(57)【要約】【課題】  心筋細胞を選択的かつ高率に製造する方法、及び幹細胞から心筋細胞への選択的分化誘導を促進する分化誘導促進剤を提供する。【解決手段】  幹細胞を、分化誘導時に、ｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２の存在下で培養する。分化誘導時は、胚様体形成期又は胚様体形成期相当期であってもよいし、あるいは胚様体を経ずに中胚葉が形成された後、心筋細胞に分化誘導されるまでの間の少なくとも１日間であってもよい。ｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２は、既知の分化誘導因子よりも高率に幹細胞から心筋を分化誘導できる。【選択図】  図１５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞から心筋細胞を分化誘導することにより心筋細胞を製造する方法であって、ｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２の存在下で前記幹細胞を分化誘導する工程を含むことを特徴とする心筋細胞の製造方法。
【請求項２】
前記分化誘導工程は、前記幹細胞を、分化誘導時に、ｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２の存在下で培養することにより行なわれる請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記分化誘導時は、胚様体形成期又は胚様体形成期相当期である請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記分化誘導時は、胚様体を経ずに中胚葉が形成された後、心筋細胞に分化誘導されるまでの間の少なくとも１日間である請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項５】
前記幹細胞が胚性幹細胞である請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
前記幹細胞は体性幹細胞である請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
前記幹細胞は、哺乳動物由来である請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
ｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２は、培地中に０．２〜１ｎｇ／ｍｌ存在している請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
幹細胞から心筋細胞の分化誘導を促進する心筋の分化誘導促進剤であって、有効成分としてｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２を含有する分化誘導促進剤。
【請求項１０】
ｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２の発現又は機能を抑制する物質を含む、心筋細胞への分化阻害剤。
【請求項１１】
前記物質は、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ誘導性核酸、ターゲティングベクター、及び抗体からなる群より選ばれる請求項１０に記載の分化阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞から心筋細胞を分化誘導することにより心筋細胞を製造する方法、及び幹細胞から心筋細胞への分化誘導を促進する分化誘導促進剤、及び心筋への分化誘導を阻害する分化阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に心筋細胞は、出生前は自律拍動しながら活発に細胞分裂を行っているが、出生直後からその分裂能を喪失し、また未分化な前駆細胞は存在しても極僅かである。このため、心筋梗塞や心筋炎等の各種ストレスに曝されることにより心筋細胞が死滅しても、喪失した心筋細胞は補充されることがないとされている。新たな心筋細胞が補充されないと、残存心筋細胞は代償性肥大により心機能を保とうとする。しかし、各種ストレスが持続し、その許容範囲を超えてしまうと、さらなる心筋細胞の疲弊、死滅を誘発して心機能の低下（すなわち、心不全）を呈するようになる。
【０００３】
心不全の最先端治療として、衰弱又は失われた心筋細胞を補充的に移植する方法が試みられている。現在のところ、成体心組織中に心筋細胞を産生し得る前駆細胞もしくは幹細胞として明らかに同定できる細胞集団は見出されていない。このため、移植用の心筋細胞源としては、未分化な幹細胞から分化誘導した心筋細胞が注目されている。心筋細胞源となる幹細胞としては、より未分化で多彩な分化能を有している多能性幹細胞、例えば胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）などが有望視されている。
【０００４】
しかし、ＥＳ細胞又はＥＧ細胞などから形成された胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ：ＥＢ）は、心筋細胞だけでなく、血球系細胞、血管系細胞、神経系細胞、腸管系細胞、及び骨・軟骨細胞などの別種の細胞にも分化し得るため、分化誘導により得られた培養細胞群は、これらの細胞の混合集団である。しかも、心筋細胞への分化効率は、一般的な分化誘導培養では、１０〜６０％程度であるため、得られる分化培養細胞群の中で心筋細胞が占める割合は、全体の５〜２０％程度に過ぎない。このため、幹細胞の分化誘導により細胞治療用の心筋細胞を製造しようとする場合、心筋細胞への分化効率を増大させること、分化誘導細胞群から心筋細胞だけを単離することが重要となる。
【０００５】
ＥＳ細胞から心筋細胞を高率に分化誘導する方法としては、ヒトＥＳ細胞を５−アザシチジンで処理する方法が報告されている（非特許文献１参照）。この方法によれば、ＥＢ中のトロポニンＩ陽性（心筋）細胞が１５％から４４％に増加することが報告されているが、それでも心筋細胞の占める割合がＥＢ中の５０％を越えることはない。
【０００６】
マウスＥＳ細胞では、レチノイン酸（非特許文献２参照）、アスコルビン酸（非特許文献３参照）、ＴＧＦβ、ＢＭＰ−２（非特許文献４参照）、ＢＭＰ−４（非特許文献５参照）、ＰＤＧＦ（非特許文献６参照）、又はＤｙｎｏｒｐｈｉｎ  Ｂ（非特許文献７参照）を添加したり、あるいは、細胞内の活性酸素種（ＲＯＳ）（非特許文献８参照）やＣａ２＋（非特許文献９参照）を増加させる処理を行うことにより、ＥＳ細胞から心筋細胞への分化率が高くなることが報告されている。
【０００７】
さらに、特許文献１には、マウスＥＳ細胞の培養において、ＢＭＰのシグナル伝達を抑制する物質を添加することによって、心筋細胞を選択的かつ高率に分化誘導できることが開示されている。
しかし、これらの何れの方法であっても、移植用細胞源としての心筋細胞を製造するための分化誘導率は、十分満足できるものではない。
【０００８】
上記以外にも、組織幹細胞（ＳＰ細胞、Ｓｃａ１＋細胞、ｉｓｌ１細胞など）をｉｎ  ｖｉｔｒｏでフィーダー細胞と共培養することによって心筋細胞の分化誘導を行う方法が知られている。しかしながら、フィーダー細胞であっても、ＥＳ細胞以外の細胞との共細胞は、最終的に得られる細胞群における心筋細胞の純度を下げることになり、分離操作が別途必要になるなど、移植用細胞源の製造方法としては、実用的でない。
【０００９】
【特許文献１】国際公開第０５／０３３２９８号パンフレット
【非特許文献１】Ｃｈｕｎｈｕｉら、「サーキュレーション・リサーチ」（“Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．”）、９１：５０８．２００２
【非特許文献２】Ｗｏｂｕｓら、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・セルラー・カージオロジー」（“Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．”）、２９：１５２５、１９９７
【非特許文献３】Ｔａｋａｈａｓｈｉら、「サーキュレーション」（“Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ”）、１０７：１９１２、２００３
