(57)【要約】      （修正有）【課題】無細胞翻訳系における遺伝子発現のための方法を提供する。【解決手段】発現される産物をコード付けする遺伝子配列を有するＲＮＡ基質および真核細胞からの翻訳系からなる反応液を培養し、前記発現される産物を任意に前記反応液から分離する、遺伝子発現のための方法。５’‐３’の方向において見られる前記ＲＮＡ基質は、シャイン・ダルガーノ配列、それに連結される第１のスペーサ配列、およびそれに連結される前記遺伝子配列からなる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
そこにおいて、反応液は、発現される発現産物をコード付けする遺伝子配列を有するＲＮＡ基質および真核細胞からの翻訳系からなり、そこにおいて、前記反応液は培養され、そして前記発現産物が任意に前記反応液から分離される無細胞翻訳系における遺伝子発現のための方法であって、５’‐３’の方向において見られる前記ＲＮＡ基質は、シャイン・ダルガーノ配列、それに連結される第１のスペーサ配列、およびそれに連結される前記遺伝子配列からなることにおいて特徴付けられる方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記ＲＮＡ基質の前記５’の部分において、読み取り枠を有するＡＴＧおよび／またはＡＵＧが、前記シャイン・ダルガーノ配列の前に配置されないことにおいて特徴付けられる方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記ＲＮＡ基質の前記ヌクレオチド配列の前記５’末端は、特にビオチン残基において、キャップまたは立体的に保護する群からなることにおいて特徴付けられる方法。
【請求項４】
請求項１から３に記載の方法であって、前記ＲＮＡ基質の前記５’末端および前記シャイン・ダルガーノ配列間で、エンハンサ配列、特にバクテリオファージから生じる５’‐非変換配列（５’ＵＴＲ）が配置されることにおいて特徴付けられる方法。
【請求項５】
請求項１から４に記載の方法であって、前記ＲＮＡ基質の前記５’末端および前記エンハンサ配列間で、ヘアピン構造が配置されることにおいて特徴付けられる方法。
【請求項６】
請求項１から５に記載の方法であって、前記ＲＮＡ基質の前記３’末端は、特にヘアピン構造によってバクテリオファージから生じる転写終了暗号、により形成されることにおいて特徴付けられる方法。
【請求項７】
請求項１から６に記載の方法であって、前記第１のスペーサ配列は、３から１０、好ましくは５から８のヌクレオチドであって、好ましくはピリミジン豊富なヌクレオチドで形成されることにおいて特徴付けられる方法。
【請求項８】
請求項１から７に記載の方法であって、前記遺伝子配列および前記ＲＮＡ基質の前記３’末端間で、好ましくは１０から５０、特に２０から４０のヌクレオチドを有する第２のスペーサ配列が配置されることにおいて特徴付けられる方法。
【請求項９】
請求項１から８に記載の方法であって、前記ＲＮＡ基質は、任意に互いに接近し、前記５’末端から開始する以下の構造要素：ビオチン、任意にヘアピン、任意にエンハンサ配列、シャイン・ダルガーノ配列、第１のスペーサ配列、遺伝子配列、任意に第２のスペーサ配列、転写終了暗号からなることにおいて特徴付けられる方法。
【請求項１０】
請求項１から９に記載の方法であって、前記翻訳系は昆虫細胞から得られたことにおいて特徴付けられる方法。
【請求項１１】
特に請求項１から１０に記載の方法のための無細胞翻訳系の前記遺伝子発現のためのキットであって、以下の構成要素、ａ）  真核細胞、特に昆虫細胞からの翻訳系、ｂ）  シャイン・ダルガーノ配列、それに連結される第１のスペーサ配列、および、それに連結される遺伝子配列、またはそのようなＲＮＡのためのＤＮＡベクトル・コード付けからなる前記５’‐３’方向において見られるＲＮＡ基質、からなるキット。
【請求項１２】
請求項１１に記載のキットであって、前記ＲＮＡ基質の前記５’の部分において、読み取り枠を有するＡＴＧおよび／またはＡＵＧは、前記シャイン・ダルガーノ配列の前に配置されないことにおいて特徴付けられるキット。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載のキットであって、前記ＲＮＡ基質の前記ヌクレオチド配列の前記５’末端は、キャップまたは立体的に保護する群、特にビオチン残基、からなることにおいて特徴付けられるキット。
【請求項１４】
請求項１１から１３の１つに記載のキットであって、前記ＲＮＡ基質の前記５’末端および前記シャイン・ダルガーノ配列間で、エンハンサ配列、特にバクテリオファージから生じる５’‐非変換配列（５’ＵＴＲ）が配置されることにおいて特徴付けられるキット。
