(57)【要約】【課題】  本発明は、外部ストレスにより生じた細胞内DNAの切断位置を一塩基単位で特定する方法を提供することを課題とする。本発明は、また、外部ストレスにより生じた細胞内DNAの切断頻度を一塩基単位で測定する方法を提供することもまた課題とする。【解決手段】  本発明の発明者らは、外部ストレスに曝露したかもしくは内部被曝させた細胞から採取したDNAを鋳型として、標識したプライマーを使用した伸長反応により伸長させることにより、外部ストレスもしくは内部被曝の結果として切断された場合のDNA上の切断位置に応じて、種々の長さの標識された断片（断片長多型）を得ることができることを見いだし、本発明を完成させるに至った。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）外部ストレスに曝露したか内部被曝させた細胞から抽出したDNAを、熱変性またはアルカリ変性により二本鎖を一本鎖にし；
b）標識したプライマーを一本鎖DNAにアニーリングし；
c）DNAポリメラーゼを利用して、一本鎖DNAを鋳型として二本鎖DNAを合成し；
d）二本鎖DNAを再び一本鎖にし、対照DNAと同時にゲル電気泳動を行い；そして
e）対照DNAの電気泳動バンドと比較することにより、DNA上の切断位置を一塩基単位で特定する；
ことを特徴とする、外部ストレスへの曝露または内部被曝による一塩基単位での細胞内DNAの切断位置特定法。
【請求項２】
外部ストレスが、放射線によるストレス、放射性核種によるストレス、化学物質によるストレス、物理的ストレスである、請求項1に記載の一塩基単位での細胞内DNAの切断位置特定法。
【請求項３】
アデノシン付加による突出末端を生成しない種類のDNAポリメラーゼを利用してDNA合成を行う、請求項1または2に記載の一塩基単位での細胞内DNAの切断位置特定法。
【請求項４】
a）外部ストレスに曝露したか内部被曝させた細胞から抽出したDNAを、熱変性またはアルカリ変性により二本鎖を一本鎖にし；
b）標識したプライマーを一本鎖DNAにアニーリングし；
c）DNAポリメラーゼを利用して、一本鎖DNAを鋳型として二本鎖DNAを合成し；
d）二本鎖DNAを再び一本鎖にしてゲル電気泳動を行い；そして
e）バンドのヒストグラムのピーク面積比から、それぞれの切断位置での切断頻度を特定する；
ことを特徴とする、外部ストレスへの曝露または内部被曝による一塩基単位での細胞内DNAの切断頻度の測定法。
【請求項５】
外部ストレスが、放射線によるストレス、放射性核種によるストレス、化学物質によるストレス、物理的ストレスである、請求項4に記載の一塩基単位での細胞内DNAの切断頻度の測定法。
【請求項６】
アデノシン付加による突出末端を生成しない種類のDNAポリメラーゼを利用してDNA合成を行う、請求項4または5に記載の一塩基単位での細胞内DNAの切断頻度の測定法。
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】
【０００１】
本発明は、外部ストレスにより生じた細胞内DNAの切断位置を一塩基単位で特定する方法に関する。本発明はまた、外部ストレスにより生じた細胞内DNAの切断頻度を一塩基単位で測定する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
DNAは放射線、紫外線、化学物質、温度などの外部ストレスにより損傷を受ける。生体は、そのようにして生じるDNA損傷を修復するために、種々のタンパク質からなるDNA損傷修復機能を持っている。しかしながら、そのような修復機能をもってしても修復できない損傷が生じた場合には、細胞死、突然変異そして発ガンなどの重大な影響を及ぼすと考えられている。
【０００３】
従来、DNAの損傷を研究する際、細胞から取り出したDNAか合成したDNA断片に、in vitroにて外部ストレスを与えて、上述した細胞外DNAに対して損傷を生じさせる手法が利用されている。そして、そのようなDNA損傷実験においては、切断が生じているかどうかの定性的な損傷状況は、上述した細胞外DNAをアガロースゲル電気泳動で解析することにより判断している。一方、一塩基単位での細胞外DNAの詳細な切断位置は、主にマクサム-ギルバート法を利用して配列決定することにより特定されている。
【０００４】
