(57)【要約】      （修正有）【課題】生物学的に安全な内視鏡観察に適した蛍光染色剤を提供する。【解決手段】次式（１）2007326789.tif 000005［式中、Ｒ1は水素原子又はヒドロキシ基を示し、Ｒ3はＲ2cが結合したフェニル基又はメチル基を示し、Ｒ2a、Ｒ2b及びＲ2cのうち１〜３個は−ＳＯ3Ｍ（ここでＭはアルカリ金属原子又はアルカリ土類金属原子を示す）又は−ＳＯ3ＮＨ4を示し、１個は−ＳＯ3-を示し、残余は水素原子を示す］で表される化合物を含有する内視鏡用組織蛍光染色剤組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（１）
【化１】
2007326789.tif 000004
（式中、Ｒ1は水素原子又はヒドロキシ基を示し、Ｒ3はＲ2cが結合したフェニル基又はメチル基を示し、Ｒ2a、Ｒ2b及びＲ2cのうち１〜３個は−ＳＯ3Ｍ（ここでＭはアルカリ金属原子又はアルカリ土類金属原子を示す）又は−ＳＯ3ＮＨ4を示し、１個は−ＳＯ3-を示し、残余は水素原子を示す）
で表される化合物を含有する内視鏡用組織蛍光染色剤組成物。
【請求項２】
式（１）で表される化合物が、ファストグリーンＦＣＦ、ブリリアントブルーＦＣＦ、ギネアグリーンＢ、パテントブルーＶＦ、パテントブルーＮＡ、パテントブルーＣＡ、ライトグリーンＳＦ及びアルファズリンＦＧから選ばれるものである請求項１記載の組織蛍光染色剤組成物。
【請求項３】
内視鏡が、共焦点内視鏡である請求項１又は２記載の組織蛍光染色剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内視鏡による診断に用いる組織蛍光染色剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
内視鏡を用いた診断技術は、上部消化管及び下部消化管における消化管内視鏡検査を中心に、特に癌、消化性潰瘍、潰瘍性大腸炎等の疾患の診断に広く応用されている。これら内視鏡検査における組織の異常（病変部）の検出は、染色剤を用いることなく１０〜５００倍程度の可視光内視鏡による観察が一般的である。他方、組織表面に色素を含む溶液を撒布した状態で内視鏡観察する色素内視鏡法と呼ばれる方法がある。この色素内視鏡法は消化器内腔表面の形状を明確に観察することができるため、色調の変化によって微細な病変部であっても容易に発見することができる。色素内視鏡法に用いられる内視鏡としては可視光内視鏡及び蛍光内視鏡がある。
【０００３】
色素内視鏡法に用いられる色素としては、例えば可視光下での消化管内腔の染色にはコントラスト法により観察するインジゴカルミン（非特許文献１）、蛍光染色にはアクリフラビン及びフルオレセイン（非特許文献２）などが主に用いられている。
【０００４】
がんなどの診断においては、生体の組織表面だけでなく、生体組織内部の観察も重要である。生体組織内部を観察する方法としては、バイオプシーなどで採取した組織の微小部を実験室で薄切し、染色の後に観察する方法が一般的である。生体組織の内部をその場で観察する方法では、例えば、ＭＲＩ、ＰＥＴ、ＣＴ、軟Ｘ線法などが全身の観察のために適用されている。消化管内視鏡に関しては、生体組織の自家蛍光反応を応用した内視鏡が商業化されている。生体組織に特定波長の光を照射することで組織の内因性蛍光物質により自家蛍光が発生するので、その強度差及びスペクトラムにより正常部位と病変部位を視覚的に観察することができる。
【０００５】
通常の内視鏡を用いて、例えば、消化管がんを診断するためには、観察により病変部を経験的に判断し、組織片を切り取って、別途実験室内で組織染色等の手法により診断せざるを得なかった。しかし、近年開発された、共焦点内視鏡を用いることで、組織を切り取ることなく、組織内部を観察することができる。
一般に、共焦点撮像システムとは、検出器の前にピンホールを置くことにより、組織内の焦点面のみの反射光を検出し、機械切削なしに組織内部の明確な画像を得ることができる技術である。通常、共焦点撮像システムは蛍光物質により染色された組織にレーザー光を走査してその蛍光像を観察する。一般に共焦点撮像システムでは、蛍光染色剤が必要である。
