(57)【要約】【課題】種々の膜結合型Ｐ４５０、とりわけ高等生物の膜結合型Ｐ４５０を大腸菌等の発現系において大量に発現させる手段を提供する。【解決手段】膜結合型Ｐ４５０発現用カセットプラスミドであって、該プラスミドにおいて、膜結合型Ｐ４５０の膜結合領域をコードするヌクレオチド配列と、膜結合型Ｐ４５０の膜結合領域以降をコードするヌクレオチド配列とが連結されおり、膜結合型Ｐ４５０の膜結合領域をコードするヌクレオチド配列の３’末端コドンが、膜結合領域のＣ末端部分に存在する保存されたプロリンをコードするものであり、膜結合型Ｐ４５０の膜結合領域以降をコードするヌクレオチド配列の５’末端コドンが、該保存されたプロリンに隣接するグリシンをコードするものであり、該連結部分がＳｍａＩ認識部位を形成しているものである、カセットプラスミド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜結合型Ｐ４５０発現用カセットプラスミドであって、膜結合型Ｐ４５０の膜結合領域をコードするヌクレオチド配列を含み、該膜結合型Ｐ４５０の膜結合領域の３’末端が高度に保存されたプロリン−グリシンをコードするためのＳｍａＩ認識部位であり、該膜結合型Ｐ４５０の膜結合領域の５’末端にプロモーターを有し、該膜結合型Ｐ４５０の膜結合領域の下流にターミネーターを有するカセットプラスミド。
【請求項２】
大腸菌での発現用の請求項１記載のカセットプラスミド。
【請求項３】
該結合型Ｐ４５０の膜結合領域をコードするヌクレオチド配列の開始メチオニンのコドンの次のコドンがアラニンのコドンである、請求項２記載のカセットプラスミド。
【請求項４】
プロモーターがｔａｃプロモーター、Ｔ７ｌａｃプロモーター、ｃｓｐＡプロモーター、ｔａｌプロモーターからなる群より選択されるものである、請求項２記載のカセットプラスミド。
【請求項５】
マルチクローニング部位を有する請求項１〜４のいずれか１項記載のカセットプラスミド。
【請求項６】
膜結合型Ｐ４５０が高等生物由来のものである請求項１〜５のいずれか１項記載のカセットプラスミド。
【請求項７】
さらにＰ４５０レダクターゼをコードするヌクレオチド配列を含み、該Ｐ４５０レダクターゼをコードするヌクレオチド配列の５’末端にプロモーターを有し、該Ｐ４５０レダクターゼをコードするヌクレオチド配列の３’末端にターミネーターを有するものである、請求項１〜６のいずれか１項記載のカセットプラスミド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜結合型Ｐ４５０を発現させるためのカセットプラスミドに関する。本発明は特に、高等生物の膜結合型Ｐ４５０酵素を大腸菌にて大量に発現させるためのカセットプラスミドに関する。
【背景技術】
【０００２】
チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ（以下、「Ｐ４５０」と称することがある）が多様な基質特異性を有することが明らかにされ、その反応機構や代謝産物について研究されている。Ｐ４５０は細菌から高等生物に至る多種多様な生物に存在し、種々の反応を触媒している。特に動植物のＰ４５０は、種々の薬剤代謝、ステロイドホルモン、ビタミンＤ３、胆汁酸の合成および変換等の重要な反応に関与している。これらのＰ４５０の反応を解析して、有用物質の合成や創薬に応用する試みが多くなされている。しかし、このような解析には大量のＰ４５０が必要となる。ヒトをはじめとする高等生物のＰ４５０は膜結合型であることが多く、他の酵素のように大腸菌で大量発現させることが困難である。その理由としては、大腸菌で発現させる場合に膜結合型Ｐ４５０は封入体を形成して不活性化しやすいこと、正しいフォールディングが起こらないこと等が挙げられる。
【０００３】
膜結合型のＰ４５０を大腸菌で効率よく発現させるために、Ｐ４５０への変異導入が試みられてきた。一例として、Ｎ末端を改変して発現効率を高めることが挙げられる（非特許文献１等参照）。しかし、このような変異導入法が成功するか否かはケースバイケースである。それゆえ、膜結合型のＰ４５０に変異を導入して大腸菌で効率よく発現させることに関しては、個々の研究者が経験則に基づいて研究を進めているのが現状であり、成功例は少ない。
