(57)【要約】      （修正有）【課題】遺伝子ターゲティングに伴うランダムインテグレーションを排除する細胞の作製方法、及びその方法によって取得された細胞、該細胞を用いた遺伝子ターゲティングを行う方法の提供。【解決手段】遺伝子ターゲティングを行う細胞内に存在するＤＮＡ修復過程に機能するＤＮＡリガーゼ遺伝子及び／又は該ＤＮＡリガーゼと複合体を形成するタンパク質をコードする遺伝子の機能を抑制又は喪失させ、ターゲティングの対象となるＤＮＡ断片のランダムインテグレーションを効果的に抑制する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来ＤＮＡを細胞内の目的のゲノム領域に導入する場合において、該細胞内に内在しＤＮＡ修復過程に機能するＤＮＡリガーゼをコードする遺伝子、及び／又は該ＤＮＡリガーゼと複合体を形成するタンパク質をコードする遺伝子の機能低下もしくは機能喪失を誘導し、該目的のゲノム領域以外への該外来ＤＮＡのランダムなインテグレーションを排除する細胞の作製方法。
【請求項２】
前記機能低下もしくは機能喪失が、前記ＤＮＡリガーゼをコードする遺伝子及び／又は該ＤＮＡリガーゼと複合体を形成するタンパク質をコードする遺伝子の配列中に突然変異又は欠失を導入することで達成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記機能低下もしくは機能喪失が、前記ＤＮＡリガーゼをコードする遺伝子及び／又は該ＤＮＡリガーゼと複合体を形成するタンパク質をコードする遺伝子の全体を破壊することで達成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
外来ＤＮＡを細胞内の目的のゲノム領域に導入する場合において、該細胞内に内在しＤＮＡ修復過程に機能するＤＮＡリガーゼ、及び／又は該ＤＮＡリガーゼと複合体を形成するタンパク質の活性抑制もしくは活性喪失を誘導し、該目的のゲノム領域以外への該外来ＤＮＡのランダムなインテグレーションを排除する細胞の作製方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡリガーゼがＤＮＡリガーゼＩＶであることを特徴とする請求項１乃至４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡリガーゼと複合体を形成するタンパク質がＸｒｃｃ４ｐであることを特徴とする請求項１乃至４に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡリガーゼがＤＮＡリガーゼＩＩＩであることを特徴とする請求項１乃至４に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が真核細胞であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記真核細胞が、少なくとも動物細胞、植物細胞、真菌細胞からなる群から選択される細胞であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記真菌がキノコであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記真菌が糸状菌（カビ）であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記糸状菌が、ニューロスポラ属、アスペルギルス属、ペニシリウム属、フザリウム属、トリコデルマ属又はムコール属のいずれかに属するものであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ニューロスポラ属に属する糸状菌が、少なくともニューロスポラ・クラッサ、ニューロスポラ・シトフィラ、ニューロスポラ・テトラスペルマ、ニューロスポラ・インターメディア、ニューロスポラ・ディスクレータからなる群から選択されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記アスペルギルス属に属する糸状菌が、少なくともアスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・パラシティク、アスペルギルス・フラバス、アスペルギルス・ノミウス、アスペルギルス・フミガタス、アスペルギルス・ニジュランス、アスペルギルス・ニガー、 アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・カワチからなる群から選択されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１乃至１４のいずれかに記載の方法で作製された細胞。
【請求項１６】
請求項１５に記載の細胞に外来ＤＮＡを導入し遺伝子ターゲティングを行う方法。
【請求項１７】
前記外来ＤＮＡの遺伝子ターゲティングに使用する相同性配列の長さが、１００ｂｐ〜３００ｂｐである請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子ターゲティング技術に関する。より詳細には、遺伝子ターゲティングに伴うランダムインテグレーションを排除する細胞の作製方法、及びその方法によって取得された細胞に関する。さらに、該細胞を用いた遺伝子ターゲティングを行う方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡの組換えは、細胞の様々な状況で生じる現象であるが、例えば、外来ＤＮＡが何らかの原因で細胞内に侵入して染色体ＤＮＡに組み込まれる際、あるいは、染色体ＤＮＡに切断などの傷害が発生したときにも誘導されることが知られている。
組換えのメカニズムについては、ＤＮＡ修復に関する精力的な研究によって、これまで多くのことが明らかにされてきた。ＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ；ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ）は、最も有害なＤＮＡ傷害の１つであるが、このＤＳＢの修復において、２つの主要な組換え経路が機能していることが明らかにされている（Ｈａｒｂｅｒ，  ＪＥ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６：２５９  ２０００）。その１つは、ＤＮＡの相同配列間の組換え（相同組換え）（ＨＲ；ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）に依存する経路であり、他方は、ＤＮＡの相同性を利用することなく、ＤＮＡストランド末端の直接的なライゲーションによりＤＳＢを再結合させる（非相同末端結合）（ＮＨＥＪ；ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ）経路である。
相同組換えの過程に働く因子として、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５２、Ｒａｄ５４、ＲＰＡなどが報告されており（Ｄｕｄａｓ及びＣｈｏｖａｎｅｃ，Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ．５６６：１３１−６７  ２００４）、一方、非相同末端結合に関与する因子には、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）であるＫｕ７０−Ｋｕ８０ヘテロダイマー、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ（以下、遺伝子をＬＩＧ３、タンパク質をＬｉｇ３ｐと記載する）、ＤＮＡリガーゼＩＶ（以下、遺伝子をＬＩＧ４、タンパク質をＬｉｇ４ｐと記載する）−Ｘｒｃｃ４ｐ複合体などが知られている（Ｃｒｉｔｃｈｌｏｗら，Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．７：５８８−５９８  １９９７；Ｈｅｆｆｅｒｉｎ及びＴｏｍｋｉｎｓｏｎ，  ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ  ４：６３９−６４８  ２００５；Ｗａｎｇら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６５：４０２０−４０３０  ２００５）。
【０００３】
出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）では、二重鎖切断の修復に、主として相同組換えが用いられており、相同組換えにより誘導される遺伝子ターゲティングの効率も極めて高い。これに対し、出芽酵母以外の真核生物では、二重鎖切断修復を行うにあたり、非相同末端結合が優先的に用いられると考えられている。そのため、出芽酵母以外の生物に対して遺伝子ターゲティングを試みると、たとえ長い相同配列を用いたとしても、外来ＤＮＡがゲノム上にランダムにインテグレートすることになる。
従って、出芽酵母以外の真核生物における遺伝子ターゲティング効率は非常に低いものとなっていた。
【０００４】
このように、多くの生物種において遺伝子ターゲティング効率は依然として低いままではあるが、ヒトにおいて遺伝子ターゲティング効率を上げることは、疾患の遺伝子治療の成功率を上げるためにも、非常に重要な課題の一つとなっている。遺伝子治療の分野において、様々な工夫が施されたベクターが数多く開発されてはいるが、これらのベクターもその多くは生体内に導入されるとゲノム上にランダムにインテグレーションされてしまう。その結果、不幸にもインテグレートされた部位が、プロトオンコジーンなどの第二の疾患誘発遺伝子の近傍である場合には、癌等の疾患が発症する危険も生じ得る（Ｂａｕｍら，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １７：２５３−２６３，２００６）。従って、遺伝子治療の分野において、ランダムインテグレーションを排除した正確な遺伝子ターゲティング技術を開発することは、最重要課題の一つとなっている。
【０００５】
高等真核生物の組換え機構を解明する上で、遺伝学的アプローチが容易に行えることなどから、分裂酵母の他、真菌、例えば、糸状菌（カビ類）などがモデル生物として多く用いられてきた。遺伝学的な情報の蓄積という点からは、出芽酵母も有力なツールになり得るが、上述したように、出芽酵母における組換えは、ほとんど相同組換え経路によって行われていることから、ランダムインテグレーションの抑制などを研究する上ではあまり適した生物とは言えない。
