(57)【要約】      （修正有）【課題】高耐熱性で、高塩濃度下においても高い、新たなＤＮＡポリメラーゼ反応系を提供する。【解決手段】超好熱性古細菌パイロコッカス・ホリコシ由来のＤＮＡポリメラーゼ、クランプ（ＤＮＡ複製中、鋳型ＤＮＡと伸長するプライマー鎖を外れないようにする留め金機能を有する複数のサブユニットからなるリング状のタンパク質複合体）及びインテイン配列を除去したクランプローダー（クランプの開閉を行う複数のサブユニットからなるタンパク質複合体）とから、ＤＮＡポリメラーゼ反応系を構築する。本反応系はＰＣＲに使用される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
デオキシヌクレオチド三リン酸を酵素基質として、ＤＮＡポリメラーゼによりプライマーＤＮＡを伸長させて、鋳型ＤＮＡと相補のＤＮＡを合成する方法であって、酵素反応系が、パイロコッカス・ホリコシ由来のＤＮＡポリメラーゼを有し、かつ以下のａ）及びｂ）のタンパク質複合体を含むことを特徴とする、ＤＮＡの合成方法。
ａ）３分子のサブユニットからなり、かつ、クランプ機能を有するタンパク質複合体であって、該サブユニットが配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質からなる、上記タンパク質複合体
ｂ）大サブユニット１分子と小サブユニット４分子からなり、かつ、クランプローダー機能を有するタンパク質複合体であって、大サブユニットが配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であり、小サブユニットが配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質からなる、上記タンパク質複合体。
【請求項２】
上記酵素反応系がＡＴＰを含有しないことを特徴とする、請求項１に記載の合成方法。
【請求項３】
上記酵素反応系が、０〜２００ｍＭ／Ｌ濃度の食塩を含有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の合成方法。
【請求項４】
パイロコッカス・ホリコシ由来のＤＮＡポリメラーゼを有し、かつ以下のａ）及びｂ）のタンパク質複合体を含むことを特徴とする、ＤＮＡ合成試薬キット。
ａ）３分子のサブユニットからなり、かつ、クランプ機能を有するタンパク質複合体であって、該サブユニットが配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質からなる、上記タンパク質複合体
ｂ）大サブユニット１分子と小サブユニット４分子からなり、かつ、クランプローダー機能を有するタンパク質複合体であって、大サブユニットが配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であり、小サブユニットが配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質からなる、上記タンパク質複合体。
【請求項５】
ＰＣＲに使用するものであることを特徴とする、請求項４に記載のＤＮＡ合成試薬キット。
【請求項６】
配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、請求項１のa）に記載のタンパク質複合体を形成したとき、クランプ機能を有するタンパク質。
【請求項７】
配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、請求項１のｂ）に記載の小サブユニットとタンパク質複合体を形成したとき、クランプローダー機能を有するタンパク質。
【請求項８】
配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、請求項１、ｂ）に記載の大サブユニットとタンパク質複合体を形成したとき、クランプローダー機能を有するタンパク質。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項９に記載のＤＮＡを含有することを特徴とする組み換えベクター
【請求項１１】
請求項１０に記載の組み換えベクターが導入されていることを特徴とする、形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パイロコッカス由来のＤＮＡポリメラーゼの働きを増強させる二つのDNA複製因子、及び該因子を用いたＤＮＡポリメラーゼ反応系に関する。
【背景技術】
【０００２】
DNAポリメラーゼはDNAシークエンシング反応、遺伝子増幅反応(PCR反応)、DNAの放射活性標識、変異遺伝子の試験管内合成等に有用な酵素である。現在までに知られているＤＮＡポリメラーゼは、アミノ酸配列の共通性から、大きく6つのファミリーに分類することができる。その中で一般的に遺伝子操作実験用試薬として利用されているのは、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩや好熱菌サーマスアクアティカスＤＮＡポリメラーゼ（Taq DNAポリメラーゼ）に代表されるファミリーＡと、Ｔ４ファージＤＮＡポリメラーゼに代表されるファミリーＢに属するものである。今までに至適温度の異なる種々のDNAポリメラーゼが細菌や動植物から発見されているが、多くが常温生物由来のため、耐熱性に乏しく、鋳型DNAの94℃以上での熱変性反応を含むPCR反応等には不適当であった。
【０００３】
また、耐熱性DNAポリメラーゼとしてTaq DNAポリメラーゼ等の好熱性細菌由来の酵素が市販されているが、いずれも3'-5'校正エキソヌクレアーゼ活性を欠くため、PCR反応等のポリメラーゼ反応中にエラーを誘発しやすく、PCR反応等には不向きである。また、高耐熱性で3'-5'校正エキソヌクレアーゼ活性を持つB型酵素が、パイロコッカスやサーモコッカス等の超好熱性古細菌より単離され、市販されているがプライマー伸長活性が弱く、長鎖DNAのPCR反応には適さない。
例えば、遺伝子増幅法としては、市販の耐熱性PolAとPolBを用いる従来型PCR法や、Displacement活性の強いf29 DNAポリメラーゼを用いる常温PCR法が開発されているが、既存のPolAとPolB酵素は複製できる領域は短く、数10kbが上限である。また、合成速度も30b/secと遅い。一方、f29 DNAポリメラーゼは常温で遺伝子増幅ができるため、増幅反応に高価な装置は必要なく、簡便に行うことができるが、ランダムプライマーを用いるため、複製される領域は比較的短く、長鎖のDNA合成産物は得難い。さらに、上記の既存酵素を用いて、血液、体液等から直接的にDNAを増幅することは困難である。この原因は、いずれの既存酵素も高塩濃度でDNA合成活性が低下するためであり、反応液中の塩濃度を下げるための、脱塩操作が必須である。
【０００４】
一方、本発明者は、耐熱性で、かつ3'-5'校正エキソヌクレアーゼ活性を有する、パイロコッカス・ホリコシ由来のＤＮＡポリメラーゼ及びその遺伝子を初めて明らかにし（特許文献１参照）、さらに該ＤＮＡポリメラーゼの大サブユニットからインテイン配列除去することにより、ＤＮＡポリメラーゼ活性を画期的に向上させることに成功している（特許文献２参照）また、このＤＮＡポリメラーゼは、プライマー長が増すにつれ伸長活性が高まるという独特な性質を有する。しかし、このＤＮＡポリメラーゼも、低塩濃度下では高い活性を有するが、高塩濃度条件下では活性が低下する。
【０００５】
【特許文献１】特許第３０１５８７８号公報
【特許文献２】特開２００１−２９９３４８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明の課題は、高耐熱性で、ＤＮＡ鎖伸長の校正機能である3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有し、かつプライマー伸長活性が強いＤＮＡポリメラーゼを使用するとともに、高塩濃度下においても高いＤＮＡポリメラーゼ活性を発揮することが可能な、新たなＤＮＡポリメラーゼ反応系を構築する点にあり、サンプルの前処理なしで、高塩濃度下であろうと数Mbの長いDNA領域を短時間で複製可能な新規技術を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、以上の課題を解決すべく、90-100℃で生育する超好熱性細菌パイロコッカス・ホリコシに着目し、その遺伝子配列からDNAポリメラーゼと相互作用し、DNAポリメラーゼ活性を増強する複製因子である、クランプとクランプローダーと推測される遺伝子を見い出した。さらに、大腸菌を使ってその遺伝子からクランプとクランプローダーを生産し、これらタンパク質が高温（85℃以上）で安定に存在し、かつ0.2Mという高い食塩濃度下においてもDNAポリメラーゼのプライマー伸長活性を増強させることを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）デオキシヌクレオチド三リン酸を酵素基質として、ＤＮＡポリメラーゼによりプライマーＤＮＡを伸長させて、鋳型ＤＮＡと相補のＤＮＡを合成する方法であって、酵素反応系が、パイロコッカス・ホリコシ由来のＤＮＡポリメラーゼを有し、かつ以下のａ）及びｂ）のタンパク質複合体を含むことを特徴とする、ＤＮＡの合成方法。
