(57)【要約】【課題】血管拡張効果および細胞保護効果を示す輸液製剤を提供する。【解決手段】配位子結合部位に一酸化炭素または一酸化窒素が結合したヘムを包含し、生体の血管内に投与された後に一酸化炭素または一酸化窒素を徐放し、血管拡張作用または細胞保護効果を示すことを特徴とする輸液製剤。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配位子結合部位に一酸化炭素または一酸化窒素が結合したヘムを包含し、生体の血管内に投与された後に一酸化炭素または一酸化窒素を徐放し、血管拡張作用または細胞保護効果を示すことを特徴とする輸液製剤。
【請求項２】
配位子結合部位に一酸化炭素が結合したヘムを包含し、虚血状態の生体の血管内に投与された後に一酸化炭素を徐放し、その後酸素運搬体として機能することにより虚血再灌流障害を防止することを特徴とする輸液製剤。
【請求項３】
５０ｎｍ〜１０００ｎｍの粒径を有する粒子の形態にあることを特徴とする請求項１または２に記載の輸液製剤。
【請求項４】
ヘモグロビンを内包したリン脂質小胞体粒子の形態にある請求項１〜３のいずれか１項に記載の輸液製剤。
【請求項５】
生理学的に許容され得る分散媒に分散した形態にある請求項１〜４のいずれか１項に記載の輸液製剤。
【請求項６】
血液から取り出した赤血球の形態にある請求項１または２に記載の輸液製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野において、輸血を必要とする患者に対して使用するための輸液製剤に係り、より詳しくは、血管拡張作用または細胞保護効果を示す配位子置換型輸液製剤に関する。本発明は、特に、虚血状態からの回復において虚血再灌流障害を防止し得る輸液製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
現行の献血／輸血システムは医療に不可欠の技術として確立している。しかし諸問題（感染、保存期限、献血者数の減少等）も抱え、輸血に代わる方法の探索が緊急課題になっており、特に酸素運搬機能を司る赤血球の代替物の実現が求められている。
【０００３】
赤血球に高濃度で含まれるヘモグロビン（Ｈｂ）が酸素結合蛋白質であることから、赤血球の代替物として、このＨｂを利用した人工赤血球の開発が進められている。Ｈｂは、厳密な精製を経れば、病原体や血液型物質を完全に除去することが可能である。Ｈｂを利用した人工赤血球としては、化学修飾Ｈｂ（水溶性高分子結合型、分子内架橋型、重合型）のほか、リン脂質小胞体の内水相に高純度Ｈｂを内包したＨｂ小胞体等が知られている。これらのうち、世界的に見て、修飾Ｈｂ溶液の開発が先行し、臨床試験の最終段階に到達したものがある（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４）。しかし、予期せぬ副作用のために開発を中断するケースが相次いでいる。これは、赤血球の生理学的意義に基づいた構造の欠如による。赤血球は直径約８μｍの中窪み円盤状粒子であり、Ｈｂ（分子量６４５００）の高濃度溶液（３５％）を赤血球膜で内包した構造を持っている。Ｈｂ溶液が赤血球膜で覆われている理由は、３５％濃厚Ｈｂ溶液の高い粘度と膠質浸透圧の抑制、Ｈｂ機能維持のための各種リン酸化合物や酵素類等機能物質の保持の役割、また、本来毒性のあるＨｂの逸脱の抑制である。遊離したＨｂは血管内皮弛緩因子である一酸化窒素（ＮＯ）を強く結合し、投与に際し血圧の異常亢進や食道の蠕動運動の障害等の副作用が明らかになっている。また、血管壁との直接的な接触により血管壁に損傷を与えることも指摘されている。従って、赤血球と同様の小胞体（細胞型）構造が重要である。
【０００４】
両親媒性分子であるリン脂質が水中で自己集合して二分子膜を形成しこれが小胞構造（リポソーム）になることが１９６０年代後半に報告され、このリン脂質小胞体にＨｂを内包する試みがなされてきたが、粒径制御等調製の困難さと、血漿蛋白質との相互作用に起因する凝集を阻止するための有効な手段が見いだせなかったため、成功しなかった（非特許文献１）。しかし、その後、リン脂質二分子膜で高濃度Ｈｂ溶液を被覆する技術が開発され、特に毛細血管を容易に通過することを可能とする粒径の制御と、血中分散安定性の向上が達成されたことにより、Ｈｂ小胞体が完成した（非特許文献２）。また、ポリエチレングリコールをリン脂質小胞体粒子の表面に配することによりＨｂ小胞体粒子間の凝集の抑制と分散安定性の向上が達成され、Ｈｂ小胞体分散溶液から酸素を実質的に完全に除去することにより、その分散溶液のまま室温にて長期間の保存が可能となった（特許文献５）。
【０００５】
Ｈｂ小胞体粒子は分子状のＨｂ修飾体に比較して粒子径が大きいため、希薄分散溶液状態でのその酸素解離速度定数は、ストップドフロー法で計測すると、Ｈｂ小胞体の方が極めて遅い（非特許文献３）。さらにＨｂ小胞体の濃厚溶液の微小細管内における酸素の放出速度も、分子状Ｈｂよりも遅い。これは、分子状Ｈｂはそれ自体が拡散することにより酸素の移動が促進される効果（促進輸送効果）があるためである（非特許文献４）。
【０００６】
