(57)【要約】      （修正有）【課題】正常な稔性を有し、かつ実用的である閉花受粉性植物の作出および選抜法を提供する。【解決手段】植物体に閉花受粉性を付与するポリペプチドである、クラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質のアミノ酸配列の第４５位のアミノ酸が親水性アミノ酸に置換されているアミノ酸配列；または、上記アミノ酸配列の第４５位以外の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、および当該ポリペプチドと特異的に結合する抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物体に閉花受粉性を付与するポリペプチドであって、
（Ａ）クラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質の第４５位のアミノ酸が親水性アミノ酸に置換されているポリペプチド；または
（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列の第４５位以外の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたポリペプチド。
【請求項２】
前記親水性アミノ酸がトレオニンであることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１に記載のポリペプチドを発現していることを特徴とする植物体。
【請求項５】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを発現していることを特徴とする植物体。
【請求項６】
閉花受粉性が付与された植物体を作製する方法であって、
（Ｉ）クラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質をコードする遺伝子に対して、該タンパク質の第４５位のアミノ酸置換に対応する変異を誘導する工程；
（ＩＩ）クラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質をコードする遺伝子において、該タンパク質の第４５位のアミノ酸置換を誘導する変異を有する遺伝子を植物体に導入する工程；または
（ＩＩＩ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド以外のクラスＢ  ＭＡＤＳボックス遺伝子の発現を抑制する工程
のいずれかを包含することを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを備えていることを特徴とする閉花受粉性が付与された植物体を作製するためのキット。
【請求項８】
請求項３に記載のポリヌクレオチドのフラグメントまたはその相補配列を含むことを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
請求項８に記載のオリゴヌクレオチドを目的の植物体由来のｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程を包含することを特徴とする閉花受粉性が付与された植物体をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
請求項８に記載のオリゴヌクレオチドを備えていることを特徴とする閉花受粉性が付与された植物体をスクリーニングするためのキット。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドと特異的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項１２】
請求項１１に記載の抗体を目的の植物体由来の組織抽出物とインキュベートする工程を包含することを特徴とする閉花受粉性が付与された植物体をスクリーニングする方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の抗体を備えていることを特徴とする閉花受粉性が付与された植物体をスクリーニングするためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、実用的なイネの組換え体作出に有用な母本の作出法に関するものであり、より詳細には、植物体に閉花受粉性を付与するタンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子ならびにこれらの利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え作物は多大な可能性を秘めているので、実用化が望まれている。しかし、環境などへの長期的な影響の評価が定まっていないことを理由に、近縁野生種または同種栽培作物との交雑による遺伝子拡散に対する強い懸念が生産者および消費者に存在し、その結果、実用化が困難となっている。環境などに対する長期的な影響評価が定まるまでは、予防原則論的な見地に立ち、遺伝子拡散防止などにより安全性を確保することが求められている。
【０００３】
イネは、一般に、高頻度で自家受粉する植物であるが、開花後に外部に花粉を飛散させるので、低頻度ではあるものの他家受粉も生じ得る。野外栽培の際に、花粉の飛散による組換え体と周辺の野生植物または同種作物との間での交雑が生じないようにするために、周辺植物との栽培距離を確保するか、または栽培時期を調整する（例えば、開花時期をずらすなど）ことが必要とされている。これらの方法が不可能な場合は、摘花、除雄、花への袋がけ、防風ネットの設置などが行われている。しかし、いずれの場合も多大な労力を必要とするので、イネにおいても花粉飛散防止技術の開発が望まれている。
【０００４】
組換え植物からの花粉飛散による遺伝子拡散を防止する技術として、葉緑体形質転換法による母性遺伝の利用、無配偶生殖（ａｐｏｍｉｘｉｓ）、雄性不稔などが提唱されている。しかし、イネでは、葉緑体形質転換法、無配偶生殖が未だ実用化に至っていない。また、雄性不稔イネは存在するが、種子を収穫するためには人工的な授粉が必要とされるので実用的ではない。
【０００５】
花粉の飛散を防止するさらなる技術として、閉花受粉が知られている。オオムギにおいては、閉花受粉性の品種を用いた遺伝解析が行われている（例えば、特許文献１および非特許文献１を参照のこと）。オオムギにおける研究に基づけば、閉花受粉性の品種が存在し、遺伝解析に基づけば、閉花受粉性が少数の遺伝子に支配されていることが明らかにされている。
【０００６】
閉花受粉性イネについては、これまでにいくつかの報告がなされている（例えば、非特許文献２および３を参照のこと）。また、閉花受粉性に類似した形質を有するものとして、「穂不抽出性イネ」が報告されている（例えば、非特許文献４を参照のこと）。他に、花器官の形態的変異により閉花性となったイネについても、いくつかの報告がなされている（非特許文献５および６を参照のこと）。
【特許文献１】特開２００５−２２９８５４公報（平成１７年９月２日公開）
【非特許文献１】Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  １０９，４８０−７（２００４）
【非特許文献２】Ｊ  Ｆａｃ  Ａｇｒｉｃ  Ｈｏｋｋａｉｄｏ  Ｕｎｉｖ．５３，７２−１３０（１９６３）
【非特許文献３】Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５０，４１９−４２０（１９８１）
【非特許文献４】Ｒｉｃｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ  ３，６２−６３（１９８６）
【非特許文献５】Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３０，７０５−７１８（２００３）
【非特許文献６】Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４３，１３０−１３５（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これまでに報告されている閉花受粉性イネとして、「閉穎大黒（ｄ７）」突然変異体は、原因遺伝子の多面的発現によって他の生育障害（例えば、矮性および短粒など）を伴うと推定され、「Ｄｈｕｎｄｈｕｎｉ」は閉花受粉性の遺伝様式が複雑である（関与遺伝子の数が多く、母性遺伝も関与する）と推定されており、これらはいずれも交配母本としての利用は困難である、
「穂不抽出性イネ」では、穂が止葉の葉鞘に包まれているので、登熟後に病害に侵される危険性、および収穫作業の繁雑化が想定され、これもまた実用的ではない。
【０００８】
開花を引き起こす駆動力として機能する花器官「鱗被」（双子葉植物の花弁に相当）の形態変異によって閉花性を示すイネとして、ｓｕｐｅｒｗｏｍａｎ１（ｓｐｗ１）変異体、Ａｃｔ：：ＯｓＭＡＤＳ３組換え体などが報告されている。しかし、これらは雄蕊に変異が生じ、激しい不稔を伴うので、実用的ではない。
【０００９】
このように、花粉の飛散を防止し得る閉花受粉性（ｃｌｅｉｓｔｏｇａｍｙ）を有している栽培品種の開発が望まれているが、日本のイネにおいては閉花受粉性の実用品種は存在しない。また、閉花受粉性を付与する遺伝子本体が存在するのか、また、どのような機序に基づいて閉花受粉性が制御されているのかについては、不明であった。
