(57)【要約】【課題】非直線的な相互作用における色素を含む物質の安定性を高めること。【解決手段】ある物質で標識付けされた試料の構造を高解像度で空間結像する方法は、選択された物質を光学的切換え信号によって試料の領域で第１の状態から第２の状態に移行させ、その際に定義された領域を意図的に省き、第１の状態の物質に割り当てられた光学測定信号を、その物質が第２の状態に移行される領域の他に意図的に省かれる領域をも含む記録領域について記録する。物質は、第１及び第２の状態が分子の立体構造状態、分子の構造式、分子内での原子の空間配置、分子内での結合の空間配置、ある分子へのその他の原子または分子の堆積、原子および／または分子のグループ化、分子の空間配向、隣接する分子相互の配向、複数の分子および／または原子から形成された配列のうちの少なくとも一つの判断基準に関して区別されるような物質の部分群から選択され、その物質が合成ナノ粒子内にある。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある物質で標識付けされた試料の構造を高解像度で空間結像する方法であって、光学的切換え信号によって繰り返し第１の光学特性を有する第１の状態から第２の光学特性を有する第２の状態へと移行可能で、該第２の状態から該第１の状態へと復帰できる物質群から該物質を選択する工程と、該物質を該切換え信号によって試料の領域で該第２の状態に移行させ、その際に、定義された領域を意図的に省く工程と、該第１の状態の該物質に割り当てられた光学測定信号を、該物質が該第２の状態に移行される領域の他に該意図的に省かれる領域をも含む記録領域について記録する工程とを備え、該物質は、該第１及び第２の状態が、分子の立体構造状態、分子の構造式、分子内での原子の空間配置、分子内での結合の空間配置、ある分子へのその他の原子または分子の堆積、原子および／または分子のグループ化、分子の空間配向、隣接する分子相互の配向、複数の分子および／または原子から形成された配列のうちの少なくとも１つの判断基準に関して区別されるような物質の部分群から選択され、該物質が合成ナノ粒子内にあることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ナノ粒子が別の物質への堆積に適するエンベロープを備えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記エンベロープが分子でコーティングされることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記エンベロープが疎水性物質または親水性物質であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記エンベロープが光透過性であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記エンベロープがケイ素からなることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ナノ粒子がケイ素含有化合物であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記物質が化学的に生成された有機化学または無機化学色素であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
色素特性を制御するために添加物が前記ナノ粒子に導入されることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
電子供与体、三重項失活剤、酸素失活剤、またはその他の発色団安定物質のような添加物が前記ナノ粒子に導入されることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２の状態の寿命が１ｎｓ以上であることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記物資の第１及び第２の状態の異なる光学特性が異なるスペクトル特性であることを特徴とする請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の光学特性が、テスト信号に対して前記第２の光学特性とは異なる吸収を示すことを特徴とする請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の光学特性が、蛍光、燐光、エレクトロルミネセンスおよび化学ルミネセンスを含む群のうちの前記第２の光学特性とは異なるルミネセンスを有することを特徴とする請