(57)【要約】【課題】  胚性幹細胞に対して薬剤投与や外来遺伝子の導入を行うことなく、単一の胚性幹細胞から、肝実質細胞のみならず血管細胞や胆管細胞等の非肝実質細胞をあわせて分化誘導することが可能であり、かつ高い肝機能を有する肝組織・臓器を高い確率で効率よく製造する方法、及び該方法により製造された肝組織・臓器を提供する。【解決手段】  胚性幹細胞をリクローニングしてサブクローンを分離するサブクローン分離工程と、該サブクローンのうち、前記サブクローン由来の胚様体を複数同時に同条件下で形成させた後、該胚様体を接着培養し、接着培養開始から４８時間後において拍動している前記胚様体の個数が、全ての前記胚様体の個数に対して７０個数％以上であるサブクローンを選択するスクリーニング工程と、前記スクリーニングされたサブクローンを培養するサブクローン培養工程とを含むことを特徴とする肝組織・臓器の製造方法、及び該方法により製造された肝組織・臓器である。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚性幹細胞をリクローニングしてサブクローンを分離するサブクローン分離工程と、
該サブクローンのうち、前記サブクローン由来の胚様体を複数同時に同条件下で形成させた後、該胚様体を接着培養し、接着培養開始から４８時間後において拍動している前記胚様体の個数が、全ての前記胚様体の個数に対して７０個数％以上であるサブクローンを選択するスクリーニング工程と、
前記スクリーニングされたサブクローンを培養するサブクローン培養工程と
を含むことを特徴とする肝組織・臓器の製造方法。
【請求項２】
スクリーニング工程において、サブクローン由来の胚様体を９６〜４８０個同時に同条件下で形成させ、接着培養を行う請求項１に記載の肝組織・臓器の製造方法。
【請求項３】
スクリーニング工程において、サブクローン由来の胚様体を複数同時に同条件下で形成させた後、該胚様体を接着培養し、接着培養開始から２４時間後において拍動している前記胚様体の個数が、全ての前記胚様体の個数に対して５０個数％以上であるサブクローンを選択する請求項１から２のいずれかに記載の肝組織・臓器の製造方法。
【請求項４】
サブクローン培養工程において、サブクローンを心筋細胞、肝実質細胞、及び肝非実質細胞に分化させ、肝組織・臓器を形成する請求項１から３のいずれかに記載の肝組織・臓器の製造方法。
【請求項５】
肝非実質細胞が、血管内皮細胞である請求項４に記載の肝組織・臓器の製造方法。
【請求項６】
サブクローン分離工程におけるリクローニングが、胚性幹細胞をＬＩＦ（白血病阻止因子）含有培地で培養し、形成されたコロニー由来のクローンを得、該クローンを培養して得たコロニーを分離することにより行われる請求項１から５のいずれかに記載の肝組織・臓器の製造方法。
【請求項７】
サブクローン培養工程において、サブクローンに対して実質的に外来遺伝子の導入を行わない請求項１から６のいずれかに記載の肝組織・臓器の製造方法。
【請求項８】
サブクローン培養工程において、サブクローン由来の胚様体を、９６〜４８０個混合して培養する請求項１から７のいずれかに記載の肝組織・臓器の製造方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載の方法により製造され、胚性幹細胞サブクローンの単一細胞由来であることを特徴とする肝組織・臓器。
【請求項１０】
人工肝臓として使用される請求項９に記載の肝組織・臓器。
【請求項１１】
請求項９に記載の肝組織・臓器に、被験物質を投与することを含むことを特徴とする薬剤スクリーニング方法。
【請求項１２】
被験物質が、肝機能障害治療薬、機能性食品、及びこれらの有効成分のいずれかである請求項１１に記載の薬剤スクリーニング方法。
【請求項１３】
コレステロール分解促進物質、及びコレステロール生合成阻害物質のいずれかの探索を行う請求項１１から１２のいずれかに記載の薬剤スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胚性幹細胞から肝組織・臓器を製造する方法、及び該方法により製造された肝組織・臓器に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、疾患や事故などによって損傷を受け、重篤な機能障害や機能不全に陥った生体組織・臓器に対して、臓器移植や人工臓器による治療が行われてきた。
特に、肝臓は生命に必要な物質の代謝反応や合成反応、及び毒性物質の解毒反応等、生命の維持に不可欠な多数の化学反応を行う臓器であるため、これらすべての機能を人工的な装置で代用することは極めて困難である。また、臓器移植は、移植された肝臓に対する拒絶反応が避けられず、該拒絶反応を抑えるための免疫抑制によって副作用を伴うことに加え、絶対的なドナー不足という問題がある。
【０００３】
これらの問題を解決するために、生体の肝細胞を併用した人工肝臓が研究され、該肝細胞と人工装置との組合せからなるハイブリット型人工肝臓（バイオハイブリッド型人工肝臓）が提案されている。具体的には、中空糸モジュール内に、生体由来の肝細胞を中空糸と接触させるように保持してなるバイオリアクターが人工肝臓として知られており（例えば、特許文献１及び２参照）、このようなバイオリアクターを用いた臨床応用の試みも行われている。
【０００４】
しかしながら、前記バイオリアクターの中空糸モジュールにおいては、中空糸に接する肝細胞にしか酸素や栄養素を供給することができないという構造上の制限があり、細胞密度の上限値が限定されるという問題がある。
さらに、前記ハイブリット型人工肝臓に用いられる生体由来の肝細胞は、主に肝臓から単離された肝実質細胞であるため、増殖性が悪く、寿命が短いため長期培養が困難であり、かつ培養中に肝細胞としての機能が著しく低下するという問題がある。このため、前記ハイブリット型人工肝臓は、前記中空糸モジュールの構造上の制約と、用いる肝細胞の性能とから、本来の肝機能の一部のみを、短期間代替できるにすぎないものとなっている。
【０００５】
一方、近年、失われた細胞、組織、及び臓器を再生して補う再生医療や細胞医療の技術として、様々な細胞へ分化する能力と、高い増殖能力とを有する胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｉｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）を利用する方法が注目されている。
前記胚性幹細胞は、胚盤胞内の未分化な細胞塊から得られ、試験管内で増殖と継代を繰り返すことが可能であり、目的とする機能を有する細胞を選択的に分化誘導することが可能であるため、様々な疾患に対する応用が期待されている。
【０００６】
しかしながら、前記胚性幹細胞を用いた肝臓の再生技術としては、様々な分化因子を用いて肝実質細胞のみを分化誘導するにとどまっている（非特許文献１〜５参照）。前記胚性幹細胞から得られた肝実質細胞を、前記ハイブリット型人工肝臓に適用したとしても、肝実質細胞のみでは肝機能は不十分であり、また前述したモジュールの構造上の制限が存在することから、本来の肝組織・臓器の機能を満足する人工肝臓は得られないという問題がある。
したがって、本来の立体的な構成と機能とを有する肝組織・臓器の再生は未だ達成されていないのが現状である。
【０００７】
【特許文献１】特開平９−５６８１４号公報
【特許文献２】特開２００４−１６６７１７号公報
【非特許文献１】Ｋ．Ａｂｅ，Ｈ．Ｎｉｗａ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２２９（１），２７−３４（１９９６）
【非特許文献２】Ｍ．Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ，Ｏ．Ｙａｎｕｋａ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，９７（２１），１１３０７−１１３１２（２０００）
【非特許文献３】Ｔ．Ｈａｍａｓａｋｉ，Ｙ．Ｉｉｂｏｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４９７（１），１５−１９（２００１）
【非特許文献４】Ｎ．Ｌｕｍｅｌｓｋｙ，Ｏ．Ｂｌｏｎｄｅｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．，２９２（５５２０），１３８９−１３９４（２００１）
【非特許文献５】Ｓ．Ｙａｍａｄａ，Ｈ．Ｋｏｊｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８１（１），２２９−３６（２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、前記従来における問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。
即ち、本発明は、胚性幹細胞の万能性と発生学的知見に基づき、胚性幹細胞に対して薬剤投与や外来遺伝子の導入を行うことなく、単一の胚性幹細胞から発生学的知見に基づき、実際の肝組織・臓器と同様に、発生学的に肝実質細胞を血管細胞や胆管細胞等の非肝実質細胞とともに分化誘導することが可能であり、かつ高い肝機能を有する肝組織・臓器を、高い確率で発生学的に効率よく製造する方法、及び該方法により製造された肝組織・臓器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記課題を解決するため、本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、胚性幹細胞の親細胞のリクローニングを行い、得られたサブクローンの拍動率を判定基準として分化能力の高いサブクローンをスクリーニングし、該サブクローンを用いることにより、肝特異的な機能を有する成熟した肝組織を高い確率で分化させることが可能であるとの新知見を得た。
肝臓の発生には、心臓原基からのシグナルが重要であることは知られているが、胚性幹細胞からの肝組織の分化誘導において、拍動率に基づいてスクリーニングしたサブクローンを用いることにより、肝組織・臓器を胚性幹細胞のみから効率的に製造できる技術は知られておらず、本発明者の新たな知見である。本発明は、本発明者らによるかかる知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段は、以下の通りである。即ち、
＜１＞  胚性幹細胞をリクローニングしてサブクローンを分離するサブクローン分離工程と、
該サブクローンのうち、前記サブクローン由来の胚様体を複数同時に同条件下で形成させた後、該胚様体を接着培養し、接着培養開始から４８時間後において拍動している前記胚様体の個数が、全ての前記胚様体の個数に対して７０個数％以上であるサブクローンを選択するスクリーニング工程と、
前記スクリーニングされたサブクローンを培養するサブクローン培養工程と
