(57)【要約】【課題】流路内に微細な突起や溝を敷設したマイクロ流体デバイスは詰まり易い。一方、流路内壁に微細構造の無いシンプルなマイクロ流体デバイスには、旋回流れを安定に形成する方法や流体を速やかに混合する方法が無いという課題があった。【解決手段】エッジ部分が流路１１に近接する第1の電極４３と、流路１１から離れた位置で対向する第２の電極４４とを備えたマイクロ流路を使用し、電極エッジから、キャリヤー流体中に浮遊する試料や添加した誘電体に働く電気力学的作用により、試料とキャリヤーからなる流れを旋回させる。旋回する流れは、試料の沈殿や流路壁への付着を防止し、速やかに流体を混合して試料と溶液成分との反応を促進する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料とともにキャリヤー流体が流れる流路と近接する一平面内に電極を配置したマイクロ流体デバイスであって、前記電極は、エッジ部分が前記流路へ近接する第１の電極と、前記流路から離れた位置で前記第１の電極と対向する第２の電極とからなり、前記第１の電極と第２の電極の間に交流電圧を印加し、前記第１の電極のエッジ部分から作用する電気力学的作用により前記試料とキャリヤー流体を旋回させることを特徴とするマイクロ流体デバイス
【請求項２】
前記試料は細胞あるいは細胞様の生体物質であり、かつ、前記電気力学的作用は前記試料に作用する誘電泳動力であることを特徴とする請求項１のマイクロ流体デバイスを用いた生体物質検査装置
【請求項３】
前記キャリヤー流体には、前記試料の他にビーズ状あるいはブロック状の誘電体が混入されており、前記電気力学的作用は前記誘電体に作用する誘電泳動力であることを特徴とする請求項１のマイクロ流体デバイスを用いたマイクロ化学リアクター
【請求項４】
前記キャリヤー流体は、水をベースとする第１の流体と、第１の流体と混ざり合わない第２の流体からなる２相の流体であり、前記電気力学的作用は前記２相の流体に作用することを特徴とする請求項１のマイクロ流体デバイスを用いたマイクロ化学リアクター
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガラス基板やプラスティック基板にマイクロサイズの流路を掘り、わずかな量の試料を扱うマイクロ流体デバイスに係わり、特にこのマイクロ流体デバイスを用いた、細胞や血液などの特性を調べる生体物質検査装置や、複数の試料溶液を速やかに混合して反応させるマイクロ化学リアクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
代表的な生体物質検査装置として、非特許文献１に示される濁度法を原理とする血小板凝集能検査方法が、止血能力の定量的な確認のために広く使われてきた。近年の研究から動脈硬化や糖尿病に起因する血栓に関わる重要な生体内反応が、血小板の数個から１００個程度凝集した小さい塊状態から始まることが分かってきており、濁度法ではこの重要な領域を検知できないという欠点が指摘されている。
【０００３】
この欠点を改善するために特許文献１に示される散乱光法が開発され、弱い凝集領域の感度が向上した。しかし、凝集塊が沈んだり試料が壁に付着したりしないようキュベット内で常時スターラーでかき混ぜる必要があり、少なくとも１ｃｃ程度の検体試料を準備するために５ｃｃほど採血しなければならない。また、検査前に血液から試料を調製する手間と技術が必要である。
【０００４】
試料の少量化と手間の軽減を目指してマイクロ流体デバイスを利用する特許文献２のような方法が考えられている。この方法はマイクロ流路内に全血を流し、その速度や特定位置での時間を計測する。全血を使うので調製の手間も少なく扱いやすいため、食物や様々なストレスが血液状態に与える影響など、たくさんのデータが取得されている。しかし、マイクロ流路途中の一部に内径数μｍ程度の特に細い構造を設けるため詰まり易く、検査不能でリジェクトされる検体が多い。また、取得されたデータには幅の広い分布が現れるなど、精度や信頼性に劣る欠点がある。
