(57)【要約】【課題】  う蝕の発生程度や発生の危険性を簡便かつ迅速に判定するための方法及び判定薬を提供。【解決手段】  本発明は、ストレプトコッカス・ソブリナス由来のＧＴＦ−Ｉに対するモノクローナル抗体を含有する試薬を用いて口腔内の当該ＧＴＦ−Ｉ量を測定することを特徴とするう蝕性リスクの判定方法、並びにストレプトコッカス・ソブリナス由来のＧＴＦ−Ｉに対するモノクローナル抗体及びストレプトコッカス・ミュータンス由来のＧＴＦ−Ｂに対するモノクローナル抗体を含有するう蝕性リスクの判定薬。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトコッカス・ソブリナス由来のグルコシルトランスフェラーゼ−Ｉに対するモノクローナル抗体を含有する試薬を用いて口腔内の当該グルコシルトランスフェラーゼ−Ｉ量を測定することを特徴とするう蝕性リスクの判定方法。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体が、寄託番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０１５１であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である請求項１記載の判定方法。
【請求項３】
前記試薬が、前記モノクローナル抗体及びストレプトコッカス・ソブリナス由来のグルコシルトランスフェラーゼ−Ｉに対するポリクローナル抗体を含有するものである請求項１又は２記載の判定方法。
【請求項４】
唾液又は歯垢を被検体とする請求項１〜３のいずれか１項記載の判定方法。
【請求項５】
ストレプトコッカス・ソブリナス由来のグルコシルトランスフェラーゼ−Ｉに対するモノクローナル抗体を含有する試薬、及びストレプトコッカス・ミュータンス由来のグルコシルトランスフェラーゼ−Ｂに対するモノクローナル抗体を含有する試薬を用いて、口腔内の当該グルコシルトランスフェラーゼ−Ｉ量及びグルコシルトランスフェラーゼ−Ｂ量を測定することを特徴とするう蝕性リスクの判定方法。
【請求項６】
ストレプトコッカス・ソブリナス由来のグルコシルトランスフェラーゼ−Ｉに対するモノクローナル抗体を含有するう蝕性リスクの判定薬。
【請求項７】
前記モノクローナル抗体が、寄託番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０１５１であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である請求項６記載の判定薬。
【請求項８】
さらに、ストレプトコッカス・ソブリナス由来のグルコシルトランスフェラーゼ−Ｉに対するポリクローナル抗体を含有するものである請求項６又は７記載の判定薬。
【請求項９】
ストレプトコッカス・ソブリナス由来のグルコシルトランスフェラーゼＩに対するモノクローナル抗体及びストレプトコッカス・ミュータンス由来のグルコシルトランスフェラーゼ−Ｂに対するモノクローナル抗体を含有するう蝕性リスクの判定薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、う蝕性リスクの判定方法及び判定薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトのう蝕原因菌としては、ストレプトコッカス・ミュータンスが広く知られており、う蝕は、ストレプトコッカス・ミュータンスが産生するグルコシルトランスフェラーゼ（以下、「ＧＴＦという」）により、口中のショ糖から粘着性・非水溶性のグルカンが生成され、これにより当該菌体が歯表面に付着してバイオフィルム（歯垢）を形成し、この歯垢中で種々の口腔内細菌が繁殖して有機酸が産生され、歯表面のpHが低下することによりエナメル質表面に脱灰を招く結果発生すると考えられている。
【０００３】
最近になって、ストレプトコッカス・ソブリナスが、ストレプトコッカス・ミュータンスよりもヒトのう蝕に強く影響していることが明らかになってきた。すなわち、ストレプトコッカス・ミュータンスはう蝕のないヒトの口腔内からも検出されたのに対し、ストレプトコッカス・ソブリナスはう蝕の多い患者のみから検出された（非特許文献１）。
【０００４】
ストレプトコッカス・ソブリナスの検出手段としては、発色培地を用いる方法（特許文献１等）が一般的である。しかし、この方法では、菌の培養を伴うことから判定までに３日〜１週間を必要とした。一方、ストレプトコッカス・ソブリナスの乾燥菌体を直接抗原として用いて得られた抗ストレプトコッカス・ソブリナス抗体を用いた診断薬（特許文献２及び３）が報告されている。
【非特許文献１】Jorunal of Dental Research, Vol. 74, p.501(1991)
【特許文献１】特開２００３−３８１６７号公報
【特許文献２】特開２００２−５８４７６号公報
