(57)【要約】      （修正有）【課題】神経毒性を検出するための方法およびキットを提供する。【解決手段】(a)被験物質を神経由来細胞に曝露する工程と、(b)前記神経由来細胞における特定なポリヌクレオチド配列の少なくとも一つのmRNAの発現量を測定する工程と、(c)前記測定したmRNAの発現量と、前記被験物質に曝露していない前記神経由来細胞における特定なポリヌクレオチド配列のmRNAの発現量とを比較する工程とを含む、被験物質の毒性を検出する方法を提供する。また、特定の塩基配列、並びにこれらの相補的配列からなる群より選択される塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる少なくとも10の連続した配列からなる核酸を含む、神経毒性を検出するためのキット。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)被験物質を神経由来細胞に曝露する工程と、
(b)前記神経由来細胞における配列番号1〜8であらわされるポリヌクレオチド配列の少なくとも一つのmRNAの発現量を測定する工程と、
(c)前記測定したmRNAの発現量と、前記被験物質に曝露していない前記神経由来細胞における配列番号1〜8であらわされるポリヌクレオチド配列のmRNAの発現量とを比較する工程と、
を含む、被験物質の毒性を検出する方法。
【請求項２】
前記神経由来細胞が神経芽細胞腫である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記神経芽細胞腫がマウス由来のNeuro2a細胞である、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記神経由来細胞が寄託番号 FERM BP-10341の細胞である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記神経由来細胞が寄託番号 FERM BP-10342の細胞である、請求項3に記載の方法。
【請求項６】
配列番号1〜8であらわされるポリヌクレオチド配列のmRNAの発現量が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、および配列番号8に記載の塩基配列、並びにこれらの相補的配列からなる群より選択される塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる少なくとも10の連続した配列からなるポリヌクレオチドを含むキットを使用して検出される、請求項1〜5に記載の方法。
【請求項７】
配列番号1〜8であらわされるポリヌクレオチド配列のmRNAの発現量が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、および配列番号8に記載の塩基配列、並びにこれらの相補的配列からなる群より選択される塩基配列に相補的であり、かつ10〜50の連続した配列からなるプライマーを含むキットを使用して検出される、請求項1〜5に記載の方法。
【請求項８】
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、および配列番号8に記載の塩基配列、並びにこれらの相補的配列からなる群より選択される塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる少なくとも10の連続した配列からなるポリヌクレオチドを含む、神経毒性を検出するためのキット。
【請求項９】
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、および配列番号8に記載の塩基配列、並びにこれらの相補的配列からなる群より選択される塩基配列に相補的であり、かつ10〜50の連続した配列からなるプライマーを含む、神経毒性を検出するためのキット。
【請求項１０】
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、および配列番号8に記載の塩基配列、並びにこれらの相補的配列からなる群より選択される塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる少なくとも10の連続した配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも1つが固定されたチップを含む、神経毒性を検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経毒性を検出するための方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、注意欠陥多動性疾患(ADHD)あるいは学習障害(LD)のような神経障害が大きな社会問題となっているがその原因のひとつとして、内分泌攪乱物質類の神経毒性が疑われる。内分泌攪乱物質類のその毒性の一部は、アリルハイドロカーボン受容体を介して発現することが知られている。アリルハイドロカーボン受容体は、多環芳香族炭化水素(PAH)が結合する受容体であり、bHLH-familyに属する転写因子である(非特許文献1)。これまでに、内分泌攪乱物質の免疫毒性や生殖毒性の一部がアリルハイドロカーボン受容体を介した経路で発現することが報告されている(非特許文献2)。脳組織においてアリルハイドロカーボン受容体の発現が検出されることから(非特許文献3)、アリルハイドロカーボン受容体が神経毒性に関与すると考えられている。また、神経機能発現、及び発達形成とアリルハイドロカーボン受容体による遺伝子発現との関連性も示唆されている。しかし、神経系におけるアリルハイドロカーボン受容体による転写活性化に基づく特徴的な遺伝子、すなわちマーカー遺伝子は、ほとんど同定されていない。そこで、化学物質の未知の毒性、特に神経毒性についてのマーカー遺伝子の取得が望まれている。
【０００３】
一方、これまでに未分化な神経芽細胞腫にアリルハイドロカーボン受容体を遺伝子導入した被験物質評価用細胞としての機能をもつN2a-R細胞が構築されている(寄託番号:FERM BP-10341、FERM BP-10342)。同細胞はダイオキシンをはじめとする被験物質に曝露することで伸展する突起の頻度が増加し、ドーパミン生合成に関与するTyrosine hydroxylase (非特許文献4)や、突起形成や伸展の際に細胞骨格分子の再構築に関わるCell division cycle42(非特許文献5)、またシナプス形成に関わるTau(非特許文献6)などの発現が増加する。これらの分子の発現を検出する、または細胞形態を観察することにより、被験物質による未分化な神経細胞の神経機能の発現の有無を判定することが可能となる。また、未分化な神経細胞が神経機能を発現する、すなわち分化する際には突起を伸展するという特徴的な形態変化を示す。つまり、突起伸展も神経機能発現の有無の判断において指標の一つである (非特許文献7)。すなわち、被験物質の神経毒性の有無を判定することが可能となる。
【０００４】
しかし、さらに迅速で簡便な被験物質の検出方法を構築するためには有効な指標が必要である。
【非特許文献１】Mark E. Hahn, Comparative Biochemistry and Physiology Part C 121 (1998):23-53.
【非特許文献２】Frank JG et al., Drug Metabolism and Disposition (1998) 26: 1194-1198.
