(57)【要約】【課題】活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）感受性測定用の簡便で実用的なＥＩＡプレートと、その有効な利用方法を提供する。【解決手段】ＡＰＣ、好ましくは凍結乾燥保存されたＡＰＣがコーティングされており、試料、好ましくは患者血液より調製した血漿試料のＡＰＣ感受性の測定に利用できるＥＩＡプレート。このＥＩＡプレートに対して試料を添加してから反応液を加えてＡＰＣ感受性を測定すると言う、実質的に単一のステップからなるＥＩＡプレートの利用方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）がコーティングされており、試料のＡＰＣ感受性の測定に利用できることを特徴とするＥＩＡプレート。
【請求項２】
前記ＡＰＣが、凍結乾燥した状態でコーティングされていることを特徴とする請求項１に記載のＥＩＡプレート。
【請求項３】
前記ＡＰＣが、反応液中での最終濃度が５〜１５ナノモルとなるようにコーティングされていることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のＥＩＡプレート。
【請求項４】
前記ＥＩＡプレートが、ＡＰＣがコーティングされたウェル領域と、ＡＰＣがコーティングされていないウェル領域とを併せ備えることを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれかに記載のＥＩＡプレート。
【請求項５】
前記ＡＰＣ感受性の測定が、患者血液より調製した試料について行われ、かつ、血栓症の予知、早期診断あるいはハイリスク群の検出のために行われるものであることを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれかに記載のＥＩＡプレート。
【請求項６】
前記患者血液が妊娠産褥期の患者血液であり、及び／又は、前記血栓症が少なくとも深部静脈血栓（ＤＶＴ）及び／又は肺塞栓症（ＰＴＥ）を包含する静脈血栓症であることを特徴とする請求項５に記載のＥＩＡプレート。
【請求項７】
請求項１〜請求項６のいずれかに記載のＥＩＡプレートに対して、試料を添加してから反応液を加えてＡＰＣ感受性を測定すると言う、実質的に単一のステップからなるプロセスを行うことを特徴とするＥＩＡプレートの利用方法。
【請求項８】
前記ＡＰＣ感受性測定により、以下のいずれかについての、早期診断、予知又はハイリスク群の検出を行うことを特徴とする請求項７に記載のＥＩＡプレートの利用方法。
（１）血栓症
（２）静脈血栓症
（３）深部静脈血栓及び／又は肺塞栓症
（４）妊娠産褥期の患者の深部静脈血栓及び／又は肺塞栓症。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＥＩＡプレート及びその利用方法に関する。更に詳しくは、本発明は、活性化プロテインＣがコーティングされており、患者より採取・調製した試料のＡＰＣ感受性の測定に利用できるＥＩＡプレートと、このＥＩＡプレートの利用とに関する。ここにおいて「ＥＩＡプレート」とは、エンザイム・イムノ・アッセイ（Enzyme ImmunoAssay）を行うためのプレートを言う。
【背景技術】
【０００２】
近年、我が国において深部静脈血栓（ＤＶＴ）や肺塞栓症（ＰＴＥ）等の血栓症が増加している。なかでも、妊娠産褥期の深部静脈血栓・肺塞栓症（ＤＶＴ・ＰＴＥ）は重篤な合併症の一つであり、これに対する有効かつ鋭敏迅速な早期診断、予知あるいはハイリスク群の検出手段の確立が望まれている。
【０００３】
本願発明者らは、下記の非特許文献１、２等において、妊娠中に抗凝固タンパク質たる活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）に対する感受性が低下していること、血栓症を発症した例ではこの感受性が更に低下していること等の知見と共に、原因不明のタンパク質に対する感受性低下が発症原因として重要であることを既に報告している。
【０００４】
【非特許文献１】SEMINARS IN THROMBOSIS AND HEMOSTASIS VOL.25, NO.5,1999 "Detection of Decreased Response to Activated Protein C duringPregnancy by an Endogenous Thrombin Potential-Based Assay"MOTOI SUGIMURA, TAKAO KOBAYASHI, NAOHIRO KANAYAMA, TOSHIHIKO TERAO