共焦点撮像システムを採用した共焦点内視鏡は、通常観察光学系と共焦点観察光学系の両者を有しているため、病変部のスクリーニングが可能であり、細胞を切り取らずに光学的な組織薄切による細胞の観察が低侵襲且つその場で可能となる点で有用である。
【０００６】
現在市販されている共焦点内視鏡は、波長４８８nmの青色レーザー光を色素励起光源として用いている。医療用の共焦点内視鏡に使用される蛍光色素は、生体に対して毒性や変異原性を示さないことが重要な性質として求められる。従って現在のところ、医療用共焦点内視鏡に使用可能な蛍光色素は、眼底造影のための静脈注射用フルオレセイン及び抗生物質として用いられているアクリフラビンに限定される(非特許文献３)。
【０００７】
共焦点内視鏡に利用される光源に関しては、将来的にその波長が多様化することが予想される。例えば、赤色〜赤外領域の光は青色光に比較して生体組織の透過性が高いため、生体組織の表面よりも深い位置での共焦点像を得ることができると考えられている。人体への投与が認可されている診断用赤外蛍光化合物にインドシアニングリーン（ICG：IndoCyanine Green）があり、主として肝臓機能検査や眼底血管造影に用いられている。共焦点内視鏡用染色剤としてインドシアニングリーンを用いると、例えば非特許文献２に記載されているフルオレセインよりも組織を明確に造影することができない。さらには、インドシアニングリーンを内視鏡用蛍光試薬として用いるには、フルオレセインと比較して毒性が高いという問題があった。
【非特許文献１】多田正大、磯  彰格  他（臨消内科、vol.7、no.2、1992）
【非特許文献２】Gastroenterology 2004, vol.127, No.3, p.706-713
【非特許文献３】Gastrointestinal Endoscopy Clin of N Am, 2005, vol.12, p.715-731
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、１）生物学的な毒性が低く、２）白色光源下でも組織表面の凹凸を強調するコントラストを付与し、３）赤色波長領域の光源により励起され蛍光を発し、４）組織に浸透し組織内部構造を共焦点内視鏡により蛍光像として視認可能な観察像を付与し、５）好染部位がフルオレセインとは異なり、特に消化管内腔側の血管、粘膜固有層、膠原線維などを明瞭に造影できる内視鏡用組織蛍光染色剤組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、染色剤の安全性、可視光における染色性、赤色波長領域の光源による蛍光の発生、及び蛍光観察における染色性の点等に着目して種々検討した結果、ファストグリーンＦＣＦ、ブリリアントブルーＦＣＦなどに代表される後記式（１）の化合物が、前記条件を満たすことを見出した。さらに、これらの化合物は、共焦点内視鏡における組織内部を染色するための蛍光染色剤として有用であること、且つそれらの染色像が非常に特徴的であり早期段階での病変の検出に有用であることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は次式（１）
【００１１】
【化１】
2007326789.tif 000002
【００１２】
（式中、Ｒ1は水素原子又はヒドロキシ基を示し、Ｒ3はＲ2cが結合したフェニル基又はメチル基を示し、Ｒ2a、Ｒ2b及びＲ2cのうち１〜３個は−ＳＯ3Ｍ（ここでＭはアルカリ金属原子又はアルカリ土類金属原子を示す）又は−ＳＯ3ＮＨ4を示し、１個は−ＳＯ3-を示し、残余は水素原子を示す）
で表される化合物を含有する内視鏡用組織蛍光染色剤組成物を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
（１）白色光源を用いる通常内視鏡下での消化管の観察において、フルオレセインなどの赤色系色素と比較して、本発明の組織蛍光染色剤は深青色系色素のためコントラストが強い。
