(57)【要約】      （修正有）【課題】大気中の二酸化窒素を効率よく吸収、同化して、市街地等の環境においても、二酸化窒素取り込み能及び同化能を安定的に発揮することができる手段、特に樹木を提供すること。【解決手段】亜硝酸還元酵素活性を有する外因性のポリペプチドをコードした核酸を発現可能に保持し、向上された二酸化窒素取り込み能及び同化能を有する、トランスジェニック木本植物又はその子孫。また該トランスジェニック木本植物又はその子孫を、ＮＯXを含有した大気下に生育させる、ＮＯXの低減方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
亜硝酸還元酵素活性を有する外因性のポリペプチドをコードした核酸を発現可能に保持してなり、向上された二酸化窒素取り込み能及び同化能を有してなる、トランスジェニック木本植物又はその子孫。
【請求項２】
該核酸が、
（Ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードした塩基配列、
（Ｂ）配列番号：２において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列をコードし、かつコードされたポリペプチドが、亜硝酸還元酵素活性を示すものである塩基配列、
（Ｃ）配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸のアンチセンス鎖に、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列であり、かつコードされたポリペプチドが、亜硝酸還元酵素活性を示すものである塩基配列、及び
（Ｄ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対し、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １１、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  １、ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ  ３の条件でＢＬＡＳＴアルゴリズムでアライメントし算出された配列同一性が、少なくとも８０％であるアミノ酸配列をコードし、かつコードされたポリペプチドが、亜硝酸還元酵素活性を示すものである塩基配列、
からなる群より選ばれた塩基配列からなる核酸である、請求項１記載のトランスジェニック木本植物又はその子孫。
【請求項３】
該核酸が、タバコモザイクウイルスのΩ配列を含むカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターと、ノパリンシンターゼターミネーターとの制御下に作動可能に連結されてなる、請求項１又は２記載のトランスジェニック木本植物又はその子孫。
【請求項４】
木本植物が、シャリンバイである、請求項１〜３いずれか１項に記載のトランスジェニック木本植物又はその子孫。
【請求項５】
（Ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードした塩基配列、
（Ｂ）配列番号：２において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列をコードし、かつコードされたポリペプチドが、亜硝酸還元酵素活性を示すものである塩基配列、
（Ｃ）配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸のアンチセンス鎖に、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列であり、かつコードされたポリペプチドが、亜硝酸還元酵素活性を示すものである塩基配列、及び
（Ｄ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対し、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １１、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  １、ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ  ３の条件でＢＬＡＳＴアルゴリズムでアライメントし算出された配列同一性が、少なくとも８０％であるアミノ酸配列をコードし、かつコードされたポリペプチドが、亜硝酸還元酵素活性を示すものである塩基配列、
からなる群より選ばれた塩基配列からなる核酸を含有した核酸構築物を木本植物に導入し、発現させることを特徴とする、木本植物の二酸化窒素取り込み能及び同化能の向上方法。
【請求項６】
該核酸構築物が、タバコモザイクウイルスのΩ配列を含むカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターと、ノパリンシンターゼターミネーターとの制御下に作動可能に該核酸が連結された核酸カセットを含有したものである、請求項５記載の木本植物の二酸化窒素取り込み能及び同化能の向上方法。
【請求項７】
請求項１〜４いずれか１項に記載のトランスジェニック木本植物又はその子孫を、ＮＯXを含有した大気下に生育させることを特徴とする、ＮＯXの低減方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、向上された二酸化窒素取り込み能及び同化能を有する木本植物及びその子孫、木本植物の二酸化窒素取り込み能及び同化能の向上方法、並びにＮＯXの低減方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＯX（窒素酸化物）は、大気汚染の原因物質の１つであり、工場、火力発電所、自動車、家庭等から排出され、光化学スモッグ、酸性雨等を引き起こす原因となる。また、ＮＯXは、間接的に温室効果を引き起こすことが知られている。
【０００３】
現在、光触媒による分解（非特許文献１）や植物の利用（非特許文献２）により、大気汚染を低減させる試みがなされている。なかでも、植物による大気汚染の低減化は、市街地の緑化の推進と相まって、注目されている。
【０００４】
しかしながら、植物の種によっては、利用される環境下では、十分な効果を得ることができない場合があるという欠点がある。
【０００５】
一方、異種タンパク質をコードする核酸の導入により得られる植物では、得られた植物体内で目的の異種タンパク質そのものが発現しない場合や、目的の異種タンパク質が発現しても導入された植物において機能しない場合があり、十分な効果が得ることが困難であるのが現状である。
【非特許文献１】藤嶋昭、他１名  「光機能化学」、株式会社昭晃堂（２００５年４月１０日発行）
【非特許文献２】山田康之編  「遺伝子組換え植物の光と影」、学会出版センター（１９９９年発行）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、前記従来技術を鑑みてなされたものであり、１つの側面では、大気中の二酸化窒素を効率よく吸収し、併せて同化すること、木本植物が本質的に有する二酸化窒素取り込み能及び同化能よりも向上された二酸化窒素取り込み能及び同化能を発現すること、大気中のＮＯXを効率よく低減させること、市街地等の環境下においても生育し、前記二酸化窒素取り込み能及び同化能を安定的に発揮すること等の少なくとも１つを可能にする、トランスジェニック木本植物又はその子孫を提供することに関する。
【０００７】
また、本発明は、他の側面では、木本植物が本質的に有する二酸化窒素取り込み能及び同化能を、より向上させることができる、木本植物の二酸化窒素取り込み能及び同化能の向上方法を提供することに関する。
【０００８】
さらに、本発明は、別の側面では、ＮＯXを含有した大気中の該ＮＯXを効率よく低減させること、市街地等の環境下においてＮＯXの低減効果を発揮させること、ＮＯXの低減効果を長期間にわたり維持させること等の少なくとも１つを可能にする、ＮＯXを含有した大気下に生育させることを特徴とする、ＮＯXの低減方法を提供することに関する。
【０００９】
本発明の他の課題は、本明細書の記載から明らかである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕  亜硝酸還元酵素活性を有する外因性のポリペプチドをコードした核酸を発現可能に保持し、向上された二酸化窒素取り込み能及び同化能を有する、トランスジェニック木本植物又はその子孫、
〔２〕  （Ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードした塩基配列、
（Ｂ）配列番号：２において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列をコードし、かつコードされたポリペプチドが、亜硝酸還元酵素活性を示すものである塩基配列、
（Ｃ）配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸のアンチセンス鎖に、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列であり、かつコードされたポリペプチドが、亜硝酸還元酵素活性を示すものである塩基配列、及び
（Ｄ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対し、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １１、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  １、ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ  ３の条件でＢＬＡＳＴアルゴリズムでアライメントし算出された配列同一性が、少なくとも８０％であるアミノ酸配列をコードし、かつコードされたポリペプチドが、亜硝酸還元酵素活性を示すものである塩基配列、
