(57)【要約】    【課題】ヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現誘導性のトランスジェニック動物を簡便かつ経済的に作製するのに用いられ、部位特異的組換え酵素の作用によってヒアルロン酸合成酵素を発現するヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入プラスミドのＤＮＡ断片を提供する。また、それが導入されたトランスジェニック動物を提供する。    【解決手段】ヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入プラスミドのＤＮＡ断片は、転写開始制御塩基配列、部位特異的遺伝子組換え酵素が認識する対の認識塩基配列に挟まれており、該酵素で切り出される不活性なスペーサ塩基配列、ヒアルロン酸合成酵素の遺伝子の塩基配列が、またはトランス発現誘導制御塩基配列、ヒアルロン酸合成酵素の遺伝子の塩基配列が、５’末端から３’末端方向に、その順で繋がっている。ヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現誘導性トランスジェニック動物は、このＤＮＡ断片が、非ヒト哺乳動物に導入されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写開始制御塩基配列、部位特異的遺伝子組換え酵素が認識する対の認識塩基配列に挟まれており、該酵素で切り出される不活性なスペーサ塩基配列、ヒアルロン酸合成酵素の遺伝子の塩基配列が、
または、トランス発現誘導制御塩基配列、ヒアルロン酸合成酵素の遺伝子の塩基配列が、
５’末端から３’末端方向に、その順で繋がっていることを特徴とするヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入プラスミドのＤＮＡ断片。
【請求項２】
該対の認識塩基配列が、loxP塩基配列またはFrt塩基配列であることを特徴とする請求項１に記載のヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入プラスミドのＤＮＡ断片。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸合成酵素が、脊椎動物のヒアルロン酸合成酵素１、２または３であることを特徴とする請求項１に記載のヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入プラスミドのＤＮＡ断片。
【請求項４】
請求項１に記載のヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入プラスミドのＤＮＡ断片が、非ヒト哺乳動物に導入されていることを特徴とするヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現誘導性トランスジェニック動物。
【請求項５】
前記非ヒト哺乳動物が、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはブタであることを特徴とする請求項４に記載のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現誘導性トランスジェニック動物。
【請求項６】
請求項４に記載のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現誘導性トランスジェニック動物、およびそれの同種で臓器特異的疾患発症性の動物を交配している動物種であることを特徴とする病態モデル用トランスジェニック動物。
【請求項７】
請求項４に記載のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現誘導性トランスジェニック動物、およびそれの同種で臓器特異的疾患発症性の動物を交配しており、それと、前記部位特異的組換え酵素を有する動物を交配した動物種であることを特徴とする病態モデル用トランスジェニック動物。
【請求項８】
臓器特異的疾患発症性の親動物が、癌発症性、動脈硬化症発症性、臓器線維症発症性、または炎症性疾患発症性であることを特徴とする請求項６または７に記載の病態モデル用トランスジェニック動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸合成異常に起因する疾患の発症や進行の機序を究明しその治療法を開発するモデル動物を作製するために用いられる、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入プラスミドのＤＮＡ断片に関する。また、そのＤＮＡ断片が導入されたヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現誘導性トランスジェニック動物、およびそれを交配したヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現誘導性で臓器特異的疾患発症性の病態モデル用トランスジェニック動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸（ＨＡ）は、関節軟骨や皮膚などに豊富に含まれる細胞外マトリックスの主要構成分子であり、高分子量のグリコサミノグリカン糖鎖からなる。ヒアルロン酸は、グルクロン酸(GlcUA)がＮ−アセチルグルコサミン(GlcNAc)にbeta-1,3結合した二糖単位(GlcUAbeta1-3GlcNAc)のbeta-1,4結合による繰り返し糖ユニットから構成されている。
【０００３】
このようなヒアルロン酸は、動物細胞内で、ヒアルロン酸合成酵素（ＨＡＳ）により生合成される。ヒアルロン酸合成酵素として、一次構造上、相同性を示すヒアルロン酸合成酵素１、２または３（夫々ＨＡＳ１、ＨＡＳ２またはＨＡＳ３）という三種類のファミリー分子が存在している。夫々の酵素が、ヒアルロン酸合成活性を有している。マウスにおけるヒアルロン酸合成酵素は、夫々Ｍｏｕｓｅ  Ｈａｓ１、Ｈａｓ２、Ｈａｓ３と表記される。
【０００４】
動物細胞内のヒアルロン酸は、細胞の増殖や移動の促進に働くものであり、組織の構造維持や機能調節、炎症、創傷治癒などの生体反応の調節に重要であると考えられている。その合成異常は、発癌、癌細胞の浸潤や転移、さらには動脈硬化や線維症のような各種疾患と、深く関わっていると言われている。
【０００５】
ヒアルロン酸合成異常に起因する前記の各種疾患の発症及び進行の機序を究明し、その治療法を開発するために、それのモデル動物が必要不可欠である。
【０００６】
非特許文献１に、ヒトヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ２）遺伝子を遺伝子導入し平滑筋細胞で特異的にヒアルロン酸合成を発現させるトランスジェニックマウスが開示されており、そのマウスを用いた実験によりヒアルロン酸と動脈硬化との関連性が示唆されている。
