(57)【要約】      （修正有）【課題】ピラノースオキシダーゼ及びその製造方法、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該遺伝子が挿入された形質転換体、該酵素を用いた糖類の測定方法、糖類測定試薬組成物、糖類測定用バイオセンサ、ケト糖類の製造方法の提供。【解決手段】特定の塩基配列で表される遺伝子をエッシェリシア属に属する微生物に挿入して形質転換体とし、これを培養して培養物からピラノースオキシダーゼを採取することを特徴とするピラノースオキシダーゼの製造方法；かかる製造方法により得られるピラノースオキシダーゼ；該酵素をコードする遺伝子；該遺伝子を含有する組換えベクター；該遺伝子が挿入されており、かつ該遺伝子が発現している形質転換体；該酵素を用いる糖類の測定方法；該酵素を含有する糖類測定試薬組成物；該酵素を用いる糖類測定用バイオセンサ；該酵素を用いるケト糖類の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される遺伝子をエッシェリシア（Escherichia）属に属する微生物に挿入して形質転換体とし、これを培養して培養物からピラノースオキシダーゼを採取することを特徴とするピラノースオキシダーゼの製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の製造方法により製造されるピラノースオキシダーゼ。
【請求項３】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる請求項２に記載のピラノースオキシダーゼ。
【請求項４】
配列番号２で表されるアミノ酸において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつピラノースオキシダーゼ活性を有する請求項２に記載のピラノースオキシダーゼ。
【請求項５】
バシジオマイセタウス・フンギ（Basidiomycetous fungi）Ｎｏ．５２株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０１０６号）由来である請求項２〜４のいずれか１項に記載のピラノースオキシダーゼ。
【請求項６】
請求項2〜5のいずれか1項に記載のピラノースオキシダーゼをコードする遺伝子。
【請求項７】
配列番号１で表される請求項６に記載の遺伝子。
【請求項８】
配列番号１で表される遺伝子と６０%以上の相同性を有し、かつピラノースオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項１０】
請求項６〜８のいずれか１項に記載の遺伝子が挿入されており、かつ該遺伝子が発現している形質転換体。
【請求項１１】
宿主がエッシェリシア（Escherichia）属、バチルス（Bacillus）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、ピキア（Pichia）属に属する微生物である請求項１０に記載の形質転換体。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の形質転換体を培養し、培養物からピラノースオキシダーゼを採取することを特徴とするピラノースオキシダーゼの製造方法。
【請求項１３】
請求項２〜５のいずれか1項に記載のピラノースオキシダーゼを用いることを特徴とする糖類の測定方法。
【請求項１４】
糖類がグルコース又は１，５−アンヒドログルシトールである請求項１３に記載の糖類の測定方法。
【請求項１５】
請求項２〜５のいずれか1項に記載のピラノースオキシダーゼを含有する糖類測定試薬組成物。
【請求項１６】
糖類がグルコース又は１，５−アンヒドログルシトールである請求項１５に記載の糖類測定試薬組成物。
【請求項１７】
請求項２〜５のいずれか1項に記載のピラノースオキシダーゼを用いることを特徴とする糖類測定用バイオセンサ。
【請求項１８】
糖類がグルコース又は１，５−アンヒドログルシトールである請求項１７に記載の糖類測定用バイオセンサ。
【請求項１９】