【非特許文献３】Petersen SL. et al., J. Comp. Neurol. (2000) 427(3): 428-439.
【非特許文献４】Bartolini G et al.,Anticancer Res. (2003) 23(2B): 1495-1499.
【非特許文献５】Alleaume C et al., Exp Cell Res. (2004) 299(2):511-24.
【非特許文献６】Knops, J et al., J. Cell Biol. (1991) 114(24): 725-733.
【非特許文献７】Spiegelman BM et al., Cell. (1979) 16(2):253-263.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、神経毒性を検出するための方法およびキットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、被験物質の神経毒性の有無により発現量が変化する遺伝子を見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明の第1の態様によれば、(a)被験物質を神経由来細胞に曝露する工程と、
(b)前記神経由来細胞における配列番号1〜8であらわされるポリヌクレオチド配列のmRNAの発現量を測定する工程と、
(c)前記測定したmRNAの発現量と、前記被験物質に曝露していない前記神経由来細胞における配列番号1〜8であらわされるポリヌクレオチド配列のmRNAの発現量とを比較する工程と、
を含む、被験物質の毒性を検出する方法が提供される。
【０００８】
本発明の第2の態様によれば、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、および配列番号8に記載の塩基配列、並びにこれらの相補的配列からなる群より選択される塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる少なくとも10の連続した配列からなる核酸を含む、神経毒性を検出するためのキットが提供される。
【０００９】
本発明の第3の態様によれば、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、および配列番号8に記載の塩基配列、並びにこれらの相補的配列からなる群より選択される塩基配列に相補的であり、かつ10〜50の連続した配列からなるプライマーを含む、神経毒性を検出するためのキットが提供される。
【００１０】
本発明の第4の態様によれば、被神経毒性を検出するためのチップであって、
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、および配列番号8に記載の塩基配列、並びにこれらの相補的配列からなる群より選択される塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる少なくとも10の連続した配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも1つが固定されたチップが提供される。
【発明の効果】
【００１１】
以上のように、本発明により、被験物質の神経毒性を特異的に検出するための方法、核酸、プローブ、およびプライマーが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
I．被験物質によりその発現量が特異的に影響を受ける遺伝子  
本発明者らは、マウス神経芽細胞Neuro2aにアリルハイドロカーボンレセプターを遺伝子導入して得られたN2a-R細胞(FERM BP-10341, FERM BP-10342)に対して、2,3,7,8-テトラクロロ-ベンゾ-p-ジオキシン(2,3,7,8-tetrachloro-benzo-p-dioxin;以下、TCDDと称する)を作用させた場合と、前記細胞に対してTCDDを作用させなかった場合とについて、それぞれの細胞において発現した前記RNAをリアルタイム定量PCRにより比較した。その結果、TCDDにより特異的にその発現量が変化した遺伝子を明らかにした。
【００１３】
ここで使用したN2a-R細胞(FERM BP-10341, FERM BP-10342)は、神経毒性を有する被験物質に感受性のある細胞である。即ち、その細胞の培養系に神経毒性を有する被験物質が存在している条件下では、その被験物質の支配を受けて種々の細胞機能の発現等が制御されるが、該培養系に被験物質が存在していない条件下では該発現が制御されない細胞である。従って、N2a-R細胞に対して神経毒性をもつ被験物質を作用させれば、被験物質の神経毒性のみの作用を細胞に対して付加することが可能である。従って、このような条件による解析により、その発現が被験物質により特異的に影響を受ける遺伝子が明らかにできた。特定されたポリヌクレオチドは、配列番号1〜8に記載の塩基配列、およびその相補的配列からなる群より選択される塩基配列で示されるポリヌクレオチドである。
【００１４】
本発明の一つの態様として提供することができる被験物質の神経毒性を検出するためのポリヌクレオチドは、被験物質の神経毒性を検出するためのポリヌクレオチドであって、配列番号1〜8に記載の塩基配列およびその相補配列で示されるポリヌクレオチドである。また、被験物質の神経毒性を検出するためのポリヌクレオチドは、配列番号1〜8に記載の塩基配列と85%〜100%の相同性を有する配列からなる核酸を含む。さらにこれらの相同性を有する配列は、配列番号1〜8に記載の塩基配列によってコードされるタンパク質と同様の活性を有することが好ましい。
【００１５】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」の語は、天然に存在する種々のDNAおよびRNA、並びにペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルホスフォネート核酸およびS-オリゴ核酸などの人工的に合成された核酸類似体などを指す。また、本明細書で使用される「85%〜100%の相同性を有する」の語は、2つの塩基配列が互いに85%〜100%に相同性であり、残りの0%〜15%の塩基配列は、1つまたは数個の塩基が欠失されるか、および/または1つまたは数個の塩基が置換されるか、および/または1つまたは数個の塩基が付加されるかによって、修飾されていることにより相同性を有していない部分であることを示す。また、各配列中の「N」または「n」はアデニン、チミン、グアニン、またはシトシンの何れかのヌクレオチドを示す。
