(57)【要約】【課題】  モズクなどの褐藻類を含む藻類をアルコール類等の有機溶媒によって加温加圧下で抽出することができるアポトーシス誘導物質を提供すること。【解決手段】アポトーシス誘導物質は、モズクなどの褐藻類を含む藻類をアルコール類等の有機溶媒によって加温加圧下で抽出することができる。このアポトーシス誘導物質は、例えば、がん細胞にアポトーシスを誘導することができることから、抗がん剤としての開発が可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
藻類を有機溶媒中において加温加圧下で処理することによってアポトーシス誘導物質を抽出することを特徴とする藻類の加温加圧抽出方法。
【請求項２】
請求項１に記載の藻類の加温加圧抽出方法において、前記藻類が褐藻類であることを特徴とする藻類の加温加圧抽出方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の藻類の加温加圧抽出方法において、前記藻類がモズクであることを特徴とする藻類の加温加圧抽出方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の藻類の加温加圧抽出方法において、前記有機溶媒がアルコール類であることを特徴とする藻類の加温加圧抽出方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の藻類の加温加圧抽出方法において、前記有機溶媒がメタノールまたはエタノールであることを特徴とする藻類の加温加圧抽出方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の藻類の加温加圧抽出方法において、前記加温の温度が４０℃〜１００℃であることを特徴とする藻類の加温加圧抽出方法。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載の藻類の加温加圧抽出方法において、前記加温の温度が５０℃〜８０℃であることを特徴とする藻類の加温加圧抽出方法。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載の藻類の加温加圧抽出方法において、前記加圧の圧力が２〜７０００気圧であることを特徴とする藻類の加温加圧抽出方法。
【請求項９】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載の藻類の加温加圧抽出方法において、前記加圧の圧力が１０〜６０００気圧であることを特徴とする藻類の加温加圧抽出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  この発明は、藻類の加温加圧抽出方法に関し、更に詳細には、特にモズクなどの海藻を溶媒中で加温加圧処理して、アポトーシス誘導物質を有効に抽出することができる加温加圧抽出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  わが国の沿岸には多種多様の海藻が生えていて、古くから食用などに利用されている。また海藻には数多くの有用物質が含有されていることも知られている。【０００３】  海藻には、アオサ、アオノリ等の緑藻類、モズク、コンブ、ワカメ、メカブ等の褐藻類、アサクサノリ、テングサ等の紅藻類がある。このうち、特に褐藻類のモズクには、フコイダンという多糖が含有されていることはよく知られている。そのフコイダンは、フコースを主成分として、ガラクトース、グルクロン酸、キシロース、マンノース、グルコース、アルギン酸など１０個以上の多くの糖等を含む硫酸化多糖である。また、フコイダンは、抗血液凝固作用、抗腫瘍作用、脂血清清澄作用、がん転移抑制作用、抗ウイルス作用等の重要な生物活性などの種々の作用効果があるとともに、アポトーシス誘導作用を有していることも知られている（例えば、特許文献１、２、３、４）。【０００４】  しかしながら、藻類から、フコイダンの他に、アポトーシス誘導作用を有する成分が抽出されることはこれまで知られていなかった。