(57)【要約】      （修正有）【課題】核酸の製造方法、使用する新規プライマーセット、製造された標的配列核酸断片および／または相補鎖核酸断片、プローブとしての製造された標的配列核酸断片および／または相補鎖核酸断片、前記標的配列核酸断片および／または相補鎖核酸断片の少なくとも一部分を導入された導入体、中間増幅産物として得られる鋳型核酸、前記方法を行うためのキット、標的配列核酸断片および／または相補鎖核酸断片と識別可能なプローブとのハイブリダイズを行うことによって対象から得た検体核酸に関する情報を得る方法の提供。【解決手段】核酸製造方法であって(a)被検核酸を準備すること；(b)前記被検核酸を増幅するためのプライマー;(c)前記(a)の被検核酸を第1の鋳型核酸とし(b)の第1から第4までのプライマーを用いて適切な増幅可能な条件下で反応することによって標的配列核酸および/またはその相補鎖核酸を含む核酸の製造；を含む方法。【選択図】図１
2007267636.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸製造方法であって、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を具備する方法；
（ａ）被検核酸を準備すること；
ここで、前記被検核酸は、標的配列と、その３’側と５’側に３つずつの任意配列を有し、
前記標的配列の３’側の３つのフォワード任意配列は、前記標的配列の最も近くに位置する第１のフォワード任意配列と、第１のフォワード任意配列の３’側に位置する第２のフォワード任意配列と、第２のフォワード任意配列の３’側に位置する第３のフォワード任意配列であり、
前記標的配列の５’側の３つのバックワード任意配列は、前記標的配列の最も近くに位置する第１のバックワード任意配列と、第１のバックワード任意配列の５’側に位置する第２のバックワード任意配列と、第２のバックワード任意配列の５’側に位置する第３のバックワード任意配列であり；
（ｂ）前記被検核酸を増幅するためのプライマーを準備すること；
ここで、前記プライマーは、第１のプライマー、第２のプライマー、第３のプライマーおよび第４のプライマーを含み、
第１のプライマーは、その３’端側に第２のフォワード任意配列に相補な配列を含む第１のプライミング配列を有し、５’端側には第１のフォワード任意配列に相同な配列を含む第１のステム−ループ形成配列を有し、更に、前記第１のプライミング配列から前記第１のステム−ループ形成配列までの間に任意の機能を有し得る第１の機能性領域を有し、
第２のプライマーは、第３のフォワード任意配列に相補な配列を含む第２のプライミング配列を含み、
第３のプライマーは、その３’端側に第２のバックワード任意配列に相同な配列を含む第３のプライミング配列を有し、５’端側には第１のバックワード任意配列に相補な配列を含む第２のステム−ループ形成配列を有し、前記第３のプライミング配列から前記第２のステム−ループ形成配列までの間に任意の機能を有し得る第２の機能性領域を有し、
第４のプライマーは、第３のバックワード任意配列に相同な配列を含む第４のプライミング配列を含み；
（ｃ）前記（ａ）で準備された被検核酸を第１の鋳型核酸とし、（ｂ）で準備された第１から第４までのプライマーを用いて、適切な増幅可能な条件下で反応することによって、標的配列核酸およびその相補鎖核酸を１以上で含む増幅産物核酸を製造すること。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸製造方法であって、更に以下の（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）を具備する方法；
（ｄ）前記（ｃ）の反応で得られた増幅産物核酸を第２の鋳型核酸として使用し、適切な転写可能な条件下で転写を行うこと；
（ｅ）前記機能性領域またはそれに由来する機能性部位を機能させること；
（ｆ）前記（ｄ）および（ｅ）の実施により転写産物核酸を製造すること。
【請求項３】
請求項１または２の何れか１項に記載の方法であって、前記第１の機能性領域および／または第２の機能性領域が、少なくとも１つのプロモーター領域を機能可能に含む方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記第１の機能性領域および／または第２の機能性領域に、フォワード方向で第１のプロモーター領域および／または第２のプロモーター領域が機能可能に含まれる方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法であって、前記第１の機能性領域および／または第２の機能性領域に、リバース方向で第１のプロモーター領域および／または第２のプロモーター領域が機能可能に含まれる方法。
【請求項６】
請求項３に記載の方法であって、前記第１の機能性領域および／または第２の機能性領域が、１つの機能性領域内に２つのプロモーター領域を有し、当該プロモーター領域は、当該プライミング配列とステム−ループ形成配列との間に位置し、３'側にフォワード方向のプロモーターが、５’側にリバース方向のプロモーターが機能可能に含まれる方法。
【請求項７】
請求項３〜６の何れか１項に記載の方法であって、第１のプライマーに含まれる第１の機能性領域または第３のプライマーに含まれる第２の機能性領域の何れか１方に、１または２のプロモーター領域が存在し、更に第３の機能性領域が前記プロモーター領域を含まない方のプライマーに存在する方法。
【請求項８】
請求項３〜７の何れか１項に記載の方法であって、更に、プロモーター以外の機能を有する第３の機能性領域および／または第４の機能性領域が、以下のように含まれる方法；
第３の機能性領域が、第１のプライマーおよび／または第３のプライマーの５’末端から当該プロモーター領域の５’末端までの間に含まれ；および／または
第４の機能性領域が、当該被検核酸に含まれる。
【請求項９】
請求項３〜８の何れか１項に記載の方法であって、更に、プロモーター以外の機能を有する第３の機能性領域および／または第４の機能性領域が、以下のように含まれる方法；
第３の機能性領域が、第１のプライマーおよび第３のプライマーの３’末端から当該プロモーター領域の３’末端までの間に含まれ；および／または、
第４の機能性領域が、当該被検核酸に含まれる。
【請求項１０】
請求項７〜９の何れか１項に記載の方法であって、前記第３の機能性領域および／またはが、切断部位配列およびターミネーター配列からなる群より選択される少なくとも１を含む方法。
【請求項１１】
請求項１から１０の何れか１項に記載の方法であって、前記増幅が、増幅サイクルを含むＬＡＭＰ法またはＲＴ−ＬＡＭＰ法の何れかである方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法における（ｃ）の製造することにより得られる増幅産物核酸からなる鋳型核酸。
【請求項１３】
請求項２に記載の方法において、（ｄ）の転写を行うこと、および（ｅ）の機能させることにより得られ、標的配列核酸および／またはその相補鎖核酸に対応する核酸を含む転写産物核酸。
【請求項１４】
１本鎖またはステムループの形状にある請求項１３に記載の転写産物核酸。
【請求項１５】
請求項１３または１４の何れか１項に記載の転写産物核酸を含むプローブ。
【請求項１６】
請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法に使用するための少なくとも第１のプライマーおよび第３のプライマーを含むプライマーセット。
【請求項１７】
請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法を行うことによる核酸の製造および／または標的核酸の検出を行うためのキットであって、少なくとも前記第１のプライマー、第３のプライマーを含み、更に任意に、第２のプライマーおよび第４のプライマー、並びに基質、緩衝剤、酵素、ターゲットとしての前記標的配列若しくはその相補鎖核酸の少なくとも１部分または転写産物核酸とハイブリダイズを行うためのプローブを含むキット。
【請求項１８】
請求項１７に記載のキットであって、前記プローブが核酸アレイに固定されたキット。
【請求項１９】
請求項２〜１１の何れか１項に記載の方法により得られた転写産物核酸をプローブとして使用して、これと検体とをハイブリダイズを行うことによって、検出対象に関する情報を得る方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記プローブが核酸アレイに固定されいている方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法により得られた増幅産物核酸、並びに請求項２〜１１に記載の方法により得られた転写産物核酸からなる群から選択された核酸の少なくとも１部分を、ゲノムまたは遺伝子因子の構成要素として、真核生物および原核生物を含む生物、ウイルス、ウイロイドおよびリケッチアからなる群より選択される宿主に導入された導入体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ核酸構造は、様々な生物および／または化学的な機能に深く関わることが知られている。例えば、ＲＮＡ核酸構造は、触媒機能、非相補配列認識能、蛋白質結合活性およびターミネーターなどとして、転写調節において重要な役割を果たしている。更にまた、ＲＮＡ核酸構造は、生体内でＲＮＡ干渉反応も引き起こす。このように広く役割を担うＲＮＡ核酸構造は、現在、それ自身を探求する種々の研究分野は勿論のこと、医療、農業、畜産および水産業等を含む広範な分野において注目されている。特に、近年、人工的にＲＮＡ核酸が製造されるようになり、それによる人工合成ＲＮＡは、前述した分野を含む幅広い分野において、応用利用に関する要望が日増しに強まっている。
【０００３】
しかしながら、従来の方法によるＲＮＡ合成方法は、製造に大変なコストと手間を必要とするため、十分にそのような社会的ニーズに対応することができない。
【０００４】
従来公知のＲＮＡ合成方法の例は、以下のようなものがある。例えば、オリゴヌクレオチド合成機を用いて化学的な重合反応により、特定の核酸配列、例えば、ステムループ構造などを取り得る配列のＲＮＡ分子を直接作成する方法；上流に転写用プロモーター領域を持つ状態でオリゴヌクレオチド合成機を用いて作成された鋳型ＤＮＡに対してＲＮＡ転写用酵素などを作用させる方法などである。
【０００５】
しかしながら、これらの方法において共通に利用される人工的なオリゴヌクレオチド合成は、化学的な重合反応が必須であり、そのために、非常に高価であり、その上、効率良く合成できる鎖長および／または配列が限定されてしまう。
【０００６】
このような問題を解決するため、最近、人工合成された少量のＤＮＡを効率良くＲＮＡ合成の鋳型とするための方法が多用されてきている。この方法では、ＤＮＡの状態で一度、増幅することを行った後、ＲＮＡ合成の鋳型として使用する方法である。このような方法の代表的な例は、鋳型ＤＮＡを含む領域をＰＣＲにより増幅した上で、ＲＮＡ合成を行う方法である。しかしながら、この方法においても増幅のために高額な設備投資が必要となり、更に以下の問題がある。例えばステムループを持つＲＮＡを作成しようとすると、鋳型ＤＮＡ中の構造やその配列が正常なＰＣＲ増幅を妨げることになり、意図しない副産物が多量に産出されてしまう。その結果、本来目的とするＲＮＡの純度や産出効率が悪くなる。
【０００７】
また最近では、簡便で高感度なＤＮＡの等温増幅法であるＬＡＭＰ増幅系が開発されている。特許文献１には、ＬＡＭＰ法により作成したＤＮＡ産物にプロモーターなどを付加し、ベクターを作成して生物に導入するためのＲＮＡ合成用鋳型ＤＮＡとして使用する方法が報告されている。
【０００８】
この方法は、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを増幅に使用することから、増幅時に標的配列中の配列組成や構造の影響をあまり受けない形で増幅するできる。しかし、ＲＮＡ構造作成を実施できるのは、次のような場合、即ち、「鋳型ＤＮＡ中にプロモーター領域が含まれている場合」および「鋳型ＤＮＡを増幅した後にプロモーター領域或いはプロモーター領域を含む発現ベクターなどと結合する操作が許容される場合」の２つのような条件を満たす場合に限定されてしまう。従って、設計や適応できる配列が限定されてしまう。その結果、増幅後に、鋳型ＤＮＡとプロモーター領域または発現ベクターを繋ぎ合わせる作業が必須になるため、効率的、経済的に目的ＲＮＡ構造を作成することが難しくなってしまい、実用に大きな課題がある。
【０００９】
また他方、ＤＮＡチップをはじめとする核酸ハイブリダイゼーション検出においては、特許文献２が、簡便で高感度な検出用ターゲットの作成法としてのＬＡＭＰ増幅系を報告している。例えば、ＬＡＭＰ法により得られたＬＡＭＰ増幅物に関する核酸ハイブリダイゼーションによる検出は、特定の核酸配列を検出する手法として近年頻繁に用いられている。しかしながら、このようなＬＡＭＰ法を使用した場合、ＬＡＭＰ産物の構造的特徴のため、下記の問題が生じる。即ち、ターゲットとなる配列の位置を厳密に制御しながら増幅プライマー及びプローブ設計を行なわねばならず、設計の自由度が乏しい。また更に、ＬＡＭＰ産物の末端側に存在するループ部分を検出に使用する必要がある。そのため、ハイブリに使われる分子の絶対数はＬＡＭＰ産物分子数によって規定されてしまい、その結果、検出感度に限界が生じている。
【特許文献１】特開2002−233367号公報
【特許文献２】特開2005−143492号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、純度や産出効率を向上させると共に効率的、経済的に目的核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなどを作成するために利用可能な核酸構造の製造方法、当該方法に使用するための新規プライマーセット、前記方法において製造された増幅産物核酸、並びに標的配列核酸および／またはその相補鎖核酸に対応する転写産物核酸、転写産物核酸の少なくとも一部分を含むプローブ、前記プローブを使用する検出方法、前記プローブおよびプライマーセットを含む核酸製造および／または検出用キット、増幅産物核酸および／または転写産物核酸の少なくとも一部分を導入された導入体を提供することである。
【００１１】
また本発明の課題は、核酸ハイブリダイゼーション検出に用いる検出用ターゲットを作成するにあたり、設計の自由度及び検出感度を向上させるために利用可能な核酸構造の製造方法、当該方法に使用するための新規プライマーセット、前記方法において製造された増幅産物核酸、並びに標的配列核酸および／またはその相補鎖核酸に対応する転写産物核酸、転写産物核酸の少なくとも一部分を含むプローブ、前記プローブを使用する検出方法、前記プローブおよびプライマーセットを含む核酸製造および／または検出用キット、増幅産物核酸および／または転写産物核酸の少なくとも一部分を導入された導入体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の課題を解決するために本発明者は以下のような手段を見出した。即ち、
核酸製造方法であって、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を具備する方法；
（ａ）被検核酸を準備すること；
ここで、前記被検核酸は、標的配列と、その３’側と５’側に３つずつの任意配列を有し、