ａ）３分子のサブユニットからなり、かつ、クランプ機能を有するタンパク質複合体であって、該サブユニットが配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質からなる、上記タンパク質複合体。
ｂ）大サブユニット１分子と小サブユニット４分子からなり、かつ、クランプローダー機能を有するタンパク質複合体であって、大サブユニットが配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であり、小サブユニットが配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質からなる、上記タンパク質複合体。
（２）上記酵素反応系がＡＴＰを含有しないことを特徴とする、上記（１）に記載の合成方法。
（３）上記酵素反応系が、０〜２００ｍＭ／Ｌ濃度の食塩を含有することを特徴とする、上記（１）又は（２）に記載の合成方法。
（４）パイロコッカス・ホリコシ由来のＤＮＡポリメラーゼを有し、かつ以下のａ）及びｂ）のタンパク質複合体を含むことを特徴とする、ＤＮＡ合成試薬キット。
ａ）３分子のサブユニットからなり、かつ、クランプ機能を有するタンパク質複合体であって、該サブユニットが配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質からなる、上記タンパク質複合体
ｂ）大サブユニット１分子と小サブユニット４分子からなり、かつ、クランプローダー機能を有するタンパク質複合体であって、大サブユニットが配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であり、小サブユニットが配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質からなる、上記タンパク質複合体。
（５）ＰＣＲに使用するものであることを特徴とする、上記（４）のＤＮＡ合成試薬キット。
（６）配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、上記（１）、a）に記載のタンパク質複合体を形成したとき、クランプ機能を有するタンパク質。
（７）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、上記（１）、ｂ）に記載の小サブユニットとタンパク質複合体を形成したとき、クランプローダー機能を有するタンパク質。
（８）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、上記（１）、ｂ）に記載の大サブユニットとタンパク質複合体を形成したとき、クランプローダー機能を有するタンパク質。
（９）上記（６）〜（８）のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（１０）上記（９）に記載のＤＮＡを含有することを特徴とする組み換えベクター
（１１）上記（１０）に記載の組み換えベクターが導入されていることを特徴とする、形質転換体。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、パイロコッカス・ホリコシ由来の新規二つのDNA複製因子、すなわち、クランプとクランプローダーが提供でき、これにより、高温、高塩環境下で、長鎖DNAを高速かつ正確に複製するDNAポリメラーゼの酵素反応系が構築可能となり、該酵素反応系は、Long-PCR等に特に有用であり、また、当該酵素反応系を用いた遺伝子配列解析に関する新手法の開発が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明において使用する、ＤＮＡポリメラーゼ、クランプ（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）、及びクランプローダー（replication  facter ,RFC）は、いずれもパイロコッカス（登録番号JCM9974）由来の、複数のサブユニットからなるタンパク質複合体である。
上記ＤＮＡポリメラーゼは、小サブユニットとインテイン配列を含有しない大サブユニットとからなる耐熱性ヘテロテトラマー酵素であって、ＤＮＡポリメラーゼ活性に加えて３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。また、この酵素は、プライマー長依存性の伸長活性を有し、プライマー長が３０merを越えると、伸長活性がより高まるという特性を有する。この小サブユニットとインテイン配列を削除した大サブユニットからなるDNAポリメラーゼは、本発明者等の先の出願（特願２０００−１１６２５７（特開２００１−２９９３４８号公報）に記載され、このインテイン配列が除去された酵素自体は公知である。
【００１１】
この先の出願の発明は、パイロコッカス・ホリコシ由来の、ＤＮＡポリメラーゼ活性及び３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ヘテロテトラマー酵素の大サブユニットにおいてインテイン配列が存在することを初めて見いだし、該インテイン配列を除去することにより、該酵素のプライマー伸長活性が著しく向上するという知見に基づきなされたものである。このパイロコッカス・ホリコシ由来の耐熱性ヘテロテトラマー酵素における小サブユニットのアミノ酸配列及びその遺伝子の塩基配列は、それぞれ、配列番号６及び５に示され、また、同大サブユニットのアミノ酸配列及びその遺伝子の配列は配列番号２及び１、図２，１にそれぞれ示され、インテイン部分のアミノ酸配列はその９５５〜１１２０番目、同塩基配列は２８６３〜３３６０番目の領域である（図２、１中、下線部はインテイン配列を表す。）
【００１２】
インテイン部分が除去された大サブユニットのアミノ酸配列及びその遺伝子の塩基配列を配列番号４及び３にそれぞれ示す。  この酵素は極めて耐熱性が良好であり、85℃で1時間処理しても、未処理の50%の活性を保持し、さらに９０℃、１時間の加熱処理でも２０％の活性を有する。また、活性の至適pHは 8.5である。
【００１３】
クランプ（以下、ＰＣＮＡという場合がある。）は、ＤＮＡ複製中、鋳型ＤＮＡと伸長するプライマー鎖を外れないようにする留め金の機能を有する、複数のサブユニットからなるリング状のタンパク質複合体であり、クランプローダーは、このクランプの開閉を行う複数のサブユニットからなるタンパク質複合体である。
【００１４】
上記パイロコッカス・ホリコシの遺伝子配列からヘテロテトラマーからなるDNAポリメラーゼと相互作用し、DNAポリメラーゼ活性を増強する複製因子である、クランプ(PCNA)とクランプローダー(RFC)は、以下のように得られる。
クランプ（PCNA）は、クランプ(PCNA)の遺伝子をPCR反応で増幅し抽出した後、蛋白質発現プラスミド等のベクターに挿入、そのプラスミドを大腸菌等の宿主微生物に組み込み、該宿主微生物を培養し、クランプ（PCNA）を産生させ、産生されたクランプ(PCNA)を加熱処理およびカラムクロマトグラムで単離精製することにより得られる。精製されたPCNAは、分子量28kDaのサブユニットからなるホモトライマーであることが明らかとなった。該サブユニットのアミノ酸配列及びその遺伝子の塩基配列は、それぞれ配列番号８及び７に示される。
【００１５】
一方、パイロコッカス・ホリコシ由来のクランプローダー(RFC)は、分子量の異なる２つのサブユニットからなり、分子量の大きいサブユニットは、インテイン配列を有し、そのアミノ酸配列及び遺伝子の塩基配列は、それぞれ配列番号１２、１１、図４、３に示される（図４、３の下線部はインテイン配列を表す。）。本発明においては、該インテイン配列を有するサブユニットをコードするＤＮＡ（配列番号１１、図３下線部）のうち、インテイン配列の上流側及び下流側のＤＮＡをそれぞれＰＣＲ増幅し、得られた２つのＤＮＡ断片を鋳型としてオーバラップＰＣＲで増幅し、インテイン配列が除去されたサブユニットをコードするＤＮＡを得る。以下、インテイン配列が除去されたサブユニットを小サブユニットといい、インテイン配列をもともと含まないサブユニットを大サブユニットという。
