(57)【要約】      （修正有）【課題】土壌からのＤＮＡ収率の高いＤＮＡ調製方法、およびＤＮＡ調製キットの提供。【解決手段】ＤＮＡ調製方法は、土壌と酢酸エチルなどの有機溶媒とを混合し、その後、土壌と有機溶媒とを分離する溶媒処理工程と、上記溶媒処理工程を経た土壌からＤＮＡを抽出する抽出工程とを含む。溶媒処理工程によって、土壌中に存在するＤＮＡ抽出を阻害する物質や、抽出後のＤＮＡのＰＣＲ反応を阻害する物質が除去されるので、ＤＮＡの収率が向上する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
土壌と有機溶媒とを混合し、その後土壌と上記有機溶媒とを分離する溶媒処理工程と、
上記溶媒処理工程を経た土壌から核酸を抽出する抽出工程とを含むことを特徴とする核酸調製方法。
【請求項２】
上記有機溶媒は、酢酸エチル、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、アセトン、およびブタノールからなる群より選択される少なくとも１つの有機溶媒であることを特徴とする請求項１に記載の核酸調製方法。
【請求項３】
上記溶媒処理工程において、有機溶媒／土壌（体積比）は１以上であることを特徴とする請求項１または２に記載の核酸調製方法。
【請求項４】
上記抽出工程によって抽出された核酸を鋳型として、ＰＣＲによる核酸の増幅を行なう増幅工程を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸調製方法。
【請求項５】
核酸抽出試薬を備え、土壌から核酸を調製する核酸調製キットであって、
核酸抽出試薬の使用前に土壌と混合して使用される有機溶媒を少なくとも備えることを特徴とする核酸調製キット。
【請求項６】
上記有機溶媒は、酢酸エチル、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、アセトン、およびブタノールからなる群より選択される少なくとも１つの有機溶媒であることを特徴とする請求項５に記載の核酸調製キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、土壌、特に油性物質によって汚染された土壌から核酸を調製する核酸調製方法、および核酸調製キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
土壌または川等の水源等の自然環境中に含まれるＤＮＡおよびＲＮＡ等の核酸を抽出する技術は、２０００年代に入ってから急速な発展を続けているＭＧ（Metagenomic）にとって、必須の技術である。ＭＧは、個々の生物のゲノムを対象としてきた従来のゲノミクスとは異なり、環境中に含まれる多様な全ての微生物のゲノムを対象とする。
【０００３】
例えば、森林および畑地の土壌１グラム中には、それぞれ１０７、１０９個を超える原核生物が存在する。しかし、そのうち実験室で培養可能な微生物は、０．１〜１％程度であると考えられている。
【０００４】
ＭＧは、培養不可能な微生物を含めた全ての環境微生物のゲノムを対象とするので、環境中の微生物組成の実態を反映するようにＤＮＡが抽出されることが求められる。
【０００５】
土壌または海水等から得られる環境ゲノムは、そのライブラリーの規模がヒトゲノム（３Ｇｂｐ）に比べて数桁のレベルで大きいことから、人類にとって有用な未知の遺伝情報（遺伝子）を極めて豊富にもつと予想される。実際、微生物生態学および進化学等の基礎研究分野に止まらず、遺伝子工学分野でのＭＧの利用は目覚しいものがある。例えば酵素工業に関しては、２００３年度２３億ドルの市場規模が、２０１０年には１６００億ドルに上るだろうとみられている。
【０００６】
環境ＤＮＡの質的にも量的にも豊かな供給源は土壌である。また、土壌の物理学的および化学的な性質は多様である。そこで、このように多様な土壌からＤＮＡを抽出するために、界面活性剤の使用、高温処理、凍結融解、またはビーズを用いた機械的破壊等、様々な方法が開発されている。また、この開発の成果に基づくＤＮＡ抽出キットが、国内外で生産販売されている。
【特許文献１】特開２００４−８１０６１号公報（２００４年３月１８日公開）
