(57)【要約】【課題】  異なる波長の戻り蛍光による色収差に起因する共焦点画像の結像位置ずれを補正して、精度の高い多色の共焦点画像を取得することができる共焦点顕微鏡を実現する。【解決手段】  多波長のレーザ光に励起される試料からの戻り蛍光の共焦点スライス画像を、前記多波長に対応してフィルタを切り換えて取得する共焦点顕微鏡において、  前記多波長に対応して光軸方向に異なる厚さになった複数のフィルタを備えたフィルタ手段を有し、多波長に対応して厚さの異なるフィルタを切り換えて共焦点スライス画像を取得する。【選択図】                    図１
2007101910.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多波長のレーザ光に励起される試料からの戻り蛍光の共焦点スライス画像を、前記多波長に対応してフィルタを切り換えて取得する共焦点顕微鏡において、
前記多波長に対応して光軸方向に異なる厚さになった複数のフィルタを備えたフィルタ手段を有し、多波長に対応して厚さの異なるフィルタを切り換えて共焦点スライス画像を取得することを特徴とする共焦点顕微鏡。
【請求項２】
前記フィルタの厚さをＴ、材料の屈折率をＮとするとき、前記共焦点スライス画像の結像位置の移動量Ｐは、Ｐ＝（１−１／Ｎ）Ｔで与えられることを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項３】
前記多波長に対応した前記共焦点スライス画像の結像位置が、同一位置に維持されることを特徴とする請求項１又は２に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項４】
前記フィルタ手段は、円盤状のフィルタホイールの円周に沿って厚さの異なる複数のフィルタが配置され、所定周期で回転制御されて時系列的にフィルタが切り換えられることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の共焦点顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多波長のレーザ光に励起される試料からの戻り蛍光の共焦点スライス画像を、多波長に対応してフィルタを切り換えて取得する共焦点顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
図３は、多波長レーザ光を用いる共焦点顕微鏡のシステム構成例を示す機能ブロック図である。１は観察対象の試料、２は試料を搭載するステージ、２１はステージ支持部である。３は蛍光顕微鏡、３１は試料１に対向配置された蛍光顕微鏡の対物レンズである。
【０００３】
４は共焦点スキャナであり、レーザ光源５からファイバ５１を介して入力される多波長（λ１，λ２，…λｎ，）のレーザ光を、試料１への焦点光を走査するビームに変換して蛍光顕微鏡３に出力する。共焦点スキャナに関しては、ニポウディスク方式の共焦点スキャナの構成が特許文献１に開示されている。
【０００４】
試料１の異なる部位の観察を行うのに、異なる波長の蛍光指示薬を用いる。その際、多波長のレーザ光に励起される試料１からの戻り蛍光は、蛍光顕微鏡３、共焦点スキャナ４を戻り、フィルタホイール６に配置されている多波長のレーザ光に対応して切り換えられる、戻り蛍光の波長のフィルタ手段を介してカメラ７内に結像され、ＰＣ８に取り込まれてモニタ９に表示される。
【０００５】
フィルタホイール６に配置されるフィルタ手段は、レーザ光のｎ個の波長（λ１，λ２，…λｎ，）に対応する戻り蛍光の波長を透過するｎ個のフィルタを備え、ＰＣ８からの制御信号Ｍにより時系列的に所定の周期で切り替え操作される。この切り換え周期は、試料１の反応速度よりも十分速く設定され、観察者はこの切り換えを意識することなく連続的に多色の共焦点画像をモニタすることができる。
【０００６】
