉｐのことであり、検体中の正電荷物質を結合させるという特徴を持っている。サンプルとして四塩化炭素投与肝炎ラット血清、前述アポトーシス培養上清を用いた。以下にプロテインチップアレイ実験操作法を簡単に述べる。サンプルは８Ｍ尿素（ＳＩＧＭＡ）／１％ＣＨＡＰＳ（ＳＩＧＭＡ）溶液で１０倍に希釈した。１０分間氷上処理を行なった後、５０ｍＭトリス（ＳＩＧＭＡ）緩衝液（ｐＨ９．０）にて更に１０倍希釈し、４，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離操作を行なってその上清を希釈サンプルとして用いた。ＳＡＸＩＩチップはＢｉｐｒｏｃｅｓｓｏｒに取り付けて実験している。Ｂｉｐｒｏｃｅｓｓｏｒとは金属チップ上に立体的ウェルを簡易作製する穴付プラスチック製アダプターであり、この方法によって希釈サンプルを大量にアプライできるのである。初めに１５０μＬの５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ９．０）をウェル状になったチップに加え、振とう機上で５分間洗浄を行なった。これを２回行なった後に先の希釈サンプル１００μＬを添加し、室温で２０分間振とうしてチップと反応させた。続いて希釈サンプルを除き、１５０μＬの５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて振とう機上で５分間洗浄を行なった。この操作を３回繰り返した。その後４００μＬの蒸留水で２回洗浄し、チップをＢｉｐｒｏｃｅｓｓｏｒから取り外した。チップが乾いた後、ＰＡＰｅｎ（Ｚｙｍｅｄ）で蛋白質の接着しているスポットを囲み、０．５μＬの飽和シナピン酸（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）／５０％アセトニトリル（Ｗａｋｏ）／０．２５％ＴＦＡ（Ｗａｋｏ）溶液を２回添加した。作製したプロテインチップアレイは、プロテイン・バイオロジー・システムＩＩ・マス・スペクトロメーター（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）によって読み取った。
図５に、代表的な測定データを示す。このデータフォーマットでは、ＳＡＸＩＩプロテインチップから脱着されたサンプルのタンパク質の分子量を横軸に、その分子量で検出器に到達した分析物の量を反映するピークを縦軸で表すことができる。よって図５から明らかなように、四塩化炭素投与４８時間に認められる約１２，０７０のピークは正常血清には一定量が認められ、肝炎時に上昇する。更にこのピークはＩＥＣ−６アポトーシス上清中に認められ、通常培養上清には認められなかった。【００５１】２次元電気泳動
アポトーシスを起こさせた細胞の培養上清は一般的な２次元電気泳動法（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって解析した。以下、簡単に方法を示す。上記調整された培養上清の蛋白質濃度を測定して電気泳動サンプルとした。固定化ｐＨ勾配等電点電気泳動用の乾燥ストリップゲルはバッファーにひたして一晩膨潤し、サンプルをしみ込ませたろ紙をピンセットでゲルの端の電極濾紙の近くに置く。白金電極を、電極濾紙に接触する位置に装着し、低粘度シリコンオイルを注いで、ゲルおよび電極濾紙全体をオイルでカバーし、フタを閉めて通電をした。一次元目の泳動終了後、ストリップゲルを取り出し、純水中で軽くすすいでオイルを除いた後に、ＳＤＳ処理液中に浸し、３０分間振盪しながらインキュベートした。次にこのストリップゲルを通常のポリアクリルゲルで泳動した。するとおおよそ分子量１万から２０万までのタンパク質がスポットとして観察できた（図６）。Ｃｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ染色をもとにスポットを選択して、スポットの切り出しをおこない、トリプシン消化を施して、Ｎ末端解析を行うことで蛋白質の同定を行うことに成功した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの結果より、すべてのプリカーサーイオンについて得られたプロダクトイオンの数値をＭａｓｃｏｔを利用して全ての生物種（Ａｌｌ  Ｅｎｔｒｉｅｓ）を対照にデータベース（ＮＣＢＩｎｒ）探索を行い、ｓｃｏｒｅ４５を超える場合に有意とした。結果としてこれまでに報告の無い新規蛋白質であることがわかった。新規蛋白質はＮ末端蛋白質配列が表の配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質で、その分子量が約１万２千、ｐＩが４．７５の蛋白質であった。この質量分析と２次元電気泳動法で同時に見つかった蛋白質をＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅと命名した。【００５２】抗Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅモノクローナル抗体の作製
次にＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質に対する抗体作製を行った。
解析データより合成ペプチドを作成し、マウスに免疫を行い、モノクローナル抗体を作成した。合成ペプチドはＣ末端にキャリアープロテインとするゴカイヘモシアニン（ＫＬＨ）結合を目的としてシステインを導入し、アミノ酸数を合計１０個として、ＫＬＨに結合させた。配列表１に示す。抗原ペプチドはＳＩＧＭＡ−Ｇｅｎｏｓｙｓ社に合成を依頼して作製された。以後このキャリアー結合合成ペプチドをＨＥＰ−ＫＬＨと呼ぶ。ＨＥＰ−ＫＬＨを１０００μｇ／ｍｌとなるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、１００μｇ（１００μｌ）をとってフロインド完全アジュバンド（和光純薬工業社）１００μｌと乳化するまでよく混和した。調製した乳化懸濁液（エマルジョン）をＢａｌｂ／ｃ６週齢  雌マウス（日本クレアー社）にジエチルエーテル麻酔下にて腹腔内投与した。２週間後には同量のＨＥＰ−ＫＬＨをフロインド不完全アジュバンド（和光純薬工業社）と混和してフロインド完全アジュバンドの時と全く同様の操作によりエマルジョンとし、それぞれマウスに感作した。以降２週間後に同様の操作を行い、５回目には最終免疫として１μｇ／μＬ  ＰＢＳの抗原ＨＥＰ−ＫＬＨ溶液５０μＬをマウス尾静脈注射により投与した。【００５３】最終免疫より３日後にＨＥＰ−ＫＬＨにより感作済みのマウスよりジエチルエーテル麻酔下に外科的摘出された脾臓を無菌的に分散し脾臓細胞を調製した。融合はケーラーとミルスタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ．２５６，４９５．１９７５）に従って行われ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）（メルク社）を用いて脾細胞と骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を融合した。融合比率は脾臓細胞数１．２×１０８個に対して骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）２×１０７個で、６：１であった。融合細胞は１０％ＦＣＳ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）ＤＭＥＭ（ＩＲＶＩＮＥ社）ＨＡＴ（コスモバイオ社）培地に分散し９６穴マイクロタイターカルチャープレート（ベクトン・ディッキンソン社）に分注して３７℃、５％ＣＯ２条件にて培養した。【００５４】約２週間後にコロニーの生育を確認してスクリーニングを実施した。スクリーニングの実施法を以下に述べる。スクリーニング用プレートを作製するために上記実施例にて免疫したＨＥＰ−ＫＬＨを５０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に溶解し、０．５μｇ／１００μｌ／ｗｅｌｌとなるように９６穴ウエル（Ｎｕｎｃ社）に分注した。この時、ＨＥＰ−ＫＬＨを結合させたキャリアープロテインであるゴカイヘモシアニン（ＫＬＨ）を同様にプレートに分注し、コントロールプレートとした。プレートを４℃で２晩静置した後に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、非特異的反応を抑えるために１．５％ＢＳＡ溶液を２００μｌ分注して、更に４℃で１晩静置した。完成したプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液で３回洗浄した後に培養上清１００μｌを反応させ、更に洗浄を行った後に２次抗体である西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスイムノグロブリン抗体（Ｚｙｍｅｄ社）を加えて反応させた。洗浄後にＨＲＰの発色基質である３ｍｇ／ｍｌ  ０−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）（ＳＩＧＭＡ社）クエ���酸発色溶液を１００μｌ加えて一定時間の発色後、１Ｎ硫酸を停止液として更に１００μｌ添加し、測定波長４９２ｎｍにて吸光度を測定した。上記のようにしてＨＥＰ−ＫＬＨに陽性になり、コントロールのＫＬＨが陰性になったクローンは限界希釈法によって再クローニングされ上清を再度チェックした。この実験より発明者は抗Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅモノクローナル抗体であるハイブリドーマＮＴｈｅｐ−１を樹立した。【００５５】得られた抗体をモノクローナル抗体タイピングキット（アマシャムファルマシア社）にて検定した結果、以下のような結果であった。