【０００５】
以上から、生体物質検査装置に使われるマイクロ流体デバイスには、（１）流路内で詰まりを生じやすい（微細構造が原因）、（２）流路内で撹拌する手段が無い、という２つの問題がある。目詰まり防止の点から、少なくとも現状の数μｍよりは幅の広い数１０μｍから１００μｍの幅をもつ一般的な流路で実現することが望ましく、また、マイクロ流路内で簡単に撹拌できる新規技術の開発が望まれている。
【０００６】
一方、マイクロ流体デバイスは、拡散律速である化学反応がサイズ効果により速くなり、微少量を密封状態で扱うため環境汚染が防止でき、温度制御の応答が速く温度分布の無い反応場が得られ、不安定爆発性の試料も安全な環境条件下で管理できるなどの特徴からマイクロ化学リアクターとしての期待も大きい。しかし、反応場である流路が短いという制限があるため、必要な反応時間の確保が難しいという課題がある。
【０００７】
反応時間を速めるために、特許文献３、非特許文献２のようなミキシングの提案や研究がなされている。しかしこれ等の方法は、マイクロ流路内部にさらに細かい構造を敷設したり、曲線状の流路を用いたりするため、濃度不均一や試料の付着が生じやすく、さらには流路の詰まりにまで発展しやすいという課題がある。
【０００８】
したがって、マイクロ化学リアクターとして使われるマイクロ流体デバイスには、（１）流路内で詰まりを生じやすい（複雑構造が原因）、（２）シンプルな流路内で撹拌する手段が無い、という２つの問題がある。これらは前述した生体物質検査装置と同じ問題であり、さらには多くの応用分野も含めたマイクロ流体デバイス全体に共通する根本課題である。
【特許文献１】特許公開平５−２４０８６３
【特許文献２】特許公開平２−１３０４７１
【特許文献３】ＷＯ  ２００３／０１１４４３（ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０２３４６２）
【非特許文献１】Ｇ．Ｖ．Ｒ．  Ｂｏｒｎ：“Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｂｙ  Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  Ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｒｅｖｅｒｓａｌ”，  Ｎａｔｕｒｅ，  ｖｏｌ．１９４，  ｐｐ．９２７−９２９  （１９６２）．
【非特許文献２】Ｋ．  Ｈｏｓｏｋａｗａ，  Ｔ．  Ｆｕｊｉｉ，  ａｎｄ  Ｉ．  Ｅｎｄｏ：“Ｈａｎｄｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｉｃｏｌｉｔｅｒ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓａｍｐｌｅｓ  ｉｎ  ａ  Ｐｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）−Ｂａｓｅｄ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｄｅｖｉｃｅ，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｖｏｌ．７１，  ｎｏ．２０，  ｐｐ．４７８１−４７８５  （１９９９）．
