(57)【要約】      （修正有）【課題】２型糖尿病の遺伝的リスク検出法等の提供。【解決手段】２型糖尿病に関する１３の遺伝子多型のうちの少なくとも１個または２個以上の遺伝子多型と、性差とを評価因子とし、各評価因子のオッズ比を乗じた発症リスクを計算し、この発症リスクを平均と分散またはパーセント区分に応じて３つ以上の複数の群を作成し、各群に応じて発症のリスクを検出する、２型糖尿病のリスクを判断するための遺伝子検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆ３の−６０３Ａ→Ｇ、ＡＣＥの−２４０Ａ→Ｔ、ＰＯＮ１の５３２Ａ→Ｇ、ＣＤ１４の−２６０Ｃ→Ｔ、ＡＤＩＰＯＱの６２Ｇ→Ｔ、ＡＢＣＡ１の２５８３Ａ→Ｇ、ＣＸ３ＣＲ１の９２６Ｃ→Ｔ、ＩＰＦ１の−１８０／３Ｇ→４Ｇ、ＴＨＢＳ２の３９４９Ｔ→Ｇ、Ｆ７の１１４９６Ｇ→Ａ、ＰＰＰ１Ｒ３Ａの２７１１Ｇ→Ｔ、ＰＥＣＡＭ１の２２０１Ｇ→Ａ、ＰＫＤ１−ｌｉｋｅのＧ→Ａ（Ｇｌｙ２４３Ａｓｐ）のうちの少なくとも１個または２個以上の遺伝子多型と、性差とを評価因子とし、各評価因子のオッズ比を乗じた発症リスクを計算し、この発症リスクを平均と分散またはパーセント区分に応じて３つ以上の複数の群を作成し、各群に応じて発症のリスクを検出することを特徴とする２型糖尿病のリスク検出法。
【請求項２】
Ｆ３の−６０３Ａ→Ｇ、ＡＣＥの−２４０Ａ→Ｔ、ＰＯＮ１の５３２Ａ→Ｇ、ＣＤ１４の−２６０Ｃ→Ｔ、ＡＤＩＰＯＱの６２Ｇ→Ｔ、ＡＢＣＡ１の２５８３Ａ→Ｇ、ＣＸ３ＣＲ１の９２６Ｃ→Ｔ、ＩＰＦ１の−１８０／３Ｇ→４Ｇ、ＴＨＢＳ２の３９４９Ｔ→Ｇ、Ｆ７の１１４９６Ｇ→Ａ、ＰＰＰ１Ｒ３Ａの２７１１Ｇ→Ｔ、ＰＥＣＡＭ１の２２０１Ｇ→Ａ、ＰＫＤ１−ｌｉｋｅのＧ→Ａ（Ｇｌｙ２４３Ａｓｐ）のうちの少なくとも１個または２個以上の遺伝子多型を検出することを特徴とする２型糖尿病の遺伝的リスク検出法。
【請求項３】
Ｆ３の−６０３Ａ→Ｇ、ＡＣＥの−２４０Ａ→Ｔ、ＰＯＮ１の５３２Ａ→Ｇ、ＣＤ１４の−２６０Ｃ→Ｔ、ＡＤＩＰＯＱの６２Ｇ→Ｔ、ＡＢＣＡ１の２５８３Ａ→Ｇ、ＣＸ３ＣＲ１の９２６Ｃ→Ｔ、ＩＰＦ１の−１８０／３Ｇ→４Ｇ、ＴＨＢＳ２の３９４９Ｔ→Ｇ、Ｆ７の１１４９６Ｇ→Ａ、ＰＰＰ１Ｒ３Ａの２７１１Ｇ→Ｔ、ＰＥＣＡＭ１の２２０１Ｇ→Ａ、ＰＫＤ１−ｌｉｋｅのＧ→Ａ（Ｇｌｙ２４３Ａｓｐ）、ＮＰＰＡの６６４Ｇ→Ａ、ＣＥＴＰの１０６１Ａ→Ｇ、ＰＣＫ１の−２３２Ｃ→Ｇ、ＡＧＥＲのＧ→Ａ（Ｇｌｙ８２Ｓｅｒ）、ＣＣＬ５の−４０３Ｇ→Ａ、ＡＰＯＡ５の−１１３１Ｔ→Ｃ、Ｆ１２の４６Ｃ→Ｔのうちの少なくとも１個または２個以上の遺伝子多型を検出することを特徴とする２型糖尿病の遺伝的リスク検出法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２型糖尿病の遺伝的リスク検出法等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病患者は非常な勢いで増加しており、全世界では１億７千万人の患者がいると言われている（非特許文献２８：関連文献については末尾にまとめて示す)。大規模調査の結果によれば、この割合で患者の増加が続くと、２０１０年までには更に５０％も糖尿病患者が増えるとの予測もある（非特許文献２９）。糖尿病患者の９０％以上は、２型糖尿病であり、この疾患の特徴は、インスリン分泌不全は比較的軽度でインスリン抵抗性が主体であるものから、インスリン抵抗性は比較的軽度でインスリン分泌不全が主体であるものまで様々である（非特許文献３０）。２型糖尿病の病因については、非エステル化脂肪酸の生産過剰、炎症性サイトカインの生産過剰、アディポカインの生産過剰、インスリン抵抗性に関連するミトコンドリアの機能低下、糖毒性、脂質毒性、あるいはβ細胞の機能低下によるアミロイドの生成などを含め様々なものが提唱されている（非特許文献２８）。デスクワーク中心のライフスタイルや栄養過多の食事も糖尿病発症の誘引になっているが、２型糖尿病の家族歴があると発症率が２.４倍高いことから、遺伝的要因も２型糖尿病の発症に関与していることが分かってきた（非特許文献２８）。２型糖尿病は、多数の遺伝子が関与する多因子疾患である。そのため、遺伝子の組合せによって、ある集団の耐糖能のレベルが変化し、２型糖尿病の罹患率に影響を与えるとされている。遺伝連鎖解析（非特許文献１〜５）と候補遺伝子解析（非特許文献６〜１０）によって、２型糖尿病に関するいくつかの遺伝子座位と候補遺伝子が見出されているが、２型糖尿病の発症に関する遺伝的要因については未だ十分に解明されていない。更に、遺伝的要因と集団間のライフスタイルや環境要因の相違を考慮すると、各集団において、２型糖尿病に関与する遺伝子多型を検討することが重要である。
【０００３】
ところで、体脂肪の量と分布は、民族間および性別により相違がある。同じ肥満指数（ＢＭＩ）を持つ男性と女性とを比べると、男性では全脂肪量は少ないけれど、腹部の脂肪量が多いことが知られている。腹部の脂肪、特に内臓脂肪は、インスリン感受性に対する負の予測因子であるが、腹部の脂肪とインスリン感受性の関係は男性と女性によって異なる（非特許文献３１）。内因性の性ホルモンが、２型糖尿病の性差に関与しているのかも知れない。メタ分析によれば、内因性のテストステロンおよび性ホルモン結合グロブリンの量は、いずれも２型糖尿病の性差に関連していた（非特許文献３２）。これらの知見によれば、２型糖尿病の病因について、性差に関連する調査を行うことが重要であることが示唆される。
このように、２型糖尿病に関与する遺伝要因については、未だ十分に解明されているとは言えない状況にある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
我々は、４８５３名の日本人について、２型糖尿病に関し、１２３個の候補遺伝子に存在する１４８個の遺伝子多型の大規模研究を行った結果、凝固因子III遺伝子（coagulation factor III）の-603A→G多型が２型糖尿病に関連していることを見出した（非特許文献３３）。我々は、内因性の性ホルモンという代謝要因に加えて、２型糖尿病に関連する遺伝的要因に性差があるのではないかという仮説を立てた。そこで、２型糖尿病の発症に関連する遺伝的多型を同定するために、男性と女性とについて別々に大規模研究を行った。
本発明は、上記の事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、２型糖尿病について、遺伝的リスクを判断するための一材料を得るための遺伝子検出法等を提供すること、および性別に応じて、２型糖尿病の遺伝的リスクを判断するための遺伝子検出法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、２型糖尿病に関し、４８５３名（男女の層別を行わない解析）または４８５４名（男女の層別を行った解析）の日本人について、１２３個の候補遺伝子中の１４８カ所の遺伝子多型に関する大規模研究の結果として得られたものである。本研究の目的は、２型糖尿病に関与する遺伝子多型を同定し、この知見に基づいて、ある者に対して２型糖尿病を予防するための有用な情報を与えることである。
【０００６】
上記課題を解決するための第１の発明に係る２型糖尿病のリスク検出法は、Ｆ３の−６０３Ａ→Ｇ、ＡＣＥの−２４０Ａ→Ｔ、ＰＯＮ１の５３２Ａ→Ｇ、ＣＤ１４の−２６０Ｃ→Ｔ、ＡＤＩＰＯＱの６２Ｇ→Ｔ、ＡＢＣＡ１の２５８３Ａ→Ｇ、ＣＸ３ＣＲ１の９２６Ｃ→Ｔ、ＩＰＦ１の−１８０／３Ｇ→４Ｇ、ＴＨＢＳ２の３９４９Ｔ→Ｇ、Ｆ７の１１４９６Ｇ→Ａ、ＰＰＰ１Ｒ３Ａの２７１１Ｇ→Ｔ、ＰＥＣＡＭ１の２２０１Ｇ→Ａ、ＰＫＤ１−ｌｉｋｅのＧ→Ａ（Ｇｌｙ２４３Ａｓｐ）のうちの少なくとも１個または２個以上の遺伝子多型と、性差とを評価因子とし、各評価因子のオッズ比を乗じた発症リスクを計算し、この発症リスクを平均と分散またはパーセント区分に応じて３つ以上の複数の群を作成し、各群に応じて発症のリスクを検出することを特徴とする。
このとき、群を形成するときに使用する分散については、統計上の分散値、或いは標準偏差値（ＳＤ）、パーセントによる区分などを用いることができる。なお、遺伝子多型については、必ずしも上記１３個には限られず、これら１３個の多型のうちの任意の１個〜１２個、或いは本明細書中で示される上記１３個の他の多型を含む１４個以上で実施することもできる。
【０００７】
本明細書中において、多型の記載方法は、次の通りである。原則として、各遺伝子について、「多型が生じている位置、データベースに登録されている塩基（Ａ：アデニン、Ｇ：グアニン、Ｃ：シトシン、Ｔ：チミン）→多型塩基」の順で記載する。例えば、「Ｆ３の−６０３Ａ→Ｇ」は、Ｆ３遺伝子について、−６０３位のＡがＧとなっている多型を意味している。但し、挿入あるいは欠失多型については、「多型が生じている位置／データベースに登録されている数とその塩基→塩基数及び塩基」の順で記載する。例えば、「ＩＰＦ１の−１８０／３Ｇ→４Ｇ」は、ＩＰＦ１遺伝子について、−１８０位の３個の連続するＧが、４個の連続するＧとなる多型を意味している。また、場所の指定がない多型（例えば、ＰＫＤ１−ｌｉｋｅのＧ→Ａ）については、表１〜表５に記載のｄｂＳＮＰのアクセス番号から、その内容を容易に理解することができる。また、順方向（forward strand）に読んでＡ／Ｇ多型としてデータベースに記録されている場合であっても、逆方向（reverse strand）で読むとＴ／Ｃ多型となる。多くの文献について、「Ｔ／Ｃ」多型として記載されている場合には、データベース中の記録であるＡ／Ｇ多型と異なることがある。
