(57)【要約】【課題】  本発明は、米アレルゲンタンパク質の蓄積抑制剤、米アレルゲンタンパク質の蓄積が抑制された形質転換イネおよびその種子の製造方法、該薬剤を利用して米アレルゲンタンパク質の蓄積を抑制する方法、さらにこれら方法によって得られる形質転換イネおよび種子を提供することを課題とする。【解決手段】  本発明では、14-20 kDaアレルゲンタンパク質遺伝子族間の保存領域を利用したRNA干渉法により、コメの主要アレルゲンである14-20 kDaアレルゲンタンパク質の除去に成功した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子量14-20kDaに含まれる米アレルゲンタンパク質をコードする１もしくは複数の遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分として含む、米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤。
【請求項２】
前記遺伝子が、配列番号：３〜７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１に記載の米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤。
【請求項３】
以下の（ａ１）〜（ｃ１）のいずれかに記載の核酸を有効成分として含む、請求項１または２に記載の米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤。
（ａ１）配列番号：３〜７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子または該遺伝子と相同性の高い遺伝子の発現を、RNAi効果により阻害する作用を有する核酸
（ｂ１）配列番号：３〜７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子または該遺伝子と相同性の高い遺伝子の発現を抑制する作用を有するアンチセンス核酸
（ｃ１）配列番号：３〜７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子または該遺伝子と相同性の高い遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
【請求項４】
前記核酸が以下の（ａ２）〜（ｄ２）のいずれかに記載の核酸である、請求項１〜３のいずれかに記載の米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤。
（ａ２）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAと少なくとも８０％以上の相同性を有する核酸および／またはその相補鎖からなる核酸
（ｂ２）配列番号：１に記載の塩基配列からなる核酸および／またはその相補鎖からなる核酸
（ｃ２）配列番号：１に記載の塩基配列において１または複数の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入された塩基配列からなる核酸、および／またはその相補鎖からなる核酸
（ｄ２）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、および／またはその相補鎖からなる核酸
【請求項５】
核酸が少なくとも請求項３の（ａ１）〜（ｃ１）のいずれかに記載の核酸またはその一部を有する核酸である、請求項４に記載の米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤。
【請求項６】
さらに、分子量31-40kDaに含まれる米アレルゲンタンパク質をコードする１もしくは複数の遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分として含む、請求項１〜５のいずれかに記載の米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤。
【請求項７】
前記遺伝子が、配列番号：８〜１０のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子である、請求項６に記載の米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤。
【請求項８】
さらに以下の（ａ３）〜（ｃ３）のいずれかに記載の核酸を有効成分として含む、請求項１〜７のいずれかに記載の米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤。
（ａ３）配列番号：８〜１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする全ての遺伝子の発現を、RNAi効果により阻害する作用を有する核酸
（ｂ３）配列番号：８〜１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする全ての遺伝子の発現を抑制する作用を有するアンチセンス核酸
（ｃ３）配列番号：８〜１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする全ての遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
【請求項９】
さらに、分子量14-20kDaおよび31-40kDa以外の米アレルゲンタンパク質をコードする１もしくは複数の遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分として含む、請求項１〜８のいずれかに記載の米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤。
【請求項１０】
前記遺伝子が、配列番号：１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子である、請求項９に記載の米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤。
【請求項１１】
さらに以下の（ａ４）〜（ｃ４）のいずれかに記載の核酸を有効成分として含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤。
（ａ４）配列番号：１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の発現を、RNAi効果により阻害する作用を有する核酸
（ｂ４）配列番号：１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する作用を有するアンチセンス核酸
（ｃ４）配列番号：１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
【請求項１２】
請求項３の（ａ１）〜（ｃ１）、請求項８の（ａ３）〜（ｃ３）、または請求項１１の（ａ４）〜（ｃ４）のいずれかに記載の核酸を発現可能に保持するベクター。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれかに記載の薬剤、または請求項１２に記載のベクターを有効成分として含む、米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤。
【請求項１４】
請求項１〜１１、１３のいずれかに記載の薬剤、または請求項１２に記載のベクターが導入された宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１〜１１、１３のいずれかに記載の薬剤、または請求項１２に記載のベクターが導入されたイネ細胞。
【請求項１６】
請求項１５に記載のイネ細胞を含む形質転換体イネ。
【請求項１７】
請求項１６に記載の形質転換体イネの子孫またはクローンである、形質転換体イネ。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載の形質転換体イネを片親として用い、他方の親に非形質転換体イネあるいは請求項１６または１７に記載の形質転換体イネを用い交配することによって作出される子孫である形質転換体イネ。
【請求項１９】
請求項１〜１１、１３のいずれかに記載の薬剤、または請求項１２に記載のベクターをイネ細胞へ導入する工程を含む、イネもしくはその種子における米アレルゲンタンパク質の蓄積を抑制する方法。
【請求項２０】
請求項１〜１１、１３のいずれかに記載の薬剤、または請求項１２に記載のベクターをイネ細胞へ導入させる工程を含む、米アレルゲンタンパク質の蓄積が抑制されたイネもしくはその種子の製造方法。
【請求項２１】
さらに米アレルゲンタンパク質の蓄積が抑制された形質転換体イネを交配させる工程を含む、請求項２０に記載の米アレルゲンタンパク質の蓄積が抑制されたイネもしくはその種子の製造方法。
【請求項２２】
請求項２０または２１に記載の方法によって取得される、米アレルゲンタンパク質の蓄積が抑制されたイネ、またはその種子であるアレルゲン低減化米。
【請求項２３】
米アレルゲンタンパク質の発現が、請求項１〜１１、１３のいずれかに記載の薬剤、または請求項１２に記載のベクターにより人為的に抑制されていることを特徴とする、米アレルゲンタンパク質の蓄積が抑制されたイネ、またはその種子であるアレルゲン低減化米。