【非特許文献２】Acta Obstet Gynecol Scand 2004; 00: 1-2"Sensitivity to activated protein C in patients with deep veinthrombosis during early puerperium period"Ryota Ohashi, Motoi Sugimura, Takakazu Kawamura, Naoaki Tamura andNaohiro Kanayama
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし上記の非特許文献１、２等においては、それらの知見に基づいてＤＶＴ・ＰＴＥの早期診断等の具体的手段をどのように構築できるか、と言う点については、必ずしも明確に指摘していない。即ち、ＤＶＴ・ＰＴＥ等に対する簡便で実用的な予備的検出手段は、未だ確立していない。
【０００６】
このような場合、従来技術としては、例えば kinetic study用の EIA reader
を利用して、ＡＰＣ感受性の測定を行うことも考えられる。しかしこの場合には、採取した患者血液に対して、遠心分離、及び血小板除去の操作に加えて、フィブリノーゲン除去（レプチラーゼ処理）等のかなり煩雑な前処理を行ってサンプルを調製する必要がある。しかも、このサンプルを EIAプレートに加えた後に、ＡＰＣを添加し、更に組織因子、合成基質（トロンビンに対する合成基質であるS-2238）及び塩化カルシウム（ＣａＣｌ２  ）を順次添加すると言う非常に多数のステップが必要である。従って非常に煩雑であり、臨床の場での即応性のある使用は困難であった。
【０００７】
そこで本発明は、上記従来技術の問題点を解消し、簡便で実用的なＡＰＣ感受性の測定体系を確立することを、解決すべき技術的課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（第１発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１発明の構成は、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）がコーティングされており、試料のＡＰＣ感受性の測定に利用できる、ＥＩＡプレートである。
【０００９】
（第２発明の構成）
上記課題を解決するための本願第２発明の構成は、前記第１発明に係るＡＰＣが、凍結乾燥した状態でコーティングされている、ＥＩＡプレートである。
【００１０】
（第３発明の構成）
上記課題を解決するための本願第３発明の構成は、前記第１発明又は第２発明に係るＡＰＣが、反応液中での最終濃度が５〜１５ナノモルとなるようにコーティングされている、ＥＩＡプレートである。
【００１１】
（第４発明の構成）
上記課題を解決するための本願第４発明の構成は、前記第１発明〜第３発明のいずれかに係るＥＩＡプレートが、ＡＰＣがコーティングされたウェル領域と、ＡＰＣがコーティングされていないウェル領域とを併せ備える、ＥＩＡプレートである。
【００１２】
（第５発明の構成）
上記課題を解決するための本願第５発明の構成は、前記第１発明〜第４発明のいずれかに係るＡＰＣ感受性の測定が、患者血液より調製した試料について行われ、かつ、血栓症の予知、早期診断あるいはハイリスク群の検出のために行われるものである、ＥＩＡプレートである。
【００１３】
（第６発明の構成）
上記課題を解決するための本願第６発明の構成は、前記第５発明に係る患者血液が妊娠産褥期の患者血液であり、及び／又は、前記血栓症が少なくとも深部静脈血栓（ＤＶＴ）及び／又は肺塞栓症（ＰＴＥ）を包含する静脈血栓症である、ＥＩＡプレートである。
【００１４】
（第７発明の構成）
上記課題を解決するための本願第７発明の構成は、第１発明〜第６発明のいずれかに係るＥＩＡプレートに対して、試料を添加してから反応液を加えてＡＰＣ感受性を測定すると言う、実質的に単一のステップからなるプロセスを行う、ＥＩＡプレートの利用方法である。
【００１５】
（第８発明の構成）
上記課題を解決するための本願第８発明の構成は、前記第７発明に係るＡＰＣ感受性測定により、以下のいずれかについての、早期診断、予知又はハイリスク群の検出を行う、ＥＩＡプレートの利用方法である。
（１）血栓症
（２）静脈血栓症
（３）深部静脈血栓及び／又は肺塞栓症
（４）妊娠産褥期の患者の深部静脈血栓及び／又は肺塞栓症。
【発明の効果】
【００１６】
（第１発明の効果）
第１発明のＥＩＡプレートにはＡＰＣがコーティングされている。その形態として、例えば第４発明のようにＡＰＣをコーティングしたウェル領域並びにＡＰＣ非コーティングのウェル領域を設けた場合について述べると、ＥＩＡプレートのこれらのウェル領域に対して試料、例えば患者血液より調製した血漿を加え、組織因子、リン脂質、ＣａＣｌ２  、トロンビンに対する発色基質の混合液を添加しトロンビンを産生させ、発色を経時的に測定することでトロンビン産生を定量する。
