(57)【要約】【課題】本発明の課題は、神経細胞のような非増殖性細胞に対しても、細胞毒性が低く遺伝子発現効率に優れた核酸分子送達用担体、及び該核酸分子送達用担体を用いた遺伝子導入方法、及びキットを提供することである。【解決手段】本発明は、リン脂質、カチオン性脂質、及びマンノシッドリピド系糖脂質化合物を含むことを特徴とする核酸分子送達用担体、および該核酸分子送達用担体を用いた遺伝子導入方法、及び、該核酸分子送達用担体を含むキットを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非増殖性細胞への核酸分子送達用担体であって、カチオン性脂質、及びマンノシッドリピド系糖脂質化合物を含むことを特徴とする核酸分子送達用担体。
【請求項２】
マンノシッドリピド系糖脂質化合物が、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）であることを特徴とする請求項１記載の核酸分子送達用担体。
【請求項３】
マンノシッドリピド系糖脂質化合物が、式（Ｉ）：
【化１】
2007112749.tif 000009
で表されるMEL-A、MEL-B及びMEL-Cからなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１または２に記載の核酸分子送達用担体。
【請求項４】
カチオン性脂質が、３β［Ｎ−（Ｎ７，Ｎ’−ジメチルアミノ−エタン）−カルバモイル］コレステロール、３β−［Ｎ−（Ｎ‘、２’−ヒドロキシエチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール、ステアリルアミン、Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ドデシル−Ｄ−グルタメートクロリド、Ｎ−［１−（２，３−オレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテートからなる群より選ばれた１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする請求項１記載の核酸分子送達用担体。
【請求項５】
非増殖性細胞が神経細胞であることを特徴とする請求項５に記載の核酸分子送達用担体。
【請求項６】
さらに、リン脂質を含むことを特徴とする請求項１記載の核酸分子送達用担体
【請求項７】
非増殖性細胞への核酸分子導入方法であって、
カチオン性脂質、及びマンノシッドリピド系糖脂質化合物を含む核酸分子送達用担体と核酸分子を混合し複合体を形成させる工程、該複合体と標的細胞とを接触させる工程を含むことを特徴とする核酸分子導入法。
【請求項８】
マンノシッドリピド系糖脂質化合物が、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）であることを特徴とする請求項７記載の核酸分子導入法。
【請求項９】
マンノシッドリピド系糖脂質化合物が、式（Ｉ）：
【化２】
2007112749.tif 000010
で表されるMEL-A、MEL-B及びMEL-Cからなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項７または８に記載の核酸分子導入法。
【請求項１０】
カチオン性脂質が、３β［Ｎ−（Ｎ７，Ｎ’−ジメチルアミノ−エタン）−カルバモイル］コレステロール、３β−［Ｎ−（Ｎ‘、２’−ドロキシエチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール、ステアリルアミン、Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ドデシル−Ｄ−グルタメートクロリド、Ｎ−［１−（２，３−オレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテートからなる群より選ばれた１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする請求項７記載の核酸分子導入法。
【請求項１１】
非増殖性細胞が神経細胞であることを特徴とする請求項７記載の核酸分子導入法。
【請求項１２】
さらに、核酸分子送達用担体にリン脂質を含むことを特徴とする請求項７記載の遺伝子導入法。
【請求項１３】
非増殖性細胞への核酸分子導入キットであって、
カチオン性脂質、及びマンノシッドリピド系糖脂質化合物を含むことを特徴とする核酸分子導入キット。
【請求項１４】
マンノシッドリピド系糖脂質化合物が、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）であることを特徴とする請求項１３に記載の核酸分子導入キット。
