(57)【要約】      （修正有）【課題】データファイル含む各事象が評価した各パラメータに関係させた情報を有し、該情報が流量血球計算器で測定され又はその後の推定値から得る新たな流量血球計算データファイルを生成する方法を提供。【解決手段】新たな該ファイル生成の方法は、１）同一試料から異なるアリコートで測定した事象の情報を有する別個の該ファイルであり、共通して、１以上のパラメータに関するデータを保持し、各情報を保持する当初データファイルを溶解する段階と、２）各変数が該計算器で測定せず溶解した該ファイル内に含まれる各事象に対してその当初該ファイルの異なる変数値の大きさと相応する不確実性の測定値とを推定する段階と、３）溶解した各当初該ファイルの事象に対して、該計算器の測定値と、当初ファイルの各事象のグループ内で測定されなかったパラメータに対する推定値との双方を保持する新たなファイルをマルチディメンションに再構成する段階を備える。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
潜在的に無限の数のディメンションを有する新たな流量血球計算（フローサイトメトリー）データファイル中に含有されている事象が評価した全セットのパラメータの各々に関係させた情報を有し、該情報が流量血球計算にて直接測定されたデータと、流量血球計算の測定が行われた後に推定されたデータとから成る新たな流量血球計算データファイルを生成する方法において、
ａ）同一のサンプルの異なるアリコートにて測定された事象に関する情報を含有する２つ又はそれ以上の別個の流量血球計算データファイルであって、１つ又はそれ以上のパラメータに関する共通のデータと、１つ又はそれ以上の異なるパラメータに関する共通の情報とを含有している当初のデータファイルを溶解し、
ｂ）それらの変数が流量血球計算器にて直接測定されなかった溶解したデータファイル内に含有された個々の事象の各々に対し、当初のデータファイルの１つ又はそれ以上の間にて異なるこれらのパラメータに対する変数の値の大きさと相応する不確実性の測定値とを推定し、
ｃ）個別の当初のデータファイルの事象の各々に対し流量血球計算器（フローサイトメータ）にて測定された実際のデータと、当初のデータファイルの１つ又はそれ以上からの事象のグループ内で測定されなかったパラメータに対して推定されたデータとの双方を含有する新たなデータファイルをマルチディメンションに再構成することから成る新たな流量血球計算データファイルを生成する方法。
【請求項２】
当初の流量血球計算データファイルを溶解する前に、１つのサンプルの２つ又はそれ以上のアリコートを単クロー抗体のパネルにて別個に染色する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サンプルが正常な細胞、新生物細胞、又は正常な細胞と新生物細胞との双方の混合体を含有する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
サンプルが末梢血液である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
サンプルが骨髄である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
サンプルが髄液である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
サンプルがリンパ節である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
サンプルが腹水である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
サンプルが胸水である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
サンプルが滑液である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
サンプルが固形組織から形成された単細胞懸濁液である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
試薬のパネルが蛍光色素に対し直接共役結合させた単クローン抗体の２つ又はそれ以上の組み合わせにより形成される請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
別個のサンプルアリコートを染色するために使用される蛍光色素−共役結合した単クローン抗体の異なる組み合わせがサンプルを染色するために使用した全ての単クローン抗体試薬の組み合わせの１つ又はその一部分の何れかにてのみ使用される全ての組み合わせ及び単クローン抗体試薬の点において同一である単クローン抗体試薬から成る請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
単クローン抗体試薬の組み合わせの各々が単クローン抗体に加えて、核酸染料を測定するため特定の蛍光色素と、ミトコンドリアと、その他の細胞器官及び細胞機能部とから成るその他のプローブを含有する請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
各組み合わせにおける単クローン抗体の各々が異なる蛍光色素に対して共役結合され、単クローナル抗体の組み合わせの各々が共通して、１つ又はそれ以上の蛍光色素−共役結合した単クローン抗体試薬を有する請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
多数の単クローン抗体の組み合わせの各々における蛍光放出の数が２つ又はそれ以上の異なる蛍光色素を備え、各蛍光色素が異なる単クローン抗体にリンク結合され、異なる単クローン抗体の蛍光放出がその組み合わせ中のその他の蛍光色素−共役結合した単クローン抗体試薬から識別可能である請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
