(57)【要約】【課題】Ｔ細胞介在性免疫応答を増大させ、標的細胞によって産生される抗原によって活性化されたＴ細胞に対して特異的である免疫療法を提供すること。【解決手段】本発明の免疫療法は、ＣＤ２８経路の活性化または抑制／不活化によるＴ細胞免疫応答の調節を包含する。活性化されたＴ細胞のリンホカイン産生誘導は、従来の免疫抑制剤存在下であっても、ＣＤ２８表面レセプター分子の結合刺激により生じる。ＣＤ２８レセプターの適当な刺激リガンドへの結合阻害または他の手段によるＣＤ２８シグナル伝達経路の不活化は、ＣＤ２８経路に関連するＴ細胞のリンホカイン産生およびそれに基づく効果を負に調節する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫疾患を処置するための薬学的組成物であって、該組成物は、以下：
ａ）治療有効量のＣＴＬＡ４−Ｉｇ；および
ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、
を含む、薬学的組成物。
【請求項２】
実施例に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、Thompsonらにより1992年４月７日付けで出願された、「CD28経路免疫調節」という名称の米国特許出願第07/864,805号、「TＨCD28リンホカイン産生の刺激を含む免疫療法」という名称の米国特許出願第07/864,807号、および「CD28関連免疫応答の増大」という名称の米国特許出願第07/864,866号の継続出願である。これらの出願は、Thompsonらにより1988年11月23日付けで出願され、現在放棄されている「CD28刺激を含む免疫療法」という名称の米国特許出願第07/275,433号の一部継続出願である。これらはすべて、本明細書中で参考のために援用されている。
【０００２】
後援関係
本発明の研究は、Naval  Medical  Research  and  Development  Command,  Research  Task  No.  M0095.0003-1007により一部支援された。政府は、本発明に関して特定の権利を有する。
【０００３】
生物学的寄託
ネズミのハイブリドーマ細胞系9.3は、ブダペスト条約の条項に従って、Rockville、MDのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American  Type  Culture  Collection）に寄託され、ATCC指定番号のHB10271号が与えられた。
【０００４】
発明の分野
本発明は、一般に、免疫療法に関する。特に、本発明は、CD28Ｔ細胞表面分子の調節を含む免疫療法に関する。
【背景技術】
【０００５】
発明の背景
Ｔ細胞と呼ばれる胸腺由来のリンパ球は、インビボの免疫応答の重要な調節因子である。Ｔ細胞は、細胞毒性および遅延型過敏症（DTH）に関与し、Ｂリンパ球抗体産生のヘルパー機能を果たす。さらに、Ｔ細胞は、例えば、Ｔ細胞の細胞周期の進行を容易にし得るインターロイキン-2(IL-2)；腫瘍壊死因子-α（TNF-α）およびリンホトキシン（LT）、すなわち、腫瘍細胞の溶解に関与することが示されているサイトカイン；広範な種類の抗ウイルスおよび抗腫瘍効果を示すインターフェロン-γ（IFN-γ）；および多系統造血因子として作用するIL-3および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、などの免疫調節分子として作用する種々のリンホカインを産生する。
【０００６】
癌、後天性免疫不全症候群（AIDS）およびそれに伴う感染症などの疾患に対して現在行われている免疫療法的治療は、免疫応答を増大させるために、IL-2およびIFN-γなどのリンホカインの全身投与を含む。しかし、このような治療は、Ｔ細胞介在性免疫応答の非特異的な増大を生じる。なぜなら、投与されたリンホカインは、感染部位または腫瘍部位に近接した活性化Ｔ細胞に対して特異的でないためである。さらに、これらの分子の薬理学的用量を全身投与すると、重篤な毒性を生じる。免疫不全患者または免疫抑制患者に対して現在行われている治療はまた、濃縮γ-グロブリン製剤を用いた免疫システムの非特異的な増大を含む。このような治療の効果および／または機構、およびそれに伴う利益を認識していなかったため、現在まで、免疫調節因子のインビボにおける分泌の刺激は、実行可能な代替法であると考えられていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、Ｔ細胞介在性免疫応答を増大させ、標的細胞によって産生される抗原によって活性化されたＴ細胞に対して特異的である免疫療法を提供することが望ましい。さらに、患者の自然免疫特異性を利用し得る免疫療法を提供することが望ましい。さらに、免疫抑制患者に用いられる得る免疫療法を提供することも望ましい。さらに、重篤な毒性効果を有する量の免疫調節分子を投与することにあまり依存しない免疫療法を提供することが望ましい。
【０００８】
所望ならば、Ｔ細胞群の除去および再導入をせずに直接投与され得る免疫療法を提供することも望ましい。さらに、そのような免疫抑制が、例えば、移植患者、ショック症候群を示す患者、および特定の形態の自己免疫疾患において有益であるＴ細胞介在性免疫応答を増大させるためだけでなく、抑制するためにも用いられ得る免疫療法を提供することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する。
（項目１）Ｔ細胞群を有する受容者が、インビボにおいて抗原にさらされて感作され、ここでその受容者のＴ細胞群の少なくとも一部がその抗原によって活性化されている、その抗原に対するＴ細胞介在性応答を選択的に増強する方法であって、以下の工程：
ａ）ＣＤ２８レセプターの細胞外ドメインに結合し得る、ＣＤ２８刺激リガンドを選択する工程；
ｂ）そのリガンドを、インビボでの投与に適切な生物学的に適合し得る形態で提供する工程；および
ｃ）その提供されたリガンドを、その活性化されたＴ細胞によりＴＨＣＤ２８リンホカイン平均細胞産生を増加させるのに充分な量で、その受容者に投与する工程；
を包含する、方法。
（項目２）上記刺激リガンドが、実質的に、抗ＣＤ２８抗体およびその刺激フラグメント、天然のＣＤ２８リガンドおよびその刺激相同物、および、それらの有効な組み合わせからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）上記リガンドが抗ＣＤ２８抗体を包含する、項目１に記載の方法。
（項目４）上記リガンドがＣＤ２８レセプターに対する天然のリガンドを包含する、項目１に記載の方法。
（項目５）上記リガンドが合成物由来である、項目１に記載の方法。
（項目６）上記リガンドが組換え分子を包含する、項目１に記載の方法。
（項目７）上記リガンドが天然のリガンドの刺激相同物である、項目２に記載の方法。
（項目８）上記抗体が、モノクローナル抗体を包含する、項目３に記載の方法。
（項目９）上記リガンドがＦ（ａｂ'）２フラグメントを包含する、項目３に記載の方法。
（項目１０）上記モノクローナル抗体がｍＡｂ９.３を包含する、項目３に記載の方法。
（項目１１）ＣＤ２８＋Ｔ細胞群を有する受容者に投与され、それによりそのＴ細胞群の少なくとも一部を活性化する外来の抗原に対する、インビボでのＴ細胞介在免疫応答を上昇させる方法であって、以下の工程：
ａ）ＣＤ２８レセプターの細胞外ドメインに結合し得る、ＣＤ２８刺激リガンドを選択する工程；
ｂ）そのリガンドを、インビボでの投与に適切な生物学的に適合し得る形態で提供する工程；および
ｃ）その提供されたリガンドを、そのＣＤ２８レセプターへの結合およびその刺激に充分な量で、その受容者に投与する工程；
を包含する、方法：
ここで、その免疫応答の上昇は、その活性化されたＴ細胞によるＴＨＣＤ２８リンホカイン平均細胞産生の増大を包含する。
（項目１２）上記刺激リガンドが、実質的に、抗ＣＤ２８抗体およびその刺激フラグメント、天然のＣＤ２８リガンドおよびその刺激相同物、および、それらの有効な組み合わせからなる群から選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）上記リガンドが抗ＣＤ２８抗体を包含する、項目１１に記載の方法。
（項目１４）上記リガンドがＣＤ２８レセプターに対する天然のリガンドを包含する、項目１１に記載の方法。
（項目１５）上記リガンドが合成物由来である、項目１１に記載の方法。
（項目１６）上記リガンドが組換え分子を包含する、項目１１に記載の方法。
（項目１７）上記リガンドが天然のリガンドの刺激相同物である、項目１２に記載の方法。
（項目１８）上記抗体が、モノクローナル抗体を包含する、項目１３に記載の方法。
（項目１９）上記リガンドがＦ（ａｂ'）２フラグメントを包含する、項目１３に記載の方法。
（項目２０）上記モノクローナル抗体がｍＡｂ９.３を包含する、項目１３に記載の方法。
（項目２１）Ｔ細胞群を有する受容者での、選択された外来の抗原に対する免疫応答の増強を誘導する方法であって、以下の工程：
ａ）その外来の抗原を、そのＴ細胞群の一部を活性化するのに充分な量で、その受容者に投与する工程；
ｂ）ＣＤ２８レセプターに対して特異的な、選択された刺激リガンドを、インビボでの投与に適切な生物学的に適合し得る形態で提供する工程；および
ｃ）その選択されたリガンドを、そのＣＤ２８レセプターを刺激するのに充分な量で投与する工程；
を包含する、方法。
（項目２２）上記リガンドが抗ＣＤ２８抗体を包含する、項目２１に記載の方法。
（項目２３）上記リガンドがＣＤ２８に対する天然のリガンドを包含する、項目２１に記載の方法。
（項目２４）上記リガンドが組換え分子を包含する、項目２１に記載の方法。
（項目２５）上記リガンドが合成物由来である、項目２１に記載の方法。
（項目２６）上記外来の抗原が微生物抗原を包含する、項目２１に記載の方法。
（項目２７）上記抗原が寄生体抗原を包含する、項目２１に記載の方法。
（項目２８）上記抗原が、上記受容者内での抗原産生のために、その受容者に抗原ｃＤＮＡを提供することにより投与される、項目２１に記載の方法。
（項目２９）上記外来の抗原が細菌抗原を包含する、項目２６に記載の方法。
（項目３０）上記外来の抗原がウイルス抗原を包含する、項目２６に記載の方法。
（項目３１）上記外来の抗原が天然物由来である、項目２６に記載の方法。
（項目３２）上記抗原が合成物由来である、項目２６に記載の方法。
（項目３３）上記抗原が組換え分子を包含する、項目２６に記載の方法。
（項目３４）細胞のＴＨＣＤ２８リンホカイン産生を増大するのに効果的な量のＣＤ２８レセプター刺激リガンドと組み合わせて外来の抗原を含む、ワクチン。
（項目３５）ＴＣＲ／ＣＤ３レセプターを活性化するのに効果的な量のＴＣＲ／ＣＤ３レセプター刺激リガンドをさらに含む、項目３４に記載のワクチン。
（項目３６）Ｔ細胞抗原レセプターを介して刺激された無活動Ｔ細胞群のアネルギー誘導を防止する方法であって、以下の工程：
ａ）ＣＤ２８レセプターの細胞外ドメインに結合し得る、ＣＤ２８刺激リガンドを選択する工程；
ｂ）そのリガンドを、生物学的に適合し得る形態で提供する工程；および
ｃ）その提供されたリガンドを、そのＣＤ２８レセプターへの結合およびその刺激に充分な量で、その細胞群に投与する工程；
を包含する、方法。
（項目３７）上記刺激リガンドが、実質的に、抗ＣＤ２８抗体およびその刺激フラグメント、天然のＣＤ２８リガンドおよびその刺激相同物、および、それらの有効な組み合わせからなる群から選択される、項目３６に記載の方法。
（項目３８）上記リガンドが抗ＣＤ２８モノクローナル抗体を包含する、項目３６に記載の方法。
（項目３９）上記リガンドが上記ＣＤ２８レセプターに対する天然のリガンドを包含する、項目３６に記載の方法。
（項目４０）上記リガンドが合成物由来である、項目３６に記載の方法。
（項目４１）上記リガンドが組換え分子を包含する、項目３６に記載の方法。
（項目４２）上記リガンドがＦ（ａｂ'）２を包含する、項目３８に記載の方法。
（項目４３）上記抗体がｍＡｂ９.３を包含する、項目３８に記載の方法。
（項目４４）Ｔ細胞群における、ＴＨＣＤ２８リンホカインの細胞産生の増大に関連するＣＤ２８経路の活性化を阻害する方法であって、以下の工程：
ａ）ＣＤ２８レセプターの細胞外ドメインに結合し得るが、刺激し得ない阻害リガンドを選択する工程；
ｂ）そのリガンドを、生物学的に適合し得る形態で提供する工程；および
ｃ）その提供されたリガンドを、そのＣＤ２８経路の活性化を阻害するのに充分な量で、そのＴ細胞群に投与する工程；
を包含する、方法。
（項目４５）上記リガンドが上記ＣＤ２８レセプターと架橋しない、項目４４に記載の方法。
（項目４６）上記リガンドが改変された天然のリガンドを包含する、項目４４に記載の方法。
（項目４７）上記リガンドが合成物由来である、項目４４に記載の方法。
（項目４８）上記リガンドが組換え分子を包含する、項目４４に記載の方法。
（項目４９）上記リガンドがＦ（ａｂ'）を包含する、項目４４に記載の方法。
（項目５０）以下の工程：
ｄ）ＣＤ２８天然リガンドに結合し得る第二の阻害リガンドを投与する工程；
をさらに包含する、項目４４に記載の方法。
（項目５１）上記Ｆ（ａｂ'）がｍＡｂ９.３のＦ（ａｂ'）を包含する、項目４５に記載の方法。
（項目５２）Ｔ細胞群におけるＴＨＣＤ２８リンホカインの細胞産生の増大に関連する、ＣＤ２８レセプター刺激結合部位に結合し得る第一の刺激リガンドによる、ＣＤ２８経路の活性化を阻害する方法であって、以下の工程：
ａ）ＣＤ２８刺激リガンドに結合し得る第二のリガンドを選択する工程；
ｂ）その第二のリガンドを、生物学的に適合し得る形態で提供する工程；および
ｃ）その提供された第二のリガンドを、競合的に結合し、そしてその刺激リガンドのそのＣＤ２８レセプター刺激結合部位への結合を阻害するのに充分な量で投与する工程；
を包含する、方法。
（項目５３）上記刺激リガンドが天然のＣＤ２８リガンドを包含する、項目５２に記載の方法。
（項目５４）上記第二のリガンドが上記刺激リガンドに対する抗体またはそのフラグメントを包含する、項目５２に記載の方法。
（項目５５）上記第二のリガンドが合成物由来である、項目５２に記載の方法。
（項目５６）上記第二のリガンドが組換え分子を包含する、項目５２に記載の方法。
（項目５７）以下の工程：
ｄ）上記ＣＤ２８レセプターに結合し得るが刺激し得ない、第三のＣＤ２８レセプター阻害リガンドを投与する工程；
をさらに包含する、項目５２に記載の方法。
（項目５８）上記投与がインビボにおいてなされる、項目５３に記載の方法。
（項目５９）上記第二のリガンドが、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４の可溶性形態を包含する、項目５２に記載の方法。
（項目６０）活性化されたＴ細胞群によるＴＨＣＤ２８リンホカインの細胞産生を抑制する方法であって、以下の工程：
ａ）ＣＤ２８シグナル伝達経路に関連するチロシンリン酸化のインヒビターを選択する工程；
ｂ）そのインヒビターを、生物学的に適合し得る形態で提供する工程；および
ｃ）その提供されたインヒビターを、そのチロシンリン酸化を阻害するのに充分な量で投与する工程；
を包含する、方法。
（項目６１）上記インヒビターがチロシンキナーゼのインヒビターを包含する、項目６０に記載の方法。
（項目６２）上記インヒビターが細胞のホスファターゼを包含する、項目６０に記載の方法。
（項目６３）上記インヒビターがハルビマイシンを包含する、項目６１に記載の方法。
（項目６４）上記インヒビターがチロシンホスファターゼを包含する、項目６２に記載の方法。
（項目６５）Ｔ細胞群によるＴＨＣＤ２８リンホカインの内因性の細胞産生の増強による、細胞傷害性Ｔ細胞機能を増大する方法であって、以下の工程：
ａ）Ｔ細胞群を活性化する工程；および
ｂ）ＣＤ２８特異リガンドでＣＤ２８レセプターを刺激する工程；
を包含する、方法：
ここで、その活性化および刺激の程度は、ＴＨＣＤ２８リンホカインの内因性の細胞産生を増大させるのに充分な程度である。
（項目６６）上記活性化工程が、上記Ｔ細胞群を活性化するのに充分な量のＴＣＲ／ＣＤ３レセプターリガンドで、その細胞群を処理する工程をさらに包含する、項目６５に記載の方法。
（項目６７）上記ＴＣＲ／ＣＤ３レセプターリガンドが抗ＣＤ３抗体またはそのフラグメントを包含する、項目６６に記載の方法。
（項目６８）上記ＣＤ２８特異リガンドが、実質的に、抗ＣＤ２８抗体およびその刺激フラグメント、天然のＣＤ２８リガンドおよびその刺激相同物、および、それらの有効な組み合わせからなる群から選択される、項目６５に記載の方法。
（項目６９）上記ＣＤ２８特異リガンドが抗ＣＤ２８抗体を包含する、項目６６に記載の方法。
（項目７０）上記ＣＤ２８特異リガンドが、ＣＤ２８レセプターに対する天然のリガンドを包含する、項目６５に記載の方法。
（項目７１）上記ＣＤ２８特異リガンドが合成物由来である、項目６５に記載の方法。
（項目７２）上記ＣＤ２８特異リガンドが組換え分子を包含する、項目６５に記載の方法。
（項目７３）上記ＣＤ２８特異リガンドが、天然のＣＤ２８特異リガンドの刺激相同物である、項目６８に記載の方法。
（項目７４）上記抗体が、モノクローナル抗体を包含する、項目６９に記載の方法。
（項目７５）上記リガンドがＦ（ａｂ'）２フラグメントを包含する、項目６９に記載の方法。
（項目７６）上記モノクローナル抗体がｍＡｂ９.３を包含する、項目７４に記載の方法。
（項目７７）上記ＴＣＲ／ＣＤ３レセプターリガンドが、ＴＣＲ／ＣＤ３に対する天然のリガンドを包含する、項目６６に記載の方法。
（項目７８）上記抗ＣＤ３抗体がＯＫＴ３を包含する、項目６７に記載の方法。
（項目７９）上記ＴＣＲ／ＣＤ３レセプターリガンドが合成物由来である、項目６６に記載の方法。
（項目８０）上記ＴＣＲ／ＣＤ３レセプターリガンドが組換え分子を包含する、項目６６に記載の方法。
（項目８１）以下の工程：
ｃ）上記Ｔ細胞群を活性化前に受容者から除去する工程；および
ｄ）その細胞群を刺激後にその受容者に再導入する工程；
をさらに包含する、項目６５に記載の方法。
（項目８２）以下の工程：
ｃ）上記Ｔ細胞群を刺激前に受容者から除去する工程；および
ｄ）その細胞群を刺激後にその受容者に再導入する工程；
をさらに包含する、項目６５に記載の方法。
（項目８３）以下の工程：
ｃ）上記Ｔ細胞群を活性化および刺激前に受容者から除去する工程；および
ｄ）その細胞群を活性化および刺激後にその受容者に再導入する工程；
をさらに包含する、項目６５に記載の方法。
（項目８４）上記活性化工程および刺激工程が、インビボにおけるＴ細胞群に対して行われる、項目６５に記載の方法。
（項目８５）免疫学的に近接な個体のＴ細胞群により、ＴＨＣＤ２８リンホカインの内因性の細胞産生を増大させる方法であって、以下の工程：
ａ）その細胞群の少なくとも一部を活性化するのに充分な量のＴＣＲ／ＣＤ３刺激リガンドで、その細胞群を処理する工程；および
ｂ）その活性化されたＴ細胞群の少なくとも一部を刺激するのに充分な量のＣＤ２８刺激リガンドで、その細胞群を処理する工程；
を包含する、方法。
（項目８６）以下の工程：
ｃ）ＴＣＲ／ＣＤ３活性化およびＣＤ２８刺激前に、受容者から上記Ｔ細胞群を除去する工程；および
ｄ）ＴＣＲ／ＣＤ３活性化およびＣＤ２８刺激後に、そのその受容者に、そのＴ細胞群を再導入する工程；
をさらに包含する、項目８５に記載の方法。
（項目８７）上記ＴＣＲ／ＣＤ３およびＣＤ２８レセプターリガンドによる処理が、同時に実行される、項目８５に記載の方法。
（項目８８）上記ＴＨＣＤ２８リンホカインがＩＬ-２を包含する、項目８５に記載の方法。
（項目８９）上記ＴＣＲ／ＣＤ３リガンドが、抗ＣＤ３抗体またはそのＦ（ａｂ'）２を包含する、項目８６に記載の方法。
（項目９０）上記ＣＤ２８リガンドが、抗ＣＤ２８抗体またはそのＦ（ａｂ'）２を包含する、項目８６に記載の方法。
（項目９１）上記ＣＤ２８リガンドが、天然のＣＤ２８リガンドを包含する、項目８６に記載の方法。
（項目９２）上記ＣＤ２８リガンドが、天然のＣＤ２８リガンドの刺激相同物を包含する、項目８６に記載の方法。
（項目９３）上記ＣＤ２８リガンドが合成物由来である、項目８６に記載の方法。
（項目９４）上記ＣＤ２８リガンドが組換え分子を包含する、項目８６に記載の方法。
（項目９５）骨髄移植受容者における、ＴＨＣＤ２８リンホカインの細胞産生を増大する方法であって、以下の工程：
ａ）その受容者からＴ細胞群を除去する工程；
ｂ）その除去された細胞群の少なくとも一部を活性化するのに充分な量のＴＣＲ／ＣＤ３レセプター刺激リガンドで、その除去された細胞群を処理する工程；
ｃ）ＣＤ２８レセプターを刺激するのに充分な量のＣＤ２８レセプター刺激リガンドで、その除去された細胞群を処理する工程；および
ｄ）その受容者に、その処理された細胞群の少なくとも一部を再導入する工程；
を包含する、方法。
（項目９６）上記ＴＣＲ／ＣＤ３レセプターリガンドが、抗ＣＤ３抗体またはそのフラグメントを包含する、項目９５に記載の方法。
（項目９７）上記ＣＤ２８レセプターリガンドが、抗ＣＤ２８抗体またはそのフラグメントを包含する、項目９５に記載の方法。
（項目９８）上記抗ＣＤ３抗体が、ＯＫＴ３またはそのＦ（ａｂ'）２を包含する、項目９６に記載の方法。
（項目９９）上記抗ＣＤ２８抗体が、ｍＡｂ９.３またはそのＦ（ａｂ'）２を包含する、項目９７に記載の方法。
（項目１００）上記ＴＣＲ／ＣＤ３レセプターリガンドが天然のリガンドを包含する、項目９５に記載の方法。
（項目１０１）上記ＣＤ２８レセプターリガンドが天然のリガンドを包含する、項目９５に記載の方法。
（項目１０２）Ｔ細胞群を有する受容者が、インビボにおいて抗原にさらされて感作され、ここでその受容者のＴ細胞群の少なくとも一部がその抗原によって活性化されている、その抗原に対するＴ細胞介在性応答を選択的に増強するための薬剤の製造における、ＣＤ２８の細胞外ドメインに結合し得るＣＤ２８刺激リガンドの使用。
（項目１０３）ＣＤ２８＋Ｔ細胞群を有する受容者に投与され、それによりそのＴ細胞群の少なくとも一部を活性化する外来の抗原に対する、インビボでのＴ細胞介在性免疫応答を上昇させるための薬剤の製造における、ＣＤ２８レセプターの細胞外ドメインに結合し得るＣＤ２８刺激リガンドの使用：
