(57)【要約】【課題】糸状菌を用いる乳酸菌の培養方法及び該培養方法により得られる培養物を提供する。【解決手段】低糖濃度培地で糸状菌を培養した糸状菌培養物中で、乳酸菌を培養することを特徴とする乳酸菌の培養方法、該培養方法により得られた培養物、該培養物を含有する免疫活性化（細胞表面抗原ＣＤ６９の発現促進）剤及び／又はアレルギー（リンフォカインＩＬ−４産生）抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
低糖濃度培地で糸状菌を培養した糸状菌培養物中で、乳酸菌を培養することを特徴とする乳酸菌の培養方法。
【請求項２】
前記糸状菌がメシマコブ、カバノアナタケ、ツリガネタケ又はベニクスノキタケである請求項１記載の培養方法。
【請求項３】
前記糸状菌がメシマコブである請求項２記載の培養方法。
【請求項４】
前記乳酸菌が、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属）、ヴァイゼラ属（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ属）又はロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属）に属する乳酸菌である請求項１ないし３の何れか１項に記載の培養方法。
【請求項５】
前記乳酸菌が、ビフィドバクテリウム  ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム  ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）ビフィドバクテリウム  ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム  インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ラクトバチルス  プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス  アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス  ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス  カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス  クルバタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラクトバチルス  サケ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅ）、ラクトコッカス  ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス  ガルビエ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｒｖｉｅａｅ）、ペディオコッカス  ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、ヴァイゼラ  キムチ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ  ｋｉｍｃｈｉｉ）又はロイコノストック  ガルリカム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｇａｒｌｉｃｕｍ）である請求項４記載の培養方法。
【請求項６】
前記乳酸菌が、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ヴァイゼラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）属又はペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、乳酸菌である請求項１ないし４の何れか１項に記載の培養方法。
【請求項７】
前記乳酸菌が、ビフィドバクテリウム  ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）又はビフィドバクテリウム  ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｌａｃｔｉｓ）である請求項６記載の培養方法。
【請求項８】
前記乳酸菌が、ビフィドバクテリウム  ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）である請求項７記載の培養方法。
【請求項９】
請求項１ないし８の何れか１項に記載の培養方法により得られた培養物。
【請求項１０】
請求項１ないし８の何れか１項に記載の培養方法により得られた培養物を含有する免疫活性化剤。
【請求項１１】
請求項１ないし８の何れか１項に記載の培養方法により得られた培養物を含有するアレルギー抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糸状菌を用いて乳酸菌を培養することにより、通常の培養に比して飛躍的に乳酸菌数が増大する乳酸菌の培養方法及びこれにより得られる培養物に関するものであり、詳細には、低糖濃度培地で糸状菌を培養した糸状菌培養物中で、乳酸菌を培養することを特徴とする乳酸菌の培養方法及び該培養方法により得られる培養物に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は、古来より、チーズ、ヨーグルト、発酵バター等の乳製品や発酵ソーセージ、発酵サラミ等の畜肉製品を製造する際にスターターとして使用されている微生物であり、最近では、パンのスターターや飼料用サイレージのスターターとしても利用されている。また、味噌、醤油、漬物等の熟成工程においても、乳酸菌は重要な役割を果していることが知られている。さらに、近年において、乳酸菌の有する種々の生理効果が明らかとなり、乳酸菌の菌体自体や乳酸菌の培養物等を健康食品や医薬品等の素材として利用するようになってきている。このように乳酸菌の利用は多岐にわたっており、乳酸菌の菌体や培養物等を簡便、かつ安価に製造することは極めて重要な課題となってきている。
【０００３】
一方、近年、数多くのキノコに種々の生理活性物質が含まれていることが報告されている。その中で、タバコウロコタケ科キコブタケ属に属するメシマコブ（Ｐｈｅｌｌｉｎｕｓ  ｌｉｎｔｅｕｓ）は、免疫活性化作用、抗腫瘍作用を持つことから、従来から健康食品または漢方薬として利用されている。
【０００４】
