(57)【要約】      （修正有）【課題】診断的な利点または治療的な利点を有する、新規ポリペプチドおよびこれらをコードする核酸分子を提供する。【解決手段】インターフェロン様（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−Ｌｉｋｅ）（ＩＦＮ−Ｌ）ポリペプチドおよびこれをコードする核酸分子。ＩＦＮ−Ｌポリペプチドを産生するための、選択的結合因子、ベクター、宿主細胞、および方法を提供する。さらに、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドに関連する疾患、障害、および状態の、診断、処置、改善、および／または予防のための方法及び薬学的組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号１または配列番号４のいずれかに示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９７６中のＤＮＡインサートのヌクレオチド
配列；
（ｃ）配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの相補体に、中程度または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；および
（ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドに少なくとも約７０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該コードされたポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１、もしくは配列番号４のいずれかに示されるヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９７６中のＤＮＡインサートのヌクレオチド配列、または（ａ）の、対立遺伝子改変体またはスプライス改変体をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号１、もしくは配列番号４のいずれかのヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９７６中のＤＮＡインサート、（ａ）または（ｂ）の領域であって、ここで、該ポリペプチドフラグメントは、配列番号２、もしくは配列番号５のいずれかに示されるコードされたポリペプチドの活性を有するか、または抗原性である、領域；
（ｄ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号１、もしくは配列番号４のいずれかのヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９７６中のＤＮＡインサート、または（ａ）〜（ｃ）いずれかの領域；
（ｅ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｄ）のいずれかの相補体にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｆ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項３】
単離された核酸分子であって、以下；
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該コードされたポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該コードされたポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該コードされたポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該コードされたポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮、およびＮ末端短縮からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該コードされたポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む（ａ）〜（ｅ）のいずれかのヌクレオチド配列；
（ｇ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｆ）のいずれかの相補体にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｈ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項４】
請求項１、請求項２または請求項３のいずれかに記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６】
真核生物細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
原核生物細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項８】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドを産生するためのプロセスであって、該ポリペプチドを発現するために適切な条件下で請求項５に記載の宿主細胞を培養する工程、および必要に応じて、該培養物から該ポリペプチドを単離する工程を包含する、プロセス。
【請求項９】
請求項８に記載のプロセスによって産生される、ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項８に記載のプロセスであって、ここで、前記核酸分子が、ＩＦＮ−ＬポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結された、ネイティブなＩＦＮ−Ｌポリペプチドに対するプロモーターＤＮＡ以外のプロモーターＤＮＡを含む、プロセス。
【請求項１１】
請求項２に記載の単離された核酸分子であって、ここで、同一性パーセントは、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔ、およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムからなる群より選択されるコンピュータープログラムを用いて決定される、単離された核酸分子。
【請求項１２】
化合物がＩＦＮ−Ｌポリペプチド活性またはＩＦＮ−Ｌポリペプチド産生を阻害するか否かを決定するためのプロセスであって、請求項５、請求項６、または請求項７のいずれかに記載の細胞を該化合物に曝露する工程、および該細胞におけるＩＦＮ−Ｌポリペプチド活性またはＩＦＮ−Ｌポリペプチド産生を測定する工程を包含する、プロセス。
【請求項１３】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるアミノ酸配列；および
（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９７６中のＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号３または配列番号６のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、必要に応じてアミノ末端メチオニンをさらに含む、アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２または配列番号５のいずれかのオルソログに対するアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２または配列番号５のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列であって、ここで、該ポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）少なくとも約２５アミノ酸残基を含む配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、ここで、該フラグメントは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有するか、または抗原性である、フラグメント；ならびに
（ｅ）配列番号２、もしくは配列番号５のいずれかに示されるアミノ酸配列、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９７６中のＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列、または（ａ）〜（ｃ）のいずれかの、対立遺伝子改変体またはスプライス改変体のアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、該ポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、該ポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、該ポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、該ポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；ならびに
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮、およびＮ末端短縮からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、該ポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列、からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１、請求項２、または請求項３のいずれかに記載の核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチドであって、ここで、該ポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１４に記載の単離されたポリペプチドであって、ここで、同一性パーセントは、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔ、およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムからなる群より選択されるコンピュータープログラムを用いて決定される、単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１３、請求項１４、または請求項１５のいずれかに記載のポリペプチドに特異的に結合する、選択的結合因子またはそのフラグメント。
【請求項１９】
配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合する、請求項１８に記載の選択的結合因子またはそのフラグメント。
【請求項２０】
抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２１】
ヒト化抗体である、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２２】
ヒト抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２３】
ポリクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２４】
モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２５】
キメラ抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２６】
ＣＤＲ移植抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２７】
抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２８】
可変領域フラグメントである、請求項１８記載の選択的結合因子。
【請求項２９】
ＦａｂフラグメントまたはＦａｂ’フラグメントである、請求項２８に記載の可変領域フラグメント。
【請求項３０】
配列番号２または配列番号５のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異性を有する少なくとも１つの相補性決定領域を含む、選択的結合因子またはそのフラグメント。
【請求項３１】
検出可能標識に結合される、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項３２】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの生物学的活性を拮抗する、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項３３】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチド関連の疾患、状態、または障害を、処置、予防、または改善するための方法であって、有効量の請求項１８に記載の選択的結合因子を患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３４】
配列番号２または配列番号５のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドで動物を免疫することによって産生される、選択的結合因子。
【請求項３５】
請求項１、請求項２、または請求項３のいずれかに記載のポリペプチドを結合し得る選択的結合因子を産生する、ハイブリドーマ。
【請求項３６】
請求項１８に記載の抗ＩＦＮ−Ｌ抗体またはフラグメントを用いて、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの量を検出または定量する方法。
【請求項３７】
請求項１３、請求項１４、または請求項１５のいずれかに記載のポリペプチド、および薬学的に受容可能な処方剤を含む、組成物。
【請求項３８】
前記薬学的に受容可能な処方剤が、キャリア、アジュバント、溶解剤、安定剤、または抗酸化剤である、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記ポリペプチドが、配列番号３または配列番号６のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４０】
請求項１３、請求項１４、または請求項１５のいずれかに記載のポリペプチドの誘導体を含む、ポリペプチド。
【請求項４１】
水溶性ポリマーを用いて共有結合的に改変された、請求項４０に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
請求項４１に記載のポリペプチドであって、ここで、前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、およびポリビニルアルコールからなる群より選択される、ポリペプチド。
【請求項４３】
請求項１、請求項２または請求項３のいずれかに記載の核酸分子および薬学的に受容可能な処方剤を含む、組成物。
【請求項４４】
前記核酸分子が、ウイルスベクター中に含まれる、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
請求項１、請求項２または請求項３のいずれかに記載の核酸分子を含む、ウイルスベクター。
【請求項４６】
異種アミノ酸配列に融合された、請求項１３、請求項１４、または請求項１５のいずれかに記載のポリペプチドを含む、融合ポリペプチド。
【請求項４７】
前記異種アミノ酸配列が、ＩｇＧ定常ドメインまたはそのフラグメントである、請求項４６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４８】
医学的状態を、処置、予防、または改善するための方法であって、請求項１３、請求項１４、もしくは請求項１５のいずれかに記載のポリペプチド、または請求項１、請求項２、もしくは請求項３のいずれかに記載の核酸によってコードされるポリペプチドを患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４９】
処置、予防または改善されている前記医学的状態が、多発性硬化症または免疫調節を要する他の病理である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
被験体において病的状態または病的状態に対する感受性を診断する方法であって、以下：
（ａ）サンプル中の、請求項１３、請求項１４、もしくは請求項１５のいずれかに記載のポリペプチド、または請求項１、請求項２、もしくは請求項３のいずれかに記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドの、発現の存在または発現量を決定する工程；および
（ｂ）該ポリペプチドの発現の存在または発現量に基づいて、病的状態または病的状態に対する感受性を診断する工程、を包含する、方法。
【請求項５１】
デバイスであって、以下：
（ａ）移植に適した膜；および
（ｂ）該膜内にカプセル化された細胞であって、該細胞は、請求項１３、請求項１４、もしくは請求項１５のいずれかに記載のタンパク質を分泌する、細胞；
を備え、
該膜は、該タンパク質に対して透過性であり、そして該細胞に有害な物質に対して不透過性である、デバイス。
【請求項５２】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドに結合する化合物を同定する方法であって、以下：
（ａ）請求項１３、請求項１４、もしくは請求項１５のいずれかに記載のポリペプチドを、化合物と接触させる工程；および
（ｂ）該化合物に対する該ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの結合の程度を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５３】
前記化合物に結合した場合に、前記ポリペプチドの活性を決定する工程をさらに包含する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
動物においてポリペプチドのレベルを調節する方法であって、請求項１、請求項２、または請求項３のいずれかに記載の核酸分子を該動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項５５】
請求項１、請求項２、または請求項３のいずれかに記載の核酸分子を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項５６】
化合物がＩＦＮ−Ｌポリペプチド活性またはＩＦＮ−Ｌポリペプチド産生を阻害するか否かを決定するためのプロセスであって、請求項５４に記載のトランスジェニック哺乳動物を該化合物に曝露する工程、および該哺乳動物におけるＩＦＮ−Ｌポリペプチド活性またはＩＦＮ−Ｌポリペプチド産生を測定する工程を包含する、プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターフェロン様（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−Ｌｉｋｅ）（ＩＦＮ−Ｌ）ポリペプチドおよびこれをコードする核酸分子に関する。本発明はまた、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドを産生するための、選択的結合因子、ベクター、宿主細胞および方法に関する。本発明はさらに、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドと関連する疾患、障害、および状態の、診断、処置、改善、および／または予防のための薬学的組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸分子の同定、クローニング、発現、および操作における技術進歩ならびにヒトゲノムの解読は、新規治療因子の発見を大きく加速した。現在、高速核酸配列決定技術は、前例のない速度で配列情報を作製し得、そしてコンピュータ分析と結合されて、ゲノムの一部および全体への重複配列の集合ならびにポリペプチドコード領域の同定を可能にする。既知アミノ酸配列のデータベース編集物に対する推定アミノ酸配列の比較によって、以前に同定された配列および／または構造の目印に対して相同性の程度を決定することが可能になる。核酸分子のポリペプチドコード領域のクローニングおよび発現は、構造分析および機能分析のためのポリペプチド産物を提供する。核酸分子およびコードされるポリペプチドの操作は、治療剤としての使用に関して生成物に対して有利な特性を与え得る。
【０００３】
過去１０年間にわたるゲノム研究における大いなる技術進歩にも関わらず、ヒトゲノムに基づく新規治療剤の開発に対する可能性は、未だ広く理解されていない。潜在的に有利なポリペプチド治療剤をコードする多くの遺伝子またはこれらがコードするポリペプチド（これらは、治療分子に対して「標的」としてはたらき得る）は、未だ同定されていない。
【０００４】
従って、診断的な利点または治療的な利点を有する、新規ポリペプチドおよびこれらをコードする核酸分子を同定することが、本発明の目的である。
【発明の開示】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、新規ＩＦＮ−Ｌの核酸分子およびコードされるポリペプチドに関する。
【０００６】
本発明は、単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号１または配列番号４のいずれかに示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９７６中のＤＮＡインサートのヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの相補体に、中程度または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；および
（ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する。
【０００７】
本発明はまた、単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドに少なくとも約７０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、上記コードされたポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１もしくは配列番号４のいずれかに示されるヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９７６中のＤＮＡインサートのヌクレオチド配列、または（ａ）の、対立遺伝子改変体またはスプライス改変体をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号１もしくは配列番号４のいずれかのヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９７６中のＤＮＡインサート、（ａ）または（ｂ）の領域であって、ここで、上記ポリペプチドフラグメントは、配列番号２もしくは配列番号５のいずれかに示されるコードされたポリペプチドの活性を有するか、または抗原性である、領域；
（ｄ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号１、もしくは配列番号４のいずれかのヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９７６中のＤＮＡインサート、または（ａ）〜（ｃ）いずれかの領域；
（ｅ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｄ）のいずれかの相補体にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｆ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する。
【０００８】
本発明はさらに、単離された核酸分子であって、以下；
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、上記コードされたポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、上記コードされたポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、上記コードされたポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、上記コードされたポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮、およびＮ末端短縮からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、上記コードされたポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む（ａ）〜（ｅ）のいずれかのヌクレオチド配列；
（ｇ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｆ）のいずれかの相補体にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｈ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する。
【０００９】
本発明は、単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるアミノ酸配列；および
（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９７６中のＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドを提供する。
【００１０】
本発明はまた、単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号３または配列番号６のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、必要に応じてさらにアミノ末端メチオニンを含む、アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２または配列番号５のいずれかのオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）に対するアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２または配列番号５のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列であって、ここで、上記ポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）少なくとも約２５アミノ酸残基を含む配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、ここで、上記フラグメントは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有するか、または抗原性である、フラグメント；ならびに
（ｅ）配列番号２、もしくは配列番号５のいずれかに示されるアミノ酸配列、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９７６中のＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列、（ａ）、または（ｂ）の、対立遺伝子改変体またはスプライス改変体のアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドを提供する。
【００１１】
本発明はさらに、単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、上記ポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、上記ポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、上記ポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、上記ポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；ならびに
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮、およびＮ末端短縮からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、上記ポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドを提供する。
【００１２】
ＩＦＮ−Ｌアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドがまた、提供される。
【００１３】
本発明はまた、本明細書中に示されるような単離された核酸分子を含む発現ベクター、本明細書中に示されるような組換え核酸分子を含む組換え宿主細胞、およびＩＦＮ−Ｌポリペプチドを産生する方法を提供し、この方法は、この宿主細胞を培養する工程、必要に応じてそのように産生されたポリペプチドを単離する工程を包含する。
【００１４】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドをコードする核酸分子を含むトランスジェニック非ヒト動物がまた、本発明に含まれる。ＩＦＮ−Ｌ核酸分子は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの発現およびＩＦＮ−Ｌポリペプチドの増加したレベル（これは、増加した循環レベルを含み得る）を可能にする様式で、動物中に導入される。あるいは、ＩＦＮ−Ｌ核酸分子は、内因性ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの発現を阻害する様式で動物に導入される（すなわち、ＩＦＮ−Ｌポリペプチド遺伝子ノックアウトを保有するトランスジェニック動物を作製する）。トランスジェニック非ヒト動物は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはげっ歯類（例えば、ラットまたはマウス）である。
【００１５】
本発明のＩＦＮ−Ｌポリペプチドの誘導体がまた、提供される。
【００１６】
本発明のＩＦＮ−Ｌポリペプチドに特異的に結合し得る選択的結合因子（例えば、抗体およびペプチド）が、さらに提供される。このような抗体およびペプチドは、アゴニストのものであってもアンタゴニストのものであってもよい。
【００１７】
本発明のヌクレオチド、ポリペプチド、もしくは選択的結合因子ならびに１つ以上の薬学的に受容可能な処方剤を含む薬学的組成物がまた、本発明によって包含される。この薬学的組成物は、治療的に有効な量の本発明のヌクレオチドまたはポリペプチドを提供するために使用される。本発明はまた、このポリペプチド、核酸分子、および選択的結合因子を使用する方法に関する。
【００１８】
本発明のＩＦＮ−ＬポリペプチドおよびＩＦＮ−Ｌ核酸分子は、疾患および障害（本明細書中に列挙されるものを含む）を処置、予防、改善、および／または検出するために使用され得る。
【００１９】
本発明はまた、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドに結合する試験分子を同定するために、試験分子をアッセイする方法を提供する。この方法は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドを試験分子と接触させて、この試験分子のこのポリペプチドに対する結合の程度を決定する工程を包含する。この方法はさらに、このような試験分子が、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを決定する工程を包含する。本発明はさらに、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの発現またはＩＦＮ−Ｌポリペプチドの活性に対する分子の影響を試験する方法を提供する。
【００２０】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの発現を調整する方法およびＩＦＮ−Ｌポリペプチドのレベルを調節する（すなわち、増加または減少する）方法がまた、本発明によって含まれる。１つの方法は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドをコードする核酸分子を動物に投与する工程を包含する。別の方法において、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの発現を調整または調節するエレメントを含む核酸分子が、投与され得る。これらの方法の例としては、本明細書中にさらに記載されるように、遺伝子治療、細胞治療、およびアンチセンス治療が挙げられる。
【００２１】
本発明の別の局面において、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドは、そのレセプター（「ＩＦＮ−Ｌポリペプチドレセプター」）を同定するために使用され得る。種々の形態の「発現クローニング」は、タンパク質リガンドに対するレセプターをクローニングするために広範囲に使用されている。例えば、ＳｉｍｏｎｓｅｎおよびＬｏｄｉｓｈ、１９９４、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１５：４３７−４１ならびにＴａｒｔａｇｌｉａら、１９９５、Ｃｅｌｌ  ８３：１２６３−７１を参照のこと。ＩＦＮ−Ｌポリペプチドレセプターの単離は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドシグナル伝達経路の新規アゴニストおよびアンタゴニストの同定または開発に有用である。このようなアゴニストおよびアンタゴニストとしては、可溶性ＩＦＮ−Ｌポリペプチドレセプター、抗ＩＦＮ−Ｌポリペプチドレセ
プター−選択的結合因子（例えば、抗体またはその誘導体）、低分子、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられ、これらのうちのいずれかは、１つ以上の疾患または障害（本明細書中に開示されるものを含む）の処置に有用であり得る。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で使用される節の表題は、組織的な目的のみのためであり、そして記載される内容を限定するようには解釈されるべきではない。本願において列挙される全ての参考文献は、明確に本明細書中に参考として援用される。
【００２３】
（定義）
用語「ＩＦＮ−Ｌ遺伝子」または「ＩＦＮ−Ｌ核酸分子」あるいは「ＩＦＮ−Ｌポリヌクレオチド」とは、配列番号１または配列番号４のいずれかに示されるヌクレオチド配列、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９７６におけるＤＮＡインサートのヌクレオチド配列、および本明細書中で定義される核酸分子を含むか、またはこれらからなる核酸分子をいう。
【００２４】
用語「ＩＦＮ−Ｌポリペプチド対立遺伝子改変体」とは、生物体または生物体の集団の染色体の所定の遺伝子座を占める遺伝子の、天然に存在する可能ないくつかの交替形態のうちの１つをいう。
【００２５】
用語「ＩＦＮ−Ｌポリペプチドスプライス改変体」とは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるＩＦＮ−Ｌポリペプチドアミノ酸配列のＲＮＡ転写物中のイントロン配列の選択的プロセシングによって生成される、核酸分子（通常はＲＮＡ）をいう。
【００２６】
用語「単離された核酸分子」とは、（１）総核酸が供給源細胞から単離される場合に、これが天然で一緒に見出されるタンパク質、脂質、炭水化物、または他の物質のうち少なくとも約５０パーセントから分離された本発明の核酸分子、（２）「単離された核酸分子」が天然で連結しているポリヌクレオチドの全てまたは一部に連結していない本発明の核酸分子、（３）天然では連結しないポリヌクレオチドに作動可能に連結した本発明の核酸分子、または（４）より大きなポリヌクレオチド配列の一部として天然には存在しない、本発明の核酸分子をいう。好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、任意の他の混入核酸分子、または天然の環境において見出される他の混入物（これらは、ポリペプチド産生における使用、または治療的使用、診断的使用、予防的使用、または研究的使用に干渉する）を実質的に含まない。
【００２７】
用語「核酸配列」または「核酸分子」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列をいう。この用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログのいずれかから形成される分子を含み、例えば、以下であるがこれらに限定されない：４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニル−シトシン、プソイドイソシトシン（ｐｓｅｕｄｏｉｓｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソ−ペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−エチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ−メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボニル−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリン。
【００２８】
用語「ベクター」は、宿主細胞にコード情報を移すために使用される任意の分子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）をいうように使用される。
【００２９】
用語「発現ベクター」は、宿主細胞の形質転換に適切であり、そして挿入された異種核酸配列の発現を、指向および／または制御する核酸配列を含むベクターをいう。発現としては、転写、翻訳、およびＲＮＡスプライシング（イントロンが存在する場合）のようなプロセスが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３０】
用語「作動可能に連結された」を用いて、本明細書中では、隣接配列の配置をいい、ここで、このように記載される隣接配列は、その通常の機能を行うように構成または構築される。従って、コード配列に作動可能に連結した隣接配列は、このコード配列の複製、転写および／または翻訳を行うことが可能であり得る。
例えば、コード配列は、このプロモーターがコード配列の転写を指向し得る場合に、プロモーターに作動可能に連結される。隣接配列は、これが正確に機能する限り、コード配列と連続する必要はない。したがって、例えば、介在性非翻訳の、転写された配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてこのプロモーター配列は、依然としてこのコード配列に「作動可能に連結」されているとみなされ得る。
【００３１】