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記物質および前記切換え信号が、該切換え信号の強度が飽和限界値を超える位置ではどこでも前記物質の前記第２の状態が完全に生ずるように互いに調整されることを特徴とする請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記意図的に省かれる領域の外の前記全記録領域内の前記切換え信号の強度が前記飽和限界値を超え、前記意図的に省かれる空間領域が前記切換え信号の局部的最低強度であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記切換え信号の前記局部的最低強度が干渉パターンのゼロ位置を有する最低強度であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記物質が、別のスイッチ信号によって前記第２の状態から前記第１の状態へと移行可能な物質群から選択されることを特徴とする請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記別のスイッチ信号が、前記切換え信号の前に、または該切換え信号と同時に前記試料に印加されることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記別のスイッチ信号が、前記記録領域を囲むより大きい領域にわたって前記試料に印加されることを特徴とする請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記切換え信号の後にテスト信号が前記試料に印加されることを特徴とする請求項１乃至２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記テスト信号が、前記意図的に省かれた領域を囲むより大きい領域にわたって前記試料に印加されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ルミネセンスが前記別のスイッチ信号によって励起され、該別のスイッチ信号が、前記切換え信号の印加中に前記試料に印加されることを特徴とする請求項１乃至２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記試料が、前記意図的に省かれた領域と共に走査されることを特徴とする請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１の状態にある前記物質に割り当てられた複数の光学測定信号が同時に、かつ前記物質がそのつど前記第２の状態に移行される領域の他に前記意図的に省かれた領域を含む複数の領域について互いに別々に記録されることを特徴とする請求項１乃至２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記切換え信号によって、前記試料の領域にある前記物質を前記第２の状態に移行させ、その際に定義された領域が意図的に省かれる工程と、該第１の状態の該物質に割り当てられた光学測定信号を、該そのつど意図的に省かれる定義された領域を含む記録領域について記録する工程と、該試料の定義された様々な領域について該物質を前記第１の状態に移行させる工程とが周期的順序で連続的に実施されることを特徴とする請求項１乃至２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１乃至２０のいずれか１項に記載の方法を用いる蛍光顕微鏡の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高解像度の空間結像方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
結像光学方法の空間解像度は、基本的に関連する光学信号の波長での回折限界（アッベ限界）によって設定される。
しかし、有効焦点の鮮鋭度と光学励起信号の入射強度との非直線的な関係を利用することによって、試料の構造を結像する際の回折限界を効果的に下回るようにする方法が蛍光顕微鏡の分野で既に公知である。
【０００３】
