(57)【要約】【課題】ターゲットＤＮＡのＤＮＡプローブへのハイブリダイゼーションや伸長反応の有無を全電子的にリアルタイム測定可能なＤＮＡ計測装置を提供する。【解決手段】金電極１１上にＤＮＡプローブ１２を固定化した絶縁ゲート電界効果トランジスタ４を用いて、金電極上でＤＮＡポリメラーゼを用いた伸長反応を行ない、伸長反応により増加するリン酸基、すなわち負電荷を直接的に絶縁ゲート型電界効果トランジスタ４のソース１３、ドレイン１４間の電流変化によって計測し、ターゲットＤＮＡとＤＮＡプローブ１２とのハイブリダイゼーションや伸長反応の有無を検出する。金電極上でのＤＮＡプローブ１２の固定化密度は4×１０12個/ｃｍ2に最適化した。溶液中で金電極１１を使用する際に問題となる外部変動（夾雑物等の影響）による表面電位の不安定性を低減するために、金電極１１と参照電極５間に電源６により１ｋＨｚ以上の高周波電圧を印加した。【選択図】図１
2007108160.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面にＤＮＡプローブが固定化され、ＤＮＡポリメラーゼを含む測定溶液と接触する金電極を有する電界効果トランジスタと、
前記測定溶液と接触する参照電極と、
前記金電極と参照電極との間に高周波電圧を印加する手段と、
試料ＤＮＡを前記測定溶液に注入する手段と、
少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）又はその誘導体を注入する手段と
を備えることを特徴とするＤＮＡ計測装置。
【請求項２】
請求項１記載のＤＮＡ計測装置において、前記金電極と前記絶縁ゲート電界効果トランジスタのゲートが導電性配線で接続されていることを特徴とするＤＮＡ計測装置。
【請求項３】
請求項１記載のＤＮＡ計測装置において、前記電界効果トランジスタのソース、ドレイン及びチャネル部分が遮光部材で覆われていることを特徴とするＤＮＡ計測装置。
【請求項４】
請求項３記載のＤＮＡ計測装置において、前記遮光部材が導電性部材であることを特徴とするＤＮＡ計測装置。
【請求項５】
請求項３記載のＤＮＡ計測装置において、前記遮光部材が接地されていることを特徴とするＤＮＡ計測装置。
【請求項６】
請求項３記載のＤＮＡ計測装置において、前記遮光部材はアルミニウム又は金であることを特徴とするＤＮＡ計測装置。
【請求項７】
請求項１記載のＤＮＡ計測装置において、前記高周波電圧の周波数は、1kHz以上であることを特徴とするＤＮＡ計測装置。
【請求項８】
請求項１記載のＤＮＡ計測装置において、前記金電極と前記参照電極又は疑似参照電極が少なくとも２組以上同一平面上に対向して形成されていることを特徴とするＤＮＡ計測装置。
【請求項９】
請求項１記載のＤＮＡ計測装置において、前記ＤＮＡプローブは、その一端に結合したアルカンチオールを介して前記金電極表面に固定化されていることを特徴とするＤＮＡ計測装置。
【請求項１０】
請求項１記載のＤＮＡ計測装置において、前記デオキシリボヌクレオチド三リン酸の誘導体が構成塩基の側鎖に負電荷を有する付加部分を結合した誘導体であることを特徴とするＤＮＡ計測装置。
【請求項１１】
請求項１０記載のＤＮＡ計測装置において、前記付加部分の一部にリン酸基を含むことを特徴とするＤＮＡ計測装置。
【請求項１２】
請求項１記載のＤＮＡ計測装置において、前記測定溶液中に、デオキシリボヌクレオチド三リン酸分解酵素を含むことを特徴とするＤＮＡ計測装置。
【請求項１３】
請求項１記載のＤＮＡ計測装置において、前記ＤＮＡプローブは、シーケンス用のユニバーサルプライマーの塩基配列を含むことを特徴とするＤＮＡ計測装置。
【請求項１４】
表面にＤＮＡプローブを固定した金電極を有する電界効果トランジスタの前記金電極を、ＤＮＡポリメラーゼを含む測定溶液に接触させ、
前記金電極と前記測定溶液に接触した参照電極との間に高周波電圧を印加し、
前記測定溶液に試料ＤＮＡを注入し、
一定時間後に少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）又はその誘導体を注入し、
前記試料ＤＮＡと前記ＤＮＡプローブの結合の前後、又は前記ＤＮＡプローブの伸長の前後で変化する前記トランジスタの電気特性を計測し、
前記ＤＮＡプローブと結合した試料ＤＮＡの有無あるいは塩基配列を検出することを特徴とするＤＮＡ計測方法。
【請求項１５】
請求項１４記載のＤＮＡ計測方法において、前記ＤＮＡポリメラーゼを含む測定溶液はデオキシリボヌクレオチド三リン酸分解酵素を含み、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）又はその誘導体の注入を繰り返し行ない、前記ＤＮＡプローブの伸長の前後で変化する前記電界効果トランジスタの電気特性を計測することにより、前記試料ＤＮＡの塩基配列を検出することを特徴とするＤＮＡ計測方法。
【請求項１６】
請求項１４記載のＤＮＡ計測方法において、前記金電極と前記電界効果トランジスタのゲートが導電性配線で接続されていることを特徴とするＤＮＡ計測方法。
【請求項１７】
請求項１４記載のＤＮＡ計測方法において、前記高周波電圧の周波数は、1kHz以上であることを特徴とするＤＮＡ計測方法。
【請求項１８】
請求項１４記載のＤＮＡ計測方法において、前記ＤＮＡプローブは、その一端に結合したアルカンチオールを介して前記金電極表面に固定化されていることを特徴とするＤＮＡ計測方法。
【請求項１９】
請求項１４記載のＤＮＡ計測方法において、前記デオキシリボヌクレオチド三リン酸の誘導体は構成塩基の側鎖に負電荷を有する付加部分を結合した誘導体であることを特徴とするＤＮＡ計測方法。
【請求項２０】
請求項１９記載のＤＮＡ計測方法において、前記付加部分の一部にリン酸基を含むことを特徴とするＤＮＡ計測方法。
【請求項２１】
請求項１４記載のＤＮＡ計測方法において、前記ＤＮＡプローブは、シーケンス用のユニバーサルプライマーの塩基配列を含むことを特徴とするＤＮＡ計測方法。
【請求項２２】
請求項１４記載のＤＮＡ計測方法において、前記試料ＤＮＡと前記ＤＮＡプローブの結合の前後、又は前記ＤＮＡプローブの伸長の前後で変化する前記トランジスタの電気特性の計測にあたっては、ドレイン電流を一定に保ち、ソース・ドレイン間の電圧、あるいはゲート電圧の変化を計測することを特徴とするＤＮＡ計測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡを非修飾で計測するＤＮＡセンサ、及びそれを用いたＤＮＡ測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、遺伝子の機能や発現解析に広く使用されているＤＮＡチップは、蛍光検出法を基本原理としているので、レーザ光源や複雑な光学系を必要とし、計測システムが大型で高価であった。その際使用するＤＮＡプローブには、蛍光体を標識する必要がある上に、蛍光体を標識したＤＮＡプローブとターゲットＤＮＡとの結合（ハイブリダイゼーション）後のフリーの蛍光体標識ＤＮＡプローブを除去するための洗浄操作（ＢＦ分離；Bind Free separation）が必要であった。