前記標的配列の３’側の３つのフォワード任意配列は、前記標的配列の最も近くに位置する第１のフォワード任意配列と、第１のフォワード任意配列の３’側に位置する第２のフォワード任意配列と、第２のフォワード任意配列の３’側に位置する第３のフォワード任意配列であり、
前記標的配列の５’側の３つのバックワード任意配列は、前記標的配列の最も近くに位置する第１のバックワード任意配列と、第１のバックワード任意配列の５’側に位置する第２のバックワード任意配列と、第２のバックワード任意配列の５’側に位置する第３のバックワード任意配列であり；
（ｂ）前記被検核酸を増幅するためのプライマーを準備すること；
ここで、前記プライマーは、第１のプライマー、第２のプライマー、第３のプライマーおよび第４のプライマーを含み、
第１のプライマーは、その３’端側に第２のフォワード任意配列に相補な配列を含む第１のプライミング配列を有し、５’端側には第１のフォワード任意配列に相同な配列を含む第１のステム−ループ形成配列を有し、更に、前記第１のプライミング配列から前記第１のステム−ループ形成配列までの間に任意の機能を有し得る第１の機能性領域を有し、
第２のプライマーは、第３のフォワード任意配列に相補な配列を含む第２のプライミング配列を含み、
第３のプライマーは、その３’端側に第２のバックワード任意配列に相同な配列を含む第３のプライミング配列を有し、５’端側には第１のバックワード任意配列に相補な配列を含む第２のステム−ループ形成配列を有し、前記第３のプライミング配列から前記第２のステム−ループ形成配列までの間に任意の機能を有し得る第２の機能性領域を有し、
第４のプライマーは、第３のバックワード任意配列に相同な配列を含む第４のプライミング配列を含み；
（ｃ）前記（ａ）で準備された被検核酸を第１の鋳型核酸とし、（ｂ）で準備された第１から第４までのプライマーを用いて、適切な増幅可能な条件下で反応することによって、標的配列核酸およびその相補鎖核酸を１以上で含む増幅産物核酸を製造すること
である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、目的とする核酸構造の製造方法、当該方法に使用するための新規プライマーセット、前記方法において製造された増幅産物核酸、並びに標的配列核酸および／またはその相補鎖核酸に対応する転写産物核酸、転写産物核酸の少なくとも一部分を含むプローブ、前記プローブを使用する検出方法、前記プローブおよびプライマーセットを含む核酸製造および／または検出用キット、増幅産物核酸および／または転写産物核酸の少なくとも一部分を導入された導入体が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
１．用語の説明
ここで使用される「核酸」とは、天然由来のＤＮＡおよびＲＮＡなど、一部分または完全に人工的に合成および／または設計された人工核酸など、並びにそれらの混合物などであってよい。
【００１５】
ここで使用される「被検物質」とは、真核生物および原核生物を含む生物、ウイルス、ウイロイド、リケッチアなど自身およびそれら由来の組織、血液、血球、尿、糞便、精液、唾液、口腔内粘膜、その他何れかの細胞などを含む天然物由来の物質、または、ＤＮＡおよびＲＮＡ、それらの部分的に人工的な誘導体並びに非天然由来の人工核酸などの何れかの核酸を有する人工物、並びにそれらの混合物またはそれらを組み合わせた物質の何れでもよい。また、「被検核酸」の語は、前述の被検物質から得た何れかの核酸をいう。
【００１６】
ここで使用される「鋳型核酸」とは、核酸の伸長および／または増幅をする際の鋳型としての役割を有する核酸をいう。
【００１７】
ここで使用される「ＬＡＭＰ法」とは、Loop-Mediated Isothermal Amplificationの略であり、標的遺伝子の６つの領域に対して４種類のプライマーを設定して、鎖の置換反応を利用し、一定温度で反応させる方法である。本発明において使用されるＬＡＭＰ法は一般的に当業者に公知の方法、またはその一部改変法した方法などを含むものである。ＬＡＰＭ法の基本的な説明は後の項目において記すが、例えば、特開2002-186481などの文献を参照されてもよい。ここで、引用される文献はこの参照によって本発明に含まれる。
【００１８】
また、ここで使用される「ＲＴ−ＬＡＭＰ」法は、Reverse-Transcribed Loop-Mediated Isothermal Amplificationの略である。当該方法はＬＡＭＰ法を応用した方法であり、標的遺伝子がＲＮＡである場合に、ｃＤＮＡへの合成も、当該増幅と同時または所望に応じて時差を以っておこない、並びに検出に利用する方法である。当該技術分野において公知の何れのＲＴ−ＬＡＭＰおよびその改変法も本発明において利用してよい。
【００１９】
２．被検核酸およびプライマー
図１に記載した本発明の１態様用いて、本発明の概要を説明する。図中、互いに相補な関係にある配列を記号「ｃ」または「Ｃ」の有無で示す。即ち、例えば「Ｆ１ｃ」は「Ｆ１」の相補配列である。
【００２０】
また、以下の説明では被検核酸の中の被検核酸１についての説明は、その相補鎖である被検核酸２１と読み替えることが可能である。また、第１から第３のフォワード任意配列の説明は、第１から第３のバックワード任意配列と読み替えることが可能である。即ち、後述する当該フォワード任意配列に対するプライマーなどの記載を、バックワード任意配列のための記載と完全にまたは部分的に読み替えることが可能である。そのような読み替えにより明白になる本発明の１側面は、当業者によって容易に理解されるものである。また、そのような読み替えによって、より明確になる態様も、本発明に含まれる好ましい態様である。
【００２１】
（１）被検核酸
まず、被検物質から被検核酸を用意する。被検核酸は、目的の配列を含む核酸をそれ自身公知の何れの方法によって採取してもよく、また、それ自身公知の方法により人工的に合成してもよい。被検核酸は、本発明の態様において、第１の鋳型核酸である。使用される被検核酸は１本鎖でも２本鎖でもよい。まず、１本鎖の被検核酸を用いる場合について説明する。
【００２２】
図１を参照されたい。被検核酸１は、その一部分に標的配列２を含む。当該標的配列２の３’側には、第１のフォワード任意配列３(以下、「Ｆ１ｃ」または「Ｆ１ｃ配列３」とも記す)、その３’側に第２のフォワード任意配列４(以下、「Ｆ２ｃ」または「Ｆ２ｃ配列４」とも記す)、更にその３’側には第３のフォワード任意配列５(以下、「Ｆ３ｃ」または「Ｆ３ｃ配列５」とも記す)が含まれる。また、当該標的配列２の５’側には、第１のバックワード任意配列６(以下、「Ｂ１」または「Ｂ１配列６」とも記す)、その５’側に第２のバックワード任意配列７(以下、「Ｂ２」または「Ｂ２配列７」とも記す)、更にその５’側には第３のバックワード任意配列８(以下、「Ｂ３」または「Ｂ３配列８」とも記す)が含まれる。
【００２３】
被検核酸が２本鎖であった場合には、それぞれの配列は互いに相補な配列となる。図１を参照されたい。被検核酸２１は、標的配列２の相補配列２２を含み、その５’側に第１のフォワード任意配列の相補鎖２３（以下、「Ｆ１」または「Ｆ１配列２３」とも記す）、その５’側には、第２のフォワード任意配列２４(以下、「Ｆ２」または「Ｆ２配列２４」とも記す)、その５’側に第３のフォワード任意配列２５(以下、「Ｆ３」または「Ｆ３配列２５」とも記す)を含む。標的配列の相補配列２２の３’側には、第１のバックワード任意配列の相補鎖２６（以下、「Ｂ１ｃ」または「Ｂ１ｃ配列２６」とも記す）、その３’側には第２のバックワード任意配列の相補鎖２７（以下、「Ｂ２ｃ」または「Ｂ２ｃ配列２７」とも記す）、更にその３’側には第３のバックワード任意配列の相補鎖２８（以下、「Ｂ３ｃ」または「Ｂ３ｃ配列２８」とも記す）が含まれる。
【００２４】
被検核酸が２本鎖の場合には、当該２本鎖に対して同時に増幅が開始されるが、被検核酸が１本鎖の場合には、被検核酸１の増幅が開始されれば、被検核酸１の相補鎖が生じるので、それに対する増幅も開始される。従って、被検核酸は１本鎖であっても２本鎖であってもよい。
【００２５】
例えば、被検核酸が２本鎖である場合、被検核酸１と完全に相補であってもよく、或いは部分的に相補的ではない配列が含まれてもよい。また、被検核酸１と被検核酸２１の長さは同じであっても、相違してもよい。
【００２６】
以下、バックワード任意配列についての説明がない場合、第１から第３のフォワード任意配列３、４、５に関する説明を第１から第３のバックワード任意配列６、７、８と読み替えることが可能である。そのように、読み替えることによって、当業者は第１、第２および第３のバックワード任意配列に関しての理解が可能になる。
【００２７】
各フォワード任意配列３、４、５は、天然に存在する塩基配列を利用してもよく、人工的に設計された配列を利用してもよく、またその混合物であってもよい。各フォワード任意配列３、４、５の長さは、５塩基以上、好ましくは１０塩基以上である。
【００２８】
ここで、被検核酸の長さは、とくに限定されるものではない。
【００２９】
標的配列の選択は、本発明の実施者が自由に選択してよく、何れの任意の配列であってもよい。好ましい標的配列の長さも、特に限定されるものではない。また、細菌、菌類、原生動物、ウイルス、ウイロイドおよびリケッチアなどを含む微生物の検出に本発明の態様を使用する場合、標的配列はそれに応じた微生物体を認識可能な配列を選択してもよい。
【００３０】
特に核酸アレイを用いた核酸検出を利用して、本発明の態様に従う標的配列若しくはその相補鎖、またはその対応する転写産物核酸をプローブまたはターゲットととして使用する場合、当該標的配列は、約５塩基〜約５００塩基、好ましくは約１０塩基〜約３００塩基の長さであることが望ましい。
【００３１】
ここで、Ｆ１ｃ配列３、Ｆ２ｃ配列４およびＦ３ｃ配列５の各配列の選択も本発明の実施者が自由に行ってよい。また、これらのフォワード任意配列の互いの間または標的配列との間に任意に間隙配列を含んでもよい。当該間隙配列は、後述するプライマーの設計および本発明の態様に従う増幅反応において生じる核酸分子構造と深く関わることもある。即ち、フォワード任意配列およびバックワード任意配列は、本発明の態様に従う増幅方法を行うために適切なプライマーの選択と深い関係にある。従って、特に当該間隙配列に関しては次のプライマーの項、および基本的な本発明の態様に従う核酸製造方法の説明の後で述べる。
【００３２】
（２）プライマー
前記被検核酸を増幅するためには、４種類のプライマーがあればよい。図１を参照されたい。そのうちの２種類のプライマーは、第１のプライマー９と第３のプライマー２９であり、それらは、各々３つの領域を含む。適切な条件下で反応が開始されると、当該プライマー９および２９の最も３’側に配置されるプライミング配列１０(即ち、Ｆ２配列１０、図中「Ｆ２」と記す)および３０(即ち、Ｂ２配列３０、図中「Ｂ２」と記す)が、被検核酸１および被検核酸２、または増幅により生じた被検核酸１の相補鎖に含まれるＦ２ｃ配列４（図中「Ｆ２ｃ」と記す）およびＢ２ｃ配列２７（図中「Ｂ２ｃ」と記す）対してアニールする。その後、被検核酸を鋳型とする核酸伸長が開始される。
【００３３】
更なる２種類のプライマーは、第２のプライマー１３と第４のプライマー３３であり、それらは、前記２種類のプライマーとは異なり、少なくとも１つの領域を含めばよい。これらの配列は、第３のフォワード任意配列５（即ち、Ｆ３ｃ配列５、図中「Ｆ３ｃ」と記す）および第３のバックワード任意配列（即ち、Ｂ３ｃ配列２８、図中「Ｂ３ｃ」と記す）の相補配列であり、それらが各々の当該任意配にアニールして伸長し、先のプライマーによって形成された２本鎖に分け入って引き剥がしながら、更なる２本鎖を形成していく。
【００３４】
更に、本発明の態様に従って使用されるプライマーについて詳細に説明する。第１、第３のプライマーには以下の３つの領域を含む。すなわち（ａ）プライミング配列、（ｂ）機能性配列、（ｃ）ステム−ループ形成配列である。
【００３５】
（ａ）プライミング配列
図１を参照されたい。当該被検核酸１にアニールし、伸長を行う第１のプライマー９（以下、「プライマー９」とも記す）は、その３’端側に第１のプライミング配列１０（図中「Ｆ２」と記し、ここにおいて「Ｆ２」とも「プライミング配列１０」とも記す）を含む。プライミング配列１０は、当該被検核酸１のＦ２ｃ配列４（図中「Ｆ２ｃ」と記す）にアニールし、適切な条件下で５’方向に伸長する。例えば、当該被検核酸１を人工的に合成する場合には、プライミング配列１０は、当該技術分野においてプライマーとして使用され得るそれ自身公知の何れのプライマーを選択および/または設計し、本発明の方法において使用してよい。また、天然の被検物質より被検核酸１を回収し使用するなどの場合には、当該被検核酸に天然に含まれる何れかの核酸断片をプライマーとして利用してもよい。その場合、プライミング配列１０は、第２のフォワード任意配列であるＦ２ｃ配列４に相補とされる。
【００３６】
。
【００３７】
（ｂ）機能性領域
（i）第１および第２の機能性領域
本発明の態様に従う核酸製造方法において使用される機能性領域は、好ましくは少なくとも第１および第３のプライマーに含まれる２つであってよい。図１を参照されたい。第１の機能性領域は、第１のプライマー９において、上述したプライミング配列１０と後述するステム−ループ形成配列１２の間に含まれる第１の機能性領域１１であってよい。また、第２のプライマー２９においても同様に、プライミング配列３０とステム−ループ形成配列３２の間に含まれる第２の機能性領域３１であってよい。
【００３８】
第１および第２の機能性領域は、好ましくはプロモーター領域である。プロモーター領域としての第１および第２の機能性領域が存在することにより、後述する核酸製造方法に具備される第１の核酸製造方法により得られる増幅産物核酸の所望の位置にプロモーター領域が配置される。これによって、当該増幅産物核酸から、これを鋳型として使用し、所望の転写産物を容易に得ることが可能になる。
【００３９】
第１および第２の機能性領域として使用されるプロモーター配列は、第１および第２のプライマー配列においてフォワードまたはリバースの何れの方向で配置されてもよい。
【００４０】
図１３を参照されたい。ここで使用される「フォワード」とは、図１３（１３Ａ）に記載されるように、５’から３’への方向性を有する当該プライマー配列に対して、プロモーターの機能する方向が３’向きのプロモーター配列（図中「Ｐｒｏ」と記す）であるものをいう。また、ここで使用される「リバース」とは、図１３（１３Ｂ）に示すように、５’から３’への方向性を有する当該プライマー配列に対して、当該プロモーターの機能する方向が５’向きのプロモーター配列（図中「Ｐｒｏ」と記す）であるものをいう。図１３における白抜きの矢印が、プロモータとその方向性を示し、その白抜き矢印の先端付近から出る矢印がプロモーターの機能する方向を示す。
【００４１】
本発明に従うと、当該プロモーター領域の好ましい例は、これらに限定するものではないが、例えば、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ＲＮＡ  ポリメラーゼIII系プロモーターであるＵ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼII系プロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼI系プロモーターなどを含む。
【００４２】
第１および第２の機能性領域は、被検配列中の何れかの部分、例えば、標的配列内に天然に含まれるものを利用しても、また人工的に天然または人工的な配列を挿入されたものであってもよい。
