(57)【要約】      （修正有）【課題】新生血管が関連する疾患の治療に有効な新規ペプチド又はその薬理学的に許容される塩，血管新生阻害補助剤，血管新生阻害剤，医療用組成物，及び医療用キットなどを提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩，エフリンＢ２又はその薬理学的に許容される塩と；(i)特定のアミノ酸配列からなるペプチド，もしくはその薬理学的に許容される塩，又は(ii)特定の配列において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,前記エフリンＢ２の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩と；を含有する医薬用組成物又は医療用キット。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩。
【請求項２】
配列番号１において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,エフリンＢ２の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩。
【請求項３】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩。
【請求項４】
配列番号２において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,エフリンＢ２の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩。
【請求項５】
配列番号３または配列番号４で表されるアミノ酸配列を具備するペプチドであって，当該ペプチドに含まれるアミノ酸残基の数が９以上，１００以下であるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩。
【請求項６】
請求項１から請求項５のいずれかに記載のペプチド，又はそれらの薬理学的に許容される塩を含有する新生血管阻害用補助剤。
【請求項７】
請求項１から請求項５のいずれかに記載のペプチド，又はそれらの薬理学的に許容される塩を含有する血管内皮細胞におけるＤＮＡ合成阻害用補助剤。
【請求項８】
請求項１から請求項５のいずれかに記載のペプチド，又はそれらの薬理学的に許容される塩を含有する血管内皮細胞におけるｐ４４／ｐ４２ＭＡＰＫリン酸化活性阻害用補助剤。
【請求項９】
請求項１から請求項５のいずれかに記載のペプチド，又はそれらの薬理学的に許容される塩を含有する新生血管阻害剤。
【請求項１０】
請求項１から請求項５のいずれかに記載のペプチド，又はそれらの薬理学的に許容される塩を含有する，“加齢黄斑変性，虚血性網膜症，眼内血管新生，角膜血管新生，網膜血管新生，脈絡膜血管新生，糖尿病性黄斑浮腫，糖尿病性網膜虚血，糖尿病性網膜浮腫，糖尿病性網膜症”からなる群から選択される，１又は２種以上の疾患の治療剤又は予防剤。
【請求項１１】
エフリンＢ２又はその薬理学的に許容される塩と；
(i)配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，もしくはその薬理学的に許容される塩，又は
(ii)配列番号１において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,前記エフリンＢ２の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩と；
を含有する医薬用組成物。
【請求項１２】
エフリンＢ２又はその薬理学的に許容される塩と；
(i)配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，もしくはその薬理学的に許容される塩，又は
(ii)配列番号２において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,前記エフリンＢ２の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩と；
を含有する医薬用組成物。
【請求項１３】
エフリンＢ２又はその薬理学的に許容される塩と；
配列番号３または配列番号４で表されるアミノ酸配列を具備するペプチドであって，当該ペプチドに含まれるアミノ酸残基の数が９以上，１００以下であるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩と
を含有する医薬用組成物。
【請求項１４】
前記エフリンＢ２が，天然のエフリンＢ２の細胞外ドメインを含み，細胞質ドメインを含まない，請求項１１から請求項１３のいずれかに記載の医薬用組成物。
【請求項１５】
前記エフリンＢ２が，ヒトＦｃとエフリンＢ２の融合タンパク質である請求項１１から請求項１３のいずれかに記載の医薬用組成物。
【請求項１６】
新生血管阻害剤である請求項１１から請求項１３のいずれかに記載の医薬用組成物。
【請求項１７】
眼内の新生血管阻害剤である請求項１１から請求項１３のいずれかに記載の医薬用組成物。
【請求項１８】
血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の治療剤である請求項１１から請求項１３のいずれかに記載の医薬用組成物。
【請求項１９】
眼内の新生血管に関連する疾患の治療剤又は予防剤である請求項１１から請求項１３のいずれかに記載の医薬用組成物。
【請求項２０】
“加齢黄斑変性，虚血性網膜症，眼内血管新生，角膜血管新生，網膜血管新生，脈絡膜血管新生，糖尿病性黄斑浮腫，糖尿病性網膜虚血，糖尿病性網膜浮腫，糖尿病性網膜症”からなる群から選択される，１又は２種以上の疾患の治療剤又は予防剤である請求項１１から請求項１３のいずれかに記載の医薬用組成物。
【請求項２１】
加齢黄斑変性及び糖尿病性網膜症のいずれか又は両方の疾患の治療剤又は予防剤である請求項１１から請求項１３のいずれかに記載の医薬用組成物。
【請求項２２】
腫瘍，慢性関節リウマチ，乾癬，アテローム性動脈硬化症，カポジ肉腫，又は固形癌の転移の治療剤である請求項１１から請求項１３のいずれかに記載の医薬用組成物。
【請求項２３】
エフリンＢ２又はその薬理学的に許容される塩，及び薬理学的に許容される担体を含有する第１の組成物と；
(i)配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，もしくはその薬理学的に許容される塩，又は
(ii)配列番号１において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,前記エフリンＢ２の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩，
及び薬理学的に許容される担体を含有する第２の組成物と；
を含有する医療用キット。
【請求項２４】
エフリンＢ２又はその薬理学的に許容される塩，及び薬理学的に許容される担体を含有する第１の組成物と；
(i)配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，もしくはその薬理学的に許容される塩，又は
(ii)配列番号２において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,前記エフリンＢ２の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩，
及び薬理学的に許容される担体を含有する第２の組成物と；
を含有する医療用キット。
【請求項２５】
エフリンＢ２又はその薬理学的に許容される塩，及び薬理学的に許容される担体を含有する第１の組成物と；
配列番号３または配列番号４で表されるアミノ酸配列を具備するペプチドであって，当該ペプチドに含まれるアミノ酸残基の数が９以上，１００以下であるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩及び薬理学的に許容される担体を含有する第２の組成物と；
を含有する医療用キット。
【請求項２６】
前記エフリンＢ２が，天然のエフリンＢ２の細胞外ドメインを含み，細胞質ドメインを含まない，請求項２３から請求項２５のいずれかに記載のキット。
【請求項２７】
前記エフリンＢ２が，ヒトＦｃとエフリンＢ２の融合タンパク質である請求項２３から請求項２５のいずれかに記載のキット。
【請求項２８】
血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の治療用キットである請求項２３から請求項２５のいずれかに記載のキット。
【請求項２９】
眼内の新生血管に関連する疾患の治療又は予防用キットである請求項２３から請求項２５のいずれかに記載のキット。
【請求項３０】
“加齢黄斑変性，虚血性網膜症，眼内血管新生，角膜血管新生，網膜血管新生，脈絡膜血管新生，糖尿病性黄斑浮腫，糖尿病性網膜虚血，糖尿病性網膜浮腫，糖尿病性網膜症”からなる群から選択される，１又は２種以上の疾患の治療又は予防用キットである請求項２３から請求項２５のいずれかに記載のキット。
【請求項３１】
加齢黄斑変性及び糖尿病性網膜症のいずれか又は両方の疾患の治療用又は予防用キットである請求項２３から請求項２５のいずれかに記載のキット。
【請求項３２】
腫瘍，慢性関節リウマチ，乾癬，アテローム性動脈硬化症，カポジ肉腫，又は固形癌の転移の治療用キットである請求項２３から請求項２５のいずれかに記載のキット。
【請求項３３】
前記第１の組成物が投与された後に，前記第２の組成物が投与される請求項２３から請求項２５のいずれかに記載のキット。
【請求項３４】
前記第２の組成物が投与された後に，前記第１の組成物が投与される請求項２３から請求項２５のいずれかに記載のキット。
【請求項３５】
前記第２の組成物が投与された後，１分後〜１０分後に前記第１の組成物が投与される請求項２３から請求項２５のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，エフリンＢ２の活性を高めるペプチド，その薬理学的に許容される塩；エフリンＢ２とそのようなペプチドを含む医薬組成物及び医療用キットなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
新生血管は，加齢黄斑変性，糖尿病性網膜症，及び未熟児網膜症のような種々の眼病理症状の顕著な特徴である。したがって，新生血管を阻害し，これらの疾患を治療又は予防できる医薬が望まれる。一方で血管が新生されることは，生体が正常に機能する上でも重要である。そこで，網膜外に向かう病的な血管形成または血管新生を抑制し，かつ網膜中において血管網が形成されることや，血管が成熟することを増強するような医薬が望まれる。
【０００３】
大野京子“加齢黄斑変性における脈絡膜新生血管の分子機構−特に色素上皮由来因子の役割について−”日本眼科学界雑誌（Journal of Ophthalmological Society）Vol.
