(57)【要約】【課題】蛋白質結晶を小サイズの結晶を含めて高い精度で検出できる蛋白質結晶検出方法を提供することを目的とする。【解決手段】蛋白質溶液の液滴を撮像した原画像を画像認識することにより前記液滴に含まれる蛋白質結晶を検出する蛋白質結晶検出において、蛋白質結晶の特徴部分としてのエッジ抽出画像に該当する画素の塊であるラベルＬａ１，Ｌａ２を対象として、ラベルＬａ１に外接する矩形枠ＦＲ１の大きさをラベルＬａ１のサイズとして検出し、矩形枠ＦＲ１の対角寸法Ｄを直径とする円Ｃ１を、エッジ抽出画像の密集度を判定するための判定領域として設定する。そして判定領域内の全画素数に対するエッジ抽出画像の抽出画素の割合を求め、検出されたラベルＬａ１のサイズが所定サイズ以上であり、且つ求められた割合が所定割合以上であれば結晶ありと判断する。【選択図】図１０
2007132775.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質溶液の液滴を撮像した原画像を画像認識することにより前記液滴に含まれる蛋白質結晶を検出する蛋白質結晶検出方法であって、
前記原画像を取得し、
前記原画像から蛋白質結晶の特徴部分に該当する画素を強調した結晶特徴画像を得る画像処理を行い、
前記特徴画像において前記特徴部分に該当する画素の塊を認識し、
前記認識した塊のサイズを検出し、
前記検出されたサイズに基づいてこの塊を包含する閉領域を判定領域として設定し、
前記判定領域内の全画素に対する前記特徴部分に該当する画素の割合を求め、
前記塊のサイズが所定サイズ以上であり、且つ前記割合が所定割合以上であれば結晶ありと判断することを特徴とする蛋白質結晶検出方法。
【請求項２】
前記特徴部分が結晶のエッジであり、前記画像処理が前記エッジを抽出するエッジ抽出処理であることを特徴とする請求項１記載の蛋白質結晶検出方法。
【請求項３】
前記塊に外接して設定された矩形枠のサイズを前記塊のサイズとして検出することを特徴とする請求項１または２記載の蛋白質結晶検出方法。
【請求項４】
前記矩形枠のサイズに基づいて、前記判定領域のサイズを設定することを特徴とする請求項３記載の蛋白質結晶検出方法。
【請求項５】
蛋白質溶液の液滴を撮像した原画像を画像認識することにより前記液滴に含まれる蛋白質結晶を検出する蛋白質結晶検出方法であって、
前記原画像を取得し、
前記原画像から蛋白質結晶の特徴部分に該当する画素を強調した結晶特徴画像を得る画像処理を行い、
前記結晶特徴画像において前記特徴部分に該当する画素の塊を認識し、
前記塊のうち最も大きな塊の画素数をカウントし、
前記結晶特徴画像に含まれる前記特徴部分に該当する画素の総数をカウントし、
最も大きな塊の画素数が所定の画素数以下であり、且つ前記総数が所定の範囲であれば前記認識した塊のサイズを検出し、
前記検出されたサイズに基づいてこの塊を包含する判定領域を設定し、
この判定領域内における前記特徴部分に該当する画素の割合を求め、
前記塊のサイズが所定のサイズ以上であり、且つ前記割合が所定の割合以上であれば結晶ありと判断することを特徴とする蛋白質結晶検出方法。
【請求項６】
前記特徴部分が結晶のエッジであり、前記画像処理が前記エッジを抽出するエッジ抽出処理であることを特徴とする請求項５記載の蛋白質結晶検出方法。
【請求項７】
前記塊に外接して設定された矩形枠の大きさを前記塊のサイズとして検出することを特徴とする請求項５または６記載の蛋白質結晶検出方法。
【請求項８】
前記矩形枠のサイズに基づいて、前記判定領域のサイズを設定することを特徴とする請求項７記載の蛋白質結晶検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質溶液中の蛋白質結晶を検出する蛋白質結晶検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年遺伝子情報を医療などの分野に有効に利用するための取り組みが活発化しており、その基礎技術として遺伝子を構成する蛋白質の構造を解析する努力が行われている。この蛋白質の構造解析は、蛋白質を構成するアミノ酸が３次元の線状に連なった立体構造を特定するものであり、Ｘ線結晶構造解析などの方法によって行われる。
