(57)【要約】【課題】ＤＮＡを基体に確実に固定化することのできるＤＮＡ固定化法及びその固定化法により調製されたＤＮＡ固定化担体を提供することを目的とする。【解決手段】  基体にDNAを固定するにあたり、Mgイオンを含むDNA溶液中に基体を浸漬するDNA固定化工程を含み（請求項１）。上記請求項１において、Mgイオンが、MgCl２であり（請求項２）。上記請求項２記載のDNA固定化法において、DNA溶液として、DNA：0.05〜1μｇ／μＬ、及びMgイオン：１〜25ｍＭを含むDNA溶液を用いる（請求項３）。上記請求項１〜３のいずれかにおいて、基体を水溶性カルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドを含む活性化反応液に浸漬する基体活性化工程を、DNA固定化工程に先立って行うことを特徴とする（請求項４）。請求項１〜４のいずれかに記載のDNA固定化法により調製されたDNA固定化担体であることを特徴とする（請求項５）。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基体にＤＮＡを固定するにあたり、マグネシウムイオンを含むＤＮＡ溶液中に基体を浸漬するＤＮＡ固定化工程を含むことを特徴とするＤＮＡ固定化法。
【請求項２】
前記マグネシウムイオンが、ＭｇＣｌ２であることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ固定化法。
【請求項３】
ＤＮＡ溶液として、ＤＮＡ：０．０５〜１μｇ／μＬ、及びマグネシウムイオン：１〜２５ｍＭを含むＤＮＡ溶液を用いる請求項２記載のＤＮＡ固定化法。
【請求項４】
基体を水溶性カルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドを含む活性化反応液に浸漬する基体活性化工程を、ＤＮＡ固定化工程に先立って行うことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ固定化法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡ固定化法により調製されたＤＮＡ固定化担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ固定化法に関し、詳しくは、短時間で簡便な処理のみで、ＤＮＡを基体に確実に固定化することのできるＤＮＡ固定化法及びその固定化法により調製されたＤＮＡ固定化担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡチップ（マイクロアレイなど）やＤＮＡビーズアレイなどのＤＮＡ固定化担体は、疾病診断、治療のほか、ゲノム解析などにも広く用いられている。
ＤＮＡ固定化担体の製造は、基体に所望のＤＮＡを固定化して行われ、従来はリガーゼなどの酵素を利用する酵素的ＤＮＡ固定化法が用いられていた（特許文献１、特許文献２参照）。
【０００３】
酵素的ＤＮＡ固定化法では、基体を活性化した後、まず２本鎖の短いオリゴヌクレオチドをチップ上に固定して、その後で所望のオリゴヌクレオチドを制限酵素末端を利用して、ＤＮＡリガーゼを利用して固定化させていた。
しかし、この方法では、ＤＮＡを基体に確実に固定化することが困難であったほか、多くの工程を経る必要があり、多くの試薬や機器が必要なほか、処理に相当の長時間を要するという問題点があった。
【０００４】
【特許文献１】国際特許公開ＷＯ０１−６８３６８号公報
【特許文献２】国際特許公開ＷＯ０１−４０１７３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記従来の問題に鑑みて、短時間で簡便な処理のみで、ＤＮＡを基体に確実に固定化することのできる手段を提供することを目的とする。すなわち、ＤＮＡを基体に確実に固定化することのできるＤＮＡ固定化法及びその固定化法により調製されたＤＮＡ固定化担体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、マグネシウムイオンを利用することにより、ＤＮＡを基体に直接固定化することができ、しかもごく短時間で処理を完了することができることを見出し、本発明に到達した。
【０００７】
本発明の請求項１記載のＤＮＡ固定化法は、基体にＤＮＡを固定するにあたり、マグネシウムイオンを含むＤＮＡ溶液中に基体を浸漬するＤＮＡ固定化工程を含むことを特徴とする。
請求項２記載のＤＮＡ固定化法は、上記請求項１において、マグネシウムイオンが、ＭｇＣｌ２であることを特徴とする。