Ｈｂ小胞体粒子分散液は膠質浸透圧を持たないので、血液交換率が高い場合には循環血液量を維持するために、血漿増量剤の添加が必要となる。例えばＨｂ小胞体を５％アルブミン水溶液に分散させた場合の膠質浸透圧は２０ｍｍＨｇとなり、粘度と浸透圧は血液とほぼ同等になり、循環動態の恒常性に寄与する。Ｈｂ小胞体の粒径は赤血球の約１／３０と小さく、血漿中に均一分散できる。Ｈｂ小胞体の動物投与試験では、臨床現場で想定される最大の交換率４０％の交換輸血においてもラットは全例が生存し、ヘマトクリットは１週間で完全に回復する。Ｈｂ小胞体は最終的に細網内皮系に捕捉され、安全に分解、排泄される。従って、Ｈｂ小胞体は、臨床では術前血液希釈、術中出血分の補給、さらに胸部外科手術における人工心肺（ＥＣＭＯ）体外循環回路の補充液としての利用が十分に期待できる。
【０００７】
Ｈｂ小胞体は、出血性ショック時の蘇生液としても検討され、赤血球と同等の酸素運搬機能が実証されている。例えば、麻酔下、ラットの循環血液量の５０％を脱血して１５分後にＨｂ小胞体を５％アルブミン溶液に分散させて投与し６時間観察した実験では、アルブミン単独の投与では８匹中２匹が死亡したのに対し、Ｈｂ小胞体の投与では循環動態も血液ガス組成も脱血液の投与と同等に推移し全例が生存した（非特許文献２）。これらの結果は、Ｈｂ小胞体が医療現場で使用できるようになれば、特に救急医療や外科的手術において、血液型の不一致や感染の心配をせずに、何時でも要求に応じて投与し、同種血輸血の回避、または必要輸血量の低減が可能となることを示唆する。
【０００８】
一方、一酸化窒素（ＮＯ）が血管内皮細胞から産生され、血管弛緩因子として作動することが報告されて以来、生体内ＮＯが情報伝達分子として様々な機能を果すことが明らかにされている。また、一酸化炭素（ＣＯ）についても、ヘムの代謝の過程で微量に産生され、これが極めて重要な役割を果していることが解ってきた。例えば肝臓では、肝実質細胞に存在する酵素ヘムオキシゲナーゼ−２（ＨＯ−２）がヘム分解酵素として存在し、この酵素によるヘム１分子の分解で、１分子のＣＯガスが放出される。このＣＯは、肝類洞血管内皮の伊東細胞に対し、血管弛緩因子として作動することが明らかになっている（非特許文献５）。また、内因性のＣＯガスは、抗炎症作用を示すことも明らかになっている（非特許文献６）。これらの事実から、ＣＯの薬効を積極的に活用するため、ＣＯガス吸入器が報告された（特許文献６）。また、静脈内投与可能な化合物としてルテニウムのＣＯ錯体等を合成し、そのＣＯ放出薬としての効果を調べる研究も行われるようになってきた（非特許文献７、特許文献７）。さらに、一酸化炭素中毒で知られるように、不完全燃焼等で生じるＣＯガスの吸入は極めて危険であるが、出血性ショックモデルラットに対し、低濃度で吸入させることにより、多臓器不全の改善が見られることが明らかになっている（非特許文献８）。
【０００９】
Ｈｂ分子は、酸素だけでなく、一酸化窒素（ＮＯ）や一酸化炭素（ＣＯ）とも結合するので、これまでは、Ｈｂを用いる人工赤血球の投与においてはこれら内因性のガス状分子を捕捉しない分子設計が重要であるとされてきた。
【００１０】
ところで、Ｈｂ小胞体の調製において、一酸化炭素（ＣＯ）を使用する工程が取り入れられている（特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１）。すなわち、ＨｂのＣＯに対する親和性は酸素の約２００倍といわれ、ＨｂＣＯ体（カルボニルヘモグロビン）は酸化劣化に対する耐性があるので、Ｈｂ精製工程においてＨｂをＨｂＣＯ体として加熱処理（６０℃、１０時間）している。Ｈｂ小胞体の調製の最終工程で、酸素気流下、可視光の照射によってＣＯは容易に解離除去され、それにより得られた酸素錯体を体内に投与している。
【００１１】
しかし、Ｈｂ小胞体にＣＯが結合したままの投与は従来知られていなかった。それはＣＯが有毒ガスであるという認識に基づいている。
【００１２】
また、アルブミン分子に合成ヘム誘導体を包接させたアルブミン−ヘム包接体が、全合成系のヘム蛋白質として開発され、その酸素運搬効果が明らかになっている。このアルブミン−ヘム包接体のヘムに一酸化炭素を結合させることにより、自動酸化が抑制され、長期間の保存安定度が得られ（非特許文献９）、また、ヘムに結合したＣＯを光照射によって排除し、酸素を結合させた後に動物に投与した場合の酸素運搬機能が確認されている。
【００１３】
しかし、ＣＯを結合したままでの投与は従来知られていなかった。
【非特許文献１】Djordjevich & Miller, Fed. Proc. 1977; 36:567
【非特許文献２】Sakai et al., Crit. Care Med. 2004;32(2); 539-45
【非特許文献３】Sakai et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 1999; 276 (2): H553-62
【非特許文献４】Sakai et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2003; 285 (6): H2543-51
【非特許文献５】Goda et al., J. Clin. Invest. 1998; 101 (3): 604-12
【非特許文献６】Otterbein et al., Nat. Med. 2000; 6 (4): 422-8.
