(57)【要約】【課題】より小さい細胞に対しても操作を容易に行うことができ、低侵襲に細胞内の電位を測定する。【解決手段】試料細胞Ａの外部に接触状態に配置される第１電極１１と、試料細胞Ａの内部に挿入される第２電極１２と、第１電極１１と試料細胞Ａに挿入された第２電極１２との間の電位差を測定する測定手段１５とを備える電気生理測定装置１を提供する。【選択図】      図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料細胞の外部に接触状態に配置される第１電極と、
前記試料細胞の内部に挿入される第２電極と、
前記第１電極と前記試料細胞に挿入された前記第２電極との間の電位差を測定する測定手段とを備える電気生理測定装置。
【請求項２】
前記試料細胞を内部に保持する試料細胞保持手段を備え、
前記第１電極が前記試料細胞保持手段の底部に設けられている請求項１に記載の電気生理測定装置。
【請求項３】
前記第１電極が、前記資料細胞の水平断面より広い面状の電極である請求項２に記載の電気生理測定装置。
【請求項４】
前記第１電極が、前記試料細胞を観察するための光の光路を避けて配置されている請求項２に記載の電気生理測定装置。
【請求項５】
前記第１電極が、前記試料細胞を観察するための光の光路上に設けられた透明電極からなる請求項２に記載の電気生理測定装置。
【請求項６】
前記試料保持手段が、該試料保持手段の内部の第１電極と試料保持手段の外部とを絶縁する請求項２に記載の電気生理測定装置。
【請求項７】
前記第２電極が、前記試料細胞より細い先端部を有する針状の電極である請求項１に記載の電気生理測定装置。
【請求項８】
前記第２電極が、半導体材料を含む請求項１に記載の電気生理測定装置。
【請求項９】
前記第２電極は、前記試料細胞に挿入される先端部が露出され、他の部分が絶縁膜により被覆されている請求項１に記載の電気生理測定装置。
【請求項１０】
前記測定手段が、前記第２電極の前記試料細胞への挿入前後において測定された前記電気的特性の変化を測定する請求項１に記載の電気生理測定装置。
【請求項１１】
前記試料細胞に対して刺激を与えるための刺激信号を前記第２電極に加える刺激信号発生手段を備える請求項１に記載の電気生理測定装置。
【請求項１２】
前記第２電極が挿入される前記試料細胞を光学的に観察する光学的観察手段を備える請求項１に記載の電気生理測定装置。
【請求項１３】
試料細胞の外部に、第１電極を接触状態に配置する工程と、
前記試料細胞の内部に第２電極を挿入する工程と、
該第１電極と、前記試料細胞の内部に挿入された第２電極との間の電位差を検出する工程とを備える電気生理測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気生理測定装置および電気生理測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞内の信号の伝達や機能の発現を解析する方法として、膜電位や膜電流の変化を検出する方法（パッチクランプ法）が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
この方法は、ガラス管の先端を細胞に接触させて吸引するとともに、ガラス管の内部に電解液を貯留することにより、ガラス管内の電解液柱を細胞に密着状態に維持される電極として使用するものである。
【特許文献１】特開２００４−２９４２１１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、パッチクランプ法は、ガラス管を細胞に接触させて、細胞を吸引するものであるため、より小さい細胞に対して、細胞を吸引する操作が困難であるとともに、ガラス管の太さに限界があるという不都合がある。また、ガラス管が細くなると、より細胞膜を突き抜けやすくなり、また接触圧の制御も困難になることから、小さい細胞に対して、侵襲性が大きく操作が困難であるという問題がある。
【０００４】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、より小さい細胞に対しても操作を容易に行うことができ、低侵襲に細胞内の電位を測定することができる電気生理測定装置および電気生理測定方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、試料細胞の外部に接触状態に配置される第１電極と、前記試料細胞の内部に挿入される第２電極と、前記第１電極と前記試料細胞に挿入された前記第２電極との間の電位差を測定する測定手段とを備える電気生理測定装置を提供する。
【０００６】
上記発明においては、前記試料細胞を内部に保持する試料細胞保持手段を備え、前記第１電極が前記試料細胞保持手段の底部に設けられていることとしてもよい。
また、上記発明においては、前記第１電極が、前記資料細胞の水平断面より広い面状の電極であることとしてもよい。
