(57)【要約】【課題】  周辺機器も含め小型で取扱い容易な全自動２次元電気泳動法の実現を目的とする。【解決手段】  基板上に作製した試料導入系を持たない１本の分離用微細流路およびこれと交差する複数本並列の分離用微細流路からなる全流路に試料と両性電解質を使った広領域緩衝液の混合液を導入して連続操作の2次元電気泳動を行う。電極は、毛管現象を示す間隙をもつ容器（毛細管、スペーサーを介して組み合わせた2枚の板など）と一体化して、所定の電極液を吸い上げて保持するキャピラリー型電極システムを採用した。【選択図】  図２
2007155560.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１次元目電気泳動用の１本の分離用流路と、前記１本の分離用流路と交差して２次元目電気泳動用の複数本の分離用流路を並列に配設し、前記の流路交差部分において１次元目電気泳動用の分離用流路と２次元目電気泳動用の分離用流路とが連通して構成されていることを特徴とする２次元電気泳動装置。
【請求項２】
１次元目電気泳動の分離用流路の両端に電極槽を設け、また、複数本並列した２次元目電気泳動の分離用流路の両端にも単一の流路毎に各々電極槽を設けたことを特徴とする請求項１に記載した２次元電気泳動装置。
【請求項３】
１次元目電気泳動の分離用流路の両端に電極槽を設け、また、複数本並列した２次元目電気泳動の分離用流路の両端にも電極槽を設けるに際して複数本の並列流路の端部に一括して接続・連通する電極槽を設けたことを特徴とする請求項１に記載した２次元電気泳動装置。
【請求項４】
１次元目分離用流路および２次元目分離用流路を透明な中空パイプで構成したことを特徴とする請求項１、２、３に記載した電気泳動装置。
【請求項５】
１次元目分離用流路および２次元目分離用流路を微細溝状構造で基板上に形成したことを特徴とする請求項１に記載した２次元電気泳動装置。
【請求項６】
請求項３における流路と電極槽を微細溝状構造で基板上に形成したことを特徴とする請求項３に記載の２次元電気泳動装置。
【請求項７】
溝状微細流路の端部が露出するようにして、基板上の溝状微細流路上に透明カバープレートを接合したことを特徴とする請求項５、６に記載した２次元電気泳動装置。
【請求項８】
基板上の溝状微細流路上に、透明カバープレートを接合したことを特徴とする請求項６に記載した２次元電気泳動装置。
【請求項９】
基板上の溝状微細流路面に接合する透明カバープレートが貫通孔を持ち、貫通孔の内部で１次元目用溝状微細流路の各々の端部が露出するように該貫通孔を配置し、
また、他の貫通孔の内部で２次元目用の複数本の溝状微細流路端部が複数本一括して露出するように２次元目用複数本溝状微細流路の両端に位置を対応させて１個づつの該貫通孔を配置し、
基板の溝状微細流路のある面に該透明カバープレートを接合したことを特徴とする請求項５に記載の２次元電気泳動装置。
【請求項１０】
基板上の溝状微細流路と溝状微細電極槽を含む領域に接合する透明カバープレートが電極槽用の貫通孔を持ち、基板の溝状微細流路のある面に接合したことを特徴とする請求項６に記載の２次元電気泳動装置。
【請求項１１】
基板上の溝状微細流路と溝状微細電極槽を含む領域に接合する透明カバープレートが電極槽用の貫通孔を持ち、１次元目用の電極槽用貫通孔の内部で１次元目用溝状微細流路の端部が露出するように該電極槽用貫通孔を配置し、
また、２次元目用の電極槽用貫通孔の内部で複数本の２次元目用溝状微細流路の端部が露出するように該電極槽用貫通孔を配置し、
基板の溝状微細流路のある面に該透明カバープレートを接合したことを特徴とする請求項６に記載の２次元電気泳動装置。
【請求項１２】
試料を両性電解質を使用する広領域緩衝液と混合して流路に導入して電気泳動をおこなうことを特徴とする請求項１，２，３，４，５，６，７，８、９，１０，１１に記載した２次元電気泳動装置。
【請求項１３】
電気泳動の１次元目が等電点分離、２次元目がゾーン分離であることを特徴とする請求項１２に記載した２次元電気泳動装置。
【請求項１４】
２次元目用溝状微細流路内に導入されている溶液が複数本の並列配置２次元目用溝状微細流路の末端に連なる部位を通して各々の流路の溶液がつながるのを防止するための「溶液連結防止帯」を、撥水処理加工により該２次元目用溝状微細流路に連なる部位に設置したことを特徴とする請求項３、４、５、６、７、８、９，１０，１１に記載した２次元電気泳動装置。
【請求項１５】
毛細管現象を呈し導電性を有する微小構造体であって、所定の電気泳動用電極液を吸い上げ、