107, No. 11, pp. 657-673, 2003（下記非特許文献１）には，以下の内容が開示されている。“加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は，先進諸国における５０代以上の失明原因の常に上位を占める重要な疾患であり，人口の高齢化に伴いますますその頻度は増加しつつある。しかしながら，ＡＭＤにおける脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）の分子機構は未だ完全には解明されていない。従来から網膜色素上皮（ＲＰＥ）が産生する血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現上昇がＣＮＶ発生に重要であるとされてきたが，トランスジェニックマウスの結果などからＶＥＧＦ単独ではＣＮＶ発生には不十分であると考えられる。ＣＮＶは無血管である網膜外層に新生血管が侵入していく現象であり，この場合には正常で血管侵入を抑制している抑制因子の発現低下の方が重要ではないかと我々は考えた。そして，近年明らかになった最強の血管新生抑制因子，色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）に注目し，加齢や酸化ストレスによって生じるＲＰＥの分化状態の崩れがＰＥＤＦの発現低下を惹起し，その結果生じるＶＥＧＦとＰＥＤＦのバランスの崩れがＣＮＶ発現の引き金を引くのではないかというメカニズムを明らかにした。”
【０００４】
Ｔ．Ｋｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，“ＰＫＣ／ＭＡＰＫ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｐｅｒｉｃｙｔｅ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｐｒｅｖｅｎｔｓ  Ｒｅｔｉｎａｌ
Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０３，ｐｐ．３７８−３８６，２００５（下記非特許文献２）のＦｉｇ６では，ｐ４４／４２ＭＡＰＫの抑制が，細胞増殖及び脈絡膜の血管新生の抑制と強い相関性があることが示されている。
【０００５】
ＷＯ２００６／００６０７９号公報（下記特許文献１）には，エフリンＢ２が，眼内における動脈及び静脈内皮細胞のＤＮＡ合成の阻害作用を有すること；エフリンＢ２が，眼内における動脈及び静脈内皮細胞におけるｐ４４／ｐ４２ＭＡＰＫ活性化の阻害作用を有すること；エフリンＢ２が，眼内における動脈及び静脈内皮細胞における管形成の阻害作用を有することが示されている。同文献では，その実施例３において，ＣＮＶ（脈絡膜新生血管）モデルを用いてエフリンＢ２が加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の治療に有効であることが示されている。しかしながら，本出願の配列番号１〜配列番号４で表されるペプチドは開示されていない。
【０００６】
エフリンＢ２に関して，さらに以下の文献が知られている。ＷＯ２００２/２６８２７号公報（特許文献２）には，エフリンＢ２が開示されている。そして，エフリンを目の血管新生の遺伝子治療剤として用いるとの記載がある（１頁４行目〜１２行目）。しかし，特許文献２は，エフリンＢ２が新生血管の成長を抑圧するものであるのか，正常血管網の形成を促進するものであるかについては何らの示唆もない。また，特許文献２は，エフリンＢ２の実施例として，腫瘍細胞の阻害実験しかしていないので，エフリンＢ２と新生血管との関係や，エフリンＢ２と正常血管との関係などについては何ら実証されていない。まして，本出願の配列番号１〜配列番号４で表されるペプチドは開示されていない。
【０００７】
特表平１０-５０２８１０号公報（特許文献３）のＬＥＲＫ-５は，エフリンＢ２に相当するものと考えられる。そして，特許文献３の実施例１では，ヒトエフリンＢ２のｃＤＮＡが単離され，実施例７ではヒトエフリンＢ２（細胞外ドメイン）とＦｃの融合タンパク質がレセプターのリン酸化を刺激することをｉｎ
ｖｉｔｒｏ(試験管内)実験で実証している。しかしながら，特許文献３では，エフリンＢ２を神経性疾病へ用いることのみが意図されており（２１頁２３行目〜２２頁２行目），新生血管関連疾患への用途は記載されていない。まして，本出願の配列番号１〜配列番号４で表されるペプチドは開示されていない。
【０００８】
特表平１０-５０１７０１号公報（特許文献４）の“Ｈｔｋリガンド”は，エフリンＢ２に相当するものと推定される。特許文献４では，Ｈｔｋリガンドの用途として，神経変性の治療があげられているが（６０頁７行目〜６３頁９行目），Ｈｔｋリガンドを新生血管など抑制などに用いる点は記載も示唆もされていない。まして，本出願の配列番号１〜配列番号４で表されるペプチドは開示されていない。
【０００９】
特表２００２-５１１４１７号公報（特許文献５）には，エフリンＢ２が，腫瘍による血管新生を増強等するとの記載がある(特許文献５の段落［００６２］)。よって，エフリンＢ２を，新生血管を阻害するために用いることについて動機付けとなるものはない。まして，本出願の配列番号１〜配列番号４で表されるペプチドは開示されていない。
【特許文献１】ＷＯ２００６／００６０７９号公報
【特許文献２】ＷＯ２００２／２６８２７号公報
【特許文献３】特表平１０−５０２８１０号公報
【特許文献４】特表平１０−５０１７０１号公報
【特許文献５】特表２００２−５１１４１７号公報
【非特許文献１】大野京子“加齢黄斑変性における脈絡膜新生血管の分子機構−特に色素上皮由来因子の役割について−”日本眼科学界雑誌Ｖｏｌ．  １０７，  Ｎｏ．  １１，  ｐｐ．  ６５７−６７３，  ２００３
【非特許文献２】Ｔ．Ｋｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，“ＰＫＣ/ＭＡＰＫ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｐｅｒｉｃｙｔｅ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ＲｅｔｉｎａｌＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Cell Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０３，ｐｐ．３７８−３８６，２００５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は，新生血管が関連する疾患の治療に有効な新規ペプチド又はその薬理学的に許容される塩などを提供することを目的とする。
【００１１】
本発明は，エフリンＢ２などの活性を高め，新生血管が関連する疾患などエフリンＢ２が関与する疾患の治療に有効な新規ペプチドなどを提供することを目的とする。本発明は，そのような新規ペプチドなどを含有する新生血管阻害剤や，エフリンＢ２の新生血管阻害能を高める新生血管阻害用補助剤などを提供することを目的とする。
【００１２】
本発明は，エフリンＢ２などと上記したペプチドなどを含む新生血管の阻害などに有効な，医薬組成物などを提供することを目的とする。
【００１３】
本発明は，エフリンＢ２などを含有する第１の組成物と，上記したペプチドなどを含む第２の組成物とを含む，新生血管の阻害などに有効な，医療用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は，基本的には，配列番号１などの低分子ポリペプチドをエフリンＢ２とあわせて用いることで，エフリンＢ２の新生血管阻害活性などを高めることができるという知見に基づくものである。さらに，本発明は，配列番号１などの低分子ポリペプチドとエフリンＢ２を別々に投与すると，これらを同時に投与した場合に比べて，エフリンＢ２の新生血管阻害活性を著しく高めることができるという知見に基づくものである。
【００１５】
本発明の第１の側面は，基本的には，配列番号１〜配列番号４のいずれか，好ましくは配列番号１又は２のいずれか，で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩に関する。
【００１６】
後述する実施例によって実証されたとおり，上記のペプチドは，エフリンＢ２と併用することでエフリンＢ２のＭＡＰＫリン酸化阻害能を飛躍的に高める作用を有する。このことは，エフリンＢ２が有する，血管内皮細胞における新生血管の抑制能を高めることを意味する。
【００１７】
本発明の第１の側面のある態様は，配列番号１又は配列番号２において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,エフリンＢ２の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩に関する。
【００１８】
このように，実施例によって実証された配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと実質的に同様なペプチドも，エフリンＢ２の活性を高める作用を有する。より具体的には，配列番号３または配列番号４を含むペプチドであって，ある程度の残基数のものは，エフリンＢ２の新生血管阻害活性を著しく高めるといえる。
【００１９】
本発明の第１の側面の好ましい態様は，上記いずれかに記載のペプチド，又はそれらの薬理学的に許容される塩を含有する特に眼内の新生血管阻害用補助剤である。この補助剤の好ましい態様は，主剤がエフリンＢ２を含有する新生血管阻害剤である。
【００２０】
本発明の第１の側面の好ましい態様は，上記いずれかに記載のペプチド，又はそれらの薬理学的に許容される塩を含有する，血管内皮細胞におけるＤＮＡ合成阻害用補助剤である。この補助剤の好ましい態様は，主剤としてエフリンＢ２を含有する剤を用いるものである。
【００２１】
本発明の第１の側面の好ましい態様は，上記いずれかに記載のペプチド，又はそれらの薬理学的に許容される塩を含有する，血管内皮細胞におけるｐ４４／ｐ４２ＭＡＰＫリン酸化活性阻害用補助剤である。この補助剤の好ましい態様は，主剤としてエフリンＢ２を含有する剤を用いるものである。
【００２２】