請求項３記載のＤＮＡ固定化法は、上記請求項２において、ＤＮＡ溶液として、ＤＮＡ：０．０５〜１μｇ／μＬ、及びマグネシウムイオン：１〜２５ｍＭを含むＤＮＡ溶液を用いることを特徴とする。
請求項４記載のＤＮＡ固定化法は、上記請求項１〜３のいずれかにおいて、基体を水溶性カルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドを含む活性化反応液に浸漬する基体活性化工程を、ＤＮＡ固定化工程に先立って行うことを特徴とする。
本発明の請求項５記載のＤＮＡ固定化担体は、上記請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡ固定化法により調製されたことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のＤＮＡ固定化法によれば、短時間で簡便な処理のみで、ＤＮＡを基体に確実に固定化することができる。
また、本発明のＤＮＡ固定化法により、制限酵素およびＤＮＡリガーゼ等の酵素を用いた処理工程を省くことが可能となり、１日かかるような処理を１〜２時間程度まで短縮することが可能である。
さらに、基体にＤＮＡを結合させるために、従来法と異なり酵素活性部位に必要な間隔を設ける必要がなく数１０〜１００倍程度のＤＮＡの固定化密度量を得られ、高価な酵素を使わないので安価にＤＮＡの固定化が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のＤＮＡ固定化法は、基体にＤＮＡを固定する方法である。ここで、基体としては、素材及び形状のいずれも特に限定されない。素材としては、ガラス、ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボンなどを挙げることができる。また、形状としては、チップ状、ビーズ状などのいずれであっても良い。中でも、いわゆるＤＮＡチップとして用いられている素材及び形状であれば、特に限定されない。
【００１０】
本発明のＤＮＡ固定化法の特徴は、マグネシウムイオンを含むＤＮＡ溶液中に基体を浸漬するＤＮＡ固定化工程を含むことにある。マグネシウムイオンをＤＮＡ溶液中に溶解させておくことにより、ＤＮＡの立体構造を安定化し、基体との結合を効率よく媒介する。
ＤＮＡ溶液に含ませるＤＮＡは、基体に固定させたいＤＮＡであれば良く、鎖長、１本鎖か２本鎖の別、直鎖状か環状を問わないが、特に鎖長については３ｂｐ以上、中でも２０ｂｐ〜１００ｋｂｐであることが好ましい。また、ＤＮＡの由来や調製方法も特に限定されず、動植物、微生物、ウイルスなど天然の生物由来のものであっても良いし人工的に合成したものであっても良い。更に、ＤＮＡは、予め制限酵素処理がなされたものであっても良いし、ＰＣＲ増幅産物などであっても良い。
また、ＤＮＡ溶液には１種類のＤＮＡだけでなく複数種類のＤＮＡを含ませることもでき、この場合には、ＤＮＡライブラリーなど、塩基配列の異なる複数種類のＤＮＡを固定化させたＤＮＡ固定化担体を得ることができる。
【００１１】
本発明では、３ｍｍ角のチップを用いているが、ＤＮＡ溶液において、ＤＮＡの濃度は、０．０５μｇ／μＬ以上とすることが好ましい。ＤＮＡの量が０．０５μｇ／μＬ未満であると、ＤＮＡを十分量基体に固定させることができず、一方、基体の大きさにより結合するＤＮＡ量の上限は決まるが、その後のＰＣＲ等の実験に用いる量を鑑みて１μｇ／μＬを上限とする。
【００１２】
一方、ＤＮＡ溶液に含ませるマグネシウムイオンとしては、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、（ＣＨ３ＣＯＯ）２Ｍｇ等のマグネシウム塩などが挙げられるが、扱いやすさ、手に入れやすさ等の理由からＭｇＣｌ２を用いることが好ましい。なお、マグネシウム塩であっても水溶性でない場合は、ＤＮＡ溶液中に溶解させることが困難となり、本発明の目的が十分に達成されないことから、好ましくない。
【００１３】
一方、ＤＮＡ溶液におけるマグネシウムイオンの濃度は、１ｍＭ以上とすることが好ましい。一般に、ＰＣＲの場合はＭｇ濃度（上限）は非特異的な増幅を行うので問題になるが、本発明の場合は、Ｍｇ濃度の上限が特に問題になることはない。よって、１ｍＭ以上、好ましくは１０〜２０ｍＭとする。
【００１４】
マグネシウムイオンを含むＤＮＡ溶液は、上記マグネシウムイオン及びＤＮＡをｄＨ２Ｏなどと混合撹拌して作成することができる。ＤＮＡ溶液の量は、基体のサイズなどによって適宜調製することができる。
マグネシウムイオンを含むＤＮＡ溶液中に基体を浸漬する際の浸漬時間や浸漬温度は、適宜設定することができる。一般に、浸漬時間は３０分〜４８時間、好ましくは３０分〜２４時間とすることができ、温度は２０〜７０℃、好ましくは３０〜６０℃とすることができる。