【０００５】  ここで、アポトーシスとは、細胞が機械的に破壊されたり、飢餓状態に陥れられたりしたときの死（ネクローシス）とは異なり、予めプログラムされた細胞死のことである。アポトーシスの過程では、細胞では核の凝縮が起こり、核中の遺伝子ＤＮＡが分解酵素で分解・断片化され、細胞表面の原形質膜の破壊が起こり、細胞質も細分化されて、細胞は死滅する。この細胞死をアポトーシスという。このアポトーシスは、偶発的な細胞死とは異なり、細胞自身によって厳密にコントロールされている。したがって、がん細胞にアポトーシスを誘導できる物質は、有力な抗がん剤候補物質となると考えられることから、新規なアポトーシス誘導物質を見出して新規な抗がん剤を開発することが要望されている。
【特許文献１】  特開平０６−６２８５２号公報
【特許文献２】  特開２０００−２３９３０２号公報
【特許文献３】  特開２０００−２３９３０１号公報
【特許文献４】  特開２０００−２３６８８９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  かかる要望に応えるべく、本発明者らは、モズクをアルコール類中で加温加圧下において抽出を試みた結果、アポトーシス誘導物質も抽出することができることを見出して、この発明を完成した。【０００７】  したがって、この発明は、モズクなどの褐藻類を含む藻類から抽出することができるアポトーシス誘導物質を提供することを目的としている。
また、この発明は、モズクなどの褐藻類を含む藻類からアポトーシス誘導物質を抽出することができる抽出方法を提供することを別の目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  上記目的を達成するために、この発明は、モズクなどの褐藻類を含む藻類をアルコール類等の有機溶媒の存在下において加温加圧下で処理して抽出することによって得られるアポトーシス誘導物質およびその抽出方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】  この発明に係るアポトーシス誘導物質は、モズクなどの褐藻類を含む藻類を水またはアルコール類等の有機溶媒の存在下において加温加圧下で抽出することによって得ることができる。【００１０】  この発明のアポトーシス誘導物質の加温加圧抽出方法は、モズクなどの褐藻類を含む藻類を水またはアルコール類等の有機溶媒の存在下において加温加圧下で処理して抽出することによってアポトーシス誘導物質を効率よく抽出する方法である。【００１１】  この発明の加温加圧抽出方法に使用することができる藻類は、藻類であれば、特に限定されるものではなく、いずれの藻類であってもよい。好ましいのはモズク、ワカメ、メカブなどの褐藻類である。モズク、ワカメなどにも多種類のものがあるが、それらもいずれも使用することができる。【００１２】  この発明において、原材料となる藻類は、アルコール類等の有機溶媒の存在下で加温加圧処理をするのがよい。使用するアルコール類としては、例えば、メタノール、エタノールなどが挙げられるが、アポトーシス誘導物質を抽出する場合には、メタノールが好ましい。【００１３】  加温加圧処理の条件のうち、加温の温度としては、使用する溶媒によって異なるが、例えば、４０℃〜１００℃、好ましくは５０℃〜８０℃の間がよく、また加圧としては、例えば、２〜７０００気圧、好ましくは１０〜６０００気圧であるのがよい。また加温加圧時間は、例えば、５分〜２時間、好ましくは１０分〜１時間の間がよい。【００１４】  この発明に係る物質のアポトーシス誘導能は、通常、ＭＴＴアッセイ法で測定することにより、またサンプル処理によって何らかの形態変化を起こした細胞を回収し酵素処理をすることによって断片化したＤＮＡを抽出し、アガロースゲル電気泳動法によりＤＮＡ断片の大きさにより分離・検出することによって測定することもてきる。このＭＴＴアッセイ法は、その詳細については後述するが、生細胞のミトコンドリア内膜の脱水酵素などによって、（３−（４，５−ジメチルチアゾ−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）が開裂して生成するＭＴＴホルマザンを、酸性イソプロパノールによる呈色反応によって細胞増殖抑制効果を調べる方法である。