【請求項２４】
請求項２２または２３に記載のアレルゲン低減化米を有効成分として含有する、飲食品組成物および加工品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米アレルゲンタンパク質の蓄積抑制剤、米アレルゲンタンパク質の蓄積が抑制された形質転換イネおよびその種子の製造方法、該薬剤を利用して米アレルゲンタンパク質の蓄積を抑制する方法、さらにこれら方法によって得られる形質転換イネおよび種子に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー症状は、身体を守るための免疫機能に異常が生じ、過剰に働くことで起こる病気で、日本ではおよそ人口の1/3にあたる約4200万人が発症しており、そのうち米に対してアレルギー反応がでるコメアレルギーは40万人以上と言われている。アレルギーの疾患としては、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、気管支喘息などが挙げられる。
【０００３】
アレルゲンは、人の身体に入り込み、アレルギーを引き起こす原因となるもので、食べ物・植物・ほこり、動物の毛・ラテックス・ダニ・金属など多岐にわたる。厚生労働省が指定して保険で検査できる物だけで、170種類以上存在する。なかでも「牛乳・卵・大豆（油）・米・小麦」は「５大アレルゲン」と呼ばれている。米のタンパク質は穀類の中で最も高い栄養価を持っているため、米を食生活から取り除いてしまうと良質なタンパク質が摂取できなくなり、栄養不足を起こす危険性がある。また米は日常食であるため、米を食べたいのに食べることができない米アレルギー患者は、非常につらいものがあると拝察され、クオリティ・オブ・ライフ（QOL）は非常に損なわれている。
【０００４】
近年の衛生状態の改善により、アレルギー患者数の増加が予想されており、特に米は日本の食生活には欠かせない穀物であることから、低アレルゲン米の開発が望まれている。これまでに収穫後の米に対する酵素分解処理や高圧処理および発芽・加熱処理工程により低アレルゲン米が開発されている。しかしながら、これらの方法は、コストがかかるため価格が高く(高圧処理：250円/200g)、また酵素処理したものについても、除去するタンパク質の特異性など様々な問題を抱えている。一方、分子育種手法を用いて作出した低アレルゲン米、16kDaコメアレルゲン遺伝子（RA17）のアンチセンス遺伝子を導入した形質転換イネでは、16 kDaコメアレルゲンが20%程度に低減化されたが、その除去率は十分ではない（非特許文献１参照）。その他遺伝資源の探索から、品種「ゆきひかり」が一部の患者では利用されている。
【０００５】
現在米アレルギー患者に提供している商品として、例えば次のようなものがある。
・（株）資生堂  ファインライス
・（株）越後天風  A-カットごはん
【０００６】
米の中には、４種類のタンパク質（アルブミン・グロブリン・グルテリン・プロラミン）があり、コメアレルギーは、アルブミン・グロブリンがアレルギーの原因である場合が多いため、上記「A-カットごはん」では、アルブミンとグロブリンを選択的に95 ％除去している。しかしいずれもその除去率は限られたものである。また米からタンパク質が除去されているため、食味にも影響があるものと推察される。
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【０００７】
【非特許文献１】Yuichi Tada,  外７名著、「Reduction of 14-16 kDa allergenic proteins in transgenic rice plants by antisense gene」、FRBS Letters、1996年、p.341-345
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、米アレルゲンタンパク質の蓄積抑制剤および米アレルゲンタンパク質の低減化した米の提供を課題とする。より詳しくは、米アレルゲンタンパク質の蓄積抑制剤、米アレルゲンタンパク質の蓄積が抑制された形質転換イネおよびその種子の製造方法、該薬剤を利用して米アレルゲンタンパク質の蓄積を抑制する方法、さらにこれら方法によって得られる形質転換イネおよび種子の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、鋭意研究を行った。
コメの主要なアレルゲンタンパク質は14-20 kDa近辺の分子量を有するタンパク質であることが知られている（図１）。本発明では、14-20 kDaアレルゲンタンパク質遺伝子族間の保存領域を利用したRNA干渉法により、コメの主要アレルゲンである14-20 kDaアレルゲンタンパク質の除去に成功した。
【００１０】
具体的な手法として、14-20 kDa米アレルゲンタンパク質遺伝子は遺伝子族を形成していることが考えられているため、データベース検索により14-20 kDa米アレルゲンタンパク質遺伝子を同定した（図２）。次に、この遺伝子族間で保存された領域を利用してRNA干渉法植物形質転換用ベクターを構築し（図４）、このベクターを導入した形質転換イネを作出した。ウエスタン分析により、作出した形質転換イネの種子における米アレルゲンタンパク質の蓄積を解析した結果、コメの主要アレルゲンである14-20 kDaアレルゲンタンパク質の蓄積が顕著に抑制されていることが明らかとなった。この結果は日本晴だけでなく、低アレルゲン米系統EM37においても同様の結果が得られた（図５）。
【００１１】
以上のように、本発明者らによって、米の主要アレルゲンである14-20 kDaアレルゲンタンパク質を特異的、かつ顕著に除去した米の開発に成功した。この手法は他のアレルゲンタンパク質の低減にも効果があると期待出来る。
【００１２】
また本発明で用いた14-20 kDaタンパク質については、その詳細な生理的な活性については、貯蔵タンパク質であることを除けばこれまでのところ全く知られていない。既存の商品でも明らかなように、アレルゲンタンパク質を特異的に、かつその蓄積を効率よく抑制した米は無く、その技術の開発が期待されている。即ち、当該タンパク質の発現を特異的に且つ複数のタンパク質を同時に抑制し、低アレルゲン米が作出できたことは、非常に大きな成果であるといえる。
【００１３】
またこれまでに分子育種手法を用いて作出した低アレルゲン米、16 kDaコメアレルゲン遺伝子（RA17）のアンチセンス遺伝子を導入した形質転換イネでは、16 kDa米アレルゲンの80%程度が除去されていることが報告されている（非特許文献１参照）。しかしながら、本発明で作出した形質転換イネの種子では、日本晴種子と比べ、14-20 kDaアレルゲンタンパク質の蓄積が顕著に抑制されており、これまでに作出された低アレルゲン米に比べ、14-20 kDaアレルゲンタンパク質の蓄積を著しく低減させることに成功した。
【００１４】
また、従来の低アレルゲン米と比較して、今回本発明者らによって作出された低アレルゲン米は抗原性の高い14-20 kDa近辺のタンパク質が特異的に低減しているため、米アレルギーを有するほとんどの患者が、当該低アレルゲン米によりこのタンパク質に対する症状軽減が期待される。米アレルギー患者にとっては朗報であり、QOLの向上を図ることにつながり、高い需要が期待できる。
【００１５】
また、米アレルギーに特異的なタンパク質のみを低減化し、それ以外のタンパク質に顕著な変化はないことから、食味への影響は従来の商品に比べあまりないものと予想される。さらに、従来品と比較して、米収穫後に酵素処理などの特別な処理の必要が無く、アレルゲン低減化米としてコスト面でもはるかに優れている。勿論通常のイネと栽培に要するコストは同じであり、米そのものの付加価値は高い。さらに酵素処理などを行わないため、通常の米と全く同じ炊飯、加工米としての利用が可能である。
【００１６】
現在米アトピー対策に用いられている「ゆきひかり」などの米アレルギー好適米を本発明に記載の薬剤を用いて形質転換すること、あるいはゆきひかりなどと本発明の形質転換イネを交配することにより、さらなる低アレルゲン化を図ることも可能である。なお、同時に複数のタンパク質を低減する優れた効果もある。
【００１７】
上述の如く本発明者らは、米アレルゲンタンパク質の発現を抑制することに成功し、米アレルゲンタンパク質を低減化した米の作出に成功することで本発明を完成させた。該タンパク質の発現を抑制する薬剤を利用することにより、イネ植物およびその種子（米）において当該タンパク質の蓄積を抑制することが可能である。
【００１８】
本発明は、米アレルゲンタンパク質の蓄積抑制剤、米アレルゲンタンパク質の蓄積が抑制された形質転換イネおよびその種子の製造方法、該薬剤を利用して米アレルゲンタンパク質の蓄積を抑制する方法、さらにこれら方法によって得られる形質転換イネおよび種子に関し、より具体的には、
〔１〕  分子量14-20kDaに含まれる米アレルゲンタンパク質をコードする１もしくは複数の遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分として含む、米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤、
〔２〕  前記遺伝子が、配列番号：３〜７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子である、〔１〕に記載の米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤、