適合可能な蛍光色素の組み合わせがフルオレセインイソチオシアン酸塩（ＦＩＴＣ）と、フィコエリトリン（ＰＥ）と、ペリジン（ｐｅｒｉｄｉｎ）クロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）と、アロフィコシアニンと、ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８と、ａｌｅｘａ  ６４７と、ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６１０と、ａｌｅｘａ  ７１０と、ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４０５と、シアニン５（Ｃｙ５）と、シアニン５．５（Ｃｙ５．５）と、パシフィックブルー（ｐａｃｉｆｉｃ  ｂｌｕｅ（ＰＢ））と、カスケードイエロー（ｃａｓｃａｄｅ  ｙｅｌｌｏｗ）と、カスケードブルー（ｃａｓｃａｄｅ  ｂｌｕｅ）と、ＰＥによりＡＰＣ又はＰｅｒＣＰ（例えば、ＰＥ／Ｃｙ５、ＰＥ／Ｃｙ５．５、ＰＥ／Ｃｙ７、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５、ＡＰＣ／Ｃｙ７）と結合された共役結合体と、量子ドット又は他の適合可能な蛍光色素又は蛍光色素タンデムと任意の追加のものから選ばれる請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
１つのデータファイルが流量血球計算器にて測定されたサンプルアリコートの各々に対して保存される請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
流量血球計算器にて測定された２つ又はそれ以上のサンプルアリコートの各々に対するデータを含有する１つのデータファイルが保存される請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
サンプルアリコートの各々に対して、同一数の事象が測定される請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
サンプルアリコートの各々に対して、異なる数の事象が測定される請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
各対のサンプルアリコートに共通するこれらのパラメータの全てがその情報が溶解したデータファイル内に含有されている測定されたその他の全てのサンプルアリコートにも共通する請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
各対のサンプルアリコートに共通するこれらのパラメータの一部のみがその情報が溶解したデータファイルに含有されている測定されたその他の全てのサンプルアリコートにも共通する請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
最初に保存されたデータファイルと溶解したデータファイルの双方がデータのマトリックスから成り、該データのマトリックスにおいて、１つの細胞の光散乱特性及び蛍光放出に関して測定された異なるパラメータの各々が異なるコラムに配置され、測定された細胞事象の各々のデータが異なるラインに配置されている請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記データファイルの各々に含有されている当初のデータファイル及び事象が流量血球計算器にて測定された順序に直接関連している順序で貼り付けられる請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記データファイルの各々に含有されている当初のデータファイル及び事象が流量血球計算器にて測定された順序と逆に関連させた順序で貼り付けられる請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記データファイルの各々に含有されている当初のデータファイル及び事象が流量血球計算器にて測定された順序に関連していない順序で貼り付けられる請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
溶解したデータファイルのコラム内のパラメータの順序が流量血球計算器にて測定された順序に直接関連している請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
溶解したデータファイルのコラム内のパラメータの順序はが流量血球計算器にて測定された順序に逆に関連している請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
溶解したデータファイルのコラム内のパラメータの順序が流量血球計算器にて測定された順序に関連していない請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
新たな溶解したデータファイル内に含まれた個別の細胞事象の各々に割り当てられる値を推定するパラメータの総数が流量血球計算器にて測定された２つ又はそれ以上のサンプルアリコート間で相違するパラメータの総数に等しく又はそれ以下である請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
溶解したデータファイル中の事象グループに対し測定されなかったパラメータの値及び相応する不確実性の測定値を計算するため、類似性に基づいた統計学的推定手法が使用される請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
溶解したデータファイル中の事象グループに対して測定されなかったパラメータに対する値及び相応する不確実性の測定値を計算するため、２つ又はそれ以上のファイルに共通する全てのパラメータが使用される請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
溶解したデータファイル中の事象グループに対して測定されなかったパラメータに対する値及び相応する不確実性の測定値を計算するため、２つ又はそれ以上のファイルに共通する全てのパラメータの一部のみが使用される請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
