(57)【要約】【課題】腎細胞癌を含む悪性腫瘍の有無やその程度を判定する方法および当該判定に有効に利用できる診断薬の提供。癌細胞の増殖を抑制して悪性腫瘍を予防または治療するために有効に利用することができる抗腫瘍剤の提供。腎細胞癌を含む悪性腫瘍の治療に有効な抗腫瘍物質のスクリーニング方法の提供。【解決手段】  悪性腫瘍の判定は、哺乳動物のHOXB13遺伝子、特にCpGアイランドのメチル化頻度またはその相関値を測定することにより行う。診断薬は上記CpGアイランドのメチル化を検出しえるプライマー対を有効成分とする。抗腫瘍剤はHOXB13のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNAを有効成分とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物のHOXB13遺伝子のメチル化頻度またはその相関値を測定することを特徴とする、悪性腫瘍の判定方法。
【請求項２】
HOXB13遺伝子のメチル化頻度が、当該遺伝子のCpGアイランドのメチル化頻度である、請求項１記載の判定方法。
【請求項３】
上記CpGアイランドが、HOXB13遺伝子の塩基番号-1〜-376の領域である請求項２記載の判定方法。
【請求項４】
上記悪性腫瘍が、腎細胞癌である請求項１乃至３のいずれかに記載する判定方法。
【請求項５】
下記の工程を有する、被験哺乳動物の悪性腫瘍の程度を判定する方法：
（１）哺乳動物のHOXB13遺伝子のメチル化頻度またはその相関値を測定する工程、
（２）測定されたメチル化頻度またはその相関値を、対照とする健常哺乳動物のHOXB13遺伝子のメチル化頻度またはその相関値と対比する工程、および
（３）上記対比した結果に基づいて、被験哺乳動物の悪性腫瘍の程度を評価する工程。
【請求項６】
メチル化頻度が、HOXB13遺伝子のCpGアイランドのメチル化頻度である請求項５記載の判定方法。
【請求項７】
上記CpGアイランドが、HOXB13遺伝子の塩基番号-1〜-376の領域である請求項６記載の判定方法。
【請求項８】
悪性腫瘍が、腎細胞癌である請求項５乃至７のいずれかに記載する判定方法。
【請求項９】
HOXB13遺伝子のCpGアイランドのメチル化頻度を検出し得るプライマー対を含有することを特徴とする、悪性腫瘍の罹患またはその程度を検出する試薬。
【請求項１０】
上記CpGアイランドが、HOXB13遺伝子の塩基番号-1〜-376の領域である請求項９記載の試薬。
【請求項１１】
プライマー対が配列番号13と14で示される塩基配列、または配列番号15と16で示される塩基配列を有するものである、請求項９または１０に記載する試薬。  
【請求項１２】
悪性腫瘍が、腎細胞癌である請求項９乃至１１のいずれかに記載する試薬。
【請求項１３】
有効成分としてHOXB13のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNAを含む、抗腫瘍剤。
【請求項１４】
腎細胞癌に対する抗癌剤である、請求項１３に記載する抗腫瘍剤。
【請求項１５】
下記の工程を有する、腎細胞癌に対する抗腫瘍物質をスクリーニングする方法：
（ａ）HOXB13遺伝子のCpGアイランドのメチル化に起因してHOXB13遺伝子の発現が抑制されている腎癌細胞に対して、被験物質を接触させる工程、
（ｂ）上記腎癌細胞におけるHOXB13遺伝子の発現量を測定し、被験物質を接触させない上記腎癌細胞のHOXB13遺伝子の発現量（対照発現量）と対比する工程、および
（ｃ）対照発現量に比してHOXB13遺伝子の発現量が増加した腎癌細胞に接触させた被験物質を、腎細胞癌に対する抗腫瘍物質として選択する工程。
【請求項１６】
HOXB13遺伝子の発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によりｍＲＮＡ量として検出する、請求項１５記載の抗腫瘍物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎細胞癌を含む悪性腫瘍の有無やその程度を判定する方法および当該判定に有効に利用できる診断薬に関する。また本発明は癌細胞の増殖を抑制して悪性腫瘍を予防または治療するために有効に利用することができる抗腫瘍剤に関する。さらに本発明は、腎細胞癌を含む悪性腫瘍の治療に有効な抗腫瘍物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎細胞癌(RCC)はヒト腎臓における最も一般的な癌であり(非特許文献１など参照)、毎年、米国では30000例以上、日本では7000例の新規症例が見つかっている。これまでの研究によりvon Hippel-Lindau (VHL)遺伝子がヒト腎細胞癌の発達に関与する主要な癌抑制遺伝子として報告され、主としてジェネティックな変化により散発性腎細胞癌症例の約60％において不活化されていることがあきらかになっている(非特許文献２〜６等参照)。しかしながら、VHL遺伝子の不活化を伴わない散発性腎細胞癌の腫瘍形成メカニズムや腎細胞癌悪性化の多段階発癌機構はあきらかになっていない。最近、fumarate hydratase (FH)遺伝子とBert Hogg Dube (BHD)遺伝子が、腎細胞癌における癌抑制遺伝子候補としてポジショナルクローニング法により同定されたが、これらは主として遺伝性のヒト腎細胞癌の発達に関与している(非特許文献７〜８等参照)。
【０００３】
癌抑制遺伝子の機能喪失が癌進行の基本的要因であるが、プロモーター領域のＤＮＡ異常メチル化が、癌抑制遺伝子の機能喪失（転写阻害）に関わっていることが知られている（非特許文献９〜１２等参照）。
【０００４】
このため、エピジェネティックに不活化されていることが知られているいくつかの癌関連遺伝子について、腎細胞癌におけるメチル化状態をあきらかにすることによって、散発性腎細胞癌で不活化されている遺伝子を同定する研究が試みられている。しかしながら、癌では数百の遺伝子が異常にメチル化されていると推定されており(非特許文献１３等参照)、未だ散発性腎細胞癌の発症と進展に関与する遺伝子の解明は進んでいない。このため、腎細胞癌の発症と進展に関与する遺伝子を指標とする臨床的に有効な腫瘍マーカーは確立されるにいたっておらず、現在の腎細胞癌の検査は、主としてエコー・ＣＴなどの画像診断によることが多く、簡便性やマススクリーニングの困難などといった問題を含んでいる。
【０００５】
一方、Homeo-box (Hox)遺伝子は転写因子をコードしており、脊椎動物の発生の過程で重要な役割を果たしている。マウスhomeo-box gene B13（マウスHoxB13遺伝子）はマウス胎児の泌尿生殖器系・尾芽・脊髄後端・後腸で発現している(非特許文献１４等参照）。Hoxb13のホモ欠失変異マウスは尾部における細胞増殖の促進とアポトーシスの減少をともなう尾部の過成長の表現系を示すことから、HoxB13の機能はマウスでは細胞増殖の抑制とプログラム細胞死を活性化することと推定されている(非特許文献１５参照)。しかしながら、ヒト成人腎臓におけるHOXB13の機能と癌化への関与は知られていない。
【非特許文献１】Thoenes W, Storkel S and Rumpelt HJ. (1986). Pathol Res Pract., 181, 125-143
【非特許文献２】Foster K, Prowse A, van den Berg A, Fleming S, Hulsbeek MM, Crossey PA, Richads FM, Cairns P, Affara NA and Ferguson-Smith MA. (1994). Hum Mol Genet., 3, 2169-2173
【非特許文献３】Gnarra JR, Tory K, Weng Y, Schmidt L, Wei MH, Li H, Latif F, Liu S, Chen F, Duh FM, Lubensky I, Duan DR, Florence C, Pozzatti R, Walther MM, BanderNH, Grossman HB, Brauch H, Pomer S, Brooks JD, Isaacs WB, Lerman MI, Zbar B and Linehan WM. (1994). Nat Genet., 7, 85-90
【非特許文献４】Herman JG, Latif F, Weng Y, Lerman MI, Zbar B, Liu S, Samid D, Duan DS, Gnarra JR, Linehan WM and Baylin SB. (1994). Proc Natl Acad Sci USA., 91, 9700-9704
【非特許文献５】Shuin T, Kondo K, Torigoe S, Kishida T, Kubota Y, Hosaka M, Nagashima Y, Kitamura H, Latif F and Zbar B. (1994). Cancer Res., 54, 2852-2855
【非特許文献６】Shuin T, Kondo K, Ashida S, Okuda H, Yoshida M, Kanno H and Yao M. (1999). Contrib Nephrol., 128, 1-10.
【非特許文献７】Nickerson ML, Warren MB, Toro JR, Matrosova V, Glenn G, Turner ML, Duray P, Merino M, Choyke P, Pavlovich CP, Sharma N, Walther M, Munroe D, Hill R, Maher E, Greenberg C, Lerman MI, Linehan WM, Zbar B and Schmidt LS. (2002). Cancer Cell, 2, 157-164
【非特許文献８】Tomlinson IP, Alam NA, Rowan AJ, Barclay E, Jaeger EE, Kelsell D, Leigh I, Gorman P, Lamlum H, Rahman S, Roylance RR, Olpin S, Bevan S, Barker K, Hearle N, Houlston RS, Kiuru M, Lehtonen R, Karhu A, Vilkki S, Laiho P, Eklund C, Vierimaa O, Aittomaki K, Hietala M, Sistonen P, Paetau A, Salovaara R, Herva R, Launonen V and Aaltonen LA. (2002). Nat Genet., 30, 406-410
【非特許文献９】Jones PA and Laird PW. (1999). Nat Genet., 21, 163-167
【非特許文献１０】Toyota M and Issa JP. (1999a). Semin Cancer Biol., 9, 349-357.