【０００３】
このような蛋白質の構造解析を行うためには、まず解析対象の蛋白質を結晶化することが求められ、この蛋白質結晶化の方法として蒸気拡散法が知られている。この方法では、結晶化対象の蛋白質を含む蛋白質溶液から蒸発する溶媒成分を同一容器内に収容された結晶化溶液によって吸収させることにより、蛋白質溶液を過飽和状態に保って結晶を徐々に生成させる。
【０００４】
結晶化を促進させるための結晶生育条件は、現状では理論的には解明されていないため、多数の試験を系統的に実行した結果から最良の条件を求めるスクリーニングの手法が用いられる。このスクリーニングにおいては、従来より対象となる蛋白質溶液を各種の結晶生育条件、すなわち前述の結晶化溶液の種類・濃度や生育温度を変化させた幾通りもの条件下で、試験を反復実行する必要があった。
【０００５】
このような試験は、蛋白質溶液および結晶化溶液を収容した結晶化用マイクロプレートなどの結晶化容器を特定温度に設定された恒温室内に保管し、結晶化の有無や進行度合いを時間経過に伴って観察することによって行われる。この蛋白質結晶検出を目的とした観察作業を効率よく行うため、従来は試験担当者が顕微鏡視野内で蛋白質溶液を目視観察することによって行われていた作業、すなわち蛋白質結晶化状態の判定を画像認識によって行う蛋白質結晶化状態判定方法が提案されている（例えば特許文献１参照）。この蛋白質結晶状態判定においては、蛋白質溶液を撮像した原画像をテクスチャ解析の手法を用いて認識処理することにより、蛋白質溶液中の沈殿や結晶を識別して、結晶化状態を判定するようにしている。
【特許文献１】特開２００５−９９４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
蒸気拡散法による蛋白質の結晶化においては結晶化の状態は様々であり、結晶化過程の蛋白質溶液中には、大小様々な大きさの結晶が混在している。結晶化状態を高精度で検出するためには、大きな結晶のみならず小さな結晶も極力検出できることが望ましい。しかしながら上述の特許文献例を含め、従来の蛋白質結晶検出のための画像認識においては、蛋白質溶液を保持する容器の画像など蛋白質結晶に該当しない画像要素や、画像中に不可避的に現れるノイズなどを除去するために行われる処理によって、画素数があるしきい値よりも小さい画像成分が除去されていた。このため従来の蛋白質結晶検出においては、溶液中に小さな蛋白質結晶が存在していても、画像処理において除去されてしまう場合が多く、蛋白質結晶を高精度で検出することが困難であった。
【０００７】
そこで本発明は、蛋白質結晶を小サイズの結晶を含めて高い精度で検出できる蛋白質結晶検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の蛋白質結晶検出方法は、蛋白質溶液の液滴を撮像した原画像を画像認識することにより前記液滴に含まれる蛋白質結晶を検出する蛋白質結晶検出方法であって、前記原画像を取得し、前記原画像から蛋白質結晶の特徴部分に該当する画素を強調した結晶特徴画像を得る画像処理を行い、前記特徴画像において前記特徴部分に該当する画素の塊を認識し、前記認識した塊のサイズを検出し、前記検出されたサイズに基づいてこの塊を包含する閉領域を判定領域として設定し、前記判定領域内の全画素に対する前記特徴部分に該当する画素の割合を求め、前記塊のサイズが所定サイズ以上であり、且つ前記割合が所定割合以上であれば結晶ありと判断する。
【０００９】
また本発明の蛋白質結晶検出方法は、蛋白質溶液の液滴を撮像した原画像を画像認識することにより前記液滴に含まれる蛋白質結晶を検出する蛋白質結晶検出方法であって、前記原画像を取得し、前記原画像から蛋白質結晶の特徴部分に該当する画素を強調した結晶特徴画像を得る画像処理を行い、前記結晶特徴画像において前記特徴部分に該当する画素の塊を認識し、前記塊のうち最も大きな塊の画素数をカウントし、前記結晶特徴画像に含まれる前記特徴部分に該当する画素の総数をカウントし、最も大きな塊の画素数が所定の画素数以下であり、且つ前記総数が所定の範囲であれば前記認識した塊のサイズを検出し、前記検出されたサイズに基づいてこの塊を包含する判定領域を設定し、この判定領域内における前記特徴部分に該当する