(57)【要約】      （修正有）【課題】クリアランス速度が高く、反復投与を必要とするペプチドホルモンの放出特性を改善し、持続的作用特性を持つ類縁体を提供する。【解決手段】親ペプチドホルモンのＮ末端のアミノ酸に親油性置換基Ｗ、またはＣ末端のアミノ酸に親油性置換基Ｚを導入することにより、修飾された薬理学的活性をもつペプチドホルモンまたはその類縁体であって、前記親油性置換基ＷとＺが８〜４０の炭素原子をもち、持続的作用特性を有するペプチドホルモンまたはその類縁体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬理学的活性を有するペプチドホルモン誘導体またはその類縁体であって、親ペプチドのＮ末端アミノ酸への親油性置換基Ｗの導入または親ペプチドのＣ末端アミノ酸への親油性置換基Ｚの導入により親ペプチドホルモンが修飾されており、前記親油性基は８以上４０以下の炭素原子を有するペプチドホルモン誘導体またはその類縁体（ただし、前記親油性置換基は、Ｎ末端のアミノ基に付着したとき負に帯電し得る基を含み、さらに前記ペプチドホルモンはインシュリンまたはその類縁体ではない）。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドホルモン誘導体であって、前記親油性基Ｗが存在するペプチドホルモン誘導体。
【請求項３】
請求項２に記載のペプチドホルモン誘導体であって、前記Ｗが、１２以上３５以下のの炭素原子を有するペプチドホルモン誘導体。
【請求項４】
請求項１に記載のペプチドホルモン誘導体であって、前記Ｚが存在するペプチドホルモン誘導体。
【請求項５】
請求項４に記載のペプチドホルモン誘導体であって、前記Ｚが、１２以上３５以下の炭素原子を有するペプチドホルモン誘導体。
【請求項６】
請求項１に記載のペプチドホルモン誘導体であって、前記親ペプチドホルモンが、副腎皮質刺激ホルモン、コルチコトロピン放出因子、アンギオテンシン、カルシトニン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチドならびにその類縁体および断片、インシュリン様増殖因子１、インシュリン様増殖因子２、エンテロガストリン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、副甲状腺ホルモン、、トロンボポイエチン、エリスロポイエチン、視床下部性放出因子、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、エンドルフィン類、エンケファリン類、バソプレッシン、オキシトシン、オピオイド類およびそれらの類縁体、スーパーオキシドジスムターゼ、インターフェロン、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼおよびリボヌクレアーゼからなる群から選択されるペプチドホルモン誘導体。
【請求項７】
請求項２に記載のペプチドホルモン誘導体であって、前記Ｗに含有されるカルボキシル基が、Ｎ末端のαアミノ基とアミド結合を形成しているペプチドホルモン誘導体。
【請求項８】
請求項２に記載のペプチドホルモン誘導体であって、前記Ｗに含有されるカルボキシル基が、Ｎ末端のリジンのε−アミノ基とアミド結合を形成しているペプチドホルモン誘導体。
【請求項９】
請求項２に記載のペプチドホルモン誘導体であって、前記ＷがCH3(CH2)n((CH2)mCOOH)CHNH-CO(CH2)2CO-であり、ｎおよびｍが整数で、炭素原子が８以上４０以下、好ましくは１２以上３５以下であるペプチドホルモン誘導体。
【請求項１０】
請求項２に記載のペプチドホルモン誘導体であって、前記Ｗは、一般式がCH3(CH2)rCO-NHCH(COOH)(CH2)2CO-の基であり、前記ｒが１０以上２４以下の整数であるペプチドホルモン誘導体。
【請求項１１】
請求項２に記載のペプチドホルモン誘導体であって、前記Ｗは、一般式がCH3(CH2)sCO-NHCH((CH2)2COOH)CO-の基であり、前記ｓが８以上２４以下の整数であるペプチドホルモン誘導体。
【請求項１２】
請求項４に記載のペプチドホルモン誘導体であって、前記Ｚに含有されるアミノ基が、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基とアミド結合を形成しているペプチドホルモン誘導体。
【請求項１３】