その例は、試料内の多光子吸収または光学励起信号の高調波の生成である。例えば誘導放出による蛍光状態の空乏化（英語表記：ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ＝ＳＴＥＤ）、または基底状態の空乏化（英語表記：ｇｒｏｕｎｄ  ｓｔａｔｅ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ＝ＧＳＤ）の場合のような光学的に誘発される遷移の飽和も、非直線的な関係として利用できる。原理的には分子解像を達成できるこのどちらの方法でも、切換え光信号が、この明細書では飽和限界値と呼ばれる特徴的限界値を超える位置ではどこでも、試料の関心対象の構造が標識付けされる蛍光色素は、蛍光が（それ以上）生じないエネルギー状態に移行する。その際に、そこから測定信号が記録される空間領域が、ゼロ位置を有し、例えば干渉によって生成される切換え光信号の局部的強度最小値によって決定される場合、その空間領域のサイズ、すなわち達成される局部解像度は、回折限界よりも低くなる。その理由は、そこから測定信号が記録される空間的に限定された部分領域が、蛍光に関与する状態の空乏化の飽和度が増加するにつれて狭まるからである。まったく同様に、焦点、またはストリップのエッジは急峻になり、それによっても局部解像度が高まる。
【０００４】
アッベによって仮定された解像限界を下回るようにするには、様々な光学結像方法において、回折光と試料の蛍光物質との間の非直線的な相互作用が利用される。誘導放出空乏化（ＳＴＥＤ、例えば、特許文献１参照）を用いた顕微鏡では、その際に非直線的過程は誘導放出による脱励起の飽和である。それに対して放射パターン化励起式顕微鏡検査（ＳＰＥＭ、例えば、特許文献２参照）では、蛍光物質の応答における非直線性を得るために一般に公知の励起飽和が用いられる。
【０００５】
その場合の基本概念は、物体の結像（物体構造の画像）を得るために、物体上に空間パターンで形成される物体の少なくとも２つの部分画像をそれぞれ異なる照明強度で撮影することである。その際、それぞれの物体点ごとに、その物体点から検出された光には、その物体点で放出される照明強度に対して非直線的な依存性があり、部分画像は、物体構造の様々な空間周波数成分の様々な寄与分を含み、部分画像から空間周波数成分の再構築によって所望の物体像を得る必要がある。様々な部分画像を把握するために、様々な空間パターンで照明強度を調整することによって、仮想の低周波および高周波の空間周波数成分が照明強度のパターンで生成され、これに物体構造の空間周波数成分が結合されるという利点がある。この結合によって、物体構造の空間周波数成分が、光学伝達関数（ＯＴＦ）に応じて画像把握のために開かれた空間周波数間隔に関して移動する。部分画像から、適宜に拡張された空間周波数領域を有する完全な物体結像を再構築することができる。
【０００６】
ＳＴＥＤ方式の場合は、試料または試料内の蛍光色素が、蛍光に対する光励起信号によって励起される。次いで、回折限界が適用される励起の空間領域は、切換え信号としての脱励起光線の干渉パターンの最低強度と重畳されることによって、縮小される。切換え信号が飽和限界値を超える位置ではどこでも、蛍光色素は誘導放出によって完全に遮断される。すなわち、以前に励起されたエネルギー状態から再び脱励起される。引き続きそこから蛍光が自然に放出される残りの空間領域は、切換え信号がまったく存在せず、または充分な強度で存在しないような、最低強度のゼロ位置の周囲の縮小エリアにしか対応しない。この蛍光顕微鏡法は、理解できるように、回折限界が低い局部解像度をもたらすものの、欠点も伴っている。励起光によって励起される蛍光色素のエネルギー状態の寿命は短い。したがって、さらに短い期間内で切換えが効果的に完了するためには、比較的高い強度の切換え信号を使用しなければならない。切換え信号による脱励起の際に、残りの蛍光と切換え信号の強度との間に非直線的関係が生成されるには、すなわち飽和に達するには、脱励起光の強度は補足的に極めて高くなければならない。したがって通常は脱励起光用には、公知の方法の実施を極めて低コストで行う高出力のパルス・レーザが使用される。
【０００７】
上記の欠点は公知のＧＳＢ方式（基底状態空乏化、例えば、非特許文献１参照）にも当てはまる。というのは、この場合も関与するエネルギー状態の寿命が短いことによって、時間制限および必要出力が設定されるからである。
【０００８】
もちろんピーク必要出力はＳＴＥＤの場合よりも少ない。
蛍光たんぱく質による切換えと、蛍光顕微鏡における解像度上昇のためのその利用方法が例えば、特許文献３に記載されている。
【０００９】
非直線的な相互作用は、解像度上昇のためのこの方法および使用される全ての方法に共通の幾つかの問題点をもたらす。従来使用されてきた色素は、一般に充分な非直線的応答を誘発するには条件付きでしか、適していない。このように、例えば高解像度方法の条件下で多くの色素は強化された漂白を呈する（例えば、非特許文献２参照）。例えば、色素Ｃｙ５を非直線的応答条件の下で安定させるには、三重項失活剤、酸素捕捉剤のような添加物が添加されなければならない（例えば、非特許文献３参照）。これらの添加物は、例えば生体内実験に必要な生理学的環境とは調和しないので、もちろん利用可能性を大幅に制約する。さらに、高解像度のために重要な特性を有する多くの重要な色素は、例えば溶剤として水を使用するような生理学的条件では使用できない（例えば、非特許文献４参照）。その理由は、とりわけ、これらの色素は、強い極性の溶剤としての水中では極めて弱い可溶性しか示さず、あるいはこれらの色素は溶剤の極性が高まるにつれて量子収量が低下することである（例えば、非特許文献５参照）。
