(57)【要約】【課題】本発明はシクロスポリン、その医薬組成物およびＣＭＶ感染の処置における使用を指向する。【解決手段】非免疫抑制性シクロスフィリン結合シクロスポリン、例えば式（１）で示される化合物2007112775.tif 000004を含む医薬組成物を単独で、または他の抗ＣＭＶ特性を有する薬剤との組み合わせにおいて、ＣＭＶ感染またはＣＭＶ誘発障害の防御、処置または予防のために提供する。または、これら医薬組成物を投与することによって、ＣＭＶ感染またはＣＭＶ誘発障害を防御、処置または予防するための方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療上有効量の非免疫抑制性シクロフィリン結合シクロスポリンを対象に投与することを含む、それを必要とする対象においてサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染またはＣＭＶ誘発障害を防御、処置または予防するための方法。
【請求項２】
培地に有効量の非免疫抑制性シクロフィリン結合シクロスポリンを適用することを含む、この培地においてＣＭＶ複製を阻止するための方法。
【請求項３】
治療上有効量の非免疫抑制性シクロフィリン結合シクロスポリンを対象に投与することを含む、それを必要とする患者においてＣＭＶ複製を阻止するための方法。
【請求項４】
治療上有効量の非免疫抑制性シクロフィリン結合シクロスポリンを移植者に投与することを含む、それを必要とする移植者においてＣＭＶ感染の再発を防御するための方法。
【請求項５】
ＣＭＶ感染またはＣＭＶ誘発障害の防御または処置における非免疫抑制性シクロフィリン結合シクロスポリンの使用。
【請求項６】
請求項１から４のいずれか１項に記載の方法において使用するための医薬組成物の調製における、非免疫抑制性シクロフィリン結合シクロスポリンの使用。
【請求項７】
１個またはそれ以上の薬学的に許容される希釈剤またはその担体と一緒に非免疫抑制性シクロフィリン結合シクロスポリンを含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法において使用するための医薬組成物。
【請求項８】
ａ）非免疫抑制性シクロフィリン結合シクロスポリンである第１の薬剤；および
ｂ）抗ＣＭＶ特性を有する併用薬；
を含む医薬的組合せ。
【請求項９】
治療上有効量の非免疫抑制性シクロフィリン結合シクロスポリンおよび抗ＣＭＶ特性を有する併用薬を同時にまたは逐次的に併用することを含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
シクロスポリンが０.７未満の結合比率（ＢＲ）でヒトシクロフィリンに結合し、ＢＲは競合ＥＬＩＳＡ試験で測定されるようなシクロスポリンＡのＩＣ５０に対するシクロスポリンのＩＣ５０の比率の１０を基数とする対数であり；そして混合リンパ球反応においてシクロスポリンＡの活性の５％を超えない活性を有する請求項１から９のいずれか１項に記載の方法、使用、組成物または組合せ。
【請求項１１】
シクロスポリンが式（Ｉ）：
【化１】
2007112775.tif 000003
（式中、
ＷはＭｅＢｍｔ、ジヒドロ−ＭｅＢｍｔまたは８'−ヒドロキシ−ＭｅＢｍｔであり；
ＸはαＡｂｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＮｖａまたはＯ−メチルスレオニン(ＭｅＯＴｈｒ)であり；
ＲはＳａｒ、(Ｄ)−ＭｅＳｅｒ、(Ｄ)−ＭｅＡｌａまたは(Ｄ)−ＭｅＳｅｒ（Ｏアセチル）であり；
ＹはＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ、ＭｅＩｌｅ、ＭｅＶａｌ、ＭｅＴｈｒ、ＭｅＡｌａ、ＭｅａＩｌｅまたはＭｅａＴｈｒ；Ｎ−エチルＶａｌ、Ｎ−エチルＩｌｅ、Ｎ−エチルＴｈｒ、Ｎ−エチルＰｈｅ、Ｎ−エチルＴｙｒまたはＮ−エチルＴｈｒ（Ｏアセチル）であり； 
ＺはＶａｌ、Ｌｅｕ、ＭｅＶａｌまたはＭｅＬｅｕであり；そして
ＱはＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕまたはＭｅＡｌａである）
の化合物である請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法、使用、組成物または組合せ。
【請求項１２】
実質的に本明細書で定義されそして記載されるような方法、使用、組成物または組合せ。
【請求項１３】
治療上有効量の非免疫抑制性シクロフィリン結合シクロスポリンを対象に投与することを含む、それを必要とする免疫不全の対象においてサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染またはＣＭＶ誘発障害を防御、処置または予防するための方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は非免疫抑制性シクロスポリン類の新たな使用に関する。
【０００２】
シクロスポリン類は、共通して薬理学的、特に免疫抑制性または抗炎症性活性を有している、構造的に特徴のある環状、ポリ−Ｎ−メチル化アンデカペプチドのクラスを含む。シクロスポリン類のうち最初に単離されたものは、シクロスポリンＡとしても公知である天然に存在する真菌代謝物シクロスポリン（ｃｉｃｌｏｓｐｏｒｉｎ）またはシクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ）であった。
【０００３】
シクロスポリンＡがＩＬ−２の転写開始を遮断することによるＴ細胞活性化の過程を干渉することにより作用することは十分に確立されている。シクロスポリンＡは多くの細胞型で生じ、そしてタンパク質フォールディングに関与する酵素であるペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼと同一であることが示されているシクロフィリンと称される１７ｋＤａのサイトゾルタンパク質と複合体を形成することが示されている。
【０００４】
シクロフィリンと強力に結合するが、免疫抑制性でないシクロスポリン類が同定されている。混合リンパ球反応（ＭＬＲ）でシクロスポリンＡの活性の５％を超えない、好ましくは２％を超えない活性を有している場合、シクロスポリンは非免疫抑制性であると考えられる。ＭＬＲはT. Meo, "Immunological Methods", Lefkovits and Peris, Eds., Academic Press, NY, pp. 227-239 (1979)に記載されている。Ｂａｌｂ／ｃマウス（雌、８−１０週齢）に由来する脾臓細胞（０.５×１０６）を放射線照射した（２０００ラド）またはマイトマイシンＣ処理したＣＢＡマウス（雌、８−１０週齢）に由来する脾臓細胞０.５×１０６と５日間同時インキュベートする。放射線照射した同種異系細胞はＢａｌｂ／ｃ脾臓細胞において増殖応答を誘発し、これはＤＮＡへの標識された前駆体の組込みにより測定することができる。刺激細胞は放射線照射される（またはマイトマイシンＣ処理される）ので、これらはＢａｌｂ／ｃ細胞に対して増殖で応答することはないが、その抗原性は保持している。ＭＬＲにおいて被験化合物に関して見出されたＩＣ５０を並行実験でシクロスポリンＡに関して見出されたＩＣ５０と比較する。加えて、非免疫抑制性シクロスポリン類はＣＮおよび下流ＮＦ−ＡＴ経路を阻止する能力を欠如する。
【０００５】
欧州特許第０４８４２８１Ａ１号はＡＩＤＳまたはＡＩＤＳ関連障害の処置における非免疫抑制性シクロスポリン類の使用を開示している。ＷＯ２００５／０２１２０２８はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の処置における非免疫抑制性シクロスポリン類の使用を開示している。本発明により、驚くべきことにシクロフィリンに結合する非免疫抑制性シクロスポリン類がサイトメガロウイルス感染（ＣＭＶ）に阻止効果を有することが見出された。
【０００６】
図面の簡単な説明
図２：（Ｊ）は対照およびＣＳＡ処理したＩＥ１陽性細胞の比較を示すグラフを表す。（Ｋ）は対照およびＣＳＡ処理したＩＥ１陽性細胞の間の感染細胞の力価を示すグラフを表す。
【０００７】
図４：（Ａ）はＣＳＡ処理により引き起こされたＩＥ１細胞の抑制に及ぼす影響を示すグラフを表す。矢印はＣｓＡが放出される時点を示している。
【０００８】
図５：（Ａ）はＣＳＡまたはＮＩＭ８１１（Ｂ）のいずれかで処理した感染または対照培養において測定されるＩＥ１陽性細胞パーセントを比較するグラフを表す。（Ｄ）はＩＥ１陽性細胞に及ぼすＣｓＡの種々の濃度の影響を測定するグラフを表す。
【０００９】
発明の開示
ＣＭＶは体内に休止状態でとどまる特徴的な能力を共通して有しているヘルペスウイルス群のメンバーである。最初のＣＭＶ感染はあまり症状がないことがあるが、常に長期の感染が続き、その間、検出可能な損傷または臨床疾患を引き起こさずにウイルスが細胞に存在する。薬物治療または疾患による体の免疫系の重篤な機能障害は一貫してウイルスを潜伏または休止状態から再活性化する。