【０００７】
また、特許文献１に、皮膚代謝関連プロモーターに結合したレポーター遺伝子を包含し、このレポーター遺伝子が発光または蛍光産物をコードするという非ヒトトランスジェニック動物が、開示されている。このトランスジェニック動物は、レポーター遺伝子の発現変化を調べるためのもので、皮膚における遺伝子発現に対する化合物の影響を評価することができるというものである。
【０００８】
これらのトランスジェニック動物は、動脈硬化や皮膚代謝異常の疾患のモデル動物となり得るが、他の癌疾患等のモデル動物となり得ない。また、従来の方法で作製したこれらのトランスジェニック動物は、組織特異的なプロモーターを直接導入遺伝子の上流に配して、導入遺伝子の発現を制御したものであるから、ヒアルロン酸合成異常の研究対象となる臓器や疾患の利用目的に応じ、個別にトランスジェニック動物を作製する必要があった。
【０００９】
【非特許文献１】Chai, S. et al, Circ. Res. 96: 583-591 (2005)
【特許文献１】特表２００３−５２０９４６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現誘導性のトランスジェニック動物を簡便かつ経済的に作製するのに用いられ、部位特異的組換え酵素の作用によってヒアルロン酸合成酵素を発現するヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入プラスミドのＤＮＡ断片を提供することを第一の目的とする。
【００１１】
また、このＤＮＡ断片が導入されており、部位特異的組換え酵素を利用してヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現とヒアルロン酸の合成とを個体毎に制御できるヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現誘導性トランスジェニック動物を提供することを第二の目的とする。
【００１２】
さらに、ヒアルロン酸合成異常に関連する各種疾患に対する研究のために用いられるもので、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現誘導性であって臓器特異的疾患発症性の病態モデル用トランスジェニック動物を提供することを第三の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記の目的を達成するためになされた特許請求の範囲の請求項１に記載のヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入プラスミドのＤＮＡ断片は、
転写開始制御塩基配列、部位特異的遺伝子組換え酵素が認識する対の認識塩基配列に挟まれており、該酵素で切り出される不活性なスペーサ塩基配列、ヒアルロン酸合成酵素の遺伝子の塩基配列が、
または、トランス発現誘導制御塩基配列、ヒアルロン酸合成酵素の遺伝子の塩基配列が、
５’末端から３’末端方向に、その順で繋がっていることを特徴とする。
【００１４】
請求項２に記載のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現誘導性トランスジェニック動物は、請求項１に記載されたもので、該対の認識塩基配列が、loxP塩基配列またはFrt塩基配列であることを特徴とする。
【００１５】
請求項３に記載のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現誘導性トランスジェニック動物は、請求項１に記載されたもので、脊椎動物のヒアルロン酸合成酵素１、２または３であることを特徴とする。
【００１６】
請求項４に記載のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現誘導性トランスジェニック動物は、請求項１に記載のヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入プラスミドのＤＮＡ断片が、非ヒト哺乳動物に導入されていることを特徴とする。
【００１７】
請求項５に記載のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現誘導性トランスジェニック動物は、請求項４に記載されたもので、前記非ヒト哺乳動物が、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはブタであることを特徴とする。
【００１８】
請求項６に記載の病態モデル用トランスジェニック動物は、請求項４に記載のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現誘導性トランスジェニック動物、およびそれの同種で臓器特異的疾患発症性の動物を交配している動物種であることを特徴とする。
【００１９】
請求項７に記載の病態モデル用トランスジェニック動物は、請求項４に記載のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現誘導性トランスジェニック動物、およびそれの同種で臓器特異的疾患発症性の動物を交配しており、それと、前記部位特異的組換え酵素を有する動物を交配した動物種であることを特徴とする。
【００２０】
請求項８に記載の病態モデル用トランスジェニック動物は、請求項６または７に記載されたもので、臓器特異的疾患発症性の親動物が、癌発症性、動脈硬化症発症性、肝硬変を含む臓器線維症発症性、または関節炎を含む炎症性疾患発症性であることを特徴とする。臓器線維症発症性として、肝硬変発症性のものが挙げられる。また炎症性疾患発症性として、関節炎発症性のものが挙げられる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入プラスミドのＤＮＡ断片は、Cre-loxP等のような部位特異的遺伝子組換え酵素とそれが認識する対の塩基配列とによる誘導性の遺伝子発現システムを利用して、あるいはトランス発現誘導制御塩基配列により、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現とヒアルロン酸合成とを個体レベルで制御し得るトランスジェニック動物を、簡便にかつ経済的に作製するために有用である。
【００２２】
本発明のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現誘導性トランスジェニック動物は、この誘導性遺伝子発現システムを利用して、任意に、所望の病態モデル作成時期や臓器特異的な疾患の病態モデルの目的に応じて、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現とヒアルロン酸合成とを制御し得る。
【００２３】
従来の発明は、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現変化の解析を評価の対象とするのに対し、本発明は、ヒアルロン酸合成酵素そのものを発現させるトランスジェニック動物であり、その酵素産物のヒアルロン酸の機能を評価できる点で優れている。