【非特許文献１】N. Kagawa et al. Steroids 68 (2003) 205-209
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の解決課題は、種々の膜結合型のＰ４５０、特に高等生物の膜結合型Ｐ４５０を大腸菌の発現系において大量に発現させる手段を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題に鑑みて鋭意研究を重ね、膜結合型Ｐ４５０の構造遺伝子中の、膜結合型Ｐ４５０の膜結合領域の高度に保存されたグリシンまでの部分をコードするヌクレオチド配列をカセットとして用いて、膜結合型Ｐ４５０発現用カセットプラスミドを構築することに成功した。本発明のカセットプラスミドは、膜結合型Ｐ４５０の膜結合領域をコードするヌクレオチド配列を含み、該膜結合型Ｐ４５０の膜結合領域の３’末端が高度に保存されたプロリン−グリシンをコードするＳｍａＩ認識部位であり、該膜結合型Ｐ４５０の膜結合領域の５’末端にプロモーターを有し、該膜結合型Ｐ４５０の膜結合領域の下流にターミネーターを有するものである。本発明者らは、そのカセットプラスミドを用いることにより、膜結合型のＰ４５０を異種生物細胞にてうまく発現させることに成功し、特に、大腸菌の発現系において高等生物のＰ４５０を大量に発現させることに成功した。
【０００６】
すなわち、本発明は下記のものを提供する：
（１）膜結合型Ｐ４５０発現用カセットプラスミドであって、膜結合型Ｐ４５０の膜結合領域をコードするヌクレオチド配列を含み、該膜結合型Ｐ４５０の膜結合領域の３’末端が高度に保存されたプロリン−グリシンをコードするためのＳｍａＩ認識部位であり、該膜結合型Ｐ４５０の膜結合領域の５’末端にプロモーターを有し、該膜結合型Ｐ４５０の膜結合領域の下流にターミネーターを有するカセットプラスミド；
（２）大腸菌での発現用の（１）記載のカセットプラスミド；
（３）該結合型Ｐ４５０の膜結合領域をコードするヌクレオチド配列の開始メチオニンのコドンの次のコドンがアラニンのコドンである、（２）記載のカセットプラスミド；
（４）プロモーターがｔａｃプロモーター、Ｔ７ｌａｃプロモーター、ｃｓｐＡプロモーター、ｔａｌプロモータープロモーターからなる群より選択されるものである、（２）記載のカセットプラスミド；
（５）マルチクローニング部位を有する（１）〜（４）のいずれかに記載のカセットプラスミド；
（６）膜結合型Ｐ４５０が高等生物由来のものである（１）〜（５）のいずれかに記載のカセットプラスミド；
（７）さらにＰ４５０レダクターゼをコードするヌクレオチド配列を含み、該Ｐ４５０レダクターゼをコードするヌクレオチド配列の５’末端にプロモーターを有し、該Ｐ４５０レダクターゼをコードするヌクレオチド配列の３’末端にターミネーターを有するものである、（１）〜（６）のいずれかに記載のカセットプラスミド。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、膜結合型Ｐ４５０を異種生物細胞にて発現させるためのカセットプラスミド、特に、高等生物の膜結合型Ｐ４５０酵素を大腸菌にて大量に発現させるためのカセットプラスミドが得られるので、Ｐ４５０による有用物質（例えば、ステロイドホルモン、ビタミンＤ３、胆汁酸等）の合成および変換、ならびにＰ４５０反応の創薬への応用が容易となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
上述のごとく、本発明は、膜結合型Ｐ４５０発現用カセットプラスミドであって、膜結合型Ｐ４５０の膜結合領域をコードするヌクレオチド配列を含み、該膜結合型Ｐ４５０の膜結合領域の３’末端が高度に保存されたプロリン−グリシンをコードするためのＳｍａＩ認識部位であり、該膜結合型Ｐ４５０の膜結合領域の５’末端にプロモーターを有し、該膜結合型Ｐ４５０の膜結合領域の下流にターミネーターを有するカセットプラスミドを提供するものである。