溶解したデータファイル中の事象グループに対して測定されなかったパラメータに対する値及び相応する不確実性の測定値を計算するため、溶解したデータファイル中の全ての事象が使用される請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
溶解したデータファイル中の事象グループに対して測定されなかったパラメータに対する値及び相応する不確実性の測定値を計算するため、溶解したデータファイル中の全ての事象の一部のみが使用される請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
溶解したデータファイル中の事象グループに対して測定されなかったパラメータに対する値及び相応する不確実性の測定値の計算が単一の事象に対して行なわれる請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
溶解したデータファイル中の事象グループに対して測定されなかったパラメータに対する値及び相応する不確実性の測定値の計算が２つ又はそれ以上の事象グループに対して行なわれる請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
１つ又はそれ以上のサンプルアリコート内の測定されたパラメータの１つ又はそれ以上が推定可能であり、そして推定手順の内部品質管理として使用され得る請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
個別の当初のデータファイルの事象の各々に対して流量血球計算器にて測定された実際のデータと、当初のデータファイルの１つ又はそれ以上から事象のグループにて測定されなかったパラメータに対して推定されたデータとの双方を含有する新たなデータファイルが従来の流量血球計算ソフトウェアプログラムを使用して解析される請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、流量血球計算（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）の分野に関するもので、特に、潜在的に無限の数のディメンションを有する新たな流量血球計算データファイル（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｄａｔａ  ｆｉｌｅｓ）を生成する方法に関するものであって、これらの新たなデータファイル中に含まれている事象の各々は直接測定され又は推定された情報であって、評価した個々のパラメータの全てに関係させた情報を有する。これらの新たな流量血球計算データファイルは、１）同一のサンプルから異なるアリコートにて測定された事象に関する情報を含有する別個の流量血球計算データファイルの１つのグループであって、これらの当初のデータファイルが共通して１つ又はそれ以上のパラメータに関する情報と同時に、１つ又はそれ以上の異なるパラメータに関する情報を含有する上記データファイルの１つのグループを溶解（ｆｕｓｉｎｇ）し、２）それらの変数が流量血球計算器（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）にて直接測定されなかった溶解したデータファイル内に含有されている個々の事象の各々に対して、溶解した当初のデータファイルの１つ又はそれ以上の間の異なる変数の値の大きさと相応する不確実性の測定値とを推定し、３）溶解した個別の当初のデータファイルの事象の各々に対し、流量血球計算器にて測定された実際のデータと当初のデータファイルの各々から事象のグループ内で測定されなかったパラメータに対する推定したデータとの双方を含有する新たなデータファイルをマルチディメンションに再構成することにより形成される。本発明は、溶解した当初のデータファイルの各々において実際に測定されたもの以外の多数のパラメータについてのサンプルから単一の細胞事象に対する情報を含有するデータファイルを生成させることを可能にする。新たなデータファイル中に含まれた個別の細胞事象の各々に値が割り当てられるパラメータの総数は溶解したデータファイルの全グループ内の測定されたパラメータの総数によってのみ制限される。これは１つのサンプル内に含有されている事象の異なる個体群をより強力に同定し、計数し且つ特徴付けることを可能にする。
【背景技術】
【０００２】
ローケン及びテレスタペン（Ｌｏｋｅｎ  ａｎｄ  Ｔｅｒｓｔａｐｐｅｎ）氏は米国特許第５，０４７，３２１号明細書において、血液及び骨髄からなる体液中の細胞成分の多数のパラメータの解析について記載している。彼等は血液及び骨髄の種々の細胞成分を判別し、かつ各成分中の細胞数をカウントし、そして２つの核酸染料−ＬＤＳ−７５１（エキシトン（Ｅｘｃｉｔｏｎ））ＤＮＡ−染料、チアゾールオレンジ（ＴＯ、モレキュラ  プローブ（Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）Ｉｎｃ）ＲＮＡ−染料−、蛍光標識した抗ＣＤ４５単クローン抗体及び２つの光散乱パラメータ（前方向及び側方向光散乱）の組み合わせを使用してこれらの各々の微分解析を備えることを可能にした。このアプローチ法は核形成した赤細胞、赤血球、網状赤血球、血小板、リンパ球、単核白血球、好中性顆粒球、好塩基球、好酸性顆粒球及び全ての核形成細胞の前駆体間を識別し且つ判別することを許容する。これにも拘らず、彼等は、このアプローチ法において、同一のサンプル中に同時に存在する正常な細胞と新生物細胞とを特定的に判別し又はこれら細胞集合体を更に特徴付けることが可能であると示すことはできなかった。
【０００３】
米国特許第６，２８７，７９１号明細書において、テルスタペン及びチェン氏（Ｔｅｒｓｔａｐｐｅｎ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ）は米国特許第５，０４７，３２１号明細書の更なる改良例を記載しているが、彼等は異なる白血球の個体群を一層良く特徴付けることは示さなかった。
【０００４】
米国特許第２，３８０，０９８号明細書において、オルファオ氏（Ｏｒｆａｏ）は血液、骨髄及びその他の体液のマルチディメンション的な白血球の判別解析方法を記載しており、この方法は、核形成した赤細胞、リンパ球、単核細胞、好中性顆粒球、好塩基球、好酸性顆粒球及び全ての核形成細胞の前駆体に加えて、樹枝状細胞及びそれらの集合体を更に同定することを許容するものである。
