(57)【要約】【課題】ラマンスペクトル取得方法において、ラマンスペクトルのＳ／Ｎを低下させることなく、このラマンスペクトルの取得に要する時間を短縮する。【解決手段】多数の金属微粒子５が表面に分散配置されてなる基板１０の表面１０Ｓ上に測定対象となる多数の試料分子１を分散して配し、基板表面１０Ｓ上の所定の領域Ｗから上記所定の領域Ｗより狭い複数の小領域Ｕ１、Ｕ２・・・を抽出する。その後、各小領域Ｕ１、Ｕ２・・・への単色光の個別照射により小領域Ｕ１、Ｕ２・・・から発せられたラマン散乱光のそれぞれを分光して、各ラマン散乱光のスペクトルを示す複数のラマン分光信号を得、上記複数のラマン分光信号を演算することにより試料分子１を同定するためのラマンスペクトルを取得する。【選択図】図２
2007101476.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多数の金属微粒子が表面に分散配置されてなる基板の前記表面上に測定対象となる多数の試料分子を分散して配し、
前記基板表面上の所定の領域から前記所定の領域より狭い小領域を複数抽出し、
前記各小領域への単色光の個別照射により該小領域から発せられたラマン散乱光のそれぞれを分光して、各ラマン散乱光のスペクトルを示す複数のラマン分光信号を得、
該複数のラマン分光信号を演算することにより前記試料分子を同定するためのラマンスペクトルを取得することを特徴とするラマンスペクトル取得方法。
【請求項２】
前記小領域が、前記所定の領域を暗視野照明したときに該所定の領域中において前記暗視野照明光の散乱光が高い輝度で発せられる領域であることを特徴とする請求項１記載のラマンスペクトル取得方法。
【請求項３】
前記小領域が、明視野光学顕微鏡を通して得られた前記所定の領域の像に基づいて定められる領域であることを特徴とする請求項１記載のラマンスペクトル取得方法。
【請求項４】
前記暗視野照明光が白色光であり、前記高い輝度で発せられる散乱光の色が前記単色光の色の補色であることを特徴とする請求項２記載のラマンスペクトル取得方法。
【請求項５】
前記単色光が、互に異なる波長を持つ複数種類の単色光であり、前記個別照射が、前記複数種類の単色光それぞれについて実行されるものであることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載のラマンスペクトル取得方法。
【請求項６】
前記演算が、前記複数のラマン分光信号を加算平均して前記ラマンスペクトルを取得するものであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項記載のラマンスペクトル取得方法。
【請求項７】
前記演算が、前記複数のラマン分光信号を加算して前記ラマンスペクトルを取得するものであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項記載のラマンスペクトル取得方法。
【請求項８】
前記演算が、前記複数のラマン分光信号のそれぞれを重み付けしてから加算するものであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項記載のラマンスペクトル取得方法。
【請求項９】
前記演算が、前記複数のラマン分光信号のうちから小さい信号強度を持つラマン分光信号を除いて前記小さい信号強度より大きい信号強度を持つラマン分光信号を得る選択処理をも含むものであることを特徴とする請求項１から８のいずれか１項記載のラマンスペクトル取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はラマンスペクトル取得方法に関し、詳しくは、多数の金属微粒子が表面に分散配置されてなる基板の表面上に配された試料分子を同定するためのラマンスペクトルを取得するラマンスペクトル取得方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より、数十から数百ナノメートルの大きさを持つ２つの金属微粒子を数十から数百ナノメートルの間隔を置いて配したときに上記金属微粒子の間に強い電場が形成され、上記電場の作用により、例えば微弱なラマン散乱光の光強度を大幅に増幅できることが知られている。