電気泳動用電極槽への該電極液の供給と電気泳動用電極を兼用すること、または電気泳動用流路の端部開放端に該電極液を接触させ、かつ、電気泳動用電極を兼用することを特徴とするキャピラリー型電極システム。
【請求項１６】
毛細管現象を呈する微小構造体の「液体吸い上げ・保持領域」内に電気泳動用給電導体電極を配設し、前記「液体吸い上げ・保持領域」内に所定の電気泳動法用電極液を吸い上げ、
電気泳動用電極槽への該電極液の供給と電気泳動用電極を兼用すること、または電気泳動用流路の端部開放端に該電極液を接触させ、かつ、電気泳動用電極を兼用することを特徴とするキャピラリー型電極システム。
【請求項１７】
請求項１５、請求項１６において、毛細管現象を呈する微小構造体は管状体又はスペーサなどで複数個の小片を固定した構成であることを特徴とする請求項１５，１６に記載のキャピラリー型電極システム。
【請求項１８】
請求項７などに示した２次元電気泳動装置と、
両性電解質を使用する広領域緩衝液と試料との混合液を２次元電気泳動装置の１次元目用流路と２次元目用流路とに導入する試料混合液導入手段と、
請求項１７などに示すキャピラリー型電極システムを電極液補充容器と２次元電気泳動装置の所定箇所との間を移動せしめる駆動機構と、
請求項１７などに示すキャピラリー型電極システムと、
電気泳動用電源を含みキャピラリー型電極システムに電圧を供給する電気泳動用電圧供給手段と、
電気泳動分離した蛍光標識蛋白質を励起発光させて電気泳動像を検出するための蛍光体励起用光源と、
流路面と電気泳動像を観察するための観察手段と、
電気泳動の全工程を予め設定した各種プログラムや得られた電気泳動像の画像データなどを格納するための記憶部と、
電気泳動プロセスの処理を行わせるために操作者が指示を与えるための入力部と、
入力部からの指示信号に基づき記憶部との連携により試料混合液注入手段・電気泳動用電圧印加手段・駆動機構・電気泳動用電源などを制御して一連の電気泳動プロセスを自動的に進行せしめる制御部とを備え、
１次元目電気泳動終了後、連続して２次元目電気泳動に移行することを特徴とする２次元電気泳動システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、たんぱく質の分離分析をおこなう電気泳動法および電気泳動装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ポリアクリルアミドゲルを電気泳動用支持体として用いるゲル電気泳動法は生命科学、医療、環境、食品の分野でたんぱく質、ペプチド、神経伝達物質、ホルモン、核酸などの分離分析手段として広く用いられている。特に、たんぱく質を等電点と分子量という異なる分離モードで分離するポリアクリルアミドゲル２次元電気泳動法は、分離能の優れた分析法として知られている。
【０００３】
ポリアクリルアミドゲル２次元電気泳動法は、泳動用支持体であるポリアクリルアミドゲルの調製が煩雑で、品質の規格化が難しい。近年ゲルのサイズは小さくなり泳動時間の短縮もはかられてきてはいるが、さらに簡便で実用的な電気泳動法および電気泳動装置が望まれている。
【０００４】
基板上に作製した微細流路を使って電気泳動を行う電気泳動マイクロチップに関する報告は１次元電気泳動法が多いが、２次元分離法も報告されてきている（例えば特許文献1、2、3）。しかし、マイクロチップで等電点とゾーンあるいは等電点と分子量の２次元電気泳動分離をシンプル且つ迅速に行うことは難しい。
【特許文献１】特表2003-514226（グズマン・ノーバート・A）
【特許文献２】特表2001-502790（カリパーテクノロジーズ、Co）
【特許文献３】特開平6-321984（ウオーターズ・インベストメンツ、Ltd、）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする主要な課題は、２次元電気泳動法における電気泳動時間の短縮と装置の小型化である。特に、シリコン、ガラス、プラスチックなどの基板上に作製した微細流路内で２次元電気泳動を行うシステムにおいて、流路構成および電気泳動操作の簡素化、さらには周辺機器も含めた全システムの小型化、自動化を図ることである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
課題を解決するための本発明による主要な解決手段を以下に述べる。
