(57)【要約】【課題】本発明は、乳がんのリンパ節転移を正確に診断できる新規なマーカーを提供することを課題とする。【解決手段】フォークヘッドボックスＡ１(Forkhead box A1: ＦＯＸＡ１)をコードする遺伝子のｍＲＮＡ又はその断片を含む、乳がん由来のがん細胞のリンパ節転移を判定するためのリンパ節転移マーカーにより、上記の課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳がん由来のがん細胞のリンパ節転移を判定するためのリンパ節転移マーカーであって、
フォークヘッドボックスＡ１(Forkhead box A1: ＦＯＸＡ１)をコードする遺伝子のｍＲＮＡ又はその断片を含むマーカー。
【請求項２】
請求項１記載のマーカーを検出するための核酸増幅用プライマであって、
（ａ）配列番号１又は２に記載の配列を有するポリヌクレオチド；及び
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドにおいて少なくとも１つのヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加された配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド
からなる群より選択されるポリヌクレオチドからなるプライマ。
【請求項３】
請求項１記載のマーカーを検出するための核酸増幅用プライマセットであって、
（ａ）配列番号１に記載の配列を有するポリヌクレオチド；及び
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドにおいて少なくとも１つのヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加された配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド
からなる群より選択される第一プライマと、
（ｃ）配列番号２に記載の配列を有するポリヌクレオチド；及び
（ｄ）前記（ｃ）のポリヌクレオチドにおいて少なくとも１つのヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加された配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド
からなる群より選択される第二プライマとを含むプライマセット。
【請求項４】
リンパ節から調製された試料に、フォークヘッドボックスＡ１（Forkhead box A1: FOXA1）をコードする遺伝子のｍＲＮＡ又はその断片を含むマーカーが過剰に存在するか否かを判定する第一判定工程と、
前記マーカーが過剰に存在すると判定された場合に、乳がん由来のがん細胞が前記リンパ節に転移していると判定する第二判定工程
とを含む乳がんのリンパ節転移判定方法。
【請求項５】
前記第一判定工程において、前記試料と、逆転写活性を有する酵素と、ＤＮＡポリメラーゼと、請求項２に記載のプライマとを用いて逆転写反応及び核酸増幅反応を行い、増幅に伴って生じた産物を測定することにより、前記マーカーが過剰に存在するか否かを判定する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記測定結果と、所定の閾値とを比較することにより、前記マーカーが過剰に存在するか否かを判定する、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳がんのリンパ節転移を判定するためのマーカー、該マーカーに由来するｃＤＮＡを増幅するためのプライマ及び該マーカーを用いた乳がんのリンパ節転移判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳がんの診断において、リンパ節中のがん細胞を検出すること（リンパ節転移診断）は、手術範囲の決定や術後の化学療法の決定に有益な情報となる。現在、リンパ節転移診断では、病理医により、生体から切除したリンパ節組織の凍結切片又はパラフィン切片を用いた組織診（例えば、ＨＥ（ヘマトキシリン−エオジン）染色、ＩＨＣ(免疫組織化学)法など）が主に行われている。しかし、リンパ節にがん細胞が存在していても、がん細胞を含まない切断面で切片を作製し、その切片を用いて組織診を行うとがん細胞を見落としてしまうことがある。
【０００３】
このような現状を受けて、現在、ＬＡＭＰ（loop-mediated isothermal amplification