【００１６】
II．核酸検出用プローブ  
上述の配列番号1〜8に記載の配列を有するポリヌクレオチドおよびその相補配列、並びにこれらの一部は、被験物質の神経毒性を検出するための核酸検出用プローブとして使用することが可能である。このような被験物質の神経毒性を検出するための核酸検出用プローブも本発明の範囲内にある。
【００１７】
被験物質の神経毒性を検出するために好ましい核酸検出用プローブは、配列番号1〜8に記載の塩基配列およびその相補配列からなる群より選択される塩基配列に含まれる少なくとも連続した10塩基〜500塩基、15塩基〜300塩基、20塩基〜100塩基よりなる核酸を含む核酸検出用プローブであってよい。さらに、配列番号1〜8に記載の塩基配列、並びにこれらの相補的配列からなる群より選択される塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる少なくとも10の連続した配列からなる核酸も、本発明の核酸検出用プローブに含まれる。ここで、「ストリンジェントな条件」は、当業者であれば容易に認識することができると考えられ、たとえば20℃〜65℃の範囲の温度で2×SSC緩衝液、0.1%w/vSDSであり、特に好ましくは高いストリンジェンシーの条件であり、少なくとも65℃の温度で0.1×SSC緩衝液、0.1%w/vSDSである。このような、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるプローブには、たとえば、被験物質の神経毒性を検出するための核酸検出用プローブは、配列番号1に記載の塩基配列と85%〜100%の相同性を有する核酸配列およびその相補的配列、配列番号2に記載の塩基配列と85%〜100%の相同性を有する核酸配列およびその相補的配列、配列番号3に記載の記載の塩基配列と85%〜100%の相同性を有する核酸配列およびその相補的配列、配列番号4に記載の塩基配列と85%〜100%の相同性を有する核酸配列およびその相補的配列、配列番号5に記載の記載の塩基配列と85%〜100%の相同性を有する核酸配列およびその相補的配列、配列番号6に記載の記載の塩基配列と85%〜100%の相同性を有する核酸配列およびその相補的配列、配列番号7に記載の記載の塩基配列と85%〜100%の相同性を有する核酸配列およびその相補的配列、配列番号8に記載の記載の塩基配列と85%〜100%の相同性を有する核酸配列およびその相補的配列にハイブリダイズすることができるプローブが含んでいてもよい。更に、本発明のプローブは、配列番号1〜8に記載の塩基配列、並びにこれらの相補的配列のうちの少なくとも1つが1つまたは数個の置換、欠失、および挿入された配列に対してハイブリダイズすることができる核酸であっても構わないが、
これらの置換、欠失、挿入された配列は、該置換、欠失、もしくは挿入がなされていない配列の相補鎖に対しても上記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる配列であることを条件とする。
【００１８】
このような核酸検出用プローブは、当業者に既知の方法を使用して、たとえば合成によって、また天然に存在する核酸を利用して組み換えによって作製することができる。
【００１９】
さらに、上記被験物質の神経毒性を検出するための核酸検出用プローブの標識は、特に限定されず例えば、32P に代表される放射性物質のほか、フルオレセインに代表される蛍光物質を用いることができる。
【００２０】
III. 核酸検出用プローブを用いた神経毒性の検出方法
このような核酸検出用プローブを利用した検出方法としては、例えば、RNase プロテクションアッセイあるいは、ノーザンハイブリダイゼーション法が挙げられる。
【００２１】
RNase プロテクションアッセイによる配列1〜8に示されるポリヌクレオチド発現量の測定は、
被検物質に曝露された細胞より抽出された一定量の粗RNA試料に、検出対象となる配列1〜8に示される遺伝子mRNA又はその一部と特異的にハイブリダイズする過剰量のRNAであるプローブを添加し、更にRNase消化した後の残存RNA量を測定することにより実施することができる。すなわち、該残存RNA量が多いほど、配列1〜8に示される遺伝子の発現量が高いと判断できる。
【００２２】
なお、該方法で用いるプローブは、例えば、80%ホルムアミド、40mM Pipes（pH6.4）、400mM NaCl、1mM EDTAからなるハイブリダイゼーション緩衝溶液中45℃、20時間保温してハイブリダイズ可能であり、かつ検出対象となる配列1〜8に示される遺伝子mRNAに特異的な塩基配列に相補的な塩基配列を有しているRNAであれば特に限定されない。また、該プローブの標識も特に限定されず、例えば、32Pに代表される放射性物質のほか、フルオレセインに代表される蛍光物質を用いることができる。
【００２３】
ノーザンハイブリダイゼーション法による配列1〜8に示される遺伝子発現量の測定は、被検物質に曝露した細胞より抽出された一定量の粗RNA試料を分子量等による分画後、ナイロンフィルター等に固定し、検出対象となる配列1〜8に示される遺伝子mRNAと過剰量の該遺伝子検出用プローブを接触させ、固定化されたRNAにハイブリダイズしたプローブより得られるシグナル強度を測定することにより実施することができる。すなわち、該シグナル強度が強いほど、配列1〜8に示される遺伝子の発現量が高いと判断できる。なお、該方法においてハイブリダイズするとは、例えば、50%ホルムアミド、0.65M NaCl、0.1Mナトリウム−Pipes、5×デンハート液、0.1%SDS、5mM  EDTAからなるハイブリダイゼーション緩衝液中42℃、20時間保温してハイブリダイズ可能であることを指す。検出用プローブは、検出対象となる配列1〜8に示される遺伝子mRNAに特異的な塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸であることが好ましいが、シグナル位置により検出対象mRNAを特定することができれば、特に限定されない。該プローブの標識も特に限定されず、例えば、32Pに代表される放射性物質のほか、フルオレセインに代表される蛍光物質を用いるもとができる。
【００２４】