【非特許文献７】Johnson et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2003; 42:3722-9
【非特許文献８】Zuckerbraun et al., Shock 2005; 23 (6): 527-32.
【非特許文献９】Tsuchida et al., Polymer Adv. Technol. 2002; 13: 845-50
【特許文献１】特許第３０３４５２９号明細書
【特許文献２】特許２７０７２４１号明細書
【特許文献３】特許２５３１６６１号明細書
【特許文献４】特公平０５−０３２３７２号公報
【特許文献５】特許第３４６６５１６号明細書
【特許文献６】特表２００５−５３１３７６号公報
【特許文献７】特表２００４−５２６７３９号公報
【特許文献８】特許第３６４８２６１号明細書
【特許文献９】特許第３３３１４３３号明細書
【特許文献１０】特許第２９３６１０９号明細書
【特許文献１１】特許第３６８２０７２号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
人工赤血球の臨床的適応の一つに、出血性ショック状態における緊急投与が想定され、赤血球投与と同等の血行動態の回復と蘇生効果が確認されている。しかし、急性出血性ショック状態に陥ると、カテコールアミン等の血管収縮因子が産生され、それにより末梢血管が収縮しているため、人工赤血球の投与は輸血と同様に、臓器によっては末梢血流の迅速な回復には繋がらない場合があるので、何らかの血管拡張剤の併用が求められていた。
【００１５】
また、出血性ショックからの蘇生は、全身的な虚血再灌流を意味し、活性酸素の産生による様々な障害、いわゆる虚血再灌流障害、さらには多臓器不全に繋がる可能性がある。一般的に虚血状態では細胞内ＡＴＰが代謝されてヒポキサンチンになり、これが組織内に高濃度で蓄積する。ここに再灌流により酸素が供給されるとキサンチンオキシダーゼの作用により活性酸素（スーパーオキサイド）が多量に発生する。また、マクロファージが活性化されて炎症性サイトカインを産生し、これに反応して好中球等が遊走される。各種接着因子も誘導され、好中球は血管内皮細胞に接着し、さらに血管外組織にまで浸潤する。ここに再灌流により酸素が供給されると、好中球細胞膜にあるＮＡＤＰＨ−オキシダーゼが大量の活性酸素を産生する。従って、出血性ショックに対する蘇生液として輸血または酸素運搬体を投与することは、初期の状態においては生体に対し酸素を過剰に供給して活性酸素産生を促し、虚血再灌流障害を助長させる。特に小腸は虚血の影響を強く受け、この虚血再灌流は小腸障害のみでなく、肺、肝、腎等の遠隔臓器の障害をもたらす。従って、酸素運搬機能が投与直後は抑制されているが、次第に増大する蘇生液が理想的である。
【００１６】
また、ＣＯガスまたはＮＯガスを直接的に吸入させ、肺胞を経由して血中に移行させる方法が検討されている。しかし、緊急時に大掛かりな吸入設備を用いたガス吸入は医療施設内では可能であるものの、受傷現場では不可能である。さらに、吸入濃度を調節しても、体内血中への移行量は肺のガス交換に依存しており、呼吸機能が低下している場合には使用できない。また、出血性ショックの蘇生手順は一般的に循環血液量の補給が先決であり、ＣＯガスまたはＮＯガスを輸液と一緒に投与できる方法が求められていた。
【００１７】
また、静脈内投与可能なルテニウムのＣＯ錯体等の化合物が開発されているものの、分子量が小さいためＣＯを放出する前に血中から消失することが予想され、血中滞留時間の長いＣＯガス担体が求められていた。
【００１８】
以上のことを背景にして、本発明は、血管拡張効果および細胞保護効果を示す輸液製剤、特に虚血状態にある患者をその虚血状態から回復させ、しかも虚血状態からの回復において虚血再灌流障害を防止し得る輸液製剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