【０００８】
一般に多型は、集団（例えば、日本人集団、西洋人集団など）が異なると、その種類・頻度が異なることが知られている。このため、日本人以外の集団において、２型糖尿病との関係が指摘されている多型であっても、必ずしも日本人集団においてそのような関連が認められるわけではない。このため、従来の報告については、集団または疾患が異なる場合には、必ずしも日本人における多型および２型糖尿病との関連が裏付けられるわけではない。
【０００９】
また、第２の発明に係る２型糖尿病の遺伝的リスク検出法は、Ｆ３の−６０３Ａ→Ｇ、ＡＣＥの−２４０Ａ→Ｔ、ＰＯＮ１の５３２Ａ→Ｇ、ＣＤ１４の−２６０Ｃ→Ｔ、ＡＤＩＰＯＱの６２Ｇ→Ｔ、ＡＢＣＡ１の２５８３Ａ→Ｇ、ＣＸ３ＣＲ１の９２６Ｃ→Ｔ、ＩＰＦ１の−１８０／３Ｇ→４Ｇ、ＴＨＢＳ２の３９４９Ｔ→Ｇ、Ｆ７の１１４９６Ｇ→Ａ、ＰＰＰ１Ｒ３Ａの２７１１Ｇ→Ｔ、ＰＥＣＡＭ１の２２０１Ｇ→Ａ、ＰＫＤ１−ｌｉｋｅのＧ→Ａ（Ｇｌｙ２４３Ａｓｐ）のうちの少なくとも１個または２個以上の遺伝子多型を検出することを特徴とする。
また、第３の発明に係る２型糖尿病の遺伝的リスク検出法は、Ｆ３の−６０３Ａ→Ｇ、ＡＣＥの−２４０Ａ→Ｔ、ＰＯＮ１の５３２Ａ→Ｇ、ＣＤ１４の−２６０Ｃ→Ｔ、ＡＤＩＰＯＱの６２Ｇ→Ｔ、ＡＢＣＡ１の２５８３Ａ→Ｇ、ＣＸ３ＣＲ１の９２６Ｃ→Ｔ、ＩＰＦ１の−１８０／３Ｇ→４Ｇ、ＴＨＢＳ２の３９４９Ｔ→Ｇ、Ｆ７の１１４９６Ｇ→Ａ、ＰＰＰ１Ｒ３Ａの２７１１Ｇ→Ｔ、ＰＥＣＡＭ１の２２０１Ｇ→Ａ、ＰＫＤ１−ｌｉｋｅのＧ→Ａ（Ｇｌｙ２４３Ａｓｐ）、ＮＰＰＡの６６４Ｇ→Ａ、ＣＥＴＰの１０６１Ａ→Ｇ、ＰＣＫ１の−２３２Ｃ→Ｇ、ＡＧＥＲのＧ→Ａ（Ｇｌｙ８２Ｓｅｒ）、ＣＣＬ５の−４０３Ｇ→Ａ、ＡＰＯＡ５の−１１３１Ｔ→Ｃ、Ｆ１２の４６Ｃ→Ｔのうちの少なくとも１個または２個以上の遺伝子多型を検出することを特徴とする。
【００１０】
更に、別の発明に係る２型糖尿病のリスク検出法は、男性の場合には、ＴＨＢＳ２の３９４９Ｔ→Ｇ、ＡＤＩＰＯＱの６２Ｇ→Ｔ、Ｆ３の−６０３Ａ→Ｇ、ＮＰＰＡの６６４Ｇ→Ａ（Ｖａｌ７Ｍｅｔ）、ＣＥＴＰの１０６１Ａ→Ｇ（Ｉｌｅ４０５Ｖａｌ）、ＰＣＫ１の−２３２Ｃ→Ｇ、ＡＢＣＡ１の２５８３Ａ→Ｇ（Ｉｌｅ８２３Ｍｅｔ）、ＡＧＥＲのＧ→Ａ（Ｇｌｙ８２Ｓｅｒ）、ＡＫＡＰ１０のＡ→Ｇ（Ｉｌｅ６４６Ｖａｌ）、ＣＤ１４の−２６０Ｃ→Ｔ、ＩＰＦ１の−１０８／３Ｇ→４Ｇのうちの少なくとも１個または２個以上の遺伝子多型を評価因子とし、女性の場合には、ＰＯＮ１のＡ→Ｇ（Ａｒｇ１６０Ｇｌｙ）、Ｆ３の−６０３Ａ→Ｇ、ＣＣＬ５の−４０３Ｇ→Ａ、ＡＰＯＡ５の−１１３１Ｔ→Ｃ、Ｆ１２の４６Ｃ→Ｔうちの少なくとも１個または２個以上の遺伝子多型を評価因子とし、各評価因子のオッズ比を乗じた発症リスクを計算し、この発症リスクを平均と分散またはパーセント区分に応じて３つ以上の複数の群を作成し、各群に応じて発症のリスクを検出することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、２型糖尿病について、遺伝的リスクおよび発症リスクを判断するための検出法等が提供される。この発明を用いることにより、２型糖尿病に対する予防が可能となり、２型糖尿病が原因となって引き起こされる疾患、例えば糖尿病性血管障害（心筋梗塞、脳血栓、末梢血管障害）、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症などの予防につながる。こうして、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
【００１３】
＜試験方法＞
研究対象１．性差による層別解析を行わない場合
研究対象は、４８５３名（男性２６８８名、女性２１６５名）の日本人であった。彼らは、研究参加施設（岐阜県立岐阜病院、岐阜県立多治見病院、岐阜県立下呂温泉病院、弘前大学病院、黎明郷リハビリテーション病院）に、２００２年１０月から２００５年３月までに来院した者であった。１４８９名（男性９６９名、女性５２０名）の２型糖尿病患者は、空腹時血糖値が６.９３ｍｍｏｌ／Ｌ以上（１２６ｍｇ／ｄＬ以上）、またはヘモグロビンＡｌｃが６.５％以上、または糖尿病薬を服用している者であった。２型糖尿病の確定は、ＷＨＯの判定基準に従った（非特許文献１１、１２）。
１型糖尿病、若年者の成人発症型糖尿病、その他の代謝障害・内分泌障害、及び重篤な肝障害或いは腎障害を患っている者については、今回の研究対象から外した。また、二次性糖尿病を生じる薬剤を服用している患者も、今回の研究対象から外した。
【００１４】
３３６４名（男性１７１９名、女性１６４５名）のコントロール者は、毎年の健康診断のために参加病院の外来を受診した者であった。コントロール者は、空腹時血糖値が６.０５ｍｍｏｌ／Ｌ（１１０ｍｇ／ｄＬ）未満であり、かつヘモグロビンＡｌｃが５.６％未満であった。また、コントロール者については、糖尿病や糖尿病薬服用の既往歴がなかった。研究プロトコールはヘルシンキ宣言に従い、三重大学医学部、弘前大学医学部、岐阜県国際バイオ研究所、および参加病院の倫理委員会によって承認された。各参加者に対しては書面によるインフォームドコンセントを得た。
研究対象２．性差による層別解析を行った場合
上記研究対象１に、２型糖尿病の女性患者１名を含む４８５４名の日本人による大規模研究を行った。それ以外の条件は、上記研究対象１に同じであった。
【００１５】
多型の選択
公開データベースの使用および本発明者の鋭意検討により、１２３個の候補遺伝子を選択した。これらの遺伝子は、膵β細胞の機能、末梢でのインスリン感受性、肝臓グルコース生産、脂質及び脂肪組織代謝、その他の代謝因子に加えて、血圧の制御、内分泌機能の制御、血管に関する生物学、単球・マクロファージに関する生物学、リンパ球及び白血球に関する生物学、凝固及び線溶系、並びに血小板機能に関与するものであった。本発明者は、これら１２３個の遺伝子に存在する１４８個の多型を選択した。これらの多型の多くは、プロモーター領域、エクソン、イントロンのスプライシングの供与部位或いは受容部位に多く位置しており、多型の結果として、コードされたタンパク質の機能または発現に変化を与える可能性があるものであった。これら１４８個の多型は、下記表１〜表５に示した。なお、表中においては、左欄から順に、座位（Locus）、遺伝子名（Gene）、簡易記載（Symbol）、多型（Polymorphism）、多型データベース登録番号（dbSNP）を示している。なお、多型データベース登録番号が無い場合には、ＮＣＢＩ遺伝子バンクに登録されている番号を示した。
【００１６】
【表１】
2007267728.tif 000002
【００１７】
【表２】
2007267728.tif 000003
【００１８】
【表３】
2007267728.tif 000004
【００１９】
【表４】
2007267728.tif 000005
【００２０】
【表５】
2007267728.tif 000006
【００２１】
遺伝子多型の検出方法
７ｍＬの静脈血を５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ(ジナトリウム塩)を含むチューブに採取し、ゲノムＤＮＡをキット(ゲノミックス社製)によって分離した。１４７個の多型の遺伝子型は、ＰＣＲと配列特異的オリゴヌクレオチドプローブをサスペンジョン・アレイ・テクノロジー（ＳＡＴ：Ｌｕｍｉｎｅｘ  １００）と組み合わせて使用する方法によって決定した（Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社）。プライマー、プローブ、その他の条件は、下表６に示した。表６は左から順に、遺伝子表記（Gene Symbol）、多型（Polymorphism）、センスプライマー（Sense primer）、アンチセンスプライマー（Antisense primer）、プローブ１（Probe 1）、プローブ２（Probe 2）、アニーリング温度（Annealing）、およびサイクル数（Cycles）を示した。また、詳細な方法については、既報のもの（非特許文献１３）を基本として、適宜に増幅条件を変えて行った。なお、２型糖尿病との関連が認められなかった多型を検出するための条件については記載を省略した。
【００２２】
【表６】
2007267728.tif 000007
【００２３】
ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法
方法の詳細については、非特許文献１３に記載の通りである。以下には、この方法の概要について説明する。
図１には、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００フローサイトメトリーで検出するマイクロビーズの微細構造と特徴を示した。マイクロビーズ（図中の符号（Ａ））は、直径が約５.５μｍ程度であり、ポリスチレン製である。ビーズ表面には、特異的な塩基配列を認識するプローブが結合されている。各ビーズには、一種類のプローブが結合されている。このマイクロビーズには、赤色色素と赤外色素との割合を変化させることにより、図中の符号（Ｂ）に示すように、最大で１００種類のものを混合した状態で、各ビーズの同定が行えるようになっている。複数種類のプローブを備えたマイクロビーズ（但し、各マイクロビーズには一種類のプローブのみ）を適当な割合で混合し、１００ビーズ／μＬとなるようにしたビーズミックスを調製した（図中の符号（Ｃ））。
【００２４】
