(57)【要約】【課題】従来の方法では可溶化できなかった細胞由来タンパク質を可溶化することを目的とする。また、本発明の可溶化方法を用いることにより、可溶化できないために解析することができなかった細胞由来タンパク質を同定することを目的とする。【解決手段】不溶性タンパク質に１種以上の界面活性剤を段階的に加えてタンパク質懸濁液を得、その後、得られたタンパク質懸濁液に高濃度の尿素−チオ尿素溶液を加えることにより、従来の方法では可溶化できなかった不溶性タンパク質を可溶化する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物細胞由来のタンパク質を可溶化する方法であって、
（ａ）不溶性タンパク質に１種以上の界面活性剤を段階的に加えてタンパク質懸濁液を得る工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られたタンパク質懸濁液に高濃度の尿素−チオ尿素溶液を加えることにより、前記不溶性タンパク質を可溶化する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞由来タンパク質を可溶化するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムの解読に引き続き、現在ヒトを含む動物および植物の組織を構成する全タンパク質の網羅的解析が進められている。そして、これらのタンパク質の解析に当たっては、単に細胞、組織を構成するタンパク質を調べ上げるだけでなく、生物の生命活動を支える細胞の機能をタンパク質レベルで明らかにすることが重要な課題となっている。
【０００３】
さらに緊急の課題として、ヒトの癌を含む難治性重症疾患の原因解明と診断のための手段として、組織あるいは細胞レベルでの生理的、病理的機能と関連づけたタンパク質の解析方法の確立が求められている。
【０００４】
これらの必要性に応じて現在広く行われているタンパク質の解析方法の１つは、界面活性剤と尿素系試薬の併用による組織タンパク質の可溶化、二次元電気泳動あるいは液体クロマトグラフィーによる分離、およびマススペクトロメトリーによるタンパク質の同定、の３段階の操作を組み合わせたものである（O’Farrell, P. H., J.Biol.Chem. 1975, 250, 4007-4021；Labilloud, T., Electrophoresis 1998, 19, 758-760；Link, A. K., Eng, J., Schieltz, D. M., Carmack, E., Mize, G. J., Morris, D. R., Garvik, B. M., Yates, J.R. 3rd. Nat. Biotechnol. 1999, 17, 676-682；Wolters, D. A., Washburn, M. P., Yates, J. R. 3rd.Anal. Chem. 2001, 73, 5683-5690）。これらの操作のうち、第２段階および第３段階については装置の種々の改良が進められているが、第１段階のタンパク質の可溶化については、組織を構成するタンパク質の約95 ％以上は可溶化できるものの、細胞膜、核および細胞骨格などを構成する残りのタンパク質については十分な可溶化方法が確立されていない。
【０００５】
最近の分子生物学研究の進展に伴い、従来の方法では可溶化できないこれらの細胞内構造を構成するタンパク質の、細胞機能にとっての重要性が指摘されており、その解明が一段と必要となってきている。
【非特許文献１】O’Farrell, P. H., J.Biol.Chem. 1975, 250, 4007-4021
【非特許文献２】Labilloud, T., Electrophoresis 1998, 19, 758-760
【非特許文献３】Link, A. K., Eng, J., Schieltz, D. M., Carmack, E., Mize, G. J., Morris, D. R., Garvik, B. M., Yates, J.R. 3rd. Nat. Biotechnol. 1999, 17, 676-682
【非特許文献４】Wolters, D. A., Washburn, M. P., Yates, J. R. 3rd.Anal. Chem. 2001, 73, 5683-5690
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、従来の方法では可溶化できなかった細胞由来タンパク質を可溶化することを目的とする。
【０００７】
本発明はまた、本発明の可溶化方法を用いることにより、可溶化できないために解析することができなかった細胞由来タンパク質を同定することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の動物細胞由来のタンパク質を可溶化する方法は、