しかしながら、アガロースゲル電気泳動による解析では、一塩基単位でのDNAの詳細な切断位置を特定することができず、一方マクサム-ギルバート法に代表される配列解析を利用すれば詳細な切断位置を特定することは可能であるが、手法自体が煩雑であり、また多大な時間および労力がかかるという問題点を抱えていた。
【０００５】
また、本来、DNAに対する外部ストレスの影響を調べるためには、細胞内のDNA損傷修復系の作用を加味した状態で判断することが望ましいため、細胞内に存在したままのDNAに外部ストレスを与え、それにより生じた切断位置を解析する方が、実際のDNAの損傷状態に即している。しかしながら、細胞内に存在したままのDNAに対する外部ストレスにより生じた切断位置を解析する方法は、未だ確立されていない。
【非特許文献１】W.D. Henner et al., J. Biol. Chem., 257, 11750-11754 (1982)
【非特許文献２】W.D. Henner et al., J. Biol. Chem., 258, 711-713 (1983)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、外部ストレスにより生じた細胞内DNAの切断位置を一塩基単位で特定する方法を提供することを課題とする。本発明は、また、外部ストレスにより生じた細胞内DNAの切断頻度を一塩基単位で測定する方法を提供することもまた課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の発明者らは、外部ストレスに曝露したかもしくは内部被曝させた細胞から採取したDNAを鋳型として、標識したプライマーを使用した伸長反応により伸長させることにより、外部ストレスもしくは内部被曝の結果として切断された場合のDNA上の切断位置に応じて、種々の長さの標識された断片（断片長多型）を得ることができることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
本発明は、具体的には、
a）外部ストレスに曝露したか内部被曝させた細胞から抽出したDNAを、熱変性またはアルカリ変性により二本鎖を一本鎖にし；
b）標識したプライマーを一本鎖DNAにアニーリングし；
c）DNAポリメラーゼを利用して、一本鎖DNAを鋳型として二本鎖DNAを合成し；
d）二本鎖DNAを再び一本鎖にし、対照DNAと同時にゲル電気泳動を行い；そして
e）対照DNAの電気泳動バンドと比較することにより、DNA上の切断位置を一塩基単位で特定する；
ことを特徴とする、外部ストレスへの曝露または内部被曝による一塩基単位での細胞内DNAの切断位置特定法を提供することにより、上述した課題を解決することができることを示した。
【０００９】
本発明はさらに、
a）外部ストレスに曝露したか内部被曝させた細胞から抽出したDNAを、熱変性またはアルカリ変性により二本鎖を一本鎖にし；
b）標識したプライマーを一本鎖DNAにアニーリングし；
c）DNAポリメラーゼを利用して、一本鎖DNAを鋳型として二本鎖DNAを合成し；
d）二本鎖DNAを再び一本鎖にしてゲル電気泳動を行い；そして
e）バンドのヒストグラムのピーク面積比から、それぞれの切断位置での切断頻度を特定する；
ことを特徴とする、外部ストレスへの曝露または内部被曝による一塩基単位での細胞内DNAの切断頻度の測定法を提供することにより、上述した課題を解決することができることを示した。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法を使用することにより、細胞内に存在した状態のDNAにおいて、外部ストレスへの曝露または内部被曝により生じる切断位置を特定することや、各切断位置での切断頻度を特定することができる。本発明の方法を使用することにより、細胞内に存在した状態のDNAにおいて外部ストレスへの曝露または内部被曝により生じる切断位置と、細胞外DNAにおいて外部ストレスへの曝露または内部被曝により生じる切断位置とを比較することにより、外部ストレスへの曝露または内部被曝に対する細胞内物質の影響を調べることもできる。
【発明の実施の形態】
【００１１】
本発明の方法においては、
a）外部ストレスに曝露したか内部被曝させた細胞から抽出したDNAを、熱変性またはアルカリ変性により二本鎖を一本鎖にし；
b）標識したプライマーを一本鎖DNAにアニーリングし；
c）DNAポリメラーゼを利用して、一本鎖DNAを鋳型として二本鎖DNAを合成し；
