(57)【要約】【課題】本発明の目的は、砒素等を含む有害化合物を、効率よく安全に無害化する方法を提供することにある。【解決手段】  本発明の抽出組成物は、砒素、アンチモン、セレンからなる群から選択される少なくとも1種の元素を含有する有害化合物を、無害な物質へ変換する酵素を含む生物体から抽出したことを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
砒素、アンチモン、セレンからなる群から選択される少なくとも1種の元素を含有する有害化合物を、無害な物質へ変換する酵素を含む生物体から抽出した抽出組成物。
【請求項２】
前記酵素が、メチル化酵素、及び／又はメチルトランスフェラーゼである請求項１記載の抽出組成物。
【請求項３】
前記生物体が、海洋生物である請求項１又は2項に記載の抽出組成物。
【請求項４】
前記海洋生物が、甲殻類である請求項３記載の抽出組成物。
【請求項５】
前記海洋生物が、貝類である請求項３記載の抽出組成物。
【請求項６】
前記貝類の内臓塊、又は貝柱から抽出される請求項５記載の抽出組成物。
【請求項７】
さらに、緩衝液を含む請求項１〜６項のいずれか1項に記載の抽出組成物。
【請求項８】
前記緩衝液のｐHが、５〜１０の範囲である請求項７記載の抽出組成物。
【請求項９】
さらに、メチル化促進因子を含有する請求項１〜８項のいずれか1項に記載の抽出組成物。
【請求項１０】
前記メチル化促進因子が、グルタチオンである請求項９記載の抽出組成物。
【請求項１１】
さらに、S−アデノシル−L−メチオニン、グリシンベタインからなる群から選択される少なくとも1種を含有する請求項１〜１０項のいずれか1項に記載の抽出組成物。
【請求項１２】
前記抽出組成物は、遠心分離及び／又は超遠心処理により得られる請求項１〜１１項のいずれか1項に記載の抽出組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１２項のいずれか1項に記載の抽出組成物を用いて、砒素、アンチモン、セレンからなる群から選択される少なくとも1種の元素を含有する有害化合物を、無害な物質へ変換する有害化合物の無害化方法。
【請求項１４】
上記１種の元素の価数を高酸化数とすることにより無害化する請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
上記１種の元素の少なくとも１つの結合手をアルキル化する請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アルキル化が、メチル化である請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記有害化合物が、亜ヒ酸、五酸化砒素、三塩化砒素、五塩化砒素、硫化砒素化合物、シアノ砒素化合物、クロロ砒素化合物、及びその他の砒素無機塩類からなる群から選択される請求項１３〜１６項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
前記メチル化によって、有害化合物をジメチル化合物又はトリメチル化合物とする請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
前記ジメチル化合物が、ジメチルアルソニルエタノール（DMAE）、ジメチルアルソニルアセテート（DMAA）、ジメチルアルシン酸、又はアルセノシュガーである請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
前記トリメチル化合物が、アルセノコリン、アルセノベタイン、又はトリメチルアルシンオキシドである請求項１８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抽出組成物及び当該抽出組成物を用いた有害化合物の無害化方法であり、特に、生物体の酵素を利用した抽出組成物及び当該抽出組成物を用いた有害化合物の無害化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
砒素、アンチモン、セレン等の重金属は、半導体等の工業材料として広く用いられている物質であるが、生物に有毒な物質であることから、環境中に流出することにより生物に与えられる影響が懸念されている。