【００４３】
当然ながら、本発明の態様において使用される第１および第２の機能性領域は、後述するようなプロモーター以外の配列であってもよく、配置される位置が異なっていてもよい。
【００４４】
また、第１および第２の機能性領域は、機能性を有する配列を配置することが可能な領域として理解されてもよい。即ち、第１のプライマーおよび第３のプライマーには、常に、第１および第２の機能性領域は存在するが、必ずしも、両方の機能性領域に機能性を有する配列が配置されなければならないわけではない。
【００４５】
（ii）機能性領域
本発明の更なる１態様において、好ましく使用される機能性領域は、これに限定されるものではないが、プロモーター領域、制限酵素サイト含有配列、ターミネーター配列、リボザイムコード配列、リボザイム認識配列およびその他の修飾酵素認識配列などであってよい。機能性領域は、第１のプライマーおよび第２のプライマーまたは被検核酸に含まれてよい。それによって、詳しくは後述する標的配列核酸およびその相補鎖核酸を含む増幅産物核酸、並びにそれらの断片を回収するため、並びに当該増幅産物核酸を鋳型として得られる転写産物核酸およびその断片を所望に応じて得るために非常に有利である。
【００４６】
当該機能性領域がプライマー配列に含まれる場合は、対応する被検核酸に完全にアニールする必要はない。しかしながら、一部に相補的および／または相同な配列を有してもよく、完全に相補的および／または相同な配列でなくてもよい。
【００４７】
機能性領域は、これに限定するものではないが、約１塩基〜約２００塩基、好ましくは約２塩基〜約８０塩基であり、且つ所望される機能性領域の種類に依存して塩基長が選択されてもよい。
【００４８】
最も好ましい機能性領域は、上述したように図１に示すようなプライミング配列１０とステム−ループ形成１２の間に、プロモーター配列１１として、フォワード方向またはリバース方向に配置されるが、この際、プライミング配列１０とステム−ループ形成１２との間に、更なるヌクレオチドが存在しても、存在しなくてもよい。そのようなヌクレオチドが存在する場合、それらも含んで機能性領域と称す。また、プロモーター配列の一部が、プライミング配列１０および／またはステム−ループ形成配列１２と幾つかのヌクレオチドを共有してもよい。その共有される部分は、プロモーター領域と解されても、プライミング配列またはステム−ループ形成配列の一部と解されてもよい。
【００４９】
また、更なる機能性配列を、当該プライマーに含ませてもよい。
【００５０】
例えば、第１および／または第２の機能性領域をプロモーター配列として、図１の１１および／または３１の位置に当該プライマー配列にフォワード方向で繋いだ条件において、当該プロモーター配列を含むプライマーの５’末端から当該プロモーター領域の５’末端までの間に第３の機能性領域および／または第４の機能性領域として制限酵素サイトを配置するように、当該プライマーを設計してもよい。また、当該プロモーター配列をリバース方向に繋いだ条件において、当該プロモーター配列を含むプライマーの３’末端から当該プロモーター領域の３’末端までの間に第３の機能性領域および／または第４の機能性領域として制限酵素サイトを配置するように、当該プライマーを設計してもよい。また、前記制限酵素サイトに変えて、同様の設計で第３の機能性領域および／または第４の機能性領域としてターミネーター領域を配置してもよい。
【００５１】
更に、図１３（１３Ｃ）に示すように、第１の機能性領域として第１のプロモーター配列をフォワード方向に、第３の機能性領域として第２のプロモーター配列をリバース方向に繋いで配置してもよい。この場合、第１と第２のプロモーター配列は同じ配列であっても、異なる配列であってもよい。
【００５２】
上述したような図１の態様においては、当該機能性領域を、便宜的に機能性領域１１（例えば、プロモーター配列１１）として記載したが、本発明に従う機能性を有する機能性領域とは、部位および／または領域としてプライミング配列１０とステム−ループ形成配列１２の間に存在すると限定されるものではない。
【００５３】
即ち、上述したように、本発明の１態様における機能性領域は、図１示す第１の機能性領域１１および第２の機能性領域３１であるが、それ以外の位置に第１および第２の機能性領域が配置されてもよく、更なる第３および第４の機能性領域が、第３の機能性領域１１および第４の機能性領域３１として配置されてもよく、また、これらの機能性領域が、当該１１および３１以外の場所に配置されてもよい。例えば、第１および第２のプライマー配列の他の位置や、被検核酸に配置されてもよい。
【００５４】
当該機能性領域が、制限酵素サイト含有配列、ターミネーター配列、リボザイムコード配列、リボザイム認識配列およびその他修飾酵素認識配列などである場合、図１の機能性領域１１および／または３１に具備されても、プライミング配列１０および／または３０、および／またはステム−ループ形成配列１２および／または３２中に完全または部分的に含まれてもよい。また、当該プライマーのそれ以外の部位に含まれてもよい。
【００５５】
また、機能性領域は、被検配列中の何れかの部分、例えば、標的配列内に天然に含まれるものであっても、また人工的に挿入されたものであってもよい。
【００５６】
本発明の態様に従うと、当該プロモーター領域の好ましい例は、これらに限定するものではないが、例えば、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ＲＮＡ  ポリメラーゼIII系プロモーターであるＵ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼII系プロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼI系プロモーターなどを含む。
【００５７】
本発明の態様に従うと、これらに限定するものではないが、当該制限酵素サイトまたは制限酵素サイト含有配列の好ましい例は、Ｉ型制限酵素認識および切断サイト、II型制限酵素認識および切断サイトなどを含む。更に、所望の配列を認識し、切断可能である配列を使用することが可能であり、例えば、リボザイムコード配列、リボザイム認識配列、タンパク性酵素およびその他の修飾酵素認識配列など、核酸切断反応の触媒作用を有する物質であればよい。
【００５８】
また、ランオフ転写（run-off転写）による転写反応停止を利用可能な、鋳型として使用した増幅産物核酸に対して、例えば、制限酵素などの配列特異的切断を行う修飾酵素を作用させて当該鋳型を切断したことにより生じた当該鋳型の末端によって、転写が自然に終結するような配列を、核酸切断反応の触媒作用を有する物質としてもよい。
【００５９】
本発明に従うと、これらに限定するものではないが、当該ターミネータ−配列の好ましい例は、シグマ因子依存性ターミネータ−およびシグマ因子非依存性ターミネータ−を含むが、更に、配列そのものまたは二次構造が直接にＲＮＡ合成を停止させるシグナルとなる配列、または配列そのものまたは二次構造への第3の物質が結合することにより、間接的にＲＮＡ合成を停止させるシグナルとなる配列であれば一般的にターミネータ−と呼ばれていない配列であっても、本発明の態様においては「ターミネータ−」として使用することが可能である。
【００６０】
（ｃ）ステム−ループ形成配列
ステム−ループ形成配列の例を図１に記す。図１において、第１のステム−ループ形成配列１２（以下、「ステム−ループ形成配列１２」とも記す）は、当該プライマー配列９の最も５’側に配置される。この配列は図１に示すようにＦ１ｃ配列１２とも称される。
【００６１】
次に、ステム−ループ形成配列１２の反応中の動きを説明する。図２を参照されたい。被検核酸１を鋳型とし、第１のプライマー９の３’末端を起点としてＤＮＡ伸長反応が進む(図２(Ａ))。得られた相補鎖４１と被検核酸１とによる２本鎖に含まれる、第３のフォワード任意配列５（図中「Ｆ３ｃ」と記す）に相補的な第３のプライマー１３(図中「Ｆ３」と記し、以下「プライマー１３」とも記す)の３’末端を起点として更なるＤＮＡ伸長反応が進む(図２(Ｃ))。その結果、得られた１本鎖４１における分子内構造が形成される（図２(Ｅ)）。ここで、ステム−ループ形成配列１２は、標的配列２の５’の最も近くに存在する第１のフォワード任意配列３の相配配列（図中、「Ｆ１」と記す）とアニールするように設計されている。
【００６２】
ステム−ループ形成配列１２は、これに限定するものではないが、約５塩基〜約１００塩基、好ましくは約１０塩基〜約６０塩基であり、且つ所望する分子内構造を得られるように設計される。
【００６３】
ここで「分子内構造」とは、例えば、図２（２Ｅ）中の「Ｆ１ｃ」と「Ｆ１」とのアニールに代表される同一分子内のアニールにより形成される構造を称す。
【００６４】
本明細書において使用される「ステム−ループ形成配列」とは、図２（２Ｅ）に示すような分子内構造を形成するために、分子内の異なる部位の配列と相補な配列を有する配列をいう。
【００６５】
また、第２のプライマー１３は、第３のフォワード任意配列５に相補的な配列を有する。
【００６６】
以上、本発明の１態様である方法において使用されるプライマーについて説明したが、更に、プライミング配列、機能性領域およびステム−ループ形成配列の３つの配列の間または各末端に隣接して間隙配列が含まれてもよい。しかしながら、第１のプライミング配列および第２のプライミング配列、例えば、図１においては、第１のプライミング配列１０（図中「Ｆ２」と記す）および第２のプライミング配列３０（図中「Ｂ２」と記す）の３’末端には更なる任意の配列が存在することは、その機能が良好に作動させ得るために望ましくない。
【００６７】
そのような配列は、人工的に設計された配列であっても、天然に存在する配列であってもよい。間隙配列としてのそのような配列の好ましい長さについては後述する。
【００６８】
また、本発明の態様に従うと、ＬＡＭＰ増幅反応の増幅効率を上げるために用いられる公知の方法であるループプライマーを活用した方法を適用してもよい。ここでループプライマーとは、「図３（３Ｇ）の５’末端側、Ｂ１領域とＢ２領域の間の配列」、または、「図３（３２Ｇ）の５’末端側Ｆ１領域とＦ２領域の間の配列」に相補的な配列を持つプライマーを、ＬＡＭＰ法ではループプライマーと呼ぶ。ＬＡＭＰ反応の基本になる４種類のプライマーに加え上記ループプライマーを１種類以上添加することにより、DNA合成の起点を増やすことが可能となり、増幅効率および増幅速度が向上する。
【００６９】
また、第１の核酸製造方法における、分子内構造の形成は非常に重要である。所望の末端ループ構造を形成し円滑な増幅を行うためには、被検核酸におけるフォワード任意配列およびバックワード任意配列の選択が重要になる。特に、第１のフォワード任意配列と第２のフォワード任意配列との間の距離、および第１バックワード任意配列と第２バックワード任意配列との間の距離の設定が大きく影響する。従って、当該距離が、０〜約５００塩基、好ましくは０〜約１００塩基、最も好ましくは約１０〜約７０塩基であることが好ましい。この距離は、当該任意配列を含まないものである。また、分子内アニールを優先して得るために、問題となる当該任意配列間のＴｍ値を（Ｆ３−Ｆ３ｃに配列間およびＢ３Ｂ３ｃ配列間のＴｍ値）≦（Ｆ２−Ｆ２ｃｘ配列間およびＢ２−Ｂ２ｃ間のＴｍ値）≦（Ｆ１−Ｆ１ｃ配列間およびＢ１−Ｂ１ｃ配列間のＴｍ値）となるように、当該任意配列を選択すればよい（ここで、「Ｆ１」および「Ｆ１ｃ」などの各記号は上述および図１を参照されたい）。なお、本発明の態様に従うと、本発明の第１の核酸製造方法で使用される、任意配列および分子内部構造に関する詳細は、それ自身公知のＬＡＭＰ法における条件を都合よく利用することが可能である。従って、更なる任意配列および分子内部構造に関しては、ＬＡＭＰ法で使用される任意配列およびプライマーの設計に関する文献、例えば、特開２００１−３０９７８５号公報を参照されたい。当該文献は、ここで引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００７０】
３．核酸製造方法
本発明の態様である核酸製造方法には、第１の核酸製造方法と第２の核酸製造方法とが具備される。
【００７１】
最も基本的な態様においては、第１の核酸製造方法によって増幅産物核酸が得られ、第２の核酸製造方法により転写産物核酸が得られる。詳細には、第１の核酸製造方法においては、被検核酸を第１の鋳型として用いて、適切な条件下で増幅反応することによって、増幅産物核酸を製造することが具備される。当該増幅反応産物核酸は、標的配列核酸および／またはその相補鎖核酸またはその断片を含む核酸である。更に、第２の核酸製造方法においては、第１の製造で得られた増幅産物核酸を第２の鋳型として使用して、転写反応を行うことによって、転写産物核酸を得ることが可能である。当該転写産物核酸は、標的配列核酸および／またはその相補鎖核酸またはその断片に対応する核酸を含む。
【００７２】
（１）第１の核酸製造方法
本発明の１の態様に従うと、第１の製造方法においては、被検核酸として天然または人工的なＲＮＡまたはＤＮＡなどが使用される。本発明の態様に従う第１の核酸製造方法によって、そのような被検核酸を本発明に従うプライマーを使用することによって増幅し、増幅産物核酸を得ることが可能である。
【００７３】
また、第１の製造方法では、好ましい増幅方法の例として、それ自身公知のＬＡＭＰ法若しくはＲＴ-ＬＡＭＰ法、またはその変法が使用されてよい。公知の通り、ＬＡＭＰ法において、鋳型として使用されるのはＤＮＡであり、当該ＬＡＭＰ産物核酸はＤＮＡであってよく、ＲＴ−ＬＡＭＰ法において、鋳型として使用されるのはＲＮＡであり、当該ＲＴ−ＬＡＭＰ産物核酸はＤＮＡであってよい。このようなＬＡＭＰ産物も本発明に従う「増幅産物核酸」であると理解されるべきである。そのような増幅産物を鋳型として使用する第２の製造方法（詳細は後述する）も、また、それにより得られる第２の製造方法により製造された産物核酸も本発明の範囲内である。
【００７４】
第１の製造方法における「適切な増幅可能な条件」とは、少なくとも鋳型、基質、増幅酵素、緩衝剤、温度およびｐＨなどの条件が適切であればよい。例えば、ＬＡＭＰ法若しくはＲＴ−ＬＡＭＰ法が使用される場合であれば、これらに限定されるものではないが、反応温度は約３０℃から約８０℃でよく、例えば、約５０℃から約７０℃、約４０℃から約５０℃、約５０℃から約６０℃、約５５℃から約６０℃、約６０℃から約６５℃、５５℃から６０℃または６０℃から６５℃であればよく、好ましくは６３℃付近である。どの反応温度を使用するかは、当該反応系において存在する核酸配列およびｐＨなどの条件に依存して決定すればよい。
【００７５】
ＬＡＭＰ法若しくはＲＴ−ＬＡＭＰ法を使用する場合、プライマーのＴｍ値の設定は、当業者に公知の通常の値でよい。
【００７６】
また、更に、本発明の更なる態様においては、ＬＡＭＰ法若しくはＲＴ−ＬＡＭＰ法に、それ自身公知のループプライマーを併用してもよい。本発明の１態様において、ループプライマーを使用することにより、使用しない場合に比較して増幅時間を有利に短縮することが可能である。
【００７７】
上記第１の製造により得られた標的配列核酸および／またはその相補鎖核酸を含む核酸は、更なる核酸製造のための鋳型としてユニークな効果を発揮し得る有用なものである。例えば、上記第１の製造により得られた標的配列核酸および／またはその相補鎖核酸を含む核酸は以下の第２の製造における転写の鋳型として使用されてよい。或いは、他の方法における鋳型として、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸の増幅および製造に使用してよい。
