(57)【要約】【課題】  鳥インフルエンザ等に有効な医薬品のほか、多数の医薬品、農薬等の原料となるシキミ酸を、効率よく、簡便な方法で、また環境に負荷を掛けない方法で製造する方法を提供することを目的とする。【解決手段】  シキミ酸を製造する方法において、１）酢酸菌由来の酵素存在下で、キナ酸から３−デヒドロシキミ酸を製造する第一工程、２）シキミ酸脱水素酵素（ＳＫＤＨ）とグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）の共役下、３−デヒドロシキミ酸からシキミ酸を製造する第二工程、の各工程を経由することを特徴としている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シキミ酸を製造する方法において、１）酢酸菌由来の酵素存在下で、キナ酸から３−デヒドロシキミ酸を製造する第一工程、２）シキミ酸脱水素酵素（ＳＫＤＨ）とグルコース脱水素酵素(ＧＤＨ)の共役下、３−デヒドロシキミ酸からシキミ酸を製造する第二工程、の各工程を経由することを特徴とするシキミ酸の製造方法。
【請求項２】
シキミ酸を製造する方法において、キナ酸から３-デヒドロシキミ酸を製造する第一工程の反応を、ｐＨ７〜ｐＨ９で行い、シキミ酸脱水素酵素（ＳＫＤＨ）とグルコース脱水素酵素(ＧＤＨ)の共役下、３−デヒドロシキミ酸からシキミ酸を製造する第二工程の反応を、ｐＨ６〜ｐＨ７で行うことを特徴とする請求項１に記載のシキミ酸の製造方法。
【請求項３】
第二工程における反応液が、ＮＡＤＰと、ＮＡＤＰに対し１００〜１００００倍モル濃度のグルコースを含むことを特徴とする請求項１または２に記載のシキミ酸の製造方法。
【請求項４】
第一工程で使用する酢酸菌由来の酵素が、キナ酸脱水素酵素（ＱＤＨ）であることを特徴とする請求項１または２に記載のシキミ酸の製造方法。
【請求項５】
第二工程で使用するシキミ酸脱水素酵素（ＳＫＤＨ）、およびグルコース脱水素酵素(ＧＤＨ)が、酢酸菌由来であることを特徴とする請求項１または２に記載のシキミ酸の製造方法。
【請求項６】
第二工程で使用する、シキミ酸脱水素酵素（ＳＫＤＨ）およびグルコース脱水素酵素(ＧＤＨ)は、これら両方の酵素を共に生産する能力を有する酢酸菌から得られた両方の酵素を含む粗酵素液の状態で使用するか、あるいは酢酸菌から単離され、精製された２つの酵素として使用することを特徴とする請求項５に記載のシキミ酸の製造方法。
【請求項７】
酢酸菌が、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属菌であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のシキミ酸の製造方法。
【請求項８】
Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属菌が、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ  ＩＦＯ  ３２４４であることを特徴とする請求項７に記載のシキミ酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酢酸菌を用いたシキミ酸の効率的な製造方法に関する。詳しくは、キナ酸を原料として、酢酸菌により３−デヒドロシキミ酸を合成し、さらに酢酸菌由来の酵素を用いて、３−デヒドロシキミ酸からシキミ酸を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シキミ酸は、多数の抗生物質、アルカロイド、除草活性物質などの有用な原料として用いられる芳香族アミノ酸の重要な中間体である。特に近年になって、世界的な流行を引き起こすと懸念されている鳥インフルエンザに対し、最も効果が期待されているタミフル（登録商標）の重要な原料化合物となっている。ＷＨＯ（世界保健機構）が、広く警告を出しているにもかかわらず、世界中で利用できる程充分な備蓄はない。その理由の１つとして、原料となるシキミ酸の調製が難しいことがあげられる。グルコースからシキミ酸に至るまでシキミ酸経路は、二つの異なった代謝経路より得られたホスホエノールピルビン酸とエリスロースー４−リン酸の縮合反応から始まる多段階の代謝経路を経由しなくてはならない。そのため、最新技術の代謝制御法や遺伝子増幅法を駆使してシキミ酸経路の代謝中間体を効率良く製造しても、シキミ酸まで到達するには障壁が大き過ぎるという欠点があった。本発明者らは、酢酸菌中の細胞膜結合型キナ酸脱水素酵素（Ｑｕｉｎｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｑｕｉｎａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＱＤＨ）を用いて、キナ酸からシキミ酸経路の中間体である３−デヒドロシキミ酸を製造する方法を明らかにし（特許文献１）、また酢酸菌の単独培養系でキナ酸からシキミ酸を製造する方法も提供している（非特許文献１）。
