(57)【要約】      （修正有）【課題】複数種のＤＮＡプールから生理活性を有するＤＮＡを効率的に同定する方法を提供する。【解決手段】多種多量のＤＮＡプールが導入されたマウス体内での、特定の生理作用を指標に、ＤＮＡプールを順次分画していくことにより、特定の生理作用を有するＤＮＡを同定する方法。この方法は、従来のトランスジェニックやノックアウトを利用したスクリーニングのような多大な労力や時間を要しないという利点や、例えば生理活性物質を産生する細胞が試験管内や免疫不全動物で増殖させることができない場合や細胞が培養途中で性質が変化して生理活性物質を産生しなくなる場合にも使用可能であるという利点を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性を有するポリペプチドをコードするDNAを同定する方法であって、下記（ａ）から（ｄ）の工程を含む方法。
（ａ）少なくとも２種のポリペプチドをコードするDNAを哺乳動物に導入し、該哺乳動物体内で発現させる工程
（ｂ）該哺乳動物における生理的変化を検出する工程
（ｃ）工程（ｂ）において生理的変化が検出された場合に、工程（ａ）において用いたDNAを分画し、分画されたそれぞれのDNAにつき、工程（ｂ）と同様にして、該哺乳動物における該生理的変化を検出する工程
（ｄ）該哺乳動物に該生理的変化をもたらす分画されたDNAを同定する工程
【請求項２】
さらに、（ｅ）該哺乳動物に該生理的変化をもたらす単一のDNAが同定されるまで、（i）DNAの分画、（ii）分画されたそれぞれのDNAにつき該哺乳動物における該生理的変化の検出、および（iii）該哺乳動物に該生理的変化をもたらす分画されたDNAの同定、を繰り返す工程、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
DNAが哺乳動物の静脈から導入される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
静脈が尾静脈である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物がげっ歯類動物である、１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
工程（ａ）において、少なくとも10種のポリペプチドをコードするDNAを哺乳動物に導入する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
工程（ａ）において、少なくとも100種のポリペプチドをコードするDNAを哺乳動物に導入する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）において、少なくとも1000種のポリペプチドをコードするDNAを哺乳動物に導入する、請求項1または2記載の方法。
【請求項９】
DNAが動物細胞、動物組織、または動物細胞株由来である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項１０】
DNAが癌細胞、癌組織、または癌細胞株由来である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物に対する一回のDNAの総導入量が100μｇ以下である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物に対する一回のDNAの総導入量が10μｇ以下である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
複数の抗原ポリペプチドに対する抗体を同時に作製する方法であって、下記（ａ）から（ｃ）の工程を含む方法。
（ａ）少なくとも２種の抗原ポリペプチドをコードするDNAを哺乳動物に導入し、該哺乳動物体内で発現させ、該抗原ポリペプチドに対して免疫させる工程
（ｂ）該抗原ポリペプチドに対する抗体を選抜する工程
（ｃ）選抜された抗体のハイブリドーマを作製する工程
【請求項１４】
該哺乳動物を免疫するために、それぞれのDNAを繰り返し該哺乳動物に導入する工程を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
抗原ポリペプチドが同じ動物細胞、動物組織、または動物細胞株由来の抗原ポリペプチドである、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
抗原ポリペプチドが同じ癌細胞、癌組織、または癌細胞株由来の抗原ポリペプチドである、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１または２に記載の方法に用いるためのキットであって、ポリペプチドをコードするDNAを哺乳動物体内で発現させるためのベクターを含むキット。
