(57)【要約】【課題】本発明は、インターロイキン12を工業的に大量生産し得る方法を提供することを課題とする。【解決手段】核多角体病ウイルスのDNAをインターロイキン12の蛋白質をコードするDNAで組み換えた組換え核多角体病ウイルスを感染させたカイコ幼虫の体液を酸性条件で処理することを特徴とするインターロイキン12の製造方法、その際の酸性条件はpH１〜4とすることが好ましい。またインターロイキン12はイヌインターロイキン12であることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核多角体病ウイルスのDNAをインターロイキン12の蛋白質をコードするDNAで組み換えた組換え核多角体病ウイルスを感染させたカイコ幼虫の体液を酸性条件で処理することを特徴とするインターロイキン12の製造方法。
【請求項２】
酸性条件がpH１〜4であることを特徴とする請求項1に記載のインターロイキン12の製造方法。
【請求項３】
インターロイキン12がイヌインターロイキン12であることを特徴とする請求項1または2記載のインターロイキン12の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はインターロイキン12の製造方法に関する。更に詳しくは、遺伝子組換え技術によって組換え核多角体病ウイルスをカイコ幼虫に感染させてインターロイキン12を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子操作技術の進歩により、各種疾病の治療に有望な生体内に内在するサイトカインなどの有用タンパク質が次々に発見され、医薬品としての用途開発研究が盛んに行われている。なかでもインターロイキン12（以下IL12）はP40とP35という2つのタンパク質から構成される(文献１)サイトカインである。本発明者らは以前にIL12のタンパク質をコードするDNAをクローニングし、遺伝子組換え技術によってIL12を製造する方法を開発した（特許文献1）。それにより核多角体病ウイルスのDNAをIL12の蛋白質をコードするDNAで組み換えた組換え核多角体病ウイルスをカイコ幼虫の生体中で増殖させる方法で、IL12を大量に製造することが可能になった。
【０００３】
しかしながら、カイコ幼虫の体液中に産生させたIL12を体液と共に抽出する際にカイコ幼虫の腸管内に存在するタンパク質分解酵素により、IL12が分解され大幅に減少あるいは消失してしまうことが明らかになった。この分解酵素の混入を防ぐため、カイコ幼虫の腹脚を切断して体液を抽出する方法（特許文献2）が知られている他、プロテアーゼインヒビターを添加して分解酵素の働きを抑制する方法もあるが、作業性や後の精製除去が困難であることなどから、IL12の大量製造は困難であった。
【非特許文献１】Wolfら、J.Immunol.146,3074-3081(1991)
【特許文献１】特開平10-36397号公報
【特許文献２】特許第2995271号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで本発明はIL12を工業的に大量生産し得る方法を提供することを課題とする。  
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らはかかる状況に鑑み、カイコ幼虫体内で産生させたIL12を体外に抽出する際に酸性条件で処理することでタンパク質分解酵素によってIL12を分解・消失させることなく高濃度に回収できることが明らかになり、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、核多角体病ウイルスのDNAをインターロイキン12の蛋白質をコードするDNAで組み換えた組換え核多角体病ウイルスを感染させたカイコ幼虫の体液を酸性条件で処理することを特徴とするインターロイキン12の製造方法である。酸性条件はpH１〜4であることが好ましい。
インターロイキン12はイヌインターロイキン12であることが好ましい。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の方法により、カイコ幼虫体内で産生させたIL12を高濃度に効率よく回収することができるようになった。
【０００８】
特にカイコ幼虫の体液の処理条件をpH1〜4の酸性条件とすることで、カイコ体内に存在するタンパク質分解酵素の働きを抑制し、IL12が分解されることなく、高濃度に回収できるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の製造法で高濃度に回収されるIL12としてはヒトIL12、ほ乳類IL12などがあげられ、特にイヌIL12の製造に好ましく本発明が適用できる。