画素の割合を求め、前記塊のサイズが所定のサイズ以上であり、且つ前記割合が所定の割合以上であれば結晶ありと判断する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、蛋白質結晶の特徴部分に該当する画素の塊のサイズを検出し、検出されたサイズに基づいて設定された判定領域の全画素に対する特徴部分に該当する画素の割合を求め、検出された塊のサイズが所定サイズ以上であり、且つ求められた割合が所定割合以上であれば結晶ありと判断することにより、蛋白質結晶の特徴部分が密集した度合いを定量的に評価して、蛋白質結晶を小サイズの結晶を含めて高い精度で検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
次に本発明の実施の形態を図面を参照して説明する。図１は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出装置の構成を示すブロック図、図２は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出装置に使用される結晶化プレートの斜視図、図３は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出装置に使用される結晶化プレートの部分断面図、図４は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出装置に使用される結晶化プレートの拡大部分断面図、図５は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法を示すフロー図、図６は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における結晶化判定処理を示すフロー図、図７（ａ）、図８（ａ）、図９（ａ）は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における蛋白質結晶画像を示す図、図７（ｂ）、図８（ｂ）、図９（ｂ）は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における蛋白質結晶特徴画像を示す図、図１０，図１１は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における蛋白質結晶の密集度判定処理の説明図である。
【００１２】
まず図１を参照して、蛋白質結晶検出装置１の構成を説明する。蛋白質結晶検出装置１は、蒸気拡散法により蛋白質溶液内に生成した蛋白質結晶を検出するために使用される専用の検出装置である。ここでは、蛋白質溶液の液滴を撮像した原画像を画像認識することにより、液滴に含まれる蛋白質結晶を検出する。
【００１３】
図１において、蛋白質結晶検出装置１は、蛋白質溶液の液滴を撮像して観察するための観察部２を備えている。観察部２は、ＸＹＺテーブル機構を備えた観察ステージ３の上方
に、顕微光学系５およびカメラ６を配置した構成となっている。カメラ６の撮像動作はカメラ制御部８によって制御され、撮像結果はカメラ制御部８によって取り込まれる。観察ステージ３の上面には観察対象の試料を収納するウェル４ａが複数設けられた結晶化プレート４が載置され保持される。
【００１４】
観察ステージ３に備えられたＸＹＺテーブル機構を駆動することにより、結晶化プレート４はＸ，Ｙ，Ｚ方向に移動し、観察対象のウェル４ａが顕微光学系５の下方に位置する。観察ステージ３の下方には照明部７が配置されており、カメラ６によってウェル４ａ内の試料を撮像する際には、照明部７によって下方から照明光を照射する。観察ステージ３、照明部７の動作は、機構制御部１０によって制御され、さらに機構制御部１０は処理・演算部９によって制御される。
【００１５】
処理・演算部９は結晶検出処理部９ａおよび記憶部９ｂを備えている。結晶検出処理部９ａは、カメラ６がウェル４ａを撮像してカメラ制御部８に取り込まれた原画像を画像認識処理し、蛋白質結晶を検出する処理を行う。処理結果は記憶部９ｂに記憶される。処理・演算部９は、表示部１１、操作・入力部１２に接続されている。表示部１１は液晶パネルなどの表示モニタであり、ウェル４ａを撮像して得られた原画像や、原画像を結晶検出処理部９ａによって処理した処理画像を表示するほか、各種操作を行う際の案内画面を表示する。操作・入力部１２はキーボードやマウス、タッチパネルなどの入力手段であり、処理・演算部９による各処理を実行する際の操作コマンドの指示や、データ入力を行う。