請求項４に記載のペプチドホルモン誘導体であって、前記Ｚは、一般式-NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)mCH3の基であり、前記ｍが８以上１８以下の整数である、すなわちＺがＮε−アシルリジン残基であるペプチドホルモン誘導体。
【請求項１４】
請求項４に記載のペプチドホルモン誘導体であり、前記Ｚは、一般式が-NHCH(COOH)(CH2)4NH-CONH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)pCH3の基であり、前記ｐが１０以上１６以下の整数であるペプチドホルモン誘導体。
【請求項１５】
請求項４に記載のペプチドホルモン誘導体であり、前記Ｚは、一般式が-NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)qCH3の基であり、前記ｑが１０以上１６以下の整数であるペプチドホルモン誘導体。
【請求項１６】
請求項４に記載のペプチドホルモン誘導体であり、前記Ｚは、一般式-NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NHCO(CH2)tCH3の基であり、前記ｔが０または１以上２２以下の整数であるペプチドホルモン誘導体。
【請求項１７】
請求項４に記載のペプチドホルモン誘導体であり、Gly-Lysジペプチドの形態のスペーサーが、親油性基Ｚと親ペプチドホルモンとの間に挿入されているペプチドホルモン誘導体。
【請求項１８】
請求項４に記載のペプチドホルモン誘導体であり、前記Ｚは、一部または全部が水素化されたシクロペンタノフェナントレン骨格を含むペプチドホルモン誘導体。
【請求項１９】
親ペプチドに比して持続的作用特性をもつ薬理学的活性を有するペプチドホルモン誘導体の製造方法であって、親ペプチドのＮ末端アミノ酸への親油性置換基Ｗの導入または親ペプチドホルモンのＣ末端アミノ酸への親油性置換基Ｚの導入により、親ペプチドホルモンを修飾することを含んでなり、前記親油性置換基は、８以上４０以下の炭素原子を有する方法（ただし、親油性置換基がＮ末端アミノ基に付着したとき負に帯電し得る基を含むという条件、さらに前記ペプチドホルモンはインシュリンまたはその類縁体ではないという条件を満たす）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、持続的作用特性を有する新規ペプチドホルモン誘導体およびその類縁体ならびにそれらの製造方法および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ペプチドホルモンは、医療において広く用いられており、組み換えＤＮＡ技術により製造できるため、その重要性は今後も増大すると予想されている。天然のペプチドホルモンまたはその類縁体を治療に用いると、一般的にそれらのクリアランス速度は、高いことが分かる。治療薬のクリアランス速度が高いことは、長期間にわたって高い血中レベルを維持することが望まれる場合には反復投与を要することになるため、不都合である。高いクリアランス速度をもつペプチドホルモンの例として、：副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、コルチコトロピン放出因子、アンギオテンシン、カルシトニン、インシュリンならびにその断片および類縁体、グルカゴン、グルカゴン様ペプチドならびにその類縁体および断片、インシュリン様増殖因子１（IGF-1）、インシュリン様増殖因子２（IGF-2）、エンテロガストリン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、副甲状腺ホルモン、トロンボポイエチン、エリスロポイエチン、視床下部性放出因子、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、エンドルフィン類、エンケファリン類、バソプレッシン、オキシトシン、オピオイド類およびそれらの類縁体、スーパーオキシドジスムターゼ、インターフェロン、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼおよびリボヌクレアーゼがある。
【０００３】
適切な薬学的組成物を利用することによって、ペプチドホルモンの放出特性(release profile)に影響を与えることが可能な場合もあるが、このアプローチは様々な欠点をもち、一般的には適用できない。そのため、ペプチドホルモンの投与における分野では、いまだ改良が必要とされている。