本発明の第１の側面の好ましい態様は，上記いずれかに記載のペプチド，又はそれらの薬理学的に許容される塩を含有する，血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の治療剤である。本発明の第１の側面の好ましい態様は，上記いずれかに記載のペプチド，又はそれらの薬理学的に許容される塩を含有する新生血管阻害剤である。この新生血管阻害剤は，上記いずれかに記載のペプチドを有効成分として有効量含むものである。この新生血管阻害剤として，眼内の新生血管阻害剤が好ましく，眼内の新生血管に関連する疾患の治療剤又は予防剤が好ましい。また，後述する実施例によって実証されたとおり，本発明のペプチドは，血管形成を阻害し，又は血管新生を阻害する。よって，上記ペプチド等は，これらに関連する疾患又は障害の治療剤として有効であるといえる。眼内の血管形成または血管新生に関連する疾患または障害として，“加齢黄斑変性，虚血性網膜症，眼内血管新生，角膜血管新生，網膜血管新生，脈絡膜血管新生，糖尿病性黄斑浮腫，糖尿病性網膜虚血，糖尿病性網膜浮腫，糖尿病性網膜症”からなる群から選択される，１種又は２種以上があげられる。眼内以外の血管形成または血管新生に関連する疾患または障害として，腫瘍，慢性関節リウマチ，乾癬，アテローム性動脈硬化症，カポジ肉腫のような疾患，及び固形癌の転移があげられる。これの剤は，上記いずれかに記載のペプチド，又はそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含むものが好ましく，主剤としてエフリンＢ２を含有する剤を用いるものであってもよい。
【００２３】
本発明は，主剤としてエフリンＢ２を含有する剤をヒト又は非ヒト哺乳類に投与する工程と，前記工程の前又は後（好ましくは後）に，上記いずれかのペプチド，又はその薬理学的に許容される塩をヒト又は非ヒト哺乳類に投与する眼内の新生血管に関連する疾患の治療方法をも提供する。本発明は，主剤としてエフリンＢ２を含有する剤をヒト又は非ヒト哺乳類に投与する工程と，前記工程の前又は後（好ましくは後）に，配列番号１又は配列番号２において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,エフリンＢ２の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩をヒト又は非ヒト哺乳類に投与する眼内の新生血管に関連する疾患の治療方法をも提供する。
【００２４】
本発明は，さらに，ヒト又は非ヒト哺乳類の新生血管阻害用補助剤（好ましくは，眼内の新生血管阻害用補助剤）を製造するための上記いずれかのペプチド，又はその薬理学的に許容される塩の使用をも提供する。本発明は，眼内の新生血管阻害用補助剤を製造するための配列番号１又は配列番号２において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,エフリンＢ２の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩の使用をも提供する。
【００２５】
本発明の第２の側面は，基本的には，エフリンＢ２又はその薬理学的に許容される塩と；(i)配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，もしくはその薬理学的に許容される塩，又は(ii)  配列番号１において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,前記エフリンＢ２の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩と；を含有する医薬用組成物に関する。すなわち，本発明の第２の側面は，基本的には，エフリンＢ２又はその薬理学的に許容される塩と；上記したいずれかのペプチド又はその薬理学的に許容される塩とを含有する医薬組成物に関する。後述する実施例によって実証されたとおり，本発明のペプチドは，エフリンＢ２と併用することで，エフリンＢ２の活性を著しく高める。よって，本発明の第２の側面に係る医薬組成物は，血管形成を効果的に阻害し，又は血管新生を効果的に阻害するので，血管形成や新生血管が関与する疾患や障害（特に眼内の新生血管が関与する疾患や障害）の治療又は予防に効果的に用いることができる。
【００２６】
本発明の第２の側面は，エフリンＢ２又はその薬理学的に許容される塩と；(i)配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，もしくはその薬理学的に許容される塩，又は(ii)配列番号２において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,前記エフリンＢ２の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩と；を含有する医薬用組成物に関する。
【００２７】
本発明の第２の側面は，更に，エフリンＢ２又はその薬理学的に許容される塩と；配列番号３または配列番号４で表されるアミノ酸配列を具備するペプチドであって，当該ペプチドに含まれるアミノ酸残基の数が９以上，１００以下であるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩とを含有する医薬用組成物に関する。
【００２８】
後述する実施例によって実証されたとおり，上記のペプチドは，エフリンＢ２と併用することでエフリンＢ２のＭＡＰＫリン酸化阻害能を飛躍的に高める作用を有する。このことは，エフリンＢ２が有する，血管内皮細胞における新生血管の抑制能を高めることを意味する。よって，エフリンＢ２と上記のペプチドなどを含有する医薬用組成物は，特に眼内の新生血管の抑制などに効果的に用いることができるものと考えられる。
【００２９】
本発明の第２の側面の好ましい態様は，前記エフリンＢ２が，天然のエフリンＢ２の細胞外ドメインを含み，細胞質ドメインを含まない，上記に記載の医薬用組成物に関する。天然のエフリンＢ２の細胞外ドメインを含み，細胞質ドメインを含まない領域が，ＥｐｈＢ４のファーマコフォアに作用する部位であると考えられるので，そのような部位を含むエフリンＢ２であれば，全長でなくても新生血管の抑制能を有すると考えられる。
【００３０】
本発明の第２の側面の好ましい態様は，前記エフリンＢ２が，ヒトＦｃとエフリンＢ２の融合タンパク質である上記いずれかに記載の医薬用組成物に関する。エフリンＢ２が新生血管の抑制能を発揮するためには，エフリンＢ２が二量体化していることが望ましいと考えられ，そのためヒトＦｃとエフリンＢ２との融合タンパク質であれば，エフリンＢ２が二量化し，高い新生血管の抑制能を発揮しうる。
【００３１】
本発明の第２の側面の好ましい態様は，新生血管阻害剤，特に眼内の新生血管阻害剤である上記いずれかに記載の医薬用組成物に関する。本発明の第２の側面の好ましい態様は，眼内の脈絡膜における新生血管阻害剤である上記いずれかに記載の医薬用組成物に関する。
【００３２】
本発明の第２の側面の好ましい態様は，眼内の新生血管に関連する疾患の治療・予防剤である上記いずれかに記載の医薬用組成物に関する。より具体的に説明すると，本発明の第２の側面の好ましい態様は，血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の治療剤である上記いずれかに記載の医薬用組成物に関する。本発明の第２の側面の好ましい態様は，“加齢黄斑変性，虚血性網膜症，眼内血管新生，角膜血管新生，網膜血管新生，脈絡膜血管新生，糖尿病性黄斑浮腫，糖尿病性網膜虚血，糖尿病性網膜浮腫，糖尿病性網膜症”からなる群から選択される，１又は２種以上の疾患の治療・予防剤である上記いずれかに記載の医薬用組成物に関する。特に好ましい態様は，加齢黄斑変性及び糖尿病性網膜症のいずれか又は両方の疾患の治療・予防剤である。
【００３３】
本発明の第２の側面の好ましい態様は，腫瘍，慢性関節リウマチ，乾癬，アテローム性動脈硬化症，カポジ肉腫，又は固形癌の転移の治療剤である上記いずれかに記載の医薬用組成物に関する。
【００３４】
本発明は，エフリンＢ２又はその薬理学的に許容される塩と；上記したいずれかのペプチド又はその薬理学的に許容される塩；をヒト又は非ヒト哺乳動物に投与する，眼内の新生血管に関連する疾患の治療方法をも提供する。
【００３５】
本発明は，眼内の新生血管に関連する疾患の治療剤を製造するための，エフリンＢ２又はその薬理学的に許容される塩と；上記したいずれかのペプチド又はその薬理学的に許容される塩の使用をも提供する。
【００３６】
本発明の第３の側面は，基本的には，エフリンＢ２又はその薬理学的に許容される塩，及び薬理学的に許容される担体を含有する第１の組成物と；(i)配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，もしくはその薬理学的に許容される塩，又は(ii)  配列番号１において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,前記エフリンＢ２の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩，及び薬理学的に許容される担体を含有する第２の組成物とを含有する医療用キットに関する。すなわち，本発明の第３の側面は，基本的には，エフリンＢ２又はその薬理学的に許容される塩，及び薬理学的に許容される担体を含有する第１の組成物と；上記したいずれかのペプチド又はその薬理学的に許容される塩及び薬理学的に許容される担体を含有する第２の組成物とを含有する医療用キットに関する。
【００３７】
上記の医療用キットは，基本的には，眼内の新生血管の抑制のための第１の組成物を主剤とし，第２の組成物を補助剤として含むものである。後述する実施例によって実証されたとおり，上記のペプチドは，エフリンＢ２と併用することでエフリンＢ２のＭＡＰＫリン酸化阻害能を飛躍的に高める作用を有する。このことは，エフリンＢ２が有する，血管内皮細胞における新生血管の抑制能を高めることを意味する。さらに，後述する実施例によって実証されたとおり，第１の組成物を投与した後に第２の組成物を投与するとＭＡＰＫの活性を著しく阻害することが示された。よって，本発明のキットは，特にそのような投与方法に有効に利用されうる。
【００３８】
本発明の第３の側面の好ましい態様は，前記エフリンＢ２が，天然のエフリンＢ２の細胞外ドメインを含み，細胞質ドメインを含まない，上記に記載のキットに関する。本発明の第３の側面の好ましい態様は，前記エフリンＢ２が，ヒトＦｃとエフリンＢ２の融合タンパク質である上記いずれかに記載のキットに関する。
【００３９】
本発明の第３の側面の好ましい態様は，新生血管阻害用，特に眼内の新生血管阻害用に用いられる上記いずれかに記載のキットに関する。本発明の第３の側面の好ましい態様は，眼内の脈絡膜における新生血管阻害用に用いられる上記いずれかに記載のキットに関する。
【００４０】
本発明の第３の側面の好ましい態様は，新生血管，特に眼内の新生血管に関連する疾患の治療又は予防用に用いられる上記いずれかに記載のキットに関する。本発明の第３の側面の好ましい態様は，血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の治療用に用いられる上記いずれかのキットに関する。本発明の第３の側面の好ましい態様は，加齢黄斑変性，虚血性網膜症，眼内血管新生，角膜血管新生，網膜血管新生，脈絡膜血管新生，糖尿病性黄斑浮腫，糖尿病性網膜虚血，糖尿病性網膜浮腫，糖尿病性網膜症”からなる群から選択される，１又は２種以上の疾患の治療用又は予防用に用いられる上記いずれかに記載のキットに関する。本発明の第３の側面の好ましい態様は，加齢黄斑変性及び糖尿病性網膜症のいずれか又は両方の疾患の治療用又は予防用に用いられる上記いずれかに記載のキットに関する。