【請求項１５】
請求項１１から１４の１つに記載のキットであって、前記ＲＮＡ基質の前記５’末端および前記エンハンサ配列間で、ヘアピン構造が配置されることにおいて特徴付けられるキット。
【請求項１６】
請求項１１から１５の１つに記載のキットであって、前記ＲＮＡ基質の前記３’末端は、バクテリオファージから生じる転写終了暗号、特にヘアピン構造によって形成されることにおいて特徴付けられるキット。
【請求項１７】
請求項１１から１６の１つに記載のキットであって、前記第１のスペーサ配列は、３から１０、好ましくは５から８のヌクレオチド、好ましくはピリミジン豊富なヌクレオチドで形成されることにおいて特徴付けられるキット。
【請求項１８】
請求項１１から１７の１つに記載のキットであって、前記遺伝子配列および前記ＲＮＡ基質の前記３’末端間で、好ましくは１０から５０、特に２０から４０のヌクレオチドを有する第２のスペーサ配列が配置されることにおいて特徴付けられるキット。
【請求項１９】
請求項１１から１８の１つに記載のキットであって、前記ＲＮＡ基質は、前記５’末端から開始する好ましくは直ちに互いに従う以下の構造要素：ビオチン、ヘアピン、任意にエンハンサ配列、シャイン・ダルガーノ配列、第１のスペーサ配列、遺伝子配列、任意に第２のスペーサ配列、転写終了暗号からなることにおいて特徴付けられるキット。
【請求項２０】
請求項１１から１９の１つに記載のキットであって、それが、構成要素ｃ）“エネルギを供給し、前記発現産物の合成のために必要であるアミノ酸、新陳代謝要素”からなる群からの１つまたはそれ以上の物質からなることにおいて特徴付けられるキット。
【請求項２１】
前記５’末端で、立体的に保護する群であるがキャップではない群、シャイン・ダルガーノ配列、および、前記シャイン・ダルガーノ配列の３’末端の遺伝子配列からなるＲＮＡ基質。
【請求項２２】
請求項２１に記載のＲＮＡ基質であって、前記５’末端から開始する好ましくは直ちに互いに従う以下の構造要素：ビオチン、任意にヘアピン、任意にエンハンサ配列、シャイン・ダルガーノ配列、第１のスペーサ配列、遺伝子配列、任意に第２のスペーサ配列、転写終了暗号を有するＲＮＡ基質。
【請求項２３】
請求項２１または２２に記載の前記ＲＮＡのためのＤＮＡコード付け。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無細胞翻訳系における遺伝子発現のための方法に関する。ここにおいて、反応液は、発現される発現産物のためにコード化する遺伝子配列および真核細胞からの翻訳系を有するＲＮＡ基質からなり、ここにおいて、反応液は培養され、発現産物は任意に反応液から分離される。発明はさらに、このような方法を実行するためのキットおよびこのような方法において使われるＲＮＡに関連がある。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の無細胞発現のための方法は、例えば文献ＥＰ ０３１２ ６１７  Ｂ１、ＥＰ ０４０１ ３６９  Ｂ１、および、ＥＰ ０  ５９３  ７５７  Ｂ１から公知である。
それによると、反応器における所望のタンパク質のための核酸鎖のコード付けの他に、転写および／または翻訳のために必要な構成要素が培養され、発現の後、ポリペチド／タンパク質が反応液から分離される。
【０００３】
翻訳のために必要なものと同様に、転写のために必要な構成要素は、例えば３０，０００G遠心分離の後、原核または真核細胞ライセートの上澄液から容易に得ることができる。このいわゆるＳ‐３０の抽出物は、転写および翻訳のために必要なすべての構成要素を含む。
【０００４】
発現は一般に２７℃または３７℃で生じるが、１７℃から４５℃の温度で生じる可能性もある。複雑な第二期/第三期構造が形成されるタンパク質の発現のため、温度の調整は特に推奨される。温度を下げることによって、合成速度は下げられ、したがって、機能している／活性のタンパク質を得るためにタンパク質に正確に折り重なる可能性が提供される。
【０００５】
