(57)【要約】      （修正有）【課題】ＤＨＰＳの制御メカニズム及びん発症メカニズムの未解明だった部分を明らかにしすると共に、新規な抗がん剤を提供する。【解決手段】ＥＲＫとＤＨＰＳとが相互作用すること、及び、ＥＲＫのリン酸化により、前記相互作用が抑制されることを新規に見出した。これらの事項から、（１）ＥＲＫがＤＨＰＳと相互作用し、ＤＨＰＳの立体構造中に存在する酵素活性部位と球状構造との相互作用状態を保持することにより、ＤＨＰＳの酵素活性（ＩＦ５Ａのハイプシン化）を抑制する。（２）ＥＲＫがリン酸化された場合、ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用が抑制され、ＤＨＰＳの酵素活性部位と球状構造との相互作用状態が保持されないため、ＤＨＰＳが酵素活性化し、ＩＦ５Ａをハイプシン化するような作用メカニズムの存在が強く示唆された。ＤＨＰＳの酵素活性部位と球状構造との相互作用状態を保持又は固定化する物質は抗がん剤として有用な可能性がある。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＲＫと相互作用するＤＨＰＳ。
【請求項２】
立体構造中に酵素活性部位と、その偽基質である球状構造を有し、
ＥＲＫと相互作用することにより、前記酵素活性部位と前記球状構造との相互作用状態が保持されることを特徴とする請求項１記載のＤＨＰＳ。
【請求項３】
ＥＲＫのリン酸化により、ＥＲＫとの相互作用が抑制されることを特徴とする請求項１記載のＤＨＰＳ。
【請求項４】
立体構造中に酵素活性部位と、その偽基質である球状構造を有し、
ＥＲＫのリン酸化により、前記酵素活性部位と前記球状構造との相互作用状態が保持されなくなることを特徴とする請求項１記載のＤＨＰＳ。
【請求項５】
ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用。
【請求項６】
相互作用するＥＲＫとＤＨＰＳ。
【請求項７】
ＤＨＰＳと相互作用するＥＲＫ。
【請求項８】
ＤＨＰＳの立体構造中に存在する酵素活性部位と、同じくＤＨＰＳの立体構造中に存在し前記酵素活性部位の偽基質である球状構造との相互作用状態を保持又は固定化する物質を少なくとも含有する抗がん剤。
【請求項９】
前記物質は、ＥＲＫであることを特徴とする請求項８記載の抗がん剤。
【請求項１０】
前記物質は、デコイとして働くＥＲＫアナログであることを特徴とする請求項８記載の抗がん剤。
【請求項１１】
前記物質は、ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用を固定化する物質であることを特徴とする請求項８記載の抗がん剤。
【請求項１２】
前記物質は、ＥＲＫのリン酸化状態を保持しつつ、ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用を回復させる物質であることを特徴とする請求項８記載の抗がん剤。
【請求項１３】
前記物質は、ＤＨＰＳの立体構造中に存在する酵素活性部位と球状構造を固定化する物質であることを特徴とする請求項８記載の抗がん剤。
【請求項１４】
前記物質は、ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用を促進する物質であることを特徴とする請求項８記載の抗がん剤。
【請求項１５】
前記物質は、ＥＲＫの発現を促進する物質であることを特徴とする請求項８記載の抗がん剤。
【請求項１６】
前記物質は、抗体であることを特徴とする請求項８記載の抗がん剤。
【請求項１７】
ＤＨＰＳの立体構造中に存在する球状構造の代わりに、同じくＤＨＰＳの立体構造中に存在する酵素活性部位と相互作用する物質を少なくとも含有する抗がん剤。
【請求項１８】
前記物質は、ＤＨＰＳの立体構造中に存在する球状構造のデコイとして働くアナログであることを特徴とする請求項１７記載の抗がん剤。
【請求項１９】
ＤＨＰＳの立体構造中に存在する酵素活性部位と、同じくＤＨＰＳの立体構造中に存在し前記酵素活性部位の偽基質である球状構造との相互作用状態を保持又は固定化する物質を探索することによる、抗がん剤のスクリーニング方法。
【請求項２０】
デコイとして働くＥＲＫアナログを探索することを特徴とする請求項１９記載のスクリーニング方法。
【請求項２１】
ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用を固定化する物質を探索することを特徴とする請求項１９記載のスクリーニング方法。
【請求項２２】
ＥＲＫのリン酸化状態を保持しつつ、ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用を回復させる物質を探索することを特徴とする請求項１９記載のスクリーニング方法。
【請求項２３】
ＤＨＰＳの立体構造中に存在する酵素活性部位と球状構造を固定化する物質を探索することを特徴とする請求項１９記載のスクリーニング方法。
【請求項２４】
ＤＨＰＳの立体構造中に存在する球状構造の代わりに、同じくＤＨＰＳの立体構造中に存在する酵素活性部位と相互作用する物質を探索することによる、抗がん剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質間相互作用に関する。より詳細には、ＥＲＫと相互作用するＤＨＰＳ、ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用、抗がん剤、抗がん剤のスクリーニング方法、などに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＡＰキナーゼ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｂａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）カスケードは、代表的な細胞内シグナル伝達経路の一つで、多様な生命現象の制御に関与することが知られている。このカスケードは、ＭＡＰＫＫＫ（ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ）、ＭＡＰＫＫ（ＭＡＰキナーゼキナーゼ）、ＭＡＰＫ（ＭＡＰキナーゼ）の三つのキナーゼ（リン酸化酵素）で構成され、ＭＡＰＫＫＫがＭＡＰＫＫをリン酸化して活性化し、ＭＡＰＫＫがＭＡＰＫをリン酸化して活性化することにより、細胞膜表面のシグナルを核内に伝達する経路である。代表的なＭＡＰキナーゼとして、ＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８が知られている。
