(57)【要約】【課題】試料中のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールを、より簡便な操作で、且つ感度良く測定する方法及び測定試薬を提供する。【００３４】【解決手段】リポタンパク質を含有する被検試料にコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼを作用させ、酵素反応により生成する過酸化水素又は還元型補酵素を測定することによりリポ蛋白質中のコレステロールを測定する方法において、分子中にベンゼンスルホン酸構造を有する界面活性剤又はその塩類を添加することを特徴とする、レムナント様リポ蛋白質中のコレステロールの測定方法；コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ、並びに分子中にベンゼンスルホン酸構造を有する界面活性剤又はその塩類を含有するレムナント様リポ蛋白質中のコレステロール測定試薬。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポタンパク質を含有する被検試料にコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼを作用させ、酵素反応により生成する過酸化水素又は還元型補酵素を測定することによりリポ蛋白質中のコレステロールを測定する方法において、分子中にベンゼンスルホン酸構造を有する界面活性剤又はその塩類を用いることを特徴とする、レムナント様リポ蛋白質中のコレステロールの測定方法。
【請求項２】
界面活性剤又はその塩類を被検試料に作用させた後に、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼを作用させるものである請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
界面活性剤又はその塩類が、アルキルベンゼンスルホン酸、ポリスチレンスルホン酸又はそれらの塩類である請求項１又は２記載の測定方法。
【請求項４】
コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ、並びに分子中にベンゼンスルホン酸構造を有する界面活性剤又はその塩類を含有するレムナント様リポ蛋白質中のコレステロール測定試薬。
【請求項５】
界面活性剤又はその塩類を含む第１試薬と、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼを含む第２試薬からなる請求項４記載の測定試薬。
【請求項６】
界面活性剤又はその塩類が、アルキルベンゼンスルホン酸、ポリスチレンスルホン酸又はそれらの塩類である請求項５記載の測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、臨床検査において動脈硬化症等の危険因子とされるレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールの測定方法及び測定試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床検査において、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）中のコレステロールは動脈硬化症の危険因子として負の因子、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）中のコレステロールは動脈硬化症の危険因子として正の因子とされており、臨床検査の分野で頻繁に測定されている。
近年、レムナント様リポ蛋白質の如く、脂質の代謝等に起因して生成するリポ蛋白質中のコレステロールが、動脈硬化症の危険因子として、ＬＤＬ中のコレステロールより密接な指標となることが示されており、生体試料中のリポタンパク質の中からレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールを効率よく測定することが課題となっている。
【０００３】
レムナント様リポタンパク質中のコレステロールの酵素測定法に関しては、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼに、リン脂質を分解するための酵素を添加することにより、また場合によっては、更に界面活性剤を添加する測定方法が報告されている(特許文献１等参照)。
【０００４】
しかしながら、斯かる方法においても、酵素反応の選択性や簡便性の点で、必ずしも充分であるとは云えない。
【０００５】
【特許文献１】
特開平２００１−２３１５９７号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、試料中のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールを、より簡便な操作で、且つ感度良く測定する方法及び測定試薬を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、斯かる実情に鑑み、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼを使用してリポ蛋白質中のコレステロールを測定する際の条件を種々検討したところ、特定の界面活性剤を用いることにより、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）、カイロミクロン（ＣＭ）、超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）、ＣＭレムナント、ＶＬＤＬレムナント、中密度リポ蛋白質（ＩＤＬ）レムナント等のリポ蛋白質を含有する生体試料の中からレムナント様リポタンパク質中のコレステロールを選択的に高感度で測定できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は、リポタンパク質を含有する被検試料にコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼを作用させ、酵素反応により生成する過酸化水素又は還元型補酵素を測定することによりリポ蛋白質中のコレステロールを測定する方法において、分子中にベンゼンスルホン酸構造を有する界面活性剤又はその塩類を用いることを特徴とする、レムナント様リポ蛋白質中のコレステロールの測定方法を提供するものである。
【０００９】