これまでに出芽酵母を用いた遺伝子ターゲティングの研究結果として、出芽酵母のＹＫＵ７０及びＹＫＵ８０の破壊株における相同組換え率の上昇を報告したものがあるが、上述のごとく、出芽酵母における相同組換え率は元来非常に高い効率で行われているなど、他の真核生物の組換え機構とは異なるものであることから、真核生物一般に適用できるような遺伝子ターゲティング効率上昇のための手がかりとはなり得ないものであった（特許文献１）。
【０００６】
また、哺乳動物細胞においても、組換え機構に関する研究は盛んに行われており、非相同末端結合に関与する因子、例えば、ＫＵタンパク質、ＤＮＡリガーゼＩＶ及びＤＮＡリガーゼＩＩＩの作用機序などが明らかにされつつある。ＫＵタンパク質やＤＮＡリガーゼＩＶの活性を阻害又は抑制すると非相同的組換えによって行われるＤＮＡ修復が抑えられ、代わって、相同組換えによる修復が主要経路として機能することが、ここ数年の間に明らかにされている（非特許文献１〜３）。また、ＤＡＮリガーゼＩＩＩについては、ＤＮＡリガーゼＩＶを欠損したマウス由来の線維芽細胞において維持されている非相同末端結合活性が、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ活性を抑制することで顕著に低下することが報告されており、このことから、ＤＮＡリガーゼＩＩＩも非相同末端結合におけるリガーゼとして機能していることが強く示唆されている（非特許文献５）。しかし、これらの知見はあくまでも内在性のＤＮＡ間における組換え機構に関するものであり、外来ＤＮＡと内在性のＤＮＡ間における組換え、つまり、遺伝子ターゲティング機構に関するものではなかった。遺伝子ターゲティングにおける、ＫＵタンパク質の関与について検討した結果も報告されてはいるが、それはネガティブなものであり（例えば、非特許文献１）、未だ、遺伝子ターゲティングを制御する機構について明確で統一的な見解は示されていない。
【０００７】
モデル生物としての糸状菌の中では、ニューロスポラ属、アスペルギルス属などは広く用いられている。これまでに、ニューロスポラ・クラッサのｍｕｓ−５１及びｍｕｓ−５２が、出芽酵母のＹＫＵ７０及びＹＫＵ８０と相同であること、これらの遺伝子の破壊株では遺伝子ターゲティング効率がほぼ１００％になる（野生型では約２０％程度）ことが、本願発明の発明者らによって報告されている（特許文献２、特許文献３、非特許文献４）。本知見は、ｍｕｓ−５１及びｍｕｓ−５２遺伝子破壊株を外来遺伝子の導入細胞として用いれば、ゲノム改変を容易に行うことを意味するものであり、組換え技術の発展に重要な手がかりを与えるものであった。
【０００８】
【非特許文献１】Ｐｉｅｒｃｅら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，  ２００１；１５：３２３７−３２４２
【非特許文献２】Ａｌｌｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，  ２００２；９９：３７５８−３７６３
【非特許文献３】Ａｌｌｅｎら，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．，  ２００３；１：９１３−９２０
【非特許文献４】Ｎｉｎｏｍｉｙａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，  ２００４；１０１：１２２４８−１２２５３
【非特許文献５】Ｗａｎｇら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６５：４０２０−４０３０  ２００５
【特許文献１】ＷＯ０２／５２０２６
【特許文献２】特開２００５−２３７３１６
【特許文献３】ＷＯ２００５／０８３０９０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ニューロスポラ・クラッサのｍｕｓ−５１及びｍｕｓ−５２遺伝子の破壊株では遺伝子ターゲティング効率がほぼ１００％になるとの上記知見は大変意義深いものであるが、ランダムインテグレーションを極力排除し、より正確なターゲティングを実現するとの課題が未だ残されていた。
本発明者は、上記事情に鑑み、真核細胞における遺伝子ターゲティングを確実にするべく鋭意研究を行った結果、非非相同末端結合に特有のＤＮＡリガーゼであると考えられているＤＮＡリガーゼＩＶの機能を喪失もしくは機能低下させた細胞株では、遺伝子ターゲティングに伴うランダムインテグレーションを排除できることを見出した。
よって、本発明は、真核細胞における遺伝子ターゲティングに伴うランダムインテグレーションを排除し、より精度の高いターゲティング方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、上記方法を用いて作出された細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明を完成させる過程において、外来ＤＮＡがランダムにゲノム上にインテグレートされる経路には、ＫＵ遺伝子に依存する経路と依存しない経路の２つが存在することが明らかとなった。そして、これら２つの経路には、非相同末端結合に関与するリガーゼの１つであるＭＵＳ５３（ＬＩＧ４のホモログ）が必要であることから、ＭＵＳ５３をはじめとする非相同末端結合に関与するリガーゼの機能を調節することで、外来ＤＮＡのランダムインテグレーションを効果的に抑制し得る可能性が示唆された。
【００１１】
上記知見に基づき本発明は以下の（１）〜（１６）として開示される。
（１）本発明の第１の態様は、「外来ＤＮＡを細胞内の目的のゲノム領域に導入する場合において、該細胞内に内在しＤＮＡ修復過程に機能するＤＮＡリガーゼをコードする遺伝子、及び／又は該ＤＮＡリガーゼと複合体を形成するタンパク質をコードする遺伝子の機能低下もしくは機能喪失を誘導し、該目的のゲノム領域以外への該外来ＤＮＡのランダムなインテグレーションを排除する細胞の作製方法」である。
（２）本発明の第２の態様は、「前記機能低下もしくは機能喪失が、前記ＤＮＡリガーゼをコードする遺伝子及び／又は該ＤＮＡリガーゼと複合体を形成するタンパク質をコードする遺伝子の配列中に突然変異又は欠失を導入することで達成されることを特徴とする上記（１）に記載の方法」である。
（３）本発明の第３の態様は、「前記機能低下もしくは機能喪失が、前記ＤＮＡリガーゼをコードする遺伝子及び／又は該ＤＮＡリガーゼと複合体を形成するタンパク質をコードする遺伝子の全体を破壊することで達成されることを特徴とする上記（１）に記載の方法」である。
（４）本発明の第４の態様は、「外来ＤＮＡを細胞内の目的のゲノム領域に導入する場合において、該細胞内に内在しＤＮＡ修復過程に機能するＤＮＡリガーゼ、及び／又は該ＤＮＡリガーゼと複合体を形成するタンパク質の活性抑制もしくは活性喪失を誘導し、該目的のゲノム領域以外への該外来ＤＮＡのランダムなインテグレーションを排除する細胞の作製方法」である。
（５）本発明の第５の態様は、「前記ＤＮＡリガーゼがＤＮＡリガーゼＩＶであることを特徴とする上記（１）乃至（４）に記載の方法」である。
（６）本発明の第６の態様は、「前記ＤＮＡリガーゼと複合体を形成するタンパク質がＸｒｃｃ４ｐであることを特徴とする上記（１）乃至（４）に記載の方法」である。
（７）本発明の第７の態様は、「前記ＤＮＡリガーゼがＤＮＡリガーゼＩＩＩであることを特徴とする上記（１）乃至（４）に記載の方法」である。
（８）本発明の第８の態様は、「前記細胞が真核細胞であることを特徴とする上記（１）乃至（７）のいずれかに記載の方法」である。
（９）本発明の第９の態様は、「前記真核細胞が、少なくとも動物細胞、植物細胞、真菌細胞からなる群から選択される細胞であることを特徴とする上記（８）に記載の方法」である。
（１０）本発明の第１０の態様は、「前記真菌がキノコであることを特徴とする上記（９）に記載の方法」である。
（１１）本発明の第１１の態様は、「前記真菌が糸状菌（カビ）であることを特徴とする上記（９）に記載の方法」である。
（１２）本発明の第１２の態様は、「前記糸状菌が、ニューロスポラ属、アスペルギルス属、ペニシリウム属、フザリウム属、トリコデルマ属又はムコール属のいずれかに属するものであることを特徴とする上記（１１）に記載の方法」である。
（１３）本発明の第１３の態様は、「前記ニューロスポラ属に属する糸状菌が、少なくともニューロスポラ・クラッサ、ニューロスポラ・シトフィラ、ニューロスポラ・テトラスペルマ、ニューロスポラ・インターメディア、ニューロスポラ・ディスクレータからなる群から選択されることを特徴とする上記（１２）に記載の方法」である。
（１４）本発明の第１４の態様は、「前記アスペルギルス属に属する糸状菌が、少なくともアスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・パラシティク、アスペルギルス・フラバス、アスペルギルス・ノミウス、アスペルギルス・フミガタス、アスペルギルス・ニジュランス、アスペルギルス・ニガー、 アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・カワチからなる群から選択されることを特徴とする上記（１２）に記載の方法」である。
（１５）本発明の第１５の態様は、「上記（１）乃至（１４）のいずれかに記載の方法で作製された細胞」である。
（１６）本発明の第１６の態様は、「上記（１５）に記載の細胞に外来ＤＮＡを導入し遺伝子ターゲティングを行う方法」である。
（１７）本発明の第１７の態様は、「前記外来ＤＮＡの遺伝子ターゲティングに使用する相同性配列の長さが、１００ｂｐ〜３００ｂｐである上記（１６）に記載の方法」である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、外来ＤＮＡの遺伝子ターゲティングを行うにあたり、ランダムインテグレーションを排除した精度の高い遺伝子導入を行うことができる。
【００１３】
本発明により、特定の遺伝子の付加、置換などを正確かつ容易に行うことができるため、多方面において有用な遺伝子改変技術を提供することができる。
【００１４】
本発明により、産業上有用な微生物の作出、動植物の育種、医療分野における治療又は遺伝子治療剤などの各分野において、新しい技術を開発する上での有効ツールとなり得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の実施態様の１つは、外来ＤＮＡを細胞内の目的のゲノム領域に導入する場合において、該細胞内に内在しＤＮＡ修復過程に機能するＤＮＡリガーゼをコードする遺伝子、及び／又は該ＤＮＡリガーゼと複合体を形成するタンパク質をコードする遺伝子の機能低下もしくは機能喪失を誘導し、該目的のゲノム領域以外への該外来ＤＮＡのランダムなインテグレーションを排除する細胞の作製方法に関するものである。
