(57)【要約】【課題】本発明の課題は、固定化した生体分子の固定化を確認することで、相互作用により観察されるシグナルをそのプローブ固定化量でノーマライズして、厳密な解析を行う手法を提供することにある。【解決手段】固体表面に固定化されている生体分子（Ａ）と、生体分子（Ｂ）の相互作用を観察する際に、該生体分子（Ａ）と生体分子（Ｃ）の相互作用を確認することで、該生体分子（Ａ）が該固体表面に固定化されていることを確認する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体表面に固定化されている生体分子（Ａ）と、生体分子（Ｂ）の相互作用を観察する際に、該生体分子（Ａ）と生体分子（Ｃ）の相互作用を確認することで、該生体分子（Ａ）が該固体表面に固定化されていることを確認する方法。
【請求項２】
生体分子（Ａ）がビオチンを有している分子であり、生体分子（Ｃ）がアビジン類であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
生体分子（Ａ）が末端にビオチンを有する核酸であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
生体分子（Ａ）が、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法で合成された二本鎖のＤＮＡ分子であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ＰＣＲに使われるプライマー二つのうち、一方のプライマー末端が、固体表面への固定化されるための官能基または結合反応グループを有し、もう一方のプライマー末端に、ビオチン分子が修飾されていることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
生体分子（Ｂ）が、蛋白質であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
生体分子（Ｂ）が、転写因子であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
相互作用を観察する手段が表面プラズモン共鳴法であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
固体表面に固定化されている生体分子（Ａ）と生体分子（Ｂ）が相互作用することで得られるシグナルを、該生体分子（Ａ）と生体分子（Ｃ）が相互作用することで得られるシグナルで補正することを特徴とするシグナル補正方法。
【請求項１０】
生体分子（Ａ）に生体分子（Ｂ）が結合することで得られるシグナルと、生体分子（Ａ）に生体分子（Ｃ）が結合することで得られるシグナルの比を求める操作を含む請求項９に記載のシグナル補正方法。
【請求項１１】
生体分子（Ｂ）と固体表面に固定化されている生体分子（Ａ）との相互作用を観察するためのバイオチップであって、該生体分子（Ａ）上に生体分子（Ｃ）と相互作用する部位を含有することを特徴とするバイオチップ。
【請求項１２】
生体分子（Ａ）と生体分子（Ｂ）が相互作用することで得られるシグナルを、該生体分子（Ａ）上の生体分子（Ｃ）と相互作用する部位と生体分子（Ｃ）が相互作用することで得られるシグナルで補正することを特徴とする請求項１１に記載のバイオチップ。
【請求項１３】
生体分子（Ａ）が二本鎖のＤＮＡ分子であり、生体分子（Ｂ）が蛋白質であり、生体分子（Ｃ）がアビジン類であり、生体分子（Ｃ）と相互作用する部位がビオチンであることを特徴とする請求項１１または１２に記載のバイオチップ。
【請求項１４】
生体分子（Ｂ）が、転写因子であることを特徴とする請求項１１〜１３のいずれかに記載のバイオチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固体基板に固定化された生体分子の固定化を確認する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体は外界から受ける環境の変化、刺激、ストレスに対して、分子レベルで応答しており、シグナル物質としてその情報を受けとり、各所に局在する分子と連鎖的に相互作用して、神経系、免疫系、内分泌系などの適所にシグナルが伝達されている。これらのシグナル伝達に関与する生体分子の機能や、生体内のシグナル伝達の状態を解析する手段として、分子間の相互作用を観察する手法が一般的に用いられている。
【０００３】