【特許文献３】特開２００２−１０５１００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記の抗ストレプトコッカス・ソブリナス抗体は、菌体全体を抗原として用いていることから、これを利用したう蝕判定法は臨床症状と一致しない。すなわち、ストレプトコッカス・ソブリナスもストレプトコッカス・ミュータンス同様に、グルコシルトランスフェラーゼにより、口中のショ糖から粘着性・非水溶性のグルカンを生成する。そして、これにより当該菌体が歯表面に付着してバイオフィルムを形成し、その歯垢中で種々の口腔内細菌が繁殖して有機酸が産生され、歯表面のpHが低下することによりエナメル質表面に脱灰が生じさせることによりう蝕が生じる。菌体全体を抗原として作成した抗体では、このストレプトコッカス・ソブリナス特有の特性を認識する抗体とはいえない。
従って、本発明の目的は、う蝕の発生程度や発生の危険性を簡便かつ迅速に判定するための方法及び判定薬を提供することにある。
【０００６】
そこで本発明者は、ストレプトコッカス・ソブリナスによって分泌され、その菌体表面に定着する性質を有する菌体結合性グルコシルトランスフェラーゼ（以下、ＧＴＦという）のうち、ＧＴＦ−Ｉがストレプトコッカス・ソブリナスに特異的であることに着目し、当該ＧＴＦ−Ｉに対するモノクローナル抗体を作成し、これを利用してＧＴＦ−Ｉ量を測定すれば、ストレプトコッカス・ソブリナスの存在量及びう蝕リスクを正確に判定できることを見出した。さらに本発明者は、当該ＧＴＦ−Ｉ量と、ストレプトコッカス・ミュータンスに特異的なＧＴＦ−Ｂ量とを同時に測定すれば、う蝕リスクがより正確に判定できることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、ストレプトコッカス・ソブリナス由来のＧＴＦ−Ｉに対するモノクローナル抗体を含有する試薬を用いて口腔内の当該ＧＴＦ−Ｉ量を測定することを特徴とするう蝕性リスクの判定方法を提供するものである。
また、本発明は、ストレプトコッカス・ソブリナス由来のＧＴＦ−Ｉに対するモノクローナル抗体を含有する試薬、及びストレプトコッカス・ミュータンス由来のＧＴＦ−Ｂに対するモノクローナル抗体を含有する試薬を用いて、口腔内の当該ＧＴＦ−Ｉ量及びＧＴＦ−Ｂ量を測定することを特徴とするう蝕性リスクの判定方法を提供するものである。
また、本発明は、ストレプトコッカス・ソブリナス由来のＧＴＦ−Ｉに対するモノクローナル抗体を含有するう蝕性リスクの判定薬を提供するものである。
さらに本発明は、ストレプトコッカス・ソブリナス由来のＧＴＦ−Ｉに対するモノクローナル抗体及びストレプトコッカス・ミュータンス由来のＧＴＦ−Ｂに対するモノクローナル抗体を含有するう蝕性リスクの判定薬を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、う蝕リスクと相関性の高いストレプトコッカス・ソブリナス由来のＧＴＦ−Ｉ量が正確かつ迅速に測定でき、その結果、正確なう蝕リスクの判定が可能となった。当該ＧＴＦ−Ｉ量とＧＴＦ−Ｂ量とを同時に測定することにより、う蝕リスクがさらに正確に判定可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明に用いられるＧＴＦ−Ｉに対するモノクローナル抗体は、ＧＴＦ−Ｉを抗原として用いて得られたモノクローナル抗体であればよいが、その抗原としては、菌体表層より収集して精製して得られたＧＴＦ−Ｉでもよいが、組み換えＧＴＦ−Ｉ（ｒＧＴＦ−Ｉ）がより好ましい。ここでｒＧＴＦ−Ｉとしては、例えば、岡山大学・英保（あぼ）らによって解析されたストレプトコッカス・ソブリナス由来のＧＴＦ−Ｉのアミノ酸配列（配列番号４）をコードする遺伝子配列を用いることができる。この配列番号４に示すＧＴＦ−ＩをコードするＤＮＡから調整する方法として、ＧＴＦ−ＩをコードするＤＮＡを含む組み換えベクターを作製し、該ベクターより適当なホスト細胞を形質転換し、その転換体を適当な培地（Ｍ４培地など）で培養して得られる培養物から精製することによりＧＴＦ−Ｉを製造することができる。また、ストレプトコッカス・ソブリヌスを含む同属由来のもので、ＧＴＦ−Ｉの存在が明らかになっている菌体あれば、いずれの菌種を使っても差し支えない。具体的には、当該ｒＧＴＦ−Ｉは、例えば、Streptococcus anginosus＜／Ｉ＞ＳＳ０３Ｅ形質転換株を１％アンモニウム及び１０μＭ  ｍｐ−アミノフェニルメチルスルホニルフルオライドを添加したＭ４培地の８Ｌ中で３７℃にて３０時間培養した後、培養液を遠心分離して、その上清を回収した。この上清より調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等で精製することによって製造することができる。これに用いるStreptococcus anginosus＜／Ｉ＞ＳＳ０３Ｅ形質転換株は、すでにShirozaらによって開発（T.Shirozaら、Secretion  of  heterologous  protein  by  genetically  engineered  Streptococcus  bordonii、Methods  in  Cell  Science、1998、vol.20、127-136）されている口腔連鎖球菌染色体上の外来遺伝子を導入できるインテグレイション−メディエート  トランスフォーメーション  システムを用いてストレプトコッカス・ソブリヌスのｇｔｆＩ遺伝子を導入することで酵素学的に活性なＧＴＦ−Ｉを発現・分泌させることができるものである。調製された精製ｒＧＴＦ−Ｉの濃度は、SＳＤＳ−ＰＡＧＥで１本の均一なバンドとして認識され、その濃度は１mg／mLである。
