(57)【要約】【課題】本発明は、哺乳動物の生体組織から分離した幹細胞を用いた、組織再生または修復用の機能性細胞を効率的に分化誘導する技術を提供することを目的とする。【解決手段】哺乳動物の生体組織から分離した幹細胞を用いて、接着培養と浮遊培養を組み合わせることで、再生医療に用いる、生着率の極めて高い移植用の機能性細胞を調製する技術を見出した。特に、本発明では、浮遊培養の工程において、細胞凝集体（スフェア体）が、直径５０〜５００μｍの大きさのもので、幹細胞の未分化状態が持続的に維持され、さらに、皮膚の機能性細胞への分化誘導効率と、移植後の生着率において極めて優れた効果を示した。すなわち、本発明は、幹細胞の未分化状態を継続的に維持させ、その後、生着率の極めて高い組織の再生または修復用の機能性細胞を効率的に分化誘導する方法を提供するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の生体組織から分離した幹細胞を、１）接着培養による工程、２）浮遊培養による工程、３）分化誘導培養による工程を含む３つの段階において実施されることを特徴とする、幹細胞の機能性細胞への分化誘導方法。
【請求項２】
生体組織が骨髄、血液、皮膚および／または脂肪組織由来であることを特徴とする、請求項１に記載の幹細胞の機能性細胞への分化誘導方法。
【請求項３】
浮遊培養として、単一細胞および／または細胞凝集体（スフェア体）を形成させることを特徴とする、請求項１から２に記載の幹細胞の機能性細胞への分化誘導方法。
【請求項４】
細胞凝集体（スフェア体）が５０〜５００μｍであることを特徴とする、請求項１から３に記載の幹細胞の機能性細胞への分化誘導方法。
【請求項５】
機能性細胞が、皮膚を構成する、角化細胞、線維芽細胞、色素細胞、皮脂腺細胞、脂肪細胞および／または毛包細胞であることを特徴とする、請求項１から４に記載の幹細胞の機能性細胞への分化誘導方法。
【請求項６】
請求項１から５に記載の幹細胞の分化誘導方法により調製された、組織再生および／または修復用の機能性細胞。
【請求項７】
哺乳動物の生体組織から分離した幹細胞を、１）接着培養による工程、２）浮遊培養による工程を含む２つの段階において実施されることを特徴とする、幹細胞の未分化維持培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物の生体組織から分離した幹細胞を、１回以上の継代培養（接着培養）と浮遊培養の工程を組み合わせることで、極めて高い生着率を備えた、組織の再生および修復に用いる機能性細胞を得るための、効率的な分化誘導方法、ならびに当該細胞の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊椎動物、特に哺乳動物の組織は、傷害もしくは疾患、または加齢などに伴い細胞・臓器の損傷が起こった場合、再生系が働き、細胞・臓器の損傷を回復しようとする。この作用に、当該組織に備わる多能性を有した細胞（以下、幹細胞と記す）や周囲の細胞が大きな役割を果している。特に、幹細胞は、あらゆる細胞・臓器に分化する多能性を有しており、この性質により細胞・組織の損傷部を補うことで回復に導くと考えられている。このような幹細胞を応用した、次世代の医療である再生医療に期待が集まっている。
【０００３】
哺乳動物における幹細胞研究で最も進んでいる組織は骨髄である。骨髄には生体の造血幹細胞が存在しており、血液細胞の主要な供給源と考えられている。さらに骨髄には、造血幹細胞とは別に、その他の臓器（例えば、骨、軟骨、筋肉、脂肪など）へ分化可能な幹細胞が包含されていることが報告されている（非特許文献１）。
【０００４】
【非特許文献１】Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  Ｍ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８４，１４３−１４７
【０００５】
さらに、近年、骨髄以外にも、肝臓、膵臓、脂肪など、あらゆる臓器に幹細胞が存在することが明らかにされ、各臓器の恒常性維持に大きく関与していると考えられている（非特許文献２〜５）。これら幹細胞を再生医療へ利用するためには、生体組織から幹細胞を分離し、目的とする所定の機能性細胞に効率よく分化誘導を行う必要がある。
【０００６】
【非特許文献２】Ｇｏｏｄｅｌｌ  Ｍ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．，１９９７，３，１３３７−１３４５
【非特許文献３】Ｚｕｌｅｗｓｋｉ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００１，５０，５２１−５３３
【非特許文献４】Ｓｕｚｕｋｉ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０００，３２，１２３０−１２３９
【非特許文献５】Ｚｕｋ  Ｐ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００１，７，２１１−２２８
【０００７】
現在までに、骨髄、血液、肝臓、膵臓、脂肪などからの幹細胞を分離する幾つかの報告がある。これらの方法は、各臓器から酵素処理などで細胞を分散し、遠心分離や幹細胞マーカー（タンパク質や遺伝子）を指標とし、フローサイトメーターなどを用いて幹細胞を分離する方法が主である。
【０００８】