ここで「ＤＮＡリガーゼ」とは、ＤＮＡ鎖連結反応を触媒する酵素のことで、特に、ＤＮＡ修復機構において機能するものが好ましく、例えば、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＶなどが好ましく、特に、ＤＮＡリガーゼＩＶが好ましい。また、ＤＮＡリガーゼと複合体を形成するタンパク質とは、例えば、ＤＮＡリガーゼＩＶと複合体を形成するＸＲＣＣ４（Ｘ−ｒａｙ  ｒｅｐａｉｒ  ｃｒｏｓｓ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ４）が好ましい。
【００１６】
ここで、「ＬＩＧ４」とは、ＤＮＡリガーゼＩＶをコードする遺伝子のことで、配列番号１、３、５又は７で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドのみならず、配列番号１、３、５又は７で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと高ストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、非相同的末端結合におけるＤＮＡリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するものも含まれる。
また、「ＸＲＣＣ４」とは、ＸＲＣＣ４をコードする遺伝子のことで、配列番号９又は１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドのみならず、配列番号９又は１１で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと高ストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌｉｇ４ｐと複合体を形成して非相同的末端結合におけるＤＮＡリガーゼ活性に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するものも含まれる。
さらに、「ＬＩＧ３」とは、ＤＮＡリガーゼＩＶをコードする遺伝子のことで、配列番号１３又は１５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドのみならず、配列番号１３又は１５で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと高ストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、非相同的末端結合におけるＤＮＡリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するものも含まれる。
なお、本明細書に記載される「遺伝子」には、コード領域の他、該遺伝子のエクソン、イントロンのみならず、プロモーター、エンハンサーなどの転写調節領域を含んでもよい。
【００１７】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと高ストリンジェント条件下でハイブリダイズできるポリヌクレオチドの塩基配列としては、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５で表わされる塩基配列と好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％の核酸配列相同性を有する塩基配列を含有するポリヌクレオチド等が挙げられる。
ここで、ストリンジェントな条件とは、当業者によって容易に決定されるハイブリダイゼーション条件のことで、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算値によって導き出される条件である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補鎖がその融点に近いから又はそれより低い環境に存在する場合における、変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。具体的には、例えば、低ストリンジェントな条件として、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄段階において、３７℃〜４２℃の温度条件下、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中で洗浄することなどが上げられる。また、高ストリンジェントな条件として、例えば、洗浄段階において、６５℃、５×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で洗浄することなどが挙げられる。ストリンジェントな条件をより高くすることにより、相同性の高いポリヌクレオチドを得ることができる。
【００１８】
ＤＮＡリガーゼをコードする遺伝子、該ＤＮＡリガーゼと複合体を形成するタンパク質をコードする遺伝子に機能低下又は機能喪失を導入するために、対象とする細胞に由来するＤＮＡリガーゼをコードする遺伝子、該ＤＮＡリガーゼと複合体を形成するタンパク質をコードする遺伝子を同定する必要がある。
目的の遺伝子配列が公知でない場合は、公知の他の種、例えば、ヒトなどの遺伝子配列（配列番号１、９、１３）を基にして、対象細胞のｃＤＮＡライブラリーなどに対してスクリーニングを行う。スクリーニングの方法としては、核酸ハイブリダイゼーション及びクローニングに関する技術分野において周知の方法を用いて、低い、中程度又は高いストリンジェントな条件下におけるハイブリダイゼーションにより得ることができる。
さらに、対象とする細胞由来のＯＲＦのデータベースが存在する場合には、該データベースに対してＢＬＡＳＴサーチ等を行い既知の遺伝子に対するホモログを同定することも可能である。この場合、検索された配列に基づいて該当する遺伝子全体を増幅するために適当なＰＣＲ用のプライマーを作製し、得られたＰＣＲ産物を適当なクローニング用のベクターに挿入することによって、目的の遺伝子をクローン化することも可能である。
同定された遺伝子は適当なクローニング用ベクター（例えば、ｐＵＣ１９など）にサブクローニングして配列確認を行う。
【００１９】
細胞に内在するＤＮＡリガーゼをコードする遺伝子、該ＤＮＡリガーゼと複合体を形成するタンパク質をコードする遺伝子の機能低下又は機能喪失させるために、該遺伝子機能を改変することができる。遺伝子の機能を改変する方法としては、限定はしないが、例えば、内在する目的遺伝子に突然変異を導入する方法、目的遺伝子全体を破壊する方法、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用する方法、目的遺伝子に対するアンチセンスを細胞内に導入する方法等、当業者にとって周知の方法が使用可能である。好ましくは、目的遺伝子に突然変異を導入する方法、目的遺伝子全体を破壊する方法又はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用する方法であり、より好ましくは、目的遺伝子全体を破壊する方法又はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用する方法であり、最も好ましくは、目的遺伝子全体を破壊する方法である。
【００２０】
遺伝子全体を破壊する方法にはクローン化した標的遺伝子（破壊の対象である遺伝子）の必須領域ＤＮＡ配列（破壊すべき領域）にマーカー遺伝子を挿入したＤＮＡを細胞に形質転換する方法がある。細胞内に導入された該ＤＮＡは、標的遺伝子の両隣接配列を介した相同組換えを誘発するため、染色体上の標的遺伝子をマーカー遺伝子で置換することができ、その結果、標的遺伝子を破壊することができる。
また、遺伝子機能を喪失させるために、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用することができる。この場合、目的遺伝子によってコードされるタンパク質の機能ドメインに関する塩基配列をもとに、短いＲＮＡ二本鎖もしくは該ＲＮＡを産生するベクターを細胞内に導入することで、目的遺伝子の機能低下または機能喪失をもたらすことができる。
さらに、インビトロおいて突然変異を導入する方法としては、部位特異的突然変異導入法、及びＰＣＲ突然変異導入法などの当該技術分野において既知の方法を用いて行うことができる。部位特異的突然変異導入法（Ｃａｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，１９８６；２３７：１−７；Ｚｏｌｌｅｒ及びＳｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８７；１５４：３２９−３５０）、カセット突然変異導入法、限定的選択突然変異導入法（Ｗｅｌｌｓ及びＰｏｗｅｒｓ．，１９８５；３４：３１５−２３）または他の既知の技術は、目的の遺伝子に変異を導入するために調製され、クローン化されたＤＮＡ上で実施することができる（Ａｕｓｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ．，１９８７；Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．２ｎｄｅｄ．，１９８９；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ，ＮＹ）。
目的遺伝子に突然変異を導入することで機能改変を行う場合、該遺伝子がコードするタンパク質の活性を欠失させるように変異を導入すること、該タンパク質と他のタンパク質が相互作用を行うのに必要な部位に変異を導入し該相互作用を消失させるような変異を導入することなどが望ましい。
上記突然変異を条件突然変異、例えば、温度感受性突然変異となるように導入すれば、所望の条件下でのみ遺伝子ターゲティングに伴うランダムインテグレーションを排除することができる。
【００２１】
本発明の他の実施態様は、外来ＤＮＡを細胞内の目的のゲノム領域に導入する場合において、該細胞内に内在しＤＮＡ修復過程に機能するＤＮＡリガーゼ、及び／又は該ＤＮＡリガーゼと複合体を形成するタンパク質の活性抑制もしくは活性喪失を誘導し、該目的のゲノム領域以外への該外来ＤＮＡのランダムなインテグレーションを排除する細胞の作製方法である。