【００２４】
この誘導性トランスジェニック動物と、臓器特異的なトランスジェニック動物とを交配させることにより、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現と、誘導的なヒアルロン酸合成とを制御することが可能である。しかも、対象の病態に合わせた臓器特異的なトランスジェニック動物を、個別に作製する必要がない。
【００２５】
また、ウィルスベクターなどの一般的な遺伝子導入技術を用いて、Cre等の部位特異的遺伝子組換え酵素を細胞に導入することによっても、また外因性の物質によってトランスに発現が制御される誘導プロモーターによっても、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現と、誘導的なヒアルロン酸合成とを制御することが可能である。
【００２６】
これらにより、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子を発現誘導した動物は、ヒアルロン酸の生体における機能解析のための試験動物として利用価値が高く、またヒアルロン酸合成異常の関連した各種疾患に対する治療法並びに治療薬の開発のためのモデル動物として有用である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の好ましい実施例を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２８】
本発明のヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入プラスミドのＤＮＡ断片は、転写開始制御塩基配列とヒアルロン酸合成酵素遺伝子の塩基配列との間に、対のloxP塩基配列で挟まれた薬剤耐性遺伝子の塩基配列が配され、さらにその下流の３’末端側に転写終結制御塩基配列が配されたものである。
【００２９】
このヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入プラスミドのＤＮＡ断片は、誘導性のヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現を制御するために、対のloxP塩基配列で挟まれたＤＮＡ領域を部位特異的に遺伝子組換えする酵素による組換えシステムを、利用することができるというものである。
【００３０】
ヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入プラスミドのＤＮＡ断片は、部位特異的組換え酵素存在下で、前記薬剤耐性遺伝子の塩基配列が一方のloxP塩基配列とともに切り出されて環状ＤＮＡとして再結合し、それが切り出された残余のＤＮＡ断片の残基同士が他方のloxP塩基配列を介して再結合するという性質を有している。
【００３１】
本発明の実施の一態様であるヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入プラスミドのＤＮＡ断片の概略を模式的に示す図１、および遺伝子組換え後のＤＮＡの一部の塩基配列を示す図２を参照して、より具体的に説明する。
【００３２】
ヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入プラスミドは、転写開始制御塩基配列であるCAGプロモーターの下流の３’末端側に、対のloxP塩基配列で挟まれたNeo (neomycine resistant gene) + poly A (SV40 early mRNA polyadenylation signal)からなり薬剤耐性遺伝子であるネオマイシン耐性遺伝子の塩基配列、さらにその下流の３’末端側に、マウスのヒアルロン酸合成酵素２（Mouse Has2）翻訳領域のcDNA と b-globin poly A (b-globin mRNA polyadenylation signal)を連結したコンストラクトを、pCALNL5ベクター（RIKEN Bioresource Center DNA Bankより入手, URL: http://www.brc.riken.jp/lab/dna/ja/）上で構築したものである。
【００３３】
トランスジェニック動物の作製には、このヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入プラスミドを二種類の制限酵素（Sal IとSfi I）で消化したＤＮＡ断片が用いられる。
【００３４】
ヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入プラスミドのＤＮＡ断片は、ヒアルロン酸合成酵素をコードするポリヌクレオチドが、非ヒト哺乳動物の細胞内で、転写開始を制御するプロモーターに繋がっているというものである。または、このＤＮＡ断片が導入された非ヒト哺乳動物の細胞内で、転写開始を制御し得る位置に配置されているというものである。
【００３５】
なお、転写開始制御塩基配列は、転写開始の機能を発現するものであればよく、ウイルスプロモーター例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター；構成蛋白質遺伝子のプロモーター、例えばβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーターであってもよく、なかでもＣＡＧプロモーターが好ましい。
【００３６】
スペーサ塩基配列は、転写開始制御塩基配列からのヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現を妨げるのに十分な長さを有するものであればよく、薬剤耐性遺伝子、例えばネオマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子；栄養要求性変異を相補する遺伝子であってもよい。
【００３７】
ヒアルロン酸合成酵素の遺伝子は、脊椎動物由来のものであればよく、具体的には（U52524, U86408 D84424, U54804,  U86409  文献： Accession No. D82964, Itano N., Kimata K.. J. Biol. Chem. 271 :9875-9878 (1996), Accession No. U59269, Shyjan A.M., et al. J. Biol. Chem. 271 :23395-23399(1996), Accession No. U52524, Spicer A.P., et al. J. Biol. Chem.271 :23400-23406 (1996), Accession No. U54804, Watanabe K., Yamaguchi Y.J Biol Chem.271 :22945-22948 (1996), Accession No. U86408, U86409,Spicer A.P., et al. J. Biol. Chem. 272 :8957-8961 (1997), Liu N., et al. Cancer Res. 61 :5207-5214 (2001)に全遺伝子配列が記載されているマウスやヒトのヒアルロン酸合成酵素１、２または３（例えばＭｏｕｓｅ  Ｈａｓ１、Ｈａｓ２、Ｈａｓ３、Ｈｕｍａｎ  ＨＡＳ１，ＨＡＳ２，ＨＡＳ３）であることが好ましい。