【００１０】
イヌIL12の2つのサブユニットをそれぞれコードするDNAを組み込んだプラスミドは例えば次のようにして製造することができる。イヌの細胞からポリ(A)RNAを抽出した後、cDNAを合成し、それぞれのサブユニットをコードする遺伝子配列を元にしたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下PCR）を行うことによって、イヌIL12の2つのサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を得ることができる。イヌの細胞、例えばマイト-ジェンなどで刺激されたイヌリンパ球などよりRNAを得る方法としては通常の方法、例えばポリソームの分離、ショ糖密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげられる。上記イヌ細胞よりRNAを抽出する方法としては、グアニジン・チオシアネート処理後CsCl密度勾配遠心を行うグアニジン・チオシアネート-塩化セシウム法（文献２）、バナジウム複合体を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活性剤で処理した後フェノール抽出を行う方法（文献３）、グアニジン・チオシアネート-ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート-グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシアネート-フェノール・クロロホルム法、グアニジン・チオシアネートで処理した後塩化リチウムで処理してRNAを沈殿させる方法などの中から適当な方法を選んで行うことができる。
【００１１】
イヌリンパ球などより通常の方法、例えば、塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシアネ−ト法、オリゴdTセルロ−スカラム法等によりmRNAを単離し、得られたmRNAから通常の方法、例えば、Gublerらの方法（文献４）、H.Okayamaらの方法（文献５）等によりcDNAを合成する。得られたmRNAからcDNAを合成するには、基本的にはトリ骨芽球ウイルス（AMV）などの逆転写酵素などを用いるほか1部プライマ−を用いてDNAポリメラ−ゼなどを用いる方法を組み合わせてよいが、市販の合成あるいはクロ−ニング用キットを用いるのが便利である。このcDNAを鋳型としてイヌIL12の2つのサブユニットをそれぞれコードする遺伝子の塩基配列を基にしたプライマ−を用いてPCRを行うことによってイヌIL12の2つのサブユニットをそれぞれコードするDNAを得ることができる。
【００１２】
このイヌIL12のタンパク質をコードするDNAをカイコのクローニングベクター（文献６）に連結して作製した組換え体プラスミドと核多角体病ウイルスDNAとをカイコ樹立細胞にコトランスフェクションして組換え核多角体病ウイルスを作製することができる。すなわち組換え核多角体病ウイルスはin vivo的な方法で作成することができる。
【００１３】
すなわち、IL12のタンパク質をコードするDNA部分を例えばpBM030（文献６）等のカイコのクローニングベクターの発現調節部分の顆粒に連結するという一般的な遺伝子操作に従って組換え体プラスミドを作製することができる。この組換え体プラスミドと核多角体病ウイルスDNAとを文献６のような方法でカイコ樹立細胞、例えばBm-N株（文献６）にコトランスフェクションした後、培養を続け、培養液中に出現した非組換え体（野生型）と組換え体のウイルスの中から限界希釈法やプラーク法などの一般的な方法によって組換え体ウイルスをクローニングすることができる。組換え体ウイルスは多角体の形成能がないことから野生型との区別は容易である。
【００１４】
イヌIL12の生産は前記の組換え核多角体病ウイルスをカイコ幼虫の生体内で増殖させることによって行う。組換え核多角体病ウイルスを含む培養液をカイコ幼虫に注射して、飼料を与えながら飼育する。飼育後、カイコ幼虫の腹部を切開し、イヌIL12を含む体液を回収する。
【００１５】