【００４１】
本発明の第３の側面の好ましい態様は，腫瘍，慢性関節リウマチ，乾癬，アテローム性動脈硬化症，カポジ肉腫，固形癌の転移，その他の血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の治療用キットに関する。
【００４２】
本発明の第３の側面の好ましい態様は，前記第１の組成物がヒト又は非ヒト哺乳動物に投与された後に，前記第２の組成物がヒト又は非ヒト哺乳動物に投与される上記いずれかに記載のキットに関する。本発明の第３の側面の好ましい態様は，前記第１の組成物が投与された後，３０秒後〜２４時間後，好ましくは１分後〜１２時間後，より好ましくは１分後〜１０分後に前記第２の組成物が投与される上記いずれかに記載のキットに関する。
【００４３】
本発明は，エフリンＢ２又はその薬理学的に許容される塩，及び薬理学的に許容される担体を含有する第１の組成物と；上記いずれかのペプチド又はその塩（例えば，(i)配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，もしくはその薬理学的に許容される塩，又は(ii)配列番号１又は配列番号２において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,前記エフリンＢ２の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩），及び薬理学的に許容される担体を含有する第２の組成物とを用い，前記第２の組成物を投与した後に前記第１の組成物を投与する新生血管に関連する疾患の治療方法をも提供する。
【発明の効果】
【００４４】
上記のとおりであるから，本発明によれば，エフリンＢ２の活性を高め，新生血管が関連する疾患の治療に有効な新規ペプチドなどを提供できる。
【００４５】
後述する実施例により，エフリンＢ２と配列番号１から配列番号４で表されるペプチドなどを含む医薬組成物は，それらを組み合わせることで，それぞれを単独に投与した場合に比べて，高い新生血管の阻害活性を得ることができることが示された。よって，本発明によれば，エフリンＢ２と所定のペプチドなどを含む新生血管の阻害などに有効な，医薬組成物を提供できる。
【００４６】
後述する実施例により，エフリンＢ２を投与した後に，配列番号１又は配列番号２で表されるペプチドを投与することで，効果的に新生血管を阻害できることが実証された。よって，本発明によれば，エフリンＢ２を含有する第１の組成物と，所定のペプチドなどを含む第２の組成物とを含む，新生血管の阻害などに有効な，医療用キットを提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
[本発明のペプチド，剤及び補助剤]
本発明の第１の側面は，基本的には，“配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド”，“配列番号１において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,エフリンＢ２の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，又はそれらの薬理学的に許容される塩”，“配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩”，“配列番号２において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,エフリンＢ２の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩”，又は“配列番号３または配列番号４で表されるアミノ酸配列を具備するペプチドであって，当該ペプチドに含まれるアミノ酸残基の数が９以上，１００以下であるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩”に関する。以下，これらをまとめて“本発明のペプチド”ともよぶ。本発明のペプチドは，自ら新生血管の阻害能を有するほか，エフリンＢ２の活性を高める働きを有する補助剤として機能する。そして，エフリンＢ２は，新生血管の発生を阻害するので，本発明のペプチドは，新生血管が関与する疾患の治療又は予防用に有用である。
【００４８】
本発明のペプチドのうち，配列番号１において１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドは，配列番号１で表されるペプチドと同様の活性を有するものである。このようなペプチドは，容易に製造できるし，また，その活性も本明細書における実施例と同様にして行うことで容易に確かめることができる。配列番号１で表されるアミノ酸配列において８位を除く４位から９位の部分（配列番号３）がストランズ（strands）Ａ−Ａ’を構成する部位であると考えられ，１３位から１６位の部分（配列番号４）がＡ’−Ｂループを構成する部位であると考えられ，しかもこの部位が作用部位であると推測される。従って，“配列番号１において１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド”として，配列番号１で表されるアミノ酸配列において２位から１０位の部分以外の部位におけるアミノ酸が１又は２個欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであることが好ましい。また，“配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩”の有効性は，後述する実施例において実証されたとおりである。そして，“配列番号２において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,エフリンＢ２の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩”についても，配列番号３もしくは配列番号４で示されるアミノ酸残基が保存され，それ以外の部位について１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるものが好ましい。なお，配列番号１で表されるアミノ酸配列において８位を除く４位から９位の部分（配列番号３）または１３位から１６位の部分（配列番号４）を含めば，適宜公知のアミノ酸配列が付加されてもよく，例えば５から１００個のアミノ酸残基からなるものであっても，１０から２０個のアミノ酸残基からなるものであってもよい。なお，このようなペプチドは，例えば，配列番号５で表されるエフリンＢ２のアミノ酸配列から前記した部位を含む部分ペプチド（例えば５から１００個のアミノ酸残基，好ましくは１０から３０個のアミノ酸残基，より好ましくは１０から２０個のアミノ酸残基）を取り出すことによって得ることもできる。さらに，そのようにして取り出したエフリンＢ２の部分ペプチドから，１又は数個（具体的には，２,３,４,又は５個）のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって，本発明のペプチドと同様の活性を有するものであってもよい。「本発明のペプチドと同様の活性」とは，例えば，眼内の新生血管の抑制能や，エフリンＢ２の補助剤としての能力などを有するものを意味する。なお，配列番号６で示される塩基配列は，配列番号５で示されるエフリンＢ２をコードするＤＮＡの塩基配列である。
【００４９】
本発明のペプチド（ポリペプチド）は，左端がＮ末端（アミノ末端），右端がＣ末端（カルボキシル末端）として表記される。本発明のペプチドは，Ｃ末端がカルボキシル基（-ＣＯＯＨ），カルボキシレート（-ＣＯＯ-），アミド（-ＣＯＮＨ２）又はエステル（-ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。ここでエステルにおけるＲとして，例えば，メチル，エチル，ｎ−プロピル，イソプロピル，ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基などがあげられる。本発明のペプチドが，Ｃ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合，そのカルボキシル基がアミド化またはエステル化されていてもよい。さらに，本発明のペプチドは，Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば，ホルミル基，アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているものなどであってもよい。
【００５０】
本発明のペプチドにおける“薬理学的に許容される塩”として，無機酸（例えば，塩酸，リン酸，臭化水素酸，硫酸）との塩，又は有機酸（例えば，酢酸，ギ酸，プロピオン酸，フマル酸，マレイン酸，コハク酸，酒石酸，クエン酸，リンゴ酸，蓚酸，安息香酸，メタンスルホン酸，ベンゼンスルホン酸）との塩などがあげられる。
【００５１】
本発明のペプチド，またはその塩は，ヒトや哺乳動物などの細胞または組織から公知のタンパク質の精製方法によって製造することができる。また，ペプチドをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造できる。また，ペプチド合成法に準じて製造することもできる。ヒトや哺乳動物の組織または細胞から本発明のペプチドを製造する場合，例えば，組織または細胞をホモジナイズした後，酸などで抽出を行ない，該抽出液を逆相クロマトグラフィー，イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより，本発明のペプチドまたはその塩を，単離精製することができる。
【００５２】
ペプチドの合成法として，例えば，固相合成法，液相合成法（泉屋信夫，加藤哲夫，青柳東彦，脇 道典，「ペプチド合成の基礎と実験」１９８５，丸善（株））があげられる。また，反応後は通常の精製法，例えば，溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせることで，本発明のペプチドを単離精製できる。上記方法で得られるペプチドが遊離体である場合は，公知の方法によって適当な塩に変換することができるし，逆に塩で得られた場合は，公知の方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００５３】