【００１５】
本発明においては、上記したＤＮＡ固定化工程に先立って、基体を水溶性カルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドを含む活性化反応液に浸漬する基体活性化工程を、ＤＮＡ固定化工程に先立って行っておくと、より効率よくＤＮＡの固定を進めることができるので好ましい。
ここで、活性化反応液には、水溶性カルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドの両方を含ませておく必要がある。水溶性カルボジイミドのみとした場合には、活性基が不安定で分解しやすく、一方、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのみとした場合には、活性化エステル基を生成しないので、好ましくない。
活性化反応液における水溶性カルボジイミドの濃度は、１〜５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは５〜４０ｍｇ／ｍＬ、特に好ましくは１０〜３０ｍｇ／ｍＬとすることができる。一方、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの濃度は、０．０１〜３０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．１〜２０ｍｇ／ｍＬ、特に好ましくは０．５〜１０ｍｇ／ｍＬとすることができる。上記数値範囲を下回ると、基体活性化工程を行う意味がなく、一方、上記数値範囲を超えると、
目的の活性基が得られないので好ましくない。
活性化反応液は、水溶性カルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドを、リン酸緩衝液等の一般的な緩衝液に溶解させることにより調製される。
【００１６】
基体にＤＮＡが固定化したかどうかの確認は、ＰＣＲを利用して行うことができる。すなわち、目的のＤＮＡを増幅させるように設計したプライマーを用いて、ＤＮＡを固定化させた基体を直接鋳型としたＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅産物を電気泳動等により視覚化して確認することができる。
こうして、本発明のＤＮＡ固定化法によって、短時間でかつ簡便な処理により、所望のＤＮＡを固定化させたＤＮＡ固定化担体を得ることができる。
【実施例】
【００１７】
実施例１（本発明のＤＮＡ固定化法）
（１）ダイヤモンドチップの活性化
まず、リン酸緩衝液（０．１Ｍ  リン酸二水素カリウム及び０．０１Ｍ  リン酸水素二カリウム）１ｍＬ中に、水溶性カルボジイミド１５．５ｍｇ及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド２．３ｍｇを含む活性化反応液を調製した。
この活性化反応液中に、ダイヤモンドチップを時々撹拌しながら３０分浸した。その後、チップを取り出し、蒸留水で３〜５回洗浄して、活性化ダイヤモンドチップを得た。
【００１８】
（２）ＤＮＡの固定化
λＤＮＡをEcoR I処理して得られる２１ｋｂｐのＤＮＡ断片を固定化するＤＮＡ試料とした。
【００１９】
こうして得られた２１ｋｂｐのλＤＮＡ断片（１μｇ／μＬ）１μＬと、２５ｍＭのＭｇＣｌ２２５μＬ及びｄＨ２Ｏ７４μＬとを混合し、全量１００μlにしてＤＮＡ固定化溶液を調製した。このＤＮＡ固定化溶液中に活性化ダイヤモンドチップを挿入し、室温で６０分反応させた。その後、チップを取り出し、蒸留水で３〜５回洗浄した。
【００２０】
（３）固定化の確認のためのＰＣＲ
まず、プライマー（センス：配列表の配列番号（１）記載の塩基配列参照）１μＬ、プライマー（アンチセンス：配列表の配列番号（２）記載の塩基配列参照）１μＬ、１０ｘＰＣＲバッファー（Applied Biosystem社製）５μＬ、ｄＮＴＰ溶液５μＬ、ＤＮＡポリメラーゼ０．２５μＬ、ｄＨ２Ｏ３７．７５μＬを加えて全量５０μＬとして、ＰＣＲ反応液を調製した。なお、上記プライマーは、上記ＤＮＡ試料である２１ｋｂｐＤＮＡ断片内の５００ｂｐ断片が増幅されるように設計されたものである。
このＰＣＲ反応液にＤＮＡ固定化チップを挿入し、ＰＣＲにて２サイクル増幅した。ＰＣＲ条件は、（９５℃３０秒−６５℃１分−７２℃１分）×１２サイクルとした。
【００２１】
ＰＣＲ終了後、ＤＮＡ固定化チップを取り出し、蒸留水で３〜５回洗浄した。洗浄したチップを、７０％エタノール中、４℃で保存した。