【００１０】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、正常な稔性を有し、草型、出穂性などの農業形質における変異を伴わない実用的な閉花受粉性植物を作出および選抜する技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、日本型イネ品種「台中６５号」を原品種として、化学変異源物質Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ（ＭＮＵ）によって誘発された突然変異体集団から、唯一の閉花受粉性イネ突然変異体ｓｕｐｅｒｗｏｍａｎ１−ｃｌｅｉｓｔｏｇａｍｙ（ｓｐｗ１−ｃｌｓ）を得た。具体的には、上記集団から（１）開花時期に雄蕊を穎の外に抽出しない突然変異体系統を選抜し、（２）その中から正常に稔実する系統を選抜した。さらに、イネｓｐｗ１−ｃｌｓ変異体についてマップベースクローニング法を行うことにより、閉花受粉性がクラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質であるＳＵＰＥＲＷＯＭＡＮ１（ＳＰＷ１）をコードする遺伝子における変異によって引き起こされたものであることを明らかにし、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明に係るポリペプチドは、植物体に閉花受粉性を付与するポリペプチドであって、（Ａ）クラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質の第４５位のアミノ酸が親水性アミノ酸に置換されているポリペプチド；または、（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列の第４５位以外の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたポリペプチド、であることを特徴としている。
【００１３】
本発明に係るポリペプチドは、植物体に閉花受粉性を付与し得る。ｓｕｐｅｒｗｏｍａｎ１（ｓｐｗ１）変異体が、雄蕊に変異が生じ、激しい不稔を伴うこと（非特許文献５を参照のこと）に鑑みれば、ＳＰＷ１において１つのアミノ酸を置換することにより植物体に閉花受粉性を付与し得るということは、全く予想し得ないことであった。
【００１４】
本発明に係るポリペプチドは、植物体に閉花受粉性を付与するポリペプチドであって、（Ａ）単子葉植物のクラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質の第４５位のアミノ酸が親水性アミノ酸に置換されているポリペプチド；または、（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列の第４５位以外の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されているポリペプチド、であってもよい。
【００１５】
本発明に係るポリペプチドは、植物体に閉花受粉性を付与するポリペプチドであって、（Ａ）配列番号１、６、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０に示されるアミノ酸配列の第４５位のアミノ酸が親水性アミノ酸に置換されているアミノ酸配列；または、（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列の第４５位以外の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列、からなるポリペプチドであってもよい。
【００１６】
本発明に係るポリペプチドは、植物体に閉花受粉性を付与するポリペプチドであって、（Ａ）配列番号１、６または８に示されるアミノ酸配列の第４５位のアミノ酸が親水性アミノ酸に置換されているアミノ酸配列；または、（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列の第４５位以外の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列、からなるポリペプチドであってもよい。
【００１７】
本発明に係るポリペプチドにおいて、上記親水性アミノ酸はトレオニンであることが好ましい。
【００１８】
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記のポリペプチドをコードすることを特徴としている。
【００１９】
本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得かつ植物体に閉花受粉性を付与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、であってもよい。
【００２０】
本発明に係る植物体は、上記のポリペプチドを発現していることを特徴としている。
【００２１】
本発明に係る植物体は、上記のポリヌクレオチドを発現していることを特徴としている。
【００２２】
本発明に係る植物体作製方法は、閉花受粉性が付与された植物体を作製する方法であって、（Ｉ）クラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質をコードする遺伝子に対して、該タンパク質の第４５位のアミノ酸置換に対応する変異を誘導する工程；（ＩＩ）クラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質をコードする遺伝子において、該タンパク質の第４５位のアミノ酸置換を誘導する変異を有する遺伝子を植物体に導入する工程；または、（ＩＩＩ）ＳＰＷ１（配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）以外のクラスＢ  ＭＡＤＳボックス遺伝子の発現を抑制する工程、のいずれかを包含することを特徴としている。
【００２３】
本発明に係る植物体作製キットは、閉花受粉性が付与された植物体を作製するためのキットであって上記のポリヌクレオチドを備えていることを特徴としている。
【００２４】
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、上記のポリヌクレオチドのフラグメントまたはその相補配列を含むことを特徴としている。
【００２５】
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、配列番号２３に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００２６】
本発明に係るオリゴヌクレオチドセットは、上記のポリヌクレオチドのフラグメントまたはその相補配列を含む、一組のオリゴヌクレオチドを含んでいることを特徴としている。
【００２７】
本発明に係るオリゴヌクレオチドセットは、配列番号２２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号２３に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含んでいることを特徴としている。
【００２８】
本発明に係るスクリーニング方法は、閉花受粉性が付与された植物体をスクリーニングする方法であって、上記のオリゴヌクレオチドを目的の植物体由来のｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程を包含することを特徴としている。
【００２９】
本発明に係るスクリーニング方法は、閉花受粉性が付与された植物体をスクリーニングする方法であって、配列番号２３に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを目的の植物体由来のｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程を包含することを特徴としている。
【００３０】
本発明に係るスクリーニング方法は、配列番号２２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを目的の植物体由来のｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程をさらに包含することが好ましい。
【００３１】
本発明に係るスクリーニングキットは、閉花受粉性が付与された植物体をスクリーニングするキットであって、上記のオリゴヌクレオチドを備えていることを特徴としている。
【００３２】
本発明に係るスクリーニングキットは、閉花受粉性が付与された植物体をスクリーニングするキットであって、配列番号２３に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを備えていることを特徴としている。
【００３３】
本発明に係るスクリーニングキットは、配列番号２２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをさらに備えていることが好ましい。
【００３４】
本発明に係る抗体は、上記のポリペプチドと特異的に結合することを特徴としている。
【００３５】
本発明に係るスクリーニング方法は、閉花受粉性が付与された植物体をスクリーニングする方法であって、上記の抗体を目的の植物体由来の組織抽出物とインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００３６】
本発明に係るスクリーニングキットは、閉花受粉性が付与された植物体をスクリーニングするキットであって、上記の抗体を備えていることを特徴としている。
【発明の効果】
【００３７】
本発明を用いれば、閉花受粉性が付与された植物体を容易に作製することができる。また、本発明を用いれば、閉花受粉性を有している植物体を容易にスクリーニングすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
〔１：ポリペプチドおよびポリヌクレオチド〕
〔１−１〕ポリペプチド
