(57)【要約】【課題】間葉系幹細胞を培養してin vitroで分化誘導を行うに際し、分化の程度を非破壊的に簡便に計測することができ、更に、試料調整における汚染の懸念も解消する。【解決手段】間葉系幹細胞を培養してin vitroで分化誘導を行った後、培地に放出されるアジポネクチンの量を測定することにより、分化の程度を非破壊的に計測する。三次元培養基材上で間葉系幹細胞を培養したときに、脂肪への分化の程度を培地に放出されるアジポネクチンの量を測定することにより、非破壊的に計測する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞を培養してin vitroで分化誘導を行った後、培地に放出されるアジポネクチンの量を測定することにより、分化の程度を非破壊的に計測する方法。
【請求項２】
三次元培養基材上で間葉系幹細胞を培養したときに、脂肪への分化の程度を培地に放出されるアジポネクチンの量を測定することにより、非破壊的に計測する方法。
【請求項３】
培地中のアジポネクチンの量を経時的に自動計測することを特徴とする請求項１、又は、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
成人の組織に存在しており、種々の組織の再生を可能にする多分化能をもつ間葉系幹細胞を再生医療の分野において組織再生に用いることが期待されている。
本発明は、かかる細胞の分化を非破壊的に且つ、簡単に測定できる新規な方法を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞の培養方法、間葉系幹細胞及び培養組織については、例えば、本出願人による特開２００５−３４０３０号（特許文献１）、或いは、特開２００５−１１７９３９号（特許文献２）、脂肪由来細胞群からの間葉系幹細胞の選択的増殖方法として、特開２００４−１２９５４９号（特許文献３）等が提案されている。
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−３４０３０号公報
【特許文献２】特開２００５−１１７９３９号公報
【特許文献３】特開２００４−１２９５４９号公報
【０００４】
これを臨床に用いるためには生体より組織を採取して、その中から間葉系幹細胞を分離した後に一定期間in vitroで培養して細胞を増やすことが必要になる。
当該間葉系幹細胞は多分化能を有するために目的とする組織を構築するためにはin vitroで分化誘導を行っておく必要があり、その際、目的とする組織細胞に分化しているかを確認する必要がある。
また、生体に移植して組織を再生させるためには、三次元基材上に細胞を播種した後にin vitroで三次元培養することが必要になる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来、再構築した培養組織の一部を用いて組織切片を作成して免疫染色などを行うなど、培養した組織の一部を破壊して検査をしなければ、目的とする組織が構築されているか判断することができなかった。
また、組織切片を作成するための試料を採取する際に、培養した組織を汚染する可能性があり、貴重な試料を無駄にせざるを得ない場合もあるため、実用化のためには大きな課題であった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、かかる点、三次元培養をした細胞の分化を非破壊的に計測する新規な方法を提供するもので、目的とする組織の細胞が細胞外に放出する何らかの組織特異的な因子を細胞外で検出することができれば、培養した試料を破壊することなく分化の程度を測定することが可能になり、また、培養中の汚染の危険性も低くすることができるであろうとの想定のもとに成されてもので、具体的には、以下の方法によることを特徴とする。
項１.  間葉系幹細胞を培養してin vitroで分化誘導を行った後、培地に放出されるアジポネクチンの量を測定すること。
項２．三次元培養基材上で間葉系幹細胞を培養したときに、脂肪への分化の程度を培地に放出されるアジポネクチンの量を測定すること。
項３．培地中のアジポネクチンの量を経時的に自動計測すること。
【０００７】
本発明は、目的とする組織細胞が特異的に産生する物質、例えばタンパク質や多糖類を指標として検出し、その量的変化を捉えることによって分化の程度を評価することが可能であれば、免疫染色法等のように組織を固定化して切片を作製し組織切片から目標とする物質を検出する破壊的方法に比べ従来の欠点が解消できるであろうこと、また、培養環境の変化、例えば培地中の血清濃度や培養基材の違いによっても間葉系幹細胞からの分化に影響が現れるが、このような培養環境の変化を検出することが可能になれば、in vitroで評価する技術となるであろうとの仮設の中で、脂肪細胞がアジポネクチンというタンパク質を特異的に産生し、細胞外に放出するとの知見を得、細胞から培地中に放出されるアジポネクチンの量を定量することにより、間葉系幹細胞の脂肪への分化の検証が可能であるとの実証を得て成されたものである。
【０００８】
即ち、本発明は、増殖培地で培養を行った場合にはアジポネクチンの産生は観察されなかったが、脂肪分化培地で培養を行うことにより経時的にアジポネクチンの量は増加することが確認され、また、培地中の血清濃度を低くして培養することにより、細胞に負荷を与えた状態での観察を行った結果、培養環境が変化してもアジポネクチンの量が脂肪滴の量と相関することが明らかになったことにより達成されたもので、アジポネクチンの量が脂肪細胞の量を示しており、脂肪分化の程度を評価するのに十分な指標となる。
【０００９】
間葉系幹細胞を培養してin vitroで脂肪に分化誘導を行う方法としては、市販の分化用培地を用いる他に、増殖用の培地にサプリメントとして（1μM dexamethasone, 0.5mM 3-isobutyl-1- methylxanthine, 200μM indomethacin, 10μg/mL insulin）を添加したものが例示でき、分化誘導後の培地に放出されたアジポネクチンの量を計測する。