ＰＣＲ反応液は、残りのサイクル分ＰＣＲを行い、アガロースゲル電気泳動で解析した。
すなわち、ＰＣＲは全体で１２サイクル行っており、そのうち固定化したチップを挿入した状態で２サイクル、取り出したあとで残り１０サイクル行ったという意味である。サイクル条件は上記の通りである。結果を図１のレーン２に示す。
なお、対照として上記（２）においてＭｇＣｌ２を添加しないＤＮＡ固定化溶液にて反応を行ったほかは、同様の処理を行った。結果を図１のレーン１に示す。
【００２２】
比較例１（酵素的ＤＮＡ固定化法（従来法））
（１）ダイヤモンドチップの活性化
実施例１の１．と同様の条件で、活性化反応液中にダイヤモンドチップを時々攪拌しながら室温で３０分間浸し、蒸留水で３〜５回洗浄して、活性化ダイヤモンドチップを得た。
【００２３】
（２）オリゴヌクレオチドの固定化
５’末端に（ｄＡ）３とEcoR I部位に対応した塩基配列を含むオリゴヌクレオチド溶液を調製し、この０．５μＭオリゴヌクレオチド溶液中に、上記活性化ダイヤモンドチップを室温で３０〜６０分浸してから（液量１００μＬでチップ２枚浸漬が可能である）、蒸留水で３〜５回洗浄して、オリゴヌクレオチド固定化チップを得た。
【００２４】
（３）相補的オリゴヌクレオチドのハイブリダイズ
上記のオリゴヌクレオチドに相補的な０．５μMオリゴヌクレオチド溶液中に、上記のオリゴヌクレオチド固定化チップを４℃で３０分間浸してから（液量１００μＬでチップ２枚の浸漬が可能である）、氷冷蒸留水で３〜５回洗浄して、制限酵素部位固定化チップを得た。
【００２５】
（４）二本鎖ＤＮＡの固定化（酵素反応）
ＤＮＡは実施例１の２と同じλＤＮＡをEcoR I処理して得られる２１ｋｂｐのＤＮＡ断片を用いた。
ライゲーション反応緩衝液、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ及び制限酵素処理された二本鎖ＤＮＡ溶液とを混合して、以下のライゲーション固定化溶液を得た。
組成や濃度は以下のとおりである。
６６ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、０．１ｍＭ  ＡＴＰ、３００ｎｇの二本鎖ＤＮＡ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ  ３５ｕｎｉｔｓが入った計５０μＬの水溶液。
ライゲーション固定化溶液中に上記の制限酵素部位固定化チップを１６℃で１６時間浸し、蒸留水で３〜５回洗浄した。
【００２６】
（５）固定化の確認のためのＰＣＲ
実施例１の３．と同様の条件でＰＣＲを行い固定化が行われたかどうか確認した。その結果を図１のレーン３に示す。
【００２７】
図１から、ＭｇＣｌ２を利用した実施例１（図１のレーン２参照）は、酵素を使用した従来法による比較例１（図１のレーン３参照）と比較して、濃いバンドの出現が確認されたことが明らかである。
また、比較例１の従来法は全工程１８〜２０時間を要したのに対し、実施例１の方法では、全工程６０〜９０分を要したに過ぎなかった。
このことから、本発明のＤＮＡ固定法では、水溶性マグネシウム塩を利用することにより、従来法に比較してＤＮＡを基体に効率よく、しかもごく短時間に処理を済ませることができることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明のＤＮＡ固定化法によれば、短時間で簡便な処理のみで、ＤＮＡを基体に確実に固定化することができる。
また、医学、農水畜産分野等でＤＮＡチップを大量に必要としている分野において、本発明により、ＤＮＡチップ製造者及び使用者に対し、迅速・安価・高品質なＤＮＡチップの供給が可能となり、より精密な遺伝子操作や遺伝子の解明の促進に寄与することができる。
【００２９】
（配列表）
SEQUENCE LISTING
<110>  株式会社日本パーカーライジング広島工場
<110>  独立行政法人科学技術振興機構
<120>  ＤＮＡ固定化法
<160>  2
<210>  1
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<400>  gatgagttcg tgtccgtaca actgg
<210>  2
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<400>  ggttatcgaa atcagccaca gcgcc
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ＤＮＡが固定化されたことを確認するための電気泳動結果である。
【図１】
2007064770.tif 000003