【００１６】
クランプローダー(RFC)の大サブユニットとインテイン配列が除去された小サブユニットをコードするＤＮＡは、同一または異なる発現ベクターに挿入し、宿主微生物導入し共発現させ、さらに加熱処理およびカラムクロマトグラムで単離精製することができる。なお、共発現とは、宿主内で２つのＤＮＡが同時に発現しそれぞれのＤＮＡ に対応するタンパク質が生成することをいい、本発明における活性を有するクランプローダは共発現させることによって初めて得られる。このように共発現させることによって得られたクランプローダーは、分子量54kDaの大サブユニットとインテイン配列を含まない38kDaの小サブユニットからなり、大サブユニット1分子と、インテイン配列を含まない小サブユニット4分子からなるヘテロペンタマーある。分子量54kDaの大サブユニットのアミノ酸配列及びその遺伝子の塩基配列は、それぞれ配列番号１０及び９に示され、同38kDaのインテイン配列を含まない小サブユニットのアミノ酸配列及びその遺伝子の塩基配列は、それぞれ配列番号１４及び１３に示される。
【００１７】
本発明の上記DNAポリメラーゼ、クランプ及びクランプローダーを構成する各サブユニットは、上述した各配列番号に示されるアミノ酸配列を有するもののみには限定されず、これらアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたものであっても、それぞれのタンパク質複合体を形成したとき、DNAポリメラーゼ活性、クランプあるいはクランプローダ機能を発揮できるものである限りこれらを包含する。また、本発明におけるこれら各サブユニットの遺伝子とは、上記各配列番号に示される塩基配列を有するもののみに限定されず、上記各配列番号に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするか、あるいは該アミノ酸配列において１あるいは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたもので蛋白質をコードするものであっても、各タンパク質複合体を形成したときそれぞれの機能を発揮できるサブユニットをコードするＤＮＡを包含する。例えば、本発明においては、上記各配列番号に示される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有するものであっても、各タンパク質複合体を形成したときそれぞれの機能を発揮できるサブユニットをコードするＤＮＡを包含する。
【００１８】
上記PCNAとRFCは、ヘテロテトラマーDNAポリメラーゼとを共存させると、非共存時と比較し、特に、高食塩濃度下、例えばＮａＣｌ、２００ｍＭ濃度下であっても顕著に該DNAポリメラーゼのプライマー伸長活性を増強させる。したがって、血液、体液等から、脱塩処理することなしに、直接的にDNAを増幅させることが可能となり、また、当然、食塩非含有の場合でもＤＮＡ合成を行うことができるから、本発明によれば、実際問題として、サンプルの食塩濃度に配慮する必要がない。
さらに、本発明のRFC（クランプローダー）は、クランプをDNAにロードする際にエネルギー源としてアデノシン−三リン酸(ATP)を要求せず、本発明の上記ヘテロテトラマーDNAポリメラーゼにPCNA及びRFCを共存させた酵素反応系は、ＤＮＡの合成において、クランプをDNAにロードする際にエネルギー源としてアデノシン−三リン酸(ATP)を添加する必要がなく、また、そればかりかＡＴＰは、高塩濃度下において、これらＤＮＡ転写因子のＤＮＡポリメラーゼ賦活化作用を阻害する点でも、特徴的である。
【００１９】
本発明のヘテロテトラマーDNAポリメラーゼ、にPCNA及びRFCはいずれも耐熱性であり、これらを組み合わせたＤＮＡ合成試薬キットは、ＰＣＲ用試薬キットとして好適である。また、この試薬キットには、さらに、酵素基質として、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰを酵素基質として組み合わせてもよいし、ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼ（PolB）等も組み合わせてもよい。
【実施例】
【００２０】
実施例１
（１）菌の培養
JCM９９７４は次の方法で培養した。
13.5ｇの食塩、4gのNa2SO4, 0.7 gのKCl, 0.2g のNaHCO3 、0.1gのKBr、30 mg のH3BO3、10gのMgCl2・6H2O、1.5g のCaCl2 、25mgのSrCl2、1.0mlのレザスリン溶液（0.2g/L）,1.0gの酵母エキス、5gのバクトペプトンを1Lに溶かし、この溶液のpHを6.8に調整し加圧殺菌した。ついで、乾熱滅菌した元素硫黄を0.2％となるように加え、この培地をアルゴンで飽和して嫌気性とした後、JCM９９７４を植菌した。培地が嫌気性となったか否かはNa2S溶液を加えて、培養液中でNa2Sによるレザスリン溶液のピンク色が着色しないことにより確認した。この培養液を95℃で２〜4日培養し、その後遠心分離し集菌した。
【００２１】
（２）染色体ＤＮＡの調整
JCM9974の染色体DNAは以下の方法により調製した。培養終了後5000rpm、10分間の遠心分離により菌体を集菌する。菌体を10mM  Tris  (pH 7.5) 1mM EDTA 溶液で２回洗浄後InCert Agarose（FMC社製）ブロック中に封入する。このブロックを１％N-lauroylsarcosine, 1mg/mlプロテアーゼK溶液中で処理することにより、染色体DNAはAgaroseブロック中に分離調製される。
【００２２】
（３）染色体DNAを含むライブラリークローンの作製
上記（2）で得られた染色体DNAを制限酵素HindIIIにより部分分解後アガロースゲル電気泳動により約40kb長の断片を調製した。このDNA断片と制限酵素HindIIによって完全分解したBacベクターpBAC108L及びpFOS1とをT4リガーゼを用いて結合させた。前者のベクターを用いた場合には結合終了後のDNAをただちに大腸菌内へ電気孔窄法により導入した。後者のベクターpFOS1を用いた場合には結合終了後のDNAをGIGA Pack Gold （ストラタジーン社製）により試験管内でλファージ粒子内に詰め込み、この粒子を大腸菌に感染させることによりDNAを大腸菌内に導入した。これらの方法により得られた抗生物質クロラムフェニコール耐性の大腸菌集団をBAC及びFosmidライブラリーとした。ライブラリーからJCM9974の染色体をカバーするのに適したクローンを選択して、クローンの整列化を行った。
【００２３】
（４）各BAC或いはFosmidクローンの塩基配列決定
整列化されたBAC或いはFosmidクローンについて順次以下の方法で塩基配列を決定していった。大腸菌より回収した各BAC或いはFosmidクローンのDNAを超音波処理することにより断片化し、アガロースゲル電気泳動により1kb及び2kb長のDNA断片を回収した。この断片をプラスミドベクターpUC118のHincII制限酵素部位に挿入したショットガンクローンを各BAC或いはFosmidクローン当たり500クローン作製した。各ショットガンクローンの塩基配列をパーキンエルマー、ABI社製自動塩基配列読み取り装置373または377を用いて決定していった。各ショットガンクローンから得られた塩基配列を塩基配列自動連結ソフトSequencherを用いて連結編集し、各BAC或いはFosmidクローンの全塩基配列を決定していった。
【００２４】
（５）DNAポリメラーゼ、クランプ、クランプローダー遺伝子の同定
上記で決定された各BAC或いはFosmidクローンの塩基配列の大型計算機による解析を行い、DNAポリメラーゼの大サブユニットをコードする遺伝子（図１中下線部はインテイン配列、配列番号１）、小サブユニットをコードする遺伝子（配列番号５）、クランプ(PCNA) をコードする遺伝子（配列番号７）、クランプローダー(RFC)を構成する大サブユニットをコードする遺伝子（配列番号９）、クランプローダー(RFC)を構成する小サブユニットをコードする遺伝子（図３中下線部はインテイン配列、配列番号１１）が同定された。
【００２５】
実施例２
（１）DNAポリメラーゼD小サブユニット発現プラスミドの構築
小サブユニット構造遺伝子（配列番号５）領域の前後に制限酵素（NdeIとBamHI）サイトを構築する目的でDNAプライマーを合成し、ＰＣＲでその遺伝子の前後に制限酵素サイトを導入した。
