(57)【要約】【課題】アンモニウム塩を含む光学活性アミノ酸水溶液から高純度の光学活性アミノ酸を簡便かつ効率良く精製する方法を提供する。【解決手段】本発明の１つの特徴は、ストリッピングによりアンモニアを除いた後に、有機溶媒を添加して晶析を行うことにより高純度の光学活性アミノ酸を結晶として単離する光学活性アミノ酸の製造方法である。本発明のその他の特徴は、アンモニウム塩を含む光学活性アミノ酸水溶液が、酵素反応により製造されたものである光学活性アミノ酸の製造方法を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学活性アミノ酸とアンモニウム塩とを含む水溶液からストリッピングによりアンモニアを除去した後、有機溶媒を添加して晶析することにより光学活性アミノ酸の結晶を単離することを特徴とする光学活性アミノ酸の製造方法。
【請求項２】
前記有機溶媒に易溶な塩を形成する塩基を用いて、前記ストリッピング時にｐＨをコントロールすることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記塩基が水酸化リチウムである請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記光学活性アミノ酸とアンモニウム塩とを含む水溶液が、酵素反応により製造されたものであることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
前記光学活性アミノ酸がＬ体のアミノ酸（Ｌ−アミノ酸）である請求項１から４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
前記Ｌ−アミノ酸とアンモニウム塩とを含む水溶液が、ラセミ体アミノ酸に対して、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素を作用させる酵素反応により製造されたものであることを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記酵素反応において、アンモニア又はその塩をラセミ体アミノ酸に対して０．３当量以上添加することを特徴とする、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記アンモニアの塩が、ギ酸アンモニウムである請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記Ｌ−アミノ酸とアンモニウム塩とを含む水溶液が、対応するケト酸に対して、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素を作用させる酵素反応により製造されたものであることを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記Ｌ−アミノ酸とアンモニウム塩とを含む水溶液が、ラセミ体アミノ酸アミドに対して、アミダーゼを作用させる酵素反応により製造されたものであることを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記光学活性アミノ酸がＤ体のアミノ酸（Ｄ−アミノ酸）である請求項１から４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１２】
前記Ｄ−アミノ酸とアンモニウム塩とを含む水溶液が、前記Ｄ−アミノ酸に対応するＮ−カルバモイルアミノ酸に対して、デカルバモイラーゼを作用させる酵素反応により製造されたものであることを特徴とする請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記Ｄ−アミノ酸とアンモニウム塩とを含む水溶液が、ラセミ体アミノ酸アミドに対して、アミダーゼを作用させる酵素反応により製造されたものであることを特徴とする請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記有機溶媒に易溶な塩を形成する酸を、前記酵素反応のｐＨコントロールに用いることを特徴とする請求項４から１３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１５】
前記酵素反応のｐＨコントロールに用いる酸が、ギ酸又は塩酸である請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記酵素反応のｐＨコントロールに用いる酸が、ギ酸である請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１７】
ラセミ体アミノ酸にＤ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素を作用させてＬ−アミノ酸に変換する反応において、アンモニア又はその塩を、前記ラセミ体アミノ酸に対して０．３当量以上添加することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１８】
前記アンモニアの塩が、ギ酸アンモニウムである請求項１７に記載の製造方法。
【請求項１９】
前記酵素反応に用いる各酵素に替えて、それら各酵素の生産能を有する形質転換体を使用することを特徴とする請求項４から１８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２０】
有機溶媒を添加する晶析工程によって光学活性アミノ酸を精製する光学活性アミノ酸の精製方法であって、以下の、
（i）光学活性アミノ酸とアンモニウム塩とを含む溶液に対して、当該アンモニウム塩を、前記有機溶媒に対する溶解度が高い塩に置換するための塩基を添加する工程、
（ii）工程（i）の後の溶液からストリッピングにより、前記置換によって得られるアンモニアを気相中に移動させて当該溶液から除去する工程、
（iii）工程（ii）の後の溶液に対して前記有機溶媒を添加することにより、前記置換によって得られる塩を当該有機溶媒に溶解させる一方、光学活性アミノ酸を晶析する工程、
の各工程を含むことを特徴とする光学活性アミノ酸の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学活性アミノ酸をアンモニウム塩を含む水溶液から高純度で単離する製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光学活性アミノ酸は医薬品等の合成中間体として有用な化合物である。光学活性アミノ酸の製造方法としては、抽出法、化学合成法、発酵法、酵素的合成法など種々の方法が知られている。
【０００３】
抽出法では蛋白質加水分解物からの大規模な精製設備が必要となる。化学合成法で製造されるアミノ酸は通常ラセミ体であるため、光学活性体を製造するためには、高価な分割剤、不斉触媒等を必要とする。発酵法では生成物濃度が低く、抽出法同様大規模な精製設備を必要とし、また、非天然型のアミノ酸の合成には適していない。酵素的合成法は安価な生体触媒を利用することにより、これらの問題点を回避して、より低コストで効率のよい製造方法を提供可能である。
【０００４】
Ｌ−アミノ酸の酵素的合成法としては、例えばラセミ体のアミノ酸にＤ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素を作用させてＬ−アミノ酸を製造する方法（非特許文献１、特許文献１）、対応するケト酸にアミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素を作用させてＬ−アミノ酸を製造する方法（特許文献２）等が知られている。また、Ｄ−アミノ酸の酵素的合成法としては、例えば、対応するＮ−カルバモイルアミノ酸にデカルバモイラーゼを作用させてＤ−アミノ酸を製造する方法（特許文献３）等が知られている。さらに、ラセミ体アミノ酸アミドにアミダーゼを作用させてＬ−アミノ酸、又はＤ−アミノ酸を製造する方法（特許文献４、５）も知られている。
【０００５】