【０００３】
現在、中国では、シキミ酸を植物のシキミ（Ｉｌｌｉｃｉｕｍ  ａｎｉｓａｔｕｍ）やトウシキミ（Ｉｌｌｉｃｉｕｍ  ｖｅｒｕｍ）から抽出しているが、天然物であるため、同質の原料を常時入手することは困難である。
【０００４】
有機化学的にシキミ酸を製造する方法については、キナ酸誘導体からフィルスマイヤー試薬を用いて脱水することによりシキミ酸誘導体を製造する方法（特許文献２）、ジアミノシキミ酸誘導体をイソフタル酸誘導体から製造する方法（特許文献３）、あるいは、フランから製造する方法（特許文献４）が知られている。これらはシキミ酸誘導体であり、目的とする物質の製造においては困難な反応を必要とする可能性がある。
【０００５】
また、シキミ酸を安価に製造する方法として、抽出源から抽出した無機塩を多量に含むキナ酸含有原料液から、キナ酸を単離せず、酸又は塩基触媒存在下、アルコール類と反応させてキナ酸エステルに変換した後、酸触媒存在下、ケトン誘導体又はアルデヒド誘導体と反応させてキナ酸エステルのアセタール体を製造し、該キナ酸誘導体からシキミ酸前駆体及びシキミ酸を製造する方法も開示されている（特許文献５）。
【０００６】
さらに、発酵法によりシキミ酸を製造する方法も知られており、シキミ酸を菌体外に分泌する性質を有するシトロバクター属に属する微生物を用いて、効率的にシキミ酸を製造する方法が開示されている（特許文献６）。しかしながら発酵法による製造法では、培養液中にはシキミ酸の他に多くの物質が存在するため精製工程が煩雑である。
【特許文献１】特開２００３−７０４９７号公報
【特許文献２】特許第３６４１３８４号公報
【特許文献３】特開２００１−３５４６３５号公報
【特許文献４】特開２００１−２８８１５２号公報
【特許文献５】特開平１１−３４９５８３号公報
【特許文献６】特開２００２−２８１９９３号公報
【非特許文献１】Ａｄａｃｈｉ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７：２１２４−２１３１（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、鳥インフルエンザ等に有効な医薬品のほか、多数の医薬品、農薬等の原料となるシキミ酸を、効率よく、簡便な方法で、また環境に負荷を掛けない方法で製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、グルコースから始まるシキミ酸経路における中間代謝物から酢酸菌を利用して容易にシキミ酸を製造する方法を開発した。すなわち、本発明は下記の構成を有する。
【０００９】
（１）シキミ酸を製造する方法において、１）酢酸菌由来の酵素存在下で、キナ酸から３−デヒドロシキミ酸を製造する第一工程、２）シキミ酸脱水素酵素（ＳＫＤＨ）とグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）の共役下、３−デヒドロシキミ酸からシキミ酸を製造する第二工程、の各工程を経由することを特徴とするシキミ酸の製造方法。
【００１０】
（２）シキミ酸を製造する方法において、キナ酸から３−デヒドロシキミ酸を製造する第一工程の反応を、ｐＨ７〜ｐＨ９で行い、シキミ酸脱水素酵素（ＳＫＤＨ）とグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）の共役下、３−デヒドロシキミ酸からシキミ酸を製造する第二工程の反応を、ｐＨ６〜ｐＨ７で行うことを特徴とする（１）に記載のシキミ酸の製造方法。
【００１１】
（３）第二工程における反応液が、ＮＡＤＰと、ＮＡＤＰに対し１００〜１００００倍モル濃度のグルコースを含むことを特徴とする（１）または（２）に記載のシキミ酸の製造方法。
【００１２】
（４）第一工程で使用する酢酸菌由来の酵素が、キナ酸脱水素酵素（ＱＤＨ）であることを特徴とする（１）または（２）に記載のシキミ酸の製造方法。
【００１３】
（５）第二工程で使用する、シキミ酸脱水素酵素（ＳＫＤＨ）およびグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）が、酢酸菌由来であることを特徴とする（１）または（２）に記載のシキミ酸の製造方法。
【００１４】
（６）第二工程で使用する、シキミ酸脱水素酵素（ＳＫＤＨ）およびグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）は、これら両方の酵素を共に生産する能力を有する酢酸菌から得られた両方の酵素を含む粗酵素液の状態で使用するか、あるいは酢酸菌から単離され、精製された２つの酵素として使用することを特徴とする（５）に記載のシキミ酸の製造方法。