【００１０】
モノクローナル抗体の製造は、実験医学（別冊）細胞工学ハンドブック（黒木登志夫ら編集、羊土社発行、第６６〜第７４頁、１９９２年）及び単クローン抗体実験操作入門（安東民衛ら著作、講談社発行、１９９１年）等に記載されているようなモノクローナル抗体の一般的な製造方法によって行うことができる。すなわち、抗原を哺乳動物に免疫することにより抗体産生細胞を取得し、該抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマをクローン化し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造される。
本発明のう蝕性リスクの判定方法及び判定薬に用いられるモノクローナル抗体の好ましい製造例を示せば以下の通りである。
【００１１】
抗体産生細胞の取得は、抗原をマウス、ラット、ハムスター、モルモット又はウサギ等の哺乳動物（ヒト抗体を産生するように遺伝子工学的に作出されたヒト抗体産生マウスのようなトランスジェニック動物も含む）、好ましくはマウス、ラット又はハムスターの皮下内、筋肉内、静脈内、フットパッド内あるいは腹腔内に１〜数回注射することにより免疫感作を施し、通常、初回免疫から約１〜１４日毎に１〜４回免疫を行い、最終免疫より約１〜５日後に脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓を摘出することにより行われる。
【００１２】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法（ネイチャー（Nature）、第２５６巻、第４９５〜第４９７頁、１９７５年）及びそれに準じる修飾方法に従って行うことができるが、抗体産生細胞と、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ又はヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラット又はヒトに由来する自己抗体産生能のないミエローマ細胞とを細胞融合することにより調製される。ミエローマ細胞としては、例えばマウス由来ミエローマＰ３／Ｘ６３−ＡＧ８．６５３（６５３）、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４（Ｓｐ２／Ｏ、Ｓｐ２）、ＰＡ１、ＦＯあるいはＢＷ５１４７、ラット由来ミエローマ２１０ＲＣＹ３−Ａｇ．２．３．、ヒト由来ミエローマＵ−２６６ＡＲ１、ＧＭ１５００−６ＴＧ−Ａ１−２、ＵＣ７２９−６、ＣＥＭ−ＡＧＲ、Ｄ１Ｒ１１あるいはＣＥＭ−Ｔ１５等を使用することができる。
【００１３】
ハイブリドーマのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の前述の免疫感作で用いた抗原に対する反応性を、ＲＩＡやＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法によって測定することにより行うことができる。
【００１４】
また、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをクローニングする方法は、通常の方法に従えばよい。例えば限外希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法等により行うことができる。
【００１５】
ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをインビトロ又はインビボ（マウス、ラット、モルモット、ハムスター若しくはウサギ等の腹水中等）で行い、得られた培養上清又は哺乳動物の腹水から単離することにより行うことができる。インビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することができる。基本培地としては、例えば、Ｈａｍ'Ｆ１２培地、ＭＣＤＢ１５３培地あるいは低カルシウムＭＥＭ培地等の低カルシウム培地及びＭＣＤＢ１０４培地、ＭＥＭ培地、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＡＳＦ１０４培地あるいはＲＤ培地等の高カルシウム培地等が挙げられ、該基本培地は、目的に応じて、例えば血清、ホルモン、サイトカイン及び／又は種々の無機若しくは有機物質等を含有することができる。