（ａ）不溶性タンパク質に１種以上の界面活性剤を段階的に加えてタンパク質懸濁液を得る工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られたタンパク質懸濁液に高濃度の尿素−チオ尿素溶液を加えることにより、前記不溶性タンパク質を可溶化する工程、
を含むことを特徴とする。
【０００９】
さらに、本発明の可溶化方法を用いることにより、動物細胞由来のタンパク質を同定する方法であって、
（ａ）可溶化溶液を用いて動物細胞をホモジネートにする工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られたホモジネートから上清を除去して沈殿物を得る工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた沈殿物を工程（ａ）で用いた可溶化溶液、次いで等張濃度の塩化カリウム溶液で洗浄して、不溶性タンパク質を得る工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた不溶性タンパク質に１種以上の界面活性剤を段階的に加えてタンパク質懸濁液を得る工程、
（ｅ）工程（ｄ）で得られたタンパク質懸濁液に高濃度の尿素−チオ尿素溶液を加えることにより、前記不溶性タンパク質を可溶化させる工程、
（ｆ）工程（ｅ）で得られた可溶化タンパク質試料を二次元電気泳動法で分離する工程、
（ｇ）工程（ｆ）で得られた二次元電気泳動ゲル上のタンパク質スポットを切り出し、酵素消化してペプチドを得る工程、
（ｈ）工程（ｇ）で得られたペプチドの質量をMALDI-TOF-MS法で測定する工程、
（ｉ）工程（ｈ）で得られたペプチドの種類および質量からペプチドマスフィンガープリント法によりタンパク質を同定する工程、
を含む方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の可溶化方法は、不溶性タンパク質に１種以上の界面活性剤を段階的に加えてタンパク質懸濁液を得、その後、得られたタンパク質懸濁液に高濃度の尿素−チオ尿素溶液を加えることにより、従来の方法では可溶化できなかった不溶性タンパク質を可溶化することができる。
【００１１】
本発明の可溶化方法を用いることにより、例えば、従来の方法では可溶化できないために解析することができなかった不溶性タンパク質を可溶化して同定することができる。これにより、ヒトの癌を含む難治性重症疾患の原因解明と診断に資することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
従来の方法では、タンパク質を可溶化するのに界面活性剤と高濃度の尿素−チオ尿素との混合液を用いてきた。しかしながら、従来の方法では、可溶化できないタンパク質が不溶性タンパク質として残ってしまっていた。これは、複合体として存在する細胞由来タンパク質が尿素と結合して、さらに大きなタンパク質複合体と尿素との複合体を形成してしまうことによると考えられる。
【００１３】
そこで本発明者らは、これらの不溶性タンパク質を溶かす方法として、まずそれぞれの不溶性タンパク質に適した界面活性剤を使って不溶性タンパク質をミセル化した後に、高濃度の尿素−チオ尿素溶液を加えることにより可溶化するという方法を開発した。
【００１４】
本発明は、動物細胞由来のタンパク質を可溶化する方法であって、
（ａ）不溶性タンパク質に１種以上の界面活性剤を段階的に加えてタンパク質懸濁液を得る工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られたタンパク質懸濁液に高濃度の尿素−チオ尿素溶液を加えることにより、前記不溶性タンパク質を可溶化する工程、
を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００１５】
本発明の対象となる動物細胞は、例えばヒトを含む動物の肝臓細胞を含むが、これに限定されない。
【００１６】
工程（ａ）では、従来の方法では可溶化できない動物細胞由来の不溶性タンパク質に１種以上の界面活性剤を段階的に加えて不溶性タンパク質をミセル化することにより、タンパク質が水中に分散したタンパク質懸濁液を得る。
【００１７】
本発明の可溶化方法に用いる界面活性剤は、不溶性タンパク質をミセル化することができるすべての界面活性剤の中から１種以上選択され、例えば、CHAPS、NP-40、ジギトニン/DMSO溶液、デオキシコール酸塩を含むが、これらに限定されない。本発明の可溶化方法において複数の界面活性剤を用いる場合には、一度に添加するのではなく、１種ずつ段階的に加えてその都度混和するのがよい。本発明の可溶化方法に用いる界面活性剤は、好ましくは、CHAPS、NP-40、ジギトニン/DMSO溶液、デオキシコール酸塩の順に添加されるが、これらに限定されず、可溶化する対象となるタンパク質に対して最適な条件に改変されうる。