を含むことを特徴とする肝組織・臓器の製造方法である。該＜１＞に記載の肝組織・臓器の製造方法においては、前記サブクローン分離工程により前記胚性幹細胞のサブクローンが分離され、前記スクリーニング工程により、前記サブクローン由来の胚様体を複数同時に同条件下で形成させた後、該胚様体を接着培養し、接着培養開始から４８時間後において拍動している前記胚様体の個数が、全ての前記胚様体の個数に対して７０個数％以上であるサブクローンが選択され、前記サブクローン培養工程により、選択された前記サブクローンが培養される。その結果、発生学的に肝組織・臓器が効率よく製造される。
＜２＞  スクリーニング工程において、サブクローン由来の胚様体を９６〜４８０個同時に同条件下で形成させ、接着培養を行う前記＜１＞に記載の肝組織・臓器の製造方法である。該＜２＞に記載の肝組織・臓器の製造方法においては、９６〜４８０個の胚様体中の拍動している前記胚様体の個数％が判定される。その結果、スクリーニングが確実に行われる。
＜３＞  スクリーニング工程において、サブクローン由来の胚様体を複数同時に同条件下で形成させた後、該胚様体を接着培養し、接着培養開始から２４時間後において拍動している前記胚様体の個数が、全ての前記胚様体の個数に対して５０個数％以上であるサブクローンを選択する前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の肝組織・臓器の製造方法である。該＜３＞に記載の肝組織・臓器の製造方法においては、前記サブクローン由来の胚様体を複数同時に同条件下で形成させた後、該胚様体を接着培養し、接着培養開始から２４時間後において拍動している前記胚様体の個数が、全ての前記胚様体の個数に対して５０個数％以上であるサブクローンが選択される。その結果、高い確率で、発生学的に肝組織・臓器が効率よく製造される。
＜４＞  サブクローン培養工程において、サブクローンを心筋細胞、肝実質細胞、及び肝非実質細胞に分化させ、肝組織・臓器を形成する前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の肝組織・臓器の製造方法である。該＜４＞に記載の肝組織・臓器の製造方法においては、前記サブクローンを肝実質細胞と肝非実質細胞とに分化させる。この結果、肝実質細胞のみからなる従来の人工肝臓とは異なり、生体内の正常肝臓と同等の前記肝組織・臓器が製造される。
＜５＞  肝非実質細胞が、血管内皮細胞である前記＜４＞に記載の肝組織・臓器の製造方法である。該＜５＞に記載の肝組織・臓器の製造方法においては、前記サブクローンを肝実質細胞とともに血管内皮細胞に分化させる。その結果、肝実質細胞のみからなる従来の人工肝臓とは異なり、長寿命かつ高機能の前記肝組織・臓器が製造される。
＜６＞  サブクローン分離工程におけるリクローニングが、胚性幹細胞をＬＩＦ（白血病阻止因子）含有培地で培養し、形成されたコロニー由来のクローンを得、該クローンを培養して得たコロニーを分離することにより行われる前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の肝組織・臓器の製造方法である。該＜６＞に記載の肝組織・臓器の製造方法においては、前記サブクローンが、前記胚性幹細胞をＬＩＦ（白血病阻止因子）含有培地で培養して形成されたコロニー由来のクローンのコロニーから分離される。その結果、未分化な状態が維持されたサブクローンが得られる。
＜７＞  サブクローン培養工程において、サブクローンに対して実質的に外来遺伝子の導入を行わない前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の肝組織・臓器の製造方法である。該＜７＞に記載の肝組織・臓器の製造方法においては、サブクローンが実質的に外来遺伝子の導入を行われずに培養される。その結果、安全性の高い肝組織・臓器が効率よく製造される。
＜８＞  サブクローン培養工程において、サブクローン由来の胚様体を、９６〜４８０個混合して培養する前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の肝組織・臓器の製造方法である。
＜９＞  前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載の方法により製造され、胚性幹細胞サブクローンの単一細胞由来であることを特徴とする肝組織・臓器である。
＜１０＞  人工肝臓として使用される前記＜９＞に記載の肝組織・臓器である。
＜１１＞  前記＜９＞に記載の肝組織・臓器に、被験物質を投与することを含むことを特徴とする薬剤スクリーニング方法である。該＜１１＞に記載の薬剤スクリーニング方法によると、被験物質が、前記肝組織・臓器に投与されて、目的の物質が効率よくスクリーニングされる。
＜１２＞  被験物質が、肝機能障害治療薬、機能性食品、及びこれらの有効成分のいずれかである前記＜１１＞に記載の薬剤スクリーニング方法である。
＜１３＞  コレステロール分解促進物質、及びコレステロール生合成阻害物質のいずれかの探索を行う前記＜１１＞から＜１２＞のいずれかに記載の薬剤スクリーニング方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によると、胚性幹細胞に対して実質的に薬剤投与や外来遺伝子の導入を行うことなく、単一の胚性幹細胞から、肝実質細胞のみならず血管細胞や胆管細胞等の非肝実質細胞をあわせて分化誘導することが可能であり、かつ高い肝機能を有する肝組織・臓器を高い確率で効率よく製造する方法、及び該方法により製造された肝組織・臓器を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（肝組織・臓器の製造方法）
本発明の肝組織・臓器の製造方法は、サブクローン分離工程と、スクリーニング工程と、サブクローン培養工程とを含み、更に必要に応じて適宜選択したその他の工程を含む。
【００１２】
本発明の肝細胞・臓器の製造方法における具体的な細胞培養の操作としては、当該技術分野の常法の操作に従って行うことができ、培養条件としては、３７℃で５％のＣＯ２存在下が好ましい。
また、本発明の肝細胞・臓器の製造方法において、細胞培養に使用される器具・装置等としては、当該技術分野で一般的に使用される器具・装置等を用いて行うことができる。
【００１３】
＜サブクローン分離工程＞
前記サブクローン分離工程は、胚性幹細胞をリクローニングしてサブクローンを分離する工程からなる。前記リクローニングとは、親細胞をクローニングして得られた親細胞クローンに対し、さらにクローニングを行うことをいう。また、前記サブクローンとは、前記親細胞クローンからクローニングにより得られたクローンを指す。
【００１４】
前記胚性幹細胞としては、インビトロにおいて培養可能であり、初期胚を培養することにより樹立され、成体を構成する種々の細胞に分化可能な多分化能を有する細胞であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、着床以前の初期胚内の内部細胞塊から樹立したＥＳ（Ｅｍｂｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ）細胞、生殖細胞から樹立されたＥＧ（Ｅｍｂｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ）細胞、及び該胚性幹細胞を培養して得られた細胞などが挙げられ、これらは既に樹立された細胞系統であってもよい。
前記胚性肝細胞としては、哺乳類、鳥類、及び爬虫類など多様な動物に由来する細胞を使用することができるが、これらの中でもマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、サル、及びヒトなどの哺乳類に由来する胚性幹細胞が好ましい。
【００１５】
前記胚性幹細胞のリクローニング方法としては、前記胚性幹細胞をＬＩＦ（白血病阻止因子）含有培地で培養し、形成されたコロニー由来の単一細胞を得、該単一細胞を培養して得たコロニーを分離することにより行われる。
具体的には、前記胚性幹細胞をＬＩＦ（白血病阻止因子）含有培地で未分化な状態を維持しながら増殖させた後、酵素等を用いて細胞同士の接着がない単一細胞状態とし、前記単一細胞状態となった前記胚性幹細胞から未分化の胚性幹細胞クローンを得て、該胚性幹細胞クローンを未分化な状態を維持しながら培養増殖してコロニーを形成させ、該コロニーからサブクローンを得る方法が挙げられる。
前記胚性幹細胞を単一細胞状態とする方法としては、常法の操作方法が挙げられる。具体的には、コンフルエントに増殖した前記胚性幹細胞を、培養している培養容器から胚性幹細胞培養用培地を除去した後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて数回洗浄し、前記培養容器にトリプシン‐ＥＤＴＡ液を投与し、５〜２０分間放置する。その後トリプシン‐ＥＤＴＡ液を除去し、前記胚性幹細胞を前記胚性幹細胞培養用培地に懸濁し、遠心分離により前記胚性幹細胞を沈殿させ、これを再度前記胚性幹細胞培養用培地に懸濁する方法が挙げられる。
【００１６】
前記胚性幹細胞培養用培地としては、細胞培養用の最小培地に、血清、ＬＩＦ（白血病阻止因子）、Ｌ−グルタミン、及び２−メルカプトエタノールなどを添加してなる培地が挙げられ、例えば、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）に、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）２０％、ピルビン酸ナトリウム１ｍＭ、非必須アミノ酸０．１ｍＭ、２−メルカプトエタノール０．１ｍＭ、及びＬＩＦ１０００Ｕ／Ｌを添加してなる培地が挙げられる。
【００１７】
前記胚性幹細胞、又は前記胚性幹細胞クローンを培養する方法としては、未分化な胚性幹細胞の形質を維持可能な方法であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記胚性幹細胞培養用培地を用い、支持細胞とともに共培養する方法が挙げられ、前記支持細胞としては、例えば、マイトマイシンＣ処理されたマウス胎児繊維芽細胞、ＳＴＯ細胞、ＮＨＬ７細胞等が挙げられる。
前記培養容器内に播種する前記胚性幹細胞、又は前記胚性幹細胞クローンの細胞密度としては、１０，０００〜８０，０００個／ｃｍ２が好ましい。
【００１８】
前記胚性幹細胞クローンの培養において、前記サブクローンを取得しやすくする目的で、前記胚性幹細胞クローンに薬剤耐性遺伝子を導入し、薬剤添加培地上で培養を行うことにより、コロニーの形成数を制御してもよい。
前記薬剤耐性遺伝子としては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。
前記薬剤耐性遺伝子の導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、レトロウィルスベクター法などが挙げられる。
【００１９】