【００１０】
実装および必要な構造が簡単であるため、極めて魅力的な、基底状態空乏化（ＧＳＤ）のような解像度上昇のための幾つかの方法は、必要な非直線的な相互作用に対する色素の安定性が欠如しているので利用できない。
【特許文献１】米国特許第５，７３１，５８８号明細書
【特許文献２】欧州特許第１，１５７，２７９号明細書
【特許文献３】欧州特許第１，６１６，２１６号明細書
【非特許文献１】エス・ダブリュー・ヘル（Ｓ．Ｗ．Ｈｅｌｌ）およびエム・クロング（Ｍ．Ｋｒｏｎｇ）“Ｇｒｏｕｎｄ−Ｓｔａｔｅ−Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ”，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｂ６０（１９９５）４９５
【非特許文献２】ダイバ（Ｄｙｂａ）等、Ａｐｐｌ．Ｏｐｔ．４２（２５）、ｐｐ．５１２３−５１２９、２００３
【非特許文献３】ハイレマン（Ｈｅｉｌｅｍａｎｎ）等、Ｊ  Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７、ｐｐ．３８０１−３８０６、２００５
【非特許文献４】イリー（Ｉｒｉｅ）等、Ｎａｔｕｒｅ  ４２０（６９１７）、ｐｐ．７５９−７６０、２００２
【非特許文献５】リアン（Ｌｉａｎｇ）等、Ｐｒｏｃｔ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１００（１４）、ｐｐ．８１０９−８１１２、２００３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、非直線的な相互作用における色素を含む物質の安定性を高めることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の目的は、請求項１の特徴を有する方法によって達成される。
この新規な方法の有利な実施形態は、従属請求項に記載されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
非直線的応答条件下で色素を安定させるために、核−エンベロープの粒子を使用した一連の方法が提案される。このナノ粒子は、例えば酸化ケイ素をベースとして合成することができる。この合成はとりわけ、米国特許出願公開第２００４／０１０１８２２号明細書から公知である。この合成では、１つまたは複数の色素分子が酸化ケイ素のエンベロープ内部に封入され、それによって、この発色団と試料中の別の物質との相互作用が、意図的に変更、例えば最小限にできる。合成時にナノ粒子の核内に補足的に封入される物質との相互作用も、意図的にその強さもしくは濃度を変更することができる。化学的に不活性な酸化ケイ素エンベロープによって、発色団および添加物の化学的および物理的作用がナノ粒子内部に限定でき、したがって、外部の試料環境への影響が最小限になる。この基本原理から、以下に記載される一連の方法が得られる。
【００１４】
非直線的応答条件下で色素の漂白挙動に好影響を及ぼすために、蛍光物質に補足的に以下のクラス（電子供与体、三重項失活剤、酸素失活剤等）からの１つまたは複数の物質が粒子内部にパックできる。その際に、ナノ粒子のエンベロープにより、この物質の取るに足らない量しか試料の外側に達さず、周囲条件を変化させないことが保証される。逆に同じことが、色素の特性に悪影響を及ぼす、例えば水のような試料内の物質にも当てはまる。
【００１５】
この物質が色素分子のすぐ近傍に存在することによって、発光しない色素カチオンのその後の形成を伴う励起状態吸収のような複数の漂白チャネルが防止でき、あるいはその作用が強く制限できる。酸化ケイ素ナノ粒子の特別の利点は、必要な添加物が色素分子の空間的近傍にあるので、添加物の量が少なくて済み、また検査される試料へのこの添加物の作用がわずか乃至ごくわずかなことにある。
【００１６】
何らかの成分の添加は、様々な時点で行うことができる。ドットの組成および結合の種類も変更できる。重要なのは、これらの成分が、色素またはその近傍にある、すなわち核内またはエンベロープの内側にある分子との共有結合によって色素と接触しなければならないことである。あるいは、添加物を非共有結合的に導入し、それによって、それらを核内で拡散できるが、ドットのエンベロープにより外部への拡散が防止されるようにすることも考えられる。