【００１８】
本発明の対象となるタンパク質は、天然型および非天然型のアミノ酸を含む天然型および非天然型ならびに野生型および変異型のあらゆるペプチドおよびポリペプチドを含む。
【００１９】
本発明において「可溶化」とは、界面活性剤を用いて不溶性タンパク質をミセル化することにより、不溶性タンパク質を水に溶かす作用を意味する。本発明において「可溶化」とはまた、変性剤、アルカリ処理などの処理で膜その他の構造体から解離させることにより水に溶かす作用も含む。
【００２０】
本発明において「不溶性」とは、可溶化していない状態を意味する。
【００２１】
工程（ｂ）では、工程（ａ）で得られたタンパク質懸濁液に高濃度の尿素−チオ尿素溶液を加えることにより、従来の方法では可溶化することができない不溶性タンパク質を最終的に可溶化する。
【００２２】
細胞由来タンパク質を抽出・精製するための可溶化方法は、一般的には、尿素と界面活性剤を同時に添加する工程を含むが、本発明の可溶化方法のように、工程（ａ）で界面活性剤を加え、その後工程（ｂ）で尿素−チオ尿素溶液を加えれば、従来の方法では可溶化せずに残っていた不溶性タンパク質を可溶化することができる。これは、従来の方法では複合体として存在する細胞由来タンパク質が尿素と結合してさらに大きなタンパク質複合体と尿素との複合体を形成して可溶化しなかったと思われるところ、本発明の可溶化方法によれば、タンパク質が尿素と複合体を形成する前にタンパク質をミセル化して分散させておくことにより、その後、尿素との複合体の形成がおこりにくくなったことによると考えられる。
【００２３】
本発明における「高濃度の尿素−チオ尿素溶液」とは、界面活性剤の添加によりミセル化したタンパク質を可溶化・変性するのに十分な濃度であればよく、例えば、ヒト肝臓細胞については、「高濃度の尿素−チオ尿素溶液」は、好ましくは尿素9 Mとチオ尿素3 Mとの混合水溶液であるが、これに限定されない。
【００２４】
本発明はまた、本発明の可溶化方法を用いることにより、動物細胞由来のタンパク質を同定する方法を提供する。図１に、本発明の可溶化方法を用いることにより動物細胞由来のタンパク質を同定する方法の一例をフローチャートとして示す。
【００２５】
図１に示すように、本発明の可溶化方法を用いることにより動物細胞由来のタンパク質を同定する方法は、
（ａ）可溶化溶液Ｉを用いて動物細胞をホモジネートにする工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られたホモジネートから上清を除去して沈殿物を得る工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた沈殿物を工程（ａ）で用いた可溶化溶液Ｉ、次いで等張濃度の塩化カリウム溶液で洗浄して、不溶性タンパク質を得る工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた不溶性タンパク質に１種以上の界面活性剤を段階的に加えてタンパク質懸濁液を得る工程、
（ｅ）工程（ｄ）で得られたタンパク質懸濁液に高濃度の尿素−チオ尿素溶液を加えることにより、前記不溶性タンパク質を可溶化する工程、
（ｆ）工程（ｅ）で得られた可溶化タンパク質試料を二次元電気泳動法で分離する工程、
（ｇ）工程（ｆ）で得られた二次元電気泳動ゲル上のタンパク質スポットを切り出し、酵素消化してペプチドを得る工程、
（ｈ）工程（ｇ）で得られたペプチドの質量をMALDI-TOF-MS法で測定する工程、
（ｉ）工程（ｈ）で得られたペプチドの種類および質量からペプチドマスフィンガープリント法によりタンパク質を同定する工程、
を含む。
【００２６】
工程（ａ）および工程（ｃ）で用いる可溶化溶液Ｉは、界面活性剤と尿素とを含む混合液であり、好ましくはNP-40（2-3 %）、尿素（9 M以上）、EDTA（0.5-1 mM）、BHTまたはBHA（1-5 mM）、DTT（10-100 mM）、対象となる動物細胞由来タンパク質の分解を阻害するのに必要充分な量のタンパク質分解酵素阻害剤を含むが、これに限定されない。可溶化溶液Ｉは、最も好ましくは、2 % NP-40、9.5 M 尿素、1 mM EDTA、0.5 % IPGバッファー（pH 3-10）、1 mM BHA、100 mM DTT、1% タンパク質分解酵素阻害剤混合液を含む。
【００２７】
工程（ａ）および工程（ｃ）において使用する可溶化溶液Ｉに含まれるタンパク質分解酵素阻害剤混合液には、例えばAEBSF、アプロチニン、ロイペプチン、ベスタチン、ペプスタチン A、E-64などが含まれうるが、これらの酵素阻害剤には限定されない。