【０００５】
米国特許第５，５３８，８５５号明細書において、オルファオ氏は他の型式の生物学的サンプル中の血液及び骨髄内のＴ、Ｂ、Ｎｋ細胞の１２の異なる集合体までの同時的な同定を通じてリンパ様区画（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）をより詳細に解析することを許容する方法を記載している。発明者は、３色の１回の染色にてＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ５６（及び（又は）ＣＤ１６）、ＣＤ４及びＣＤ８抗原に対して組み合わせた染色法を使用した。しかし、このアプローチ法を使用することにより、彼は同定した細胞の集合体をさらに特徴付けることはできず、また、これと同時に、正常な末梢血液中に存在する非リンパ細胞の全ての集合体（例えば、樹枝状細胞の小集団）を特定的に同定できたわけではない。
【０００６】
上述した方法の何れにおいても、記載された方法は、同定した細胞をより詳細に直接特徴付けることはできなかった。かかる場合、識別可能な蛍光放出と関係したそれ以上の染色及びそれ以上の異なる蛍光放出を測定することができる流量血球計算器を使用することが必要とされる。過去２０年の間、流量血球計算器において同時に測定することのできる異なる蛍光放出の数は３から１７色まで顕著に増大している。しかし、この数は依然として制限されており、それは異なる正常なサンプル及び病理状態のサンプル中に存在する細胞成分を詳細に特徴付けるため２０以上のマーカが必要とされることが多いからである。一例として、末梢血液ＴＣＲアルファ−ベータ＋Ｔ−細胞のＴＣＲＶベータレパートリーの評価のためには、典型的に、異なる数のＴＣＲＶベータグループのタンパク質を対象とする２０以上の異なるマーカの染色を必要とする。同様に、白血病のサンプルの定常的な診断免疫表現型解析は、数１０の異なるマーカ（典型的に、２０ないし４０抗原）に対する骨髄及び（又は）血液細胞の染色パターンの評価に基づくものである。このように、１７の異なる蛍光放出を同時に測定することのできる能力を備える場合でさえ、最新の流量血球計算計測器は、依然として多色能力が制限されている。上述したように、流量血球計算データファイル中に含有されている個別の事象又は事象グループに対する同時に測定された蛍光放出の最大数は、適合可能な、識別可能な蛍光放出を有する蛍光色素の利用可能性と、流量血球計算器にて検知することのできる蛍光放出の最大数とに依存する。かかる制限のため、利用可能な流量血球計算器が測定することのできる蛍光放出の数よりも多数のマーカに対して１つのサンプルを染色することは、次々と測定された２つ又はより多くの別個のアリコートにて通常、行われる。かかる方法の一例として、米国特許第５，１３７，８０９号明細書において、ローケン（Ｌｏｋｅｎ）及びシャ（Ｓｈａ）氏等は骨髄中の細胞成分の多数のパラメータを解析するための方法を記載している。彼等は最初のステップにおいて、全ての白血球を染色するため、各々が異なる蛍光色素にて標識された単クローン抗体の組み合わせを使用して、また、第二のステップにて、白血球の選んだ個体群を染色するため更なる組み合わせを使用することについて記載している。しかし、かかる方策は、１）同一のサンプルからの異なるアリコート、２）同一の又は異なる個人からの同一又は異なる組織から由来する異なるサンプル、又は３）異なる条件下にて測定された異なるサンプルアリコート中に含有されている個人の細胞に対する測定された光散乱量及び蛍光放出量に関する情報を自動的に関係させ且つ直接的に比較することを許容するものではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述した全ての方法は、血液、骨髄及びその他のサンプル中に存在する正常な白血球の異なる個体群の可変数を同定することを許容し、また、これらの方法は使用される単クローン抗体及び核酸染料の特定の組み合わせに基づいて選んだ細胞の小集団のみを標識することを許容する。しかし、これらの方法は、１つのサンプル中の正常な細胞と自然に又は人工的に混合した新生物の細胞を特定的に且つ再現可能に同定するための方策を提供することはできない。
【０００８】
米国特許出願第１０／７９１．９９４号明細書において、オルファオ、ペドレイラ及びソブラル  ダ  コスタ氏等（Ｏｒｆａｏ，Ｐｅｄｒｅｉｒａ  ａｎｄ  Ｓｏｂｒａｌ  ｄａ  Ｃｏｓｔａ）は流量血球計算測定法を使用して、最小数の血液、骨髄の髄液及びリンパ節サンプルを監視するため、これらを正常な細胞から判別すべく使用される新生物細胞中の異常な表現型のものをマルチディメンションに検出する方法を記載している。この方法は、１）同一のサンプルからの異なるアリコート、２）同一の被験者の別個のサンプルからの異なるアリコート、３）異なる個人の相違するサンプルからの異なるアリコートに相応する異なる測定にて取得された流量血球計算データの間にて、これらが異なる条件下にて測定された場合でさえ、客観的に比較することも許容する。この方法によれば、１つ又はそれ以上のサンプルからのデータを含有する２つ又はそれ以上の異なるデータファイルからのデータを合体させることにより大きい流量血球計算データファイルが生成される。これらのデータファイルにおいて、無限の数のパラメータに関する情報を互いに保存することができる。しかし、リストモードデータファイル中の事象の各々は、その特定の事象に対する流量血球計算器にて実際に測定されたパラメータから得られたデータにのみ関係付けられ、測定されたパラメータと、その特定の事象に対し測定されなかったパラメータとの間にて、これらのパラメータが溶解したデータファイル中に含有されているその他の事象に対して評価された場合でさえ、個々の事象に対し何らの関連付けをなすことはできない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は潜在的に無限数のディメンションを有する新たな流量血球計算データファイルを生成する方法に関するものであって、これらのデータファイル中に含有されている事象は評価された全セットのパラメータの各々に対し関係付けられた情報を有し、かかる情報は流量血球計算器にて直接的に測定され又はその後に推定されるか何れかのデータに相応する。