【００７８】
（２）第２の核酸製造方法
本発明の好ましい１態様において、上述の第１の製造により得られた増幅産物核酸を鋳型として使用し、更に本発明に従う機能性領域を利用することによって、更なる第２の核酸製造方法が提供される。
【００７９】
例えば、増幅産物核酸として１本鎖ＤＮＡを得た場合、これを鋳型として転写反応を行って、転写産物核酸を得ることが可能である。当該転写産物核酸を得るためには、機能性領域としてプロモーター領域が選択されることが望ましい。
【００８０】
そのような第２の核酸製造方法を行うことにより、転写反応が実行され、本発明の更なる態様である転写産物核酸が得られる。本発明の最も基本的な態様によると、転写産物核酸は、標的配列核酸および/またはその相補鎖核酸またはその断片に対応する核酸を含む１本鎖ＲＮＡからなる転写産物核酸として得ることが可能であり、それらの核酸も本発明の範囲に含まれる。
【００８１】
ここで、「転写可能な条件」とは、鋳型とプロモーターを基にＲＮＡの転写を行うことが可能なそれ自身公知の何れの条件であってもよい。
【００８２】
また、本発明においては、前述の第１の核酸製造方法と第２の核酸製造方法は、同時若しくは順次、または随時の何れの時期において行ってもよい。所望の製造方法および種々の条件に応じて、実施者が詳細な条件を選択して使用すればよい。
【００８３】
例えば、転写に必要な酵素の例は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｈ１  ＲＮＡポリメラーゼおよびＵ６  ＲＮＡポリメラーゼなどを含むが、これに限定されるものではない。また、転写反応に適切な反応温度は、約４℃〜約１００℃、好ましくは約１５℃から約８０℃であればよい。
【００８４】
また、転写に必要な基質はＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰなどであればよい。また、これら基質の誘導体などであってもよい。更に、適切なｐＨを維持するために緩衝剤などを使用してもよい。
【００８５】
本発明の態様に従う第２の核酸製造方法では、第１の核酸製造方法で得られた増幅産物核酸を鋳型として使用して実施される。当該増幅産物核酸を合成するために、第１の核酸製造方法において利用された当該機能性領域により与えられた機能部位、例えば、切断部位などを利用することが可能である。それらの機能部位は、その機能の性質により利用するべき時期が異なるので、当該機能を十分に生かせるような時期に利用ことが望ましい。
【００８６】
本発明の態様では、第２の核酸製造方法は、以下を具備する；１）第１の核酸合成方法により得られた増幅産物を鋳型核酸として使用し、適切な転写可能な条件下で転写を行うことと、２）第１の核酸合成において利用された機能性領域またはそれに由来する機能性部位を機能させることと、３）前記１）および２）により転写産物を製造すること。
【００８７】
機能性領域またはそれに由来する機能性部位を機能するためには、適切な時期に利用することが必要になる。例えば、当該第１のプライマーの機能性領域にプロモーターが含まれている場合には、転写の段階において利用すればよい。前記機能性領域が制限酵素サイトであれば、その存在により増幅産物核酸には、当該制限酵素サイトに由来する機能部位、即ち、切断部位が含まれる。従って、転写に先駆けてまたは同時に当該増幅産物核酸を適切な酵素により処理してもよい。また当該機能性領域がターミネータ−配列を当該増幅産物核酸に付与するためのターミネータ−配列である場合、当該転写時に機能すればよい。
【００８８】
本明細書において使用される用語「切断部位」とは、上記のような制限酵素サイト含有配列、リボザイムコード配列、リボザイム認識配列およびその他修飾酵素認識配列が存在することによって提供される切断されるべき部位をいう。
【００８９】
（３）第１の核酸製造方法の１態様
本発明の１態様により提供されるプライマーは、特に、ＬＡＭＰ法において効果的に使用し得る。ＬＡＭＰ法とは、鎖置換反応を利用して核酸を増幅する方法である。そのためには、標的遺伝子の６つの領域に対して４種類のプライマーを設定し、一定温度で反応させ、結果的に連続した反復配列かならなる核酸を得ることが可能となる。
【００９０】
本発明の１態様として基本的なＬＡＭＰ法を利用して行う例について図２および図３を用いて説明する。
【００９１】
図２を参照されたい。まず、上述した本発明に従って用意されたプライマー９および被検核酸１を、適切な条件下で伸長および増幅反応する。その結果、Ｆ２とＦ２ｃがアニールし伸長が開始され(図２（Ｂ）)、同時または非同時期に、或いは順次に、Ｆ３およびＦ３ｃがアニールして伸長が開始される(図２（Ｃ）)。
【００９２】
当該適切な条件とは、所望の適切な反応が得られる条件下であればよく、例えば、温度、ｐＨ，基質および緩衝液などの反応条件組成などは、使用する酵素による増幅反応が進行する条件であればよく、特に何らかに限定されるものでなない。例えば、当該適切な条件とは、所望のＬＡＭＰ反応が得られる条件であればよい。伸長のための酵素は、それ自身公知のポリメラーゼであればよく、以下に限定されるものではないが、特に、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼが好ましく、例えば、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼおよびエクソヌクレアーゼ活性を除いたＢｃａＤＮＡポリメラーゼなどが例である。しかしながら、これらの酵素の各種変異体についても、当該変異体が配列依存型の相補鎖合成活性および鎖置換活性を有するのであれば、本発明に利用することができる。
【００９３】
適切な温度の例は、約４℃〜約１００℃、好ましくは約２０℃〜約９５℃である。
【００９４】
反応系に存在する基質は、反応に応じてｄＮＴＰ混合物およびＮＴＰ混合物などであればよく、或いは人工的に合成した基質であってもよい。
【００９５】
また、ｐＨは、約２〜約１１、好ましくは約５〜約１０である。好ましいｐＨを維持するための緩衝剤、例えば、リン緩衝液、トリス緩衝液およびヘペス緩衝液などが含まれてよい。
【００９６】
上述図２（Ｃ）の反応により、図２（Ｄ）のような鋳型となった被検核酸１と合成核酸４２の２本鎖と、Ｆ３により引き離された１本鎖の伸長鎖４１が得られる。また、伸長鎖４１は、５'端側に相補配列を有するので分子内構造を有する核酸４３を生じる(図２（Ｅ）)。
【００９７】
続いて、図３（３Ｅ）を参照されたい。得られた核酸４３は続いて、プライマー２９(ここにおいて「第３のプライマー」とも称される)の鋳型核酸となって伸長反応され、伸長鎖４４が形成される。この反応によって、２本鎖核酸４５が生じる（図３（３Ｆ））。当該２本鎖核酸４５は、プライマー３３によって引き剥がされて１本鎖４７が生じる。
【００９８】
得られた１本鎖４７は５’端側および３’端側に相補配列を有するため、両末端にループのある分子内構造を有するループ核酸４８が得られる（図３（３Ｇ））。
【００９９】
被検核酸が２本鎖であった場合でも、１本鎖被検核酸の増幅で生じたその相補鎖についても、同様の過程を経て、１本鎖５０（図３（３２Ｆ））が得られ、更なる過程を経てループ核酸５１（図３（３２Ｇ））が得られる。この相補鎖に関しても、後述する増幅サイクルにおける当該被検核酸１と同様な増幅を受ける。
【０１００】
本発明の好ましい態様における方法では、更に以下のような増幅サイクルが行われる。図４を参照されたい。
【０１０１】
図４（４Ａ）に示すように、図３（３Ｇ）で得られたループ核酸４８は、その３’末端のF１を起点として自己を鋳型として、プローブ４９(上述では「第３のプライマー」とも称される)が核酸伸長する。この伸長に伴って、５’端の分子内構造であるループが剥がされる。また、図４（４Ｂ）に示す相補なループ核酸５１も同様に、プローブ５２（上述では「第３のプライマー」とも称される）により核酸伸長される。
【０１０２】
図４（４Ｃ）および（４Ｄ）に示す核酸は、図４（４Ａ）の伸長反応後に得られる中間体５３および５４である。第１および第３のプライマーによる伸長の後に、第２のおよび第４のプライマーによる引き剥がしが繰り返される。最終的には、標的配列に対する相同配列と相補配列を交互に繰り返して含むＬＡＭＰ産物、例えば、ＬＡＭＰ産物５５が得られる。このＬＡＭＰ産物５５が、本発明の１態様として提供される増幅産物核酸である。
【０１０３】
上述の第１の核酸製造方法に使用された第３のプライマーが、図４（４Ｅ）に示されるプライマー５６であったとすると、得られる増幅産物核酸は、その下方に記載されるプロモーター領域を含む増幅産物核酸５５となる。当該第３のプライマー５６は、機能性領域にリバース方向で繋がれたプロモーター領域（図中「Ｐｒｏ」と記す）を含む。
【０１０４】
従って、得られる増幅産物核酸５５に繰り返して存在する、配列Ｂ２と配列Ｂ１Ｃの間にはいつも当該プロモーターが配置される。当該プロモーターは図中、白抜きの太い矢印で示す。また、増幅産物５５の３’側および５’側には、更なる配列が存在すると理解されたい。
【０１０５】
ここで、上述では、第３のプライマーが、図４（４Ｅ）に示されるプライマー５６である場合には、増幅産物核酸５５が得られると記載したが、必ずしも増幅産物核酸の最少単位の配列が、このように並ぶとは限らない。即ち、増幅産物核酸５５では、３’側から、ここでの便宜上の最少単位が以下のように配置される；「Ｆ１−Ｆ２Ｃ−Ｆ１Ｃ」、標的配列（またはその相補配列）、「Ｂ１−Ｂ２−Ｂ１Ｃ」、標的配列の相補配列（または標的配列）、「Ｆ１−Ｆ２−Ｆ１Ｃ」、標的配列（またはその相補配列）、「Ｂ１−Ｂ２Ｃ−Ｂ１Ｃ」、標的配列の相補配列（または標的配列）、「Ｆ１−Ｆ２Ｃ−Ｆ１Ｃ」、標的配列（またはその相補配列）、「Ｂ１−Ｂ２−Ｂ１Ｃ」。しかしながら、この配列が必ず生じるのではなく、「標的配列」と「標的配列の相補鎖」が交互に繰り返して配列されるものの、標的配列/標的配列の相補鎖に挟まれた領域（前記「」内に記載された領域）の順序および周期については、ＬＡＭＰ増幅時の末端構造に依存する為、いくつかのバリエーションを持つこととなり、必ずしも決まった配列および／または周期とはならない場合がある。従って、図４（４Ｅ）に示した増幅産物核酸５５は、１つの例であると当業者には理解されるであろう。従って、後述の図６、図７、図８、図９、図１０、図１４に示される増幅産物核酸についても同様のことが言える。
【０１０６】
このような増幅産物核酸は、鋳型ＤＮＡとしてそれを用いた第２の核酸製造方法において有利に使用される。
【０１０７】
（４）第２の核酸製造方法の１態様
上述したように、第１の核酸製造により得られた増幅産物核酸には、機能性領域が含まれる。当該増幅産物核酸と当該機能性領域を利用することによって、第２の核酸製造方法を行うことが可能である。上述した図４（４Ｅ）に記載の増幅産物核酸５５を鋳型ＤＮＡとして使用して、第２の核酸製造方法を行う。このように、当該機能性領域の少なくとも１つがプロモーター領域であることは、第２の核酸製造方法において好ましい１例である。
【０１０８】
図４(４Ｅ)に示されるように、得られた増幅産物核酸５５には、第２のバックワード任意配列の相同配列（図中「Ｂ２」）の５’側で、第１のバックワード任意配列（図中「Ｂ１Ｃ」）の相補配列の３’側に５’方向に繋がれたプロモーター（図中、当該プロモーター配列の大凡の位置を破線で楕円で囲んだ。また、プロモーター配列は白抜きの太い矢印で示した）が存在する。このプロモーターを使用して、適切な転写可能な条件下で転写を行うことにより、合成されたＲＮＡを得ることが可能である。この転写は、当該増幅産物核酸においてプロモーターの存在する位置に関して殆ど全てにおいて達成される。図４（４Ｅ）に示す例の場合には、２ヶ所から転写が始まり、その結果として所望の核酸断片が形成される。この例では図面に示されたプローブの数は２であるが、実際には、増幅された分だけのプロモーターが存在する。従って、転写産物核酸の中に、非常に多くの所望の転写産物を得ることが可能である。
【０１０９】
（５）従来の転写産物について
図５を参照されたい。図５に示す従来の増幅産物核酸は、従来のプライマーを用いて従来のＬＡＭＰ法を行うことにより得られたものである。従来法では、ＲＮＡ合成起点を書くＬＡＭＰ産物分子の末端に１つだけしか有することができない。即ち、図５においては、３’末端側に示した矢印６１の領域のみが、転写起点である。従って、転写により得られる産物の量も、得られる転写産物の長さおよび種類が限られていた。
【０１１０】
４．第１の核酸製造方法におけるプライマーの設計と第２の核酸製造方法の例
以下に本発明の１態様に従う、機能性領域としてプロモーターを含むプライマーを利用して第１の核酸製造方法を行い、それによって得られる増幅産物核酸を鋳型として利用する第２の核酸製造方法についての例を、以下に設計例として示す。
【０１１１】
（１）第１の設計例
図６（６Ａ）を参照されたい。この態様においてプロモーターを機能性領域として含むプライマーは、第３のプライマーである。第３のプライマーのプライミング配列であるＢ２領域（図中「Ｂ２」と記す）の５’側、ステム−ループ形成配列であるＢ１Ｃ領域（図中「Ｂ１Ｃ」と記す）の３’側に鋏まれ、リバース方向にプロモーター領域がつながれている。
【０１１２】
このような第３のプライマーを使用し、上述の通りに第１の核酸製造方法を行う。その結果、得られる増幅産物核酸は図６（６Ｂ）に示す増幅産物核酸７０である。
【０１１３】
上述のようなプライマーを使用することにより得られた増幅産物核酸７０は、当該増幅産物核酸の第２のバックワード任意配列（即ち、「Ｂ２」）に相同な配列Ｂ２と第１のバックワード任意配列（即ち、「Ｂ１Ｃ」）に相補な配列Ｂ１Ｃの間に、リバース方向で繋がれるように設計する。
【０１１４】
当該プロモーター領域７１ａおよび７１ｂは、図中、白抜きの太い矢印で示し、その周囲を破線で囲んだ。
【０１１５】
具体的には、第１の機能性領域に機能を具備しないで設計された第１のプライマーと、上記のように設計された図６（６Ａ）に示す第３のプライマーと、第２および第４のプライマーと、更にＤＮＡからなる被検核酸とを、酵素、緩衝液および基質などと共に、適切な増幅反応が得られる条件下で増幅反応を行う。図６に記載されるような増幅産物核酸７０が得られる。
【０１１６】
続いて、増幅産物核酸７０を鋳型として、酵素、緩衝液および基質などと共に、適切な転写反応が得られる条件下で転写反応を行う。
【０１１７】
このように、増幅産物核酸７０を鋳型として、当該プロモーター領域７１ａおよび７１ｂを利用した転写反応を行うことによって、転写産物核酸７２ａおよび７２ｂが得られる。
【０１１８】
このような態様によると、所謂、ＬＡＭＰ産物の増幅ユニット毎に１以上のプロモーター領域７１（図中、代表的に７１ａおよび７１ｂの２ヶ所を示している）が組み込まれた形のＤＮＡを得ることができる。それによって、このＤＮＡを鋳型として用いた転写反応の際、１分子のＬＡＭＰ産物に対して複数の転写起点が生まれることとなり、図５に示すような従来既存の方法に比べて、効率の良い転写反応を提供することが可能である。図６に示すように本態様では、転写反応により得られる合成されたＲＮＡは、例えば、転写産物７２ａおよび７２ｂとして得ることが可能である。
【０１１９】
ここで、「ＬＡＭＰ産物の増幅ユニット」とは、標的配列とその相補鎖配列を２つずつ含む範囲をいう。
【０１２０】