前記サブクローンを分離する方法としては、例えば、前記胚性幹細胞クローンを前記胚性幹細胞培養用培地中で４〜７日培養し、形成されたコロニーを実体顕微鏡下でピペット等を用いて吸引して回収し、該コロニーを単一細胞状態として前記胚性幹細胞培養用培地に懸濁する方法が挙げられる。
前記コロニーとしては、比較的増殖が速いものが好ましく、実体顕微鏡下で観察したときに、高く盛り上がり、周辺に扁平な細胞が存在しないという形態的特徴を有するものが好ましく、例えば、図１９に示すような形態のコロニーが好ましい。
【００２０】
＜スクリーニング工程＞
前記スクリーニング工程は、前記サブクローン由来の胚様体を複数同時に同条件下で形成させた後、該胚様体を接着培養し、接着培養開始から４８時間後において拍動している前記胚様体の個数が、全ての前記胚様体の個数に対して７０個数％以上であるサブクローンを選択する工程からなる。
【００２１】
前記スクリーニング工程において形成させる前記胚様体としては、単一細胞状態の前記サブクローン５００〜２，０００個が凝集した胚に類似した構造体であり、前記サブクローンを、同一組成の培地を使用し、同一温度条件下で同時に浮遊培養して形成させたものが好ましい。
前記サブクローン由来の胚様体の作製方法としては、例えば、単一細胞状態の前記サブクローンを、１０〜２５個／μＬとなるように、ＬＩＦを含有しない胚様体形成用培地に懸濁し、浮遊培養させる方法が挙げられる。
前記浮遊培養の方法としては、例えば、細胞懸濁液を滴下した培養容器を反転させ、懸垂状態のドロップを形成して培養するハンギングドロップ法などが挙げられる。
前記胚様体の培養容器としては、例えば、マルチウェルプレート等が好ましい。前記マルチウェルプレートとしては、９６穴プレートが好ましい。
【００２２】
前記胚様体形成用培地としては、細胞培養用の最小培地に、血清、アミノ酸、及び２−メルカプトエタノールなどを添加してなり、実質的にＬＩＦを含有しない培地が挙げられ、例えば、ＩＭＤＭ（イスコフ改変ダルベッコ培地）に、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）２０％、ピルビン酸ナトリウム１ｍＭ、非必須アミノ酸０．１ｍＭ、及び２−メルカプトエタノール０．１ｍＭを添加してなる培地が挙げられる。
【００２３】
ここで、拍動している胚様体とは、継続的に一定のリズムで収縮が観られる胚様体を指す。具体的には、実体顕微鏡下において観察したとき、該収縮が連続的かつ規則的に（例えば、収縮と収縮との間隔が０．１〜１０秒）観られる胚様体である。
拍動している前記胚様体の個数の全胚様体の個数に対する割合（以下、「拍動率」という。）としては、例えば、胚様体を実体顕微鏡下で観察し、拍動している胚様体数から、下記式（１）により求めることができる。
前記拍動率の測定において、全胚様体の数としては５０個以上であることが好ましく、１００個以上であることがより好ましい。
拍動率（個数％）＝〔（拍動している胚様体数）／（全胚様体数）〕×１００
式（１）
【００２４】
前記サブクローンとしては、該サブクローン由来の胚様体の拍動率が、接着培養開始から４８時間後において７０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、接着培養開始から２４時間後において５０％以上であることが特に好ましい。
前記サブクローン由来の胚様体の拍動率が、接着培養開始から４８時間後において７０％未満であると、該サブクローンから前記肝組織・臓器が得られないことがある。
【００２５】
＜サブクローン培養工程＞
前記サブクローン培養工程は、前記スクリーニング工程においてスクリーニングされた前記サブクローンを、心筋細胞、肝実質細胞、及び肝非実質細胞に分化させ、肝組織・臓器を形成する工程からなる。また、前記サブクローン培養工程においては、前記サブクローンに対して実質的に外来遺伝子の導入を行わない。このため、効率よく安全性の高い前記肝組織・臓器を製造することができる。
前記スクリーニング工程においてスクリーニングされた前記サブクローンは、前記肝組織・臓器の製造に用いられるまで、前記胚性幹細胞培養用培地を用いて未分化な状態を維持しながら継代培養される。なお、継代は６代を上限とすることが好ましい。
【００２６】
前記スクリーニング工程においてスクリーニングされた前記サブクローンは、単一細胞状態として前記胚様体形成用培地に懸濁し、浮遊培養することにより前記胚様体を形成させる。次いで、得られた前記胚様体９６〜４８０個を集め、分化用培地を用い、接着培養容器に播種して接着培養することにより、前記肝組織・臓器を製造することができる。
【００２７】
前記分化用培地としては、細胞培養用の最小培地に、血清、アミノ酸、２−メルカプトエタノール、及びＬＩＦ等を添加してなり、実質的にＬＩＦを含有しない培地が挙げられ、例えば、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＭＥＭ（イスコブ改変ダルベッコ−イーグル培地）に、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）２０％、ピルビン酸ナトリウム１ｍＭ、非必須アミノ酸０．１ｍＭ、２−メルカプトエタノールを添加してなる培地が挙げられる。
【００２８】
前記接着培養容器としては、前記胚様体の接着培養が可能な細胞培養用培養器であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マルチプレート、マイクロウェルプレート、シャーレ、フラスコ、ディッシュ、バッグ、及び中空糸デバイス等が挙げられる。前記接着培養において、前記胚様体と前記接着培養容器との接着性を制御するために、表面処理を行ってもよい。
前記表面処理としては、例えば、ゼラチンコート、コラーゲンコート、フィブロネクチンコート、ラミニンコート、マトリゲルコート等の方法が挙げられる。
【００２９】
本発明の肝組織・臓器の製造方法により、前記リクローニングされた胚性幹細胞サブクローンを、心筋細胞、肝実質細胞、及び肝非実質細胞に分化させ、前記胚様体の接着培養開始から１０〜１８日後に、形態学的にも組織学的にも生体内の正常肝組織・臓器の特徴を有し、肝実質細胞及び肝非実質細胞とからなる前記肝組織・臓器に分化させることができる。
前記形態学的特徴としては、例えば、２核の形態を有すること、アルブミン染色に陽性であることなどの特徴が挙げられる。
前記組織学的特徴としては、例えば、アンモニア分解能を有すること、タンパク質（アルブミン）産生能を有すること、テストステロンの水酸化活性を有することなどが挙げられる。
【００３０】
＜心筋細胞＞
前記胚性幹細胞から肝組織への分化は、心筋細胞の出現と相関を有し、発生学的知見からも、心臓原基からのシグナルにより、内胚葉が前腸へ分化し、拍動する心筋細胞からのシグナルにより肝憩室、肝芽へと分化し、肝組織へ分化することが知られている。
前記心筋細胞の発現を確認する方法としては、前記胚様体コロニーの拍動開始により確認することができ、また、ＡＮＰ、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４等の心筋細胞特異的マーカーの遺伝子発現、又は心筋細胞特異的マーカータンパク質の発現により確認することができる。
【００３１】
＜肝実質細胞＞
前記肝実質細胞は、発生学的に、前記胚様体における前記心筋細胞の出現に続いて出現することが知られている。実験的に前記肝実質細胞は、胚様体から分化した前記心筋細胞近傍に発現が観察されることが知られている。
前記肝実質細胞への分化能及び前記肝実質細胞への分化を確認する方法としては、
トランスサイレチン（ＴＴＲ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）胎児肝細胞、ａ１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、チロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）、トリプトファンオキシゲナーゼ（ＴＯ）、チロシンアミノトランスフェラーゼ、アシアログリコプロテインレセプター（ＡＳＧＲ）、アルブミンなどの肝細胞（胎児肝細胞）特異的マーカー遺伝子発現、若しくは肝細胞特異的マーカータンパク質の発現、又は抗アルブミン抗体による免疫染色などにより確認することができる。
また、マウスの肝細胞においては、２核を有する細胞が多く確認されることから、細胞核を形態学的に確認することにより確認することができる。
【００３２】
＜肝非実質細胞＞
前記肝非実質細胞とは、類洞内皮細胞、クッパー細胞、及び胆管細胞などが挙げられ、発生学的に前記肝実質細胞の発現とほぼ同時に発現することが知られており、特に、血管内皮細胞への分化が重要であることが知られている。
前記非肝実質細胞への分化能及び前記非肝実質細胞への分化を確認する方法としては、ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ１、血管内皮増殖因子ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２、並びに血管新生調節因子ＶＥＧＦなどの血管内皮特異的マーカー遺伝子発現、若しくは血管内皮特異的マーカータンパク質の発現、又はＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ１抗体による免疫染色などにより確認することができる。
【００３３】
前記特異的マーカー遺伝子発現の検出方法としては、特に制限はなく、公知の方法から適宜選択することができ、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法、ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ法などが挙げられる。
前記タンパク質発現の検出方法としては、特に制限はなく、公知の方法から適宜選択することができ、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロッティング法、ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ法などが挙げられる。
【００３４】
本発明の肝組織・臓器の製造方法は、胚性幹細胞に対して薬剤投与や外来遺伝子の導入を行うことなく、単一の胚性幹細胞から、肝実質細胞のみならず血管細胞や胆管細胞等の非肝実質細胞をあわせて分化誘導することが可能であることから、後述する肝組織・臓器の製造に好適に使用することができる。
【００３５】
（肝組織・臓器）
本発明の肝組織・臓器は、上述した本発明の肝組織・臓器の製造方法により製造され、胚性幹細胞サブクローンの単一細胞由来の肝組織・臓器である。
【００３６】