一方、間葉系幹細胞を三次元培養する方法としては、コラーゲンスポンジ、P(LA/CL)スポンジ、キチン不織布、アルギン酸不織布、PGA不織布などの基材に細胞を播種し、in vitroで三次元培養を行う方法が例示でき、培養初期には細胞増殖用培地で培養を行い、一定期間後に脂肪分化培地で培養を行う。この過程において、定期的に培地を回収して培地に含まれるアジポネクチンの量を測定する。
なお、培地中に放出されるアジポネクチンは、例えば、抗原抗体反応を利用したELISA法(Enzyme-linked immunosorbent assay:「酵素免疫定量法」)により定量することができる。
また、アジポネクチンの量を経時的に自動計測する方法としては、酵素免疫定量法を応用した自動化装置が例示できる
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、間葉系幹細胞の分化誘導の程度を破壊や汚染をすることなく計測でき、また、培養環境によってアジポネクチンの産生量に差が観察されるため、培養条件や培養基材の細胞に対する影響も評価できる。
更に、培養環境の変化、例えば培地中の血清濃度や培養基材の違いによっても間葉系幹細胞からの分化に影響が現れるが、これによって、培養環境in vitroでの条件の評価もできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に本発明につき、実施例をあげて説明する。
【実施例１】
【００１２】
ヒト間葉系幹細胞（hMSC）を増殖用培地（α-MEM＋15%FCS）に分散させ、コラーゲンスポンジ（12mmφ）に播種し（初期播種密度；5.25×105cells/培地１mL）37℃・5%炭酸ガスインキュベータ内で６時間培養した。その後、脂肪分化培地（FCS15%；2.0mL/well）に交換し、5%炭酸ガスインキュベータ内37℃で培養した（６〜20日間；２，３日に１回培地交換）。
交換時に回収した培地中のアジポネクチンの定量をAssayMax Human Adiponectin (Acrp30) ELISA Kit（Assaypro）を用いて行った。なお、コントロールとしては新鮮培地を測定した値を用いた。細胞中の脂質の量を定量するために、培養後の細胞/コラーゲンスポンジをPBSで洗浄（２回）し、10%中性ホルマリンで固定（４℃、１hr）した。その後、60％イソプロパノール水溶液で洗浄してオイルレッドＯ染色（15min）を行った。水で洗浄（３回）した後にイソプロパノールで赤色色素を抽出（15min）吸光度の（520nm）測定を行った。その結果を図１、図２に示す。
かかる実施例によれば、図１に示すように、分化用培地で培養すると培地中のアジポネクチン量が増加するが、増殖用培地で培養するとアジポネクチンは産生されないことが明らかになった。
また、図２に示すように、細胞中の脂質の量をオイルレッドＯの量で測定したところ、分化培地で培養したものは脂質の量が増加しており、図１に示した培地中のアジポネクチンの量と関連があることが明らかになった。
【実施例２】
【００１３】
ヒト間葉系幹細胞（hMSC）を増殖用培地（α-MEM＋15%FCS）に分散させ、コラーゲンスポンジ（12mmφ）に播種し（初期播種密度；5.25×105cells/培地１mL）37℃・5%炭酸ガスインキュベータ内で６時間培養した。その後、脂肪分化培地（2.0mL/well）に交換し、5%炭酸ガスインキュベータ内37℃で培養した（６〜20日間；２，３日に１回培地交換）。脂肪分化培地に添加するFCS（ウシ血清）の量を1,5,10,15%として培養を行った。
交換時に回収した培地中のアジポネクチンの定量をAssayMax Human Adiponectin (Acrp30) ELISA Kit（Assaypro）を用いて行った。なお、コントロールとしては新鮮培地を測定した値を用いた。細胞中の脂質の量を定量するために、培養後の細胞/コラーゲンスポンジをPBSで洗浄（２回）し、10%中性ホルマリンで固定（４℃、１hr）した。その後、60％イソプロパノール水溶液で洗浄してオイルレッドＯ染色（15min）を行った。水で洗浄（３回）した後にイソプロパノールで赤色色素を抽出（15min）吸光度の（520nm）測定を行った。その結果を図３、図４に示す。
図３によれば、FCSの量が増加するほどアジポネクチンの量は多くなった。
図４によれば、細胞中に含まれる中性脂肪の量もFCSの量が増加するにつれて多くなる。
なお、図５に培地中のアジポネクチンの量と細胞中の脂質の量の相関を示した。両者には相関が認められ、培地中に放出されるアジポネクチンの量を測定することにより、間葉系幹細胞から脂肪に分化した割合を求めることが可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００１４】
間葉系幹細胞を培養してin vitroで分化誘導を行うに際し、分化の程度を非破壊的に簡便に計測することができ、更に、試料調整における汚染の懸念も解消されるため、当該用途に好適に用いることができる。
アジポネクチン以外に分化した細胞が培地中に放出するサイトカインの種類を選択することにより、間葉系幹細胞が脂肪の他、軟骨や骨、心筋といった細胞に分化しているかを非破壊的に評価することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】脂肪分化培養させたｈＭＳＣからの培地中へのアジポネクチン産生量の経時変化を表した図。
【図２】脂肪分化培養させたｈＭＳＣ中の中性脂肪量（オイルレッドの染色量）の経時変化を表した図。
【図３】脂肪分化培養させたｈＭＳＣからの培地中へのアジポネクチン産生量の経時変化を脂肪分化培地に添加するＦＣＳの量を変えて行った結果を表した図。
【図４】脂肪分化培養させたｈＭＳＣ中の中性脂肪量（オイルレッドの染色量）の経時変化を脂肪分化培地に添加するＦＣＳの量を変えて行った結果を表した図。
【図５】脂肪分化培養させたｈＭＳＣ；細胞内中性脂肪量と培地中アジポネクチン産生量の比較を表した図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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