一方、上記の方法等によって得られる光学活性アミノ酸の水溶液に無機塩等が不純物として混在している場合には、高品質の光学活性アミノ酸を得るためにこれら不純物を除去する必要がある。無機塩等を含む水溶液からのアミノ酸の単離方法としては、電気透析により無機塩を除去する方法（特許文献６）、イオン交換樹脂を用いてアミノ酸を精製する方法（特許文献７、８）、夾雑カチオンを透析装置を用いて水素イオンと交換した後、カチオン交換樹脂にてアミノ酸を精製する方法（特許文献９）、クロレンド酸等のような沈殿剤を加えてアミノ酸との難溶性付加物を形成させて回収する方法（特許文献１０、１１）等が知られている。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ０５／０９０９５０号公報
【特許文献２】特開平１０−２３８９６号公報
【特許文献３】特開昭６２−２５９９０号公報
【特許文献４】特開昭５９−１５９７８９号公報
【特許文献５】特開昭６３−８７９９８号公報
【特許文献６】特開昭５８−１００６８７号公報
【特許文献７】特公昭４８−２３５５号公報
【特許文献８】特開昭５６−３９７９２号公報
【特許文献９】特開昭６２−１９５３５１号公報
【特許文献１０】特公昭４５−１０５６号公報
【特許文献１１】特公昭４５−２９１６８号公報
【非特許文献１】中島伸佳ら、「ラセミ体メチオニンのＬ−エナンチオマーへの酵素的変換」(Enzymatic conversion of racemic methionine to the L-enantiomer)、ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイアティー・ケミカル・コミュニケーション(Journal of the chemical society chemical communications)、１９９０年、１３号、９４７頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし上記特許文献６〜１１に記載の方法によるアミノ酸の単離方法では、大規模、又は高価な装置や難溶性付加物を再度分解して遊離アミノ酸を回収する工程が必要であり、余分な工程や設備が必要となる点で、工業的に好ましくない。
【０００７】
本発明の目的はアンモニウム塩を含む光学活性アミノ酸水溶液から、簡便かつ効率的に光学活性アミノ酸を単離する製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題に鑑み、鋭意研究した結果、アンモニウム塩を含む光学活性アミノ酸水溶液に水酸化リチウムのような、有機溶媒に易溶な塩を形成する塩基を添加してｐＨをコントロールしながら減圧するストリッピングによりアンモニアを除き、その後、有機溶媒を添加して晶析することにより、光学活性アミノ酸を高純度の結晶として効率良く単離できることを見出した。なお、ここでいうストリッピングとは、液体中に存在する気体を気相中に移す操作を意味する。
【０００９】
また、本発明者らは、本精製方法が、例えば、以下の（i）〜（iv）の各酵素反応によって製造された光学活性アミノ酸水溶液から光学活性アミノ酸を単離する工程に有効であることを見出した。
（ｉ）ラセミ体のアミノ酸に、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素を作用させることによりＬ−アミノ酸に変換する反応（立体反転反応）、
（ii）対応するケト酸に、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素を作用させることによりＬ−アミノ酸に変換する反応（還元アミノ化反応）、
（iii）対応するＮ−カルバモイルアミノ酸に、デカルバモイラーゼを作用させることによりＤ−アミノ酸に変換する反応（デカルバモイラーゼ反応、及び
（iv）ラセミ体のアミノ酸アミドに、アミダーゼを作用させることによりＬ−アミノ酸、又はＤ−アミノ酸に変換する反応（アミダーゼ反応）。
【００１０】
また、本発明者らは、上記酵素反応においてｐＨ調整用の酸としてギ酸又は塩酸のような、有機溶媒に易溶な塩を形成する酸を用いることによって、高収率かつ高純度にて光学活性アミノ酸を単離・製造することができることを見出した。さらに上記立体反転反応において、アンモニア又はギ酸アンモニウムを添加する、あるいはｐＨをコントロールするための酸としてギ酸を用いることにより、反応収率の向上、反応時間の短縮が達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、以下の１または複数の特徴を有する。
１）本発明の一つの特徴は、光学活性アミノ酸とアンモニウム塩とを含む水溶液からストリッピングによりアンモニアを除去した後、有機溶媒を添加して晶析することにより光学活性アミノ酸の結晶を単離することを特徴とする光学活性アミノ酸の製造方法である。
２）本発明の一つの特徴は、前記有機溶媒に易溶な塩を形成する塩基を用いて、前記ストリッピング時にｐＨをコントロールすることである。
４）本発明の一つの特徴は、前記光学活性アミノ酸とアンモニウム塩とを含む水溶液が、酵素反応により製造されたものであることである。
６）本発明の一つの特徴は、前記Ｌ−アミノ酸とアンモニウム塩とを含む水溶液を、ラセミ体アミノ酸に対して、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素を作用させる酵素反応により製造することである。
７）本発明の一つの特徴は、前記酵素反応において、アンモニア又はその塩をラセミ体アミノ酸に対して０．３当量以上添加することである。
９）本発明の一つの特徴は、前記Ｌ−アミノ酸とアンモニウム塩とを含む水溶液を、対応するケト酸に対して、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素を作用させる酵素反応により製造することである。
１０）本発明の一つの特徴は、前記Ｌ−アミノ酸とアンモニウム塩とを含む水溶液を、ラセミ体アミノ酸アミドに対して、アミダーゼを作用させる酵素反応により製造することである。
１２）本発明の一つの特徴は、前記Ｄ−アミノ酸とアンモニウム塩とを含む水溶液を、前記Ｄ−アミノ酸に対応するＮ−カルバモイルアミノ酸に対して、デカルバモイラーゼを作用させる酵素反応により製造することである。
１３）本発明の一つの特徴は、前記Ｄ−アミノ酸とアンモニウム塩とを含む水溶液を、ラセミ体アミノ酸アミドに対して、アミダーゼを作用させる酵素反応により製造することである。
１４）本発明の一つの特徴は、前記有機溶媒に易溶な塩を形成する酸を、前記酵素反応のｐＨコントロールに用いることである。
１７）本発明の一つの特徴は、ラセミ体アミノ酸にＤ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素を作用させてＬ−アミノ酸に変換する反応において、アンモニア又はその塩を、前記ラセミ体アミノ酸に対して０．３当量以上添加することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法である。
１９）本発明の一つの特徴は、前記酵素反応に用いる各酵素に替えて、それら各酵素の生産能を有する形質転換体を使用することである。
２０）本発明の一つの特徴は、有機溶媒を添加する晶析工程によって光学活性アミノ酸を精製する光学活性アミノ酸の精製方法であって、以下の、
（i）光学活性アミノ酸とアンモニウム塩とを含む溶液に対して、当該アンモニウム塩を、前記有機溶媒に対する溶解度が高い塩に置換するための塩基を添加する工程、
（ii）工程（i）の後の溶液からストリッピングにより、前記置換によって得られるアンモニアを気相中に移動させて当該溶液から除去する工程、
（iii）工程（ii）の後の溶液に対して前記有機溶媒を添加することにより、前記置換によって得られる塩を当該有機溶媒に溶解させる一方、光学活性アミノ酸を晶析する工程、の各工程を含むことを特徴とする光学活性アミノ酸の精製方法である。
【００１２】
本発明のその他の特徴およびそれらの利点は、以下の実施形態を含む明細書によって明らかにされる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は上述の構成からなり、アンモニウム塩を含む光学活性アミノ酸水溶液から高純度の光学活性アミノ酸を簡便かつ効率良く精製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、実施形態に基づいて本発明を詳細に説明する。本発明の範囲は、実施形態および実施例によって限定されるものではない。
【００１５】
１．アンモニウム塩を含む光学活性アミノ酸水溶液の調製