また、被験物質の神経毒性を検出するための核酸検出用プローブは、上述の核酸に加えて更なる配列を含んでいてもよい。たとえば、プローブを基体に固定するために、基体とプローブの間にリンカー配列を有する核酸として提供されてもよい。また、核酸検出用プローブは、基板上に固定化されてプローブ固定化チップとして提供されてもよい。また、そのようなプローブ固定化チップも本発明の範囲内に含まれる。
【００２５】
本発明の更なる側面に従うと、プローブ固定化チップは、上述した核酸検出用プローブを、以下のような基板に固定化することにより製作することが可能である。本発明に従って使用される基板の例は、多孔質体、マイクロタイタープレート、ビーズ、球状物質、粒子状物質、磁性体および磁気ビーズ等の基体などである。また、核酸検出用プローブを固定化すべき基体の材質、大きさおよび形状などは特に限定されるものではない。
【００２６】
前記プローブ固定化チップを用いた試料物質中の核酸の配列の検出は、例えば、被験物質を曝露した細胞から核酸成分の抽出を行った後、前記試料核酸とプローブ固定化チップとを接触させ、プローブ固定化チップ上のプローブと試料核酸とのハイブリダイゼーション反応を検知すればよい。
【００２７】
前記プローブ固定化チップ上のプローブと試料中の核酸成分とのハイブリダイゼーション反応を検知するには、主に、（１）標識物質を用いる方法、（２）電気化学的方法の２種類が考えられる。
【００２８】
（１）の標識物質を用いる方法の場合には、試料核酸は、予めＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５若しくはローダミンなどの蛍光色素、またはビオチン、ハプテン、オキシダーゼ若しくはホスファターゼ等の酵素、またはフェロセン若しくはキノン類等の電気化学的に活性な物質で標識してもよい。或いは前述した物質で標識したセカンドプローブを用いることで検出を行ってもよい。複数の標識物質を同時に使用してもよい。
【００２９】
（２）の電気化学的方法の場合、プローブを固定化する基体として導電性物質を用い、プローブ固定化チップを電極として使用する。この電極を用いたハイブリダイゼーション反応の存在の検出は他の一般的な電気化学的検出法と同じように、この電極の他に、対極や参照極を使用してよい。参照極を配置する場合、例えば、銀／塩化銀電極や水銀／塩化水銀電極などの一般的な参照極を使用し得る。異なる塩基配列を有するプローブは、それぞれ別々の異なる導電性基体に固定化して同一の基板などに配設されたチップを構成してよい。これにより精度の高い測定を行うことが可能である。その場合、各電極から得られる電気化学的信号がどのプローブに対応したものであるのか検知する。
【００３０】
試料物質から抽出した核酸成分とプローブ固定化チップに固定化されたプローブとのハイブリダイゼーション反応は、例えば、以下のように行うことが望ましい。即ち、ハイブリダイゼーション反応溶液は、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液中で行う。この溶液中にはハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキストラン、並びに、サケ精子ＤＮＡ、牛胸腺ＤＮＡ、ＥＤＴＡおよび界面活性剤などを添加してもよい。ここに抽出した核酸成分を添加し、９０℃以上で熱変性させればよい。プローブ固定化チップの挿入は、変性直後、或いは０℃に急冷後に行ってよい。また、基体上に液を滴下することでハイブリダイゼーション反応を行うことも可能である。反応中は、撹拌、或いは振とうなどの操作で反応速度を高めてもよい。反応温度は、例えば、１０℃〜９０℃の範囲で、反応時間は１分以上１晩程度で行えばよい。ハイブリダイゼーション反応後、電極を取り出し洗浄を行う。洗浄には、例えば、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いればよい。
【００３１】
（１）の標識物質を用いる方法の場合、ハイブリダイゼーション反応の検出は、標識の種類に応じた適宜の検出装置を用いて、試料中の標識された塩基配列又は２次プローブ中の標識を検出することによって行えばよい。標識が蛍光物質の場合には、例えば、蛍光検出器を用いて標識を検出すればよい。
【００３２】
（２）の電気化学的方法の場合、以下のような手順で検出を行えばよい。基体は洗浄後、電極表面に形成した二本鎖部分に選択的に結合する二本鎖認識体を作用させ、電気化学的な測定を行えばよい。ここで用いられる二本鎖認識体は特に限定されるものではないが、例えば、ヘキスト３３２５８、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーターおよびポリインターカレーター等を用いることが可能である。更に、これらのインターカレーターを電気化学的に活性な金属錯体、例えば、フェロセン、ビオロゲン等で修飾しておくことも可能である。ＤＮＡ結合物質の濃度は、その種類によって異なるが、一般的には１ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの範囲で使用する。この際には、イオン強度０．００１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いればよい。電極を二本鎖認識体と反応させた後、洗浄し、電気化学的な測定を行えばよい。
【００３３】
電気化学的な測定では、二本鎖認識体が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加し、二本鎖認識体に由来する反応電流値を測定すればよい。この際、電位は定速で掃引するか、或いはパルスで印加するか、或いは定電位を印加することができる。測定には、例えば、ポテンショスタット、デジタルマルチメーターおよびファンクションジェネレーター等の装置を用いて電流、電圧を制御してもよい。得られた電流値を基に、検量線から標的核酸の濃度が算出され得る。
【００３４】
電極を用いた塩基配列検出装置は、例えば、核酸抽出部、核酸反応部、二本鎖認識体反応部、電気化学測定部および洗浄部等から構成される。
【００３５】
また、電気化学的な手法に基づくプローブ固定化チップの他の例は、例えば、以下の文献に開示されている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４，  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８）。この文献は引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００３６】