前記肝組織・臓器の用途としては、肝機能が要求される用途であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、人工肝臓として使用することができ、具体的には、再生医療及び細胞医療等の分野におけるバイオ人工肝臓、ハイブリッド型人工肝臓装置における体外循環型人工肝臓、及びバイオリアクターなどが挙げられる。
前記肝組織・臓器としては、前記胚様体の接着培養開始から１０〜１８日目の前記肝組織・臓器を使用することが好ましく、１５〜１８日目の前記肝組織・臓器を使用することがより好ましい。
【００３７】
前記バイオ人工肝臓としては、例えば、前記肝組織・臓器を、肝臓、脾臓、又は腹腔内に移植して、体内で肝臓の再構築を行うものが挙げられる。
【００３８】
前記体外循環型人工肝臓としては、例えば、公知の透析装置や血漿分離における血液循環回路内に、前記肝組織・臓器を充填したモジュールを備え、被処理液である血液などの体液と前記肝組織・臓器とを接触させることにより、有害物質の代謝・除去を行うものが挙げられる。
前記モジュールとしては、前記被処理液の循環が可能で、かつ前記肝組織・臓器の培養が可能な容器であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、中空糸モジュール、バイオリアクターなどが挙げられる。
【００３９】
前記バイオリアクターとしては、前記肝組織・臓器を含む反応器を用い、肝臓由来の生理活性物質や有用物質の産生を行うものが挙げられ、例えば、血液凝固因子産生用バイオリアクター等が挙げられる。
【００４０】
本発明の肝組織・臓器は、肝実質細胞及び肝非実質細胞を含むため、肝実質細胞のみからなる従来の人工肝臓と比較して、高い肝機能を有する点で有利である。
【００４１】
（薬物スクリーニング方法）
前記薬剤スクリーニング方法は、本発明の肝組織・臓器に、被験物質を投与することを含み、さらに必要に応じて、適宜選択したその他の工程を含む。
前記薬剤スクリーニング方法の具体的な方法としては、例えば、本発明の肝組織・臓器の培養液に被験物質を添加し、一定時間インキュベートした後、前記培養液中及び前記肝組織・臓器を構成する細胞内の少なくともいずれかに含まれる代謝産物等を解析する方法などが挙げられる。
【００４２】
前記被験物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、肝機能障害治療薬、機能性食品、及びこれらの有効成分のいずれかが挙げられる。
前記肝機能障害治療薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、新規治療薬、及び既存の治療薬のいずれであってもよい。前記新規治療薬のスクリーニングは、該治療薬の有効性の評価に好適であり、既存の治療薬のスクリーニングは、該治療薬の有効性評価及び適合性評価に好適である。
前記機能性食品としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、肝機能向上効果が期待される前記機能性食品などが挙げられる。前記機能性食品を被験物質としたスクリーニングは、前記機能性食品中の有用物質や毒性物質等の探索及び評価に好適である。
【００４３】
前記薬剤スクリーニングとしては、例えば、肝機能向上に有用な成分のスクリーニング、及び肝臓に障害を与える有害成分のスクリーニングなどが挙げられる。
前記肝機能向上に有用な成分のスクリーニングとしては、例えば、コレステロール分解促進物質、及びコレステロール生合成阻害物質の探索などが挙げられる。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこの実施例に何ら限定されるものではない。
【００４５】
（試験例）
＜胚性幹細胞の分化誘導＞
−胚性幹細胞（親細胞）の培養−
１２９／Ｏｌａマウス由来の胚性幹細胞Ｅ１４．１（（Ｐ．Ｏ．Ｓｅｇｌｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１３，２９−８３（１９７６）、Ｒ．Ｋｕｈｎ，Ｋ．Ｒａｊｅｗｓｋｙら，Ｓｉｅｎｃｅ．，２５４（５０３２），７０７−７１０（１９９１））；東京大学医科学研究所の岩倉洋一郎博士、吉田進昭博士より恵与された）を、マイトマイシンＣ処理したマウス胚性繊維芽細胞をフィーダー細胞として共培養した。前記胚性幹細胞Ｅ１４−１は、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ社製）に、牛胎児血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）２０％、ピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン社製）１ｍＭ、非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ社製）１００μＭ、Ｍ２−メルカプトエタノール（シグマ社製）１００μ、ＬＩＦ（ケミコン社製）１０３Ｕ／ｍｌを加えた培地を用い、未分化な形質を維持しながら培養した。
培地交換を毎日行い、コンフルエントに達するまで前記Ｅ１４．１細胞を３日間増殖させた。
【００４６】
−胚様体の作製−
コンフルエントに達した前記Ｅ１４．１細胞を、０．０５％  トリプシン、１．０％  ニワトリ血清、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳを用いて処理し、単一細胞状態とした。次いで、前記Ｅ１４．１細胞を、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Ｇｉｂｃｏ社製）に牛胎児血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）２０％、ピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン社製）１ｍＭ、非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ社製）１００μＭ、及びＭ２−メルカプトエタノール（シグマ社製）１００μを加えた胚様体形成用培地に懸濁し、該細胞懸濁液を５０μＬあたり前記Ｅ１４−１細胞が１，０００個含まれるように調製した。
９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社製）本体の各ウェルに、予めミネラルオイル（ＳＩＧＭＡ社製）３５０μＬを充填し、該９６ウェルプレートの蓋の内側部分の各ウェルに対応する部位に前記Ｅ１４．１細胞懸濁液を５０μＬずつ滴下した。前記９６ウェルプレート本体上に、前記Ｅ１４．１細胞懸濁液が搭載された蓋を反転させて組合せ、培養を開始した（以下、ハンギングドロップ法という）。前記ハンギングドロップ法により、前記Ｅ１４．１細胞を、５％ＣＯ２を通気したインキュベータで３７℃で５日間培養を行い、胚様体を得た。
【００４７】
−分化誘導−
前記９６ウェルプレートの１ウェル中の胚様体を、接着培養容器としてゼラチンコートした６ｃｍプレート（ＩＷＡＫＩ社製）の１ウェルに播種したものを合計２０枚作製した。前記接着培養容器中に、分化用培地（２０％ＦＣＳ、ＩＭＤＭ、１００×非必須アミノ酸、１００×ピルビン酸ナトリウム、メルカプトエタノール）を４ｍＬ加え、３７℃で５％ＣＯ２を通気したインキュベータ中で前記胚様体の接着培養を開始した。
前記接着培養容器を４群に分け、前記分化用培地中に、下記に示す条件に基づき成長因子をそれぞれ添加し、１８日間培養を行った。
【表１】
2007014273.tif 000002
＊１：繊維芽細胞成長因子（インビトロジェン社製）１００ｎｇ／ｍＬ
＊２：肝細胞成長因子（ジェンザイム社製）２０ｎｇ／ｍｌ
＊３：マウスオンコスタチンＭ（ジェンザイム社製）１０ｎｇ／ｍＬ
上記の他に、デキサメタソン（ＩＳＮバイオメディカル社製）１００ｎＭ、ＩＴＳ（組成：インスリン１０μｇ、トランスフェリン５μｇ、セレニウム５ｎｇ／ｍＬ；インビトロジェン社製）１０μｇ／ｍＬ、及びニコチンアミド（ナカライテスク社製）１０ｍＭを６日目に添加した。
【００４８】
前記胚様体は、前記接着培養容器のゼラチン上に接着して増殖し、コロニーを形成した。接着培養開始から１０日目の胚様体コロニーを実体顕微鏡下で観察し、拍動が観られる胚様体コロニーと拍動がみられない胚様体コロニーとを採取し、それぞれの胚様体コロニーについて、以下に示すＲＴ−ＰＣＲ法により肝特異的マーカー及び心房特異的マーカーの発現を観察した。なお、肝特異的マーカーの陽性コントロールとして、胎齢１５日目のマウス肝臓、及び成体（生後１０週齢）マウス肝臓から下記に示す方法で単離した胎児肝細胞及び初代培養成体肝細胞を用い、心房特異的マーカーの陽性コントロールとして、胎齢１５日目のマウス心臓から下記に示す方法で単離した胎児心筋細胞を用いた。また、陰性対象として、分化誘導前のＥ１４．１細胞を用いた。
【００４９】
−陽性コントロール用細胞の調製方法−
（１）胎児肝細胞、胎児心筋細胞
胎齢１５日目のマウスから摘出した肝臓及び心臓は、それぞれ細切し、コラゲナーゼＩＩを添加したＨａｎｋｓ液を加えて常法により処理し、細胞を遊離させた。得られた細胞をゼラチンコートした６ｃｍディッシュに播種し、１０％  牛胎児血清、１００μＭ  非必須アミノ酸溶液、ペニシリン１０００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン−グルタミン１０００μｇ／ｍＬが添加されたダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ社製）を加えて数時間静置した後、培地交換を行った。調製した胎児肝細胞（ＦＬ）、及び胎児心臓細胞（ＦＨ）は、５％ＣＯ２を通気したインキュベータ中で培地を毎日交換しながら３７℃で培養した。
（２）初代培養成体肝細胞
１２９／ＳｖＪ雄マウス（生後１０週齢）の肝臓から、コラゲナーゼ潅流法（Ｐ．Ｏ．Ｓｅｇｌｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１３，２９−８３（１９７６））により肝細胞懸濁液を得た。該肝細胞懸濁液から、５０％Ｐｅｒｃｏｌｌ密度勾配遠心法によって肝細胞を回収した。得られた前記肝細胞を、ゼラチンコートしたディッシュに播種し、牛胎児血清１０％、非必須アミノ酸溶液１００μＭ、ペニシリン１０００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン−グルタミン１０００μｇ／ｍＬが添加されたダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ社製）を加えて数時間静置した後、培地交換を行い、初代培養成体肝細胞を得た。調製した前記初代培養成体肝細胞（ＡＬ）は、５％ＣＯ２を通気したインキュベータ中で培地を毎日交換しながら３７℃で培養した。
【００５０】
−ＲＴ−ＰＣＲ法による解析−