カイコ体液を酸性条件とするには、回収したカイコ体液に直ちに酸を加える方法、酸性溶液中にカイコ体液を受ける方法、もしくは開腹したカイコをそのまま酸性溶液中に入れて攪拌し後に残査を除去する方法などが可能であるが、開腹したカイコをそのまま酸性溶液中に入れて攪拌し後に残査を除去する方法が好ましい。またこれらの操作は氷浴中で行うのが好ましいが限定されるものではない。
【００１６】
使用する酸としては塩酸、硫酸、硝酸などの鉱酸、または蟻酸、酢酸などの有機酸を用いる事ができる。本発明においては塩酸が好ましく用いられる。酸性の範囲はpH1〜4とする。
【００１７】
このようにして調製した酸性液中には酸により変性凝固した物質が生じるため、遠心分離器を用いるなどしてそれらを除去し、イヌIL12を単離・精製する。単離・精製するための方法に特に限定はなく、通常のタンパク質の精製方法を用いることができる。イヌIL12が本来有する活性を指標としながらシリカゲル担体、イオン交換担体、ゲルろ過担体、キレート担体、色素担持担体等を用いたクロマトグラフィーや限外ろ過、ゲルろ過、透析、塩析等による脱塩、濃縮を組み合わせることによって精製し・単離することができる。
【実施例】
【００１８】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。但し、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００１９】
参考例1  イヌIL12 P40,P35遺伝子の取得
（１）イヌcDNAの調製
イヌ肝臓、リポポリサッカライド（LPS）（50μg/mL）で48時間刺激したイヌ末梢血単核球およびニワトリニューカッスル病ウイルスで7時間処理した（107 pfu/mL）イヌ脾臓由来リンパ球よりISOGEN（ニッポンジーン社）を用いて総RNAを調製した。得られたRNAを1mM エチレンジアミン４酢酸塩（EDTA）を含む10mM トリス塩酸緩衝液（pH7.5）（以下TEと略する。）に溶解し、70℃で5分間処理した後、1M LiClを含むトリス塩酸緩衝液（TE）を同量加えた。0.5M LiClを含むTEで平衡化したオリゴdTセルロースカラムにRNA溶液をアプライし、同緩衝液にて洗浄した。さらに0.3M LiClを含むTEにて洗浄後、0.01%SDSを含む2mM EDTA（pH7.0）で吸着したポリ（A）RNAを溶出した。こうして得られたポリ（A）RNAを用いて一本鎖cDNAを合成した。すなわち、滅菌した0.5mLのミクロ遠心チューブに5μgのポリ（A）RNAと0.5μgのオリゴdTプライマー（12-18mer）を入れ、ジエチルピロカルボネート処理滅菌水を加えて12μLにし、70℃で10分間インキュベートしたのち氷中に1分間つけた。これに200mM トリス塩酸（pH8.4），500mM KCl溶液を2μL，25mM MgCl2 を2μL，10mM dNTPを1μLおよび0.1M DTTを2μLそれぞれ加え、42℃で5分間インキュベートしたのち、200ユニットのGibcoBRL社製Super Script II RTを1μL加え、42℃でさらに50分間インキュベートしてcDNA合成反応を行った。さらに70℃で15分間インキュベートして反応を停止し、氷上に5分間置いた。この反応液に1μLのE.coli RNaseH（2units/mL）を加え、37℃で20分間インキュベートした。
【００２０】
（２）イヌIL12 P40遺伝子の取得
イヌIL12 P40のN末端およびC末端の塩基配列（文献７）をもとに、５´ＡＴＧＣＡＴＣＣＴＣＡＧＣＡＧＴＴＧＧＴＣＡＴＣＴＣＣＴＧＧ３´（配列番号１）と５´ＣＴＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＣＡＣＡＧＡＴＧＣＣＣＡＧＴＣＧＣＴ３´（配列番号２）の2種類のプライマーをDNAシンセサイザーにて合成した。上記（１）のイヌ肝臓より得られたcDNAを0.5mLのミクロ遠心チューブに2μL添加し、各プライマーを20pmol，20mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）、1,5mM MgCl2、25mM KCl，100μg/mLゼラチン、50μM各dNTP、4単位Taq DNAポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量100μLとする。DNAの変性条件を94℃、1分、プライマーのアニーリング条件を55℃、2分、プライマーの伸長条件を72℃、3分の各条件でパーキンエルマーセータス（Perkin-Elmer Cetus）社のDNAサーマルサイクラーを用い、35サイクル反応させた。これを1％アガロースゲルにて電気泳動し、約990bpのDNA断片を常法（文献８）に従って調製した。