【発明の開示】
【０００４】
発明の概要
本明細書において、ペプチドという用語は、小ペプチド、ポリペプチド、およびタンパクの全てを意味する。ペプチドおよびペプチドホルモンという用語は、天然および合成ペプチドホルモンならびにそれらの断片および類縁体を意味する。類縁体とは、親ペプチドの１以上のアミノ酸が欠失、もしくは他のアミノ酸で置換されているか、または１以上のアミノ酸が付加されており、質的に（必ずしも量的であることは要しない）親ペプチドと同じ薬理学的効果を維持しているものをいう。
【０００５】
本発明は、持続的作用特性をもつペプチドホルモンの新規誘導体に関する。
【０００６】
このため、最も包括的にいえば、本発明は、天然のペプチドホルモンまたはその類縁体のＮ末端またはＣ末端アミノ酸のいずれかに、８以上４０以下の炭素原子を含む親油性置換基を導入して修飾した薬理学的活性を有するペプチドホルモンである。ただし、前記親油性置換基は、Ｎ末端のアミノ基に付着したとき負に帯電し得る基を含み、さらに前記ペプチドホルモンは、インシュリンまたはその類縁体ではない。
【０００７】
本発明の１つの好適な実施態様によれば、親油性基Ｗに含まれるカルボキシル基は、親ペプチドのアミノ酸のＮ末端のα−アミノ基とアミド結合を形成する。
【０００８】
本発明の他の好適な実施態様によれば、親油性基Ｗに含まれるカルボキシル基は、Ｎ末端のリジンのε−アミノ基とアミド結合を形成する。
【０００９】
本発明の他の好適な実施態様によれば、親油性基Ｗは、スペーサーおよび巨大な親油性置換基からなっている。好ましくは、スペーサーは、コハク酸、グルタミン酸またはアスパラギン酸である。好ましくは、巨大な親油性置換基は、アミノ基を有するものをも含む直鎖脂肪酸である。コハク酸をスペーサーとして用いたときには、カルボキシル基のうちの一つは、親ペプチドのＮ末端のアミノ酸中のアミノ基とアミド結合を形成し、もう一方のカルボキシル基は巨大な親油性基中のアミノ基とアミド結合を形成する。グルタミン酸またはアスパラギン酸が、スペーサーとして用いられたときには、カルボキシル基のうち１つは、親ペプチドのＮ末端のアミノ酸中のアミノ基とアミド結合を形成し、巨大な親油性置換基は、好ましくは、直鎖脂肪酸または一部もしくは全部が水素化されたシクロペンタノフェナントレン骨格を含む酸のアシル基であり、そのアシル基が、スペーサーのアミノ基に付着している。
【００１０】
本発明の他の好適な実施態様によれば、親油性基Ｚに含まれるアミノ基は、親ペプチドのＣ末端のアミノ酸のカルボキシル基とアミド結合を形成する。
【００１１】
本発明の他の好適な実施態様によれば、Ｚは、アミノ基を有する直鎖脂肪酸である。
【００１２】
本発明の他の好適な実施態様によれば、Ｚは、負に帯電し得る基を有する。
【００１３】
本発明の他の好適な実施態様によれば、Ｚは、遊離のカルボン酸基を有する。
【００１４】
本発明の他の好適な実施態様によれば、親油性基Ｚは、スペーサーおよび巨大な親油性置換基からなる。好ましくは、スペーサーは、リジン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸である。リジンがスペーサーとして用いられるときは、１つの好適な実施態様において、巨大な親油性置換基は、直鎖脂肪酸または一部もしくは全部が水素化されているシクロペンタノフェナントレン骨格を含有する酸のアシル基であり、そのアシル基がスペーサー群のアミノ基に付着している。さらなる好適な実施態様において、リジンをスペーサーとして用いるときには、リジンのε−アミノ基と巨大な親油性置換基との間に、さらにスペーサーが挿入される。１つの好適な実施態様において、このようにさらに挿入されるスペーサーは、コハク酸であり、リジンのε−アミノ基および巨大な親油性置換基中のアミノ基とアミド結合を形成する。他の好適な実施態様においては、このようにさらに挿入されるスペーサーは、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、リジンのε−アミノ基、さらに巨大な親油性置換基中のカルボキシル基とアミド結合を形成する。ここで、前記親油性置換基は、好ましくは、直鎖脂肪酸または一部もしくは全部が水素化されたシクロペンタノフェナントレン骨格を有する。
【００１５】
他の好適な実施態様においては、本発明は、当該発明のペプチド誘導体を薬剤として使用することに関する。
【００１６】
他の好適な実施態様においては、本発明は、当該発明のペプチド誘導体を含有する薬剤に関する。