請求項２〜５のいずれか1項に記載のピラノースオキシダーゼを用いることを特徴とするケト糖類の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピラノースオキシダーゼ、これをコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該遺伝子が挿入された形質転換体、該ピラノースオキシダーゼの製造方法、該ピラノースオキシダーゼを用いた糖類の測定方法、該ピラノースオキシダーゼを含有する糖類測定試薬組成物、該ピラノースオキシダーゼを用いる糖類測定用バイオセンサ、該ピラノースオキシダーゼを用いるケト糖類の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ピラノースオキシダーゼは、Ｄ-グルコースや他のアルドピラノースの２位の炭素を酸化し、２−ケト産物と過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素である。
ピラノースオキシダーゼは、抗生物質の生成（非特許文献１）や、フルクトースの工業生産（非特許文献２）への応用可能性が述べられている。またピラノースオキシダーゼは、グルコースバイオセンサーとしての利用が期待されている。ピラノースオキシダーゼによって生成した過酸化水素を、パーオキシダーゼやカタラーゼなどを共役させてから適切な発色系に供するなどして定量することにより、試料中のグルコースの酵素的な測定を行うことができる。具体的には、食品や体液などのグルコースの測定に用いることができる。特に、糖尿病診断検査などの臨床場面においては、血糖の検査法として有用であると期待されている。
【０００３】
従来から使用されているグルコースオキシダーゼと比較して、ピラノースオキシダーゼの利点としては、基質親和性が高いこと（非特許文献３）、並びにβ-Ｄ-グルコースのみならず、同時にα-Ｄ-グルコースにも作用するので、ムタロターゼを加える必要のないこと（非特許文献４）が挙げられる。さらに、ピラノースオキシダーゼは、糖尿病の血糖コントロールマーカーとして注目されている1,5-アンヒドログルシトールを基質とするため（非特許文献５）、糖尿病の診断薬として使用されている。
【非特許文献１】Koths et al.(1992) Carbohydr. Res. 232: 59-75
【非特許文献２】Shaked and Wolfe (1988) Methods Enzymol. 137: 599-615
【非特許文献３】Nishimura et al. (1996) J. Biotechnol. 52:11-20
【非特許文献４】Taguchi et al. (1985) J. Appl. Biochem. 7: 289
【非特許文献５】Yabuuchi et al. (1989) Clin. Chem. 35: 2039-2043
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、新規なピラノースオキシダーゼを提供することを目的とする。
また、本発明は、かかるピラノースオキシダーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該遺伝子が挿入された形質転換体、該ピラノースオキシダーゼの製造方法、該ピラノースオキシダーゼを用いた糖類の測定方法、該ピラノースオキシダーゼを含有する糖類測定試薬組成物、該ピラノースオキシダーゼを用いる糖類測定用バイオセンサ、該ピラノースオキシダーゼを用いるケト糖類の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、特定の担子菌が生産するピラノースオキシダーゼが、優れたピラノースオキシダーゼ活性を有する新規な酵素であり、かかる酵素を用いて、糖類、ケト糖類の測定が可能であり、またかかるピラノースオキシダーゼを用いて糖類測定用のバイオセンサを製造できることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、請求項１記載の発明は、配列番号１で表される遺伝子をエッシェリシア（Escherichia）属に属する微生物に挿入して形質転換体とし、これを培養して培養物からピラノースオキシダーゼを採取することを特徴とするピラノースオキシダーゼの製造方法を提供するものである。
また、請求項２記載の発明は、かかる製造方法により製造されるピラノースオキシダーゼを提供するものである。
また、請求項３記載の発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる請求項２記載のピラノースオキシダーゼを提供するものである。
また、請求項４記載の発明は、配列番号２で表されるアミノ酸において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつピラノースオキシダーゼ活性を有する請求項２に記載のピラノースオキシダーゼを提供するものである。
