(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｌ−セレクチンの新規スプライシングバリアントの提供。【解決手段】Ｌ−セレクチンのスプライシングバリアントは、選択的スプライシングにより、マウスの通常Ｌ−セレクチンのエキソン７とエキソン８との間にカセットエキソンｖ１又はカセットエキソンｖ１及びｖ２が挿入される結果生成されるものである。スプライシングバリアントは、特定のアミノ酸配列からなるスプライシングバリアントｖ１、及び、特定のアミノ酸配列からなるスプライシングバリアントｖ２を含む。【選択図】図１
2007300886.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−セレクチンのスプライシングバリアントであって、
配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１の第３９番目〜第３８５番目のアミノ酸配列からなるスプライシングバリアントｖ１、
配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号２の第３９番目〜第３８７番目のアミノ酸配列からなるスプライシングバリアントｖ２、及び、
これらのタンパク質の配列において１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、通常Ｌ−セレクチンよりも細胞外切断を受けにくい性質を示すタンパク質からなる群から選択されるＬ−セレクチンのスプライシングバリアント。
【請求項２】
Ｌ−セレクチンのスプライシングバリアント又は通常Ｌ−セレクチンに由来するポリペプチドであって、
スプライシングバリアントｖ１に由来する配列番号１の第３５６番目〜第３８５番目の配列、第３６２番目〜第３８５番目の配列、第３７８番〜第３８５番目の配列、及び第３６２番目〜第３７７番目の配列、
スプライシングバリアントｖ２に由来する配列番号２の第３５６番目〜第３８７番目の配列、第３６２番目〜第３８７番目の配列、第３７８番〜第３８７番目の配列、及び第３６２番目〜第３７７番目の配列、並びに、
通常Ｌ−セレクチンに由来する配列番号５の配列、及びその第７番目〜第１７番目の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項３】
請求項１記載のスプライシングバリアント若しくは請求項２記載のポリペプチドをコードする配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項４】
Ｌ−セレクチンのスプライシングバリアント転写産物由来ポリヌクレオチドであって、
スプライシングバリアントｖ１ｍＲＮＡに由来する配列番号３の配列、その第１番目〜第１１５５番目の配列、第１１５番目〜第１１５５番目の配列、及び第１０８２番目〜第１１３０番目の配列、
スプライシングバリアントｖ２ｍＲＮＡに由来する配列番号４の配列、その第１番目〜第１１６１番目の配列、第１１５番目〜第１１６１番目の配列、第１０８２番目〜第１１８１番目の配列、及び第１１３１番目〜第１１８１番目の配列、並びに、
これらの相補配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項３又は４記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項６】
請求項５記載のベクターが遺伝子導入され、前記遺伝子導入により請求項１記載のスプライシングバリアント若しくは請求項２記載のポリペプチドを発現する遺伝子導入体。
【請求項７】
Ｌ−セレクチンに対する抗体であって、
スプライシングバリアントｖ１のＣ（カルボキシ）末端領域である配列番号６の配列、その第７番目〜第３０番目の配列、若しくは第２３番目〜第３０番目の配列、又は、それらの部分配列からなるポリペプチドに対して産生され、スプライシングバリアントｖ１を特異的に認識し、通常Ｌ−セレクチン及びスプライシングバリアントｖ２と交差反応しない抗体、
スプライシングバリアントｖ２のＣ末端領域である配列番号７の配列、その第７番目〜第３２番目の配列、若しくは第２３番目〜第３２番目の配列、又は、それらの部分配列からなるポリペプチドに対して産生され、スプライシングバリアントｖ２を特異的に認識し、通常Ｌ−セレクチン及びスプライシングバリアントｖ１と交差反応しない抗体、
通常Ｌ−セレクチンのＣ末端領域である配列番号５の配列、若しくはその第７番目〜第１７番目の配列、又は、それらの部分配列に対して産生され、通常Ｌ−セレクチンを特異的に認識し、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２と交差反応しない抗体、並びに、
スプライシングバリアントｖ１及びｖ２に共通するＣ末端領域の配列番号６若しくは７の第１番目〜第２２番目の配列若しくは第７番目〜第２２番目の配列、又は、それらの部分配列に対して産生され、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２を特異的に認識し、通常Ｌ−セレクチンと交差反応しない抗体からなる群から選択される抗Ｌ−セレクチン抗体。
【請求項８】
Ｌ−セレクチンの検出キットであって、
スプライシングバリアントｖ１を特異的に検出又は増幅可能で、通常Ｌ−セレクチン及びスプライシングバリアントｖ２を検出又は増幅しないプローブ又はプライマーであって、エキソンｖ１＋エキソン８の配列（配列番号９＋配列番号１１の配列）若しくはその相補配列にハイブリダイズ可能なプローブ又はプライマー、
スプライシングバリアントｖ２を特異的に検出又は増幅可能で、通常Ｌ−セレクチン及びスプライシングバリアントｖ１を検出又は増幅しないプローブ又はプライマーであって、エキソンｖ２配列（配列番号１０の配列）若しくはその相補配列にハイブリダイズ可能なプローブ又はプライマー、
通常Ｌ−セレクチンを特異的に検出又は増幅可能で、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２を検出又は増幅しないプローブ又はプライマーであって、エキソン７＋エキソン８の配列（配列番号８＋配列番号１１の配列）若しくはその相補配列にハイブリダイズ可能なプローブ又はプライマー、並びに、
スプライシングバリアントｖ１及びｖ２を特異的に検出又は増幅可能で、通常Ｌ−セレクチンを検出又は増幅しないプローブ又はプライマーであって、エキソンｖ１の配列（配列番号９の配列）若しくはその相補配列にハイブリダイズ可能なプローブ又はプライマーからなる群から選択される少なくとも１つのプローブ又はプライマーを含むＬ−セレクチンの検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−セレクチン新規スプライシングバリアントに関する。
【背景技術】
【０００２】
セレクチンファミリーは、特定の糖鎖をＣａ2+依存的に認識するＣ型レクチン様構造をＮ末端に持つ糖タンパク質の一群で、白血球の血管外移動に関与する接着分子である。セレクチンファミリーには、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチンの３種類の分子が存在する。いずれも、シアリルルイスｘ、あるいは硫酸化シアリルルイスｘという特定の糖鎖構造（リガンド）に結合する。