【非特許文献１】松本直幸ら  平成１４年度 農業環境研究成果情報（第9集）p.１７：スキムミルクを用いた黒ボク土からのDNA抽出法
【非特許文献２】Hoshino and Matsumoto；Programme and Abstracts, 7th Symposium on Bacterial Genetics and Ecology, Bergen, Norway，88（2002）
【非特許文献３】P. Robe, R. Nalin, C. Capellano, T.M. Vogel, P. Simonet  Eur. J. Soil Biol. 39: 183-190 (2003)
【非特許文献４】R.A. Hurt, X. Qiu, L. Wu, Y. Roh, A.V. Palumbo, J.M. Tiedje, J. Zhou   Appl. Environ. Microbiol. 67: 4495-4503 (2001)
【非特許文献５】N. Fortin, D. Beaumier, K. Lee, C.W. Greer  J. Microbiol. Methods 56: 181-191
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、従来のキットでは、多くの土壌において、ＤＮＡが全く抽出されないか、または抽出量が非常に少ないという問題がある。その原因は未だ十分には解明されていないが、土壌内の成分へのＤＮＡの吸着、および、土壌内における酵素反応を阻害する物質の存在等が影響しているのではないかと考えられている。
【０００８】
つまり、細胞を破砕する等によって細胞外にＤＮＡを取り出すことができても、このＤＮＡが、例えば土壌中の砂礫または腐食物質に吸着されることによって水相へ移行しにくくなる。これによって、土壌からのＤＮＡの抽出効率が低下する。腐食物質とは、難分解性の有機物の混合物であり、土壌に普遍的に含まれるものである。
【０００９】
また、土壌から抽出されたＤＮＡは、ＰＣＲによって増幅された後、ライブラリーの構築等に利用されるが、土壌内には、ＰＣＲおよびライブラリーで使用される酵素の反応を阻害する物質が含まれている。この阻害物質の存在によってＰＣＲの増幅効率が低下し、その結果、ＤＮＡが全く増幅されないまたは増幅率が非常に小さいといった問題が起こる。このような阻害物質の例として、上述の腐食物質が挙げられる。
【００１０】
さらに、腐食物質に限らず、未知の原因により土壌からのＤＮＡの抽出が困難である例、および、ＤＮＡ抽出後の操作が影響を受ける例が報告されている。
【００１１】
本発明は、上記従来の課題に鑑みたものであり、その目的は、土壌中からの核酸収率のよい核酸調製方法および核酸調製キットを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、核酸抽出工程に先立って、土壌と有機溶媒とを混合し、その後土壌と上記有機溶媒とを分離する溶媒処理工程を行なうことで、土壌からの核酸収率が従来の技術よりも著しく高まることを独自に見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
本発明は上記新規な知見に基づいて完成されたものであり、以下の発明を包含する。
（１）土壌と有機溶媒とを混合し、その後土壌と上記有機溶媒とを分離する溶媒処理工程と、上記溶媒処理工程を経た土壌から核酸を抽出する抽出工程とを含む核酸調製方法。
（２）上記有機溶媒は、酢酸エチル、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、アセトン、およびブタノールからなる群より選択される少なくとも１つの有機溶媒である上記（１）に記載の核酸調製方法。
（３）上記溶媒処理工程において、有機溶媒／土壌（体積比）は１以上である上記（１）または（２）に記載の核酸調製方法。
（４）上記抽出工程によって抽出された核酸を鋳型として、ＰＣＲによる核酸の増幅を行なう増幅工程を含む上記（１）〜（３）のいずれかに記載の核酸調製方法。
（５）核酸抽出試薬を備え、土壌から核酸を調製する核酸調製キットであって、核酸抽出試薬の使用前に土壌と混合して使用される有機溶媒を少なくとも備える核酸調製キット。