ここで、その免疫応答の上昇は、その活性化されたＴ細胞によるＴＨＣＤ２８リンホカイン平均細胞産生の増大を包含する。
（項目１０４）Ｔ細胞群を有する受容者に対して選択された外来の抗原であって、そのＴ細胞群の少なくとも一部を活性化するのに充分な量で投与される外来の抗原に対する、免疫応答の増強を誘導するための薬剤の製造における、ＣＤ２８レセプターに特異的な、選択された刺激リガンドの使用。
（項目１０５）Ｔ細胞抗原レセプターを介して刺激される無活動Ｔ細胞群のアネルギー誘導を防止するための薬剤の製造における、ＣＤ２８レセプターの細胞外ドメインに結合し得るＣＤ２８刺激リガンドの使用。
（項目１０６）Ｔ細胞群における、ＴＨＣＤ２８リンホカインの細胞産生の増大に関連するＣＤ２８経路の活性化を阻害するための薬剤の製造における、ＣＤ２８レセプターの細胞外ドメインに結合し得るが、刺激し得ない阻害リガンドの使用。
（項目１０７）Ｔ細胞群におけるＴＨＣＤ２８リンホカインの細胞産生の増大に関連する、ＣＤ２８レセプター刺激結合部位に結合し得る第一の刺激リガンドによる、ＣＤ２８経路の活性化を阻害するための薬剤の製造における、ＣＤ２８刺激リガンドに競合的に結合し得、その刺激リガンドのそのＣＤ２８レセプター刺激結合部位への結合を阻害する、第二のリガンドの使用。
（項目１０８）活性化されたＴ細胞群によるＴＨＣＤ２８リンホカインの細胞産生を抑制するための薬剤の製造における、ＣＤ２８シグナル伝達経路に関連するチロシンリン酸化のインヒビターの使用。
（項目１０９）活性化されたＴ細胞群によるＴＨＣＤ２８リンホカインの内因性の細胞産生の増強による、細胞傷害性Ｔ細胞機能を増大するための薬剤の製造における、ＣＤ２８レセプターを刺激するＣＤ２８特異リガンドの使用。
（項目１１０）免疫学的に近接な個体の活性化されたＴ細胞群による、ＴＨＣＤ２８リンホカインの内因性の細胞産生を増大させるための薬剤の製造における、その細胞群の少なくとも一部を活性化するためのＴＣＲ／ＣＤ３刺激リガンド、その活性化されたＴ細胞群の少なくとも一部を刺激するためのＣＤ２８刺激リガンド、またはそれらの両方、の使用。
（項目１１１）骨髄移植受容者から除去され、薬剤による処理後にその受容者に再導入されたＴ細胞群でのＴＨＣＤ２８リンホカインの細胞産生を増大するためのその薬剤の製造における、その細胞群の少なくとも一部を活性化するためのＴＣＲ／ＣＤ３レセプター刺激リガンド、ＣＤ２８レセプターを刺激するためのＣＤ２８レセプター刺激リガンド、またはそれらの両方、の使用。
【００１０】
発明の要旨
本発明は、Ｔ細胞介在性免疫応答がCD28経路によって調節される免疫療法を含む。CD28レセプターを抗CD28抗体または他の刺激作用性結合等価物に結合させると、活性化Ｔ細胞介在性リンホカイン産生を誘導する。免疫抑制または負の調節は、刺激作用性リガンドへのCD28レセプターの結合を妨げるか、またはCD28シグナル伝達経路を不活性化することによって、達成される。
【００１１】
本発明の免疫療法は、活性化Ｔ細胞のCD28表面レセプター分子を刺激する驚くべきかつこれまで認識されていなかった効果を利用する。活性化Ｔ細胞とは、免疫応答が、Ｔ細胞レセプター（TCR）／CD3  Ｔ細胞表面複合体と、外来抗原またはその等価物との相互作用によって、必然的ではないが一般的に開始または「活性化」された細胞のことをさす。このような活性化は、Ｔ細胞の増殖を起こすが、リンホカイン産生などのＴ細胞エフェクター機能を限定的に誘導するだけである。
【００１２】
抗CD28抗体でCD28細胞表面分子を刺激すると、Ｔ細胞リンホカイン産生が顕著に増大する。驚いたことに、抗CD28で共刺激してTCR/CD3複合体の刺激が最大となるときでさえ、抗TCR/CD3単独で誘導されるときよりもＴ細胞増殖はあまり増大しないが、IL-2リンホカインのレベルは実質的に増加する。さらに驚いたことに、IL-2のレベルが著しく増加するだけでなく、CD28の刺激にこれまで関連していない全セットのリンホカイン類（以下、TＨCD28リンホカインと呼ぶ）のレベルも増加する。注目すべきことに、CD28刺激に起因するＴ細胞増殖およびリンホカインの産生増大は両方とも、シクロスポリンおよびグルココルチコイドによる免疫抑制に対する耐性を示す。
【００１３】
従って、本発明の免疫療法は、CD28Ｔ細胞表面分子を刺激して、人体が人体自身から感染または癌を取り除くのを助けることによって、Ｔ細胞介在性免疫応答が調節され得る方法を提供する。本発明の方法また、Ｔ細胞増殖を増大させるためだけでなく、所望ならばCD28刺激によって調節されることが現在知られている全セットのＴ細胞リンホカイン類のレベルおよび産生を増大させることによって免疫応答を増大または上昇させる（boost）ためにも用いられ得る。
【００１４】
さらに、Ｔ細胞免疫応答を増大させる際のCD28刺激の効果は、Ｔ細胞活性化またはTCR/CD3複合体のある種の形態の刺激を必要としているように思われるので、本発明の免疫療法は、疾患によって、または特定の感染もしくは癌から人体を保護するための治療によって予め活性化されたＴ細胞を選択的に刺激し、それによって免疫機能を増加させるために現在用いられている方法の非特異的な毒性を回避するために用いられ得る。さらに、本発明の免疫療法は、免疫抑制条件下でもＴ細胞介在性免疫機能を増大させるため、AIDSなどの免疫不全症にかかっている個体に特定の利益を与える。
【００１５】
さらに、以下に説明する本発明の原理は、本発明を人体の治療という観点から例示しているが、本明細書中で説明する方法は、家畜の病気の治療への適用にも同様に有用であるということが認識される。
【００１６】
本発明およびその利点は、図面および以下に示す実施例に関連した好ましい実施態様の詳細な説明を読むことによってより十分に理解され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
好適な実施態様の詳細な説明
本発明の免疫療法の好適な実施態様において、CD28分子が刺激されて、抗原の、さもなければ活性化されたＴ細胞のＴ細胞介在性免疫応答を増大させる。CD28は、約80%の成熟Ｔ細胞の表面上で発現される44キロダルトンのタンパク質であり、免疫グロブリン遺伝子に対して実質的に相同性を示す。Poggi,A.ら、Eur.J.Immunol.、17:1065-1068(1987)およびAruffo,A.ら、PNAS (USA)、84:8573-8577 (1987)を参照のこと。両者は、本明細書中に参考として援用されている。本発明の方法による、CD28分子の細胞外ドメインの抗CD28抗体との結合は、Ｔ細胞増殖の増大とリンホカインのレベルの増加をもたらす。
【００１８】
実施例III〜IVおよびVI〜VIIIにおいて、Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞TCR/CD3複合体（これは、Ｔ細胞免疫応答の特異性を介在する）を、mAb  G19-4などの固定化抗CD3モノクローナル抗体を用いて刺激することにより、またはPMAおよびイオノマイシン(ionomycin)を用いて化学的に刺激することにより達成された。しかし、その代わりに、Ｔ細胞の活性化が、CD2表面タンパク質の刺激などの、CD3刺激を直接含まない経路により達成され得ることもまた認識されるべきである。
【００１９】
しかし、実際に、活性化されたＴ細胞群は、患者自身の免疫系により提供され得、それは、全体の免疫抑制を妨げ、任意の外来抗原、または、疾患、感染、接種または自己免疫により存在する実質的にレベルの増加した抗原に対する応答で活性化されたＴ細胞を有し得る。「外来抗原」という用語は、本明細書では広義に使用し、生体によっても通常に産生されない抗原を意味し、または、癌腫におけるように、それを産生している細胞により通常に産生されない抗原を意味する。この用語はまた、通常には、「自己(self)」として見られるべきであるが、自己免疫疾患状態中で起こり、外来抗原であるかのように免疫応答を誘発する抗原を含むという意味である。「実質的に増大した」抗原レベルとは、正常範囲を超え、そのような上昇により生体に潜在的に有害な効果を有する抗原レベルを意味する。
【００２０】
本発明の方法によれば、CD28分子自身の刺激は、CD28に対して結合特異性および刺激効果を有するリガンド(モノクローナル抗体またはその部分(例えば、F(ab')２)のような)の投与により達成される。適切な抗体は、mAb9.3、Dr.Jeffrey  A. Ledbetter  of  Oncogen  Corporation,  Seattle,  WAからの要求により頒布および入手可能(非商業的な目的で)であるATCCに寄託されたIgG2a抗体、またはmAb  KOLT-2を含む。これらの両モノクローナル抗体は、「白血球分類II」Ch.12、147-156頁、Reinhertz,E. L.ら編(1986)に記載されるように、CD28の細胞外ドメインに対する結合特異性を有することが示されている。モノクローナル抗体 9.3F(ab')２はまた、CD28レセプターを刺激し得る満足すべきリガンドであることがまた示されている。本発明の方法は、CD28表面分子を結合する、キメラ(chimaeric)抗体、非免疫グロブリンの天然および組換えリガンドの使用を予想していることもまた理解されるべきである。つい最近、CD28に対する天然リガンド、すなわちB7/BB1がまた同定され、そして本発明の原理に従って使用され得る。Linsley,P.S.ら、J.Exp.Med.174:561(1991)を参照のこと。さらに、天然リガンドの結合性相同体はまた、天然であるか、あるいは、生化学的技術、免疫学的技術、組換え技術または他の技術により合成されたかを問わず、本発明の原理に従って使用され得る。本明細書中で示されるリガンドは、それらの適用に依存して、それらの可溶形態または細胞結合形態として利用され得る。モノクローナル抗体9.3およびB7は、一般に好適な刺激性リガンドである。
【００２１】
CD28の細胞外ドメインは、Aruffo,A.ら、PNAS(USA)、84:8573-8577(1987)により配列決定され、一般に以下のアミノ酸配列を含む：
【００２２】
【化１】
2007056034.tif 000002
本明細書および請求項において以後使用される、「細胞外ドメイン」という用語は、上記の提示されたアミノ酸配列、任意のその実質的部分、またはそれに実質的な相同性を有する任意の配列を意味する。
【００２３】
実施例III-Vのデータにより示されるように、CD28刺激によるＴ細胞介在性免疫応答の実質的増大は、活性化Ｔ細胞に特異的であるようである。そのような特異性は、特に臨床的に重要であり、そして本発明の免疫療法の重要な利点の一つである。抗CD28抗体または他のCD28リガンドの投与は、既に活性化され免疫応答に関わるＴ細胞または活性化のプロセス中にあるＴ細胞の応答を特異的に増大する。しかし、CD28レセプターへの本発明のCD28特異的リガンドの結合後、Ｔ細胞が活性化される場合でさえ、CD28刺激が有効であり得ることもまた認識されるべきである。従って、腫瘍部位または感染部位でまたは近辺で、Ｔ細胞は、これら部位で産生されたまたは存在する抗原により活性化されており、CD28刺激により選択的に「上昇する(boosted)」。
【００２４】
免疫応答を上昇させることもまた、例えば、ワクチン中に存在する抗原に対する応答を増大させることにおいて、健康な個体に対して有益であり得る（実施例IXを参照のこと）。本発明に従って、抗原の投与と共にCD28で刺激すると、従来のワクチンを用いるだけでなく、例えばヒトレトロウイルス（例えば、HIVおよびある種のヘルペスウイルス）で適切な免疫応答を誘起するのが困難な状況において、さらに効果的に免疫化され得る。本発明のCD28による刺激が用いられ得る例としては、麻疹、インフルエンザ、ポリオ、ヘルペス（すなわち、HCMV、エプスタイン・バーウイルス、タイプIおよびII）に対するウイルス性ワクチン；百日咳（Bordatella  pertussis）、破傷風（Clostridium  tetanus）、肺炎（Streptococcus  pneumoniae）、髄膜炎および淋病（Neisseria）、ならびに腸疾患性細菌（例えば、Salmonella、E.  coli、およびShigella）に対する細菌性ワクチンが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の原理はまた、寄生虫感染症（原生動物寄生虫により引き起こされる感染症（例えば、マラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、アメーバ症、トキソプラスマ症、ニューモシスチス・カリニ、およびバベシア症）、条虫（例えば、サナダムシ）により引き起こされる感染症、および他の寄生生物により引き起こされる感染症を包含する）に対する接種にも適用され得る。Nature356:152(1992)に記載のように、抗CD28と共に刺激される細胞内抗原産生物のcDNAを注入することによる体液性応答の免疫化もまた、本発明の範囲内にあるとして意図されることが理解される。
【００２５】
TCR/CD3の刺激が最大のとき、Ｔ細胞の増殖は著しく増大しないが、ある種のリンホカインのレベルがCD28の活性化によって実質的に増加し、これらのリンホカインの細胞産生が増加することを示している。従って、疾患または感染症のために、本来の最大のTCR/CD3刺激またはインビボでそれと等量のＴ細胞の活性化を受けている患者では、本発明の方法に従って、抗CD28抗体またはCD28を刺激する他のCD28リガンドを投与することにより、リンホカインの産生が実質的に増大する。
【００２６】
驚くべきことに、本発明の方法に従ってCD28刺激因子を投与して達成されるリンホカイン産生の増大により、特に実施例IIIで示すように、完全なセットのリンホカインの産生が増大し、このことから、これらのリンホカインはCD28を調節するある形態下にあることが示される。このセットの一部のリンホカイン（後に決定するように、IL-2、TNF-α、LT、IFN-γ、およびIL-3を包含する）は、Mosmann,T.R.ら、Immunol. Today, 8:223〜227(1987)に記載されている、マウスに存在するTＨ1細胞リンホカインにいくらか類似している。ヒトIL-4産生は、CD28の刺激では増大しないと元来は考えられていたが、実施例IIIに示すようなより最近のアッセイにより、他のリンホカイン（IL-4およびIL-5を包含する）の産生が増大することも現在明らかにされている。そして、IL-6およびIL-1の産生が増大することもまた実施例IXで示された。しかしながら、「TＨ1リンホカイン」という用語は、元来は表記を簡単にするために用いられ、上記のリンホカインに明確には限定されておらず、そしてCD28  Ｔ細胞表面分子の結合または刺激により、産生が影響されるかまたは調節される全てのリンホカインを含むことを意味したことが理解される。従って、CD28により影響されるリンホカインのグループを、以下よりTＨCD28リンホカインと表記し、また、「TＨCD28リンホカイン」という用語は、本明細書中で挙げる特定のリンホカインに限定されることを意図しないことが理解される。さらに、本発明の原理が獣医学の適用に用いられることにより、動物のＴ細胞介在性免疫応答およびリンホカインの産生が増大し得る。従って、本明細書中で用いる「TＨCD28リンホカイン」という用語はまた、類似した動物のリンホカインを含むことを意味する。このように、本発明の方法に従って、抗CD28抗体または他のCD28リガンドを投与することにより、完全なセットのリンホカインの産生およびレベルが著しく増大し得る。
【００２７】
本発明の免疫療法はまた、免疫抑制された患者（例えば、AIDS患者）において、Ｔ細胞介在性免疫応答を促進するのに用いられ得る。実施例VI〜VIIIに示すように、Ｔ細胞の増殖およびCD28で調節されたリンホカインのレベルまたは産生の増大は、シクロスポリンまたはデキサメタゾンにより引き起こされるような免疫抑制の存在下でさえも機能し続ける。従って、CD28刺激因子（例えば、mAb  9.3または他のCD28リガンド）の投与は、インビボでリンホカインのレベルを増大させるため、免疫抑制された患者を治療するのに用いられ得る。
【００２８】
さらに、敗血性ショックおよび腫瘍誘発性悪液質を含む種々の症候群は、CD28経路の活性化およびリンホカインの潜在的毒性レベルの産生の増大を包含し得る。免疫応答はまた、器官移植の受容者または自己免疫疾患におけるような別の状況では有害であり得る。従って、CD28経路の負の調節または不活性化はまた、以下におよび実施例XおよびXIで十分に議論するように、上記および他の臨床的病状の免疫療法を提供し得る。
【００２９】
抗CD28抗体の投与が、以前は、活性化Ｔ細胞部位におけるリンホカインレベルの実質的な増大に対する可能な免疫療法として重大には熟考されていなかったことが理解されるべきである。例えば、mAb  9.3の添加は、Ｔ細胞の増殖をいくらか増大するとだけ考えられ、TＨCD28リンホカイン産生の実質的な増大を誘発するとは考えられていなかった。
【００３０】
CD28の結合がＴ細胞介在性免疫応答を調節することによる任意の特定のメカニズムで規定されることは、本明細書の趣旨ではないが、刺激メカニズムのモデルは、実験データ（そのうちのあるものは実施例VIIIに示されている）より仮定されそして支持されている。多くのリンホカイン遺伝子が、構成的に発現したハウスキーピング遺伝子由来のmRNAよりも細胞質内で迅速に分解することが以前から示されており、このことから、これらの誘導性mRNAの不安定性が選択されて、遺伝子発現が迅速に調節されるという仮説が導かれる。本明細書中に記載されそして請求の範囲で請求されるCD28調節のメカニズムは、上記のTＨCD28リンホカインのセットのための迅速分解性mRNAの安定化に関係すると考えられている。現在までのところ、いかなる真核細胞系においても、細胞表面の活性化経路が、mRNAの分解で特定の変化を誘導することにより遺伝子発現を変化させ得ることを示す他のメカニズムは記載されていないようである。（CD28活性化の可能なモデルのさらに詳細な分析が本明細書中で以下に示される。）
実施例IVに示すように、CD28およびTCR/CD3が共に刺激されると、TＨCD28リンホカインのmRNAが増加し、これは、Ｔ細胞の活性化に関係する全ての遺伝子の定常状態でのmRNAの発現の増大が一般化した結果ではなかった。この増加は不均衡であり、従って、培地中の細胞の増殖割合の増加によって説明され得なかった。本明細書中で詳細には説明しないさらなる研究に加えて、これらのデータより、活性化Ｔ細胞のCD28表面分子の活性化が、リンホカインmRNAを特に安定化するために機能することが示される。mRNAの安定性が増大すると（すなわち、その分解が遅くなると）、mRNAの翻訳が増大し、次に細胞あたりのリンホカインの産生が増大する。Ｔ細胞あたりのリンホカインの産生が増大すると、Ｔ細胞は他の炎症細胞および造血細胞の応答に影響し、これはパラクリン産生と称される。対照的に、単に細胞増殖が増大することによるリンホカインレベルの増大（例えば、Martin,P.J.ら、J. Immunol. 136:3282〜3287(1986)に示される）は、オートクライン産生と一般に称される。表記を簡単にするため、パラクリン産生はまた、本明細書中では「細胞の」リンホカイン産生と表記される。
【００３１】
このように、本発明の原理に従って、CD28に対して特異的に結合するリガンドは、CD28経路を刺激するインビボでの投与に適した生物学的に適合する形態で投与される。「CD28経路の刺激」とは、CD28分子の刺激を意味し、これによって、Ｔ細胞のTＨCD28リンホカイン産生が増大する。「インビボでの投与に適した生物学的に適合する形態」とは、リガンドの毒性効果がたとえあるとしても、その治療効果のほうが重要である場合における投与されるべきリガンドの形態を意味する。CD28リガンドの投与は、任意の適切な薬理学的形態であり得、これは溶液でのリガンドの静脈内注射を包含するが、これに限定されない。
【００３２】
リンホカイン産生のCD28調節のモデルは、リンホカインレベルの刺激および増強に関して上記のように説明されるが、CD28経路の負の調節または阻害もまた本発明の原理に従うことが理解されるべきである。免疫応答の負の調節または抑制は、種々の病状（敗血性ショック、腫瘍誘発性悪液質、自己免疫疾患、および、心臓、肺、腎臓、膵臓、肝臓、および他の器官移植を受けた患者の病状を包含する）に対して臨床上特に重要である。負の調節に対する一つの好ましいアプローチは、CD28レセプターの天然のリガンド上への刺激的結合部位の遮断である。例えば、CTLA-4（以下でさらに詳細に議論する）（これはCD28と32％のアミノ酸相同性を有しており、そしてCD28よりもB7に対して強い結合親和性を有すると考えられる）は、B7と結合して、CD28の結合およびそれによる活性化を防ぐように用いられ得る。Linsley,P.S.ら、J. Exp. Med., 174:561(1991)を参照のこと。このような調節は、実施例Xに記載するように、インビボで行われている。この実施例では、完全なMHC不適正対合心臓同種移植の急性拒絶は、B7依存性Ｔ細胞活性化を遮断することにより（すなわち、CD28と、可溶性組み換え融合タンパク質CTLA4Igとの結合により）防止された。CTLA4Igで観察された免疫抑制は、Ｔ細胞のサブセットを循環させるのに著しく変化しなかった。他のB7結合性リガンド（例えば、B7に対するモノクロナール抗体）も同様に用いられ得ることが理解される。
【００３３】
負の調節はまた、刺激性リガンドを擬態し得るがCD28経路を活性化しない非刺激性リガンド（例えば、レセプターを架橋しないかそうでなければ活性化しない、F(ab')、改変した天然の、合成の、組換えの、または他のリガンド）でCD28結合部位を占有することによって、B7へのCD28レセプターの結合を遮断することにより達成され得ることが理解される。
【００３４】
