(57)【要約】【課題】測定装置構造が簡便となり、更なる小型化、小消費電力、濁りの原因物質の処理操作不要にすることができる感度良好な電気化学式のアデニンヌクレオチドの測定法を提供する。【解決手段】アデノシン三リン酸を酵素Ｅ1によりアデノシン二リン酸に変換させる工程Ａ、該アデノシン二リン酸およびリン酸供与体Ｐ2を酵素Ｅ2によりアデノシン三リン酸および脱リン酸化されたリン酸供与体Ｐ2に変換させる工程Ｂ、および該供与体Ｐ2’を酸化還元反応に供することで該供与体Ｐ2’を電気化学的に測定する工程Ｃ、を含むことを特徴とする、アデニンヌクレオチドの測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノシン三リン酸を酵素Ｅ1によりアデノシン二リン酸に変換させる工程Ａ、
該アデノシン二リン酸およびリン酸供与体Ｐ2を酵素Ｅ2によりアデノシン三リン酸および脱リン酸化されたリン酸供与体Ｐ2に変換させる工程Ｂ、および
該供与体Ｐ2’を酸化還元反応に供することで該供与体Ｐ2’を電気化学的に測定する工程Ｃ、
を含むことを特徴とする、アデニンヌクレオチドの測定方法。
【請求項２】
工程Ａおよび工程Ｂを複数回繰返して反応させることにより、その反応回数に応じてアデノシン三リン酸および脱リン酸化されたリン酸供与体Ｐ2’を生成させることを特徴とした請求項１記載のアデニンヌクレオチドの測定方法。
【請求項３】
工程Ｂにより生成された脱リン酸化されたリン酸供与体Ｐ2’をアデニンヌクレオチド量として測定することを特徴とした請求項１または２記載のアデニンヌクレオチドの測定方法。
【請求項４】
酵素Ｅ1として、ミオキナーゼを用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のアデニンヌクレオチドの測定方法。
【請求項５】
工程Ｃにおいて、酸化還元反応を酸化還元酵素Ｅ3によって行うことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のアデニンヌクレオチドの測定方法。
【請求項６】
工程Ｃにおいて、該供与体Ｐ2’を酸素分子を消費する酸化還元反応に供し、消費された酸素量を検出することで供与体Ｐ2’を電気化学的に測定すること特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のアデニンヌクレオチドの測定方法。
【請求項７】
工程Ｃにおいて、該供与体Ｐ2’を過酸化水素が産生する酸化還元反応に供し、産生した過酸化水素量を検出することで供与体Ｐ2’を電気化学的に測定すること特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のアデニンヌクレオチドの測定方法。
【請求項８】
工程Ｃにおいて、電気化学的に検出する手段が、電子受容体として電子メディエータを用いるものであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のアデニンヌクレオチドの測定方法。
【請求項９】
酵素Ｅ2としてピルビン酸キナーゼ、酵素Ｅ3としてピルビン酸オキシダーゼを用いた請求項１記載のアデニンヌクレオチドの測定方法。
【請求項１０】
酵素Ｅ2としてピルビン酸キナーゼ、酵素Ｅ3としてピルビン酸デヒドロゲナーゼを用いた請求項１記載のアデニンヌクレオチドの測定方法。
【請求項１１】
酵素Ｅ2としてヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼ、酵素Ｅ3としてグルコースオキシダーゼを用いた請求項１記載のアデニンヌクレオチドの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アデノシン三リン酸（以下ＡＴＰと略す）、アデノシン二リン酸（以下ＡＤＰと略す）、アデノシン一リン酸（以下ＡＭＰと略す）またはそれらの混合物など、いわゆるアデニンヌクレオチドを測定するための方法に関するものである。より詳細には、アデニンヌクレオチドを電気化学的に、感度良好に測定する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
アデニンヌクレオチドは、生体のエネルギー代謝に関与している。生体内で起こる種々の化学反応には、ＡＴＰが加水分解されてＡＤＰまたはＡＭＰとなる際に放出されるエネルギーを利用して行われるものが多い。また、アデニンヌクレオチドは、生体内においてリボ核酸（ＲＮＡ）の前駆体、生体内リン酸化反応におけるリン酸供与体などとしても利用される。
このように、アデニンヌクレオチドは、生体において極めて重要な役割を果たす化合物であることから、アデニンヌクレオチドの測定は、様々な分野において、重要な役割を担っている。
例えば、アデニンヌクレオチドの一つであるＡＴＰは、食品衛生分野において、細菌などの微生物や、微生物による汚染の温床となる食物残渣など、汚染の程度の指標としてＡＴＰ濃度が利用される。また、生細胞数、細胞の代謝変化のモニタリングや、食品の成熟度や腐敗度などを含む食品の品質管理、水質浄化における水質検査など、様々な指標として用いられている。
従来からＡＴＰを測定する方法としてルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を利用した生物発光法が知られている。この方法は、二価の金属イオン存在下、試料から抽出したＡＴＰにルシフェリンおよびルシフェラーゼを作用させることで発光させる。この発光は、１分子あたり１個のフォトンが放出されるので、発光時間に対する値を積分することによってＡＴＰを定量的に検出できる。
【０００３】
しかしながら、ルシフェリン−ルシフェラーゼによる生物発光法は、ＡＴＰを迅速に測定できる利点がある反面、発光が非常に短時間で消失する発光安定性が悪いという課題を有しており、感度と精度を獲得するため、反応時間の厳密な制御と、短時間で消失する発光を捕らえるためのオートインジェクション機能を備えた測定装置の使用を必要としていた。
そのため、生物発光反応がある程度進行して発光量が低下してきた時点で、ピロリン酸を反応系に添加し、一時的に強い発光を生じさせることにより、発光反応において途中で光のピーク強度を再び増大させ、発光時間を延長させる方法（非特許文献１参照）が考案されたが、ＡＴＰの新たな再生が存在しないため、ＡＴＰが消費されるにしたがい、経時的に発光が減衰するため、発光時間を長時間にわたって安定化させることはできない。
【０００４】
前記のルシフェリン−ルシフェラーゼの発光安定性の課題を解決すべく、ＡＴＰ再生反応系を形成することで、発光を減衰することなく発光安定性を獲得する方法が考案された（特許文献１参照）。