文献ＥＰ ０３１２ ６１７のＢ１において開示されるタンパク質の無細胞発現のための方法において、タンパク質のための核酸鎖コード付けは、ｍＲＮＡとして反応液に加えられる。このことにより、無細胞系のポリペチドの製造のため、翻訳装置の構成要素のみが、反応器に提供される必要があるエネルギ供給物質として、アミノ酸およびＡＴＰおよびＧＴＰと同様に翻訳、特にリボソーム、開始、伸長、終結因子およびアミノアクリル‐ｔＲＮＡ‐シンセターゼに必要である。続くポリペチド/タンパク質合成において、ポリペチド/タンパク質の他に、例えばＡＤＰ、ＡＭＰ、ＧＤＰ、ＧＭＰおよび無機リン酸塩のような低分子の物質もまた、物質ＡＴＰおよびＧＴＰを供給するエネルギおよびアミノ酸を消費して、形成される。反応を維持するため、翻訳の間に消費される物質は、翻訳の間、外へ案内されることができ、同時に、初期の濃度を維持するため、エネルギ供給物質およびアミノ酸が導かれることができる。
【０００６】
文献ＥＰ ０４０１ ３６９  Ｂ１は、タンパク質のための核酸コード付けが反応液にｍＲＮＡまたはＤＮＡとして加えられることができる方法を開示する。後者は、ＤＮＡが本質的にｍＲＮＡより安定性を有し、ＤＮＡのＲＮＡへの必要な転写過程（適用可能であれば別々に実行される）は、反応の前に必要でないが、ＤＮＡは例えば媒介体または線状の構成物として直接使うことができるという利点を有する。ＤＮＡを用いることによって、無細胞発現系は、前述の翻訳因子の他に、例えばＲＮＡポリメラーゼ、因子およびＲｈｏタンパク質、および、ヌクレオチドＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰおよびＣＴＰのようなＤＮＡのＲＮＡへの転写のために必要な転写因子をさらに含まなければならない。ここでまた、翻訳の間、例えばＡＤＰ、ＡＭＰ、ＧＤＰ、ＧＭＰおよび無機リン酸塩のように転写/翻訳の間消費される低分子の物質が、導き出されることができ、同時に、エネルギ供給物質、ヌクレオチドおよびアミノ酸は、初期の濃度を維持するために導かれることができる。
【０００７】
遺伝子発現のためのさらなる方法は、たとえば文献ＤＥ １０１  ３７  ７９２  Ａ、および、ＤＥ  １０  ２００４  ０３２  ４６０  Ａから公知である。遺伝子発現のためのライセートの製造方法は、文献ＤＥ  １０３  ３６  ７０５  Ａから公知である。
【０００８】
シャイン‐ダルガーノ配列（シャイン  Ｊ．，ダルガーノ，Ｌ．，ネイチャー、２５４（５４９５）：３４‐３８（１９７５）は、リボソームによって検出され、したがって翻訳の開始点をマークする原核生物のｍＲＮＡの部分鎖である。それは一般に、第１のコード付けＡＵＧの５’の側面にあり、主にプリン類から構成されている。その配列は、この生物種に典型的であり、公的にアクセス可能な遺伝子データバンクから、様々な生物種が取られる可能性がある。それに対して、真核生物のＲＮＡは、一般に初期化配列としてコザック配列からなる。昆虫細胞系において、コザック配列はしかし極僅かの重要性しかない。本願明細書において、転写効率は、キンウワバ科バクロウイルスからの５’ＵＴＲのポリヘドリン遺伝子によって相当に増加する（ラミング  Ｋ，クリーガー  Ｊ，ストロットマン  Ｊ，ブクホフ  Ｉ，キュービック  Ｓ、バウムスターク  Ｃ、および、ブリア  Ｈ、１９９３、クローン化および臭気物質リセプタの発現、ネイチャー  ３６１、３５３‐３５６）。
【０００９】
所望のＲＮＡに転写されるＲＮＡまたはＤＮＡが使われる上記の結果から、系によって、真核生物または原核は異なる。タンパク質などの様々な生産者は、異なる理由のために異なる系を好む。これは、原核系と同じく、成熟核の製造に関連がある収量で発現が可能であるように所望される場合、例えば特定のタンパク質の特定の遺伝子製品の合成のため、2つの異なるＲＮＡまたはＤＮＡが生成されなければならず、同じ遺伝子配列が使われることを意味する。これには費用がかかる。
【発明の開示】
【００１０】
本発明の技術的な目的は、原核系においていかなる変更もせずに採用されることができるＲＮＡを使う成熟核系において発現する無細胞遺伝子のための方法を提案することである。
【００１１】
この技術的な目的を達成するため、発明は、上記の生物種の方法を教示し、ここで、シャイン‐ダルガーノ配列、それに好ましくは接近して連結される第１のスペーサ配列、および、それに好ましくは接近して連結される遺伝子配列からなる５‘‐３’方向において見られる（ｍ）ＲＮＡ基質によって特徴付けられる。
【００１２】
発明は、コザック配列を含まず、むしろ初期配列として原核生物に典型的なシャイン・ダルガーノ配列を含む場合でさえも遺伝子発現が、ＲＮＡと共に成熟核系においてと同様に原核系においても可能であるという驚くべき研究結果に基づいている。
【００１３】
