(57)【要約】【課題】    低濃度基質状態で、速やかに部位特異的組換えを触媒できる新規なインテグラ−ゼを提供する。【解決手段】下記の（Ａ）及び（Ｂ）の理化学的性質を有する新規インテグラーゼ、その遺伝子等を提供する。このような新規なインテグラーゼを使用することで、従来問題であった遺伝子治療あるいは真核生物のゲノム工学による育種における非効率な標的遺伝子組み込みが改善され、さらに副生する部位非特異な遺伝子組み込みを抑制し、効率的な標的遺伝子組み込みを可能とする。  （Ａ）作用および基質特異性；    下記の２種のＤＮＡ配列間（ａｔｔＢおよびａｔｔＰ）で部位特異的な組換えを触媒する。ａｔｔＢ：5’-TCGATCAGCTCCGCGGGCAAGACCTTCTCCTTCACGGGGTGGAAGGTCGG-3’ａｔｔＰ：5’-GTTCCAGCCCAACAGTGTTAGTCTTTGCTCTTACCCAGTTGGGCGGGATA-3’  （Ｂ）分子量；  約６６．５Ｋｄ（キロダルトン）である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質を有する新規インテグラーゼ。
（Ａ）作用および基質特異性；
下記の２種のＤＮＡ配列間（ａｔｔＢおよびａｔｔＰ）で部位特異的な組換えを触媒する。
ａｔｔＢ：5’-TCGATCAGCTCCGCGGGCAAGACCTTCTCCTTCACGGGGTGGAAGGTCGG-3’
ａｔｔＰ：5’-GTTCCAGCCCAACAGTGTTAGTCTTTGCTCTTACCCAGTTGGGCGGGATA-3’
（Ｂ）分子量；
約６６．５Ｋｄ（キロダルトン）である。
【請求項２】
配列番号１に示すアミノ酸配列または該アミノ酸配列の一若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する、請求項１記載のインテグラーゼ。
【請求項３】
配列番号１に示すアミノ酸配列または該アミノ酸配列の一若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするインテグラーゼ遺伝子。
【請求項４】
インテグラーゼ遺伝子が、配列番号２に示す塩基配列または該塩基配列の一若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するものである、請求項３記載の遺伝子。
【請求項５】
遺伝子が、アクチノファージＴＧ１に由来するものである、請求項３叉は４記載の遺伝子。
【請求項６】
請求項３叉は４記載の遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインテグラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ断片。
【請求項７】
細胞内における部位特異的遺伝子組換えもしくは標的遺伝子組み込みを誘導する方法であって、酵素として請求項１又は２記載のインテグラーゼを使用する方法。
【請求項８】
細胞内における部位特異的遺伝子組換えもしくは標的遺伝子組み込みを誘導する方法であって、酵素として請求項３〜６いずれか１項に記載のインテグラーゼ遺伝子叉はＤＮＡ断片を用いて調製したインテクラーゼ活性を有するものを使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なインテグラーゼ、当該酵素をコードする遺伝子及びそれらの利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
真核生物のゲノム構造を改変し、その遺伝子発現制御を操作する、いわゆるゲノム工学技術は、遺伝子治療のみならず、様々な真核生物の育種において重要な方法である。中でも外来遺伝子の真核生物ゲノム中の標的組み込みが特に重要である。従来の真核生物への遺伝子の導入では、組み込み部位の制御が難しく、ランダムな外来遺伝子の組み込みによる他の遺伝子発現の異常や重要な遺伝子の破砕などが副生する問題がある。  
【０００３】
ＤＮＡの相同性を利用した標的遺伝子組み込みは有効であるが、組換え頻度が極めて低いという問題がある。この問題解決手段として、近年は部位特異的な組換えをするレコンビナーゼが注目を浴びている。
【０００４】
大腸菌ファージＰ１のＣｒｅレコンビネナーゼや酵母のＦＬＰレコンビナーゼなどは、部位特異的なＤＮＡ組換えを起こし、真核細胞内で機能できることが確認されているが、同時に組み込まれた遺伝子の切出しも触媒するため、結果的に遺伝子導入頻度は低く、遺伝子導入より欠失変異の作製に広く用いられている。
【０００５】
また、大腸菌ファージラムダのインテグラーゼは、部位特異的な遺伝子組み込みを触媒するが、宿主大腸菌の因子を必要とするなど真核生物のゲノム改変には直接適用できない。そのため、外来遺伝子のゲノムへの組み込みに有効なレコンビナーゼとしては、酵素単独で部位特異的な遺伝子の組み込みを触媒し、さらに酵素単独では組み込んだ遺伝子の切出しを触媒できないものが望ましい。
【０００６】