本発明の実施形態としての光学活性アミノ酸の製造方法は、アンモニウム塩を含む光学活性アミノ酸水溶液であれば、いかなる方法によって製造されたものであっても適用できる。例えば、（i）ラセミ体アミノ酸にＤ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素を作用させてＬ−アミノ酸に変換する酵素反応（立体反転反応）、（ii）対応するケト酸にアミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素を作用させてＬ−アミノ酸に変換する酵素反応（還元アミノ化反応）は、通常アンモニウム塩を添加して行うとことから、実施形態により効率的に高純度のＬ−アミノ酸を製造することができる。
【００１６】
実施形態により精製されうる光学活性アミノ酸としては、以下の一般式（１）
【００１７】
【化１】
2007254439.tif 000002
（式中、Ｒは置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、もしくは置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリール基を表す。）で表される光学活性アミノ酸を挙げることができる。上記Ｒにおける置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基としては、特に限定されず、例えば、メチル基、イソプロピル基、イソブチル基、１−メチルプロピル基、カルバモイルメチル基、２−カルバモイルエチル基、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、メルカプトメチル基、２−メチルチオエチル基、（１−メルカプト−１−メチル）エチル基、４−アミノブチル基、３−グアニジノプロピル基、４（５）−イミダゾールメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、クロロメチル基、メトキシメチル基、２−ヒドロキシエチル基、３−アミノプロピル基、２−シアノエチル基、３−シアノプロピル基、４−（ベンゾイルアミノ）ブチル基、又は、２−メトキシカルボニルエチル基などが挙げられる。
【００１８】
置換基を有していてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基としては、特に限定されず、例えば、ベンジル基、インドリルメチル基、４−ヒドロキシベンジル基、２−フルオロベンジル基、３−フルオロベンジル基、４−フルオロベンジル基、又は、３，４−メチレンジオキシベンジル基等が挙げられる。置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリール基としては、フェニル基、または４−ヒドロキシフェニル基などが挙げられる。置換基としては、アミノ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、アルキル基、アラルキル基、アリール基、アルカノイル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、又はハロゲン原子等が挙げられる。
【００１９】
また、実施形態の製造方法は、水に対する溶解度が比較的高く、晶析によって目的物（光学活性アミノ酸）と不純物（無機塩等）との分離が困難、あるいは効率の悪い光学活性アミノ酸に対して特に効果的である。
【００２０】
水に対する溶解度が高い光学活性アミノ酸としては特に限定されないが、例えば前記式（１）における置換基Ｒがメチル基、イソプロピル基、イソブチル基、１−メチルプロピル基、カルバモイルメチル基、２−カルバモイルエチル基、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、２−メチルチオエチル基、（１−メルカプト−１−メチル）エチル基、４−アミノブチル基、３−グアニジノプロピル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基であるもの等を挙げることができる。
２．立体反転反応に使用する酵素
上記アンモニウム塩を含む光学活性アミノ酸水溶液を製造する方法として、立体反転反応を例に挙げて説明する。ただし、以下に例示する立体反転反応は例示であって、当業者に周知の、その他の立体反転反応、および、上述した（ii）還元アミノ化反応、（iii）デカルバモイラーゼ反応、(iv)アミダーゼ反応による、上記アンモニウム塩を含む光学活性アミノ酸水溶液に対しても、本発明の光学活性アミノ酸の製造方法を利用することができる。
【００２１】
まず、立体反転反応に使用する酵素について説明する。Ｄ−アミノ酸オキシダーゼとは、酸素の存在下、Ｄ−アミノ酸を酸化し、２−オキソ酸、過酸化水素、およびアンモニアを生成する酵素である。また、アミノ酸脱水素酵素とは、２−オキソ酸又は環状イミンを還元的にアミノ化する活性を有する酵素であり、例えばフェニルアラニン脱水素酵素、ロイシン脱水素酵素、ピロリン−２−カルボン酸レダクターゼ等を挙げることができる。これらアミノ酸脱水素酵素による反応は、ＮＡＤＨのような還元型の補酵素を必要とし、当該反応の進行に伴い、補酵素ＮＡＤＨは酸化型に変換される。
【００２２】
好適な実施形態では、この酸化型の補酵素を還元型に変換する能力（以後、補酵素再生能と呼ぶ）を有する酵素、及び当該補酵素再生能を有する酵素の基質となる化合物を、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼおよびアミノ酸脱水素酵素と共存させて反応を行うことにより、補酵素の使用量を大幅に削減できる。補酵素再生能を有する酵素としては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、又はグルコース脱水素酵素等を挙げることができる。好適には、ギ酸脱水素酵素が使用される。
【００２３】
実施形態で用いるＤ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素としては、動物、植物、微生物由来のものが使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。
【００２４】
２−１．Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの生産能力を有する微生物としては、例えば、以下の公知の当該酵素の生産能力を有する微生物である、アースロバクター属（Arthrobacter）、アスペルギルス属（Aspergillus）、キャンディダ属（Candida）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、クルブラリア属（Curvularia）、エクソフィアラ属（Exophiala）、フサリウム属（Fusarium）、ジベレラ属（Gibberella）、ハンセヌラ属(Hansenula)、クオエッケラ属(Kloeckera)、クリベロマイセス属（Kluyveromyces）、ニューロスポラ属（Neurospora）、ピキア属（Phichia）、ロドスポリディウム属（Rhodosporidium）、ロドトルラ属（Rhodotorula）、スポロボロマイセス属（Sporobolomyces）、トリゴノプシス属（Trigonopsis）、バーチシリウム属（Verticillium）、ヤロヴィア属(Yarrowia)等が挙げられる。好ましくはキャンディダ属（Candida）に属する微生物由来の酵素が挙げられ、なかでもキャンディダ  インターメディア（Candida intermedia）が好ましく、さらに好ましくは、キャンディダ  インターメディア（Candida intermedia）ＮＢＲＣ０７６１株である。上記キャンディダ  インターメディア（Candida intermedia）ＮＢＲＣ０７６１株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門（〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）より入手可能である。
【００２５】
２−２．アミノ酸脱水素酵素
