(57)【要約】【課題】マツタケ（Tricholoma matsutake）を利用して、安全で、長期間投与・摂取可能な、血栓症予防・治療（血栓症により誘発され得る疾患の発症予防止効果も含む）剤および食品を提供する。【解決手段】マツタケ（Tricholoma matsutake）、特にはマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株、の菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）のいずれかをそのまま、あるいはその乾燥物、あるいはそれらの抽出物（例えば熱水抽出液、アルカリ溶液抽出液）を含有する、血栓症予防・治療剤および食品。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マツタケ（Tricholoma matsutake）またはその抽出物を含む、血栓症予防・治療剤。
【請求項２】
マツタケ（T. matsutake）が菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）である、請求項１記載の血栓症予防・治療剤。
【請求項３】
マツタケ（T. matsutake）がＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株である、請求項１または２記載の血栓症予防・治療剤。
【請求項４】
マツタケ（T. matsutake）がＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の菌糸体の乾燥粉末である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の血栓症予防・治療剤。
【請求項５】
マツタケ抽出物が、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の菌糸体の熱水抽出液またはアルカリ溶液抽出液、である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の血栓症予防・治療剤。
【請求項６】
マツタケ（Tricholoma matsutake）またはその抽出物を含む、血栓症予防・治療のための食品。
【請求項７】
マツタケ（T. matsutake）が菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）である、請求項６記載の食品。
【請求項８】
マツタケ（T. matsutake）がＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株である、請求項６または７記載の食品。
【請求項９】
マツタケ（T. matsutake）がＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の菌糸体の乾燥粉末である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の食品。
【請求項１０】
マツタケ抽出物が、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の菌糸体の熱水抽出液またはアルカリ溶液抽出液、である、請求項６〜９のいずれか１項に記載の食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物やヒトにおける血栓症の予防・治療のための薬剤および食品に関する。本発明の薬剤および食品は、医薬品として投与することができるだけでなく、種々の形態、例えば、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）やいわゆる健康食品（いずれも飲料を含む）、または飼料として飲食物の形で与えることも可能である。さらには、口中に一時的に含むものの、そのほとんどを口中より吐き出す形態、例えば、歯磨き剤、洗口剤、チューインガム、うがい剤などの形で与えることも、あるいは鼻から吸引させる吸入剤の形で与えることも可能である。
【背景技術】
【０００２】
少子・高齢社会を健康で活力あるものにするため、（財）「健康・体力づくり事業財団」により、生活習慣病などを予防し、壮年期死亡の減少、健康寿命の延伸等を目標とする２１世紀における国民健康づくり運動「健康日本２１」が提唱され、生活習慣病や高齢化に伴う障害の予防・治療のため、個人が生活習慣を改善し、病気を予防する、いわゆる“ヘルスケア（健康管理）”が求められている。このような社会的背景のもと、食品や食物のもつ機能性が注目されている。
【０００３】
血栓症は生活習慣病に深く関わっており、日本人の死因トップ３に入る脳卒中、心臓疾患の主因とされ、ライフ・スタイルの欧米化や高齢社会の到来とともに、ますますの患者数増加が見込まれている。本症は血管内で形成される血栓や塞栓によって血管の狭窄や閉塞をきたし、脳や心臓、四肢などの臓器に充分な血液が供給されなくなるために、これらの組織が機能障害をきたす虚血性疾患である。たとえ死に至らなくても、後遺症は、患者の日常生活に大きな影響を及ぼす。
【０００４】
血栓症由来の代表疾患は、脳梗塞（国内の推定患者数：約１４０万人）や心筋梗塞（国内の推定患者数：約８０万人）であり、発症には動脈硬化が関連するとされている。また、慢性動脈閉塞症（国内の推定患者数：約７０万人）の発症には糖尿病や高血圧などが関連するとされ、本症が進行すると下肢に間歇性跛行症状や安静時疼痛、潰瘍、壊疽に至る。このほか、静脈の血流停滞が発症に関係する疾患には肺塞栓症やエコノミークラス症候群（国内の推定患者数：約４０００人／年）などが挙げられる。
【０００５】
血栓（血管にできる血塊）の本来の役割は、健常な血管壁傷害時に傷口を修復して止血することにある。生体内では、血栓をつくる働き（凝固系）と、溶かす働き（線溶系）がバランスをとりあっているが、なんらかの原因でそのバランスが崩れたり、血管が病的になると、さまざまな刺激により、血小板が活性化・凝集して血栓形成が優勢になる。生成した血栓は血管を閉塞して血液を正常に流さなくなり、血栓症を引き起こす。発症には遺伝的素因や環境的要素が関係しており、生成部位や大きさ、広がりなどにより、病態や予後は異なる。発症のメカニズムは複雑であり、血管壁の変化や血液性状の変化、血液のうっ滞が関与していると考えられ、血栓形成における血管壁や血小板などの相互作用が分子レベルで解析されている。
【０００６】
血栓症治療の最終目標は血栓症の症状改善ではなく、延命につながる血栓症の再発防止とされている。すなわち、本症は不可逆的な障害を起こす場合が多いので、速やかな治療が肝要とされている。一般的に、ウロキナーゼなどの血栓溶解剤、アスピリンやチクロピジンなどの抗血小板剤、へパリンやワーファリンなどの抗凝固剤が治療に用いられているが、治療域の狭さや薬物相互作用、出血性の副作用、投薬時間の影響などの問題点が指摘されている。したがって、より効果的で安全に使用できる薬剤や機能性食品が求められている。
【０００７】
ところで、きのこ類は多用な生物活性を有することから、古くから日本人の健康に寄与してきた。例えばマツタケ〔Tricholoma matsutake（S. Ito & Imai）Sing.〕については、特公昭５７−１２３０号公報（特許文献１）に、マツタケ菌糸体の液体培養物を熱水または希アルカリ溶液で抽出して得られる抽出液から分離精製されたエミタニン−５−Ａ、エミタニン−５−Ｂ、エミタニン−５−Ｃ、およびエミタニン−５−Ｄに、サルコーマ１８０細胞の増殖阻止作用があることが開示され、特許第２７６７５２１号公報（特許文献２）には、マツタケ子実体の水抽出物から分離精製された分子量２０〜２１万のタンパク質（サブユニットの分子量１０〜１１万）が抗腫瘍活性を有することが開示されている。
【０００８】