Ｃａｌｏｓらは、放線菌ファージ（アクチノファージ）φＣ３１のインテグラーゼに着目し、その真核細胞における標的遺伝子組み込みへの利用を検討している。φＣ３１のインテグラーゼは、ファージと宿主のゲノム上のａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｓｉｔｅ（ａｔｔＰとａｔｔＢ）の間で組換えを起こし、また組み込み遺伝子の切り出しにはＸｉｓというファージ蛋白質を要求するので、切出しを伴わない遺伝子の部位特異的な導入に有効である（Thorp, H. M., and Smith, M. C. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 5505-5510 (1998), Kuhstoss, S. and Rao, R. N., J. Mol. Biol., 222, 897-908 (1991), Rausch, H., and Lehmann, M., Nucleic Acids Res, 19, 5187-5189 (1991)）。
【０００７】
また、Ｃａｌｏｓらは、φＣ３１のインテグラーゼとａｔｔＢ／ａｔｔＰの組み合わせは、動物細胞内でも機能し、部位特異的組換えを生じることを確認し、さらにトランスジェニックショウジョウバエの作製にも成功している（Groth, A. C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 5995-6000 (2000), Thyagarajan, B., et al., Mol. Cell. Biol., 21, 3926-3934 (2001), Groth, A. C., et al., Genetics, 166, 1775-1782 (2004)）。
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００５−１０７７９０号公報
【非特許文献１】Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,5505-5510 (1998)
【非特許文献２】J.Mol.Biol.,222,897-908(1991)
【非特許文献３】Nucleic Acids Res,19,5187-5189(1991)
【非特許文献４】Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97,5995-6000(2000)
【非特許文献５】Mol.Cell.Biol.,21,3926-3934(2001)
【非特許文献６】Genetics,166,1775-1782(2004)
【非特許文献７】Mol.Microbiol.,55,1896-1910(2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、φＣ３１のインテグラーゼを用いた場合、部位特異的な遺伝子組み込みの頻度は低く、また多量の導入ＤＮＡの注入を必要とするため、部位非特異な組換え（組み込み）も生じる問題が残る（Groth, A. C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 5995-6000 (2000), Thyagarajan, B., et al., Mol. Cell. Biol., 21, 3926-3934 (2001)）。
【００１０】
Ｔｈｏｒｐｅらによるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのφＣ３１インテグラーゼの活性解析では、ａｔｔＢおよびａｔｔＰを含むプラスミドＤＮＡの濃度がある程度濃くないと反応は進まず、また反応速度も遅く、組換えに数時間を要している（Thorpe, H. M. and Smith M. C. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 5505-5510 (1998)）。ゆえに、φＣ３１インテグラ−ゼの特性および活性の低さが、部位特異的な組換えの非効率の原因と考えられ、そこでＢｉｂｂらは、φＣ３１インテグラ−ゼより活性の高いインテグラーゼとして、別のアクチノファージであるφＲｖ１のインテグラ−ゼに関して検討しているが、依然として組換え反応に高濃度な基質ＤＮＡを必要とし、反応時間も数時間を要している（Bibb, L. A., et al., Mol. Microbiol., 55, 1896-1910 (2005)）。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記問題を解決すべく、低濃度基質状態で、速やかに部位特異的組換えを触媒できるインテグラ−ゼを利用することで上述の問題を解決できるのではと考えた。すなわち、低濃度基質での反応が可能であり、また組換え反応が速やかに進行するのであれば、真核生物へ導入するＤＮＡ量を激減する事ができ、それゆえに部位非特異的な遺伝子組み込みを防ぐと同時に効率的な標的遺伝子組み込みが可能となると期待される。
【００１２】
そこで、本発明者は、種々のアクチノファージのインテグラ−ゼを解析し、アクチノファージＴＧ１（Foor, F., et al., Gene, 39, 11-16 (1985)）由来のインテグラ−ゼが目的とする酵素特性および活性を有することを見出し、本発明を完成させた。したがって、本発明は以下の通りである。