発明によって、単一のｍＲＮＡ（またはしたがってＤＮＡコード付け）によって、定義された遺伝子生産物が、原核系または成熟核系のいずれにおいてもユーザの選択によって発現されることが達成される。このことにより、同じ遺伝子であるが異なる系のための異なるＲＮＡまたはＤＮＡの構造は、必要とされない、いわば、両方の系のための普遍的な生産物が得られる。それは、原則として、それぞれの系において発現されることができるすべての遺伝子の使用が可能である。ＤＮＡまたは（ｍ）ＲＮＡとしての所望の遺伝子の配列は、公的にアクセス可能な遺伝子データバンクから取ることができる。
【００１４】
本発明のため、成熟核系における遺伝子発現のためのｍＲＮＡは、代わりに１つまたはそれ以上の以下の原核生物に典型的な要素：５’ＵＴＲ、５’末端（ヘアーピン）での二次構造、シャイン・ダルガーノ配列、および／または、バクテリオファージから生じる転写終了暗号が提供される場合、必ずしも、真核生物に典型的な要素の５’末端キャップ、コザック配列、および、３’末端ポリ（Ａ）最後部からなる必要はないことが明らかにされた。
【００１５】
キャップは、７‐メチルＧＴＰを表し、３つの異なる形状の性質を帯びて発生する：すべてのキャップは、５’末端でリボースへの三リン酸塩結合によって連結される７-メチル・グアニル酸を含む。キャップ０はメチル化されたリボースを有さず、キャップ１で１つの、キャップ２では２つのリボソームがＣ２酸素原子でメチル化される。７‐メチルＧＴＰは、リボソームでのｍＲＮＡの局在定位のために必要とされる。ポリ（Ａ）は、エキソヌクレアーゼによる分解から３’末端を保護する。
【００１６】
好適な実施例において、読み取り枠を有するＡＴＧおよび／またはＡＵＧは、シャイン・ダルガーノ配列の前のＲＮＡ基質の５’部分に配置されない。
【００１７】
原則的に、ＲＮＡの５’末端は変更されない可能性がある。しかしながら、ＲＮＡ基質のヌクレオチド配列の５’末端がキャップの中で形成される、または、ビオチン残基を担持する場合、収量の改良が達成される。
【００１８】
ＲＮＡ基質およびシャイン・ダルガーノ配列の５’末端間において、エンハンサ配列、特にバクテリオファージから生じた５’‐非変換配列（５’ＵＴＲ）が配置される可能性がある。これは、特に原核生物において、特に翻訳速度を増加させるために推奨される。驚くべきことに、さらにエンハンサ配列は成熟核系において妨げられない。
【００１９】
ＲＮＡ基質の５’末端およびエンハンサ配列の間で、ヘアピン構造が配置される可能性がある。これはまた、成熟核系における分解に対する保護のために効果的である。翻訳開始が開始因子のためのキャップの不良な接触性により抑制されるので、自然の効率的に変換された真核生物に典型的なｍＲＮＡは、しかしながら、それらの５’末端で強固な第二期構造を有しない。（ハーシーＪＷＢおよびメリックＷＣ、２０００、タンパク質合成の経路および開始のメカニズム。Ｐ．３３‐８８：遺伝子発現の翻訳調節，編集ソネンバーグ  Ｎ、ハーシーＪＷＢおよびマシューズＭＢ、コールドスプリング・ハーバー・ラボラトリー出版、ニューヨーク）。ＲＮＡ基質の３’末端がバクテリオファージから生じる転写終了暗号、特にヘアピン構造によって形成される場合、対応する考慮は適用される。
【００２０】
第１のスペーサ配列は、３から２０、好ましくは５から１５の好ましくはピリミジン豊富なヌクレオチドであるがプリン類配列でないヌクレオチドで形成される可能性がある。遺伝子配列およびＲＮＡ基質の３’末端の間で、好ましくは１０から５０、特に２０から４０のヌクレオチドの長さを有する第２のスペーサ配列が配置される可能性がある。
【００２１】
詳細には、ＲＮＡ基質は、任意に接近して互いに連続する以下の構造要素からなる可能性がある：５’末端キャップまたはビオチンから開始して、任意にヘアピン、任意にエンハンサ配列、シャイン‐ダルガーノ配列、第１のスペーサ配列、遺伝子配列、任意に第２のスペーサ配列、転写終了暗号。
【００２２】
発明のＲＮＡは、以下のセルまたは細胞系からライセートとして得られた翻訳系において例えば使われる可能性がある：ＢＨＫ２１（ハムスター）、ＭＯＬＴ‐４（ヒト）、ＭＯＰＣ ２１（マウス）、ＲＰＭＩ ８２２６（ヒト）、Ｊｕｒｋａｔ ＦＨＣＲＣ（ヒト）、ＨＬ６０（ヒト）、ＨＥＫ ２９３（ヒト）、ＣＨＯ（ハムスター）、ＨｅＬａ（ヒト）、ＰＣ１２（ラット）、Ｓｆ９（昆虫）、Ｓｆ２１（昆虫）、ＣＯＳ‐１（サル）、ＣＯＳ‐７（サル）、Ｄ２（ショウジョウバエ）、ＮＩＨ ３Ｔ３（マウス）、Ｔｎ５ Ｂｌ‐４（昆虫）およびＴｎ ３６８（昆虫）。さらに、例えばウサギ網状赤血球ライセートまたはコムギ胚ライセートのような動物および野菜由来のライセートが使用されることができる、好適なライセートは、昆虫細胞から得られる。適切なシャイン‐ダルガーノ配列およびエンハンサ配列は、選択された昆虫生物種の一般の遺伝子データバンクから容易に取ることができる。
