(57)【要約】      （修正有）【課題】高温下で活性を示す耐熱性リゾチームを提供する。【解決手段】好熱菌サーマス・アクアチカスに感染するバクテリオファージΦＩＮ９３由来の、特定のアミノ酸配列を有する耐熱性リゾチーム、または前記の配列に対し１乃至複数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有しかつ耐熱性の活性を示すリゾチーム、及び該酵素のアミノ酸配列をコードする特定の塩基配列を持つ遺伝子。この耐熱性リゾチームは、反応至適温度が６０〜１２０℃と高い温度条件下で良好な活性を示し、高温環境下における殺菌等に好適に用いられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する耐熱性リゾチーム、または、配列番号２記載の配列に対し１乃至複数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有しかつ耐熱性リゾチーム活性を示す耐熱性リゾチーム。
【請求項２】
バクテリオファージφＩＮ９３に保有される、分子量約３３０００の耐熱性リゾチーム。
【請求項３】
酵素を９５℃、１時間の加熱した後のリゾチーム活性が、加熱前の活性の９０％以上である、請求項１または２記載の耐熱性リゾチーム。
【請求項４】
至適温度が６０℃〜１２０℃である、請求項１〜３いずれかに記載の耐熱性リゾチーム。
【請求項５】
配列番号１に記載のＤＮＡ配列、または該ＤＮＡ配列から１以上のヌクレオチドが欠失、付加または置換したＤＮＡ配列を有し、耐熱性リゾチームをコードするリゾチーム遺伝子。
【請求項６】
請求項１記載の耐熱性リゾチームをコードするＤＮＡ配列を有する、リゾチーム遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な耐熱性リゾチームを提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
リゾチームは細胞壁のムコ多糖を加水分解する能力を有する溶菌酵素であり、風邪薬等の医薬品、化粧品、農薬、レンズ洗浄剤、食品保存剤、空気清浄機のフィルターへの固定化など、常温の温度域の環境で細菌汚染を防ぐ目的で利用されている。リゾチームとしてはこれまで、卵白リゾチーム及び大腸菌に感染するＴ４ファージのリゾチームなど３７℃前後の常温で反応するものが知られている。しかしながら高温域では常温性のリゾチームでは酵素活性が低下するため、例えば７０℃あるいはそれ以上の高温域環境において好んで生育する好熱性細菌に対して、このようなリゾチームを用いての細菌汚染防止は実質的に不可能であった。
【０００３】
本出願人は先に、二本鎖ＤＮＡバクテリオファージφＩＮ９３、およびファージφＩＮ９３を溶原化している高度好熱菌であるサーマス・アクアチカスＴＺ２株を見いだし、報告している（特許文献１）。また、サーマス・アクアチカスＴＺ２株は旧工業技術院生命工学研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１３７１３として寄託されている。
【特許文献１】特許第２９８６３３８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、常温性リゾチームでは対処できない高温環境下における細菌汚染防止等に有用な、耐熱性リゾチームを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、高度好熱菌であるサーマス・アクアチカスＴＺ２株（以下サーマス菌）に感染する好熱性ファージであるφＩＮ９３より新規の耐熱性リゾチームを単離することに成功し、本願発明を完成させた。
【０００６】
本発明は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する耐熱性リゾチーム、または、配列番号２記載の配列に対し１乃至複数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有しかつ耐熱性リゾチーム活性を示す耐熱性リゾチームを提供する。本発明はまた、該耐熱性リゾチームをコードするＤＮＡ配列を有する単離リゾチーム遺伝子を提供する。
ここで、「リゾチーム活性」とは、いずれの公知の測定方法によっても良い測定方法にて測定され得るリゾチーム活性を意味する。