【００１３】
（１）下記の理化学的性質を有する新規インテグラーゼ。
（Ａ）作用および基質特異性；
下記の２種のＤＮＡ配列間（ａｔｔＢおよびａｔｔＰ）で部位特異的な組換えを触媒する。
ａｔｔＢ：5’-TCGATCAGCTCCGCGGGCAAGACCTTCTCCTTCACGGGGTGGAAGGTCGG-3’
ａｔｔＰ：5’-GTTCCAGCCCAACAGTGTTAGTCTTTGCTCTTACCCAGTTGGGCGGGATA-3’
（Ｂ）分子量；
約６６．５Ｋｄ（キロダルトン）である。
【００１４】
（２）配列番号１に示すアミノ酸配列または該アミノ酸配列の一若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する、上記（１）記載のインテグラーゼ。
【００１５】
（３）配列番号１に示すアミノ酸配列または該アミノ酸配列の一若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするインテグラーゼ遺伝子。
（４）インテグラーゼ遺伝子が、配列番号２に示す塩基配列または該塩基配列の一若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するものである、上記（３）記載の遺伝子。
【００１６】
（５）遺伝子が、アクチノファージＴＧ１に由来するものである、上記（３）叉は（４）記載の遺伝子。
（６）上記（３）叉は（４）記載の遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインテグラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ断片。
【００１７】
（７）細胞内における部位特異的遺伝子組換えもしくは標的遺伝子組み込みを誘導する方法であって、酵素として上記（１）又は（２）記載のインテグラーゼを使用する方法。
（８）細胞内における部位特異的遺伝子組換えもしくは標的遺伝子組み込みを誘導する方法であって、酵素として上記（３）〜（６）いずれか１項に記載のインテグラーゼ遺伝子叉はＤＮＡ断片を用いて調製したインテクラーゼ活性を有するものを使用する方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、新規なインテグラーゼおよびその遺伝子が提供され、従来問題であった遺伝子治療あるいは真核生物のゲノム工学による育種における非効率な標的遺伝子組み込みが改善され、さらに副生する部位非特異な遺伝子組み込みを抑制し、効率的な標的遺伝子組み込みを可能とするものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（１）本発明のインテグラーゼ
本発明のインテグラーゼは、下記の理化学的性質を有するものである。
（Ａ）作用および基質特異性
下記の２種のＤＮＡ配列間（ａｔｔＢおよびａｔｔＰ）で部位特異的な組換えを触媒する。
ａｔｔＢ：5’-TCGATCAGCTCCGCGGGCAAGACCTTCTCCTTCACGGGGTGGAAGGTCGG-3’
ａｔｔＰ：5’-GTTCCAGCCCAACAGTGTTAGTCTTTGCTCTTACCCAGTTGGGCGGGATA-3’
（Ｂ）分子量
約６６．５ｋｄ（キロダルトン）である。
【００２０】
本発明のインテグラーゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する。また、該アミノ酸配列は、上記反応を触媒する活性を維持する限りにおいて、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、修飾または付加されていてもよい。上記のアミノ酸配列の欠失、置換、修飾または付加は、出願前周知技術である部位特異的突然変異誘発法（例えば、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,4662-5666(1984)、Nucleic Acid Res.10,6487-6500(1982);Nature 316,601-605(1985)など）などにより実施することができる。また、本発明のインテグラーゼには、上記反応を触媒する活性を維持する限りにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有する酵素も含まれる。
【００２１】
本発明のインテグラーゼは、アクチノファージＴＧ１から配列番号１に示すアミノ酸配列を有する酵素をコードする遺伝子、具体的には配列番号２に示す塩基配列からなるインテグラーゼ遺伝子をクローニングし、これを使用して調製する。
【００２２】
本発明においては、本発明のインテグラーゼを生産することができる限りにおいて、配列番号２で示される塩基配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された遺伝子、またはそれらの遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子、さらに配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の相同性を有する遺伝子も利用することができる。