【０００３】
近年、蛍光体を必要とせず非修飾でＤＮＡを計測する方法も開発されている。例えば、水晶振動子表面にＤＮＡプローブを固定化し、ターゲットＤＮＡとのハイブリダイゼーション前後で変化する水晶振動子の共振周波数を計測するＱＣＭ (Quartz Crystal Microbalance)法や、表面プラズモン共鳴（SPR、Surface Plasmon Resonance）を利用して、センサ表面に固定化されたＤＮＡプローブとターゲットＤＮＡとのハイブリダイゼーション前後で変化するセンサ表面の液体の状態変化を計測するＳＰＲ法がある。ＱＣＭの測定原理は、水晶発振子の電極上への物質の付着により振動数が減少（周波数変化）するものであり、振動数変化と付着物質の質量との関係は、Sauerbrey 式と呼ばれる以下の式で表される。
【０００４】
【数１】
2007108160.tif 000003
【０００５】
ここで、
Δm；  質量変化
F0；基本振動数
ΔF；基本振動数の変化量
A；電極面積
μQ；水晶の剪断応力
ρQ；水晶の密度
【０００６】
水晶発振子の電極上での質量変化は振動数変化と比例関係にあり、例えば基本振動数F0 (Hz)が27 MHz の水晶発振子を空気中で使用すれば、電極 1cm2 あたりに約 0.62 ng の物質が付着すると 1 Hz 振動数が減少することが確かめられている。１個の塩基が付加する一塩基伸長の場合には、ＤＮＡの固定化密度を4×1012 molecules/cm2、一塩基伸長の際の分子量変化を約３００と仮定すると、一塩基伸長することにより2.0×10-9 g/cm2の質量変化が起こり、この値は約３Hzの周波数の変化量に相当する。しかし、実際に使用する液体中条件では溶媒の粘度変化の影響を受ける（Anal. Chim. Acta 175 (1985) 99-105）。溶媒の粘度変化の影響は以下の式で表される。
【０００７】
【数２】
2007108160.tif 000004
【０００８】
ここで、
ρL；溶媒の密度
ηL；溶媒の粘度
ρQ；水晶の密度
ηQ；水晶の剪断応力
【０００９】
このことは、実際の測定の際に試料導入時の脈流や溶液組成変化の他に温度変化の影響を受けることを示している。例えば、温度変化の影響は、水の場合には粘度変化が支配的でその変化率は2%/℃であり、その際の周波数変化は約1000Hz/℃である。この値は、温度が１℃変化すると6.0×10-7g/cm2の質量変化に相当することを意味している。そのため、ＱＣＭ法では、これらの影響を低減するために、高精度の恒温槽や送液システムが必要であり、装置が大型で煩雑である。実際に温度コントロールを行なった測定でも、周波数の揺らぎが16〜24Hz程度あり、1.0×10-8〜1.5×10-8g/cm2の質量変化の検出が検出下限である（Langmuir 9, (1993) 574-576、J. Am. Chem. Soc. 120, (1998) 8537-8538）。このように、ＱＣＭ法は温度変化に敏感であるため、一塩基伸長反応の際の2.0×10-9g/cm2の質量変化の計測は困難である。ＳＰＲ法も同様に試料導入時の脈流や溶液組成変化の他に温度変化の影響を受ける。
【００１０】
一方、小型で簡便な手法として注目されている方法として、ＤＮＡプローブにターゲットＤＮＡをハイブリダイズさせ、相補鎖伸長反応で生成するピロリン酸をＡＴＰに変え、このＡＴＰをルシフェリン/ルシフェラーゼ発光系で発光させ、この生物発光を検出することにより、相補鎖伸長反応で取り込まれた基質（デオキシリボヌクレオチド三リン酸）を知り、プライマーの隣接部位から、順次、塩基配列決定を行うピロシーケンシング法（Anal. Biochemistry 280, (2000) 103-110、特表２００１―５０６８６４号公報、特許３５１０２７２号公報）や、ソース・ドレイン間の上に形成されたゲート絶縁層にＤＮＡプローブを固定化し、ＤＮＡプローブとターゲットＤＮＡとのハイブリダイゼーションによる絶縁膜上の表面電位をソース・ドレイン間の電流値の変化として検出するＦＥＴセンサ（特表２００１−５１１２４５号公報）がある。これら方法の中で生物発光を用いる検出方法は、ターゲットＤＮＡのＤＮＡプローブへのハイブリダイゼーションの有無を蛍光体の標識やＢＦ分離無しで検出できる方法として有望である。
【００１１】
【特許文献１】特表２００１−５０６８６４号公報
【特許文献２】特許３５１０２７２号公報
【特許文献３】特表２００１−５１１２４５号公報
【特許文献４】特表２００３−３０６９０６号公報
【非特許文献１】Anal. Chim. Acta 175 (1985) 99-105
【非特許文献２】Langmuir 9, (1993) 574-576
【非特許文献３】J. Am. Chem. Soc. 120, (1998) 8537-8538
【非特許文献４】Anal. Biochemistry 280, (2000) 103-110
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記した生物発光法を用いたピロシーケンシング法は、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応と、伸長反応で生じたピロリン酸をＡＴＰに変換する反応（例えば、ＡＴＰスリフリラーゼ）と、ＡＴＰ変換酵素によって生成したＡＴＰを利用してルシフェリン/ルシフェラーゼ系で発光させる反応の３つの酵素反応工程からなっている。そのため、各々の酵素に別々の基質等の試薬が必要であった。また、ここで使用する各酵素反応は、各々違った最適反応条件を有しているため、反応条件を各々の酵素が最大限に働くように調製する必要があった。さらに、伸長反応に使用するデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）の中で、ｄＡＴＰはルシフェリン/ルシフェラーゼ反応の擬似基質（すなわち、発光する）であり、ノイズ源になるため、アナログ体としてデオキシアデノシンα−チオトリホスフェート（ｄＡＴＰαＳ）を使用しなければならなかった（特許３５１０２７２号公報）。ｄＡＴＰαＳはｄＡＴＰに比べて高価であり、ＤＮＡポリメラーゼ基質としての反応性が悪い上に、熱安定性が悪く、分解しやすい問題があった。また、デオキシリボヌクレオチド三リン酸は、本反応の基質であるピロリン酸が混在しており、ピロホスファターゼ等の酵素で分解処理する煩雑な工程が必要であった。多数サンプルを同時に処理するためには、反応槽を微小化して高密度に２次元配置を行なう必要がある。その際、反応槽の微小化に伴い発光量が小さくなり感度低下する問題に加えて、２次元配置の高密度化に伴い反応槽間で発光が漏れ込むクロストークが問題となってくる。
【００１３】