図２には、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法の手順の概要を示した。
＜増幅反応（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）＞
目的とするＤＮＡを増幅するＰＣＲ反応には、５’末端をビオチンでラベルしたプライマーを用いた。１.５ｍＭ塩化マグネシウムを含む１ｘＰＣＲ溶液（５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.３）、２％ＤＭＳＯ、０.２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、及び０.１μＭ〜１０μＭプライマーセットを混合し、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（５０Ｕ／ｍＬ）と５０ｎｇ〜１００ｎｇのゲノムＤＮＡを加えて２５μＬとした。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間処理の後、９４℃で２０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒間の伸長を１サイクルとし、これを５０サイクル繰り返した。機器としてＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いた。
【００２５】
＜ハイブリダイゼーション（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）＞
増幅したＤＮＡを変性した後、ビーズミックスとハイブリダイズさせた。９６ウエルプレートの各ウエルに、５μＬの増幅反応後のＰＣＲ増幅液、５μＬのビーズミックス、及び４０μＬのハイブリダイズ用緩衝液（３.７５Ｍ  ＴＭＡＣ、６２.５ｍＭ  ＴＢ（ｐＨ８.０）、０.５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０.１２５％  Ｎ−ラウロイルザルコシン）を添加し、全量５０μＬとした。この混合液を添加した９６ウエルプレートについて、９５℃で２分間の変性、及び５２℃で３０分間のハイブリダイゼーションを行った（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラーを用いた。）。
図２中には、増幅したＤＮＡを認識するプローブを有するビーズ（１）のみが、ＤＮＡと結合する様子が示されている。
【００２６】
＜ストレプトアビジン−フィコエリトリン反応（ＳＡ−ＰＥ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）＞
次に、上記ビーズミックス−ＤＮＡをＳＡ−ＰＥと反応させた。ハイブリダイゼーション反応の後、各ウエルに１００μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（１ｘＰＢＳ（ｐＨ７.５）、０.０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を添加し、１０００ｘｇで５分間の遠心を行い、上清を取り去ることで、マイクロビーズを洗浄した。各ウエルに残ったマイクロビーズに、それぞれ７０μＬのＳＡ−ＰＥ溶液（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにより、市販品（Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社製）を１００倍希釈したもの）を添加し混合した後、５２℃で１５分間の反応を行った（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラーを用いた。）。
図２中には、ビーズ（１）のプローブにのみビオチン化ＤＮＡが結合しているので、そのビオチンにＳＡ−ＰＥが結合する様子が示されている。
【００２７】
＜測定（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）＞
次に、反応後のサンプルはＬｕｍｉｎｅｘ１００を用いて、ビーズ種類の同定と、そのビーズにＰＥが結合しているか否かを判定した。測定は２種類のレーザを使用して行い、ビーズの種類は６３５ｎｍレーザにより同定し、ＰＥ蛍光は５３２ｎｍレーザを用いて定量した。オリゴビーズに結合したＤＮＡは１測定あたり各々のビーズを最低５０個ずつ測定し、定量されたＰＥの蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を使用した。
図２中には、各ビーズ（１）〜（３）が同定され、かつビーズ（１）にのみＰＥが測定されたことから、ビーズ（１）に結合させたプローブが認識するＤＮＡが増幅された様子が示されている。
【００２８】
統計解析
＜性別による層別解析を行わない場合＞
臨床データは、２型糖尿病患者群（Type 2 diabetes mellitus）とコントロール群（Controls）との間で、対応のないスチューデントt検定により比較した。質的データは、カイ二乗検定によって比較した。対立遺伝子頻度は遺伝子カウント法によって概算し、ハーディ・ワインベルク平衡にあてはまるかどうかを判断するためにカイ二乗検定を使った。各常染色体上の遺伝子多型における遺伝子型分布は、２型糖尿病患者群とコントロール群との間でカイ二乗検定(３ｘ２)によって比較した。Ｘ染色体上にある遺伝子多型については、対立遺伝子頻度をカイ二乗検定(２ｘ２)によって比較した。
【００２９】
危険率（ｐ）が６％未満で（ｐ＜０.０６）２型糖尿病と関連した多型は、交絡因子を含む多項ロジスティック回帰分析法により解析した。このとき、交絡因子については、年齢（age）、性別(sex：女性＝０、男性＝１)、喫煙状態(smoking：非喫煙者＝０、喫煙者＝１)、および各遺伝子型を独立変数とし、２型糖尿病を従属変数とした。各遺伝子型は、優性、劣性、および２つの付加（付加１および２）遺伝モデルに従って評価し、ｐ値、オッズ比、および９５％信頼区間を計算した。
【００３０】
各遺伝モデルは２つの群から構成される。優性モデルは「変異型のホモ接合体とヘテロ接合体の結合群」対「野生型のホモ接合体」、劣性モデルは「変異型のホモ接合体」対「野生型のホモ接合体とヘテロ接合体の結合群」、付加１モデルは「ヘテロ接合体」対「野生型のホモ接合体」、付加２モデルは「変異型のホモ接合体」対「野生型のホモ接合体」である。また、２型糖尿病に対する遺伝子型または他の交絡因子の効果を確認するために、ステップワイズ変数増加法により解析を行った。モデルへの包含の基準レベルを０.２５とし、モデルからの除外の基準レベルを０.１とした。
【００３１】
２型糖尿病と遺伝子型の多重比較の結果を得る際に、タイプＩエラーを避けるために統計的有意性に関する厳密な基準（ｐ＜０.００１)を採用した。その他の臨床的バックグラウンドデータについては、危険率５％未満（ｐ＜０.０５）は統計的に有意であると見なした。統計的有意性は、両側検定によって試験した。統計解析は、ＪＭＰソフトウェア・バージョン５.１（ＳＡＳインスティテュート社製）によって実行した。
＜性別による層別解析を行う場合＞
基本的には、上記＜性別による層別解析を行わない場合＞と同じ統計解析に従った。但し、多項ロジスティック回帰分析法の交絡因子については、年齢（age）、ＢＭＩ、喫煙状態(smoking：非喫煙者＝０、喫煙者＝１)、および各遺伝子型を独立変数とし、２型糖尿病を従属変数とした。
また、２型糖尿病と遺伝子型の多重比較の結果を得る際に、タイプＩエラーを避けるために統計的有意性に関する基準として、ｐ＜０.００５を採用した。
上記以外については、＜性別による層別解析を行わない場合＞と同じ統計解析を行った。
【００３２】
１．性別による層別解析を行わない場合
＜試験結果＞
４８５３名の研究対象に関する背景データを表７に示した。表には、左欄より順に、特徴（Characteristics）、２型糖尿病患者（Type 2 diabetes mellitus）、およびコントロール者（Controls）を示している。また、特徴欄は、上より順に、対象者数（No. of subjects）、年齢（Age）、性別（男性／女性）（Sex(male/female)）、肥満指数（Body mass index）、現在または過去の喫煙率（Current or former smoker）、高血圧（Hypertenshion）、収縮期血圧（Systolic blood pressure）、拡張期血圧（Diastolic blood pressure）、空腹時血糖（Fasting plasma glucose）、及びヘモグロビンＡｌｃ（HbA1c）を示している。
【００３３】
【表７】
2007267728.tif 000008
【００３４】
年齢と肥満指数のデータは、平均±ＳＤで示した。喫煙率については、一日あたり１０本以上を吸った場合を喫煙とした。高血圧については、収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇ以上、または拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ以上の者、或いは降圧剤を服用している者とした。高コレステロール血症については、血清総コレステロール値が５.７２ｍｍｏｌ／Ｌ（２２０ｍｇ／ｄＬ）以上、または脂質降下薬を服用している者とした。表中、＊はコントロールとの間で、ｐ＜０.００１の危険率で有意であったことを意味している。