【００２３】
なお、１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された遺伝子とは、上述のアミノ酸配列と同様に、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により欠失、置換、修飾または付加できる程度の数の塩基が欠失、置換、修飾または付加されることを意味する。また、ストリンジェントな条件下とは、５ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣは塩化ナトリウム８．７６ｇ、クエン酸ナトリウム４．４１ｇを１リットルの水に溶かしたもの）、０．１％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウロイルザルコシン・ナトリウム塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．５％（ｗ／ｖ）ブロッキング試薬を含む溶液を用い、６０℃で２０時間程度反応温度条件下でハイブリダイゼーション反応を行なうことを意味する。
【００２４】
さらに、本発明では、インテグラーゼをコードする遺伝子の上流にさらにＳＤ配列（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含んでなる遺伝子も利用することも可能で、このような遺伝子を利用することで、酵素の生産量を著しく増加させることができる。
【００２５】
このような遺伝子のクローニング、クローン化したＤＮＡ断片を用いた発現ベクターの調製、発現ベクターを用いたインテグラーゼの調製などは、分子生物学の分野に属する技術者にとっては周知の技術であり、具体的には、例えば「Molecular Cloning」（Maniatisら編、Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor、New York(1982)）に記載の方法に従って行うことができる。
【００２６】
たとえば、アクチノファージが感染しているＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属菌から精製したインテグラーゼのＮ−末端、Ｃ−末端などのアミノ酸配列の一部を既知の方法で決定し、それに相当するオリゴヌクレオチドを合成する。合成したオリゴヌクレオチドをプローブとしてアクチノファージＤＮＡよりインテグラーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片をクローニングすればよい。
【００２７】
また、適当な制限酵素で染色体ＤＮＡを切断し、得られたＤＮＡ断片を用いて常法によりゲノムライブラリーを作成し、作成したゲノムライブラリーの中から、インテグラーゼ活性を基にスクリーニングすることで、目的とする遺伝子をクローニングすることができる。または、すでにクローン化されたアクチノファージインテグラーゼ遺伝子構造と相同性のある遺伝子をＰＣＲ法などでクローニングすることも可能である。
【００２８】
クローン化に用いる宿主は特に限定されないが、操作性及び簡便性から大腸菌など微生物を宿主とするのが適当である。
【００２９】
インテクラーゼの特性および活性を解析するため、クローン化したインテクラーゼ遺伝子の高発現系を構築する。たとえばマキザム−ギルバートの方法（Methods in Enzymology,65,499(1980)）もしくはダイデオキシチェーンターミネーター法（Methods in Enzymology,101,20(1983)）などを応用してクローン化したＤＮＡ断片の塩基配列を解析して該遺伝子のコーディング領域を特定し、宿主微生物に応じて該遺伝子が微生物菌体中で自発現可能となるように発現制御シグナル（転写開始及び翻訳開始シグナル）をその上流に連結した組換え発現ベクターを作製する。
【００３０】
インテクラーゼを異種微生物内で大量に産生させるために使用する発現制御シグナルとしては、人為的制御が可能で、インテクラーゼの生産量を飛躍的に上昇させるような強力な転写開始並びに翻訳開始シグナルを用いることが望ましい。このような転写開始シグナルとしては、宿主として大腸菌を用いる場合には、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター（Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,80,21(1983)、Gene,20,231(1982)）、ｔｒｃプロモーター（J.Biol.Chem.,260,3539(1985)）などを例示することができる。  
【００３１】
ベクターとしては、種々のプラスミドべクター、ファージベクターなどが使用可能であるが、微生物菌体内で複製可能であり、適当な薬剤耐性マーカーと特定の制限酵素切断部位を有し、菌体内のコピー数の高いプラスミドベクターを使用するのが望ましい。具体的に大腸菌を宿主とする場合には、ｐＢＲ３２２（Gene,2,95(1975)）、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９（Gene，33,103(1985)）などを例示することができる。