さらに、本発明者らにより、マツタケ熱水抽出液、マツタケアルカリ溶液抽出液、あるいはこれら抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分が免疫増強活性を有することが見出されている（国際公開第０１／４９３０８号パンフレット（特許文献３））。本発明者らはまた、マツタケの特定の菌糸体由来の部分精製画分にストレス負荷回復促進作用があることも見出した（特開２００３−０５０２２７号公報(特許文献４)）。
【０００９】
【特許文献１】特公昭５７−１２３０号公報
【特許文献２】特許第２７６７５２１号公報
【特許文献３】国際公開第０１／４９３０８号パンフレット
【特許文献４】特開２００３−０５０２２７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述のようにマツタケには抗腫瘍活性、免疫増強活性、ストレス負荷回復促進作用などの種々の生理活性が含まれることが見出されている。しかしながら、本発明者の知る限りにおいて、マツタケが血栓症に対して優れた予防・治療効果を有するということについては、これまで報告がされていない。
【００１１】
本発明者は、マツタケが血栓症に対し優れた予防・治療効果を有することを新たに見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明の課題は、マツタケを利用した血栓症の予防・治療剤および食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、マツタケ（Tricholoma matsutake）またはその抽出物を含む、血栓症予防・治療剤および食品に関する。
【００１４】
また本発明は、マツタケ（T. matsutake）が菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）である、上記血栓症予防・治療剤および食品に関する。
【００１５】
また本発明は、マツタケ（T. matsutake）がＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株である、上記血栓症予防・治療剤および食品に関する。
【００１６】
また本発明は、マツタケ（T. matsutake）がＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の菌糸体の乾燥粉末である、上記血栓症予防・治療剤および食品に関する。
【００１７】
また本発明は、マツタケ抽出物が、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の菌糸体の熱水抽出液またはアルカリ溶液抽出液である、上記血栓症予防・治療剤および食品に関する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、安全で、安定的に大量供給が可能な、血栓症予防・治療のための薬剤および食品が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の血栓症予防・治療剤および食品に用いられるマツタケ〔Tricholoma matsutake（S. Ito & Imai）Sing.〕は、菌糸体、培養物（Broth）、子実体のいずれの形態のものも用いることができ、生でも乾燥したものでもよい。本発明では子実体は胞子も含むものとする。これら菌糸体、培養物（Broth）、子実体の各抽出物も用いることができる。
【００２０】
本発明では特にマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株が好ましく用いられる。
【００２１】
マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株は、本出願人によって新規菌株として従前に出願され（国際公開第０２／３０４４０号パンフレット）、独立行政法人産業技術総合研究所（（旧）工業技術院生命工学研究所）に平成１２年９月１４日に寄託されている。このマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株は、京都府亀岡市で採取したマツタケＣＭ６２７１株から子実体組織を切り出し、試験管内で培養することにより菌糸体継代株を得たものであり、株式会社クレハ  生物医学研究所で維持している。
【００２２】
マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の子実体の形態は、「原色日本新菌類図鑑（１）」（今関六也・本郷次雄編、保育社、昭和３２年発行）プレート（plate）９頁および２６頁に記載のマツタケ子実体に合致するものであった。
【００２３】
マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の継代は、エビオス寒天斜面培地で実施することができる。マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の菌糸体をエビオス寒天平板培地に接種すると、白色の菌糸が放射状に密に生育し、大きなコロニーを形成する。走査型電子顕微鏡で観察すると、太さ１〜２μｍの枝状の菌糸体が無数に存在し、菌糸体側部に数μｍ程度の突起物が時々みられる。該菌株の菌糸体を大量培養する場合は、液体培地に接種し、静置培養、振盪培養、タンク培養等により行うことができる。
【００２４】
なお、マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株は、もっぱら菌糸体の形状で継代維持または培養することが可能であるが、子実体の形状となることもある。
【００２５】
マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の菌学的性質は以下のとおりである。
【００２６】
（１）麦芽エキス寒天培地における培養的・形態的性質
白色の菌糸が放射状に密に生育してコロニーを形成する。接種３０日目のコロニー径は約４ｃｍである。
【００２７】
（２）ツアペック寒天培地、オートミール寒天培地、合成ムコール寒天培地、およびフェノールオキシダーゼ反応検定用培地における培養的・形態的性質
【００２８】
上記いずれの培地においても、接種後１ヶ月経過しても菌糸の発育はほとんどみられない。
【００２９】
（３）ＹｐＳｓ寒天培地における培養的・形態的性質
白色の光沢を有し、マット状に生育する。接種３０日目の生育距離は約５ｍｍである。
【００３０】
（４）グルコース・ドライイースト寒天培地における培養的・形態的性質
白色の光沢を有し、マット状に生育する。接種３０日目の生育距離は約２ｍｍである。
【００３１】
（５）最適生育温度および生育範囲
滅菌処理した液体培地（３％グルコース、０．３％酵母エキス、ｐＨ７．０）１０ｍＬの入った１００ｍＬ容三角フラスコに、マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の種菌約２ｍｇを接種し、５〜３５℃の種々の温度でそれぞれ培養し、２８日目にフラスコから菌体を取り出し、蒸留水でよく洗浄した後に乾燥させ、質量を測定した。その結果、菌体質量は５〜１５℃の範囲で直線的に増加し、１５〜２５℃の範囲で緩やかに増加した。２７．５℃以上ではほとんど増殖しなかった。最適生育温度は１５〜２５℃である。
【００３２】
（６）最適生育ｐＨおよび生育範囲
液体培地（３％グルコース、０．３％酵母エキス）のｐＨを１モル／Ｌ塩酸または１モル／Ｌ水酸化カリウムで調整し、ｐＨ３．０〜８．０の種々の培地を調製して菌体の生育ｐＨを調べた。すなわち各培地をフィルター滅菌し、培地１０ｍＬを滅菌済１００ｍＬ容三角フラスコに分注した。マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の種菌約２ｍｇを接種後、２２℃で培養し、フラスコから菌体を取り出し、蒸留水でよく洗浄した後に乾燥させ、質量を測定した。その結果、菌体の生育限界はｐＨ３．０〜７．０、最適生育ｐＨは４．０〜６．０であった。
【００３３】
（７）対峙培養による帯線形成の有無