【００１０】
感染性ＣＭＶは以前に感染したいずれのヒトの体液にも放出され、そしてしたがって、尿、唾液、血液、涙液、精液および母乳で見出され得る。検出可能な兆候なしに、かつ症状を引き起こすことなく、ウイルスの放出は断続的に行われ得る。
【００１１】
米国および世界中でＣＭＶは、先天性ウイルス感染のような中枢神経系（ＣＮＳ）に影響する先天異常の最も重要な感染原因である。ＣＭＶに感染したとき、ほとんどの女性に症状はなく、そして極稀に単核球症に類似する疾患を有する。彼女らの発達中の胎児が、先天性ＣＭＶ疾患のリスクを有し得ることになる。ＣＭＶはまた臓器移植の移植者、血液透析を行っている患者、癌の患者、免疫抑制剤を投与されている患者およびＨＩＶ感染患者を含む免疫不全の個体において脳損傷を引き起こす。肺炎、網膜炎（眼の感染）および胃腸疾患はかかる疾患の共通した徴候である。このウイルスにより脳損傷に至る正確なメカニズムは十分には解明されていない。免疫不全の、または生命を脅かす疾病を有する患者におけるＣＭＶ感染を処置するために、現在抗ウイルス治療が処方されているが、多くの抗ウイルス治療が高毒性である。
【００１２】
したがって、本発明はＣＭＶ感染またはＣＭＶ誘発障害の防御または処置における非免疫抑制性シクロフィリン結合シクロスポリン類の使用を提供する。
【００１３】
ＣＭＶ感染またはＣＭＶ誘発障害には網膜炎、肺炎、胃腸疾患、乳幼児の神経成長および発達の問題が挙げられる。また非免疫抑制性シクロフィリン結合シクロスポリン類を、例えばＣＭＶ感染の母から生まれた新生児、またはウイルスに暴露されたヘルスケアもしくは保育に携わる者、または移植者、ＨＩＶもしくはＡＩＤＳ患者の予防的処置として用いることもできる。
【００１４】
Quesniaux, Eur J Immunol, Vol. 17, pp. 1359-1365 (1987)に記載される競合ＥＬＩＳＡ試験において、シクロスポリンがシクロスポリンＡの結合の少なくとも５分の１でヒト組換えシクロフィリンに結合するとき、シクロスポリンはシクロフィリンに結合すると考えられている。この試験では、シクロフィリンをＢＳＡコートしたシクロスポリンＡと共にインキュベートする間に試験すべきシクロスポリンを加え、そして競合物質なしで対照反応の５０％阻止を得るのに必要とされる濃度を算出する（ＩＣ５０）。結果を結合比率（ＢＲ）として表現し、これは被験化合物のＩＣ５０およびシクロスポリンＡ自体の同時試験におけるＩＣ５０の比率の１０を基数とする対数である。したがって、１.０のＢＲは被験化合物がシクロスポリンＡの結合よりも１０倍少なくヒトシクロフィリンに結合することを示しており、そして負の値はシクロスポリンＡの結合よりも強力に結合することを示している。ＣＭＶに対して活性であるシクロスポリン類は０.７よりも低いＢＲを有し、好ましくはゼロに等しいかまたはそれよりも低い。
【００１５】
非免疫抑制性シクロフィリン結合シクロスポリン類の実例には、例えば式（Ｉ）：
【化１】
2007112775.tif 000002
（式中、
ＷはＭｅＢｍｔ、ジヒドロ−ＭｅＢｍｔまたは８'−ヒドロキシ−ＭｅＢｍｔであり；
ＸはαＡｂｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＮｖａまたはＯ−メチルスレオニン(ＭｅＯＴｈｒ)であり；
ＲはＳａｒ、(Ｄ)−ＭｅＳｅｒ、(Ｄ)−ＭｅＡｌａまたは(Ｄ)−ＭｅＳｅｒ（Ｏアセチル）であり；
ＹはＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ、ＭｅＩｌｅ、ＭｅＶａｌ、ＭｅＴｈｒ、ＭｅＡｌａ、ＭｅａＩｌｅまたはＭｅａＴｈｒ；Ｎ−エチルＶａｌ、Ｎ−エチルＩｌｅ、Ｎ−エチルＴｈｒ、Ｎ−エチルＰｈｅ、Ｎ−エチルＴｙｒまたはＮ−エチルＴｈｒ（Ｏアセチル）であり； 
ＺはＶａｌ、Ｌｅｕ、ＭｅＶａｌまたはＭｅＬｅｕであり；そして
ＱはＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕまたはＭｅＡｌａである）
の化合物が挙げられる。
【００１６】
基Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ＱおよびＲは独立して以下の好ましい意味を有する：
Ｗは好ましくはＷ’であり、ここでＷ’はＭｅＢｍｔまたはジヒドロ−ＭｅＢｍｔであり；
Ｘは好ましくはＸ’であり、ここでＸ’はαＡｂｕまたはＮｖａであり、さらに好ましくはＸ”であり、ここでＸ”はαＡｂｕであり；
Ｒは好ましくはＲ’であり、ここでＲ’はＳａｒであり；
Ｙは好ましくはＹ’であり、ここでＹ’はγ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ、ＭｅＶａｌ、ＭｅＴｈｒ、ＭｅＩｌｅ、Ｎ−エチルＩｌｅまたはＮ−エチルＶａｌであり；
Ｚは好ましくはＺ’であり、ここでＺ’はＶａｌまたはＭｅＶａｌであり；そして
Ｑは好ましくはＱ’であり、ここでＱ’はＭｅＬｅｕである。
【００１７】
式（Ｉ）の化合物の好ましい群は、ＷがＷ’であり、ＸがＸ’であり、ＹがＹ’であり、ＺがＺ’であり、ＱがＱ’であり、そしてＲがＲ’であるものである。
【００１８】
式（Ｉ）の好ましい化合物の実例は、例えば：
ａ）［ジヒドロ−ＭｅＢｍｔ］１−［γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ］４−シクロスポリン；ＢＲ＊＝０.１；ＩＲ＜１％
ｂ）［ＭｅＶａｌ］４−シクロスポリン；ＢＲ＝０.１；ＩＲ＜１％
ｃ）［ＭｅＩｌｅ］４−シクロスポリン；ＢＲ＝−０.２；ＩＲ＜１％
ｄ）［ＭｅＴｈｒ］４−シクロスポリン；
ｅ）［γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ］４−シクロスポリン；ＢＲ＝０.４；ＩＲ＜１％
ｆ）［エチルＩｌｅ］４−シクロスポリン；ＢＲ＝０.１；ＩＲ＜２％
ｇ）［エチルＶａｌ］４−シクロスポリン；ＢＲ＝０；ＩＲ＜２％
ｈ）［Ｎｖａ］２−［γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ］４−シクロスポリン；
ｉ）［γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ］４−［γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ］６−シクロスポリン；
ｊ）［ＭｅＶａｌ］５−シクロスポリン；ＢＲ＝０.４；ＩＲ＝５.３％
ｋ）［ＭｅＯＴｈｒ］２−［（Ｄ）ＭｅＡｌａ］３−［ＭｅＶａｌ］５−シクロスポリン；
ｊ）［８’−ヒドロキシ−ＭｅＢｍｔ］１−シクロスポリン；ＢＲ＝０.３５；ＩＲ＝１.８％
ｋ）［ＭｅＡｌａ］６−シクロスポリン；ＢＲ＝−０.４；ＩＲ＝３.２
ｌ）［γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ］９−シクロスポリン；ＢＲ＝０.１５；ＩＲ＝２.９
ＩＲ＝免疫抑制性比率（シクロスポリンＡに相対した活性のパーセンテージとして表現する）
【００１９】
式（Ｉ）の化合物は種々の方法で得られ、これは欧州特許第号０４８４２８１Ａ１またはＷＯ００／０１７１５（その内容は出典明示により本明細書の一部とする）に開示されるように：
１）発酵
２）生体内変換
３）誘導体化
４）部分合成
５）全合成
として分類され得る。
【００２０】
一連のさらに具体的なまたは代替の実施態様では、本発明はまた：
１.１  治療的有効量の非免疫抑制性シクロフィリン結合シクロスポリン、例えば式（Ｉ）の化合物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象においてＣＭＶ感染またはＣＭＶ誘発障害を予防または処置する方法；
１.２  この培地に有効量の非免疫抑制性シクロフィリン結合シクロスポリン、例えば式（Ｉ）の化合物を適用することを含む、培地におけるＣＭＶ複製を阻止する方法；
１.３  治療的有効量の非免疫抑制性シクロフィリン結合シクロスポリン、例えば式（Ｉ）の化合物を対象に投与することを含む、それを必要とする患者においてＣＭＶ複製を阻止する方法；
１.４  治療的有効量の非免疫抑制性シクロフィリン結合シクロスポリン、例えば式（Ｉ）の化合物を移植者に投与することを含む、それを必要とする移植者においてＣＭＶ感染の再発を防止する方法；
２.  前記した任意の方法において使用するための医薬組成物の調製における非免疫抑制性シクロフィリン結合シクロスポリン、例えば式（Ｉ）の化合物の使用；
３.  １つまたはそれより多い薬学的に許容される希釈剤またはその担体と一緒に非免疫抑制性シクロフィリン結合シクロスポリン、例えば式（Ｉ）の化合物を含む、前記した任意の方法において使用するための医薬組成物；
４.  治療的有効量の非免疫抑制性シクロフィリン結合シクロスポリン、例えば式（Ｉ）の化合物を対象に投与することを含む、それを必要とする免疫障害を有する該対象においてＣＭＶ感染またはＣＭＶ誘発障害を防御または処置する方法；