【非特許文献３】Ｋ．Ｖ．Ｉ．Ｓ．  Ｋａｌｅｒ  ａｎｄ  Ｔ．Ｂ．  Ｊｏｎｅｓ：“Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｓｐｅｃｔｒａ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  Ｆｅｅｄｂａｃｋ−Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｌｅｖｉｔａｔｉｏｎ”，  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ｖｏｌ．５７，  ｐｐ．１７３−１８２  （１９９０）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上の背景技術で述べたように、生体物質検査装置やマイクロ化学リアクターに使われるマイクロ流体デバイスでは、流路内にさらに細かい構造体を敷設する方法が使われている。しかし、流路の構造や形状の複雑化により不均一濃度の発生、試料や析出物の付着、さらには流路の詰まりを生じ易くなるという課題がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、エッジ部分が流路に近接する位置の電極と、流路から離れた位置の対向電極とを備えたマイクロ流体デバイスを用い、電極間に交流電圧を印加することにより、上記、課題を解決するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、シンプルな構造の流路内で試料とキャリヤー流体の旋回を可能にし、マイクロ流体デバイスに応用の可能性を広げる新規の手段を提供する。この旋回流れを発生させる手段により、流路内の試料の速やかな混合、浮遊物の沈殿や流路壁への付着の阻止、さらに流路内の目詰まり防止などの点でマイクロ流体デバイスの性能向上を実現する。特に、血小板凝集能や血液流動性を検査する生体物質検査装置、また少量の試料から反応生成物を得るマイクロ化学リアクターの用途に適している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に、本発明によるマイクロ流体デバイスで、流路内に旋回流れを形成する方法を詳細に述べる。
【実施例１】
【００１３】
まず、本発明の説明に必要な、誘電泳動力について簡単に説明する。非特許文献３によれば、誘電泳動力（Ｆ）は、粒子（比誘電率ε２）が分散された流体中（比誘電率ε１）に電界勾配が存在する場合に発生し、電界の極性（電気力線の向き）には関係なく粒子に作用する引力（あるいは斥力）であり
Ｆ＝２πｒ３ε０ε１・Ｒｅ［ＣＭ（ω）］・ｇｒａｄ｜Ｅ｜２    …  式１
ε０：真空の誘電率、ｄ：粒子の直径、Ｅ：電界ベクトル
と表される。式１から、誘電泳動力（Ｆ）は粒子半径ｒの３乗（または体積）と、クラジウス−モソッティ係数ＣＭ（ω）の実数部でありマイナス０．５からプラス１．０までの間の値をとるＲｅ［ＣＭ（ω）］と、電界の２乗の勾配である∇｜Ｅ｜２  の３つの項の積に比例する。
【００１４】
一般には、誘電泳動力を発生するために電極へ印加する電圧として、周波数が約１００Ｈｚから１００ＭＨｚの間の交流を使用する。この周波数範囲の交流電圧を用いると、粒子が帯電している場合に作用する電気泳動力を時間平均の効果によりキャンセルすることができる。また、電極が直に流体に接触している場合に生じる（電気分解などの）電極反応を抑制することができる。
【００１５】
流体を２０°Ｃの水とすれば比誘電率ε１は約７８であり、通常の物質では多くても比誘電率ε２は１０以下であるから、水中ではほとんどの物質に対してＲｅ［ＣＭ（ω）］は負となり、電極から反発する力（斥力）である負の誘電泳動力（Ｆ＜０）が働く。したがって、流路の周囲に設置した複数の電極から誘電泳動力を作用させると、水に浮遊して移動する試料は電極からの反発力により電極エッジから離れる方向に移動する。
【００１６】
我々はこの誘電泳動の実験を行って、次のような現象を発見した。実験には、図１（ａ）に示すように、板状の電極２枚のエッジを対向させ、一辺が約１００μｍの正方形の断面をもつマイクロ流路１１がエッジ部分を跨ぐ位置に配置した第１の電極４３と、マイクロ流路１１から離れた位置に配置した第２の電極４４を備えたマイクロ流体デバイス１０を製作して使用した。流路内に数μｍ径の樹脂ビーズ（試料２０）を浮遊させた水（キャリヤー液体２５）を流し、２つの電極間に交流電圧を印加したところ、マイクロ流路１１内に勢いよく旋回する流れが発生する。
【００１７】