特許文献１には、アガリクス等の糸状菌を健康食品として用いる際に、培養生産物中に未利用の糖分が残存することがあり、この残存した糖分が、糖尿病患者などのような一部の消費者にとって問題となることから、該培養生産物に酵母菌、乳酸菌を加えて混合培養し、残存する糖分を消費させる方法が記載されている。
しかし特許文献１は、糸状菌を用いる乳酸菌の培養方法を開示するものでなく、また、低糖の条件、即ち低糖培地において乳酸菌を培養することに関しては何らの記載もされていない。
【特許文献１】特開２００５−１２６３５４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、通常の培養に比して飛躍的に乳酸菌数が増大する乳酸菌の培養方法及び該培養方法により得られる有用な生理活性を有する培養物の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、低糖濃度培地で糸状菌を培養した糸状菌培養物中で乳酸菌を培養すると、飛躍的に乳酸菌数が増大することを見出し、本発明を完成させた。また、得られた培養物は、優れた免疫活性化（細胞表面抗原ＣＤ６９の発現促進）作用及び／又はアレルギー（リンフォカインＩＬ−４産生）抑制作用を示すことも見出した。
【０００７】
即ち、本発明は、
１．低糖濃度培地で糸状菌を培養した糸状菌培養物中で、乳酸菌を培養することを特徴とする乳酸菌の培養方法、
２．前記糸状菌がメシマコブ、カバノアナタケ、ツリガネタケ又はベニクスノキタケである前記１．記載の培養方法、
３．前記糸状菌がメシマコブである前記２．記載の培養方法、
４．前記乳酸菌が、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属）、ヴァイゼラ属（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ属）又はロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属）に属する乳酸菌である前記１．ないし３．の何れか１つに記載の培養方法、
５．前記乳酸菌が、ビフィドバクテリウム  ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム  ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム  ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム  インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ラクトバチルス  プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス  アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス  ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス  カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス  クルバタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラクトバチルス  サケ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅ）、ラクトコッカス  ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス  ガルビエ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｒｖｉｅａｅ）、ペディオコッカス  ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、ヴァイゼラ  キムチ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ  ｋｉｍｃｈｉｉ）又はロイコノストック  ガルリカム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｇａｒｌｉｃｕｍ）である前記４．記載の培養方法、
６．前記乳酸菌が、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属又はヴァイゼラ（Ｗｅｉｓ s ｅｌｌａ）属又はペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）
属、に属する乳酸菌である前記１．ないし４．の何れか１つに記載の培養方法、
７．前記乳酸菌が、ビフィドバクテリウム  ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｌｏｎｇｕｍ）又はビフィドバクテリウム  ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）である前記６．記載の培養方法、
８．前記乳酸菌が、ビフィドバクテリウム  ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｌｏｎｇｕｍ）である前記７．記載の培養方法、
９．前記１．ないし８．の何れか１つに記載の培養方法により得られた培養物、
１０．前記１．ないし８．の何れか１つに記載の培養方法により得られた培養物を含有する免疫活性化剤、
１１．前記１．ないし８．の何れか１つに記載の培養方法により得られた培養物を含有するアレルギー抑制剤、
に関するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の乳酸菌の培養方法により、飛躍的に乳酸菌数が増大した乳酸菌培養物を得ることができる。また、使用する糸状菌は、既に健康食品や漢方薬として使用されているものであるため、ヒトが摂取する上で非常に安全性の高いものといえる。更に、得られた乳酸菌培養物は、免疫活性化、すなわち免疫細胞の表面抗原の1つであるＣＤ６９分子の発現
促進（ＣＤ６９陽性細胞の割合の増加）活性を示し、また、アレルギー反応の抑制作用の1つとしてＩＬ−４の産生抑制作用を示した。
【０００９】
ＣＤ６９は、免疫細胞における活性化マーカーであり、従って、ＣＤ６９分子の発現が促進（ＣＤ６９陽性細胞の割合の増加）されると、免疫が賦活されることになる。また、ＩＬ−４はアレルギー反応に係るサイトカインであり、アレルギー反応を活性化する作用を有し、また、アレルギー反応に係るＴ細胞であるＴｈ２細胞の分化の際にも関与する。従って、ＩＬ−４の産生を抑制することにより、アレルギー反応が抑制されることになる。