【００２３】
本発明は、以下の構成要素からなる任意に真核生物または原核の無細胞翻訳系の遺伝子発現のためのキットにさらに関連がある：
ａ）  特定の昆虫細胞における真核細胞からの転写および／または翻訳系
ｂ）  ５‘‐３’方向に見て、シャイン・ダルガーノ配列、それに好ましくは接近して連結される第１のスペーサ配列および、それに好ましくは接近して連結される遺伝子配列、または、このようなＲＮＡのためのＤＮＡコード付けからなるＲＮＡ基質。
【００２４】
キットはさらにまた、ユーザは系のどちらかを選ぶことができる原核細胞からの転写および／または翻訳系からなる可能性がある。ＤＮＡが使われる場合、それぞれの系が必要な転写因子を含むことが理解される。
【００２５】
本発明は、５’末端での立体的な保護群（しかしながらキャップではない）、シャイン・ダルガーノ配列、および、シャイン・ダルガーノ配列の３’末端での遺伝子配列からなる（ｍ）ＲＮＡにさらに関連がある。立体的な保護群として、例えば、以下の構造のうちの１つが使われる可能性がある：
ビオチン・ジゴキシゲニン（フルオレセインのようなフルオロフォア）Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｂｏｄｉｐｙ、Ａｌｅｘａ、Ａｔｔｏ；Ｇｐ４Ｇ ； Ａｐ３Ｇ； Ｇ； ｍ７Ｇｐ４Ｇ； ｍ７ＧＰ３ｍ７Ｇ；ｍ７Ｇｐ４ｍ７Ｇ； ｂｅｎｚ７Ｇｐ３Ｇ ； ｂｅｎｚ７ Ｇｐ４Ｇ； ｂｅｎｓ７，３‘ＯＭｅＧｐ４Ｇ； ｅｔ７Ｇｐ３Ｇ； ｍ７ ， ３’ ＯＭｅＧｐ３Ｇ； ｍ７ ， ３‘ ＯＭｅＧｐ４Ｇ ； ｍ７ ， ２’ ＯＭｅＧｐ４Ｇ ； ｍ７Ｇｐ５Ｇ； ｍ７，３‘ＯｍｅＧｐ５Ｇ； ｍ７，２ｄｅｏｘｙＧｐ３Ｇ； ｍ７，２’ｄｅｏｘｙＧｐ４Ｇ； ｍ７ＧｐＣＨ２ｐｐＧ； ｍ７ＧｐｐＣＨ２ｐＧ；Ｇｐ３Ｇ；ｍ７，３‘ＯｍｅＧｐＣＨ２ｐｐＧ； ３’ＯｍｅＧｐｐＣＨ２ｐＧ；ｍ７，２‘ＯｍｅＧｐｐＣＨ２ｐＧ； ｍ７ＧｐＣＨ２ｐｐｍ７Ｇ．
本発明はさらに、上記したようにさらなる化学基によって変更される可能性があるＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡおよびそこから変更された形状からのオリゴマとのＲＮＡ混成物からなる。
本発明は、発明のＲＮＡのためのＤＮＡコード付けに最終的に関連がある。
【００２６】
ＲＮＡまたはＤＮＡのさらなる特徴に関して、別々にまたはキットで、上記の説明への参照は作成される。
【００２７】
以下では、発明は実行例のみを表す実施例に関して記載される。
【００２８】
例１：発明のｍＲＮＡ
図１は、発明のｍＲＮＡの一般の構造を示す。第１に、ビオチン残基１を見ることができる。その代わり、異なる立体的な保護群、適用可能である場合、キャップとしての７-メチル・グアノシン群もまた提供される可能性がある。それから、ヘアピン構造２およびファージエンハンサ配列３が続く。そして、シャイン・ダルガーノ配列４が続く。主にピリミジン塩基である５から８のヌクレオチドからなる第１のスペーサ配列５によって、発現される遺伝子のためにコード付けされた遺伝子配列６に連結される。それから、実際的には任意であってもよい２０から４０のヌクレオチドを有する第２のスペーサ配列７が続く。また３’末端で、ヘアピン構造８は配置される。
【００２９】
シャイン・ダルガーノ配列の選択は、翻訳系のための基準を表す真核細胞生物種によって生じる。
【００３０】
昆虫生物種の細胞に基づいた発現系における「ウシ属の心臓からの脂肪酸-結合タンパク質」のタンパク質の発現のために例えば適切である特定の配列は、一例として配列Ｓｅｑ．‐ＩＤ １のみにおいて示される。それは、図３において示される媒介カードおよびＳｅｑ．‐ＩＤ ２において示される配列であるプラスミドｐＸＦＡから転写される。所望のタンパク質および所望の発現系だけによって選ばれなければならない他のいかなる遺伝子配列、シャイン・ダルガーノ配列などが使われる可能性があると理解される。
【００３１】
例2：実施例１によるｍＲＮＡの製造。
プラスミドｐＸＦＡ（図３，Ｓｅｑ．‐ＩＤ ２）は、製造業者の説明書に従って制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＰｃｉＩ（ＮＥＢ）で消化された。ここから起こった残りの媒介体（３，１９６ｂｐ）は、切取りプラスミド断片および不完全に消化されたプラスミドからのアガロースゲルにおいて、電気泳動的に分離された。残りの媒介体を有するゲル部分は切取られ、そこからＤＮＡは、製造業者の説明書に従ってゲル溶出によって精製され（高純度なＰＣＲ生産物精製キット，ロシュ）、２６０ｎｍの光吸収によって測光的にＤＮＡ濃度は決定された。