【００１７】
他の好適な実施態様においては、本発明は、薬理学的受容能をもつキャリアーとともに、当該発明によるＩＧＦ−１誘導体を治療的有効量含んでなる治療を必要とする患者の骨粗鬆症を治療するための薬学的組成物に関する。
【００１８】
他の好適な実施態様においては、本発明は、患者に薬理学的受容能をもつキャリアーとともに、当該発明によるＩＧＦ−１誘導体を治療的有効量投与することを含んでなる治療を必要とする患者の骨粗鬆症を治療する方法に関する。
【００１９】
本発明に関連する親ペプチドのうち興味深い例は、以下のとおりである：
副腎皮質刺激ホルモン、コルチコトロピン放出因子、アンギオテンシン、カルシトニン、インシュリンならびにその断片および類縁体、グルカゴン、グルカゴン様ペプチドならびにその類縁体および断片（例えばGLP-1およびGLP-2ならびにその類縁体および断片）、インシュリン様増殖因子１、インシュリン様増殖因子２、エンテロガストリン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、副甲状腺ホルモン、トロンボポイエチン、エリスロポイエチン、視床下部性放出因子、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、エンドルフィン類、エンケファリン類、バソプレッシン、オキシトシン、オピオイド類およびそれらの類縁体、スーパーオキシドジスムターゼ、インターフェロン、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼおよびリボヌクレアーゼ。
【００２０】
特に好適なＩＧＦ−１およびＩＧＦ−１類縁体の誘導体の例は以下の通りである：
Lys68（Ｎε−テトラデカノイル）デス（69,70）ヒトIGF-1；
Lys68［Ｎε-γ-Glu（Ｎα−ヘキサデカノイルOH）］−OH デス（69,70）ヒトIGF-1；
Ｌｙｓ69（Ｎε−テトラデカノイル）デス（７０）ヒトＩＧＦ−１；
Ｓｅｒ69−ＮＨ（ＣＨ2）nＣＯＯＨ デス（７０）ヒトＩＧＦ−１（ここで、ｎは１２以上２４以下の整数）；
Ｓｅｒ69−ＮＨ（ＣＨ2）nＣＨ3 デス（７０）ヒトＩＧＦ−１（ここで、ｎは１２以上２４以下の整数）；
Ｌｙｓ71（Ｎε−テトラデカノイル）ヒトＩＧＦ−１；
Ａｌａ70−ＮＨ（ＣＨ2）nＣＯＯＨ ヒトＩＧＦ−１、（ここで、ｎは１２以上２４以下の整数）；および
Ａｌａ70−ＮＨ（ＣＨ2）nＣＨ3 ヒトＩＧＦ−１、（ここで、ｎは１２以上２４以下の整数）。
【００２１】
好適なソマトスタチン誘導体は以下である：
Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Tyr-Thr-Ser-Cys-Lys［Ｎε-γ-Glu（Ｎα−テトラデカノイル−ＯＨ）］−ＯＨ（２つのシステイン残基は、ジスルフィド架橋で結合している）。
【００２２】
好適なGLP-1誘導体は以下である：
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys［Ｎε-γ-Glu(Ｎα-テトラデカノイル）-OH］-OH。
【００２３】
好適なＡＮＰ類縁体は以下である：
Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-Lys［Ｎε-γ-Glu（Ｎα-テトラデカノイル）-OH］-OH。
【００２４】
好適なダイノルフィン類縁体の誘導体の型は以下である：
Tyr-Gly-Gly-Phe-Cys-Arg-Arg-D-Ala-Arg-Pro-Cys-NH-(CH2)nCOOH(ここで、ｎは８以上２４以下の整数)。
【００２５】
好適なエンテロガストリンの誘導体は以下である：
H-Ala-Pro-Gly-Pro-Arg-Lys（Ｎε-テトラデカノイル）-OH。
【００２６】
発明の詳細な説明
薬学的組成物
本発明によるペプチド誘導体を含む薬学的組成物は、治療を要する患者に、非経口的に投与し得る。非経口投与は、注射器（ペン状注射器も可）を用いた皮下、筋肉内または静脈内注射によりなし得る。あるいは、非経口投与は、注入用ポンプを用いて行ってもよい。さらに、点鼻スプレーの形でペプチド誘導体を投与するために、組成物は、粉末または液体とすることもできる。さらにまた、ペプチド誘導体は、経皮的に投与してもよい。
【００２７】
本発明の化合物を含有する薬学的組成物は、例えば、１９８５年のRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載されているような従来技術によって、調製し得る。