本発明は、１）同一のサンプルから異なるアリコートにて測定された事象に関する情報を保持する２つ以上の別個の流量血球計算データファイルであって、これらの当初のデータファイルが共通して１つ又はそれ以上のパラメータに関するデータを含有すると同時に、１つ又はそれ以上の異なるパラメータに関する情報を含有する上記データファイルを溶解するステップと、２）それらの変数が流量血球計算器にて直接測定されなかった溶解したデータファイル内に含有されている個々の事象の各々に対して、溶解した当初のデータファイルの１つ又はそれ以上の間の異なる変数の値の大きさと相応する不確実性の測定値とを推定するステップと、３）溶解した個別の当初のデータファイルの事象の各々に対し、流量血球計算器にて測定された実際のデータと、当初のデータファイルの１つ又はそれ以上から事象のグループ内で測定されなかったパラメータに対する推定したデータとの双方を含有する新たなデータファイルをマルチディメンションに再構成するステップとを備えている。本発明は溶解した当初のデータファイルの各々に含有されている個別の事象に対して流量血球計算器にて実際に測定されたもの以外の多数のパラメータに関するサンプルからの単一の細胞事象に対する情報を含有するデータファイルを生成させることを可能にする。新たなデータファイル中に含まれた個別の細胞事象の各々に値が割り当てられるパラメータの総数は、溶解したデータファイルの全グループ内の測定されたパラメータの総数と等しい大きさとすることができる。それは、１つのサンプル内に含有されている事象の異なる個体群をより強力に同定し、計数し且つ特徴付けることを可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明によれば、当初の流量血球計算データファイルを溶解する前に、１つのサンプルの２つ又はそれ以上のアリコートを単クローン抗体のパネルにて別個に染色する。サンプルは、正常な細胞、新生物細胞又は正常な細胞及び新生物細胞の双方の混合体を保持することができる。サンプルは、末梢血液、骨髄、リンパ節、脾臓、腹水、髄液、滑液、胸水及び固形組織から作成された単細胞懸濁液を備えることができる。サンプルを染色するために使用した試薬のパネルは、蛍光色素に対し直接、共役結合させた単クローン抗体の２つ又はそれ以上の組み合わせにより形成される。これらの蛍光色素−共役結合した単クローン抗体の組み合わせは、全ての単クローン抗体試薬の組み合わせの１つ又はその一部分の何れかにてのみ使用される全ての組み合わせ及び単クローン抗体試薬にて同一である単クローン抗体試薬の組み合わせから成っている。単クローン抗体試薬の組み合わせの各々は、単クローン抗体に加えて、サンプルを染色するその他のプローブを保持することができる。上記追加的なプローブは、核酸染料に特定の蛍光色素、ミトコンドリア、及びその他の細胞器官（例えば、チモーゲン顆粒、染色体、イオン、タンパク質、脂質、炭水化物）又は細胞機能（例えば、食作用、タンパク質の分泌、活性化、増殖、分化）から成っている。各組み合わせにおける単クローン抗体の各々は異なる蛍光色素に対して共役結合され、単クローン抗体の組み合わせの各々は、共通して、１つ又はそれ以上の蛍光色素−共役結合した単クローン抗体試薬を有している。多数の単クローン抗体の組み合わせの各々における蛍光放出の数は、２つ又はそれ以上の異なる蛍光色素を備えており、これらの各々は異なる単クローン抗体に連結され、該抗体の蛍光放出は、その組み合わせ中のその他の蛍光色素−共役結合した単クローン抗体試薬から識別可能である。本発明にて使用可能な蛍光色素は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）と、フィコエリトリン（ＰＥ）と、ペリジン（ｐｅｒｉｄｉｎ）クロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）と、アロフィコシアニンと、ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８と、ａｌｅｘａ  ６４７と、ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６１０と、ａｌｅｘａ  ７１０と、ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４０５と、シアニン５（Ｃｙ５）と、シアニン５．５（Ｃｙ５．５）と、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ（ＴＲ））と、パシフィックブルー（ｐａｃｉｆｉｃ  ｂｌｕｅ（ＰＢ））と、カスケードイエロー（ｃａｓｃａｄｅ  ｙｅｌｌｏｗ）と、カスケードブルー（ｃａｓｃａｄｅ  ｂｌｕｅ）と、ＰＥによりＡＰＣ又はＰｅｒＣＰ（例えば、ＰＥ／Ｃｙ５、ＰＥ／Ｃｙ５．５、ＰＥ／Ｃｙ７、ＰＥ／ＴＲ、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５、ＡＰＣ／Ｃｙ７）と結合された共役結合体と、量子ドット又は他の適合可能な蛍光色素又は蛍光色素タンデムとを含む。
【００１１】
流量血球計算器にて測定する前に、細胞を染色するため使用した正確なサンプルの作成方法を上記に詳細に説明し、また、よく使用されており、これらは現場の当業者によって容易に実施することが可能である。
【００１２】
サンプルを作成し且つ染色した後、単クローン抗体の組み合わせの各々にて染色したサンプルアリコートからの多数の細胞と関係付けられた蛍光放出は、従来の方法に従って流量血球計算器によって測定し、また、２つ又はそれ以上の独立的なリストモードデータファイルを保存する。保存したデータファイルの各々は、測定されたサンプルアリコートの各々にて解析した個人の細胞の特有の光散乱及び蛍光放出の特性に関する情報を保持する。サンプルアリコートの各々に対し同一の又は異なる数の事象を流量血球計算にて測定することができる。変形例において、２つ又はそれ以上の異なるサンプルアリコートに関する情報を流量血球計算にて測定した後、直接、単一のデータファイルに保存してもよい。
