(57)【要約】【課題】ＰＥＰ−１９を分解する蛋白質を見出し、該蛋白質によるＰＥＰ−１９の分解に基づく疾患の防止および／または治療を可能にする手段を提供すること。【解決手段】ＰＥＰ−１９がμ−カルパインおよびｍ−カルパインそれぞれにより分解されることを見出したことに基づいて、ＰＥＰ−１９のμ−カルパインによる分解、および／または、ＰＥＰ−１９のｍ−カルパインによる分解、を阻害することを特徴とする、神経細胞死の阻害手段、さらには神経細胞死に基づく疾患、例えば虚血性脳疾患または神経変性疾患の防止および／または治療のための手段を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルパイン阻害剤により、下記の群より選ばれる少なくとも１の分解を阻害する方法；
（１）カルシウム存在下におけるｍ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解、および
（２）カルシウム存在下におけるμ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解。
【請求項２】
ＡＬＬＮ（Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−ＣＨＯ）、ＡＬＬＭ（Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＣＨＯ）、およびカルペプチン（ｃａｌｐｅｐｔｉｎ）からなる群より選ばれる少なくとも１のカルパイン阻害剤により、下記の群より選ばれる少なくとも１の分解を阻害する方法；
（１）カルシウム存在下におけるｍ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解、および
（２）カルシウム存在下におけるμ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解。
【請求項３】
グルタミン酸受容体拮抗剤により、下記の群より選ばれる少なくとも１の分解を阻害する方法；
（１）カルシウム存在下におけるｍ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解、および
（２）カルシウム存在下におけるμ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解。
【請求項４】
Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ；ＮＭＤＡ）受容体拮抗剤により、下記の群より選ばれる少なくとも１の分解を阻害する方法；
（１）カルシウム存在下におけるｍ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解、および
（２）カルシウム存在下におけるμ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解。
【請求項５】
請求項１から４に記載の分解阻害方法のうち少なくともいずれか１の方法を用いることを特徴とする、虚血性神経細胞死の阻害方法。
【請求項６】
虚血性神経細胞死が虚血性細胞外グルタミン酸濃度上昇を起因とする虚血性神経細胞死である、請求項５に記載の虚血性神経細胞死の阻害方法。
【請求項７】
下記の群より選ばれる少なくとも１の分解を阻害する化合物の同定方法であって、ＰＥＰ−１９とｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインの相互作用を可能にする条件下、ある化合物とＰＥＰ−１９、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインを接触させ、次いで該分解により生じるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、該シグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、該化合物が該分解を阻害する化合物であるか否かを判定する同定方法。
（１）カルシウム存在下におけるｍ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解、および
（２）カルシウム存在下におけるμ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解。
【請求項８】
下記の群より選ばれる少なくとも１の分解を阻害する、カルパイン阻害剤。
（１）カルシウム存在下におけるｍ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解、および
（２）カルシウム存在下におけるμ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解。
【請求項９】
請求項７に記載の同定方法により同定された化合物および請求項８に記載のカルパイン阻害剤のうち少なくともいずれかを含有する虚血性神経細胞死の阻害剤。
【請求項１０】
虚血性神経細胞死が虚血性細胞外グルタミン酸濃度上昇を起因とする虚血性神経細胞死である、請求項９に記載の虚血性神経細胞死の阻害剤。
【請求項１１】
請求項７に記載の同定方法により同定された化合物、請求項８に記載のカルパイン阻害剤、ならびに請求項９および１０に記載の虚血性神経細胞死の阻害剤のうち少なくともいずれかを用いることを特徴とする、虚血性脳疾患若しくは神経変性疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項１２】
請求項７に記載の同定方法により同定された化合物、請求項８に記載のカルパイン阻害剤、ならびに請求項９および１０に記載の虚血性神経細胞死の阻害剤のうち少なくともいずれかを用いることを特徴とする、アルツハイマー病またはハンチントン病の防止方法および／または治療方法。
【請求項１３】
請求項７に記載の同定方法により同定された化合物、請求項８に記載のカルパイン阻害剤、ならびに、請求項９および１０に記載の虚血性神経細胞死の阻害剤のうち少なくともいずれかを含有する、虚血性脳疾患もしくは神経変性疾患の防止剤および／または治療剤。
【請求項１４】
請求項７に記載の同定方法により同定された化合物、請求項８に記載のカルパイン阻害剤、ならびに、請求項９および１０に記載の虚血性神経細胞死の阻害剤のうち少なくともいずれかを含有する、アルツハイマー病またはハンチントン病の防止剤および／または治療剤。
【請求項１５】
ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパイン、ｍ−カルパインをコードするポリヌクレオチドおよび／またはμ−カルパインをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、および、該ベクターで形質転換されてなる形質転換体のうち少なくともいずれか１つと、ＰＥＰ−１９、ＰＥＰ−１９をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、および、該ベクターで形質転換されてなる形質転換体のうち少なくともいずれか１つ、を含有することを特徴とする試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルシウム存在下におけるｍ−カルパインによるＰＥＰ−１９（ｂｒａｉｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ＰＥＰ−１９；Ｐｕｒｋｉｎｊｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ４とも称される；以下ＰＥＰ−１９と称する）の分解およびカルシウム存在下におけるμ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解からなる群より選ばれる少なくとも１の分解を阻害する方法、該分解の阻害剤、該分解の阻害化合物の同定方法に関する。さらに、本発明は、前記分解阻害方法を用いることを特徴とする、虚血性神経細胞死の阻害方法に関する。また、本発明は、前記同定方法により同定された化合物および／または前記阻害剤を含有する虚血性神経細胞死の阻害剤に関する。さらに、本発明は、前記同定方法により同定された化合物および／または前記阻害剤を含有する、虚血性脳疾患または神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病の防止剤、治療剤、改善剤に関する。また、本発明は、前記同定する方法により同定された化合物および／または前記阻害剤を用いることを特徴とする、虚血性脳疾患または神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病の防止方法、治療方法、改善方法に関する。さらに、本発明は、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパイン、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、および該ベクターで形質転換されてなる形質転換体のうち少なくともいずれか１つと、ＰＥＰ−１９、ＰＥＰ−１９をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、および、該ベクターで形質転換されてなる形質転換体のうち少なくともいずれか１つ、を含有することを特徴とする試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物は、細胞の生存とアポトーシス（細胞死）を調節することで外界のストレスから身を守るが、生存とアポトーシス制御機構の調節の乱れによる過剰な細胞死は、種々の疾患を招く可能性がある。特に、脳における神経細胞死は特別な意味を有する。脳には虚血等の侵襲によって脆弱性を示す特定の部位があることが知られている。該部位は海馬、基底核、小脳、あるいは大脳皮質等であり、これらの部位の細胞は脳のなかでも記憶や学習等の高次機能に関連している。したがって、この特定の部位の神経細胞死は記憶障害や痴呆等の脳疾患をもたらす。神経細胞死の病態を解明してその防御法を開発することはこれらの疾患の予防や治療に直接つながり、高齢化社会における医療において重要な課題である。
【０００３】
虚血から神経細胞死に至る過程においては、興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸による神経の過剰興奮が関与していることが強く示唆されている（非特許文献１）。グルタミン酸は、中枢神経系において主要な興奮性神経伝達物質であり、記憶・学習等の脳高次機能に重要な役割を果たしている。しかし、その機能的な重要性の反面、過剰なグルタミン酸は神経細胞障害作用を持ち、様々な神経疾患に伴う神経細胞死等の原因と考えられている。脳虚血は神経細胞膜の脱分極を招き、その結果、神経末端からグルタミン酸等の神経伝達物質が神経細胞外（シナプス間隙）に過剰に放出される。過剰量のグルタミン酸はイオンチャネル結合型の受容体に作用し、細胞内に大量のカルシウムが蓄積する。このことによりカルシウム依存性に活性化される酵素（カルモジュリン等）等が活性化され、さらに下流のカルモジュリン依存性因子に作用する結果、神経細胞死に至ると考えられている。
【０００４】
以下に本明細書において引用した文献を列記する。
【非特許文献１】桐野高明「脳虚血とニューロンの死」、１９９６年、中央医学社。
【非特許文献２】反町洋之、「生化学」２０００年、第７２巻、第１１号、ｐ．１２９７−１３１５。