例えば、Ｚｕｋらは、脂肪から遠心分離法を用いて幹細胞を分離する方法を報告している（非特許文献６）。また、Ｒｅｙｅｓらは、骨髄に存在する幹細胞のマーカータンパク質（ＡＣ１３３）を発見し、これを利用することで、幹細胞を分離し、特殊な培養液を用いて培養する技術について報告している（非特許文献７）。また、膵臓からの幹細胞の分離法に関しても同様に、マーカータンパク質（ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ４５およびＴＥＲ１１９）を利用した選択的分離法に関する特許が公開されている（特許文献１）。さらに、その他の方法では、肝臓における幹細胞のマーカータンパク質（Ｔｔｍ２Ａ）をコードするｍＲＮＡを利用することで幹細胞の分離法についての発明が開示されている（特許文献２）。このように、各臓器から幹細胞を選択的に分離する技術についての報告または開示がある。
【０００９】
【非特許文献６】Ｚｕｋ  Ｐ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，２００２，１３，４２７９−４２９５
【非特許文献７】Ｒｅｙｅｓ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２００２，１０９，３３７−３４６
【特許文献１】ＷＯ２００２／０８８３３５号
【特許文献２】特開２００４−１８７６７９号
【００１０】
また、各組織から分離した幹細胞の分化誘導技術の検討も進められている。
【００１１】
例えば、幹細胞のオクタマーバインディングトランスクリプションファクター−３／４（Ｏｃｔ−３／４）の発現を調節することで、神経細胞へ分化誘導する発明が開示されている（特許文献３）。また、間葉系幹細胞を用いた軟骨への分化誘導する方法（非特許文献８、特許文献４）や、造血幹細胞に、ノッチリガンドタンパク質を作用させることで白血球細胞に分化誘導する方法についての開示もある（特許文献５）。さらに、インスリン産生細胞（β細胞）への分化誘導（非特許文献９）、心筋細胞への分化誘導（非特許文献１０）など、様々な細胞への分化誘導技術について報告されている。
【００１２】
【特許文献３】特開２００４−２３６６０７号
【非特許文献８】Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓ  Ａ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８８，１０６，２１３９−２１５１
【特許文献４】特開２００４−２５４６５５号
【特許文献５】特開２００５−１３０５９号
【非特許文献９】Ｌｕｍｅｌｓｋｙ  Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９２，１３８９−１３９４
【非特許文献１０】Ｍａｋｉｎｏ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｏｌｏｇｙ，１９９９，１０３，６９７−７０５
【００１３】
さらに近年では、これら分化誘導技術をより効果的に行い、分化誘導効率を高める特殊な培養技術についての報告または開示がある。
【００１４】
例えば、幹細胞の分化誘導時に１〜５０００ｍＶの電気刺激を与えることで、血管細胞へ効率的に誘導する発明（特許文献６）や、中空糸の内腔に幹細胞を入れた後、遠心力または圧力をかけて凝集体を形成させ、未分化の状態のまま幹細胞を培養することで、軟骨細胞への分化誘導効率を高める発明の開示もみられる（特許文献７）。また、脳から得られた幹細胞を特異的に神経細胞へ導く浮遊培養法についての報告がある（非特許文献１１）。
【００１５】
【特許文献６】特開２００４−１２９６０３号
【特許文献７】特開２００４−１６６６０４号
【非特許文献１１】Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  Ｂ．Ａ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２，１２，４５６５−４５７４
【００１６】
以上のように、本発明に関連する先行技術については幾つか挙げられるが、再生医療への応用を考えると、複雑な組織を再生するためには、その組織の損傷に合わせた機能性細胞を効率よく調製することが必要である。
【００１７】
特に、皮膚は角化細胞、線維芽細胞、色素細胞、皮脂腺細胞、脂肪細胞および毛包細胞など、多くの機能性細胞から構成された複雑な組織であり、皮膚の再生医療には、幹細胞からこれら機能性細胞を効率よく調製し、移植に用いることが必要である。
【００１８】
近年、皮膚の再生医療では、培養表皮シートや三次元培養皮膚などの臨床応用が進められている。しかし、これら培養皮膚は、角化細胞または線維芽細胞のみで構成されるため、その他の機能性細胞（色素細胞、皮脂腺細胞、脂肪細胞や毛包細胞）を含んでおらず、これら細胞を組み込んだ高機能な皮膚の再生が望まれていた（非特許文献１２、１３）。
【００１９】
【非特許文献１２】猪口  貞樹，医学のあゆみ，２００１，１９９，１１４２−１１４６
【非特許文献１３】白方  裕司，日皮会誌，１９９９，１０９，１３０１−１３０７
【００２０】
また、現在まで、複雑な組織ほど細胞移植後の生着率は悪く、繰り返し細胞移植が必要となり、満足のいく治療効果は得られていない。今後、再生医療において生着率の高い移植用の機能性細胞を安定供給するためにも、より簡便で、生着率の高い機能性細胞の分化誘導方法が望まれていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
かかる状況に鑑み、本発明は、上記のような従来技術における問題点を解決し、生体組織から分離した幹細胞から、極めて高い生着率を備えた、組織の再生および修復に用いる機能性細胞を得るための、効率的な分化誘導方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