本発明は、植物体に閉花受粉性を付与するポリペプチドを提供する。本発明に係るポリペプチドは、植物におけるクラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質の第４５位のアミノ酸が親水性アミノ酸に置換されているポリペプチドまたはその変異体であることを特徴としている。上記植物は、好ましくは単子葉植物であり、より好ましくはイネ科植物（例えば、イネ、オオムギ、コムギ、ライムギ、エンバク、キビ、アワ、モロコシなど）であり、最も好ましくは、イネ、オオムギまたはコムギである。
【００３９】
植物におけるクラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質はＡＰ３型とＰＩ型とに分類される。ＡＰ３型としては、イネのＳＰＷ１（配列番号１）、オオムギのＨｖＡＰ３（配列番号１０）、コムギのＴａＭＡＤＳ＃５１（配列番号１４）およびＴａＭＡＤＳ＃８２（配列番号１６）が挙げられ、ＰＩ型としてはイネのＯｓＭＡＤＳ２（配列番号６）およびＯｓＭＡＤＳ４（配列番号８）、オオムギのＨｖＰＩ（配列番号１２）、コムギのＷＰＩ１（配列番号１８）およびＷＰＩ２（配列番号２０）が挙げられるが、植物におけるクラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質はこれらに限定されない。なお、これらのタンパク質に対するｃＤＮＡ配列を、配列番号２（イネのＳＰＷ１）、配列番号１１（オオムギのＨｖＡＰ３）、配列番号１５（コムギのＴａＭＡＤＳ＃５１）、配列番号１７（ＴａＭＡＤＳ＃８２）、配列番号７（イネのＯｓＭＡＤＳ２）、配列番号９（ＯｓＭＡＤＳ４）、配列番号１３（オオムギのＨｖＰＩ）、配列番号１９（コムギのＷＰＩ１）および配列番号２１（ＷＰＩ２）に示す。
【００４０】
本発明に係るポリペプチドは、このようなクラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質の第４５位のアミノ酸が親水性アミノ酸に置換されていることを特徴としている。本発明者らが作出した植物体において、イネのクラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質であるＳＵＰＥＲＷＯＭＡＮ１（ＳＰＷ１）タンパク質において第４５位のアミノ酸がイソロイシンからトレオニンに置換されていたが（配列番号４）、本発明に係るポリペプチドにおける第４５位のアミノ酸置換はこれに限定されない。なお、トレオニン以外の親水性アミノ酸としては、グリシン、セリン、システイン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジンが挙げられる。ｓｕｐｅｒｗｏｍａｎ１（ｓｐｗ１）変異体（非特許文献５を参照のこと）が、雄蕊に変異が生じ、激しい不稔を伴うことに鑑みれば、ＳＰＷ１において１つのアミノ酸を置換することにより植物体に閉花受粉性を付与し得るということは、全く予想し得ないことである。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。
【００４２】
本発明に係るポリペプチドは、その天然の環境から取り出されたネイティブなポリペプチドであっても、宿主細胞中で発現されかつ任意の適切な技術によって実質的に精製されている組換えのポリペプチドであってもよい。
【００４３】
また、本発明に係るポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇなどの当該分野において周知のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。
【００４４】
本明細書中においてポリペプチドまたはタンパク質に関して用いられる場合、用語「変異体」は、植物体に閉花受粉性を付与する活性を有するポリペプチドが意図される。このような変異体は、１個以上のアミノ酸が欠失、挿入、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが好ましく、より好ましくは、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり得る。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しないので、さらに好ましい。
【００４５】
本発明に係るポリペプチドにおいて、好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または付加を有し得る。これらは、本発明に係るポリペプチドの、植物体に閉花受粉性を付与する活性を変化させない。ポリペプチドを構成するアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在し得ることもまた周知である。また、当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができ、本明細書に記載されている手法に従えば、作製した変異体が所望の活性を有するか否かを容易に決定し得る。
【００４６】
このように、本実施形態に係るポリペプチドは、植物体に閉花受粉性を付与する活性を有するポリペプチドであって、クラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質の第４５位のアミノ酸が親水性アミノ酸に置換されているポリペプチドまたはその変異体であることを特徴としており、一実施形態において、本実施形態に係るポリペプチドは、（Ａ）配列番号１、６、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０に示されるアミノ酸配列の第４５位のアミノ酸が親水性アミノ酸に置換されているアミノ酸配列；または、（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列の第４５位以外の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、からなるポリペプチドであり得る。さらなる実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、（Ｃ）配列番号１、６もしくは８に示されるアミノ酸配列の第４５位のアミノ酸が親水性アミノ酸に置換されているアミノ酸配列；または、（Ｄ）上記（Ｃ）のアミノ酸配列の第４５位以外の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、からなるポリペプチドであり得る。
【００４７】
〔１−２〕ポリヌクレオチド
本発明はまた、植物体に閉花受粉性を付与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、植物におけるクラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質の第４５位のアミノ酸が親水性アミノ酸に置換されているポリペプチドまたはその変異体をコードすることを特徴としている。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「ＤＮＡ配列」、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用される。
【００４９】
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態で存在し得る。ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【００５０】
１つの局面において、本実施形態に係るポリヌクレオチドは、配列番号２に示される塩基配列の第３４８位または３４９位の塩基が置換されてなるポリヌクレオチドまたはその変異体であり得る。配列番号２に示される塩基配列の第３４８位または第３４９位の塩基が置換されていることにより、コードされるポリペプチドの第４５位のアミノ酸は、疎水性アミノ酸から親水性アミノ酸に置換されている。好ましくは、本実施形態に係るポリヌクレオチドは、配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその変異体であり得る。
【００５１】
本明細書中においてＤＮＡまたはポリヌクレオチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、植物体に閉花受粉性を付与する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意図され、「配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの変異体」は、配列番号５に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド；あるいは、配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであることが意図される。
【００５２】
ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなり）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、「ストリンジェントな」ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０ｎｔより長いポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。このようなポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）は、本明細書中においてより詳細に考察されるようなプローブ（プライマーを含む。）としても有用である。