【非特許文献３】Ｈｕａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，「ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」２００１年，第７巻，ｐ．３５５−３６２。
【非特許文献４】Ｍａｔｓｕｓｉｍａ−Ｎｉｓｈｉｗａｋｉ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ」１９９６年，第２２５巻，ｐ．９４６−９５１。
【非特許文献５】Ｐａｒｉａｔ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」１９９７年，第１７巻，ｐ．２８０６−２８１５。
【非特許文献６】Ｗａｔｔ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」１９９３年，第２１巻，ｐ．５０９２−５１００。
【非特許文献７】Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」１９８４年，第２５９巻，ｐ．１２４８９−１２４９４。
【非特許文献８】Ｒａｖｉｄ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」２０００年，第２７５巻，ｐ．３５８４０−３５８４７。
【非特許文献９】Ｄｅｂｉａｓｉ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」１９９９年，第７３巻，ｐ．６９５−７０１。
【非特許文献１０】Ｄｕｔｔ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，「ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ」１９９８年，第４３６巻，ｐ．３６７−３７１。
【非特許文献１１】Ｅｓｓｅｒ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，「Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ」１９９４年，第３７巻，ｐ．２３６−２４７。
【非特許文献１２】Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」１９８６年，第９９巻，ｐ．１７３−１７９。
【非特許文献１３】Ｎａｔｈ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ」２０００年，第２７４巻，ｐ．１６−２１。
【非特許文献１４】Ｅｒｈａｒｄｔ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ」２０００年，第１１巻，第１７号，ｐ３７１９−３７２３。
【非特許文献１５】Ｕｔａｌ，Ａ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ」１９９８年，第８６巻，第４号，ｐ．１０５５−１０６３。
【非特許文献１６】Ｎｉｘｏｎ，Ｒ．Ａ．，「Ａｇｅｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ」２００３年，第２巻，ｐ．４０７−４１８。
【非特許文献１７】Ｓｌｅｍｍｏｎ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」１９９６年，第２７１巻，第２７号，ｐ．１５９１１−１５９１７。
【非特許文献１８】Ｊｏｈａｎｓｏｎ，Ｒ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｎｃｅ」２０００年，第２０巻，第８号，ｐ．２８６０−２８６６。
【非特許文献１９】Ｋ．Ｍ．Ｕｌｍｅｒ，「Ｓｃｉｅｎｃｅ」１９８３年，第２１９巻，ｐ．６６６−６７１。
【非特許文献２０】「ペプチド合成」丸善株式会社、１９７５年。
【非特許文献２１】「Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６年。
【非特許文献２２】Ｚｉａｉ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」１９９８年、第５１巻、第６号，ｐ．１７７１−１７７６。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
脳虚血性脳疾患の治療のためには神経細胞が虚血により細胞死に至る機構を明らかにすることが重要である。これまでに虚血性脳疾患に関する研究が数多くなされてきた。しかしながら、生体内で顕著な効果のある虚血性脳疾患の防止および／または治療手段は未だ確立されていない。したがって、本発明の課題は、脳虚血性疾患の防止および／または治療を可能にする手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意努力し、グルタミン酸刺激により誘導される神経細胞死においてニューロン特異的ポリペプチドであるＰＥＰ−１９の細胞含量が低下すること、および本細胞死がＰＥＰ−１９の一過性発現により抑制されることを見出した。さらに、ＰＥＰ−１９がｍ−カルパインと相互作用することをインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）で予測し、ｍ−カルパインおよびμ−カルパインがそれぞれカルシウム依存的にＰＥＰ−１９を分解することを実験的に証明して本発明を完成した。
【０００７】
１．カルパイン阻害剤により、下記の群より選ばれる少なくとも１の分解を阻害する方法；
（１）カルシウム存在下におけるｍ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解、および
（２）カルシウム存在下におけるμ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解、
２．ＡＬＬＮ（Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−ＣＨＯ）、ＡＬＬＭ（Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＣＨＯ）、およびカルペプチン（ｃａｌｐｅｐｔｉｎ）からなる群より選ばれる少なくとも１のカルパイン阻害剤により、下記の群より選ばれる少なくとも１の分解を阻害する方法；
（１）カルシウム存在下におけるｍ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解、および
（２）カルシウム存在下におけるμ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解、
３．グルタミン酸受容体拮抗剤により、下記の群より選ばれる少なくとも１の分解を阻害する方法；
（１）カルシウム存在下におけるｍ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解、および
（２）カルシウム存在下におけるμ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解、
４．Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ；ＮＭＤＡ）受容体拮抗剤により、下記の群より選ばれる少なくとも１の分解を阻害する方法；
（１）カルシウム存在下におけるｍ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解、および
（２）カルシウム存在下におけるμ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解、
５．前項１から４に記載の分解阻害方法のうち少なくともいずれか１の方法を用いることを特徴とする、虚血性神経細胞死の阻害方法、
６．虚血性神経細胞死が虚血性細胞外グルタミン酸濃度上昇を起因とする虚血性神経細胞死である、前項５に記載の虚血性神経細胞死の阻害方法、
７．下記の群より選ばれる少なくとも１の分解を阻害する化合物の同定方法であって、ＰＥＰ−１９とｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインの相互作用を可能にする条件下、ある化合物とＰＥＰ−１９、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインを接触させ、次いで該分解により生じるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、該シグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、該化合物が該分解を阻害する化合物であるか否かを判定する同定方法、
（１）カルシウム存在下におけるｍ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解、および
（２）カルシウム存在下におけるμ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解、
８．下記の群より選ばれる少なくとも１の分解を阻害する、カルパイン阻害剤、
（１）カルシウム存在下におけるｍ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解、および
（２）カルシウム存在下におけるμ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解、
９．前項７に記載の同定方法により同定された化合物および前項８に記載のカルパイン阻害剤のうち少なくともいずれかを含有する虚血性神経細胞死の阻害剤、
１０．虚血性神経細胞死が虚血性細胞外グルタミン酸濃度上昇を起因とする虚血性神経細胞死である、前項９に記載の虚血性神経細胞死の阻害剤、
１１．前項７に記載の同定方法により同定された化合物、前項８に記載のカルパイン阻害剤、ならびに前項９および１０に記載の虚血性神経細胞死の阻害剤のうち少なくともいずれかを用いることを特徴とする、虚血性脳疾患若しくは神経変性疾患の防止方法および／または治療方法、
１２．前項７に記載の同定方法により同定された化合物、前項８に記載のカルパイン阻害剤、ならびに前項９および１０に記載の虚血性神経細胞死の阻害剤のうち少なくともいずれかを用いることを特徴とする、アルツハイマー病またはハンチントン病の防止方法および／または治療方法、
１３．前項７に記載の同定方法により同定された化合物、前項８に記載のカルパイン阻害剤、ならびに、前項９および１０に記載の虚血性神経細胞死の阻害剤のうち少なくともいずれかを含有する、虚血性脳疾患もしくは神経変性疾患の防止剤および／または治療剤、
１４．前項７に記載の同定方法により同定された化合物、前項８に記載のカルパイン阻害剤、ならびに、前項９および１０に記載の虚血性神経細胞死の阻害剤のうち少なくともいずれかを含有する、アルツハイマー病またはハンチントン病の防止剤および／または治療剤、
１５．ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパイン、ｍ−カルパインをコードするポリヌクレオチドおよび／またはμ−カルパインをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、および、該ベクターで形質転換されてなる形質転換体のうち少なくともいずれか１つと、ＰＥＰ−１９、ＰＥＰ−１９をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、および、該ベクターで形質転換されてなる形質転換体のうち少なくともいずれか１つ、を含有することを特徴とする試薬キット、