用語「宿主細胞」を用いて、核酸配列で形質転換されたか、または形質転換され得、次いで目的の選択された遺伝子を発現し得る細胞をいう。この用語には、選択された遺伝子が存在する限り、子孫が形態学または遺伝子構造において本来の親と同一であろうとなかろうと、親細胞の子孫を含む。
【００３２】
用語「ＩＦＮ−Ｌポリペプチド」とは、配列番号２または配列番号５のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド、および関連するポリペプチドをいう。関連ポリペプチドとしては、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドフラグメント、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドオルソログ、ＩＦＮ−Ｌポリペプチド改変体、およびＩＦＮ−Ｌポリペプチド誘導体が挙げられ、これらは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの少なくとも１つの活性を保有する。ＩＦＮ−Ｌポリペプチドは、本明細書中で定義される成熟ポリペプチドであり得、そしてこれらが調製される方法に依存して、アミノ末端メチオニン残基を有しても有さなくてもよい。
【００３３】
用語「ＩＦＮ−Ｌポリペプチドフラグメント」とは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの、アミノ末端（リーダー配列を有するかまたは有さない）での短縮化および／またはカルボキシ末端での短縮化を含むポリペプチドをいう。用語「ＩＦＮ−Ｌポリペプチドフラグメント」はまた、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドオルソログ、ＩＦＮ−Ｌポリペプチド誘導体、またはＩＦＮ−Ｌポリペプチド改変体のアミノ末端および／またはカルボキシ末端短縮化、あるいはＩＦＮ−Ｌポリペプチド対立遺伝子改変体またはＩＦＮ−Ｌポリペプチドスプライス改変体によってコードされるポリペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシ末端短縮化をいう。ＩＦＮ−Ｌポリペプチドフラグメントは、選択的ＲＮＡスプライシング、またはインビボプロテアーゼ活性から生じ得る。ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの膜結合形態もまた、本発明によって意図される。好ましい実施形態において、短縮化および／または欠失は、約１０アミノ酸、または約２０アミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１００より多くのアミノ酸を含む。このように生成されるポリペプチドフラグメントは、約２５個連続したアミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１５０アミノ酸、または約２００アミノ酸を含む。このようなＩＦＮ−Ｌポリペプチドフラグメントは、必要に応じて、アミノ末端メチオニン残基を含み得る。このようなフラグメントは、例えば、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドに対する抗体を生成するために使用
され得ることが理解される。
【００３４】
用語「ＩＦＮ−Ｌポリペプチド」とは、配列番号２または配列番号５のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド、および関連するポリペプチドをいう。関連ポリペプチドとしては、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドフラグメント、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドオルソログ、ＩＦＮ−Ｌポリペプチド改変体、およびＩＦＮ−Ｌポリペプチド誘導体が挙げられ、これらは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの少なくとも１つの活性を保有する。ＩＦＮ−Ｌポリペプチドは、本明細書中で定義される成熟ポリペプチドであり得、そしてこれらが調製される方法に依存して、アミノ末端メチオニン残基を有しても有さなくてもよい。
【００３５】
用語「ＩＦＮ−Ｌポリペプチドフラグメント」とは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの、アミノ末端（リーダー配列を有するかまたは有さない）での短縮化および／またはカルボキシ末端での短縮化を含むポリペプチドをいう。用語「ＩＦＮ−Ｌポリペプチドフラグメント」はまた、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドオルソログ、ＩＦＮ−Ｌポリペプチド誘導体、またはＩＦＮ−Ｌポリペプチド改変体のアミノ末端および／またはカルボキシ末端短縮化、あるいはＩＦＮ−Ｌポリペプチド対立遺伝子改変体またはＩＦＮ−Ｌポリペプチドスプライス改変体によってコードされるポリペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシ末端短縮化をいう。ＩＦＮ−Ｌポリペプチドフラグメントは、選択的ＲＮＡスプライシング、またはインビボプロテアーゼ活性から生じ得る。ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの膜結合形態もまた、本発明によって意図される。好ましい実施形態において、短縮化および／または欠失は、約１０アミノ酸、または約２０アミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１００より多くのアミノ酸を含む。このように生成されるポリペプチドフラグメントは、約２５個連続したアミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１５０アミノ酸、または約２００アミノ酸を含む。このようなＩＦＮ−Ｌポリペプチドフラグメントは、必要に応じて、アミノ末端メチオニン残基を含み得る。このようなフラグメントは、例えば、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドに対する抗体を生成するために使用
され得ることが理解される。
【００３６】
用語「ＩＦＮ−Ｌポリペプチドオルソログ」は、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるＩＦＮ−Ｌポリペプチドアミノ酸配列に対応する、別の種由来のポリペプチドをいう。例えば、マウスおよびヒトのＩＦＮ−Ｌポリペプチドは、互いにオルソログであるとみなされる。
【００３７】
用語「ＩＦＮ−Ｌポリペプチド改変体」は、配列番号２または配列番号５（リーダー配列を有するかまたは有さない）のいずれかに示されるＩＦＮ−Ｌポリペプチドアミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸配列の置換、欠失（例えば、内部欠失および／またはＩＦＮ−Ｌポリペプチドフラグメント）、および／または付加（例えば、内部付加および／またはＩＦＮ−Ｌ融合ポリペプチド）を有するアミノ酸配列を含むＩＦＮ−Ｌポリペプチドをいう。改変体は、天然に存在する（例えば、ＩＦＮ−Ｌポリペプチド対立遺伝子改変体、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドオルソログ、およびＩＦＮ−Ｌポリペプチドスプライス改変体）か、または、人工的に構築され得る。このようなＩＦＮ−Ｌポリペプチド改変体は、配列番号１または配列番号４のいずれかに示されるＤＮＡ配列から変化するＤＮＡ配列を有する、対応する核酸分子から調製され得る。好ましい実施形態において、この改変体は、１〜３、または１〜５、または１〜１０、または１〜１５、または１〜２０、または１〜２５、または１〜５０、または１〜７５、または１〜１００、または１００より多くのアミノ酸の置換、挿入、付加、および／または欠失を有し、ここで、この置換は、保存的、または非保存的、あるいはその任意の組み合わせであり得る。
【００３８】
用語「ＩＦＮ−Ｌポリペプチド誘導体」は、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチド、本明細書中で定義されるＩＦＮ−Ｌポリペプチドフラグメント、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドオルソログ、またはＩＦＮ−Ｌポリペプチド改変体をいい、これらは、化学的に改変されている。用語「ＩＦＮ−Ｌポリペプチド誘導体」はまた、本明細書中で定義されるＩＦＮ−Ｌポリペプチド対立遺伝子改変体またはＩＦＮ−Ｌポリペプチドスプライス改変体によってコードされるポリペプチドをいい、これは化学的に改変されている。
【００３９】
用語「成熟ＩＦＮ−Ｌポリペプチド」は、リーダー配列を欠失したＩＦＮ−Ｌポリペプチドをいう。成熟ＩＦＮ−Ｌポリペプチドはまた、他の改変（例えば、アミノ末端（リーダー配列を有するかまたは有さない）および／またはカルボキシ末端のタンパク質分解性プロセシング、より大きな前駆体からのより小さなポリペプチドの切断、Ｎ連結および／またはＯ連結グリコシル化など）を含み得る。
【００４０】
用語「ＩＦＮ−Ｌ融合ポリペプチド」は、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチド、本明細書中で定義されるＩＦＮ−Ｌポリペプチドフラグメント、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドオルソログ、ＩＦＮ−Ｌポリペプチド改変体、またはＩＦＮ−Ｌ誘導体のアミノ末端またはカルボキシ末端での、１つ以上のアミノ酸の融合（例えば、異種タンパク質またはペプチド）をいう。用語「ＩＦＮ−Ｌ融合ポリペプチド」はまた、本明細書中で定義されるＩＦＮ−Ｌポリペプチド対立遺伝子改変体またはＩＦＮ−Ｌポリペプチドスプライス改変体によってコードされるポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端での、１つ以上のアミノ酸の融合をいう。
【００４１】
用語「生物学的に活性なＩＦＮ−Ｌポリペプチド」とは、配列番号２または配列番号５のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドの、少なくとも１つの活性特徴を有するＩＦＮ−Ｌポリペプチドをいう。さらに、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドは、免疫原としての活性を有し得る；すなわち、このＩＦＮ−Ｌポリペプチドは、抗体が惹起され得る少なくとも１つのエピトープを含む。
【００４２】
用語「単離されたポリペプチド」とは、（１）供給源細胞から単離される場合に、天然で一緒に見出されるポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または他の物質の少なくとも約５０％から単離された本発明のポリペプチド、（２）「単離されたポリペプチド」が天然で連結するポリペプチドの全てまたは一部に連結しない（共有結合的または非共有結合的相互作用によって）、本発明のポリペプチド、（３）天然には連結しないポリペプチドに作動可能に連結（共有結合的または非共有結合的相互作用によって）する、本発明のポリペプチド、または（４）天然には存在しない本発明のポリペプチドをいう。好ましくは、この単離されたポリペプチドは、任意の他の混入ポリペプチドまたは天然の環境において見出される他の混入物（これは、その治療的使用、診断的使用、予防的使用、または研究
的使用に干渉する）を実質的に含まない。
【００４３】
用語「同一性」とは、当該分野で公知のように、配列の比較によって決定される、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の配列間の関係をいう。当該分野において、「同一性」はまた、場合に応じて、２つ以上のヌクレオチドまたは２つ以上のアミノ酸配列間の一致によって決定されるように、核酸分子またはポリペプチド間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」は、２つ以上の配列のうち小さなものと、特定の数理的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）により取り扱われたギャップ整列（存在する場合）との間の一致の同一パーセントを評価する。
【００４４】
用語「類似性」は、関連した概念であるが、「同一性」とは対照的に、「類似性」は、同一的一致および保存的置換の一致の両方を含む関連性の基準をいう。２つのポリペプチド配列が、例えば１０／２０個同一のアミノ酸を有し、そして残りが全て非保存的置換である場合、パーセント同一性および類似性は、どちらも５０％である。同じ例において、保存的置換であるさらに５つの位置が存在する場合、パーセント同一性は５０％のままであるが、パーセント類似性は７５％（１５／２０）である。したがって、保存的置換が存在する場合、２つのポリペプチド間のパーセント類似性は、これらの２つのポリペプチド間のパーセント同一性よりも高い。
【００４５】
用語「天然に存在する」または「ネイティブの」は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などのような生物学的物質と関連して使用される場合、天然において見出され、そしてヒトによって操作されていない物質をいう。同様に、「天然に存在しない」または「ネイティブではない」は、本明細書中で使用される場合、天然で見出されないか、またはヒトによって構造的に改変もしくは合成された物質をいう。
【００４６】
用語「有効量」および「治療有効量」は、各々、本明細書中に示されるＩＦＮ−Ｌポリペプチドの１つ以上の生物学的活性の観察可能なレベルを支持するために使用されるＩＦＮ−ＬポリペプチドまたはＩＦＮ−Ｌ核酸分子の量をいう。
【００４７】
用語「薬学的に受容可能なキャリア」または「生理学的に受容可能なキャリア」は、本明細書中で使用される場合、薬学的組成物としてのＩＦＮ−Ｌポリペプチド、ＩＦＮ−Ｌ核酸分子、またはＩＦＮ−Ｌ選択的結合因子の送達の達成または増強に適切な１つ以上の処方物質をいう。
【００４８】
用語「抗原」とは、選択的結合因子（例えば、抗体）により結合され得、そしてさらに動物において使用されて、その抗原のエピトープに結合し得る抗体を産生じ得る分子または分子の一部をいう。抗原は、１つ以上のエピトープを有し得る。
【００４９】
用語「選択的結合因子」とは、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドに特異性を有する分子（単数または複数）をいう。本明細書中で使用される場合、用語「特異的」および「特異性」とは、選択的結合因子の、ヒトＩＦＮ−Ｌポリペプチドに結合し、かつ非ＩＦＮ−Ｌポリペプチドに結合しない能力をいう。しかし、選択的結合因子がまた、配列番号２または配列番号５のいずれかに記載されるようなポリペプチドのオルソログ（すなわち、その種間変形（例えば、マウスＩＦＮ−ＬポリペプチドおよびラットＩＦＮ−Ｌポリペプチド））に結合し得ることが、理解される。
【００５０】
用語「形質導入」とは、通常はファージによる１つの細菌から別の細菌への遺伝子の伝達をいう。「形質導入」はまた、レトロウイルスによる真核生物細胞配列の獲得および伝達をいう。
【００５１】
用語「トランスフェクション」は、細胞による異種または外因性ＤＮＡの取り込みをいうために使用され、そして細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入された場合には「トランスフェクトされ」ている。多数のトランスフェクション技術は、当該分野で周知であり、そして本明細書中に開示される。例えば、Ｇｒａｈａｍら，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１９８９）；Ｄａｖｉｓら，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８６）；ａｎｄ  Ｃｈｕら，１９８１，Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照のこと。このような技術を使用して、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入し得る。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」とは、細胞の遺伝的特徴における変化をいい、そして細胞は、新しいＤＮＡを含有するように改変された場合に形質転換されている。例えば、細胞は、それがそのネイティブな状態から遺伝的に改変される場合に形質転換される。トランスフェクションまたは形質導入に続いて、ＤＮＡの形質転換は、物理的に細胞の染色体に組み込むことにより細胞のＤＮＡと組換わり得るか、複製されることなしにエピソームエレメントとして一時的に維持され得るか、またはプラスミドとして独立的に複製し得る。ＤＮＡが細胞分裂と共に複製される場合に、細胞は、安定に形質転換されたとみなされる。
【００５３】
（核酸分子および／またはポリペプチドの関連性）
関連した核酸分子が、配列番号１または配列番号４のいずれかの核酸分子の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体を包含すること、および上記のヌクレオチド配列のいずれかに相補的である配列を包含することが理解される。関連した核酸分子はまた、配列番号２または配列番号５のいずれかにおけるポリペプチドと比較して１以上のアミノ酸残基の置換、改変、付加および／または欠失を含むかまたは本質的にこれからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する。このような関連したＩＦＮ−Ｌポリペプチドは、例えば、１以上のＮ結合型もしくはＯ結合型のグリコシル化部位の付加および／もしくは欠失、または１以上のシステイン残基の付加および／もしくは欠失を含み得る。
【００５４】
関連した核酸分子はまた、配列番号２または配列番号５のいずれかのＩＦＮ−Ｌポリペプチドの少なくとも約２５個連続したアミノ酸、または少なくとも約５０個のアミノ酸、または少なくとも約７５個のアミノ酸、または少なくとも約１００個のアミノ酸、または少なくとも約１５０個のアミノ酸、または少なくとも約２００個のアミノ酸、または２００個より多くのアミノ酸残基のポリペプチドをコードする、ＩＦＮ−Ｌ核酸分子のフラグメントを包含する。
【００５５】
さらに、関連したＩＦＮ−Ｌ核酸分子はまた、本明細書中で定義したとおりの中程度または高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１、もしくは配列番号４のいずれかのＩＦＮ−Ｌ核酸分子またはポリペプチドをコードする分子の十分に相補的な配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む分子を包含し、このポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号５、または本明細書中に定義したとおりの核酸フラグメント、または本明細書中に定義したとおりのポリペプチドをコードする核酸フラグメントのいずれかに示されるアミノ酸配列を含む。ハイブリダイゼーションプローブは、本明細書中に提供されるＩＦＮ−Ｌ配列を用いてｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリーまたは合成ＤＮＡライブラリーを関連した配列についてスクリーニングして調製され得る。ＩＦＮ−ＬポリペプチドのＤＮＡ配列および／またはアミノ酸配列のうちの、既知配列に対して顕著な同一性を示す領域は、本明細書中に記載されるとおりの配列アラインメントアルゴリズムを用いて容易に決定され、そしてこれらの領域を用いて、スクリーニングのためのプローブを設計し得る。
【００５６】
用語「高度にストリンジェントな条件」とは、配列が非常に相補的であるＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを許容し、かつ顕著に不一致のＤＮＡのハイブリダイゼーションを排除するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度および変性剤（例えば、ホルムアミド）の濃度によって主に決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての「高度にストリンジェントな条件」の例は、６５〜６８℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムまたは４２℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび５０％ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）；Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ第４章（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）を参照のこと。
【００５７】
よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミドまたは他の変性剤）もまた用いられ得るが、ハイブリダイゼーションの速度が影響される。他の薬剤は、非特異的および／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少させる目的のために、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液中に含まれ得る。例は、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ＮａＤｏｄＳＯ４、（ＳＤＳ）、ｆｉｃｏｌｌ、デンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた用いられ得る。これらの添加剤の濃度および種類は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施される；しかし、代表的なイオン強度の条件では、ハイブリダイゼーションの速度は、ｐＨからほぼ独立する。Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ第４章（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）を参照のこと。
【００５８】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基組成、長さおよび塩基対の不一致程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、これらの変動要因を適応させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にするために当業者によって調整され得る。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の方程式によって評価され得る：
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中でのナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中での（グアニン＋シトシン）塩基の百分率である。不完全に一致したハイブリッドについては、融解温度は、１％の不一致毎に約１℃下げ
られる。
【００５９】
用語「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が形成され得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、５０〜６５℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムまたは３７〜５０℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび２０％ホルムアミドである。例示として、０．０１５Ｍナトリウムイオン中での５０℃という「中程度にストリンジェントな条件」は、約２１％の不一致を可能にする。
【００６０】
「高度にストリンジェントな条件」と「中程度にストリンジェントな条件」との間に絶対的な区別が存在しないことが当業者によって認識される。例えば、０．０１５Ｍナトリウムイオン（ホルムアミドなし）では、完全に一致した長さのＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃で（同じイオン強度で）の洗浄を用いると、このことは、約６％の不一致を可能にする。より遠く関連した配列を捕獲するために、当業者は、単純に、温度を低くし得るかまたはイオン強度を高くし得る。
【００６１】
約２０ｎｔまでのオリゴヌクレオチドプローブについての１Ｍ  ＮａＣｌ＊中での融解温度の良好な評価は、以下によって与えられる：
Ｔｍ＝Ａ−Ｔ塩基対あたり２℃  ＋  Ｇ−Ｃ塩基対あたり４℃＊６×塩クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのナトリウムイオン濃度は、１Ｍである。Ｓｕｇｇｓら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ６８３（ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ編，１９８１）を参照のこと。
【００６２】
オリゴヌクレオチドについての高度ストリンジェンシー洗浄条件は通常、６×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中でのそのオリゴヌクレオチドのＴｍよりも０℃〜５℃低い温度においてである。
【００６３】
別の実施形態では、関連した核酸分子は、配列番号１もしくは配列番号４のいずれかに示されるとおりのヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０パーセント同一であるヌクレオチド配列を含むかもしくはこれからなるか、または配列番号２もしくは配列番号５のいずれかに示すとおりのポリペプチドに対して少なくとも約７０パーセント同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかもしくは本質的にこれからなる。好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１もしくは配列番号４のいずれかに示されるとおりのヌクレオチド配列に対して約７５パーセント、もしくは約８０パーセント、もしくは約８５パーセント、もしくは約９０パーセント、もしくは約９５、９６、９７、９８、もしくは９９パーセント同一であるか、またはヌクレオチド配列は、配列番号２、もしくは配列番号５のいずれかに示されるとおりのポリペプチド配列に対して約７５パーセント、もしくは約８０パーセント、もしくは約８５パーセント、もしくは約９０パーセント、もしくは約９５、９６、９７、９８、もしくは９９パーセント同一であるポリペプチドをコードする。関連した核酸分子は、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの少なくとも１つの活性を保有するポリペプチドをコードする。
【００６４】
核酸配列における相違は、配列番号２または配列番号５のいずれかのアミノ酸配列と比較して、アミノ酸配列の保存的および／または非保存的改変をもたらし得る。
【００６５】
配列番号２または配列番号５のいずれかのアミノ酸配列に対する保存的改変（およびコードするヌクレオチドに対する、対応する改変）は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの機能的特徴および化学的特徴と類似の機能的特徴および化学的特徴を有するポリペプチドを生じる。対照的に、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの機能的特徴および／または化学的特徴における実質的な改変は、以下を維持することに対するその影響が顕著に異なる、配列番号２または配列番号５のいずれかのアミノ酸配列における置換を選択することによって達成され得る：（ａ）例えば、シートもしくはヘリックスコンホメーションのような、置換領域における分子骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ。
【００６６】
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置でのアミノ酸残基の極性にも電荷にもほとんどまたは全く影響がないような、標準的残基によるネイティブなアミノ酸残基の置換を含み得る。さらに、ポリペプチド中の任意のネイティブな残基はまた、「アラニンスキャニング変異誘発」について以前に記載されたように、アラニンによって置換され得る。
【００６７】
保存的アミノ酸置換はまた、生物学的系における合成によるよりむしろ、化学的なペプチド合成によって代表的に組み込まれる、天然には存在しないアミノ酸残基を含む。これらとしては、ペプチド模倣物、およびアミノ酸部分の他の逆転形態または反転形態が挙げられる。
【００６８】
天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて、複数のクラスに分割され得る：
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００６９】
例えば、非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーの、別のクラス由来のメンバーに対する交換を包含し得る。このような置換された残基は、非ヒトＩＦＮ−Ｌポリペプチドと相同なヒトＩＦＮ−Ｌポリペプチドの領域またはこの分子の非相同領域に導入され得る。
【００７０】
このような変化を行う際に、アミノ酸のヒドロパシー指数（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）が考慮され得る。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて、ヒドロパシー指数を割り当てられている。ヒドロパシー指数は、以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【００７１】
タンパク質に対する相互作用的な生物学的機能を確認する際の、ヒドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当該分野において一般的に理解されている（Ｋｙｔｅら、１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−３１）。特定のアミノ酸が類似のヒドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸の代わりに使用され得、そして依然として類似の生物学的活性を維持し得ることが、公知である。ヒドロパシー指数に基づいて変化を起こす際に、ヒドロパシー指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、そして±０．５以内であるものが、なおより特に好ましい。
【００７２】
類似のアミノ酸の置換が親水性に基づいて効果的になされ得る（特に、これによって作製された生物学的機能的に等価なタンパク質またはペプチドが、この場合においてと同様に、免疫学的実施形態における使用に関して考慮される場合）こともまた、当該分野において理解されている。タンパク質の最も大きな局所的平均親水性は、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配される場合に、その免疫原性および抗原性、すなわち、そのタンパク質の生物学的特性に相関する。
【００７３】
以下の親水性の値が、これらのアミノ酸残基に割り当てられた：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。類似の親水性の値に基づいて変化を行う際に、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、そして±０．５以内であるものが、なおより特に好ましい。一次アミノ酸配列から、エピトープをまた、親水性に基づいて同定し得る。これらの領域はまた、「エピトープコア領域」と呼ばれる。
【００７４】
所望のアミノ酸置換（保存的であれ非保存的であれ）は、当業者によって、このような置換が所望される時点で決定され得る。例えば、アミノ酸置換を使用して、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの重要な残基を同定し得るか、または本明細書中に記載されるＩＦＮ−Ｌポリペプチドの親和性を増加もしくは減少させ得る。例示的なアミノ酸置換は、表Ｉに記載される。
【００７５】
【表１】
2007014331.tif 000002
【００７６】
当業者は、周知技術を用いて配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの適切な改変体を決定し得る。活性を崩壊させずに変更され得るその分子の適切な領域を決定するために、当業者は、活性に関して重要であると考えらない領域を標的化し得る。例えば、同じ種由来または他の種由来の、類似した活性を有する類似したポリペプチドが既知の場合、当業者は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列をそのような類似したポリペプチドと比較し得る。そのような比較を用いて、当業者は、類似したポリペプチドの間で保存されているその分子の残基および部分を同定し得る。そのような類似したポリペプチドに対して保存されていないＩＦＮ−Ｌポリペプチドの領域における変化は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの生物学的活性および／または構造に逆の影響をおそらくほとんど与えないことが理解される。当業者はまた、たとえ比較的保存された領域においても、活性を維持しながら天然に存在する残基を化学的に類似したアミノ酸で代用し得る（保存的アミノ酸残基置換）ことを理解する。従って、生物学的活性または構造に対して重要であり得る領域でさえ、生物学的活性を崩壊させることなく、またはポリペプチド構造に逆の影響を与えることなく、保存的アミノ酸置換に供され得る。
【００７７】
さらに、活性または構造に重要である類似したポリペプチドにおける残基を同定する、構造−機能研究を当業者は、再検討し得る。そのような比較を考慮して、当業者は、類似したポリペプチドにおいて活性もしくは構造に重要であるアミノ酸残基に対応する、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドにおけるアミノ酸残基の重要性を予測し得る。当業者は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドのそのような予測された重要なアミノ酸残基に関して、化学的に類似したアミノ酸置換を選択し得る。
【００７８】
当業者はまた、類似したポリペプチドにおける三次元構造に関連して、三次元構造およびアミノ酸配列を分析し得る。そのような情報を考慮して、当業者は、三次元構造についてＩＦＮ−Ｌポリペプチドのアミノ酸残基のアラインメントを推測し得る。当業者は、タンパク質の表面上であると推測されるアミノ酸残基に対して急激な変更を作製しないように選択し得る。なぜなら、そのような残基は、他の分子との重要な相互作用に関与し得るからである。さらに、当業者は、各アミノ酸残基において単一アミノ酸置換を含む試験改変体を作製し得る。この改変体は、当業者に公知の活性アッセイを用いてスクリーニングされ得る。そのような改変体を使用して、適切な改変体に関する情報を集め得る。例えば、当業者は、特定のアミノ酸残基に対する変更が、崩壊された活性、不適当に減少された活性、または不適切な活性を生じることを発見した場合、そのような変更を有する改変体は、回避される。言い換えると、そのような慣用的な実験から集められた情報に基づいて、当業者は、さらなる置換が単独または他の変異と組み合わせてかのいずれかで回避されるべきであるアミノ酸を、容易に決定し得る。
【００７９】
多数の科学刊行物が、二次構造の推測に向けられている。Ｍｏｕｌｔ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７：４２２−２７、１９９６、Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３：２２２−４５、１９７４；Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１１３：２１１−２２、１９７４；Ｃｈｏｕら、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４７：４５−４８，１９７８；Ｃｈｏｕら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４７：２５１−２７６およびＣｈｏｕら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．、２６：３６７−８４、１９７９を参照のこと）。さらに、コンピュータープログラムが、現在利用可能であり、二次構造の予測によって補助する。二次構造を推測する１つの方法は、相同性モデリングに基づく。例えば、３０％よりも大きい配列同一性、または４０％よりも大きい配列類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質は、しばしば、類似した構造トポロジーを有する。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の近年の成長により、二次構造の推測可能性（ポリペプチド構造またはタンパク質構造内の潜在的な折り畳みの数を含む）の促進がもたらされた。Ｈｏｌｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、２７：２４４−４７，１９９９を参照のこと。所定のポリペプチドもしくはタンパク質における限定された数の折り畳みが存在すること、および一旦構造の臨界の数が決定されると、構造予測が劇的により正確になること、が示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、７  ３６９−７６、１９９７）。
【００８０】
二次構造を予測するさらなる方法としては、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、７：３７７−８７、１９９７；Ｓｉｐｐｌら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、４：１５−９、１９９６）、「プロフィール分析」（Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５３：１６４−７０、１９９１；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８３：１４６−５９、１９９０；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８４４３５５−５８、１９８７）、および「進化的連鎖（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｍｅら、前出、およびＢｒｅｎｎｅｒ、前出を参照のこと）が、挙げられる。
【００８１】