この方法は、ＡＭＰ、ピロリン酸、ホスホエノールピルビン酸およびマグネシウムイオンに、ピルビン酸オルトホスフェイトジキナーゼを作用させることにより、ＡＴＰ、ピルビン酸およびリン酸を生成させる反応（反応１）を行う。次いでＡＴＰ、ルシフェリン、溶存酸素およびマグネシウムイオンに、ルシフェラーゼを作用させることにより、ＡＭＰ、ピロリン酸、オキシルルシフェリン、炭酸ガスおよび光を生じせしめる反応（反応２）を行う。前記反応１と反応２を組み合わせ、繰返し反応させることでＡＴＰの再生反応系が形成され、発光安定性を獲得できる。この反応を以下に示す。
【０００５】
【化１】
2007155713.tif 000002
【０００６】
また、試料中のＡＴＰに、ＡＭＰとミオキナーゼとを反応させて、二分子のＡＤＰに変換させる反応（反応３）と、ポリリン酸化合物の存在下で、ＡＤＰとポリリン酸キナーゼとを反応させて、ＡＴＰとポリリン酸化合物に変換させる反応（反応４）において、反応３と反応４を一対の反応系となし、その反応回数に応じて２のべき乗でＡＴＰを増幅させ、増幅されたＡＴＰを生物発光法により検出することで、極微量のＡＴＰを検出する方法も考案されている（特許文献２参照）。この反応を以下に示す。
【０００７】
【化２】
2007155713.tif 000003
【０００８】
一方、電気化学的測定方法として、グルコースオキシダーゼとヘキソキナーゼを用いたＡＴＰ測定法が提案されている（特許文献３参照）。本測定法は、グルコースに対してグルコースオキシダーゼとヘキソキナーゼとの競合反応の割合がＡＴＰの量によることを利用したものである。
また、ＡＴＰ加水分解酵素（ＡＴＰａｓｅ）を作用させることにより、ＡＴＰを加水分解させ、水素イオンを生成することを利用し、そのｐＨ変化を水素イオン感応性電界効果型トランジスタで検出するＡＴＰ測定法も提案されている（特許文献４および特許文献５参照）。
【非特許文献１】Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．４６，  ３９９−４１６；１９５５
【特許文献１】特開平９−２３４０９９号公報
【特許文献２】特開２００１−２９９３９０号公報
【特許文献３】特開昭６０−１７３４７号公報
【特許文献４】特開昭６１−１２２５６０号公報
【特許文献５】特開昭６１−２６９０５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、前記生物発光法を基とした従来技術は、発光検出装置が高価な上、光学系の部品が必要となり、結果として装置構造が複雑であるという課題を有していた。
また、この方法では、ＡＴＰを発光検出法により検出しているため、測定装置の消費電力が大きいという問題がある。
次いで、生物発光法は、試料中に溶存酸素が存在する状況下においてのみ発光計測が可能であるため、溶存酸素の存在しない試料を測定することができなかった。
さらに、一般的に、発光検出法による分析方法は、濁りある試料には適用困難である。したがって、上記手法では、牛乳や血液のような濁度の高い試料は、そのまま測定することが困難で、測定前に、濁りの要因となっている物質を除去処理や、溶解するための処理、または試料を希釈する必要があるという課題を有していた。
【００１０】
前記従来技術である電気化学式の測定方法では、生物発光法の課題を解決でき、さらに、電子メディエータを用いることで、溶存酸素のない試料を測定できるという利点を有する反面、ＡＴＰ測定感度が、１０−４〜１０−６Ｍ程度に過ぎず、食品衛生分野など、実用に用いられる感度に到達しておらず、感度良好な電気化学式のＡＴＰ測定方法が望まれていた。
本発明は、前記従来課題を解決するもので、測定装置構造が簡便となり、更なる小型化、小消費電力かつ生物発光法で必要な濁りの原因となる物質の前処理操作不要な高感度電気化学式のアデニンヌクレオチドの測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本願発明者らは、下記構成により上記課題が解決されることを見出した。
＜１＞
アデノシン三リン酸を酵素Ｅ1によりアデノシン二リン酸に変換させる工程Ａ、
該アデノシン二リン酸およびリン酸供与体Ｐ2を酵素Ｅ2によりアデノシン三リン酸および脱リン酸化されたリン酸供与体Ｐ2’に変換させる工程Ｂ、および
該供与体Ｐ2’を酸化還元反応に供することで該供与体Ｐ2’を電気化学的に測定する工程Ｃ、
を含むことを特徴とする、アデニンヌクレオチドの測定方法。
＜２＞
工程Ａおよび工程Ｂを複数回繰返して反応させることにより、その反応回数に応じてアデノシン三リン酸および脱リン酸化されたリン酸供与体Ｐ2’を生成させることを特徴とした＜１＞記載のアデニンヌクレオチドの測定方法。
＜３＞
工程Ｂにより生成された脱リン酸化されたリン酸供与体Ｐ2’をアデニンヌクレオチド量として測定することを特徴とした＜１＞または＜２＞記載のアデニンヌクレオチドの測定方法。
＜４＞
酵素Ｅ1として、ミオキナーゼを用いることを特徴とする＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載のアデニンヌクレオチドの測定方法。
＜５＞
工程Ｃにおいて、酸化還元反応を酸化還元酵素Ｅ3によって行うことを特徴とする＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載のアデニンヌクレオチドの測定方法。
＜６＞
工程Ｃにおいて、該供与体Ｐ2’を酸素分子を消費する酸化還元反応に供し、消費された酸素量を検出することで供与体Ｐ2’を電気化学的に測定すること特徴とする＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載のアデニンヌクレオチドの測定方法。
＜７＞
工程Ｃにおいて、該供与体Ｐ2’を過酸化水素が産生する酸化還元反応に供し、産生した過酸化水素量を検出することで供与体Ｐ2’を電気化学的に測定すること特徴とする＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載のアデニンヌクレオチドの測定方法。
＜８＞
工程Ｃにおいて、電気化学的に検出する手段が、電子受容体として電子メディエータを用いるものであることを特徴とする＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載のアデニンヌクレオチドの測定方法。
＜９＞
酵素Ｅ2としてピルビン酸キナーゼ、酵素Ｅ3としてピルビン酸オキシダーゼを用いた＜１＞記載のアデニンヌクレオチドの測定方法。
＜１０＞
酵素Ｅ2としてピルビン酸キナーゼ、酵素Ｅ3としてピルビン酸デヒドロゲナーゼを用いた＜１＞記載のアデニンヌクレオチドの測定方法。
＜１１＞