本発明のポリペプチドのうち配列番号１で表されるペプチドを固相合成法で製造する場合，例えば，アミノ酸配列の２０位の残基の，保護アミノ酸残基のカルボキシル基を直接（又は場合によりスペーサーを介して，）クロロメチル基あるいはオキシメチル基を有する不溶性樹脂に結合させる。その後，アミノ酸配列の１９位から１位までの各保護アミノ酸を固相合成法に従って順次結合させる。その後，不溶性樹脂およびアミノ酸の保護基を脱離させる。このようにして，本発明のポリペプチドを得ることができる。前記不溶性樹脂，スペーサー，及びＮ−保護アミノ酸を不溶性樹脂に結合したＮ−保護アミノ酸樹脂などは，公知の方法で調製でき，また市販されるものを適宜用いてもよい。
【００５４】
不溶性樹脂は，Ｃ末端のＮ−保護アミノ酸のカルボキシル基と直接結合できるか，又はスペーサーを介して結合でき，前記カルボキシル基から脱離できるものであれば特に限定されず，公知のものを適宜用いることができる。このような不溶性樹脂として，例えば，Ｂｏｃ（t-ブチルオキシカルボニル）ストラテジーによりペプチドを合成する場合は，クロロメチル樹脂（クロロメチル化スチレン- ジビニルベンゼン共重合体），オキシメチル樹脂，又はスペーサーを導入した４−オキシメチル−Ｐａｍ（フェニルアセタミドメチル）樹脂が好ましい。一方，Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）ストラテジーによりペプチドを合成する場合は，オキシメチルフェノキシメチル（Ｗａｎｇ）樹脂が好ましい。
【００５５】
保護アミノ酸とは，官能基を公知の方法により保護基で保護したアミノ酸を意味する。保護アミノ酸として，市販される公知の保護アミノ酸を適宜用いることができる。本発明のポリペプチドを合成する場合には，以下に示す保護基のいずれかを選択するのが好ましい。すなわち，アミノ酸のα−アミノ基の保護基として，Ｂｏｃ（t-ブチルオキシカルボニル）又はＦｍｏｃ (９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）が好ましい。アルギニン（Ａｒｇ）のグアニジノ基の保護基として，Ｔｏｓ（トシル），ＮＯ２（ニトロ），Ｍｔｒ（４−メトキシ−２, ３, ６−トリメチル ベンゼンスルホニル）又はＰｍｃ（２, ２, ５, ７, ８- ペンタメチルクロマン−６−スルホニル）が好ましい。リジン（Ｌｙｓ）のε−アミノ基の保護基として，Ｚ（ベンジルオキシカルボニル），Ｃl ・Ｚ（２−クロロベンジルオキシカルボニル），Ｂｏｃ，又はＮｐｙｓ（３−ニトロ−２−ピリジンスルフエニル）が好ましい。ヒスチジン（Ｈｉｓ）のイミダゾリル基の保護基として，Ｔｏｓ，Ｚ，Ｐａｃ（フェナシル），Ｂｏｍ（ベンジルオキシメチル），Ｄｎｐ（ジニトロフェニル）又はＴｒｔ（トリチル）が好ましい。システイン（Ｃｙｓ）のメルカプト基の保護基として，Ｂｚｌ (ベンジル），ＭＢｚｌ (４−メトキシベンジル），４−Ｍe Ｂｚｌ（４−メチルベンジル），Ａｃｍ（アセタミドメチル），Ｔｒｔ，Ｎｐｙｓ，t-Ｂｕ (t-ブチル），t-ＢｕＳ（t-ブチルチオ）があげられ，これらの中では，ＭＢｚｌ，４−Ｍe Ｂｚｌ，Ｔｒｔ，Ａｃｍ，又はＮｐｙｓが好ましい。チロシン（Ｔｙｒ）の水酸基の保護基として，Ｂｚｌ，Ｃl2・Ｂｚｌ（２, ６−ジクロロベンジル），t-Ｂｕがあげられる。一方，チロシン（Ｔｙｒ）の水酸基は，特に保護基を導入しなくてもよい。トリプトファン（Ｔｒｐ）のインドール基の保護基として，ＣＨＯ（フォルミル基）があげられる。一方，トリプトファン（Ｔｒｐ）のインドール基は，特に保護基を導入しなくてもよい。メチオニン（Ｍｅｔ）のチオメチル基の保護基として，メチルスルホキシド基があげられるが，特に保護基を導入しなくてもよい。セリン（Ｓｅｒ）およびトレオニン（Ｔｈｒ）の水酸基の保護基として，Ｂｚｌ又はｔ−Ｂｕ基があげられる。アスパラギン酸（Ａｓｐ）およびグルタミン酸（Ｇｌｕ）のカルボキシル基の保護基として，ＯＢｚｌ（ベンジルエステル），ＯｔＢｕ（ｔ−ブチルエステル），ＯｃＨｅｘ（シクロヘキシルエステル），又はＯＰａｃ（フェナシルエステル）が好ましい。アスパラギン（Ａｓｎ）およびグルタミン（Ｇｌｎ）のカルバミド基の保護基として，Ｔｒｔ又はＸａｎ（キサンチル基）が好ましい。
【００５６】
保護アミノ酸の結合は，通常の縮合法，例えば，ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）法，ＤＩＰＣＤＩ（ジイソプロピルカルボジイミド）法［Ｔａｒｔａｒ．Ａら；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４４，５０００（１９７９）］，活性エステル法，混合又は対称酸無水物法，カルボニルジイミダゾール法，ＤＣＣ- ＨＯＢt(１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）法［Ｋｅｏｎｉｇ ，Ｗら；Ｃｈｅｍ.Ｂｅｒ.,１０３，７８８  ，ｐｐ．２０２４-２０３４（１９７０）］，ジフエニルホスホリルアジド法，ＢＯＰ試薬（ベンゾトリアゾリル−Ｎ−ヒドロキシトリスジメチルアミノホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩）を用いるＢＯＰ−ＨＯＢｔ法（Ｈｕｄｓｏｎ，  Ｄ．，  Ｊ．  Ｏｒｇ. Ｃｈｅｍ．，５３，  ６１７（１９８８）)，ＨＢＴＵ（２−（１Ｈ）−ベンゾトリアゾ−ル−１−イル)−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート）−ＨＯＢｔ法（Ｋｎｏｒｒ，Ｒ．ら，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．,  ３０，  １９２７  （１９８９）），ＴＢＴＵ（２−（１Ｈ）−ベンゾトリアゾール−1−イル)−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレイト）−ＨＯＢｔ法（Ｋｎｏｒｒ，Ｒ． ら, Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３０，１９２７（１９８９））等に従って行なうことができる。これらのうち，ＤＣＣ法，ＤＣＣ−ＨＯＢt 法，ＢＯＰ−ＨＯＢｔ法，ＨＢＴＵ−ＨＯＢｔ法，又は対称酸無水物法が好ましい。
【００５７】
これらの縮合反応は，たとえば，ジクロロメタン，ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ），Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）等の有機溶媒又はそれらの混合溶媒中で行なわれる。α- アミノ基の保護基の脱離試薬としては，トリフルオロ酢酸／ジクロロメタン，ＨＣl ／ジオキサン，ピペリジン／ＤＭＦ又はピペリジン／ＮＭＰ等が用いられ，該保護基の種類により適宜選択する。また，合成の各段階における縮合反応の進行の程度はＥ．カイサーらの方法 [Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ３４，  ５９５（１９７０） ］（ニンヒドリン反応法）によって検査されればよい。以上のようにして，所望のアミノ酸配列を有する保護ペプチド樹脂を得ることができる。
【００５８】
保護ペプチド樹脂は，フッ化水素，ＴＦＭＳＡ（トリフルオロメタンスルホン酸）［Ａａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  発行，Ｅ．  Ｇｒｏｓｓ編集，Ｈ．  Ｙａｊｉｍａら; “ Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ”５，６５（１９８３）］，ＴＭＳＯＴf （トリメチルシリルトリフラート），ＴＭＳＢr(トリメチルシリルブロミド）[Ｆｕｊｉｉ，Ｎ ら； Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．,３５，３８８０（１９８７）］，またはトリフルオロ酢酸などで処理することにより，該樹脂および保護基を同時に脱離させることができる。上記の脱離試薬は，該ストラテジー（Ｂｏｃ又はＦｍｏｃ)，該樹脂，該保護基の種類により適宜選択する。
【００５９】
このようにして得られたペプチドは，公知の方法，例えば，抽出，再結晶，各種クロマトグラフィー（ゲルろ過，イオン交換，分配，吸着，逆相），電気泳動，向流分配等により単離精製することができる。これらの中では，逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて精製する方法が好ましい。上記方法で得られるペプチドが遊離体である場合は，公知の方法によって適当な塩に変換できる。また，ペプチドが塩の形態で得られた場合は，公知の方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００６０】
後述する実施例で示されるように，エフリンＢ２は，内皮細胞（ＥＣ）のＤＮＡ合成；ＥＣにおける細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）リン酸化；ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦの両方で誘導されるｐ４４／ｐ４２ＭＡＰキナーゼ活性化；ＥＣ脈管形成；ｂＦＧＦで誘導された角膜血管形成；及び網膜から硝子体腔内に伸びる病的な新生血管を阻害する。
【００６１】
また，本発明のペプチドは，エフリンＢ２の活性を高めるので，眼内の新生血管阻害補助剤，眼内の静脈内皮細胞におけるＤＮＡ合成阻害用補助剤及び眼内の静脈内皮細胞におけるｐ４４／ｐ４２ＭＡＰＫリン酸化活性阻害用補助剤を提供できる。これらの補助剤の好ましい態様は，主剤としてエフリンＢ２を含有する剤を用いるものである。
【００６２】
血管内皮細胞をＶＥＧＦで刺激すると受容体下流のシグナル伝達系によりＭＡＰＫが活性化され，リン酸化されたＭＡＰＫの上昇が認められる（Ａｂｅｄｉ，Ｈ．ａｎｄ  Ｚａｃｈａｒｙ，Ｉ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１５４４２−１５４５１（１９９７））。ＭＡＰＫの活性化は血管新生における血管内皮細胞の増殖に重要な役割を担うことが知られている（Ｍｅｒｅｎｍｉｅｓ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ＆  Ｄｉｆｆｅｒ．，８３−１０（１９９７）；Ｆｅｒｒａｒａ，  Ｎ．  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ，  Ｔ．  Ｅｎｄｏｃｒ．  Ｒｅｖ．，  １８，  ４−２５（１９９７））。従って，本発明のペプチドは，血管新生抑制作用又はエフリンＢ２により血管新生抑制作用の補助活性を有するといえる。病態部位における血管新生は，眼内以外では主として，腫瘍，慢性関節リウマチ，乾癬，アテローム性動脈硬化症，カポジ肉腫のような疾患，並びに固形癌の転移と深く結びついている（Ｆｏｒｋｍａｎ，  Ｊ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  １：  ２７−３１（１９９５），  Ｂｉｃｋｎｅｌｌ，  Ｒ．，  Ｈａｒｒｉｓ，  Ａ．Ｌ．Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ８：  ６０−６５（１９９６））。従って，本発明のペプチドは，腫瘍，慢性関節リウマチ，乾癬，アテローム性動脈硬化症，カポジ肉腫のような疾患，並びに固形癌の転移，その他の血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の治療に用いることができ，本発明はそのような治療剤をも提供しうる。