【００５４】
本発明に係るポリヌクレオチドはまた、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。
【００５５】
このように、本実施形態に係るポリヌクレオチドは、植物体に閉花受粉性を付与する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、植物におけるクラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質の第４５位のアミノ酸が親水性アミノ酸に置換されているポリペプチドまたはその変異体をコードすることを特徴としている。１つの局面において、本発明に係るポリヌクレオチドは、植物体に閉花受粉性を付与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、（Ａ）配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；（Ｂ）上記（Ａ）の塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換もしくは付加されてなるポリヌクレオチド；または（Ｃ）上記（Ａ）のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチド、であり得る。なお、配列番号５に示される塩基配列を例にして本発明に係るポリヌクレオチドを説明したが、本発明に係るポリヌクレオチドがこれに限定されないことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【００５６】
〔２：本発明に係るポリペプチドの利用〕
〔２−１〕閉花受粉性が付与された植物体およびその作出方法
１つの局面において、本発明は、本発明に係るポリペプチドを発現している植物体を提供する。他の局面において、本発明は、本発明に係るポリヌクレオチドを発現している植物体を提供する。
【００５７】
一実施形態において、本発明に係る植物体は、ｓｐｗ１−ｃｌｓ型変異を有していない植物体にｓｐｗ１−ｃｌｓ型変異を導入することにより作製され得る。なお、本明細書中において、クラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質における第４５位のアミノ酸の親水性アミノ酸への置換および該タンパク質をコードする遺伝子における該アミノ酸置換に対応する塩基置換を、必要に応じて「ｓｐｗ１−ｃｌｓ型変異」と称し、該置換によって閉花受粉性が付与された植物体を「ｓｐｗ１−ｃｌｓ型変異体」と称する。なお、クラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質の第４５位付近が主に疎水性アミノ酸から構成されていることに鑑みれば、第４５位以外の疎水性アミノ酸を親水性アミノ酸に置換することによって得られた変異体もまたｓｐｗ１−ｃｌｓ型変異体として本発明の範囲内に包含されるべきである。
【００５８】
すなわち、本実施形態に係る植物体の作製方法は、植物体において本発明に係るポリペプチドを発現させる工程を包含することを特徴としている。植物体において本発明に係るポリペプチドを発現させる工程は、植物体へｓｐｗ１−ｃｌｓ型変異を導入する工程であることが好ましい。植物体へのｓｐｗ１−ｃｌｓ型変異の導入工程は、
（Ｉ）クラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質をコードする遺伝子に対して、該タンパク質の第４５位のアミノ酸置換に対応する変異を誘導する工程；または
（ＩＩ）クラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質をコードする遺伝子において、該タンパク質の第４５位のアミノ酸置換を誘導する変異を有する遺伝子を植物体に導入する工程
であり得る。すなわち、（Ｉ）は、本発明に係るポリヌクレオチドを植物体内において生成する工程であり、（ＩＩ）は、本発明に係るポリヌクレオチドを植物体に導入する工程である。なお、（Ｉ）としては、（ｉ）ジーンターゲティングによるｓｐｗ１−ｃｌｓ型変異の導入、または（ｉｉ）突然変異源処理によるｓｐｗ１−ｃｌｓ型変異の導入、が挙げられるが、これらに限定されない。（ＩＩ）としては、（ｉｉｉ）ｓｐｗ１−ｃｌｓ型変異遺伝子の導入、または（ｉｖ）交配によるｓｐｗ１−ｃｌｓ型変異の導入、が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
（ｉ）ジーンターゲティングによるｓｐｗ１−ｃｌｓ型変異の導入
当該分野において周知の技術（例えば、ジーンターゲティング法（Ｔｅｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２），Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｂｙ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｉｃｅ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０（１０）：１０３０−４））を用いて目的のアミノ酸位またはその付近に１または数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたクラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質変異体を作製することにより、閉花受粉性植物を作出することができる。
【００６０】
（ｉｉ）突然変異源物質での処理によるｓｐｗ１−ｃｌｓ型変異の導入
目的の植物を突然変異源物質で処理してクラスＢ  ＭＡＤＳボックス遺伝子座に変異を生じさせることにより、閉花受粉性植物を作出することができる。本発明者は、日本型イネ品種「台中６５号」を化学変異源物質Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ（ＭＮＵ）で処理して突然変異体集団を得、該集団から開花時期に雄蕊を穎の外に抽出しない突然変異体系統を選抜し、選抜された系統から正常に稔実する系統をさらに選抜することにより、閉花受粉性イネ突然変異体ｓｕｐｅｒｗｏｍａｎ１−ｃｌｅｉｓｔｏｇａｍｙ（ｓｐｗ１−ｃｌｓ）を得た。さらに、マップベースクローニング法により、ＳＵＰＥＲＷＯＭＡＮ１（ＳＰＷ１）遺伝子の変異を確認した。なお、当業者は、当該分野において周知の突然変異原物質を必要に応じて適宜選択し得る。
【００６１】
（ｉｉｉ）ｓｐｗ１−ｃｌｓ型変異遺伝子の導入
実施例にて後述するように、ｓｐｗ１−ｃｌｓ型変異を有するゲノムＤＮＡ断片を、クラスＢ  ＭＡＤＳボックス遺伝子の機能欠失型変異体（例えば、ｓｐｗ１−１、ｓｐｗ１−２など）に導入することにより、閉花受粉性植物を作出することができる。なお、当業者は、当該分野における技術常識に従って、遺伝子を首尾よく植物に導入して、その遺伝子を構成的または組織特異的に発現させることができる。
【００６２】
（ｉｖ）交配によるｓｐｗ１−ｃｌｓ型変異の導入
閉花受粉性を付与したい品種を、上述したように作製したｓｐｗ１−ｃｌｓ型の変異体と交配させ、その後代のうちｓｐｗ１−ｃｌｓ型変異をホモに有するものを選抜することにより、閉花受粉性植物を作出することができる。
【００６３】
他の実施形態において、本発明に係る植物体は、ｓｐｗ１−ｃｌｓ型変異を有していない植物体においてＳＰＷ１以外のクラスＢ  ＭＡＤＳボックス遺伝子の発現を抑制することにより作製され得る。具体的には、実施例にて後述するように、ＳＰＷ１以外のクラスＢ  ＭＡＤＳボックス遺伝子のうち、鱗被で特異的に作用するもの（例えば、ＯｓＭＡＤＳ２）の発現を抑制することにより、閉花受粉性植物を作出することができる。この場合、冗長的に機能する他のクラスＢ  ＭＡＤＳボックス遺伝子により、雄蕊の形成は正常に行われる。なお、当業者は、当該分野における技術常識（例えば、ノックアウト法、アンチセンス法、コサプレッション法およびＲＮＡｉ法など）に従って、目的の遺伝子の発現を首尾よく抑制し得る。
【００６４】
このように、本明細書を読んだ当業者は、当該分野における周知技術を用いて本発明に係る植物体を容易に作出することができ、以下に詳述するオリゴヌクレオチドおよび抗体を用いれば、本発明に係る植物体を容易に選抜することができる。なお、目的の植物体（すなわち、ｓｐｗ１−ｃｌｓ型変異を有する変異体）をスクリーニングするためには、ＴＩＬＬＩＮＧ法（特異的プローブおよびミスマッチ部位特異的エンドヌクレアーゼ処理によって、目的の遺伝子座における変異を検出する方法）などによっても検出することができ、得られた変異体におけるＳＰＷ１遺伝子の塩基配列を解析することにより、目的のアミノ酸位またはその付近にアミノ酸置換が生じている個体や、１または数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加された個体を見出すことができる。
【００６５】
〔２−２〕オリゴヌクレオチド（プローブまたはプライマー）およびその利用
本発明は、本発明に係るポリヌクレオチドのフラグメントからなるオリゴヌクレオチドを提供する。本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化学合成されてもよい。
【００６６】
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、閉花受粉性が付与された植物体を選抜するに有用である。すなわち、本発明に係るオリゴヌクレオチドを用いれば、ｓｐｗ１−ｃｌｓ型変異を容易に検出し得る。よって、本発明を用いれば、閉花受粉性を有する植物体を容易にスクリーニングすることができる。よって、本発明に係るオリゴヌクレオチドを目的の植物体由来のゲノムＤＮＡなどとハイブリダイズさせる工程を包含するスクリーニング方法、および、本発明に係るオリゴヌクレオチドを備えているスクリーニングキットもまた、閉花受粉性を有する植物体をスクリーニングするための本発明の範囲に含まれることが容易に理解されるべきである。