【００１３】
本発明によれば、各対のサンプルアリコートに共通するこれら全てのパラメータは、その情報が溶解したデータファイル内に保存されるその他の全てのサンプルアリコートとも共通する。変形例において、各対のサンプルアリコートに共通する全てのこれらのパラメータの一部のみがその情報が溶解したデータファイルに保存される測定された全てのその他のサンプルアリコートにも共通する。
【００１４】
構造的観点から見て、保存したデータファイルの各々は、測定された異なる細胞事象の各々に関する情報が一本のラインにて整合されるデータのマトリックスから成っており、連続的に測定された事象はデータマトリックス内で連続的なラインに配置される。事象の各々に対し、その光散乱−前方（ＦＳＣ）及び側方光散乱（ＳＳＣ）−、及び蛍光放出と関係したパラメータに関する情報は、データマトリックスの異なるコラムに配置される。
【００１５】
２つ又はそれ以上のリストモードデータファイルを溶解するため、溶解すべきファイルからのデータは、既知の順序にてデータベース内で貼り付けられる。溶解したデータファイルにおいて、細胞の光散乱特性（ＦＳＣ、ＳＳＣ）及び蛍光放出に関係した全セットのデータファイル中にて測定された異なるパラメータの各々は、異なるコラムに配置される一方、測定された細胞事象の各々に関するデータは異なるラインに配置される。同一の当初のデータファイルから来る事象は、流量血球計算器にて測定した後、直接又は逆に関係付けた順序にて次々と順次に配置される。変形例において、上記データファイルの各々に含有されている当初のデータファイル及び事象は、これらが流量血球計算器にて測定された順序と関係しない順序にて貼り付けられる。ラインの各々に対し、溶解したデータファイル内のサンプルアリコートの各々に相応する事象（細胞事象）について全てのパラメータの一部のみを測定したため、直接測定されたパラメータ及びその特定の事象について流量血球計算器にて評価しなかったパラメータに相応する満たされたコラム及び満たされないコラムがそれぞれ存在する。データベースコラムはパラメータの各々又はパラメータのグループが測定された順序と直接的に又は逆に関係付けた順序にて順番付けすることができる。変形例において、溶解したデータベースマトリックス内のコラムは、異なる順序に従うようにしてもよい。次に、細胞事象（ライン）の各々に対する空のデータベースコラムは、溶解したデータファイル中の事象グループに対し測定されなかったパラメータの値及び相応する不確実性の測定値を計算するため、類似性に基づいた統計学的推定手法を使用して満たされる。
【００１６】
各個々の事象に対する全ての空のデータベースコラムを満たすため、測定された全ての共通の蛍光放出＋光散乱の測定値は当初の全てのデータファイルに対する「共通のパラメータ」とみなされ、これらは、型式及び数（ｋ＝測定された「共通のパラメータ」の総数）にて可変である。一方、溶解した当初の全データファイルの一部分に含有されている事象についてのみ流量血球計算器にて記録されたその他の全ての蛍光放出の測定値は、「共通でないパラメータ」とみなされる。「共通のパラメータ」及び「共通でないパラメータ」の双方に相応する溶解したデータファイル中に含まれた全てのデータは、可変数のサンプルアリコート（ｎ＝測定されたサンプルアリコートの数）にて測定される。従って、ｃｉ ｈ はｉｔ ｈ のサンプルアリコートのｈｔ ｈ の共通でないパラメータを表わし、ここで、ｉ＝１，．．．，ｎ、ｈ＝１，．．．，ｋである。同様に、ｎｃｉ ｈ はｉｔ ｈ のサンプルアリコートのｈｔ ｈ の共通でないパラメータを表わし、ここで、ｉ＝１，．．．，ｎ、ｈ＝１，．．．，ｍである。単一のサンプルアリコートに相応する当初のデータファイルの各々における事象の数がｊとして表わされるならば、ｃｉ ｈ 及びｎｃｉ ｈ は、各ｉ＝１，．．．，ｎ、ｈ＝１，．．．，ｋ及び各ｉ＝１，．．．，ｎ、ｈ＝１，．．．，ｍのそれぞれに対しＲｊ にてベクトルとして表わすことができる。更に、ｃｉ ｈ （ｇ）、ｎｃｉ ｈ （ｇ）（ここで、ｇはサンプルアリコート内で測定された事象を表わす）がベクトルｃｉ ｈ 及びｎｃｉ ｈ のｇｔ ｈ の成分としてそれぞれみなされるならば、所定の事象は、「ｓ」に対し（サンプルアリコートｉ＝１，．．．，ｎに対し）、ｃｉ （ｓ）≡（ｃｉ １ （ｓ），ｃｉ ２ （ｓ），．．．，ｃｉ ｋ （ｓ））∈Ｒｋ となり、所定の事象「ｐ」に対し（管ｉ＝１，．．．，ｎの各々に対し）、ｎｃｉ （ｐ）≡（ｎｃｉ １ （ｐ），ｎｃｉ ２ （ｐ），．．．，ｎｃｉ ｍ （ｐ））∈Ｒｍ となる。
【００１７】
上記に規定した表記法に基づいて、ｎα ≠ｎβ であり、ｎα ，ｎβ ＝１，２，．．．，ｎである場合、２つのｎα 及びｎβ サンプルアリコートに相応する溶解したデータファイルの２つが検討されるならば、各々がｊ事象について測定されたデータを保持する場合、次の手順が実行される。
【００１８】
ａ）１つの事象ｓ又は１組みの事象Ωについて考える。ｃα （ｓ）の値をとる（サンプルアリコートαにて）。この変形例において、任意の関数Ｆｃ（Ω）∈Ｒｋ を計算する（例えば、Ｆｃ（Ω）＝平均値（ξ⊃Ωに対するｃα （ξ））。一方は、Ω＝ｓを有し、Ｆｃ（Ω）≡ｃα （Ω）＝ｃα （ｓ）であり、このため、後者は実際上、第一のものを一般化したものであることが分かる。
【００１９】
ｂ）ｃα （ｓ）に対する任意の測定可能な類似性（例えば、最小距離、この場合、最近傍の原理（ｎｅａｒｅｓｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）を使用するであろう）により、これらの事象「ｑ」についてｎβ にて探知する。これと代替的に、Ｆｃ（Ω）にて（ｃα （ｓ）に代えて）同一の方法を使用する。これらの「ｑ」事象は、Ｌ（Ｌ∈Ｒｑ は１セットの標識である）として標識されるものと想定する。次に、１セットのＮＣβ （Ｌ）を構築する。
【００２０】
ｃ）ｎｃβ （Ｌ）を分散に従って、ｎｃβ （Ｌ）分布を評価し且つ、その状況を処理する。
【００２１】