【００１７】
ＡＰＴＳの添加の例は、米国特許出願公開第２００４／０１０１８２２号明細書（実施例１、段落［０１４３］）に記載されている。
さらに、粒子のエンベロープを、例えば酸素、溶剤、ｐＨ値などのような悪影響を及ぼす物質または検査試料の環境特性を蛍光物質（単数または複数）から遠ざけ、または障害となる相互作用を低減するために利用することもできる。それにより、それぞれの色素にとって、生理学的またその他の所望の特性を放棄する必要なく、色素の必要条件に最適に適合するミクロ環境を作り出すことが可能になる。ナノ粒子のエンベロープにより、特に、測定不能または極めて不充分にしか測定可能ではなかった溶剤環境での色素の使用が可能になる。特にこの方法によって、量子収量および漂白耐性が明確に改善できる。特に大きな潜在的可能性が、水中でほとんどまったく不溶性であり、したがって極めて限定的にしか使用可能でなかった、光切換え可能な蛍光物質の分野で期待できる。
【００１８】
この拡大された使用分野の他に、光切換え可能な分子を最適化するためのこのようなナノ粒子は、極めて大きな潜在的可能性をもたらす。１つの可能性は、「人工ロドプシン系」の製作、すなわち外部エンベロープ内に封入することによる発光団の切換え特性の改善である。すなわち、ロドプシンたんぱく質の発光団、つまりレチナールは、溶液中で例えば極めて遅い切換え速度や極めて低い切換え量子効率のような、自然のたんぱく質環境内よりも大幅に劣った切換え特性を示す。したがって、外部エンベロープと発光団の相互作用により、意図的に光切換え可能な分子の量子機械的な動力学に介入し、したがって、その特性を改善することができる。極めて一般的に言って、外部エンベロープ内への封入により、色素特性を意図的に変更または最適化する新たな可能性が生ずる。
【００１９】
色素のこのような改善に加えて、特定の色素に対する試料の適応性も高めることができる。従来は例えば生物試料に対する毒性のために固定された細胞試料にしか使用できなかった色素も、エンベロープ内への封入によって人工的に毒性が軽減でき、したがって生体細胞にも使用できる。したがって検査される物体の機能に対する着色の影響も軽減できる。
【００２０】
さらに、粒子表面を好ましくは以下のクラスの分子、すなわち化学的修飾（好ましくはアルコール、アミン、石炭酸、ハロゲン化物、チオールおよびその誘導体）ヌクレオチド、ペプチド、たんぱく質（特に抗体および抗原）、発光団（特に蛍光物質））で補足的にコーティングすることによって、官能化が達成できる。
【００２１】
さらに、ナノ粒子は、重複した吸収および放出スペクトルを有する複数の色素の封入により、励起光に対する強い非直線的応答のために高解像度の結像にとって特に有用であるような、ＦＲＥＴ構造（蛍光共鳴エネルギー移動）を合成する可能性をもたらす。その際に、供与体色素と受容体色素分子の間の（例えば距離、溶剤を介した）相互作用が意図的に変更できる。
【００２２】
異なる光学特性を有する２つの状態を備える物質の使用は、本発明の中心的な態様である。その際に、切換え信号によってその物質を意図的に第１の状態から第２の状態に切り換えることができる。この過程は可逆的である。すなわち、物質は再び第１の状態に戻すことができ、あるいは自動的に第１の状態に戻ることができる。第１の状態での物質の光学特性は、これだけが測定信号に対応するものである点で、第２の状態の物質と異なっている。しかし、関連する光学特性が「バイナリ」であること、すなわち一方の状態が１００％であり、他方の状態が０％であることは必ずしも必須ではない。そうではなくて、関連する光学特性に大幅な差が生じ、測定信号を少なくとも圧倒的に第１の状態に割り当てることができれば充分である。
【００２３】
むしろ、両方の状態は、少なくとも以下の判断基準、すなわち、分子の立体構造状態、分子の構造式、分子内の原子の空間配置、分子内の結合の空間配置、分子へのその他の原子または分子の堆積、原子および／または分子のグループ化、分子の空間配向、隣接する分子相互の配向、複数の分子および／または原子から形成される配列に関して異なっている。したがって、対応する物質を第１の状態から第２の状態に移行させるために、光切換え信号は、例えば原子群の再配列、光異性化、特にシストランス異性化、光周期化、プロトン化または脱プロトン化、スピン反転、結合された分子または分子サブユニット間での電子移動および／またはエネルギー移動を引き起こす。
【００２４】