【００２８】
このため、本発明のペプチド誘導体の注射可能な組成物は、希望の最終産物を得るための添加物の溶解および混合を含む製薬産業の従来技術を用いて、適切に調製し得る。
【００２９】
このため、１つの手順に従えば、ペプチド誘導体は、調製すべき組成物の最終容量よりわずかに少ない量の水に溶解される。必要なものとして等張剤(isotonicagents)、防腐剤および緩衝液が添加され、必要なら、酸（例えば塩酸）または塩基（例えば水酸化ナトリウム水溶液）を用いてｐＨ値を調整する。最後に、溶液の容量を水で調整し、成分を希望の濃度にする。
【００３０】
等張剤の例としては、塩化ナトリウム、マニトールおよびグリセロールがある。
【００３１】
防腐剤の例としては、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルｐ−ヒドロキシ安息香酸、およびベンジルアルコールがある。
【００３２】
適当な緩衝液の例としては、酢酸ナトリウムおよびリン酸ナトリウムがある。
【００３３】
ある種のペプチドホルモンの点鼻投与用の組成物は、例えば、（ノボノルディクス Ａ／Ｓに対する）European Patent第２７２０９７号に記載されているように調製し得る。
【００３４】
この発明のペプチド誘導体は、様々な疾病の治療に用いることができる。使用すべきペプチド誘導体および患者に対する至適量のレベルは、治療すべき疾病；用いる該ペプチド誘導体の効力、年齢、体重、身体の活力、患者の食事を含む種々の要因；他の薬物との組み合わせ；患者の重症度などに依存する。本発明のペプチド誘導体の投薬量は、他の既知のペプチドホルモンと同様、その分野の熟練者によって、各患者ごとに決定することが望ましい。
【００３５】
以下の実施例によって、さらに本発明の説明を行うが、これは保護の範囲を制限するものと解するべきではない。前記の記載および以下の例中で開示される特徴は、これらを独立でまたは任意に組み合わせて、本発明を多様な形態で実施するための基礎となろう。
【実施例】
【００３６】
略称
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
Ｆｏｒ：ホルミル
Ｄｄｅ：１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリジン）−エチル
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
Ｔｂｕ：ｔｅｒt−ブチル
Ａｃｍ：アセトアミドメチル
ＤＩＣ：Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド
ＨＯＢＴ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸。
【００３７】
分析
産物の分子量は、Bio-Ion 20装置（Bio-Ion Nordic AB、Uppsala, Sweden）を用いたプラズマ脱着質量分析（PDMS）により得た。
【００３８】
親油性の決定
ヒトインシュリンに対するペプチドおよびペプチド誘導体の相対的親油性（Ｋ'rel）は、Ａ）１０％アセトニトリルを含む０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．３、Ｂ）溶出用の５０％アセトニトリル水溶液の混合液を用いた、LiChrosorb RP18(5μｍ、4×250mm)高速液体クロマトグラフィーカラムを、４０℃で無勾配溶出させて測定した。溶出物は、２１４ｎｍでの溶出液の紫外線吸収を観測することによってモニターした。空隙時間（vold time；ｔ0）は、０．１ｍＭ 硝酸ナトリウムを注入して決定した。ヒトインシュリンの保持時間（tinsulin）は、Ａ溶液とＢ溶液の比率を変えて、少なくとも２t0になるように調整した。
【００３９】
Ｋ' rel＝（ｔderivative−ｔ0）／（ｔinsulin−ｔ0）。
【００４０】
実施例１
For-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys（Ｎε-テトラデカノイル）-OHの合成