上部プライマー: PolS1; 5'-TTTTGTCGACGTACATATGGATGAATTCGTAAAG-3'  （下線部はNdeIサイトを示す。）（配列番号１５）
下部プライマー: PolS2; 5'-TTTTGAGCTCTTTGGATCCTTAGAAGCTCCATCAGCACCACCT-3'  （下線部はBamHIサイトを示す。）（配列番号１６）
ＰＣＲ反応後、制限酵素（NdeIとBamHI）で完全分解（37℃で2時間）した後、その構造遺伝子を精製した。さらに、pET11a或いはpET15b（Novagen社製)を制限酵素NdeIとBamHIで切断・精製した後、上記の構造遺伝子とＴ4リガーゼで１６℃、２時間反応させ連結した。連結したＤＮＡの一部を大腸菌E. coli  XL1-BlueMRF’ のコンピテントセルに導入し形質転換体のコロニーを得た。得られたコロニーから発現プラスミドをアルカリ法で精製した。得られた発現プラスミドは各々pET11a/PolS或いはpET15b/PolSと略記された。構造遺伝子上にランダム変異が無い事はDNAシーケンスイングにより確認された。
【００２６】
（２）DNAポリメラーゼDの大サブユニットを発現する為のプラスミドの構築
大サブユニット遺伝子は2段階でpGEMEX-1ベクター（プロメガ社製）にクローニングされた。前半部のDNA断片は以下の二つのプライマーを用い、PCR法で得た。
上部プライマー: PolL1; 5'-CTCGACTTTAGCATATGGCTCTGATGGAGC-3'  （下線部はNdeIサイトを示す。）（配列番号１７）
下部プライマー: PolL2; 5'-GCTTGTCGACGCCATAAACTTTGACATTATCCATTGCGCGCTTAAGCAAC-3'（下線部はSalIサイトを示す。）（配列番号１８）
このPCR産物はNdeIとSalIで完全消化された後、pGEMEX-1ベクターにクローニングされ、pGEM/PolL1-2と略記された。
後半部のDNA断片は以下の二つのプライマーを用い、PCR法で得た。
上部プライマー: PolL3; 5'-TTTATGGCGTCGACAAGCTGAAGG-3'（下線部はSalIサイトを示す。）（配列番号１９）
下部プライマー: PolL4; 5'-TATAACTTATGCATTGTGGTTATTTCGCTGAGAAG-3'（下線部はNsiIサイトを示す。）（配列番号２０）
このPCR産物はSalIとNsiIで完全消化された後、先に調製したpGEM/PolL1-2にクローニングされ、完全長の大サブユニット遺伝子を含むpGEM/PolLを得た。
【００２７】
（３）インテインを除去した大サブユニットを発現する為のプラスミドの構築
図1に示すようにP. horikoshiiのDNAポリメラーゼDの大サブユニット遺伝子の中にはインテイン（蛋白質性のイントロンをコードする）が一つ含まれるので、プライマーPolL3とPolL6を用いたPCR法でインテインの上流のDNA断片を増幅し、プライマーPolL5とPolL4を用いたPCR法でインテインの下流のDNA断片を増幅した。この２断片とプライマーPolL3とPolL4を用い、インテインの除かれたDNA断片をオーバーラップPCRで増幅した。次にこの産物を制限酵素SalIとNsiIで完全消化された後、先に調製したpGEM/PolL1-2にクローニングされ、インテインの除かれた大サブユニット遺伝子（配列番号３）を含むpGEM/PolL(-Intein)を得た。
PolL5: 5'-CACGCTGCAAAGAGGAGAAATTGCGATGGTGATGAAGATGCT-3'（配列番号２１）
PolL6: 5'-AGCATCTTCATCACCATCGCAATTTCTCCTCTTTGCAGCGTG-3'（配列番号２２）
【００２８】
（４）小サブユニットとインテインを除去した大サブユニットを共発現するプラスミドの構築
当該ヘテロテトラマーDNAポリメラーゼDの安定した生産を図る為に両サブユニットを共発現するプラスミドの構築を行った。まず、pET15b/PolSのBamHIサイトの直上流域に新しいマルチクローニングサイトを導入する為にプライマーPolS1とPolS3を用いPCR反応を行った。なお、下記のようにPolS3には5'-末端より順番にBamHI、NsiI、SalI、SacIIサイトがコードされている。PCR産物をNdeIとBamHI処理し、pET15bに挿入することにより、小サブユニットの終止コドンとBamHIサイトの間にマルチクローニングサイトを含むpET15b/PolS(M)を造成した。
【００２９】
次に、pGEM/PolL(-Intein)を鋳型DNAとし、プライマーPolL7とPolL2を用いPCR反応を行った。得られた産物は新しいSacIIサイトを5'-末端に持ち、pGEM/PolL(-Intein)のタンパク質発現ユニットのうち、リボソーム結合サイトからコード領域中のSalIサイトまでを含んでいる。これをSacIIとSalI処理し、pET15b/PolS(M)に造成されたマルチクローニングサイトに挿入された。このプラスミドはpET15b/PolSL1-2と略記される。さらに、pGEM/PolL(-Intein)をSalIとNsiI処理し、大サブユニットの後半部分の遺伝子（インテインを含まない）を単離し、これをpET15b/PolSL1-2のタンパク質発現ユニットの最後に残ったSalIとNsiIサイトに挿入した。えられたプラスミドはpET15b/PolSL(-Intein)と略記される。
【００３０】
この発現プラスミド、pET15b/PolSL(-Intein)によりアミノ末端にヒスチジンタグが付加した小サブユニットとインテインを含まない大サブユニットの共発現が可能になった。
PolS3: 5'-CGGGATCC ATGCATGGTCGACACCGCGGTCAGCACCACCTACTAAAGTCGAG-3'（下線部は5'-末端より順番にBamHI、NsiI、SalI、SacIIサイトを示す。）（配列番号２３）
PolL7: 5'-GGTGTCCGCGGCTCACTATAGGGAGACCAC-3'（下線部はSacIIサイトを、太字はpGEMEX-1ベクターのリボソーム結合サイトを示す。）（配列番号２４）
【００３１】
実施例３
クランプ(PCNA) 発現プラスミドの構築
PCNA構造遺伝子（配列番号７）領域の前後に制限酵素（NdeIとXhoI）サイトを構築する目的でDNAプライマーを合成し、ＰＣＲでその遺伝子の前後に制限酵素サイトを導入した。
上部プライマー: PCNA1; 5'-GGGGGCATATGCCATTCGAAATAGTCTTTGAGGG-3'  （下線部はNdeIサイトを示す。）（配列番号２５）
下部プライマー: PCNA2; 5'-GGGGGCTCGAGTCACTCCTCAACCCTTGG-3'  （下線部はXhoIサイトを示す。）（配列番号２６）
【００３２】
ＰＣＲ反応後、制限酵素（NdeIとXhoI）で完全分解（37℃で2時間）した後、その構造遺伝子を精製した。さらに、pET11aのマルチクローニングサイトにXhoIサイトを付加したpET11a’を新たに造成し、制限酵素NdeIとXhoIで切断・精製した後、上記の構造遺伝子とＴ4リガーゼで１６℃、２時間反応させ連結した。連結したＤＮＡの一部を大腸菌E. coli  XL1-BlueMRF’のコンピテントセルに導入し形質転換体のコロニーを得た。得られたコロニーから発現プラスミドをアルカリ法で精製した。得られた発現プラスミドはpET11a’/PCNAと略記された。構造遺伝子上にランダム変異が無い事はDNAシーケンスイングにより確認された。
【００３３】
実施例４
（１）クランプローダー(RFC)を構成する小サブユニット発現プラスミドの構築
図３に示すようにP. horikoshiiのクランプローダーを構成する一方のサブユニット遺伝子(RFCS)の中にはインテイン（蛋白質性のイントロンをコードする；図３中下線部）が一つ含まれるので、プライマーRFCS1とRFCS3を用いたPCR法でインテインの上流のDNA断片を増幅し、プライマーRFCS4とRFCS2を用いたPCR法でインテインの下流のDNA断片を増幅した。この２断片とプライマーRFCS1とRFCS2を用い、インテインの除かれたDNA断片をオーバーラップPCRで増幅した。次にこの産物を制限酵素NdeIとBamHIで完全消化された後、その構造遺伝子（配列番号１３）を精製した。さらに、pET11a（Novagen社製)を制限酵素NdeIとBamHIで切断・精製した後、上記の構造遺伝子とＴ4リガーゼで１６℃、２時間反応させ連結した。連結したＤＮＡの一部を大腸菌E. coli  XL1-BlueMRF’のコンピテントセルに導入し形質転換体のコロニーを得た。得られたコロニーから発現プラスミドをアルカリ法で精製した。得られた発現プラスミドはpET11a/RFCSと略記された。