【００１７】
ＡＰＣをコーティングしたウェルではトロンビン産生が抑制されるが、ＡＰＣ非コーティングのウェルではトロンビン産生が抑制されず、その時点で対照のウェルと比較してＡＰＣ感受性の変化をそのまま一括測定することができる。以上の作用によって、試料のＡＰＣ感受性を極めて簡易に測定できる。
【００１８】
本願発明者は、実施例において後述するように、ＡＰＣ感受性が、ＤＶＴ及び／又はＰＴＥに対する、あるいは、更に広義には血栓傾向の検出等に対する優れた予備的あるいはリスク抽出の診断マーカーになることを見出した。従って、第１発明のＥＩＡプレートによる測定結果に基づき、抗凝固タンパク質たるＡＰＣに対する感受性の低下の有無を判定し、これにより、上記の諸症状の予知、早期診断あるいはハイリスク群の検出を容易に行うことができる。
【００１９】
（第２発明の効果）
第２発明のＥＩＡプレートにおいては、ＡＰＣが凍結乾燥した状態でコーティングされているので、比較的長期の４°Ｃ保管中などにおいてもＡＰＣが失活し難いと言う利点がある。その他にも、測定時の用時調整が不要である等の利点もある。
【００２０】
（第３発明の効果）
ＥＩＡプレートにおけるＡＰＣのコーティング密度は任意に設定することができるが、例えば反応液最終濃度で５〜１５ナノモル程度であることが好ましい。５ナノモル未満であれば、ＡＰＣ感受性の測定感度が不十分となる場合があり得る。１５ナノモルを超えると、ＡＰＣ自身の酵素活性により合成基質を切断し、トロンビン活性を正確に測定できない場合があり得る。
【００２１】
（第４発明の効果）
第４発明のように、ＥＩＡプレートが、ＡＰＣがコーティングされたウェル領域と、ＡＰＣがコーティングされていないウェル領域とを併せ備えることにより、後述するように、ＥＩＡプレートによるＡＰＣ感受性の測定が、より簡便化される。
【００２２】
（第５発明の効果）
ＥＩＡプレートによるＡＰＣ感受性の測定を行う目的は限定されないが、とりわけ、患者血液より調製した試料（例えば、血球を遠心分離した試料）を用いて、血栓傾向あるいは血栓症の予知、早期診断あるいはハイリスク群の検出等の目的のために行うことが有用である。
【００２３】
（第６発明の効果）
妊娠産褥期は過凝固状態であり、妊娠産褥期の２次線溶の亢進の結果、静脈血栓症の凝固学的マーカーとして比較的用いられる FDP-DD 値の上昇の特異性が低い。これに対し、ＡＰＣに対する感受性が妊娠中から産褥直後にかけて低下するものの、産褥期１月以内に正常に復し（前記非特許文献１にて報告）、血栓症を発症した例では更に低下している（前記の非特許文献２にて報告）。
【００２４】
これらの点に基づき、ＥＩＡプレートによるＡＰＣ感受性の測定は、とりわけ妊娠産褥期の患者血液より調製した試料について行う場合、及び／又は、少なくともＤＶＴ及び／又はＰＴＥを包含する静脈血栓症の予知、早期診断あるいはハイリスク群の検出等の目的のために行う場合に、有用性が高いと考えられる。
【００２５】
（第７発明の効果）
第７発明のＥＩＡプレートの利用方法によれば、第１発明〜第６発明のいずれかに係るＥＩＡプレートに対して試料（例えば、患者血液より調製した試料）を添加し、反応液を加えてＡＰＣ感受性を測定すると言う、実質的に単一のステップによって測定を行うことが可能である。
【００２６】
従って、前記したような既存の EIA reader 等を利用してＡＰＣ感受性の測定を行う従来技術に比較して、簡便で実用的なＡＰＣ感受性の測定体系を提供することができ、臨床の場での即応性のある使用が可能となる。
【００２７】
（第８発明の効果）
上記した第７発明のＥＩＡプレートの利用方法は、任意の目的を以て行うことができるが、特に、下記の（１）〜（４）のいずれかについての早期診断、予知又はハイリスク群の検出を行う場合に、有用性が高い。
（１）血栓症
（２）静脈血栓症
（３）深部静脈血栓及び／又は肺塞栓症
（４）妊娠産褥期の患者の深部静脈血栓及び／又は肺塞栓症。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
次に、第１発明〜第８発明を実施するための形態を、その最良の形態を含めて説明する。以下において「本発明」と言うときは、第１発明〜第８発明を包括的に指している。
【００２９】
〔活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）〕
ＡＰＣそのものは、抗凝固タンパク質として当業者に良く知られている。従ってＡＰＣのアミノ酸配列、生理活性等の説明は省略する。