（２）白色光内視鏡と共焦点内視鏡を併せ持つ内視鏡による観察において、白色光に対しては、深青色のコントラストを組織に付与し、赤色の励起光に対しては蛍光を示す。このため上記の内視鏡の使用時に病変部の発見とその共焦点画像の取得が一つの色素で提供できる。
（３）式（１）の化合物は、蛍光を示し、また、分子にスルホン酸基を持っており、腸などを染色した際には細胞間隙や結合組織を良好に染色する。該色素の染色性はフルオレセインとは異なっており、これらの色素と併用することで、共焦点像観察において組織に関するより多くの情報を得ることができる。
（４）本発明の組織蛍光染色剤が、特に繊維組織の発達した腫瘍に対して、結合組織の状態を直接観察できることは重要である。動脈及び静脈の血管壁も好染され、腫瘍内部の血管を観察することができる。
（５）本発明の組織蛍光染色剤は、赤色に近い波長の蛍光を出すため、深部の焦点面からの蛍光を観察する際に蛍光が通過する組織による蛍光の減衰がフルオレセインと比して少なく、従って、より深部の組織の共焦点像を明瞭に得ることができる。
（６）本発明の組織蛍光染色剤は水に溶解した状態ではいずれの波長に対しても微かな蛍光しか示さない。しかし消化管内腔に撒布すると強い蛍光を発する。撒布による染色時に洗浄が不要且つ低いバックグラウンドの蛍光観察が可能であるという利点を持つ。
（７）従って、本発明の組織蛍光染色剤を用いれば、可視光及び蛍光、共焦点内視鏡観察下において、すなわち組織を採取することなく、病変部の表面及び組織内部の可視化を同時に行うことができ、その染色像が鮮明であることから、消化管疾患等の診断に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の内視鏡には、消化管内視鏡、呼吸器内視鏡、血管内視鏡、腹腔内視鏡、胸腔内視鏡などの医療用内視鏡が挙げられる。このうち消化管内視鏡が特に好ましい。本発明において、可視光内視鏡には、可視光で観察する内視鏡が全て含まれ、通常の内視鏡、拡大内視鏡、及び可視光を観察する色素内視鏡が含まれる。一方、蛍光内視鏡には、励起光を照射して生じる蛍光を測定する内視鏡が含まれ、これには拡大蛍光内視鏡が含まれる。また、共焦点内視鏡は、共焦点撮像システムを搭載した内視鏡をいう。なお、共焦点内視鏡は通常観察光学系と共焦点観察光学系の両者を有している。
【００１５】
本発明の組織蛍光染色剤は、前記式（１）で表される化合物を含有する。式（１）中、Ｒ1は水素原子又はヒドロキシ基を示す。Ｒ1がヒドロキシ基を示す場合には、その結合位置は、式（１）中のメチン基のメタ位又はパラ位が好ましい。Ｒ3はＲ2cが結合したフェニル基又はメチル基を示す。Ｒ2a、Ｒ2b及びＲ2cのうち、１〜３個は−ＳＯ3Ｍ（ここでＭはアルカリ金属原子又はアルカリ土類金属原子を示す）又は−ＳＯ3ＮＨ4を示すが、１又は２個が−ＳＯ3Ｍ又は−ＳＯ3ＮＨ4であるのが好ましい。Ｒ2a、Ｒ2b及びＲ2cのうち１個は−ＳＯ3-である。また、残余のＲ2a、Ｒ2b及びＲ2cは水素原子である。ここで、Ｍで示されるアルカリ金属原子としては、ナトリウム、カリウム、リチウムが挙げられるが、ナトリウムが特に好ましい。アルカリ土類金属原子としては、カルシウム、マグネシウム等が挙げられるが、カルシウムが特に好ましい。
【００１６】
これらの式（１）で表される化合物の好ましい具体例としては、ファストグリーンＦＣＦ、ブリリアントブルーＦＣＦ、ギネアグリーンＢ、パテントブルーＶＦ、パテントブルーＮＡ、ライトグリーンＳＦ、アルファズリンＦＧ、パテントブルーＣＡ（パテントブルーＮＡのカルシウム塩型）等が挙げられる。
【００１７】
【化２】
2007326789.tif 000003
【００１８】
ファストグリーンＦＣＦは緑色3号として、ブリリアントブルーＦＣＦは青色１号として、ギネアグリーンＢは緑色４０２号として、パテントブルーＮＡは青色２０２号として、ライトグリーンＳＦは緑色２０５号として、アルファズリンＦＧは青色２０５号として、パテントブルーＣＡ青色２０３号としてそれぞれ知られている。これらは、化粧品や医薬品の着色剤として広く使用されている。従って、これらの成分の安全性は確立されている。しかし、これらの化合物が蛍光を発することは知られておらず、また組織に適用した場合に組織内部において鮮明な蛍光像を呈することはまったく知られていない。