前記表１に記載の各条件Ａ〜Ｄで培養した各胚様体コロニーについて、接着培養容器に播種して接着培養を開始してから１０日目（２４０時間後）に拍動が観られるものと拍動がみられないものとをそれぞれ選択した。前記採取した計８種類の胚様体コロニーから、ＭａｇＥＸｔｒａｃｔｏｒ  ｍＲＮＡ  ｋｉｔ（東洋紡績（株）製）を用い、添付マニュアルに従って、トータルＲＮＡを２μｇそれぞれ調製し、ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ  ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  ｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒ（インビトロジェン社製）を用いて各ｃＤＮＡを合成した。
ここで、前記胚様体コロニーの拍動の有無は、前記胚様体コロニーを実体顕微鏡下で観察し、連続的かつ規則的な収縮が観られるコロニーを、拍動ありと判定した。
【００５１】
前記８種類の胚様体コロニーと同様にして、前記胎児肝細胞、前記胎児心筋細胞、前記初代培養成体肝細胞、及びＥ１４．１細胞から、トータルＲＮＡを２μｇそれぞれ調製し、各ｃＤＮＡを合成した。
【００５２】
前記各ｃＤＮＡを０．１μｇ／μＬに調製した液を用いて、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰ、５Ｕ／μＬ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ（株）製）、及び０．２μｍｏｌ／Ｌの下記に示す各プライマーからなる反応用液を調製した。
【００５３】
前記プライマーは、肝細胞マーカーとしてアルブミンの遺伝子発現量を評価するためにアルブミン特異的プライマー（配列番号１：５´−ＧＣＴＡＣＧＧＣＡＣＡＧＴＧＣＴＴＧ−３´、配列番号２：５´−ＣＡＧＧＡＴＴＧＣＡＧＡＣＡＧＡＴＡＧＴＣ−３´、Ｔ．Ｈａｍａｚａｋｉ，Ｙ．Ｉｉｂｏｓｈｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，４９７（１），１５−１９（２００１））、及び心筋細胞マーカーとして心房性ナトリウムペプチド（ＡＮＰ）の遺伝子発現量を評価するためにＡＮＰ特異的プライマー（配列番号３：５´−ＡＴＧＧＧＣＴＣＣＴＴＣＡＴＣＡＣ−３´、配列番号４：５´−ＴＧＴＴＧＣＡＧＣＣＴＡＧＴＣＣＡＣＴＣ−３´）を用いた。
また、コントロールとしてヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｐｒｔ）特異的プライマー（配列番号５：５´−ＧＴＴＧＧＡＴＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＴＴＴＧＴＴＧ−３´、配列番号６：５´−ＧＡＧＧＧＴＡＧＧＣＴＧＧＣＣＴＡＴＡＧＧＣＴ−３´）を用いた。
【００５４】
前記反応用溶液を、９４℃で４分間を１サイクル反応させた後、９４℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で１分間を２サイクル、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間を２７サイクル、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１０分間を１サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。該ＰＣＲ反応後の溶液をアガロースゲル電気泳動に供し、出現したバンドから、各プライマーに対応した特異的遺伝子の発現を評価した。結果を図１、及び表２に示す。
【００５５】
【表２】
2007014273.tif 000003
＋＋：発現が強く検出された
＋：発現が検出された
±：ごくわずかに発現が検出された
−：発現が検出されなかった
【００５６】
図１及び表２から、拍動がみられた胚様体コロニーには、培養中の成長因子の添加の有無に関わらず、アルブミン遺伝子の発現が強くみられた。このことから、成長因子を添加することなく、胚性幹細胞から心筋細胞と肝細胞とを分化誘導可能であり、特に、拍動する細胞の存在により肝細胞が誘導される可能性が明らかになった。
【００５７】
（実施例１）
＜リクローニングによるサブクローンの樹立＞
前記Ｅ１４．１細胞を、試験例と同様にして未分化な形質を維持しながら、コンフルエントになるまで増殖させた。前記胚性幹細胞培養用培地を除去し、培養したＥ１４．１細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、トリプシン‐ＥＤＴＡ培地で分離し、前記胚性幹細胞培養用培地に懸濁し、単一細胞状態とした。
ゼラチンコーティングされた１０ｃｍディッシュ（ＩＷＡＫＩ製）に、単一細胞状態の前記Ｅ１４．１クローン細胞を播種し、培地交換を行いながら、３７℃で５％ＣＯ２を通気したインキュベータで５日間培養した。前記Ｅ１４．１クローン細胞は、互いに凝集せず、ディッシュ内側表面に付着し、分裂・増殖を繰り返してコロニーを形成した。
【００５８】
前記コロニーを実体顕微鏡下でコロニーを選択し、該コロニーを、孔径が約０．５ｍｍのガラスピペットを用いて、４０〜８０個ピックアップした。
【００５９】
前記各コロニーは、トリプシン０．０５％、ニワトリ血清１．０％、及びＥＤＴＡ１ｍＭを含むＰＢＳを用いて処理し、単一細胞状態とした後、前記胚性幹細胞培養用培地（ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ社製）に、牛胎児血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）２０％、ピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン社製）１ｍＭ、非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ社製）１００μＭ、Ｍ２−メルカプトエタノール（シグマ社製）１００μ、ＬＩＦ（ケミコン社製）１０３Ｕ／ｍｌ）を用い、未分化な形質を維持しながら培養し、サブクローンとしてＭｙ−１、Ａｂ−３、及びＭｙ−５の系統を樹立した。
【００６０】
前記Ｍｙ−１、Ａｂ−３、及びＭｙ−５のサブクローンを、それぞれ、試験例と同様に培養して胚様体を作製し、前記９６ウェルプレート１０枚分の胚様体を得た。
次いで、前記９６ウェルプレートの１ウェル中の胚様体を、接着培養容器としてゼラチンコートした９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社製）に播種し、これを合計３枚作製した。前記接着培養容器中に、前記分化用培地を０．３ｍＬ加え、３７℃で５％ＣＯ２を通気したインキュベータ中で前記胚様体の接着培養を開始した。
前記接着培養容器での培養開始から１日（２４時間）ごとに、前記接着培養容器中の前記胚様体コロニーを実体顕微鏡により観察し、拍動の有無を確認した。前記胚様体コロニーの拍動の有無は、試験例と同様にして判定した。観察した全コロニー中、拍動がみられたコロニー数の割合を図２に示す。
【００６１】
＜サブクローンの分化＞
得られたＭｙ−１、Ａｂ−３、及びＭｙ−５の各サブクローンの培養を継続し、接着培養容器に播種後４８時間後の胚様体コロニーを採取し、試験例と同様にして、ＲＴ−ＰＣＲ法によりアルブミン遺伝子の発現を評価した。ただし、前記胚様体コロニーは、拍動の有無により選別することなく採取した。
アガロースゲル電気泳動の結果、Ｍｙ−１及びＡｂ−３にはアルブミン遺伝子の発現を示すバンドがみられたが、Ｍｙ−５のアルブミン遺伝子の発現を示すバンドは目視で確認できなかった。結果を表３に示す。
【００６２】
【表３】
2007014273.tif 000004
※：接着培養容器に播種後４８時間後の拍動率
＋：発現が検出された
−：発現が検出されなかった
【００６３】
（実施例２）
＜リクローニングしたサブクローンの分化誘導＞
（１）サブクローンの分化能評価
−ＲＴ−ＰＣＲ法による解析−
実施例１で得られたサブクローンＡｂ−３（接着培養開始から４８時間後の拍動率が８０％）を用い、前記分化用培地に成長因子をしなかった試験例の条件Ｄと同様にして培養し、胚様体コロニーを得た。培養開始から３日目及び５日目の胚様体、並びに組織培養プレートに播種後２、４、６、及び８日目の胚様体コロニーをそれぞれ採取し、試験例と同様にしてトータルＲＮＡを２μｇそれぞれ調製し、各ｃＤＮＡを合成した。また、前記胎児肝細胞、前記初代培養成体肝細胞、及びＥ１４．１細胞から、試験例と同様にしてトータルＲＮＡを２μｇそれぞれ調製し、各ｃＤＮＡを合成した。
【００６４】
前記各ｃＤＮＡを０．１μｇ／μＬに調製した液を用いて、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰ、ｍｏｌ／Ｌ、５Ｕ／μＬ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ（株）製）、及び０．２μｍｏｌ／Ｌの下記に示す各プライマーからなる反応用液を調製した。
【００６５】
前記プライマーは、内胚葉特異的マーカーとして、トランスサイレチンの遺伝子発現量を評価するためにトランスサイレチン（ＴＴＲ）特異的プライマー（配列番号７：５´−ＣＴＣＡＣＣＡＣＡＧＡＴＧＡＧＡＡＧ−３´、配列番号８：５´−ＧＧＣＴＧＡＧＴＣＴＣＴＣＡＡＴＴＣ−３´、Ｔ．Ｈａｍａｚａｋｉ，Ｙ．Ｉｉｂｏｓｈｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，４９７（１），１５−１９（２００１））、α−フェトプロテインの遺伝子発現量を評価するためにα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）特異的プライマー（配列番号９：５´−ＴＣＧＴＡＴＴＣＣＡＡＣＡＧＧＡＧＧ−３´、配列番号１０：５´−ＡＧＧＣＴＴＴＴＧＣＴＴＣＡＣＣＡＧ−３´、Ｔ．Ｈａｍａｚａｋｉ，Ｙ．Ｉｉｂｏｓｈｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，４９７（１），１５−１９（２００１））、ａ１−アンチトリプシンの遺伝子発現量を評価するためにａ１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）特異的プライマー（配列番号１１：５´−ＡＡＴＧＧＡＡＧＡＡＧＣＣＡＴＴＣＧＡＴ−３´、配列番号１２：５´−ＡＡＧＡＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣ−３´、Ｔ．Ｈａｍａｚａｋｉ，Ｙ．Ｉｉｂｏｓｈｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，４９７（１），１５−１９（２００１））、並びに肝細胞マーカーとして、試験例で使用したアルブミン特異的プライマーを用いた。また、未分化細胞マーカーとして、転写因子Ｏｃｔ−３／４の遺伝子発現量を評価するためにＯｃｔ−３／４特異的プライマー（配列番号１３：５´−ＡＧＣＡＣＧＡＧＴＧＧＡＡＡＧＣＡＣＴ−３´、配列番号１４：５´−ＣＴＣＡＴＴＧＴＴＧＴＣＧＧＣＴＴＣＣＴ−３´）を用い、コントロールとして試験例で使用したｈｐｒｔ特異的プライマーを用いた。