本発明における「Ｌｉｇ４ｐ」とは、「ＬＩＧ４」によってコードされるタンパク質のことで、配列番号２、４、６、又は８で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質である。ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質」とは、配列番号２、４、６、又は８で表わされるアミノ酸配列と約２０％以上、好ましくは約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、非相同的末端結合におけるＤＮＡリガーゼ活性を有するタンパク質のことである。
あるいは、配列番号２、４、６、又は８表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質とは、配列番号２、４、６、又は８で表わされるアミノ酸配列中の１又は数個（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、非相同的末端結合におけるＤＮＡリガーゼ活性を有するタンパク質のことである。
【００２２】
本発明における「Ｘｒｃｃ４ｐ」とは、「ＸＲＣＣ４」によってコードされるタンパク質のことで、配列番号１０又は１２で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質である。ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質」とは、配列番号９又は１１で表わされるアミノ酸配列と約２０％以上、好ましくは約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌｉｇ４ｐと複合体を形成して非相同末端結合におけるＤＮＡリガーゼ活性に関与するタンパク質のことである。
あるいは、配列番号１０又は１２表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質とは、配列番号１０又は１２で表わされるアミノ酸配列中の１又は数個（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌｉｇ４ｐと複合体を形成して非相同末端結合におけるＤＮＡリガーゼ活性に関与するタンパク質のことである。
【００２３】
さらに、本発明における「Ｌｉｇ３ｐ」とは、「ＬＩＧ３」によってコードされるタンパク質のことで、配列番号１４又は１６で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質である。ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質」とは、配列番号１４又は１６で表わされるアミノ酸配列と約２０％以上、好ましくは約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、非相同的末端結合におけるＤＮＡリガーゼ活性を有するタンパク質のことである。
あるいは、配列番号１４又は１６表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質とは、配列番号１４又は１６で表わされるアミノ酸配列中の１又は数個（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、非相同的末端結合におけるＤＮＡリガーゼ活性を有するタンパク質のことである。
【００２４】
細胞に内在するＤＮＡリガーゼ、該ＤＮＡリガーゼと複合体を形成するタンパク質の活性抑制又は活性喪失させるためには、上述の「ＤＮＡリガーゼをコードする遺伝子、該ＤＮＡリガーゼと複合体を形成するタンパク質をコードする遺伝子の機能低下又は機能喪失」させるために使用可能な方法の他に、当業者において周知の方法であって、ＤＮＡリガーゼ、該ＤＮＡリガーゼと複合体を形成するタンパク質の活性を低下又は喪失させる方法であれば如何なる方法も使用することができる。限定はしないが、例えば、目的タンパク質の活性を低下又は喪失させる抗体を目的の細胞内へ導入する方法、目的タンパク質の不活性型（ドミナントネガティブ）を目的の細胞内へ導入するか又は目的の細胞内で発現させる方法、目的タンパク質の活性を阻害する低分子のインヒビターを目的の細胞内へ導入する方法などを挙げることができる。
抗体や目的タンパク質の不活性型を細胞内へ導入するためには、例えば、細胞膜透過性ペプチドを抗体、目的タンパク質の不活性型に連結して細胞内へ導入してもよく、又は市販のキットを使用することもできる。
目的タンパク質の不活性型を細胞内で発現させるためには、当業者の通常の技術常識に従って容易に行うことができる。目的の細胞に応じて、発現ベクター（目的の細胞に応じたプロモーターなど、発現誘導に必要な構成要素を備えているもの）を選択して、適切な培養条件下にて目的タンパク質の不活性型を発現させることができる。
【００２５】
さらに、ＤＮＡリガーゼ又は該ＤＮＡリガーゼ複合体を形成するタンパク質の活性抑制又は活性喪失を誘導するために、各々の複合体中の相手方（例えば、Ｌｉｇ４ｐの活性を抑制又は喪失させる場合にはＸｒｃｃ４ｐが相当する）の機能を抑制又は喪失することによっても達成することができる。
上記抗体や目的タンパク質の不活性型の細胞内への導入又は発現は、特定の時点で導入又は発現させることにより、遺伝子ターゲティングに伴うランダムインテグレーションの発生を特定の時点で排除することができる。
【００２６】
本発明で用いられる細胞は、一般に、真核細胞であれば組織由来の細胞であっても、株化培養細胞であってもよく、限定はしないが、相同組換え率の低い、動物細胞、植物細胞、真菌細胞などが適している。
動物細胞としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ヒツジ、ネコ、イヌなどの哺乳類細胞の他、鳥類、は虫類、両生類などの細胞であっても使用可能である。
また、植物細胞としては、例えば、イネ、ダイズ、コムギ、オオムギ、ライムギ、綿花、トウモロコシ、イモ、ピーナッツ、アラビドプシスが適している。
さらに、遺伝子操作が比較的容易な真菌類なども使用可能であり、キノコ、糸状菌（カビ）が使用可能である。使用可能なキノコとしては、例えば、しめじ、椎茸、エノキタケ、ヒトヨタケ、木材不朽菌などを挙げることができる。また、使用可能な糸状菌（カビ）としては、ニューロスポラ属、アスペルギルス属、ペニシリウム属、フザリウム属、トリコデルマ属またはムコール属などを挙げることができる。中でも好適な糸状菌としては、ニューロスポラ属に含まれるニューロスポラ・クラッサ、ニューロスポラ・シトフィラ、ニューロスポラ・テトラスペルマ、ニューロスポラ・インターメディア、ニューロスポラ・ディスクレータなど、また、アスペルギルス属に含まれるアスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・パラシティク、アスペルギルス・フラバス、アスアスペルギルス・ノミウス、アスペルギルス・フミガタス、アスペルギルス・ニジュランス、ペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・カワチなどが好適に使用可能である。
【００２７】
本発明により、遺伝子ターゲティングに伴う外来ＤＮＡのランダムなインテグレーションを排除することができる。
本発明の方法を用いて実現されるランダムインテグレーションの排除は、野生型の細胞におけるランダムインテグレーションの頻度と比較して、例えば、３０％以下、より好ましくは２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下であり、最も好ましくは、０％である。
【００２８】
さらに本発明の実施態様のには、本発明の方法により作製された細胞に外来ＤＮＡを導入し遺伝子ターゲティングを行う方法が含まれる。ゲノム上の目的の遺伝子領域に外来のＤＮＡを導入する場合、外来ＤＮＡの５’末端及び３’末端に各々隣接して、目的遺伝子領域のＤＮＡの一部の配列からなる「相同配列」を配置させる必要がある。この相同配列の長さは当業者の通常の知識に基づいて決定することができるが、好ましくは、１０００ｂｐ以下、より好ましくは２０ｂｐ〜１０００ｂｐ、さらに好ましくは１００ｂｐ〜３００ｂｐ、最も好ましくは、１００ｂｐ〜２００ｂｐである。
外来ＤＮＡの細胞内への導入方法は、当該技術分野において周知の方法であれば使用可能であるが、例えば、スフェロプラスト法、電気ショック法（エレクトロポレーション法）、リン酸カルシウム法、カチオン性脂質による方法などが利用可能であるが、電気ショック法（エレクトロポレーション法）がもっとも好ましい。
【００２９】
以下に実施例を示すが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
ニューロスポラ
１．実験材料
表１に、本実施例で用いたニューロスポラ株を示す。７４−ＯＲ３１−１６Ａ（Ｄｅ  Ｓｅｒｒｅｓら，Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｓｅａｒｃｈ  ７１：５３−６５  １９８０）およびＣ１−Ｔ１０−２８ａ（研究室のストック）を野生株として用いた。大腸菌ＤＨ−１およびＸＬ−１Ｂｌｕｅはプラスミドの増幅に用いた（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．２ｎｄｅｄ．，１９８９；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ，ＮＹ）。プラスミドｐＵＣ１９及びｐＣＢ１００３は新しいベクターの構築に用いた。
【００３１】
【表１】
2007300857.tif 000002
【００３２】
２．方法
２−１．ニューロスポラにおける遺伝子研究法
遺伝子解析はＤａｖｉｓおよびｄｅ  Ｓｅｒｒｅｓ（Ｄａｖｉｓおよびｄｅ  Ｓｅｒｒｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７：７９−１４３  １９７０）の記載に従って行った。
２−２．ＰＣＲ法
ＰＣＲ増幅はＥｘｐａｎｄＴＭ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて指示書に従って行った。
２−３．Ｈｙｇｒ遺伝子によるニューロスポラ・クラッサのＬＩＧ４ホモログ遺伝子（以下、ｎｃＬＩＧ４と記述する）の置換を行うためのプラスミドの構築。
ハイグロマイシン耐性遺伝子ＨｙｇｒによるｎｃＬＩＧ４の置換方法を図１に示す。ニューロスポラＬＩＧ４を７４−ＯＲ３１−１６Ａのゲノムをテンプレートに用いてＰＣＲ−１により増幅した。
（ＰＣＲの条件：９４℃２分後、９４℃１５秒、５８℃３０秒、６８℃４分のサイクルを１０回、さらに９４℃２分の後、９４℃１５秒、５８℃３０秒、６８℃４分（１サイクルごとに６８℃の時間を５秒ずつ増やしていく）を２０サイクル、さらに６８℃７分、その後４℃で保存）。