【００１９】
ファストグリーンＦＣＦの市販品としては、例えば和光純薬のファストグリーンＦＣＦが挙げられる。またブリリアントブルーＦＣＦの市販品としては、例えばキリヤ化学の食用青色1号、三栄源エフエフアイの食用青色1号等が挙げられる。ギネアグリーンＢの市販品としては、シグマ−アルドリッチ製ギネアグリーンＢが挙げられる。パテントブルーＶＦの市販品としては、シグマ−アルドリッチ製パテントブルーＶＦが挙げられる。ライトグリーンＳＦの市販品としては、和光純薬製ライトグリーンＳＦが挙げられる。アルファズリンＦＧの市販品としては、シグマ−アルドリッチ製エリオグラウシンが挙げられる。
【００２０】
本発明の組織染色剤中の式（１）の化合物の含有量は、染色性及び染色像の鮮明さの点から０．０１〜７０質量％、さらに０．０１〜５０質量％、特に０．０１〜２０質量％が好ましい。
【００２１】
本発明の組織染色剤は、液体、顆粒、錠剤等の形態で使用することができる。消化管内で撒布する場合又は粘膜下投与する場合は液体が好ましく、経口投与する場合は液体、顆粒、錠剤等が好ましい。
【００２２】
本発明の組織染色剤には、その形態(剤型)に応じて種々の成分を配合できる。例えば粘稠剤、増粘剤、界面活性剤、甘味剤、防腐剤、香料、pH調整剤、水等を配合できる。
【００２３】
pH調整剤としては、pHを５〜９にするもの、例えば、塩酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、酢酸及びこれらの塩、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、ピロリン酸四ナトリウムなどが挙げられる。
【００２４】
また溶剤としてエタノール、水などを配合し得る。錠剤の場合は、結合剤、崩壊剤などの公知の錠剤用成分を用いることができる。
【００２５】
本発明の組織染色剤は、組織を青色〜緑色系に染色することができるので、通常の白色光内視鏡観察時における組織染色剤として有用である。ここで用いられる内視鏡は通常の内視鏡及び拡大内視鏡であり、１０〜５００倍の倍率を有する内視鏡観察に有用である。
【００２６】
ファストグリーンＦＣＦは例えば６２８nmで励起され６５２nmで蛍光を検出することができる。ブリリアントブルーＦＣＦは例えば６２９nmで励起され６５０nmで蛍光を検出することができる。ギネアグリーンＢは、例えば６２４nmで励起され６３５nmで蛍光を検出することができる。パテントブルーＶＦは、例えば６４１nmで励起され６５４nmで蛍光を検出することができる。ライトグリーンＳＦは、例えば６３３nmで励起され６５２nmで蛍光を検出することができる。アルファズリンＦＧは、例えば６３３nmで励起され６４３nmで蛍光を検出することができる。
【００２７】
組織への染色性に関しては、通常組織と前がん状態や腫瘍の存在下で異なる。通常組織を染色した場合では、小腸や大腸などでは上皮細胞の細胞膜及び細胞間隙を染色する。一方、悪性腫瘍の観察においては細胞個々の特徴として、（１）核容積が増大し核優位となること、（２）核のクロマチンの増量と過染性、（３）核小体の増大と増多、（４）核学的には染色体の数や形態に異常を見ること、（５）胞体が好塩基的に染まり、しかもこれが細胞の増殖性に関係すること、などが挙げられる。また、腫瘍細胞では多くの核クロマチンが核膜に接して集合し、小胞体が単純化してくる。さらにミトコンドリアは不ぞろいで大きさも不均一となり、細胞内にフィラメント様の構造物が多くなる。本発明の組織染色剤組成物を用いれば、まず、膠原繊維及び弾性繊維、筋層などが好染される。そのため、腫瘍の生成される可能性のある部位の情報をいち早く知ることができる点で非常に有用である。次に、結合した組織においてのみ蛍光を発する性質であるため、知りたい情報だけを得られ、非常に意義が高いと言える。
