(57)【要約】【課題】  検体中の分析対象物質をイムノクロマト法で検出あるいは測定する際に、判定の実施時刻を厳密に管理する必要がない検出あるいは測定方法及びそれに用いるキットが求められていた。【解決手段】  少なくとも判定部位と標識結合体保持部位を有する乾式試験片を使用し、展開液を用いて毛管作用により検体を移送する検体中の分析対象物質の検出あるいは測定において、展開液の緩衝剤の濃度が０．０１ｍＭ〜１０ｍＭであることを特徴とする検体中の分析対象物質の検出あるいは測定方法及びｓれに用いる検査・測定キットを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも判定部位と標識結合体保持部位を有する乾式試験片を使用し、展開液を用いて毛管作用により検体を移送する検体中の分析対象物質の検出あるいは測定において、展開液の緩衝剤の濃度が０．０１ｍＭ〜１０ｍＭであることを特徴とする検体中の分析対象物質の検出あるいは測定方法。
【請求項２】
標識が金コロイドである請求項１に記載の検体中の分析対象物質の検出あるいは測定方法。
【請求項３】
判定部位及び／又は標識結合体保持部位において検体中の分析対象物質と抗体が結合することを特徴とする請求項１又は２に記載の検体中の分析対象物質の検出あるいは測定方法。
【請求項４】
展開液の緩衝剤がリン酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール又は２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸である請求項１〜３のいずれか一項に記載の検体中の分析対象物質の検出あるいは測定方法。
【請求項５】
検体が乳頭分泌液である請求項１〜４のいずれか一項に記載の検体中の分析対象物質の検出あるいは測定方法。
【請求項６】
分析対象物質が癌胎児性抗原である請求項１〜５のいずれか一項に記載の検体中の分析対象物質の検出あるいは測定方法。
【請求項７】
乾式試験片及び展開液を含んで構成され、請求項１〜６のいずれか一項に記載された検体中の分析対象物質の検出あるいは測定方法で用いる検査・測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、判定部位と標識結合体保持部位を有する乾式試験片を使用し、展開液を用いて毛管作用により検体を移送する検体中の分析対象物質の検出あるいは測定において、展開液の緩衝剤が特定の濃度であることを特徴とする検体中の分析対象物質の検出あるいは測定方法、及びそれに用いる検査・測定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料中に含まれる微量物質を体外で検出あるいは測定する方法として、免疫学的測定方法が汎用されている。その手法の内、クロマトグラフィーを用いた、いわゆるイムノクロマト（グラフ）法は操作が簡単で結果がでるまでの時間も短いため、近年、家庭や病院における臨床検査や臨床診断で広く利用されている。
【０００３】
イムノクロマト法の典型例としては、液体が毛管現象で移動することができる多孔性のシート状ストリップ（乾式試験片）に、検出あるいは測定する分析対象物質に特異的に反応する抗体が固定化された判定部位、その上流に金コロイド等の着色粒子で標識された検出あるいは測定する分析対象物質に特異的に反応する抗体（標識抗体）がストリップに固定されていない状態で塗布、乾燥等により配置された標識結合体保持部位を有し、これの判定部位の上流から分析対象物質を含む液体試料を添加し、展開液又は液体試料それ自身により溶解した標識抗体と該分析対象物質を反応させ、更に、ストリップの判定部位に固定化された抗体に「分析対象物質−標識抗体」複合体を捕獲させて、判定部位における金コロイド等の着色粒子の標識により液体試料中の分析対象物質の検出あるいは測定をする方法がある。
特許文献１及び２には少量の生体試料中の分析対象物質をイムノクロマト法で検出する方法が記載されているが、緩衝剤の濃度についての検討はしていない。
【０００４】
【特許文献１】特開平１０−１７７０２８号公報
【特許文献２】特開平１０−１８５９２０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
生体試料中の分析対象物質をイムノクロマト法で検出する場合、該物質がある濃度以上あるいはある濃度以下であることをもって判断する場合が多い。即ち、ストリップの判定部位に着色が観察されるか否か、あるいはその着色強度が所定の強度より濃いかあるいは薄いかにより判断する。又、生体試料中の分析対象物質の濃度をストリップの判定部位の着色強度から求める場合もある。ところが、この着色強度は反応時間とともに増加し、更に、その後のストリップの乾燥等によっても変化するため、信頼できる測定結果を得るためには判定までの時間を厳密に管理する必要があった。
