(57)【要約】【課題】アポトーシスを誘導すること無しに、かつ、免疫抑制を惹き起こすこと無しに、滑膜細胞の増殖を抑制可能な滑膜細胞増殖抑制剤、並びに、滑膜細胞増殖が関与する疾患を治療又は予防可能な薬用組成物及び治療方法を提供すること。【解決手段】下記構造式（Ａ）で表される化合物、及びその医薬的に許容される塩の少なくともいずれかを有効成分として含有することを特徴とする滑膜細胞増殖抑制剤、前記滑膜細胞増殖抑制剤を含む薬用組成物、及び、前記滑膜細胞増殖抑制剤を用いた治療方法である。【化５】2007326824.tif 000006【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式（Ａ）で表される化合物、及びその医薬的に許容される塩の少なくともいずれかを有効成分として含有することを特徴とする滑膜細胞増殖抑制剤。
【化１】
2007326824.tif 000005
【請求項２】
請求項１に記載の滑膜細胞増殖抑制剤を含むことを特徴とする薬用組成物。
【請求項３】
抗関節リウマチ剤、抗変形性関節症剤、抗乾癬性関節炎剤、及び抗痛風剤の少なくともいずれかである請求項２に記載の薬用組成物。
【請求項４】
関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、及び痛風の少なくともいずれかの治療に用いられる請求項２から３のいずれかに記載の薬用組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の滑膜細胞増殖抑制剤及び請求項２から４のいずれかに記載の薬用組成物の少なくともいずれかを投与し、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、及び痛風の少なくともいずれかを治療することを特徴とする治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、後述する構造式（Ａ）で表される化合物、及びその医薬的に許容される塩の少なくともいずれかを有効成分として含有した滑膜細胞増殖抑制剤、前記滑膜細胞増殖抑制剤を含む薬用組成物、並びに、前記滑膜細胞増殖抑制剤を用いた治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節滑膜は、元来、一層の滑膜細胞からなるが、何らかの炎症機転によって滑膜細胞が過度に増殖し、滑膜増生を来すことがある。
増生した滑膜では滑膜細胞が活性化し、該滑膜細胞から様々な炎症性メディエーターや、組織破壊性タンパク質分解酵素が産生される。この一連の炎症反応は、増殖性滑膜炎と称され、該増殖性滑膜炎の結果、軟骨変性や骨組織破壊等の重大な機能障害がもたらされる。このような滑膜細胞の増殖がその病態に関与する疾患としては、例えば、関節リウマチ、変形骨関節症、乾癬性関節炎、及び痛風などが知られている。
【０００３】
前記関節リウマチは、自己免疫疾患のひとつで、リンパ球等からの炎症性メディエーター（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α等）が関節近傍において過剰に存在することにより、組織の炎症や骨破壊が進行し、病態が現れる疾患である。その病因のひとつとして、前記滑膜細胞の増殖が挙げられているが、その病因は複数存在すると考えられているため、多面的な治療方法が求められており、複数の戦略での治療薬の開発が望まれている。
【０００４】
従来、関節リウマチの治療方法としては、鎮痛剤及び抗炎症剤の投与による対症療法が行われてきたが、対症療法では、発症を遅延させることは可能であっても、症状の進行を停止し、更には疾患自体を治癒させることは不可能であった。
これに対し、近年、元来抗癌剤として用いられていた薬剤の一部がリンパ球増殖抑制剤としても効果があることに基づき、これらを投与することにより、更には抗ＴＮＦ−α抗体を併用して治療を行うことにより、炎症が治まり、場合によっては疾患の進行が停止し、疾患の改善率や治癒率が上昇することが報告されている。
しかしながら、これらの薬剤の投与は、治療効果が高い一方で、リンパ球増殖抑制による免疫抑制効果も高いため、投与された患者は常に免疫抑制状態となり、感染等に極めて弱い状況となるという問題がある。
【０００５】
前記抗癌剤、抗ＴＮＦ−α抗体の他、炎症を抑えることにより関節リウマチを治療する薬剤は複数存在するが、例えば、特定の患者には非常に有効であっても、他の患者には効果が低いという薬剤も多く、汎用性が高く、かつ完全な治癒効果を示す薬剤は未だ知られていない。
【０００６】
一方、関節リウマチの治療薬のひとつとして、その病因のひとつである前記滑膜細胞の増殖を抑制する薬剤（滑膜細胞増殖抑制剤）が提案されている。