【非特許文献４】Ｂｅｈｆａｒら、「ＦＡＳＥＢジャーナル」（“ＦＡＳＥＢ  Ｊ．”）、１６：１５５８、２００２
【非特許文献５】Ｓｃｈｕｌｔｈｅｉｓｓら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．、１１（４）、４５１、１９９７
【非特許文献６】Ｓａｃｈｉｎｉｄｉｓら、「カージオバスキュラー・リサーチ」（“Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．”）、５８：２７８、２００３
【非特許文献７】Ｖｅｎｔｕｒａら、「サーキュレーション・リサーチ」（“Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．”）、９２：６２３、２００３
【非特許文献８】Ｓａｕｅｒら、「ＦＥＢＳレターズ」（“ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．”）、４７６：２１８、２０００
【非特許文献９】Ｌｉら、「ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー」（“Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．”）、１５８：１０３、２００２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、心筋細胞を選択的かつ高率に製造する方法、及び幹細胞から心筋細胞への選択的分化誘導を促進する分化誘導促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、心臓原基初期形成に重要なＷｎｔシグナル分子群の発現変化をｐ１９．ＣＬ細胞で網羅的に解析した結果、分化初期に高発現する因子として、ｓＦＲＰ−１遺伝子、ｓＦＲＰ−２遺伝子を単離し、さらに、これらの遺伝子が、胚性癌種細胞（ＥＣ細胞）における心筋細胞への分化誘導時に一過的に高発現すること、及び幹細胞から心筋細胞への分化誘導を促進することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明の心筋細胞の製造方法は、幹細胞から心筋細胞を分化誘導することにより心筋細胞を製造する方法であって、ｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２の存在下で前記幹細胞を分化誘導する工程を含むことを特徴とする。
【００１３】
前記分化誘導工程は、前記幹細胞を、分化誘導時に、ｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２の存在下で培養することにより行なわれることが好ましい。また、前記分化誘導時は、胚様体形成期又は胚様体形成期相当期であってもよいし、あるいは胚様体を経ずに中胚葉が形成された後、心筋細胞に分化誘導されるまでの間の少なくとも１日間であってもよい。
【００１４】
前記幹細胞が胚性幹細胞であってもよいし、体性幹細胞であってもよい。これらの幹細胞は、哺乳動物由来であることが好ましい。
【００１５】
ｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２は、培地中に０．２〜１ｎｇ／ｍｌ存在していることが好ましい。
【００１６】
本発明の分化誘導促進剤は、幹細胞から心筋細胞の分化誘導を促進する心筋の分化誘導促進剤であって、有効成分としてｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２を含有する。
【００１７】
本発明の心筋細胞への分化阻害剤は、ｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２の発現又は機能を抑制する物質を含むもので、前記物質は、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ誘導性核酸、ターゲティングベクター、及び抗体からなる群より選ばれることが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の製造方法によれば、幹細胞の分化誘導時に、ｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２の存在下で培養するだけで、心筋細胞に分化誘導される割合を高くすることができ、効率よく心筋細胞を製造することができる。また、本発明の分化誘導促進剤は、培地に添加するだけで、心筋細胞へ分化する割合を高くすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の心筋細胞の製造方法は、幹細胞から心筋細胞を分化誘導することにより心筋細胞を製造する方法であって、前記幹細胞を、ｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２の存在下で分化誘導する工程を含む。当該工程は、具体的には、分化誘導時に、ｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２の存在下で、幹細胞を培養する工程であることが好ましい。
【００２０】
本発明で用いられる幹細胞は、少なくともインビトロでの培養下で心筋細胞様形質を有する細胞に分化し得る性質を有した未分化細胞であればよい。このような幹細胞としては、適当な条件下において三胚葉（外胚葉、中胚葉、および内胚葉）全ての系譜の細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞が好ましい。
【００２１】
多能性幹細胞としては、既に培養細胞として広く使用されているマウス、サル、ヒト等の哺乳動物由来の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、多能性を有する体性幹細胞等を挙げることができる。マウス由来ＥＳ細胞の具体例としては、ＥＢ３細胞、Ｅ１４細胞、Ｄ３細胞、ＣＣＥ細胞、Ｒ１細胞、１２９ＳＶ細胞、Ｊ１細胞等が挙げられる。ＥＳ細胞、ＥＧ細胞などの作製、継代、保存については、従来公知の方法を用いて実施することができる
【００２２】
体性幹細胞としては、胎児、臍帯血、さらには成体の臓器や骨髄などの生体組織や血液などに由来する体性幹細胞などが挙げられ、これらのうち、中胚葉系幹細胞、間葉系幹細胞が好ましく用いられる。骨髄をインビトロで培養して得られる骨髄間質細胞中には、間葉系幹細胞等の中胚葉に由来する幹細胞が含まれている。また、骨髄以外の組織、例えば、脂肪、臍帯、月経血に含まれる間葉系幹細胞が、中胚葉組織の脂肪、軟骨、骨、骨格筋、心筋に分化誘導できることが報告されている（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら、「サーキュレーションリサーチ」、９５、９−２０、２００４）。
【００２３】
さらに、本発明の製造方法に使用される幹細胞として、上記胚性幹細胞、体性幹細胞の他、胚性癌種細胞（ＥＣ細胞）を使用することもできる。ＥＣ細胞とは、腫瘍中に含まれる胚様細胞（テラトカルシノーマ）のことで、癌細胞ではあるが、未分化で分化全能性を有する胚細胞に類似した性質を有する。ＥＣ細胞の具体例としては、マウス由来のＰ１９．ＣＬ６（文献：再生医療、日本再生医療学会雑誌  Ｖｏｌ．４  Ｎｏ．３、メディカルレビュー社、２００５年、６１−６８頁参照）が挙げられる。
【００２４】
本発明の心筋細胞の製造に用いられる幹細胞は、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）、霊長類（例えば、サル、ヒト）等の哺乳動物由来であることが好ましい。本発明の製造方法によって得られた心筋細胞を細胞治療に用いる場合には、レシピエントと同種の動物由来の幹細胞を用いることが好ましい。また、本発明の製造方法を、再生医療に用いられる心筋細胞のソースに適用しようとする場合には、ヒトの幹細胞が好ましく用いられる。
【００２５】
以上のような幹細胞を、分化誘導時に、ｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２存在下で培養する。
分化誘導時とは、例えば、幹細胞を胚様体形成を経て中胚葉を形成し、さらに心筋が分化されるまでの時期、また胚様体の形成を経ずに中胚葉を形成させる場合には、少なくとも中胚葉への分化誘導を開始させた後、心筋に分化されるまでの時期をいう。
