(57)【要約】【課題】細胞の癌化の原因となる転写因子E2F1の活性を抑制する物質を見出し、新たな制癌剤を提供する。【解決手段】  CDCA4又はその部分ペプチドを有効成分として含有することを特徴とするE2F1の活性抑制剤、癌細胞増殖抑制剤、及び制癌剤。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
CDCA4又はその部分ペプチドを有効成分として含有することを特徴とするE2F1の活性抑制剤。
【請求項２】
CDCA4が、配列番号１記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質であることを特徴とする請求項１記載のE2F1の活性抑制剤。
【請求項３】
CDCA4の部分ペプチドが、配列番号１記載のアミノ酸配列における第１７５番目から第２４１番目のアミノ酸配列を含むペプチドであることを特徴とする請求項１記載のE2F1の活性抑制剤。
【請求項４】
CDCA4又はその部分ペプチドを有効成分として含有することを特徴とする癌細胞増殖抑制剤。
【請求項５】
CDCA4が、配列番号１記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質であることを特徴とする請求項４記載の癌細胞増殖抑制剤。
【請求項６】
CDCA4の部分ペプチドが、配列番号１記載のアミノ酸配列における第１７５番目から第２４１番目のアミノ酸配列を含むペプチドであることを特徴とする請求項４記載の癌細胞増殖抑制剤。
【請求項７】
CDCA4又はその部分ペプチドを有効成分として含有することを特徴とする制癌剤。
【請求項８】
CDCA4が、配列番号１記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質であることを特徴とする請求項７記載の制癌剤。
【請求項９】
CDCA4の部分ペプチドが、配列番号１記載のアミノ酸配列における第１７５番目から第２４１番目のアミノ酸配列を含むペプチドであることを特徴とする請求項７記載の制癌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転写因子E2F1の活性抑制剤、並びにその抑制作用を利用した癌細胞の増殖抑制剤及び制癌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
転写因子E2F1の過剰発現は細胞を癌化する。従って、E2F1活性を抑制できれば癌化を制御することが可能である。従来、E2F1を増強する転写制御因子は知られていたが、抑制する転写制御因子については理解が不十分であった。
【０００３】
ところで、最近、WatanabeらはCDCA4（cell division cycle associated 4）が癌抑制遺伝子であるp53の転写活性を調節することを報告している（非特許文献１、Watanabeらは「CDCA4」を「SEI-3」と呼んでいる。）。しかし、Watanabeらは、このタンパク質とE2F1との関連性については何も報告していない。
【０００４】
【非特許文献１】Rie Watanabe-Fukunaga et al., Genes to Cells (2005) 10, 851-860
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、細胞の癌化の原因となる転写因子E2F1の活性を抑制する物質を見出し、新たな制癌剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、１）E2F1はGeminin遺伝子及びMCM7遺伝子の活性化するが、CDCA4は、その活性化を抑制すること、２）上記の抑制作用は全長CDCA4だけでなく、CDCA4のN末端領域欠損体も有すること、３）癌細胞中の内在CDCA4遺伝子の発現を抑制すると、癌細胞の増殖性が向上することを見出した。
【０００７】
本発明は、以上の知見に基づき完成されたものである。
【０００８】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（９）を提供するものである。
【０００９】
（１）CDCA4又はその部分ペプチドを有効成分として含有することを特徴とするE2F1の活性抑制剤。
【００１０】
（２）CDCA4が、配列番号１記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質であることを特徴とする（１）記載のE2F1の活性抑制剤。
【００１１】
（３）CDCA4の部分ペプチドが、配列番号１記載のアミノ酸配列における第１７５番目から第２４１番目のアミノ酸配列を含むペプチドであることを特徴とする（１）記載のE2F1の活性抑制剤。