分子間の相互作用を観察する手段として、ＥＬＩＳＡ法やゲルシフト法、免疫沈降法が用いられてきたが、いずれも操作が煩雑でかつスループットが低い問題があった。そこで、これらの問題点を解決するために、生体分子を固定化した「チップ」を使って、分子間の相互作用を観察する方法が、一般的に使われるようになった。最も代表的な「チップ技術」はＤＮＡマイクロアレイであろう。ＤＮＡマイクロアレイとは、ｃＤＮＡやオリゴヌクレオチドといったＤＮＡがガラスなどの基板上に共有結合や非共有結合でアレイ状に固定化されているものである。プローブは、予めｃＤＮＡやオリゴヌクレオチド断片として調製され、アレイヤーを用いたスポッティングなどにより基板上に固定化される。また、フォトリソグラフィーや有機化学合成方法を用いてチップ上でＤＮＡ配列を形成させる方法も開発されている。
【０００４】
このようなＤＮＡマイクロアレイはＤＮＡチップとも呼ばれている。蛍光などの標識を施したＤＮＡやＲＮＡが、固定化されているＤＮＡに捕捉される（ハイブリダイゼーション）と、スキャナーなどでシグナルとして検出される。このような手法により、一チップあたり数千から数十万の配列を有するＤＮＡチップが作製できることから、網羅的なｍＲＮＡ発現解析や遺伝子解析方法として一般的に使用されてきている。
【０００５】
近年、「チップ技術」はＤＮＡ結合性蛋白質の解析、蛋白間相互作用解析、糖鎖解析など、他の生体分子との相互作用への応用が検討されており、創薬や臨床検査へ利用が期待されている。従来のチップ技術では、測定対象物質を検出するためには、その物質に直接的または間接的にラベル分子を結合させる必要がある。ラベル分子には蛍光物質が使われるのが一般的である。しかし、このようなラベル操作は煩雑かつ、生体分子の機能が損なわれる危険性があった。
【０００６】
そこで、ラベルフリーに生体分子を相互作用解析する技術として、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）や水晶発振子（ＱＣＭ）が普及してきた。これらの技術は「チップ技術」であるにもかかわらず、スループットが低い問題を抱えていた。最近になって、ＳＰＲイメージング技術が開発され、多点でラベルフリーに解析できるようになった。
【０００７】
上記ラベルフリー相互作用解析技術は、反応のエンドポイントで解析するだけでなく、相互作用をリアルタイムで検出することが可能であり、反応速度解析から、親和性、平衡状態に関する情報を得ることができる。
【０００８】
上記「チップ技術」において相互作用によって得られるシグナルの強度は、プローブに捕捉される分子数と相関関係にある。さらに、捕捉される分子数は、プローブの固定化量が影響する。例えば、本来弱い相互作用を示すプローブでも、固定化量が多いと、シグナル強度が大きくなり、見かけでの相互作用が強いという結果になるため、プローブの固定化量をできるだけ統一するのが好ましい。しかし、固定化量の統一が困難な場合も多く、その場合は固定化量によるシグナルのノーマライズが必要となる。
【０００９】
一般的なＤＮＡマイクロアレイにおけるノーマライズ方法として、ポジティブコントロールを同一基板上に固定化して、相互作用で検出されたシグナルと、ポジティブコントロールのシグナルの比を求める方法が多く使われている（特許文献１）。しかし、基板上の各々のスポットでは固定化量が同じであるとの前提のもとで、基板全体に対してノーマライズしているのみであり、各々のスポットの固定化量に応じてノーマライズはしていない。ＤＮＡマイクロアレイのように、ほぼ同じ長さのＤＮＡを固定化する場合は、固定化する際のＤＮＡの濃度を統一しておけば、固定化量はほぼ同一となるが、ＤＮＡの長さが大きく異なる場合や、蛋白質・ペプチドを固定化する場合は固定化量を統一するのは非常に困難であり、厳密な解析を行うためには固定化量に応じたノーマライズ方法が必要となる。
【００１０】
一般的なスループットの低いＳＰＲやＱＣＭにおいては、プローブの固定化反応をモニターする方法が使われる（特許文献２）。すなわち、固定化反応中に得られるシグナルの高さが固定化量に対応するものとなる。後に得られる相互作用によるシグナルとの比を取ることで、ノーマライズすることが可能となる。しかし、アレイフォーマットでの解析では、各々のスポットに対する固定化反応をモニターするのは非常に困難かつ、煩雑となるため、非現実的である。
【００１１】
【特許文献１】特開２００４−０２８６９５
【特許文献２】特開２００５−０８４０２８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、固定化した生体分子の固定化を確認することで、相互作用により観察されるシグナルをそのプローブ固定化量でノーマライズして、厳密な解析を行う手法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決することを見出した。