本発明の第一は、２次元電気泳動に際し試料のみの導入流路を持たない１本の１次元目用分離流路と、これと交差して複数本並列する２次元目用分離流路を設けて２次元電気泳動を行うことにある。また、予め試料と両性電解質を用いた広領域緩衝液との混合液を１次元目用と２次元目用の両方の流路全体に導入しておき、１次元目の電気泳動が終了後に直ちに２次元目の電気泳動を開始することを特徴としている。これにより、１次元目電気泳動終了後の試料を２次元目電気泳動用担体に移し替えるような工程が不要となるので、電気泳動時間が短縮される。
【０００７】
また、本発明の第二は、マイクロチップを成す基板上に、上記の流路構成を半導体微細加工技術を応用して溝状に形成したことにある。これにより、２次元電気泳動装置本体の小型化が図れ、電気泳動時間が大幅に短縮された。  
【０００８】
さらに、本発明の第三は、電気泳動用電極を、毛細管現象を示す間隙をもつ構造体（毛細管、あるいはスペーサーを介して組み合わせた2枚の平板など）と一体化させたキャピラリー型電極システムにある。電気泳動時、所定の電極液に触れて毛細管現象で液を吸い上げて保持するキャピラリー型電極システムを、それぞれ予め試料と緩衝液の混合液を満たしてある分離用微細流路の端部に接触させて液絡を図ってから電圧を加える。ついで、１次元目の場合と同様に２次元目用のキャピラリー型電極システムを使用して、１次元目の電気泳動終了後に直ちに連続して２次元目の電気泳動に移行できる。  
【発明の効果】
【０００９】
本発明の効果として、電気泳動マイクロチップ上で連続した等電点−ゾーン２次元電気泳動が可能になった。
【００１０】
本発明の効果として、マイクロチップを用いた電気泳動プロセスの簡素化と電気泳動の高速化ができた。
【００１１】
本発明の効果として、微少試料の分析が可能になり、2種類のパラメータで分離するため試料の分離能が向上した。
【００１２】
本発明の効果として、電気泳動部、データ処理部、並びに電池で駆動する高電圧電源など周辺機器を含めた全システムが小型化し、装置の全自動化が可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
基本的には、マイクロチップ上の流路構成は、１次元電気泳動用には試料のみの導入流路を持たない１本の分離用流路、２次元電気泳動用には上記１次元電気泳動用の試料のみの導入流路を持たない１本の分離用流路とこれに交差する複数本の並列マイクロ流路からなり、それぞれの流路の末端には電極槽を配し、流路の上には透明なカバープレートを接合する。
【００１４】
さらに、電気泳動に際しては、電気泳動用電極を、毛細管現象を示す間隙をもつ構造体（毛細管、あるいはスペーサーを介して組み合わせた2枚の平板など）と一体化させたキャピラリー型電極システムを採用した。あらかじめ液を満たした流路にこの電極システムの先端が触れると液絡がはかれるため、操作が簡単で電気泳動に要する時間を短縮できる。なお、上記の毛細管現象を示す間隙をもつ構造体を電極液に対して化学的耐性のある導電性材料（例えば、白金、金、耐食性合金、など）で構成すれば、電気泳動用の電極として使用できるので、あらためて上記構造体の中に設ける電極が不要となる。
【００１５】
さらに本発明では、試料を両性電解質を使用する広領域緩衝液と混合して分離用流路と電極槽に導入する。ただしこのとき、1次元目の電気泳動時に２次元目流路への電流のリークを避けるため、２次元目の電気泳動用電極槽には撥水処理を施すことによって上記の試料混合液を導入しない。  
【００１６】
また、試料たんぱく質については、蛍光物質あるいは蛍光たんぱく質で蛍光標識した。これを前述のように両性電解質を使用する広領域緩衝液と混合して１，２次元電気泳動用の両分離用流路と１次元目の電気泳動用電極槽に導入して電気泳動をおこなう。1次元目の電気泳動用キャピラリー型電極システムは、それぞれｐＨの値が異なる電極液を保持して、１次元電気泳動用流路の端部、または１次元電気泳動用電極槽に配置されて１次元電気泳動をおこなう。１次元目の電気泳動終了後、連続して２次元目の電気泳動をおこなう。２次元目の電気泳動は、２次元目の電気泳動用電極液（例えばトリス−グリシン緩衝液など）を保持したキャピラリー型電極システムを、２次元目用の複数本並列した流路の端部に配置して液絡をはかり、キャピラリー型電極システムから電圧を印加する。この２次元目の電気泳動は、等電点―ゾーン電気泳動である。
【００１７】
蛍光標識した試料たんぱく質は1次元目の等電点電気泳動で等電点をパラメータとして分離濃縮され、2次元目のゾーン電気泳動でさらに分子サイズなどのパラメータで分離される。当初全流路に存在していた試料のうち電気泳動過程で濃縮されたものは検出され、バックグラウンドにある試料は検出されない。電気泳動分離スポットは蛍光物質励起光源で発光し、フィルターを通してCCDカメラに取り込まれ、データ処理がおこなわれる。