証拠を累積することにより、Ｔ細胞レセプターの占有に加え、他の共刺激シグナルが、完全なＴ細胞介在性免疫応答を誘導するのに必要とされることが示唆される。Ｔ細胞で発現するCD28レセプターは、細胞のリンホカイン産生のパラクリンレベルを誘導し得る、新規なシグナル伝達経路の表面成分として機能する。CD28とその天然のリガンドB7（これは活性化したB細胞マクロファージまたは樹状細胞の表面で発現する）とのインビトロでの相互作用は、抗原レセプター−活性化Ｔ細胞での高レベルのリンホカイン産生を誘導する共刺激因子として作用し得る。従って、負の調節への別のアプローチは、以下に記載するように、CD28シグナル伝達経路の活性化を阻害することである。
【００３５】
CD28シグナル伝達経路は完全には理解されていないが、実施例XIは、CD28の結合により、Ｔ細胞レセプター（TCR）誘導性のチロシンリン酸化とは異なる、タンパク質のチロシンリン酸化が誘導されることを示している。例えば、TCR誘導性のチロシンリン酸化は、休止Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞の両方で生じるが、CD28誘導性のチロシンリン酸化は、既に活性化したＴ細胞において最初に生じる。最も著しい点は、CD28レセプターが、細胞に結合したB7と連結した後の結果であり、ここでリン酸化は一貫して単一の基質のみで検出し得た。Jurkat  E6-1  Ｔ細胞系を用いた実験により、CD28誘導性のチロシンリン酸化を観察するには、PMAの予備処理が必ず必要であることが示された。対照的に、Jurkat  J32系においては細胞の予備活性化は必要ではなく、他方、上記のように、CD28の応答性を誘導するためには、正常Ｔ細胞のPMAまたはTCRの予備的刺激が比較的必要であった。Jurkat変異体に関する研究は、さらに、CD28誘導性のチロシンリン酸化およびその生物学的機能はTCRが存在しないときに生じ得ることを示した。この点に関し、Ｔ細胞の活性化に含まれる他の補助分子(例えば、CD2、Ly-6、Thy-1、およびCD5)がTCRの存在を必要とすると考えられるという点で、CD28は独特であると考えられる。従って、特定のチロシンリン酸化は、CD28リガンドの結合の結果として直接生じると考えられ、B7/BB1レセプターを発現する補助細胞によって、CD28を通じて送達されるシグナルを伝達することに包含される。
【００３６】
チロシンキナーゼ、ハルビマイシンAのsrc系列のインヒビターに関する、およびチロシンホスファターゼに関する研究は、実施例XIに記載のように、リンホカイン遺伝子の発現に対するCD28刺激の機能的効果には、上記のタンパク質のチロシンリン酸化が必要であることをさらに示している。このように、チロシンのリン酸化インヒビターに関するデータは、CD28介在性のシグナル伝達の不活性化が、本発明の原理に従って、リンホカイン産生を負に調節するのにも用いられ得ることを示している。
【００３７】
本発明に従ったCD28刺激を通じた免疫療法はまた、骨髄移植受容者の治療における臨床的適用性を有する。自家および同種間の骨髄移植（BMT）の成功は、一般に、再発性悪性疾患、対宿主性移植片病（GVHD）、およびBMT後に生じる生命を脅かす免疫不全により制限されている。これらの問題を克服するための一つのアプローチは、リンホカイン注入と組み合わせたリンパ球の養子移入であり、これによって、免疫の再構成を促進するか、または悪性細胞に関する細胞毒性を仲介する。しかしながら、このようなリンホカイン注入による移入に伴う副作用は非常に著しい。
【００３８】
従って、外部から加えられるIL-2の非存在下で、CD3およびCD28の共刺激に応答したＴ細胞の増殖およびリンホカインの合成は、実施例XIIIに記載のように、外因性のリンホカインを注入せずに、インビボでＴ細胞の欠陥を修復する活性化Ｔ細胞の養子移入の臨床的使用のための唯一の機会を提供する。実施例XIVに示される研究は、抗CD3（OKT3またはG19-4）に対するインビトロでの欠陥増殖性応答が培養物中にmAb9.3を加えることにより修復され得ることを示している。Joshi,I.ら、Blood  Suppl.(Abstract)(1991)を参照のこと。Ｔ細胞とOKT3/9.3との共刺激は、サイトカイン／リンホカイン（例えば、IL-2、GM-CSF、およびTNFα）のmRNA発現レベルが増大した結果として増殖性応答を修復した。前出のJoshiの文献；Perrin,P.J.ら、Blood  Suppl.(Abstract)(1991)を参照のこと。従って、精製した正常CD4＋細胞は、OKT3/9.3で共刺激されて、長期間リンホカインを増強し、そして分泌し得る。mAb9.3の刺激を用いた予備臨床研究は、サルにおいて不適切な効果を示さなかった。CD3で刺激した細胞（CTC）は、正常B細胞にヘルパー因子を提供するが、CD3-CD28で共刺激した細胞は、CD3で刺激したＴ細胞よりもヘルパー因子を産生することにおいてさらに効果的であると考えられる。従って、共刺激はまた、BMT後の養子免疫療法のために、ヘルパー細胞および細胞毒性Ｔ細胞の増殖を増強し得る。インビトロで拡張したＴ細胞のインビボでの投与は、骨髄移植において二つの卓越した有用性を提供する。造血について強い正の効果を有する多くのリンホカイン（例えば、GM-CSF、IL-3、およびIL-6）を産生する、CD28処理細胞の能力は、骨髄移植後の移植成長（engraftment）を促進するべきである。さらに、細胞毒性の原因となりそしてリンホカイン（例えば、TNF）の産生を引き起こす抗CD28の能力は、骨髄移植の抗新生物形成効果を増大させるべき養子免疫療法の新規な形態である。
【００３９】
アネルギーにおけるCD28の可能な役割もまた試験された。一般に、休止Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞抗原レセプターの刺激により開始される。この活性化は、自己コードされるMHC分子の抗原結合溝に存在する抗原ペプチドの咬合（engagement）を介して、または外来MHC分子の咬合によって生じ得る。しかしながら、このレセプター介在性活性化事象は、休止細胞でのＴ細胞応答の開始を必要とするが、最近の研究では、抗原レセプターのみによって伝達されたシグナルが、効果的なＴ細胞介在性免疫応答へ導くには十分でないことを示している。実際、いくつかのインビトロモデルは、休止Ｔ細胞のＴ細胞レセプター（TCR）/CD3活性化のみによって、Ｔ細胞が抗原特異的レセプターによるさらなる刺激でアネルギーになる状態へ誘導されることを示唆している。この状態は比較的永続し、少なくとも数週間であり、これによって、その細胞は抗原の刺激に対してさらに応答し得なくなる。付加的なＴ細胞共刺激性分子の非存在下での、TCR/CD3複合体のみによるこの孤立した活性化が、Ｔ細胞が末梢で自己抗原に応答するのを防止することによって、末梢免疫応答を調節するのに重要な役割を演じることが仮定される。
【００４０】
従って、増殖性応答を与えそして細胞介在性免疫応答を開始させるＴ細胞に対して、休止Ｔ細胞は、通常、その抗原特異的Ｔ細胞レセプターを介する刺激だけでなく、付加的な共刺激シグナルを細胞に提供する第二のレセプターを介する刺激も必要とする。本明細書中に示すデータ（例えば、実施例XII）は、CD28が、インビトロおよびインビボでのＴ細胞の応答に対して必須の共刺激シグナルを提供することを示している。従って、Ｔ細胞のリンホカイン産生を増大させるCD28レセプターの能力により、細胞介在性免疫応答が開始されるだけでなく、休止Ｔ細胞におけるアネルギーの誘導も防止される。
【００４１】
プログラムされた細胞死の防止におけるCD28の役割もまた試験された。細胞死の誘導は、胸腺における自己反応性または非反応性Ｔ細胞の排出において主要な役割を有する。胸腺において、Ｔ細胞レセプターのシグナルは、自己抗原に特異的なＴ細胞レセプターを発現する細胞を含む選択的かつ特異的な様式で、プログラムされた細胞死を誘導し得ると考えられる。Turka,L.A.ら、J. Immunol., 144:1646〜53(1990)に記載のように、CD28は胸腺におけるＴ細胞の発生中に発現し、そして、mAb9.3の結合は胸腺細胞の細胞死を防止する。プログラムされた細胞死はまた、末梢リンパ系器官の成熟Ｔ細胞で生じると考えられる。Ｔ細胞レセプターを通じて送達されるシグナルは、細胞死を誘導し得る（Newell,M.K.ら、Nature, 347:286〜8(1990)を参照のこと）。細胞死は、免疫病理学のある形態において役割を有するということもまた提案されている。例えば、HIV-1の感染において、進行性免疫不全が、ウイルス誘導性の細胞障害効果の直接的な結果ではなく、免疫学的に仲介した細胞死の結果であり得ることが提案されている。Ameisen,J.C.ら、Immunol. Today, 4:102(1991)を参照のこと；Groux H.ら、J. Exp. Med. 175:331〜340(1992)もまた参照のこと。実施例XIIIの結果は、CD28が成熟Ｔ細胞の細胞死を防止し得ることを示している。従って、CD28の異常な発現または活性化は、いくつかの自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス、胸腺で排出されなかったかまたは末梢リンパ系でアネルギー状態から抜け出せなかった異常な自己反応性Ｔ細胞を特徴とする疾患）の免疫病理学において役割を有し得る。同様に、CD28の活性化を誘導する能力は、進行性のＴ細胞枯渇（例えば、HIV-1の感染）を特徴とする疾患において有用であり得る。
【００４２】
超抗原SEAおよびSEB（MHCに結合するための従来のプロセシングを必要としない）は、G０からG１への移行およびIL-2レセプターの発現の誘導により決定されるように、補助細胞の非存在下における精製Ｔ細胞を直接活性化し得ることもまた、実施例XIIで示された。しかしながら、SEAもSEBも、単独では十分にＴ細胞を増殖しなかった。SEBまたはSEAによるＴ細胞増殖の誘導には、第二の共刺激シグナルの添加が必要であった。これは、CD28を補助細胞またはモノクロナール抗体のいずれかで刺激することにより提供され得た。前に報告したように、補助細胞の存在下でエンテロトキシンにより誘導されるＴ細胞の増殖は、クラスIIのMHCに対する遮断抗体（HLA-DR）により一部阻害された。対照的に、共刺激がCD28を介して提供される精製Ｔ細胞においては、増殖はクラスIIの抗体で阻害されず、そしてHLA-DRの発現は検出されなかった。さらに、CD28を介する共刺激は、シクロスポリンの効果に一部抵抗した。これらの結果より、CD28の共刺激が、リンホカインの産生およびそれに続くエンテロトキシン活性化Ｔ細胞の増殖を誘導するのに十分であり、そしてこの効果がクラスIIのMHCの発現に依存しないことが示される。超抗原で活性化した細胞（例えば、トキシックショック症候群、および、リウマチ様関節炎またはライム関節炎で生じる細胞）のCD28のインビボでの活性化の防止は、疾患の罹患率を実質的に減少し得る。
【００４３】
既に記載のように、本発明は、活性化の特定のメカニズムに制限されることを意図していないが、CD28活性化経路におけるCTLA-4の役割が調べられており、そして本明細書中に記載されるデータと一致するモデルが仮定されている（例えば、実施例XVを参照のこと）。発明者らの研究室における最近の研究により、CTLA-4遺伝子が、染色体２上のCD28のすぐ隣に位置し、類似のゲノムの構築を伴い、そして32％のアミノ酸相同性を有することが示された。これらの染色体の位置および配列、ならびに構築の類似性に基づくと、CD28およびCTLA-4は、おそらく進化的な遺伝子の重複を表している。従って、本明細書中では、CD28およびCTLA-4という用語が採用されているが、標準的な命名法によると、CD28αおよびCD28βと称されるのがより適し得る。
【００４４】
CTLA-4は休止リンパ系細胞では発現しないが、RNAレベルでのその発現は、Ｔ細胞の活性化により迅速に誘導され得る。CTLA-4が機能し得る二つの可能なメカニズムが以下に仮定される。第一に、CD28およびCTLA-4は、それらの細胞外ドメイン中で対合していない一つのシステインを含むので、このシステイン残基は、表面上に架橋したダイマーレセプターを形成するのに用いられ得る。これが事実ならば、CTLA-4が、通常、CD28と共にヘテロダイマーとして表面上に発現することが示唆され得る。このような状況下で、天然のリガンドB7に対するCTLA-4の親和性が高いほど、ダイマーの状態において、シグナル化性能の増強と共にレセプターの親和性がより高くなり得る。これによって、抗原活性化細胞でCD28-CTLA-4ヘテロダイマーを介したシグナル伝達能力が増強し得る。さらに、CD28およびCTLA-4が、ヘテロダイマーの状態で活性化細胞中に最初に見いだされるならば、このことは、CD28含有レセプターが活性化細胞中で増強したシグナル化能力を有するという観察結果を説明し得る。
【００４５】
他方、本明細書中に記載されるデータはまた、CTLA-4が、CD28の競合的インヒビターとしてＴ細胞の活性化により誘導され、そして、B7とCD28との間の相互作用を表面でさらに阻害することにより、進行中の免疫応答を負に調節するのに用いられるというモデルに適合する。さらに、表面で発現するCTLA-4がまた、分離型（shed  form）で発現することがまったく可能であり、この分離型のレセプターが、B7-CD28の進行中の相互作用の可溶性競合的インヒビターとして作用し、これにより、その環境下で抗原供与細胞が付加的Ｔ細胞を活性化するのを防止する。従って、CD28の付加的イソ型（すなわち、CTLA-4）を産生するＴ細胞の能力は、CD28およびCTLA-4の発現の相互作用が、CD28含有レセプターを介して活性化されるＴ細胞の能力に対して強い効果を有することを示唆する。
【００４６】
CD28経路の活性化および阻害に関する研究は、Ｔ細胞を活性化してリンホカイン産生を増大させるCD28の天然のリガンドB7の能力が、CD28ホモダイマーまたはCD28-CTLA-4ヘテロダイマーのいずれかであるCD28含有レセプターを通じて完全に媒介されることを示している。従って、CTLA-4ホモダイマーは、Ｔ細胞の活性化に重要ではないが、Ｔ細胞リンホカイン産生の負の調節において重要な役割を演じ得、一方、CD28-CTLA-4ヘテロダイマーは、Ｔ細胞の活性化によるCD28含有レセプターの増強したシグナル化特性の原因であり得ることが、データより示唆される。
【００４７】
CD28介在性シグナル伝達事象におけるCTLA-4の役割は、本明細書中に取り上げそして記載される正常Ｔ細胞の活性化に対するCD28の新規で強力な効果が、ヒトＴ細胞系で今までに観察されなかった理由を説明し得る。CD28経路に関する初期の研究は、JurkatヒトＴ細胞のような細胞系について行われた。これらの細胞を刺激してCTLA-4を発現させる幅広い試みは、完全に陰性であった（図20を参照のこと）。対照的に、正常Ｔ細胞の細胞周期進行へ導く標準的な活性化事象は、化学的分裂促進剤（例えば、ファイトヘマグルチニン(PHA)およびホルボールミリステートアセテート(PMA)）を介したとしても、TCR/CD3複合体が架橋されるように、CTLA-4の発現の迅速な誘導を導く。従って、先の研究者達が、細胞のリンホカイン産生を増強するCD28活性化経路を理解または利用するのが不可能であったのは、おそらく、これらの細胞系におけるCD28のCTLA-4イソ型が発現しなかったことによるものであった。興味深いことに、休止Ｔ細胞と抗CD28モノクロナール抗体との共刺激は、CTLA-4遺伝子の発現を増強する（図21を参照のこと）。従って、実際、正常細胞におけるCD28活性化経路は、CD28ホモダイマーを介する初期のCD28の刺激がCTLA-4の発現を増強させることにより、ヘテロダイマーの発現およびシグナル伝達を増強させ、正のフィードバックループを含み得る。あるいは、増強したCTLA-4は、CD28シグナル伝達と競合してリンホカイン産生の最終的な終結を導き、そして、負のフィードバックループとして作用することによりCD28介在性の進行中のリンホカイン産生を負に調節する、レセプターの産生へと導き得る。
【実施例】
【００４８】
実施例Ｉ
CD28刺激因子モノクローナル抗体9.3の調製
モノクローナル抗体(mAb)9.3（CD28分子の細胞外ドメインに結合するIgG2aモノクローナル抗体）を、Hansenら、Immunogen.、10：247-260(1980)で記載されるようにして独自に誘導した雑種細胞系により産生した。高力価のモノクローナル抗体9.3を含む腹水を、Balb/C  x  C57BL/6  F１マウスに5〜10x10６個の雑種細胞を腹腔内接種して、調製した。マウスは、予め腹腔内への0.5mlのPristane(Aldrich  Chemical  Co.、Milwaukee、WI)で感作させていた。モノクローナル抗体9.3を、Hardy,R.、「Handbook  of  Experimental  Immunology」、Ch.13(1986)に記載のブドウ球菌プロテインＡセファロースカラムで、腹水から精製した。
【００４９】
機能的アッセイに用いる前に、精製mAb  9.3をリン酸緩衝生理食塩水（KCl  0.2グラム／リットル  dH２O；KH２PO４  0.2グラム／リットル  dH２O；NaCl  8.0グラム／リットル  dH２O；Na２HPO４・7H２O  2.16グラム／リットル  dH２O）に対して充分に透析し、次いで、0.22立方ミクロンの無菌フィルター(Acrodisc、Gelman  Sciences、Ann  Arbor、MI)を介して濾過した。mAb  9.3調製物から、20℃で45分間、100,000xgでの遠心分離により凝集物を取り除いた。生じる精製mAb  9.3を、リン酸緩衝生理食塩水中で再懸濁させ、OD280分析により決定される最終濃度を200μg/mlとし、そして使用の前に４℃で保存した。
【００５０】
実施例II
CD28＋  Ｔ細胞の単離
バフィーコートを、21歳〜31歳の健康なドナーの白血球搬出(leukopheresis)により得た。末梢血リンパ球(PBL)（約2.5x10９）を、リンパ球分画培地(Lymphocyte  Separation  Medium)（Litton  Bionetics、Kensington、MD）密度勾配遠心分離法によりバフィーコートから単離した。次いで、Ｔ細胞のCD28＋サブセットを、Yamadaら、Eur.J. Immunol.、15：1164-1688(1985)に記載のCD11およびCD28表面抗原の相互的および非重複の分布を利用して、免疫吸着を用いる負の選択(negative  selection)によりPBLから単離した。PBLを、約20x10６／mlにて、20mM  HEPES緩衝液(pH  7.4)(GIBCO  Laboratories、Grand  Island、NY)、5mM  EDTA(SIGMA  Chemical  Co.、St.Louis、MO)、および５％熱活性化ヒトAB血清(Pel-Freez、BrownDeer、WI)を含有するRPMI  1640培地(GIBCO  Laboratories、Grand  Island、NY)中で懸濁させた。細胞を、４℃にて、以下のモノクローナル抗体の飽和量を有する回転振とう器上で20分間、インキュベートした：モノクローナル抗体60.1（抗CD11a）（Bernstein,I.D.ら、「Leukocyte  Typing  II」、第３巻、1-25頁、Reinherz, E.L.ら編、(1986)を参照せよ）；1F5（抗CD20）（Clark,E.A. ら、PNAS(USA)、82：1766-1770(1985)を参照せよ）；FC-2（抗CD16）（June, C.H. ら、J. Clin.Invest.、77：1224-1232(1986)を参照せよ）；および抗CD14。抗体のこの混合物は、全てのＢ細胞、単核細胞、大顆粒リンパ球(large  granular  lymphocyte)、およびCD28−  Ｔ細胞をマウスイムノグロブリンでコートした。細胞をPBSで３回洗浄して未結合の抗体を除去し、次いで、１個の細胞あたり３個の磁気粒子の比で、ヒツジ抗マウスイムノグロブリンでコートした磁気粒子(Dynal,Inc.、Fort  Lee、NJ)と共に、４℃で１時間、インキュベートした。次いで、磁気粒子に結合した抗体コート細胞を、Lea, T.ら、Scan. J.Immunol.、22：207-216(1985)に記載の磁気分離により除去した。典型的には、約700x10６個のCD28＋  Ｔ細胞を回収した。細胞精製はフローサイトメトリー、および組織化学的手法により定期的にモニターした。フローサイトメトリーは、Ledbetter,J.A.ら、「Lymphocyte  Surface  Antigens」、119-129頁（Heise, E.編、1984）で記載のように行った。簡単には、CD28＋  Ｔ細胞を、Goding,J.W.、「Monoclonal  Antibodies  Principles  and  Practice」、230頁（Goding, J.W.編、1983）に記載のように、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)-共役抗CD2  mAb  OKT11(Coulter、Hialeah、FL)、およびFITC-共役抗CD28  mAb  9.3で染色した。CD28＋  Ｔ細胞は、非結合イソタイプ適合のFITCラベルしたコントロール抗体(Coulter、Hialeah、FL)と比較して、FITC-共役モノクローナル抗体OKT11で99％を上回って陽性であり、そしてFITC-共役モノクローナル抗体9.3で98％を上回って陽性であった。残りの単核細胞は、Sigma  Chemical  Co.、St.Louis、MOから得た市販のキットを用いて、非特異的エステラーゼの染色により定量し、そしてそれは本研究で用いた全ての細胞群において0.1％未満であった。生存度は、Mishell,B.B.ら、「Selected  Methods  in  Cell.Immunology」、16-17頁(1980)に記載のトリパンブルー排除により測定して、約98％であった。
【００５１】