前記滑膜細胞増殖抑制剤としては、例えば、滑膜細胞のアポトーシスを誘導することにより滑膜細胞の増殖を抑制するものとして、ジテルペン化合物（特許文献１参照）、ＦＡＤＤ遺伝子（特許文献２参照）、Ｆａｓリガンド（特許文献３参照）、抗Ｆａｓ抗体（特許文献４参照）、３，６−アンヒドロガラクトース及びその誘導体（特許文献５参照）等、滑膜細胞とコラーゲンとの接着阻害により滑膜細胞の増殖を抑制するものとして、イミダゾール誘導体（特許文献６参照）、キノリン誘導体及びキノロン誘導体（特許文献７参照）等が提案されている。これらの他にも、前記滑膜細胞増殖抑制剤として、ヒアルロン酸と亜鉛の会合物（特許文献８参照）、キノロンカルボン酸誘導体（特許文献９参照）、乳ホエータンパク中の物質（特許文献１０参照）、ｂＦＧＦアンタゴニスト（特許文献１１参照）、ＩＬ−６アンタゴニスト（特許文献１２参照）、ｃＡＭＰ誘導体（特許文献１３参照）、ビタミンＤ３及びその誘導体（特許文献１４参照）、ｃ−ｅｒｂＢ−２活性阻害剤（特許文献１５参照）、γ−セクレターゼ様プロテアーゼ阻害剤（特許文献１６）等が提案されている。
【０００７】
これらの滑膜細胞増殖抑制剤は、関節リウマチのみならず、変形性関節症、乾癬性関節炎、及び痛風等の滑膜細胞の増殖が関与する疾患の発症予防、症状の軽減、重篤化の抑制のための有用物質として期待される。
しかしながら、アポトーシスを誘導すること無しに、即ち、より安全に滑膜細胞の増殖を抑制可能な滑膜細胞増殖抑制剤、並びに、免疫抑制を惹き起こすこと無しに、即ち、感染症等に対する患者の抵抗性を低下させること無しに、滑膜細胞増殖が関与する疾患を治療又は予防可能な薬用組成物及び治療方法は、未だ見出されていないのが現状である。
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−１６８７１３号公報
【特許文献２】特開２０００−１９８７３７号公報
【特許文献３】特開平１１−０６０５０１号公報
【特許文献４】特開平０８−２０８５１５号公報
【特許文献５】ＷＯ９９／０６４４２４号公報
【特許文献６】特開２００３−０４０８８８号公報
【特許文献７】特開２００２−３７１０７８号公報
【特許文献８】特開２００３−０８９６４７号公報
【特許文献９】特開２００２−２９３７４５号公報
【特許文献１０】特開２００１−０１１０９４号公報
【特許文献１１】特開２０００−２２９８８３号公報
【特許文献１２】特開平０８−２０８５１４号公報
【特許文献１３】特開平０７−３２４０３５号公報
【特許文献１４】特開平０７−１４５０６２号公報
【特許文献１５】ＷＯ０１／０７６６３０号公報
【特許文献１６】ＷＯ０１／０７２３２１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、アポトーシスを誘導すること無しに、かつ、免疫抑制を惹き起こすこと無しに、滑膜細胞の増殖を抑制可能な滑膜細胞増殖抑制剤、並びに、滑膜細胞増殖が関与する疾患を治療又は予防可能な薬用組成物及び治療方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するために本発明者らは鋭意検討した結果、以下の知見を得た。即ち、後述する構造式（Ａ）で表される化合物（Ｎ−｛５−［２−（ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｏｘｙ）−６−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ］−１，３−ｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ｝−５−［（４−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］−２−ｐｙｒａｚｉｎａｍｉｎｅ；本明細書中において、「化合物Ａ」と称することがある）が、滑膜細胞増殖に対して強い抑制作用を有する一方で、アポトーシスを誘導せず、かつ、リンパ球活性等の免疫作用にも影響を与えないという知見である。
前記化合物Ａは、例えばＷＯ２００６／００８８７４号公報に開示されているアミノチアゾール骨格含有化合物であり、例えば前記公報には、前記化合物がＣＤＫ４／６に対して選択的に阻害活性を有していることや、臨床分離癌細胞の細胞増殖に対して抑制作用を有していること等が開示されている。
しかしながら、前記化合物Ａが、アポトーシスを誘導せず、かつ、リンパ球活性等の免疫作用を抑制することも無しに、滑膜細胞の増殖を抑制可能であることは従来全く知られておらず、本発明者らの新たな知見である。
【００１１】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  下記構造式（Ａ）で表される化合物、及びその医薬的に許容される塩の少なくともいずれかを有効成分として含有することを特徴とする滑膜細胞増殖抑制剤である。
【化２】
2007326824.tif 000002
＜２＞  前記＜１＞に記載の滑膜細胞増殖抑制剤を含むことを特徴とする薬用組成物である。