【００２８】
後述の実施例で示すように、式（１）の化合物は、他の食用色素に比べて、蛍光を発光するという特性を有するだけでなく、組織内部の蛍光染色像が鮮明であるという特性を有する。従って、本発明の染色剤は、内視鏡用組織蛍光染色剤として有用である。
【００２９】
なお、共焦点光学システムを採用した内視鏡が、通常観察光学系と共焦点観察光学系との両者を有しているものであれば、通常光下での観察により病変部を肉眼観察し、次いで疑問になった病変部について、共焦点内視鏡により組織内部(例えば、２５０μmまで)の蛍光染色断層像を観察することにより、病変部組織を切除することなく組織表面及び組織内部の診断が可能となる。すなわち、生体組織の細胞や核の形状を生きた状態のまま観察することができる。この結果、前癌状態、癌、潰瘍、潰瘍性大腸炎等の消化管の疾患の診断が安全、迅速、低侵襲で可能となり、且つ精度が飛躍的に向上する。
【００３０】
これらの内視鏡観察においては、本発明の組織染色剤は、消化管内腔に直接撒布又は粘膜下投与してもよく、経口的、経静脈的に投与してもよい。
【実施例】
【００３１】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら制限されるものではない。
【００３２】
実施例１
ファストグリーンＦＣＦについて吸光スペクトル及び蛍光励起スペクトル測定を行った。ファストグリーンＦＣＦ（和光純薬製）を１．０mg／mLに調整し、分光光度計（島津製作所製、ＢｉｏＳｐｅｃ−１６００）により波長２００〜７５０nmまでの吸光度を連続的に測定し、吸収極大となる波長を決定した。得られた吸収極大波長６２８nmを励起波長として照射し、その励起光の光軸に対して垂直方向に検出される散乱光の波長を分光蛍光光度計（島津製作所製、ＲＦ−１５００）により測定し、６２８nmの励起極大波長及び６５２nmの蛍光極大波長を得た。図１に蛍光光度計にて測定した励起極大波長及び蛍光極大波長を示す。
同様の試験を行った結果、ブリリアントブルーＦＣＦは、吸収極大波長が６２９nmであり、励起極大波長６１９nm、蛍光極大波長６５０nmであった。ギネアグリーンＢは、吸収極大波長が６２０nmであり、励起極大波長６２４nm、蛍光極大波長６３５nmであった。パテントブルーＶＦは、吸収極大波長が６３９nmであり、励起極大波長６４１nm、蛍光極大波長６５４nmであった。ライトグリーンＳＦは、吸収極大波長が６３５nmであり、励起極大波長６３３nm、蛍光極大波長６５２nmであった。アルファズリンＦＧは、吸収極大波長が６３０nmであり、励起極大波長６３３nm、蛍光極大波長６４３nmであった。従って、式(１)の化合物は赤色波長領域の光源により励起され、蛍光を発することが示された。
【００３３】
比較例１
インドシアニングリーンの蛍光スペクトラムを図２に示す。ファストグリーンＦＣＦに比べ、蛍光強度が低いことがわかる。
【００３４】
実施例２
染色剤の染色特異性を知るためにファストグリーンＦＣＦ（和光純薬製）を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH７）を用いて２．０mg／mLに希釈調製し、共焦点顕微鏡（ライカ社製、ＴＣＳ−ＳＰ２）を使用し観察を行った。
試料はマウスを開腹し大腸を摘出し、1センチ角に切り染色剤に浸漬させたものを用いた。
共焦点顕微鏡の観察条件は、Ｈｅ−Ｎｅレーザーを６３３nmの波長で照射し、６５０〜７５０nmの波長範囲で蛍光観察した。共焦点ピンホール径は１．００airyで、６３倍油浸レンズを使用した。
図３に共焦点顕微鏡により撮影した画像を示す。ファストグリーンＦＣＦは大腸の粘膜上皮の細胞間隙を蛍光造影することが示された。
【００３５】
比較例２
実施例２で染色したファストグリーンＦＣＦの染色性の比較を従来から使用されているフルオレサイト(Alcon製)で比較染色した。
実施例２同様に浸漬にて染色し、４８８nmの波長で励起させ、蛍光像を観察した。
共焦点顕微鏡の照射レーザー波長以外の条件は同じである。