【００３２】
作製した組換えべクターを用いて微生物を形質転換する。宿主となる微生物としては安全性が高く取扱いやすいものであれば特に限定されない。例えば、大腸菌、酵母など遺伝子組換えに常用されている微生物を使用することができる。その中でも、大腸菌が有利であり、例えば組換えＤＮＡ実験に使用されるＫ１２株、Ｃ６００菌、ＪＭ１０５菌、ＪＭ１０９菌（Gene, 33, 103-119(1985)）などが使用可能である。
【００３３】
微生物を形質転換する方法はすでに多くの方法が報告されており、宿主として使用する微生物に応じて適宜選択すればよい。例えば大腸菌を宿主として使用する場合、低温下、塩化カルシウム処理して菌体内にプラスミドを導入する方法（J.Mol.Biol., 53,159(1970)）により大腸菌を形質転換することができる。
【００３４】
得られた形質転換体は、当該微生物が増殖可能な培地中で増殖させ、さらにクローン化したインテグラーゼ遺伝子の発現を誘導して菌体内に当該酵素が大量に蓄積するまで培養を行う。形質転換体の培養は、炭素源、窒素源などの当該微生物の増殖に必要な栄養源を含有する培地を用いて常法に従って行えばよい。例えば、大腸菌を宿主として使用する場合、培地として２ｘＹＴ培地（Methods in Enzymology,100,20(1983)）、ＬＢ培地、Ｍ９ＣＡ培地（Molecular Cloning、前述）などの大腸菌の培養に常用されている培地を用い、２０〜４０℃の培養温度で必要により通気攪拌しながら培養することができる。また、ベクターとしてプラスミドを用いた場合には、培養中におけるプラスミドの脱落を防ぐために適当な抗生物質（プラスミドの薬剤耐性マーカーに応じ、アンピシリン、カナマイシンなど）の薬剤を適当量培養液に加えて培養する。
【００３５】
培養中にインテグラーゼ遺伝子の発現を誘導する必要がある場合には、用いたプロモーターで常用されている方法で該遺伝子の発現を誘導する。例えば、ｌａｃプロモーターやｔａｃプロモーターを使用した場合には、培養中期に発現誘導剤であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと略称する）を適当量添加する。
【００３６】
このようにして調製した培養物から膜分離あるいは遠心分離処理などにより菌体を回収する。回収した菌体を適当な緩衝液に懸濁し、超音波処理、フレンチプレス処理などにより物理的に菌体を破砕するか、あるいはリゾチーム処理など酵素的に溶菌させ、菌体残さを遠心分離または膜処理により除去して無細胞抽出液を調製する。さらに、硫安塩析処理、透析処理、エタノールなどの溶媒処理、各種クロマトグラフィー処理などの酵素精製に通常使用されている処理を単独で、または数種組み合わせてインテグラーゼを調製する。      
【００３７】
調製されたインテグラーゼを用いて、その活性および特性の解析や確認を文献（Thorpe, H. M. and Smith M. C. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 5505-5510 (1998), Bibb, L. A., et al., Mol. Microbiol., 55, 1896-1910 (2005)）の方法に従い、実施することができる。
【００３８】
（２）本発明のインテグラーゼの利用
このように調製されたインテグラーゼ遺伝子を適当なベクターに挿入し、真核生物細胞に注入すること、あるいはインテグラーゼ遺伝子のｍＲＮＡを真核生物細胞に注入することで、ａｔｔＢとａｔｔＰ  ＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ間で部位特異的組換えを誘導することができる。具体的には、文献（Thyagarajan, B., et al., Mol. Cell Biol., 21, 3926-3934 (2001)、Gtoth, A. C., et al., Genetics, 166, 1775-1782 (2004)）などの方法に準じて実施できる。
【００３９】
まず、インテグラーゼを真核細胞内で生産させるためのベクターを作製する。インテグラーゼを真核生物細胞内で産生させるために使用する発現制御シグナルとしては、人為的制御が可能で、インテグラーゼの産性を制御できるような転写開始並びに翻訳開始シグナルを用いることが望ましい。ベクターとしては、種々のプラスミドなど、真核生物細胞内で複製できないベクターが使用可能である。
【００４０】
次に、ａｔｔＢ（もしくはａｔｔＰ）ＤＮＡ配列を含有し、適当な薬剤耐性などのマーカーを有し、複製機能を持たないプラスミドを作製し、対象とする真核生物細胞に導入し、染色体にインテグレートさせる。真核生物細胞を形質転換する方法はすでに多くの方法が報告されており、宿主として使用する生物に応じて適宜選択すればよい。
【００４１】
また、導入を目的とする遺伝子とａｔｔＰ（もしくはａｔｔＢ）ＤＮＡ配列を含有し、真核生物内で複製できないプラスミドを作製する。なお、このベクターは先のａｔｔＢ（もしくはａｔｔＰ）含有ベクターとは、異なる選択マーカーを有する事が望ましい。