【００３８】
ヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入プラスミドのＤＮＡ断片は、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子をコードするポリヌクレオチドの下流に、転写終結塩基配列、すなわちターミネーター領域を有していることが好ましい。
【００３９】
ヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入プラスミドのＤＮＡ断片の作製に用いられるベクターは、非ヒト哺乳動物に投与可能なものであれば特に限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクターであってもよい。
【００４０】
ヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入プラスミドのＤＮＡ断片は、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子が導入されたベクターからSal IとSfi I制限酵素によって導入遺伝子部分を切り出したものであってもよい。
【００４１】
本発明のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現誘導性のトランスジェニック動物は、このＤＮＡ断片が、非ヒト哺乳動物、好ましくはマウスに導入される。
【００４２】
このトランスジェニック動物は、前記ヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入プラスミドのＤＮＡ断片の性質を利用して、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現を誘導できるというものである。このＤＮＡ断片を導入するには、受精卵にマイクロインジェクションする方法；ウィルスベクター法；胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に該ベクターを導入するトランスフェクション法、レトロウイルスベクターを用いた感染法、エレクトロポレーション法のような一般的な遺伝子導入技術により行なわれる。
【００４３】
前記のトランスジェニック動物は、部位特異的遺伝子組換え酵素例えばCreリコンビナーゼを有しない。したがって、CAGプロモーターと、ヒアルロン酸合成酵素２の遺伝子の塩基配列とが、ネオマイシン耐性遺伝子によって分断された状態のままであり、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子の転写が誘導されない。
【００４４】
本発明のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現誘導性のモデル動物は、このヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現誘導性トランスジェニック動物、およびそれの同種で臓器特異的疾患発症性の動物を交配して得られる動物種である。
【００４５】
このヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現誘導性のモデル動物に、部位特異的遺伝子組換え酵素が作用することによって、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子の誘導と、臓器特異的疾患発症とが、発現する。具体的には、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現誘導性のモデル動物は、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現誘導性トランスジェニック動物、およびそれの同種で臓器特異的疾患発症性の動物を交配したものに、前記部位特異的組換え酵素例えばCreリコンビナーゼを有する動物を交配することにより、得られる。その産子は、両親動物に夫々由来するCreリコンビナーゼとヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入プラスミドのＤＮＡ断片と臓器特異的疾患発症性の遺伝子とを有する。そのため、図１に示すように、このCreリコンビナーゼが、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子含有ベクターのＤＮＡ断片に作用し、そのＤＮＡ組換え反応により、導入遺伝子中の二カ所のloxP部位で遺伝子組換えが生じる結果、一方のloxP塩基配列とNeo + poly Aの塩基配列とが、環状ＤＮＡとして切り出され、残余のＤＮＡ断片が他方のloxP塩基配列を介して再結合して短絡し、相同組換えを引起こし、遂には、転写開始制御塩基配列であるCAGプロモーターからのマウスのヒアルロン酸合成酵素２（Has2）の転写が誘導される。
【００４６】
このようなモデル動物は、部位特異的遺伝子組換え酵素に起因するヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現誘導性の発現時期を自在にコントロールでき、さらに様々な臓器特異的疾患発症性の組織にヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現誘導性の発現をコントロールすることができる。
【００４７】
部位特異的組換え酵素例えばCreリコンビナーゼやFlpリコンビナーゼを有するトランスジェニック動物は、種々の動物種として入手可能なもので、Zadelaar S.M., et al. Transgenic Res. 15 :31-36 (2006)に記載されたSM-CreER(T2)(ki)/rosa26マウスであってもよく、また市販の（C57BL/6-TgN(AlbCre)21Mgn, Tg(Ins2-cre)25Mgn, B6.Cg-Tg(Mx1-cre)1Cgn/J, B6.Cg-Tg(Nes-cre)1Kln/J, B6.Cg-Tg(Tek-cre)12Flv/J, B6.Cg-Tg(cre/Esr1)5Amc/J, FVB-Tg(GFAP-cre)25Mes/J, STOCK Tg(MMTV-cre)1Mam/J等(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA)であってもよい。