また、請求項５記載の発明は、バシジオマイセタウス・フンギ（Basidiomycetous fungi）Ｎｏ．５２株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０１０６号）由来である請求項２〜４のいずれか１項に記載のピラノースオキシダーゼを提供するものである。
また、請求項６記載の発明は、請求項2〜5のいずれか1項に記載のピラノースオキシダーゼをコードする遺伝子を提供するものである。
また、請求項７記載の発明は、配列番号１で表される請求項６に記載の遺伝子を提供するものである。
また、請求項８記載の発明は、配列番号１で表される遺伝子と６０%以上の相同性を有し、かつピラノースオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を提供するものである。
また、請求項９記載の発明は、請求項６〜８のいずれか１項に記載の遺伝子を含有する組換えベクターを提供するものである。
また、請求項１０記載の発明は、請求項６〜８のいずれか１項に記載の遺伝子が挿入されており、かつ該遺伝子が発現している形質転換体を提供するものである。
また、請求項１１記載の発明は、宿主がエッシェリシア（Escherichia）属、バチルス（Bacillus）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、ピキア（Pichia）属に属する微生物である請求項１０に記載の形質転換体を提供するものである。
また、請求項１２記載の発明は、請求項１０又は１１に記載の形質転換体を培養し、培養物からピラノースオキシダーゼを採取することを特徴とするピラノースオキシダーゼの製造方法を提供するものである。
また、請求項１３記載の発明は、請求項２〜５のいずれか1項に記載のピラノースオキシダーゼを用いることを特徴とする糖類の測定方法を提供するものである。
また、請求項１４記載の発明は、糖類がグルコース又は１，５−アンヒドログルシトールである請求項１３に記載の糖類の測定方法を提供するものである。
また、請求項１５記載の発明は、請求項２〜５のいずれか1項に記載のピラノースオキシダーゼを含有する糖類測定試薬組成物を提供するものである。
また、請求項１６に記載の発明は、糖類がグルコース又は１，５−アンヒドログルシトールである請求項１５に記載の糖類測定試薬組成物を提供するものである。
また、請求項１７に記載の発明は、請求項２〜５のいずれか1項に記載のピラノースオキシダーゼを用いることを特徴とする糖類測定用バイオセンサを提供するものである。
また、請求項１８に記載の発明は、糖類がグルコース又は１，５−アンヒドログルシトールである請求項１７に記載の糖類測定用バイオセンサを提供するものである。
また、請求項１９に記載の発明は、請求項２〜５のいずれか1項に記載のピラノースオキシダーゼを用いることを特徴とするケト糖類の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のピラノースオキシダーゼを用いれば、高い精度で糖類の測定が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明のピラノースオキシダーゼは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるものである。また、天然のタンパク質の中には、それを生産する生物種の違いや生態型の違いによる遺伝子の変異等に起因して、１又は数個のアミノ酸変異を有する変異タンパク質が存在することは周知である。したがって、本発明のピラノースオキシダーゼは、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつピラノースオキシダーゼ活性を有するピラノースオキシダーゼも含む。また、一般に、酵素の製造方法の相違によって、酵素に結合する糖鎖の構成、量が異なる。糖鎖の結合が多いタンパク質では、糖鎖部分が電子の移動を妨げるため、バイオセンサとして用いるためには、糖鎖を除去することが好ましい。本発明の製造方法により得られるピラノースオキシダーゼは、結合する糖鎖が実質的に０であり、バイオセンサとして極めて有用である。
【０００９】
本発明のピラノースオキシダーゼは、以下の理化学的性質を有することが好ましい。
（１）基質特異性：Ｄ−グルコースに対し最高の特異性を示し、６−デオキシ−Ｄ−グルコース、δ−Ｄ−グルコノラクトン、Ｌ−ソルボース、Ｄ−キシロースにも作用する。