【００６３】
これらの剤や補助剤は，本発明のペプチドを有効量含有するものがあげられる。「有効量」とは，所望の目的を達成するために十分な量を意味する。眼内の新生血管阻害用補助剤における「有効量」とは，例えば，エフリンＢ２などの眼内の新生血管阻害剤の新生血管阻害作用を高めるために十分な量を意味する。具体的な，本発明のペプチドの投与量は，対象疾患，投与対象，投与ルートなどにより適宜調整すればよい。本発明のペプチドの投与量として，例えば，目に硝子体注射投与する場合，一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては，一眼あたり１×１０２ｎｇ〜１ｍｇ，好ましくは１×１０２ｎｇ〜１μｇ，より好ましくは１×１０２ｎｇ〜７×１０２ｎｇがあげられる。投与回数は適宜調整すればよく，例えば，一日一回主剤であるエフリンＢ２を含有する剤とともに投与するものなどがあげられる。また，補助剤を経口投与する場合，一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては，一回につき２μｇ〜１×１０２ｍｇ，好ましくは２μｇ〜１ｍｇ，より好ましくは１×１０２ｎｇ〜２μｇ，より好ましくは２μｇ〜１×１０２μｇがあげられる。これらの量は，患者の体重，性別などを適宜考慮して，調整すればよい。ヒト以外の哺乳動物に上記の剤又は補助剤を投与する場合も，体重６０ｋｇ当たりに換算した量を適宜投与すればよい。
【００６４】
本発明のペプチドは，それ自体，又は医薬組成物（補助剤）として投与することができる。本発明のペプチドは，たとえば薬理学的に許容され得る担体，希釈剤又は賦形剤を含むものがあげられる。本発明のペプチドを含有する補助剤は，投与形態に適する剤形として調整されればよい。
【００６５】
たとえば，本発明のペプチド又は補助剤を点眼剤又は注射剤として用いる場合，有効量の本発明のペプチドと，公知の希釈剤（希釈剤は，薬理学的に許容され得る担体に含まれる）とを含む点眼剤又は注射剤であればよい。希釈剤として，滅菌水，純水，蒸留水などの水；生理食塩水；ブドウ糖溶液；エタノールなどのアルコール；グリセロール，プロピレングリコール，ポリエチレングリコールなどのポリアルコール；滅菌有機溶媒；又は水性デンプン；ＰＢＳのいずれか１種又は２種以上の混合物などがあげられる。
【００６６】
本発明のペプチドを含有する点眼剤又は注射剤は，エピネフリン，塩酸エピネフリン，塩酸エフェドリン，などの充血除去成分；チル硫酸ネオスチグミン，トロピカミドなどの眼調節薬成分；硫酸亜鉛，乳酸亜鉛，アラントイン，イプシロン−アミノカプロン酸，インドメタシン，塩化リゾチームなどの抗炎症薬成分；アシタザノラスト，アンレキサノクス，イブジラスト，トラニラスト，塩酸ジフェンヒドラミンなどの抗ヒスタミン薬成分又は抗アレルギー薬成分；アミノ酸類；塩酸オキシブプロカイン，塩酸コカイン，塩酸コルネカイン，塩酸ジブカインなどの局所麻酔薬成分；などを適宜含有してもよい。コンドロイチン硫酸ナトリウム，ヒアルロン酸ナトリウムなどの増粘剤；塩化ベンザルコニウムなどの界面活性剤；安息香酸ナトリウム，エタノール，塩化ベンザルコニウムなどの防腐剤，殺菌剤又は抗菌剤；塩酸，ホウ酸，水酸化ナトリウム，炭酸水素ナトリウムなどのｐＨ調節剤；亜硫酸水素ナトリウム，亜硫酸ナトリウム，塩化カリウムなどの等張化剤；メントール，カンフル，ハッカ油，ペパーミント油などの香料または清涼化剤；クエン酸緩衝剤などの緩衝剤などを適宜含有するものであってもよい。
【００６７】
本発明のペプチドを含む補助剤は，錠剤，カプセル剤，顆粒剤，散剤，シロップ剤などの経口投与剤であってもよい。この場合，薬理学的に許容される担体として，賦形剤，希釈剤，滑沢剤，結合剤，崩壊剤，安定剤，及び矯味矯臭剤から適宜選択されるものがあげられる。
【００６８】
本発明のペプチドを含む補助剤は，公知の方法に従って製造できる。点眼剤又は注射剤は，例えば，希釈剤などに本発明のペプチドを添加し，アンプルなどの容器に入れることにより製造できる。錠剤は，例えば，本発明のペプチドを公知の担体と混合した医薬組成物を打錠機により打錠することにより製造できる。カプセル剤は，例えば，カプセルなどの形態をしている担体中に，本発明のペプチドを封入することにより製造できる。
【００６９】
また，本発明のペプチドは，エフリンＢ２の活性を高めるので，後述するようにエフリンＢ２を含む医療用組成物，又はキットなどに適宜利用されうる。
【００７０】
［エフリンＢ２及び本発明のペプチドを含有する医薬用組成物，及び治療・予防剤］
本発明の第２の側面は，基本的には，エフリンＢ２又はその薬理学的に許容される塩と；本発明のペプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩と；を含有する医薬用組成物に関する。これらの中では，エフリンＢ２又はその薬理学的に許容される塩と，配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩を含有する医薬用組成物が好ましい。
【００７１】
ＷＯ２００６／００６０７９号公報（特許文献１）に開示されるとおり，エフリンＢ２は，眼内における動脈及び静脈内皮細胞のＤＮＡ合成の阻害作用；眼内における動脈及び静脈内皮細胞におけるｐ４４／ｐ４２ＭＡＰＫ活性化の阻害作用；眼内における動脈及び静脈内皮細胞における管形成の阻害作用を有する。そして，同文献における生体内実験で実証されたように，エフリンＢ２は，眼内の脈絡膜における新生血管を抑制し，加齢黄斑変性（ＡＭＤ）など，眼内の新生血管に関連する疾患の治療に有効である。
【００７２】
一方，後述する実施例によって実証されたとおり，本発明のペプチドは，エフリンＢ２と併用することでエフリンＢ２のＭＡＰＫリン酸化阻害能を飛躍的に高める作用を有する。このことは，エフリンＢ２が有する，眼内の静脈（動脈）内皮細胞における新生血管の抑制能を高めることを意味する。よって，エフリンＢ２と本発明のペプチドなどを含有する医薬用組成物は，特に眼内の新生血管の抑制など，眼内の新生血管に関連する疾患の治療に特に有効であると考えられる。本発明の医薬用組成物は，有効量のエフリンＢ２を含有すればよい。
【００７３】
本発明の医薬用組成物に用いられるエフリンＢ２は，アナログおよび改変体を含む任意のエフリンＢ２であってもよい。なお，エフリンＢ２は，可溶性エフリンＢ２（通常，細胞外ドメインを含むが，細胞質ドメインを含まない）であってもよい。エフリンＢ２は，天然に存在するタンパク質を単離精製したものであっても，遺伝子組換えにより微生物などから生成されたものであってもよい。例えば，米国特許第６，３０３，７６９号明細書又はＭｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５  Ｎｏｖ；３２（１６）：１１９７−２０５に記載されるヒトエフリンＢ２のｃＤＮＡの配列を参照して，慣用の技術を用いて，全長タンパク質，細胞外ドメインを含むタンパク質などを作製してもよい。当業者が通常用いる技術を用いることにより，天然のエフリンＢ２を好ましく改変することもできる。また，エフリンＢ２は，医薬品や試薬として市販されているいずれを用いてもよい。
【００７４】
エフリンＢ２は，全長であってもよい。エフリンＢ２の好ましい態様は，天然のエフリンＢ２の細胞外ドメインを含み，細胞質ドメインを含まないものである。天然のエフリンＢ２の細胞外ドメインを含み，細胞質ドメインを含まない領域が，ＥｐｈＢ４のファーマコフォアに作用する部位であると考えられるので，そのような部位を含むエフリンＢ２であれば，全長でなくても新生血管の抑制能を有すると考えられる。そのようなエフリンＢ２として，配列番号５のうち−２８〜３０８位のアミノ酸残基からなるもの，配列番号５のうち１〜３０８位のアミノ酸残基からなるもの，配列番号５のうち−２８〜１９９位のアミノ酸残基からなるもの，配列番号５のうち１〜１９９位のアミノ酸残基からなるもの，及びそれらと９０％以上の相同性を有するもの（好ましくは９５％以上相同性を有するもの，又は配列番号３か配列番号４で示される部位を含みつつ９０％以上の相同性を有するもの）であって，エフリンＢ２と同様の活性を有するものがあげられる。なお，相同性は，例えば適宜パラメータを最適化したＧＡＰコンピュータプログラムのバージョン６を用いて求めればよい。なお，配列番号５で示されるペプチドは，エフリンＢ２のＮ末端シグナルペプチド（配列番号５のアミノ酸−２８から−１），細胞外ドメイン（アミノ酸１から１９９），膜貫通領域（アミノ酸２００から２２５），および細胞質ドメイン（アミノ酸２２６から３０８）からなるペプチドである（なお，配列番号５に示されるアミノ酸の番号については配列番号５に係るペプチドのアミノ酸配列及びこのペプチドをコードする遺伝子の塩基配列を図６に示す。）。
【００７５】
また，エフリンＢ２が，ヒトＦｃとエフリンＢ２の融合タンパク質であってもよい。エフリンＢ２が新生血管の抑制能を発揮するためには，エフリンＢ２が二量体化していることが望ましいと考えられ，そのためヒトＦｃとエフリンＢ２との融合タンパク質であれば，エフリンＢ２が二量化し，高い新生血管の抑制能を発揮しうる。この融合タンパク質に用いられるエフリンＢ２は，エフリンＢ２の細胞外ドメイン，又は細胞外ドメインを含み，細胞質ドメインを含まないものが好ましい。Ｎ末端シグナルペプチド及び膜貫通領域については，それら全てが含まれてもよいし含まれなくてもよく，またそれらのうち一部のみが含まれていてもよい。エフリンＢ２とヒトＦｃの融合タンパク質は，たとえば，特表平１０-５０２８１０号公報（特許文献３）に記載される方法により作出できる。
【００７６】
本発明の第２の側面の好ましい態様は，新生血管阻害，特に眼内の新生血管阻害剤である上記いずれかに記載の医薬用組成物に関する。本発明の第２の側面の好ましい態様は，眼内の脈絡膜における新生血管阻害剤である上記いずれかに記載の医薬用組成物に関する。これら医薬組成物は，公知の薬理学的に許容される担体などを適宜含んでもよい。このような担体として，先に説明したものを適宜用いることができる。また，新生血管阻害剤などとして，先に説明した補助剤と同様の剤形のものを同様にして製造できる。
【００７７】