アミノ酸脱水素酵素の生産能力を有する微生物としては、例えば、以下の公知の当該酵素の生産能力を有する微生物である、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、スポロサルシナ属（Sporosarcina）、サーモアクチノマイセス属（Thermoactinomyces）、マイクロバクテリウム属（Microbacterium）、ハルモナス属（Halomona）、クロストリジウム属（Clostridium）、バチルス属（Bacillus）、ニューロスポラ属（Neurospora）、エシェリヒア属（Escherichia）、アエロバクター属（Aerobactor）等が挙げられる。
【００２６】
好ましくはバチルス属（Bacillus）に属する微生物由来の酵素が挙げられる。さらに好ましくは、バチルス  バディウス（Bacillus badius）ＩＡＭ１１０５９株、バチルス  スファエリカス（Bacillus sphaericus）ＮＢＲＣ３３４１株由来の酵素が挙げられる。上記バチルス  バディウス（Bacillus badius）ＩＡＭ１１０５９はフェニルアラニン脱水素酵素を生産する微生物であり、ＥＰ２５６５１４号、及びＢｉｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９５年、５９巻、１０号、１９９４頁で公知である。上記、バチルス  バディウス（Bacillus badius）ＩＡＭ１１０５９株は、東京大学分子細胞生物学研究所（〒113-0032  東京都文京区弥生1-1-1）より、また上記バチルス  スファエリカス（Bacillus sphaericus）ＮＢＲＣ３３４１株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門（〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）よりそれぞれ入手可能である。
【００２７】
また、上記バチルス  スファエリカス（Bacillus sphaericus）ＮＢＲＣ３３４１株は、ロイシン脱水素酵素を生産する微生物であり、公知のバチルス  サチルス（Bacillus subtilis ）のロイシン脱水素酵素とアミノ酸残基数が同じであり、アミノ酸配列で１００％一致する。遺伝子配列では１０９５塩基中、１４塩基が異なっている。バチルス  サチルス（Bacillus subtilis）の遺伝子配列は、Ｎａｔｕｒｅ、１９９７年、３９０巻、２４９頁およびＮＣＢＩデータベースのアクセッションナンバーＣＡＢ１４３３９で公知である。また、ピロリン−２−カルボン酸レダクターゼがニューロスポラ属（Neurospora）、エシェリヒア属（Escherichia）、アエロバクター属（Aerobactor）で知られていることは、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９６２年、５巻、８８２頁で述べられている。
【００２８】
２−３．補酵素再生能を有する酵素
ギ酸脱水素酵素の生産能力を有する微生物としては、例えば、以下の公知の当該酵素の生産能力を有する微生物である、キャンディダ属（Candida）、クロイッケラ属（Kloeckera）、ピキア属（Pichia）、リポマイセス属（Lipomyces）、シュードモナス属（Pseudomonas）、モラキセラ属（Moraxella）、ハイホマイクロビウム属（Hyphomicrobium）、パラコッカス属（Paracoccus）、チオバシラス属（Thiobacillus）、アンシロバクター属（Ancylobacter）等が挙げられる。
【００２９】
好ましくはチオバシラス属（Thiobacillus）、アンシロバクター属（Ancylobacter）に属する微生物由来の酵素が挙げられる。さらに好ましくはチオバシラス  エスピー（Thiobacillus sp.）ＫＮＫ６５ＭＡ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７１）、アンシロバクター  アクアティカス（Ancylobacter aquaticus）ＫＮＫ６０７Ｍ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３３５）由来の酵素が挙げられる。受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７１およびＢＰ−７３３５で特定される微生物は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566  茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に寄託されている。
【００３０】
２−４．酵素の取得
上記の各酵素を効率良く高生産する高活性菌を得るためには、周知のとおり、形質転換微生物を作成することが有効である。作成方法としては、例えばＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を示す菌株からＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子をクローニングした後、適当なベクターとの組換えプラスミドを作成し、これを用いて、特に限定されないが、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等の宿主微生物を形質転換することにより形質転換体を得ることができる。
【００３１】
ベクターとしては宿主内で自律複製できる微生物由来のプラスミド、ファージまたはその誘導体が使用できる。なかでも、宿主微生物として、例えば、菌学的性質が当業者に周知であって、形質転換用に提供されているエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、ベクターとして当該微生物中で自律複製できるベクターを用いるのが好ましい。このようなベクターとしては、例えば、当業者が容易に入手可能、あるいは市販されているｐＵＣ１８（タカラバイオ株式会社）、ｐＵＣ１９（タカラバイオ株式会社）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ株式会社）、ｐＡＣＹＣ１８４（株式会社 ニッポンジーン）、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ株式会社）、ｐＳＴＶ２９（タカラバイオ株式会社）、ｐＳＣ１０１（フナコシ株式会社）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（タカラバイオ株式会社）、又は国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号公報の明細書の記載に基づいて当業者が製造しうるｐＵＣＮＴ、若しくはそれらの誘導体を挙げることができる。それらの誘導体とは、酵素の生産量上昇、プラスミド安定化を目的として、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ＳＤ配列、複製開始部位（ｏｒｉ）、その他の調節などに関わる遺伝子を改質したもの、また、薬剤耐性、クローニング部位の制限酵素サイトを改質したものなどを指す。
【００３２】
このようにして得られた形質転換体の一例として、キャンディダ  インターメディア（Candida intermedia）ＮＢＲＣ０７６１株由来のＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含有するエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５９７）（特願２００５−２２４５０５号参照）、及びチオバシラス  エスピー（Thiobacillus sp.）ＫＮＫ６５ＭＡ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７１）由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を含有するエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴ００１）（ＦＥＲＭ  ＢＰ-７６７２）、又はエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴ００２）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７３）（国際公開第ＷＯ０３／０３１６２６号公報参照）等を挙げることができる。上記受託番号ＦＥＲＭ番号で特定される形質転換体は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566  茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に寄託されている。