（６）上記有機溶媒は、酢酸エチル、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、アセトン、およびブタノールからなる群より選択される少なくとも１つの有機溶媒である上記（５）に記載の核酸調製キット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る核酸調製方法は、土壌と有機溶媒とを混合し、その後土壌と上記有機溶媒とを分離する溶媒処理工程と、上記溶媒処理工程を経た土壌から核酸を抽出する抽出工程とを含む構成である。
【００１５】
上記構成によって、土壌の重量当たりの核酸の収率が、従来の核酸抽出方法よりも高められる。また、本発明の核酸調製方法は、多様な土壌に対して、適用可能である。
【００１６】
また、本発明には、核酸抽出試薬を備え、土壌から核酸を調製する核酸調製キットであって、核酸抽出試薬の使用前に土壌と混合して使用される有機溶媒を少なくとも備える核酸調製キットも含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、核酸調製方法および核酸調製キットに関するものである。そこで、まず核酸の調整方法について説明し、次いで核酸調製キットについて説明する。なお、本発明において「核酸」とは、ＤＮＡおよびＲＮＡのどちらであってもよい。
【００１８】
＜１＞核酸調製方法
本発明の核酸調製方法は、土壌と有機溶媒とを混合し、その後土壌と上記有機溶媒とを分離する溶媒処理工程と、上記溶媒処理工程を経た土壌から核酸を抽出する抽出工程とを含めばよい。これ以外の構成は、特に限定されるものではない。
【００１９】
上記構成によると、土壌からの核酸収率（土壌の重量当たりの核酸収量）が、従来の土壌からの核酸抽出方法と比較して、非常に高いという効果を奏する。また、本発明の核酸調製方法は、種々の土壌に対して好適に利用できる。つまり、従来の方法では核酸抽出が困難であった土壌からでも、効率よく核酸を抽出することができる。
【００２０】
なお、非特許文献５には、ＤＮＡ抽出に先立って土壌を洗浄する方法が記載されているものの、使用している溶媒は、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ、およびＴｒｉｔｏｎＸ-１００を含むトリス-塩酸緩衝液であり、本発明のように、有機溶媒を用いるものではない。
【００２１】
また、フェノールやクロロホルム等の有機溶媒を核酸調製に使用することはあるが、土壌からの抽出に先立って有機溶媒による洗浄を行なうことが、核酸抽出の効率を向上させる効果を奏することは、本発明者らが新規に見出した知見である。また、本発明者らは、有機溶媒のうち、酢酸エチル、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、アセトン、およびブタノールが特に効果的であることを下記実施例でも実証している。
【００２２】
溶媒処理工程に用いる有機溶媒は、種々の有機溶媒を目的に合わせて適宜選択、組み合わせることが可能である。なお、本発明者らは、一般的な土壌に対して、酢酸エチル＞ジクロロメタン＝ジエチルエーテル＝アセトン＞ブタノールの順に核酸抽出効果を高める効果が高いことを確認している。溶媒処理工程においては、各有機溶媒の沸点、またはその近傍の温度にて処理することにより、土壌有機物の効率的除去や核酸分解酵素の不活性化などにより、さらに核酸抽出効率を向上させることができる。
【００２３】
本発明の核酸調製方法の作用機構は、次のようなものであると考えられる。溶媒処理工程において、まず、土壌と上記有機溶媒とを混合することによって、土壌中の物質の一部が有機溶媒相に移行する。その後、土壌と有機溶媒とを分離することによって、溶媒相に溶解した物質は土壌中から除去される。この溶媒処理工程によって除かれる土壌成分の中には、核酸抽出を妨げる抽出阻害物質が含まれていると考えられる。つまり、溶媒処理工程によって、土壌中に存在する抽出阻害物質が除去されるので、その後の抽出工程における抽出効率が向上する。
【００２４】
また、上記溶媒処理工程によって除かれる土壌成分の中には、ＰＣＲ等における酵素反応を阻害する反応阻害物質が含まれていることが好ましい。これによって、抽出工程によって抽出された核酸を用いてＰＣＲを行った場合、ＰＣＲによる増幅効率が高く、容易に多量の核酸を得ることができるという効果を奏する。