【００１６】
図２，図３を参照して、結晶化プレート４について説明する。図２に示すように、結晶化プレート４には複数のウェル４ａが格子状に形成されている。ウェル４ａは、円形の凹部の中心に円柱状の液保持部４ｂが設けられたいわゆるカルデラ状の液体収納用の凹部であり、ウェル４ａ内には、結晶化の対象となる試料、すなわち結晶化対象の蛋白質を含んだ蛋白質溶液１４と、結晶化に用いられる結晶化溶液１３とが分注される。
【００１７】
図３はこれらの試料を収容した１つのウェル４ａの断面を示している。ウェル４ａ内では、液保持部４ｂの頂部に設けられたポケット内に液滴状の蛋白質溶液１４が載置状態で保持されており、液保持部４ｂを囲むリング状の貯液部４ｃには、結晶化溶液１３が貯溜されている。後述するように蛋白質結晶化の開始に際しては、液保持部４ｂに保持された蛋白質溶液１４に所定量の結晶化溶液１３を貯液部４ｃから取り出して分注して混合した後、各ウェル４ａ上面に密封用のシール部材１５が貼着される。
【００１８】
この状態の結晶化プレート４を所定の温度雰囲気下で保管することにより、蛋白質溶液１４中の溶媒成分を蒸発させ、これにより蛋白質溶液１４の蛋白質濃度を過飽和状態にまで高めて蛋白質結晶を生成する。このとき、蛋白質溶液１４から蒸発する溶媒と結晶化溶液１３に吸収される蒸気とが平衡状態を保ちながら蛋白質溶液１４からの溶媒の蒸発が緩やかに進行することにより、安定した結晶生成が行われる。
【００１９】
観察部２はこのような結晶生成過程の結晶化プレート４を観察することにより、各ウェル４ａにおける蛋白質結晶の有無や結晶化の度合いを検出する。すなわち、図１に示すように、観察ステージ３にセットされた結晶化プレート４をカメラ６の下方に水平移動させて、観察対象のウェル４ａ内の液保持部４ｂをカメラ６の撮像光軸に位置合わせするとともに、観察ステージ３を昇降させてウェル４ａ内における撮像対象の断面位置をカメラ６の合焦レベルに合わせる。そして下方の照明装置７から照明光を照射した状態で、カメラ６によって結晶化プレート４を撮像することにより、結晶化プレート４に保持された蛋白質溶液の画像が取り込まれる。
【００２０】
このカメラ６による撮像において、観察ステージ３のＺ位置を調整することにより、ウ
ェル４ａの凹部内に保持された蛋白質溶液１４内における任意の水平断面の画像を取得することができる。すなわち観察ステージ３を所定ピッチで合焦方向（Ｚ方向）に移動させながら、カメラ６で蛋白質溶液１４を撮像することにより、図４に示すように、蛋白質溶液１４において合焦方向の位置が異なる複数の水平断面を示すレイヤーＬ１，Ｌ２，Ｌ３，Ｌ４，Ｌ５の画像（以下、「レイヤー画像」と略称する。）が各断面毎に取り込まれる。
【００２１】
次に、蛋白質結晶検出処理について図５のフローに沿って説明する。まず、図１に示すように、観察対象となる結晶化プレート４を観察ステージ３に載置した後、焦点位置調整を行う（ＳＴ１）。すなわち観察ステージ３を昇降させて、ウェル４ａ内における撮像対象のレイヤーをカメラ６の合焦レベルに合わせる。そして当該レイヤーにおいて画像取込を行う（ＳＴ２）。すなわち照明装置７から照明光を照射し、結晶化プレート４に保持された液滴をカメラ６によって撮像して、蛋白質溶液のレイヤー画像を原画像として取り込む。次いでこの画像取込により予め設定されたレイヤー数Ｎ（ここではＮ＝５）を対象とした枚数の画像取込が完了しているか否かを判断し、未完了であれば（ＳＴ１）に戻り、同様のステップを反復する。
【００２２】
このようにして取り込まれた原画像中には、蛋白質結晶が種々の形態で存在する。図７（ａ）、図８（ａ）、図９（ａ）は、このようにして得られた蛋白質結晶の画像を示している。図７（ａ）は大型結晶２１の画像を示しており、図８（ａ）は小型結晶２２が多数密集して存在する場合の画像を、さらに図９（ａ）は小型結晶２２が疎らに存在する場合の画像をそれぞれ示している。