For-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Ly-OHは、Bachem Feinchemikalien AG、スイスから購入した。本ペプチドは、ヒト好中球の強力な化学誘因物質である。表題の化合物は、１７ｍｇのFor-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys-OHを５ｍｌのＤＭＦに溶解し、その後３５μｌのトリエチルアミン、さらに２０ｍｇの固体のテトラデカノイン酸サクシニミジル−Ｎ−ヒドロキシ−エステルを添加して調製する。反応は、逆相Ｃ１８シリカ物質を充填したカラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフィーでモニターした。溶出には、０．１％ＴＦＡ水溶液中のエタノールを３０％から８０％にする勾配を使用した。産物は、逆相Ｃ１８シリカ材を充填したカラム（長さ２５０ｍｍ、直径２０ｍｍ）で精製した。得られた化合物は、７４％エタノール／０．１％ＴＦＡ水溶液に溶かし、次にカラムにかけ、温度４０℃、流速６ｍｌ／時間で、同じ緩衝液を用いて、イソクラティック溶出で精製した。収量は、２０ｍｇであった。化合物の同定は、ＰＤＭＳによって確認した。
【００４１】
ＰＤＭＳによって示された分子量：１０３４、理論値：１０３４
ヒトインシュリンに対する表題の化合物の親油性は、８．２×１０3であった。
【００４２】
参照
参照物質、For-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys-OHは、Bachem Feinchemikalien AG、スイスから購入し、そのまま用いた。ヒトインシュリンに対する参照物質の親油性は、２．３であった。
【００４３】
実施例２
H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Lys（Ｎεテトラデカノイル）-OHの合成
エンケファリン誘導体、H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Lys（Ｎεテトラデカノイル）-OHは、（A-2435 Bachem Feinchemikalien AG、スイス）から作成された。Boc-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Lys-OHは、実施例１で述べたように、テトラデカノイン酸サクシニミジル−Ｎ−ヒドロキシエステルでアシル化した。反応混合液は、乾燥するまで蒸発させ、残存物をＴＦＡに溶解し、これを乾燥するまで蒸発させ、エタノール／水／０．１％に溶かし込んで実施例１の記述のように逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製した.、収量は、１５ｍｇであった。
【００４４】
ＰＤＭＳで求めた分子量：９０９、理論値：９０７
ヒトインシュリンに対する表題の化合物の親油性は、２．３×１０3であった。
【００４５】
参照
参照物質、H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Lys-OH は、２０ｍｇのBoc-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Lys-OHを２００μｌのＴＦＡに溶かし、乾燥するまで蒸発させることにより、合成した。残存物を５％酢酸に溶解させ、凍結乾燥した。ヒトインシュリンに対する参照物質の親油性は、３．０×１０-3であった。
【００４６】
実施例３
H-Pro-His-Pro-Phe-His-Phe-Phe-Val-Tyr-Lys(Ｎεテトラデカノイル)-OHの合成 
Fmoc- Pro-His-Pro-Phe-His-Phe-Phe-Val-Tyr-Lys-OH （ Bachem Feinchemikalien AG、スイスより入手）は、レニンの強力な阻害剤であり、実施例１で述べたように、テトラデカノイン酸サクシニミジル−Ｎ−ヒドロキシ−エステルと反応させた。アシル化反応後、Ｆｍｏｃ基は、反応混合液に最終濃度２０％になるようにピペリジンを添加して、除去した。表題の化合物は、実施例１に記載したように逆相高速液体クロマトグラフィーで分離した。収量は、２３ｍｇであった。
【００４７】
ＰＤＭＳで求めた分子量：１５２９．６、理論値：１５２９
ヒトインシュリンに対する相対的親油度は、５．３×１０3であった。
【００４８】
参照