【００３５】
男性の割合、肥満指数、喫煙率、高血圧、及び高コレステロール血症については、２型糖尿病患者はコントロールに比べて有意に高かった。
次に、２型糖尿病のリスク診断を行うために必要な因子を抽出するため、遺伝子多型および年齢・性別・喫煙について、ステップワイズ変数増加法による解析を行った（詳細については後述する）。その結果、次に説明するように、２型糖尿病に関するリスク診断を行えることが分かった。
【００３６】
＜２型糖尿病のリスク診断システム＞
表８には、２型糖尿病のリスク診断システムに関する詳細を示した。表には、左欄より順に、因子（Variable）、ｐ値（P value）、オッズ比（９５％信頼区間）（OR(95%CI)）を示した。また、最下段には、従来の危険因子（Conventional risk factors）と、今回の研究で見出された遺伝因子（Genetic risk factors）のオッズ比を乗じた総合リスク（Total risk）を示した。
【００３７】
【表８】
2007267728.tif 000009
【００３８】
後述のステップワイズ変数増加法で危険率が０.０５未満（P＜0.05）であった遺伝子多型群および年齢・性別・喫煙を独立因子（交絡因子）とし、２型糖尿病を従属因子として多項ロジスティック回帰分析を行い、P値、オッズ比、９５％信頼区間を各因子について算出した。したがってこれらの因子は独立したものであり、オッズ比の積（かけ算）により総合的な２型糖尿病のリスクを予測することができる。多項ロジスティック回帰分析の結果、従来の危険因子としては性別（男性の方が高リスク）が、遺伝因子としては、Ｆ３、ＡＤＩＰＯＱ、ＡＣＥ、ＣＤ１４、ＡＢＣＡ１、ＰＯＮ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＩＰＦ１、ＴＨＢＳ２、Ｆ７、ＰＰＰ１Ｒ３Ａ、ＰＥＣＡＭ１、ＰＫＤ１−ｌｉｋｅの各遺伝子多型が２型糖尿病に関連した。従来の危険因子では最小オッズ比が１.００で最大オッズ比が１.７３、遺伝因子では最小オッズ比が０.３３で最大オッズ比が１３.３６であった。したがって、従来の危険因子と遺伝因子を総合すると、最小オッズ比が０.３３で最大オッズ比が２３.１１であり、７０倍の差が認められた。
【００３９】
本研究成果の臨床的な意義について以下に述べる。病院、クリニックまたは健診センターにおいて希望者に対して従来の危険因子と今回の遺伝因子に関する検査を行い、２型糖尿病の発症リスクの予測を行う。従来の危険因子と遺伝因子全体のオッズ比の積の分布からリスクの程度を３段階以上（例えば、５段階）に分ける。例えば、平均±１ＳＤの範囲を平均的リスク群とし、平均＋１ＳＤから平均＋２ＳＤをやや高リスク群、平均＋２ＳＤ以上を高リスク群とする。また、平均−１ＳＤから平均−２ＳＤをやや低リスク群、平均−２ＳＤ以下を低リスク群とする。
実際に本研究において、リスク値の分布は、リスクが高い群では２型糖尿病患者群が１２．４％でコントロール群が３．９％、リスクがやや高い群では２型糖尿病患者群が３１．５％でコントロール群が１４．３％、平均的リスクの群では２型糖尿病患者群が５２．６％でコントロール群が６４．８％、リスクがやや低い群では２型糖尿病患者群が３．６％でコントロール群が１７．１％、リスクが低い群では２型糖尿病患者群が０％でコントロール群も０％であった。他の方法として、コントロール群のリスク値の大きい順に全体を５％、２０％、５０％、２０％、５％に区分し、リスク値の最も大きい５％の群をリスクが高い群、次の２０％の群をリスクがやや高い群、次の５０％の群を平均的リスクの群、次の２０％の群をリスクがやや低い群、リスク値が最も小さい５％の群をリスクが低い群とする。実際に本研究における２型糖尿病患者群の分布は、リスクが高い群は１５．３％（コントロール群は５．０％）、リスクがやや高い群は３８．８％（コントロール群は２０．０％）、平均的リスクの群は３９．７％（コントロール群は５０．１％）、リスクがやや低い群は５．６％（コントロール群は２０．０％）、リスクが低い群は０．７％（コントロール群は５．０％）であった。
なお、本研究では有意な関連が認められなかったが、一般的に加齢・肥満も２型糖尿病に影響すると考えられるのでこれらを含めることもできる。
【００４０】
結果については、医師等の有資格者の判断を含めてカウンセリングを行い、とりわけ高リスク群またはやや高リスク群に属する場合には生活習慣の改善（禁煙・飲酒の減量・食事療法即ちカロリー制限・運動療法・ストレス解消・睡眠不足解消など）を行うことにより２型糖尿病の一次・二次予防を積極的に推進する。特に多量の飲酒、高カロリー・高脂肪食、運動不足などの生活習慣は、一般的に２型糖尿病の原因と考えられているため、遺伝的に２型糖尿病のリスクが平均より高いと予測された場合は、生活習慣の改善により２型糖尿病のリスクを減少させるようにクライアントに説明する。特に２型糖尿病の家族歴のある人への適用が有効である。本システムにより２型糖尿病のオーダーメイド予防が可能になり、２型糖尿病に起因する種々の疾患、即ち糖尿病性血管障害（心筋梗塞、脳血栓、末梢血管障害）、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症などの予防につながる。ひいては、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止や今後の医療費削減などにつながり、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【００４１】
＜統計解析＞
次に、上記リスク判断システムを開発するに至った統計解析の結果について説明する。
カイ二乗検定により、１６個の遺伝子多型が２型糖尿病との関連を示した（ｐ＜０.０５）。詳細を表９示した。表においては、左欄より順に、遺伝子表記（Gene symbol）、多型（Polymorphism）、および危険率（ｐ）を示している。
【００４２】
【表９】
2007267728.tif 000010
【００４３】
これらの多型については、２型糖尿病との関連について更に詳細に分析した。年齢、性別、および喫煙頻度を補正した多項ロジスティック回帰分析を行ったところ、凝固因子III（Ｆ３）の−６０３Ａ→Ｇ多型が劣性モデル及び付加２モデルにおいて、２型糖尿病の発生に有意に（ｐ＜０.０１）関連した。このとき、Ｆ３の−６０３Ｇ対立遺伝子は２型糖尿病に対する危険因子となっていた。詳細を表１０に示した。
【００４４】
【表１０】
2007267728.tif 000011
【００４５】
表においては、左欄より順に、遺伝子表記（Gene symbol）、多型（Polymorphism）、優性モデル（Dominant）における危険率（p）・オッズ比（OR）・９５％信頼区間（95% CI）、劣性モデル（Recessive）における危険率（p）・オッズ比（OR）・９５％信頼区間（95% CI）、付加１モデル（Additive 1）における危険率（p）・オッズ比（OR）・９５％信頼区間（95% CI）、付加２モデル（Additive 2）における危険率（p）・オッズ比（OR）・９５％信頼区間（95% CI）をそれぞれ示している。多項ロジスティック回帰分析は、年齢、性別、および喫煙の有無について補正して行った。また、表中、危険率が０.００１未満（ｐ＜０.００１）のデータについては、太字で示した。２型糖尿病との関連が最も強いＦ３の−６０３Ａ→Ｇ多型では、２型糖尿病においては、ＡＡ遺伝子型が６４.７％、ＡＧ遺伝子型が２９.３％、ＧＧ遺伝子型が６.０％であり、コントロールにおいては、ＡＡ遺伝子型が６４.８％、ＡＧ遺伝子型が３１.６％、ＧＧ遺伝子型が３.５％であった。また、これらの多型の遺伝子型分布については、コントロール及び２型糖尿病のいずれにおいてもハーディ・ワインバーグ平衡を満たしていた。
【００４６】
次に、２型糖尿病に対する１３個の多型の遺伝子型、年齢、性別、および喫煙の影響について、ステップワイズ変数増加法により解析した。結果を表１１に示した。表中には、左欄より順に、因子（Variable）、ｐ値（p value）、寄与率（R2）を示している。統計的有意性が高い順に、性別（Sex）、Ｆ３遺伝子型（劣性モデル）が有意であり（ｐ＜０.００１）、各要因が独立して２型糖尿病に影響を与えることが分かった。
【００４７】
【表１１】
2007267728.tif 000012
【００４８】
＜考察＞
本発明者は、２型糖尿病との関連が疑われる１２３個の候補遺伝子について、１４８カ所の多型を調べた。４８５３人の被験者について大規模研究を行ったところ、Ｆ３の−６０３Ａ→Ｇ多型が、日本人の２型糖尿病と有意に関係していた。従来には、Ｆ３遺伝子を含む染色体領域（1p22-21）が、日本人において２型糖尿病との関連を示すという報告は認められなかった（非特許文献１４〜１６）。また、Ｆ３について、２型糖尿病の素因となる遺伝子であるとの報告も見られない。
【００４９】
Ｆ３（組織因子または組織トロンボプラスチン）は、４７ｋＤａの分子量を示す膜貫通型糖タンパク質であり、結合因子ＶＩＩａに反応して凝固因子Ｘを活性化して因子Ｘａに変化させ、外因性凝固系カスケードを開始させる。Ｆ３は、循環中の白血球や内皮細胞には通常には発現されていないが、血管内の炎症性サイトカイン、成長因子、せん断応力、バルーンによる障害によって白血球や内皮細胞から発現される（非特許文献１７）。肥満マウスと痩せマウスとを比較することで、Ｆ３のｍＲＮＡは脂肪組織を含むいくつかの組織中で多く発現されることが判った（非特許文献１８、１９）。このことは、肥満や２型糖尿病などのインスリン抵抗性の状態では、高インスリン血症によって、局所的に多くの組織でＦ３の発現を誘導することを意味しているのかも知れない。