（Ａ）  蛍光検出法により検出されるプローブ固定化チップの作製
上述した本発明に従う核酸検出用プローブを基板に固定化する。基板は、例えば、ガラス基板およびシリコン基板等、従来用いられる何れの基板も使用することが可能である。固定化手段は、スポッター等を使用する手段、一般的な半導体技術を使用した手段等、当業者にそれ自身公知の手段を用いて固定することが可能である。
【００３７】
（Ｂ）電気化学的方法により検出されるプローブ固定化チップの作製
上述した本発明に従う核酸検出用プローブを、基板、例えば、電極基板、に共有結合、イオン結合、物理吸着または化学吸着等によって固定化する。電気化学的方法により検出されるプローブ固定化チップの例は、平成８年１０月２４日に登録された特許番号第２５７３４４３号の自動遺伝子検出装置等であるが、これに限られるものではない。当該文献は引用することによりここに組み込まれる。
【００３８】
本発明の更なる１側面に従うと、基板と、前記基板に固定化された上述した本発明に従う核酸検出用プローブとを具備するプローブ固定化チップを提供するものであり、そのようなプローブ固定化チップも本発明の範囲内にある。
【００３９】
本発明の１側面に従うと、上述の被検物質の神経毒性を検出するための核酸またはその一部は、被検物質の神経毒性を検出するための核酸検出用プローブとして使用することが可能である。そのような被験物質の神経毒性を検出するための核酸検出用プローブも本発明の範囲内にある。
【００４０】
IV. 核酸検出用プライマー
配列1〜8に示されるポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーは配列1〜8に示される遺伝子のGenBank Accession No.から得られた塩基配列をもとに市販のプライマー構築ソフトを用いて選択したプライマーが好適に使用できる。例えば配列番号9〜24に記載の塩基配列を有するプライマーを用いることができる。上記配列番号1〜8に特異的な遺伝子増幅用プライマーとしては、たとえば配列番号1に記載の塩基配列およびその相補的配列、配列番号2に記載の塩基配列およびその相補的配列、配列番号3に記載の塩基配列およびその相補的配列、配列番号4に記載の塩基配列およびその相補的配列、配列番号5に記載の塩基配列およびその相補的配列、配列番号6に記載の塩基配列およびその相補的配列、配列番号7に記載の塩基配列およびその相補的配列、配列番号8に記載の塩基配列およびその相補的配列からなる群より選択される塩基配列に含まれる連続した15塩基〜30塩基の核酸を含む核酸検出用プライマーであってよい。
【００４１】
また、配列番号1〜8に特異的な遺伝子増幅用プライマーは、配列番号1に記載の塩基配列と85%〜100%の相同性を有する核酸配列およびその相補的配列、配列番号2に記載の塩基配列と85%〜100%の相同性を有する核酸配列およびその相補的配列、配列番号3に記載の記載の塩基配列と85%〜100%の相同性を有する核酸配列およびその相補的配列、配列番号4に記載の塩基配列と85%〜100%の相同性を有する核酸配列およびその相補的配列、配列番号5に記載の記載の塩基配列と85%〜100%の相同性を有する核酸配列およびその相補的配列、配列番号6に記載の記載の塩基配列と85%〜100%の相同性を有する核酸配列およびその相補的配列、配列番号7に記載の記載の塩基配列と85%〜100%の相同性を有する核酸配列およびその相補的配列、配列番号8に記載の記載の塩基配列と85%〜100%の相同性を有する核酸配列およびその相補的配列からなる群より選択される塩基配列に含まれる連続した10、15，20、25、30、40、50、またはそれ以上の塩基よりなる核酸を含んでいてもよい。
【００４２】
また更に、被験物質の神経毒性を検出するための核酸検出用プライマーの好ましい例は、配列番号1を検出するためには、配列番号9、配列番号10に記載の塩基配列により示される核酸が含まれる。またより好ましくは、配列番号9と配列番号10に記載の塩基配列により示される核酸を、それぞれフォワードプライマーとリバースプライマーとして使用する。
【００４３】
配列番号2を検出するためには、好ましくは配列番号11、配列番号12に記載の塩基配列により示される核酸が含まれる。またより好ましくは配列番号11と配列番号12に記載の塩基配列により示される核酸を、それぞれフォワードプライマーとリバースプライマーとして使用する。
【００４４】
配列番号3を検出するためには、好ましくは配列番号13、配列番号14に記載の塩基配列により示される核酸が含まれる。またより好ましくは配列番号13と配列番号14に記載の塩基配列により示される核酸を、それぞれフォワードプライマーとリバースプライマーとして使用する。
【００４５】
配列番号4を検出するためには、好ましくは配列番号15、配列番号16に記載の塩基配列により示される核酸が含まれる。またより好ましくは配列番号13と配列番号14に記載の塩基配列により示される核酸を、それぞれフォワードプライマーとリバースプライマーとして使用する。
【００４６】
配列番号5を検出するためには、好ましくは配列番号17および配列番号18に記載の塩基配列により示される核酸が含まれる。より好ましくは配列番号15と配列番号16に記載の塩基配列により示される核酸を、それぞれフォワードプライマーとリバースプライマーとして使用する。
【００４７】
配列番号6を検出するためには、好ましくは、配列番号19および配列番号20に記載の塩基配列により示される核酸が含まれる。より好ましくは配列番号19と配列番号20を、それぞれフォワードプライマーとリバースプライマーとして使用する。
【００４８】
さらに、被験物質の神経毒性を検出するための核酸検出用プライマーは、上述の核酸に加えて更なる配列を含んでいてもよい。また、上記配列を有するプライマーは、リアルタイム定量PCRに最適なように設計することができる。
【００４９】
核酸増幅方法には、特に限定はなく、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＴＭＡ法、ＮＡＳＢＡ法等のいずれもが好適に使用できる。
【００５０】
V. 核酸検出用プライマーを用いた神経毒性の検出方法
上記核酸検出用プライマーを用いることにより、次のような手順によって被験物質の神経毒性を検出することが可能である。
【００５１】
配列1〜8に示された遺伝子のｍＲＮＡの競合ＲＴ−ＰＣＲあるいはリアルタイムＰＣＲにより被験物質の神経毒性を検出を実施することができる。その場合、上記プライマーの組み合わせを用いることができ、その増幅結果から配列1〜8に示される遺伝子の発現の度合いを定量的に測定することができる。