上記の測定者の負担を軽くする分析対象物質の検出あるいは測定方法が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は前記課題を解決すべく鋭意研究の結果、展開液を用いるイムノクロマト法において、展開液の緩衝剤の濃度を０．０１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲にすることにより、判定時間後の判定部位の着色強度の経時変化が少なくなることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
即ち、本発明は以下の（１）〜（７）に関する。
（１）少なくとも判定部位と標識結合体保持部位を有する乾式試験片を使用し、展開液を用いて毛管作用により検体を移送する検体中の分析対象物質の検出あるいは測定において、展開液の緩衝剤の濃度が０．０１ｍＭ〜１０ｍＭであることを特徴とする検体中の分析対象物質の検出あるいは測定方法。
【０００８】
（２）標識が金コロイドである上記（１）に記載の検体中の分析対象物質の検出あるいは測定方法。
（３）判定部位及び／又は標識結合体保持部位において検体中の分析対象物質と抗体が結合することを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の検体中の分析対象物質の検出あるいは測定方法。
【０００９】
（４）展開液の緩衝剤がリン酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール又は２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸である上記（１）〜（３）のいずれか一項に記載の検体中の分析対象物質の検出あるいは測定方法。
（５）検体が乳頭分泌液である上記（１）〜（４）のいずれか一項に記載の検体中の分析対象物質の検出あるいは測定方法。
（６）分析対象物質が癌胎児性抗原である上記（１）〜（５）のいずれか一項に記載の検体中の分析対象物質の検出あるいは測定方法。
（７）乾式試験片及び展開液を含んで構成され、上記（１）〜（６）のいずれか一項に記載された検体中の分析対象物質の検出あるいは測定方法で用いる検査・測定キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の特定の濃度の緩衝剤を含有する展開液を用いた検体中の分析対象物質の検出あるいは測定方法は、従来の方法に比べて判定部位での着色が所定の判定時間以降で変化が少なく、いつでも判定を行うことができ、判定時間によらず信頼できる結果が得られる。この結果、本発明の方法及びそれに用いる検査・測定キットにより判定時間を厳密に管理する必要がなくなり、イムノクロマト法による検査・測定を簡便に行うことが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の検体中の分析対象物質の検出あるいは測定方法は、少なくとも判定部位と標識結合体保持部位を有する乾式試験片を使用し、展開液を用いて毛管作用により検体を移送する検体中の分析対象物質の検出あるいは測定において、展開液の緩衝剤の濃度が０．０１ｍＭ〜１０ｍＭであることを特徴とする。
【００１２】
本発明の検出あるいは測定方法に使用する乾式試験片とは、液体が毛管現象で移動することができる多孔性のシート状ストリップであり、通常のイムノクロマト法で用いられる短冊状のクロマトグラフィー用基材を用いることができる。この乾式試験片の一部に判定部位、その上流に標識結合体保持部位を設けたものである。
【００１３】
本発明の検出あるいは測定方法に使用する乾式試験片における判定部位とは、検体中の検出あるいは測定する分析対象物質と特異的に結合する物質が固定化されており、例えば、標識結合体の結合した分析対象物質が結合すると、それを肉眼又はデンシトメータ等の装置で判定する部位である。判定部位のストリップは展開液及び検体が毛管現象により移動するものであれば特に材質は問わないが、一般的なクロマトグラフィー用基材、例えば、セルロース、ニトロセルロースのようなセルロース修飾体、ナイロン、ポリエチレン、ろ紙又はガラス繊維等の多孔性膜や繊維状膜等の基材が好ましく、特にニトロセルロース膜が好ましい。
【００１４】
分析対象物質又は標識結合体の結合した分析対象物質と特異的に結合する物質としては適宜選択され得るが、例えば、タンパク質や糖鎖には抗体やレクチンが挙げられる。抗体にはそれと特異的に結合する抗原が挙げられる。中でもタンパク質の場合には抗体が好ましい。又、ＤＮＡやＲＮＡの場合はその相補的なＤＮＡやＲＮＡを用いることもできる。