【請求項１８】
ベクターが、挿入されたDNAを哺乳動物で発現させるためにサイトメガロウイルスのエンハンサーおよびニワトリβアクチンプロモーターを含む、請求項８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性を有するポリペプチドをコードするDNAを哺乳動物体内で同定する方法および該同定に用いるためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、組織や細胞から生理活性を有するポリペプチドをコードするDNAを同定するためには、タンパク質の精製という方法が必須であった。また、逆にバイオインフォマティックスによって遺伝子の塩基配列を予想し、実際の機能をノックアウトマウスやトランスジェニックマウスを作製し解析することによって明らかにする方法も考えられる。
【０００３】
しかしながら、例えば、生理活性物質を産生するヒト腫瘍細胞などの一部は、試験管内や免疫不全動物（例えば、ヌードマウスやSCIDマウスなど）で増殖させることができなかったり、あるいは培養途中で細胞の性質が変化して生理活性物質を産生しなくなる場合もあり、そうした場合には従来の方法では生理活性物質の同定ができなかった。
【０００４】
また、多数の遺伝子プールの中から生理活性を持つものを同定する場合、それぞれの遺伝子に対してノックアウト動物やトランスジェニック動物を作成して、生理活性を検出するのは多大な労力と時間を要し、現実的ではない。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、複数種のDNAのプールから、生理活性を有するDNAを効率的に同定する方法および該同定に用いるためのキットを提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決すべく、哺乳動物体内を利用して、複数種のDNAプールの中から特定の生理活性を有するDNAを同定することが可能であるか否かの検討を行った。
【０００６】
具体的には、サイトメガロウイルスのエンハンサーおよびニワトリのβアクチンプロモーターを有し、哺乳動物細胞で挿入遺伝子を強発現させることができるベクターに、EPO遺伝子およびIL-6遺伝子をそれぞれ組み込み、これにより構築されたベクターを空のベクターと伴にマウスの尾静脈より導入し、該マウスにおける、EPOおよびIL-6の効果の検討を行った。  
【０００７】
その結果、驚くべきことに、該マウス体内で、EPOおよびIL-6の作用が互いに干渉しあうことなく、それぞれの作用が独立に検出された。このEPOおよびIL-6の作用は、ベクターのプール中に、EPO遺伝子発現ベクターあるいはIL-6遺伝子発現ベクターに対し、1000倍量の空のベクターが存在する場合でも認められた。
【０００８】
即ち、本発明者らは、多種多量のDNAプールが導入された哺乳動物体内において、特定のDNAの生理作用を独立に検出することが可能であることを見出した。この知見は、哺乳動物体内での特定の生理作用を指標に、多種多量のDNAプールを順次分画していくことにより、特定の生理作用を有するDNAを同定することが可能であることを意味する。このようなスクリーニングは、哺乳動物体内を利用するため、試験管内や免疫不全動物で増殖させることができない細胞や培養途中で性質が変化してしまう細胞が産生する生理活性物質であっても、同定することができるという利点を有する。また、従来のトランスジェニックやノックアウトを利用したスクリーニングのような多大な労力や時間を要しないという点も、このスクリーニングのさらなる利点である。
【０００９】
本発明は、哺乳動物体内（in vivo）において、生理活性を有するDNAを効率的に同定する方法および該同定に用いるためのキットに関し、より詳しくは、
（１）  生理活性を有するポリペプチドをコードするDNAを同定する方法であって、下記（ａ）から（ｄ）の工程を含む方法、
（ａ）少なくとも２種のポリペプチドをコードするDNAを哺乳動物に導入し、該哺乳動物体内で発現させる工程
（ｂ）該哺乳動物における生理的変化を検出する工程
（ｃ）工程（ｂ）において生理的変化が検出された場合に、工程（ａ）において用いたDNAを分画し、分画されたそれぞれのDNAにつき、工程（ｂ）と同様にして、該哺乳動物における該生理的変化を検出する工程
（ｄ）該哺乳動物に該生理的変化をもたらす分画されたDNAを同定する工程
（２）  さらに、（ｅ）該哺乳動物に該生理的変化をもたらす単一のDNAが同定されるまで、（i）DNAの分画、（ii）分画されたそれぞれのDNAにつき該哺乳動物における該生理的変化の検出、および（iii）該哺乳動物に該生理的変化をもたらす分画されたDNAの同定、を繰り返す工程、を含む、（１）に記載の方法、
（３）  DNAが哺乳動物の静脈から導入される、（１）または（２）に記載の方法、