酵素Ｅ2としてヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼ、酵素Ｅ3としてグルコースオキシダーゼを用いた＜１＞記載のアデニンヌクレオチドの測定方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のアデニンヌクレオチドの測定方法によれば、測定装置構造が簡便となり、更なる小型化かつ小消費電力な電気化学式の測定装置が提供でき、また、濁った試料でも容易に測定することができる。
さらに、前記工程Ａと、工程Ｂを一対となす反応系を複数回繰り返すことにより、ＡＴＰおよび脱リン酸化されたリン酸供与体量を増幅させ、脱リン酸化されたリン酸供与体をアデニンヌクレオチド量と換算して検出するため、感度良好に測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下に、本発明のアデニンヌクレオチドの測定方法の実施の形態を詳細に説明する。
下記は、本発明の測定方法の概略を示すスキームである。
【００１４】
【化３】
2007155713.tif 000004
【００１５】
本発明のアデニンヌクレオチドの測定方法または測定装置は、下記工程Ａ〜Ｃまたはそれらを行う手段を含む。
ＡＴＰを酵素Ｅ1によりＡＤＰに変換させる工程Ａ、
ＡＤＰおよびリン酸供与体Ｐ2を酵素Ｅ2によりＡＴＰおよび脱リン酸化されたリン酸供与体Ｐ2’に変換させる工程Ｂ、および
供与体Ｐ2’を酸化還元反応に供することで供与体Ｐ2’を電気化学的に測定する工程Ｃ。
【００１６】
尚、本発明において、アデニンヌクレオチドとは、主としてＡＴＰ（アデノシン三リン酸）、ＡＤＰ（アデノシン二リン酸）、ＡＭＰ（アデノシン一リン酸）、およびその類似体、の各々またはその組み合わせを示す。
また、本発明における測定とは、たとえば存在の有無を確かめる検出や、存在量を測る定量などを表す。
【００１７】
工程ＡでＡＴＰが酵素Ｅ1によりＡＤＰに変換され、工程ＢでＡＤＰおよびリン酸供与体Ｐ2が酵素Ｅ2によりＡＴＰおよび脱リン酸化されたリン酸供与体Ｐ2’に変換される。そして工程Ａと工程Ｂが一対となり、一対の反応がｎ回起きるとｎ個の脱リン酸化されたリン酸供与体Ｐ2’が生じる。このように、リン酸供与体Ｐ2を過剰に存在させることにより、反応系に存在するアデニンヌクレオチドの量（この場合はＡＴＰとＡＤＰの合計量）に比例して脱リン酸化されたリン酸供与体Ｐ2’が生じ、脱リン酸化されたリン酸供与体Ｐ2’の量を酸化還元反応により測定することで、検査対象中のアデニンヌクレオチドの量を求めることができる。
【００１８】
また、上述のように工程Ａと工程Ｂが一対となり繰り返し反応が生じるため、産出される脱リン酸化されたリン酸供与体Ｐ2’の量は時間にも比例して増えていく。これにより、ごく低濃度のサンプルであっても高い感度で測定することができる。
【００１９】
さらに、工程ＡはＡＭＰおよびＡＴＰを酵素Ｅ1により２個のＡＤＰに変換させる工程であることが好ましい。この場合、工程Ａおよび工程Ｂの酵素反応が一対となり、その一対の酵素反応をｎ回おこなうことで２n個の供与体Ｐ2’が生成するので、短時間で感度を大幅に向上できる。この場合、リン酸供与体Ｐ2に加えてＡＭＰの量を過剰量存在させることにより、検査対象中のＡＴＰおよびＡＤＰの合計量を測定することができる。
【００２０】
また、本発明においては、Ｃ工程を介することにより、電気化学的に測定することが可能となるため、簡単な装置を用いて短時間に測定することができる。
以下、各工程について詳述する。
【００２１】
まず、工程Ａについて詳述する。
工程Ａで使用する酵素Ｅ1として、上述のようにＡＴＰをＡＤＰに変換する酵素であれば特に限定されず、たとえば下記のようなものがあげられる。
【００２２】
１）ＥＣ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｄｅ)２．７．に属するリンを含む基を転移するＡＴＰからＡＤＰに変換する酵素
２）ＥＣ３．５．に属するペプチド結合以外のＣ−Ｎ結合に作用するＡＴＰからＡＤＰに変換する酵素
３）ＥＣ３．６．に属する酸無水物に作用するＡＴＰからＡＤＰに変換する酵素
４）ＥＣ４．１．に属する炭素−炭素結合に作用するＡＴＰからＡＤＰに変換する酵素
５）ＥＣ４．６．に属するリン−酸素結合に作用するＡＴＰからＡＤＰに変換する酵素
６）ＥＣ６．２．に属する炭素−硫黄結合を生成するＡＴＰからＡＤＰに変換する酵素
７）ＥＣ６．３．に属する炭素−窒素結合を生成するＡＴＰからＡＤＰに変換する酵素
８）ＥＣ６．４．に属するリン酸エステル結合を合成するＡＴＰからＡＤＰに変換する酵素
【００２３】
また、上記したようにＡＭＰとＡＴＰを基質として２ＡＤＰを作る酵素も好ましい。このような酵素としては、例えばミオキナーゼがあげられる。
【００２４】
次に工程Ｂについて詳述する。
工程Ｂにおいて、リン酸供与体Ｐ2は反応系に対して過剰に存在させることが必要である。ここで、過剰量とは、後述する電気化学的測定法に供するのに充分な量であり、測量対象および検体に応じて適宜設定することができる。
リン酸供与体Ｐ2は、ＡＤＰとともに酵素Ｅ2の基質となりＡＴＰおよび脱リン酸化されたリン酸供与体Ｐ2’となるものであれば特に制限されず、酵素Ｅ2とともに適宜選択される。
リン酸供与体Ｐ2および酵素Ｅ2の好ましい組み合わせについては後述する。
【００２５】
次に工程Ｃについて詳述する。
工程Ｃは、脱リン酸化されたリン酸供与体Ｐ2’を酸化還元反応に供することで供与体Ｐ2’を電気化学的に測定する工程である。
酸化還元反応は脱リン酸化されたリン酸供与体Ｐ2’に対して酸化型電子受容体Ｐ3を反応させることにより酸化して、脱リン酸化されたリン酸供与体Ｐ2’に、電子受容体が還元型Ｐ3’となることによって行われる。本発明においてはこの還元型の電子受容体の量もアデニンヌクレオチドの量に比例する（基本的に同じとなる）ので、還元型の電子受容体の量を電気化学的測定手段によって測定することで、アデニンヌクレオチドの量を知ることが可能となる。還元型の電子受容体は、電気化学的測定手段により再度酸化型の電子受容体となり、工程Ｃの反応に循環的に利用されることが好ましい。尚、酸化型の電子受容体についてもリン酸供与体Ｐ2と同様に反応系に過剰にある必要があるが、電子受容体が電気化学的測定手段によって再利用される場合はそれも鑑みて量を設定できる。
【００２６】
ここで酸化還元反応は好ましくは酵素Ｅ3によって触媒される酵素反応である。
酵素Ｅ3は、基質となる供与体Ｐ2’の種類により適宜選択される。
工程Ｃにおいて、電子受容体として電子メディエータを用いることが好ましい。