参照物質、H-Pro-His-Pro-Phe-His-Phe-Phe-Val-Tyr-Lys-OHは、Fmoc-Pro-His-Pro-Phe-His-Phe-Phe-Val-Tyr-Lys-OH(Bachem Feinchemikalien AG、スイスより入手)から合成した。具体的には、２０ｍｇのFmoc-Pro-His-Pro-Phe-His-Phe-Phe-Val-Tyr-Lys-OHを５００μｌの２０％ビペリジンのＤＭＦ溶液に溶解し、２０分放置した。参照物質は、実施例１に記載したように逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製した。
【００４９】
ヒトインシュリンに対する参照物質の相対的親油度は、２．３×１０2であった。
【００５０】
実施例４
Arg4、Arg9、Lys15（Ｎε-テトラデカノイル）ソマトスタチンの合成
表題の物質は、Saxon Biochemicals GMBH、ハノーバー、ドイツから入手した Fmoc-Arg4、Arg9、Lys15ソマトスタチンから合成した。５０ｍｇのFmoc-Arg4、Arg9、Lys15ソマトスタチンを３４６μｌのＤＭＦと５３．９μｌの４−メチルモルフォリンの混合液に溶かした。混合液を１５℃に冷やし、１００μｌのＤＭＦに溶かした１５．９ｍｇのテトラデカノイン酸サクシニミジル−Ｎ−ヒドロキシ−エステルを添加した。反応は、３時間２０分進行させた後、５％酢酸のＤＭＦ溶液を４１４０μｌ添加して停止させた。表題の化合物は、逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて、以下のように精製した：サンプルは、Lichrosorb RP-18(7μｍ)Merck、ドイツ、Ａｒｔ．９３９４．カラム（１０×２５０ｍｍ）にかけた。カラムは、９０％の緩衝液Ａ（５ｏｍＭ ｔｒｉｓ、７５ｍＭ （ＮＨ4）2ＳＯ4、硫酸でｐＨ７．０に調整、２０％アセトニトリル）と１０％の緩衝液Ｂ（８０％アセトニトリル）の混合液で平衡化されたものである。サンプルをカラムにのせて、流速４ｍｌ／時間、４０℃で緩衝液Ａ中の緩衝液Ｂの濃度を１０％から９０％にする線形勾配で溶出した。表題化合物を含む画分を乾燥するまで蒸発させ、５０％酢酸に溶解し、４℃でBIO GEL P2（BIO RAD、カリフォルニア、アメリカ）カラムを使用したゲル濾過によって脱塩した。希望する産物を含む画分を水で希釈し、凍結乾燥した。収量は、２ｍｇであった。化合物の同定は、ＰＤＭＳにより確認した。
【００５１】
ＰＤＭＳで求めた分子量：２０３３、理論値：２０３２。
【００５２】
豚における延長効果の測定
実施例４の表題ペプチドをボールトンとハンターの試薬（Boulton ＆Hunters'reagent;Boulton、A.E.and Hunter、Ｗ.Ｍ.(1973)）を用いて、以下のように125Ｉでラベルした：
５０ｎｍｏｌのペプチドを１ｍｌのＤＭＳＯに溶解した後、４００μｌのＤＭＦと２μｌのＮ−エチルイソプロピルアミンを添加する。５００μＣｉの放射能を含むボールトンとハンターの試薬に溶液を添加する。反応を２０分間進行させ、エタノールアミンのＤＭＦ溶液１０μｌを加える。得られたポリペプチドを、上述のように流速１ｍｌ／分で、カラム（４×２５０ｍｍ）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーで精製、単離した。
【００５３】
延長効果を測定するために、豚における消失速度を調べ、Ｔ50%を決定した。Ｔ50%、とは、外部のガンマカウンターを用いて測定したとき、注入部位から125Ｉでラベルしたペプチドのうちの５０％が消失する時間である(Ribel、Uら、The Pigas a Model for Subcutaneous Absorption in Man.:M.Serrano-Rios、P.J.Lefebre(Eds):Diabetes 1985;Proceeding of the 12th Congress of the International Diabetes Federation,Madrid 、 Spain 、 1985(Excerpta Medica 、Amseterdam(1986)891-96)。
【００５４】
豚の皮下に注射した125Ｉでラベルしたペプチド誘導体は、Ｔ50%が１．７±０．５時間（ｎ＝４）であったが、テトラデカノイル化されていない125Ｉでラベルしたペプチドでは０．７±０．１時間であった。
【００５５】
参照