ＰＣＲ−１のプライマー
（ｐ−１）５’ＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴＴＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧ３’（配列番号１７）  
（ｐ−２）５’ＡＣＡＧＴＣＧＣＣＴＴＧＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＴ３’（配列番号１８）
このＰＣＲ産物のｎｃＬＩＧ４遺伝子外の両側をＨｉｎｄＩＩＩで切断したｎｃＬＩＧ４を含む直鎖上ＤＮＡ断片を、同じくＨｉｎｄＩＩＩで処理したｐＵＣ１９にライゲーションした（図１、ｐＵＣ１９−ＬＩＧ４）。その後、このプラスミドをＥｃｏＲＶで処理し、ｎｃＬＩＧ４内の１．２  ｋｂｐを切り出して、その領域にｐＣＢ１００３由来のＨｙｇｒ（ＨｐａＩ処理）をライゲーションした（図１、ｐＵＣ１９−ＬＩＧ４：：Ｈｙｇｒ）。最後にこのプラスミドを再びＨｉｎｄＩＩＩで処理することにより、形質転換用ＤＮＡ断片を得た。
【００３３】
２−４．電気ショック法（エレクトロポレーション法）
分生子懸濁液は１Ｍソルビトール中２．０×１０９濃度で調製した。形質転換用ＤＮＡ断片  ５μｌを分生子懸濁液１００μｌと混合し、氷上にて５分間インキュベートした。混合液をエレクトロポレーター（ＢＴＸ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｍｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ６００  Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ  Ｉｎｃ．）により電気ショックをかけた。
（電気ショックの条件：チャージ電圧１．５Ｖ、最高電圧／計時モード２．５ｋＶ／抵抗、計時キャパシタンス５０μＦ、計時抵抗Ｒ６（１８６オーム））。
【００３４】
２−５．ｎｃＬＩＧ４の置換
電気ショック後、１．２％スクロースを含有するＶｏｇｅｌｓ’最小培地１ｍｌを加え、３０℃で２時間インキュベートした。この２００μｌをハイグロマイシン（５００μｇ／ｍｌ）を含む寒天培地に塗り広げた。ハイグロマイシン耐性のコロニーを単離し、標的遺伝子座において置換が生じているかどうかをＰＣＲ−２で検討した。また、その株がホモカリオンであるかどうかについてもＰＣＲ−３で確認した。ホモカリオンになった株について、余分なＨｙｇｒ遺伝子コピーが含まれていないかどうかをサザンブロット法により確認した。
ＰＣＲ−２のプライマー
（ｐ−１）５’ＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴＴＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧ３’（配列番号１７）
（ｐ−３）５’ＣＡＴＴＧＡＣＴＧＧＡＧＣＧＡＧＧＣＧＡＴＧＴＴ３’（配列番号１９）
ＰＣＲ−３のプライマー
（ｐ−１）５’ＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴＴＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧ３’（配列番号１７）
（ｐ−４）５’ＴＧＴＧＴＧＡＴＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＴＴＧＡＣＣ３’（配列番号２０）
【００３５】
２−６．変異原感受性
ブレオマイシン（ＢＬＭ）及びメチルメタンスルホン酸塩（ＭＭＳ）に対する感受性について既刊の文献の記載に従って行った（Ｉｎｏｕｅ及びＩｓｈｉｉ，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，１９８４；１２５：１８５−１９４）。
【００３６】
３．結果
３−１．ｎｃＬＩＧ４の置換実験
ヒトＬＩＧ４に対するニューロスポラ・クラッサのホモログを見つけるために、ニューロスポラゲノムデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ／ｆｕｎｇｉ／ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ＿ｃｒａｓｓａ＿７／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）に対してサーチを行った。検索された候補遺伝子を仮にｎｃＬＩＧ４と名付けた。ｎｃＬＩＧ４遺伝子は１０４６アミノ酸をコードする。図２には、ヒトＬＩＧ４とｎｃＬＩＧ４のアミノ酸配列の比較を示す。ヒトＬｉｇ４ｐとｎｃＬｉｇ４ｐは２５％の相同性、３８％の類似性を有していた（出芽酵母Ｌｉｇ４ｐ（ｓｃＬＩＧ４）とｎｃＬｉｇ４ｐは２６％の相同性、４１％の相同性）。ｎｃＬＩＧ４の増幅を７４−ＯＲ３１−１６ＡのゲノムをテンプレートとしてＰＣＲで増幅した。その後の形質転換用ＤＮＡの作成は、上記２．方法で示した通りに行った。この形質転換用ＤＮＡを野生型ニューロスポラ・クラッサに導入し、ハイグロマイシン耐性コロニーを単離した。約２０の形質転換体からゲノムを抽出し、ｎｃＬＩＧ４がＨｙｇｒによって置換されているかどうかをＰＣＲによって確認した。このときのＰＣＲプライマーは、図１に示されるように、一方をｎｃＬＩＧ４の外側に、他方をＨｙｇｒの内側に設定した。ハイグロマイシン耐性コロニーの約１０％がｎｃＬＩＧ４の位置にＨｙｇｒを有していた。この内の１つの形質転換体を野生株と掛け戻し交雑を行い、ｎｃＬＩＧ４：：Ｈｙｇｒを保持する株を両交配型について獲得し、ｎｃＬＩＧ４変異株として用いた（ＫＺＭ６２２２ＡおよびＫＡＭ６２２４ａ）。これらの株は、栄養生長およびホモ接合交雑増殖は正常であるが、僅かにＢＬＭとＭＭＳに対して感受性があった（図３）。
【００３７】
３−２．野生株、ｎｃＬＩＧ４、ｎｃＫＵ８０変異株におけるｍｔｒ遺伝子のターゲッティング
染色体ＩＶ上のｍｔｒ遺伝子を置換実験の標的に選んだ。ｍｔｒ遺伝子に欠損を持つ変異体は、アミノ酸アナログであるｐ−フルオロフェニルアラニン（ＰＦＰ）に耐性を示す。ターゲッティングベクターは、ｍｔｒＯＲＦをビアラフォス耐性遺伝子ｂａｒに置換することによって構築した。ｂａｒ遺伝子の両側に５０ｂｐ、１００ｂｐ、３００ｂｐ、５００ｂｐ、１ｋｂｐ、２ｋｂｐのｍｔｒ遺伝子との相同配列を持たせた直鎖状ＤＮＡ断片をターゲッティングに用いた。これらのＤＮＡ断片を異なる遺伝的バックグラウンドを持つ株にエレクトロポレーション法により導入した。ビアラフォス（２００μｇ／ｍｌ）に耐性を持つ形質転換体を単離し、それらがＰＦＰ（２０μｇ／ｍｌ）に耐性であるかどうか検討した。形質転換が相同組換えによるものであれば、その形質転換体はビアラフォスとＰＦＰに対して耐性となるはずである。よって、ビアラフォス耐性形質転換体数に対するＰＦＰ耐性形質転換体数の割合を遺伝子ターゲッティング効率（％）として測定することができる。相同配列長が２ｋｂｐのとき、遺伝子ターゲッティング効率は野生株では約２３％であるのに対して、ｎｃＬＩＧ４変異株とｎｃＫＵ８０変異株では１００％であった。また、相同配列長が１００ｂｐ〜１ｋｂｐにおいて、遺伝子ターゲッティング効率はｎｃＬＩＧ４変異株では全て１００％であったのに対して、ｎｃＫＵ８０変異株では相同配列長が短くなるにつれて減少し、相同配列長が１００ｂｐのときには、数％程度であった（図４）。
この結果から、野生株に比較してＫＵ８０変異株では、遺伝子ターゲティング効率が高く、ランダムインテグレーションがかなり抑制されているが、相同配列が短くなるに従って、ランダムインテグレーションの割合が増大していることが分かる。これに対して、ｎｃＬＩＧ４を欠損させた変異株では、短い相同配列を用いた場合においても遺伝子ターゲティング効率が常に１００％であり、ランダムインテグレーションが有効に排除されていることが明らかとなった。
【実施例２】
【００３８】
アスペルギルス
Ｉ．麹菌のＬＩＧ４ホモログ遺伝子破壊株の作製
１．実験材料
１−１．試薬
試薬は特に断りのない限り、和光純薬 (株) の特級試薬を用いた。各種制限酵素、修飾酵素類は、宝酒造、ロシュ、ＴＯＹＯＢＯ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ のものを適宜用い、添付されたプロトコルに従い反応させた。
１−２．菌株
ＬＩＧ４ホモログ遺伝子の単離用の麹菌株としてはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ（アスペルギルス・オリゼ）  ＲＩＢ４０、破壊用の麹菌宿主にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＮＳ４（ｎｉａＤ，ｓＣ）を用いた。組換えプラスミドの取得には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ｓｕｐＥ４４，ΔｌａｃＵ１６９，ｈｓｄＲ１７，ｒｅｃＡ１，ｇｉｒＡ９６，ｔｈｉ−１，ｒｅｌＡ１）を用いた。破壊用プラスミド作製には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＹ４７４１（ＭＡＴａ，ｈｉｓ３Δ，ｌｅｕ２Δ，ｍｅｔ１５Δ，ｕｒａ３Δ）を用いた。
【００３９】
１−３．培地
（ｉ）ＬＢ培地（ｐＨ７．０）；１％Ｂａｃｔｏ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％Ｂａｃｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％ＮａＣｌ
（ｉｉ）ＬＢ＋Ａｍｐ培地（ｐＨ７．０）；ＬＢ培地にアンピシリンを終濃度５０ｍｇ／ｌとなるように加えた。さらに、プレートの場合は、１．５％の寒天を加えた。
（ｉｉｉ）ＹＰＤ培地；０．５％Ｂａｃｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、  １％Ｂａｃｔｏ  ｐｅｐｔｏｎｅ、  １％Ｇｌｕｃｏｓｅ
（ｉｖ）最小（Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ；ＣＤ）培地；７０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、７ｍＭ  ＫＣｌ、１１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１％Ｇｌｕｃｏｓｅ、０．８％ＮａＣｌ、０．２ｍＭ  Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ
さらに、プレートの場合は  １．５％の寒天を加えた。形質転換の際は、Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅを添加しないものを用いた。
（ｖ）ＣＤＰ培地；最小培地に、１％Ｂａｃｔｏ  ｐｅｐｔｏｎｅを加えた。
（ｖｉ）１０００×ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ；３．６ｍＭ  ＦｅＳＯ４、３０．７ｍＭ  ＺｅＳＯ４、１．６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．７ｍＭ  ＭｎＳＯ４、０．３ｍＭ  Ｎａ２Ｂ４Ｏ７、０．０４ｍＭ（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ
（ｖｉｉ）酵母用最小培地（ＳＤ）培地；２％Ｇｌｕｃｏｓｅ、０．６７％ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ
（ｖｉｉｉ）ＳＤ＋ｈｉｓ，ｌｅｕ，ｍｅｔ培地；ＳＤ培地に、Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、Ｌｅｕｃｉｎｅ、Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅを加えた。
【００４０】
２．方法
２−１．大腸菌の形質転換
大腸菌のコンピテントセル作製および形質転換操作は、Ｈａｎａｈａｎの方法に従って行った。すなわち、−８０℃で保存していた大腸菌のコンピテント細胞を融解し、エッペンドルフチューブ（１．５ｍｌ）に１００μｌ移し、プラスミドを加えた。氷中に３０分放置し、４２℃でのヒートショックを３０秒間行った。氷水中で２分間冷却し、ＬＢ培地を０．９ｍｌ加えて、３７℃で１時間振盪培養した後、ＬＢ＋Ａｍｐ培地プレートにまき、３７℃で一晩培養した。
２−２．アルカリ法によるプラスミドＤＮＡの調製（大量調製）
大腸菌のコロニーを滅菌した爪楊枝で１コロニーずつ拾い上げ、５０ｍｌのファルコンチューブでＬＢ＋Ａｍｐ培地２０ｍｌに植菌し、３７℃で一晩振盪培養した。３５００ｒｐｍで１０分間遠心し、沈殿にＧＴＥ溶液（５０ｍＭ  グルコース、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０）２００μｌを加えてボルテックスミキサーで撹拌し、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。これに、ＮａＯＨ−ＳＤＳ溶液（０．２Ｎ  ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）４００μｌを加え混合し、氷中で５分間放置後、酢酸カリウム溶液（５Ｍ  酢酸カリウム  ６０ｍｌ、氷酢酸  １１．５ｍｌ、Ｈ２Ｏ  ２８．５ｍｌ）３００μｌを加えて混合し、更に５分間以上氷中に放置した。これを  １５０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清等量のイソプロパノールを加えて１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、粗ＤＮＡの沈殿を得た。これを４００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ８．０）に溶解し、４μｌのＲＮａｓｅ  Ａ（１ｍｇ／ｍｌ）を加え、３７℃で３０分間インキュベートし、反応させた。その後、フェノール・クロロホルム（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールを体積比  ２５：２４：１で混合）抽出を行い、クロロホルム・イソアミルアルコール（クロロホルム：イソアミルアルコール  体積比  ２４：１）処理後、エタノール沈殿でプラスミドを得、４０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。得られたプラスミドＤＮＡは、適切な制限酵素で処理後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的のプラスミドであることを確認した。
【００４１】
２−３．目的ＤＮＡ断片の回収
目的とするＤＮＡ断片は、制限酵素処理後アガロースゲル電気泳動により分離し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１）に添付されたプロトコルに従って精製した。
２−４．麹菌のゲノムＤＮＡの調製
麹菌株を１００ｍｌのＹＰＤ、又はＣＤＰ培地で３０℃、約３０時間振盪培養し、ガラスフィルターを用いて集菌後、蒸留水で洗浄した。ペーパータオルでよく脱水した菌体を液体窒素下において乳鉢で粉砕した。粉砕した菌体を０．４ｍｌのＴＥ緩衝液に懸濁し、０．４ｍｌの溶菌溶液（５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）を加えた。これに等量のフェノール・クロロホルムを加え、遠心分離後水層を分離した。２．５倍量のエタノールを加え、遠心分離後沈殿を５００μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。そこに、５０μｇのＲＮａｓｅＡを加え、３７℃で３０分保持し、２回のフェノール・クロロホルム抽出の後、クロロホルム・イソアミルアルコール処理し、２．５倍量のエタノールを加え遠心分離によりゲノムＤＮＡの沈殿を得た。
【００４２】
２−５．ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅
オリゴヌクレオチドプライマーの合成は、日本遺伝子研究所（株）、オペロン  バイオテクノロジー（株）、シグマ  アルドリッチ  ジャパン（株）に委託した。
ＤＮＡポリメラーゼには、Ｅｘ−Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）を用いて、添付されたプロトコルに従って行った。すなわち、５ＵのＥｘ−Ｔａｑポリメラーゼ、１／１０ｖｏｌ．のＥｘ−Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ、２００ｍＭのｄＮＴＰｓｍｉｘ、１ｍＭのセンス及びアンチセンスプライマー、鋳型となるゲノムＤＮＡを混合し、サーマルサイクラーＴＰ２４０（ＴａＫａＲａ）で、９５℃  ３０秒、（Ｔｍ−５〜１０）℃  ３０秒、７２℃  ６０秒／１ｋｂを３０サイクル繰り返した。
２−６．酵母の形質転換操作
５  ｍｌのＹＰＤ培地で酵母を３０℃で一晩振盪培養した前培養液を新しいＹＰＤ培地１０ｍｌにＯ．Ｄ６００が０．４になるように加え、３０℃で４時間振盪培養した。２５００ｒｐｍ，２分間遠心分離し、上清を除き、菌体を沈殿として得、１  ｍｌの滅菌水に懸濁しエッペンドルフチューブに移した。５０００ｒｐｍ，１分間遠心分離し、上清を除いた。そこにＰＥＧ（５０％  ｗ／ｖ）２４０μｌ、１Ｍ  酢酸リチウム溶液３６μｌ、一本鎖ＤＮＡ（２．０  ｍｇ／ｍｌ）２５μｌ、ＤＮＡ溶液５０μｌを加えてボルテックスミキサーで懸濁した。それを３０℃に３０分間静置した後、４２℃で２０分間ヒートショックを与えた。５０００ｒｐｍ，１分間遠心分離し、上清を除き、菌体を回収した。回収した菌体を１００μｌの滅菌水に懸濁させ、選択培地上にまき、３０℃で２−３日培養した。
【００４３】
２−７．酵母からのＤＮＡの回収
５ｍｌの選択培地で酵母を３０℃で一晩振盪培養し、２０００ｒｐｍ，５分間遠心分離により集菌し上清を除いた。１０ｍｌの滅菌水で洗浄し、２０００ｒｐｍ，５分間遠心分離して上清を除き、菌体を回収した。回収した菌体を３００μｌの破砕用バッファー（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ｐＨ８．０）に懸濁し、エッペンドルフチューブに移した。そこに適量のガラスビーズを加えた。３００μｌのフェノール・クロロホルムを加え、ボルテックスミキサーで２分３０秒激しく撹拌した後、１５０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し水層を回収した。回収した水層に再び３００μｌ  のフェノール・クロロホルムを加え、ボルテックスミキサーで激しく撹拌した後、１５０００  ｒｐｍ、１０分間遠心分離し水層を回収した。回収した水層に３０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム溶液と２．５倍量のエタノールを加え、１５０００ｒｐｍ，２０分間遠心分離し、ＤＮＡを沈殿として得た。
【００４４】
２−８．麹菌の形質転換操作
ＹＰＤ培地又はＣＤＰ培地５０ｍｌに、白金耳を用いて適量のＡ．ｏｒｙｚａｅ  ＮＳ４株の分生子を植菌し、３０℃で約３０時間振盪培養し、菌体を滅菌したガラスフィルター（３Ｇ１）でろ過して集め、滅菌水で数回洗浄した後、滅菌したスパーテルでよく脱水した。菌体をプロトプラスト化液（１０ｍｇ／ｍｌ  Ｙａｔａｌａｓｅ、５ｍｇ／ｍｌ  Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  Ｏｎｏｚｕｋａ  Ｒ−１０、０．８Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ  ６．０）に懸濁して、１２０ｒｐｍ，３０℃で３時間振盪し、プロトプラストを作製した。Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）でろ過し、ろ液を２０００ｒｐｍ，５分遠心してプロトプラストを沈殿として回収した。回収したプロトプラストを０．８Ｍ  ＮａＣｌで２回洗浄し、２０００ｒｐｍ，５分遠心して沈殿させ回収した。プロトプラスト数を検鏡にて計測し、２×１０８個／ｍｌとなるように  Ｓｏｌ．Ｉ（０．６  Ｍ  ＫＣｌ、１０  ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）に懸濁した後、Ｓｏｌ．Ｉ  の０．２倍量の  Ｓｏｌ．ＩＩ（４０％  ｗ／ｖ  ＰＥＧ  ４０００、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）を加えよく混合した。
これを、０．２ｍｌに分注し、適当な制限酵素により直鎖状にした１０μｌ（１ｍｇ／ｍｌ）のプラスミドＤＮＡを加え、よく混合し、氷中に３０分間放置した。これに１ｍｌのＳｏｌ．ＩＩを加え、室温で１５−２０分間放置した後１０ｍｌのＳｏｌ．Ｉを加えて２０００ｒｐｍ，５分間遠心した。上清を除き、沈殿したプロトプラストを２００μｌのＳｏｌ．Ｉに懸濁して、０．８Ｍ  ＮａＣｌを加えた最小培地上にのせ、その上に４５℃に温めた同組成の軟寒天培地（０．６％  寒天）を重層した。