１．固体表面に固定化されている生体分子（Ａ）と、生体分子（Ｂ）の相互作用を観察する際に、該生体分子（Ａ）と生体分子（Ｃ）の相互作用を確認することで、該生体分子（Ａ）が該固体表面に固定化されていることを確認する方法。
２．生体分子（Ａ）がビオチンを有している分子であり、生体分子（Ｃ）がアビジン類であることを特徴とする１の方法。
３．生体分子（Ａ）が末端にビオチンを有する核酸であることを特徴とする１または２の方法。
４．生体分子（Ａ）が、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法で合成された二本鎖のＤＮＡ分子であることを特徴とする１〜３のいずれかの方法。
５．ＰＣＲに使われるプライマー二つのうち、一方のプライマー末端が、固体表面への固定化されるための官能基または結合反応グループを有し、もう一方のプライマー末端に、ビオチン分子が修飾されていることを特徴とする４の方法。
６．生体分子（Ｂ）が、蛋白質であることを特徴とする１〜５のいずれかの方法。
７．生体分子（Ｂ）が、転写因子であることを特徴とする１〜６のいずれかの方法。
８．相互作用を観察する手段が表面プラズモン共鳴法であることを特徴とする１〜７のいずれかの方法。
９．固体表面に固定化されている生体分子（Ａ）と生体分子（Ｂ）が相互作用することで得られるシグナルを、該生体分子（Ａ）と生体分子（Ｃ）が相互作用することで得られるシグナルで補正することを特徴とするシグナル補正方法。
１０．生体分子（Ａ）に生体分子（Ｂ）が結合することで得られるシグナルと、生体分子（Ａ）に生体分子（Ｃ）が結合することで得られるシグナルの比を求める操作を含む９のシグナル補正方法。
１１．生体分子（Ｂ）と固体表面に固定化されている生体分子（Ａ）との相互作用を観察するためのバイオチップであって、該生体分子（Ａ）上に生体分子（Ｃ）と相互作用する部位を含有することを特徴とするバイオチップ。
１２．生体分子（Ａ）と生体分子（Ｂ）が相互作用することで得られるシグナルを、該生体分子（Ａ）上の生体分子（Ｃ）と相互作用する部位と生体分子（Ｃ）が相互作用することで得られるシグナルで補正することを特徴とする１１のバイオチップ。
１３．生体分子（Ａ）が二本鎖のＤＮＡ分子であり、生体分子（Ｂ）が蛋白質であり、生体分子（Ｃ）がアビジン類であり、生体分子（Ｃ）と相互作用する部位がビオチンであることを特徴とする１１または１２のバイオチップ。
１４．生体分子（Ｂ）が、転写因子であることを特徴とする１１〜１３のいずれかのバイオチップ。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、生体分子間の相互作用を観察する際、一方の生体分子が固体表面に固定化されていることを確認すること、さらには固定化量に応じたシグナルのノーマライズが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下に、本発明を詳細に説明する。本発明は、固体基板上に生体分子（Ａ）を固定化し、生体分子（Ａ）と生体分子（Ｂ）との相互作用を観察する方法において、生体分子（Ａ）が固定化されているかどうかを生体分子（Ｃ）との相互作用によって確認する方法である。生体分子（Ｂ）によって得られる結合シグナルでは、特異的な結合に由来するものかどうか、判断が困難な場合があるため、生体分子（Ｃ）を用いて、生体分子（Ａ）の基板上における存在を確認することは、非常に意義深い。
【００１６】
生体分子（Ａ）およびその分子と相互作用する生体分子（Ｂ）は、生体に関連のある分子であり、核酸、蛋白質、ペプチド、糖、脂質やホルモン、薬物候補物質などが挙げられる。これらの生体分子（Ａ）および生体分子（Ｂ）は、生体から抽出した天然分子でも、化学的に合成された分子でもよい。
【００１７】
生体分子（Ａ）は、生体分子（Ｂ）との相互作用を測定するために、固体基板に固定化されているが、複数の生体分子（Ａ）が同一基板に固定化され、アレイ状に固定化されていると好ましい。複数の生体分子（Ａ）をアレイ状に固体基板に固定化することで、網羅的な相互作用解析が可能になり、容易に生体分子（Ｂ）が相互作用する物質、部位などを特定することができるからである。
【００１８】