電子メディエータは、酸化還元酵素反応において、酵素と電極間の電子伝達を触媒する化合物であり、溶存酸素の存在しない試料の測定を可能となるので好ましい。
具体的には、たとえばフェリシアン化カリウム／フェロシアン化カリウムや１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチル硫酸塩（ｍＰＭＳ）などを用いることが好ましい。
【００２７】
また、該供与体Ｐ2’を酸素分子の消費する酸化還元反応に供し、消費された酸素量を検出することも、既存の酸素分子測定手段を利用できるので好ましい。
あるいは、該供与体Ｐ2’を過酸化水素の産生する酸化還元反応に供し、産生した過酸化水素を電気化学的に測定することも好ましい。
ここで、電気化学的測定手段としては、たとえば電流、電圧、電気量、インピーダンスなどを用いた測定手段があげられる。
電気化学的に測定することで、前述したように生物発光などの従来の測定手段に比べて簡単な装置を用いて測定することが可能となる。さらに、本願の測定手段で検出される電気化学的量を予め各基質量において測定して検量線を引いておくなどの方法で、任意の測定対象に含まれる基質を容易に定量することも可能となる。
【００２８】
以下に、リン酸供与体Ｐ2および酵素Ｅ2、ならびに酵素Ｅ3とその他の基質の好ましい組み合わせを示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２９】
（１）
Ｅ2：ピルビン酸キナーゼ
（ＡＤＰ＋ホスホエノールピルビン酸→ＡＴＰ＋ピルビン酸）
Ｅ3：ピルビン酸オキシダーゼ
（ピルビン酸＋Ｏ２＋リン酸＋Ｈ２Ｏ→アセチルリン酸＋Ｈ２Ｏ２＋ＣＯ２）
【００３０】
（２）
Ｅ2：ピルビン酸キナーゼ
（ＡＤＰ＋ホスホエノールピルビン酸→ＡＴＰ＋ピルビン酸）
Ｅ3：ピルビン酸デヒドロゲナーゼ
（ピルビン酸＋酸化型電子受容体＋リン酸→アセチルリン酸＋還元型電子受容体＋ＣＯ２）
【００３１】
（３）
Ｅ2：グルコキナーゼ
（ＡＤＰ＋Ｄ−グルコース６−リン酸→ＡＴＰ＋Ｄ−グルコース）
Ｅ3：グルコースオキシダーゼ
（Ｄ−グルコース＋Ｏ２→Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン＋Ｈ２Ｏ２）
【００３２】
（４）
Ｅ2：グルコキナーゼ
（ＡＤＰ＋Ｄ−グルコース６−リン酸→ＡＴＰ＋Ｄ−グルコース）
Ｅ3：ピラノースオキシダーゼ
（Ｄ−グルコース＋Ｏ２→２−デヒドロ−Ｄ−グルコース＋Ｈ２Ｏ２）
【００３３】
（５）
Ｅ2：グルコキナーゼ
（ＡＤＰ＋Ｄ−グルコース６−リン酸→ＡＴＰ＋Ｄ−グルコース）
Ｅ3：グルコースデヒドロゲナーゼ
（Ｄ−グルコース＋酸化型電子受容体→Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン＋還元型電子受容体）
【００３４】
（６）
Ｅ2：ガラクトキナーゼ
（ＡＤＰ＋α−Ｄ−ガラクトース１−リン酸→ＡＴＰ＋Ｄ−ガラクトース）
Ｅ3：ガラクトースオキシダーゼ
（Ｄ−ガラクトース＋Ｏ２→Ｄ−ガラクト−ヘキソジアルドース＋Ｈ２Ｏ２）
【００３５】
（７）
Ｅ2：グルコノキナーゼ
（ＡＤＰ＋６−ホスホ−Ｄ−グルコネート→ＡＴＰ＋Ｄ−グルコネート）
Ｅ3：グルコネート−２−デヒドロゲナーゼ
（Ｄ−グルコネート＋酸化型電子受容体→２−デヒドロ−Ｄ−グルコネート＋還元型電子受容体）
【００３６】
（８）
Ｅ2：デヒドログルコノキナーゼ
（ＡＤＰ＋６−ホスホ−２−デヒドロ−Ｄ−グルコネート→ＡＴＰ＋２−デヒドロ−Ｄ−グルコネート）
Ｅ3：グルコネート−２−デヒドロゲナーゼ
（２−デヒドロ−Ｄ−グルコネート＋還元型電子受容体→Ｄ−グルコネート＋酸化型電子受容体）
【００３７】
（９）
Ｅ2：デヒドログルコノキナーゼ
（ＡＤＰ＋６−ホスホ−２−デヒドロ−Ｄ−グルコネート→ＡＴＰ＋２−デヒドロ−Ｄ−グルコネート）
Ｅ3：デヒドログルコネートデヒドロゲナーゼ
（２−デヒドロ−Ｄ−グルコネート＋酸化型電子受容体→２，５−ジデヒドロ−Ｄ−グルコネート＋還元型電子受容体）
【００３８】
（１０）
Ｅ2：アデノシンキナーゼ
（ＡＤＰ＋ＡＭＰ→ＡＴＰ＋アデノシン）
Ｅ3：ヌクレオシドオキシダーゼ
（アデノシン＋２Ｏ２→９−リブロノシルアデニン＋２Ｈ２Ｏ２）
【００３９】
（１１）
Ｅ2：グリセロンキナーゼ
（ＡＤＰ＋グリセロンリン酸→ＡＴＰ＋グリセロン）
Ｅ3：グリセロールデヒドロゲナーゼ
（グリセロン＋還元型電子受容体→グルセロール＋酸化型電子受容体）
【００４０】
（１２）
Ｅ2：グリセロールキナーゼ
（ＡＤＰ＋ｓｎ−グリセロール３−リン酸→ＡＴＰ＋グリセロール）
Ｅ3：グリセロールデヒドロゲナーゼ
（グリセロール＋酸化型電子受容体→グリセロン＋還元型電子受容体）
【００４１】
（１３）
Ｅ2：コリンキナーゼ
（ＡＤＰ＋Ｏ−ホスホコリン→ＡＴＰ＋コリン）
Ｅ3：コリンオキシダーゼ
（コリン＋Ｏ２→ベタインアルデヒド＋Ｈ２Ｏ２）
【００４２】
（１４）
Ｅ2：コリンキナーゼ
（ＡＤＰ＋Ｏ−ホスホコリン→ＡＴＰ＋コリン）
Ｅ3：コリンデヒドロゲナーゼ
（コリン＋酸化型電子受容体→ベタインアルデヒド＋還元型電子受容体）
【００４３】
（１５）
Ｅ2：Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼ
（ＡＤＰ＋Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸→ＡＴＰ＋Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）
Ｅ3：Ｎ−アシルへキソサミンオキシダーゼ
（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン＋Ｏ２→Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミネート＋Ｈ２Ｏ２）
【００４４】
（１６）
Ｅ2：エタノールアミンキナーゼ
（ＡＤＰ＋Ｏ−ホスホエタノールアミン→ＡＴＰ＋エタノールアミン）
Ｅ3：エタノールアミンオキシダーゼ
（エタノールアミン＋Ｈ２Ｏ＋Ｏ２→グリコアルデヒド＋ＮＨ３＋Ｈ２Ｏ２）
【００４５】
（１７）
Ｅ2：β−グルコシドキナーゼ
（ＡＤＰ＋６−ホスホ−β−グルコシル−（１，４）−Ｄ−グルコース→ＡＴＰ＋セロビオース）
Ｅ3：セロビオースオキシダーゼ
（セロビオース＋Ｏ２→セロビオノ−１，５−ラクトン＋Ｈ２Ｏ２）
【００４６】
（１８）
Ｅ2：β−グルコシドキナーゼ
（ＡＤＰ＋６−ホスホ−β−グルコシル−（１，４）−Ｄ−グルコース→ＡＴＰ＋セロビオース）
Ｅ3：セロビオースデヒドロゲナーゼ
（セロビオース＋酸化型電子受容体→セロビオノ−１，５−ラクトン＋還元型電子受容体）
【００４７】
（１９）