【００３０】
〔ＥＩＡプレート〕
本発明のＥＩＡプレートの形状やサイズ等は限定されないが、例えば、通常のＥＩＡプレートと同様に、全体として薄板状で、多くのウェルを備えたプレートとして構成することができる。更に好ましくは、全体として半球形とすることができる。半球形のＥＩＡプレートでは、蛍光発色で見る場合の感度が向上すると言う利点がある。
【００３１】
このＥＩＡプレートにはＡＰＣがコーティングされている。より好ましくは、ＡＰＣがコーティングされたウェル領域と、ＡＰＣ非コーティングのウェル領域とを設定する。この場合、「第１発明の効果」欄で前記したように、ＥＩＡプレートの利用上の簡便性が向上する。
【００３２】
ＡＰＣとしては、予め凍結乾燥した状態のものを用いることが好ましく、これには凍結乾燥したＡＰＣの市販品も含まれるが、凍結乾燥その他の特段の前処理をしないＡＰＣを用いることも可能である。
【００３３】
ＡＰＣの凍結乾燥に当たっては、例えば、ｐＨ７．３〜７．５程度の緩衝液にＡＰＣを溶解し、これを凍結乾燥に供することができる。このＡＰＣの溶解液には、この種の生理活性タンパク質の溶解液に配合されることがある、必要又は有益な任意の添加剤を配合することもできる。
【００３４】
ＡＰＣは、ＥＩＡプレート上の、少なくともウェル表面の底部にコーティングされていれば良い。ＡＰＣのコーティングの形態は限定されない。例えば、ＡＰＣ又はその上記のような凍結乾燥物を緩衝液に溶かし、好ましくはこれをウェルに添加して陰圧・低温下でコーティングする。但し、実質的に有効である限りにおいて、例えばスプレーコーティング等の他の任意のコーティング手段も採用することができる。更に、予めＡＰＣを表面にコーティングしたフィルムを調製しておき、これをプレート上に貼付しても良い。以上のような各種形態のコーティングにおいてＡＰＣのコーティング密度は限定されないが、「第３発明の効果」欄で前記した理由から、反応液最終濃度で５〜１５ナノモル程度とすることが、特に好ましい。
【００３５】
〔供試サンプル〕
本発明のＥＩＡプレートを用いてＡＰＣ感受性の測定に供する試料の種類は、ＡＰＣ感受性の測定を行うことに何らかの意味がある試料である限りにおいて、限定されない。このような試料としては、少なくとも血漿成分が含まれていれば良い。
【００３６】
好ましくは、患者の血液や、これに血球分離処理を施した試料（血漿）等が例示される。特に任意の種類の血栓症や塞栓症が懸念される患者や、とりわけ妊娠産褥期の患者等の血液試料又は血漿試料が好ましく例示される。
【００３７】
〔ＥＩＡプレートの利用方法〕
本発明に係るＥＩＡプレートの利用方法は、上記したいずれかのＥＩＡプレートに対して、上記したいずれかの試料（好ましくは患者血液より調製した試料）を添加した後、反応液を加えてＡＰＣ感受性を測定すると言う、実質的に単一のステップからなる。
【００３８】
ここにおいて「反応液」とは、少なくとも、組織因子及びリン脂質より構成されるトロンボプラスチン、ＣａＣｌ２  、トロンビンに対する発色基質を含む。
【００３９】
「第１発明の効果」欄で前記したところを更に具体的に述べると、ＥＩＡプレートに加えた試料中の第Ｖ凝固因子、第VIII凝固因子がＡＰＣと結合した後、反応液に含まれるトロンボプラスチン（組織因子及びリン脂質より構成される）により凝固反応が惹起されるが、ＡＰＣ非コーティングのウェル領域ではトロンビン産生は抑制されないのに対し、ＡＰＣコーティングのウェル領域ではトロンビン産生は抑制される。この結果を経時的連続測定のできる EIA reader 装置によって検出し、そのデータからＡＰＣ感受性が測定される。
【００４０】
ＡＰＣ感受性の測定を行う目的は限定されないが、特に、一般的な血栓症や塞栓症についての、あるいは特に、妊娠産褥期の患者の深部静脈血栓及び／又は肺塞栓症についての、早期診断、予知又はハイリスク群の検出を行うと言う目的が有用である。
【実施例】
【００４１】
次に本発明の実施例を説明する。本発明の技術的範囲がこれらの実施例によって限定されないことは、もちろんである。
【００４２】
（実施例１：供試サンプルの調製）
表１に示すように、ＤＶＴ／ＰＴＥを発症した妊娠産褥期の患者群６名、及びＤＶＴ／ＰＴＥを発症していない正常妊娠の患者群３０名について、それぞれ、本人の了解を得て採血し、それらの血液を３０００ r.p.m. で１０分間の遠心分離に供して血球を除去することにより、血漿を得た。
〔表１〕
DVT/PTE 群(N＝6)           正常妊娠群(N＝30)       
年齢                   28.9 ± 5.3       28.8 ± 4.2     N.S.