【非特許文献１１】Baylin SB, Esteller M, Rountree MR, Bachman KE, Schuebel K and Herman JG. (2001). Hum Mol Genet., 10, 687-692
【非特許文献１２】Herman JG and Baylin SB. (2003). N Engl J Med., 349, 2042-2054
【非特許文献１３】Costello JF, Fruhwald MC, Smiraglia DJ, Rush LJ, Robertson GP, Gao X, Wright FA, Feramisco JD, Peltomaki P, Lang JC, Schuller DE, Yu L, Bloomfield CD, Caligiuri MA, Yates A, Nishikawa R, Su Huang H, Petrelli NJ, Zhang X, O'Dorisio MS, Held WA, Cavenee WK and Plass C. (2000). Nat Genet., 24, 132-138
【非特許文献１４】Zeltser L, Desplan C and Heintz N. (1996). Development, 122, 2475-2484
【非特許文献１５】Economides KD, Zeltser L and Capecchi MR. (2003). Dev Biol., 256, 317-330
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、悪性腫瘍、特に腎細胞癌に特異的に見られる現象を指標として、腎細胞癌を始めとする悪性腫瘍の罹患の有無やその程度を簡便に判定する方法、ならびに当該判定に有効に利用できる診断薬を提供することを目的とする。また腎癌細胞等の癌細胞の増殖を抑制することによって悪性腫瘍の発症や進行を予防しまた改善するために有効に利用することができる抗腫瘍剤を提供することを目的とする。さらに本発明は、当該抗腫瘍剤の有効成分となる抗腫瘍物質をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を進めていたところ、原発性腎細胞癌腫瘍および腎癌細胞株においてヒトhomeobox B13遺伝子（本明細書および特許請求の範囲において「HOXB13遺伝子」ともいう）のCpGアイランドが、正常細胞株および正常腎臓組織と比較して有意に高い頻度で異常にメチル化されていることを見出し、さらにかかるHOXB13遺伝子のメチル化はHOXB13発現の消失と相関しており、HOXB13非発現細胞株をメチル基転移酵素阻害剤で処理することによって、その発現が回復することを見出した。さらに、本発明者らは、HOXB13遺伝子を発現しない高度メチル化腎癌細胞株に外来性のHOXB13遺伝子を発現させることにより腎癌細胞の増殖が抑制され、アポトーシスが誘導されることを見出した。この知見はHOXB13遺伝子がヒト腎細胞癌において癌抑制遺伝子として働き、抗腫瘍物質として有効に利用できることを示唆するものである。
【０００８】
本発明はかかる知見に基づいて完成したものであり、下記の具体的な態様を有するものである；
（I) 悪性腫瘍の判定方法
項1．哺乳動物のHOXB13遺伝子のメチル化頻度またはその相関値を測定することを特徴とする、悪性腫瘍の判定方法。
項２．HOXB13遺伝子のメチル化頻度が、当該遺伝子のCpGアイランドのメチル化頻度である、項１記載の判定方法。
項３．上記CpGアイランドが、HOXB13遺伝子の塩基番号-1〜-376の領域である項２記載の判定方法。
項４．悪性腫瘍が、腎細胞癌である項１乃至３のいずれかに記載する判定方法。
【０００９】
（II) 悪性腫瘍の程度の判定方法
項５．下記の工程を有する、被験哺乳動物の悪性腫瘍の程度を判定する方法：
（１）哺乳動物のHOXB13遺伝子のメチル化頻度またはその相関値を測定する工程、
（２）測定されたメチル化頻度またはその相関値を、対照とする健常哺乳動物のHOXB13遺伝子のメチル化頻度またはその相関値と対比する工程、および
（３）上記対比した結果に基づいて、被験哺乳動物の悪性腫瘍の程度を評価する工程。
項６．メチル化頻度が、HOXB13遺伝子のCpGアイランドのメチル化頻度である項５記載の判定方法。
項７．上記CpGアイランドが、HOXB13遺伝子の塩基番号-1〜-376の領域である項６記載の判定方法。
項８．悪性腫瘍が、腎細胞癌である項５乃至７のいずれかに記載する判定方法。
【００１０】
（III) 悪性腫瘍の罹患やその程度を検出する診断薬
項９．HOXB13遺伝子のCpGアイランドのメチル化頻度を検出し得るプライマー対を含有することを特徴とする、悪性腫瘍の罹患またはその程度を検出する診断薬。
項１０．上記CpGアイランドが、HOXB13遺伝子の塩基番号-1〜-376の領域である項９記載の試薬。
項１１．プライマー対が配列番号13と14で示される塩基配列、または配列番号15と16で示される塩基配列を有するものである、項９または１０に記載する診断薬。
項１２．悪性腫瘍が、腎細胞癌である項９乃至１１のいずれかに記載する診断薬。
【００１１】
（IV) 抗腫瘍剤
項１３．有効成分としてHOXB13のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNAを含む、抗腫瘍剤。
項１４．腎細胞癌に対する抗癌剤である、項１３に記載する抗腫瘍剤。
【００１２】
（V）スクリーニング方法
項１５．下記の工程を有する、腎細胞癌に対する抗腫瘍物質をスクリーニングする方法：
（ａ）HOXB13遺伝子のCpGアイランドのメチル化に起因してHOXB13遺伝子の発現が抑制されている腎癌細胞に対して、被験物質を接触させる工程、
（ｂ）上記腎癌細胞におけるHOXB13遺伝子の発現量を測定し、被験物質を接触させない上記腎癌細胞のHOXB13遺伝子の発現量（対照発現量）と対比する工程、および
（ｃ）対照発現量に比してHOXB13遺伝子の発現量が増加した腎癌細胞に接触させた被験物質を、腎細胞癌に対する抗腫瘍物質として選別する工程。
項１６．HOXB13遺伝子の発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によりｍＲＮＡ量として検出する、項１５記載の抗腫瘍物質のスクリーニング方法。
【００１３】
なお、上記において「HOXB13遺伝子の塩基番号-1〜-376の領域」とは、ヒトHOXB13遺伝子のexon 1の開始コドンを塩基番号1とした場合に、塩基番号-1〜-376に位置する領域を意味する。以下、本明細書の全体を通じて、「塩基番号xxx」という場合のxxxは、HOXB13遺伝子exon 1の開始コドンを塩基番号1とした場合の塩基の位置を示すものとする。
【００１４】
一方、本明細書において、特定の塩基配列またはアミノ酸配列の「yyy番目」という場合は、当該塩基配列の5’末端の塩基またはアミノ酸配列のN末端のアミノ酸を１番目とした場合の、当該塩基またはアミノ酸の位置を示すものとする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、HOXB13遺伝子が原発性腎細胞癌において、正常腎組織には見られない腫瘍特異的メチル化を示し、またメチル化によって不活化されること、腎癌細胞へのHOXB13遺伝子の導入によってアポトーシスが誘導され癌細胞の増殖が抑制されることを見い出したことに基づいて完成されたものである。本発明によれば、HOXB13遺伝子のメチル化を検出することによって腎細胞癌を含む悪性腫瘍の罹患やその程度を判定する診断方法を提供することができる。さらに、本発明によれば、上記悪性腫瘍の罹患やその程度を診断する方法に有効に使用できる診断薬を提供することができる。また本発明によれば、HOXB13遺伝子またはその発現産物の腎癌細胞増殖抑制機能を利用した抗腫瘍剤を提供することができる。さらに、本発明によれば、HOXB13遺伝子の脱メチル化による発現回復を指標として、原発性腎細胞癌に対する新しい抗腫瘍物質を探索する為の方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（Ｉ） 悪性腫瘍の判定方法
本発明は悪性腫瘍マーカー、好ましくは腎細胞癌のマーカーとして、メチル化されたhomeo-box B13遺伝子（HOXB13遺伝子）を用いることを特徴とする。
【００１７】
本発明において、悪性腫瘍マーカーとして使用されるHOXB13遺伝子としては、哺乳動物、好ましくはヒト由来のHOXB13のアミノ酸配列（NCBI RefSeq. NP_006352）をコードする塩基配列を含む、翻訳領域（コーディング領域）、非翻訳領域、およびその5’上流に位置するプロモーター領域、を含む遺伝子を挙げることができる。例えば、ヒト由来のHOXB13遺伝子の塩基配列はGenbank Accession No. AC091179に、マウス由来のHoxb13遺伝子の塩基配列はGenbank Accession No. AL645478に記載されている。ヒト由来HOXB13遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に、またそれによってコードされるヒト由来HOXB13（タンパク質）のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００１８】
なお、ヒト由来HOXB13遺伝子の塩基配列（配列番号１）中、26112〜26711番目および27661〜27915番目の領域は、それぞれ翻訳領域[exon 1]および [exon 2]であり、26712〜27660番目の領域は非翻訳領域、および25691〜26111番目の領域はプロモーター領域である。本発明で利用されるHOXB13遺伝子には、上記Genbankなどに登録されている公知の塩基配列を有する遺伝子のほか、かかる塩基配列に、生物の種差、個体差もしくは器官や組織間の差異により、天然に生じる変異による塩基の欠失、置換若しくは付加が生じた塩基配列を有する遺伝子も含まれる。
【００１９】
哺乳動物では、遺伝子（ゲノムDNA）を構成する４種類の塩基のうちシトシンのみがメチル化されるという現象がある。このDNAのメチル化修飾は、5’-CG-3’で示される塩基配列（Cはシトシンを、Gはグアニンを意味する。以下、当該塩基配列を「CpG」または「CpG配列」と称する）中のシトシンの5炭素部分にメチル基が付加することによって行われる。ゲノムのこのようなCpG配列に富む領域は「CpGアイランド」と呼ばれる。CpGアイランドは、多くのケースで遺伝子の転写プロモーター領域に存在している。なお、細胞分裂に先立つDNA複製に際して、複製直後は鋳型鎖のCpG配列中のシトシンのみがメチル化された状態となるが、メチル基転移酵素の働きにより即座に新生鎖のCpG配列中のシトシンもメチル化される。このため、DNAのメチル化は、DNA複製後も、新しい２組のDNAにそのまま引き継がれることになる。
【００２０】
本発明の悪性腫瘍の判定方法は、哺乳動物に由来するHOXB13遺伝子のメチル化を指標とするものであり、メチル化を受けたHOXB13遺伝子を有する被験者は悪性腫瘍、特に腎細胞癌に罹患している可能性が高いと判断することができる。特に本発明の判定方法は、HOXB13遺伝子の塩基配列の内、一つ以上のCpG配列中のシトシンのメチル化を指標として行なうことができる。特にCpG配列が密集する領域（CpGアイランド）におけるCpG配列のシトシンのメチル化を指標として行なうことが好ましい。
【００２１】
HOXB13遺伝子に存在する一つ以上のCpG配列を含む塩基配列としては、ヒト由来のHOXB13遺伝子（配列番号１）のexon １（配列番号１の26112〜26711番目）とその５’上流に位置するプロモーター領域（配列番号１の25691〜26111番目）を含む領域の塩基配列を挙げることができる。より具体的には、ヒト由来のHOXB13遺伝子の塩基配列（配列番号１）中、25691〜26711番目の領域の塩基配列があげられる。
【００２２】
配列番号１で示される塩基配列中に存在するCpG配列のシトシン、とりわけCpGアイランド中に存在するCpG配列のシトシンは、例えば、腎臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。HOXB13遺伝子において当該CpGアイランドは、HOXB13遺伝子の塩基配列（配列番号1）中、25736〜26111番目の領域である。当該領域は、HOXB13遺伝子のexon 1の開始コドンを塩基番号１とすると塩基番号-376〜-1の領域に該当する。当該領域の塩基配列を配列番号3に示す。
【００２３】
さらに具体的には、腎臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１で示される塩基配列において、上記CpGアイランド内に含まれる、25919番目、25932番目、25934番目、および25936番目のシトシンをあげることができる。