リゾチーム活性測定方法としては、基質液として細菌をクロロホルムで変性させた菌体成分の懸濁液を用い、基質液に酵素を作用させる前後の吸光度により基質である菌体成分の酵素による分解の程度、即ちリゾチーム活性を測定する方法が挙げられる。具体的には例えばJ. Biochem 83, 727-936 (1978)に記載の方法、即ちクロロホルムにて死滅させた細菌（Pseudomonas aeruginosa）を一定濁度となるよう５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０または４．０）中に懸濁して基質液を調製し、この基質液に酵素液を投入し、インキュベートして濁度の変化を分光光度計により測定し、濁度の減少によりリゾチーム活性を測定する方法がある。また、同様の方法において基質としてミクロコッカスを用いる方法もある。さらには、本願実施例に示すように、クロロホルムにより変性したサーマス・アクアチカスＴＺ２株の菌体成分を用いて、リゾチーム活性を測定してもよい。
【０００７】
本発明で提供されるリゾチームは、耐熱性リゾチームであり、高温下で十分な活性を示すものである。即ち、本発明の耐熱性リゾチームの至適温度は６０℃以上であり、好適には６０℃〜１２０℃の範囲にある。
【０００８】
好ましくは本発明で提供されるリゾチームは、本願実施例に示されるサーマス・アクアチカスＴＺ２株菌体成分を用いた活性測定法によって精製酵素の活性を測定した場合に、７０℃における比活性（Ｕ／Ａ２８０）が１００以上、より好ましくは５００以上、さらに好ましくは１０００以上のリゾチーム活性を示すものである。
【０００９】
また、本発明の耐熱性リゾチームは好適には至適温度、至適ｐＨにおけるその活性が、該リゾチームを９５℃にて１時間加熱した後も、７０％以上、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上保たれるものである。
【００１０】
別の態様においては、本発明の耐熱性リゾチームは、ファージφＩＮ９３から単離される、分子量が約３３，０００の酵素である。
【００１１】
さらに別の態様においては、本発明は配列番号１で示されるＤＮＡ配列を有するか、または配列番号１で示されるＤＮＡ配列に対して１以上のヌクレオチドが欠失、付加または置換したＤＮＡ配列を有し、耐熱性リゾチームをコードする単離遺伝子を提供する。
【００１２】
ここで「耐熱性リゾチームをコードする」とは、上記で説明した耐熱性リゾチームとしての活性を有するタンパク質をコードすることを意味する。
【００１３】
本発明の耐熱性リゾチームの至適ｐＨは、約６〜約１０と非常に広範囲である。従って、本発明の耐熱性リゾチームは、高温下での殺菌が必要となる種々の場面において、好適に用いることが可能である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の耐熱性リゾチームは、従来公知の卵白リゾチームやＴ４  ｔａｉｌリゾチームと構造が顕著に相違する、全く新しいタンパク質である。
本発明の耐熱性リゾチームは、至適温度が非常に高温域であり、従来不可能であった高温域で使用される機器の殺菌消毒等に用いることができる。
本発明は下記実施例によりさらに詳細に説明される。しかしながら、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００１５】
Ｉ．  好熱性ファージφＩＮ９３が保有する耐熱性リゾチームの精製
１）ファージ液の大量培養
下記に示すＡ２培地を用いて、７０℃の温度で前培養（振とう培養２００ｒｐｍ）した高度好熱菌サーマス・アクアチカスＴＺ２株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−４１３７１３、以下「サーマス菌」）を種菌として、本培養を行った。本培養は、Ａ２培地を７５ｍｌずつ分注した三角フラスコに、７５μＬの種菌を接種し、７０℃の温度で振とう培養（２００ｒｐｍ）を行なった。３時間培養後、好熱性ファージφＩＮ９３液を７５μＬ添加して感染させ、菌体が破壊されるのを確認（約２．５時間後）した後に培養を止めた。破壊されたサーマス菌の破片を遠心（３５００ｒｐｍ、２０分間）により沈殿させて除いた。この上清にファージが存在しているため、アミコンウルトラ５０，０００ＭＷＣＯ  を用いて遠心（３５００ｒｐｍ）して濃縮し、更に１０ｍＭ  リン酸緩衝液ｐＨ６．０を加えて、左記緩衝液への置換を行ない６．５ｍｌに調製し、ファージ液とした。