【００１５】
（７）酢酸菌が、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属菌であることを特徴とする（１）〜（６）のいずれかに記載のシキミ酸の製造方法。
【００１６】
（８）Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属菌が、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ  ＩＦＯ  ３２４４であることを特徴とする、（７）に記載のシキミ酸の製造方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のシキミ酸の製造法により、シキミ酸およびシキミ酸経路の代謝中間体の製造が容易になったため、これらを原料とする有用物質の製造が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明者らは、先に、細胞膜結合型キナ酸脱水素酵素（Ｑｕｉｎｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｑｕｉｎａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＱＤＨ）と３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ（３−Ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ：ＤＱＤ）が、酢酸菌の細胞質膜外皮上に広く存在し、特にＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属菌では、通常の発酵生産手法でキナ酸が３−デヒドロキナ酸を経由して３−デヒドロシキミ酸に酸化されることを見出し報告した。（Ａｄａｃｈｉ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７：２１２４−２１３１（２００３）（上記非特許文献１）、Ａｄａｃｈｉ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７：２１１５−２１２３（２００３）、Ｖａｎｇｎａｉ  Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２４１：１５７−１６２（２００４））
【００１９】
さらに、酢酸菌の細胞質では、３−デヒドロシキミ酸からシキミ酸を生成する場合と、逆にシキミ酸を酸化して３−デヒドロシキミ酸を生成する、可逆的作用を有するＮＡＤＰ依存性シキミ酸脱水素酵素（Ｓｈｉｋｉｍａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＳＫＤＨ）が存在することを、１つの細胞系で行った結果明らかにした。（Ａｄａｃｈｉ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７：２１２４−２１３１（２００３）（上記非特許文献１）、Ａｄａｃｈｉ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７：２１１５−２１２３（２００３）、Ａｄａｃｈｉ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１６４７：１０−１７（２００３）、Ａｄａｃｈｉ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６０：６４３−６５３（２００３））
【００２０】
このことから、シキミ酸の製造量を上げるためには、図1に示すような二つの独立した酵素反応系を利用することが必要であることを見出し、二工程からなるシキミ酸の製造方法を完成させた。
【００２１】
＜反応第一工程＞
第一工程では、キナ酸からＱＤＨにより３−デヒドロキナ酸が生成し、３−デヒドロキナ酸からＤＱＤにより３−デヒドロシキミ酸が生成する流れであり、キナ酸と乾燥菌体、あるいは細胞膜とを従来の方法で培養し、培養液中に存在するＱＤＨとＤＱＤにより、３−デヒドロシキミ酸を製造する反応工程である。培養液中には、乾燥菌体、あるいは細胞膜由来のＱＤＨおよびＤＱＤが存在することが必要であり、特にＱＤＨを生成する菌株を選び使用しなければならない。ＱＤＨが生成される菌株であればいずれの菌株でも良い。
【００２２】
＜反応第二工程＞