実施例III
モノクローナル抗体9.3でのCD28刺激によるヒトTＨCD28リンホカインの細胞産生の増加
Ａ．IL-2、TNF-α、IFN-γ、およびGM-CSFの産生増加。
【００５２】
CD28＋  Ｔ細胞を、種々の組み合わせの刺激因子の存在下で約1x10５細胞／ウェルで培養した。刺激因子には、以下のものが含まれた：ホルボールミリステートアセテート(PMA)(LC  Services  Corporation、Woburn、MA)が3ng/ml；抗CD28  mAb  9.3が100ng/ml；Geppertら、J.Immunol.、138：1660-1666(1987)；また、Ledbetterら、J. Immunol.、135：2331-2336(1985)で先に記載のプラスチック組織培養プレートの表面への吸着により固定された抗CD3  mAb  G19-4が200ng/ml；イオノマイシン(Iono)（Calbiochem.、San  Diego、CA）が100ng/ml。培養上澄み液を24時間目に集め、そして系列希釈してTＨCD28リンホカインの存在をアッセイした。
【００５３】
具体的には、IL-2は、Gillisら、Nature、268：154-156(1977)で先に記載のバイオアッセイを用いてアッセイした。１ユニット(U)を、24時間の培養で7x10３個のCTLL-2（ヒト細胞障害性Ｔ細胞系）の最大増殖量の半分を誘導するのに必要なIL-2の量として定義した。個々の実験において、上記の各培養条件のためのIL-2の相対的なレベルを、市販のELISAアッセイ(Genzyme  Corp.、Boston、MA)を用いて別個に確認した。TNF-α/LTレベルは、Kunkelら、J.Biol. Chem.、263：5380-5384(1988)で先に記載の半自動化L929線維芽細胞溶解アッセイを用いて測定した。TNF-α/LTのユニットを、TNF-α(Genzyme  Corp.、Boston  MA)の内部標準を用いて定義した。TNF-αおよびLTの両方が独立して存在することを、各サイトカインに特異的であるモノクローナル抗体が、固定化抗CD3  mAb  G19-4および抗CD-28  mAb  9.3で共刺激された細胞の上澄み液によって媒介される細胞溶解を部分的に阻害する能力によって確認した。IFN-γは、市販のキット(Centocor、Malvern、PA)を用いてラジオイムノアッセイにより測定した。IFN-γのユニットを、テストキットに提供される１２５IラベルしたヒトIFN-γを用いて標準曲線から決定した。GM-CSFは、TNF-αおよびLTに対する中和モノクローナル抗体の存在下で、Langeら、Blood、70：192-199(1987)に記載のように、ヒトGM-CSF依存細胞系AML-193の増殖の刺激により検出した。精製GM-CSF(Genetics  Institute、Cambridge、MA)の10ng/mlにより誘導された３H-チミジン取り込みを100Uとして定義した。細胞の個々のアリコートを、刺激後48時間で回収し、そして、Thompsonら、Nature、314：363-366(1985)で先に記載のように、ヨウ化プロピジウム(propidium  iodide)で細胞を染色し、フローサイトメトリーにより分析することにより、細胞周期の後期(S+G２+M)にある細胞の百分率をアッセイした。
【００５４】
表１に示すように、CD3刺激Ｔ細胞のCD28刺激は、IL-2、TNF-α、IFN-γ、およびGM-CSFの細胞産生の著しい増加を生じた。
【００５５】
【表１】
2007056034.tif 000003
Ｂ．Ｔ細胞IL-4、IL-5、およびIL-3分泌への抗CD28刺激の効果
TＨ2タイプのリンホカインのＴ細胞産生への抗CD28  mAb刺激の効果に関する先の研究は、刺激の最初の数日に限定されていた。それらの研究において、IL-4は抗CD28刺激後に検出され得なかった（Thompsonら、PNAS86：1333(1989)に記載）。この問題の再検討で、抗CD28は、IL-4およびIL-5の産生を増加させ得、従って、先に記載されたTＨ1タイプのリンホカインだけでなくTＨ2タイプのリンホカインの産生を増加させることが見いだされた。表２に示したように、少量のIL-4およびIL-5の両方が、抗CD3と抗CD28での刺激の24時間後に検出され得る。しかし、細胞が培養中で８日後に再刺激された際には、大量のIL-4およびIL-5の両方が分泌される。表３に示すように、同様の結果が、Ｔ細胞のCD28サブセットがホルボールミリステートアセテート(PMA)と抗CD28  mAbとを組み合わせて刺激した際に、見いだされた。これらの結果は、少量のIL-4およびIL-5が、休止Ｔ細胞の抗CD28による初めの刺激の後に検出され得ることを示した。しかし、刺激を継続すると分化が生じ、そして多量のIL-4および、特に大量のIL-5が産生され、一方でより少量のIL-2およびγ-IFNもまた産生される。
【００５６】
【表２】
2007056034.tif 000004
上記の表２のデータは、次のプロトコルを用いて得た：CD28＋  Ｔ細胞を、実施例IIに記載のように、モノクローナル抗体および磁気イムノビーズを用いて負の選択により単離した。細胞を、10％FCSを含むRPMI培地（培地）、あるいはプラスチックに吸着した抗CD3モノクローナル抗体G19-4、または、プラスチックに吸着した抗CD3に加えて0.5μ/mlで溶液に添加した抗CD28  mAb  9.3を含む培養ウェルで、1x10６個/mlで培養した。細胞培養物からの上澄み液を、市販のELISAキットを用いてリンホカイン濃度について分析し、そして値を、IL-4、IL-5およびγ-IFNについてはpg/mlとして、またはIL-2については１mlあたりのユニットとして表した。上澄み液を24時間の培養後、分析し（初期）、あるいは、細胞を上記の刺激の形で８日間培養し、細胞を回収し、洗浄し、次いで、当初の処理で再刺激し、そして上澄み液をさらに24時間の刺激の後、分析した（再刺激）。その値は、２回の培養の平均を示す。
【００５７】
【表３】
2007056034.tif 000005
上記の表３のデータは、以下のプロトコルを用いて得た：CD28＋  Ｔ細胞を、実施例IIに記載のように、モノクローナル抗体および磁気イムノビーズを用いて負の選択により単離した。細胞を、10％FSCを含むRPMI培地（培地）中にて、あるいは培地とPMA  ３ng/ml中にて、またはPMAと抗CD28  mAb  9.3を0.5μg/ml中にて、1x10６個/mlで培養した。細胞培養物の上澄み液を、市販のELISAキットを用いてリンホカイン濃度について分析し、そして値を、IL-4、IL-5およびγ-IFNについてpg/mlとして表した。上澄み液を24時間の培養の後、分析し（初期）、あるいは、細胞を上記の刺激の形で８日間培養し、次いで、再刺激し、そして上澄み液をさらに24時間の刺激の後、分析した（再刺激）。その値は、２回の培養の平均を示す。
【００５８】
抗CD28処理後のＴ細胞におけるIL-3発現の誘導
IL-3は、Ｔ細胞により主として産生され、そして一般にTＨ1細胞により産生されると考えられている多重結合(multilineage)造血増殖因子である。本明細書中に記載の実験的プロトコルおよび結果は、Guba,S.C.ら、J  Clin. Invest. 84(6)：1701-1706(1989)に詳細に記載され、本明細書中で参考として援用されている。
【００５９】
PBLを上記のように単離した。Ｔ細胞のCD28＋サブセットをJune,C.H.ら、Mol. Cell. Biol. 7：4472-4481(1987)に記載の負の選択により単離した。いくつかの実験においては、Ｔ細胞のCD28＋サブセットを、PBLをmAb  9.3とインキュベートし、次いで、ヒツジ抗マウスコート磁気ビーズ(Advanced  Magnetics  Institute、Cambridge、MA)でCD28＋細胞を取り出すことにより単離した。ノーザン(RNA)ブロット分析を、June,C.H.ら、Mol. Cell. Biol. 7：4472-4481(1987)に記載のように行った。IL-3プローブは、1.0kbXho  I  cDNAフラグメントであった。
【００６０】
Ｔ細胞の活性化のTCR/CD3経路の刺激が、IL-3遺伝子発現を誘導したかどうかを決定するために、CD28＋  Ｔ細胞を、最大量のプラスチック固定化抗CD3  mAbで、１μg/mlの9.3  mAbの存在下または非存在下で、１〜36時間刺激した。表４に示すように、抗CD28は、CD3単独による誘導に比べて、IL-3  mRNA発現の３〜５倍の増強を生じた。CD28は、IL-3遺伝子発現の速度論を変化させず、抗CD3処理後、または抗CD3＋抗CD28処理後、６時間でピークレベルに達した。さらなる実験は、ノーザン分析（表４）により決定されたように、IL-3遺伝子の発現がＴ細胞のCD28＋サブセットに限定されることを示した。IL-3  mRNAの安定度もまた決定された。Ｔ細胞を、抗CD3、または抗CD3と抗CD28  mAbで３時間処理し、IL-3  mRNA発現を誘導させた。３時間目に、アクチノマイシンＤを培養物に添加し、さらなるRNA合成を阻害させた。全細胞のRNAを単離し、そして残存するIL-3  mRNAをノーザン分析により決定した。抗CD3と抗CD28で処理した細胞のIL-3  mRNAの半減期は、抗CD3処理した細胞のIL-3  mRNAよりも少なくとも８倍より長かった（表４）。従って、他のリンホカインについての抗CD28の上記の結果から予期されるように、IL-3遺伝子誘導における抗CD28の効果は、CD28がIL-3メッセンジャーRNAを安定化させる能力により、大部分が説明され得ることを結論付け得る。
【００６１】
【表４】
2007056034.tif 000006
実施例IV
CD28刺激と他のＴ細胞表面分子の刺激との比較
CD28＋  Ｔ細胞を、約1x10５細胞／ウェルで、５％熱不活性化ウシ胎児血清(FCS)、PHA  10μg/ml、PMA  ３ng/ml、100ng/mlのイオノマイシン、100ng/mlの抗CD28  mAb  9.3、あるいは１μg/mlのCD45に特異的なmAb  9.4または１μg/mlのCD2に特異的なmAb  9.6、あるいは200ng／ウェルのCD3に特異的な固定化mAb  G19-4を含有するRPMI培地で培養した。
【００６２】
CD28＋  Ｔ細胞を、５％熱不活性化ウシ胎児血清を含有するRPMI中、平底の96-ウェルマイクロタイタープレート中で４組のサンプルについて培養した。細胞の等しいアリコートを18時間培養し、次いで、１μCi／ウェルの３H-ウリジンで６時間パルスを与え、または72時間培養し、次いで、１μCi／ウェルの３H-チミジンで６時間パルスを与えた。細胞をグラスファイバーフィルター上に集めた後、平均および標準偏差を（cpmで）、液体シンチレーションカウンターにより決定した。
【００６３】
抗CD3モノクローナル抗体によりプラスチックに固定された細胞を含む全ての培養物を、目視により検査し、完全に細胞を集めたことを確認した。これらの培養物における細胞がPHAに応答して増殖できない原因は、上記実施例IIに記載の負の免疫吸着による、補助細胞、インビボで活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、およびCD11＋(CD28−)Ｔ細胞の激しい減少のためである。各実験において、細胞をフルオレセイン共役抗CD2  mAb  OKT11およびフルオレセイン共役抗CD28  mAb  9.3で染色した。そしてそれぞれ99％を上回る表面、および98％を上回る表面が陽性であった。
【００６４】
典型的な実験を図１および図２に示す。図１および図２に示すように、抗CD28は、それ自体、ウリジンまたはチミジン取り込みに対して顕著な効果を有さず、固定化抗CD3  mAb  G19-4により誘導される増殖、またはホルボールミリステートアセテート(PMA)およびイオノマイシン(Iono)を含む化学的に誘導されるＴ細胞増殖のいずれかを増大するように作用することもない。しかし、図２に示すように、抗CD28は、両方のセットの細胞のウリジンの取り込みを顕著に増加させた。これに対して、抗CD2  mAb  OKT11および抗CD45  mAb  9.4を含む他のモノクローナル抗体は、抗CD3刺激細胞のウリジン取り込みに顕著な効果を有さなかった。これは、細胞におけるこれらの抗体の効果がないためではない。なぜなら、抗CD2モノクローナル抗体は抗CD3刺激細胞の増殖を顕著に増大させたからである。別の実験において、イソタイプ適合mAbと他のＴ細胞表面抗原（CD4、CD6、CD7、またはCD8）との結合は、抗CD28で認められたものと類似の効果を生じなかった。
【００６５】
これらのデータから、CD28による活性化Ｔ細胞の刺激が特異な表現型を有することを確認できる。その表現型は、Ｔ細胞の増殖を直接増強することなく、Ｔ細胞の定常状態RNAへの放射性マーカーの取り込み速度を直接増強するようである。
【００６６】
実施例Ｖ
Ex  vivoでのCD28刺激によるヒトTＨCD28リンホカインの細胞産生の増加
インビトロシステムでの証拠に基づくと、抗原による活性化またはそれと同等なものを経た後でなければ、CD28はリンホカインの細胞産生に顕著な効果を有さないようであった。しかし、9.3  mAbによるCD28結合は、抗TCR/CD3活性化Ｔ細胞がヒトTＨ１タイプのリンホカインの産生を持続する能力を顕著に増大させた。生理学的なセッティングにおけるこの効果をテストするために、ex  vivoの全血液モデルでのＴリンパ球の活性化を調べた。
【００６７】
50から100mlの静脈血を、承諾を得た後に正常なボランティアから標準的な無菌手順により得た。血液を25U/mlの防腐剤無添加のヘパリン(Spectrum、Gardenia、CA)でヘパリン化し、凝固を防止した。次いで、各々10mlのアリコートを、15mlのポリプロピレンチューブ内に、ロッキングプラットホーム(rocking  platform)上に置き、サンプルの流動および通気を保持した。
【００６８】
リンホカイン遺伝子発現の誘導におけるCD28の刺激の効果をアッセイするために、TNF-α分子の産生をモデルとして選択した。その理由は、このタンパク質が全血液中で極端に短い半減期（約15分）を有するためである。上記のように単離した全血液の10mlを、可溶性抗CD3  mAb  G19-4の１μg/mlの濃度と、または抗CD28  mAb  9.3の１μg/mlの濃度と、あるいはその２つの抗体を組み合わせたものと、インキュベートした。血漿を、１時間および４時間で実施例IIIに記載のようにTNF-αについてアッセイした。そのような実験の１つの例を表５に示し、最大のCD3の刺激およびCD28の共刺激により、TNF-αの持続した産生が顕著に増加したことを示す。
【００６９】
【表５】
2007056034.tif 000007
実施例VI
CD28誘導Ｔ細胞の増殖のシクロスポリンへの耐性
本明細書中に記載の用いたプロトコルおよび結果は、June, C.H.ら、Mol. Cell. Biol.、7：4472-4481(1987)で詳細に記載されており、本明細書中に参考として援用されている。
【００７０】
Juliusら、Euro.J. Immunol.、 3：645-649(1973)に記載のようにナイロンウール濾過により濃厚にしたＴ細胞を、以下の組み合わせの刺激因子の存在下で約5x10４個／ウェルで培養した：抗CD28  mAb  9.3(100ng/ml)およびPMA(1ng/ml)；あるいは固定化抗CD3  mAb  G19-4（200ng／ウェル）；またはPMA(100ng/ml)。上記の組み合わせはまた、Wiesingerら、Immunobiol.、156：454-463(1979)に記載のようにエタノール-Tween  80に溶解した、４倍の力価量(titration)（25ng/ml〜1.6μg/ml)のシクロスポリン(CSP)(Sandoz、Hanover、NJ)を含んでいた。
【００７１】
３H-チミジン取り込みを、培養の３日目に測定し、そして８つの独立した実験のうちの典型的な結果を図３に示す。CD28誘導Ｔ細胞増殖の相加平均（91,850±1300（平均±標準偏差））は、PMAの投与を伴う場合、ほとんど完全なシクロスポリン耐性を示す。以下の表６は、次の条件下、平底96-ウェルマイクロタイタープレート(CoStar、Cambridge、MA)中、約5x10４細胞／ウェルで培養されたCD28＋  Ｔ細胞のCD3誘導増殖へのシクロスポリンの効果を示す：固定化mAb  G19-4；または固定化mAb  G19-4およびmAb  9.30  100ng/ml；または固定化mAb  G19-4およびPMA  1ng/ml；またはmAb  9.3  100ng/mlおよびPMA  1ng/ml。シクロスポリンを上記のように調製し、そして０、0.2、0.4、0.8、1.2μg/mlで培養物中に含有させた。
【００７２】
３H-チミジン取り込みを上記のように３日目の培養物で決定した。増殖の阻害の百分率を、培地のみで、またはシクロスポリン1.2μg/mlで、培養したCD28＋  Ｔ細胞間について計算した。シクロスポリンの非存在下で培養したCD28＋  Ｔ細胞に、シクロスポリン希釈液を与えた。培地、またはPMA、またはモノクローナル抗体9.3単独で培養した細胞の３H-チミジン取り込みは、150cpm未満であった。表６に示すように、CD3およびCD28の共刺激は、Ｔ細胞増殖のシクロスポリンへの耐性の著しい増加を生じ、そしてPMAの存在下でのCD28の刺激では、Ｔ細胞増殖のシクロスポリン抑制の完全な欠如を生じた。表７に示すように、CD28と固定化抗CD3との刺激はまた、免疫抑制剤であるデキサメタゾンによるＴ細胞増殖の抑制に対する耐性を生じた。
【００７３】
【表６】
2007056034.tif 000008
【００７４】
【表７】
2007056034.tif 000009
実施例VII
シクロスポリンの存在下でのヒトＴＨＣＤ２８リンホカイン分泌
実施例IIIに記載したように、CD28＋  Ｔ細胞を種々の刺激因子の存在下で培養した。培養上清を24時間で採取し、上記のようにIL-2、TNF-α/LT、INF-γ、およびGM-CSFについて系列希釈物をアッセイした。細胞の別個のアリコートを刺激後48時間で回収し、細胞周期の後期(S+G２+M)にある細胞の比率についてアッセイした。
【００７５】
表８(実施例IIIのデータも比較のために引用する)に示されるように、0.6μg/mlでシクロスポリンを試験プロトコールに含む場合、CD28＋Ｔ細胞は、mAb  9.3およびPMA;または固定化したmAb  G19-4およびmAb  9.3;またはPMAおよびイオノマイシンおよびmAb  9.3で刺激した培養物中で、シクロスポリンの存在下、TＨCD28リンホカインを分泌することが判明した。しかし、固相mAb  G19-4;またはイオノマイシンおよびPMAにより誘導されるTＨCD28リンホカイン産生は、シクロスポリンの存在下で完全に抑制された。
【００７６】
【表８】
2007056034.tif 000010
実施例VIII
シクロスポリンの存在下におけるヒトＴＨＣＤ２８リンホカインｍＲＮＡ発現
CD28の刺激がシクロスポリン耐性TＨCD28リンホカイン遺伝子の発現および分泌を導くかどうかをさらに試験するために、種々の刺激物質による刺激の後で、IL-2、TNF-α、LT、IFN-γ、およびGM-CSFの誘導を抑制するシクロスポリンの能力を試験した。詳細には、５％FCS(MED)を含む完全RPM1培地（GIBCO,Grand  Island,NY)中で、CD28＋T細胞を2×10６/mlで培養した。CD28＋T細胞の個々のアリコートを、PMA  3ng/mlおよび抗CD28  mAb  9.3(1mg/ml)；または固定化抗CD3  mAb  G19-4(1μg/ウェル)；または固定化mAb  G19-4(1μg/ウェル)およびmAb  9.3(1ng/ml)を含む1.0μg/mlシクロスポリンの存在下または非存在下で6時間インキュベートした。CD28＋  T細胞を採取し、以前にThompsonらによるNature,314:363-366(1985)に記載のように、全細胞RNAを単離し、リボソームRNAについて均等に分配した(equalized)。
【００７７】
ノーザンブロットを調製し、そしてJune,C.H.らによるMol.Cell.Biol., 7:4472-4481(1987)に記載のように、３２Pでラベルされ、nick翻訳された遺伝子の特異的プローブで連続してハイブリダイズした。IL-2プローブは、June,C.H.らによるMol.Cell.Biol.,7:4472-4481(1987)に記載の1.0kbのPst  I  cDNAフラグメントであり；IFN-γプローブは、YoungらによるJ.Immunol.,136:4700-4703(1986)に記載の1.0kbのPst  I  cDNAフラグメントであった。GM-CSFプローブは、WongらによるScience,228:810-815(1985)に記載の700塩基対のEcoRI-HindIII  cDNAフラグメントであり；4F2プローブは、LindstenらによるMol.Cell  Biol.,8:3820-3826(1988)に記載の1.85kbのEcoRI  cDNAフラグメントであり；IL4プローブは、YokotaらによるPNAS(USA),83:5894-5898(1986)に記載の0.9kbのXho  I  cDNAフラグメントであり；そしてヒト白血球抗原(HLA)プローブは、LindstenらによるMol.Cell.Biol.,8:3820-3826(1988)に記載のHLA-B7遺伝子由来の1.4kbのPst  Iフラグメントであった。TNF-αおよびLTの特異的プローブは、SteffenらによるJ.Immunol.,140:2621-2624(1988)およびWangらによるScience,228:149-154(1985)に記載の遺伝子特異的な30個のヌクレオチドオリゴマーとして合成した。ハイブリダイゼーションの後で、ブロットを洗浄し、そして-70℃で、オートラジオグラフィーにさらした。Lindstenら、Mol.Cell.Biol.,8:3820-3826(1988)に記載のデンシトメトリーによって、バンドの濃度の定量を行った。