〔３〕  以下の（ａ１）〜（ｃ１）のいずれかに記載の核酸を有効成分として含む、〔１〕または〔２〕に記載の米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤、
（ａ１）配列番号：３〜７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子または該遺伝子と相同性の高い遺伝子の発現を、RNAi効果により阻害する作用を有する核酸
（ｂ１）配列番号：３〜７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子または該遺伝子と相同性の高い遺伝子の発現を抑制する作用を有するアンチセンス核酸
（ｃ１）配列番号：３〜７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子または該遺伝子と相同性の高い遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
〔４〕  前記核酸が以下の（ａ２）〜（ｄ２）のいずれかに記載の核酸である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤、
（ａ２）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAと少なくとも８０％以上の相同性を有する核酸および／またはその相補鎖からなる核酸
（ｂ２）配列番号：１に記載の塩基配列からなる核酸および／またはその相補鎖からなる核酸
（ｃ２）配列番号：１に記載の塩基配列において１または複数の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入された塩基配列からなる核酸、および／またはその相補鎖からなる核酸
（ｄ２）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、および／またはその相補鎖からなる核酸
〔５〕  核酸が少なくとも〔３〕の（ａ１）〜（ｃ１）のいずれかに記載の核酸またはその一部を有する核酸である、〔４〕に記載の米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤、
〔６〕  さらに、分子量31-40kDaに含まれる米アレルゲンタンパク質をコードする１もしくは複数の遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分として含む、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤、
〔７〕  前記遺伝子が、配列番号：８〜１０のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子である、〔６〕に記載の米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤、
〔８〕  さらに以下の（ａ３）〜（ｃ３）のいずれかに記載の核酸を有効成分として含む、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤、
（ａ３）配列番号：８〜１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする全ての遺伝子の発現を、RNAi効果により阻害する作用を有する核酸
（ｂ３）配列番号：８〜１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする全ての遺伝子の発現を抑制する作用を有するアンチセンス核酸
（ｃ３）配列番号：８〜１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする全ての遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
〔９〕  さらに、分子量14-20kDaおよび31-40kDa以外の米アレルゲンタンパク質をコードする１もしくは複数の遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分として含む、〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤、
〔１０〕  前記遺伝子が、配列番号：１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子である、〔９〕に記載の米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤、
〔１１〕  さらに以下の（ａ４）〜（ｃ４）のいずれかに記載の核酸を有効成分として含む、〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤、
（ａ４）配列番号：１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の発現を、RNAi効果により阻害する作用を有する核酸
（ｂ４）配列番号：１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する作用を有するアンチセンス核酸
（ｃ４）配列番号：１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
〔１２〕  〔３〕の（ａ１）〜（ｃ１）、〔８〕の（ａ３）〜（ｃ３）、または〔１１〕の（ａ４）〜（ｃ４）のいずれかに記載の核酸を発現可能に保持するベクター、
〔１３〕  〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載の薬剤、または〔１２〕に記載のベクターを有効成分として含む、米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤、
〔１４〕  〔１〕〜〔１１〕、〔１３〕のいずれかに記載の薬剤、または〔１２〕に記載のベクターが導入された宿主細胞、
〔１５〕  〔１〕〜〔１１〕、〔１３〕のいずれかに記載の薬剤、または〔１２〕に記載のベクターが導入されたイネ細胞、
〔１６〕  〔１５〕に記載のイネ細胞を含む形質転換体イネ、
〔１７〕  〔１６〕に記載の形質転換体イネの子孫またはクローンである、形質転換体イネ、
〔１８〕  〔１６〕または〔１７〕に記載の形質転換体イネを片親として用い、他方の親に非形質転換体イネあるいは〔１６〕または〔１７〕に記載の形質転換体イネを用い交配することによって作出される子孫である形質転換体イネ、
〔１９〕  〔１〕〜〔１１〕、〔１３〕のいずれかに記載の薬剤、または〔１２〕に記載のベクターをイネ細胞へ導入する工程を含む、イネもしくはその種子における米アレルゲンタンパク質の蓄積を抑制する方法、
〔２０〕  〔１〕〜〔１１〕、〔１３〕のいずれかに記載の薬剤、または〔１２〕に記載のベクターをイネ細胞へ導入させる工程を含む、米アレルゲンタンパク質の蓄積が抑制されたイネもしくはその種子の製造方法、
〔２１〕  さらに米アレルゲンタンパク質の蓄積が抑制された形質転換体イネを交配させる工程を含む、〔２０〕に記載の米アレルゲンタンパク質の蓄積が抑制されたイネもしくはその種子の製造方法、
〔２２〕  〔２０〕または〔２１〕に記載の方法によって取得される、米アレルゲンタンパク質の蓄積が抑制されたイネ、またはその種子であるアレルゲン低減化米、
〔２３〕  米アレルゲンタンパク質の発現が、〔１〕〜〔１１〕、〔１３〕のいずれかに記載の薬剤、または〔１２〕に記載のベクターにより人為的に抑制されていることを特徴とする、米アレルゲンタンパク質の蓄積が抑制されたイネ、またはその種子であるアレルゲン低減化米、
〔２４〕  〔２２〕または〔２３〕に記載のアレルゲン低減化米を有効成分として含有する、飲食品組成物および加工品、を提供するものである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、米アレルゲンタンパク質の蓄積抑制剤、米アレルゲンタンパク質の蓄積が抑制された形質転換イネおよびその種子の製造方法、該薬剤を利用して米アレルゲンタンパク質の蓄積を抑制する方法、さらにこれら方法によって得られる形質転換イネおよび種子が確立された。
【００２０】
抗原性の最も高い16kDaタンパク質および該タンパク質と相同性の高いタンパク質が通常の米と比較して特異的に低減している米の開発は、アレルギー患者にとって朗報であり、高い需要が期待できる。また、米アレルゲンタンパク質を低減化した既存製品に比べて、食味に対し影響を及ぼしにくいと予想され、米収穫後に酵素処理などの特別な処理の必要が無いので、コスト面でもはるかに優れている。勿論通常のイネと栽培に要するコストは同じであり、米そのものの付加価値は高い。さらに従来品と異なり、米に対して酵素処理などを行わないため、通常の米と全く同じ炊飯、加工米としての利用ができる。現在アトピー対策に用いられている「ゆきひかり」などの米アレルギー好適米を本発明に記載の薬剤を用いて形質転換すること、あるいは本発明の形質転換イネと交配することにより、さらなる低アレルゲン化を図ることも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明者らは、米アレルゲンタンパク質をコードする遺伝子をイネで発現させることによって、イネ種子の米アレルゲンタンパク質の蓄積が抑制されることを見出した。即ち本発明は、イネ植物に内在する遺伝子であって、イネ植物体もしくはその種子において米アレルゲンタンパク質をコードする遺伝子の発現を人為的に抑制する、米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤およびその技術により作出されるアレルゲン低減化米を提供する。