【００２１】
このDNA断片をInvitrogen社のT-Vectorに宝酒造（株）のDNA Ligation Kit Ver.1を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドDNAを常法により調製した。次にこのプラスミドにPCR断片が挿入されていることを前述と同じ条件のPCRによって確認後、蛍光DNAシーケンサー（パーキンエルマー社製DNAシーケンサー373S）を用い、その添付プロトコールに従って、パーキンエルマー社のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて、得られたDNA断片がイヌIL12 P40をコードする配列であることを確認した。
【００２２】
（３）イヌIL12 P35遺伝子のクローニング
イヌIL12 P35のN末端およびC末端の塩基配列（文献７）をもとに、５´ＡＴＧＴＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴ３´（配列番号３）と５´ＴＴＡＧＧＡＡＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＡＡＣＴＣＡＴＣＡＴＴＣＴ３´（配列番号４）の２種類のプライマ−をDNAシンセサイザーにて合成した。上記（１）の鶏ニューカッスル病ウイルスで処理したイヌ脾臓由来リンパ球より得られたcDNAを鋳型として上記（２）と同様にして約670bpのDNA断片を得た後、T-vectorに挿入し、イヌIL12 P35をコードする配列であることを確認した。
【００２３】
参考例２イヌIL12の生産
（１）イヌIL12産生組換え核多角体病ウイルスの作製
核多角体病ウイルストランスファーベクターpAcAB3（ファーミンジェン社製）のプロモーター下流の制限酵素XbaIおよびSmaI切断部位にそれぞれP40およびP35サブユニットcDNAを常法に従って連結し、組換えトランスファーベクターを得た。さらにファーミンジェン社製の核多角体病ウイルストランスフェクションキットを用いてその添付マニュアルに従って、組換え核多角体病ウイルスを作製した。
【００２４】
（２）昆虫細胞でのイヌIL12の生産上記（１）で得られた組換え核多角体病ウイルスを、ファーミンジェン社製のバキュロゴールドProtein-Free Insect Mediumで75cm2のフラスコでコンフルエントまで平面培養したSf21細胞（Spondoptera Flugiperda由来、ファーミンジェン社より入手）に感染させ、4日間培養した後、イヌIL12が生産された培養上清を得た。
【００２５】
参考例３ イヌIL12の検出
参考例２（２）で得られた昆虫細胞の培養上清中のイヌIL12をウエスタンブロッティング法によって検出した。培養上清をアトー（株）製のパジェル中、SDS-PAGEに供した。その後、アトー（株）製のクリアブロットメンブランに常法に従ってブロッティング後、メンブランを、抗イヌP40ポリクローナル抗体および抗イヌP35ポリクローナル抗体を含むウサギ血清を含むブロックエース（大日本製薬（株）製）溶液に6時間反応させ、0.02%Tween20を含むPBSにて3回洗浄し、さらにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギIgG（バイオラット（株）製）を含むブロックエース溶液に6時間反応させ、同様に洗浄した後、コニカ（株）製のコニカイムノステインHRP1000にて発色を行った。その結果、約40kD、約75kDおよび約85kDの3本のバンドが検出された。このうち、約75kDのバンドが、イヌP40とP35のヘテロダイマーから成るイヌIL12であり、約40kDのバンドは、イヌP40モノマー、約85kDのバンドは、イヌP40ホモダイマーである。
【００２６】
参考例４ イヌIL12の活性測定
参考例２（２）で生産されたイヌIL12の活性測定は以下のようにして行った。イヌリンパ球からのイヌIFNγ誘導活性検定のために、抗ウイルス活性を測定した。イヌ脾臓よりリンパ球を分離し、10%FBS-ERDFに106cells/mLの細胞密度で懸濁し、このうち2.5mLとヒトIL2（Genzyme社製）250Uを6cmディッシュに添加した。これに上記（２）で得られた培養上清2.5mLとヒトIL2 250Uを加え、5%CO2 、37℃の条件で2日間培養し、ウイルスとしてVesicular Stomatitis Virus，感受性細胞としてMDCK（ATCC  CCL-34）を用い、文献9のCPE法に従ってこの培養液の抗ウイルス活性を測定した。その結果、107希釈単位/mL以上の抗ウイルス活性が検出された。