【０００３】
従来、これらの重金属の環境中への流出を防止するため、有毒な亜ヒ酸等の無機砒素を含む廃液にポリ塩化アルミニウム（ＰＡＣ）等の凝集剤を添加し、該凝集剤と原水中の鉄分に砒素を凝集、吸着し、沈殿させた後、濾過により回収する方法や、活性アルミナ、セリウム系吸着剤により砒素化合物等を吸着させ回収する方法が一般的に知られている。
【０００４】
一方、自然界において、海藻等の海洋生物では、無機砒素が体内に蓄積されるとともに、その無機砒素の一部が生理反応により、ジメチル化砒素あるいはトリメチル化砒素などの有機砒素化合物へ転換されることが明らかとなっている（非特許文献１）。そして、これらの有機砒素化合物は、一般に、哺乳類動物に対して無機砒素よりも低い毒性を示すことが知られている。
【非特許文献１】Kaise et al., 1998, Organomet. Chem., 12, 137-143
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、濾過、吸着等を利用した上述の重金属を回収する方法では、有害なままである無機砒素等の有害化合物を含んだ汚泥及び吸着剤が、依然として有害物であるとの問題点がある。加えて、当該有害化合物が外部に漏れないようにコンクリート等で密封するなどした上で保管するか又は埋め立てる必要があり、保管場所、埋め立て地用の広いスペースを要するとの問題点もあった。
【０００６】
また、上記の海洋生物に無機砒素を取り込ませても、海洋生物の体内に蓄積できる量が限られており、大量に無害化した砒素を得るためには、膨大な量の生物体の生体組織が副産物として発生するという問題点もあった。更には、純粋な無害化した砒素化合物を単離するには、生物体の生体組織から複雑な分離操作を繰り返し行う必要があるとの問題点もあった。
【０００７】
そこで、本発明は、上記問題点を解決すべく、保管場所等の広いスペースを必要とせず、不必要な副産物を発生させず、かつ簡便な操作で、砒素等を含む有害化合物を無害化する方法、その無害化反応を触媒するための生物体からの酵素の抽出組成物、およびその抽出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、生物体利用による、砒素等を含む有害化合物の減毒効果に関して、鋭意研究した結果、砒素、アンチモン、セレンからなる群から選択される少なくとも1種の元素を含有する有害化合物を、無害な物質とすることが可能であることを見出し本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明の抽出組成物は、砒素、アンチモン、セレンからなる群から選択される少なくとも1種の元素を含有する有害化合物を、無害な物質へ変換する酵素を含む生物体から抽出したことを特徴とする。
【００１０】
また、本発明の抽出組成物の好ましい実施態様において、前記酵素が、メチル化酵素、及び／又はメチルトランスフェラーゼであることを特徴とする。
【００１１】
また、本発明の抽出組成物の好ましい実施態様において、前記生物体が、海洋生物であることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明の抽出組成物の好ましい実施態様において、前記海洋生物が、甲殻類であることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明の抽出組成物の好ましい実施態様において、前記海洋生物が、貝類であることを特徴とする。
【００１４】
また、本発明の抽出組成物の好ましい実施態様において、前記貝類の内臓塊、又は貝柱から抽出されることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明の抽出組成物の好ましい実施態様において、さらに、緩衝液を含むことを特徴とする。
【００１６】
また、本発明の抽出組成物の好ましい実施態様において、前記緩衝液のｐHが、５〜１０の範囲であることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明の抽出組成物の好ましい実施態様において、さらに、メチル化促進因子を含有することを特徴とする。
【００１８】