【００１６】
Ａ２：０．１％トリプトン（Ｄｉｆｃｏ）と０．１％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）を含有するＣａｓｔｅｎｈｏｌｔｚの基礎塩溶液[Brock,T.D.およびFreeze,H.(1969) J.Bacteriol.98, 289-297]である。
【００１７】
２）カルボキシメチルイオン交換カラムによる精製
得られたファージ液をカルボキシメチルイオン交換カラム（ＣＭ−セファロース  ファスト  フロー  （ファルマシア社製））により精製を行なった。まず、カルボキシメチルイオン交換カラム（直径２ｃｍ×高さ６ｃｍ  約１９ｍｌ）に、上記のファージ液６．５ｍｌを添加した。次に、１０ｍＭ  リン酸緩衝液ｐＨ６．０  ５０ｍｌを添加して洗浄し、各画分を回収した。
【００１８】
次に、１０ｍＭ  リン酸緩衝液ｐＨ６．０においてＮａＣｌの濃度をステップワイズで０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍまで上げた溶離液を２ｍｌずつ添加して溶出を行なった。回収した各画分は、アミコンウルトラ１０，０００ＭＷＣＯを用いて遠心（３５００ｒｐｍ）して脱塩を行い、更に１０ｍＭ  リン酸緩衝液ｐＨ７．０を加えて、左記緩衝液へ置換し各１ｍｌに調製した。
【００１９】
３）リゾチーム活性の測定
各画分について、リゾチーム活性及び蛋白質含有量を計測した。リゾチーム活性の測定は、基質としてサーマス・アクアチカスＴＺ２株(サーマス菌)をクロロホルムにより変性させた菌体成分を用いて行った。ファージを添加しない以外は上記１）と同様にして培養したサーマス菌を遠心（３５００ｒｐｍ、２０分間）により集菌し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、等容量のクロロホルムを添加して振とうした後、遠心（３５００ｒｐｍ、２０分間）により得られた中間層を乾燥させ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。分光光度計Ｕ−３３１０（日立ハイテクノロジーズ）にて波長５４０ｎｍにおける吸光度を約１．２に調節し、エッペンドルフチューブに各５００μｌずつ分注したものを基質液として用いた。
【００２０】
基質液へ酵素液１０μｌを投入した後、７０℃、３分間インキュベートした。その後、懸濁液中の菌体成分の量を波長５４０ｎｍにて計測した。吸光度の減少はリゾチーム活性による菌体成分の溶解を示す。基質溶液１ｍｌの５４０ｎｍにおける吸光度を１分間に０．１減少させる活性の強さを１単位（ｕｎｉｔ）とした。
ＮａＣｌの濃度が０．１Ｍ及び０．２Ｍである画分に活性が認められた。（図１）
各画分の蛋白質の含有量を分光光度計にて波長２８０ｎｍの吸光度を測定することによって計測した。
【００２１】
４）ハイドロキシアパタイトカラムによる精製
次に、活性画分をハイドロキシアパタイトカラム（Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  ＢｉｏＲａｄ社製）により精製した。ハイドロキシアパタイトカラム（直径１ｃｍ×高さ１．３ｃｍ  約１．０ｍｌ）に、上記活性画分を合わせた２ｍｌの液を添加した。１０ｍＭ  リン酸緩衝液ｐＨ７．０  １０ｍｌを添加して洗浄し、各画分は回収した。次に、１０ｍＭ  リン酸緩衝液ｐＨ７．０においてＮａＣｌの濃度をステップワイズで０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍまで上げた溶離液を１ｍｌずつ添加して溶出を行なった。回収した各画分は、アミコンウルトラ１０，０００ＭＷＣＯを用いて遠心（３５００ｒｐｍ）して脱塩を行い、更に１０ｍＭ  リン酸緩衝液ｐＨ７．０を加えて、左記緩衝液へ置換し各１ｍｌに調製した。上記３）に記載した方法にて酵素活性を測定した結果、ＮａＣｌの濃度が０．２Ｍの画分に活性が認められた。（図２）
【００２２】
上記各精製段階における活性画分に含まれる酵素の比活性は、下記の通りであった。
【表１】
2007300831.tif 000002
【００２３】