本発明の第２の側面の好ましい態様は，眼内の新生血管に関連する疾患の治療・予防剤である上記いずれかに記載の医薬用組成物に関する。より具体的に説明すると，本発明の第２の側面の好ましい態様は，“加齢黄斑変性，虚血性網膜症，眼内血管新生，角膜血管新生，網膜血管新生，脈絡膜血管新生，糖尿病性黄斑浮腫，糖尿病性網膜虚血，糖尿病性網膜浮腫，糖尿病性網膜症”からなる群から選択される，１又は２種以上の疾患の治療・予防剤である上記いずれかに記載の医薬用組成物に関する。特に好ましい態様は，加齢黄斑変性及び糖尿病性網膜症のいずれか又は両方の疾患の治療・予防剤である。また，先に説明したとおり，本発明のペプチドは，血管新生抑制作用又はエフリンＢ２により血管新生抑制作用の補助活性を有するといえる。病態部位における血管新生は，眼内以外では主として，腫瘍，慢性関節リウマチ，乾癬，アテローム性動脈硬化症，カポジ肉腫のような疾患，並びに固形癌の転移と深く結びついている（Ｆｏｒｋｍａｎ，  Ｊ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  1：  ２７−３１（１９９５）；  Ｂｉｃｋｎｅｌｌ，  Ｒ．，  Ｈａｒｒｉｓ，  Ａ．Ｌ．Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ８：  ６０−６５（１９９６））。従って，本発明の第２の側面の好ましい態様は，腫瘍，慢性関節リウマチ，乾癬，アテローム性動脈硬化症，カポジ肉腫，又は固形癌の転移の治療剤である医薬用組成物に関する。
【００７８】
すなわち，本発明の医薬組成物は，既に罹患している眼内の新生血管に関連する疾患の治療剤として用いることができる他，これらの疾患を予防するため，又はこれらの疾患が発生する事態を遅延させるための予防剤としても使用しうる。
【００７９】
本発明の第２の側面に係る医薬用組成物又は治療・予防剤に含まれるエフリンＢ２と本発明のペプチドの割合（モル比）は適宜調整すればよい。しかしながら，後述する実施例によって実証されたとおり，エフリンＢ２と本発明のペプチドのモル比として１：１×１０−３〜１：１×１０３があげられ，１：１×１０−２〜１：１×１０２が好ましく，１：１×１０−１〜１：１×１０が好ましく，１：１〜１：１×１０３が好ましく，１：１〜１：１×１０２が好ましく，１：１〜１：１×１０が好ましく，１：１〜１：５×１０が好ましく，１：１×１０〜１：５×１０がより好ましい。
【００８０】
［医療用キット］
本発明の第３の側面は，基本的には，エフリンＢ２又はその薬理学的に許容される塩，及び薬理学的に許容される担体を含有する第１の組成物と；本発明のペプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩，及び薬理学的に許容される担体を含有する第２の組成物を含有する医療用キット（以下，「本発明の医療用キット」ともよぶ。）に関する。すなわち，エフリンＢ２などを含有する第１の組成物と，本発明のペプチドなどを含有する第２の組成物とを含む医療用キットに関する。本発明のペプチドとして，配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩が好ましい。
【００８１】
上記の医療用キットは，基本的には，新生血管の抑制，特に眼内の新生血管の抑制のための第１の組成物を主剤とし，第２の組成物を補助剤として含むものである。後述する実施例によって実証されたとおり，本発明のペプチドは，エフリンＢ２と併用することでエフリンＢ２のＭＡＰＫリン酸化阻害能を飛躍的に高める作用を有する。このことは，エフリンＢ２が有する，眼内の静脈（動脈）内皮細胞における新生血管の抑制能を高めることを意味する。さらに，後述する実施例によって実証されたとおり，第１の組成物を投与した後に第２の組成物を投与するとＭＡＰＫの活性を著しく阻害することが示された。よって，本発明のキットは，特にそのような投与方法に有効に利用されうる。
【００８２】
本発明の医療用キットに含まれるエフリンＢ２は，先に説明したものを適宜用いることができる。
【００８３】
本発明の医療用キットの好ましい態様は，新生血管阻害用，特に眼内の新生血管阻害用に用いられるものであり，さらに好ましい態様は，眼内の脈絡膜における新生血管阻害用に用いられるものである。本発明の第３の側面の好ましい態様は，眼内の新生血管に関連する疾患の治療又は予防用に用いられる上記いずれかに記載のキットに関する。本発明の第３の側面の好ましい態様は，加齢黄斑変性，虚血性網膜症，眼内血管新生，角膜血管新生，網膜血管新生，脈絡膜血管新生，糖尿病性黄斑浮腫，糖尿病性網膜虚血，糖尿病性網膜浮腫，糖尿病性網膜症”からなる群から選択される，１又は２種以上の疾患の治療用又は予防用に用いられる上記いずれかに記載のキットに関する。本発明の第３の側面の好ましい態様は，加齢黄斑変性及び糖尿病性網膜症のいずれか又は両方の疾患の治療用又は予防用に用いられる上記いずれかに記載のキットに関する。
【００８４】
先に説明したとおり，本発明のペプチドは，血管新生抑制作用又はエフリンＢ２により血管新生抑制作用の補助活性を有するといえる。病態部位における血管新生は，眼内以外では主として，腫瘍，慢性関節リウマチ，乾癬，アテローム性動脈硬化症，カポジ肉腫のような疾患，並びに固形癌の転移と深く結びついている（Ｆｏｒｋｍａｎ，  Ｊ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  １：  ２７−３１（１９９５）；  Ｂｉｃｋｎｅｌｌ，  Ｒ．，  Ｈａｒｒｉｓ，  Ａ．Ｌ．Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ８：  ６０−６５（１９９６））。従って，本発明の第３の側面の好ましい態様は，腫瘍，慢性関節リウマチ，乾癬，アテローム性動脈硬化症，カポジ肉腫，又は固形癌の転移の治療に用いられる上記いずれかに記載のキットに関する。すなわち，本発明の第３の側面の好ましい態様は，腫瘍，慢性関節リウマチ，乾癬，アテローム性動脈硬化症，カポジ肉腫，又は固形癌の転移の治療用キットに関する。
【００８５】
第１の組成物は眼内の新生血管など新生血管に関連する疾患の治療剤又は予防剤であり，第２の組成物は前記第１の組成物の補助剤であってもよい。これらの組成物，治療剤，予防剤及び補助剤は，先に説明したものを適宜用いることができる。そして，これらに含まれるエフリンＢ２や本発明のペプチドの含有量も上記したものを適宜用いることができる。
【００８６】
後述する実施例によって実証されたとおり，エフリンＢ２と本発明のペプチドを同時に投与した場合に比べ，エフリンＢ２を投与した後に，本発明のペプチドを投与した場合のほうが，ＭＡＰＫ活性化を抑えることができる。したがって，本発明の第３の側面の好ましい態様は，前記第１の組成物が投与された後に，前記第２の組成物が投与される上記いずれかに記載のキットに関する。前記第１の組成物が投与された後，３０秒後〜２４時間後，好ましくは１分後〜１２時間後，より好ましくは１分後〜１０分後に前記第２の組成物が投与される上記いずれかに記載のキットに関する。また，本発明のペプチドを投与した後にエフリンＢ２を投与しても，エフリンＢ２と本発明のペプチドを同時に投与した場合に比べＭＡＰＫ活性化を抑えることができる。したがって，本発明の第３の側面の好ましい態様は，前記第２の組成物が投与された後に，前記第１の組成物が投与される上記いずれかに記載のキットに関する。前記第２の組成物が投与された後，３０秒後〜２４時間後，好ましくは１分後〜１２時間後，より好ましくは１分後〜１０分後に前記第１の組成物が投与される上記いずれかに記載のキットに関する。
【００８７】
[ＣＮＶモデルに対する本発明のペプチド及びエフリンＢ２の評価]
本発明のペプチド及びエフリンＢ２が，ＡＭＤなど，眼内の血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の治療剤として有効であることは，たとえば，レーザー誘導性脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）モデルを用いて実証できる。レーザー誘導性ＣＮＶモデルは，ＡＭＤの生態モデルと考えられる。以下，ＣＮＶモデルのプロトコル例について説明する。
【００８８】
たとえば，６匹のカニクイザル（オス３〜６kg）由来の１２眼を用いてＣＮＶモデル実験を行う。これらの動物は全て，苦痛のないように無病原状態で収容する。そのため，実験は，塩酸ケタミンで全身麻酔を施した状態で行う。
【００８９】
−実験的脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）の誘導―
上記サルの眼の眼底部の後部極において，眼科レーザー用レンズ（３−M Infant Laser OG ３MIA，Ocular Instruments, Inc.）を使用し，眼底後極部をクリプトンレーザー（マルチカラーレーザー光凝固装置  ＭＣ−３００，株式会社ニデック，スリットランプ  ９００BQ，Haag Streit）で光凝固する。レーザー光の強度はたとえば，約７００mWとする。その際，凝固サイズを１００mm，凝固時間を０．１秒とし，１眼あたり８発の凝固を行えばよい。
【００９０】
−本発明のペプチド及びエフリンＢ２投与方法と濃度−
投与方法と濃度の例を下記表１に示す。表中，被験物質及び対照物質の欄中，矢印は，あるペプチドを投与した後に次のペプチドを投与することを意味する。レーザー照射直後と照射後５日の合計２回，下記の硝子体内濃度のＰＢＳ，エフリンＢ２，本発明のペプチドを硝子体内に投与する。１投与あたり０．１ｍＬずつ，３０Ｇ針を用いて毛様体扁平部から眼内に注射する。ネガティブコントロールとして，０．１ｍＬのＰＢＳを注射する。ポジティブコントロールとして，１．６６ｎＭのエフリンＢ２を用いる。動物番号３〜５は，３分差で投与を行う。例えば，動物番号３（右眼）は，エフリンＢ２（１００
mＬ）を投与した３分後に配列番号１のペプチド（１００mL）を投与するので，２種類の被験物質を各１００mＬの計２００mＬ投与することになる。 
【００９１】
【表１】
2007326838.tif 000003
【００９２】
−ＣＮＶの評価−
ＣＮＶモデル実験は，例えば，以下のようにして評価する。レーザー照射後１０日目に蛍光眼底造影検査を行って，脈絡膜新生血管を評価する。検査は両眼で時間をずらして実施する。両眼ともにフルオレセイン（蛍光眼底造影剤フルオレサイト注射液1号，日本アルコン株式会社，0.1mL/kg）投与後5分及び10分に，それぞれ右，左の順に連続して2枚ずつ撮影を行う。撮影された写真に基づいて，眼科専門医が評価を行う。
【００９３】
その後，ペントバルビタールナトリウム（東京化成工業株式会社）水溶液（64.8 mg/mL，0.4 mL/kg）の橈側皮静脈内投与により試験動物に麻酔を行い，体重を測定後，放血安楽死させ，外表，内部器官及び組織を肉眼的に観察する。左右眼球（視神経を含む）について，摘出後3%グルタールアルデヒド・2%パラホルムアルデヒド混合固定液で浸漬固定する。固定後の眼球のレーザー照射部位（8部位）を細切し，パラフィン包埋を行い，パラフィン切片（10切片）を作製した後，H.E.染色（1切片のみ）を施す。
【００９４】