【０００９】
本発明のカセットプラスミドを導入する宿主細胞は特に制限はなく、いずれの起源、いずれの種類の細胞であっても使用することができる。組み換え法により目的酵素を大腸菌にて発現させることが広く行われている。その理由は、酵母、昆虫細胞、ほ乳類細胞を用いる方法に比べて安価で維持管理が容易であり、増殖速度が速いので大量の目的産物が短時間で得られること等が挙げられる。したがって、膜結合型Ｐ４５０のような発現が困難で発現量が少ない酵素を大腸菌にて発現させることは非常に好ましい。それゆえ、本発明のカセットプラスミドも、膜結合型Ｐ４５０を大腸菌にて発現させることのできるものが好ましい。特にヒトをはじめとする高等生物のＰ４５０が触媒する反応は、種々の薬物代謝、ステロイドホルモンの合成、ビタミンＤ３の合成など多種多様であるので、これらを効率よく発現させることは医薬品の開発や薬物代謝の研究、有用物質の合成等において非常に有用である。
【００１０】
膜結合型Ｐ４５０は多種多様な生物種に存在しており、高等動物および高等植物のものがよく知られている。それらの膜結合型Ｐ４５０は、Ｎ末端側に膜結合領域を有している。膜結合型Ｐ４５０の膜結合領域と可溶性領域の切り替え点付近に高度に保存されたアミノ酸配列ＰＰＧ（プロリン−プロリン−グリシン）が存在する（膜結合型Ｐ４５０のアミノ酸配列は、例えばhttp://www.p450.kvl.dk/cyp_all_112401.pdf（2001 Soeren Bak and Suzanne Paquette）に掲載されており、その第１ページ目を図１として示す）。本発明者らは、ＰＰＧアミノ酸配列中のプロリン−グリシン配列に着目し、膜結合型Ｐ４５０の構造遺伝子中の膜結合領域と可溶性領域の切り替え点付近にある上記ＰＰＧ配列のグリシン（Ｇ）までの部分をコードするヌクレオチド配列をカセットとして用いて、膜結合型Ｐ４５０発現用カセットプラスミドを構築することに成功した（制限酵素ＳｍａＩの認識部位の６個のヌクレオチドからなる配列はプロリン−グリシンをコードする）。かかる試みは本願発明が最初である。本明細書において、膜結合型Ｐ４５０の膜結合領域の上記グリシンまでの部分をコードするヌクレオチド配列を単に「カセット」と称することがある。
【００１１】
上記カセットの３’末端の高度に保存されたプロリン−グリシンをコードするヌクレオチド配列がｃｃｃｇｇｇであればそのまま使用し、そうでなければｃｃｃｇｇｇに改変して使用する。そのことにより、制限酵素ＳｍａＩ認識部位が形成され、膜結合型Ｐ４５０の可溶性領域をコードするヌクレオチド配列のカセットへの着脱に大変便利であり、様々な膜結合型Ｐ４５０を再構築して発現させることができる。上述のごとく、多くの膜結合型Ｐ４５０は膜結合領域と可溶性領域の切り替え点付近にＰＰＧ配列を含み、その中のプロリン−グリシン部分をコードするヌクレオチド配列がｃｃｃｇｇｇである場合には、膜結合型Ｐ４５０遺伝子をＳｍａＩ処理することにより、容易にカセット配列をコードするヌクレオチド配列を得ることができる。このことは、後で述べる挿入ヌクレオチド配列の取得についてもあてはまる。そして、本発明のカセットプラスミドを用いて膜結合型Ｐ４５０を発現させる場合において、膜結合型Ｐ４５０のアミノ酸配列中に本来的に存在するＰＰＧ配列は変化しないので、発現される酵素の立体構造や活性に対する影響も考慮しなくてよい。
【００１２】
カセットはいずれの生物に由来するものであってもよい。例えば、マウス、ラット、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、ヒト等の高等動物や、Arabidopsis、Tobacum、Petunia等の高等植物に由来するものであってもよい。カセットのヌクレオチド配列は、天然のヌクレオチド配列を使用してもよく、あるいは改変して用いてもよい。改変の例としては、膜結合領域のいくつかのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を欠失、置換、付加することが挙げられる。