(57)【要約】【課題】  安価な原料であるエチレングリコールからの、酵素または微生物を用いた効率的なグリオキシル酸の製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】  エチレングリコールに、エチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有する酸化酵素又は微生物、グリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換する能力を有する酸化酵素又は微生物、及び、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する能力を有する酸化酵素又は微生物を作用させてグリオキシル酸を生成させる。または、エチレングリコールに、エチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有する酸化酵素又は微生物、グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する能力を有する酸化酵素又は微生物、及び、グリコール酸をグリオキシル酸へ変換する能力を有する酸化酵素又は微生物を作用させてグリオキシル酸を生成させる。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エチレングリコールをグリオキシル酸へ変換するグリオキシル酸の製造方法であって、下記第１反応、第２反応および第３反応からなる酸化反応を連続して行うことを特徴とする製造方法：
（第１反応）エチレングリコールに、エチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有する酸化酵素（オキシダーゼ）、又は、当該酸化酵素を産生する微生物の培養物若しくはその処理物を作用させてグリコールアルデヒドを生成させる。
（第２反応）第１反応で生じたグリコールアルデヒドに、グリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換する能力を有する酸化酵素（オキシダーゼ）、又は、当該酸化酵素を産生する微生物の培養物若しくはその処理物を作用させてグリオキサールを生成させる。
（第３反応）第２反応で生じたグリオキサールに、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する能力を有する酸化酵素（オキシダーゼ）、又は、当該酸化酵素を産生する微生物の培養物若しくはその処理物を作用させてグリオキシル酸へ変換する。
【請求項２】
エチレングリコールをグリオキシル酸へ変換するグリオキシル酸の製造方法であって、下記第１反応、第２反応および第３反応からなる酸化反応を連続して行うことを特徴とする製造方法。
（第１反応）エチレングリコールに、エチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有する酸化酵素（オキシダーゼ）、又は、当該酸化酵素を産生する微生物の培養物若しくはその処理物を作用させてグリコールアルデヒドを生成させる。
（第２反応）第１反応で生じたグリコールアルデヒドに、グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する能力を有する酸化酵素（オキシダーゼ）、又は、当該酸化酵素を産生する微生物の培養物若しくはその処理物を作用させてグリコール酸を生成させる。
（第３反応）第２反応で生じたグリコール酸に、グリコール酸をグリオキシル酸へ変換する能力を有する酸化酵素（オキシダーゼ）、又は、当該酸化酵素を産生する微生物の培養物若しくはその処理物を作用させてグリオキシル酸を生成させる。
【請求項３】
エチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有する酸化酵素が、アルコールオキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ、及び、アスペルギルス・オクラゼウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）から得られる酸化酵素からなる群から選ばれる少なくとも１つの酸化酵素である請求項１および２のいずれか記載のグリオキシル酸の製造方法。
【請求項４】
前記アルコールオキシダーゼがピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、トルロプシス（Ｔｏｌｕｒｏｐｓｉｓ）属、及び、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属からなる群から選ばれる少なくとも１つの微生物から得られるアルコールオキシダーゼであり、前記グリセロールオキシダーゼがアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する微生物から得られるグリセロールオキシダーゼである請求項３記載のグリオキシル酸の製造方法。
【請求項５】
グリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換する能力を有する酸化酵素が、リゾビアレス（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）目、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、及び、パエニバシルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属からなる群から選ばれる少なくとも１つの微生物から得られる酸化酵素である請求項１、３および４のいずれか記載のグリオキシル酸の製造方法。
【請求項６】
グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する能力を有する酸化酵素が、ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、セルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、及び、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属からなる群から選ばれる少なくとも１つの微生物から得られる酸化酵素である請求項１、３、４および５のいずれか記載のグリオキシル酸の製造方法。
【請求項７】
グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する能力を有する酸化酵素が、ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、セルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、及び、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属からなる群から選ばれる少なくとも１つの微生物から得られる酸化酵素である請求項２、３および４のいずれか記載のグリオキシル酸の製造方法。
【請求項８】
グリコール酸をグリオキシル酸へ変換する能力を有する酸化酵素が、グリコール酸オキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ、及び、２−ヒドロキシ酸オキシダーゼからなる群から選ばれる少なくとも１つの酸化酵素である請求項２、３、４および７のいずれか記載のグリオキシル酸の製造方法。
【請求項９】
前記２−ヒドロキシ酸オキシダーゼがアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物から得られる（Ｄ）−２−ヒドロキシ酸オキシダーゼである請求項８記載のグリオキシル酸の製造方法。
【請求項１０】
エチレングリコールを含む反応液に、エチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有する酸化酵素又は当該酸化酵素を産生する微生物の培養物若しくはその処理物、グリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換する能力を有する酸化酵素又は当該酸化酵素を産生する微生物の培養物若しくはその処理物、および、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する能力を有する酸化酵素又は当該酸化酵素を産生する微生物の培養物若しくはその処理物を添加して、同一反応容器中、第１反応、第２反応および第３反応を同時進行させて行うことからなる請求項１、３、４、５および６のいずれか記載のグリオキシル酸の製造方法。
【請求項１１】
エチレングリコールを含む反応液に、エチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有する酸化酵素又は当該酸化酵素を産生する微生物の培養物若しくはその処理物、グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する能力を有する酸化酵素又は当該酸化酵素を産生する微生物の培養物若しくはその処理物、および、グリコール酸をグリオキシル酸へ変換する能力を有する酸化酵素又は当該酸化酵素を産生する微生物の培養物若しくはその処理物を添加して、同一容器反応中、第１反応、第２反応および第３反応を同時進行させて行うことからなる請求項２、３、４、７、８および９のいずれか記載のグリオキシル酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物及び／または微生物由来の酵素を用いることによるエチレングリコールからグリオキシル酸を製造する方法に関する。グリオキシル酸はバニリン、エチルバニリンなどの合成原料として用いられ、農薬、更には医薬品の合成の中間体としても有用な化合物である。
【背景技術】
【０００２】
従来よりグリオキシル酸の製造方法としては、グリオキサールの硝酸酸化などの化学的手法が知られており、また現在はグリオキシル酸のほとんどがこれら化学的手法により製造されている。しかしながら、グリオキサールの硝酸酸化などの化学的手法はグリオキシル酸以外の有機酸などの副生成物を生じやすく、製造されたグリオキシル酸の品質に好ましくない影響を与え、これらを除去するためには煩雑な工程を必要とする。又、大量に使用された硝酸などの中和工程で生成する大量の塩類廃棄物の処理が問題となる。
【０００３】
グリオキシル酸の生化学的製造方法としては、植物由来のグリコール酸オキシダーゼを用いグリコール酸をグリオキシル酸へ変換する方法（特許文献１，２，３参照）や微生物によるグリコール酸からのグリオキシル酸への変換方法（特許文献４，５参照）およびグリオキサールを微生物または酸化還元酵素によりグリオキシル酸へ変換する方法（特許文献６，７参照）などが知られている。
【０００４】
グリコール酸オキシダーゼを用いる場合、基質であるグリコール酸が比較的高価であり、汎用化学品であるグリオキシル酸を製造する場合、経済性に問題がある。一方で、多くの酵素は高濃度のグリオキサール存在下では失活してしまう。そのため、グリオキサールを基質として反応する場合、高濃度仕込み反応が出来ない。このような理由により、安価な基質からの効率的なグリオキシル酸の製造方法の開発が望まれていた。
【特許文献１】特表平７−５０２８９５号公報
【特許文献２】特表平８−５０８１５９号公報
【特許文献３】国際公開第０３／１０００４３号パンフレット
【特許文献４】特開平７−１６３３８０号公報