以上のことより、本発明の乳酸菌の培養方法により得られる培養物は、免疫を賦活化し且つアレルギー反応を抑制する効果を奏することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明に使用する糸状菌としては、メシマコブ、カバノアナタケ、ツリガネタケ及びベニクスノキタケ等が挙げられ、好ましくはメシマコブが挙げられる。
【００１１】
糸状菌を培養するための培地としては、液体培地でも固体培地よいが、大量生産に適する液体培地を用いて培養するのが好ましい。液体培養は、効率よく栄養成分が吸収されるので糸状菌の成長が固体培養に比べて良好であり、タンク培養ができるので場所をとらないといった利点や滅菌がしやすいといった利点を有する。
上記培地には、炭素源、窒素源など糸状菌を培養する際の生育に必要な栄養素が含まれており、さらにビタミン類やミネラルを含むことができる。
【００１２】
炭素源としては、グルコース、スクロース、マンニトール、ガラクトース、トレハロース、マルトース、ラクトース、デキストリン、コーンスターチ、グリセロール等が挙げられ、好ましくはグルコースが挙げられる。使用する炭素源（糖）の量は、低糖濃度になるよう調整されるが、通常０．３％未満になるよう調整され、好ましくは、０．２５％ないし０．２９％の範囲であり、また、好ましくは、０．２６％ないし０．２８％の範囲であり、また、０．２７％の濃度である。
特に、グルコースを用い、上記の濃度の範囲となるものが好ましい。
【００１３】
窒素源としては、イーストエキス、モルトエキス、ペプトン、ポリペプトン、ソイトン、カシトン、カザミノ酸、硝酸カルシウム、硫酸アンモニウム、米ぬかなどが挙げられ、好ましくはイーストエキスが挙げられる。
【００１４】
ビタミン類やミネラルを用いる際は、具体的には、チアミン、ビオチン、葉酸、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム等が挙げられる。
【００１５】
培地のｐＨとしては、通常の培養に用いられるｐＨの範囲で行うことができるが、好ましくは６．０ないし７．０の範囲、また、６．３ないし６．７の範囲及び６．５が挙げられる。
【００１６】
糸状菌の培養に使用する具体的な培地としては、例えば、１リットルの水に対して、グルコース２．７ｇ、イーストエキス５ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇを添加してｐＨを６．５に調整した培地組成からなるものが挙げられる。
【００１７】
培養温度は、通常の糸状菌の培養に用いられる温度範囲で行うことができるが、好ましくは２５℃ないし３０℃の範囲、２７℃ないし２９℃の範囲及び２８℃が挙げられる。
糸状菌の培養期間は、本発明に使用される糸状菌の種類により異なるが、通常、１週間〜２ヶ月程度である。培養条件は糸状菌の種類により知られている条件を採用することができる。
また、糸状菌の培養は、糸状菌を小スケールで上記記載の条件で培養した後、小スケールで培養した培養物を用いて大スケールの培養を行うこともできる。
また、培養は静置培養、攪拌培養の何れの方法も用いることができるが、静置培養が好ましい。
【００１８】
上記で得られた糸状菌が培養された糸状菌培養物中に、乳酸菌を接種して培養を行うことができる。
この場合、乳酸菌は、糸状菌の培養中に接種するか又は糸状菌の培養後に接種すること
により乳酸菌を培養することができるが、糸状菌の培養後に接種して乳酸菌を培養するのが好ましい。
乳酸菌の培養条件は、乳酸菌の培養を行うための通常の条件を用いて行うことができる。
上記培養物中には、乳酸菌の生育を促すための栄養源を添加することができ、例えば、脱脂粉乳を添加するのが好ましい。
脱脂粉乳等を添加する場合、該脱脂粉乳等は滅菌された水との混合溶液として添加するのが好ましく、その添加量は、水に対する質量割合で、１０ないし３０％、好ましくは１５ないし２５％、また、例えば、２０％である。
また、全培地質量に対しては、５ないし１５％、好ましくは７．５ないし１２．５％、また、例えば、１０％である。
【００１９】
使用する乳酸菌としては、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属）、ヴァイゼラ属（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ属）又はロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属）に属する乳酸菌が挙げられ、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属又はペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属）、ヴァイゼラ属（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ属）に属する乳酸菌が好ましい。
【００２０】
具体的な乳酸菌としては、ビフィドバクテリウム  ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム  ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム  ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム  インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ラクトバチルス  プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス  アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス  ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス  カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス  クルバタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラクトバチルス  サケ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅ）、ラクトコッカス  ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス
ガルビエ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｒｖｉｅａｅ）、ペディオコッカス  ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、ヴァイゼラ  キムチ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ  ｋｉｍｃｈｉｉ）又はロイコノストック  ガルリカム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｇａｒｌｉｃｕｍ）が挙げられ、ビフィドバクテリウム  ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）又はビフィドバクテリウム  ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）が好ましく、また、ビフィドバクテリウム  ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）が好ましい。上記の乳酸菌は単独で用いてもよいし、混合して用いてもよい。
【００２１】
培養条件は、用いる乳酸菌に適した公知の条件を用いることができるが、培養温度は通常、２０ないし４５℃の範囲であり、好ましくは、３０ないし４０℃の範囲であり、また、例えば、３７℃である。
また、培養時間は、数時間から数日の範囲であり、好ましくは、１０時間ないし４０時間、また、１５時間ないし３５時間、また、例えば、２４時間である。
【００２２】
以上の乳酸菌の培養方法により得られた培養物は、所定の方法で加工され、医薬品又は健康食品とすることができる。培養物が液体培養物である場合は、そのまま飲料の形態とすることもできるし、凍結乾燥後に粉末化し、粉末品や錠剤品の形態とすることもできる。製品化の際には、必要に応じて所定の添加剤を添加することができる。また、得られた
培養物に抽出等の操作を行うことにより、免疫活性化（細胞表面抗原ＣＤ６９の発現促進）作用及び／又はアレルギー（リンフォカインＩＬ−４産生）抑制作用における活性成分を分離して用いることもできる。
【実施例】
【００２３】
以下に示す実施例において、本発明を具体的且つ更に詳細に説明する。下記実施例は本発明の説明のためのみのものであり、これらの実施例により本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
尚、本実施例中で使用するＢ．ｌａｃｔｉｓは、ビフィドバクテリウム  ラクティスを意味し、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍは、ビフィドバクテリウム  ロンガムを意味する。
【００２４】
実施例１
下表に従って培地（液体培地）を調製し、メシマコブ菌糸体を３週間、28℃で静置培養にて培養した。
―――――――――――――――――――――――
グルコース              ２．７ｇ
イーストエキス          ５ｇ
ＫＨ2ＰＯ4              １ｇ
脱イオン水              １Ｌ
―――――――――――――――――――――――
ｐH6.5；121℃、15分滅菌
メシマコブ菌糸体・乳酸菌混合培養、メシマコブ菌糸体単独培養、乳酸菌単独培養及び培地調整法を図１に従って行った。
得られたメシマコブ菌糸体を含む培養液に乳酸菌（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）をそれぞれ別の菌糸体培養液に接種してメシマコブ菌糸体と乳酸菌の混合培養を行った。その際には同量の水と最終的に質量割合が２０％になるように脱脂粉乳を添加した。具体的には上記で調製したメシマコブ菌糸体培養液５００ｍＬに、水５００ｍL及び脱脂
粉乳２００ｇよりなる滅菌した混合液の５００ｍＬを添加したものに乳酸菌を接種して混合培養した。メシマコブ菌糸体・乳酸菌混合培養は、３７℃で２４時間行い、得られた培養物を凍結乾燥してメシマコブ菌糸体・乳酸菌混合培養物（以下、混合培養物と記載するが、特に乳酸菌としてＢ．ｌａｃｔｉｓを用いた混合培養物を混合培養物（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）と記載し、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍを用いた混合培養物を混合培養物（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）と記載する。）を得た。混合培養の培養直後における乳酸菌生菌数を計測し表１に示した。メシマコブ菌糸体を同じ培地で37℃、24時間で培養した。得られた培養物を凍結乾燥してメシマコブ菌糸体単独培養物とした。
また、滅菌脱脂粉乳培地（10％）を用い乳酸菌を単独で37℃、24時間で培養し、生菌数を計測し表１に示した。培養物を凍結乾燥し乳酸菌単独培養物とした。メシマコブ菌糸体単独培養物と乳酸菌単独培養物を1：1の比例で混合したもの（以下、混合物と記載するが、特に乳酸菌としてＢ．ｌａｃｔｉｓを用いた混合物を混合物（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）と記載し、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍを用いた混合物を混合物（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）と記載する。）を比較のために調製した。
表１：混合培養直後及び単独培養直後における乳酸菌生菌数の比較
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
乳酸菌                    培養前              培養後        混合培養後
―――――
種類                  （ＣＦＵ／ｇ）      （ＣＦＵ／ｇ）    単独培養後
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
単独培養    4.7×107±1.5×106    2.0×108±1.5×108      1倍
B.lactis  ―――――――――――――――――――――――――――――――
混合培養    4.7×107±1.5×106    1.1×1010±3.0×108    55倍
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
単独培養    7.3×107±4.4×106    1.2×106±3.9×104      1倍
B.longum  ―――――――――――――――――――――――――――――――