エビオス寒天平板培地に、マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株のブロック（約３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍ）と、公知の１３種類のマツタケ株（例えば、ＩＦＯ  ６９１５株；（財）発酵研究所）の各ブロック（約３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍ）とを、約２ｃｍ間隔に対峙して植菌し、２２℃で３週間培養した後、両コロニー境界部に帯線が生じるか否かを判定した。
【００３４】
その結果、マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株は、公知のマツタケ株（１３種類）のいずれの株に対しても明確な帯線を形成しなかった。なお、マツタケでは異株間対峙培養で帯線は生じないとされており、公知のマツタケ株（１３種類）間についても、明確な帯線を形成した組み合わせはなかった。
【００３５】
（８）栄養要求性
滅菌処理した菌根菌用合成培地（「太田培地」。Ohtaら、"Trans. Mycol. Soc. Jpn.", 31, 323-334, 1990)１０ｍＬの入った１００ｍＬ容三角フラスコに、マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の種菌約２ｍｇを接種し、２２℃で培養し、４２日目にフラスコから菌体を取り出し、蒸留水でよく洗浄した後に乾燥させ、質量を測定したところ、菌体４４１ｍｇが得られた。
【００３６】
上記菌根菌用合成培地中の炭素（Ｃ）源であるグルコースの代わりに、２８種類の糖質関連物質のいずれか１つを加えた各培地に、マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株を接種して培養し、培養終了後、菌体質量を測定した。その結果、菌体質量が多かった糖質関連物質から菌体質量が少なかった糖質関連物質を順に示せば、以下のとおりである。
【００３７】
小麦デンプン＞トウモロコシデンプン＞デキストリン＞メチルβグルコシド＞セロビオース＞マンノース＞フラクトース＞アラビノース＞ソルビトール＞グルコース＞ラクトース＞グリコーゲン＞マンニトール＞リボース＞マルトース＞トレハロース＞ガラクトース＞ラフィノース＞メリビオース＞Ｎ−アセチルグルコサミン。
【００３８】
なお、セルロース、ダルチトール、シュークロース、キシロース、メチルαグルコシド、イヌリン、イノシトール、およびソルボースでは、菌の発育はほとんどみられなかった。
【００３９】
次に、上記菌根菌用合成培地中の窒素（Ｎ）源である酒石酸アンモニウムの代わりに、１５種類の窒素関連物質のいずれか１つを加えた各培地に、マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株を接種して培養し、培養終了後、菌体質量を測定した。
【００４０】
その結果、菌体質量が多かった窒素関連物質から菌体質量が少なかった窒素関連物質を順に示せば、以下のとおりである。
【００４１】
コーンスティープリカー＞大豆ペプトン＞ミルクペプトン＞硝酸アンモニウム＞硫酸アンモニウム＞酒石酸アンモニウム＞炭酸アンモニウム＞アスパラギン＞リン酸アンモニウム＞塩化アンモニウム＞硝酸ナトリウム＞肉エキス＞酵母エキス＞カザミノ酸＞クロレラ＞トリプトーン＞硝酸カリウム。
【００４２】
さらに、上記合成培地中のミネラルおよびビタミン類のうち、特定の１成分を除去した培地に、マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株を接種して培養し、培養終了後、菌体質量を測定した。
【００４３】
その結果、塩化カルシウム・二水和物、硫酸マンガン（II）・五水和物、硫酸亜鉛・七水和物、硫酸コバルト・七水和物、硫酸銅・五水和物、硫酸ニッケル・六水和物、塩酸アミン、ニコチン酸、葉酸、ビオチン、塩酸ピリドキシン、塩化カーチニン、アデニン硫酸・二水和物、または塩酸コリンのいずれか１つを培地から除いても、菌体質量にほとんど影響がなかった。
【００４４】
一方、硫酸マグネシウム・七水和物、塩化鉄（II）、またはリン酸二水素カリウムのいずれか１つを培地から除くと、菌体質量は顕著に減少した。すなわち、マグネシウム、鉄、リン、およびカリウムは、マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の増殖に必須と考えられる。
【００４５】
（９）ＤＮＡ塩基組成（ＧＣ含量）
ＧＣ含量は４９．９％である。
【００４６】
（１０）ＲＡＰＤ法により生成するＤＮＡパターン
６種類の異なるＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction)用プライマー（１０ｍｅｒ）をそれぞれ単独で用いるＲＡＰＤ（Random Amplified Polymorphic DNA）法により生成するＤＮＡパターンについて、マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株と、公知の４４種類のマツタケ株（例えば、ＩＦＯ  ６９１５株；（財）発酵研究所）とを比較したところ、マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株は、公知のマツタケ株（４４種類）のいずれとも異なるＤＮＡパターンを示した。
【００４７】
本発明の血栓症予防・治療剤および食品は、有効成分として、（i）マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株（例えば、当該株の菌糸体、培養物（Broth）または子実体）の生のものをそのまま、あるいはこれを乾燥粉末としたもの、（ii）マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の熱水抽出液（例えば、当該株の菌糸体、培養物（Broth）または子実体の、熱水抽出液）、（iii）マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株のアルカリ溶液抽出液（例えば、当該株の菌糸体、培養物（Broth）または子実体の、アルカリ溶液抽出液）などを含む態様が好ましく例示されるが、これら例示に限定されるものではない。
【００４８】
本発明では上記（i）の態様が好ましい。
【００４９】
本発明の血栓症予防・治療剤および食品における有効成分として用いられ得るマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の菌糸体としては、例えば、培養により得られる菌糸体（すなわち培養菌糸体）と培地との混合物から適当な除去手段（例えば、濾過）により培地を除去しただけの状態で使用することもできるし、あるいは、培地を除去した後の菌糸体から適当な除去手段（例えば、凍結乾燥）により水分を除去した菌糸体乾燥物の状態で使用することもでき、さらには前記菌糸体乾燥物を粉砕した菌糸体乾燥物粉末の状態で使用することもできる。
【００５０】
本発明の血栓症予防・治療剤および食品における有効成分として用いられ得るマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の培養物（Broth）としては、例えば、培養により得られる菌糸体（すなわち培養菌糸体）と培地との混合物の状態で使用することもできるし、あるいは、前記混合物から適当な除去手段（例えば、凍結乾燥）により水分を除去した培養物（Broth）乾燥物の状態で使用することもでき、さらには前記培養物（Broth）乾燥物を粉砕した培養物（Broth）乾燥物粉末の状態で使用することもできる。
【００５１】