【００３３】
なお、本発明で用いた組換えＤＮＡ技術は当該分野において周知であり、例えば、Molecular Cloning 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)、Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)に記載されている。
【００３４】
上記形質転換体等を培養することにより当該酵素を大量に生産することができ、Ｌ−アミノ酸の製造に利用することができる。微生物の培養は、通常の培地を用いて行えば良い。培養に使用する培地としては、炭素源、窒素源および無機塩類などの栄養素を含む通常の培地で良い。これに、ビタミン、アミノ酸などの有機微量栄養素を添加すると、好ましい結果が得られる場合が多い。炭素源としては、グルコースやシュークロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、アルコール類などが適宜使用される。窒素源としては、アンモニウム塩、アンモニア水、アンモニアガス、尿素、酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカーなどが用いられる。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、鉄塩、硫酸塩、塩素などが用いられる。
【００３５】
培養は温度範囲２５℃から４０℃で行えるが、２５℃から３７℃が特に好ましい。また、ｐＨは４から８で培養できるが５から７．５が好ましい。また、回分式、連続式のいずれの培養方法でもよい。
【００３６】
必要に応じてイソプロピル−１−チオ−β―Ｄ−ガラクトサイド（ＩＰＴＧ）、ラクトース等の添加等の酵素誘導のための処理を行なうこともできる。
３．立体反転反応
次に、立体反転反応によるラセミ体アミノ酸からのＬ−アミノ酸の製造方法について説明する。立体反転反応では、ラセミ体のアミノ酸と前述のＤ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素とその基質となる化合物を同時に存在させ、水性媒体中で反応を行なう。
【００３７】
反応にはカタラーゼを添加してもよい。カタラーゼを添加することでＤ−アミノ酸オキシダーゼの反応で生成する過酸化水素を分解し、基質あるいは生成物の分解を抑えることができる。カタラーゼとしては、動物、植物、微生物由来のものが使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。微生物としては、当該酵素の生産能力を有する微生物であればいずれも利用できるが、例えば、以下の公知の、当該酵素の生産能力を有する微生物である、マイクロコッカス属（Micrococcus）、ロドシュードモナス属（Rhodopseudomonas）等がある。また、市販の酵素も使用することもできる。市販酵素としては例えば、Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）、ＣＡＴＡＬＡＳＥ（Ｂｅｅｆ  Ｌｉｖｅｒ）（Ｐ−Ｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｃａｌｓ，Ｉｎｃ．社製）がある。
【００３８】
また、実施形態において使用するＤ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、補酵素再生能を有する酵素、及びカタラーゼは、それぞれの活性を有する微生物を培養して生産したものを用いてもよいし、あるいはそれぞれの酵素遺伝子を導入した形質転換体を育種し、培養して生産したものを使用してもよく、さらに複数の酵素遺伝子を導入した形質転換体を育種し、培養して生産したものを使用してもよい。
【００３９】
実施形態において、生産されたＤ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素および補酵素再生能を有する酵素、及びカタラーゼは、酵素自体として用いることができるほか、微生物もしくはその処理物としても用いることができる。ここで、微生物の処理物とは、例えば、粗抽出液、培養菌体凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、またはそれらの菌体の破砕物を意味する。
【００４０】
更にそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化して得た固定化酵素として用いられ得る。固定化は当業者に周知の方法である架橋法、共有結合法、物理的吸着法、包括法などで行い得る。
【００４１】
また、上記反応にＦＡＤを添加してもよい。ＦＡＤはＤ−アミノ酸オキシダーゼの補酵素であり、添加することにより、反応の効率が向上することが期待できる。ＦＡＤの添加濃度としては、基質に対して、好ましくは０当量以上、１０当量以下、さらに好ましくは０当量以上、１当量以下、さらに好ましくは０当量以上、０．１当量以下である。
【００４２】
また、上記立体反転反応にはＮＡＤ等の補酵素を添加してもよい。ＮＡＤ等の補酵素を添加しない場合にも、微生物中に存在するＮＡＤ等の補酵素により反応が進行する場合もあるが、ＮＡＤ等の補酵素を添加することで、反応の効率が向上することが期待できる。ＮＡＤ等の補酵素の添加濃度としては、基質に対して、好ましくは０当量以上、２当量以下、さらに好ましくは０．００００１当量以上、０．１当量以下、さらに好ましくは０．０００１当量以上、０．０１当量以下である。
【００４３】
３−１．アンモニア又はアンモニア塩の添加
また、上記立体反転反応に、アンモニア又はその塩を添加することにより、反応収率の向上、及び／又は反応時間の短縮を図ることができる。アンモニアの添加濃度としては、基質であるラセミ体アミノ酸に対して、好ましくは０．１当量以上、より好ましくは０．３当量以上、０．６５当量以上、０．８当量以上である。添加量の上限は特に限定されないが、添加量が多い程、後述するストリッピング工程にて除去するアンモニアの量が増加するため、通常は１０当量以下、好ましくは２当量以下、さらに好ましくは１．５当量以下で行う。アンモニアの塩としては、ギ酸アンモニウム、塩化アンモニウム、炭酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等が挙げられるが、反応収率の向上及び反応時間の短縮化という観点から、ギ酸アンモニウムが特に好ましい（実施例５，６に対応）。
【００４４】
３−２．基質の仕込み濃度・反応温度
上記立体反転反応の基質の仕込み濃度は０．１％（ｗ／ｖ）以上、９０％（ｗ／ｖ）以下、好ましくは１％（ｗ／ｖ）以上、６０％（ｗ／ｖ）以下で溶解または懸濁した状態で反応を行い、上記分割および立体反転反応における反応温度は１０℃以上、８０℃以下、好ましくは２０℃以上、６０℃以下の適当な温度で調節し保ちつつ暫時静置または攪拌すればよい。
【００４５】
３−３．ｐＨ調整
上記反応のｐＨは、４以上、１２以下で行うのが好ましく、さらに好ましくはｐＨ６以上、１１以下である。ｐＨの調整は、酸、又は塩基を添加することで行うことができるが、補酵素再生能を有する酵素としてギ酸脱水素酵素を使用した場合は、通常、補酵素の再生と共にギ酸が二酸化炭素に変換され、反応液から除去されるため、反応の進行と共にｐＨが上昇し、酸を用いてｐＨを調整する必要がある。酵素反応のｐＨ調整、または酵素反応のｐＨコントロールとは、主として溶液のｐＨを酵素反応に適した値に設定または調整することをいう。
【００４６】
ｐＨ調整に使用する酸（「酵素反応のｐＨコントロールに用いる酸」に対応）としては、塩酸、硫酸等の鉱酸、ギ酸、酢酸等の有機酸を使用することができるが、後に述べる晶析工程において使用する有機溶媒に易溶な塩を形成する酸が好ましく、例として塩酸、ギ酸等を挙げることができる。さらにギ酸を使用した場合は（実施例１に対応）、塩酸を使用した場合（実施例３に対応）に比べて立体反転反応におけるＬ−アミノ酸の収率が向上することから、より好ましい。
