(57)【要約】【課題】特定の細胞種への遺伝子導入が可能な遺伝子導入剤を提供する。【解決手段】芳香環に複数の高分子鎖が置換基として導入された高分子化合物と核酸とのポリプレックスに対し、抗体を吸着させてなる遺伝子導入剤。前記芳香環が炭素数５〜８の芳香環の、単環又は縮合環よりなることを特徴とする遺伝子導入剤。前記高分子鎖は、ポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖又はポリアクリレート系高分子ブロック鎖であることを特徴とする遺伝子導入剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
芳香環に複数の高分子鎖が置換基として導入された高分子化合物と核酸とのポリプレックスに対し、抗体を吸着させてなる遺伝子導入剤。
【請求項２】
請求項１において、前記芳香環が炭素数５〜８の芳香環の、単環又は縮合環よりなることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項３】
請求項２において、前記芳香環が、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、ビフェニル環、ビフェニレン環、ピリジン環、ピロール環、フラン環又はピレン環であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項４】
請求項３において、前記芳香環がベンゼン環であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項５】
請求項４において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して２〜６個導入されていることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項６】
請求項５において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して４個又は６個導入されていることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項７】
請求項６において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して６個導入されていることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、前記高分子鎖は、ポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖又はポリアクリレート系高分子ブロック鎖であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、前記高分子ブロック鎖が、ポリアミノスチレン、ポリブロモメチルスチレン、ポリグリシジルメタクリレートもしくはポリメタクリル酸又はこれらの誘導体からなる高分子ブロック鎖であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項において、前記高分子化合物の分子量が５千〜５０万であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１１】
請求項１０において、前記高分子化合物の分子量が５千〜１０万であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１項において、前記抗体がポリクローナル抗体であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１３】
請求項１ないし１１のいずれか１項において、前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入剤に係り、特に、目的とする特定の細胞種への遺伝子導入を行うことが可能な遺伝子導入剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。
【０００３】
従来、目的とする特定の細胞種へ遺伝子を導入する技術としてはウイルスベクター法が知られているが、以下に述べるような欠点がある。
【０００４】
(1)  ウイルスベクターは、一般に、合成工程が複雑で感染の危険性がある。また、ウイルス内には挿入できないような大きな核酸が導入できない。例えばアデノウイルスでは、導入サイズは９０００ｂ以下である。  
(2)  レセプターを介して細胞へ侵入するタイプのウイルスの場合、レセプターが発現されていない細胞へは導入できない。目標の細胞のレセプターが陽性でなければ、ウイルスベクター側の改変が必要である。また、レセプター自体はＣＡＲ，ＣＤ４６など種々の細胞で共通して発現しているため、細胞選択性としては非特異的な面もある。また、遺伝子治療を目指して研究をする場合に、マウスなど小動物での実験が必須であるが、ヒト細胞に存在するレセプターがマウスに存在しなければ実験が成立しない；細胞の種類によってレセプター発現量が異なり、これが導入効率に影響してしまう；アデノウイルスの設計には主としてＣＡＲ（コサッキーアデノウイルスレセプター）を利用するが、疾病によってＣＡＲの発現量が少ない患者も多く、遺伝子治療への応用に制約を受けることもある；といった欠点がある。  