【００１８】
したがって、基板、カバープレートなどマイクロチップを構成するガラス、シリコン、プラスチック、セラミックスなどの材料は、電気泳動像検出に用いる蛍光物質励起用光源で検出の妨げになるような蛍光を発しないものでなくてはならない。
【００１９】
2次元目電気泳動用の複数の並列流路と交差する1次元目電気泳動の分離用流路の位置、すなわち２次元用流路の長さの分割比を変えたものを作ることが出来る。試料の特性や電気泳動条件、さらには流路表面の材質による電気浸透流の影響などが試料の移動方向や移動距離に影響することに対応できる。
【００２０】
分析に必要な試料は微少量であり、例えばヒト血清蛋白質を使う場合、指先から採取した10μl程度の血液を超小型遠心器で分離し、市販の蛍光標識キットなどを用いて簡単に充分量調製して用いることができる。
【００２１】
試料―緩衝液混合液の導入のしやすさ、電気浸透流の制御、試料の流路内壁への吸着防止
には、流路内や基板表面に親水性処理、撥水性処理、表面粗さを調整したり、試料―緩衝
液の混合液にサッカロース、線状ポリアクリルアミド、HPMC
(hydroxypropylmethylcellulose)などを添加しておこなう。
【００２２】
１，２次元電気泳動の分離用担体が液体であるため、目的とする泳動流路以外への電流のリークは防がなくてはならない。たとえば、２次元目電気泳動用流路の端部に接する部分、流路の上のみを覆うカバープレートの側面、マイクロチップ基板の表面などには撥水処理を施す。これにより、１次元目電気泳動中に２次元目用流路へ電流がリークするのを防止できる。また、キャピラリー型電極システムを用いて電極液と分離用流路内の溶液との液絡をした際の電極液の不要な濡れ広がりを防止できる。
【００２３】
試料に混合する両性電解質を使用する広領域緩衝液の濃度は、試料の濃度に応じて調製する。試料量が少ないほど低濃度に調製し、等電点電気泳動の時間短縮につながる。
【実施例１】
【００２４】
図１に示した本発明のマイクロチップは、半導体微細加工技術を応用してシリコンウエハー上に１本の微細流路とその両端に電極槽を刻んであり、試料のみの導入流路はない。マイクロ流路１０１のサイズは、流路幅１００μm、深さ１００μm、長さ１５．６mmであり、陽極槽１０２及び陰極槽１０３は幅２．５mm、奥行２．０ｍｍ、深さ１００μmである。流路内部表面は約１μmの厚さの酸化膜（ＳｉＯ2膜）が形成されているが、ウエハー表面の酸化膜は除去されている。カバープレートは設けていない。この流路と電極槽に試料として調製した混合液（allophycocyanin１５ng/μl、市販の両性電解質（両性電解質を使用した広領域緩衝液）ｐＨ３．５〜１０のもの０．０５％、サッカロース３０%）約３μlを導入した後、図３に示した本発明のキャピラリー型電極システム、すなわち、電極３０２と内径１mm、外径１．４mm程度の電極液保持用キャピラリー管３０１を一体化させ、電極液３０３を吸い上げて保持する機構を用い、０．０１Mのリン酸溶液を吸い上げて保持しているキャピラリー型電極システムを陽極槽１０２に、０．０４Mの水酸化ナトリウム溶液を吸い上げて保持している電極システムを陰極槽１０３に配置して液絡をはかった後、キャピラリー型電極システムから電圧を加えて等電点電気泳動をおこなった。印加電圧１００Vで２分泳動し、さらに３００Vで２分泳動をつづける過程で、徐々に１次元電気泳動用流路内のallophycocyaninが濃縮され分離スポットとして検出された。
【実施例２】
【００２５】
図２−(A)に示した本発明のマイクロチップはシリコンウエハー上に半導体微細加工技術を応用して刻んだ１本の１次元目電気泳動の分離用流路２０１およびこれと交差する１００本の２次元目電気泳動の分離用流路２０２と４個の電極槽、すなわち１次元目電気泳動の陽極槽２０４と１次元目電気泳動の陰極槽２０５、さらに２次元目電気泳動の電極槽ａ２０６と２次元目電気泳動の電極槽ｂ２０７で構成されている。流路が交差する部分の断面斜視図を図２−(B)に示した。図示のように、１次元目電気泳動の分離用流路２０１と、これと交差する複数本の２次元目電気泳動の分離用流路２０２とは、その交差部において液体が双方に流通できる、連通した構造となっている。図中の２００は１次元目電気泳動の分離用流路方向を、２１０はＳｉ基板を示す。本実施例で用いたマイクロチップの流路のサイズは幅１００μm、深さ１００μm、並列流路の間隔（並列流路の仕切側壁２０３の厚み）は５０μmであり、１次元目電気泳動の分離用流路の長さは１５．６mm、２次元目電気泳動の分離用流路の長さは１次元用流路をはさんで短い流路長２次元目電気泳動の分離用流路の長さａ２０８が１．３５mm、２次元目電気泳動の分離用流路の長さｂ２０９が８．７５mmである。電極槽のサイズは１次元目用が幅２mm、奥行き２mm、深さ１００μmで、２次元目用は幅１５．４mm、奥行き２mm、深さ１００μmである。流路内部表面は約1μmの厚さの酸化膜（ＳｉＯ2膜）が形成されているが、ウエハー表面の酸化膜は除去されている。