125Ｉでラベルした参照ペプチドは、Fmoc-Arg4、Arg9、Lys15ソマトスタチンから合成された。具体的には、２０ｍｇのFmoc-Arg4、Arg9、Lys15ソマトスタチンを１０００μｌの２０％ピペリジン／ＤＭＦに溶解した。２０分後、産物を逆相高速液体クロマトグラフィーで精製、脱塩、凍結乾燥し、実施例４で述べたようにボールトンとハンターの試薬でラベルする。
【００５６】
実施例５
Lys15（Ｎε−テトラデカノイル）心房性ナトリウム利尿ペプチドの合成
ヒト（H-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-Lys（Ｎε-テトラデカノイル）−COOHは、標準的Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成（Methods in Molecular Biology、Vol.35:Peptide syntheis Protocols）により合成した。Ｃ末端のリジンのε−アミノ基は、下記の手順に従ってテトラデカノイン酸サクシニミジル−Ｎ−ヒドロキシ−エステルを用いてアシル化した。合成は、ポリオキシエチレンを植え付けたた低架橋度のポリスチレンをベースとした樹脂（TentaGel Resin）上で、ポリプロピレンの注射器の中で手動でなされた。
【００５７】
手順：
１グラムの樹脂に、３倍等量の酸に弱いであるリンカ−４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸（HMPA）を添加する。活性化試薬として０．５倍等量の4-ジメチルアミノピリジン存在下、３倍等量のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨを第一のアミノ酸として結合させた。保護基であるＦｍｏｃを２０％ピペリジン／ＤＭＦを３０分間作用させて、切断する。他の全てのアミノ酸は、活性化試薬としてＤＩＣとＨＯＢＴを１：１で混合したＤＭＦ溶液を用いて、Ｎα−Ｆｍｏｃで保護したアミノ酸の形で結合させた。アミノ酸のうちシステインは、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨの形で結合させた。システインの保護基をはずし、１０ｍＭヨードのＤＭＦ溶液で２分間処理して酸化した。最後のＦｍｏｃ保護基を除去した後、最後に結合したアミノ酸のＮα基を、５倍等量のジ−ｔｅｒｔ−ブチルジ炭酸と結合させにより、Ｂｏｃ基で保護した。Ｎε−ＬｙｓのＤｄｅ保護基は、２０分間、２％ヒドラジン／ＤＭＦで処理して切断し、遊離のＮε基は、５倍量のテトラデカノイン三サクシニジミルＮ−ヒドロキシエステルを用いて切断した。Ｂｏｃ−、ｔＢｕ保護基、ＨＭＰＡリンカーは、１．５時間、９５％ＴＦＡ、５％水を作用させてアシル化した。ＴＦＡ／水は、減圧下で蒸発させ、ペプチドはジエチルエーテル中でＨＣｌ塩として沈殿させて、１０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．８）から凍結乾燥した。総収量は、３５ｍｇであった。、Ｎ末端の配列決定により、産物は正しい配列をもっていることが示された。
【００５８】
ＰＤＭＳによって示された分子量：３４１７
これは計算で求めた分子量にナトリウムを加えたものに相当する。
【００５９】
実施例６
Lys30（Ｎε−デカノイル）グルカゴン
表題の化合物は、Saxon Biochemicals GMBH、ハノーバー、ドイツに合成を依頼し、購入した。
【００６０】
４．３２ｍｇのLys30（Ｎε−デカノイル）グルカゴン（グルカゴン４ｍｇに相当）を０．９％塩化ナトリウムを添加した１．８ｍＭ塩酸４ｍｌ（ｐＨの測定値は、２．７）に溶解した。得られた溶液を濾過により除菌し、小瓶にうつした。
【００６１】
２群のウサギ（ｎ＝６）に、１匹につき２ＩＵのインシュリン アクトラピッド（Insulin Actrapid）を−６０分に注射した。０分において、グループ１には、ウサギ１匹につきのモル等量のLys30（Ｎε−デカノイル）グルカゴン０．５４ｍｇを皮下に、グループ２には、ウサギ１匹につき０．５ｍｇのグルカゴンを皮下に投与した。血液は、−６０，０，１５，３０，６０，１２０，１８０および２４０分に採取し、グルコース濃度をヘキソキナーゼ法で決定した。得られた血液のグルコース濃度を表にmg glucose/100mlの単位で示した。
【表１】
2007056023.tif 000002
【００６２】
表から明らかなように、グルカゴンの血中グルコースを上昇させる効果が、Lys30（Ｎε−デカノイル）グルカゴンで保持され、作用も延長している。
【外国語明細書】
2007056023000001.pdf