図４にフルオレサイトによる染色像を、図５に二重染色像を示す。図４及び図５から、ファストグリーンＦＣＦの持つ蛍光染色剤としての特徴は、フルオレセインとは好染部位が異なっていることが示された。これら２種類の蛍光染色剤を同時に用いることで、組織を構成する細胞の構造をより明瞭に観察可能となることが示された。
【００３６】
実施例３
ファストグリーンＦＣＦ(和光純薬製)の染色性により共焦点顕微鏡で得られる画像の観察能が変わるため、染色性の評価を行った。
ファストグリーンＦＣＦを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH６）を用いて１．０mg／mLに調製し、その染色液１００μLをマウス（ddY、１１週齢、オス）の大腸に注入した。満遍なく、且つ染色剤の流出を防止して大腸を染色するために、マウスを開腹し、取り出した大腸の上行結腸側と下行結腸側を止血クリップで留めて注入した。
大腸の内腔側を共焦点顕微鏡（ライカ社製、ＴＣＰ  ＳＰ２）により、組織の断面を観察した。
撮影条件は共焦点ピンホール径１．００airyとし、２０倍レンズを使用した。
図６に表層より５．０μm毎に断面像を観察し撮影したものを示す。本実施例により、ファストグリーンＦＣＦは大腸粘膜の上皮細胞下にある粘膜固有層を良好に蛍光造影する。
【００３７】
比較例３
医療用造影剤であるインドシアニングリーン(生理食塩水で１mg／mLに調整)を用いて組織染色を行った。マウスの大腸を灌流による方法で染色し、その摘出した大腸片の共焦点顕微鏡（ライカ社製、ＴＣＰ  ＳＰ２）による観察を行った。組織内観察の結果、染色性の特徴においては、ファストグリーンＦＣＦと類似していたが、蛍光強度が非常に低く、十分な観察を行うのは困難だった。
【００３８】
実施例４
ファストグリーンＦＣＦ(ファストグリーンＦＣＦ、和光純薬製)の染色性と組織浸透性を組織切片の観察により確認した。
実施例３と同様に染色を行ったマウスの摘出大腸の組織片をＯＣＴコンパウンド(サクラファインテック社製、Tissue-Tek  O.C.T compound)で包埋し、ドライアイスで急冷する事により凍結させた。それを６μmで薄切し凍結切片を作成して蛍光観察を行った。蛍光観察は共焦点顕微鏡（ライカ社製、ＴＣＰ  ＳＰ２）で行った。（撮影条件：４０倍レンズを使用し、ピンホール径１７１．３μm）結果を図８に示す。
【００３９】
比較例４
同じくＯＣＴコンパウンドで包埋した組織切片をＨＥ染色して観察したものを比較例として、図９に示す。これにより、ファストグリーンＦＣＦは大腸粘膜の上皮細胞下にある粘膜固有層を良好に蛍光造影することが示され、整合性も保たれた。
【００４０】
実施例５
本発明の組織染色剤組成物染色剤の部位による染色性評価を行った。十二指腸、大腸及び肝臓を摘出し観察した。
ファストグリーンＦＣＦをpH６．０の生理食塩水を用いて調製し、１０mg／mLとした。調製したファストグリーンＦＣＦをマウス（ddY、１１週齢、オス）の尾静脈から１００μL投与し、５分後に開腹した。目視での浸透性及び共焦点顕微鏡（ライカ社製、ＴＣＰ  ＳＰ２）による染色性と蛍光性を観察した。
十二指腸は、目視でわかる程度にはっきりと深緑色に染色されていた。
細胞質ではなく細胞膜や細胞間隙が強く染色され、細胞の形と大きさを観察することができた。
共焦点顕微鏡による観察条件は、共焦点ピンホール径１．００airyであり、６３倍油浸レンズを使用した。図１０に表層から４０μm付近の共焦点顕微鏡像を示す。
【００４１】
大腸は目視で認識できる程度にはっきりした色の変化が表面に現れていなかったが、共焦点撮像システムによる撮影が可能な程度に色素が浸透していることを確認した。
表層付近の細胞間隙、及び粘膜固有層がよく染色されていた。
共焦点顕微鏡の観察条件は共焦点ピンホール径１．００airyとし、６３倍油浸レンズを用いて撮影した表層から約１０μm付近の断面像を図１１に示す。
【００４２】