【０００３】
そのうち、ＥＲＫ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ−Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｋｉｎａｓｅ）は、細胞の増殖、分化、生存に関与するＭＡＰキナーゼで、ＥＲＫ１とＥＲＫ２の二つのアイソフォームがある。
【０００４】
ＥＲＫを介したＭＡＰキナーゼカスケードとして、例えば、次のカスケードが知られている。発ガン遺伝子ＲａｓなどがＭＡＰＫＫＫのＲａｆ１、Ｂ−Ｒａｆなどを活性化し、それらのＭＡＰＫＫＫがＭＡＰＫＫのＭＥＫ（ＭＫＫ１、ＭＫＫ２など）を活性化し、ＭＥＫがＥＲＫを活性化（リン酸化）する。活性化されたＥＲＫ（リン酸化ＥＲＫ）は、核内に移行し、転写因子（Ｅｌｋ１、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎなど）などのエフェクターに作用する（非特許文献１など参照）。
【０００５】
また、上記のカスケード（発ガン遺伝子ＲａｓなどによってＥＲＫが活性化されるカスケード）は、腫瘍細胞の増殖率を増加させることが知られている。そこで、新規抗がん剤として、このカスケードを抑制する物質を探索する試みが行われている（非特許文献１参照）。
【０００６】
ここで、本発明と関連性があるタンパク質、ＤＨＰＳについて説明する。
【０００７】
ＤＨＰＳ（ＤｅｏｘｙＨｙＰｕｓｉｎｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ）は、スペルミジン存在下で、ｅＩＦ５Ａ（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ５Ａ）をハイプシン化（活性化）する酵素である（図１０参照）。
ＤＨＰＳは、立体構造中に、酵素活性部位（本体構造）、鎖状構造、球状構造を有し、酵素活性部位と球状構造は、鎖状構造を介して繋がっている。立体構造解析などにより、酵素活性部位と球状構造は相互作用することが知られており、球状構造は酵素活性部位の偽基質であると推測されている。
酵素活性部位と球状構造との相互作用は、４分子間で行われている。即ち、ＤＨＰＳは四量体を形成し、いずれかのＤＨＰＳの酵素活性部位と他のＤＨＰＳの球体構造とが、それぞれ、相互作用している。そして、酵素活性部位と球状構造とが相互作用している状態の時、酵素活性（ＩＦ５Ａのハイプシン化）が抑制され、両構造が相互作用していない状態の時、酵素活性化すると推測されている（非特許文献２参照）。
【０００８】
なお、ＩＦ５Ａの活性化と子宮頚部がん・前立腺がんとの関係が報告されており、がんマーカーとして注目されている（例えば、非特許文献３参照）。
【非特許文献１】Johnson G.L et al, “Mitogen-activated Protein Kinase PathwaysMediated by ERK, JNK, and p38 Protein Kinases” Science, Vol.298:1911-1992(2002)
【非特許文献２】Der-Ing Liao, Edith C Wolff, Myung Hee Park and David R Davies, “Crystalstructure of the NAD complex of human deoxyhypusine synthase: an enzyme with aball-and-chain mechanism for blocking the active site.” J.Bio.Chem. 2004 279:28697-28705
【非特許文献３】Cracchiolo BM, Heller DS, Clement PM, Wolff EC, Park MH,Hanauske-Abel HM, “Eukaryotic initiation factor 5A-1(eIF5A-1) as a diagnosticmarker for aberrant proliferation in intraepithelial neoplasia of the vulva.”Gynecol Oncol. 2004 94:217-22
【非特許文献４】Young Ae Joe, Edith C. Wolff, and Myung Hee Park “Cloning andExpression of Human Deoxyhypusine Synthase cDNA.” J.Bio.Chem. 1995 270:22386-22392
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前記の通り、ＤＨＰＳは、がんマーカーとして注目されている。しかし、ＤＨＰＳの制御メカニズムとがん化との関係は不明のままである。
また、発ガン遺伝子ＲａｓなどからＥＲＫまでのカスケードと、がん発症との関連性については、前記の通り明らかになりつつあるが、ＥＲＫ活性化からがん発症に至る経路については、未解明のままである。
【００１０】
そこで、本発明は、ＤＨＰＳの制御メカニズムを明らかにすること、がん発症メカニズムの未解明だった部分を明らかにすること、及び、新規な抗がん剤を提供すること、を主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明では、まず、ＥＲＫと相互作用するＤＨＰＳ、ＤＨＰＳと相互作用するＥＲＫ、並びに、ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用、を提供する。