【０００３】
この原理を応用して、金属微粒子を分散配置した試料基板上に測定対象となる分子、例えば、生体分子であるタンパク質を多数配し、上記金属微粒子の近傍から上記タンパク質の影響を受けて発せられたラマン散乱光を分光し、この分光によって得られたラマンスペクトルを分析して上記タンパク質を同定する手法が知られている（特許文献１参照）。
【０００４】
この手法によれば、タンパク質の影響を受けたラマン散乱光の光強度を大幅に増幅させることができ、これにより、このラマン散乱光を分光して得られるラマンスペクトルのＳ/Ｎを従来に比して改善することができる。
【０００５】
なお、上記光強度を大幅に増幅させる領域（ホットスポットともいう）は、試料基板中の所望の位置に意図的に作り込むことはできず試料基板中に散在している。また、上記領域からタンパク質の影響を受けて発せられた１種類のラマン散乱光に基づくタンパク質の同定では信頼性が不十分であるので、複数箇所において発せられた複数種類のラマン散乱光に基づいてタンパク質を同定するのが一般的である。
【０００６】
そのため、試料基板上で発生したラマン散乱光の検出によるタンパク質の同定には以下のような方式が用いられている。すなわち、一定以上の光強度を持つラマン散乱光が発せられる領域を複数含む広い領域において各ラマン散乱光をまとめて検出し分光して得られたラマンスペクトルに基づいてタンパク質を同定する方式、あるいは、上記試料基板上を２次元走査して、一定以上の光強度を持つラマン散乱光を発する領域が検出される毎にそのラマン散乱光を分光して複数種類のスペクトルを得それらに基づいてタンパク質を同定するためのラマンスペクトルを取得する方式等が用いられている（非特許文献１参照）。
【０００７】
また、上記試料基板を暗視野照明下で顕微鏡観察したときに、照明光の散乱光が高い輝度で観察される試料基板中の領域は、上記ラマン散乱光の光強度を大幅に増幅させる領域である可能性が高いことも知られている（非特許文献１参照）。
【特許文献１】特開２００５−１４４５６９号公報
【非特許文献１】Applied Physics letters 83,2274 (03)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ところで、上記のように、試料基板上を２次元走査して、一定以上の光強度を持つラマン散乱光が検出される毎にそのラマン散乱光を分光して複数のスペクトルを得、それらに基づいて上記タンパク質の同定に用いるラマンスペクトルを取得する方式では２次元走査に多くの時間を要し測定時間が長くなるという問題がある。一方、試料基板上のより広い領域において互に異なる位置から発せられる複数種類のラマン散乱光をまとめて検出し分光して上記タンパク質の同定に用いるラマンスペクトルを得る方式は、測定時間を短縮できる点では優れているが、ノイズ成分を多く含む光強度の弱いラマン散乱光をもまとめて検出してしまうため取得されるラマンスペクトルのＳ／Ｎが低下するという問題がある。
【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、ラマンスペクトルのＳ／Ｎを低下させることなく、このラマンスペクトルの取得に要する時間を短縮することができるラマンスペクトル取得方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明のラマンスペクトル取得方法は、多数の金属微粒子が表面に分散配置されてなる基板の前記表面上に測定対象となる多数の試料分子を分散して配し、前記基板表面上の所定の領域から前記所定の領域より狭い小領域を複数抽出し、各小領域への単色光の個別照射によりこれらの小領域から発せられたラマン散乱光のそれぞれを分光して、各ラマン散乱光のスペクトルを示す複数のラマン分光信号を得、複数のラマン分光信号を演算することにより試料分子を同定するためのラマンスペクトルを取得することを特徴とするものである。
【００１１】