発明者らは上述の背景と課題を熟慮し、鋭意研究を重ねた結果、人工赤血球の構成成分の配位子結合部位（ヘム）に予めＣＯガスまたはＮＯガスが結合した状態で血管内投与することによって血管拡張効果および細胞保護効果を得る手法を見いだした。特に、配位子結合部位に予めＣＯガスが結合した状態で出血性ショック状態の動物に対し血管内投与することで、虚血再灌障害を防止し得ることを見いだした。ヘムに対しＣＯガスは極めて強力に結合するが、血管内投与後は酸素との配位子交換反応により、徐々にＣＯを放出し、血管弛緩因子として作用し、血管を拡張して末梢血流を促進させる。予めＣＯを結合させたヘムは、投与直後では酸素運搬効果は低いものの、虚血再灌流による活性酸素の産生量を低減させ、組織細胞を保護する効果が期待できるし、輸液として循環血液量の増大にも貢献する。また、Ｈｂ分子は４個のサブユニットから構成されているが、このうち一部にＣＯが結合した状態では酸素配位のアロステリック効果が消失し、残りのサブユニットの酸素親和性が極めて高い状態になるので、ＣＯを放出して末梢血管を拡張しながら低酸素領域に陥った末梢組織に効率的に酸素を運搬することが可能となる。ヘムは、ＣＯを放出し終えると完全な酸素運搬体として機能し、赤血球と同様に、全身に必要量の酸素を供給することができるのである。
【００２０】
すなわち、本発明は、配位子結合部位に一酸化炭素が結合したヘムを包含し、虚血状態の生体の血管内に投与された後に一酸化炭素を徐放し、その後酸素運搬体として機能することにより虚血再灌流障害を防止することを特徴とする輸液製剤を提供する。
【００２１】
本発明の輸液製剤の、血管内投与された後のＣＯの徐放は、虚血再灌流障害を防止することに繋がり、特に肝臓組織および心臓組織の保護効果が顕著に得られる。
【００２２】
また、本発明の輸液製剤がＨｂ小胞体により代表される細胞型Ｈｂ製剤のように粒子径が１００〜５００ｎｍに調節されている場合は、粒子自体の血中滞留時間が長く、また非細胞型のＨｂを利用する輸液製剤に比較してＣＯ保持効果が長く適度なＣＯ放出速度が得られる。
【００２３】
さらに、本発明の輸液製剤は、血管内投与後、ＣＯガスを放出した後は、静脈を経て肺胞に到達すると速やかに酸素が結合し、動脈を経て末梢組織に到達し、結合した酸素を放出するようになる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、臨床現場で、ＣＯガスまたはＮＯガスを結合したヘムを含む輸液製剤を投与することにより、血管拡張効果および細胞保護効果を得ることができる。また、出血性ショック状態の患者に対し、ＣＯガスを結合したヘムを含む輸液製剤を投与することにより、投与直後に遊離ＣＯが末梢血管を拡張させて血流を速やかに回復させるとともに、次第に酸素運搬体として作動するようになり、赤血球と同等の酸素運搬機能を得て、正常な酸素代謝状態を維持することができる。従って、虚血再灌流障害が有効に防止される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明をより詳しく説明する。
【００２６】
本発明の輸液製剤は、ヘムを活性成分として包含し、その配位子結合部位に一酸化炭素（ＣＯ）または一酸化窒素（ＮＯ）が配位している。
【００２７】
本発明のヘム（Ｈｂ）を含む輸液製剤としては、Ｈｂに化学的修飾を加え分子量や粒子径を増大させて、血管外漏出とＨｂの毒性を低減させた修飾Ｈｂ溶液（重合型、水溶性高分子結合型）のほか、赤血球と類似の構造をした細胞型Ｈｂ（H. Sakai et al., Bioconjug. Chem. 2000; 11:56-64参照）等のいわゆる輸液製剤が含まれる。重合型Ｈｂには、グルタルアルデヒド等の架橋剤でＨｂの表面のリジン残基と結合させたＨｂ重合体（S.A. Gould et al., J. Am. Coll. Surg., 2002;195:445-52参照）、Ｈｂのグロビン鎖の末端カルボン酸とリジン残基を分子間で直接結合させたＨｂ重合体（B. Matheson et al., J. Appl. Physiol., 2002; 93:1479-86参照）がある。水溶性高分子結合型としては、ヒドロキシエチルスターチと共重合させたもの（T. Hu et al., Biochem. J. 2005; 392:555-64参照）、Ｈｂの表面に片末端メトキシ基ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を結合させたＰＥＧ−Ｈｂ（T.M. Chang, Appl. Biochem. Biotechnol., 1984;10:5-24参照）等が利用できる。細胞型Ｈｂとしては、ナイロン、ポリ乳酸、ゼラチン、シリコンゴム等高分子薄膜から形成されるカプセルの中にＨｂが高濃度で内包されている形態や（L. Djordjevich & I.F. Miller, Fed. Proc., 1977; 36:567）、リン脂質二分子膜から構成されるリン脂質小胞体（リポソーム）の中にＨｂが内包されている形態（Ｈｂ小胞体）もある。