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明では、ＰＥＰ−１９とカルパインが相互作用することを見出し、インビトロにおいてカルパインがＰＥＰ−１９をカルシウム依存的に分解することを初めて明らかにした。さらに、本分解がカルパイン阻害薬により阻害されることを明らかにした。また、グルタミン酸刺激により誘導される細胞死の過程において、ＰＥＰ−１９の細胞内含量が時間経過により低下すること、本細胞死がＰＥＰ−１９の一過性発現により抑制されること、ならびにカルパイン阻害薬およびグルタミン酸受容体拮抗薬によりグルタミン酸刺激を受けた細胞におけるＰＥＰ−１９の含量低下が抑制されることを実証した。ＰＥＰ−１９は神経細胞に特異的に発現しており、神経細胞の生存と細胞死に重要な役割を果たしていると考えられる。これらから、本発明により、カルパインによるＰＥＰ−１９の分解、に基づく虚血性神経細胞死の阻害、並びに虚血性神経細胞死に基づく疾患、例えば虚血性脳疾患、神経変性疾患の防止、治療または改善が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明について発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。以下の詳細な説明は例示であり、説明のためのものに過ぎず、本発明を何ら限定するものではない。
本明細書においては単離された若しくは合成の完全長蛋白質；単離された若しくは合成の完全長ポリペプチド；または単離された若しくは合成の完全長オリゴペプチドを意味する総称的用語として「ポリペプチド」という用語を使用することがある。ここで蛋白質、ポリペプチド若しくはオリゴペプチドはペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合している２個以上のアミノ酸を含むものである。以降、アミノ酸を表記する場合、１文字または３文字にて表記することがある。
【００１０】
本発明においては、ラット初代培養神経細胞にグルタミン酸刺激を行って細胞死を誘発させる過程で、ＰＥＰ−１９の細胞内含量が時間経過にしたがって低下すること、逆にＰＥＰ−１９を細胞内に一過性に強制発現させることでグルタミン酸による細胞死が抑制されることを明らかにした。また、グルタミン酸処理と同時にカルパイン阻害剤であるカルペプチン（ｃａｌｐｅｐｔｉｎ）処理又はＮＭＤＡ受容体拮抗剤であるＡＰ−５処理を行うことで、ＰＥＰ−１９の蛋白質の分解が抑制されることを明らかにした。さらに、本発明においては、ＰＥＰ−１９とｍ−カルパインが相互作用することを国際公開ＷＯ０１／６７２９９号パンフレット記載の方法に従ってインシリコで予測した。さらに実験的に、カルシウム依存的にｍ−カルパインおよびμ−カルパインそれぞれによりＰＥＰ−１９が分解されることを初めて明らかにした。
【００１１】
カルパイン（ＥＣ  ３．４．２２．１７）は、カルシウム依存性システインプロテアーゼであり、蛋白質を限定的に切断してその構造や機能を変化させる酵素である。カルパインには、構造的特徴、組織局在およびカルシウム要求性等によって分類される多くのアイソザイムが知られており、これらからなるスーパーファミリーを構成している。
ｍ−カルパインは、カルパインスーパーファミリーの１つであり、カルパイン２とも呼ばれ、多くの組織で発現している（非特許文献２）。ｍ−カルパインは１ｍＭ程度のカルシウム濃度で活性化され、酵素活性を発現する。μ−カルパインは、カルパイン１とも呼ばれ、ｍ−カルパインと同様に多くの組織で発現している（非特許文献２および３）。μ−カルパインは、ｍ−カルパインと比較してカルシウム要求性が低く、数十μＭ程度のカルシウム濃度で活性化され、その酵素活性を発現する。
【００１２】
ｍ−カルパインおよびμ−カルパインにより分解される蛋白質としては、ｐ５３やレチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）等多くの転写因子が報告されている（非特許文献４〜６）。カルパインにより分解される蛋白質には、カルパインによって優先的に切断されるアミノ酸モチーフが存在する（非特許文献７）。例えば、ロイシン残基（Ｌｅｕ）またはバリン残基（Ｖａｌ）等の疎水性アミノ酸残基に続く、チロシン残基（Ｔｙｒ）、メチオニン残基（Ｍｅｔ）またはアルギニン残基（Ａｒｇ）とそれに続くアミノ酸残基との間で切断される。
【００１３】
ＰＥＰ−１９は海馬の顆粒細胞、小脳のプルキンエ細胞等に含まれているニューロン特異的ポリペプチドである。ＩＱドメインを介してカルシウム非依存的にカルモジュリンに結合する。これまでに、ＰＣ１２細胞株を用いた実験でＰＥＰ−１９過剰発現により紫外線照射による細胞死が抑制されることが示されている（非特許文献１４）。細胞死は神経変性疾患の大きな要因の一つである。ＰＥＰ−１９と神経変性疾患の関連を示す報告としては、アルツハイマー病患者の小脳におけるＰＥＰ−１９の発現が低下することや、ハンチントン病患者の脳において、尾状核、被殻、淡蒼球、黒質におけるＰＥＰ−１９の発現が消失することが組織化学的染色法により確認されている（非特許文献１５）。
【００１４】
カルパインと神経変性疾患の関連については、アルツハイマー病患者の黒質においてカルパインが活性化していること、アルツハイマー病モデルマウスにカルパイン阻害剤を投与したところ運動機能の低下抑制が観察されたこと等を示す報告（非特許文献１６）があり、カルパインの活性化は神経変性過程に寄与している可能性があると考えられている。
【００１５】
細胞内カルシウムレベルは脳虚血後の病理学事象において重要な役割を担うことが知られている。ＰＥＰ−１９が結合するカルモジュリンは、細胞内カルシウム濃度の上昇により活性化され、下流の様々な蛋白質の機能を制御しており、細胞内カルシウム濃度上昇によるアポトーシスに大きく関与している（非特許文献１７）。
【００１６】
ＰＥＰ−１９はカルモジュリンに結合し、ＰＥＰ−１９によってカルモジュリン依存性の酵素（ＣａＭ  ｋｉｎａｓｅ  ＩＩ）の活性化が抑制されることがある（非特許文献１８）。従って、神経細胞では、ＰＥＰ−１９がカルモジュリンに結合することで、カルモジュリンによる神経細胞の細胞死誘導が抑制されていると考えられる。しかし、脳虚血においては、シナプス間隙のグルタミン酸濃度が著しく上昇すると細胞内カルシウム濃度が上昇し、カルシウム濃度依存的にカルパインが活性化する。そして活性化されたカルパインによりＰＥＰ−１９が分解される。本願発明において、μ−カルパインによるＰＥＰ−１９の切断位置が、ＰＥＰ−１９のアミノ酸配列第４７番目のグルタミン残基と第４８番目のセリン残基との間であることを明らかにした（実施例５）。本切断位置は、ＰＥＰ−１９とカルモジュリンの結合に関与するＰＥＰ−１９のＩＱドメイン内部に位置する為、μ−カルパインによるＰＥＰ−１９の切断（分解）がＰＥＰ−１９のカルモジュリンへの結合能を失わせたと考える。このことにより、ＰＥＰ−１９はカルモジュリンに結合できず、カルモジュリンがカルシウムにより活性化されて下流のカルモジュリン依存性因子に作用することで、細胞死が導かれる可能性が示唆される。したがって、カルパインによるＰＥＰ−１９の分解を阻害することが創薬のターゲットとなると考えられる。
【００１７】
本発明においては、カルシウム存在下におけるｍ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解およびカルシウム存在下におけるμ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解からなる群より選ばれる少なくとも１の分解を阻害する方法を提供する。
【００１８】
本明細書中において、「カルシウム存在下」におけるカルシウム濃度は、カルパインのカルシウム要求性を考慮し、カルパインを活性化してそれらの酵素活性を誘発できる濃度とする。例えば、ｍ−カルパインを活性化するためには、好ましくは１ｍＭ以上のカルシウム濃度が好適である。μ−カルパインを活性化するためには、好ましくは約１０μＭ以上、より好ましくは２０μＭ以上、さらに好ましくは約３０μＭ以上のカルシウム濃度が好適である。
【００１９】
「ｍ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解」とは、ｍ−カルパインによりＰＥＰ−１９が切断され、その結果ＰＥＰ−１９が断片化することを意味する。また、「μ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解」とは、μ−カルパインによりＰＥＰ−１９が切断され、その結果ＰＥＰ−１９が断片化することを意味する。
【００２０】
「ｍ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解の阻害」とは、ｍ−カルパインによるＰＥＰ−１９の切断とそれによるＰＥＰ−１９の断片化を低減させること、またはｍ−カルパインによるＰＥＰ−１９の切断とそれによるＰＥＰ−１９の断片化を起こさせないことを意味する。また、「μ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解」とは、μ−カルパインによるＰＥＰ−１９の切断とそれによるＰＥＰ−１９の断片化を低減させること、またはμ−カルパインによるＰＥＰ−１９の切断とそれによるＰＥＰ−１９の断片化を起こさせないことを意味する。
【００２１】
本発明はカルパイン阻害剤により実施できる。「カルパイン阻害剤」とは、カルパインの酵素活性を阻害する物質を意味する。酵素活性として、好ましくは、ＰＥＰ−１９の分解活性を挙げることができる。カルパイン阻害剤は、可逆的阻害剤および非可逆的阻害剤のいずれをも含む。非可逆的阻害剤は、競合阻害剤（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、非競合阻害剤（ｎｏｎｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、不競合阻害剤（ｕｎｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）のいずれをも含む。このような阻害効果を有する物質（後述する例として競合阻害効果を有するポリペプチド類、抗体および低分子化合物等が挙げられる）を阻害剤と称する。
【００２２】
競合阻害剤はその相互作用が基質の反応性と拮抗的である為、カルパインの競合阻害剤は、カルパインと基質の反応性を拮抗的に阻害する。従って、カルパイン阻害剤として、好ましくはカルパインの競合阻害剤を例示可能である。このような競合阻害剤として、ＡＬＬＭ（Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＣＨＯ、非特許文献８）、ＡＬＬＮ（Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−ＣＨＯ、非特許文献９）、およびカルペプチン（Ｚ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−ＣＨＯ）、アンチパイン（ａｎｔｉｐａｉｎ、［（Ｓ）−１−Ｃａｒｂｏｘｙ−２−ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌ］−ｃａｒｂａｍｏｙｌ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−ａｒｇｉｎａｌ）、ロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｙｌ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎａｌ）を例示できる。