（４）  静脈が尾静脈である、（３）に記載の方法、
（５）  哺乳動物がげっ歯類動物である、（１）から（４）のいずれかに記載の方法、
（６）  工程（ａ）において、少なくとも10種のポリペプチドをコードするDNAを哺乳動物に導入する、（１）または（２）に記載の方法、
（７）  工程（ａ）において、少なくとも100種のポリペプチドをコードするDNAを哺乳動物に導入する、（１）または（２）に記載の方法、
（８）  工程（ａ）において、少なくとも1000種のポリペプチドをコードするDNAを哺乳動物に導入する、（１）または（２）記載の方法、
（９）  DNAが動物細胞、動物組織、または動物細胞株由来である、（１）または（２）に記載の方法、
（１０）  DNAが癌細胞、癌組織、または癌細胞株由来である、（１）または（２）に記載の方法、
（１１）  哺乳動物に対する一回のDNAの総導入量が100μｇ以下である、（１）または（２）に記載の方法、
（１２）  哺乳動物に対する一回のDNAの総導入量が10μｇ以下である、（１）または（２）に記載の方法、
（１３）  複数の抗原ポリペプチドに対する抗体を同時に作製する方法であって、下記（ａ）から（ｃ）の工程を含む方法、
（ａ）少なくとも２種の抗原ポリペプチドをコードするDNAを哺乳動物に導入し、該哺乳動物体内で発現させ、該抗原ポリペプチドに対して免疫させる工程
（ｂ）該抗原ポリペプチドに対する抗体を選抜する工程
（ｃ）選抜された抗体のハイブリドーマを作製する工程
（１４）  該哺乳動物を免疫するために、それぞれのDNAを繰り返し該哺乳動物に導入する工程を含む、（１３）に記載の方法、
（１５）  抗原ポリペプチドが同じ動物細胞、動物組織、または動物細胞株由来の抗原ポリペプチドである、（１２）または（１３）に記載の方法、
（１６）  抗原ポリペプチドが同じ癌細胞、癌組織、または癌細胞株由来の抗原ポリペプチドである、（１２）または（１３）に記載の方法、
（１７）  （１）または（２）に記載の方法に用いるためのキットであって、ポリペプチドをコードするDNAを哺乳動物体内で発現させるためのベクターを含むキット、
（１８）  ベクターが、挿入されたDNAを哺乳動物で発現させるためにサイトメガロウイルスのエンハンサーおよびニワトリβアクチンプロモーターを含む、（８）に記載のキット、
を提供するものである。
【００１０】
本発明は、生理活性を有するポリペプチドをコードするDNAを哺乳動物体内で同定する方法を提供する。
本発明の方法においては、まず、少なくとも２種のポリペプチドをコードするDNAを哺乳動物に導入し、該哺乳動物体内で発現させる（工程（ａ））。
本発明において哺乳動物に導入するためのDNAとしては、特に制限はなく、生理活性を同定することを望む任意のポリペプチドをコードするDNAを用いることができる。例えば、動物細胞、動物組織、または動物細胞株由来のDNAを好適に用いることができる。具体的には、例えば、血液疾患や自己免疫疾患に関連するDNAを同定する場合には、T細胞、血液細胞、または血液幹細胞由来のDNAを用い、また、癌の形成に関与するDNAを同定する場合には、癌細胞、癌組織、または癌細胞株由来のDNAを用いるなど、実験の目的に応じて任意のDNAを用いればよい。
【００１１】
本発明者らにより、異なる生理活性を有するポリペプチドをコードする複数種のDNAが哺乳動物体内で同時に発現した場合でも、それぞれの生理活性を独立に検出することができることが明らかとなった。従って、本発明においては、少なくとも２種のポリペプチドをコードするDNAを哺乳動物に導入することを特徴としている。哺乳動物には、10種以上（例えば、100種以上、1000種以上）のポリペプチドをコードするDNAを導入することができる。
【００１２】
哺乳動物へのDNAの一回投与量は、該DNAの発現産物の生理活性を検出しうる限り、特に制限はないが、好ましくは100μg以下である。本発明においては、哺乳動物に導入する全DNA量が10μgであっても、発現したポリペプチドの生理活性を検出することができたため、10μg以下のDNAの投与も可能である。DNAの哺乳動物への投与は、必要に応じて、複数回行うことができる。
【００１３】