d）二本鎖DNAを再び一本鎖にし、対照DNAと同時にゲル電気泳動を行い；そして
e）対照DNAの電気泳動バンドと比較することにより、DNA上の切断位置を一塩基単位で特定する；
ことにより、外部ストレスへの曝露または内部被曝による一塩基単位での細胞内DNAの切断位置特定法を提供することができる。
【００１２】
この方法を利用することにより、目的とするDNAが外部ストレスへの曝露または内部被曝を受けた場合に、細胞内でDNA上のどのような位置に損傷を受け、その結果切断されるかを、配列決定をすることなく、簡便に明らかにすることができる。
【００１３】
本発明の方法においては、まず、目的とするDNAが細胞内に存在する生理学的条件下にて、外部ストレスに曝露させるか内部被曝させる。このような外部ストレス処理により、目的とするDNA上に全く損傷が生じない細胞も存在するが、目的とするDNA上の種々の部位において切断が生じた細胞もまた存在する。そのため、外部ストレス処理した多数の細胞から目的とするDNAを採取すると、切断されていないDNAの他に、目的とするDNAについて、断片長多型を有するものが出現する可能性がある。本発明の方法においては、このような断片長多型を識別することを特徴とする。
【００１４】
本発明において外部ストレスに負荷するという場合、外部ストレスに曝露させる場合と内部被爆させる場合とをいう。そして、外部ストレスに曝露させるという場合、細胞を細胞外から外部ストレスに曝露することをいい、一方内部被曝させるという場合、外部ストレスを細胞内に取り込ませ、細胞内でストレスに曝露することをいう。本発明における外部ストレスは、DNAに対して損傷を生じさせるストレスであればどのようなものであってもよく、例えば、X線やγ線などの低LET放射線および中性子線やα線などの高LET放射線などの放射線によるストレス；79Se、239Puなどの放射性核種によるストレス；活性酸素、白金錯体、ブレオマイシンなどの化学物質によるストレス；および熱、圧力、磁力、紫外線などによる物理的ストレスを例としてあげることができる。
【００１５】
また、外部ストレスに曝露したか内部被曝させた細胞は、外部ストレスを負荷した培養条件下での細胞であっても、外部ストレスを負荷した生体から採取した細胞であってもよい。
【００１６】
続いて、このようにして外部ストレスに曝露したかまたは内部被爆させた細胞から、目的とするDNAを抽出する。本発明において、目的とするDNAは、細胞内に存在するどのようなDNAであってもよく、例えばゲノムDNAやプラスミドDNAであってもよい。本発明において好ましくは、取扱いの容易性の観点からプラスミドDNAを使用する。細胞から目的とするDNAを抽出するためには、SambrookとRussel（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition (2001)）に記載される方法など、当該技術分野において既知のいずれの手法を使用してもよい。
【００１７】
上述の工程において抽出した二本鎖DNAを、熱変性あるいはアルカリ変性などにより変性させて一本鎖にする。二本鎖DNAの変性のために熱変性を採用するかアルカリ変性を採用するかは、当業者が容易に決定することができる事項である。熱変性では、例えば94〜95℃で30秒〜5分間インキュベーションすることなどにより二本鎖DNAを変性させて一本鎖にすることができる。また、アルカリ変性では、例えばNaOH水溶液中で二本鎖DNAをインキュベーションすることにより二本鎖DNAを変性させて一本鎖にする。
【００１８】
このようにして一本鎖にしたDNAに対して、標識したプライマーをアニーリングする。このプライマーは、目的とするDNAにハイブリダイズすることができ、伸長反応のプライマーとして機能することを特徴とする。プライマーの標識は、検出可能なシグナルを発生する標識であればいずれを使用することもでき、32P、33P等の放射性同位元素による放射性標識や、蛍光標識や酵素標識、化学発光等の非放射性標識を使用することができる。
【００１９】