なお、２次元目電気泳動用の電極槽には撥水処理を施してあり、また、試料混合液の導入はしてない。１次元目の電気泳動時、２次元目用複数流路の末端を通して１次元目電気泳動の電流がリークするのを防ぐためである。
試料として調製した混合液（phycoerythrin１０ng/μl、市販の両性電解質（両性電解質を使用した広領域緩衝液）ｐＨ３．５〜１０のもの０．０４％、サッカロース３０%）約２０μlを全ての流路と１次元目電気泳動用電極槽に導入した後、図３に示した本発明のキャピラリー型電極システムを用いて電気泳動をおこなうが、０．０１Mのリン酸溶液を吸い上げて保持しているキャピラリー型電極システムを１次元目電気泳動の陽極槽２０４に、０．０４Mの水酸化ナトリウム溶液を吸い上げて保持している電極システムを１次元目電気泳動の陰極槽２０５に配置して液絡をはかった後、電圧を加えて等電点電気泳動をおこなった。印加電圧２００Vで３分泳動して１次元電気泳動用流路内でphycoerythrinが分離スポットとして検出されたところで連続して２次元目の電気泳動に切り替えた。２次元目の電気泳動に用いる電極も図４に示した本発明のキャピラリー型電極システムで、電極４０２を1mm程度のスペーサー４０４を介して組み合わせた毛管現象を示す間隙を持つ平行平板４０１と一体化した構成になっている。前記の２枚の平板の間隙に、０．０５Mトリス（Tris（hydroxy）aminomethane）−０．３８Mグリシン緩衝液を吸い上げ保持したものを電極液として一対用いた。１００本の並列流路である２次元目電気泳動の分離用流路２０２のそれぞれの両端に接触するよう配置して液絡をはかった後、２次元目電気泳動の電極槽ａ２０６を陰極、２次元目電気泳動の電極槽ｂ２０７を陽極として電圧5Vを印加した。１次元目の等電点電気泳動で濃縮されたphycoerythrinのスポットは1〜２分後には２次元目の流路内に入り、５分後には中央部まで泳動していることが検出された。２次元目の電極槽の極性は電気泳動条件、たとえば、電気浸透流の影響などによって変えることがある。
ここではマイクロチップ基板としてシリコンウエハーを用いているが、ガラス、プラスチック、セラミックスなどを用いることもある。ただし、導電性材料使用時は、微細流路表面の絶縁処理が必要である。
【実施例３】
【００２６】
図３、図４に本発明に係るキャピラリー型電極液システムの実施例を示す。図３では、毛細管現象を呈する微小構造体に円形のガラスパイプを用い、電極液保持用キャピラリー管３０１を形成している。この電極液保持用キャピラリー管３０１内には、予め電極３０２が固定設置され一体化されている。電極３０２は、例えば白金線などであり、電極液中を通ってキャピラリーの先端にまで通じるように配設されている。電極液保持用キャピラリー３０１の断面形状は、円形に限定されるものではなく、楕円形、角型、長方形など必要に応じ種々の管状形状とすることが出来る。
【００２７】
また、図４では、毛管現象を示す間隙を持つ平行平板４０１をスペーサー４０４により固定することにより毛細管現象を呈する微小構造体を構成している。この毛管現象を示す間隙を持つ平行平板４０１で囲まれた内部には予め電極４０２が固定設置され一体化されている。電極４０２は、例えば白金線などであり、所定の電極液４０３が吸い上げられた状態では、電極液中を通して２枚のガラス平板間隙の底部にまで通じるように配設されている。ここでは、２枚のガラス平板により毛細間現象を利用して電極液を吸い上げる構造を形成しているが、これに限定されるものではない。例えば、波型形状の板を用いて同様の構成を採ることも可能であり、板状体の枚数も必要に応じ増加してもよい。
以上のキャピラリー型電極システムを用いることにより、所定の電極液を吸い上げた後、例えばマイクロチップ中の電極液槽や流路に満たされている溶液部分に本発明のキャピラリー型電極システムを移動した後、その先端を該当部分に触れることにより電極液の供給が行われ、ついで、電気泳動に必要な電圧を連続して迅速に給電することが可能となる。