＜３＞  抗関節リウマチ剤、抗変形性関節症剤、抗乾癬性関節炎剤、及び抗痛風剤の少なくともいずれかである前記＜２＞に記載の薬用組成物である。
＜４＞  関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、及び痛風の少なくともいずれかの治療に用いられる前記＜２＞から＜３＞のいずれかに記載の薬用組成物である。
＜５＞  前記＜１＞に記載の滑膜細胞増殖抑制剤を投与し、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、及び痛風の少なくともいずれかを治療することを特徴とする治療方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、従来における諸問題を解決することができ、アポトーシスを誘導すること無しに、かつ、免疫抑制を惹き起こすこと無しに、滑膜細胞の増殖を抑制可能な滑膜細胞増殖抑制剤、並びに、滑膜細胞増殖が関与する疾患を治療又は予防可能な薬用組成物及び治療方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（滑膜細胞増殖抑制剤）
本発明の滑膜細胞増殖抑制剤は、下記構造式（Ａ）で表される化合物（Ｎ−｛５−［２−（ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｏｘｙ）−６−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ］−１，３−ｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ｝−５−［（４−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］−２−ｐｙｒａｚｉｎａｍｉｎｅ；本明細書中において、「化合物Ａ」と称することがある）、及びその医薬的に許容される塩の少なくともいずれかを有効成分として含有し、必要に応じて更にその他の成分を含有する。
【化３】
2007326824.tif 000003
【００１４】
前記塩としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、無機塩及び有機塩のいずれかが挙げられ、より具体的には、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩などが挙げられる。
【００１５】
−化合物Ａ−
前記構造式（Ａ）で表される化合物（化合物Ａ）の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＷＯ２００６／００８８７４号公報に記載の方法を参照して製造することができる。
前記滑膜細胞増殖抑制剤中の前記化合物Ａの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、また、前記滑膜細胞増殖抑制剤は前記化合物Ａそのものであってもよい。
【００１６】
−その他の成分−
前記その他の成分としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記化合物Ａを溶解、希釈等するための、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、クエン酸バッファーなどが挙げられる。また、前記滑膜細胞増殖抑制剤中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００１７】
−滑膜細胞−
前記滑膜細胞増殖抑制剤の対象となる前記滑膜細胞としては、滑膜組織由来の増殖可能な細胞であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、滑膜線維芽細胞などが挙げられる。前記滑膜細胞は、生体内の細胞であってもよいし、体外培養細胞であってもよい。また、前記滑膜細胞の由来動物種としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サルなどが挙げられる。また、前記滑膜細胞は、例えば、滑膜細胞の増殖を伴う関節炎を患った患者や、滑膜細胞の増殖を伴う関節炎を誘発された実験用モデル動物等から採取することも可能である。
【００１８】
前記滑膜細胞増殖抑制剤は、アポトーシスを誘導すること無しに、前記滑膜細胞の増殖を抑制可能であり、このため、前記滑膜細胞増殖剤は安全性が高く、副作用無しに、滑膜細胞の増殖がその病態に関与する疾患を治療又は予防することができる。
前記滑膜細胞増殖抑制剤が前記滑膜細胞の増殖を抑制可能であることは、例えば、ＢｒｄＵ取り込み量測定、フローサイトメトリー等の公知の細胞増殖分析方法、細胞周期分析方法を用いて確認することができる。また、前記滑膜細胞増殖抑制剤がアポトーシスを誘導しないことについても、例えば、ＳｕｂＧ１解析、ＴＵＮＥＬ解析、アガロースゲル電気泳動法等の公知のアポトーシス検出方法を用いて確認することができる。