【００７８】
図４のノーザンブロットによって例示されるように、PMAを含むmAb  9.3による刺激、および、mAb  G19-4を含むmAb  9.3による刺激は、シクロスポリンに対して耐性を示すヒトTＨCD28リンホカイン遺伝子発現を導いた。対照的に、TCR/CD3  mAb  G19-4のみによる刺激は、シクロスポリンの存在下で完全に抑制された。
【００７９】
実施例IX
ＣＤ２８刺激によるＴ細胞のインビボでの活性化
Ａ．モノクローナル抗体9.3  F(ab')２
Ledbetter,J.A.らによるJ.Immunol.,135:2331-2336(1985)に記載のように、mAb  9.3のF(ab')２フラグンメントを調製した。精製され、そしてエンドトキシン非含有のF(ab')２フラグメントを、30分間にわたって、健康なマカック類(M.nemestrina)のサルに、1mg/kg体重で静脈内注射した。注射の２日および７日後、5mlの血液を抜き取り、そして試験した。
【００８０】
サルの血液由来の末梢血リンパ球を、実施例IIに記載のように、濃度グラジエント遠心分離によって単離した。PMA(1ng/ml)に応答する末梢血単核細胞の増殖を、実施例IVに記載のように、処理されたサルおよびコントロール動物（F(ab')２フラグメント未処理）３匹ずつで試験した。３日間の実験の最後の6時間における３H-チミジンの摂取によって増殖を測定し、そしてその結果を図５に示した。３つの培養物の平均が示され、そしてその平均の標準偏差は各時点において20％未満であった。図５に示すように、F(ab')２  mAb  9.3フラグメントによるインビボでのCD28の刺激は、少なくとも７日間、T細胞の増殖を増加させた。
【００８１】
Ｂ．モノクローナル抗体９．３
霊長類のMacaca  mulattaに、２種類の投与量（10mgおよび0.1mg）のmAb  9.3を静脈内投与した。３匹の動物を、各投与量について、以下に記載のように評価した。
【００８２】
細胞群の変化    多量の投与量について、即時性の効果をはじめの120分間にわたってモニターした。図６Ａおよび６Ｂに描かれた代表的な結果は、リンパ球の数の経時的な変化を示す。ALC、および、CD28＋細胞の分布を、図６Ａに示す。一方、図６Ｂは、CD4＋およびCD8＋細胞の分布を例示している。絶対的リンパ球数(ALC)は、はじめの60分間にわたって減少し、次いで、24時間で増加した（図６Ａを参照のこと）。この場合には、CD28陽性リンパ球の数は本質的に同一のままであるが、はじめの30分の後、抗体でコートされた（ヤギ抗マウスフィコエリスリンを加えることによって測定された）。この同じ動物において、CD4およびCD8陽性群が測定され、そして24時間での増加は、CD8＋CD28−細胞によるものであった（図６Ｂを参照のこと）。８日後に再評価した動物は、抗体でコートされた35％と60％との間のCD28＋細胞を有していた。0.1mgで処理された霊長類の循環するリンパ球数には、著しい変化はなかった。
【００８３】
インビトロでの刺激の後に放出されるサイトカイン  破傷風トキソイドで予め免疫化され、そして10mgのmAb  9.3で処理された霊長類から特定の時点で単離されたPBLを、インビトロで培養して、サイトカイン生産における抗原性の刺激の効果を測定した。図７Ａは、インビトロでのTNFの生産を表し、一方、図７Ｂは、インビトロでのIL-6の生産を表す。コンカナバリン-a(Con-a)で刺激されたPBLは、△で表される。破傷風トキソイド(TT)で刺激されたPBLは、●で表される。刺激されていないPBLは、○で表される。図７Ａおよび７Ｂにおいて示されるように、ベースライン細胞の培養物は、Con-a刺激およびTT刺激のいずれにも応答しなかった。しかし、図７Ａにおいて示されるように、抗体の注入６時間後の動物から単離されたPBLは、TNF生産の増加を示した。図７Ｂにおいて示されるように、24時間後、刺激されていない培養物は、TNFは生産したが、IL-6は生産しなかった。TT刺激されたPBLでは、ミトゲンで刺激された培養物と同様量のTNFおよびIL-6を生産した。この応答は、72時間に至るまで一定であった。
【００８４】
モノクローナル抗体9.3を、ボーラスとして（10mg(n=3)で１日のみ）、または複数日注入物として（５日間連続して10mg/日(n=3)で）のいずれかで霊長類に投与し、そしてその動物を同時に追跡した。抹消血細胞群の変化は、劇的ではなかった。前に見られたように、ALCは、最初の注射により減少したが、さらに注入物を投与しない場合にはベースラインを越えて回復した。しかし、複数回の注射により処理された動物については、ALCは、mAb投与の期間中、通常の約25％未満を維持した。複数回処理された動物のALCは、21日間の実験期間にわたって通常のレベルを越えるレベルには回復しなかった。絶対的好中球数は、５日間処理されたグループでは、約30％減少した。
【００８５】
血清中のサイトカイン    血清をIL-6、TNF、およびIL-1βについて分析した。血清調製物からのTNFの検出は、首尾良くはいかなかった。従って、今回、結果は得られていない。図８Ａおよび８Ｂは、mAb  9.3の注入後のIL-6の血清濃度を示す。図８Ａおよび８Ｂにおいて示されるように、mAb注入の24時間後、IL-6レベルの上昇が検出された。１回注射した動物においては、IL-6レベルは、４日目にピークまで上昇したが、８日目に再び測定されたとき、低下が見られた（図８Ａを参照のこと）。対照的に、５日間処理された動物（多数回投与量）は、８日間にわたってIL-6において継続的な上昇を示した(図８Ｂを参照のこと）。
【００８６】
図９Ａおよび９Ｂは、mAb  9.3の注入の後のIL-1の血清濃度を示す。図９Ａおよび９Ｂにおいて示されるように、血清中のIL-1βの測定によると、１回注射された動物（図９Ａを参照のこと）および複数回注射された動物（図９Ｂを参照のこと）の両者において８日後まではいずれのIL-1も検出されなかった。しかし、21日目には、複数回注射された動物ではレベルが上昇していたのに対し、１回注射された動物ではレベルは低下した。
【００８７】
インビトロでの刺激後のサイトカインの放出    IL-6生産は、インビトロでのTTによる刺激の３日後では、動物のPBLにおいて検出されなかった（図１０）。このことは、上記のインビトロでの結果と対照的であった。しかし、IL-6の生産の増加が７日目に検出され、そしてさらに著しい増加が、５日間処理された霊長類から単離されたPBLから見られた。14日目に単離されたPBLの培養物において、生産の増加がさらに見られた。
【００８８】
PBLのIL-6生産および増殖    図１０Ａおよび１０Ｂは、サルから単離された、インビトロで刺激されたPBLのIL-6生産を示している。図１０Ａおよび１０Ｂにおいて、１日目、３日目、および14日目は、コントロールを表す△および刺激されたPBL応答を表す○で示される。図１０Ａは、１回注射された動物の応答を示し、そして図１０Ｂは、複数回注射された動物の応答を示す。（PBから採取された細胞量は、実施されるアッセイの数を制限し、その結果、０日目のポイントおよび０日目のデータがないことに注意すること。）PBLを、異なる処理されたグループから単離し、そしてCon-a、TT、および刺激されていないものに対するそれらの増殖応答について評価した。歴史的には、TT応答は、約5,000cpmであり、そしてCon-a応答は、約35,000cpmであった。従って、この結果により、Con-aに対するPBL増殖応答は、減少し、そして徐々に回復したことが示される。TTで刺激した場合には、増殖応答は見られなかった。このことは、インビトロでの培養において見られるリンホカイン生産と対照的である。
【００８９】
実施例X
CTLA4Igによる免疫調節
Ａ．インビトロ
アロ抗原に対する一次免疫応答におけるCTLA4Igの効果を、まず、Lewisラット（RT1ｌ、応答体(responder))とBrown-Norwayラット(RT1ｎ、刺激体(stimulator))との間で、一方向混合リンパ球培養(MLC)において試験した。リンパ球を、気管旁および頚リンパ節から単離した。Turka,L.A.ら、Transplant.,47:388-390(1989)に記載されたように、96ウェルの丸底のプレート中の４つづつで、培養を行った。４日後に培養物を採取し、そして１mCi/ウェルの３H-チミジンを、培養の最後の６時間に加えた。このアッセイにおいて、Brown-Norway刺激体の細胞を、30Gyで照射してその細胞の増殖を抑制し、次いで、Lewis応答体のリンパ球の培養物に加えた。増殖応答は、Marrack,P.ら、Immunol.Today,9:308-315(1988)に論じられているように、同種異系のMHCに対する応答としての、細胞表面のTCRを介する活性化の結果として、通常、約1-5%の細胞において生じる。CTLA4Ig、または、Fell,H.P.ら、J.Bio.Chem.(印刷中)に記載のイソタイプ適合の(isotype-matched)コントロールモノクローナル抗体L6を、種々の濃度で加えた。
【００９０】
図１１は、一方向混合リンパ球培養におけるCTL4lgの効果を表す。図１１に示されるように、CTL4lgは、用量依存様式において増殖をブロックし得、1mg/mlの濃度では実質的に完全な阻害が見られた。（結果は、３H-チミジンの取り込み±標準偏差の１分間当たりの数として表される）。自発的な増殖は、Brown-Norway刺激体の非存在下で、Lewis細胞によるチミジンの取り込みである。このことは、図１１において黒塗りの四角で示されている。これらの結果と一致して、同種異系反応性のT細胞応答はまた、Azuma,M.ら、J.Exp.Med.,175:353-360(1992)に示されるように、抗CD-28モノクローナル抗体の非刺激F(ab')フラグメントによって阻害され得る。これらのデータは、組み合わせると、インビトロでの増殖応答を開始するために、同種異系反応性のT細胞は、TCRのMHCエンゲージメントにより刺激されるだけでなく、CD28レセプターのB7咬合による共刺激を要求しなければならないことを示唆する。
【００９１】
Ｂ．インビボ：心臓同種移植
次にCTLA4Igをラットの臓器移植のモデルに用い、そのインビボでのアロ抗原応答を遮断する能力を確認した。レシピエント動物は異所性心臓移植を受け、それはBolling,S.F.ら、Transplant.、53:283-286(1992)に記載のように首の血管に吻合する。移植片を触診により機構的機能を、そして心電計により電気生理学機能をモニターした。移植片拒絶は、触診可能な収縮機能の最終日に起こるといわれた。最初の試験として、動物を毎日CTLA4Igまたはアイソタイプ適合のコントロールモノクローナル抗体L6の注射で７日間処置した。CTLA4Igを0.015mg／日(５匹)、0.05mg／日(５匹)、および0.5mg／日(８匹)の用量で投与した。L6は0.5mg／日で与えた。未処置ルイス(Lewis)ラットは6.8±0.3日(n=10)で異所性Brown-Norway同種移植片を拒絶した。CTLA4Ig処置動物中の移植片は薬物投与の完了後も機能を維持した。一方、未処置動物、またはL6コントロール抗体で処置した動物は、表９に示すように一様に８日(p<0.0001)までにその移植片を拒絶した(p値はカイ二乗分析により算出した)。
【００９２】
【表９】
2007056034.tif 000011
CTLA4Ig処置ラットでは、観察できる急性または慢性の副作用は上記タンパク質の投与からは示されなかった。剖検によればCTLA4Ig処置動物に大きな解剖学上の異常は観察されなかった。
【００９３】
未処置動物およびCTLA4Ig処置動物を組織学検査のために屠殺した。心臓同種移植片を、未処置動物(図12Ａに示す)およびCTLA4Ig処置動物(0.5mg／日)(図12Ｂに示す)から、移植後４日で取り除いた。同種移植片はホルマリンで固定し、組織切片をヘマトキシリンーエオシンで染色した。（オリジナル写真は200X倍)。未処置動物から取り出したドナーの心臓は、重篤な急性細胞性拒絶の組織学的な所見を示した。それは間隙性単核細胞の水腫形成を伴う著しい浸潤、筋細胞の破壊、および細動脈壁の浸潤を含む。それに対して、CTLA4Ig処置動物由来の移植心臓は単に弱いリンパ球浸潤を示した。明白な単核細胞壊死および細動脈障害の証拠は存在しなかった。各動物由来の本来の心臓は組織学的な異常を示さなかった。
【００９４】
CTLA4Ig治療が薬物処置後に持続する移植寛容の状態を確立したかどうかを決定するために、毎日CTLA4Ig注射で７日間処置した動物を移植片機能の停止まで追加の治療をせずに観察した。動物は未処置、CTLA4Ig(0.5mg／日x７日間)またはイソタイプ適合のコントロールモノクローナル抗体L6(0.5mg／日x７日間)のいずれかを受けた。全ての場合において、処置は移植時に開始した。図13は処置ラットおよびコントロールラットにおける同種移植片の生存(survival)を示すグラフである。移植片の生存は、0.05mg／日のCTLA4Igで処置した動物で18-40日であった。移植片の生存は毎日評価した。永続性移植が誘導されないのは不十分な用量のCTLA4Igのためであるようではなかった。なぜなら、10倍高い用量(0.5mg／日)で処置した動物が、長期(50日より長い)の移植片機能を維持した１匹を含めて、図13に記載のような類似の移植片の生存曲線を示したからである。図13では、移植片の生存は移植片機能の最終日として記載する。0.015mg／日x７日間(n=５)の用量で処置した動物は、平均12.6±2.1日間(n=５)生存した。さらに、定量ELISAアッセイでの測定によれば、この群での血清CTLA4Igの谷のレベルは10μg/mlより多く、その濃度はインビトロでは最大抑制である(図11参照)。18-43日後に機能を停止したCTLA4Ig処置動物由来の同種移植片の組織学的検査で、急性細胞性拒絶の典型的な兆候を示した。その兆候は、７日後にそれらの心臓を拒絶したコントロール動物において見られるのと同程度の重症度であった。移植片機能を維持した動物を57日目に屠殺した。この動物由来の同種移植片にはいかなる組織学的な異常も認められなかった。
【００９５】
屠殺時に、57日「寛容」動物および33日目に心臓を拒絶したCTLA4Ig処置動物由来のリンパ球を、それらの機能性応答について試験した。これらの応答をコントロール(移植しなかった)ルイスラット由来のリンパ球の応答と比較し、その結果をコントロール応答の比率として標準化した。コントロール動物に比較して、「寛容」および拒絶の両方の動物由来のリンパ球は、Con-a(寛容、62.5％；拒絶、51.1％；p=0.63、２側Ｔ検定)、および第三群のACIラット(RT1ａｖｉ)由来の細胞(寛容、160％；拒絶、213％；p=0.58)に対して同程度に増殖する応答をした。しかし、有意な差異がBrown-Norway細胞に対する応答において見られ（寛容、34.2％；拒絶、238％；p<0.005)、機能性移植片を有する動物由来のＴ細胞はドナーのMHC抗原に対して特に低応答性であることを示唆した。57日「寛容」動物由来の胸腺および脾臓は、大きさおよび細胞数が移植していないコントロールラットと同様であった。そして、胸腺、リンパ節、および脾臓のフローサイトメトリー分析で、各動物におけるCD4＋およびCD8＋Ｔ細胞の両方の比率が同様であることが判明した。57日「寛容」動物から本来のルイスレシピエントへ養子移植した脾細胞は、その動物がBrown-Norway心臓同種移植片を拒絶する速さに影響しなかった。従って、寛容はこの動物中のサプレッサー細胞により維持されるようではなかった。
【００９６】
高濃度CTLA4Ig(0.5mg／日x７日間)で処置した５匹の同種移植レシピエントのうち４匹が研究期間内に移植片を拒絶した事実は、共同刺激分子B7の遮断が永続性移植片寛容を一貫して誘導しなかったことを示す。１つの可能性のある説明では、CTLA4Igが一時的な非応答状態を誘導し、回復下でレシピエントＴ細胞が移植片拒絶に影響し得る。あるいは、CTLA4Ig処置の結果、B7-依存性共同刺激なしで標的抗原の認識をし得ることにより、循環しているＴ細胞において永続的に非応答状態になり得る。CTLA4Ig処置の中止後に胸腺から現れる新たに成熟したＴ細胞はこの機構により寛容になり得ず、B7-共同刺激されたＴ細胞のアロ活性の結果として移植片拒絶を媒介し得る。これらの２つの可能性を識別するために、ラットを心臓移植の３日前に胸腺切除し、移植後毎日CTLA4Igの注射(0.5mg／日x７日間)で処置した。これらの動物は移植片を28日から33日の間に拒絶し、このことは同種移植レシピエントは新たなＴ細胞の流入によらず、同種免疫応答を開始したことを示した。従って、CTLA4Ig処置時に存在するＴ細胞は、結局移植片拒絶を誘導し得るようである。このことは、一時的な非応答状態からのＴ細胞の回復を示し得るか、またはCTLA4Ig処置期間中のＴ細胞の流通のキネティックスを反映し得る。
【００９７】
Ｃ．シクロスポリンの相乗効果
可溶性CD28レセプターホモログ（CTLA4Ig）がインビトロおよびインビボで細胞媒介応答を抑制し得ることを示す能力に基づいて実験を行って、この免疫抑制剤がシクロスポリンと付加的なまたは相乗的な効果を有するか否かを決定した。刺激体としてBrown-Norwayラットリンパ節細胞、そして応答体としてルイス系統ラットリンパ節細胞を用いる混合リンパ球反応(MLR)を、共培養後72時間のトリチウム化チミジンの取り込みを測定することにより測定した。0.1μg/ml濃度でのCTLA4Igおよび30ng/mlでのシクロスポリンのみ、またはその組み合わせた能力を測定した。図14は種々の条件下での３H-チミジン取り込みを示す。図14において理解できるように、いずれの免疫抑制剤も混合リンパ球の増殖する応答について部分的な減少のみ引き起こしたが(MLR+CTLA4IgおよびMLR+CSP)、２つの組み合わせ(MLR+CSP+CTLA4Ig)はこれらのMHC-非適合系統間の混合リンパ球の反応を完全に遮断した。この効果は、付加効果を有する２つの免疫抑制試薬から予測したより大きく、CTLA4Igおよびシクロスポリンが独立した機構によりＴ細胞活性化を遮断し、アロ抗原への応答におけるＴ細胞の活性化に対して相乗効果を有することを示唆する。
【００９８】
実施例XI
第２メッセンジャーによるリンパ球産生の制御
リンパ球産生における種々の第２メッセンジャーを調べた。特に、２つの主要な細胞第２メッセンジャー系に対する役割、プロテインキナーゼＣの活性化および細胞内カルシウムの上昇が、リンパ球遺伝子の転写の中心的な調節剤として特徴付けられた。さらに、特異的なチロシンリン酸化反応が、翻訳および／またはmRNA安定性における改変の発生に相関し得ることが確認された。セリンおよびトレオニンキナーゼへのさらなる調査は、それらがまたリンホカイン産生に含まれるシグナル伝達事象において役割を有し得ることを示す。対照的に、cGMPによる調節への実験は、この薬剤が、リンパ球産生に比較的非特異的な作用を有することを示した。
【００９９】
CD28に関係するチロシンリン酸化反応は、さらに以下に記載のように調べられた。
【０１００】
プロトコール
モノクローナル抗体：抗CD2  mAb  G19-4(IgG1)、抗CD28  mAb  9.3(IgG2a)、抗CD5  mAb  10.2(IgG2a)、および抗CD45  mAb  9.4(IgG2a)を産生し、精製しそしてある場合には、Ledbetter,J.A.ら、J.Immunol.、135:2331(1985)およびLedbetter, J.A.ら、J.Immunol.、137:3299(1986)に記載のようにビオチン化した。抗B7  mAb  133(IgM)、および、Freedman,A.S.ら、J.Immunol.、139:3260(1987)に記載されたような腹水の希釈液を用いた。抗CD3  mAb  OKT3(IgG2a)を、マイクロスフェア(KPL,Gaithersburg,MD)に共有結合的に結合したヤギ抗マウスIgGに、プールした腹水の1/10５希釈液をHBSS中で10７ビーズ/mlと、室温でインキュベーションし、引き続いて充分に洗浄することにより吸収させた。
【０１０１】
細胞：Ｔ細胞のCD28＋サブセットを、末梢血Tリンパ球から、以前にJune,C.H.ら、Mol.Cell.Biol.、7:4472(1987)に記載されたように、ヤギ抗マウスIgでコートされた磁性粒子を用いた免疫吸収を用いる負の選択により、単離した。これにより、＞99%  CD3＋でありしかもNK細胞のようなCD2＋/CD3−を含まない休止Ｔ細胞の集団を得た。Jurkat  T  白血病細胞系E6-1はDr.A.Weissからの供与品であり、完全培地、例えば、2mM  L-グルタミン、50μg/mlゲンタマイシン、および10%  FCS(HyClone  Laboratories,Logan, UT)を含むRPMI  1640で維持した。ある場合には、Ｔ細胞またはJurkat細胞を、完全培地中、または、5ng/ml  PMA(Sigma  Chemical  Co.,St.Louis, MO)またはOKT3ビーズ(±5ビーズ/細胞)を含む完全培地中で、実験前に培養した。Jurkat  J32細胞系(CD2＋、CD3−、CD28＋)は、Makni,H.ら、J.Immunol.,146:2522(1991)中に記載されている。J32変異体(CD2＋、CD3−、CD28＋)は、γ線照射で誘導される変異および免疫選択(上述のMakni、(1991)参照)に由来した。そのような一つのクローン化された変異体J32-72.4は、培養中で安定である。これら細胞の表面レセプター発現は、間接免疫蛍光法により定量化しそしてフローサイトメトリーにより分析した。各試料の平均対数蛍光強度を測定し、そして式△FL=10［（Ｅ−Ｃ）／Ｄ］により線形相対蛍光単位(△FL)に変換した；ここでEは実験抗体試料の平均対数蛍光強度であり、Cは対照抗体試料の平均対数蛍光強度であり、Dは10個あたり50チャンネル(50  channels/decade)である。TCR/CD3およびCD28レセプターに対して、J32細胞の△FLは、27.0および57.0であり、そしてJ32-74.2細胞に対して1.1および40.7であった。J32-72.4のノーザンブロット分析は、検出可能なTCR-β  mRNAを示さなかったが、TCR-α、CD3-γ、δ、およびε、およびTCRζ  mRNAの発現は、親のJ32細胞のそれと似ていた(未公開データ)。