また、生体分子（Ａ）には、共有結合、または、非共有結合で固体表面に固定化するため、官能基や結合グループが導入されていることが好ましい。その物質としては、チオール基、アミノ基、カルボキシル基、ビニル基、ビオチン、ヒスチジンタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ハロタグ、ＳＮＡＰタグ、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグなどの官能基や結合グループが挙げられる。固定化方法としては、共有結合が好ましい。共有結合であると、脱離する心配がほとんどないからであり、確実に基板上に固定化することができる。中でも、チオール基は共有結合が可能であり、マレイミド基、エポキシ基、チオール基、ジスルフィド基と反応が特異的に進むため最も好ましい。これらの官能基を固体基板に形成させておくことにより、チオール基を有する生体分子（Ａ）を強固に固体表面に固定化することができる。
【００１９】
ここで固定化した生体分子（Ａ）と、生体分子（Ｂ）の相互作用が観察されるが、相互作用によって得られるシグナルの強度は、相互作用の強弱で異なるため、相互作用の強さを評価することが可能である。しかし、得られるシグナル強度は、生体分子（Ａ）の固定化量によっても左右される。そのため、例えば、本来、相互作用が弱い物質が生体分子（Ａ）として固定化されていても、その固定化量が他の固定化物質より多ければ、相互作用測定の際、シグナル強度が大きくなり、見かけの相互作用が強いという結果になるため、好ましくない。
【００２０】
複数の生体分子（Ａ）を、同一基板上に固定化したアレイにおいては、固定化する際の濃度を一定にすることで、固定化量をほぼ一定にすることができる。しかし、分子量が大きく異なる場合、同様の反応を行っても、固定化量にバラツキが生じ、見かけの相互作用が異なってしまう。
【００２１】
そこで、各生体分子（Ａ）と生体分子（Ｂ）の相互作用で得られるシグナルを、それぞれの固定化量でノーマライズすることが好ましい。その方法として、生体分子（Ａ）の一部に、生体分子（Ｃ）と相互作用する部位を利用する、または、（Ｃ）と相互作用する部位を設けておき、生体分子（Ａ）と生体分子（Ｃ）の相互作用により得られるシグナルを利用する方法が好ましい。相互作用する生体分子（Ｃ）の分子数は、生体分子（Ａ）の固定化量と比例関係にあるため、生体分子（Ｃ）と生体分子（Ａ）の相互作用で得られたシグナルで生体分子（Ｂ）と生体分子（Ａ）の相互作用で得られたシグナルをノーマライズすることができる。
【００２２】
生体分子（Ｃ）は生体分子（Ａ）に特異的に結合することが好ましく、その反応の親和性が高く、強固な結合であるとさらに好ましい。例えば、生体分子（Ａ）がビオチンを有している分子であるなら、生体分子（Ｃ）はアビジン類の蛋白質であることが好ましく、また、生体分子（Ａ）がＧＳＴやヒスチジン、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇといったタグ融合蛋白質であれば、生体分子（Ｃ）は、それぞれの抗タグ抗体が好ましい。この他にも、ホルモンやレセプターといったシグナル伝達物質や薬物候補低分子物質などで、すでに抗体がスクリーニングされている分子が生体分子（Ａ）として固定化されている場合は、その抗体により固定化されていることを確認し、さらに固定化量によるノーマライズを行うことが可能である。
【００２３】
これらの中でも、特に、ビオチンとアビジン類蛋白質の相互作用で固定化を確認することが最も好ましい。ビオチンとアビジン類蛋白質の相互作用は、特異性が非常に高く、抗原抗体反応よりも親和性が高く、ほぼ不可逆的に反応する（結合定数  抗原抗体反応：１０９Ｍ、ビオチン−アビジン１０１５Ｍ）からである。アビジン類としてはアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンなどが挙げられる。
【００２４】
生体分子（Ａ）は、前述のような末端の修飾が容易であること、また、複数の種類を容易に得られることから、核酸であることが好ましい。
【００２５】
特に本発明で効果を発揮できるのは、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によって合成された二本鎖ＤＮＡを基板上に固定化する場合である。ＰＣＲ産物の長さはさまざまであり、濃度を制御することも難しいため、固定化量の制御が困難である。従って、相互作用によって得られたシグナルの強弱を評価するために、ノーマライズが不可欠となる。
【００２６】