(3)  レトロウイルスの場合は、分裂期の細胞にのみ導入が可能で、休止期の細胞へは応用できない；染色体への組み込みが可能で、免疫原性はないが、不安定で生体内使用には不適である；といった欠点がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記従来の実状に鑑みてなされたものであって、目的とする特定の細胞種への遺伝子導入が可能な遺伝子導入剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
請求項１の遺伝子導入剤は、芳香環に複数の高分子鎖が置換基として導入された高分子化合物と核酸とのポリプレックスに対し、抗体を吸着させてなるものである。
【０００７】
請求項２の遺伝子導入剤は、請求項１において、前記芳香環が炭素数５〜８の芳香環の、単環又は縮合環よりなることを特徴とするものである。
【０００８】
請求項３の遺伝子導入剤は、請求項２において、前記芳香環が、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、ビフェニル環、ビフェニレン環、ピリジン環、ピロール環、フラン環又はピレン環であることを特徴とするものである。
【０００９】
請求項４の遺伝子導入剤は、請求項３において、前記芳香環がベンゼン環であることを特徴とするものである。
【００１０】
請求項５の遺伝子導入剤は、請求項４において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して２〜６個導入されていることを特徴とするものである。
【００１１】
請求項６の遺伝子導入剤は、請求項５において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して４個又は６個導入されていることを特徴とするものである。
【００１２】
請求項７の遺伝子導入剤は、請求項６において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して６個導入されていることを特徴とするものである。
【００１３】
請求項８の遺伝子導入剤は、請求項１ないし７のいずれか１項において、前記高分子鎖は、ポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖又はポリアクリレート系高分子ブロック鎖であることを特徴とするものである。
【００１４】
請求項９の遺伝子導入剤は、請求項１ないし８のいずれか１項において、前記高分子ブロック鎖が、ポリアミノスチレン、ポリブロモメチルスチレン、ポリグリシジルメタクリレートもしくはポリメタクリル酸又はこれらの誘導体からなる高分子ブロック鎖であることを特徴とするものである。
【００１５】
請求項１０の遺伝子導入剤は、請求項１ないし９のいずれか１項において、前記高分子化合物の分子量が５千〜５０万であることを特徴とするものである。
【００１６】
請求項１１の遺伝子導入剤は、請求項１０において、前記高分子化合物の分子量が５千〜１０万であることを特徴とするものである。
【００１７】
請求項１２の遺伝子導入剤は、請求項１ないし１１のいずれか１項において、前記抗体がポリクローナル抗体であることを特徴とするものである。
【００１８】
請求項１３の遺伝子導入剤は、請求項１ないし１１のいずれか１項において、前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の遺伝子導入剤で用いられる高分子化合物は、芳香環に複数の高分子鎖を導入してなるスター型分岐ポリマーである。
【００２０】
本発明の遺伝子導入剤は、この高分子化合物（スター型分岐ポリマー）と遺伝子を混合してナノ粒子状のポリプレックスを形成させ、次いで抗体の水溶液を混合し、ポリプレックスナノ粒子の表面に抗体を吸着させて安定化させたものである。なお、この吸着は、疎水結合や静電力により行われるものと推察される。
【００２１】
核酸は一般に生体内においてあまり安定ではなく、ある種の酵素によって分解される。本発明の遺伝子導入剤では、核酸をスター型分岐ポリマーとの凝集体とし、この凝集体の周囲に抗体を吸着固定させて酵素から保護するので、少なくとも凝集体内部の核酸を生体内で正常に機能させることができる。しかも、ポリプレックス表面の抗体によって、遺伝子を導入しようとする細胞を免疫学的に認識させ、特定の細胞種に特異的に遺伝子導入を行うことができる。
【００２２】
生体内で特定の細胞へのみ遺伝子を導入するためには、該特定の細胞にのみ発現しているレセプターの抗体を吸着させて、血管内投与を行えば良い。一例を挙げると、ポリプレックスへＦｌｋ１抗体を吸着させれば、血管内皮増殖因子レセプターのＦｌｋ１を発現している細胞へ特異的に遺伝子導入を行え、血管内皮細胞へ分化する前にレポーター遺伝子を導入することができる。これを、生体へ細胞移植することで血管内皮前駆細胞が生体内でどのように血管新生に関わるか、を研究することができる。
【００２３】