このような事情により、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、哺乳動物の生体組織から分離した幹細胞を、１回以上の接着培養と浮遊培養の工程を組み合わせることで、幹細胞の未分化状態を維持したまま培養を行い、極めて生着率の高い機能性細胞へ分化誘導する技術を見出し、本発明を完成するに至った。
【００２３】
したがって、本発明は、幹細胞を培養する過程で、当該細胞を段階的に機能性細胞へ分化誘導する培養技術であって、当該細胞の培養段階が、１）接着培養による工程、２）浮遊培養による工程、３）分化誘導培養による工程を含む３つの段階において実施され、この工程により培養することで、幹細胞の未分化状態を継続的に維持させたまま培養を行い、その後、生着率の極めて高い移植用の機能性細胞を調製するものである。
【００２４】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００２５】
本発明で用いることのできる幹細胞は、本発明の目的に沿うものであれば、胚性の幹細胞、もしくは、骨髄、血液、皮膚、脂肪、脳、肝臓、膵臓、腎臓、筋肉やその他の組織から得られる、体性の幹細胞、さらには当該細胞の初代培養細胞、継代培養細胞、凍結細胞いずれであってもよい。しかし、好ましくは、骨髄、血液、皮膚、脂肪組織由来の幹細胞を用いることができる。また、哺乳動物における、幹細胞の分化の方向性、および、分化の過程等について同等の特性を持っていれば、全ての哺乳動物に応用が可能である。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の哺乳動物から得られた幹細胞を用いることができる。
【００２６】
また、哺乳動物の幹細胞を得る方法としては、上記の非特許文献１〜１１に記した方法や、遠心分離による方法、また、幹細胞マーカーを指標としてフローサイトメーターなどの機器を利用して分離する方法が挙げられる。
【００２７】
これら哺乳動物から得られた幹細胞について、以下の３段階を含む培養法にて幹細胞を培養し、その後、分化誘導を行う。
【００２８】
１）接着培養による工程：哺乳動物から得られた幹細胞を、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の環境下で培養する第一の工程。具体的には、接着培養用の培養液を用いて、幹細胞を接着培養し、主に幹細胞を増殖させる工程。この工程を、少なくとも１回以上行うことが好ましい。
【００２９】
２）浮遊培養による工程：１）接着培養による工程の後に、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の環境下で培養する第二の工程。具体的には、浮遊培養用の培養液を用いて、幹細胞を浮遊培養し、主に幹細胞の多分化能と移植時の生着率を向上させる工程。好ましくは、浮遊細胞により、単一の細胞および／または細胞の凝集体（スフェア体）を形成させる工程。この工程を、少なくとも１回以上行うことが好ましい。
【００３０】
上記の２）浮遊培養による工程にある、細胞の凝集体（スフェア体）とは、浮遊培養により幹細胞が増殖したもので、桑の実状の細胞凝集体のことである。凝集体の確認は、顕微鏡により行う。この時、凝集体の大きさは、直径が５０〜５００μｍであることが好ましい。また、直径が１００〜３００μｍであることが、より好ましい。
【００３１】
３）分化誘導培養による工程：２）浮遊培養による工程の後に、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の環境下で培養する第三の工程。具体的には、分化誘導培養用の培養液を用いて、幹細胞を分化誘導し、主に幹細胞を目的の機能性細胞へ分化誘導する工程。
【００３２】
１）接着培養による工程に用いる、接着培養用の培養液としては、以下のものが使用できる。
【００３３】
具体的には、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン）を含む基本培地（例えば、Ｄｕｌｂｅｃｏ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｄｅ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ），Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ），ＲＰＭＩ１６４０，Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ），Ｄｕｌｂｅｃｏ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｄｅ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２），Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ））に、増殖因子として塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）の少なくともいずれか１種を添加した培地が用いられ、好ましくは、これら増殖因子の全てが含有されたものである。また、増殖速度を増大させるために、必要に応じて、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ビタミン類、インターロイキン類、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コラーゲン、フィブロネクチン、プロゲステロン、セレナイト、Ｂ２７−サプリメント、Ｎ２−サプリメント、ＩＴＳ−サプリメントが含有されてもよい。また、必要に応じて、抗生物質が含有されてもよい。
【００３４】