【００４７】
３−４．その他の反応条件
本反応の基質は一括添加してもよいし、分割添加してもよいし、連続的に添加してもよい。上記分割および立体反転反応は、バッチ法または連続方式で行い得る。
【００４８】
本発明の立体反転反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。水性媒体としては、水、緩衝液、これらにエタノールのような水溶性有機溶媒を含む水性媒体、あるいは、水に溶解しにくい有機溶媒、たとえば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサンなどの有機溶媒を含む水性媒体との２層系などの適当な溶媒を用いることができる。さらに必用に応じて、抗酸化剤、界面活性剤、補酵素、金属などを添加することもできる。
【００４９】
上記のような酵素反応により製造されたＬ−アミノ酸を含む水溶液中に存在する菌体成分等の不溶物は、常套分離方法、例えば活性炭処理、ろ過、抽出等の分離方法、またはそれらの組合せにより除去することができる。
４．ストリッピングによるアンモニアの除去
上記のような方法にて取得したアンモニウム塩を含む光学活性アミノ酸水溶液からのアンモニアの除去方法について説明する。
【００５０】
アンモニアは水溶液に塩基を添加してｐＨを塩基性に保ちつつ減圧するストリッピングにより除去することができる。なお、ストリッピングとは液体中に存在する気体を気相中に移す操作を意味する。
【００５１】
ストリッピング時のｐＨは７以上が好ましく、より好ましくはｐＨ８以上、さらに好ましくは９以上である。ｐＨの上限に特に制限はないが、ｐＨが高くなるほど後述する晶析工程においてｐＨ調整に使用する酸の量が増加するため、通常はｐＨ１１以下で行う。ストリッピング工程でのｐＨ調整（ｐＨコントロール）は、主として、上記アンモニウム塩を含む光学活性アミノ酸水溶液のｐＨを塩基性に保つことにより、アンモニアの除去を容易にするために行う。
【００５２】
ｐＨ調整に用いる塩基（「ストリッピング時にｐＨをコントロールするための塩基」に対応）としては、例えば、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化セシウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウムなどのアルカリ金属水酸化物、もしくはアルカリ土類金属水酸化物、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンなどの３級アミン、エタノールアミン、イソプロパノールアミンなどのアミノアルコール類を挙げることができる。上記の塩基のうち、後述する晶析時に高純度の光学活性アミノ酸結晶を得るためには、添加する有機溶媒に易溶な塩を形成するものの使用が好ましく、例として水酸化リチウムが挙げられる。
【００５３】
ストリッピング時の圧力は５００ｈＰａ以下が好ましく、より好ましくは２００ｈＰａ以下である。また、ストリッピング時の温度は１０℃以上、１００℃以下が好ましく、より好ましくは３０℃以上、８０℃以下である。ストリッピングは、水溶液中に含まれるアンモニウムイオン量が、後の晶析工程において塩として混入しない濃度に低下するまで継続すればよい。具体的には、光学活性アミノ酸水溶液中に残留しているアンモニウムイオン濃度が０．０５Ｍ以下、あるいはアンモニウムイオンの残量がストリッピング開始時の５％以下になるまで行うのが好ましく、アンモニウムイオン濃度が０．０２Ｍ以下、あるいはアンモニウムイオンの残量がストリッピング開始時の２％以下になるまで行うのがより好ましい。また、ストリッピング中の光学活性アミノ酸濃度を調節するため、水を添加しながら行ってもよい。
【００５４】
「３−１．アンモニア又はアンモニア塩の添加」の項目で説明したように、上記立体反転反応においては、アンモニア又はその塩を添加することによって反応収率の向上等を図ることができる。一方、その反応中に生成する無機塩（アンモニア塩）は、有機溶媒に溶け難いため、後の工程（有機溶媒添加による晶析工程）で結晶に混入してしまい、精製される光学活性アミノ酸の純度を低下させる原因となっていた。
【００５５】
従来の技術によれば、そのような無機塩を除去するために、上記工程（アルコール添加による晶析工程）の前に、上記背景技術の項目で説明した、電気透析による無機塩を除去やイオン交換樹脂を用いた精製等が行われていた。すなわち、当業者であれば、混入物を除去する場合には、上述のように電気透析やイオン交換樹脂を利用するのが一般的であった。
【００５６】
この点、実施形態では、混入物の除去をするために、（単にその混入物を除去するのではなく）別途、水酸化リチウム等の塩基を添加するという従来技術とは全く異なるアプローチを採用している。アンモニウム塩を含む光学活性アミノ酸水溶液からの光学活性アミノ酸の精製工程においてストリッピングの工程を採用し、簡便かつ効率的に光学活性アミノ酸を精製する技術は、本件発明者によって初めて得られた知見の１つである。
５．光学活性アミノ酸の晶析
上記方法にてアンモニアを除去した光学活性アミノ酸水溶液に適当な有機溶媒を加えることにより光学活性アミノ酸を結晶として取得することができる。
【００５７】
添加する「有機溶媒」としては、水と均一に混合し得るものであれば特に限定されるものではなく、例えばメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブタノールなどのアルコール類、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどが挙げられ、好ましくはメタノール、エタノール、イソプロパノールである。また、これら有機溶媒は単独で用いてもよいし、必要に応じて２種以上を混合して用いてもよい。
【００５８】
これらの水と均一に混合し得る有機溶媒と水との好ましい比率は、光学活性アミノ酸や有機溶媒の種類等により異なる。一般に、有機溶媒の比率が高いほど収率を高めることができる。上記有機溶媒の比率は通常、全溶媒中の有機溶媒の割合が５０％以上、更には８０％以上であれば概して好結果を与える。普通７０％を越える収率、好ましくは８０％を越える収率、より好ましくはほぼ定量的収率を達成できるように、有機溶媒の種類や比率、光学活性アミノ酸の濃度を決定するのが好ましく、これらの好適な条件は簡単な実験により容易に選定することができる。
【００５９】
上記晶析操作は必要に応じて中和、冷却、濃縮等の公知の晶析方法と組み合わせることにより、さらに収率を高めることができる。
【００６０】
中和とは、上記光学活性アミノ酸水溶液に適当な酸を加えることにより、反応液のｐＨを好適な範囲に調整することをいう。ここでいう好適なｐＨの範囲としては、光学活性アミノ酸の結晶が析出するｐＨであれば特に限定されるものではないが、収率を向上させるためにはその光学活性アミノ酸の等電点付近に調整するのが好ましく、通常ｐＨ２以上、１１以下で行なう。
【００６１】
使用する酸としては、後述する晶析時に高純度の光学活性アミノ酸結晶を得るためには、添加する有機溶媒に易溶な塩を形成するものが好ましく、例えば塩酸等の鉱酸やギ酸、酢酸等の有機酸が挙げられる。
【００６２】
晶析を行う際の温度は、光学活性アミノ酸の種類や、添加する有機溶媒の種類により異なる。一般に、温度が低いほど収率を高めることができ、通常、４０℃以下、好ましくは２０℃以下で実施される。下限は、系の固化温度である。
【００６３】
また、過飽和の形成を抑制してスムースに結晶化を行うため、或いは、高品質化の観点から、上記晶析は攪拌下で実施するのが好ましい。また、必要に応じ、種晶を添加して結晶化を促進させることができる。
【００６４】
以上のようにして得られた光学活性アミノ酸の結晶は、例えば、遠心分離、加圧濾過、減圧濾過等による固液分離、更に、必要に応じてケーキ洗浄を行い、湿体として取得することができる。また、更に減圧下、乾燥し、乾体として取得することができる。
【実施例】
【００６５】
以下に本発明の具体的な実施例を示す。しかし、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００６６】
以下