また、本発明の抽出組成物の好ましい実施態様において、前記メチル化促進因子が、グルタチオンであることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明の抽出組成物の好ましい実施態様において、さらに、S−アデノシル−L−メチオニン、グリシンベタインからなる群から選択される少なくとも1種を含有することを特徴とする。
【００２０】
また、本発明の抽出組成物の好ましい実施態様において、前記抽出組成物は、遠心分離及び／又は超遠心処理により得られることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明の有害化合物の無害化方法は、請求項１〜１０項のいずれか1項に記載の抽出組成物を用いて、砒素、アンチモン、セレンからなる群から選択される少なくとも1種の元素を含有する有害化合物を、無害な物質へ変換することを特徴とする。
【００２２】
また、本発明の有害化合物の無害化方法の好ましい実施態様において、上記１種の元素の価数を高酸化数とすることにより無害化することを特徴とする。
【００２３】
また、本発明の有害化合物の無害化方法の好ましい実施態様において、上記１種の元素の少なくとも１つの結合手をアルキル化することを特徴とする。
【００２４】
また、本発明の有害化合物の無害化方法の好ましい実施態様において、前記アルキル化が、メチル化であることを特徴とする。
【００２５】
また、本発明の有害化合物の無害化方法の好ましい実施態様において、前記有害化合物が、亜ヒ酸、五酸化砒素、三塩化砒素、五塩化砒素、硫化砒素化合物、シアノ砒素化合物、クロロ砒素化合物、及びその他の砒素無機塩類からなる群から選択されることを特徴とする。
【００２６】
また、本発明の有害化合物の無害化方法の好ましい実施態様において、前記メチル化によって、有害化合物をジメチル化化合物又はトリメチル化化合物とすることを特徴とする。
【００２７】
また、本発明の有害化合物の無害化方法の好ましい実施態様において、前記ジメチル化合物が、ジメチルアルソニルエタノール（DMAE）、ジメチルアルソニルアセテート（DMAA）、ジメチルアルシン酸、又はアルセノシュガーであることを特徴とする。
【００２８】
また、本発明の有害化合物の無害化方法の好ましい実施態様において、前記トリメチル化化合物が、アルセノコリン、アルセノベタイン、又はトリメチルアルシンオキシドであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２９】
本発明の抽出組成物によれば、調製が容易であり、保存に適しており、しかも生物体をそのまま飼育する必要がないため、低コスト化を達成し得るという有利な効果を奏する。また、本発明の有害化合物の無害化方法によれば、有害化合物を処理するに当たり、自然界における生物体を利用するので、極めて安全性が高いという有利な効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明の抽出組成物は、砒素、アンチモン、セレンからなる群から選択される少なくとも1種の元素を含有する有害化合物を、無害な物質へ変換する酵素を含む生物体から抽出される。本発明の抽出組成物を用いれば、後述するように、人間が摂取可能な海洋生物と同程度以下に無機砒素の量を低減することが可能である。
【００３１】
ここで、本明細書において、有害化合物とは、環境中に流出し、生物に暴露された際に、何らかの悪影響を生物に与える恐れがある化合物を意味する。
【００３２】
前記有害化合物のうち砒素を含有する有害化合物としては、亜ヒ酸、五酸化砒素、三塩化砒素、五塩化砒素、硫化砒素化合物、シアノ砒素化合物、クロロ砒素化合物、及びその他の砒素無機塩類等が挙げられる。これらの砒素は、例えばLD50(mg/kg)（マウスにおける50％致死量）が20以下であり、一般に生物に対して有毒な値である。
【００３３】
また、アンチモンを含有する有害化合物としては、三酸化アンチモン、五酸化アンチモン、三塩化アンチモン、五塩化アンチモン等が挙げられる。
【００３４】
さらに、セレンを含有する有害化合物としては、二酸化セレン、三酸化セレン等が挙げられる。
【００３５】