【００５２】
上記リアルタイム検出においては、インターカレーターによる検出、ＴａｑＭａｎプローブによる検出、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡキメラプローブの開裂反応による検出等の方法が使用できる。リアルタイムPCRを使用する場合、全RNAから(dT)プライマーを用いて逆転写反応を行った後で、各遺伝子断片を特異的に増幅できるPCRプライマーを用いてリアルタイム定量PCRを行う。たとえば、リアルタイム定量PCRは、Opticon Monitorリアルタイム定量PCR(MJリサーチ社製)で行うことができる。リアルタイムPCR試薬には、たとえばDyNAmo SYBR Green qPCR kit(フィンザイム社製)を使用することができる。
【００５３】
さらに、被験物質の神経毒性を検出するための核酸検出用プライマーは、上述した核酸に加えて更なる配列を含んでいてもよい。また、上記配列を有するプライマーは、リアルタイム定量PCRに最適なように設計することができる。
【００５４】
反応は、たとえば鋳型のcDNA溶液2μlに、上記配列番号1〜8に特異的な遺伝子増幅用プライマーを1μlと滅菌水7μlを加えて全量を10μlと、これに等量のリアルタイムPCR試薬を加えてよく混合することによって行うことができる。PCR反応は、たとえば変性:98℃,10秒、アニーリング:58℃,10秒、伸長:72℃,20秒を1サイクルとして計40サイクル行うことができる。また、遺伝子増幅量の測定は、たとえば各サイクルの伸長反応後にSYBR Green Iの蛍光強度によって測定することができる。このとき、同様な方法で測定したシクロフィリン遺伝子などの発現量を内部標準として相対発現量に換算することができる。
【００５５】
次に、上記測定したmRNAの発現量と、被験物質に曝露していない神経由来細胞における配列番号1〜8の配列のmRNAの少なくとも一つの発現量とを比較する。被験物質に曝露していない神経由来細胞におけるmRNAの発現量は、上記方法を使用して行うことができる。また、上記被験物質に曝露していない神経由来細胞におけるmRNAの発現量の測定と同時に測定することが好ましいが、被験物質に曝露していない神経由来細胞におけるmRNAの発現量を予め測定しておくこともできる。
【００５６】
また、このような被験物質に曝露していない神経由来細胞における配列番号1〜8の配列のmRNAの少なくとも一つの発現量との比較により、それぞれのmRNAについての閾値を予め設定しておき、その閾値を越えるか否かによって検査対象である被験物質の神経毒性の有無および程度の判定を行うことができる。
【００５７】
VI. 核酸検出用キット
(1)核酸検出用プローブを具備するキット
配列番号1〜8に記載の塩基配列、並びにこれらの相補的配列からなる群より選択される塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる少なくとも10の連続した配列からなるポリヌクレオチドを含むキットが提供できる。mRNAの発現量を指標とし、核酸検出用プローブを用いた神経毒性の検出方法に記載の核酸増幅法を用いた検出方法により、神経毒性を検出するためのキットの場合、配列番号1〜8のいずれかに示される塩基配列を含有する塩基配列で示されるDNA又は配列1〜8のいずれかに示されるDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAをcDNAとするmRNAを検出可能な、上記、核酸検出用プローブを構成の必須要件とする。例えば、RNase プロテクションアッセイキットの場合は、上記核酸検出用プローブに加え、80%ホルムアミド、40mM Pipes(pH6.4)、400mM、1mM EDTAからなるハイブリダイゼーション緩衝液を含んでも良い。また該プローブは32Pに代表される放射性物質のほか、フルオレセインに代表される蛍光物質で標識されていても良い。なお本キットにより検出される配列1〜8に示される遺伝子の種類及びその数は特に限定されない。従って本キットを構成するプローブも特に限定されなく、検出対象とする配列1〜8に示される遺伝子の種類及びその数により適宜選択すればよい。
【００５８】
(2)核酸検出用プライマーを具備するキット
具体的には、細胞内における、配列1〜8に示される遺伝子の発現量の変化を検出する方法において、該遺伝子より発現されるmRNAの量を指標に検出するキットが例示される。例えば、検出方法にRT-PCRを利用した本発明におけるキットは、上記プライマー対の他に、逆転写酵素、dNTP、耐熱性DNAポリメラーゼが組み込まれていてもよい。なお本キットにより検出される配列1〜8に示される遺伝子の種類及びその数は特に限定されない。従って本キットを構成するプライマー対も特に限定されなく、検出対象とする配列1〜8に示される遺伝子の種類及びその数により適宜選択すればよい。
【実施例】
【００５９】
実施例1:TCDD応答遺伝子の選択  
(1)N2a-R細胞の培養  
まず、アリルハイドロカーボンレセプター遺伝子過剰発現細胞N2a-R細胞の培養に使用したDF培地は、牛胎児血清を10%で含むダルベッコMEM培地とハム培地を1:1の割合で混合することにより調製した。
【００６０】
アリルハイドロカーボンレセプター遺伝子過剰発現細胞N2a-R細胞(寄託番号 FERM BP-10341、FERM BP-10342)を、DF培地中で37℃、5%二酸化炭素存在下で1日間培養した。次に、この培養の後、得られた細胞を2つの培養容器に分注することにより2つの区に分けた。片方の区には、2,3,7,8-テトラクロロ-ベンゾ-p-ジオキシン(2,3,7,8-tetrachloro-benzo-p-dioxin;以下、TCDDと称する)を終濃度が10nMとなるように加えた(以下、これをTCDD添加区と称する)。これに対してもう一方の区にはDMSOを加えた(以下、これをTCDD未添加区と称する)。これら2つの区のアリルハイドロカーボンレセプター遺伝子過剰発現細胞N2a-R細胞を3日間及び7日間培養した。
【００６１】
(2)TCDD添加区およびTCDD未添加区において発現された遺伝子の比較  
上記(1)に記載の方法により培養した2つの条件の区(TCDD添加区およびTCDD未添加区)の細胞において発現された遺伝子をマウスオリゴマイクロアレイ (Agilent社製)を用いて比較した。