【００６７】
すなわち、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、本発明に係るポリヌクレオチドのフラグメントまたはその相補配列を含むことを特徴としており、配列番号２３に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよい。また、本発明に係るオリゴヌクレオチドセットは、上記オリゴヌクレオチドを少なくとも１つ含んでいることを特徴としており、配列番号２２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号２３に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００６８】
さらに、本発明に係るスクリーニング方法は、閉花受粉性が付与された植物体をスクリーニングする方法であって、本発明に係るオリゴヌクレオチドを目的の植物体由来のｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程を包含することを特徴としており、配列番号２３に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを目的の植物体由来のｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程を包含してもよく、この場合、配列番号２２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを目的の植物体由来のｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程をさらに包含することが好ましい。
【００６９】
なおさらに、本発明に係るスクリーニングキットは、閉花受粉性が付与された植物体をスクリーニングするキットであって、本発明に係るオリゴヌクレオチドを備えていることを特徴としており、配列番号２３に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを備えていてもよく、この場合、配列番号２２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをさらに備えていることが好ましい。
【００７０】
当該分野において周知の植物品種識別法としては、ＲＦＬＰ法、ＲＡＰＤ法、ＡＦＬＰ法、ＣＡＰＳ法、ＳＳＲ法、ＩＳＳＲ法、ＳＮＰ法などが挙げられ、本明細書を読んだ当業者は、採用する手法に応じて適切なオリゴヌクレオチドを適宜設計し得る。
【００７１】
標的とするクラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質の配列情報がすでに知られていることや、該タンパク質の第４５位のアミノ酸置換が生じているか否かを検出し得ればよいことに鑑みれば、ＣＡＰＳ法（特にｄＣＡＰＳ法）を用いることが好ましい。ＣＡＰＳ法は、ＰＣＲ産物を特定の制限酵素により切断して切断断片の長さの違いに応じて塩基置換（多型）を検出する方法であり、好ましい制限酵素部位がない場合にプライマー（オリゴヌクレオチド）を工夫して好ましい制限酵素部位を新たに設けることも可能である（ｄＣＡＰＳ法）。
【００７２】
例えば、第１のオリゴヌクレオチド（５’−ＴＧＣＡＧＡＡＣＴＣＧＴＧＧＴＡＣＴＴＧＣＣＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＡＣＣＡＴＧ−３’（配列番号２３））は、増幅するテンプレートとなるＳＰＷ１  ｃＤＮＡ（配列番号２）またはＳＰＷ１ゲノムＤＮＡ（配列番号３）の相補配列（５’−ＴＧＣＡＧＡＡＣＴＣＧＴＧＧＴＡＣＴＴＧＣＣＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＡＴＡＡＴＧ−３’）に一部塩基置換を導入している。第１のオリゴヌクレオチドとプライマー対を形成してｓｐｗ１−ｃｌｓ型変異部位を含むフラグメントを増幅し得るように、第２のオリゴヌクレオチド（例えば、５’−ＣＡＧＧＧＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＣＴＣＴＧＣＧＡＣＧＣＣＣＡＧＧＴＣＧＣＣＡ−３’（配列番号２２））を設計する。第１および第２のオリゴヌクレオチドをプライマー対として用いたＰＣＲによる増幅フラグメントをＮｃｏＩ処理した場合に、ｓｐｗ１−ｃｌｓ型変異がある場合は、増幅フラグメントは生成された部位（ＣＣＡＴＧＧ）で切断されるが、変異がない（野生型）の場合は、増幅フラグメントは生成された部位（ＴＣＡＴＧＧ）では切断されない。
【００７３】
なお、配列番号２３に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを例としてｄＣＡＭＰＳマーカーである第１のオリゴヌクレオチドを説明したが、本発明に係るオリゴヌクレオチドはこれに限定されない。また、配列番号２２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを例としてプライマー対を形成する第２のオリゴヌクレオチドを説明したが、本発明に係るオリゴヌクレオチドはこれにも限定されない。
【００７４】
本発明に係る同一出願人は、新たな１塩基多型判別技術を開発している（特開２００４−２４８６３５公報（平成１６年９月９日公開）を参照のこと）。一実施形態において、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、上記技術に適用するためのオリゴヌクレオチドであり得る。すなわち、本実施形態に係るオリゴヌクレオチドは、１塩基多型の遺伝子型を判別するためのＰＣＲプライマーであって、該プライマーの３’末端から１番目の塩基は判別すべき該１塩基多型の位置に対応し、該プライマーの３’末端から３番目の塩基は該プライマーがアニールする鋳型（テンプレート）配列と相補的な塩基から置換されていることを特徴としている。上記置換はＧからＴ、ＡからＣへ、ＴからＧ、またはＣからＡの置換であることが好ましい。本実施形態に係るオリゴヌクレオチドのＴｍ値は５０℃以上であり、好ましくは６０℃以上であり、より好ましくは６５℃以上であり、最も好ましくは７０℃以上である。本実施形態に係るオリゴヌクレオチドを用いれば、目的の増幅産物を得ることができるか否かに応じて標的遺伝子中に１塩基多型（１塩基置換）が存在するか否かを知ることができる。
【００７５】
本明細書において使用される場合、用語「プライマー」は、適切な条件下での鋳型指向性ＤＮＡ合成の開始点として作用する一本鎖オリゴヌクレオチドが意図される。プライマーとしての好ましい長さは、意図される用途に応じて適宜変更され得るが、一般的には、１５〜５０の間の任意の数の塩基からなるヌクレオチドであり得、好ましくは１５〜３０ヌクレオチドである。プライマーは、鋳型配列に完全に一致する必要はないが、鋳型とハイブリダイズするに十分相補的であるべきである。用語「プライマー対」は、増幅される核酸配列の５’末端とハイブリダイズする５’（上流）プライマーおよび増幅されるその配列の３’末端の相補物とハイブリダイズする３’（下流）プライマーを含む一組のプライマーセットが意図される。
【００７６】
なお、本明細書において、核酸増幅反応として「ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）」を用いて例示的に説明しているが、本実施形態に係るオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ以外の核酸増幅反応にもまた適用可能である。
【００７７】
すなわち、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、本発明に係るポリヌクレオチドのフラグメントまたはその相補配列からなることを特徴としており、当該分野において周知の品種識別技術に適用可能なものである。よって、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、ｓｐｗ１−ｃｌｓ型変異を検出するために適用する各技術に応じて適宜設計されるものであり、特定のオリゴヌクレオチドに限定されないということを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【００７８】
〔２−３〕抗体およびその利用
本発明は、本発明に係るポリペプチドと特異的に結合する抗体を提供する。本発明に係る抗体は、本発明に係るポリペプチドと特異的に結合し得るものであれば限定されず、該ポリペプチドに対するポリクローナル抗体等でもよいが、該ポリペプチドに対するモノクローナル抗体であることが好ましい。モノクローナル抗体は、性質が均一で供給しやすい、ハイブリドーマとして半永久的に保存ができるなどの利点を有する。
【００７９】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体および抗イディオタイプ抗体が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８０】