【００２８】
工程（ｂ）では、工程（ａ）で得られたホモジネートにIPGバッファー（0.5-0.8 %）を加え、好ましくは30-37 ℃で30-60分間（最も好ましくは37 ℃で60分間）保温した後、可溶性タンパク質を含む上清を遠心分離法により除去して、不溶性タンパク質を含む沈殿物を得る。
【００２９】
工程（ｃ）では、工程（ｂ）で得られた不溶性タンパク質を含む沈殿物を工程（ａ）で用いたのと同じ可溶化溶液Ｉで（好ましくは3回）洗い流して沈殿物に混入している可溶性タンパク質を除去し、その後さらに、不溶性タンパク質に付着して沈殿している尿素を等張濃度の塩化カリウムを含む溶液を用いて（好ましくは2回）洗い流し、不溶性タンパク質を得る。等張濃度の塩化カリウムを含む溶液は、例えば、1.15 % KCl、10 mM Tris-HCl（pH 7.4）、1 mM EDTA、10 mM DTT、1 % タンパク質分解酵素阻害剤混合液を含むが、これに限定されない。
【００３０】
工程（ｄ）では、本発明の可溶化方法の工程（ａ）と同様に、工程（ｃ）で得られた不溶性タンパク質に１種以上の界面活性剤を段階的に加えて不溶性タンパク質をミセル化し、タンパク質懸濁液を得る。工程（ｄ）で用いる界面活性剤は、工程（ｃ）で得られた不溶性タンパク質をミセル化することができるすべての界面活性剤から選択され、複数の界面活性剤を用いる場合には、一度に添加するのではなく、段階的に加えてその都度混和するのがよい。
【００３１】
工程（ｅ）では、本発明の可溶化方法の工程（ｂ）と同様に、工程（ｄ）で得られたタンパク質懸濁液に高濃度の尿素−チオ尿素溶液を加えることにより、従来の方法では可溶化することができない不溶性タンパク質を最終的に可溶化することができる。
【００３２】
「高濃度の尿素−チオ尿素溶液」は、例えば、ヒト肝臓細胞については、好ましくは尿素9 Mとチオ尿素3 Mとの混合水溶液であるが、これに限定されない。
【００３３】
工程（ｆ）では、本発明の可溶化方法により可溶化したタンパク質に可溶化溶液ＩＩを加えてタンパク質溶液の濃度を調整し、二次元電気泳動を行った。ヒト肝臓細胞について、可溶化溶液ＩＩは、7 M 尿素、2 M チオ尿素、2 % NP-40、1 mM EDTA、1 % IPGバッファー、10 mM DTT、1 % タンパク質分解酵素素材剤混合液を含むが、これに限定されない。
【００３４】
図２に、本発明の可溶化方法を用いて可溶化されたヒト肝臓細胞由来タンパク質の二次元電気泳動マップの一例を示す。図２に表示されている番号はタンパク質スポット番号であり、表１および表２のスポット番号に対応している。二次元電気泳動法により分離されたタンパク質はゲルに固定された後、銀染色され、そして銀染色されたタンパク質のスポットは画像解析装置で分析される。
【００３５】
工程（ｇ）では、工程（ｆ）で得られた二次元電気泳動ゲル状のタンパク質スポットを切り出し、得られたタンパク質を切断することによりペプチドを得ることができる。タンパク質を切断するために用いられる方法は、例えば酵素消化や化学的切断を含むが、これらに限定されない。酵素消化による切断方法には、トリプシン、V8、リジルエンドペプチダーゼなどが用いられるが、これらの酵素に限定されない。
【００３６】
工程（ｈ）では、工程（ｇ）で得られたペプチドの質量をMALDI-TOF-MS（マトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間型-質量分析）法で測定することができる。
【００３７】
図３に、MALDI-TOF-MS法で得られたマススペクトルの一例として、タンパク質スポット番号９９のタンパク質のマススペクトルを示す。タンパク質スポット番号は表１のスポット番号に対応している。
【００３８】
工程（ｉ）では、工程（ｈ）で得られたマススペクトルとタンパク質データベースとを用いて、ペプチドの種類および質量からペプチドマスフィンガープリント（PMF）法により解析してタンパク質の同定を行うことができる。タンパク質データベースとしては、例えば、International Protein Index database, human, version 3(http://www.ebi.ac.uk/IPI/IPI)、NCBI (National Center for Biotechnology Information)などがある。
【００３９】
本発明の可溶化方法は、上述のように動物細胞由来のタンパク質を同定する方法に用いることができるが、その用途はこれに限定されず、従来の方法では可溶化することができない不溶性タンパク質を可溶化する必要があるあらゆる用途に用いられ得る。
【実施例】
【００４０】