上記培養工程は、特に限定されるものでなく、一般にマツタケ菌を培養する方法を任意に用いることができるが、例えば、マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株（「マツタケ菌I」）を固形培地または液体培地で培養または保存してマツタケ菌IIを得る工程、前記マツタケ菌IIを静置液体培養してマツタケ菌IIIを得る工程、前記マツタケ菌IIIを振盪培養してマツタケ菌IVを得る工程、前記マツタケ菌IVを１００Ｌ未満の小型培養装置を用いて、培養液中に通気を行わない攪拌培養してマツタケ菌Vを得る工程、前記マツタケ菌Vを１００Ｌ以上の中型・大型培養装置を用いて深部攪拌培養してマツタケ菌VIを得る工程、前記マツタケ菌VIを１００Ｌ以上の中型・大型培養装置を用いて深部攪拌培養してマツタケ菌VIIを得る工程、および前記マツタケ菌VIIを１００Ｌ以上の中型・大型培養装置を用いて深部撹拌培養してマツタケ菌VIIIを得る工程、からなる培養方法（国際公開第２００４／０３８００９号パンフレット）が、マツタケ菌の生理活性を損うことなく大量生産できるという点から好適に用いられる。
【００５２】
〈マツタケ菌Iを培養または保存してマツタケ菌IIを得る工程〉
用いる培地としては、一般にマツタケ菌を培養する栄養源基質を有する培地であれば特に制限なく使用することができる。例えば、太田培地（Ohtaら、"Trans. Mycol. Soc. Jpn.", 31, 323-334, 1990）、ＭＭＮ培地（Marx, D. H., "Phytopathology", 59:153-163, 1969）、浜田培地（浜田、"マツタケ", 97-100, 1964）等が挙げられるが、これら例示に限定されるものでない。
【００５３】
固形培地用の固形化剤としては、カラギーナン、マンナン、ペクチン、寒天、カードラン、デンプン、アルギン酸等が好適例として挙げられる。これらのうち寒天が好ましい。
【００５４】
使用可能な培地の栄養源基質には、炭素源、窒素源、無機元素源などが挙げられる。
【００５５】
上記炭素源としては、米デンプン、小麦粉デンプン、バレイショデンプン、サツマイモデンプン等のデンプン類；デキストリン、アミロペクシン等の多糖類；マルトース、シュクロース等の少糖類；フラクトース、グルコース等の単糖類などが挙げられる。さらに麦芽エキスを挙げることができる。マツタケ菌の生長速度から、グルコースなどの単糖類が好ましい時期と、デンプン類が好ましい時期とがあるので、時期に応じた炭素源を選択し、必要に応じて組合せて使用する。
【００５６】
上記窒素源としては、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティーブリカー、大豆粉、大豆ペプトンなどの天然由来物質や、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素などが挙げられる。これらは単独で、あるいは組合せて用いることができる。一般に生長速度を考慮すると、天然由来物質、特に酵母エキスが好ましい。
【００５７】
上記無機元素源は、リン酸および微量元素を供給するために使用される。例を挙げると、リン酸塩のほか、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、マンガン、銅、鉄などの金属イオンの無機塩（例えば、硫酸塩、塩酸塩、硝酸塩、リン酸塩、等）があり、必要量を培地中に溶解する。
【００５８】
また、培地にビタミンＢ1などのビタミン類、アミノ酸類を添加することもできる。
【００５９】
さらに、使用するマツタケ菌の性質に応じて、植物抽出物、有機酸、核酸関連物質などを添加することができる。植物抽出物としては、果菜類、根菜類、葉菜類などの抽出物が例示される。有機酸としては、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、フマル酸、乳酸などが例示される。核酸関連物質としては、市販の核酸、核酸抽出物、酵母、酵母エキスなどが例示される。
【００６０】
固形培地を調製する場合、炭素源の使用量は、好ましくは１０〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは１０〜５０ｇ／Ｌ、特に好ましくは２０〜３０ｇ／Ｌである。
【００６１】
窒素源の使用量は、窒素元素相当量で０．００５〜０．１モル／Ｌが好ましく、より好ましくは０．００７〜０．０７モル／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０５モル／Ｌである。
【００６２】
リン酸塩の使用量は、リン元素相当量で０．００１〜０．０５モル／Ｌが好ましく、より好ましくは０．００５〜０．０３モル／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０２モル／Ｌである。さらに他の無機塩、ビタミン類、植物抽出物、有機酸、核酸関連物質など、マツタケ菌の性質に応じて適宜添加することができる。また、調製した栄養源基質溶液のｐＨを、好ましくは４〜７、より好ましくは４．５〜６．０、特に好ましくは５．０〜５．５とする。
【００６３】
〈静置液体培養〉
次に、マツタケ菌II（マツタケ菌Iを固形培地または液体培地で培養または保存したマツタケ菌）を静置液体培養してマツタケ菌IIIを製造する方法について記載する。
【００６４】
通常、１００ｍＬ〜２Ｌ容の三角フラスコを用いて行う。
【００６５】
この静置液体培養は、液体培地にマツタケ菌IIを接種することにより開始する。
【００６６】
接種したマツタケ菌IIを含有する培養液と液体培地とを合せた混合物と、接種したマツタケ菌IIを含有する培養液との体積比（「接種時拡大倍率」）が好ましくは２〜５０倍、より好ましくは３〜３０倍となる量の液体培地を使用する。
【００６７】
接種したマツタケ菌IIを含有する培養液中のマツタケ菌IIの乾燥菌糸体質量と、接種したマツタケ菌IIを含有する培養液と液体培地とを合せた混合物の体積比（「初発菌糸体濃度」）を、好ましくは０．０５〜３ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１〜２ｇ／Ｌとなるように、液体培地にマツタケ菌IIを含有する培養液を接種する。
【００６８】
該静置液体培養での培養温度は１５〜３０℃が好ましく、より好ましくは２０〜２５℃であり、培養期間は３０〜４００日間が好ましく、より好ましくは１２０〜２４０日間である。培養期間が３０日未満、あるいは４００日超では、大量培養に適した生育能を有するマツタケ菌IIIを得ることが困難となる。
【００６９】
静置液体培養後の培養液中の乾燥菌糸体含有量（単位：ｇ／Ｌ）を初発菌糸体濃度との比（「菌糸体増加率」）が、２〜２５倍となるように培養することが、生育能の点から好ましい。
【００７０】
静置液体培養に使用する液体培地は、その浸透圧を、好ましくは０．０１〜０．８ＭＰａ、より好ましくは０．０２〜０．７ＭＰａ、特に好ましくは０．０３〜０．５ＭＰａとなるように、栄養源基質を使用する。
【００７１】
静置液体培養に用いる栄養源基質として、マツタケ菌Iを培養する固形培地と同じ炭素源、窒素源、無機元素源、ビタミンＢ1などのビタミン類、アミノ酸類等を使用することができる。
【００７２】
炭素源の使用量は、好ましくは１０〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは２０〜６０ｇ／Ｌ、特に好ましくは２５〜４５ｇ／Ｌである。通常、グルコース等の単糖類を使用する。
【００７３】
窒素源の使用量は、窒素元素相当量で０．００５〜０．１モル／Ｌが好ましく、より好ましくは０．００７〜０．０７モル／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０５モル／Ｌである。
【００７４】
リン酸塩を使用する場合は、リン元素相当量で０．００１〜０．０５モル／Ｌが好ましく、より好ましくは０．００５〜０．０３モル／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０２モル／Ｌになるようにする。