【００４８】
臓器特異的疾患発症性の動物は、癌発症性、動脈硬化症発症性、肝硬変を含む臓器線維症発症性、または関節炎を含む炎症性疾患発症性を有する種々の動物種として入手可能なもので、Wakita, T. J. Biol. Chem. 273 :9001-9006(1998)やWipke, B.T., Allen, P.M. J. Immunol. 167 : 1601-1608 (2001)に記載されたものであってもよく、また市販のFVB/N-Tg(MMTVneu)202Mul/JやB6.129P2-Apoetm1Unc/J (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA)であってもよい。中でも乳癌発症性マウスであることが好ましい。
【００４９】
上記ベクターに使用される部位特異的遺伝子組換え酵素は、遺伝導入する対象の非ヒト哺乳動物の細胞に内在のリコンビナーゼで認識されない異種リコンビナーゼ認識配列であることが好ましい。そのため、大腸菌のバクテリオファージＰ１由来の部位特異的遺伝子組換え酵素であるCreリコンビナーゼと認識塩基配列であるloxP配列との組合せ、または酵母由来の部位特異的遺伝子組換え酵素Flpリコンビナーゼと認識塩基配列であるfrt配列との組合せが、一層好ましい。
【００５０】
ヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入プラスミドのＤＮＡ断片は、トランス発現誘導制御塩基配列、ヒアルロン酸合成酵素の遺伝子の塩基配列が繋がっていてもよい。
【００５１】
このＤＮＡ断片は、外因性の物質によってトランスに発現が制御されるトランス発現誘導制御塩基配列である誘導プロモーターを有している。誘導プロモーターが、例えばメタロチオネイン−１の遺伝子のプロモーターであるとき、外因性の物質として、重金属、ステロイド、アルキル化剤、キレート剤、サイトカインを投与することにより、所望の時期にヒアルロン酸合成酵素の転写が誘導される。
【００５２】
なお、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入プラスミドのＤＮＡ断片が導入される非ヒト哺乳動物は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはブタが好ましく、中でもマウスが一層好ましく、雌雄のいずれでもよい。
【実施例】
【００５３】
以下、本発明のヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入プラスミドのＤＮＡ断片、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現誘導性のトランスジェニック動物、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現誘導性のモデル動物を作製した例を、具体的に説明する。
【００５４】
（実施例１：ヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入プラスミドのＤＮＡ断片の作製）
マウス脳由来cDNAライブラリー(Clontech, Mountain View, CA, USA)を鋳型にPCR法によりmouse Has2ｃＤＮＡ[Accession No. U52524, Spicer, A.P. et al. J. Biol. Chem., 271:23400-23406 (1996)]を得た。公知の方法［Itano, N. et al, J. Biol. Chem., 274: 25085-25092 (1999)］に従って、pFLAG-CMV2ベクター(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)にBglIIとSmaI制限酵素切断部位に挿入して、FLAGタグをコードする塩基配列をアミノ末端に追加し、FLAG-mouse Has2 DNA断片を作製した。このFLAG-mouse Has2 DNA断片を、ベクターpCALNL5（RIKEN Bioresource Center DNA Bankより入手）のSacIとSmaI部位に、TDNAライゲース(New England Biolabs,Inc. Beverly, MA, USA)を用いて挿入した。
【００５５】
FLAG-mouse Has2ｃＤＮＡ断片が組み込まれたベクターをpCALNL5-Has2と名付けた。このCALNL5-Has2のベクターからSalIとSfiI制限酵素（New England Biolabs,Inc. Beverly, MA, USA）によりＤＮＡ断片を切り出し、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入プラスミドのＤＮＡ断片を得た（図１および２）。
【００５６】
なお、pCALNL5のベクターは、ＣＡＧプロモーター（ニワトリβ−アクチンプロモーター配列とサイトメガロウイルス前初期エンハンサー配列の組み合わせ）、５’末端側の第一のloxP塩基配列、ｎｅｏ耐性遺伝子（pSV2neoからのBgl II-Sma I断片１．０ｋｂ）、３’末端側の第二のloxP鎖とpCAGGSからのポリＡシグナルを含んでいる。このpCALNL5のベクターは、全塩基配列が既に知られたものであり、Kanegae, Y. et al., Gene, 181(1-2), 207-12 (1996)や、Niwa, H. et al., Gene, 108(2), 193-9 (1991)や、Kanegae, Y. et al., Nucleic Acid Res., 23(19), 3816-21 (1995)に記載されている。
【００５７】
（実施例２：ヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現誘導性のトランスジェニック動物）
このヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入プラスミドのＤＮＡ断片を、公知の方法［Hogan,B et al, "Manipulating the mouse embryo. A LaboratoryManual" Cold Spring Harbor Laboratory (1986)］に従い、BALB/cCrSlcマウス（日本エスエルシー(株)製）由来の受精卵へ、マイクロインジェクション法により注入し、受精卵をICRマウスの子宮に移植して産子を得ることにより、Has2遺伝子発現誘導性トランスジェニックマウスを作製した。
【００５８】
産子のうち導入遺伝子が染色体中に挿入されたトランスジェニックマウスの系統は、Has2遺伝子の配列に基づいて合成したＤＮＡプライマー（表１）を用いて、後述の試験方法に示すとおりPCR(polymerase chain reaction)法により同定した。
【００５９】