また、親水性高分子と疎水性高分子が共重合した両親媒性高分子が形成するカプセル（ポリマーソーム）の中にＨｂを内包した形態も利用できる（D.R. Arifin, & A.F. Palmer. Biomacromolecules, 2005; 6:2172-81参照）。しかし、細胞膜と類似の脂質成分から構成され、生体適合性に優れるＨｂ小胞体が好ましい。一般的に修飾Ｈｂは粒子径が小さく、配位子促進輸送効果が現れるため、配位子の放出速度が極めて速くなり、配位子の保持効果が低下する。従って、細胞型Ｈｂのように粒子径はできるだけ大きいものがよく、５０ｎｍ以上であることが好ましい。しかし、製造工程におけるフィルタ滅菌の容易性、血中での均一分散性、および毛細管を塞栓させないことを考慮すると、その粒子径は１０００ｎｍ以下、好ましくは３００ｎｍ以下である。Ｈｂ小胞体は、脂質成分（リン脂質、コレステロール、負電荷脂質、ポリエチレングリコール結合脂質）が分子間相互作用により自発的に集合した形態にあるので、粒子径を極めて容易に制御できるという利点を有する。粒子径の厳密な調節には、エクストルージョン法が最適であるが（前出H. Sakai et al., Bioconjug. Chem., 2000; 11:56-64参照）、高速撹拌法によって剪断応力を与えることによってもある程度の調節可能である。さらに、その粒子内部には３５ｇ／ｄＬもの高濃度Ｈｂ（約３万個のＨｂ）が充填でき、一粒子当たりの配位子運搬数は１２万個になる。
【００２８】
輸血用赤血球（血液から取り出された赤血球）に含有されるＨｂにＣＯまたはＮＯを結合させて投与すれば、これもＣＯまたはＮＯの徐放効果が得られる。しかし、赤血球はその構造が脆弱なので、ＣＯまたはＮＯガスのバブルにより容易に溶血する可能性があるので、輸液製剤としては、構造的により安定な輸液製剤（例えば、ヘモグロビンを内包したリン脂質小胞体粒子の形態にある輸液製剤等）を用いることがより好ましい。
【００２９】
いうまでもなく、本発明の輸液製剤は、人工赤血球（特に細胞型Ｈｂ）、血液から取り出された赤血球等の小胞体が生理学的に許容され得る分散媒に分散した形態にあり得る。生理学的に許容され得る分散媒としては、等張の生理食塩水を好適に用いることができるが、さらにその高張溶液でもよい。また、ヒト血清由来アルブミン、リコンビナントアルブミン、ヒドロキシエチルスターチ、デキストラン、修飾ゼラチン等代用血漿剤の水溶液を併用することもできる。いずれの形態においても、本発明の輸液製剤は、電解質や代用血漿剤を用いて、生理学的に許容される晶質浸透圧（２００ｍＯｓｍ／Ｌ〜２５００ｍＯｓｍ／Ｌ、膠質浸透圧（０〜８０ｍｍＨｇ）、ｐＨ（４〜９）に調節される。
【００３０】
Ｈｂを用いる輸液製剤の保存形態としては従来、酸素が結合した状態でガラス容器内に充填され、これを冷蔵保存する方法、またはプラスチック製バッグに充填されて冷凍保存する方法が知られている。また、充填容器内に存在する酸素を実質的に完全に除去し、酸素流入を完全に遮断し、溶液状態で室温保存する方法が知られている。本発明では、いずれの形態においてもＨｂの酸素結合部位であるヘムの全てまたは一部にＣＯまたはＮＯが結合した状態に変換して保存をすればよい。輸液製剤にＣＯガスを通気すれば、オキシヘモグロビン（ＨｂＯ2）は次第にカルボニルヘモグロビン（ＨｂＣＯ）に変換されるし、配位子が結合していないデオキシモグロビン（デオキシＨｂ）の状態にある輸液製剤にＣＯガスを通気すれば、極めて速やかにＣＯが結合し、ＨｂＣＯに変換される。ＣＯの結合反応を促進するため、気−液界面積を増大させる目的で、液膜を形成してＣＯガスと接触させたり、市販の膜型人工肺を使用してもよい。ＣＯは酸素よりも結合力が２００倍強く耐熱性が向上し、また自動酸化が抑制され、保存安定度が向上する利点を有する。ＮＯガスの場合も同様に、配位子が結合していないデオキシＨｂの状態にある輸液製剤にＮＯガスを通気すれば極めて速やかにＮＯが結合し、ニトロシルヘモグロビン（ＨｂＮＯ）に変換される。ＨｂＣＯまたはＨｂＮＯの含量は、可視吸収スペクトルにおいてソレー帯またはＱ帯におけるデオキシＨｂとの吸光度比から容易に算出できる。
【００３１】