【００７５】
さらに、他の無機塩、ビタミン類、植物抽出物、有機酸、核酸関連物質など、マツタケ菌の性質に応じて適宜添加することができる。
【００７６】
調製した栄養源基質溶液のｐＨを、好ましくは４〜７、より好ましくは４．５〜６．５、特に好ましくは５．０〜６．０とする。
【００７７】
マツタケ菌IIIを含有する静置液体培養による培養液の一部若しくは全部を、マツタケ菌IIを含有する培養液（若しくは培養物）と同様に静置液体培養の接種源として、再度、静置液体培養工程で使用することもできる。
【００７８】
〈振盪培養〉
次いで、マツタケ菌III（マツタケ菌IIを静置液体培養して得られたマツタケ菌）を振盪培養して、マツタケ菌IVを製造する方法について記載する。
【００７９】
通常、３００ｍＬ〜５Ｌ容の三角フラスコを用いて行う。
【００８０】
この振盪培養は、液体培地にマツタケ菌IIIを接種することにより開始する。
【００８１】
接種したマツタケ菌IIIを含有する培養液と液体培地とを合せた混合物と、接種したマツタケ菌IIIを含有する培養液との体積比（「接種時拡大倍率」）が、好ましくは２〜５０倍、より好ましくは３〜３０倍、特に好ましくは５〜１０倍となる量の液体培地を使用する。
【００８２】
なお、接種時拡大倍率に見合う培養液の量を確保するために、静置液体培養を複数の培養装置を用いて製造することもできる。
【００８３】
接種したマツタケ菌IIIを含有する培養液中のマツタケ菌IIIの乾燥菌糸体質量と、接種したマツタケ菌IIIを含有する培養液と液体培地とを合せた混合物の体積比（「初発菌糸体濃度」）を、好ましくは０．０５〜３ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１〜２ｇ／Ｌとなるように、液体培地にマツタケ菌IIIを含有する培養液を接種する。
【００８４】
振盪培養では、培養温度は１５〜３０℃が好ましく、より好ましくは２０〜２５℃であり、培養期間は７〜５０日間が好ましく、より好ましくは１４〜２８日間である。
【００８５】
振盪培養に要する動力として、通常、三角フラスコ内の培養液単位体積あたりの攪拌所要動力０．０５〜０．４ｋＷ／ｍ3を用いる。
【００８６】
静置液体培養後の培養液中の乾燥菌糸体含有量（単位：ｇ／Ｌ）と初発菌糸体濃度との比（「菌糸体増加倍率」）が２〜２５倍となるように培養することが、生育能の点で好ましい。
【００８７】
振盪培養に使用する液体培地は、その浸透圧を、好ましくは０．０１〜０．８ＭＰａ、より好ましくは０．０２〜０．７ＭＰａ、特に好ましくは０．０３〜０．５ＭＰａとなるように、栄養源基質を使用する。
【００８８】
振盪培養に用いられる栄養源基質として、マツタケ菌IIを培養する液体培地と同じ炭素源、窒素源、無機元素源、ビタミンＢ1などのビタミン類、アミノ酸類を使用することができる。
【００８９】
炭素源の使用量は、好ましくは１０〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは２０〜６０ｇ／Ｌ、特に好ましくは２５〜４５ｇ／Ｌである。通常、グルコース等の単糖類を使用する。
【００９０】
窒素源の使用量は、窒素元素相当量で０．００５〜０．１モル／Ｌが好ましく、より好ましくは０．００７〜０．０７モル／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０５モル／Ｌである。
【００９１】
リン酸塩の使用量は、リン元素相当量で０．００１〜０．０５モル／Ｌが好ましく、より好ましくは０．００５〜０．０３モル／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０２モル／Ｌになるようにする。
【００９２】
さらに、他の無機塩、ビタミン類、アミノ酸類、植物抽出物、有機酸、核酸関連物質など、マツタケ菌の性質に応じて適宜添加することができる。
【００９３】
調製した栄養源基質溶液のｐＨを、好ましくは４〜７、より好ましくは４．５〜６．５、特に好ましくは５．０〜６．０とする。
【００９４】
〈攪拌培養〉
次に、攪拌培養により、マツタケ菌V、マツタケ菌VI、マツタケ菌VII、マツタケ菌VIIIを製造する方法について記載する。
【００９５】
この攪拌培養は、液体培地にマツタケ菌（IV〜VII）を接種することにより開始する。以下の説明において、マツタケ菌IVは、マツタケ菌IIIを振盪培養して得られるマツタケ菌をいい；マツタケ菌Vは、マツタケ菌IVを１００Ｌ未満の小型培養装置を用いて培養液中に通気を行わない撹拌培養を行って得られたマツタケ菌をいい；マツタケ菌VIは、マツタケ菌Vを１００Ｌ以上の中型・大型培養装置を用いて深部撹拌培養して得られたマツタケ菌をいい；マツタケ菌VIIは、マツタケ菌VIを１００Ｌ以上の中型・大型培養装置を用いて深部撹拌培養して得られたマツタケ菌をいい；マツタケ菌VIIIは、マツタケ菌VIIを１００Ｌ以上の中型・大型培養装置を用いて深部撹拌培養して得られたマツタケ菌をいう。
【００９６】
攪拌培養で用いる液体培地は、次のようにして調製することができる。
【００９７】
栄養源基質は、振盪培養で使用する、炭素源、窒素源、無機元素源、ビタミンＢ1などのビタミン類、アミノ酸類と同じものを使用することができる。
【００９８】
炭素源の使用量は、好ましくは１０〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは２０〜６０ｇ／Ｌ、特に好ましくは２５〜４５ｇ／Ｌである。デンプン類を好ましく使用できる。
【００９９】
攪拌を行う培養液中の浸透圧に影響するグルコースなどの単糖類を併用する場合、その使用量は、好ましくは０．１〜６０ｇ／Ｌ、より好ましくは０．５〜４０ｇ／Ｌ、特に好ましくは０．７〜２０ｇ／Ｌである。
【０１００】
窒素源の使用量は、窒素元素相当量で０．００５〜０．１モル／Ｌが唖好ましく、より好ましくは０．００７〜０．０７モル／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０５モル／Ｌである。
【０１０１】
リン酸塩の使用量は、リン元素相当量で０．００１〜０．０５モル／Ｌが好ましく、より好ましくは０．００５〜０．０３モル／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０５モル／Ｌである。
【０１０２】
さらに、他の無機塩、ビタミン類、アミノ酸類、植物抽出物、有機酸、核酸関連物質など、マツタケ菌の性質に応じて適宜、添加することができる。
【０１０３】
調製した栄養源基質溶液のｐＨを、好ましくは４〜７、より好ましくは４．５〜６．５、特に好ましくは５．０〜６．０とする。
【０１０４】
攪拌培養に使用する液体培地は、その浸透圧を、好ましくは０．０１〜０．８ＭＰａ、より好ましくは０．０２〜０．７ＭＰａ、特に好ましくは０．０３〜０．５ＭＰａとなるように、栄養源基質を使用する。
【０１０５】
攪拌培養の培養温度は、１５〜３０℃、好ましくは２０〜２５℃とする。
【０１０６】
接種したマツタケ菌（IV〜VII）を含有する培養液と液体培地とを合せた混合物と、接種したマツタケ菌（IV〜VII）を含有する培養液との体積比（「接種時拡大倍率」）が、好ましくは２〜５０倍、より好ましくは３〜３０倍、特に好ましくは５〜１０倍となる量の液体培地を使用する。
【０１０７】
接種したマツタケ菌（IV〜VII）を含有する培養液中のマツタケ菌（IV〜VII）の乾燥菌糸体質量と、接種したマツタケ菌（IV〜VII）を含有する培養液と液体培地とを合せた混合物の体積比（「初発菌糸体濃度」）を、好ましくは０．０１〜５ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０５〜３ｇ／Ｌ、特に好ましくは０．１〜２ｇ／Ｌとなるように、液体培地にマツタケ菌（IV〜VII）を含有する培養液を接種する。
【０１０８】
攪拌培養で得られるマツタケ菌（V〜VII）を、さらに攪拌培養の母菌として用いる場合の培養日数は、３〜２０日間が好ましく、特には５〜１４日間である。