【００１２】
（４）CDCA4又はその部分ペプチドを有効成分として含有することを特徴とする癌細胞増殖抑制剤。
【００１３】
（５）CDCA4が、配列番号１記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質であることを特徴とする（４）記載の癌細胞増殖抑制剤。
【００１４】
（６）CDCA4の部分ペプチドが、配列番号１記載のアミノ酸配列における第１７５番目から第２４１番目のアミノ酸配列を含むペプチドであることを特徴とする（４）記載の癌細胞増殖抑制剤。
【００１５】
（７）CDCA4又はその部分ペプチドを有効成分として含有することを特徴とする制癌剤。
【００１６】
（８）CDCA4が、配列番号１記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質であることを特徴とする（７）記載の制癌剤。
【００１７】
（９）CDCA4の部分ペプチドが、配列番号１記載のアミノ酸配列における第１７５番目から第２４１番目のアミノ酸配列を含むペプチドであることを特徴とする（７）記載の制癌剤。
【発明の効果】
【００１８】
CDCA4又はその部分ペプチドは、E2F1の活性を抑制するので、E2F1の活性抑制剤として利用できる。また、癌細胞のCDCA4遺伝子の発現を抑制することにより、その癌細胞の増殖性が向上することから、CDCA4には癌細胞の増殖抑制効果があると考えられる。従って、CDCA4又はその部分ペプチドは、癌細胞の増殖抑制剤として利用できる。更に、E2F1の過剰発現は細胞を癌化するので、このE2F1の活性を抑制するCDCA4又はその部分ペプチドは制癌剤としても利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
後述する実施例１に示すように、CDCA4又はその部分ペプチドは、E2F1の活性を抑制する。従って、CDCA4又はその部分ペプチドは、E2F1の活性抑制剤として利用することができる。
【００２１】
E2F1の活性抑制剤に使用するCDCA4は、E2F1の活性を抑制できるものであればどのようなものでもよいが、ヒト由来のCDCA4、例えば、配列番号１記載のアミノ酸配列で表されるCDCA4を使用するのが好ましい。
【００２２】
また、CDCA4の部分ペプチドも、E2F1の活性を抑制できるものであればどのようなものでもよいが、配列番号１記載のアミノ酸配列における第１７５番目から第２４１番目のアミノ酸配列を含むペプチドを使用するのが好ましい。
【００２３】
ここで、「配列番号１記載のアミノ酸配列における第１７５番目から第２４１番目のアミノ酸配列を含むペプチド」には、配列番号１記載のアミノ酸配列における第１７５番目から第２４１番目のアミノ酸配列のみからなるペプチドのほか、これに他のアミノ酸配列が付加されたペプチド、例えば、配列番号１記載のアミノ酸配列における第７５番目から第２４１番目のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１記載のアミノ酸配列における第３７番目から第２４１番目のアミノ酸配列からなるペプチドが含まれる。
【００２４】
CDCA4又はその部分ペプチドはE2F1の活性抑制剤だけでなく、それ以外の用途にも利用できる。
【００２５】
例えば、後述する実施例２に示すように、癌細胞内のCDCA4遺伝子の発現を抑制すると、その癌細胞の増殖性が向上する。従ってCDCA4又はその部分ペプチドは、癌細胞の増殖抑制作用を持つと考えられ、癌細胞の増殖抑制剤として利用することができる。
【００２６】
また、前述したように、E2F1の過剰発現は細胞を癌化するので、このE2F1の活性を抑制するCDCA4又はその部分ペプチドを制癌剤としても利用することができる。
【００２７】
CDCA4又はその部分ペプチドは制癌剤として使用する場合、一般的なタンパク質製剤又はペプチド製剤と同様に製剤化することできる。また、CDCA4又はその部分ペプチドの投与量は特に限定されないが、成人１日当たり0.1〜10 mg投与することが好ましい。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例及び参考例により、本発明を更に詳細に説明する。
【００２９】
最初に、本実施例等において使用した材料及び実験方法について説明する。
【００３０】
１．プラスミド構築