また、例えば、大腸菌での発現効率を上げるために、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がアラニンとなるようにコドンを変更することも改変に含まれる。また、上記の高度に保存されたアミノ酸配列ＰＰＧ中の２番目のプロリンのコドンがｃｃｃでない場合および／またはグリシンのコドンがｇｇｇでない場合に、それぞれｃｃｃおよびｇｇｇとしてＳｍａＩ認識部位を形成することも改変に含まれる。これらの改変は、当該分野にて公知の方法により、目的に応じて適宜行うことができる。上記のようなカセットのヌクレオチド配列の改変によって、本発明のカセットプラスミドの発現効率を高めることができる。
【００１３】
本発明のカセットプラスミドにおいて、カセットの５’末端にプロモーターが連結されるのが通常である。プロモーターは、目的とする膜結合型Ｐ４５０の発現を促進するものであれば、いずれのものであってもよく、様々なものが当業者に公知である。また、プロモーターは、カセットまたは膜結合型Ｐ４５０の膜結合領域以降のヌクレオチド配列に本来的なものであってもよく、そうでなくてもよい。本発明のカセットプラスミドを大腸菌での膜結合型Ｐ４５０の発現に使用する場合のプロモーターとしては、ｔａｃプロモーター、Ｔ７ｌａｃプロモーター、ｃｓｐＡプロモーター、ｔａｌプロモータープロモーター等が挙げられる。プロモーターは１個であってもよく、同一または同種のものを複数個、あるいは異種のものを複数個連結してもよい。
【００１４】
膜結合型Ｐ４５０の膜結合領域以降のヌクレオチド配列（以下、本明細書において「挿入ヌクレオチド配列」という場合がある）は、高度に保存されたグリシンのコドンおよびそれ以降のＰ４５０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。挿入ヌクレオチド配列の５’末端のグリシンのコドンはいずれのものであってもよい。当該グリシンのコドンの５’末端にリン酸基を導入し、ＳｍａＩを作用させてカセットに挿入する。ヌクレオチド配列の５’末端のグリシンのコドンをｇｇｇとし、その５’側にさらに３個のヌクレオチドｃｃｃを付加した形にしておく（すなわち、ＳｍａＩ認識部位を形成しておく）ことにより、ＳｍａＩを作用させたときにリン酸基が５’末端に生じ、カセットへの挿入を円滑に行うことができる。挿入ヌクレオチド配列の３’末端に任意の制限酵素認識部位を付加しておいて、上記ｓｍａＩ部位およびその下流に配置された当該任意の制限酵素認識部位（挿入ヌクレオチド配列はこれらの制限酵素認識部位によって挟まれた形となっている）を利用して、本発明のカセットプラスミド中に挿入する。このような制限酵素部位を用いたカセットプラスミドへの目的ヌクレオチド配列の組み込みは当該分野にて公知の方法によって行うことができる。挿入ヌクレオチド配列は、カセットと同じ動物種に由来するものであってもよく、異なる動物種に由来するものであってもよい。挿入ヌクレオチド配列は、天然のヌクレオチド配列を使用してもよく、あるいは改変して用いてもよい。改変の例としては、いくつかのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を欠失、置換、付加することが挙げられる。これらの改変は、当該分野にて公知の方法により、目的に応じて適宜行うことができる。
【００１５】
本発明のカセットプラスミドは、マルチクローニング部位を有していてもよい。そのことにより、さらに多種多様な挿入ヌクレオチド配列に対応することができる。
【００１６】
各種の膜結合型Ｐ４５０のアミノ酸配列が公知であり、例えば、http://www.p450.kvl.dk/cyp_all_112401.pdfに掲載されている。また、各種のＰ４５０遺伝子のヌクレオチド配列も公知であり、例えば、http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.htmlの動物・植物の欄に掲載されている。当業者はこれらの情報を用いて、本発明のカセットプラスミドを作成し、所望の膜結合型Ｐ４５０分子種を発現させることができる。
