(57)【要約】【課題】糸状菌の固体培養において、培養時間の経過とともに不安定となり易い分生子の生菌数および生菌率を安定させ、効率的に分生子を生産することのできる培養方法を提供すること。【解決手段】固体物および植物オイルを含む培地で糸状菌を培養する、糸状菌の培養方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体物および植物オイルを含む培地で糸状菌を培養する、糸状菌の培養方法。
【請求項２】
固体物が、麹、小麦フスマ、および米からなる群より選択される１種以上である、請求項１記載の培養方法。
【請求項３】
植物オイルが、ライスオイル、コーンオイル、およびベニバナオイルからなる群より選択される１種以上である、請求項１又は２記載の培養方法。
【請求項４】
培地が、固体物１００重量部に対して植物オイル２〜２５重量部を含むことを特徴とする、請求項１〜３いずれか記載の培養方法。
【請求項５】
糸状菌が、昆虫病原性糸状菌または植物病原性糸状菌である、請求項１〜４いずれか記載の培養方法。
【請求項６】
糸状菌が、ボーベリア属、メタリジウム属、ノムラエア属、ベルチシリウム属、トリコデルマ属、グリオクロディウム属、ケトミウム属、非病原性フサリウム属、放線菌ストレプトマイセス属、およびドレクスレラ属からなる群より選択される１種以上に属する糸状菌である、請求項１〜５いずれか記載の培養方法。
【請求項７】
糸状菌が、ボーベリア・バッシアナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａ）、ボーベリア・ブロンニアティ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂｒｏｎｇｎｉａｒｔｉｉ）、ボーベリア・アモルファ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ａｍｒｐｈａ）、メタリジウム・アニソプリェ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）、ノムラエア・リライ（Ｎｏｍｕｒａｅａ  ｒｅｌｅｙ）、およびベルチシリウム・レカニー（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｍ  ｌｅｃａｎｉｉ）からなる群より選択される１種以上の糸状菌である、請求項１〜６いずれか記載の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糸状菌の培養方法に関する。更に詳しくは、本発明は、固体物と植物オイルを含む培地を使用することを特徴とする、糸状菌の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
農林園芸における病害虫の防除には、一般的に化学農薬を使用する場合が多い。しかし、化学農薬には、病害虫の防除に働くばかりでなく、人や家畜といった他の生物にも害を与える可能性があり、また環境に対しても悪影響を与える可能性があるという問題があった。
【０００３】
そこで近年、昆虫病原性菌や植物病原性菌を利用した微生物農薬が注目され、一部で使用されている。例えば、糸状菌に関しては、甲虫類やシロアリに殺虫効果のあるボーベリア・ブロンニアティ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂｒｏｎｇｎｉａｒｔｉｉ）、鱗翅目害虫等に殺虫効果のあるボーベリア・バッシアナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａ）、その他にも、ボーベリア・アモルファ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ａｍｒｐｈａ）、メタリジウム・アニソプリェ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）、ベルチシリウム・レカニー（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｍ  ｌｅｃａｎｉｉ）等の製剤が開発されている。
【０００４】
これらの糸状菌製剤は、糸状菌が生きた状態で活性を示す場合がほとんどである。しかし、糸状菌、特に昆虫病原性糸状菌は、自然環境中における安定性が極めて悪い。この問題を解決するために、例えば、保存時および輸送時の糸状菌およびその分生子の安定性を高めるべく、包装材を用いて保存する方法等が開示されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
昆虫病原性糸状菌の昆虫に対する致死機構は、その分生子が昆虫の皮膚表面に付着することではじまる。分生子は皮膚表面で菌糸を伸張し、皮膚を貫通して体内に伸張する。そして体内では、昆虫の体液中で、短菌糸の状態で分裂増殖を繰り返す。この間に、昆虫は体内の栄養分と水分を奪われ、死に至る。昆虫の死後、再び菌は体表外に菌を貫通して分生子を形成する。すなわち、病害虫に対する防除性を得るためには、糸状菌の生きた分生子が必要である。また同様に、植物病原性糸状菌においても、生きた分生子が有効成分となる。
【０００６】