method）法やＰＣＲ（polymerase chain reaction）法などを用いたがんの分子診断の研究が盛んに行われるようになっている。分子診断は、分子マーカー（例えば、がん細胞に特異的に発現するタンパク質、このタンパク質をコードする遺伝子、この遺伝子のｍＲＮＡなど）を検出することにより行うことができる。例えば、乳がんのリンパ節転移を判定するための分子マーカー（以下、単にマーカーともいう）としては、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）やヒト胎児性抗原（ＣＥＡ）が有用であることが知られている。これらのタンパク質は、正常なリンパ節での発現量とリンパ節に転移してきた乳がん細胞での発現量とに有意な差が認められる分子である。
【０００４】
上記のマーカー以外にも乳がん細胞では多種のタンパク質が発現しており、マーカーとなり得る分子の探索が盛んに行われている。例えば、非特許文献１では、フォークヘッドボックスＡ１(Forkhead box A1: ＦＯＸＡ１)などのタンパク質が乳がん細胞で高発現であることが報告されている。
【非特許文献１】EA Williamson et al., BRCA1 and FOXA1 proteins coregulate the expression of the cell cycle-dependent kinase inhibitor p27Kip1; Oncogene (2005), p.1〜9
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、非特許文献１で報告されているタンパク質は、正常なリンパ節細胞における発現量がわからないため、これらのうち何れがリンパ節転移マーカーとして有用であるか不明である。また、非特許文献１では、乳がん細胞で多量に発現するタンパク質のｍＲＮＡをリンパ節転移マーカーとして用いることについては記載されていない。
【０００６】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、乳がんのリンパ節転移診断用マーカーとして新規なマーカーを提供することである。
また、本発明の他の目的は、上記マーカーに由来するｃＤＮＡを増幅するためのプライマを提供することである。
また、本発明の他の目的は、上記マーカーを用いた乳がんのリンパ節転移判定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、乳がん由来のがん細胞のリンパ節転移を判定するためのリンパ節転移マーカーであって、フォークヘッドボックスＡ１(Forkhead box A1: ＦＯＸＡ１)をコードする遺伝子のｍＲＮＡ又はその断片を含むマーカーである。
【０００８】
また、本発明は、上記のマーカーを検出するための核酸増幅用プライマであって、（ａ）配列番号１又は２に記載の配列を有するポリヌクレオチド、及び（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドにおいて少なくとも１つのヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加された配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチドの何れかのポリヌクレオチドからなるプライマ、並びに上記のマーカーを検出するためのプライマセットでもある。
【０００９】
さらに、本発明は、リンパ節から調製された試料に、ＦＯＸＡ１をコードする遺伝子のｍＲＮＡ又はその断片を含むマーカーが過剰に存在するか否かを判定する第一判定工程と、
前記マーカーが過剰に存在すると判定された場合に、乳がん由来のがん細胞が前記リンパ節に転移していると判定する第二判定工程
とを含む乳がんのリンパ節転移判定方法でもある。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によると、乳がんのリンパ節転移診断に用い得る新規なマーカーを提供することができる。また、本発明によると、上記マーカーに由来するｃＤＮＡを増幅するためのプライマを提供することができる。また、本発明によると、上記マーカーを用いた乳がんのリンパ節転移判定方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のマーカーは、乳がん由来のがん細胞に過剰に存在するＦＯＸＡ１と呼ばれるタンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡ又はこのｍＲＮＡの一部である。このマーカーを検出することにより、リンパ節中のがん細胞が検出される。なお、本明細書では、「過剰に存在する」とは、リンパ節の正常細胞における存在量に比べて多量に存在することを意味する。また、「検出する」とは、存否を判定することだけでなく、定量することをも含む。「ｍＲＮＡ」とは、成熟したｍＲＮＡだけでなく、ｍＲＮＡの前駆体（転写後のスプライシングやポリアデニル修飾前のｍＲＮＡなど）も含む。
