(57)【要約】【課題】簡便且つ迅速な下面ビール酵母の判定方法を提供すること。【解決手段】酵母ゲノム中のLg-FLO1遺伝子のプロモーター領域、特には、翻訳開始点の上流1 bp〜上流2000 bpの領域に、下面ビール酵母特異的なDNA断片又は塩基配列が存在するか否かを検出することによって、下面ビール酵母とそれ以外の酵母、特に、下面ビール酵母と上面ビール酵母とを明確に区別する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
i)判定対象のビール酵母由来のDNAを鋳型として、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするビール酵母の遺伝子の上流1 bp〜上流2000 bpを含む領域を増幅するプライマー対を用いたPCRを行うこと、
ii)サッカロミセス・セレビシアエに属する対照ビール酵母由来のDNAを鋳型として前記プライマー対を用いたPCRを行うこと、
iii)前記判定対象のビール酵母由来のDNAを鋳型としたPCRによって得られた増幅産物と、前記対照ビール酵母由来のDNAを鋳型としたPCRによって得られた増幅産物との大きさを比較すること、
iv)前記判定対象のビール酵母由来のDNAを鋳型としたPCRによって得られた増幅産物が前記対照ビール酵母由来のDNAを鋳型としたPCRによって得られた増幅産物よりも大きい場合に、前記判定対象のビール酵母を下面ビール酵母と決定すること、
を含む、下面ビール酵母の判定方法。
【請求項２】
プライマーG_1（配列番号１９）及びプライマーG_3（配列番号２８）からなる群より選択される１のプライマーと、プライマーRG1_5（配列番号２７）プライマー、RG（配列番号１５）、プライマーRF3（配列番号２０）、プライマーHM（配列番号１６）及びプライマーH_1（配列番号３４）からなる群より選択される１のプライマーとを組合せて、プライマー対として用いる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
プライマーG_1（配列番号１９）とプライマーRG1_5（配列番号２７）との組合せをプライマー対として用いる、請求項２記載の方法。
【請求項４】
対照ビール酵母がサッカロミセス・セレビシアエに属する実験室酵母である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
電気泳動で解析した場合に、判定対象の酵母由来のDNAを鋳型としたPCRによって得られた増幅産物が、対照酵母サッカロミセス・セレビシアエ由来のDNAを鋳型としたPCRによって得られた増幅産物よりも40 bp〜130 bp大きい、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
i) 判定対象の酵母由来のDNAを鋳型として、プライマーG_1（配列番号１９）とプライマーRG1_5（配列番号２７）を用いたPCRを行うこと；及び
ii) 得られた増幅産物の大きさが電気泳動で解析して345 bp〜435 bpである場合に、判定対象の酵母を下面ビール酵母として区別すること；
を含む、下面ビール酵母の判定方法。
【請求項７】
i) 判定対象のビール酵母由来のDNAを制限酵素で断片化し、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするビール酵母の遺伝子の上流1 bp〜上流2000 bpを含むDNA断片を得ること；
ii) サッカロミセス・セレビシアエに属する対照ビール酵母由来のDNAを前記制限酵素で断片化して、DNA断片を得ること；
iii) 得られたDNA断片に、プライマーScVIII524F(配列番号２５）とプライマーScVIII525R（配列番号２６）を用いS. cerevisiaeの染色体DNAを鋳型とするPCRで増幅して得られたDNA断片をプローブとしてハイブリダイズさせること；
iv) 判定対象のビール酵母由来のDNA断片のうち前記プローブとハイブリダイズしたものの大きさが、対照ビール酵母由来のDNA断片のうち前記プローブとハイブリダイズするものの大きさよりも大きい場合に前記判定対象のビール酵母を下面ビール酵母と決定すること；
を含む、下面ビール酵母の判定方法。
【請求項８】
制限酵素が、Bam HI、Cla I、Eco RI、Eco RV及びXba Iからなる群より選択される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
電気泳動により解析した場合に、判定対象の酵母由来のDNA断片のうちプローブとハイブリダイズしたものの大きさが、対照酵母サッカロミセス・セレビシアエ由来のDNA断片のうちプローブとハイブリダイズしたものの大きさよりも40 bp〜130 bp大きい、請求項７又は８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、下面ビール酵母を判定する方法に関する。本発明は、下面ビール酵母とそれ以外の酵母とを区別する方法、また、下面ビール酵母と上面ビール酵母とを区別する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ビール酵母には大きく分けて上面ビール酵母と下面ビール酵母とがあることが知られている。ビール醸造では、発酵が終了して沈降した下面ビール酵母を回収して次回の発酵に使用するため、下面ビール酵母とそれ以外の酵母（特に、上面ビール酵母）とを区別することが重要である。酵母の一般的な凝集性測定法としては、Burns法(J. Inst. Brew., 43, 31, 1937)（非特許文献１）やHelm法(Wallerstein Lablratory Communications 16, 315, 1953)（非特許文献２）があるが、これらは培養や発酵を行う必要があるので、測定に時間（約2週間）を要する。
近年、ビール酵母染色体の解析の研究に基づき、染色体上の差異によってビール酵母を簡便に分類する方法が試みられてきた。例えばFEMS Microbiol., Letters Vol.108, p259, (1993)（非特許文献３）には、S. cerevisiae, S. bayanus等を、26SｒRNAをコードする遺伝子と5SｒRNAをコードする遺伝子との間のスペーサー領域をPCRで増幅し、制限酵素で処理した断片長の多型(RFLP)を見ることで分離できることが報告されている。
また、下面ビール酵母の染色体には、S. cerevisiaeのDNA配列と相同性が高い染色体（S. cerevisiae型染色体）とその類縁種であるS. bayanusと相同性が高い染色体（S. bayanus型染色体）の2種あることが報告されている（Yeast 14,923 (1998), System. Appl. Microbiol., 22, 341 (1999)）（非特許文献４及び５）。特開2001-8684でも、当該スペーサー領域のDNA配列を明らかにすることで、下面ビール酵母の当該領域のDNA塩基配列は、S. cerevisiae型とS. bayanus型のいずれかであることが示され、この知見に基づき、下面ビール酵母をPCRによって検出することができることが報告されている。
【０００３】
しかしながら、非特許文献３の方法では、PCRを行った後に、制限酵素処理を必要としている技術的な困難さ、手順的な複雑さがあり、下面ビール酵母を、S.cerevisiae等の極めて類縁の菌種と区別することもできない。また、特許文献１の方法では、下面ビール酵母であるか、あるいはS.cerevisiaeに類縁の酵母種であるのかは区別することができなかった。
一方、酵母の凝集性に関与するLg-FLO1遺伝子に注目し、そのDNA塩基配列から下面ビール酵母の凝集性を判定する方法やビール酵母の凝集性を調節する方法が公開されている（特開平8−205900、特開平8-266287）。これにより、Lg-FLO1遺伝子ORFのDNA塩基配列の一部は明らかになっているが全ては明らかにされておらず（特開平8-205900、特開平8-266287、DDBJ accession number AB003521、D89860）、Lg-FLO1遺伝子の染色体上の位置や、S. cerevisiae型とS. bayanus型の両方に存在するのか又はどちらか一方にのみ存在するのかについても不明であった。また、Lg-FLO1遺伝子に着目して下面ビール酵母とそれ以外の酵母とを区別することが可能であるかも不明であった。
このように、今現在、ビール醸造に使用される主要な下面ビール酵母と、上面ビール酵母等の他のSacchromyces属の酵母とを区別する適切且つ容易な方法は存在していない。
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−８６８４
【特許文献２】特開平８−２０５９００
【特許文献３】特開平８−２６６２８７
【非特許文献１】J. Inst. Brew., 43, 31, 1937
【非特許文献２】Wallerstein Lablratory Communications 16, 315, 1953
【非特許文献３】FEMS Microbiol., Letters Vol.108, p259, (1993)
【非特許文献４】Yeast 14,923 (1998)
【非特許文献５】System. Appl. Microbiol., 22, 341 (1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、下面ビール酵母とそれ以外の酵母、特には、下面ビール酵母と上面ビール酵母とを明確に区別できる、簡便且つ迅速な下面ビール酵母の判定方法を提供することである。