使用に際し、配位座の全てまたは一部にＣＯまたはＮＯが結合されヘムを含む本発明の輸液製剤（通常、上記生理学的に許容され得る分散媒に分散された形態、または同分散媒に溶解した溶液の形態にある）を静脈内投与する。Ｈｂ小胞体のように粒子径が大きい場合は膠質浸透圧を持たないので、大量に投与する際にはアルブミンやヒドロキシエチルスターチ等代用血漿剤の投与も必要になる。いうまでもなくＣＯ、ＮＯガスは毒性も示すので、投与に際しては血行動態や血液ガス組成を継続してモニタリングする。また、投与されたＣＯガスは体内で薬理効果を示した後、最終的には呼気として排出されるのみであるので、呼吸状態の維持管理が重要である。血中のＨｂＣＯ量またはＨｂＮＯ量の推移は、採血液の可視吸収スペクトルにおいてソレー帯またはＱ帯におけるデオキシＨｂとの吸光度比から容易に算出できる。本発明の輸液製剤の投与量としては、ＣＯとして、０．００１〜０．２５ミリモル／ｋｇ（体重）となるような量である。ＮＯとしては、ＣＯとほぼ同程度か、それよりも少ない。
【００３２】
ＣＯが結合したヘムを含む本発明の輸液製剤を投与することにより、先ず血管拡張効果が期待できる。そのメカニズムとしては次のことが考えられる。（ｉ）ＣＯガスが血管壁平滑筋にあるグアニル酸シクラーゼ（ＧＣ）に直接結合して血管拡張し、末梢血流を改善する。（ｉｉ）正常組織では血管弛緩因子であるＮＯがミオグロビン（Ｍｂ）と反応して失活する経路が存在するが、このとき本発明の輸液製剤から放出されるＣＯがＭｂに結合することにより、ＮＯの失活が抑制される。ＧＣに対する作用はＣＯよりもＮＯの方が数千倍強力であり、血管拡張により末梢血流を改善する。（ｉｉｉ）末梢血流の改善は、代謝産物の除去と酸素供給を促進する。
【００３３】
本発明の輸液製剤による虚血再灌流障害の低減のメカニズムとしては、（ｉｖ）ヘムにＣＯを結合させることにより酸素含量を低下させ、投与直後の酸素負荷を低減でき、ヒポキサンチン−キサンチンオキシダーゼの反応による活性酸素の産生量を低減させる。（ｖ）活性化好中球の細胞膜に存在するヘム蛋白質ＮＡＤＰＨ−オキシダーゼが活性酸素を産生するが、本発明の輸液製剤から放出されるＣＯガスがＮＡＤＰＨ−オキシダーゼのヘム活性部位に結合することによって、活性酸素の産生が抑制され、細胞障害を抑制する。これらのメカニズムは類推の域を脱していないが、内因性ＣＯおよび吸入ＣＯガスの効果は最近では多くの研究者が報告しているところである。
【００３４】
本発明のＣＯが結合したヘムを包含する輸液製剤は、血管内投与後ＣＯを放出すると、代わって酸素が可逆的にＨｂのヘムに結合解離するようになり、赤血球と同等の酸素運搬機能を呈する。すなわち、本発明のＣＯが結合したヘムを包含する輸液製剤は、血管内に投与すると、初期にはＣＯ運搬体として機能し、その後酸素運搬体として機能する。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を実施例等により説明する。
【００３６】
比較例１
Ｈｂ小胞体（ＨｂＶ）は、既報（H. Sakai et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 2004; 311:874-84）に従って調製した。具体的には、Ｈｂ溶液に一酸化炭素を結合させて６０℃にて１０時間の加熱処理を行い、さらに限外濾過膜処理により高純度高濃度Ｈｂ溶液を得た。これにアロステリック因子としてピリドキサル５’−リン酸を添加した。次いで、混合脂質粉末（ジパルミトイルホスファチジルコリン／コレステロール／負電荷脂質／ポリエチレングリコール結合型ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）を添加して形成された多重層のＨｂ小胞体を、エクストルージョン法を用いて平均粒径を２５０ｎｍに制御した。酸素気流下、可視光の照射によりＨｂに結合した一酸化炭素を光解離させ、酸素と置換させた。最後に、ガラス容器に封入して、窒素ガスを通気して完全に酸素を除去して保存した。使用直前に空気を通気して酸素を結合したＨｂ小胞体とした。
【００３７】