【００６６】
前記反応用溶液を、９４℃で４分間を１サイクル反応させた後、９４℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で１分間を２サイクル、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間を２７サイクル、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１０分間を１サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。該ＰＣＲ反応後の溶液をアガロースゲル電気泳動に供し、出現したバンドから、各プライマーに対応した特異的遺伝子の発現を評価した。結果を図３、及び表４に示す。
【００６７】
【表４】
2007014273.tif 000005
＋＋：発現が強く検出された。
＋：発現が検出された。
±：発現がわずかに検出された。
−：発現が検出されなかった。
【００６８】
図３及び表４から、前記サブクローンＡｂ−３の胚様体コロニー中の細胞に、肝細胞特異的遺伝子群の発現が確認され、リクローニングにより得られたサブクローンが、肝細胞への分化能を有することがわかった。
【００６９】
−ウェスタンブロット法による解析−
実施例１で得られた前記サブクローンＡｂ−３を用い、分化用培地に成長因子をしない試験例の条件Ｄと同様にして培養し、胚様体コロニーを得た。前記組織培養プレートに播種後４、６、８、１２、１６、及び１８日目の胚様体コロニーをそれぞれ採取し、下記の方法で細胞溶解液を調製した。また、前記胚様体コロニーと同様にして、前記初代培養成体肝細胞、ＳＴＯ細胞、及びＥ１４．１細胞から細胞溶解液をそれぞれ調製した。前記胎児肝細胞及び前記初代培養成体肝細胞は、試験例と同様にして調製した。
【００７０】
前記各細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで遠心洗浄し、細胞残渣を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．１％  ＳＤＳ、１％  デオキシコール酸ナトリウム、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、２μｇ／ｍＬ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１０μｇ／ｍＬ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ  ５μｇ／ｍＬ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎを含むバッファー中に溶解し、細胞溶解液を調製した。
該細胞溶解液を４℃、１２０００回転で１０分間遠心分離し、上清を回収し、ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｅｃｅ社製）を用いてタンパク質の量を測定し、各溶液中のタンパク質濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように調整し、サンプル溶液を得た。
前記サンプル溶液を、８％ポリアクリルアミドゲルの各レーン上に１５μＬずつ加え、１２０ｍＡで１．５時間、室温にて電気泳動を行った。泳動したタンパク質は、前記ポリアクリルアミドゲルから、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）上に、０．３Ｖで１時間かけて転写した。前記タンパク質が転写されたＰＶＤＦ膜を、ＰＢＳで溶解した５％スキムミルクで１時間室温にてブロッキングを行った後、
０．１％ＢＳＡを添加した０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ−Ｔ溶液で希釈したペルオキシダーゼ標識抗ウサギヒツジ抗体（アマシャムファルマシアバイオテク社製）と室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔ溶液で前記ＰＶＤＦ膜を洗浄した後、ケミルミネッセンス（ＥＣＬ、アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて発光させ、Ｘ線フィルム（ＲＸ−Ｕ、富士写真フイルム社製）を感光させ、タンパク質を検出した。結果を図４に示す。
【００７１】
図４から、リクローニングにより得られた前記サブクローンＡｂ−３の胚様体コロニー中の細胞から、肝細胞特異的なアルブミン、心筋細胞特異的なアクチンの産生が確認された。このことから、分化用培地中に成長因子を添加することなく、リクローニングして得た胚性幹細胞サブクローンからアルブミンを産生する肝様細胞が得られることがわかった。また、検出されたアルブミン量が経時的に増加していることから、胚葉体コロニー中に含まれる肝様細胞の割合が時間とともに増加し、分化がすすむことがわかった。
【００７２】
（２）成長因子の産生
上記（１）において、前記分化用培地中に成長因子を添加しないでも前記胚様体が分化したことから、前記胚様体自身が成長因子を産生している可能性について調べた。
プライマーとして、ＨＧＦ（肝細胞成長因子）特異的プライマー（配列番号１５：５´−ＡＧＡＣＡＣＣＡＣＡＣＣＧＧＣＡＣＡＧＴ−３´、配列番号１６：５´−ＡＴＡＧＧＧＣＡＡＴＡＡＴＣＣＣＡＡＧＧ−３´）、ＦＧＦ（繊維芽細胞成長因子）特異的プライマー（配列番号１７：５´−ＡＣＣＧＡＧＡＧＧＴＴＣＡＡＣＣＴＧＣＣ−３´、配列番号１８：５´−ＧＣＣＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＣＧＡＧＧＡＣＣ−３´）を用いた以外は、上記（１）と同様にしてＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現を評価した。結果を図５に示す。
【００７３】
図５から、前記組織培養プレートに播種後、胚様体自身が成長因子を産生していることがわかった。
【００７４】
（実施例３）
＜胚性幹細胞分化における成長因子の関与＞
（１）分化初期における成長因子添加の影響
実施例１で得られた前記サブクローンＡｂ−３を用い、試験例の条件Ｃと同様にして前記分化用培地に成長因子を添加した群と、試験例の条件Ｄと同様にして前記分化用培地に成長因子を添加しなかった群とに分けて培養し、それぞれ胚様体コロニーを得た。前記組織培養プレートに播種後１０日目の胚様体コロニーをそれぞれ採取し、試験例と同様にしてトータルｍＲＮＡを２μｇ調製し、ｃＤＮＡを合成した。また、試験例と同様にして、前記胎児肝細胞、前記初代培養成体肝細胞、及びＥ１４．１細胞から、トータルＲＮＡを２μｇそれぞれ調製し、各ｃＤＮＡを合成した。
【００７５】
前記各ｃＤＮＡを０．１μｇ／μＬに調製した液を用いて、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰ、５Ｕ／μＬ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ（株）製）、及び０．２μｍｏｌ／Ｌの下記に示す各プライマーからなる反応用液を調製した。
【００７６】
前記プライマーは、成熟肝細胞（肝実質細胞）特異的マーカーとして、チロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）の遺伝子発現量を評価するために、チロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）特異的プライマー（配列番号１９：５´−ＡＣＣＴＴＣＡＡＴＣＣＣＡＴＣＣＧＡ−３´、配列番号２０：５´−ＴＣＣＣＧＡＣＴＧＧＡＴＡＧＧＴＡＧ−３´、Ｔ．Ｈａｍａｚａｋｉ，Ｙ．Ｉｉｂｏｓｈｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，４９７（１），１５−１９（２００１））、及びトリプトファンオキシゲナーゼ（ＴＯ）の遺伝子発現量を評価するために、トリプトファン２，３−ジオキシキナーゼ特異的プライマー（配列番号２１：５´−ＴＧＣＧＣＡＡＧＡＡＣＴＴＣＡＧＡＧＴＧＡ−３´、配列番号２２：５´−ＴＧＣＧＣＡＡＧＡＡＣＴＴＣＡＧＡＧＴＧＡ−３´）、並びに肝細胞マーカーとして、試験例で使用したアルブミン特異的プライマーを用いた。また、コントロールとして試験例で使用したｈｐｒｔ特異的プライマーを用いた。
【００７７】
前記反応用溶液を、９４℃で４分間を１サイクル反応させた後、９４℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で１分間を２サイクル、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間を２７サイクル、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１０分間を１サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。該ＰＣＲ反応後の溶液をアガロースゲル電気泳動に供し、出現したバンドから、各プライマーに対応した特異的遺伝子の発現を評価した。結果を図６に示す。
【００７８】
（２）分化後期における成長因子添加の影響
実施例１で得られた前記サブクローンＡｂ−３を用い、試験例の条件Ｃと同様にして前記分化用培地に成長因子を添加した群と、試験例の条件Ｄと同様にして前記分化用培地に成長因子を添加しなかった群とに分けて培養し、それぞれ胚様体コロニーを得た。前記組織培養プレートに播種後１８日目の胚様体コロニーをそれぞれ採取し、試験例と同様にしてトータルｍＲＮＡを２μｇ調製し、ｃＤＮＡを合成した。また、試験例と同様にして、前記初代培養成体肝細胞、及びＥ１４．１細胞から、トータルＲＮＡを２μｇそれぞれ調製し、各ｃＤＮＡを合成した。
【００７９】
前記各ｃＤＮＡを０．１μｇ／μＬに調製した液を用いて、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰ、ｍｏｌ／Ｌ、５Ｕ／μＬ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ（株）製）、及び０．２μｍｏｌ／Ｌの下記に示す各プライマーからなる反応用液を調製した。
【００８０】
前記プライマーは、成熟肝細胞（肝実質細胞）特異的マーカーとして、前記チロシンアミノトランスフェラーゼ特異的プライマー、前記トリプトファン２，３−ジオキシキナーゼ特異的プライマー、アシアログリコプロテインレセプター（ＡＳＧＲ）の遺伝子発現量を調べるために、ＡＳＧＲ−１特異的プライマー（配列番号２３：５´−ＧＣＴＧＧＡＡＡＡＡＣＡＧＣＡＧＡＡＧＧ−３´、配列番号２４：５´−ＣＴＧＴＴＣＣＡＴＣＣＡＣＣＣＡＴＴＴＣ−３´）、及びＡＳＧＲ−２特異的プライマー（配列番号２５：５´−ＣＧＧＡＣＣＣＴＧＡＡＡＧＡＡＡＣＣＴＴ−３´、配列番号２６：５´−ＡＴＧＡＡＡＣＴＧＧＣＴＣＣＴＧＴＧＣＴ−３´）、並びに肝細胞マーカーとして、試験例で使用したアルブミン特異的プライマーを用いた。