【特許文献５】特開平８−３２２５８１号公報
【特許文献６】国際公開第２００４／０７２２８１号パンフレット
【特許文献７】特願２００５−０３５８９２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、本発明は、安価な原料であるエチレングリコールからの、酵素または微生物を用いた効率的なグリオキシル酸の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、酸化酵素による複数の酸化反応を組合せることにより、エチレングリコールからグリオキシル酸を効率的に製造することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の第１発明は、下記第１反応、第２反応および第３反応からなる酸化反応を連続して行うことを特徴とするエチレングリコールからのグリオキシル酸の製造方法に関する。
（第１反応）エチレングリコールに、エチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有する酸化酵素（オキシダーゼ）、又は、当該酸化酵素を産生する微生物の培養物若しくはその処理物を作用させてグリコールアルデヒドを生成させる。
（第２反応）第１反応で生じたグリコールアルデヒドに、グリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換する能力を有する酸化酵素（オキシダーゼ）、又は、当該酸化酵素を産生する微生物の培養物若しくはその処理物を作用させてグリオキサールを生成させる。
（第３反応）第２反応で生じたグリオキサールに、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する能力を有する酸化酵素（オキシダーゼ）、又は、当該酸化酵素を産生する微生物の培養物若しくはその処理物を作用させてグリオキシル酸へ変換する。
【０００７】
また、本発明の第２発明は、下記第１反応、第２反応および第３反応からなる酸化反応を連続して行うことを特徴とするエチレングリコールからのグリオキシル酸の製造方法に関する。
（第１反応）エチレングリコールに、エチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有する酸化酵素（オキシダーゼ）、又は、当該酸化酵素を産生する微生物の培養物若しくはその処理物を作用させてグリコールアルデヒドを生成させる。
（第２反応）第１反応で生じたグリコールアルデヒドに、グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する能力を有する酸化酵素（オキシダーゼ）、又は、当該酸化酵素を産生する微生物の培養物若しくはその処理物を作用させてグリコール酸を生成させる。
（第３反応）第２反応で生じたグリコール酸に、グリコール酸をグリオキシル酸へ変換する能力を有する酸化酵素（オキシダーゼ）、又は、当該酸化酵素を産生する微生物の培養物若しくはその処理物を作用させてグリオキシル酸を生成させる。
かくして、本発明の製造方法において、グリオキシル酸は、安価な原料であるエチレングリコールから効率良く製造されることが可能となる。
以下に本発明を詳述する。
【０００８】
本発明は、前述のごとく、エチレングリコールをグリコールアルデヒドへ、グリコールアルデヒドをグリオキサールへ、グリコールアルデヒドをグリコール酸へ、グリオキサールをグリオキシル酸へ、グリコール酸をグリオキシル酸へ変換する能力を有する酸化酵素（オキシダーゼとも言うが、以下は酸化酵素と記載する）、又は、当該酸化酵素を産生する微生物を組合せて用いることを特徴とするエチレングリコールからのグリオキシル酸の製造方法である。
【０００９】
すなわち、本発明の第１発明は、エチレングリコールに、エチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有する酸化酵素又は微生物を作用させてグリコールアルデヒドを生成させる第１の反応を行い（下記化学反応式の（１））、グリコールアルデヒドに、グリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換する能力を有する酸化酵素又は微生物を作用させてグリオキサールを生成させる第２の反応を行い（下記化学反応式の（２））、グリオキサールに、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する能力を有する酸化酵素又は微生物を作用させてグリオキシル酸へ変換する第３の反応を行う（下記化学反応式の（３））ことを特徴とするグリオキシル酸の製造方法である（下記化学反応式の（１）→（２）→（３））。
【００１０】
また、本発明の第２発明は、エチレングリコールに、エチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有する酸化酵素又は微生物を作用させて、グリコールアルデヒドを生成させる第１の反応を行い（下記化学反応式の（１））、グリコールアルデヒドに、グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する能力を有する酸化酵素又は微生物を作用させてグリコール酸を生成させる第２の反応を行い（下記化学反応式の（４））、グリコール酸に、グリコール酸をグリオキシル酸へ変換する能力を有する酸化酵素又は微生物を作用させてグリオキシル酸へ変換する第３の反応を行う（下記化学反応式の（５））ことを特徴とするグリオキシル酸の製造方法である（下記化学反応式の（１）→（４）→（５））。
【００１１】
【化１】
2007228924.tif 000002
【００１２】
尚、本発明は、反応に使用する酵素が酸化酵素（オキシダーゼという場合もある）であることも大きな特徴の一つである。酸化酵素（オキシダーゼ）の反応様式を以下の化学反応式に示すが、本反応では、基質以外には酸素または酸素と水があれば反応は進行する。一方、同様な酸化反応を脱水素酵素（デヒドロゲナーゼとも言う場合もある）を用いて行うことも可能な場合もあるが、この場合、反応にはＮＡＤ＋やＮＡＤＰ＋などの高価な補酵素が必要であるが、酸化酵素（オキシダーゼ）を用いれば、このような補酵素を必要としない点で有利である。
【００１３】
【化２】
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【００１４】
第１発明および第２発明における第１の反応で使用する酸化酵素、すなわちエチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有する酸化酵素としては、エチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有するものであれば特に限定されないが、例えば、アルコールオキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼが挙げられる。
【００１５】
アルコールオキシダーゼの起源としては特に限定されないが、酵母、カビ、細菌が産生するアルコールオキシダーゼが挙げられ、例えばピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、トルロプシス（Ｔｏｌｕｒｏｐｓｉｓ）属、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属に属する酵母が産生するアルコールオキシダーゼが挙げられる。
グリセロールオキシダーゼとしては、酵母、カビ、細菌が産生するグリセロールオキシダーゼが挙げられ、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属が産生するグリセロールオキシダーゼが挙げられる。
【００１６】
上記以外の酵素では、アスペルギルス属に属する微生物、例えばアスペルギルス・オクラゼウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）、その一例としてアスペルギルス・オクラゼウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）ＡＩＵ  ０３１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７８５）が産生するエチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有する酸化酵素が挙げられる。同該ＡＩＵ  ０３１株は本発明者らにより土壌から分離・同定され、前記寄託番号にて独立法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番地  中央第６）に寄託されている。
【００１７】
本発明では、エチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有する酸化酵素として、最終生成物であるグリオキシル酸に対する酸化活性を実質的に持たないものを使用することが好ましい。さらに、第２発明の第１反応に使用する場合、グリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換する能力（上記化学反応式（２））を有さないもの、またはその能力が低いものが望ましい。しかし、エチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有する酸化酵素がグリコールアルデヒドにも作用し、グリオキサール又はグリコール酸へ変換する能力を有する場合も、反応条件を好適に設定することにより、これらの酵素も本発明に使用することが可能である。好適な条件の一つとして、これら第１反応に使用する酵素の上記化学反応式（２）に対する活性量に比べ、第２反応に使用する酵素の量を多くし、反応の流れをグリコールアルデヒドからグリオキサール又はグリコール酸（上記化学反応式（１）→（４））へ傾けることが挙げられる。
【００１８】
第１発明における第２の反応で使用する酸化酵素、すなわちグリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換する能力を有する酸化酵素としては、グリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換する能力を有するものであれば特に限定されないが、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、リゾビアレス（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）目、パエニバシルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属等に属する微生物が産生する酸化酵素が挙げられる。
【００１９】
上記微生物の代表的なものとして、例えば特開２００５−２４５２３６号公報記載のアースロバクター・スピーシーズ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＫＮＫ１５４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５３）、リゾビアレス（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）ＫＮＫ０５４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５６）が挙げられ、また、パエニバシルス・スピーシーズ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＡＩＵ  ＡＬ３１１（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７８６）が挙げられる。尚、上記微生物ＫＮＫ１５４、ＫＮＫ０５４およびＡＩＵ  ＡＬ３１１は、本発明者らにより土壌から分離・同定され、前記寄託番号にて独立法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番地  中央第６）に寄託されている。