標識したプライマーを起点にして、DNAポリメラーゼによる伸長反応を利用して、鋳型である一本鎖DNAから二本鎖DNAを合成する。この反応を行う際に使用するDNAポリメラーゼは、アデノシン付加による突出末端を生成しない種類のDNAポリメラーゼであることが必要である。これは、突出末端が生成されると一塩基単位での切断位置を正確に特定できなくなるためである。このようなDNAポリメラーゼとして、クレノウ酵素、PyroBEST DNAポリメラーゼ（タカラバイオ）、PrimeSTAR HS DNAポリメラーゼ（タカラバイオ）などを使用することができる。二本鎖DNAの合成条件は、DNAポリメラーゼの至適活性条件に基づいて、当業者が容易に設定することができ、例えばDNAポリメラーゼとしてクレノウ酵素を使用する場合には40℃にて20分間、DNAポリメラーゼとしてPyroBEST DNAポリメラーゼを使用する場合には72℃にて6分などの条件で、反応を行う。この様にして1回の伸長反応を行うことにより、1本の鋳型DNAにつき標識プライマーを含むDNA鎖が1本作製される。そして、前述した様に外部ストレスの負荷により、目的とするDNAが断片長多型を生じるため、この伸長工程により、各断片に由来する種々の長さの伸長断片が作製されることになる。
【００２０】
次いで、目的とするDNAの種々の断片長多型を分離するため、上述の工程において作製された二本鎖DNAを、熱変性またはアルカリ変性などを使用して再び一本鎖に変性させた後、ゲル電気泳動を行う。このゲル電気泳動は、核酸を分離することができるものであればどのようなものであってもよく、例えば平板のポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲルを用いたゲル電気泳動またはキャピラリーポリアクリルアミドゲルなどを用いたキャピラリーゲル電気泳動が含まれる。
【００２１】
それぞれの断片長多型DNAは、一方の末端に必ずプライマーに由来する標識を有しているため、標識由来のシグナルから各DNA断片の長さをDNAラダーとして精密に識別することができる。そして、非処置の同一DNAや分子量マーカーDNAなどの対照DNAの電気泳動バンドと比較することにより、目的とするDNAの切断位置を一塩基単位で識別することができる。
【００２２】
本発明の方法においてはさらに、
a）外部ストレスに曝露したか内部被曝させた細胞から抽出したDNAを、熱変性またはアルカリ変性により二本鎖を一本鎖にし；
b）標識したプライマーを一本鎖DNAにアニーリングし；
c）DNAポリメラーゼを利用して、一本鎖DNAを鋳型として二本鎖DNAを合成し；
d）二本鎖DNAを再び一本鎖にしてゲル電気泳動を行い；そして
e）各バンドの標識由来シグナルを数値化することにより、それぞれの切断位置での切断頻度を特定する；
ことにより、外部ストレスへの曝露または内部被曝による一塩基単位での細胞内DNAの切断頻度の測定法を提供することができる。
【００２３】
上述したようにゲル電気泳動を行った後、各DNA断片に対応する各バンドからの標識由来シグナルを数値化する。標識由来シグナルを数値化するための方法としては、各バンドのヒストグラムのピーク面積を求める方法、台形則、シンプソン則等が存在する。そして、各DNA断片に対応する各バンドから得られた標識由来シグナルの数値に基づいて、各DNA断片の頻度を算出することができる。
【００２４】
この方法を利用することにより、細胞内の目的とするDNAが、外部ストレスへの曝露または内部被曝を受けた場合に、DNA上のどのような位置においてどの程度の頻度で切断が生じるか、を定量的に明らかにすることができる。
【００２５】
さらに、本発明の方法においては、細胞内に存在した状態のDNAにおいて外部ストレスへの曝露または内部被曝により生じる切断位置と、細胞外DNAにおいて外部ストレスへの曝露または内部被曝により生じる切断位置とを、前述した手法を用いてそれぞれ解析し、得られた結果を比較することにより、外部ストレスへの曝露または内部被曝に対する細胞内物質の影響を調べることもできる。
【実施例】
【００２６】
本発明をさらに具体的に説明するため、γ線を照射した細胞内プラスミドDNAと細胞外プラスミドDNAの切断位置を特定した実施例ならびに各切断位置での切断頻度を測定した実施例について説明する。
【００２７】
実施例1：γ線照射とプラスミドDNAの切断
本実施例においては、pUC19プラスミドDNAを目的とするDNAとして使用して、外部ストレスとDNAの切断との関係を特定することを目的とした。
【００２８】
（i）DNAサンプルの調製
pUC19プラスミドDNAのサンプルを調製するため、以下の操作を行う。すなわち、pUC19プラスミドDNAを細胞内に保有している大腸菌を、37℃にて一晩、アンピシリンを含むLB培地中で液体培養する。培養後、液体培地の一部を8000×g、4℃で5分間遠心処理し、10 mMリン酸緩衝液を10 ml加えて沈殿を再懸濁する。遠心処理と再懸濁の操作を3回繰り返し、最後の懸濁後、2 mlのマイクロチューブに2 mlずつ分取し、大腸菌サンプルを調製した。