【００１６】
モノクローナル抗体の単離及び精製は、上述の培養上清あるいは腹水を、飽和硫酸アンモニウム、ユーグロブリン沈殿法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ又はＤＥ５２等）、抗イムノグロブリンカラム又はプロテインＡカラム等のアフィニティカラムクロマトグラフィーに供すること等により行うことができる。
【００１７】
採取したモノクローナル抗体が目的とするモノクローナル抗体であることの確認は、例えば精製ＧＴＦ−Ｉに対するＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法によって測定することにより行うことができる。
【００１８】
本発明で用いられる抗ＧＴＦ−Ｉモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマ５Ａ（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０１５１）が産生するモノクローナル抗体が特に好ましい。このモノクローナル抗体は、本発明者らが先に報告した抗ＧＴＦ−Ｉモノクローナル抗体Ｂ１７（ＦＥＭＳ  Immunology and Medical Microbiology, 27(2000),9-15）に比べて２．８〜２５．６倍ＧＴＦ−Ｉとの反応性が高く、特に好ましい。
【００１９】
一方、ポリクローナル抗体の調製は、常法に従って行うことができる。すなわち、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタ又はウシ等の哺乳動物、好ましくはラット、モルモット、ウサギ又はヤギに、精製ＧＴＦ−Ｉを、前述モノクローナル抗体の製造方法で述べたような方法で免疫することにより抗ＧＴＦ−Ｂ抗体を含む血清を得ることができる。
また、本発明のポリクローナル抗体は、上述の哺乳動物由来の抗血清を、飽和硫酸アンモニウム、ユーグロブリン沈殿法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ又はＤＥ５２等）、抗イムノグロブリンカラム又はプロテインＡカラム等のアフィニティカラムクロマトグラフィーに供すること等により単離及び精製した抗体であることが好ましい。
【００２０】
採取したポリクローナル抗体が目的とするポリクローナル抗体であることの確認は、前述の哺乳動物の免疫感作で用いた精製ＧＴＦ−Ｉ等に対する反応性を、ＲＩＡやＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法によって測定することにより行うことができる。
【００２１】
上記で得られた抗体を用い、免疫比濁法、酵素免疫測定法、ラテックス免疫測定法、ラジオイムノアッセイ、フルオロイムノアッセイ、イムノクロマトアッセイ、光学免疫測定法等の免疫学的測定法を用いることにより菌体表面上のＧＴＦ−Ｉ量を測定することができる。また、ＧＴＦ−Ｉはストレプトコッカス・ソブリナスの菌体表面に定着する不溶性酵素であるため、後記実施例に示すようにＧＴＦ−Ｉ量を測定することにより同時にストレプトコッカス・ソブリナスの検出及び該菌の菌濃度を測定することが可能となる。一方、必要に応じて、膜蛋白質可溶化に有効な界面活性剤を用い、その種類や濃度をコントロールすることで、菌体表面に定着しているＧＴＦ−Ｉを遊離させることができ、ＧＴＦ−Ｉのみを測定することも可能である。
【００２２】
本発明のう蝕性リスクの判定方法及び判定薬において使用される好ましい免疫測定法の一つとして、競合免疫測定法が挙げられる。
すなわち、検体に放射性同位体等で標識したＧＴＦ−Ｉを一定量混合し、更に抗ＧＴＦ−Ｉ抗体を混合し検体中のＧＴＦ−Ｉ及び標識ＧＴＦ−Ｉと反応させる。検体中のＧＴＦ−Ｉは、標識ＧＴＦ−Ｉと競合して抗ＧＴＦ−Ｉ抗体と反応するため、検体中にＧＴＦ−Ｉが存在する分、標識ＧＴＦ−Ｉとの反応が減少する。反応後、抗ＧＴＦ−Ｉ抗体をあらかじめ固相担体に結合させておくか、抗イムノグロブリン抗体、プロテインＡと抗ＧＴＦ−Ｉ抗体を反応させることにより、結合、非標識ＧＴＦ−Ｉを分離する。一般に用いられる方法により結合していない分画を測定することが可能となる。
【００２３】
また、いわゆるサンドイッチ系の測定も好適である。すなわち、抗ＧＴＦ−Ｉ抗体をマイクロタイタープレート、ビーズ、ニトロセルロース膜、ナイロン膜等の免疫測定法に一般に用いられる担体に結合させ、これを検体と接触させることにより、検体中の菌体表面ＧＴＦ−Ｉを担体上にある抗ＧＴＦ−Ｉ抗体と反応させる。一般に用いられている方法により結合していない分画を洗い、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、ビオチン等で標識した抗ＧＴＦ−Ｉ抗体と接触させ、担体上にある抗ＧＴＦ−Ｉ抗体と結合した菌体表面ＧＴＦ−Ｉと反応させる。一般に用いられている方法により結合していない分画を洗い、標識されている放射性同位元素、酵素、蛍光物質、ビオチン等を検出することにより菌体表面ＧＴＦ−Ｉ量を測定することが可能となる。また、金コロイドのような視覚的に判定可能な物質を前述の抗体の一つに標識をして、上述のサイドイッチ系又は競合法に応用し、判定することも可能である。