【００２０】
本発明では、グリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換する能力を有する酸化酵素として、最終生成物であるグリオキシル酸に対する酸化活性を実質的に持たないものを使用することが好ましい。
【００２１】
第１発明における第３反応で使用する酸化酵素、すなわちグリオキサールをグリオキシル酸へ変換する能力を有する酸化酵素としては、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する能力を有するものであれば特に限定されないが、グリオキシル酸を蓄積させるという点で、グリオキシル酸に対して活性を有さないか、または低い活性しか有さない酵素が好ましい。このような酵素としては、例えば、ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、セルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属等に属する微生物が産生するアルデヒドオキシダーゼが挙げられる。
【００２２】
上記微生物の代表的なものとして、国際公開第２００４／０７２２８１号パンフレット記載のステノトロフォモナス・スピーシーズ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ２３５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９００２）、ストレプトミセス・スピーシーズ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ２６９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５５６）、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ０５８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５５５）、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ２５４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９００３）、ミクロバクテリウム・スピーシーズ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＫＮＫ０１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５５４）、アクロモバクター・スピーシーズ（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＮＢＲＣ  １３４９５、セルロモナス・スピーシーズ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＪＣＭ  ２４７１、セルロモナス・タルバタ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｔｕｒｂａｔａ）ＮＢＲＣ  １３５０６、セルロモナス・タルバタ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｔｕｒｂａｔａ）ＮＢＲＣ  １５０１２、セルロモナス・タルバタ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｔｕｒｂａｔａ）ＮＢＲＣ  １５０１４、セルロモナス・タルバタ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｔｕｒｂａｔａ）ＮＢＲＣ  １５０１５、セルロシミクロビウム・セルランス（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓ）ＮＢＲＣ  １５０１３、セルロシミクロビウム・セルランス（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓ）ＮＢＲＣ  １５５１６、セルロシミクロビウム・セルランス（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓ）ＪＣＭ  ６２０１、モルガネラ・モルガニ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ）ＮＢＲＣ  ３８４８等が挙げられる。
【００２３】
そのほか、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＡＩＵ  ３６２（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３６３）、バークホルデリア・スピーシーズ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＡＩＵ  １２９（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７８７）等も挙げることが出来る。
【００２４】
尚、上記微生物ＫＮＫ２３５、ＫＮＫ２６９、ＫＮＫ０５８、ＫＮＫ２５４、ＫＮＫ０１１、ＡＩＵ  ３６２、ＡＩＵ  １２９は本発明者らにより土壌から分離・同定され、前記寄託番号にて独立法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番地  中央第６）に寄託されている。ＮＢＲＣ  １３４９５、ＮＢＲＣ  １３５０６、ＮＢＲＣ  １５０１２、ＮＢＲＣ  １５０１４、ＮＢＲＣ  １５０１５、ＮＢＲＣ  １５０１３、ＮＢＲＣ  １５５１６およびＮＢＲＣ  ３８４８は独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部・生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ；〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に保存されており、同機関より入手可能である。ＪＣＭ  ２４７１およびＪＣＭ  ６２０１は、独立行政法人理化学研究所微生物系統保存施設（ＪＣＭ；〒３５１−０１９８  埼玉県和光市広沢２−１）に保存されており、同機関より入手可能である。
【００２５】
第２発明における第２反応で使用する酸化酵素、すなわちグリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する能力を有する酸化酵素としては、グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する能力を有するものであれば特に限定されない。我々は、ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、セルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属に属する微生物が、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する能力を有する酸化酵素（アルデヒドオキシダーゼ）を産生することを見出したが（国際公開第２００４／０７２２８１号パンフレット）、更にこれら酸化酵素について詳細な検討を行った結果、これら酸化酵素はグリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する能力を有することを今回明らかにした。
【００２６】
第２発明の第２反応に用いる酵素としては、例えば、ステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、セルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属等に属する微生物が産生するアルデヒドオキシダーゼが挙げられる。
【００２７】
上記微生物の代表的なものとして、国際公開第２００４／０７２２８１号パンフレット記載のステノトロフォモナス・スピーシーズ（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ２３５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９００２）、ストレプトミセス・スピーシーズ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ２６９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５５６）、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ０５８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５５５）、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ２５４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９００３）、ミクロバクテリウム・スピーシーズ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＫＮＫ０１１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５５４）、アクロモバクター・スピーシーズ（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＮＢＲＣ  １３４９５、セルロモナス・スピーシーズ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＪＣＭ  ２４７１、セルロモナス・タルバタ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｔｕｒｂａｔａ）ＮＢＲＣ  １３５０６、セルロモナス・タルバタ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｔｕｒｂａｔａ）ＮＢＲＣ  １５０１２、セルロモナス・タルバタ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｔｕｒｂａｔａ）ＮＢＲＣ  １５０１４、セルロモナス・タルバタ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｔｕｒｂａｔａ）ＮＢＲＣ  １５０１５、セルロシミクロビウム・セルランス（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓ）ＮＢＲＣ  １５０１３、セルロシミクロビウム・セルランス（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓ）ＮＢＲＣ  １５５１６、セルロシミクロビウム・セルランス（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓ）ＪＣＭ  ６２０１、モルガネラ・モルガニ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ）ＮＢＲＣ  ３８４８等が挙げられる。