さらに、胆管上皮細胞マーカーとして、肝特異的有機アニオントランスポーター（ＬＳＴ−１）の遺伝子発現量を評価するためにＬＳＴ−１特異的プライマー（配列番号２７：５´−ＴＧＣＧＣＡＡＧＡＡＣＴＴＣＡＧＡＧＴＧＡ−３´、配列番号２８：５´−ＴＧＡＧＴＴＧＧＡＣＣＣＣＴＴＴＴＣＡＣ−３´）を用いた。コントロールとしては、試験例で使用したｈｐｒｔ特異的プライマーを用いた。
【００８１】
前記反応用溶液を、９４℃で４分間を１サイクル反応させた後、９４℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で１分間を２サイクル、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間を２７サイクル、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１０分間を１サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。該ＰＣＲ反応後の溶液をアガロースゲル電気泳動に供し、出現したバンドから、各プライマーに対応した特異的遺伝子の発現を評価した。結果を図７に示す。
【００８２】
図６から、前記組織培養プレートに播種後１０日目の胚様体コロニーでは、前記分化用培地中に成長因子を添加して培養した胚様体は、添加せずに培養した胚様体と比較して肝実質細胞へ分化した細胞の割合が高く、成長因子の添加によって肝実質細胞への分化が加速されることがわかった。しかしながら、図７から、前記組織培養プレートに播種後１８日目の胚様体コロニーでは、前記分化用培地中に成長因子を添加して培養した胚様体と、添加せずに培養した胚様体との間に、肝実質細胞特異的細胞の発現に大きな差異はなく、成長因子の添加が胚様体の分化には必須でないことがわかった。特に、成長因子を添加せずに培養した胚葉体にのみＬＳＴ−１の発現がみられたことから、成長因子の添加により、肝組織への分化が阻害されている可能性が明らかになった。
【００８３】
（実施例４）
＜組織形態学的観察＞
前記サブクローンＡｂ−３を、実施例２と同様に前記分化用培地に成長因子を添加せずに培養した。前記接着培養容器に播種後１０日目の胚様体コロニー、及び１８日目の胚様体コロニーを、それぞれ下記に示す方法でアルブミン抗体を用いて免疫染色し、アルブミン産生細胞を観察した。
【００８４】
前記接着培養容器内の培地を除去し、４％パラホルムアルデヒドを添加したＰＢＳを加え、前記胚様体コロニーを３０分間固定した。次いで０．１％ｔｒｉｔｏｎＸを添加し、室温で１時間処理し、細胞膜の透過性を高めた。固定した前記胚様体コロニーを、４％ロバ血清を添加したブロッキング緩衝液（Ｊａｃｓｏｎ  ｉｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製）で室温で１０分間処理した後、１次抗体として２５０倍希釈したウサギ抗マウスアルブミン抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）を添加して４℃で一晩インキュベートし、蛍光２次抗体として１００倍希釈したＦＩＴＣ標識ロバ抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｊａｃｓｏｎ  ｉｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を添加して室温で１時間反応させ、蛍光顕微鏡（ＢＸ６０：オリンパス社製）で観察した。前記アルブミン産生細胞を免疫染色した前記接着培養容器に播種後１０日目の胚様体コロニーの写真を図８Ｂに、１８日目の胚様体コロニーの写真を図９Ａ、図９Ｂにそれぞれ示す。また、１０日目の胚様体コロニーを白色光下で観察した写真を図８Ａに示す。
【００８５】
図８Ａ及び図８Ｂから、アルブミン産生細胞は、拍動する心筋細胞領域（ＣＡ）の周囲に島状のクラスターを形成していることがわかる。
また、図９Ａから、１８日目の胚様体コロニー中にはアルブミン産生細胞に分化した細胞の割合が高くなっていることがわかり、図９Ｂから、アルブミン産生細胞が２核の細胞であることがわかる。２核を有する細胞は、正常マウス個体における成熟肝細胞の形態的特徴であることから、胚様体コロニー中のアルブミン産生細胞が、形態学的にも肝細胞であることが確認された。
【００８６】
（実施例５）
＜胚様体由来肝細胞の機能評価＞
前記サブクローンＡｂ−３を用い、実施例２と同様に前記胚様体を作製した。前記胚様体を３０個集めた群、５０個集めた群について、前記接着培養容器に播種し、接着培養した。前記分化用培地には成長因子を添加せずに培養し、１０日目の胚様体コロニー、及び１８日目の胚様体コロニーをそれぞれ得た。
前記胚様体コロニー、前記胚性幹細胞Ｅ１４．１、前記マウス初代培養成体肝細胞、及びマウス肝細胞セルラインＨｅＰａ１−６のそれぞれに対し、２ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌを添加した無血清培地（ＩＭＤＭ）を加え、３７℃でインキュベートし、ＮＨ４Ｃｌ添加６時間後、１２時間後、及び２４時間後において、前記無血清培地中に存在するＮＨ４Ｃｌ量をインドフェノール法で測定し、添加量に対する増減を評価した。結果を図１０に示す。
図１０中、「□」は前記マウス初代培養成体肝細胞、「■」は前記１８日目のサブクローンＡｂ−３胚様体コロニー５０個、「○」は前記１８日目のサブクローンＡｂ−３胚様体コロニー３０個、「●」は前記１０日目のサブクローンＡｂ−３胚様体コロニー３０個、「▼」は前記ＨｅＰａ１−６、及び「▲」は前記Ｅ１４．１細胞の結果をそれぞれ示す。いずれも使用した細胞からゲノムＤＮＡを抽出して細胞数を測定し、各１００細胞あたりの分解能に換算した結果である。
【００８７】
図１０から、前記サブクローンＡｂ−３の３０個の胚様体又は５０個の胚様体から分化した胚様体コロニーは、高いアンモニア分解能を示し、多数の胚様体を集めて培養したコロニーは、高い肝機能を示す肝組織に分化していることがわかった。
【００８８】
（実施例６）
＜肝組織への分化＞
−ＲＴ−ＰＣＲ法による解析−
実施例１で得られた前記サブクローンＡｂ−３を用い、分化用培地に成長因子をしなかった試験例の条件Ｄと同様にして培養し、胚様体コロニーを得た。培養開始から３日目及び５日目の胚様体、並びに組織培養プレートに播種後２、４、６、及び８日目の胚様体コロニーをそれぞれ採取し、試験例と同様にしてトータルＲＮＡを２μｇそれぞれ調製し、各ｃＤＮＡを合成した。また、前記胎児肝細胞、及びＥ１４．１細胞から、試験例と同様にしてトータルＲＮＡを２μｇそれぞれ調製し、各ｃＤＮＡを合成した。
【００８９】
前記各ｃＤＮＡを０．１μｇ／μＬに調製した液を用いて、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰ、５Ｕ／μＬ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ（株）製）、及び０．２μｍｏｌ／Ｌの下記に示す各プライマーからなる反応用液を調製した。
【００９０】
前記プライマーは、血管内皮細胞特異的マーカーとして、ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ１の遺伝子発現量を調べるために、ＰＥＣＡＭ−１特異的プライマー（配列番号２９：５´−ＧＴＣＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＧＴＡＧ−３´、配列番号３０：５´−ＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＧＴＣＣＡＡＣＡＡＣ−３´）、血管内皮増殖因子の遺伝子発現量を調べるために、ＶＥＧＦＲ−１特異的プライマー（配列番号３１：５´−ＴＧＴＧＧＡＧＡＡＡＣＴＴＧＧＴＧＡＣＣＴ−３´、配列番号３２：５´−ＴＧＧＡＧＡＡＣＡＧＣＡＧＧＡＣＴＣＣＴＴ−３´）及びＶＥＧＦＲ−２特異的プライマー（配列番号３３：５´−ＴＣＴＧＴＧＧＴＴＣＴＧＣＧＴＧＧＡＧＡ−３´、配列番号３４：５´−ＧＴＡＴＣＡＴＴＴＣＣＡＡＣＣＡＣＣＣ−３´）、並びに血管新生調節因子の遺伝子発現量を調べるために、ＶＥＧＦ特異的プライマー（配列番号３５：５´−ＣＡＧＧＣＴＧＣＴＧＴＡＡＣＧＡＴＧＡＡ−３´、配列番号３６：５´−ＡＡＴＧＣＴＴＴＣＴＣＣＧＣＴＣＴＧＡＡ−３´）を用いた。また、未分化細胞マーカーとして、実施例２で使用したＯｃｔ−３／４特異的プライマーを用い、コントロールとしては、試験例で使用したｈｐｒｔ特異的プライマーを用いた。
【００９１】
前記反応用溶液を、９４℃で４分間を１サイクル反応させた後、９４℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で１分間を２サイクル、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間を２７サイクル、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１０分間を１サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。該ＰＣＲ反応後の溶液をアガロースゲル電気泳動に供し、出現したバンドのから、各プライマーに対応した特異的遺伝子の発現を評価した。結果を図１１、及び表５に示す。
【００９２】
【表５】
2007014273.tif 000006
＋＋：発現が強く検出された。
＋：発現が検出された。
±：発現がわずかに検出された。
−：発現が検出されなかった。
【００９３】
図１１及び表５から、前記サブクローンＡｂ−３から分化した胚様体は、分化に伴い、肝実質細胞のみならず、血管内皮細胞への分化が同時に観られることがわかった。このことから、前記胚様体は、遺伝子レベルで個体発生の時間軸と同様に分化し、肝組織・臓器の構築可能性を有することが明らかになった。
【００９４】
−免疫染色による形態的解析−
前記サブクローンＡｂ−３から、実施例２と同様にして胚様体を作製し、前記胚様体を２０個集めて前記接着培養容器に播種した。前記分化用培地には成長因子を添加せずに培養した。前記接着培養容器に播種後１０日目の胚様体コロニー（以下、Ａ１０と表す）、及び１８日目の胚様体コロニー（以下、Ａ１８と表す）を、免疫染色した。アルブミン産生細胞は、実施例４と同様に染色し、赤色に発色させた。血管内皮細胞は、一次抗体として２５０倍希釈したヤギＩｇＧ抗マウスＰＥＣＡＭ−１抗体（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用い、二次抗体として６０倍希釈したＴＲＩＴＣ標識ブタ抗ウサギ抗体（ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ社製）を用いた以外は、実施例４と同様にして染色して緑色に発色させた。染色した胚様体コロニーは、蛍光顕微鏡及び共焦点顕微鏡を用いて観察した。結果を図１２〜１４に示す。