好ましいＩＦＮ−Ｌポリペプチド改変体としては、グリコシル化改変体が挙げられ、ここで、グリコシル化部位の数および／または種類は、配列番号２または配列番号５のいずれかに記載されるアミノ酸配列と比較して変更されている。１つの実施形態において、ＩＦＮ−Ｌポリペプチド改変体は、配列番号２または配列番号５のいずれかに記載のアミノ酸配列よりも多いかまたは少ない数のＮ結合型グリコシル化部位を含む。Ｎ結合型グリコシル化部位は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒによって特徴付けられ、ここで、Ｘとして示されるアミノ酸残基は、プロリン以外の任意のアミノ酸残基であり得る。この配列を作製するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ結合型炭水化物鎖の付加のための潜在的に新たな部位を提供する。あるいは、この配列を除去する置換は、存在するＮ結合型炭水化物鎖を除く。また、Ｎ結合型炭水化物鎖の再配列が提供され、ここで、一つ以上のＮ結合型グリコシル化部位（代表的には、天然にある部位）が除去されて一つ以上の新しいＮ結合型部位が作製される。さらに好ましいＩＦＮ−Ｌ改変体としては、システイン改変体が挙げられ、ここで、一つ以上のシステイン残基が、配列番号２または配列番号５のいずれかに記載されるアミノ酸と比較して、欠失されているか、または別のアミノ酸（例えば、セリン）を置換している。システイン改変体は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドが、不溶性封入体の単離の後のように、生物学的に活性なコンフォメーションに折り畳まれなければならない場合に有用である。システイン改変体は、一般的に、ネイティブなタンパク質よりも少ないシステイン残基を有し、そして代表的には、不対システインから生じる相互作用を最少化するために偶数を有する。
【００８２】
他の実施形態において、関連する核酸分子は、少なくとも１つのアミノ酸の挿入を有する配列番号２または配列番号５のいずれかに記載されるポリペプチド（そして、ここで、このポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれかに記載されるポリペプチドの活性を有する）をコードするヌクレオチド配列から、あるいは、少なくとも１つのアミノ酸の欠失を有する配列番号２または配列番号５のいずれかに記載されるポリペプチド（そして、ここで、このポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれかに記載されるポリペプチドの活性を有する）をコードするヌクレオチド配列から構成される／成る。関連する核酸分子はまた、配列番号２または配列番号５のいずれかに記載されるポリペプチド（そして、ここで、このポリペプチドは、カルボキシ末端切断および／またはアミノ末端切断を有し、そして、さらに配列番号２または配列番号５のいずれかに記載されるポリペプチドの活性を有する）をコードするヌクレオチド配列から構成される／成る。関連する核酸分子はまた、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、カルボキシ末端切断および／またはアミノ末端切断を有する配列番号２または配列番号５のいずれかに記載されるポリペプチド（そして、ここで、このポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれかに記載されるポリペプチドの活性を有する）をコードするヌクレオチド配列から構成される／成る。
【００８３】
さらに、配列番号２または配列番号５のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは他のＩＦＮ−Ｌポリペプチド改変体は、相同なポリペプチドに融合されてホモダイマーを形成し得るか、または異種のポリペプチドに融合されてヘテロダイマーを形成し得る。異種のペプチドおよびポリペプチドとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＩＦＮ−Ｌ融合タンパク質の検出および／または単離を可能するためのエピトープ；膜貫通レセプタータンパク質またはその一部分（例えば、細胞外ドメインまたは膜貫通および細胞内ドメイン）；膜貫通レセプタータンパク質に結合するリガンドまたはその一部分；触媒活性である酵素またはその一部分；オリゴマー化を促進するポリペプチドまたはペプチド（例えば、ロイシンジッパードメイン）；安定性を増加するポリペプチドまたはペプチド（例えば、免疫グロブリン定常領域）；ならびに配列番号２または配列番号５のいずれかに記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはＩＦＮ−Ｌポリペプチド改変体とは異なる治療活性を有するポリペプチド。
【００８４】
融合は、配列番号２または配列番号５のいずれかに記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは他のＩＦＮ−Ｌポリペプチド改変体のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかでなされ得る。融合は、リンカー分子またはアダプター分子なしで直接的であり得るか、あるいはリンカー分子またはアダプター分子を使用して間接的であり得る。リンカー分子またはアダプター分子は、１つ以上のアミノ酸残基、代表的には約２０〜約５０個のアミノ酸残基であり得る。リンカー分子またはアダプター分子はまた、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼ、またはプロテアーゼの切断部位を有するように設計され得て融合部分の分離を可能にする。一旦構築されると、融合ポリペプチドは、本明細書中に記載される方法に従って誘導され得ることが理解される。
【００８５】
本発明のさらなる実施形態において、配列番号２または配列番号５のいずれかに記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは他のＩＦＮ−Ｌポリペプチド改変体は、ヒトＩｇＧのＦｃ領域の一つ以上のドメインに融合される。抗体は、２つの機能的に独立した部分（「Ｆａｂ」として公知の可変ドメイン（抗原に結合する）および「Ｆｃ」として公知の定常ドメイン（食細胞による攻撃および補体活性化のようなエフェクター機能に関係する）を含む。Ｆｃは、長い血清半減期を有し、一方、Ｆａｂは短寿命である（Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３７：５２５−３１、１９８９）。治療タンパク質と一緒に構築される場合、Ｆｃドメインは、より長い半減期を提供し得るか、またはＦｃレセプター結合、プロテインＡ結合、補体固定およびおそらく胎盤輸送のような機能を組込み得る（同書）。表ＩＩは、当該分野で公知の特定のＦｃ機能の使用を要約する。
【００８６】
【表２】
2007014331.tif 000003
【００８７】
一つの例において、ヒトＩｇＧヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の全てまたは一部は、当業者に公知の方法を使用してＩＦＮ−ＬポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合され得る。別の例において、ヒトＩｇＧヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３領域は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドフラグメント（例えば、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの予想される細胞外部分）のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかと融合し得る。
【００８８】
得られるＩＦＮ−Ｌ融合ポリペプチドは、プロテインＡアフィニティーカラムの使用によって精製され得る。Ｆｃ領域に融合されたペプチドおよびタンパク質は、融合されていない対応物よりも実質的に長い半減期を示すことが見出された。また、Ｆｃ領域への融合は、融合ポリペプチドの二量化／多量体化を可能にする。Ｆｃ領域は、天然に存在するＦｃ領域であり得るか、または特定の質（例えば、治療的質、循環時間、凝集の減少など）を改善するために変更され得る。
【００８９】
関連する核酸分子およびペプチドの同一性および類似性は、公知の方法によって容易に計算され得る。このような方法としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．Ｌｅｓｋ編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｄ．Ｗ．Ｓｍｉｔｈ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｍ．Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，およびＪ．Ｄｅｖｅｒｅｕｘ編，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１；ならびにＣａｒｉｌｌｏ編，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３，１９８８に記載される方法。
【００９０】
同一性および／または類似性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間に最も大きな一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公に利用可能なコンピュータプログラムに記載される。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＧＣＧプログラムパッケージ（ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１２：３８７，１９８４；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を含む）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０上記）から公に入手可能である。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた同一性を決定するために使用され得る。
【００９１】
２つのアミノ酸配列を整列させるための特定の整列スキームは、２つの配列の短い領域のみの一致を生じ得、この小さな整列された領域は、２つの全長配列間に有意な関係がないとしても非常に高い配列同一性を有し得る。従って、好ましい実施形態においては、選択された整列方法（ＧＡＰプログラム）は、標的ポリペプチドの少なくとも５０個の連続するアミノ酸にわたる整列を生じる。
【００９２】
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、配列同一性の割合が決定される２つのポリペプチドは、それらのそれぞれのアミノ酸の最適の一致（アルゴリズムによって決定される「一致したスパン（ｍａｔｃｈｅｄ ｓｐａｎ）」）について整列される。ギャップオープニングペナルティー（ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ）（これは、平均ダイアゴナルの３倍として計算され；「平均ダイアゴナル」は、使用される比較マトリクスのダイアゴナルの平均であり；「ダイアゴナル」は、特定の比較マトリクスによってそれぞれの完全なアミノ酸一致に割り当てられるスコアまたは数である）およびギャップエクステンションペナルティー（これは、通常ギャップオープニングペナルティーの１／１０である）、ならびにＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２のような比較マトリクスがアルゴリズムとともに使用される。標準比較マトリクス（ＰＡＭ２５０比較マトリクスのついてＤａｙｈｏｆｆら、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、第５巻、補遺３５（３）、１９７８；ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリクスについてＨｅｎｉｋｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、８９：１０９１５−１０９１９、１９９２）もまたアルゴリズムによって使用される。
【００９３】
ポリペプチド配列の比較に好ましいパラメーターとしては、以下が挙げられる： アルゴリズム（Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−５３（１９７０）、 比較マトリクス（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｍａｔｒｉｘ）：ＢＬＯＳＵＭ ６２、Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、前出）
ギャップペナルティー（Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ）：１２ ギャップレングスペナルティー（Ｇａｐ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｅｎａｌｔｙ）：４ 類似性の閾値：０。
【００９４】
ＧＡＰプログラムは、上記パラメーターを用いて有用である。上記パラメーターは、ＧＡＰアルゴリズムを使用してポリペプチド比較についてのデフォルトパラメーター（末端ギャップについてペナルティーなしで）である。
【００９５】
核酸分子配列比較についての好ましいパラメーターとしては、以下が挙げられる： アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，前出）
比較マトリクス：一致＝＋１０、不一致＝０ ギャップペナルティー：５０ ギャップレングスペナルティー：３。
【００９６】
ＧＡＰプログラムはまた、上記パラメーターを用いて有用である。上記パラメーターは、核酸分子比較に付いてのデフォルトパラメーターである。
【００９７】
他の例示的なアルゴリズム、ギャップオープニングペナルティー、ギャップエクステンションペナルティー、比較マトリクス、同一性の閾値などが当業者によって使用され得、これには、Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ９，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，１９９７に記載されるものを含む。なされる特定の選択は、当業者に明らかであり、なされる特定の比較（例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡ間、タンパク質−タンパク質間、タンパク質−ＤＮＡ間）；さらに、比較が配列の対間である（この場合、ＧＡＰまたはＢｅｓｔＦｉｔが一般的に好ましい）か、一つの配列と配列の大きなデータベースとの間（この場合、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＡが好ましい）であるか）に依存する。
【００９８】
（核酸分子）
核酸分子は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、種々の方法（化学合成、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリースクリーニング、発現ライブラリースクリーニングおよび／またはｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を含むがこれらに限定されない）で容易に得られ得る。
【００９９】
本明細書中で使用される組換えＤＮＡ方法は、一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））および／またはＡｕｓｕｂｅｌら編（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４））に記載される方法である。本発明は、本明細書中に記載される核酸分子およびこのような分子を得るための方法を用意する。
【０１００】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子が一つの種から同定された場合、その遺伝子の全てまたは一部は、同じ種からのオーソロガス遺伝子または関連遺伝子を同定するためのプローブとして使用され得る。プローブまたはプライマーは、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドを発現すると考えられる種々の組織供給源からのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。
【０１０１】
さらに、配列番号１または配列番号４のいずれかに記載される配列を有する核酸分子の一部または全てを使用してゲノムライブラリーをスクリーニングし、ＩＦＮ−Ｌをコードする遺伝子を同定および単離し得る。代表的には、中程度または高いストリンジェンシーの条件は、スクリーニングのために使用されてスクリーニングから得られた偽陽性の数を最小にする。
【０１０２】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子はまた、発現クローニング（これは、発現されたタンパク質の性質に基づく陽性クローンの検出を使用する）によって同定され得る。代表的には、核酸ライブラリーは、宿主細胞表面において発現されそして示されるクローン化タンパク質への抗体または他の結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）の結合によってスクリーニングされる。抗体または結合パートナーは、検出可能な標識を用いて修飾されて所望のクローンを発現するそれらの細胞を同定する。
【０１０３】
以下に記載される説明に従って行われる組換え発現技術は、これらのポリヌクレオチドを作製し、そしてコードされるポリペプチドを発現するために従われ得る。例えば、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列を適切なベクターに挿入することによって、当業者は、大量の所望のヌクレオチド配列を容易に作製し得る。次いで、この配列を使用して検出プローブまたは増幅プライマーを作製し得る。あるいは、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入し得る。発現ベクターを適切な宿主に導入することによって、コードされるＩＦＮ−Ｌポリペプチドは、大量に作製され得る。
【０１０４】
適切な核酸配列を得るための別の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。この方法において、ｃＤＮＡは、酵素逆転写酵素を使用して、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡまたは全ＲＮＡから調製される。次いで、２つのプライマー（代表的には、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの２つの別個の領域に対して相補的である）が、ＴａｑポリメラーゼのようなポリメラーゼとともにこのｃＤＮＡに付加され、そしてこのポリメラーゼが、これら２つのプライマー間のこのｃＤＮＡの領域を増幅する。
【０１０５】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を調製する別の手段は、Ｅｎｇｅｌｓら、１９８９，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．２８：７１６−３４によって記載されるもののような、当業者に周知の方法を使用する、化学合成である。これらの方法としては、とりわけ、核酸合成のためのリン酸トリエステル、ホスホルアミダイト、およびＨ−ホスホネート方法が挙げられる。このような化学合成のために好ましい方法は、標準的なホスホルアミダイト化学を使用する、ポリマーにより支持される合成である。代表的に、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、数百ヌクレオチド長である。約１００ヌクレオチドより長い核酸は、これらの方法を使用して、いくつかのフラグメントとして合成され得る。次いで、これらのフラグメントが一緒に連結されて、ＩＦＮ−Ｌ遺伝子の全長ヌクレオチド配列を形成し得る。通常、このポリペプチドのアミノ末端をコードするＤＮＡフラグメントは、ＡＴＧを有し、これは、メチオニン残基をコードする。このメチオニンは、宿主細胞において産生されたポリペプチドがその細胞から分泌されるよう設計されるか否かに依存して、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの成熟形態で存在してもそうでなくてもよい。当業者に公知の他の方法が、同様に使用され得る。
【０１０６】
特定の実施形態において、核酸改変体は、所定の宿主細胞におけるＩＦＮ−Ｌポリペプチドの最適な発現のために変更されたコドンを含む。特定のコドン変更は、発現のために選択されるＩＦＮ−Ｌポリペプチドおよび宿主細胞に依存する。このような「コドン最適化」は、種々の方法によって（例えば、所定の宿主細胞において高度に発現される遺伝子における使用に好ましいコドンを選択することによって）実施され得る。高度に発現された細菌遺伝子のコドン優先性のための「Ｅｃｏ＿ｈｉｇｈ．Ｃｏｄ」のようなコドン度数表を組み込むコンピュータアルゴリズムが使用され得、そしてＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって提供される。他の有用なコドン度数表としては、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｌｏｗ．ｃｏｄ」、「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｍａｉｚｅ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、および「Ｙｅａｓｔ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ．」が挙げられる。
【０１０７】
いくつかの場合において、ＩＦＮ−Ｌポリペプチド改変体をコードする核酸分子を調製することが所望であり得る。改変体をコードする核酸分子は、プライマー（単数または複数）が所望の点変異を有する部位特異的変異誘発、ＰＣＲ増幅、または他の適切な方法を使用して生成し得る（変異誘発技術の記載に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、およびＡｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）。Ｅｎｇｅｌｓら、前出によって記載される方法を使用する化学合成もまた、このような改変体を調製するために使用され得る。当業者に公知の他の方法が、同様に使用され得る。
【０１０８】
（ベクターおよび宿主細胞）
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を、標準的な連結技術を使用して適切な発現ベクターに挿入する。ベクターは、代表的に、使用される特定の宿主細胞において機能的であるように選択される（すなわち、ベクターは、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が生じ得るように、宿主細胞機構と適合性である）。ＩＦＮ−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子は、原核生物宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫（バキュロウイルス系）宿主細胞および／または真核生物宿主細胞において増幅／発現され得る。宿主細胞の選択は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドが翻訳後修飾（例えば、グリコシル化および／またはホスホリル化）されるか否かに一部依存する。そうである場合、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、または哺乳動物宿主細胞が好ましい。発現ベクターの総説について、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８５巻（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９０）を参照のこと。
【０１０９】
代表的に、任意の宿主細胞に使用される発現ベクターは、プラスミド維持のためならびに外来性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のために配列を含む。このような配列（集合的に、「隣接配列」と呼ばれる）は、特定の実施形態において、代表的に、以下のヌクレオチド配列の１つ以上を含む：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含む完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択マーカーエレメント。これらの配列のそれぞれが、以下に議論される。
【０１１０】
必要に応じて、ベクターは、「タグ」コード配列（すなわち、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドコード配列の５’末端または３’末端に配置されるオリゴヌクレオチド分子）を含み得；オリゴヌクレオチド配列は、ｐｏｌｙＨｉｓ（例えば、ｈｅｘａＨｉｓ）、別の「タグ」（例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ（赤血球凝集素インフルエンザウイルス））または市販の抗体が存在するｍｙｃをコードする。このタグは、代表的には、ポリペプチドの発現の際にポリペプチドに融合され、宿主細胞からの、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドのアフィニティー精製のための手段として役立ち得る。アフィニティー精製は、例えば、アフィニティーマトリクスとしてタグに対して抗体を使用するカラムクロマトグラフィーによって達成され得る。必要に応じて、タグは、続いて、切断のために特定のペプチダーゼを使用するような種々の手段によって、精製されたＩＦＮ−Ｌポリペプチドから除去され得る。
【０１１１】
隣接配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または系統由来）であり得るか、異種（すなわち、宿主細胞種または系統以外の種由来）であり得るか、ハイブリッド（すなわち、１つより多くの供給源由来の隣接配列の組み合わせ）であり得るか、または合成であり得るか、あるいは隣接配列は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチド発現を調節するために正常に機能するネイティブな配列であり得る。このように、隣接配列の供給源は、任意の原核生物または真核生物、任意の脊椎生物または無脊椎生物、あるいは任意の植物であり得、但し、隣接配列は、宿主細胞の機構において機能的であり、そして宿主細胞の機構によって活性化され得る。
【０１１２】
本発明のベクターに有用な隣接配列は、当該分野において周知である任意のいくつかの方法によって得られ得る。代表的には、ＩＦＮ−Ｌ遺伝子隣接配列以外の、本明細書中で有用な隣接配列は、マッピングおよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に同定されており、従って、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して、適切な組織供給源から単離され得る。いくつかの場合において、隣接配列の全長ヌクレオチド配列は公知であり得る。ここで、隣接配列は、核酸合成またはクローニングのために本明細書中で記載される方法を使用して合成され得る。
【０１１３】
隣接配列の全てまたは一部のみが公知である場合、ＰＣＲを使用して、そして／あるいは適切なオリゴヌクレオチドならびに／または同じもしくは別の種由来の隣接配列フラグメントを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られ得る。隣接配列が公知でない場合、隣接配列を含むＤＮＡのフラグメントは、例えば、コード配列または別の遺伝子（単数または複数）を含み得る大きな片のＤＮＡから単離され得る。単離は、適切なＤＮＡフラグメントを生成するための制限エンドヌクレアーゼ消化、続くアガロースゲル精製を使用する単離、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）、または当業者に公知の他の方法によって達成され得る。この目的を達成するための適切な酵素の選択は、当業者に容易に明かである。
【０１１４】
複製起点は、代表的に、市販から購入された原核生物発現ベクターの一部であり、この起点は、宿主細胞においてベクターの増幅に役立つ。特定のコピー数に対するベクターの増幅は、いくつかの場合において、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの最適な発現に重要であり得る。選択されたベクターが複製起点部位を含まない場合、公知の配列に基づいて化学的に合成され得、そしてベクターに連結され得る。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）からの複製起点は、大部分のグラム陰性細菌に適切であり、そして種々の起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶまたはＢＰＶのようなパピローマウイルス）は、哺乳動物細胞におけるベクターのクローニングのために有用である。一般的に、複製成分の起点は、哺乳動物発現ベクター（例えば、ＳＶ４０起点は、ただそれが初期プロモーターを含むので、しばしば、使用される）を必要としない。
【０１１５】
転写終結配列は、代表的にポリペプチドコード領域の末端の３’側に配置され、そして転写を終結させるのに役立つ。通常、原核生物細胞における転写終結配列は、Ｇ−Ｃリッチフラグメント、続いてポリ−Ｔ配列である。この配列はライブラリーから容易にクローン化され得るか、またはベクターの一部として市販で購入され、これは、本明細書中に記載されるような核酸合成のための方法を使用して容易に合成され得る。
【０１１６】
選択マーカー遺伝子エレメントは、選択培養培地において増殖される宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。代表的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物宿主細胞に対して、抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシン）に対する耐性を与えるか；（ｂ）細胞の栄養要求性の欠損を補うか；（ｃ）あるいは複合培地から入手可能でない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞における選択のために使用され得る。
【０１１７】
他の選択遺伝子は、発現される遺伝子を増幅するために使用され得る。増幅は、増殖に重要なタンパク質の産生により大きく要求される遺伝子が、組換え細胞の連続的な生成の染色体内でタンデムに反復されるプロセスである。哺乳動物細胞に対する適切な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびチミジンキナーゼが挙げられる。哺乳動物細胞形質転換体は、選択圧下に置かれ、ここで、形質転換体のみが、ベクターに存在する選択遺伝子によって生存するように独特に適合される。選択圧は、培地中の選択因子の濃度が連続的に変化し、それによって選択遺伝子とＩＦＮ−ＬポリペプチドをコードするＤＮＡとの両方の増幅を導く条件下で、形質転換された細胞を培養することによって課される。結果として、増加した量のＩＦＮ−Ｌポリペプチドが、増幅されたＤＮＡから合成される。
【０１１８】
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、そしてＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（原核性物）またはＫｏｚａｋ配列（真核生物）によって特徴付けられる。このエレメントは、代表的に、発現されるＩＦＮ−Ｌポリペプチドのプロモーターの３’側およびコード配列の５’側に配置される。Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列は、可変であるが、代表的には、ポリプリン（すなわち、高いＡ−Ｇ含有量を有する）である。多くのＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列は、同定されており、それぞれが、本明細書中に記載の方法を使用して、原核生物ベクターを使用して容易に合成され得る。
【０１１９】
リーダー配列、またはシグナル配列は、宿主細胞からＩＦＮ−Ｌポリペプチドを指向させるために使用され得る。代表的には、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、ＩＦＮ−Ｌ核酸分子のコード領域に位置するか、または直接ＩＦＮ−Ｌポリペプチドコード領域の５’末端に位置する。多くのシグナル配列が同定されており、選択された宿主細胞において機能性であるシグナル配列の任意が、ＩＦＮ−Ｌ核酸分子と組み合わせて使用され得る。従って、シグナル配列は、ＩＦＮ−Ｌ核酸分子に対して同種（天然）または異種であり得る。さらに、シグナル配列は、本明細書中に記載される方法を使用して化学的に合成され得る。大部分において、シグナルペプチドの存在による宿主細胞からのＩＦＮ−Ｌポリペプチドの分泌は、分泌されたＩＦＮ−Ｌポリペプチドからのシグナルペプチドの除去を生じる。シグナル配列は、ベクターの成分であり得るか、またはベクターに挿入されたＩＦＮ−Ｌ核酸分子の一部であり得る。
【０１２０】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドコード領域に結合されたネイティブなＩＦＮ−Ｌポリペプチドシグナル配列をコードするヌクレオチド配列またはＩＦＮ−Ｌポリペプチドコード領域に結合された異種シグナル配列をコードするヌクレオチド配列のいずれかの使用が本発明の範囲内に含まれる。選択された異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセスされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであるべきである。ネイティブなＩＦＮ−Ｌポリペプチドシグナル配列を認識せず、プロセスしない原核生物宿主細胞について、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または熱安定エンテロトキシンＩＩリーダーのグループから選択される原核生物シグナル配列によって置換される。酵母分泌について、ネイティブなＩＦＮ−Ｌポリペプチドシグナル配列は、酵母インベルターゼ、α因子、または酸ホスファターゼリーダーによって置換され得る。哺乳動物細胞発現において、ネイティブなシグナル配列が満足であるが、他の哺乳動物シグナル配列が適切であり得る。
【０１２１】
グリコシル化が真核生物宿主細胞発現系において望ましいような、いくつかの場合において、グリコシル化または収量を改善するために種々のシグナルペプチド（ｐｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）が操作され得る。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更し得るかまたはプロ配列（ｐｒｏ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を加え得、これはまた、グリコシル化に影響し得る。最後のタンパク質産物は、１位に（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）、発現に付随して１つ以上のさらなるアミノ酸を有し得、これは、完全に除去されないかもしれない。例えば、最終のタンパク質産物は、アミノ末端に結合される、ペプチダーゼ切断部位において見出される１つまたは２つのアミノ酸残基を有し得る。あるいは、いくつかの酵素切断部位は、酵素が成熟ポリペプチド内のこのような領域で切断する場合、所望のＩＦＮ−Ｌポリペプチドの少し短縮した形態を生じ得る。
【０１２２】
多くの場合において、核酸分子の転写は、ベクター内の１つ以上のイントロンの存在によって増加する；これは、ポリペプチドが真核生物宿主細胞（特に、哺乳動物宿主細胞）において産生される場合、特に当てはまる。使用されるイントロンは、特に使用される遺伝子が全長ゲノム配列またはそのフラグメントである場合、ＩＦＮ−Ｌ遺伝子内に天然に存在し得る。イントロンが遺伝子内に天然に存在しない（大部分のｃＤＮＡについて）場合、イントロンは、別の供給源から得られ得る。隣接配列およびＩＦＮ−Ｌ遺伝子に関してイントロンの位置は、イントロンが効果的に転写されなければならないので、一般的に重要である。従って、ＩＦＮ−Ｌ ｃＤＮＡ分子が転写される場合、イントロンの好ましい位置は、転写開始部位の３’側で、ｐｏｌｙ−Ａ転写終止配列の５’側である。好ましくは、イントロン（単数または複数）は、コード配列を妨害しないように、ｃＤＮＡの１つの側または他の側（すなわち、５’側または３’側）に配置される。任意の供給源（ウイルス、原核生物および真核生物（植物または動物）を含む）由来の任意のイントロンを使用して本発明を実行し得るが、但し、このイントロンは、挿入される宿主細胞に適合性である。合成イントロンもまたここに含まれる。必要に応じて、１つより多くのイントロンがベクター内で使用され得る。
【０１２３】
本発明の発現ベクターおよびクローニングベクターは、代表的には、宿主生物によって認識され、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドをコードする分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する構造遺伝子（一般的に、約１００〜１０００ｂｐ）の開始コドンに対して上流（すなわち、５’側）に配置される非転写配列である。プロモーターは、通常、２つのクラス（誘導プロモーターおよび構成プロモーター）の１つにグループ化される。誘導プロモーターは、培養条件におけるいくらかの変化（例えば、栄養の存在または非存在、あるいは温度の変化）に応答してそれらの制御下で、ＤＮＡからの転写の増加したレベルを開始する。他方、構成プロモーターは、連続的な遺伝子産物の産生を開始する；すなわち、遺伝子発現に対してほとんど制御しないかまたは制御しない。多数のプロモーター（種々の潜在的な宿主細胞によって認識される）が周知である。適切なプロモーターは、供給源のＤＮＡからプロモーターを制限酵素消化によって取り出し、そして所望のプロモーター配列をベクターに挿入することによって、ＩＦＮ−ＬポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結される。ネイティブなＩＦＮ−Ｌプロモーター配列は、ＩＦＮ−Ｌ核酸分子の増幅および／または発現に指向させるために使用され得る。しかし、ネイティブなプロモーターと比較して大きい転写および発現タンパク質のより高い産生が可能であり、そして使用のために選択された宿主細胞系と適合性である場合、異種プロモーターが好ましい。
【０１２４】
原核生物宿主との使用に適切なプロモーターとしては、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼ；トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系；およびハイブリッドプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター）が挙げられる。他の公知の細菌プロモーターもまた、適切である。これらの配列は、公開されており、その結果、当業者は、任意の有用な制限部位を供給するのに必要とされるリンカーまたはアダプターを使用して、所望のＤＮＡにそれらの配列を連結し得る。
【０１２５】