また、トランスジェニックマウスの乳癌より組織抽出液を調整し、以下に示すウエスタンブロット分析により抗FLAG抗体を用いてFLAG-Has2融合タンパク質の発現を検出した。また、乳癌組織よりRNA を抽出し、逆転写酵素を用いてcDNAを合成した後、以下に示すリアルタイムPCR法によりHas2遺伝子の発現を解析した。
【００６０】
このトランスジェニックマウスとＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスとを交配させ、その仔マウスが３週齢の時、尾の生検サンプルから染色体ＤＮＡを抽出し、後述の試験方法に示すとおりPCR法により組み込まれた遺伝子の存在をスクリーニングした。
【００６１】
（実施例３：病態モデル用トランスジェニック動物）
前記実施例２で作製したHas2遺伝子発現誘導性トランスジェニックマウスに乳癌を自然発症させるため、それと、乳癌発症モデルマウスのFVB/N-Tg(MMTVneu)202Mul/J (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA)とを交配させ、乳癌発症Has2遺伝子発現誘導性トランスジェニックマウスを得た。Has2遺伝子とNeu遺伝子との両導入遺伝子を持つHas2/Neuダブルトランスジェニックマウスを、表１に記載された各遺伝子に特異的なＤＮＡプライマーを用いて、後述の試験方法に示すとおりPCR法により同定した。
【００６２】
また並行して、MMTV-Neuトランスジェニックマウスと乳腺でCre遺伝子組換え酵素を特異的に発現するMMTV-Creトランスジェニックマウス（STOCK Tg(MMTV-cre)1Mam/J, The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA）と交配し、NeuとCre両遺伝子を乳腺で発現するCre/Neuダブルトランスジェニックマウスを作製した。
【００６３】
導入遺伝子の組み合わせは、表１に記載された各遺伝子に特異的なＤＮＡプライマーを用いて、後述の試験方法に示すとおりPCR法により解析した。
【００６４】
Has2/NeuマウスとCre/Neuマウスを交配し、４種の異なった組み合わせの遺伝子型（Neu、 Cre/Neu、Has2/Neu (Has2+Neo)、およびHas2/Neu/Cre (Has2ΔNeo)）を持つトランスジェニックマウスを得た。
【００６５】
このうちHas2+Neo とHas2ΔNeo遺伝子型を持つ同月齢（６ヶ月齢）の雌マウスは、次に乳癌の発症を促進するためにFVB/N雄マウス（FVB/NJcl, CLEA Japan Inc., Tokyo, Japan）と交配した。
【００６６】
実施例２および３で得られたトランスジェニックマウスについて、以下のようにして、各種試験を行なった。
【００６７】
（試験１：PCR法による遺伝子型の解析）
各トランスジェニックマウスの尾ＤＮＡを定法に従って抽出し、以下の表に記載したＤＮＡプライマーを用いてGene Amp PCR System 9700（Applied Biosystems社製）を用いてPCR反応を行った。PCR反応はHas2及びNeu遺伝子の場合には、94℃で2分間保持した後、続いて94℃の変性45秒、59℃のアニーリング1分、及び72℃で1分の伸長反応からなるサイクルを35回繰り返し、最後に、72℃で7分の伸長反応を行った。Cre遺伝子の場合には、94℃で3分間保持した後、続いて94℃の変性30秒、55℃のアニーリング1分、及び72℃で1分の伸長反応からなるサイクルを35回繰り返し、最後に、72℃で2分の伸長反応を行った。増幅したＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色して赤外線によりバンドを検出した。
【００６８】
【表１】
2007267686.tif 000002
【００６９】
（試験２：Cre組換え酵素の発現による遺伝子組換え反応の確認）
乳癌発症後約2週間で癌組織を外科的に切除し、ゲノムＤＮＡを定法に従い調整した。遺伝子組換えの成否は、CAGプロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子そしてマウスHas2遺伝子の塩基配列をもとに合成したプライマー（GAG forward、Neo reverse, Has2-7 reverse）を用いてPCR遺伝子増幅により確認した。増幅したＤＮＡ断片は、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色して検出及びそのサイズを算出した。Cre酵素の発現前後における遺伝子組換え反応は、ＤＮＡ断片の増幅及びサイズ変化により解析した。また、アガロースゲル電気泳動後、ゲルから切り出したゲル断片からＤＮＡをHigh pure PCR product purification kit （Roch Diagnostics GmbH社製）を用いて精製し、pGEM-T Easy vector system I (Promega Corp社製)を用いて、プラスミドベクターに組み込んだ。そして、そのベクターの塩基配列をABI Prism 310 Genetic Analyzer (（Applied Biosystems社製）解析して、Cre組換え酵素によるloxP 配列箇所における遺伝子組換えを確認した。
【００７０】
（試験３：ヒアルロン酸量の測定）
乳癌発症後約2週間で癌組織を外科的に切除し、200 mlの細胞溶解液 (50mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 100 mM NaCl, 500 mg/ml プロテアーゼ K, pH. 8.0) 中で破砕し、50℃、一昼夜反応して調整した。組織中のヒアルロン酸量の測定は、Itano, N. et al. J. Biol. Chem. (2004) 279, pp18679-18687を参考に実施した。簡単には、先ずBSAに架橋したヒアルロン酸を96穴プレートにコートした。次に、b-HABP（牛軟骨由来アグリカンのN末ドメインをビオチン化したヒアルロン酸プローブ）とヒアルロン酸を含むサンプルとを混合し、BSA架橋ヒアルロン酸でコートしたウェルに添加した。37℃で1時間インキュベートした後、0.2% Tween 20を含むTBS(50 mM Tris-Hcl, 0.15 M NaCl, pH. 7.5)で３回洗浄した。各ウェルにホースラディッシュパーオキシダーゼを架橋したストレプトアビジンを添加して、37℃で1時間インキュベートした。各ウェルを0.2% Tween 20を含むTBSで３回洗浄した後、DAB（ジアミノベンジジン）発色基質を添加して37℃で1時間インキュベートした。マイクロプレートリーダーにより490nmの吸光度を測定し、既知濃度のヒアルロン酸標準品から得た検量線を用いて組織中ヒアルロン酸含量を算出した。
【００７１】
（試験４：リアルタイムRT-PCR法によるHas2遺伝子発現の解析）