【００２３】
不可逆的カルパイン阻害剤であるＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＣＨ２Ｆ（非特許文献１０）、Ｍｕ−Ｖａｌ−ＨＰｈ−ＣＨ２Ｆ（非特許文献１１）およびＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−クロロメチルケトン（Ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌｋｅｔｏｎｅ）（非特許文献１２）等が市販されている。可逆的カルパイン阻害剤である４−フルオロフェニルスルホニル（Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ（非特許文献１３）等が市販されている（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）。
【００２４】
本発明において、グルタミン酸受容体拮抗剤の一つであるＮＭＤＡ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ）受容体拮抗剤であるＡＰ−５、カルパイン阻害剤であるカルペプチンにより、グルタミン酸刺激により誘導された細胞死におけるＰＥＰ−１９の減少を抑制することができた（実施例３）。さらに、ＰＥＰ−１９のカルパインによる分解を、カルパイン阻害剤であるＡＬＬＮ、ＡＬＬＭおよびカルペプチンのいずれによっても阻害することができた（実施例４）。
【００２５】
グルタミン酸受容体はイオンチャネル型と代謝型とに大別され、イオンチャネル型はアゴニストに対する選択性に基づき３種に分類される。これらは各々、ＮＭＤＡ受容体、２−アミノ−３−（３−ヒドロキシ−５−メチルイソキサゾール４−イル）プロパン酸（ＡＭＰＡ）受容体、およびカイニン酸受容体と呼ばれる。虚血後の細胞内へのカルシウム流入には、ＮＭＤＡ受容体およびＡＭＰＡ受容体が関与していることが知られている。ＮＭＤＡ受容体は、ＮＭＤＡ、イボテン酸等のアゴニストにより選択的に活性化される。このＮＭＤＡ受容体への強い刺激は、大量のカルシウムイオンを神経細胞へ流入させ、これが神経細胞死の原因の一つと考えられている。
【００２６】
従って、本方法は、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインのカルシウムによる活性化を阻害する手段により実施可能である。具体的には、グルタミン酸受容体拮抗剤、より具体的にはＮＭＤＡ受容体拮抗剤により実施可能である。
【００２７】
ＮＭＤＡ受容体はイオンチャネルと複合体をなしており、その受容体部に対して選択的かつ競合的なアンタゴニズムを持つ試薬として、Ｄ−２−アミノ−５−ホスホバレリン酸（ＡＰ−５）、３−（２−カルボキシピペラジン−４−イル）プロピル−１−リン酸（ＣＰＰ）が知られている。一方、ＮＭＤＡ受容体に直接作用する非競合的アンタゴニストとしては、ジゾシルピン（ＭＫ−８０１）、フェンサイクリジン（ＰＣＰ）が知られている。さらにＮＭＤＡ受容体に対する選択的・競合的アンタゴニズムを作用機序として開発された治療薬としては、キノキサリン−２，３−ジオン等のヘテロ原子含有の２環系・３環系の化合物が知られている（ＡＣＥＡ１２０１、ＺＤ９３７９、ＧＶ１  ５０５２６等）。非競合的アンタゴニズムに基づく治療薬としては、ＭＫ−８０１を始め多種が開発されている（フェルバメート、フルピルチン、アマンタジン、ミメンチン、カルヴェディロール等）。
【００２８】
また、ｍ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解部位またはμ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドから、カルシウム存在下におけるｍ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解およびカルシウム存在下におけるμ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解からなる群より選ばれる少なくとも１の分解を阻害するポリペプチドを選択することにより、カルパイン阻害剤であるポリペプチドを取得することができる。選択されたポリペプチドに１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入したポリペプチドも本発明に含まれる。このように変異を導入したポリペプチドは、カルシウム存在下におけるｍ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解およびカルシウム存在下におけるμ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解からなる群より選ばれる少なくとも１の分解を阻害するものが好ましい。
【００２９】
ｍ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解、μ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解、およびそれらの分解阻害の検出は、ｍ−カルパインまたはμ−カルパインとＰＥＰ−１９とをカルシウム存在下において接触させた後、ウェスタンブロット法等の公知の方法を使用して実施可能である。
【００３０】
本発明において、μ−カルパインによるＰＥＰ−１９の切断位置が、ＰＥＰ−１９のアミノ酸配列第４７番目のグルタミン残基と第４８番目のセリン残基の間であることを明らかにした（実施例５および６）。従って、ＰＥＰ−１９のμ−カルパインにより分解される部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドとして、ＰＥＰ−１９のアミノ酸配列第４７番目のグルタミン残基と第４８番目のセリン残基を含む、ＰＥＰ−１９の部分ポリペプチドを例示できる。かかる部分ポリペプチドのアミノ酸配列長は、好ましくは５〜３０アミノ酸残基、より好ましくは２０アミノ酸残基程度であり得る。
【００３１】
変異を有するポリペプチドは天然に存在するものであってよく、また変異を導入したものであってもよい。欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマー（Ｕｌｍｅｒ）の技術（非特許文献１９）を利用できる。このような変異の導入において、当該ポリペプチドの基本的な性質（物性、機能または免疫学的活性等）を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互置換は容易に想定される。さらに、これら利用できるポリペプチドは、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。このようなポリペプチドの具体例として、ＡＬＬＮ（Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−ＣＨＯ）、ＡＬＬＭ（Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＣＨＯ）、カルペプチン等が挙げられる。
【００３２】
上記ポリペプチドは、ペプチド化学において知られる一般的な方法で製造できる。例えば、成書（非特許文献２０および２１）に記載の方法が例示されるが、これらに限らず公知の方法が広く利用可能である。具体的には、通常の液相法および固相法によるペプチド合成法、例えばＦｍｏｃ法等を挙げることができる。または市販のアミノ酸合成装置を用いて製造可能である。あるいは遺伝子工学的手法により取得することもできる。例えば目的とするポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞中で発現できる組換えＤＮＡ（発現ベクター）を作成し、これを適当な宿主細胞、例えば大腸菌にトランスフェクションして形質転換した後に該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から目的とするポリペプチドを回収することにより製造可能である。
【００３３】
カルシウム存在下におけるｍ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解およびカルシウム存在下におけるμ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解からなる群より選ばれる少なくとも１の分解を阻害する方法は、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインを認識する抗体であって、ｍ−カルパインとＰＥＰ−１９の相互作用および／またはμ−カルパインとＰＥＰ−１９の相互作用を阻害する抗体を用いることによって達成可能である。かかる抗体は、ＰＥＰ−１９、ｍ−カルパインまたはμ−カルパイン自体、ＰＥＰ−１９のｍ−カルパインによる分解部位、あるいはＰＥＰ−１９のμ−カルパインによる分解部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原として、自体公知の抗体作製方法により得ることができる。
【００３４】
カルシウム存在下におけるｍ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解およびカルシウム存在下におけるμ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解からなる群より選ばれる少なくとも１の分解を阻害する阻害剤は、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインを特異的に阻害するものが好ましい。特異的とは、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインを強く阻害するが、他の酵素は阻害しないまたは弱く阻害することを意味する。さらに、ＰＥＰ−１９を基質とする場合には強く阻害するが、他の基質の場合は阻害しないまたは弱く阻害する場合、より好ましく特異的である。
【００３５】
上記したように、本発明においては、グルタミン酸刺激により誘導される神経細胞死の過程で、ＰＥＰ−１９の細胞内含量が時間経過にしたがって低下すること、逆に細胞内にＰＥＰ−１９を一過性強制発現させることによりグルタミン酸により誘導される細胞死が抑制されることを明らかにした。虚血性神経細胞死は、グルタミン酸刺激が主要因となり誘導されることから、本発明は虚血性神経細胞死の阻害方法、より詳しくは虚血性細胞外グルタミン酸濃度上昇を起因とする虚血性神経細胞死の阻害方法を提供する。かかる阻害方法は、例えば、カルシウム存在下におけるｍ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解およびカルシウム存在下におけるμ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解からなる群より選ばれる少なくとも１の分解を阻害する方法を使用することにより、実施可能である。さらに、ＰＥＰ−１９により実施可能である。