なお、他の公知の合成カチオン性ポリマーと遺伝子のポリプレックスまたはカチオン性脂質と遺伝子のポリプレックスと抗体を混合したものでトランスフェクションを行っても効果は得られない。一般のカチオン性ポリマーベクターと遺伝子のポリプレックスは、抗体などを混合するとポリプレックス同士が凝集して沈殿していまい、遺伝子導入効果が発現されないのが一般的である。
【００２４】
本発明で使用したスター型分岐ポリマーは、その独自の分子構造によるイオン強度・電荷密度がポリプレックスの形成に至適と考えられ、水溶液中で安定して分散するポリプレックスが得られる。ポリプレックスへ包埋された遺伝子は、抗体はもちろん酵素の作用に対しても安定である。そのため、抗体をポリプレックスへ吸着させてもポリプレックスが安定に分散しているものと考えられる。
【００２５】
抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでも構わないが、より特異的な細胞選択性を付与するためにモノクローナル抗体が好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下に本発明の遺伝子導入剤の実施の形態を詳細に説明する。
【００２７】
［高分子化合物］
まず、本発明の遺伝子導入剤において用いられる高分子化合物について説明する。
【００２８】
この高分子化合物は、芳香環に複数の高分子鎖が置換基として導入された化合物である。
【００２９】
ここで、この高分子鎖の核となる芳香環としては、炭素数５〜８の芳香環、特に炭素数６の芳香環（即ちベンゼン環）の、単環又は２〜６個の縮合環、例えば、ナフタレン環、アントラセン環、ビフェニル環、ビフェニレン環、ピリジン環、ピロール環、フラン環、ピレン環が挙げられ、好ましくはベンゼン環である。
【００３０】
核となる芳香環に導入される高分子鎖の数は、ベンゼン環であれば２〜６個、ナフタレン環の場合２〜８個、アントラセン環、ピレン環の場合２〜１０個であるが、多い程効果的であり、例えばベンゼン環であれば２，３，４又は６個、特に４又は６個、とりわけ６個であることが好ましい。
【００３１】
高分子鎖を導入するための原料となる芳香環化合物としては、例えば芳香環がベンゼン環の場合、次のようなベンゼン誘導体が挙げられる。
【００３２】
即ち、３分岐鎖用としては、２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られる２，４，６−トリス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）メシチレンであり、４分岐鎖としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンである。
【００３３】
芳香環に導入された高分子鎖のうちの少なくとも一つ、好ましくはそのすべてがその先端側に活性高分子ブロック鎖を有するものである。この高分子鎖は、ビルル系単量体の単独又は異なるビニル系単量体の共重合体よりなるビニル系高分子ブロック鎖、特に３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２等の重合体よりなるポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖であることが好ましい。
【００３４】
芳香環にこのような高分子鎖を導入してなる高分子化合物、例えば、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドの重合体よりなる高分子ブロック鎖を導入した高分子化合物を合成するには、まず、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドと前述の各ベンゼン誘導体とをメタノールなどのアルコール溶液あるいは溶解性を考慮してクロロホルムなどの低極性溶媒の溶液として混合し、光重合反応させることにより、ベンゼン環に対し上記ベンゼン誘導体由来の−ＣＨ２−等を介して３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドの重合体が結合した高分子化合物を製造する。
【００３５】
本発明において、芳香環に複数の高分子鎖が導入されてなる高分子化合物の分子量は５千〜５０万、特に５千〜５万、とりわけ１万〜２万程度であることが好ましい。この分子量が過度に大きいと、高分子化合物及び核酸で複合体を形成させた際の複合体のサイズが大きくなったり、溶解性が低くなったり、生体内へ使用する場合に、排泄に不利になることが考えられる。逆に過度に小さいと低分子量有機化合物としての性質が強く発生して細胞毒性、高浸透圧、など生物学的な弊害が出てしまう。
【００３６】
また、１本の高分子鎖を構成する単量体の数は、その単量体の種類や反応性等によっても異なるが、ポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖を構成する単量体数は５〜１０００程度であることが好ましい。
【００３７】
［核酸］
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００３８】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００３９】
この核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチド特にＤＮＡが好適であるが、リボ核タンパク質であってもよい。