からなる群より選ばれた塩基配列からなる核酸を含有した核酸構築物を木本植物に導入し、発現させることを特徴とする、木本植物の二酸化窒素取り込み能及び同化能の向上方法、並びに
〔３〕  前記〔１〕記載のトランスジェニック木本植物又はその子孫を、ＮＯXを含有した大気下に生育させることを特徴とする、ＮＯXの低減方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のトランスジェニック木本植物又はその子孫によれば、亜硝酸還元酵素活性を有する外因性のポリペプチドをコードした核酸を発現可能に保持しているため、大気中の二酸化窒素を効率よく吸収し、併せて同化することができるという優れた効果を奏する。また、本発明のトランスジェニック木本植物又はその子孫によれば、二酸化窒素の吸収とともに同化を行なうことができるため、大気中のＮＯXを効率よく低減させることができる。さらに、本発明のトランスジェニック木本植物又はその子孫によれば、木本植物が本質的に有する二酸化窒素取り込み能及び同化能よりも向上された二酸化窒素取り込み能及び同化能を発現することができるという優れた効果を奏する。また、本発明のトランスジェニック木本植物又はその子孫によれば、市街地等の環境下においても、二酸化窒素取り込み能及び同化能を安定的に発揮することができるという優れた効果を奏する。
【００１２】
また、本発明の木本植物の二酸化窒素取り込み能及び同化能の向上方法によれば、木本植物が本質的に有する二酸化窒素取り込み能及び同化能を、より向上させることができるという優れた効果を奏する。
【００１３】
さらに、本発明のＮＯXの低減方法によれば、本発明のトランスジェニック木本植物又はその子孫が用いられているため、市街地等の環境下においてＮＯXの低減効果を得ることができ、ＮＯXを含有した大気中の該ＮＯXを効率よく低減させることができるという優れた効果を奏する。また、本発明のＮＯXの低減方法によれば、ＮＯXの低減効果を長期間にわたり維持することができるという優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、１つの側面では、亜硝酸還元酵素活性を有する外因性のポリペプチドをコードした核酸を発現可能に保持し、向上された二酸化窒素取り込み能及び同化能を有する、トランスジェニック木本植物又はその子孫に関する。
【００１５】
本発明のトランスジェニック木本植物又はその子孫は、亜硝酸還元酵素活性を有する外因性のポリペプチドをコードした核酸を発現可能に保持していることに１つの大きな特徴がある。
【００１６】
したがって、本発明のトランスジェニック木本植物又はその子孫では、通常、天然由来の木本植物において生じうる二酸化窒素暴露による生育阻害が実質的に抑制されるという優れた性質を発現する。また、本発明のトランスジェニック木本植物又はその子孫は、天然由来の木本植物では機能の発現が困難であった亜硝酸還元酵素活性を有する外因性のポリペプチドを発現するという優れた性質を有する。
【００１７】
また、本発明のトランスジェニック木本植物又はその子孫は、亜硝酸還元酵素活性を有する外因性のポリペプチドをコードした核酸を発現可能に保持しているため、木本植物が本質的に有する二酸化窒素取り込み能及び同化能に比べ、著しく向上された二酸化窒素取り込み能とともに、著しく向上された二酸化窒素同化能をも発現するという優れた性質を有する。
【００１８】
さらに、本発明のトランスジェニック木本植物又はその子孫は、前記ポリペプチドの亜硝酸還元酵素活性が発現し、かつ植物内において、二酸化窒素の代謝に関連する他の酵素、タンパク質等の機能と、前記ポリペプチドの亜硝酸還元酵素活性とが協調的に作動しているため、大気中のＮＯXを効率よく低減させることができるという優れた効果を奏する。
【００１９】
さらに、本発明のトランスジェニック木本植物又はその子孫は、従来、トランスジェニック植物のモデル植物として用いられているシロイヌナズナ等に代表される一年生の植物に比べ、長期間にわたって生育でき、市街地等の環境下においても生育し、前記二酸化窒素取り込み能及び同化能を安定的に発揮することができる。
【００２０】
なお、本明細書において、単に「植物」と表記する場合、特に断りのない限り、かかる用語は、成熟植物個体、根、茎、葉、生殖器官（花器官及び種子を含む）等の各種器官、各種組織、植物細胞、プロトプラスト、スフェロプラスト、誘導カルス、再生個体等を意味する。
【００２１】
前記「トランスジェニック木本植物」とは、亜硝酸還元酵素活性を有する外因性のポリペプチドをコードした核酸を導入して得られた第１代のトランスジェニック木本植物、該第１代のトランスジェニック木本植物の挿し木により得られた挿し木クローン植物等を包含する概念を意味する。
【００２２】
前記挿し木クローンは、母株の一部を切り取り、これを挿し穂として、挿し床に挿して生育させることにより得られる植物である。
【００２３】
また、本明細書において、「トランスジェニック木本植物の子孫」とは、自家受粉、他の同種植物との交配等で得られた種子から得られた植物をいう。
【００２４】
前記木本植物としては、例えば、シャリンバイ、ソメイヨシノ、エンジュ、オオシマザクラ、ニセアカシア、ハイビスカスの一種、ヒメイタビ、クチナシ、イタリアポプラ、ユズリハ、クスノキ、ホルトノキ、フサアカシア、アジサイ、ケヤキ、シダレヤナギ、ギンマルバユーカリ、ウツギ、ユーカリ、カクレミノ、チャ、コナラ、サンゴジュ、コブシ、ニシキギ、ミズナラ、メタセコイア、キョウチクトウ、トウネズミモチ、トウカエデ、ラクウショウ、シラカシ、クヌギ、キリシマツツジ、アカマツ、ナツツバキ、カンツバキ、イヌガヤ、マテバシ、ネズミモチ、ヒサカキ、シイノキ、ウバメガシ、ナンキンハゼ、クロガネモチ、プラタナス、ソヨゴ、マサキ、マルバシャリンバイ、モクセイ、イスノキ、イチョウ、ハイネズ、トベラ、イチイ、ナギ、ドイツトウヒ、ハマヒサカキ、ハイビャクシン、オオムラサキ、ヤブツバキ、ヤマモモ、カナリーキヅタ、イヌマキ、モッコク、ミヤマビャクシン、ヒイラギ、ヒノキ、カイズカイブキ、スギ等が挙げられる。なかでも、様々な環境下での生育が可能である観点から、好ましくは、シャリンバイである。
【００２５】
本明細書において、前記「亜硝酸還元酵素活性を有する外因性のポリペプチドをコードした核酸」の用語は、当該核酸の導入対象となる木本植物に内在の亜硝酸還元酵素遺伝子ではなく、外的に木本植物に導入される対象となる核酸を意味する。
【００２６】
前記亜硝酸還元酵素活性を有する外因性のポリペプチドをコードした核酸は、該核酸によりコードされるポリペプチドが、木本植物内において、亜硝酸還元酵素活性を発現するものである核酸であればよい。具体的には、例えば、前記核酸が、植物又は動物由来である場合、発現効率、導入効率等の観点から、前記核酸は、好ましくは、ｃＤＮＡであることが望ましい。また、前記核酸は、亜硝酸還元酵素活性を示すポリペプチドを効率よく発現させ、亜硝酸還元酵素活性を十分に発揮させる観点から、導入対象となる植物におけるコドン使用頻度に応じ、コドンを改変したものであってもよい。
【００２７】
前記亜硝酸還元酵素活性を有する外因性のポリペプチドは、亜硝酸還元酵素活性を有するものであれば、該亜硝酸還元酵素活性以外の触媒活性を有する、いわゆる二機能酵素等であってもよい。
【００２８】
ポリペプチドの亜硝酸還元酵素活性は、例えば、レイ（Ｗｒａｙ  ＪＬ）ら〔メソッド  イン  プラント  バイオケミストリー（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第３巻、第２４１頁〜第２５６頁（１９９０）に記載の方法に準じて測定されうる。具体的には、例えば、
−  評価対象のポリペプチドを含有した試料  ４５μＬを、アッセイ溶液〔５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＮａＮＯ2、１ｍＭ  メチル・バイオロゲン〕  １９５μＬに添加し、ついで、得られた混合物に、Ｎａ2Ｓ2Ｏ4 の終濃度が、１１．５ｍＭとなるように、５７．４ｍＭ  Ｎａ2Ｓ2Ｏ4の２９０ｍＭ  ＮａＨＣＯ3溶液  ６０μＬを添加し、３０℃で５分間インキュベーションするステップ、
−  得られた反応物のうち、２０μＬ相当量の試料を、４８０μＬの水に添加し、得られた混合物を激しく混合して反応を停止させるステップ、及び
−  得られた産物に、１％（ｗ／ｖ）  スルファニルアミドの３Ｎ  ＨＣｌ溶液  ５００μＬと０．０２％（ｗ／ｖ）  Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩  ５００μＬとを添加し、５４０ｎｍにおける吸光度を測定するステップ、
を行なうことにより、亜硝酸還元酵素活性を測定することができる。本発明においては、かかる測定方法において、ポリペプチドの試料の代わりに、ポリペプチドを含有しない試料を用いた対照と比べて、５４０ｎｍにおける吸光度が、増加することが、ポリペプチドが亜硝酸還元酵素活性を有することの指標となる。
【００２９】
また、前記核酸の供給源としては、特に限定されるものではなく、例えば、シロイヌナズナ、タバコ、ホウレンソウ、白樺、トマト、ホウズキ、トウガラシ、ポプラ、マスタード、ヨーロッパアカマツ、ダイズ、インゲン、エンドウ、ミヤコグサ、オオムギ、コムギ、オート、イネ、トウモロコシ、クリバー、イチゴ、モモ、ビート等が挙げられる。なかでも、木本植物における亜硝酸還元酵素活性の発現が良好に行なわれる観点から、前記核酸は、好ましくは、シロイヌナズナに由来する亜硝酸還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸であることが望ましい。
【００３０】
前記核酸としては、具体的には、例えば、（Ａ）配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸等が挙げられる。前記（Ａ）の核酸は、シロイヌナズナ由来の亜硝酸還元酵素遺伝子（ＡＴｎｉｉ）のｃＤＮＡの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＢ００６０３２）を有するものである。