Ｅ2：チアミンキナーゼ
（ＡＤＰ＋チアミンリン酸→ＡＴＰ＋チアミン）
Ｅ3：チアミンオキシダーゼ
（チアミン＋２Ｏ２→チアミン酢酸＋２Ｈ２Ｏ２）
【００４８】
（２０）
Ｅ2：キシリトールキナーゼ
（ＡＤＰ＋キシリトール５−リン酸→ＡＴＰ＋キシリトール）
Ｅ3：キシリトールオキシダーゼ      
（キシリトール＋Ｏ２→キシロース＋Ｈ２Ｏ２）
【００４９】
（２１）
Ｅ2：アスパラギン酸キナーゼ
（ＡＤＰ＋４−ホスホ−Ｌ−アスパラギン酸→ＡＴＰ＋Ｌ−アスパラギン酸）
Ｅ3：Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼ
（Ｌ−アスパラギン酸＋Ｈ２Ｏ＋Ｏ２→オキサロ酢酸＋ＮＨ３＋Ｈ２Ｏ２）
【００５０】
（２２）
Ｅ2：グルタミン酸５−キナーゼ
（ＡＤＰ＋Ｌ−グルタミン酸５−リン酸→ＡＴＰ＋Ｌ−グルタミン酸）
Ｅ3：Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ
（Ｌ−グルタミン酸＋Ｏ２＋Ｈ２Ｏ→２−オキソグルタレート＋ＮＨ３＋Ｈ２Ｏ２）
【００５１】
（２３）
Ｅ2：グルタミン酸１−キナーゼ
（ＡＤＰ＋α−Ｌ−グルタミルリン酸→ＡＴＰ＋Ｌ−グルタミン酸）
Ｅ3：Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ
（Ｌ−グルタミン酸＋Ｏ２＋Ｈ２Ｏ→２−オキソグルタレート＋ＮＨ３＋Ｈ２Ｏ２）
【００５２】
（２４）
Ｅ2：ケトヘキソキナーゼ
（ＡＤＰ＋Ｄ−フルクトース１リン酸→ＡＴＰ＋Ｄ−フルクトース）
Ｅ3：マンニトールデヒドロゲナーゼ
（Ｄ−フルクトース＋酸化型電子受容体→Ｄ−マンニトール＋還元型電子受容体）
【００５３】
（２５）
Ｅ2：フルクトキナーゼ
（ＡＤＰ＋Ｄ−フルクトース６−リン酸→ＡＴＰ＋Ｄ−フルクトース）
Ｅ3：マンニトールデヒドロゲナーゼ
（Ｄ−フルクトース＋酸化型電子受容体→Ｄ−マンニトール＋還元型電子受容体）
【００５４】
（２６）
Ｅ2：コリンキナーゼ
（ＡＤＰ＋Ｏ−ホスホコリン→ＡＴＰ＋コリン）
Ｅ3：コリンモノオキシゲナーゼ
（コリン＋Ｏ２＋２還元型電子受容体＋２Ｈ＋→ベタインアルデヒドハイドレート＋Ｈ２＋２酸化型電子受容体）
【００５５】
（２７）
Ｅ2：グルクロノキナーゼ
（ＡＤＰ＋１−ホスホ−α−Ｄ−グルクロネート→ＡＴＰ＋Ｄ−グルクロネート）
Ｅ3：イノシトールオキシゲナーゼ
（Ｄ−グルクロネート＋Ｈ２Ｏ→ミオ−イノシトール＋Ｏ２）
【００５６】
（２８）
Ｅ2：ウリジンキナーゼ
（ＡＤＰ＋ＵＭＰ→ＡＴＰ＋ウリジン）
Ｅ3：ピリミジン−デオキシヌクレオシド２’−ジオキシゲナーゼ
（ウリジン＋コハク酸塩＋ＣＯ２→２’−デオキシウリジン＋２−オキソグルタレート＋Ｏ２）
【００５７】
（２９）
Ｅ2：イノシトール３−キナーゼ
（ＡＤＰ＋１Ｄ−ミオ−イノシトール３リン酸→ＡＴＰ＋ミオ−イノシトール）
Ｅ3：イノシトールオキシゲナーゼ
（ミオ−イノシトール＋Ｏ２→Ｄ−グルクロネート＋Ｈ２Ｏ）
【００５８】
（３０）
Ｅ2：イノシンキナーゼ
（ＡＤＰ＋ＩＭＰ→ＡＴＰ＋イノシン）
Ｅ3：ヌクレオシドオキシダーゼ
（イノシン＋Ｏ２→９−リブロノシルハイポキサチン＋Ｈ２Ｏ）
【００５９】
（３１）
Ｅ2：アセテートキナーゼ
（ＡＤＰ＋アセチルリン酸→ＡＴＰ＋酢酸）
Ｅ3：アセチルアセトンジオキシゲナーゼ
（酢酸＋２−オキソプロパノール→ペンタン−２，４ジオン＋Ｏ２）
【００６０】
酵素Ｅ1〜Ｅ3は各々市販されているものを使用することもできるし、一般的な方法により生体から精製あるいは合成した酵素を使用することもできる。酵素の使用に際しては、安定化剤やｐＨ調整剤、緩衝剤等、使用する酵素の公知の最適環境に合わせて適宜調整することができる。
酵素Ｅ1〜Ｅ3の使用量は特に限定されない。
【００６１】
尚、本発明においては、工程Ａ〜Ｃを分離・精製等をさしはさまずに同一の反応系において行うことが簡便のため好ましい。
【００６２】
また、本発明の各酵素はそれぞれ反応系に溶解していてもよいし、固定化していてもよい。固定化については、たとえば、「生物化学実験法２８  バイオリアクター実験入門」（学会出版センター）等に記載の一般的な方法でおこなうこともできる。また、リン酸供与体Ｐ2などの基質も固定化されていてもよい。
固定化した反応系として、例えば薄膜に各基質や酵素が固定化されているものや、その積層体などがあげられる。
【００６３】
以下に、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００６４】
＜酵素反応式１＞  
工程Ａ：  ＡＴＰ  ＋  ＡＭＰ  →  ２ＡＤＰ  （酵素Ｅ1；ミオキナーゼ）
工程Ｂ：  ＡＤＰ  ＋  ホスホエノールピルビン酸  →  ピルビン酸  ＋ＡＴＰ  （酵素Ｅ２；ピルビン酸キナーゼ）
工程Ｃ：  ピルビン酸  ＋Ｏ2  ＋  リン酸  ＋  Ｈ2Ｏ  →  アセチルリン酸  ＋  Ｈ2Ｏ2  ＋ＣＯ2  （酵素Ｅ３；ピルビン酸オキシダーゼ）
【００６５】
上記酵素反応式１は、本発明の実施例１におけるアデニンヌクレオチドの一つであるＡＴＰの測定を行ったものを示している。
【００６６】
まず、ＡＴＰとＡＭＰをミオキナーゼの酵素反応により、２分子のＡＤＰに変換される（工程Ａ）。
次いで生成した２分子のＡＤＰおよび２分子のリン酸供与体であるホスホエノールピルビン酸をピルビン酸キナーゼと反応させることで、２分子のＡＴＰおよび脱リン酸化されたリン酸供与体である２分子のピルビン酸が生成される（工程Ｂ）。
工程Ａと工程Ｂを一対の反応系となし、複数回繰返し反応させることで、２のべき乗のＡＴＰおよびＡＴＰの生成に応じたピルビン酸が生じる。
ＡＴＰの増幅に応じて生成されたピルビン酸をＡＴＰ量と換算せしめ、ピルビン酸を酸素、リン酸およびＨ２Ｏ存在下で、ピルビン酸オキシダーゼと反応させることにより、アセチルリン酸、過酸化水素および二酸化炭素を生じ、ピルビン酸オキシダーゼによる反応で生じた過酸化水素を電気化学的に検出することで、ＡＴＰを検出する（工程Ｃ）。
【００６７】
（酵素電極の作製と評価）
０．１ｇ／ｍＬに調整した東洋合成工業製スチルバゾリウム化ビニルアルコール（ＰＶＡ−ＳｂＱ）１００μＬに、０．０１３ユニット、０．０３９ユニット、０．１３ユニット相当のＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ由来のピルビン酸オキシダーゼ溶液を混合し、その混合液１１．５μＬを直径３ｍｍのプラチナ（Ｐｔ）電極表面に滴下し、４℃で一晩放置することで、風乾させた。風乾後、蛍光灯の光を電極に１５分間照射することで光架橋し、ピルビン酸オキシダーゼ電極を作製した。