【００２９】
このようにして調製した大腸菌サンプルの一部を用い、QIAprep Spin Miniprepキット（QIAGEN社）を利用して細胞外DNAサンプルを調製する。非処理細胞外DNAは最終的に精製水（または10 mMリン酸緩衝液などの適当な溶液）に溶解し、濃度は50 ng/μlに合わせる。
【００３０】
このようにして調製した細胞外DNAサンプルの一部を、細胞外DNAに対する外部ストレス処理の影響を調べるために使用し、別の一部を非処理細胞内DNAの対照サンプルとして使用した。
【００３１】
（ii）細胞外DNAの外部ストレス処理
上記（i）の方法で採取し、精製水（または10 mMリン酸緩衝液などの適当な溶液）に再溶解した細胞外pUC19プラスミドDNAに対して、50 Gy、80 Gyまたは100 Gyのγ線を照射することにより（日本原子力研究開発機構高崎量子応用研究所、コバルト60γ線照射施設）、細胞外DNAの外部ストレス処理を行った。
【００３２】
（iii）細胞内DNAの外部ストレス処理
pUC19プラスミドDNAを細胞内に保有している大腸菌を、37℃にて一晩、アンピシリンを含むLB培地中で液体培養する。培養後、細胞内DNAの外部ストレス処理を行った。精製水（または10 mMリン酸緩衝液などの適当な溶液）に再溶解した大腸菌に対して、500 Gy、1 kGy、5 kGyまたは10 kGyのγ線を照射することにより、外部ストレス処理を行った。
【００３３】
外部ストレス処理された大腸菌内のpUC19プラスミドDNAのサンプルを調製するため、以下の操作を行う。すなわち、液体培地の一部を8000×g、4℃で5分間遠心処理し、10 mMリン酸緩衝液を10 ml加えて沈殿を再懸濁する。遠心処理と再懸濁の操作を3回繰り返し、最後の懸濁後、2 mlのマイクロチューブに2 mlずつ分取し、大腸菌サンプルを調製した。
【００３４】
上述した外部ストレス処理した大腸菌細胞から、QIAprep Spin Miniprepキット（QIAGEN社）を利用して、外部ストレス処理したpUC19プラスミドDNAを調製する。外部ストレス処理DNAは最終的に精製水に溶解し、濃度は50 ng/μlに合わせる。
【００３５】
（iv）切断の有無の確認
（ii）の工程でγ線照射した細胞外DNAサンプル1μlと、（iii）の工程でγ線照射した細胞内DNA由来のサンプル1μlとを、アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動の終了後、臭化エチジウム溶液に10分間浸した後、紫外線照射下で、DNAバンドを観察してDNAが切断されているかどうか確認した。
【００３６】
結果を図1に示す。図1Aは、細胞外DNAに対してγ線照射した後のDNAの状態を示しており、図1Bは、細胞内DNAに対してγ線照射した後のDNAの状態を示している。両図において、「I型DNA」は切断が起きていない状態のDNAを示し、「III型DNA」は切断が起きた状態のDNAを示す。そして、図1Aおよび1Bにおいて、各レーンの数字は、照射したγ線の線量を示しており、レーン「50」は50 Gyのγ線照射したDNA、レーン「80」は80 Gyのγ線照射したDNA、レーン「100」は100 Gyのγ線照射したDNA、レーン「500」は500 Gyのγ線照射したDNA、レーン「1K」は1 kGyのγ線照射したDNA、レーン「5K」は5 kGyのγ線照射したDNA、そしてレーン「10K」は10 kGyのγ線照射したDNAをそれぞれ示す。また、両図において、レーン「M1」はスーパーコイルマーカーDNA、レーン「NC」はガンマ線の照射無しの陰性対照、そしてレーン「M2」は500塩基対マーカーDNAをそれぞれ示す。
【００３７】
これらの結果から、ガンマ線の照射無しではDNAに切断は起きていないが、ガンマ線を照射したDNAでは多かれ少なかれ、また細胞外であっても細胞内であっても、DNAが切断されていることが分かる。また、細胞外DNAでは50 Gy程度のγ線照射によりほぼすべてのプラスミドDNAが切断しているのに対して、細胞内のDNAの場合には、500 GyでもわずかしかプラスミドDNAが切断されておらず、それ以上のγ線を照射すると線量依存的に切断頻度が高くなっていることがわかった。