酵母宿主との使用に適切なプロモーターはまた、当該分野において周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターとの使用に有利に使用される。哺乳動物宿主細胞との使用に適切なプロモーターは周知であり、限定しないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ２）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましいシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーターが挙げられる。他の適切な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター（例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーター）が挙げられる。
【０１２６】
ＩＦＮ−Ｌ遺伝子発現を制御する際に関心があり得るさらなるプロモーターとしては、限定しないが、以下が挙げられる：ＳＶ４０初期プロモータ領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−１０）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’側の長い終末反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２ ：７８７−９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４−４５）；メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）；β−ラクタマーゼプロモーターのような原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５：３７２７−３１）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：２１−２５）。組織特異性を示し、そしてトランスジェニック動物において利用されている以下の動物転写制御領域もまた関心がある：膵臓腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６３９−４６；Ｏｒｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５）；膵臓β細胞において活性なインシュリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−２２）；リンパ球において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６４７−５８；Ａｄａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３−３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１４３６−４４）；精巣、乳房、リンパ球、および肥満細胞において活性なマウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：４８５−９５）；肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−７６）；肝臓において活性なα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：１６３９−４８；Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５８）；肝臓において活性なα１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−７１）；骨髄性細胞において活性なβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−４０；Ｋｏｌｌｉａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）；脳の稀突起神経膠細胞において活性なミエリンベースのタンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ ４���：７０３−１２）；骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−８６）；ならびに視床下部において活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−７８）。
【０１２７】
エンハンサー配列は、より高等な真核生物によって本発明のＩＦＮ−ＬポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を増加するように、ベクターに挿入され得る。エンハンサーは、転写を増加させるためにプロモーターに作用する、通常約１０〜３００ｂｐの長さのＤＮＡのシスに作用するエレメントである。エンハンサーは、相対的な方向および位置に非依存性である。これらは、転写ユニットに対して５’側および３’側に見出された。哺乳動物遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインシュリン）。しかし、代表的には、ウイルス由来のエンハンサーが、使用される。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化について例示的に増強するエレメントである。エンハンサーは、ＩＦＮ−Ｌ核酸分子に対して５’位または３’位でベクターにスプライシングされ得るが、代表的には、プロモーターから５’位側に配置される。
【０１２８】
本発明の発現ベクターは、市販のベクターのような開始ベクターから構築され得る。このようなベクターは、全ての所望な隣接配列を含んでも良いし、含まなくても良い。本明細書中に記載される隣接配列の１つ以上がすでにベクター内にない場合、これらは、個々に得られ得、ベクターに連結され得る。隣接配列のそれぞれを得るために使用される方法は、当業者に周知である。
【０１２９】
本発明を実行するために好ましいベクターは、細菌宿主細胞、昆虫宿主細胞、および哺乳動物宿主細胞と適合性のベクターである。このようなベクターとしては、特に、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３、およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＥＴ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−ａｌｐｈａ（ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９０／１４３６３）ならびにｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）が挙げられる。
【０１３０】
さらなる適切なベクターとしては、限定しないが、コスミド、プラスミド、または改変ウイルスが挙げられるが、これらのベクター系は、選択された宿主細胞と適合性でなければならないことが理解される。このようなベクターとしては、限定しないが、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（高コピー数ＣｏｌＥｌ−ベースのファージミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）、Ｔａｑ増幅ＰＣＲ産物をクローニングするために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えば、ＴＯＰＯＴＭ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ、ＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ならびにバキュロウイルス発現系のような哺乳動物ベクター、酵母ベクターまたはウイルスベクター（ｐＢａｃＰＡＫプラスミド誘導体、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）が挙げられる。
【０１３１】
ベクターが構築され、そしてＩＦＮ−Ｌポリペプチドをコードする核酸分子がベクターの適切な部位に挿入された後に、完全なベクターが増幅および／またはポリペプチド発現に適切な宿主細胞に挿入され得る。ＩＦＮ−Ｌポリペプチドに対する発現ベクターの選択された宿主細胞への形質転換は、トランスフェクション、感染、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン法、または他の公知の技術のような方法を含む周知の方法によって達成され得る。選択される方法は、一部、使用される宿主細胞の種類の機能である。これらの方法および他の適切な方法は、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出に記載される。
【０１３２】
宿主細胞は、原核生物宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核生物宿主細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、または脊椎動物細胞）であり得る。宿主細胞は、適切な条件下で培養される場合、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドを合成し、これは、続いて、培養培地から（宿主細胞がそのポリペプチドを培地に分泌する場合）収集され得るか、直接そのポリペプチドを産生する宿主細胞から収集される（そのポリペプチドが分泌されない場合）。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性（例えば、グリコシル化またはリン酸化）に望ましいかまたは必要なポリペプチド修飾、および生物学的に活性な分子に折り畳まれる容易さなどの種々の因子に依存する。
【０１３３】
多数の適切な宿主細胞が当該分野で公知であり、そして多くのものがＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手可能である。例としては、哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＨＯ ＤＨＦＲ（−）細胞（Ｕｒｌａｕｂら、１９８０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，９７：４２１６−２０）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞もしくは２９３Ｔ細胞または３Ｔ３細胞が挙げられるが、これらに限定されない。適切な哺乳動物宿主細胞の選択ならびに形質転換、培養、増幅、スクリーニング、産物産生および精製のための方法は、当該分野で公知である。他の適切な哺乳動物細胞株は、サルＣＯＳ−１細胞株およびＣＯＳ−７細胞株ならびにＣＶ−１細胞株である。さらなる例示的な哺乳動物宿主細胞としては、形質転換された細胞株を含む、霊長類細胞株およびげっ歯類細胞株が挙げられる。正常な二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養に由来する細胞株、ならびに一次外植片もまた適切である。候補細胞は、選択遺伝子が遺伝子型的に欠損していてもよいし、または優性に作用する選択遺伝子を含んでいてもよい。他の適切な哺乳動物細胞株としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ−ｃもしくはＮＩＨマウスに由来する３Ｔ３株、またはＢＨＫハムスター細胞株もしくはＨａＫハムスター細胞株。各々これらの細胞株は、タンパク質発現の分野の当業者に公知であり、そしてタンパク質発現の分野の当業者にとって利用可能である。
【０１３４】
本発明に適切な宿主細胞として同様に有用であるのは、細菌細胞である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの種々の株（例えば、ＨＢ１０１、ＤＨ５、ＤＨ１０、およびＭＣ１０６１）が、バイオテクノロジーの分野において宿主細胞として周知である。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、他のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．などの種々の株もまた、本方法において使用され得る。
【０１３５】
当業者に公知の酵母細胞の多くの株もまた、本発明のポリペプチドの発現のための宿主細胞として利用可能である。好ましい酵母細胞としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。
【０１３６】
さらに、所望される場合、昆虫細胞系が、本発明の方法において利用され得る。このような系は、例えば、Ｋｉｔｔｓら、１９９３、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：８１０〜１７；Ｌｕｃｋｌｏｗ、１９９３、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：５６４〜７２；およびＬｕｃｋｌｏｗら、１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４５６６〜７９に記載される。好ましい昆虫細胞は、Ｓｆ−９およびＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【０１３７】
グリコシル化ＩＦＮ−Ｌポリペプチドを発現するためにトランスジェニック動物もまた使用し得る。例えば、トランスジェニック乳汁産生動物（例えば、ウシまたはヤギ）を使用し得、そしてその動物の乳汁中の本発明のグリコシル化ポリペプチドを入手し得る。ＩＦＮ−Ｌポリペプチドを産生するために植物もまた使用し得るが、一般に、植物中で生じるグリコシル化は、哺乳動物細胞にて産生されるものと異なり、そしてヒト治療用途に適切でないグリコシル化産生物を生じ得る。
【０１３８】
（ポリペプチド産生）
ＩＦＮ−Ｌポリペプチド発現ベクターを含む宿主細胞が、当業者に周知の標準培地を使用して培養され得る。この培地は、通常、その細胞の増殖および生存に必要な栄養素すべてを含む。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を培養するのに適切な培地は、例えば、Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）および／またはＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）である。真核生物細胞を培養するのに適切な培地は、ロズウェルパークメモリアル研究所培地１６４０（Ｒｏｓｗｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｍｅｄｉｕｍ １６４０）（ＲＰＭＩ １６４０）、最小必須培地（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉａｍ）（ＭＥＭ）および／またはダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）が挙げられ、これら全ては、培養される特定の細胞株により必要とされる血清および／または増殖因子が補充され得る。昆虫培養に適切な培地は、必要な場合にはイーストレート（ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）、ラクトアルブミン加水分解産物および／またはウシ胎仔血清を補充した、グレース培地である。
【０１３９】
代表的には、トランスフェクトまたは形質転換された細胞の選択的増殖に有用な抗生物質または他の化合物が、この培地に補充物として添加される。使用される化合物は、宿主細胞が形質転換されたプラスミド上に存在する選択マーカーエレメントにより決定される。例えば、その選択マーカーエレメントがカナマイシン耐性である場合、培養培地に添加される化合物は、カナマイシンである。選択的増殖のための他の化合物としては、アンピシリン、テトラサイクリンおよびネオマイシンが挙げられる。
【０１４０】
宿主細胞により産生されるＩＦＮ−Ｌポリペプチドの量は、当該分野で公知の標準的方法を使用して評価され得る。このような方法としては、限定はしないが、ウェスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離、免疫沈降、および／または活性アッセイ（例えば、ＤＮＡ結合ゲルシフトアッセイ）が挙げられる。
【０１４１】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドが宿主細胞から分泌されるように設計された場合、ポリペプチドの大部分は、細胞培養培地にて見出され得る。しかし、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドは細胞質および／または核（真核生物宿主細胞について）あるいは細胞質ゾル（グラム陰性細菌宿主細胞について）に存在する。
【０１４２】
宿主細胞の細胞質および／または核（真核生物宿主細胞について）あるいは細胞質ゾル（グラム陰性細菌宿主細胞について）に存在するＩＦＮ−Ｌポリペプチドについては、細胞内物質（グラム陰性細菌についての封入体を含む）が、当業者に公知の任意の標準的技術を使用して宿主細胞から抽出され得る。例えば、宿主細胞は、フレンチプレス、ホモジナイゼーション、および／または超音波処理によって、ペリプラズム／細胞質の中身を放出するように溶解され得、それに続いて遠心分離され得る。
【０１４３】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドが細胞質ゾルにおいて封入体を形成した場合、その封入体は、しばしば、内側細胞膜および／または外側細胞膜に結合し得、従って、遠心分離後に、主にペレット物質中に見出される。次いで、このペレット物質は、極端なｐＨ状態で処理され得るか、またはカオトロピック剤（例えば、界面活性剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素、または尿素誘導体）を還元剤（例えば、ジチオスレイトール（アルカリ性ｐＨ）もしくはトリスカルボキシエチルホスフィン（酸性ｐＨ））の存在下で用いて処理されて、封入体を遊離、ばらばらにおよび可溶化し得る。可溶化形態のＩＦＮ−Ｌポリペプチドは、次いで、ゲル電気泳動、免疫沈降などを使用して分析され得る。ＩＦＮ−Ｌポリペプチドを単離することが所望される場合、単離は、本明細書中に記載される方法およびＭａｒｓｔｏｎら、１９９０、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１８２：２６４−７５に記載される方法のような、標準的方法を使用して達成され得る。
【０１４４】
いくつかの場合において、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドは、単離の際に生物学的に活性でないかもしれない。そのポリペプチドを「リフォールディング」する、すなわち、その３次構造に変換してジスルフィド結合を生じるための種々の方法が、生物学的活性を回復するために使用され得る。このような方法は、可溶化されたポリペプチドを通常は７を超えるｐＨに、特定の濃度のカオトロープの存在下で曝すことを包含する。カオトロープの選択は、封入体可溶化のために使用される選択に非常に類似するが、通常このカオトロープは、より低い濃度で使用され、そして可溶化に使用されるカオトロープと必ずしも同じではない。ほとんどの場合、リフォールディング／酸化溶液はまた、還元剤を含むかまたは還元剤に加えてその酸化形態を特定の比で含んで、特定の酸化還元ポテンシャルを生じ、それによりそのタンパク質のシステイン架橋の形成を生じるようなジスルフィドシャッフリングを可能にする。一般的に使用される酸化還元カップルのいくつかとしては、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化銅（ＩＩ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、および２−２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）が挙げられる。多くの場合、共溶媒が、リフォールディングの効率を高めるために使用され得るかまたは必要であり得、そしてこの目的に使用されるさらに一般的な試薬としては、グリセロール、種々の分子量のポリエチレングリコール、アルギニンなどが挙げられる。
【０１４５】
封入体が、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの発現の際に有意な程度まで形成されない場合は、そのポリペプチドは、主に、細胞ホモジネートの遠心分離後に上清中に見出される。そのポリペプチドは、本明細書中に記載されるような方法を使用して、上清からさらに単離され得る。
【０１４６】
溶液からのＩＦＮ−Ｌポリペプチドの精製は、種々の技術を使用して達成され得る。そのポリペプチドが、そのカルボキシル末端もしくはアミノ末端のいずれかに、ヘキサヒスチジンのようなタグを含む（ＩＦＮ−Ｌポリペプチド／ヘキサＨｉｓ）かまたはＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）もしくはｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のような他の小さいペプチドを含むように合成されている場合、そのポリペプチドは、カラムマトリックスがそのタグに対して高い親和性を有するアフィニティーカラムにその溶液を通すことによって、１工程のプロセスで精製され得る。
【０１４７】
例えば、ポリヒスチジンは、ニッケルに対して高い親和性および特異性で結合する。従って、ニッケルのアフィニティーカラム（例えば、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ニッケルカラム）が、ＩＦＮ−Ｌポリペプチド／ポリＨｉｓの精製に使用され得る。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１０．１１．８節（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ １９９３）を参照のこと。
【０１４８】
さらに、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドは、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドを特異的に認識しそして結合し得る、モノクローナル抗体を使用して精製され得る。
【０１４９】
精製のための他の適切な手段としては、限定はしないが、アフィニティークロマトグラフィー、免疫アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、電気泳動（ネイティブゲル電気泳動を含む）およびその後のゲル溶出、ならびに分取等電点電気泳動（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」マシーン／技術、Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）が挙げられる。いくつかの場合、２つ以上のこれらの精製技術が、純度の上昇を達成するために組み合わされ得る。
【０１５０】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドはまた、当該分野で公知の技術を使用する、化学合成法（例えば、固相ペプチド合成）により調製され得、その公知技術は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、１９６３、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３２、ならびにＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．１９８４）に示される技術である。このようなポリペプチドは、アミノ末端にメチオニンを含んで合成され得るし、または含まずに合成され得る。化学的に合成されたＩＦＮ−Ｌポリペプチドは、これらの参考文献に示される方法を使用して、ジスルフィド架橋を形成するように酸化され得る。科学的に合成されたＩＦＮ−Ｌポリペプチドは、組換え産生されるかもしくは天然の供給源から精製された対応するＩＦＮ−Ｌポリペプチドに匹敵する生物学的活性を有すると予測され、従って、組換えＩＦＮ−Ｌポリペプチドもしくは天然のＩＦＮ−Ｌポリペプチドと交換可能に使用され得る。
【０１５１】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドを得る別の手段は、そのＩＦＮ−Ｌポリペプチドが天然で見出される生物学的サンプル（例えば、供給源組織および／または流体）からの精製を介する。このような精製は、本明細書中に記載のようなタンパク質精製のための方法を使用して実行され得る。精製の間のＩＦＮ−Ｌポリペプチドの存在は、例えば、組換え産生されたＩＦＮ−Ｌポリペプチドもしくはそのペプチドフラグメントに対して調製された抗体を使用して、モニターされ得る。
【０１５２】
核酸およびポリペプチドを産生するためのさらなる多数の方法が、当該分野で公知であり、そしてその方法は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドに対する特異性を有するポリペプチドを産生するために使用され得る。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：１２２９７−１２３０３、を参照のこと。これは、ｍＲＮＡとそのコードされるペプチドとの間の融合タンパク質の産生を記載する。また、Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９９、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：２６３−２７３も参照のこと。さらに、米国特許第５，８２４，４６９号は、特定の生物学的機能を果たし得るオリゴヌクレオチドを得る方法を記載する。この手順は、各々が５’ランダム配列、所定の中心配列、および３’ランダム配列を有する、オリゴヌクレオチドの不均質プールを産生することを包含する。生じた不均質プールは、所望の生物学的機能を示さない細胞集団に導入される。次いで、この細胞の部分集団が、所定の生物学的機能を示す部分集団についてスクリーニングされる。この部分集団から、所望の生物学的機能を果たし得るオリゴヌクレオチドが、単離される。
【０１５３】
米国特許第５，７６３，１９２号、同第５，８１４，４７６号、同第５，７２３，３２３号および同第５，８１７，４８３号は、ペプチドもしくはポリペプチドを産生するためのプロセスを記載する。これは、確率的（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ）遺伝子もしくはそのフラグメントを産生すること、次いでこれらの遺伝子を、その確率的遺伝子によりコードされる１つ以上のタンパク質を産生する宿主細胞に導入することによって、なされる。次いで、この宿主細胞は、所望の活性を有するペプチドもしくはポリペプチドを産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。
【０１５４】
ペプチドもしくはポリペプチドを産生するための別の方法は、「Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」（ＲＡＧＥ−ＧＤ）として公知である、Ａｔｈｅｒｓｙｓ，Ｉｎｃ．により出願されたＰＣＴ／ＵＳ９８／２００９４（ＷＯ９９／１５６５０）に記載され、このプロセスは、インサイチュ組換え方法による内因性遺伝子発現の活性化もしくは遺伝子の過剰発現を包含する。例えば、内因性遺伝子の発現は、非相同組換えもしくは非正統的（ｉｌｌｅｇｉｔｉｍａｔｅ）組換えによってその遺伝子の発現を活性化し得る標的細胞に調節配列を組み込むことによって、活性化もしくは増加される。標的ＤＮＡは、まず、放射線に供され、そして遺伝子プロモーターが挿入される。このプロモーターは、最終的には遺伝子の前の途切れ目に位置し、その遺伝子の転写を開始する。これは、所望のペプチドもしくはポリペプチドの発現を生じる。
【０１５５】
これらの方法がまた、包括的ＩＦＮ−Ｌポリペプチド発現ライブラリーを作製するために使用され得、このライブラリーが続いて種々のアッセイ（例えば、生化学的アッセイ、細胞アッセイ、および生物全体アッセイ（例えば、植物、マウスなど））における高スループット表現型スクリーニングに使用され得ることが、理解される。
【０１５６】
(合成）
本明細書中に記載される核酸およびポリペプチド分子が組換え手段および他の手段によって産生され得ることが当業者に理解される。
【０１５７】
（選択的結合因子）
用語「選択的結合因子」とは、１以上のＩＦＮ−Ｌポリペプチドに対する特異性を有する分子をいう。適切な選択的結合因子としては、抗体およびその誘導体、ポリペプチド、ならびに小分子が挙げられるが、これらに限定されない。適切な選択的結合因子は、当該分野で公知の方法を使用して調製され得る。本発明の例示的ＩＦＮ−Ｌポリペプチド選択的結合因子は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの特定の部分を結合し得、それによって、ＩＦＮ−ＬポリペプチドレセプターへのＩＦＮ−Ｌポリペプチドの結合を阻害する。
【０１５８】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドを結合する選択的結合因子（例えば、抗体および抗体フラグメント）は、本発明の範囲内にある。抗体は、ポリクローナル（単一特異的なポリクローナルを含む）抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体（例えば、ＣＤＲグラフト化抗体）、ヒト抗体、単鎖抗体および／または二特異性抗体、ならびにそれらのフラグメント、改変体または誘導体であり得る。抗体フラグメントは、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドのエピトープに結合する抗体の部分を含む。このようなフラグメントの例としては、全長抗体の酵素的切断によって生成される、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）フラグメントが挙げられる。他の結合フラグメントとしては、組換えＤＮＡ技術（例えば、抗体可変領域をコードする核酸配列を含む組換えプラスミドの発現）によって精製されるフラグメントが挙げられる。
【０１５９】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドに対するポリクローナル抗体は、一般に、ＩＦＮ−Ｌおよびアジュバントの複数回の皮下注射または腹腔内注射によって、動物（例えば、ウサギまたはマウス）において産生される。ＩＦＮ−Ｌポリペプチドを、キャリアタンパク質に結合体化することが有用であり得、このキャリアタンパク質は、免疫される種において免疫原性である（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清、アルブミン、ウシサイログロブリンまたはダイズトリプシンインヒビター）。また、凝集因子（例えば、ミョウバン）も、免疫応答を増強するために使用される。免疫後、動物を採血し、そして血清を、抗ＩＦＮ−Ｌ抗体力価についてアッセイする。
【０１６０】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、培養物中の継代細胞株による抗体分子の産生を提供する、任意の方法を使用して産生される。モノクローナル抗体を調製するための適切な方法の例としては、Ｋｏｈｌｅｒら、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７のハイブリドーマ法、およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ、１９８４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１〜６３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９８７））が挙げられる。ＩＦＮ−Ｌポリペプチドと反応性のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた、本発明によって提供される。
【０１６１】
本発明のモノクローナル抗体は、治療剤としての使用のために改変され得る。１つの実施形態は、「キメラ」抗体であり、ここで、重鎖（Ｈ）および／または軽鎖（Ｌ）の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と、同一であるかまたは相同であり、鎖の残りの部分は、別の種に由来するかまたは別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と、同一であるかまたは相同である。このような抗体のフラグメントもまた、それらが、所望の生物学的活性を示す限り、含まれる。米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１−６８５５を参照のこと。
【０１６２】
別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野で周知である。米国特許第５，５８５，０８９号および同第５，６９３，７６２号を参照のこと。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト供給源由来のそのヒト化抗体に１以上のアミノ酸残基が導入されている。ヒト化は、例えば、齧歯目の相補的決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部を、ヒト抗体の対応する領域で置換することによる、当該分野で記載される方法（Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６）によって、行われ得る。
【０１６３】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドを結合する、ヒト抗体もまた、本発明に含まれる。内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体のレパートリーを産生し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス）を使用して、このような抗体は、必要に応じてキャリアに結合体化されたＩＦＮ−Ｌポリペプチド抗原（すなわち、少なくとも６個連続するアミノ酸を有する）で免疫することによって産生される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：２５５１−２５５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、１９９３、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．７：３３を参照のこと。１つの方法において、このようなトランスジェニック動物は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をその中でコードする内因性遺伝子座を不活化し、ヒト重鎖および軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座を、そのゲノム内に導入することによって産生される。次いで、部分的に改変された動物（完全未満の補体の改変を有する）を交雑育種して、所望の免疫系の改変の全てを有する動物を得る。免疫原を投与した場合、これらのトランスジェニック動物は、これらの抗原に免疫特異的な可変領域を含む、（例えば、マウスよりもむしろ）ヒトのアミノ酸配列を有する抗体を産生する。ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８およびＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９２６を参照のこと。さらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９１／２４５、ＰＣＴ／ＧＢ８９／０１２０７、ならびにＥＰ５４６０７３Ｂ１およびＥＰ５４６０７３Ａ１に記載される。ヒト抗体はまた、本明細書中に記載されるような、宿主細胞における組換えＤＮＡの発現またはハイブリドーマ細胞における発現によって産生される。
【０１６４】
代替的な実施形態において、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーにおいて生成され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１）。これらのプロセスは、糸状バクテリオファージの表面上での抗体レパートリーのディスプレイ、引き続いて、選択された抗原に対するそれらの結合によるファージの選択によって免疫選択を模倣する。１つのこのような技術は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１７３６４（これは、このようなアプローチを用いたＭＰＬ−レセプターおよびｍｓｋ−レセプターに対する高親和性でかつ機能的アゴニスト抗体の単離を記載する）に記載される。
【０１６５】
キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、およびヒト化抗体は、代表的には、組換え方法により産生される。これらの抗体をコードする核酸は、宿主細胞に導入され、そして本明細書中に記載される材料および方法を用いて発現される。好ましい実施形態において、抗体は、哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）において発現される。モノクローナル（例えば、ヒト）抗体は、宿主細胞における組換えＤＮＡの発現によるか、または本明細書中に記載のハイブリドーマ細胞における発現により産生され得る。
【０１６６】
本発明の抗ＩＦＮ−Ｌ抗体は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの検出および定量について、任意の公知のアッセイ方法（例えば、競合結合アッセイ、直接的サンドイッチアッセイおよび間接的サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイ（Ｓｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７））において用いられ得る。抗体は、使用されるアッセイ方法に適切な親和性でＩＦＮ−Ｌポリペプチドを結合する。
【０１６７】
診断適用に関しては、特定の実施形態において、抗ＩＦＮ−Ｌ抗体は、代表的には検出可能な部分で標識され得る。この検出可能な部分は、直接的または間接的のいずれかで検出可能なシグナルを生じ得る任意の部分である。例えば、検出可能な部分は、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、９９Ｔｃ、１１１Ｉまたは６７Ｇａ）、蛍光化合物もしくは化学発光化合物（例えば、フルオロセインイソチオシアネート、ローダミンもしくはルシフェリン）；または酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたは西洋ワサビベルオキシダーゼ）（Ｂａｙｅｒら，１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１８４：１３８−１６３）であり得る。
【０１６８】