また、このＤＮＡ断片の検出はアポトーシス誘導の指標となる。【００１５】  この発明によって得られるアポトーシス誘導物質含有抽出物を利用する場合には、例えば、アポトーシス誘導物質含有抽出物の１日使用量は、約１μｇ〜１０ｇであるのがよいが、それらの組成量は、これらの範囲に限定されるものではなく、状況などに応じて適宜変えることができる。なお、アポトーシス誘導物質含有抽出物は、いずれの藻類由来のものを混合して使用することができ、例えば、モズク由来のものと、メカブ由来のものと、またはその他の藻類由来のものと、を混合して使用してもよい。この場合、その混合割合は特に限定されるものではない。さらに、この発明によって得られるアポトーシス誘導物質含有抽出物には、有機溶媒によって抽出されるフコイダンならびにその他の有用物質も含有されていてもよい。【００１６】  以下、この発明を実施例によって説明するが、下記実施例は、この発明をいかなる意味においても限定するものではなく、単にこの発明をより具体的に説明する意図で記載するものであると理解すべきである。したがって、この発明は下記実施例によって一切限定されるものではない。
【実施例１】
【００１７】（メタノール抽出）
約１ｋｇの塩蔵オキナワモズクを、洗浄１回当たり５リットルの水道水を使用して、５分間ミキサーで攪拌しながら解凍、洗浄、脱塩を行った。この操作を５回ないし６回繰り返した。得られた脱塩オキナワモズクは、１時間水に漬けて、塩分濃度の確認後、水を切って１時間放置した。このようにして十分に塩抜きしたモズク１２２０．９ｇを２つに分けて、８０℃で１２時間通風乾燥して水分を完全に除去した。完全に乾燥したモズクを大まかに粉砕して、それぞれ約３００ｍｌ容高圧処理用ポリ容器に入れ、メタノールをモズクが漬かるように注入した後、空気を抜いた。
上記処理を施したモズクを、６０℃、６０００気圧の高温高圧で１０分間処理した。高温処理後、６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、得られた上層を回収し、５０℃で減圧濃縮した。濃縮したメタノール抽出モズクは濃い緑色をしていた。この濃縮モズクをさらに減圧濃縮した後、乾固してメタノールを除去して、アポトーシス誘導物質１５３．３ｍｇを得た。
【実施例２】
【００１８】（エタノール抽出）
約１キロｇの塩蔵オキナワモズクを、洗浄１回当たり５リットルの水道水を使用して、５分間ミキサーで攪拌しながら解凍、洗浄、脱塩を行った。この操作を５回ないし６回繰り返した。得られた脱塩オキナワモズクは、１時間水に漬けて、塩分濃度の確認後、水を切って１時間放置した。このようにして十分に塩抜きしたモズク１２２０．９ｇを２つに分けて、８０℃で１２時間通風乾燥して水分を完全に除去した。完全に乾燥したモズクを大まかに粉砕して、それぞれ約３００ｍｌ容高圧処理用ポリ容器に入れ、エタノールをモズクが漬かるように注入した後、空気を抜いた。
上記処理を施したモズクを、６０℃、６０００気圧の高温高圧で１０分間処理した。高温処理後、６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、得られた上層を回収し、５０℃で減圧濃縮した。濃縮したエタノール抽出モズクは濃い緑色をしていた。この濃縮モズクをさらに減圧濃縮した後、乾固してエタノールを除去して、アポトーシス誘導物質１３．８ｍｇを得た。
【実施例３】
【００１９】細胞増殖抑制試験
この発明による抽出物のサンプルについての細胞増殖抑制作用は、ヒト前骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０細胞）を用いてＭＴＴアッセイ法で調べた。この実験では、サンプル濃度を５，２５，５０，１００μｇ／ｍｌに設定した。