【００１９】
また、前記滑膜細胞増殖抑制剤は、リンパ球活性等の免疫作用を抑制すること無しに、前記滑膜細胞の増殖を抑制可能であり、このために、前記滑膜細胞増殖抑制剤は患者の免疫力低下を惹き起こすことなく、滑膜細胞の増殖がその病態に関与する疾患を治療又は予防することができる。
前記滑膜細胞増殖抑制剤が免疫作用を抑制しないことは、例えば、リンパ球数測定等の公知の免疫活性測定手法を用いて確認することができる。
【００２０】
また、前記滑膜細胞増殖抑制剤の有効成分（前記化合物Ａ）はペプチド医薬等に比べて分子量が小さいため、例えば、生体に投与した場合、標的となる滑膜増生を生じた部位へ移行し易い点で、有利である。
前記滑膜細胞増殖抑制剤は、例えば、後述する本発明の薬用組成物、後述する本発明の治療方法などに好適に使用可能である。
【００２１】
（薬用組成物）
本発明の薬用組成物は、本発明の前記滑膜細胞増殖抑制剤を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００２２】
前記薬用組成物中の、前記滑膜細胞増殖抑制剤の含有量としては、特に制限はなく、例えば、後述する前記薬用組成物の剤型や、投与対象である患者の症状の程度等に応じて適宜選択することができる。
【００２３】
−その他の成分−
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。また、前記担体としても、特に制限はなく、例えば、前記薬用組成物の剤型等に応じて適宜選択することができる。
前記薬用組成物中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、例えば、後述する前記薬用組成物の剤型等に応じて、適宜選択することができる。
【００２４】
−剤型−
前記薬用組成物の剤型としては、特に制限はなく、所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、坐剤、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤などが挙げられる。これらの中でも、前記剤型としては、経口固形剤、経口液剤、及び注射剤が好ましい。
【００２５】
前記経口固形剤としては、例えば、前記滑膜細胞増殖抑制剤に、賦形剤、更には必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記賦形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。
また、前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられ、前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられ、前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられ、前記着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられ、前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
【００２６】
前記経口液剤としては、例えば、前記滑膜細胞増殖抑制剤に、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられ、前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられ、前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。
【００２７】
前記注射剤としては、例えば、前記滑膜細胞増殖抑制剤に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。
前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
【００２８】
前記坐剤としては、例えば、前記滑膜細胞増殖抑制剤に、ポリエチレングリコール、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセリド等の公知の坐剤製剤用担体と、必要に応じてツイーン（ＴＷＥＥＮ：登録商標）等の界面活性剤などを加えた後、常法により製造することができる。
【００２９】
前記軟膏剤としては、例えば、前記滑膜細胞増殖抑制剤に、公知の基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等を配合し、常法により混合し、製造することができる。
前記基剤としては、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィンなどが挙げられる。前記保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピルなどが挙げられる。
