(57)【要約】【課題】  本発明は、工業生産に適した特定の水溶性多糖の製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】  本発明によれば、マスタケ菌糸体（Laetiporus sulphureus）の液体培養において、ｐＨを2.0以下に調整することによって菌体外にマスタケ由来の水溶性多糖を効率的に生産させる方法が提供され、当該方法によって得た水溶性多糖は、従来法で得たものに比べ、耐熱性にすぐれた素材である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨを２．０以下に調整したマスタケ菌糸体（Laetiporus sulphureus）の液体培養によって菌体外にマスタケ由来の水溶性多糖を生産する方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は担子菌マスタケの菌糸体（Laetiporus sulphureus）を液体培養して得られる水溶性多糖を製造する方法を提供するものであり、さらに詳しくは特定のｐＨ領域での液体培養方法の採用によって、効率的に水溶性多糖を得る方法を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
マスタケをはじめ、担子菌に含まれる多糖には抗腫瘍活性があると言われており、製造法に関しても例えば特開昭50-12295号に開示された「制ガン性物質の製造方法」あるいは特開昭53-94018号に開示された「抗腫瘍性多糖体の製造法」がみられている。
【特許文献１】特開昭５０-１２２９５号公報
【特許文献２】特開昭５３-９４０１８号公報
【０００３】
しかし、これらはいずれも菌糸体を培養し、培養で得られた菌糸体を熱水抽出あるいは希アルカリ水溶液にて菌糸体から該生産物を得る方法であり、培養液自体を有効に利用する方法ではない。
【０００４】
これに対して本発明では、菌体にも莢膜性多糖の産生が認められるが、液体培養法により菌体外、すなわち培養液中に高濃度の水溶性多糖を生産させる培養法を提供するものであり、従来の菌糸体から得られるものとは大きく異なるものである。
【０００５】
本出願人は、さきにマスタケを液体培養することにより得られた粘性物を利用した「増粘剤及びその用途」の特許出願（特開平6-343479号）を行った。かかるマスタケ由来の水溶性多糖は糖質類を炭素源とする液体培地中で培養させるいわゆる通常の発酵法によって生成されている。
【０００６】
しかしながら、当該従来の液体培養法による水溶性多糖の製造にあっては、培養液あたりの水溶性多糖の収率が低く、しかも安定した収率での多糖産生が出来ないなどの欠点がみられた。
【特許文献３】特開平６-３４３４７９号公報
【０００７】
そこで本発明者は、かかる製法上の欠点を排除すべく、従来の液体培養における菌体生成量およびマスタケ由来の多糖生成量との関係を詳細に検討し、鋭意研究を重ねた。その結果、多糖生産能を有するマスタケの菌株を、糖質類を炭素源とする培地中で培養せしめてマスタケ由来の多糖を生成させる培養法において、高収率でかつ安定して製造しうる新たな事実を見出し、本発明を完成するにいたった。
【０００８】
すなわち、本発明によれば、ｐＨを２．０以下に調整したマスタケ菌糸体（Laetiporus sulphureus）の液体培養によって、菌体外にマスタケ由来の水溶性多糖を生産させる方法が提供される。
【０００９】
従来の培養法により得られる水溶性多糖は１.５ｇないし１.８ｇ/Ｌであったが、本発明の方法により得られる水溶性多糖は、２.６ｇないし３．２ｇ/Ｌという高収率で安定して製造しうるという顕著な効果を奏しうる。以下に、本発明の実施形態を詳しく説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明において使用する種菌は、マスタケ菌糸体である。マスタケ（Laetiporus sulphureus）とは、担子菌類、同担子菌亜網、菌蕈類、サルノコシカケ科のアイカワタケ属に属するきのこである。
マスタケは鱒茸と書かれるように、幼菌のころの傘は鱒のようなサーモンピンク色を呈し、肉質は柔らかく食に適したきのこである。