一方、ＦＥＴセンサは、原理的にはソースとドレインの上に形成されたゲート絶縁層に固定化されたＤＮＡプローブの伸長反応で付加されたリン酸基の増加分を電位変化として検出することが可能である。発光計測と比較して、使用する試薬（酵素や基質等）が少ない利点がある。しかし、従来のＤＮＡプローブのゲート絶縁層への固定化は、ゲート絶縁層表面をアミノプロピルシランやポリリジン等で化学修飾してアミノ基を導入し、グルタルアルデヒドやフェニレンジイソシアネートを用いて、末端をアミノ基で化学修飾したＤＮＡプローブを反応させて行なうため、煩雑な前処理を必要とした。近年、ＤＮＡプローブを固定化するための金電極と絶縁ゲート電界効果トランジスタのゲートを導電性配線で接続した延長ゲート型ＦＥＴセンサ（特表２００３−３０６９０６号公報）が提案され、ＤＮＡ固定部であるセンシング部に金電極を使用することにより、金電極へのＤＮＡプローブの固定化もアルカンチオールをリンカーとして有するＤＮＡプローブを用いて金とチオールの特異的な結合を利用して容易に行なうことができるようになった。しかし、延長ゲート型ＦＥＴセンサに適したＤＮＡプローブの固定化の形態やその使用法についての詳細な考察がなかった。特に、検出感度に大きく影響するハイブリダイゼーション効率とＤＮＡプローブ固定化密度の関係や、夾雑物等による溶液中での外乱要因の影響を低下させる方法が明らかではなかった。また、多数サンプルを同時に処理するためのセンサの配置等が明らかでなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明では、金電極上にＤＮＡプローブを固定化した延長ゲート型ＦＥＴセンサを用いて、金電極上でＤＮＡポリメラーゼを用いた伸長反応を行ない、伸長反応の生成物であるピロリン酸を間接的に測定せず、伸長反応によりＤＮＡプローブに付加される１個のリン酸基を有する酸基、すなわち固相上に固定化されたＤＮＡプローブの負電荷の増加を直接的に延長ゲート型ＦＥＴセンサで計測する。金電極上での伸長反応は、通常のシーケンス法で用いられている酵素が使用できる。当然、段階的反応を行なうピロシーケンス法で用いられているＤＮＡポリメラーゼを用いることもできる。例えば、Ｔ７ポリメラーゼ、クレノウ、シークエナーゼVer.2.0等があり、任意の好適なポリメラーゼを用いることができる。その際、使用する基質は、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）であるが、ピロシーケンスの場合のように、ノイズ源になるｄＡＴＰの代わりにアナログ体としてｄＡＴＰαＳを使用する必要がない。ＤＮＡシーケンスを行なう場合には、伸長反応の基質であるデオキシリボヌクレオチド三リン酸を１種類ずつ、順次加えていき、添加前後で変化するドレイン電流値から伸長反応の有無を決定する。すなわち、伸長反応の有無の計測後、過剰のデオキシリボヌクレオチド三リン酸を洗浄除去し、次の基質を加えて伸長反応を行なうサイクルを繰り返すことにより、シーケンスを決定することができる。過剰のデオキシリボヌクレオチド三リン酸の除去のために、ピロシーケンス反応の場合と同じように反応溶液に基質分解酵素であるアピラーゼを混在させても良い。
【００１５】
さらに測定感度を向上させたい場合には、使用する基質として、デオキシリボヌクレオチド三リン酸の構成塩基の側鎖に負電荷を有する付加部分を結合した誘導体を用いれば良い。例えば、塩基のアミノ基に炭素鎖のリンカーを介してリン酸、あるいはポリリン酸を結合した誘導体を使用すれば良い。
【００１６】
多数のサンプルを同時に処理する場合には、同一平面に金電極と参照電極又は疑似参照電極を対向させて配置させれば良い。
【００１７】
金電極上でのＤＮＡプローブの固定化は、末端にアルカンチオールを有するＤＮＡプローブ溶液を用いて、金電極表面に滴下あるいはスポットするだけの簡単な操作で行うことができる。検出感度に大きく影響する金電極上でのハイブリダイゼーション効率を上げるには、金電極上のＤＮＡプローブ固定化密度を最適化すれば良い。ＤＮＡプローブ固定化密度の最適化は、金電極と結合する反応基を有するリンカーと結合したＤＮＡプローブと、金電極と結合する反応基を有するリンカーのみを有する化合物を、一定の分子数比で含むＤＮＡ固定化溶液を用いて、ＤＮＡプローブをリンカーのみを有する化合物との競合反応下で固定化することにより行うことができ、最適なハイブリダイゼーション効率を維持することができる。一般に、アルカンチオールの固定化密度は、4.6×１０14個/ｃｍ2である。また、２本鎖ＤＮＡの直径は、約2.4nmであるため、ハイブリダイゼーションを効率良く行わせるためには、ＤＮＡプローブの固定化密度は4×１０12個/ｃｍ2以下が好ましい。測定感度を考慮すると、4×１０10個/ｃｍ2〜4×１０12個/ｃｍ2が好適である。これの条件を満足すれば、最適なハイブリダイゼーション効率と金電極表面のシールド効果を共に維持することができる。その際に使用するＤＮＡ固定化溶液は、ＤＮＡプローブとアルカンチオールを分子数比が１：２〜１：１００で、アルカンチオールの濃度が０.５ｍＭ以上であればよい。尚、ここで述べるＤＮＡプローブは、ターゲットＤＮＡとハイブリダイゼーションを行うもので、例えば一本鎖であるＤＮＡ、ＲＮＡもしくはＰＮＡ等である。
【００１８】
通常、リンカーのみを有する化合物は、アルキル基が炭素鎖３以上であるアルカンチオールを用いる。その際使用できるアルカンチオールの末端は、アミノ基、水酸基、カルボキシル基である。ＤＮＡプローブを固定化する場合には、ＤＮＡが負に帯電しているため、アミノ基を有するアルカンチオールを使用すると相互作用によりＤＮＡ断片が表面に横たわった状態になり測定安定性（安定化時間及び測定値のゆらぎ）が低下するので、水酸基、又はカルボキシル基を有するアルカンチオールを使用した方が良い。使用するアルカンチオールは、例えば末端基に水酸基を有するメルカプトエタノール、６−ヒドロキシ−１−ヘキサンチオール、８−ヒドロキシ−１−オクタンチオール、１１−ヒドロキシ−１−ウンデカンチオール等を用いることができるが、測定対象物の有する電荷に応じて、末端基をアミノ基、カルボキシル基、水酸基を用いれば問題ない。
【００１９】
溶液中で金電極を使用する際に問題となる外部変動（夾雑物等の影響）による表面電位の不安定性（すなわち、ドリフト）に関しては、金電極と参照電極間に１ｋＨｚ以上の高周波電圧を印加することにより、その影響を低減できる。尚、この高周波電圧印加により、ＤＮＡプローブと測定対象物との結合が外れることは無い。また、金電極を用いることにより、溶液中の電極表面での反応は起こらない。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によると、金電極上にＤＮＡプローブを固定化した延長ゲート型ＦＥＴセンサを用いて、金電極上でＤＮＡポリメラーゼを用いた伸長反応を行ない、伸長反応の生成物を直接的に延長ゲート型ＦＥＴセンサで蛍光体を必要とせず非修飾で全電子的に計測することができる。その際使用する基質は、ピロシーケンスの場合のように、ｄＡＴＰの代わりにアナログ体として高価で不安定であるｄＡＴＰαＳを使用する必要がなく、さらにデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）に混載するピロリン酸を除去する工程も必要ない。
【００２１】