哺乳動物へ導入されるDNAは、通常、哺乳動物細胞用発現ベクターに挿入されている。哺乳動物細胞用発現ベクターとしては、哺乳動物細胞において挿入されたDNAの発現を保証するものであれば特に制限はない。例えば、ニワトリβアクチンプロモーターを使用するベクター（例えば、pCAGGS；Niwa H. et al., Gene 108: 193-200(1991)）、CMVプロモーターを使用するベクター（例えば、pCMV-Script；STRATAGENE）、pcDNA3.1/His；Invitrogen）、EF-1αプロモーターを使用するベクター（例えば、pEF1/His；Invitrogen）、SRαプロモーターを使用するベクター（例えば、pME18SFL3；Maruyama K & Sugano S. Gene 138, 171 (1994))を用いることができる。サイトメガロウイルスのエンハンサーおよびニワトリβアクチンプロモーターを含むpCAGGSは、本発明において特に好適に用いることができる。哺乳動物細胞用発現ベクターを哺乳動物に導入する際に、該ベクターをポリマー、リポソーム、あるいはPEI（polyethylenimine）などと混合させることにより、DNAの発現効率を向上させることも可能である。また、哺乳動物細胞用発現ベクターに代えて、例えば、既知のレトロウイルスベクターやアデノウイルスベクターに代表するウイルスベクターを利用することも可能である。
【００１４】
本発明の方法に用いる哺乳動物としては、特に制限はなく、例えば、ラットやマウスなどのげっ歯類を好適に用いることができる。哺乳動物へのDNAの導入は、例えば、静脈投与、筋肉内投与、経口投与、皮下若しくは皮内投与、経鼻投与、肝臓若しくは心臓への直接的な臓器投与など、種々の方法が利用可能である。マウスやラットなどのげっ歯類を用いる場合には、尾静脈投与が好適である。投与の際にGene Gun(Bio-Rad社)を用いたり、電気的な刺激をかけることによって、発現効率が向上させ得る。
【００１５】
本発明の方法においては、次いで、該哺乳動物における生理的変化を検出する（工程（ｂ））。
検出すべき生理的変化としては制限はないが、例えば、血液細胞の変化（例えば、赤血球数、白血球数、血小板数などの変化）、血液の生化学値の変化（例えば、GOTやGTPの数値、グルコース、カルシウム、リンなどの量の変化）、尿中の尿素量の変化などを例示することができる。目的の生理的変化は、予め実験者らにより設定されていてもよい。また、哺乳動物へのDNAの導入後に、興味ある生理的変化を見出してもよい。
【００１６】
本発明の方法においては、次いで、工程（ｂ）において生理的変化が検出された場合に、工程（ａ）において用いたDNAを分画し、分画されたそれぞれのDNAにつき該哺乳動物における該生理的変化を検出する（工程（ｃ））。
本工程は、例えば、以下のようにして行うことができる。哺乳動物体内へ導入するDNAのライブラリーが大腸菌を宿主として構築されている場合、まず、生理活性が検出されたDNA分画に対応する大腸菌のプールを特定し、このプールをプレートにまき、個々の大腸菌をクローン化する。クローン化した大腸菌を分画し、それぞれの大腸菌の分画からDNA（ベクター）を調製する。このようにして調製されたDNA分画をそれぞれ哺乳動物に導入し、目的の生理的変化を検出する。
【００１７】
本発明の方法においては、次いで、該哺乳動物に該生理的変化をもたらす分画されたDNAを同定する（工程（ｄ））。
この工程において同定されたDNA分画に複数種のDNAが含まれている場合には、必要に応じて、さらに、該哺乳動物に該生理的変化をもたらす単一のDNAが同定されるまで、（i）さらなるDNAの分画、（ii）分画されたそれぞれのDNAが該哺乳動物における該生理的変化をもたらすか否かの検出、および（iii）該哺乳動物に該生理的変化をもたらすDNAの同定、を繰り返すことができる（工程（ｅ））。同定されたDNAは、その後の実験の必要に応じて、塩基配列を決定してもよい。
【００１８】
また、本発明は、上記同定に用いるためのキットであって、ポリペプチドをコードするDNAを哺乳動物体内で発現させるためのベクターを含むキットを提供する。ベクターは、哺乳動物体内で挿入されたDNAの発現を保障するものであれば特に制限はない。サイトメガロウイルスのエンハンサーおよびニワトリβアクチンプロモーターを含むベクターは好適な一例である。
【００１９】
本発明を応用すれば、複数の抗原ポリペプチドに対する抗体を同時に作製することができる。即ち、本発明は、複数の抗原ポリペプチドに対する抗体を同時に作製する方法であって、（ａ）少なくとも２種の抗原ポリペプチドをコードするDNAを哺乳動物に導入し、該哺乳動物体内で発現させ、該抗原ポリペプチドに対して免疫させる工程、（ｂ）該抗原ポリペプチドに対する抗体を選抜する工程、（ｃ）選抜された抗体のハイブリドーマを作製する工程、を含む方法を提供する。
【００２０】
この方法は、モノクローナル抗体の作製（G. K・hlerとC. Milsteinらの方法）に準じて、例えば、以下のように実施すればよい。少なくとも２種の抗原ポリペプチドをコードするDNAが導入されたマウスの脾臓を摘出して細胞浮遊液を作る。