（実施例１）ｐＨ調整に「ギ酸」を使用した立体反転反応によるＬ−ノルバリンの合成
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５９７）（特願２００５−２２４５０５号参照）を滅菌した培地Ａ（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、塩化ナトリウム０．５％、アンピシリン０．０１％、脱イオン水に溶解、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）に植菌後、３７℃で３０時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、脱イオン水に懸濁後、超音波により菌体を破砕して、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを含む粗酵素液を得た。
【００６７】
また、後述する参考例３に示す方法で育種した、ロイシン脱水素酵素活性及びギ酸脱水素酵素活性の両方の活性を有する形質転換体を、滅菌した培地Ａに植菌後、３３℃で４８時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、脱イオン水に懸濁後、超音波により菌体を破砕して、ロイシン脱水素酵素及びギ酸脱水素酵素を含む粗酵素液を得た。
【００６８】
ラセミ体ノルバリン７．８ｇに、上記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを含む粗酵素液、ロイシン脱水素酵素及びギ酸脱水素酵素を含む粗酵素液、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）、ＮＡＤ４．６ｍｇ、及びギ酸アンモニウム３．３６ｇを添加し、さらに５Ｍアンモニア水約１ｇを添加してｐＨを８．０に調整した後、脱イオン水を添加して１００ｇになるよう反応液（以下、適宜「反応液Ａ」と表現する。）を調製した。
【００６９】
この反応液を３Ｍギ酸水溶液にてｐＨを８．０にコントロールしながら３０℃で好気的に攪拌し、１９時間反応を行なった。生成したＬ−ノルバリンの収率及び光学純度を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分析した結果、ラセミ体に対し９４．４％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ−ノルバリンが得られた。
（ＨＰＬＣ分析条件）カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ  ＯＡ−５０００（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、住化分析センター社製）、移動相：２ｍＭ硫酸銅水溶液／メタノール＝９５／５、流速：１ｍｌ／分、カラム温度：３０℃、検出：２５４ｎｍ
（実施例２）ｐＨ調整に「ギ酸」を使用した酵素反応液からのＬ−ノルバリンの精製
以下の工程により、実施例１で得た酵素反応液からＬ−ノルバリンを精製した。
（１）活性炭処理等
実施例１にて得られた酵素反応液に活性炭「特製白鷺」（武田薬品工業社製）５ｇ、ろ過助剤「ラヂオライト＃７００」（昭和化学工業社製）２ｇ、トルエン１ｍｌを添加し、３０℃で２時間攪拌した。不溶物を減圧ろ過にて除去し、脱イオン水３５ｍｌにて洗浄した。
（２）アンモニアストリッピング
得られたろ液に水酸化リチウム１．５４ｇを添加してｐＨ９．５に調整した。水酸化リチウム及び脱イオン水の添加によりｐＨを９．５、全重量を１００ｇに保ちつつ、内温約５０℃、圧力１３０ｈＰａにて攪拌下、９０分間ストリッピングを行った。
（３）塩酸による中和および濃縮
上記ストリッピング後の溶液に、３５％塩酸２．８ｇを添加してｐＨ６．０に調整した後、さらに全体重量が２０．６ｇになるまで減圧濃縮を行った。
（４）アルコール添加による晶析および結晶のろ別
減圧濃縮後、常圧に戻し、溶液に対してメタノール４８．４ｇを添加して２５℃にて２．５時間攪拌後、０℃まで冷却し、１．５時間攪拌を続けた。析出した結晶を減圧濾過し、充分に脱液した後、８３％メタノール１８ｍｌで洗浄した。その後、得られた湿結晶を減圧乾燥（約１０ｈＰａ、５０℃、約５時間）し、Ｌ−ノルバリンを結晶として得た。
【００７０】
得られたＬ−ノルバリンの結晶を実施例１と同様の条件にて分析したところ、純度は９９.６ｗｔ％、実施例１で得られた酵素反応液からの回収率は８２．７％であった。
（実施例３）ｐＨ調整に「塩酸」を使用した立体反転反応によるＬ−ノルバリンの合成
実施例１と同様の方法にて調製した反応液（上記「反応液Ａ」参照）を、２Ｍ塩酸水溶液にてｐＨを８．０にコントロールしながら３０℃で好気的に攪拌し、２２時間反応を行なった。
【００７１】
生成したＬ−ノルバリンの収率及び光学純度を実施例１と同様の条件で分析した結果、ラセミ体に対し８７．０％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ−ノルバリンが得られた。
（実施例４）ｐＨ調整に「塩酸」を使用した酵素反応液からのＬ−ノルバリンの精製
以下の工程により、実施例３で得た酵素反応液からＬ−ノルバリンを精製した。
（１）活性炭処理等
実施例３にて得られた酵素反応液に活性炭「特製白鷺」（武田薬品工業社製）１０ｇ、ろ過助剤「ラヂオライト＃７００」（昭和化学工業社製）２ｇ、トルエン１ｍｌを添加し、３０℃で２時間攪拌した。不溶物を減圧ろ過にて除去し、脱イオン水９０ｍｌにて洗浄した。
（２）アンモニアストリッピング
得られたろ液に水酸化リチウム１．８４ｇを添加してｐＨ９．５に調整した。水酸化リチウム及び脱イオン水の添加によりｐＨを９．５に保ちつつ、内温約４０℃、圧力７０〜４０ｈＰａにて攪拌下、１５０分間ストリッピングを行った。
（３）塩酸による中和および濃縮
上記ストリッピング後の溶液に、３５％塩酸３．２ｇを添加してｐＨ６．０に調整した後、さらに全体重量が１８．１ｇになるまで減圧濃縮を行った。
（４）アルコール添加による晶析および結晶のろ別
減圧濃縮後、常圧に戻し、溶液に対してメタノール３２．３ｇを添加して２５℃にて２．５時間攪拌後、０℃まで冷却し、２時間攪拌を続けた。析出した結晶を減圧濾過し、充分に脱液した後、８０％メタノール１２ｍｌで洗浄した。その後、得られた湿結晶を減圧乾燥（約１０ｈＰａ、５０℃、約５時間）し、Ｌ−ノルバリンを結晶として得た。
【００７２】
得られたＬ−ノルバリンの結晶を実施例１と同様の条件にて分析したところ、純度は９９.３ｗｔ％、実施例１で得られた酵素反応液からの回収率は８３．２％であった。
（実施例５）立体反転反応によるＬ−ノルバリンの合成（アンモニア添加量の影響）
ラセミ体ノルバリン５０ｍｇに、実施例１と同様の方法にて調製したＤ−アミノ酸オキシダーゼを含む粗酵素液、実施例１と同様の方法にて調製したロイシン脱水素酵素及びギ酸脱水素酵素を含む粗酵素液、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）、ＮＡＤ０．３ｍｇ、及び、ギ酸アンモニウムとギ酸ナトリウムを表１に示すようにギ酸の合計量がラセミ体ノルバリンの０．６５当量になるように調整して添加し、脱イオン水を添加して１ｍｌになるよう反応液を調製した。
【００７３】
この反応液を試験管内に入れて３０℃にて振とうし、２Ｎ塩酸にて８．０にコントロールしながら反応した。反応２．５時間目、及び５時間目に生成したＬ−ノルバリンの収率を実施例１と同様の条件にて分析した結果、表１に示すようにアンモニアの添加による反応速度の向上効果が認められた。
【００７４】
【表１】
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（実施例６）立体反転反応によるＬ−ノルバリンの合成（ギ酸アンモニウム添加量の影響）
ラセミ体ノルバリン７．８ｇに、実施例１と同様の方法にて調製したＤ−アミノ酸オキシダーゼを含む粗酵素液、実施例１と同様の方法にて調製したロイシン脱水素酵素及びギ酸脱水素酵素を含む粗酵素液、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）、ＮＡＤ４６ｍｇ、及びギ酸アンモニウム３．３６ｇ（ラセミ体ノルバリンに対して０．８当量）又は２．７３ｇ（ラセミ体ノルバリンに対して０．６５当量）を添加し、さらに５Ｍアンモニア水約１ｇを添加してｐＨを８．０に調整した後、脱イオン水にて１００ｇになるよう反応液を調製した。