また、好ましい実施態様において、前記酵素が、メチル化酵素、及び／又はメチルトランスフェラーゼである。このような酵素に着目したのは、砒素等の有害化合物は、例えば無機砒素を有機砒素、より具体的には、アルキル化砒素とすることにより、無害、無毒化が達成でき、ひいては、有害化合物の無害化を達成できるという観点からである。
【００３６】
前記生物体としては、特に限定されるものではないが、前記酵素を含有し、より効率的にメチル化を達成できるという観点から、海洋生物であることが好ましい。また、海洋生物としては、アルセノベタインの蓄積量が大きいこと、養殖技術が確立しているというという観点から、甲殻類であることが好ましい。甲殻類としては、例えば、養殖可能なヨシエビ、クルマエビなどのエビ類またはカニ類を挙げることができる。なお本願明細書において「養殖可能なエビ類またはカニ類」とは、食用などの用途のために一般的に養殖されている種々のエビ類またはカニ類を広く包含するものである。無毒化された砒素を回収するという効果を達成できる限り、他の甲殻類やムール貝、カキなどの貝類を使用することも可能である。本発明において、ヨシエビ、クルマエビなどの養殖可能なエビを使用することは、生育範囲が広いというという観点から、特に好適な態様である。ヨシエビは体長5cmから10cmの南方系のエビであり、東京湾以南の太平洋岸や富山湾以南の日本海側に分布している。
【００３７】
また、生物体の特定の部位に、前記酵素が多く含まれる場合もあるので、そのような部位を積極的に利用してもよい。甲殻類の場合には、例えば、肝臓、生殖腺などが前記酵素を含むと考えられ、貝類においては、内臓、生殖腺、貝柱などが前記酵素を含むと考えられるので、このような部位を用いてもよい。なお、本明細書において、内臓塊とは、内臓のほか、生殖腺を含む概念を意味する。
【００３８】
本発明の抽出組成物には、さらに、緩衝液を含むことができる。緩衝液は、通常、生体材料を単離、精製、保存等に用いられるものを使用することができ、特に限定されるものではなく、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液などの緩衝液を例示することができる。また、前記緩衝液のｐHとしては、生体内の酵素活性を考慮して、５〜１０の範囲であることが好ましい。
【００３９】
本発明の抽出組成物には、有害化合物のメチル化を効率よく達成するという観点から、さらに、メチル化促進因子を含有することができる。メチル化促進因子として、GSH、ベタインやメチオニンなどを挙げることができるが、これらの物質に限定されるものではない。砒素のアルセノベタインへの変換において砒素を還元する能力やメチル基転移反応などが律速となっている可能性が考えられるが、これらの物質を添加することによりアルセノベタインへの変換を促進することができると考えられる。よってGSHなどのメチル化促進因子を使用することにより、さらに効率的に有害化合物の無害化を達成可能である。
【００４０】
好ましい実施態様において、本発明の抽出組成物には、さらに、S−アデノシル−L−メチオニン、グリシンベタインからなる群から選択される少なくとも1種を含有してもよい。
【００４１】
本発明の抽出組成物は、遠心分離及び／又は超遠心処理により得ることができる。遠心分離及び／又は超遠心処理の条件は特に限定されるものではないが、例えば、超遠心処理においては５万〜１５万Gが好ましい。
【００４２】
次に、本発明の抽出組成物を利用した有害化合物の無害化方法について説明すれば、以下の通りである。
【００４３】
本発明の有害化合物の無害化方法は、上記本発明の抽出組成物を用いて、砒素、アンチモン、セレンからなる群から選択される少なくとも1種の元素を含有する有害化合物を、無害な物質へ変換する。具体的な有害化合物としては、上記本発明の抽出組成物で説明したものを挙げることができる。
【００４４】
そのほか、有害化合物を含むものとして、一度有害化合物が生物に取り込まれてアルキル化された化合物を含む植物プランクトンなどの生物体を挙げることもできる。この場合、植物プランクトンなども有害化合物を取り込んでアルキル化することができ、アルキル化された化合物を含む生物体をホモジネート等し、その後抽出して得られた抽出物に対して、さらに、上記本発明の抽出組成物を適用すれば、更なるアルキル化、即ち、有害化合物の無害化を達成することができる。
【００４５】