【００４２】
次に作製したａｔｔＢ（もしくはａｔｔＰ）含有細胞にａｔｔＰ（もしくはａｔｔＢ）含有プラスミドとインテグラーゼ遺伝子含有ベクターを同時に注入する。導入されたインテグラーゼ遺伝子含有ベクターにより一時的にインテグラーゼを発現させ、染色体上のａｔｔＢ（もしくはａｔｔＰ）と導入されたａｔｔＰ（もしくはａｔｔＢ）ＤＮＡ配列間で部位特異的な組換えを起こさせ、ａｔｔＰ（もしくはａｔｔＢ）含有プラスミドを染色体上のａｔｔＢ（もしくはａｔｔＰ）部位に組み込むことができる。
【００４３】
また、インテグラーゼ遺伝子を鋳型としてインテグラーゼのｍＲＮＡを常法に従い試験管内で合成し、インテグラーゼ遺伝子含有ベクターの代わりに該ｍＲＮＡを細胞内に注入することで、インテグラーゼを一過的に合成させて、同時に注入されたａｔｔＰ（もしくはａｔｔＢ）含有プラスミドを染色体内に組み込むこともできる。なお、この際に本発明のインテグラーゼ遺伝子を利用すれば、形質転換時のＤＮＡ濃度を制限することができ、もって部位非特異的なａｔｔＰ（もしくはａｔｔＢ）含有プラスミドの組み込みを抑制することができる。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。また、実施例におけるＤＮＡの調製、制限酵素による切断、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結、大腸菌の形質転換法、ＤＮＡ塩基配列の決定などは全て「Molecular cloning II」（Sambrookら編、Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)）に従って行った。また、制限酵素、及びＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼなどのＤＮＡ関連酵素はすべて宝バイオ（株）より入手した。
【００４５】
実施例１；アクチノファージＴＧ１インテグラーゼ遺伝子のクローニング
プラスミドｐＧＥＸ−６Ｐ−１（GE Healthcare Bioscience社より入手）を鋳型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法によりＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）遺伝子を増幅した。
【００４６】
プライマー（Ａ）5'-CTACAGCCACTAGTCATATGGAATCCCCTATACTAGG-3'
プライマー（Ｂ）5'-TCCCAGGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGATCCGATTTTGGAGG-3'
【００４７】
ＰＣＲによるＧＳＴ遺伝子の増幅は、反応液１００μＬ中（５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々０．２μＭ、ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）２．５ユニット）をPerkin-Elmer Cetus Instrument社製  DNA Thermal Cyclerを用いて、熱変性（９８℃、１０秒）、アニーリングとポリメライゼーション（６８℃、２分）のステップを３０回繰り返すことにより行った。
【００４８】
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（Molecular Cloning II、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、０．７ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断し、同じく制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＥＴ−２１ａＡ（Ｎｏｖａｇｅｎ社より入手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３３２３）を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＥＴ−ＧＳＴを単離した。ｐＥＴ−ＧＳＴは、ｐＥＴ−２１ａのＴ７プロモーター下流のＮｄｅＩとＢａｍＨＩ切断部位に０．７ｋｂのＧＳＴ遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【００４９】
アクチノファージＴＧ１のａｔｔＰ配列を含む２．４８ｋｂのＮｓｉＩ−ＸｈｏＩＤＮＡ断片がｐＵＣ１８に挿入されたプラスミドｐＫＵ４６２（北里大学より入手）を鋳型としてφＣ３１インテグラーゼ遺伝子と相同性を示すオープンリーディングフレーム（１８６０ｂｐ）を以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法により増幅した。
【００５０】
プライマー（Ｃ）5'-TTCCAGGGGCCCCTGGGATCCATGGTCATTCTGGCAGGCGGC−３'