ＭＴＴアッセイ法は次のとおりである。９６ウエルプレートにヒト前骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０細胞）をウエル当たり２．０ｘ１０４個／１００μｌの割合で注入して、５％ＣＯ２の存在下３７℃で２４時間前培養を行った。次に、各ウエルにサンプルを２μｌずつ添加し、５％ＣＯ２の存在下３７℃で規定時間処理を行った。規定時間経過後、ＭＴＴ液（５ｍｇ／ｍｌ）を各ウエルに１０μｌの割合で添加し、５％ＣＯ２の存在下３７℃で４時間処理を行った。処理後、遮光しながら、各ウエルに０．０４Ｎ塩酸イソプロパノール１００μｌずつ添加し、よく攪拌して、暗紫色の結晶を溶解して、ミクロプレートリーダーを用いて吸光度（５９５ｎｍ）を測定し、細胞生存率（％）を下記の式により算出した。
細胞生存率（％）＝
（細胞吸光度−サンプル吸光度）／コントロール細胞吸光度  ｘ  １００【００２０】（メタノール抽出物の細胞増殖抑制）
実施例１で得られたメタノール抽出物についての細胞増殖抑制試験の結果を表１および図１に示す。【００２１】
【表１】
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【００２２】  表１および図１の結果から、実施例１で得られたメタノール抽出物は、サンプル濃度５μｇ／ｍｌから顕著な細胞増殖抑制効果を示すことが分かった。また細胞増殖を半分に抑制する濃度ＩＣ５０は２６．２μｇ／ｍｌであった。【００２３】（エタノール抽出物の細胞増殖抑制）
実施例２で得たエタノール抽出物をサンプルとして細胞増殖抑制試験の結果は表２および図１に示す通りである。【００２４】
【表２】
2007269767.tif 000003
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【００２５】  表２および図１の結果から、実施例２で得られたエタノール抽出物は、サンプル濃度５μｇ／ｍｌから顕著な細胞増殖抑制効果を示すことが分かった。また細胞増殖を半分に抑制する濃度ＩＣ５０は５０．０μｇ／ｍｌであった。
【実施例４】
【００２６】アポトーシス誘導
この発明に係る抽出物のアポトーシス誘導能は次のようにして調べた。６ｃｍディシュにヒト前骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０細胞）を１．０ｘ１０６個／３ｍｌの割合で注入して５％ＣＯ２の存在下３７℃で２４時間継代培養を行った。これに規定濃度のサンプルを添加し、５％ＣＯ２の存在下３７℃で規定時間処理をした後、ＤＮＡの抽出をした。次に、アガロースゲルを用いた電気泳動を行って、エチジウムブロマイドによってゲル染色をした後、ＵＶ照射によりＤＮＡバンドを検出した。【００２７】（メタノール抽出サンプルのアポトーシス誘導能）
上記メタノール抽出サンプルをＨＬ−６０細胞に５，２５，５０，７５、１００μｇ／ｍｌのサンプル濃度で添加して、２４時間サンプル処理をした。その後、光学顕微鏡下で観察したところ、顕著な細胞小体の形成や細胞形態の変化などのアポトーシス誘導の特長たる形態変化が認められた（図２Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｅ。なお、Ｆはコントロール、Ｇはコントロールに０．２％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）添加）。
この細胞を回収後、酵素処理して細胞ＤＮＡを抽出し、これを０．２％アガロースゲル電気泳動にかけて断片化ＤＮＡの検出をした。この結果、５μｇ／ｍｌのサンプル濃度で２４時間処理した細胞から、明確な断片化ＤＮＡが検出され、アポトーシス誘導が起こっていることが確認された（図３。図中、左側から、指標、コントロール、０．２％ＤＭＳＯ、５μｇ／ｍｌサンプル濃度，２５μｇ／ｍｌサンプル濃度，５０μｇ／ｍｌサンプル濃度，７５μｇ／ｍｌサンプル濃度、１００μｇ／ｍｌサンプル濃度）。【００２８】  また、同様のサンプル処理条件でヒト前骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０細胞）を処理してタンパク質を回収した。これをウエスタンブロッテイング法によりタンパク質を検出したところ、アポトーシス誘導の指標となるタンパク質であるカスパーゼ３の活性化とＰＡＲＰの不活性化とがサンプル濃度依存的に検出された。【００２９】（エタノール抽出サンプルのアポトーシス誘導能）