【００１１】
本発明において、培養中の培地に添加される糖質はブドウ糖が特に良く、窒素源としては大豆由来の水溶性ペプタイドが望ましい。カゼイン性またはパンクレアチン由来のペプトンは水溶性多糖の生成量が低く適していない。
また、糖質及び窒素源以外の培地条件としては、特に限定はされないが通常の液体培養に用いられる酵母エキスを必要とし、その他にもリン酸１カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩類が使用される。
【００１２】
ｐＨについては、２.０以下でマスタケ菌糸体を液体培養することが必須の要件である。ｐＨ２ないし７の範囲内でも水溶性多糖の生成はみられるものの多糖の収率が低いうえ、耐熱性に劣る欠点があるため工業的な量産化の条件としては不十分である。
【００１３】
ｐＨの調整方法については、特に制約はないが、リン酸、塩酸等の無機強酸でのｐＨ調整が可能である。しかし、マスタケはイオウ茸（菌）とも呼ばれていることから、本発明においては通常、１０％硫酸によってｐＨ調整する方法が好適に採用し得る。
【００１４】
液体培養の方法は、回分培養及び生産性を高めるために水溶性多糖回収と発酵とを半連続的に繰り返す流加培養が可能である。回分培養および流加培養とも通気量は培養液に対して０．２ｖｖｍから１．５ｖｖｍ、培養温度は２５℃から３５℃が好ましく、攪拌速度は、培養初期においては粘性がないため、初めは強くなくてもかまわないが、培養日数が経過するに従い粘性が増してくることから、経過時間に従って攪拌速度を速めることが量産化の不可条件として重要である。
【００１５】
つぎに実施例および比較例をあげて本発明の方法を説明するが、これらの開示は本発明の好適な態様を示すものであって、本発明を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００１６】
＜製造例１＞
種菌として、マスタケ菌糸体（Laetiporus sulphureus）を用い、これをポテトデキストロース寒天培地（オクソイド社製）の斜面培地に接種し、３０℃で１週間斜面培養を行い、ついでこのものを胞子懸垂して調製した。
【００１７】
種母培地として、ブドウ糖３％、ハイニュートＳ（大豆ペプチド。不二製油株式会社製の商品名）０.２％、酵母エキス０.２％、リン酸１カリウム０.１％、硫酸マグネシウム０.０５％、塩化ナトリウム０.０１％、塩化カルシウム０.０１％および消泡剤としてシリコーンＫＭ−７２（日光ケミカルズ株式会社）製の商品名）０.１％の培地を１０％硫酸でｐＨ３.５に調整したものを用いて、これを２０００ｍＬ坂口フラスコに１０００ｍＬ充填し、１２１℃で１５分間殺菌して室温まで冷却したのち、前記種菌を接種した。培養は３０℃、振盪回数１２０回/分、振幅５ｃｍで１週間振盪培養し、種母を調整した。
【００１８】
本培養の培地として、ブドウ糖５％、ハイニュートＳ（前出）０.５％、酵母エキス０.５％、リン酸１カリウム０.１％、硫酸マグネシウム０.０５％、塩化ナトリウム０.０１％、塩化カルシウム０.０１％および消泡剤としてシリコーンＫＭ−７２（日光ケミカルズ株式会社）製の商品名）０.１％の培地を１０％硫酸でｐＨ３.５に調整したものを用いて、これを３０Ｌ容ジャーファーメンター（株式会社丸菱バイオエンジニア製）に２０Ｌ充填し、１２１℃で１５分間殺菌して室温まで冷却させたのち、前記種母を接種した。培養は３０℃、通気量０.５ｖｖｍおよび回転速度１００〜３５０ｒｐｍで行い、培養中は１０％硫酸でｐＨ２以下（約ｐＨ１.８〜２.０未満）に制御して２０日間培養した。
【００１９】
なお、培養の終点は２０日としたが、２０日ないし３０日位までは、得られた水溶性多糖に物性の違いはみられない。培養期間を長くすると、粘度の低下が生じ始めるため、培養時の粘度が一定になった時点を培養の終点とするのが望ましい。
【００２０】
＜製造例２＞