【００２３】
そして（ＳＴ３）において、Ｎ枚完了が確認されたならば、原画像を対象としてエッジ抽出処理を実行する（ＳＴ４）。すなわち、レイヤー画像を対象として微分処理によるエッジ抽出処理を行うことにより、原画像から特徴部分、すなわち蛋白質結晶のエッジ部分に該当する画素を抽出して強調した結晶特徴画像（以下、「エッジ抽出画像」という）を得る画像処理を行う。図７（ｂ）、図８（ｂ）、図９（ｃ）は、このようにして得られたエッジ抽出画像を示している。図７（ｂ）においては、大型結晶２２のエッジ部分が抽出されたエッジ抽出画像２１ａが大型結晶２１の輪郭に倣う形で現れている。また図８（ｂ）、図９（ｂ）においては、小型結晶２２のエッジ部分が抽出されたエッジ抽出画像２２ａが、原画像における粗密度合いに応じた形で現れている。
【００２４】
次いでラベリング処理を実行する（ＳＴ５）。すなわち、エッジ抽出画像において、エッジ部分、すなわち特徴部分に該当する画素の塊を認識し、認識された塊毎にラベル番号を付す処理を行う。そしてラベリング処理が行われたエッジ抽出画像から、結晶化判定のためのパラメータを抽出する（ＳＴ６）。
【００２５】
以下、これらのパラメータについて説明する。まずラベル数Ｌ（ｎ）は、レイヤー番号ｎのエッジ抽出画像にてラベリングされた塊の総数を示すものであり、各レイヤー毎に求められる。抽出総画素数ＧＮは、Ｎ枚のエッジ抽出画像にて抽出された特徴部分に相当する画素数をカウントした数であり、抽出総画素数ＧＮが大きいほど、当該ウェル内に蛋白質結晶が存在する可能性が高いことを示している。最大ラベル画素数ＧＬは、レイヤー番号１〜Ｎの各エッジ抽出画像において認識された塊のうち、最も大きな塊の画素数をカウントした数であり、同様に最大ラベル画素数ＧＬが大きいほど蛋白質結晶が存在する可能性が高い。すなわちこのパラメータ抽出においては、最も大きな塊の画素数をカウントし、結晶特徴画像に含まれる特徴部分に該当する画素の総数をカウントする。
【００２６】
さらにここでは、結晶化判定のためのパラメータとして、以下のように定義されるレイヤー間非変動率Ａを求めている。レイヤー間非変動率Ａは、特定の隣接する２つのレイヤ
ー、すなわち最大の画素数を有するエッジ抽出画像に対応するレイヤー（代表レイヤー）と、この代表レイヤーに隣接する上下２つのレイヤーのうちより大きい画素数に対応したレイヤー（隣接レイヤー）とを対象として、これら２つのレイヤー画像の画素数の比率（隣接レイヤー画素数／代表レイヤー画素数）を％で示すものである。レイヤー間非変動率が大きいほど、ある厚みを介して隣接した２つのレイヤーにわたって同一の物質が存在している蓋然性が高く、したがって蛋白質結晶の存在可能性が高いことを意味する。
【００２７】
このようなレイヤー間非変動率Ａを求めることにより、２つのレイヤー間に同一の物質が共通して存在する割合を推定することができ、このレイヤー間非変動率を結晶化判定の判定パラメータとして用いることにより、後述するように、ある厚みを持った蛋白質結晶の存在と厚みが小さい沈殿物などの非結晶生成物の存在とを、数値データに基づいて識別することが可能となっている。
【００２８】
このように定義されたパラメータに基づき、以下に説明するアルゴリズムにしたがって、蛋白質結晶化判定が行われる。まず、図７に示すような大型結晶２１を対象とした大型結晶判定処理（図５のフローにおいて破線枠Ｉにて示す）が行われる。すなわち、（ＳＴ６）にて得られた最大ラベル画素数ＧＬが、予め定められたしきい値である結晶判定基準ＧＬ（ＴＨ）よりも大きいか否かを判断する（ＳＴ７）。
【００２９】
ここで結晶判定基準ＧＬ（ＴＨ）は、大型結晶２１のエッジ抽出画像２１ａ（図７（ｂ）参照）に含まれるラベルの下限サイズに相当する画素数を基に設定されている。そして（ＳＴ７）の条件に該当し、最大ラベル画素数ＧＬが結晶判定基準ＧＬ（ＴＨ）よりも大きいならば、大型結晶のエッジ抽出画像に相当するような画素数のラベルが検出されたことを示している。したがってこの場合には、図７に示すような大型結晶２１が存在する可能性が高いと判断し、結晶あり判定がなされる（ＳＴ１０）。
【００３０】