【０００３】
Ｌ−セレクチンは、おおよそすべての末梢血中の白血球表面に存在する分子量７〜９万の糖タンパク質である。Ｌ−セレクチンは、欠損すると末梢リンパ節へのリンパ球ホーミングが著しく阻害されることから、ホーミングレセプターとも呼ばれる。Ｌ−セレクチンは、リンパ球ホーミングを媒介するリンパ節の高内皮細静脈（ＨＥＶ）上の糖鎖（Ｌ−セレクチンリガンド）を認識してリンパ球ローリングを引き起こす。リンパ球は、リンパ節においてこのＨＥＶを通り血流中から血管外に移動する。
【０００４】
Ｌ−セレクチンの変異体については、いくつか報告されているが（特許文献１及び２参照）、Ｌ−セレクチンのスプライシングバリアントの報告は未だされていない。
【特許文献１】特表平７−５０６２５３号公報
【特許文献２】特開２００４−４９２３４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、Ｌ−セレクチンの新規スプライシングバリアントの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するため、本発明のＬ−セレクチンのスプライシングバリアントは、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１の第３９番目〜第３８５番目のアミノ酸配列からなるスプライシングバリアントｖ１、配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号２の第３９番目〜第３８７番目のアミノ酸配列からなるスプライシングバリアントｖ２、及び、これらのタンパク質の配列において１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、通常Ｌ−セレクチンよりも細胞外切断を受けにくい性質を示すタンパク質からなる群から選択されるＬ−セレクチンのスプライシングバリアントである。
【０００７】
本発明者らは、セレクチンについて鋭意研究を重ね、既知のマウスＬ−セレクチンの５'非翻訳領域とコード領域のカルボキシ末端とにそれぞれ位置する一対のプライマーと、マウスの骨髄培養細胞から抽出したＲＮＡとを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った結果、第７エキソンと第８エキソン間のイントロン上に新規なカセットエキソンｖ１及びｖ２（図１参照）を見出し本発明に到達した。
【発明の効果】
【０００８】
白血球上のＬ−セレクチンは、細胞の活性化により細胞外切断を受け、可溶性Ｌ−セレクチンを生じる。細胞表面のＬ−セレクチンがこのような細胞外切断を受けることで、細胞の生体内での動態が変化することが知られている。すなわち、細胞外切断を制御することにより細胞の動態を変化させることができる。本発明のＬ−セレクチン新規スプライシングバリアントｖ１及びｖ２は、いずれも、細胞の刺激に対して、通常Ｌ−セレクチンよりも細胞外切断を受けにくいという性質を示す。したがって、本発明のＬ−セレクチンスプライシングバリアントを用いれば、細胞外切断制御の分子機構の解明が可能となり、ひいては、細胞外切断の分子機構に基づいて、生体内での白血球の動態を変化させる薬剤の開発が可能となる。そして、このような薬剤は、さまざまな炎症・感染時に白血球の動態を変化させることにより免疫応答を制御する新たな免疫抑制剤となる可能性がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、また、Ｌ−セレクチンのスプライシングバリアント又は通常Ｌ−セレクチンに由来するポリペプチドであって、スプライシングバリアントｖ１に由来する配列番号１の第３５６番目〜第３８５番目の配列、第３６２番目〜第３８５番目の配列、第３７８番〜第３８５番目の配列、及び第３６２番目〜第３７７番目の配列、スプライシングバリアントｖ２に由来する配列番号２の第３５６番目〜第３８７番目の配列、第３６２番目〜第３８７番目の配列、第３７８番〜第３８７番目の配列、及び第３６２番目〜第３７７番目の配列、並びに、通常Ｌ−セレクチンに由来する配列番号５の配列、及びその第７番目〜第１７番目の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。
【００１０】
本発明は、また、ポリヌクレオチドであって、本発明のスプライシングバリアント若しくは本発明のポリペプチドをコードする配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチドを提供する。
【００１１】
本発明は、さらにまた、Ｌ−セレクチンのスプライシングバリアント転写産物由来ポリヌクレオチドであって、スプライシングバリアントｖ１ｍＲＮＡに由来する配列番号３の配列、その第１番目〜第１１５５番目の配列、第１１５番目〜第１１５５番目の配列、及び、第１０８２番目〜第１１３０番目の配列、スプライシングバリアントｖ２ｍＲＮＡに由来する配列番号４の配列、その第１番目〜第１１６１番目の配列、第１１５番目〜第１１６１番目の配列、第１０８２番目〜第１１８１番目の配列、及び、第１１３１番目〜第１１８１番目の配列、並びに、これらの相補配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを提供する。
【００１２】
本発明は、また、本発明のポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。
【００１３】
本発明は、さらにまた、遺伝子導入体であって、本発明のベクターが遺伝子導入され、その遺伝子導入により本発明のタンパク質又は本発明のポリペプチドを発現する遺伝子導入体を提供する。
【００１４】
本発明は、また、Ｌ−セレクチンに対する抗体であって、スプライシングバリアントｖ１のＣ（カルボキシ）末端領域である配列番号６の配列、その第７番目〜第３０番目の配列、若しくは第２３番目〜第３０番目の配列、又はそれらの部分配列からなるポリペプチドに対して産生され、スプライシングバリアントｖ１を特異的に認識し、通常Ｌ−セレクチン及びスプライシングバリアントｖ２と交差反応しない抗体、スプライシングバリアントｖ２のＣ末端領域である配列番号７の配列、その第７番目〜第３２番目の配列、若しくは第２３番目〜第３２番目の配列、又はそれらの部分配列からなるポリペプチドに対して産生され、スプライシングバリアントｖ２を特異的に認識し、通常Ｌ−セレクチン及びスプライシングバリアントｖ１と交差反応しない抗体、通常Ｌ−セレクチンのＣ末端領域である配列番号５の配列、若しくはその第７番目〜第１７番目の配列、又はそれらの部分配列に対して産生され、通常Ｌ−セレクチンを特異的に認識し、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２と交差反応しない抗体、並びに、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２に共通するＣ末端領域の配列番号６若しくは７の第１番目〜第２２番目の配列若しくは第７番目〜第２２番目の配列、又はそれらの部分配列に対して産生され、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２を特異的に認識し、通常Ｌ−セレクチンと交差反応しない抗体からなる群から選択される抗Ｌ−セレクチン抗体を提供する。