【００３２】
ＤＮＡは、製造業者の説明書に従って、ＥａｓｙＸｐｒｅｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｉｎｓｅｃｔ Ｋｉｔ  （キアゲン）でＲＮＡにおいて、１つの例外を有して転写された：キットのＮＴＰ混合の代わりに、以下の構成要素が、転写反応と称される終濃度と共に使用された：ＡＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰがそれぞれ３．７５ｍＭ、ＧＴＰが１．５ ｍＭ（すべてのロシュ）、および、ビオチンＡｐＧが２ｍＭ（合成の用途、ノクソン社，ベルリン，ドイツ，図２）。
【００３３】
転写の後、反応バッチは、ＤＮＡの脱離のため、０．５μｌ、１０ Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ‐ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅＩ(ロシュ)で反応を起こし、３７℃で３０分間培養した。それから、反応バッチは、キットの精製系によって精製された。精製された転写バッチのＲＮＡ濃度は、２６０ｎｍでの光の吸収によって測光的に決定され、ゲル-電気泳動的に（図５）分析された。
【００３４】
他のｍＲＮＡは、以下の例外を有する上記に言及したように生成された：キットのＮＴＰ混合の代わりに、以下の構成要素が、転写反応と称される終濃度と共に使用された：ＡＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰがそれぞれ３．７５ｍＭ、ＧＴＰが１．５ｍＭ（すべてのロシュ）、および、Ｐ１，Ｐ３‐ジ（グアノシン-５’）三リン酸塩が０．５ｍＭ（カタログＮｏ．ＤＩ０１２，シグマ）。ｍＲＮＡは、実施例2において言及されるようにさらに処理され、ゲル-電気泳動的に分析された（図５）。
【００３５】
例３：成熟核系における例２のタンパク質の発現
製造業者の説明書にしたがってＥａｓｙＸｐｒｅｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｋｉｔ（カタログＮｏ．３２５５２、キアゲン）で実行された無細胞翻訳のため６００ｎＭの終濃度で、最終的な翻訳反応において翻訳反応に関連した実施例２に記載された第１のｍＲＮＡが使用された。加えて、８０ｄｐｍ／ｐｍｏｌのモル活性に達するように、１４Ｃでマークされたバリンが翻訳のために使われた。タンパク質収量は、熱したトリクロロ酢酸に不溶性の放射能でマークされたアミノ酸反応生産物の取込み、および、シンチレーションカウンタ（Ｎｏ．３，図４）の測定によって定量化された。反応液１ｍｌあたり２μｇのタンパク質が得られた。合成されたタンパク質の均一性は、ゲル電気泳動的に分析された（図６）。
【００３６】
例において言及された第２のＲＮＡは上記のように変換され、タンパク質収量は定量化された（Ｎｏ．４，図４）。タンパク質の５．７μｇ／ｍｌの反応液が得られた。合成されたタンパク質の均一性は、ゲル電気泳動的に分析された（図６）。
【００３７】
Ｎｏ．１−２のため、真核生物調整要素（図７，Ｓｅｑ．‐ＩＤ ３）からなるプラスミドｐＩＸ４．０‐ＦＡ‐Ａは、実施例2において示されたように精製された制限酵素ＢｂｓＩおよびＰｃｉＩによって消化され、ＤＮＡ濃度は決定された。ＤＮＡは、例２にて説明されたように転写反応のために使われた。キットのＮＴＰ混合の代わりに、以下の構成要素が、転写反応と称される終濃度と共に使われた：Ｎｏ．１:ＡＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰがそれぞれ３．７５ｍＭ、ＧＴＰが１．５ ｍＭ、キャップが０．５ｍＭ（ｍ７Ｇ（５‘） ｐｐｐ（５’）Ｇ， カタログ Ｎｏ． ８０５０， アンピオン）； Ｎｏ．２：Ｎｏ．５に関しての構成要素。
【００３８】
ｐＩＸ４．０‐ＦＡ‐Ａからプラスミド断片の転写から生じたＲＮＡヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．‐ＩＤ ４において示される。すべてのｍＲＮＡは、ゲル電気泳動的に分析された（図５）。
【００３９】
ここで記載されるすべての転写バッチは、例２の第２の部分にて説明したように翻訳反応のために使われ、それぞれのタンパク質収量は決定された。Ｎｏ．６のために、ＲＮａｓｅ‐ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒがＲＮＡの代わりに使われた。すべてのタンパク質合成反応は、ゲル電気泳動的に分析された（図６）。