このような植物プランクトンについて例示すれば、クロレラ、海藻類及び海苔などを挙げることができる。無機砒素を回収してアルキル化するという効果を達成できる限り、他の植物プランクトンを使用することも可能である。なお用いられる生物は必ずしも植物プランクトンに限定されるものではなく、他の生物を用いることも可能である。
【００４６】
好ましい態様において、砒素、アンチモン、及びセレンなどの元素の価数を高酸化数とすることにより無害化する。ここで、高酸化数とは、その元素が取得ることが可能な酸化数の中で、より高い酸化数という意味と考えることができる。例えば、砒素の場合は５価、アンチモンの場合は５価、セレンの場合は６価などである。また、砒素などの金属と生体タンパク質が結合して、代謝系に悪影響を与えることを防ぐという観点から、上記１種の元素の少なくとも１つの結合手をアルキル化することが好ましく、特に、メチル化することが好ましい。このメチル化によって、有害化合物をジメチル化化合物又はトリメチル化合物とすることができる。ジメチル化合物としては、ジメチルアルソニルエタノール（DMAE）、ジメチルアルソニルアセテート（DMAA）、ジメチルアルシン酸、又はアルセノシュガーを挙げることができ、トリメチル化合物が、アルセノコリン、アルセノベタイン、又はトリメチルアルシンオキシドを挙げることができる。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明の実施例を説明するが、下記の実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。
実施例１〜４
【００４８】
〔クルマエビ〕
〔酵素抽出実験〕
クルマエビ（15匹、50g）より肝臓を取り出した。肝臓重量は14.3gであった。肝臓に抽出バッファー（20mM Tris-HCl ( pH7.6 )-250mM Sucrose）50mLを添加し、ポリトロンホモジナイザーで分散後、テフロンホモジナイザーを用いて破砕した。用いる機器ははあらかじめ冷却した。破砕液を25mL回収（ホール）し、肝臓破砕液とした。残りの破砕液について、100,000×g、45分超遠心分離（日立製Hitachi Himac CP-80α）を実施した。超遠心分離後上層（赤色部分、18mL）、上清（褐色部分、30mL）を回収した。各々等量の100mM Tris-HCl( pH 7.6 )-20mM GSHを添加した。また、マグネシウム（１１４ｐｐｍ）、メチルコバラミン（ＭｅＣｏｂ、１００ｐｐｍ）、グリシンベタイン濃度（１１７ｐｐｍ）、ＳＡＭ（４４０ｐｐｍ）を添加した。尚全ての操作は4℃で実施した。
【００４９】
〔砒素基質の調製〕
無機砒素として、亜ヒ酸ナトリウム水溶液を準備した。ジメチル砒素として、カコジル酸水溶液を調製した。アルセノシュガー源として、無機砒素を取り込ませたナノクロロプシス（ナノクロロプシス破砕物）を次のようにして準備した。対数増殖期まで前培養した微細藻類ナノクロロプシス（Nannochloropsis oculata）をダイゴ人工海水SP（和光純薬）とダイゴIMK培地（和光純薬）からなる６Lの培地に１×１０６cells/mlとなるように植菌し、蛍光灯照射下、温度25度、バブリングを行い培養した。培養開始48時間後に金属ヒ素として１ｐｐｍとなるように亜ひ酸を添加し、１２０時間培養することで、ヒ素の取込試験を実施した。ヒ素取込後の藻体は遠心分離により集菌し、蒸留水で5回洗浄し、ヒ素取込ナノクロロプシスの試料を調整した。室重量で約６ｇ得た。ナノクロロプシス300mgを液体窒素を用い凍結し、クライオプレス（型番CP-100W、マイクロテックニチオン社）を用い10秒間、5回衝撃を与えることによりナノクロロプシスの破砕を実施した。これをナノクロロプシス破砕物とした。
【００５０】
ナノクロロプシス抽出物（ナノクロロプシスをメタノールで抽出処理し、エバポレーションによりメタノールを除去したもの）を準備した。
【００５１】
〔抽出酵素による試験〕
３７℃で３時間、酵素反応を実施した。反応は丸底のプラスチックチューブで実施し、BIO-SHAKER  BR-15（TAITEC）を用いて反応中の攪拌を実施した。
【００５２】
〔砒素含有量の測定〕
試験終了後、反応物の無機砒素、有機砒素を測定した。無機砒素、有機砒素の測定には、形態別砒素分析システム（島津製作所製、原子吸光分光光度計ＡＡ−６８００、前処理装置ＡＳＡ−２ｓｐ）を用いた。