５）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による単離の検証
上記４）で得られた活性画分について、メルカプトエタノールを添加して、９５℃５分間反応させた後、１２．５％  ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施した。その結果、分子量３３，０００に単一バンドが検出され、リゾチームが単離できた。
【００２４】
６）Ｎ末端アミノ酸配列の決定
１２．５％  ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により検出された単一バンドについて、定法によりＮ末端アミノ酸配列の１０残基（Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕを決定した。決定したアミノ酸配列を基に、既に塩基配列が決められている好熱性ファージφＩＮ９３ＤＮＡ上の位置を決定した。その結果、ＡＴＧから始まる９１８（終始コドン含めて）の塩基配列のＯＲＦがリゾチーム遺伝子であることが確認された。アミノ酸配列を配列表の配列番号１に、塩基配列を配列番号２に示す。
【００２５】
ＩＩ．  精製して単離した耐熱性リゾチームの性質
１）公知リゾチームとの塩基配列相同性
本発明の耐熱性リゾチームのアミノ酸配列を、他の常温性のリゾチーム（卵白リゾチーム、Ｔ４ファージリゾチーム）と比較した。結果を図３および４に示す。各図から明らかなように、本願発明のリゾチームと、従来知られている常温性のリゾチームとのアミノ酸レベルのホモロジーはそれぞれ１５．０３％および１７．８５％と非常に低いものであった。
【００２６】
２）反応至適ｐＨ
上記Ｉ−４）で得られたリゾチームを用い、ｐＨ５〜１１までの範囲で酵素反応を行い、反応至適ｐＨを求めた。ｐＨ５の緩衝液は１０ｍＭ  クエン酸−リン酸ナトリウムを用いた。ｐＨ５〜８の緩衝液は１０ｍＭ  リン酸緩衝液を用いた。ＰＨ９〜１１の緩衝液は１０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウムを用いた。
活性測定は基質としてサーマス菌をクロロホルムにより変性させた菌体成分を用いて、上記Ｉ−２）と同様の手法により行った。反応は７０℃、１０分間で行なった。
【００２７】
反応至適ｐＨは、ｐＨ６〜１０と広範囲であることがわかった。（図５）
【００２８】
３）反応至適温度
反応温度３７℃〜１５０℃までの範囲で酵素反応を行い、反応至適温度を求めた。反応はｐＨ７のリン酸緩衝液を用いて、上記Ｉ−３）と同じ条件で反応を行なった。
【００２９】
反応至適温度は６０℃〜１２０と広範囲であることがわかった。（図６）
【００３０】
４）耐熱性
上記Ｉ−４）で得られた耐熱性リゾチームをｐＨ７の緩衝液中に投入し、９５℃の条件で加温した。加温前（０時間）、加温１時間後、６時間後に７０℃にてリゾチーム活性を測定し、０時間の活性に対する相対活性を求めた。
【００３１】
９５℃で１時間加温しても活性が９３．８％保持されることがわかった。（図７）
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ファージφＩＮ９３液をカルボキシメチルイオン交換カラムにより精製した結果得られた各画分の、リゾチーム活性（Ｕ／ｍｌ）およびタンパク質含有量（Ａ２８０）の測定結果を示す図である。
【図２】図１の結果得られた活性画分をさらにハイドロキシアパタイトかラムにより精製した結果得られた各各画分の、リゾチーム活性およびタンパク質含有量（Ａ２８０）の測定結果を示す図である。
【図３】本発明の耐熱性リゾチームのアミノ酸配列と、常温性リゾチームである卵白リゾチームのアミノ酸配列の比較を示す図である。
【図４】本発明の耐熱性リゾチームのアミノ酸配列と、常温性リゾチームであるＴ４  ｔａｉｌリゾチームのアミノ酸配列の比較を示す図である。
【図５】本発明の耐熱性リゾチームの反応至適ｐＨを調べた結果を示す図である。
【図６】本発明の耐熱性リゾチームの反応至適温度を調べた結果を示す図である。
【図７】本発明の耐熱性リゾチームの耐熱性試験の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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