【００２２】
本発明において「米（コメ）アレルゲンタンパク質」とは、米アレルギーを引き起こす原因タンパク質を指し、本発明においては分子量14-20kDa近辺、31-40kDa近辺などに加えてその他のアレルゲンタンパク質が含まれる。
【００２３】
本明細書におけるタンパク質とは、複数のアミノ酸からなる重合体を意味し、そのアミノ酸の長さは特に制限されない。従って、本発明のタンパク質には、所謂「ポリペプチド」、および「オリゴペプチド」も含まれる。本発明のタンパク質は、天然に存在する状態から修飾されていないもの、および修飾されているものの双方を含む。修飾としては、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸の転移RNA媒介付加、ユビキチン化等が含まれる。
【００２４】
本発明は、分子量14-20kDaに含まれる米アレルゲンタンパク質をコードする１もしくは複数の遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分として含む、米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤を提供する。この「分子量14-20kDaに含まれる米アレルゲンタンパク質」をコードする遺伝子は、好ましくは配列番号：３〜７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子である。
【００２５】
上記分子量14-20kDaの米アレルゲンタンパク質には、RA5、RA14、RA16、RA17、AK107215の５種のタンパク質が含まれる。上記各タンパク質をコードするアミノ酸配列、および当該アミノ酸をコードする塩基配列について以下のように配列表に記載する（カッコ内が塩基配列に対する配列番号である）。
RA5／配列番号：３（１２）
RA14／配列番号：４（１３）
RA16／配列番号：５（１４）
RA17／配列番号：６（１５）
AK107215／配列番号：７（１６）
なおAK107215とはGenBank Data Bankにおけるアクセッション番号である。
【００２６】
またRA14タンパク質をコードするアミノ酸の配列の一部（RA14 ORF塩基配列の162-462部位）であって、上記配列番号：３〜７に記載のアミノ酸配列において相同性の高いアミノ酸配列（センス鎖）をコードする塩基配列を配列番号：１に示す。また対応するアンチセンス鎖をコードする塩基配列を配列番号：２に示す。なお本発明における米アレルゲンタンパク質は、必ずしも、配列表に具体的に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質に限定されない。
【００２７】
本発明において、米アレルゲンタンパク質は、イネ由来であることが好ましいが、イネの品種は特に制限されない。イネ以外の植物における米アレルゲンと同等なタンパク質（米アレルゲンのホモログ・オルソログ等）も本発明における「米アレルゲンタンパク質」に含まれる。例えば、米アレルゲンに相当するタンパク質を有する植物、または、米アレルゲンタンパク質が実質的に機能し得る植物であれば、本発明を実施することが可能である。
【００２８】
本発明において「遺伝子の発現が人為的に抑制」とは、米アレルゲンタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する機能を有する核酸（例えば、siRNAまたはアンチセンスRNA等）の作用により遺伝子の発現が抑制されている状態、を挙げることができる。
【００２９】
本発明における「抑制」には、米アレルゲンタンパク質をコードする遺伝子の発現が完全に抑制されている場合、顕著に抑制されている場合、および、イネ植物における米アレルゲンタンパク質をコードする遺伝子の発現量が、他の植物における遺伝子の発現量と比較して有意に低下している場合等が含まれる。
【００３０】
また本発明は以下の（ａ１）〜（ｃ１）のいずれかに記載の核酸を有効成分として含む、米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤を提供する。
（ａ１）配列番号：３〜７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子または該遺伝子と相同性の高い遺伝子の発現を、RNAi効果により阻害する作用を有する核酸
（ｂ１）配列番号：３〜７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子または該遺伝子と相同性の高い遺伝子の発現を抑制する作用を有するアンチセンス核酸
（ｃ１）配列番号：３〜７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子または該遺伝子と相同性の高い遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
【００３１】
本発明における「核酸」とはRNAまたはDNAを意味する。また、所謂PNA (peptide nucleic acid)等の化学合成核酸アナログも、本発明の核酸に含まれる。PNAは、核酸の基本骨格構造である五単糖・リン酸骨格を、グリシンを単位とするポリアミド骨格に置換したもので、核酸によく似た３次元構造を有する。
【００３２】
内在性遺伝子の発現の阻害は、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖RNAを用いたRNA干渉（RNA interferance、以下「RNAi」と略称する）によって行うことができる。本発明のRNAi効果により阻害する作用を有する核酸は、一般的にsiRNAとも言われる。RNAiは、標的遺伝子のmRNAと相同な配列からなるセンスRNAとこれと相補的な配列からなるアンチセンスRNAとからなる二本鎖RNA（以下、「dsRNA」と略称する）を細胞等に導入することにより、標的遺伝子mRNAの破壊を誘導し、標的遺伝子の発現を抑制し得る現象である。このようにRNAiは、標的遺伝子の発現を抑制し得ることから、従来の煩雑で効率の低い相同組換えによる遺伝子破壊方法に代わる簡易な遺伝子ノックアウト方法として、または、遺伝子治療への応用可能な方法として注目を集めている。
【００３３】
RNAiは当初、線虫において発見され、現在では線虫だけでなく、植物、線形動物、ショウジョウバエ、原生動物などの様々な生物において観察されている。これら生物では、実際に外来よりdsRNAを導入することにより標的遺伝子の発現が抑制されることが確認され、さらにはノックアウト個体を創生する方法としても利用されつつある。
【００３４】
本発明においてはRNAiに用いるRNAは、配列番号：３〜７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子または該遺伝子と相同性の高い遺伝子もしくは該遺伝子の部分領域と必ずしも完全に同一である必要はないが、完全な相同性を有することが好ましい。
【００３５】
本発明の上記（ａ１）の核酸の好ましい態様として、配列番号：３〜７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子または該遺伝子と相同性の高い遺伝子に対してRNAi（RNA interference；RNA干渉）効果を有する二本鎖RNA（siRNA）を挙げることができる。より具体的には、配列番号：３〜７に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列の部分配列に対するセンスRNAおよびアンチセンスRNAからなる二本鎖RNA(siRNA)を挙げることができる。
【００３６】
なお、上記RNA分子において一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構造を有するsiRNA(short hairpin RNA ; shRNA)も本発明に含まれる。即ち、分子内において二本鎖RNA構造を形成し得る一本鎖RNA分子もまた本発明に含まれる。
また、上記RNA分子において21-15ヌクレオチドからなる小RNA（small temporally regulated RNA ; stRNA）も本発明に含まれる。
【００３７】