（２）至適pHおよびpH安定性：pH5.5〜8.0の範囲で最高活性を有し、50℃、30分処理後、pH5.5〜9.0の間で安定である。
（３）至適温度および熱安定性：至適温度が60℃であり50℃までは失活が認められず、60℃、30分間処理後90％以上、70℃、30分間処理後50％以上の残存活性を有する。
（４）分子量：ゲル瀘過法により測定した分子量が約30万である。
（５）等電点：6.2
（６）阻害剤特異性：Ag+,Cu++,Hg++,Ni++,PCMB（ｐ−クロロマーキュリーベンゾエート）によって阻害される。Fe++によっては阻害されない。高濃度NaClによって阻害されない。
（７）Km値：3.1mM（Ｄ−グルコース）
【００１０】
本発明の遺伝子は、かかるピラノースオキシダーゼをコードする遺伝子であるが、好ましくは配列番号１で表される塩基配列からなる遺伝子である。さらに、配列番号１で表される塩基配列との相同性が、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、特に好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上であり、かつ、本発明のピラノースオキシダーゼとしての特性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む。なお、配列番号１で表される塩基配列中、１〜１９２９の配列が配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする配列であり、１９３０〜１９３２の配列は終止コドンに対応する配列である。
【００１１】
本発明のピラノースオキシダーゼは、本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法等は特に限定されず、天然のタンパク質、遺伝子工学的手法により組換えＤＮＡから発現させたタンパク質、あるいは化学合成タンパク質のいずれでもよい。このうち、本発明のピラノースオキシダーゼは、バシジオマイセタウス・フンギ５２株から採取されたもので、かつ遺伝子工学的手法により発現させることが簡便で収率が高く、また結合する糖鎖の量が実質的に０である点で好ましい。
【００１２】
本発明のピラノースオキシダーゼの遺伝子工学的手法を用いた製造方法の一例を、以下に説明する。
（ｍＲＮＡの取得）
担子菌、好ましくはバシジオマイセタウス・フンギ５２株を、細粉化して緩衝液で抽出した後ろ過する。上清に塩化リチウムを加えて沈澱させ、沈澱を回収してＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）処理水に溶解させた後ＤＮａｓｅで処理し、次いで上清を回収してＤＥＰＣ処理水に溶解させることにより、ｍＲＮＡを得ることができる。
【００１３】
（ＲＴ−ＰＣＲ）
得られたｍＲＮＡを鋳型として、制限酵素サイトをピラノースオキシダーゼ遺伝子の上流と下流にそれぞれデザインしたプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行い、ピラノースオキシダーゼ遺伝子を増幅させる。
【００１４】
（組換えベクターの作成）
組換えベクター作成用の発現ベクターは、発現させるタンパク質がそのままの形で生産されるもの、あるいはそのＮ末端またはＣ末端にヒスチジンのタグが付加された形で生産されるもの、あるいはＮ末端またはＣ末端にマルトース結合タンパク質やＧＳＴペプチドが融合された形で生産されるものなどから、適宜選択される。組換えベクターは、発現ベクターを上記制限酵素と同じ制限酵素を用いて切断して線状分子にした後、ＲＴ−ＰＣＲで得られたピラノースオキシダーゼ遺伝子を導入することにより作成することができる。
【００１５】
（形質転換体の作成）
本発明の遺伝子が組込まれた組換えベクターの宿主細胞への導入（形質転換（形質移入））は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、細菌（E. coli、Bacillus subtilis等）の場合は、例えばCohenらの方法（Proc.Natl.Acad.Sci. USA.、第６９巻、第２１１０頁、１９７２年）、プロトプラスト法（Mol.Gen.Genet.、第１６８巻、第１１１頁、１９７９年）やコンピテント法（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）、第５６巻、第２０９頁、１９７１年）によって、酵母（Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris等）の場合は、例えばハイネン（Hinnen）らの方法（Proc.Natl.Acad.Sci. USA.