第二工程では、３−デヒドロシキミ酸からシキミ酸を製造する。これは、細胞質ゲル内に存在する二種類の酵素を共役させて酵素反応を行う工程である。すなわちＮＡＤＰ下、グルコースからグルコノ−δ−ラクトンとＮＡＤＰＨに変換する活性を有するＮＡＤＰ依存性グルコース脱水素酵素（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＧＤＨ）と、ＳＫＤＨとを同時進行で反応させることにより、３−デヒドロシキミ酸からシキミ酸を製造することができる。この場合、３−デヒドロシキミ酸を添加する前に、反応系にはＮＡＤＰに対し過剰のグルコースを存在させておくことが望ましい。
【００２３】
＜酢酸菌の選択＞
本発明で用いる酢酸菌としては、ＱＤＨを多く有する菌が望ましく、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓやＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｍｅｌａｎｏｇｅｎｕｓなどが好ましく、特にＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ  ＩＦＯ  ３２４４が最も好ましい。
【００２４】
＜酵素の調製＞
第二工程で使用するＧＤＨおよびＳＫＤＨは、酢酸菌から精製して得ることができる。ＧＤＨおよびＳＫＤＨは、両方の酵素を共に生産する能力を有する酢酸菌を培養して、該酢酸菌の細胞質内に前記酵素を蓄積させ、該菌体の破砕液から抽出することにより得られた両方の酵素を含む粗酵素液の状態でも使用でき、あるいは前記の菌体破砕液から、別々に単離し、精製した二つの酵素として使用することもできる。ＧＤＨの精製は、Ａｄａｃｈｉらの方法（Ａｄａｃｈｉ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４４：３０１−１０８（１９８０））を用いることができる。
【００２５】
また、ＳＫＤＨは以下の方法で精製して得ることができる。酢酸菌を、メルカプトエタノールを含むリン酸Ｂｕｆｆｅｒ中でホモゲナイズし、遠心分離により得られた上清をカラムクロマトグラフィーにより精製する。カラムクロマトグラフィーは、定法に従って行うが、ＳＫＤＨの精製においては、ＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラム、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム、Ｂｌｕｅ−Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム等を用いＫＣｌを含有させたメルカプトエタノールで溶出する。溶出液からは、定法に従って、硫酸アンモニウム沈殿法により精製することができる。
【００２６】
＜酵素反応条件＞
本発明における第一工程および第二工程での反応温度は、反応が進行すれば、特に限定されない。基質の溶解度、使用される酵素の安定性を考慮すると、２０℃〜５０℃、好ましくは２５℃〜３０℃の温度で反応させることが望ましい。
【００２７】
第一工程における酵素反応液のｐＨは、使用される酵素の安定性、生成物の安定性
を考慮することが必要である。ｐＨ４〜ｐＨ９の反応液で２０時間酵素反応を行った場合のキナ酸から３−デヒドロシキミ酸への変換状況は、ペーパークロマトグラフィー法で確認することができる。図２に示す結果から、ｐＨ４〜ｐＨ５では３−デヒドロシキミ酸への変換を全く確認できず、ｐＨ６では約５０％の変換を認め、ｐＨ７〜ｐＨ９では高効率な変換を確認した。この結果から、反応は、ｐＨ７〜ｐＨ９で行うことが好ましいと推定された。しかしながら、長時間反応した場合には、副生成物のプロトカテキン酸が生成されることが確認されており、反応は短時間（２０時間程度）で終わらせることが望ましい。
【００２８】
第二工程において、３−デヒドロシキミ酸の還元反応によりシキミ酸を生成する反
応系で使用するＳＫＤＨは、３−デヒドロシキミ酸からシキミ酸が生成する還元反応と、シキミ酸から３−デヒドロシキミ酸が生成する逆向きの酸化反応とが、ｐＨに依存して平衡状態に達することを前記で述べたが、本発明者らは、さらに以下の知見を得ている。高純度に精製されたＳＫＤＨは、ｐＨ１０．０では、ＳＫＤＨ酸化活性を示しシキミ酸に対する酵素活性は６０ｕｎｉｔｓ／ｍｇであり、ｐＨ６〜ｐＨ７においては、還元活性を示し３−デヒドロシキミ酸に対する酵素活性は２５ｕｎｉｔｓ／ｍｇであった。またＫｍ（ミカエリス‐メンテン定数）を示すと、ｐＨ１０．０におけるシキミ酸に対する酸化反応では０．５ｍＭ、ｐＨ５〜ｐＨ７における３−デヒドロシキミ酸に対する還元反応では０．２ｍＭであった。従って、本発明の第二工程において、３−デヒドロシキミ酸から有効にシキミ酸を製造するためには、反応液をｐＨ６〜ｐＨ７、好ましくはｐＨ７に保つことが望ましい。
【００２９】
＜ペーパークロマトグラフィ法＞