また、ピロシーケンス反応の場合には、必要な試薬（酵素や基質等）が多いため、過剰のデオキシリボヌクレオチド三リン酸の除去は反応溶液に基質分解酵素であるアピラーゼを混在させて行なっていたが、本発明では使用する酵素はポリメラーゼのみであるため、一塩基伸長反応終了後直ぐに基質の洗浄除去を行なうことにより、反応サイクルを早くすることが可能になり、ＤＮＡシーケンスの時間を短縮できる効果がある。
【００２２】
伸長反応に使用する基質としてデオキシリボヌクレオチド三リン酸の構成塩基の側鎖に負電荷を有する付加部分が結合した誘導体を用いれば、伸長反応に伴う金電極表面の電位変化を大きくすることができる。例えば、塩基のアミノ基に炭素鎖のリンカーを介してリン酸、あるいはポリリン酸を結合した誘導体を使用すれば、負電荷が２〜３倍に増大し、伸長反応に伴う金電極表面の電位変化も２〜３倍に増加して、高感度計測が可能になる。
【００２３】
多数のサンプルを同時に処理する場合に多数の金電極に対して１個の参照電極を用いて電位計測を行なうと、隣の金電極の電位変化の影響や金電極と参照電極間の距離の違いによる印加電位の差の影響を受けやすいが、同一平面に金電極と参照電極又は疑似参照電極を対向させて配置することにより、隣の金電極上の電位変化の影響を受けずに、同時に多数の計測が可能になる。このように多数サンプルを同時に処理するための２次元配置の高密度化に伴うクロストークの問題も無い。
【００２４】
ＤＮＡプローブとアルカンチオールを分子数比が１：２〜１：１００のＤＮＡ固定化溶液を用いて、ＦＥＴセンサに結合した金電極にＤＮＡプローブをハイブリダイゼーションの効率の良い固定化密度（4×１０12個/ｃｍ2以下）に簡単に制御することができ、最適なハイブリダイゼーション効率を維持するＤＮＡ固定化ＦＥＴセンサを作製することができる。その際問題となる延長ゲート型ＦＥＴセンサの金電極表面の溶液中のイオンの影響は、ＤＮＡ固定化溶液中のアルカンチオールの固定化密度を4×１０14個/ｃｍ2以上に制御すれば、金電極表面のシールド効果が維持されて、容易に取り除くことができる。
【００２５】
また、測定の際に問題となる外部変動（溶液中に存在する夾雑物等の影響）による表面電位の不安定性（すなわち、ドリフト）に関しては、金電極と参照電極間に高周波電圧を印加することにより、その影響を低減できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
図１は、本発明によるＤＮＡ固定化ＦＥＴセンサを用いたＤＮＡ計測装置を示すブロック図である。本発明の計測システムは、測定部１、信号処理回路２、及びデータ処理装置３から構成される。測定部１内には、絶縁ゲート型電界効果トランジスタ４、参照電極５、参照電極５に高周波電圧を印加する電源６、ターゲットＤＮＡ溶液注入器７、基質溶液注入器８、測定セル９から構成されている。測定セル９内の反応溶液１０中には、絶縁ゲート型電界効果トランジスタ４上に形成された金電極１１、金電極１１の表面に固定化されたＤＮＡプローブ１２、参照電極５が配置されている。
【００２７】
測定手順は以下の通りである。最初、測定セル９内の反応溶液１０中にターゲットＤＮＡ溶液注入器７を用いてターゲットＤＮＡ溶液を注入し、ターゲットＤＮＡとＤＮＡプローブ１２をハイブリダイズさせる。一定時間後、反応溶液１０中に基質溶液注入器８を用いて基質溶液を注入し、伸長反応を起こす。尚、反応溶液１０中には、基質以外の伸長反応に必要な酵素、試薬類が予め含まれている。測定は、絶縁ゲート型電界効果トランジスタ４内のソース１３、ドレイン１４間の電流変化をリアルタイムでモニターし、信号処理回路２、及びデータ処理装置３で記録する。ターゲットＤＮＡとＤＮＡプローブ１２とのハイブリダイゼーションや伸長反応が起こると、金電極の表面状態が変化し、表面電位が変化するため、ターゲットＤＮＡ溶液及び基質溶液の添加の前後で変化するソース１３、ドレイン１４間の電流値の変化を計測することにより、ターゲットＤＮＡとＤＮＡプローブ１２とのハイブリダイゼーションや伸長反応の有無を検出することができる。その際、測定外部変動による影響を低減するために、測定中は参照電極５に電源６により高周波電圧を印加している。
【００２８】
ターゲットＤＮＡ溶液注入器７、及び基質溶液注入器８は、シリンジポンプ又は加圧式送液装置を使用することができる。注入する体積が１μＬ以上であればシリンジポンプ、加圧式送液装置共に使用できるが、注入体積が１μＬ以下であれば、抵抗管にキャピラリーを使用した加圧式送液装置が望ましい。例えば、注入体積が０．２μＬの場合には、内径２５μｍ、長さ２０ｍｍの流量制御用キャピラリーを使用し、加圧２気圧、加圧時間２秒の条件下で正確に注入を行なうことができる。本発明では、基質溶液注入器８を１個使用したが、４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸用に４個の質溶液注入器使用することにより、シーケンスを行なうことも可能である。その際、反応溶液１０中の伸長反応後の未反応の過剰のデオキシリボヌクレオチド三リン酸の除去は、溶液を除去・洗浄すればよい。すなわち、１種類の基質を注入して一定時間後、未反応の過剰のデオキシリボヌクレオチド三リン酸を含む反応溶液を除去・洗浄して、新たに反応溶液を加える工程を追加して、４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸を順次加えて伸長反応を行なうサイクルを繰り返し行なえばよい。あるいは、未反応の過剰のデオキシリボヌクレオチド三リン酸を分解するために分解酵素であるアピラーゼを混在させておいても良い。その場合には、洗浄工程がなくなる利点があるが、分解反応に時間が１分程度かかるため、サイクル時間が長くなる。
【００２９】
ＤＮＡプローブ１２は、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡもしくはＰＮＡ等であり、金電極に結合する末端にアルカンチオールのリンカーを有している。参照電極５は、測定溶液１０中の金電極１１の表面で起こる平衡反応あるいは化学反応に基づく電位変化を安定に測定するために、基準となる電位を与える。通常は参照電極としては、飽和塩化カリウムを内部溶液に使用している銀・塩化銀電極、あるいは甘こう（カロメル）電極が用いられるが、測定する試料溶液の組成が一定の場合には、疑似電極として銀・塩化銀電極のみを使用しても問題はない。
【００３０】
図２は、本発明のＤＮＡ計測装置に使用する絶縁ゲート電界効果トランジスタの構造を示す図である。図２(a)、(b)は、各々断面構造及び平面構造を表わしている。絶縁ゲート電界効果トランジスタ２１は、シリコン基板の表面にソース２２、ドレイン２３、及びゲート絶縁物２４を形成し、金電極２５を設けてある。ＤＮＡプローブを固定化する金電極２５と絶縁ゲート電界効果トランジスタのゲート２６を導電性配線２７で接続してある。好ましくは、絶縁ゲート電界効果トランジスタは、シリコン酸化物を絶縁膜として用いる金属酸化物半導体（Metal-oxide-semiconducor）電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）であるが、薄膜トランジスタ（ＴＦＴ）を用いても問題はない。本構造を採用することにより、ＤＮＡプローブを固定化する金電極２５を任意の場所に、かつ任意の大きさに形成できる。さらに、測定対象の違う様々なセンサチップを作製する場合にも個別に作製する必要がなく、従来の半導体プロセスを用いてプローブ固定化電極以外の部分を共通に作製し、最後に測定対象に合わせてプローブ固定化電極及び測定対象物の固定化を行なうことができ、大幅に製作コストが低減できる。また、本発明で用いるプローブ固定化用金電極はチオール化合物と容易に結合して安定であるため、チオール基(通常は、アルカンチオールリンカー)を有するプローブを用いることにより、固定化が容易となる。また、金電極は不活性のため溶液中で安定である、すなわち電位ドリフト等を生じない。