をも提供する。
【００２１】
ヒト対象の研究には明らかな限界があり、そしてＣＭＶは厳密な種特異性を有するので、モデル系はマウスＣＭＶ（ＭＣＭＶ）でのマウス胎仔の感染により誘発された脳異常ついて利用可能である（Tsutsui, Y., Kashiwai, A., Kawamura, N. & Kadota C. (1993) Am J Pathol 143, 804-13; Tsutsui, Y., (1995) Pathol Int 45, 91-102）。マウス神経幹細胞はＭＣＭＶに感受性が高く（Kosugi, I., Sjinmura, Y.,  Kawasaki, H., Arai, Y., Li, R. Y., Baba, S. & Tsutsui, Y. (2000) Lab Invest 80, 1373-83）、神経幹／前駆細胞（ＮＳＰＣ）調製物を含む未成熟グリア細胞の量が脳切片におけるＭＣＭＶに対する感受性を決定し（Kawasaki, H., Kosugi, I., Arai, Y. & Tsutsui, Y. (2002) Lab Invest 82, 1347-58）、そして神経幹細胞におけるＭＣＭＶの潜伏の可能性が示唆されている（Tsutsui, Y., Kawasaki, H. & Kosugi, I. (2002)  J Virol 76, 7247-54）。この証拠によりＣＮＳ神経幹／前駆細胞の感染がヒトのＣＮＳ疾患に寄与し得ることが示される。
【００２２】
神経幹細胞（ＮＳＣ）は長期の自己再生能を有する未成熟細胞であり、そしてニューロン、グリアおよび乏突起膠細胞のような神経細胞表現型に分化する能力を有している（Reynolds, B. A., Tetzlaff, W. Weiss, S. (1992) J Neurosci 12, 4565-74）。
【００２３】
ＮＳＣの脳への移植はパーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、卒中、ハンチントン病（Lindvall, O., Kokaia, Z. & Martinez-Serrano, A. (2004) Nat Med 10 Suppl, s 42-50）およびさらにはウイルス特異的脳損傷のような多くの脳疾患の処置になり得る。しかしながら、拒絶応答のような重大な課題は、かかる拒絶の１つの結果がＣＭＶの再活性化であり得るので重要である（Li, R. Y., Kosugi, I. & Tsutsui, Y. (2004) Acta Neuropathol (Berl) 107, 406-12)。ＮＳＣ移植治療では免疫抑制処置が必要かもしれない（Barker, R. A. & Widner, H. (2004) Neurorx 1, 472-481）。同種異系の胎仔移植片での結果により、有効な免疫抑制が、移植後少なくとも１年間、パーキンソン病の機能的結果を最適化するのに必要であること示唆される（Olanow, C. W., Goetz, C. G., Kordower, J. H., Stoessl, A. J., Sossi, V., Brin, M. F., Shannon, K. M., Nauert, G. M., Perl, D. P., Godbold, J. & Freeman, T. B. (2003) Ann Neurol 54, 403-14）。
【００２４】
驚くべきことに、非免疫抑制性シクロフィリン結合シクロスポリンはＮＳＰＣにおいてＭＣＭＶのレベルを有意に低下させた。幹／前駆細胞におけるＭＣＭＶの複製が非免疫抑制性シクロフィリン結合シクロスポリンにより抑制された場合、細胞は数週間ウイルスゲノムを保持した。非免疫抑制性シクロフィリン結合シクロスポリンを培養から抜いた場合、これらの細胞において活発なウイルス複製が再開され、これは阻止用量の非免疫抑制性シクロフィリン結合シクロスポリンの存在下でマウスＮＳＰＣが潜伏性／持続性感染を支持したことを示唆している。具体的には、我々はＮＳＰＣにおけるＭＣＭＶ複製に及ぼす免疫モジュレーター、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の影響に取り組んでいる。ＣｓＡはこれらの細胞において用量依存的な様式でＭＣＭＶ複製を抑制するが、関連化合物ＦＫ５０６は抑制しない。
【００２５】
したがって１つの態様では、前記で特定したＣＭＶ感染に関連する疾患および症状の処置における非免疫抑制性シクロフィリン結合シクロスポリン類（以後「本発明のシクロスポリン類」）の有用性を、例えば後記する方法にしたがって標準的な動物または臨床試験で実証することができる。
【実施例】
【００２６】
ＮＳＰＣ培養
ネズミＥＧＦ−、ＦＧＦ−応答性ＣＮＳ  ＮＳＰＣを７、２１日齢のＢＡＬＢ／ｃマウスおよび胎仔ＢＡＬＢ／ｃマウス（SLC Japan）の脳室下帯から調製する。成体のＳＶＺを刻み、次いでトリプシン１.３３ｍｇ、０.６７ｍｇ／ｍｌヒアルロニダーゼおよび０.２ｍｇ／ｍｌキヌレン酸（全てSigma（Missouri, USA）より）を含有する標準培養培地中３７℃で３０分間解離させる。組織を０.７ｍｇ／ｍｌトリプシン阻害剤（Roche Diagnostics）を含有する標準培養培地に移す。これらの切片をマイクロピペットで機械的に解離させる。胎仔マウス（Ｅ１５）および７日齢マウスに由来する大脳半球もまた機械的に解離させる。双方の細胞懸濁液を５％Ｂ２７サプリメント（Gibco）を含有する、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）ならびに５ｍＭ  Hepesバッファー、０.６％グルコース、３ｍＭ炭酸水素ナトリウムおよび２ｍＭグルタミンを含有するＦ−１２培地（Gibco BRL）の１：１混合物中で成長させる。前記の培地に２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（マウス顎下腺から精製；Becton Dicinson（Bedford, MA））およびｂＦＧＦ（組換えヒトＦＧＦは大腸菌により発現される；Sigma）を２０ｎｇ／ｍｌで、ならびにヘパリンを加える。懸濁液中７−１４日後に培養単細胞は細胞塊(sphere)になる。これらの細胞塊を神経上皮細胞マーカー、アンチネスチンに対するウサギポリクローナル抗体（Dr. H. Kitani, 動物衛生研究所（つくば市、日本）により提供される）、マウスMusashi1に特異的なラットモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Dr. Okano, 慶應義塾大学医学部（日本）により提供される）およびモノクローナルマウス抗ブタビメンチン抗体（DAKO（日本））で免疫染色することによりＮＳＰＣとして確認する。細胞塊を形成することができる細胞のクローン性を試験するために、Kosugi et al., Lab Invest, Vol. 80, pp. 1373-1383 (2000)に記載されるように、球形からの細胞を９６ウェルプレートにプレートする。培養の７日後、細胞塊の存在または不在に関してウェルを検査する。
【００２７】
ＣＮＳ  ＮＳＰＣの分化の誘導
Reynolds and Weiss, Dev Biol, Vol. 175, pp. 1-13 (1996)に記載されるようにＣＮＳ幹細胞の分化の誘導を行う。継代後４日間培養した細胞塊のＮＳＰＣを１００ｍｇ／ｍｌポリ−Ｄ−リジン（Sigma（St. Louis, MO））でコーティングしたガラスカバースリップにプレートする。細胞塊をＥＧＦ、ＦＧＦを欠如するが、１％熱不活性化ウマ血清（Gibco）を補充した培地で分化誘導させる。分化後５日に、カバースリップ上で培養した細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、そしてウシグリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）（Dako）に対するウサギポリクローナル抗体、マウスモノクローナル抗βチューブリンＩＩＩ（神経マーカー）（Sigma）およびAnti-Human Olig2 Rabbit IgG Affinity（IBL）を用いることにより免疫細胞化学により分析する。
【００２８】
ＣｓＡ、ＦＫ５０６、ＮＩＭ８１１、ＰＳＣ８３３
ＣｓＡ（Sigma）を最初にエタノールに溶解し、ストック溶液を−３０℃で保存した。ＦＫ５０６（タクロリマス）は藤沢薬品工業（日本）による恵与である。ＣｓＡ誘導体、ＮＩＭ８１１およびＰＳＣ８３３はNovartis Pharma AG（Basel, Switzerland）からの恵与であり、エタノールに溶解されている。培養に添加する直前にＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて化合物を望ましい濃度に希釈する。