ウィスター系ラット（雄、体重約２５０ｇ）を、１．５％セボフルレンの吸入により、麻酔状態とし、自発呼吸を維持させた。ラットの頸動脈と頸静脈にカテーテルを留置し、頸動脈より５０％脱血した（全血液量を５６ｍＬ／ｋｇとすると、脱血量は２８ｍＬ／ｋｇ、約８．４ｍＬ）。脱血速度は１ｍＬ／分とした。脱血後、１５分間放置し、試料を投与した。投与試料は、上記酸素を結合したＨｂＶの分散液と２５％アルブミン（ＨＳＡ）を混合したＨｂＶ／ＨＳＡ（ＨｂＶ／２５％ｒＨＳＡ＝８．６／１．４（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、［Ｈｂ］＝８．６ｇ／ｄＬ、ｎ＝８）、脱血した自己血（ＳＡＢ群、ｎ＝８）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ群、ｎ＝８）、および洗浄赤血球をＨＳＡに分散させ、Ｈｂ濃度を８．６ｇ／ｄＬに調整した溶液（ＲＢＣ／ＨＳＡ、ｎ＝８）、およびＨＳＡ単独であった。測定ポイントは、脱血前、脱血後、投与直後、投与１時間後、投与３時間後、および投与６時間後（犠牲死）とした。投与６時間後、血液を６ｍＬ程度採取、採血管に入れて遠心分離し血球成分を除去。血清を超遠心分離機にかけてＨｂＶを除去し、血液生化学的検査を実施し、肝機能を反映する項目としてアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を測定した。また、心筋機能を反映する項目として、乳酸脱水素酵素アイソエンザイム−１（ＬＤＨ−１）を測定した。
【００３８】
ＨＳＡ群のみ８例中、２例が投与３時間後から６時間後の間に死亡した。他は生存した。血圧（ＭＡＰ）は、脱血前に１００ｍｍＨｇ程度であったが、脱血後に３０ｍｍＨｇ程度にまで低下した。ＳＡＢ群は投与直後に１１０ｍｍＨｇにまで上昇したが、１時間後に９０ｍｍＨｇになり、そのまま６時間推移した。ＨＳＡ群は投与直後に９０ｍｍＨｇに上昇したが、１時間後に７４ｍｍＨｇにまで低下した。生存したラットの６時間後の血圧は７１ｍｍＨｇでありＳＡＢ群に比較して有意に低い値であった。一方でＨｂＶは投与後に９８ｍｍＨｇにまで回復、１時間後には９３ｍｍＨｇになり、そのまま６時間後まで推移し、ＨＳＡ群よりも有意に高い値であり、ＳＡＢ群と同等であった。ヘマトクリット（Ｈｃｔ）は、脱血前約４３％であるが、脱血後に約３５％に低下した。ＳＡＢ群では投与後に４３％程度にまで回復した。一方、ＨＳＡ群とＳＡＢ群では、投与直後に血液が希釈されるため、約２０％に低下した。血液ガス組成については、脱血後に代償機能によりＰａＯ2の上昇、ＰａＣＯ2の低下、またｐＨの低下と乳酸値の上昇が見られた。蘇生液の投与直後に、全群に関してＰａＯ2、ＰａＣＯ2が初期値にまで回復した。ｐＨ値は投与直後に最低値を示した。また乳酸値も投与直後には回復しなかったが、１時間後には初期値まで回復し、６時間まで推移した。ｐＨ、乳酸値の回復の遅れは、投与直後に末梢微小循環が回復に向い、蓄積していた代謝産物が洗い出されたために見られた現象である。全群ともに同様の傾向を示したが、ｒＨＳＡ投与死亡群では、ＰａＯ2が低値傾向を示した。従って、酸素運搬の低下による低血圧と、麻酔条件では呼吸に依る代償機能が不十分であったことが死因と考えられる。従って、Ｈｂ小胞体の出血性ショック蘇生効果は、赤血球と同等であることが解る。
【００３９】
投与６時間経過後の血液生化学検査の結果、ＨｂＶ群、ＳＡＢ群、ＲＢＣ群のＡＳＴ値はそれぞれ２４９±１０４、２２８±９７、２１１±１０９Ｕ／Ｌとなり、またＡＬＴ値はそれぞれ９７±５４、１０８±６０、９５±７３Ｕ／Ｌであり、正常値（ＡＳＴ：６４±１３Ｕ／Ｌ；ＡＬＴ：３２±８Ｕ／Ｌ）に比較して極めて高い値になっていた。一般的にＡＳＴは、心筋、肝、脳に高濃度に存在し、ついで骨格筋、腎等に多く含まれる。また、ＡＬＴは肝臓に最も多く含まれ、以下は腎、心筋、骨格筋の順番である。臨床的には、ＡＳＴ、ＡＬＴの上昇は主に肝疾患の時に見られる。従って、ＡＳＴ値およびＡＬＴ値が著明に増大した事実から判断して、出血性ショックによる虚血と人工赤血球投与による再灌流の結果、肝臓に虚血再灌流障害が生起したことを意味する。また、ＨｂＶ群、ＳＡＢ群、ＲＢＣ群のＬＤＨ−１値は、それぞれ、３０８±１１１、２８７±１５７、２０７±１２９Ｕ／Ｌであり、正常値（３２±１７Ｕ／Ｌ）に比較して極めて高い値になった。一般的にＬＤＨ−１は心筋に多く存在し、臨床的には心筋梗塞などの障害があるときに高い値になる。従って、ＬＤＨ−１が顕著に増大した事実から判断して、出血性ショックによる虚血と人工赤血球投与による再灌流の結果、心筋に虚血再灌流障害が生起したことを意味する。
【００４０】
実施例１
比較例１で調製し、脱酸素状態でガラス容器に封入保存されていたＨｂ小胞体の分散液（容量１０ｍＬ）について、ブチルゴム製の蓋に金属製の導入針を刺し、ＣＯガスをバブルし、Ｈｂの配位子を全てＣＯとし、つまり１００％ＨｂＣＯとした。この溶液８．６ｍＬに対し、２５％濃度のアルブミン溶液を１．４ｍＬ添加し、膠質浸透圧を約２０ｍｍＨｇに調節した。結果としてＨｂ濃度は８．６グラム／ｄＬになった。これを蘇生液（ＨｂＶ−ＣＯ／ＨＳＡ）とした。