また、本発明の目的は、前記方法に有用である下面ビール酵母に特異性の高いプライマーやプローブを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、酵母のゲノムDNA又は酵母のゲノム由来のDNA（例えば、クローン化された酵母DNA断片）において下面ビール酵母に特異的なDNA断片又は塩基配列の存在を検出することによって、下面ビール酵母とそれ以外の酵母、特には、下面ビール酵母と上面ビール酵母とを区別する方法を見出した。その方法は、具体的には以下の通りである。
【０００７】
第一には、i) 判定対象のビール酵母由来のDNAを鋳型として、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするビール酵母の遺伝子の上流1 bp〜上流2000 bpを含む領域を増幅するプライマー対を用いたPCRを行うこと、
ii) サッカロミセス・セレビシアエに属する対照ビール酵母由来のDNAを鋳型として前記プライマー対を用いたPCRを行うこと、
iii) 前記判定対象のビール酵母由来のDNAを鋳型としたPCRによって得られた増幅産物と、前記対照ビール酵母由来のDNAを鋳型としたPCRによって得られた増幅産物との大きさを比較すること、
iv) 前記判定対象のビール酵母由来のDNAを鋳型としたPCRによって得られた増幅産物が前記対照ビール酵母由来のDNAを鋳型としたPCRによって得られた増幅産物よりも大きい場合に、前記分類対象のビール酵母を下面ビール酵母と決定すること、
を含む、下面ビール酵母の判定方法である。
あるいは、プライマーG_1（配列番号１９）及びプライマーG_3（配列番号２８）からなる群より選択される１のプライマーと、プライマーRG1_5（配列番号２７）、プライマーRG（配列番号１５）、プライマーRF3（配列番号２０）、プライマーHM（配列番号１６）及びプライマーH_1（配列番号３４）からなる群より選択される１のプライマーとを組合せて、プライマー対として用いる、前記第一の方法である。
あるいは、プライマーG_1（配列番号１９）とプライマーRG1_5（配列番号２７）との組合せをプライマー対として用いる、前記第一の方法である。
あるいは、対照ビール酵母がサッカロミセス・セレビシアエに属する実験室酵母である、前記第一の方法である。
あるいは、電気泳動で解析した場合に、判定対象の酵母由来のDNAを鋳型としたPCRによって得られた増幅産物が、対照酵母サッカロミセス・セレビシアエ由来のDNAを鋳型としたPCRによって得られた増幅産物よりも40 bp〜130 bp大きい、前記第一の方法である。
【０００８】
第二には、i) 判定対象の酵母由来のDNAを鋳型として、プライマーG_1（配列番号１９）とプライマーRG1_5（配列番号２７）を用いたPCRを行うこと；及び
ii) 得られた増幅産物の大きさが電気泳動で解析して345 bp〜435 bpである場合に、判定対象の酵母を下面ビール酵母として区別すること；
を含む、ビール酵母の判定方法である。
第三には、i) 判定対象のビール酵母由来のDNAを制限酵素で断片化し、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするビール酵母の遺伝子の上流1 bp〜上流2000 bpを含むDNA断片を得ること；
ii) サッカロミセス・セレビシアエに属する対照ビール酵母由来のDNAを前記制限酵素で断片化して、DNA断片を得ること；
iii) 得られたDNA断片に、プライマーScVIII524F(配列番号２５）とプライマーScVIII525R（配列番号２６）を用いS. cerevisiaeの染色体DNAを鋳型とするPCRで増幅して得られたDNA断片をプローブとしてハイブリダイズさせること；
iv) 判定対象のビール酵母由来のDNA断片のうち前記プローブとハイブリダイズしたものの大きさが、対照ビール酵母由来のDNA断片のうち前記プローブとハイブリダイズするものの大きさよりも大きい場合に前記判定対象のビール酵母を下面ビール酵母と決定すること；
を含む、下面ビール酵母の判定方法である。
あるいは、制限酵素が、Bam HI、Cla I、Eco RI、Eco RV及びXba Iからなる群より選択される、前記第三の方法である。
あるいは、電気泳動により解析した場合に、判定対象の酵母由来のDNA断片のうちプローブとハイブリダイズしたものの大きさが、対照酵母サッカロミセス・セレビシアエ由来のDNA断片のうちプローブとハイブリダイズしたものの大きさよりも40 bp〜130 bp大きい、前記第三の方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、下面ビール酵母とそれ以外の酵母とを区別する正確で且つ迅速な方法、特には、下面ビール酵母と上面ビール酵母とを区別する、正確で簡便且つ迅速な判定方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、酵母ゲノム中に下面ビール酵母特異的なDNA断片又は塩基配列が存在するか否かを検出することによって、下面ビール酵母とそれ以外の酵母、特に、下面ビール酵母と上面ビール酵母と明確に区別する方法である。また、本発明は、酵母ゲノム中のLg-FLO1遺伝子のプロモーター領域、具体的には、翻訳開始点の上流1 bp〜上流2000 bpの領域に、下面ビール酵母特異的なDNA断片又は塩基配列が存在するか否かを検出することによって、下面ビール酵母とそれ以外の酵母、特に、下面ビール酵母と上面ビール酵母とを明確に区別する方法である。また、本発明は、前記領域を特異的に増幅できる特異性の高いプライマーを用いて一段階のPCRを行うことによって、明確、簡便且つ迅速に、下面ビール酵母を検出する方法である。
【００１１】
ビール酵母とは、一般にビール醸造に使用される酵母を指し、生物学的分類でいうと、例えばサッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・パストリアヌス(Saccharomyces pastorianus)が挙げられる。
歴史的には、「上面ビール酵母」と「下面ビール酵母」との区別は、ビール醸造過程で発酵後に見られるビール酵母の動態（表面付近に浮き上がる又は凝集して沈む）により区別されてきたが、今現在、当業者間では、下面ビール酵母と上面ビール酵母とは生物学的分類において異なる種であり、上面ビール酵母は主としてサッカロミセス・セレビシアエ(S. cerevisiae)に分類され、下面ビール酵母はサッカロミセス・セレビシアエとサッカロミセス・バヤナス(S. bayanus)との交雑体であってサッカロミセス・パストリアヌス(S. pastorianus)に分類されるという見解が一般的となっている。従って、本発明の方法は、サッカロミセス・パストリアヌスと他のサッカロミセス属の類縁種とを区別する方法、特にはサッカロミセス・パストリアヌスとサッカロミセス・セレビシアエとを区別する方法ということもできる。
【００１２】
本発明者らは、下面ビール酵母に特異的なDNA断片又は塩基配列がビール酵母の凝集性に関するLg-FLO1タンパク質（配列番号５）をコードするLg-FLO1遺伝子のプロモーター領域、具体的には、Lg-FLO1遺伝子の翻訳開始点の上流1 bp〜約2000 bpの領域、より具体的には、Lg-FLO1遺伝子の翻訳開始点の上流1 bp〜約400 bpの領域（配列番号３）に存在することを見出した。下面ビール酵母VIII染色体のLg-FLO1遺伝子上流のDNA塩基配列はサッカロミセス・セレビシアエのVIII染色体上右腕のDNA塩基配列と一致する領域を多く有するが、下面ビール酵母のLg-FLO1遺伝子の翻訳開始点上流領域には、サッカロミセス・セレビシアエの対応領域と比較して付加的なDNA塩基配列が存在しており、そのようなDNA塩基配列を本明細書において、下面ビール酵母に特異的なDNA断片又は塩基配列という。典型的には、配列番号１の配列若しくはその類似配列が直列に２以上繰り返した配列又はそのような配列を有する断片を指す。配列番号１の配列が３以上繰り返すのが好ましく、最も好ましくは配列番号１の配列が３つ繰り返すDNA塩基配列（配列番号２）又はそのような配列を有する断片である。本明細書において、そのような配列が存在する領域を下面ビール酵母特異的な領域とも呼ぶ。
また、本発明者らは、今まで不明であったLg-FLO1遺伝子の染色体上の位置及びそのORFの全塩基配列（配列番号４）も明らかにした。
さらに、本発明者らは、下面ビール酵母特異的なDNA断片又は塩基配列を含むLg-FLO1遺伝子上流領域が、Lg-FLO1遺伝子のプロモーターとしての機能を有することも見出した（実施例４）。当業者間では、プロモーターの3'末端領域にmRNAポリメラーゼが結合することによって対象遺伝子が発現することが知られており、従って、下面ビール酵母特異的なDNA断片又は塩基配列を含む上述の領域に高い相同性を有する塩基配列も、mRNAポリメラーゼが結合可能な限りにおいてLg-FLO1遺伝子のプロモーターとしての機能を有することが予測される。
【００１３】
本発明の判定方法では、判定対象の酵母細胞からゲノムDNAを抽出及び/又は精製して、そのゲノムDNAが下面ビール特異的なDNA断片又は塩基配列を有するか否かを検出する。あるいは、判定対象の酵母細胞から抽出及び/又は精製したゲノムDNA由来のDNA（例えば、クローン化された酵母DNA断片）について、下面ビール特異的なDNA断片又は塩基配列を有するか否かを検出してもよい。よって、本明細書において「酵母由来のDNA」は、酵母から抽出（及び精製）されたゲノムDNA並びにそのようなゲノムDNA由来のDNA例えば、クローン化された酵母DNA断片）を含む。