【００１２】
上述の通り、ＤＨＰＳが、立体構造中に、酵素活性部位と球状構造を有すること、及び、酵素活性部位と球状構造とが相互作用すること、が知られている。また、上述の通り、球状構造は酵素活性部位の偽基質であると推測されている。
しかし、全長のＤＨＰＳは、単独でも酵素活性がある（非特許文献４参照）。即ち、ＤＨＰＳの立体構造中に球状構造が存在する場合でも、ＤＨＰＳの酵素活性は抑制されないため、球状構造が偽基質としてどのように機能しているかどうか、不明であった。
一方、ＤＨＰＳの球状構造が、酵素活性部位の偽基質として、ＤＨＰＳの活性制御に関与すると仮定した場合、酵素活性部位と球状構造との相互作用状態を安定的に保持させる別の分子の存在を想定できる。即ち、その分子が、両者の相互作用状態を保持させることにより、ＤＨＰＳの酵素活性を調節していると想定できる。
【００１３】
本発明者らは、ＥＲＫとＤＨＰＳとが相互作用（結合）すること、及び、ＥＲＫのリン酸化により、前記相互作用が抑制されることを新規に見出した。
このことは、ＥＲＫが、ＤＨＰＳの立体構造中の酵素活性部位と球状構造との相互作用を安定的に保持し、ＤＨＰＳの酵素活性を調節している可能性を強く示唆する。
【００１４】
従って、本発明者らは、これらの事項より、ＤＨＰＳの活性制御メカニズムが次の通りであると推測する。
ＥＲＫがＤＨＰＳと相互作用し、ＤＨＰＳの酵素活性部位と球状構造との相互作用状態を保持させることにより、ＤＨＰＳの酵素活性（ＩＦ５Ａのハイプシン化）を抑制する。
一方、ＥＲＫがリン酸化された場合、ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用が抑制され、ＤＨＰＳの酵素活性部位と球状構造との相互作用状態が保持されないため、ＤＨＰＳが酵素活性化し、ＩＦ５Ａをハイプシン化する。
【００１５】
続いて、本発明では、ＤＨＰＳの立体構造中に存在する酵素活性部位と球状構造との相互作用状態を保持又は固定化する物質を少なくとも含有する抗がん剤、及び、ＤＨＰＳの立体構造中に存在する球状構造の代わりに、同じくＤＨＰＳの立体構造中に存在する酵素活性部位と相互作用する物質を少なくとも含有する抗がん剤、を提供する。
【００１６】
上記の新知見は、また、次のようながん発症メカニズムの存在を強く示唆する。
発ガン遺伝子ＲａｓなどによってＥＲＫが活性化されるカスケードなどにより、ＥＲＫの活性化（リン酸化）が亢進する。ＥＲＫのリン酸化により、ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用が解除され、ＤＨＰＳの酵素活性部位と球状構造との相互作用状態が保持されなくなる。それにより、ＤＨＰＳが過剰に酵素活性化し、ＩＦ５Ａが過剰にハイプシン化し、がん化を促進する。
【００１７】
従って、ＤＨＰＳの酵素活性部位と球状構造との相互作用状態を保持又は固定化する物質、または、球状構造の代わりに酵素活性部位と相互作用する物質は、抗がん剤としての適用される可能性が高い。
【００１８】
具体的には、例えば、次のような物質を抗がん剤として想定する。
（１）ＥＲＫ自体、
（２）デコイとして働くＥＲＫアナログ、
（３）ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用を固定化する物質（例えば、ＥＲＫとＤＨＰＳの両者に結合し、架橋する物質）、
（４）ＥＲＫのリン酸化状態を保持しつつ、ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用を回復させる物質、
（５）ＤＨＰＳの立体構造中に存在する酵素活性部位と球状構造との相互作用状態を固定化する物質（例えば、酵素活性部位と球状構造を架橋する物質）、
（６）ＤＨＰＳの鎖状構造に作用する物質、
（７）抗体（例えば、ＥＲＫとＤＨＰＳの両者と結合し、両者の相互作用を保持させる抗体、若しくはＤＨＰＳの立体構造中に存在する酵素活性部位と球状構造の両者に結合し、両者の相互作用を保持させる抗体）、
（８）ＤＨＰＳの球状構造のデコイとして働くアナログ（ボールアナログ）、
（９）ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用を促進する物質、
（１０）ＥＲＫの発現を促進する物質。
【００１９】
続いて、本発明では、ＤＨＰＳの酵素活性部位と球状構造との相互作用状態を保持又は固定化する物質を探索することによる、抗がん剤のスクリーニング方法、及び、ＤＨＰＳの立体構造中に存在する球状構造の代わりに、酵素活性部位と相互作用する物質を探索することによる、抗がん剤のスクリーニング方法を提供する。
例えば、候補物質に、ＤＨＰＳの酵素活性部位と球状構造との相互作用状態を保持又は固定化する作用がある場合、または、候補物質が、ＤＨＰＳの球状構造の代わりにＤＨＰＳの酵素活性部位と相互作用する場合、その物質は、抗がん剤として有効な可能性がある。
【００２０】
以下、本発明に係るタンパク質について、説明する。
【００２１】
本発明に係るＥＲＫは、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、若しくは前記いずれかのタンパク質のアミノ酸配列と相同性を有し、ＤＨＰＳと相互作用する領域を保持するタンパク質である。即ち、例えば、前記いずれかのタンパク質のスプライシング・バリアント（同一の遺伝子に由来するが、スプライシングにより、配列の一部が異なっているタンパク質、以下同じ）や、前記いずれかのタンパク質のアミノ酸配列中の一部に、置換、欠損、挿入、付加部分が含まれる場合も、本発明に係るＥＲＫに包含される。なお、ＥＲＫ１は、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質、ＥＲＫ２は、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質である。