【実施例４】
【００２８】
本発明によるマイクロチップ上に形成した流路の上をカバープレートで覆う構造の実施例を、図５−(A)、(B)に示す。マイクロチップ本体の構成は実施例２と同様であるので詳述を避けるが、Ｓｉ基板５１０上に１次元目電気泳動の分離用流路５０１、２次元目電気泳動の分離用流路５０２が溝状に形成されている。また、１次元目用流路には１次元目電気泳動の陽極槽５０４、１次元目電気泳動の陰極槽５０５が、２次元目用流路には２次元目電気泳動の電極槽ａ２０６、２次元目電気泳動の電極槽ｂ２０７が設置されている。さらに、Ｓｉ基板上には、ガラス製のカバープレート５０９が接合されている。このカバープレートには、電極槽に対応する位置にそれぞれ貫通孔５０８を設けている。図５−(B)は、同図−(A)のＱ−Ｑ‘における拡大断面図であり、２次元目電気泳動の電極槽ａ５０６に対応してカバープレート５０９に貫通孔５０８があけられている。このとき、２次元目電気泳動の分離用流路５０２側の貫通孔の端部は流路側に寸法dだけ後退させてある。すなわち、流路の端部を寸法ｄだけ露出させている。これは、例えば、実施例３で述べたキャピラリー型電極システムを用いて電極槽に電極液を注入して液絡を図る場合に、既に流路内に満たされている溶液と電極液とをより確実に液絡させるための処置である。２次元目用電極槽には、１次元目電気泳動が終了するまで電極液を注入しないことが多く、この処置は有効に作用する。また、この流路端部をｄだけ露出させる処置はすべての流路の端部に適用しても差し支えない。カバープレートの後退寸法（流路端部の露出寸法）ｄは、一例を挙げれば１ｍｍ程度であるが、限定的なものではなく、流路の構造・寸法に応じて適宜選択すればよい。
【実施例５】
【００２９】
本発明による他の実施例を図６−(A)、(B)に示す。Ｓｉ基板を用いたマイクロチップ本体に形成されている流路の構成は実施例２、実施例４と同様であるので詳述を避けるが、各流路端末には一切電極槽を設置していない。Ｓｉ基板６１０上に１次元目電気泳動の分離用流路６０１、２次元目電気泳動の分離用流路６０２が溝状に形成されており、図示のようにＳｉ基板上の流路部分を覆うように、ガラス製のカバープレート６０９が接合されている。図６−(B)は、同図−(A)の２次元目用マイクロ流路の端部付近の拡大断面図であり、キャピラリー型電極システムが流路端部に接触している状態を示し、６１１は電極液を保持するキャピラリー型電極システム用平行平板、６１２は電極、６１３は２次元目電気泳動用電極液である。
【００３０】
各流路（例えば２次元目電気泳動の分離用流路６０２）内の溶液（例えば試料―緩衝液の混合液６２０）と実施例３で開示したキャピラリー型電極システム内の所定の２次元目電気泳動用電極液６１３との液同士の接触（液絡）を確実に行うために、実施例４と同様に各流路の端部を寸法Ｌだけ露出させている。この流路端部をＬだけ露出させる処置はすべての流路の端部に適用する。流路端部の露出寸法Ｌは、一例を挙げれば１〜２ｍｍ程度であるが、限定的なものではなく、流路の構造・寸法に応じて適宜選択すればよい。また、２次元目電気泳動用電極液６１３の不要な濡れ広がりを防止するために、図示のようにカバープレートの端面及び表面と、Ｓｉ基板上の酸化膜（ＳｉＯ２）層（図示せず）上にも撥水処理層６１５を設けている。なお、撥水処理層６１５により電極液の濡れ広がりが防止でき、かつ流路内に満たされている溶液の蒸発が許容できる場合には、本図で示したカバープレート６０９は必ずしも必要ではなく、マイクロチップの構造をより簡素化できる。
【実施例６】
【００３１】
本発明の電気泳動マイクロチップで用いる分析用試料は蛍光標識の前処理を行い、前記前処理済み試料を両性電解質を使用する広領域緩衝液と混合した状態で流路系に導入する。流路への試料混合液の導入のしやすさ、電気泳動時の電気浸透流、流路壁への吸着などを
制御するためサッカロース、線状ポリアクリルアミド、HPMC
（hydroxypropylmethylcellulose）などを試料混合液と混合して用いる。試料と混合する両性電解質は試料量が少ない場合はこれに応じて低濃度に調製して電気泳動の高速化をはかる。
さらに血清蛋白質を分析する場合の試料前処理の一例を示すと、採血用穿刺器具の針で指先から採取した１０μlの血液を超小型遠心分離器で分離し、得られた約１μlの血清を市販の蛍光たんぱく質標識キットで標識すれば、短時間で充分量の試料が準備できる。
【実施例７】
【００３２】