【００１５】
本発明は、また、Ｌ−セレクチンの検出キットであって、スプライシングバリアントｖ１を特異的に検出又は増幅可能で、通常Ｌ−セレクチン及びスプライシングバリアントｖ２を検出又は増幅しないプローブ又はプライマーであって、エキソンｖ１＋エキソン８の配列（配列番号９＋配列番号１１の配列、ここで“Ａ＋Ｂの配列”とは、配列Ａと配列Ｂとがこの順で連続した配列をいう。以下同じ。）若しくはその相補配列にハイブリダイズ可能なプローブ又はプライマー、スプライシングバリアントｖ２を特異的に検出又は増幅可能で、通常Ｌ−セレクチン及びスプライシングバリアントｖ１を検出又は増幅しないプローブ又はプライマーであって、エキソンｖ２配列（配列番号１０の配列）若しくはその相補配列にハイブリダイズ可能なプローブ又はプライマー、通常Ｌ−セレクチンを特異的に検出又は増幅可能で、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２を検出又は増幅しないプローブ又はプライマーであって、エキソン７＋エキソン８の配列（配列番号８＋配列番号１１の配列）若しくはその相補配列にハイブリダイズ可能なプローブ又はプライマー、並びに、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２を特異的に検出又は増幅可能で、通常Ｌ−セレクチンを検出又は増幅しないプローブ又はプライマーであって、エキソンｖ１の配列（配列番号９の配列）若しくはその相補配列にハイブリダイズ可能なプローブ又はプライマー、からなる群から選択される少なくとも１つのプローブ又はプライマーを含むＬ−セレクチンの検出キットを提供する。
【００１６】
本発明において、“スプライシングバリアント”とは、選択的スプライシグに起因する異なるｍＲＮＡ（転写産物）及びそれにコードされるタンパク質（翻訳産物）をいう。本発明においては、特に言及がない場合には、タンパク質を示すものとする。
【００１７】
本発明において、“通常Ｌ−セレクチン”とは、従来知られていたマウスＬ−セレクチンをいい、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅデータベースの登録番号ＮＭ＿０１１３４６、同Ｐｒｏｔｅｉｎデータベースの登録番号ＮＰ＿０３５４７６のＬ−セレクチンをいう。
【００１８】
本発明において、“タンパク質”及び“ポリペプチド”は、ともに、タンパク質、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドを含む。
【００１９】
本発明において、“ポリヌクレオチド”とは、オリゴヌクレオチドを含み、その長さは特に限定されない。また、ヌクレオチドも、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は、従来公知のこれらの誘導体や類縁体等を使用できる。ヌクレオチドがＲＮＡの場合、配列表のｔ（チミン）塩基は、ｕ（ウラシル）塩基に読み替えるものとする。また、本発明において、“ポリヌクレオチド”は、一本鎖であってもよく、二本以上の複数鎖であってもよい。
【００２０】
次に、本発明のＬ−セレクチンのスプライシングバリアントについて、図１を用いて説明する。図１は、マウスＬ−セレクチンの遺伝子構造を示す図である。同図において、エキソンは、四角で示され、イントロンは、実線で示される。同図に示すとおり、従来のマウス通常Ｌ−セレクチン（Ｌ−ｓｅｌ−ｃ）は、９つのエキソンで構成される。これに対し、本発明者らは、通常Ｌ−セレクチンの第７エキソンと第８エキソンとの間にカセットエキソンｖ１とカセットエキソンｖ２の存在を見出した。
【００２１】
すなわち、図１に示すとおり、本発明のスプライシングバリアントｖ１（Ｌ−ｓｅｌ−ｖ１）は、エキソン７とエキソン８との間にカセットエキソンｖ１が挿入された構成であり、本発明のスプライシングバリアントｖ２（Ｌ−ｓｅｌ−ｖ２）は、エキソン７とエキソン８との間に、カセットエキソンｖ１及びｖ２が挿入された構成である。なお、エキソンｖ１とｖ２との間にはイントロンは存在しない。
【００２２】
したがって、Ｌ−セレクチン遺伝子の第７エキソンと第８エキソン間は、図２に示すような構成となる。すなわち、同図に示すとおり、エキソン７とエキソン８間のイントロンに、４９ｂのエキソンｖ１（配列番号９）と５１ｂのエキソンｖ２（配列番号１０）とがイントロンを介さずに連続して存在する構成である。そして、このような構成の遺伝子が転写され、選択的スプライシングを受けることにより、通常Ｌ−セレクチン成熟ｍＲＮＡの他に、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２の成熟ｍＲＮＡが産生される。図３に、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２ｍＲＮＡのコード領域の３'末端の構成と配列を、通常Ｌ−セレクチンのコード領域３'末端と比較して示す。同図において、大文字は翻訳領域（コード領域）を示し、小文字は非翻訳領域を示し、下線は通常Ｌ−セレクチンと同じ配列のエキソンを示し、太字はエキソンｖ１を示し、太字イタリックはエキソンｖ２を示し、四角は終止コドンを示す。同図に示すとおり、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２では、エキソンｖ１の挿入により読み枠が変化し、終止コドンの位置も変化している。したがって、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２では、Ｃ末端側のアミノ酸配列が、通常Ｌ−セレクチンと異なる。
【００２３】
通常Ｌ−セレクチン及び本発明のスプライシングバリアントｖ１及びｖ２のＣ末端側のアミノ酸配列を図４に示す。上述したとおり、Ｌ−セレクチンは、Ｎ末端側が細胞外ドメインであり、Ｃ末端側が細胞内ドメインとなる。同図の通常Ｌ−セレクチン（Ｌ−ｓｅｌ−ｃ；ＮＰ＿０３５４７６）の第３５６番目から第３７２番目の１７アミノ酸配列（配列番号５）は、通常Ｌ−セレクチンの細胞内ドメインの配列である。同図に示すように、この細胞内ドメインの配列のうちＣ末端１１アミノ酸が、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２では、それぞれ、新たな２４アミノ酸及び２６アミノ酸へ変化している（それぞれ、配列番号６及び７）。なお、同図において、これらの３つの細胞内ドメインに共通する６アミノ酸をイタリックで示し（配列番号５〜７の第１番目〜第６番目）、スプライシングバリアントｖ１とｖ２間でのみ共通する１６アミノ酸配列を下線で示し（配列番号６及び７の第７番目〜第２２番目）、これら３つで互いに異なる配列を太字で示す。