【００３６】
さらに、本発明は、カルシウム存在下におけるｍ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解およびカルシウム存在下におけるμ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解からなる群より選ばれる少なくとも１の分解を阻害する化合物の同定方法を提供する。本方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して構築可能である。
【００３７】
例えば、ＰＥＰ−１９とｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインの相互作用を可能にする条件下、当該条件下で調べようとする化合物（被験化合物、候補化合物）とＰＥＰ−１９、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインを接触させ、次いで該分解により生じるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、該シグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、該化合物が該分解を阻害する化合物であるか否かを判定することができる。
【００３８】
ＰＥＰ−１９とｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインの相互作用を可能にする条件は、インビトロのものであってよく、インビボのものであってもよい。例えば、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインとＰＥＰ−１９とを共発現させた細胞を用いることもできる。細胞における発現は、ＰＥＰ−１９をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターと、ｍ−カルパインをコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターおよび／またはμ−カルパインをコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターとを、慣用の遺伝子工学的方法でこれらを細胞にトランスフェクションすることにより達成可能である。また、例えば、カルシウム、ＰＥＰ−１９ならびにｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインが溶解している適当な緩衝液を用いるインビトロアッセイによっても実施可能である。カルシウム濃度は、用いるカルパインを活性化し、その酵素活性を誘発できる濃度であればよい。
【００３９】
被験化合物とＰＥＰ−１９、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインの接触は、ＰＥＰ−１９の該カルパインによる分解反応の前に行なってもよいし、それらの反応と共存させることも可能である。
【００４０】
ここでシグナルとは、そのもの自体がその物理的または化学的性質により直接検出され得るものを指し、マーカーとはそのものの物理的または生物学的性質を指標として間接的に検出され得るものを指す。シグナルとしてはルシフェラーゼ、グリーン蛍光蛋白質、および放射性同位体等、マーカーとしては、レポーター遺伝子、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等、または検出用のエピトープタグ、例えば６×Ｈｉｓ−ｔａｇ等、公知のものが利用できる。これらシグナルまたはマーカーの検出方法は当業者には周知のものである。簡便には、ｍ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解および／またはμ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解は、これら蛋白質またはこれら蛋白質の分解物の存在若しくは不存在の検出および／またはその量の変化の測定により判定可能である。これら蛋白質量またはこれら蛋白質の分解物量の定量は、自体公知の蛋白質またはペプチドの検出方法、例えばウェスタンブロッティング法等を用いて実施できる。  
【００４１】
本発明において使用するｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパイン、ＰＥＰ−１９は、これらを遺伝子工学的手法で発現させた細胞、無細胞系合成産物、化学合成産物、または該細胞や生体試料から調製したものであってよく、これらからさらに精製されたものであってもよい。また、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインとＰＥＰ−１９の相互作用、およびこれら蛋白質の機能、例えばｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインの蛋白質分解酵素活性やＰＥＰ−１９の酵素基質としての性質等に影響がなければ、Ｎ末端側やＣ末端側に別の蛋白質やポリペプチド、例えばβ−ガラクトシダーゼ、ＩｇＧ等の免疫グロブリンＦｃ断片、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、またはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のｔａｇペプチド類を、直接的にまたはリンカーペプチド等を介して間接的に、遺伝子工学的手法等を用いて付加したものであってもよい。
【００４２】
本発明において、ｍ−カルパイン、μ−カルパイン若しくはＰＥＰ−１９又はその遺伝子を生体試料から調製、使用する場合、その由来はヒトに限らない。例えば、ラット、マウス、ブタ、ウシ等の生体由来試料からこれら蛋白質又は該蛋白質をコードする遺伝子を調製して使用することも可能である。
【００４３】
本発明において使用できる、ヒトＰＥＰ−１９の蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１に、ヒトＰＥＰ−１９のＤＮＡの塩基配列を配列番号２に、ヒトμ−カルパインラージサブユニットの蛋白質のアミノ酸配列を配列番号３に、ヒトμ−カルパインラージサブユニットのＤＮＡの塩基配列を配列番号４に、ヒトμ−カルパインスモールサブユニットの蛋白質のアミノ酸配列を配列番号５に、ヒトμ−カルパインスモールサブユニットのＤＮＡの塩基配列を配列番号６に、ラットｍ−カルパインラージサブユニットの蛋白質のアミノ酸配列を配列番号７に、ラットｍ−カルパインラージサブユニットのｍＲＮＡの塩基配列を配列番号８に、ラットｍ−カルパインスモールサブユニットの蛋白質のアミノ酸配列を配列番号９に、ラットｍ−カルパインスモールサブユニットのＤＮＡの塩基配列を配列番号１０に、ブタｍ−カルパインラージサブユニットの蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１１に、ブタｍ−カルパインスモールサブユニットの蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１２に、ブタｍ−カルパインスモールサブユニットのＤＮＡの塩基配列の配列番号１３に示す。
【００４４】
被検化合物としては、例えば化学ライブラリーや天然物由来の化合物、またはｍ−カルパイン、μ−カルパイン、ＰＥＰ−１９の一次構造や立体構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等が挙げられる。あるいは、ＰＥＰ−１９のｍ−カルパインにより分解される部位、またはＰＥＰ−１９のμ−カルパインより分解される部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドの構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等も被検化合物・候補化合物として好適である。
【００４５】
さらに、本発明は、カルシウム存在下におけるｍ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解およびカルシウム存在下におけるμ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解からなる群より選ばれる少なくとも１の分解を阻害する、カルパイン阻害剤を提供する。カルパイン阻害剤として、好ましくはカルパインの競合阻害剤であり得る。
本発明において、カルパイン阻害剤であるカルペプチンにより、グルタミン酸刺激により誘導された細胞死におけるＰＥＰ−１９の減少を抑制することができた（実施例３）。さらに、カルシウム存在下（実施例においては、６ｍＭ  ＣａＣｌ２）におけるＰＥＰ−１９のｍ−カルパインによる分解およびカルシウム存在下（実施例においては、６ｍＭ  ＣａＣｌ２）におけるＰＥＰ−１９のμ−カルパインによる分解を、カルパイン阻害剤であるＡＬＬＮ、ＡＬＬＭおよびカルペプチンのいずれによっても阻害することができた（実施例４）。従って、本発明に係るカルパイン阻害剤として、ＡＬＬＮ、ＡＬＬＭまたはカルペプチンを例示することができる。
【００４６】
また、上記同定方法で得られた化合物は、本発明に係るカルパイン阻害剤、本発明に係るカルパイン競合阻害剤、ＰＥＰ−１９のｍ−カルパインによる分解の阻害剤、ＰＥＰ−１９のμ−カルパインによる分解の阻害剤として利用可能である。当該化合物は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することにより、医薬用組成物として調製可能である。医薬用組成物の調製において、これらの化合物は、単独で使用することもできるし、複数を組合わせて使用することもできる。
【００４７】
ＰＥＰ−１９、上記同定方法で同定された化合物、本発明に係るカルパイン阻害剤、本発明に係るカルパイン競合阻害剤は、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解に基づく神経細胞死の阻害剤、阻害方法に利用可能である。好ましくは、虚血性神経細胞死の阻害剤、阻害方法として有用である。より好ましくは、虚血性神経細胞外グルタミン酸濃度上昇を起因とする虚血性神経細胞死の阻害剤、阻害方法に利用できる。
【００４８】
ＰＥＰ−１９、上記同定方法で同定された化合物、本発明に係るカルパイン阻害剤、本発明に係るカルパイン競合阻害剤、本発明に係る虚血性神経細胞死の阻害剤は、さらに、ｍ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解および／またはμ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解に基づく疾患の防止剤および／または治療剤、ならびに当該疾患の防止方法および／または治療方法に利用可能である。かかる疾患として、例えば神経細胞死に基づく疾患、具体的には虚血性脳疾患または神経変性疾患を挙げることができる。神経変性疾患としては、アルツハイマー病、ハンチントン病を挙げることができる。
【００４９】
本発明に係る疾患の防止剤および／または治療剤は、ＰＥＰ−１９、上記同定方法で同定された化合物、本発明に係るカルパイン阻害剤、本発明に係るカルパイン競合阻害剤、本発明に係る虚血性神経細胞死の阻害剤のうち少なくともいずれか１つを有効成分としてその有効量を含む医薬としてなしてもよいが、通常は、１種または２種以上の医薬用担体を用いて医薬用組成物として製造することが好ましい。