【００２６】
ＥＳ胚様体の形成を経て心筋細胞を製造する場合には、少なくとも胚様体形成期に、ＥＳ細胞を、ｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２存在下で培養することが好ましい。例えば、マウスＥＳ細胞では、胚様体形成期に少なくとも１日間、好ましくは胚様体形成期の１日間と胚葉体形成後に続けて２日間、ｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２存在下で培養することが好ましい。
【００２７】
また、胚様体を形成させずにＥＳ細胞から心筋細胞を製造する場合や体性幹細胞を用いて心筋細胞を製造する場合、マウスＥＳ細胞の胚様体形成期に相当する時期、例えば中胚葉形成期に、マウスＥＳ細胞の胚様体形成期における１日間に相当する期間、ｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２存在下で培養することが好ましい。また、胚様体を形成させずにＥＳ細胞から中胚葉に分化誘導した後、心筋に分化するまでの間の一定期間に、ｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２存在下で培養するようにしてもよい。具体的期間は、使用する幹細胞、培養条件等に応じて、適宜選択される。
【００２８】
ＥＳ細胞をはじめとする幹細胞は、浮遊状態で培養すると胚盤胞に似た分化状態の胚様体になる。胚様体形成までは、幹細胞はインビトロで未分化のままで培養（未分化培養）されるが、このとき、例えばマウスＥＳ細胞においては、ＬＩＦ（白血病抑制因子）存在下で、培養することが好ましい。
【００２９】
胚様体形成のための培養法（胚様体形成培養）には、平面培養法、浮遊凝集培養法、懸濁培養法などがあるが、例えばマウスＥＳ細胞では、それまでに行なっていた幹細胞の培養プレートからトリプシン等を用いて細胞を剥離し、ＬＩＦを除いた培養皿上に懸濁培養することによって行なうことができる。胚様体形成のための方法は特に限定しないが、具体的には、マウスＥＳ細胞を、培養プレートから０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて剥離し、α−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳを含む）に懸濁した後、３×１０４細胞／ｍｌの細胞濃度に調整する。調整した細胞液を、１５μｌづつ、培養皿の上蓋にスポットし（６０〜７０個）、懸濁した細胞滴が下になるように上蓋の向きを返して、培養プレートの下皿に載せて、３７℃、５％二酸化炭素通気下で１〜２日培養することにより行なうことが好ましい。ＥＢ形成時の懸濁液中の細胞密度は３００細胞／滴であることが好ましく、より好ましくは４５０細胞／滴である。
【００３０】
胚様体を介さずに中胚葉を形成させる方法としては、例えばマウスＥＳ細胞では、幹細胞培養液からＬＩＦを除いた後、低細胞濃度で５０ｎｇ／ｍｌ程度のＡｃｔｉｖｉｎで未分化幹細胞を付着培養することにより、中内胚葉（中胚葉前駆細胞）の形成を経て中胚葉が形成する方法；あるいはＬＩＦ等の誘導抑制因子の除去後、ゼラチン塗布した培養皿上で分化培地中にて平面培養を行ない中胚葉を形成する方法などが挙げられる。このような中胚葉を形成させるときに、ｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２存在下で培養するようにしてもよい。
【００３１】
以上のように、分化誘導時に、ｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２存在下で培養する工程において、培地におけるｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２の濃度は、使用する幹細胞の種類、培養条件により適宜選択されるが、例えば、マウスＥＳ細胞を胚様体形成を経て心筋細胞へ分化誘導させる方法では、０．２〜５００ｎｇ／ｍｌが好ましく、より好ましくは０．２〜１０ｎｇ／ｍｌであり、最も好ましくは１ｎｇ／ｍｌ程度である。
【００３２】
ここで、ＦＲＰとは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のことで、ＦＺタンパクのリガンド結合部位に３０〜４０％の相同性を有する約１１０残基のシステインリッチドメインを含む。「Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（ＦＺ）」は、７回膜貫通型の膜タンパク質で、Ｗｎｔファミリーのレセプターである。Ｗｎｔは、細胞外に分泌され、発生、形態形成などの様々な生命現象に関わるＷｎｔシグナル伝達経路のリガンドで、Ｗｎｔシグナルにより、β−カテニンが安定化し、核へ移行して、ＴＣＦ／ＬＥＦファミリーの転写因子と複合体を形成して、標的遺伝子の転写活性化を引き起こす。ＦＲＰは、発生の間及び成人では、Ｗｎｔ作用の阻害剤として機能し得ることが報告されている（Ｆｉｎｃｈら、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ，ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｏｆ  Ｗｎｔ  ａｃｔｉｏｎ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：６７７０−６７７５，１９９７）。また、  ｓＦＲＰ発現は、ｓＦＲＰ−１の抗アポトーシス効果を通して、子宮の平滑筋の発生に寄与することが報告されている（Ｆｕｋｕｈａｒａ，Ｋら、「Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １  ｉｓ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｕｔｅｒｉｎｅ  ｌｅｉｏｍｙｏｍａｓ，ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｈｉｇｈ  ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｕｎｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｍｅｔａｂ．８７：１７２９−１７３６，２００２）。また、単球を抗ＦＲＰ−１モノクローナル抗体の存在下でインビトロ培養開始後、約２４時間で破骨細胞へ分化させることができることが提案報告されている（特開平１１−１９６８６４）。しかしながら、ｓＦＲＰ−１又は２が、心筋の分化誘導に関係あることは知られていない。
【００３３】
本発明で用いることができるｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２は、例えば、幹細胞がヒト由来細胞であれば、ヒト由来のｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２のように同種由来のものを用いるのが好ましい。ヒト由来のｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２としては、ＮＣＢＩデータベースにアクセッション番号ＮＰ０３８８６２又はＮＰ０３３１７０として登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。また、用いる幹細胞と異なる種由来のｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２やその誘導体であっても、それらの細胞に対し、ｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２活性がある場合には、本発明でいうｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２に含まれる。
【００３４】
分化誘導は、未分化細胞が中胚葉から心筋細胞へ分化誘導がおこるような条件であれば、いかなる条件でもよく、用いる幹細胞により適宜選択される。例えば、マウスＥＳ細胞を用いる場合には、ＬＩＦ不在下、好ましくは心筋細胞への分化誘導剤存在下で培養することにより行なう。心筋細胞への分化誘導剤としては、例えば、ＤＭＳＯ、血清、５−アザシチジン、トリコスタチンＡなどを用いることができる。