【００６２】
まず、上記(1)に記載の2つの区の細胞から、それぞれ全RNAを抽出した。この抽出は、RNA Extraction  Kit(ファルマシア社製)を用いて、付属のマニュアルに従って行った。この抽出により得られた全RNAから、DNAを除去するためにDNaseIを処理した。その後、得られた溶液中に含まれる全RNA量を分光光度計で測定し、1μL当たりのRNAが250pmolとなるように濃度を調節した。
【００６３】
上記(1)に記載の2つの区の細胞から得られた全RNAを精製後、全RNA20μgに対し、オリゴdTプライマーをアニールさせた後、aminoallyl-dUTP存在下で逆転写酵素反応を行いaminoallyl-dUTPが導入されたcDNAを作製した。逆転写酵素反応で得られたcDNAとCy-dyeとのカップリング反応を行ってcDNAを蛍光標識した。なお、上記(1)に記載の2つの区のうちTCDD添加区細胞に由来するcDNAをCy5に、TCDD未添加区細胞に由来するcDNAをCy3にそれぞれ蛍光標識した。得られた2つの区の細胞由来のCy5、Cy3で標識されたcDNA溶液を混合し、マイクロアレイ基盤上に添加後、60度で17時間のハイブリダイゼーションを行った。その後、マイクロアレイをSSCバッファーを用いて洗浄後、マイクロアレイ基盤の遠心乾燥を行った。マイクロアレイの蛍光スキャニングはAgilent scannrer(Agilent社製)を用いて行った。画像データから数値データへの変換は専用ソフトFeature Extraction(Agilent社製)を用いて行った。バックグラウンドにはnegative control の蛍光値を用い、各スポットの蛍光値から差し引いた。サンプル・コントロール間のノーマリゼーションは、lowessを用いたグローバルノーマリゼーション法で行った。スキャニング時のフォトマルのゲインについては、全てのマイクロアレイでhighとlowの2種類で取得した。high取得時に蛍光強度が飽和していた遺伝子については、low取得時のデータを採用した。上記の方法から得られた遺伝子は、それぞれ、配列番号1〜8である。。配列番号1は、cDNA sequence BC034076であり、マウス由来である。配列番号2は、16days embryo head cDNA, RIKEN full-length enriched library, clone:C130072E11,full insert sequenceであり、マウス由来である。配列番号3は、RIKEN cDNA C230093N12 geneであり、マウス由来である。配列番号4は、RIKEN cDNA 1500002O20 geneであり、マウス由来である。配列番号5は、RIKEN cDNA 5830484J08 geneであり、マウス由来である。配列番号6は、RIKEN cDNA 1700124K17 geneであり、マウス由来である。配列番号7は、RIKEN cDNA 2310056P07 geneであり、マウス由来である。配列番号8は、cDNA sequence BC023105でありマウス由来である。
【００６４】
(3)(2)で得られた遺伝子のリアルタイムPCRによる発現変動の確認  
上記(2)で決定した配列番号1〜8の塩基配列をそれぞれ配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7および配列番号8に示す。これらを特異的に増幅できるPCRプライマーの例として次のプライマーを設計した。
【００６５】
配列番号1を増幅するためのPCRプライマーは、上流プライマーが配列番号9に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドであり、下流プライマーが配列番号10に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドである。
【００６６】
配列番号2を増幅するためのPCRプライマーは、上流プライマーが配列番号11に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドであり、下流プライマーが配列番号12に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドである。
【００６７】
配列番号3を増幅するためのPCRプライマーは、上流プライマーが配列番号13に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドであり、下流プライマーが配列番号14に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドである。
【００６８】
配列番号4を増幅するためのPCRプライマーは、上流プライマーが配列番号15に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドであり、下流プライマーが配列番号16に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドである。
【００６９】
配列番号5を増幅するためのPCRプライマーは、上流プライマーが配列番号17に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドであり、下流プライマーが配列番号18に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドである。
【００７０】
配列番号6を増幅するためのPCRプライマーは、上流プライマーが配列番号19に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドであり、下流プライマーが配列番号20に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドである。
【００７１】
配列番号7を増幅するためのPCRプライマーは、上流プライマーが配列番号21に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドであり、下流プライマーが配列番号22に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドである。
【００７２】