【０１０２】
ＣＨＯ細胞のＢ７トランスフェクション：ＣＨＯ細胞を、Ｂ７  cDNAで、以前に、Gimmi,C.D.ら、PNAS(USA)、88:6575(1991)中に記載されたように、トランスフェクトした。これら細胞は、以前に、CD28  mAbで誘導されたＴ細胞活性化を模した方法でリンパ球増殖およびリンホカイン分泌を刺激することが示されている。Linsley,P.S.ら、J.Exp.Med.,173:721(1991)およびGimmi、上述(1991)参照。Ｂ７を発現しないトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、リクローン化しそしてＣＨＯ-Ｂ７と称した。ＣＨＯ細胞を、Gimmi、上述(1991)中で記載されたように、0.5mM  EDTAを含むPBS中30分間のインキュベーションにより組織培養プレートから剥し、そして0.4%パラホルムアルデヒド中で固定した。固定されたＣＨＯ-Ｂ７細胞を対照細胞として使用した。
【０１０３】
タンパク質チロシンリン酸化の免疫ブロット分析：
抗ホスホチロシン抗体を用いた免疫ブロットアッセイの詳細は、Hsi,E.Dら、J.Biol.Chem.,264:10836(1989)およびJune,C.Hら、J.Immunol.,144:1591(1990)中に記載されている。細胞を、5-10x10７細胞/mlで、反応培地、即ち、0.8%FCSおよび20mM  Hepesを含むHBSS中、37℃で、時間3分で懸濁し、そして時間0分で刺激した。モノクローナル抗体(mAb)は、10μg/ml最終濃度で使用した。架橋のために、ビオチン化したmAbを、室温で5-8分間、細胞とインキュベートし、細胞を時間3分で予熱し、そして時間0で最終濃度40μg/mlのアビジン(Sigma  Chemical  Co.)で刺激した。刺激は、氷冷した10x溶解緩衝液の添加により終了させ、0.5%  Triton  X-100の最終濃度とした。June、J.Immunol、上述(1990)を参照。4℃で溶解後、核をペレット化し、そして核を除いた上澄液を7.5%ゲル上のSDS-PAGEにかけ、ポリビニリデンジフルオライド微細多孔膜(Millipore,Bedford,MA)にトランスファーし、そしてこの膜を１２５ＩスタフィロコッカスプロテインＡ(ICN,Irvine,CA)でラベルされたアフィニティ精製された抗ホスホチロシン抗体を用いてプローブし、ｘ線フィルムに曝した。
【０１０４】
結果
ハルビマイシンＡはCD28刺激IL2産生を阻害する：以前の研究により、ホルボールエステル、カルシウムイオノフォア、およびCD28レセプターのmAbとのライゲーションにより提供される３つの明瞭な生化学シグナルが、最適IL-2分泌を起こすのに必要であることが示されている(June,C.H.ら、J.Immunol.,143:153(1989)参照)。PMA、イオノマイシンの存在下、またはCD28  mAb単独下で培養された細胞は、検出可能なIL-2を産生せず、そして、June,J.Immunol.,(1989)上述、およびFraser,J.D.ら、Science(Wash.,D.C.)251:313(1991)中で以前に報告されたように、CD28レセプターの刺激は、固定化された抗CD2  mAb、PMA、またはPMA＋イオノマイシンで刺激されたＴ細胞のIL-2産生を強力に高める方向に制御した(up-regulated)。CD28が引き金となるシグナル化においてチロシンキナーゼの可能な役割を調べるため、srcファミリータンパク質チロシンキナーゼのインヒビターであるハルビマイシンA(Uehara,Y.ら、Biochem.Biophys.Res.Commun.,163:803(1989)参照)の、IL-2産生のCD28が引き金となる増強に対する作用を調査した。Ｔ細胞をハルビマイシンA(1μM)の不存在下(図15の白棒で示す)または存在下(図15の黒棒で示す)で一晩培養した。次いで細胞をさらに24時間、培地に固定化された抗CD3  mAb(G19-4)、PMA(3ng/ml)(P)、またはPMA＋イオノマイシン(150ng/ml)(P+I)の存在下、可溶性抗CD28  mAb  9.3(1μg/ml)の存在下または不在下で培養した。細胞フリーの上澄液を集め透析してハルビマイシンAを取り除き、そして連続希釈液を、June,J.Immunol.,上述(1989)中に記載されたようなバイオアッセイによりIL-2含有量について分析した。図15は、CD28で刺激されたIL-2産生に対するハルビマイシンAの作用を示す。固定化された抗CD3、またはPMAを用いた刺激に応答する、CD28  mAbで介在されたIL-2産生の増強は、ハルビマイシンAの存在下でほぼ完全に阻害された。これに対し、PMA、イオノマイシンまたは9.3  mAbのみで培養された細胞は、＜10U/mlのIL-2を産生した。
【０１０５】
CD3により引き起こされる基部シグナリング経路の分裂により、抗CD3および抗CD28で刺激された細胞に対するハルビマイシンの作用が可能的に説明され得る。これに一致して、CD3が引き金となるIL-2産生は、ハルビマイシンAにこのうえなく感受性であることが示されている。June,C.H.ら、PNAS(USA)、87:7722(1990)を参照。しかし、PMA＋イオノマイシンまたはPMA＋CD28の組み合わせの刺激を用いて誘導されたIL-2産生は、原則的に、ハルビマイシンAの作用を試験するCD28シグナルを分離する能力を許容する。PMA＋抗CD28で刺激されたIL-2産生は、ハルビマイシンAの作用に感受性であり、他方では、前に注記したように、PMA＋イオノマイシンで刺激されたIL-2分泌は、ハルビマイシンAの作用に耐性であった。PMA＋イオノマイシン＋抗CD28の組み合わせによる刺激は、PMA＋イオノマイシンの最適量より多いIL-2分泌を引き起こす結果となり、このことは、June,J.Immunol.,上述(1989)；およびFraser,J.D.ら、Science(Wash.D.C.)251:313(1991)の以前の報告と一致する。しかし、ハルビマイシンAの存在下で、PMA＋イオノマイシン＋CD28で刺激された細胞は、ハルビマイシンの不在下でPMA＋イオノマイシンで刺激された細胞とほぼ等量のIL-2を産生した。それとともに、上記の結果は、TCRおよびCD28両レセプターは、ハルビマイシンに感受性であることを示唆し、そしてさらにIL-2遺伝子発現に対するこれら３つの薬剤の独立の作用を示唆する。June、J.Immunol.,上述(1989);およびFraser、上述(1991)参照。
【０１０６】
mAbと架橋するＣＤ２８レセプターはPMA処理されたJurkat細胞でタンパク質チロシンリン酸化を誘導する：
上記の機能的結果を得て、CD28が介在するシグナル伝達におけるタンパク質チロシンリン酸化の関与の可能性を、Ｔ細胞白血病系Jurkat  E6-1の全細胞溶解液の核を除いた上澄の免疫ブロット分析により調べた。Jurkat  E-6細胞を、２日間PMA(5ng/ml)の存在下または不在下で培養した。洗浄後、120μl中の10７細胞を、反応培地(対照)、抗CD3  mAb(G19-4)、抗CD28  mAb(9.3)、または架橋された抗CD28  mAb(9.3)(最終濃度、10μg/ml)で刺激した。架橋には、ビオチン化したmAbを時間10分で、次いで、時間ゼロでアビジン(40μg/ml)を添加した。２分後、反応を氷冷溶解緩衝液を用いて終了させ、そして核を除いた上澄液をSDS-PAGE電気泳動により分離し、イモビロン(immobilon)に移し、そして抗ホスホチロシンを用いて免疫ブロットし、次いで１２５I-プロテインＡおよびオートラジオグラフィーを行った。
【０１０７】
Ledbetter,J.A.ら、Blood,75:1531(1990)による以前の報告では、増加したチロシンリン酸化が、CD28レセプターを架橋後休止Ｔ細胞で検出され得なかった。この報告に一致して、二価性または架橋されたCD28  mAbの結合後刺激されなかったJurkat細胞中において、チロシンリン酸化に変化は検出されなかった。以前の研究では、CD28刺激単独では、Jurkat細胞中のリンホカイン産生に至らずまたは主要Ｔ細胞の増殖を誘導しないことが示されている。Weiss,A.ら、J.Immunol.,137:819(1986);Martin,P.J.ら、J.Immunol.,136:3282(1986);およびHara,T.ら、J.Exp.Med.,161:1513(1985)を参照。CD28のCD28  mAbによる、または、B7、天然CD28リガンドによる固着は、Ｔ細胞がPMAまたはTCR/CD3  mAbで刺激されて提供される、共刺激シグナルを送達する。June,C.H.ら、Immunol.Today,11:211(1990);Koulova,L.ら、J.Exp.Med.,173:759(1991);Linsley,P.S.ら、J.Exp.Med.,173:721(1991);およびGimmi,C.D.ら.,PNAS(USA)88:6575(1991)参照。このように、CD28で誘導されたタンパク質チロシンリン酸化は、共刺激シグナルの関係でのみ生じ得るようであった。
【０１０８】
この仮説を試験するために、Jurkat細胞をPMA中で培養しそして次いで以前に記載されたように抗CD28  mAbで刺激した。PMAで刺激された細胞では、2分間のCD28の架橋は、約47、約62、約75、約82、約100、約110、および約145kDの分子量で移動する基質上のリン酸化を誘導した。二価性CD28  mAbはチロシンリン酸化を誘導したが、その程度はより小さかった。June,C.H.ら、J.Immunol.,144:1591(1990)に一致して、Jurkat細胞のCD3による引き金は、休止Jurkat細胞およびPMA処理Jurkat細胞において、ホスホプロテイン(pp)56,pp65,pp75,pp100,pp110,およびpp145のチロシンリン酸化を誘導した。特に興味深いのはpp75およびpp100であり、試験されたすべての条件下で、CD28刺激により一致してリン酸化された。
【０１０９】
mAbと架橋するＣＤ２８レセプターは正常Ｔ細胞中でタンパク質チロシンリン酸化を誘導する：
同様の実験を、CD28が形質転換されなかった細胞中でチロシンリン酸化を増大し得るか否かを測定するために、正常ヒトドナーからの高度に精製された末梢血Ｔ細胞を用いて行った。末梢血CD28＋Ｔ細胞をPMA(5ng/ml)中で6時間培養した。洗浄後、10７細胞を、2分間、培地(対照)、抗CD3  mAb(G19.4)、抗CD28  mAb(9.3)、架橋された抗CD28  mAb(9.3)、または架橋された抗CD5  mAb(10.2)で刺激した。細胞を溶解し、そしてタンパク質チロシンリン酸化を、以前に記載したように測定した。PMA処理された細胞上のCD28の架橋は、みかけ上、45、75、および100kDの位置に移動するチロシンリン酸化された基質を誘導した。再び、pp75およびpp100が最も優勢にそして一致して再産生された。
【０１１０】
PMA刺激の24-48時間後に観察されたCD28刺激の作用は、6時間後に見られたそれより顕著であった。休止Ｔ細胞上でのCD28のmAbによるライゲーションは、みかけ上、僅かに検出されるチロシンリン酸化を引き起こした。PMAによる抗CD28mAb刺激に対する増大した応答性の誘導は、CD28で誘導されたチロシンリン酸化を普遍的に観察するには4-6時間のPMA処理を必要とするほど緩慢である。シクロヘキシイミドを用いた実験は、細胞がCD28に応答性になるには新規のタンパク質合成が必要であることを示す。CD28で誘導されたチロシンリン酸化の特異性は、CD5をイソタイプが相一致したmAbで架橋することにより調べた。75kD基質上の増大したチロシンリン酸化が、ときどきCD5架橋により誘導された。対照的に、CD5は、pp100上でチロシンリン酸化を誘導しなかった。同様に、MHCクラスIレセプターの架橋はまた、この基質のチロシンリン酸化を誘導しなかった。
【０１１１】
ＣＤ２８レセプター架橋はＣＤ３処理された正常Ｔ細胞でタンパク質チロシンリン酸化を誘導する：上記の実験は、CD28が、静止細胞中で比較的不活性であり、そして結果としてプロテインキナーゼＣ活性化に応答性になることを示唆する。TCR刺激がまた細胞にCD28シグナルを呼び出す(prime)か否かを測定するために、Ｔ細胞を培地中または抗CD3でコートされたビーズの存在下で一晩培養した。細胞を回収し、そして8x10６細胞を、架橋された抗-CD28  mAbで0-5分間刺激し、細胞を溶解し、そしてタンパク質チロシンリン酸化を以前に記載されたように測定した。架橋されたCD28  mAbは、休止Ｔ細胞中で多くの基質について、CD28刺激後2-5分でピークとなる低レベルのチロシンリン酸化を誘導した。対照的に、CD28  mAbは、CD3で呼び出された細胞中で1分以内で最大となる顕著なチロシンリン酸化を誘導した。このように、抗CD3を用いたＴ細胞の共刺激は、応答の程度の増加および応答の動力学の加速により示されたように、CD28で誘導されたチロシンリン酸化を増大した。CD28に対する応答性のこの誘導は、これらの研究に用いられたＴ芽細胞が、細胞サイクルの後期G１相中であったことを別の研究が示したように、DNA合成を必要としなかった。
【０１１２】
ＣＤ２８レセプター−Ｂ７/ＢＢ１レセプター相互作用がＴ細胞中の特異的チロシンリン酸化を誘導する：上記の結果は、CD28  mAbが、前もって活性化されたＴ細胞に関する種々の基質中でチロシンリン酸化を増大し得ることを示す。以前の研究は、CD28が、架橋の程度に依存して２つの生化学的に別のシグナルを送達することを示した。Ledbetter,J.A.ら、Blood,75:1531(1990)参照。Ｔ細胞の刺激後に観察されたCD28  mAbの独特の機能的性質は、高度に架橋されたCD28  mAbを必要とせず、無傷のまたはF(ab')２CD28  mAbを用いて得られる。Hara,T.ら、J.Exp.Med.,161:1513(1985)中で論議されたように、研究は、CD28リガンドを発現するCHO細胞がCD28  mAbの機能的作用を模倣することを示した。Linsleyら、上述(1991)、およびGimmi、上述(1991)参照。これらの細胞は、多分、CD28レセプターが介在するシグナル伝達を研究するための、より生理学的な手段となる。CHO-B7＋細胞をPMAで処理されたＴ細胞と、CHO/Ｔ細胞比1:10で5-30分間インキュベートした。細胞表面上(CHO-B7−細胞)でB7を発現しないB7でトランスフェクトされたCHO細胞を対照として用いた。刺激前、CHO細胞をパラホルムアルデヒドで固定しホスホチロシンのバックグラウンドを減少させた。以前の研究は、この処理が、無傷のB7-CD28相互作用を残しておき、そして機能的作用を確実にすることを示した。Gimmi、上述(1991)を参照。時間ゼロ点で、まず溶解緩衝液をＴ細胞に添加し、次いで、直ちに混合液にCHO細胞を添加した。CHO-B7＋細胞は、主に100kDの位置に移動する基質上で検出される特異的チロシンリン酸化を誘導した。このCHO-B7-で誘導されたチロシンリン酸化は、刺激後5分以内で検出され、そして少なくとも30分間プラトーレベルで高められたままであった。CHO-B7で誘導されたチロシンリン酸化は種々のCHO-Ｔ細胞比で明瞭であり、そして100kD基質のみが一致して観察された。CHO-B7−細胞は、pp100のチロシンリン酸化を誘導しなかった。このB7で誘導されたチロシンリン酸化は、CHO細胞の抗B7  mAbとの予備インキュベーションがCHO-B7で誘導されたpp100チロシンリン酸化を妨げたように、CD28-B7相互作用に依存した。B7-CHO細胞は、ある実験では、pp100チロシンリン酸化で僅かな増加を誘導した；しかし、これは普遍的には観察されなかった。
【０１１３】
他の実験では、同種異系抗原(アロ抗原)で誘導されたT芽細胞を、CD28で誘導されたチロシンリン酸化について試験した。Ｔ細胞を、異質遺伝子型の照射された細胞とともに８日間培養し、そして次いでCD28  mAbで刺激した。74および100kD基質において最も顕著なチロシンリン酸化が観察された。このように、同種異系抗原、CD3  mAb、またはPMAで予備活性化されたＴ細胞のCD28刺激が、開始が早くそして継続期間の短い、限られた数の基質においてチロシンリン酸化を誘導し得る。
【０１１４】
ＣＤ４５によりおよびハルビマイシンにより阻害されたＣＤ２８で誘導されるチロシンリン酸化：
タンパク質チロシンキナーゼインヒビターハルビマイシンAが、CD28で誘導されるIL-2分泌を効果的に阻害し得るということがわかったので、このインヒビターをCD28で誘導されるチロシンリン酸化に対する作用について試験した。Ｔ細胞を、示されたハルビマイシンA濃度の存在下または対照培地中、一晩PMA(5ng/ml)で処理した。細胞を集め、洗浄し、そして8x10６細胞を培地または架橋抗CD28  mAbで2分間刺激した。界面活性剤に可溶性のタンパク質を、以前に記載されたように調製した。抗CD28  mAbで誘導されたチロシンリン酸化は、特異的にCD28で誘導されたIL-2産生を阻害する条件下で、ハルビマイシン処理された細胞中でほぼ完全に阻害された。
【０１１５】
CD28  mAbで誘導されたチロシンリン酸化の短い一時的経過は、ホスファターゼによる制御を示唆した。CD28が介在するシグナル伝達に対しホスファターゼの作用を向けるために、Ｔ細胞をPMA(5ng/ml)を用いて一晩培養した。10７細胞を10分間、培地(対照)、ビオチン化された抗CD45  mAb(9.4)、抗CD28  mAb(9.3)、または両者を用いてインキュベートした。モノクローナル抗体を時間０でアビジンで架橋した。反応を２分後に終了した。界面活性剤可溶性タンパク質の抗ホスホチロシン抗体を用いた免疫ブロット分析を以前に記載されたように実施した。CD28架橋が誘導したpp75およびpp100におけるチロシンリン酸化は、CD45により完全に阻害された。Samelson,L.E.ら、J.Immunol.,145:2448(1990)中に記載された以前の結果に一致して、CD45のみの架橋は、120-135kD基質の増大したチロシンリン酸化を引き起こした；この作用はまた、CD28＋CD45処理された細胞中で見られた。このように、上記の研究は、CD28で誘導されたチロシンリン酸化は、srcファミリータンパク質チロシンキナーゼのインヒビターに感受性であり、そしてさらに、CD45タンパク質チロシンホスファターゼがCD28で誘導されたタンパク質チロシンリン酸化を阻害し得ることを示す。
【０１１６】
ＣＴＬＡ−４発現はＣＤ２８経路活性化に続くＩＬ−２発現を予言する：精製された休止Ｔ細胞を、固定化された抗CD2Ab、抗CD3+mAb  9.3、PMA + イオノマイシン、PMA + mAb  9.3 およびPMA + イオノマイシン +mAb  9.3を用いて、タンパク質-チロシンキナーゼインヒビターハルビマイシンの存在下または不在下で８時間刺激した。２回のノーザンブロットを、CTLA-4、CD28、IL-2またはHLA特異的プローブにハイブリダイズした。CD28、CTLA-4およびIL-2の発現を、次いで、ノーザンブロットにより分析した。IL-2発現は、CD28経路活性化に続くCTLA-4発現とよく相関した。CTLA-4およびIL-2発現はまた、ハルビマイシンと同程度まで抑制されたが、CD28発現は未変化のままであった。このことは、CD28経路活性化に対するタンパク質-チロシンキナーゼインヒビターの抑制作用が、CTLA-4発現の抑制を通じて介在され得ることを示唆する。
【０１１７】
実施例ＸＩＩ
CD28およびブドウ球菌エンテロトキシンによるMHC独立Ｔ細胞増殖の誘導
プロトコール
Ｔ細胞の単離    健常人ボランティアから末梢血を採血した。Ficoll-Hypaque(Pharmacia)クッションを用いた密度勾配遠心分離法により単核細胞フラクションを得た。このフラクションを末梢血単核細胞(PBMCs)を利用する実験に使用した。上記単核細胞とＢ細胞、単球、および活性化Ｔ細胞に対する抗体カクテルとをインキュベートすることにより、精製静止Ｔ細胞を得た。次いで、前述のJune(1987)に記載のヤギ抗マウス免疫グロブリン被覆磁気ビーズ(Advanced  Magnetics  Inc.)とインキュベートすることにより、抗体被覆細胞を除去した。この方法を適宜行うことにより、フローサイトメトリーによれば、99%超過がCD2＋である個体群を得た。
【０１１８】
増殖アッセイ    96ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェル中で5x10５個の精製Ｔ細胞またはPBMCsを培養することにより、増殖を調べた。最終培養容積は、10％FCS、ペニシリン（100U/ml）、ストレプトマイシン（100μg/ml）および２mM  Ｌ−グルタミンを補足したRPMI  1640(Gibco)200μlであった。培養開始時に、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（SEA）、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（SEB）(Toxin  Technologies)およびシクロスポリンＡ(Sandoz)を指示された用量で加えた。培養期間の開始時に、抗CD28モノクローナル抗体（mAb  9.3,J.Ledbetterより供与された）および抗HLA-DRモノクローナル抗体（mAb  L243, J.Ledbetterより供与された）を加えた。培養の最後の８時間に、トリチウム標識チミジン（３H-TdR,ICN）を１μCi／ウェルの濃度で含有させた。７２時間後、PHD細胞採集機(Cambridge  Technologies)を用いて、ガラス製ミクロファイバーフィルターストリップ(Whatman)上に細胞を採集し、そして液体シンチレーションカウンター(LKB)で計測した。すべての計測値は、３回または４回の培養の平均cpm±標準偏差で表される。