本発明の上記「RNAi効果により抑制し得る二本鎖RNA」は、当業者においては、該二本鎖RNAの標的となる本発明の遺伝子の塩基配列を基に、適宜作製することができる。一例を示せば、配列番号：３〜７に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列をもとに、本発明の二本鎖RNAを作製することができる。即ち、配列番号：３〜７に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列をもとに、該配列の転写産物であるmRNAの任意の連続するRNA領域を選択し、この領域に対応する二本鎖RNAを作製することは、当業者においては、通常の試行の範囲内において適宜行い得ることである。また、該配列の転写産物であるmRNA配列から、より強いRNAi効果を有するsiRNA配列を選択することも、当業者においては、公知の方法によって適宜実施することが可能である。また、一方の鎖（例えば、配列番号：３〜７に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列）が判明していれば、当業者においては容易に他方の鎖（相補鎖）の塩基配列を知ることができる。siRNAは、当業者においては市販の核酸合成機を用いて適宜作製することが可能である。また、所望のRNAの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。
【００３８】
また、特定の内在性遺伝子の発現を阻害する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者によく知られている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を阻害する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。即ち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ(A)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を阻害する（平島および井上, 新生化学実験講座2 核酸IV遺伝子の複製と発現, 日本生化学会編, 東京化学同人, 1993, 319-347.）。
【００３９】
本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用により配列番号：３〜７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子または該遺伝子と相同性の高い遺伝子の発現を阻害してもよい。一つの態様としては、配列番号：３〜７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子または該遺伝子と相同性の高い遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、配列番号：３〜７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子または該遺伝子と相同性の高い遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される植物が持つ内在性の本発明の遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的遺伝子の転写産物に対して80％以上、好ましくは90％以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも15塩基以上500塩基未満、好ましくは50塩基以上400塩基未満、より好ましくは100塩基以上350塩基未満であることが好ましいが、本発明のアンチセンス核酸は、必ずしもこの長さに限定されない。
【００４０】
また、配列番号：３〜７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子または該遺伝子と相同性の高い遺伝子の発現の阻害は、リボザイム、またはリボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、RNAを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。
【００４１】
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なRNA切断リボザイムを作出できることが示されている（Kikuchi, Y. ＆ Sasaki, N., Nucl Acids Res, 1991, 19, 6751.、菊池洋, 化学と生物, 1992, 30, 112.）。このように、リボザイムを用いて配列番号：３〜７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子または該遺伝子と相同性の高い遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を阻害することができる。
【００４２】
なお、上記の各方法は、他の米アレルゲンタンパク質をコードする遺伝子の発現の阻害にも適用が可能である。
【００４３】
また本発明は、以下の（ａ２）〜（ｄ２）のいずれかに記載の核酸を有効成分として含む、米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤を提供する。
（ａ２）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAと少なくとも８０％以上の相同性を有する核酸および／またはその相補鎖からなる核酸
（ｂ２）配列番号：１に記載の塩基配列からなる核酸および／またはその相補鎖からなる核酸
（ｃ２）配列番号：１に記載の塩基配列において１または複数の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入された塩基配列からなる核酸、および／またはその相補鎖からなる核酸
（ｄ２）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、および／またはその相補鎖からなる核酸
【００４４】
本発明において「相補鎖」とは、A:T、G:Cの塩基対からなる二本鎖DNA、あるいはA:U、G:Cの塩基対からなる二本鎖RNAの一方の鎖の配列に対する他方の鎖を指す。
【００４５】
本発明の核酸には、上記以外の核酸であっても、例えば配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAと高い相同性を有し、かつ米アレルゲンタンパク質の発現を抑制する核酸が含まれる。高い相同性とは、配列番号：１に記載の塩基配列全体で少なくとも80％以上、好ましくは90％以上（例えば、95,96,97,98,99％以上）の配列の同一性を指す。塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1990, 87, 2264-2268.、Karlin, S. & Altschul, SF., Proc Natl Acad Sci USA, 90, 5873.）を用いて決定することができる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul, SF. et al., J Mol Biol, 1990, 215, 403.）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターを例えばscore＝100、wordlength＝12に設定することができる。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。
【００４６】
また、本発明における核酸としては、米アレルゲンタンパク質の発現を抑制する機能を示す限り、配列番号：１に記載の塩基配列において、１または複数の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入された塩基配列からなる核酸、および／またはその相補鎖からなる核酸であってもよい。このような核酸を調製するために当業者によく知られた方法としては、例えば、site-directed mutagenesis（Kramer, W. & Fritz, HJ., Methods Enzymol, 1987, 154, 350.）による変異の導入を挙げることができる。また、核酸における塩基の変異は、自然界において生じることもある。
【００４７】
また本発明における核酸としては、米アレルゲンタンパク質の発現を抑制する限り、配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、および／またはその相補鎖からなる核酸であってもよい。ハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば42℃、0.1×SSC、0.1％SDSの条件であり、好ましくは50℃、0.1×SSC、0.1％SDSの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば65℃、5×SSC及び0.1％SDSの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するDNAが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００４８】
また、上記核酸以外であっても、米アレルゲンタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制し得るような、上記（ａ１）〜（ｃ１）のいずれかに記載の核酸またはその一部を有する核酸も、本発明の米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤に含まれる。
【００４９】