【００２９】
細胞生存性の分析
ＮＳＰＣは未処理であるか、またはＣｓＡ、ＮＩＭ８１１、ＰＳＣ８３３、ＦＫ５０６で処理し、そしてヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（５μｇ／ｍｌ）を与えられる。フローサイトメトリー分析を実施して、ＰＩの取り込み（ＬＦＬ−３チャネル）および細胞サイズ（前方散乱光）を同時にモニタリングする。正常な細胞サイズ集団内では、Mangan, Welch and Wahl, J Immunol, Vol. 146, pp. 1541-1546 (1991)に定義されるように、ＰＩに対して低い透過性を表示する細胞は生存細胞であると理解される。生存細胞を示すために、７日培養の後にＰＩ陰性比率を確認し、そして細胞を計数する。
【００３０】
ウイルス調製
ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）増強ＲＭ４５０３を発現することができるＭＣＭＶのＫ１８１株から誘導した組換えウイルスをこれらの試験において使用する（van Den Pol et al., J Neurosci, Vol. 19, pp. 10948-10965 (1999)参照）。ＲＭ４５０３は、ＭＣＭＶゲノムのＭＣＭＶエンハンサーに近接して挿入されたＨＣＭＶプロモーター−エンハンサーフラグメント（転写開始部位に相対して２４２から＋７）から構成されるキメラプロモーター−エンハンサーの制御下でマーカー遺伝子インサートを発現するように構築される。発現カセットをＭＣＭＶ  ＩＥ２遺伝子に挿入するが、これは細胞培養におけるウイルス成長に関して、ならびにＢＡＬＢ／ｃマウスにおける成長、潜伏性および病原性に関して完全に可欠であることが示されている。腹腔内接種の後、ＲＭ４５０３は唾液腺において野生型に類似する力価に到達する。
【００３１】
ウイルス感染
懸濁液中に解離したＮＳＰＣまたはマウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）を種々の感染多重度（ＭＯＩ）でＭＣＭＶで、および新鮮培養培地で感染させる。ＭＥＦを用いるプラークアッセイにより細胞のアリコートでウイルス力価を測定する。その他の細胞のアリコートを免疫蛍光およびフローサイトメトリーによるＭＣＭＶ抗原の検出のために加工する。
【００３２】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーのために、細胞塊のＣＮＳ  ＮＳＰＣを機械的解離で処理し、そして次に４％パラホルムアルデヒドで固定し、そして７０％エタノール中で保存する。Ｔ−ＰＢＳ（０.２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００および５％ＦＢＳを含有するＰＢＳ）で洗浄した後、細胞を懸濁液中で、Shinmura et al., Am J Pathol, Vol. 151, pp.1331-1340 (1997)に記載される最初期（ＩＥ）−８９Ｋ抗原に特異的なＮ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびウサギ抗シクロフィリンＡ抗血清と反応させる。２次標識のために、ＦＩＴＣ抱合ウサギ抗ラット免疫グロブリン（DAKO（日本））を用いてＭＣＭＶ抗原を検出する。ＦＩＴＣ抱合ブタポリクローナル抗ウサギ免疫グロブリン（DAKO）またはフィコエリトリン抱合アフィニティー精製ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Rockland Immunochemicals Inc（Gilbertsville, PA, USA））をシクロフィリンＡ抗原に用いる。各分析に関して１×１０４個のゲートをかけられた細胞で、ＥＰＩＣＳプロファイル分析器（Coulter（Miami, FL））を用いるフローサイトメトリーにより染色された細胞を分析する。次いで全ての２次抗体の交差反応性の不在を確認する。
【００３３】
トランスフェクションおよびレポーターアッセイ
ヌクレオフェクターエレクトロポレーター（Amaxa Biosystems（ドイツ））を用いて、製造者の推奨するプロトコールに従って、マウスＮＳＰＣおよびＥＬ−４細胞（マウス：Ｔリンパ球；リンパ腫）へのトランスフェクションを行う。デュアル−ルシフェラーゼレポーターアッセイ系（Promega（Madison, WI））を用いてレポーターアッセイを行う。エレクトロポレーションの後、ＥＬ−４をホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（ＰＭＡ）（１０ｎＭ）（Sigma）およびイオノマイシン（１ｍＭ）（Sigma）によりＣｓＡまたはＦＫ５０６と共に２４時間刺激する。実験的レポーター遺伝子（組換えホタルルシフェラーゼ）を内部対照（組換えウミシイタケルシフェラーゼ）の活性に標準化することにより細胞生存性およびトランスフェクション効率における差異により引き起こされる変動が最小化される。レポータープラスミドはｐＮＦ−ＡＴ−Ｌｕｃ、ｐＡＰ−１−Ｌｕｃ、ｐＮＦ−  Ｂ−Ｌｕｃ（PathDetectレポーター系；stratagene（La Jolla, CA））およびｐＲＬ−ＴＫ（デュアル−ルシフェラーゼレポーターアッセイ系；Promega）である。インビトロおよびインビボでの発現分析のためのＭＣＭＶ  ＩＥ遺伝子プロモーターＬａｃＺレポーター遺伝子をAiba-Masago et al., Am J Pathol, Vol. 154, pp. 735-743 (1999)に従って構築する。ヌクレオチド−１３４３から−６（１３８８ｂｐ）を含有するＭＣＭＶ−ＩＥプロモーター領域をＳＶ４０に由来する核局在シグナル、大腸菌βガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）コード化配列、ならびにマウスプロタミン由来のポリ（Ａ）およびイントロンに関する配列を含有するｐｎｌａｃＦベクターに挿入する。ＣｓＡまたはＮＩＭ８１１と共にβ−Ｇａｌ酵素アッセイ系（Promega）を用いてβ−Ｇａｌ酵素アッセイを行う。β−Ｇａｌ活性の活性を標準化するために、各実験で組換えウミシイタケルシフェラーゼ活性を確認する。
【００３４】
組換えシクロフィリンＡでの逆転実験
組換えＭＣＭＶを感染させたＮＳＰＣをＣｓＡまたはＮＩＭ８１１（０.５μＭ）の存在下で培養し、次いで１−１００ｎｇ／ｍｌヒト組換えシクロフィリンＡ（ＣｙＰＡ）（BioMol（Plymouth Meeting, PA））を培地に加える。フローサイトメトリーにより感染後１０日にＩＥ１陽性ＮＳＰＣのパーセンテージを確認する。
【００３５】
実施例１
神経幹／前駆細胞の単離およびその生存性に及ぼす薬物の効果
成体ＮＳＰＣを２１日齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの脳室下帯から収集し、そして前記したようにＥＧＦおよびＦＧＦと一緒に血清不含培地条件下で培養する。ＥＧＦおよびＦＧＦに応答して、単一の神経幹細胞が増殖してニューロスフェアーを作成する。これらの細胞の継代培養により、これらの細胞の自己再生能力が延長されていることが示される。自己再生は幹細胞の定義に極めて重要であり、そしてクローンアッセイにより試験される（Reynolds, B. A. & Weiss, S, (1996) Dev Biol 175, 1-13）。解離され、希釈された幹細胞のプレーティングの７日後に、幹細胞の４.７７％が細胞塊として再生される。より関係づけられた細胞であると考えられるその他の細胞は神経前駆細胞と称される。免疫細胞化学的染色により、未分化の細胞塊はネスチン、初期の神経外胚葉細胞マーカー、その他の神経幹／前駆マーカー、Musashi-1およびビメンチンを発現することが実証される。ニューロスフェアーが前記したようなニューロン、星状細胞および乏突起膠細胞に分化し得ることが確認されている。被験化合物により非特異的毒性を引き起こし得る可能性を排除するために、種々濃度の化合物で７日間処理した後、ＰＩ取り込みの測定および細胞計数を用いることにより細胞生存性を試験する。１μＭもの全薬物（ＣｓＡ、ＦＫ５０６、ＮＩＭ８１１、ＰＳＣ８３３）で処理した後、毒性はほとんど観察されない。０.５μＭＣｓＡ処理下でＮＳＰＣはニューロン、星状細胞および乏突起膠細胞に分化することができる。
【００３６】
実施例２
ＮＳＰＣにおいてＣｓＡはＭＣＭＶ増殖を抑制する