【００３１】
本発明においては、前記核酸は、木本植物内において、亜硝酸還元酵素活性を発現するものであれば、前記（Ａ）の核酸のバリアントであってもよい。前記バリアントは、前記配列番号：１の塩基配列とは異なっていても、コードされたポリペプチドについて、前記亜硝酸還元酵素活性の測定方法により評価した場合に亜硝酸還元酵素活性が検出されるものであればよい。かかるバリアントとしては、具体的には、
（Ｂ）配列番号：２において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列をコードし、かつコードされたポリペプチドが、亜硝酸還元酵素活性を示すものである塩基配列、
（Ｃ）配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸のアンチセンス鎖に、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列であり、かつコードされたポリペプチドが、亜硝酸還元酵素活性を示すものである塩基配列、
（Ｄ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対し、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １１、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  １、ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ  ３の条件でＢＬＡＳＴアルゴリズムでアライメントし算出された配列同一性が、少なくとも８０％であるアミノ酸配列をコードし、かつコードされたポリペプチドが、亜硝酸還元酵素活性を示すものである塩基配列、
等のいずれかの塩基配列を含有した核酸等が挙げられる。
【００３２】
前記（Ｂ）の核酸において、配列番号：２におけるアミノ酸残基の変異、すなわち、置換、欠失、付加又は挿入の数は、少なくとも１個、具体的には、１個又は複数個、好ましくは、１個又は数個である。なお、アミノ酸残基の置換には、アミノ酸残基の保存的置換すなわち、生理的に同等な物理化学的性質を与えるアミノ酸残基との置換も含まれる。この場合、配列番号：２における保存的置換の数は、該保存的置換を有するポリペプチドが、亜硝酸還元酵素活性を示すものであれば、上記変異の数の範囲に限定されるものではない。本明細書において、前記「生理的に同等な物理化学的性質を与えるアミノ酸残基」としては、ポリペプチドの有する生理活性、すなわち、亜硝酸還元酵素活性を維持し、かつ生体において、立体構造における形状の特徴、疎水性、電荷、ｐＫ等に関して同等の物理化学的性質を示しうるアミノ酸残基が挙げられる。より具体的には、下記グループ１〜６：
グループ１：  グリシン、アラニン；
グループ２：  バリン、イソロイシン、ロイシン；
グループ３：  アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；
グループ４：  セリン、スレオニン；
グループ５：  リジン、アルギニン；及び
グループ６：  フェニルアラニン、チロシン
のいずれかのグループに属するアミノ酸残基と、同じグループに属する他のアミノ酸残基との置換が挙げられる。なお、前記（Ｂ）の核酸には、配列番号：２において、少なくとも１個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列をコードし、かつコードされたポリペプチドが、亜硝酸還元酵素活性を示すものである塩基配列を含有した核酸も包含される。
【００３３】
前記（Ｃ）の核酸は、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸のアンチセンス鎖をプローブとして用い、慣用のハイブリダイゼーション技術により、種々の供給源の核酸から選別し、単離すること等により得られうる。ここで、ストリンジェントな条件とは、中ストリンジェントの条件、好ましくは、高ストリンジェントの条件をいう。
【００３４】
より具体的には、前記ストリンジェントな条件とは、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％  ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍｌ  変性断片化サケ精子ＤＮＡと５０％  ホルムアミドとを含む溶液中、前記配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸のアンチセンス鎖に、評価対象の核酸とを５５℃で一晩保温し、低イオン強度、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、０．１×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、例えば、３７℃以上、ストリンジェントには、４２℃以上、よりストリンジェントには、５０℃以上、より一層ストリンジェントには、６０℃以上等の条件下での洗浄を行なう条件をいい、特に、バックグラウンドの非特異的なシグナルが実質的に存在しなくなる条件をいう。なお、前記プローブとして、亜硝酸還元酵素活性を示すポリペプチドに特異的なアミノ酸配列をコードした核酸のアンチセンス鎖を用いてもよい。かかる（Ｃ）の核酸は、前記亜硝酸還元酵素活性の測定方法により評価した場合、コードされたポリペプチドが亜硝酸還元酵素活性を有することが示されるものである。また、コードされたポリペプチドが亜硝酸還元酵素活性を有することが示されるものであれば、前記（Ｃ）の核酸によりコードされたポリペプチドのアミノ酸数残基長は、は、例えば、１〜３０アミノ酸残基長、好ましくは、１〜２０アミノ酸残基長、より好ましくは、１〜１０アミノ酸残基長、さらに好ましくは、１〜５アミノ酸残基長、配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと長さが異なるものであってもよい。
【００３５】
前記（Ｄ）の核酸にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、前記配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対して、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １１、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  １、ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ  ３の条件でＢＬＡＳＴアルゴリズムでアライメントし算出した場合、配列同一性が、少なくとも８０％、好ましくは、９０％以上、より好ましくは、９５％以上、特に好ましくは、９８％以上である。前記ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、例えば、米国国立衛生研究所のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）より提供されるＢＬＡＳＴプログラム等で利用可能である。
【００３６】
前記バリアントは、自然発生バリアントであってもよく、配列番号：１に示される塩基配列を有する核酸に人為的に変異を導入して得られた人為的なバリアントであってもよい。前記人為的なバリアントは、例えば、
−  慣用の部位特異的変異導入法（ＰＣＲに基づく方法等）等により、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸の所望の位置に変異を導入して、変異導入核酸を得る工程、
−  得られた変異導入核酸を、用いる宿主に応じた適切なベクターに組込み、バリアント発現ベクターを得る工程、
−  前記バリアント発現ベクターを用いて、適切な宿主（例えば、大腸菌、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等）を形質転換して、形質転換体を得る工程、及び
−  得られた形質転換体について、亜硝酸還元酵素活性を示すポリペプチドを有する形質転換体の有無を調べて、活性を示すものを選抜する工程、
を行なうことにより得られうる。ここで、前記宿主として、木本植物の細胞、例えば、シャリンバイの細胞を用いることにより、当該核酸を、木本植物に導入した場合の機能発現を確認することもできる。
【００３７】
前記第１代のトランスジェニック木本植物は、例えば、前記亜硝酸還元酵素活性を有する外因性のポリペプチドをコードした核酸をアグロバクテリウム法により導入すること、すなわち、アグロバクテリウムを介して、前記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選ばれた塩基配列を有し、かつコードされたポリペプチドが、木本植物内において、亜硝酸還元酵素活性を発現するものである核酸を含有した核酸構築物を木本植物に導入し、発現させること等により得られうる。
【００３８】
前記第１代のトランスジェニック木本植物の作製方法は、より具体的には、例えば、
１）  前記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選ばれた塩基配列を有し、かつコードされたポリペプチドが、木本植物内において、亜硝酸還元酵素活性を発現するものである核酸を含有した核酸構築物を構築する工程、
２）  前記工程１）で得られた核酸構築物を、アグロバクテリウムに導入して、トランスフェクション用アグロバクテリウムを得る工程、
３）  前記工程２）で得られたトランスフェクション用アグロバクテリウムを用いて、木本植物の外植片又は該外植片から誘導されたカルスにトランスフェクションして、トランスフェクタントを得る工程、