【０１０９】
これらの培養日数後に、マツタケ菌（V〜VII）の乾燥菌糸体含有量が、好ましくは０．５〜１０ｇ／Ｌ、より好ましくは１〜８ｇ／Ｌ、特に好ましくは１〜６ｇ／Ｌになっている培養液は、攪拌培養に適した生育能を有するマツタケ菌（V〜VII）を含有している。
【０１１０】
静置液体培養後の培養液中の乾燥菌糸体含有量（単位：ｇ／Ｌ）と初発菌糸体濃度との比（「菌糸体増加率」）が２〜２５倍となるように培養することが、生育能の点で好ましい。
【０１１１】
他方、攪拌培養で得られるマツタケ菌（V〜VIII）を、マツタケ菌糸体として分離する場合の培養日数は５〜３０日間であり、好ましくは７〜２０日間、特に好ましくは１０〜１５日間である。
【０１１２】
これらの培養日数から、炭素源の資化速度が著しく低下した時を培養終了とするのが好ましいが、適宜、製造サイクル、製造コスト等の製造形態に合せて決定することができる。
【０１１３】
静置液体培養後の培養液中の乾燥菌糸体含有量（単位：ｇ／Ｌ）と初発菌糸体濃度との比（「菌糸体増加倍率」）が３５〜１００倍となるように培養することが、工業的な生産の点で好ましい。
【０１１４】
マツタケ菌IVを含有する振盪培養で製造した培養液を、１００Ｌ以上の中型、および大型培養槽などの培養装置による攪拌培養工程で使用することもできる。
【０１１５】
攪拌培養に使用する培養装置は、通気攪拌ができ、無菌性が確保できれば特に制限なく使用することが可能で、必要に応じて通気することができ、または通気装置を装着できるものを使用する。したがって、通常の、小型、中型および大型の培養槽、またはジャーファーメンターを使用することができる。
【０１１６】
１００Ｌ未満のジャーファーメンターまたは小型培養槽を用いて、マツタケ菌IVの培養を行いマツタケ菌Vを製造する場合、液体培地中に通気せずに、攪拌培養を行うのが好ましい。１００Ｌ未満のジャーファーメンターまたは小型培養槽で通気を行って培養すると、菌糸が凝集し、成長点が欠失して母菌としての生育能が損われる場合があるからである。
【０１１７】
また、１００Ｌ以上の中型、および大型培養槽などの培養装置により工業スケールで深部攪拌培養を行う場合、必要に応じて通気を行う。この場合の通気量は０．０５〜１．０ｖｖｍ、特には０．２〜０．５ｖｖｍとするのが好ましい。
【０１１８】
攪拌培養における攪拌は、培養初期では培養液単位体積あたりの所要攪拌動力で制御する。通常、０．０１〜２ｋＷ／ｍ3、好ましくは０．０５〜１ｋＷ／ｍ3の範囲で攪拌を行うことにより、マツタケ菌糸体が良好に生育する。培養初期を過ぎれば菌が生育を始め、酸素供給量が不足し、さらに、生育した菌糸体の分散が不十分になるので、適宜、攪拌の強度を大きくすることが必要になる。当該深部攪拌では、培養初期には低通気、低撹拌速度で培養し、培養後期には高通気、高攪拌速度で培養するのが好ましい。
【０１１９】
深部攪拌培養から得られたマツタケ菌糸体の分離・回収は、常法によって行うことができる。例えば、フィルタープレスなどによる濾過、遠心分離などである。
【０１２０】
得られた菌糸体は、例えば蒸留水により充分に洗浄してから、次の熱水抽出工程を実施するのが好ましい。また抽出効率が向上するように、破砕物または粉体の状態に加工するのが好ましい。
【０１２１】
本発明の血栓症予防・治療剤および食品における有効成分として用いられ得るマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の子実体としては、例えば、子実体をそのままで、または子実体を破砕した状態で使用することもできるし、あるいは、子実体から適当な除去手段（例えば、凍結乾燥）により水分を除去した子実体乾燥物の状態で使用することもでき、さらには、前記子実体乾燥物を粉砕した子実体乾燥物粉末の状態で使用することもできる。
【０１２２】
本発明の血栓症予防・治療剤および食品における有効成分として用いられ得るマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の熱水抽出液は、例えば培養により得られるマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の菌糸体（すなわち培養菌糸体）、培養物（Ｂｒｏｔｈ）、または子実体を熱水で抽出することにより得ることができる。
【０１２３】
熱水抽出に用いる熱水の温度は、マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株に含有される血栓症予防・治療効果を示す成分が、熱水抽出液中に充分に抽出される温度である限り特に限定されるものではないが、６０〜１００℃程度が好ましく、８０〜９８℃程度がより好ましい。
【０１２４】
菌糸体または子実体を熱水抽出に用いる場合には、抽出効率が向上するように、破砕物または粉体の状態に加工することが好ましい。
【０１２５】
また抽出の際には、抽出効率が向上するように、攪拌または振盪しながら実施するのが好ましい。抽出時間は、例えば、菌糸体の状態（例えば、破砕物または粉体の状態に加工した場合にはその加工状態）、熱水の温度、または攪拌若しくは振盪の有無若しくは条件に応じて、適宜決定することができるが、通常１〜６時間程度であり、２〜３時間程度が好ましい。
【０１２６】
得られた熱水抽出液は、不要物が混在する状態で、そのまま、本発明の血栓症予防・治療剤の有効成分として用いることもできるし、あるいは不溶物を除去してから、さらにはそこから抽出液中の低分子画分（好ましくは分子量３５００以下の画分）を除去してから、本発明の血栓症予防・治療剤の有効成分として用いることもできる。
【０１２７】
本発明の血栓症予防・治療剤および食品における有効成分として用いられ得るマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株のアルカリ抽出液は、例えば、上述したマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株の熱水抽出液の製造方法において、熱水の代わりにアルカリ溶液を用いること以外は、上記熱水抽出液の製造方法に準じた方法により得ることができる。
【０１２８】
アルカリ溶液抽出に用いるアルカリ溶液としては、特に限定されるものではないが、例えば、アルカリ金属（ナトリウム、カリウムなど）の水酸化物、特には水酸化ナトリウムの水溶液を用いることができる。アルカリ溶液のｐＨは８〜１３が好ましく、９〜１２がより好ましい。アルカリ溶液抽出は０〜３０℃程度で実施するのが好ましく、０〜２５℃程度がより好ましい。抽出時間は、例えば、菌糸体残渣の状態（例えば、破砕物または粉体の状態に加工した場合にはその加工状態）、アルカリ溶液のｐＨ若しくは温度、または攪拌若しくは振盪の有無若しくは条件に応じて、適宜決定することができるが、通常３０分間〜５時間程度であり、１〜３時間程度が好ましい。得られたアルカリ溶液抽出液は、そのまま、あるいは所望により中和処理を実施してから、本発明の血栓症予防・治療剤および食品に用いる。
【０１２９】
本発明の血栓症予防・治療剤および食品は、有効成分であるマツタケ、特にはマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株、あるいはその抽出物を、単独で、あるいは所望により薬剤学的に許容し得る担体とともに、ヒトや動物に投与することができる。
【０１３０】
本発明において「血栓症予防・治療」とは、動物やヒトなどにおいて、血栓症発症の予防、血栓症発症後（病的状態）の治療を意味するが、血栓症の発症を遅延・抑制せしめる効果も含む。また血栓症により誘発され得る疾患の発症防止効果も含む。したがって、本発明の血栓症予防・治療剤および食品の投与・摂取時期は、特に限定されるものではないが、日常的に継続投与・摂取するのが好ましい。
【０１３１】
本発明における血栓症予防・治療効果は、血栓症のタイプを問うものでなく、いずれのタイプの血栓症に対しても奏功し得る。