【００２４】
したがって、本発明のスプライシングバリアントは、配列番号１のアミノ酸配列、又は、配列番号１の第３９番目〜第３８５番目のアミノ酸配列からなるスプライシングバリアントｖ１、及び、配列番号２のアミノ酸配列、又は、配列番号２の第３９番目〜第３８５番目のアミノ酸配列からなるスプライシングバリアントｖ２を含む。ここで、Ｎ末端側第１番目〜第３８番目のアミノ酸配列の領域は、通常Ｌ−セレクチンにおいてシグナルペプチドであることが知られている領域である。
【００２５】
また、本発明のスプライシングバリアントは、その他の態様として、上述のスプライシングバリアントｖ１又はｖ２のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列からなるタンパク質を含む。ここで、“相同”なアミノ酸配列とは、その機能を維持できるほど十分に類似していることをいう。その相同性としては、例えば、９０％以上であり、好ましくは９５％以上であり、より好ましくは、９７．５％以上である。
【００２６】
より具体的には、本発明のスプライシングバリアントは、上述のスプライシングバリアントｖ１又はｖ２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸配列が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である。ここで、欠失、置換もしくは付加が可能なアミノ酸残基数としては、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上であって、好ましくは、１〜３個、より好ましくは、１又は２個である。このようなタンパク質は、通常Ｌ−セレクチンよりも細胞外切断を受けにくい性質を示すことが好ましい。なお、細胞外切断の受けやすさは、例えば、後述する実施例に記載の方法など、当該技術分野の当業者が従来公知の方法で測定することができる。
【００２７】
上述のように規定されるアミノ酸配列からなるタンパク質であれば、糖鎖修飾を含む様々な修飾の有無に関らず、本発明のスプライシングバリアントに含まれる。
【００２８】
本発明のＬ−セレクチンのスプライシングバリアントは、例えば、本発明のスプライシングバリアントをコードする本発明のポリヌクレオチドを用いて生産することができ、また、各種細胞へ遺伝子導入することによりＬ−セレクチンの機能解析などに利用できる。これらの本発明のスプライシングバリアントの生産方法及び使用方法は、例えば、通常Ｌ−セレクチンに当業者が適用する従来公知の生産方法及び使用方法を適用できるが、これらに特に限定されない。とりわけ、上述のとおり、本発明のスプライシングバリアントｖ１及びｖ２はいずれも通常Ｌ−セレクチンよりも細胞外切断を受けにくいという性質を示すから、本発明のスプライシングバリアントは、例えば、細胞外切断制御の分子機構の解明や、細胞外切断の分子機構に基づく生体内での白血球の動態を変化させる薬剤の開発に使用できる。
【００２９】
次に、本発明のポリペプチドについて説明する。本発明のポリペプチドは、本発明のスプライシングバリアントに由来するポリペプチドである。スプライシングバリアントｖ１に由来する本発明のポリペプチドとしては、配列番号１の配列番号１の第３５６番目〜第３８５番目の配列、第３６２番目〜第３８５番目の配列、第３７８番〜第３８５番目の配列、第３６２番目〜第３７７番目の配列などのアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。配列番号１の第３５６番目〜第３８５番目の配列は、配列番号６の配列と同一であり、本発明のスプライシングバリアントｖ１のＣ末端細胞内ドメインである（図４参照）。配列番号１の第３６２番目〜第３８５番目の配列は、前記Ｃ末端細胞内ドメインのうち、通常Ｌ−セレクチン及び本発明のスプライシングバリアントｖ２と共通する配列（ＲＲＬＫＫＧ）を除いたものである（図４参照）。配列番号１の第３７８番〜第３８５番目の配列（ＱＥＩＳＲＫＤＧ）は、前記Ｃ末端細胞内ドメインのうち、Ｌ−セレクチン及び本発明のスプライシングバリアントｖ２との共通領域がない本発明のスプライシングバリアントｖ１特異的な配列である（図４参照）。そして、配列番号１の第３６２番目〜第３７７番目の配列は、本発明のスプライシングバリアントｖ１とｖ２にのみ共通する配列である（図４参照）。
【００３０】
スプライシングバリアントｖ２に由来する本発明のポリペプチドとしては、配列番号２の第３５６番目〜第３８７番目の配列、第３６２番目〜第３８７番目の配列、第３７８番〜第３８７番目の配列、及び第３６２番目〜第３７７番目の配列などのアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。配列番号２の第３５６番目〜第３８７番目の配列は、配列番号７の配列と同一であり、本発明のスプライシングバリアントｖ２のＣ末端細胞内ドメインである（図４参照）。配列番号２の第３６２番目〜第３８７番目の配列は、前記Ｃ末端細胞内ドメインのうち、前記共通配列（ＲＲＬＫＫＧ）を除いたものである（図４参照）。配列番号２の第３７８番〜第３８７番目の配列（ＣＡＬＰＨＬＳＴＦＩ）は、前記Ｃ末端細胞内ドメインのうち、Ｌ−セレクチン及び本発明のスプライシングバリアントｖ１との共通領域がない本発明のスプライシングバリアントｖ２特異的な配列である（図４参照）。そして、配列番号２の第３６２番目〜第３７７番目の配列は、本発明のスプライシングバリアントｖ１とｖ２にのみ共通する配列である（図４参照）。
【００３１】
本発明のポリペプチドは、また、その他の態様として、通常Ｌ−セレクチンに由来する配列番号５の配列、及びその第７番目〜第１７番目の配列からなるポリペプチドである。配列番号５の配列は、上述のとおり、通常Ｌ−セレクチンのＣ末端細胞内ドメインであり、配列番号５の第７番目〜第１７番目の配列は、前記Ｃ末端細胞内ドメインから前記共通配列（ＲＲＬＫＫＧ）を除いたものである。
【００３２】
また、本発明のポリペプチドは、さらなるその他の態様として、スプライシングバリアントｖ１又はｖ２と相同な配列からなる本発明のスプライシングバリアントから由来する上述のポリペプチドに対応するアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
【００３３】
上述のように規定されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであれば、糖鎖修飾を含む様々な修飾の有無に関らず、本発明のポリペプチドに含まれる。
【００３４】
本発明のポリペプチドは、例えば、後述する本発明のポリヌクレオチドを用いてインビボ若しくはインビトロで生産しても又は人工的に化学合成してもよく、いずれも、従来公知の生産方法を適用できる。そして、本発明のポリペプチドは、これらに限定されないが、例えば、後述するとおり、本発明の抗体の産生などに利用できる。
【００３５】
次に、本発明のポリヌクレオチドについて説明する。本発明のポリヌクレオチドは、第１の態様として、本発明のスプライシングバリアント若しくは本発明のポリペプチドをコードする配列、又はその相補配列からなるポリヌクレオチドである。