【００２４】
この測定系に用いる抗ＧＴＦ−Ｉ抗体、標識抗ＧＴＦ−Ｉ抗体は、前述しようにモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又はその組み合わせのいずれを用いることも可能である。ここで肝要なことは、担体に結合する抗体とＧＴＦ−Ｉとの複合体が標識抗体と結合できるよう、抗体を組み合わせることである。
【００２５】
本発明おいては、ＧＴＦ−Ｉを認識するモノクローナル抗体をプラスチックプレートに固定化し、２次抗体にＧＴＦ−Ｉに対するポリクローナル抗体、３次抗体にペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体を用いたＥＬＩＳＡ法が特に好ましい。従って、本発明のう蝕性リスクの判定薬は、これらの抗ＧＴＦ−Ｉ抗体、標識抗体及び検出試薬等を含有した酵素免疫測定試薬である場合が好ましい。
【００２６】
また、凝集検定も有利な実施形態であり、前述の抗体の一方で被覆された粒子と、他の抗体で被覆された粒子を作製し、検出すべき物質への粒子の結合により、凝集が起こり、これは濁り変化により判定あるいは検出することができる。
【００２７】
尚、以上の測定法においては、抗ＧＴＦ−Ｉ抗体のみならず、ペプシン、パパイン等で処理した抗体フラグメント（Ｆａｂ'又はＦ（ａｂ'）2）を使用することもできる。
【００２８】
本発明における被検試料としては、唾液又は歯垢が好ましい。
【００２９】
本発明においては、ＧＴＦ−ＩだけでなくＧＴＦ−Ｂを同時に測定するのが、う蝕リスクをより正確に判定するうえで好ましい。ＧＴＦ−Ｂの測定には、抗ＧＴＦ−Ｂ抗体、特に抗ＧＴＦ−Ｂモノクローナル抗体を用いるのが好ましい。
【００３０】
本発明で用いられる抗ＧＴＦ−Ｂモノクローナル抗体の好ましい具体例としては、特開２００２−２６７６７３号公報記載のＧＴＦ−Ｂのデキストラン結合部位（配列番号３）を認識するモノクローナル抗体として寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７５６７であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体、ＧＴＦ−ＢのＮ末端側活性部位（配列番号２）を認識するモノクローナル抗体として寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７５６６であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体等が挙げられる。なお、配列番号１は、ＧＴＦ−Ｂのアミノ酸配列である。
【００３１】
また、ＧＴＦ−Ｂモノクローナル抗体は、ＧＴＦ−Ｂ等に特異的に反応し、ストレプトコッカス・ミュータンスが産生するＧＴＦ−Ｄ及びＧＴＦ−Ｃに反応しないという性質を併せ持つことが好ましい。
【００３２】
斯かるモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体は、それぞれを単独で用いてもよいが、複数の抗体を組み合わせて用いることもでき、特に、ＧＴＦ−Ｂのデキストラン結合部位（配列番号３）を認識するモノクローナル抗体とＧＴＦ−ＢのＮ末端側活性部位（配列番号２）を認識するモノクローナル抗体及びＧＴＦ−Ｂに対するポリクローナル抗体を組合せて用いることが好ましい。
これらの抗ＧＴＦ−Ｂ抗体を用いる測定系も、前記抗ＧＴＦ−Ｉ抗体を用いることができる測定系として記載した測定系をすべて用いることができる。このうち、ＥＬＩＳＡが特に好ましい。
【００３３】
斯かる方法により、無う蝕（正常）者及び高う蝕者の唾液中のＧＴＦ−Ｉ量を測定したところ、後記実施例に示すように総菌濃度あたりのＧＴＦ−Ｉ濃度及びＧＴＦ−Ｉを分泌する菌濃度は、高う蝕者のものが無う蝕者のものより高い結果となり、ＧＴＦ−Ｉ濃度及びＧＴＦ−Ｉを分泌する菌濃度はう蝕の程度と有意に相関することが示された。従って、口腔中のＧＴＦ−Ｉ量は、う蝕の程度を把握するための指標となり、これを測定することによりう蝕性リスクを判定することができ、また抗ＧＴＦ−Ｉ抗体を含有するＧＴＦ−Ｉ量の測定試薬は、う蝕性リスクの判定薬として用いることができる。また、上記の結果に、さらに、抗ＧＴＦ−Ｂ抗体を用いるＧＴＦ−Ｂの測定結果を組み合せると、よりう蝕リスクの高い患者が正確に判定できる。従って、口腔中のＧＴＦ−Ｉ量とＧＴＦ−Ｂ量を測定することは、より正確にう蝕の程度を把握するための指標となり、これらを測定することによりう蝕性リスクをより正確に判定できる。
【実施例】
【００３４】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
【００３５】