単離および解離の直後に、ＮＳＰＣをＭＣＭＶ（ＲＭ４５０３）で細胞あたり１プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＭＯＩで感染させる。感染した細胞は感染後３日からＧＦＰ媒介の緑色蛍光を示し、そしてＧＦＰ発現細胞の数はインキュベーション時間の経過とともに増加する。ＣｓＡ処理下の細胞はその他の全培養期間に対照培養よりも少ししかＧＦＰ陽性細胞を示さない。細胞における感染性を評価するために、ＭＣＭＶ  ＩＥ１抗原に特異的なＮ２  ｍＡｂを用いて免疫細胞染色を行う（Shinmura, Y., Aiba-Masago, S., Kosugi, I., Li, R. Y., Baba, S. & Tsutsui, Y. (1997) Am J Pathol 151, 1331-40.）。ＭＯＩが１で感染した後、対照およびＣｓＡ処理培養でＩＥ１陽性細胞のパーセンテージを決定する。ＭＣＭＶ感染後５、７および１０日に、ＣｓＡ処理培養では対照培養よりもＩＥ１陽性細胞が有意に少ない。種々の培養期間からのアリコートのウイルス力価をプラークアッセイ法により試験する。ＭＣＭＶ感染後５、７および１０日に、ＣｓＡ処理培養は対照培養よりも有意に低いウイルス力価を示す。ウイルス複製の阻止を示すことにおいて、ＩＥ１陽性細胞のパーセンテージ（図２Ｊ）は感染ウイルスの力価（図２Ｋ）とよく相関した。ＮＳＰＣにおけるＣｓＡ処理に及ぼすウイルス負荷の影響を知るために、０.５μＭＣｓＡ処理下、種々のＭＣＭＶウイルス力価（ＭＯＩは０.１、１、１０）でＣｓＡ培養と対照培養との間でＩＥ１陽性細胞のパーセンテージを比較する。ＣｓＡは全てのウイルス用量でＭＣＭＶ感染を抑制するが、低ＭＯＩでより有効である。
【００３７】
ＭＯＩが１で感染したＮＳＰＣの感染性におけるＣｓＡの用量依存性をも調査する。ＣｓＡ濃度が上昇するにつれて、ＭＣＭＶの感染性は比例して低下する。これらの結果により、ＣｓＡが用量依存的な様式でＭＣＭＶを阻止することが示される。ＣｓＡによるＭＣＭＶの阻止がＮＳＰＣの全発達段階で共通した現象であることを確認するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに由来する胎仔ＮＳＰＣを妊娠１５日で、ならびに７および２１日齢のマウスから単離する。７ｄｐｉでのＭＣＭＶ（ＭＯＩは１）に対する感受性を発達途上のＮＳＰＣの間で比較する。データは、ＣｓＡは全ての発達中のＮＳＰＣでＭＣＭＶを阻止するが、胎仔および７日齢ＮＳＰＣは２１日齢マウスのものよりも約３倍感受性が高いことを示している。
【００３８】
ＭＣＭＶに対して最も感受性の高い細胞であるマウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）におけるＭＣＭＶ増殖に及ぼすＣｓＡの影響もまた試験する。ＣｓＡにより非特異的毒性が引き起こされる可能性を排除するために、ＣｓＡで７日間処理した後、ＰＩ取り込みの測定および細胞計数を用いることにより細胞生存性を試験する。０.５μＭものＣｓＡで処理した後にも毒性はほとんど観察されない。ＭＯＩ１でＭＥＦをＭＣＭＶ（ＲＭ４５０３）で感染させる。感染後３日（ｄｐｉ）でほとんどのＭＥＦがＧＦＰを発現し、そして細胞変性効果（ＣＰＥ）を示す。０.５μＭＣｓＡで処理したＭＥＦは対照培養と比較してＧＦＰ陽性細胞およびＣＰＥに関してＭＣＭＶ感染性にほとんど影響を示さない。ＩＥ１陽性細胞のパーセンテージおよび種々の培養期間からのアリコートのウイルス力価は対照培養とＣｓＡ処理培養の間でほとんど差異を示さない。
【００３９】
実施例３
ＭＣＭＶ増殖に及ぼすＣｓＡ阻止の免疫抑制効果
ＣｓＡおよびＦＫ５０６はＴ細胞で免疫抑制効果を示すために共通の標的、カルシニューリン（ＣＮ）を有する。ＦＫ５０６はＣｓＡよりもおよそ１００倍大きい免疫抑制活性を有することが報告されている（Sawada, S., Suzuki, G., Kawase, Y. & Takaku, F. (1987) J Immunol 139, 1797-803.）。我々の研究では、ＦＫ５０６は、ＧＦＰ陽性細胞に関して０.５μＭ  ＦＫ５０６でＭＣＭＶ感染を阻止しない。ＩＥ１陽性細胞のパーセンテージにより、ＦＫ５０６は薬物用量（０.１、０.５、１.０μＭ）でＣｓＡの効果と比較した場合、ＭＣＭＶ感染に抑制効果をほとんど呈さないことが示される。プラークアッセイにより、ＦＫ５０６は０.５μＭでＭＣＭＶ増殖を抑制しないことが示される。これらの結果により、ＣｓＡによるＭＣＭＶの阻止効果はＣＮ経路に関係しないことが示唆される。ＣｓＡは細胞標的分子、シクロフィリン（ＣｙＰ）に結合し、そしてそのペプチジル−プロリルシス／トランスイソメラーゼ機能を不活性化することが解っている（Matsuda, S. & Koyasu, S. (2000) Immunopharmacology 47, 119-25）。しかしながら、この不活性化は免疫抑制のメカニズムに関与しない。ＮＩＭ８１１はシクロフィリンに結合できるが、ＣＮおよびその下流のＮＦ−ＡＴ経路の阻止能力を欠如する非免疫抑制性ＣｓＡ類似体である（Billich, A., Hammerschmid, F., Peichl, P., Wenger, R., Zenke, G., Quesniaux, V. & Rosenwirth, B. (1995) J Virol 69, 2451-61）。ＮＩＭ８１１は対照培養と比較して、０.５μＭでＭＣＭＶ感染を抑制する。ＩＥ１陽性細胞のパーセンテージにより、ＮＩＭ８１１は用量依存的な様式でＭＣＭＶ増殖を阻止することが示される。プラークアッセイデータにより、対照培養と比較して、０.５μＭの濃度でＭＣＭＶ増殖を約１／４００に抑制することが示される。ＰＳＣ８３３はシクロフィリンともＣＮ／ＮＦ−ＡＴ経路とも結合する能力を有さないｐ−糖タンパク質阻害剤として知られているＣｓＡ誘導体である（Keller, R. P, et al. (1992) Int J. Cancer 50, 593-7）。ＰＳＣ８３３はＮＩＭ８１１と比較して、ＭＣＭＶ  ＩＥ１発現および増殖のレベルに影響しない。これらの結果により、シクロフィリンはＮＳＰＣにおいてＣｓＡによるＭＣＭＶ阻止の主要な標的であることが示唆される。ＣｓＡ／ＣｙＰ複合体はカルシニューリンに直接結合し、そしてホスファターゼ活性を阻止し、その結果、転写因子ＮＦ−ＡＴのサイレンシングに至る。ＣＮ／ＮＦ−ＡＴ経路の阻止はＴ細胞におけるＣｓＡ媒介の免疫抑制に必須のメカニズムである（Matsuda, S. & Koyasu, S. (2000) Immunopharmacology 47, 119-25）。
【００４０】
ＣｓＡによるＭＣＭＶ増殖の阻止効果のメカニズムがＣＮ／ＮＦ−ＡＴ阻止能力に関係するかどうかを明らかにするために、レポーターアッセイによりＣｓＡで処理したＮＳＰＣにおけるＮＦ−ＡＴの転写活性を試験する。Ｔリンパ球細胞系（ＥＬ−４）においてＮＦ−ＡＴの活性は０.１μＭの濃度でＣｓＡにより抑制されるが、高濃度のＣｓＡでさえ、ＣｓＡはＮＳＰＣにおけるＮＦ−ＡＴ活性に影響を及ぼさない。ＦＫ５０６もまたＴリンパ球において０.０１μＭの濃度でさえＮＦ−ＡＴ活性を阻止する。ＣｓＡはＮＦ−ＡＴに加えてＡＰ−１およびＮＦ−κＢの活性に影響することが報告されており、これはＣＮ／ＮＦ−ＡＴ経路以外の別の標的の存在を意味している（Mattila, P. S., Ullman, K. S., Fiering, S., Emmel, E. A., McCutcheon, M., Crabtree, G. R. & Herzenberg, L. A. (1990) Embo J 13, 4370-81; Rincon, M & Flavell, R. A. (1994) Embo J 13, 4370-81）。ＡＰ−１およびＮＦ−κＢファミリーメンバーもまたＭＣＭＶおよびＨＣＭＶ主要最初期プロモーター／エンハンサーの双方の調節に重要である（Thomsen, D. R., Stenberg, R. M., Goins, W. F. & Stinski, M. F. (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81, 659-63; Hummel, M., Zhang, Z., Yan, S., DePlaen, I., Golia, P., Varghese, T., Thomas, G. & Abecassis, M. I. (2001) J Virol 75, 4814-22）。我々のレポーターアッセイにより、ＣｓＡがＮＳＰＣのＡＰ−１およびＮＦ−κＢシグナリング経路に影響しないことが示唆される。前記の結果より、ＮＦ−ＡＴ経路、ＡＰ−１およびＮＦ−κＢシグナル経路はＮＳＰＣにおけるＣｓＡの抗ＭＣＭＶ活性に関係しないことが示唆される。ＡＰ−１およびＮＦ−κＢ結合部位を有するＭＣＭＶ−ＩＥプロモーター／エンハンサーの活性はＮＳＰＣにおいてＣｓＡにも、ＮＩＭ８１１にも抑制されない。
【００４１】
実施例４
ＮＳＰＣにおける持続感染に及ぼすＮＩＭ８１１の影響