ＰＣＲ産物は、固体表面に共有結合、または、非共有結合で固定化する。その固定化のために、ＰＣＲで用いられる一方のプライマーの末端に、固定化のための官能基や結合グループが導入されていることが好ましい。すでに述べたがチオール基、アミノ基、カルボキシル基、ビニル基、ビオチン、ヒスチジンタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ハロタグ、ＳＮＡＰタグ、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグなどの官能基や結合グループが挙げられる。固定化のための官能基や結合グループが導入される末端としては５’末端が好ましい。ＰＣＲの反応がスムーズにいくためである。プライマーはセンス側であってもアンチセンス側であってもどちらでもよい。
【００２７】
ＰＣＲ産物の固定化を確認するために、もう一方のプライマーの末端にビオチンを入れておくことが好ましい。末端は５’末端であることが好ましい。また、相互作用の測定の際に、上記のようにノーマライズするとさらに好ましい。
【００２８】
いずれのプライマーの長さは特に限定されるものではないが、１５〜４０ｍｅｒが好ましく、１５〜３０ｍｅｒがより好ましい。この範囲外であると、非特異的なアニーリングが起こり、目的の配列以外の不純物が混入している危険性がある。いずれのプライマーも、テンプレートに対して、全ての配列で相補的であってもよく、一部の配列で相補的でない部分を含んでもよい。
【００２９】
また、ＰＣＲで用いられるプライマーは複数の配列を用いることが好ましい。プライマーの組み合わせにより、様々な長さ、範囲の二本鎖ＤＮＡを得ることができるからである。この場合、それぞれの配列の組合せに対して、ＰＣＲが施され、その合成物が個別に固定化される。固定化される方法としては、同一基板上にアレイ状に固定化されるのが好ましい。プライマーの設計方法について、一つのセンスプライマーに対して、アンチセンスプライマーを複数用いると好ましい。生体分子（Ｂ）が相互作用する部分が、テンプレート上のどの位置であるかを同定することができるからである。
【００３０】
ＰＣＲ法でＤＮＡを増幅する場合、使用するＤＮＡポリメラーゼは、ＴａｑやＫＯＤなどのＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。なかでも、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、他のＤＮＡポリメラーゼより、増幅効率や伸長性を優れていることから、本発明に使用することが好ましい。プライマー濃度、ポリメラーゼ濃度、テンプレート濃度、ＰＣＲにおけるサイクル数、伸張温度、ＰＣＲ溶液の組成などは特に限定されるものではなく、一般的に推奨されている条件の範囲で選ぶことができる。
【００３１】
使用するテンプレートは、特に限定されるものではない。ゲノムＤＮＡ、プラスミドベクター、ｃＤＮＡなどを用いることができる。なかでも、ゲノムＤＮＡは、プライマーを複数用いることにより、多種類のＰＣＲ産物を得ることが可能であるため、最も好ましい。
【００３２】
得られたＰＣＲ産物は、非常に希薄であるため精製された上で、濃縮されることが好ましい。精製の方法は特に限定されるものではないが。ゲルろ過を使った方法、ゲルからの切り出しを行う方法、磁気ビーズを使った方法などが挙げられる。濃縮する方法は特に限定されるものではないが、溶媒を蒸発させて濃縮する方法、絶乾して水または緩衝液を与える方法、メンブレンフィルターを使って濃縮する方法などが挙げられる。
【００３３】
固定化する固体基板は金属基板が好ましい。金属基板は、表面に金薄層が形成された透明基板であることが好ましい。金表面には金−硫黄結合を利用し、直接的あるいは間接的に表面へ生体分子（Ａ）を固定化することができる。
【００３４】
直接的には、チオール基と金の（１１１）面の結合を利用して固定化する方法である。間接的には、金表面に官能基を導入した後に、生体分子（Ａ）に修飾されている官能基あるいは結合グループと直接的あるいは間接的に結合させることが可能である。金表面に官能基を導入する方法としては二官能基型アルカンを金表面に密に充填する方法が好ましい。二官能基型アルカンとしては限定されるものではないが、例えば末端にアミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、スクシンイミド基、ビニル基などを有し、反対側の末端にチオール基を有するアルカンチオール、またはそれらの二量体であるジスルフィドなどが挙げられる。二官能基型アルカンを使って表面に官能基を導入したのち、生体分子（Ａ）は直接あるいは間接的に表面に固定化される。間接的に、スペーサーを介して生体分子（Ａ）が固定化されると、固定化された核酸分子にモビリティが与えられるため特に好ましい。スペーサーとしては、ポリエチレングリコールなどの合成親水性高分子、デキストランなどの天然親水性高分子、チミンやアデニンのＤＮＡ繰り返し配列などが挙げられる。