【００１２】
乳がんの細胞では、多種類のタンパク質が発現しており、あるタンパク質ががん細胞に多量に含まれていることが分かっているだけではリンパ節転移マーカーとして有用か否かを判別することはできない。有用なリンパ節転移マーカーとは、がん細胞で発現する多種のタンパク質のうち、正常なリンパ節の細胞よりも乳がんが転移したリンパ節の細胞に過剰に存在することが確認されたタンパク質をコードするｍＲＮＡ又はこのｍＲＮＡの一部である。
【００１３】
マーカーを検出しようとする場合、検出用試料を調製することが好ましい。検出用試料は、生体から採取されたリンパ節の細胞を可溶化したものを用いることができる。リンパ節の細胞を含む試料としては、例えば、手術により摘出されたリンパ節の細胞を含む細胞塊、生検により採取されたリンパ節の細胞を含む試料などが挙げられる。
【００１４】
検出用試料は、例えば以下のようにして調製することができる。先ず、リンパ節の細胞に可溶化のための試薬（以下、「可溶化液」とする）を添加する。可溶化液中の細胞をホモジナイズなどにより破砕して細胞膜内の分子を溶液中に遊離させる。さらに遠心分離して上清を採取し、これを検出用試料とすることができる。なお、遠心分離前及び／又は遠心分離後に核酸精製や核酸抽出などの処理を行ってもよい。
【００１５】
得られた検出用試料に含まれ得る本発明のマーカーを検出するには、該検出用試料に、マーカーを検出し得るプライマ、逆転写活性を有する酵素、ＤＮＡポリメラーゼを添加して反応液を調製して、核酸増幅を行い、増幅されたｃＤＮＡを検出することが好ましい。核酸増幅法としては、特に限定されないが、例えばＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法など、公知の方法を用いることができる。マーカーはＲＮＡであるため、核酸増幅反応の前に逆転写反応を含む核酸増幅法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法やＲＴ−ＬＡＭＰ法など）を用いることができる。このような核酸増幅法を用いることによってマーカーのｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡが逆転写され、このｃＤＮＡを鋳型として核酸増幅反応が進行することができる。
【００１６】
逆転写反応及び核酸増幅反応は、鋳型である本発明のマーカーに対応するｃＤＮＡの配列及びプライマの配列に応じて適宜条件を変更することができる。逆転写反応及び核酸増幅反応の条件は、例えばSambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載されたものを用いることができる。
【００１７】
マーカーを検出するためのプライマとしては、マーカーに対応するｃＤＮＡを増幅することができるポリヌクレオチドであれば、その配列は特に限定されない。プライマの長さは５〜１００ヌクレオチドが好ましく、１０〜５０ヌクレオチドがより好ましい。プライマは、当該技術において公知の核酸合成方法により製造することができる。
【００１８】
上記のプライマは、プライマ機能を有していれば一つ以上のヌクレオチドの変異（置換、欠失、挿入、付加など）を有していてもよい。「プライマ機能」とは、マーカーに対応するｃＤＮＡ（マーカーから逆転写されたｃＤＮＡ又はこのｃＤＮＡの相補鎖）にハイブリダイズし、核酸増幅における伸長反応の基点となる機能のことである。変異を有するポリヌクレオチドは、マーカーから転写されたｃＤＮＡ配列中のポリヌクレオチドがハイブリダイズする領域に対して、６０％以上の相補性を有することが好ましく、８０％以上の相補性を有することがより好ましい。また、このポリヌクレオチドがプライマとして機能するために、ポリヌクレオチドの３’末端側の少なくとも３塩基が完全に相補的であることが好ましく、３’末端側の少なくとも５塩基が完全に相補的であることがより好ましい。
【００１９】
該プライマは、好ましくは：
（ａ）配列番号１又は２に記載の配列を有するポリヌクレオチド；又は
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドにおいて少なくとも１つのヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加された配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド
からなる。
【００２０】
また、上記のプライマは、本発明のマーカーに対応するｃＤＮＡを核酸増幅法で増幅することができる第一プライマと第二プライマ（フォワードプライマとリバースプライマ）の組み合わせからなるプライマセットとして用いることもできる。この場合、該プライマセットは、
（ａ）配列番号１に記載の配列を有するポリヌクレオチド；又は
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドにおいて少なくとも１つのヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加された配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド
からなる第一プライマと：
（ｃ）配列番号２に記載の配列を有するポリヌクレオチド；又は
（ｄ）前記（ｃ）のポリヌクレオチドにおいて少なくとも１つのヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加された配列を有し、核酸増幅反応においてプライマ機能を有するポリヌクレオチド
からなる第二プライマとを含むのが好ましい。
【００２１】
上記のプライマは、当該技術において通常用いられる技術により修飾されていてもよい。上記プライマの標識は、放射活性元素又は非放射活性分子を用いて行うことができる。用いられる放射活性同位体としては、32P、33P、35S、3H又は125Iを挙げることができる。非放射活性物質は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン又はジゴキシゲニンのようなリガンド、ハプテン、色素及び放射線発光性、化学発光性、生物発光性、蛍光又はリン光性の試薬のような発光性試薬から選択される。
【００２２】
逆転写活性を有する酵素及びＤＮＡポリメラーゼは、当該技術においてよく知られたものを用いることができる。逆転写活性を有する酵素としては、AMV (Avian Myeloblastosis Virus) 逆転写酵素、M-MLV (Molony Murine Leukemia Virus) 逆転写酵素などが挙げられる。また、ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼなどを用いることができる。
【００２３】
上記の核酸増幅により生成した産物を測定することにより、マーカーを検出することができる。
例えば、増幅されたｃＤＮＡを検出することにより、マーカーを検出することができる。増幅されたｃＤＮＡの検出は、反応液とエチジウムブロマイド、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎなどの蛍光インターカレーターとを混合して反応液中のｃＤＮＡを蛍光染色し、反応液の蛍光強度を測定することにより行うことができる。また、反応液に予め上記のような蛍光インターカレーターを加えておき、反応液の蛍光強度をリアルタイムで測定することにより、マーカーを定量することができる。
【００２４】
また、ｃＤＮＡの増幅に伴い副産物としてピロリン酸マグネシウムが生成される場合、これを検出することによりｃＤＮＡを検出してもよい。このピロリン酸マグネシウムは不溶性であるため、ピロリン酸マグネシウムの増加に伴って反応液が白濁する。よって、反応液を光学的に測定（例えば、濁度測定、吸光度測定など）することによってｃＤＮＡを検出することもできる。また、リアルタイムで光学的測定を行うことにより、マーカーを定量することができる。
【００２５】
次に、上記のマーカーの検出結果に基づいて、乳がんのリンパ節転移判定を行うことができる。
本発明のマーカーは、がん細胞だけでなく正常な細胞でもわずかに存在が認められる場合がある。このような場合、上記のマーカーの検出結果を所定の閾値と比較することにより、乳がん由来のがん細胞のリンパ節への転移を判定することが好ましい。
【００２６】
例えばＲＴ−ＰＣＲを用いてリアルタイムでマーカーを検出する場合、所定の蛍光強度や濁度に達するまでのＰＣＲサイクル数を測定し、この測定値を対応する閾値と比較することにより、乳がん由来のがん細胞のリンパ節転移を検出することもできる。また、所定のサイクル数における蛍光強度や濁度を測定し、この測定値を対応する閾値と比較することにより、リンパ節転移を検出することもできる。
【００２７】