また本発明は、上記分子量14-20kDaに含まれる１もしくは複数の米アレルゲンタンパク質だけでなく、さらに分子量31-40kDaに含まれる１もしくは複数の米アレルゲンタンパク質の蓄積を抑制する薬剤を提供する。即ち、上述の分子量14-20kDaに含まれる米アレルゲンタンパク質をコードする１もしくは複数の遺伝子の発現を抑制する核酸に加えて、さらに分子量31-40kDaに含まれる米アレルゲンタンパク質をコードする１もしくは複数の遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分として含む、米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤である。この「分子量31-40kDaに含まれる米アレルゲンタンパク質」をコードする遺伝子は、好ましくは配列番号：８〜１０のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子である。
【００５０】
上記31-40kDa分子量の米アレルゲンタンパク質には、Glb33、ch5-AK067996、Ch2-BAD28547の３種のタンパク質が含まれる。上記各タンパク質をコードするアミノ酸配列について以下のように配列表に記載する。
Glb33／配列番号：８
ch5-AK067996／配列番号：９
Ch2-BAD28547／配列番号：１０
【００５１】
また本発明は、上述の分子量14-20kDaに含まれる米アレルゲンタンパク質をコードする１もしくは複数の遺伝子の発現を抑制する核酸に加えて、さらに以下の（ａ３）〜（ｃ３）のいずれかに記載の核酸を有効成分として含む、米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤を提供する。
（ａ３）配列番号：８〜１０の記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする全ての遺伝子の発現を、RNAi効果により阻害する作用を有する核酸
（ｂ３）配列番号：８〜１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする全ての遺伝子の発現を抑制する作用を有するアンチセンス核酸
（ｃ３）配列番号：８〜１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする全ての遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
【００５２】
また本発明は、上記14-20kDaおよび／または31-40kDa分子量の米アレルゲンタンパク質だけでなく、その他の米アレルゲンタンパク質の蓄積を抑制する薬剤を提供する。即ち、上述の分子量14-20kDaに含まれる米アレルゲンタンパク質をコードする１もしくは複数の遺伝子の発現を抑制する核酸および／または分子量31-40kDaに含まれる米アレルゲンタンパク質をコードする１もしくは複数の遺伝子の発現を抑制する核酸に加えて、分子量14-20kDaおよび31-40kDa以外の米アレルゲンタンパク質をコードする１もしくは複数の遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分として含む、米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤を提供する。この「分子量14-20kDaおよび31-40kDa以外の米アレルゲンタンパク質」をコードする遺伝子は、好ましくは配列番号：１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子である。
【００５３】
上記分子量14-20kDaおよび31-40kDa以外の米アレルゲンタンパク質には、26kDa globulinが含まれる。このタンパク質をコードするアミノ酸配列について以下のように配列表に記載する。
26kDa globulin／配列番号：１１
【００５４】
また本発明は、上述の分子量14-20kDaおよび／または31-40kDaに含まれる米アレルゲンタンパク質をコードする１もしくは複数の遺伝子の発現を抑制する核酸に加えて、さらに以下の（ａ４）〜（ｃ４）のいずれかに記載の核酸を有効成分として含む、米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤を提供する。
（ａ４）配列番号：１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の発現を、RNAi効果により阻害する作用を有する核酸
（ｂ４）配列番号：１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する作用を有するアンチセンス核酸
（ｃ４）配列番号：１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
【００５５】
本発明において「米アレルゲンタンパク質蓄積抑制」とは、通常、イネにおいて元々米アレルゲンタンパク質が存在する部位の米アレルゲンタンパク質の生成や蓄積を抑制すること、またはイネにおいて米アレルゲンタンパク質が存在する部位において、米アレルゲンタンパク質の量（含有量）を低下させることを言う。
【００５６】
本発明において、米アレルゲンタンパク質の蓄積が抑制される部位は特に制限されないが、例えば種子、葉、節間、茎、えい（もみ）等を挙げることができる。好ましくは種子である。本発明において「種子」とは、イネの場合には「米（コメ）」、「玄米」等を指す。
【００５７】
さらに本発明は、上記（ａ１）〜（ｃ１）、（ａ３）〜（ｃ３）、（ａ４）〜（ｃ４）のいずれかに記載の核酸を発現可能に保持するベクターも提供する。本発明のベクターとしては、形質転換されたイネを作製するために、イネの細胞内で上記核酸を発現させるためのベクターが含まれる。植物細胞の形質転換に用いられるベクターとしては、該細胞内で挿入された核酸を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、siRNAをより簡便に利用することを目的としたsiRMA発現ベクターが開発されている。siRNAを発現させるプロモーターとしては、Pol III系のH1、U6、tRNAが一般的に用いられている。H1およびU6に関しては、ヘアピン構造部分の長さが21塩基であるsiRNAが最も高い遺伝子発現抑制を示すことが知られているが、tRNAに関してはヘアピン構造部分の長さが29塩基付近である場合に高い遺伝子発現抑制を示すことが示されている。その他にも、下記実施例で利用したRNAiベクター（pANDA（Daisuke MIKI and Ko SHIMAMOTO, (2004) Simple RNAi vectors for stable and transienct suppression of gene function in Rice. Plant and Cell Physiol. 45, 490-495）を用いることができる。しかし本発明においては上記RNAi（siRNA発現）ベクターに限定されず、市販のRNAiベクターを用いることが可能である。例えば、pB7GWIWG2(I)（Karimi,M., De Meyer, B. and Hilson, P. Modular cloning and expression of tagged fluorescent protein in plant cells. Trends Plant Sci. 2005 March; 10(3): 103-105.）、pB7GWIWG2(II)、pH7GWIWG2(I)、pH7GWIWG2(II)、pK7GWIWG2(I)、pK7GWIWG2(II)、pK7GWIWG2(I)、pK7GWIWG2(II)、pK7GWIWG2D(II)なども利用することが可能である。
【００５８】
さらに植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター）を有するベクターや外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることも可能である。例えば本発明の上記（ａ１）〜（ｃ１）、（ａ３）〜（ｃ３）、（ａ４）〜（ｃ４）のいずれかに記載の核酸を発現し得るベクターは、該核酸の一方の鎖をコードするDNA、および該核酸の他方の鎖をコードするDNAがそれぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有してもよい。恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター、イネのアクチンプロモーター、トウモロコシのユビキチンプロモーター等が挙げられる。
【００５９】