【００３５】
分化誘導時の培養方法は、特に限定しないが、好ましくは付着培養である。ゼラチン等の細胞外マトリックスをコートした培養皿を用いて付着培養してもよいし、温度感応性応答培養皿を用いて心筋細胞シートを作製させるようにしてもよい。
【００３６】
尚、本発明の製造方法は、少なくとも分化誘導時に、ｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２の存在下で培養すればよく、例えば胚様体形成後も続けてｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２の存在下で培養することを排除するものではない。また、胚様体形成までの未分化培養も、ｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２存在下で行なっても良い。
【００３７】
本発明の製造方法で使用する培地、すなわち胚様体形成培養及び分化誘導培養に用いられる培地は、幹細胞の培養で使用する培地を用いることができる。例えば、、最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、Ｆ１２培地またはＲＰＭＩ１６４０培地、あるいはそれらの混合培地を基本培地として含むものなどである。これらの培地には、必要に応じて、各種アミノ酸、各種無機塩、各種ビタミン、各種抗生物質、緩衝剤などが含有されている。培養条件は適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０℃〜約４０℃である。
【００３８】
以上のような条件で、幹細胞を培養することにより、心筋細胞に選択的に分化誘導されて、心筋細胞を高率的に製造することができる。
【００３９】
本発明の製造方法により得られる心筋細胞の集団には、最終分化された心筋細胞の他、将来、機能的な心筋細胞となり得る能力を有した心筋前駆細胞や、胎児型心筋細胞など、分化段階の細胞を含でいてもよい。
【００４０】
心筋細胞に分化されたか否かは、胚様体の自律拍動効率の上昇、心筋マーカー遺伝子の発現、又はｃＴｎＴ等の心筋タンパク質の発現レベル等により判定できる。移植用細胞源として用いる場合、生細胞の状態で判定する必要があることから、心筋細胞であることの確認は、自律拍動の有無、電気生理的刺激に対する反応などにより行なうことが好ましい。
【００４１】
心筋細胞に特異的な種々のマーカーの発現は、従来の生化学的又は免疫化学的手法により検出される。その方法は特に限定されないが、好ましくは、免疫化学的染色法や免疫電気泳動法などの免疫化学的手法が使用される。これらの方法では、心筋前駆細胞又は心筋細胞に結合するマーカー特異的ポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体を使用することができる。個々の特異的マーカーを標的とする抗体は市販されており、容易に入手することが可能である。心筋前駆細胞又は心筋細胞に特異的なマーカーとしては、例えば、ミオシン重鎖／軽鎖、α−アクチニン、トロポニンＩ、ＡＮＰ、ＧＡＴＡ−４、Ｎｋｘ２．５、ＭＥＦ−２ｃ等が挙げられる。
【００４２】
本発明の製造方法によれば、従来より既知の心筋分化誘導促進因子であるＢＭＰ２，ＢＭＰ−４，Ｎｏｇｇｉｎよりも高率で心筋細胞へ分化するので、心筋細胞の生産性が高い。例えばマウスＥＳ細胞、ＥＢ細胞では、分化誘導開始から７〜１５日経過後において、培養されたＥＢのうち９８％以上が自律拍動性を有する心筋細胞に分化できる。また、本発明の製造方法では、ｓＦＲＰ−１、２添加後の心筋構造タンパク質（ｃＴｎＴ）の発現量が、例えばマウスＥＳ細胞、ＥＢ細胞では、１３日後に４〜５倍上昇する程度に高く、この点からも、心筋細胞への分化誘導が促進され、高率で心筋細胞が生産されるといえる。
【００４３】
尚、以上の実施態様においては、ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２は、それ自体を培地に添加する場合について説明したが、これらに代えて、ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２を少なくとも上記期間に発現することができるｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２遺伝子として存在させていてもよい。具体的には、ｓＦＲＰ−１遺伝子又はｓＦＲＰ遺伝子２の発現ベクターまたはこれらの遺伝子発現ベクターを導入した細胞、ｓＦＲＰ−１遺伝子又はｓＦＲＰ遺伝子発現、分泌細胞との共培養などが挙げられる。
【００４４】
〔分化誘導促進剤〕
本発明の分化誘導促進剤は，幹細胞から心筋細胞の分化誘導を促進する心筋の分化誘導促進剤であって、有効成分としてｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２を含有する。
本発明で用いることができるｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２としては、例えば、ＮＣＢＩデータベースにアクセッション番号ＮＰ０３８８６２又はＮＰ０３３１７０として登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。用いる幹細胞と異なる種由来のｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２やその誘導体であっても、それらの細胞に対し、ｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２活性がある場合には、本発明でいうｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２に含まれる。
【００４５】
本発明の分化誘導促進剤は、具体的には、これらのタンパク質が安定して存在できる形態を有する。例えば、溶媒として、リン酸ナトリウムバッファーを用いたｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２含有溶液などが挙げられる。溶液のｐＨは７．２〜７．６であることが好ましい。
本発明の分化誘導促進剤は、有効成分であるｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２、溶媒の他、必要に応じて緩衝液、ｐＨ調節剤、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などが含有されていてもよい。
また、本発明の分化誘導促進剤の担体は、上記溶媒などを用いることができる。
【００４６】
〔分化阻害剤〕
本発明の心筋細胞への分化阻害剤は、幹細胞においてｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２のうちの少なくとも何れかの発現を抑制する物質（発現抑制物質）を含むものである。あるいは、培養中の幹細胞が発現、分泌したｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２の機能を失わせるように、変性させる物質（変性物質）を含むものである。
【００４７】
変性物質を、幹細胞の培地に添加することにより、培養中のｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２の濃度が相対的に増加することが抑制されるため、心筋細胞への分化誘導が抑制されることになる。このような変性物質としては、例えば、抗ｓＦＲＰ−１抗体、抗ｓＦＲＰ−２抗体などが挙げられる。
【００４８】
ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２の発現抑制物質は、ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾、局在化及び蛋白質フォールディング等の、いかなる段階で作用するものであってもよい。
【００４９】