また、例えばＲＴ−ＬＡＭＰを用いてリアルタイムでマーカーを検出する場合、所定の蛍光強度や濁度に達するまでの時間を測定し、この測定値を対応する閾値と比較することにより、リンパ節転移を検出することもできる。また、所定の時間が経過した時点での蛍光強度や濁度を測定し、この測定値を対応する閾値と比較することにより、リンパ節転移を検出することもできる。また、複数の閾値を設定することにより、例えば「強陽性」、「陽性」、「陰性」など多段階にがん細胞のリンパ節転移を検出することも可能である。
【００２８】
閾値は、がん細胞が含まれることが確認された生体試料（陽性試料）に含まれるマーカー量に対応する値以下であり、且つがん細胞が含まれないことが確認された生体試料（陰性試料）に含まれるマーカー量に対応する値よりも高い値に設定することができる。また、複数の陽性試料のマーカー量に対応する値と、複数の陰性試料のマーカー量に対応する値とを測定し、最も高確率に陽性試料と陰性試料とを区別できる値を閾値とすることが好ましい。
【００２９】
また、上記のマーカーの検出にマイクロアレイ技術を用いることもできる。具体的には、先ず固相にマーカーに対応するｃＤＮＡに相補的なポリヌクレオチドプローブ（以下、単にプローブともいう）を固定する。この固相に、検出用試料中のマーカーからの逆転写反応により得られたｃＤＮＡを含む試料を添加して、プローブにｃＤＮＡを捕捉させる。ここに蛍光インターカレーターを添加してプローブとｃＤＮＡとのハイブリッドを蛍光染色し、蛍光強度を検出する。蛍光強度の検出結果から、マーカーの定量や存否の判定を行うことができる。プローブがｃＤＮＡよりも短い場合は、プローブがハイブリダイズしていないｃＤＮＡの領域にハイブリダイズするプローブを添加することにより、蛍光シグナルを増強することができる。
【００３０】
なお、固相にマーカーに対応するプローブを固定し、マーカーとプローブとのハイブリッドを形成させて、このハイブリッドを検出することによりマーカーを検出してもよい。
【００３１】
該プローブは、上記のプライマについて説明したのと同様の方法により設計及び製造することができる。該プローブとしては、上記のプライマと同様の配列を有するものを用いることができる。
【００３２】
上述した何れかの方法を用いることにより、マーカーが試料中に過剰に存在するか否かを判定することができる。試料中にマーカーが過剰に存在していると判定された場合は、乳がん由来のがん細胞がリンパ節に転移していると判定される。
【００３３】
本実施形態のマーカーを検出するために必要な試薬などを試薬キットとして提供することができる。該キットは、少なくとも上述のプライマ、逆転写活性を有する酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓを含む。また、このキットは、酵素反応に好適な条件を与える緩衝剤を含むことが好ましい。
【００３４】
なお、本明細書において「マーカーを検出する」とは、マーカーであるｍＲＮＡの全領域を検出することだけでなく、一部の領域を検出することをも含む。本実施形態では、マーカーの一部の領域に対応するｃＤＮＡを増幅し、これを検出することが好ましい。この場合、検出されるｃＤＮＡの領域の長さは、プライマの長さよりも１〜５００ヌクレオチド長いことが好ましく、５０〜５００ヌクレオチド長いことがより好ましい。また、上記のプライマセットを用いる場合、増幅されるｃＤＮＡの領域の長さは、第一プライマの長さと第二プライマの長さとの和よりも１〜５００ヌクレオチド長いことが好ましく、５０〜５００ヌクレオチド長いことがより好ましい。
【実施例１】
【００３５】
本発明者らは、乳がんのリンパ節への転移を検出できるマーカーを探索した。まず、公共データベースに登録されているヒト遺伝子発現ライブラリから乳腺関連の遺伝子発現ライブラリを選択し、このデータベースから、乳腺での発現量が高く、リンパ節での発現量が低い遺伝子を、乳腺での発現量の高い順に上位から５８種選択した。次いで、これら５８種のタンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡ（以下、これら５８種のｍＲＮＡをマーカー候補と呼ぶ）を検出できるプライマを５８組設計した。
【００３６】
乳がん由来のがん細胞の転移が組織学的に認められたリンパ節（陽性リンパ節）４個及び乳がん由来のがん細胞の転移が組織学的に認められなかったリンパ節（陰性リンパ節）４個を用いて、下記のようにして陽性試料及び陰性試料を調製した。
【００３７】