また、上記培養液には、１〜２０％の含有率で血清が含まれることが好ましい。しかし、血清はロットの違いにより成分が異なり、その効果にバラツキがあるため、ロットチェックを行った後に使用することが好ましい。
【００３５】
市販品としては、インビトロジェン製の間葉系幹細胞基礎培地や、三光純薬製の間葉系幹細胞基礎培地などを用いることができる。
【００３６】
２）浮遊培養による工程に用いる、浮遊培養用の培養液としては、以下のものが使用できる。
【００３７】
具体的には、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン）を含む基本培地（例えば、Ｄｕｌｂｅｃｏ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｄｅ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ），Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ），ＲＰＭＩ１６４０，Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ），Ｄｕｌｂｅｃｏ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｄｅ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２），Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ））に、添加因子として塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）、または、Ｂ２７−サプリメントの少なくともいずれか１種を添加した培地が用いられ、好ましくは、これら添加因子の全てが含有されたものである。また、幹細胞の未分化状態を維持させるためと、移植時の生着率を向上させるために、必要に応じて、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コラーゲン、フィブロネクチン、プロゲステロン、セレナイト、Ｎ２−サプリメント、ＩＴＳ−サプリメントが含有されてもよい。また、必要に応じて、抗生物質が含有されてもよい。
【００３８】
また、上記培養液では、血清を含まないことが好ましい。血清はロットの違いにより成分が異なり、さらに、幹細胞の分化に影響する未知の成分が含まれる可能性があるためである。
【００３９】
市販品としては、インビトロジェン製のＮｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍや、タカラ製の神経前駆細胞培地キットなどを用いることができる。
【００４０】
３）分化誘導培養による工程に用いる、分化誘導用の培養液としては、以下のものが使用できる。
【００４１】
具体的には、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン）を含む基本培地（例えば、Ｄｕｌｂｅｃｏ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｄｅ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ），Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ），ＲＰＭＩ１６４０，Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ），Ｄｕｌｂｅｃｏ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｄｅ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２），Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ））に、分化誘導因子として、各機能性細胞に合わせて、細胞塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、エンドセリン類、ビタミン類、サイトカイン類、インターロイキン類、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、レチノイン酸、コラーゲン、フィブロネクチン、プロゲステロン、セレナイト、Ｂ２７−サプリメント、Ｎ２−サプリメント、ＩＴＳ−サプリメントを、必要に応じて含有し使用する。また、必要に応じて、抗生物質が含有されてもよい。
【００４２】
また、上記培養液には、０．１〜２０％の含有率で血清が含まれることが好ましい。しかし、血清はロットの違いにより成分が異なり、その効果にバラツキがあるため、ロットチェックを行った後に使用することが好ましい。
【００４３】
市販品としては、三光純薬製の分化誘導培養液や、ＴＯＹＯＢＯ製の分化培養キットなどを用いることができる。
【００４４】
いずれの培養工程においても、以上の培養液を用いて、３７℃、５％炭酸ガスの環境下で、培養を行い、１〜３日毎の培地交換を行うことが好ましい。
【００４５】
以上の１）〜３）の培養工程を行うことで、幹細胞の未分化能を維持させたまま培養し、その後、分化誘導することで極めて高い生着率を備えた、組織の再生および／または修復に用いる機能性細胞を得ることができる。
【発明の効果】
【００４６】
本発明は、哺乳動物の骨髄、血液、脂肪または皮膚組織をはじめとする生体組織から分離した幹細胞を用いて、上記の１）〜３）の培養工程により、幹細胞の未分化状態を維持したまま培養を行い、その後、分化誘導することで生着率の優れた組織の再生および／または修復に用いる機能性細胞を、簡便に効率よく得ることを特徴とする分化誘導方法である。特に、移植に用いる機能性細胞が、皮膚を構成する、角化細胞、線維芽細胞、色素細胞、皮脂腺細胞、脂肪細胞および／または毛包細胞である場合において、顕著な生着率の向上がみられる分化誘導方法である。以上より、本発明は、組織の再生医学の分野において大きく貢献できるものと期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