【００１５】
分析対象物質又は標識結合体の結合した分析対象物質と特異的に結合する物質のストリップへの固定化方法は、物理吸着や共有結合等の公知の方法を用いることができ、又、固定化した後、検出あるいは測定の際の干渉を防ぐために必要に応じて公知のブロッキング処理を行ってもよい。
【００１６】
本発明の検出あるいは測定方法に使用する乾式試験片における標識結合体保持部位とは判定部位の上流にあり、検体中の検出あるいは測定する分析対象物質と特異的に結合する物質に標識体を物理吸着若しくは化学結合で結合させたもの、又は、単離精製した分析対象物質に標識体を物理吸着若しくは化学結合で結合させたものを塗布、乾燥等により固定されていない状態、即ち、展開液により下流に移動できる状態で配置した部位である。
【００１７】
標識結合体保持部位は、判定部位と同一のストリップ上に設けても、判定部位とは異なる、例えば、ガラス繊維ろ紙等のクロマトグラフィー用基材に別の部品として作製し、判定部位のストリップと繋げることにより乾式試験片としてもよい。
【００１８】
標識結合体に用いる分析対象物質と特異的に結合する物質としては、分析対象物質によって適宜選択され、例えば、タンパク質や糖鎖には抗体やレクチンが挙げられる。抗体にはそれと特異的に結合する抗原が挙げられる。分析対象物質がタンパク質の場合、抗体が好ましい。又、ＤＮＡやＲＮＡの場合はその相補的なＤＮＡやＲＮＡを用いることもできる。
標識結合体は、展開液等と接触して容易に溶け標識結合体保持部位に残らないようにするため、ショ糖やマンニトール等の糖類やアミノ酸、牛血清アルブミンやカゼイン等のタンパク質とともに塗布・乾燥するとよい。
【００１９】
標識体としては、着色粒子が好ましく、例えば、金、銀、白金若しくは銅等の金属粒子あるいは金属コロイド；酸化鉄等の金属酸化物粒子あるいは金属酸化物コロイド；フタロシアニン系若しくはアゾ系等の顔料粒子；セレン、テルル、硫黄等の非金属粒子；又は、染料等で着色したものを含む有色ラテックス粒子等が挙げられ、特に金コロイドが好ましい。
【００２０】
本発明における検出あるいは測定方法に使用する緩衝剤とは、溶液のｐＨを一定に保つ目的で生化学実験等に一般に使用される緩衝液を作るための試薬であり、本発明に使用する展開液に緩衝作用を持たせるために用いる。緩衝液は酸とその塩の混合液、塩基とその塩の混合液、あるいは、多価の酸若しくは塩基の場合は塩と塩（例えば、炭酸ナトリウムと炭酸水素ナトリウム等）の混合液等である。
該緩衝剤としては特に限定されず、一般の生化学実験等に使用されるものが挙げられ、例えば、リン酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）、ホウ酸、酢酸、クエン酸、炭酸、グリシン、グッド（例えば、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸等）等が挙げられる。なお、これらは遊離の酸あるいは塩基として示したものであり、通常の緩衝剤として知られるこれらの塩を使用したものであってもよい。
又、リン酸−クエン酸緩衝液の様に複数の緩衝剤を組み合わせて使用することもできる。
本発明の検出あるいは測定方法に使用する緩衝剤としてはリン酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸が好ましく、中でもトリスが特に好ましい。
【００２１】
本発明における展開液中の緩衝剤濃度としては、緩衝作用を有する酸あるいは塩基の濃度として０．０１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲が好ましく、２．５ｍＭ〜１０ｍＭの範囲がより好ましい。緩衝剤の濃度が０．０１ｍＭより低くなると緩衝作用が不十分になる。
【００２２】
更に、展開液には、緩衝剤以外に緩衝作用の無い食塩等を添加して使用することもでき、又、生物学的親和性に基づく副反応を抑制したり、非特異反応を抑制するために公知の添加剤を添加して使用してもよい。
該添加剤としては、例えば、抗原抗体反応の促進あるいは非特異反応の抑制のための蛋白質（例えば、牛血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン等）、高分子化合物（例えば、ポリエチレングリコール、デキストラン、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等）、非イオン性界面活性剤（例えば、ツイーン２０、トリトンＸ−１００等）、イオン性界面活性剤又はポリアニオン（例えば、デキストラン硫酸、ヘパリン、ポリスチレンスルホン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等）若しくはその塩等；あるいは、抗菌剤としてのアジ化ナトリウム、チメロサール、ケーソンＣＧ、長鎖アルキル４級アンモニウム塩等が挙げられる。