【００４０】
例３ａ：哺乳類細胞に基づく成熟核系における例２からのタンパク質の発現
例２に記載される第１のｍＲＮＡが、製造業者の説明書に従ってＴＮＴ網状赤血球溶菌液系で実行される無細胞翻訳のため３００ｎＭの終濃度で、翻訳反応と関連して使われた（カタログＮｏ．Ｌ４ ６１０，プロメガ）。加えて、７０６ｄｐｍ／ｐｍｏｌのモル活性に達するように、１４Ｃでマークされたロイシンが翻訳のために使われた。タンパク質収量は、熱したトリクロロ酢酸に不溶性の放射能でマークされたアミノ酸反応生産物の取込み、および、シンチレーションカウンタ（Ｎｏ．３，図９）の測定によって定量化された。１ｍｌ反応液あたり０．５μｇのタンパク質が得られた。例において言及された第２のｍＲＮＡは上記のように変換され、タンパク質収量は定量化された（Ｎｏ．４，図９）。１ｍｌ反応液あたり０．５６μｇのタンパク質が得られた。
【００４１】
例４：原核系における例２からの第１のタンパク質の発現
翻訳反応に関して、製造業者の説明書に従って大腸菌細胞に基づくｉｎ‐ｖｉｔｒｏ  ＰＢＳ‐Ｋｉｔで実行される無細胞翻訳のための４００ｎＭの終濃度において、ＲＮＡが使われた（カタログＮｏ．Ｐ‐１１０２、ＲｉＮＡ社、ベルリン）。加えて、３．３５ｄｐｍ／ｐｍｏｌのモル活性に達するように、１４Ｃでマークされたバリンが翻訳のために使われた。タンパク質収量は、熱したトリクロロ酢酸に不溶性の放射能でマークされたアミノ酸反応生産物の取込み、および、シンチレーションカウンタ（Ｎｏ．３，図９）の測定によって定量化された。合成されたタンパク質の均一性は、ゲル電気泳動的に分析された（図６）。２００μｇ／ｍｌのタンパク質の反応液が得られた（Ｎｏ．４，図８参照）。
【００４２】
例５：結果
図４は、脂肪酸-結合タンパク質コード付けのための異なるｍＲＮＡコード付けの機能としてタンパク質収量を示す。以下の偏差を有し、中心のｍＲＮＡは例２にて説明したように、生じられた。Ｎｏ．５のため、キットのＮＴＰ混合の代わりに、以下の構成要素が、転写反応と称した終濃度と共に使われた：ＡＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰがそれぞれ３．７５ｍＭ、ＧＴＰが１．５ｍＭ。
【００４３】
図５は、異なるｍＲＮＡの電気泳動的解析を示す。各々のｍＲＮＡの中で、２００ｎｇはアガロースゲルに適用され、ゲルはエチジウムブロミドでの分解後、着色された。トレースの番号は、図４のｍＲＮＡの番号に対応する。Ｒ：ＲＮＡサイズ標準；Ｋ：制御ＲＮＡ。以下のｍＲＮＡが、使われた（トラック番号）：
Ｎｏ．１：キャップを有する真核生物-典型的なｍＲＮＡ、効果的な昆虫に典型的な５’ＵＴＲ、バキュロウィルス・ポリヘドリン遺伝子および３’末端でのポリ（Ａ）配列。
Ｎｏ．２：キャップのないＮｏ．１に記載のｍＲＮＡ。
【００４４】
Ｎｏ．３：キャップがなく、代わりに５’末端でのビオチンで、昆虫に典型的な５’ＵＴＲおよびコザック配列なしで、代わりに原核生物に典型的な５’ＵＴＲおよび５’末端での強固な第二構造で、３’末端でのポリ（Ａ）配列がなく、代わりに原核生物に典型的な３’ＵＴＲで３’末端でのＴ７ページ転写終了暗号を有する発明のｍＲＮＡ。
【００４５】
Ｎｏ．４：キャップがなく、代わりに５’末端でのＰｌ，Ｐ３‐Ｄｉ（グアノシン‐５’）三リン酸塩で、昆虫に典型的な５’ＵＴＲおよびコザック配列なしで、代わりに原核生物に典型的な５’ＵＴＲおよび強固な第二構造で、３’ポリ（Ａ）配列がなく、代わりに原核生物に典型的な３’ＵＴＲで３’末端でのＴ７ページ転写終了暗号を有するＮｏ．３に記載の発明のｍＲＮＡ。
【００４６】
Ｎｏ．５：ビオチンのないＮｏ．３に記載のｍＲＮＡ。
Ｎｏ．６：ｍＲＮＡなし。
【００４７】
図６は、異なるｍＲＮＡから始まった合成されたタンパク質の均一性の電気泳動的解析を示す。
【００４８】
例３および４に記載されるタンパク質合成バッチは、ＳＤＳポリ-アクリルアミドゲルにおいて分離され、ゲルのオートラジオグラムは決定された。ｅ：成熟核系における発現、Ｐ：原核系における発現。数は、図４の番号に対応する。Ｍ１：マーカータンパク質、Ｍ２：非放射性マーカータンパク質（オートラジオグラムにおいて見えない）。
【００４９】