【００２４】
HOXB13遺伝子のメチル化頻度は、調査対象となるCpG中のシトシンのメチル化 の有無を複数のハプロイドについて調べたときの、当該シトシンがメチル化 されているハプロイドの割合で表すことができる。また、本発明の方法は、HOXB13遺伝子のメチル化頻度に代えて、またこれと並行して、HOXB13遺伝子のメチル化頻度と相関関係がある指標値（本発明においては「相関値」ともいう）を測定することによっても行うことができる。かかる相関値としては、例えばHOXB13遺伝子の発現量、より具体的には、当該遺伝子の転写産物の量（mRNA量）や当該遺伝子の翻訳産物の量（HOXB13タンパク質量）を挙げることができる。このようなHOXB13遺伝子のメチル化とその発現量との間には、上記HOXB13遺伝子のメチル化頻度が高くなればそれに伴い発現量が減少するといった負の相関関係が存在する。
【００２５】
本発明の方法は、具体的には哺乳動物から分離した生体試料であって、DNAを含む試料を対象として行うことができる。哺乳動物としては、実験動物として使用されるマウス、ラット、ウサギなどを挙げることもできるが、好ましくはヒトである。生体試料としては、例えば、腎癌細胞等の癌細胞若しくはそれを含む組織、及び、腎癌細胞等の癌細胞由来のDNAを含み得る細胞、それを含む組織（ここでの組織とは、血液、血漿、血清、リンパ液等の体液、リンパ節等を含む広義の意味で用いられる。）若しくは体分泌物（尿や乳汁等）等を挙げることができる。これらの生体試料はそのまま測定用の検体として用いてもよいし、また、かかる生体試料から分離、分画、固定化等の種々の操作により調製されたDNA含有画分を試料として用いてもよい。
【００２６】
測定に際しては、まずこれらの試料から、例えば市販のDNA抽出用キット等を用いてDNAを抽出する。例えば血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清を検体としてその中に含まれる遊離DNA（腎癌細胞由来のDNAが含まれる）を分析すると、血球由来のDNAを避けて腎癌細胞由来のDNAを解析することができる。
【００２７】
(Ｉ-１) 抽出されたDNAを、非メチル化シトシンを修飾する試薬（以下、「非メチル化シトシン修飾試薬」または単に「修飾試薬」という）と接触させた後、HOXB13遺伝子の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列中のシトシンを含むDNAを、解析対象とするシトシンのメチル化の有無を識別するプライマーを用いてPCR反応で増幅し、得られる増幅産物の量を調べる。
【００２８】
ここで、HOXB13遺伝子の塩基配列中に存在する一つ以上のCpG配列としては、前述するように、例えば配列番号1で示されるHOXB13遺伝子の25736〜26111番目に位置するCpGアイランドの塩基配列を挙げることができる。中でも好ましくは、配列番号1中の25837〜26075番目および25860〜26111番目を挙げることができる。
【００２９】
かかるCpGアイランド中に存在するCpG中のシトシンは、腎細胞癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化 状態（hypermethylation））を示す。
【００３０】
非メチル化シトシン修飾試薬としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム等の重亜硫酸塩（bisulfite）等を用いることができる。非メチル化シトシン修飾試薬に、抽出されたDNAを接触させるには、例えば、まず当該DNAをアルカリ溶液（pH9〜14）中で修飾試薬（溶液中の濃度：例えば、終濃度3M）で約10〜16時間程度、55℃で処理する。この場合、メチル化されていないシトシン（以下、「非メチル化シトシン」という）はウラシルに変換され、一方、メチル化されているシトシン（以下、「メチル化シトシン」という）はウラシルに変換されず、シトシンのままである。次いで、修飾試薬で処理されたDNAを鋳型とし、かつ、メチル化シトシンが含まれる場合の塩基配列（メチル化シトシン[CpG中のシトシン]はシトシンのままであり、非メチル化シトシン[CpGに含まれないシトシン]はウラシルとなった塩基配列）とかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列からそれぞれ選ばれる一対のメチル化特異的プライマーを用いるPCR（以下、「メチル化特異的PCR」とも称する。）と、修飾試薬で処理されたDNAを鋳型とし、かつ、シトシンがメチル化されていない場合の塩基配列（全てのシトシンがウラシルとなった塩基配列）とかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列からそれぞれ選ばれる一対の非メチル化特異的プライマーを用いるPCR（以下、「非メチル化特異的PCR」とも称する。）を行う。上記PCRにおいて、メチル化特異的プライマーを用いるPCRの場合（前者）には、解析対象とするシトシンがメチル化されているDNAが増幅され、一方、非メチル化特異的プライマーを用いるPCRの場合（後者）には、解析対象とするシトシンがメチル化されていないDNAが増幅される。これらいずれかの増幅産物の存在の有無により、対象となるシトシンのメチル化の有無を判定することができる。
【００３１】
ここで、メチル化特異的プライマーおよび非メチル化特異的プライマーは、非メチル化シトシンがウラシルに変換され、かつ、メチル化シトシンはウラシルに変換されないことを考慮して、おのおのメチル化シトシンを含む塩基配列および非メチル化シトシンを含む塩基配列に特異的なPCRプライマーとして設計される。非メチル化シトシン修飾試薬処理により化学的に変換され相補的ではなくなったDNA鎖を基に設計することから、元来二本鎖であったDNAのそれぞれの鎖を基に、それぞれからメチル化特異的プライマーと非メチル化特異的プライマーとを作成することもできる。かかるプライマーは、メチル、非メチルの特異性を高めるために、プライマーの3'末端近傍にCpG配列中のシトシンを含むように設計することが好ましい。また、解析を容易にするために、プライマーの一方を標識してもよい。
【００３２】
より具体的には、HOXB13遺伝子のメチル化の有無をPCRで判定するためのプライマーとしてはHOXB13遺伝子のプロモーター領域、特にCpGアイランド領域に存在するCpGのシトシンを１以上含む塩基配列を基にして、上記のようにして設計することができる。
【００３３】
例えば、配列番号1で示される塩基配列中に存在するCpGのシトシン、具体的には、配列番号1で示される塩基配列において25919番目、25932番目、25934番目及び25936番目に位置するシトシンを１以上含む塩基配列を基に設計することができる。かかるプライマーの例を以下に示す。
【００３４】
＜非メチル化特異的プライマー対＞
MSPU1F: TTTAGGTTGTAGTTAATTAGTGTGTGT（配列番号4）
MSPU1R: AAACCAAAAAAATCCAAAACATT（配列番号5）
MSPU2F: TTTAGGTTGTAGTTAATTAGTGT（配列番号6）
MSPU2R: AACCAAAAAAATCCAAAACATT（配列番号7）
MSPU3R: CCAAAAAAATCCAAAACATT（配列番号8）
なお、ここでMSPU1FとMSPU1R、MSPU2FとMSPU2R、およびMSPU1FとMSPU3Rは、それぞれ配列番号１の25911〜26040番目、25911〜26039番目、および25911〜26037番目の領域を増幅するためのプライマー対である。
【００３５】
＜メチル化特異的プライマー対＞
MSPM1F: GTCGTAGTTAATTAGCGCGC（配列番号9）
MSPM1R: AACCGAAAAAATCCAAAACGT（配列番号10）
MSPM2F: TAGGTCGTAGTTAATTAGCGC（配列番号11）
MSPM2R: ACCGAAAAAATCCAAAACGTT（配列番号12）
ここでMSPM1FとMSPM1R およびMSPM2FとMSPM2Rは、それぞれ配列番号１の25917〜26039番目および25914〜26038番目の領域を増幅するためのプライマー対である。
【００３６】
メチル化特異的PCRにおける反応液としては、例えば、鋳型とするDNA、各プライマー溶液、dNTP、10×緩衝液(例えば、100mM Tris-HCl pH8.3、500mM KCl、20mM MgCl2)、および耐熱性DNAポリメラーゼを混合し、これに滅菌超純水を加えた反応液をあげることができる。反応条件としては、例えば、前記のような反応液を、94℃にて10分間保温した後、94℃にて30秒間、次いで55〜65℃にて60秒間さらに72℃にて45秒間を１サイクルとする反応を30サイクル程度行う条件があげられる。かかるPCRを行った後、増幅産物の有無を比較する。例えば、電気泳動法（例えば、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動やアガロースゲル電気泳動）を用いる場合、電気泳動後のゲルをDNA染色して、メチル化特異的プライマーを用いたPCRと非メチル化特異的プライマーを用いたPCRで得られた各々の増幅産物のバンドを検出する。ここでDNA染色の代わりに予め標識されたプライマーを使用してその標識を指標としてバンドの有無を比較することもできる。また、定量を必要とする場合には、PCR反応産物をリアルタイムでモニタリングしカイネティックス分析を行うことにより、それぞれの産物の量を比較することもできる。かかる方法として、例えば、遺伝子量に関して２倍程度のほんのわずかな差異をも検出できる高精度の定量が可能なリアルタイムPCRを挙げることができる。リアルタイムPCRとしては、例えば鋳型依存性核酸ポリメラーゼプローブ等のプローブを用いる方法又はサイバーグリーン等のインターカレーターを用いる方法等が挙げられる。リアルタイムPCR法のための装置及びキットは既に市販されている。
【００３７】
以上（Ｉ-１）で説明した方法は、一般にメチル化 特異的PCRとして、Herman等(Herman et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA,93,9821-9826,1996)等により報告されている方法であり、この方法を一部修飾して使用することもできる。
【００３８】
（Ｉ-２）他の方法として、メチル化または非メチル化を問わず、まずHOXB13遺伝子の特定領域、好ましくはCpGアイランド領域をPCRで増幅し、その後増幅された配列を制限酵素で切断し、電気泳動により得られるバンドが１本かまたは２本に分かれるかによって診断することもできる。メチル化シトシンがある場合はバンドが２本に分かれる。
【００３９】
この方法で用いられる制限酵素は、メチル化されていないシトシン（非メチル化シトシン）を含む配列を非メチル化シトシン修飾試薬〔亜硫酸水素ナトリウム等の重亜硫酸塩(bisulfite)〕処理した後は認識せず、メチル化されたシトシンを含む認識配列だけを消化することのできる制限酵素であることが好ましい。CpGアイランドに含まれるシトシンがメチル化されていないDNAの場合、このような制限酵素を作用させても非メチル化シトシン修飾試薬処理後の当該DNAは切断されず、一方、認識配列に含まれるシトシンがメチル化されているDNAの場合、当該DNAは切断される。制限酵素の具体的な例としては、例えば、BstUI、TaqI等をあげることができる。好ましくはBstUIである。
【００４０】
当該制限酵素による消化の有無を調べる方法としては、例えば、HOXB13遺伝子の特定領域、好ましくはCpGアイランドのDNAを鋳型とし、解析対象とするシトシンを認識配列に含み、当該認識配列以外には前記制限酵素の認識配列を含まないDNAを増幅可能なプライマー対を用いてPCRを行い、増幅したDNA（増幅産物）を制限酵素処理して切断断片の有無を調べる方法をあげることができる。解析対象とするシトシンがメチル化されている場合には、切断断片が得られる。一方、解析対象とするシトシンがメチル化されていない場合には、切断断片が得られない。このようにして、切断されたDNA断片の量を比較することにより、解析対象となるシトシンのメチル化の程度を測定することができる。
【００４１】
例えば、配列番号１で示される塩基配列において25932番目、25934番目、および25936番目に示されるシトシンは、BstUIの認識配列に含まれているため、上記方法により当該シトシンのメチル化の程度を判定することができる。ここで使用されるプライマー対の例を以下に示す。
【００４２】
MIRC9-2のプライマー対
MIRC9-2F：GGGTAAAGTATTTTYGTAGTTTT（配列番号13）
MIRC9-2R：CCTTAACTCCATCCAAAATAAC（配列番号14）
MIRC9-3のプライマー対