【請求項１５】
マンノシッドリピド系糖脂質化合物が、式（Ｉ）：
【化３】
2007112749.tif 000011
で表されるMEL-A、MEL-B及びMEL-Cからなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１３または１４に記載の核酸分子導入キット。
【請求項１６】
カチオン性脂質が、３β［Ｎ−（Ｎ７，Ｎ’−ジメチルアミノ−エタン）−カルバモイル］コレステロール、３β−［Ｎ−（Ｎ‘、２’−ドロキシエチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール、ステアリルアミン、Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ドデシル−Ｄ−グルタメートクロリド、Ｎ−［１−（２，３−オレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテートからなる群より選ばれた１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする請求項１３記載の核酸分子導入キット。
【請求項１７】
非増殖性細胞が神経細胞であることを特徴とする請求項１０記載の核酸分子導入キット。
【請求項１８】
さらに、リン脂質を含むことを特徴とする請求項１３に記載の核酸分子導入キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非増殖性細胞用高い遺伝子発現率を示す核酸分子導入剤としてカチオン性脂質、及びマンノシッドリピド系糖脂質化合物を含む核酸分子送達用担体と、及び該核酸分子送達用担体による非増殖性細胞用への核酸分子導入方法、及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、遺伝子導入効率の向上を目的に、リポソームの構成成分の検討が行われており、主成分である中性のリン脂質以外に、正電荷を持つ脂質化合物、例えばコレステロール誘導体などを少量添加する試みも行われている（非特許文献１）。特に正電荷を有するリポソームは、遺伝子との複合体を形成する上で必要であるが、カチオン性のリポソームベクターは一般に細胞毒性が高く、未だ満足する効果は得られていない。
【０００３】
先に、本発明者らの一人は、MELを含有したリポソーム（MELリポソーム）が細胞に対して高い遺伝子導入作用を有していることを見出している（特許文献１、非特許文献２）。また、エタノール注入法で粒子サイズが小さいリポソームを調製することで、in  ｖｉｖｏ投与で有効なMELリポソームを見出している（特許文献２）。さらに、細胞が浮遊している状態でのトランスフェクションについても有効であることを見出している（特許文献３）。また、リポフェクトアミンなど優れたin  vitro発現効果を有するリポソームが市販されている。しかし、それらはCOS細胞やHeLa細胞などのような増殖性の細胞での有効性であり、神経細胞のような非増殖性細胞では未だ満足のいく結果が得られていないのが現状である。
【０００４】
ある種のウィルスは宿主細胞の膜表面に結合し、細胞膜と融合することによりヌクレオカプシドを細胞質内に送り込む。一般に、リポソームの場合は細胞との融合は起こりにくく、エンドサイトーシスにより取り込まれ、ライソゾームによる分解を免れた遺伝子の一部が核に取り込まれ発現すると言われている。膜融合の場合はリソゾームによる分解を受けることなく細胞内に送達される。ＭＥＬリポソームは膜融合性を持っていることが知られている（非特許文献３）。さらに、本発明者らの一人は、カチオン性のコレステロール誘導体の中で、OH-Cholを用いたものに神経細胞への遺伝子導入効果が見られることを報告している（非特許文献４）。しかし、いまだ神経細胞のような非増殖性細胞に対しても遺伝子発現効率に優れた、満足のいく方法は見いだされていないのが現状である。
【特許文献１】特開２００３−４０７６７
【特許文献２】特願２００４−９３５２４
【特許文献３】特願２００４−３６９２９９
【非特許文献１】中西ら、蛋白質・核酸・酵素、44 (11), 1590-1596 (1999)
【非特許文献２】北本大、フレグランスジャーナル、5, 29-38 (2002)
【非特許文献３】Y. Inoh, D. Kitamoto, N. Hirashima, and M. Nakanishi, BiosurfactantMEL-A drastically increase gene transfection via membrane fusionｃ, J.Contr. Release., 94 (2), 423-431 (2004)