この過程の終了時で且つｎα サンプルアリコートに相応する全ての事象に対する手順を実行した後、ｎα サンプルアリコートに相応する「ｊ」事象に対する全ての空のコラムが満たされるであろう。一方、全ての事象及び全ての対のサンプルアリコートに対する手順を実行した後、全ての（ｎ×ｊ）事象に対するｋ＋ｍパラメータの情報を保持する（ｎ×ｊ）ライン及びｋ＋ｍコラムを有するマトリックスを構成することになる。
【００２２】
上述したものに相応して、溶解したデータファイル中の事象グループに対して測定されなかったパラメータに対する値及び相応する不確実性の測定値の計算は、個別の事象「ｓ」の各々に対して実行される。変形例において、溶解したデータファイル中の事象グループに対して測定されなかったパラメータに対する値及び相応する不確実性の値の計算は２つ又はそれ以上の事象グループ「Ω」に対して実施される。
【００２３】
更に、１つ又はそれ以上のサンプルアリコート内の測定されたパラメータの１つ又はそれ以上を推定することができる。かかる推定は、推定手順の内部品質管理として使用することができる。
【００２４】
本発明によれば、溶解したデータファイル中の事象グループに対して測定されなかったパラメータに対する値及び相応する不確実性の測定値を計算するため、２つ又はそれ以上のサンプルアリコートに共通する全てのパラメータ又はその一部分のみが使用される。更に、本発明において、溶解したデータファイル中の全ての事象又はその一部分のみを使用して、溶解したデータファイルの事象グループに対する流量血球計算にて直接測定されなかったパラメータに対する値及び相応する不確実性の測定値を計算する。
【００２５】
この新たに満たしたマトリックスに含まれるデータは、流量血球計算データファイルの特定の解析のために開発された任意の従来のソフトウェアプログラムを使用して解析することができる。
【００２６】
本発明は、以下に、その適用分野を制限しない１つの例について説明する。
【実施例１】
【００２７】
１．サンプル：
健常な１人のボランティアから静脈穿刺によって５ｍＬの末梢血液（ＰＢ）を得て且つ、抗凝血剤としてＥＤＴＡを保持するヴァキュティナー（ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ）（登録商標名）（ニュージャージー州、ニュージャージー、ベクトン  ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））内に配置した。
【００２８】
２．サンプルの作成：
サンプルを静かに混合させた後、１０６有核細胞を保持するＰＢサンプルの２００μＬを５つの異なる複製管内に配置した。次に、管の各々に対し、次の５つの単クローン抗体の６色の組み合わせの１つを追加し、異なる蛍光色素（ＦＩＴＣ／ＰＥ／ＰＥ−ＴＲ／ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５／ＡＰＣ／ＡＰＣ−Ｃｙ７）と共役結合させた単クローン抗体の各々を５μＬの容積中に飽和量として添加する：１）ＣＤ２２／ＣＤ２３／ＣＤ１９／ＣＤ４５／ＣＤ５／ＣＤ２０、２）ＣＤ４３／ＣＤ７９ｂ／ＣＤ１９／ＣＤ４５／ＣＤ５／ＣＤ２０、３）ＣＤ９／ＣＤ２７／ＣＤ１９／ＣＤ４５／ＣＤ５／ＣＤ２０、４）ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１０／ＣＤ１９／ＣＤ４５／ＣＤ５／ＣＤ２０及び、５）ＣＤ１０３／ＣＤ２５／ＣＤ１９／ＣＤ４５／ＣＤ５／ＣＤ２０。静かに混合させた後、サンプルアリコートは暗所にて室温で１５分間培養した。この培養後、滅菌水で１／１０（体積／体積）希釈した、２ｍＬのＦＡＣＳ溶解溶液（カリフォルニア州、サンジョセ、ベクトン  ディキンソン  バイオサイエンセズ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加した。静かに混合させた後、染色し且つ溶解したサンプルアリコートを暗所で室温にて更に１０分間、培養した。次に、細胞を遠心分離し（５４０ｇにて５分間）、２ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ＝７．６）にて洗浄し、５００μＬのＰＢＳ／管内に再懸架させた。
【００２９】
３．データの取得：
染色したサンプルアリコートの各々を静かに混合させた後、ＦＡＣＳＤＩＶＡ（ＢＤＢ）ソフトウェアプログラムを使用して、４８８ｎｍ及び６３５ｎｍにて放出する２つのレーザ光を具備するＦＡＣＳＡＲＩＡ流量血球計算器（カリフォルニア州、サンジョセ、ベクトン／ディキンソン  バイオサイエンセズ（Ｂｅｃｔｏｎ／Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）−ＢＤＢ−）にて染色した細胞の光の散乱及び蛍光放出を測定した。解析したサンプルアリコートの各々に対し、前方向（ＦＳＣ）及び側方向光の散乱（ＳＳＣ）及び５×１０５ 細胞／サンプルアリコートに対するＦＩＴＣ、ＰＥ、ＰＥ−ＴＲ、ＰＥ−Ｃｙ５．５、ＡＰＣ及びＡＰＣ−Ｃｙ７の蛍光放出に対する情報を保持する単一のデータファイルを収集した。更に、事象の各々の取得順序（取得時間）に相応する情報をも記録した。データの取得は、２００に設定されたＦＳＣ閾値を使用して「サンプルの作成」に関する上記の部分にて規定した順序にて異なる管に対して実施した。
【００３０】
４．データの操作及びデータの解析：
次に、生成された５つのデータファイルの各々に含有されているデータをＦＣＳ１ａ．支援ソフトウェアプログラム（カリフォルニア州、スタンフォード、スタンフォード大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｔａｎｆｏｒｄ））を使用してエクセルデータベース（スペイン、マドリード、マイクロソフト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ））内にエクスポートした。エクセルデータベース内に配置されたならば、各々が異なるサンプルアリコートに相応する５つの個別の全てのデータベースを単一のデータベースとなるように溶解し、この場合、第二のサンプルアリコートから測定された第一の事象は、その第一のサンプルアリコートについて測定された最後の事象に相応するもののその直後のラインに配置し、第三のサンプルアリコートから測定された第一の事象は、第二のサンプルアリコートについて測定された最後の事象に相応するものの直後のラインに配置し、第四のアリコートサンプルから測定された第一の事象は、第三のサンプルアリコートに対して測定された最後の事象に相応するものの直後のラインに配置し、第五のサンプルアリコートから測定された第一の事象は、第四のサンプルアリコートについて測定された最後の事象に相応するものの直後のラインに配置した。