以下、次に本発明を詳細に説明するため、具体的且つ詳細な実施例を挙げるが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４８】
骨髄、血液、脂肪または皮膚組織から、幹細胞を、以下の方法で遠心分離法により分離した後、上記１）〜２）の培養工程である、１回以上接着培養し、その後、浮遊培養に移行させた細胞を用いて、従来の接着培養のみで培養する方法と、浮遊培養のみで培養する方法、そして本発明の接着培養と浮遊培養を組み合わせた方法における、幹細胞の状態（未分化の状態）について、下記の方法にて評価した。
【００４９】
培養液１の調製（接着培養液）
接着培養液として、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ＭｅｄｉｕｍとＦ−１２培養液の１：１混合培養液（Ｇｉｂｃｏ）に、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、１０％）、非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ）、ヌクレオシド溶液（Ｇｉｂｃｏ）、１０３ＵのＥＳＧＲＯ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）、１００ｕｎｉｔ／ｍＬのペニシリン（シグマ）と１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ベーリンガー）を添加した培養液を用いた（以降、培養液１と記す）。
【００５０】
培養液２の調製（浮遊培養液）
浮遊培養液として、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ＭｅｄｉｕｍとＦ−１２培養液の１：１混合培養液（Ｇｉｂｃｏ製）に、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬ、シグマ製）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬ、シグマ製）、非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ製）、ヌクレオシド溶液（Ｇｉｂｃｏ製）、Ｂ２７サプリメント（インビトロジェン製）、１０３ＵのＥＳＧＲＯ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ製）、１００ｕｎｉｔ／ｍＬのペニシリン（シグマ製）と１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ベーリンガー製）を添加した無血清培養液を用いた（以降、培養液２と記す）。
【００５１】
骨髄由来幹細胞の調製
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雄性、４週齢）の大腿骨を無菌的に摘出し、周囲の結合組織を出来る限り除去した後、両骨端を骨尖刃刀にて切り落とした。その後、２５Ｇ針付の注射筒を一方の骨端に突き刺し、ＰＢＳ（−）を注入し骨髄を５０ｍＬ容の遠沈管（Ｆａｌｃｏｎ製）に押し出した。その後、セルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ製）を通しながら別の５０ｍＬ容の遠沈管に移し、遠心分離した。上清を除去し、新たに培養液２を加えて細胞を分散させ洗浄した。この洗浄操作を２回繰り返した。洗浄後、遠心分離法により幹細胞を分離した。
【００５２】
血液由来幹細胞の調製
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雄性、４週齢）から採血し、赤血球用血液（ミルティニーバイオ製）にて７分間処理を行った。その後、遠心分離し、上清を除去した後、新たに培養液２を加えて細胞を分散させ洗浄した。この洗浄操作を２回繰り返した。洗浄後、遠心分離法により幹細胞を分離した。
【００５３】
皮膚および脂肪由来幹細胞の調製
Ｃ５７ＢＬ／６（雄性、４週齢）を刈毛処理した後、皮膚及び腹部皮下脂肪組織をそれぞれ別々に無菌的に摘出し、ＰＢＳ（−）で３回洗浄した後、直径６ｃｍの組織培養ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ製）に移した。それぞれの組織を、尖刃刀により約２ｍｍ角に細切し、０．２％コラゲナーゼ溶液（新田ゼラチン製）を加え、プラスチックディッシュを上下左右に揺らして溶液中に拡散させた。これらを、３７℃で３０分間インキュベートすることで細胞外マトリックスを消化した後、穏やかにピペッティングし細胞を分散させた。この細胞分散液を５０ｍＬ容の遠沈管（Ｆａｌｃｏｎ製）にセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ製）を通しながら移した。さらに、培養液１を適量添加し、よくピペッティングした後、５分間遠心分離した。遠心後、上清画分を除去し、新たに培養液１を加えて細胞を分散させ洗浄した。この洗浄操作を２回繰り返した。洗浄後、遠心分離法により幹細胞を分離した。
【００５４】
以上の方法にて骨髄、血液、皮膚および脂肪組織から得られた幹細胞を用いて、まず培養液１による３日間の接着培養を行った、その後、培養液２による浮遊培養に移行し、１４日間培養した（接着培養後に浮遊培養へ移行させる培養方法。以下、実施例１と記す）。なお、浮遊培養により得られた細胞凝集体（スフェア体）は、１００〜３００μｍであった（以降の試験にも適用）。