前記小領域は、所定の領域を暗視野照明したときに前記所定の領域中において暗視野照明光の散乱光が高い輝度で発せられる領域としたり、あるいは、前記小領域は、明視野光学顕微鏡を通して得られた前記所定の領域の像に基づいて定められる領域とすることができる。
【００１２】
前記暗視野照明光を白色光とし、高い輝度で発せられる散乱光の色を単色光の色の補色とすることが望ましい。
【００１３】
前記単色光を、互に異なる波長を持つ複数種類の単色光とし、前記個別照射を、複数種類の単色光それぞれについて実行されるものとすることができる。
【００１４】
前記演算は、前記複数のラマン分光信号を加算平均してラマンスペクトルを取得するものとすることができる。また、前記演算は、前記複数のラマン分光信号を加算して前記ラマンスペクトルを取得するものとすることができる。さらに、前記演算は、前記複数のラマン分光信号のそれぞれを重み付けしてから加算するものとすることもできる。
【００１５】
なお、前記加算平均の演算、前記加算の演算、あるいは前記重み付け加算の演算は、前記複数のラマン分光信号の全てをその演算の対象としてもよいし、前記複数のラマン分光信号のうちの一部をその演算の対象としてもよい。
【００１６】
前記演算は、前記複数のラマン分光信号のうちから小さい信号強度を持つラマン分光信号を除いて、前記小さい信号強度より大きい信号強度を持つラマン分光信号を得る選択処理をも含むものとすることができる。
【００１７】
なお、前記信号強度の大きさは、各ラマン分光信号における信号強度の平均値、各ラマン分光信号における信号強度の最大値、あるいは各ラマン分光信号の信号強度を全波長域に亘って積分した積分値等を採用することができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のラマンスペクトル取得方法によれば、多数の金属微粒子が表面に分散配置されてなる基板の前記表面上に測定対象となる多数の試料分子を分散して配し、基板表面上の所定の領域から上記所定の領域より狭い小領域を複数抽出し、各小領域への単色光の個別照射により各小領域から発せられたラマン散乱光のそれぞれを分光して、各ラマン散乱光のスペクトルを示す複数のラマン分光信号を得、これらのラマン分光信号を演算することにより試料分子を同定するためのラマンスペクトルを取得するようにしたので、ラマンスペクトルのＳ／Ｎを低下させることなく、このラマンスペクトルの取得に要する時間を短縮することができる。
【００１９】
また、基板表面上の所定の領域を暗視野照明し、この所定の領域中の、暗視野照明光の散乱光が高い輝度で発せられる上記所定の領域より狭い小領域を複数抽出し、各小領域への単色光の個別照射により各小領域から発せられたラマン散乱光のそれぞれを分光して、各ラマン散乱光のスペクトルを示す複数のラマン分光信号を得、これらのラマン分光信号を演算することにより試料分子を同定するためのラマンスペクトルを取得するようにすれば、ラマンスペクトルのＳ／Ｎを低下させることなく、このラマンスペクトルの取得に要する時間を短縮することができる。
【００２０】
また、基板表面上の所定の領域から、明視野光学顕微鏡を通して得られた上記所定の領域の像に基づいて定められるこの所定の領域より狭い小領域を複数抽出し、各小領域への単色光の個別照射により各小領域から発せられたラマン散乱光のそれぞれを分光して、各ラマン散乱光のスペクトルを示す複数のラマン分光信号を得、これらのラマン分光信号を演算することにより試料分子を同定するためのラマンスペクトルを取得するようにしたので、ラマンスペクトルのＳ／Ｎを低下させることなく、このラマンスペクトルの取得に要する時間を短縮することができる。
【００２１】
すなわち、上記方法によれば、ラマン散乱光が大幅に増幅される可能性の高い複数の小領域を同時に抽出するようにしたので、基板上を２次元走査していた従来方式に比して上記小領域を見つけるのに要する時間を短縮することができる。さらに、上記抽出された各小領域から発せられるラマン散乱光を個別に分光して複数のラマン分光信号を得るようにしたので従来方式に比してラマンスペクトルのＳ／Ｎを低下させることがない。これにより、試料分子を効率良く正確に同定することができる。
【００２２】