【０１３２】
本発明の血栓症予防・治療剤および食品の投与・摂取剤型としては特に限定されるものでなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、または注射剤、外用液剤、軟膏剤、座剤、局所投与のクリーム、点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。
【０１３３】
経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、または合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、または酸化防止剤等を用いて、常法により製造することができる。
【０１３４】
非経口投与方法としては、注射（皮下、静脈内など）等が例示される。なかでも注射剤が最も好適に用いられる。
【０１３５】
例えば、注射剤の調製においては、有効成分の他に生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、または乳化剤などを任意に用いることができる。
【０１３６】
また、本発明の血栓症予防・治療剤および食品は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明の血栓症予防・治療剤および食品をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療すべき組織中に外科的に移植することができる。
【０１３７】
本発明の血栓症予防・治療剤および食品は、これに限定されるものではないが、マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株あるいはその抽出物等の有効成分を０．０１〜９９質量％、好ましくは０．１〜８０質量％の量で含有することができる。
【０１３８】
本発明の血栓症予防・治療剤および食品を用いる場合の投与・摂取量は、被投与者の年齢、性別、体重、または投与・摂取方法などに応じて適宜決定することができ、経口的にまた非経口的に投与・摂取することが可能である。
【０１３９】
また、投与・摂取形態も医薬品に限定されるものではなく、種々の形態、例えば、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）やいわゆる健康食品（いずれも飲料を含む）、または飼料として飲食物の形で与えることも可能である。さらには、口中に一時的に含むものの、そのほとんどを口中より吐き出す形態、例えば、歯磨き剤、洗口剤、チューインガム、うがい剤などの形で与えることも、あるいは鼻から吸引させる吸入剤の形で与えることも可能である。例えば、マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株あるいはその抽出物等の有効成分を、添加剤（食品添加剤など）として、所望の食品（飲料を含む）、飼料、歯磨剤、洗口剤、チューインガム、またはうがい剤等に添加することができる。
【０１４０】
なお、上記において、特定保健用食品は、その食品が持つ健康機能の表示が認められる食品（食品ごとに厚生労働省の許可を必要とする）をいい、栄養機能食品は栄養成分の機能を明記できる食品（厚生労働省が作成した規格基準を満たす必要あり）をいい、いわゆる健康食品とは上記保健機能食品以外の食品一般を広く意味するもので、健康補助食品等を含むものである。
【実施例】
【０１４１】
次に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例によってなんら限定されるものでない。
【０１４２】
（実施例１）
［マツタケ菌糸体粉末の調製］
株式会社クレハ  生物医学研究所で樹立および維持しているマツタケＣＭ６２７１株（マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株）の菌糸体を、滅菌済み培地（３％グルコース、０．３％酵母エキス、ｐＨ６．０）１００ｍＬの入った５００ｍＬ容三角フラスコ２０本に接種し、２２℃で２５０ｒｐｍの振盪培養機で４週間培養を行った。培養終了後、培養物（Broth）を濾紙濾過により菌糸体を分離し、蒸留水で充分に洗浄した後、凍結乾燥した。得られた乾燥物を粉砕して菌糸体粉末（以下、単に「ＣＭ６２７１」とも記す）２０ｇを得た。
【０１４３】
（実施例２）
［コラーゲン・エピネフィリン誘発マウス肺血栓症に対する防御効力の評価］
マウスにコラーゲンとエピネフィリン混合液を静脈内注射すると肺塞栓を形成して死亡若しくは麻痺症状を呈することが１９８３年にデ・ミノ（Di Minno）らにより報告され、血栓塞栓治療薬のスクリーニング法として汎用されている。そこで、本血栓塞栓症モデルを用い、ＣＭ６２７１の作用を調べた。
【０１４４】
（i）試験動物
日本クレア（株）から６週齢の雄性ＩＣＲマウスを購入し、１週間予備飼育の後、試験に供した。なお飼育は、温度２２±５℃、湿度５０±１０％、１２時間明暗サイクルの環境下にある飼育室で行った。
【０１４５】
（ii）血栓の誘発方法
血栓の誘発はデ・ミノ（Di Minno）らの方法に準じた（Di Minnoet et al., "J Pharmacol Exp Ther"、225: 57-60、1983）。すなわち、コラーゲン（シグマアルドリッチジャパン（株）製）とエピネフィリン（日本薬局方エピネフィリン注射液ボスミン注、第一製薬（株）製）を用い、それぞれを生理食塩水で１２００μｇ／ｍＬと１３２０μｇ／ｍＬに調整後、等量を混合してその０．２ｍＬをマウスに静脈内投与した。
【０１４６】
（iii）ＣＭ６２７１の投与
ＣＭ６２７１は、０．５％メチルセルロース４００ＣＰ（信越化学工業（株）製）溶液に懸濁したものをマウスに経口投与した。
【０１４７】
（iv）実験群構成、処置および結果
上記雄性ＩＣＲマウスを無作為にＡ〜Ｃ群の３群（各群：ｎ＝１０）に分け、
Ａ群（陰性対照群）には蒸留水（０．２ｍＬ／匹／日）を１０日間連続経口投与、
Ｂ群にはＣＭ６２７１（５００ｍｇ／ｋｇ）を１０日間連続経口投与、
Ｃ群にはＣＭ６２７１（１ｋｇ／ｋｇ）を１０日間連続経口投与し、
上記連続経口投与の最終投与後９０分間経過後、コラーゲン・エピネフィリン混液（上記(ii)に示す薬剤）を静脈内注射した。
【０１４８】
注射後、１５分間観察し、死亡若しくは麻痺した個体を計数した。結果を表１に示す。
【０１４９】
次に、マウスの肺を摘出し、１０％中性緩衝ホルムアルデヒド溶液に浸漬、固定し、パラフィン包埋した。その薄切標本をヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）およびアザン・マロリー染色し、凝集塊の存在を確認した。図１、図２にＡ群、Ｃ群の肺薄切標本（ＨＥ染色した肺病理組織）の顕微鏡写真（２０倍）をそれぞれ示す。
【０１５０】
【表１】
2007269701.tif 000003
【０１５１】
表１に示す結果から明らかなように、Ａ群（陰性対照群）では９／１０匹の死亡若しくは麻痺例が認められたが、Ｂ群、Ｃ群ではそれぞれ７／１０、５／１０匹にそれぞれ減少した。
【０１５２】
また肺の病理鑑定については、図１〜２に示す顕微鏡写真から以下のように鑑定した。
【０１５３】
Ａ群では、細静脈および肺胞毛細血管に多発性の血栓が多数みられた（図１）が、Ｃ群では細静脈および肺胞毛細血管に血栓がわずかにみられるのみで、血栓が減少しており（図２）、ＣＭ６２７１投与と病態との相関が示唆された。
【０１５４】
（実施例３）
[尾出血時間に及ぼす影響]
DejanaやHornstraらは、マウス尾血管を傷つけてから出血が止まるまでの時間を測定する方法を用いて、抗血栓作用を有する物質をスクリーニングしている（Dejana et al., "Thrombosis Res" 15: 191-197, 1979; Hornstra et al., "Prostaglandin", 21:727-738, 1981）。そこで、当該モデルに準拠して、マツタケ菌糸体の作用を評価した。