【００４０】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００４１】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００４２】
また、アンチセンスによるリプレッシングの他に、２１〜２３塩基の二本鎖ＲＮＡを使用したＲＮＡ干渉によるｍＲＮＡ破壊などに利用することも可能である。
【００４３】
［ポリプレックスの形成］
高分子化合物（スター型分岐ポリマー）と核酸とを複合させてポリプレックスを形成するには、この高分子化合物の濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の分散液に対し、常温にて核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対して高分子化合物を過剰量添加し、高分子化合物を核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。
【００４４】
［抗体］
本発明の遺伝子導入剤に吸着されている抗体は、前述の通り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでもよいが、モノクローナル抗体のほうが好ましい。抗体の具体例としては、ｃ−Ｋｉｔ、Ｓｃａ−１、βＩＩＩ-ｔｕｂｕｌｉｎ、ＮＦＭ、ＴＴＲ、ＭＡＰ２、Ｓｏｘ-1、ＮＳＥ、Ｓ−１００蛋白、ＧＦＡＰ、internexin、peripherin、ＣＤ３１、ＣＤ４６、ＣＤ３４、Ｆｌｋ１、ＣＡＲなど、通常の免疫染色に利用されている抗体が使用可能である。
【００４５】
［抗体の吸着による遺伝子導入剤の形成］
抗体をポリプレックスに吸着させるには、スター型カチオン性ポリマーと核酸とを水溶液中で混合することで形成させたポリプレックスと、抗体の水溶液を混合する。
【００４６】
本発明で使用するスター型カチオン性ポリマーは、高い電荷密度、強いイオン強度、分子構造の優位性（カチオン性ポリマー鎖をコアとして外殻に疎水性ポリマー鎖ブロックを導入することができる）により、核酸を失活させることなく及びポリプレックスを凝集させることなく、核酸ポリプレックスを形成する。このポリプレックスに対し、抗体を疎水結合的及び／又は静電的に吸着させることが可能である。
【００４７】
この特性を利用して、細胞のレセプターに特異的な抗体を吸着させることで、ポリプレックスが吸着する細胞への選択性を付与することができる。すなわち、遺伝子導入する細胞の選択性を与えることができる。
【００４８】
［生体への投与］
上述のような高分子化合物（スター型分岐ポリマー）と核酸とのポリプレックスに抗体が固定されてなる本発明の遺伝子導入剤は、生体内へ投与される。
【００４９】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、幹細胞であってもよく、また、使用する核酸（すなわちその機能）に応じて、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等であってもよい。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などであってもよい。
【００５０】
本発明の遺伝子導入剤は任意の方法で生体に投与することができる。
【００５１】
体内へ挿入するデバイスとしては、経皮的に患部付近の組織へ刺入するものや、血管カテーテル、ステントグラフトのように血管内へ留置するものなどがあるが、この限りではない。
【００５２】
当該投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００５３】
この遺伝子導入剤を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００５４】
また、この遺伝子導入剤を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００５５】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００５６】
この遺伝子導入剤は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【実施例】
【００５７】
以下に実施例及び比較例を挙げて本発明をより具体的に説明する。  
なお、実施例１は抗体としてＦｌｋ１抗体を用いたものであり、比較例１では抗体を用いていない。
【００５８】
［実施例１，比較例１］
〈スター型分岐ポリマー（高分子ブロック鎖導入高分子化合物）の合成〉
［１］ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの合成
【００５９】
【化１】
2007228856.tif 000002
【００６０】
ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼン５ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム３１．８ｇをエタノール１Ｌ中へ加え、室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、減圧乾燥後、クロロホルム２００ｍＬへ溶解し、ここへ１５０ｍＬの水を加えて液液抽出を行って臭化ナトリウムを除去した。この操作を３回繰り返した後、クロロホルム層を硫酸マグネシウムで２４時間乾燥させた。濾過後、ｎ−ヘキサンを加えて再結晶を行って、微かに淡青色を帯びたヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの白色結晶を得た（収率９０％）。  
1H  NMR(in  CDCl3):δ  1.26-1.31(t,36H,J=6.9  Hz,-CH2SC(S)N(CH2CH3)2),3.71-4.01(wq,24H,J=6.9  Hz,-CH2SC(S)N(CH2CH3)2),4.57(s,12H,-CH2SC(S)NEt2)
【００６１】
［２］６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマーの合成
【００６２】
【化２】
2007228856.tif 000003
【００６３】
モノマーの３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドは、減圧蒸留で精製した。ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルチオカルバミルメチル）ベンゼン８．７ｍｇを２０ｍＬのクロロホルムへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド３．９ｇを加えて混合し、全量をクロロホルムで希釈して５０ｍＬに調整した。石英セル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした。２００Ｗ高圧水銀灯で３０分間の光照射を行った。照度は照度計（ＵＶＲ−１，ＴＯＰＣＯＮ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して１ｍＷ／ｃｍ２（２５０ｎｍ）に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで再沈殿させて精製した。これを少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させてヘキサキス｛Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル−ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル｝ベンゼン（６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマー）を得た（重合率４０％）。
【００６４】
分子量はＧＰＣにより１７，３００と測定され，1H  NMR(in  D2O)の測定結果は、δ  1.00-1.70(br,416H,-CH2CH-and-CH2CH2CH2-),1.90(br,104H,-CH2CH-),2.09(s,624H,-N(CH3)2),2.25(br,208H,-CH2N(CH3)2),2.98(br,208H,-CONHCH2-)で、目的物であることを確認した。
【００６５】
〈抗体〉
ポリプレックスへ吸着させる抗体として、市販品のＦｌｋ１抗体を使用した。
【００６６】
［遺伝子導入実験］
〈細胞播種〉
未分化ＥＳ細胞をＬＩＦ（白血病阻害因子）存在下で培養し、コラーゲンディッシュへ播き替えた。
【００６７】
〈遺伝子導入及び測定〉
上記のようにして合成した６分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭポリマー（以下『ＳＶ』という）を生理食塩水中に溶解し、０．８μｇ／μＬ濃度のＳＶ溶液を調製した。ここへ３０ｎｇ／μＬ濃度のＧＦＰプラスミド２０ｍＭトリスＥＤＴＡ緩衝溶液を混合して５分間室温下でインキュベートし、ＳＶとＧＦＰプラスミドの遺伝子複合体を形成させた。ここへ生理食塩水（比較例１）、３５μｇ／ｍＬ濃度のＦｌｋ１生理食塩水溶液（実施例１）を混合し、５分間インキュベートし、遺伝子複合体へペプチドが吸着した微粒子の溶液を調製した。
【００６８】
これらの溶液をそれぞれ１５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で３０分間インキュベートし、これを培養細胞へ加えた。ＤＮＡ量は２５０ｎｇとなるように調整した。
【００６９】
４８時間の追加培養を行い、蛍光顕微鏡で観察すると生理食塩水群では培養皿の全体に均一にＧＦＰの蛍光を観察することができた。実施例１では蛍光を発する細胞は散在し、細胞数は全体の約１／３程度であった。さらにＣＤ３４染色を行うと、実施例１ではＧＦＰ陽性/ＣＤ３４陽性細胞が全体の１／３程度で、残りの２／３の細胞はＧＦＰ陰性/ＣＤ３４陰性細胞であった。比較例１ではＧＦＰ陽性/ＣＤ３４陰性細胞が全体に均一に存在するが、ＧＦＰ陽性/ＣＤ３４陽性の細胞は散在し、実施例よりも優位に少なかった。以上より、本発明の、Ｆｌｋ１抗体を吸着させたＧＦＰ遺伝子ポリプレックスはＦｌｋ１陽性細胞へ選択的に（優先的に）ＧＦＰ遺伝子を導入することが確認された。