上述の設計では、説明を簡素化するために第３のプライマーの第２の機能性領域にのみにプロモーター領域を配置し、第１のプライマーの第１の機能性領域には機能性を持たせない例を示したが、実際にこのように設計することも可能であるし、また、第１のプライマーの第１の機能性領域にもプロモーター領域を組み込むことも可能であり、その場合、転写に関するＲＮＡ合成起点を更に増やすことが可能になり、更に多くのＲＮＡの合成を達成することが可能である。
【０１２１】
（２）第２の設計例
図７を参照されたい。本態様に従うと、第１のプライマーの第１の機能性領域には機能性を与えないが、第１のプライマーの何れかの部分に第３の機能性領域として、増幅産物核酸に所望の制限酵素サイトを与えるための配列を具備させた第１のプライマー８４のように設計することができる。それ以外は、上述の第１の設計例と同様なプライマーを準備する。即ち、第１の設計例と同様に第３のプライマーの第２の機能性領域にはプロモーターを配列Ｂ２とＢ１Ｃの間にリバース方向に繋いで設計する（図７（７Ａ））。第１のプライマー８４は、前述の通り、第３の機能性配列領域として、制限酵素サイトが第１のプライミング配列（図中「Ｆ２」と記す）の３’端辺りから、第１のステム-ループ配列の３’端の手前辺りまでの間に与えられる（図７（７Ｃ））。その他の第２および第４のプライマーは上述の第１の設計例と同様で、第３のフォワード任意配列に相補的な配列、第３のバックワード任意配列に相補的な配列を含むように設計する。
【０１２２】
その後、被検核酸と、第１から第４のまでのプライマーおよび、酵素、緩衝液および基質などと共に、適切な増幅反応が得られる条件下で増幅反応を行う。その結果、図７（７Ｂ）に示す増幅産物核酸８１が得られる。この増幅産物核酸８１には、制限酵素サイトを与えるための第１のプライマーの第３の機能性領域の作用により、制限酵素サイト８２ａ、ｂおよびｃが含まれる。
【０１２３】
本態様の場合、好ましくは、当該制限酵素サイトは、それを与えるための第３の機能性配列を、第１のプライマー８４の３’末端から当該第１のステム-ループ配列の３’端手前辺りまでの間に含まれるように配置される。その結果、図７（７Ｂ）に示すように、制限酵素サイトは、８２ａ、８２ｂ、８２ｃの位置に配置される。
【０１２４】
このような増幅産物核酸８１を第２の核酸製造方法に鋳型として用いる場合には、予め、当該制限酵素サイトを認識および切断可能な制限酵素を用いて、適切な条件下で消化しておくことが好ましい。その後に、切断された増幅産物核酸８１を鋳型として利用し、酵素、緩衝液および基質などと共に、適切な転写反応が得られる条件下で転写反応を行う。
【０１２５】
それにより得られる転写産物核酸は、転写されるＲＮＡ８３ａおよび８３ｂとして図７に記載されているが、これに限らず、多量の転写産物核酸を得ることができる。
【０１２６】
上述では、第１のプライマーの第１の機能性領域に機能性を持たせない例を説明したが、当該第１の機能性領域に更なるプロモーター領域を組み込んでもよく、それにより、さらに多くの転写起点を生ずることが可能になる。
【０１２７】
また、制限酵素サイトを第３のプライマーの何れかの位置、好ましくは、当該第３のプライマーの３’末端から当該プロモータ領域の３’末端までの間に配置されてよい。
【０１２８】
以上のような本態様の変形例もまた、本発明の範囲内である。
【０１２９】
上述した本態様および本態様の変形例により、簡便に且つ短時間で効率よく、多くの所望の転写産物核酸を得ることが可能である。
【０１３０】
ここで、第１または第２の機能性領域に配置されるプロモーター配列と、更なる第３の機能性領域、例えば、制限酵素サイトと関係の例を記載する。
【０１３１】
第１および／または第３のプライマーに、第１および／または第２のプロモーターが配置され、その配置されたプロモーターが、フォワード方向で第１の機能性領域および／または第２の機能性領域に含まれる場合、当該第３の機能性領域は、前記プロモーター領域を含む当該プライマーの５’末端から、当該プロモーター領域の５’末端までの間に配置されることが好ましい。および／または
前記第１および／または第２のプロモーターが、リバース方向で第１の機能性領域および／または第２の機能性領域に含まれる場合、当該第３の機能性領域は、前記プロモーター領域を含む当該プライマーの３’末端から当該プロモーター領域の３’末端までの間に配置されることが好ましい。
【０１３２】
または、第３の機能性領域が、当該被検核酸に含まれてもよい。
【０１３３】
（３）第３の設計例
図８を参照されたい。本態様に従うと、第１のプライマーの第１の機能性領域には機能性を与えないが、第１のプライマー９４の何れかの部分に第３の機能性領域として、増幅産物核酸に所望の制限酵素サイトを与えるような配列を具備させるように設計する。且つ、第３のプライマー９０の第２の機能性領域にはプロモーター領域を配列Ｂ２とＢ１Ｃの間に、フォワード方向に繋いで設計する（図８（８Ａ））。更に第２および第４のプライマーは上述の第１の設計例と同様で、第３のフォワード任意配列に相補的な配列であり、第３のバックワード任意配列に相補的な配列を含むように設計する。
【０１３４】
その後、上述の第２の設計例と同様に増幅反応を行う。その結果、図８（８Ｂ）に示す増幅産物核酸９１が得られる。この増幅産物核酸９１には、所望の制限酵素サイトを与えるための第１のプライマーの第３の機能領域の作用により、制限酵素サイト９２ａ、９２ｂおよび９２ｃが含まれている。
【０１３５】
本態様の場合、好ましくは、当該制限酵素サイトは、それを与えるための第３の機能性配列を第１のプライマーの３’末端から当該第１のステム-ループ配列の３’端の手前辺りまでの間に含まれるように配置される。その結果、図８（８Ｂ）に示すように、制限酵素サイトは、図８（８Ｂ）中９２ａ、９２ｂ、９２ｃの位置に配置される。
【０１３６】
このような増幅産物核酸９１を第２の核酸製造方法に鋳型として用いる場合、予め、当該制限酵素サイトを認識および切断可能な制限酵素を用いて、適切な条件下で消化しておくことが好ましい。その後で、消化された増幅産物核酸９１を鋳型として利用し、酵素、緩衝液および基質などと共に、適切な転写反応が得られる条件下で転写反応を行う。
【０１３７】
当該プロモーター配列が適切に機能するように繋がれた増幅産物核酸９１の相補鎖によって、得られる転写産物核酸は、図８（８Ｂ）に記載されるように、転写されるＲＮＡ９３ａおよび９３ｂとして得られる。また、図面に記載されていない部分にも多くの所望の転写産物核酸を得ることが可能である。
【０１３８】
また、更に、増幅産物核酸９１自体からは、増幅核酸９１において適切に機能されるように繋がれたプロモーター配列９６（図中、太い矢印で示した）により、転写が開始され、転写されるＲＮＡ９５が得られる。
【０１３９】
上述では、第１のプライマーの第１の機能性領域に機能性を持たせない例を説明したが、当該第１の機能性領域にプロモーター領域を組み込んでもよく、それにより、さらに多くの転写起点を生ずることが可能になる。
【０１４０】
また、制限酵素サイトを第３のプライマーの何れかの位置、好ましくは、当該第３のプライマーの５’末端から当該プロモータ領域の５’末端までの間に配置されてよい。
【０１４１】
以上のような本態様の変形例もまた、本発明の範囲内である。
【０１４２】
上述した本態様および本態様の変形例により、簡便に且つ短時間で効率よく、多くの所望の転写産物核酸を得ることが可能である。
【０１４３】
（４）第４の設計例
図９を参照されたい。本態様に従うと、第１のプライマーの第１の機能性領域には機能性を与えず、且つ第３のプライマー１００の第２の機能性領域には、プロモーター領域を配置する。即ち、当該プロモーター配列は、配列Ｂ２とＢ１Ｃの間に、リバース方向に繋いで設計される（図９（９Ａ））。更に、第３のプライマーの何れかの部分に第３の機能性領域として、増幅産物核酸に所望の制限酵素サイトを与えるような配列を具備させるように設計する。好ましくは、第３のプライマーの第３の機能性領域は、増幅産物核酸に所望の制限酵素サイトを与えるための配列を、第３のプライマーの３’末端から当該第３の機能性領域、即ち、プロモーター配列の３’末端までの間に配置されることが好ましい。
【０１４４】
そのような第３のプライマー１００と、第１のプライマーと、第２および第４のプライマー、並びに被検核酸を鋳型核酸として用いて、酵素、緩衝液および基質などと共に、適切な増幅が得られる条件下で増幅反応を行う。
【０１４５】
得られた増幅産物核酸を、図９（９Ｂ）に記載した。増幅産物核酸１０１は、プロモーター配列１０２ａと１０２ｂを第１のバックワード任意配列の相補配列であるＢ１Ｃと、第２のバックワード任意配列の相同配列であるＢ２の間にリバース方向に接続されて配置る。
【０１４６】
更に当該第３の機能性領域の機能により、制限酵素サイト１０３ａ、１０３ｂおよび１０３ｃが、第２のバックワード任意配列の相同配列（図中、「Ｂ２」と記す）およびＢ２Ｃ配列の辺りに付与される（図９（９Ｂ））。
【０１４７】
このような増幅産物核酸１０１を、第２の核酸製造方法において鋳型として用いる場合、上述の第２および３の設計例と同様に、予め、当該制限酵素サイトを認識および切断可能な制限酵素を用いて、適切な条件下で消化しておくことが好ましい。その後に消化された増幅産物８１を鋳型として利用し、例えば、転写ポリメラーゼなどの酵素、緩衝液および基質などと共に、適切な転写反応が得られる条件下で転写反応を行う。
【０１４８】
それにより得られる転写産物核酸は、図９中、転写されるＲＮＡ１０４ａおよび１０４ｂとして記載されている。
【０１４９】
これら得られる転写産物核酸は１本鎖であり、５’および３’末端に互いに相補な配列を有し、それらがアニールし分子内構造を有するステム−ループ核酸１０５ａが得られる（図９（９Ｃ））。当該ステムループ核酸１０５ａを更に模式的に示したのが図９（９Ｄ）のステムループ核酸１０５ｂである。ステム−ループ核酸１０５ａのみではなく、図には示さないが同様な内部構造を有するステム−ループ核酸が、転写されるＲＮＡ１０４ｂからも得られる。
【０１５０】
このようなステム−ループ核酸は、Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡ触媒やｓｉＲＮＡなどの機能性ＲＮＡ分子として利用することが可能である。このような本態様に従うと、ステム−ループ構造を有する核酸を経済的に、且つ簡便に製造することが可能である。
【０１５１】
因みに、増幅産物核酸１０１は、ある一部分において相補な配列を有する。従って、図９（９Ｅ）に示すような内部構造を有する増幅産物核酸１０６として存在する。
【０１５２】
このような制限酵素と鋳型切断を組み合わせた方法を用いれば、所望の配列を少なくとも１コピー含む、ステム−ループ構造を有するＲＮＡ構造が効率的、経済的且つ簡便に作成することが可能である。
【０１５３】
本明細書における「制限酵素サイト」の語は、特定の制限酵素により認識され切断される「制限酵素サイト」の意味を含み、更に、文脈によって、ある対象核酸、例えば、増幅産物核酸などに対して、所望の制限酵素サイトを付与することの可能な配列をも意味する。従って、単に「制限酵素サイト」とある場合は、その文脈や状況によって、何れかの意味を選択すればよい。
【０１５４】
（５）第５の設計例
上記(１)〜(３)までの設計例に記載された方法の何れかにおいて、得られる増幅産物核酸中にＲＮＡポリメレースのターミネーター配列を付与することも可能である。これにより第２の核酸製造方法におけるＲＮＡ合成を所望の位置にて停止させることが可能である。このような方法も本発明の範囲内である。
【０１５５】
具体例としては、例えば上述の(２)および(３)で用いられる上述の方法で使用した制限酵素サイトの代わりにターミネーター配列を組み込めるようにプライマーを設計すればよい。それによって、制限酵素サイトの機能による効果と同様な効果を得ることが出来る(図１０参照されたい)。
【０１５６】
予めターミネーターを組み込む位置は、所望に応じて実施者が選択および組み込みを行えばよいが、好ましくはプロモーターによる転写開始点から、約１塩基以上、好ましい約５塩基以上下流の位置が好ましい。
【０１５７】
例えば、図１０（１０Ａ）に示した増幅産物核酸１１０を得るようにプライマーを設計すると、次のようになる。即ち、第１のプライマーの第１の機能性領域には機能を与えず、第３のプライマーの第２の機能性領域には、プロモーター領域を配置する。即ち、当該プロモーター配列は、配列Ｂ２とＢ１Ｃの間にリバース方向に繋いで設計される。更に第３のプライマーのプロモーターよりも３’側にターミネータ−配列を配置する。
【０１５８】
そのような第３のプライマーと、第１のプライマーと、第２および第４のプライマー、並びに被検核酸を鋳型核酸として用いて、酵素、緩衝液および基質などと共に、適切な増幅が得られる条件下で増幅反応を行うと、増幅産物核酸１１０が得られる。
【０１５９】
更に当該第３の機能性領域の機能により、ターミネータ−配列１１２が、第２のバックワード任意配列の相補配列（図中、「Ｂ２Ｃ」と記す）の辺りに付与される（図１０（１０Ａ））。
【０１６０】
このような増幅産物核酸１１０を、第２の核酸製造方法において鋳型として用いる場合、例えば、転写ポリメラーゼなどの酵素、緩衝液および基質などと共に、適切な転写反応反応が得られる条件下で転写反応を行えばよい。
【０１６１】
それにより得られる転写産物核酸１１３は、図１０（１０Ｂ）中、転写されるＲＮＡ１１３ａおよび１１３ｂとして記載されている。
【０１６２】
このように得られる転写産物核酸は１本鎖であり、５’および３’末端に互いに相補な配列を有しているので、それらがアニールし分子内構造を有するステム−ループ核酸１１４が得られる（図１０（１０Ｃ））。
【０１６３】
（６）第６の設計例
図１０（１０Ｄ）を参照されたい。本態様では、第１のプライマーと第３のプライマーの設計以外は、上記（５）第５の設計例と同じように行う例を示す。
【０１６４】
第１のプライマーの第１の機能性領域には機能を与えないが、機能性領域の下流に第３の機能性領域としてターミネータ−配列を組み込み、第３のプライマーには第２の機能性領域としてプロモーター領域をリバース方向に繋ぐように設計する。
【０１６５】
第１の核酸製造方法を、第５の設計例と同様に行うことにより、図１０（１０Ｄ）に示す増幅産物核酸１２０が得られる。
【０１６６】
当該第３の機能性領域の機能により、プロモーター配列１２１ａおよびｂが、第２のバックワード任意配列の相補配列（図中、「Ｂ２Ｃ」と記す）の当りに付与される（図１０（１０Ｄ））。ターミネータ−配列１２２は、第２のフォワード任意配列の相補配列（図中「Ｆ２」と記す）辺りに付与される（図１０（１０Ｄ））。
【０１６７】
このような増幅産物核酸１２０を用いて、第５の設計例と同様に第２の核酸製造方法を実施することにより、転写されるＲＮＡ１２３ａおよびｂが得られる。ここで得られる転写されるＲＮＡ１２３ａおよびｂは、標的配列またはその相補配列の何れか１つだけを有するＲＮＡ断片である。このような核酸断片は分子生物学的及び遺伝子工学的なさまざまな用途に活用可能であるが、代表的な利用例としては例えば標的配列を検出するためのプローブまたは検出対象となるターゲットなどとして有効に使用される。
【０１６８】
（７）第７の設計例
図１４を参照されたい。更に、機能性領域の作用として、プロモーター配列の組み込みと、制限酵素による鋳型切断とを組み合わせた方法の更なる例を説明する。
【０１６９】
本態様に従うと、第３のプライマーの第２の機能性領域としてプロモーター配列をフォワード方向で繋ぐことと、第３のプライマーの５’末端からプロモーターの５‘末端までの間に制限酵素サイトを設けること以外は、第４の設計例と同様にプライマーの設計を行う態様が提供される。
【０１７０】