発現抑制物質の例は、ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２をコードする遺伝子の転写産物、詳細にはｍＲＮＡもしくは初期転写産物に対するアンチセンス核酸である。アンチセンス核酸とは、標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）を発現する細胞の生理的条件下で該標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）とハイブリダイズし得る塩基配列からなり、且つハイブリダイズした状態で該標的ｍＲＮＡ（初期転写産物）にコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得る核酸をいう。アンチセンス核酸の種類はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。さらに、アンチセンス核酸は、ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２をコードする遺伝子の転写産物とハイブリダイズして翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡと結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ｍＲＮＡへの転写を阻害し得るものであってもよい。
【００５０】
発現抑制物質のさらに別の例は、ＲＮＡｉ誘導性核酸である。ＲＮＡｉ誘導性核酸とは、細胞内に導入されることにより、ＲＮＡｉ効果を誘導し得る核酸をいい、好ましくはＲＮＡである。ＲＮＡｉ効果とは、ｍＲＮＡと同一のヌクレオチド配列（又はその部分配列）を含む２本鎖構造のＲＮＡが、当該ｍＲＮＡの発現を抑制する現象をいう。ＲＮＡｉ効果を得るには、例えば、少なくとも２０以上の連続する標的ｍＲＮＡと同一のヌクレオチド配列（又はその部分配列）を有する２本鎖構造のＲＮＡを用いることが好ましい。２本鎖構造は、異なるストランドで構成されていてもよいし、一つのＲＮＡのステムループ構造によって与えられる２本鎖であってもよい。ＲＮＡｉ誘導性核酸としては、たとえばｓｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどが挙げられる。
【００５１】
このような発現抑制物質は、ウィルスベクターなどを用いて、幹細胞に導入される。発現抑制物質が導入された幹細胞は、ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２の発現が抑制され、心筋細胞への分化が阻害される。
【実施例】
【００５２】
〔幹細胞〕
以下の実施例では、幹細胞として、Ｐ１９．ＣＬ６細胞及びＥＢ５細胞を用いた。Ｐ１９．ＣＬ６細胞は、マウス由来の胚性癌腫細胞である。ＥＢ５細胞は、マウス由来のＥ１４ｔｇ２ａ細胞を親株として、未分化発現遺伝子Ｏｃｔ３／４遺伝子座にＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ  Ｓ薬剤耐性遺伝子を組み込んで作成されたＥＳ細胞株である。分化したＥＳ細胞株では、耐性遺伝子を発現しないため、培養液中への２０Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ  Ｓ投与により、分化細胞を除去して未分化ＥＳ細胞のみを継代可能である。
【００５３】
〔Ｐ１９．ＣＬ６心筋分化誘導時におけるｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２の経時的発現パターン〕
Ｐ１９．ＣＬ６細胞をα−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳを含む）培地で１０ｃｍプレートにて付着培養を行い、剥離（０．０５％トリプシン−１ｍＭ  ＥＤＴＡ含有液で３分間振盪）・播種（４０倍希釈）を繰り返し継代培養した。３回目の継代培養後、細胞を剥離し、１ｘ１０４細胞／ｍｌ濃度で２ｍｌのα−ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ、１％ＤＭＳＯを含むＭＥＭ培地）中にて１４日間、培地交換を一日毎に行い分化誘導培養を行った。培養０日目、３日後、５日後、７日後、１０日後、１２日後、１４日後に、培養液を除き、細胞をＰＢＳ１ｍｌで２回洗浄後、１．５ｍｌチューブに移し、２５００回転、１分間の遠心操作で細胞を回収した。回収した細胞にＴｒｉｚｏｌを１ｍｌ加えて細胞を破砕し、ＲＮＡを６０％イソプロパノールで精製した。精製した全ＲＮＡ２５ｍｇをＤＮａｓｅＩ酵素で３７℃、１５分間処理しゲノムＤＮＡを除去した後、逆転写酵素Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｎｏ．１８０６４−０１４）２ｍｌを用いて、ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを用いて定量ＲＴ−ＰＣＲを行い、ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２、ＧＡＴＡ−４の発現量を定量した。具体的には、合成したｃＤＮＡの５０分の１量にＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  １２．５ｍｌ（ＡＢＩ）と２ｍＭプライマー混合液２．５ｍｌを混合して、ＰＲＩＳＭ７０００（ＡＢＩ）を用いて定量ＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。各遺伝子発現量はハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨの発現量で基準化した。使用した定量ＲＴ−ＰＣＲプライマーの配列は下記の通りである。
【化１】
2007267658.tif 000003
【００５４】
ｓＦＲＰ−１発現量の経時変化を図１、ｓＦＲＰ−２発現量の経時変化を図２、ＧＡＴＡ−４発現量の経時変化を図３に示す。
ＤＭＳＯを用いてｐ１９．ＣＬ６細胞を分化誘導した場合、図３から、初期心筋分化に必須なGATA-4の発現のピークは１０日目であることがわかる。図１及び図２から、ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２のいずれも、１０日目に一過的に発現量が上昇していることがわかった。
【００５５】
〔ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２  ｓｉＲＮＡによる遺伝子欠損と心筋マーカーの発現変化〕
ＭＬＵＶレトロウイルスベクターにおいて、マウスＵ６プロモーターの下流にＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイトを導入し、両制限酵素サイトの間に、ｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２をコードする遺伝子を連結して、ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２のｓｉＲＮＡを発現させることができるｓｉＲＮＡベクターを構築した。尚、ｓＦＲＰ−１のｓｉＲＮＡ又はｓＦＲＰ−２のｓｉＲＮＡは、下記合成オリゴマーを二重鎖にしてクローニングした。
【化２】
2007267658.tif 000004
【００５６】
２９３Ｔ細胞を３．５ｘ１０５細胞／ｍｌで６穴プレートに播種して、３７℃、５％二酸化炭素通気下で培養した。２４時間後、上記で構築したｓｉＲＮＡレトロベクターＤＮＡ  ２ｍｇ、Ｇａｇ／Ｐｏｌ  ＤＮＡ  ０．５ｍｇ、ＶＳＶ−Ｇ  ＤＮＡ  ０．５ｍｇ、１００ｍｌ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、及び１０ｍｌ  ＦｕＧｅｎｅ６を含有する混合液を加えて、２４時間培養することにより、２９３Ｔ細胞に遺伝子導入して、ｓｉＲＮＡレトロウィルス産生細胞を作製した。培養上清を除き、α−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）１ｍｌを加えて、２４時間培養し、レトロウイルスを産生させた。レトロウイルスを含む培養上清に、α−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）１ｍｌ及び４ｍｇ／ｍｌのポリブレン２ｍｌを添加混合した後、０．４５ｍｍフィルターに通してウイルス液を調製した。
【００５７】