【００２７】
実施例１  カイコ生体中でのイヌIL12の生産と酸処理によるイヌIL12の分解抑制
5令2日目のカイコ幼虫に、参考例2の（２）で得た組換え核多角体病ウイルスのウイルス液を2μL/頭注射し、25℃で4日間、市販の人工飼料（カネボウシルクエレガンス社製）を与えて飼育した。飼育後、10頭のカイコの腹部をハサミで切開し、20mMリン酸バッファー(pH7)100mLに浸漬して攪拌し、カイコ虫体等の残査を除去してカイコ体液の抽出液を得た。得られた抽出液について直ちに塩酸を加えpH1.0〜5.0に調整したもの、プロテアーゼインヒビター（ロシュ社）を規定量添加したものおよび無処理のものをそれぞれ4℃で20時間保持した。塩酸で処理した液については水酸化ナトリウム溶液で中和後、得られた各々のカイコ体液抽出液を5000rpm、15分間遠心分離し上清を回収した。得られた上清についてウエスタンブロッティングを行いイヌIL12の検出を行った結果および抗ウイルス活性を測定した結果を表1に示した。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
この結果から、pH1〜4の酸処理によってプロテアーゼインヒビターの添加処理と同等のイヌIL12の分解抑制効果が得られることが明らかになった。また抗ウイルス活性も酸処理によって劣化することなく維持されることが明らかになった。なお、pH5.0の条件ではイヌIL12のバンドが検出されなかったが、ｐＨ１〜４の酸性条件で処理されたものよりは劣るが、無処理の例に比較して、高い抗ウイルス活性が確認された。以上のことから、精製除去が困難なプロテアーゼインヒビターを添加することなく、簡便な酸処理によってイヌIL12の製造が可能であることが明らかである。
【００３０】
実施例２  カイコ生体中で生産したイヌIL12の精製
実施例１により得られたpH3.0で酸処理したカイコ体液抽出物上清を材料として精製を行った。抽出物上清約400mLを担体量約30mLのスルホプロピルセファロースに通液、洗浄後、塩化ナトリウムの濃度勾配により吸着物を溶出し、イヌIL12が検出された画分を集めた。この溶出画分を担体量5mLのBlueセファロース（ハイトラップタイプ）に通液、洗浄後硫酸アンモニウムの濃度勾配により吸着物を溶出し、イヌIL12が検出された画分を集めた。この溶出画分をさらに担体量約10mLのフェニルセファロースに通液、洗浄後塩化ナトリウムの濃度勾配で吸着物を溶出し、イヌIL12が検出された画分を精製イヌIL12とした。精製イヌIL12のウエスタンブロッティングの結果を図１に示す。その結果、単一バンドとなる高純度の精製IL12が得られた。また、この精製イヌIL12について抗ウイルス活性を確認した結果、105単位/mLであり、精製工程を経ても十分に抗ウイルス活性が維持されていることが明らかになった。
【００３１】
参考文献：
１．Wolfら：J.Immunol.146,3074-3081(1991)
２．Chirgwinら：Biochemistry,18,5294(1979)
３．Bergerら：Biochemistry,18,5143(1979)
４．Gublerら：Geen.25,236-269(1983)
５．Okayamaら：Mol.Cell.Biol.,2,161,(1982)&3,280,(1983)
６．T.Horiuchiら：Agric.Biol.Chem.,51,15 73-1580,(1987)
７．Okanoら：J.Interferon&Cytokine Res.,17,713-718(1997)
８．Molecular Cloning.Cold Spring Harbor Loboratory.New York.1982.
９．日本生化学会編：続生化学実験講座第5巻,(1986).P250-256,東京化学同人.
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】実施例２で行った精製イヌインターロイキン12のウエスタンブロッティングの結果
【図１】
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【配列表】
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