まず、各リンパ節(約１００〜３００ｍｇ／個)に可溶化液(２００ｍＭグリシン−ＨＣｌ、５％  Ｂｒｉｊ３５(ポリオキシエチレン(３５)ラウリルエーテル)、２０％  ＤＭＳＯ、及び０．０５％  ＫＳ−５３８ (信越化学工業) を含む）４ｍＬを添加し、ブレンダーでホモジナイズした。得られたホモジネートを10,000×ｇ、室温で１分間遠心分離し、上清４００μＬからRNeasy Miniキット(キアゲン社製、カタログ番号74014)を用いてＲＮＡを抽出・精製してＲＮＡ溶液を得た。このＲＮＡ溶液の吸光度(λ＝２８０ｎｍ)を測定して濃度を確認した後、それぞれ１０ｎｇ／μＬとなるよう希釈調製した。陽性リンパ節４個から調製されたＲＮＡ溶液を混合して陽性検体を調製し、陰性リンパ節４個から調製されたＲＮＡ試料を混合して陰性検体を調製した。
【００３８】
上記のようにして得られた陽性検体及び陰性検体と、上記の５８組のプライマを用いて、ＡＢＩリアルタイムＰＣＲ装置（Prism 7000）を用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行ない、５８種のｍＲＮＡの検出を行なった。
【００３９】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、定量ＲＴ−ＰＣＲキットであるQuanti Tect SYBR Green ＲＴ−ＰＣＲキット(キアゲン社製、カタログ番号204245)を用い、その使用説明書に従って行なった。反応液の組成及び反応条件は、以下のとおりである。
【００４０】
反応液：
ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  Ｈ2Ｏ                            １０．９９μＬ
２×Ｍｉｘ                                             １２．５０μＬ
１００μＭフォワードプライマ(最終濃度５００ｎＭ)         ０．１３μＬ
１００μＭリバースプライマ(最終濃度５００ｎＭ)           ０．１３μＬ
Quanti Tect RTミックス                                   ０．２５μＬ
陽性検体又は陰性検体                                     １．００μＬ
合計                                                   ２５．００μＬ
【００４１】
反応条件
５０℃、３０分
９５℃、１５分
ＰＣＲ：以下の工程を４０サイクル；
９４℃、１５秒、
６０℃、１分。
【００４２】
上記の条件でＲＴ−ＰＣＲを行ない、陰性検体を用いてある特定の蛍光強度に到達するまでのＰＣＲサイクル数(陰性検体ＰＣＲサイクル数)と、陽性検体を用いてある特定の蛍光強度に到達するまでのＰＣＲサイクル数(陽性検体ＰＣＲサイクル数)とを測定した。陰性検体ＰＣＲサイクル数が多く、陽性検体ＰＣＲサイクル数が少ないほど、その遺伝子が陰性検体中で発現量が少なく、陽性検体中で発現量が多い、すなわちその遺伝子が、転移が起こったリンパ節中で特異的に発現量が多いことを意味する。
【００４３】
陽性検体ＰＣＲサイクル数を縦軸に、陰性検体ＰＣＲサイクル数を横軸にとってプロットしたグラフを図１に示す。図１の結果から、従来、乳がんのリンパ節への転移マーカーとして知られていなかったＦＯＸＡ１をコードするｍＲＮＡがマーカーとして有用であることが判明した。ＦＯＸＡ１のｍＲＮＡの配列は、配列番号３に示すとおりである。配列番号３の配列は、ｍＲＮＡ配列中のＵ（ウラシル）をＴ（チミン）に置換して表記したものである。この配列は、Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)から、アクセッション番号NM_004496で入手できる。
【００４４】
なお、対照として用いたβ−アクチン(ＡＣＴＢ)は、ハウスキーピング遺伝子のタンパク質として知られており、多くの細胞において多量に発現しているものである。よって、陰性検体ＰＣＲサイクル数も陽性検体ＰＣＲサイクル数もともに少ない。
また、従来から乳がんのリンパ節転移マーカーとして知られていたＣＫ１９のｍＲＮＡは、陽性検体ＰＣＲサイクル数が比較的少なく、陰性検体ＰＣＲサイクル数が比較的多いことがわかる。
【００４５】
上記のＦＯＸＡ１マーカーを検出した際に用いたプライマ及び対応する配列番号は、次のとおりである。
フォワードプライマ：5'-atggttgtattgggcagggt-3' (配列番号１)
リバースプライマ：5'-accagtcccactaagcagcc-3' (配列番号２)
【実施例２】
【００４６】