４）  トランスフェクタントから再生個体を得る工程、
を含む。
【００３９】
前記工程１）では、亜硝酸還元酵素活性を有する外因性のポリペプチドをコードした核酸、すなわち、前記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選ばれ、かつコードされたポリペプチドが、木本植物内において、亜硝酸還元酵素活性を発現するものである核酸を、適切なプロモーターと、所望により、適切なターミネーターとの制御下に作動可能に連結させ、木本植物内で選別可能なマーカー遺伝子を含むベクターに連結させることにより、核酸構築物を構築する。
【００４０】
前記プロモーターとしては、特に限定されないが、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、タバコモザイクウイルスのΩ配列を含むカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター等が挙げられる。また、前記ターミネーターとしては、特に限定されないが、例えば、ノパリンシンターゼターミネーター等が挙げられる。なかでも、木本植物による二酸化窒素取り込み能及び同化能を適切に発現させる観点から、前記核酸は、好ましくは、タバコモザイクウイルスのΩ配列を含むカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターと、ノパリンシンターゼターミネーターとの制御下に作動可能に連結されていることが望ましい。
【００４１】
前記核酸構築物は、好ましくは、タバコモザイクウイルスのΩ配列を含むカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターと、ノパリンシンターゼターミネーターとの制御下に作動可能に前記核酸が連結された核酸カセットを含有したものである。
【００４２】
前記マーカー遺伝子としては、特に限定されないが、例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。
【００４３】
前記工程１）の核酸構築物の構築には、アグロバクテリウムと木本植物とにおいて保持されるバイナリーベクター等のベクターが用いられうる。前記ベクターとしては、特に限定されないが、例えば、ｐＩＧ１２１−Ｈｍ等が挙げられる。
【００４４】
前記工程２）において、アグロバクテリウムへの核酸構築物の導入は、特に限定されないが、例えば、エレクトロポレーション等により行なわれうる。
【００４５】
核酸構築物導入後のアグロバクテリウムの培養は、用いられたベクター中のマーカー遺伝子による選択に適した薬剤を含有した慣用の培地〔例えば、ＬＢ培地（組成：１％（ｗ／ｖ）  トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）  酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０））〕を用いて行なわれうる。具体的には、核酸構築物導入後のアグロバクテリウムの培養は、前記マーカー遺伝子として、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を保持したベクターを用いた場合、５０ｍｇ／Ｌ  ハイグロマイシンを補ったＬＢ培地中、２８℃で維持することにより行なわれうる。
【００４６】
前記外植片は、成熟植物から採取された組織であってもよく、無菌的に培養された植物体から採取された組織であってもよい。前記外植片は、好ましくは、無菌的に培養された植物体、例えば、より好ましくは、滅菌された容器（例えば、試験管、フラスコ等）等の内部で生育させて得られた植物体から採取された組織であることが望ましい。前記組織としては、具体的には、滅菌処理された種子を発芽させて得られた植物体から採取された組織等が挙げられる。
【００４７】
種子の発芽において、培養時間、明暗条件、温度条件、湿度条件等は、木本植物の種類に応じて適宜選択されうる。
【００４８】
種子の発芽に用いられる培地としては、木本植物の生育に適した無機成分と炭素源とを少なくとも含有し、必要に応じて、植物成長調節物質、ビタミン、アミノ酸等の成分を含有した培地が挙げられる。前記培地中における前記成分の含有量は、木本植物の生育に適した量であればよい。前記無機成分としては、窒素、リン、カリウム、ナトリウム、カルシウム、硫黄、鉄、マンガン、亜鉛、ヨウ素、ホウ素、モリブデン、塩素、コバルト等の元素を含む無機化合物等が挙げられる。炭素源としては、炭水化物、例えば、ショ糖、グルコース等が挙げられる。前記培地としては、例えば、２％（ｗ／ｖ）  シュークロース含有Ｗｏｏｄｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（以下、「ＷＰＭ」）、ムラシゲスクーグ培地等が挙げられる。なかでも、木本植物を良好に生育させることができる観点から、好ましくは、２％（ｗ／ｖ）  シュークロース含有ＷＰＭである。なお、前記２％（ｗ／ｖ）  シュークロース含有固体ＷＰＭは、ＷＰＭ〔下記表１；ロイド（Ｌｌｏｙｄ  ＧＢ）ら、Ｐｔｏｃ．Ｉｎｔ．Ｐｔａｎｔ．Ｐｒｏｐａｇａｔｏｒｓ  Ｓｏｃ．、第３０巻、第４２１頁〜第４２７頁、１９８０参照〕に対して、シュークロースを終濃度２％（ｗ／ｖ）、ジェランガム（和光純薬株式会社）を終濃度０．３％（ｗ／ｖ）となるように添加し、１Ｎ  ＫＯＨでｐＨ５．８に調整し、得られたものである。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
前記外植片としては、より具体的には、特に限定されないが、例えば、茎頂（成長点）、葉、茎、根（例えば、根端等）、種子、胚、胚軸、花粉等が挙げられる。前記外植片として、例えば、シャリンバイの胚軸を用いる場合、用いられる胚軸は、滅菌した種子を、２％（ｗ／ｖ）  シュークロースを含有した固体ＷＰＭ（ｐＨ５．８）上、蛍光灯（３０〜４０μｍｏｌ・ｍ-2ｓ-1）による１５時間の明条件と９時間の暗条件とからなる明暗条件下に、２２〜２８℃、好ましくは、２５±１℃、７０±１０％  相対湿度で培養し、発芽させ、２〜３ｍｍ長の胚軸を切り取ることにより作製されうる。
【００５１】
前記外植片からカルスを誘導させる場合、カルス化を誘導するために適した有効量の植物成長調節物質を含有した培地で該外植片を培養することにより得られうる。なお、培地中の植物成長調節物質の量、培養時間、明暗条件、温度条件、湿度条件等は、木本植物の種類に応じて適宜選択されうる。
【００５２】
前記植物成長調節物質としては、サイトカイニン、オーキシン等が挙げられる。前記サイトカイニンとしては、特に限定されないが、例えば、ベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチン、６−（ｒ，ｒ−ジメチルアラミノ）プリン、２−クロロ−４−ピリジル−フェニルウレア、１−フェニル−３−（１，２，３−チアジアゾル−５−イル）ウレア等が挙げられる。なかでも、好ましくは、ベンジルアデニンが望ましい。また、前記オーキシンとしては、特に限定されないが、例えば、ナフタレン酢酸、インドール酢酸、インドール酪酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、４−クロロ−２−メチルフェノキシ酢酸、ｐ−クロロフェノキシ酢酸、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸等が挙げられ、なかでも、好ましくは、ナフタレン酢酸が望ましい。
【００５３】
具体的には、前記外植片が、シャリンバイの胚軸である場合、該胚軸を、２．０ｍｇ／Ｌ  ベンジルアデニンと０．２ｍｇ／Ｌ  α−ナフタレン酢酸とを補った固体ＷＰＭ上で、１０日間培養すること等によりカルスが誘導されうる。
【００５４】
前記工程３）において、トランスフェクションは、適切な培地中に懸濁させたトランスフェクション用アグロバクテリウムの細菌懸濁物に、該外植片又はカルスを浸漬させ、ついで、浸漬後の外植片又はカルスを培養することにより行なわれうる。
【００５５】
かかる工程３）において、トランスフェクションの効率を向上させる観点から、好ましくは、細菌懸濁物への浸漬に先立ち、前記外植片又はカルスについて、穿刺等を行なうことにより傷をつけておくことが望ましい。
【００５６】
前記細菌懸濁物中のトランスフェクション用アグロバクテリウムの含有量は、適宜設定されうる。
【００５７】
浸漬後の外植片又はカルスにおけるアグロバクテリウムの感染は、植物成長調節物質を含有した培地、例えば、好ましくは、０．５〜５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは、２．０ｍｇ／Ｌ  ベンジルアデニンと好ましくは、０．１〜０．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは、０．２ｍｇ／Ｌ  α−ナフタレン酢酸とを補った固体ＷＰＭ等上で、適切な培養時間、適切な明暗条件、温度条件、湿度条件下に維持することにより行なわれうる。なお、培地中の植物成長調節物質の量、培養時間、明暗条件、温度条件、湿度条件等は、木本植物の種類に応じて適宜選択されうる。
【００５８】
アグロバクテリウムの感染の効率を向上させる観点から、前記培地は、好ましくは、アセトシリンゴン等をさらに含有していることが望ましい。具体的には、例えば、シャリンバイのカルスの場合、前記浸漬後のカルスを、２．０ｍｇ／Ｌ  ベンジルアデニンと１．１ｍｇ／Ｌ  α−ナフタレン酢酸と１９．６ｍｇ／Ｌ（１００μＭ）  アセトシリンゴンとを補った固体ＷＰＭ上に置き、蛍光灯（３０〜４０μｍｏｌ・ｍ-2ｓ-1）による１５時間の明条件と９時間の暗条件とからなる明暗条件下に、２５±１℃、７０±１０％  相対湿度で、約７日間培養することが望ましい。
【００５９】