クラス          軽鎖
クローンＮＴｈｅｐ−１      ＩｇＧ１        κ【００５６】モノクローナル抗体の工業的生産性
実験例で得られたハイブリドーマＮＴｈｅｐ−１  ５×１０７細胞個をプリスタン（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）０．５ｍｌ投与後２週間のＢａｌｂ／ｃマウス（日本クレアー社）、１２週齢、雌性に腹腔内投与し、約２週間後にマウス腹腔内に貯留した腹水をジエチルエーテル麻酔下にて外科的に採取した。スクリーニングで行ったＥＬＩＳＡ法により、腹水をサンプルとして段階希釈して確認すると高濃度のモノクローナル抗体が含まれていた。この腹水を硫安４０％で処理し、ＰＢＳに透析した後、プロテインＧカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）により精製してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。すると非還元では分子量約１５０，０００に単一の、メルカプトエタノール還元では分子量約５０，０００のバンドと２５，０００の２本のバンドが確認された。精製された抗体はマウス１匹あたり約３０ｍｇであって工業的利用を行うには十分量であった。【００５７】抗Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅポリクローナル抗体の作製
次に発明者はＨＥＰ−ＫＬＨと反応するポリクローナル抗体を作製した。免疫はウサギを用いて行われ、実験はＳＩＧＭＡ−Ｇｅｎｏｓｙｓ社に依頼して行った。タイターをチェックした後、採血されたサンプルより先のモノクローナル抗体の腹水産生と同様にプロテインＧカラムにて抗体を精製した。【００５８】ウエスタン・ブロッティング
実際の検体中に作製した抗体と反応する理論蛋白質が存在するかを確認するためにウエスタン・ブロッティングを行った。サンプルは正常ラット血清及び肝部分切除ラット血清、四塩化炭素肝障害ラット血清である。以下簡単に方法を述べる。肝部分切除血清はＨｉｇｇｉｎｓ＆Ａｎｄｅｒｓｏｎの方法により肝臓を７０％部分切除した後一定時間後（６、１２，２４，４８，７２，９６，１２０，１４４，１９２時間後）に採血を行って−８０℃に保管した。四塩化炭素肝障害モデルは投与前２４時間に絶食させた６週齢Ｗｉｓｔｅｒ系雌性ラットに、オリーブオイルと四塩化炭素を１：１で混合し、１ｍｌ／Ｒａｔ  Ｋｇになるよう、ラット体重にあわせて腹腔内投与し、麻酔下にて経時的（４５分，９０分，４時間，６時間，１２時間，２４時間，４８時間，９６時間，１２０時間，１４４時間，１９２時間）に採血した。血液は血清サンプルとして使用するまで−８０℃に保管した。上記の血清をＰＢＳにて５０倍に希釈し、２−メルカプトエタノールを含むＳＤＳサンプル緩衝液と１：１で混合してその２０μＬをアプライした。還元条件下にて１０ｍＡでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、セミドライ法によるウエスタン・ブロッティングによりアクリルアミドよりＰＶＤＦ膜へ蛋白質を転写して、ブロックエース（大日本製薬）によって４℃、一晩ブロッキングを行った。ブロッキング後、抗ＮＴｈｅｐ−１抗体を３７℃で２時間反応させた。その後、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄して、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（Ｚｙｍｅｄ）を反応させ、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ検出キット（Ｗａｋｏ）を利用して発色させた。反応性を確認したところＮＴｈｅｐ−１は理論どおり分子量約１万２千の蛋白質と反応していた。しかも、その蛋白質は部分切除や肝炎によって増減していた。Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅは正常時一定の濃度で発現している。しかし物理的障害や炎症などが起きるとその血中濃度は障害早期（６時間）に低下する。そしてすぐに血中値上昇に転じ、一定の障害が回復すると血中濃度は上昇することがわかった（図７）。【００５９】ＥＬＩＳＡ法による測定