【００９５】
図１２は、前記Ａ１０の血管内皮細胞のみを染色した写真である。図１２から、血管内皮細胞が網目状に検出され血管様構造を形成していることがわかった。
図１３は、前記Ａ１０のアルブミン細胞及び血管内皮細胞を染色した写真である。図１３から、血管内皮細胞は、アルブミン産生細胞群の領域に伸張し、接触していることがわかった。図１４は、前記Ａ１８のアルブミン細胞及び血管内皮細胞を染色した写真である。図１３のＡ１０と比較して、血管内皮細胞は、アルブミン産生細胞群に並列して網状構造を構築しながら増殖し、アルブミン産生細胞とネットワークを形成していることがわかった。これらのことから、前記サブクローンが肝細胞のみならず、血管内皮細胞にも分化して、その結果、肝組織が形成されることが明らかになった。
【００９６】
（実施例７）
＜肝組織形成における血管内皮細胞の影響＞
−免疫染色による形態的解析−
前記サブクローンＡｂ−３を、実施例２と同様に前記分化用培地に成長因子を添加せずに培養し、胚様体コロニーを得た。また、前記分化用培地中にＮ−（２，６−ジオキソ−３−ピペリジル）フタルイミド（サリドマイド、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｃｏｏｋｓｏｎ社製）を２５μｇ／ｍＬ、及び１００μｇ／ｍＬの各濃度でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解したものを添加した以外は実施例２と同様にして培養し、胚様体コロニーを得た。
各胚様体について、前記接着培養容器に播種後３日目の拍動率を観察した。結果を表６に示す。
【００９７】
【表６】
2007014273.tif 000007
表６から、分化用培地中にサリドマイドを添加することにより、胚様体の拍動率が低下し、心筋細胞への分化が阻害されている可能性が明らかになった。
【００９８】
前記分化用培地中にサリドマイドを１００μｇ／ｍＬ添加して培養した胚様体コロニー（Ａ１８）を、実施例４と同様にして、アルブミン産生細胞及び血管内皮細胞を免疫染色し、蛍光顕微鏡及び共焦点顕微鏡を用いて観察した。結果を図１５に示す。サリドマイドを添加せずに培養して得た胚様体コロニーの結果を図１６に示す。
【００９９】
また、得られた前記各胚様体コロニーについて、血管内皮細胞の発現領域の面積を、画像解析ソフトウェア（Ｓｃｉｏｎ  ｉｍａｇｅ  Ｂｅｔａ  ４．０．２）を用いて測定し、比較を行った。測定は、各コロニー３種からそれぞれ１５の領域を選択して行い、平均値と標準偏差を求め、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔにより解析した。有意水準はＰ＜０．００１とした。結果を図１７に示す。
【０１００】
図１５及び図１６から、分化用培地中にサリドマイドを添加したことにより血管内皮細胞の発現が抑制され、またアルブミン産生細胞の発現も抑制されていることが組織観察からわかった。また、図１７から、血管内皮細胞の発現領域の面積が、分化用培地中にサリドマイドを添加することにより、約２０％に縮小したことがわかった。
【０１０１】
−ＲＴ−ＰＣＲ法による解析−
実施例１で得られた前記サブクローンＡｂ−３を用い、下記表７に示す条件とした以外は試験例と同様にして培養し、胚様体コロニーを得た。前記組織培養プレートに播種後１８日目の胚様体コロニー（Ａ１８）をそれぞれ採取し、試験例と同様にしてトータルＲＮＡを２μｇそれぞれ調製し、各ｃＤＮＡを合成した。また、前記Ｅ１４．１細胞、前記胎児心筋細胞、前記胎児肝細胞、及び初代培養生体肝細胞から、試験例と同様にしてトータルＲＮＡを２μｇそれぞれ調製し、各ｃＤＮＡを合成した。
【表７】
2007014273.tif 000008
＊１：Ｎ−（２，６−ジオキソ−３−ピペリジル）フタルイミド（サリドマイド、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｃｏｏｋｓｏｎ社製）
＊２：試験例の条件Ｃと同様
【０１０２】
前記各ｃＤＮＡを０．１μｇ／μＬに調製した液を用いて、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰ、５Ｕ／μＬ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ（株）製）、及び０．２μｍｏｌ／Ｌの下記に示す各プライマーからなる反応用液を調製した。
【０１０３】
前記プライマーは、実施例６で用いたＰＥＣＡＭ−１特異的プライマー（配列番号２９及び３０）、ＶＥＧＦＲ−１特異的プライマー（配列番号３１及び３２）、ＶＥＧＦＲ−２特異的プライマー（配列番号３３及び３４）、及び試験例で用いたアルブミン特異的プライマー（配列番号１及び２）、並びに実施例１で用いたチロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）特異的プライマー（配列番号１９及び２０）を用いた。また、コントロールとしては、試験例で使用したｈｐｒｔ特異的プライマー（配列番号５及び６）を用いた。
【０１０４】
前記反応用溶液を、９４℃で４分間を１サイクル反応させた後、９４℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で１分間を２サイクル、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間を２７サイクル、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１０分間を１サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。該ＰＣＲ反応後の溶液をアガロースゲル電気泳動に供し、出現したバンドから、各プライマーに対応した特異的遺伝子の発現を評価した。結果を図１８、及び表８に示す。
【０１０５】
【表８】
2007014273.tif 000009
＋＋：発現が強く検出された。
＋：発現が検出された。
±：発現がわずかに検出された。
−：発現が検出されなかった。
【０１０６】
図１８及び表８から、前記サブクローンＡｂ−３から分化した胚様体は、サリドマイドの添加により、濃度依存的に血管内皮細胞の遺伝子レベルでの発現が抑制されていることがわかった。また、アルブミンの発現も抑制されていることから、胚性幹細胞由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの肝細胞の分化誘導及び増殖において、生体内での発生における知見と同様、血管内皮細胞に分化した細胞の存在が必要であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明の肝組織・臓器の製造方法は、胚性幹細胞に対して分化因子を用いることなく、単一の肝実質細胞のみならず、血管細胞や胆管細胞等の非肝実質細胞をあわせて分化誘導することが可能であり、かつ高い肝機能を有する肝組織・臓器を高い確率で効率よく製造することができるため、再生医療及び細胞医療等の分野におけるバイオ人工肝臓の製造、人工肝臓装置におけるリアクターの製造などに好適に使用することができ、本発明の肝組織・臓器の製造方法におけるリクローニング方法は、キメラマウスの作成などに応用することができる。
また、前記製造方法により製造された本発明の肝組織・臓器は、バイオ人工肝臓、移植用人工肝臓として好適に使用することができ、また、薬物動態試験用デバイス、機能性食品開発のための評価デバイスなどとして好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】図１は、試験例の結果を示す電気泳動写真である。
【図２】図２は、実施例１において、拍動がみられたコロニー数の割合を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例２のＲＴ−ＰＣＲの結果を示す電気泳動写真である。
【図４】図４は、実施例２のウェスタンブロット解析（タンパク質泳動）の結果を示す写真である。
【図５】図５は、実施例２のＲＴ−ＰＣＲの結果を示す電気泳動写真である。
【図６】図６は、実施例３（１）のＲＴ−ＰＣＲの結果を示す電気泳動写真である。
【図７】図７は、実施例３（２）のＲＴ−ＰＣＲの結果を示す電気泳動写真である。
【図８Ａ】図８Ａは、実施例４において観察された接着培養容器播種後１０日目の胚様体コロニーの写真である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、実施例４において免疫染色した接着培養容器播種後１０日目の胚様体コロニーの写真である。
【図９Ａ】図９Ａは、実施例４において免疫染色した接着培養容器播種後１８日目の胚様体コロニーの写真である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、実施例４において免疫染色した接着培養容器播種後１８日目の胚様体コロニーの写真である。なお、核の位置を白丸で示している。
【図１０】図１０は、実施例５のアンモニア分解能の評価結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、実施例６のＲＴ−ＰＣＲの結果を示す電気泳動写真である。
【図１２】図１２は、実施例６の胚様体コロニーの組織免疫染色の結果を示す写真である。
【図１３】図１３は、実施例６の胚様体コロニーの組織免疫染色の結果を示す写真である。
【図１４】図１４は、実施例６の胚様体コロニーの組織免疫染色の結果を示す写真である。
【図１５】図１５は、実施例７の組織免疫染色の結果を示す写真である。
【図１６】図１６は、実施例７の組織免疫染色の結果を示す写真である。
【図１７】図１７は、実施例７の血管内皮細胞発現領域を示すグラフである。
【図１８】図１８は、実施例７のＲＴ−ＰＣＲ結果を示す電気泳動写真である。
【図１９】図１９は、本発明の肝組織・臓器の製造方法のサブクローン分離工程において、分離するのに好ましいサブクローンの形態の一例を示す写真である。
【図２】
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【図１０】
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【図１７】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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