【００２３】
本発明の検出あるいは測定方法に使用する乾式試験片には、必要に応じて、検体を添加するための試料添加部位、検体中の血球等の固形成分を除去する部位（血球分離部位等）、展開液を添加するための展開液添加部位、判定部位に捕獲されなかった検体や展開液を吸い取る吸収部位（吸収パッド等）、測定が正常に行われたことを示す対照部位等を組み入れてもよい。これらの部位の部材は、毛管現象により分析対象物質や展開液が移動できれば特に限定されず、単一の多孔性部材シートであってもよいが、一般的には、ニトロセルロース膜、ろ紙、ガラス繊維ろ紙等の複数の多孔性部材からその目的に応じた部材を選択して用い、台紙等に貼り付けて毛管がつながるように各部材を配置して乾式試験片として構成してもよい。更に、プラスチックのケース等に入れて乾式試験片としてもよい。本発明に使用する乾式試験片の１態様を図１に示す。
【００２４】
本発明の検出あるいは測定方法は、展開液を標識結合体保持部位又はその上流に設けた展開液添加部位に添加する。検体の量、検体の性質、検出あるいは測定の目的等により、検体と展開液を別々に乾式試験片に添加しても、検体をあらかじめ展開液で希釈して添加してもよい。検体と展開液を別々に乾式試験片に添加して検出あるいは測定する場合には、検体は判定部位の上流で且つ展開液添加部位の下流で、標識結合体保持部位に接触しない部分に設けた試料添加部位に検体を添加した後に展開液を展開液添加部位に添加して検出あるいは測定を行う。あらかじめ展開液で検体を稀釈して検出又は測定する場合は、試料添加部位を別に設ける必要はなく、検体を希釈した展開液を展開液添加部位に添加すればよい。
【００２５】
本発明の検出あるいは測定方法において展開液と検体の量比は、検体と展開液を別々に乾式試験片に添加して検出あるいは測定を行う場合には、判定部位にトラップされなかった検体中の成分を判定部位の下流に移動させることができる展開液量があればよい。一方、検体を展開液であらかじめ稀釈して検出又は測定を行う場合には、展開終了後においても検体中の成分は判定部位に留まり着色強度の経時変化に影響を及ぼすので、影響を及ぼさない濃度まで展開液で稀釈しなければならない。好ましくは、検体を展開液により４倍以上に稀釈し、検体稀釈液中の検体濃度として２５％以下にするのが好ましい。
【００２６】
本発明の検出あるいは測定方法の検体としては、例えば、生体試料、即ち、血液、血漿、血清、尿、唾液、髄液、羊水、乳頭分泌液、涙、汗、皮膚からの浸出液、組織や細胞及び便からの抽出液等が挙げられる。好ましくは、微量しか採取できない乳頭分泌液が挙げられる。
本発明の検出あるいは測定方法における分析対象物質としては、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＨＥＲ２タンパク、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＣＡ１９−９、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、免疫抑制酸性タンパク（ＩＰＡ）、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、便潜血、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ＣＫ−ＭＢ、ＣＲＰ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、梅毒抗体、インフルエンザウイルス、クラミジア抗原、Ａ群β溶連菌抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｓ抗原、ロタウイルス、アデノウイルス、アルブミン、糖化アルブミン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。中でも、ＣＥＡが好ましい。
【００２７】
本発明には、上記の乾式試験片、展開液を含む検体中の分析対象物質を検出あるいは測定する検査・測定キットも含まれ、該キットは、その他に、検体採取用具、展開液滴下用具、測定対象物質の濃度を決めるための判定見本等を含む構成であってもよい。
【実施例】
【００２８】
以下に、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２９】