下記反応溶液１に対して、ピルビン酸オキシダーゼ電極、銀（Ａｇ）／塩化銀（ＡｇＣｌ）を参照電極、Ｐｔワイヤを対極とし、＋６００ｍＶの印加電位をかけて、各濃度のピルビン酸添加時の応答電流値を測定した。なお、測定条件としては、３７℃、ｐＨ７．０で行った。また、コントロールとして、ピルビン酸オキシダーゼを固定していないＰｔ電極についても同様の応答電流値を測定した。
【００６８】
＜反応溶液１＞
（イ）関東化学製  塩化マグネシウム六水和物；１０ｍＭ（終濃度）
（ロ）和光純薬製  フラビンアデニンジヌクレオチド二ナトリウムＮ水和物；０．０１ｍＭ（終濃度）
（ハ）ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製  塩化チアミンピロリン酸；０．２ｍＭ（終濃度）
（ニ）ｐＨ７．０  リン酸緩衝液；５０ｍＭ（終濃度）
【００６９】
評価を行った結果を図１に示した。図１中のＰＯはピルビン酸オキシダーゼを示す。
ピルビン酸オキシダーゼを固定していないＰｔ電極は、応答電流値が観察されなかったのに対し、ピルビン酸オキシダーゼを固定化した電極はそれぞれ、ピルビン酸濃度に応じた電流値の上昇が見られた。なお、０．０１３ユニット、０．０３９ユニットのピルビン酸オキシダーゼを固定したＰｔ電極は、ピルビン酸の検出限界が約２４μＭであった。それに対し、０．０１３ユニットのピルビン酸オキシダーゼを固定したＰｔ電極に関しては、ピルビン酸の検出限界が約６０μＭであった。
【００７０】
（増幅反応の検証）
本発明の工程Ａ（ミオキナーゼ）と工程Ｂ（ピルビン酸キナーゼ）が一対の反応系となし、複数回繰り返し反応させることでＡＴＰが増幅していることを確認した。
まず、下記の反応溶液２を２ｍＬ作製し、酵素反応を開始させた。反応開始後、それぞれのサンプルを１分毎に９０μＬ採取し、キッコーマン製ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光試薬９０μＬと反応させ、テルモ製ルミノメータでＡＴＰ濃度を測定した。
なお、測定条件は、ｐＨ７．０、室温（約２５℃）である。
【００７１】
＜反応溶液２＞
（イ）オリエンタル酵母製  酵母由来  ミオキナーゼ；０．０４７Ｕ／ｍＬ（終濃度）
（ロ）ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製  ウサギ筋肉由来  ピルビン酸キナーゼ；５．６Ｕ／ｍＬ（終濃度）
（ハ）和光純薬製  ホスホエノールピルビン酸；２ｍＭ（終濃度）
（ニ）関東化学製  塩化マグネシウム六水和物；１０ｍＭ（終濃度）
（ホ）和光純薬製  アデノシン一リン酸；１ｍＭ（終濃度）
（ヘ）和光純薬製  アデノシン三リン酸；１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ（終濃度）
（ト）ｐＨ７．０  リン酸緩衝液；５０ｍＭ（終濃度）
【００７２】
それぞれのサンプルがＡＴＰ濃度に応じて、異なった増幅がされている結果となった（図２）。したがって、工程Ａであるミオキナーゼによる酵素反応と、工程Ｂのピルビン酸キナーゼによる酵素反応を一対の反応系とし、複数回繰り返し反応させることで、ＡＴＰおよびピルビン酸が増幅されていることを示している。
【００７３】
（ＡＴＰの測定）
ピルビン酸オキシダーゼ電極は、東洋紡製Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ由来のピルビン酸オキシダーゼ０．０１５ユニットをＰＶＡ−ＳｂＱを用いて、前記同様の手順で固定したものを用いた。
反応溶液３を作製し、０．０１５ユニットを固定したピルビン酸オキシダーゼ電極に加え、銀（Ａｇ）／塩化銀（ＡｇＣｌ）を参照電極、Ｐｔワイヤを対極とし、＋６００ｍＶの印加電位をかけて、７分間反応させ、１分毎の応答電流値を測定した。なお、測定条件として、２５℃、ｐＨ７．０で、測定したＡＴＰ濃度は、３３３ｎＭ、３３ｎＭ、３ｎＭで行った。
【００７４】
＜反応溶液３＞
（イ）関東化学製  塩化マグネシウム六水和物；１０ｍＭ（終濃度）
（ロ）ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製  フラビンアデニンジヌクレオチド二ナトリウム塩；０．０１ｍＭ（終濃度）
（ハ）ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製  塩化チアミンピロリン酸；０．２ｍＭ（終濃度）
（ニ）和光純薬製  アデノシン一リン酸；０．３３ｍＭ（終濃度）
（ホ）和光純薬製  アデノシン三リン酸；３３３ｎＭ、３３ｎＭ、３．３ｎＭ（終濃度）
（ヘ）和光純薬製  ホスホエノールピルビン酸；０．３３ｍＭ（終濃度）
（ト）ＳＩＧＭＡ製  ニワトリ筋肉由来  ミオキナーゼ；０．５８Ｕ／ｍＬ（終濃度）
（チ）ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製  ウサギ筋肉由来  ピルビン酸キナーゼ；１．７３Ｕ／ｍＬ（終濃度）
（リ）ｐＨ７．０  リン酸緩衝液；５０ｍＭ（終濃度）
【００７５】
各サンプルは、反応開始２分後から応答電流が確認され、それぞれのＡＴＰ濃度に応じて、異なった曲線で、増幅されていることがわかる（図３）。以上のことから、上記工程Ａおよび工程Ｂを一対の反応系となし、複数回繰り返して反応させることによりＡＴＰが増幅され、増幅されたＡＴＰに応じて生成されたピルビン酸を工程Ｃによって酸化還元反応に供し、生じた過酸化水素を電気化学的に検出することで微量のＡＴＰをも電気化学的に測定可能であることがわかる。また、３３３ｎＭ、３３ｎＭ、３．３ｎＭのＡＴＰ濃度の異なるサンプルがそれぞれの異なった増幅をされていることから、ＡＴＰを定量的に測定することが可能であることを示している。
【実施例２】
【００７６】
＜酵素反応式２＞  
工程Ａ：  ＡＴＰ  ＋  ＡＭＰ  →  ２ＡＤＰ  （酵素Ｅ1；ミオキナーゼ）
工程Ｂ：  ＡＤＰ  ＋  ホスホエノールピルビン酸  →  ピルビン酸  ＋ＡＴＰ  （酵素Ｅ２；ピルビン酸キナーゼ）
工程Ｃ：  ピルビン酸  ＋  酸化型電子受容体  ＋  リン酸  →  アセチルリン酸＋還元型電子受容体＋ＣＯ２  （酵素Ｅ３；ピルビン酸デヒドロゲナーゼ）
【００７７】
上記酵素反応式２は、本発明の実施例２におけるアデニンヌクレオチドの測定を行ったものを示している。
実施例１では、工程Ｃの酵素Ｅ３としてピルビン酸オキシダーゼを用いているが、実施例２では、ピルビン酸デヒドロゲナーを用いている。また、工程Ｃの酸化還元反応に用いた電子受容体として、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチル硫酸塩（ｍＰＭＳ）を使用した。