競合結合アッセイは、限定された量の抗ＩＦＮ−Ｌ抗体との結合について試験サンプル分析物（ＩＦＮ−Ｌポリペプチド）と競合する標識された標準物質（例えば、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドまたはその免疫学的に反応性の部分）の能力に依存する。試験サンプル中のＩＦＮ−Ｌポリペプチドの量は、この抗体に結合する標準物質の量に逆比例する。結合する標準物質の量の測定を容易にするために、抗体は、代表的には、競合の前または後に不溶化され、その結果、この抗体に結合する標準物質および分析物は、結合しないままの標準物質および分析物から簡単に分離され得る。
【０１６９】
サンドイッチイムノアッセイは、代表的には、２つの抗体（各々、検出され、そして／または定量されるタンパク質の異なる免疫原性部分（すなわち、エピトープ）に結合し得る）の使用に関する。サンドイッチアッセイにおいて、この試験サンプル分析物は、代表的には、固体支持体に固定化された第１の抗体に結合され、その後、第２の抗体が分析物に結合し、このようにして不溶性の３部分で構成される複合体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照のこと。第２の抗体は、それ自体検出可能な部分で標識され得るか（例えば、直接サンドイッチアッセイ）、または検出可能な部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定され得る（間接サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１つの型は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）であり、この場合、この検出可能な部分は酵素である。
【０１７０】
抗ＩＦＮ−Ｌ抗体を含む、選択的結合因子はまた、インビボイメージングのために有用である。検出可能な部分で標識した抗体は、動物に、好ましくは、血流に投与され得、そしてこの宿主においてこの標識した抗体の存在および位置がアッセイされる。この抗体は、核磁気共鳴、電離放射線、または当該分野で公知の他の検出手段のいずれかによって、動物中で検出可能である任意の部分で標識され得る。
【０１７１】
抗体を含む、本発明の選択的結合因子は、治療剤として使用され得る。これらの治療剤は、一般に、アゴニストまたはアンタゴニストであり、これらは、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を、それぞれ増強または減少させるかのいずれかである。１つの実施形態において、本発明のアンタゴニスト抗体は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドに特異的に結合し得、そしてインビボまたはインビトロでＩＦＮ−Ｌポリペプチドの機能活性を阻害または排除し得る、抗体またはその結合フラグメントである。好ましい実施形態において、選択的結合因子（例えば、アンタゴニスト抗体）は、少なくとも約５０％、および好ましくは、少なくとも約８０％で、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの機能活性を阻害する。別の実施形態において、選択的結合因子は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチド結合パートナー（リガンドまたはレセプター）と相互作用し得、これにより、インビトロまたはインビボにおいてＩＦＮ−Ｌポリペプチド活性を阻害または排除し得る、抗ＩＦＮ−Ｌポリペプチド抗体であり得る。アゴニストおよびアンタゴニストの抗ＩＦＮ−Ｌポリペプチド抗体を含む、選択的結合因子は、当該分野で周知であるスクリーニングアッセイによって同定される。
【０１７２】
本発明はまた、ＩＦＮ−Ｌ選択的結合因子（例えば、抗体）を含むキットおよび生物学的サンプル中でＩＦＮ−Ｌポリペプチドレベルを検出するのに有用である他の試薬に関する。このような試薬としては、検出可能な標識、血清ブロック剤、ポジティブコントロールサンプルおよびネガティブコントロールサンプル、ならびに検出試薬が挙げられ得る。
【０１７３】
（マイクロアレイ）
ＤＮＡマイクロアレイ技術は、本発明に従って利用され得ることが、理解される。ＤＮＡマイクロアレイは、固体支持体（例えば、ガラス）上に配置された核酸の小型高密度アレイである。このアレイ内の各細胞またはエレメントは、相補的核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）とハイブリダイゼーションするための標識として作用する、単一の核酸種の複数のコピーを含む。ＤＮＡマイクロアレイ技術を使用する発現プロファイリングにおいて、ｍＲＮＡは、最初に細胞サンプルまたは組織サンプルから抽出され、次いで、酵素標識されたｃＤＮＡから蛍光標識されたｃＤＮＡに変換される。この材料は、マイクロアレイにハイブリダイズされ、そして未結合のｃＤＮＡは、洗浄により除去される。次いで、このアレイ上に示された個々の遺伝子の発現は、各標的核酸分子に特異的に結合する標識されたｃＤＮＡの量を定量することによって視覚化される。この方法において、数千の遺伝子の発現が、生物学的材料の単一サンプルから、ハイスループットの並行様式で定量され得る。
【０１７４】
このハイスループット発現プロファイリングは、本発明のＩＦＮ−Ｌ分子に関連して広範の適用を有し、これには、以下が挙げられるが、これに限定されない：治療のための標的として、ＩＦＮ−Ｌ疾患関連遺伝子の同定および確認；関連するＩＦＮ−Ｌ分子およびそのインヒビターの分子毒性；臨床試験のための集団の階層化および代替マーカーの生成；ならびにハイスループットスクリーニングにおいて、選択化合物の同定を援助することによって、関連するＩＦＮ−Ｌポリペプチド小分子薬物探索を増強すること。
【０１７５】
（化学的誘導体）
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの化学的に改変された誘導体は、開示が本明細書中に記載される場合、当業者によって調製され得る。ＩＦＮ−Ｌポリペプチド誘導体は、このポリペプチドへ天然に結合する分子の型または位置のいずれかで、異なる様式で改変される。誘導体は、天然に結合した化学的な基の１以上の除去によって形成される分子を含み得る。配列番号２、もしくは配列番号５、または他のＩＦＮ−Ｌポリペプチドのいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドは、１以上のポリマーの共有結合によって改変され得る。例えば、選択されたポリマーは、代表的に水溶性であり、その結果、結合するタンパク質は、水環境（例えば、生理学的な環境）下で沈殿しない。ポリマーの混合物が、適切なポリマーの範囲内に含まれる。好ましくは、最終生成物の調製の治療学的使用のために、このポリマーは、薬学的に受容可能である。
【０１７６】
このポリマーの各々は、任意の分子量を有し得、そして分枝または非分枝であり得る。このポリマーの各々は、代表的に、約２ｋＤａと約１００ｋＤａとの間の平均分子量を有する（この用語「約（およそ）」は、水溶性ポリマーの調製の際に、上記の分子量より多いか、上記の分子量よりいくらか少ない重量を有することを示す）。各ポリマーの平均分子量は、好ましくは、約５ｋＤａと約５０ｋＤａとの間、より好ましくは、約１２ｋＤａと約４０ｋＤａとの間、そして最も好ましくは、約２０ｋＤａと約３５Ｄａとの間である。
【０１７７】
適切な水溶性ポリマーまたはその混合物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｎ連結炭水化物またはＯ連結炭水化物、糖、リン酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（これは、モノポリエチレングリコール（Ｃ１−Ｃ１０）、アルコキシポリエチレングリコール、またはアリールオキシポリエチレングリコールを含む、タンパク質を誘導体化するために使用されたＰＥＧの形態を含む）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン（例えば、低分子量（例えば、約６ｋＤのデキストラン））、セルロース、または他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリジン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシ／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、およびビニルアルコール。共有結合したＩＦＮ−Ｌポリペプチドマルチマーを調製するために使用され得る、二官能性架橋分子もまた、本発明に含まれる。
【０１７８】
一般に、化学的誘導は、活性化したポリマー分子とタンパク質を反応させるために使用される任意の適切な条件下で、実施され得る。ポリペプチドの化学的誘導体を調製するための方法は、一般的に、以下の工程を包含する：（ａ）配列番号２もしくは配列番号５、または他のＩＦＮ−Ｌポリペプチドのいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドが、１以上のポリマー分子に結合する条件下で、活性化したポリマー分子（例えば、ポリマー分子の反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）とポリペプチドを反応させる工程、ならびに（ｂ）反応生成物を得る工程。最適の反応条件は、既知のパラメータおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、ポリマー分子のタンパク質に対する比が大きくなるほど、結合したポリマー分子の割合も大きくなる。１つの実施形態において、ＩＦＮ−Ｌポリペプチド誘導体は、アミノ末端に単一ポリマー分子部分を有する。例えば、米国特許第５，２３４，７８４号を参照のこと。
【０１７９】
ポリペプチドのペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、当該分野で公知の任意のペグ化反応を使用して特異的に実施され得る。このような反応は、例えば、以下の参考文献に記載されている：Ｆｒａｎｃｉｓら，１９９２，Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ３：４−１０；欧州特許第０１５４３１６号および０４０１３８４号；ならびに米国特許第４，１７９，３３７号。例えば、ペグ化は、本明細書中に記載されるように、反応性ポリエチレングリコール分子（または、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施され得る。アシル化反応のために、選択されたポリマーは、単一の反応性エステル基を有さねばならない。還元的アルキル化について、選択されたポリマーは、単一の反応性アルデヒド基を有さねばならない。例えば、反応性アルデヒドは、水溶性であるポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドか、またはモノＣ１−Ｃ１０アルコキシもしくはそのアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。
【０１８０】
別の実施形態において、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドは、ビオチンに化学的に結合され得る。次いで、このビオチン／ＩＦＮ−Ｌポリペプチド分子は、アビジンに結合され得、その結果、４価のアビジン／ビオチン／ＩＦＮ−Ｌポリペプチド分子が得られる。ＩＦＮ−Ｌポリペプチドはまた、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）またはトリニトロフェノール（ＴＮＰ）に共有結合され得、そして得られた結合体は、抗ＤＮＰまたは抗ＴＮＰ−ＩｇＭで沈澱されて、１０価の十量体の結合体を形成する。
【０１８１】
一般に、本発明のＩＦＮ−Ｌポリペプチド誘導体の投与によって、緩和または調節され得る条件は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドについて本明細書中に記載されたものを含む。しかし、本明細書中に開示されるＩＦＮ−Ｌポリペプチド誘導体は、非誘導体化分子と比較した場合、さらなる活性、増強もしくは減少した生物学的活性、または他の特徴（例えば、増加または減少した半減期）を有し得る。
【０１８２】
（遺伝子操作された非ヒト動物）
マウス、ラット、または他のげっ歯類；ウサギ、ヤギ、ヒツジ、または他の家畜のような非ヒト動物が、さらに本発明の範囲内に含まれ、ここで、ネイティブなＩＦＮ−Ｌポリペプチドをコードする遺伝子は崩壊（すなわち「ノックアウト」）され、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの発現レベルは、有意に減少するか、または完全に破壊される。このような動物は、米国特許第５，５５７，０３２号に記載されるような技術および方法を使用して調製され得る。
【０１８３】
本発明は、マウス、ラット、または他のげっ歯類；ウサギ、ヤギ、ヒツジ、または他の家畜のような非ヒト動物をさらに含み、この動物のネイティブな形態のＩＦＮ−Ｌ遺伝子または異種ＩＦＮ−Ｌ遺伝子のいずれかが、これらの動物によって過剰発現され、これによって、「トランスジェニック」動物を作製する。このようなトランスジェニック動物は、米国特許第５，４８９，７４３号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２８１２２号に記載されるような周知の方法を使用して調製され得る。
【０１８４】
本発明は、非ヒト動物をさらに含み、ここで、本発明の１以上のＩＦＮ−Ｌポリペプチドのプロモーターは、（例えば、相同的な組換え方法を使用することによって）活性化されるかまたは不活性化されるかのいずれかであり、１以上のネイティブなＩＦＮ−Ｌポリペプチドの発現のレベルを改変する。
【０１８５】
これらの非ヒト動物は、薬物候補物スクリーニングのために使用され得る。このようなスクリーニングにおいて、動物での薬物候補物の影響が測定され得る。例えば、薬物候補物は、ＩＦＮ−Ｌ遺伝子の発現を減少または増加させ得る。特定の実施形態において、産生されるＩＦＮ−Ｌポリペプチドの量は、動物を薬物候補物に曝露した後に測定され得る。さらに、特定の実施形態において、動物での薬物候補物の実際の影響を検出し得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現により、疾患状態または病理学的状態を生じ得るか、あるいは疾患状態または病理学的状態と関連し得る。このような場合において、遺伝子の発現を減少させる薬物候補物の能力または病理学的状態を防止または阻害する能力を試験し得る。別の例において、ポリペプチドのフラグメントのような、特定の代謝産物の産生は、疾患状態または病理学的状態を生じるか、あるいは疾患状態または病理学的状態と関連する。このような場合、このような代謝産物の産生を減少させる薬物候補物の能力または病理学的状態を防止または阻害する能力を試験し得る。
【０１８６】
（ＩＦＮ−Ｌポリペプチド活性の他の調節因子についてのアッセイ）
いくつかの状態において、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの活性の調節因子である分子（すなわち、アゴニストまたはアンタゴニスト）を同定することが所望され得る。ＩＦＮ−Ｌポリペプチドを調節する天然または合成分子は、本明細書中に記載されるように、１以上のスクリーニングアッセイを使用して同定され得る。このような分子は、エキソビボ様式またはインビトロ様式のいずれかで、注射、または経口送達、移植デバイスなどによって投与され得る。
【０１８７】
「試験分子」とは、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの活性を調節する（すなわち、増加または減少させる）能力に関する評価の下にある分子を言う。最も一般的に、試験分子は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドと直接的に相互作用する。しかし、試験分子はまた、例えば、ＩＦＮ−Ｌ遺伝子発現に影響を与えることによってか、またはＩＦＮ−Ｌポリペプチド結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）に結合することによって、ＩＦＮ−Ｌポリペプチド活性を間接的に調節し得ることがまた、意図される。１つの実施形態において、試験分子は、少なくとも約１０−６Ｍ、好ましくは、約１０−８Ｍ、より好ましくは、約１０−９Ｍ、そしてさらにより好ましくは約１０−１０Ｍの親和性定数でＩＦＮ−Ｌポリペプチドと結合する。
【０１８８】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドと相互作用する化合物を同定するための方法は、本発明によって包含される。特定の実施形態において、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドは、試験分子とＩＦＮ−Ｌポリペプチドとの相互作用が可能な条件下で、試験分子と共にインキュベートされ、そして相互作用の範囲が測定される。試験分子は、実質的に精製された形態または粗製の混合物中でスクリーニングされ得る。
【０１８９】
特定の実施形態において、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドアゴニストまたはアンタゴニストは、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、または小分子量の分子であり得、これらは、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドと相互作用して、その活性を調節する。ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの発現を調節する分子は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドをコードする核酸と相補的であるかまたはＩＦＮ−Ｌポリペプチドの発現を指向または制御する核酸配列に対して相補的である核酸分子を含み、そしてこの分子は、発現のアンチセンス調節因子として作用する。
【０１９０】
一旦、試験化合物がＩＦＮ−Ｌポリペプチドと相互作用するとして同定されると、この分子は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチド活性を増加または減少させるその能力についてさらに評価され得る。試験分子とＩＦＮ−Ｌポリペプチドとの相互作用の測定は、いくつかの形式で実施され得、これには、細胞ベースの結合アッセイ、膜結合アッセイ、液相アッセイ、および免疫アッセイが挙げられる。一般に、試験分子は、特定の期間、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドと共にインキュベートされ、そしてＩＦＮ−Ｌポリペプチド活性が、生物学的活性を測定するための１つ以上のアッセイによって決定される。
【０１９１】
試験分子とＩＦＮ−Ｌポリペプチドとの相互作用はまた、免疫アッセイにおいて、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用して直接的にアッセイされ得る。あるいは、本明細書中に記載されるようなエピトープタグを含むＩＦＮ−Ｌポリペプチドの改変形態は、溶液および免疫アッセイ中で使用され得る。
【０１９２】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドが、結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）との相互作用を介して、生物学的活性を示す場合、種々のインビトロアッセイが、対応する結合パートナー（例えば、選択的結合因子、レセプター、またはリガンド）へのＩＦＮ−Ｌポリペプチドの結合を測定するために使用され得る。これらのアッセイは、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドのその結合パートナーに対する結合の速度および／または程度を増加または減少させる試験分子の能力に関して、この試験分子をスクリーニングするために使用され得る。１アッセイにおいて、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドは、マイクロタイタープレートのウェル中で免疫化される。次いで、放射標識したＩＦＮ−Ｌポリペプチド結合パートナー（例えば、ヨウ素化したＩＦＮ−Ｌポリペプチド結合パートナー）および試験化合物は、このウェルに、一時に一方をか（いずれかの順序で）または同時に、添加され得る。インキュベーション後に、このウェルは洗浄され、そしてシンチレーション計数器を使用して、放射性が計数され、結合パートナーがＩＦＮ−Ｌポリペプチドに結合する程度が決定され得る。代表的に、分子は、濃度範囲にわたって試験され、そして試験アッセイの１以上のエレメントを欠く一連のコントロールウェルは、結果の評価の正確性のために使用され得る。この方法の代わりは、タンパク質の「位置」を逆にする工程を逆にする工程（すなわち、マイクロタイタープレートウェルに対してＩＦＮ−Ｌポリペプチド結合パートナーを固定化し、試験分子および放射標識したＩＦＮ−Ｌポリペプチドとともにインキュベートし、そしてＩＦＮ−Ｌポリペプチド結合の程度を決定する工程）を包含する。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１８章（Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．ならびにＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ １９９５）を参照のこと。
【０１９３】
放射性標識に対する代替として、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドまたはその結合パートナーは、ビオチンと結合体化され得、そしてビオチン化されたタンパク質の存在が、次いで、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）（これらは、比色定量的に検出され得る））に結合したストレプトアビジンを使用して検出され得るか、またはストレプトアビジンの蛍光タグ化によって検出され得る。ＩＦＮ−ＬポリペプチドまたはＩＦＮ−Ｌポリペプチド結合パートナー（これらは、ビオチンに結合されている）に対する抗体はまた、ＡＰまたはＨＲＰに連結した酵素連結ストレプトアビジンとの複合体のインキュベーション後に、検出目的のために使用され得る。
【０１９４】
ＩＦＮ−ＬポリペプチドまたはＩＦＮ−Ｌポリペプチド結合パートナーはまた、アガロースビーズ、アクリルビーズ、または他の型のこのような不活性な固相基材への付着によって固定化され得る。基材−タンパク質複合体は、相補タンパク質および試験化合物を含む溶液内に配置され得る。インキュベーション後、これらのビーズは、遠心分離によって沈澱され得、そしてＩＦＮ−Ｌポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合の量が、本明細書中に記載の方法を使用して評価され得る。あるいは、基材−タンパク質複合体は、試験分子および相補タンパク質がカラムを通過されることによって、カラム内に固定化され得る。ＩＦＮ−Ｌポリペプチドとその結合パートナーとの間の複合体の形成が、次いで、本明細書中に記載の技術（例えば、放射性標識または抗体結合）のいずれかを使用して評価され得る。
【０１９５】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチド結合タンパク質とＩＦＮ−Ｌポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少させる試験分子を同定するために有用な別のインビトロアッセイは、表面プラズモン共鳴検出器システム（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））である。ＢＩＡｃｏｒｅシステムは、製造業者によって特定されるように利用される。このアッセイは、本質的に、ＩＦＮ−ＬポリペプチドまたはＩＦＮ−Ｌポリペプチド結合パートナーのいずれかの、デキストランでコートされたセンサーチップ（これは、検出器に位置する）への共有結合を含む。次いで、この試験化合物および他の相補タンパク質が、同時にかまたは連続的にかのいずれかで、センサーチップを含むチャンバーに注入され得る。結合する相補タンパク質の量は、センサーチップのデキストランコート側面と物理的に結合する分子量の変化に基づいて評価され得、この分子量の変化は、検出器システムによって測定される。
【０１９６】
いくつかの場合において、２つ以上の試験化合物を一緒に、ＩＦＮ−ＬポリペプチドとＩＦＮ−Ｌポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少させるそれらの能力について評価することが望ましくあり得る。これらの場合において、本明細書中に記載のアッセイは、第一の試験化合物と同時にか、またはそれに続いてのいずれかで、このようなさらなる試験化合物を添加することによって容易に改変され得る。このアッセイにおける工程の残りは、本明細書中に記載される。
【０１９７】
インビトロアッセイ（例えば、本明細書中に記載されるもの）は、ＩＦＮ−ＬポリペプチドとＩＦＮ−Ｌポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成に対する影響について、多数の化合物をスクリーニングするために、有利に使用され得る。これらのアッセイは、ファージディスプレイ、合成ペプチド、および化学合成ライブラリーにおいて生成された化合物をスクリーニングするために、自動化され得る。
【０１９８】
ＩＦＮ−ＬポリペプチドとＩＦＮ−Ｌポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少する化合物はまた、ＩＦＮ−ＬポリペプチドまたはＩＦＮ−Ｌポリペプチド結合パートナーのいずれかを発現する細胞および細胞株を使用して、細胞培養物においてスクリーニングされ得る。細胞および細胞株は、任意の哺乳動物から得ることができるが、好ましくは、ヒト、または他の霊長類、イヌ類またはげっ歯類の供給源由来である。ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの、ＩＦＮ−Ｌポリペプチド結合パートナーを発現する細胞への、その表面での結合は、試験化合物の存在または非存在下で評価され、そして結合の程度が、例えば、ＩＦＮ−Ｌポリペプチド結合パートナーに対するビオチン化抗体を使用するフローサイトメトリーによって決定され得る。細胞培養アッセイは、本明細書中に記載されるタンパク質結合アッセイにおいて、陽性であるとスコア付けされる化合物をさらに特徴付けするために有利に使用され得る。
【０１９９】
細胞培養物はまた、薬物候補物の影響をスクリーニングするために使用され得る。例えば、薬物候補物は、ＩＦＮ−Ｌ遺伝子の発現を減少または増加させ得る。特定の実施形態において、生成されるＩＦＮ−ＬポリペプチドまたはＩＦＮ−Ｌポリペプチドフラグメントの量は、細胞培養物の薬物候補物への曝露の後に測定され得る。特定の実施形態において、細胞培養物への薬物候補物の実質的な影響が検出され得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は、細胞培養物への特定の影響を有し得る。このような場合に、遺伝子の発現を増加または減少させる薬物候補物の能力、または細胞培養物に対する特定の影響を防害または阻害するその能力が試験され得る。他の例において、特定の代謝産物（例えば、ポリペプチドのフラグメント）の生成が、疾患または病的状態を生じ得るか、またはそれらと関連し得る。このような場合、細胞培養物におけるこのような代謝産物の生成を減少する薬物候補物の能力が試験され得る。
【０２００】
（内部移行タンパク質）
ｔａｔタンパク質配列（ＨＩＶ由来）が、タンパク質を細胞内に内部移行させるために、使用され得る。例えば、Ｆａｌｗｅｌｌら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：６６４−６８を参照のこと。例えば、ＨＩＶ ｔａｔタンパク質の１１アミノ酸の配列（Ｙ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ；配列番号１８）（「タンパク質形質導入ドメイン」、またはＴＡＴ ＰＤＴを称される）は、細胞の細胞質膜および核膜を横切る送達を媒介するとして記載されている。Ｓｃｈｗａｒｚｅら，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５６９−７２；およびＮａｇａｈａｒａら，１９９８，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：１４４９−５２を参照のこと。これらの手順において、ＦＩＴＣ構築物（ＦＩＴＣ標識Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ；配列番号１９）（これは、腹腔内投与に続いて組織を貫通する）が調製され、そしてこのような構築物の細胞への結合が、蛍光活性化分類（ＦＡＣＳ）分析によって検出される。ｔａｔ−β−ｇａｌ融合タンパク質で処置された細胞は、β−ｇａｌ活性を示す。注入に続いて、このような構築物の発現が、多くの組織（肝臓、腎臓、肺、心臓および脳組織を含む）において検出され得る。このような構築物は、細胞に入るためにある程度広がり、そういうものとして、細胞内への移入に続いて、再折り畳みを必要とし得ると考えられる。
【０２０１】
従って、ｔａｔタンパク質配列は、所望のポリペプチドを細胞に内部移入させるために使用され得ることが理解される。例えば、ｔａｔタンパク質配列を使用して、ＩＦＮ−Ｌアンタゴニスト（例えば、抗ＩＦＮ−Ｌ選択的結合因子、低分子、可溶性レセプター、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、ＩＦＮ−Ｌ分子の活性を阻害するために、細胞内投与され得る。本明細書中で使用される場合、用語「ＩＦＮ−Ｌ分子」は、本明細書中に記載されるような、ＩＦＮ−Ｌ核酸分子およびＩＦＮ−Ｌポリペプチドの両方をいう。所望ならば、ＩＦＮ−Ｌタンパク質自体はまた、これらの手順を使用して、細胞に内部投与され得る。Ｓｔｒａｕｓ，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１４６６−６７をまた参照のこと。
【０２０２】
（ＩＦＮ−Ｌポリペプチドを用いた細胞供給源の同定）
本発明の特定の実施形態に従って、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドと関連する特定の細胞型の供給源を決定し得ることが有用であり得る。例えば、適切な治療を選択する際の補助として疾患または病的状態の起源を決定することが有用であり得る。特定の実施形態において、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドをコードする核酸は、プローブとして使用されて、このようなプローブを用いて細胞の核酸をスクリーニングすることによって、本明細書中に記載の細胞を同定し得る。他の実施形態において、抗ＩＦＮ−Ｌポリペプチド抗体を使用して、細胞におけるＩＦＮ−Ｌポリペプチドの存在について試験し得、従って、このような細胞が本明細書中に記載される型の細胞か否かを決定し得る。
【０２０３】
（ＩＦＮ−Ｌポリペプチド組成物および投与）
治療組成物は、本発明の範囲内である。このようなＩＦＮ−Ｌポリペプチド薬学的組成物は、治療有効量のＩＦＮ−ＬポリペプチドまたはＩＦＮ−Ｌ核酸分子を、投与の様式と適合するように選択された薬学的にまたは生理学的に受容可能な処方剤との混合物中に、含み得る。薬学的組成物は、治療有効量の１以上のＩＦＮ−Ｌポリペプチド選択的結合因子を、投与の様式と適合するように選択された薬学的にまたは生理学的に受容可能な処方剤との混合物中に、含み得る。
【０２０４】
受容可能な処方物材料は、好ましくは、使用される投薬量および濃度で、レシピエントに対して非毒性である。
【０２０５】
薬学的組成物は、例えば、ｐＨ、浸透圧、粘度、清澄性、色、等張性、におい、無菌性、安定性、解離または放出の速度、吸着、または組成物の浸透を改変、維持または保存するための処方物材料を含み得る。適切な処方物材料としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン）、抗菌剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｓｕｌｆｉｔｅ））、緩衝液（例えば、ホウ酸塩、炭酸水素塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、または他の有機酸）、バルキング剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）、キレート化剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、複合体化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）、フィラー、単糖類、二糖類、および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）、着色剤、味付け剤および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）、保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素）、溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール）、糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、懸濁剤、表面活性剤または湿潤剤（例えば、プルオニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルビテート（例えば、ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０またはｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０）；トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロールまたはチロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ））、安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）、張度増強剤（例えば、ハロゲン化アルカリ金属（好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）、またはマンニトール、ソルビトール）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的なアジュバント。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０を参照のこと。
【０２０６】
最適な薬学的組成物は、当業者によって、例えば、意図される投与経路、送達形式、および所望の投薬量に依存して決定される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，前出を参照のこと。このような組成物は、ＩＦＮ−Ｌ分子の、物理的な状態、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボクリアランスの速度に影響し得る。
【０２０７】
薬学的組成物における主要なビヒクルまたはキャリアは、本来水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、注入のための適切なビヒクルまたはキャリアは、水、生理学的な生理食塩水溶液、または人工脳脊髄液であり、おそらく非経口投与のための組成物において一般的な他の材料で補充されている。中性の緩衝化生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。他の例示的な薬学的組成物は、約ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝液または約ｐＨ４．０−５．５の酢酸塩緩衝液を含み、これはさらに、ソルビトールまたは適切な置換物を含み得る。本発明の１つの実施形態において、ＩＦＮ−Ｌポリペプチド組成物は、所望の程度の純度を有する選択された組成物を、任意の処方薬剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，前出）と混合することによって、凍結乾燥ケークまたは水溶液の形態で、保存のために調製され得る。さらに、ＩＦＮ−Ｌポリペプチド産物は、スクロースのような適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として処方され得る。
【０２０８】
このＩＦＮ−Ｌポリペプチドの薬学的組成物は、非経口送達のために選択され得る。あるいは、これらの組成物は、吸入または消化管を介する送達（例えば、経口的に）のために、選択され得る。このような薬学的に受容可能な組成物の調製は、当該分野の技術内にある。
【０２０９】
処方成分が、投与の部位に受容可能な濃度で存在する。例えば、緩衝液は、生理学的ｐＨまたは多少より低いｐＨ（典型的に、約５〜約８のｐＨ範囲内）にこの組成物を維持するために使用される。
【０２１０】
非経口投与が意図される場合、本発明における使用のための治療組成物は、薬学的に受容可能なビヒクルに所望のＩＦＮ−Ｌ分子を含む発熱物質を含まない非経口的に受容可能な水溶液の形態であり得る。非経口注入のために特に適切なビヒクルは、滅菌蒸留水であり、ここで、ＩＦＮ−Ｌ分子が、滅菌で、等張溶液として処方され、適切に保存される。なお別の調製は、所望の分子と、薬剤（例えば、注入可能なミクロスフィア、生体侵食（ｂｉｏ−ｅｒｏｄｉｂｌｅ）薬剤、ポリマー化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸のような）、ビーズまたはリポソーム）との処方物に関係し、これは、次いで蓄積注射を介して送達され得る産物の制御されたまたは持続された放出を提供する。ヒアルロン酸がまた、使用され得、そしてこれは、循環において、維持された持続時間を促進する効果を有し得る。所望の分子の導入のための他の適切な手段は、移植可能な薬物送達デバイスを含む。
【０２１１】
１つの実施形態において、薬学的組成物は、吸入のために処方され得る。例えば、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドは、吸入のための乾燥粉末として処方され得る。ＩＦＮ−Ｌポリペプチドまたは核酸分子の吸入溶液はまた、エアロゾル送達のための噴霧体と共に処方され得る。なお別の実施形態において、溶液は、噴霧され得る。肺投与が、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２００６９にさらに記載され、これは化学的に改変されたタンパク質の肺送達を記載する。
【０２１２】
特定の処方物が、経口投与され得ることがまた意図される。本発明の１つの実施形態において、このよう様式で投与されるＩＦＮ−Ｌポリペプチドが、固体投薬形態（例えば、錠剤またはカプセル）の調合において慣用的に使用されるキャリアを伴うか、または伴わず処方され得る。例えば、カプセルは、バイオアベイラビリティーが最大化され、そして前全身分解が最小化される場合、胃腸管内での点で処方物の活性部分を放出するように設計され得る。さらなる薬剤が、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの吸収を容易にするために含まれ得る。希釈剤、味付け剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、およびバインダーがまた、使用され得る。
【０２１３】