【００３５】
本発明においては、生体分子（Ａ）と相互作用する生体分子（Ｂ）は蛋白質であることが好ましい。相互作用の測定対象が低分子であると、測定手段の検出限界により、相互作用を検出できない場合があるが、本発明の効果を損なわない限り使用してもよい。本発明で推奨される蛋白質は高分子であり、さらに修飾やラベルが他の生体分子より比較的容易なため、後述する様々な相互作用の検出方法に順応している。さらに蛋白質はＤＮＡ結合性蛋白質であることが好ましく、さらに好ましくは転写因子であることが好ましい。
【００３６】
生体分子（Ａ）と生体分子（Ｂ）の相互作用と生体分子（Ａ）と生体分子（Ｃ）の相互作用を検出する手段は、同一の方法であることが好ましい。それぞれの相互作用で得られるシグナルから、その比を求めるため、異なる検出方法を用いた場合、シグナルの強弱が異なる可能性があるからである。また、これらの相互作用の検出は、ラベルによって検出する方法とラベルフリーで検出する方法が挙げられる。ラベルする方法としては、蛋白質にラベルし検出する方法、蛋白質をラベル化抗体で検出する方法、または二次抗体で検出する方法などが挙げられる。ラベルの方法は特に限定されるものではないが、ＧＦＰなどの蛍光蛋白質との融合蛋白質を形成する方法、放射線同位体とコンジュゲートを形成させる方法などが挙げられる。ラベルフリーな検出手段としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、局在プラズモン共鳴（ＬＰＲ）、水晶発振子（ＱＣＭ）、エリプソメトリ、二面偏波式干渉、和周波発生（ＳＦＧ）、第２高調波発生（ＳＨＧ）などの方法が挙げられる。そのなかでＳＰＲは、ラベルフリーであるため好ましい。中でも、ＳＰＲの一種であるＳＰＲイメージング法はチップの広い範囲にｐ偏光光束を照射し、その反射像をＣＣＤカメラで撮影する方法であり、アレイフォーマットで複数の点を同時に測定できることができるため、特に好ましい。
【実施例】
【００３７】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００３８】
転写因子Ｎｒｆ２／ＭａｆＧとその認識配列ｎｑｏ１ＡＲＥの相互作用をモデル系として用いた。ビオチン−ストレプトアビジン（以下、ＳＡ）反応とストレプトアビジン抗体（以下、ＳＡ抗体）の結合反応を用いて、ＰＣＲで合成した二本鎖ＤＮＡが固定化しプローブとして機能しているかの確認と、その固定化量と転写因子として相互作用するタンパク質量の相関性を検討した（図１）。
【００３９】
（ＰＣＲによるＤＮＡプローブの調製）
センスプライマーは1種類（配列番号１）、アンチセンスプライマーは５種類（配列番号２〜６）使用した。ＰＣＲで用いたプライマーを表１に示す。なお、センスプライマーの５´末端には、基板表面に固定化するため、チオール基が修飾されている（チオール基に対する保護基はＰＣＲ終了後に除去）。また、アンチセンスプライマーの５´末端には、ビオチンが修飾されている。ｎｑｏ１ＡＲＥ−１２４−ＡＳを用いて増幅したｎｑｏ１ＡＲＥ−１２４のみ、認識配列ｎｑｏ１ＡＲＥ配列を含まず、それ以外のプライマーを用いたＰＣＲ増幅産物は、ｎｑｏ１ＡＲＥ配列を含む（図２）（配列番号７）。
【００４０】
【表１】
2007108010.tif 000002
【００４１】
Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ（登録商標）（Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ：東洋紡績株式会社製）２.５Ｕ、５０ｎｇマウスゲノムＤＮＡ、１０ｐｍｏｌプライマーを含むＰＣＲ溶液（５０μｌ×２）を用いて、９４℃（３０秒）−６２.５（３０秒）−７２℃（１分）のサイクルを３５回行った。ＰＣＲ反応後、２％アガロース電気泳動により、長さの異なるＰＣＲ産物の増幅を確認した（図３）。
【００４２】
（チオール基の保護基の除去）
５’末端がチオール基修飾されたセンスプライマーを用いるが、チオール基は容易に、酸化されるため、ＰＣＲ反応の段階では、保護基をつけた状態で反応を行った。ＰＣＲ終了後、保護基を除去する処理を行った。ＰＣＲ産物に、終濃度４０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を１６時間室温で反応させることにより、保護基を除去し後、磁気ビーズ（ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（登録商標）：東洋紡績株式会社製）により精製、乾燥した。×５ＳＳＣ（７５ｍＭクエン酸ナトリウム、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）／１ｍＭＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）３μＬで溶解した。