【非特許文献４】A. Noguchi, N. Hirashima, T. Furuno and M. Nakanishi, Activation of receptor tyrosinase kinase gene transfection in rat neuronal PC12 cells by cationic liposomees, Nueroscience Lett., 325, 29-32 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明の目的は、神経細胞のような非増殖性細胞に対しても、細胞毒性が低く遺伝子発現効率に優れた核酸分子送達用担体、及び該核酸分子送達用担体を用いた遺伝子導入方法、及びキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示すような手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明は、非増殖性細胞に対しても核酸分子、特に遺伝子発現効率に優れた核酸分子送達用担体、及び該核酸分子送達用担体を用いた核酸分子導入方法、及びキットに関する。
１．  
非増殖性細胞への核酸分子送達用担体であって、カチオン性脂質、及びマンノシッドリピド系糖脂質化合物を含むことを特徴とする核酸分子送達用担体。
２．  
マンノシッドリピド系糖脂質化合物が、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）であることを特徴とする項１記載の核酸分子送達用担体。
３．  
マンノシッドリピド系糖脂質化合物が、式（Ｉ）：
【０００７】
【化１】
2007112749.tif 000002
【０００８】
で表されるMEL-A、MEL-B及びMEL-Cからなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする項１または２に記載の核酸分子送達用担体。
４．  
カチオン性脂質が、３β［Ｎ−（Ｎ７，Ｎ’−ジメチルアミノ−エタン）−カルバモイル］コレステロール、３β−［Ｎ−（Ｎ‘、２’−ヒドロキシエチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール、ステアリルアミン、Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ドデシル−Ｄ−グルタメートクロリド、Ｎ−［１−（２，３−オレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテートからなる群より選ばれた１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする項１記載の核酸分子送達用担体。
５．  
非増殖性細胞が神経細胞であることを特徴とする項５に記載の核酸分子送達用担体。
６．  
さらに、リン脂質を含むことを特徴とする項１記載の核酸分子送達用担体
７．  
非増殖性細胞への核酸分子導入方法であって、
カチオン性脂質、及びマンノシッドリピド系糖脂質化合物を含む核酸分子送達用担体と核酸分子を混合し複合体を形成させる工程、該複合体と標的細胞とを接触させる工程を含むことを特徴とする核酸分子導入法。
８．  
マンノシッドリピド系糖脂質化合物が、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）であることを特徴とする項７記載の核酸分子導入法。
９．  
マンノシッドリピド系糖脂質化合物が、式（Ｉ）：
【０００９】
【化２】
2007112749.tif 000003
【００１０】
で表されるMEL-A、MEL-B及びMEL-Cからなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする項７または８に記載の核酸分子導入法。
１０．  
カチオン性脂質が、３β［Ｎ−（Ｎ７，Ｎ’−ジメチルアミノ−エタン）−カルバモイル］コレステロール、３β−［Ｎ−（Ｎ‘、２’−ドロキシエチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール、ステアリルアミン、Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ドデシル−Ｄ−グルタメートクロリド、Ｎ−［１−（２，３−オレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテートからなる群より選ばれた１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする項７記載の核酸分子導入法。