混合培養    7.3×107±4.4×106    3.0×109±4.2×108    2500倍
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
Ｂ．ｌａｃｔｉｓ、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍの生菌数はそれぞれ単独で培養した時に比べて混合培養では乳酸菌生菌数がそれぞれ５５倍、２５００倍に上昇した。
【００２５】
実施例２
混合培養物の免疫賦活効果をｉｎ  ｖｉｔｒｏで調べた。免疫賦活効果は混合培養物と混合物とで比較検討した。比較する試料中のメシマコブ菌糸体量を等しくするため、混合培養物には乳酸菌培地（スキムミルク）を等量混合したものを「混合培養物」とし、混合物はメシマコブ菌糸体単独培養物と乳酸菌単独培養物を等量混合したものを「混合物」とした。また、培地のみの試料を「cont. 」とした。
細胞培養用９６穴プレートに５×１０5個／穴のＣ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞を入れ
、混合培養物、或いは混合物を終濃度１００μｇ／ｍＬになるように添加した。細胞培養液の総量は２５０μＬ／穴とした。
細胞培養を開始してから３日後に細胞を回収し、フローサイトメーターを使用して免疫細胞の活性化マーカーであるＣＤ６９の発現上昇の程度を確認した。
混合培養物（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）及び混合物（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）の結果を図２に示し、混合培養物（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）及び混合物（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）の結果を図３に示した。
混合物と培養した脾臓細胞中のＣＤ６９陽性細胞の割合は、８．７％（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）、６．２％（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）に対して、混合培養物（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）では１３．５％、混合培養物（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）では１６．４％であった。
何れの乳酸菌を用いた場合でも混合培養物は混合物と比較して免疫細胞をより活性化させることが判った。
【００２６】
実施例３
混合培養物のアレルギー抑制効果をｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験で検討した。ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内にＯｖａｌｂｕｍｉｎ  １ｍｇ／匹を含むＡｌｕｍ  ａｊｕｖａｎｔ  ２ｍｇ／匹を１５０μＬ／匹に調製し、ｄａｙ０とｄａｙ６の計２回接種した。その後ｄａｙ１３にマウスを解剖し、脾臓を採取した。調製した脾臓細胞を細胞培養用９６穴プレートに５×１０5個／穴入れ、さらに混合培養物、或いは混合物を終濃度１００μｇ／ｍＬ
になるように添加した。細胞培養液の総量は２５０μＬ／穴とした。培養開始から１週間後に培養上清を回収し、上清中のＩＬ−４濃度を測定した。
混合培養物（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）及び混合物（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）の結果を図４に示し、混合培養物（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）及び混合物（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）の結果を図５に示した。
混合物と混合培養物の上清中のＩＬ−４濃度は、それぞれ、Ｂ．ｌａｃｔｉｓでは、１４９ｐｇ／ｍＬと６７ｐｇ／ｍＬ、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍでは、２３０ｐｇ／ｍＬと８７ｐｇ／ｍＬと、混合物に比して混合培養物で低下していることが判った。これは、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスをＴｈ１優位にさせることを意味する。
上記の結果より、混合培養物は、アレルギー反応を抑制できる可能性が示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施例１で行った、メシマコブ菌糸体・乳酸菌混合培養、メシマコブ菌糸体単独培養、乳酸菌単独培養及び培地調整法を示す図である。
【図２】実施例２で行った、混合培養物（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）と混合物（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）におけるＣＤ６９陽性細胞の割合を比較したグラフである。
【図３】実施例２で行った、混合培養物（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）と混合物（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）におけるＣＤ６９陽性細胞の割合を比較したグラフである。
【図４】実施例３で行った、混合培養物（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）と混合物（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）におけるＩＬ−４濃度を比較したグラフである。
【図５】実施例３で行った、混合培養物（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）と混合物（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）におけるＩＬ−４濃度を比較したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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