本発明による２次元電気泳動装置の別の実施例を図７−(A)、(B)に示す。図７−(A)は模式構成を示す斜視図、図７−(B)は同図−(A)のＳ−Ｓ‘における部分拡大断面図を示す。１次元目電気泳動に使用する１本の１次元目電気泳動の分離用流路（内部幅１５０μm、内部深さ３００μm）７０１を、また、上記１次元目用流路に交差して接合する１８本並列した２次元目電気泳動用のキャピラリー管７０２を設ける。２次元目電気泳動用のキャピラリー管７０２には、例えばマイクロキャピラリー管（例えば、内径１５０μm、外径５５０μm）を用いた。さらにそれぞれの流路端部に１次元目電気泳動の陽極槽７０４、１次元目電気泳動の陰極槽７０５、２次元目電気泳動の電極槽ａ７０６、２次元目電気泳動の電極槽ｂ７０７を設けている。また、各構成要素（１次元用流路、２次元用流路、電極槽）の材質は、同一の材質で構成する必要はなく、また、ガラスなどに限定されるものではない。工作上に問題がなければ異質材料を組み合わせることもかのうである。但し、１次元目用流路、２次元目用流路は、透明な絶縁物で構成する必要があり、全部の部材に関しては、使用する薬液に対して耐性を有するなど、電気泳動を実行するために必然的に要求される制約が存在する。本実施例に示した２次元電気泳動装置の使用方法は、大略、実施例２、実施例３で述べたと同様であるので記述を省略する。なお、当然ながら、本装置のサイズが大きく、前述のキャピラリー型電極システムの適用が困難な場合には、各電極槽に電極液を従来から常用されている方法にて注入し、その後、電気泳動用の電極を電極液に接触させるという従来手法を部分的に適用することは充分可能である。
【実施例８】
【００３３】
図８は本発明による２次元電気泳動システムの模式構成図である。電気泳動部８０１は、例えば請求項３や請求項７に示すような２次元電気泳動マイクロチップ８１０と、１次元目電気泳動用電極システム８１１、１次元目電気泳動用電極システム操作アーム８１３、２次元目電気泳動用電極システム８１２、２次元目電気泳動用電極システム操作アーム８１４、および各操作アーム８１３・８１４を駆動するための駆動機構（図示せず）などで構成されている。また、１次元目電気泳動用電極システム８１１・２次元目電気泳動用電極システム８１２を介して１次元目用微細流路や２次元目用微細流路に電圧を加えるための電気泳動用電源８０２が具備されている。
さらに、２次元電気泳動マイクロチップ８１０の表面側の状況は上部に設置されたＣＣＤカメラ８２０からの画像信号を、画像処理部８０５を介してディスプレイ８０７により拡大観察することができる。
【００３４】
さらには、電気泳動を実行するにあたり、操作者が２次元電気泳動システムに対して各種の指示を与えるための入力部８０６と、電気泳動の一連工程を設定した各種のプログラムや得られた電気泳動像の画像データなどを格納するための記憶部８０４と、電気泳動の一連工程を自動的に進行せしめる制御部８０３とを具備している。
また、電気泳動分離した蛍光標識たんぱく質を検出するための蛍光物質の励起用光源８２１が電気泳動部８０１の上部に設置されている。
【００３５】
次に、このシステムの自動動作の一例を以下に述べる。
まず最初に、操作者は予め設定されている複数の処理メニューから所望するプログラムを選択し、処理スタートを指示する。プログラムの選択や処理スタートの指示は、入力部を介して実行される。以降、制御部は記憶部や操作アーム駆動機構、電気泳動用電源、画像処理部などと連携してプログラムを進行させて行く。
まず、両性電解質を用いた広域緩衝液に試料を溶かした溶液を、溶液注入装置（図示せず）を用いて１次元目用マイクロ流路と２次元目マイクロ流路の両方に注入する。次に、１次元目電気泳動用電極システム８１１が、１次元目電気泳動用電極システム操作アーム８１３の動作により１次元用電極液補充容器（図示せず）から所定量の２種類の電極液を吸い上げる。ついで、１次元目電気泳動用電極システム８１１は、１次元目マイクロ流路の電極槽の上部まで移動したのち、下降して電極液を電極槽内に供給する。ついで、電気泳動用電源から約３分間、１次元目電気泳動のための電圧が供給され、１次元目電気泳動が終了する。この間、１次元目電気泳動を実行中に、２次元目電気泳動用電極システム８１２は１次元目と同様の動作により所定の電極液を吸い上げて待機している。
【００３６】
１次元目電気泳動が終了したと同時に、２次元目電気泳動用電極システム８１２は２次元目マイクロ流路の電極槽まで移動・降下して、電極槽に電極液を供給する。ついで、１次元目と同様に電気泳動用電源から約５分間、２次元目電気泳動のための電圧が供給され、２次元目の電気泳動が終了する。