第３のプライマー１９０を図１４（１４Ａ）に示す。第２の機能性領域としてのプロモーター配列（図中「Ｐｒｏ」と記す）は、第２のプライミング配列（図中「Ｂ１Ｃ」と記す）と第２のステム−ループ形成配列（図中「Ｂ２」）との間にフォワードで繋がれるように設計されている。
【０１７１】
上述の第４の設計例に記載した通りに第１の核酸製造方法と第２の核酸製造方法を行う。
【０１７２】
第１の核酸製造方法により得られる増幅産物核酸１９１は、プロモーター配列１９２ａ、１９２ｂを第１のバックワード任意配列（図中「Ｂ１Ｃ」と記す）の相同配列と第２のバックワード任意配列の相補配列（図中「Ｂ２」と記す）との間に３’方向に向けて配置されるように付与される。また、第３のプライマーの働きにより、制限酵素サイト１９３ａ、ｂおよびｃが図中に示されるような形で付与される。
【０１７３】
増幅産物核酸１９１の相補鎖を鋳型として使用する第２の核酸製造方法では、プロモーター１９２ａおよびｂ（図中、白抜きの太い矢印で示す）が適切に機能し、転写されるＲＮＡ１９４ａとｂが得られる（図１４（１４Ｂ））。各々の１本鎖ＲＮＡの３’末端および５’末端には互いに相補な配列が存在するため、分子内構造が形成されたステム−ループ核酸１９５ａが形成される（図１４（１４Ｃ））。これを更に模式化したのがステム−ループ核酸１９５ｂである（図１４（１４Ｄ））。
【０１７４】
また、増幅産物核酸１９１自体を鋳型として使用する第２の核酸増幅方法では、増幅産物核酸１９１において適切に機能するように繋がれたプロモーター配列１９６（図中、黒い太矢印で示す）が機能し、転写されるＲＮＡ１９７が得られる。
【０１７５】
このようなステム−ループ核酸は、、Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡ触媒やｓｉＲＮＡなどの機能性ＲＮＡ分子としても利用することが可能である。このような本態様に従うと、ステム−ループ構造を有する核酸を経済的に、且つ簡便に製造することが可能である。
【０１７６】
因みに、増幅産物核酸１９１およびその相補鎖は、ある一部分において相補な配列を有する。従って、図１４（１４Ｅ）に示すような内部構造を有する増幅核酸１９６のような形態で存在する。
【０１７７】
このような制限酵素と鋳型切断を組み合わせた方法を用いれば、所望の配列を少なくとも１コピー含む、ステム−ループ構造を有するＲＮＡ構造が効率的、経済的且つ簡便に作成することが可能である。ここでは、プロモーターと制限酵素サイトを用いてステムループ構造を取り得るＲＮＡを作出する方法を説明したが、前記第６の設計例で説明したのと同様、制限酵素サイトの代わりにターミネーター配列を利用することによっても所望のＲＮＡ構造は容易に作出可能である。
【０１７８】
上述の例では、第１の核酸製造方法と第２の核酸製造方法を別々に、または順次行う例を示したが、例えば、耐熱性ポリメレースを用いるなどして、第１の核酸製造方法と第２の核酸製造方法を同時に行ってもよく、そのような態様も本発明の範囲内である。
【０１７９】
なお、上述の第１の核酸製造方法、例えば、ＬＡＭＰ法などにおいて、場合によっては、第２のプライマー(例えば、図１中「Ｆ３」とも記される)と第４のプライマー(例えば、図１中「Ｂ３」とも記される)が当該増幅反応系に存在しなくとも、上述した方法と同様に本発明の態様に従う所望の増幅が可能な場合もある。従って、上述した本発明の態様においては、必ずしも、第２のプライマーと第４のプライマーが必要でない場合もある。
【０１８０】
（８）プロモーターの方向性について
プロモーター配列を機能性領域としてプライマーへ配置する場合の繋ぎ方と、転写反応におけるその作用について、図１３を用いて説明する。
【０１８１】
プロモーター配列への繋ぎ方は、３通りある。まず、図１３（１３Ａ）に示すような、プライマー１６０のプライミング配列（図中、斜線の入ったボックスに「２」と記す）と、ステム−ループ配列（図中、「１Ｃ」と記す）の間に、３’方向に向けてプロモーター配列（図中「Ｐｒｏ」と記す）を配置するように、プライマー１６０にフォワードで繋ぐ方法である。
【０１８２】
このように繋ぐと、当該プロモーターは、プロモーターの方向に対して、鋳型が５’から３’方向の核酸１６１であるときには転写反応は進まず、鋳型が３'から５’方向の核酸１６２であるときには転写反応が進む。
【０１８３】
次に、プライマー１７０のプライミング配列（図中、斜線の入ったボックスに「２」と記す）と、ステム−ループ配列（図中、「１Ｃ」と記す）の間に、５’方向に向けてプロモーター配列（図中「Ｐｒｏ」と記す）を配置するように、プライマー１７０にリバースで繋ぐ方法がある。
【０１８４】
このように繋ぐと、当該プロモーターは、プロモーターの方向に対して、鋳型が５’から３’方向の核酸１７２であるときには転写反応は進まず、鋳型が３'から５’方向の核酸１７１であるときには転写反応が進む。
【０１８５】
更に、プライマー１８０のプライミング配列（図中、斜線の入ったボックスに「２」と記す）と、ステム−ループ配列（図中、「１Ｃ」と記す）の間に、５’側に、５’方向に向けてプロモーター配列（図中「Ｐｒｏ」と記す）を配置するように第１のプロモーター配列を、３’側に３'方向に向けて第２のプロモーター配列を配置するように、２つのプロモーター配列をプライマー１７０にリバースで繋ぐ方法がある。
【０１８６】
このように繋ぐと、５’側の第１のプロモーターは、プロモーターの方向に対して、鋳型が３’から５’方向の核酸１８１であるときのみに転写反応が進み、３’側の第２のプロモーターは、プロモーター方向に対して鋳型が３'から５’方向の核酸１８２であるときのみに転写反応が進む。
【０１８７】
以上のように、本態様に従う第１および第３プライマーは、第１のフォワード任意配列の相同配列と第２のフォワード任意配列の相補配列および／または第１のバックワード任意配列の相補配列と第２のバックワード任意配列の相同配列の間に１以上のプロモーター配列をフォワード方向および／またはリバース方向に鋏み込む形で設計されてよい。
【０１８８】
このように設計されたプライマーは第１の核酸製造方法において有利に使用され、その結果、機能性領域として転写産物核酸において多数の有利な転写開始点を提供することが可能になる。それにより、従来の方法に比べて、より効率のよい転写反応を行うことができる。
【０１８９】
５．検出方法
上述の（４）第２の核酸製造方法の１態様、および（１）第１の設計例から(７)の設計例において、設計および作出されたＲＮＡを用いて、特定の核酸配列を検出することも可能である。従って、核酸ハイブリダイゼーション検出行なう検出方法も本発明の範囲である。
【０１９０】
図１１および１２を参照されたい。本発明の態様によって、第１の核酸合成方法により得られた増幅産物核酸、例えば、ＬＡＭＰ産物、を更に転写し、所望に応じたステム−ループ核酸を得ることが可能である。これにより、図１１(１１Ａ)に記載されるような検出用プローブ１０３ａが適切に結合することが可能であるように設計することが可能である。即ち、本発明の態様に従うステム−ループ核酸は、転写産物であり、その鎖長は短く、分子の取り得る高次構造の影響も少ないので、ハイブリダイゼーション阻害効果が少ない。これは、ハイブリダイゼーションを利用する何れの検出方法においても非常に大きな利点となる。
【０１９１】
これに対して従来法では、図９（９Ｅ）に記載するようなＬＡＭＰ産物核酸１３１ａ、ｂおよびｃのステム−ループ構造の部分をプローブ１３０に対してハイブリダイズを行うことによって検出が行われる。従って、複数のステム−ループ構造を繰り返し含むＬＡＭＰ産物核酸１３１の構造的特徴から、即ち、鎖の長さが長く、分子の取り得る高次構造の影響によるハイブリダイゼーション阻害効果が大きく現れてしまう。従って、「標的となるべき配列」の位置を厳密に制御しながら、増幅プライマーおよびプローブ設計を行わねばならず、設計の自由度に乏しい。
【０１９２】
また更に、従来法では、図１１(１１Ａ)から(１１Ｃ)の何れの様式で、ＬＡＭＰ産物中に含まれるステム−ループの部分１３１ａ、ｂおよびｃがプローブ１３０に対してハイブリダイズを行うかによって、偽陽性および／または偽陰性となり得ることも問題とされている。
【０１９３】
即ち、例えば、図１１（１１Ａ）に示すようなループ構造部分がプローブ１３０が固相される基板の方向を向いた状態で且つ、所望の配列が当該ループ構造部分の側面付近に存在する場合には、図中で丸印が付されるように、好ましいハイブリダイゼーションが得られる。
【０１９４】
これに対して、例えば、図１１（１１Ｂ）に示すような場合、即ち、ステム構造部分が前記基板の方向を向いた状態で且つ所望の配列が当該ループ構造部分の側面付近に存在する場合であり、プローブ１３０の当該所望の配列とプローブの相補配列がハイブリダイズした場合に、ステム構造部分が当該相補配列から前記基板までの距離よりも長い場合には、好ましいハイブリダイゼーションが得ることは難しく、ターゲットであるステム−ループ構造部分１３１ｂによって構造障害が生じている。図中バツ印が付されるように、この場合は好ましいハイブリダイゼーション条件ではない。
【０１９５】
また、例えば、図１１（１１Ｃ）に示すような場合、即ち、所望の配列がステム構造部分にある場合である。この場合は、そのループ構造部分が当該基板側にあっても、当該基板とは反対方向にあっても、ステム−ループ構造部分１３１ｃによる構造障害が生じる可能性が高い。従って，図１１（Ｃ）にバツ印が付されるように好ましくないハイブリダイゼーション条件である。
【０１９６】
又更に、本発明の態様を用いれば、第１の核酸製造方法により得られた増幅産物核酸、例えば、ＬＡＭＰ産物の特定の配列から所望の転写産物核酸を得ることが可能である。このような転写産物核酸は、ＲＮＡからなる所望の1本鎖のターゲット核酸（図中、「ターゲット配列」と記す）として都合よく利用することが可能である。
【０１９７】
それによって、従来問題となっているＬＡＭＰ産物構造の立体障害の影響を少なくすることが可能であり、その結果、プローブとターゲット核酸とのハイブリダイズが首尾よく達成され、それにより良好な検出感度で検出を行うことが可能になる。
【０１９８】
その上更に、本発明の態様に従うと、１分子の増幅産物核酸、例えば、ＬＡＭＰ産物など、を鋳型として用いて、第２の核酸製造方法を実施することにより、ターゲット分子として利用可能な転写産物核酸を１度の転写反応において複数得ることが可能な増幅効果が提供される。
【０１９９】
図１２（１２Ａ）に示すように、例えば、従来でターゲットとして使用されている増幅産物核酸、例えば、ＬＡＭＰ産物などのステム−ループ核酸構造部分１４０の場合、１つの増幅産物核酸内に複数の標的配列１４１が存在はしているが、実際に、プローブとのハイブリダイゼーションに好ましく利用され得る標的配列は、ループ核酸構造部分に存在する標的配列１４２のみである。
【０２００】
これに対して、本発明の態様においては、従来の方法とは異なり、直接に増幅産物核酸、例えば、ＬＡＰＭ産物などをターゲットとして使用するのではない。即ち、当該増幅産物核酸１５０を鋳型として使用して、第２の核酸製造方法を実施することによって、標的配列１５０（これは従来では直接に「ターゲット配列」として使用されていた。従って、図中では「ターゲット配列」と記す）から、所望のプローブとのハイブリダイゼーションに都合よく使用できるＲＮＡ分子を製造する。このような本発明の態様では、１つの増幅産物核酸、例えば、ＬＡＰＭ産物などから、一度に多数の好ましくターゲットとして使用できる転写産物核酸、即ち、ＲＮＡ分子、を得ることが可能である。これにより、従来法に比較して、検出方法に使用するプローブの設計や、検出方法自体の設計において、より高い自由度を得ることが可能である。これによって更に、本発明の態様は、核酸チップ（一般的には「核酸アレイ」とも称され、本明細書においても「核酸アレイ」とも記す）を用いた検出法にも利用できる汎用性を提供できる。
【０２０１】
６．導入体
本発明に従う態様により得られた増幅産物核酸および転写産物核酸並びにその一部、、例えば、標的配列および／または相補配列を含む核酸およびその一部などを、生体に導入すること、およびそのような導入がなされた導入体も本発明の範囲に含まれる。
【０２０２】
そのような導入体の宿主は、それ自体当業者に公知の何れの宿主であればよい。好ましい例は、哺乳類、昆虫、魚類，植物、原生動物、細菌、古細菌、菌類、ウイルス、リケッチア、ウイロイドおよびそれらを由来とする培養器官、組織および細胞などを含むが、これに限定されるものではない。ここで言う宿主とは、増幅産物核酸および転写産物核酸並びにその一部を導入された対象生物あるいはそれらに寄生可能な自己複製体のことを示す。
【０２０３】
当該導入方法は、それ自体当業者に公知の何れの手段を使用してもよい。そのような手段によって得られた導入体、例えば、生物、例えば、ゲノムまたはその他の遺伝子因子を構成要素として導入され含む生物、例えば、真核生物および原核生物など、ウイルス、例えば、レトロウイルス、アデノウイルスおよびフロモウイルスなど、並びにウイロイド、例えば、ポスピウイロイド科、およびアブサンウイロイド科などを含む生物に導入された生物も、全て本発明の範囲内である。
【０２０４】
導入体の例を以下に記す；
ｉ）  増幅産物核酸またはその一部を宿主に導入された導入体であり、この場合、宿主体内で所望のＲＮＡ転写が生じる；
ii)  増幅産物核酸またはその一部をウイルスなどの感染性のある宿主に導入した導入体であり、この場合には、宿主の感染対象となる生物内で所望のＲＮＡが生じる；
iii)  増幅産物核酸またはその一部をウイルスなどの感染性のある宿主に導入した導入体であり、この場合には、導入を受けた宿主により更なる生物体への感染が生じ、それにより当該生物体に対する遺伝子導入が生じ、その結果、感染を受けた生物体内において所望のＲＮＡが生じる；
iv)  増幅産物核酸を鋳型として転写された転写産物核酸、例えば、ＲＮＡなどを作出し、この作出された転写産物核酸、例えば、ＲＮＡなどを宿主に導入することにより得られた導入体；
v)  増幅産物核酸を鋳型として転写された転写産物核酸、例えば、ＲＮＡなどを作出し、この作出された転写産物核酸、例えば、ＲＮＡなどをウイルスなどの感染性のある宿主に導入した導入体であり、この場合には、導入を受けた宿主により更なる生物体への感染が生じることにより、当該生物体に対する遺伝子導入が生じ、その結果、感染を受けた生物体内において所望のＲＮＡが生じる；
vi)  増幅産物核酸を鋳型として転写された転写産物核酸、例えば、ＲＮＡなどを作出し、この作出去れた転写産物核酸を、ウイルスなどの感染性のある宿主に導入した導入体であり、この場合には、導入を受けた宿主により更なる生物体への感染が生じ、それにより当該生物体に対する遺伝子導入が生じ、その結果、感染を受けた生物体において逆転写によるＤＮＡへの変換と遺伝子導入が生じ、当該生物体内でＲＮＡ転写が生じる。
【０２０５】
以上のような導入体の例も、本発明の範囲内である。
【０２０６】
７．試薬キット
本発明の更なる態様に従うと、本発明の方法を実施するための試薬キットが提供される。そのような試薬キットの例は、本発明に従う何れかの方法を実施するに当たり必要とされるプライマー、核酸増幅用酵素、被検核酸、例えば、ＲＮＡ合成の鋳型となりうるＤＮＡ分子またはＲＮＡ、増幅および／または転写に必要な基質、制限酵素、ＲＮＡ合成酵素、これらから産生されるＲＮＡ分子、およびハイブリダイゼーション用核酸プローブ、それを固定化した固相担体、容器および例えば，反応用緩衝液などの緩衝剤、からなる群より少なくとも１選択された構成要素を具備する試薬キットであればよく、これに限定するものではないが、本発明の態様に従うプライマーを含むことがより好ましい。当該試薬キットは、好ましくは、当該プライマー、核酸増幅用酵素、ＲＮＡ合成酵素を少なくとも含めばよい。また、当該試薬キットは、上述した第1の核酸製造のための試薬キットであっても、第２の核酸製造のための試薬キットでもあってもよい。また更に、本発明の態様に従うと、耐熱性ポリメレースを用いることによりＬＡＭＰ反応と転写を１チューブ内で同時に進行させることが可能である。