実施例１  サンドイッチＥＬＩＳＡによるソブリナス菌グルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ−Ｉ）の定量法
＜１−１＞免疫抗原ＧＴＦ−Ｉの調整
免疫原としてのＧＴＦ−Ｉ酵素蛋白は、Streptococcus anginosus＜／Ｉ＞ＳＳ０３Ｅ形質転換株を１％アンモニウム及び１０μＭ  ｍｐ−アミノフェニルメチルスルホニルフルオライドを添加したＭ４培地の８Ｌ中で３７℃にて３０時間培養した後、培養液を遠心分離（８，０００rpm、１０min）して、その培養上清を回収した。この上清より調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥで精製し、ｒＧＴＦ−Ｉの純化標品を取得した。
【００３６】
＜１−２＞免疫及び細胞融合
（ｉ）免疫動物からの脾臓細胞の調整
免疫方法は８〜１０週令のＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に、精製ＧＴＦ−Ｉを適当なアジュバンド、フロインドアジュバンド、ＲＰＭＩ−１６４０とともに注射することにより初回免疫した。初回免疫から１４、２８、４２日目に精製ＧＴＦ−Ｉを皮下に注射することにより追加免疫し、さらにモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ調製の前々日及び前日に同様にして免疫し、マウスから脾臓細胞を調製した。
（ii）マウス骨髄細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄細胞Ｐ３−Ｕ１を正常培地「ＲＰＭＩ−１６４０にグルタミン１．５mM及び牛胎児血清１３％を加えた培地」に培養（３７℃、ＣＯ2、５％通気）し、４日後に２×１０7以上の細胞を得た。
（iii）ハイブリドーマの作製
ＲＰＭＩ−１６４０(日本製薬社(製))でよく洗浄した免疫マウス脾臓細胞１×１０8個とマウス骨髄細胞２×１０7個とを混合し、１５００rpmで５分間遠心分離した。
沈殿として得られた脾臓細胞とＰ３−Ｕ１骨髄腫細胞の混合した細胞群をほぐした後、攪拌しながら５０％ポリエチレングリコール、１０％ＤＭＳＯ溶液を加え、ＲＰＭＩ−１６４０を徐々に加える。遠心後、集めて細胞をＨＡＴ培地（ＲＰＭＩ−１６４０にヒポキサンチン、チミジン、アミノプテリンを加えた培地）を加え、細胞を懸濁し、ＣＯ2インキュベーター３７℃中で２時間培養する。再度遠心後、上清を捨て、細胞をゆるやかにほぐし、ＨＡＴ培地に懸濁し、９６穴プレートに分注し、５％ＣＯ2インキュベーターで１０〜１４日間培養する。
【００３７】
＜１−３＞ハイブリドーマのスクリーニング
抗ｒＧＴＦ−Ｉモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングは、精製ｒＧＴＦ−Ｉを固相化したＥＬＩＳＡを用いて行った。すなわち、精製ｒＧＴＦ−Ｉを２μｇ／mLの濃度に調整後、９６穴ＥＩＡプレートに５０μｌ／穴ずつ分注し、室温で固相化した。２時間後、Ｔｗｅｅｎ２０及びＮａＣｌ及びリン酸緩衝液でブロッキングを行った。一次抗体として上記ハイブリドーマ培養上清を９６穴に移し、４℃一晩放置した。その後、二次抗体としてヤギの抗マウスＩｇＧ−ＰＯＤ結合物を分注し、室温で一時間反応させた。反応後、同緩衝液にて２回洗浄し、ＯＰＤ基質液（ｏ−フェニレンジアミンに過酸化水素を添加した溶液）を分注し発色させ、１Ｎの硫酸で反応を停止させる。プレートリーダーにより吸光度を主波長４９２nm、副波長６２０nmにて測定する。抗ｒＧＴＦ−Ｉモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが認められたウェルについて、限界希釈法によりクローニングを２から４回繰り返し、安定して抗体産生の認められたものを、抗ＧＴＦ−Ｉモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株＃１Ｂ、１Ｇ、３Ｅ、５Ａとして選択した。
【００３８】
＜１−４＞モノクローナル抗体の大量調製
プリスタン処理（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン０．５ｍｌ／匹を腹腔内投与し、１〜２週間飼育する。）した１０週令マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に上記のハイブリドーマ株各１×１０6個細胞／匹を腹腔内注射する。１０〜２１日後にハイブリドーマ株は腹水癌化する。１０〜２１日後に腹水のたまったマウスから腹水（４〜１０mL／匹）を採取し、遠心分離して固形分を除去した。上清を５０％硫安塩析後、１５０mMのＮａＣｌ及び２０mMリン酸緩衝液（pH７．４）で一晩透析し、これを粗精製モノクローナル抗体とする。
【００３９】
＜１−５＞抗ＧＴＦ−Ｉポリクローナル抗体の調製