【００３０】
前記貼付剤としては、例えば、公知の支持体に前記軟膏剤としてのクリーム剤、ゲル剤、ペースト剤等を、常法により塗布し、製造することができる。前記支持体としては、例えば、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布、軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルム、発泡体シートなどが挙げられる。
【００３１】
−用途−
前記薬用組成物は、例えば、前記滑膜細胞の増殖がその病態に関与する疾患の治療又は予防剤として好適であり、前記疾患としては、例えば、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、痛風などが好適に挙げられる。また、前記薬用組成物は、例えば後述する本発明の治療方法などに好適に使用可能である。
【００３２】
（治療方法）
本発明の治療方法は、前記滑膜細胞増殖抑制剤及び前記薬用組成物の少なくともいずれか（前記滑膜細胞増殖抑制剤及び／又は前記薬用組成物）を投与することを含み、更に必要に応じて適宜その他の工程を含み、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、及び痛風の少なくともいずれかを治療することを特徴とする。
【００３３】
−投与−
前記滑膜細胞増殖抑制剤及び／又は前記薬用組成物の投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サルなどが挙げられる。
また、前記滑膜細胞増殖抑制剤及び／又は前記薬用組成物の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記薬用組成物の剤型等に応じて適宜選択することができる。
また、前記滑膜細胞増殖抑制剤及び／又は前記薬用組成物の投与量としては、投与対象である患者の年齢、体重、性別、症状等に応じて適宜選択することができる。例えば、前記薬用組成物が経口剤（経口固形剤、経口液剤）の場合、成人１日あたり、有効成分である前記化合物Ａの量として、１０〜２０ｇが好ましい。また、前記薬用組成物が注射剤の場合、成人１日あたり、有効成分である前記化合物Ａの量として、１〜２ｇが好ましい。
また、前記滑膜細胞増殖抑制剤及び／又は前記薬用組成物の投与頻度としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記１日あたりの投与量を、１日に１回で投与してもよいし、複数回（例えば２〜４回程度）に分けて投与してもよい。
【００３４】
また、前記滑膜細胞増殖抑制剤及び／又は前記薬用組成物の投与時期としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記疾患の発症前に投与されてもよいし、発症後に投与されてもよい。前記滑膜細胞増殖抑制剤及び／又は前記薬用組成物は、発症前の投与、及び発症後の投与のいずれにおいても滑膜細胞増殖抑制効果を奏することができる。
【００３５】
−その他の工程−
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、従来公知の他の抗関節リウマチ剤、抗変形性関節症剤、抗乾癬性関節炎剤、抗痛風剤等を投与する工程などが挙げられる。即ち、前記滑膜細胞増殖抑制剤及び／又は前記薬用組成物は、単独でも優れた治療又は予防効果を奏するが、前記したような従来公知の他の薬剤との併用も可能である。
【００３６】
（効果）
本発明の滑膜細胞増殖抑制剤及び薬用組成物は、アポトーシスを誘導すること無しに滑膜細胞増殖を抑制可能であり、また、免疫活性を抑制すること無しに、滑膜細胞増殖が病態に関与する疾患を治療又は予防することができるので、安全性が高く副作用の少ない、かつ、患者の免疫力低下を惹き起こすことの無い抗関節リウマチ剤、抗変形性関節症剤、抗乾癬性関節炎剤、抗痛風剤等として有用である。また、本発明の治療方法によれば、前記滑膜細胞増殖抑制剤及び／又は前記薬用組成物を投与することにより、患者の免疫力を低下させること無しに、かつ安全に、滑膜細胞増殖が病態に関与する疾患の治療又は予防を行うことが可能となる。
本発明の滑膜細胞増殖抑制剤及び薬用組成物は、前記したように、免疫反応を抑制すること無しに滑膜細胞増殖を直接的に阻害することが可能であるため、例えば、リンパ球の活性化とは独立して起こる関節炎を治療するのに有効であると考えられる。また、現在一般に提供されている抗リウマチ薬のほとんどは免疫反応の阻害を対象としたものであるのに対し、本発明の滑膜細胞増殖抑制剤及び薬用組成物は、免疫反応の阻害無しに滑膜細胞増殖を阻害するという、異なる側面からの治療又は予防が可能であることから、本発明の滑膜細胞増殖抑制剤及び／又は薬用組成物と、従来の抗リウマチ薬との併用による、相乗的な治療又は予防効果も期待される。