GAL4遺伝子のDNA結合領域（以下、DBD）とCDCA4遺伝子産物の融合タンパク質をヒト子宮頸癌細胞株HeLaで発現させる目的で、CDCA4 cDNAをRT-PCR法で増幅し（詳細はRT-PCR法の項を参照）、pCMV-BDベクター（Stratagene社）にクローニングした。CDCA4遺伝子産物として、1-241アミノ酸を含む全長タンパク質（以下、DBD/1-241）、Ｎ末端領域1-36アミノ酸を欠損（以下、DBD/37-241）、Ｎ末端領域1-74アミノ酸を欠損（以下、DBD/75-241）、Ｎ末端領域1-174アミノ酸を欠損（以下、DBD/175-241）、さらにＣ末端領域175-241アミノ酸を欠損（以下、DBD/1-174）させた５つを作製した。PCR増幅の際のプライマー配列は、GenBankデータベースに登録された配列 (Accession Number NM_145701)を参照した。
【００３１】
プライマー配列は、以下に示すとおりである。
【００３２】
（１）5’-cgggatcctttgcacgaggactgaagagg-3’ (DBD/1-241およびDBD/1-174用フォワードプライマー;下線部はBamHI配列、配列番号２)
（２）5’-cggaattctcaggtctccaccaggatctc-3’ (DBD/1-241、DBD/37-241、DBD/75-241 およびDBD/175-241用リバースプライマー;下線部EcoRI配列、配列番号３)
（３）5’-cgggatccctcctggacatgtctctg-3’ (DBD/37-241用フォワードプライマー;下線部はBamHI配列、配列番号４)
（４）5’-cgggatcccaggatgggacgtggcgcaca-3’ (DBD/75-241用フォワードプライマー; 下線部はBamHI配列、配列番号５)
（５）5’-cgggatccagctgcatggaagagctg-3’ (DBD/175-241用フォワードプライマー;下線部はBamHI配列、配列番号６)
（６）5’-cggaattctcaggggtttttagtctccag-3’ (DBD/1-174用リバースプライマー; 下線部EcoRI配列、配列番号７) 
PCR産物は制限酵素BamHIおよびEcoRIで切断後、pCMV-BDベクターにクローニングした。ベクター作製後、塩基配列はシーケンシングにより確認した。DBDの結合配列をルシフェラーゼ遺伝子の上流に有するレポータープラスミドpFR-LucはStratagene社から購入した。
【００３３】
一方、緑色蛍光タンパク質（以下、GFP）とCDCA4遺伝子産物の融合タンパク質をヒト子宮頸癌細胞株HeLaで発現させる目的で、CDCA4 cDNAをRT-PCR法で増幅し（詳細はRT-PCR法の項を参照）、pEGFP-N2ベクター （Clontech社）にクローニングした。CDCA4遺伝子産物として、1-241アミノ酸を含む全長タンパク質（以下、1-241/GFP）、Ｎ末端領域1-72アミノ酸を欠損（以下、73-241/GFP）、さらにＣ末端領域175-241アミノ酸を欠損（以下、1-174/GFP）させた３つを作製した。
【００３４】
プライマー配列は、以下に示すとおりである。
【００３５】
（１）5’-cggaattcgccgccatgtttgcacgaggactgaag-3’ (1-241/GFPおよび1-174/GFP用フォワードプライマー;下線部はEcoRI配列、配列番号８)
（２）5’-cgggatcccggtctccaccaggatctccac-3’ (1-241/GFPおよび73-241/GFP用リバースプライマー;下線部BamHI配列、配列番号９)
（３）5’-cggaattcgccgccatgacgcaggatgggacgtg-3’ (73-241/GFP用フォワードプライマー; 下線部はEcoRI配列、配列番号１０)
（４）5’- cgggatccgggtttttagtctccagcgt-3’ (1-174/GFP用リバースプライマー; 下線部BamHI配列、配列番号１１)
PCR産物は制限酵素EcoRI およびBamHIで切断後、pEGFP-N2ベクターにクローニングした。ベクター作製後、塩基配列はシーケンシングにより確認した。
【００３６】
上記以外のプラスミドとして、pcDNA3-HA-E2F1発現ベクターは Dr. Joseph R. Nevins (Duke University Medical Center) より入手した。
【００３７】
２．細胞培養およびDNAトランスフェクション
HeLa細胞はEarle’s modified Eagle’s medium（Invitrogen社）に10%牛胎仔血清と抗生物質を添加した培地で、37℃、5% CO2下で培養した。
【００３８】