プライマー（Ｄ）5'-AAAACCATGGGACGGATCCTCACGCCGCCGCTGTGAACCC−３’
【００５１】
ＰＣＲによるφＣ３１インテグラーゼ遺伝子の増幅は、反応液１００μＬ中（５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ｃ）（Ｄ）各々０．２μＭ、ＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニット）をPerkin-Elmer Cetus Instrument社製  DNA Thermal Cyclerを用いて、熱変性（９８℃、２０秒）、アニーリング（５０℃、３５秒）、ポリメライゼーション（７２℃、２分）のステップを３０回繰り返すことにより行った。
【００５２】
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（Molecular Cloning II、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．８６ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、同じく制限酵素ＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＥＴ−ＧＳＴとＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ社より入手）を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＥＴＧＳＴ−ＴＧ１を単離した。ｐＥＴ−ＧＳＴは、ｐＥＴ−ＧＳＴのＧＳＴ遺伝子下流のＢａｍＨＩ切断部位に１．８６ｋｂのアクチノファージＴＧ１のインテグラーゼ遺伝子がＧＳＴ遺伝子とインフレームで挿入されたものである。
【００５３】
なお、プラスミドｐＥＴＧＳＴ−ＴＧ１は、プラスミドＤＮＡ（ｐＥＴＧＳＴ−ＴＧ１）の表記で、平成１８年（２００６）２月２４日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに国内寄託がなされ、受託番号としてＦＥＲＭ  ＡＰ−２０８１７を与えられている。
【００５４】
実施例２：アクチノファージＴＧ１インテグラーゼの発現と調製
プラスミドｐＥＴＧＳＴ−ＴＧ１を保持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌をアンピシリンを１００μｇ／ｍｌ含有するＬＢ培地で３０℃で２時間培養後、終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、２５℃で３時間培養した。遠心分離により菌体を回収し、１ｘＰＢＳ緩衝液（（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．３）で再懸濁した。超音波破砕を３０秒間、２回行い、遠心分離によって上清を得た。この上清からBulk GST Purification Module（GE Healthcare Biosciences社製）を用いてＧＳＴ−ＴＧ１インテグラーゼ融合蛋白質を精製した。
【００５５】
１ｘＰＢＳで平衡化したGlutathione Sepharose 4Bを上清に添加し、１×ＰＢＳで洗浄後、１×PreScission buffer（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＤＴＴ）を添加し室温で１時間放置した。その後、０．０５ＵｎｉｔのPreScission protease（GE Healthcare Biosciences社製）を含んだ１×PreScission bufferを添加し、４℃で４時間放置し、ＧＳＴとインテグラーゼの間に存在するPreScission proteaseサイトで切断を行った。遠心分離によりＴＧ１インテグラーゼを回収し、酵素標品とした。
【００５６】
実施例３：アクチノファージＴＧ１インテグラーゼの活性解析
ＴＧ１インテグラーゼの基質となるａｔｔＢ断片の調製のため、Streptomyces vermitilisの染色体の一部を含むコスミドＣＬ＿２３７＿Ａ０７（北里大学より入手）を鋳型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、該菌株のａｔｔＢ配列を含む５００ｂｐのＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅した。
【００５７】
(ＴＧ１ａｔｔＢ５００−５')
５’−TTCCAGGGGCCCCTGAGTACTGCCGAGCGGCCGGATGTCGG−３’
(ＴＧ１ａｔｔＢ５００−３')
５’−AAAACCATGGGACGGATCCCCCGGCTGCTGCTCGTCAAC−３’
【００５８】
３ｐｍｏｌのＴＧ１インテグラーゼと０．０３ｐｍｏｌのａｔｔＰ配列を含むプラスミドｐＫＵ４６２ＤＮＡ、および０、０．０１ｐｍｏｌ、０．０３ｐｍｏｌ、０．０９ｐｍｏｌ、０．３ｐｍｏｌとなるようにａｔｔＢ−ＤＮＡ断片を加え、全量１０μｌのReaction buffer（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）で、３０℃で２時間保温した。反応後、６５℃で１０分間保温し、インテグラーゼ反応を停止させた。反応液を1.0％アガロースゲル電気永動に供し、酵素活性を解析した。