本明細書中で使用される場合、用語「本発明に係るポリペプチドと特異的に結合する」は、クラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質の第４５位のアミノ酸が親水性アミノ酸に置換されているポリペプチドと特異的に結合するが、第４５位のアミノ酸が置換されていないクラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質とは結合しないことが意図される。よって、本発明を用いれば、閉花受粉性を有する植物体を容易にスクリーニングすることができる。よって、本発明に係る抗体を目的の植物体由来の組織抽出物とインキュベートする工程を包含するスクリーニング方法、および、本発明に係る抗体を備えているスクリーニングキットもまた、閉花受粉性を有する植物体をスクリーニングするための本発明の範囲に含まれることが容易に理解されるべきである。
【００８１】
本発明に係る抗体は、本発明に係るポリペプチドと特異的に結合することを特徴としている。また、本発明に係るスクリーニング方法は、閉花受粉性が付与された植物体をスクリーニングする方法であって、上記の抗体を目的の植物体由来の組織抽出物とインキュベートする工程を包含することを特徴としている。さらに、本発明に係るスクリーニングキットは、閉花受粉性が付与された植物体をスクリーニングするキットであって、上記の抗体を備えていることを特徴としている。
【００８２】
本明細書中で使用される場合、用語「本発明に係るポリペプチドと特異的に結合する抗体」は、該ポリペプチドと特異的に結合し得る完全な抗体分子および抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含むことが意図される。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは完全な抗体のＦｃ部分を欠いており、循環によってさらに迅速に除去され、そして完全な抗体の非特異的組織結合をほとんど有し得ない（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３）（本明細書中に参考として援用される））。従って、これらのフラグメントが好ましい。
【００８３】
「抗体」は、種々の公知の方法（例えば、ＨａｒＬｏｗら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）」、岩崎ら、「単クローン抗体  ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ、講談社（１９９１）」）に従えば作製され得る。
【００８４】
モノクローナル抗体は、当該分野において周知の方法（例えば、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７（１９７５））、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４，７２（１９８３））およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６（１９８５））などを参照のこと）を用いれば作製され得る。
【００８５】
ペプチド抗体もまた、当該分野に周知の方法（例えば、Ｃｈｏｗ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）によって作製され得る。
【００８６】
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに本発明に係る抗体の他のフラグメントが、本明細書中で開示される方法に従って使用され得ることは、当業者には明白である。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生じる）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生じる）のような酵素を使用するタンパク質分解による切断によって産生され得る。あるいは、本発明に係るポリペプチド結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用または化学合成によって産生され得る。
【００８７】
このように、本実施形態に係る抗体は、本発明に係るポリペプチドと特異的に結合するフラグメント（例えば、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を備えていればよく、異なる抗体分子のＦｃフラグメントとからなる免疫グロブリンも本発明に含まれることに留意すべきである。
【００８８】
つまり、本発明の目的は、本発明に係るポリペプチドと特異的に結合する抗体およびその利用を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々の免疫グロブリンの種類（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）、ペプチド抗原作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される抗体も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。
【００８９】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００９０】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００９１】
〔１：手法〕
〔１−１．閉花受粉性を有する変異体の同定〕
閉花受粉性を有する変異体を見出すために、Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ（ＭＮＵ）で変異誘発したコメ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．ｓｕｂｓｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ  ｃｖ．Ｔａｉｃｈｕｎｇ  ６５）のＭ２集団をスクリーニングした。上記Ｍ２集団を通常の条件下で生育したところ、野生型のコメは開花期に開花し１５分後に閉じたが、いくつかの葯が、穎が閉じた後もなお外側に残存した。そこで、先ず、開花期に穎の外に葯が観察されない植物を選んだ。続いて、閉花受粉性が単一の劣性形質として示される、受精能を有する系統を見出した。異なる遺伝的背景におけるこの変異体の閉花受粉性の安定性を確認するために、この変異体をｃｖ．Ｋａｓａｌａｔｈ（ｓｕｂｓｐ．ｉｎｄｉｃａ）と交配させ、Ｆ２集団における閉花受粉性の分離を試みた。
【００９２】
〔１−２．パラフィン切片〕
野生型およびｓｐｗ１−ｃｌｓの穎花を、ＦＡＡ（ホルムアルデヒド：氷酢酸：エタノール＝１：１：１８）中にて４℃で２４時間固定し、次いで、濃度勾配を有する一連のエタノール中にて脱水した。１００％エタノール中にて脱水したサンプルをキシレンに置換し、Ｐａｒａｐｌａｓｔ  ｐｌｕｓ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｌａｂｗａｒｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に包埋した。８μｍ厚でのミクロトーム切片をＤｅｌａｆｉｅｌｄ’ｓ  ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎｅで染色し、光学顕微鏡で観察した。
【００９３】
〔１−３．走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）〕
新鮮なサンプルを走査型電子顕微鏡（ＶＥ−８０００，Ｋｅｙｅｎｃｅ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）で直接観察した。
【００９４】
〔１−４．インサイチュハイブリダイゼーション〕
パラフィン切片を、８μｍ厚のミクロトーム切片をＡＰＳコートしたスライドガラス（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ  Ｇｌａｓｓｅｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）上にアプライした以外については上記したように調製した。ＳＰＷ１、ＯｓＭＡＤＳ２およびＯｓＭＡＤＳ４の全長ｃＤＮＡまたは部分長ｃＤＮＡより、ジゴキシゲニン標識したアンチセンスプローブおよびセンスプローブを調製した。インサイチュハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションシグナルの免疫学的検出を、Ｋｏｕｃｈｉ，Ｈ．  ａｎｄ  Ｈａｔａ，Ｓ．  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３８，１０６−１１９（１９９３）に記載の方法に従って行った。
【００９５】
〔１−５．ジーンマッピング〕
マップベースクローニングのために、ホモ接合の閉花受粉性植物とｃｖ．Ｋａｓａｌａｔｈ（ｓｕｂｓｐ．ｉｎｄｉｃａ）とのＦ２集団を使用した。ＣＡＰＳマーカーを用いて、原因遺伝子を、第６染色体の長腕上にマッピングした。
【００９６】
〔１−６．植物の形質転換〕