【００３４】
RFCS1: 5'-GGGGGGCATATGCATAATATGGAAGAGGTTCGCGAGG-3' （下線部はNdeIサイトを示す。）（配列番号２７）
RFCS2: 5'-GGGGGATCCTCACTTCTTCTTTCCAACTAAGGTAAA-3' （下線部はBamHIサイトを示す。）（配列番号２８）
RFCS3: 5'-GCAGGTCCTCCTGGTGTTGGAAAGACTACAGCAGCTTTAGCCCTCTCA-3'（配列番号２９）
RFCS4: 5'-TGAGAGGGCTAAAGCTGCTGTAGTCTTTCCAACACCAGGAGGACCTGC-3'（配列番号３０）
【００３５】
（２）クランプローダー(RFC)を構成する大サブユニット発現プラスミドの構築
大サブユニット構造遺伝子（配列番号・・）領域の前後に制限酵素（NdeIとBamHI）サイトを構築する目的でDNAプライマーを合成し、ＰＣＲでその遺伝子の前後に制限酵素サイトを導入した。
上部プライマー: RFCL1; 5'-GGGGGGCATATGCCGGATGTTCCATGGATTGAG-3'  （下線部はNdeIサイトを示す。）（配列番号３１）
下部プライマー: RFCL2; 5'-GGGGGATCCGGGGATGCATGGGGGTCGACCTAATTCTTCTTAATAAAGTCAAAGAGTGTG-3'  （下線部はBamHIサイトを示す。）（配列番号３２）
【００３６】
ＰＣＲ反応後、制限酵素（NdeIとBamHI）で完全分解（37℃で2時間）した後、その構造遺伝子を精製した。さらに、pET15b（Novagen社製)を制限酵素NdeIとBamHIで切断・精製した後、上記の構造遺伝子とＴ4リガーゼで１６℃、２時間反応させ連結した。連結したＤＮＡの一部を大腸菌E. coli  XL1-BlueMRF’のコンピテントセルに導入し形質転換体のコロニーを得た。得られたコロニーから発現プラスミドをアルカリ法で精製した。得られた発現プラスミドはpET15b/RFCLと略記された。
【００３７】
（３）RFC大小サブユニットの共発現系の構築
次に、共感染によるRFC大小サブユニットの共発現系構築を目的に、大サブユニット遺伝子(RFCL)を、pET系ベクターとcompatibleな（異なった起源のOri配列を有する）pACYCDuet-1(Novagen社製)のマルチクローニングサイト2のNcoIサイトとBamHIサイト間に挿入した。詳しい方法は以下に示す。
【００３８】
まず、RFCL 遺伝子中にNcoI認識配列が一ケ所存在するので、これをオーバーラップPCR法でサイレント変異させた。具体的には、pET15b/RFCLを鋳型DNAとして用い、プライマーRFCL3とRFCL5を用いたPCR法でNcoI認識配列上流のDNA断片を増幅し、プライマーRFCL6とRFCL4を用いたPCR法でNcoI認識配列下流のDNA断片を増幅した。この２断片とプライマーRFCL3とRFCL4を用い、NcoI認識配列が消去されたDNA断片をオーバーラップPCRで増幅した。プライマーRFCL3とRFCL4はベクターpET15bのマルチクローニングサイトの上流と下流に各々アニールする配列となっているので、オーバーラップPCR産物にはpET15b由来のNcoIとBamHIサイトが含まれている。そこで、この産物を制限酵素NcoIとBamHIで完全消化した後、その構造遺伝子を精製した。さらに、pACYCDuet-1を制限酵素NcoIとBamHIで切断・精製した後、上記の構造遺伝子とＴ4リガーゼで１６℃、２時間反応させ連結した。連結したＤＮＡの一部を大腸菌E. coli  XL2-blueのコンピテントセルに導入し、終濃度が500 mg/mlのクロラムフェニコールに対し耐性となった形質転換体コロニーを得た。
【００３９】
得られたコロニーから発現プラスミドをアルカリ法で精製した。得られた発現プラスミドはpACYC/RFCLと略記された。
RFCL3: 5'-GCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCG-3' （配列番号３３）
RFCL4: 5'-AGCAGCCAACTCAGCTTCCTTTCGGGCTTTGTT-3' （配列番号３４）
RFCL5: 5'-CCTGTACTTCTCAATCCAGGGAACATCGGGCAT-3'（配列番号３５）
RFCL6: 5'-ATGCCCGATGTTCCCTGGATTGAGAAGTACAGG-3'（配列番号３６）
【００４０】
実施例５
組換え遺伝子の発現
(１) DNAポリメラーゼD
大腸菌（E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL, Stratagene社製）のコンピテントセルを融解して、ファルコンチューブに0.1 ｍl移す。その中に発現プラスミド溶液0.005ｍlを加え氷中に30分間放置した後42度でヒートショックを30秒間行い、SOC medium 0.9 ｍlを加え、37度で1時間振とう培養する。その後アンピシリンを含む２ＹＴ寒天プレートに適量まき、37度で一晩培養し、形質転換体を得た。
当形質転換体をアンピシリンを含む２ＹＴ培地（２リットル）で600ｎｍの吸収が1に達するまで培養した後、IPTG（Isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside）を加え30℃でさらに8時間培養した。培養後遠心分離（6,000 rpm，20min）で集菌した。
【００４１】
(２)クランプ(PCNA)
大腸菌（E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL, Stratagene社製）のコンピテントセルを融解して、ファルコンチューブに0.1 ｍl移す。その中に発現プラスミド溶液0.005ｍlを加え氷中に30分間放置した後42度でヒートショックを30秒間行い、SOC medium 0.9 ｍlを加え、37度で1時間振とう培養する。その後アンピシリンを含む２ＹＴ寒天プレートに適量まき、37度で一晩培養し、形質転換体を得た。この形質転換体をE. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL/pET11a’/PCNAと命名して独立行政法人産業技術総合研究所（茨城県つくば市東1丁目13）に平成18年5月12日に寄託し、寄託番号FERM AP-20911を与えられた。
当形質転換体をアンピシリンを含む２ＹＴ培地（２リットル）で600ｎｍの吸収が0.5に達するまで培養した後、IPTG（終濃度0.5 mM）を加え37℃でさらに4時間培養した。培養後遠心分離（6,000 rpm，20min）で集菌した。
【００４２】
(３)クランプローダー(RFC)
2種の発現ベクターの共感染によるRFC大小サブユニットの共発現を行った。まず、大腸菌（E. coli BL21  (DE3), Stratagene社製）のコンピテントセルを融解して、ファルコンチューブに0.1 ｍl移す。その中に発現プラスミドpET11a/RFCS溶液0.005ｍlを加え氷中に30分間放置した後42度でヒートショックを30秒間行い、SOC medium 0.9 ｍlを加え、37度で1時間振とう培養する。その後アンピシリンを含む２ＹＴ寒天プレートに適量まき、37度で一晩培養し、形質転換体E. coli BL21 (DE3)/pET11a/RFCSを得る。さらに、この形質転換体をCaCl2処理し、コンピテントセルを調整する。その中に発現プラスミドpACYC/RFCL溶液0.005ｍlを加え氷中に30分間放置した後42度でヒートショックを30秒間行い、SOC medium 0.9 ｍlを加え、37度で1時間振とう培養する。その後、2種の抗生物質、アンピシリンとクロラムフェニコール（終濃度が各々100 mg/mlと50 mg/ml）を含む２ＹＴ寒天プレートに適量まき、37℃で一晩培養し、形質転換体E. coli BL21 (DE3)/pET11a/RFCS/pACYC/RFCLを得た。この形質転換体を独立行政法人産業技術総合研究所（茨城県つくば市東1丁目13）に平成18年5月12日に寄託し、寄託番号FERM AP-20912を与えられた。
【００４３】