【００５９】
反応の模式図を図４に示し、結果を図１に示す。その結果から明らかなように、調製したＴＧ１インテグラーゼが当該活性を有していることが確認され、さらにこれまで知られているφＲＶ１インテグラーゼなどと異なり、基質濃度が０．０１ｐｍｏｌでも組換え反応が進行することが確認された。
【００６０】
次に、前記と同じ反応条件（ａｔｔＢ−ＤＮＡ断片は、０．３ｐｍｏｌ）で、時間の経過による組換えを解析した。反応の模式図を図４に示し、結果を図２に示す。図２から明らかなように、φＲＶ１インテグラーゼなどと比べ反応速度は格段に速く、反応開始５分後には、すでに組換えが進行しており、２時間後ではほぼ組換え反応が終了していることが確認された。なお、ＴＧ１インテグラーゼ活性を上記の反応条件で１分間に１ｎｍｏｌの生成物を生成する活性を１ユニットとすると、φＲＶ１インテグラーゼの活性は１．６７ユニット／μｍｏｌ酵素（Bibb, L. A., et al., Mol. Microbiol., 55, 1896-1910 (2005)）、本発明のＴＧ１インテグラーゼは２６ユニット／μｍｏｌ酵素と算出され、ＴＧ１インテグラーゼは、従来のφＲＶ１インテグラーゼの約１６倍におよぶ高い活性を有していることが判明した。
【００６１】
さらに、前記の反応で、基質であるａｔｔＰ配列を含有するプラスミドｐＫＵ４６２ＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩＩで切断してLinearとしたものと、supercoilのままの状態での反応効率の違いを解析した。反応の模式図を図５に示し、結果を図３に示す。図３から明らかなように、基質ＤＮＡは、Ｌｉｎｅａｒでもｓｕｐｅｒｃｏｉｌどちらの状態であっても組換え効率に差はないことが確認された。
【００６２】
＜受領書＞
2007228920.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、はｓｕｐｅｒｃｏｉｌ状のプラスミド（ｐＫＵ４６２）、５００ｂｐのａｔｔＢ断片、精製したＴＧ１ｉｎｔｅｇｒａｓｅを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける組換え反応の結果を示したものである。反応には０．０３ｐｍｏｌのｐＫＵ４６２、３ｐｍｏｌのＴＧ１ｉｎｔｅｇｒａｓｅを用いた。ａｔｔＢ断片の量は、左から、ＤＮＡ無し、０．０１ｐｍｏｌ、０．０３ｐｍｍｏｌ、０．０９ｐｍｏｌ、０．３ｐｍｏｌを示す。Ｐは反応物、Ｓは基質ＤＮＡを示す。Ｍはサイズマーカーである。
【図２】図２は、時間の経過による生成物の変化を調べた結果である。反応は図１の時と同じである。ａｔｔＢ断片の量は、０．３ｐｍｏｌ用いた。レーン上の数字は反応させた分数を示す。
【図３】図３は、組換え反応の基質がＬｉｎｅａｒとＳｕｐｅｒｃｏｉｌの状態での組換え反応の効率の違いと調べた結果を示したものである。反応は、図２の時と同じである。組換え反応前に制限酵素処理したものはＬｉｎｅａｒ、組換え反応後に制限酵素処理したものはＳｕｐｅｒｃｏｉｌを示す。レーン上の数字は反応時間（分）を示す。
【図４】図４は、図１と図２の反応の模式図を示したものである。ａｔｔＰ配列を持ったプラスミドｐＫＵ４６２と５００ｂｐのａｔｔＢ配列を持ったＰＣＲ産物が反応することにより、ａｔｔＬ配列とａｔｔＲ配列を持った生成物ができる。
【図５】図５は、図３の反応の模式図を示したものである。上の図は、Ｓｕｐｅｒｃｏｉｌ状のｐＫＵ４６２とａｔｔＢ断片との組換え産物をＢｇｌＩＩで切断を行ったものである。下の図は、ｐＫＵ４６２をＢｇｌＩＩによって切断し、ＬｉｎｅａｒとなったｐＫＵ４６２とａｔｔＢ断片を用いて組換え反応を行ったものである。それぞれの反応で、４０６０ｂｐと１９１３ｂｐの断片が生じる。
【図１】
2007228920.tif 000003
【図２】
2007228920.tif 000004
【図３】
2007228920.tif 000005
【図４】
2007228920.tif 000006
【図５】
2007228920.tif 000007
【配列表】
2007228920000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年3月23日(2006.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
なお、プラスミドｐＥＴＧＳＴ−ＴＧ１は、プラスミドＤＮＡとしてｐＥＴＧＳＴ−ＴＧ１の表記で、平成１８年（２００６）２月２４日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに国内寄託がなされ、受託番号としてＦＥＲＭ  Ｐ−２０８１７を与えられている。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
＜受託証＞
2007228920.tif 000008