乳がん由来のがん細胞の転移が組織学的に認められたリンパ節１５個からそれぞれＲＮＡ溶液（陽性試料）１５検体を調製した。また、乳がん由来のがん細胞の転移が組織学的に認められなかったリンパ節１５個からそれぞれＲＮＡ溶液（陰性試料）１５検体を調製した。陽性試料１５検体及び陰性試料１５検体を用いて、それぞれリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行ない、ＦＯＸＡ１を検出した。ＲＮＡ溶液の調製方法及びＲＴ−ＰＣＲの条件については、実施例１と同様である。ＦＯＸＡ１を検出するためにＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマは、配列番号１及び２の配列を有するプライマである。
【００４７】
また、上記の陽性検体及び陰性検体に、ＦＯＸＡ１検出用のプライマに代えて、以下の：
フォワードプライマ：5'- ccacactgtgcccatctacg -3' (配列番号４)
リバースプライマ：5'- aggatcttcatgaggtagtcagtcag -3' (配列番号５)
の配列を有する、β−アクチンのｍＲＮＡを増幅するためのプライマを用いてＲＴ−ＰＣＲを行なった。β−アクチンはハウスキーピング遺伝子のタンパク質であり、ほとんどの組織で発現することが知られている。
なお、ＲＮＡを含む検体ではなく、純水を混合した反応液をネガティブコントロール（ＮＣ）として上記と同様にＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００４８】
これらのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおいて、ある特定の蛍光強度に到達するまでのＰＣＲのサイクル数(Ｃｔ)を測定した結果を、図２に示す。図２（ａ）は、ＦＯＸＡ１のｍＲＮＡを検出するためのプライマを用いてＮＣ、陽性試料、及び陰性試料中のマーカーの検出を行った際のサイクル数を示す図である。図２（ｂ）は、β−アクチンのｍＲＮＡを検出するためのプライマを用いてＮＣ、陽性試料、及び陰性試料中のβ−アクチンのｍＲＮＡの検出を行った際のサイクル数を示す図である。
図２（ａ）の結果から、ＦＯＸＡ１をコードするｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡは、リンパ節への転移が組織学的に確認されている試料において少ないサイクル数で増幅され、リンパ節への転移が確認されない試料ではより多くのサイクル数を必要として増幅されたことがわかる。また、図２（ｂ）より、β−アクチンのｍＲＮＡは陰性試料及び陽性試料の何れを用いても同様のサイクル数で検出されており、核酸濃度が極端に異なる試料を用いていないことが確認された。また、陽性試料を用いて確認されたＤＮＡの増幅は、プライマダイマーなどの非特異反応によるものではないことが確認された。
以上のことから、本発明のリンパ節転移マーカーは、乳がん細胞のリンパ節への転移を検出するのに好適に用いることができるということができる。
【００４９】
また、図２（ａ）及び（ｂ）の結果より、ＦＯＸＡ１のｍＲＮＡの検出の際に、サイクル数３５〜３７を閾値として設定することにより、本実施例で用いた全ての陽性試料を陽性と判定することができ、全ての陰性試料を陰性と判定することができることがわかる。
がん細胞のリンパ節転移の有無が不明であるリンパ節から調製した試料を用いた場合、上述の閾値と、この試料を用いて測定されたサイクル数とを比較することにより、そのリンパ節に乳がん由来のがん細胞が転移しているか否かを検出することができる。
【００５０】
本発明のマーカーを、従来の乳がんのリンパ節への転移マーカー（例えば、ＣＫ１９やＣＥＡなど）の１種以上と組み合わせることにより、より精度の高いリンパ節転移検出を行うことも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】実施例１において、ＲＴ−ＰＣＲを行ない、陰性検体を用いてある特定の蛍光強度に到達するまでのＰＣＲサイクル数(陰性検体ＰＣＲサイクル数)と、陽性検体を用いてある特定の蛍光強度に到達するまでのＰＣＲサイクル数(陽性検体ＰＣＲサイクル数)とを測定した結果を示すグラフである。
【図２】リンパ節への転移が確認された患者のリンパ節からの試料及び転移が認められない患者のリンパ節からの試料においてＦＯＸＡ１又はβ−アクチンのｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅させたときに、ある特定の蛍光強度に達するまでのＰＣＲのサイクル数(Ｃｔ)を示す。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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