さらに、目的のトランスフェクタントの選別は、培養後の産物を、用いられたベクター中のマーカー遺伝子による選択に適した薬剤を含有した培地で、適切な培養時間、適切な明暗条件、温度条件、湿度条件下にさらに培養し、生存する個体を選別することにより行なわれうる。なお、前記培地には、植物成長調節物質をさらに含有していてもよい。前記培養時間、明暗条件、温度条件、湿度条件等は、木本植物の種類に応じて適宜選択されうる。
【００６０】
前記工程４）において、再生個体は、例えば、前記工程３）で得られたトランスフェクタントを継代培養して、不定芽を形成させ、該不定芽を、発根条件下に維持して、発根した小植物体を得、その後、得られた小植物体を、適切な条件下、土壌又は人工土壌等で栽培することにより得られる。
【００６１】
前記不定芽の形成は、前記工程３）で得られたトランスフェクタントを、適切な培地、具体的には、植物成長調節物質を含有した培地、例えば、２．０ｍｇ／Ｌ  ベンジルアデニンと０．２ｍｇ／Ｌ  α−ナフタレン酢酸とを含有した固体ＷＰＭ等上で、適切な培養時間、適切な明暗条件、温度条件、湿度条件下に培養することにより行なわれうる。なお、かかる培地には、不定芽の形成を妨げないものであれば、用いられたマーカー遺伝子等の存在の検出のための薬剤等の物質、化合物等を適宜含有してもよい。木本植物が、シャリンバイの場合、例えば、トランスフェクタントを、２．０ｍｇ／Ｌ  ベンジルアデニンと１．１ｍｇ／Ｌ  α−ナフタレン酢酸と５００ｍｇ／Ｌ  カルベニシリン（和光純薬工業株式会社）と１０ｍｇ／Ｌ  ハイグロマイシンとを補充した固体ＷＰＭ上で２週間毎に継代し６週間まで培養し、ついで、２．０ｍｇ／Ｌ  ベンジルアデニンと１．１ｍｇ／Ｌ  α−ナフタレン酢酸と５００ｍｇ／Ｌ  カルベニシリン（和光純薬工業株式会社）とを補充した固体ＷＰＭ上で２週間毎に継代し６週間以上培養する。
【００６２】
前記発根条件としては、例えば、トランスフェクタントから不定芽を切り出し、得られた不定芽の切り口にオーキシンを投与（例えば、オーキシンを塗布すること、オーキシンに浸漬させること等）し、その後、適切な培地、具体的には、固体ＷＰＭ等上で、適切な培養時間、適切な明暗条件、湿度条件下に培養する条件等が挙げられる。前記培養時間、明暗条件、温度条件、湿度条件等は、木本植物の種類に応じて適宜選択されうる。発根に際して用いられうるオーキシンとしては、具体的には、例えば、インドール−３−酢酸等が挙げられる。木本植物が、シャリンバイの場合、発根は、トランスフェクションから約１３週間後のハイグロマイシン耐性不定芽（約０．５〜０．８ｃｍ）を、胚軸切片の表面から直接切り出し、得られた産物の切り口を、１ｍｇ／ｍＬ  インドール−３−酢酸中に数秒浸漬させ、ついで、浸漬後の産物を、ペトリディッシュ中の固体ＷＰＭに置き、２２〜２８℃、好ましくは、２５±１℃、７０±１０％  相対湿度で維持して根形成を行ない、その後、２２〜２８℃、好ましくは、２５±１℃、７０±１０％  相対湿度で、培養を、５〜８週間以上続けることにより、行なわれうる。その後、得られた小植物体を、培地から取り出し、根を十分に滅菌水で洗浄する。
【００６３】
成熟植物個体は、得られた小植物体を、適切な条件下、土壌又は人工土壌等で栽培することにより得られうる。具体的には、小植物体を、培地で湿らせた適切な支持体が入った滅菌プラスチック容器に植出しし、適切な温度条件、明暗条件、湿度条件下、無菌的に培養し、ついで、順化させ、鉢上げを行なうことにより、成熟植物個体を得ることができる。
【００６４】
前記支持体としては、植物体を維持しうるものであればよく、例えば、商品名：フロリアライト（株式会社サンエイ製）、パーライト、バーミキュライト、その混合物、ロックウール等が挙げられる。かかる支持体を湿らすために用いられる培地としては、ＷＰＭ、ムラシゲ−スクーグ培地、商品名：ハイポネクス溶液等が挙げられる。
【００６５】
前記順化は、木本植物の種類に応じて適宜選択でき、例えば、２０〜２５℃で２週間、その後１５〜３０℃で２週間の温度条件、７０〜９０％で２週間、その後、５０〜６０％で２週間の湿度条件、１５時間の明条件と９時間の暗条件とからなる明暗条件等の条件下に、植出し後の植物を維持することにより行なわれうる。具体的には、順化は、例えば、シャリンバイの場合、パーライトとバーミキュライトとが１：１（重量比）で入ったプラスチックポットに移して、２２±１℃、７０±１０％  相対湿度で、連続的な蛍光灯（１００μｍｏｌ・ｍ-2ｓ-1）下、０．１％（ｖ／ｖ）  ハイポネックス（商品名、株式会社ハイポネックスジャパン製）を４日毎に注水する条件下に維持すること等により行なわれうる。
【００６６】
前記挿し木クローンは、具体的には、例えば、
１）前記第１代のトランスジェニック木本植物の一部を切り取り、挿し穂を得る工程、及び
２）得られた挿し穂を挿し床に挿し、生育させる工程、
を行なうことにより得られうる。かかる挿し木クローンは、第１代の植物の遺伝学的形質と同じ形質を発現するという利点がある。
【００６７】
前記挿し穂としては、木本植物の種類等により適宜選択され得、例えば、茎、葉、葉芽、根等又はその一部が挙げられる。また、前記挿し穂は、例えば、茎の場合、発根を効率よく行なう観点、効率よく挿し木クローン植物を得る観点等から、例えば、トランスジェニック木本植物の先端部分であること、茎である場合には、節を含むこと、適切な数の葉を有すること等のいずれか又はこれらの組み合わせの条件を有するものであることが望ましい。また、前記挿し穂は、生育に際する吸水を効率よく行なわせる観点から、その切断面の面積を大きくすることが望ましい。また、前記挿し穂は、挿し床に挿すに先立ち、吸水させておくことが望ましい。
【００６８】
前記挿し床としては、土壌、人工土壌等の固体であってもよく、水、生育に必要な各種物質を含有した溶液等の液体であってもよい。前記挿し床が固体である場合、好ましくは、適切な通気性や排水性を発揮するものであることが望ましい。前記挿し床としては、具体的には、バーミキュライト、パーライトとバーミキュライトとの混合物等が挙げられる。
【００６９】
なお、本発明のトランスジェニック木本植物又はその子孫は、前記のようにして得られるものであるが、トランスジェニック植物系（２５１３）として、広島大学大学院理学研究科数理分子生命理学専攻  分子形質発現学研究室〔郵便番号：７３９−８５２６  東広島市鏡山１−３−１内〕において、保存されており、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにおける規定に準じ、特許法施行規則第２７条の３の規定に従い、その挿し木クローンとして、分譲する意思がある。
【００７０】
本発明は、他の側面では、前記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選ばれた塩基配列からなる核酸を含有した核酸構築物を木本植物に導入し、発現させることを特徴とする、木本植物の二酸化窒素取り込み能及び同化能の向上方法に関する。
【００７１】
本発明の木本植物の二酸化窒素取り込み能及び同化能の向上方法は、前記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選ばれた塩基配列からなる核酸を含有した核酸構築物が木本植物に導入し、発現させていることに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の木本植物の二酸化窒素取り込み能及び同化能の向上方法によれば、木本植物において、前記核酸によりコードされた亜硝酸還元酵素活性を有するポリペプチドを発現させることができ、かつ植物内において、二酸化窒素の代謝に関連する他の酵素、タンパク質等の機能と、前記ポリペプチドの亜硝酸還元酵素活性とを協調的に作動させることができるという優れた効果を発揮する。また、これにより、本発明の木本植物の二酸化窒素取り込み能及び同化能の向上方法によれば、木本植物において、向上された二酸化窒素取り込み能とともに、向上された二酸化窒素同化能をも発現させることができる。
【００７２】
本発明の木本植物の二酸化窒素取り込み能及び同化能の向上方法において、核酸構築物としては、前記と同様のものが挙げられる。また、核酸構築物の導入は、前記トランスジェニック木本植物又はその子孫の作製方法と同様の手法により行なわれうる。
【００７３】
本発明は、別の側面では、前記トランスジェニック木本植物又はその子孫を、ＮＯXを含有した大気下に生育させることを特徴とする、ＮＯXの低減方法に関する。
【００７４】
本発明のＮＯXの低減方法は、本発明のトランスジェニック木本植物又はその子孫が用いられていることに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明のＮＯXの低減方法によれば、市街地等の環境下においてＮＯXの低減効果を得ることができるという優れた効果を発揮する。また、本発明のＮＯXの低減方法によれば、本発明のトランスジェニック木本植物又はその子孫が用いられているため、ＮＯXを含有した大気中の該ＮＯXを効率よく低減させることができるという優れた効果を発揮する。さらに、本発明のＮＯXの低減方法によれば、従来、トランスジェニック植物のモデル植物として用いられているシロイヌナズナ等に代表される一年生の植物に比べ、長期間にわたって生育でき、市街地等の環境下においても生育できる本発明のトランスジェニック木本植物又はその子孫が用いられているため、ＮＯXの低減効果を長期間にわたり維持することができるという優れた効果を発揮する。本発明のＮＯXの低減方法によれば、街路樹として適した木本植物により、ＮＯX存在大気環境の修復を効率よく行なうことができる。
【００７５】
本発明のＮＯXの低減方法においては、１つの実施態様では、本発明のトランスジェニック木本植物又はその子孫は、成熟植物個体、又は該成熟植物個体には至らない再生個体として、ＮＯXを含有した大気下において、ＮＯXを含有した大気及びＮＯXが低減された大気が通過でき、かつ所望により、当該トランスジェニック木本植物又はその子孫を生育させる場所における規制による基準を満たす環境、例えば、トランスジーンの環境への伝播を抑止できる環境で生育させる。具体的には、本発明のトランスジェニック木本植物又はその子孫を、街路樹として、道路、公園等に植え、生育させてもよく、建築物の屋上や敷地内に植え、生育させてもよく、植物パネル等のように、木本植物の生育に適した担体に支持させ、所望の場所に配置し、生育させてもよい。