また、誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば細菌・ウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの外因によって発現することが知られているプロモーターなどが挙げられる。このようなプロモーターとしては、例えば、細菌・ウイルスの感染や侵入によって発現するイネキチナーゼ遺伝子のプロモーターやタバコのPRタンパク質遺伝子のプロモーター、低温によって誘導されるイネの「lip19」遺伝子のプロモーター、高温によって誘導されるイネの「hsp80」遺伝子と「hsp72」遺伝子のプロモーター、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナの「rab16」遺伝子のプロモーター、紫外線の照射によって誘導されるパセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター、嫌気的条件で誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。また、イネキチナーゼ遺伝子のプロモーターとタバコのPRタンパク質遺伝子のプロモーターはサリチル酸などの特定の化合物によって、「rab16」は植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。
【００６０】
本発明のベクターは、当業者においては一般的な遺伝子工学技術により適宜作製することができる。より具体的には、本発明の核酸を公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。
【００６１】
本発明のベクターは、宿主細胞内において本発明の上記（ａ１）〜（ｃ１）、（ａ３）〜（ｃ３）、または（ａ４）〜（ｃ４）に記載の核酸（以下、単に「本発明の核酸」と記載する場合がある）を保持したり、米アレルゲンタンパク質の発現を抑制させるためにも有用である。
【００６２】
本発明の上記薬剤もしくは本発明の上記核酸を発現保持可能に保持するベクターは、例えば、米アレルゲンタンパク質の蓄積が抑制された植物体もしくは種子の作出等に利用することが可能である。本発明の上記薬剤もしくは本発明の核酸を発現保持可能に保持するベクターを、所望のイネ植物体もしくはその種子において発現させることにより、米アレルゲンタンパク質の蓄積が抑制された植物体もしくはその種子を作製することが可能である。従って本発明は、本発明の上記薬剤、または本発明の核酸を発現保持可能に保持するベクターを有効成分として含む、米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤を提供する。
【００６３】
本発明における「米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤」とは、イネ植物体もしくはその種子の全部またはその一部の米アレルゲンタンパク質の蓄積を抑制する作用を有する薬剤を言い、通常、イネ植物体もしくはその種子の米アレルゲンタンパク質の蓄積を抑制させることを用途とする、本発明の上記薬剤、または本発明の核酸を発現保持可能に保持するベクターを有効成分とする物質、または組成物（混合物）を指す。
【００６４】
本発明の薬剤においては、有効成分である上記薬剤、または本発明の核酸を発現保持可能に保持するベクター以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
【００６５】
本発明の上記核酸は、通常、適当なベクターへ担持（挿入）され、宿主細胞へ導入される。即ち本発明は、本発明の上記薬剤または上記ベクターが導入された宿主細胞を提供する。該ベクターとしては、挿入した核酸を安定に保持するものであれば特に制限されない。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、植物個体内でポリペプチドを発現するベクターであれば特に制限されないが、例えば、試験管内発現であればpBESTベクター（プロメガ社製）、大腸菌であればpETベクター（Invitrogen社製）、培養細胞であればpME18S-FL3ベクター（GenBank Accession No. AB009864）、生物個体であればpME18Sベクター（Mol Cell Biol. 8:466-472(1988)）などを例示することができる。ベクターへの本発明の核酸の挿入は、常法により、例えば、Gatewayテクノロジー法（Invitrogen社）および制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応法などにより行うことができるがこれらに限定されない。
【００６６】
上記宿主細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々の宿主細胞が用いられる。例えば、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、昆虫細胞（例：ドロソフィラS2、スポドプテラSF9）、動物細胞（例：CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes メラノーマ細胞）および植物細胞を例示することができる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9）、リポフェクション法（GIBCO-BRL社製）、マイクロインジェクション法などの公知の方法で行うことが可能である。
また、植物の生体内で本発明の核酸を発現させる方法としては、本発明の核酸を適当なベクターに組み込み、例えば、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。ベクターへの本発明の核酸の挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である（Molecular Cloning, 5.61-5.63）。植物体内への投与は、ex vivo法であっても、in vivo法であってもよい。また、植物体内へ本発明の核酸を導入する方法としては、好ましくは、アグロバクテリウムを介して遺伝子を導入する方法が挙げられる。
また、本発明の核酸が導入された形質転換植物体イネを作成することも可能である。
また本発明は、上記した米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤、または本発明のベクターが導入された形質転換イネ細胞、さらに当該イネ細胞を含む形質転換体イネを提供する。
【００６７】
本発明の米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤、または本発明のベクターが導入されるイネ細胞には、形質転換植物体作製のためのイネ細胞が含まれる。イネの他にも、例えば同じイネ科植物である、トウモロコシ、コムギ、オオムギなどの細胞を用いても構わない。本発明のイネ細胞には、培養細胞の他、イネ植物体中の細胞も含まれる。また、イネ細胞には、種々の形態のイネ細胞、例えば、葉の切片、カルス、懸濁培養細胞、プロトプラスト、苗条原基、多芽体、毛状根等も含まれる。イネ細胞へのベクターの導入は、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。形質転換イネ細胞からのイネ植物体の再生は、当業者に公知の方法で行うことが可能である。例えば、イネにおいては、形質転換イネ植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し植物体を再生させる方法、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し植物体を再生させる方法、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法、およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００６８】
本発明の米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤、または本発明のベクターの導入により形質転換したイネ細胞を効率的に選択するために、上記ベクターは、適当な選抜マーカー遺伝子を含む、もしくは選抜マーカー遺伝子を含むプラスミドベクターと共に植物細胞へ導入することが好ましい。この目的に使用される選抜マーカー遺伝子は、例えば抗生物質ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシンまたはゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、および除草剤ホスフィノスリシンに耐性であるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６９】
ベクターを導入したイネ細胞は、導入された選抜マーカー遺伝子の種類に従って適当な選抜用薬剤を含む公知の選抜用培地に置床し培養する。これにより形質転換されたイネ培養細胞を得ることができる。
【００７０】
形質転換されたイネ細胞は、再分化させることによりイネ植物体を再生させることが可能である。再分化の方法は植物細胞の種類により異なるが、例えば、イネであればFujimuraら（Plant Tissue Culture Lett. 2:74 (1995)）の方法が挙げられ、トウモロコシであればShillitoら（Bio/Technology 7:581 (1989)）の方法やGorden-Kammら（Plant Cell 2:603(1990)）が挙げられる。
【００７１】