ＭＯＩ１でＭＣＭＶに感染したＮＳＰＣをＣｓＡ（０.５μＭ）処理下で培養し、次いで細胞をＣｓＡ不含培地に移す。ＭＣＭＶ−ＩＥ１陽性細胞は、ＣｓＡ処理した細胞と比較してＣｓＡ処理していない培地において有意に増加する（図４Ａ）。したがって、阻害剤はＭＣＭＶ阻止に関して可逆的である。このＭＣＭＶ持続感染／再活性化現象がシクロフィリンに関係するメカニズムにより引き起こされることを確認するために、ＮＳＰＣをＮＩＭ８１１（１μＭ）の存在下、ＭＯＩが０.１でＭＣＭＶに感染させる。１４ｄｐｉにＧＦＰ陽性細胞は未処理細胞において有意に増加するが、一方ＮＩＭ８１１で処理した細胞では陽性細胞はほとんど観察されない。これをフローサイトメトリーによりＩＥ１陽性細胞のパーセンテージとして確認する。ＮＩＭ８１１処理下で持続的に感染したＮＳＰＣを２週毎にＮＩＭ８１１処理培養およびＮＩＭ８１１不含培養に分けた。ＧＦＰ陽性細胞は感染後少なくとも６週にはＮＩＭ８１１処理培養においてほとんど観察されない。ＮＩＭ８１１を培養培地から除去したときに、ＧＦＰ陽性細胞は明らかにＮＩＭ８１１によりＭＣＭＶ抑制された培養から現れる。この結果はフローサイトメトリーによりＩＥ１陽性細胞のパーセンテージとして確認される。このＮＩＭ８１１によりＭＣＭＶ抑制された細胞からの再活性化は８週まで観察される。８週後はＮＳＰＣにおいて持続感染したＭＣＭＶは再活性化できなくなる。
【００４２】
実施例５
ＮＳＰＣにおけるシクロフィリンＡのＭＣＭＶ感染との関連性
シクロフィリンは器官中に豊富にあり、そして広範に分布しているタンパク質である。主要なシクロフィリンアイソフォームはシクロフィリンＡ（ＣｙＰＡ）と称される細胞質内の１８ｋＤａタンパク質である（シクロフィリンのＰＰｌａｓｅ活性の８０％以上）（Price, E. R., Zydowsky, L. D., Jin, M. J., Baker, C. H., McKeon, F. D. & Walsh, C. T. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88, 1903-7）。本明細書ではＣｓＡおよびＮＩＭ８１１によるＭＣＭＶの阻止に及ぼすＣｙＰＡの逆転効果を試験する。ＣｓＡまたはＮＩＭ８１１（０.５μＭ）の存在下、ＭＯＩ１でＮＳＰＣをＭＣＭＶで感染させた後、ヒト組換えＣｙＰＡを用量依存的な様式で培養に加える。１０ｄｐｉにＩＥ１抗原陽性細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーにより各々異なる培養で試験する。１００ｎｇ／ｍｌの濃度でＣｙＰＡを伴うＮＳＰＣはＣｓＡ（図５Ａ）またはＮＩＭ８１１により引き起こされるＭＣＭＶの阻止を逆転させる。ＣｙＰＡは１ｎｇ／ｍｌＣｙＰＡの用量からＣｓＡにより引き起こされるＭＣＭＶ阻止を逆転させる。ＣｙＰＡは、ＣｓＡよりもシクロフィリンに対してより強力な親和性を有しているＮＩＭ８１１により引き起こされるＭＣＭＶの阻止を用量依存的な様式で逆転させる（Billich, A., Hammerschmid, F., Peichl, P., Wenger, R., Zenke, G., Quesniaux, V. & Rosenwirth, B. (1995) J Virol 69, 2451-61）（図５Ｄ）。
【００４３】
次いでフローサイトメトリーにより、成体ＮＳＰＣおよび線維芽細胞におけるＣｙＰＡの発現を比較する。フローサイトメトリー分析により成体ＮＳＰＣにおいてＣｙＰＡ発現の２つのピークがあることが示される。左のピークはＣｙＰＡの発現が低い細胞を表し、そして右のピークはＣｙＰＡの発現が高い細胞を表す。しかし線維芽細胞におけるＣｙＰＡの発現はＣｙＰＡの高発現を有する単極性である（図５Ｅ）。感染の５日後にＭＣＭＶ―ＩＥ１抗原／ＣｙＰＡの二重染色を行い、そして２色のフローサイトメトリーによりＭＣＭＶ陽性細胞を発現するＣｙＰＡ陽性細胞はＮＳＰＣの２３.８％に相当することが実証される。ＣｙＰＡ陰性細胞およびＭＣＭＶ陽性細胞の組成はＮＳＰＣの６.３％である。ＭＣＭＶ陽性細胞の約８０％はＣｙＰＡ抗原を発現する。これらの結果により高レベルのＣｙＰＡを有する細胞はＭＣＭＶを増殖する傾向にあることが示される。
【００４４】
本研究では、ＣｓＡはＮＳＰＣにおいてＭＣＭＶ増殖を阻止することが示される。強力な免疫抑制剤として公知のＣｓＡは一般にＣＭＶ感染の誘因であると考えられている。我々の結果は先行の一般的な考えに矛盾するようである。再活性化は主に免疫不全の宿主においてＭＣＭＶを除去するための宿主免疫応答の失敗によるという見解がある（Polic, B., Hengel, H., Krmpotic, A., Trgovcich, J., Pavic, I., Luccaronin, P., Jonjic, S. & Koszinowski, U. H. (1998) J Exp Med 188, 1047-54）。一方で、ＭＣＭＶ増殖の誘導が細胞刺激因子の状態と関係するという可能性がある。この実験で用いた細胞培養系は後天性免疫系を含まないので、ＣｓＡの抗ＭＣＭＶ効果はＴリンパ球を介するその免疫抑制効果とは無関係であると考えることができる。
【００４５】
本研究では、ＣｓＡはＮＳＰＣにおいてＭＣＭＶ増殖を阻止するが、ＦＫ５０６はＭＣＭＶ増殖を阻止しない。これらのイムノフィリンの結合標的、シクロフィリンに対するＣｓＡ、およびＦＫＢＰ１２に対するＦＫ５０６の差異は、シクロフィリンがＭＣＭＶ増殖の阻止に関与していることを示している。特異的なシクロフィリン阻害剤であるＮＩＭ８１１もまたＮＳＰＣにおいてＭＣＭＶ増殖を強力に阻止する。この証拠により、シクロフィリンがＭＣＭＶ増殖の過程において重大な役割を果たすことが示唆される。ＣｙＰＡ以外のアイソフォームがこのＭＣＭＶ阻止に関与しているかもしれないという可能性があることは示されているが（Price, E. R., Zydowsky, L. D., Jin, M. J., Baker, C. H., McKeon, F. D. & Walsh, C. T. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88, 1903-7）、ＭＣＭＶ抗原陽性細胞はＮＳＰＣでＣｙＰＡで二重染色され、そして組換えＣｙＰＡはＣｓＡおよびＮＩＭ８１１により引き起こされるＭＣＭＶ阻止を逆転させるという証拠は、少なくともＣｙＰＡがＭＣＭＶ増殖に関与しているという示唆を支持している。
【００４６】
ウイルス形成では、シクロフィリンはＨＩＶ（Franke, E. K., Yuan, H. E. & Luban, J. (1994) Natire 372, 359-62; Luban, J., Bossolt, K. L., Franke, E. K., Kalpana, G. V. & Goff, S. P. (1993) Cell 73, 1067-78）、ワクシニアウイルス（Castro, A. P., Carvalho, T. M., Moussatche, N. & Damasco, C. R. (2003) J Virol 77, 9052-68）およびＨＣＶ（Watashi, K., Hijikata, M., Hosaka, M., Yamaji, M. & Shimotohna, K. (2003) Hepathologu 38, 1282-8）のようないくつかのウイルスに関連している。シクロフィリンのＨＣＶおよびワクシニアウイルスに対する正確な標的は依然として明らかにされていない。ＭＣＭＶがゆっくりと増殖した成体ＮＳＰＣを用いることで、前記の研究により、ヘルペスウイルス科におけるシクロフィリンとウイルス複製との間の関係が実証される。１μＭ  ＮＩＭ８１１の存在下でＮＳＰＣのＭＣＭＶでの感染が８週まで抑制され得るということは留意するに値する。培養からのＮＩＭ８１１の剥奪はＭＣＭＶ持続培養からのＭＣＭＶ再活性化の誘因となる。シクロフィリンを介する感染の過程において、どのチェックポイントに関してＣｓＡおよびＮＩＭ８１１がＭＣＭＶ増殖を停止することができるかは依然疑問のままである。ＩＥ１−ＩＥ３転写ユニットからの転写を推進する主要最初期プロモーター（ＭＩＥＰ）の活性化はＭＣＭＶ増殖感染に重要であることは以前に報告されている（Aiba-Masago, S., Baba, S., Li, R. Y., Shinmura, Y., Kosugi, I., Arai, Y., Nishimura, M. & Tsutsui, Y. (1999) Am J Pathol 154, 735-43; Li, R. Y., Baba, S., Kosugi, I., Arai, Y., Kawasaki, H., Shinmura, Y., Sakakibara, S. I., Okano, H. & Tsutsui, Y. (2001) Glia 35, 41-52）。本トランスフェクション研究では、ＣｓＡおよびＮＩＭ８１１はＭＩＥＰ転写因子（ＮＳＰＣにおけるＡＰ−１およびＮＦ−κＢ活性もＭＩＥプロモーター活性も）を阻止しない。これらの結果により、ＣｓＡはシクロフィリンを介してＭＩＥＰ活性の上流または下流のレベルでＭＣＭＶ増殖を抑制することが示唆される。
【００４７】