また、上記発明においては、前記第１電極が、前記試料細胞を観察するための光の光路を避けて配置されていることとしてもよい。
【０００７】
また、上記発明においては、前記第１電極が、前記試料細胞を観察するための光の光路上に設けられた透明電極からなることとしてもよい。
また、上記発明においては、前記試料保持手段が、該試料保持手段の内部の第１電極と試料保持手段の外部とを絶縁することとしてもよい。
【０００８】
また、上記発明においては、前記第２電極が、前記試料細胞より細い先端部を有する針状の電極であることとしてもよい
また、上記発明においては、前記第２電極が、半導体材料を含むこととしてもよい。
【０００９】
また、上記発明においては、前記第２電極は、前記試料細胞に挿入される先端部が露出され、他の部分が絶縁膜により被覆されていることとしてもよい。
また、上記発明においては、前記測定手段が、前記第２電極の前記試料細胞への挿入前後において測定された前記電気的特性の変化を測定することとしてもよい。
【００１０】
また、上記発明においては、前記試料細胞に対して刺激を与えるための刺激信号を前記第２電極に加える刺激信号発生手段を備えることとしてもよい。
また、上記発明においては、前記第２電極が挿入される前記試料細胞を光学的に観察する光学的観察手段を備えることとしてもよい。
【００１１】
また、本発明は、試料細胞の外部に、第１電極を接触状態に配置する工程と、前記試料細胞の内部に第２電極を挿入する工程と、該第１電極と、前記試料細胞の内部に挿入された第２電極との間の電位差を検出する工程とを備える電気生理測定方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、より小さい細胞に対しても操作を容易に行うことができ、低侵襲に細胞内の電位を測定することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の第１の実施形態に係る電気生理測定装置１および電気生理測定方法について、図１〜図４を参照して説明する。
本実施形態に係る電気生理測定装置１は、図１に示されるように、細胞を観察するための顕微鏡装置２に備えられる。
【００１４】
顕微鏡装置２は、細胞を収容する容器３を載置するステージ４と、該ステージ４上の細胞を照明する照明装置５と、細胞において反射あるいは透過した光、あるいは細胞から発生した蛍光を観察する観察装置６と、ステージ４を駆動制御するステージコントローラ７と、照明装置５および観察装置６を制御する顕微鏡コントローラ８と、観察装置６により得られた画像を処理する画像処理装置９と、該画像処理装置９により処理された画像を表示する表示装置１０とを備えている。
【００１５】
前記照明装置５には、細胞に対して、観察装置６とは反対側から照明光を照射する透過照明光源５Ａおよび、該透過照明光源５Ａから発せられた照明光を細胞に集光するコンデンサレンズ５Ｃと、細胞に対して観察装置６と同一方向から照明光を照射する落射照明光源５Ｂとが備えられている。
また、観察装置６には、図示しない対物レンズを含む観察光学系と、該観察光学系を介した細胞からの光を撮像して画像を取得するＣＣＤ素子６Ａと、細胞からの光を直接観察するための接眼レンズ６Ｂとが備えられている。
【００１６】
本実施形態に係る電気生理測定装置１は、図２に示されるように、前記顕微鏡装置２のステージ４上に載置され、バッファ液あるいは培養液Ｌを貯留する前記容器３の底面に設けられた平板状の第１電極１１と、該第１電極１１上において培養される細胞Ａに対して上方から近接させられる第２電極１２と、該第２電極１２を移動させる駆動ユニット１３と、該駆動ユニット１３を制御する駆動ユニット制御回路１４と、前記第１電極１１および第２電極１２間の電位差を測定する測定回路１５とを備えている。
【００１７】
前記第１電極１１は、透明電極により構成され、その表面に細胞Ａが培養されるようになっている。
前記第２電極１２は、図２および図３に示されるように、先端に尖鋭な針部１２Ａを有するカンチレバー状に形成されている。第２電極１２は、シリコン基板１２Ｂの表面に導電膜１２Ｃを成膜することにより形成されている。シリコン基板１２Ｂ上に形成された導電膜１２Ｃは、先端の針部１２Ａにおいて細胞Ａの核Ｃ内に完全に収容される程度の寸法だけ露出させられ、それ以外の部分は絶縁膜１２Ｄによって被覆されている。第２電極１２は、取付部材１６により駆動ユニット１３に取り付けられている。
【００１８】
駆動ユニット１３は、Ｘ，Ｙ，Ｚ方向に針部１２Ａを移動させる、例えば、３軸の直線移動機構を備えている。容器３は、絶縁材料により構成され、内部の第１電極１１を外部に対して電気的に絶縁するようになっている。また、第１電極１１は接地されている。
【００１９】
前記測定回路１５は、図２に示されるように、第１電極１１と第２電極１２との間に接続されている。測定回路１５は、容器３底面の第１電極１１と、第２電極１２の針部１２Ａに露出している導電膜１２Ｃとの間に、刺激信号（活動電位）を発生させる刺激信号発生装置１５Ａと、刺激信号に対する応答を計測する電気信号測定装置１５Ｂとを備えている。