更に、次のコラムを形成した：コラム１、ＦＳＣ；コラム２、ＳＳＣ；コラム３、ＣＤ２２；コラム４、ＣＤ２３；コラム５、ＣＤ１９；コラム６、ＣＤ４５；コラム７、ＣＤ５；コラム８、ＣＤ２０；コラム９、ＣＤ４３；コラム１０、ＣＤ７９ｂ；コラム１１、ＣＤ９；コラム１２、ＣＤ２７；コラム１３、ＣＤ１１ｃ；コラム１４、ＣＤ１０；コラム１５、ＣＤ１０３及び；コラム１６：ＣＤ２５。単クローン抗体試薬のＣＤ２２／ＣＤ２３／ＣＤ１９／ＣＤ４５／ＣＤ５／ＣＤ２０多色の組み合わせにて着色されたサンプルアリコートに相応するデータは、ライン１ないしライン５００，０００を含むコラム１ないし８に記録した。第二のサンプルアリコート（ＣＤ４３／ＣＤ７９ｂ／ＣＤ１９／ＣＤ４５／ＣＤ５／ＣＤ２０多色染色）に対して測定されたデータは、ライン５００，００１ないしライン１，０００，０００のコラム１、２及び５ないし１０内に保存した。第三のサンプルアリコート（ＣＤ９／ＣＤ２７／ＣＤ１９／ＣＤ４５／ＣＤ５／ＣＤ２０染色）の情報は、ライン１，０００，００１ないしライン１，５００，０００にてコラム１、２、５ないし８、１１及び１２内に保存した。第四のサンプルアリコート（ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１０／ＣＤ１９／ＣＤ４５／ＣＤ５／ＣＤ２０染色）について測定されたデータは、ライン１，５００，００１ないしライン２，０００，０００にてコラム１、２、５ないし８、１３及び１４内に保存した。第五のサンプルアリコート（ＣＤ１０３／ＣＤ２５／ＣＤ１９／ＣＤ４５／ＣＤ５／ＣＤ２０多色染色）の情報は、ライン２，０００，００１ないしライン２，５００，０００にてコラム１、２、５ないし８、１５及び１６内に保存した。その後、空のままであるデータベースセルを、以下に説明するように計算した推定データ値にて満たした。
【００３１】
測定された、共通の抗体に関係した蛍光放出分プラス前方向（ＦＳＣ）及び側方向光散乱（ＳＣＣ）の双方の測定値を全ての当初のデータファイルに対する「共通のパラメータ」「ｋ」とみなした（「共通のパラメータ」の総数は６であるから、ｋ＝６）。全ての単クローン抗体の蛍光放出分の測定値（ＣＤ２２−ＦＩＴＣ／ＣＤ２３−ＰＥ／ＣＤ４３−ＦＩＴＣ／ＣＤ７９ｂ−ＰＥ／ＣＤ９−ＦＩＴＣ／ＣＤ２７−ＰＥ／ＣＤ１１ｃ−ＦＩＴＣ／ＣＤ１０−ＰＥ／ＣＤ１０３−ＦＩＴＣ／ＣＤ２５−ＰＥ）は、「共通でないパラメータ」「ｍ」とみなした（「共通でないパラメータの総数は１０であるから、ｍ＝１０）。これらの共通のパラメータ及び共通でないパラメータは、５つのサンプルアリコート「ｎ」中にて測定した（染色し、作成し且つ、流量血球計算器にて測定された５つのサンプルアリコートに相応して、ｎ＝５）。従って、測定された５つのサンプルアリコートに相応するものとして保存された当初の５つのデータファイルの各々は、ｃｉ ｈ がｉｔ ｈ 管（ｉ＝１，２，．．．，５）のｈｔ ｈ （ｈ＝１，．．．，６）の共通のパラメータを表わし、ｎｃｉ ｈ がｉｔ ｈ 管（ｉ＝１，２，．．．，５）のｈｔ ｈ （ｈ＝１，．．．，１０）の共通でないパラメータを表わす場合、６つの共通のパラメータ及び２つの異なるパラメータを保持する。サンプルアリコート（「ｊ」）の各々について測定された事象の総数は、５００，０００事象（ｊ＝５００，０００）であった。このため、ｃｉ ｈ 及びｎｃｉ ｈ は、ｉ＝１，．．．，５、ｈ＝１，．．．，６の各々、及びｉ＝１，．．．，５、ｈ＝１，．．．，１０の各々に対してそれぞれＲ５ ０ ０ ０ ０ ０ におけるベクトルとして表わした。更に、所定の事象「ｓ」及び所定の事象「ｐ」（サンプルアリコートｉ＝１，．．．，５の各々に対する）について、ｃｉ ｈ （ｇ）、ｎｃｉ ｈ （ｇ）（ｇ＝１，２，．．．，５００，０００の場合）は、ベクトルｃｉ ｈ 及びｎｃｉ ｈ のｇｔ ｈ 成分であると考えて、それぞれ、ｃｉ （ｓ）≡（ｃｉ １ （ｓ），ｃｉ ２ （ｓ），．．．，ｃｉ ６ （ｓ））∈Ｒ６ 及びｎｃ ｉ （ｐ）≡（ｎｃｉ １ （ｐ），ｎｃｈ ２ （ｐ），．．．，ｎｃｉ １ ０ （ｐ））∈Ｒ１ ０ であるとみなした。以前に画成した表記法を考慮して、次のように、ｎ１ の事象ｊの各々について、サンプルアリコートｎ１ 、ｎ２ に対する手順を実行した。
【００３２】
所定の事象「ｓ」に対して、サンプルアリコートｎ１ 中のｃ１ （ｓ）の値を計算した。次に、ｃ１ （ｓ）に最近傍ｇをｎ２ にて探知した。その後、これらのｑ点はＬとして標識されたものと想定して（Ｌ∈Ｒｑ は１セットの標識である）、１セットのｎｃ２ （Ｌ）データ点を構成した。構成したｎｃ２ （Ｌ）は、コンパクトであり且つ、単一のデータ点の集合により形成される。次に、ｎｃ１ Ｅ Ｓ Ｔ ＝中間値（ｎｃ２ （Ｌｓ ｕ ｂ ））であると推定し、ここで、Ｌｓ ｕ ｂ は、Ｌの任意の集合体である。一方、ｎｃ２ （Ｌ）がコンパクトでなく、また、２つ以上のデータ点の集団（ｃｌｏｕｄ）があるならば、我々は、集団の各々の発生確率を計算し、集団の各々の発生確率を考慮に入れて推定を為し、これら集団の１つを選び、また、ｎｃ１ ＿ Ｅ Ｓ Ｔ ＝中間値（ｎｃ２ （Ｌｓ ｕ ｂ ））であると推定した。ここで、Ｌｓ ｕ ｂ は、この集団中の点に対するＬの任意の集合体である。
【００３３】
この過程の終了時で且つ、ｎ１ サンプルアリコートに相応する全ての事象に対する手順を実行した後、ｎ１ サンプルアリコートに相応する「ｊ」事象に対する全ての空のコラムを満たした。一方、全ての事象及び全ての対のサンプルアリコートについて手順を実行した後、全ての２，５００，０００に対する１６のパラメータの情報を保持する２，５００，０００（５００，０００×５）のライン及び１６（６＋１０）のコラムを有するマトリックスを構成した。次に、この新たに満たしたマトリックス中に含有されているデータを従来の流量血球計算ソフトウェアプログラム（ＦＡＣＳＤＩＶＡ）を使用して解析した。