【００３６】
また、本発明のポリヌクレオチドは、第２の態様として、Ｌ−セレクチンのスプライシングバリアント転写産物（成熟ｍＲＮＡ）に由来するポリヌクレオチドである。スプライシングバリアントｖ１ｍＲＮＡに由来するポリヌクレオチドとしては、配列番号３の配列、その第１番目〜第１１５５番目の配列、第１１５番目〜第１１５５番目の配列、又は第１０８２番目〜第１１３０番目の配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号３の配列は、スプライシングバリアントｖ１コード領域（１〜１１５８）に、通常Ｌ−セレクチンｍＲＮＡではコード領域であったエキソン９の残りの領域を加えたヌクレオチド配列である（図３参照）。配列番号３の第１番目〜第１１５５番目の配列は、スプライシングバリアントｖ１コード領域（１〜１１５８）から終止コドンを削除したヌクレオチド配列であり、配列番号３の第１１５番目〜第１１５５番目の配列は、さらに、シグナル配列に対応するコード領域を削除したヌクレオチド配列である。配列３の第１０８２番目〜第１１３０番目の配列は、配列番号９と同一のエキソンｖ１の配列である。
【００３７】
スプライシングバリアントｖ２ｍＲＮＡに由来するポリヌクレオチドとしては、配列番号４の配列、その第１番目〜第１１６１番目の配列、第１１５番目〜第１１６１番目の配列、第１０８２番目〜第１１８１番目の配列、又は第１１３１番目〜第１１８１番目の配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号４の配列は、スプライシングバリアントｖ１コード領域（１〜１１６４）に、エキソンｖ２の残りの部分及び通常Ｌ−セレクチンではコード領域であったエキソン８及び９を加えたヌクレオチド配列である（図３参照）。配列番号４の第１番目〜第１１６１番目の配列は、スプライシングバリアントｖ２コード領域（１〜１１６４）から終止コドンを削除したヌクレオチド配列であり、配列番号４の第１１５番目〜第１１６１番目の配列は、さらに、シグナル配列に対応するコード領域を削除したヌクレオチド配列である。配列番号４の第１０８２番目〜第１１８１番目の配列は、配列番号９＋配列番号１０の配列に相当するエキソンｖ１＋ｖ２の配列であり、配列番号４の第１１３１番目〜第１１８１番目の配列は、配列番号１０と同一のエキソンｖ２の配列である。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドは、その他の態様として、前述のスプライシングバリアントｖ１及びｖ２由来のポリヌクレオチドの配列において１若しくは数個の塩基が、欠失、置換若しくは付加され、前記ポリヌクレオチドの相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。欠失、置換もしくは付加が可能な塩基数としては、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上であって、好ましくは、１〜３個、より好ましくは、１又は２個である。前記ストリンジェントな条件は、例えば、５×ＳＳＣ＋０．３％ＳＤＳ中で熱変性した後、６５℃で４〜１６時間のハイブリダイゼーションし、常温の２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ、及び、２×ＳＳＣでそれぞれ５分間洗浄し、０．０５×ＳＳＣでリンスすること等が挙げられる。そして、本発明のポリヌクレオチドは、さらなる態様として、これらのポリヌクレオチドの相補配列からなるポリヌクレオチドである。
【００３９】
本発明のポリヌクレオチドの製造方法としては、特に制限されず、例えば、従来公知の方法により化学合成により製造してもよく、酵素的にインビボ又はインビトロで製造してもよい。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、本発明のスプライシグバリアントや本発明のペプチドを生産するため若しくはそのためのベクターの製造に使用したり、本発明のスプライシングバリアントのｍＲＮＡを検出するプローブやプライマーとして使用したりできる。
【００４０】
したがって、本発明は、その他の態様として、ベクターであって、本発明のポリヌクレオチドを含有するベクターである。本発明のベクターとしては、大腸菌などへ導入するためのベクターであっても、動物細胞などへ導入するためのベクターであってもよく、それぞれの宿主に応じた発現システムを備えることができる。例えば、大腸菌を宿主とする場合、大腸菌で増幅されるための「ｏｒｉ」を有し、さらに、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を有すれば、特に制限されない。具体的には、例えば、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ等が挙げられる。ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＣＭＶプロモーター等を有することが好ましい。細胞への形質転換を選抜するための遺伝子、例えば、ネオマイシンやＧ４１８等に対する薬剤耐性遺伝子を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３等が挙げられる。本発明のベクターは、本発明のポリヌクレオチドを用いれば、当業者により容易に製造・使用することができる。
【００４１】
本発明は、さらにその他の態様として、上述の本発明のベクターが遺伝子導入され、それにより本発明のスプライシングバリアント及び／又は本発明のポリペプチドを発現する細胞やその細胞を有する個体を含む。本発明においてこれらを遺伝子導入体と呼ぶ。本発明の遺伝子導入体は、例えば、種々のＬ−セレクチンのアッセイを始め、これを利用する薬剤開発等に利用できる。
【００４２】
次に、本発明の抗体について説明する。本発明は、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２の細胞内ドメインにおけるアミノ酸変化に起因して、少なくとも以下の４つの態様において、本発明の抗体を提供する。すなわち、第１の態様は、スプライシングバリアントｖ１を特異的に認識し、かつ、通常Ｌ−セレクチン及びスプライシングバリアントｖ２と交差反応しない抗体であり、第２の態様は、スプライシングバリアントｖ２を特異的に認識し、かつ、通常Ｌ−セレクチン及びスプライシングバリアントｖ１と交差反応しない抗体であり、第３の態様は、通常Ｌ−セレクチンを特異的に認識し、かつ、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２と交差反応しない抗体であり、第４の態様は、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２を特異的に認識し、通常Ｌ−セレクチンと交差反応しない抗体である。
【００４３】