【００７６】
また、本発明のＮＯXの低減方法においては、他の実施態様では、本発明のトランスジェニック木本植物又はその子孫は、植物細胞、プロトプラスト、スフェロプラスト又は誘導カルス等として、ＮＯXを含有した大気及びＮＯXが低減された大気が通過できる半閉鎖的環境（例えば、ＮＯXを含有した大気及びＮＯXが低減された大気が通過できるフィルター等と、温度、湿度、光等の制御手段等とを備えた培養装置等）で培養することもできる。
【実施例】
【００７７】
以下、本発明を、実施例等により詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例により限定されるものではない。
【００７８】
（実施例１）
（１）プラスミドの構築
シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）由来の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ）遺伝子（ＡＴｎｉｉ）のｃＤＮＡ（配列番号：１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＢ００６０３２）を、ゲノム配列〔田中俊憲ら、ＤＮＡ  Ｓｅｑ．、第５巻、第５７頁〜第６１頁（１９９４）〕に基づき、ＰＣＲでクローニングした。
【００７９】
得られたｃＤＮＡを、ｐＥ２１１３−ＧＵＳ〔独立行政法人  農業生物資源研究所の大橋祐子博士から供与；ミツハラ（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ  Ｉ．）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、第３７巻、第４９頁〜第５９頁（１９９６）〕由来のタバコモザイクウイルスのΩ配列（オメガプロモーター）を含む改変カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターと、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）ターミネーターとに融合化し、キメラ発現カセットを得た。
【００８０】
得られたキメラ発現カセットを、キメラハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）とネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）とを含むバイナリーベクターｐＩＧ１２１−Ｈｍ（名古屋大学農学部教授  中村研三博士より供与）に挿入し、図１に示されるｐＩＧ１２１−ＡｔＮｉＲを得た。
【００８１】
（２）シャリンバイ試料の作製
広島大学東広島キャンパスで収穫されたシャリンバイ（Ｒ．ｕｍｂｅｌｌａｔａ）の種子を洗浄液で洗浄し、５％（ｗ／ｖ）  次亜塩素酸ナトリウムを用いて１時間滅菌し、滅菌水（１８．０ＭΩ）を用いて３回リンスした。
【００８２】
ついで、滅菌された種子を、プラスチックペトリディッシュ（株式会社アテクト製）中、２％（ｗ／ｖ）  シュークロース含有固体ＷＰＭに置いた。
【００８３】
なお、２％（ｗ／ｖ）  シュークロース含有固体ＷＰＭは、前記表１に示される組成のＷＰＭに対して、シュークロースを終濃度２％（ｗ／ｖ）、ジェランガム（和光純薬株式会社）を終濃度０．３％（ｗ／ｖ）となるように添加し、１Ｎ  ＫＯＨでｐＨ５．８に調整し、得られたものである。
【００８４】
ついで、ペトリディッシュを、生育チャンバー（商品名：ｍｏｄｅｌ  ＴＣＲ−５Ｐ、株式会社日本医化器械製作所製）に置き、前記種子を、蛍光灯（３０〜４０μｍｏｌ・ｍ-2ｓ-1）による１５時間の明条件と９時間の暗条件とからなる明暗条件下に、２５±１℃、７０±１０％  相対湿度で培養した。発芽後（播種後約１０日）、胚軸（２〜３ｍｍ長）を切り取り、該胚軸を、２．０ｍｇ／Ｌ  ベンジルアデニンと０．２ｍｇ／Ｌ  α−ナフタレン酢酸とを補った固体ＷＰＭ上に置き、１０日間培養した。図２のパネル（Ａ）に、シャリンバイの胚軸の典型的な写真を示す。
【００８５】
（３）アグロバクテリウムによるトランスフェクション
前記（１）で得られたｐＩＧ１２１−ＡｔＮｉＲを、凍結融解法あるいはエレクトロポレーション法により、アグロバクテリウム  トゥメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）  ＬＢＡ４４０４株に導入した。
【００８６】
その後、得られたアグロバクテリウムを、５０ｍｇ／Ｌ  ハイグロマイシンＢ（和光純薬株式会社製）と１００ｍｇ／Ｌ  リファンピシン（シグマ社製）とを補ったＬＢ培地〔組成：１％（ｗ／ｖ）  トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）  酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）〕  ３ｍＬ中、２８℃で２日間培養した。
【００８７】
得られた培養物を、３０００×ｇで３分間の遠心分離に供した。ついで、得られたペレットを、６００ｎｍにおける光学密度が約０．１となるように、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ4水溶液に懸濁させ、細菌懸濁物を得た。
【００８８】
一方、前記（２）で得られた予め１０日間培養していたシャリンバイの胚軸の頂部を、メスで穿刺した。ついで、前記胚軸を、数秒間、前記細菌懸濁物に浸漬させることにより、アグロバクテリウムによるトランスフェクションを行なった。浸漬後の胚軸を、滅菌された紙に置いて、余剰の細菌懸濁物を該紙に吸収させた。
【００８９】
前記胚軸を、ペトリディッシュ中、２．０ｍｇ／Ｌ  ベンジルアデニンと１．１ｍｇ／Ｌ  α−ナフタレン酢酸と１９．６ｍｇ／Ｌ（１００μＭ）  アセトシリンゴン（シグマ社製）とを補った固体ＷＰＭ上に置き、蛍光灯（３０〜４０μｍｏｌ・ｍ-2ｓ-1）による１５時間の明条件と９時間の暗条件とからなる明暗条件下に、２５±１℃、７０±１０％  相対湿度で、７日間培養した。
【００９０】
その後、得られた外植片を、２．０ｍｇ／Ｌ  ベンジルアデニンと１．１ｍｇ／Ｌ  α−ナフタレン酢酸と５００ｍｇ／Ｌ  カルベニシリン（和光純薬工業株式会社）と１０ｍｇ／Ｌ  ハイグロマイシンとを補った固体ＷＰＭの入ったペトリディッシュに移した。前記外植片を、同じ培地で、２週間毎に継代し、全６週間まで培養し、ついで、ハイグロマイシンを欠いている同培地中で、６週間以上継代培養した。
【００９１】
その結果、トランスフェクションから約１３週間後、アグロバクテリウムによりトランスフェクションした約４％の胚軸外植片は、図２のパネル（Ｂ）に示すようなハイグロマイシン耐性不定芽を形成した。
【００９２】
（４）トランスジェニック植物の再生
トランスフェクションから約１３週間後のシャリンバイのハイグロマイシン耐性不定芽（０．５〜０．８ｃｍ）を、胚軸切片の表面から直接切り出し、切り口を、１ｍｇ／ｍＬ  インドール−３−酢酸中に数秒浸漬させた。浸漬後の産物を、ペトリディッシュ中の固体ＷＰＭに置き、２５±１℃、７０±１０％  相対湿度で維持して根形成を行なった。その後、２５±１℃、７０±１０％  相対湿度で、培養を、５〜８週間以上続けた。その結果、図２のパネル（Ｃ）に示されるように、７０％を超える苗条は、根付いた。
【００９３】
根付いた若い植物を、培地から取り出し、根を十分に滅菌水で洗浄して、培地を除去した。ついで、前記植物を、ＷＰＭで湿らせた商品名：フロリアライト（株式会社サンエイ製）が入った滅菌プラスチック容器（商品名：アグリポット、キリンビール株式会社製）に移し、蛍光灯（３０〜４０μｍｏｌ・ｍ-2ｓ-1）による１５時間の明条件と９時間の暗条件とからなる明暗条件下に、２５±１℃、７０±１０％  相対湿度で、無菌的に、約７ヶ月以上培養した。トランスフェクションから１２ヶ月後に得られた植物を図２のパネル（Ｄ）に示す。
【００９４】
ついで、トランスフェクションから１２ヶ月後、植物を、パーライトとバーミキュライトとが１：１（重量比）で入ったプラスチックポットに移し、順化させ、ついで、該ポットを、別の生育チャンバー（ＮＭＣＩ  ｍｏｄｅｌ  ＥＲ−２０−Ａ）に置いた。植物を、２２±１℃、７０±１０％  相対湿度で、連続的な蛍光灯（１００μｍｏｌ・ｍ-2ｓ-1）下、０．１％（ｖ／ｖ）  ハイポネックス（商品名、株式会社ハイポネックスジャパン製）による４日毎の注水で、２０ヶ月以上生育させた。
【００９５】
ついで、トランスフェクションから３２ヶ月後の植物の生えたポットを、閉鎖系温室（商品名：ＮＭＣＩ  ｍｏｄｅｌ  ＢＴＨ−Ｐ１−ＴＨ）に置いた。植物を、自然光下で、２２±１℃、７０±１０％  相対湿度で、３４０±８０ｐｐｍ  ＣＯ2で、１ヶ月間、０．１％（ｖ／ｖ）  ハイポネックス（商品名）の注水で、生育させた。
【００９６】
図２のパネル（Ｅ）に、トランスフェクションから３５ヶ月後のトランスジェニック植物を示す。
【００９７】
（実施例２）
トランスジーンの確認
（１）ＤＮＡ抽出
トランスフェクションから１２ヶ月後〔図２のパネル（Ｄ）〕のシャリンバイの葉組織  約５〜１０ｍｇを、液体窒素で凍結させ、ミキサーミル〔商品名：ｍｏｄｅｌ  ＭＭ２０００；三田村理研工業株式会社製〕を用いてホモジナイズした。ついで、得られたホモジネートに、２５０μＬのＣＴＡＢ緩衝液〔３％（ｗ／ｖ）  臭化セチルトリメチルアンモニウム、１．４Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）〕を添加した。その後、前記ホモジネートを６０℃で３０分間インキュベーションした。得られた産物について、クロロホルム／イソアミルアルコール〔２４：１（体積比）〕の添加によるタンパク質変性と、２−プロパノールの添加によるＤＮＡ沈殿とを行ない、７０％（ｖ／ｖ）  エタノールで洗浄した。その後、得られたＤＮＡのペレットに、ＴＥ緩衝液〔組成：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）〕を添加し、溶解させ、全ＤＮＡ試料を得た。