（ＳＴ７）の条件に該当しない場合には、大型結晶の存在可能性は低いものの、小型結晶の存在可能性ありと推定して、以下の判定処理に従う。すなわちまず抽出総画素数ＧＮが生成物判定基準Ｇ１より大きいか否かを判断する（ＳＴ８）。ここで生成物判定基準Ｇ１は、図８（ｂ）に示すように、小型結晶２２のエッジ抽出画像２２ａを高密度で含むレイヤー画像の存在の可能性ありと判断して差し支えないような画素数に設定されている。
【００３１】
そして（ＳＴ８）の条件に該当し、抽出総画素数ＧＮが生成物判定基準Ｇ１よりも大きいならば、小型結晶が高密度で存在する可能性ありと判断し、さらにこの可能性を高い蓋然性で推認可能か否かを判断するため、第１の小型結晶判定処理（図５のフローにおいて破線枠ＩＩにて示す）に進む。ここでは、（ＳＴ６）で求められたレイヤー間非変動率Ａが予め定められた微結晶判定基準Ａ（ＴＨ）よりも大きいか否かを判断する（ＳＴ９）。
【００３２】
ここで微結晶判定基準Ａ（ＴＨ）は、隣接する２つのレイヤー間にわたって同一の小型結晶が存在する可能性が高いと判断して差し支えないようなレイヤー間非変動率Ａの値が用いられる。そして（ＳＴ９）の条件に該当し、すなわちレイヤー間非変動率Ａが微結晶判定基準Ａ（ＴＨ）よりも大きいならば、結晶あり判定がなされる（ＳＴ１０）。また（ＳＴ９）の条件に該当しないならば、結晶無し判定がなされる（ＳＴ１１）。
【００３３】
そして（ＳＴ８）において条件に該当しない場合には、さらに、抽出総画素数ＧＮが、生成物判定基準Ｇ１以下であり且つ結晶無し判定基準Ｇ２以上であるという条件に該当するか否かを判断する（ＳＴ１２）。ここで結晶無し判定基準Ｇ２は、図９（ｂ）に示すように、小型結晶２２のエッジ抽出画像２２ａが疎らに含まれている可能性ありと判断すべき画素数、換言すれば抽出された画素を画像上のノイズと見なして棄却することが適切ではないような画素数に設定されている。ここで（ＳＴ１２）の条件に該当しないならば、
小型結晶の存在可能性はきわめて低いと判断して、結晶無し判定がなされる（ＳＴ１１）。
【００３４】
また（ＳＴ１２）の条件に該当する場合には、次に説明するように、疎らに存在する小型結晶２２を対象とした検出処理、すなわち第２の小型結晶判定処理が実行される（ＳＴ１３）。そしてこれにより、判定対象とすべき場合分けの全てについて、蛋白質結晶化判定処理が終了する。なお従来の蛋白質検出処理においては、（ＳＴ１２）の条件に該当する小型結晶は、結晶化に至らない非結晶生成物として取り扱われていた。
【００３５】
第２の小型結晶判定処理について、図６のフローに沿って、図１０を参照して説明する。この判定処理においては、各レイヤーにて得られたエッジ抽出画像を対象として以下の処理が順次実行される。まず、最初のレイヤーを対象とした判定処理が開始されると、当該エッジ抽出画像に含まれるラベルＩ（Ｉは各ラベルを特定するインデックス）の画素数Ｋ（Ｉ）をカウントする（ＳＴ２１）。そして求められた画素数Ｋ（Ｉ）が、予め定められたエッジ判定基準Ｋ１以上であるという条件に該当するか否かを判断する（ＳＴ２２）。
【００３６】
ここでエッジ判定基準Ｋ１は、抽出された画素の塊が図９（ｂ）に示すエッジ抽出画像２２ａに該当するか否かを示すしきい値である。そしてここで（ＳＴ２２）の条件に該当する場合には、当該ラベルＩはエッジ抽出画像であるとみなして、当該ラベルＩのサイズ計測を行う（ＳＴ２３）。すなわちここでは、エッジ抽出画像において認識された塊のサイズを検出する処理が行われる。
【００３７】
このラベルのサイズ計測について、図１０を参照して説明する。ここでは、図１０（ａ）に示すように、隣接して存在する２つのラベルＬａ１，Ｌａ２を対象とする場合について説明する。まず、一方のラベルＬａ１に着目し、図１０（ｂ）に示すように、ラベルＬａ１に外接する矩形枠ＦＲ１を設定する。ここで矩形枠ＦＲ１は、画像の直交座標系におけるＸ軸、Ｙ軸に方向を合わせて設定される。そして矩形枠ＦＲ１の辺寸法Ｘ、Ｙの大きい方を当該ラベルＬａ１のサイズとして検出するとともに、矩形枠ＦＲ１の対角寸法Ｄを求める。
【００３８】