酵母からのゲノムDNA抽出は、公知の方法のいずれを用いて行ってもよい。例えば、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, P130(1990)などに記載の方法が挙げられる。また、DNA抽出用のキットやカラム等、例えばQiagen社のQiagen Genomic-tip 500/G等を用いて行うこともできる。本発明では、抽出したゲノムDNAをそのまま、PCRの鋳型として用いることができ、又は制限酵素処理してサザンハイブリダイゼーションに用いることができる。抽出したゲノムDNAは、PCRの場合には約1 ng/mlの濃度で、サザンハイブリダイゼーションの場合は約2〜5 μgが用いられる。
本発明の下面ビール酵母特異的なDNA断片又は塩基配列の有無を検出するためには、特定の塩基配列の存在及び特定の塩基配列に対する相同性を調べる公知な手法のいずれをも用いることができる。例えば、PCR（Polymerase Chain Reaction）法、サザンハイブリダイゼーション、シークエンシングなどの手法を、単独で又は組み合わせて用いることができる。簡便且つ迅速な判定という観点からは、PCR反応及び/又はサザンハイブリダイゼーションが好ましく、最も好ましくは、制限酵素処理やクローン化を必要としない一段階のPCR反応である。
【００１４】
PCR法は、Saikiらが開発した方法（Science 230, 1350(1985)）を参考にして実施することもできる。PCR反応に用いるポリメラーゼは、一般にPCRに用いられる高温耐性のポリメラーゼでよいが、長い断片を増幅する場合には特に長鎖を増幅することのできるものが好ましい。そのようなポリメラーゼとしてはTaKaRa Ex Taq（タカラバイオ社）などが挙げられる。市販されているPCRキット、例えばタカラバイオ社のPerfectShot Ex Taqなどを用いて行うこともできる。
PCRに用いるプライマーは、下面ビール酵母特異的なDNA断片又は塩基配列を含む領域を増幅できるように設計することが必要であり、プライマー設計用プログラムを用いて設計してもよい。当業者であれば、所望のDNA増幅領域を考慮して適切なPCRプライマーを設計することができるであろう。例えば、配列番号３の塩基番号１〜１５６の領域からセンス鎖の連続する約15 bp〜約30 bpの配列を選択して順方向のプライマーを設計し、配列番号３の塩基番号２４１〜３８５又は配列番号４の塩基番号１〜３８５２の領域からアンチセンス鎖の連続する約15 bp〜約30 bpの配列を選択して逆方向のプライマー（アンチセンスプライマー）を設計することもできる。また、このように選択した連続する塩基配列の5'末端側に1 bp〜10 bpの任意の塩基配列が付加されていても、プライマーとして用いることができる。プライマーは、一般的には、プライマー中のGC含量が40 ％〜60 ％となるように設計される。一般的なプライマーの長さは15 bp〜30 bp（15 mer〜30 mer）であり、本発明に使用するものとしては15 bp〜50 bp（15 mer〜50 mer）のものが好ましく、最も好ましくは20 bp〜30 bp（20 mer〜30 mer）である。
【００１５】
具体的なプライマーセットとしては、例えば、センスプライマーG_1（配列番号１９）とアンチセンスプライマーRG1_5（配列番号２７）との組合せ、センスプライマーG_1（配列番号１９）とアンチセンスプライマーRG（配列番号１５）との組合せ、センスプライマーG_1（配列番号１９）とアンチセンスプライマーRF3（配列番号２０）との組合せ、センスプライマーG_1（配列番号１９）とアンチセンスプライマーHM（配列番号１６）との組合せ、センスプライマーG_1（配列番号１９）とアンチセンスプライマーH_1（配列番号３４）との組合せ、センスプライマーG_3（配列番号２８）とアンチセンスプライマーRG1_5（配列番号２７）との組合せ、センスプライマーG_3（配列番号２８）とアンチセンスプライマーRG（配列番号１５）との組合せ、センスプライマーG_3（配列番号２８）とアンチセンスプライマーRF3（配列番号２０）との組合せ、センスプライマーG_3（配列番号２８）とアンチセンスプライマーHM（配列番号１６）との組合せ、センスプライマーG_3（配列番号２８）とアンチセンスプライマーH_1（配列番号３４）との組合せ等を選択することができる。最も好ましくは、センスプライマーG_1（配列番号１９）とアンチセンスプライマーRG1_5（配列番号２７）との組合せである。これらのプライマーの5'末端側に1 bp〜10 bpの任意の塩基配列が付加されていても、又は標識（ビオチンなど）が付加されていても、本発明の方法のためのプライマーとして用いることができる。
本発明のPCR反応条件は、一般的な条件に従って行うことができる。また、使用するプライマーのGC含量や長さ及び使用する酵素（ポリメラーゼ）の性質などを考慮して、最適な条件（温度、時間、サイクル数）を決定してもよい。キットを用いる場合には、その供給元が提供する使用説明書に沿って行ってもよい。具体的には、熱変性過程92 ℃〜99 ℃にて1 秒間〜120 秒間；アニーリング過程42 ℃〜65 ℃にて1 秒間〜2 分間；伸長過程55 ℃〜75 ℃にて1 秒間〜2 分間のサイクルを1〜50回といったPCR条件を用いることができる。また、アニ−リング過程と伸長過程は、同一温度で行うこともできる。
【００１６】
このようなプライマー及び条件を用い判定対象のビール酵母由来のDNAを鋳型としてPCRを行って得られた増幅産物の大きさを、S. cerevisiaeに属する対照酵母、例えば実験室酵母又は上面ビール酵母由来のDNAを鋳型として同じプライマー及び条件を用いてPCRを行った結果得られる増幅産物の大きさと比較することができる。その結果、判定対象のビール酵母由来のDNAを鋳型として得られたPCR増幅産物の大きさが、対照酵母由来のDNAを鋳型として得られたPCR増幅産物の大きさよりも大きい場合は、判定対象のビール酵母が下面ビール酵母であると決定することができる。また、判定対象のビール酵母由来のDNAを鋳型として得られたPCR増幅産物の大きさが、対照酵母由来のDNAを鋳型として得られたPCR増幅産物の大きさと同等である場合は、判定対象のビール酵母が上面ビール酵母であると決定することができる。
判定対象のビール酵母由来のDNAを鋳型としてPCRを行って得られた増幅産物は、対照酵母由来のDNAを鋳型として同じプライマー及び条件を用いたPCR産物の大きさと比較しなくても、判定することができる。具体的には、センスプライマーG_1（配列番号１９）とアンチセンスプライマーRG1_5（配列番号２７）を用いて判定対象のビール酵母由来のDNAを鋳型としてPCRを行い、得られた増幅産物の大きさが電気泳動で解析して345 bp〜435 bp、典型的には380 bp〜400 bpである場合は、判定対象のビール酵母が下面ビール酵母であると決定することができる。
【００１７】
また、下面ビール酵母特異的なDNA断片又は塩基配列の存在を検出する別の方法として、サザンハイブリダイゼーションを挙げることができる。サザンハイブリダイゼーションは、判定対象の酵母のゲノムDNAを制限酵素処理により断片化して電気泳動を行い、プローブとハイブリダイズさせて、ハイブリダイズしたDNA断片の大きさの違いを検出することができる。
用いられる制限酵素は、酵母のゲノムDNAを断片化した場合に、プローブにハイブリダイズする領域と下面ビール酵母特異的なDNA断片又は塩基配列の存在する領域（下面ビール酵母特異的な領域）とが同一のDNA断片上に存在するようなものを選択することができる。当業者であれば、そのような制限酵素を適切に選択することができる。本発明の方法では、例えば、Bam HI、Cla I、Eco RI、Eco RV又はXba Iなどの制限酵素を用いることができる。
【００１８】
サザンハイブリダイゼーションに用いるプローブは、下面ビール酵母特異的なDNA断片又は塩基配列を含む領域を特異的に検出できるように設計すればよい。すなわち、制限酵素処理して得られた酵母ゲノムDNA断片が、プローブがハイブリダイズする領域と下面ビール酵母特異的なDNA断片又は塩基配列を含む領域との両方を有すればよい。本発明の場合、Lg-FLO1遺伝子のORF領域を含むプローブを用いると、Lg-FLO1遺伝子の他にもFLO1遺伝子等のFLO1ホモログ遺伝子のような複数のハイブリダイズし得る遺伝子があり、ハイブリダイズするバンドが複数生じるため、ハイブリダイゼーション結果の解析を明瞭におこなうことができない。そこで、Lg-FLO1遺伝子の上流部分に存在するS. cerevisiae VIII染色体右腕特異的なDNA塩基配列を含むプローブを用いて、FLO1ホモログ遺伝子による複数のハイブリダイズするバンドによる解析の困難性を克服することができた。S. cerevisiae VIII染色体右腕に特異的なDNA塩基配列を有するプローブは、S. cerevisiaeのゲノムデータ-ベースであるSGD(Saccharomyces Genome Datebase, http://www.yeastgenome.org/)を検索して設計することができる。Lg-FLO1遺伝子翻訳開始点の上流1 bp〜上流約20 kbpの範囲で適切なプローブを設計すれば、ハイブリダイズしたDNA断片の大きさを比較することでLg-FLO1遺伝子内の欠失を確認することができる。具体的には、プライマーScVIII524F(配列番号２５)とプライマーScVIII525R（配列番号２６）を用い実験室酵母S. cerevisiaeの染色体DNAを鋳型とするPCRで増幅して得られる約1 kbpのDNA断片（Lg-FLO1遺伝子翻訳開始点の上流約1 kbp〜約2 kbp）が挙げられ、このプローブは、Lg-FLO1遺伝子の上流1 bp〜上流2000 bpの領域を含むDNA断片とハイブリダイズし得る。