肝臓においては、十二指腸や大腸で見られた細胞間隙や細胞膜のみでなく、小葉部分が染色されており、その構造がはっきり観察できた。また、周囲の中隔がより強く染色されている。共焦点顕微鏡の撮影条件は、共焦点ピンホール径１．００airyとし、６３倍油浸レンズを用いて撮影した表層から１０μm付近の断面像を図１２に示す。
【００４３】
本実施例により、ファストグリーンＦＣＦは白色光源下での小腸柔毛の観察が容易となるようなコントラストを付与することが示された。同時に、共焦点顕微鏡下では上皮細胞の形状を明瞭に蛍光造影することから、ファストグリーンＦＣＦは白色光源下、赤色励起光源下のいずれの光源に対しても組織の構造を観察するために有用であることが示された。また、肝臓の共焦点顕微鏡観察においても、ファストグリーンＦＣＦは肝臓の小葉間結合組織であるグリソン鞘がよく造影されており、この結果は大腸の粘膜固有層の結合組織の蛍光が強い観察結果と共通する。すなわち、本実施例により、ファストグリーンＦＣＦは肝臓の結合組織も良好に蛍光造影することが示された。
【００４４】
実施例６
マウス（ddY、１１週齢、オス）の食道部分を摘出し、ブリリアントブルーＦＣＦを用いて染色し、共焦点顕微鏡（ライカ社製、ＴＣＰ  ＳＰ２）で観察した。
用いたブリリアントブルーＦＣＦは０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(pH７)で１０mg／mLに調製した。
撮影条件は共焦点ピンホール径を１．００airyとし、２０倍レンズを使用した。
図１３は表層から深部へ５．０μm毎に撮影した断面画像である。表層から１００μm付近までの画像が鮮明に取得できた。
組織表層付近では角化扁平上皮細胞、組織内部では扁平上皮細胞が並んでいるのが確認できた。本実施例により、ブリリアントブルーＦＣＦは食道上皮細胞の細胞間隙が蛍光造影されることが示された。
【００４５】
実施例７
ラット（Ｆ３４４／DuCrj、１５週齢、メス）の卵巣上部に生成された腫瘍組織を摘出し、共焦点顕微鏡（ライカ社製、ＴＣＰ  ＳＰ２）による組織内部の断面像の観察を行った。
ファストグリーンＦＣＦを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH７）を用いて１．０mg／mLに調製した。
ラットの腫瘍組織を摘出し、調製した染色剤に５分間浸漬して染色した。浸透しない余分なファストグリーンを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH６）で洗い流し、共焦点顕微鏡により観察を行った。
観察条件は、ピンホール径を１．００airyとし、レンズは６３倍油浸レンズを用いた。
共焦点顕微鏡の撮影画像を図１４に示す。図１４は表層から１０μm付近より下方へ５．０μm毎に撮影された連続画像である。本実施例により、ファストグリーンＦＣＦは腫瘍組織中の結合組織繊維を良好に蛍光造影することが示された。
【００４６】
実施例８
腫瘍部分の染色性を確認するためにベニコウジ黄色素を用いて、ファストグリーンＦＣＦと二重染色を行った。ベニコウジ黄色素は、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH６）を用いて１．０mg／mLに調製したものである。
共焦点顕微鏡画像を図１５に示す。
３画像は実施例７の図１４に対応して撮影されたものであり、同一部位である。ベニコウジ黄色素は細胞全体（核を除く）を染色しているのに対し、ファストグリーンＦＣＦは細胞も若干染色しているが、繊維状の部分がより強く染色されていることが比較画像より明らかである。本実施例により、ファストグリーンＦＣＦはベニコウジ黄色素とは異なる染色性を持ち、ファストグリーンＦＣＦをベニコウジ黄色素と併用することで組織を構成する細胞の構造をより明瞭に観察可能となることが示された。
【００４７】
実施例９
パテントブルーを用いて染色及び共焦点顕微鏡による観察をいった。パテントブルー(シグマ−アルドリッチ社製、Patent Blue VF)を生理食塩水で１０mg／mLに調製し、マウス（ddY、６週齢、オス）の心臓から灌流させて染色を行った。