このウィルス液を、１ｘ１０４細胞／ｍｌで播種したＰ１９．ＣＬ６細胞に加え、２４時間、３７℃、５％二酸化炭素通気下で培養することにより、ウイルス感染させた。感染後、ウイルス液を除去し、選択培地として、２ｍｇ／ｍｌピューロマイシンを含むα−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）２ｍｌで４日間培養することにより、ｓｉＲＮＡレトロウイルスが感染したＰ１９．ＣＬ６細胞を選択した。
ウィルス感染細胞（ｓｉＲＮＡ発現Ｐ１９．ＣＬ６細胞）の選択後、直ちに、培地に１％ＤＭＳＯを添加することにより、分化誘導を行った。分化誘導１０日後のｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２及び心筋分化マーカー遺伝子（ＧＡＴＡ−４、Ｎｋｘ２．５、α−ＭＨＣ）の発現量を測定した。ｓＦＲＰ−１ｓｉＲＮＡ単独発現細胞（図中、ｓＦ１）、ｓＦＲＰ−２ｓｉＲＮＡ単独発現細胞（ｓＦ２）、さらにｓＦＲＰ−１ｓｉＲＮＡ及びｓＦＲＰ−２ｓｉＲＮＡの共発現細胞（ｓＦ１＋２）における各遺伝子のノックダウン効率の測定結果を図４，各ｓｉＲＮＡ発現細胞におけるＤＭＳＯ分化１３日後の心筋分化マーカー発現量の測定結果を図５に示す。
【化３】
2007267658.tif 000005
【００５８】
図４に示すように、ｓＦＲＰ−１  ｓｉＲＮＡ単独発現細胞では、ＤＭＳＯ分化誘導時に、ｓＦＲＰ−１の転写活性を７８％失っており、ｓＦＲＰ−２  ｓｉＲＮＡ単独発現細胞では、ＤＭＳＯ分化誘導時に、ｓＦＲＰ−２の転写活性を９３％失っていた。また、ｓＦＲＰ−１  ｓｉＲＮＡ単独発現細胞では、ｓＦＲＰ−１  ｓｉＲＮＡがｓＦＲＰ−１のみならず、ｓＦＲＰ−２の発現も抑制してい。同様に、ｓＦＲＰ−２  ｓｉＲＮＡ単独発現細胞においても、ｓＦＲＰ−２  ｓｉＲＮＡがｓＦＲＰ−２のみならず、ｓＦＲＰ−１の発現も抑制していた。さらに、ｓＦＲＰ−１  ｓｉＲＮＡ及びｓＦＲＰ−２  ｓｉＲＮＡの共発現細胞では、ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２の発現抑制が増強されていた。これらのことから、相同性の高い両者のｓｉＲＮＡが相互にｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２の発現を抑制していると考えられる。
【００５９】
図５から、ｓＦＲＰ−１ｓｉＲＮＡ単独発現細胞（図中、ｓＦ１）、ｓＦＲＰ−２ｓｉＲＮＡ単独発現細胞（図中、ｓＦ２）、さらにｓＦＲＰ−１ｓｉＲＮＡ及びｓＦＲＰ−２ｓｉＲＮＡの共発現細胞（図中、ｓＦ１＋２）のいずれにおいても、心筋分化マーカー遺伝子（ＧＡＴＡ−４、Ｎｋｘ２．５、α−ＭＨＣ、α−Ａｃｔｉｎ）の発現が著しく抑制されており、共発現細胞では、その抑制効果はさらに促進されていることが確認できた。従って、ｓＦＲＰ−１とｓＦＲＰ−２は相乗的に心筋分化に関与していることが明らかになった。
【００６０】
〔ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２の添加条件と心筋細胞への分化誘導の関係〕
０．１％ゼラチン処理した１０ｃｍプレートに、Ｇ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ；Ｎｏ．１１７１０−０３５、１０％  ＫＤＲ、１０００Ｕ／ｍｌ  ＬＩＦ、５０ｍｇ／ｍｌ  Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎｅを含む）培地をいれて、マウスＥＳ細胞由来の胚様体（ＥＢ５）の未分化付着培養を行った。培養細胞の剥離（０．２５％トリプシン−１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５分間）、新たな培地への播種（１０倍希釈）を繰り返して、継代培養した。２回目の継代培養後、細胞を剥離し、０．１％ゼラチン処理した６穴プレートにてＧ−ＭＥＭ（１０％  ＫＤＲ、１０００Ｕ／ｍｌ  ＬＩＦ、５０ｍｇ／ｍｌ  Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎｅを含む）培地２ｍｌで２日間未分化培養した後、細胞を再び剥離し、１５ｍｌチューブに細胞液を移し、８００ｇ、４分間遠心操作を行い、α−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ；Ｎｏ．１２５７１−０６３、１０％ＦＢＳを含む）培地に懸濁した。剥離した細胞を３ｘ１０４細胞／ｍｌ細胞濃度に調整し、細胞液を１５ｍｌずつ培養皿の上蓋にスポットし（６０〜７０個）、懸濁した細胞滴が下になるように上蓋の向きを返して、培養プレートの下皿に載せて３７℃、５％二酸化炭素通気下で１日間、胚様体形成培養を行った。０．１％ゼラチン処理した９６穴プレートの各ウェルにα−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳを含む）１００μｌを入れて、１ｍｌチップで各胚様体を１個ずつ移し、α−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳを含む）培地交換を一日毎に行い付着培養にて分化誘導培養を１５日間行った。
【００６１】
ｓＦＲＰ−１（Ｎｏ．１３８４−ＳＦ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）又はｓＦＲＰ−２  （１１６９−ＦＲ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）１００ｎｇ／ｍｌを、下記（１）〜（６）の時期に添加した。
（１）未分化培養２日間のみに添加  
（２）未分化状培養２日間と胚様体形成期１日間
（３）未分化状培養２日間と胚様体形成期１日間とそれに続くＥＢ付着培養１日間  
（４）胚様体形成期１日間のみ
（５）胚様体形成期１日間とＥＢ付着培養１日間
（６）胚様体形成期１日間とＥＢ付着培養２日間。  
【００６２】
比較のために、心筋細胞への分化誘導因子として知られているＮｏｇｇｉｎを、Ｎｏｇｇｉｎ添加効果が認められると考えられている上記添加条件（２）（未分化培養時の２日間と胚様体形成時の１日間）の場合に、１５０ｎｇ／ｍｌで投与した。また、コントロールとして、ｓＦＲＰ−１及びｓＦＲＰ−２のいずれも添加しなかった以外は同様の条件で分化誘導培養を行なった。
分化誘導培養９日後、１１日後、１３日後に、自律拍動を光学顕微鏡で観察し、自律拍動率を求めた。
【００６３】
自律拍動率は、各培養条件について４８個のプレートで培養し、自律拍動を示すプレートの割合を、全ＥＢ数に対する拍動性ＥＢ数の割合として算出した。
ｓＦＲＰ−１を上記（１）〜（６）の添加条件で添加した場合の自律拍動率を図６（ａ）〜（ｆ）、ｓＦＲＰ−２を上記（１）〜（６）の添加条件で添加した場合の自律拍動率を図７（ａ）〜（ｆ）に示す。図６及び図７中、ｓＦＲＰ添加の場合は黒四角（■）及び実線で示され、ｓＦＲＰ無添加の場合は黒四角（■）及び点線で示され、Ｎｏｇｇｉｎ添加の場合には白丸（○）と実線で示している。
【００６４】
図６及び図７から、ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２を、（１）〜（６）のいずれの条件で添加しても、ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２不在のコントロールより自立拍動率が上昇した。添加条件としては１３日目で８０％の自立拍動率を示す添加条件（１）〜（６）、好ましくは８０％以上の効果を示す添加条件（４）〜（６）、より好ましくは９日〜１３日目において未処理に対して最も高い促進効果が認められる添加条件（６）でＥＳ細胞を処理することが望ましいことがわかる。また、図６（ｂ）及び図７（ｂ）から、添加条件（２）においても、ｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２の投与効果は、Ｎｏｇｇｉｎの投与効果と同等かそれ以上であることがわかる。従って、添加条件（６）でｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２を投与した場合の分化誘導促進効果は、Ｎｏｇｇｉｎによる分化誘導促進効果をはるかにしのぐことがわかる。