MIRC9-3F：AGAGAGAGAGAGAGAATAAGT（配列番号15）  
MIRC9-3R：AAATCTAAAAAACACCCAACTC（配列番号16）
ここでMIRC9-2のプライマー対およびMIRC9-3のプライマー対による増幅領域は、それぞれ配列番号１の25860〜26151番目および25837〜26075番目の領域である。
【００４３】
また、当該制限酵素による消化の有無を調べる他の方法としては、例えば、解析対象とするシトシンを認識配列に含むメチル化感受性制限酵素を作用させたDNAに対して、HOXB13遺伝子に由来し、かつ、当該制限酵素の認識配列を含まないDNAをプローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズしたDNAの長さを調べる方法をあげることもできる。解析対象とするシトシンがメチル化されている場合には、当該シトシンがメチル化 されていない場合よりも長いDNAが検出される。検出された長いDNAの量と短いDNAの量とを比較することにより、解析対象となるシトシンのメチル化 の頻度を測定することができる。
【００４４】
（Ｉ-３）また別の方法として、生体試料から抽出したDNAを、非メチル化シトシン修飾試薬（亜硫酸水素ナトリウム等の重亜硫酸塩等）と接触させた後、HOXB13遺伝子の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGを含むDNAと、シトシンのメチル化の有無を識別可能なプローブとをハイブリダイゼーションさせ、当該プローブと上記DNAとの結合の有無を調べる方法を挙げることもできる。
【００４５】
当該ハイブリダイゼーションに用いられるプローブは、解析対象とするCpGのシトシンを含む塩基配列を基にして、メチル化を受けていないシトシンがウラシルに変換され、かつ、メチル化を受けているシトシンはウラシルに変換されないことを考慮して設計される。即ち、メチル化シトシンが含まれる塩基配列（メチル化シトシン[CpG中のシトシン]はシトシンのままであり、非メチル化シトシン[CpGに含まれないシトシン]はウラシルとなった塩基配列）またはこれに対して相補的な塩基配列を有するメチル化特異的プローブと、シトシンがメチル化されていない場合の塩基配列（全てのシトシンがウラシルとなった塩基配列）またはこれに対して相補的な塩基配列を有する非メチル化特異的プローブを設計する。尚、このようなプローブは、DNAとプローブとの結合の有無を容易に解析するために標識されていてもよい。またプローブは通常の方法に準じて担体上に固定して用いることもできる。
【００４６】
非メチル化シトシン修飾試薬に、DNAを接触させるには、例えば、まず当該DNAをアルカリ溶液（pH9〜14）で変性した後、当該修飾試薬（溶液中の濃度：例えば、終濃度3M）等で約10〜16時間（一晩）程度、55℃で処理する。反応を促進するため、95℃での変性と、50℃での反応を10-20回繰り返すことも出来る。この場合、非メチル化シトシンはウラシルに変換され、一方、メチル化シトシンはウラシルに変換されず、シトシンのままである。必要に応じて、非メチル化シトシン修飾試薬で処理されたDNAを鋳型として上記（Ｉ-１）の方法と同様にPCRを行うことにより当該DNAを予め増幅させておいてもよい。
【００４７】
次いで、非メチル化シトシン修飾試薬で処理されたDNA又は前記PCRで予め増幅されたDNAと、上記プローブとをハイブリダイゼーションする。ハイブリダイゼーションは、例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。ハイブリダイゼーションは、通常ストリンジェントな条件下に行われる。ここで「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、6×SSC（1.5M NaCl、0.15M クエン酸三ナトリウムを含む溶液を10×SSCとする）を含む溶液中で45℃にてハイブリッドを形成させた後、2×SSCで50℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、2×SSCで50℃の条件（低ストリンジェンシーな条件）から0.2×SSCで50℃までの条件（高ストリンジェントな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェントな条件）から65℃（高ストリンジェントな条件）から選択することができる。また、塩濃度と温度との両方を変えることもできる。
【００４８】
かかるハイブリダイゼーションを行った後、メチル化特異的プローブと結合したDNAの量と、非メチル化特異的プローブと結合したDNAの量とを比較することにより、解析対象となるシトシン（即ち、プローブの設計の基となった塩基配列に含まれるCpG中のシトシン）のメチル化の頻度を測定することができる。
【００４９】
より具体的には、HOXB13遺伝子のメチル化頻度を測定するためのプローブは、例えば、HOXB13遺伝子のプロモーター領域、特にCpGアイランドにある塩基配列内に存在するCpGのシトシンを１以上含む塩基配列を基にして設計することができる。例えば、配列番号１で示される塩基配列中に存在するCpG中のシトシン、具体的には、配列番号１で示される塩基配列において25919番目、25932番目、25934番目、25936番目のシトシンを１以上含む塩基配列を基に設計することができる。かかるプローブの例を以下に示す。
【００５０】
＜セット１＞
非メチル化特異的プローブ：ACACACACTAATTAACTACAACCTAAA（配列番号17）
メチル化特異的プローブ：GCGCGCTAATTAACTACGAC（配列番号18）
上記非メチル化特異的プローブは、前記非メチル化特異的プライマー対（MSPU1FとMSPU1Rのセット）で増幅される領域を、また上記メチル化特異的プローブは、前記メチル化特異的プライマー対（MSPM1FとMSPM1Rのセット）で増幅される領域を、それぞれ認識するプローブである。
【００５１】
＜セット２＞
非メチル化特異的プローブ：ACACTAATTAACTACAACCTAAA（配列番号19）
メチル化特異的プローブ：GCGCTAATTAACTACGACCTA（配列番号20）。
【００５２】
上記非メチル化特異的プローブは、前記非メチル化特異的プライマー対（MSPU2FとMSPU2Rのセット）で増幅される領域を、また上記メチル化特異的プローブは、前記メチル化特異的プライマー対（MSPM2FとMSPM2Rのセット）で増幅される領域を、それぞれ認識するプローブである。
【００５３】
（Ｉ-４）メチル化頻度を決定する他の方法としては、非メチル化シトシン修飾試薬（亜硫酸水素ナトリウム等）で処理したDNAを用い、HOXB13遺伝子の特定領域、好ましくは特定のCpGアイランド領域をPCRで増幅後、TAクローニング法によりクローンを作製し、その増幅断片の塩基配列をシークエンスして決定する方法を挙げることができる。これにより当該増幅領域に含まれる全てのCpG配列についてメチル化/非メチル化を識別することができ、またメチル化頻度を測定することができる。
【００５４】
（II） 悪性腫瘍の程度の判定方法
本発明の判定方法は、上記方法によって測定されるHOXB13遺伝子のメチル化頻度は、悪性腫瘍、特に腎細胞癌の程度の進展に従って増加し、両者に正の相関関係があるという知見に基づいて設計されたものである。
【００５５】
本発明の判定方法は、下記の工程を有することを特徴とする：
（１）哺乳動物のHOXB13遺伝子のメチル化頻度またはその相関値を測定する工程、
（２）測定されたメチル化頻度またはその相関値を、対照とする健常哺乳動物のHOXB13遺伝子のメチル化頻度またはその相関値と対比する工程、および
（３）上記対比した結果に基づいて、被験哺乳動物の悪性腫瘍の程度を評価する工程。
【００５６】
上記第１工程において、哺乳動物、好ましくはヒトのHOXB13遺伝子のメチル化頻度またはその相関値を測定する方法は、（Ｉ)に記載する方法に従って行うことができる。第２工程では、第１工程で測定されたメチル化頻度またはその相関値〔メチル化頻度に相関関係がある指標値（例えば、発現産物の量）〕と、腎癌細胞等の癌細胞を持たないと診断される健常な哺乳動物由来の検体に含まれるHOXB13遺伝子のメチル化頻度またはその相関値（対照）とを比較して、当該比較により得られる差異に基づき前記検体の悪性腫瘍度を判定する。仮に、哺乳動物由来の検体に含まれるHOXB13遺伝子のメチル化頻度やその相関値が対照と比較して高ければ（HOXB13遺伝子が対照と比較の上で高メチル化状態であれば）、当該検体の悪性腫瘍度が対照と比較の上で高いと判定することができる。
【００５７】
ここで「悪性腫瘍度」とは、一般に当該分野において使用される意味と同様であって、具体的には、例えば、哺乳動物由来の検体が細胞である場合には当該細胞の悪性度を意味し、また、例えば、哺乳動物由来の検体が組織である場合には当該組織における癌細胞の存在量等を意味している。
【００５８】
本発明の判定の第１工程において、哺乳動物由来の検体に含まれるHOXB13遺伝子のメチル化頻度に相関関係がある指標値を測定する方法としては、例えば、HOXB13遺伝子の転写産物であるmRNAの量を測定する方法をあげることができる。当該測定には、例えば、RT−PCR法、ノーザンブロット法〔Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory（1989）〕、in situ RT−PCR法〔Nucleic Acids Res.,21,3159−3166（1993）〕、in situハイブリダイゼーション法、NASBA法〔Nucleic acid sequence−based amplification,nature,350,91−92（1991）〕等の公知な方法を用いることができる。哺乳動物由来の検体に含まれるHOXB13遺伝子の転写産物であるmRNAを含む試料は、通常の方法に準じて当該検体から抽出、精製等により調製すればよい。
【００５９】
調製された試料中に含まれるmRNAの量を測定するためにノーザンブロット法が用いられる場合には、検出用プローブはHOXB13遺伝子又はその一部（HOXB13遺伝子の制限酵素切断、HOXB13遺伝子の塩基配列に従い化学合成した約100bp〜約1000bp程度のオリゴまたはポリヌクレオチド等）を含むものであればよく、前記試料中に含まれるmRNAとのハイブリダイゼーションにおいて用いられる検出条件下に検出可能な特異性を与えるものであれば特に制限はない。
【００６０】
また調製された試料中に含まれるmRNAの量を測定するためにRT-PCR法が用いられる場合には、使用されるプライマーは、HOXB13遺伝子のみを特異的に増幅できるものであればよく、その増幅する領域や塩基長等には特に制限はない。かかるプライマーとしては、例えば、以下に示すプライマー（Ｓ:sense、Ａ:antisense）等をあげることができる。
Ｓ:5'-TTGCCTGTGGACAGTTACC-3’（配列番号21）（配列番号１の26601〜26619番目の領域に相当）
Ａ:5'-AACTTGTTAGCCGCATACTC-3'（配列番号22）（配列番号1の27760〜27779番目の領域に相当）。
【００６１】
これらのプライマーを用いて後述の実験例に示すようにしてRT-PCR法による転写産物の量を測定することもできる。定量を必要とする場合にはリアルタイムPCRを用いて、それぞれの産物の量を比較することもできる。
【００６２】
また本発明の判定方法の第１工程において、哺乳動物由来の検体に含まれるHOXB13遺伝子のメチル化頻度に相関関係がある指標値を測定する他の方法としては、例えば、HOXB13遺伝子の翻訳産物であるHOXB13（タンパク質）の量を測定する方法をあげることができる。当該測定には、例えば、HOXB13またはその部分ペプチドに対する特異的抗体（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体）を用いたイムノブロット法、免疫沈降による分離法、間接競合阻害法（ELISA法）等の公知な方法を用いればよい（例えば、細胞工学ハンドブック、羊土社、207(1992)等参照）。HOXB13またはその部分ペプチドに対する特異的抗体は、当該タンパク質などを免疫抗原として用いる通常の免疫学的な方法に準じて製造することができる。具体的には、免疫抗原として使用されるHOXB13の部分ペプチドの例としては、実験例５で使用される、ヒトHOXB13のアミノ酸配列（配列番号２）の268〜281番目に相当する14アミノ酸配列からなるペプチド〔RVKEKKVLAKVKNS：（配列番号23）〕、または当該アミノ酸配列を含むペプチドを挙げることができる。
【００６３】
（III） 悪性腫瘍の判定用診断薬