上記メタノール抽出サンプルのアポトーシス誘導能の場合と同様に、上記エタノール抽出サンプルをＨＬ−６０細胞に５，２５，５０，７５、１００μｇ／ｍｌのサンプル濃度で添加して、２４時間サンプル処理をした。その後、光学顕微鏡下で観察したところ、顕著な細胞小体の形成や細胞形態の変化などのアポトーシス誘導の特長たる形態変化が認められた（図４Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ。なお、Ｆはコントロール、Ｇはコントロールに０．２％ＤＭＳＯ添加）。
この細胞を回収後、酵素処理して細胞ＤＮＡを抽出し、これを２％アガロースゲル電気泳動にかけて断片化ＤＮＡの検出をした。この結果、５μｇ／ｍｌのサンプル濃度で２４時間処理した細胞から、明確な断片化ＤＮＡが検出され、アポトーシス誘導が起こっていることが確認された（図５。図中、左側から、指標、コントロール、０．２％ＤＭＳＯ、５μｇ／ｍｌサンプル濃度，２５μｇ／ｍｌサンプル濃度，５０μｇ／ｍｌサンプル濃度，７５μｇ／ｍｌサンプル濃度、１００μｇ／ｍｌサンプル濃度）。【００３０】  また、同様のサンプル処理条件でヒト前骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０細胞）を処理してタンパク質を回収した。これをウエスタンブロッテイング法によりタンパク質を検出したところ、アポトーシス誘導の指標となるタンパク質であるカスパーゼ３の活性化とＰＡＲＰの不活性化とがサンプル濃度依存的に検出された。
【産業上の利用可能性】
【００３１】  この発明は、モズク、メカブなどの褐藻類を含む藻類をアルコール類等の有機溶媒によって加温加圧下でアポトーシス誘導物質を効率よく抽出することができる。この発明によって得られるアポトーシス誘導物質は、例えば、がん細胞にアポトーシスを誘導することができるので、抗がん剤としての開発が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】実施例２および３で得られたメタノール抽出物およびエタノール抽出物についての細胞増殖抑制試験の結果を示すグラフ。
【図２】実施例２で得られたメタノール抽出物によるＨＬ−６０細胞の形態変化を示す図。Ａは５μｇ／ｍｌのサンプル濃度、Ｂは２５μｇ／ｍｌのサンプル濃度、Ｃは５０μｇ／ｍｌのサンプル濃度、Ｄは７５μｇ／ｍｌのサンプル濃度、Ｅは１００μｇ／ｍｌのサンプル濃度、Ｆはコントロール、Ｇはコントロールに０．２％ＤＭＳＯのみを添加したものをそれぞれ示す。
【図３】実施例２で得られたメタノール抽出物のサンプル濃度５，２５，５０，７５，１００μｇ／ｍｌによるＨＬ−６０細胞のＤＮＡ断片化を示す図。
【図４】実施例３で得られたエタノール抽出物によるＨＬ−６０細胞の形態変化を示す図。Ａは５μｇ／ｍｌのサンプル濃度、Ｂは２５μｇ／ｍｌのサンプル濃度、Ｃは５０μｇ／ｍｌのサンプル濃度、Ｄは７５μｇ／ｍｌのサンプル濃度、Ｅは１００μｇ／ｍｌのサンプル濃度、Ｆはコントロール、Ｇはコントロールに０．２％ＤＭＳＯのみを添加したものをそれぞれ示す。
【図５】実施例３で得られたエタノール抽出物のサンプル濃度５、２５，５０，７５，１００μｇ／ｍｌによるＨＬ−６０細胞のＤＮＡ断片化を示す図。
【図１】
2007269767.tif 000005
【図２Ａ】
2007269767.tif 000006
【図２Ｂ】
2007269767.tif 000007
【図２Ｃ】
2007269767.tif 000008
【図２Ｄ】
2007269767.tif 000009
【図２Ｅ】
2007269767.tif 000010
【図２Ｆ】
2007269767.tif 000011
【図２Ｇ】
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【図３】
2007269767.tif 000013
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５】
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