【００３８】
実施例2：プラスミドDNA上の切断位置の特定
本実施例においては、実施例1においてγ線照射により切断されたpUC19プラスミドDNAの切断位置を特定することを目的とした。
【００３９】
（i）DNAサンプルの精製
50 ng/μlのDNAを含むそれぞれのサンプル9μlにキャリヤーとして10 mg/mlのグリコーゲンを2μl加え、さらに、3 Mの酢酸ナトリウム溶液（pH 5.2）を2μl、エタノールを40μl加えて軽く攪拌し、-70℃で5分間放置した。13000×gで15分間遠心した後、上澄みを除去し、沈殿物を70％エタノールで軽くすすいでから、減圧乾燥させることにより、DNAサンプルを精製した。
【００４０】
（ii）DNAサンプルのアルカリ変性
上記（i）の工程で精製したDNAサンプルが入っている容器に対して、精製水を8μl、2mM エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を1μl、2M 水酸化ナトリウムを1μl添加し、攪拌した。この溶液を37℃で5分間放置した後、3M 酢酸ナトリウム（pH5.2）溶液を2μl、70％エタノールを50μlずつ加え、軽く攪拌した後、-70℃で5分間放置した。次いで、13000×gで15分間遠心処理した後、上澄みを除去し、沈殿物を70％エタノールで軽くすすいでから、減圧乾燥することにより、アルカリ変性DNAサンプルを調製した。このアルカリ変性処理により、二本鎖DNAが解離され、一本鎖DNAとなった。
【００４１】
（iii）対照DNAサンプルのアルカリ変性
実施例1（i）において調製した50 ng/μlのDNAサンプル9μlにキャリアとして10 mg/mlのグリコーゲンを2μl添加し、さらに3 Mの酢酸ナトリウム（pH 5.2）を2μl、70％エタノールを40μl添加して軽く攪拌し、-70℃で5分間放置した。13000×gで15分間遠心処理した後、上清を除去し、沈殿物を70％エタノールで軽くすすいでから、減圧乾燥させた。
【００４２】
乾燥後、精製水8μl、2 mM EDTAを1μl、2 M水酸化ナトリウムを1μl添加し、攪拌した。この溶液を37℃にて5分間放置した後、3 M酢酸ナトリウム（pH 5.2）溶液を2μl、70％エタノールを50μlずつ添加し、軽く攪拌した後、-70℃で5分間放置した。次いで、13000×gで15分間遠心処理した後、上清を除去し、沈殿物を70％エタノールで軽くすすいでから、減圧乾燥させることにより、対照とするアルカリ変性DNAサンプルを調製した。
【００４３】
（iv）32Pによるプライマーの5'末端標識
pUC19プラスミドDNA用のM1プライマー（5’-AGTCACGACGTTGTA-3’；SEQ ID NO: 1）の5'末端に、DNA 5'末端標識キット「MEGALABEL」（タカラバイオ）を使用して32P標識を導入した。具体的には、マイクロチューブに、5 pmol/μlのM1プライマーを1μl、キットに含まれている10×リン酸化バッファーを1μl、精製水を2μl、[γ-32P]ATP（比放射能222 TBq/mmol、放射能濃度37 MBq/ml）を5μl、そしてキットに含まれているクローン化T4ポリヌクレオチドキナーゼを1μl添加し、37℃にて30分間保温した。次いで、90℃にて2分間加熱処理し、酵素を失活させ、その後氷中で冷却することにより、M1プライマーの5'末端を32Pで標識した。
【００４４】
（v）外部ストレス処理したDNAサンプルの伸長
（ii）の工程で一本鎖DNAとなった鋳型DNAと（iv）の工程で5'末端を32Pで標識したM1プライマーとを使用して、DNA断片の伸長反応を行った。伸長反応は、7-DEAZA Sequencing Kit（タカラバイオ）を使用して行った。プロトコルは以下の通りである。
【００４５】
（ii）の工程で得られた一本鎖DNAサンプルが入っている容器に、10×bufferを1μl、1 mM dNTP溶液を2μl、精製水を4μl、5'末端32P標識プライマー（M1）2μlを添加して、よく攪拌する。98℃で1分間加熱後、直ちに氷中で3分間冷却することにより、32P標識プライマーをアニーリングさせた。これに、クレノウ酵素を1μl加えて軽く攪拌し、40℃で20分間保温して伸長反応を行った。
【００４６】
伸長反応の後、停止溶液を3μl添加してから攪拌し、95℃で3分間加熱して酵素を失活させた後、氷中で急冷した。