図２は、実験で撮影したムービー画像から、２コマを抜き出した写真である。この実験の２つの電極４０は、先端間の距離が約６００μｍ離れ、１８０度の回転対称となる互い違いの平行位置に配置されている。また、電極間には５０Ｈｚ、１５Ｖｐ−ｐの交流電圧が印加されている。図２（ａ）と図２（ｂ）の時間差は約０．３秒で、その間に白抜き矢印で示した直径６μｍの蛍光ビーズが、長径約５００μｍの楕円軌道を描き、秒速２ｍｍ程度の速さで旋回する。このことは電極先端エッジ部から誘電体粒子へ反発力が作用することを示している。
【００１８】
以上の現象は、計算機解析からも誘電泳動力の作用であることが確認された。さらに計算機解析により、図３（ａ）に示すような幅の狭い電極対を互い違いに複数段を連続させる構成とした場合、図３（ｂ）に示すように、樹脂ビーズ（試料２０）は流れの方向と直交する軸を中心として旋回する部分ができることも分かった。
【００１９】
図４に示すＹ字状のマイクロ流路は、試料を分散した第1の試料溶液２６と、第1の試料溶液と反応させる物質を含む第２の試料溶液２７を２つの流入口から流入させ、流路１１に設置した図１（ａ）の断面の配置となる電極からの作用により混合して反応させ、反応結果を観測、あるいは反応生成物を得るためのマイクロ流体デバイスの例である。
【００２０】
このデバイスの性能を調べるために、第1の試料溶液２６にルシフェラーゼ水溶液を、第２の試料溶液２７にはルシフェリン水溶液を混入し、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応による発光を観測する実験をおこなった。２つの溶液が合流した後しばらくは、２つの溶液の界面しか発光せず、混合は起らずに層流が維持されることが分かる。試料溶液が第１の電極４３と第２の電極４４が設置された領域に入ると、発光領域がマイクロ流路幅いっぱいまで広がり、急激に発光量が増大し、数ｍｍの位置で発光量は飽和する。このことから、電極の作用により試料が旋回し、２つの試料溶液は旋回する流れにより完全に混合されることが分かる。したがって、マイクロ化学リアクターに必要な、優れたミキシング性能を有することが分かった。
【００２１】
以上述べたように、本発明により、流路内に特別な細かい構造を設けることなく、シンプルな構造のマイクロ流路内で試料とキャリヤー液体を旋回させるマイクロ流体デバイスが可能になる。以降、図１（ａ）と図１（ｂ）に示した構造の電極を旋回電極、図３（ａ）と図３（ｂ）に示した構造の電極を横旋回電極と呼ぶことにする。
【００２２】
本発明は、この旋回電極あるいは横旋回電極を用いることが可能な全てのマイクロ流体デバイスに適用されるものである。以下に、生体物質検査装置に応用した実施例を示す。
【実施例２】
【００２３】
図５は、本発明による旋回電極と横旋回電極を備えたマイクロ流体デバイスを、生体物質検査装置の中でも特に血小板凝集能検査装置として応用した実施例の全体構成図である。ここでは検査対象である血小板試料２１の流れに沿って、血小板凝集能検査装置の動作を説明する。
【００２４】
検査の前処理として、３．８％クエン酸採血を行った被検者の血液から多血小板血漿（ＰＲＰ）あるいは貧血小板血漿（ＰＰＰ）の血小板試料２１を作成し、第１の送液ポンプ１６に備えられた試料リザーバー内で、体温と同じ３７℃にてインキュベートする。一方、血小板凝集惹起剤２２として、エピネフリン（Ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）０．３μＭを作成し、第２の送液ポンプ１７に備えられた凝集惹起剤用リザーバーにセットする。
【００２５】
検査は第１の送液ポンプ１６の起動で開始する。送液ポンプ１６から圧力でマイクロ流体デバイス１０の流路へ試料である血小板血漿が送り込まれ、その１分後に第２の送液ポンプ１７から血小板凝集惹起剤２２が、マイクロ流体デバイス１０の別の流路へ送り込まれる。マイクロ流体デバイス内部は、図６に示すようにＹ字状の流路が形成され、血小板試料２１と血小板凝集惹起剤２２はそれぞれ第１の流入口１２と第２の流入口１３から別々に流入してから同じ流路へ合流する。