【００４１】
比較例１に記載の方法と同じ方法により、ウィスター系ラット（雄、体重２５０〜３００ｇ）を１．５％セボフルレンの吸入で麻酔状態とし、自発呼吸を維持し、頸動脈と頸静脈にカテーテルを留置した。頸動脈より循環血液量の５０％相当の血液を１ｍＬ／分の速度で抜いた。１５分間放置した後、脱血量と同量のＣＯを結合したＨｂ小胞体分散液を投与し、６時間に亘り血行動態、血液ガス組成、をモニタリングした。また、採血液中のＨｂＣＯの濃度を可視吸収スペクトルから計測した。脱血前の血圧約９６ｍｍＨｇは、脱血後に約２９ｍｍＨｇまで低下し、投与後に約８９ｍｍＨｇにまで回復した。これは比較例１記載のＨｂＶ／ＨＳＡ群よりも僅かに低い値であった。ＨｂＣＯの比率は、投与直後２５±３％であったが、３０分後に１４±４％、１時間後に６±２％、３時間後には１±２％にまで低下しており、ＨｂＶの殆どが酸素運搬体として機能していた。６時間経過後の血液生化学検査の結果、ＡＳＴ値は１８５±８２Ｕ／Ｌ、ＡＬＴ値は５０±１６Ｕ／Ｌ、ＬＤＨ−１値は９７±３８Ｕ／Ｌであり、比較例１に記載の場合に比較して顕著に低下していたことから、肝機能障害および心筋障害（虚血再灌流障害）が低減されていることが明らかになった。
【００４２】
実施例２
ウィスター系ラットの赤血球を得るため、ラット（雄、体重２５０〜３００ｇ）をエーテル麻酔下、開腹し、下大静脈より採血した。これを遠心分離（２０００ｇ、１５分）して赤血球層を得て、さらに５％アルブミン溶液を添加して遠心分離、再分散する操作を２回繰り返した。この洗浄赤血球分散液１０ｍＬを５０ｍＬガラス容器に入れ、ブチルゴム製の蓋で封入した。金属製の導入針を刺し、ＣＯガスを通気し、Ｈｂの配位子を全てＣＯとし、つまり１００％ＨｂＣＯとした。通気の操作で溶血が認められたので、再度遠心分離して上澄みを除去し、再度５％アルブミン溶液を添加し、最終的にＨｂ濃度を８．６ｇ／ｄＬに調節した。これを蘇生液（ｗＲＢＣ−ＣＯ／ＨＳＡ）とした。採血から投与試験に用いるまでの所要時間は、３時間以内とした。
【００４３】
比較例１および実施例１に記載の方法と同じ方法により、ウィスター系ラット（雄、体重２５０〜３００ｇ）の出血性ショックモデルに対し、ｗＲＢＣ−ＣＯ／ＨＳＡを投与した。脱血前の血圧約１００ｍｍＨｇは、脱血後に約３１ｍｍＨｇまで低下し、投与後に約８９ｍｍＨｇにまで回復し、そのまま６時間推移した。ＨｂＣＯの比率を血液ガス組成測定装置（ラジオメータ社製、ＡＢＬ−７００）で測定したところ、投与直後３９±２％であったが、３０分後に２５±２％、１時間後に１４±２％、３時間後には４±１％、６時間後に漸く１％程度にまで低下しており、ｗＲＢＣの殆どが酸素運搬機能を回復してとしていた。赤血球のＣＯ放出速度は明らかにＨｂ小胞体よりも遅かった。６時間経過後の血液生化学検査の結果、ＡＳＴ値は１２６±５４Ｕ／Ｌ、ＡＬＴ値は３３±９Ｕ／Ｌ、ＬＤＨ−１値は７２±４６Ｕ／Ｌであり、比較例１に記載の場合に比較して顕著に低下していたことから、肝機能障害および心筋障害（虚血再灌流障害）が低減されていることが明らかになった。
【００４４】
実施例３
修飾Ｈｂとして、ウシヘモグロビンをグルタルアルデヒドで重合したポリＨｂ溶液について、Ｈｂ小胞体とＣＯの放出速度の相違を検討した。先ずポリＨｂおよびＨｂ小胞体分散液（［Ｈｂ］＝１０ｇ／ｄＬ）に一酸化炭素ガスを通気し、一酸化炭素を結合させた溶液を調製した。ラットの血液から洗浄赤血球を調製し、Ｈｂ濃度を１０ｇ／ｄＬにした。酸素を結合したラット赤血球４．５ｍＬに対し、一酸化炭素が結合したポリＨｂまたはＨｂ小胞体を０．５ｍＬ添加し、速やかにボルテックスミキサーで混合した。ポリＨｂまたはＨｂ小胞体に結合した一酸化炭素が徐々に遊離して赤血球に結合するので、混合後３０秒、１分、３分後に、０．５ｍＬを採取し、遠心分離（２０００ｇ、３０秒）して上澄みのポリＨｂまたはＨｂ小胞体の分画について、カルボニルヘモグロビン（ＨｂＣＯ）の割合を測定した。亜ニチオン酸ナトリウム粉末を添加して酸素を除去したときの可視吸光度スペクトルにおけるデオキシＨｂ（４３０ｎｍ）とＨｂＣＯ（４１９ｎｍ）のピーク比からＨｂＣＯの割合を算出した。ポリＨｂ溶液の場合、ＨｂＣＯの割合は混合後３５％（３０秒）、１５％（１分）、９％（３分）のように低下したのに対し、Ｈｂ小胞体の場合は、４２％（３０秒）、２３％（１分）、１１％（３分）となり、Ｈｂ小胞体の方がポリＨｂよりもＣＯ放出速度が遅く、ＣＯ徐放性に優れていた。