【実施例】
【００３７】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００３８】
＜化合物Ａの調製＞
下記構造式（Ａ）で表される化合物（Ｎ−｛５−［２−（ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｏｘｙ）−６−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ］−１，３−ｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ｝−５−［（４−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］−２−ｐｙｒａｚｉｎａｍｉｎｅ；本明細書中において、「化合物Ａ」と称することがある）を萬有製薬株式会社より入手し、溶解バッファー（５％グルコース含有１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸バッファー（ｐＨ４））で溶解した。これを本発明の滑膜細胞増殖抑制剤又は薬用組成物として、以下の各実施例で使用した。なお、前記化合物Ａの濃度は各実施例に記載する通りとし、必要に応じて、ＤＭＳＯで希釈し、所望の濃度に調製して使用した。
【化４】
2007326824.tif 000004
【００３９】
（実施例１）
＜滑膜線維芽細胞増殖に対する抑制作用＞
実施例１では、化合物Ａがヒト及びマウスの滑膜線維芽細胞の増殖及び細胞周期進行に及ぼす影響を評価した。
【００４０】
−滑膜線維芽細胞の調製−
ヒトのリウマチ様滑膜線維芽細胞（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：ＲＳＦ）は、東京医科歯科大学病院又は国立病院機構下志津病院で関節全置換術又は滑膜切除術を受けた関節リウマチ（ＲＡ）患者の滑膜組織から採取し、調製した。患者らの関節リウマチ（ＲＡ）は米国リウマチ学会の基準（Ａｒｎｅｔｔら；Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．１９８８；３１：３１５−３２４参照）に従い診断した。また、手術前に患者からの同意を得た。なお、本実施例における全ての実験手段は、理化学研究所及び東京医科歯科大学の倫理委員会により承認済である。
また、マウスの滑膜線維芽細胞（ｍｏｕｓｅ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：ＭＳＦ）は、ＩＩ型コラーゲンで免疫され関節炎を誘発されたＣＩＡマウス（後述、実施例２参照）の膝関節滑膜組織から採取し、調製した（Ａｂａｄら；Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００１；１６７（６）：３１８２−３１８９参照）。
前記ＲＳＦ及びＭＳＦはそれぞれ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及び１０％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ社）を添加したＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ社）中で培養した。
【００４１】
−増殖分析−
前記ＲＳＦ及びＭＳＦの増殖分析を、ＢｒｄＵ取り込みにより行った。前記ＲＳＦ及びＭＳＦをそれぞれ、９６ウェルプレート中に２〜５，０００細胞／ウェルで播き、一晩培養した後、１０μｇ／ＬのＩＬ−１β及び１０μｇ／ＬのＴＮＦαを用いて２４時間、サイトカイン刺激した。なお、ヒト及びマウスのＩＬ−１β及びＴＮＦαはＷａｋｏ社から購入した。また、前記各サイトカイン濃度は予備実験で最適用量として決定された値である。
前記化合物Ａ（０．０１〜１０μＭ）、又は、コントロールとして５％グルコース含有１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸バッファー（ｐＨ４）をウェルに添加した。２４時間後、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を添加し、培養を継続した。２０時間後、取り込まれたＢｒｄＵをＢｒｄＵ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｅｘａｌｐｈａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）を用いて定量した。結果を図１に示す。
なお、図１には、化合物Ａ無添加区（コントロール）におけるＢｒｄＵ取り込み量を１００％とした場合の、各濃度での化合物Ａ添加区のＢｒｄＵ取り込み量を百分率で示した。標準偏差（ＳＤ）を示すエラーバーと共に３ウェルの平均値を示した。独立して行った３回の実験の代表的な結果を示した。