摘出した乳癌からトータルRNAをRNeasy total RNA Isolation kit (QIAGEN社製) を用いて単離した。200 ng当量のトータルRNAを鋳型として、ランダムプライマーを用いてreverse transcription reagent (Takara Biochemicals社製) により42℃、1時間反応して逆転写反応を行った。リアルタイム定量 PCRは、 Itano, N. et al. J. Biol. Chem. (2004) 279, pp18679-18687に従って行った。Has2遺伝子の相対発現量は、TaqMan rodent GAPDH detection reagents(Applied Biosystems, 社製)を用いて対照として測定したGAPDH mRNA の相対量の比として算出した。
【００７２】
（試験５：ウエスタンブロット分析）
癌組織をRIPA 緩衝液（10 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate and protease inhibitors, pH7.2）中で破砕して溶解液を作製した。溶解液（タンパク質10μｇ当量）をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、PVDF ナイロン膜に電気的に転写した後. 抗FLAG抗体で室温1時間反応した。0.2% Tween 20を含むTBSで３回洗浄した後、二次抗体としてホースラディッシュパーオキシダーゼを架橋した抗マウス抗体を用いて室温30分間反応した。0.2% Tween 20を含むTBSで３回洗浄した後、ECLウエスタンブロット検出試薬により反応し、FLAG融合Has2タンパク質バンドより生じた発光をX線フィルムに感光して検出した。
これらの試験の結果は、以下の通りである。
【００７３】
（試験結果A：Has2遺伝子発現誘導性トランスジェニックマウスについての結果）
Has2遺伝子の誘導性発現ベクターを受精卵に導入して得た産子のうち、PCR解析の結果、９系統に遺伝子が導入されていた。このうち導入Has2遺伝子の発現が最も高い１系統を誘導性トランスジェニックマウスとして選別した。樹立したHas2遺伝子発現誘導性トランスジェニックマウスは外見上正常に発生し、かつ生殖能力を維持していた。
【００７４】
（試験結果B：Has2遺伝子発現誘導性トランスジェニックマウスを用いた悪性乳癌発症モデルマウスについての結果）
本発明のHas2遺伝子発現誘導性トランスジェニックマウスと乳癌発症モデルマウスMMTV-Neuとを交配し、得られた産子のうち、Has2とneu両遺伝子を有するHas2/NeuダブルトランスジェニックマウスをPCR法により選別した。またMMTV-Neuトランスジェニックマウスと乳腺特異的にCre組換え酵素を発現するように設計したMMTV-Creトランスジェニックマウスとの交配により、neuとcre両遺伝子を乳腺で発現するCre/Neuダブルトランスジェニックマウスを作製した。Has2/NeuダブルトランスジェニックマウスとCre/Neuダブルトランスジェニックマウスとを交配し、４種の異なった組み合わせの遺伝子型を持つトランスジェニックマウス (Neu、 Cre/Neu、Has2/Neu (Has2+Neo)そしてHas2/Cre/Neu (Has2ΔNeo))を得た。
【００７５】
（試験結果C：誘導性トランスジェニックマウスにおけるCre-loxP遺伝子組換えの結果）
Has2+Neo とHas2ΔNeoの遺伝子型を持つトランスジェニックマウスのうち、同月齢（６ヶ月齢）の雌マウスは、FVB/N雄マウスと交配して乳癌の発症を促進した。発生した乳癌組織を外科的に切除してゲノムＤＮＡを調整した。そしてゲノムＤＮＡを鋳型にしてPCR法による遺伝子増幅と増幅した遺伝子産物の塩基配列の決定を行い、Cre酵素による遺伝子組換え反応の成否を判定した。
【００７６】
具体的には、Cre非発現群（Has2+Neo）の腫瘍から調整したゲノムＤＮＡを鋳型にCAGプロモーターとネオマイシン耐性遺伝子のプライマーによるPCR反応（#1の反応）を行い、360bpのサイズを持つＤＮＡ断片の増幅を認めた。一方、Cre発現群(Has2ΔNeo)から調整したＤＮＡを鋳型にした場合には、同サイズのＤＮＡ断片の増幅は認められなかった。また、CAGプロモーターとHas2遺伝子のプライマーを用いてPCR（#2の反応）を行った結果、Cre非発現群では1880bpのサイズを持つＤＮＡ断片の遺伝子増幅を認めたが、Cre発現群では670bpの遺伝子増幅を認めた。この結果は、二つのloxP配列で挟まれたネオマイシン耐性遺伝子が遺伝子組換えにより切り出されたことを示している。この670bpの増幅ＤＮＡ断片を単離して塩基配列を決定した結果、確かにCre組換え酵素により二つのloxP配列で遺伝子組換えが起きて、ネオマイシン耐性遺伝子が切り出されていることが確認された（Cre酵素による遺伝子組換え反応の成否をPCR法で判定した写真を示す図３参照）。Cre:Neu及びNeuマウスに発生した乳癌の標品を用いた場合には何れの遺伝子増幅も認めなかった。なお、ＭはＤＮＡサイズマーカーの泳動像を示し、側面の数値はマーカーのサイズを示す。
【００７７】
乳癌組織より組織抽出液を調整してヒアルロン酸含量を測定した結果、Cre非発現下においてヒアルロン酸の過剰な産生は認められなかった。一方、Cre発現群の乳癌においては、ヒアルロン酸含量においてCre非発現群に比して5倍以上の増加を認めた（表２参照）。
【００７８】
ヒアルロン酸糖鎖長をゲル濾過クロマトグラフィーにより検討した。対照群(Has2+Neo、Cre:Neu及びNeu：黒丸)に比べてHas2ΔNeo(白丸)において腫瘍形成速度の促進が認められた。Has2ΔNeo乳癌からのヒアルロン酸がHas2+Neo乳癌に比べて高分子ヒアルロン酸及び低分子ヒアルロン酸量において増加していることが明らかとなった（図４参照）。
【００７９】
また、リアルタイム定量PCRの結果、Has2の発現はCre発現群の乳癌において、非発現群の約１６倍高値であった（表２）。以上の結果から、本発明のヒアルロン酸合成酵素遺伝子の誘導性トランスジェニックマウスが、Creの発現によって導入Has2のヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現とヒアルロン酸の合成を増加させることが明らかとなった。
【００８０】
【表２】
2007267686.tif 000003
【００８１】
（評価試験：疾患モデル動物としての利用価値を上記乳癌発症のモデル実験系で評価）
本発明であるヒアルロン酸合成酵素遺伝子の誘導性トランスジェニックマウスについて、疾患モデル動物としての利用価値を上記乳癌発症のモデル実験系で評価した。
【００８２】
Has2+Neo とHas2ΔNeoの遺伝子型を持つトランスジェニックマウスは、発癌実験のためneu遺伝子を有しており、妊娠により雌マウスにNeu癌遺伝子によって乳癌が多発した。