【００１９】
またプローブは、ハイブリダイズしたDNA断片を検出するために、予め放射性同位体(32P)や非放射性マーカー（アルカリホスファターゼ、ビオチン等）などによって標識しておく。プローブの標識は一般的な方法を用いて行うことができ、キット、例えばAlkPhos Direct Labelling and Detection System（アマシャム社）などを用いて行ってもよい。
ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で行うことができる。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を言う。例えば、プローブを放射線同位元素32Pで標識した場合は、サザンハイブリダイゼーションにおける洗浄条件が55 ℃〜70 ℃、0.2〜2×SSC、0.1 ％SDS、好ましくは65 ℃、2×SSC、0.1 ％SDSに相当する条件が挙げられる。この条件と同等な条件は当業者に良く知られたものであり、例えばMolecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)等にも記載されている。
そのようなプローブ及び条件を用いてハイブリダイゼーションを行って、プローブとハイブリダイズした判定対象のビール酵母由来のDNA断片の大きさを、プローブとハイブリダイズした対照酵母、例えば実験室酵母又は上面ビール酵母由来のDNA断片の大きさと比較することができる。その結果、プローブとハイブリダイズした判定対象のビール酵母由来のDNA断片の大きさが、プローブとハイブリダイズした対照酵母由来のDNA断片の大きさよりも大きい場合は、判定対象のビール酵母が下面ビール酵母であると決定することができる。また、プローブとハイブリダイズした判定対象のビール酵母由来のDNA断片の大きさが、プローブとハイブリダイズした対照酵母由来のDNA断片の大きさと同等である場合は、判定対象のビール酵母が上面ビール酵母であると決定することができる。
【００２０】
DNA断片を大きさによって分離及び/又は精製するために、アガロースゲルやポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動が一般的に用いられる。ゲルのアガロース濃度又はポリアクリルアミド濃度、泳動緩衝液、電圧条件等は、対象とするDNA断片の大きさや所望の分離能に依存し、当業者であれば技術常識に基づいて適切な値や条件を選択することができる。本発明の方法では、50 bp〜2000 bpのDNA断片について、40 bp〜 130 bpの大きさの違いを検出することができればよい。よって、本発明の方法では、アガロースゲルの場合は2 ％〜6 ％のアガロース濃度、好ましくは3.5 ％〜4.5 ％のアガロース濃度を用いることができる。泳動緩衝液は、例えば、TAE（トリス酢酸）バッファー、TBE(トリスホウ酸)バッファー、TPE（トリスリン酸）バッファーなどを用いることができる。
アガロース電気泳動によって分離したDNA断片の大きさの違いは、一般に用いられる方法によって検出することができる。例えば、PCR産物の場合はエチジウムブロマイド等を用いてDNAのバンドを可視化することによって検出することができ、サザンハイブリダイゼーションの場合は、予めプローブに標識されている放射性同位体や非放射性マーカーなどをオートラジオグラフィーや酵素反応など適切な手法で検出することによって、プローブとハイブリダイズしたDNA断片のバンドを可視化することができる。
【実施例１】
【００２１】
＜Lg-FLO1遺伝子の全DNA塩基配列及びLg-FLO1遺伝子上流のDNA塩基配列の決定＞
（１）下面ビール酵母のVIII染色体右腕末端周辺由来のコスミドのクローニング
下面ビール酵母の凝集性に関与するLg-FLO1遺伝子は、これまでの凝集性に関する研究からVIII染色体に存在することが予想されたが(J. Amer. Soc. Brew. Chem. 59, 107 (2001), J. Biosci. Bioeng., 93, 395 (2002))、S. cerevisiae型、S. bayanus型のいずれのVIII染色体上に存在するのかは明らかとなっていなかった。そこで、Lg-FLO1遺伝子が下面ビール酵母のS. cerevisiae型、S. bayanus型のいずれのVIII染色体上に存在するのかを明らかにするため、下面ビール酵母のVIII染色体右腕末端のコスミドクローンのクローニングを行った。
【００２２】
下面ビール酵母FY-2株を100mlのYPD培地（1 ％ Yeast extract, 2 ％ Petone, 2 ％ Glucose）で培養後、Qiagen社のQiagen Genomic-tip 500/G(Cat. No.10262)のプロトコールを用いて、下面ビール酵母FY-2株のゲノムDNAを抽出した。抽出されたゲノムDNAは、約0.5 mg/mlの濃度で、約0.5mlであった。
抽出した下面ビール酵母FY-2株のゲノムDNAから、EPICENTRE社のCopyControlTM Fosmid Library Production Kitのプロトコールに従って、コスミドライブラリーを作製した。調整したFY-2株ゲノムDNA溶液0.1mlを超音波処理することで、低分子化し、5〜20 ％ ショ糖密度勾配遠心法（日立超遠心機 CP65β, スイングローターP28S , 26000 rpm, 16時間）で、約40 kbpのDNA断片のフラクションを回収し、エタノール沈殿によって濃縮した。得られた下面ビール酵母FY-2株の約40 kbpのゲノムDNA 約0.25 μgを、EPICENTRE社製のコスミドCopyControlpCC1FOSTM(EPICENTRE社Cat. No. CCFOS110) 0.5 μgとT4 DNAライゲースによってライゲーションし、ライゲーション溶液をインビトロパッケージングキット MaxPlaxTM Lambda Packaging Extractでパッケージングした後、大腸菌EPI300-T1R株に形質導入して、下面ビール酵母のゲノムライブラリーを作製した。形質導入された大腸菌はクロラムフェニコール耐性菌として選択した。
【００２３】
下面ビール酵母VIII染色体右腕末端周辺の由来のコスミドのクローニングは、クロラムフェニコール含有LB培地（1 ％ Typotone, 0.5 ％ Yeast extract, 1 ％ NaCl, 1.5 ％ agar, クロラムフェニコール 12.5 μg/ml）で生育した形質導入株をコロニーハイブリダイゼーションして候補となるクローンを選択し、その末端DNA塩基配列を決定して、S. cerevisiae及びS. bayanusとの相同性を検討することで行った。コロニーハイブリダイゼーションは、クロラムフェニコール含有LB培地に生育した形質導入株のコロニーを、ナイロン膜（アマシャム社製Hybond-N+）に転写した後、0.4N NaOH-1.5M NaCl溶液に7分間浸漬し、0.5M Tris-HCl(pH7.0)-1.5M NaCl溶液で3分間、2回浸漬することで中和し、2×SSC（0.3M NaCl-0.3M クエン酸ナトリウム pH7.0）溶液に浸漬することで、ナイロン膜に形質導入株のDNAを固定した。コロニーハイブリダイゼーションに用いたプローブは、実験室酵母Sacchaormyces cerevisiaeの第VIII染色体右腕に座乗する遺伝子であるSCH9, SKN7, BAT1遺伝子等のORFをコードするDNAフラグメントを、実験室酵母S. cerevisiae YPH500株の染色体DNAを鋳型としたPCRにより増幅して用いた。プローブとする各遺伝子ORFを増幅するためのPCRに用いるプライマーは、S. cerevisiaeのゲノムデータ-ベースであるSGD(Saccharomyces Genome Datebase, http://www.yeastgenome.org/)を検索することで決定した。PCRは、タカラバイオ社製Perfect shotを用い、そのプロトコールに従った。PCRの条件は、94℃ 30秒間、55℃ 30秒間、72℃ 1分間のサイクルを30回、72℃にて5分間で終了とした。プローブの標識とハイブリダイゼーション及び検出の方法は、アマシャム社のAlkPhos Direct Labelling and Detection Systemのプロトコールに従った。
コロニーハイブリダイゼーションの結果、下面ビール酵母のVIII染色体右腕末端周辺由来のコスミドと考えられる4つのクローン（9_M04、3_H24、10_P04、12_J12）を得ることができた。これらの各コスミドクローンから、Qiagen tip 500のプロトコールに従ってコスミドDNAを抽出し、ベックマンコールター社製のDNAシークエンサーCEQ8000のプロトコール（GenomeLabTM Dye Terminator Cycle Sequencing with Qiuk Start Kit P/N608120）に従って、挿入DNAの末端DNA塩基配列を決定した。シークエンス用のプライマーは、pCC1TM/pEpiFOSTM Forward Sequencing Primer (EPICENTRE社Cat. No. F5FP010)あるいは、pCC1TM/pEpiFOSTM Reverse Sequencing Primer (EPICENTRE社Cat. No. F5RP010)を用いて行った。