本発明の酵素反応により生成する、３−デヒドロキナ酸、３−デヒドロシキミ酸、シキミ酸、および原料であるキナ酸の確認は、ペーパークロマトグラフィ法により行うことができる。ＹｏｓｈｉｄａとＨａｓｅｇａｗａの方法（Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｓ．ａｎｄ  Ｈａｓｅｇａｗａ  Ｍ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，７０：３７７−３８８（１９５７））に準じ、本発明者らが先に報告した方法（Ａｄａｃｈｉ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７：２１２４−２１３１（２００３））でペーパークロマトグラフィーを行う場合は、ギ酸を２％含む、ベンジルアルコール：２−ブタノール：２−プロパノール：水＝３：１：１：１（Ｗ／Ｖ）の展開溶媒を用いて、存在する物質をペーパー上に分離したのち、乾燥する。１Ｍの酢酸と１Ｍの酢酸ナトリウムの混合溶液１２．５ｍｌにメタ過ヨーソ酸ナトリウム１６０ｍｇを溶解した液をスプレーし、２０分後に３％アニリンのアルコール溶液をスプレーする。この条件では、原料のキナ酸と酸化代謝物の３−デヒドロキナ酸は、ほぼ同じＲｆ値を示すが、スポットの色が異なり、キナ酸は淡いピンク色を呈し、３−デヒドロキナ酸は黄色を呈する。さらに３−デヒドロキナ酸の上方にシキミ酸の赤いスポットを、さらに上方に３−デヒドロシキミ酸の黄色のスポットを確認することができる。
【００３０】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定さ
れるものではない。
【実施例１】
【００３１】
３−デヒドロシキミ酸の製造
１ｇのキナ酸と２．５ｇの酢酸菌Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ  ＩＦＯ  ３２４４の細胞膜乾燥体を、５００ｍｌのエルレンマイアーフラスコに入れ、１００ｍｌのＭｃＩｌｖａｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８）を加え、３０℃で２０時間振盪して反応させた。反応を終了させるためトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を５．５％になるように添加し、遠心分離により菌体等を除き、３−デヒドロシキミ酸を含む上清を得た。
【００３２】
３−デヒドロシキミ酸の確認
上記で得られた上清に０．１Ｍの酢酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）を加えて５０倍に希釈した。３−デヒドロシキミ酸の生成を確認するため、希釈液の1部を取り０．２５μモルのＮＡＤＰＨ（オリエンタル酵母社製）とＳＫＤＨ（３−デヒドロシキミ酸の還元活性として１ｕｎｉｔ）を加えて０．１Ｍの酢酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）で１ｍｌとし、２５℃で反応させた。ＮＡＤＰＨのＮＡＤＰへの変換が平衡に達する時点で確認したところ、３−デヒドロシキミ酸の最終濃度は約４０ｍＭであった。これは、キナ酸の７５％が３−デヒドロシキミ酸に変換したことを示す。
【００３３】
３−デヒドロシキミ酸の精製
上記、０．１Ｍの酢酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）を加えて５０倍に希釈した３−デヒドロシキミ酸を含む画分は、Ｄｏｗｅｘ５０を充填したカラムクロマトグラフィーに供し、アルカリで中和したのち、凍結乾燥した。この凍結乾燥体を少量の水に溶解し、不溶性物質を遠心分離より除去した。この結果、シキミ酸製造の原料となる３−デヒドロシキミ酸濃度は２．１Ｍであった。
【実施例２】
【００３４】
シキミ酸脱水素酵素の精製
菌体（湿重量約３００ｇ）を、５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む２ｍＭのリン酸カリウムｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２：ＫＰＢ）１ｌに懸濁した。この菌体懸濁液を、加圧式ホモジナイザー（Ｍｉｎｉ−Ｌａｂ、ｔｙｐｅ  ８．３０Ｈ、Ｒａｎｎｉｅ社製、デンマーク）に二回かけ、菌体を破砕した。得られた菌体破砕液を、６８，０００×ｇで９０分間遠心分離して不溶固体を除き、上清を取り出した。ここで得られた上清１１００ｍｌをＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラム（５×３０ｃｍ）に供し、ＫＰＢで平衡化した。１００ｍＭ  ＫＣｌを含有するＫＰＢでカラムを洗い流し、次いで、２００ｍＭ  ＫＣｌを含有するＫＰＢでＳＫＤＨを溶出した。