、第７５巻、第１９２７頁、１９７８年）やリチウム法（J.Bacteriol.、第１５３巻、第１６３頁、１９８３年）によって、動物細胞の場合は、例えば、グラハム（Graham）の方法（バイロロジー（Virology）、第５２巻、第４５６頁、１９７３年）によって、昆虫細胞の場合は、例えば、サマーズ（Summers）らの方法（Mol.Cell.Biol.、第３巻、第２１５６〜第２１６５頁、１９８３年）によってそれぞれ形質転換することができる。なお、形質転換は、上記組換えベクターによって発現させる必要はなく、例えば本発明のピラノースオキシダーゼ遺伝子を宿主細胞の染色体ＤＮＡに直接挿入し、発現させる手段を用いてもよい。本発明において、宿主は、エッシェリシア（Escherichia）属に属する微生物であることが好ましい。
【００１６】
（ピラノースオキシダーゼの発現、採取）
本発明のタンパク質は、上記の如く調整された発現ベクターを含む形質転換細胞を栄養培地で培養し、発現したピラノースオキシダーゼを採取することによって得ることができる。栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが例示されるが、本発明のピラノースオキシダーゼの基質となる栄養を使用した場合、過酸化水素が発生し、これが宿主細胞の性質に影響を及ぼすことも予想される。無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また、所望により他の栄養素（例えば無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。培養は、当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨ及び培養時間は、本発明のタンパク質が大量に生産されるように適宜選択される。
【００１７】
本発明の糖類測定試薬組成物は、本発明のピラノースオキシダーゼを必須成分として含むものであり、ピラノース、特にグルコース、１，５−アンヒドログルシトールの測定に適している。１，５−アンヒドログルシトールは、ヒト髄液及び血漿中に存在し、特に糖尿病の場合に血漿中の濃度が低下することが知られている。したがって、この１，５−アンヒドログルシトールをマーカーとして定量すれば、糖尿病の診断が可能である。
【００１８】
本発明の糖類測定試薬組成物は、測定しようとする糖類以外の糖類を除去する試薬（糖類除去剤）、過酸化水素検出用試薬と組合わせることが好ましい。以下、測定しようとする糖類として１，５−アンヒドログルシトールを例にして説明する。糖類の除去剤としては、ホウ酸結合樹脂、陰イオン交換樹脂及び陽イオン交換樹脂を組合せたものや、強塩基性の陰イオン交換樹脂と陽イオン交換樹脂を組合せたものが好ましい。強塩基性陰イオン交換樹脂又はホウ酸で検体を処理すると、１，５−アンヒドログルシトールは全く除去されずに糖類が選択的に除去され、１，５−アンヒドログルシトールを含む試料が得られる。
【００１９】
過酸化水素検出試薬としては、ペルオキシダーゼもしくはペルオキシダーゼ様活性物質と発色基質もしくは発色剤およびカップラー、ペルオキシダーゼとケイ光基質、ペルオキシダーゼと発光基質、フェリシアンイオンと発光基質の組み合せなどが例示される。過酸化水素を検出する方法としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP)を触媒酵素として、各種のＨＲＰ基質を過酸化水素で酸化するものであり、酸化反応の結果生成した色素、ケイ光物質や化学発光をそれぞれ吸光度測定、ケイ光測定及び発光測定すれば良い。
【００２０】
糖類測定試薬組成物は、全てを混合して単一の試薬としてもよく、相互に干渉する成分が存在する場合には、各成分を適宜な組み合せとなる様に分割してもよい。また、これらは、溶液状、もしくは粉末状試薬として調製してもよく、さらにこれらを濾紙もしくはフィルムなどの適当な支持体に含有させ試験紙もしくは分析用フィルムとして調製してもよい。なお、過塩素酸などの除タンパク剤や１，５−アンヒドログルシトール一定量を含有する標準試薬を添付してもよい。糖類測定試薬組成物中の酵素の量は、１試料当り０．５〜２０単位程度が好ましい。１，５−アンヒドログルシトールを定量するための検体は、例えば髄液、血漿、血清、尿などがあげられる。これらの検体中にはピラノースオキシダーゼと反応しうる、グルコースなどの糖類が存在するので、その糖類を除去した試料を用いることが好ましい。