図４は、従来のフィルタ手段を備えた共焦点顕微鏡の光学系を示すイメージ図である。試料１からの戻り蛍光の共焦点画像Ｇは、蛍光顕微鏡３の対物レンズ３１を経由して共焦点スキャナ４内に結像され、さらにリレーレンズ４１及びフィルタホイール６において選択されているフィルタ（図示では６２）を経てカメラ７内に結像する。この結像位置にイメージセンサ（図示せず）が配置されている。
【０００７】
図５は、レーザ光のｎ個の波長（λ１，λ２，…λｎ，）に対応した戻り蛍光の波長に合わせて、フィルタホイール６に備えられるｎ個のフィルタの配列を示す平面図である。円盤状のフィルタホイール６の円周に沿って透過周波数特性の異なるｎ個のフィルタ６１，６２，…６ｎが配置されており、所定周期で回転制御されて時系列的に光学経路に切り換え配置される。
【０００８】
ｎ個のフィルタ６１，６２，…６ｎは、表面の光学的な処理によりその透過周波数特性が、レーザ光のｎ個の波長（λ１，λ２，…λｎ，）に対応する戻り蛍光の波長を透過する特性を備えるものであるが、図４に示されるように、各フィルタの光軸方向の厚さが、すべて同一の厚さＴとされている。
【０００９】
【特許文献１】特開平５−６０９８０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
蛍光指示薬の波長はほぼ全可視領域に渡るため、対物レンズ３１あるいはリレーレンズ４１において必ず色収差が生じ、戻り蛍光の波長毎に結像位置が異なる。その結果、多色の共焦点画像を重ねた時に、色ずれが生じ、実際の構造とは異なる画像が得られ、観察の精度が落ちてしまう。
【００１１】
図６は、レーザ光の波長λ１及びλ２に対応する異なる波長の戻り蛍光が、同一の厚さＴを有するフィルタ６１及び６２を介してカメラ７内に結像する共焦点画像Ｇの結像位置のずれを示すイメージ図である。
【００１２】
本発明は上述した問題点を解決するためになされたものであり、異なる波長の戻り蛍光による色収差に起因する共焦点画像の結像位置ずれを補正して、精度の高い多色の共焦点画像を取得することができる共焦点顕微鏡を実現することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
このような課題を達成するために、本発明は次の通りの構成になっている。
（１）多波長のレーザ光に励起される試料からの戻り蛍光の共焦点スライス画像を、前記多波長に対応してフィルタを切り換えて取得する共焦点顕微鏡において、
前記多波長に対応して光軸方向に異なる厚さになった複数のフィルタを備えたフィルタ手段を有し、多波長に対応して厚さの異なるフィルタを切り換えて共焦点スライス画像を取得することを特徴とする共焦点顕微鏡。
【００１４】
（２）前記フィルタの厚さをＴ、材料の屈折率をＮとするとき、前記共焦点スライス画像の結像位置の移動量Ｐは、Ｐ＝（１−１／Ｎ）Ｔで与えられることを特徴とする（１）に記載の共焦点顕微鏡。
【００１５】
（３）前記多波長に対応した前記共焦点スライス画像の結像位置が、同一位置に維持されることを特徴とする（１）又は（２）に記載の共焦点顕微鏡。
【００１６】
（４）前記フィルタ手段は、円盤状のフィルタホイールの円周に沿って厚さの異なる複数のフィルタが配置され、所定周期で回転制御されて時系列的にフィルタが切り換えられることを特徴とする（１）乃至（３）のいずれかに記載の共焦点顕微鏡。
【発明の効果】
【００１７】
以上説明したことから明らかなように、本発明によれば次のような効果がある。
（１）戻り蛍光の異なる波長による色収差を、この波長に対応するフィルタの厚さを変えることで補正し、全ての共焦点画像を同一位置に結像させることができる。
【００１８】
（２）この結果、多色の共焦点画像を重ねた時の色ずれの発生がなくなるので、多波長レーザ光による精度の高い多色の共焦点画像の観察が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を図面により詳細に説明する。図１は、本発明を適用したフィルタ手段を備えた共焦点顕微鏡の光学系を示すイメージ図である。図３乃至図６で説明した要素と同一要素には同一符号を付して説明を省略する。以下、本発明の特徴部につき説明する。