【００１７】
本発明のカセットプラスミドにおいて、挿入ヌクレオチド配列の３’末端にターミネーターが連結されるのが通常である。ターミネーター配列は、本発明のカセットプラスミド中にあらかじめ存在していてもよく、挿入ヌクレオチド配列に連結されていてもよい。適切なターミネーターは当該分野において公知であり、当業者はそれらを選択して使用することができる。
【００１８】
Ｐ４５０は、Ｐ４５０レダクターゼ（以下、「レダクターゼ」と称することがある）とカップリングすることにより機能を発揮する。したがって、Ｐ４５０の発現と同時にレダクターゼを発現させることが望ましい。レダクターゼをコードするヌクレオチド配列を本発明のカセットプラスミドのＰ４５０遺伝子の下流に挿入して発現させてもよい。また例えば、レダクターゼをコードするヌクレオチド配列を本発明の膜結合型Ｐ４５０発現用カセットプラスミドとは別個のベクターに挿入し、本発明のカセットプラスミドとともに１の細胞において同時発現させてもよい。レダクターゼの種類に関しては特に制限はなく、発現される膜結合型Ｐ４５０と共役して、その機能を発揮させうるものであればよい。したがって、レダクターゼは、発現させるべき膜結合型Ｐ４５０に本来的に伴うものであってもよく、あるいは別のＰ４５０に伴うものであってもよい。
【００１９】
レダクターゼをコードするヌクレオチド配列の５’末端にプロモーターを連結し、３’末端にターミネーターを連結するのが通常である。プロモーターは、レダクターゼの発現を促進するものであれば、いずれのものであってもよい。また、プロモーターは、使用するレダクターゼに本来的なものであってもよく、そうでなくてもよい。レダクターゼ用のプロモーターは当業者に公知であるが、大腸菌での発現に適したプロモーターとしてはｔａｃプロモーター、Ｔ７ｌａｃプロモーター、ｃｓｐＡプロモーター、ｔａｌプロモータープロモーター等が挙げられる。プロモーターは１個であってもよく、同一または同種のものを複数個、あるいは異種のものを複数個連結してもよい。ターミネーター配列もまた当該分野において公知であり、適宜選択して使用することができる。
【００２０】
本発明のカセットプラスミドの構築に際して骨格となるベクターについては特に制限はなく、いずれのものであってもよいが、発現に用いる宿主細胞に適したものを使用することが好ましい。例えば、大腸菌での膜結合型Ｐ４５０の発現には、ｐＥＴベクター、ｐＧＥＸベクター、ｐＣｏｌｄベクター等のベクターを骨格として用いて本発明のカセットプラスミドを作成することができる。
【００２１】
以下に実施例を示して本発明をさせに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例１】
【００２２】
植物Ｐ４５０とヒトＰ４５０レダクターゼを共発現するカセットプラスミドの構築を行った。カセットとしてマウス由来のヌクレオチド配列、挿入ヌクレオチド配列は植物由来のヌクレオチド配列、レダクターゼはヒト由来のものを使用した。
【００２３】
マウスＰ４５０分子種ＣＹＰ１Ａ２（神戸大学遺伝子実験センター遺伝子ライブラリーから選択）のＮ末端側の領域（膜結合領域と可溶性領域の切り替え点付近の高度に保存されたＰＰＧ配列を含む）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図２上段に示す。このヌクレオチド配列に対して常法により改変を施して図２下段に示すようなヌクレオチド配列とし、カセットとした（図２中のアミノ酸標記は当業者に公知の１文字表記である）。すなわち、改変前のヌクレオチド配列（図２上段）の下線部の配列を改変後も利用することとした（これ以外の配列は除去した）。そして、Ｎ末端から９個のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を図２下段の下線を引いた配列に改変した。Ｎ末端から２番目のアミノ酸はアラニンとなった。これらの改変により膜結合型Ｐ４５０の発現効率の向上をはかった。さらにカセットの３’末端の高度に保存されたグリシンのコドンｇｇａをｇｇｇに改変してＳｍａＩ認識部位を形成した（図２下段の２つめの下線で示す）。使用したマウスＰ４５０分子種ＣＹＰ１Ａ２のＮ末端側の領域（膜結合領域を含む）のヌクレオチド配列を配列番号：１に、改変により得られたカセットのヌクレオチド配列を配列番号：２に示す。