【００４２】
−細胞周期分析−
前記ＲＳＦ及びＭＳＦの細胞周期分析を、以下のようにして行った。前記ＲＳＦ及びＭＳＦを、前記化合物Ａ（２．５μｍｏｌ／Ｌ）の存在下、又はコントロールとして５％グルコース含有１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸バッファー（ｐＨ４）の存在下で、前記と同様にして２４時間サイトカイン刺激した後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、０．１５％ＴｒｉｔｏｎＸ／ＰＢＳで再懸濁した。ヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍｌ）で染色し、ＦＡＣＳ  ｃａｌｉｂｅｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いてＤＮＡ含量を調べた。結果を図２に示す。
なお、図２には、ＤＮＡ含量のヒストグラム及び各細胞周期段階の細胞の割合を示す百分率群を示した。独立して行った３回の実験の代表的な結果を示した。
【００４３】
前記増殖分析の結果、前記化合物ＡはＲＳＦ及びＭＳＦの増殖を用量依存的に阻害した（図１）。また、試験した全ての濃度で、前記化合物Ａの添加による表現型の細胞死は観察されなかった。
また、前記細胞周期分析の結果、前記化合物Ａは、いずれの型の細胞においても、アポトーシスの指標となるｓｕｂ−Ｇ１群を増加させること無しに、Ｇ０／Ｇ１期の細胞群を増加させた、即ち、Ｇ１期での細胞周期停止を導いた（図２）。
これらの結果から、前記化合物Ａは、アポトーシスを誘導すること無しに、滑膜線維芽細胞の増殖を強力に抑制できる作用を有していることが判った。
【００４４】
（実施例２）
＜コラーゲン誘導性関節炎に対する抑制作用＞
−コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）マウスの作製−
マウスのコラーゲン誘導性関節炎（Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ＣＩＡ）は、ＩＩ型コラーゲンに対する自己免疫の結果、滑膜細胞の増殖を伴う滑膜炎がおき、関節リウマチのように関節が破壊される疾患であり、増殖性滑膜炎の良いモデルである。以下の方法により、前記コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）マウスを作製し、前記化合物Ａによる関節炎の抑制作用を評価した。
７週齢の雄ＤＢＡ／１マウス（日本チャールズ・リバー株式会社）に、フロイント完全アジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ：ＣＦＡ）（Ｄｉｆｃｏ社）で乳化したウシＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）（コラーゲン技術研修会）２００μｇを、尾の付け根に免疫した。初回免疫後、２１日後に再度免疫し、ＣＩＡマウスを作製した。
【００４５】
−化合物Ａの投与−
前記ＣＩＡマウスに、１２時間ごとに（１日に２回）７日間、前記化合物Ａを２００ｍｇ／ｋｇ経口投与した。前記経口投与はＣＩＡマウスの関節炎が確認された日（初回免疫から２４日後）から開始した。
また、化合物Ａの投与は、治療効果を失わずに１日１回の３０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与にまで減少させることができたため、この処置を実際の関節炎治療を想定し、関節炎を発症した後の前記ＣＩＡマウスに行った。１日１回３０ｍｇ／ｋｇの前記化合物Ａの腹腔内投与を、５日間連続して行い、１日空けて、再び５日間連続して行った。
また、コントロールとして、それぞれ化合物Ａの代わりに５％グルコース含有１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸バッファー（ｐＨ４）を投与したＣＩＡマウスも準備した。
【００４６】
−関節炎評価−
前記ＣＩＡマウスの各肢の関節炎発症の程度を、一肢につき４点以下、即ち一個体につき１６点以下で、以下の関節炎スコア評価基準に従い評価した。
[関節炎スコア評価基準]
０：腫脹は認められない。
１：１箇所の関節で腫脹が認められる。
２：２以上の関節で腫脹が認められるが、重度ではない。
３：２以上の関節での重度な腫脹が認められる。
４：２以上の関節での重度な腫脹が認められる（計数的な腫脹を含む）。
前記関節炎スコアはステューデントｔ−検定により統計学的に分析した。
また、前記経口投与を行ったＣＩＡマウスの関節の腫脹の程度を、後肢の厚さ及び足首の幅をマイクロメータ（尾崎製作所）を用いて測定することにより定量した。結果を図３Ａ〜Ｄに示す。
【００４７】