蛍光顕微鏡の分野での現況技術に対する本発明の利点は、当該物質の状態が、蛍光に関するエネルギー状態よりも通常は何倍も長い寿命を有することにある。したがって第２の状態の寿命は、通常は１ｎｓである。寿命は好ましくは少なくとも１０ｎｓである。
【００２５】
特に好ましいのは熱安定状態である。
初期状態および／または最終状態が比較的長寿命（＞１０ｎｓ）である多数の切換え過程は、比較的緩速の過程しかなく、それどころか、しばしば切換え過程と競合する過程はないので、比較的低い強度で解像され、飽和状態にすることができる。
【００２６】
物質の両方の状態の異なる光学特性は、異なるスペクトル特性とすることができる。例えば第１の光学特性は、テスト光信号に対して第２の光学特性とは異なる吸収を示し、その際に、測定信号は透過または反射でも観測できる。異なるスペクトル特性としては、蛍光、燐光、エレクトロルミネセンス、および化学ルミネッセンスを含む群からなる異なるルミネセンスが好ましい。
【００２７】
そのスペクトル特性、特にその色を変化させ、同時に本発明の枠内で重要な構造を標識付ける物質として適した分子は、フォトクロームとも呼ばれる。
異なるスペクトル特性の代わりに、物質の２つの状態は、例えばテスト光信号または試料から自己放出される測定信号に関して異なる偏光特性も有することができる。
【００２８】
この新規の方法で局部解像において回折限界を下回るようにするには、切換え信号による第１の状態から第２の状態への移行が、切換え信号の強度に非直線的に依存するように、切換え信号と物質を相互に調整する必要がある。これは、第２の状態への物質の移行が、切換え信号が飽和限界値を超える位置ではどこでも完全にまたはほぼ完全に行われる場合に達成される。具体的には、意図的に省かれた空間領域外の全記録領域内の切換え信号の強度が飽和限界値を超えなければならず、また同時に意図的に省かれた空間領域は切換え信号の局部的な最低強度でなければならない。強度のゼロ位置を有するこのような局部的最低強度は、干渉パターンによって準備できる。そのためには基本的にさらに投影を使用することもできる。さらに切換え信号を鋭角または鈍角で側方から照射することができる。その上、切換え信号の局部的最低強度を生成するためのホログラムも可能である。簡単な干渉パターンの最低強度を用いると、切換え信号から省かれた最小の空間領域が特に簡単に定義可能である。
【００２９】
この新規の方法では、好ましくは、別のスイッチ信号によって第２の状態から第１の状態へと移行可能な物質が使用される。別のスイッチ信号は、前記切換え信号と同様に光信号であってもよい。これは、例えば電気信号または熱信号であってもよい。さらに、第１の状態への復帰が自発的に、すなわち周囲温度で熱駆動により行われることも可能である。このように、分子が光誘発のシストランス異性化を受けし、純粋に熱により第１の状態に復帰できることが知られている。この別のスイッチ信号を用いると、物質を意図的に第１の状態に戻すことができ、これは方法全体を促進するのに有利となることがある。
【００３０】
別の切換え信号は、好ましくは切換え信号の前に、あるいは測定信号の記録後に利用される。切換え信号による切換えが別の切換え信号によって本質的に損なわれない限り、別の切換え信号は、試料に切換え信号を印加中にも印加できる。さらに、別の切換え信号を関心対象の空間領域に限定する必要はなく、それによって切換え光信号を印加する際のコストが軽減され、別の種類の別の切換え信号が始めて可能になる。
【００３１】
記録される測定信号を生成するためにテスト信号が試料に向けられる場合は、このテスト信号は、切換え信号の後に試料に印加される。その際に、テスト信号も意図的に省かれた空間領域の１つを囲むより大きい領域にわたって、試料に印加される。この新規の方法の局部解像度を高めるために必要な空間的限定は、光切換え信号によって行われる。
【００３２】
測定信号が試料から放出される光である場合は、テスト信号として使用される対応する励起信号が切換え信号と同時に試料に印加できる。しかし、励起信号と別の切換え信号がいずれにせよ同一ではない限り、励起信号は、常に別の切換え信号の後に、または早くともこれと同時に試料に印加されるべきである。
【００３３】
試料を完全に結像するためには、試料が切換え信号によって意図的に省かれた領域と共に走査されること、すなわち全ての点で走査されることが必要である。その際に、試料は、一時点で互いに離隔した複数の点、すなわち定義された領域でも同時に測定できる。その際に、第１の状態の物質に割り当てられた複数の光学測定信号は、物質が第２の状態に移行される領域の他にそれぞれ意図的に省かれた領域を含む複数の記録領域について同時ではあるが互いに別々に記録される。記録は、そのつど試料の座標に対する使用されるスイッチ信号、特に切換え信号の空間移動によって実施できる。切換え信号によって意図的に省かれた全ての空間領域は好ましくは干渉パターンの最低強度であるので、ラスタ走査は切換え信号の１つまたは複数の干渉最低値の移動によって実施できる。その際に、この移動は干渉光の移相によって実施できる。