【０２０７】
以上のように、ＲＮＡ製造用鋳型となり得る、例えば、ＬＡＭＰ産物などの増幅産物核酸を作出する為のプライマー、前記プライマーを用いて作出された、例えば、ＬＡＭＰ産物構造などの増幅産物核酸構造及びその製造方法、例えば、ＬＡＭＰ産物構造などの増幅産物核酸構造を鋳型として作出された転写産物核酸、例えば、ＲＮＡなど及びその構造、これを用いた標的配列検出方法及び検出するためのターゲット製造用キットおよび標的配列検出用アッセイキットも本発明の範囲内である。
【０２０８】
以上のような本発明の態様によって、その設計における自由度の高い核酸製造用プライマーを提供する。また更に、前記プライマーを用いることにより核酸合成を行って汎用性に富む核酸を提供する。
【０２０９】
また、本発明の態様に従う方法により得られた何れかの核酸をプライマーおよび／またはプローブとして提供する。またそれらを用いての核酸合成法を提供する。更に、そのような方法により得られた核酸を用いることにより、従来よりも高感度な核酸チップ検出を可能にする。
【０２１０】
更に本発明の態様に従うと、核酸チップのターゲットの設計自由度の向上を可能にするさらに、本発明の態様に従うと、核酸チップ検出の高感度化が提供される。
【０２１１】
本発明の態様に基づく方法を用いると簡便かつ経済的に所望のＲＮＡ核酸構造を作出することが出来ると共に、ハイブリダイゼーションに用いることの出来るターゲット核酸設計の際の自由度向上とハイブリダイゼーションの高感度化が提供される。また更に、本発明の態様に従う方法により得られた核酸がプライマーおよび／またはプローブとして提供される。
【０２１２】
［実施例］
以下に、本発明による実施例を説明する。
【０２１３】
実施例１
図１３（１３Ａ）ようなプライマーセットおよび鋳型ＤＮＡを使用して、核酸製造を行った。
【０２１４】
まず、配列番号１に記載の配列を含む被検核酸と、下記塩基配列を持つ5種類のプライマーを準備した；
配列番号１；（Human-NAT2遺伝子、部分配列）
GTGGGCTTCATCCTCACCTATAGAAAATTCAATTATAAAGACAATACAGATCTGGTCGAGTTTAAAACTCTCACTGAGGAAGAGGTTGAAGAAGTGCTGAAAAATATATTTAAGATTTCCTTGGGGAGAAATCTCGTGCCCAAACCTGGTGATGGATCCCTTACTATTTAGAATAAGGAACAAAATAAACCCTTGTGTATGTATCACCCAACTCACTAATTATCAACTTATGTGCTATCAGATATCCTCTCTA
配列番号２；（F3 primer）
GTGGGCTTCATCCTCAC
配列番号３；（FIP primer）
AGCACTTCTTCAACCTCTTCCTC*TAAAGACAATACAGATCTGGTCG
配列番号４；（BIP-primer、比較対照用；T7promoterを含まない配列）
GGGGAGAAATCTCGTGCCCAA*GGGTTTATTTTGTTCCTTATTC
配列番号５；（BIP primer；B1C-T7promoter+Leader-B2）
GGGGAGAAATCTCGTGCCCAA*TAATACGACTCACTATAGGGC*GGGTTTATTTTGTTCCTTATTC。
【０２１５】
配列番号6；（B3 primer）
TGATAATTAGTGAGTTGGGTGAT
上記配列中の「＊」は、構成要素の境目を表す。
【０２１６】
配列番号1は、ヒトのＮＡＴ２遺伝子の部分配列である。配列２は、第３のフォワード任意配列である。
【表１】
2007267636.tif 000003
【０２１７】
表１に示すような組成にて温度は６３℃、時間は1時間として核酸増幅を行った。この時、核酸サンプルの代わりに滅菌水を添加したものをネガティブコントロールとした。増幅したＬＡＭＰ産物をアガロースゲル電気泳動で確認した結果、ＬＡＭＰ産物に典型的なラダー状のパターンが現れ、また、その産物量や産物の分子量構成については、プロモーター領域を含まない通常のＬＡＭＰプライマーを増幅に使用した場合と全く遜色がなかった。一方、鋳型ＤＮＡを含まない場合は全く増幅が見られない。得られたＬＡＭＰ産物を一般的な方法に従いダイデオキシ塩基配列解析を行なったところ期待通りの塩基配列の増幅が確認された。
【０２１８】
以上より、本発明で提案しているプロモーターを含む形のプライマーを用いた場合、配列特異的なＬＡＭＰ増幅が可能となることが確認された。
【０２１９】
ＬＡＭＰ増幅の基本単位の配列は配列番号７で示されるヌクレオチドである。
【０２２０】
配列番号７；
AGCACTTCTTCAACCTCTTCCTCTAAAGACAATACAGATCTGGTCGAGTTTAAAACTCTCACTGAGGAAGAGGTTGAAGAAGTGCTGAAAAATATATTTAAGATTTCCTTGGGGAGAAATCTCGTGCCCAAACCTGGTGATGGATCCCTTACTATTTAGAATAAGGAACAAAATAAACCCGCCCTATAGTGAGTCGTATTATTGGGCACGAGATTTCTCCCC。
【０２２１】
ここで得られたＬＡＭＰ産物に対して、Ｔ７プロモーター、ＲＮaｓｅ−インヒビターおよび酵素反応に必要とされるバッファーを添加し、３７℃、５分〜１時間保温することにより、ＬＡＭＰ産物からのＲＮＡ転写を行なった。この際、既存手法（図５に示すような方法）を用いてＲＮＡサンプルについても作成を行ない同時評価を行なった。
【０２２２】
ＤＮaｓｅＩ処理によりＲＮＡのみを純化し電気泳動を行ったところ、既存手法に比べ、本発明による手法では、明らかに大量のＲＮＡが合成されていることが判明した。
【０２２３】
なお、本実施例ではＢ１ＣとＢ２領域の間にプロモーターを繋いだ形のＢＩＰプライマーを使用した例を挙げたが、図４、図６に示す形でB1CとB2領域の間にリバース方向でプロモーターをつないだ場合においても、ＦＩＰプライマーのＦＩＣとＦ２Ｃ領域にプロモーター繋いだものであっても、ＢＩＰ、ＦＩＰプライマーの両方にプライマーを入れたものであっても効率的な鋳型ＤＮＡの製造及びＲＮＡ合成が出来る事を確認した。また、ここでは、ＬＡＭＰ／Ｔ７プロモーター／Ｔ７ポリメラーゼの組み合わせを使用した例を示したが、他のプロモーター/ＲＮＡ合成酵素の組み合わせであってもまた、ＲＴ−ＲＡＮＰを用いた場合にも同様に実施可能であった。また、得られたＲＮＡ産物をｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡ触媒やｓｉＲＮＡなどの機能性ＲＮＡ分子として使用することも可能であった。
【０２２４】
実施例２
図８に示すようなプライマーおよび鋳型核酸を用いて核酸製造を行った。
【０２２５】
下記配列を持つような４種類のプライマーを準備し、表１に示すような組成にておこなった。
【０２２６】
配列番号２；（F3 primer）
GTGGGCTTCATCCTCAC
配列番号８；（FIP primer；F1C-EcoRV 認識配列-F2）
AGCACTTCTTCAACCTCTTCCTC*GATATC*taaagacaatacagatctggtcg
配列番号５；（BIP primer；B1C- T7promoter+Leader-B2）
GGGGAGAAATCTCGTGCCCAA*TAATACGACTCACTATAGGGC*GGGTTTATTTTGTTCCTTATTC
配列番号６；。（B3 primer）
TGATAATTAGTGAGTTGGGTGAT。
【０２２７】
上記配列中の「＊」は、各構成要素の境目を表す。
【０２２８】
温度は６３℃、時間は1時間として核酸増幅を行った。この時、核酸サンプルの代わりに滅菌水を添加したものをネガティブコントロールとした。増幅したＬＡＭＰ産物をアガロースゲル電気泳動で確認した結果、ＬＡＭＰ産物に典型的なラダー状のパターンが現れた。一方、鋳型ＤＮＡを含まない場合は全く増幅が見られなかった。得られたＬＡＭＰ産物を一般的な方法に従いダイデオキシ塩基配列解析を行なったところ、期待通りの塩基配列の増幅が確認された。以上の結果から、本発明で提案しているプロモーターを含む形のプライマーを用いた場合にも、配列特異的なＬＡＭＰ増幅が可能となることが確認された。
【０２２９】
ＬＡＭＰ増幅の基本単位の配列は配列番号９で示されるヌクレオチドであった。
【０２３０】
配列番号９；
AGCACTTCTTCAACCTCTTCCTCGATATCTAAAGACAATACAGATCTGGTCGAGTTTAAAACTCTCACTGAGGAAGAGGTTGAAGAAGTGCTGAAAAATATATTTAAGATTTCCTTGGGGAGAAATCTCGTGCCCAAACCTGGTGATGGATCCCTTACTATTTAGAATAAGGAACAAAATAAACCCGCCCTATAGTGAGTCGTATTATTGGGCACGAGATTTCTCCCC。
【０２３１】
ここで得られたＬＡＭＰ産物に対して、適当な条件下で制限酵素ＥｃｏＲＶ処理を行った上で、Ｔ７プロモーター、ＲＮaｓｅ−インヒビター及び酵素反応に必要とされる緩衝剤を添加し、１時間保温することにより、ＬＡＭＰ産物からのＲＮＡ転写を行なった。
【０２３２】
ＤＮＡｓｅＩ処理によりＲＮＡのみを純化し電気泳動をおこなうと伴に、得られたＲＮＡを逆転してｃＤＮＡにした。その上で、塩基配列解析を行い、本発明の態様に従う方法による転写産物の１次構造を調べた。その結果、期待されたＲＮＡが大量に得られたことが判明した。
【０２３３】
なお、ここでは、実施例１記載の方法に制限酵素による鋳型切断を組み合わせたＲＮＡ製造方法の形態のうちの図８に記載した１つの構造が示された（図８参照）。また、同様にプロモーターをリバース方向に繋いだ図7に記載した設計であっても、同様に効果的なＲＮＡ作成が可能であった。
【０２３４】
また、詳細は記載していないが、フォワード任意配列に対応する第１のプライマーの第１のプライミング配列と第１のステム−ループ配列の間にプロモーターを繋いだ設計で行った実験も行った。その結果、そのような設計のプライマーの使用によっても、効率的なＲＮＡ合成ができることが確認された。また、ここでは、ＬＡＭＰ法と制限酵素ＥｃｏＲＶとＴ７プロモーターとＴ７ポリメラーゼを組み合わせて使用した例を示したが、他のプロモーターと核酸切断反応を触媒する酵素などとＲＮＡ合成酵素との組み合わせでも実験した。更に、ＲＴ−ＬＡＭＰ法を利用した実験も行った。その結果、全ての場合において、当該方法が非常に有用であることを示す結果が得られた。また、ＲＮＡ産物をＰｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡ触媒またはｓｉＲＮＡなどの機能性ＲＮＡ分子と使用することも可能であった。
【０２３５】
実施例３
図９に示すようなプライマーおよび鋳型核酸を用いて拡散製造を行った。被検核酸は、配列番号１に記載の配列を含む核酸を使用し、配列番号２、配列番号３、配列番号１０および配列番号６の４種類のプライマーを準備し表１に示すような組成にて増幅反応を行った。
【０２３６】
配列番号２  （F3 primer）
GTGGGCTTCATCCTCAC
配列番号３  （FIP primer）
AGCACTTCTTCAACCTCTTCCTC*TAAAGACAATACAGATCTGGTCG
配列番号１０  （BIP primer；B1C- SmaI 認識配列-T7promoter+Leader-B2）
GGGGAGAAATCTCGTGCCCAA*TCGCCCTATAGTGAGTCGTATTA*CCCGGG*TTTATTTTGTTCCTTATTC
配列番号６  （B3 primer）
TGATAATTAGTGAGTTGGGTGAT
上記配列中の「＊」は、各構成要素の境目を表す。
【０２３７】
温度は６３℃、時間は１時間として核酸増幅を行った。このとき、核酸サンプルの泡利に滅菌水を添加したものをネガティブコントロールとした。増幅したＬＡＭＰ産物である増幅産物核酸をアガロースゲル電気泳動で確認した結果、ＬＡＭＰ産物に典型的なラダー状のパターンが現れた。一方、鋳型ＤＮＡを含まない場合は、全く増幅が見られなかった。得られたＬＡＭＰ産物を一般的な方法に従って、ダイデオキシ塩基配列解析を行ったところ期待通りの塩基配列の増幅が確認された。以上により、本発明で提案するプロモーターを含む形のプライマーを用いた場合でも、配列特異的なＬＡＭＰ増幅が可能であることが確認された。即ち、本発明の態様に従う方法によって、配列特異的な核酸製造ができることが確認された。
【０２３８】
ＬＡＭＰ増幅の基本単位の配列は配列番号１１により示される核酸であった。
【０２３９】
配列番号１１  （LAMP増幅基本単位の配列）
AGCACTTCTTCAACCTCTTCCTCTAAAGACAATACAGATCTGGTCGAGTTTAAAACTCTCACTGAGGAAGAGGTTGAAGAAGTGCTGAAAAATATATTTAAGATTTCCTTGGGGAGAAATCTCGTGCCCAAACCTGGTGATGGATCCCTTACTATTTAGAATAAGGAACAAAATAAACCCGGGTAATACGACTCACTATAGGGCGATTGGGCACGAGATTTCTCCCC
ここで得られたＬＡＭＰ産物に対して、適切な条件下で制限酵素処理を行った上で、Ｔ７プロモーター、ＲＮａｓｅ−インヒビターおよび酵素反応に必要な緩衝剤を添加し、１時間保温することにより、ＬＡＭＰ産物からのＲＮＡ転写を行った。
【０２４０】
ＤＮａｓｅｌ処理により、ＲＮＡのみを純化し、電気泳動を行った。同時にＲＮａｓｅＡプロテクションアッセイによるステムループ構造の確認をした。また、得られたＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡにした。その上で塩基配列解析を行い、本発明の態様に従う方法による転写産物の１次および２次構造を調べた。その結果、データには示さないが、期待されたステム−ループ状のＲＮＡが大量に形成できたことを確認した。
【０２４１】
なお、ここでは、実施例１記述の方法に制限酵素による鋳型切断を組み合わせたステム−スープＲＮＡ製造方法の形態のうちの１例（即ち、図９に示した設計物である）を使用したが、図１４に示した設計についても実験を行った。その結果、同様に効果的なステム−ループ状ＲＮＡ構造を作成できた。  また、この例では、バックワード任意配列に対応する第３のプライマーの第２のプライミング配列と第２のステム−ループ形成配列の間にＴ７プロモーターを繋いだ形の第３のプライマーを使用したが、第１のプライマー、即ち、フォワード任意配列に対応するプライマーの第１のプライミング配列と第１のステム−ループ形成配列の間にプロモーターを繋いだ実験も行った。データには示していないが、その結果、本例に記載した結果と同様に、効果的なステムループ状ＲＮＡ構造を作成できた。
【０２４２】
また更に、本実施例ではＬＡＭＰ法と制限酵素ＳｍａｌとＴ７プロモーターとＴ７ポリメラーゼの組み合わせを使用した例を示したが、他のプロモーターと核酸切断反応を触媒する酵素などとＲＮＡ合成酵素の組み合わせで実験を行っても、更に、ＲＴ−ＬＡＭＰを用いた実験でも、同様に有効に本発明の態様に従う方法が有利に実施できることが示された。さらに、得られたＲＮＡ産物をＰｒｅ−ｍｉＲＮＡ，ＲＮＡ触媒またはｓｉＲＮＡなどの機能性ＲＮＡ分子として使用する実験を行ったが、その結果も他の結果と同様、それらの使用が有利に実施できることが示された。