【００２１】
本発明の糖類測定方法は、本発明のピラノースオキシダーゼを用いるものであり、ピラノース、特にグルコース、１，５−アンヒドログルシトールの測定に適しており、また、本発明の糖類測定試薬組成物を用いることが好ましい。以下、測定しようとする糖類として１，５−アンヒドログルシトールを例にして説明する。まず、検体を糖類除去剤で処理した試料、好ましくはさらに除タンパク処理も施した試料に電子受容体及びピラノースオキシダーゼを試料１ml当り酵素が好ましくは０．５〜１０単位、特に好ましくは１〜５単位となる量添加し、好ましくは４〜５０℃、特に好ましくは２５〜４０℃で、好ましくは０．５〜３時間、特に好ましくは０．５〜１時間インキュベートし、次いで生成する過酸化水素量を過酸化水素検出用試薬で測定し、別に作成した検量線から１，５−アンヒドログルシトールの量を求めればよい。
【００２２】
本発明のピラノースオキシダーゼを用いて糖類、好ましくはピラノース、特に好ましくはグルコース、１，５−アンヒドログルシトール測定用のバイオセンサを得ることができる。本発明のバイオセンサの一例を以下に示す。絶縁性基板上にスクリーン印刷などの方法により、電極系を形成し、この電極系上に親水性高分子、本発明のピラノースオキシダーゼ、および電子受容体を含有する反応層を形成する。このバイオセンサは、以下のようにして、試料中の基質濃度を定量し得る。まず、試料液をバイオセンサの反応層上に滴下することにより、反応層が溶解し、試料液中の基質と反応層内のピラノースオキシダーゼとの間で酵素反応が進行し、次いで、反応層内の電子受容体が還元される。酵素反応終了後、この還元された電子受容体を電気化学的に酸化することにより、このとき得られる酸化電流値から試料液中の基質濃度が定量される。
バイオセンサに用いる酵素が糖タンパクである場合、糖鎖部分が電子の移動を妨げるため、糖類を除去することが望ましい。糖タンパクから糖鎖を除去するため、例えばカビ由来の糖タンパク（酵素）をグリコシダーゼ等の糖類除去試薬で前処理を施すことが望ましい。しかしながら、本発明のピラノースオキシダーゼは、大腸菌等の原核生物で発現させると、元来糖鎖を実質的に含まないタンパクとなるため、容易にバイオセンサとして用いることが可能である。
【００２３】
本発明のピラノースオキシダーゼは酸化酵素であるから、これを用いて、適当なｐＨ、温度、好気的条件下で、ケト糖類を製造することができる。例えば、ピラノースオキシダーゼを用いて、３−デオキシ−Ｄ−グルコースを３−デオキシグルコソンに、Ｄ−グルコースをＤ−グルコソンに転換することができる。
【００２４】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２５】
（ピラノースオキシダーゼ生産菌の培養）
バシジオマイセタウス・フンギ５２株を、以下の条件で培養した。
◎培地組成
乳糖：４．０％、脱脂大豆：３．０％、ＣＳＬ：１．０％、グリシン：０．２％、アデカノール：０．１％、クロラムフェニコール：５０mg／L（ｐＨ６．０）
◎培養条件
試験管（直径２．２ｃｍ×長さ１９．５ｃｍ）８本に上記培地を１０ｍＬずつ分注し、１２１℃で２０分間殺菌して冷却した後、上記菌株を一白金耳ずつ接種し、２５℃で２４時間振盪培養して、種培養液を調製した。
次いで、５Ｌジャーに上記培地を４Ｌ充填し、１２１℃で２０分間殺菌して冷却した後、上記種培養液を添加し、通気量１ｖ／ｖ／ｍ、回転数３５０ｒｐｍ、２５℃で１３０時間培養を行った。ピラノースオキシダーゼ活性が上昇中の培養開始から９５時間後に湿菌体３ｇを採取し、ｍＲＮＡの調製に供した。
【００２６】
（ｍＲＮＡの取得）
以下に示す通り、ＣＬＯＮＴＥＣ社のＥｘｔｒａｃｔ−Ａ−Ｐｌａｎｔ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ＫｉｔのＴｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ法に基づいてｍＲＮＡの調製を行った。
上記で得られた湿菌体３ｇを、冷蒸留水で洗浄した後乾燥し、液体窒素で凍結して凍結乾燥菌体を得た。この菌体を粉砕し、Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５ｍＬとフェノール５ｍＬを加えて８０℃でインキュベートした。上清を回収し、フェノール５ｍＬとクロロホルム・イソアミルアルコール５ｍＬを加えてインキュベートし、上清を回収した。次いで、４Ｍ塩化リチウムを５ｍＬ加え、−８０℃で凍結した。これを溶解し、沈澱を回収した。回収した沈澱に７０％エタノール２ｍＬを加えて乾燥後、ＤＥＰＣ処理水５００μＬに溶解した。これをＤＮａｓｅ処理した後、水飽和フェノール５００μＬとクロロホルム・イソアミルアルコール５００μＬを加えて上清を回収した。これにエタノールを加えて沈澱させたものをＤＥＰＣ処理水２００μＬに溶解した。この結果、湿菌体３ｇより４５４μｇのｍＲＮＡ（約４．５μｇ／μＬ）が得られた。