【００５５】
比較例１
実施例１と同様に、骨髄、血液、皮膚および脂肪組織から調製したそれぞれの細胞を用いて、培養液２による浮遊培養を行わず、継続して培養液１により１７日間の接着培養を行った（接着培養による培養方法。以下、比較例１と記す）。
【００５６】
比較例２
実施例１と同様に、骨髄、血液、皮膚および脂肪組織から調製したそれぞれの細胞を用いて、培養液１による接着培養を行わず、継続して培養液２による１７日間の浮遊培養を行った（浮遊培養による培養方法。以下、比較例２と記す）。なお、浮遊培養により得られた細胞凝集体（スフェア体）は、実施例１と同様に、１００〜３００μｍであった（以降の試験にも適用）。
【００５７】
アルカリフォスファターゼ活性の測定による幹細胞の未分化状態の比較
実施例１、比較例１および比較例２における、幹細胞の未分化状態を以下の方法で比較した。
【００５８】
幹細胞の未分化状態の指標として、アルカリフォスファターゼ活性を測定した（文献：末盛  博文，実験医学別冊  幹細胞・クローン研究プロトコール，２００１，１０−１６）。具体的には、アルカリフォスファターゼ検出キット（ＣＨＥＭＩＣＯＮ製）を用いて、実施例１、比較例１および比較例２における培養開始時点のアルカリフォスファターゼ活性を１００％として、培養３日後、７日後および１４日後のアルカリフォスファターゼ活性（％）を測定し、結果を１〜４に示した。
【００５９】
【表１】
2007267672.tif 000002
【００６０】
【表２】
2007267672.tif 000003
【００６１】
【表３】
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【００６２】
【表４】
2007267672.tif 000005
【００６３】
以上の表１〜４に示した結果から、実施例１の方法は、比較例１および比較例２に比べて、骨髄、血液、皮膚および脂肪由来幹細胞の全てにおいて、培養３日、７日、１４日後も幹細胞の未分化状態が顕著に保たれていた。
【００６４】
また、浮遊培養による期間を調節することで、細胞凝集体（スフェア体）の大きさを、直径５０μｍ以下と、５００μｍ以上のものにおいて同様な試験を行ったところ、直径１００〜３００μｍのものに比べて、未分化状態（アルカリフォスファターゼ活性％）が２割程度低下した。
【００６５】
以上の結果より、実施例１による培養方法における直径１００〜３００μｍの細胞凝集体（スフェア体）は、幹細胞の未分化状態を持続的に維持させることを確認した。
【実施例２】
【００６６】
実施例１による培養を行ったそれぞれの細胞を用いて、以下の方法で皮膚を構成する機能性細胞である、角化細胞、線維芽細胞、色素細胞、皮脂腺細胞、脂肪細胞および毛包細胞への分化誘導効率（％）を比較した。
【００６７】
角化細胞への分化誘導および確認
実施例１、比較例１または比較例２で培養したそれぞれの細胞を、角化細胞用培養液（ＴＯＹＯＢＯ製）に角化細胞増殖因子（ＫＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬ、シグマ製）を添加した培地にて、３７℃、５％ＣＯ２の条件で１４日間培養した。培養液は３日間毎に新鮮な角化細胞用培養液に交換した。角化細胞への分化誘導確認は、細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、免疫染色（ケラチン）により、ケラチンが染色された細胞を指標に行った。
【００６８】
線維芽細胞への分化誘導および確認
実施例１、比較例１または比較例２で培養したそれぞれの細胞を、線維芽細胞用培養液（ＴＯＹＯＢＯ製）に線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬ、シグマ製）を添加した培地にて、３７℃、５％ＣＯ２の条件で１４日間培養した。培養液は３日間毎に新鮮な線維芽細胞用培養液に交換した。線維芽細胞への分化誘導確認は、細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、免疫染色（フィブロネクチン）により、フィブロネクチンが染色された細胞を指標に行った。
【００６９】
色素細胞への分化誘導および確認
実施例１、比較例１または比較例２で培養したそれぞれの細胞を、色素細胞用培養液（ＴＯＹＯＢＯ）に幹細胞因子（ＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍＬ、シグマ製）およびエンドセリン（１０ｎｇ／ｍＬ、シグマ製）を添加した培地にて、３７℃、５％ＣＯ２の条件で１４日間培養した。培養液は３日間毎に新鮮な色素細胞用培養液に交換した。色素細胞への分化誘導確認は、細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、フォンタナ・マッソン染色（メラニン）により、メラニンが染色された細胞を指標に行った。
【００７０】
皮脂腺細胞への分化誘導および確認
実施例１、比較例１または比較例２で培養したそれぞれの細胞を、皮脂腺細胞用培養液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ＭｅｄｉｕｍとＦ−１２培養液の１：１混合培養液（Ｇｉｂｃｏ製））に、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、１０％）、上皮細胞成長因子（EGF、１０ｎｇ／ｍＬ、シグマ製）、テストステロン（シグマ製）を添加した培地にて、３７℃、５％ＣＯ２の条件で１４日間培養した。培養液は３日間毎に新鮮な脂肪細胞用培養液に交換した。皮脂腺細胞への分化誘導確認は、細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、免疫染色（PPARγ）により、PPARγが染色された細胞を指標に行った。