本発明の第１の態様の抗体、すなわち、スプライシングバリアントｖ１を特異的に認識し、かつ、通常Ｌ−セレクチン及びスプライシングバリアントｖ２と交差反応しない抗体は、例えば、スプライシングバリアントｖ１のＣ末端領域である配列番号６の配列、その第７番目〜第３０番目の配列、若しくは第２３番目〜第３０番目の配列、又は、それらの部分配列からなるポリペプチドなどを用いて産生できる（図４参照）。これらの中でも、使用するポリペプチドとしては、スプライシングバリアントｖ１特異的な配列番号６の第２３番目〜第３０番目の配列（ＱＥＩＳＲＫＤＧ）からなるポリペプチドが好ましい。
【００４４】
本発明の第２の態様の抗体、すなわち、スプライシングバリアントｖ２を特異的に認識し、かつ、通常Ｌ−セレクチン及びスプライシングバリアントｖ１と交差反応しない抗体は、例えば、スプライシングバリアントｖ２のＣ末端領域である配列番号７の配列、その第７番目〜第３２番目の配列、若しくは第２３番目〜第３２番目の配列、又は、それらの部分配列からなるポリペプチドなどを用いて産生できる（図４参照）。これらの中でも、使用するポリペプチドとしては、スプライシングバリアントｖ２特異的な配列番号７の第２３番目〜第３２番目の配列（ＣＡＬＰＨＬＳＴＦＩ）からなるポリペプチドが好ましいが、これらの配列の疎水性が高すぎて抗体産生効率が低い場合には、配列番号７の第７番目〜第３２番目の配列からなるポリペプチド又はその断片を使用することも好ましい。
【００４５】
本発明の第３の態様の抗体、すなわち、通常Ｌ−セレクチンを特異的に認識し、かつ、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２と交差反応しない抗体は、例えば、通常Ｌ−セレクチンのＣ末端領域である配列番号５の配列、若しくはその第７番目〜第１７番目の配列、又は、それらの部分配列からなるポリペプチドなどを用いて産生できる（図４参照）。これらの中でも、使用するポリペプチドとしては、通常Ｌ−セレクチンに特異的な配列番号５の第７番目〜第１７番目の配列からなるポリペプチドが好ましい。
【００４６】
本発明の第４の態様の抗体、すなわち、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２を特異的に認識し、通常Ｌ−セレクチンと交差反応しない抗体は、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２に共通するＣ末端領域の配列番号６若しくは７の第１番目〜第２２番目の配列若しくはその第７番目〜第２２番目の配列、又は、それらの部分配列からなるポリペプチドなどを用いて産生できる（図４参照）。使用するポリペプチドとしては、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２のみに特異的な配列番号６若しくは７の第７番目〜第２２番目の配列からなるポリペプチドが好ましい。
【００４７】
本発明の抗体は、上述のポリペプチドを用いる他は、特に制限されず、従来公知の抗体産生方法により製造できる。また、本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。本発明の抗体は、例えば、本発明のスプライシングバリアント又は通常Ｌ−セレクチンを特異的に検出することに利用できる。
【００４８】
本発明は、さらにその他の態様として、選択的スプライシングにより挿入されるカセットエキソンｖ１及びｖ２の配列に基づき少なくとも以下の４つの態様においてプローブ又はプライマーを提供できる。すなわち、第１の態様として、スプライシングバリアントｖ１を特異的に検出又は増幅可能で、通常Ｌ−セレクチン及びスプライシングバリアントｖ２を検出又は増幅しないプローブ又はプライマーであり、第２の態様として、スプライシングバリアントｖ２を特異的に検出又は増幅可能で、通常Ｌ−セレクチン及びスプライシングバリアントｖ１を検出又は増幅しないプローブ又はプライマーであり、第３の態様として、通常Ｌ−セレクチンを特異的に検出又は増幅可能で、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２を検出又は増幅しないプローブ又はプライマーであり、第４の態様として、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２を特異的に検出又は増幅可能で、通常Ｌ−セレクチンを検出又は増幅しないプローブ又はプライマーである。前記プローブは、例えば、ノーザンブロッティングや、ＤＮＡマイクロアレイなどにおいて目的配列の検出に使用できる。また、前記プライマーは、例えば、各種ＰＣＲ反応において目的配列の増幅に利用できる。これらのプローブ又はプライマーは、適宜、標識化若しくは修飾化されてもよい。前記４つの態様のプローブ又はプライマーは、当該技術分野の当業者であれば、下記の内容に基づき容易に製造及び使用できる。
【００４９】
前記第１の態様のプローブ又はプライマー、すなわち、スプライシングバリアントｖ１を特異的に検出又は増幅可能で、かつ、通常Ｌ−セレクチン及びスプライシングバリアントｖ２を検出又は増幅しないプローブ又はプライマーは、例えば、エキソンｖ１＋エキソン８の配列（配列番号９＋配列番号１１の配列）若しくはその相補配列にハイブリダイズ可能なものから選択できる。スプライシングバリアントｖ１、ｖ２、及び、通常Ｌ−セレクチンの成熟ｍＲＮＡにおいて、スプライシングバリアントｖ１に特異的な領域は、エキソンｖ１とエキソン８との境界領域である（図３参照）。したがって、この境界領域に特異的な配列からなるプローブ又はプライマーを選択して前記第１の態様のプローブ又はプライマーを得ることが好ましい。その具体例としては、配列番号１５のヌクレオチド配列からなるヌクレオチドＭＬｓｅｌ−Ｒ６が挙げられる（5'-CTTGAGATTTCTTGCCTCAA-3'）。このＭＬｓｅｌ−Ｒ６は、後述の実施例で示すとおり、ＰＣＲ反応におけるスプライシングバリアントｖ１に特異的な３'プライマーとして使用でき、また、スプライシングバリアントｖ１に特異的なプローブとして使用できる。
【００５０】
前記第２の態様のプローブ又はプライマー、すなわち、スプライシングバリアントｖ２を特異的に検出又は増幅可能で、かつ、通常Ｌ−セレクチン及びスプライシングバリアントｖ１を検出又は増幅しないプローブ又はプライマーは、例えば、エキソンｖ２の配列（配列番号１０の配列）若しくはその相補配列にハイブリダイズ可能なものから選択できる。スプライシングバリアントｖ１、ｖ２、及び、通常Ｌ−セレクチンの成熟ｍＲＮＡにおいて、スプライシングバリアントｖ２に特異的な領域は、エキソンｖ２全体及びその両端の境界領域である（図３参照）。したがって、このエキソンｖ２全体及びその両端の境界領域に特異的な配列からなるプローブ又はプライマーを選択して前記第２の態様のプローブ又はプライマーを得ることが好ましい。その具体例としては、配列番号１６のヌクレオチド配列からなるヌクレオチドＭＬｓｅｌ−Ｒ５が挙げられる（5'-GTTTTGAGTAGATCTGCTAGATAAACGTGGAC-3'）。このＭＬｓｅｌ−Ｒ５は、後述の実施例で示すとおり、ＰＣＲ反応におけるスプライシングバリアントｖ２に特異的な３'プライマーとして使用でき、また、スプライシングバリアントｖ２に特異的なプローブとして使用できる。