糸状菌は製剤化目的で培養される場合、分生子を生産させる目的から、通常、小麦フスマや米殻、大豆粉等の固体物を含む培地で固体培養される。菌は固体培地上で菌糸を伸ばし、分生子柄を形成して、そこに約１０μｍ前後の分生子を生育させる。しかし、分生子を生産させるための糸状菌の固体培養において、その分生子の生菌数および生菌率は、培養時間の経過とともに非常に不安定となり易いという大きな問題点があった。
【０００７】
【特許文献１】特表平７−５０８６４５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、糸状菌の固体培養において、培養時間の経過とともに不安定となり易い分生子の生菌数および生菌率を安定させ、効率的に分生子を生産することのできる培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、糸状菌を固体培養する際に、植物オイルを添加することで、有効成分である分生子の生産を安定させ、その生菌数および生菌率を高く維持させることができることを見出した。
【００１０】
即ち、本発明は、
[１] 固体物および植物オイルを含む培地で糸状菌を培養する、糸状菌の培養方法；
[２] 固体物が、麹、小麦フスマ、および米からなる群より選択される１種以上である、[１]記載の培養方法；
[３] 植物オイルが、ライスオイル、コーンオイル、およびベニバナオイルからなる群より選択される１種以上である、[１]又は[２]記載の培養方法；
[４] 培地が、固体物１００重量部に対して植物オイル２〜２５重量部を含むことを特徴とする、[１]〜[３]いずれか記載の培養方法；
[５] 糸状菌が、昆虫病原性糸状菌または植物病原性糸状菌である、[１]〜[４]いずれか記載の培養方法；
[６] 糸状菌が、ボーベリア属、メタリジウム属、ノムラエア属、ベルチシリウム属、トリコデルマ属、グリオクロディウム属、ケトミウム属、非病原性フサリウム属、放線菌ストレプトマイセス属、およびドレクスレラ属からなる群より選択される１種以上に属する糸状菌である、[１]〜[５]いずれか記載の培養方法；ならびに
[７] 糸状菌が、ボーベリア・バッシアナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａ）、ボーベリア・ブロンニアティ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂｒｏｎｇｎｉａｒｔｉｉ）、ボーベリア・アモルファ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ａｍｒｐｈａ）、メタリジウム・アニソプリェ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）、ノムラエア・リライ（Ｎｏｍｕｒａｅａ  ｒｅｌｅｙ）、およびベルチシリウム・レカニー（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｍ  ｌｅｃａｎｉｉ）からなる群より選択される１種以上の糸状菌である、[１]〜[６]いずれか記載の培養方法
に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、糸状菌の固体培養において、培養時間の経過とともに不安定となり易い糸状菌の分生子の生菌数および生菌率を安定させ、生きた分生子を効率よく生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の糸状菌の培養方法は、固体物を主として含有する培地（固体培地）を使用する培養（固体培養）方法である。本発明の糸状菌の培養方法に使用される固体培地に主として含有される固体物としては、糸状菌が培養可能なものであれば特に限定はされないが、例えば、麹、小麦粉、小麦フスマ、米、米殻、大豆粉、木粉、タバコ粉、デンプン、セルロース、シクロデキストリン等が例示される。これらは１種で用いてもよく、または２種以上を組み合わせて用いてもよい。また、これらの中では、自然分解効率の観点から、麹、小麦フスマ、米からなる群より選択される１種以上が好ましい。
【００１３】
本発明の糸状菌の培養方法に使用される固体培地は、植物オイルを含有することを特徴とするものである。植物オイルを含有する固体培地を使用することによって、本発明の糸状菌の培養方法は、従来ならば培養時間の経過とともに不安定になり易い分生子の生菌数および生菌率を安定させることができる。本発明の糸状菌の培養方法に使用される固体培地に含有される植物オイルとしては、特に限定されるものではないが、例えば、ライスオイル、コーンオイル、ベニバナオイル、大豆オイル、菜種オイル等が挙げられる。これらは１種で用いてもよく、または２種以上を組み合わせて用いてもよい。これらの中では、糸状菌の安定培養の観点から、ライスオイル、コーンオイル、およびベニバナオイルからなる群より選択される１種以上が好ましい。これらの植物オイルは、例えば市販されているものを使用することができる。
【００１４】
本発明の糸状菌の培養に使用される固体培地中における固体物と植物オイルの含有割合としては、分生子の生産安定性や生菌数の維持の観点から、固体物１００重量部に対して、植物オイル２〜２５重量部であることが好ましく、５〜２０重量部であることがより好ましい。
【００１５】