BMI                   33.5 ± 2.3       24.0 ± 3.0     P ＜0.05
Ht [％]                 34 ± 2.3         34.2 ± 4.5      N.S.
Plt[×104 μl]         32.9 ± 4.7         29.9 ± 6.8     N.S.
FDP-dimer[μg/ml]     11.2 ± 4.6         N.E.
TAT[ng/ml]             8.7 ± 4.2         N.E.
APC-sr                 3.34 ± 1.0       2.0 ± 1.1       P ＜0.05
N.E.: not examined
（実施例２：ＥＩＡプレートを用いたＡＰＣ感受性の測定）
一方、本発明のＥＩＡプレート（ＡＰＣを反応液最終濃度で５．９ナノモルとなるように凍結乾燥コーティングしたもの）を必要数準備し、これらの各ＥＩＡプレート上におけるＡＰＣコーティングのウェル領域とＡＰＣ非コーティングのウェル領域とのそれぞれ等しい数のウェルに対して、上記の合計３６名の患者に係る各血漿サンプルをそれぞれ１５０μＬずつ添加した。次いで３７°Ｃの恒温水槽上で１５分間静置した。
【００４３】
次に、それぞれのＥＩＡプレートに対して３５０μＬずつの反応液を加えて、 EIA reader （オランダ・ Thrombinoscope 社製の EIA kinetic reader ）を用いて測定を行った。この反応液は、前記したように、トロンボプラスチン、ＣａＣｌ２  、トロンビンに対する発色基質（蛍光基質）を含むものである。
【００４４】
上記の測定結果に基づき、各ＥＩＡプレートについて、ＡＰＣコーティングのウェル領域における血漿サンプルのトロンビン産生の測定値をＡＰＣ非コーティングのウェル領域における血漿サンプルのトロンビン産生の測定値で除算した。  なお、対照として、健常男性の血液から実施例１と同様にして調製した血漿サンプルについても、ＥＩＡプレートを用いた同上のＡＰＣ感受性の測定を行い、その場合の、ＡＰＣコーティングのウェル領域における血漿サンプルのトロンビン産生の測定値をＡＰＣ非コーティングのウェル領域における血漿サンプルのトロンビン産生の測定値で除算した結果を得た。そして、この対照の結果を用いて、上記の実施例２の測定結果を補正する過程を同時に行った。
【００４５】
以上により得られた、ＤＶＴ／ＰＴＥ発症妊娠産褥期患者群６名と、ＤＶＴ／ＰＴＥを発症していない正常妊娠の患者群３０名とについてのＡＰＣ感受性測定値の平均値を表１に示す（表１の「APC-sr」の項）。表１では、ＤＶＴ／ＰＴＥ発症妊娠産褥期患者群は、「ＤＶＴ／ＰＴＥ群」と表記し、ＤＶＴ／ＰＴＥを発症していない正常妊娠の患者群は、「正常妊娠群」と表記した。なお、これとは別に、参考のために表１に示す「ＢＭＩ」、「Ｈｔ [％] 」等の項目についても、常法に従い測定データを得ているので、それらのデータも併せ示した。
【００４６】
なお、上記のＤＶＴ／ＰＴＥ群と正常妊娠群とについては、前記した従来法を用いた方法によるＡＰＣの感受性測定も行った。その具体的な測定結果のデータは省略するが、上記の表１とほぼ同等の結果を得ている。
【００４７】
従って、本発明のＥＩＡプレートを用いたＡＰＣ感受性測定は、簡便で実用的なため臨床の場での即応性のある使用が可能であり、かつ、従来法との対比から測定結果の信頼性もあることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明により、ＡＰＣ感受性測定用の簡便で実用的な新規ＥＩＡプレートと、その有効な利用方法が提供される。