別の薬学的組成物は、錠剤の製造に適切な非毒性賦形剤との混合物中に、有効量のＩＦＮ−Ｌポリペプチドを含み得る。錠剤を滅菌水または別の適切なビヒクルに溶解することによって、溶液が、単位用量形態で調製され得る。適切な賦形剤としては以下を含むが、これらに限定されない：不活性な希釈剤（炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウム、ラクトース、あるいはリン酸カルシウム）；または結合剤（例えば、デンプン、ゼラチンまたはアラビアゴム）；あるいは潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク）。
【０２１４】
さらなるＩＦＮ−Ｌポリペプチドの薬学的組成物は、当業者に明らかであり、持続または制御送達処方物中にＩＦＮ−Ｌポリペプチドを含む処方物を含む。種々の他の持続または制御送達手段（例えば、リポソームキャリア、生体侵食マイクロスフィアあるいは多孔性ビーズおよび蓄積注射）を処方するための技術はまた、当業者に公知である。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９（これは、薬学的組成物の送達のための多孔性ポリマー性ミクロ粒子の制御放出を記載する）を参照のこと。
【０２１５】
徐放性調製物のさらなる例としては、成形された物品の形態（例えば、フィルム、またはマイクロカプセル）の半透過性ポリマーマトリックスを含む。徐放性マトリックスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許第０５８４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら，前出）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３９８８号）。徐放性組成物はまた、リポソームを含み得、これは、当該分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって調製され得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８−９２；および欧州特許第０３６６７６号、同第０８８０４６号、および同第１４３９４９号を参照のこと。
【０２１６】
インビボ投与のために使用されるＩＦＮ−Ｌの薬学的組成物は、代表的に滅菌でなければならない。このことは、滅菌濾過膜を介する濾過によって達成され得る。組成物が、凍結乾燥される場合、この方法を使用する滅菌は、凍結乾燥および再構成の前に、またはそれに続いてのいずれかで実施され得る。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥された形態または溶液で保存され得る。さらに、非経口組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器（例えば、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアル）内に配置される。
【０２１７】
一旦、薬学的組成物が処方されると、それは、滅菌バイアル中に溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、または脱水和粉末または凍結乾燥粉末として保存され得る。このような処方物は、すぐに使用できる形態または投与の前に再構成を必要とする形態（凍結乾燥された形態）のいずれかで保存され得る。
【０２１８】
特定の実施形態において、本発明は、単一用量投与単位を生成するためのキットに関する。このキットは、各々、乾燥タンパク質を有する第一の容器および水性処方物を有する第二の容器の両方を含み得る。また、本発明の範囲内には、単一および多チャンバーの予め充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジおよび分散シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含むキットが含まれる。
【０２１９】
治療的に使用されるＩＦＮ−Ｌの薬学的組成物の有効量は、例えば、治療の内容および目的に依存する。当業者は、処置のための適切な投薬レベルが、従って、送達される分子、ＩＦＮ−Ｌ分子が使用されている指標、投与の経路、および患者のサイズ（体重、体表面、または器官の大きさ）および状態（年齢および一般的な健康）に、部分的に依存して変化することを理解する。従って、臨床家は、最適な治療効果を得るために、投薬量を力価決定し（ｔｉｔｅｒ）、投与経路を改変し得る。代表的な投薬量は、上記の因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上までの範囲であり得る。他の実施形態において、投薬量は、０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまで；または１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまで；または５μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲であり得る。
【０２２０】
投薬の頻度は、使用される処方物中でのＩＦＮ−Ｌ分子の薬物動態学のパラメーターに依存する。典型的に、臨床家は、所望の効果を達成する投薬量に達するまで組成物を投与する。従って、組成物は、経時的な単一用量として、２以上の用量（これは、同量の所望の分子を含んでも、含まなくてもよい）として、あるいは移植デバイスまたはカテーテルを介する連続的な注入として、投与され得る。適切な投薬量のさらなる改良は、当業者によって慣用的になされ、そしてそれらによって慣用的に実施される課題の範囲内である。適切な投薬量は、適切な用量−応答データの使用を介して確認され得る。
【０２２１】
薬学的組成物の投与の経路は、以下のような公知の方法と一致する：経口的に；静脈内、腹腔内、脳内（実質内の）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、または病巣内の経路による注入を介して；徐放性系によって；または移植デバイスによって。所望される場合、これらの組成物は、ボーラス注射によって投与され得るか、または注入によって連続的に投与され得るか、または移植デバイスによって投与され得る。
【０２２２】
あるいはまたはさらに、組成物は、その上に所望の分子が吸収されるかまたはカプセル化される膜、スポンジ、または他の適切な材料の移植を介して局所的に投与され得る。移植デバイスが使用される場合、このデバイスは、任意の適切な組織または器官に移植され得、そして所望の分子の送達は、拡散、時限放出ボーラスまたは連続的な投与を介し得る。
【０２２３】
いくつかの場合において、エキソビボ様式において、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの薬学的組成物を使用することが所望され得る。このような例において、患者から除去された細胞、組織、または器官は、これらの細胞、組織、または器官が引き続いて患者に移植して戻された後にＩＦＮ−Ｌポリペプチドの薬学的組成物に曝露される。
【０２２４】
他の場合において、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドは、本明細書中に記載される方法を使用して、遺伝的に操作されて、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドを発現および分泌する特定の細胞を移植することによって送達され得る。このような細胞は、動物またはヒト細胞であり得、そして自己、異種、または外因性の細胞であり得る。必要に応じて、細胞は、不死化され得る。免疫学的応答の機会を減少するために、細胞は、周囲の組織の浸潤を回避するために、カプセル化され得る。カプセル化材料は、典型的に、生体適合性の半浸透性ポリマー性包囲物または膜であり、これらは、タンパク質産物の放出を可能にするが、患者の免疫系または周囲の組織からの他の有害な因子によって細胞の破壊を防止する。
【０２２５】
本明細書中において議論されるように、単離された細胞集団（例えば、幹細胞、リンパ球、赤血球、軟骨細胞、ニューロンなど）を１つ以上のＩＦＮ−Ｌポリペプチドで処理することが、望ましくあり得る。このことは、細胞膜に対して透過性の形態である場合には、単離された細胞をこのポリペプチドに直接曝露することによって達成され得る。
【０２２６】
本発明のさらなる実施形態は、治療ポリペプチドのインビトロ産生と、遺伝子治療または細胞治療による治療ポリペプチドの産生および送達との両方のための、細胞および方法（例えば、相同組換えおよび／または他の組換え産生方法）に関する。相同組換えおよび他の組換えの方法を使用して、通常は転写に対してサイレントなＩＦＮ−Ｌ遺伝子（すなわち、過少発現される遺伝子）を含む細胞を改変し得、これによって、治療有効量のＩＦＮ−Ｌポリペプチドを発現する細胞を産生し得る。
【０２２７】
相同組換えは、もともとは、遺伝子を標的化して転写活性な遺伝子における変異を誘導するか、または修正するために開発された技術である。Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，１９８９，Ｐｒｏｇ．ｉｎ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．＆ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６：３０１。基本的な技術が、特定の変異を哺乳動物ゲノムの特定の領域に導入するため（Ｔｈｏｍａｓら、１９８６，Ｃｅｌｌ ４４：４１９−２８；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，１９８７，Ｃｅｌｌ ５１：５０３−１２；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８５８３−８７）、または欠損遺伝子における特定の変異を修正するため（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３３０：５７６−７８）の方法として、開発された。例示的な相同組換え技術は、米国特許第５，２７２，０７１号；欧州特許第９１９３０５１号および同第５０５５００号；ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７６４２、ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ ９１／０９９５５）に記載されている。
【０２２８】
相同組換えによって、ゲノムに挿入されるべきＤＮＡ配列は、それを標的ＤＮＡに付着させることによって、目的の遺伝子の特定の領域に指向され得る。この標的ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡの領域に相補的（相同）であるヌクレオチド配列である。ゲノムの特定の領域に対して相補的な標的ＤＮＡの小さな断片は、ＤＮＡ複製プロセスの間に、親鎖と接触される。これは、細胞に挿入されてハイブリダイズしたＤＮＡの一般的な特性であり、そして従って、共有される相同領域を介して、内因性ＤＮＡの他の断片と組み換わる。この相補鎖が、変異または異なる配列またはさらなるヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに付着される場合には、これはまた、この組換えの結果として新たに合成された鎖に組み込まれる。プルーフリーディング機能の結果として、ＤＮＡの新たな配列がテンプレートとして働くことが可能である。従って、移入されたＤＮＡは、ゲノムに組み込まれる。
【０２２９】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドと相互作用し得るかまたはその発現を制御し得るＤＮＡの領域（例えば、隣接配列）が、標的ＤＮＡのこれらの断片に付着する。例えば、プロモーター／エンハンサーエレメント、サプレッサ、または外因性転写調節エレメントが、意図される宿主細胞のゲノムに、所望のＩＦＮ−ＬポリペプチドをコードするＤＮＡの転写に影響を与えるに十分な近さおよび配向で、挿入される。制御エレメントは、この宿主細胞ゲノムに存在するＤＮＡの部分を制御する。従って、所望のＩＦＮ−Ｌポリペプチドの発現は、ＩＦＮ−Ｌ遺伝子自体をコードするＤＮＡのトランスフェクションによってではなく、むしろ、ＩＦＮ−Ｌ遺伝子の転写のための認識可能なシグナルを有する内因性遺伝子配列を提供するＤＮＡ調節セグメントと結合した標的ＤＮＡ（目的の内因性遺伝子と相同の領域を含む）の使用によって、達成され得る。
【０２３０】
例示的な方法において、細胞における所望の標的遺伝子（すなわち、所望の内因性細胞遺伝子）の発現は、予め選択された部位における細胞ゲノムへの相同組換えを介して、少なくとも調節配列、エキソン、およびスプライスドナー部位を含むＤＮＡの導入によって、変更される。これらの構成成分は、新たな転写ユニットの産生を実際に生じるような様式で、染色体（ゲノム）ＤＮＡに導入される（ここで、ＤＮＡ構築物に存在する調節配列、エキソン、およびスプライスドナー部位は、内因性遺伝子に作動可能に連結する）。染色体ＤＮＡへのこれらの構成成分の導入の結果として、所望の内因性遺伝子の発現が変化する。
【０２３１】
本明細書中で記載されるように、変化された遺伝子発現は、通常は得られたままの細胞においてサイレントな（発現されていない）遺伝子の活性化（または発現させる）、ならびに得られたままの細胞において生理学的に有意なレベルでは発現されない遺伝子の発現の増加を包含する。この実施形態はさらに、調節または誘導のパターンを変化させる工程を包含し、その結果、これは、得られたままの細胞において生じる調節または誘導のパターンとは異なり、そして得られたままの細胞において発現される遺伝子の発現を減少（排除を含む）させる。
【０２３２】
細胞の内在性ＩＦＮ−Ｌ遺伝子からのＩＦＮ−Ｌポリペプチドの産生を増加するかまたはこれを引き起こすために相同組換えが使用され得る１つの方法は、最初に、相同組換えを使用して、部位特異的組換え系由来の組換え配列（例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ、ＦＬＰ／ＦＲＴ）（Ｓａｕｅｒ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５：５２１−２７；Ｓａｕｅｒ，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２２５：８９０−９００）を、細胞の内在性ゲノムＩＦＮ−Ｌポリペプチドコード領域の上流（すなわち、５’側）に配置する工程を包含する。ゲノムＩＦＮ−Ｌポリペプチドコード領域のすぐ上流に配置された部位に対して相同性の組換え部位を含むプラスミドは、適切なリコンビナーゼ酵素と共に、改変された細胞株に導入される。このリコンビナーゼによって、プラスミドは、このプラスミドの組換え部位を介して、この細胞株のゲノムＩＦＮ−Ｌポリペプチドコード領域のすぐ上流に位置する組換え部位に組込み得る（ＢａｕｂｏｎｉｓおよびＳａｕｅｒ、１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２０２５−２９；Ｏ’Ｇａｒｍａｎら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１−５５）。転写を増加させることが知られている任意の側方配列（例えば、エンハンサー／プロモーター、イントロン、翻訳エンハンサー）は、このプラスミド中に適切に配置される場合、細胞の内在性ＩＦＮ−Ｌ遺伝子からの新たなまたは増加したＩＦＮ−Ｌポリペプチド産生を生じる新たなまたは改変された転写単位を作製するような様式で一体化する。
【０２３３】
部位特異的組換え配列が細胞の内在性ゲノムＩＦＮ−Ｌポリペプチドコード領域のすぐ上流に配置された細胞株を使用するさらなる方法は、細胞株のゲノムの他の位置に第２の組換え部位を導入するために相同組換えを使用することである。適切な組換え酵素は、次いで、二組換え部位細胞株に導入され、組換え事象（欠失、転化、および転移）を生じ（Ｓａｕｅｒ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５：５２１−２７；Ｓａｕｅｒ，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｘｙｍｏｌ．，２２５：８９０−９００）、これは、細胞の内在性ＩＦＮ−Ｌ遺伝子からの新規なまたは増加したＩＦＮ−Ｌポリペプチド産生を生じる新しいかまたは改変された転写ユニットを作製する。
【０２３４】
細胞の内在性ＩＦＮ−Ｌ遺伝子からのＩＦＮ−Ｌポリペプチドの発現を増加するため、または引き起こすためのさらなるアプローチは、細胞の内在性ＩＦＮ−Ｌ遺伝子からの新たなまたは増加したＩＦＮ−Ｌポリペプチドの産生を生じる様式で、遺伝子（単数または複数）（例えば、転写因子）の発現を増加するかまたは引き起こし、そして／または遺伝子（単数または複数）（例えば、転写リプレッサ）の発現を減少する工程を包含する。この方法は、天然に存在しないポリペプチド（例えば、転写因子ドメインに融合した部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド）を、細胞の内在性ＩＦＮ−Ｌ遺伝子からの新たなまたは増加したＩＦＮ−Ｌポリペプチドの産生が起こるように、細胞に導入する工程を包含する。
【０２３５】
本発明はさらに、標的遺伝子の発現を変化させる方法において有用なＤＮＡ構築物に関する。特定の実施形態において、例示的なＤＮＡ構築物は、以下を含む：（ａ）１つ以上の標的配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン、および（ｄ）不対スプライスドナー部位。ＤＮＡ構築物中の標的配列は、エレメント（ａ）〜（ｄ）の細胞中の標的遺伝子への組込みを指向し、その結果、これらのエレメント（ｂ）〜（ｄ）は、内在性標的遺伝子の配列に作動可能に連結される。別の実施形態において、ＤＮＡ構築物は、以下を含む：（ａ）１つ以上の標的配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン、（ｄ）スプライスドナー部位、（ｅ）イントロン、および（ｆ）スプライスアクセプター部位。ここで、標的配列は、エレメント（ａ）〜（ｆ）の組込みを指向し、その結果、（ｂ）〜（ｆ）のエレメントは、内在性遺伝子に作動可能に連結される。標的配列は、相同組換えが生じる細胞染色体ＤＮＡの予め選択された部位に対して相同性である。この構築物において、エキソンは、一般的に、調節配列の３’であり、そしてスプライスドナー部位は、このエキソンの３’である。
【０２３６】
特定の遺伝子の配列（例えば、本明細書中で記載されるＩＦＮ−Ｌポリペプチドの核酸配列）が公知である場合、遺伝子の選択された領域に対して相補的なＤＮＡの部分は、合成されるか、またはそうでなければ、例えば、目的の領域に結合している特定の認識部位におけるネイティブのＤＮＡの適切な制限等によって得られ得る。この部分は、細胞に挿入された際に、標的配列として働き、そしてそのゲノム内の相同性領域にハイブリダイズする。このハイブリダイゼーションが、ＤＮＡ複製の間に生じる場合、このＤＮＡの部分、およびそれに結合した任意のさらなる配列は、Ｏｋａｚａｋｉフラグメントとして作用し、そしてＤＮＡの新たに合成された娘鎖に組み込まれる。従って、本発明は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドをコードするヌクレオチドを含み、このヌクレオチドは、標的配列として使用され得る。
【０２３７】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチド細胞治療（例えば、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドを産生する細胞の移植）もまた企図される。この実施形態は、生物学的に活性な形態のＩＦＮ−Ｌポリペプチドを合成および分泌し得る細胞を移植する工程を包含する。このようなＩＦＮ−Ｌポリペプチド産生細胞は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの天然産物である細胞であり得るか、または組換え細胞であって、そのＩＦＮ−Ｌポリペプチドを産生する能力が、所望のポリペプチドをコードする遺伝子またはＩＦＮ−Ｌポリペプチドの発現を増大する遺伝子で形質転換することによって増大された、組換え細胞であり得る。このような改変は、遺伝子を送達し、その発現および分泌を促進するために適切なベクターによって達成され得る。ＩＦＮ−Ｌポリペプチドを投与されている患者における強力な免疫学的反応を最小化するために、異種のポリペプチドの投与と共に生じる場合、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドを産生する天然の細胞が、ヒト起源であり、そしてヒトＩＦＮ−Ｌポリペプチドを産生することが好ましい。同様に、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドを産生する組換え細胞が、ヒトＩＦＮ−Ｌポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換されることが好ましい。
【０２３８】
移植細胞は、周辺組織の浸潤を回避するようにカプセル化され得る。ヒトまたは非ヒト動物細胞は、生体適合性の半透性ポリマー封入物または膜（これは、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの放出を可能にするが、患者の免疫系または周辺組織からの他の有害な因子による細胞の崩壊を防止する）の形態で患者に移植され得る。あるいは、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドをエキソビボで産生するように形質転換された患者自身の細胞が、このようなカプセル化なしで、患者に直接移植され得る。
【０２３９】
生きた細胞をカプセル化するための技術は当該分野で公知であり、そしてカプセル化された細胞の調製およびそれらの患者への移植は、慣用的に達成され得る。例えば、Ｂａｅｔｇｅら（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／０５４５２およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２９９）は、生物学的に活性な分子の効果的な送達のために遺伝子操作された細胞を含む膜カプセルを記載する。このカプセルは、生体適合性であり、そして容易に回収可能である。このカプセルは、哺乳動物宿主に移植された際に、インビボで下方制御に供されないプロモーターに作動可能に連結された生物学的に活性な分子をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトされた細胞をカプセル化する。このデバイスは、生きた細胞由来の分子のレシピエント内の特定の部位への送達を提供する。さらに、米国特許第４，８９２，５３８号；同第５，０１１，４７２号；および同第５，１０６，６２７号を参照のこと。生きた細胞をカプセル化するためのシステムは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１０４２５（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）に記載される。ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／／１０４７０（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）；Ｗｉｎｎら、１９９１，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１３：３２２−２９；Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、１９９１，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１１：２６９−７５；およびＴｒｅｓｃｏら、１９９２，ＡＳＡＩＯ ３８：１７−２３もまた参照のこと。
【０２４０】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドのインビボおよびインビトロの遺伝子治療送達もまた想定される。遺伝子治療技術の一例は、構成的または誘発性プロモーターに作動可能に連結され得るＩＦＮ−ＬポリペプチドをコードするＩＦＮ−Ｌ遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび／または合成ＤＮＡのいずれか）を使用して、「遺伝子治療ＤＮＡ構築物」を形成することである。このプロモーターは、内在性ＩＦＮ−Ｌ遺伝子に対してホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。ただし、これは、構築物が挿入される細胞または組織型において活性である。遺伝子治療ＤＮＡ構築物の他の成分は、必要に応じて、部位特異的組込みのために設計されたＤＮＡ分子（例えば、相同組換えのために有用な内在性配列）、組織特異的プロモーター、エンハンサーまたはサイレンサー、親細胞に対する選択優位性を提供し得るＤＮＡ分子、形質転換された細胞を同定するための標識として有用なＤＮＡ分子、ネガティブ選択系、細胞特異的結合因子（例えば、細胞標的化のため）、細胞特異的内部移行因子、ベクターからの発現を増強させる転写因子、およびベクターの産生を可能にする因子を含み得る。
【０２４１】
遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、次いで、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを使用して細胞に導入され得る（エキソビボまたはインビボのいずれか）。遺伝子治療ＤＮＡ構築物を導入するための１つの手段は、本明細書中に記載されるようなウイルスベクターの使用による。特定のベクター（例えば、レトロウイルスベクター）は、ＤＮＡ構築物を細胞の染色体ＤＮＡに送達し、そしてこの遺伝子は、染色体ＤＮＡに組み込まれ得る。他のベクターは、エピソームとして機能し、そして遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、細胞質に残る。
【０２４２】
さらに他の実施形態において、調節エレメントが、標的細胞におけるＩＦＮ−Ｌ遺伝子の制御された発現のために含められ得る。このようなエレメントは、適切なエフェクターに応答して作動状態にされる。このようにして、治療的ポリペプチドは、所望の場合に発現され得る。１つの従来の制御手段は、低分子結合ドメインおよび生物学的プロセスを開始し得るドメインを含むキメラタンパク質（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質または転写活性化タンパク質）を二量化する低分子二量化剤またはラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）の使用を包含する（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４１８６５、ＷＯ９７／３１８９８およびＷＯ９７／３１８９９を参照のこと）。タンパク質の二量化は、導入遺伝子の転写を開始するために使用され得る。
【０２４３】
代替の調節技術は、目的の遺伝子から発現されたタンパク質を、凝集体またはクラスターとして細胞の内側に貯蔵する方法を使用する。目的の遺伝子は、小胞体における凝集タンパク質の残留を生じる、条件的凝集ドメインを含む融合タンパク質として発現される。貯蔵されたタンパク質は安定であり、そして細胞の内側で不活性である。しかし、このタンパク質は、条件的凝集ドメインを除去し、それによって凝集体またはクラスターを特異的に破壊し、その結果、このタンパク質が細胞から分泌され得る、薬物（例えば、低分子リガンド）を投与することによって放出され得る。Ａｒｉｄｏｒら、２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：８１６−１７およびＲｉｖｅｒａら、２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：８２６−３０を参照のこと。
【０２４４】
他の適切な制御手段または遺伝子スイッチとしては、本明細書中で記載される系が挙げられるが、これらに限定されない。Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ（ＲＵ４８６）は、プロゲステロンアンタゴニストとして使用される。改変されたプロゲステロンレセプターリガンド結合ドメインのプロゲステロンアンタゴニストへの結合は、２つの転写因子のダイマーを形成することによって、転写を活性化し、次いで、核に至り、ＤＮＡに結合する。このリガンド結合ドメインは、レセプターが天然のリガンドに結合する能力を排除するように改変される。改変されたステロイドホルモンレセプター系はさらに、米国特許第５，３６４，７９１号、ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４０９１１およびＷＯ９７／１０３３７に記載される。
【０２４５】
さらに別の制御系は、エクジソンレセプター（細胞質レセプター）に結合し、そしてこれを活性化するエクジソン（ショウジョウバエステロイドホルモン）を使用する。次いで、このレセプターは核にトランスロケーションし、特異的なＤＮＡ応答エレメント（エクジソン応答性遺伝子由来のプロモーター）に結合する。エクジソンレセプターは、転写を開始するための、トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、およびリガンド結合ドメインを含む。エクジソン系はさらに、米国特許第５，５１４，５７８、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／３８１１７、ＷＯ９６／３７６０９、およびＷＯ９３／０３１６２に記載される。
【０２４６】
別の制御手段は、陽性テトラサイクリン制御可能トランス活性化因子を使用する。この系は、転写を活性化するポリペプチドに連結された変異したｔｅｔリプレッサータンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（逆テトラサイクリン調節製トランス活性化因子タンパク質を生じた変異したｔｅｔ Ｒ−４アミノ酸の変化、すなわち、これは、テトラサイクリンの存在下でｔｅｔオペレーターに結合する）を含む。このような系は、米国特許第５，４６４，７５８号、同第５，６５０，２９８号、および同第５，６５４，１６８号に記載される。
【０２４７】
さらなる発現制御系および核酸構築物は、米国特許第５，７４１，６７９号および同第５，８３４，１８６号（Ｉｎｎｏｖｉｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）に記載される。
【０２４８】
インビボ遺伝子治療は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドをコードする遺伝子を、ＩＦＮ−Ｌ核酸分子の局所注射によって、または他の適切なウイルス性もしくは非ウイルス性の送達ベクターによって、細胞に導入することにより達成され得る。Ｈｅｆｔｉ，１９９４，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２５：１４１８−３５。例えば、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドをコードする核酸分子は、標的細胞への送達のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに含まれ得る（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／３４６７０；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７１７８を参照のこと）。組換えＡＡＶゲノムは、典型的に、機能的プロモーターに作動可能に連結したＩＦＮ−ＬポリペプチドをコードするＤＮＡ配列およびポリアデニル化配列に隣接するＡＡＶ逆方向末端反復を含む。
【０２４９】
代替の適切なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、肝炎ウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、および乳頭腫ウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されない。米国特許第５，６７２，３４４号は、組換え神経栄養性ＨＳＶ−１ベクターを含むインビボウイルス媒介遺伝子転移系を記載する。米国特許第５，３９９，３４６号は、治療タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを挿入するためにインビトロで処理されたヒト細胞の送達によって、治療タンパク質を患者に提供するためのプロセスの例を提供する。遺伝子治療技術の実施のためのさらなる方法および材料は、米国特許第５，６３１，２３６号（アデノウイルスベクターを含む）、同第５，６７２，５１０号（レトロウイルスベクターを含む）、同第５，６３５，３９９号（サイトカインを発現するレトロウイルスベクターを含む）に記載される。
【０２５０】
非ウイルス性送達法としては、リポソーム媒介移入、裸のＤＮＡ送達（直接注射）、レセプター媒介移入（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈澱、および微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃）が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子治療材料および方法はまた、誘導性プロモーター、組織特異的エンハンサー−プロモーター、部位特異的組込みのために設計されたＤＮＡ配列、親細胞に対する選択優位性を提供し得るＤＮＡ配列、形質転換された細胞を同定するための標識、ネガティブな選択系および発現制御系（安全性の指標）、細胞特異的結合因子（細胞標的化のため）、細胞特異的内部移行因子およびベクターによる発現を増強させる転写因子ならびにベクター製造の方法を含み得る。遺伝子治療技術の実施のためのこのようなさらなる方法および材料は、米国特許第４，９７０，１５４号（エレクトロポレーション技術を含む）、同第５，６７９，５５９号（遺伝子送達のためのリポタンパク質含有系を記載する）、同第５，６７６，９５４号（リポソームキャリアを含む）、同第５，５９３，８７５号（リン酸カルシウムトランスフェクションのための方法を記載する）、および同第４，９４５，０５０号（生物学的に活性な粒子がある速度で細胞に噴霧され、それによりこの粒子がこの細胞の表面を貫通し、そしてこの細胞の内側に組み込まれるプロセスを記載する）、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４０９５８（核リガンドを含む）に記載される。
【０２５１】
ＩＦＮ−Ｌ遺伝子治療または細胞治療がさらに、同じか異なる細胞における１つ以上のさらなるポリペプチドの送達を含み得ることもまた企図される。このような細胞は、患者に別々に導入され得るか、この細胞は、単一の移植可能デバイス（例えば、上記のカプセル化膜）に含められ得るか、あるいはこの細胞は、ウイルスベクターによって別々に改変され得る。
【０２５２】
遺伝子治療によって細胞における内在性ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの発現を増加させる手段は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドプロモーターに１つ以上のエンハンサーエレメントを挿入することであり、ここでエンハンサーエレメントは、ＩＦＮ−Ｌ遺伝子の転写活性を増加させるように働き得る。使用されるエンハンサーエレメントは、遺伝子を活性化することを所望する組織に基づいて選択される−その組織でプロモーター活性化を与えることが知られているエンハンサーエレメントが選択される。例えば、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドをコードする遺伝子がＴ細胞において「作動状態になる（ｔｕｒｎｅｄ ｏｎ）」場合、ｌｃｋプロモーターエンハンサーエレメントが使用され得る。ここで、付加される転写エレメントの機能的部分は、標準的なクローニング技術を使用して、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドプロモーターを含むＤＮＡフラグメントに挿入され得る（そして必要に応じて、ベクターおよび／または５’および／または３’隣接配列に挿入され得る）。「相同組換え構築物」として公知のこの構築物は、次いで、エキソビボまたはインビボのいずれかで、所望の細胞に導入され得る。
【０２５３】
遺伝子治療はまた、内在性プロモーターのヌクレオチド配列を改変することによって、ＩＦＮ−Ｌポリペプチド発現を減少させるために使用され得る。このような改変は、典型的に、相同組換え方法によって達成される。例えば、不活性化のために選択されたＩＦＮ−Ｌ遺伝子のプロモーターの全てまたは一部を含むＤＮＡ分子は、転写を調節するプロモーターの断片を除去および／または置換するように操作され得る。例えば、プロモーターの転写活性化因子のＴＡＴＡボックスおよび／または結合部位は、標準的な分子生物学的技術を使用して欠失され得；このような欠失は、プロモーター活性を阻害し得、それにより対応するＩＦＮ−Ｌ遺伝子の転写を抑制し得る。プロモーターにおけるＴＡＴＡボックスまたは転写活性化因子結合部位の欠失は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドプロモーター（調節されるＩＦＮ−Ｌ遺伝子と同じかまたは関連の種由来）のすべてまたは関連の部分を含むＤＮＡ構築物を生成することによって達成され得、ここで、１つ以上のＴＡＴＡボックスおよび／または転写活性化因子結合部位のヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、および／または挿入によって変異される。結果として、ＴＡＴＡボックスおよび／または活性化因子結合部位は、減少した活性を有するか、または完全に不活性にされる。この構築物（これはまた、典型的に、改変されたプロモーターセグメントに隣接したネイティブの（内在性）５’および３’ＤＮＡ配列に対応する少なくとも約５００塩基のＤＮＡを含む）は、直接または本明細書中に記載されるようなウイルスベクターを介してのいずれかで、適切な細胞に（エキソビボまたはインビボのいずれかで）導入され得る。典型的に、細胞のゲノムＤＮＡへのこの構築物の組込みは、相同組換えによってであり、ここで、このプロモーター構築物の５’および３’ＤＮＡ配列は、内在性染色体ＤＮＡへのハイブリダイゼーションによって、改変プロモーター領域を組み込むのを助けるのに役立ち得る。
【０２５４】
（治療的使用）
ＩＦＮ−Ｌの核酸分子、ポリペプチド、ならびにそのアゴニストおよびアンタゴニストを使用して、本明細書中に記載の疾患、障害または状態を含む、多くの疾患、障害または状態を処置、診断、回復または予防し得る。
【０２５５】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストには、ＩＦＮ−Ｌポリペプチド活性を調節し、そしてこのＩＦＮ−Ｌポリペプチドの成熟形態の少なくとも１つの活性を増加させるまたは減少させるかのいずれかの分子が含まれる。アゴニストまたはアンタゴニストは、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドと相互作用しそしてこれによってその活性を調節する、補因子（例えば、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質または低分子量分子）であり得る。ポリペプチドの潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストとしては、ＩＦＮ−Ｌタンパク質の細胞外ドメインの一部または全てを含むＩＦＮ−Ｌポリペプチドの可溶性形態または膜結合形態のいずれかと反応する、抗体が挙げられる。ＩＦＮ−Ｌポリペプチド発現を調節する分子としては、代表的に、発現のアンチセンスレギュレーターとして作用し得る、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。