【００２４】
挿入ヌクレオチド配列としては、シロイヌナズナ（Arabidopsis）のＣＹＰ７４Ａ、ＣＹＰ９０Ｂ１、タバコ（Tobacum）のＣＹＰ７１Ａ１１、ＣＹＰ８１Ｂ２、およびペチュニア（Petunia）のＣＹＰ７１Ｄ１４、ＣＹＰ７０３Ａ１（いずれも神戸大学遺伝子実験センター遺伝子ライブラリーから選択）からクローニングしたものを用い、高度に保存されたグリシンのコドンおよびそれ以降のヌクレオチド配列を使用した。ＣＹＰ７４Ａ由来の挿入ヌクレオチド配列を配列番号：３に、ＣＹＰ９０Ｂ１由来の挿入ヌクレオチド配列を配列番号：４に、ＣＹＰ７１Ａ１１由来の挿入ヌクレオチド配列を配列番号：５に、ＣＹＰ８１Ｂ２由来の挿入ヌクレオチド配列を配列番号：６に、ＣＹＰ７１Ｄ１４由来の挿入ヌクレオチド配列を配列番号：７に、ＣＹＰ７０３Ａ１由来の挿入ヌクレオチド配列を配列番号：８に示す。挿入ヌクレオチド配列の３’末端にＳａｌＩ認識部位を常法により付加した（配列番号：３〜８にはＳａｌＩ認識部位が付加されている）。
【００２５】
以下に、図３を参照して、植物Ｐ４５０とヒトＰ４５０レダクターゼを共発現するカセットプラスミドの構築手順について説明する。
【００２６】
上記カセットをｐＴ７ベクター（Novagen社）のＮｄｅＩおよびＳｍａＩ部位に挿入して、ｐＴ７ｍ１Ａ２  ｆｏｒ  ＳａｌＩプラスミドを得た。一方、植物由来の上記挿入ヌクレオチド配列をｐＴ７ベクターのＳｍａＩおよびＳａｌＩ部位に挿入した。ｐＴ７ｍ１Ａ２  ｆｏｒ  ＳａｌＩプラスミドをＳｍａＩおよびＳａｌＩで切断し、植物由来の上記挿入ヌクレオチド配列を挿入したプラスミドをＳｍａＩおよびＳａｌＩで切断した。これらの切断したプラスミドを連結して、ＮｄｅＩ部位とＳａｌＩ部位の間にマウス由来のカセットおよび植物由来のＰ４５０挿入ヌクレオチド配列が挿入されたプラスミドを得た。得られたプラスミドをＮｄｅＩおよびＳａｌＩで切断した。
【００２７】
一方、マウスＰ４５０分子種ＣＹＰ１Ａ２（神戸大学遺伝子実験センター遺伝子ライブラリーから選択）の全長配列（これに２個のｔａｃプロモーターとターミネーターを連結した）と、ヒト由来のレダクターゼをコードする配列（これに１個のｔａｃプロモーターとターミネーターを連結した）とをｐＴ７プラスミド骨格に挿入してプラスミドｐＣＷＲｍ１Ａ２を得て、これをＮｄｅＩおよびＳａｌＩで切断した。これら２つの切断されたプラスミドを連結して、目的のマウスＰ４５０とヒトＰ４５０レダクターゼを共発現するカセットプラスミドを得た。
【００２８】
このようにして得られたカセットプラスミドを塩化カルシウム法により大腸菌ＤＨ５α株に導入し、ＬＢ培地にて２５℃で４８時間培養してマウス・植物キメラＰ４５０およびヒトレダクターゼ複合体を発現させた。それらのうち、タバコのＣＹＰ７１Ａ１１、タバコのＣＹＰ８１Ｂ２、シロイヌナズナのＣＹＰ７４Ａ、シロイヌナズナのＣＹＰ８１Ｂ２由来の配列を挿入ヌクレオチド配列として挿入したプラスミドを導入した大腸菌により得られた培養液の還元型ＣＯ差スペクトルを調べた結果を図４に示す。いずれの場合においても４６５ｎｍ付近に吸収極大が示され、Ｐ４５０の発現が示された（培地中に大量に生成された、４２０ｎｍに吸収極大を持つＰ４５０以外のヘム蛋白により、Ｐ４５０の吸収極大が４６５ｎｍ付近にシフトした）。
【００２９】
次に、上記のごとく得られたプラスミドのうち、タバコＣＹＰ７１Ａ１１由来の膜結合型Ｐ４５０配列を挿入したプラスミドを塩化カルシウム法により大腸菌ＤＨ５α株に導入して形質転換体を得た。基質としてラウリン酸（１．０ｍＭ）を含有するＬＢ培地を用いて形質転換体を３７℃で１２時間培養し、培養上清をＴＬＣにて分析した。ＴＬＣプレートとしてはシリカゲル６０Ｆ２５４（ドイツメルク製）を使用した。ＴＣＬの展開溶媒はジエチルエーテル：エーテル：ギ酸＝７０：３０：１（重量比）の組成を有するものであった。図５に結果を示す。本発明のカセットプラスミド中に組み込まれたタバコＣＹＰ７１Ａ１１由来の膜結合型Ｐ４５０配列が発現して、基質であるラウリン酸が水酸化されてω水酸化ラウリン酸が生成したことが確認された。