前述する本発明の悪性腫瘍およびその程度の判定方法において、HOXB13遺伝子のメチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値を測定するために使用し得るプライマー、プローブ又はHOXB13に対する特異的抗体は、哺乳動物、好ましくはヒト腎細胞癌などの悪性腫瘍の検出用試薬（診断薬）として有用である。本発明は、これらのプライマー、プローブ又は特異的抗体のいずれか少なくとも一つを試薬として含有する腎癌細胞等の癌細胞の検出用キットや、これらプライマー、プローブ又は特異的抗体等が担体上に固定化されてなる腎癌細胞等の癌細胞の検出用チップも提供するものである。これらのプライマー、プローブ又は特異的抗体として、具体的には上記（Ｉ）、（II）および下記の実験例に記載のものを挙げることができる。
【００６４】
（IV）抗腫瘍剤
HOXB13遺伝子の発現は、健常な哺乳動物由来の細胞や組織等の検体よりも腎癌細胞等の癌細胞において低い。また、HOXB13遺伝子に係るDNAメチル化を阻害する物質を腎癌細胞等の癌細胞に作用させることにより、当該遺伝子の発現産物の量を増加させることができる。また、後述する実験例に示すように、HOXB13遺伝子を発現しない高度メチル化腎癌細胞株に外来性のHOXB13遺伝子を発現させることにより腎癌細胞の増殖が抑制され、アポトーシスが誘導されることを確認した。これらの知見はHOXB13遺伝子又はHOXB13タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるcDNAがヒト腎細胞癌において癌抑制遺伝子として働き、腎臓癌等の悪性腫瘍の治療や腎臓等の正常組織の癌化抑制に有効な抗腫瘍物質として有用であることを示唆するものである。また、同様にHOXB13遺伝子のメチル化頻度を低下させる物質やHOXB13遺伝子に係るDNAメチル化を阻害する物質など、HOXB13タンパク質の発現量を増大させることができる物質は、腎臓癌等の悪性腫瘍の治療や腎臓等の正常組織の癌化抑制に有効な抗腫瘍物質として有用であると考えられる。
【００６５】
従って本発明は、有効成分として、HOXB13タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNAを含む抗腫瘍剤（抗悪性腫瘍剤、抗癌剤）を提供する。当該DNAは、HOXB13遺伝子そのものであってもよいし、またHOXB13（タンパク質）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を発現可能な状態で含むDNA（例えば、ベクターDNAなど）であってもよい。本発明の抗腫瘍剤は、その有効量を非経口的にヒト等の哺乳動物（例えば、悪性腫瘍であると診断されうる哺乳動物の体内にある細胞、好ましくは腎細胞）に対し投与することができる。例えば、非経口的に投与する方法としては、例えば、注射（皮下、静脈内、局所）等を挙げることができる。
【００６６】
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明の抗腫瘍剤の種類、投与形態等によって異なるが、通常は、患者細胞において有効成分が細胞内で有効に働くような濃度レベルと等しい細胞内レベルをもたらす有効成分量を投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回又は数回に分けて投与することができる。
【００６７】
ここで、HOXB13遺伝子を細胞に導入する方法としては、ウイルスベクターを利用した遺伝子導入方法、非ウイルス性ベクターを利用した遺伝子導入方法（日経サイエンス,1994年4月号,20-45頁、実験医学増刊,12(15)(1994)、実験医学別冊「遺伝子治療の基礎技術」,羊土社（1996））等の方法をあげることができる。前者の遺伝子導入方法としては、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のDNAウイルス又はＲＮＡウイルスに、HOXB13又は変異HOXB13をコードするDNAを組み込んで導入する方法等があげられる。また非ウイルス性ベクターを利用した遺伝子導入方法としては、例えば、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（DNAワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等があげられる。
【００６８】
また、HOXB13遺伝子のDNAを抗腫瘍剤としての遺伝子治療剤の有効成分として利用する方法としては、当該遺伝子のDNAを直接体内に導入するin vivo法、ヒトから特定な細胞を取り出し体外で当該遺伝子のDNAを当該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すex vivo法（日経サイエンス,1994年4月号,20-45頁、月刊薬事,36(1),23-48（1994）、実験医学増刊,12(15)(1994)）等をあげることができる。
【００６９】
前者のin vivo法の場合には、前記遺伝子のDNAが疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、腎臓癌細胞、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に注射により投与することができる。前記抗腫瘍剤としての遺伝子治療剤の剤型としては、注射剤、他には懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤とすることもできる。このような製剤は、薬学的に許容される、例えば、水溶性溶剤、非水溶性溶剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤、安定剤等の担体に前記遺伝子（ベクター型もしくはウィルス型、又はプラスミド型の前記遺伝子の形態を含む）を配合することにより製造することができる。必要に応じて、防腐剤、懸濁化剤、乳化剤等の補助剤を添加してもよい。また、非経口的に投与する場合（一般的には注射等が好ましい。）には、当該抗腫瘍剤を溶液等の通常の液剤の形態で使用することができる。
【００７０】
（Ｖ）スクリーニング方法
前述するようにHOXB13遺伝子のメチル化を阻害する物質を腎癌細胞等の癌細胞に作用させることにより、当該遺伝子の発現産物の量を増加させることができ、またHOXB13遺伝子を発現しない高度メチル化腎癌細胞株に外来性のHOXB13遺伝子を発現させることにより腎癌細胞の増殖が抑制される。これらの知見は、腎癌細胞等の癌細胞におけるHOXB13遺伝子の発現レベルの低下又はそれに伴う機能低下を補うことのできる物質、例えば非メチル化（又は、癌で認められるようなメチル化 異常を起こしていない）HOXB13遺伝子、当該遺伝子の発現産物、当該遺伝子の発現を促進する能力を有する物質（例えば、HOXB13遺伝子のメチル化を阻害する物質、HOXB13遺伝子のメチル化頻度を低下させる物質等）は、腎臓癌等の悪性腫瘍の治療や、腎臓等の正常組織の癌化抑制に有用であることを意味している。
【００７１】
そこで本発明は、かかる知見に基づいて腎臓癌等の悪性腫瘍の治療や腎臓等の正常組織の癌化抑制に有用な抗腫瘍物質を探索する方法（スクリーニング方法）を提供する。本発明のスクリーニング方法は下記の工程を有することを特徴とする：
（ａ）HOXB13遺伝子のCpGアイランドのメチル化に起因してHOXB13遺伝子の発現が抑制されている腎癌細胞に対して、被験物質を接触させる工程、
（ｂ）上記腎癌細胞におけるHOXB13遺伝子の発現量を測定し、被験物質を接触させない上記腎癌細胞のHOXB13遺伝子の発現量（対照発現量）と対比する工程、および
（ｃ）対照発現量に比してHOXB13遺伝子の発現量が増加した腎癌細胞に接触させた被験物質を、腎細胞癌に対する抗腫瘍物質として選別する工程。
【００７２】
本発明探索方法の第（ａ）工程で使用される腎癌細胞としては、哺乳動物由来の腎臓癌組織から分離された癌細胞であってもよいし、またセルラインとして確立された哺乳動物由来の腎癌細胞株であってもよい。前記哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター等をあげることができる。具体的には、例えば、実験例で使用した786-O、UMRC-6、KC-12、ACHN、A498、OUR-10、OUR-20、VHL-renal、YCR、Caki-1、Caki-2、SKRC-1、SKRC-7、TUHR4TKB、TUHR14TKB等のヒト由来の腎臓癌細胞株をあげることができる。なお、これらの細胞株のうち、786-O, ACHN, A498, Caki-1, Caki-2（以上、ATCC）, TUHR4TKBおよびTUHR14TKB（以上、RIKEN CELL BANK）は市販されており商業的に入手することができる。
【００７３】
第（ａ）工程で使用される腎癌細胞は、HOXB13遺伝子の欠失（特に、ホモタイプの欠失）は認められないが、HOXB13遺伝子のCpGアイランドのメチル化に起因して当該遺伝子の発現量が抑制されている腎臓癌細胞株である。これらの細胞株の取得は、常法に従い行うことができる。例えば、少なくとも、HOXB13遺伝子の欠失（好適にはホモタイプの欠失）が認められないことを、例えばＣＧＨ法やＦＩＳＨ法で確認された腎臓癌細胞の中から、既存の脱メチル化試薬（例えば、5-アザデオキシシチジン）を作用させることにより、HOXB13遺伝子のレベルが回復する細胞を選択して、これを継代して、所望する「HOXB13遺伝子のCpGアイランドのメチル化に起因してHOXB13遺伝子の発現が抑制されている腎臓癌細胞株」（以下、メチル化癌細胞株ともいう）として取得することができる。
【００７４】
被験物質としては、制限はされないが、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物、または無機化合物などを挙げることができ、スクリーニングは、これらの被験物質またはこれらを含む組成物（例えば、細胞抽出物、遺伝子ライブラリーの発現産物等を含む）を、前述するHOXB13遺伝子のCpGアイランドのメチル化に起因してHOXB13遺伝子の発現が抑制されている腎癌細胞と接触させることにより行うことができる。
【００７５】
本発明の第ａ工程において腎癌細胞に被験物質を接触させるための環境としては、腎癌 細胞の生命活動を維持させるような環境が好ましく、例えば、当該癌細胞のエネルギー源が共存するような環境をあげることができる。具体的には、培地中で第（ａ）工程が行なわれることが好都合である。腎癌細胞の量としては、通常約10４〜10８細胞あればよく、約10５〜10７細胞が好ましい。また被験物質の濃度としては、通常約0．1ng／ml〜約100μg/mlであればよい。腎癌細胞に被験物質を接触させる時間は、通常１時間以上5日程度である。腎癌細胞に被験物質を接触させる回数は、一回であってもよいし、複数回であってもよい。
【００７６】
本発明方法の第（ｂ）工程において腎癌細胞におけるHOXB13遺伝子の発現量を測定するには、前述したHOXB13遺伝子のメチル化頻度に相関関係がある指標値（相関値）を測定する方法に準じて測定すればよい。具体的には、リアルタイムRT-PCR法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、DNAチップ法等のmRNAを定量する方法、好適にはリアルタイムRT-PCR法を挙げることができる。
【００７７】
本発明の第（ｂ）工程において、被験物質を接触した腎癌細胞のHOXB13発現量と、被験物質を接触させない腎癌細胞のHOXB13発現量（対照のHOXB13発現量）との対比が行われる。第（ｃ）工程では、当該第（ｂ）工程での対比の結果、各被験物質についてHOXB13遺伝子の発現を促進する能力が判定される。この場合、被験物質を接触させた腎癌細胞のHOXB13発現量が対照のHOXB13発現量と比較して高ければ、当該被験物質はHOXB13遺伝子の発現を促進する能力を有すると判定することができる。なお、対照として、腎癌細胞に予めHOXB13遺伝子の発現を促進する能力が判っている他の被験物質を接触させた際のHOXB13遺伝子の発現量を用いてもよい。
【００７８】
尚、バックグランド又はコントロールとして、正常腎臓細胞株等の正常細胞株や、腎臓癌細胞等の癌細胞を持たないと診断され得る健常な哺乳動物由来の検体に含まれるHOXB13遺伝子の発現量を、被験物質を接触させた場合及び接触させない場合の両者において測定することが好ましい。
【００７９】
斯くしてHOXB13遺伝子の発現を増大させた被験物質を、腎臓癌の抗腫瘍物質の候補物質として選別することができる。上記スクリーニングで選別された物質は、腎臓癌等の悪性腫瘍の治療や腎臓等の正常組織の癌化抑制に有用な医薬組成物の有効成分として使用することが可能である。
【００８０】