配列番号8を増幅するためのPCRプライマーは、上流プライマーが配列番号23に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドであり、下流プライマーが配列番号24に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドである。
【００７３】
新たに、上記(1)に記載の方法と同じ条件で、但し、TCDD添加濃度は0、10nMでアリルハイドロカーボンレセプター遺伝子過剰発現細胞N2a-R細胞を培養した。それらの各区について全RNAを抽出した。抽出した全RNAから(dT)プライマーを用いて逆転写反応を行った後で、各遺伝子断片を特異的に増幅できるPCRプライマーを用いてリアルタイム定量PCRによって、TCDDによる発現量を比較した。リアルタイム定量PCRはOpticon Monitorリアルタイム定量PCR(MJリサーチ社製)で行った。リアルタイムPCR試薬にはDyNAmo SYBR Green qPCR kit(フィンザイム社製)を使用した。鋳型のcDNA溶液2μlに、上記の配列番号1〜8に特異的な遺伝子増幅用プライマーを1μlと滅菌水7μlを加えて全量を10μlと、これに等量のリアルタイムPCR試薬を加えてよく混合した。PCR反応は変性:98℃,10秒、アニーリング:58℃,10秒、伸長:72℃,20秒を1サイクルとして計40サイクル行った。遺伝子増幅量の測定は各サイクルの伸長反応後にSYBR Green Iの蛍光強度を測定することで行った。同様な方法で測定したシクロフィリン遺伝子の発現量を内部標準として、相対発現量に換算した。結果を図1-A〜Hに示す。
【００７４】
図1-A、B、C、Dから明かであるように、配列番号1〜4は、リアルタイムPCRによって特異的に増幅され、3日間もしくは7日間の10nM TCDDの添加によって発現量が増加した(図1、2、3、および4)。配列番号1および3は、3日間もしくは7日間の10nM TCDDの曝露に対して応答性があることが確認できた。また、配列番号2は、3日間の10nM TCDDの添加によって発現量が増加した(図3)。従って、配列番号2は、3日間の10nM TCDDの曝露に対して応答性があることが確認できた。配列番号4は、7日間の10nM TCDDの添加によって発現量が増加した(図14)。従って、配列番号4は、7日間の10nM TCDD曝露に対して応答性があることが確認できた。配列番号5〜8は、3日間もしくは7日間TCDD添加によって発現量が減少した(図5、6、7、8)。配列番号5および8は、3日間の10nM TCDDの添加によって発現量が減少した(図5、8)。従って、配列番号5および8は、3日間の10nM TCDD曝露に対して応答性があることが確認できた。また、配列番号6は、7日間の10nM TCDDの添加によって発現量が減少した(図6)。従って、配列番号6は、7日間の10nM TCDD曝露に対して応答性があることが確認できた。配列番号7は、3日間および7日間の10 nM TCDDの添加によって発現量が減少した(図7)。従って配、列番号7は、3日間および7日間の10 nM TCDD曝露に対して応答性があることが確認できた。
【００７５】
上記のとおり、TCDD応答性の塩基配列が提供される。また、これらは、被験物質の神経毒性の判定に使用可能なマーカーとして提供された。さらには、被験物質の神経毒性作用を特異的に検出するための核酸検出用プライマ-として使用することができた。
【００７６】
実施例2：被験物質の神経毒性ノーザンハイブリダイゼーションによる検出法
上記(1)に記載の方法と同じ条件で、但し、TCDD添加濃度は0、10nMでアリルハイドロカーボンレセプター遺伝子過剰発現細胞N2a-R細胞を培養する。それらの各区について全RNAを抽出する。抽出された一定量の粗ＲＮＡ試料を分子量等による分画後ナイロンフィルター等に固定し、検出対象となる配列1〜8に示されるホリヌクレオチドmRNAと過剰量の該遺伝子検出用プローブを接触させ、固定化されたRNAにハイブリダイズしたプローブより得られるシグナル強度が強いほど、配列1〜8に示されるポリヌクレオチドの発現量が高いと判断できる。なお、該方法においてハイブリダイズするとは、例えば、50%ホルムアミド、0.65M  NaCl、0.1M ナトリウム-Pipes、5×デンハート液、0.1% SDS、5mM EDTAからなるハイブリダイゼーション緩衝液中42℃、20時間保温してハイブリダイズ可能であることを指す。検出用プローブは、検出対象となる配列1〜8に示されるポリヌクレオチドのmRNAに特異的な塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸であることが好ましいが、RNAの検出において数ヵ所にシグナルが得られるような塩基配列であっても、シグナル位置により検出対象mRNAを特定することができれば、特に限定されない。該プローブの標識も特に限定されず、例えば、32P に代表される放射性物質のほか、フルオレセインに代表される蛍光物質を用いることができる。その結果、配列番号1〜4に示されるポリヌクレオチドのmRNAは3日間もしくは7日間の10nM TCDDの添加によってハイブリダイゼーションで得られるシグナルは増大する。また、配列番号5〜8に示されるポリヌクレオチドは、3日間もしくは7日間のTCDD添加によってハイブリダイゼーションで得られるシグナルは減少する。
【００７７】
本発明の態様に従うと、ハイブリダイゼーションで得られるシグナルを検出することにより被検物質の神経毒性を特異的に検出することが可能な方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】実施例1-(3)において行ったリアルタイムPCRの結果を示すグラフ。
【図２】実施例1-(3)において行ったリアルタイムPCRの結果を示すグラフ。
【図３】実施例1-(3)において行ったリアルタイムPCRの結果を示すグラフ。
【図４】実施例1-(3)において行ったリアルタイムPCRの結果を示すグラフ。
【図５】実施例1-(3)において行ったリアルタイムPCRの結果を示すグラフ。
【図６】実施例1-(3)において行ったリアルタイムPCRの結果を示すグラフ。
【図７】実施例1-(3)において行ったリアルタイムPCRの結果を示すグラフ。
【図８】実施例1-(3)において行ったリアルタイムPCRの結果を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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