１１．  
非増殖性細胞が神経細胞であることを特徴とする項７記載の核酸分子導入法。
１２．  
さらに、核酸分子送達用担体にリン脂質を含むことを特徴とする項７記載の遺伝子導入法。
１３．  
非増殖性細胞への核酸分子導入キットであって、
カチオン性脂質、及びマンノシッドリピド系糖脂質化合物を含むことを特徴とする核酸分子導入キット。
１４．  
マンノシッドリピド系糖脂質化合物が、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）であることを特徴とする項１３に記載の核酸分子導入キット。
１５．  
マンノシッドリピド系糖脂質化合物が、式（Ｉ）：
【００１１】
【化３】
2007112749.tif 000004
【００１２】
で表されるMEL-A、MEL-B及びMEL-Cからなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする項１３または１４に記載の核酸分子導入キット。
１６．  
カチオン性脂質が、３β［Ｎ−（Ｎ７，Ｎ’−ジメチルアミノ−エタン）−カルバモイル］コレステロール、３β−［Ｎ−（Ｎ‘、２’−ドロキシエチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール、ステアリルアミン、Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ドデシル−Ｄ−グルタメートクロリド、Ｎ−［１−（２，３−オレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテートからなる群より選ばれた１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする項１３記載の核酸分子導入キット。
１７．  
非増殖性細胞が神経細胞であることを特徴とする項１０記載の核酸分子導入キット。
１８．  
さらに、リン脂質を含むことを特徴とする項１３に記載の核酸分子導入キット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、非増殖性細胞に対しても核酸分子、特に遺伝子発現効率に優れた核酸分子送達用担体、及び該核酸分子送達用担体を用いた核酸分子導入方法、及びキットを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の核酸分子送達用担体の一つの好ましい態様はリポソームである。核酸分子送達用担体は、リン脂質、カチオン性脂質、及びマンノシッドリピド系糖脂質化合物から構成される。これらの物質によりミセルが形成される。このミセルに結合する物質としては、遺伝子が好ましいが、これに限定されるものではない。
【００１５】
本発明では、毒性の低いカチオン性脂質としてコレステロール誘導体を用いて作製した核酸分子送達用担体に、さらにマンノシッドリピド系糖脂質化合物であるマンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）を添加することにより、COS細胞やHeLa細胞などの増殖性の細胞以外にも神経細胞のような非増殖性の細胞にも核酸分子の導入及び発現効果があることを見出した。
【００１６】
カチオン性コレステロール誘導体は毒性が低いという利点を有するが、一方、核酸分子送達用担体が固くなり安定性が低く取り扱いしにくいという欠点を有する。本発明では意外にも、MELを添加することで膜流動性が変化し安定性を向上することができ、しかもエンドサイトーシスだけでなく膜融合により細胞内に導入することができるということを見いだした。
【００１７】
本発明で用いられるリン脂質としては特に限定はされないが、例えば１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の他、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、リゾレシチン等の天然リン脂質、或いはこれらを定法により水素添加したもの（例えば水素添加大豆レシチン等）等が挙げられる。好ましくはＤＯＰＥがよい。
【００１８】