例えば、血液疾患や自己免疫疾患の治療に用いる抗体を作成することを望む場合には、T細胞、血液細胞、または血液幹細胞由来の抗原を用い、また、抗癌活性を有する抗体を作成することを望む場合には、癌細胞、癌組織、または癌細胞株由来の複数種の抗原をコードするDNAを用いるなど、実験の目的に応じて任意の抗原をコードするDNAを用いればよい。抗原は、好ましくは同一の細胞、組織、または細胞株由来である。マウスへのDNAの導入は、効果的な免疫応答を誘導するために、繰り返し行うことが好ましい。得られた脾細胞と培養骨髄腫細胞（例えば、P3 X 63-Ag8・U1など）とをポリエチレングリコールを用いて融合させ、HAT培地を含む培地中で培養する。培養中に生き残った細胞を、最終的に限界希釈によってクローン化し、抗体産生ハイブリドーマライブラリーとする。このハイブリドーマライブラリーに抗体を産生させ回収することにより、複数の抗原ポリペプチドに対する抗体を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
[実施例１]   マウス体内を利用したDNAのスクリーニング法
機能未知の遺伝子100あるいは1000プールを一度にマウスに導入し、何らかの生理作用が観察されたときに、このプールを小分けにし再導入することを繰り返すことで、生理活性を有する遺伝子にたどりつく方法を検討した。
この方法は宮崎ら(Niwa H. et al., Gene 108: 193-200, 1991)が開発したpCAGGSベクターを用いて、マウスの生体内で遺伝子を過剰に発現させる方法である。pCAGGSベクターは、サイトメガロウイルスのエンハンサーに、ニワトリのβアクチンプロモーターを組み合わせており、哺乳動物の細胞でベクターに挿入された遺伝子を強く発現させることができる。本発明者らは、発現させたい遺伝子をベクターに組み込み、in vivo遺伝子導入キット（商品名TransIt In Vivo Gene Delivery System,TAKARA社）の溶液に懸濁させ、マウスの尾静脈から投与した。
【００２２】
（１）マウス体内でのDNAの発現の検討
GFPを組み込んだベクターを投与すると（通常、10μgのベクターを1匹のマウスに投与している）、投与6日後にマウスの肝臓でGFPの強い発現が確認できた。同様に、マウスEPO、あるいはマウスIL-6を組み込んだベクターを投与することによって、血液中にこれらのサイトカインが検出され（図１）、また肝臓ではこれらのサイトカインのmRNAの発現が確認できた（図２）。
【００２３】
（２）スクリーニングへの応用
遺伝子のスクリーニングに際しては、遺伝子を挿入したベクター(クローン)1つ1つを、マウス1匹ずつ投与することは、数をこなさなければならないスクリーニングとしては、時間的・労力的に現実的ではない。従ってスクリーニングには、少なくとも100個（種類）のベクターを混ぜて、1匹のマウスに投与してもそのうちの1つのベクターの効果を見いだせる必要があると考えられた。そこで、どの程度までDNAが薄まっても（すなわち目的の遺伝子以外のベクターが過剰に混ざった状態でも）、その遺伝子の効果が見いだされるか否かを、IL-6とEPOのベクターを混ぜて検討を行うことにした。実験系は次の通りである（表１）。
【００２４】
【表１】
2007267743.tif 000002
【００２５】
1群にICR 12週令のオス n=4 or 5を用いて、投与翌日（day1）と、一週間後（day7）にサンプリングを行った。以下に表示してあるクローン数とは、スクリーニングの際の想定ミックスクローン数を示している。例えば、群2では全体のDNAの1/1000を、EPO、あるいはIL-6のベクターが占める。従って、この場合においても、なおEPO、あるいはIL-6の効果が見られたとき、１クローンあたり0.1μgあれば、十分効果を見いだせる可能性があるということになる。しかも目的のベクター以外のものが、例え99.8μg存在しても（すなわち、1000個のベクターが混ざっていても）、雑多なものに邪魔されることなく、目的の遺伝子の効果が認められるということになる。
【００２６】
群1はDNAが投与されたときのバックグラウンドの影響を調べるもの。群4は通常のEPOやIL-6のベクターを単独でマウスに投与していた用量であるが、EPOやIL-6のベクターを混ぜると単独では見られなかった効果や、あるいはそれぞれの効果を相殺する可能性があるので、それらを確認するためのものである。群5は投与するDNAの全量（10μg）を通常マウスに投与している量にあわせたコントロールで、群6は目的以外の蛋白質が多く発現した時（この場合GFP）の影響を想定したコントロールである。群7は未処置のマウスのコントロールである。
【００２７】
結果を図３および図４に示す。それぞれのベクターを10μg投与した検討（図１）によると、day7でEPOベクター投与群は赤血球数の増加が認められ、IL-6ベクター投与群は体重減少（IL-6はcachexiaの一因子）が顕著に認められることが明らかになっている。これらを遺伝子の効果の指標にして、データを解釈すると以下のようになる。