【００９８】
（２）ＰＣＲ解析
５００ｎｇ相当量の前記（１）で得られた全ＤＮＡと１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）と、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2と、各０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ（タカラバイオ株式会社製）と、１．２５ＵのｒＴａｑ（タカラバイオ株式会社製）と各０．５μＭのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｎｉｉ遺伝子用プライマー対とを含有したＰＣＲ用反応混合物（２０μＬ）を用い、ＰＣＲを行なった。
【００９９】
前記Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｎｉｉ遺伝子用プライマー対は、２１８ｂｐ断片の増幅について、
5'-TGCTTGTGGGAGGATTCTTTAGTC-3'（フォワードプライマー；配列番号：３）と、
5'-TTGGCATTCTCTTCTCTACCTCAG-3'（リバースプライマー；配列番号：４）と
からなるプライマー対である。
【０１００】
ＰＣＲのサーマルプロファイルは、９４℃５分での変性、９４℃１分と６０℃２分と７２℃１分とを１サイクルの反応とする３５サイクルの反応と、７２℃３分のインキュベーションとした。
【０１０１】
その後、得られたＰＣＲ産物  ２μＬを鋳型として用い、２次ＰＣＲを、最初のＰＣＲと同様に行なった。
【０１０２】
得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により解析した。その結果を、図２のパネル（Ｆ）に示す。
【０１０３】
図２のパネル（Ｆ）に示されるように、試験した植物の全てについて、Ａｔｎｉｉ遺伝子のコーディング領域に対応する２１８ｂｐバンドがみられることがわかる。その結果、全３７個体のＰＣＲ−陽性トランスジェニック植物系が得られた。
【０１０４】
（比較例１）
（１）シロイヌナズナ試料の作製
シロイヌナズナ  エコタイプＣ２４の種子を、植物を、パーライトとバーミキュライトとが１：１（重量比）で入ったプラスチックポットに移し、生育チャンバー（ＮＭＣＩ  ｍｏｄｅｌ  ＥＲ−２０−Ａ）中、２２℃、７０％  相対湿度で、連続的な蛍光灯（７０μｍｏｌ  ｍ-2ｓ-1）下、５〜６週間生育させた。なお、４日毎に、１０．３ｍＭ  ＮＨ4ＮＯ3と９．４ｍＭ  ＫＮＯ3とを含むムラシゲ−スクーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ）培地〔ムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｔ．）ら，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．、第１５巻、第４７３頁（１９６２）〕に用いられた無機塩の１／２強度の溶液で、植物への注水を行なった。なお、ムラシゲ−スクーグ培地（ＭＳ培地）の組成を、表２に示す。
【０１０５】
【表２】
2007228858.tif 000003
【０１０６】
（比較例２）
野生型植物の栽培
トランスジェニック植物と同じ代の野生型植物を準備するため、実施例１におけるアグロバクテリウムによるトランスフェクションの開始の時に、野生型シャリンバイの栽培を開始し、培養容器、培地、培養液、生育チャンバー、時間等について、実施例１のトランスジェニック植物の場合と同じ条件下で行なった。
【０１０７】
種子を発芽させ、ペトリディッシュ中、固体ＷＰＭ上で５ヶ月間、無菌で培養し、その後、７ヶ月間、プラスチック容器中で培養を行なった。
【０１０８】
ついで、植物を、パーライトとバーミキュライトとが１：１（重量比）で入ったプラスチックポットに移し、非無菌的に２０ヶ月生育させた。ついで、前記プラスチックポットを、閉鎖系温室に移し、前記植物を１ヶ月以上生育させた。
【０１０９】
（試験例１）
亜硝酸還元酵素の発現の確認
（１）タンパク質抽出
１年齢の野生型シャリンバイの葉（約１ｇ）、１年齢のトランスジェニックシャリンバイの葉（１ｇ）及び４週齡のシロイヌナズナの葉（０．３ｇ）を、液体窒素で凍結させ、得られた産物それぞれを、乳鉢と乳棒とを用いて細かくすりつぶした。得られた産物（１００ｍｇの葉）に対して、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と２％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳと５％（ｖ／ｖ）  β−メルカプトエタノールとを含有した緩衝液  ９μＬを添加し、さらに、ホモジナイズした。得られたホモジネートを、２００００×ｇで２０分間、２回遠心分離した。ついで、上清を回収し、３０秒間超音波処理した。その後、得られた産物を、マイクロセップ遠心装置〔ポールライフサイエンシーズ（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）社製〕中、５０ｋＤ  オメガメンブレン（商品名）を用いた限外ろ過に供した。
【０１１０】
得られた濾液に、アセトンを添加し、終濃度８０容積％に調整し、得られた混合物を、−２０℃で４時間放置した。ついで、混合物を、２００００×ｇで１０分間、遠心分離し、得られたペレット（抽出されたタンパク質）を空気乾燥させた。その後、前記タンパク質を、８Ｍ  尿素と２％（ｗ／ｖ）  ３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）と２％（ｖ／ｖ）  ＩＰＧ緩衝液〔ｐＨ４〜７；ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス株式会社製〕と０．００１％（ｗ／ｖ）  ブロモフェノール・ブルーとを含む緩衝液に溶解させた。タンパク質含有量を、バイオラッド社製、商品名：ＤＣプロテインアッセイキット２を用い、ブラッドフォード法〔ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ＭＭ）ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第７２巻、第２４８頁〜第２５４頁（１９７６）〕で決定した。
【０１１１】
（２）抗体の作製
タバコの全長ＮｉＲ１  ｃＤＮＡのＰＣＲクローン化配列〔ボーチェレット（Ｖａｕｃｈｅｒｅｔ  Ｈ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、第２巻、第５５９頁〜第５６９頁（１９９２）〕を、製造者により提供されたゲートウェイプロトコールに従い、ｐＤＥＳＴTM１７ベクター〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製〕にサブクローン化した。ポリヒスチジンタグしたタバコＮｉＲ１タンパク質を、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）  ＢＬ２１−ＳＩ細胞で生産させ、ＴＡＬＯＮTMカラム〔クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社製〕を用いて、精製した。ウサギを、精製組換えＮｉＲで免疫した。ついで、ＨｉＴｒａｐアフィニティーカラム〔商品名、ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス株式会社製〕を用いて、免疫後のウサギの血清から、抗タバコＮｉＲポリクローナル抗体を精製した。
【０１１２】
（３）２次元電気泳動
前記（１）で得られた野生型シャリンバイから抽出したタンパク質（１００μｇ）、トランスジェニックシャリンバイから抽出したタンパク質（１００μｇ）及びシロイヌナズナから抽出したタンパク質（２０μｇ）を、それぞれ、１次ゲル〔商品名：Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  ＤｒｙＳｔｒｉｐ  ｐＨ４〜７、ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス株式会社社製〕に供した。商品名：Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ  ＩＩ装置〔ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス株式会社社製〕を用い、３時間の間は、３００Ｖから３，５００Ｖに直線的に増加させ、３，５００Ｖで４．５時間続けることにより、等電点電気泳動を水平に行なった。その後、等電点電気泳動ゲルを、３０分間、ＳＤＳサンプルバッファー〔組成：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、６Ｍ  尿素、３０％（ｖ／ｖ）  グリセロール、２％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳ、ブロモフェノールブルー〕で平衡化させた。ついで、平衡化後のゲルを、１０％（ｗ／ｖ）  ポリアクリルアミド−ＳＤＳスラブゲルに付け、３５ｍＡで３時間電気泳動した。
【０１１３】
２次元ゲルで分離させたタンパク質を、エレクトロブロッター〔商品名：Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  ＳＤ、バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社製〕により、メンブラン〔商品名：Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社製〕に転写させた。