当形質転換体をアンピシリンとクロラムフェニコールを含む２ＹＴ培地（200 ml）で600ｎｍの吸収が0.6に達するまで培養した後、IPTG（終濃度0.3 mM）を加え25℃でさらに20時間培養した。培養後遠心分離（6,000 rpm，20min）で集菌した。
【００４４】
実施例６
組換えタンパク質の精製
(１)耐熱性DNAポリメラーゼD
集菌した菌体を-20℃で凍結し、融解後に２倍量の10mMトリス塩酸緩衝液（pH 8.0）と1 mgのDNaseを加え懸濁液を得た。得られた懸濁液を37℃で30分保温した後、10分間超音波照射した。さらに８５℃で30分加熱後、遠心分離(11,000 rpm、20分)し上澄液を得た。これを粗酵素液とした。次にこの粗酵素液をNi-カラム（Novagen,  His・Bind metal chelation resin &  His・Bind buffer kitを使用）に添加し、親和性クロマトグラムを行った。ここで得られた60mMイミダゾール流出画分をセントリプレップ30(アミコン社)で100mMリン酸緩衝液(pH6.0)に置換した。さらに、これをHiTrap SP（ファルマシア社製）カラムに吸着させ、NaCl濃度勾配による溶出を行った。次に、各画分のSDS-電気泳動を行い、含まれるタンパク質の分子量を測定した。遺伝子配列より当該DNAポリメラーゼのサブユニットの分子量は144,000 Daと70,000 Daと予測されたので、この分子量のタンパク質を含む画分を集め、セントリプレップ30を用い50 mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.0）へ置換した。これをさらに次の親和性クロマトグラム、HiTrap ヘパリン（ファルマシア社製）カラムに吸着させ、NaCl濃度勾配による溶出を行い精製酵素を得た。
【００４５】
(２)耐熱性クランプ(PCNA)
集菌した菌体を-20℃で凍結し、融解後に２倍量の50mMトリス塩酸緩衝液（pH 8.0）, 0.1M NaCl, 2mM 2-メルカプトエタノール, 0.1mM EDTA, 10% グリセロールを加え懸濁液を得た。これを超音波照射し、遠心分離(30000g、20分)により上澄液を得た。さらに75℃で15分加熱後、遠心分離(30000g、20分)し、上澄液を得た。これを80℃で10分加熱後、遠心分離で上澄液を得た。次に、Poly(ethylenimine)（シグマ社製）とNaClを各々終濃度0.15％と0.58Mまで加え、4℃で30分撹拌した。これを遠心分離(30000g、20分)し、その上澄液に(NH4)2SO4を80%飽和まで加えた。氷上で2時間撹拌後、遠心分離(30000g、20分)で沈澱を回収し、これを50mMトリス塩酸緩衝液（pH 8.0）, 0.1M NaCl, 2mM 2-メルカプトエタノール, 0.1mM EDTA, 10% グリセロールで溶解した。同緩衝液で透析後、サンプルを50mMトリス塩酸緩衝液（pH 8.0）で平衡化された陰イオン交換カラム、HiTrapQ (アマシャムファルマシア社製、5ml)に添加し、同緩衝液中、0 - 1M NaCl濃度勾配で溶出した。さらに、これを50mMトリス塩酸緩衝液（pH 8.0）, 0.2M NaClで平衡化したSuperdex 200カラム (10/300、アマシャムファルマシア社製)に添加し、同緩衝液で溶出し、精製PCNAを得た。
【００４６】
(３)耐熱性クランプローダー(RFC)
集菌した菌体を-20℃で凍結し、融解後に２倍量のプロテアーゼ阻害剤（Complete, EDTA-free, ロッシュ社製）を含む50mMトリス塩酸緩衝液（pH 8.0）を加え懸濁液を得た。これをフレンチプレスで細胞破砕し、75℃で15分加熱後、遠心分離(30000g、20分)し、上澄液を得た。これを50mMトリス塩酸緩衝液（pH 8.0）で平衡化したHiTrap heparinカラム (アマシャムファルマシア社製、5ml)に添加し、同緩衝液中、0 - 1M NaCl濃度勾配で溶出した。この溶出分画をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)で分析し、大小サブユニットから構成されるRFC複合体の溶出ピークを同定した。さらにこの溶出ピークフラクションを集め、Ni-カラム（Novagen,  His・Bind metal chelation resin &  His・Bind buffer kitを使用）に添加し、親和性クロマトグラムを行った。ここで得られた200mMイミダゾール流出画分をセントリプレップ30(アミコン社)で濃縮した。これを50mMトリス塩酸緩衝液（pH 8.0）, 0.2M NaClで平衡化したSuperdex 200カラム (10/300、アマシャムファルマシア社製)に添加し、同緩衝液で溶出し、精製RFC複合体を得た。
【００４７】
実施例７
ＤＮＡポリメラーゼ反応系の検定
（１）試験条件
（ａ）PCR反応
当該DNAポリメラーゼDの活性検出を目的に、前記の２種のDNAオリゴマー（Upper primerとLower primer）と当該DNAポリメラーゼの小サブユニットをコードする発現ベクターpET15b/PolSを鋳型DNAとしてPCR反応を行った。反応温度条件は１サイクルが３ステップ（94℃：１分、61℃：２分、70℃：３分）からなり、35サイクルを繰り返した。反応液組成(100μl)は20 mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.8）,10 mM KCl, 4 mM MgSO4, 0.1% Triton X-100, 0.375 mM dNTP mix, 100 pmol Upper primer, 100 pmol Lower primer, 0.1 μg  DNAポリメラーゼであった。
【００４８】
（ｂ）DNA合成反応
DNA合成反応はKornbergらの方法（１、２）に従った。反応液組成(200 ml)は20 mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.8）,10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% Triton X-100, 0.25 mM dNTP mix,  0.37 Mbq の(a-32P) dATP, 20 mg の加熱急冷処理サケ精巣DNA, 0.1 mg の DNAポリメラーゼであった。反応は75℃で30分間行い、反応後これに0.5 mgの氷冷サケ精巣DNAを加え、500 mlの氷冷1N過塩素酸と500mlの氷冷水を添加し、酸不溶性画分を遠心分離（9000xg 5分間）で得た。この沈殿を300mlの0.2N NaOHに溶解し、再度300μl の氷冷1 N過塩素酸と300 mlの氷冷水を加え、遠心分離で酸不溶性画分を得た。この沈殿を1 mlの1 N酢酸で洗浄し、遠心分離後沈殿を0.4 mlの2 Nアンモニア水に溶解し、この放射活性をCherenkov効果で液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。また、75℃の30分間の合成反応に於て10 nmolのdNTPを取り込む酵素量を1単位( Unit)と規定する。
【００４９】
（ｃ）至適pH
至適pHは、上記測定条件における反応温度を75℃に固定し、酵素反応液のpHを酸性域はリン酸緩衝液を、アルカリ域はトリス塩酸緩衝液を用いpH5.8から9.5まで変化させ、酸不溶性画分への放射活性の取り込みにより決定された。
【００５０】
（ｄ）至適Mg2+濃度
至適Mg2+濃度は上記DNA合成反応で反応温度を75℃に固定し、Mg SO4濃度を0 mMから20 mMまで変化させ、酸不溶性画分への放射活性の取り込みにより決定された。
【００５１】
（ｅ）熱安定性
加熱処理用の酵素液(100μl )は20 mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0 at 25 ℃）, 500mM NaCl, 10 mM MgSO4と0.1 mg/ml濃度の当該酵素を含む。これをGeneAmp PCR System 2400
(Perkin Elmer) で60℃から95℃まで1時間加熱処理し、残存活性を上記DNA合成反応を用い、酸不溶性画分への放射活性の取り込みで測定した。
【００５２】
（ｆ）プライマー伸長活性
プライマー伸長活性は以下のように測定された。M13ファージ一本鎖DNA(0.2 mg)と32Pで5'-ラベル化された0.5 pmol のプライマー(15mer, 34mer, 50mer)を各々20 mM トリス塩酸緩衝液(pH8.5)中でアニールさせ、10mM  MgCl2存在下、0.05 UnitのDNAポリメラーゼを加え、75℃で反応させた。反応は2分後、10分後に、Stop液を加える事で停止させた。反応産物は8M尿素を含む15％ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)で分析された。