【００２８】
通常行われる機能未知の遺伝子のスクリーニングで想定される群3の100クローンプール分（CAG 98μg, EPO 1μg,IL-6 1μg ）で、コントロール群（群1）に比してHCT値が顕著に増加しており、また体重増加も抑制される傾向にあった。また、群5（CAG 9.8μg, EPO 0.1μg, IL-6 0.1μg ）でも、ほとんど同じ程度の効果が見られることから、全DNA量を10μgにして、１クローン当たり0.1μgに減量することも可能であることが明らかになった。
【００２９】
以上のことから、多種の遺伝子プールを一度に導入しても、互いに干渉しあうことなく、それぞれの作用が検出できることが確認され、さらにターゲットとする遺伝子の効果を反映する系さえあれば、本方法によるin vivoスクリーニングは、例え1,000クローンプールでも機能するものと考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
これまでは活性物質（タンパク質）を、例えば産生する細胞の培養上清から精製するという方法が一般的であった。配列が既知で機能が未知の遺伝子ならば、CHO細胞などでリコンビナントタンパク質を調製し、それをマウスなどの動物に免疫することで抗体も作製できる。そうして作製したリコンビナントタンパク質と抗体を組み合わせることで、その遺伝子の機能解析を行うことができる。また、コンピューター上で遺伝子の配列を予想し、それを利用してその遺伝子のトランスジェニック動物を作製し機能解析に利用することもできる。最近では、一連のSaturation Mutagenesisの手法によって、変異マウスのライブラリーを作製し、例えば目的の病態を示すマウスからその原因遺伝子（変異）を同定することも可能になってきた。しかし、こうした方法はいずれもタンパク質の精製や、抗体や動物の作製などの過程において、多大な労力と時間がかかってきた。また、DNAチップなどを利用することによって、ある細胞特異的に発現する遺伝子を決定することは可能であるものの、発現情報のみでは機能解析の標的や創薬の標的として絞り込むことは困難であった。本発明の方法は、特に（１）in vitroで適当な評価系がなく、in vivoでしか有効な評価系がない場合、（２）活性物質を産生する細胞や組織が限られている場合や、継代によって活性がなくなる恐れがある場合にも有効で、しかも従来の方法に比べて、例えばタンパク質の精製や動物の作製などの過程を省けることで、迅速にその機能遺伝子を単離することが可能である。また、本方法を繰り返すことによって、複数の抗原に対する抗体を一時に取得できると考えられるので、例えば癌細胞が発現する遺伝子プールを繰り返し導入することで、癌に対する抗体ライブラリーを作製することも可能である。従って、その中から癌細胞に対して有効な抗体を選別し、その抗体が結合する抗原を同定することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、マウスに導入した遺伝子の発現効果を示すグラフである。
【図２】図２は、マウス肝臓における導入遺伝子の発現を示す写真である。6μg polyA+RNAをノーザンブロットに使用した。
【図３】図３は、マウス体内で発現したEPOの効果を示すグラフである。
【図４】図４は、マウス体内で発現したIL-6の効果を示すグラフである。
【図１】
2007267743.tif 000003
【図２】
2007267743.tif 000004
【図３】
2007267743.tif 000005
【図４】
2007267743.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月23日(2007.5.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の抗原ポリペプチドに対する抗体を同時に作製する方法であって、下記（ａ）から（ｃ）の工程を含む方法。
（ａ）少なくとも２種の抗原ポリペプチドをコードするDNAを非ヒト哺乳動物に導入し、該非ヒト哺乳動物体内で発現させ、該抗原ポリペプチドに対して免疫させる工程
（ｂ）該抗原ポリペプチドに対する抗体を選抜する工程
（ｃ）選抜された抗体のハイブリドーマを作製する工程
【請求項２】
該非ヒト哺乳動物を免疫するために、それぞれのDNAを繰り返し該非ヒト哺乳動物に導入する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗原ポリペプチドが同じ動物細胞、動物組織、または動物細胞株由来の抗原ポリペプチドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
抗原ポリペプチドが同じ癌細胞、癌組織、または癌細胞株由来の抗原ポリペプチドである、請求項１または２に記載の方法。