【００５０】
単球におけるＦ３の発現量は、健常群に比べて糖尿病患者群の方が多いことが知られている（非特許文献２０）。健常者とコントロールが良好で合併症を起こしていない２型糖尿病患者との両群において、同数程度の細胞由来微粒子が確認されているが、２型糖尿病患者においては、Ｆ３を発現しているヘルパーＴ細胞・顆粒球・血小板由来の微粒子が多く認められることが知られている（非特許文献２１）。血中Ｆ３濃度については、２型糖尿病患者の方が健常者よりも高く、更に心血管障害を併発した糖尿病患者では、そうでない糖尿病患者よりも高いことが知られている。
【００５１】
このことから、Ｆ３濃度は血管合併症に関与しているのかも知れない（非特許文献２２、２３）。実際、Ｆ３の−６０３Ａ→Ｇ多型は心筋梗塞に関与しており、このとき−６０３Ｇ対立遺伝子が危険因子であることが判っている（非特許文献２４）。膵島移植後には、移植組織に対して血液を介した速やかな炎症反応（instant blood-mediated inflammatory reaction：ＩＢＭＩＲ）がよく見られることが知られている（非特許文献２５）。この文献の著者らは、Ｆ３がランゲルハンス島の内分泌細胞によって発現・分泌されること、及びインビトロ系においてはＩＢＭＩＲが抗Ｆ３抗体及び不活性化VIIaによって阻害されることから、ＩＢＭＩＲがＦ３によって引き起こされると結論しており、Ｆ３活性を阻害することにより、膵島移植後の急速な炎症反応が抑えられるのではないかと述べている。
【００５２】
Ｆ３の発現は、細胞型特異的プロモーターの活性によって、転写レベルで増加する。Ｆ３の転写は、血管内皮細胞と単球においてはＡＰ−１とＮＦ−κＢ部位によって、上皮細胞・平滑筋細胞・及び単球においてはＥｇｒ−１とＳｐ１部位によって、誘導が行われる（非特許文献１７）。Ｆ３のプロモーター領域では多くの多型が知られている。−１８１２Ｃ→Ｔ、−１３２２Ｃ→Ｔ、−１２０８Ｄ／Ｉ、−６０３Ａ→Ｇの４個の多型は連鎖不平衡であること、及び−１４４２Ｇ→Ｃ、−２１Ｃ→Ｔの２個の多型は希であることが知られている（非特許文献２６）。−１２０８位のＤ／Ｉ（欠失／挿入）多型においては、Ｄ（欠失）ホモ接合体を有する者は、Ｉ（挿入）ホモ接合体を有する者に比べると、血液中のＦ３濃度が低いことが知られている（非特許文献２６）。
【００５３】
−６０３Ａ→Ｇ多型は、単球においてＦ３−ｍＲＮＡ量の増加に関係しており、ＡＡ遺伝子型を持つ者に比べると、Ｇ対立遺伝子を持つ者の方が、Ｆ３−ｍＲＮＡ量が多いことが知られている（非特許文献２７）。本研究によれば、Ｆ３の−６０３Ａ→Ｇ多型は２型糖尿病の発症に有意に関係しており、このとき−６０３Ｇ対立遺伝子が危険因子であることが判った。これはＦ３の多型が２型糖尿病と関係することを示す初めての報告である。我々が得た結果は、従来の３つの知見、すなわち（１）血中及び各種細胞中のＦ３濃度が糖尿病患者では増加すること、（２）Ｆ３の増加割合は、糖尿病患者で心臓疾患を併発した患者・膵島移植患者において多くなること、及び（３）−６０３Ａ→Ｇ多型のＧ対立遺伝子を持つ者ではＦ３の発現量が多いこと（非特許文献２０〜２３、２５）、について矛盾するものではなかった。
【００５４】
２．性別による層別解析を行った場合
＜試験結果＞
４８５４名の研究対象に関する背景データを表１２に示した。表には、左より順に、特徴（Characteristic）、男性（Men）における２型糖尿病患者（Type 2 diabetes mellitus）、コントロール者（Controls）、およびＰ値（P）、女性（Women）における２型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus）、コントロール者（Controls）、およびＰ値（P）を示している。また、特徴については、上より順に、対象者数（No. of subjects）、年齢（Age）、喫煙率（Smoking）、肥満指数（Body mass index）、収縮期血圧（Systolic blood pressure）、拡張期血圧（Diastolic blood pressure）、血中総コレステロール（Serum total cholesterol）、血中中性脂肪（Serum triglycerides）、血中ＨＤＬコレステロール（Serum HDL-cholesterol）、空腹時血糖（Fasting plasma glucose）、及びヘモグロビンＡｌｃ（HbA1c）を示している。
【００５５】
【表１２】
2007267728.tif 000013
【００５６】
対象者数および喫煙率以外のデータについては、平均±ＳＤで示した。男性の場合には、ＢＭＩ、収縮期血圧、拡張期血圧、血中総コレステロール、血中中性脂肪、空腹時血糖、およびヘモグロビンＡｌｃは、コントロール者に比べて２型糖尿病患者の方が高かった。一方、年齢とＨＬＤコレステロールについては、コントロール者に比べて２型糖尿病の方が低かった。
女性の場合には、年齢、収縮期血圧、拡張期血圧、血中総コレステロール、血中中性脂肪、空腹時血糖、およびヘモグロビンＡｌｃは、コントロール者に比べて２型糖尿病患者の方が高く、ＨＤＬコレステロールについては、コントロール者に比べて２型糖尿病患者の方が低かった。
次に、２型糖尿病のリスク診断を行うために必要な因子を抽出するため、遺伝子多型および年齢・性別・喫煙について、ステップワイズ変数増加法による解析を行った（詳細については後述する）。その結果、次に説明するように、２型糖尿病に関するリスク診断を行えることが分かった。
【００５７】
＜２型糖尿病のリスク診断システム＞
表１３には、２型糖尿病のリスク診断システムに関する詳細を示した。表には、左欄より順に、男性（Men）における因子（Variable）、ｐ値（P）、オッズ比（９５％信頼区間）（OR(95%CI)）、および女性（Women）における（Variable）、ｐ値（P）、オッズ比（９５％信頼区間）（OR(95%CI)）を示した。また、遺伝因子（Genetic risk factors）のオッズ比を乗じた総合リスク（Total risk）を示した。
【００５８】
【表１３】
2007267728.tif 000014
後述のステップワイズ変数増加法で危険率が０.０５未満（P＜0.05）であった遺伝子多型群および年齢・ＢＭＩ・喫煙を独立因子（交絡因子）とし、２型糖尿病を従属因子として、男女別に多項ロジスティック回帰分析を行い、Ｐ値、オッズ比、９５％信頼区間を算出した。したがってこれらの因子は独立したものであり、オッズ比の積（かけ算）により総合的な２型糖尿病のリスクを男女別に予測することができる。多項ロジスティック回帰分析の結果、男性では遺伝因子として、ＴＨＢＳ２、ＡＤＩＰＯＱ、Ｆ３、ＮＰＰＡ、ＣＥＴＰ、ＰＣＫ１、ＡＢＣＡ１、ＡＧＥＲ、ＡＫＡＰ１０、ＣＤ１４、ＩＰＦ１の各遺伝子多型が２型糖尿病に関連した。これらの多型の組み合わせにより最小オッズ比が０.２８で最大オッズ比が９.３７であり、３３倍の差が認められた。また女性では遺伝因子として、ＰＯＮ１、Ｆ３、ＣＣＬ５、ＡＰＯＡ５、Ｆ１２の各遺伝子多型が２型糖尿病に関連した。これらの多型の組み合わせにより最小オッズ比が０.６９で最大オッズ比が５.７２であり、８倍の差が認められた。
【００５９】
本研究成果の臨床的な意義について以下に述べる。病院、クリニックまたは健診センターにおいて希望者に対して遺伝子多型に関する検査を行い、２型糖尿病の遺伝的な発症リスクの予測を男女別に行う。遺伝子多型全体のオッズ比の積の分布からリスクの程度を男女別に３段階以上（例えば、５段階）に分ける。例えば、コントロール群のリスク値の大きい順に全体を５％、２０％、５０％、２０％、５％に区分し、リスク値の最も大きい５％の群をリスクが高い群、次の２０％の群をリスクがやや高い群、次の５０％の群を平均的リスクの群、次の２０％の群をリスクがやや低い群、リスク値が最も小さい５％の群をリスクが低い群とする。また、他の方法として、平均±１ＳＤの範囲を平均的リスク群とし、平均＋１ＳＤから平均＋２ＳＤをやや高リスク群、平均＋２ＳＤ以上を高リスク群とする。また平均−１ＳＤから平均−２ＳＤをやや低リスク群、平均−２ＳＤ以下を低リスク群とする。本研究では有意な関連が認められなかったが、一般的に加齢・肥満も２型糖尿病に影響すると考えられるのでこれらの因子を含めることもできる。
【００６０】
結果については、医師等の有資格者の判断を含めてカウンセリングを行い、とりわけ高リスク群またはやや高リスク群に属する場合には生活習慣の改善（禁煙・飲酒の減量・食事療法即ちカロリー制限・運動療法・ストレス解消・睡眠不足解消など）を行うことにより２型糖尿病の一次・二次予防を積極的に推進する。特に２型糖尿病の家族歴のある人への適用が有効である。本システムにより男女別に２型糖尿病のオーダーメイド予防が可能になり、２型糖尿病に起因する種々の疾患、即ち糖尿病性血管障害（心筋梗塞、脳血栓、末梢血管障害）、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎障害などの予防につながる。ひいては、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止や今後の医療費削減などにつながり、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【００６１】