【００４３】
（対照プローブの調整）
ｎｑｏ１ＡＲＥを有する合成オリゴプローブ（ｎｑｏ１ＡＲＥ−ｃ）（配列番号８）をポジティブコントロールとした。また、ｎｑｏ１ＡＲＥを有さない合成オリゴプローブ（ｔｈｉｏｌ）（配列番号１０）をネガティブコントロールとした。オリゴＤＮＡ鎖（配列番号８および１０）は、５’チオール末端からチミン１５塩基をスペーサーとして介した後、それぞれの配列が入るように設計されている。それぞれの配列のスペーサー部分を除いた配列に相補的なオリゴＤＮＡ鎖（配列番号９および１１）を準備した。それぞれ固定化前にアニールして、二本鎖ＤＮＡとした。それぞれの配列は表２に示した。
【００４４】
【表２】
2007108010.tif 000003
【００４５】
５×ＳＳＣ／１ｍＭＴＣＥＰに５’チオール末端ＤＮＡが５０μＭ、その相補的オリゴＤＮＡを１００μＭになるように溶液を調製し、オリゴＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた。さらに、この反応溶液を５×ＳＳＣ／１ｍＭＴＣＥＰで希釈し、５μＭの二本鎖ＤＮＡ溶液を調整した。あらかじめ、チオール基の保護基は除去してあるが、ＴＣＥＰにより、チオール基の酸化が防止されている。
【００４６】
（ＳＰＲ測定チップ表面の処理）
ＤＮＡチップ作製には、ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ（登録商標）  ＮＨ２チップ（東洋紡績株式会社製）を使用した。このチップは、ＮＨ２基が導入された５００μｍ四方のスポット領域が８×１２＝９６個形成されている。スポット領域でない領域（バックグラウンド領域）には、非特異吸着を抑制するポリエチレングリコールが固定化されている。
スポット領域に、ＰＥＧの両端にそれぞれマレイミド基とＮＨＳ基を有する架橋剤ＭＡＬ−ｄＰＥＧ１２−ＮＨＳ（Ｑｕａｎｔａ  ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ社製）５ｍｇ／ｍｌを２時間反応させ、表面にマレイミド基を導入した。
【００４７】
（プローブの固定化）
マレイミド基表面のチップに、ＰＣＲ産物を自動スポッター（ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ（登録商標）：東洋紡績株式会社製）を用いてスポットし、室温で１６時間反応し、プローブを表面に固定化した。
【００４８】
（チップの洗浄、ＳＰＲ機器への設置）
ＰＣＲ産物を固定化した表面を５×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１５分間、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１５分間、０．２×ＳＳＣ１５分間で洗浄した後、１ｍＭチオール末端ＰＥＧ１時間反応させて、未反応のマレイミド基をブロッキングした。
【００４９】
ＳＰＲイメージング機器（ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ（登録商標）：東洋紡績株式会社製）のフローセルにセットし、転写因子測定用緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭＴＣＥＰ、ｐＨ７．９）をフローセル内に流した。
【００５０】
（ヘテロダイマーの調整）
ヘテロダイマーＮｒｆ２／ＭａｆＧは、ＭａｆＧ及びＤＮＡとの結合部位を有するＮｒｆ２ＣＴと、ｂ−Ｚｉｐ構造、ＤＮＡ結合部位などを有しているＭａｆＧ１−１２３を二種類混合することにより調整する。上記転写因子測定用緩衝液中にＮｒｆ２ＣＴが５００ｎＭ、ＭａｆＧ１−１２３が５０ｎＭ含まれるように調整した。Ｎｒｆ２ＣＴが過剰に存在する条件であるため、ＭａｆＧ１−１２３のホモポリマーの存在はほとんど無視することができ、ＭａｆＧ／Ｎｒｆ２ヘテロダイマーが５０ｎＭ存在しているとみなすことができる。なお、Ｎｒｆ２はホモダイマーと形成することはない。
【００５１】
（相互作用測定）