【００２８】
そのほか、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＡＩＵ  ３６２（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３６３）、バークホルデリア・スピーシーズ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＡＩＵ  １２９（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７８７）等も挙げることが出来る。
【００２９】
本発明では、グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する能力を有する酸化酵素として、最終生成物であるグリオキシル酸に対する酸化活性を実質的に持たないものを使用することが好ましい。
【００３０】
第２発明における第３反応で使用する酸化酵素、すなわちグリコール酸をグリオキシル酸へ変換する能力を有する酸化酵素としては、グリコール酸をグリオキシル酸へ変換する能力を有するものであれば特に限定されないが、グリオキシル酸を蓄積させるという点で、グリオキシル酸に対して活性を有さないか、または低い活性しか有さない酵素が好ましい。グリコール酸をグリオキシル酸へ変換する能力を有する酸化酵素としては、従来から知られているホウレンソウなどの植物由来のグリコール酸オキシダーゼが挙げられる。また、礒部らは、微生物が産生するグリセロールオキシダーゼがグリコール酸をグリオキシル酸へ変換する能力を有することを報告しており（特開平７−１６３３８０号公報およびＢｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，５９（４），５７５−５８１（１９９５）記載）、そのようなグリセロールオキシダーゼとしては、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する微生物が産生するグリセロールオキシダーゼが挙げられる。
【００３１】
また、グリコール酸をグリオキシル酸へ変換する能力を有する酸化酵素としては、２−ヒドロキシ酸オキシダーゼが挙げられる。ここで言う「２−ヒドロキシ酸オキシダーゼ」とは、脂肪族カルボン酸の２位の位置に水酸基を有するもの、いわゆる２−ヒドロキシ酸に作用し、対応する２−ケト酸を生成する能力を有する酸化酵素を意味する。本発明のグリオキシル酸の製造に利用できる２−ヒドロキシ酸オキシダーゼとしては、例えば、国際公開第０３／１０００４３号パンフレット記載のアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物、例えばアースロバクター・スピーシーズ  ＫＮＫ−ＧＡ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３７５）が産生する（Ｄ）−２−ヒドロキシ酸オキシダーゼが挙げられる。
【００３２】
本発明で使用する「酸化酵素」は、単一にまたは部分的に精製された酵素であってもよい。本発明で使用する微生物は、これら酵素の産生能を有する微生物の培養物またはその処理物を使用することも可能である。「微生物の培養液」とは、菌体を含む培養液あるいは培養菌体を意味し、「その処理物」とは、例えば、粗抽出液、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、またはそれら菌体の磨砕物等を意味する。さらに上記酸化酵素又は微生物は、公知の方法で固定化されて用いることができる。固定化は、当業者に周知の方法（例えば架橋法、物理的吸着法、包括法等）で行うことができる。上記酸化酵素の産生能を有する微生物としては、野生株または変異株、あるいは上記酵素のＤＮＡをベクターに組込み、これを宿主内に導入してなる形質転換体（組替え体）であってもよい。また、本発明で使用する酸化酵素の産生能を有する形質転換体は、酸化酵素をコードするＤＮＡを宿主のゲノムに安定的に組み込むことによっても製造できる。一方で、本発明で使用する複数の酸化酵素を同一宿主細胞内に導入した形質転換微生物の培養物またはその処理物を用いれば、別々に両酵素を発現する微生物を培養する必要はないため、より効率的にグリオキシル酸が製造できる。このような形質転換体は、使用する酸化酵素をコードするＤＮＡを、同一のベクターに組込み、これを宿主に導入することにより製造できるし、また、それぞれのＤＮＡを不和合性の異なったベクターにそれぞれ組込み、それらを同一の宿主に導入することによっても製造できる。一方、宿主としては、大腸菌などの細菌、酵母、カビ、放線菌などを使用することが可能である。  
【００３３】
本発明の第１発明、第２発明共に、その第１、第２および第３の各々の反応をそれぞれ別々の反応容器中で行うことによりバッチ方式で実施することも出来るが、各反応を行う酵素又は微生物を単一容器中に添加し、ワン・ポット方式で３種類の反応を同時進行させることにより実施することが可能である。その場合、第１、第２および第３反応を行う酵素又は微生物の量を調整することにより、第１反応および第２反応で生成するグリコールアルデヒド、及び、グリコール酸又はグリオキサールを順次、速やかに変換することが可能であり、それらが反応系に高濃度に蓄積することがないため、酵素の失活が押さえられ好ましく、また生産工程の効率化においても好ましい。
【００３４】
第１発明において、ワンポット方式で反応を行い第１反応で生成したグリコールアルデヒドを第２反応により速やかにグリオキサールへ変換することは、グリコールアルデヒドの高濃度蓄積による酵素の失活を押さえると共に、グリコールアルデヒドがグリコール酸へ変換される副反応（上記化学反応式（４））を押さえることが出来、好ましい。したがって、第２反応で使用する酵素量（グリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換する活性量）としては、第１反応で使用する酵素の量（エチレングリコールをグリコ−ルアルデヒドへ変換する活性量）に比べ、極端に低いことは、好ましくなく、その使用量としては、好ましくは、第１反応で使用する酵素量（エチレングリコールをグリコ−ルアルデヒドへ変換する活性量）の１／２以上、好ましくは等量以上、より好ましくは２倍以上が望ましい。一方で、第１反応の基質であるエチレングリコールの濃度を下げ、第１反応により生じるグリコールアルデヒドの量を制限することにより、上記のように、第１反応の酵素量と第２反応の酵素量を精密に制御せずとも、第１反応で生成したグリコールアルデヒドを第２反応によりスムースにグリオキサールへ変換することも可能である。このような場合、エチレングリコール濃度は１Ｍ以下、好ましくは５００ｍＭ以下、より好ましくは１００ｍＭ以下に設定することが望ましい。この場合、反応途中で、エチレングリコールの濃度を測定しつつ、反応の進行と当時に、順次エチレングリコールを添加し、所定の濃度範囲に管理することで、連続的に反応を行うことが出来る。
【００３５】
また、第１発明の第３反応（グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する）に使用する酵素は、アルデヒド基をカルボン酸へ変換する反応を触媒する酵素であり、前記化学反応式（４）のグリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する活性を有する場合がある。したがって、第３反応で使用する酵素が前記化学反応式（４）の活性も有する場合、第２反応に使用する酵素の量（エチレングリコールをグリオキサールへ変換する活性量）は、第３反応で使用する酵素が有する前記化学反応式（４）の活性量よりも過剰であることが好ましい。
【００３６】
第２発明においては、先に述べた通り、第１反応に使用する酵素、すなわちエチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有する酵素としては、グリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換する能力（上記化学反応式（２））を有さないもの、またはその能力が低いものが望ましい。しかし、エチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する活性を有する酸化酵素がグリコールアルデヒドにも作用し、グリオキサールへ変換する活性を有する場合も、反応条件を好適に設定することにより、これらの酵素も本発明に使用することが可能である。このような条件として、第２反応に使用する酵素量（グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する活性量）が第１反応に使用する酵素のグリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換する活性量の１／２以上、好ましくは等量以上、さらに好ましくは２倍以上が望ましい。
【００３７】
第１反応、第２反応及び第３反応の反応条件は使用する酵素、基質濃度により異なるが、反応は酸素存在下で行い、反応温度は１０〜７０℃、熱安定性の観点から１０〜５０℃が好ましく、ｐＨは４〜１２、酵素の最適反応ｐＨ、ｐＨ安定性の観点からｐＨ５〜９が好ましい。基質であるエチレングリコールは、第一反応のエチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する酵素を効率的に働かせるために、高く設定した方かよく、１００ｍＭ以上、更に１Ｍ以上が好ましい。その一方で、前述の通り、グリコールアルデヒドの高濃度の蓄積を回避するための一つの方法として、エチレングリコールを低濃度に維持することが有効な場合がある。その場合は逆に、エチレングリコールの濃度は、１Ｍ以下、好ましくは５００ｍＭ以下、さらに好ましくは１００ｍＭ以下に制限することが好ましい。また酸素の反応液への溶解を促進するため、反応は振とう、攪拌条件下で行なわれることが好ましい。さらに大気圧以上の加圧下で反応を行うことにより、反応液への酸素の溶解度が向上し、反応がより進む場合もある。
【００３８】
尚、酸化酵素による酸化反応によって、過酸化水素が生成するが、この過酸化水素は酵素を失活させたり、グリオキシル酸をギ酸へと分解する場合もある。しかし、反応系にカタラーゼを添加することにより生成した過酸化水素を分解、除去し、酵素の失活やグリオキシル酸の分解を防ぐことが可能である。使用するカタラーゼは、過酸化酵素を速やかに分解、除去するという観点から、使用する酸化酵素の活性の１０倍以上、好ましくは１００倍以上、さらに好ましくは１０００倍以上の活性量を使用する事が望ましい。また、さきに述べた形質転換体に酸化酵素と共にカタラーゼを組換え発現させることにより効率良く過酸化水素を分解することが可能である。一方、形質転換体の宿主として、もともとカタラーゼを産生する能力を有する微生物を使用することが好ましい。メタノール酵母は、もともと菌体内にカタラーゼを産生すると同時に、本発明の第１発明および第２発明における第１反応、すなわちエチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する能力を有するアルコールオキシダーゼを菌体内に高濃度に産生することが知られており、これらメタノール酵母を形質転換体の宿主として利用することは、反応の効率化の点で好ましい。