CDCA4遺伝子産物について転写調節能の有無を調べる目的で、１ウェル当たり200 ngの pFR-Lucと0.6 ngのRenillaルシフェラーゼ遺伝子レポータープラスミド（以下、pRL-TK、Promega社；pGL3やpFR-Lucが有する蛍ルシフェラーゼ遺伝子ではない。従ってRenillaルシフェラーゼ活性は内部標準として用いた）、さらに 200 ngのDBD、DBD/1-241、DBD/75-241あるいはDBD/1-174のいずれかを1μlのFugene遺伝子導入試薬（Promega社）と混和し培養液に添加した。HeLa細胞は予め、１ウェル当たり2×104個と成るように24ウェルプレートに分注した。DNA導入48時間後、Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega社）でルシフェラーゼ活性を測定した。実験は３回実施し蛍ルシフェラーゼ活性/Renillaルシフェラーゼ活性値で表した。
【００３９】
プロモーター・アッセイも同様に実施した。 即ち、200 ngの蛍ルシフェラーゼ遺伝子レポータープラスミド（pGL3-basic；Promega社より購入、pGL3-Geminin (4.98 kb, Oncogene 23; 3802-3812参照)、あるいはpGL3-MCM7 (0.46 kb, Oncogene 23;3802-3812参照)）と0.6 ngのRenillaルシフェラーゼ遺伝子レポータープラスミド、および400 ngの発現べクター（200 ng のpcDNA3-HA-E2F1あるいはpcDNA3と200 ng のGFP、1-241/GFP、73-241/GFPあるいは1-174/GFP）を上述同様、HeLa細胞に導入した。ルシフェラーゼ活性測定に関しても同様である。
【００４０】
３．RT-PCR法およびその他の遺伝子工学的手法
細胞の全RNAはRNeasy Mini Kit（Qiagen）を用い、HeLa細胞から回収した。逆転写反応は、500 ngのRNA、oligo(dT) プライマー、および1×アニールバッファーを8μlのRNase/Dnase不含水で溶解し、65℃で5分間反応後、急冷した。次にcDNA合成のため熱変性させたRNA溶液に、2×反応液とSuperScript III/RNaseOUT酵素混合液（いずれもInvitrogen社）を添加し、総計20μlとした。直ちに 50℃で50分間、次いで85℃ で5分間反応させ、急冷した。
【００４１】
PCR反応は KOD -Plus- DNAポリメラーゼ（東洋紡）を用い、以下の条件で実施した。94℃ で2分加熱後、94℃（15秒）、58℃（30秒）、68℃（60秒）を30サイクル繰り返した。PCR増幅後、DNA断片はQIAquick PCR Purification Kit （Qiagen社）で精製し、上述した制限酵素でベクターと同時に切断後、1.2% アガロースゲルおよび1×TAE buffer内で電気泳動し紫外線下で分離した。目的のDNAバンドを切り出し、Suprec-01 DNA recovering column（宝酒造）で アガロースとDNAを分離した。調整したベクターとPCR産物はLigation high （東洋紡）による16℃ 、30分間の反応で連結した。エタノール沈殿後、DNAは適量のTEバッファーに溶解し、E. coli DH5alpha Electro-Cells（宝酒造）にMicro-Pulser （Bio-Rad社）でトランスフォーメーションした。アンピシリンあるいはカナマイシンを含むLB寒天培地上でコロニーを形成した大腸菌を、LB液体培地で一晩増殖させ、 QIAprep Spin Miniprep kit （Qiagen社）によりプラスミドを精製した。
【００４２】
４．ウェスタンブロット法 
タンパク質回収に際し、細胞はまずRIPA lysis buffer （50 mM Tris-HCl, pH7.6, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, およびそれぞれ1μg/mlのaprotinin, pepstatin, leupeptin）に溶解し、氷中で20分間静置後、遠心分離（12,000 rpm）した上清を以降の実験に供した。タンパク質濃度はBio-Rad protein assay kit （Bio-Rad社）で約10μgに調整し、100 mMのDTTを含むLaemmli sample bufferに溶解後、100 ℃ で10分間加熱した。タンパク質泳動はNuPAGE 4-12% Bis-TrisゲルとMES running buffer （Invitrogen社）で実施し、その後Hybond-PVDF membrane（Amersham社）に転写した。転写後、PVDF membraneは0.1%のTween 20と5%のnon-fat dried milkを含むTBS溶液内で室温、1時間静置後、GAL4 DBDモノクローナル抗体（sc-510, Santa Cruz Biotechnology社）あるいはGFPポリクローナル抗体（632459, Clontech社）を含むTBS溶液内で室温、1時間反応させた。