また本発明は、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ、並びに分子中にベンゼンスルホン酸構造を有する界面活性剤又はその塩類を含有するレムナント様リポ蛋白質中のコレステロール測定試薬を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の測定方法は、試薬として、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼ、並びに分子中にベンゼンスルホン酸構造を有する界面活性剤又はその塩類を用い、これをリポタンパク質を含有する被検試料に作用させ、酵素反応により生成する過酸化水素又は還元型補酵素を測定することによりリポ蛋白質中のコレステロールを測定するものである。
【００１１】
本発明の酵素反応は、水性媒体中で行われるが、特に緩衝液中で行うのが好ましい。
緩衝液に使用する緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤及びグッドの緩衝剤等が挙げられる。グッドの緩衝剤としては、Ｎ−（２−アセタミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ−（２−アセタミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（以下、ＭＯＰＳという）、３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）等が挙げられる。
緩衝液のｐＨは４〜１０、好ましくは５〜９である。緩衝液の使用濃度は、５〜５００ｍＭが好ましく、１０〜２００ｍＭがより好ましく、２０〜１００ｍＭが特に好ましい。
【００１２】
コレステロールエステラーゼとしては、コレステロールエステルを加水分解する能力を有する酵素であれば特に限定されず、例えば微生物又は動物由来のコレステロールエステラーゼやリポプロテインリパーゼ等が挙げられる。
【００１３】
コレステロールオキシダーゼとしては、コレステロールを酸化して過酸化水素を生成する能力を有する酵素であれば特に限定されず、例えば微生物又は動物由来のコレステロールオキシダーゼが挙げられる。
【００１４】
コレステロールデヒドロゲナーゼとしては、コレステロールを酸化して酸化型補酵素を還元する能力を有する酵素であれば特に限定されず、例えば微生物又は動物由来のコレステロールデヒドロゲナーゼが挙げられる。
【００１５】
尚、これらの酵素は、当該酵素の特異性、安定性をさらに向上させるためにポリエチレングリコールを主成分とする基、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピル基などで該酵素を化学的に修飾したものでもよく、また、遺伝子操作により得られる同等の活性を有する改良酵素でもよい。
【００１６】
上記コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ及びコレステロールデヒドロゲナーゼの使用量は、反応液中、それぞれ０．０１〜２００Ｕ／ｍｌが好ましく、０．１〜１００Ｕ／ｍｌがより好ましい。
【００１７】
分子中にベンゼンスルホン酸構造を有する界面活性剤又はその塩類としては、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼのレムナント様リポ蛋白質に対する選択性を高めることができるもの、すなわち当該酵素のレムナント様リポタンパク質に対する作用を高めるか、或いは当該酵素群のレムナント様リポ蛋白質以外のリポ蛋白質に対する作用を低減させることによって、レムナント様リポ蛋白質に対する酵素反応を相対的に増強せしめるものであればよく、例えばラウリルベンゼンスルホン酸等のアルキルベンゼンスルホン酸、ポリスチレンスルホン酸又はこれらの塩類が好適に挙げられ、塩類としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。
具体的には、例えばニューレックスＲ（アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム；日本油脂）、ポリスチレンスルホン酸カルシウム（三和ケミカル）等が好適に挙げられ、中でもニューレックスＲを用いるのが、酵素反応の選択性を高める点で特に好ましい。
【００１８】
斯かる界面活性剤又はその塩類の使用濃度は、特に限定されないが、０．００１〜１０％が好ましく、０．０１〜５％がより好ましく、０．０５〜１％が特に好ましい。
【００１９】
本発明の測定方法において、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを用いる場合は、コレステロールの反応により酸素から過酸化水素が発生する。発生した過酸化水素は、例えばパーオキシダーゼの存在下、４−アミノアンチピリンとフェノール類、４−アミノアンチピリンとトリンダー試薬又は高感度の色素源を用いて定量することができる。
【００２０】
フェノール類としては、例えばフェノール、４−クロロフェノール、ｍ−クレゾール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等があげられる。
【００２１】
トリンダー試薬（同仁化学研究所第１９版総合カタログ、２００２年）としては、Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジスルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−ｍ−３−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（ＡＰＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−３−スルホプロピルアニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−２−ヒドロキシ−３−スルフプロキシル−３−メトキシアニリン等のアニリン類あるいはＮ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン等が挙げられる。
【００２２】
高感度の色素源としては、特公昭６０−３３４７９号公報で示される１０−（Ｎ−メチルカルバモイル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、特公平４−２７８３９で示されるビス［３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン（ＢＣＭＡ）、特開昭６２−２９６号公報で示される化合物等が挙げられる。
これら色素源の濃度としては、０．０１〜10ｍｇ／ｍｌが好ましい。
【００２３】