次いでサイズ判定が行われる（ＳＴ２４）。すなわち検出されたサイズが予め定められた判定基準値ＫＷより大きいか否かを判断する。ここで判定基準値ＫＷは、当該ラベルのサイズが小型結晶２２のエッジ抽出画像２２ａの平面的な拡がり度合いを示すサイズとして適切であるか否かを判定するためのしきい値である。そして（ＳＴ２４）の条件に該当する場合には、当該ラベルは小型結晶２２の存在を示すものであると判断して、当該ラベル近傍における密集度計則を行う（ＳＴ２５）。
【００３９】
この密集度計測に際しては、図１０（ｃ）に示すように、図１０（ｂ）にて設定された矩形枠ＦＲ１に外接する円Ｃ１（対角寸法Ｄを直径とする円Ｃ１）を、密集度を判定するための判定領域に設定する。すなわちここでは、（ＳＴ２３）にて検出されたラベルのサイズに基づいて、このラベルを包含する閉領域としての円Ｃ１を判定領域として設定する。次いで円Ｃ１内の全画素に対するエッジ抽出画素の割合を、密集度の指標として求める。
【００４０】
ここでは、判定領域である円Ｃ１内におけるエッジ抽出画素数をカウントし、求められたエッジ抽出画素数の円Ｃ１の総画素数に対する割合を％で求める。ここに示す例では、ラベルＬａ１のみならず、ラベルＬａ２に属するエッジ抽出画素のうち、円Ｃ１内に存在する部分が合わせてカウントされる。このような方法を採用することにより、複数のラベルが近接して存在する場合における密集度を簡便な方法で数値化することができる。
【００４１】
次いで密集度判定が行われる（ＳＴ２６）。すなわちこのようにして求められた密集度が予め定められた密集度判定値よりも大きいか否かを判断する。ここで、求められた密集度が密集度判定値よりも大きいならば、図９に示すように、小型結晶２２が局部的に集合して存在すると判断して結晶あり判定がなされ（ＳＴ２７）、この後図５に示す処理フローに戻る。
【００４２】
そして（ＳＴ２６）にて判定条件に該当しない場合には、インデックスＩに１を加算して処理ステップを歩進させる（ＳＴ２８）。（ＳＴ２２）、（ＳＴ２４）において条件に該当しない場合にも、同様に（ＳＴ２８）に進む。ここでは、当該処理時におけるインデックスＩがラベル数Ｌ（ｎ）以上であるか否か、すなわち当該レイヤーにおいて全てのラベルを対象として上述処理が完了したか否かを判断し、この条件に該当しない場合には（ＳＴ２１）に戻って同様の処理ステップを反復実行する。
【００４３】
次いで（ＳＴ２７）にて全てのラベルＩについての処理が完了したことを確認した後、次のレイヤーを対象として同様の処理を反復実行する。そして全レイヤーについて上述処理が完了したか否かを判断する（ＳＴ３０）。ここで未完了ならば、（ＳＴ２１）に戻って次のレイヤーを対象として同様の処理ステップを反復実行する。そして（ＳＴ３０）にて、全レイヤーについて処理完了を確認した後に、結晶無し判定（または結晶以外の生成物あり判定）がなされ（ＳＴ３１）、図５に示す処理フローに戻る。
【００４４】
なお、図１０に示す例においては、密集度判定のための判定領域の設定に際し、矩形枠ＦＲ１に外接する円を用いた例を示しているが、判定領域の形状は円形領域には限定されず、種々の形態を選択可能である。図１１は、矩形枠ＦＲ１の辺寸法Ｘ，Ｙを定数（Ｋ）倍して、辺寸法ＫＸ，ＫＹの矩形の判定領域を設定した例を示している。要は、エッジ抽出画素の塊としてのラベルを包含する閉領域であって、この閉領域に基づいてサイズが明定可能な形態であればよい。
【００４５】
上記説明したように、本実施の形態に示す蛋白質結晶検出方法は、結晶化プレート４に保持された蛋白質溶液の液滴を撮像した原画像を画像認識することにより、液滴に含まれる蛋白質結晶を検出するものである。そしてこの蛋白質結晶検出方法は、（１）蛋白質溶液の液滴を撮像した原画像を取得し、（２）原画像から蛋白質結晶の特徴部分に該当する画素を強調した結晶特徴画像を得る画像処理を行い、（３）この結晶特徴画像において特徴部分に該当する画素の塊を認識し、認識された塊のうち最も大きな塊の画素数をカウントし、（４）結晶特徴画像に含まれる特徴部分に該当する画素の総数をカウントし、（５）最も大きな塊の画素数が所定の画素数以下であり、且つ前記総数が所定の範囲であれば前記認識した塊のサイズを検出し、（６）検出されたサイズに基づいてこの塊を包含する閉領域を判定領域として設定し、（７）判定領域内の全画素に対する特徴部分に該当する画素の割合を求め、（８）塊のサイズが所定サイズ以上であり、且つ前記割合が所定割合以上であれば結晶ありと判断するようにしている。