【００５３】
（ｇ）3'-5'エキソヌクレアーゼ活性
32Pで5'-ラベル化された50merのプライマー(0.5 pmol )を用いて3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を測定した。反応液は20μl 反応液中に20mMトリス塩酸緩衝液（pH8.5)、12mM MgCl2、4ngのラベル化DNAを含み、これに0.05  UnitのDNAポリメラーゼを加え、75℃で反応させた。反応は30分後に、Stop液を加える事で停止させた。反応産物は8M尿素を含む15％ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)で分析された。
【００５４】
(ｈ) RFC複合体とPCNAとの相互作用
RFC複合体とPCNAとの結合活性を以下のように調べた。PCNA 400pmolと RFC複合体400pmol を100mlの反応液中（10mM MgCl2, 0.5M NaCl, 所定濃度のATPを含む）で混和し、室温で20分保持する。これに40mlの Ni2+-chilating resinを加え、室温で10分振とう撹拌する。その後、5000gで30秒遠心し、樹脂を沈澱として回収する。これを200mlの0.5M NaCl、10mM MgCl2、5mM imidazole を含む20mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0)で4回洗浄し、40mlの0.5M NaCl、10mM MgCl2、500mM imidazole を含む20mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0)で目的タンパク質複合体を溶出した。溶出サンプルのタンパク質組成はSDS-PAGEで分析した。
【００５５】
(ｉ) RFC複合体とPCNAのDNAポリメラーゼ活性に及ぼす効果
DNAポリメラーゼDの基質となるprimed substrateの調整法を以下に述べる。まずPrimerとなる51mer オリゴヌクレオチド（5'-GTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAAGGACGGCCAGTGCC-3’（配列番号３７））の5’端を32Pでラベル化した。20mlの反応液中には1xキナーゼ緩衝液（Toyobo社製）、20pmol 上述51merオリゴヌクレオチド、6ml g-32P ATP (3000Ci/mmol)、2ml T4 Kinaseが含まれる。これを37℃で3時間反応させ、その後、95℃で3分加熱処理し、32P-ラベル化オリゴヌクレオチドをQIAquick Nucleotide Removal Kit (QIAGEN社製)で精製した。次に、100mlの1 x M buffer（Toyobo社製）中で2 nmolのM13 ssDNAと4 pmolの32Pラベル化51merオリゴヌクレオチドを混ぜて、5分煮沸し、室温まで自然放熱することによりアニーリングさせた。
【００５６】
上述したprimedM13 ssDNAを鋳型とし、DNAポリメラーゼ反応を行なった。その反応系に、RFC複合体とPCNAを添加することにより、これらDNA複製因子のDNAポリメラーゼ活性への腑活化効果を評価した。その反応液（20ml）の組成と終濃度は以下のようである。
20 mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.8)
10 mM KCl
10 mM (NH4)2SO4
0.1% Triton X-100
6 mM MgSO4
0.25 mM dNTPs
400 ng DNAポリメラーゼ
2 mg PCNA
2 mg RFC複合体
0.04 pmol 32Pラベル化primedM13 ssDNA
50-200 mM NaCl
10 mM ATP
【００５７】
この反応液（20ml）を60℃で5分反応させ、反応後、4mlの反応停止液（0.3 M NaOH, 60 mM EDTA, 0.1% ブロモフェノールブルー, 10%グルセロール）を加えた。これを5分煮沸し、50 mM NaOH, 1 mM EDTAを電極液として1.2%アルカリアガロース電気泳動で反応産物の分子種を分析した。
【００５８】
（２）検定結果
（ａ）DNAポリメラーゼDの諸性質
１）タンパク質化学的性質
当該酵素の大サブユニットはインテイン除去前と除去後では各々1434アミノ酸残基と1268アミノ酸残基より構成され、その分子量は各々163,000 Daと144,000 Daである。小サブユニットは623アミノ酸残基より構成され、その分子量は70,000 Daである。
【００５９】
２）小サブユニットとインテインを除去した大サブユニットを共発現することによる活性型酵素の高効率発現
各サブユニットを単独発現させると極めて不安定で、安定的高発現は不可能である。そこで共発現系を構築する事にした。これにより活性型酵素の高発現が可能になり、物理化学的性質の解析と熱安定化機構の解明を行う事ができた。
【００６０】
３）DNA合成活性の検出と PCR反応
大腸菌組み換え体からの粗酵素液を用いて、DNA合成活性を調べた。表１に示す様に、サブユニット単独では活性は検出されない。また、小サブユニットとインテインが含まれた大サブユニットとの組み合わせでも非活性であった。以上の結果より、小サブユニットとインテインが除去された大サブユニットからなるヘテロダイマー構造が活性発現に必須であることが明かとなった。さらに、小サブユニットとインテインを除去した大サブユニットからなるヘテロダイマー酵素pET15b/PolSL(-Intein)を精製し、精製酵素(0.1μg)と10 mM MgSO4を用い、DNA合成活性を調べた。酵素添加系では非添加系に較べ175倍以上の放射活性の上昇を検出した。次に当該精製酵素を用い、PCR反応を行った結果、目的DNAフラグメントと同じ長さ（1.9 kb）の増幅反応産物をアガロースゲル電気泳動で確認した。また、当該酵素を含まない反応系では PCR反応産物は検出されなかった。さらに、以上の事実より、小サブユニットとインテインが除去された大サブユニットからなる当該ヘテロダイマーDNAポリメラーゼDは十分活性であることが明らかになった。
【００６１】
表１
大腸菌組み換え体からの粗酵素液(2ml)を用いたDNA合成活性の検出
酵素源                                                  活性（CPM）
負コントロール（蒸留水のみ）                            2,567
pET15b/PolS                                              1,181
pGEM/PolL                                                4,777
pGEM/PolL(-Intein)                                      3,827
pET15b/PolSL                                            3,237
pET15b/PolSL (-Intein)                                  12,323
陽コントロール（Deep Vent polymerase, 1unit）            86,189
【００６２】
４）至適pH
75℃で至適pHは8.5であった（図５）。
５）至適Mg2+濃度
本酵素の至適Mg2+濃度は12 mMであった（図６）。
６）熱安定性
図７に示すように、当該酵素は85℃、1時間の加熱処理でも50%の活性を保持していた。さらに、90℃、1時間の加熱処理でも20%の活性を有した。
【００６３】
７）プライマー伸長活性
図８に示すように本酵素は15merプライマーでは伸長活性が検出されなかったが、プライマー長が34mer、50merと伸びるに従い、強いプライマー伸長活性が認められた。この様なプライマー伸長活性のプライマー長依存性は他のDNAポリメラーゼでは報告されていない。
【００６４】
８）3'-5'エキソヌクレアーゼ活性