上記のスクリーニング方法によって選別された候補物質は、さらに腎臓癌を有する病態非ヒト動物を用いた薬効試験、安全性試験、さらに腎臓癌患者（ヒト）もしくはその前状態にある患者（ヒト）への臨床試験に供してもよく、これらの試験を実施することによって、より実用的な抗腫瘍物質、ならびに腎臓癌等の悪性腫瘍の治療や腎臓等の正常組織の癌化抑制に有用な医薬組成物の有効成分を選別取得することができる。
【００８１】
このようにして選別された物質は、必要に応じて構造解析を行った後、その物質の種類に応じて、化学的合成、生物学的合成（発酵を含む）または遺伝子工学的操作によって、工業的に製造することができ医薬組成物の調製に使用することができる。
【実施例】
【００８２】
以下に、本発明の構成ならびに効果をより明確にするために、実験例及び実施例を記載する。但し、本発明は、これらの実施例等に何ら影響されるものではない。
【００８３】
実験材料とその調製 
以下の実験には、下記の17のヒト腎細胞癌細胞株を用いた：KMRC-1およびKMRC-2（発明者が作成）, 786-O, UMRC-6 〔the National Cancer Institute-Frederick Cancer Research and Development Center（Frederick, MD, USA）のDr. B. Zbarより供与〕, KC-12, ACHN, A498, OUR-10, OUR-20, VHL-renal, YCR, Caki-1, Caki-2〔横浜市立大学泌尿器科より供与〕, SKRC-1およびSKRC-7〔近畿大学のDr H Uemuraより供与〕, TUHR4TKBおよびTUHR14TKB（RIKEN CELL BANKより入手）。
【００８４】
56例の原発性腎細胞癌とその隣接正常組織サンプルは全て日本人腎細胞癌患者より患者の同意を得て手術切除物から取得した(以下、case 1-68と表記)。全ての原発性腎細胞癌は腎癌取扱い規約 (Kanehara Company, 1999)にしたがって病理学的判定をおこなった。
【００８５】
ゲノムDNAは、細胞株および組織サンプルより標準的なフェノール/クロロホルム法により抽出した。
【００８６】
実験例１  腎細胞癌におけるメチル化CpGアイランドの同定
腎細胞癌においてメチル化しているCpGアイランドを同定するためにMethylated CpG island amplification/representational difference analysis (MCA/RDA)法を用いた。MCA/RDAはToyotaらの方法に若干の修整を加えておこなった (Toyota M, et al., (1999). Cancer Res., 59, 2307-2312；Ueki T, et al., (2001). Cancer Res., 61, 8540-8546)。概要を以下に示す。
【００８７】
5μgのDNAを100 unitsのSmaI (New England Biolabs, Beverly, MA)で切断した後、20 unitsのXmaI (New England Biolabs)で切断した。RMCA PCR アダプターは、RMCA12 (5’-CCGGGCAGAAAG-3’：配列番号24)とRMCA24 (5’-CCACCGCCATCCGAGCCTTTCTGC-3’：配列番号25)を65℃で２分間インキュベートした後、室温まで冷却して作製した。制限酵素処理断片(0.5μg)を 0.5 nmolのこのRMCA PCRアダプターにT4 DNAリガーゼ (TAKARA, Tokyo, Japan)を用いてライゲートした後、3μlの各ligation mixをPCR増幅に供した。反応液は16.6 mM Tris-HCl (pH 8.0), 4 mM MgCl2, 166 mM (NH4)2SO4, 0.1 mg/ml BSA, 5% v/v DMSO, 300μMの各deoxynucleotide triphosphate, 200 pmolのf RMCA24プライマーおよび15 unitsのTaq ポリメラーゼ(TAKARA)を含む全量200μlである。反応液を72℃で5分間インキュベートした後、95℃を1 分、77℃を3分の反応を25サイクルして、final extensionは 72℃で10分間おこなった。
【００８８】
representational difference analysis（RDA）にはKMRC-1 あるいはKMRC-2のどちらかの腎癌細胞株に由来するMCAアンプリコンをテスターとして用い、4人の別個の患者(男性2人、女性2人)の正常腎組織から得たDNAの混合物から得られたMCA アンプリコンをドライバーとして用いた。JMCA PCRアダプターを１回めのRDAに、NMCA PCRアダプターを２回目のRDAに用いた。
【００８９】
JMCAとNMCAのためのプラーマーはつぎのとおりである：
JMCA 用プライマー
JMCA24： 5’-GTGAGGGTCGGATCTGGCTGGCTC-3’（配列番号26）
JMCA12： 5’-CCGGGAGCCAGC-3’（配列番号27）
NMCA 用プライマー
NMCA24： 5’-GTTAGCGGACACAGGGCGGGTCAC-3’（配列番号28）
NMCA12： 5’-CCGGGTGACCCG-3’ （配列番号29）。
【００９０】
１回目と２回目の競合的ハイブリダーゼーションには、それぞれのアダプターにライゲートした500および100ngのテスター・アンプリコンを用いた。2回目の競合的ハイブリダーゼーションと選択的PCR増幅の後、RDA生成物は pBluescript II plasmid vector (Stratagene, La Jolla, CA)にクローン化された。単離したクローンのDNAシークエンスはABI 3100 automated DNA sequencerとBigDye Terminator cycle sequencing kit ver.3 (Applied Biosystems, Foster City, CA)およびMT-T3 primer (SIGMA, St. Louis, MO)を用いて決定した。既知の配列とのホモロジー・サーチはBLASTプログラム(National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)を用いて行った。CpG アイランド領域はCpG island Searcher (http://cpgislands.usc.edu/)を用いて決定した。
【００９１】
表1に、CpGアイランドに関する基準(i.e. length > 200 bp, GC content > 50%, ObsCpG/ExpCpG > 0.6) (Gardiner-Garden M and Frommer M. (1987). J. Mol. Biol., 196, 261-282）を満たすCpG配列を含み、かつ特異的メチル化が検出された４つのクローン（MIRC8、MIRC9、MIRC11、MIRC17）を示す。
【００９２】
【表１】
2007267700.tif 000002
【００９３】
BLASTサーチにより、４つのクローンのうちMIRC9が染色体17q21.2に位置するHOXB13遺伝子の5’領域であることが同定された(GenBank accession no. U57052)。図１ａに単離されたMIRC9クローンとHOXB13遺伝子のCpGアイランドとの関係を示す。CpGアイランドの2塩基対の位置は垂直線で、HOXB13遺伝子のエクソンはボックスで示す（Exon 1、Exon 2）。COBRAにより分析した領域は水平の実線で、Bisulfite sequencingにより分析した領域は水平の破線で示す。この結果から、HOXB13遺伝子の5’領域のDNAメチル化により、HOXB13遺伝子が不活化し、腎細胞癌の発達に関与しているものと考えられた。
【００９４】
実験例２    HOXB13遺伝子メチル化のCOBRA法による解析
実験例１で見つかった原発性腎細胞癌におけるHOXB13遺伝子のメチル化を、combined bisulfite restriction analysis（COBRA法）により原発腎細胞癌56症例とそれらの隣接正常組織サンプルで調べた。
【００９５】
具体的には、腎癌細胞株、原発性腫瘍および隣接正常組織から得たゲノムDNAを亜硫酸水素ナトリウム処理(Clark et al., (1994). Nucleic Acids Res., 22, 2990-2997)に供し、次いでCOBRAを、先に報告された方法(Xiong Z et al., (1997). Nucleic Acids Res., 25, 2532-2534)に従っておこなった。概要は以下のとおりである。
【００９６】
2μlの亜硫酸水素処理DNA溶液を 67 mM Tris-HCl (pH 8.8), 16.6 mM (NH4)2SO4, 6.7mM MgCl2, 10mM β-メルカプトエタノール, 2.5 mMの各dNTP 混合物, 0.5 μMの各プライマー, および1 unitのEx Taq Hot Start Version polymerase (TAKARA)を含む50μlの反応液中で増幅した。増幅産物(15-20μl)をメチル化に起因して得られるCpG部位配列を認識する制限酵素を用いて切断した。
【００９７】
HOXB13用に用いたプライマー対は以下のとおりである: 
MIRC9-2のプライマー対
MIRC9-2F： 5’-GGGTAAAGTATTTTYGTAGTTTT-3’（配列番号13）
MIRC9-2R：5’-CCTTAACTCCATCCAAAATAAC-3’ （配列番号14）
MIRC9-3のプライマー対
MIRC9-3F：5’-AGAGAGAGAGAGAGAATAAGT-3’（配列番号15）
MIRC9-3R：5’-AAATCTAAAAAACACCCAACTC-3’ （配列番号16）
PCRは、MIRC9-2のプライマー対を用いた場合、94℃で3 分間反応させた後、引き続き94℃で40秒間、60℃で30秒間および72℃で30秒間の反応を35サイクル、またMIRC9-3のプライマー対を用いた場合、94℃で3 分間反応させた後、引き続き94℃で40秒間、58℃で30秒間および72℃で30秒間の反応を35サイクル行った。HOXB13用に制限酵素としてBstUI (New England Biolabs)を使用した。他の遺伝子(p14ARF, p15INK4B, p16INK4A, CHFR, CACNA1G, TMS1, BNIP3, COX-2, hMLH1, DAPK, DCC, MINT1, MINT2)についても同様にCOBRAを行った。その際に用いたプライマー配列、PCR条件、制限酵素は先に報告されたとおりである (Ogi et al.,(2002) Clin Cancer Res., 8, 3164-3171; Satoh A, et al.,(2003) Cancer Res., 63, 8606-8613; Terasawa et al., (2004). Clin Cancer Res., 10, 2000-2006； Kikuchi et al.,(2002). Int J Cancer, 97, 272-277)。得られたDNA断片を、2.5％ 寒天ゲルで電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色した。
【００９８】
原発性腎細胞癌腫瘍組織（Primary RCC）におけるHOXB13遺伝子メチル化のCOBRA法による解析結果を図１ｂに示す（PCR用プライマーとしてMIRC9-3セットを使用）。図１ｂ中の符号は、N=正常腎組織、T=原発性癌、U=非メチル化断片、M=メチル化断片を示す。HOXB13の腫瘍特異的な異常メチル化は原発性腎細胞癌56例中17例（30％）で検出された。図１ｂに示すように、HOXB13は原発性腎細胞癌でメチル化しているが、その隣接正常腎組織サンプルではメチル化は検出されなかった。
【００９９】
腎細胞癌におけるHOXB13のメチル化をさらに詳細に調べるため、15種類の腎癌細胞株（786-O、UMRC-6、KC-12、ACHN、A498、OUR-10、OUR-20、VHL-renal、YCR、Caki-1、Caki-2、SKRC-1、SKRC-7、TUHR4TKB、TUHR14TKB）をCOBRA法により解析した（PCR用プライマーとしてMIRC9-3セットを使用）。結果を図２ａに示すが、それらのうち11種類（73％）にHOXB13の異常メチル化が検出された。図２ａ中の符号は、U=非メチル化断片、M=メチル化断片を示す。UMRC-6、KC-12、VHL-renalおよびSKRC-7の4種の腎癌細胞株ではHOXB13の上流域はほぼ完全にメチル化されており、一方、他の7種の腎癌細胞株(786-O, A498, Caki-1, Caki-2, SKRC-1, TUHR4TKB, TUHR14TKB)では部分的にメチル化がみられた。
【０１００】
これらの結果から、腎細胞癌および腎癌細胞株にはいずれも特異的なメチル化が高頻度に認められた。
【０１０１】