【００３１】
本発明で使用する絶縁ゲート電界効果トランジスタは、ＳｉＯ2（厚さ；１７．５ｎｍ）を用いた絶縁層を有するデプレション型ＦＥＴであり、金電極を４００μｍ×４００μｍの大きさで作製してある。通常の測定は、水溶液を使用するため、本素子は溶液中で動作しなければならない。溶液中で測定する場合には、電気化学反応を起こし難い−０．５〜０．５Ｖの電極電位範囲で動作することが必要である。そのため、本実施例ではデプレション型ｎチャネルＦＥＴの作製条件、すなわち閾値電圧（Ｖｔ）調整用イオン打ち込み条件を調整し、ＦＥＴの閾値電圧を−０．５Ｖ付近に設定してある。
【００３２】
図３は、本発明の他の実施例のＤＮＡ計測装置に使用する絶縁ゲート電界効果トランジスタの構造例を示す図である。図３（ａ）、（ｂ）は、各々断面構造及び平面構造を表わしている。絶縁ゲート電界効果トランジスタは、シリコン基板３１の表面にソース３２、ドレイン３３、及びゲート絶縁物３４を形成し、金電極３５を設けてある。ＤＮＡプローブを固定化する金電極３５と絶縁ゲート電界効果トランジスタのゲート３６を導電性配線３７で接続してある。金電極以外の部分は、遮光部材３８で覆われている。遮光部材としては、絶縁性が高く光透過性の低いプラスチック材や接着剤を使用することができる。また、半導体作製プロセスにおいて導電性材料であるアルミニウム層を形成しても良い。その際は、金電極とアルミニウム層の間に絶縁層を形成し、さらにアルミニウム層が帯電しないように接地することが望ましい。本構造を採用することにより、暗箱等を必要とせず簡便に使用することができる。
【００３３】
図４（ａ）、（ｂ）は、本発明によるＤＮＡ計測定装置に使用する絶縁ゲート電界効果トランジスタの遮光効果を示す図である。遮光効果の評価は、絶縁ゲート電界効果トランジスタの電流・電圧特性の測定結果を暗箱の有無で比較した。トランジスタの電流・電圧特性の測定は、ソース、ドレイン間の電圧は0.5Ｖで、参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極を使用し、半導体パラメータアナライザ（Agilent 4155C Semiconductor Parameter Analyzer）を用いて行った。
【００３４】
図４（ａ）は遮光対策を行わない絶縁ゲート電界効果トランジスタの測定結果、図４（ｂ）はセンシング部である金電極部分以外を遮光部材で覆って遮光対策を施した絶縁ゲート電界効果トランジスタの測定結果である。その結果、図４（a）に示すように、遮光対策を行わない絶縁ゲート電界効果トランジスタは暗箱内の場合のドレイン電流値４１と暗箱無しの場合のドレイン電流値４２が大きく変化する。遮光対策を施した絶縁ゲート電界効果トランジスタは、図４（ｂ）に示すように暗箱内の場合のドレイン電流値４３と暗箱無しの場合のドレイン電流値４４はほとんど変化なく、光の影響を受けていないことが分かる。
【００３５】
以下、本発明の他の実施の形態を説明する。図５は、本発明によるＤＮＡ固定化ＦＥＴセンサを用いたＤＮＡ計測装置の構成を示す図である。本発明に使用する絶縁ゲート電界効果トランジスタ５１は、シリコン基板の表面にソース５２、ドレイン５３、及びゲート絶縁物５４を形成し、ソース５２、ドレイン５３間のゲート絶縁物表面に金電極５５を設けてある。金電極５５の表面には、ＤＮＡプローブ５６とアルカンチオール５７が固定化されている。実際の測定の際には、金電極５５、金電極５５の表面上に固定化されたＤＮＡプローブ５６とアルカンチオール５７、及び参照電極５８が測定セル５９中の反応溶液６０中に配置し、参照電極５８に電源６１により高周波電圧を印加し、反応溶液６０中に含まれるターゲットＤＮＡとＤＮＡプローブ５６との結合の前後で変化する絶縁ゲート電界効果トランジスタ５１の電気特性変化、すなわちソース５２とドレイン５３との間を流れる電流値の変化を検出することにより、反応溶液６０中に含まれるターゲットＤＮＡの伸長の有無を検出することができる。
【００３６】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション効率は、ＤＮＡプローブの固定化密度に大きく依存する。例えば、ＤＮＡプローブが高密度で固定化されると、ハイブリダイズするターゲットＤＮＡが接近出来ないことや２本鎖形成に伴う隣同士のリン酸基の反発により、ハイブリダイゼーションの効率が悪くなるからである。さらに、本発明で使用するＦＥＴセンサでは、ＤＮＡプローブの固定化密度の他に金電極表面のシールド、すなわち金電極表面での溶液中のイオンの影響の除去が問題となる。そのため、本発明では、ＤＮＡプローブ固定化密度とリンカーであるアルカンチオールの固定化密度の両方を考慮し、図５に示すように、金電極５５へのＤＮＡプローブ５６の固定化の際には、ＤＮＡプローブ５６の配列制御及び金電極５５の表面の保護のために、アルカンチオール５７も同時に固定化した。
【００３７】
図６は、本発明によるＦＥＴセンサのセンシング部である金電極へのＤＮＡプローブの固定化法の操作フローを示している。図６（ａ）はＤＮＡ固定化溶液の模式図、図６（ｂ）はＤＮＡプローブの固定化密度が制御された様子を示す図、図６（ｃ）は固定化密度が制御されたＤＮＡプローブを用いてハイブリダイゼーションを行なった様子を示す図である。
【００３８】
一般に、チオールを有する化合物は、金表面と反応してＡｕ−Ｓ結合し、高密度・高配向な自己組織化単分子膜を形成することが知られている。本発明ではその性質を利用して、ＤＮＡプローブ７１とリンカー７２との競合反応を行ない、ＤＮＡプローブの固定化密度を制御し、さらに金電極７３の表面のシールドを行なった。固定化されるＤＮＡプローブとリンカーの分子数比は、ＤＮＡ固定化溶液中のＤＮＡプローブとリンカーの分子数比に大きく依存するため、ＤＮＡプローブ溶液とリンカー溶液の混合比を変えることにより、容易に制御することができる。すなわち、ＤＮＡプローブとリンカーの混合濃度を固定化反応前に調整するだけで、容易にＤＮＡ固定化濃度及び金電極表面のシールドを行なうことができる。その後、ターゲットＤＮＡを添加してハイブリダイゼーションを行なうことにより、２本鎖ＤＮＡ７４を形成することができる。
【００３９】