ゲノムＤＮＡフラグメントまたはｃＤＮＡ（変異ありまたはなし）の全てを、ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用するＰＣＲ反応によって増幅し、その配列を確認した。ＤＮＡフラグメントを、ｐＺＨ２Ｂ（Ｍ．Ｋｕｒｏｄａ氏よりご供与戴いた）にクローニングした。ＲＮＡｉ実験のために、３１２ｂｐ（ＳＰＷ１）、３００ｂｐ（ＯｓＭＡＤＳ２）および５８ｂｐ（ＯｓＭＡＤＳ４）の遺伝子特異的ＤＮＡフラグメントを、コメユビキチン遺伝子プロモータおよびイネアスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子の第３イントロンを有するｐＺＨ２Ｂｉ（Ｍ．Ｋｕｒｏｄａ氏よりご供与戴いた）にｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄの方向でクローニングした。Ｏｉｋａｗａら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５，６８７−７００（２００４）に記載の方法に従って、ベクターを、アグロバクテリウムを介した形質転換によって、ハイグロマイシンによる選択条件下でイネ胚盤由来のカルスに導入した。アリル特異的ｄＣＡＰＳマーカー（配列番号２２および２３）を用いて、ｓｐｗ１−ｃｌｓまたはｓｐｗ１−１のホモ接合カルスを選択した。
【００９７】
〔１−７．酵母ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄアッセイ〕
ＳＰＷ１、ＯｓＭＡＤＳ２およびＯｓＭＡＤＳ４の野生型または変異型（Ｉ４５ＴまたはＶ４５Ｔ）のＭドメイン、ＩドメインおよびＫドメインに対応するコード配列を、ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して増幅し、配列を確認し、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄベクターｐＡＳ２−１およびｐＡＣＴ２にサブクローニングした。酵母形質転換およびβ−ガラクトシダーゼ液体アッセイの全てを、酵母細胞を２０℃でインキュベートした以外は、Ｗａｎｇ，Ｋ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４２８，９４５−９５０（２００４）に記載の方法に従って行った。
【００９８】
〔２：閉花受粉性を有するｓｐｗ１−ｃｌｓの表現型〕
図１ａに、野生型形質を示す分離系統（左）およびｓｐｗ１−ｃｌｓ（右）の外観を示し、閉花性を比較した。図１ｂに、穎の一部を切除したｓｐｗ１−ｃｌｓの米粒の発育過程を示した。矢印は未成熟な種を示し、矢頭は雄蕊を示す。これより、ｓｐｗ１−ｃｌｓにおいては、雄蕊が穎の中に残っていることがわかる。
【００９９】
図１ｃおよびｄに、野生型およびｓｐｗ１−ｃｌｓ変異体の内部花器官構造を示した。野生型では鱗被（矢印）が伸長していないが（図１ｃ）、ｓｐｗ１−ｃｌｓでは鱗被（矢印）が細長く伸長しているものの他の花器官が正常である（図１ｄ）。さらに、野生型（左）とｓｐｗ１−ｃｌｓ型（右）との鱗被の形態の比較を図１ｅに示す。このように、閉花受粉性イネｓｐｗ１−ｃｌｓにおいては、鱗被が形態変化して伸長していたが、雄蕊などの他の器官では変化を生じていなかった。
【０１００】
野生型（左）およびｓｐｗ１−ｃｌｓ（右）の穎花の横断切片を図１ｆに示す。矢印は鱗被を示す。野生型では鱗被が肥大し、野生型のイネの鱗被では、多くの維管束が発達しているのに対して、ｓｐｗ１−ｃｌｓ変異体では鱗被が薄く、ｓｐｗ１−ｃｌｓの鱗被では、維管束は未発達であり、扁平な構造を有していた。また、図１ｇおよびｈに、野生型およびｓｐｗ１−ｃｌｓ変異体の、鱗被（ｌｏ）および内穎の周縁部（ｍａ）の走査型電子顕微鏡像を示した。野生型のイネの鱗被表面は丸く膨潤した細胞によって構成されていたが（図１ｇ）、ｓｐｗ１−ｃｌｓにおいては内穎の周縁部に観察される細長く平坦な細胞によって構成されていた（図１ｈ）。これらの結果より、ｓｐｗ１−ｃｌｓにおいては、本来鱗被として発達すべき器官が穎と鱗被との中間に相当する器官に形態変化し、その結果、細胞が膨潤する能力を失い、開花を生じることができなくなったと考えられる。
【０１０１】
図１ｉは、インド型イネ品種Ｋａｓａｌａｔｈとｓｐｗ１−ｃｌｓ変異体とを交配して得られた、野生型（開放花形成）を示すＦ２個体であり、右はｓｐｗ１−ｃｌｓ型（閉花受粉性）を示すＦ２個体を示す図である。ｓｐｗ１−ｃｌｓとインド型イネ品種「Ｋａｓａｌａｔｈ」との交配によって得られたＦ２集団においても２５％の閉花受粉性個体が得られた。閉花受粉性の形質は、遺伝的背景とは独立して安定して発現している、すなわち、遺伝的背景が変更されても閉花受粉性が安定的に発現されることがわかった。
【０１０２】
外来遺伝子として３５Ｓプロモータ：：ＧＦＰ遺伝子を導入したｓｐｗ１−ｃｌｓ変異体の受精後の花を図１ｊに示す。図では、内部を観察し得るように穎の一部を切除している。ＧＦＰ遺伝子の高発現による緑色蛍光および閉花受粉性が観察され、雄蕊を内部に残存させたまま子房が発達していることがわかる。このことより、遺伝子組換えの母本として利用した場合においても、安定的に閉花受粉性を発現することが確認された。
【０１０３】
「閉穎大黒」として知られているｄ７突然変異体は、これまでに報告されている閉花受粉性イネである。ｄ７変異体では、正常な鱗被を有しているものの、外花穎および内花穎の近位部が強固に融合しており、その結果、開花期において開花しない。しかし、ｄ７変異体は原因遺伝子の多面的発現によって他の生育障害（例えば、矮性および短粒など）を伴うと推定されており、現実的には利用可能ではない。
【０１０４】
そこで閉花受粉性を有する変異体ｓｐｗ１−ｃｌｓにおける草型および穂の形態を野生型と比較した（図２）。野生型形質を示す分離個体の草型を図２ａに示し、ｓｐｗ１−ｃｌｓの草型を図２ｂに示す。また、図２ｃは、穂の形態を比較した図であり、左が野生型を示し、右がｓｐｗ１−ｃｌｓを示す。図２ｄは、野生型（左）とｓｐｗ１−ｃｌｓ変異体（右）との間での米粒の外観の比較を示す図である。ｓｐｗ１−ｃｌｓは閉花受粉性を有していることを除けば野生型と同様の外観を有していることがわかる。しかし、ｓｐｗ１−ｃｌｓは、野生型イネと同等の種子稔実率を有し、穂は正常に抽出し、他の形質（草型、出穂日など）についても野生型のイネと優位な差はなかった（表１）。
【０１０５】
【表１】
2007300876.tif 000002
【０１０６】
以上より、ｃｌｓは鱗被の特性に特異的に影響を与えると考えられ、ｓｐｗ１−ｃｌｓ変異体は実用的な利用に適しているといえる。
【０１０７】
〔３：ｓｐｗ１−ｃｌｓにおける閉花受粉性の作用機序〕
ＳＰＷ１遺伝子の変異により閉花受粉性がもたらされる作用機序を知るために、ＳＰＷ１遺伝子に関する形質転換植物の花の形態を解析した（図３）。図３は、ＳＰＷ１遺伝子の機能欠失型突然変異体ｓｐｗ１−１の花器官構造（図３ａ）、ＲＮＡｉ法によりＳＰＷ１遺伝子の発現を強く抑制した系統の花器官構造（図３ｃ）、ＲＮＡｉ法によりＳＰＷ１遺伝子の発現を弱く抑制した系統の花器官構造（図３ｄ）を示す。
【０１０８】
まず、ＲＮＡｉ法によってＳＰＷ１遺伝子の発現量を低下させると、ＳＰＷ１の機能欠失型突然変異アリルであるｓｐｗ１−１（図３ａ）およびｓｐｗ１−２（示さず）、鱗被の伸長および雄蕊の雌蕊化を示すもの（図３ｃ）、ならびにｓｐｗ１−ｃｌｓと同様に鱗被の伸長だけを示して雄蕊の外観は正常であるもの（図３ｄ）が観察された。ＳＰＷ１遺伝子の発現抑制が強い場合は、機能欠失型突然変異体ｓｐｗ１−１と同様に、鱗被の伸長および雄蕊の雌蕊化が観察された。ＳＰＷ１遺伝子の発現抑制が弱い場合は、ｓｐｗ１−ｃｌｓ変異体と同様の鱗被の伸長のみが観察された。しかし、これらの系統は、花粉に変異を生じており、完全に不稔であった。
【０１０９】
図３ｅは、機能欠失型変異株ｓｐｗ１−１に対する変異型ＳＰＷ１遺伝子による機能相補を示す図である。Ｉ４５Ｔ変異を有する変異型ＳＰＷ１遺伝子（ｇＳＰＷ１Ｉ４５Ｔ）をｓｐｗ１−１に導入すると、伸長した鱗被および正常な雄蕊を有するｓｐｗ１−ｃｌｓ型の花となることを示す。この結果より、ＳＰＷ１遺伝子の働きを適度に低下させることによってｓｐｗ１−ｃｌｓと類似の形態変化を誘発することができること、および単純にＳＰＷ１遺伝子の発現量を低下させただけでは花粉稔性および種子稔性を確保することが困難であることがわかった。
【０１１０】
本発明では、マップベースクローニング法により、閉花受粉性がＳＵＰＥＲＷＯＭＡＮ１（ＳＰＷ１）遺伝子の変異によって引き起こされたものであることを明らかにした。ＳＰＷ１は、ＭＡＤＳボックスタンパク質転写活性化因子のクラスＢに分類されるが、クラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質は、さらに、ＰＩＳＴＩＬＬＡＴＡ（ＰＩ）サブファミリーとＡＰＥＴＡＬＬＡ３（ＡＰ３）サブファミリーとに分類される。さらに、上記サブファミリーに属するタンパク質がヘテロ二量体を形成してＣＡｒＧボックスと称される特定の配列を有するＤＮＡに結合し、遺伝子の転写を活性化する。シロイヌナズナなどで提唱されている花の形態形成の「ＡＢＣモデル」においては、クラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質は、双子葉植物では花弁および雄蕊の形態形成に必要であり、単子葉植物では鱗被および雄蕊の形態形成に必要であることが知られている。ＳＰＷ１は、イネにおける唯一のＡＰ３型クラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質であり、ＰＩ型タンパク質であるＯｓＭＡＤＳ２およびＯｓＭＡＤＳ４とヘテロ二量体を形成し、鱗被および雄蕊の形態形成を制御していると考えられている。図３ｂは、ＳＰＷ１遺伝子の構造を示す図である。ボックス部分はエキソン、細線部分はイントロンを示し、ＡＴＧは翻訳開始コドン、ＴＧＡは翻訳終止コドンを表す。ｓｐｗ１−１およびｓｐｗ１−２はいずれもスプライシング異常により機能欠失型変異（ｓｕｐｅｒｗｏｍａｎ変異）をもたらし、鱗被が穎状に変換し、雄蕊が雌蕊に変換する。ｓｐｗ１−ｃｌｓ変異体では、第４５位のアミノ酸（イソロイシン（Ｉ））がトレオニン（Ｔ）に置換されている。
【０１１１】