【００３９】
本発明に使用する酸化酵素の活性（オキシダーゼ活性）の検出、定量は、以下の化学反応式に示すように、酸化反応により生成する過酸化水素を４−アミノアンチピリン（以下４−ＡＡ）とＮ−エチル−（２−ヒドロキシ−３−スルフォプロピル）−ｍ−トルイジン（以下ＴＯＯＳ）を反応させ、生成するキノンイミン色素を検出、定量することにより行うことができる。
【００４０】
【化３】
2007228924.tif 000004
【００４１】
具体的には、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）中、基質（エチレングリコール、グリコールアルデヒド、グリオキサール、グリコール酸、又は、グリオキシル酸；エチレングリコールは１０００ｍＭ、それ以外は２０ｍＭ）、０．６９ｍＭ  ４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、１．０９ｍＭ  Ｎ−エチル−（２−ヒドロキシ−３−スルフォプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、５Ｕ／ｍｌ  ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）および酸化酵素を含む１．０ｍｌの反応液を３０℃でインキュベートし、反応液の色の変化（紫色へ変化）の目視による確認または、５５５ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行った。尚、本発明において、１分間に１μｍｏｌのＨ２Ｏ２を生成する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義する。
【発明の効果】
【００４２】
本発明の方法によれば、汎用化学品として有用なグリオキシル酸を安価な原料であるエチレングリコールから効率的に製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
以下に、実施例を挙げ、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１）アスペルギルス・オクラゼウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）ＡＩＵ  ０３１（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７８５）株からのエチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換する酸化酵素の粗酵素液の調製
コレステロール２ｇ、硝酸アンモニウム２ｇ、リン酸水素二カリウム２ｇ、リン酸二水素ナトリウム１ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．２ｇ、酵母エキス１ｇ、Ｔｒｉｔｎ  Ｘ−１００  １ｇ（いずれも１Ｌ当り）の組成よりなる培地（ｐＨ６．５）を調整し、５００ｍｌ容坂口フラスコに１５０ｍｌ分注し、高圧蒸気滅菌を行った（１２０℃、２０分）。これら培地に予め同培地で前培養しておいたアスペルギルス・オクラゼウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）ＡＩＵ  ０３１の培養液を１ｍｌ植菌し、３０℃で２日間振盪培養を行った。このようにして得られた培養液から遠心分離により菌体を集め、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で洗浄後、同緩衝液５ｍｌに懸濁し、０．５ｍｍガラスビーズを用いて細胞破砕し、遠心分離により菌体残渣を除き、約５ｍｌの無細胞抽出液を得た。本無細胞抽出液をセントリプラス  ＹＭ−１０（ミリポア社製）を用いて濃縮し、０．５ｍｌの濃縮液（粗酵素液）を得た。
【００４４】
（実施例２）リゾビアレス  ＫＮＫ０５４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５６）株からの、グリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換する酸化酵素の精製
エチレングリコール１０ｇ、酵母エキス０．１ｇ、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社製）８ｇ、リン酸二水素カリウム３ｇ、リン酸水素二カリウム７ｇ（いずれも１Ｌあたり）の組成よりなる培地（ｐＨ７）を調製し、５Ｌジャーファーメンターに同培地を４Ｌ分注し、高圧蒸気滅菌を行った（１２０℃、２０分）。
これらの培地に予め同培地で前培養しておいたリゾビアレス  ＫＮＫ０５４の培養液を４０ｍＬを植菌し、３０℃、通気０．５ｖｖｍ、攪拌６００ｒｐｍで３日間培養を行う。本ジャーファーメンター培養を繰り返し９６Ｌの培養液を取得し、ついで得られた培養液９６Ｌから遠心分離により菌体を集め、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）にて洗浄後、同緩衝液８００ｍＬに懸濁した。得られた菌体懸濁液をダイノミル（Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ社製）で破砕後、遠心分離により菌体残渣を除き、無細胞抽出液２３５０ｍＬを得た。さらに本無細胞抽出液２３５０ｍＬに攪拌しながら、５％硫酸プロタミン溶液を５５．２ｍＬ加え、その後遠心分離により沈殿物を除き、粗酵素液を得た。この粗酵素液に冷却したスターラーで攪拌しながら所定量の硫酸アンモニウムを添加し、硫酸アンモニウム濃度５０−６５％で沈殿するタンパク質を遠心分離により集めた。
【００４５】
得られたタンパク質を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で溶解し、同緩衝液に対し透析を行った後、同緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）カラム（２６０ｍＬ）にチャージし、０−０．３Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配により溶出し、活性画分を集めた。この活性画分に終濃度１Ｍになるように硫酸アンモニウムを添加し、予め１Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−トヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）カラム（１６０ｍＬ）にチャージし、１−０．２Ｍの硫酸アンモニウム直線濃度勾配により溶出し、活性画分を集めた後、硫酸アンモニウムを６０％飽和になるまで添加し、遠心分離により、沈殿したタンパク質を集め、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で溶解し、同緩衝液に対し透析を行った。本透析後の酵素液を０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ＨＲ１６／６０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）カラム（１２０ｍＬ）にチャージし、同緩衝液で溶出を行ったところ、分子量１１５０００Ｄａに相当する画分に、２８０ｎｍのタンパク吸収と活性が一致する溶出ピークを得た。活性フラクションを集め、以後の実験に使用した。
【００４６】
（実施例３）アースロバクター・スピーシーズ  ＫＮＫ１５４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５３）株からの、グリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換する酸化酵素の精製
エチレングリコール１０ｇ、酵母エキス０．１ｇ、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社製）８ｇ、リン酸二水素カリウム３ｇ、リン酸水素二カリウム７ｇ（いずれも１Ｌあたり）の組成よりなる培地（ｐＨ７）を調製し、５Ｌジャーファーメンターに同培地を４Ｌ分抽し、高圧蒸気滅菌を行った（１２０℃、２０分）。
【００４７】
これらの培地に予め同培地で前培養しておいたアースロバクター・スピーシーズ  ＫＮＫ１５４の培養液を４０ｍＬを植菌し、３０℃、通気０．５ｖｖｍ、攪拌５００ｒｐｍで３日間培養を行う。本ジャーファーメンター培養を繰り返し３２Ｌの培養液を取得し、ついで得られた培養液３２Ｌから遠心分離により菌体を集め、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）にて洗浄後、同緩衝液９３０ｍＬに懸濁した。得られた菌体懸濁液をダイノミル（Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ社製）で破砕後、遠心分離により菌体残渣を除き、無細胞抽出液１６００ｍＬを得た。この無細胞抽出液に冷却したスターラーで攪拌しながら所定量の硫酸アンモニウムを添加し、硫酸アンモニウム濃度４０−６０％で沈殿するタンパク質を遠心分離により集めた。
【００４８】
得られたタンパク質を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で溶解し、同緩衝液に対し透析を行った後、同緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）カラム（２６０ｍＬ）にチャージし、０−０．３Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配により溶出し、活性画分を集めた。この活性画分に終濃度１Ｍになるように硫酸アンモニウムを添加し、予め１Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−トヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）カラム（１６０ｍＬ）にチャージし、１−０．３Ｍの硫酸アンモニウム直線濃度勾配により溶出し、活性画分を集めた。活性画分を限外ろ過により濃縮さらに５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）にてブッファー交換を行った後、同緩衝液で予め平衡化したＲｅｓｏｕｃｅ  Ｑ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）カラム（６ｍｌ）にチャージし、０−１．０Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配により溶出したところ、２８０ｎｍのタンパク吸収と活性が一致する溶出ピークを得た。活性フラクションを集めることにより、電気泳動的に単一な酵素標品を得た。
【００４９】
（実施例４）パエニバシルス・スピーシーズ  ＡＩＵ  ＡＬ３１１（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７８６）株が産生するグリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換する能力を有する酸化酵素の粗酵素液の調製