ＤＮＡプローブの固定化は、ＤＮＡプローブとアルカンチオールを分子数比が一定の分子数比（例えば、１：１０）のＤＮＡ固定化溶液を用いて行なった。その際使用するバッファーは、10mM Tris-HCl, 5mM Mg, pH7.2を使用した。固定化時間は約１時間とした。本発明において用いるＤＮＡプローブの長さは、目的に応じて異なるが、通常は２０塩基以上の１本鎖ＤＮＡが用いられる。好適には２０〜３０塩基の１本鎖ＤＮＡである。また、リンカーとしては通常は炭素鎖６〜１１個のアルカンチオールが用いられる。ＤＮＡを固定化する場合には、ＤＮＡが負に帯電しているため、アミノ基を有するアルカンチオールを使用すると相互作用によりＤＮＡ断片が表面に横たわった状態になり測定安定性（安定化時間及び測定値のゆらぎ）が低下するので、水酸基、又はカルボキシル基を有するアルカンチオールを使用した方が良い。このように使用するアルカンチオールは、例えば末端基に水酸基を有するメルカプトエタノール、６−ヒドロキシ−１−ヘキサンチオール、８−ヒドロキシ−１−オクタンチオール、１１−ヒドロキシ−１−ウンデカンチオール等を用いることができるが、測定対象物の有する電荷に応じて、末端基にアミノ基、カルボキシル基、水酸基を用いれば問題ない。また、電極表面への物理吸着が問題となる場合にはフロロカーボン基等を用いれば問題ない。
【００４０】
本発明で使用したＤＮＡプローブは、リンカーとして炭素鎖６個のアルカンチオールを持つ１本鎖ＤＮＡ（5'-HS-(CH2)6- CACACTCACAGTTTTCACTT -3'，ALDH２遺伝子と相補的な配列）を用いた。その際の競合反応をさせるアルカンチオールは、６−ヒドロキシ−１−ヘキサンチオール(６−ＨＨＴ)である。ＤＮＡプローブと６−ＨＨＴの混合比率は、１：１０である。その際のＤＮＡプローブ固定化密度は４×１０12個/ｃｍ2であった。尚、ＤＮＡプローブの固定化密度は、強アルカリ溶液中でのＣＶにより求めた。ＦＥＴセンサの感度はＤＮＡプローブの固定化密度が高いほうが向上するので、ＤＮＡプローブの理想的な固定化密度を考慮すると、ＤＮＡプローブの固定化密度は４×１０10個/ｃｍ2〜４×１０12個/ｃｍ２が好適である。その際に使用するＤＮＡ固定化溶液は、ＤＮＡプローブとアルカンチオールを分子数比が１：５〜１：１００である。また、ＤＮＡプローブと競合反応に使用するアルカンチオールの濃度が５００μＭ以上であれば、金電極表面のシールド効果は維持できる。
【００４１】
実際に測定した結果を図７に示す。ＤＮＡプローブと６−ＨＨＴの濃度比が１：１０である混合溶液を用いてＤＮＡプローブの固定化を行なった。使用したＤＮＡプローブは、２０塩基の１本鎖ＤＮＡ（5'-HS-(CH2)6-CACACTCACAGTTTTCACTT-3'，ALDH２遺伝子と相補的な配列）を、ターゲットＤＮＡは５０塩基の１本鎖ＤＮＡ（5'-TGGGCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTAAAGTGAAAACTGTGAGTGTG-3'、ALDH２遺伝子と相補的な配列）を使用した。本測定は、ゲート側の参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極）に周波数；１ＭＨｚ、中心電圧；５０ｍＶ、振幅電圧；５０ｍＶの交流電圧を印加して行なった。本実施例で使用した反応条件及び試薬組成を以下に示す。
【００４２】
反応条件
反応体積：100μＬ
基質添加量：10μＬ（dATP、dCTP、dGTP、dTTP：200μM）
反応溶液の試薬組成
0.1 M Tris-acetate buffer, pH7.75
0.5 mM EDTA
5.0 mM magnesium acetate
0.1% bovine serum albumin
1.0 mM dithiothreitol
0.1 U/μL DNA polymerase I, Exo-klenow Fragment
【００４３】
ターゲットＤＮＡを導入後（ＤＮＡプローブとハイブリダイズした２本鎖ＤＮＡ）のドレイン電流８２は、試料を導入前（１本鎖ＤＮＡ）のドレイン電流８１に比べて減少した。次に基質溶液（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合溶液）を加えると、さらにドレイン電流８３は減少した。この結果は、２本鎖ＤＮＡ形成及び伸長反応により、金電極表面の負の電荷が増加したためであると考えられる。すなわち、金電極表面に固定化されたＤＮＡプローブは側鎖にリン酸基を有し、全体的に負電荷を帯びている。ハイブリダイゼーションに伴い、測定対象のターゲットＤＮＡ断片の長さに応じた負電荷が増加し、それに伴いドレイン電流値が減少した。さらに、伸長反応により伸長反応に寄与した長さに応じた負電荷が増加して、さらにドレイン電流値が減少したためである。
【００４４】
塩基長の違う３種類のターゲットＤＮＡを用いて伸長反応を行なった結果を図８に示す。使用したＤＮＡプローブは２０塩基の１本鎖ＤＮＡ（5'-HS-(CH2)6- CACACTCACAGTTTTCACTT -3'，ALDH２遺伝子と相補的な配列）であり、ターゲットＤＮＡは以下に示す３０、４０、５０塩基の３種類の１本鎖ＤＮＡである。
ターゲットＤＮＡ；
5'-GCATACACTAAAGTGAAAACTGTGAGTGTG-3'
5'-CGGGCTGCAGGCATACACTAAAGTGAAAACTGTGAGTGTG-3'
5'-TGGGCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTAAAGTGAAAACTGTGAGTGTG-3'
【００４５】
また、ＤＮＡプローブの固定化は、ＤＮＡプローブと６−ＨＨＴの濃度比が１：１０である混合溶液を用いて行なった。本測定は、ゲート側の参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極）に周波数；１ＭＨｚ、中心電圧；５０ｍＶ、振幅電圧；５０ｍＶの交流電圧を印加して行なった。その結果、伸長反応に伴いドレイン電流の変化値は、ターゲットＤＮＡの長さに応じて、３０塩基、４０塩基、５０塩基の順番に大きくなった（ターゲットＤＮＡの長さが３０塩基、４０塩基、５０塩基の場合は、各々１０、２０、３０塩基伸長する。）。この結果は、伸長反応により伸長反応に寄与した長さに応じた負電荷が増加して、それに伴いドレイン電流値が変化したことを示している。
【００４６】
本発明の他の実施例である本発明の装置を用いたシーケンシング法について以下に説明する。本装置で行うシーケンシング法の原理は、ターゲットＤＮＡにハイブリダイズしたＤＮＡプローブの伸長反応に伴うリン酸基の増加、すなわち負電荷の増加をＦＥＴセンサのドレイン電流の変化として検出するものである。
【００４７】