また、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールデヒドロゲナーゼを用いる場合は、コレステロールの反応により酸化型補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）から還元型補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）Ｈが発生する。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、３００〜５００ｎｍ、好ましくは３３０〜４００ｎｍ、特に好ましくは約３４０ｎｍでの反応液の吸光度を測定することにより定量することができる。なお、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの定量は、ジアホラーゼ、テトラゾリウム塩を添加してホルマザン色素を生成させ、ホルマザン色素を比色して行うこともできる。
反応は、１０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃、通常３７℃で、１〜３０分間、好ましくは２〜１０分間行う。
【００２４】
本発明の測定方法においては、上記界面活性剤又はその塩類を被検試料に作用させた後に、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼを作用させることが好ましい。従って、本発明の測定試薬は、界面活性剤又はその塩類を含有する第１試薬と、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼを含有する第２試薬からなる試薬として構成するのが好ましく、第１試薬に被検試料を添加して２５℃〜４０℃で撹拌した後、第２試薬を添加して２〜１０分間反応させて、測定することが好ましい。
【００２５】
また、当該測定試薬には、必要により生体試料中のグロブリンなどの蛋白質を可溶化するための種々の塩類、リポ蛋白質凝集剤、他の酵素等を含有させることができる。
斯かる塩類としては、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、塩化リチウム、硫酸リチウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸マグネシウム、硝酸カルシウムなどが挙げられ、０〜１００ｍＭの範囲で使用される。
【００２６】
リポ蛋白質凝集剤としてはリンタングステン酸塩、デキストラン硫酸塩、ヘパリンなどのポリアニオンが、マグネシウム、カルシウム、コバルト等の２価の金属塩があげられる。他の酵素としてはアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。
【００２７】
尚、本発明を適用する被検試料は、特に限定されるものではなく、具体的には生体試料においては血液自体又は血漿、血清等の血液画分を使用することができる。
【００２８】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
実施例１
（１）試料の調製
血清成分をレムナント様リポタンパク質画分、ＬＤＬ画分及びＨＤＬ画分に分画し、各リポタンパク質の測定を行った。該タンパク質の分画方法を下記に示す。
抗アポＢ−１００抗体結合アフィニテイカラム、抗アポＡ−１抗体結合アフィニテイカラムをそれぞれ作製し、血清を添加して結合画分を回収し、それぞれＬＤＬ，ＨＤＬとした。また、前述両カラムに血清を添加し素通り画分を回収しレムナント様リポタンパク質画分（ＲＬＰ）とした。それぞれのリポタンパク質はＨＰＬＣによる分析で確認を行った。また、各リポタンパク質中のコレステロールの濃度を総コレステロール測定用試薬キットを用いて５ｍｇ／ｍｌに調製した。
（２）測定試薬の調製
下記に示されるレムナント様リポ蛋白質中のコレステロール測定試薬を作製した。
【００２９】
試薬１
グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＰＩＰＥＳ、同仁化学社製）  ５０ｍＭ
ＨＤＡＯＳ（同仁化学社製）                            １ｍＭ
界面活性剤（表１参照；本発明品１〜２、比較品２〜８）
試薬２
グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製）    ５０ｍＭ
４−アミノアンチピリン（関東化学社製）                ３ｍＭ
パーオキシダーゼ（天野エンザイム社製）              １０単位／ｍｌ
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製）            １５単位／ｍｌ
コレステロールオキシダーゼ（天野エンザイム社製）      ６単位／ｍｌ
【００３０】
（３）測定方法・結果
試薬１を２１０μl分光光度計のセルに入れ、試料２０μｌを添加して攪拌し、３７℃で加温した。ついで３４４秒後に３７℃に予備加温された試薬２を７０μl添加して攪拌し、主波長５７２ｎｍ及び副波長７４８ｎｍにて６６７秒後まで測定した。
試薬２添加時、即ち３４４秒後（測光ポイント１８）から６７７秒後（測光ポイント３８）までの吸光度変化率を求め、ＲＬＰ、ＨＤＬ及びＬＤＬにおいて、ＲＬＰの吸光度変化率を１００とした場合の相対比率を算出した。結果を表１及び図１〜１０に示す。
【００３１】
【表１】
2007014201.tif 000002
【００３２】
表１及び図１〜１０より、本発明品１及び２は、比較品１〜８と比較して、ＬＤＬ及びＨＤＬに対する酵素反応が共に抑制され、ＲＬＰに対する酵素作用の選択性が顕著に上昇していた。
【００３３】
【発明の効果】
本発明の測定方法及び測定試薬を用いることにより、レムナント様リポ蛋白質中のコレステロールを極めて簡便な方法にて感度良く測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明品１を用いた場合の各リポ蛋白質の反応曲線を示す図である。
【図２】図２は、本発明品２を用いた場合の各リポ蛋白質の反応曲線を示す図である。
【図３】図３は、比較品１を用いた場合の各リポ蛋白質の反応曲線を示す図である。
【図４】図４は、比較品２を用いた場合の各リポ蛋白質の反応曲線を示す図である。
【図５】図５は、比較品３を用いた場合の各リポ蛋白質の反応曲線を示す図である。
【図６】図６は、比較品４を用いた場合の各リポ蛋白質の反応曲線を示す図である。
【図７】図７は、比較品５を用いた場合の各リポ蛋白質の反応曲線を示す図である。
【図８】図８は、比較品６を用いた場合の各リポ蛋白質の反応曲線を示す図である。
【図９】図９は、比較品７を用いた場合の各リポ蛋白質の反応曲線を示す図である。
【図１０】図１０は、比較品８を用いた場合の各リポ蛋白質の反応曲線を示す図である。
【図１】
2007014201.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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