図９に示すように本酵素は50merのオリゴヌクレオチドに対し強い3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を示した。以上の事から当該酵素は、分子量144kDaと70kDaの二つのサブユニットからなるヘテロダイマータンパク質で、DNAを鋳型とし、相補鎖を合成し、3'-5'校正エキソヌクレアーゼ活性を保持するDNA依存性DNAポリメラーゼであることがわかった。
【００６５】
（ｂ）PCNAの諸性質
PCNAは大腸菌組換え体で大量発現され、大部分の大腸菌タンパク質の加熱処理除去、ポリエチレンイミンでの除核酸、硫安沈澱での濃縮、陰イオン交換クロマトグラム、ゲルろ過カラムクロマトで完全に精製された。図１０に示すように、SDS-PAGEで見積もられたPCNAサブユニットの見かけの分子量は遺伝子から予測される分子量28kDaと一致した。また、精製標品のゲルろ過カラムクロマトの溶出位置からNative体の分子量は110kDaと予測され、ホモトライマーであることが明らかになった。
【００６６】
（ｃ）RFC複合体の諸性質
１）RFC複合体のSDS-PAGE。
RFC複合体は大腸菌組換え体で大量発現され、大部分の大腸菌タンパク質の加熱処理除去、ヘパリンを用いた親和性カラムクロマト、大サブユニットのアミノ末端に存在するヒスチジンタグに対するニッケルレジン親和性カラムクロマト、ゲルろ過カラムクロマトで完全に精製された。図１１に示すように、SDS-PAGEで見積もられたRFC複合体の大(L)小(S)サブユニットの見かけの分子量は60kDaと36kDaであり、遺伝子から予測される分子量54kDaと38kDaとほぼ一致した。また、大小サブユニットのタンパク質バンドの色素結合強度から、大小サブユニットのモル比が1：4と計算され、Native体はヘテロペンタマーであることが分かった。
【００６７】
（ｄ）RFC複合体のATP非存在下におけるPCNAの認識
図１２にRFC複合体のヒスチジンタグとニッケルレジンを用いて、RFC複合体に結合したPCNAをpull downし、SDS-PAGEで分析した結果を示した。その結果、RFC複合体とPCNAは各々活性体として精製され、相互を認識し結合活性を有することが明かとなった。また、この結合はATPに依存しないことが明らかになった。
【００６８】
（ｅ）RFC複合体とPCNAによる高塩濃度下でのDNAポリメラーゼ活性の腑活化に対するATPの必要性
図１３に示すように、DNAポリメラーゼDは単独では200mM NaCl存在下ではDNAポリメラーゼ活性を発現することはできないが、PCNAが加わると0.75 kbまでDNA合成を行なうことが明らかになった。一方、200mM NaCl存在下で、DNAポリメラーゼDにRFC複合体とPCNAが加わると、M13ssDNAの相補鎖全長（7.2 kb）を60℃で5分間で合成できることが明らかになった。この際、ATPの添加は不必要で、逆に10 mM ATPが存在すると、RFC複合体とPCNAによる高塩濃度下でのDNAポリメラーゼの腑活化効果が著しく阻害されることが明らかになった。
以上の結果から、ヘテロテトラマーDNAポリメラーゼにPCNAとRFCを共存させると、非共存時と比較し、高食塩濃度下で顕著に本DNAポリメラーゼのプライマー伸長活性を増強できることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】DNAポリメラーゼDの大サブユニットの遺伝子配列を示す図である。下線部はインテイン配列を示す。
【図２】DNAポリメラーゼDの大サブユニットのアミノ酸配列。下線部はインテイン配列を示す。
【図３】クランプローダー(RFC)を構成する小サブユニットの遺伝子配列を示す図である。下線部はインテイン配列を示す。
【図４】クランプローダー(RFC)を構成する小サブユニットのアミノ酸配列を示す図である。下線部はインテイン配列を示す。
【図５】本発明のＤＮＡポリメラーゼの至適ｐＨを測定した結果を示す図である。
【図６】本発明のＤＮＡポリメラーゼの至適Ｍｇ２＋濃度を測定した結果を示す図である。
【図７】本発明のＤＮＡポリメラーゼの加熱処理後残存活性を測定した結果を示す図である。
【図８】本発明のＤＮＡポリメラーゼのプライマー伸長活性を試験した結果を示す図である。レーン１〜３は15merプライマーを、レーン４〜６は34merプライマーを、レーン7〜9は50merプライマーを使用した。レーン１、4、7は酵素存在下で2分反応させた。レーン2、5、8は酵素存在下で10分反応させた。レーン3、6、9はコントロールで酵素は反応系に加えられていない。
【図９】本発明のＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を試験した結果を示す図である。50merのオリゴヌクレオチドを基質として使用した。レーン1は酵素存在下での30分間反応を、レーン2はコントロールで酵素は反応系に加えられていない。
【図１０】本発明のPCNAの分子量をSDS-PAGEで測定した結果を示す図である。レーン1は分子量マーカー、レーン2は精製PCNAを示す。
【図１１】本発明のRFC複合体の分子量をSDS-PAGEで測定した結果を示す図である。レーン1は分子量マーカー、レーン2は精製RFC複合体を示し、Lは大サブユニット、Sは小サブユニット。
【図１２】本発明のRFC複合体によるPCNAのpull down実験の結果を示す図である。ATP存在下、非存在下でのRFC複合体とPCNAの相互作用をSDS-PAGEで分析した。
【図１３】本発明のRFC複合体とPCNAによるＤＮＡポリメラーゼＤ活性の増強を試験した結果を示す図である。ATPは10 mM濃度を使用した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年7月5日(2006.7.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
(２)クランプ(PCNA)
大腸菌（E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL, Stratagene社製）のコンピテントセルを融解して、ファルコンチューブに0.1 ｍl移す。その中に発現プラスミド溶液0.005ｍlを加え氷中に30分間放置した後42度でヒートショックを30秒間行い、SOC medium 0.9 ｍlを加え、37度で1時間振とう培養する。その後アンピシリンを含む２ＹＴ寒天プレートに適量まき、37度で一晩培養し、形質転換体を得た。この形質転換体をE. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL/pET11a’/PCNAと命名して独立行政法人産業技術総合研究所（茨城県つくば市東1丁目13）に平成18年5月12日に寄託し、寄託番号FERM P-20911を与えられた。
当形質転換体をアンピシリンを含む２ＹＴ培地（２リットル）で600ｎｍの吸収が0.5に達するまで培養した後、IPTG（終濃度0.5 mM）を加え37℃でさらに4時間培養した。培養後遠心分離（6,000 rpm，20min）で集菌した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
(３)クランプローダー(RFC)
2種の発現ベクターの共感染によるRFC大小サブユニットの共発現を行った。まず、大腸菌（E. coli BL21  (DE3), Stratagene社製）のコンピテントセルを融解して、ファルコンチューブに0.1 ｍl移す。その中に発現プラスミドpET11a/RFCS溶液0.005ｍlを加え氷中に30分間放置した後42度でヒートショックを30秒間行い、SOC medium 0.9 ｍlを加え、37度で1時間振とう培養する。その後アンピシリンを含む２ＹＴ寒天プレートに適量まき、37度で一晩培養し、形質転換体E. coli BL21 (DE3)/pET11a/RFCSを得る。さらに、この形質転換体をCaCl2処理し、コンピテントセルを調整する。その中に発現プラスミドpACYC/RFCL溶液0.005ｍlを加え氷中に30分間放置した後42度でヒートショックを30秒間行い、SOC medium 0.9 ｍlを加え、37度で1時間振とう培養する。その後、2種の抗生物質、アンピシリンとクロラムフェニコール（終濃度が各々100 ・g/mlと50 ・g/ml）を含む２ＹＴ寒天プレートに適量まき、37℃で一晩培養し、形質転換体E. coli BL21 (DE3)/pET11a/RFCS/pACYC/RFCLを得た。この形質転換体を独立行政法人産業技術総合研究所（茨城県つくば市東1丁目13）に平成18年5月12日に寄託し、寄託番号FERM P-20912を与えられた。