また、マウスＥＳ細胞を用いた心筋細胞への分化誘導系において、ヒトのｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２が心筋への分化誘導促進効果を確認できたこと、マウスｓＦＲＰ−１とヒトｓＦＲＰ−１ホモローグはアミノ酸レベルで９４％の相同性があり、マウスｓＦＲＰ−２とヒトｓＦＲＰ−２ホモローグはアミノ酸レベルで９８％の相同性があることから、マウスＥＳ細胞に対してマウスのｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２の心筋への分化誘導促進効果はもちろん、ヒトのＥＳ細胞に対するｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２の心筋への分化誘導促進効果もあると大いに考えられる。
【００６５】
〔ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２の含有濃度と心筋細胞への分化誘導との関係〕
上記添加条件（６）の場合について、心筋分化効率が促進されるｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２の至適濃度を調べた。
０．１％ゼラチン処理した９６穴プレートの各ウェルに、分化誘導培地（１０％ＦＢＳを含有したα−ＭＥＭ培地）１００μｌ入れ、さらにｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２を、０．２、１、１０、５０、１００、５００ｎｇ／ｍｌで添加した。各濃度について４８ウェルづつ調製し、各ウェルに、１ｍｌチップで各胚様体を１個ずつ移し、α−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳを含む）培地交換を一日毎に行い、付着培養にて分化誘導培養を１５日間行った。
【００６６】
分化誘導培養９日後、１１日後、１３日後に、自律拍動を光学顕微鏡で観察し、上記の添加時期の検討の場合と同様にして、自律拍動率を求めた。ｓＦＲＰ−１添加の場合の測定結果を図８、ｓＦＲＰ−２添加の場合の測定結果を図９に示す。図８及び図９において、ｓＦＲＰ添加の場合を、実線で示す。また、比較のために、ｓＦＲＰ無添加の場合を、点線で示す。
【００６７】
図８から、付着培養後１１日目では、いずれの濃度の場合も、ｓＦＲＰ−１不在の場合よりも、ｓＦＲＰ−１を添加した場合の方が自律拍動率が高くなった。１〜１０ｎｇ／ｍｌの場合には、付着培養９日目から自律拍動率が高くなる傾向が認められた。特に１ｎｇ／ｍｌの場合には、付着培養後９〜１１日目において促進効果が認められ、且つ１１日目で９０％以上が自律拍動を示し、心筋細胞への分化誘導が高率に促進されていることがわかる。
【００６８】
図９から、ｓＦＲＰ−２添加の場合には、いずれの濃度であっても、付着培養７日目から、ｓＦＲＰ不在の場合よりも、高い自律拍動率を示した。特に、０．２〜１０ｎｇ／ｍｌの場合に、この傾向は顕著であった。また、０．２〜１ｎｇ／ｍｌの場合には、付着培養後９日目において６０％以上の促進効果が認められ、且つ１１日目で９０％以上が自律拍動を示し、心筋細胞への分化誘導が高率に促進されていることがわかる。
【００６９】
〔ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２の添加濃度と心筋構造タンパク質ｃＴｎＴの発現効果との関係〕
０．１％ゼラチン処理した９６穴プレートの各ウェルに、分化誘導培地（１０％ＦＢＳを含有したα−ＭＥＭ培地）１００μｌ入れ、さらにｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２を、０．２、１、１０、５０、１００、５００ｎｇ／ｍｌで添加した。各濃度について８ウェルづつ調製し、各ウェルに、１ｍｌチップで各胚様体を１個ずつ移し、α−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳを含む）培地交換を一日毎に行い、付着培養にて分化誘導培養を１０日間行った。
【００７０】
付着培養１０日目に、心筋構造タンパク質ｃａｒｄｉａｃ  ｔｒｏｐｏｎｉｎＴ（ｃＴｎＴ）量を、細胞免疫染色法により調べた。細胞免疫染色は、細胞をＰＢＳ１ｍｌで２回洗浄後、２％パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ１ｍｌで２０分間、固定した後、ＰＢＳ洗浄を３回行い、０．２％トリトンＸ１００−ＰＢＳで１５分間、抗体透過処理を行った。３％ＢＳＡ−ＰＢＳで３０分間、非特異的抗体吸着を抑制した後、マウス抗ｃＴｎＴ抗体（２００倍希釈：ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ）で１時間、一次抗体反応を行った。ＰＢＳ洗浄３回後、Ａｌｅｘａ４８８−抗マウスＩｇＧ抗体（５００倍希釈：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）で１時間、二次抗体反応を行った後、ＰＢＳで３回洗浄することにより、未反応の抗体を除去した。免疫染色法後、蛍光強度を蛍光プレートリーダー（ＤＴＸ８８０）で測定し、８ウェルの蛍光強度の平均値を求めた。
【００７１】
ｓＦＲＰ−１の測定結果を図１０に、ｓＦＲＰ−２の測定結果を図１１に示す。
０．２〜１ｎｇ／ｍｌでｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２処理をした１０日目のＥＢはｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２未処理に比べてｃＴｎＴタンパク量が２．５〜３倍亢進していることが確認できた。１０〜５０ｎｇ／ｍｌでｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２処理でも有意な促進効果が認められた。
【００７２】
〔ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２の投与と心筋構造蛋白質ｃＴｎＴ発現の経時的変化〕
０．２ｎｇ／ｍｌ及び５０ｎｇ／ｍｌでｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２を添加して、付着培養４日後、７日後、１０日後、１３日後の心筋構造タンパク質ｃＴｎＴの発現変化を抗ｃＴｎＴ抗体による細胞免疫染色法を用いて調べた。抗ｃＴｎＴ抗体による細胞免疫染色方法は、上記のｓＦＲＰの添加濃度とｃＴｎＴの発現効果との関係を調べた場合と同様にして行なった。
【００７３】
また、付着培養４日後、７日後、１０日後、１３日後に、あわせて、核染色を行なった。核染色は、ヘキスト３３３４２（１０００倍希釈）−ＰＢＳで１０分間反応させることにより行なった。
抗ｃＴｎＴ抗体による細胞染色及びヘキストによる核染色の様子を蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ７１）で観察した。ｓＦＲＰ−１投与の場合の染色像を図１１、ｓＦＲＰ−２投与の場合の染色像を図１２に示す。また、ｃＴｎＴタンパク量を蛍光プレートリーダーで測定し、６ウェルの蛍光強度の平均値を算出した結果を図１３に示す。
図１３から、付着培養７日目で  ０．２ｎｇ／ｍｌのｓＦＲＰ−１添加、又は５０ｎｇ／ｍｌのｓＦＲＰ−２添加の場合にｃＴｎＴの発現が促進されていた。付着培養１３日目では、ｓＦＲＰ−１又はｓＦＲＰ−２添加の場合には、コントロール（ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２のいずれも無添加）と比べて、ｃＴｎＴの発現を３倍も増強していることがわかった。
【００７４】
〔ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２投与による心筋構造遺伝子ｃＴｎＴの発現と、既知促進因子投与による心筋構造遺伝子ｃＴｎＴの発現との比較〕
ＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２に代えて、分化誘導培地に既知の分化誘導促進因子ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４又はＮｏｇｇｉｎを添加した場合のｃＴｎＴ遺伝子の発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲで測定した。ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２、既知促進因子（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、Ｎｏｇｇｉｎ）を添加した場合について、分化誘導培養７日後、１０日後、１３日後のｃＴｎＴ遺伝子発現量の測定結果を図１４に示す。