動物肝臓組織（生または凍結保存したもの、50-200 mg）を平底の2 ml入りエッペンドルフ（登録商標）管に取り、これに400-500 μlの可溶化溶液Ｉ（2 % NP-40、9.5 M 尿素、1 mM EDTA、0.5 % IPGバッファー（pH 3-10）、1 mM BHA、100 mM DTT、1% タンパク質分解酵素阻害剤混合液(AEBSF、アプロチニン、ロイペプチン、ベスタチン、ペプスタチン A、E-64)を含む）を加えてホモジネートとした。
【００４１】
37 ℃で60分間保温した後、遠心分離法により可溶性タンパク質を含む上清を除去し、可溶化溶液Ｉでは可溶化しなかった不溶性タンパク質を含む沈殿物を得た。
【００４２】
沈殿物を600 μlの可溶化溶液Ｉで3回、等張濃度の塩化カリウム溶液（1.15 % KCl、10 mM Tris-HCl（pH 7.4）、1 mM EDTA、10 mM DTT、1 % タンパク質分解酵素阻害剤混合液を含む）で2回洗浄した。
【００４３】
沈殿物に40 μlの250 mM CHAPS（PH 2）を加えてよく混和し、これに1/10量の30 % NP-40、1/10量の1 % ジギトニン/DMSO溶液、1/10量の5 %デオキシコール酸塩を順次加えてその都度混和した。
【００４４】
この混和物に200 μlの9 M 尿素−3 M チオ尿素溶液を加えて混和したところ、透明に近い溶液が得られた。
【００４５】
この透明に近い溶液の一部を採って可溶化溶液ＩＩ（7 M 尿素、2 M チオ尿素、2 % NP-40、1 mM EDTA、1 % IPGバッファー、10 mM DTT、1 % タンパク質分解酵素素材剤混合液を含む）を加え、タンパク質の濃度が150-300 μg/450 μlになるように調整した。一次元電気泳動には市販のimmobiline（商標） dry strip（pH 3-10、24 cm、Amersham社製）を用いた。再水和溶液を加えて再水和を11-12時間行った後、500 Vで1時間、1,000 Vで1時間、その後8,000 Vに設定して、Vhr（ボルトアワー）値の総量が190 kVhrsになるまで泳動を行った。二次元泳動には12.5 % アクリルアミドゲル板（24 cm×20 cm）を用いた。二次元泳動終了後のタンパク質は酢酸−メタノール溶液中でゲルに固定した後、銀染色した。
【００４６】
銀染色したタンパク質スポットを切り取り、トリプシンで消化して生じたペプチドをMALDI-TOF-MS法で測定した。マススペクトロスメトリーで得たペプチドの種類と質量からPMF法によりタンパク質の同定を行った。データベースとしては、IPI（International Protein Index database, human, version 3）を用いた。
【００４７】
PMF法により解析することができた銀染色したタンパク質スポットの総数は212であり、101種類のタンパク質として同定された（表１および表２）。
【００４８】
同定された101種類のタンパク質のうち、本発明の可溶化方法を用いることによって初めて同定することができた67種類のヒト肝臓細胞由来タンパク質を表１に示す。
【表１】
2007112732.tif 000002
2007112732.tif 000003
2007112732.tif 000004
【００４９】
また、同定された101種類のタンパク質のうち、本発明の可溶化方法によっても従来の可溶化方法によっても同定することができた34種類のヒト肝臓細胞由来タンパク質を表２に示す。これらの34種類のタンパク質は、すなわち可溶化溶液Ｉに可溶化するヒト肝臓細胞由来タンパク質である。
【表２】
2007112732.tif 000005
【００５０】
以上のように、本発明の可溶化方法を用いることにより、67種類のタンパク質を新たに抽出・同定することができた。これらの67種類のタンパク質のうち20種類以上のタンパク質は、シグナル伝達を含む細胞調節機能において重要な役割を果たしていることが知られており、癌やその病因が未だ解明されていない疾患の診断において有用なマーカーであると考えられている。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、本発明の可溶化方法を用いることにより動物細胞由来のタンパク質を同定する方法の一例をフローチャートに示したものである。
【図２】図２は、本発明の可溶化方法を用いて可溶化されたヒト肝臓細胞由来タンパク質の二次元電気泳動マップの一例を示したものである。
【図３】図３は、MALDI-TOF-MS法で得られたマススペクトルの一例として、タンパク質スポット番号９９のタンパク質のマススペクトルを示したものである。
【図１】
2007112732.tif 000006
【図３】
2007112732.tif 000007
【図２】
2007112732.tif 000008