【０１１４】
（４）ウエスタンブロット解析
ＰＢＳＴ溶液〔生理的食塩水に溶解させた２％（ｗ／ｖ）  脱脂乳及び０．１％（ｖ／ｖ）  ＴｗｅｅｎTM−２０〕を用いて、８時間、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜をブロックした。ついで、前記ＰＶＤＦ膜と、前記（２）で得られた抗タバコＮｉＲポリクローナル抗体とを接触させた。前記ＰＶＤＦ膜を、前記ＰＢＳＴ溶液で２回洗浄し、ついで、ヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート〔ベクターラボラトリーズ（ＶＥＣＴＯＲ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕でプローブした。その後、洗浄緩衝液中で、前記ＰＶＤＦ膜を２回洗浄した後、商品名：Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｌｕｓ〔ＮＥＮライフサイエンス（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）社製〕と商品名：ＶｅｒｓａＤｏｃ  ５０００イメージングシステム〔バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）社製〕とを用いて、免疫陽性スポットを視覚化させた。その結果を、図３に示す。
【０１１５】
図３のパネル（Ｂ）に示されるように、トランスジェニックシャリンバイの場合、ｐＩ５〜６前後の分子量約６３ｋＤａの広い免疫陽性シグナルが検出され、約８スポットが認識された。一方、図３のパネル（Ａ）に示されるように、野生型シャリンバイの場合、トランスジェニックシャリンバイのシグナルの塩基性側（約ｐＩ６）に近い非常に良く似た分子量の免疫陽性シグナル（３つの認識可能なスポット）が検出された。また、図３のパネル（Ｃ）に示されるように、シロイヌナズナの場合も、トランスジェニックシャリンバイのシグナルの酸性側（ｐＩ６未満）におけるものと同様の分子量で免疫陽性シグナル（４スポット）が検出された。したがって、導入されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＮｉＲ  ｃＤＮＡが、トランスジェニックシャリンバイで発現されたことがわかった。
【０１１６】
（試験例２）
ＮＯ2取り込み及び同化の解析
アグロバクテリウムによるトランスフェクションから約３３ヶ月後のトランスジェニック植物（シャリンバイ）と、発芽から約３３ヶ月後の野生型植物とを、閉鎖系温室内のＮＯX−燻蒸チャンバー中、自然光下で、２２±０．３℃、７０±４％  相対湿度、３４０±８０ｐｐｍ  ＣＯ2で１週間、２００±５０ｐｐｂ  15ＮＯ2（５５．６  ａｔｏｍ  ％  15Ｎ）を用いて燻蒸した。
【０１１７】
その後、各植物の上部（茎頂から１番目から４番目の葉）及び中間部（茎頂から５番目から８番目の葉）から、葉を回収した。ついで、前記葉を蒸留水で洗浄し、凍結乾燥させ、使用時まで、デシケーター内に保存した。
【０１１８】
ＮＯ2由来の全窒素（「ＴＮＮＯ２」と示す）を、マススペクトロメトリー〔商品名：Ｄｅｌｔａ  Ｃ；サーモ−フィニガン（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｎｎｉｇａｎ）社製〕直結型エレメントアナライザー〔商品名：ＥＡ１１０８  ＣＨＮＳ／Ｏ、フィルソンズ  インストゥルメンツ（Ｆｉｓｏｎｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）社製〕を用いて、乾燥させた植物葉中の窒素含量と安定同位体比を測定して両者の値からＴＮＮＯ２を算出した。また、ＮＯ2由来の還元窒素又はケルダール窒素（「ＲＮＮＯ２」と表記する）を、ケールダール法を用いて還元態窒素量を、マススペクトロメトリー〔商品名：Ｄｅｌｔａ  Ｃ；サーモ−フィニガン（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｎｎｉｇａｎ）社製〕を用いて安定同位体比を測定し、両者の値から乾燥させた植物葉中のＲＮＮＯ２を算出した。
【０１１９】
トランスジェニック植物系の典型的な結果及び該トランスジェニック植物と同じ齢（発芽から約３３ヶ月後）の野生型植物の結果を、図４に示す。なお、野生型についての数値は、３個体の平均（ＳＤ）を示し、トランスジェニック植物系の数値は、各系の植物由来の３個体の複製物の平均を示す。トランスジェニック植物系の複製物は、切り枝による挿し木により作製した。
【０１２０】
図４に示されるように、特に、トランスジェニック植物系（２５１３）は、野生型シャリンバイよりも、植物の上部及び中間部の両方において、１．６〜２．０倍高いＴＮＮＯ２及びＲＮＮＯ２を示した。すなわち、本実施例における手法によれば、キメラＡｔｎｉｉ  ｃＤＮＡが発現に適した状態で導入され、木本植物による二酸化窒素取り込み能及び同化能を適切な機能を作動させる状態で発現させうることがわかる。また、この結果は、キメラＡｔｎｉｉ  ｃＤＮＡの適切な導入及び適切な発現が、シャリンバイによるＮＯ2の取り込み及び同化を向上させることを示唆する。
【０１２１】
なお、前記トランスジェニック植物系（２５１３）は、広島大学大学院理学研究科数理分子生命理学専攻  分子形質発現学研究室〔郵便番号：７３９−８５２６  東広島市鏡山１−３−１内〕において、挿し木クローンが保存されており、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにおける規定に準じ、特許法施行規則第２７条の３の規定に従い、分譲する意思がある。
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
本発明によれば、街路樹として各地で数多く植樹されている木本植物において、従来困難であった二酸化窒素取込能及び同化能を向上させることができ、街路樹による大気中の二酸化窒素の低減を、より効率よく行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】図１は、プラスミドｐＩＧ１２１−ＡｔＮｉＲの概略図を示す。図中、「Ａｔｎｉｉ  ｃＤＮＡ」は、シロイヌナズナ亜硝酸還元酵素遺伝子のｃＤＮＡ、「Ｎｏｓ  Ｐｒｏ」は、ノパリンシンターゼ、「ｎｐｔＩＩ」は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、「ＮＯＳ」は、ノパリンシンターゼターミネーター、「３５Ｓ  Ｐｒｏ」は、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、「Ω  ｐｒｏ」は、オメガ配列を有する３５Ｓプロモーター、「ｈｐｈ」は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、「ＲＢ」は、右縁、「ＬＢ」は、左縁を示す。
【図２】図２は、シャリンバイのトランスジェニック苗条又は植物及びＰＣＲの結果の写真を示す。図２中、パネル（Ａ）は、発芽後、１０日の胚軸、パネル（Ｂ）は、トランスフェクションから、１３週間後の不定芽、パネル（Ｃ）は、トランスフェクションから２１週間後の根付いた苗条、パネル（Ｄ）は、プラスチック容器中フロリアライト上の生育するトランスフェクションから１２ヶ月後のトランスジェニック植物、及びパネル（Ｅ）は、生育チャンバーで生育するトランスフェクションから３５ヶ月後のトランスジェニック植物を示す。図中、「Ｆ」は、野生型（ＷＴ）及びトランスジェニック植物系（２５１２、２５２１、３６１、３６２、４３３１、４３４、４３７）のＰＣＲ解析の結果を示す。矢印は、シロイヌナズナ由来亜硝酸還元酵素遺伝子（Ａｔｎｉｉ）に特異的な２１８ｂｐバンドを示す。「Ｍ」は、１００ｂｐラダーマーカー、「Ｎ」は、陰性対照（鋳型ＤＮＡなし）、「Ｐ」は、陽性対照（０．９５μｇ  ｐＩＧ１２１−ＡｔＮｉＲ）を示す。
【図３】図３は、２次元ゲル電気泳動で分離したＮｉＲタンパク質のウエスタンブロット解析を示す図である。図３のパネル（Ａ）は、野生型シャリンバイから抽出したタンパク質（１００μｇ）、パネル（Ｂ）は、トランスジェニックシャリンバイから抽出したタンパク質（１００μｇ）、パネル（Ｃ）は、シロイヌナズナから抽出したタンパク質（２０μｇ）を示す。
【図４】図４は、非形質転換野生型のＴＮＮＯ２及びＲＮＮＯ２と、トランスジェニック系（２５１３）のＴＮＮＯ２及びＲＮＮＯ２とを示す。野生型は、発芽後約３３月齢であり、トランスジェニック系は、アグロバクテリウムトランスフェクション後３３月齢である。葉試料を、各植物の上部（図中、「Ｕ」；茎頂から１番目〜４番目の葉）及び中間部（図中、「Ｍ」；５番目〜８番目の葉）から切り出した。野生型のデータは、３個体の異なる木（各植物について、３個体の複製物）についての標準偏差を伴う平均を示す。トランスジェニック系のデータは、１個体の植物の３つの複製物の平均を示す。複製物間の相対変動は、５％未満である。
【配列表フリーテキスト】
【０１２４】
配列番号：３は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ亜硝酸還元酵素遺伝子の増幅用プライマーの配列を示す。
【０１２５】
配列番号：４は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ亜硝酸還元酵素遺伝子の増幅用プライマーの配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
2007228858.tif 000006
【図４】
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【配列表】
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