【００２２】
本発明に係るＤＨＰＳは、配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくはＤＨＰＳのアミノ酸配列と相同性を有し、ＥＲＫと相互作用する領域を保持するタンパク質である。即ち、例えば、前記タンパク質のスプライシング・バリアントや、前記アミノ酸配列中の一部に、置換、欠損、挿入、付加部分が含まれる場合も、本発明に係るＤＨＰＳに包含される。
【発明の効果】
【００２３】
本発明は、がん発症メカニズムの解明の一助になるほか、新規な作用メカニズムに基づく抗がん剤又はそのスクリーニング方法などに応用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
＜ＥＲＫ、ＤＨＰＳ、ＩＦ５Ａの相互関係について＞
はじめに、図１から図４を用いて、ＥＲＫ、ＤＨＰＳ、ＩＦ５Ａの相互関係について、説明する。
【００２５】
図１は、ＥＲＫによるＤＨＰＳ活性制御メカニズムを示す模式図である。
【００２６】
図１中、（Ａ）は、ＤＨＰＳがＩＦ５Ａと相互作用（結合）し、ＩＦ５Ａをハイプシン化することを示す。ハイプシン化ＩＦ５Ａ（Ｈｐｕ−ＩＦ５Ａ）は、上述の通り、活性化状態であり、細胞増殖を惹起する。また、ＩＦ５Ａの過剰なハイプシン化は、がん化を惹起する。
【００２７】
図１中、（Ｂ）は、ＥＲＫが存在する場合、ＥＲＫとＤＨＰＳとが相互作用し、ＩＦ５ＡとＤＨＰＳは相互作用しないことを示す。その場合、ＩＦ５ＡとＤＨＰＳは相互作用しないため、ＩＦ５Ａはハイプシン化されない。
【００２８】
図１中、（Ｃ）は、ＥＲＫがＭＥＫによってリン酸化（図中、「Ｐ−」）された場合、ＥＲＫとＤＨＰＳの相互作用は抑制され、ＩＦ５ＡとＤＨＰＳとが相互作用することを示す。その場合、ＤＨＰＳとＩＦ５Ａが相互作用するため、ＩＦ５Ａはハイプシン化され、活性化する。
【００２９】
図２は、ＤＨＰＳの酵素活性部位と球状構造とが相互作用する前の状態を示す模式図、図３は、ＤＨＰＳの酵素活性部位と球状構造が相互作用した状態を示す模式図、図４は、ＤＨＰＳとＥＲＫとが相互作用した状態を示す模式図である。
【００３０】
ＤＨＰＳ（符号１）は、立体構造中に、酵素活性部位１１、鎖状構造１２、球状構造１３を有する。酵素活性部位１１には、球状構造１３との相互作用部位１１１が存在する。
ＥＲＫ（符号２）は、立体構造中に、リン酸結合部位（ＭＥＫなどによってリン酸化される部位、図示せず）、酵素活性部位（基質と相互作用し、基質をリン酸化する部位、図示せず）、ＤＨＰＳ相互作用部位（ＤＨＰＳと相互作用する部位）などを有する。
【００３１】
ＤＨＰＳの酵素活性（ＩＦ５Ａのハイプシン化）の抑制に関する作用メカニズムは、次の通りである。
まず、ＤＨＰＳの酵素活性部位１１と球状構造１３とが相互作用（符号Ｂ）する（図２及び図３参照）。次に、ＤＨＰＳの酵素活性部位１１と球状構造１３とが相互作用した状態で、ＤＨＰＳとＥＲＫが相互作用（符号Ａ）し（図３及び図４参照）、ＤＨＰＳの酵素活性部位１１と球状構造１３との相互作用状態が保持される（図４参照）。これにより、ＤＨＰＳの酵素活性が抑制され、ＩＦ５Ａ（図示せず）のハイプシン化が抑制される。
【００３２】
一方、ＤＨＰＳの酵素活性化に関する作用メカニズムは、次の通りである。
まず、ＤＨＰＳとＥＲＫとが相互作用した状態（図４参照）から、ＥＲＫがリン酸化され、解離する（図３参照）。ＥＲＫがＤＨＰＳから解離することにより、ＤＨＰＳの酵素活性部位１１と球状構造１３との相互作用Ｂが保持されない状態（解離可能な状態）になる。（図２参照）。そして、ＤＨＰＳの酵素活性部位１１と球状構造１３との相互作用Ｂが解除されることにより、ＤＨＰＳが酵素活性を回復し、ＩＦ５Ａ（図示せず）をハイプシン化する。
【００３３】
なお、図２から図４では、ＤＨＰＳが四量体を形成し、いずれかのＤＨＰＳの酵素活性部位１１と、他分子のＤＨＰＳの球状構造１３と相互作用しているが、本発明はそのような場合のみに狭く限定されない。即ち、例えば、ＤＨＰＳの同一分子内の酵素活性部位１１と球状構造１３とが相互作用する場合や、四量体でない場合も、本発明に包含される。
【００３４】
＜抗がん剤について＞
続いて、図５を用いて、本発明に係る抗がん剤について説明する。
【００３５】
上述の通り、本発明に係る抗がん剤として、ＤＨＰＳの立体構造中に存在する酵素活性部位と球状構造との相互作用状態を保持又は固定化する物質、前記球状構造の代わりに前記酵素活性部位と相互作用する物質、などを想定できる。
具体的には、（１）ＥＲＫ自体、（２）デコイとして働くＥＲＫアナログ、（３）ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用を固定化する物質（例えば、ＥＲＫとＤＨＰＳの両者に結合し、架橋する物質）、（４）ＥＲＫのリン酸化状態を保持しつつ、ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用を回復させる物質、（５）ＤＨＰＳの立体構造中に存在する酵素活性部位と球状構造との相互作用状態を固定化する物質（例えば、酵素活性部位と球状構造を架橋する物質）、（６）ＤＨＰＳの鎖状構造を作用する物質、（７）抗体（例えば、ＥＲＫ又はＤＨＰＳ、若しくはその両者と結合し、両者の相互作用を保持させる抗体、ＤＨＰＳの立体構造中に存在する酵素活性部位又は球状構造、若しくはその両者に結合し、両者の相互作用を保持させる抗体）、
（８）ＤＨＰＳの立体構造中に存在する球状構造のデコイとして働くアナログ（ボールアナログ）、（９）その他、などが想定できる。以下、順に説明する。
【００３６】
（１）ＥＲＫ自体：
前記の通り、ＥＲＫは、ＤＨＰＳと相互作用し、ＤＨＰＳの酵素活性部位１１と球状構造１３との相互作用状態を保持させる（図５符号２参照）。従って、ＥＲＫ自体が、ＩＦ５Ａの過剰なハイプシン化を抑制する可能性、即ち、抗がん剤としての適用可能性がある。