図３ｆは、クラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質（シロイヌナズナ（ＰＩ、ＡＰ３）およびイネ（ＳＰＷ１、ＯｓＭＡＤＳ２、ＯｓＭＡＤＳ４））のＭＡＤＳドメインにおけるアミノ酸配列の比較を示す図である。図中、反転表記は、５種中３種以上のタンパク質においてアミノ酸が保存されていることを示し、網掛け部分は、類似の性質を有するアミノ酸が保存されていることを示す。野生型のクラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質において第４５位のアミノ酸（矢印）はすべて疎水性アミノ酸（ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ））であり、高度に保存されているが、ｓｐｗ１−ｃｌｓでは親水性アミノ酸であるトレオニン（Ｔ）に変異している。このことにより、タンパク質の構造が微妙に変化していることが示唆される。なお、クラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質の第４５位付近は主に疎水性アミノ酸から構成されていることに鑑みれば、第４５位以外の疎水性アミノ酸を親水性アミノ酸に置換することによってｓｐｗ１−ｃｌｓ型の変異体を得ることもまた、本発明の範囲内に包含されるべきである。
【０１１２】
次いで、ｓｐｗ１−ｃｌｓ変異が、ＭＡＤＳボックスドメイン（ＤＮＡ結合性タンパク質ドメイン）におけるアミノ酸置換（第４５位のイソロイシンのトレオニンへの変異（Ｉ４５Ｔ））によるものであることを確認した（図４）。図４ａは、ｓｐｗ１−ｃｌｓ変異体に対する野生型ＳＰＷ１遺伝子による機能相補を示す図である。ｓｐｗ１−ｃｌｓ変異体に野生型ＳＰＷ１遺伝子（ｇＳＰＷ１ｗｔ）を導入することにより野生型の花（鱗被（矢印）が伸長しない）になった。一方、ｓｐｗ１−ｃｌｓ型変異株に対して変異型ＳＰＷ１遺伝子（ｇＳＰＷ１Ｉ４５Ｔ）を導入しても、鱗被は伸長したままであり、正常な雄蕊を有するｓｐｗ１−ｃｌｓ型の花のままであった（図４ｂ）。これらのことより、Ｉ４５Ｔ変異がｓｐｗ１−ｃｌｓ変異の原因であることがわかった。この変異を利用して作製したｄＣＡＰＳマーカー（配列番号２２および２３）は、幼苗において閉花受粉性を判別し得る。このＤＮＡマーカーを用いれば、交配により閉花受粉性を導入した栽培品種を首尾よく選抜し、効率的に育成し得る。
【０１１３】
イネなどの多くのイネ科植物においては、鱗被の膨潤によって開花が生じると考えられているので、本発明に従えば、クラスＢ  ＭＡＤＳボックス遺伝子に同様の突然変異を付与してヘテロ二量体形成能を適切に低下させることによって、多くのイネ科植物において閉花受粉性作物を作出または選抜し得る。
【０１１４】
〔４：クラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質の相互作用〕
上述したように、閉花受粉性の原因遺伝子であることが同定されたＳＰＷ１は、高等植物において広く花弁（鱗被）および雄蕊の形態形成を制御することが知られている「クラスＢ  ＭＡＤＳボックス遺伝子」の１つである。これらの遺伝子の産物であるクラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質は、ＡＰ３型およびＰＩ型の２種類のサブクラスに分類されＡＰ３型サブクラスのタンパク質とＰＩ型サブクラスのタンパク質とが形成したヘテロ二量体がＤＮＡに結合し、形態形成に必要な遺伝子群の転写を活性化させることが知られている。ＳＰＷ１は、イネにおける唯一のＡＰ３型タンパク質であり、ＰＩ型タンパク質であるＯｓＭＡＤＳ２およびＯｓＭＡＤＳ４とヘテロ二量体を形成すると考えられている。そこで、ｓｐｗ１−ｃｌｓ変異によって生じるＩ４５Ｔ型のＳＰＷ１タンパク質（ＳＰＷ１Ｉ４５Ｔ）において、２つのＰＩ型タンパク質とのヘテロ二量体形成に変化が生じているか否かを、酵母ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法を用いて解析した。
【０１１５】
図５ａは、酵母ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法による、野生型またはＩ４５Ｔ変異型のＳＰＷ１タンパク質の、ＯｓＭＡＤＳ２タンパク質またはＯｓＭＡＤＳ４タンパク質に対するタンパク質−タンパク質相互作用を解析した結果を示す図である。レポーター遺伝子（ＬａｃＺ遺伝子）の発現強度を指標にして、野生型ＳＰＷ１タンパク質（ＳＰＷ１（ｗｔ）：白カラム）および変異型ＳＰＷ１タンパク質（ＳＰＷ１（Ｉ４５Ｔ）：黒カラム）と、ＯｓＭＡＤＳ２の野生型タンパク質もしくはＶ４５Ｔ変異型タンパク質またはＯｓＭＡＤＳ４の野生型タンパク質もしくはＶ４５Ｔ変異型タンパク質との間の相互作用を測定した。その結果、Ｉ４５Ｔ型のＳＰＷ１タンパク質（ＳＰＷ１Ｉ４５Ｔ）においてヘテロ二量体形成能が低下していることがわかった。図５ａでは、２種類のタンパク質が強く結合するほど高い値を示す。野生型ＳＰＷ１ｗｔは、野生型のＯｓＭＡＤＳ２およびＯｓＭＡＤＳ４と結合するが、変異型ＳＰＷ１Ｉ４５ＴはＯｓＭＡＤＳ４とほとんど結合せず、ＯｓＭＡＤＳ２との結合は数分の一に減弱することがわかる。また、ＯｓＭＡＤＳ２およびＯｓＭＡＤＳ４のＶ４５Ｔ変異体を作製してＳＰＷ１ｗｔとの結合を確認した。その結果、ＳＰＷ１ｗｔとの結合は、ＯｓＭＡＤＳ２Ｖ４５ＴではＯｓＭＡＤＳ２ｗｔの約半分に、ＯｓＭＡＤＳ４Ｖ４５Ｔではほとんど結合しないことがわかった。さらに、ＳＰＷ１Ｉ４５ＴとＯｓＭＡＤＳ２Ｖ４５ＴまたはＯｓＭＡＤＳ４Ｖ４５Ｔとの間では全く結合が生じないことがわかった。
【０１１６】
図５ｂおよびｃは、インサイチュハイブリダイゼーション法によるＯｓＭＡＤＳ２遺伝子およびＯｓＭＡＤＳ４遺伝子の発現部位を示した図である。インサイチュハイブリダイゼーション法による解析の結果、ＯｓＭＡＤＳ２は鱗被および雄蕊の原基にて発現し（図５ｂ）、ＯｓＭＡＤＳ４は雄蕊の原基のみにて発現する（図５ｃ）ことがわかった。これらの結果より、ｓｐｗ１−ｃｌｓ型変異株について、鱗被の原基ではＳＰＷ１Ｉ４５ＴとＯｓＭＡＤＳ２との結合が弱いために鱗被形成が阻害され、雄蕊の原基ではＳＰＷ１Ｉ４５ＴとＯｓＭＡＤＳ４との結合が全く生じずＳＰＷ１Ｉ４５ＴとＯｓＭＡＤＳ２との結合が弱いものの、雄蕊形成には十分な活性を保っていることが示唆された。
【０１１７】
ＯｓＭＡＤＳ４は鱗被の原基には発現していないので、ＳＰＷ１とＯｓＭＡＤＳ２との間の相互作用は鱗被形成に重要であると考えられる。このことは、雄蕊を形成するにはＳＰＷ１Ｉ４５ＴとＯｓＭＡＤＳ２とのヘテロ二量体化レベルは低くても十分であるが、完全な鱗被の特性を確立するには不十分であるということによって支持される。また、このような考えを確認するために、ＲＮＡｉ法によりＯｓＭＡＤＳ２遺伝子およびＯｓＭＡＤＳ４遺伝子の発現を抑制した。図５ｄおよびｅに、ＲＮＡｉ法によりＯｓＭＡＤＳ２遺伝子およびＯｓＭＡＤＳ４遺伝子の発現を抑制した系統の花器官構造を示す。
【０１１８】
ＯｓＭＡＤＳ２遺伝子の発現を抑制した植物においては、ＯｓＭＡＤＳ４  ｍＲＮＡが第２ｗｈｏｒｌには存在しないが第３ｗｈｏｒｌには存在するので、正常な雄蕊を有しつつ、伸張した穎様の鱗被を示した（図５ｄ）。しかし、ＯｓＭＡＤＳ４遺伝子の発現を抑制した植物においては、ＯｓＭＡＤＳ２が第２ｗｈｏｒｌおよび第３ｗｈｏｒｌの両方に存在するので、表現型を示さなかった（図５ｅ）。
【０１１９】
以上の結果より、ｓｐｗ１−ｃｌｓにおいては、クラスＢ  ＭＡＤＳボックスタンパク質であるＳＰＷ１タンパク質のＯｓＭＡＤＳ２およびＯｓＭＡＤＳとのヘテロ二量体形成能が低下し、その結果、クラスＢ活性が低下し、よって鱗被のみが形態変化を生じ、雄蕊には形態変化を生じなかったと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
開花性の栽培品種は、自ら花粉を飛散させるとともに他品種の花粉を受容しやすいので、交雑および／または遺伝子拡散が懸念される。しかし、雄蕊の機能が保持されていないと自家受粉し得ない。本発明は、切望されていた閉花受粉性を有する栽培品種を提供し、育種の効率化に大きく貢献し得る。
【０１２１】
従来、閉花性であるか否かを判定するには、実際に植物個体の開花状態を観察し、開花の際に葯が頴から出ているか否かを目で見て調査しなければならなかった。しかも、閉花性でありながら雄蕊の機能を保持しているものを選別することは困難であった。本発明は、閉花受粉性を有する植物を首尾よく選別し得る遺伝マーカーを提供し、植物の育種の大幅な効率化に寄与する。
【０１２２】
このように、本発明は、広く農業全般に利用可能であり、食品産業においても有効利用され得る。また、本発明は、生物分野の基礎研究にも利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】図１は、閉花受粉性突然変異体ｓｐｗ１−ｃｌｓの表現型を示す図である。
【図２】図２は、閉花受粉性突然変異体ｓｐｗ１−ｃｌｓと野生型との間で、草型、穂および米粒を比較した図である。
【図３】図３は、閉花受粉性突然変異体ｓｐｗ１−ｃｌｓにおける花器官構造の変化、およびｓｐｗ１−ｃｌｓ変異の原因遺伝子を示す図である。
【図４】図４は、閉花受粉性突然変異体ｓｐｗ１−ｃｌｓに対する野生型ＳＰＷ１遺伝子による機能相補を示す図である。
【図５】図５は、閉花受粉性に関するＯｓＭＡＤＳ２およびＯｓＭＡＤＳ４の影響を調べた結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2007300876.tif 000006
【図５】
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【配列表】
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