【００７８】
（酵素電極の作製と評価）
０．０８４ユニット相当の東洋紡製Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のピルビン酸デヒドロゲナーゼを直径３ｍｍのプラチナ（Ｐｔ）電極表面に滴下し、４℃で一晩風乾した。風乾後、電極表面を和光純薬製２５％グルタルアルデヒド溶液の蒸気に約３０分間曝すことで、ピルビン酸デヒドロゲナーゼをＰｔ電極表面に固定化する。
固定化後、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ電極をｐＨ７．０の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に浸すことで、電極表面を平衡化させる。
最後にｐＨ７．０の５０ｍＭ  リン酸緩衝液に1時間浸すことで洗浄し、測定に用いる酵素電極とする。
下記反応溶液４に対して、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ電極、銀（Ａｇ）／塩化銀（ＡｇＣｌ）を参照電極、Ｐｔワイヤを対極とし、＋６００ｍＶの印加電位をかけて、各濃度のピルビン酸添加時の応答電流値を測定した。なお、測定条件としては、２５℃、ｐＨ７．０で行った。
【００７９】
＜反応溶液４＞
（イ）関東化学製  塩化マグネシウム六水和物；１０ｍＭ（終濃度）
（ロ）ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製  フラビンアデニンジヌクレオチド二ナトリウム塩；０．０１ｍＭ（終濃度）
（ハ）ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製  塩化チアミンピロリン酸；０．２ｍＭ（終濃度）
（ニ）同人化学研究所製  １−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチル硫酸塩；１０ｍＭ（終濃度）
（ホ）ｐＨ７．０  リン酸緩衝液；５０ｍＭ（終濃度）
【００８０】
評価を行った結果を図４に示した。
ピルビン酸デヒドロゲナーゼの電極評価の結果、ピルビン酸濃度に応じた電流値の上昇が見られた。なお、ピルビン酸の検出限界が約２０μＭであった。
【００８１】
（ＡＴＰの測定）
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ電極は、東洋紡製Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のピルビン酸デヒドロゲナーゼ０．０８４ユニットを、グルタルアルデヒド溶液による前記同様の手順で固定したものを用いた。
反応溶液５を作製し、０．０８４ユニットを固定したピルビン酸デヒドロゲナーゼ電極に加え、銀（Ａｇ）／塩化銀（ＡｇＣｌ）を参照電極、Ｐｔワイヤを対極とし、＋６００ｍＶの印加電位をかけて、３分間反応させ、１５秒毎の応答電流値を測定した。なお、測定条件として、２５℃、ｐＨ７．０で、測定したＡＴＰ濃度は、３μＭ、３３３ｎＭ、３３ｎＭのＡＴＰで行った。
【００８２】
＜反応溶液５＞
（イ）関東化学製  塩化マグネシウム六水和物；１０ｍＭ（終濃度）
（ロ）ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製  フラビンアデニンジヌクレオチド二ナトリウム塩；０．０１ｍＭ（終濃度）
（ハ）ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製  塩化チアミンピロリン酸；０．２ｍＭ（終濃度）
（ニ）和光純薬製  アデノシン一リン酸；０．３３ｍＭ（終濃度）
（ホ）和光純薬製  アデノシン三リン酸；３．３μＭ、３３３ｎＭ、３３ｎＭ（終濃度）
（ヘ）和光純薬製  ホスホエノールピルビン酸；０．３３ｍＭ（終濃度）
（ト）ＳＩＧＭＡ製  ニワトリ筋肉由来  ミオキナーゼ；０．２９Ｕ／ｍＬ（終濃度）
（チ）ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製  ウサギ筋肉由来  ピルビン酸キナーゼ；５．２Ｕ／ｍＬ（終濃度）
（リ）同人化学研究所製  １−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチル硫酸塩；１０ｍＭ（終濃度）
（ヌ）ｐＨ７．０  リン酸緩衝液；５０ｍＭ（終濃度）
【００８３】
それぞれのサンプルは、反応開始１分後から応答電流が確認され、実施例１同様にＡＴＰ濃度に応じた増幅曲線を得ることができた（図５）。以上のことから、工程Ｃにピルビン酸デヒドロゲナーゼを用い、電子受容体として人口電子メディエータを用いてもＡＴＰを検出できることが判明した。また、各ＡＴＰ濃度の異なるサンプルがそれぞれの異なった増幅をされていることから、ＡＴＰを定量的に測定することが可能であることを示している。
【００８４】
（ＡＤＰの測定）
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ電極は、東洋紡製Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のピルビン酸デヒドロゲナーゼ０．０９６ユニットを、グルタルアルデヒド溶液による前記同様の手順で固定したものを用いた。
反応溶液６を作製し、０．０９６ユニットを固定したピルビン酸デヒドロゲナーゼ電極に加え、銀（Ａｇ）／塩化銀（ＡｇＣｌ）を参照電極、Ｐｔワイヤを対極とし、＋６００ｍＶの印加電位をかけて、４分間反応させ、３０秒毎の応答電流値を測定した。なお、測定条件として、２５℃、ｐＨ７．０で行った。
また、これまでの実施例では、ＡＴＰの測定データを示してきたが、今回は、アデニンヌクレオチドの一つである３μＭ、３３３ｎＭ、３３ｎＭのＡＤＰを測定した。
【００８５】
＜反応溶液６＞
（イ）関東化学製  塩化マグネシウム六水和物；１０ｍＭ（終濃度）
（ロ）ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製  フラビンアデニンジヌクレオチド二ナトリウム塩；０．０１ｍＭ（終濃度）
（ハ）ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製  塩化チアミンピロリン酸；０．２ｍＭ（終濃度）
（ニ）和光純薬製  アデノシン一リン酸；０．３３ｍＭ（終濃度）
（ホ）和光純薬製  アデノシンニリン酸；３．３μＭ、３３３ｎＭ、３３ｎＭ（終濃度）
（ヘ）和光純薬製  ホスホエノールピルビン酸；０．３３ｍＭ（終濃度）
（ト）ＳＩＧＭＡ製  ニワトリ筋肉由来  ミオキナーゼ；０．２６６Ｕ／ｍＬ（終濃度）