興味深いことに、前記の成体ＮＳＰＣ研究では、フローサイトメトリー分析によりＣｙＰＡ発現パターンは二極性である。インビトロで形成されるニューロスフェアーは幹細胞および前駆細胞を含むさらに分化した細胞の異質な混合物からなることに留意することは重要である（Reynolds, B. A. & Weiss, S. (1996) Dev Biol 175, 1-13）。このＣｙＰＡの二極性発現はニューロスフェアーの独特な特性の結果であり得る。
【００４８】
ＭＣＭＶ陽性細胞はフローサイトメトリーによりＣｙＰＡの高発現を伴う細胞である傾向を有している。ＣｙＰＡの高発現はＭＣＭＶ増殖のための条件を提供することが示唆される。ＣｓＡまたはＮＩＭ８１１によるＣｙＰの阻止が用量依存的な様式でＭＣＭＶ増殖の抑制に至るという事実はこの仮説に合致する。
【００４９】
ＮＳＰＣのヒト脳への移植は神経変性障害のための有望な処置である。同種異系間移植によりＭＩＥプロモーターの活性化のためのＮＦ−κＢおよびＡＰ−１を含む転写因子の発現が誘発され（Soderberg-Naucler, C., Fish, K.N. & Nelson, J. A. (1997) Cell 91, 119-26）、結果的にＣＭＶが再活性化が引き起こされる。最近、免疫刺激下でＣｙＰＡがその発現を上方調節することが報告されている。インビボではＣｙＰＡ発現は正常マウス頚動脈の管腔内皮細胞において検出できないが、全身ＬＰＳ注射の後には急速に誘導される（Kim, S. H., Lessner, S. M., Sakurai, Y. & Galis, Z. S. (2004) Am J Pathol 164, 1567-74）。ＣｙＰＡはＬＰＳ活性化マクロファージの炎症誘発性分泌生成物として同定されており（Sherry, B., Yarlett, N., Strupp, A. & Cerami, A. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89, 3511-5）、そして敗血症患者の血清において検出される（Tegeder, I., Schumacher, A., John, S., Geiger, H., Geisslinger, G., Bang, H. & Brune, K. (1997) J Clin Immunol 17, 380-6）。一方、それにより炎症刺激がＣＭＶ複製を引き起こす多くの刺激がある。同種異系または炎症刺激はＣｙＰＡを上方調節してＣＭＶ増殖を増強するということが示唆されている。神経幹移植治療における炎症刺激はＣＭＶ潜伏感染した細胞におけるＣｙＰレベルを上昇させ、そしてＣＭＶ増殖のための条件を提供し得る。
【００５０】
神経保護のためのＣｓＡの正確なメカニズムが重点的に研究されている（Kaminska, B., Gaweda-Walerych, K. & Zawadzka, M. (2004) J Cell Mol Med 8, 45-58）。ＮＩＭ８１１のような非免疫抑制性イムノフィリンリガンドもまた神経保護効果を有している（Kaminska, B., Gaweda-Walerych, K. & Zawadzka, M. (2004) J Cell Mol Med 8, 45-58; Steiner, J. P., Connolly, M. A., Valentine, H. L., Hamilton, G. S., Dawson, T. M., Hester, L. & Snyder, S. H. (1997) Nat Med 3, 421-8）。ＣｓＡまたはシクロフィリン阻害剤の投与は脳において移植されたＮＳＰＣの生存を促進するのを補助するであろう。
【００５１】
実施例６
臨床試験
慢性ＣＭＶ感染を有する全部で８０−１００人の妊娠した女性が６−９か月の研究に登録される。各患者は式（Ｉ）の化合物、例えば［Ｍｅｌｌｅ］４−シクロスポリンを２００−４００ｍｇの用量で投与される。ＣＭＶ抗原の血清レベルを各女性患者で隔週に決定する。その後、これらの女性患者から生まれた乳幼児を２週毎に８週間、次いでその後月１回、ＣＭＶ抗原の血清レベルに関して試験する。
【００５２】
処置および予防に必要な１日用量は例えば用いた非免疫抑制性シクロフィリン結合シクロスポリン、宿主、投与様式、処置すべき状態の重篤度に依存して異なる。好ましい１日用量範囲は、１回用量または分割用量として１日あたり約１−５０ｍｇ／ｋｇである。患者に適当な１日用量は例えば１−２０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．またはｉ．ｖ．のオーダーである。経口投与に適当な単位投与形態は約０.２５−１０ｍｇ／ｋｇの活性成分、例えば［Ｍｅｌｌｅ］４−シクロスポリンを１個またはそれ以上の薬学的に許容される希釈剤またはその担体と一緒に含む。
【００５３】
本発明のシクロスポリン類を任意の従来の経路、特に経腸的に、例えば経口的に、例えば飲用の溶液、錠剤もしくはカプセル、または非経口的に、例えば注射用溶液もしくは懸濁液の形態で投与することができる。好ましい医薬組成物は例えば英国特許第２２２２７７０Ａ号に記載されるようなマイクロエマルジョンに基づくものでよい。
【００５４】
本発明のシクロスポリン類を単一の成分として、またはその他の薬物、例えば抗ＣＭＶ活性を有する薬物、例えばインターフェロン、例えばα−２−インターフェロンもしくはペグ化インターフェロン、または抗ウイルス剤、例えばリバビリン、ラミブジン、ＮＶ０８もしくはＮＭ２８３と一緒に投与することができる。
【００５５】
用いた併用薬に関する１日用量は例えば用いる化合物、宿主、投与様式、処置すべき状態の重篤度に依存して異なる。例えばラミブジンを１日用量１００ｍｇで投与することができる。
【００５６】
前記にしたがって、本発明はさらに別の態様を提供する：
５.  ａ）非免疫抑制性シクロフィリン結合シクロスポリン、例えば式（Ｉ）の化合物である第１の薬剤；および
ｂ）併用薬、例えば前記で定義したような第２の薬剤；
を含む医薬的組合せ。
６.  治療上有効量の非免疫抑制性シクロフィリン結合シクロスポリン、例えば式（Ｉ）の化合物、および併用薬、例えば前記で定義したような第２の薬剤の、例えば同時にまたは逐次的に併用することを含む前記で定義したような方法。
【００５７】
本明細書にて用いる「同時投与」もしくは「組合せ投与」なる用語または同様の用語は単一の患者への選択された治療薬の投与を包含することを意味し、そして薬剤を同一の投与経路により、または同時に投与する必要がない処置計画を含むことを意図する。
【００５８】
本発明の医薬的な組合せの投与の結果、その医薬的に活性な成分を１つだけ適用する単一治療に比較して、有益な効果、例えば相乗治療効果に至る。好ましい相乗的な組合せは、非免疫抑制性シクロフィリン結合シクロスポリンと∝−ＩＦＮとの組合せである。
【００５９】
［Ｍｅｌｌｅ］４−シクロスポリンは本発明による使用のための好ましい非免疫抑制性シクロフィリン結合シクロスポリンである。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図２】（Ｊ）は対照およびＣＳＡ処理したＩＥ１陽性細胞の比較を示すグラフを表す。（Ｋ）は対照およびＣＳＡ処理したＩＥ１陽性細胞の間の感染細胞の力価を示すグラフを表す。
【図４】（Ａ）はＣＳＡ処理により引き起こされたＩＥ１細胞の抑制に及ぼす影響を示すグラフを表す。矢印はＣｓＡが放出される時点を示している。
【図５】（Ａ）はＣＳＡまたはＮＩＭ８１１（Ｂ）のいずれかで処理した感染または対照培養において測定されるＩＥ１陽性細胞パーセントを比較するグラフを表す。（Ｄ）はＩＥ１陽性細胞に及ぼすＣｓＡの種々の濃度の影響を測定するグラフを表す。
【図２】
2007112775.tif 000005
【図４】
2007112775.tif 000006
【図５】
2007112775.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成18年3月15日(2006.3.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
図面の簡単な説明
図１：（Ａ）は対照およびＣＳＡ処理したＩＥ１陽性細胞の比較を示すグラフを表す。（Ｂ）は対照およびＣＳＡ処理したＩＥ１陽性細胞の間の感染細胞の力価を示すグラフを表す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
図２：（Ａ）はＣＳＡ処理により引き起こされたＩＥ１細胞の抑制に及ぼす影響を示すグラフを表す。矢印はＣｓＡが放出される時点を示している。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
図３：（Ａ）および（Ｂ）はＣＳＡおよびＮＩＭ８１１のそれぞれで処理した感染および対照培養において測定されるＩＥ１陽性細胞パーセントを比較するグラフを表す。（Ｃ）はＩＥ１陽性細胞に及ぼすＣｓＡの種々の濃度の影響を測定するグラフを表す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