実施例１  トリス−塩酸緩衝液を用いた展開液によるＣＥＡの測定
（１）測定装置の作製
１）金コロイドの調製
濃度０．０１重量％の塩化金酸水溶液４００ｍｌを沸騰させ、これに濃度１重量％のクエン酸ナトリウム水溶液６ｍｌを加え、溶液の色が赤色に変わるまで加熱沸騰し、金コロイド分散液を調製した。その後、遠心分離機により金コロイドを沈殿させ上清を抜き取り、精製水で再分散してＯＤ（光学濃度）＝３．０に調製した。
２）金コロイド粒子標識抗体の調製
１）で調製した金コロイド分散液１００ｍｌに１ｍＭ炭酸カリウム水溶液を加えｐＨ７．２に調整した後、蒸留水を加えて全量を３００ｍｌにした。それに、０．５ｍｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＣＥＡモノクローナル抗体Ｆ（ａｂ’）２を３ｍｌ加えて１５分攪拌した後、１０重量％のＢＳＡ（牛血清アルブミン）を含む４ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５を３４ｍｌ加え１０分間攪拌した。この分散液を４℃、１０，０００ｒｐｍで１時間遠心して上清を除いた後、得られたペレットに１重量％のＢＳＡを含む４ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５を加えて再懸濁した。同様にして遠心操作を更に２回繰り返した後、ＯＤ＝３．０になるよう再懸濁した。
３）金コロイド粒子標識抗体パッド（標識結合体保持部材）の調製
上記の金コロイド粒子標識抗体懸濁液５．５ｍｌに１重量％のＢＳＡと５重量％のサッカロースを含む４ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５を５．５ｍｌ加えよく混合した後、その全量をミリポア社製グラスファイバーフィルター（１０×１８ｃｍ）に含浸させ凍結乾燥した。
４）抗体固定化メンブレン
１００ｍＭ食塩水に溶解したウサギ抗ヒトＣＥＡ抗体（濃度２ｍｇ／ｍｌ）を２５×２５０ｍｍに切断したミリポア社製ニトロセルロースメンブレン（ハイフローメンブレン、マイラーバック）の判定部位とする位置（図１参照）に幅１ｍｍのライン状に添着し風乾した。その後、１重量％のスキムミルクを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５に１時間浸漬し、次いで３重量％のサッカロースを含む５ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５に１時間浸漬し、再び風乾して抗体固定化メンブレンとした。
５）装置の組み立て
上流側から展開液添加部位となる展開液添加パッド（アドバンテック東洋製ろ紙、１５ｍｍ×５ｍｍ）、金コロイド粒子標識抗体パッド（２０ｍｍ×５ｍｍ）、試料添加部位（ミリポア社製グラスファイバーフィルター、８ｍｍ×５ｍｍ）、検体中の血球成分を除くための血球分離膜（ワットマン社製ＧＦ／ＡＶＡ、１１ｍｍ×５ｍｍ）、抗体固定化メンブレン（２５ｍｍ×５ｍｍ）、未反応の検体及び展開液を吸い取る吸収パッド（アドバンテック東洋製ろ紙、３０ｍｍ×５ｍｍ）の順に糊の付いたプラスチックシート上に各部品を１ｍｍの重なりをもって繋がるように貼り付けて配置し（図１参照）、測定装置を作製した。
（２）測定
１）展開液
０．１％トリトンＸ−１００、０．３％塩化ナトリウム及び０．０２％アジ化ナトリウムを含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）を試験用展開液として調製した。なお、トリス−塩酸緩衝液中のトリスの濃度は０．０１ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭになるように調製した。
２）測定
検体として１０００ｎｇ／ｍｌのＣＥＡ標準品を含有する血清を用いて、（１）の測定装置の試料添加部位に３μｌ添加し、直ちに展開液２００μｌを展開液添加部位に添加する。判定部位に出現した金コロイドの着色を、１５分後、３０分後、６０分後、９０分後及び１２０分後にアトー株式会社製デンシトメータで測定した。デンシトメータのＣＣＤカメラで撮影した画像をデータ処理ソフト（ＡＴＴＯ  Ｄｅｎｓｉｔｏｇｒａｐｈ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  Ｌａｎｅ  ＆  Ｓｐｏｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；アトー株式会社）で処理して、金コロイドによる着色強度を輝度として求めた。１５分後の輝度と各々の時間の輝度の比（輝度比）をもって１５分以降の経時変化を表１に示す。