エチレングリコール５０ｇ、酵母エキス０．５ｇ、硝酸アンモニウム２ｇ、リン酸水素２カリウム１ｇ、リン酸２水素カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．２ｇ、塩化カルシウム・２水和物０．５ｇ（いずれも１リットル当り）の組成からなる培地（ｐＨ５．５−６．０）を調整し、５００ｍｌ容坂口フラスコに１５０ｍｌ分注し、高圧蒸気滅菌を行った（１２０℃、２０分）。これら培地に予め同培地で前培養しておいたパエニバシルス・スピーシーズ  ＡＩＵ  ＡＬ３１１の培養液を１．５ｍｌ植菌し、３０℃で２日間振盪培養を行った。このようにして得られた培養液から遠心分離により菌体を集め、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で洗浄後、同緩衝液５ｍｌに懸濁し、０．５ｍｍガラスビーズを用いて細胞破砕し、遠心分離により菌体残渣を除き、約５ｍｌの無細胞抽出液を得た。本無細胞抽出液をセントリプラス  ＹＭ−１０（ミリポア社製）を用いて濃縮し、０．５ｍｌの濃縮液（粗酵素液）を得た。
【００５０】
（実施例５）セルロシミクロビウム・セルランス  ＮＢＲＣ１５５１６株が産生するグリオキサールをグリオキシル酸へ変換する酸化酵素の粗酵素液の調製
酵母エキス１０ｇ、硝酸アンモニウム２ｇ、リン酸水素２カリウム１ｇ、リン酸水素１ナトリウム１．３ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．２ｇ、塩化カルシウム０．１ｇ（いずれも１リットル当たり）の組成からなる培地（ｐＨ７）６０ｍｌを５００ｍｌ坂口スラスコに入れ（３本）、高圧蒸気滅菌後、同培地で予め培養したセルロモナス・セルランスＮＢＲＣ１５５１６の培養液１．２ｍｌを植菌し、３０℃、１３０ｒｐｍで４８時間、振盪培養した。得られた培養液を集め、遠心分離により菌体を集め、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁した（５０ｍｌ）。この菌体懸濁液を超音波破砕し、遠心分離により菌体残渣を除き、３０ｍｌ無細胞抽出液を得た。本無細胞抽出液をセントリプラス  ＹＭ−１０（ミリポア社製）を用いて濃縮し、４ｍｌの濃縮液（粗酵素液）を得た。
【００５１】
（実施例６）セルロシミクロビウム・セルランス  ＮＢＲＣ１５５１６株からの、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する酸化酵素の精製
酵母エキス１０ｇ、硫酸アンモニウム２ｇ、リン酸水素２カリウム１ｇ、リン酸水素１ナトリウム１ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．２ｇ、塩化カルシウム・２水和物０．１ｇ（いずれも１リットル当り）の組成よりなる培地（ｐＨ７）６０ｍｌを５００ｍｌ坂口フラスコに入れ高圧蒸気滅菌後、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓ  ＮＢＲＣ１５５１６株を１白金耳植菌し、２８℃で２日間振とう培養し、前培養液を得た。次いで、５Ｌミニジャーに上記組成の培地３Ｌを入れ、高圧蒸気滅菌後、前培養液６０ｍｌを植菌し、２８℃、通気０．５ｖｖｍ、攪拌４００ｒｐｍで２７時間培養を行った。同様の培養を繰返して得た合計４５Ｌの培養液のｐＨを７に調整し、遠心分離により、菌体と４５Ｌの培養液上清を得た。菌体と培養液上清に、グリオキサール対する酸化活性が検出されたが、精製の容易さを考慮し、培養液上清から目的の酸化酵素を精製することとした。得られた培養液上清を攪拌型ウルトラホルダーＵＨＰ１５０（アドバンテック東洋社製）を用いて２．４Ｌに濃縮後、氷冷下、攪拌しながら所定量の硫酸アンモニウムを添加し、硫酸アンモニウム０〜６０％飽和の範囲で沈澱する蛋白質を遠心分離により集めた。得られた蛋白質を２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）で溶解し、充分量の同緩衝液に対して透析を行った後、同緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラム（３００ｍｌ）にアプライし、塩化ナトリウム０〜０．５Ｍの濃度勾配により溶出し、活性画分を集めた。この活性画分に硫酸アンモニウムを終濃度１Ｍとなるよう添加し、予め１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−トヨパール６５０Ｍ（６０ｍｌ）にアプライし、硫酸アンモニウム１〜０．５Ｍの直線濃度勾配で溶出し、活性画分を集めた。得られた酵素液を２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７に透析し、次いで、予め同緩衝液で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅＱ（アマシャムファルマシアバイオテック社製）カラム（６ｍｌ）にアプライし、塩化ナトリウム０．３５Ｍを含む同緩衝液で洗浄後、塩化ナトリウム０．３５〜０．５Ｍの直線濃度勾配で溶出し、活性画分を集めた。得られた酵素液を限外濾過濃縮し、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲカラム（２４ｍｌ）（アマシャムファルマシアバイオテック社製）にアプライし、同緩衝液で溶出し、２８０ｎｍのタンパク吸収と活性が一致する溶出ピークを得た。活性フラクションを集めることにより、電気泳動的に単一な酵素標品を得た。
【００５２】
（実施例７）バークホルデリア・スピーシーズ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＡＩＵ  １２９（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７８７）からのグリオキサールをグリオキシル酸へ変換する能力を有する酸化酵素の精製
酵母エキス０．６２５ｇ、硝酸アンモニウム２．５ｇ、リン酸水素２カリウム１．２５ｇ、リン酸２水素ナトリウム１．２５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．２５ｇ、塩化カルシウム・２水和物０．６２５ｇ（いずれも１Ｌ）あたり）の組成よりなる培地（ｐＨ５．５−６．０）を調整し、５００ｍｌ容坂口フラスコに１５０ｍｌ分注し、高圧蒸気滅菌後（１２０℃、２０分）、メンブランフィルターで除菌した５％  ２−メトキシエタノール水溶液を培地中の２−メトキシエタノール濃度が１％になるように添加した。これら培地に予め同培地で前培養しておいたバークホルデリア・スピーシーズ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＡＩＵ１２９の培養液（一次種母液）を１．５ｍｌ植菌し、３０℃で２日間振盪培養して二次種培養液を調製した。続いて、この二次種培養液２０ｍｌを上記培地と同一組成の液体培地２  Ｌを入れた３  Ｌ容フラスコに植菌し、３０℃で５日間振盪培養した。このようにして培養した１０Ｌの培養液から菌体を集めて、以下の方法で酵素を精製した。尚、酵素の精製にはリン酸緩衝液  ｐＨ７．５を用いた。
【００５３】
１０Ｌ培養液から集菌した菌体（湿重量：２５．５ｇ）を１０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁し、１０℃以下の温度で０．５ｍｍガラスビーズを用いて１６分間（２分ｘ８回）細胞破砕した。この細胞破砕液を遠心分離して菌体残渣を除去し、上清画分を粗酵素液として酵素の精製に用いた。細胞破砕液から菌体残渣を除去して調製した粗酵素液を、１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム（２．５×２０ｃｍ）に吸着させた。本カラムを５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液１Ｌで洗浄した後、酵素を５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（３００ｍｌ）と０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（３００ｍｌ）を用いて直線濃度勾配法で溶出した。ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムから溶出された活性画分に１Ｍ量の固形の硫安を添加し、生成した不溶物を除去した。この酵素液を１．０Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化した５０ｍｌのＰｈｅｎｙｌ−Ｔｏｐｏｐｅａｒｌカラム（２．５ｘ１１ｃｍ）に通液した後、カラムを０．６Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液で十分洗浄した。次に目的とする酵素を０．６Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（２００ｍｌ）と１０ｍＭリン酸緩衝液（２００ｍｌ）を用いて直線濃度勾配法で溶出した。Ｐｈｅｎｙｌ−Ｔｏｐｏｐｅａｒｌカラムから溶出された酵素活性画分を限外濾過膜で２ｍｓ／ｃｍまで脱塩濃縮した後、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム（１．５×２０ｃｍ）に吸着させた。本カラムを５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液で十分洗浄した後、酵素を５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（１５０ｍｌ）と０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（１５０ｍｌ）を用いて直線濃度勾配法で溶出した。ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムからの溶出液を限外濾過膜で濃縮し、この濃縮酵素液に４５％飽和になるように硫安を添加した後、１時間攪拌放置し、生成した沈殿物を遠心分離で集めた。続いて、この上清画分に５５％飽和まで硫安を添加し、生成した沈殿物を遠心分離で集め、さらに６５％飽和まで硫安を添加し、生成した沈殿物を遠心分離で集めた。そして５５％飽和と６５％飽和の沈殿画分の酵素を０．６Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液で溶解した。上述の硫安塩析で得た酵素液を１．０Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化した５０ｍｌのＰｈｅｎｙｌ−Ｔｏｐｏｐｅａｒｌカラム（２．５ｘ１１ｃｍ）に通液し、カラムを０．６Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液で十分洗浄した。次に目的とする酵素を０．６Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（２００ｍｌ）と１０ｍＭリン酸緩衝液（２００ｍｌ）を用いて直線濃度勾配法で溶出した。Ｐｈｅｎｙｌ−Ｔｏｐｏｐｅａｒｌカラムからの溶出液を限外濾過膜で０．２ｍｌまで濃縮した後、５０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５５カラム（１×４５ｃｍ）でゲル濾過を行い、２８０ｎｍのタンパク吸収と活性が一致する溶出ピークを得た。活性フラクションを集めることにより、電気泳動的に単一な酵素標品を得た。
【００５４】
（実施例８）アースロバクター・スピーシーズ  ＫＮＫ−ＧＡ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３７５）株からの、グリコール酸をグリオキシル酸へ変換する酸化酵素の精製