また、暗視野照明光を白色光とし、高い輝度で発せられる散乱光の色を単色光の色の補色とすれば、小領域において単色光を効率良く吸収させることができるので、ラマン散乱光を効率良く発生させることができる。
【００２３】
また、上記演算を、複数のラマン分光信号を加算平均してラマンスペクトルを取得するものとすれば、平均化によるノイズ成分の低減と、局所的に生じた信号強度の大きな変動の影響とを抑制することができ、より正確な試料分子の同定を可能にするラマンスペクトルを得ることができる。
【００２４】
また、上記演算を、複数のラマン分光信号を加算してラマンスペクトルを取得するものとすれば、平均化によるノイズ成分の低減と、局所的に生じた信号強度の大きな変動の影響とを抑制することができ、より正確な試料分子の同定を可能にするラマンスペクトルを得ることができる。
【００２５】
ここで、上記演算を、複数のラマン分光信号のうちから小さい信号強度を持つラマン分光信号を除いて上記小さい信号強度より大きい信号強度を持つラマン分光信号を得る選択処理をも含むものとすれば、Ｓ/Ｎの低いラマン分光信号を除くことができ、より正確な試料分子の同定を可能にするラマンスペクトルを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。図１は本発明のラマンスペクトル取得方法を実施するためのラマンスペクトル取得システムの概略構成を示す図、図２は基板の表面を拡大して示す拡大図である。
【００２７】
上記ラマンスペクトル取得システムは、顕微鏡部５０、基板ステージ部６０、ラマン散乱用光照射部６５、分光測定部７０、および演算部８０を備えている。
【００２８】
基板ステージ部６０は、基板１０を支持するテーブル６１、テーブル６１を水平方向（図中Ｘ−Ｙ平面方向）に移動させるステージ部６２、およびステージ部６２によるテーブル６１の移動を制御するステージ制御部６３を備え、テーブル６１上に載置された基板１０のＸ方向およびＹ方向における位置決めを行なう。
【００２９】
基板１０は、金属微粒子５が表面１０Ｓに分散配置されたものである。金属微粒子５は金、銀等の貴金属材料からなるものであることが望ましいが、必ずしもそのような場合に限らない。
【００３０】
顕微鏡部５０は、テーブル６１上に配置された基板１０を暗視野照明するための暗視野照明光Ｌｄを発する暗視野照明部５２、基板１０の表面１０Ｓ（以後、基板表面１０Ｓともいう）の像を後述のカラー２次元ＣＣＤ５４上に結像させる結像光学系５７、結像光学系５７により結像された基板表面１０Ｓの像を撮像するカラー２次元ＣＣＤ５４、およびカラー２次元ＣＣＤ５４で撮像した上記像を画像処理するための画像処理部５９を備えている。結像光学系５７は上記基板表面１０Ｓの像をカラー２次元ＣＣＤ５４上に結像させる対物レンズ５７Ａと接眼レンズ５７Ｂ、および対物レンズ５７Ａから接眼レンズ５７Ｂへ光を伝播させる光路を折り曲げるための反射ミラー５７Ｃを有している。
【００３１】
なお、上記顕微鏡部５０は、明視野光学顕微鏡として使用することもできる。そのような場合には、暗視野照明部５２を、明視野照明光を発する明視野照明部５２Ｍに変更する。
【００３２】
ここでは、暗視野照明光は白色光であるが、この暗視野照明光は白色光である場合に限るものではない。また、上記明視野照明光は、ここでは白色光であるが、この明視野照明光は白色光である場合に限るものではない。
【００３３】
図１においては、基板１０の対物レンズ５７Ａの側とは反対側（下側）からこの基板１０に対して暗視野照明光や明視野照明光を入射させているが、このような場合には、基板１０をガラス板等の透明材料の表面１０Ｓに金属微粒子５を分散配置させたものとすることができる。また、基板１０の対物レンズ５７Ａの側（上側）からこの基板１０に対して暗視野照明光や明視野照明光を入射させる場合には、基板１０を不透明な材料の表面１０Ｓに金属微粒子５を分散配置させたものとしてもよい。
【００３４】