0.1%のTween 20を含むTBSで10分間、3回洗浄後、PVDF membraneに alkaline phosphatase-conjugated anti-mouseあるいはrabbit immunoglobulin （Promega社）を含むTBS溶液内を添加し、室温、1時間反応させた。0.1%のTween 20を含むTBSで10分間、3回洗浄後、PVDF membrane上のシグナルはWestern blue stabilized substrate（Promega社）で検出した。
【００４３】
５．RNA阻害による内在性CDCA4遺伝子発現の低下
125 pmolのsiRNA（Silencer Negative Control#1 Cat. No. 4611あるいはCDCA4に対するPre-designed siRNA ID#25960、共にAmbion社）を250 μlのOpti-MEM I Reduced Serum Medium（Invitrogen社）に溶解し、別のチューブには2.5 μlのLipofectamine 2000試薬（Invitrogen社）を250 μlのOpti-MEM I Reduced Serum Medium（Invitrogen社）加え室温で15分間静置した。両方のチューブを混和し、さらに室温で15分間静置した。HeLa細胞を２×１０５となるよう調整した6ウェルプレートに、上述した溶液を添加し、24時間後にtotal RNAを回収しRT-PCRに供した。一方、細胞数の計測とATPアッセイには、24時間後に再度siRNAを導入し、翌日以降の細胞をアッセイに供した。
【００４４】
CDCA4に対するsiRNA配列は、以下のとおりである。
【００４５】
Sense: GGUGUGUUUUCUUUUGUGCtt（配列番号１２）
Antisense: GCACAAAAGAAAACACACCtt（配列番号１３）
CDCA4の発現変化検出のためのプライマー配列は、以下のとおりである。
【００４６】
5’-atgtttgcacgaggactgaagagg-3’（配列番号１４）
5’-ggtctccaccaggatctccacc-3’（配列番号１５）
細胞数の計測はエルマ血球計算盤で、またATPアッセイはCellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay（Promega社）のプロトコールに従った。
【００４７】
〔参考例〕
CDCA4又はその欠損体が転写活性に与える影響を調べるため、以下の実験を行った。
【００４８】
CDCA4遺伝子産物として、1-241アミノ酸を含む全長タンパク質（DBD/1-241）、Ｎ末端領域1-36アミノ酸を欠損（DBD/37-241）、Ｎ末端領域1-74アミノ酸を欠損（DBD/75-241）、Ｎ末端領域1-174アミノ酸を欠損（DBD/175-241）、さらにＣ末端領域175-241アミノ酸を欠損（DBD/1-174）させた５つを作製した（図１）。N末端側から特徴的なドメイン（cyclin A-binding、heptad repeatおよびputative acidic region）を図示した。
【００４９】
200 ngの pFR-Lucと0.6 ngのRenillaルシフェラーゼ遺伝子レポータープラスミド、さらに 200 ngのDBD、DBD/1-241、DBD/37-241、DBD/75-241 DBD/175-241あるいはDBD/1-174のいずれかをHeLa細胞に導入後、ルシフェラーゼ活性を測定した。実験は３回実施し蛍ルシフェラーゼ活性/Renillaルシフェラーゼ活性値で表した。この結果を図２に示す。
【００５０】
図２に示すように、全長CDCA4及びＮ末端領域欠損体を発現させることにより、ルシフェラーゼ活性が上昇した。特にＮ末端領域欠損体を発現させた場合には、活性の上昇は著しかった。一方、Ｃ末端領域欠損体を発現させた場合には、ルシフェラーゼ活性にほとんど変化はみられなかった。これらのことから、CDCA4のＣ末端領域に転写活性を上昇させる働きがある可能性が考えられる。
【００５１】
なお、導入したDNA由来のタンパク質が発現しているかどうかは、GAL4DBDモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法により確認した（図３）。
【００５２】
〔実施例１〕
E2F1はGeminin遺伝子及びMCM7遺伝子を活性化する。このE2F1の活性化作用に、CDCA4がどのような影響を与えるかを調べるため、以下の実験を行なった。
【００５３】