実施例２
ＮＳＰＣにおいてＣｓＡはＭＣＭＶ増殖を抑制する
単離および解離の直後に、ＮＳＰＣをＭＣＭＶ（ＲＭ４５０３）で細胞あたり１プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＭＯＩで感染させる。感染した細胞は感染後３日からＧＦＰ媒介の緑色蛍光を示し、そしてＧＦＰ発現細胞の数はインキュベーション時間の経過とともに増加する。ＣｓＡ処理下の細胞はその他の全培養期間に対照培養よりも少ししかＧＦＰ陽性細胞を示さない。細胞における感染性を評価するために、ＭＣＭＶ  ＩＥ１抗原に特異的なＮ２  ｍＡｂを用いて免疫細胞染色を行う（Shinmura, Y., Aiba-Masago, S., Kosugi, I., Li, R. Y., Baba, S. & Tsutsui, Y. (1997) Am J Pathol 151, 1331-40.）。ＭＯＩが１で感染した後、対照およびＣｓＡ処理培養でＩＥ１陽性細胞のパーセンテージを決定する。ＭＣＭＶ感染後５、７および１０日に、ＣｓＡ処理培養では対照培養よりもＩＥ１陽性細胞が有意に少ない。種々の培養期間からのアリコートのウイルス力価をプラークアッセイ法により試験する。ＭＣＭＶ感染後５、７および１０日に、ＣｓＡ処理培養は対照培養よりも有意に低いウイルス力価を示す。ウイルス複製の阻止を示すことにおいて、ＩＥ１陽性細胞のパーセンテージ（図１Ａ）は感染ウイルスの力価（図１Ｂ）とよく相関した。ＮＳＰＣにおけるＣｓＡ処理に及ぼすウイルス負荷の影響を知るために、０.５μＭＣｓＡ処理下、種々のＭＣＭＶウイルス力価（ＭＯＩは０.１、１、１０）でＣｓＡ培養と対照培養との間でＩＥ１陽性細胞のパーセンテージを比較する。ＣｓＡは全てのウイルス用量でＭＣＭＶ感染を抑制するが、低ＭＯＩでより有効である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
実施例４
ＮＳＰＣにおける持続感染に及ぼすＮＩＭ８１１の影響
ＭＯＩ１でＭＣＭＶに感染したＮＳＰＣをＣｓＡ（０.５μＭ）処理下で培養し、次いで細胞をＣｓＡ不含培地に移す。ＭＣＭＶ−ＩＥ１陽性細胞は、ＣｓＡ処理した細胞と比較してＣｓＡ処理していない培地において有意に増加する（図２Ａ）。したがって、阻害剤はＭＣＭＶ阻止に関して可逆的である。このＭＣＭＶ持続感染／再活性化現象がシクロフィリンに関係するメカニズムにより引き起こされることを確認するために、ＮＳＰＣをＮＩＭ８１１（１μＭ）の存在下、ＭＯＩが０.１でＭＣＭＶに感染させる。１４ｄｐｉにＧＦＰ陽性細胞は未処理細胞において有意に増加するが、一方ＮＩＭ８１１で処理した細胞では陽性細胞はほとんど観察されない。これをフローサイトメトリーによりＩＥ１陽性細胞のパーセンテージとして確認する。ＮＩＭ８１１処理下で持続的に感染したＮＳＰＣを２週毎にＮＩＭ８１１処理培養およびＮＩＭ８１１不含培養に分けた。ＧＦＰ陽性細胞は感染後少なくとも６週にはＮＩＭ８１１処理培養においてほとんど観察されない。ＮＩＭ８１１を培養培地から除去したときに、ＧＦＰ陽性細胞は明らかにＮＩＭ８１１によりＭＣＭＶ抑制された培養から現れる。この結果はフローサイトメトリーによりＩＥ１陽性細胞のパーセンテージとして確認される。このＮＩＭ８１１によりＭＣＭＶ抑制された細胞からの再活性化は８週まで観察される。８週後はＮＳＰＣにおいて持続感染したＭＣＭＶは再活性化できなくなる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
実施例５
ＮＳＰＣにおけるシクロフィリンＡのＭＣＭＶ感染との関連性
シクロフィリンは器官中に豊富にあり、そして広範に分布しているタンパク質である。主要なシクロフィリンアイソフォームはシクロフィリンＡ（ＣｙＰＡ）と称される細胞質内の１８ｋＤａタンパク質である（シクロフィリンのＰＰｌａｓｅ活性の８０％以上）（Price, E. R., Zydowsky, L. D., Jin, M. J., Baker, C. H., McKeon, F. D. & Walsh, C. T. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88, 1903-7）。本明細書ではＣｓＡおよびＮＩＭ８１１によるＭＣＭＶの阻止に及ぼすＣｙＰＡの逆転効果を試験する。ＣｓＡまたはＮＩＭ８１１（０.５μＭ）の存在下、ＭＯＩ１でＮＳＰＣをＭＣＭＶで感染させた後、ヒト組換えＣｙＰＡを用量依存的な様式で培養に加える。１０ｄｐｉにＩＥ１抗原陽性細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーにより各々異なる培養で試験する。１００ｎｇ／ｍｌの濃度でＣｙＰＡを伴うＮＳＰＣはＣｓＡ（図３Ａ）またはＮＩＭ８１１（図３Ｂ）により引き起こされるＭＣＭＶの阻止を逆転させる。ＣｙＰＡは１ｎｇ／ｍｌＣｙＰＡの用量からＣｓＡにより引き起こされるＭＣＭＶ阻止を逆転させる。ＣｙＰＡは、ＣｓＡよりもシクロフィリンに対してより強力な親和性を有しているＮＩＭ８１１により引き起こされるＭＣＭＶの阻止を用量依存的な様式で逆転させる（Billich, A., Hammerschmid, F., Peichl, P., Wenger, R., Zenke, G., Quesniaux, V. & Rosenwirth, B. (1995) J Virol 69, 2451-61）（図３Ｃ）。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
次いでフローサイトメトリーにより、成体ＮＳＰＣおよび線維芽細胞におけるＣｙＰＡの発現を比較する。フローサイトメトリー分析により成体ＮＳＰＣにおいてＣｙＰＡ発現の２つのピークがあることが示される。左のピークはＣｙＰＡの発現が低い細胞を表し、そして右のピークはＣｙＰＡの発現が高い細胞を表す。しかし線維芽細胞におけるＣｙＰＡの発現はＣｙＰＡの高発現を有する単極性である。感染の５日後にＭＣＭＶ―ＩＥ１抗原／ＣｙＰＡの二重染色を行い、そして２色のフローサイトメトリーによりＭＣＭＶ陽性細胞を発現するＣｙＰＡ陽性細胞はＮＳＰＣの２３.８％に相当することが実証される。ＣｙＰＡ陰性細胞およびＭＣＭＶ陽性細胞の組成はＮＳＰＣの６.３％である。ＭＣＭＶ陽性細胞の約８０％はＣｙＰＡ抗原を発現する。これらの結果により高レベルのＣｙＰＡを有する細胞はＭＣＭＶを増殖する傾向にあることが示される。
【手続補正書】
【提出日】平成18年3月15日(2006.3.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
【図１】（Ａ）は対照およびＣＳＡ処理したＩＥ１陽性細胞の比較を示すグラフを表す。（Ｂ）は対照およびＣＳＡ処理したＩＥ１陽性細胞の間の感染細胞の力価を示すグラフを表す。
【図２】（Ａ）はＣＳＡ処理により引き起こされたＩＥ１細胞の抑制に及ぼす影響を示すグラフを表す。矢印はＣｓＡが放出される時点を示している。
【図３】（Ａ）および（Ｂ）はＣＳＡおよびＮＩＭ８１１のそれぞれで処理した感染および対照培養において測定されるＩＥ１陽性細胞パーセントを比較するグラフを表す。（Ｃ）はＩＥ１陽性細胞に及ぼすＣｓＡの種々の濃度の影響を測定するグラフを表す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2007112775.tif 000008
【図２】
2007112775.tif 000009
【図３】
2007112775.tif 000010
【外国語明細書】
2007112775.tif 000011
2007112775.tif 000012
2007112775.tif 000013
2007112775.tif 000014
2007112775.tif 000015
2007112775.tif 000016
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2007112775.tif 000018
2007112775.tif 000019
2007112775.tif 000020
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2007112775.tif 000022
2007112775.tif 000023
2007112775.tif 000024
2007112775.tif 000025
2007112775.tif 000026
2007112775.tif 000027
2007112775.tif 000028
2007112775.tif 000029
2007112775.tif 000030
2007112775.tif 000031
2007112775.tif 000032
2007112775.tif 000033
2007112775.tif 000034
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