【００３７】
（２）デコイとして働くＥＲＫアナログ：
ＥＲＫアナログとは、ＥＲＫ立体構造中のＤＨＰＳ相互作用部位と類似の構造を有し、ＥＲＫのおとりとして、ＤＨＰＳ立体構造中のＥＲＫ相互作用部位に結合することができる物質をいう（図５符号Ｍ１参照）。ＥＲＫアナログには、ＥＲＫ立体構造中の、ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用部位又はその一部分と同様の立体構造を含むタンパク質又はポリペプチドも含まれる。
ＥＲＫアナログを用いることにより、ＤＨＰＳの酵素活性部位１１と球状構造１３との相互作用状態を保持又は固定化できるため、抗がん剤としての適用可能性がある。
また、ＥＲＫアナログには、副作用が少ない可能性が高いという有利性がある。ＥＲＫは、細胞内の様々な生命現象に関わっているため、ＥＲＫに直接的に作用する抗がん剤は、副作用を持つ可能性が高い。それに対し、ＥＲＫアナログは、ＥＲＫのその他の機能に影響を与えずに、ＤＨＰＳの酵素活性化を抑制できるため、副作用の少ない可能性が高い。
【００３８】
（３）ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用を固定化する物質：
ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用を固定化する物質として、例えば、ＥＲＫとＤＨＰＳの両者と共有結合を形成し、ＥＲＫの解離を抑制する物質（架橋剤）が挙げられる（図５符号Ｍ２参照）。
例えば、この物質がＥＲＫとＤＨＰＳの両者を架橋し、ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用を固定化することにより、ＤＨＰＳの酵素活性部位と球状構造との解離を抑制できるため、抗がん剤として、適用可能性がある。
なお、この物質も、ＥＲＫの酵素活性（基質のリン酸化）に影響を与えないため、副作用が少ない可能性が高い。
【００３９】
（４）ＥＲＫのリン酸化状態を保持しつつ、ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用を回復させる物質：
この物質は、ＥＲＫのリン酸化状態を保持することにより、ＭＡＰキナーゼとしての機能を保持できるため、生体に与える影響（副作用）を抑えることができる。
一方、ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用が回復するため、ＤＨＰＳの酵素活性部位１１と球状構造１３との解離を抑制できる。
従って、この物質は、副作用の少ない抗がん剤として、適用可能性がある。
【００４０】
（５）ＤＨＰＳの立体構造中に存在する酵素活性部位と球状構造との相互作用状態を固定化する物質：
このような物質として、例えば、酵素活性部位と球状構造を架橋する物質が挙げられる（図５符号Ｍ３参照）。
例えば、この物質が、ＤＨＰＳの立体構造中の酵素活性部位と球状構造とを架橋すると、両者の解離を抑制できるため、抗がん剤として、適用可能性がある。
なお、この物質も、ＥＲＫの酵素活性（基質のリン酸化）に影響を与えないため、副作用が少ない可能性が高い。
【００４１】
（６）ＤＨＰＳの鎖状構造に作用する物質：
例えば、この物質が、ＤＨＰＳの立体構造中の鎖状構造に作用することにより、ＤＨＰＳの立体構造中に存在する酵素活性部位と球状構造との相互作用状態を保持又は固定化する場合、抗がん剤として、適用可能性がある（図５符号Ｍ４参照）。
【００４２】
（７）抗体：
例えば、この物質が、ＥＲＫ又はＤＨＰＳ、若しくはその両者と結合し、両者の相互作用を保持させる抗体である場合、その抗体がＥＲＫとＤＨＰＳの両者に結合して両者を架橋し、ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用を保持させる。従って、ＤＨＰＳの酵素活性部位と球状構造との解離を抑制できるため、抗がん剤として、適用可能性がある（図５符号Ｍ５参照）。
【００４３】
また、例えば、この物質が、ＤＨＰＳの立体構造中に存在する酵素活性部位又は球状構造、若しくはその両者に結合し、両者の相互作用を保持させる抗体である場合、その抗体が、ＤＨＰＳの立体構造中の酵素活性部位と球状構造の両者に結合して両者を架橋し、両者の解離を抑制する。従って、両者の相互作用状態を保持させることができるため、抗がん剤として、適用可能性がある（図５符号Ｍ６参照）。
【００４４】
なお、抗体は、公知方法により作製可能である。また、これらの抗体は、ＥＲＫの酵素活性（基質のリン酸化）に影響を与えないため、副作用が少ない可能性が高い。
【００４５】
（８）ＤＨＰＳの立体構造中に存在する球状構造のデコイとして働くアナログ（ボールアナログ）：
この物質が、ＤＨＰＳの立体構造中に存在する球状構造の代わりに、酵素活性部位に結合すると、ＤＨＰＳの酵素活性部位と球状構造との相互作用状態が擬似的に保持された状態となるため、ＤＨＰＳの酵素活性が抑制される可能性がある。従って、この物質は、抗がん剤として適用可能性がある（図５符号Ｍ７参照）。
なお、このアナログには、球状構造中の、酵素活性部位との相互作用部位又はその一部分と同様の立体構造を含むタンパク質又はポリペプチドも含まれる。
【００４６】
（９）その他：
その他、ＤＨＰＳの立体構造中に存在する酵素活性部位と球状構造との相互作用状態を保持又は固定化する物質として、例えば、ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用を促進する物質、ＥＲＫの発現を促進する物質、なども想定できる。
これらの物質も、上記と同様、ＤＨＰＳの酵素活性部位と球状構造との解離を抑制できるため、抗がん剤としての適用可能性がある。
【００４７】
＜スクリーニング方法について＞
続いて、本発明に係るスクリーニング方法の例について、以下説明する。
【００４８】