【００２４】
決定したDNA塩基配列の相同性の検索は、S. cerevisiaeに対しては、S. cerevisiaeのゲノムデータ-ベースであるSGD(Sacchromyces Genome Datebase, http://www.yeastgenome.org/)を検索することで行った。S. cerevisiaeの類縁菌であるS. bayanusとの相同性は、ワシントン大学のGenome Sequencing Centerのホームページ上(http://genomeold.wustl.edu/projects/yeast/)で検索することで行った。
【００２５】
コスミドクローン9_M04の挿入DNAについて決定した塩基配列のうち、pCC1TM/pEpiFOSTMForward Sequencing Primerを用いて決定したDNA塩基配列（配列番号６）は、実験室酵母S． cerevisiaeのVIII染色体の配列に対して高い相同性（687塩基中686塩基が一致、相同性99 ％）を示し、S. cerevisiaeの類縁種であるS. bayanusの一つのcontigとの相同性（550塩基中469塩基が一致、相同性85 ％）はS. cerevisiaeのものと比較すると低いものであった。pCC1TM/pEpiFOSTM Reverse Sequencing Primerを用いて決定したDNA塩基配列（配列番号７）についても同様であって、S. bayanus由来のcontigとの相同性（373塩基中301塩基が一致、相同性80 ％）に比べて、S. cerevisiaeとの相同性（704塩基中697塩基が一致、相同性99 ％）の方が高かった。コスミドクローン9_M04の挿入DNAのうち、pCC1TM/pEpiFOSTM Forward Sequencing Primerを用いて決定したDNA塩基配列は、S. cerevisiae VIII染色体上にあるERG9遺伝子と高い相同性を有していた。また、コスミドクローン9_M04の挿入DNAをpCC1TM/pEpiFOSTM Reverse Sequencing Primerを用いて決定したDNA塩基配列は、S. cerevisiae VIII染色体上にあるYHR210C遺伝子と高い相同性を有していた。以上の結果より、コスミドクローン9_M04は、下面ビール酵母のS. cerevisiae型VIII染色体の図１に示した領域のDNA、すなわち、下面ビール酵母のS. cerevisiae 型のVIII染色体上にあるERG9遺伝子とYHR210C遺伝子との間の領域のDNAが挿入されているものと考えられた(図１)。
【００２６】
コスミドクローン3_H24の挿入DNAのうち、pCC1TM/pEpiFOSTM Forward Sequencing Primerを用いて決定したDNA塩基配列（配列番号８）は、S. cerevisiaeとの相同性(674塩基中573塩基が一致、相同性85 ％)に比べて、S. bayanusとの相同性（696塩基中648塩基が一致、相同性93 ％）の方が高かった。コスミドクローン3_H24の挿入DNAのうち、pCC1TM/pEpiFOSTM Reverse Sequencing Primerを用いて決定したDNA塩基配列（配列番号９）も、S. cerevisiaeとの相同性(620塩基中510塩基が一致、相同性82 ％)に比べて、S. bayanusとの相同性（623塩基中583塩基が一致、相同性93 ％）の方が高かった。pCC1TM/pEpiFOSTM Forward Sequencing Primerを用いて決定したDNA塩基配列（配列番号８）は、S. cerevisiae VIII染色体上にあるSCH9遺伝子と比較的高い相同性を有しており、pCC1TM/pEpiFOSTM Reverse Sequencing Primerを用いて決定したDNA塩基配列（配列番号９）は、S. cerevisiae VIII染色体上にあるKOG1遺伝子と比較的高い相同性を有していた。従って、コスミドクローン3_H24は、下面ビール酵母のS. bayanus型VIII染色体の図１に示した領域のDNA、すなわち、KOG1遺伝子からSCH9遺伝子の間のDNAが挿入されているものと考えられた。なお、コスミドクローン3_H24の挿入DNAについて決定したDNA塩基配列（配列番号８及び９）は、これまでに報告があったS. cerevisiaeあるいはS. bayanusいずれのDNA塩基配列とも一致していない、新規なDNA塩基配列である。
【００２７】
コスミドクローン10_P04の挿入DNAのうち、pCC1TM/pEpiFOSTM Forward Sequencing Primerを用いて決定したDNA塩基配列（配列番号１０）は、S. cerevisiae IX染色体との高い相同性があったのに対し(541塩基中517塩基が一致、相同性95 ％)、S. bayanusとの相同性はこれに比較すると低いものであった（360塩基中300塩基が一致、相同性83 ％）。pCC1TM/pEpiFOSTM Reverse Sequencing Primerを用いて決定したDNA塩基配列（配列番号１１）も、S. cerevisiae VIII染色体との高い相同性があったのに対し(490塩基中483塩基が一致、相同性98 ％)に比べて、S. bayanusとの相同性はこれと比較して低いものであった（143塩基中123塩基が一致、相同性86 ％）。コスミドクローン10_P04の挿入DNAをpCC1TM/pEpiFOSTM Forward Sequencing Primerを用いて決定したDNA塩基配列（配列番号１０）は、S. cerevisiae IX染色体上のYIL169c遺伝子と高い相同性を有していた。一方、コスミドクローン10_P04の挿入DNAのうち、pCC1TM/pEpiFOSTM Reverse Sequencing Primerを用いて決定したDNA塩基配列（配列番号１１）は、S. cerevisiae VIII染色体上のNVJ1遺伝子と高い相同性を有していた。従って、コスミドクローン10_P04は、図７に示す部分のDNA、すなわち、S. cerevisiae VIII染色体上のNVJ1遺伝子から右腕部分が途中、S. cerevisiae IX染色体上のYIL169c遺伝子周辺で組み換わった領域が挿入されていると考えられた。
【００２８】
コスミドクローン12_J12の挿入DNAのうち、pCC1TM/pEpiFOSTM Forward Sequencing Primerを用いて決定したDNA塩基配列（配列番号１２）は、S. cerevisiae VIII染色体との高い相同性があったのに対し(500塩基中493塩基が一致、相同性98 ％)、S. bayanusとの相同性はこれに比較すると低いものであった（341塩基中274塩基が一致、相同性80 ％）。コスミドクローン12_J12の挿入DNAのうち、pCC1TM/pEpiFOSTM Reverse Sequencing Primerを用いて決定したDNA塩基配列（配列番号１３）も、S. cerevisiae IX染色体との高い相同性があったのに対し(409塩基中388塩基が一致、相同性94 ％)に比べて、S. bayanusのcontigと高い相同性を示さなかった。コスミドクローン12_J12の挿入DNAをpCC1TM/pEpiFOSTM Forward Sequencing Primerを用いて決定したDNA塩基配列（配列番号１２）は、S. cerevisiae VIII染色体上のYHR209w遺伝子と高い相同性を有していた。一方、コスミドクローン12_J12の挿入DNAをpCC1TM/pEpiFOSTM Reverse Sequencing Primerを用いて決定したDNA塩基配列（配列番号１３）は、S. cerevisiae IX染色体上の左腕テロメアの配列及び周辺配列と高い相同性を有していた。従って、コスミドクローン12_J12は、S. cerevisiae VIII染色体上のYHR209w遺伝子から右腕部分の途中が、S. cerevisiae IX染色体の左腕のテロメアから周辺領域に組み換わっていると考えられた（図１）。
以上、コスミドクローン10_P04及び12_J12の検討結果より、試験に用いた下面ビール酵母FY-2株のS. cerevisiae型VIII染色体右腕末端周辺が、S. cerevisiae IX染色体上の左腕テロメアの配列及び周辺配列が挿入された構造の染色体の存在も考えられた。なお、J. Biosci. Bioeng., 93, 395 (2002)には、下面ビール酵母のLg-FLO1遺伝子のORF内から、S. cerevisiae IX染色体上の左腕テロメアの配列及び周辺配列が挿入された染色体が存在することが報告されている。
【００２９】
（２）Lg-FLO1遺伝子の下面ビール酵母染色体上の位置の解明
前述の実験より、下面ビール酵母のS. cerevisiae型及びS. bayanus型のVIII染色体右腕末端周辺のDNA塩基配列の一部があきらかになったので（配列番号７、配列番号８）、既に明らかになっている部分的なLg-FLO1遺伝子のDNA塩基配列（DDBJ accession number D89860, AB003521）の一部を用いて、PCRを行うことで、Lg-FLO1遺伝子が下面ビール酵母のS. cerevisiae型、S. bayanus型のいずれのVIII染色体に位置するかを明らかにすることを試みた。