＜統計解析＞
次に、上記リスク判断システムを開発するに至った統計解析の結果について説明する。
カイ二乗検定により、男性については１４個の遺伝子多型が、女性については７個の遺伝子多型が、それぞれ２型糖尿病との関連を示した（ｐ＜０.０６）。詳細を表１４に示した。表においては、左欄より順に、男性（Men）における遺伝子表記（Gene）、多型（Polymorphism）、および危険率（P）、並びに女性（Women）における遺伝子表記（Gene）、多型（Polymorphism）、および危険率（P）を示している。
【００６２】
【表１４】
2007267728.tif 000015
【００６３】
これらの多型については、２型糖尿病との関連について更に詳細に分析した。年齢、ＢＭＩ、および喫煙率を補正した多項ロジスティック回帰分析を行ったところ、男性の場合には、トロンボスポンジン２（THBS2)の３９４９Ｔ→Ｇ多型が劣性モデルにおいて、Ｆ３の−６０３Ａ→Ｇ多型が劣性モデルにおいて、ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ａ（NPPA）の６６４Ｇ→Ａ（Ｖａｌ７Ｍｅｔ）多型が劣性モデルにおいて、それぞれ２型糖尿病に有意に（ｐ＜０.０１）関連した（表１５を参照）。また、女性の場合には、パラオキソナーゼ１遺伝子（PON1）のＡ→Ｇ（Ａｒｇ１６０Ｇｌｙ）多型が優性モデル及び付加１モデルにおいて、Ｆ３の−６０３Ａ→Ｇ多型が劣性モデル及び付加２モデルにおいて、それぞれ２型糖尿病に有意に（ｐ＜０.０１）関連した（表１６を参照）。
【００６４】
【表１５】
2007267728.tif 000016
【００６５】
【表１６】
2007267728.tif 000017
【００６６】
表においては、左欄より順に、遺伝子（Gene）、多型（Polymorphism）、優性モデル（Dominant）における危険率（P）・オッズ比（OR）・９５％信頼区間（95% CI）、劣性モデル（Recessive）における危険率（P）・オッズ比（OR）・９５％信頼区間（95% CI）、付加１モデル（Additive 1）における危険率（P）・オッズ比（OR）・９５％信頼区間（95% CI）、付加２モデル（Additive 2）における危険率（P）・オッズ比（OR）・９５％信頼区間（95% CI）をそれぞれ示している。多項ロジスティック回帰分析は、年齢、ＢＭＩ、および喫煙率について補正して行った。また、表中、危険率が０.００５以下（ｐ≦０.００５）のデータについては、太字で示した。
【００６７】
次に、２型糖尿病に関連する多型の遺伝子型（カイ二乗解析によって同定されたもの）、年齢、ＢＭＩ、および喫煙の影響について、ステップワイズ変数増加法により解析した。結果を表１７に示した。表中には、左欄より順に、男性（Men）における因子（Variable）、Ｐ値（P）、寄与率（R2）、女性（Women）における因子（Variable）、Ｐ値（P）、寄与率（R2）を示している。男性においては、統計的有意性が高い順に、ＢＭＩ、ＴＨＢＳ２遺伝子型（劣性モデル）、ＡＤＩＰＯＱ遺伝子型（優性モデル）が有意であり（ｐ＜０.００５）、各要因が独立して２型糖尿病に影響を与えることが分かった。また、女性においては、統計的有意性が高い順に、ＰＯＮ１遺伝子型（優性モデル）、年齢が有意であり（ｐ＜０.００５）、各要因が独立して２型糖尿病に影響を与えることが分かった。
【００６８】
【表１７】
2007267728.tif 000018
【００６９】
＜考察＞
２型糖尿病と関連する遺伝子多型について、性別により異なるか、あるいは男女に共通のものがあるか、などの点については未だ検討されていない。本発明者は、２型糖尿病との関連が疑われる１４８カ所の多型について、男性または女性に分けた解析を行った。今回の大規模研究によって、男性についてはＴＨＢＳ２の３９４９Ｔ→Ｇ多型が、女性についてはＰＯＮ１のＡ→Ｇ（Ａｒｇ１６０Ｇｌｙ）多型が、それぞれ２型糖尿病と有意に関連していた。これらの結果は、日本人においては、２型糖尿病に関連する遺伝子多型が性別により異なっていることを示している。
【００７０】
トロンボスポンジンは、細胞−細胞及び細胞−マトリックスの情報伝達に関与する細胞外糖タンパクのファミリーに属している（非特許文献３４）。多くの脊椎動物において、それぞれ異なる遺伝子からの産物を代表する５個のファミリーメンバー（ＴＨＢＳ１〜ＴＨＢＳ５）が知られている。ＴＨＢＳ１とＴＨＢＳ２は、分子量が約１４５ｋＤａのサブユニットからなる三量体であり、ＴＨＢＳ３からＴＨＢＳ５は分子量が約１００ｋＤａのサブユニットからなる五量体である（非特許文献３５）。ＴＨＢＳ２欠損マウスは、コラーゲン繊維の生産、皮膚のもろさ、腱および靱帯の強度において異常を示すことが知られているが、ＴＨＢＳ２が結合組織において構造的に如何なる役割を果たしているかについては知られていない（非特許文献３６）。ＴＨＢＳ２遺伝子における３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）の３９４９Ｔ→Ｇ多型は、心筋梗塞に関連しており、このときＧ遺伝子型が防御因子であることが知られている（非特許文献３７，３８）。今回の我々の研究では、男性の場合には、ＴＨＢＳ２のＴ→Ｇ多型（３’ＵＴＲ）が２型糖尿病と関連しており、このときＧ遺伝子型が防御因子であることが分かった。しかしながら、詳細なメカニズムについては依然として不明のままである。
【００７１】
血中パラオキソナーゼ１（ＰＯＮ１）は、有機リン酸エステルの加水分解を行うカルシウム依存性エステラーゼであり、肝臓・腎臓・および小腸を含む臓器に広く分布している。またＰＯＮ１は、ＨＤＬと結合して血中にも存在する。ＰＯＮ１は、有機リン酸エステルの解毒機能と、ＬＤＬの酸化予防機能があると言われている（非特許文献３９）。ＰＯＮ１欠損マウスは、有機リン系農薬のクロルピリホスオキソン及びクロルピリホスの毒性に対する感受性が増加する。ＰＯＮ１欠損マウスから精製されたＨＤＬはＬＤＬの酸化を止めることができず、同マウスから精製されたＨＤＬ及びＬＤＬは、野生型マウスから精製されたＨＤＬ及びＬＤＬに比べると、酸化されやすかった。更に、ＰＯＮ１欠損マウスに高脂肪食を与えると、野生型マウスに比べて、アテローム性動脈硬化に掛かりやすかった（非特許文献４０）。血中パラオキソナーゼ活性は、非糖尿病患者群に比べると、糖尿病患者では、減少することが分かっている（非特許文献４１，４２）。ＰＯＮ１のＡ→Ｇ（Ｇｌｎ１９２Ａｒｇ）多型は、２型糖尿病において冠動脈疾患に関連し、このときＧ遺伝子型が危険因子であることが分かっている（非特許文献４３）。ＰＯＮ１のプロモーター領域中にある−１０７Ｔ→Ｃ多型は、単独で或いはＡ→Ｇ（Ｇｌｎ１９２Ａｒｇ）多型との組合せで、２型糖尿病患者の冠動脈疾患に関連するとの報告がある（非特許文献４４）。我々の研究結果によれば、ＰＯＮ１のＡ→Ｇ（Ａｒｇ１６０Ｇｌｙ）多型は、女性においては、２型糖尿病と有意に関連しており、このときＧ遺伝子型が危険因子であることが分かった。しかしながら、分子機構については、依然として不明のままである。
【００７２】
このように本実施形態によれば、２型糖尿病について、遺伝的リスクおよび発症リスクを判断するための検出法を提供することができる。この実施形態を用いることにより、２型糖尿病の予防が可能となり、２型糖尿病が原因となって引き起こされる糖尿病性血管障害（心筋梗塞、脳血栓、末梢血管障害）、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症などの疾患の罹患率を減少させることにより、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【００７３】
【非特許文献１】Hanis CL, Boerwinkle E, Chakraborty R, et al. (1996) A genome-wide search for human non-insulin-dependent (type 2) diabetes genes reveals a major susceptibility locus on chromosome 2. Nat Genet 13:161-166
【非特許文献２】Mahtani MM, Widen E, Lehto M, et al. (1996) Mapping of a gene for type 2 diabetes associated with an insulin secretion defect by a genome scan in Finnish families. Nat Genet 14:90-94
【非特許文献３】Elbein SC, Hoffman MD, Teng K, Leppert MF, Hasstedt SJ (1999) A genome-wide search for type 2 diabetes susceptibility genes in Utah Caucasians. Diabetes 48:1175-1182
【非特許文献４】Ghosh S, Watanabe RM, Hauser ER, et al. (1999) Type 2 diabetes: evidence for linkage on chromosome 20 in 716 Finnish affected sib pairs. Proc Natl Acad Sci USA 96:2198-2203