ＳＰＲからのシグナルが安定したのを確認した後に、ヘテロダイマーＮｒｆ２／ＭａｆＧを５０ｎＭの濃度で、セル内に１０分間１００μｌ／ｍｉｎの速度で注入し、次に緩衝液を流した（図4）。相互作用の有無は、ＳＰＲシグナル上昇の有無で判断した。
認識配列ｎｑｏ１ＡＲＥ配列を含むｎｑｏ１ＡＲＥ−１７６、４４４、９９５、１４８８、及び、コントロールｎｑｏ１ＡＲＥ−ｃのＳＰＲシグナルは上昇し、含まないｎｑｏ１ＡＲＥ−１２４、及び、ｔｈｉｏｌのＳＰＲシグナルは上昇しなかった。ただし、ヘテロダイマーの結合によるシグナル上昇の程度は、異なっており、ＰＣＲ産物の長さが長いほど、シグナル強度が低い傾向となる。ただし、シグナルが低くなる原因が、ＰＣＲ産物の長さのためであるか、ＰＣＲ産物の基板への固定化量の差のためであるかは不明である。そこで、基板上への固定化量を確認するためにＳＡ、抗ＳＡ抗体を順に相互作用させ、得られるシグナルを評価した。
【００５２】
（固定化確認）
転写因子との相互作用測定に引き続き、５μｇ／ｍｌ  ＳＡを３分間流した後、緩衝液を流した。さらに、１μｇ／ｍｌ  ＳＡ抗体を５分間流した後、緩衝液を流した（図4）。
ＰＣＲで合成した５種類のＤＮＡプローブ（ｎｑｏ１ＡＲＥ−１２４、１７６、４４４、９９５、１４８８）に対しては、ビオチン−ＳＡ結合によりシグナルが上昇し、さらに、ＳＡ抗体を用いた抗原抗体反応により、シグナルを増強させた。ビオチン分子を有さない合成オリゴを用いたＤＮＡプローブ（ｎｑｏ１ＡＲＥ−ｃ、ｔｈｉｏｌ）は、いずれの反応に対して、シグナルは上昇しなかった。認識配列ｎｑｏ１ＡＲＥを有さないために転写因子と反応しないプローブｎｑｏ１ＡＲＥ−１２４が、ＳＡ、ＳＡ抗体ともに結合反応を示すことから、ＰＣＲ産物が固定化されていることが確認できた。
【００５３】
（固定化量と相互作用の相関）
それぞれのＤＮＡプローブに対しての、転写因子の相互作用時のシグナル強度とＳＡ抗原抗体反応時のシグナル強度の比を算出したところ、大きな差はないと思われた（表３）。ＰＣＲ産物が長いほどヘテロダイマーが相互作用しにくいとは言えず、固定化量が少なかったためにシグナルが低くなっていると思われた。この手法により、ＰＣＲ産物が表面に固定化されていることを確証し、さらに二種類の蛋白質の相互作用によって得られるシグナルの比から、相互作用の強弱によるシグナル差であるか、固定化量の違いによるシグナル差であるかを判定することができた。
【００５４】
【表３】
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【００５５】
［比較例］
センスプライマーの５´末端にチオール基を修飾したセンスプライマーと、末端未修飾のアンチセンスプライマーを用いて、実施例と同様にＰＣＲ、固定化、ＳＰＲによる転写因子との相互作用の測定を行った。引き続き、ＳＤＳにより、結合した転写因子を変性、解離させた。この時のＳＰＲシグナルは転写因子相互作用の測定前に戻る（図５−Ｆ）。さらに、尿素により、固定化した二本鎖ＤＮＡを変性させ、チオール基により固定化している一本鎖ＤＮＡとした。この時、結合していた一本鎖ＤＮＡ分だけ、シグナルが減少することで、固定化している物質が二本鎖ＤＮＡであることを確認し、各ＤＮＡプローブの固定化量を比較することができた（図５−Ｉ）。
【００５６】
固定化したＰＣＲ産物が複雑な立体構造を有する場合など、ＳＰＲ装置上では、完全な変性・解離が困難で、ＳＰＲシグナルの減少が確認できないことがあり、この比較例は非常に煩雑であるとともに、正しい結果が得られない場合があるため好ましくない。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明により、生体分子間の相互作用を観察する際、一方の生体分子が固体表面に固定化されていることを確認すること、さらには固定化量に応じたシグナルのノーマライズが可能である。従って、厳密な解析が可能となり、特に、転写因子の機能を知るために本発明は大いに有用であることからも、産業界に大きく寄与することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】固定化したＰＣＲ産物とＭａｆＧ／Ｎｒｆ２、ＳＡ、ＳＡ抗体の結合の概念図
【図２】ｎｑｏ１ＡＲＥ付近の配列
【図３】ＰＣＲ増幅産物の確認
【図４】Ｎｒｆ２／ＭａｆＧとＳＡ、ＳＡ抗体によるＳＰＲシグナル変化
【図５】Ｎｒｆ２／ＭａｆＧとの相互作用とＳＤＳ，尿素による変性、解離のＳＰＲシグナル変化
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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