【００７１】
脂肪細胞への分化誘導および確認
実施例１、比較例１または比較例２で培養したそれぞれの細胞を、脂肪細胞用培養液（ＴＯＹＯＢＯ製）にインスリン（シグマ製）を添加した培地にて、３７℃、５％ＣＯ２の条件で１４日間培養した。培養液は３日間毎に新鮮な脂肪細胞用培養液に交換した。脂肪細胞への分化誘導確認は細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、オイルレッドＯ染色により、脂肪滴が赤く染色された細胞を指標に行った。
【００７２】
毛包細胞への分化誘導および確認
実施例１、比較例１または比較例２で培養したそれぞれの細胞を、毛包細胞用培養液（ＴＯＹＯＢＯ製）にアスコルビン酸マグネシウム（シグマ製）を添加した培地にて、３７℃、５％ＣＯ２の条件で１４日間培養した。培養液は３日間毎に新鮮な毛包細胞用培養液に交換した。毛包細胞への分化誘導確認は細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液により固定した後、免疫染色（ヘアーケラチン）により、ヘアーケラチンが染色された細胞を指標に行った。
【００７３】
比較例３
比較例１（接着培養）による培養を行ったそれぞれの細胞を用いて、実施例２と同様に、上記の角化細胞、線維芽細胞、色素細胞、皮脂腺細胞、脂肪細胞および毛包細胞への分化誘導および確認を行った。
【００７４】
比較例４
比較例２（浮遊培養）による培養を行ったそれぞれの細胞を用いて、実施例２と同様に、上記の角化細胞、線維芽細胞、色素細胞、皮脂腺細胞、脂肪細胞および毛包細胞への分化誘導および確認を行った。
【００７５】
実施例２、比較例３および比較例４の分化誘導効率（％）の比較
実施例２、比較例３または比較例４で培養した細胞を、それぞれ角化細胞、線維芽細胞、色素細胞、皮脂腺細胞、脂肪細胞および毛包細胞への分化誘導した後、各細胞の確認染色を行い、顕微鏡観察にて単一細胞（５００個）当りの分化した細胞数を計測した。その結果をもとに分化誘導効率（計測した細胞（５００個）中の分化した細胞数の割合％）を算出し、実施例２、比較例３および比較例４における分化誘導効率を比較した。
【００７６】
【表５】
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【００７７】
【表６】
2007267672.tif 000007
【００７８】
【表７】
2007267672.tif 000008
【００７９】
【表８】
2007267672.tif 000009
【００８０】
表５〜８に示した結果から、実施例２の方法は、骨髄、血液、皮膚および脂肪由来の幹細胞全てにおいて、比較例３と比較例４に比べて、皮膚を構成する機能性細胞（角化細胞、線維芽細胞、色素細胞、皮脂腺細胞、脂肪細胞および／または毛包細胞）への分化誘導効率が顕著に上昇した。
【００８１】
また、細胞凝集体（スフェア体）の大きさを、直径５０μｍ以下と、５００μｍ以上にしたものにおいて同様な試験を行ったところ、直径１００〜３００μｍのものに比べて、分化誘導効率（％）が２割程度低下した。
【００８２】
以上の結果より、実施例２による培養方法により、各機能性細胞への分化誘導効率が著しく向上することを確認した。
【実施例３】
【００８３】
実施例２、比較例３および比較例４で分化誘導した各細胞を用いて、以下の方法で細胞移植を行い、移植後のそれぞれの生着率（％）を比較した。
【００８４】
生着率（％）の確認
骨髄、血液、脂肪または皮膚組織から幹細胞を分離した後、実施例２で分化誘導した各細胞（角化細胞、線維芽細胞、色素細胞、皮脂腺細胞、脂肪細胞および／または毛包細胞）を用いて、以下の方法にて、皮膚移植を行い、生着率（％）について測定した。
【００８５】
移植用の皮膚を構成する各機能性細胞の調製
実施例２で分化誘導した各細胞（角化細胞、線維芽細胞、色素細胞、皮脂腺細胞、脂肪細胞および／または毛包細胞）を、それぞれ５％ＦＢＳ添加ハンクス液（Ｈａｎｋ‘ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に分散し、以下の各細胞のマーカーにて分化した機能性細胞を標識し、フローサイトメーターにて分離回収した。具体的には、角化細胞の分離用マーカーとして抗ケラチン抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ製）、線維芽細胞の分離用マーカーとして抗ファイブロブラスト抗体（Ｒ＆Ｄ製）、色素細胞の分離用マーカーとして抗ＭＩＴＦ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ製）、皮脂腺細胞の分離用マーカーとして抗ＰＰＡＲγ抗体（ベイバイオ製）、脂肪細胞の分離用マーカーとしてＮｉｌｅ  Ｒｅｄ染色（アルドリッチ製）、毛包細胞の分離用マーカーとして抗ヘアーケラチン抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ製）をそれぞれ用いて、３０分間氷中にて反応させた後、５％ＦＢＳ添加ハンクス液にて３回洗浄した。続いてＡｌｅｘａ  Ｆｒｕｏ  ４８８で標識した抗ＩｇＧモノクローナル２次抗体（インビトロジェン製）と３０分間氷中にて反応させた。なお、ＮｉｌｌＲｅｄ染色については、２次抗体反応の工程は必要ないため、省いた。反応終了後、５％ＦＢＳを含むハンクス液にて３回洗浄した後、ＰＢＳに細胞を懸濁した。これら蛍光標識したそれぞれの機能性細胞を、フローサイトメーター（ベックトン・ディッキンソン製）にて分離回収し、移植用細胞として用いた。