【００７５】
尚、添加濃度については、Ｎｏｇｇｉｎは１５０ｎｇ／ｍｌであり、その他は０．２ｎｇ／ｍｌとした。また、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４の投与時期は胚様体形成期の懸滴培養１日間とした。
【００７６】
ｃＴｎＴ遺伝子発現量の測定は、次のようにして行なった。添加因子それぞれの場合について、８ウェルずつ分化誘導培養をし、付着培養後７日目、１０日目、１３日目に、ＰＢＳで２回洗浄後、形成されたＥＢを剥離し、ＥＢ４個ずつを１．５ｍｌチューブに回収した。ＲＮａｅｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、回収したＥＢの全ＲＮＡを抽出した。抽出した全ＲＮＡ２００〜４００ｎｇとＥｘｓｃｒｉｐｔ（ＴＡＫＡＲＡ）用いて、抽出したＲＮＡのｃＤＮＡ合成を行った。合成したｃＤＮＡの１０分の１量とｃＴｎＴプライマー２ｍＭの混合液２ｍｌ、Ｐｏｗｅｒ  Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ（ＡＢＩ）１０ｍｌを混和し、反応液２０ｍｌで定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。定量ＲＴ−ＰＣＲに用いたｃＴｎＴプライマーは次の通りである。
【化４】
2007267658.tif 000006
【００７７】
図１４から、付着培養７日目でのｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２投与ＥＢ群のｃＴｎＴ発現量はコントロール（分化誘導促進因子不在）に比べて５倍以上亢進している事が確認できた。さらに、付着培養１０日目では、ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２投与ＥＢ群のｃＴｎＴ発現量が、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４投与ＥＢ群の発現量よりも高かった。また、Ｎｏｇｇｉｎ投与群の発現量と比較した場合、付着培養１０日目でｓＦＲＰ−１投与群のｃＴｎＴ発現量の方が高く、付着培養１３日目ではｓＦＲＰ−２投与ＥＢ群の方が高かった。さらに、ｓＦＲＰ−１投与ＥＢ群のｃＴｎＴ発現量は１０日目をピークに減少し、ＢＭＰ−４投与群、Ｎｏｇｇｉｎ投与群においても、この傾向が認められた。これに対して、ｓＦＲＰ−２投与群のｃＴｎＴ発現量は、付着培養１０日目、１３日目と増加しており、分化誘導促進効果が、他の因子よりも持続することがわかった。
【００７８】
〔ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２投与による心筋マーカー遺伝子の発現量と、既知分化誘導促進因子投与による心筋マーカー遺伝子の発現量との比較〕
ＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２に代えて、分化誘導培地に既知の分化誘導促進因子ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４又はＮｏｇｇｉｎを添加した場合について、付着培養７日目の心筋遺伝子（ＧＡＴＡ−４、Ｎｋｘ２．５、α−ＭＨＣ）の発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲにより解析した。ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２と既知促進因子ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、Ｎｏｇｇｉｎを添加した場合の心筋マーカー遺伝子の発現量の比較結果を図１５に示す。
尚、添加濃度については、Ｎｏｇｇｉｎは１５０ｎｇ／ｍｌであり、その他は０．２ｎｇ／ｍｌとした。また、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４の投与時期は胚様体形成期の懸滴培養１日間とした。
【００７９】
図１５から、いずれの心筋マーカー遺伝子（ＧＡＴＡ−４、Ｎｋｘ２．５、α−ＭＨＣ）の発現量も、ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２投与ＥＢ群の方が、コントロール（分化誘導因子不在）よりも高かった。また、ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２投与群の心筋マーカー遺伝子の発現量は、他の既促進因子（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、Ｎｏｇｇｉｎ）投与群の発現量よりも高く、ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２がこれらの既知促進因子よりも高い促進効果を有することが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明の心筋細胞の製造方法は、現在知られている分化誘導促進因子を用いた場合よりも心筋細胞への分化誘導が高率であるｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２を用いているので、幹細胞から移植細胞用の心筋細胞の製造方法として有用である。
本発明の心筋細胞への分化誘導促進剤は、現在知られている分化誘導促進因子よりも幹細胞から心筋細胞へ選択的且つ高率に分化誘導することができるので、心筋細胞を選択的且つ高率に分化誘導したい場合に有用である。
本発明の分化阻害剤は、心筋細胞への分化誘導を阻害するので、心筋細胞以外の細胞に分化誘導したい場合、心筋細胞又はそれ以外の細胞への分化誘導の研究に、利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】Ｐ１９．ＣＬ６細胞の心筋への分化誘導後のｓＦＲＰ−１発現量の経時変化を示すグラフである
【図２】Ｐ１９．ＣＬ６細胞の心筋への分化誘導後のｓＦＲＰ−２発現量の経時変化を示すグラフである
【図３】Ｐ１９．ＣＬ６細胞の心筋への分化誘導後のＧＡＴＡ−４発現量の経時変化を示すグラフである。
【図４】Ｐ１９．ＣＬ６細胞並びにｓＦＲＰ−１及び／又はｓＦＲＰ−２のｓｉＲＮＡを発現するＰ１９．ＣＬ６細胞におけるｓＦＲＰ−１,ｓＦＲＰ−２の発現量を示すグラフである。
【図５】Ｐ１９．ＣＬ６細胞並びにｓＦＲＰ−１及び／又はｓＦＲＰ−２のｓｉＲＮＡを発現するＰ１９．ＣＬ６細胞における心筋分化マーカー遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図６】ＥＢ５細胞におけるｓＦＲＰ−１の各種添加条件と自律拍動率の関係を示すグラフである。
【図７】ＥＢ５細胞におけるｓＦＲＰ−２の各種添加条件と自律拍動率の関係を示すグラフである。
【図８】ＥＢ５細胞におけるｓＦＲＰ−１の各添加濃度と自律拍動率の関係を示すグラフ群である。
【図９】ＥＢ５細胞におけるｓＦＲＰ−２の各添加濃度と自律拍動率の関係を示すグラフ群である。
【図１０】（ａ）はｓＦＲＰ−１の濃度とｃＴｎＴ発現量との関係を示すグラフであり、（ｂ）はｓＦＲＰ−２の濃度とｃＴｎＴ発現量との関係を示すグラフである。
【図１１】ｓＦＲＰ−１添加によるＥＢ５細胞のｃＴｎＴタンパクの発現変化を示す顕微鏡写真である。
【図１２】ｓＦＲＰ−２添加によるＥＢ５細胞のｃＴｎＴタンパクの発現変化を示す顕微鏡写真である。
【図１３】ｓＦＲＰ−１及びｓＦＲＰ−２添加によるＥＢ５細胞のｃＴｎＴタンパクの発現量の経時変化を示すグラフである。
【図１４】ｓＦＲＰ−１及びｓＦＲＰ−２添加によるＥＢ５細胞のｃＴｎＴ遺伝子の発現量の経時変化を示すグラフである。
【図１５】ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２及び既知分化誘導促進因子と、心筋マーカータンパク発現量との関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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