なお、暗視野照明された基板表面１０Ｓの暗視野像Ｊｗの撮像に使用する対物レンズ５７Ａと、後述する分光測定に使用する対物レンズ７４Ａとは両方共にレボルバ５１に装着されており、レボルバ５１を回転させることにより暗視野像撮像時と分光測定時とで互いの位置が入れ替わる。分光測定用の対物レンズ７４Ａの倍率は、暗視野像撮像用の対物レンズ５７Ａの倍率より大きく、ここでは、分光測定用の対物レンズ７４Ａの倍率が５０倍でN.A.が０．８、暗視野像撮像用の対物レンズ５７Ａの倍率が２０倍でN.A.が０．３である。
【００３５】
なお、上記対物レンズ５７Ａは、明視野照明された基板表面１０Ｓの明視野像を取得する場合にも使用することができる。
【００３６】
ラマン散乱用光照射部６５は、緑色の単色光を射出するレーザ光源６５Ａと、レーザ光源６５Ａから発せられた単色光を平行光にするコリメートレンズ６６とを備えている。レーザ光源６５Ａとしては、出力５０ｍＷ、波長５３２ｎｍＮｄ：ＹＡＧ（ＳＨＧ）レーザを採用することができる。
【００３７】
ここでは、上記レーザ光源６５Ａから射出されるレーザ光である単色光の色は緑色（波長５３２ｎｍ）であり、後述の各小領域から高い輝度で発せられる暗視野照明光Ｌｄの散乱光の色が上記単色光の色の補色となるように上記各小領域を抽出することが望ましい。すなわち、上記単色光が吸収されやすい領域を、上記各小領域として選択することが望ましい。上記基板表面１０Ｓで吸収されやすい波長は、上記基板表面１０Ｓ上の場所ごとに異なるが、様々な色の散乱光を発する多数の領域のうちの上記単色光の補色を発する領域は上記単色光を吸収しやすい領域である。
【００３８】
なお、上記抽出される各小領域は、上記各小領域から高い輝度で発せられる暗視野照明光Ｌｄの散乱光の色が上記単色光の色の補色である場合に限るものではない。
【００３９】
分光測定部７０は、分光器７２と、基板表面１０Ｓ上における後述する小領域Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３・・・（以後まとめて小領域Ｕともいう）から発生したラマン散乱光Ｌａｍ１、Ｌａｍ２、Ｌａｍ３・・・（以後、まとめてラマン散乱光Ｌａｍともいう）を分光器７２に導くための分光用光学系７４を備え、基板表面１０Ｓから発せられたラマン散乱光Ｌａｍ１、Ｌａｍ２、Ｌａｍ３・・・のそれぞれを分光して上記ラマン散乱光Ｌａｍ１、Ｌａｍ２、Ｌａｍ３・・・のスペクトルを示すラマン分光信号Ｓｇ１、Ｓｇ２、Ｓｇ３・・・（以後、まとめてラマン分光信号Ｓｇともいう）を得るものである。
【００４０】
なお、分光測定部７０で分光測定を行なう場合には反射ミラー５７Ｃが図中矢印−Ｘ方向に移動せしめられる。分光用光学系７４は、各小領域Ｕから発生したラマン散乱光Ｌａｍのそれぞれを集光させる対物レンズ７４Ａ、上記対物レンズ７４Ａで集光されたラマン散乱光Ｌａｍの一部を透過させ、このラマン散乱光Ｌａｍを生じさせるための単色光Ｌｔの一部を反射せしめるハーフミラー７４Ｂ、ハーフミラー７４Ｂを通ったラマン散乱光Ｌａｍを透過させ、このラマン散乱光Ｌａｍと共に上記ハーフミラー７４Ｂを通って入射する単色光Ｌｔの反射光であるレイリー散乱光を遮断する狭帯域フィルタであるノッチフィルタ７４Ｅ、ノッチフィルタ７４Ｅを通ったラマン散乱光Ｌａｍを後述するピンホール７４Ｄの孔に集光させる集光レンズ７４Ｃ、集光レンズ７４Ｃによって集光されたラマン散乱光Ｌａｍを通しこのラマン散乱光Ｌａｍに混入するノイズ成分を除去するピンホール７４Ｄを備え、分光器７２が上記ピンホール７４Ｄを通ったラマン散乱光Ｌａｍを分光する。
【００４１】
分光器７２は、回折格子および光検出器（例えば、ＣＣＤ、光電子増倍管、あるいはフォトダイオード等）で構成されている。
【００４２】
なお、ラマン散乱用光照射部６５から発せられコリメートレンズ６６により平行光にせしめられた単色光Ｌｔは、ハーフミラー７４Ｂで反射せしめられて向きを変え上記対物レンズ７４Ａを通って上記小領域Ｕへ入射する。
【００４３】
演算部８０は、基板表面１０Ｓ上の互に異なる小領域Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３・・・から発せられた複数種類の各ラマン散乱光Ｌａｍ１、Ｌａｍ２、Ｌａｍ３のスペクトルを示すラマン分光信号Ｓｇ１、Ｓｇ２、Ｓｇ３・・・が入力され、上記複数種類のラマン分光信号Ｓｇを例えば加算平均して１つのラマンスペクトルＳＬｐを取得する。上記加算平均してラマンスペクトルを得る代わりに、単に上記複数種類のラマン分光信号Ｓｇを単に加算してラマンスペクトルを得るようにしてもよい。