モノクローナル抗体がＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅを認識することが証明されたため、次に発明者はＥＬＩＳＡ（免疫酵素測定法）による濃度測定を試みた。以下に簡単に方法を述べる。はじめに抗Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅポリクロナール抗体を５μｇ／１００μＬＰＢＳ／ｗｅｌｌで９６穴ウエル（Ｎｕｎｃ社）に分注した。プレートを４℃で２晩静置した後に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、非特異的反応を抑えるために１．５％ＢＳＡ溶液を２００μｌ分注して、更に４℃で１晩静置した。完成したプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液で３回洗浄した後に緩衝液（３％ＢＳＡ−ＰＢＳ）溶液を５０μＬ分注した。そこに血清サンプル５０μＬを添加して合計１００μＬをよく振とうして、３７℃、１時間反応させた。反応させた後に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、後に２次抗体である西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ＮＴＨｅｐ−１抗体を加えて３７℃、１時間反応させた。反応終了後、３回の洗浄を行ってＨＲＰの発色基質である３ｍｇ／ｍｌ  ０−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）（ＳＩＧＭＡ社）クエン酸発色溶液を１００μｌ加えて一定時間の発色後、１Ｎ硫酸を停止液として更に１００μｌ添加し、測定波長４９２ｎｍにて吸光度を測定した。結果を図８に示す。この結果よりウエスタン・ブロッティングの結果は裏付けられた。つまり、障害時にはその血中濃度が増加していたのである。障害が治癒しはじめるとその値は減少した。【００６０】障害時特異的自己抗体の検出
発明者は上記のようなＥＬＩＳＡ実験において、障害が慢性化してくると、よく非特異反応が認められることを確認した。これは血液中に自己蛋白質に対する抗体が産生されて、酵素標識二次抗体（抗ＩｇＧ、Ａ、Ｍなど）がラット抗体と交差するために起こるものであろうと予想した。つまり、慢性化すると特異的自己抗体が現れる可能性があると思われたのである。そこで肝臓をホモジネートして可溶性蛋白質、膜蛋白質、核蛋白質などに分けてその後、界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘにより可溶化し（ＥＭＢＯ  Ｊ．１９８３；２（９）：１４７９−８６．）、ポリアクリルアミド電気泳動後ウエスタン・ブロッティングを行った。一次抗体の代わりに各種２０％ラット血清−３％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて反応させ、二次抗体には抗ラットイムノグロブリン−ＨＲＰ標識抗体を使用した。すると四塩化炭素を繰り返し投与して肝障害を長期誘導した肝炎モデルラットでは幾つかのバンドが確認されたが、一番増減した蛋白質は膜画分に存在することがわかった。発明者は分子量、抗体との反応性などからこの蛋白質をコネキシン３２（Ｃｘ−３２）と同定した。【００６１】抗コネキシン３２自己抗体検出系の構築
そこで本発明者はすでに既知のコネキシン３２合成ペプチドを用いた実験方法を参考として（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｅｌｌ．１９９２；２４（１）：６１−７３．）、測定系構築を試みた。発明者はＮＣＢＩ情報データベースよりラットコネキシン３２遺伝子、及び蛋白質情報を調査し（ＮＭ＿０１７２５１）、合成ペプチドを作成した（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ）。配列表２に示す。選択配列はＣ末端１７個（２６４−２８０）であり、本合成ペプチドを前出のキャリアープロテイン（ＫＬＨ）と結合させ、コネキシン抗原（Ｃｘ３２−ＫＬＨ）とした。Ｃｘ３２−ＫＬＨを５０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に溶解し、０．５μｇ／１００μｌ／ｗｅｌｌとなるように９６穴ウエル（Ｎｕｎｃ社）に分注した。この時、Ｃｘ３２−ＫＬＨを結合させたキャリアープロテインであるゴカイヘモシアニン（ＫＬＨ）を同様にプレートに分注し、コントロールプレートとした。プレートを４℃で２晩静置した後に０、０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、非特異的反応を抑えるために１．