実験例３  HOXB13遺伝子メチル化のBisulfite sequencing法による解析
HOXB13遺伝子の上流領域におけるメチル化の範囲をあきらかにするため、HOXB13遺伝子のメチル化が検出された原発性腎細胞癌のサンプルを、それらの隣接正常組織サンプルとともにBisulfite sequencing法による解析に供した。
【０１０２】
亜硫酸水素-PCR生成物のシークエンスは、MIRC9-3FとMIRC9-2R プライマーを用いて増幅したフラグメントを、pGEM-T Easy Vector Systems (Promega, Madison, WI)を用いてpGEM-T Easy vectorにクローン化して決定した。各原発性腎細胞癌サンプルあるいは腎癌細胞株について、少なくとも10クローンのシークエンスを行った。DNA シークエンスはBigDye Terminator cycle sequencing kit ver.1.1 (Applied Biosystems) およびABI 3100 automated DNA sequencerを用いて決定した。
【０１０３】
決定した原発性腎細胞癌腫瘍組織におけるHOXB13遺伝子の癌特異的メチル化CpGサイトを図１ｃに示す。具体的には、図１ｃは、HOXB13メチル化を示す原発性腎細胞癌サンプル（Tumor）とその対をなす正常腎組織サンプル（Normal kidney tissue）のHOXB13 bisulfite sequencingの結果を示す。図中、「Case 5」,「Case 33」,「Case 34」とは症例番号を示す。PCR産物をベクターにクローン化し、それぞれのサンプルについて少なくとも10クローンのシークエンスをおこなった。分析したCpG部位は垂直線で図の上部に示し、左から1〜22の番号で表示している。メチル化の割合が50〜100％の場合を黒、20〜50％の場合を斜線、0〜20％の場合を白で示す。COBRA法による解析をおこなったBstUI制限酵素認識部位の位置を垂直矢印で示す。COBRA法ではCpG部位＃３と＃４、あるいは＃４と＃５が対でメチル化された場合のみ検出される。図１ｃから、これらの部位は腫瘍サンプルでのみメチル化されていることがわかる。この結果から、BstUI制限酵素を用いたCOBRA法で示されたCpG部位の腫瘍特異的なメチル化がBisulfite sequencing法でも確認された。それに加えて、癌由来サンプルでは他のCpGアイランドもメチル化傾向が増大することが示された。 
【０１０４】
腎細胞癌細胞株における各CpG部位のメチル化状態を確認するため、２種の高度メチル化腎癌細胞株(UMRC-6, SKRC-7)、部分メチル化腎癌細胞株(TUHR4TKB)、非メチル化腎癌細胞株(ACHN)についても、Bisulfite sequencingに供し、HOXB13遺伝子5’領域の癌特異的メチル化CpGサイトを調べた。具体的には、PCR産物をベクターにクローン化し、少なくとも11クローンのシークエンスをそれぞれの細胞株についておこなった。結果を図２ｂに示す。黒丸はメチル化、白丸は非メチル化CpG部位をそれぞれ示す。HOXB13遺伝子の5’領域におけるCpG部位の分布は上部に垂直線で示す。翻訳開始部位は水平矢印で上部に示す。この結果、高度メチル化腎癌細胞株は２つとも分析された全てのCpG部位が稠密にメチル化していた。対照的に、非メチル化腎癌細胞株は全ての領域がほとんどメチル化しておらず、部分メチル化腎癌細胞株は中程度のメチル化状態を示した。以上のことから、腎癌細胞株においてHOXB13遺伝子が特異的にメチル化していることが示された。
【０１０５】
実験例４    HOXB13遺伝子のRT-PCR法による発現解析
ヒト成人とマウスの正常前立腺と結腸組織でHOXB13遺伝子は豊富に発現していることが報告されている(Sreenath et al., (1999). Prostate, 41, 203-207；Jung C, et al., (2004). Cancer res., 64, 9185-9192)。多様なヒト正常組織〔肝臓（Liver）、腎臓（Kidney）、前立腺（Prostate）、精巣（Testis）、副腎（Adrenal gland）、子宮（Uterus）、胎盤（Placenta）、脊髄（Spinal cord）、肺（Lung）、心臓（Heart）、骨格筋（Skeletal muscle）、甲状腺（Thyroid gland）、胸腺（Thymus）、骨髄（Bone marrow）、全脳（Brain，whole）、小脳（Brain，cerebellum）〕におけるHOXB13発現を、RT-PCRで解析した。結果を図３ａに示す。RT-PCR解析によりHOXB13遺伝子が前立腺に加えて正常腎臓、精巣、子宮、胎盤、胸腺でも発現していることがあきらかになった。
【０１０６】
HOXB13遺伝子の異常メチル化が腎細胞癌における発現の消失と関係するかをあきらかにするため、15種類の腎癌細胞株(786-O, UMRC-6, KC-12, ACHN, A498, OUR-10, OUR-20, VHL-renal, YCR, Caki-1, Caki-2, SKRC-1, SKRC-7, TUHR4TKB, およびTUHR14TKB)を用いてRT-PCRによるHOXB13の発現解析をおこなった。なお、解析は各腎癌細胞株より得たtotal RNAを逆転写(RT+)後、プラトーまで増幅して行った。図３ｂに、腎癌細胞株におけるHOXB13発現をRT-PCRで解析した結果を示す。図３ｂに示すように、４つの高度メチル化腎癌細胞株(UMRC-6, KC-12, VHL-renal, SKRC-7)ではHOXB13遺伝子の発現は完全に消失していた。
【０１０７】
さらに、HOXB13遺伝子不活化に対するメチル化の影響を評価するため、3種類の高度メチル化腎癌細胞株(UMRC-6, KC-12, VHL-renal)を1μMのメチル化阻害剤5-aza-2’-deoxycytidine (5-aza-dC)を含む培地で3日間培養した。さらに、ヒストンの脱アセチル化がDNAメチル化によって引き起こされる遺伝子不活化に関係することから、300nMのhistone deacetylase (HDAC) 阻害剤トリコスタチンA (TSA)で24時間細胞を処理し、total RNAを調製してRT-PCRによる発現解析をおこなった。結果を図３ｃに示す。図３ｃに示すように、5-aza-dC（メチル基転移酵素阻害剤）で処理した場合、全ての細胞株でHOXB13遺伝子の再発現がみられた。しかしながら、TSA単剤（HDAC阻害剤）ではHOXB13発現の回復は誘導されなかった。HOXB13遺伝子の発現を増強する5-aza-dCとTSAの共同的効果がVHL-renal株で見られたが、UMRC-6やKC-12株では、そのような効果は観察されなかった。これらの結果は、HOXB13遺伝子の不活化が主としてメチル化に依存した様式で制御されていることを示唆する。
【０１０８】
なお、上記RT-PCRによるHOXB13遺伝子の発現解析は、各腎癌細胞株からtotal RNAを RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)を用いて調製し、Oligo(dT)15 primer (Promega)とOmniscript RT Kit (Qiagen)を用いて逆転写反応し、得られたDNAについて次のプライマーを用いてRT-PCRすることで行った。正常ヒト組織由来total RNAはClontech Laboratories (Palo Alto, CA)より得た。
H13F： 5’-TTGCCTGTGGACAGTTACC-3’ （配列番号21）
H13R： 5’-AACTTGTTAGCCGCATACTC-3’ （配列番号22）。
【０１０９】
RNAの信頼性を検証するコントロールとして、glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) をコードする遺伝子を、各腎癌細胞株および正常ヒト組織について、次のプライマーを用いて増幅した；
GAPDHUP： 5’-CGGATTTGGTCGTATTGG-3’ （配列番号30）
GAPDHLW： 5’-TCCTGGAAGATGGTGATG-3’ （配列番号31）。
【０１１０】
実験例５  HOXB13遺伝子の免疫組織化学分析法による発現解析
HOXB13遺伝子の異常メチル化が原発性腎細胞癌サンプルにおける発現の消失の原因となるかを明らかにするため、抗HOXB13ラビットポリクローナル抗体（以下、「抗HOXB13抗体」という）を用いて免疫染色をおこなった。抗HOXB13抗体は、ヒトHOXB13のアミノ酸配列（配列番号2）中の14アミノ酸配列 (RVKEKKVLAKVKNS：（配列番号23）) に対応する化学合成ペプチドを用いてウサギを免疫することで作製した。
【０１１１】
COBRAにより解析した各原発性腎細胞癌症例のメチル化状態に基づいて、Clear cellタイプの腎細胞癌計11症例（メチル化症例3例、非メチル化症例8例）について検証をおこなった。この11症例のホルマリン固定パラフィン包埋組織（腎細胞癌）から得た5 μm厚切片を用いて、Ventana automated IHC system (DiscoveryTM, Ventana Medical systems, Inc., Tucson, Ariz.)により免疫組織化学分析用スライドを作製した。脱パラフィン処理した組織切片を108℃で16分間熱処理により抗原性を回復させた後、希釈抗HOXB13抗体(3.4 μg/ml)と反応させた。自動化手順はindirect biotin-avidin systemに基づきビオチニル化ユニバーサル2次抗体とジアミノベンジジン基質およびヘマトキシリン対比染色を用いた。
【０１１２】
原発性腎細胞癌におけるHOXB13の免疫組織化学分析の結果を図４に示す。
【０１１３】
図４中、ａおよびｃはそれぞれHOXB13メチル化症例（ケース54）および非メチル化症例（ケース34）のHE染色像を、ｂおよびｄはそれぞれHOXB13メチル化症例（ケース54）および非メチル化症例（ケース34）の抗HOXB13抗体による染色像を示す。HE染色像によりClear cellタイプの腎細胞癌であることがわかる。抗HOXB13抗体によって腫瘍細胞の細胞質部分が染まる。図４ｂに示すように、非メチル化症例8例の腎細胞癌では、抗HOXB13抗体により細胞質に陽性の染色が見られた。これとは対照的にHOXB13メチル化を示した3例の原発性腎細胞癌症例では抗HOXB13抗体による細胞質の染色像は認められなかった(図 ４ｃとｄ)。癌細胞周辺の非癌部に関しては、HOXB13の発現は正常近位尿細管細胞で発現が検出された(図４ｃの右部分)。このことから、原発性腎細胞癌におけるHOXB13の発現はCOBRA法により分析されたメチル化状態とよく相関することがあきらかになった。
【０１１４】
実験例６  HOXB13遺伝子発現による腎癌細胞増殖の抑制のコロニーフォーメーションアッセイによる確認
（１）FLAG標識HOXB13発現ベクターの構築
pDNR-Dual vector組み込みヒトHOXB13 cDNAをOpen Biosystems (Huntsville, AL)より得た後、C末端にFLAG-tagを付加してpLP-IRESneo expression vector (Clontech)にサブクローン化した。pDNR-EGFP (Clontech) に組み込まれたEGFP遺伝子も同様にpLP-IRESneo vectorにサブクローン化した。pDNR-EGFP (Clontech) に組み込まれたEGFP遺伝子も同様にしてpLP-IRESneo vectorにサブクローン化し、pLP-IRES- EGFP発現ベクターを作製した。
【０１１５】
（２）コロニーフォーメーションアッセイ
腎細胞癌におけるHOXB13遺伝子の高頻度の腫瘍特異的メチル化とそれに相関した遺伝子不活化は、HOXB13不活化が腎癌における腫瘍形成と悪性の進行に関与するかもしれないことを示唆している。HOXB13遺伝子が癌抑制遺伝子として働くかどうかを明確にするため、FLAG-tagを付加したHOXB13遺伝子を、HOXB13遺伝子が完全にメチル化され不活化している腎癌細胞株KC-12にpLP-IRES-FLAG-HOXB13発現ベクター（FLAG標識HOXB13発現ベクター）を導入することで発現させ、コロニーフォーメーションアッセイをおこなった。なお、コントロールとして同一細胞株に空のpLP-IRESneoベクターを導入したものを用いた。
【０１１６】