【０２５６】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドは、公知のインターフェロンに対するＩＦＮ−Ｌポリペプチドの相同性に基づいて、癌細胞の増殖および維持を制御する際に役割を果たし得る。従って、ＩＦＮ−Ｌの核酸分子、ポリペプチドならびにそれらのアゴニストおよびアンタゴニストは、癌の診断および／または処置のために有用であり得る。このような癌の例としては、慢性骨髄性白血病、毛様細胞性白血病、カポージ肉腫、黒色腫、肺癌、脳の癌、乳癌、造血系の癌、前立腺癌、卵巣癌および精巣癌が挙げられるがこれらに限定されない。他の癌は、本発明の範囲に包含される。
【０２５７】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドは、公知のインターフェロンに対するＩＦＮ−Ｌポリペプチドの相同性に基づいて、免疫系の調節に役割を果たし得る。従って、ＩＦＮ−Ｌの核酸分子、ポリペプチドならびにそれらのアゴニストおよびアンタゴニストは、免疫系の機能不全の診断および／または処置のために有用であり得る。このような疾患の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：多発性硬化症、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎（ｐｓｉｏｒｉａｔｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、炎症性関節炎、変形性関節炎、炎症性関節疾患、自己免疫疾患、狼瘡、糖尿病、炎症性腸疾患、移植拒絶、および対宿主性移植片病。免疫系の機能不全によって影響を受ける他の疾患は、本発明の範囲に包含される。
【０２５８】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドは、公知のインターフェロンに対するＩＦＮ−Ｌポリペプチドの相同性に基づいて、ウイルス感染および微生物感染の制御に役割を果たし得る。従って、ＩＦＮ−Ｌの核酸分子、ポリペプチドならびにそれらのアゴニストおよびアンタゴニストは、感染の診断および／または処置のために有用であり得る。このような疾患の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：肝炎、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルスおよび慢性肉芽腫症（ｇｒａｎｕｌａｍａｔｏｕｓ）。感染によって引き起こされる他の疾患は、本発明の範囲に包含される。
【０２５９】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドは、公知のインターフェロンに対するＩＦＮ−Ｌポリペプチドの相同性に基づいて、骨形成および骨維持の制御に役割を果たし得る。従って、ＩＦＮ−Ｌの核酸分子、ポリペプチドならびにアゴニストおよびアンタゴニストは、骨の疾患の診断および／または処置のために有用であり得る。このような疾患の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：骨粗鬆症、大理石骨秒、骨形成不全、パジェット病、歯周病および高カルシウム血症。他の骨障害は、本発明の範囲に包含される。
【０２６０】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドは、公知のインターフェロンに対するＩＦＮ−Ｌポリペプチドの相同性に基づいて、不適切な細胞増殖に役割を果たし得る。従って、ＩＦＮ−Ｌの核酸分子、ポリペプチドならびにアゴニストおよびアンタゴニストは、異常な細胞増殖が存在する疾患の診断および／または処置のために有用であり得る。このような疾患の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：動脈硬化症および血管再狭窄。不適切な細胞増殖によって影響を受ける他の疾患は、本発明の範囲に包含される。
【０２６１】
特定の実施形態では、本発明は、分泌型もしくは可溶性のヒトｆａｓ抗原またはその組換え型（ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９６／２０２０６；Ｍｏｕｎｔｚら，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：４８２９−３７；および欧州特許第５１０６９１号）と組み合わせた（前処置、後処置または同時処置）ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの使用に関する。ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９６／２０２０６は、分泌型ヒトｆａｓ抗原（Ｉｇ融合タンパク質を含めて、ネイティブおよび組換え型）、可溶性組換え型ヒトｆａｓ抗原をコードするのを担う遺伝子を単離するための方法、この遺伝子を適切なベクターおよび細胞型にクローニングするための方法、ならびにこの遺伝子を発現してインヒビターを産生する方法を開示する。欧州特許第５１０６９１号は、可溶性ｆａｓ抗原を含めて、ヒトｆａｓ抗原をコードする核酸、この核酸を発現するためのベクター、およびこのベクターでトランスフェクトされた形質転換体を教示する。非経口的に投与される場合、分泌型または可溶性ｆａｓ抗原融合タンパク質の用量は各々、一般に、約１μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇである。
【０２６２】
本明細書中に引用される疾患および障害の処置は、疼痛および炎症の制御のための第１線の薬物の使用を包含し得る；これらの薬物は、非ステロイド性抗炎症薬物（ＮＳＡＩＤ）として分類される。第２の処置は、コルチコステロイド、徐作用性抗リウマチ薬物（ＳＡＡＲＤ）または疾患改変（ＤＭ）薬物を包含する。以下の化合物に関する情報は、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ（第１６版、１９９２）およびＰｈａｒｍａｐｒｏｊｅｃｔｓ（ＰＪＢ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ）に見出され得る。
【０２６３】
特定の実施形態では、本発明は、本明細書中に引用される疾患および障害（急性および慢性の炎症（例えば、リウマチ病）ならびに対宿主性移植片病を包含する）の処置のための、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドおよび１以上のＮＳＡＩＤのうちのいずれかの使用に関する。ＮＳＡＩＤは、その抗炎症作用を、少なくとも部分的に、プロスタグランジン合成の阻害に負う（ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（第７版、１９８５））。ＮＳＡＩＤは、少なくとも９つの群に特徴付けられ得る：（１）サリチル酸誘導体、（２）プロピオン酸誘導体、（３）酢酸誘導体、（４）フェナム酸誘導体、（５）カルボン酸誘導体、（６）酪酸誘導体、（７）オキシカム（ｏｘｉｃａｍ）、（８）ピラゾールおよび（９）ピラゾロン。
【０２６４】
別の特定の実施形態では、本発明は、１以上のサリチル酸誘導体、プロドラッグエステル、または薬学的に受容可能なその塩のいずれかと組み合わせた（前処置、後処置または同時処置）ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの使用に関する。このようなサリチル酸誘導体、プロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能なその塩は、以下を包含する：アセトアミノサロール、アロキシプリン、アスピリン、ベノリラート、ブロモサリゲニン、アセチルサリチル酸カルシウム、トリサリチル酸コリンマグネシウム、サリチル酸マグネシウム、サリチル酸コリン、ジフルニサル、エテルサラート、フェンドサール、ゲンチジン酸、サリチル酸グリコール、サリチル酸イミダゾール、アセチルサリチル酸リジン、メサラミン、サリチル酸モルホリン、サリチル酸１−ナフチル、オルサラジン、パルサルミド、アセチルサリチル酸フェニル、サリチル酸フェニル、サラセタミド、サリチルアミドＯ−酢酸、サルサラート、サリチル酸ナトリウムおよびスルファサラジン。類似の鎮痛特性および抗炎症特性を有する、構造的に関連したサリチル酸誘導体もまた、このグループによって包含されることが意図される。
【０２６５】
さらなる特定の実施形態では、本発明は、１以上のプロピオン酸誘導体、プロドラッグエステル、または薬学的に受容可能なその塩のいずれかと組み合わせた（前処置、後処置または同時処置）ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの使用に関する。このようなプロピオン酸誘導体、プロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能なその塩は、以下を包含する：アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ブクロクス酸、カルプロフェン、デキスインドプロフェン、フェノプロフェン、フルノキサプロフェン、フルプロフェン、フルルビプロフェン、フルクロプロフェン、イブプロフェン、イブプロフェンアルミニウム、イブプロキサム、インドプロフェン、イソプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン（ｌｏｘｏｐｒｏｆｅｎ）、ミロプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、オキサプロジン、ピケトプロフェン、ピメプロフェン、ピルプロフェン、プラノプロフェン、プロチジン酸、ピリドキシプロフェン（ｐｙｒｉｄｏｘｉｐｒｏｆｅｎ）、スプロフェン、チアプロフェン酸およびチオキサプロフェン。類似の鎮痛特性および抗炎症特性を有する、構造的に関連したプロピオン酸誘導体もまた、このグループによって包含されることが意図される。
【０２６６】
なお別の特定の実施形態では、本発明は、１以上の酢酸誘導体、プロドラッグエステル、または薬学的に受容可能なその塩のいずれかと組み合わせた（前処置、後処置または同時処置）ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの使用に関する。このような酢酸誘導体、プロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能なその塩は、以下を包含する：アセメタシン、アルクロフェナク、アムフェナク、ブフェキサマック、シンメタシン、クロピラク、デルメタシン（ｄｅｌｍｅｔａｃｉｎ）、ジクロフェナクカリウム、ジクロフェナクナトリウム、エトドラク、フェルビナク、フェンクロフェナク、フェンクロラク、フェンクロジン酸、フェンチアザク、フロフェナク、グルカメタシン、イブフェナック、インドメタシン、イソフェゾラク、イソキセパック、ロナゾラク、メチアジン酸、オキサメタシン、オキシピナク（ｏｘｐｉｎａｃ）、ピメタシン、プログルメタシン、スリンダク、タルメタシン、チアラミド、チオピナク、トルメチン、トルメチンナトリウム、ジドメタシンおよびゾメピラク。類似の鎮痛特性および抗炎症特性を有する、構造的に関連した酢酸誘導体もまた、このグループによって包含されることが意図される。
【０２６７】
別の特定の実施形態では、本発明は、１以上のフェナム酸誘導体、プロドラッグエステル、または薬学的に受容可能なその塩のいずれかと組み合わせた（前処置、後処置または同時処置）ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの使用に関する。このようなフェナム酸誘導体、プロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能なその塩は、以下を包含する：エンフェナム酸、エトフェナマート、フルフェナム酸、イソニキシン、メクロフェナム酸、メクロフェナム酸ナトリウム、メトフェナム酸（ｍｅｄｏｆｅｎａｍｉｃ ａｃｉｄ）、メフェナム酸、ニフルム酸、タルニフルマート、テロフェナマート、トルフェナム酸およびウフェナマート。類似の鎮痛特性および抗炎症特性を有する、構造的に関連したフェナム酸誘導体もまた、このグループによって包含されることが意図される。
【０２６８】
さらなる特定の実施形態では、本発明は、１以上のカルボン酸誘導体、プロドラッグエステル、または薬学的に受容可能なその塩のいずれかと組み合わせた（前処置、後処置または同時処置）ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの使用に関する。使用され得るカルボン酸誘導体、プロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能なその塩は、以下を包含する：クリダナク、ジフルニサル、フルフェニサール、イノリジン（ｉｎｏｒｉｄｉｎｅ）、ケトロラクおよびチノリジン。類似の鎮痛特性および抗炎症特性を有する、構造的に関連したカルボン酸誘導体もまた、このグループによって包含されることが意図される。
【０２６９】
なお別の特定の実施形態では、本発明は、１以上の酪酸誘導体、プロドラッグエステル、または薬学的に受容可能なその塩のいずれかと組み合わせた（前処置、後処置または同時処置）ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの使用に関する。酪酸誘導体、プロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能なその塩は、以下を包含する：ブマジゾン、ブチブフェン、フェンブフェンおよびキセンブシン。類似の鎮痛特性および抗炎症特性を有する、構造的に関連した酪酸誘導体もまた、このグループによって包含されることが意図される。
【０２７０】
別の特定の実施形態では、本発明は、１以上のオキシカム、プロドラッグエステル、または薬学的に受容可能なその塩のいずれかと組み合わせた（前処置、後処置または同時処置）ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの使用に関する。オキシカム、プロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能なその塩は、以下を包含する：ドロキシカム、エノリカム、イソキシカム、ピロキシカム、スドキシカム、テノキシカムおよび４−ヒドロキシル−１，２−ベンゾチアジン１，１−ジオキシド４−（Ｎ−フェニル）−カルボキサミド。類似の鎮痛特性および抗炎症特性を有する、構造的に関連したオキシカムもまた、このグループによって包含されることが意図される。
【０２７１】
さらに別の特定の実施形態において、本発明は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの、任意の１つ以上のピラゾール、プロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能なそれらの塩と組み合わせた（前処置、後処置、または同時処置）使用に関する。使用され得るピラゾール、プロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能なそれらの塩には：ジフェナミゾールおよびエピリゾールが挙げられる。類似の鎮痛および抗炎症特性を有する、構造的に関連するピラゾールもまた、この群に包含されることが意図される。
【０２７２】
さらなる特定の実施形態において、本発明は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの、任意の１つ以上のピラゾロン、プロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能なそれらの塩と組み合わせた（前処置、後処置、または同時処置）使用に関する。使用され得るピラゾロン、プロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能なそれらの塩には：アパゾン、アザプロパゾン、ベンズピペリロン、フェプラゾン、モフェブタゾン、モラゾン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピペブゾン、プロピルフェナゾン、ラミフェナゾン、スキシブゾン、およびチアゾリノブタゾンが挙げられる。類似の鎮痛および抗炎症特性を有する、構造的に関連するピラゾロンもまた、この群に包含されることが意図される。
【０２７３】
別の特定の実施形態において、本発明は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの、任意の以下の１つ以上のＮＳＡＩＤと組み合わせた（前処置、後処置、または同時処置）使用に関する。ε−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン、アニトラザフェン、アントラフェニン、ベンダザック、ベンダザックリシネート、ベンジダミン、ベプロジン、ブロペラモール、ブコローム、ブフェゾラク、シプロカゾン、クロキシマート、ダジダミン、デボキサメト、デトミジン、ジフェンピラミド（ｄｉｆｅｎｐｉｒａｍｉｄｅ）、ジフェンピラミド（ｄｉｆｅｎｐｙｒａｍｉｄｅ）、ジフィサラミン、ジタゾール、エモルファゾン、ファネチゾールメシラート、フェンフルミゾール、フロクタフェニン、フルミゾール、フルニキシン、フルプロカゾン、フォピルトリン、フォスフォサル、グアイメサール、グアイアゾレン、イソニキシン（ｉｓｏｎｉｘｉｒｎ）、レフェタミンＨＣｌ、レフルノミド、ロフェミゾール、ロチファゾール、リシンクロニキシナート、メセクラゾン、ナブメトン、ニクチンドール、ニメスリド、オルゴテイン、オルパノキシン、オキサセプロール、オキサパドール、パラニリン、ペリソキサール、ペリソキサールクエン酸塩、ピフォキシム、ピプロキセン、ピラゾラク、ピルフェニドン、プロカゾン、プロキサゾール、チエラビンＢ，チフラミゾール、チメガジン、トレクチン、トルパドール、トリプトアミド、ならびに会社コード番号で称されるＮＳＡＩＤ（例えば、４８０１５６Ｓ、ＡＡ８６１、ＡＤ１５９０、ＡＦＰ８０２、ＡＦＰ８６０、ＡＩ７７Ｂ、ＡＰ５０４、ＡＵ８００１、ＢＰＰＣ、ＢＷ５４０Ｃ、ＣＨＩＮＯＩＮ１２７、ＣＮ１００、ＥＢ３８２、ＥＬ５０８、Ｆ１０４４、ＦＫ−５０６、ＧＶ３６５８、ＩＴＦ１８２、ＫＣＮＴＥＩ６０９０、ＫＭＥ４、ＬＡ２８５１、ＭＲ７１４、ＭＲ８９７、ＭＹ３０９、ＯＮＯ３１４４、ＰＲ８２３、ＰＶ１０２、ＰＶ１０８、Ｒ８３０、ＲＳ２１３１、ＳＣＲ１５２、ＳＨ４４０、ＳＩＲ１３３、ＳＰＡＳ５１０、ＳＱ２７２３９、ＳＴ２８１、ＳＹ６００１、ＴＡ６０、ＴＡＩ−９０１（４−ベンゾイル−１−インダンカルボン酸）、ＴＶＸ２７０６、Ｕ６０２５７、ＵＲ２３０１、およびＷＹ４１７７０。ＮＳＡＩＤと類似の鎮痛および抗炎症特性を有する、構造的に関連するＮＳＡＩＤもまた、この群に包含されることが意図される。
【０２７４】
さらに別の特定の実施形態において、本発明は、本明細書中に記載の疾患および障害（リウマチ病、対宿主性移植片病、および多発性硬化症のような急性炎症および慢性炎症を含む）の処置のための、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの、任意の１つ以上のコルチコステロイド、プロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能なそれらの塩と組み合わせた（前処置、後処置、または同時処置）使用に関する。コルチコステロイド、プロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能なそれらの塩には：ヒドロコルチゾンおよびヒドロコルチゾンに由来する以下のような化合物が挙げられる。２１−アセトキシプレグネノロン、アルクロメラゾン、アルゲストン、アムシノニド、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、ブデソニド、クロロプレドニゾン、クロベタゾール、プロピオン酸クロベタゾール、クロベタゾン、酪酸クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチコステロン、コルチゾン、コルチバゾール、デフラザコン、デソニド、デスオキシメラゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、ジフロコルトロン、ジフルプレドナート、エノキソロン、フルアザコート、フルクロロニド、フルメタゾン、フルメタゾンピバレート、フルニソリド、フルシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオロシノロンアセトニド、フルオコルチンブチル、フルオコルトロン、ヘキサン酸フルオコルトロン、吉草酸ジフルコルトロン、フルオロメトロン、酢酸フルペロロン、酢酸フルプレドニデン、フルプレドニゾロン、フルランデノリド、フォルモコルタール、ハルシノニド、ハロメタゾン、酢酸ハロプレドン、ヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、リン酸ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾン２１−ナトリウム、ヒドロコルチゾンテブテート、マジプレドン、メドリゾン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、モメタゾンフロエート、パラメタゾン、プレドニカルバート、プレドニゾロン、２１−ジエドリアミノ酢酸プレドニゾロン、リン酸プレドニゾロンナトリウム、コハク酸プレドニゾロンナトリウム、２１−ｍ−スルホ安息香酸プレドニゾロンナトリウム、２１−ステアログリコレートプレドニゾロンナトリウム、プレドニゾロンテブテート、２１−トリメチル酢酸プレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニバール、プレドニリデン、２１−ジエチルアミノ酢酸プレドニリデン、チキソコルトール、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンベネトニド、およびトリアミシノロンヘキサセトニド。類似の鎮痛および抗炎症特性を有する、構造的に関連するコルチコステロイドもまた、この群に包含されることが意図される。
【０２７５】
別の特定の実施形態において、本発明は、本明細書中に記載の疾患および障害（リウマチ病、宿主対移植片疾患、および多発性硬化症のような急性炎症および慢性炎症を含む）の処置のための、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの、任意の１つ以上の遅効性の抗リウマチ薬物（ＳＡＡＲＤ）または疾患改変性抗リウマチ薬物（ＤＭＡＲＤ）、プロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能なそれらの塩と組み合わせた（前処置、後処置、または同時処置）使用に関する。ＳＡＡＲＤまたはＤＭＡＲＤ、プロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能なそれらの塩には：アロクプレイドナトリウム、オーラノフィン、金チオグルコース、金チオグリカニド、アザチオプリン、ブレキナルナトリウム、ブシラミン、３−金チオ−２−プロパノール−１−スルホン酸カルシウム、クロラムブシル、クロロキン、クロブザリト、クプロキソリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、ダプソン、１５−デオキシスペルグアリン、ジアセレイン、グルコサミン、金塩（例えば、シクロキン金塩、金チオリンゴ酸ナトリウム、金チオ硫酸ナトリウム）、ヒドロキシクロロキン、硫酸ヒドロキシクロロキン、ヒドロキシ尿素、ケブゾン、レバミゾール、ロベンザリト、メリチン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミゾリビン、ミコフェノール酸モフェチル、ミロラール、ナイトロジェンマスタード、Ｄ−ペニシラミン、ピリジノールイミダゾール（例えば、ＳＫＮＦ８６００２およびＳＢ２０３５８０）、ラパマイシン、チオール類、チモポイエチン、およびビンクリスチン。類似の鎮痛および抗炎症特性を有する、構造的に関連するＳＡＡＲＤまたはＤＭＡＲＤもまた、この群に包含されることが意図される。
【０２７６】
別の特定の実施形態において、本発明は、本明細書中に記載の疾患および障害（急性炎症および慢性炎症を含む）の処置のための、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの、任意の１つ以上のＣＯＸ２インヒビター、プロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能なそれらの塩と組み合わせた（前処置、後処置、または同時処置）使用に関する。ＣＯＸ２インヒビター、プロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能なそれらの塩の例としては、例えば、セレコキシブが挙げられる。類似の鎮痛および抗炎症特性を有する、構造的に関連するＣＯＸ２インヒビターもまた、この群に包含されることが意図される。
【０２７７】
さらに別の特定の実施形態において、本発明は、急性および慢性炎症を含む、本明細書中に記載される疾患および障害の処置のための、１つ以上の抗菌剤、プロドラッグエステル、またはその薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせた（前処置、後処置、または同時処置）、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの使用に関する。抗菌剤としては、例えば、ペニシリン、セファロスポリンおよび他のβ−ラクタム、アミノ配糖体、アゾール、キロノン類、マクロライド、リファマイシン、テトラサイクリン、スルホンアミド、リンコサミド（ｌｉｎｃｏｓａｍｉｄｅ）およびポリミキシンの広範なクラスが挙げられる。ペニシリンは、以下を含むがこれらに限定されない：ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フロクサシリン、アンピシリン、アンピシリン／スルバクタム、アモキシリン、アモキシリン／クラブラン酸、ヘタシリン、シクラシリン（ｃｙｃｌａｃｉｌｌｉｎ）、バカンピシリン、カルベニシリン、カルベニシリンインダニル（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ｉｎｄａｎｙｌ）、チカルシリン、チカルシリン／クラブラン酸、アズロシリン、メズロシリン、ピペラシリン（ｐｅｐｅｒａｃｉｌｌｉｎ）、およびメシリナム。セファロスポリンおよび他のβ−ラクタムとしては、以下を含むがこれらに限定されない：セファロチン、セファピリン、セファレキシン、セフラジン、セファゾリン、セファドロキシル、セファクロール、セファマンドール、セフォテタン、セフォキシチン、セルロキシム（ｃｅｒｕｒｏｘｉｍｅ）、セフォニシド、セフォラジン（ｃｅｆｏｒａｄｉｎｅ）、セフィキシム、セフォタキシム、モキサラクタム、セフチゾキシム、セトリアキソン（ｃｅｔｒｉａｘｏｎｅ）、セフォペラゾン（ｃｅｐｈｏｐｅｒａｚｏｎｅ）、セフタジジム、イミペネムおよびアズトレオナム。アミノ配糖体としては、以下を含むがこれらに限定されない：ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネチルマイシン、カナマイシンおよびネオマイシン。アゾールとしては、フルコナゾールを含むがこれに限定されない。キノロン類としては、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、エノキサシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、スパルフロキサシンおよびテマフロキサシンを含むがこれらに限定されない。マクロライドとしては、エリスロマイシン（ｅｒｙｔｈｏｍｙｃｉｎ）、スピラマイシンおよびアジスロマイシンを含むがこれらに限定されない。リファマイシンとしては、リファンピンを含むがこれに限定されない。テトラサイクリンとしては、スピサイクリン（ｓｐｉｃｙｃｌｉｎｅ）、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリン、デメクロサイクリン、デオキシサイクリン（ｄｅｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）、グアメサイクリン（ｇｕａｍｅｃｙｃｌｉｎｅ）、リメサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、ぺニメピサイクリン（ｐｅｎｉｍｅｐｉｃｙｃｌｉｎｅ）、ピパサイクリン、ロリテトラサイクリン、サンサイクリン、セノサイクリン（ｓｅｎｏｃｉｃｌｉｎ）およびテトラサイクリンを含むがこれらに限定されない。スルホンアミドとしては、���ルファニルアミド、スルファメトキサゾール、スルファセタミド、スルファジアジン、スルフィソキサゾールおよびｃｏ−トリモキサゾール（トリメトプリム／スルファメトキサゾール）を含むがこれらに限定されない。リンコサミドとしては、クリンダマイシンおよびリンコマイシンを含むがこれらに限定されない。ポリミキシン（ポリペプチド）としては、ポリミキシンＢおよびコリスチンを含むがこれらに限定されない。
【０２７８】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチド機能のアゴニストまたはアンタゴニストは、処置される状態に適切であるように、１つ以上のサイトカイン、増殖因子、抗生物質、抗炎症剤および／または化学療法剤と組み合わせて（同時にかまたは連続的）使用され得る。
【０２７９】
望ましくないレベルのＩＦＮ−Ｌポリペプチドによって引き起こされるかまたは媒介される他の疾患は、本発明の範囲内に含まれる。望ましくないレベルとしては、過剰レベルのＩＦＮ−Ｌポリペプチド、および正常以下（ｓｕｂ−ｎｏｒｍａｌ）のレベルのＩＦＮ−Ｌポリペプチドが挙げられる。
【０２８０】
（ＩＦＮ−Ｌ核酸およびＩＦＮ−Ｌポリペプチドの使用）
本発明の核酸分子（それ自体は生物学的に活性なポリペプチドをコードしない核酸分子を含む）を使用して、ＩＦＮ−Ｌ遺伝子および関連遺伝子の染色体上の位置をマッピングし得る。マッピングは、当該分野で公知の技術（例えば、ＰＣＲ増幅およびインサイチュハイブリダイゼーション）により行われ得る。
【０２８１】
ＩＦＮ−Ｌ核酸分子（それ自体は生物学的に活性なポリペプチドをコードしない核酸分子を含む）は、哺乳動物組織または体液サンプル中のＩＦＮ−Ｌ核酸分子の存在について、定性的または定量的のいずれかで試験するための、診断アッセイにおけるハイブリダイゼーションプローブとして有用であり得る。
【０２８２】
他の方法はまた、１つ以上のＩＦＮ−Ｌポリペプチドの活性を阻害することが所望される場合に使用され得る。このような阻害は、発現制御配列（三重らせん形成）またはＩＦＮ−Ｌ ｍＲＮＡに対して、相補的かつハイブリダイズする核酸分子によりもたらされ得る。例えば、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ分子（これらは、ＩＦＮ−Ｌ遺伝子の少なくとも一部に相補的である配列を有する）は、細胞中に導入され得る。アンチセンスプローブは、本明細書中に開示されるＩＦＮ−Ｌ遺伝子の配列を使用して、利用可能な技術により設計され得る。代表的には、このようなアンチセンス分子の各々は、選択された各ＩＦＮ−Ｌ遺伝子の開始部位（５’末端）に相補的である。このアンチセンス分子が次いで、対応するＩＦＮ−Ｌ ｍＲＮＡにハイブリダイズする場合、このｍＲＮＡの翻訳は、防止されるかまたは低減される。アンチセンスインヒビターは、細胞または生物におけるＩＦＮ−Ｌポリペプチドの減少または不在に関連する情報を提供する。
【０２８３】
あるいは、遺伝子治療を使用して、１つ以上のＩＦＮ−Ｌポリペプチドの優性ネガティブインヒビターを作製し得る。この状況において、各選択されたＩＦＮ−Ｌポリペプチドの変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡは、調製され得、そして本明細書中に記載されるウイルスまたは非ウイルスの方法のいずれかを使用して患者の細胞中に導入され得る。このような変異体の各々は、代表的にはその生物学的役割において内因性ポリペプチドと競合するように設計される。
【０２８４】
さらに、ＩＦＮ−Ｌポリペプチド（生物学的に活性でも活性でなくても）免疫原として使用され得、すなわち、これらのポリペプチドは、抗体が誘発され得る少なくとも１つのエピトープを含有する。ＩＦＮ−Ｌポリペプチドに結合する選択的結合因子（本明細書中に記載されるような）は、インビボおよびインビトロでの診断目的のために使用され得、これらの目的としては、体液サンプルまたは細胞サンプル中のＩＦＮ−Ｌポリペプチドの存在を検出するための標識された形態での使用を含むが、これに限定されない。これらの抗体をまた使用して、本明細書中に列挙される疾患および障害を含む多数の疾患および障害を、予防、処置、または診断し得る。これらの抗体は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドに特徴的な少なくとも１つの活性を低減するかまたは遮断するように、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドに結合し得るか、またはポリペプチドに結合してＩＦＮ−Ｌポリペプチドに特徴的な少なくとも１つの活性を増加し得る（ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの薬物動態を増加させることによるものを含む）。
【０２８５】
本発明のＩＦＮ−Ｌポリペプチドは、発現クローニングストラテジーを使用して、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドレセプターをクローン化するために使用され得る。放射性標識（１２５Ｉ）ＩＦＮ−Ｌポリペプチドまたはアフィニティ／活性−タグ化ＩＦＮ−Ｌポリペプチド（例えば、Ｆｃ融合物またはアルカリホスファターゼ融合物）を、結合アッセイにおいて使用して、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドレセプターを発現する細胞型または細胞株または組織を同定し得る。このような細胞または組織から単離されたＲＮＡは、ｃＤＮＡに変換され得、哺乳動物発現ベクターにクローン化され、そして哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳまたは２９３細胞）にトランスフェクトされて発現ライブラリーを作製する。放射性標識またはタグ化されたＩＦＮ−Ｌポリペプチドは、次いで、アフィニティリガンドとして使用されて、このライブラリーから、その表面上にＩＦＮ−Ｌポリペプチドレセプターを発現する細胞のサブセットを同定および単離し得る。ＤＮＡは、次いでこれらの細胞から単離され得、そして哺乳動物細胞にトランスフェクトされて二次発現ライブラリー（ここで、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドレセプターを発現する細胞の画分は、元のライブラリーよりも何倍も高い）を作製し得る。この富化プロセスは、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドレセプターを含有する単一の組換えクローンが単離されるまで繰り返し反復され得る。ＩＦＮ−Ｌポリペプチドレセプターの単離は、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドシグナル伝達経路の新規なアゴニストおよびアンタゴニストを同定または開発するために有用である。このようなアゴニストおよびアンタゴニストとしては、可溶性ＩＦＮ−Ｌポリペプチドレセプター、抗ＩＦＮ−Ｌポリペプチドレセプター抗体、低分子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、そしてこれらは、本明細書中に記載される疾患または障害の１つ以上を、処置、予防、または診断するために使用され得る。
【０２８６】
ｐＳＰＯＲＴ１（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）中にサブクローニングされ、そしてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ株にトランスフェクトされた、ヒトＩＦＮ−ＬポリペプチドをコードするｃＤＮＡの寄託（受託番号ＰＴＡ−９７６を有する）を、１９９９年１１月２３日付けで、アメリカン タイプ カルチャー コレクション，バージニア ２０１１０−２２０９，マナサス，ユニバーシティ ブールバード １０８０１に行った。
【０２８７】
以下の実施例は、例示目的のみのために意図され、いかようにも、本発明の範囲を限定するとは解釈されるべきではない。
【０２８８】
（実施例１：ラットＩＦＮ−Ｌポリペプチド遺伝子のクローニング）
概して、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されるような材料および方法を、ラットＩＦＮ−Ｌポリペプチドをコードする遺伝子をクローニングおよび分析するために使用した。
【０２８９】
ラットＩＦＮ−Ｌポリペプチドをコードする配列を、コンピューター支援分析（ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ）と組み合わせて大規模無作為ｃＤＮＡ配列決定によって、ラット胎盤ｃＤＮＡライブラリーから単離した。ラット胎盤ｃＤＮＡライブラリーを構築するために、ラット胚（１７日齢）［Ｅ１７］胎盤ｍＲＮＡを、標準的な方法によって調製した（ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ，１９８７，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６）。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ ｃＤＮＡ ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を使用して合成した後、ラットｃＤＮＡを、ｐＳＰＯＲＴ１ベクター（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）のＳａｌＩおよびＮｏｔＩ部位にサブクローニングした。
【０２９０】
ラットＩＦＮ−Ｌポリペプチドについての全長ｃＤＮＡの配列分析によって、この遺伝子が、１９１アミノ酸のタンパク質をコードする５７３ｂｐのオープンリーディングフレームを含むことが示された（図１Ａ〜１Ｂ）。このラットＩＦＮ−Ｌポリペプチド配列は、シグナルペプチドを含むことが予測されている（図１Ａ、下線によって示される推定シグナルペプチド）。ラットＩＦＮ−Ｌポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおけるタンパク質配列とのラットＩＦＮ−Ｌポリペプチド配列の比較後に、インターフェロンタンパク質ファミリーの新規なメンバーであるとして同定された。
【０２９１】
（実施例２：ヒトＩＦＮ−Ｌポリペプチド遺伝子のクローニング）
概して、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されるような材料および方法を、ヒトＩＦＮ−Ｌポリペプチドをコードする遺伝子をクローニングおよび分析するために使用した。
【０２９２】
インターフェロン遺伝子ファミリーの既知のメンバーのゲノム構造を調べることによって、このファミリーのメンバーが、固有のイントロン不在（ｉｎｔｒｏｎｌｅｓｓ）構造を共有することが明らかにされた。従って、ヒトＩＦＮ−Ｌポリペプチドをコードする配列を、ラットＩＦＮ−Ｌポリペプチド遺伝子由来のプローブを用いてヒトゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離した。