【００４４】
上記ラマンスペクトル取得システムを用いたラマンスペクトル取得方法の実施について具体的に説明する。図３（ａ）は暗視野像撮像用の対物レンズを通して結像される基板表面の大領域を示す図、図３（ｂ）、（ｃ）は分光測定用の対物レンズの視野中における小領域を示す図である。図４は小領域から発せられたラマン散乱光を分光して得た複数のスペクトルとこれらのスペクトルを演算して取得した試料分子を同定するためのラマンスペクトルを示す図である。図５は小領域外から発せられたラマン散乱光を分光して得た複数のスペクトルとこれらのスペクトルを演算して取得した試料分子を同定するためのラマンスペクトルを示す図である。なお、図４（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および図５（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）それぞれの縦軸Ｅは光強度を示し、横軸Ｈｎは波数シフト（１／ｃｍ）を示している。
【００４５】
図１および図２に示すように、はじめに、多数の金属微粒子５が基板表面１０Ｓに分散配置されてなる基板表面１０Ｓ上に測定対象となる多数の試料分子１を分散して配する。そして、基板ステージ部６０のテーブル６１上に基板１０を載置する。
【００４６】
次に、暗視野照明部５２により基板表面１０Ｓ上の所定の領域である大領域Ｗを暗視野照明する。そして、上記大領域Ｗ中の上記暗視野照明による暗視野照明光Ｌｄの散乱光が高い輝度で発せられる上記大領域Ｗより狭い複数の小領域Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３・・・を抽出する。
【００４７】
すなわち、暗視野照明部５２により暗視野照明された基板表面１０Ｓ上の所定の領域である大領域Ｗを示す暗視野像Ｊｗ（図３（ａ）参照）が結像光学系５７を通してカラー２次元ＣＣＤ５４上に結像せしめられ、カラー２次元ＣＣＤ５４は上記暗視野像Ｊｗを撮像して得た画像信号Ｇｗを画像処理部５９へ出力する。画像信号Ｇｗが入力された画像処理部５９は上記大領域Ｗ中から上記各小領域Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３・・・を抽出して対物レンズ５７Ａの光軸Ｃを基準にした各小領域Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３・・・の位置を求める。そして、上記各小領域Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３・・・の位置を示す位置データＤｐをステージ制御部６３へ出力する。
【００４８】
つづいて、ラマン散乱用光照射部６５が、上記各小領域Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３・・・への単色光Ｌｔの個別照射を行い、分光測定部７０が小領域Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３・・・から発せられたラマン散乱光Ｌａｍ１、Ｌａｍ２、Ｌａｍ３・・・のそれぞれを分光して、各ラマン散乱光Ｌａｍ１、Ｌａｍ２、Ｌａｍ３・・・のスペクトルを示す複数のラマン分光信号Ｓｇ１、Ｓｇ２、Ｓｇ３・・・を得る。
【００４９】
すなわち、レボルバ５１の回転により、上記暗視野照明による暗視野像Ｊｗの撮像に使用した対物レンズ５７Ａの位置に分光測定用の対物レンズ７４Ａを位置させるとともに、反射ミラー５７Ｃを図中矢印−Ｘ方向に移動させて光路から外す。ここで、上記分光測定用の対物レンズ７４Ａの光軸Ｃは、暗視野像Ｊｗを撮像したときの対物レンズ５７Ａの光軸Ｃと一致している。
【００５０】