【００２５】
抽出阻害物質および反応阻害物質としては、土壌中の石油成分または腐食物質が挙げられるが、もちろんこれに限定されず、未知の抽出阻害物質および反応阻害物質が、ジクロロメタン処理工程によって除かれる場合も、本発明に含まれる。また、抽出阻害物質および反応阻害物質を除去することができるというのは、本発明の効果を説明するための作用機構の一例に過ぎない。つまり、本発明は、溶媒処理工程と抽出工程とを含めばよく、上述の作用機構に限定されるものではない。
【００２６】
溶媒処理工程には、環境中から採取された土壌を直接用いてもよいし、水等による洗浄、または乾燥等、何らかの前処理を行ったものを用いてもよい。
【００２７】
また、本発明の溶媒処理工程において、有機溶媒／土壌（体積比）は１以上であることが好ましい。この土壌の体積とは、乾燥状態または湿潤状態のどちらであってもよく、ジクロロメタン処理工程に供する土壌の体積であるとする。上記構成によると、特に核酸抽出効率および増幅効率が高められるという効果を奏する。これは、有機溶媒／土壌を１以上とすることによって、抽出物質および反応阻害物質を特に効率よく除去することができるからであると考えられる。
【００２８】
また、溶媒処理工程の対象となる土壌中には油性物質が含まれており、上記油性物質が土壌中に占める割合は、１重量％以上である場合、本発明の効果は特に顕著である。油性物質とは、疎水性を有する物質であり、具体的には、重油、原油、石油、ガソリン、軽油、灯油、潤滑油、切削油、コールタール又はグリース等が挙げられる。これらの油性物質を含む土壌からは、核酸の抽出および増幅が特に困難であることが知られている。しかし、本発明の核酸調製方法によると、このような油性物質を、しかも１重量％以上含んだ土壌からも、核酸を調製することができる。
【００２９】
溶媒処理工程を行なう回数は、特に限定されるものではなく、土壌に含まれる抽出阻害物質および反応阻害物質の量等、土壌に合わせて適宜変更可能である。つまり、土壌と有機溶媒との混合、およびその後の土壌と有機溶媒との分離は、１回ずつ行ってもよいし、２回以上繰り返してもよい。
【００３０】
現在、油槽所跡地および工場跡地等における油性物質による土壌および周囲の水源の汚染が数多く報告されており、汚染土壌および水源の浄化は急務である。油性物質を含む土壌には、潜在的に、油性物質を分解する能力を有する微生物が多種存在すると考えられている。つまり、本発明の核酸調製方法によると、これら微生物のゲノムを得ることができるので、油性物質の分解に有用な酵素等の遺伝情報を取得することができる。
【００３１】
溶媒処理工程において、土壌と有機溶媒とを混合する方法は、土壌と有機溶媒とを十分に混合することによって、抽出阻害物質および反応阻害物質を有機溶媒中に溶解させることができればよく、特に限定されるものではない。すなわち、振盪撹拌によって混合および撹拌してもよく、ミルによって土壌中の粒子の破砕と有機溶媒との混合とを同時に行ってもよく、土壌と有機溶媒との混合物中に撹拌子を投入し、この撹拌子を回転させることによって撹拌してもよい。
【００３２】
また、溶媒処理工程に、土壌の凍結融解およびビーズを用いた粉砕等、従来の核酸抽出に用いられてきた種々の手技を組み合わせることも可能である。
【００３３】
さらに、土壌と有機溶媒とを分離する方法も特に限定されるものではなく、遠心、ろ過、乾燥、これらの組み合わせ等、適宜変更可能である。
【００３４】
なお、抽出工程としては、分子生物学における従来公知の核酸抽出方法を好適に利用することができる。特に、土壌からの核酸抽出方法として知られている方法を好適に利用することができる。土壌中の微生物から核酸を抽出するには、一般的に（ｉ）細胞を破壊すること、および（ｉｉ）破壊した細胞から核酸を抽出することの２段階からなると言える。上記（ｉ）については乳鉢乳棒、ビーズ、凍結融解、加熱、超音波処理などによる機械的な破壊と、ドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤やＥＤＴＡなどのキレート剤による化学的破壊、およびリゾチームやプロテイナーゼＫなどの酵素を用いる酵素学破壊などが知られている。上記（ｉｉ）については抽出後の精製をも考慮してフェノールまたはクロロホルム抽出、それに続くエタノール、イソプロパノールまたはポリエチレングリコールによる抽出などが知られている。ＤＮＡの抽出効率を上げるためにスキムミルク方法も挙げられる。本発明は上記の抽出操作に先立つ前処理の方法であるので、何れの抽出方法にも適用可能である。