この腫瘍発生率はCre発現群、即ちヒアルロン酸産生を人為的に高めた群において有意に増加していた。
【００８３】
図５に示すように、腫瘍の発生以降における腫瘍の成長速度を測定した結果、対照群(Has2+Neo、Cre:Neu及びNeu：黒丸)に比べて、Cre発現群であるHas2ΔNeo(白丸)において腫瘍形成速度の促進が認められた。
【００８４】
図６は、Cre発現下及び非発現下における乳癌の病理組織学的解析結果の写真である。それに示されるように、Cre発現下及び非発現下における乳癌の病理組織学的解析から、Has2ΔNeoマウスにおいてHas2+Neoマウスに比べ乳癌組織中に宿主線維芽細胞の侵入と著しい間質形成が認められた。なお、下段は強拡大像を示す。
【００８５】
図７は、腫瘍内間質反応と血管を免疫蛍光染色により蛍光顕微鏡下で観察した写真である。その左上下の写真は、腫瘍内の血管を抗CD31抗体により染色して観察した像で、右上下写真はそれぞれ抗I型コラーゲン抗体と抗フィブロネクチン抗体による染色像を示す。それに示されているように、Has2ΔNeo腫瘍においてHas2+Neo腫瘍に比べて微小な血管が数多く形成されており、Has2ΔNeo腫瘍において宿主線維芽細胞によって産生するフィブロネクチンやI型コラーゲンなどの細胞外基質から構成されていることが明らかとなった。
【００８６】
図８に、腫瘍血管のサイズ分布を示す。腫瘍血管のサイズ分布を抗CD31抗体による免疫染色後、蛍光顕微鏡下で測定した。その結果、これらCre発現群の乳癌においては、間質反応の結果と思われる腫瘍血管の有意な形成促進が認められた。特に、Has2ΔNeo腫瘍においてHas2+Neo腫瘍に比べて微小血管数が約二倍であることが明らかとなった。
【００８７】
以上の様な生体反応は、ヒト乳癌のうち極めて悪性度の高い硬癌で観察されることから、本実施例では、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子の誘導性トランスジェニックマウスに、乳癌特異的なヒアルロン酸産生能を付与することで悪性乳癌のモデル動物と成り得ることが実証された。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明のヒアルロン酸合成酵素遺伝子を導入した誘導性トランスジェニック動物は、Cre-loxPのような誘導性遺伝子発現システムを用いることによりCreのような部位特異的遺伝子組換え酵素の制御下にヒアルロン酸産生を人為的に制御することが可能である。
【００８９】
前記のとおり、乳癌特異的のような臓器特異的疾患発症特異的にCreのような部位特異的遺伝子組換え酵素を発現させると、腫瘍のような細胞内に著しい間質反応が惹起される。間質反応は、線維芽細胞の増殖とそれらが産生するフィブロネクチンやI型コラーゲンなどの細胞外基質の蓄積を伴って進行する。各種臓器の線維化では、この様な著しい間質反応が原因となっている。例えば、肝硬変では、肝炎ウイルスなどが原因とされる持続的な炎症によって肝臓内に間質反応が惹起され、その結果、肝臓の硬化と機能障害が起きる。従って、本発明のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現誘導性トランスジェニックマウスは、ヒアルロン酸の合成異常が疾病の進行と深く結びついている癌、そのような癌の浸潤・転移、さらには、動脈硬化や肝硬変などの各種臓器の繊維化のモデル動物として応用可能である。
【００９０】
肝硬変のモデル動物を想定した場合には、肝特異的にCre等の部位特異的遺伝子組換え酵素を発現するトランスジェニック動物と、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現誘導性トランスジェニック動物を交配することで、肝臓でのヒアルロン酸産生の増加を誘導することが可能である。次に肝傷害により炎症状態を惹起することで、肝硬変のモデル動物を作り出し得る。
【００９１】
本発明の特徴は肝臓以外にも、肺や腎、動脈などに特異的にCre等の等の部位特異的遺伝子組換え酵素を発現させることで、肺線維症、腎線維症、動脈硬化など臓器線維症を発症するモデル動物を簡便にかつ経済的に生み出すことができる。
【００９２】
Cre等の部位特異的遺伝子組換え酵素制御下に組織の間質反応を誘導できる本発明のヒアルロン酸合成酵素遺伝子の誘導性トランスジェニック動物は、Cre等の部位特異的遺伝子組換え酵素の発現部位を調節することにより、あらゆる組織・臓器において時空間的にヒアルロン酸合成酵素の発現とヒアルロン酸産生を制御することが可能である。Cre組換え酵素の時空間的発現制御は、それをコードする遺伝子を組織特異的プロモーターによって制御することやウィルスベクターを用いて、局所で発現させることによって可能である。
【００９３】
更に、Cre等の部位特異的遺伝子組換え酵素発現システムを構築することにより、必要に応じ、任意の場所に任意の時期に、ヒアルロン酸産生を誘導することが可能であり、新規疾患も出る動物を創出することができる。
【００９４】
これらモデル動物は、上記疾患の治療のための治療法や治療薬開発において、前臨床動物試験を支えるために、極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】本発明を適用するトランスジェニック動物作製に用いたヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入プラスミドのＤＮＡ断片のコンストラクトの構造とCreリコンビナーゼによる遺伝子組換えを模式的に表す図である。
【００９６】
【図２】本発明を適用するヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入プラスミドのＤＮＡ断片の遺伝子配列の一部を示す図である。
【００９７】
【図３】本発明を適用する病態モデル用トランスジェニック動物につき、Cre酵素による遺伝子組換え反応の成否をPCR法で判定した写真である。
【００９８】
【図４】本発明を適用する病態モデル用トランスジェニック動物につき、ヒアルロン酸糖鎖長をゲル濾過クロマトグラフィーで分析した結果を示すグラフである。
【００９９】
【図５】本発明を適用する病態モデル用トランスジェニック動物につき、腫瘍の成長速度を測定した結果を示すグラフである。
【０１００】
【図６】本発明を適用する病態モデル用トランスジェニック動物につき、Cre発現下及び非発現下における乳癌の病理組織学的解析結果を示す写真である。
【０１０１】
【図７】本発明を適用する病態モデル用トランスジェニック動物につき、腫瘍内間質反応と血管を免疫蛍光染色により蛍光顕微鏡下で観察した写真である。
【０１０２】
【図８】本発明を適用する病態モデル用トランスジェニック動物につき、腫瘍血管のサイズ分布を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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