（チ）ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製  ウサギ筋肉由来  ピルビン酸キナーゼ；３．３７Ｕ／ｍＬ（終濃度）
（リ）同人化学研究所製  １−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチル硫酸塩；１０ｍＭ（終濃度）
（ヌ）ｐＨ７．０  リン酸緩衝液；５０ｍＭ（終濃度）
【００８６】
結果、各ＡＤＰ濃度のサンプルは、これまでの実施例で測定したＡＴＰ同様の応答電流が確認され、それぞれのＡＤＰ濃度に応じた増幅曲線を得ることができた（図６）。以上のことから、微量のアデニンヌクレオチドを電気化学的に測定できることがいえる。
【実施例３】
【００８７】
実施例１および実施例２では、工程Ａにミオキナーゼ、工程Ｂにピルビン酸キナーゼ、工程Ｃにピルビン酸酸化酵素であるピルビン酸オキシダーゼおよびピルビン酸デヒドロゲナーゼを用いた系で微量のアデニンヌクレオチドを電気化学的に測定できることを示した。
実施例３では、工程Ａ、ＢおよびＣに用いる酵素としてそれぞれミオキナーゼ、ヘキソキナーゼ、グルコースオキシダーゼを用いた系でアデニンヌクレオチドが測定可能であることを示す。
【００８８】
＜酵素反応式１＞  
工程Ａ：  ＡＴＰ  ＋  ＡＭＰ  →  ２ＡＤＰ  （酵素Ｅ1；ミオキナーゼ）
工程Ｂ：  ＡＤＰ  ＋  Ｄ−グルコース−６−リン酸  →  Ｄ−グルコース  ＋ＡＴＰ  （酵素Ｅ２；ヘキソキナーゼ）
工程Ｃ：  Ｄ−グルコース  ＋  Ｏ2  →  Ｄ−グルコノ−１−ラクトン  ＋  Ｈ2Ｏ2  （酵素Ｅ３；グルコースオキシダーゼ）
【００８９】
（酵素電極の作製と評価）
３．７１ユニット、０．７４ユニット、０．３７ユニット、０．０７４ユニット相当のオリエンタル酵母製酵母由来のグルコースオキシダーゼを直径３ｍｍのプラチナ（Ｐｔ）電極表面に滴下し、４℃で一晩風乾した。風乾後、グルタルアルデヒド溶液を用いて、実施例２同様の手順で電極表面にグルコースオキシダーゼを固定した。
下記反応溶液７に対して、グルコースオキシダーゼ電極、銀（Ａｇ）／塩化銀（ＡｇＣｌ）を参照電極、Ｐｔワイヤを対極とし、＋６００ｍＶの印加電位をかけて、各濃度のグルコース添加時の応答電流値を測定した。なお、測定条件としては、２５℃、ｐＨ７．０で行った。
【００９０】
＜反応溶液７＞
（イ）関東化学製  塩化マグネシウム六水和物；１０ｍＭ（終濃度）
（ロ）ｐＨ７．０  リン酸緩衝液；５０ｍＭ（終濃度）
【００９１】
評価を行った結果を図７に示した。
それぞれの濃度のグルコースオキシダーゼを固定した電極は、グルコース濃度に応じた電流値の上昇が見られた。なお、３．７１ユニットのグルコースオキシダーゼを固定した電極の検出限界は、３μＭのグルコースであったのに対し、０．７４ユニット、０．３７ユニット、０．０７４ユニット固定した電極の検出限界は５０μＭ、０．０７４ユニット固定した電極に関しては、５００μＭであった。
【００９２】
（ＡＴＰの測定）
グルコースオキシダーゼ電極は、オリエンタル酵母製酵母由来のグルコースオキシダーゼ３．７１ユニットを前記同様の手順でグルタルアルデヒド溶液に固定したものを用いた。
反応溶液８を作製し、３．７１ユニットのグルコースオキシダーゼを固定した酵素電極に加え、銀（Ａｇ）／塩化銀（ＡｇＣｌ）を参照電極、Ｐｔワイヤを対極とし、＋６００ｍＶの印加電位をかけて、８分間反応させ、３０秒毎の応答電流値を測定した。なお、測定条件として、２５℃、ｐＨ７．０で、３μＭ、３３３ｎＭ、３３ｎＭのＡＴＰを測定した。
【００９３】
＜反応溶液８＞
（イ）関東化学製  塩化マグネシウム六水和物；１０ｍＭ（終濃度）
（ロ）和光純薬製  アデノシン一リン酸；０．３３ｍＭ（終濃度）
（ハ）和光純薬製  アデノシン三リン酸；３．３μＭ、３３３ｎＭ、３３ｎＭ（終濃度）
（ニ）和光純薬製  Ｄ−グルコース−６−リン酸一ナトリウム塩  ０．６６ｍＭ（終濃度）
（ホ）ＳＩＧＭＡ製  ニワトリ筋肉由来  ミオキナーゼ；２．３Ｕ／ｍＬ（終濃度）
（ヘ）オリエンタル酵母製  酵母由来  ヘキソキナーゼ；０．１８Ｕ／ｍＬ（終濃度）
（ト）ｐＨ７．０  リン酸緩衝液；５０ｍＭ（終濃度）
【００９４】
各ＡＴＰ濃度のサンプルは、反応開始２分後から応答電流が確認され、実施例１および２同様、それぞれのＡＴＰ濃度に応じた増幅曲線を得ることができた（図８）。以上のことから、実施例１および２で行った工程Ａにミオキナーゼ、工程Ｂにピルビン酸キナーゼを組み合わせたＡＴＰ増幅反応とは異なる酵素の組み合わせでもＡＴＰを測定可能である。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明にかかるアデニンヌクレオチドの測定方法は、測定装置構造が簡便となり、更なる小型化、小消費電力であり、濁りの原因となる物質の処理操作不要、感度良好な電気化学式アデニンヌクレオチド検査装置および酵素センサに応用できることを特徴とし、食品衛生分野における細菌などの微生物や、微生物汚染の温床となる食物残渣よる汚染の程度指標であるＡＴＰ検査の利用や、食品の成熟度や腐敗度などを含む食品の品質管理、水質浄化での水質検査などの利用として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】本発明の実施例１におけるピルビン酸オキシダーゼ電極を評価した結果を示す図である。
【図２】本発明の実施例１におけるＡＴＰの増幅を評価した結果を示す図である。
【図３】本発明の実施例１におけるピルビン酸オキシダーゼ電極を用いてＡＴＰを電気化学的に測定した結果を示す図である。
【図４】本発明の実施例２におけるピルビン酸デヒドロゲナーゼ電極を評価した結果を示す図である。
【図５】本発明の実施例２におけるピルビン酸デヒドロゲナーゼ電極を用いてＡＴＰを電気化学的に測定した結果を示す図である。
【図６】本発明の実施例２におけるピルビン酸デヒドロゲナーゼ電極を用いてＡＤＰを電気化学的に測定した結果を示す図である。
【図７】本発明の実施例３におけるグルコースオキシダーゼ電極を評価した結果を示す図である。
【図８】本発明の実施例３におけるグルコースオキシダーゼ電極を用いてＡＴＰを電気化学的に測定した結果を示す図である。
【図１】
2007155713.tif 000005
【図２】
2007155713.tif 000006
【図３】
2007155713.tif 000007
【図４】
2007155713.tif 000008
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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