【００５３】
〔比較例〕
砒素基質を加えず、実施例と同様の実験を行った。
【表１】
2007300802.tif 000002
【００５４】
実施例１〜４に示したように、比較例に比べて、ジメチル化砒素（ＤＭＡ）、トリメチル化砒素（ＴＭＡ）の濃度が増加しており、砒素基質が、最も無害なトリメチル化砒素に変換されていることがわかった。特に実施例４においては、ＴＭＡの濃度が、比較例の約１．５倍に増加しており、顕著な効果が見られた。
【００５５】
実施例５〜１０
〔カキ〕
〔カキ抽出液の調製〕
マガキ1匹（重量20g）をナイフを用いて細かく裁断した。裁断後、予め氷冷した抽出バッファー（20mM Tris-HCl ( pH7.6 )-125mM Sucrose-10 mM GSH）20 mLを添加し超音波破砕機（日本精機社製 Model US600）を用いて、氷中で5分間破砕した。さらに破砕液を予め氷冷したテフロン（登録商標）ホモジナイザーを用いて破砕しカキ抽出液とした。
【００５６】
〔カキ抽出液を用いた無機砒素のアルセノベタイン変換酵素活性の検出〕
前記カキ抽出液を用いて、無機砒素のアルセノベタン変換酵素活性の検出を実施した。カキ酵素抽出液をポリプロピレン製のチューブに4mLとり、添加因子として100 mM アデノシルメチオニン（シグマ社製）、120 mM MgCl2(ナカライテスク社製)、100mM ベタイン（シグマ社製）を30uLずつ添加し、さらに740 ppm As2O3を30uL添加した。酵素反応は攪拌しながら、15、37、55℃でそれぞれ3時間実施した。
【００５７】
【表２】
2007300802.tif 000003
【００５８】
実施例５〜１０に示したように、比較例に比べて、ジメチル化砒素（ＤＭＡ）の濃度が増加しており、砒素基質が、減毒性のジメチル化砒素に変換されていることがわかった。特に実施例５，６，９においては、トリメチル化砒素（ＴＭＡ）の濃度が増加しており、砒素基質が、最も無害なトリメチル化砒素に変換されていることがわかった。ＴＭＡの濃度が、比較例の約１．７倍に増加しており、顕著な効果が見られた。
【００５９】
実施例１１〜１５
〔牡蠣各部分の抽出液の調整〕
マカキ３個体についてカキ各部分の抽出液の作製および酵素反応を実施した。ナイフを用いてマカキの殻を除去し、肉部分を取り出した。ナイフを用いて内臓部分、外套部分、貝柱に分けた。氷上で、ナイフを用いて各部分を細かく裁断した。湿重量で、内臓部、８．８ｇ、外套部、３．９ｇ、貝柱、２．０ｇをそれぞれ得た。各部の重量と同じ重量の破砕緩衝液（60mM  Tris-HCL、pH 7.6、125mM  スクロース、10mM  ＧＳＨ）を添加し、氷冷しながら、テフロンホモジナイザーで破砕した（抽出液）。解体から、破砕まで約20分で行った。２ｍＬのエッペンドルフチューブに、抽出液１ｍＬを入れた。これに、添加因子として、１００ｍＭ  ＳＡＭを１０μＬ、１００ｍＭベタインを１０μＬ、メチルコバラミン（１０ｍｇ／ｍＬ）を１０μＬ、塩化マグネシウム（１２０ｍＭ）を１０μＬ加えた。更に、ヒ素基質として、酸化の無機ヒ素（Ａｓ濃度として、７６０ｐｐｍ）を１０μＬ、もしくは、クロレラ抽出液を１００μＬ添加した。３７℃で３時間反応させて、ＨＰＬＣ−ＩＣＰ−ＭＳ（アジレント７５００ＣＥ）で分析した。内臓抽出液については、遠心分離（10,000×ｇ、10分間）した場合の、上清についても実施した（比較例６、実施例１５）。
【００６０】
【表３】
2007300802.tif 000004
【００６１】
実施例１１，１２，１３，１４，１５に示したように、比較例３，５，６に比べて、ジメチル体（DMA）、トリメチル体（アルセノベタイン(AB)、アルセノコリン(AC)）が増大した（表中、TMAOは、トリメチルアルシンオキシドの略である。）。特に、内臓塊、貝柱の部分の抽出液に、メチル化の効果があることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、牡蠣抽出液反応におけるジメチル砒素の生成を示す図である。
【図２】図２は、牡蠣抽出液反応におけるアルセノベタインの生成を示す図である。
【図１】
2007300802.tif 000005
【図２】
2007300802.tif 000006