【０２９３】
放射性ラットＩＦＮ−Ｌプローブを、ラットＩＦＮ−ＬポリペプチドｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって作製した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ９６００サーモサイクラー（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）および以下の反応条件を使用して実施した：２０ｎｇのラットＩＦＮ−ＬポリペプチドｃＤＮＡ、各々２０ｐｍｏｌのプライマー１７９５−０１（５’−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−３’；配列番号２０）および１７９５−０２（５’−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ａ−３’；配列番号２１）、各々１ｍｍｏｌのｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ、０．０１ｍｍｏｌのｄＣＴＰ、１００μＣｉの３２Ｐ−ｄＣＴＰ、４ｍＭのＭｇＣｌ２、１×ＰＣＲ緩衝液、ならびに５ＵのＴａｑポリメラーゼ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。「コールド（ｃｏｌｄ）」ＰＣＲ反応（すなわち、放射性標識化ｄＣＴＰの存在下において実施されず、かつ平衡状態のｄＮＴＰ混合物を使用する反応）を、標識化反応と同時に調製した。増幅反応を、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で１分間の４５サイクルで実施した。プールされた標識化および非標識化のプローブを、Ｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｇ−５０カラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、１００℃で１０分間煮沸し、そして氷上にて２０分間冷却し、次いで、ハイブリダイゼーション溶液に添加した。少なくとも５×１０５ｃｐｍ／μＬの特異的活性を有するプローブを、この方法を使用して作製した。
【０２９４】
ヒトＩＦＮ−Ｌポリペプチドをコードする配列を、ヒトλゲノムＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カタログ番号９４６２０６）をスクリーニングすることによって単離した。一次スクリーニングのために、１×１０６個のクローンを、５０，０００コロニー／プレートの密度でプレーティングし、そして標準的な技術を使用して、ニトロセルロースフィルターに転写した。ポジティブクローンを、分析前に再スクリーニングした。
【０２９５】
ラットＩＦＮ−Ｌプローブを、３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、２×デンハルト溶液、１０μｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡ、０．２％ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．１％ピロリン酸塩中において４２℃で一晩、このフィルターにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、フィルターを、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中において室温で３０〜６０分間洗浄し、次いで、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中において５５℃で１５分間洗浄した。
【０２９６】
３個のポジティブクローンを、一次スクリーニングおよび二次スクリーニングの後に回収し、そして、λファージＤＮＡを、固体プレート培養方法によって調製した。ＮｏｔＩ挿入物を、このクローンから切り出し、そしてｐＳＰＯＲＴ１（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）中に連結し、そして引き続き、これらの連結物を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０株を形質転換した。形質転換後、プラスミドを、Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して回収した。
【０２９７】
３個のポジティブゲノムＤＮＡクローン由来のプラスミドを、ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングにおいて利用したラットＩＦＮ−Ｌプローブを使用するサザンブロット分析によって分析した。回収したプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、消化されたフラグメントを、アガロースゲルにおいて分解し、次いで、ナイロンメンブレンに転写した。ハイブリダイゼーション条件は、ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングにおいて利用された条件と同一であった。サザンブロット分析によって、３個のポジティブゲノムクローンが、同一のゲノム挿入物を含む可能性が高いことが示された。ラットＩＦＮ−Ｌプローブとハイブリダイズするフラグメントを、引き続き、配列決定分析のために、ｐＳＰＯＲＴ１中にサブクローニングした。この分析によって、３個のポジティブゲノムＤＮＡクローンが、同一のゲノム挿入物を含むことが確認された。
【０２９８】
ヒトＩＦＮ−Ｌポリペプチドをコードする配列を含む３個のゲノムクローンの配列分析によって、この遺伝子が、２０７アミノ酸のタンパク質をコードする６２１ｐｂのオープンリーディングフレームを含むことが示された（図２Ａ〜２Ｂ）。このヒトＩＦＮ−Ｌポリペプチド配列は、シグナルペプチドを含むことが予測された（図２Ａ、下線によって示される推定シグナルペプチド）。ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの配列分析は、このタンパク質が、分泌されるサイトカイン分子であることを強く示唆している。
【０２９９】
６４％の類似性が、ヒトＩＦＮ−Ｌ遺伝子のオープンリーディングフレームとラットＩＦＮ−Ｌ ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームとの間で観察された。図３は、ヒトＩＦＮ−Ｌポリペプチド（配列番号２）と、ヒトＩＦＮ−β（配列番号７）と、ラットＩＦＮ−Ｌポリペプチド（配列番号４）とのアミノ酸配列アラインメントを示す。ヒトＩＦＮ−Ｌポリペプチドは、ヒトＩＦＮ−βに対して３０％同一性である。ヒトＩＦＮ−Ｌポリペプチドは、ラットＩＦＮ−Ｌポリペプチドに対して４０．５％同一性であり、そして５０％類似性である。ヒトＩＦＮ−Ｌポリペプチド中の５つすべての推定システイン残基は、ラットＩＦＮ−Ｌポリペプチド中のそれらのシステイン残基と完全に一致する。
【０３００】
（実施例３：ＩＦＮ−Ｌ ｍＲＮＡ発現）
ＩＦＮ−Ｌ ｍＲＮＡの発生的発現パターンを、いくつかの異なる段階のマウスおよびラットの胚においてＩＦＮ−Ｌポリペプチド転写物の存在を検出するための３２Ｐ−標識化全長ラットｃＤＮＡプローブを使用するノーザンブロット分析によって決定した。ラット胎盤ｃＤＮＡライブラリーの構築のために使用されたのと同じ技術を使用して、ラットおよびマウスの胚からＲＮＡを単離した。ノーザンブロットを、４０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、１ｍＭ ＥＤＴＡ，および０．１％中において、４２℃にて４時間、プレハイブリダイゼーションした。このブロットを、ラットＩＦＮ−Ｌプローブを添加したことを除いて同じ溶液中において、４２℃にて一晩ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、ブロットを、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中において６０℃にて３０分間洗浄した。
【０３０１】
ＩＦＮ−Ｌ ｍＲＮＡの発現を、標準的な技術を使用するＲＴ−ＰＣＲによって、種々のヒト組織において試験した。ヒトＩＦＮ−Ｌ ｍＲＮＡは、膵臓、小腸、前立腺、子宮、甲状腺および胎盤において検出された。
【０３０２】
ＩＦＮ−Ｌ ｍＲＮＡの発現を、インサイチュハイブリダイゼーションによって局在化した。正常胚および成体マウス組織のパネルを４％パラホルムアミド中で固定し、パラフィンに包埋し、そして５μｍに切片化した。切片化した組織を、０．２Ｍ ＨＣｌ中で透過化処理し、プロテイナーゼＫで消化し、そしてトリエタノールアミンおよび無水酢酸でアセチル化した。切片を、ハイブリダイゼーション溶液（３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０，５ｍＭ ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液、０．２％ ＳＤＳ、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．２５ｍｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ、２５μｇ／ｍｌ ポリＡ，２５μｇ／ｍｌ ポリＣおよび５０％ホルムアミド）中で１時間６０℃でプレハイブリダイズし、次いで、１０％デキストランおよび２×１０４ｃｐｍ／μｌの３３Ｐ−標識アンチセンスリボプローブ（ヒトＩＦＮ−Ｌ遺伝子に相補的）を含有する同じ溶液中で６０℃で一晩ハイブリダイズする。標準的技術を用いて、ヒトＩＦＮ−Ｌ ｃＤＮＡ配列を含有するクローンのインビトロ転写によって、このリボプローブを得る。
【０３０３】
ハイブリダイゼーション後、切片を、ハイブリダイゼーション溶液中でリンスし、ＲＮａｓｅＡで処理してハイブリダイズしていないプローブを消化し、次いで０．１×ＳＳＣ中で５５℃で３０分間洗浄する。次いで、切片をＮＴＢ−２エマルジョン（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に浸し、４℃に３週間曝し、発色させ、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで対比染色する。組織形態学およびハイブリダイゼーションシグナルを、脳（矢状断面１つおよび冠状断面２つ）、胃腸管（食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、近位結腸、および遠位結腸）、下垂体、肝臓、肺、心臓、脾臓、胸腺、リンパ節、腎臓、副腎、膀胱、膵臓、唾液腺、雄性および雌性生殖器（雌性の卵巣、卵管、および子宮；ならびに雄性の精巣、精巣上体、前立腺、精嚢および輸精管）、ＢＡＴおよびＷＡＴ（皮下、腎臓周囲）、骨（大腿）、皮膚、乳房、および骨格筋についての暗野かつ標準のイルミネーションによって同時に分析する。
【０３０４】
（実施例４：ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの生成）
（Ａ．細菌におけるＩＦＮ−Ｌポリペプチドの発現）
ＰＣＲを用いて、ヒトまたはラットのいずれかのＩＦＮ−ＬポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列を、この配列の５’および３’末端に対応するプライマー（表１）を用いて増幅し、これは、増幅したＤＮＡ産物の発現ベクター内への挿入を可能にするために制限酵素部位を組み込んだ。増幅後に、ＰＣＲ産物をゲル精製し、適切な制限酵素で消化し、そして標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて発現ベクターｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣ番号９８１１３）へ連結した。ＰＣＲインサートとベクター配列の連結後、連結反応混合物を使用して、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ宿主株（例えば、Ａｍｇｅｎ株番号２５９６）中に形質転換し、そして形質転換体をカナマイシン薬物耐性について選択した。選択したコロニー由来のプラスミドＤＮＡを、単離し、そしてＤＮＡ配列決定に供して適切なインサート（挿入物）の存在を確認した。
【０３０５】
ラットＩＦＮ−Ｌポリペプチド細菌発現ベクターを構築するために、ＩＦＮ−Ｌ核酸配列をプライマー１８２５−２２および１８２５−２１を用いてｃＤＮＡテンプレートから増幅した。これらのプライマーによる増幅後に得られたＰＣＲ産物を、ｐＡＭＧ２１のＮｄｅ Ｉ部位およびＢａｍ ＨＩ部位に挿入し、次いで連結反応を細菌形質転換において用いた。得られた細菌クローンをＡｍｇｅｎ株番号３７２９と名付けた。図４は、Ａｍｇｅｎ株番号３７２９のｐＡＭＧ２１インサートのヌクレオチド配列およびこのインサートによってコードされる予測アミノ酸配列を示す。
【０３０６】
ラットＩＦＮ−Ｌポリペプチド細菌発現ベクター（ここでは、位置１８０のシステインがセリン残基で置換された）を、プライマー１８２５−２２および１９０９−５６を用いて構築した。これらのプライマーによる増幅後得られたＰＣＲ産物を、ｐＡＭＧ２１のＮｄｅ Ｉ部位およびＢａｍ ＨＩ部位に挿入し、次いで連結反応を細菌形質転換において用いた。
【０３０７】
【表３】
2007014331.tif 000004
【０３０８】
得られた細菌クローンをＡｍｇｅｎ株番号３８５８と名付けた。図５は、Ａｍｇｅｎ株番号３８５８のｐＡＭＧ２１インサートのヌクレオチド配列およびこのインサートによってコードされる予測アミノ酸配列を示す。
【０３０９】
ヒトＩＦＮ−Ｌポリペプチド細菌発現ベクターを構築するために、ＩＦＮ−Ｌ核酸配列をプライマー１９６７−３２および１９８２−１４を用いてｃＤＮＡテンプレートから増幅した。これらのプライマーによる増幅後に得られたＰＣＲ産物を、ｐＡＭＧ２１のＸｂａ Ｉ部位およびＢａｍ ＨＩ部位に挿入し、次いで連結反応を細菌形質転換において用いた。得られた細菌クローンをＡｍｇｅｎ株番号４０４７と名付けた。図６は、Ａｍｇｅｎ株番号４０４７のｐＡＭＧ２１インサートのヌクレオチド配列およびこのインサートによってコードされる予測アミノ酸配列を示す。
【０３１０】
ヒトＩＦＮ−Ｌポリペプチド細菌発現ベクター（ここでは、位置１９３のシステインがセリン残基で置換された）を、プライマー１９６７−３２および１９６７−３３を用いて構築した。これらのプライマーによる増幅後得られたＰＣＲ産物を、ｐＡＭＧ２１のＸｂａ Ｉ部位およびＢａｍ ＨＩ部位に挿入し、次いで連結反応を細菌形質転換において用いた。得られた細菌クローンをＡｍｇｅｎ株番号３９６９と名付けた。図７は、Ａｍｇｅｎ株番号３９６９のｐＡＭＧ２１インサートのヌクレオチド配列およびこのインサートによってコードされる予測アミノ酸配列を示す。
【０３１１】
ヒトＩＦＮ−ＬポリペプチドのＮ末端改変を発現しているヒトＩＦＮ−Ｌポリペプチド細菌発現ベクターを、プライマー１９６７−３２および１９６７−３３によって株番号４０４７からプラスミドを増幅することによって構築した。これらのプライマーによる増幅後得られたＰＣＲ産物を、ｐＡＭＧ２１のＮｄｅ Ｉ部位およびＢａｍ ＨＩ部位に挿入し、次いで連結反応を細菌形質転換において用いた。得られた細菌クローンをＡｍｇｅｎ株番号４１８２と名付けた。図８は、Ａｍｇｅｎ株番号４１８２のｐＡＭＧ２１インサートのヌクレオチド配列およびこのインサートによってコードされる予測アミノ酸配列を示す。
【０３１２】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドを生成するために、形質転換された宿主細胞を、まず、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの導入前に、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地で３０℃でインキュベートする。ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの発現を、３０ｎｇ／ｍＬのＮ−（３−オキソヘキサノイル）−ｄｌ−ホモセリンラクトンの添加、それに続く３０℃かまたは３７℃での６時間のインキュベーションによって、誘導した。ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの発現を、培養物、細菌ペレットの再懸濁および溶解物の遠心分離、ならびに、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による宿主細胞タンパク質の分析によって評価した。
【０３１３】
Ｅ．ｃｏｌｉが産生したＩＦＮ−Ｌポリペプチドに相当する、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上の単一のバンドを、ゲルから切り出し、そしてＮ末端アミノ酸配列を、本質的にＭａｔｓｕｄａｉｒａら、１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１０〜３５に記載のように決定した。
【０３１４】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドを、以下の通り精製した。まず、細胞を高圧均質化によって、水中で溶解し、封入体を遠心分離によって収集した。次いで、可溶化した封入体を種々の折り畳み（ｒｅｆｏｌｄ）条件に供した。
【０３１５】
（Ｂ．ＩＦＮ−Ｌポリペプチド哺乳動物発現ベクターの構築）
ヒトとラットの両方のＩＦＮ−Ｌポリペプチドのネイティブタンパク質およびネイティブタンパク質Ｆｃ融合バージョンを、ＣＨＯか２９３のいずれかの哺乳動物発現系において生成した。ＩＦＮ−ＬポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列を、５’および３’末端に対応するプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した（表２）。
【０３１６】
ＩＦＮ−Ｌポリペプチド発現ベクターを構築するために、ＩＦＮ−Ｌ核酸配列を以下に記載するように増幅した。ラットＩＦＮ−Ｌ核酸配列を３つのプライマーの対の１つ（順方向プライマー１８４７−７７、および１８４７−８８、１８９６−５６、または１８９６−５７のいずれか）を用いて得た。ラットＩＦＮ−ＬポリペプチドＦｃ融合構築物を、第１のセットのプライマー（これは、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＮｏｔ Ｉクローニング部位を取り込み、そして終止コドンを取り込まなかった）で調製されたＰＣＲ産物をクローニングすることによって生成した。第２のセットのプライマー（これは、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＳａｌ Ｉクローニング部位ならびに２つの終止コドンを組み込んだ）で調製されたＰＣＲ産物を、ｐＤＳＲαにクローニングすることによって、または第３のセットのプライマー（これは、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＮｏｔ Ｉクローニング部位ならびに２つの終止コドンを組み込んだ）で調製されたＰＣＲ産物を、ｐＤＳＲ４にクローニングすることによって、ラットＩＦＮ−Ｌ可溶ポリペプチドを生成した。
【０３１７】
【表４】
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【０３１８】
ヒトＩＦＮ−Ｌ核酸配列を、３つのプライマーの対の１つ（順方向１８５４−４８および１８５４−４９、および順方向プライマー１８５５−４４、および１８５４−４５または１８５４−４６のいずれか）を用いて得た。ヒトＩＦＮ−ＬポリペプチドＦｃ融合構築物を、第１のセットのプライマー（これは、Ｎｏｔ Ｉクローニング部位を取り込み、そして終止コドンを取り込まなかず、そして第Ｘａ因子切断部位を取り込んだ）で調製されたＰＣＲ産物をクローニングすることによって生成した。第２のセットのプライマー（これは、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＳａｌ Ｉクローニング部位ならびに２つの終止コドンを組み込んだ）で調製されたＰＣＲ産物を、ｐＤＳＲαにクローニングすることによって、または第３のセットのプライマー（これは、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＮｏｔ Ｉクローニング部位ならびに２つの終止コドンを組み込んだ）で調製されたＰＣＲ産物を、ｐＤＳＲ４にクローニングすることによって、ヒトＩＦＮ−Ｌ可溶ポリペプチドを生成した。第２の順方向プライマー（１９５４−４７）をまた、１９５５−４４の代わりに使用し、２つの開始コドンを保有する構築物を生成した。
【０３１９】
ＰＣＲ増幅を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ９６００サーモサイクラーおよび以下の反応条件を用いて実施した：ラットまたはヒトＩＦＮ−ＬポリペプチドｃＤＮＡ２０ｎｇ、各適切なプライマー２０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ １ｍｍｏｌ、ＭｇＣｌ２ ４ｍＭ、１×ＰＣＲ緩衝液、およびＴａｑポリメラーゼ ５Ｕ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。増幅反応を、９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、および７２℃で１分間４サイクルの間実施し、続いて９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、そして７２℃で１分間２６サイクルの間実施した。
【０３２０】
ＰＣＲ産物をＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製スピンカラムを用いて精製し、次いで、適切な制限エンドヌクレアーゼによる消化に供した。消化後、フラグメントをアガロースゲル上で分離し、Ｑｉａｇｅｎゲル精製スピンカラムを用いて精製し、そして適切なベクターに連結した。連結物を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０に形質転換した。選択された形質転換株の配列分析後、大規模なプラスミド貯蔵物を、組織培養トランスフェクションのために調製した。
【０３２１】
（Ｃ．哺乳動物細胞におけるＩＦＮ−Ｌポリペプチドの発現および精製）
リポフェクチンまたはリン酸カルシウムプロトコールのいずれかを用いて、２９３ ＥＢＮＡ細胞またはＣＨＯ細胞中に、ＩＦＮ−Ｌポリペプチド発現構築物を導入した。
【０３２２】
生成されるＩＦＮ−Ｌポリペプチドに対する機能的研究を行うため、ハイグロマイシン選択２９３ ＥＢＮＡクローニングのプールから大量の馴化培地を生成した。この細胞を５００ｃｍ Ｎｕｎｃ Ｔｒｉｐｌｅ Ｆｌａｓｋｓ中で、８０％コンフルエンスになるまで培養し、その後、培地を回収する１週間前に無血清培地に切り換えた。馴化培地を回収し、そして精製まで−２０℃に凍結した。
【０３２３】
馴化培地を下記のとおり、アフィニティークロマトグラフィーによって精製する。この培地を解凍し、次いで０．２μｍフィルターに通した。プロテインＧカラムをＰＢＳでｐＨ７．０に平衡化し、次いで濾過した培地をロードした。このカラムをＡ２８０の吸収がベースラインに達するまでＰＢＳで洗浄した。０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌを用いてｐＨ７．２でＩＦＮ−Ｌポリペプチドを、カラムから溶出し、直ちに１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを用いてｐＨ８．５で中和した。ＩＦＮ−Ｌポリペプチドを含有する画分をプールし、ＰＢＳ中で透析し、そして−７０℃で貯蔵した。
【０３２４】
ヒトＩＦＮ−Ｌポリペプチド−Ｆｃ融合ポリペプチドの第Ｘａ因子切断について、アフィニティークロマトグラフィー精製したタンパク質を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２中でｐＨ８．０で透析する。制限プロテアーゼ第Ｘａ因子を、透析したタンパク質に１／１００（ｗ／ｗ）で添加し、そしてこのサンプルを室温で一晩消化した。
【０３２５】
（実施例５：ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの生物学的活性）
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドのリン酸化を、以下のようにアッセイした。細胞株を、実施例４Ｃにおいて生成したラットＩＦＮ−Ｌ Ｆｃ融合ポリペプチド１μｇ／ｍＬか、またはコントロール溶液に、３７℃で１５分間暴露した。ＩＦＮ−Ｌポリペプチド暴露後、細胞を溶解し、そして細胞タンパク質を回収し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。次いで、分離したタンパク質を抗ｐＴｙｒ抗体を用いてウエスタンブロットによって分析した。いくつかの細胞株は、ＩＦＮ−Ｌ Ｆｃ融合ポリペプチドへの暴露後、細胞タンパク質リン酸化において増加を示した。
【０３２６】
（実施例６：抗ＩＦＮ−Ｌポリペプチド抗体の生成）
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドに対する抗体を、生物学的合成または化学的合成によって生成した、精製タンパク質またはＩＦＮ−Ｌペプチドを用いて免疫することによって獲得し得る。抗体を生成するための適切な手順は、ＨｕｄｓｏｎおよびＢａｙ、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第二版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｉｌｉｃａｔｉｏｎ）に記載の手順を含む。
【０３２７】
抗体生成のための１つの手順において、動物（代表的には、マウスまたはウサギ）に、ＩＦＮ−Ｌ抗原（例えば、ＩＦＮ−Ｌポリペプチド）を注射し、そして、ハイブリドーマ産生のため、ＥＬＩＳＡによって決定した十分な血清力価レベルを有する動物を、選択する。免疫した動物の脾臓を回収し、そして単一細胞懸濁液として調製し、これから脾臓細胞を回収する。脾臓細胞をマウスミエローマ細胞（例えば、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４細胞）に融合し、ＤＭＥＭ（２００Ｕ／ｍＬペニシリン、２００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン、および４ｍＭグルタミン含有）中でまずインキュベートし、次いで、ＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）中でインキュベートする。選択後、組織培養上清を各融合ウェルから取り出し、そしてＥＬＩＳＡによって、抗ＩＦＮ−Ｌ抗体産生について試験する。
【０３２８】
抗ＩＦＮ−Ｌを得るため、別の手順をまた、使用し得る。この手順は例えば、ヒト抗体の生成のためのヒトＩｇ遺伝子座を保有するトランスジェニックマウスの免疫、および合成抗体ライブラリー（例えば、抗体可変ドメインの変異誘発によって生成されるライブラリーなど）のスクリーニングである。
【０３２９】
（実施例７：トランスジェニックマウスにおけるＩＦＮ−Ｌポリペプチドの発現）
ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの生物学的活性を評価するため、肝臓特異的ＡｐｏＥプロモーターの制御下で、ＩＦＮ−Ｌポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質をコードする構築物を調製する。この構築物の送達により、ＩＦＮ−Ｌポリペプチドの機能に関する情報である、病理的変化を生じることが期待される。同様に、βアクチンプロモーターの制御下で、全長ＩＦＮ−Ｌポリペプチドを含む構築物を調製する。この構築物の送達により、偏在性発現を生じることが期待される。
【０３３０】
これらの構築物を生成するために、ＰＣＲを用いて、所望の配列の５’および３’末端に対応し、そしてプライマーを用いてＩＦＮ−ＬポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列を増幅し、そしてこの配列は、発現ベクター内への増幅産物の挿入を可能にするために制限酵素部位を組み込む。増幅後、ＰＣＲ産物をゲル精製し、適切な制限酵素で消化し、そして標準的組み換えＤＮＡ技術を用いて発現ベクター中に連結する。例えば、増幅したＩＦＮ−Ｌポリペプチド配列を、Ｇｒａｈａｍら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１７：２７２〜７４およびＲａｙら，１９９１ Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：２２６５〜７３に記載のように、ヒトβアクチンプロモーターの制御下で発現ベクター中にクローニングし得る。
【０３３１】
連結（ライゲーション）後、反応混合物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主株をエレクトロポレーションによって形質転換し、そして形質転換体を、薬物耐性について選択する。選択したコロニー由来のプラスミドＤＮＡを単離して、ＤＮＡ配列決定に供し、適切なインサートの存在および変異が存在しないことを確認する。ＩＦＮ−Ｌポリペプチド発現ベクターを、２回のＣｓＣｌ密度勾配遠心分離を通じて精製し、適切な制限酵素で切断し、そして、ＩＦＮ−Ｌポリペプチド導入遺伝子を含有する直線フラグメントを、ゲル電気泳動によって精製する。精製したフラグメントを、５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）および０．２ｍＭ ＥＤＴＡ中で、２ｍｇ／ｍＬの濃度で、再懸濁する。
【０３３２】
ＢＤＦ１×ＢＤＦ１交配マウス由来の単一細胞胚を、記載（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／２３６１４）のように注射する。胚を、ＣＯ２インキュベーター中で一晩培養し、そして１５〜２０の２細胞胚を偽妊娠ＣＤ１雌性マウスの卵管に移す。マイクロインジェクションした胚の着床から得た子孫を、以下のように、ゲノムＤＮＡサンプル中に取り込んだ導入遺伝子のＰＣＲ増幅でスクリーニングする。耳切片を２０ｍＬの耳緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０，１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ、および５００ｍｇ／ｍＬ プロテイナーゼＫ）中で、５５℃で一晩消化する。次いで、このサンプルを２００ｍＬのＴＥで希釈し、そして２ｍＬの耳サンプルを、適切なプライマーを用いるＰＣＲ反応中で用いる。
【０３３３】
８週齢で、トランスジェニック創始動物およびコントロール動物を、剖検および病理分析のため、屠殺する。脾臓の一部を取り出し、そしてＴｏｔａｌ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、脾臓から、総細胞ＲＮＡを単離し、そして導入遺伝子発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって決定する。脾臓から回収したＲＮＡを、以下のように、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＰｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いてｃＤＮＡに変換する。適切なプライマー（発現ベクター配列に位置し、そしてＩＦＮ−Ｌポリペプチド導入遺伝子の３’側である）を用いて、導入遺伝子転写物からｃＤＮＡ合成をプライムする。トランスジェニック創始動物およびコントロール由来の１０ｍｇの総脾臓ＲＮＡを、１ｍＭのプライマーとともに、１０分間７０℃でインキュベートし、そして氷上に置く。次いで、反応物に、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．１ｍＭ ＤＴＴ、および２００ＵのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素を補充する。４２℃で５０分間のインキュベーション後、７２℃で１５分間加熱することによって反応を停止し、２ＵのＲＮａｓｅ Ｈを用いて２０分間３７℃で消化する。次いで、サンプルをＩＦＮ−Ｌポリペプチドに特異的なプライマーを用いるＰＣＲによって増幅する。
【０３３４】
（実施例８：トランスジェニックマウスにおけるＩＦＮ−Ｌポリペプチドの生物学的活性）
安楽死の前に、トランスジェニック動物を計量し、イソフルオロラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）によって麻酔し、そして心臓穿刺によって採血する。サンプルを、血液学および血清化学分析に供する。Ｘ線撮影を、最終的な放血後に行う。肉眼での解剖の際に、主な内臓器官を、重量分析に供する。
【０３３５】
肉眼での解剖後、組織（すなわち、肝臓、脾臓、膵臓、胃、胃腸管全体、腎臓、生殖器官、皮膚および乳腺、骨、脳、心臓、肺、胸腺、気管、食道、甲状腺、副腎、膀胱、リンパ節および骨格筋）を取出し、そして１０％緩衝化Ｚｎ−ホルマリン中で組織学的検査のために固定する。固定後、組織をパラフィンブロック中で処理し、そして３ｍｍの切片を得る。全ての切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、次いで組織学的分析に供する。
【０３３６】
トランスジェニックマウスおよびコントロールマウスの両方の脾臓、リンパ節およびパイアー斑を、以下の通りにＢ細胞特異的抗体およびＴ細胞特異的抗体による免疫組織学的分析に供する。ホルマリンで固定したパラフィン包埋切片を脱パラフィン処理し、そして脱イオン水中で水和する。切片を３％過酸化水素でクエンチし、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋ（Ｌｉｐｓｈａｗ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）でブロックし、そしてラットモノクローナル抗マウスＢ２２０およびＣＤ３（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）中でインキュベートする。抗体結合を、色素原（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）としてＤＡＢ（ＢｉｏＴｅｋ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を用いて、ビオチン化ウサギ抗ラット免疫グロブリンおよびペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジン（ＢｉｏＧｅｎｅｘ，Ｓａｎ Ｒａｍｏｎ，ＣＡ）によって検出する。切片を、ヘマトキシリンで対比染色する。
【０３３７】
剖検後、トランスジェニック動物およびコントロールの同腹仔由来の脾臓および胸腺のＭＬＮおよび切片を取出す。シリンジの平らな末端を用いて１００ｍｍナイロン性細胞ストレーナー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）の底に対してこの組織を穏やかに粉砕することによって単細胞懸濁物を調製する。細胞を２回洗浄し、計数し、次いで各組織由来の約１×１０６細胞を、２０μＬ容量において０．５μｇ ＣＤ１６／３２（ＦｃγＩＩＩ／ＩＩ）Ｆｃブロックで１０分間インキュベートする。次いで、サンプルを、ＦＩＴＣまたはＰＥに結合体化した、ＣＤ９０．２（Ｔｈｙ−１．２）、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）、ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ−１）、Ｇｒ−１、ＣＤ４またはＣＤ８に対するモノクローナル抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の０．５μｇ抗体を有する、１００μＬ容量のＰＢＳ（Ｃａ＋およびＭｇ＋を欠く）、０．１％ウシ血清アルブミンおよび０．０１％アジ化ナトリウム中で２〜８℃で３０分間染色する。抗体結合後、細胞を洗浄し、次いでＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのフローサイトメトリーによって分析する。
【０３３８】
本発明を好ましい実施形態に関して記載してきたが、改変および修飾が当業者に思い浮かぶことが理解される。それゆえ、添付の特許請求の範囲が、特許請求される本願発明の範囲内に入る全てのこのような等価な改変物を包含することが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０３３９】
【図１Ａ】ラットＩＦＮ−Ｌ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）、およびラットＩＦＮ−Ｌポリペプチドの推定のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。推定シグナルペプチドが示されている（下線）。
【図１Ｂ】ラットＩＦＮ−Ｌ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）、およびラットＩＦＮ−Ｌポリペプチドの推定のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。推定シグナルペプチドが示されている（下線）。
【図２Ａ】ヒトＩＦＮ−Ｌ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号４）、およびヒトＩＦＮ−Ｌポリペプチドの推定のアミノ酸配列（配列番号５）を示す。予想されるシグナルペプチドが示されている（下線）。
【図２Ｂ】ヒトＩＦＮ−Ｌ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号４）、およびヒトＩＦＮ−Ｌポリペプチドの推定のアミノ酸配列（配列番号５）を示す。予想されるシグナルペプチドが示されている（下線）。
【図３】ヒトＩＦＮ−Ｌポリペプチド（ｈｕＩＦＮ−Ｌ；配列番号５）、ヒトＩＦＮ−β（ｈｕＩＦＮ−β；配列番号７）、ラットＩＦＮ−Ｌポリペプチド（ｒａＩＦＮ−Ｌ；配列番号２）のアミノ酸配列アラインメント、およびそれらのアミノ酸位置を示す。これらはある程度の類似性（ｃｏｎｓ）を共有する；
【図４】Ａｍｇｅｎ株＃３７２９のＮｄｅＩ−Ｂａｍ  ＨＩ  ｐＡＭＧ２１インサートのヌクレオチド配列（配列番号８）およびこのインサートによってコードされる推定アミノ酸配列（配列番号９）を示す。
【図５】Ａｍｇｅｎ株＃３８５８のＮｄｅＩ−Ｂａｍ  ＨＩ  ｐＡＭＧ２１インサートのヌクレオチド配列（配列番号１０）およびこのインサートによってコードされる推定アミノ酸配列（配列番号１１）を示す。
【図６】Ａｍｇｅｎ株＃４０４７のＸｂａＩ−Ｂａｍ  ＨＩ  ｐＡＭＧ２１インサートのヌクレオチド配列（配列番号１２）およびこのインサートによってコードされる推定アミノ酸配列（配列番号１３）を示す。
【図７】Ａｍｇｅｎ株＃３９６９のＸｂａＩ−Ｂａｍ  ＨＩ  ｐＡＭＧ２１インサートのヌクレオチド配列（配列番号１４）およびこのインサートによってコードされる推定アミノ酸配列（配列番号１５）を示す。
【図８】Ａｍｇｅｎ株＃４１８２のＮｄｅＩ−Ｂａｍ  ＨＩ  ｐＡＭＧ２１インサートのヌクレオチド配列（配列番号１６）およびこのインサートによってコードされる推定アミノ酸配列（配列番号１７）を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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