【００４６】
そして、原画像から蛋白質結晶の特徴部分に該当する画素を強調した結晶特徴画像を得る画像処理を、特徴部分としての結晶のエッジを抽出するエッジ抽出処理によって行う形態となっている。さらに、塊のサイズを検出するに際し、塊に外接して設定された矩形枠のサイズを塊のサイズとして検出する方法を採用しており、この矩形枠のサイズに基づいて、判定領域のサイズを設定するようにしている。
【００４７】
このような方法を採用することにより、蛋白質結晶検出のための画像認識において、蛋白質溶液を保持する容器の画像など蛋白質結晶に該当しない画像要素や、画像中に不可避的に現れるノイズなどを除去するために行われる処理によって、画素数があるしきい値よ
りも小さい画像成分が除去されてしまうことによる検出誤差を排除して、蛋白質結晶を小サイズの結晶を含めて高い精度で検出することができる。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明の蛋白質結晶検出方法は、蛋白質結晶を小サイズの結晶を含めて高い精度で検出することができるという効果を有し、生化学分野などにおいて蛋白質の構造解析に先立って行われる蛋白質結晶化処理において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出装置の構成を示すブロック図
【図２】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出装置に使用される結晶化プレートの斜視図
【図３】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出装置に使用される結晶化プレートの部分断面図
【図４】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出装置に使用される結晶化プレートの拡大部分断面図
【図５】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法を示すフロー図
【図６】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における結晶化判定処理を示すフロー図
【図７】（ａ）本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における蛋白質結晶画像を示す図（ｂ）本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における蛋白質結晶特徴画像を示す図
【図８】（ａ）本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における蛋白質結晶画像を示す図（ｂ）本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における蛋白質結晶特徴画像を示す図
【図９】（ａ）本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における蛋白質結晶画像を示す図（ｂ）本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における蛋白質結晶特徴画像を示す図
【図１０】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における蛋白質結晶の密集度判定処理の説明図
【図１１】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における蛋白質結晶の密集度判定処理の説明図
【符号の説明】
【００５０】
１  蛋白質結晶検出装置
２  観察部
４  結晶化プレート
４ａ  ウェル
６  カメラ
１３  蛋白質溶液
１４  結晶化溶液
２１  大型結晶
２１ａ  エッジ抽出画像
２２  小型結晶
２２ａ  エッジ抽出画像
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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