３０℃にて３−１０日静置培養し、旺盛な生育を示すコロニーを選び、分生子を白金耳で同組成の培地に植え継いだ。
【００４５】
２−９．コロニー  ＰＣＲによる形質転換体の確認
滅菌済み爪楊枝にて４００μｌのＹＰＤ培地が入ったエッペンドルフチューブに分生子を植菌した。３０℃で４０−５０時間培養し、培養液を除いたチューブに菌体と等量のガラスビーズをいれ、−８０℃で３時間以上静置し菌体を凍結させた。凍結した菌体の入ったチューブを室温で５分間ボルテックスミキサーにて撹拌し、５分間−８０℃に放置した。これを２回繰り返し、菌体を破砕した。そのチューブに４００μｌの溶菌溶液を加え、１５分間放置した。その後、４００μｌのフェノール・クロロホルムを加え穏やかに撹拌し、１５０００ｒｐｍ，５分間遠心分離し、水層を回収した。この水層に４０μｌの３Ｍ  酢酸ナトリウム溶液を加え、２．５倍量のエタノールを加えて、−２０℃で２０分間静置し、１５０００ｒｐｍ，２０分遠心分離しゲノムＤＮＡを沈殿として回収した。回収したＤＮＡは乾燥後５０μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、０．５μｇのＲＮａｓｅ  Ａを加えて３７℃で３０分間以上放置した。このＤＮＡ溶液１μｌをテンプレートとしてＰＣＲ反応に用いた。
【００４６】
２−１０．サザンブロット解析
ゲノムＤＮＡを、各５μｇ、適当な制限酵素で切断し、アガロースゲルで電気泳動して分画した後、ナイロンメンブラン（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋；Ａｍｅｒｓｈａｍ）へ０．４Ｎ  ＮａＯＨによりアルカリトランスファーし、２×ＳＳＣ  （０．０３Ｍ  クエン酸ナトリウム、０．３Ｍ  ＮａＣｌ）で洗浄した。そして、ＥＣＬ  検出キット（ＥＣＬ  ＤｉｌｅｃｔＴＭ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）によりペルオキシダーゼ標識したＤＮＡ断片をプローブとして検出を行った。プローブの標識は、回収した０．２μｇのＤＮＡを含む、２０μｌの溶液を１０分間煮沸して熱変性させ、それに等量のＤＮＡ標識試薬を加え混合し、更に等量のグルタルアルデヒド溶液を加え、３７℃で１０分間インキュベートした。
メンブランを０．２５ｍｌ／ｃｍ２のｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（５％  ブロッキング試薬、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）で４２℃  １時間プレハイブリダイゼーションを行い、標識したプローブを加えて４２℃で１６−２０時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイズ後、４２℃に保温したｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ（６Ｍ  Ｕｒｅａ、０．４％  ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣ）で２回洗浄し、更に２×ＳＳＣで２回洗浄した後、キット添付の発光試薬を加えて検出を行った。
２−１１．形質転換体の純化操作
コロニーＰＣＲによって目的のバンドが検出された形質転換体は、サザンブロッティングにより、プラスミドの導入部位とコピー数を調べ、目的の遺伝子破壊が行われた株を選択した。得られた株から胞子懸濁液を作製し、単核化フィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  ５．０μｍ  孔）を用いて単核化を行い、得られたコロニーについてコロニーＰＣＲによりホモカリオンとなった目的の遺伝子破壊株を選択した。
【００４７】
３．結果
３−１．ｌｉｇＤ破壊株作製用プラスミドベクターの構築
酵母及びヒトのＬＩＧ４タンパク質とホモロジーの高いタンパク質をコードしている遺伝子を麹菌ゲノム解析情報から探索した結果、“ＡＯ０９０１２００００３２２”（旧“ＡＯ０７０３１１０００１１９”）として同定された遺伝子が見出された。本遺伝子は、Ａ．ｏｒｙｚａｅ  ＲＩＢ４０のｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ５のスーパーコンティグＳＣ１１３（遺伝学研究所のデータベースＤＤＢＪの登録番号ＡＰ００７１６６）に含まれており、コードされるタンパク質はＤＤＢＪの登録番号ＢＡＥ６２９１４（配列番号８）として登録されている。なお、本タンパク質と酵母とヒトのＬＩＧ４タンパク質との相同性を図５に示した。そこで、この遺伝子を麹菌のＬＩＧ４ホモログ遺伝子と考えてｌｉｇＤと命名し、この遺伝子を遺伝子置換法により破壊するために、ｌｉｇＤ破壊用ベクターを構築した。破壊用ベクターは、ＰＣＲと酵母の高い相同組換え能力を利用して作製した（図６）。
まず、ＰＣＲによりｌｉｇＤＯＲＦの５’−末端領域１ｋｂと、３’−側下流領域１ｋｂのＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲに用いたプライマーは酵母・大腸菌シャトルベクターであるｐＹＥＳ２及び硫酸塩資化マーカーであるｓＣと相同配列をリンカーとして持つものを用いた。これにより両端にｐＹＥＳ２及びｓＣと相同部位をもつＤＮＡ断片を得た。
すなわち、ｌｉｇＤの上流領域を増幅させる際のプライマーセットは、ｐＹＥＳ２マルチクローニングサイト内の２９ｍｅｒとｌｉｇＤＯＲＦの開始コドンを含む５’−末端領域の配列  ２０ｍｅｒからなる計４９ｍｅｒのプライマー１（下に記したＰ−１ＡＯ）及び、ｌｉｇＤの開始コドンから１ｋｂ下流の配列２０ｍｅｒと、ｓＣＯＲＦの上流配列２９ｍｅｒからなる計４９ｍｅｒのプライマー２（Ｐ−２ＡＯ）を用いた。また、開始コドンを制限酵素  ＡａｔＩＩサイトに変換した。
（Ｐ−１ＡＯ）５’ＴＡＴＴＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＧＡＴＣＣＡＡＴＡＡＧＡＣＧＴＣＧＡＴＴＣＴＧＡＣＧ３’（配列番号２１）
（Ｐ−２ＡＯ）５’ＧＣＣＡＴＡＴＴＴＴＧＧＡＴＴＴＴＴＡＴＡＴＣＣＡＡＧＡＴＣＣＡＴＡＴＧＡＡＧＣＴＧＣＡＴＡＣＧＣ３’（配列番号２２）
【００４８】
また、ｌｉｇＤ下流領域を増幅させる際のプライマーセットは、ｓＣの３’側配列２９ｍｅｒと、ｌｉｇＤＯＲＦ外の下流領域２０ｍｅｒからなる計４９ｍｅｒのプライマー３（Ｐ−３ＡＯ）及びプライマー３に用いたｌｉｇＤの領域よりもさらに１ｋｂ下流の２０ｍｅｒとｐＹＥＳ２マルチクローニングサイト内の２９ｍｅｒからなる計４９ｍｅｒのぷらいまー４（Ｐ−４ＡＯ）を用いた。
（Ｐ−３ＡＯ）５’ＣＡＴＡＣＧＧＧＣＡＧＣＴＡＴＴＧＣＣＡＡＧＡＧＡＡＧＣＴＣＣＡＴＧＧＧＣＣＴＡＡＣＣＣＡＡＡＴＣ３’（配列番号２３）
（Ｐ−４ＡＯ）５’ＣＧＣＣＡＧＴＧＴＧＡＴＧＧＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＴＣＣＣＡＴＣＴＴＣＡＧＣＴＧＣＧＧＡＣ３’（配列番号２４）
ｌｉｇＤの上流領域及び下流領域を増幅する際のＰＣＲ反応は、共にＡ．ｏｒｙｚａｅ  ＲＩＢ４０株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、９５℃２分処理した後に、１：９５℃３０秒、２：５２℃３０秒、３：７２℃１分、の反応過程を３０サイクル行い、その後７２℃で７分間反応させた。反応産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、１ｋｂのバンドが検出されることにより、それぞれの断片が増幅されたことを確認した。
一方、ｐＹＥＳ２をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで処理し、直鎖状にしたｐＹＥＳ２断片を得た。
また、選択マーカーｓＣをもつプラスミドであるｐＵＳＣをＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで処理し、ｓＣマーカーを切り出した。
ＰＣＲによって得たｌｉｇＤの上流領域の断片と下流領域の断片、及び制限酵素処理により取得したｐＹＥＳ２断片とｓＣマーカー断片の４つのＤＮＡ断片を用いてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＹ４７４１株の形質転換を行い、酵母内での相同組換えを利用することでｌｉｇＤ  破壊用プラスミドベクターを構築した（図７）。得られた酵母の形質転換体から相同組換えによって構築されたプラスミドＤＮＡを回収し、そのＤＮＡを用いて大腸菌の形質転換を行ってｌｉｇＤ破壊用プラスミドベクターを大量に調製した。
【００４９】
３−２．ｌｉｇＤ遺伝子破壊株の作製
ｌｉｇＤ遺伝子を置換破壊法によって破壊する目的で、上で調製したプラスミドをＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩで処理し、ｌｉｇＤ破壊用断片を切り出し、Ａ．ｏｒｙｚａｅ  ＮＳ４株に形質転換を行った。ＮＳ４株はプロトプラスト化の前培養をＹＰＤ培地で行い、形質転換体の選択培地にはＮＳ４株用のＣＤ培地からメチオニンを抜いたものを用いた。その結果、ｓＣマーカー導入によって選択培地に旺盛に生育してくる形質転換体を２６株取得した。
３−３．コロニーＰＣＲによるｌｉｇＤ破壊の確認
取得した２６株の形質転換体の中からコロニーＰＣＲによりｌｉｇＤ破壊株をスクリーニングした。ｌｉｇＤ遺伝子破壊の確認のために用いたプライマーセット１は、ｌｉｇＤ破壊用断片に含まれている配列よりもさらに上流の染色体上の配列３０ｍｅｒ（Ｐ−５ＡＯ）、およびｌｉｇＤ破壊用断片のｓＣマーカー内の配列３０ｍｅｒ（Ｐ−６ＡＯ）を用いて、破壊された場合に１．４ｋｂの断片が増幅されるように設計した（図８（Ｂ））。
（Ｐ−５ＡＯ）５’ＣＣＧＧＧＴＧＡＡＧＴＣＡＡＴＴＴＡＴＣＴＴＡＴＣＧＴＴＧＣ３’（配列番号２５）
（Ｐ−６ＡＯ）５’ＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＡＴＴＣＡＧＡＧＴＧＧＧＧＧＧＣＴＡＣＧ３’（配列番号２６）
また、破壊株に野生型のｌｉｇＤが残っていない（つまりホモカリオンとなっている）ことを確認するために、ｌｉｇＤＯＲＦ内部の配列３０ｍｅｒのプライマー（Ｐ−７ＡＯ）  を設計した。Ｐ−５ＡＯとＰ−７ＡＯからなるプライマー２を用いることで、野生型のｌｉｇＤが残っていた場合には１．５ｋｂの断片が増幅されることになる（図８（Ａ））。