種菌及び種母培地は製造例１に準じた。本培養の培地として、ブドウ糖７％、ハイニュートＳ（前出）１.０％、酵母エキス１.０％、リン酸１カリウム０.２％、硫酸マグネシウム０.１％、塩化ナトリウム０.０２％、塩化カルシウム０.０１％および消泡剤としてシリコーンＫＭ−７２（前出）０.１％の培地を１０％硫酸でｐＨ２.０に調整したものを用いて、これを３０Ｌ容ジャーファーメンター（株式会社丸菱バイオエンジニア製）に２０Ｌ充填し、１１０℃で２０分間殺菌して室温まで冷却させたのち、種母を接種した。培養は２５℃、通気量０.８ｖｖｍおよび回転速度１００〜４００ｒｐｍで行い、培養中は１０％硫酸でｐＨ２以下（約ｐＨ１.８〜２.０未満）に制御して３０日間培養した。
【００２１】
＜製造例３＞
種菌及び種母培地は製造例１に準じた。本培養の培地として、ブドウ糖５％、ハイニュートＳ（前出）１.０％、酵母エキス０.５％、リン酸１カリウム０.１％、硫酸マグネシウム０.０５％、塩化ナトリウム０.０１％、塩化カルシウム０.０１％および消泡剤としてシリコーンＫＭ−７２（前出）０.２％の培地を１０％硫酸でｐＨ２.０に調整したものを用いて、これを３０Ｌ容ジャーファーメンター（株式会社丸菱バイオエンジニア製）に２０Ｌ充填し、１１０℃で２０分間殺菌して室温まで冷却させたのち、種母を接種した。培養は３０℃、通気量０．５ｖｖｍおよび回転速度１００〜４５０ｒｐｍで行い、培養中は１０％硫酸でｐＨ２以下（約ｐＨ１.８〜２.０未満）に制御した。培養２５日目に、水溶性多糖の生産が平衡に達したため、培養液を１０Ｌ回収した。次に、この回収量１０Ｌに相当する上記培地組成の２倍濃度の滅菌した新鮮培地を培養槽に添加後、さらに２０日間培養を行った。以下、同様に水溶性多糖の生産が平衡に達した時点で２倍濃度の滅菌した新鮮培地を半連続的に繰返しながら本発明の液体培養を７５日間行った。
【００２２】
＜比較例＞
本培養の培地組成は＜製造例１＞と同様にして、培地のｐＨ５．５７および培養中のｐＨ制御は行わずに２０日間培養した。
【００２３】
＜試験例１＞水溶性多糖の産生変化
これら製造例１および比較例における各培養液中のブドウ糖濃度、水溶性多糖の生産量および培地のｐＨについて、経時変化をそれぞれ５日間隔で調べた。その結果を次表に示す。このように、製造例１におけるマスタケ由来の水溶性多糖は、比較例よりも生成量が著しく大きいことが明らかであり、この差は培養時におけるｐＨ２.0以下の制御により、ブドウ糖が効率よく多糖に変化したことを示すものである。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
＜試験例２＞  耐熱性の比較
実施例で製造した水溶性多糖の耐熱性を比較例で得られた水溶性多糖及び他の天然多糖類と比較した例（１２１℃における加熱時間による経時変化）を表２に示す。粘度計はＢ形粘度計（株式会社東京計器製）ローターＮｏ．２を用いた。
製造例１における水溶性多糖は１２１℃で８０分間の加熱処理を行っても粘度の低下は認められないが、比較例（従来品）は加熱時間とともに緩やかな低下がみられる。また、他の天然多糖水溶液は加熱時間とともに顕著な粘度の低下がみられた。このことにより、本製法で得られる水溶性多糖は極度の加熱処理を行っても粘度の変化が全く認められないことから、幅広い用途への応用可能性が示唆される。
【００２６】
【表２】
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【００２７】
＜試験例３＞  保湿性の比較
高周波インピーダンスメーター（ＩＢＳ社製；MODEL IB-365）を用い、精製水をコントロールとして実施例で得られた水溶性多糖の保湿性を比較例で得られた水溶性多糖及び保湿性が高いヒアルロン酸ナトリウムと比較した。測定方法は、ヒト前腕部内側に試料を塗布（２ｃｍ×２ｃｍ）し、３０秒後すばやくガーゼで軽く拭き取り、３０秒毎に皮膚の電導度（コンダクタンス）を経時的に１０分まで測定した（測定条件：測定室内温度２０℃、湿度６０％、測定回数ｎ＝１０）。結果を「高周波インピーダンスメーターによる電導度（コンダクタンス）の比較」として表３に示す。
【００２８】
表３の結果は電導度が高いほど保湿性が高いことを示しており、実施例で得られた水溶性多糖は、比較例で得られた水溶性多糖及び保湿性が優れているヒアルロン酸ナトリウムと同等の保湿性を有していることが確認された。
【００２９】
【表３】
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