図4から分かるように、脂肪酸-結合タンパク質の高収率は、シャイン・ダルガーノ配列なしで、５’末端でキャップを有し、昆虫に典型的な５’ＵＴＲおよび３’末端でのポリ（Ａ）配列（Ｎｏ．１）を有する真核生物に典型的なｍＲＮＡと比較して、発明のｍＲＮＡと共に、５’末端でのシャイン‐ダルガーノ配列および強固な第二構造で、５’末端でキャップなしで、コザック配列なしで、翻訳を効率的に増加させる昆虫に典型的な５’ＵＴＲなしで、および、３’末端でポリ（Ａ）配列なしで（Ｎｏ．３および４）、２または５．７μｇ／ｍｌで使用された真核生物無細胞翻訳系において達成される。
【００５０】
さらに、５’末端で変更のない真核生物に典型的なｍＲＮＡ（Ｎｏ．５）は、少しの効率だけで変換される。これは、このｍＲＮＡのための発現強度がキャップの存在に強く依存することを示す。それに対して、５’末端で変更のない原核生物に典型的なｍＲＮＡ（No.５）は、約２倍効率的に変換され、キャップがないが、５’末端でビオチンを有する原核生物に典型的なｍＲＮＡ（Ｎｏ．３）は、約3倍効率的であり、キャップがないが、５’末端でＰ１，Ｐ３ジ（グアノシン‐５’）三リン酸塩（Ｎｏ．４）を有する原核生物に典型的なｍＲＮＡは、約１０倍効率的である。
【００５１】
図６は、合成された脂肪酸-結合タンパク質（１４．８ｋＤａ）が予想される分子量によって検出されることを示す。真核生物に典型的なｍＲＮＡのため、合成されたタンパク質は、3つのバンド（トラックｅ１）の形で検出される。それに対して、発明のｍＲＮＡが、成熟核のおよび原核タンパク質合成系においてタンパク質合成のための基質として使われる場合、タンパク質は１つのバンドの形で本質的に現れる（トラックｅ３、ｅ４、ｐ３およびｐ４）。
【００５２】
図８は、脂肪酸結合タンパク質のための異なるｍＲＮＡコード付けの機能としての原核系におけるタンパク質収量を示す。ｍＲＮＡ（Ｎｏ．３）のおよび比較ｍＲＮＡ（Ｎｏ．１、５および６）の製造のため、参照は、図４および付随する文において作成される。図8から分かるように、発明（Ｎｏ．３）のｍＲＮＡは、脂肪酸結合タンパク質２００μg／ｍｌ収量できわめて効率的に変換される。タンパク質収量は、５’末端（Ｎｏ．４）でビオチンを含まないこの系のための標準ｍＲＮＡと実際には同じである。それに対比して、昆虫特定の５’ＵＴＲおよび３’末端でのポリ（Ａ）配列（Ｎｏ．１）と共に、５’末端でキャップを有する真核生物に典型的なｍＲＮＡは、実際には全く変換されない。これは、系が原核生物に典型的な要素を有するｍＲＮＡのために特定のあり、５’末端での原核ｍＲＮＡの修飾は転写効率に影響を有しないことを示す。
【００５３】
実施例３ａの結果を示す図９から分かるように、高収率の脂肪酸結合タンパク質は、シャイン・ダルガーノ配列、および、５’末端でキャップなしで、コザック配列なしで、翻訳を効率的に増加させる哺乳類細胞に特定の５’ＵＴＲなしで、および、３’末端でポリ（Ａ）配列（Ｎｏ．３、４および５）なしで、０．５０、０．５６または０．５９μｇ／ｍｌで、真核生物に典型的なｍＲＮＡ（Ｎｏ．１）と比較して５’末端での強固な第二構造を有し発明によって、ｍＲＮＡを有する哺乳類細胞に基づいて使用された真核生物無細胞翻訳系において達成される。  
【００５４】
さらに、修飾なしの５’末端での真核生物に典型的なｍＲＮＡ（Ｎｏ．２）は、少ない効率のみによって変換される。これは、このｍＲＮＡのための発現強度がキャップの存在に強く依存することを示す。それに対比して、ａ）  ５’末端での修飾なしで（Ｎｏ．５）、ｂ）  キャップなしで、しかしながら５’末端でビオチン（Ｎｏ．３）を有して、および／または、ｃ）  キャップなしで、しかしながら５’末端でＰ１、Ｐ３-Ｄｉ（グアノシン５）三リン酸塩（Ｎｏ． ４）を有して発明の原核生物に典型的なｍＲＮＡは、５’末端での修飾なしで真核生物に典型的なｍＲＮＡの約２倍効率的に変換される。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】発明のｍＲＮＡの一般の構造を示す。
【図２】化学式を示す。
【図３】媒介カードを示す。
【図４】脂肪酸-結合タンパク質コード付けのための異なるｍＲＮＡコード付けの機能としてタンパク質収量を示す。
【図５】異なるｍＲＮＡの電気泳動的解析を示す。
【図６】異なるｍＲＮＡから始まった合成されたタンパク質の均一性の電気泳動的解析を示す。
【図７】真核生物調整要素を示す。
【図８】脂肪酸結合タンパク質のための異なるｍＲＮＡコード付けの機能としての原核系におけるタンパク質収量を示す。
【図９】縦軸をＦＡＢＰ合成［μｇ／ｍｌ］、横軸を使用済みのｍＲＮＡとするグラフを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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