（Ｐ−７ＡＯ）５’ＧＡＧＴＡＣＧＧＧＴＴＴＣＴＣＴＧＴＴＣＧＧＡＴＡＧＴＧＣＧ３’（配列番号２７）
ＰＣＲ反応は、９５℃２分処理した後に、１：９５℃３０秒、２：６０℃３０秒、３：７２℃９０秒、の反応過程を３０サイクル行い、その後７２℃で７分間反応させた。反応産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的の大きさのバンドが検出されるかどうかでｌｉｇＤ破壊の有無を調べた。得られた形質転換体についてコロニーＰＣＲを行うことでｌｉｇＤ破壊の確認を行った結果、形質転換体２６株より５株のｌｉｇＤ破壊候補株を選抜した。これらの株は、形質転換体として取得した直後では、ヘテロカリオンの状態になっており、野生型のｌｉｇＤが残っていたことから、このうちの１株について純化を行った。単核の分生子を濃縮することにより純化を行い、ＰＣＲによって最終的に得られた株には野生型のｌｉｇＤが残っていないことを確認した（図９）。
【００５０】
３−４．サザンブロット解析によるｌｉｇＤ破壊の確認
ＰＣＲによって選抜されたｌｉｇＤ破壊候補株はサザンブロット解析により、ｌｉｇＤ破壊と染色体上に導入された破壊用断片の置換部位およびコピー数を調べた。
サザンブロット解析は、ＳｐｅＩとＳａｌＩで完全消化したゲノムＤＮＡに対し、ｌｉｇＤ破壊用ベクターをＭｓｃＩとＮｏｔＩで処理し、ｌｉｇＤＯＲＦ  下流領域を切り出してプローブとした。サザン解析を行った結果、野生株では  ５．５ｋｂの位置に１バンドが検出されるが、ｌｉｇＤ破壊株ではこのバンドが消失しており、新たに２．７ｋｂの位置に１バンドが検出された。このことから、１コピーのプラスミドが染色体上のｌｉｇＤ部位に導入され、野生型のｌｉｇＤが残っていないことが確認された（図１０）。
【００５１】
３−５．ｌｉｇＤ破壊株の表現型の観察
３−５−１．菌糸成長・分生子形成
完全培地プレートに親株であるＮＳ４株及びｌｉｇＤ破壊株の分生子を２×１０３個植菌し、３０℃にて３日間静置培養し、菌糸成長、分生子形成について観察した。しかし、野生株と比較して差は見られなかった（図１１）。
３−５−２．生育速度
５０  ｍｌのＹＰＤ培地にＮＳ４株及びｌｉｇＤ破壊株の分生子を１×１０６個植菌した。３０℃、２４時間及び４８時間振盪培養した後、集菌し菌体を乾燥させ、乾燥重量を測定することで生育速度の差を比較した。しかし、生育速度についても野生株と比べ特に差は見られなかった（図１２）。
３−５−３．Ｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＥＭＳ）への応答
ニューロスポラ・クラッサにおけるＫＵ破壊株では、ＭＭＳやＥＭＳなどのＤＮＡ二重鎖切断を引き起こすような薬剤に対して感受性が上昇する。そこで、ｌｉｇＤ破壊株についても、各種濃度のＥＭＳを含むＣＤプレート培地における生育を野生株と比較した。０％、０．１％、０．２％、０．３％のＥＭＳを含むＣＤプレート培地にＮＳ４株及びｌｉｇＤ破壊株の分生子を２×１０３個植菌し、３０℃にて３日間静置培養しＥＭＳへの応答を調べた結果、野生株も破壊株もＥＭＳ濃度の上昇とともに生育が悪くなるが、両者の感受性に差は見られなかった（図１３）。
【００５２】
ＩＩ．麹菌ｌｉｇＤ破壊株を宿主とした相同組換え効率の検定
１．方法および結果
１−１．ｌｉｇＤ破壊株を宿主として用いたｐｒｔＲ破壊
ｌｉｇＤ破壊株のターゲティング効率について検証するため、ｌｉｇＤ破壊株を宿主としてＡ．ｏｒｙｚａｅ（アスペルギルス・オリゼ）のプロテアーゼの生産に関わる転写因子遺伝子であるｐｒｔＲ破壊を行い、その遺伝子破壊効率を求めた。
ｐｒｔＲ破壊は、プラスミドｐＲＴＤＲ／ｐｔｒＡＴＡＸを用いて遺伝子置換法により遺伝子破壊を行った（図１４）。ｐＲＴＤＲ／ｐｔｒＡＴＡＸをＳｐｅＩ及びＸｈｏＩで処理して、ｐｒｔＲのＯＲＦより上流の配列１ｋｂと下流の配列１ｋｂの内部に選択マーカーとして麹菌のピリチアミン耐性遺伝子（ｐｔｒＡ）を挿入した断片を直鎖状にして、ｐｒｔＲ破壊のための形質転換に使用した。
形質転換の宿主としてｌｉｇＤ破壊株及び対照としてｌｉｇＤ破壊株の親株であるＮＳ４株を用いた。また、プロトプラスト作製の前培養にはｌｉｇＤ破壊株、ＮＳ４株ともにＣＤＰ  培地を用いた。選択培地としてＣＤ＋ピリチアミン培地（ＣＤ培地に終濃度０．１μｇ／ｍｌとなるようにピリチアミンを添加）を用いた。
形質転換の結果、ｌｉｇＤ破壊株からは５５株、ＮＳ４株からは６０株のピリチアミン耐性を示す形質転換体が取得できた。
【００５３】
１−２．コロニーＰＣＲによるｐｒｔＲ破壊の確認とターゲッティング効率の測定
ｌｉｇＤ破壊株およびＮＳ４株を宿主として得られた形質転換体について、それぞれコロニーＰＣＲを行うことにより、ｐｒｔＲ破壊の有無を確認した。プライマーセットとしては、ｐｒｔＲ破壊用断片に含まれている配列よりさらに上流の染色体上の配列をセンスプライマー（Ｐ−８ＡＯ）とし、ｐｒｔＲ破壊用断片中のｐｔｒＡマーカー内部の配列をアンチセンスプライマー（Ｐ−９ＡＯ）としたものを用いて、ＰＣＲにより１．３ｋｂの断片が増幅するように設計した（図１５）。
（Ｐ−８ＡＯ）５’ＴＡＣＡＧＴＧＧＴＴＣＣＧＣＴＴＴＣＧＴ３’（配列番号２８）
（Ｐ−９ＡＯ）５’ＧＡＧＴＣＡＡＣＧＴＧＡＴＡＡＧＧＧＣＡ３’（配列番号２９）
ＰＣＲ反応は、９５℃２分処理した後に、１：９５℃３０秒、２：６０℃３０秒、３：７２℃  ９０秒、の反応過程を３０サイクル行い、その後７２℃で７分間反応させた。反応産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的の大きさのバンドが検出されるかどうかでｐｒｔＲ破壊の有無を確認した（図１６）。また、同時に同じゲノムをテンプレートとしてｌｉｇＤ破壊株ではｌｉｇＤ破壊確認のＰＣＲを、ＮＳ４株では野生型ｌｉｇＤ残存確認のＰＣＲを行うことにより、コロニーＰＣＲに問題がないことを確認した。
コロニーＰＣＲを行うことにより、形質転換体のうち染色体上のｐｒｔＲ部位にターゲティングされてｐｒｔＲ遺伝子が破壊された株の割合を求めたところ、ｌｉｇＤ破壊株を宿主に用いた場合は、ターゲティング効率が９６．４％と１００％に近い値であった。同条件で行った  ＮＳ４株の場合のターゲティング効率は８．３％であり、ｌｉｇＤ破壊株におけるターゲティング効率はＮＳ４株と比較して１０倍以上も上昇することが示された（表２）。この結果から、ｌｉｇＤ破壊株は相同組換え効率がきわめて高くなっており、遺伝子破壊などの宿主として非常に有用であることが示された。なお、本実験では選択マーカーとして麹菌のピリチアミン耐性遺伝子（ｐｔｒＡ）を用いているため、相同組換え効率が高くなった場合には破壊を目的としたｐｒｔＲ部位ではなく、染色体の別の位置にあるｐｔｒＡ部位に相同的に組み込まれる可能性もあることから、ｌｉｇＤ破壊株でｐｒｔＲ部位にターゲティングされなかった３．６％の株ではｐｔｒＡ部位に相同的に挿入されている可能性がある。
【００５４】
【表２】
2007300857.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明により、遺伝子ターゲティングに伴うランダムなインテグレーションを効果的に排除することが可能となるため、より精度の高い遺伝子改変技術を提供することができる。その結果、特定の遺伝子を確実に導入し、該遺伝子を所望の細胞の中で安定に発現させることができる。また、特定の遺伝子を確実に破壊することも可能となることから、微生物を用いた食品加工の分野などにおける、有用株の作出を容易に達成することができるようになる。
また、本発明により、物質生産を阻害する遺伝子や、細胞毒素生産系に関与する遺伝子など、産業上利用可能な生物にとって不利益を及ぼす遺伝子の除去を容易に行うことができる。
さらに、本発明により提供される方法を高等動植物に応用することにより、動植物の品種改良はもとより、医療分野における創薬および遺伝子治療においても新たな技術の提供が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】Ｈｙｇｒを用いて、ニューロスポラ・クラッサのＬＩＧ４を破壊する手順を示す。
【図２】ヒトＬＩＧ４、ニューロスポラ・クラッサのＬＩＧ４及び出芽酵母のＬＩＧ４のアミノ酸配列の比較を示す。
【図３】Ｈｙｇｒ遺伝子による置換株の変異源感受性を示す。
【図４】野生株、ＫＵ８０変異株及びｎｃＬＩＧ４変異株を用いた遺伝子ターゲティング効率を比較したグラフを示す。Ａは各変異株における形質転換頻度を示し、Ｂは遺伝子ターゲティング効率を示す。
【図５】ヒトＬＩＧ４、アスペルギルス・オリゼのＬＩＧ４ホモログであるｌｉｇＤ及び出芽酵母のＬＩＧ４のアミノ酸配列の比較を示す。
【図６】酵母を用いたｌｉｇＤ破壊用プラスミドの調製過程の概略図を示す。
【図７】ｌｉｇＤ破壊用プラスミドの構成を示す。
【図８】コロニーＰＣＲによるｌｉｇＤ破壊の確認用プライマーの位置関係を示す。
【図９】ＰＣＲによるｌｉｇＤ破壊の確認結果を示す。
【図１０】野生株及びｌｉｇＤ破壊株のサザンブロット解析の結果を示す。
【図１１】野生株及びｌｉｇＤ破壊株の菌糸成長・分生子形成を比較した結果を示す。
【図１２】ＹＰＤ液体培地で、２４時間及び４時間培養し、菌体を回収して乾燥重量を測定した結果を示す。
【図１３】野生株及びｌｉｇＤ破壊株のＥＭＳに対する感受性を調べた結果を示す。
【図１４】ターゲティング効率検定に用いたｐｒｔＲ破壊用ベクターの構成を示す。
【図１５】ｐｒｔＲ破壊の概要と破壊確認用プライマーセットの位置関係を示す。
【図１６】ＰＣＲによるΔｐｒｔＲ破壊株（ｐｒｔＲ部位への挿入）の確認結果を示す。
【図５】
2007300857.tif 000004
【図１】
2007300857.tif 000005
【図２】
2007300857.tif 000006
【図３】
2007300857.tif 000007
【図４】
2007300857.tif 000008
【図６】
2007300857.tif 000009
【図７】
2007300857.tif 000010
【図８】
2007300857.tif 000011
【図９】
2007300857.tif 000012
【図１０】
2007300857.tif 000013
【図１１】
2007300857.tif 000014
【図１２】
2007300857.tif 000015
【図１３】
2007300857.tif 000016
【図１４】
2007300857.tif 000017
【図１５】
2007300857.tif 000018
【図１６】
2007300857.tif 000019
【配列表】
2007300857000001.app