【００２０】
このように構成された本実施形態に係る電気生理測定装置１を用いた電気生理測定方法について、以下に説明する。
本実施形態に係る電気生理測定装置１を用いて、細胞Ａの膜電位を測定するには、ステージコントローラ７および顕微鏡コントローラ８を作動させ、ステージ４の作動により測定したい細胞Ａを顕微鏡観察下に配置する。そして、駆動ユニット制御回路１４の作動により駆動ユニット１３を作動させ、第２電極１２の針部１２Ａを細胞Ａの上方から細胞Ａに近接させる。
【００２１】
そして、このとき、第１電極１１と第２電極１２との間に接続された測定回路１５を作動させ、針部１２Ａの導電膜１２Ｃと第１電極１１との間の電気化学系のインピーダンスを測定する。
容器３の底面に設けられた第１電極１１が細胞Ａに接触することにより、細胞膜Ｂの電位が第１電極１１の電位（接地電位）に固定されている。そして、第２電極１２の針部１２Ａに設けた導電膜１２Ｃが細胞膜Ｂに接触するまでの間においては、図４に符号Ｐで示されるように、第２電極１２と細胞膜Ｂとの距離が変化しても、両者間のインピーダンスに変化はない。
【００２２】
さらに、第２電極１２を下降させて、針部１２Ａに設けた導電膜１２Ｃが細胞膜Ｂに接触すると、図４に符号Ｑで示されるように、第２電極１２と細胞膜Ｂとの間のインピーダンスが急激に変化する。そして、第２電極１２をさらに下降させて、針部１２Ａに設けた導電膜１２Ｃが細胞Ａの核Ｃ内に侵入すると、導電膜１２Ｃが細胞内電位となることにより、インピーダンスが所定値になる（符号Ｒ）。したがって、細胞Ａ内への針部１２Ａの挿入作業中に第１電極１１と第２電極１２との間のインピーダンスを測定して、電解液抵抗の変化を検出することにより、針部１２Ａに設けた導電膜１２Ｃの細胞Ａへの接触および侵入を精度よく検知することができる。
【００２３】
この場合において、本実施形態に係る電気生理測定方法によれば、針部１２Ａに設けた導電膜１２Ｃが細胞Ａ内に侵入したことが検知された後に、針部１２Ａの移動を停止し、再度、測定回路１５の作動により、活動電位を測定する。すなわち、測定回路１５内の刺激信号発生装置１５Ａの作動により、所定の刺激信号を発生し、電気信号測定装置１５Ｂの作動により、その刺激信号に対する応答信号を測定し、記録する。
【００２４】
本実施形態に係る電気生理測定装置１を用いた電気生理測定方法によれば、シリコン基板１２Ｂをベースとした先端の細い針部１２Ａを１本だけ細胞Ａ内に侵入させて測定を行うので、細胞Ａに対する侵襲性を低く抑えることができる。また、針部１２Ａの細胞Ａ内への侵入をインピーダンスの変化により容易に判断することができ、作業者によるばらつきが少なく、小さい細胞Ａに対しても安定した操作を行うことができるという利点がある。さらに、絶縁膜１２Ｄから露出する導電膜１２Ｃを極小さく制限でき、導電膜１２Ｃの露出部分全体を細胞Ａ内に侵入させて、ノイズが小さく安定した測定を行うことができる。
【００２５】
なお、本実施形態においては、第１電極１１と第２電極１２間のインピーダンスの変化により、針部１２Ａの細胞Ａ内への侵入を検知することとしたが、これに限定されるものではなく、針部１２Ａ先端の位置と、細胞Ａの位置とを光学的手段により確認しながら侵入を判別することとしてもよい。
【００２６】
また、第１電極１１として、その表面上で細胞Ａを培養する透明電極を採用した。これにより、第１電極１１および容器３底面を介した落射照明および透過照明が可能となる。これに代えて、第１電極１１としては不透明な電極を採用し、照明光が通過する光路を避けて配置することとしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る電気生理測定装置を示す全体構成図である。
【図２】図１の電気生理測定装置のカンチレバー近傍の構造を示す拡大図である。
【図３】図１の電気生理測定装置のカンチレバーに設けた針部の細胞への挿入動作を説明する図であり、（ａ）は接触前、（ｂ）は接触時、（ｃ）は侵入後の状態をそれぞれ示している。
【図４】図１の挿入動作に伴う第１電極と第２電極間のインピーダンス変化を示すグラフである。
【符号の説明】
【００２８】
Ａ  細胞（試料細胞）
１  電気生理測定装置
２  顕微鏡装置（光学的観察手段）
３  容器（試料細胞保持手段）
１１  第１電極（透明電極）
１２  第２電極
１２Ａ  針部（針状の電極）
１２Ｄ  絶縁膜
１５  測定回路（測定手段）
１５Ａ  刺激信号発生回路（刺激信号発生手段）
【図１】
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【図２】
2007322165.tif 000004
【図３】
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【図４】
2007322165.tif 000006