本発明で用いられるカチオン性脂質としては特に限定はされないが、例えば３β［Ｎ−（Ｎ７，Ｎ’−ジメチルアミノ−エタン）−カルバモイル］コレステロール（以下「ＤＣ−コレステロール」と記す。）、３β−［Ｎ−（Ｎ‘、２’−ヒドロキシエチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（以下「OH−コレステロール」と記す。）、ステアリルアミン、Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ドデシル−Ｄ−グルタメートクロリド、Ｎ−［１−（２，３−オレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート等が挙げられる。中でも、OH−コレステロールが細胞毒性の低い点から好ましい。
【００１９】
本発明で用いられるＭＥＬとしては特に限定はされないが、例えば、ＭＥＬ−Ａ、ＭＥＬ−Ｂ、ＭＥＬ−Ｃの３種類がある。特に好ましいものは、ＭＥＬ−Ａであり、式（１）
【００２０】
【化４】
2007112749.tif 000005
【００２１】
に対応させれば、マンノースの２位、３位に炭素数８〜１２のアルカノイル基を有し、ＲI、ＲIIがアセチル基である化合物である。
【００２２】
本発明の核酸分子送達用担体の調製は、好ましくは中性脂質ＤＯＰＥ、カチオン性脂質ＤＣ−Ｃｈｏｌ及びＭＥＬを用いて調製すればよい。
中性脂質とカチオン性脂質のモル比は、通常モル比で１０：１〜１０：２０、好ましくは、５：１〜１：１である。ＭＥＬは中性脂質とカチオン性脂質の混合物に対し、通常モル比で、（中性脂質とカチオン性脂質の混合物）：ＭＥＬ＝１０００：１〜０：１であり、好ましくは、５０：１〜１：１、さらに好ましくは５：１の混合物とするのがよい。
【００２３】
核酸分子送達用担体に遺伝子を結合させる方法としては、そのまま懸濁させるか、又は凍結乾燥若しくはスプレードライによって粉末化したものを水、生理食塩液等で再懸濁させればよい。
【００２４】
本発明によって得られた核酸分子送達用担体は、静脈内投与することができる。また、本発明のＭＥＬリポソームは、培養細胞を用いる核酸分子（特に遺伝子）の導入、発現等の研究用試薬としても使用することができる。
【００２５】
本発明の核酸分子送達用担体を含む核酸分子導入キットは、核酸分子送達用担体、懸濁用媒体、容器及び必要に応じて導入用核酸分子を含む。
【００２６】
好ましくは、核酸分子送達用担体は、核酸分子送達用担体懸濁液又は粉末であり、懸濁用媒体は水又はバッファー溶液を用いることができる。
【００２７】
本発明においては、核酸分子としてＤＮＡあるいはＲＮＡあるいはその他の遺伝子を用いることができる。ＤＮＡあるいはＲＮＡは、一本鎖もしくは二本鎖であってよく、また線状、環状等であってもよく、さらに１種類以上のＤＮＡあるいはＲＮＡを同時に用いることもできる。また、ＰＮＡなども用いることができる。
【実施例】
【００２８】
以下の実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、これらに何ら限定されるものではない。
調製例１
（ＭＥＬリポソームの調製）
ＭＥＬリポソームはバンガム法により調製した。すなわち、ＯＨ−Ｃｈｏｌ：L- ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン (DOPE) (アバンチボーラーリピッド社)：マンノシルエリスリトールリピッド(MEL−Ａ)= ３/ ２/ １ (モル比)で各種成分を量りとり、クロロホルム適当量に溶解し、ロータリーエバポレーター(N-1000S. S-W型、東京理化機器株式会社)で留去し、引き続き真空下１時間乾燥した。そこへ、ＰＢＳ4mLを加え、これを水浴型超音波装置(W-220R、本多電子株式会社)を用い約５分間ソニケーションした後、さらにチップ型超音波装置で10分間ソニケーションし0.44μmのフィルターを通した。
（ＭＥＬリポソームと遺伝子との複合体（リポプレックス）の調製）
リポプレックスの作製は電荷比DC-Chol (+) / DNA (-) =1/1で行った。まず、滅菌水に溶解したルシフェラーゼ遺伝子pCMV-luc (pGL3 enhanced Plasmid) (Promega社) 1μgに対し、核酸のアニオンに対するリホ゜ソームのカチオンモル比で１〜４になるようにMELリポソームを添加し、十分に混合し、室温で15分間インキュべートすることにより、複合体を調製した。
［実施例１］神経細胞への遺伝子導入
（神経細胞の培養方法）
ラット副腎髄質褐色細胞腫（ＰＣ１２）は、１０％ＦＢＳ、５％HSを含むDMEM培地で３７℃、５％ＣＯ2 存在下で培養した。また、神経細胞様に分化させる場合は５０ｎｇ／ｍｌのNGF存在下で７日間培養した。神経細胞への分化は神経突起の伸長により確認した。
（神経細胞への遺伝子導入方法）