本発明の糸状菌の培養方法に使用される固体培地には、通常、上記の固体物、植物オイルの他に、水が含有される。本発明に使用される水の種類としては、特に限定されるものではないが、例えば、滅菌水、蒸留水などが使用される。
【００１６】
固体培地中の水の含有量としては、特に限定はされないが、適度な水分保持による通気性維持の観点から、植物オイルと水の合計重量が固体物の重量と等しくなるような、水の量であることが好ましい。
【００１７】
また、固体培地には更に、所望に応じて、その他の成分、例えば糖分、窒素源等が含有されていてもよい。培地中のこれらの成分の含有量は、本発明の効果を損なわない程度であれば特に限定されず、所望に応じて含有されればよい。
【００１８】
本発明の糸状菌の培養方法に使用する固体培地は、例えば、上記のような固体物に、植物オイル、水、および任意にその他の成分を添加して混合することによって調製することができる。これらの添加順序は限定されるものではなく、全てを同時に混合してもよい。調製された固体培地は、培養に使用される前にオートクレーブ等により滅菌されることが好ましい。
【００１９】
また、本発明において培養対象となる糸状菌としては、固体培地によって培養することのできる糸状菌であれば特に限定はされないが、本発明によれば生きた分生子が効率よく生産されることから、生きた分生子が微生物農薬等として有効な糸状菌が好適である。具体的には、例えば、昆虫病原性糸状菌、植物病原性糸状菌等が挙げられる。より具体的には、ボーベリア属、メタリジウム属、ノムラエア属、ベルチシリウム属、トリコデルマ属、グリオクロディウム属、ケトミウム属、非病原性フサリウム属、放線菌ストレプトマイセス属、およびドレクスレラ属からなる群より選択される１種以上に属する糸状菌が挙げられる。更に具体的には、ボーベリア・バッシアナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａ）、ボーベリア・ブロンニアティ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂｒｏｎｇｎｉａｒｔｉｉ）、ボーベリア・アモルファ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ａｍｒｐｈａ）、メタリジウム・アニソプリェ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）、ノムラエア・リライ（Ｎｏｍｕｒａｅａ  ｒｅｌｅｙ）、およびベルチシリウム・レカニー（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｉｍ  ｌｅｃａｎｉｉ）からなる群より選択される１種以上の糸状菌が挙げられる。
【００２０】
本発明の糸状菌の培養（固体培養）は、上記のようにして得られた固体培地に、事前に前培養することにより得られた糸状菌を接種して行うことが好ましい。前培養は、本培養と同様の、またはポテトデキストロース寒天培地等を用いた固体培養であってもよいし、後述のような液体培養であってもよい。いずれかの方法で得られた前培養物を、固体培地１００重量部あたり、１０重量部程度接種することが好ましい。培養温度は、好ましくは１０〜３５℃、より好ましくは２０〜３０℃、更に好ましくは２５〜２８℃である。培養時間は、後述するような好ましい生菌数を得る観点から、好ましくは５〜１４日、より好ましくは６〜１０日培養される。
【００２１】
なお、本発明における糸状菌の培養は、上記のように先に植物オイルを含有する固体培地を調製し、その固体培地を使用することによって行ってもよいが、先ず植物オイルを含有しない固体培地を調製し、培養前または培養途中に、植物オイルを該固体培地に添加する培養方法もまた、本発明の範囲に含まれる。その場合、固体培地中の固体物と添加される植物オイルとの重量比は、上記したような割合となることが好ましい。
【００２２】
本発明の培養方法によって得られる糸状菌の、固体培養物あたりの分生子密度については特に限定されないが、その生菌数としては、乾燥培養物１ｇあたり１×１０８個以上が好ましく、１×１０９個以上がより好ましく、１×１０１０個以上が更に好ましい。本明細書中において、生菌数とは、生きた分生子数と同意である。生菌数は、例えば寒天平板希釈法等により求めることができる。また、生菌率としては、４０％以上が好ましく、５０％以上がより好ましい。生菌率は、例えば顕微鏡下トーマの血球計算板で計測した分生子の全数に対する生菌数の比率として求めることができる。
【００２３】
また、本発明の糸状菌の培養方法においては、前記のように、糸状菌は固体培地に接種される前に、液体培地によって前培養されていることが好ましい。液体培養は菌糸の生育速度が速いことから、液体培養によって、望ましい量の分生子の生産に必要な量の糸状菌菌体の生産を速やかに行ない、次いで固体培養で分生子形成を行わせることによって、より短期間に大量の分生子を生産させることができる。この場合、液体培地としては、糸状菌の液体培養に従来使用されているものを用いればよく、また、液体培養の条件は、培養対象の糸状菌や液体培地成分等によっても異なるが、それぞれに従来知られている条件で培養されればよい。
【実施例】
【００２４】
以下の実施例において、生菌数は、寒天平板希釈法により求め、また、生菌率は、顕微鏡トーマの血球計算板で計測した分生子の全数に対する生菌数の比率として求めた。