【００５１】
前記第３の態様のプローブ又はプライマー、すなわち、通常Ｌ−セレクチンを特異的に検出又は増幅可能で、かつ、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２を検出又は増幅しないプローブ又はプライマーは、例えば、エキソン７＋エキソン８の配列（配列番号８＋配列番号１１の配列）若しくはその相補配列にハイブリダイズ可能なものから選択できる。スプライシングバリアントｖ１、ｖ２、及び、通常Ｌ−セレクチンの成熟ｍＲＮＡにおいて、通常Ｌ−セレクチンに特異的な領域は、エキソン７とエキソン８との境界領域である（図３参照）。したがって、この境界領域に特異的な配列からなるプローブ又はプライマーを選択して前記第３の態様のプローブ又はプライマーを得ることが好ましい。その具体例としては、配列番号１４のヌクレオチド配列からなるヌクレオチドＭＬｓｅｌ−Ｒ９が挙げられる（5'-TCTTGAGATTTCTTGCCTTTTTTTAAC-3'）。このＭＬｓｅｌ−Ｒ９は、後述の実施例で示すとおり、ＰＣＲ反応における通常Ｌ−セレクチンに特異的な３'プライマーとして使用でき、また、通常Ｌ−セレクチンに特異的なプローブとして使用できる。
【００５２】
前記第４の態様のプローブ又はプライマー、すなわち、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２を特異的に検出又は増幅可能で、かつ、通常Ｌ−セレクチンを検出又は増幅しないプローブ又はプライマーは、例えば、エキソンｖ１の配列（配列番号９の配列）若しくはその相補配列にハイブリダイズ可能なものから選択できる。スプライシングバリアントｖ１、ｖ２、及び、通常Ｌ−セレクチンの成熟ｍＲＮＡにおいて、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２に特異的な領域は、エキソンｖ１全体及びその５'側のエキソン７との境界領域である（図３参照）。したがって、このエキソンｖ１全体及びその５'側のエキソン７との境界領域に特異的な配列からなるプローブ又はプライマーを選択して前記第４の態様のプローブ又はプライマーを得ることが好ましい。
【００５３】
次に、本発明の検出キットについて説明する。本発明の検出キットは、Ｌ−セレクチンのスプライシングバリアントｖ１及びｖ２並びに通常Ｌ−セレクチンの少なくとも１つを特異的に検出するためのキットであって、上述した４つの態様のプローブ又はプライマーのうち少なくとも１つの態様のプローブ又はプライマーを含む検出キットである。この検出キットによれば、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイなどの方法により検出ができる。本発明のキットは、前記少なくとも１つの態様のプローブ又はプライマーを含む以外については、特に制限されず、取り扱い説明書の他、適宜試薬を含むことができる。また、このキットは、通常Ｌ−セレクチン並びにスプライシングバリアントｖ１及びｖ２の３種類をすべて増幅できる共通プライマーセットを含んでもよい。前記共通プライマーセットとしては、例えば、共通５'プライマーＭＬｓｅｌ−Ｆ１Ｂ（5'-TGAGGATCCGTGCAGGAGGCTGAGGCCTGCAGAG-3'：配列番号１２）及び共通５'プライマーＭＬｓｅｌ−Ｒ１Ｅ（5'-GTAGAATTCAGTATGGATCATCCATCCTTTCTTG-3'： 配列番号１３）の組み合わせが挙げられる。なお、前記ＭＬｓｅｌ−Ｆ１Ｂ及びＭＬｓｅｌ−Ｒ１Ｅにおいて５'側の９ｂの配列はクローニング用の制限酵素認識部位（特に下線部）であるため、これらは欠失させてもよいし、他の制限酵素認識部位としてもよい。
【００５４】
本発明の検出キットのその他の態様において、本発明の検出キットは、上述した４つの態様の本発明の抗体のうち少なくとも１つを含む検出キットである。この検出キットによれば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ等の免疫学的測定方法により検出ができる。本発明のキットは、前記少なくとも１つの抗体を含む以外については、特に制限されず、取り扱い説明書の他、適宜試薬を含むことができる。
【００５５】
そして、本発明は、さらなるその他の態様として、本発明のポリヌクレオチド、本発明の抗体、又は、本発明の検出キットを用いた、Ｌ−セレクチンのスプライシングバリアントｖ１及びｖ２並びに通常Ｌ−セレクチンの少なくとも１つを特異的に検出する方法を提供できる。それぞれの検出方法における具体的な方法については、当業者であれば、従来公知の検出方法を適用できる。
【００５６】
以下、実施例を用いて本発明を説明する。本発明は、これらの内容に限定されない。
【実施例１】
【００５７】
Ｌ−セレクチンスプライシングバリアントｍＲＮＡの検出
通常Ｌ−セレクチンの５'非翻訳領域に位置する５'プライマー：ＭＬｓｅｌ−Ｆ１Ｂとコード領域のカルボキシ末端に位置する３'プライマー：ＭＬｓｅｌ−Ｒ１Ｅとを用いて、マウス（Ｃ５７ＢＬ６系統）の骨髄細胞由来のＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行った。プライマーの配列は、下記表１に示す。そのＲＴ−ＰＣＲ産物の塩基配列を決定した結果、図１に示すとおり、通常Ｌ−セレクチンに加えて、スプライシングバリアントｖ１（Ｌ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ−ｖ１）及びスプライシングバリアントｖ２（Ｌ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ−ｖ２）と名付けた２つの転写産物が得られた。同図において、エキソンとイントロンを、それぞれ、四角及び実線で示す。点線は、スプライス部位の結合を示す。スプライシングバリアントｖ１の転写産物は、Ｌ−セレクチン遺伝子の第７−第８エキソン間に位置するカセットエキソンｖ１に起因する４９ｂの挿入があった。また、スプライシングバリアントｖ２転写産物は、４９ｂのエキソンｖ１挿入配列のすぐ後ろに、さらに５１ｂからなるエキソンｖ２配列が挿入されていた。この２つのエキソン（ｖ１及びｖ２）は、イントロンをはさむことなく連続して存在した。
【００５８】
【表１】
2007300886.tif 000003
【００５９】
スプライシングバリアントｖ１及びｖ２の発現パターンの確認
様々なマウスの組織・細胞から得たトータルＲＮＡを精製し、５'非翻訳領域に位置する共通５'プライマー：ＭＬｓｅｌ−Ｆ１Ｂと、通常Ｌ−セレクチン、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２にそれぞれに特異的な３'プライマー（下記表２参照）とを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。プライマーの配列を、下記表２に示す。
【００６０】
【表２】
2007300886.tif 000004