【００３０】
比較例１  トリス−塩酸緩衝液を用いた展開液によるＣＥＡの測定
実施例１の測定装置を用い、展開液のトリス−塩酸緩衝液中のトリスの濃度を２５ｍM、５０ｍＭ、１５０ｍＭにして実施例１と同様な方法で測定を行ない、結果を表１に示す。
【００３１】
［表１］
2007322310.tif 000002
表１に示すように、トリス濃度２５ｍＭ以上では、時間の経過とともに輝度が上昇し輝度比が大きくなっている（９０分で１．２３〜１．３４、１２０分で１．２４〜１．３６）。それに対して、トリス濃度１０ｍＭ以下では９０分で１．０３〜１．１７、１２０分で１．０６〜１．１２と、トリス濃度２５ｍＭ以上に比べて輝度比の変化が小さく、輝度の経時変化が小さいことが明らかである。
【００３２】
実施例２、比較例２  リン酸緩衝液展開液によるＣＥＡの測定
（１）測定装置
実施例１で作製した測定装置を使用した。
（２）測定
１）展開液
０．３％塩化ナトリウムを含むリン酸濃度５ｍＭのリン酸緩衝液（リン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素カリウム；ｐＨ＝７．５）（実施例２）又はリン酸濃度１５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）（比較例２）を試験用展開液とした。
２）測定
実施例１と同様な方法で測定し、評価結果を表２に示す。
（３）結果
表２に示すように、リン酸濃度１５０ｍＭのリン酸緩衝液を使用した場合と比較して、リン酸濃度５ｍＭのリン酸緩衝液を使用した場合には輝度比の変化が小さく、輝度の経時変化が小さいことが明らかである。
【００３３】
［表２］
2007322310.tif 000003
【００３４】
実施例３、比較例３  ＨＥＰＥＳ緩衝液展開液によるＣＥＡの測定
（１）測定装置
実施例１で作製した測定装置を使用した。
（２）測定
１）展開液
０．３％塩化ナトリウムを含む２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸−水酸化ナトリウム；ｐＨ＝７．５）（実施例３）又は２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸１５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．５）（比較例３）を試験用展開液とした。
２）測定
実施例１と同様な方法で測定し、評価結果を表３に示す。
（３）結果
表３に示すように、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸１５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液を使用した場合と比較して、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液を使用した場合には輝度比の変化が小さく、輝度の経時変化が小さいことが明らかである。
【００３５】
［表３］
2007322310.tif 000004
【００３６】
実施例４、比較例４  濃度の異なるトリス−塩酸緩衝液展開液で検体をあらかじめ稀釈した場合のＣＥＡの測定
（１）測定装置
実施例１で作製した測定装置を使用した。
（２）測定
１）検体含有展開液の調製
検体として１０００ｎｇ／ｍｌのＣＥＡ標準品を含有する血清を用いて、検体５μｌを各濃度のトリス−塩酸緩衝液を用いた試験用展開液でそれぞれ稀釈して２００μｌとした。試験用展開液は０．１％トリトンＸ−１００、０．３％塩化ナトリウム及び０．０２％アジ化ナトリウムを含むトリス濃度５ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）（実施例４）又はトリス濃度１５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）（比較例４）を用いた。
２）測定
検体含有展開液２００μｌを実施例１で作成した測定装置の展開液添加部位に添加し、判定部位に出現した金コロイドの着色を、１５分後、３０分後、６０分後及び１２０分後にアトー株式会社製デンシトメータで測定した。デンシトメータのＣＣＤカメラで撮影した画像をデータ処理ソフト（ＡＴＴＯ  Ｄｅｎｓｉｔｏｇｒａｐｈ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  Ｌａｎｅ  ＆  Ｓｐｏｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；アトー株式会社）で処理して、金コロイドによる着色強度を輝度として求めた。１５分後の輝度と各々の時間の輝度の比（輝度比）をもって１５分以降の経時変化を表４に示す。