【００２７】
（プライマーの作製）
上記で得られたｍＲＮＡの部分塩基配列を参考にして、上流と下流にそれぞれ制限酵素ＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩサイトをデザインした、ＲＴ−ＰＣＲのための合成プライマーを作製した。配列番号３で表される配列をセンスプライマー、配列番号４で表される配列をアンチセンスプライマーとして用いた。
【００２８】
（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＲＴ−ＰＣＲは、ＴａＫａＲａ製ＲＮＡ  ＬＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．１．１を用い、以下の手順で行った。
ｍＲＮＡ０．４５μｇに、ＲＮａｓｅフリーの蒸留水８．５μＬとオリゴｄＴアダプタープライマー１μＬ（０．１２５μＭ）を加えた。次いで、これに塩化マグネシウム４μＬ（５ｍＭ）、１０×ＲＮＡ  ＰＣＲ  緩衝液２μＬ、ｄＮＴＰフリーの蒸留水８．５μＬ、ＲＮａｓｅインヒビター０．５μＬ（１Ｕ／μＬ）、逆転写酵素１μＬ（０．２５Ｕ／μＬ）を加えて、７０℃１０分、４２℃３０分、９９℃５分、５℃５分の熱履歴を加えた。次いで、これに塩化マグネシウム６μＬ（２．５ｍＭ）、１０×ＬＡ  ＰＣＲ緩衝液（ＩＩ）８μＬ、滅菌蒸留水６３．５μＬ、センスプライマー１μＬ（０．２μＭ）、アンチセンスプライマー１μＬ（０．２μＭ）、ＬＡ  Ｔａｑ０．５μＬ（２．５Ｕ／１００μＬ）を加え、９４℃２分加熱後、９４℃３０秒、５５℃３０分、７２℃１分の熱履歴を２８サイクル行い、増幅産物を得た。これを１．５％アガロースゲル電気泳動にかけたところ、予想される約１．９ｋｂｐのＲＴ−ＰＣＲ産物が増幅し、配列解析の結果、ピラノースオキシダーゼ遺伝子が確認された（図１）。
【００２９】
（発現用プラスミドの構築）
ｐＥＴ２１ａ（＋）（５．４ｋｂｐ）をＥｃｏＲＩ及びＮｄｅＩで切断し、上記で得られた、上流側にＮｄｅＩ、下流側にＥｃｏＲＩサイトが結合したピラノースオキシダーゼ遺伝子（１．９ｋｂｐ）を連結させ、発現用プラスミドを構築した。
【００３０】
（大腸菌での発現）
上記で得られたピラノースオキシダーゼ遺伝子を組み込んだｐＥＴ２１ａ（＋）を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地で３７℃で培養を行った。６６０ｎｍでの吸光値が約０．５になったときにＩＰＴＧを０．１ｍＭになるように添加し、ピラノースオキシダーゼの発現を誘導した。１５時間後、遠心分離を行って集菌し、菌体を２０ｍＭリン酸緩衝液（ＫＰＢ）（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波破砕を行って無細胞抽出液を調製した。次いで、以下の方法でピラノースオキシダーゼ活性を測定した。
（ピラノースオキシダーゼ活性測定方法）
水２．４ｍＬ、１Ｍ  ＫＰＢ（ｐＨ７．０）０．１ｍＬ、ペルオキシダーゼ（１００Ｕ／ｍＬ）０．１ｍＬ、４−アミノアンチピリン（２４．６ｍＭ）０．１ｍＬ、フェノール（４２０ｍＭ）０．１ｍＬの混合液に、上記で得られた試料０．１ｍＬを加えて３７℃で１分間インキュベートした。次いで、これにＤ−グルコース（１Ｍ）０．１ｍＬを加えて、５００ｎｍにおけるΔＯＤを測定し、初速度法により、以下の算出式を用いて活性を算出した。
【００３１】
【数１】
2007300818.tif 000002
【００３２】
その結果、上記培養液１ｍＬあたり０．２Ｕのピラノースオキシダーゼ活性が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明は、糖製造、生体物質の測定等の技術分野で利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ＲＴ−ＰＣＲにより増幅した産物をアガロースゲル電気泳動で分析した結果を示す。
【図１】
2007300818.tif 000003
【配列表】
2007300818000001.app