【００３４】
この新規の方法に従って試料を走査する際には、下記の工程の周期的シーケンスが生ずる。すなわち、試料の領域にある物質を切換え信号によって第２の状態に移行させ、その際に定義された領域が意図的に省かれる工程と、第１の状態の物質に割り当てられた光学測定信号を、そのつど意図的に省かれる領域を含む記録領域について記録する工程と、物質を第１の状態に移行させる工程とが生ずる。その際に、既に示唆したように、最低強度を有する切換え信号だけをそのつど試料の関心対象である定義された領域に正確に向けることで充分である。
【００３５】
この新規の結像方法は、通常の蛍光顕微鏡上で構造を蛍光物質で標識付けした後に行うことができ、その際に回折限界以下に解像度を改善するための追加コストは比較的少なく、切換え光信号を生成するための追加手段のみに限定できる。この手段は例えば、簡単なレーザまたは従来のランプを含み得る。方法を促進するために複数の領域で同時に測定される好ましい実施形態では、個々の領域からの測定信号が同時に（ＣＣＤ）カメラで読み取られる。次いで、試料の測定された領域の異なる位置を有する複数の画像の結合によって、試料の全体像が得られる。
【００３６】
図１は、蛍光物資、例えばＣｙ５が封入された酸化ケイ素の核と、酸化ケイ素のエンベロープと、例えば抗体を含む機能的コーティング層とからなる、本発明に従って使用されるナノ粒子を示す。
【００３７】
図２は、例えばＣｙ５を光スイッチとして含むナノ粒子によるスイッチ挙動（ＰＳＦエンジニアリングの画像）を示す。
図２は、スイッチオン（例えばＣｙ５では４８８ｎｍ）または蛍光励起、および同時のスイッチオフ（例えば６３２ｎｍ）のための回折限界強度分布を示す。強度とナノ粒子のスイッチ状態の間の非直線的関係により、回折限界よりも明らかに低い蛍光ナノ粒子の分布が達成できる。その際、図２の計定のための非直線的関係は、スイッチ速度（オン・オフ）から速度方程式を解くことによって求められる。
【００３８】
図３は、構造化された照明の場合の励起分布、およびその際に生じる、色素の非直線的応答による照明の高調波の画像を示す。
図３は、蛍光励起およびナノ粒子のスイッチオフのための構造化されない強度分布、およびナノ粒子のスイッチオンのための正弦波態様に変調された強度分布を示す。強度とナノ粒子のスイッチ状態の間の非直線的関係によって、正弦変調の空間周波数だけではなく、そこからの高調波も試料内に伝達される（蛍光ナノ粒子の空間分布のフーリエ変換を参照）。空間的に移動した正弦パターンを有する複数の画像を撮影することによって、フーリエ空間の評価アルゴリズムによりこれらの個別画像から個々の高解像度画像が計算できる。この非直線的関係は、図２の場合と同様に計算された。
【００３９】
図４は、ナノ粒子内に１つの供与体色素と６つの受容体色素分子を有するナノ粒子ＦＲＥＴ構造のエネルギー図を示す。
ＤおよびＤ＊は、それぞれ供与体分子の基底状態および第１励起状態である。これと同様に、受容体分子の基底状態および第１励起状態はＡおよびＡ＊で示される。その際、ＡまたはＡ＊の前の数字は、ＡまたはＡ＊のそれぞれの状態にある受容体分子の数を示している。直線の矢印は、光子の関与による遷移、すなわち光子の吸収または放出を示す。一方、波線の矢印は、供与体分子から受容体分子への放射なしのエネルギー移動を示す。全ての受容体分子が既に励起されている場合だけ、供与体分子の励起時に蛍光光の放出が生ずる（最右の矢印）。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】蛍光物資、例えばＣｙ５が封入された酸化ケイ素の核と、酸化ケイ素のエンベロープと、例えば抗体を含む機能的コーティング層とからなる、本発明に従って使用されるナノ粒子を示す図。
【図２】例えばＣｙ５を光スイッチとして含むナノ粒子によるスイッチ挙動（ＰＳＦエンジニアリングの画像）を示す図。
【図３】構造化された照明の場合の励起分布、およびその際に生ずる色素の非直線的応答による照明の高調波を示す図。
【図４】ナノ粒子内に１つの供与体色素と６つの受容体色素分子を有するナノ粒子ＦＲＥＴ構造のエネルギー図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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