【０１５５】
（i）試験動物
実施例２と同様にして飼育した雄性ＩＣＲマウスを試験に供した。
【０１５６】
（ii）尾出血時間に及ぼす影響の評価方法
出血時間の測定はHornstraらの方法（前出文献）に準じた。すなわち、雄性ＩＣＲマウス尾先端部分と尾部先端から１．５ｃｍ離れた部分の２箇所を、剃刀で横に２ｍｍ切開後、ただちに、３７℃に保った生理食塩水中に垂直に漬けて、出血が止まるまでの時間を記録した。
【０１５７】
（iii）ＣＭ６２７１の投与
ＣＭ６２７１は、０．５％メチルセルロース４００ＣＰ（信越化学工業（株）製）溶液に懸濁したものをマウスに経口投与した。
【０１５８】
（iv）実験群構成、処置および結果
上記雄性ＩＣＲマウスを無作為にＥ〜Ｆ群の２群（各群：ｎ＝６）に分け、
Ｅ群（陰性対照群）には蒸留水（０．２ｍＬ／匹／日）を１０日間連続経口投与、
Ｆ群にはＣＭ６２７１（１ｋｇ／ｋｇ）を１０日間連続経口投与し、
上記連続経口投与の最終投与後９０分間経過後、上記（ii）に示す方法でアッセイを実施し、止血までの時間を測定した。結果を表２に示す。
【０１５９】
【表２】
2007269701.tif 000004
【０１６０】
表２に示す結果から明らかなように、ＣＭ６２７１投与により出血時間の延長が認められた。
【０１６１】
（実施例４）
［エクスビボ（ex vivo）血小板凝集活性に及ぼす影響］
血管の損傷部位においては、血小板がコラーゲンやフォンウィレブランド（ｖＷＤ；von Willebrand）因子・コラーゲン複合体を認識し、そこに粘着することで血栓形成が始まり、次いで血小板活性化に伴って、血小板顆粒から放出される物質が周囲の血小板に作用して、さらなる活性化を引き起こすという正のフィードバック（positive feedback）が生じ、血小板凝集が速やかに進行、血栓形成に至ると考えられている。事実、血栓症や糖尿病、高脂血症患者では、血小板凝集能の亢進が報告されている。
【０１６２】
上述の知見を基に、WS. Kang らは、緑茶由来の抗血栓症物質の評価を行い、当該物質の投与がエクスビボ（ex vivo）で血小板凝集能を抑制することを報告している（WS. Kang et al., ”Thrombosis Res”, 96:229-237, 1999）。そこで、ＣＭ６２７１を投与したラットから血小板を分離し、インビトロ（in vitro）凝集能を調べた。
【０１６３】
（i）試験動物
日本チャールスリバー（株）から７週齢の雄性ＳＤ（SPF/VAF Crlji:CD）ラットを購入し、１週間予備飼育の後、試験に供した。なお飼育は、温度２２±５℃、湿度５０±１０％、１２時間明暗サイクルの環境下にある飼育室で行った。
【０１６４】
（ii）抗血小板凝集活性に及ぼす影響の評価方法
抗血小板凝集活性の測定はKimuraらの方法（Kimura et al., "Arzneim Forsch Drug Res",35: 1144-1149, 1985）に準じた。
【０１６５】
すなわち、雄性ＳＤラットを無作為に２群（各群：ｎ＝６）に分け、一方の群にＣＭ６２７１  １ｇ／ｋｇ／日を、他方の群に蒸留水０．２ｍＬ／匹／日を、それぞれ１０日間連日経口投与した。最終投与前日は絶食とし、最終投与９０分間経過後、エーテル麻酔にてと殺、腹部大静脈から採血し、へパリンを５０Ｕ／ｍＬになるように加えてよく混和した後、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上層部を回収し、ＰＲＰ（＝platelet-rich plasma；多血小板血漿）とした。さらに下層部を３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して上層部を回収し、ＰＰＰ（＝platelet-poor plasma；少血小板血漿）とした。
【０１６６】
次いで、血小板凝集計付属のキュベットに３００μＬのＰＲＰまたはＰＰＰを分注して３７℃で１分間保温、次いで血小板凝集能があるコラーゲン３２．８μｇ／ｍＬ濃度またはアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）１．３μＭ  を加え、血小板凝集計を用いて波長６００ｎｍでの吸光度変化を経時的に測定した。ＰＲＰ単独群の吸光度を凝集率０％、ＰＰＰ単独群のそれを凝集率１００％とし、この間で描かれる凝集曲線の最大透過度を示す点を最大凝集時とした。このときの対照溶媒添加時の最大凝集に対する被検体添加時の最大凝集の比から抑制率を算出した。結果を表３に示す。
【０１６７】
【表３】
2007269701.tif 000005
【０１６８】
表３に示す結果から明らかなように、コラーゲン刺激、ＡＤＰ刺激いずれの場合においても、ＣＭ６２７１投与によりラット血小板の凝集能が抑制されたことが確認された。
【０１６９】
（実施例５）
［血液凝固指標に及ぼす影響］
血管系、血小板系、線溶系とともに、凝固系は血流の恒常性維持に重要な役割を担っている。血液凝固系は内因系と外因系から成り立っている。前者は第XII因子により、後者は組織因子と第VII因子により活性化が始まるが、第Ｘ因子以降は共通のメカニズムが働き、最終的にフィブリン析出（凝固）に至る。これら血液凝固系の状態を反映する代表的指標として、活性化トロンボプラスチン（ＡＰＴＴ）、プロトトロンビン時間（ＰＴ）、フィブリノーゲン（Ｆｂｇ）が汎用されている。
【０１７０】
そこで、ラットを用いて、凝固系の指標である血小板数、ＰＴおよびＦｂｇ値に及ぼすＣＭ６２７１投与の影響を調べた。
【０１７１】
（i）試験動物および試験・評価方法
実施例４と同様の処置を施したラット血液を用いて検査を実施した。すなわち、雄性ＳＤラットを無作為に２群（各群：ｎ＝６）に分け、一方の群にＣＭ６２７１  １ｇ／ｋｇ／日を、他方の群に蒸留水０．２ｍＬ／匹／日を、それぞれ１０日間連日経口投与した。最終投与前日は絶食とし、最終投与９０分間経過後、エーテル麻酔にてと殺、腹部大静脈から採血した。これら血液を被験検体として、以下の項目を分析した。
【０１７２】
血小板数の測定は、ＥＤＴＡを１ｍｇ／血液１ｍＬになるように添加してよく混和させた血液を被検体とし、多項目自動血球計数装置Sysmex KX-21（シスメックス（株）製）を用いて計測した。
【０１７３】
プロトトロンビン時間（ＰＴ）およびフィブリノーゲン（Ｆｂｇ）値は、全自動血液凝固測定装置Sysmex CA-500（シスメックス（株）製）と血液凝固検査用試薬（シスメックス（株）製）を用いて、凝固時間法により測定した。
【０１７４】
（ii）結果
結果を表４に示す。
【０１７５】
【表４】
2007269701.tif 000006
【０１７６】
表４に示す結果から明らかなように、蒸留水投与群とＣＭ６２７１投与群の血小板数およびフィブリノーゲン値は略同じであり、今回のシステムでは、ＣＭ６２７１の凝固系に及ぼす影響は低いことが示唆された。
【０１７７】
（まとめ）
マウス肺血栓症の評価系において、ＣＭ６２７１の経口投与は、コラーゲン注射による死亡もしくは麻痺症状の頻度を減少させた。さらに、ＣＭ６２７１の投与は、尾部出血時間を延長させるとともに、エクスビボ（ex vivo）血小板凝集能を減少させたが、血小板数やプロトトロンビン時間やフィブリノーゲン値にほとんど影響を及ぼさなかった。これらの成績は、ＣＭ６２７１が血小板機能阻害を通じて抗血栓作用を発揮することを示唆している。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】実施例２におけるＡ群の肺薄切標本（組織）の顕微鏡写真を示す図面代用写真である。
【図２】実施例２におけるＣ群の肺薄切標本（組織）の顕微鏡写真を示す図面代用写真である。
【図１】
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【図２】
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