【００３５】
また、本発明の核酸調製方法は、上記抽出工程によって抽出された核酸を鋳型として、ＰＣＲによる核酸の増幅を行なう増幅工程を含んでもよい。上述したように、本発明の核酸調製方法は、溶媒処理工程によって反応阻害物質を除去することができるので、ＰＣＲによる増幅効率が著しく高まる。増幅工程としては、分子生物学における従来公知のＰＣＲ法を好適に利用することができる。
【００３６】
＜２＞核酸調製キット
本発明の核酸調製キットは、核酸抽出試薬を備え、土壌から核酸を調製する核酸調製キットであって、核酸抽出試薬の使用前に土壌と混合して使用される有機溶媒を少なくとも備えればよい。
【００３７】
この核酸調製キットは、上記＜１＞欄の核酸調製方法によって、土壌中から核酸を調製する目的で使用される。つまり、有機溶媒は、核酸抽出試薬と混合されているものではなく、別体として核酸調製キットに含まれる。有機溶媒の種類および使用方法については、上記＜１＞欄で述べた通りである。
【００３８】
核酸抽出試薬とは、上記＜１＞欄の抽出工程を行なうのに必要な試薬である。つまり、核酸抽出試薬とは、ドデシル硫酸ナトリウム、緩衝液、リゾチーム、およびプロテイナーゼＫ等から構成されていることが好ましい。この他にも、従来の土壌核酸抽出キットに利用されてきた試薬を好適に利用することができる。
【００３９】
バイオテクノロジーの応用分野は、トランスジェニック植物の作出に代表されるGreen Biotechnology、薬品製造等が含まれるRed Biotechnology、バイオプラスチックス、バイオジーゼル、様々な酵素および食品の製造を担うWhite Biotechnologyと多様である。従来、これらバイオテクノロジーにおいて対象なるのは、既知生物の既知の遺伝子であった。しかし、ＭＧにおいて対象となるのは、環境ＤＮＡ（またはＲＮＡ）中に存在する未知の遺伝情報、すなわち遺伝子そのものである。
【００４０】
上述したように、環境中の微生物のほとんどは培養が不可能または著しく困難である。そのため、古典的な菌の単離および培養技術の組み合わせによって得ることのできる微生物およびその遺伝子は、地球上の全遺伝子から見ると極めて僅少である。
【００４１】
本発明によって、より効率よく土壌から環境ＤＮＡ（またはＲＮＡ）を得ることが可能となるので、本発明は、土壌環境ＤＮＡ（またはＲＮＡ）を用いたＭＧの発展および応用に広く利用可能である。
【００４２】
本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、有効な有機溶媒を適宜混合したり、連続的に使用したりするなど、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４４】
〔実施例１〕
（Ａ）溶媒処理工程
乾燥した水田土壌を０．５ｇマイクロチューブにとり、そこに５００μＬのジクロロメタンを加えた。ボルテックスミキサーによりよく混合した後、遠心分離（１３０００ｒｐｍ、３分）を行った。遠心分離後の上澄みを捨てた後、再度ジクロロメタンを加えて同じ操作を合計３回行なった。以上の処理を行った土壌は、１５分風乾してジクロロメタンを飛ばした。
【００４５】
（Ｂ）抽出工程
上記（Ａ）において得られた土壌試料から、日本ジーン社の土壌ＤＮＡ抽出キット  ＩＳＯＩＬ  を用い、同社指定のプロトコルに従って、ＤＮＡを抽出した。但し、撹拌はビーズビーター（(株)和研薬）を１３０００ｒｐｍ、４０秒の条件で用いた。抽出したＤＮＡを、１００μＬのＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）緩衝液に溶解させた。これをＤＮＡ試料と呼ぶ。
【００４６】
（Ｃ）解析
上記（Ｂ）で得られたＤＮＡ試料のＵＶスペクトルを測定することにより、ＤＮＡ量および純度を測定した。また、得られたＤＮＡの一部（５〜１０μＬ）をアガロースゲル電気泳動に供し、バンドパターンを解析した。