【００２６】
合流点から下流に向かう領域には、まず横旋回電極４２が設置されており、この領域で血小板試料２１と血小板凝集惹起剤２２が混合され、凝集反応が開始し進行する。血小板凝集の進行とともに比較的大きな凝集塊の沈殿や流路の壁への付着が起きやすくなるが、混合液体はその時点で、すでに旋回電極４１に囲まれた領域に進行している。通常の圧力流れでは流路方向へ放物線状の速度分布を生じ、流路の壁に近い部分の液体が停滞して、浮遊物質の付着が起こりやすい。しかし、この旋回電極４１の領域では、断面方向への旋回流れが加わるため、壁への付着および沈殿は起こらない。
【００２７】
旋回電極には、壁付着や沈殿を阻止する効果以外に、粒子のサイズに応じて分離する効果がある。図７は、旋回電極領域における旋回の様子を示した流路の断面図である。誘電泳動力は式１に示したように粒子の体積あるいは粒径ｒの３乗に比例する力であるから、大きい凝集塊２４は強い力を受けて大きな半径で旋回し、小さい凝集塊２３は小さな半径で旋回する。旋回する半径にこのような違いがあると、図８の流路の縦断面図に示す放物線状の速度分布の影響により、流れ方向への速度は大きい凝集塊２４で遅く、小さい凝集塊２３では速くなる。その結果、流れの方向へ凝集塊の大きさの順に帯状の分離パターンが生じ、粒度の分析が可能になる。
【００２８】
次に図９を用いて、検出光照射領域での操作を説明する。試料は、小さい凝集塊２３が先に、大きい凝集塊２４が後になるバンドを維持したまま、キャリヤー液体２５とともに、マイクロ流路１１の混合領域から検出光照射領域５３へ流れてくる。検出光照射領域５３では、流路に焦点を合わせた顕微鏡５１が設置されている。
【００２９】
検出光照射領域５３に達したバンド構造の試料の流れに検出光５２が照射され、その散乱光、反射光が顕微鏡５１を通して光センサー５４により電気信号に変換され、データ収集解析装置３３へ送られる。この電気信号には血小板凝集塊の大きさと密度を反映した光強度と血小板凝集塊の大きさを反映した到達時間に対するスペクトラム、絶対値補正用のマーカー粒子２８の検知データなどが含まれており、これらのデータを基にデータ収集解析装置３３にて解析、分析が行われ、粒度分布やその他の分析結果が得られる。
【００３０】
以上に述べたように、本発明による、シンプルな流路構造で旋回する流れを発生させることができるマイクロ流体デバイスを用いることにより、目詰まりや検体のリジェクトが無く、信頼性の高い血小板凝集能検査装置を実現する。また、従来装置では不充分であった測定精度を向上し、試料の少量化、装置の小型化の点でも優れた装置を提供する。
【００３１】
（変形例）
本発明の実施例２では、血小板を試料とし、その凝集能を検査する装置例を述べたが、試料や目的は他の生体試料であっても構わない。例えば赤血球を試料とするならば、赤血球は柔らかさ（変形能）の違いによりマイクロ流路内で生じる速度差を計測できる。柔らかい試料ほど外側を旋回し、速度が遅くなるためである。また白血球を試料とするならば、白血球の粘着能の違いによりマイクロ流路内で生じる速度差を計測できる。さらには調製が楽な全血を試料とする血液流動性を検査する装置であれば、従来よりもはるかに信頼性が高く、測定精度も良いデータを得ることができる。
【００３２】
本発明の実施例２では、血小板を試料とし、その凝集塊の粒度分布データを取得する方法について述べたが、ここで用いた旋回流れにより試料を分離する方法は、粒子の大きさだけでなく、誘電泳動力で差が出る他の属性で分離することも可能である。例えば、細胞やバクテリヤでは、同じ試料であっても生きている試料と死んだ試料で細胞膜の活性や生体内代謝物質の種類が変化し、誘電泳動力の作用に差が出ることが知られている。したがって生細胞と死細胞の分離であってもよく、また、多種多様な細胞の混在する試料からその誘電的な属性での分類や個数の分布を調べる用途であっても構わない。