【００８６】
機能性細胞の移植および生着率（％）の測定
フローサイトメーターにより分離回収した各機能性細胞（角化細胞、線維芽細胞、色素細胞、皮脂腺細胞、脂肪細胞および／または毛包細胞）それぞれ１０６個を、ヌードマウス（雄性、４週齢）の皮下に移植した。具体的には、移植する１０６個の細胞を、予めＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ（モレキュラープローブ製）にて蛍光標識し、その時点の蛍光強度を測定し１００％とした。移植部位をマジックにてマーキングし、移植１週間、２週間、４週間後に移植部位を摘出し、酵素処理により細胞を分散させ、蛍光強度を測定し、移植時の蛍光強度（１００％）と比較することで、生着率（％）を算出した。
【００８７】
比較例５
比較例３で分化誘導した各細胞（角化細胞、線維芽細胞、色素細胞、皮脂腺細胞、脂肪細胞および／または毛包細胞）を用いて、実施例３と同様にヌードマウス（雄性、４週齢）の皮下に移植し、その生着率（％）を測定した。
【００８８】
比較例６
比較例４で分化誘導した各細胞（角化細胞、線維芽細胞、色素細胞、皮脂腺細胞、脂肪細胞および／または毛包細胞）を用いて、実施例３と同様にヌードマウス（雄性、４週齢）の皮下に移植し、その生着率（％）を測定した。
【００８９】
実施例３、比較例５または比較例６による細胞移植後の生着率（％）の比較
実施例３、比較例５または比較例６における、皮膚を構成する機能性細胞（角化細胞、線維芽細胞、色素細胞、皮脂腺細胞、脂肪細胞および／または毛包細胞）の移植１週間、２週間、４週間後の生着率（％）を比較し、結果を９〜１４に示した。
【００９０】
【表９】
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【００９１】
【表１０】
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【００９２】
【表１１】
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【００９３】
【表１２】
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【００９４】
【表１３】
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【００９５】
【表１４】
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【００９６】
表９〜１４に示した結果から実施例３は、比較例５または比較例６に比べて、移植１週間、２週間、４週間後すべてにおいて、極めて高い生着率を示した。
【００９７】
また、表９〜１４以外の細胞（実施例３、比較例５および比較例６における、骨髄由来幹細胞から分化誘導した線維芽細胞、色素細胞、皮脂腺細胞、脂肪細胞または毛包細胞、血液由来幹細胞から分化誘導した角化細胞、色素細胞、皮脂腺細胞、脂肪細胞または毛包細胞、皮膚由来幹細胞から分化誘導した線維芽細胞、色素細胞、皮脂腺細胞、脂肪細胞または毛包細胞、脂肪由来幹細胞から分化誘導した角化細胞、線維芽細胞、色素細胞）についても同様な試験を行ったところ、いずれも実施例３の方法は、比較例５および比較例６に比べて、移植１週間、２週間、４週間後すべてにおいて、極めて高い生着率を確認した。
【００９８】
また、細胞凝集体（スフェア体）の大きさを、直径５０μｍ以下と、５００μｍ以上にしたものにおいて同様な試験を行ったところ、直径１００〜３００μｍのものに比べて、生着率（％）が３割程度低下した。
【００９９】
以上の結果より、実施例３による方法は、細胞移植における生着率を優位に向上させることを確認した。
【０１００】
以上の結果から、骨髄、血液、脂肪または皮膚組織から得られた幹細胞を用いて、従来の接着培養のみによる培養、または浮遊培養のみで培養した時に比べて、接着培養と浮遊培養を組み合わせることで、幹細胞の未分化状態を持続させ、生着率の高い機能性細胞への分化誘導効率が顕著に向上することを明らかにした。また、この時、浮遊細胞における細胞凝集体（スフェア体）の大きさが、直径５０〜５００μｍのものに関して、幹細胞の未分化状態の維持と、その後の機能性細胞への分化誘導効率、さらに移植時の生着率が極めて優れていた。特に、本発明の分化誘導方法では、機能性細胞として、皮膚を構成する角化細胞、線維芽細胞、色素細胞、皮脂腺細胞、脂肪細胞および／または毛包細胞において、分化誘導率が相乗的に向上することを明らかにした。本発明によれば、簡便に皮膚を構成する機能性細胞（角化細胞、線維芽細胞、色素細胞、皮脂腺細胞、脂肪細胞および／または毛包細胞）を調製することが可能であり、皮膚の損傷に応じて幹細胞から必要な機能性細胞を調製することが可能であると考える。故に本発明は、今後の再生医療における、移植用の細胞調製方法および移植方法に大きく貢献できるものと考える。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明の活用例として、再生医療への応用が期待される。例えば、骨髄、血液、皮膚および脂肪組織の幹細胞から、再生医療における生着率の高い移植用細胞を、効率よく調製することが可能となった。特に、皮膚を構成する機能性細胞（角化細胞、線維芽細胞、色素細胞、皮脂腺細胞、脂肪細胞および／または毛包細胞）を簡便に調製することが可能となり、さらに、移植後の生着率も極めて高いことから、今後の再生医療における有用な細胞調製技術として期待される。すなわち、本発明は、生体組織から得られた幹細胞を、従来よりも極めて生着率の高い、皮膚などの組織の再生および／または修復用の機能性細胞へ効率よく分化誘導する、優れた幹細胞の分化誘導方法といえる。