アースロバクター・スピーシーズ  ＫＮＫ−ＧＡ１株を５００ｍｌ容坂口フラスコ中グルコース２０ｇ、酵母エキス１ｇ、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｂｒｏｔｈ８ｇ（いずれも１Ｌあたり）の組成よりなる培地（ｐＨ７）１００ｍｌに植菌し、２８℃で１日培養し、前培養液を得た。ついで、５リットル容ミニジャー中にグリコール酸５ｇ、酵母エキス１ｇ、リン酸二水素カリウム３．５ｇ、リン酸水素二アンモニウム６．５ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇ、硫酸亜鉛７水和物０．０２ｇ、硫酸第一鉄７水和物０．０３ｇ、硫酸銅５水和物０．００２ｇ、塩化カルシウム２水和物０．１ｇ、塩化ナトリウム０．３ｇ（いずれも１Ｌあたり）の組成よりなる培地（ｐＨ７）３Ｌに、得られた前培養液を植菌し、０．５ｖｖｍ、３５０ｒｐｍ、ｐＨ７．２以下（水酸化ナトリウム水溶液でコントロール）で培養を行い、培養７、２１、２７、３２時間目にグリコール酸をそれぞれ１５ｇずつ添加し、４５時間培養した。
【００５５】
ついで、得られた培養液から遠心分離により菌体を集め０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）１．２Ｌに懸濁した。
得られた菌体懸濁液をダイノミルにより破砕後、遠心分離により上清液１．１Ｌを得た。上清液に５％硫酸プロタミン水溶液を６２ｍｌ添加し３０分間攪拌後、遠心分離により沈殿物を除き、１．２Ｌの上清液を得た。
得られた上清液１．２Ｌを氷冷下スターラーで攪拌しながら、所定量の硫酸アンモニウムを添加し、硫酸アンモニウム２５−４０％で沈殿するタンパク質を遠心分離により集めた。
得られた硫安沈殿タンパクを３２０ｍｌの０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で溶解し、同緩衝液１５Ｌにより透析を行った後、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で予め平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ（東ソー製）カラム（カラム直径：４ｃｍ、高さ：２０ｃｍ）にチャージし、０−０．２Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配により、流速９０ｍｌ／ｈｒで溶出させ活性画分を集めた。得られた活性画分に硫酸アンモニウム濃度が０．６Ｍになるように１．２Ｍ硫酸アンモニウムを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液を添加後、０．６Ｍ硫酸アンモニウムを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で予め平衡化したＰｈｅｎｙｌ−トヨパール６５０Ｍ（東ソー製）カラム（カラム直径：２．４ｃｍ、高さ：２４ｃｍ）にチャージし、０．６Ｍ−０Ｍの硫酸アンモニウム直線濃度勾配により、流速７０ｍｌ／ｈｒで溶出させ活性画分を集め、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）により透析した。その後、透析後の液を、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で予め平衡化したＳｕｐｅｒＱトヨパール６５０Ｍ（東ソー製）カラム（カラム直径：２．４ｃｍ、高さ：２０ｃｍ）にチャージし、０Ｍ−０．３Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配により、流速５０ｍｌ／ｈｒで溶出させ、活性画分を集めた。得られた活性画分の硫酸アンモニウム濃度が０．４Ｍになるように調整し、０．４Ｍ硫酸アンモニウムを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で予め平衡化したＢｕｔｙｌ−トヨパール６５０Ｓ（東ソー製）カラム（カラム直径：１．４ｃｍ、高さ：１０ｃｍ）にチャージし、０．４Ｍ−０Ｍの硫酸アンモニウム直線濃度勾配により、流速３０ｍｌ／ｈｒで溶出させ活性画分を集めた。その後、活性画分の硫酸アンモニウム濃度を０．６Ｍに調整した後、０．６Ｍ硫酸アンモニウムを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で予め平衡化したＲＥＳＯＵＲＣＥ  １５ＰＨＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社製）カラム（６ｍｌ）にチャージし、０．６Ｍ−０Ｍの硫酸アンモニウム直線濃度勾配により流速２ｍｌ／ｍｉｎで溶出させ、２８０ｎｍのタンパク吸収と活性が一致する溶出ピークを得た。活性フラクションを集めることにより、電気泳動的に単一な酵素標品を得た。
【００５６】
（実施例９）エチレングリコールからグリオキシル酸の合成反応（エチレングリコール→グリコールアルデヒド→グリオキサール→グリオキシル酸）
１Ｍエチレングリコール、０．６Ｕ（エチレングリコール酸化活性）／ｍｌのピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｒｉｓ）由来のアルコールオキシダーゼ（シグマ社製）、１Ｕ（グリコールアルデヒド酸化活性）／ｍｌの実施例２で得たリゾビアレス  ＫＮＫ０５４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５６）由来酸化酵素の精製酵素（グリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換）、０〜０．５Ｕ（グリオキサール酸化活性）／ｍｌの実施例５で得たセルロシミクロビウム・セルランス  ＮＢＲＣ１５５１６株由来の酸化酵素の粗酵素液（グリオキサールをグリオキシル酸へ変換）、１００００Ｕ／ｍｌのカタラーゼ（Ｂｏｖｉｖｅ  Ｌｉｖｅｒ由来；ナカライ社製）を含む３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．５ｍｌを試験管中で、２８℃、６時間振盪しながら反応を行った後、反応液１００μｌに２００μｌの２００ｍＭ過塩素酸水溶液を添加し、遠心分離後（１５０００ｒｐｍ、１０分間）、上清をＨＰＬＣにより分析した。本反応により生成したグリコールアルデヒド、グリオキサール、グリオキシル酸を表１に示す。上記３種の酸化酵素により、エチレングリコールがグリオキシル酸へ効率良く変換されていた。
【００５７】
【表１】
2007228924.tif 000005
【００５８】
［ＨＰＬＣ分析条件］
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  Ｒｓｐａｋ  ＫＣ−８１１（昭和電工社製）を二本連結
検出：ＲＩ（エチレングリコール、グリコールアルデヒド、グリオキサール、グリコール酸、グリオキシル酸）
ＵＶ（グリコール酸、グリオキシル酸）
カラム温度：４０℃
溶離液：５０ｍＭ過塩素酸水溶液
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出時間：エチレングリコール；２２．６分、グリコールアルデヒド；１７．９分、グリオキサール；１５．７分、グリコール酸；１８．５分、グリオキシル酸；１５．７分
【００５９】
（実施例１０）エチレングリコールからグリオキシル酸の合成反応（エチレングリコール→グリコールアルデヒド→グリオキサール→グリオキシル酸）
１Ｍエチレングリコール、０．６Ｕ（エチレングリコール酸化活性）／ｍｌのピキア属酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｒｉｓ）由来のアルコールオキシダーゼ（シグマ社製）、１Ｕ（グリコールアルデヒド酸化活性）／ｍｌの実施例３で得たアースロバクター・スピーシーズ  ＫＮＫ１５４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５３）由来酸化酵素の精製酵素（グリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換）、０．５Ｕ（グリオキサール酸化活性）／ｍｌの実施例５で得たセルロシミクロビウム・セルランス  ＮＢＲＣ１５５１６株由来の酸化酵素の粗酵素液（グリオキサールをグリオキシル酸へ変換）、１００００Ｕ／ｍｌのカタラーゼ（Ｂｏｖｉｖｅ  Ｌｉｖｅｒ由来；ナカライ社製）を含む３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．５ｍｌを試験管中で、２８℃、６時間振盪しながら反応を行った後、実施例９と同様な方法で、ＨＰＬＣ分析を行った。その結果、５２ｍＭのグリオキシル酸が生成していた。
【００６０】
（実施例１１）エチレングリコールからグリオキシル酸の合成反応（エチレングリコール→グリコールアルデヒド→グリオキサール→グリオキシル酸）
１Ｍエチレングリコール、０．６Ｕ（エチレングリコール酸化活性）／ｍｌのピキア属酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｒｉｓ）由来のアルコールオキシダーゼ（シグマ社製）、１Ｕ（グリコールアルデヒド酸化活性）／ｍｌの実施例２で得たリゾビアレス  ＫＮＫ０５４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５６）由来酸化酵素の精製酵素（グリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換）、０．５Ｕ（グリオキサール酸化活性）／ｍｌの実施例６で得たセルロシミクロビウム・セルランス  ＮＢＲＣ１５５１６由来の酸化酵素の精製酵素（グリオキサールをグリオキシル酸へ変換）、１００００Ｕ／ｍｌのカタラーゼ（Ｂｏｖｉｖｅ  Ｌｉｖｅｒ由来；ナカライ社製）を含む３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．５ｍｌを試験管中で、２８℃、６時間振盪しながら反応を行った後、実施例９と同様な方法で、ＨＰＬＣ分析を行った。その結果、４７ｍＭのグリオキシル酸が生成していた。
【００６１】
（実施例１２）エチレングリコールからグリオキシル酸の合成反応（エチレングリコール→グリコールアルデヒド→グリオキサール→グリオキシル酸）
１Ｍエチレングリコール、０．６Ｕ（エチレングリコール酸化活性）／ｍｌのピキア属酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｒｉｓ）由来のアルコールオキシダーゼ（シグマ社製）、１Ｕ（グリコールアルデヒド酸化活性）／ｍｌの実施例２で得たリゾビアレス  ＫＮＫ０５４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５６）由来酸化酵素の精製酵素（グリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換）、０．５Ｕ（グリオキサール酸化活性）／ｍｌの実施例７で得たバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＡＩＵ  １２９（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７８７）由来の酸化酵素の精製酵素、１００００Ｕ／ｍｌのカタラーゼ（Ｂｏｖｉｖｅ  Ｌｉｖｅｒ由来；ナカライ社製）を含む３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．５ｍｌを試験管中で、２８℃、６時間振盪しながら反応を行った後、実施例９と同様な方法で、ＨＰＬＣ分析を行った。その結果、５２ｍＭのグリオキシル酸が生成していた。