【非特許文献５】Vionnet N, Hani El-H, Dupont S, et al. (2000) Genomewide search for type 2 diabetes-susceptibility genes in French whites: evidence for a novel susceptibility locus for early-onset diabetes on chromosome 3q27-qter and independent replication of a type 2-diabetes locus on chromosome 1q21-q24. Am J Hum Genet 67:1470-1480
【非特許文献６】Vionnet N, Stoffel M, Takeda J, et al. (1992) Nonsense mutation in the glucokinase gene causes early-onset non-insulin-dependent diabetes mellitus. Nature 356:721-722
【非特許文献７】Almind K, Bjorbaek C, Vestergaard H, Hansen T, Echwald S, Pedersen O (1993) Amino acid polymorphisms of insulin receptor substrate-1 in non-insulin-dependent diabetes mellitus. Lancet 342:828-832
【非特許文献８】Altshuler D, Hirschhorn JN, Klannemark M, et al. (2000) The common PPARγ Pro12Ala polymorphism is associated with decreased risk of type 2 diabetes. Nat Genet 26:76-80
【非特許文献９】Horikawa Y, Oda N, Cox NJ, et al. (2000) Genetic variation in the gene encoding calpain-10 is associated with type 2 diabetes mellitus. Nat Genet 26:163-175
【非特許文献１０】Hara K, Boutin P, Mori Y, et al. (2002) Genetic variation in the gene encoding adiponectin is associated with an increased risk of type 2 diabetes in the Japanese population. Diabetes 51:536-540
【非特許文献１１】The Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus (1998) Report of the Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Diabetes Care 21:S5-S19
【非特許文献１２】Kuzuya T, Nakagawa S, Satoh J, et al. (2002) Report of the Committee on the Classification and Diagnosis Criteria of Diabetes Mellitus. Diabetes Res Clin Pract 55:65-85
【非特許文献１３】Itoh Y, Mizuki N, Shimada T, et al. (2005) High-throughput DNA typing of HLA-A, -B, -C, and -DRB1 loci by a PCR-SSOP-Luminex method in the Japanese population. Immunogenetics 57:717-729
【非特許文献１４】Ehm MG, Karnoub MC, Sakul H, et al.; American Diabetes Association GENNID Study Group (2000) Genetics of NIDDM. Genomewide search for type 2 diabetes susceptibility genes in four American populations. Am J Hum Genet 66:1871-1881
【非特許文献１５】Mori Y, Otabe S, Dina C, et al. (2002) Genome-wide search for type 2 diabetes in Japanese affected sib-pairs confirms susceptibility genes on 3q, 15q, and 20q and identifies two new candidate loci on 7p and 11p. Diabetes 51:1247-1255
【非特許文献１６】Iwasaki N, Cox NJ, Wang YQ, et al. (2003) Mapping genes influencing type 2 diabetes risk and BMI in Japanese subjects. Diabetes 52:209-213
【非特許文献１７】Mackman N (1995) Regulation of the tissue factor gene. FASEB J 9:883-889
【非特許文献１８】Samad F, Pandey M, Loskutoff DJ (1998) Tissue factor gene expression in the adipose tissues of obese mice. Proc Natl Acad Sci USA 95:7591-7596
【非特許文献１９】Samad F, Pandey M, Loskutoff DJ (2001) Regulation of tissue factor gene expression in obesity. Blood 98:3353-3358
【非特許文献２０】Ichikawa K, Yoshinari M, Iwase M, et al. (1998) Advanced glycosylation end products induced tissue factor expression in human monocyte-like U937 cells and increased tissue factor expression in monocytes from diabetic patients. Atherosclerosis 136:281-287
【非特許文献２１】Diamant M, Nieuwland R, Pablo RF, Sturk A, Smit JW, Radder JK (2002) Elevated numbers of tissue-factor exposing microparticles correlate with components of the metabolic syndrome in uncomplicated type 2 diabetes mellitus. Circulation 106:2442-2447
【非特許文献２２】Lim HS, Blann AD, Lip GY (2004) Soluble CD40 ligand, soluble P-selectin, interleukin-6, and tissue factor in diabetes mellitus: relationships to cardiovascular disease and risk factor intervention. Circulation 109:2524-2528
【非特許文献２３】Lim HS, Chong AY, Freestone B, Blann AD, Lip GY (2005) The effect of multi-factorial intervention on plasma von Willebrand factor, soluble E-selectin and tissue factor in diabetes mellitus: implications for atherosclerotic vascular disease. Diabet Med 22:249-255
【非特許文献２４】Ott I, Koch W, von Beckerath N, et al. (2004) Tissue factor promoter polymorphism -603 A/G is associated with myocardial infarction. Atherosclerosis 177:189-191
【非特許文献２５】Moberg L, Johansson H, Lukinius A, et al. (2002) Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation. Lancet 360:2039-2045