【００２０】
図１において、本発明が適用されたフィルタ６０１（λ１用），６０２（λ２用），…６０ｎ（λｎ用）は、図５と同様に、フィルタホイール６００の円周に沿って配置され、制御信号Ｍにより回転操作される。
【００２１】
本発明の特徴は、フィルタ６０１（λ１用），６０２（λ２用），…６０ｎ（λｎ用）の光軸方向の厚さが、夫々Ｔ１，Ｔ２，…Ｔｎのように、各戻り蛍光の波長に対応して異なる厚さを備える点にある。
【００２２】
本発明は、フィルタの光軸方向の厚さＴにより共焦点画像Ｇの結像位置が移動する光学的な特性を利用して、各戻り蛍光の波長に対応した結像位置を、色収差によるずれと逆方向に移動させて補正し、結果として各戻り蛍光の波長に対応した結像位置を一定位置に維持させるものである。
【００２３】
一般的には、リレーレンズ４１とカメラ７の間に厚さＴのフィルタを挿入した場合、フィルタを挿入しない場合に比べて、結像位置が次式で計算される距離Ｐ分だけ移動する。
結像位置の移動量Ｐ＝（１−１／Ｎ）Ｔ                  （１）
【００２４】
ここで、Ｎはフィルタの材料の屈折率を表す。屈折率ｎは波長によって異なるため、フィルタの厚さＴが一定であれば、結像位置の移動量Ｐが波長毎に異なり、前記した色収差による結像位置のずれが生じる。
【００２５】
本発明では、前記式（１）の特性を利用して、各戻り蛍光の波長に対応した結像位置の移動量が等しくなるように、波長毎の屈折率Ｎに対応したフィルタの厚さＴを変化させて結像位置を補正して一定位置に維持させている。
【００２６】
図２は、レーザ光の異なる波長に対応する異なる波長の戻り蛍光の共焦点画像Ｇが、厚さの異なるフィルタを介してカメラ７内の同一位置に結像することを説明するイメージ図である。
【００２７】
図２（Ａ）は、レーザ光の波長λ１に対応する戻り蛍光の波長用の厚さＴ１のフィルタ６０１による共焦点画像Ｇの結像位置を示す。図２（Ｂ）は、レーザ光の波長λ２に対応する戻り蛍光の波長用の厚さＴ２のフィルタ６０２による共焦点画像Ｇの結像位置を示す。これら画像位置は一致している。
【００２８】
図２（Ａ）において、仮にフィルタ６０１の厚さＴ１がフィルタ６０２の厚さＴ２に等しい従来構成であった場合には、レーザ光の波長λ１による戻り蛍光の共焦点画像Ｇ´は点線で示すようにＧの位置からずれることになる。本発明によればこのずれが補正され、全てのレーザ光波長による戻り蛍光の共焦点画像Ｇの結像位置が同一位置に維持される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明を適用したフィルタ手段を備えた共焦点顕微鏡の光学系を示すイメージ図である。
【図２】レーザ光の異なる波長に対応する異なる波長の戻り蛍光の共焦点画像が、厚さの異なるフィルタを介してカメラ内の同一位置に結像することを説明するイメージ図である。
【図３】多波長レーザ光を用いる共焦点顕微鏡のシステム構成の一例を示す機能ブロック図である。
【図４】従来のフィルタ手段を備えた共焦点顕微鏡の光学系を示すイメージ図である。
【図５】多波長のレーザ光による戻り蛍光に対応して、フィルタホイールに備えられるフィルタの配列を示す平面図である。
【図６】レーザ光の異なる波長に対応する異なる波長の戻り蛍光が、同一の厚さを有するフィルタを介してカメラ内に結像する共焦点画像の結像位置ずれを示すイメージ図である。
【符号の説明】
【００３０】
１  試料
３  蛍光顕微鏡
３１  対物レンズ
４  共焦点スキャナ
４１  リレーレンズ
７  カメラ
６００  フィルタホイール
６０１，６０２，…６０ｎ  フィルタ
Ｔ１，Ｔ２，…Ｔｎ  フィルタの厚さ
Ｇ  共焦点画像
【図１】
2007101910.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
2007101910.tif 000006
【図５】
2007101910.tif 000007
【図６】
2007101910.tif 000008