下面ビール酵母FY-2株のS. cerevisiae型VIII染色体右腕末端周辺のDNA塩基配列（配列番号７）より、プライマー9M04R1（5'-CTTCTTGAGATGGAAGGAGCTGATGCTAC-3'）（配列番号１４）を作製し、一方、Lg-FLO1遺伝子のDNA塩基配列のうち、既に明らかとなっている部分（DDBJ accession number D89860）より、プライマーRG(5'-CCAAAAAGATCAGAACTCCAAGAGGCAG-3')（配列番号１５）を作製し、あるいは、同様に既に明らかになっている部分（DDBJ accession number AB003521）より、プライマーHM(5'-CGTTTACCATACGATTGCCAGCAATACGG-3')（配列番号１６）を作製し、下面ビール酵母FY-2株の染色体DNAを鋳型として、PCRを行った。PCRは、タカラバイオ社製TakaRa LA TaqTM with GC Bufferのプロトコールに従って行った。すなわち、鋳型DNAは、前述した方法で精製した下面ビール酵母FY-2株のゲノムDNAを、最終濃度1 ng/mlで、各プライマーの最終濃度は0.2 μM、反応BufferはGC Buffer I、PCR反応条件は、94℃で1分間の後、94℃ 30秒間、60℃ 30秒間、72℃ 2分間のサイクルを30回、72℃で5分間で終了とした。PCRの増幅産物は、1 ％アガロース電気泳動で確認した。
同様に、下面ビール酵母のS. bayanus型VIII染色体右腕末端周辺のDNA塩基配列（配列番号８）よりプライマー3H24F1（5'-GTCTCTAGGTGTATTGATATTCGAAATGTG-3'）（配列番号１７）を作製し、一方、Lg-FLO1遺伝子のDNA塩基配列のうち、既に明らかとなっている部分（DDBJ accession number AB003521）からのプライマーRGあるいは、同様に既に明らかになっている部分（DDBJ accession number AB003521）より作製したプライマーHMを用いて、下面ビール酵母FY-2株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。PCRの条件等は、タカラバイオ社製TakaRa LA TaqTM with GC Bufferのプロトコールに従った前述の場合と同様であった。
その結果、S. cerevisiae型VIII染色体右腕末端周辺のDNA塩基配列を用いてPCRを行った場合にのみ、増幅産物を得ることができ（図２、レーン1,2）、S. bayanus型VIII染色体右腕末端周辺のDNA塩基配列を用いてPCRを行った場合には、増幅産物を得ることはできなかった（図２、レーン3,4）。以上より、Lg-FLO1遺伝子は、下面ビール酵母染色体のうち、S. cerevisiae型の VIII染色体の右腕末端に存在することがわかった（図１）。
【００３０】
（３）Lg-FLO1遺伝子の全DNA塩基配列及びLg-FLO1遺伝子上流のDNA塩基配列の決定
前述（２）の実験により、Lg-FLO1遺伝子の下面ビール酵母染色体上の位置が明らかとなったので、Lg-FLO1遺伝子ORFの後半部分のクローニングを行うため、既知の部分的なLg-FLO1遺伝子のDNA塩基配列（DDBJ accession number D89860）から作製したプライマーF3（5'-GCTTCCTGTTAGTGTGGTATTGCCAGATGG-3'）（配列番号１８）と、既知の部分的なLg-FLO1遺伝子のDNA塩基配列（DDBJ accession number AB003521）から作製したプライマーH_1（5'-AAGCTTTTTTGTAAAACAGATTTTTTGCC-3'）（配列番号３４）とを用いて、PCRを行った。そのPCR産物をプラスミドpCR2.1（Invitogen. Inc.）に挿入し、プラスミドpCR-LgFLO1を作製した。PCRの条件は、前述したタカラバイオ社製TakaRa LA TaqTM with GC Bufferのプロトコールに従って行ったものと同じである。すなわち、鋳型DNAは、前述した方法で精製した下面ビール酵母FY-2株のゲノムDNAを、最終濃度1 ng/mlで、各プライマーの最終濃度は0.2 μM、反応BufferはGC Buffer I、PCR反応条件は、94℃で1分間の後、94℃ 30秒間、60℃ 30秒間、72℃ 2分間のサイクルを30回、72℃にて5分間で終了とした。そのPCR産物をInvitrogen社のTOPO TA Cloningのプロトコールに従い、プラスミドpCR2.1（Invitogen. Inc.）に挿入し、プラスミドpCR-LgFLO1を作製した。すなわち、PCR終了後、直ちに、その増幅産物4 μlを、Topoisomerase Iが共有結合しているプラスミドpCR2.1（3'末端にTが付加されている）液1μlと混合させ、室温で5分間放置し、PCR増幅産物が挿入されたプラスミドを作製し、大腸菌TOP10株に形質転換した。
【００３１】
さらに、S. cerevisiaeのVIII染色体の右腕末端のDNA塩基配列を、SGD(Sacchromyces Genome Datebase, http://www.yeastgenome.org/)により明らかにし、その一部の配列より作製したプライマーG_1（5'-GTTTTGCGCTCATTAAAACCTAGTGGGAG-3'）（配列番号１９）と、既知の部分的なLg-FLO1遺伝子のDNA塩基配列（DDBJ accession number D89860）より作製したプライマーRF3（5'-CCATCTGGCAATACCACAC-3'）（配列番号２０）とを用いて、PCRを行い、Lg-FLO1遺伝子の上流及びORF前半部分のクローニングを試みた。PCRの条件は、前述したタカラバイオ社製TakaRa LA TaqTM with GC Bufferのプロトコールに従って行ったものと同じである。そのPCR産物を前述したInvitrogen社のTOPO TA Cloningのプロトコールに従いプラスミドpCR2.1に挿入し、プラスミドpCR-LgFLO1_2を作製した。
プラスミドpCR-LgFLO1及びプラスミドpCR-LgFLO1_2に挿入されたDNA断片の塩基配列を決定することで、Lg-FLO1遺伝子の全DNA塩基配列及びLg-FLO1遺伝子上流のDNA塩基配列を決定した。DNA塩基配列の決定方法は、前述したベックマンコールター社製のDNAシークエンサーCEQ8000のプロトコール（GenomeLabTM Dye Terminator Cycle Sequencing with Qiuk Start Kit P/N608120）に従った方法と同様であり、タカラバイオ社製Kilo-sequence用Deletion Kitを用いて、プラスミド挿入DNA断片全体のシークエンスを行った。決定したDNA塩基配列（配列番号４）は、図３に示した。このDNA配列から想定されるLg-FLO1蛋白質のアミノ酸配列（配列番号５）は、図４に示した。Lg-FLO1遺伝子の上流領域のDNA塩基配列は、S. cerevisiaeのVIII染色体の右腕末端の対応領域のDNA塩基配列と概ね同一であったが、下面ビール酵母のLg-FLO1遺伝子の上流領域には、S. cerevisiaeのVIII染色体右腕末端の対応領域には存在しない84 bpの付加的な塩基配列があることがわかった（図５）。また、タンパク質をコードするORF領域には、ASTAITTTEPWTGTFTSTSTEMTTVTGTNGLPTDETIIVIRTPTT(配列番号２１）のアミノ酸配列又はその類似配列である45アミノ酸残基の繰り返し配列が７ヶ所と、SSLPPVTSATTSQETA（配列番号２２）のアミノ酸配列又はその類似配列である16アミノ酸残基の繰り返し配列が１３ヶ所認められた（図４）。
【実施例２】
【００３２】
＜下面ビール酵母FY-2株のS.cerevisiae型VIII染色体右腕の構造の解析＞
実施例１（１）におけるコスミドクローン10_P04及び12_J12の解析で明らかになったように、解析を行っている下面ビール酵母FY-2株のS. cerevisiae型VIII染色体右腕末端周辺に、S. cerevisiae IX染色体左腕テロメア周辺が挿入された構造の染色体が存在することが予想された。このような構造を有する染色体が下面ビール酵母に存在することは、前報（J. Biosci. Bioeng., 93, 395 (2002)）で報告されており、同報ではVIII染色体右腕にあるLg-FLO1遺伝子に、S. cerevisiae IX染色体上のYIL169c遺伝子が挿入され、ILF1遺伝子が形成されているということが報告されている。これを確認するため、VIII染色体右腕末端がIX染色体左腕末端に組み替わった染色体の存在状態を確認し、ILF1遺伝子のクローニング及びDNA塩基配列の決定を行って、下面ビール酵母FY-2株のS. cerevisiae型VIII染色体右腕の構造の解明を試みた。
既に報告されているLg-FLO1遺伝子のDNA配列（DDBJ accession number D89860）から作製したプライマーGM(5'-GCCTTTTGGAATACTGCCTCTTGGAGTTC-3')（配列番号２３）と、Saccharomyces Genome Database(SGD)より明らかにされたYIL169c遺伝子のDNA塩基配列から作製したプライマーI(5'-GGATTCTTCAGCGTTGAAGT-3')（配列番号２４）とを用い、鋳型DNAには下面ビール酵母FY-2株の染色体DNA及びコスミドクローン10_P04、12_J12のDNAを用いて、PCRを行い、ILF1遺伝子の存在を確認した。確認は、1 ％アガロース電気泳動で行った。PCRの条件は、前述したタカラバイオ社製TakaRa LA TaqTM with GC Bufferの方法と同じであり、94℃で1分間の後、94℃ 30秒間、60℃ 30秒間、72℃ 2分間のサイクルを30回、72℃で5分間で終了とした。ILF1遺伝子のクローニングは、同両プライマーと、下面ビール酵母FY-2株の染色体DNAを鋳型DNAとしたPCR産物を、前述したInvitrogen社のTOPO TA Cloningのプロトコールに従い、プラスミドpCR2.1（Invitogen. Inc.）に挿入し、プラスミドpCR-ILF1を作製することで行った。