５％ＢＳＡ溶液を２００μｌ分注して、更に４℃で１晩静置した。完成したプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液で３回洗浄した後に緩衝液（３％ＢＳＡ−ＰＢＳ）溶液を１００μＬ分注した。そこに血清サンプル１００μＬを添加して合計２００μＬをよく振とうして、３７℃、１時間反応させた。反応させた後に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液で更に３回洗浄し、後に２次抗体である西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ラットイムノグロブリン抗体（Ｚｙｍｅｄ社）を加えて３７℃、１時間反応させた。反応終了後、３回の洗浄を行ってＨＲＰの発色基質である３ｍｇ／ｍｌ  ０−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）（ＳＩＧＭＡ社）クエン酸発色溶液を１００μｌ加えて一定時間の発色後、１Ｎ硫酸を停止液として更に１００μｌ添加し、測定波長４９２ｎｍにて吸光度を測定した。結果を図９に示す。
【発明の効果】
【００６２】以上に詳細に説明した通り、本発明によれば、肝障害時に増減が見られるＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅおよび抗コネキシン３２自己抗体を利用して肝臓疾患の診断、治療に用いることができる。Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅは、正常肝臓組織より障害時においてその発現量が低くなる。また、抗コネキシン３２自己抗体は障害が大きく、長くなるほど発現が大きくなる。それ故、Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅおよび抗コネキシン３２自己抗体の発現を同時に確認することは、より疾患の状況を的確に把握し、治療、再生に役立てることにつながる。本発明の利用によって、肝臓疾患を高感度に検出し、応用治療可能な技術が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】  図１はＳＩＭＦｓ添加初代培養肝細胞（１３日）に観察されたＩｎ  Ｖｉｔｒｏでの微胆管を示す。
【図２】  図２はＳＩＭＦｓ添加９０日後に初代培養肝臓細胞から形成されたＭｉｃｒｏ  Ｌｉｖｅｒを示す。
【図３】  図３は薬物肝炎時におけるＳＩＭＦｓのＩｎ  Ｖｉｖｏでの治療効果を示す。四塩化炭素肝障害後にＳＩＭＦｓを腹腔内投与した実験区では肝炎マーカーが低値を示し、治療効果が認められる。
【図４】  図４は、ラット小腸上皮細胞株ＩＥＣ−６アポトーシス蛋白質のラット肝実質細胞培養結果を示す。図１Ａでは正常肝実質細胞で増殖効果が無いことを示す。図１ＢではＰＨ４８時間後の細胞ではアポトーシス蛋白質にのみ増殖能が認められたことを示す。
【図５】  図５はＳＥＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳを利用したＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ存在確認を示す。正常血清，肝部分切除４８時間血清，アポトーシス培養上清に共通して存在した。
【図６】  図６は、ＩＥＣ−６アポトーシス蛋白質の２次元電気泳動結果を示す。矢印は差が認められて解析を進めた蛋白質を示す。
【図７】  図７は、各種肝障害症例血清の電気泳動後にウエスタン・ブロッティングを行い、Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質に対するモノクローナル抗体ＮＴｈｅｐ−１を用いて検出した時の結果を示す。肝障害直後に減少したＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅが血清中で増加していくことがわかる。
【図８】  図８は、Ｈｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質に対するポリクローナル抗体とモノクローナル抗体ＮＴｈｅｐ−１を用いてＥＬＩＳＡを構築した時の結果を示す。１９２時間までにＨｅｐａｔｅｓｔｉｎｅ蛋白質の一過性ピークが認められる。
【図９】  図９は、四塩化炭素肝障害によるラット抗Ｃｘ３２自己抗体の出現を表す。薬物肝障害を起こす回数が増えるほど、血清中に自己抗体が多く現れることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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