【非特許文献２６】Arnaud E, Barbalat V, Nicaud V, et al. (2000) Polymorphisms in the 5' regulatory region of the tissue factor gene and the risk of myocardial infarction and venous thromboembolism: the ECTIM and PATHROS studies. Etude Cas-Temoins de l'Infarctus du Myocarde. Paris Thrombosis Case-Control Study. Arterioscler Thromb Vasc Biol 20:892-898
【非特許文献２７】Reny JL, Laurendeau I, Fontana P, et al. (2004) The TF-603A→G gene promoter polymorphism and circulating monocyte tissue factor gene expression in healthy volunteers. Thromb Haemost 91:248-254
【非特許文献２８】Stumvoll M, Goldstein BJ, van Haeften TW (2005) Type 2 diabetes: principles of pathogenesis and therapy. Lancet 365:1333-1346.
【非特許文献２９】Zimmet P, Alberti KGMM, Shaw J (2001) Global and societal implications of the diabetes epidemic. Nature 414,782-787.
【非特許文献３０】The Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus (2003) Report of the Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Diabetes Care 26:S5-S20.
【非特許文献３１】Rattarasarn C, Leelawattana R, Soonthornpun S, Setasuban W, Thamprasit A (2004) Gender differences of regional abdominal fat distribution and their relationships with insulin sensitivity in healthy and glucose-intolerant Thais. J Clin Endocrinol Metab 89:6266-6270.
【非特許文献３２】Ding EL, Song Y, Malik VS, Liu S (2006) Sex differences of endogenous sex hormones and risk of type 2 diabetes: a systematic review and meta-analysis. JAMA 295:1288-1299.
【非特許文献３３】Yamada Y, Matsuo H, Segawa T, Watanabe S, Kato K, Kameyama T, Yokoi K, Ichihara S, Metoki N, Yoshida H, Satoh K, Nozawa Y (2006) Assessment of genetic factors for type 2 diabetes mellitus. Int J Mol Med 18:299-308.
【非特許文献３４】Lawler J (2000) The functions of thrombospondin-1 and -2. Curr Opin Cell Biol 12:634-640.
【非特許文献３５】Bornstein P (2001) Thrombospondins as matricellular modulators of cell function. J Clin Invest 107:929-934.
【非特許文献３６】Bornstein P, Armstrong LC, Hankenson KD, Kyriakides TR, Yang Z (2000) Thrombospondin 2, a matricellular protein with diverse functions. Matrix Biol 19:557-568.
【非特許文献３７】Topol EJ, McCarthy J, Gabriel S, Moliterno DJ, Rogers WJ, Newby LK, Freedman M, Metivier J, Cannata R, O’Donnell CJ, Kottke-Marchant K, Murugesan G, Plow EF, Stenina O, Daley GQ (2001) Single nucleotide polymorphisms in multiple novel thrombospondin genes may be associated with familial premature myocardial infarction. Circulation 104:2641-2644.
【非特許文献３８】Boekholdt SM, Trip MD, Peters RJG, Engelen M, Boer JMA, Feskens EJM, Zwinderman AH, Kastelein JJP, Reitsma PH (2002) Thrombospondin-2 polymorphism is associated with a reduced risk of premature myocardial infarction. Arterioscler Thromb Vasc Biol 22:e24-e27.
【非特許文献３９】Durrinton PN, Mackness B, Mackness MI (2001) Paraoxonase and atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 21:473-480.
【非特許文献４０】Shih DM, Gu L, Xia YR, Navab M, Li WF, Hama S, Castellani LW, Furlong CE, Costa LG, Fogelman AM, Lusis AJ (1998) Mice lacking serum paraoxonase are susceptible to organophosphate toxicity and atherosclerosis. Nature 394:284-287.
【非特許文献４１】Abbott CA, Mackness MI, Kumar S, Boulton AJ, Durrington PN (1995) Serum paraoxonase activity, concentration, and phenotype distribution in diabetes mellitus and its relationship to serum lipids and lipoproteins. Arterioscler Thromb Vasc Biol 11:1812-1818.
【非特許文献４２】Letellier C, Durou MR, Jouanolle AM, Le Gall JY, Poirier JY, Ruelland A (2002) Serum paraoxonase activity and paraoxonase gene polymorphism in type 2 diabetic patients with or without vascular complications. Diabetes Metab 28:297-304.
【非特許文献４３】Pfohl M, Koch M, Enderle MD, Kuhn R, Fullhase J, Karsch KR, Haring HU (1999) Paraoxonase 192 Gln/Arg gene polymorphism, coronary artery disease, and myocardial infarction in type 2 diabetes. Diabetes 48:623-627.
【非特許文献４４】James RW, Leviev I, Ruiz J, Passa P, Froguel P, Garin M-CB (2000) Promoter polymorphism T(-107)C of the paraoxonase PON1 gene is a risk factor for coronary artery disease in type 2 diabetic patients. Diabetes 49:1390-1393.
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】Ｌｕｍｉｎｅｘ１００で検出するマイクロビーズの微細構造と特徴を示す図である。
【図２】ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法の手順の概要を示す図である。
【図１】
2007267728.tif 000019
【図２】
2007267728.tif 000020
【配列表】
2007267728000001.app