粗精製ＧＴＦ−Ｉの１００μｇとフロインドの完全アジュバンド（Freud's Complete adjuvant、Sigma社（製））を等量混合し、ウサギ四肢及び背中の皮膚数十ヶ所に注射して免疫した。２ヵ月〜３ヵ月の間に５〜６回同様に投与した。最終投与２週間後に全血液を採取し、その血清を取得した。血清を５０％硫安塩析後、１５０mMのＮａＣｌ及び２０mMリン酸緩衝液（pH７．４）で一晩透析し、これを粗精製ポリクローナル抗体とする。
【００４０】
＜１−６＞モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の精製
前記＜１−３＞で取得したモノクローナル抗体＃１Ｂ、１Ｇ、３Ｅ、５Ａ各々の粗精製モノクローナル抗体、及び前記＜１−４＞で取得した粗精製ポリクローナル抗体に、ＭＡＰＳＩＩ結合バッファー（バイオラッド社（製））を等量加え、フィルター（ミリポア社（製））で濾過し、白沈を除いた。得られた濾液をHiTrap Protein Aアフィニティーカラム（ファルマシアバイオテック社（製））に添加した。ＭＡＰＳＩＩ結合パッファー（バイオラッド社（製））で洗浄後、ＭＡＰＳＩＩ溶出パッファー（バイオラッド社（製））で溶出させた（３mL／チューブ，１０本）。溶出パターンを波長２８０nmでの吸光度で測定し、該溶出パターンに従い、抗体を含む分画を回収した。
【００４１】
＜１−７＞固相化抗体の作製
１５０mMのＮａＣｌを含む２０mMリン酸緩衝液（pH７．４、以下ＰＢＳという）に前記で調製した精製モノクローナル抗体＃１Ｂ、１Ｇ、３Ｅ、５Ａ及び精製ポリクローナル抗体を１０μｇ／mLの濃度で調製後、９６穴ＥＩＡプレートに５０μｌ／穴ずつ分注し、室温で２時間放置し抗原をプレートに固相化した。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔ−ＰＢＳという）で２回洗浄後、１％のＢＳＡを含むＴ−ＰＢＳを３５０μｌ／穴ずつ分注し、室温で１時間放置し底面上の蛋白結合性残基をブロックした。内容物を除去後、１％のＢＳＡ及び１０％のシュークロースを含むＴ−ＰＢＳを３５０μｌ／穴ずつ分注した。室温で１時間放置後、内容物を除去し自然乾燥させた。
【００４２】
＜１−８＞モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の精製のペルオキシダーゼ標識
５mMの酢酸ナトリウム緩衝液（pH４．５）にペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰという）を１０mg／mLの濃度で溶解した溶液に、メタ過よう酸ナトリウムを蒸留水で１００mg／mLの濃度で溶解した溶液を、ＨＲＰ：メタ過よう酸ナトリウム＝１mg：０．４３mgの比で加え、暗所、室温で３０分間反応させた。ついで反応液を５mMの酢酸ナトリウム緩衝液（pH４．５）で平衡化したセファデックスＧ−２５ゲル（１．５×３０cm；ファルマシアバイテック社（製））のカラムに添加して、活性化ＨＲＰ画分を回収した。次に精製＃１Ｂ、１Ｇ、３Ｅ、５Ａモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を０．１Ｍの重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．３）で一晩透析した溶液に、活性化ＨＲＰ画分を重量比１：１で混合し、暗所、室温で１時間反応させた。反応後、テトラヒドロホウ酸ナトリウムを蒸留水で２mg／mLの濃度で溶解した溶液を、反応液５００μｌに対して１０μｌで混合し、暗所、室温で１５分間反応させた。反応後、等量の飽和硫安を加え、氷上で１時間放置した。１２０００rpmで１０分間遠心分離後、上清を除去してＨＲＰ標識抗体を回収し、ＰＢＳに懸濁した。波長２８０nmでの吸光度を測定し、吸光度を用い以下の試験を行なった。
【００４３】
＜１−９＞モノクローナル抗体の選択
前記＜１−７＞で作製した固相化抗体、モノクローナル抗体＃１Ｂ、１Ｇ、３Ｅ、５Ａ及びポリクローナル抗体（以下、固相化マイクロプレートという）を用いる。固相化マイクロプレートの各ウェルに０．２％のＢＳＡを含むＴ−ＰＢＳで希釈した測定試料（５０μｌ、ストレプトコッカス・ソブリヌス菌（Streptococcus sobrinus）菌体を生理食塩水で懸濁した溶液）を加え、室温で２時間インキュベートした。固相化マイクロプレートをＴ−ＰＢＳで２回洗浄後、０．２％のＢＳＡを含むＴ−ＰＢＳで希釈した前述＜１−８＞で作製したペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を４ｍＯＤに希釈した溶液を５０μｌ／穴ずつ分注し、室温で１時間インキュベートした。固相化マイクロプレートをＴ−ＰＢＳで２回洗浄後、ＯＰＤ基質液（ｏ−フェニレンジアミンヂアミン２塩酸塩６０mgをのクエン酸・リン酸緩衝液（ｐＨ５．２）２０mLに溶かした溶液に、３０％の過酸化水素２０μｌを加えた溶液）を５０μｌ／穴ずつ分注し発色後、１Ｎの硫酸溶液を５０μｌ／穴ずつ分注し反応を停止させた。プレートリーダーにて吸光度を主波長４９２nm、副波長６２０nmで測定し、測定中の菌体量は、ストレプトコッカス・ソブリヌス菌由来標準物質から作製した検量線から求めた。この中より、特異性が最も優れていた５Ａ抗体とポリクローナル抗体の組み合わせを選択した（表１）。