上記光軸Ｃを基準にした各小領域Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３・・・の位置が入力されたステージ制御部６３がステージ部６２を制御してテーブル６１を移動させ、始めに小領域Ｕ１を対物レンズ７４Ａの光軸Ｃ上に移動させる。これにより、図３（ｂ）に示すように小領域Ｕ１は対物レンズ７４Ａの視野の中心に位置せしめられ、また、分光測定用の対物レンズ７４Ａの視野中に占める小領域Ｕ１の割合は上記暗視野撮像用の対物レンズ５７Ａの視野中に占める小領域Ｕ１の割合より大きくなる。
【００５１】
そして、ラマン散乱用光照射部６５のレーザ光源６５Ａから射出されコリメートレンズ６６、ハーフミラー７４Ｂ、ノッチフィルタ７４Ｅ、および対物レンズ７４Ａを通った単色光Ｌｔが小領域Ｕ１へ照射される。上記単色光Ｌｔの照射を受けた小領域Ｕ１から発せられたラマン散乱光Ｌａｍ１は分光用光学系７４を通って分光器７２へ入射する。分光器７２は上記ラマン散乱光Ｌａｍ１を分光してこのラマン散乱光Ｌａｍ１のスペクトルを示すラマン分光信号Ｓｇ１を生成する。
【００５２】
その後、ステージ制御部６３によるステージ部６２の制御により、小領域Ｕ２を対物レンズ７４Ａの光軸Ｃ上に位置させる。これにより、図３（ｃ）に示すように、対物レンズ７４Ａの視野中心に小領域Ｕ２が位置する。そして、上記と同様に、分光測定部７０が、単色光Ｌｔの照射を受けた小領域Ｕ２から発せられたラマン散乱光Ｌａｍ２を分光してラマン分光信号Ｓｇ２を得る。以下同様に、分光測定部７０が、各小領域Ｕ３・・・から発せられたラマン散乱光Ｌａｍ３・・・を分光して各ラマン分光信号Ｓｇ３・・・を得る。
【００５３】
演算部８０は、分光測定部７０から入力された上記複数のラマン分光信号Ｓｇ１、Ｓｇ２、Ｓｇ３・・・を演算し、試料分子１を同定するためのラマンスペクトルＳＬｐを取得する。
【００５４】
より具体的には、図４に示すように、スペクトルＳｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３・・・を示す各ラマン分光信号Ｓｇ１、Ｓｇ２、Ｓｇ３・・・を、例えば加算平均してラマンスペクトルＳＬｐを得る。
【００５５】
上記ラマンスペクトルＳＬｐは演算部８０から試料分子同定部８５へ入力され、試料分子同定部８５が上記ラマンスペクトルＳＬｐに基づいて試料分子１を同定する。
【００５６】
これに対して、図５に示すように、暗視野照明光Ｌｄの散乱光が高い輝度で発せられなかった、上記小領域Ｕ以外で発せられたノイズ成分を多く含むラマン散乱光を分光して得られたスペクトルＳｐ１１、Ｓｐ１２、Ｓｐ１３・・・を示す各ラマン分光信号Ｓｇ１１、Ｓｇ１２、Ｓｇ１３・・・を取得し、それらのラマン分光信号を加算平均して得たラマンスペクトルＳＬｐｘは、上記ラマンスペクトルＳＬｐに比してＳ/Ｎが低いため試料分子の正確な同定を行なうことは難しい。
【００５７】
なお、上記演算部８０による演算を、複数のラマン分光信号Ｓｇ１、Ｓｇ２、Ｓｇ３・・・のうちから小さい信号強度を持つラマン分光信号、例えばラマン分光信号Ｓｇ２を除いて上記小さい信号強度より大きい信号強度を持つラマン分光信号Ｓｇ１、Ｓｇ３・・・を得るデータ選別を行い、その後、上記大きい信号強度を持つ複数のラマン分光信号Ｓｇ１、Ｓｇ３・・・を演算して試料分子１を同定するためのラマンスペクトルを取得するものとしてもよい。
【００５８】
上記データ選別は、信号強度が小さいラマン分光信号を除くものである。信号強度が小さいラマン分光信号が得られた領域はラマン増強度が低い領域、もしくは試料分子がホットサイト近傍に存在しない可能性の高い領域であり、そのような領域から得られたラマン分光信号のＳ/Ｎは低い。上記のようなラマン分光信号を除くことにより、Ｓ/Ｎの高いラマンスペクトルを得ることができる。複数のラマン分光信号のうちから取り除くラマン分光信号を決める判定は、上記複数のラマン分光信号の各信号強度の平均値の比較等によって行なうことができる。
【００５９】
より具体的には、上記データ選別は、Ｎ個の各小領域から得られた複数のラマン分光信号のそれぞれをＲｉ（ｋ）〔ｉ＝１、Ｎ〕ここでｋは波数シフト量とし、上記複数のラマン分光信号の演算によって得られた上記試料分子を代表するラマンスペクトルをＲ（ｋ）：ｋは上記と同様の波数シフト量とすると  