本発明の形質転換体イネは、米アレルゲンタンパク質をコードする遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする、遺伝子改変植物である。該遺伝子改変植物は、例えば、「ノックアウト植物」、「ノックダウン植物」あるいは「トランスジェニック植物」と呼ばれる場合もある。本発明の米アレルゲンタンパク質の蓄積が抑制された形質転換植物体イネは、例えば、米アレルゲンタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する機能を有する核酸をイネ植物へ導入することによって、作出することが可能である。即ち、本発明の米アレルゲンタンパク質の蓄積が抑制された形質転換植物体イネは、本発明の上記核酸を有効成分とする薬剤、あるいは該核酸を発現し得る本発明の上記ベクターを、所望のイネ植物へ導入し、これにより得られた形質転換イネ細胞を再生させることによって作製することができる。
【００７２】
本発明の上記核酸は、イネもしくはその種子の米アレルゲンタンパク質の蓄積を抑制する機能を有するが、本発明の薬剤あるいは本発明の核酸を発現保持可能に保持するベクターを任意のイネ品種に導入し発現させることにより、イネ植物体もしくはその種子における米アレルゲンタンパク質の蓄積を抑制することが可能である。この形質転換に要する期間は、従来のような交雑による遺伝子移入に比較して極めて短期間であり、また、他の形質の変化を伴わない点で有利である。
【００７３】
一旦、ゲノム内に本発明の核酸が導入された形質転換イネ植物体が得られれば、該イネ植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該イネ植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明の核酸が導入されたイネ細胞、該イネ細胞を含むイネ植物体、該イネ植物体の子孫およびクローン、並びに該イネ植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。即ち本発明には、本発明の形質転換体イネを片親として用い、他方の親に非形質転換体イネあるいは本発明の形質転換体イネを用い交配することによって作出される子孫である形質転換体イネも含まれる。
【００７４】
このようにして作出されたイネ植物体もしくはその種子は、米アレルゲンタンパク質の蓄積が抑制されることが期待される。
【００７５】
また本発明は、米アレルゲンタンパク質の発現を抑制する方法に関する。即ち本発明の米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤、または本発明のベクターをイネ細胞に導入する工程を含む、イネもしくはその種子における米アレルゲンタンパク質の蓄積を抑制する方法である。
【００７６】
さらに、上述のように、本発明の米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤、または本発明のベクターをイネ細胞へ導入し、該イネ細胞からイネ植物体を再生させる工程を含む、米アレルゲンタンパク質の蓄積が抑制されたイネもしくはその種子の製造方法もまた本発明に含まれる。さらに、米アレルゲンタンパク質の蓄積が抑制された形質転換体イネを交配させる工程を含む、米アレルゲンタンパク質の蓄積が抑制されたイネもしくはその種子の製造方法も本発明に含まれる。即ち本発明の米アレルゲンタンパク質の蓄積が抑制されたイネ植物体もしくはその種子は、育種法によっても作出することが可能である。
【００７７】
上記育種法としては、例えば、本発明の米アレルゲンタンパク質の蓄積が抑制された品種と交雑させることを特徴とする一般的な育種法（交雑育種法等）を挙げることができる。該方法によって、米アレルゲンタンパク質の蓄積が抑制されたイネ植物体もしくはその種子を作出することができる。
【００７８】
育種法によって本発明のイネ植物体もしくは種子を作製する際には、公知の種々の文献を参照して適宜実施することができる。（細胞工学別冊・植物細胞工学シリーズ15「モデル植物の実験プロトコール」秀潤社、2001年、加藤鎌司著「2.1 イネ・コムギの交配」p.6-9；  高牟礼逸朗、佐野芳雄著「2. 交配法」p.46-48）
【００７９】
また本発明は、本発明の方法によって取得される米アレルゲンタンパク質の蓄積が抑制されたイネ、またはその種子であるアレルゲン低減化米を提供する。本発明には、米アレルゲンタンパク質の発現が、上記米アレルゲンタンパク質蓄積抑制剤、または本発明のベクターによる人為的に抑制されていることを特徴とする米アレルゲンタンパク質の蓄積が抑制されたイネ、またはその種子であるアレルゲン低減化米が含まれる。
【００８０】
また本発明は、本発明の上記アレルゲン低減化米を有効成分として含有する飲食品組成物および加工品を提供する。本発明のアレルゲン低減化米は、通常の米と同様の用途に使用することができる。例えば米そのものを、炊く、煮る、炒める、蒸す、あるいは揚げる等の処理をすることにより食用とすることができる。また、米以外の飲食品組成物と組み合わせて使用することもできる。例えば、炊き込みご飯、雑炊、炒飯等に利用しても構わない。また、米を粉砕することにより、米粉、白玉粉、うどん、そば、スパゲティ、マカロニ、ビーフン、パン、又はせんべい、あられ、クッキー等の米菓子等の加工原料としてもよい。また米油等の抽出原料として用いても構わない。さらに、醸造または発酵等の原料として利用してもよい。米ぬかも飲食品を漬けるための用途に利用されても構わない。勿論本発明のアレルゲン低減化米は、人間だけでなく、動物用試料（例えばペットフード）として用いても構わない。また上述したアレルゲン低減化米を有効成分として含有する飲食品組成物および加工品は、容器包装した形態であってもよい。例えば、プラスチック成型容器などの容器に封入された形態であったり、レトルトパウチなどの容器に封入され密封後に殺菌された飲食品も本発明に含まれる。つまり、本発明のアレルゲン低減化米の用途および用法は特に制限されない。
【実施例】
【００８１】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕
14-20 kDaコメアレルゲンタンパク質遺伝子は遺伝子族を形成していることが考えられているため、データベース検索により14-20 kDaコメアレルゲンタンパク質遺伝子を同定した（図２）。
図２に記載される、四角で囲った領域に含まれるRA5、RA16、RA17、およびAK107214の各塩基配列に対して、RA14 ORF塩基配列の162-462部位（以下RA14-RNAiと相同性解析（同一性）を行った結果を以下に示す。
【００８２】
RA14-RNAi (301 bp) vs RA5 (295 bp)         88.67 %
RA14-RNAi (301 bp) vs RA16 (289 bp)        84.33 %
RA14-RNAi (301 bp) vs RA17 (295 bp)        87.67 %
RA14-RNAi (301 bp) vs AK107215 (286 bp)    79.73 %
【００８３】
次に、この遺伝子族間で保存された領域を利用してRNA干渉法植物形質転換用ベクターを構築し（図４）、このベクターを導入した形質転換イネを作出した。
ウエスタン分析により、作出した形質転換イネの種子におけるコメアレルゲンタンパク質の蓄積を解析した結果、コメの主要アレルゲンである14-20 kDaアレルゲンタンパク質の蓄積を顕著に抑制することに成功した（図５）。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１は、米種子タンパク質に対してアレルギーを有する患者の血清についてRASTを実施した結果を示す。米の主要なアレルゲンタンパク質は14-20 kDaタンパク質である（Urisu, A. et al., (1991) Int.Arch.Allergy Appl.Immunol., 96, 244-252.）
【図２】図２は、14-20 kDa米アレルゲンタンパク質（RA14、RA5、RA16、RA17、AK107215）をコードする塩基配列をアライメントした結果を示す図である。四角で示した領域はRNA干渉法植物形質転換用ベクターに用いた領域を示す。
【図３】図３は、33kDa米アレルゲンタンパク質（33-kDa、ch5-AK067996、Ch2-BAD28547）のアミノ酸配列をアライメントした結果を示す図である。
【図４】図４は、RNA干渉法に用いた形質転換用ベクター（上からpANDA-RA14、As-RA14 1301）を示す。
【図５】図５は、形質転換イネにおける14-20 kDaアレルゲンタンパク質の検出結果を示す写真である。Ａはイネ種子タンパク質のCBB染色、Ｂは抗-RA14（anti-RA14）タンパク質抗体を用いたウエスタンブロッティング分析の結果である。各レーンは以下の通りである。１：日本晴、２：EM37、３：日本晴pANDA1、４：日本晴pANDA9、５：日本晴pANDA10、６：EM37 pANDA4、７：EM37 pANDA5、８：EM37 pANDA12-2。EM37は米貯蔵タンパク質変異体である。レーン３、４、５および８ではRNAiによる顕著な抑制効果が認められる。レーン６および７ではRNAiによる抑制効果は認められなかった。
【図１】
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【図４】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【配列表】
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