【００４７】
〔比較例１〕
上記（Ａ）の操作を行なわず、乾燥した水田土壌０．５ｇをそのまま用いた以外は、上記（Ｂ）および（Ｃ）と同様の操作を行った。
【００４８】
（Ｄ）実施例１および比較例１の解析結果
図１は比較例１で、図２は実施例１で得られたＤＮＡのＵＶスペクトルである。また、図３のレーン１〜３は比較例１で、レーン４〜６は実施例１で得られたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動の結果を示す図面である。
【００４９】
図１・２のスペクトルにおける２６０ｎｍの吸光度から、得られたＤＮＡ量は、比較例１で０．８０μｇ／５００ｍｇ（土壌）、実施例１で２．４３μｇ／５００ｍｇ（土壌）であることが分かった。すなわち、溶媒処理工程（Ａ）によって、ＤＮＡ抽出効率は約３倍に増加した。また、吸光度比（２６０ｎｍ／２８０ｎｍ）から、実施例１の方が比較例１よりもＤＮＡの純度が高いことが明らかとなった。溶媒処理工程（Ａ）によって、ＤＮＡ抽出効率が向上しているのは、図３からも明白である。
【００５０】
〔実施例２〕
（Ｅ）溶媒処理工程および抽出工程
土壌として石狩油田跡地（石狩市厚田区）の原油汚染土壌（約１０重量％の原油を含む）を用いた以外は、実施例１の（Ａ）および（Ｂ）と同様の操作を行い、ＤＮＡ試料を得た。
【００５１】
（Ｆ）ＰＣＲ工程
上記（Ｅ）で得られたＤＮＡ試料を鋳型とし、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の保存配列をプライマーとしてＰＣＲを行った。ネガティブコントロールとして、鋳型ＤＮＡを加えずにＰＣＲを行った。
【００５２】
（Ｇ）解析
上記（Ｆ）で得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供して１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅の有無を確認した（図６（ｂ））。
【００５３】
また、同ＰＣＲ産物を濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）に供することで、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡバンドパターンを解析した（図７）。なお、ポジティブコントロールとして、Pseudomonas aeruginosa strain WatG のＤＮＡを鋳型として、同様にＰＣＲを行った。
【００５４】
〔実施例３〕
実施例２の石狩油田跡地に隣接している草地の原油未汚染土壌を用いた以外は、実施例２の（Ｅ）〜（Ｇ）と同様の操作を行った。また上記（Ｅ）と同様の操作で得られたＤＮＡ試料について、ＵＶスペクトルを測定した。
【００５５】
〔比較例２・３〕
溶媒処理工程（実施例１の（Ａ））を行なわず、土壌をそのまま抽出工程に用いた以外は、実施例２の（Ｅ）および（Ｆ）と同様の操作を行った。なお、比較例２は実施例２と同様に原油汚染土壌を、比較例３は実施例３と同様に原油未汚染土壌を用いた。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供して、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅の有無を確認した（図６（ａ））。また、上記（Ｅ）と同様の操作で得られたＤＮＡ試料について、ＵＶスペクトルを測定した。
【００５６】
（Ｈ）実施例２・３、比較例２・３の解析結果
実施例３、比較例３について、上記（Ｅ）の操作で得られたＤＮＡ試料のＵＶスペクトルを測定した結果を、それぞれ図５・４に示す。図５・４に示すように、溶媒処理工程を行なうことによって、より効率よく土壌からＤＮＡを抽出することができた。
【００５７】
また、比較例２・３におけるＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供した結果、１８０ｂのＤＮＡ断片はほとんど検出されなかった（図６（ａ））。一方、溶媒処理を行った実施例２・３では、どちらも１８０ｂのＤＮＡ断片が検出された（図６（ｂ）のレーン１・２）。