正電荷リポソームは中性リン脂質、正電荷コレステロール誘導体、バイオサーファクタント（Ｌ-ＣＭＶ）と混合後細胞に加え、無血清培地（ＳＦＭ１０１）中で４時間導入した。導入４０時間後に、遺伝子導入効率を評価した。結果は表１に示した。
（ルシフェラーゼ活性の測定）
MELリポソームを用いた導入遺伝子の活性を評価するためピッカジーン(東洋インキ株式会社)を用いて ルシフェラーゼ活性を測定した。
（ＰＣ１２細胞への遺伝子導入効率の評価）
未分化のＰＣ１２細胞を用いて遺伝子導入効率を評価した結果、MEL-Aを含まないリポソームの場合と比較して、ＭＥＬ-Ａ含有リポソームの方が導入効率が約３倍に増大した。次に、ＰＣ１２をＮＧＦ（ｎｅｒｖｅｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）存在下で７日間培養し、神経様に分化した段階で同様に遺伝子導入を行なった結果、ＭＥＬ-Ａを添加したリポソームでは未添加のものに比べて導入効率が約３倍に増大した。このことは、株化培養神経細胞においてＭＥＬ-Ａが遺伝子導入効率を増大させる作用をもつことを示している。
【００２９】
【表１】
2007112749.tif 000006
【００３０】
［実施例２］上頚神経節の初代培養細胞への蛍光蛋白質ＹＦＰの遺伝子導入
（上頚神経節の初代培養細胞を用いたＭＥＬ-Ａ含有正電荷リポソームによる遺伝子導入）
上頚神経節（ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｓｅｒｖｉｃａｌ  ｇａｎｇｌｉａ ；ＳＣＧ）は、ＣＢＡマウスの新生児から単離した。単離した神経を０．２５％トリプシンを含むハンクス緩衝液中で、３７℃１時間インキュベートした。トリプシン除去後、Ｆ１２培地中でピペッティングして細胞を分散させ、マトリゲルコートしたチャンバーにまき、１０％ＦＣＳ、５０ｎｇ／ｍｌ ＮＧＦ、２μＭ ｃｙｔｏｓｉｎｅ  β-Ｄ-ａｒａｂｉｎｏ-ｆｕｒａｎｏｓｉｄｅを加えたＦ１２培地中で培養した。
【００３１】
遺伝子導入後は、PC-12細胞と同様に行なった。ただし、遺伝子は蛍光蛋白質ＹＦＰ（ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現するｐＥＹＦＰ-Ｎ１を導入した。
ＹＦＰ発現細胞の蛍光画像の取得は、蛍光蛍光共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ５１０；Ｚｅｉｓｓ）を用いて行なった（ｅｘ．４８８ｎｍ，ｅｍ．５１５−５６５ｎｍ）。得られた蛍光画像を画像解析ソフトＮＩＨ  Ｉｍａｇｅを用いて解析した。結果は表２に示した。
【００３２】
【表２】
2007112749.tif 000007
【００３３】
５０個の上頚神経節（ＳＣＧ）細胞について細胞体領域のＹＦＰの蛍光強度を測定し、単位面積あたりの平均蛍光強度を比較した。その結果、ＭＥＬ-Ａ含有リポソームの方がＭＥＬ-Ａを含有しないリポソームに比べて約２．５倍蛍光強度が高くなった。このことは、神経細胞の初代培養系においてもＭＥＬ-Ａが遺伝子導入効率を高める作用をもつことを示している。
［実施例３］上頚神経節の初代培養細胞へのＮＧＦ受容体遺伝子の導入
（上頚神経節へのＮＧＦ受容体遺伝子の導入とその作用）
神経成長因子（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＮＧＦ）の高親和性受容体であるＴｒｋＡをコードするｃＤＮＡをＰＣ１２細胞からＲＴ-ＰＣＲ法により得た。Ｔｒｋ−Ａと蛍光蛋白質ＹＦＰの融合蛋白質を発現するプラスミドを構築後、上と同様の方法で、上頚神経節（ＳＣＧ）に導入した。蛍光画像は、共焦点レーザー顕微鏡を用いて取得し、ＮＩＨ  ｉｍａｇｅを用いて解析した。結果は表３に示した。
【００３４】
【表３】
2007112749.tif 000008
【００３５】
導入４０時間後、細胞を観察した結果、Ｔｒｋ-ＹＦＰの蛍光が観察され、導入遺伝子が発現していることが確認された。また、Ｔｒｋ-ＹＦＰを導入した細胞としなかった細胞についてＳＣＧ細胞の神経突起の長さを測定し、細胞１個あたりの総突起長を比較した結果、Ｔｒｋ-ＹＦＰを導入した細胞で突起の伸長が亢進していることが明らかとなった。このことは、ＭＥＬ-Ａ含有リポソームを用いて導入された蛋白質が初代神経細胞で発現し、正常に機能することを示唆している。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明により、神経細胞のような非増殖性細胞に対しても、細胞毒性が低く遺伝子発現効率に優れた核酸分子送達用担体、及び該核酸分子送達用担体を用いた遺伝子導入方法、及びキットを提供することで、産業界に大きく寄与することが期待される。