【０１１９】
フローサイトメトリー．１mlのＴ細胞を培地のみで、SEA(100ng/ml)またはSEB(1μg/ml)で、SEAまたはSEBに抗CD28抗体(1μg/ml)を加えたもので、あるいはPMA(3ng/ml)に抗CD28抗体(1μg/ml)を加えたもので、３７℃、７２時間インキュベートした。各試料のアリコートをDarzynkiewicz,Z.によりMeth. Cell. Biol., 33:285 (1990)に記載のような細胞周期分析用のアクリジンオレンジ(Polysciences)、FITC結合抗IL-2レセプター抗体(Coulter)、FITC結合抗HLA-DR抗体(Becton-Dickinson)、またはイソタイプ一致無関連抗体(Becton-Dickinson)で染色した。各試料をFACScanフローサイトメーター(Becton-Dickinson)で分析した。
【０１２０】
結果
CD28は、超抗原で活性化される精製Ｔ細胞に対する共刺激活性を与える．高度に精製されたＴ細胞を、濃度変化を伴うSEA(0.1ng/mlから1.0μg/ml)またはSEB(0.01μg/mlから100μg/ml)のいずれかで培養した。CD28に対する刺激抗体を加え、複製培地を調製した。７２時間培養の最後の８時間で３H-TdRを適用し、取り込まれたチミジンを上述のように液体シンチレーション計測により測定した。各条件とも４回実施した。SEB単独による処理では、上記コントロール培養以上のチミジン取り込みは得られなかった。しかしながら、抗CD28抗体を加えると、一定のSEB投与量に対して有意な増殖を得た。抗CD28抗体単独による処理は、何ら効果を示さなかった。補助細胞の欠如は、PHAに対する増殖がないことにより立証された。SEAを用いた場合も同様の結果を得た。
【０１２１】
SEAまたはSEBによる刺激は細胞周期開始を導く
CD28の刺激単独ではＴ細胞周期開始は誘導されないことより、CD28がSEAまたはSEBのいずれかで処理されたＴ細胞に対して共刺激活性を与えるという観察は、これらのエンテロトキシンが精製Ｔ細胞における細胞周期開始を誘導し得ることを示唆した。このことを調べるために、SEB(1μg/ml)単独で、あるいはSEB(1μg/ml)および抗CD28モノクローナル抗体(1μg/ml)で、精製Ｔ細胞培養物を４８時間刺激し、細胞周期分析のためにアクリジンオレンジで染色した。Ｇ０／Ｇ１間期を決定するために、刺激されない細胞を同時に処理した。ＲＮＡ含有量が増加しＤＮＡ含有量が変化しないものはＧ１期の細胞であると考察した。ＲＮＡ、ＤＮＡ含有量がともに増加した細胞は、Ｓ期、Ｇ２期またはＭ期のものであると考察した。付随的に、アリコートをFITC結合抗IL-2レセプター抗体で染色した。エンテロトキシン単独による４８時間処理により、１０％を超えるＴ細胞がＧ０からＧ１へと進行したことが、ＤＮＡ含有量の増加なしのＲＮＡ染色の増加により決定された。同様に、エンテロトキシン単独では、７２時間の時点で、上記細胞の１５％にIL-2レセプター発現が誘導された。一方、抗CD28モノクローナル抗体が存在すると、細胞周期のＧ０段階に残っていた細胞のかなりの割合でＤＮＡ含有量が増加し、従って細胞周期のＳ期、Ｇ２期またはＭ期に移行した。これらのデータは、SEB単独の刺激はＴ細胞の活性化には十分であるが、細胞周期の完全な進行には不十分なシグナルしか送れないことを示す。CD28経路の同時刺激により第２のシグナルが細胞に送られ、上記細胞は、Ｓ期に進行し、そして増殖する。
【０１２２】
SEAおよび抗CD28により刺激されたＴ細胞の増殖はシクロスポリンＡに対して耐性である    CD28は最初のシグナルがPMAにより供給される場合には、シクロスポリンＡ(CsA)の効果に耐性であるシグナル伝達経路を利用し、細胞がＴ細胞レセプターを介して最初に活性化される場合には、CsAに対して部分的に耐性である経路を利用することが示される。上述のJune(1987)を参照のこと。エンテロトキシンによるＴ細胞活性化に包含される上記経路をさらに調べるために、SEA、ならびに、SEAおよび抗CD28抗体（上述のように３H-TdR取り込みを調べた）により活性化された培養物にシクロスポリンＡ(1μg/ml)を含ませた。SEB、SEA単独ではチミジン取り込みは誘導されなかったが、CD28に対する抗体を加えると有為な増殖を生じた。シクロスポリンＡ(1μg/ml)の存在下でさえ、培養物がSEAと抗CD28抗体の組み合わせで活性化される場合には、投与量に依存した増殖が起こる。PMAおよび抗CD28抗体により活性化されるコントロール培養物は、シクロスポリンＡに対して耐性であり、PMAおよびイオノマイシンによる活性化は、シクロスポリンＡに対して感受性であった。
【０１２３】
SEBおよび抗CD28による活性化はMHCクラスIIとは無関係である    以前の研究は、ブドウ球菌エンテロトキシンが抗原存在細胞表面(APCs)のＴＣＲおよびMHCクラスII分子を同時に結合し得ることを示した。Herrmann,TらのEur. J. Immunol., 19:2171 (1989);およびChintagumpala, M. M.らのJ. Immunol.,147:3876 (1991)を参照のこと。培養物中にAPCsが存在しなければ増殖は認められないという結果により、超抗原によるＴ細胞活性化は、MHCクラスIIの発現に依存すると解釈される。このことは、Fleischer,BらのJ. Exp. Med., 167:1697(1988); Carlsson, RらのJ. Immunol., 140:2484 (1988);およびHerman,AらのJ. Exp. Med., 172:709 (1990)で議論されている。高度に精製されたＴ細胞がエンテロトキシンと抗CD28抗体との同時刺激により増殖が誘導され得るという我々の知見は、Ｔ細胞の超抗原活性化にMHCクラスIIが全く必要とされ得ないことを示唆した。あるいは、活性化Ｔ細胞がMHCクラスIIを発現し得、従って、他のＴ細胞に対してトランスに、クラスII依存性超抗原を提示し得る。
【０１２４】
この可能性を調べるために、図１６に示すように、HLA-DRに対するブロッキング抗体（モノクローナル抗体L243）を、エンテロトキシンあるいはエンテロトキシンおよび抗CD28抗体で活性化されたＴ細胞およびPBMCsの培養物に含ませた。図中の各点は３回または４回の培養の平均±標準偏差で表される。SEB単独区では、顕著な増殖は認められない。先に示したように、抗CD28抗体を含むと、SEBがその投与量に依存してＴ細胞増殖を誘導する。抗クラスII抗体が投与量1.0または10μg/ml（10μg/mlのデータは示されない）で含まれる場合には、増殖は減少しない。一方、図１７に示すように、同じドナーから単離されエンテロトキシンで刺激されたPBMCsの増殖は、抗クラスII抗体により顕著に阻害された。さらに、２４時間および７２時間でのHLA-DRの発現を、CD28共刺激を伴うまたは伴わないSEA（0.1または1.0ng/ml）で活性化された精製Ｔ細胞により調べた。フローサイトメトリーで測定した結果、どちらの条件でもHLA-DRは発現しなかった。これにより、エンテロトキシンおよび抗CD28により誘導される、Ｔ細胞の増殖が、MHCクラスII分子による提示には依存しないことを示した。
【０１２５】
実施例ＸＩＩＩ
プログラムされた細胞死の防止
抗CD28mAbが、成熟Ｔ細胞における細胞死を防止し得るか否かを試験するために一連の実験を行った。一般に、Jurkat白血病細胞が、末梢血Ｔ細胞にみられる生理的効果に類似の効果を有する成熟Ｔ細胞の例として使用される。例えば、Jurkat細胞は、抗CD3mAbおよび抗CD28mAbで、IL-2の分泌が誘導され得、そして該Jurkat細胞は、HIV-1により感染され殺され得る。Jurkat系JHMI-2.2をA.Weiss(USCF)から得た；ムスカリンＭ１レセプターサブタイプをトランスフェクトし、これらの細胞内で安定して発現させる。0.3x10６/ウェルのJHMI-2.2細胞を、完全培地中の培養ウェル、あるいは、10μg/mlの9.3  mAbの存在または非存在下で、プラスチックに吸着された抗CD3mAb  G19-4を含有するウェルまたは9.3  mAb単独を含むウェルに加えた。培養１〜３日後に細胞死を記録し、ウェルの目視検査により、０（死滅せず）、１＋（20から70％の細胞が死滅）、そして２＋（70から100％の細胞が死滅）にグレード化し、トリパンブルー浸透性により確認した。表１０に示すように、抗CD3処理したウェル中の細胞が死滅したが、培地中の細胞は成長し続け、生存し続けた。対照的に、抗CD3と抗CD28とを含有するウェル中の細胞は増殖し続けた。抗CD3に誘導された細胞死から細胞を救う抗CD28の能力は特異的である。なぜなら、カルバコール（30μM）（Ｔ細胞レセプター／CD3複合体と異なるメカニズムを介する細胞中のシグナル伝達を活性化すると思われるＭ１レセプターの特異的アゴニスト）もまたJurkat細胞中の細胞死を誘導したからである。抗CD28はカルバコールに誘導された細胞死を阻害しなかった。
【０１２６】
【表１０】
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実施例ＸＩＶ
骨髄の研究．
可溶性または固定化抗CD3（OKT3）によるＴ細胞活性化後のＴ細胞増殖    Ｔ細胞増殖を活性化し誘導する、可溶性または固定化OKT3を用いて、一連のタイトレーション試験を行った。固定化OKT3（２μg/mlで37℃、１時間プレコートしたプレート）および可溶性OKT3（10ng/ml）はともに、Ｅロゼット（Ｅ＋）精製Ｔ細胞またはPBLからのＴ細胞増殖性の応答を誘導した。PBLまたは精製Ｔ細胞を、固定化OKT3上で、または培養開始時に10ng/mlの可溶性OKT3を加えて、１時間から７日間インキュベートして活性化した。一連の実験において、固定化OKT3によるＴ細胞の活性化後の増殖は、可溶性OKT3による活性化後のPBLによる増殖性の応答に匹敵した。
【０１２７】
抗CD3および抗CD28に引き起こされたPBLにより介在される細胞毒性    低投与量のIL-2または抗CD28の存在下での培養７日後の抗CD3活性化PBLの細胞毒性を調べた。この一連の実験において、先に報告したインビトロでのIL-2によるＴ細胞処理の免疫増大効果に代わる、リンホカインの生産を増加させるCD28の能力を調べている。Press,H.F.らのJ. Clin. Immunol. 1;51-83 (1981) で議論されているように、１溶解単位は、1x10６個のエフェクター細胞あたり5x10３個の標的細胞の20％溶解に相等する。DaudiおよびK562を含む種々の標的を試験した。表１１に代表的な実験における細胞毒性の結果を示す。
【０１２８】
【表１１】
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Ｔ細胞に匹敵するPBL中のOKT3誘導細胞毒性    異なる被検体５例において、OKT3による活性化から８日後のDaudi、K562およびBSB細胞を殺す能力について、PBLをＴ細胞（Ｅ＋）と比較した。これらの実験は、５％ヒト血清（HS）を捕給したX-Vivo  10中で行った。PBLを使用した５例の正常な被検体のDaudi、K562およびBSBに対する平均細胞毒性は、それぞれ、15.0、7.4、そして9.2LUであった。同じ５例の被検体のＴ細胞における、Daudi、K562およびBSBに対する平均細胞毒性は、それぞれ、14.3、7.7、そして9.3LUであった。
【０１２９】
細胞培養中のインビトロ時間の関数としての細胞毒性    最適な細胞毒性について調べるために、Ｔ細胞を抗CD3およびIL-2と共に31日間培養し、DaudiおよびK562に対する細胞毒性を１週間ごとに調べた。この期間中、対数的な細胞増殖が維持され、細胞数が300倍に増加した。細胞毒性は、いかなる培養期間でも有力な関数であった（０、８、15、22、および29日の培養時点で、＜0.1、24、3.5、0.5、および1.0LU）。Daudiが標的の場合にも、類似の結果が得られた（０、８、15、22、および29日の培養時点で、＜0.01、23、5、2、および5LU）。
【０１３０】
可溶性または固定化OKT3により誘導される細胞毒性    ７種の実験において、活性化後のＴ細胞に介在された細胞毒性を、可溶性または固定化OKT3と比較した。いずれの方法とも、DaudiおよびK562に対する細胞毒性を誘導した。可溶性OKT3活性化Ｔ細胞は、Daudiに対する27LU(SD-18)の平均細胞毒性、およびK562に対する21LU(SD-16)の平均細胞毒性に介在した。固定化OKT3活性化Ｔ細胞は、Daudiに対する22LU(SD-16)の平均細胞毒性、およびK562に対する12LU(SD-8)の平均細胞毒性に介在した。これらの実験は、10％ウシ胎児血清（FBS）を補給したRPMI  1640中のＥ＋細胞で実施した。可溶性OKT3(10ng/ml)または固定化OKT3(2μg/ml)による誘発後、７から８日目に、細胞毒性を評価した。
【０１３１】
IL-2濃度の影響．OKT3活性化の最適時間を確立した後、IL-2の投与量をタイトレートした。いくつかの実験で、IL-2の投与量を6000IU/mlから60IU/mlに徐々に減少させた。IL-2がこの範囲でタイトレートされた場合には、３日間の培養後タイトレートされたチミジン取り込みにより調べた増殖は一定であった。対照的に、細胞毒性はIL-2投与量により変化し、IL-2投与量が低い場合に最大となった（rIL-2の投与量が30、150、300、600、および6000IU/mlの培養において、Daudi標的に係る溶解単位はそれぞれ28、9、8.5、9、および4.8LUであった）。このデータは、抗CD3で引き起こされたＴ細胞の増殖および細胞毒性の応答がともに、IL-2の投与量が低い場合に得られ、そして維持され得ることを示す。
【０１３２】
増殖および細胞毒性における血清および培地の影響    成長を持続させ、そして細胞毒性を維持する能力について、HS、FBS，および血清を有さない培地を比較した。このデータは、増殖ならびにDaudi、K562およびBSBに対する細胞毒性が、血清濃度が２％を下回ると急激に減少することを示す。X-Vivo  10とRPMI  1640との間に有意差はなかった。
【０１３３】
抗CD3および抗CD28処理後のCTC源としての骨髄単核細胞（BMMNC）    BMMNCが悪性腫瘍患者の治療のためのＴ細胞源として機能するか否かを調べるために、OKT3およびIL-2または抗CD28による刺激後、BMMNCをX-Vivo  10培地中で培養した。BMMNC群は、最初にCD3＋細胞をわずか25％しか含有していなかったが、増殖性および細胞毒性の応答は、培養２週間後に最良となった。DaudiおよびK562に対して調べた場合には、Ｔ細胞はCD3およびIL-2刺激後40倍を超えて増殖し、８〜15日目の培養物の細胞毒性は5LUと12LUとの間であった。これらのデータは、骨髄移植前の患者からの自己組織の骨髄採取物から得られたBMMNCが、細胞毒性Ｔ細胞の好適な供給源となることを示す。表１２は、健常者および患者の骨髄の両方がCD3およびIL-2処理後の満足し得る細胞毒性源を供給することを示す。健常者の骨髄または自己組織の骨髄を用いた４種の実験において、９から19日の培養後、中央値が89倍の細胞増殖（18から173倍の範囲）を得た。OKT3で刺激されたBMMNCに介在されたDaudiおよびK562に対する平均細胞毒性は、それぞれ、5.5LU(範囲2-11)および4.3LU(範囲2-8)であった。すべての培養物を、OKT3による活性化後、14日目に調べ、50IU/ml  IL-2の存在下で増殖した。10ng/mlの可溶性OKT3(S)または2μg/mlでコートされた固定化OKT3(I)のいずれかを表１２に示すように加えた。
【０１３４】
【表１２】
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エフェクターＴ細胞源としてのBMMNCの抗CD3および抗CD28による処理    ３人の患者の増殖および細胞毒性の応答を調べた。上記患者は長い化学療法を受けていたが、彼らのPBLまたはBMMNCは、抗CD3および抗CD28による処理後、強い増殖性および細胞毒性の応答を維持した。PBLまたはBMMNC(1.5x10５)を、固定化OKT3  mAbまたは50IU/mlのrIL-2または0.5μg/mlの9.3mAb存在下で、５％ヒト血清を加えたRPMI中で培養した。増殖を培養３日目に、細胞毒性を培養７日目に評価した。表１３にBMMNCに関しての結果を要約する。
【０１３５】
【表１３】
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OKT3活性化Ｔ細胞（CTC）は造血前駆体の成長を阻害しない
造血前駆体アッセイにおいて、OKT3活性化Ｔ細胞（CTC）に混在したBMMNCが、CFU-GMの発育を阻害するか否かを調べるため、成長１週間後にPBLから得たCTCを新鮮BMMNCと混合し、この混合物を培養してCFU-GMアッセイを行った。自己組織のCTCを様々な比率でBMMNCと混合し、37℃で１時間インキュベートし、次いで標準CFU-GMアッセイを行った。CTCはコロニー形成に有害な影響を示さず、広い範囲のCTC:BMMNC比（1:25から1:5まで）に対して、CFU-GMコロニー数がコントロールの75％以内であった。CTC:BMMNCが１：１の比率においてさえ、CFU-GMコロニー数の90％を超えるもの（浄化された自己組織骨髄移植片中のCFU-GM阻害の許容％）が阻害されなかった。これらのデータは、CTCは自己組織骨髄移植片の植え付きを阻害したり遅らせたりしないことを示唆する。
【０１３６】
BMT前の患者からのPBLまたはBMMNCの増殖および細胞毒性機能    AMLまたはリンパ腫に対するきびしい治療を予め施された患者から得たPBLまたはBMMNCが、抗CD3で活性化され得、そして低いIL-2投与量で成長し得るか否かを調べるため、数人の患者からBMT前に得られたPBLまたはBMMNCを試験した。試験された患者のPBLおよびBMMNCは、健康な同種異系骨髄ドナーから得られた正常なPBLまたはBMMNCに匹敵し得るような様式で、増殖し、そして細胞毒性を示した。化学療法または放射線治療によりきびしい治療を施された患者が、抗CD3活性に対して低い計数または低い応答を有することは知られている。従って、細胞損失または増殖不活性を補うプロトコルにおいて、開始する細胞の数を増加させた。抗CD3で活性化されたＴ細胞のヘルパー活性を高めまたは細胞毒性を高める共刺激因子として9.3を使用すると、活性化Ｔ細胞のインビトロでの増殖が向上し得る。この実施例（実施例XIV）で示されたデータは、mAb  9.3が移植後のリンパ球の増殖欠如を矯正し得、免疫再形成を促進し、さらに、ABMT受容者の悪性腫瘍細胞に対する細胞毒性を増強するOKT3/9.3共刺激アプローチ使用についての理論的根拠をサポートし得る。Blood78:1286-1291 (1991)のKatsanis, E.らによる最近の研究は、BMT受容者からのＴ細胞がOKT3およびIL-2による共刺激により増殖し得ることを示す。
【０１３７】
短期間および長期間のBMT受容者からのPBL中のIL-2レセプター(IL-2R)、IL-2、およびIL-3についてのメッセンジャーＲＮＡレベル    初期の研究（Lum,L.G.らのBlood Suppl. (要約) (1991)を参照のこと）は、BMT受容者からのＴ細胞がIL-2を分泌せず、またはIL-2Rを発現しないことを示唆した。このような欠損は、リンホカインまたはリンホカインレセプターについてのｍＲＮＡ合成不全に起因し得る。BMT受容者からのＴ細胞がIL-2、IL-2R、およびIL-3についてのｍＲＮＡを検出可能なレベルで発現させないか否かを測定した。11例の同種異系の（３例の短期間、STで表す、８例の長期間、LTで表す）および４例の自己組織の（２例のSTおよび２例のLT）受容者からのPBLを、刺激なし(-)あるいはファイトヘマグルチニン（PHA）およびホルボールエステル（TPA）刺激(+)後の、IL-2、IL-2R、およびIL-3のｍＲＮＡレベルを調べた。全ＲＮＡから逆転写酵素（RTアーゼ）により合成されたｃＤＮＡを、特異的プライマーを用いたPCRで増幅し、そのPCR生成物をエチジウムブロマイドを含有する1.5％アガロースゲルで泳動した。表１４は、PBLが検出可能なレベルのIL-2、IL-2R、およびIL-3のｍＲＮＡを有する受容者のフラクションおよびパーセントを示す。
【０１３８】
【表１４】
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大部分のSTおよびLTの自己由来ならびに同種異系のBMT受容者からのPBLは、PHA+TPAによる刺激後、IL-2、IL-2R、およびIL-3について、あるレベルのｍＲＮＡを発現した。ST受容者の場合には、試験した２例のABMT受容者のうち２例とも、そして試験した３例の同種異系受容者のうち３例とも、IL-2RおよびIL-3についてのｍＲＮＡレベルを発現させるPBLを有し、試験した２例の同種異系受容者のうち２例とも、IL-2についてｍＲＮＡを発現した。ほとんどの場合において、IL-2、IL-2R、およびIL-3についての不完全なｍＲＮＡ合成は、IL-2分泌およびIL-2Rの発現欠損の原因になり得ない。転写後の事象が、BMT受容者からのＴ細胞による不完全なリンホカインの分泌において、より重要な役割を果たし得る。
【０１３９】