【実施例２】
【００３０】
哺乳動物Ｐ４５０とヒトＰ４５０レダクターゼを共発現するカセットプラスミドの構築を行った。カセットとしてマウス由来のヌクレオチド配列、挿入ヌクレオチド配列はマウス由来のヌクレオチド配列、レダクターゼはヒト由来のものを使用した。
【００３１】
マウスＰ４５０分子種ＣＹＰ２Ｃ２９（神戸大学遺伝子実験センター遺伝子ライブラリーから選択）のＮ末端側の領域（膜結合領域と可溶性領域の切り替え点付近の高度に保存されたＰＰＧまでの領域）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図６上段に示す。このヌクレオチド配列に対して常法により改変を施して図６下段に示すようなヌクレオチド配列とし、カセットとした（図６中のアミノ酸標記は当業者に公知の１文字表記である）。すなわち、カセットＮ末端から２番目のアミノ酸としてアラニンがコードされるようにして、膜結合型Ｐ４５０の発現効率の向上をはかった。そしてＣ末端のプロリンのコドンｃｃｔおよびグリシンのコドンｇｇｃをそれぞれｃｃｃおよびｇｇｇに改変してＳｍａＩ認識部位の配列とした。使用したマウスＰ４５０分子種ＣＹＰ２Ｃ２９のＮ末端側の領域（膜結合領域と可溶性領域の切り替え点付近の高度に保存されたＰＰＧまでの領域）のヌクレオチド配列を配列番号：９に、改変により得られたカセットのヌクレオチド配列を配列番号：１０に示す。
【００３２】
挿入ヌクレオチド配列としては、マウスのＣＹＰ２Ｃ２９からクローニングしたものを用い、高度に保存されたグリシンのコドンおよびそれ以降のヌクレオチド配列を使用した。ＣＹＰ２Ｃ２９由来の挿入ヌクレオチド配列を配列番号：１１に示す。挿入ヌクレオチド配列の３’末端にＳａｌＩ認識部位を常法により付加した（配列番号：１１にはＳａｌＩ認識部位が付加されている）。
【００３３】
以下に、図７を参照して、哺乳動物Ｐ４５０とヒトＰ４５０レダクターゼを共発現するカセットプラスミドの構築手順について説明する。
【００３４】
上記カセットをｐＴ７ベクターのＮｄｅＩおよびＳｍａＩ部位に挿入して、ｐＴ７ｍ２Ｃ２９  ｆｏｒ  ＳａｌＩプラスミドを得た。一方、マウス由来の上記挿入ヌクレオチド配列をｐＴ７ベクターのＳｍａＩおよびＳａｌＩ部位に挿入した。ｐＴ７ｍ２Ｃ２９  ｆｏｒ  ＳａｌＩプラスミドをＳｍａＩおよびＳａｌＩで切断し、マウス由来の上記挿入ヌクレオチド配列を挿入したプラスミドをＳｍａＩおよびＳａｌＩで切断した。これらの切断したプラスミドを連結して、ＮｄｅＩ部位とＳａｌＩ部位の間にマウス由来のカセットおよびマウス由来のＰ４５０挿入ヌクレオチド配列が挿入されたプラスミドを得た。得られたプラスミドをＮｄｅＩおよびＳａｌＩで切断した。
【００３５】
一方、マウスＰ４５０分子種ＣＹＰ２Ｃ２９（神戸大学遺伝子実験センター遺伝子ライブラリーから選択）の全長配列（これに２個のｔａｃプロモーターとターミネーターを連結した）と、ヒト由来のレダクターゼをコードする配列（これに１個のｔａｃプロモーターとターミネーターを連結した）とをｐＴ７プラスミド骨格に挿入してプラスミドｐＣＷＲｍ２Ｃ２９を得て、これをＮｄｅＩおよびＳａｌＩで切断した。これら２つの切断されたプラスミドを連結して、目的のマウスＰ４５０とヒトＰ４５０レダクターゼを共発現するカセットプラスミドを得た。実施例１および２で使用したヒト由来のレダクターゼをコードする配列のヌクレオチド配列を配列番号：１２に示す。
【００３６】
このようにして得られたカセットプラスミドを塩化カルシウム法により大腸菌ＤＨ５α株に導入し、ＬＢ培地にて２５℃で４８時間培養してマウスＰ４５０およびヒトレダクターゼ複合体を発現させた。このプラスミドを導入した大腸菌により得られた培養液の還元型ＣＯ差スペクトルを調べた結果を図８に示す。４５０ｎｍ付近に吸光度の山が示され、Ｐ４５０の発現が示された。なお、対照プラスミドは、Ｐ４５０レダクターゼのみを発現するＰ４５０発現用カセットプラスミドである。