ＤＨＰＳの酵素活性部位と球状構造との相互作用状態を保持又は固定化する物質を探索することにより、または、ＤＨＰＳの立体構造中に存在する球状構造の代わりに、酵素活性部位と相互作用する物質を探索することにより、抗がん剤を探索できる可能性がある。
【００４９】
デコイとして働くＥＲＫアナログの探索は、例えば、候補物質とＤＨＰＳとの相互作用を検出することにより行うことができる。ＤＨＰＳと相互作用する物質は、ＥＲＫと同様、ＤＨＰＳの立体構造中に存在する酵素活性部位と球状構造との相互作用状態を保持又は固定化する物質である可能性がある。
【００５０】
ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用を固定化する物質（架橋剤など）を探索する場合、例えば、次のような方法により、目的の物質を探索する。
ＥＲＫとＤＨＰＳの存在下に、候補物質を供給した後、ＭＥＫなどを供給する。そして、ＭＥＫによりＥＲＫがリン酸化された後も、引き続き、ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用状態が保持されている場合、その物質は、目的の物質である可能性がある。
【００５１】
ＥＲＫのリン酸化状態を保持しつつ、ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用を回復させる物質を探索する場合、例えば、次のような方法により、目的の物質を探索する。
リン酸化ＥＲＫとＤＨＰＳの存在下に、候補物質を供給した後、そのリン酸化ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用を検出する。そして、その相互作用が検出できた場合、その物質は目的の物質である可能性がある。
【００５２】
ＤＨＰＳの立体構造中に存在する酵素活性部位と球状構造を固定化する物質、若しくはＤＨＰＳの立体構造中に存在する球状構造の代わりに、酵素活性部位と結合する物質（ＤＨＰＳの球状構造のデコイとして働くアナログなど）、を探索する場合、例えば次のような方法により、目的の物質を探索する。
ＤＨＰＳとＩＦ５Ａとスペルミジンの存在下に候補物質を供給し、ＩＦ５Ａのハイプシン化（活性化）を検出する。そして、ＩＦ５Ａのハイプシン化が抑制された場合、その物質は、目的の物質である可能性がある。
【００５３】
その他、ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用を促進する物質を探索する場合は、例えば、ＥＲＫとＤＨＰＳ存在下に候補物質を供給し、相互作用を検出することにより行うことができる。
また、ＥＲＫの発現を促進する物質を探索する場合は、例えば、培養細胞に候補物質を供給し、ＥＲＫの発現量をウエスタンブロットなどで検出することにより行うことができる。
【００５４】
なお、上述の各スクリーニング方法において、タンパク質間の相互作用の検出は、既知の方法を用いることができる。例えば、共免疫沈降法、カラムを用いたプルダウン法、質量分析計を用いた方法、蛍光標識を用いたイメージング、などを適用できる。
【００５５】
本発明に係る各スクリーニング方法は、全て、キット化が可能である。その場合、例えば、ＭＥＫ、ＥＲＫ、ＤＨＰＳ、抗ＥＲＫ抗体、抗ＤＨＰＳ抗体、相互作用検出試薬（共免疫沈降法、カラムを用いたプルダウン法、ウエスタンブロットなどに用いる試薬、質量分析に用いる試薬）などを、相互作用検出方法に応じて適宜組み合わせ、キット化する。その場合、前記各タンパク質は、変異体を用いてもよい（ＤＨＰＳの酵素活性部位のみ又は球状構造のみの変異体を含む）。
【実施例１】
【００５６】
実施例１は、ＥＲＫがＤＨＰＳの酵素活性を抑制すること、及び、ＥＲＫをリン酸化するとＤＨＰＳの酵素活性が回復することを示した実験である。
【００５７】
前記の通り、ＤＨＰＳは、スペルミジン存在下で、ＩＦ５Ａをハイプシン化する酵素である。そこで、本実験では、ハイプシン化されたＩＦ５Ａを質量分析計で測定することにより、ＤＨＰＳの酵素活性を検出した。実験手順の概要と実験結果を、以下に示す。
【００５８】
まず、本実験に用いるタンパク質であるＤＨＰＳ、ＩＦ５Ａ、ＥＲＫ、ドミナントアクティブＭＥＫ（以下、「ｄａＭＥＫ」とする）を調製した。調製は一般的に用いられている方法により行った。まず、コード遺伝子をプラスミドに組み込んだ後、大腸菌にそのプラスミドをトランスフェクションし、大腸菌を増殖させた。次に、大腸菌を溶解した後、大腸菌内に発現した目的のタンパク質を精製した。
【００５９】
なお、「ｄａＭＥＫ」は、活性化した状態で発現させたＭＥＫである（即ち、常に、ＥＲＫリン酸化能を有する）。「ＭＥＫ」は、上述の通り、ＭＡＰＫＫであり、活性化（リン酸化）したＭＥＫは、ＥＲＫをリン酸化する。
【００６０】
次に、ＩＦ５Ａとスペルミジンの存在下に、ＤＨＰＳを添加し、ハイプシン化されたＩＦ５Ａを質量分析計で測定した。その結果、ハイプシン化ＩＦ５Ａが検出された（図６中、「１」の棒グラフ）。なお、図６中のグラフの縦軸は、本実験条件におけるハイプシン化ＩＦ５Ａ検出量（測定値）を１００％とした時の割合（％）を示す。
【００６１】
次に、上記実験条件に、さらに、ＥＲＫを加え、ハイプシン化されたＩＦ５Ａを質量分析計で検出した。その結果、ハイプシン化ＩＦ５Ａはほとんど検出されなかった（図６中、「２」の棒グラフ）。即ち、ＥＲＫを加えることにより、ＤＨＰＳの酵素活性は、ほぼ完全に抑制された。
【００６２】
次に、上記実験条件に、さらに、ｄａＭＥＫを加え、ハイプシン化されたＩＦ５Ａを質量分析計で検出した。その結果、ハイプシン化ＩＦ５Ａ検出量は、４０％強まで回復した（図６中、「３」の棒グラフ）。即ち、ｄａＭＥＫを加えることにより、ＤＨＰＳの酵素活性は、回復した。
【００６３】
以上の実験結果は、ＤＨＰＳの酵素活性がＥＲＫにより完全に抑制され、ＥＲＫをリン酸化することにより、ＤＨＰＳの酵素活性が回復すること、即ち、ＥＲＫがＤＨＰＳの酵素活性を調節していることを示す。
【００６４】