【００５０】
本発明に係る医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択されるが、通常約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲とするのが適当である。
【００５１】
医薬用担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤等の希釈剤や賦形剤等を例示でき、これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択使用される。
【００５２】
例えば水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等が挙げられる。これらは、本発明に係る剤形に応じて適宜１種類または２種類以上を組合せて使用される。
【００５３】
所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤等を適宜使用して調製することもできる。
【００５４】
安定化剤としては、例えばヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等を例示でき、これらは単独でまたは界面活性剤等と組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。上記Ｌ−アミノ酸は、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸等のいずれでもよい。糖類も特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等のいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のいずれでもよい。界面活性剤も特に限定はなく、イオン性および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。これには、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエ−テル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。
【００５５】
緩衝剤としては、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）等を例示できる。
【００５６】
等張化剤としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン等を例示できる。
【００５７】
キレート剤としては、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸等を例示できる。
【００５８】
本発明に係る医薬および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生埋的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することも可能である。
【００５９】
医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ乃至１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。上記投与量は１日１〜数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。
【００６０】
本発明の医薬組成物を投与するときには、該医薬組成物を単独で使用してもよく、あるいは目的の疾患の防止、治療または改善に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。
【００６１】
投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与のほか、皮下、皮内、筋肉内等への投与を挙げることができる。あるいは経口による投与も可能である。さらに、経粘膜投与または経皮投与も可能である。
【００６２】
投与形態としては、各種の形態が目的に応じて選択でき、その代表的なものとしては、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。
【００６３】
さらに、本発明は、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパイン、ｍ−カルパインをコードするポリヌクレオチドおよび／またはμ−カルパインをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、および該ベクターで形質転換されてなる形質転換体の少なくともいずれか１つと、ＰＥＰ−１９、ＰＥＰ−１９をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、および、該ベクターで形質転換されてなる形質転換のうち少なくともいずれか１つ、を含有することを特徴とする試薬キットを提供する。当該キットは、例えば、本発明に係る同定方法に使用することができる。
【００６４】
ｍ−カルパインおよびμ−カルパインは、標品として取得することができる。
【００６５】
ｍ−カルパインをコードするポリヌクレオチドおよび／またはμ−カルパインをコードするポリヌクレオチドは、例えば、ヒトｃＤＮＡライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。該ポリヌクレオチドを含有するベクターは該ポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに自体公知の遺伝子工学的手法で導入することにより製造することができる。該ベクターで形質転換されてなる形質転換体は、適当な宿主を用い自体公知のトランスフェクション法を用いて製造することが可能である。
【００６６】
本キットは、ｍ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解、μ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解等の検出に用いられるシグナルおよび／またはマーカー、緩衝液、並びに塩等の必要とされる物質を含むことができる。さらに、安定化剤および／または防腐剤等の物質を含んでいてもよい。製剤化にあたっては、使用する各物質それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。
【実施例１】
【００６７】
（ＰＥＰ−１９高発現のグルタミン酸毒性に対する作用）
初代培養神経細胞内でＰＥＰ−１９を高発現させ、グルタミン酸刺激によりどのような影響を受けるのかを検討した。
【００６８】
＜材料およびその調製＞
Ｗｉｓｔａｒ系ラット（胎生１７〜１８日齢）大脳皮質より初代培養神経細胞を得た。発現ベクターはＮ末端側にＦＬＡＧ−ｔａｇを付加したＰＥＰ−１９の翻訳領域をｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に組換えることにより作成したＰＥＰ−１９発現プラスミド、およびβＧａｌ発現ベクターを用いた。
【００６９】
＜方法＞
初代培養神経細胞にＰＥＰ−１９発現プラスミドを導入し、グルタミン酸により刺激した。具体的には、細胞数３×１０６／ウェル（Ｎ＝６）の初代培養神経細胞をポリエチレンイミンでコートしたカバースリップを入れた２４ウェルプレートに播種し、Ｂ２７添加物を含むＤＭＥＭ培地中で５％  ＣＯ２の存在下、３７℃にて５日間培養後、リン酸カルシウム法にてＰＥＰ−１９発現プラスミドおよびβＧａｌ発現ベクターをトランスフェクションした。培養２日後に２００μＭ  グルタミン酸（東京化成工業社製）で処理を行い、細胞死を惹起した。６時間後に４％  パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、抗βＧａｌ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で免疫染色、ヘキスト染色で核を染めた。その後、顕微鏡下でβＧａｌ発現細胞を観察し、細胞の生死を判定して計数した。
【００７０】
＜結果＞
グルタミン酸処理により、６時間後の死細胞の割合が３倍程度に増加するが、図１に示すようにＰＥＰ−１９高発現により死細胞の割合はグルタミン酸無処理の細胞群とほとんど変わらなかった。このことからＰＥＰ−１９を細胞内で高発現させることで、グルタミン酸誘導型細胞死を抑制できることがわかった。
【実施例２】
【００７１】
（ＰＥＰ−１９と相互作用する機能を有する蛋白質のインシリコでの探索）
ＰＥＰ−１９と相互作用する機能を有する蛋白質を、国際公開第ＷＯ０１／６７２９９号パンフレットに記載の予測方法に従って予測した。
【００７２】
＜材料および方法＞
ＰＥＰ−１９のアミノ酸配列（配列番号１）をある長さのオリゴペプチドに分解し、各オリゴペプチドのアミノ酸配列あるいはそのアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を持った蛋白質をデータベース中で検索し、得られた蛋白質とＰＥＰ−１９との間でローカルアライメントを行い、ローカルアライメントのスコアの高いものをＰＥＰ−１９と相互作用すると予測した。
【００７３】
＜結果＞
図２に示すように、予測解析の結果、ＰＥＰ−１９由来のアミノ酸残基からなるオリゴペプチド（ＫＫＡＧＳＱ（配列番号１４）、ＥＦＤＩＤＭＤ（配列番号１６））と相同性のあるオリゴペプチド（ＫＫＡＤＹＱ（配列番号１５）、ＥＦＤＩＳＥＤ（配列番号１７））が、ｍ−カルパインのアミノ酸配列中に存在することがわかった。
【実施例３】
【００７４】
（グルタミン酸によるＰＥＰ−１９減少に対するＮＭＤＡ受容体拮抗薬とカルパイン阻害薬の作用）
ＮＭＤＡ拮抗薬やカルパイン阻害薬による処理を行うことにより、グルタミン酸誘導性のＰＥＰ−１９の分解を抑制できるか否かを検討した。
【００７５】
＜材料およびその調製＞
実施例１と同様にＷｉｓｔａｒ系ラット（胎生１７〜１８日齢）大脳皮質より初代培養神経細胞を得た。抗ＰＥＰ−１９抗体は非特許文献２２を参考にウサギに抗体作製用抗原ＰＥＰ−１９を免疫して作製した。
【００７６】
＜方法＞
初代培養神経細胞のグルタミン酸処理および薬剤処理を行った。具体的には、細胞数５×１０５／ディッシュ（Ｎ＝１）の初代培養神経細胞を１２ウェルプレートに播種し、Ｂ２７添加物を含むＤＭＥＭ培地中で５％  ＣＯ２の存在下、３７℃にて２週間培養後、ＮＭＤＡ拮抗薬であるＡＰ−５  ０．５ｍＭ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）あるいはカルパイン阻害薬であるカルペプチン（ＣａｌｂｉｏＣｈｅｍ社製）２０μＭを添加し、１時間後に５００μＭのグルタミン酸（東京化成工業社製）で処理をし、４時間培養した。その後細胞を回収し、細胞ライセートを調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ってイモビロンＰＶＤＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に転写した後、抗ＰＥＰ−１９抗体（第一製薬株式会社製）を用いてウエスタンブロットを行った。
【００７７】
＜結果＞