【００３７】
次に、上と同様にして得た形質転換体を、基質としてテストステロン（１．０ｍＭ）を含むＬＢ培地にて３７℃で２４時間培養し、培養上清をＨＰＬＣにて分析した。ＨＰＬＣカラムはＯＤＳカラムを、溶離液としては７０％メタノールを使用した。図９に結果を示す。本発明のカセットプラスミド中に組み込まれたマウスＣＹＰ２Ｃ２９由来の膜結合型Ｐ４５０配列が発現して、基質であるテストステロンが代謝されて少なくとも３種の生成物が得られたことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明は、医薬品の開発、薬物代謝の研究などに利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、http://www.p450.kvl.dk/cyp_all_112401.pdf（2001 Soeren Bak and Suzanne Paquette）の第１ページ目である。図の右下の太線は高度に保存されたプロリン−プロリン−グリシン配列の存在位置を示す。
【図２】図２は、マウスＰ４５０分子種ＣＹＰ１Ａ２配列のＮ末端側の領域（膜結合領域と可溶性領域の切り替え点付近の高度に保存されたＰＰＧ配列を含む）の改変前のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるアミノ酸配列（上段）、カセットとして使用した改変後のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるアミノ酸配列（下段）を示す。下線については実施例１の記載参照。
【図３】図３は、植物Ｐ４５０とヒトＰ４５０レダクターゼを共発現するカセットプラスミドの構築手順を示す。
【図４】図４は、植物Ｐ４５０とヒトＰ４５０レダクターゼを共発現するカセットプラスミドを挿入した大腸菌により得られた培養液の還元型ＣＯ差スペクトルを調べた結果を示す。
【図５】図５は、実施例２で得られたＣＹＰ７１Ａ１１由来の膜結合型Ｐ５４０を発現する形質転換体を培養した際の、Ｐ４５０によるラウリン酸の代謝の様子を示すＴＬＣである。左のレーンは基質ラウリン酸を添加せずに形質転換体を培養した場合、右のレーンは基質ラウリン酸を添加して形質転換体を培養した場合の培養上清をスポットしたものである。ｏｒｉはＴＬＣ展開開始点、Ｍは生成物であるω水酸化ラウリン酸のスポット位置（Ｒｆ；０．３１）、Ｐは基質であるラウリン酸のスポット位置（Ｒｆ；０．７５）を示す。
【図６】図６は、マウスＰ４５０分子種ＣＹＰ２Ｃ２９配列のＮ末端側の領域（膜結合領域と可溶性領域の切り替え点付近の高度に保存されたＰＰＧまでの領域）の改変前のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるアミノ酸配列（上段）およびカセットとして使用した改変後のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるアミノ酸配列（下段）を示す。下段の実線は上段と配列が同じであることを示す。
【図７】図７は、哺乳動物Ｐ４５０とヒトＰ４５０レダクターゼを共発現するカセットプラスミドの構築手順を示す。
【図８】図８は、哺乳動物Ｐ４５０とヒトＰ４５０レダクターゼを共発現するカセットプラスミドを導入した大腸菌により得られた培養液の還元型ＣＯ差スペクトルを調べた結果を示す。矢印は４５０ｎｍの位置を示す。
【図９】図９は、実施例２で得られたＣＹＰ２Ｃ２９由来の膜結合型Ｐ５４０を発現する形質転換体を培養した際の、Ｐ４５０によるテストステロンの代謝の様子を示すＨＰＬＣチャートである。ｔは基質であるテストステロンのピーク、ｍはテストステロン代謝物のピークである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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