【００３３】
また本発明の実施例２では、試料検出部で光学顕微鏡により照射光の反射光や散乱光を検出する方法を用いたが、もちろん透過光を用いることも可能であり、更には蛍光標識試料と蛍光顕微鏡の組合せや、光学的検知以外の、例えばファラデーケージの通過を検知する静電的な検知や、微小領域の熱応答を利用する検知の方法であっても良く、本発明の主旨は検知方法により制限を受けるものではない。
【００３４】
本発明の実施例１の図４では、第１の試料溶液２６と第２の試料溶液２７を混合する例を説明したが、本発明の主旨によれば混合する流体の数に制限を与えるものではなく、合流する流体の数は３以上であっても構わない。
【００３５】
また本発明の実施例では、送液ポンプによる圧力流れの送液を示したが、送液は圧力流れに限定されるものではなく他の方法でも可能である。例えば、マイクロ流路の流入口と流出口に設けた電極に直流電圧を印加し、電気泳動あるいは電気浸透流を利用して送液する方法であっても良く、本特許の意図を何ら妨げるものではない。交流電圧による誘電泳動力は、直流電圧で駆動する電気泳動や電気浸透流とは相互に影響が無く独立に作用させることができる点が特徴の１つである。
【００３６】
また本実施例では誘電泳動力の作用する対象は固体、液体について述べた。しかし気体もまた誘電率が水より小さい誘電物質であり、水とともに使えば誘電泳動力が作用する物質であり、液体と混ざり合わない流体である。したがって気体と液体からなる気液２相流であっても良く、粘性係数が小さい気体の性質を利用すれば、平行２相流だけでなく互いの流体が逆方向に流れる向流２相流も可能である。
【００３７】
また本実施例では、第1の電極４３のエッジ部が流れの方向への直線となる電極形状の例を示したが、電極エッジ部は図１０（ａ）に示すような櫛歯状、あるいは図１０（ｂ）に示す波状、あるいは、ここでは示していない他の形状であっても可能である。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
以上述べたように本発明によるマイクロ流体デバイスは、流路内に旋回流れを安定に形成する用途、流路内で試料の混合を促進させる用途に有効であり、特に、血小板凝集能や血液流動性を検査する生体物質検査装置、また少量の試料から反応生成物を得るマイクロ化学リアクターの用途に適している。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】旋回流れを発生する電極の配置図
【図２】旋回を制止する電極の配置図
【図３】横方向の旋回を発生する電極の配置図
【図４】旋回で２液を混合するマイクロ流体デバイス平面図
【図５】血小板凝集能検査装置の全体図
【図６】血小板凝集能検査装置用マイクロ流体デバイスの平面図
【図７】凝集塊旋回領域の流路断面図
【図８】凝集塊分離効果の原理図
【図９】血小板凝集能検査装置の試料検出部拡大図
【図１０】変形例である電極をデバイス背面から見た配置図
【符号の説明】
【００４０】
１０  マイクロ流体デバイス
１１  マイクロ流路
１２  第１の流入口
１３  第２の流入口
１４  廃液流出口
１５  生成物流出口
１６  第１の送液ポンプ
１７  第２の送液ポンプ
１８  廃液容器
２０  試料
２１  血小板試料
２２  血小板凝集惹起剤
２３  小さい凝集塊
２４  大きい凝集塊
２５  キャリヤー液体
２６  第１の試料溶液
２７  第２の試料溶液
２８  マーカー粒子
２９  生成物溶液
３１  交流電源
３２  プロセス制御装置
３３  データ収集解析装置
４０  交流電極
４１  旋回電極
４２  横旋回電極
４３  第１の電極
４４  第２の電極
５１  顕微鏡
５２  検出光
５３  検出光照射領域
５４  光センサー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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