次に、溶出したＳＫＤＨを、ＫＰＢで１００ｍＭ  ＫＣｌ濃度とし、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−５０カラム（２．５×２０ｃｍ）に供した。１５０ｍＭ  ＫＣｌを含有するＫＰＢでカラムを洗い流し、次いで、段階的に、１７５ｍＭ、２００ｍＭ、２２０ｍＭのＫＣｌを含有するＫＰＢでＳＫＤＨを溶出した。次に、１７５ｍＭと２００ｍＭのＫＣｌを含有するＫＰＢで溶出した画分を合わせ、ＫＰＢで１００ｍＭ  ＫＣｌ濃度とし、Ｂｌｕｅ−Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂカラム（１．５×２０ｃｍ）に供した。１００ｍＭ  ＫＣｌを含有するＫＰＢでカラムを洗浄した後、３００ｍＭ  ＫＣｌを含有するＫＰＢでＳＫＤＨを溶出した。ＳＫＤＨ画分を硫酸アンモニウム沈殿法で処理してＳＫＤＨの沈殿を得た。沈殿を少量のＫＰＢに溶解し、ＫＰＢで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５カラム（１．５×１２５ｃｍ）に供した。溶出液は、３５滴（約１．２ｍｌ）ずつ分画した。ＳＫＤＨ活性が最も高かったのは第９２番目の画分であった。ＳＫＤＨ活性を有する画分を集め、硫酸アンモニウム沈殿法を行うことにより、菌体破砕で得られた上清と比べ、その比活性が２５５０倍に高められたＳＫＤＨを得た。
【００３５】
シキミ酸の製造
実施例１で得られた３−デヒドロシキミ酸２５０ｍｇ（約１．４ｍモル）と、上記の方法で得られたＳＫＤＨ（３−デヒドロシキミ酸の還元活性として２０ｕｎｉｔｓ）、ＮＡＤＰ（５μモル：オリエンタル酵母社製）、ＧＤＨ（１０００ｕｎｉｔｓ）、グルコースを（約５．０ｍモル）加え、５ｍＭのβ−メルカプトエタノールと５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む、３０ｍＭのＫＰＢ（ｐＨ７．０）で全量を２０ｍｌとした。反応は２５℃で行い、反応液０．１ｍｌを取り出し６０％ＴＣＡを１０μｌ加えて反応を終了させ、沈殿物を遠心分離により除去した。反応の途中、および終了時点で、このように反応液の一部を経時的に取り出して、ペーパークロマトグラフィー法による分析を行った結果を図３（上）に示した。３−デヒドロシキミ酸からシキミ酸への還元反応は、未反応の３−デヒドロシキミ酸が消滅した９０分で完了したことが明らかになった。
【００３６】
また、別途サンプル液を、０．２５μモルのＮＡＤＰ存在下、ＳＫＤＨ（酸化活性として１ｕｎｉｔ）と５０ｍＭグリシン−  ＮａＯＨ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ１０．０）を加えて１時間反応させ、シキミ酸量を酵素変換した３−デヒドロシキミ酸量として３４０ｎｍの吸光度で測定した結果を図３（下）に示した。その結果、３−デヒドロシキミ酸からシキミ酸への酵素反応は１００％進行しており、ペーパークロマトグラフィーと一致した。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明により、コーヒー糟などキナ酸を含む材料の有効利用が可能になり、また、シキミ酸およびシキミ酸経路の代謝中間体を原料とする医薬品等の有用物質の製造が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】シキミ酸の製造方法における二工程を示した図面である。反応第一工程は、酢酸菌細胞膜存在下、キナ酸からＧＤＨにより３−デヒドロキナ酸が生成し、３−デヒドロキナ酸からＤＱＤにより３−デヒドロシキミ酸が生成することを表し、反応第二工程は、細胞質由来のＧＤＨにより、ＮＡＤＰ存在下、グルコースがグルコノ−δ−ラクトンとＮＡＤＰＨに変換することにより、３−デヒドロシキミ酸が細胞質由来のＳＫＤＨによりシキミ酸に変換されることを表している。
【図２】種々のｐＨにおける３−デヒドロシキミ酸生成を確認するために行ったペーパークロマトグラフィーの図面に代わる写真である。キナ酸（ＱＡ）、３−デヒドロキナ酸（ＤＱＡ）、３−デヒドロシキミ酸（ＤＳＡ）のスポットを表している。
【図３】（上）シキミ酸生成を確認するために、経時的に反応液０．１ｍｌを取り出し、反応を停止させて行ったペーパークロマトグラフィーの図面に代わる写真である。シキミ酸（ＳＫＡ）、３−デヒドロシキミ酸（ＤＳＡ）のスポットを表している。（下）反応液の一部を経時的に取り出して酵素反応を行い、３−デヒドロシキミ酸からシキミ酸に変換された割合を表した図面である。
【図１】
2007300809.tif 000002
【図２】
2007300809.tif 000003
【図３】
2007300809.tif 000004