図３に示すようにグルタミン酸によるＰＥＰ−１９の減少は、ＡＰ−５（ＮＭＤＡ拮抗薬）、カルペプチン（カルパイン阻害薬）により抑制された。このことから、グルタミン酸誘導性の細胞死において、ＮＭＤＡ受容体を介した細胞内のカルシウムの増加によって活性化されたカルパインがＰＥＰ−１９を分解し、その結果、カルモジュリンが過剰に機能する可能性が示唆された。
【実施例４】
【００７８】
（ＰＥＰ−１９のカルパインによる分解（ｉｎ  ｖｉｔｒｏプロテアーゼアッセイ））
カルパインによるＰＥＰ−１９の分解を哺乳類培養細胞および大腸菌にて発現させたＰＥＰ−１９蛋白質と精製カルパインを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏプロテアーゼアッセイにて検討した。
【００７９】
１．哺乳類培養細胞発現ＰＥＰ−１９
＜方法＞
哺乳類培養細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−Ｈｉｓ（Ｎ末端Ｈｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ−ｔａｇ付加、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にＰＥＰ−１９遺伝子を組み込み、発現ベクターＰＥＰ１９／ｐｃＤＮＡ３．１−Ｈｉｓを構築した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてＰＥＰ−１９／ｐｃＤＮＡ３．１−Ｈｉｓをトランスフェクションし、４８時間培養後、ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００）で細胞を溶解、４℃で１５０００ｒｐｍ、３０分間遠心した上清を細胞ライセートとした。作製した細胞ライセートにヒトμ−カルパイン、ラットｍ−カルパインまたはブタｍ−カルパイン（ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を添加し、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）／１ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）／６ｍＭ  ＣａＣｌ２存在下で３７℃、１時間インキュベーションした。カルシウム非存在下として、ＣａＣｌ２の代わりに１０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を添加した試料を作製した。インキュベーション後の試料は等量の２×ＳＤＳサンプルバッファーを加え５分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離後、抗ＰＥＰ−１９抗体を用いたウエスタンブロットによりＰＥＰ−１９を検出した。検出はＥＣＬ−ＰＬＵＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を使用して行った。
【００８０】
＜結果＞
図４に示すように、哺乳類培養細胞に発現させたＰＥＰ−１９蛋白質はヒトμ−カルパイン、ラットｍ−カルパインおよびブタｍ−カルパインにより、カルシウム添加群において分解が認められた。一方、ＥＤＴＡ添加群では、カルパイン存在下でもＰＥＰ−１９の分解が見られなかった。これらから、ＰＥＰ−１９はカルパインによってカルシウム依存的に分解されることが判明した。
【００８１】
２．大腸菌発現ＰＥＰ−１９
＜方法＞
大腸菌用発現ベクターｐＥＴ２４（＋）（Ｎ末端Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にＰＥＰ−１９遺伝子を組み込み、発現ベクターＰＥＰ−１９／ｐＥＴ２４（＋）を構築した。大腸菌ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）株にＰＥＰ−１９／ｐＥＴ２４（＋）をトランスフォーメーションし、Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＰＥＰ−１９発現大腸菌を作製した。この大腸菌を０．１ｍＭ  イソプロピル  １−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導し、６時間培養後、菌体を遠心により回収した。Ｂｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）で菌体を溶解し、４℃、１６０００ｒｐｍにて２０分間遠心後、上清を分離した。得られた上清からＴＡＬＯＮ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）でＨｉｓ−ｔａｇ付加ＰＥＰ−１９蛋白質を精製した。精製したＨｉｓ−ｔａｇ付加ＰＥＰ−１９は８ｋＤａ  Ｆｒａｍｅ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＰＩＥＲＣＥ社製）で透析を行い、溶液をＰＢＳと置換し、プロテアーゼアッセイの基質とした。Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＰＥＰ−１９蛋白質をヒトμ−カルパイン、ラットｍ−カルパインまたはブタｍ−カルパイン（ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）と２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）／１ｍＭ  ＤＴＴ／６ｍＭ  ＣａＣｌ２存在下で３７℃、１時間インキュベーションした。カルシウム非存在下としてＣａＣｌ２の代わりに１０ｍＭのＥＤＴＡを添加した試料を作製した。インキュベーション後の試料は等量の２×ＳＤＳサンプルバッファーを加え５分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離後、抗ＰＥＰ−１９抗体を用いたウエスタンブロットによりＰＥＰ−１９を検出した。なお、検出はＥＣＬ−ＰＬＵＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を使用した。
【００８２】
＜結果＞
図５に示すように、大腸菌で発現させたＰＥＰ−１９蛋白質はヒトμ−カルパイン、ラットｍ−カルパインおよびブタｍ−カルパインにより、カルシウム添加群おいて分解が確認された。一方、ＥＤＴＡ添加群ではカルパイン存在下でもＰＥＰ−１９の分解が見られなかったことにより、ＰＥＰ−１９はカルパインによってカルシウム依存的に分解されることが示された。
【００８３】
３．カルパイン阻害薬による分解阻害
＜方法＞
実施例４の１．における哺乳類培養細胞発現ＰＥＰ−１９と同様にＰＥＰ−１９／ｐＣＤＮＡ３．１−Ｈｉｓ発現ベクターでＰＥＰ−１９蛋白質を発現させた細胞ライセートを作製した。細胞ライセートにヒトμ−カルパインまたはラットｍ−カルパイン（ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を添加し、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）／１ｍＭ  ＤＴＴ／６ｍＭ  ＣａＣｌ２存在下で３７℃、１時間インキュベーションした。カルシウム非存在下としてＣａＣｌ２の代わりに１０ｍＭのＥＤＴＡを添加した試料を、またカルパイン阻害薬添加群として最終濃度５０μＭとなるようにＡＬＬＮ、ＡＬＬＭまたはカルペプチン（ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を添加した試料をそれぞれ作製した。インキュベーション後の試料は等量の２×ＳＤＳサンプルバッファーを加えて５分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離後、抗ＰＥＰ−１９抗体を用いたウエスタンブロットによりＰＥＰ−１９を検出した。なお、検出はＥＣＬ−ＰＬＵＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を使用した。
【００８４】
＜結果＞
図６に示すようにＰＥＰ−１９蛋白質のヒトμ−カルパインおよびラットｍ−カルパインによる分解はＡＬＬＮ、ＡＬＬＭ、カルペプチンのいずれかのカルパイン阻害薬によって阻害された。
【実施例５】
【００８５】
（ＭＳ装置「４７００  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ」を用いたＨｉｓ−ｔａｇ付加ＰＥＰ−１９（Ｔ７−ＰＥＰ−１９−Ｈｉｓ）消化ペプチドの分析）
μ−カルパイン処理前後のＰＥＰ−１９の質量情報を得ることを目的としてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ−ＭＳ装置「４７００  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ」を用いた質量分析を行った。
【００８６】
ＰＥＰ−１９として、Ｎ末端およびＣ末端にそれぞれＴ７−ｔａｇおよびＨｉｓ−ｔａｇが付加されたＰＥＰ−１９（以下、Ｔ７−ＰＥＰ−１９−Ｈｉｓと称する）を大腸菌発現系にて発現させて用いた。
【００８７】
＜方法＞
大腸菌発現系にて発現させたＴ７−ＰＥＰ−１９−ＨｉｓをＴＡＬＯＮ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて精製し、試料（１）（μ−カルパイン添加前の試料）とした。これに、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ  ＤＴＴ、および６ｍＭＣａＣｌ２共存下、等量のμ−カルパインを添加し、３７℃で１時間酵素反応させ、試料（２）（μ−カルパイン添加後の試料）とした。分析装置には、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型ＭＳ装置「４７００  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ａｎａｌｙｚｅｒ」（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した。
【００８８】
５ μｌの試料（１）および（２）に各々５ μｌの２％ギ酸を添加し、Ｚｉｐ  ｔｉｐ  Ｃ１８（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて試料を脱塩後、２ μｌに濃縮した。その０．５μｌをマトリックスとともにＭＡＬＤＩ用サンプルプレートに塗布し、乾固後、「４７００  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ」でＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ−ＭＳ分析を行った。マトリックスにはα−ＣＨＣＡを使用した。試料（１）はＬｉｎｅａｒ  ｍｏｄｅ、試料（２）はＲｅｆｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｏｄｅで測定した。
【００８９】
＜結果＞