【００６１】
まず、これらのプライマーセットが、通常Ｌ−セレクチン、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２をそれぞれ特異的に増幅可能であるかどうかを確認した。通常Ｌ−セレクチン、スプライシングバリアントｖ１又はｖ２のいずれかを遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞から調製したトータルＲＮＡに対して、３通りのプライマーセットを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。その結果を図５Ａに示す。同図に示すとおり、上述のプライマーセットは、それぞれ、特異的に通常Ｌ−セレクチン、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２の転写産物を増幅できることが確認された。
【００６２】
次に、様々な白血球細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、顆粒球、ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、図５Ｂ）及び組織（脾臓細胞、胸腺、リンパ節、パイエル板細胞、小腸、脳、肺、肝臓、腎臓、図５Ｃ）由来のトータルＲＮＡに対して、上述の特異的プライマーセットを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。その結果を図５Ｂ及び図５Ｃに示す。同図に示すとおり、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２は、通常Ｌ−セレクチンが発現している細胞で発現していた。そのなかでも、Ｔｈ１細胞において、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２の発現割合が高いことが確認された。
【００６３】
通常Ｌ−セレクチン特異的抗体及びスプライシングバリアントｖ１特異的抗体の作製
通常Ｌ−セレクチンに特異的な領域である配列番号５の第７番目〜第１７番目のアミノ酸配列からなる合成ポリペプチド（図４参照）、及び、スプライシングバリアントｖ１に特異的な領域である配列番号６の第２３番目〜第３０番目のアミノ酸配列からなる合成ポリペプチド（図４参照）を用いて、それぞれに特異的なポリクローナル抗体、抗Ｌ−ｓｅｌ−ｃ抗体、及び、抗Ｌ−ｓｅｌ−ｖ１抗体を作製した。その特性を確認するために、通常Ｌ−セレクチン、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２のいずれかを遺伝子導入したＣＨＯ細胞のライセートを用いてウエスタンブロッティングを行った。図６にその結果の一例を示す。同図に示すとおり、前記抗Ｌ−ｓｅｌ−ｃ抗体及び抗Ｌ−ｓｅｌ−ｖ１抗体は、これら３つのＬ−セレクチン間で交差反応することなく、それぞれ、特異的な抗原抗体反応を示した。
【００６４】
ＰＭＡ誘導による細胞外切断感受性の確認
Ｌ−セレクチンは、ＰＭＡ（phorbol-12-myristyl-13-acetate）により細胞が活性化されると細胞外で切断され細胞外の部分が放出される“遊離（Ｓｈｅｄｄｉｎｇ）”を示す。そこで、ＣＯＳ−７細胞に、通常Ｌ−セレクチン、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２をそれぞれ遺伝子導入し、その２日後にＰＭＡで遺伝子導入細胞を活性化してＬ−セレクチンの細胞外切断を誘導した。その後、Ｌ−セレクチンの細胞表面における発現をフローサイトメトリーで測定し、ＰＭＡで細胞を刺激した場合としない場合とにおけるＬ−セレクチン陽性細胞の割合を比較した。図７にその結果の一例を示す。同図のデータは、（ＰＭＡ処理細胞におけるＬ−セレクチン陽性パーセンテージ）／（ＰＭＡ非処理細胞におけるＬ−セレクチン陽性パーセンテージ）×１００を示す。同図に示すとおり、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２は、通常Ｌ−セレクチンに比べて、ＰＭＡに誘導される細胞外切断を受けにくいことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
以上、説明したとおり、本発明のＬ−セレクチンのスプライシングバリアントは、例えば、細胞外切断制御の分子機構の解明に有用であり、生体内での白血球の動態を変化させる薬剤の開発に有用である。したがって、本発明は、例えば、医療分野、製薬分野に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、マウスＬ−セレクチン遺伝子及び選択的スプライシングにより生成される３つの異なる成熟ｍＲＮＡを示す図である。
【図２】図２は、マウスＬ−セレクチン遺伝子の構成を説明する図である。
【図３】図３は、通常Ｌ−セレクチン、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２の成熟ｍＲＮＡの翻訳領域の３'末端周辺のヌクレオチド配列を示す図である。
【図４】図４は、通常Ｌ−セレクチン、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２におけるＣ末端細胞内ドメインのアミノ酸配列を示す図である。
【図５】図５Ａは、通常Ｌ−セレクチン、スプライシングバリアントｖ１及びｖ２の検出に用いた特異的プライマーセットの特異性を示す図である。図５Ｂ及び図５Ｃは、さまざまな白血球及び組織におけるスプライシングバリアントの発現を示す図である。
【図６】図６は、抗Ｌ−ｓｅｌ−ｃ抗体及び抗Ｌ−ｓｅｌ−ｖ１抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果の一例を示す
【図７】図７は、ＰＭＡ細胞刺激後の細胞表面のＬ−セレクチン陽性細胞の割合をフローサイトメトリーで測定した結果の一例である。
【配列表フリーテキスト】
【００６７】
配列番号１：Ｌ−ｓｅｌ−ｖ１タンパク質
配列番号２：Ｌ−ｓｅｌ−ｖ２タンパク質
配列番号３：Ｌ−ｓｅｌ−ｖ１ｍＲＮＡ
配列番号４：Ｌ−ｓｅｌ−ｖ２ｍＲＮＡ
配列番号５：Ｌ−ｓｅｌ−ｃ Ｃ末端ペプチド
配列番号６：Ｌ−ｓｅｌ−ｖ１ Ｃ末端ペプチド
配列番号７：Ｌ−ｓｅｌ−ｖ２ Ｃ末端ペプチド
配列番号８：エキソン７
配列番号９：エキソンｖ１
配列番号１０：エキソンｖ２
配列番号１１：エキソン８
配列番号１２：共通５'プライマーＭＬｓｅｌ−Ｆ１Ｂ
配列番号１３：共通３'プライマーＭＬｓｅｌ−Ｒ１Ｅ
配列番号１４：Ｌ−ｓｅｌ−ｃ特異的３'プライマーＭＬｓｅｌ−Ｒ９
配列番号１５：Ｌ−ｓｅｌ−ｖ１特異的３'プライマーＭＬｓｅｌ−Ｒ６
配列番号１６：Ｌ−ｓｅｌ−ｖ２特異的３'プライマーＭＬｓｅｌ−Ｒ５
【図１】
2007300886.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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