次に、電気泳動用チップ全面に、蛍光物質の励起用光源８２１からの励起光を照射して電気泳動像を発現させる。励起用光源は、用いる蛍光体の種類により選択する。蛍光発光により発現した電気泳動像は、種々の倍率でディスプレイにより観察できる。また、画像データを記憶部に格納することも可能である。
なお、電気泳動時のチップの発熱が障害になる場合には、電気泳動チップの下部に放熱機構（例えば、冷却フィン、空冷放熱器、水冷機構、ペルチェ素子を用いた冷却機構など）を装備することも容易である。
【００３７】
以上述べたように、電気泳動マイクロチップを用いる本システムでは、分析試料は微少量で、試料は両性電解質を使用する広領域緩衝液と混合して導入するため、試料導入流路も操作も省くことが出来る。さらに１次元目の電気泳動を終了後に、直ちに連続して２次元目の電気泳動に移行できるので、従来の2次元ゲル電気泳動のように、１次元目電気泳動が終了したキャピラリーゲルを２次元目用の平板ゲルの上に移動する複雑な操作が不要となった。このような操作の簡素化と容易さが２次元電気泳動プロセスの全自動化と装置の小型化を実現した。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の活用例としては、医療、食品、環境分析およびその品質管理など広い分野に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】実施例１の１次元電気泳動に用いる微細流路を説明する平面図
【図２】(A)は、実施例２の２次元電気泳動に用いる微細流路を説明する平面図、(B)は(A)の部分拡大斜視図
【図３】本発明のキャピラリー型電極システムの断面図
【図４】本発明のキャピラリー型電極システムの他の実施例を示す構成図
【図５】(A)は実施例４のカバープレート配置を示す平面図、(B)は同図（Ａ）の部分拡大断面図
【図６】(A)は実施例５のマイクロチップの構成平面図であり、(B)は電極システムを配置したときの部分拡大断面図
【図７】(A)は、実施例７のマルチキャピラリー管からなる２次元流路の斜視図、(B)は、同図(A)の部分拡大断面図
【図８】実施例８を示すシステム構成図
【符号の説明】
【００４０】
１０１――マイクロ流路
１０２――陽極槽
１０３――陰極槽
２００――１次元目電気泳動の分離用流路方向
２０１――１次元目電気泳動の分離用流路
２０２――２次元目電気泳動の分離用流路
２０３――並列流路の仕切側壁
２０４――１次元目電気泳動の陽極槽
２０５――１次元目電気泳動の陰極槽
２０６――２次元目電気泳動の電極槽ａ
２０７――２次元目電気泳動の電極槽ｂ
２０８――２次元目電気泳動の分離用流路の長さａ
２０９――２次元目電気泳動の分離用流路の長さｂ
３０１――電極液保持用キャピラリー管
３０２――電極
３０３――電極液
４０１――毛管現象を示す間隙を持つ平行平板
４０２――電極
４０３――電極液
４０４――スペーサー
５０１――１次元目電気泳動の分離用流路
５０２――２次元目電気泳動の分離用流路
５０３――並列流路の仕切側壁
５０４――１次元目電気泳動の陽極槽
５０５――１次元目電気泳動の陰極槽
５０６――２次元目電気泳動の電極槽ａ
５０７――２次元目電気泳動の電極槽ｂ
５０８――貫通孔
５０９――カバープレート
５１０――基板
６０１――１次元目電気泳動の分離用流路
６０２――２次元目電気泳動の分離用流路
６０９――カバープレート
６１０――基板
６１１――キャピラリー型電極システム用平行平板
６１２――電極
６１３――２次元目電気泳動用電極液
６２０――試料―緩衝液の混合液
７０１――１次元目電気泳動の分離用流路
７０２――２次元目電気泳動用のキャピラリー管
７０４――１次元目電気泳動の陽極槽
７０５――１次元目電気泳動の陰極槽
７０６――２次元目電気泳動の電極槽a
７０７――２次元目電気泳動の電極槽b
８０１――電気泳動部
８０２――電気泳動用電源
８０３――制御部
８０４――記憶部
８０５――画像処理部
８０６――入力部
８０７――ディスプレイ
８１０――電気泳動マイクロチップ
８１１――１次元目電気泳動用電極システム
８１２――２次元目電気泳動用電極システム
８１３――１次元目電気泳動用電極システム操作アーム
８１４――２次元目電気泳動用電極システム操作アーム
８２０――CCDカメラ
８２１――蛍光物質の励起用光源
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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