【００５８】
実施例２・３のＤＧＧＥに供したところ、図７に示すように多数のバンドが認められた。油田跡地（実施例２）と草地土壌（実施例３）のバンドパターンが顕著に異なることから、双方の土壌における微生物コミュニティの構成に大きな違いがあることが分かる。
【００５９】
以上の結果により、溶媒処理工程は原油による汚染の有無に関わらず、ＤＮＡ抽出効率を向上させ、また、ＰＣＲにおける反応性を改善することが明らかとなった。
【００６０】
〔実施例４〕
（Ｉ）溶媒処理工程
乾燥した水田土壌を０．５ｇマイクロチューブにとり、そこに５００μＬの1％ＮａＣｌ水溶液、脱イオン水、ブタノール、アセトン、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、クロロホルム、石油エーテル、酢酸エチル、またはエタノールを加えた。実施例１にならいボルテックスミキサーによりよく混合した後、遠心分離（１３０００ｒｐｍ、３分）を行った。遠心分離後の上澄みを捨てた後、再度それぞれ同じ溶媒を加えて同じ操作を合計３回行った。以上の処理を行った土壌は、１５分風乾して有機溶媒を飛ばした。脱イオン水、ＮａＣｌ水溶液は有機溶媒と比較して蒸発し難いため、１５分以上乾燥した。
【００６１】
（Ｊ）抽出工程
実施例１の（Ｂ）欄と同様の操作を行い、ＤＮＡ試料を調製した。但し、ＤＮＡ抽出時はミクロスマッシュを１３０００ｒｐｍ、４０秒の条件で用いた。
【００６２】
（Ｋ）解析と結果
上記（Ｊ）欄の操作で得られたＤＮＡ試料の１／１０量（１０μＬ）をアガロースゲル電気泳動に供し、バンドパターンを解析した。図８に示すようにブタノール、アセトン、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、酢酸エチルを用いたときに明確なＤＮＡが検出できた。特に酢酸エチルが効果的であることが分かった。１％ＮａＣｌ、水、クロロホルム、石油エーテルの場合は明確なＤＮＡのバンドを示さなかった。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明のＤＮＡ調製方法およびＤＮＡ調製キットによると、土壌から効率よく環境ＤＮＡを調製することができる。また、従来の技術ではＤＮＡ調製が困難であった条件の土壌からも、ＤＮＡを調製することができる。それゆえ、本発明のＤＮＡ調製方法およびＤＮＡ調製キットによると、産業的に有用な微生物および酵素等の遺伝情報をより多く得ることができる。このような遺伝情報は、医薬品、食品、化学工業製品等の製造業の分野、および環境浄化等の分野等において、広く利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】本発明の比較例１における抽出工程後のＤＮＡのＵＶスペクトルである。
【図２】本発明の実施例１における抽出工程後のＤＮＡのＵＶスペクトルである。
【図３】本発明の比較例１および実施例１における抽出工程後のＤＮＡのアガロースゲル電気泳動の結果を示す図面である。
【図４】本発明の比較例３における抽出工程後のＤＮＡのＵＶスペクトルである。
【図５】本発明の実施例３における抽出工程後のＤＮＡのＵＶスペクトルである。
【図６】（ａ）は本発明の比較例２・３における、（ｂ）は実施例２・３におけるＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図面である。なお、図６（ａ）のレーン１・２は比較例２、レーン３・４は比較例３、（ｂ）のレーン１は実施例２、Ｎ・Ｎ’はネガティブコントロール、レーン２は実施例３の結果を示す。
【図７】実施例２・３における１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子ＰＣＲ増幅ＤＮＡ（１８０ｂｐ）のＤＧＧＥ解析の結果を示す図面である。レーン１は実施例２、レーン２は実施例３、レーンＰはポジティブコントロールの泳動結果である。
【図８】実施例４における泳動結果を示す図面である。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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