CDCA4遺伝子産物として、1-241アミノ酸を含む全長タンパク質（1-241/GFP）、Ｎ末端領域1-72アミノ酸を欠損（73-241/GFP）、さらにＣ末端領域175-241アミノ酸を欠損（1-174/GFP）させた３つを作製した。N末端側から特徴的なドメイン（cyclin A-binding、heptad repeatおよびputative acidic region）を図示した（図４）。
【００５４】
200 ngの蛍ルシフェラーゼ遺伝子レポータープラスミド（pGL3-basic、pGL3-Geminin、あるいはpGL3-MCM7）と0.6 ngのRenillaルシフェラーゼ遺伝子レポータープラスミド、および400 ngの発現べクター（200 ng のpcDNA3-HA-E2F1あるいはpcDNA3と200 ng のGFP、1-241/GFP、73-241/GFPあるいは1-174/GFPの組み合わせ）をHeLa細胞に導入し、その後、ルシフェラーゼ活性を測定した。HeLa細胞への遺伝子の導入及びルシフェラーゼ活性の測定は参考例と同様に行なった。pGL3-basic、pGL3-Geminin、及びpGL3-MCM7を導入した場合の結果をそれぞれ図５、図６及び図７に示す。
【００５５】
図６及び図７に示すように、pGL3-Geminin、pGL3-MCM7のいずれを導入したときも、E2F1が単独で存在する場合には、ルシフェラーゼ活性が上昇したが、全長CDCA4又はそのＮ末端領域欠損体が共存する場合に、そのような上昇はみられなかった。一方、Ｃ末端領域欠損体が共存する場合には、E2F1単独の場合と同様ルシフェラーゼ活性が上昇した。これらのことから、全長CDCA4又はそのＮ末端領域欠損体には、Geminin遺伝子及びMCM7遺伝子の活性化するというE2F1の働きを抑制する作用があると考えられる。
【００５６】
なお、導入したDNA由来のタンパク質が発現しているかどうかは、GFPポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法により確認した（図８）。1-241/GFPにおいて＊印のバンドは翻訳が不完全なタンパク質あるいは翻訳後切断・分解された全長CDCA4遺伝子産物由来と考えられる。
【００５７】
〔実施例２〕
内在性CDCA4遺伝子の発現低下が細胞にどのような影響を与えるかを調べるため、以下の実験を行なった。
【００５８】
内在性CDCA4遺伝子の発現低下は、siRNAを用いて行なった。siRNA導入24時間後にRT-PCRを行い、その増幅産物を電気泳動で確認した（図９）。図９に示すように、CDCA4遺伝子に対するsiRNA導入した場合（図９右）、コントロール（図９左）に比べ増幅産物の量は少なかった。なお、比較のため18SrRNAに対してRT-PCRを行なったが、この場合には両者間に増幅産物の量の違いはみられなかった。
【００５９】
siRNA導入後（3-6日後）における細胞数の変化及び細胞由来ATP量の変化を図１０及び図１１にそれぞれ示す。
【００６０】
これらの図に示すように、CDCA4遺伝子の発現を低下させることにより、癌細胞であるHeLa細胞の細胞数及び細胞由来のATP量が増加した。このことから、CDCA4には、ガン細胞の増殖を抑制する効果があると推測される。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】GAL4遺伝子のDNA結合領域とCDCA4遺伝子産物の融合タンパク質の構造を示す図。
【図２】参考例で行なったルシフェラーゼ活性測定試験の結果を示す図。
【図３】参考例で行なったウェスタンブロットの結果を示す図。
【図４】GFPとCDCA4遺伝子産物の融合タンパク質の構造を示す図。
【図５】実施例１で行なったルシフェラーゼ活性測定試験の結果を示す図（pGL3-basic）。
【図６】実施例１で行なったルシフェラーゼ活性測定試験の結果を示す図（pGL3-Geminin）。
【図７】実施例１で行なったルシフェラーゼ活性測定試験の結果を示す図（pGL3-MCM7）。
【図８】実施例１で行なったウェスタンブロットの結果を示す図。
【図９】siRNAによるCDCA4遺伝子の発現抑制実験の結果を示す図。
【図１０】内在性CDCA4遺伝子の発現を抑制した細胞の細胞数の経時的変化を示す図。
【図１１】内在性CDCA4遺伝子の発現を抑制した細胞の細胞由来ATP量の経時的変化を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図３】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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