なお、図３Ａ〜Ｃには、前記化合物Ａの経口投与による、関節炎スコア、並びに、肢の厚み及び足首の幅の経時的変化をそれぞれ示した。また、図３Ｄには、関節炎を発症した後の前記化合物Ａの腹腔内投与による関節炎スコアの経時的変化を示した。標準偏差（ＳＤ）を示すエラーバーと共に８マウスの平均値を示した（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１）。
【００４８】
前記化合物Ａの経口投与により、ＣＩＡマウスの関節炎スコア、並びに、肢及び足首の腫脹は低減された（図３Ａ〜Ｃ）。また、化合物Ａの投与は、治療効果を失わずに１日１回の３０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与にまで減少させることができたため、この処置を関節炎の発症後に開始したところ、同様にＣＩＡマウスの関節炎スコアは低減された（図３Ｄ）。また、本発明者らは前記化合物Ａの投与により、関節炎の回復は除き、マウスの身体的な所見、行動等に何ら異常が起こらないことも確認した。これらの結果から、前記化合物Ａは、正常な生体機能に悪影響を及ぼすこと無しに、関節炎を抑制可能であり、また、進行中の関節炎に対しても治療効果を発揮し得ることが判った。
【００４９】
（実施例３）
＜免疫反応に対する作用＞
生体の免疫反応に対する前記化合物Ａの作用を、ＩＩ型コラーゲン反応性Ｔ細胞の増殖に及ぼす影響の有無を検討することにより評価した。
【００５０】
前記実施例２と同様にして、マウスにＩＩ型コラーゲンを免疫した。前記免疫開始と同時に、前記化合物Ａ３０ｍｇ／ｋｇを腹腔内に５日間連続して投与し、１日空けて、再び５日間連続して投与した。コントロールとして、化合物Ａを投与しないマウス（ＩＩ型コラーゲンの免疫のみ）も準備した。前記免疫開始から１２日目にリンパ節を摘出し、細胞群を９６ウェルプレートに４００，０００細胞／ウェルで播き、各量（０、４、２０、１００μｇ／ｍｌ）のＩＩ型コラーゲンと共に７２時間培養後、ＢｒｄＵを添加し、更に培養した。１７時間後、取り込まれたＢｒｄＵをＥＬＩＳＡにて定量し、ＩＩ型コラーゲン反応性Ｔ細胞の増殖を検討した。結果を図４に示す。
なお、図４には、培養時にＩＩ型コラーゲンを添加しなかった（０μｇ／ｍｌ）場合のＢｒｄＵ取り込み量を１００％とした場合の、各群のＢｒｄＵ取り込み量を百分率で示した。
【００５１】
結果、ＩＩ型コラーゲンと共に化合物Ａを投与した群（図４、化合物Ａ）では、ＩＩ型コラーゲンのみを投与した群（図４、コントロール）と同様に、培養時に添加したＩＩ型コラーゲンの量に依存してＩＩ型コラーゲン反応性Ｔ細胞が増加していることが示された（図４）。
このことから、前記化合物Ａは、免疫反応によるＴ細胞増殖を抑制しないこと、即ち、免疫抑制を惹き起こさないことが判った。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明の滑膜細胞増殖抑制剤及び薬用組成物は、アポトーシスを誘導すること無しに滑膜細胞増殖を抑制可能であり、また、免疫活性を抑制すること無しに、滑膜細胞増殖が病態に関与する疾患を治療又は予防することができるので、安全性が高く副作用の少ない、かつ、患者の免疫力低下を惹き起こすことの無い抗関節リウマチ剤、抗変形性関節症剤、抗乾癬性関節炎剤、抗痛風剤等として有用である。また、本発明の治療方法によれば、前記滑膜細胞増殖抑制剤及び／又は前記薬用組成物を投与することにより、患者の免疫力を低下させること無しに、かつ安全に、滑膜細胞増殖が病態に関与する疾患の治療又は予防を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、化合物Ａが滑膜線維芽細胞の増殖に及ぼす影響を示したグラフ図である。
【図２】図２は、化合物Ａが滑膜線維芽細胞の細胞周期進行に及ぼす影響を示したヒストグラムである。
【図３Ａ】図３Ａは、化合物Ａの経口投与による関節炎スコア変化を示すグラフ図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、化合物Ａの経口投与による肢の厚み変化を示すグラフ図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、化合物Ａの経口投与による足首の幅の変化を示すグラフ図である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、化合物Ａの腹腔内投与による関節炎スコア変化を示すグラフ図である。
【図４】図４は、化合物ＡがＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）反応性Ｔ細胞増殖に及ぼす影響を示すグラフ図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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