【００７５】
この反応液を、３Ｍ硫酸水溶液にてｐＨを８．０にコントロールしながら３０℃で好気的に攪拌し、２２．５時間反応を行なった。
【００７６】
生成したＬ−ノルバリンの収率及び光学純度を実施例１と同様の条件にて分析した結果、いずれの反応でも光学純度１００％ｅｅのＬ−ノルバリンが得られたが、反応収率はギ酸アンモニウムをラセミ体に対し０．８当量添加した場合は９６．２％であったのに対して、０．６５当量しか添加しなかった場合は９２．８％であり、ギ酸アンモニウムの添加効果が認められた。
（比較例１）ｐＨ調整に硫酸を使用した立体反転反応によるＬ−ノルバリンの合成
実施例１と同様の方法にて調製した反応液（上記「反応液Ａ」参照）を、３Ｍ硫酸水溶液にてｐＨを８．０にコントロールしながら３０℃で好気的に攪拌し、１９時間反応を行なった。
【００７７】
生成したＬ−ノルバリンの収率及び光学純度を実施例１と同様の条件で分析した結果、ラセミ体に対し９７．３％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ−ノルバリンが得られた。
（比較例２）ｐＨ調整に硫酸を使用した酵素反応液からのストリッピング操作を行わないＬ−ノルバリンの精製
以下の工程により、比較例１で得た酵素反応液からＬ−ノルバリンを精製した。
（１）活性炭処理等
比較例１にて得られた酵素反応液に３Ｍ硫酸水溶液０．７１ｇを添加してｐＨを６．０に調整後、活性炭「特製白鷺」（武田薬品工業社製）１０ｇ、ろ過助剤「ラヂオライト＃７００」（昭和化学工業社製）２ｇ、トルエン１ｍｌを添加し、３０℃で１時間攪拌した。不溶物を減圧ろ過にて除去し、脱イオン水７０ｍｌにて洗浄した。
（２）濃縮（ストリッピング操作は行わない）
得られたろ液を、全体重量が１７．２ｇになるまで減圧濃縮を行った。
（３）アルコール添加による晶析および結晶のろ別
減圧濃縮後、常圧に戻し、溶液に対してメタノール１２．７ｇを添加して０℃まで冷却し、２時間攪拌を続けた。析出した結晶を減圧濾過し、充分に脱液した後、６７％メタノール１２ｍｌで洗浄した。その後、得られた湿結晶を減圧乾燥（約１０ｈＰａ、５０℃、約５時間）し、Ｌ−ノルバリンを結晶として得た。
【００７８】
得られたＬ−ノルバリンの結晶を実施例１と同様の条件にて分析したところ、純度は７５．８ｗｔ％、酵素反応液からの回収率は８７．１％であった。
（参考例１）ギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体の育種
チオバシラス  エスピー（Thiobacillus sp.）ＫＮＫ６５ＭＡ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７１）のゲノムを鋳型に、ＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−１：配列表の配列番号１、及び、Ｐｒｉｍｅｒ−２：配列表の配列番号２）を用いてＰＣＲを行なった。受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７１特定される微生物は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566  茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に寄託されている。
【００７９】
上記ＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで切断した。その切断断片と、同酵素で切断したベクタープラスミドｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号公報の明細書の記載に基づいて当業者が製造可能）とを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて結合することで、ギ酸脱水素酵素を大量に発現できるように設計されたプラスミドを取得した。
【００８０】
得られたプラスミドをエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１のコンピテントセル（タカラバイオ社製）と混合し形質転換を行なうことで、ギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体を育種した。
【００８１】
得られた形質転換体を、試験管内にて滅菌した６ｍｌの培地Ａに植菌後、３７℃で２４時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミド抽出を行い、ギ酸脱水素酵素を大量に発現できるように設計されたプラスミドを回収した。
（参考例２）ロイシン脱水素酵素活性を有する形質転換体の育種
バチルス  スファエリカス（Bacillus sphaericus）ＮＢＲＣ３３４１株のゲノムを鋳型に、ＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−３：配列表の配列番号３、及び、Ｐｒｉｍｅｒ−４：配列表の配列番号４）を用いてＰＣＲを行なった。バチルス  スファエリカス（Bacillus sphaericus）ＮＢＲＣ３３４１株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門（〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）より入手可能である。
【００８２】
上記ＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｃＩで切断した。その切断断片と、同酵素で切断したベクタープラスミドｐＵＣＴ（ｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号公報の明細書の記載に基づいて当業者が製造可能）のＮｄｅＩサイトを破壊したプラスミドベクター）とを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて結合することで、ロイシン脱水素酵素を大量に発現できるように設計されたプラスミドを取得した。得られたプラスミドをエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（タカラバイオ社製）のコンピテントセルと混合し形質転換を行なうことで、ロイシン脱水素酵素活性を有する形質転換体を育種した。
【００８３】
得られた形質転換体を、試験管内にて滅菌した６ｍｌの培地Ａに植菌後、３７℃で２４時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミド抽出を行い、ロイシン脱水素酵素を大量に発現できるように設計されたプラスミドを回収した。
（参考例３）ロイシン脱水素酵素活性及びギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体の育種
参考例２で得られたロイシン脱水素酵素を大量に発現できるように設計されたプラスミドをＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで切断し、ロイシン脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片をＴａＫａＲａＲＥＣＯＣＨＩＰ（タカラバイオ社製）を用いて回収した。同ＤＮＡ断片と、同酵素で切断した、参考例１で得られたギ酸脱水素酵素を大量に発現できるように設計されたプラスミドとを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて結合することで、ロイシン脱水素酵素及びギ酸脱水素酵素を大量に発現できるように設計されたプラスミドを取得した。得られたプラスミドをエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１のコンピテントセル（タカラバイオ社製）と混合し形質転換を行なうことで、ロイシン脱水素酵素活性及びギ酸脱水素酵素活性の両方の活性を有する形質転換体を育種した。同形質転換体は、実施例１等にて使用した。
【配列表】
2007254439000001.app