（３）結果
表４に示すように、検体含有トリス濃度１５０ｍＭのトリス緩衝液を使用した場合と比較して、検体含有トリス濃度５ｍＭのトリス緩衝液を使用した場合には輝度比の変化が小さく、輝度の経時変化が小さいことが明らかである。
【００３７】
［表４］
2007322310.tif 000005
【００３８】
実施例５、比較例５  トリス−塩酸緩衝液を用いた展開液による乳頭分泌液中のＣＥＡの測定
（１）測定装置
実施例１で作製した測定装置を使用した。
（２）測定
１）展開液；０．１％トリトンＸ−１００、０．３％塩化ナトリウム、０．０２％アジ化ナトリウムを含むトリス濃度５ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）（実施例５）又はトリス濃度１５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）（比較例５）を展開液とした。
２）検体
検体Ｎｏ．１  ＣＥＡ１００ｎｇ／ｍｌを含む乳頭分泌液
検体Ｎｏ．２  ＣＥＡ４００ｎｇ／ｍＬを含む乳頭分泌液
検体Ｎｏ．３  ＣＥＡ１０００ｎｇ／ｍｌを含む乳頭分泌液
３）測定
測定装置の試料添加部位に各検体の乳頭分泌液３μｌを添加し、直ちに展開液２００μｌを展開液添加部位に添加する。判定部位に出現した金コロイドの着色を１５分後及び１２０分後にアトー株式会社製デンシトメータで測定した。デンシトメータのＣＣＤカメラで撮影した画像をデータ処理ソフト（ＡＴＴＯ  Ｄｅｎｓｉｔｏｇｒａｐｈ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  Ｌａｎｅ  ＆  Ｓｐｏｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；アトー株式会社）で処理して、金コロイドによる着色強度を輝度として求めた。１５分後の輝度に対する１２０分後の輝度の比（輝度比）をもって輝度比の経時変化を表５に示す。
（３）結果
表５に示すように、トリス濃度１５０ｍＭのトリス緩衝液を使用した場合と比較して、トリス濃度５ｍＭのトリス緩衝液を使用した場合は１２０分後の輝度比の変化が小さく、輝度の経時変化が小さいことが明らかである。
【００３９】
［表５］
2007322310.tif 000006
【００４０】
試験例  検体の異なる稀釈倍率によるトリス−塩酸緩衝液を用いた展開液によるＣＥＡの測定
（１）測定装置
実施例１で作製した測定装置を使用した。
（２）測定
１）検体含有展開液の調製
１０００ｎｇ／ｍｌのＣＥＡ標準品を含有する血清３μｌと、適量のＣＥＡ濃度０ｎｇ／ｍｌの血清及び展開液を用いて、検体含有展開液中の検体（血清）濃度が１００％、５０％、２５％、１．５％で、且つ、ＣＥＡ濃度を同一とした検体含有展開液２００μｌを調製した。試験用展開液は０．１％トリトンＸ−１００、０．３％塩化ナトリウム、０．０２％アジ化ナトリウムを含むトリス濃度５ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）を用いた。
２）測定
乾式試験片の展開液添加部位に上記１）で調製した検体含有展開液２００μｌを調製後直ちに添加する。判定部位に出現した金コロイドの着色を、１５分後、３０分後、６０分後及び１２０分後にアトー株式会社製デンシトメータで測定した。デンシトメータのＣＣＤカメラで撮影した画像をデータ処理ソフト（ＡＴＴＯ  Ｄｅｎｓｉｔｏｇｒａｐｈ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  Ｌａｎｅ  ＆  Ｓｐｏｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；アトー株式会社）で処理して、金コロイドによる着色強度を輝度として求めた。１５分後の輝度と各々の時間の輝度の比（輝度比）をもって１５分以降の経時変化を表６に示す。
（３）結果
表６に示すように、検体含有展開液中の検体濃度が５０％以上になると輝度比が大きくなり、輝度の経時変化が大きいことが明らかである。
【００４１】
［表６］
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【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明の検出あるいは測定方法に使用する乾式試験片の１態様を例示したもの
【図１】
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