上述の通り、ＤＨＰＳの立体構造中に存在する球状構造が、酵素活性部位の偽基質として、ＤＨＰＳの活性制御に関与すると仮定した場合、酵素活性部位と球状構造との相互作用を安定的に保持させる別の分子の存在を想定できる。
従って、上記実験結果は、また、ＥＲＫが、ＤＨＰＳの立体構造中の酵素活性部位と球状構造との相互作用を保持させる分子であることを強く示唆する。
【実施例２】
【００６５】
実施例２は、ＥＲＫが、ＤＨＰＳとＩＦ５Ａとの相互作用（結合）を抑制することを示した実験である。実験手順の概要を以下に示す。
【００６６】
まず、本実験に用いる三つのタンパク質、ＥＲＫ、ＤＨＰＳ、ＩＦ５Ａを調製した。調製は、前記と同様、一般的に用いられている方法により行った。なお、ＤＨＰＳは、Ｎ末端側にＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）タグを付け、ＭＢＰタグとの融合タンパク質として調製した。同様に、ＩＦ５Ａは、Ｎ末端側にＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）タグを付け、ＧＳＴタグとの融合タンパク質として調製した。
【００６７】
次に、ＤＨＰＳとＩＦ５Ａの混合溶液に、ＥＲＫを添加した後、グルタチオンビーズ（ＧＳＴタグと特異的に結合する、以下同じ）を用いてアフィニティー沈降を行い、沈降物（ＩＦ５Ａ複合体）を得た。次に、その沈降物中のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法）によりゲル内に展開させ、そのゲルをＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎ−ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜に転写した後、抗ＥＲＫ抗体、抗ＭＢＰ抗体、抗ＧＳＴ抗体を用いて、ウエスタンブロットを行った。なお、ＤＨＰＳの検出は抗ＭＢＰ抗体で、ＩＦ５Ａの検出は抗ＧＳＴ抗体で、それぞれ行った。
【００６８】
結果を図７に示す。図７中、「ｉｎｐｕｔ」はアフィニティー沈降前の溶液について行ったウエスタンブロット写真であることを、「ｅｌｕｔｉｏｎ」はアフィニティー沈降後に得られた溶液について行ったウエスタンブロット写真であることを、それぞれ示す。
【００６９】
ＥＲＫを添加していない場合、図７中、「ｅｌｕｔｉｏｎ」の一番左側のレーンのウエスタンブロット写真が示す通り、ＩＦ５Ａのバンドとともに、ＤＨＰＳのバンドが検出された。それに対し、ＥＲＫを添加した場合、図７中、「ｅｌｕｔｉｏｎ」のその他のレーンが示すとおり、ＥＲＫの添加量に比例して、ＤＨＰＳのバンドが減少した。
【００７０】
以上の結果は、ＥＲＫが、ＤＨＰＳとＩＦ５Ａとの相互作用（結合）を抑制することを示す。
【実施例３】
【００７１】
実施例３は、ＥＲＫとＤＨＰＳが相互作用（結合）すること、及び、ＥＲＫのリン酸化により、ＥＲＫとＤＨＰＳの結合が解除されることを示す実験である。実験手順の概要を以下に示す。
【００７２】
まず、タンパク質、ＥＲＫとＤＨＰＳを調製した。調製は、前記と同様、一般的に用いられている方法により行った。なお、ＥＲＫは、Ｎ末端側にＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）タグを付け、ＧＳＴタグとの融合タンパク質として調製した。また、ＤＨＰＳは、Ｓタグを付け、Ｓタグとの融合タンパク質として調製した。
【００７３】
次に、ＥＲＫとＤＨＰＳの混合溶液について、グルタチオンビーズを用いてアフィニティー沈降を行い、沈降物（ＥＲＫ複合体）を得た。次に、その沈降物中のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法）によりゲル内に展開させ、そのゲルをＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎ−ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜に転写した後、抗ＧＳＴ抗体、抗リン酸化ＥＲＫ抗体、Ｓタンパク質（Ｓタグと特異的に結合する、以下同じ）を用いて、ウエスタンブロットを行った。なお、ＥＲＫの検出は抗ＧＳＴ抗体で、ＤＨＰＳの検出はＳタンパク質で、それぞれ行った。
【００７４】
また、別途、ＥＲＫとＤＨＰＳの混合溶液に、ＡＴＰとｄａＭＥＫを添加した後、前記と同様、グルタチオンビーズを用いてアフィニティー沈降を行い、沈降物（ＥＲＫ複合体）を得た。そして、前記と同様の手順の後、抗ＧＳＴ抗体、抗リン酸化ＥＲＫ抗体、Ｓタンパク質を用いて、ウエスタンブロットを行った。
【００７５】
結果を図８に示す。
図８中、「ｉｎｐｕｔ」はアフィニティー沈降前の溶液について行ったウエスタンブロット写真であることを、「ｅｌｕｔｉｏｎ」はアフィニティー沈降後に得られた溶液について行ったウエスタンブロット写真であることを、それぞれ示す。
図８中、「ｄａＭＥＫ」及び「ＡＴＰ」の欄は、それぞれ、ｄａＭＥＫ又はＡＴＰを添加したかどうかを示し、「−」は添加していないことを、「＋」は添加したことを示す。
【００７６】
図８中、「ｅｌｕｔｉｏｎ」の一番左側のレーンのウエスタンブロット写真が示す通り、グルタチオンビーズを用いて、ＥＲＫのアフィニティー沈降を行った場合、ＥＲＫのバンドとともに、ＤＨＰＳのバンドが検出された。この結果は、ＥＲＫとＤＨＰＳが相互作用（結合）することを示す。
【００７７】
一方、ｄａＭＥＫとＡＴＰを添加した場合、図８中、「ｅｌｕｔｉｏｎ」の一番右側のレーンのウエスタンブロット写真が示す通り、ＤＨＰＳのバンドが消失した。前記の通り、ｄａＭＥＫはＡＴＰ存在下でＥＲＫをリン酸化する（前記レーンのうち、中段のウエスタンブロット写真参照）。従って、本実験結果は、ＥＲＫがリン酸化されると、ＥＲＫとＤＨＰＳとの結合が阻害されることを示す。
【００７８】