【００２５】
実施例１
ボーベリア・バッシアナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａ）を、コーンスチープリカー４重量％、グルコース２重量％を含む液体培地で、２５℃で３日間、液体培養した。次いで、固体培地用小麦フスマ１００ｇに対し、滅菌水９５ｇ、ライスオイル５ｇを添加して混合し、オートクレーブ滅菌して固体培地を調製した。得られた固体培地に、ボーベリア・バッシアナの液体培養液１０ｍｌ（培地１ｍｌあたり短糸菌約１×１０９個）を接種し、シャーレ内に分配して、２５℃で１４日間、固体培養した。
【００２６】
その結果、生菌数は、固体培養５日目以後、乾燥培養物１ｇあたり１×１０１０個以上を維持し（図１）、また、生菌率は、全培養期間を通してほぼ５０％以上であった（図２）。
【００２７】
実施例２
滅菌水９０ｇ、ライスオイル１０ｇを添加する以外は、実施例１に準じてボーベリア・バッシアナを培養した。その結果、生菌数は、培養６日目以後、乾燥培養物１ｇあたり１×１０１０個以上を維持し（図１）、また、生菌率は全培養期間を通してほぼ５０％以上であった（図２）。
【００２８】
実施例３
滅菌水８５ｇ、ライスオイル１５ｇを添加する以外は、実施例１に準じてボーベリア・バッシアナを培養した。その結果、生菌数は、培養７日目以後、乾燥培養物１ｇあたりほぼ１×１０１０個以上を維持し(図１)、また、生菌率はほぼ５０％以上であった（図２）。
【００２９】
実施例４
滅菌水８０g、ライスオイル２０ｇを添加する以外は、実施例１に準じてボーベリア・バッシアナを培養した。その結果、生菌数は、培養６日目以後、乾燥培養物１ｇあたりほぼ５×１０９個以上を維持し(図１)、生菌率は全培養期間を通してほぼ５０％以上であった(図２)。
【００３０】
比較例１
滅菌水１００ｇを添加し、ライスオイルは添加せず、それ以外は実施例１に準じてボーベリア・バッシアナを培養した。その結果、生菌数は、培養７日目以後大きく減少し(図１)、また、培養７日目以後の生菌率は２０％以下となった(図２)。
【００３１】
実施例５
ライスオイルの添加量を２、３、４、５、１０または１５ｇとし、滅菌水の添加量をそれぞれ滅菌水とライスオイルの合計量が１００ｇとなるような量で添加する以外は、実施例１〜４と同様にしてボーベリア・バッシアナを培養した。その結果、培養後７日目における生菌数は、全ての添加量において乾燥培養物１ｇあたり１×１０１０個以上であった（図３）。また、培養後６日目における生菌率はほぼ４０％以上であった（図４）。
【００３２】
比較例２
滅菌水１００ｇを添加し、ライスオイルは添加せず、それ以外は実施例５に準じて固体培養を行った。その結果、生産される分生子の生菌数は、培養６日目以後大きく減少し(図３)、また、培養７日目以後の生菌率は数％と低いものであった（図４）。
【００３３】
実施例６
ライスオイル、コーンオイル、またはベニバナオイルをそれぞれ用い、実施例１に準じてボーベリア・バッシアナを培養した。その結果、生菌数は、ライスオイルについては培養５日目以後、それ以外は培養６日目以後、乾燥培養物１ｇあたり１×１０１０個以上を維持し（図５）、また、生菌率は培養６日目以後、ほぼ５０％以上であった（図６）。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明の糸状菌の培養方法は、培養時間の経過とともに不安定となり易い糸状菌の分生子の生菌数、生菌率を安定させることができるため、生きた分生子の生産に優れており、そのため、微生物農薬としての製剤化を目的とするような植物病原性糸状菌や昆虫病原性糸状菌の培養において、非常に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、ライスオイルをそれぞれ０〜２０ｇ添加した培地を使用した場合の、乾燥培養物１ｇあたりのボーベリア・バッシアナの生菌数を表すグラフである。縦軸は生菌数（個）を示し、横軸は培養期間（Ｄ＝日）を示す。
【図２】図２は、ライスオイルをそれぞれ０〜２０ｇ添加した培地を使用した場合の、ボーベリア・バッシアナの生菌率を表すグラフである。縦軸は生菌率を示し、横軸は培養期間（Ｄ＝日）を示す。
【図３】図３は、ライスオイルをそれぞれ０〜１５ｇ添加した培地を使用した場合の、乾燥培養物１ｇあたりのボーベリア・バッシアナの生菌数を表すグラフである。縦軸は生菌数（個）を示し、横軸は培養期間（Ｄ＝日）を示す。
【図４】図４は、ライスオイルをそれぞれ０〜１５ｇ添加した培地を使用した場合の、ボーベリア・バッシアナの生菌率を表すグラフである。縦軸は生菌率を示し、横軸は培養期間（Ｄ＝日）を示す。
【図５】図５は、それぞれの種類の植物オイルを５ｇ添加した培地を使用した場合の、乾燥培養物１ｇあたりのボーベリア・バッシアナの生菌数を表すグラフである。縦軸は生菌数（×１０１０個）を示し、横軸は培養期間（日）を示す。
【図６】図６は、それぞれの種類の植物オイルを５ｇ添加した培地を使用した場合の、ボーベリア・バッシアナの生菌率を表すグラフである。縦軸は生菌率を示し、横軸は培養期間（日）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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