ＦＥＴセンサの金電極上には、伸長反応用プライマーであるＤＮＡプローブが固定化してある。ＤＮＡプローブの固定化は、ＤＮＡプローブと６−ＨＨＴの濃度比が１：１０である混合溶液を用いて行なった。測定は、固定化ＤＮＡプローブに測定対象のターゲットＤＮＡをハイブリダイズさせ、ＤＮＡプローブとターゲットＤＮＡがハイブリダイズした状態においてＤＮＡポリメラーゼを加えて伸長反応を行う。その際、伸長反応の基質であるデオキシリボヌクレオチド三リン酸を１種類ずつ、順次加えていくと、相補的な塩基の場合のみ伸長反応が起き、リン酸基の増加に伴い負電荷が増加し、ドレイン電流が変化する。デオキシリボヌクレオチド三リン酸を順番に繰り返し加えた際の、ＦＥＴセンサのドレイン電流値変化の有無を検出しながら１個ずつ塩基配列を決定していく方法であり、本発明の装置を用いて容易に行うことができる。その際、反応溶液中の伸長反応後の未反応の過剰のデオキシリボヌクレオチド三リン酸の除去は、溶液を除去・洗浄すればよい。すなわち、１種類の基質を注入して一定時間後に伸長反応の有無を検出し、次に未反応の過剰のデオキシリボヌクレオチド三リン酸を含む反応溶液を除去・洗浄して、新たに反応溶液を加える。この工程を４種類の基質について繰り返し行なう。あるいは、未反応の過剰のデオキシリボヌクレオチド三リン酸を分解するために、分解酵素であるアピラーゼを混在させておいても良い。その場合には、洗浄工程がなくなる利点があるが、分解反応に時間が１分程度かかるため、サイクル時間が長くなる。
【００４８】
図９は、本発明によるＤＮＡ固定化ＦＥＴセンサを用いたＤＮＡシーケンングの結果を示す図である。図中の縦軸はＦＥＴセンサのドレイン電流値、横軸は時間、記号Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔは各々加えた基質、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを示している。また、記号Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔの下の矢印は、ターゲットＤＮＡと相補的な塩基（すなわち、マッチした塩基）を示している。使用したＤＮＡプローブは２０塩基の１本鎖ＤＮＡ（5'-HS-(CH2)6-CACACTCACAGTTTTCACTT-3'，ALDH２遺伝子と相補的な配列）であり、ターゲットＤＮＡは５０塩基の１本鎖ＤＮＡ（5'-TGGGCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTAAAGTGAAAACTGTGAGTGTG-3'、ALDH２遺伝子と相補的な配列）を使用した。また、ＤＮＡプローブと６−ＨＨＴの濃度比が１：１０である混合溶液を用いてＤＮＡプローブの固定化を行なった。本測定は、ゲート側の参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極）に周波数；１ＭＨｚ、中心電圧；５０ｍＶ、振幅電圧；５０ｍＶの交流電圧を印加して行なった。本実施例で使用した反応条件及び試薬組成を以下に示す。尚、ここで使用した反応条件や試薬濃度は、測定法の一例であり、装置構成及びターゲットＤＮＡに応じて適宜変更できる。
【００４９】
反応条件
反応体積：100μＬ
基質添加量：10μＬ（dATP、dCTP、dGTP、dTTP：200μM）
反応溶液の試薬組成
0.1 M Tris-acetate buffer, pH7.75
0.5 mM EDTA
5.0 mM magnesium acetate
0.1% bovine serum albumin
1.0 mM dithiothreitol
0.1 U/μL DNA polymerase I, Exo-klenow Fragment
0.1 U/mL Apyrase
【００５０】
その結果、相補的な塩基を加えた場合のみにドレイン電流値が減少し、伸長反応を検出できたことを確認できた。加えた基質の種類とその際のドレイン電流値の変化の有無から、塩基配列がATCACATACGであると決定できた。本実施例では、未反応の過剰のデオキシリボヌクレオチド三リン酸の除去を基質の分解酵素であるアピラーゼを混在させて行なったが、未反応の過剰のデオキシリボヌクレオチド三リン酸の除去を反応溶液の除去・洗浄によって行なうこともできる。
【００５１】
本実施例では、シーケンス反応（伸長反応）の基質としてデオキシリボヌクレオチド三リン酸を用いたが、さらに測定感度を向上させたい場合には、使用する基質をデオキシリボヌクレオチド三リン酸の構成塩基の側鎖に負電荷を有する付加部分が結合した誘導体を用いれば良い。例えば、一般に使用されている蛍光体標識基質と同じように塩基のアミノ基に炭素鎖のリンカーを介して蛍光体の代わりにリン酸を結合した誘導体（図１０(ａ）)、あるいはポリリン酸を結合した誘導体（図１０(ｂ）)を使用すれば良い。図１０にはＡＴＰ誘導体の一例を示したが、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰの各誘導体に関しても蛍光体標識基質と同じように行なえば問題ない。すなわち、デオキシリボヌクレオチド三リン酸への蛍光体標識は、ダイターミネータラベルとしてシーケンス反応に使用されるものであり、それと同じ位置で同じ様なリンカーの長さで結合すれば、シーケンス反応（すなわち、伸長反応）を阻害しない。また、本実施例ではＤＮＡプローブとして特定の遺伝子の塩基配列を用いたが、通常のシーケンスと同様にクローニングサイトに用いられるユニバーサルプライマー（例えば、Ｍ１３のユニバーサルプライマー；5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'）の塩基配列を含むＤＮＡプローブを用いることにより、通常のＤＮＡシーケンサーと同じように、クローニングやＰＣＲで増幅した未知のサンプルの塩基配列を決定できる。
【００５２】
本発明の他の実施例のアレイ素子の例を図１１により説明する。本発明のアレイ素子は、素子基板１１１には複数個の延長ゲート型トランジスタを形成してあり、表面には該延長ゲート型トランジスタの各々ゲートが導電性配線で各々の金電極１１２に接続されている。金電極１１２の周囲には疑似参照電極１１３が一対一で形成してある。金電極１１２の外周を囲むように参照電極１１３を一対で形成することにより、金電極上へのＤＮＡプローブやアルカンチオールの固定化が不十分（すなわち、金電極上に欠損が存在する）であってもそれに伴う露出した金表面での電流発生や電位勾配等の影響を隣に及ぼすことを低減することができる。また、同一基板上に複数のトランジスタを形成することにより、トランジスタの電気的特性を同じに出来る利点もある。実際にアレイ素子を使用して計測する場合には、トランジスタに入力する電源線及び信号の出力線がアレイ素子の個数分だけ必要となる。そこで、本発明の実施例では、図１２に示すように、アレイ素子基板１２１上に延長ゲート型トランジスタの各々ゲートと導電性配線で接続された金電極１２２と該金電極１２２の外周を囲む疑似参照電極１２３が一対一で形成してあるアレイ素子を使用する場合に、電源１２４からの各トランジスタへの入力線を共通にし、各トランジスタからの各々の信号出力線１２６は、マルチプレクサ１２７で選択されて１本の信号出力線１２８を介して信号処理装置１２９に入力することにより、入出力線を減らした。また、信号線１２６及びマルチプレクサ１２７をアレイ素子基板１２１上に一体形成することにより、さらに配線数を減らすこともできる。このアレイ素子は、シリコン酸化物を絶縁膜として用いる金属酸化物半導体（Metal-oxide-semiconductor）電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）であるが、薄膜トランジスタ（ＴＦＴ）を用いても問題はない。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明によるＤＮＡ計測装置を示すブロック図。