なお、図８中、「ｅｌｕｔｉｏｎ」の左から三番目のレーンのウエスタンブロット写真では、リン酸化ＥＲＫのバンドが検出され（本レーンのうち、中段のウエスタンブロット写真）、ＤＨＰＳのバンドが減少した（本レーンのうち、下段のウエスタンブロット写真）。この結果は、ＥＲＫとＤＨＰＳの混合溶液にＡＴＰを添加した結果、ＥＲＫの自己リン酸化が生じたためであると推測する。
【実施例４】
【００７９】
実施例４では、ＥＲＫとＤＨＰＳとの間の相互作用メカニズムについて検討した。実験手順の概要を以下に示す。
【００８０】
まず、タンパク質、ＥＲＫとＤＨＰＳを調製した。ＥＲＫは、野生型（ＷＴ）、リン酸化酵素としての活性を持たない変異体（Ｋ５４Ｒ）、ＭＥＫによってリン酸化されない変異体（ＴＡＹＦ）、の三種類を調製した。調製は、前記と同様、一般的に用いられている方法により行った。なお、ＥＲＫ（三種類）は、それぞれ、Ｎ末端側にＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）タグを付け、ＧＳＴタグとの融合タンパク質として調製した。また、ＤＨＰＳは、Ｓタグを付け、Ｓタグとの融合タンパク質として調製した。
【００８１】
次に、ＥＲＫとＤＨＰＳの混合溶液に、グルタチオンビーズを用いてアフィニティー沈降を行い、沈降物（ＥＲＫ複合体）を得た。次に、その沈降物中のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法）によりゲル内に展開させ、そのゲルをＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎ−ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜に転写した後、抗ＧＳＴ抗体、抗リン酸化ＥＲＫ抗体、Ｓタンパク質を用いて、ウエスタンブロットを行った。なお、ＥＲＫの検出は抗ＧＳＴ抗体で、ＤＨＰＳの検出はＳタンパク質で、それぞれ行った。
【００８２】
また、別途、ＥＲＫとＤＨＰＳの混合溶液に、ＡＴＰとｄａＭＥＫを添加した後、前記と同様、グルタチオンビーズを用いてアフィニティー沈降を行い、沈降物（ＥＲＫ複合体）を得た。そして、前記と同様の手順の後、抗ＧＳＴ抗体、抗リン酸化ＥＲＫ抗体、Ｓタンパク質を用いて、ウエスタンブロットを行った。
【００８３】
結果を図９に示す。
図９中、「ｉｎｐｕｔ」はアフィニティー沈降前の溶液について行ったウエスタンブロット写真であることを、「ｅｌｕｔｉｏｎ」はアフィニティー沈降後に得られた溶液について行ったウエスタンブロット写真であることを、それぞれ示す。
図９中、「ｄａＭＥＫ」及び「ＡＴＰ」の欄は、それぞれ、ｄａＭＥＫ又はＡＴＰを添加したかどうかを示し、「−」は添加していないことを、「＋」は添加したことを示す。
【００８４】
図９中、「Ｋ５４Ｒ」について示した四つのレーンのうち、一番右側のレーンのウエスタンブロット写真が示すとおり、酵素活性（リン酸化活性）を持たない変異ＥＲＫ（Ｋ５４Ｒ）を用いた場合でも、野生型（ＷＴ）と同様、ｄａＭＥＫとＡＴＰの添加により、リン酸化ＥＲＫのバンドが検出され（本レーンの下から二番目のウエスタンブロット写真参照）、ＤＨＰＳのバンドが消失した（本レーンの一番下のウエスタンブロット写真参照）。
このことは、ＥＲＫとＤＨＰＳの相互作用は、ＥＲＫのリン酸化能を必要としないことを示す。
【００８５】
一方、図９中、「ＴＡＹＦ」について示した四つのレーンのうち、一番右側のレーンのウエスタンブロット写真が示すとおり、ＭＥＫによってリン酸化されない変異体（ＴＡＹＦ）を用いた場合、ｄａＭＥＫとＡＴＰを添加しても、ＤＨＰＳのバンドは消失しなかった。
このことは、ＥＲＫのリン酸化が、ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用を調節していることを実証している。
【００８６】
以上のように、本実験より、（１）ＥＲＫとＤＨＰＳの相互作用は、ＥＲＫの酵素活性（リン酸化活性）とは全く別の作用メカニズムに基づくものであること、及び、（２）ＥＲＫのリン酸化が、ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用を調節していることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明は、がん発症メカニズムの中の、重要な細胞内シグナル伝達経路を解明した点で、有用である。従って、本発明は、抗がん剤、抗がん剤のスクリーニング方法、抗がん剤スクリーニングキットなどに適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】ＥＲＫ、ＤＨＰＳ、ＩＦ５Ａの相互関係を示す模式図。
【図２】ＤＨＰＳの酵素活性部位と球状構造とが相互作用する前の状態を示す模式図。
【図３】ＤＨＰＳの酵素活性部位と球状構造が相互作用した状態を示す模式図。
【図４】ＤＨＰＳとＥＲＫとが相互作用した状態を示す模式図。
【図５】本発明に係る物質の作用部位を示す模式図。
【図６】ＥＲＫがＤＨＰＳの酵素活性を抑制することを示すグラフ。
【図７】ＥＲＫが、ＤＨＰＳとＩＦ５Ａとの相互作用を抑制することを示すウエスタンブロット写真（図面代用写真）。
【図８】ＥＲＫのリン酸化により、ＥＲＫとＤＨＰＳの結合が解離することを示すウエスタンブロット写真（図面代用写真）。
【図９】ＥＲＫのリン酸化が、ＥＲＫとＤＨＰＳとの相互作用を制御することを示すウエスタンブロット写真（図面代用写真）。
【図１０】従来技術を示す図であって、ＤＨＰＳによるＩＦ５Ａのハイプシン化を示す模式図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１０】
2007014277.tif 000009
【図７】
2007014277.tif 000010
【図８】
2007014277.tif 000011
【図９】
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【配列表】
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