図７に示すように、試料（１）のＭＳ測定の結果、強度の高いｍ／ｚ ９２００のイオンが検出された。また、図８に示すように、試料（２）のＭＳ測定の結果、ｍ／ｚ ６３９３．９および２８１８．６をモノアイソトピック質量（Ｍｍ．）とするイオンが観測された。さらに、ｍ／ｚ２８１８．６のイオンをＭＳ／ＭＳ測定したところ、ｍ／ｚ８４１．３、７０４．３、５６７．２、４３０．２のフラグメントが観測された。これらのイオンの質量差（約１３７）は、連続したＨｉｓの存在の可能性を示した。ｍ／ｚ  ２８１８．６のペプチドがＨｉｓ−ｔａｇを有すると仮定した場合、ｍ／ｚ８４１．３のイオンはｙ６イオン（Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ）の質量（８４１．４）と一致した。以上の結果から、消化前のＴ７−ＰＥＰ−１９−Ｈｉｓの質量は約９２００であること、それにμ−カルパインを添加することで、Ｍｍ．６３９３．９と２８１８．６の２つのペプチドが生成すること、さらに、Ｍｍ．２８１８．６のペプチドにはＨｉｓ−ｔａｇが存在することが示唆された。
【００９０】
Ｔ７−ＰＥＰ−１９−Ｈｉｓのアミノ酸配列をもとに作成した質量テーブルを用いて、得られたＭＳ測定結果を照合した。その結果、消化前のＴ７−ＰＥＰ−１９−Ｈｉｓのアミノ酸配列は、Ｔ７−ｔａｇのアミノ末端（Ｍｅｔ）が１残基切断された配列にＰＥＰ−１９の配列およびＨｉｓ−ｔａｇの配列が連結されたもの、すなわちＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＲＤＰＭＳＥＲＱＧＡＧＰＴＮＧＫＤＫＴＳＧＥＮＤＧＱＫＫＶＱＥＥＦＤＩＤＭＤＡＰＥＴＥＲＡＡＶＡＩＱＳＱＦＲＫＦＱＫＫＫＡＧＳＱＳＬＥＨＨＨＨＨＨと推測された。また、消化後のサンプルから検出されたペプチドの一方（Ｍｍ．６３９３．９）はアミノ末端側（ＡＳＭＴＧ・・・ＡＶＡＩＱ、Ｍｍ．：６３９３．９）、他方（Ｍｍ．２８１８．６）はカルボキシル末端側（ＳＱＦＲＫ・・・ＬＥＨＨＨＨＨＨ、Ｍｍ．：２８１８．４）であり、μ−カルパインによるＰＥＰ−１９切断部位は４７位（Ｇｌｎ）と４８位（Ｓｅｒ）の間であると推測された。
【実施例６】
【００９１】
（ＭＳ装置「ＬＴＱ−ＦＴ」を用いたＨｉｓ−ｔａｇ付加ＰＥＰ−１９（Ｔ７−ＰＥＰ−１９−Ｈｉｓ）消化ペプチドの分析）
実施例５で導き出した推測の正否を確認するため、より分解能・質量精度が高いＬＣ／ＭＳ／ＭＳ装置「ＬＴＱ−ＦＴ」を用いて、μ−カルパインで分解したＴ７−ＰＥＰ−１９−Ｈｉｓおよび分解前のＴ７−ＰＥＰ−１９−Ｈｉｓの分析を行った。
【００９２】
＜方法＞
大腸菌発現系にて発現させたＴ７−ＰＥＰ−１９−ＨｉｓをＴＡＬＯＮ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて精製し、試料（１）（μ−カルパイン添加前の試料）とした。これに、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１ｍＭ  ＤＴＴ、および６ｍＭ  ＣａＣｌ２共存下、等量のμ−カルパインを添加し、３７℃で１時間酵素反応させ、試料（２）（μ−カルパイン添加後の試料）とした。各試料を０．０１％トリフルオロ酢酸で１００倍希釈し、その１μｌをＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析した。分析装置には、ＨＰＬＣ装置「ＰａｒａｄｉｇｍＭＳ４」（ＡＭＲ社製）とオートサンプラー「ＨＴＣＰＡＬ」（ＡＭＲ社製）を接続し、ｎａｎｏＥＳＩを搭載した、ＥＳＩ−ＩＴ−ＦＴＩＣＲ型ＭＳ装置「ＬＴＱ−ＦＴ」（ＴｈｅｒｍｏＥＬＥＣＴＲＯＮ社製）を使用した。
【００９３】
＜結果＞
試料（１）では、ＨＰＬＣ溶出時間２５．７分にピークが検出され、スペクトル上にｍ／ｚ １３１５．３および１１５１．０のイオンが観測された。それらのイオンをｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ（デコンボリューション）したところ、前駆体の平均質量９２００．０が算出された。先のイオンは各々その７価および８価イオンであった。また、試料（２）では、ＨＰＬＣ溶出時間２２．２分のピークのスペクトル上にｍ／ｚ１２８０．６の５価イオンが観測され、デコンボリューションの結果、前駆イオンの平均質量６３９９．０が算出された。さらに、図９に示すように、前記５価イオンをＭＳ／ＭＳ測定したところ、ｍ／ｚ１２５１．５８、１２２８．９６、および１２１４．７５の５価イオンが観測され、その質量差から、本ペプチドの末端配列がＡＩＱであることが明らかとなった。
【００９４】
このことから、消化前のＴ７−ＰＥＰ−１９−Ｈｉｓの平均質量は９２００であること、および、Ｔ７−ＰＥＰ−１９−Ｈｉｓをμ−カルパイン処理することで生成するペプチドの１つは、末端配列がＡＩＱである平均質量６３９９．０のペプチドであることが明らかとなった。本結果は、実施例５で導き出した推測内容を明確に支持した。
【００９５】
以上の結果を総合的に判断し、図１０に示すように、μ−カルパインによるＰＥＰ−１９切断部位（推定）は４７位（Ｇｌｎ）と４８位（Ｓｅｒ）の間である、という結論を得た。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明はＰＥＰ−１９とｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインの相互作用、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインによるＰＥＰ−１９の分解、に基づく虚血性神経細胞死の阻害、並びに虚血性神経細胞死に基づく疾患、例えば虚血性脳疾患、神経変性疾患の防止、治療または改善のために利用可能であり、医薬分野において非常に有用性が高い。さらに、グルタミン酸誘導性神経細胞死の機構の解明等の研究分野にも利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】グルタミン酸処理６時間後の死細胞の割合はコントロールと比較して３倍程度に増加した。これに対し、ＰＥＰ−１９高発現により死細胞の割合はグルタミン酸無処理の細胞群と変わらなかった。（実施例１）
【図２】ＰＥＰ−１９とｍ−カルパインとの相互作用をインシリコで予測した結果を示す。ＰＥＰ−１９とｍ−カルパインのローカルアライメントを行い、高いスコアを示した領域を表示した。上の配列および下の配列はそれぞれ、ＰＥＰ−１９に存在する配列およびｍ−カルパインに存在する配列である。（実施例２）
【図３】グルタミン酸による細胞死誘導において、グルタミン酸によるＰＥＰ−１９の発現の減少はＡＰ−５（ＮＭＤＡ拮抗薬）、カルペプチン（カルパイン阻害薬）により抑制された。（実施例３）
【図４】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現させたＨｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ−ｔａｇ付加ＰＥＰ−１９蛋白質（Ｈｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ−ＰＥＰ１９）はカルシウム依存的にｍ−カルパインおよびμ−カルパインによって分解された。（実施例４）
【図５】大腸菌で発現させたＨｉｓ−ｔａｇ付加ＰＥＰ−１９蛋白質（Ｈｉｓ−ＰＥＰ１９）がカルシウム依存的にｍ−カルパインおよびμ−カルパインによって分解された。（実施例４）
【図６】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現させたＨｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ−ｔａｇ付加ＰＥＰ１９蛋白質（Ｈｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ−ＰＥＰ１９）のｍ−カルパインおよびμ−カルパインによる分解が、カルパイン阻害剤（ＡＬＬＮ、ＡＬＬＭ、カルペプチン）によって阻害された。（実施例４）
【図７】μ−カルパイン未処理のＨｉｓ−ｔａｇ付加ＰＥＰ−１９（Ｔ７−ＰＥＰ−１９−Ｈｉｓ）の平均質量が９２００であることを示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルである。（実施例５）
【図８】μ−カルパイン処理後のＨｉｓ−ｔａｇ付加ＰＥＰ−１９（Ｔ７−ＰＥＰ−１９−Ｈｉｓ）から、Ｍｍ．６３９３．９および２８１８．６のイオンが観測されることを示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルである。（実施例５）
【図９】μ−カルパイン処理後のＨｉｓ−ｔａｇ付加ＰＥＰ−１９（Ｔ７−ＰＥＰ−１９−Ｈｉｓ）から得られたｍ／ｚ １２８０．６のイオンから、末端配列がＡＩＱであることを示唆するｍ／ｚ１２５１．６、１２２９．０、１２１４．８のフラグメントが生成することを示すＬＣ／ＥＳＩ−ＦＴＭＳ／ＭＳスペクトルである。（実施例６）
【図１０】μ−カルパインによるＨｉｓ−ｔａｇ付加ＰＥＰ−１９（Ｔ７−ＰＥＰ−１９−Ｈｉｓ）の推定切断部位を示す。μ−カルパインによるＨｉｓ−ｔａｇ付加ＰＥＰ−１９（Ｔ７−ＰＥＰ−１９−Ｈｉｓ）切断部位はＰＥＰ−１９の４７位（Ｇｌｎ）と４８位（Ｓｅｒ）の間に存在する。下線部は、それぞれＴ７−ｔａｇの一部あるいはＨｉｓ−ｔａｇを示し、太字部分（ＭＳＥＲＱＧＡ・・・ＫＫＡＧＳＱＳ）はＰＥＰ−１９本体のアミノ酸配列を示す。（実施例６）
【配列表フリーテキスト】
【００９８】
配列番号１：ヒトＰＥＰ−１９のアミノ酸配列。
配列番号２：ヒトＰＥＰ−１９の遺伝子配列。
配列番号３：ヒトμ−カルパインラージサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号４：ヒトμ−カルパインラージサブユニットの遺伝子配列。
配列番号５：ヒトμ−カルパインスモールサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号６：ヒトμ−カルパインスモールサブユニットの遺伝子配列。
配列番号７：ラットｍ−カルパインラージサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号８：ラットｍ−カルパインラージサブユニットの遺伝子配列。
配列番号９：ラットｍ−カルパインスモールサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号１０：ラットｍ−カルパインスモールサブユニットの遺伝子配列。
配列番号１１：ブタｍ−カルパインラージサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号１２：ブタｍ−カルパインスモールサブユニットのアミノ酸配列。
配列番号１３：ブタｍ−カルパインスモールサブユニットの遺伝子配列。 
配列番号１４：ＰＥＰ−１９とｍ−カルパインとのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＰＥＰ−１９の部分オリゴペプチド。
配列番号１５：ＰＥＰ−１９とｍ−カルパインとのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したｍ−カルパインの部分オリゴペプチド。
配列番号１６：ＰＥＰ−１９とｍ−カルパインとのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＰＥＰ−１９の部分オリゴペプチド。
配列番号１７：ＰＥＰ−１９とｍ−カルパインとのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したｍ−カルパインの部分オリゴペプチド。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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