【０２４３】
実施例４
図１０に示すようなターミネーター配列を具備する鋳型核酸を使用する例を本発明の態様に従って行った。
【０２４４】
まず、配列番号１２で示される配列を含む被検核酸と、配列番号６、配列番号１３、配列番号１４および配列番号２からなる４種類のプライマーを準備した。配列番号１２（人工合成DNA部分配列）
GTGGGCTTCATCCTCACCTATAGAAAATTCAATTATAAAGACAATACAGATCTGGTCGAGTTTATATCTCTCACTGAGGAAGAGGTTGAAGAAGTGCTGATTAATATATTTAAGATTTCCTTGGGGAGAAATCTCGTGCCCAAACCTGGTGATGGATCCCTTACTATTTAGAATAAGGAACATTATAAACCCTTGTGTATGTATCACCCAACTCACTAATTATCAACTTATGTGCTATCAGATATCCTCTCTA
配列番号６  （F3 primer）TGATAATTAGTGAGTTGGGTGAT
配列番号１３  （FIP primer；F1C- terminator -F2）
GGGGAGAAATCTCGTGCCCAA*AAAA*GGGTTTATAATGTTCCTTATTC
配列番号１４  （BIP primer；B1C-ｈU6 promoter-B2）
AGCACTTCTTCAACCTCTTCCTC*CTTGTGGAAAGGACGAAACACCG*TAAAGACAATACAGATCTGGTCG
配列番号2  （B3 primer）
GTGGGCTTCATCCTCAC
上記の表１に示すような組成にて温度は６３℃、時間は１時間として核酸増幅を行った。この時、核酸サンプルの代わりに滅菌水を添加したものをネガティブコントロールとした。
【０２４５】
増幅したＬＡＭＰ産物をアガロースゲル電気泳動で確認した結果、ＬＡＭＰ産物に典型的なラダー状のパターンが得られた。一方、鋳型ＤＮＡを含まない場合は全く増幅が見られなかった。得られたＬＡＭＰ産物を一般的な方法に従いダイデオキシ塩基配列解析を行なったところ、期待通りの塩基配列の増幅が確認された。ＬＡＭＰ増幅の基本単位の配列番号１５の配列であった。
【０２４６】
配列番号１５（LAMP増幅基本単位の配列）
GGGGAGAAATCTCGTGCCCAAAAAAGGGTTTATAATGTTCCTTATTCTAAATAGTAAGGGATCCATCACCAGGTTTGGGCACGAGATTTCTCCCCAAGGAAATCTTAAATATATTAATCAGCACTTCTTCAACCTCTTCCTCAGTGAGAGATATAAACTCGACCAGATCTGTATTGTCTTTACGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGGAGGAAGAGGTTGAAGAAGTGCT
以上より、本発明で提案しているプロモーターとターミネータ−を含む形のプライマーを用いた場合にも、配列特異的なＬＡＭＰ増幅が可能であることが明らかになった。
【０２４７】
ここで得られたＬＡＭＰ産物を、定法に従って、カチオニックリポソーム法によりＨｅＬａ細胞に導入し、適切な条件下で培養後、グアニジンチオシアネート／ＳＤＳ−フェノール法により細胞からのＲＮＡ抽出を行った。抽出されたＲＮＡサンプルに対してＤＮａｓｅｌ処理によりＲＮＡのみを純化し電気泳動を行った。同時に、得られたＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡにした上で塩基配列解析を行って、本実施例における方法による産物の１次構造を調べた。その結果、期待された構造をもつＲＮＡが大量にできたことが判明した。
【０２４８】
なお、ここでは、図１０（１０Ｄ）に示した組み合わせでの設計物を用いて実験した結果を示したが、図１０（１０Ａ）および図１３に示すようなプライマーを１以上使って反応を行う実験も行った。それらのプライマーを用いて作成されたＬＡＭＰ産物中にＲＮＡ合成に使用するＲＮＡポリメラーゼに対応したターミネーター配列が含まれるような幾つかの組み合わせで設計して実験を行った。その結果、所望のＲＮＡ構造を効果的且つ簡便に作成できることが明らかになった。
【０２４９】
ターミネーター配列はプライマー内部に設計しても、ＬＡＭＰ増幅の標的配列中に含ませていても同じ効果が得られた。
【０２５０】
なお、ここでは、図１０（１０Ｄ）に示したくみあわせで設計したプライマーを用いて行った実験結果を示したが、図１０（１０Ａ）および図１３に示すようなプライマー１以上用いて作成したＬＡＭＰ産物中にＲＮＡ合成に使用するＲＮＡポリメラーゼに対応したターミネータ−配列が含まれるように設計した幾つかの組み合わせについても試験した。その結果、何れも所望のＲＮＡ構造を効果的且つ簡便に作成することが可能であった。
【０２５１】
ターミネータ−配列は、プライマー内部に設計しても、ＬＡＭＰ増幅の標的配列中に含ませても同様な結果が得られた。
【０２５２】
また、この実施例では、バックワード任意配列に対応するプライマーにｈＵ６プロモーターをリバース方向で繋いだ形の第３のプライマーを使用したが、プロモーターをフォワード方向で繋いだ形の第３のプライマーを使用した場合にも、フォワード任意配列に対応するプライマーに同様のプロモーターを繋いだ場合でも、同様に良好な結果が得られた。また、前記２種類のプライマーの両方にプロモーターを繋いだ場合にも、良好に効率的なＲＮＡ合成ができた。また、ここでは、ＬＡＭＰ法とｈＵ６プロモーターとＵ６ポリメラーゼを組み合わせた系で試験を行ったが、その他に、ＲＴ−ＬＡＭＰ法と他のプロモーターと他のターミネータ−と他のＲＮＡ合成酵素を組み合わせた系でも同様に試験したが、その場合も良好な結果が得られた。なお、本実施例では、LAMP産物を細胞内に導入し、細胞内のＲＮＡ転写反応利用による方法に関する実験例を示したが、本実験で示した転写反応はin vivo だけではなく in vitro の実験系でも良好な結果が得られる事を確認済みである。また、得られたＲＮＡ産物は、Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡ触媒またはｓｉＲＮＡなどの機能性ＲＮＡ分子として有効に使用できた。
【０２５３】
実施例５  図１５に示すようなプライマーを用いて核酸製造を行った。
【０２５４】
まず、配列番号１に記載の配列を含む被検核酸と配列番号１６に記載の配列を含む被検核酸との２種類と、更に、配列番号２、配列番号３、配列番号５および配列番号６を４種類のプライマーとして準備した。
【０２５５】
配列番号１６  G857A、変異型（A型）（※小文字部分が変異型SNPの位置）
GTGGGCTTCATCCTCACCTATAGAAAATTCAATTATAAAGACAATACAGATCTGGTCGAGTTTAAAACTCTCACTGAGGAAGAGGTTGAAGAAGTGCTGAAAAATATATTTAAGATTTCCTTGGGGAGAAATCTCGTGCCCAAACCTGGTGATGaATCCCTTACTATTTAGAATAAGGAACAAAATAAACCCTTGTGTATGTATCACCCAACTCACTAATTATCAACTTATGTGCTATCAGATATCCTCTCTA
配列番号2  （F3 primer）
GTGGGCTTCATCCTCAC
配列番号3  （FIP primer）
AGCACTTCTTCAACCTCTTCCTC*TAAAGACAATACAGATCTGGTCG
配列番号5  （BIP primer；B1C-T7promoter+Leader-B2）
GGGGAGAAATCTCGTGCCCAA*TAATACGACTCACTATAGGGC*GGGTTTATTTTGTTCCTTATTC
配列番号6  （B3 primer）
TGATAATTAGTGAGTTGGGTGAT
上記配列中の「＊」は、各構成要素の境目を表す。
【０２５６】
上述した表１に示すような組成にて温度は６３℃、時間は１時間として核酸増幅を行った。この時、核酸サンプルの代わりに滅菌水を添加したものをネガティブコントロールとした。増幅したＬＡＭＰ産物をアガロースゲル電気泳動で確認した結果、ＬＡＭＰ産物に典型的なラダー状のパターンが現れた。一方、鋳型ＤＮＡを含まない場合は全く増幅が見られなかった。
【０２５７】
得られたＬＡＭＰ産物を一般的な方法に従いダイデオキシ塩基配列解析を行なったところ期待通りの塩基配列の増幅が確認された。
【０２５８】
以上より、本発明で提案しているプロモーターを含む形のプライマーを用いれば、配列特異的なＬＡＭＰ増幅が可能となることが確認された。
【０２５９】
ここで得られたＬＡＭＰ産物に対して、Ｔ７プロモーター、ＲＮＡｓｅ−インヒビター及び酵素反応に必要とされるバッファーを添加し、１時間保温することにより、ＬＡＭＰ産物からのＲＮＡ転写を行なった。反応後、１／９量の２０ｘＳＳＣ緩衝液を添加し、予め用意しておいた核酸プローブ固定化チップに対して添加して、５５℃で１０分間ハイブリダイゼーションを行った。なお、その際対象区として、既存手法により作成されたターゲット核酸の１例として、上記ＬＡＭＰ産物についても同時に評価を行った。ここで使用した核酸プローブ固定化チップは、３’末端にチオール基を導入することにより基板に具備される金電極に固定化された配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９に示される核酸を核酸プローブとして使用した。
【０２６０】
配列番号17  （NAT2、G857A-SNP、Aタイプ検出用Probe）
ACCTGGTGATGAATCCCTTACTATTT
配列番号18  （NAT2、G857A-SNP、Gタイプ検出用Probe）
CCTGGTGATGGATCCCTTACTAT
配列番号19  （ネガティブコントロール用Probe）
なお、配列番号１９は、バックグラウンド電流値を検知するための陰性コントロールプローブとして使用した。配列番号１７は、ＮＡＴ２遺伝子Ｇ８５７Ａ−ＳＮＰのＡ型多型を検知するプローブである。配列番号１８は、ＮＡＴ２遺伝子Ｇ８５７Ａ−ＳＮＰのＧ型多型を検知するプローブである。
【０２６１】
ハイブリダイゼーション後、０．２ｘＳＳＣで４５℃で２０分間洗浄し、最後に、ヘキスト３３２５８の電流応答を測定したところ、電流値増加について図１６、図１７および図１８のような結果が得られた。
【０２６２】
図１６に示すコントロールサンプルの結果よりも、図１７に示すように本発明の態様に従って得られた転写産物の検出の方が２倍以上の感度で測定された。また、図１８に示すように、本発明の態様に従う方法によりＳＮＰをより精度よく検出可能であることが明らかになった。
【０２６３】
なお、本実施例では電流検出型ＤＮＡチップを使用して行った実験結果を示したが、、他の検出方式による検出、即ち、ＤＮＡチップなどの核酸チップ、具体的には蛍光検出方式や化学発色方式、ビーズアレーなどにも適用可能であった。
【０２６４】
また、測定対象としてＮＡＴ２遺伝子およびそのＳＮＰ判定を行った結果を示したが、本発明の用途は、これに限定されるものではなく、微生物やウイルスの検知、または遺伝子の発明限定法の検知などにも使用可能である。
【０２６５】
以上の結果から、本発明の方法を用いることで既存手法に比べてハイブリダイゼーションによる配列検出の高感度化が実現できることが示された。それと伴に、ターゲット核酸設計の際の自由度向上が可能となったことも示された。
【図面の簡単な説明】
【０２６６】
【図１】本発明の１態様であるプローブおよび被検核酸を示す模式図。
【図２】本発明の１態様である増幅方法を示すスキーム。
【図３】本発明の１態様である増幅方法を示すスキーム。
【図４】本発明の１態様である増幅方法における核酸の一部を示す模式図。
【図５】従来の方法で得られた鋳型ＤＮＡの模式図。
【図６】本発明の１態様であるプローブおよび鋳型核酸を示す模式図。
【図７】本発明の１態様であるプローブおよび鋳型核酸を示す模式図。
【図８】本発明の１態様であるプローブおよび鋳型核酸を示す模式図。
【図９】本発明の１態様であるプローブおよび鋳型核酸を示す模式図。
【図１０】本発明の１態様である鋳型核酸を示す模式図。
【図１１】ＬＡＭＰ  産物のチップによる検出の様子を示す模式図。
【図１２】ステムループ核酸と核酸チップによる検出を示す模式図。
【図１３】本発明の１態様であるプローブ示す模式図。
【図１４】本発明の１態様であるプローブおよび被検核酸を示す模式図。
【図１５】本発明の１態様であるプローブおよび被検核酸を示す模式図。
【図１６】従来の方法に従う結果を示すグラフ。
【図１７】本発明に従う実施例の結果を示すグラフ。
【図１８】本発明に従う実施例の結果を示すグラフ。
【符号の説明】
【０２６７】
１．被検核酸    ２．標的配列    ３．第１のフォワード任意配列    ４．第２のフォワード任意配列    ５．第３のフォワード任意配列    ６．第１のバックワード任意配列    ７．第２のバックワード任意配列    ８．第３のバックワード任意配列    ９．第１のプライマー    １０．第１のプライミング配列    １１．機能性領域    １２．第１のステム−ループ形成配列    １３．５６．第２のプライマー    ２１．被検核酸の相補鎖    ２２．標的配列の相補配列    ２３．第１のフォワード任意配列の相補鎖    ２４．第２のフォワード任意配列の相補鎖    ２５．第３のフォワード配列の相補鎖    ２６．第１のバックワード任意配列の相補鎖    ２７．第２のバックワード任意配列の相補鎖    ２８．第３のバックワード任意配列の相補鎖    ２９．４９．第３のプライマー    ３０．第２のプライミング配列    ３１．第２の機能性領域    ３２．第２のステム−ループ形成配列    ３３．第４のプライマー    ４１．４２．４４．４７．伸長鎖    ４３．核酸    ４８．５１．ループ核酸    ４５．２本鎖核酸    ４６．５５．鋳型核酸    ５３．５４．中間体    ５５．６０．７０．８１．９１．１０１．１３１．１４０．ＬＡＭＰ産物(核酸)    ６１．７１ａ．７１ｂ．１０２ａ．１０２ｂ．プロモーター    ６２．７２ａ．７２ｂ．転写産物    ８０．９０．１６０．１７０．１８０．プライマー    ８３ａ．８３ｂ．９３ａ．９３ｂ．１０３ａ．１０４ａ．１０４ｂ．１１３ａ．１１３ｂ．１２３ａ．１２３ｂ．１９４ａ．１９４ｂ．転写されるＲＮＡ    ９１．１０１．１０１．１１０．１２０．１９１．増幅産物核酸    ９２ａ．９２ｂ．９２Ｃ．１０３ａ．１０３ｂ．１０３ｃ．１９３ａ．１９３ｂ．１９３ｃ．制限酵素サイト    １００．１９０．第３のプライマー    １０２ａ．１０２ｂ．プロモーター配列    １０５ａ．分子内構造    １０５ｂ．１１４．１９５ａ．１９５ｂ．ステム−ループ構造    １０６．１９６．増幅核酸    １１２．１２１ａ．１２１ｂ．ターミネータ−配列    １１３．転写産物核酸    １３０．プローブ    １３１．１４０．ステムーループ核酸構造部分    １４１．１４２．１５２．ターゲット配列    １５３．ＲＮＡ分子    １６１．１６２．１７１．１７２．１本鎖核酸    
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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