【００４７】
（vi）対照DNAサンプルの伸長
（iii）の工程で一本鎖DNAとなった対照DNAサンプルと（iv）の工程で5'末端を32P標識したM1プライマーとを使用して、対照DNAサンプルの伸長反応を、BcaBEST Dideoxy Sequencing Kit（タカラバイオ）を用いて行った。プロトコルは以下の通りである。
【００４８】
（iii）のアルカリ変性処理で一本鎖となったDNAサンプルが入っている容器に、10×Bufferを1.5μl、精製水を10.5μl、5'末端32P標識プライマー（M1）2μl、およびBcaBEST DNAポリメラーゼを1μl加えてよく攪拌した。直ちにこの混合物3.5μlずつを、4種類のdNTP-ddNTP Mixtureをそれぞれ2μlずつ分取した4本の別々のマイクロチューブに対して添加して攪拌した。65℃で3分間保温して伸長反応を行った後、Chase Mixture（dNTP各1 mMを含有）を1μl加えてさらに65℃で3分間保温して伸長反応を継続した。伸長反応の後、停止溶液を3μl添加してから攪拌し、95℃で3分間加熱して酵素を失活させた後、氷中で急冷した。
【００４９】
（vii）電気泳動
上記（v）と（vi）の工程で調製したDNAサンプル（すなわち、クレノウ酵素を用いて伸長させたDNAサンプルとBcaBEST DNAポリメラーゼを用いて伸長したDNAサンプル）を、6％ポリアクリルアミドゲルに重層して電気泳動を行った。泳動後、ゲルを10％酢酸-10％メタノール混合液に15分程度浸した後、ゲルをろ紙に移し、ゲルドライヤーで乾燥させた。オートラジオグラフィーなどで放射能を可視化し、バンドの位置により切断箇所を特定した。
【００５０】
この結果を、図2に示す。図2において、レーン3〜6は、pUC19プラスミドDNAの塩基配列を表しており、これらのバンドと比較することで、外部ストレス処理したDNA切断が起きている箇所を特定することができる。レーン1は50 Gyのγ線を照射した細胞外DNA、レーン2は80 Gyのγ線を照射した細胞外DNA、レーン7は1 kGyのγ線を照射した細胞内DNA、そしてレーン8は10 kGyのγ線を照射した細胞内DNAを、それぞれ示す。それぞれのレーンのバンドが、外部ストレスによりDNAの切断が起きている箇所を表している。
【００５１】
実施例3：プラスミドDNA上の各切断位置での切断頻度の測定
本実施例においては、実施例2と同様の手順でゲル電気泳動を行った後、バンドのヒストグラムのピーク面積比から切断頻度を特定した。
【００５２】
結果を図3に示す。この図において、強度は任意の値で示した。ピークで示される位置が切断の起きている塩基を表している。これを比較用の塩基配列と照らし合わせることにより、切断位置を一塩基単位で特定することができた。また、ピークの面積比を比べることで、各切断位置における切断頻度を特定できた。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の方法を使用することにより、細胞内に存在した状態のDNAにおいて、外部ストレスへの曝露または内部被曝により生じる切断位置を特定することや、各切断位置での切断頻度を特定することができる。本発明の方法を使用することにより、細胞内に存在した状態のDNAにおいて外部ストレスへの曝露または内部被曝により生じる切断位置と、細胞外DNAにおいて外部ストレスへの曝露または内部被曝により生じる切断位置とを比較することにより、外部ストレスへの曝露または内部被曝に対する細胞内物質の影響を調べることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図1は、γ線照射後のpUC19プラスミドDNAのアガロースゲル電気泳動画像である。γ線により切断が生じているかどうか確認している。
【図２】図2は、γ線照射後のpUC19プラスミドDNAのポリアクリルアミド電気泳動画像である。
【図３】図3は、図2のそれぞれのレーンをヒストグラム化したしたものである。
【図３】
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【図１】
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【図２】
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