使用したパテントブルー溶液は６００μLであり、手や足が肉眼でもわかる程度に青みを帯びていた。マウスを開腹して大腸を摘出し、共焦点システム及び切片の観察を行った。
図１６は組織の表層から６０μmの断層像である。撮影条件は２０倍レンズ使用、ピンホール径は１．００airyとした。共焦点顕微鏡はライカ社製、ＴＣＰ  ＳＰ２を使用した。図１６から、パテントブルーにより粘膜固有層は明瞭に観察できることが判明した。
【００４８】
実施例１０
実施例９で染色したマウスの大腸をおよそ６μmにスライスした凍結切片を蛍光観察し、染色性を観察した。また、隣接する凍結切片を用いてＨＥ染色を行い比較し、パテントブルー染色で蛍光観察が可能であった部位を特定した。
観察に使用したのは共焦点顕微鏡で、倍率は２０、４０、６３倍で観察した。図１７は２０倍レンズ使用でピンホール径２．６６airyのものである。
蛍光観察された大腸の切片は、内腔が強い蛍光を帯びているため観察能が高いといえる。
【００４９】
実施例１１
ギネアグリーンを用いて消化管内腔の染色を行い、その染色性を凍結切片の観察により確認した。
ギネアグリーン（シグマーアルドリッチ社製、Guinea Green B）を生理食塩水で１０mg／mLに調製し、マウス（ddY、６週齢、オス）の心臓から６００μLを灌流させた。
また、異なる凍結切片を用いてＨＥ染色を行ったものと比較し、ギネアグリーン染色により蛍光観察が可能であった部位を特定した。
観察に使用したのは共焦点顕微鏡で、倍率２０、４０、６３倍で観察した。図１８は４０倍レンズを使用しピンホール径１．００airyの条件で観察し、撮影されたものである。
図１９にギネアグリーン染色とほぼ同一箇所の薄切切片をＨＥ染色したものを示す。
この場合も実施例１０と同様に内腔側が強い蛍光を帯びていた。この結果、ギネアグリーンを用いた共焦点システムの観察能は高いことが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ファストグリーンＦＣＦの励起及び蛍光スペクトラムを示す図である。
【図２】インドシアニングリーンの励起及び蛍光スペクトラムを示す図である。
【図３】ファストグリーンＦＣＦで蛍光染色したマウス大腸の共焦点顕微鏡観察結果を示す図である。
【図４】フルオレサイトで蛍光染色したマウス大腸の共焦点顕微鏡観察結果を示す図である。
【図５】ファストグリーンＦＣＦとフルオレサイトで二重染色したマウス大腸の共焦点顕微鏡観察結果を示す図である。
【図６】ファストグリーンＦＣＦで蛍光染色したマウス大腸内腔の共焦点顕微鏡観察結果を示す図である。
【図７】インドシアニングリーンで蛍光染色したマウス大腸内腔の共焦点顕微鏡観察結果を示す図である。
【図８】ファストグリーンＦＣＦによる組織内部の染色性を示す図である。
【図９】組織切片のＨＥ染色による結果を示す図である。
【図１０】ファストグリーンＦＣＦによる十二指腸表層から４０μm付近の染色結果を示す図である。
【図１１】ファストグリーンＦＣＦによる大腸表層から約１０μm付近の染色結果を示す図である。
【図１２】ファストグリーンＦＣＦによる肝臓表層から１５μm付近の染色結果を示す図である。
【図１３】ブリリアントブルーＦＣＦによる食道表層から１００μm付近の染色結果を示す図である。
【図１４】ファストグリーンＦＣＦによる染色像をラット腫瘍表層から１０μmから５．０μm毎に連続撮影した図である。
【図１５】ベニコウジ黄色素による染色像をラット腫瘍表層から１０μmから５．０μm毎に連続撮影した図である。
【図１６】パテントブルーによるマウス大腸の共焦点顕微鏡観察結果を示す図である。
【図１７】マウス大腸のＨＥ染色像を示す図である。
【図１８】ギネアグリーンによるマウス大腸の共焦点顕微鏡観察結果を示す図である。
【図１９】マウス大腸のHE染色像を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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