下面ビール酵母のS. cerevisiae型VIII染色体右腕の構造の解明のために、下面ビール酵母FY-2株の染色体DNAを鋳型DNAとしたPCRと、S. cerevisiae のVIII染色体特異的な領域のDNAをプローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行った。
下面ビール酵母のS. cerevisiae型VIII染色体右腕の構造の解明のためのPCRは、プライマー9M04R1とプライマーHMとを用い下面ビール酵母FY-2株の染色体DNAを鋳型DNAとしたPCRで、Lg-FLO1遺伝子の存在を確認し、プライマー9M04R1とプライマーIとを用い下面ビール酵母FY-2株の染色体DNAを鋳型DNAとしたPCRで、ILF1遺伝子の存在を確認することで行った。これらのプライマーは、先に記載したものである。PCRの条件は、前述したタカラバイオ社製TakaRa LA TaqTM with GC Bufferのプロトコールに従って行ったものと同じである。すなわち、鋳型DNAは、前述した方法で精製した下面ビール酵母FY-2株のゲノムDNAを、最終濃度1 ng/mlで、各プライマーの最終濃度は0.2 μM、反応BufferはGC Buffer I、PCR反応条件は、94℃で1分間の後、94℃ 30秒間、60℃ 30秒間、72℃ 2分間のサイクルを30回、72℃にて5分間で終了とした。PCR産物の1 μlを1 ％アガロースで電気泳動して検出した。
【００３３】
プライマーGMとプライマーIを用いたPCRによって、下面ビール酵母FY-2株の染色体DNA及びコスミドクローン（10_P04又は12_J12）のDNAのいずれのDNAを鋳型とした場合であっても、同一のPCR増幅産物が得られた（図６）ことより、下面ビール酵母FY-2株では、前報（J. Biosci. Bioeng., 93, 395 (2002)）で報告されているILF1遺伝子が形成されていると考えられた。そこで、ILF1遺伝子をクローニングして、DNA塩基配列を決定した。決定したILF1遺伝子のうち、Lg-FLO1遺伝子とS. cerevisiae IX染色体上にあるYIL169c遺伝子との組換え領域について図７に示す。前報（Proceeding of European Brewing Congress (2003)）に記載されているように、ILF1遺伝子は、Lg-FLO1遺伝子とS. cerevisiae IX染色体上にあるYIL169c遺伝子とが、in-frameで接続していることを確認できた。
プライマーGMとプライマーIを用いたPCR、及び、プライマーGMとプライマーHMを用いたPCR、いずれも下面ビール酵母FY-2株の染色体DNAを鋳型DNAとして、PCR増幅産物を得た（図８Ａ）。
下面ビール酵母のS. cerevisiae型VIII染色体右腕の構造の解明のためのサザンハイブリダイゼーションは、S. cerevisiaeのVIII染色体特異的なDNA塩基配列を含む領域1 kbpを、プライマーScVIII524F(5'-GGAGAAGGAATAACTTCCGGTTGCAGCTAC-3')（配列番号２５）とScVIII525R(5'-GTGTAATTCTCGAGGGTGCCGTGAAAAAG-3')（配列番号２６）を用い、実験室酵母S. cerevisiae X-2180-1Aの染色体DNAを鋳型とするPCRで増幅してプローブとし、行った。このPCRのプライマーに用いた両方のDNA塩基配列も、実験室酵母Saccharomyces cerevisiaeのゲノムデータベースである(SGD)に記載のあるものである。サザンハイブリダイゼーションは、下面ビール酵母FY-2株の染色体DNA約2 μgを、制限酵素Cla I、Bam HI、Eco RI、Eco RV又はXba Iを約20 U〜50 U用いて処理し、1 ％アガロースで電気泳動した後、ナイロンメンブラン（アマシャム社製Hybond-N+）に転写して、標識したプローブとハイブリダイゼーションさせてハイブリダイズしたバンドを検出することで行った。プローブの標識とハイブリダイゼーション及び検出の方法は、アマシャム社のAlkPhos Direct Labelling and Detection Systemのプロトコールに従った。
サザンハイブリダイゼーションでは、各制限酵素で2本のハイブリダイズするバンドを得た（図８Ｂ）。従って、下面ビール酵母FY-2株のS. cerevisiae型VIII染色体右腕は、図１に示したように、Lg-FLO1遺伝子が座乗した染色体とS. cerevisiae IX染色体左腕テロメア周辺が挿入されたことにより、ILF1遺伝子が座乗した染色体とがあるヘテロの状態であることが判明した（図８Ｃ）。
【実施例３】
【００３４】
＜Lg-FLO1遺伝子上流の特有の塩基配列を利用した下面ビール酵母の検出＞
実施例１の実験によりLg-FLO1遺伝子のORFの全DNA塩基配列（配列番号４）及び上流領域のDNA塩基配列（配列番号３）が明らかとなり、その上流領域の塩基配列は実験室酵母S. cerevisiaeのVIII染色体の右腕末端のDNA塩基配列と概ね一致していたが、下面ビール酵母のLg-FLO1遺伝子の上流領域には、実験室酵母S. cerevisiaeのVIII染色体の右腕末端の対応領域には欠落している84 bpの塩基配列があることがわかった。この84 bpの塩基配列は、配列番号１の塩基配列(42 bp)が直列に繰り返されて２つ並んでいるものであって、その84 bpの塩基配列の上流にはその塩基配列が更に１つ直列して存在しており、配列番号１の塩基配列が直列に３つ繰り返されていた（配列番号２）（図４）。一方、実験室酵母S. cerevisiaeのVIII染色体右腕末端の対応領域は、配列番号１の塩基配列を１つだけ有しており、この塩基配列は繰り返されてはいなかった（図４）。この繰り返されている特異的な領域の存在による上流領域の長さの違いを基準として、下面ビール酵母の検出をすることが可能であるかを検討した。
下面ビール酵母としては、出願人保有株であるFY-2株及びBF2株、NYCY1324(National Collection of Yeast Cultures(Norwich, U. K.))、Jorgensen2036(Alfred Jorgensen Laboratory Ltd.(Copenhagen, Denmark))、VLB202(Versuchs und Lehranstalt fur Brauerei(Berlin, Germany))を用いた。このうち、Jorgensen2036は、強度の凝集性を、FY-2株、BF2株、VLB202は、中度の凝集性を、NYCY1324は、非凝集性を示す。凝集性の程度は、文献（Yeast genetics : fundamental and applied aspects., Springer Verlag, New York, 1983, 205-224）記載の方法に従って階級付けた。上面ビール酵母として、出願人保有株であるTF1株、TF2株、TF3株及び菌株保存機関の保存菌株であるATCC46785を用いた。このうち、ATCC46785は、強度の凝集性を示し、他の上面ビール酵母は凝集性を示さない。実験室酵母は、S. cerevisiae X-2180-1Aを用いた。実施例１に記載するのと同様の方法を用いて、各酵母菌株からゲノムDNAを抽出し、PCRを行った。PCRには、Lg-FLO1遺伝子プロモーター領域を増幅させるため、前掲のプライマーG_1とLg-FLO1遺伝子の翻訳開始点領域の配列よりプライマーRG1_5(5'-GTCATTTTTTTTAGTGGTGCTAATC-3')（配列番号２７）を作製して用いた。PCRは、タカラバイオ社製Perfect shotを用い、そのプロトコールに従った。PCRの条件は、94℃ 30秒間、55℃ 30秒間、72℃ 1分間のサイクルを30回、72℃にて5分間で終了とした。アガロース電気泳動は、増幅されるDNA断片が比較的低分子であるので、分離能を考慮し、4 ％アガロース（FMC社製Sea-Kem Agarose）を使用した。
PCRの結果は、図９に示した。下面ビール酵母のゲノム解析株であるFY-2株からは、このPCRによって、約400 bpの増幅断片を得た（図９Ａ及び９Ｂのレーン２）。一方、実験室酵母であるS. cerevisiae X-2180-1Aでは、約300 bpの増幅断片であって（図９Ａ及び９Ｂのレーン３）、明瞭に区別することができた。調べた下面ビール酵母は、その凝集性とは関係なく、その増幅産物は全て、ゲノム解析株FY-2株と同様に、約400 bpであった（図９Ａのレーン４〜７）。一方、上面ビール酵母は、その凝集性とは関係なく、その増幅産物は全て、実験室酵母S. cerevisiae X-2180-1Aと同様に、約300 bpであった（図９Ｂのレーン４〜７）。以上の結果より、Lg-FLO1遺伝子の上流で認められた84 bpの塩基の付加は（図５）下面ビール酵母特異的であることがわかり、Lg-FLO1遺伝子の上流領域中にこの追加の断片の挿入による前記領域の長さの違いを基準として、下面ビール酵母を他の酵母（上面ビール酵母及び実験室酵母）と区別することができた。
【実施例４】
【００３５】