【図２】本発明による絶縁ゲート電界効果トランジスタの構造例を示す図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は断面図。
【図３】本発明による絶縁ゲート電界効果トランジスタの他の構造例を示す図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は断面図。
【図４】絶縁ゲート電界効果トランジスタの遮光効果を示す図であり、（ａ）は遮光対策を行わない素子の測定結果を示す図、（ｂ）は遮光対策を行った素子の測定結果を示す図。
【図５】本発明によるＤＮＡ計測装置の他の例を示すブロック図。
【図６】金電極へのＤＮＡプローブの固定化法の操作フローを示す図であり、（ａ）はＤＮＡ固定化溶液の模式図、（ｂ）はＤＮＡプローブの固定化密度が制御された様子を示す図、（ｃ）は固定化密度が制御されたＤＮＡプローブを用いてハイブリダイゼーションを行なった様子を示す図。
【図７】本発明によるＤＮＡ計測装置を用いたＤＮＡハイブリダイゼーション及び伸長反応の計測結果の一例を示す図。
【図８】塩基長の違う３種類のターゲットＤＮＡを用いて伸長反応を計測した結果を示す図。
【図９】本発明によるＤＮＡ計測装置を用いたＤＮＡシーケンングの結果の一例を示す図。
【図１０】デオキシリボヌクレオチド三リン酸誘導体の一例を示す図であり、（ａ）はリン酸基を１個結合した誘導体の図、（ｂ）はリン酸基を２個結合した誘導体の図。
【図１１】本発明によるアレイ素子を示す図。
【図１２】本発明のアレイ素子を用いた測定方式の説明図。
【符号の説明】
【００５４】
１…測定部、２…信号処理回路、３…データ処理装置、４，２１，５１…絶縁ゲート型電界効果トランジスタ、５，５８…参照電極、６，６１，１２４…電源、７…ターゲットＤＮＡ溶液注入器、８…基質溶液注入器、９，５９…測定セル、１０，６０…反応溶液、１１，２５，３５，５５，７３，１１２，１２２…金電極、１２，５６，７１…ＤＮＡプローブ、１３，２２，３２，５２…ソース、１４，２３，３３，５３…ドレイン、２４，３４，５４…ゲート絶縁物、２６，３６…ゲート、２７，３７…導電性配線、３１…シリコン基板、３８…遮光部材、４１，４２，４３，８１，８２，８３…ドレイン電流、５７…アルカンチオール、７２…リンカー、７４…２本鎖ＤＮＡ、１１１，１２１…素子基板、１１３，１２３…疑似参照電極、１２６，１２８…信号出力線、１２７…マルチプレクサ、１２９…信号処理装置
【図１】
2007108160.tif 000005
【図２】
2007108160.tif 000006
【図３】
2007108160.tif 000007
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2007108160.tif 000012
【図９】
2007108160.tif 000013
【図１０】
2007108160.tif 000014
【図１１】
2007108160.tif 000015
【図１２】
2007108160.tif 000016
【配列表】
2007108160000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年5月26日(2006.5.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
一方、小型で簡便な手法として注目されている方法として、ＤＮＡプローブにターゲットＤＮＡをハイブリダイズさせ、相補鎖伸長反応で生成するピロリン酸をＡＴＰに変え、このＡＴＰをルシフェリン/ルシフェラーゼ発光系で発光させ、この生物発光を検出することにより、相補鎖伸長反応で取り込まれた基質（デオキシリボヌクレオチド三リン酸）を知り、プライマーの隣接部位から、順次、塩基配列決定を行うピロシーケンシング法（Anal. Chem. Acta. 175, (1985) 99-105、特表２００１―５０６８６４号公報、特許３５１０２７２号公報）や、ソース・ドレイン間の上に形成されたゲート絶縁層にＤＮＡプローブを固定化し、ＤＮＡプローブとターゲットＤＮＡとのハイブリダイゼーションによる絶縁膜上の表面電位をソース・ドレイン間の電流値の変化として検出するＦＥＴセンサ（特表２００１−５１１２４５号公報）がある。これら方法の中で生物発光を用いる検出方法は、ターゲットＤＮＡのＤＮＡプローブへのハイブリダイゼーションの有無を蛍光体の標識やＢＦ分離無しで検出できる方法として有望である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
【特許文献１】特表２００１−５０６８６４号公報
【特許文献２】特許３５１０２７２号公報
【特許文献３】特表２００１−５１１２４５号公報
【特許文献４】特開２００５−７７２１０号公報
【非特許文献１】Anal. Chim. Acta 175 (1985) 99-105
【非特許文献２】Langmuir 9, (1993) 574-576
【非特許文献３】J. Am. Chem. Soc. 120, (1998) 8537-8538
【非特許文献４】Anal. Chem. Acta. 175, (1985) 99-105
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
一方、ＦＥＴセンサは、原理的にはソースとドレインの上に形成されたゲート絶縁層に固定化されたＤＮＡプローブの伸長反応で付加されたリン酸基の増加分を電位変化として検出することが可能である。発光計測と比較して、使用する試薬（酵素や基質等）が少ない利点がある。しかし、従来のＤＮＡプローブのゲート絶縁層への固定化は、ゲート絶縁層表面をアミノプロピルシランやポリリジン等で化学修飾してアミノ基を導入し、グルタルアルデヒドやフェニレンジイソシアネートを用いて、末端をアミノ基で化学修飾したＤＮＡプローブを反応させて行なうため、煩雑な前処理を必要とした。近年、ＤＮＡプローブを固定化するための金電極と絶縁ゲート電界効果トランジスタのゲートを導電性配線で接続した延長ゲート型ＦＥＴセンサ（特開２００５−７７２１０号公報）が提案され、ＤＮＡ固定部であるセンシング部に金電極を使用することにより、金電極へのＤＮＡプローブの固定化もアルカンチオールをリンカーとして有するＤＮＡプローブを用いて金とチオールの特異的な結合を利用して容易に行なうことができるようになった。しかし、延長ゲート型ＦＥＴセンサに適したＤＮＡプローブの固定化の形態やその使用法についての詳細な考察がなかった。特に、検出感度に大きく影響するハイブリダイゼーション効率とＤＮＡプローブ固定化密度の関係や、夾雑物等による溶液中での外乱要因の影響を低下させる方法が明らかではなかった。また、多数サンプルを同時に処理するためのセンサの配置等が明らかでなかった。