具体的には、HOXB13非発現腎癌細胞株KC-12（高度メチル化腎癌細胞株）にpLP-IRES-FLAG-HOXB13発現ベクター(HOXB13)あるいはコントロールのpLP-IRES-EGFPベクター (空ベクター：pLP-neo)（各々8μg）を、Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いてトランスフェクトした。トランスフェクション後24時間で細胞 (5ｘ104) を100 mm dishに広げ、0.5 mg/ml G418を含む培地で14日間培養した後、ギムザ染色をおこなった。コロニー計数は3回の培養でおこなった。コロニーフォーメーションアッセイの結果を図５ａおよびｂに示す。図５ｂはトランスフェクトしたKC-12細胞の3回培養のコロニー数の平均値をコントロールに対するパーセントで示したものである（コロニー数の定量的解析）。
【０１１７】
この結果からわかるように、KC12腎癌細胞の増殖（コロニー形成）は、HOXB13遺伝子の再発現によって顕著に減少した。これはHOXB13遺伝子が細胞増殖を抑制することを示している。
【０１１８】
実験例７  HOXB13遺伝子発現によるアポトーシスの誘導の蛍光顕微鏡法による確認
実験例６において、外来性のHOXB13遺伝子の発現により高度メチル化腎癌細胞株の増殖が抑制されたことから、次に高度メチル化によりHOXB13発現を欠いている腎癌細胞株（UMRC-6腎癌細胞株）にHOXB13遺伝子を発現させて、HOXB13遺伝子の発現が腎癌細胞株でアポトーシスが誘導されるかどうかを検証した。
【０１１９】
具体的には、60 mm dish中でカバーガラス上に増殖した上記細胞に、TransFast Transfection Reagent (Promega)を用いて5 μgのpLP-IRES-FLAG-HOXB13発現ベクター（FLAG標識HOXB13発現ベクター）あるいはpLP-IRES-EGFPベクター（空ベクター）をトランスフェクトした。48時間培養後、カバーガラス上の細胞をPBSで２回洗浄し、3% paraformaldehydeを含むPBSで室温で20分間固定した。その後、0.1% Triton X-100（in PBS）で3分間透過処理し、10% ヤギ血清を含むPBSで室温で30分間ブロッキングをおこなった。
【０１２０】
次いで、DNA結合色素のDAPIで染色し、アポトーシスを検出するためのTUNEL分析をおこなった。まず、サンプルを抗FLAG M2 (SIGMA) 一次抗体溶液 (20 mM Tris-HCl, pH8.0, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20, 0.1% BSA)で37℃、60分間インキュベートした。二次抗体にはAlexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (Molecular Probes, Eugene, OR)を用いた。TUNEL assayにはApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit (Chemicon, Temecula, CA)を用いた。次いで、カバーガラスをVECTASHIELD Mounting Medium with DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA)でマウントし蛍光顕微鏡を用いて観察した。結果を図６ａに示す。HOXB13の発現により、核の凝集とTUNEL陽性を示すapoptosis細胞が増加し細胞死に至った(図６ａのUMRC-6/FLAG-HOXB13)。これとは対照的に、コントロールのEGFP発現細胞ではアポトーシス性の細胞死の増加は認められなかった(図６ａのUMRC-6/EGFP)。
【０１２１】
また、上記細胞について、caspase依存性アポトーシスを検出するために、抗cleaved caspase-3抗体を用いた染色をおこなった。具体的には、サンプルを抗Cleaved Caspase-3抗体 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA)溶液 (20 mM Tris-HCl, pH8.0, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20 and 0.1% BSA)で37℃、60分間インキュベートし、二次抗体にAlexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG (Molecular Probes)を用いて反応させた。Caspase-3活性化の免疫蛍光分析を図６ｂに示す。HOXB13発現細胞（UMRC-6/FLAG-HOXB13）は核の凝集にともなうcaspase-3の活性化を示した。これらの結果はHOXB13が腎癌細胞株においてcaspase依存性経路を介してアポトーシスを誘導することを示している。
【０１２２】
実験例８  HOXB13遺伝子と他の遺伝子のメチル化状態の比較
腎細胞癌におけるHOXB13遺伝子と他の癌関連遺伝子のメチル化頻度を比較するため、既知の13のCpGアイランドのメチル化状態を原発性腎細胞癌40症例と腎癌細胞株（RCC cell lines）16株についてCOBRA法により調べた。これらのCpGアイランドには種々の癌でしばしば高度にメチル化していることが知られている11の遺伝子 (p14ARF, p15INK4B, p16INK4A, CHFR, CACNA1G, TMS1, BNIP3, COX-2, hMLH1, DAPK, DCC)と二つのCpGアイランド (MINT1, MINT2)を含む。これらの遺伝子のメチル化の概要を表２に示す。
【０１２３】
【表２】
2007267700.tif 000003
【０１２４】
これらのCpG アイランドのうち6ケ (CHFR, CACNA1G, COX-2, TMS1, DAPK, MINT1)は原発性腎細胞癌で3〜18%の低い頻度のメチル化を示した。残りの遺伝子(p14ARF, p15INK4B, p16INK4A, BNIP3, hMLH1, DCC, MINT2)はメチル化を認めなかった。これらのことから、原発性腎細胞癌ではHOXB13がしばしばメチル化している(30%)のに対して、他の遺伝子のメチル化頻度は相対的に低いことがわかった。
【０１２５】
実験例９  HOXB13遺伝子のメチル化と臨床病理因子の相関
検討をおこなった原発性腎細胞癌56症例について、HOXB13遺伝子のメチル化と性別、年齢、腫瘍グレード、臨床病期、腫瘍サイズ、微小血管浸潤、転移、VHL不活化との相関をχ2-testにより分析した。結果を表３に示す。
【０１２６】
【表３】
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【０１２７】
HOXB13遺伝子のメチル化は腫瘍グレード、病期、腫瘍サイズ、微小血管浸潤と顕著な相関を示した (P<0.05)。
【０１２８】
次にHOXB13遺伝子のメチル化と臨床病理学的指標の関連をlogistic regression modelを用いた多変量解析により分析した。結果を表４に示す。
【０１２９】
【表４】
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【０１３０】
HOXB13遺伝子メチル化と腫瘍グレード、微小血管浸潤には顕著な相関が見られた (P<0.05)。HOXB13遺伝子メチル化とVHL不活化の間に相関は認められなかった。よって、HOXB13のエピジェネティックな不活化はVHLの状態とは無関係である。このことは、散発性のclear cellタイプ腎細胞癌症例の約40%を占める (Foster et al., (1994). Hum Mol Genet., 3, 2169-2173; Gnarra et al., (1994). Nat Genet., 7, 85-90;  Herman et al., (1994). Proc Natl Acad Sci USA., 91, 9700-9704; Shuin et al., (1994). Cancer Res., 54, 2852-2855.;Shuin et al.,(1999). Contrib Nephrol., 128, 1-10)、VHLの不活化をともなわない腎細胞癌の腫瘍形成のメカニズムを解明する一助となるであろう。注目すべき点としては、logistic regression modelを用いた臨床病理学的因子の多変量解析によりHOXB13遺伝子のメチル化と腫瘍グレードおよび微小血管浸潤の間に顕著な相関が認められた。このことはHOXB13遺伝子の不活化が腎臓癌の悪性度を高めていることを示唆している。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】原発性腎癌におけるHOXB13遺伝子メチル化の分析結果を示す。図１ａは、単離されたMIRC9クローンとHOXB13遺伝子のCpGアイランドの関係を示す。図１ｂはCOBRAの代表的な結果を示す。N=正常腎組織、T=原発性癌、U=非メチル化断片、M=メチル化断片を示す。図１ｃはHOXB13遺伝子メチル化を示す原発性腎細胞癌と正常腎組織サンプルのHOXB13 bisulfite sequencingの結果を示す。黒は50-100％のメチル化、斜線は20-50％のメチル化、白は0-20％のメチル化を示す。
【図２】腎癌細胞株におけるHOXB13遺伝子のメチル化状態を示す。図２ａは、腎癌細胞株のCOBRAの結果を示す。U=非メチル化断片、M=メチル化断片を意味する。図２ｂはHOXB13遺伝子の5’領域のBisulfite sequencingの結果を示す。黒丸はメチル化、白丸は非メチル化CpG部位をそれぞれ示す。
【図３】正常ヒト組織と腎癌細胞株におけるHOXB13遺伝子の発現を示す。図３ａは多様なヒト正常組織におけるHOXB13遺伝子発現のRT-PCRによる解析結果を示す。図３ｂは腎癌細胞株におけるHOXB13遺伝子発現のRT-PCRによる解析結果を示す。図３ｃは高度メチル化腎癌細胞株のメチル基転移酵素阻害剤処理によるHOXB13発現に対する影響を示す。
【図４】原発性腎細胞癌におけるHOXB13の免疫組織化学分析結果を示す。図４ａは clear cell-typeの腎細胞癌であることを示すHE染色像である。図４ｂは HOXB13遺伝子非メチル化腎細胞癌の抗HOXB13抗体による陽性染色像を示す。図４ｄはHOXB13遺伝子メチル化を示すHOXB13非発現癌細胞の拡大図である。
【図５】高度メチル化腎癌細胞株におけるHOXB13再発現の影響を示す。図５ａは外来性のHOXB13遺伝子の発現による腎癌細胞株の増殖の抑制をコロニーフォーメーションアッセイにより分析した結果である。図５ｂはそのコロニー数の定量的解析結果である。ランスフェクトしたKC-12細胞のコロニー数（３回培養の平均値）をコントロール100％とした場合のパーセントで示す。Barは3回の培養の標準誤差を示す。
【図６】HOXB13高度メチル化腎癌細胞株におけるHOXB13発現によるアポトーシスの誘導を示す。図６ａは、HOXB13非発現UMRC-6細胞にFLAG-HOXB13あるいはコントロールとしてEGFP発現ベクターをトランスフェクトし免疫蛍光分析をおこなった結果である。図６ｂは、Caspase-3活性化の免疫蛍光分析を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１３２】
配列番号4はMSPU1Fプライマーの塩基配列
配列番号5はMSPU1Rプライマーの塩基配列
配列番号6はMSPU2Fプライマーの塩基配列
配列番号7はMSPU2Rプライマーの塩基配列
配列番号8はMSPU3Rプライマーの塩基配列
配列番号9はMSPM1Fプライマーの塩基配列
配列番号10はMSPM1Rプライマーの塩基配列
配列番号11はMSPM2Fプライマーの塩基配列
配列番号12はMSPM2Rプライマーの塩基配列
配列番号13はMIRC9-2Fプライマーの塩基配列
配列番号14はMIRC9-2Rプライマーの塩基配列
配列番号15はMIRC9-3Fプライマーの塩基配列
配列番号16はMIRC9-3Rプライマーの塩基配列
配列番号17は非メチル化特異的プローブの塩基配列
配列番号18はメチル化特異的プローブの塩基配列
配列番号19は非メチル化特異的プローブの塩基配列
配列番号20はメチル化特異的プローブの塩基配列
配列番号21はセンス（Ｓ）プライマーの塩基配列
配列番号22はアンチセンス（Ａ）プライマーの塩基配列
配列番号23は抗体作成用の免疫性抗原のアミノ酸配列
配列番号24はPCRアダプターの塩基配列
配列番号25はPCRアダプターの塩基配列
配列番号26はJMCA24プライマーの塩基配列
配列番号27はJMCA12プライマーの塩基配列
配列番号28はNMCA24プライマーの塩基配列
配列番号29はNMCA12プライマーの塩基配列
配列番号30はGAPDHUPプライマーの塩基配列
配列番号31はGAPDHLWプライマーの塩基配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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