【００６２】
（実施例１３）エチレングリコールからグリオキシル酸の合成反応（エチレングリコール→グリコールアルデヒド→グリオキサール→グリオキシル酸）
１Ｍエチレングリコール、１Ｕ（エチレングリコール酸化活性）／ｍｌの実施例１で得たアスペルギルス・オクラゼウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）ＡＩＵ  ０３１（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７８５）株由来酸化酵素の粗酵素液（エチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換）、１Ｕ（グリコールアルデヒド酸化活性）／ｍｌの実施例２で得たリゾビアレス  ＫＮＫ０５４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５６）由来酸化酵素の精製酵素（グリコールアルデヒドをグリオキサールへ変換）、０．５Ｕ（グリオキサール酸化活性）／ｍｌの実施例７で得たバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＡＩＵ  １２９（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７８７）由来の酸化酵素の精製酵素、１００００Ｕ／ｍｌのカタラーゼ（Ｂｏｖｉｖｅ  Ｌｉｖｅｒ由来；ナカライ社製）を含む３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．３ｍｌを試験管中で、２８℃、６時間振盪しながら反応を行った後、実施例９と同様な方法で、ＨＰＬＣ分析を行った。その結果、７８ｍＭのグリオキシル酸が生成していた。
【００６３】
（実施例１４）グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する酸化酵素の取得
酵母エキス５ｇ、硝酸アンモニウム２ｇ、リン酸水素２カリウム１ｇ、リン酸水素１ナトリウム・２水和物１．３ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．２ｇ、塩化カルシウム０．１ｇ（いずれも１リットル当り）の組成よりなる培地（ｐＨ７）１０ｍｌを大型試験管に分注し、高圧滅菌後、表１記載の微生物を１白金耳植菌し、２８℃で２日間振とう培養した。得られた培養液を遠心分離し、菌体を集め、１ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁した。この菌体懸濁液を超音波破砕し、遠心分離により菌体残渣を除き、無細胞抽出液を得た。このようにして得られた無細胞抽出液について、グリコールアルデヒド、グリオキサールに対する酸化活性（オキシダーゼ活性）を測定した。その結果を表２にまとめる。その結果、これら菌株の無細胞抽出液には、グリオキサールと共にグリコールアルデヒドに対して酸化活性（オキシダーゼ活性）が存在することが明らかとなった。
【００６４】
【表２】
2007228924.tif 000006
【００６５】
［酸化活性測定方法］
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、２０ｍＭ  基質（無添加、グリコールアルデヒド、又は、グリオキサール）、０．６９ｍＭ  ４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、１．０９ｍＭ  Ｎ−エチル−（２−ヒドロキシ−３−スルフォプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、２Ｕ／ｍｌ  ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、および０．２ｍｌの上記無細胞抽出液を含む１．０ｍｌの反応液を試験管中で、３０℃で振とうし、目視で生成するキノンイミン色素を検出した。
【００６６】
（実施例１５）グリコールアルデヒドからのグリコール酸の合成
３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中、２０ｍＭグリコールアルデヒド、５０００Ｕ／ｍｌカタラーゼ（Ｂｏｖｉｖｅ  Ｌｉｖｅｒ由来；ナカライ社製）および０．２ｍｌの実施例１４で得た無細胞抽出液を含む１．０ｍｌの反応液を試験管中で、３０℃で６時間振とうしながら反応を行った後、反応液１００μｌに２００μｌの２００ｍＭ過塩素酸水溶液を添加し、遠心分離後（１５０００ｒｐｍ、１０分間）、上清をＨＰＬＣにより分析した。その結果を表３に示す。いずれの無細胞抽出液においても、グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換する活性が見出された。本反応では、反応系にＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋などの補酵素を添加していないことからデヒドロゲナーゼタイプの酵素では反応が進行しないこと、更に実施例１４で示したように、反応に使用した無細胞抽出液中にはグリコールアルデヒドに対するオキシダーゼ活性が存在することより、本実施例におけるグリコール酸の生成は、オキシダーゼすなわち酸化酵素によるものであると推測される。
【００６７】
［ＨＰＬＣ分析条件］
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  Ｒｓｐａｋ  ＫＣ−８１１（昭和電工社製）を二本連結
検出：ＲＩ（エチレングリコール、グリコールアルデヒド、グリコール酸、グリオキサール、グリオキシル酸）
ＵＶ（グリコール酸、グリオキシル酸）
カラム温度：４０℃
溶離液：５０ｍＭ過塩素酸水溶液
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出時間：エチレングリコール；２２．６分、グリコールアルデヒド；１７．９分、グリオキサール；１５．７分、グリコール酸；１８．５分、グリオキシル酸；１５．７分
【００６８】
【表３】
2007228924.tif 000007
【００６９】
（実施例１６）セルロシミクロビウム・セルランス  ＮＢＲＣ１５５１６株から得た精製酵素を用いたグリコール酸の合成反応
２０ｍＭグリコールアルデヒド、０．１Ｕ（グリコールアルデヒドオキシダーゼ活性）／ｍｌの実施例６で得たセルロシミクロビウム・セルランス  ＮＢＲＣ１５５１６株由来の酸化酵素の精製酵素、１００００Ｕ／ｍｌ  カタラーゼ（Ｂｏｖｉｖｅ  Ｌｉｖｅｒ由来；ナカライ社製）を含む３００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）０．５ｍｌを試験管中で、２８℃、６時間振盪しながら反応を行った後、実施例１５と同様な方法でＨＰＬＣ分析を行った。その結果、１８ｍＭグリコール酸が生成していた。
【００７０】
（実施例１７）セルロシミクロビウム・セルランス  ＮＢＲＣ１５５１６株粗酵素液を用いたグリコール酸の合成反応
２０ｍＭグリコールアルデヒド、０．１Ｕ（グリコールアルデヒドオキシダーゼ活性）／ｍｌの実施例５で得たセルロシミクロビウム・セルランス  ＮＢＲＣ１５５１６株由来の酸化酵素の粗酵素液、１００００Ｕ／ｍｌ  カタラーゼ（Ｂｏｖｉｖｅ  Ｌｉｖｅｒ由来；ナカライ社製）を含む３００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）０．５ｍｌを試験管中、２８℃、６時間振盪しながら反応を行った後、実施例１５と同様な方法でＨＰＬＣ分析を行った。その結果、１７ｍＭグリコール酸が生成していた。
【００７１】
（実施例１８）エチレングリコールからグリオキシル酸の合成反応（エチレングリコール→グリコールアルデヒド→グリコール酸→グリオキシル酸）
１Ｍエチレングリコール、０．６Ｕ（エチレングリコール酸化活性）／ｍｌのピキア属酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｒｉｓ）由来のアルコールオキシダーゼ（シグマ社製）、０．２Ｕ（グリコールアルデヒド酸化活性）／ｍｌの実施例５で得たセルロシミクロビウム・セルランス  ＮＢＲＣ１５５１６由来の酸化酵素の粗酵素液（グリコールアルデヒドをグリコール酸へ変換）、０または０．５Ｕ（グリコール酸酸化活性）／ｍｌのホウレンソウ由来グリコール酸オキシダーゼ（シグマ社製）、１００００Ｕ／ｍｌのカタラーゼ（Ｂｏｖｉｖｅ  Ｌｉｖｅｒ由来；ナカライ社製）を含む３００ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）０．５ｍｌを試験管中で、２８℃、６時間振盪しながら反応を行った後、反応液１００μｌに２００μｌの２００ｍＭ過塩素酸水溶液を添加し、遠心分離後、上清をＨＰＬＣにより分析した。その結果、２７ｍＭのグリオキシル酸が生成していた。
【００７２】
（実施例１９）エチレングリコールからグリオキシル酸の合成反応（エチレングリコール→グリコールアルデヒド→グリコール酸→グリオキシル酸）
１Ｍエチレングリコール、０．６Ｕ（エチレングリコール酸化活性）／ｍｌのピキア属酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｒｉｓ）由来のアルコールオキシダーゼ（シグマ社製）、０．２Ｕ（グリコールアルデヒド酸化活性）／ｍｌの実施例５で得たセルロシミクロビウム・セルランス  ＮＢＲＣ１５５１６由来の酸化酵素の粗酵素液、０．５Ｕ（グリコール酸酸化活性）／ｍｌの実施例８で得たアースロバクター・スピーシーズ  ＫＮＫ−ＧＡ１株由来酸化酵素の精製酵素（グリコール酸をグリオキシル酸へ変換）、１００００Ｕ／ｍｌのカタラーゼ（Ｂｏｖｉｖｅ  Ｌｉｖｅｒ由来；ナカライ社製）を含む３００ｍＭトリス−ＨＣｌ酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．５ｍｌを試験管中で、２８℃、６時間振盪しながら反応を行った後、実施例１５と同様な方法で、ＨＰＬＣ分析を行った。その結果、５３ｍＭのグリオキシル酸が生成していた。
【００７３】
（実施例２０）エチレングリコールからグリオキシル酸の合成反応（エチレングリコール→グリコールアルデヒド→グリコール酸→グリオキシル酸）
１Ｍエチレングリコール、１Ｕ（エチレングリコール酸化活性）／ｍｌの実施例１で得たアスペルギルス・スピーシーズ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＡＩＵ  ０３１の酸化酵素の粗酵素液（エチレングリコールをグリコールアルデヒドへ変換）、０．５Ｕ（グリコールアルデヒド酸化活性）／ｍｌの実施例５で得たセルロシミクロビウム・セルランス  ＮＢＲＣ１５５１６由来の酸化酵素の粗酵素液（グリコールアルデヒドからグリコール酸への変換）、０．５Ｕ（グリコール酸酸化活性）／ｍｌの実施例８で得たアースロバクター・スピーシーズ  ＫＮＫ−ＧＡ１由来酸化酵素の精製酵素（グリコール酸をグリオキシル酸へ変換）、１００００Ｕ／ｍｌのカタラーゼ（Ｂｏｖｉｖｅ  Ｌｉｖｅｒ由来；ナカライ社製）を含む３００ｍＭトリス−ＨＣｌ酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．２ｍｌを試験管中で、２８℃、６時間振盪しながら反応を行った後、実施例１５と同様な方法で、ＨＰＬＣ分析を行った。その結果、４２ｍＭのグリオキシル酸が生成していた。