＜Lg-FLO1遺伝子上流の下面ビール酵母特異的な領域の機能解析＞
Lg-FLO1遺伝子上流のDNA塩基配列は、概ね実験室酵母S. cerevisiaeのVIII染色体右腕末端の対応領域のDNA塩基配列と同一であったが、その領域には存在しない84 bpの下面ビール酵母特異的な塩基配列が付加されていることがわかった（図５）。この下面ビール酵母特異的な塩基配列を含む領域はLg-FLO1遺伝子上流に存在することからLg-FLO1遺伝子のプロモーターとして機能することが予測されたため、外来遺伝子の発現が可能であるかによって前記領域のプロモーターとしての機能を確かめた。
Lg-FLO1遺伝子上流の下面ビール酵母特異的な塩基配列をコードするDNA断片は、実験室酵母S. cerevisiaeのVIII染色体右腕末端のDNA塩基配列から作製したプライマーG_3（5'-GCGGAAAAATACTTATTTTCAGGTTGTC-3'）（配列番号２８）と、Lg-FLO1遺伝子翻訳開始点周辺のDNA塩基配列から作製したプライマーRG1_5とを用い、下面ビール酵母FY-2株ゲノムDNAを鋳型としたPCRで増幅した。このDNA断片はFY-2株Lg-FLO1遺伝子の上流約2 kbpに相当する。実験室酵母S. cerevisiaeのVIII染色体右腕末端の対応領域をコードするDNA断片も、同様にオリゴヌクレオチドG_3とRG1_5をプライマーに用い、鋳型DNAとしては実験室酵母S. cerevisiae X-2180-1AのゲノムDNAを用いて、PCRで増幅した。PCRの方法は、前述したタカラバイオ社製のPerfect shotを用いたもので行い、94℃ 30秒間、55℃ 30秒間、72℃ 1分間のサイクルを30回、72℃にて5分間で終了とした。PCR産物のクローニングは、前述したインビトロゲン社製のTOPO-TAクローニングキットの方法を用い、PCR産物をプラスミドpCR2.1（Invitogen. Inc.）に挿入し、プラスミドpCR-LgFLO1P（下面ビール酵母特異的な塩基配列を挿入）及びプラスミドpCR−FLO5P（実験室酵母S. cerevisiaeのVIII染色体上の対応する領域の塩基配列を挿入）を作製して行った。
【００３６】
クローニングした各DNA断片は、大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ遺伝子）を有し、酵母TRP1遺伝子を選択マーカーとし、2 μｍ DNAを酵母複製開始起点とする酵母発現用プラスミドpYABEに挿入した。Lg-FLO1遺伝子上流の下面ビール酵母特異的な塩基配列をコードするDNA断片がlacZ遺伝子に対し正方向に挿入されたプラスミドpYABE−LgFLO1Pと逆方向に接続されたプラスミドpYABE−LgFLO1Rとを作製した。また、実験室酵母S. cerevisiaeの対応領域の塩基配列をコードするDNA断片がlacZ遺伝子に対し正方向に挿入されたプラスミドpYABE−LgFLO5Pと逆方向に接続されたプラスミドpYABE−FLO5Rを作製した。それぞれのプラスミドを実験室酵母S. cerevisiae YPH500(MATα, ade2, his3, leu2, lys2, trp1, ura3)に導入し、形質転換株を得た。得られた各形質転換株のβ−ガラクトシダーゼ活性は、酵母遺伝子実験マニュアル（大矢禎一  監訳  丸善（株）出版  2002年）のp131に記載されている「酵母を用いたβ-ガラクトシダーゼアッセイ」の「方法2：浸透性細胞によるアッセイ」に基づき、基質o−二トロフェニル−β−Ｄ−ガラクシドから遊離するo−ニトロフェノールを420 nmの吸光度を測定することで確かめた。
4種のプラスミドを導入した実験室酵母S. cerevisiae YPH500の各形質転換株のβ−ガラクトシダーゼ活性は、以下の表1に示した。
【００３７】
【表１】
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Lg-FLO1遺伝子プロモーターが正方向に挿入されたプラスミドpYABE−LgFLO1Pが導入された形質転換株のみがβ−ガラクトシダーゼ活性を有していた。
以上の結果より、SGDで公開されている実験室酵母S. cerevisiaeVIII染色体右腕末端上においてLg-FLO1遺伝子上流領域に対応する領域のDNA塩基配列は、mRNAの転写を誘導する活性を有していないが、前記対応する領域に84 bpの塩基が付加されているLg-FLO1遺伝子上流の下面ビール酵母特異的な塩基配列を含む領域は、mRNAの転写を誘導する活性、すなわちプロモーター活性を有していることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】コスミドクローン挿入DNAについて推定された下面ビール酵母VIII染色体上の位置を示す。
【図２】Lg-FLO1遺伝子の下面ビール酵母染色体上の存在状態をPCRによって確認した結果を示す。レーン１はプライマー9M04R1とプライマーHMとを用いて得られたPCR産物、レーン２はプライマー9M04R1とプライマーRGとを用いて得られたPCR産物、レーン３はプライマー3H24F1とプライマーHMとを用いて得られたPCR産物、レーン４はプライマー3H24F1とプライマーRGとを用いて得られたPCR産物の1 ％アガロース電気泳動の結果を示す。
【図３Ａ】Lg-FLO1遺伝子の上流領域及びORFのDNA塩基配列を示す。
【図３Ｂ】Lg-FLO1遺伝子の上流領域及びORFのDNA塩基配列を示す。
【図３Ｃ】Lg-FLO1遺伝子の上流領域及びORFのDNA塩基配列を示す。
【図３Ｄ】Lg-FLO1遺伝子の上流領域及びORFのDNA塩基配列を示す。
【図３Ｅ】Lg-FLO1遺伝子の上流領域及びORFのDNA塩基配列を示す。
【図４】Lg-FLO1遺伝子の想定されるアミノ酸配列を示す。囲みは、アミノ酸配列の繰り返し領域を示す。
【図５】Lg-FLO1遺伝子上流領域とS. cerevisiae VIII染色体上の対応領域とのDNA塩基配列の比較を示す。上段がLg-FLO1遺伝子の上流領域のDNA塩基配列であり、下段がS. cerevisiae VIII染色体上の対応領域のDNA塩基配列である。直線の部分はLg-FLO1遺伝子の上流領域で繰り返される42 bpの塩基配列を示す。四角の囲み部分は、Lg-FLO1タンパク質の想定翻訳領域を示す。
【図６】プライマーGMとプライマーIとを用いたPCRによってILF1遺伝子の存在を確認した結果を示す。レーン１は鋳型DNAとして下面ビール酵母FY-2染色体DNAを用いた結果、レーン２は鋳型DNAとしてコスミドクローン10_P04のDNAを用いた結果、レーン３は鋳型DNAとしてコスミドクローン12_J12のDNAを用いた結果を示す。レーンＭは、λ-HindIII DNA分子量マーカーを示す。
【図７】Lg-FLO1遺伝子とYIL169c遺伝子とが組換わっているILF1遺伝子内の前記両遺伝子の接合部位を示す。
【図８】下面ビール酵母S. cerevisiae型VIII染色体右腕の構造の解析結果を示す。図８Ａは、FY-2株の染色体DNAを鋳型DNAとして、Lg-FLO1遺伝子を増幅するプライマー対とIFN1遺伝子を増幅するプライマー対とを用いて行ったPCRの結果を示す。レーン１はλ-HindIII DNA分子量マーカーであり、レーン２はプライマーGM及びHMを用いた結果（Lg-FLO1遺伝子を増幅）であり、レーン３はプライマーGM及びIを用いた結果（ILF1遺伝子を増幅）である。図８Ｂは、FY-2株の染色体DNAを別々の制限酵素で処理し、S. cerevisiae型VIII染色体特異的なDNA塩基配列約1kb（プライマーScVIII524F及びScVIII524Rを用いて増幅される領域）をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った結果を示す。レーン１は制限酵素Bam HIを用いた結果、レーン２は制限酵素Cla Iを用いた結果、レーン３は制限酵素Eco RIを用いた結果、レーン４は制限酵素Eco RVを用いた結果、レーン５は制限酵素Xba Iを用いた結果である。図８Ｃは、解析によって判明した下面ビール酵母S. cerevisiae型VIII染色体右腕の構造を示す。縦線部分は、図８Ｂのサザンハイブリダイゼーションで用いたプローブの位置である。
【図９】Lg-FLO1遺伝子上流の下面ビール酵母特異的な領域を利用した酵母菌株の判定結果を示す。図９Ａは、実験室酵母（レーン３：S. cerevisiae X-2180-1A）と下面ビール酵母（レーン２：FY-2株、レーン４：BF2株、レーン５：NCYC134株、レーン６：Jorgensen2036株、レーン７：VLB202株）のゲノムDNAを鋳型として、プライマーG_1及びRG1_5を用いて行ったPCR産物の泳動結果を示す。レーン１は100 bpラダーである。図９Ｂは、実験室酵母（レーン３：S. cerevisiae X-2180-1A）、下面ビール酵母（レーン２：FY-2株）及び上面ビール酵母（レーン４：TF1株、レーン５：TF2株、レーン６：TF3株、レーン７：ATCC46785株）のゲノムDNAを鋳型として、プライマーG_1及びRG1_5を用いて行ったPCR産物の泳動結果を示す。レーン１は100 bpラダーである。
【図１】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図２】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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