【００４４】
【表１】
2007322124.tif 000002
【００４５】
ウエスタンブロッティングにより、５Ａ抗体及び本発明者が先に作成した抗ＧＴＦ−Ｉモノクローナル抗体であるＢ１７抗体のｒＧＴＦ−Ｉに対する反応性を検討した。その結果、Ｂ１７抗体の１００倍希釈と５Ａ抗体の１２８０〜２５６０倍希釈の反応性がほぼ同等であり、５Ａ抗体はＢ１７抗体の１２．８〜２５．６倍ＧＴＦ−Ｉに対する反応性が高いことが判明した。
【００４６】
＜１−１０＞サンドイッチＥＬＩＳＡ
本発明で確立されたサンドイッチＥＬＩＳＡによるＧＴＦ−Ｉ定量法は＜１−９＞で選択された＃５Ａを用いた＜１−９＞で示した方法である。
ＧＴＦ−Ｉ酵素量は、上述の測定方法において、測定試料を０．５Ｎ  ＮａＯＨで抽出することにより定量することができた。検量線を図１に示す。
【００４７】
実施例２  サンドイッチＥＬＩＳＡによるソブリナス菌グルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ−Ｉ）の定量及びう蝕リスク判定
ＤＭＦＴとは、永久歯の一人当たりの虫歯罹患経験歯数を言い、D; Decayed teethの略（未処置のムシ歯）、M; Missing teethの略（喪失歯）、F ;Filled teethの略（治療済みの歯）、T; Teethの略である。ＤＭＦＴが１５以上のヒトを高う蝕者（Ｈ）と定義する。
この検体２種を用いてＧＴＦ−Ｉ量との関係を確認した。
【００４８】
（１）方法
実検体を用いたS. sobrinusからの菌体結合性ＧＴＦ−Ｉ抽出の検討を行い、実検体（被検者Ａ及びＢ）を、０．５Ｎ  ＮａＯＨの条件で抽出して、検量線からＧＴＦ−Ｉ濃度を計算した。
すなわち、２mLの歯垢懸濁液を遠心（１０，０００rpm，５min）し、沈殿に０．５Ｎ  ＮａＯＨを５０μＬ添加して、１分間放置した。１００μＬの中和液を添加したものを遠心（１０，０００rpm，５min）し、１５０μＬの上清から再度沈殿（再抽出）させ、５０μＬの０．５Ｎ  ＮａＯＨを添加して、１分間放置した。１００μＬの中和液を添加した後、再度遠心（１０，０００rpm，５min）し、１５０μＬの上清（２）を得た。表２には、ＤＭＦＴ、Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ数の比較と精製ＧＴＦ−Ｉ標準物質から作製した検量線から求めたＧＴＦ−Ｉ量の結果の比較を示した。また図２にそれらを図式化した
ものを示した。
上清（１）と（２）を混合して、約３００μＬをＥＬＩＳＡ用の検体とした。この検体５０μＬをＥＬＩＳＡに用いて、検量線（０．５Ｎ  ＮａＯＨ）から、ＧＴＦ−Ｉ濃度を計算した。
【００４９】
【表２】
2007322124.tif 000003
【００５０】
実施例３  ＧＴＦ−Ｂとの組み合わせによるう蝕度判定
虫歯罹患経験歯数、S.mutans及びS.sobrinus菌数既知のブラッシング歯垢０．３mLを０．５Ｎ  ＮａＣｌで抽出し、ＧＴＦ−Ｉ及びＧＴＦ−Ｂの両ＥＬＩＳＡ試薬で測定を行い、発色の有無及び強弱を＋・−で評価した。なお、ＧＴＦ−Ｂ  ＥＬＩＳＡ試薬は、以下のように作製した試薬を用いた。すなわち、実施例１の＜１−１０＞サンドイッチＥＬＩＳＡの項で示した固相化抗体で使用している＃５Ａの抗体の替わりに抗ＧＴＦ−Ｂ抗体である＃１３６あるいは＃１２６（特開２００２−２６７６７３号公報記載の寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７５６６あるいはＰ−１７５６７であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体）を用いて、ＧＴＦ−Ｉ定量法と同様な処方の試薬を作成した。表３には、抗ＧＴＦ−Ｂモノクローナル抗体として♯１３６を用いた場合の結果を示したが、♯１２６でも同様の結果を得た。
【００５１】
【表３】
2007322124.tif 000004
【００５２】
上記の結果、虫歯罹患経験歯数とS.mutans及びS.sobrinus菌数並びにＧＴＦ−Ｉ及びＧＴＦ−Ｂの両ＥＬＩＳＡ試薬で測定との間に相関があり、特に菌数を測定しなくても本ＧＴＦ酵素を測定することで、う蝕度の判定が可能であった。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明測定系によるストレプトコッカス・ソブリナス由来のＧＴＦ−Ｉ測定結果を示す検量線である。
【図２】歯垢中のＧＴＦ−ＩとＤＦＭＴとの関係を示す図である。
【図１】
2007322124.tif 000005
【図２】
2007322124.tif 000006
【配列表】
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