CTCはIgの合成を補助し、リンホカインおよびパーホリン(perforin)についてのｍＲＮＡを発現する．Ueda,M.らによりJ. Cell. Biochem. (要約) (1992年に提出)で議論されたように、ELISA-プラーク(PFC)アッセイにより計測されるようなPW刺激後に、正常なＴ細胞あるいはOKT3で活性化されたＴ細胞を正常なＢ細胞に加えることにより、ヘルパー活性を評価した。25、50、または75x10３個の正常なＴ細胞を加えた場合、培養されたＢ細胞100万個に対するPFC数は、それぞれ3200、4100、8800個であった。同数のCTCを加えた場合には、PFC数はそれぞれ220、2100、および2600個であった。従って、CTCは実質的なヘルパー活性を示す。さらに、Ig合成についてのサプレッサーアッセイにおいて、CTCは正常な自己組織由来のまたは同種異系のＴ細胞ならびにＢ細胞を抑制しなかった。ヘルパー活性は放射線抵抗性であった。RTアーゼ-PCR法を用いて、OKT3活性化後６時間から３日間で、IL-2、IL-3、IL-6、およびパーホリンについてのメッセンジャーＲＮＡを検出した。要約すると、CTCヘルプＢ細胞はIgを産生し、正常なＴ細胞およびＢ細胞によるIg合成を抑制しなかった。従って、BMT後の適用され得るCTCの転移は、GVL効果を仲介し得るだけでなく、免疫再生を促進し得る。
【０１４０】
BMT受容者のPBL中の抗CD3誘導増殖応答の欠如は、抗CD28を加えることにより回復した．抗CD3および抗CD3/抗CD28に刺激されたBMT受容者からのＴ細胞の増殖応答における、インビトロデータは、mAb  9.3をOKT3と組み合わせて用いると、報告されたようなインビボの臨床的効果を有し得るという前提をサポートする。Joshi,I.らのBlood  Suppl. (要約) (1991)を参照のこと。BMT受容者からのＴ細胞は、マイトジェンまたは抗CD3刺激後の増殖を欠如する。以前の研究は、正常なＴ細胞の抗CD3(G19-4)および9.3による共刺激が、リンホカインｍＲＮＡの安定化による抗CD3に誘導された増殖を増強することを示す。自己組織のおよび同種異系のBMT受容者（BMT後53-605日）のPBL中の不完全な抗CD3誘導増殖応答を矯正する、抗CD3(G19-4またはOKT3)+9.3の能力を評価するための実験を行った。受容者からのPBLまたはコントロールを、G19-4、G19-4+9.3、OKT3、またはOKT3+9.3で３日間刺激した。9.3を100ng/mlの最終濃度で加えた。ABMT受容者に対して15回の試験を行い、同種異系の受容者に対して16回の試験を行った。表１５は、抗CD3刺激PBLに9.3を加えた後に、受容者のPBLが増殖応答を増大させ（↑）、減少させ（↓）、または変化しなかった（−）場合の受容者数を示す。括弧は、9.3を加えた後に、その増殖応答を増大した受容者のパーセントを示す。
【０１４１】
【表１５】
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G19-4+9.3またはOKT3+9.3の共刺激は、ABMT受容者において、G19-4またはOKT3単独（ｐ＜0.05、それぞれの列の合計）で誘導された増殖応答を顕著に増加させた。要約すると、BMT受容者における抗CD3誘導Ｔ細胞増殖の欠如は、9.3との共刺激により回復した。これらの発見は、減損したＴ細胞増殖で明示される免疫欠陥を有する患者に対する治療上の意味を有する。実際、HIV感染患者からのＴ細胞の増殖欠如が抗CD28処理により回復するという類似の結果が得られた。HIVにおける増殖の欠如に関してはLane,H.C.らのJ. Engl. J. Med., 313:85 (1985)を参照のこと。
【０１４２】
抗CD3  OKT3および抗CD28  9.3を用いた共刺激は、ABMT受容者からのPBL中でIL-2の測定可能なmRNAレベルを高めた。OKT3で刺激し、OKT3/9.3で共刺激した後のIL-2のmRNAレベルについて、RTase-PCRを用いて、短期ABMT受容者からのPBLを研究した。RTaseにより全RNAから合成されたcDNAを、IL-2に特異的なプライマーを用いるPCRにより増幅し、そしてこのPCR生成物を臭化エチジウムを含有する1.5%のアガロースゲル上で展開した。前段落に記した発見と一致して、ABMT受容者からの活性化T細胞は、OKT3による単独の刺激後も、IL-2についてのmRNAの測定可能なレベルを有しなかったのに対して、OKT3/9.3で刺激した同じT細胞は、臭化エチジウムで染色されたアガロースゲル上で測定された458bpのIL-2の独自のバンドを有していた。これは、ABMT受容者からのT細胞中でのIL-2についてmRNA発現の明らかな欠如をいかにOKT3/9.3が修復し得るかの例示である。
【０１４３】
抗CD3を用いた活性化後の負に選択されたCD4＋細胞に対する抗CD28  9.3を用いた刺激は、IL-2非依存性増殖応答を誘導する。Thompson,C.B.らのPNAS(USA)86:1333〜1337(1989)に記載されているような一連の負に選択する工程により、CD4＋細胞を精製した。PBLを、非CD28＋細胞に対するmAbsの混合物と共にインキュベートし、洗浄し、そしてヤギ抗マウス抗体で被覆された免疫磁気ビーズと共にインキュベートした。このCD28＋が富んだ細胞画分を、抗CD8処理によってCD8＋細胞を除去することにより、そしてこのCD8＋細胞を免疫磁気ビーズに結合させることにより、さらに精製した。
【０１４４】
健常ドナーからの残存するCD28＋、CD4＋T細胞を、これらの細胞をOKT3が吸着したプラスチックを含有する培養皿に加えることにより、培養した。48時間後、これらの細胞を取り出し、rIL-2(200IU/ml)または抗CD28mAb(100ng/ml)のいずれかを含有するフラスコ中で培養した。これらの細胞に、0.5x10６/mlの細胞密度を維持するのに要求される新鮮培地を加え、そしておよそ週に１回の間隔でOKT3が吸着したプラスチック上で24時間培養することにより、再刺激した。これら細胞は、細胞数が4〜5log１０範囲の対数成長期で維持した。図18に示されるように、抗CD3および抗CD28を用いて増殖させた細胞は、通常、抗CD3およびIL-2の最適の量で成長した細胞より、10〜30倍も増加した。FBSを含有しない合成培地(X-Vivo10)を使用した場合、抗CD3および抗CD28で処理された細胞はまた、抗CD3およびIL-2で処理された細胞より10倍にも増加した。CD4が非常に富んだ細胞は、レクチンファイトヘマグルチニン(PHA)の最適量存在下では増殖しなかった。それゆえ、抗CD28を用いたCD4細胞のインビトロでの増加は、外因性成長因子の添加に依存しない(これらの細胞にIL-2または他の成長因子を加えない)ので、前記の方法に関して、利点がある。さらに、このシステムは、副細胞の存在が必要とされないため、副細胞が制限され、または不足している臨床現場にとって有利である。
【０１４５】
抗CD3活性化T細胞の発現型。IL-2存在下で6〜12日間成長したCTC細胞群は、多くのCD3＋細胞を含有した(84％より多い、中間値88％)。CD56＋細胞（NK細胞のマーカー）の割合は1.3％より少なかった。OKT3によるE＋細胞の誘発は、優先的にCD3＋細胞を選択する。CD4＋細胞は、18％またはそれより少なく、そしてCD8＋細胞は66％より多かった。溶解活性は、この培養物中のCD56＋細胞の割合とは関連しなかった。
【０１４６】
抗CD28およびIL-2が介在する細胞成長後のT細胞の免疫発現型は異なっている。増加したT細胞の部分集合を調べるため、抗CD3およびIL-2、または、抗CD3および抗CD28のいずれかを用いて、PBLを16日間、増殖させた。CD4およびCD8の割合は、IL-2存在下で成長した細胞では23.8％および84.5％であり、そしてCD28存在下で成長した細胞では56.0％および52.6％であった。これらの結果は、IL-2存在下で成長した細胞ではCD8＋細胞が優勢であるという良く確立された所見（例えば、前記段落を参照；Cantrell,D.A.らのJ. Exp. Med. 158:1895(1983)も参照）に比べ、CD28による増殖は、CD4＋細胞に有利であることを示唆した。この可能性をさらに調べるため、本実施例のいずれかに記載されているように、モノクローナル抗体および磁気免疫ビーズを用いた負の選択を用いて、CD4細胞を98％純度まで濃縮した。これらの細胞を、抗CD3、およびIL-2または抗CD28のいずれかを用いて１カ月間培養して増殖させた。培養の初めの26日間で、これらの細胞は同等に増加したが、表16に見られるように、細胞の発現型は培養時間の増加に伴って、徐々に異なってきた。
【０１４７】
【表１６】
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インビトロでTILを増加させるための抗CD28の使用  種々の新生物に対して、後期に適用される免疫療法における、腫瘍浸潤リンパ球(TIL細胞)を増加させるためのIL-2および不活化腫瘍細胞の使用が、有望であることが示されている（例えば、Rosenberg,S.A.らのNEJM  323:570-578(1990)を参照）。TIL細胞を、腎細胞癌患者の腎切除標本から分離した。この細胞を、腫瘍細胞、およびIL-2、または、CD28およびIL-2のいずれかと共に培養し、そして第14日目から週に一回の間隔でmAb  OKT3を加えた。表17は、抗CD28が、幾例かの患者で、上記細胞を増殖させるのに優れた方法（細胞の収率が20倍にもなる）であることを示している。免疫発現型の分析もまた、CD4  T細胞が「TIL」培養物中で増加することを表している。さらに、これらの細胞は、DAUDI標的に対して強力な細胞毒性、すなわち、エフェクター：標的が、40:1、20:1、10:1および5:1比率時に、82.8％、69.7％、78.8％および101.5％の特異的細胞溶解を示した。
【０１４８】
【表１７】
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抗CD3および抗CD28による共刺激は、CD4＋細胞中のIL-2およびTNF-αのmRNAの発現を高める。インビトロで抗CD28により増殖したCD4細胞がリンホカインの効果的な供給源で有り得るか否かを調べるため、休止CD4細胞を、抗CD3  mAbで48時間刺激し、続いて50IU/mlの組換え型IL-2を添加し、抗CD3および抗CD28で共刺激したCD4T細胞と比較した。全RNAを、各組み合わせから採集した。全体で10μgのRNAを各レーンにロードした。均一なローディングを示すために、クラスIプローブ（HLA  B7）を用いた。ブロットを、IL-2、TNF-αおよびHLAに特異的な３２P標識プローブで連続的にハイブリダイズした。第１日および第８日目に、上記培養物を、IL-2または抗CD28  mAb  9.3(0.1μg/ml)の存在下で抗CD3  mAbを用いて再刺激した。各レーンの同等のローディングを示すために、このブロットは、はぎとられ、そしてHLAクラスI  mRNAの定常領域についてのプローブを用いてリハイブリダイズした。図19のノーザンブロットに例示されるように、抗CD3および抗CD28で共刺激した後のIL-2およびTNF-αのmRNAは明らかに増加し、そしてIL-2およびTNF-αのmRNAは、IL-2で増殖された細胞のそれを10〜50倍も上回った。同様の結果は、抗CD3およびIL-2または抗CD28で週に１回再刺激して、１カ月間培養した培養物を調べた場合にも、得られた。
【０１４９】
抗CD3および抗CD28で長期刺激したCD4＋細胞培養物の上清は、IL-2、GM-CSFおよびTNF-αのかなりの量を含有する。200IU/mlのIL-2またはIL-2が存在しない抗CD3および抗CD28の組み合わせの存在下で、抗CD3刺激を行った後、その上清について、CTLL-2細胞系を用いたIL-2含有量、ELISAによるGM-CSF含有量、そしてELISAによるTNF-α含有量を測定した。このCD4＋細胞を、抗CD3およびIL-2、または、抗CD3および抗CD28を用いて、およそ週に１回の間隔で各々再刺激した。CD4＋細胞の抗CD3および抗CD28培養物は、外因性IL-2存在下で成長した抗CD3活性化細胞から得られた上清中に見られるIL-2とほぼ同じ量のIL-2が生成された。抗CD3および抗CD28で刺激したCD4＋細胞によって産生されたGM-CSFの量もまた、かなり多かった。上清の測定時期に依存して、TNF-αのレベルが変動したが、TNF-αのmRNAを誘導するには、抗CD3および抗CD28を用いた共刺激は、抗CD3およびIL-2を用いた刺激より優れていた。これらのデータは、抗CD28と抗CD3との共刺激は、IL-2のいくつかの機能を代用するだけでなく、CD4＋細胞の他の合成機能をも増強し得ることを示す。
【０１５０】
実施例XV
CD28およびCTLA-4発現の研究
CD28＋Ｔ細胞に限定されたCTLA-4発現。部位特異的プライマーおよびヒトゲノムDNAのDNA  PCRを利用することにより、ヒトCTLA-4のエキソンIIに対応する348bpフラグメントを作製し、ゲルで精製し、そして３２P-標識プローブとして使用した。磁気ビーズ免疫吸着を用いた負の選択により、精製されたヒトT細胞を、CD28＋フラクションおよびCD28−フラクションに分離した。CD28−T細胞を、培地中で、あるいはPMA＋イオノマイシンまたはPMA＋抗CD28  mAb(mAb  9.3)を用いて12時間刺激し、測定した。CD28＋細胞を、上記後者の２物質を用いて12時間刺激した。RNAを、グアニジンイソチオシアネートにより抽出し、そして塩化セシウム勾配法によって精製した。等量の（臭化エチジウム染色により決定された）RNAを、ホルムアルデヒド-アガロースゲルにかけて分離し、そして同等のRNAローディングを示すように、ニトロセルロースに移した。続いて、このブロットを、上記作製したCTLA-4プローブを用いて調べた。CTLA-4は、PMAまたはPMA＋mAb9.3刺激後のCD28＋細胞で発現されたが、休止細胞または刺激されたCD28−細胞では発現されなかった。同じブロットをHLAプローブでハイブリダイズし、RNAのローディングが同等であることを確認した。
【０１５１】
CD28経路活性化を引き起こす条件下で誘導されたCTLA-4発現。精製された休止CD28＋細胞を、PMA単独で、イオノマイシン単独で、およびPMA＋イオノマイシンで、１時間、６時間、12時間および24時間刺激した。RNAを抽出し、そしてCD28およびCTLA-4プローブに対するハイブリダイゼーションにより分析した。ノーザンブロット分析では、CTLA-4発現が、PMAまたはPMA＋イオノマイシン（CD28経路の活性化に対して共刺激的な条件である）により誘導されたことが示された。CD28経路活性化に対して共刺激的でないイオノマイシン単独では、CTLA-4発現は誘導されなかった。対照的に、CD28発現は、イオノマイシンまたはPMAに対して一定的であり、また、PMAおよびイオノマイシンの刺激に対しては抑制される様であった。また、CTLA-4発現の誘導は、刺激１時間後すぐに生じ、これは、CD28経路活性化に伴うIL-2発現での６〜12時間に匹敵することも注意されるべきである。CTLA-4発現が、CD28経路活性化（すなわち、増強されたIL-2発現）により生じた生理現象に先行するので、CTLA-4発現は以後の現象の発生に関して、役割を果たしている様である。
【０１５２】
精製されたヒトT細胞を、処理しないか、あるいはPMA＋PHA、第二抗体（ヤギ抗マウスIg）で架橋された抗CD28  mAb、または同様の方法で架橋された抗CD5  mAbを用いて１時間、４時間または23時間刺激した。ノーザンブロット分析では、CD28レセプター（PMAおよびイオノマイシンとは異なったメカニズムでCD28経路を活性化させる）の架橋がCTLA-4発現を誘導することが示された。
【０１５３】
CD28経路活性化に対して、わずかにしか、または全く応答しないCD28＋細胞系は、CTLA-4を発現しない。Kozbor,D.らのJ. Immunol.,138:4128-4132(1987)およびLedbetter, J. A.らのPNAS(USA),84:1384-1388(1987)において議論されるように、CD28＋ではあるが、CD28共刺激に対し反応性が乏しい（T細胞系Jurkat  CJ）、または反応性がまったくない（骨髄腫細胞系RPMI-8226）２つの細胞系を、PMA＋イオノマイシン＋mAb  9.3で刺激し、続いて、CD28およびCTLA-4発現についてノーザンブロット法により分析した。T細胞白血病細胞系Jurkat  CJおよび骨髄腫細胞系RPMI8226に対するノーザンブロット分析では、これらの細胞系は、CD28を発現するにもかかわらず、CTLA-4を発現しないことが示された。
【０１５４】
T細胞を、ファイトヘマグルチニン(PHA)、ホルボールミリステートアセテート(PMA)およびイオノマイシン(IONO)または抗CD28モノクローナル抗体（α-CD28）を包含する種々のマイトジェンの組み合わせと共にインキュベートし、そのCTLA-4  mRNA発現を誘導する能力を調べた。図20に示されるように、上記マイトジェン、PHAおよびPMAの組み合わせは、正常ヒトT細胞でのCTLA-4発現を速やかに誘導するが、全ての調べた組み合わせは、Jurkat  T細胞系でのCD28イソ型CTLA-4の発現を誘導しなかった。両方の細胞型とも、全ての試験条件下で、充分なレベルのCD28  mRNAを発現する。
【０１５５】
休止T細胞を、抗CD28モノクローナル抗体で共刺激し、正常ヒト細胞での活性化を調べた。図21に示されるように、濃度が１μg/mlである、平板に付着している抗CD3（α-CD3）モノクローナル抗体は、刺激１時間後で初めて観察される、低いレベルにすぎないCTLA-4  mRNA発現を誘導した。これに対し、抗CD28(α-CD28)モノクローナル抗体(１μg/ml)を溶かした抗CD3モノクローナル抗体(１μg/ml）を用いた共刺激は、CTLA-4mRNA発現の誘導を著しく増加させた。
【０１５６】
上記開示には、修飾、変更または置換の許容される範囲を包含することが意図されることは理解されるべきである。従って、添付のクレームは広く、そして本発明の精神および範囲に一致して解釈されるべきである。
【０１５７】
本明細書中で引用された全ての刊行物および出願書類は、本明細書に参考として援用されている。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】図１は、CD28で刺激されたＴ細胞によるチミジンの取り込みの増大がないことを示す棒グラフである。
【図２】図２は、抗CD3で刺激されたＴ細胞をCD28刺激することによるウリジン取り込みの増加を示す棒グラフである。
【図３】図３は、CD28刺激により誘導されたＴ細胞増殖のシクロスポリン耐性の増大を示すグラフである。
【図４】図４は、抗CD28により誘導された、PMA-または抗CD3活性化Ｔ細胞リンホカイン発現に対するシクロスポリンの効果のノーザンブロット分析である。
【図５】図５は、CD28刺激によるサルにおけるＴ細胞のインビボ活性化を示すグラフである。
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、抗CD28  mAbの注入後のリンパ球レベルの変化を表すグラフである。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、種々の条件下での、PBLによるTNFおよびIL-6のインビトロ産生を表すグラフである。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、抗CD28  mAbの単回投与および多回投与後のIL-1βの血清濃度を表すグラフである。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、抗CD28  mAbの単回投与および多回投与後のIL-６の血清濃度を表すグラフである。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、抗CD28  mAbの、単回ボーラス注射または多回注射で処置されたサルから単離されたインビトロ刺激されたPBLのIL-6産生を表すグラフである。
【図１１】図１１は、一方向(one-way)混合されたリンパ球培養物中の３Ｈチミジン取り込みに対するCTLA４Igの阻害効果を表すグラフである。
【図１２】図１２Ａおよび１２Ｂは、組織病理を示す心臓同種移植片(allograft)の写真である。
【図１３】図１３は、CTLA４IgG処置後の心臓同種移植片の生存のKaplan-Meier  life分析である。
【図１４】図１４は、協同的免疫抑制剤としてのCTLA４Igおよびシクロスポリンを示す棒グラフである。
【図１５】図１５は、CD28で刺激されたIL-2産生に対するハルビマイシン(ハルビマイシン A)の効果を示す棒グラフである。
【図１６】図１６は、HLA-DRに対して、ブロック性mAbの存在下および非存在下で、精製された休止Ｔ細胞に関するSEBおよび抗CD28による活性化を示す棒グラフである。
【図１７】図１７は、末梢血単核細胞中で、HLA-DRに対して、SEB単独、または、SEBおよびブロック性mAbによる活性化を示す棒グラフである。
【図１８】図１８は、抗CD3および抗CD28で増殖したCD4＋末梢血Ｔ細胞のインビトロでの長期間の成長を示すグラフである。
【図１９】図１９は、抗CD3および抗CD28で共刺激した後、IL-2およびTNF-αに対する、mRNAの増大のノーザンブロット分析である。
【図２０】図２０は、CTLA-4  mRNA発現を誘導するマイトジェンの能力のノーザンブロット分析である。
【図２１】図２１は、抗CD3  mAbおよび可溶性抗CD28  mAbで共刺激することによるCTLA-4  mRNA発現の誘導のノーザンブロット分析である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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