Ｒ（ｋ）＝ΣＲｉ（λ）  〔∫Ｒｉ（ｋ）ｄｋ＞α〕αは最低必要なラマン分光信号の積分強度の値  
の式によって示すことができる。
【００６０】
また、上記演算部８０による演算を、複数のラマン分光信号Ｓｇ１、Ｓｇ２、Ｓｇ３・・・のそれぞれを重み付けしてから加算平均して試料分子１を同定するためのラマンスペクトルを取得するものとしてもよい。
【００６１】
上記重み付き加算平均は、複数の小領域のうちの一部において局所的、突発的に発生した、極端に大きな信号強度を持つ特定のラマン分光信号の影響が、取得されるラマンスペクトルに大きく現れることを抑制するものである。例えば、各ラマン分光信号の信号強度の平均値のそれぞれが互に略一致するように、各ラマン分光信号に対する重み付平均の演算を行うことができる。
【００６２】
より具体的には、上記重み付き加算平均は、
Ｒ（ｋ）＝Σ（Ｒｉ（ｋ）／∫Ｒｉ（ｋ）ｄλ）  〔ｉ＝１、Ｎ〕
の式によって示すことができる。
【００６３】
なお、上記単色光を、互に異なる波長を持つ複数種類の単色光とし、個別照射を、複数種類の単色光それぞれについて実行するようにしてもよい。すなわち、図１に示すように、ラマン散乱用光照射部６５に、互に異なる波長を持つ複数種類の単色光のそれぞれを射出するレーザ光源６５Ａ，６５Ｂ，６５Ｃを備えるようにし、複数種類の単色光のそれぞれについて上記個別照射を実行して各ラマン分光信号を得、これらのラマン分光信号を演算してラマンスペクトルを取得するようにしてもよい。
【００６４】
上記実施の形態では、レボルバによって交換される暗視野像撮像用の対物レンズと分光測定用の対物レンズの互いの光軸を共通の基準位置とすることにより、暗視野照明下の撮像で抽出した小領域の位置を、分光測定を行なうときの小領域の位置に対応付けていた。しかしながら、基板ステージ部に載置した基板を暗視野照明下で撮像した後、この基板を基板ステージ部から外して別の場所で分光測定を行なう場合には、基板の角部や、基板上にプリントされたマーキングやバーコードを共通の基準位置にすることにより、暗視野照明下での撮像で抽出した小領域の位置を、分光測定を行なうときの小領域の位置に対応付けることができる。
【００６５】
なお、暗視野照明部５２を明視野照明部５２Ｍに変更して上記顕微鏡部５０を明視野光学顕微鏡として構成し、基板表面１０Ｓ上の所定の領域を明視野照明してこの明視野光学顕微鏡を通して得られた上記所定の領域の像に基づいて上記所定の領域より狭い複数の小領域を抽出するようにしてもよい。
【００６６】
さらに、上記小領域の抽出は、上記暗視野照明や明視野照明を利用した手法で行なう場合の他、電子顕微鏡の観察により直接行なうこともできる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本発明のラマンスペクトル取得方法を実施するためのラマンスペクトル取得システムの概略構成を示す図
【図２】多数の試料分子が分散するように配された基板の表面を拡大して示す拡大図
【図３】図３（ａ）は暗視野像撮像用の対物レンズを通して結像される基板表面の大領域を示す図、図３（ｂ）および（ｃ）は分光測定用の対物レンズの視野中における小領域を示す図
【図４】小領域から発せられたラマン散乱光を分光して得た複数のスペクトルとこれらのスペクトルを演算して取得した試料分子を同定するためのラマンスペクトルを示す図
【図５】小領域外から発せられたラマン散乱光を分光して得た複数のスペクトルとこれらのスペクトルを演算して取得した試料分子を同定するためのラマンスペクトルを示す図
【符号の説明】
【００６８】
１    試料分子
５    金属微粒子
１０    基板
１０Ｓ    基板表面
５０    顕微鏡部
６０    基板ステージ部
６５    ラマン散乱用光照射部
７０    分光測定部
８０    演算部
Ｗ    所定の領域
Ｕ    小領域
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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