以下，実施例に基づいて本発明を具体的に説明する。しかしながら，本発明は，以下の実施例によって限定されない。
【実施例１】
【００９５】
−配列番号１で表されるポリペプチドの合成−
配列番号１（ＲＳＩＶＬＥＰＩＹＷＮＳＳＮＳＫＦＬＰＧ）で表されるポリペプチドを以下のようにして合成した。すなわち，マルチシンテック（ＭｕｌｔｉＳｙｎｔｅｃｈ）社の自動ペプチド合成装置“シロＩＩ（ＳｙｒｏＩＩ ）” を用い，Ｆｍｏｃ (９−フルオレニルメチルオキシカルボニル)ストラテジーによる固相合成法により調整した。合成には，ＨＢＴＵ（２−（１Ｈ）−ベンゾトリアゾ−ル−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）−ＨＯＢｔ(１−ヒドロキシベンゾトリアゾール)法（Ｋｎｏｒｒ,Ｒ.ら, ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ., １９２７ （１９８９））を用いた。合成スケールは，２５マイクロモルであった。なお，用いたレジン及びアミノ酸は，それぞれ表３と表４とに示すとおりであった。
【００９６】
（１）Ｆｍｏｃ−アミノ酸樹脂を反応ベッセル及びＦｍｏｃアミノ酸用カートリッジにとり，そのベッセル及びカートリッジを，上記した自動ペプチド合成装置に装着し，ＦａｓｔＭｏｃプログラムにより自動合成操作を行った。
（２）ペプチドの自動合成に際し，まずＤＣＭ（ジクロロメタン）にて５分間樹脂を潤滑させた。その後，ＮＭＰ(Ｎ−メチル−２−ピロリドン)にて５分間処理し，洗浄した。その後，以下のプロトコルを繰返し行った。１サイクルの合成反応は，下表２のとおりである。
【００９７】
【表２】
2007326838.tif 000004
【００９８】
（３）脱保護基及び脱樹脂操作
上記のようにして得られた合成ペプチドをＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）／水／トリエチルシラン（Ｔｒｉｅｔｈｙｌｓｉｌａｎ）［９０:５:５］を用い，室温にて２時間反応させた。反応混合液から樹脂をろ別し，トリフルオロ酢酸１ｍｌにて２回洗浄し，ろ液及び洗液をあわせたものに氷冷下エーテル１００ｍｌを加え，生じた沈殿物を遠心分離し，残渣をデカンテーションにより上清から分離した。
【００９９】
（４）精製
得られた残渣を，氷冷下エーテルにて洗浄した後，遠心分離し，上清を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製した。逆相高速液体クロマトグラフィーは，島津社製ＨＰＬＣ“ＬＣ１０ＡＤ”を用い，カラムはクロマシル（Ｋｒｏｍａｓｉｌ）ＫＲ“１００−１０
Ｃ１８”の２５０ｘ３０ｍｍのものを用いた。逆相高速液体クロマトグラフィーの条件は，溶離液として，０．１％ＴＦＡ水溶液（Ａ液）及び８０％アセトニトリルを含む０．１％ＴＦＡ水溶液（Ｂ液）の２液グラジエントで，当初Ｂ液５％，３０分後にＢ液８０％，検出波長２１０ｎｍであった。精製されたペプチドを含む画分を回収後，凍結乾燥した。
【０１００】
（５）ポリペプチドの分析
最終的に精製されたペプチドを，島津社製ＨＰＬＣ“ＬＣ１０ＡＤ”及び，クロマシル（Ｋｒｏｍａｓｉｌ）ＫＲ“１００−１０Ｃ１８”の２５０ｘ４（又は６）ｍｍのカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより確認した。また，最終的に精製されたペプチドを，ブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）社製ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置“リフレックス（Ｒｅｆｌｅｘ）ＩＩ”によっても確認した。
【０１０１】
【表３】
2007326838.tif 000005
【０１０２】
【表４】
2007326838.tif 000006
【実施例２】
【０１０３】
−細胞培養−
本実施例は，ＨＵＶＥＣ（人臍帯静脈内皮細胞）を用いて行った。細胞株は３７℃の恒温槽で解凍し，１０ｍｌの血管内皮細胞培地（Ｈｕｍｅｄｉａ，ＥＧ-２キット，クラボウ製）に溶解後，タイプＩコラーゲンコート １０ｃｍ 培養皿（ＩＷＡＫＩ製）１枚に全量をプレーティングした。その後，３７℃，ＣＯ２／ａｉｒ＝６％／９４％でＨＵＶＥＣを２４時間培養した。ＤＭＳＯを除去するため，ＥＧ−２培地１０ｍｌに培地の交換を行った。８０〜９０％コンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）の状態になったら継代培養を行った。この時の細胞濃度は，およそ５×１０６個／Ｄｉｓｈ程度であった。７２時間程でコンフルエントになった。
【０１０４】
コラーゲンコート６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ製）に５×１０５個／ｗｅｌｌ程度でプレーティングを行った。培養を続け，コンフルエントになったら血管内皮細胞培地（Ｈｕｍｅｄｉａ，ＥＧ-２キット，クラボウ製）から細胞増殖因子（hＥＧＦ,hＦＧＦ-Ｂ）を除いた培地（６ｗｅｌｌの場合は２ｍｌ）に培地交換して２４時間培養した（ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）。培地を除き，血管内皮細胞培地（Ｈｕｍｅｄｉａ，ＥＧ-２キット，クラボウ製）から細胞増殖因子を除いた培地にペプチド分解酵素の阻害剤バシトラシン(最終濃度１００マイクロｇ／ｍｌ)を加えたものをコントロールとして加えた。他の処理群は，このトンコロール培地でペプチド及びエフリンＢ２を希釈して細胞に加え，１０分後（もしくは適当な時間を設定）にＰＢＳで２回洗浄した後，ライシスバッファ（ＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ）（６ｗｅｌｌの場合は０．２ｍｌ／ｗｅｌｌ）を用いて細胞の全細胞ライセートを回収した。
【実施例３】
【０１０５】
−ｐ４４／４２ＭＡＰＫリン酸化に対する配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドの効果−
ｐ４４／４２ＭＡＰＫリン酸化に対するエフリンＢ２，実施例１で得られたペプチド，及びそれらの併用剤の効果を以下のように実証した。
血管内皮細胞を，血管内皮細胞培地（ＨｕｍｅｄｉａＥＧ-２キット，クラボウ製）から細胞増殖因子を除いた培地にペプチド分解酵素の阻害剤バシトラシン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）を加えたものをコントロールとし，実施例１で得られたペプチド（配列番号１で表されるペプチドである。以下，「配列番号１のペプチド」ともよぶ）とエフリンＢ２（エフリンＢ２の細胞外ドメインとＦｃとの融合タンパク質である）を混合したものなどを用いて１０分間処理した。ドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）は１０％のアクリルアミドを用い，２００ボルトにて４０分間の条件で分離し，ウェット方式で１００ボルトの条件下一時間ＰＶＤＦ膜に転写した。３％スキムミルクで１時間ブロッキングした後，膜を一次抗体としてリン酸化ｐ４４/４２ＭＡＰＫに対する抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，Ｄａｎｖｅｒｓ, ＭＡ, ＵＳＡ）を用い，これとともに４℃にて一晩インキュベートした（１ : ２，０００）。ＴＢＳ-ｔで１０分間×４回の洗浄後，膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ標識２次抗体（Ｂｉｏ-Ｒａｄ, Ｒｉｃｈｍｏｎｄ, ＣＡ, ＵＳＡ）(１ : ２０，０００)と共に室温にて４０分間インキュベートした。可視化を製造業者の指示に従ってアマシャム社製増強化学発光（ＥＣＬ）検出システムを用いて行った。
【０１０６】
図１は，配列番号２（ＲＳＩＶＬＥＰＩＹＷ）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを実施例１と同様にして得て（得られたペプチドを「配列番号２のペプチド」ともよぶ），実施例３におけるｐ４４／４２ＭＡＰＫリン酸化に対するエフリンＢ２，配列番号１のペプチド，配列番号２のペプチド及びそれらの併用剤の結果を示すウェスタンブロッティングの写真である。第１と第２レーンは，コントロールを示し；第３と第４レーンは，３ｎＭのエフリンＢ２で処理後１３分が経過したものを示し；第５と第６レーンは，６ｎＭのエフリンＢ２で処理し，３分後に配列番号１の２００ｎＭのペプチドで処理後さらに１０分が経過したものを示し；第７と第８レーンは，６ｎＭのエフリンＢ２で処理し，３分後に配列番号２の２００ｎＭのペプチドで処理後さらに１０分が経過したものを示す。なお，処理開始から１３分後の全細胞ライセート回収時における第３,第４，第５，第６，第７および第８における最終濃度は，それぞれペプチドが１００ｎＭ，エフリンＢ２が３ｎＭであった。
【０１０７】
また，図１に，一次抗体としてリン酸化・脱リン酸化型を問わずすべてのｐ４４／４２ＭＡＰＫを認識する抗体，または，α−チューブリンを認識する抗体を用いてウェスタンブロッティング解析した写真を示す。
【０１０８】
第１，２レーンと第３，４レーンを比較すると，エフリンＢ２は，血清によるｐ４４／４２ＭＡＰＫリン酸化活性の阻害能を有することがわかる。第１，２レーンと第５，６レーンを比較すると，エフリンＢ２と配列番号１のペプチドを投与する併用剤は，エフリンＢ２単独で投与したときよりもｐ４４／４２ＭＡＰＫリン酸化活性の高い阻害能を有することがわかる。また，第１，２レーンと第７，８レーンを比較すると，エフリンＢ２と配列番号２のペプチドを投与する併用剤は，エフリンＢ２単独で投与したときよりもｐ４４／４２ＭＡＰＫリン酸化活性の高い阻害能を有することがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明のペプチド，剤，補助剤，医薬組成物及び医療用キットは，特に眼内の新生血管に関する疾患の治療又は予防などに有効であるから，医薬産業などにおいて利用されうる。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１は，実施例３におけるｐ４４／４２ＭＡＰＫリン酸化に対するエフリンＢ２，配列番号１のペプチド，配列番号２のペプチド及びそれらの併用剤の結果を示す図面に替わるウェスタンブロッティングの写真である。
【図２】図２は，配列番号５に係るペプチドのアミノ酸配列を示す図であり，配列番号４に示されるアミノ酸の−２８番目から３０８番目までのアミノ酸を示す。図中，四角で囲った部分は配列番号１で示されるペプチド部分である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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